(57)【要約】  本発明は、８−メトキシブチン（８−ｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔｉｎ）又はその許容可能な塩を有効成分で含む皮膚美白又は熱老化改善用組成物に関するもので、前記組成物は、細胞毒性を現わさないと共に、熱老化を防止すると知られた熱衝撃タンパク質７０の発現を増加させ、皮膚色素沈着と関連されたチロシナーゼの活性を阻害する効果を示すことによって、８−メトキシブチンを有効成分で含む組成物は、皮膚美白又は熱老化改善用化粧料組成物、皮膚外用剤又は健康機能食品などで有用に用いられ得る。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
８−メトキシブチン（８−ｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔｉｎ）又はその化粧品学的に許容可能な塩を有効成分で含むことを特徴とする、皮膚美白又は熱老化改善用化粧料組成物。
【請求項２】
前記皮膚美白は、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）の活性抑制により達成されることを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項３】
前記皮膚熱老化改善は、熱衝撃タンパク質（ＨＳＰ７０）の発現増加により達成されることを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項４】
前記８−メトキシブチンは、植物性エストロゲン活性を有することを特徴とする、請求項１に記載の化粧料組成物。
【請求項５】
８−メトキシブチン又はその許容可能な塩を有効成分で含むことを特徴とする、皮膚美白又は熱老化改善用皮膚外用剤。
【請求項６】
８−メトキシブチン又はその食品学的に許容可能な塩を有効成分で含むことを特徴とする、皮膚美白又は熱老化改善用健康機能食品。
【請求項７】
８−メトキシブチン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分で含むことを特徴とする、皮膚美白又は熱老化改善用薬学的組成物。
【請求項８】
８−メトキシブチン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分で含むことを特徴とする、皮膚美白又は熱老化改善用医薬外品組成物。
【請求項９】
８−メトキシブチン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分で含む組成物を個体の皮膚に塗布するステップを含むことを特徴とする、皮膚美白又は熱老化改善方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、８−メトキシブチン（８−ｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔｉｎ）又はその許容可能な塩を有効成分で含む皮膚美白又は熱老化改善用組成物に関するもので、具体的に、８−メトキシブチン又はその許容可能な塩を有効成分で含む皮膚美白又は熱老化改善用化粧料組成物；皮膚美白又は熱老化改善用皮膚外用剤；皮膚美白又は熱老化改善用健康機能食品；皮膚美白又は熱老化改善用薬学的組成物；皮膚美白又は熱老化改善用医薬外品組成物；及び上記組成物を皮膚に塗布するステップを含む皮膚美白又は熱老化改善方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然物は、薬、飲食、化粧品に活用される可能性を有した素材として昔から活用されてきた。アルカロイド、テルペン、フラボノイドなどの植物に由来した天然物質が知られた。このうち、フラボノイドは、ポリフェノール物質の大きいグループで構成されており、果物、野菜、医薬用植物などから発見され、花、果物、野菜の色を決定し且つＵＶ吸収を保護する重要な役割をする。フラボノイドは、二つのベンゼン環が連結された１５−炭素構造を基本として特定残基の酸化や置換によって区分される。
【０００３】
フラボノイドの活性は、抗酸化、肝保護、抗菌、抗ウイルス、抗癌効果など多様な生物学的活性を有するものとして報告された。多くの活性の中でも優れた抗老化、美白活性で化粧品素材への活用可能性を有している。
【０００４】
皮膚老化の最大の原因は、太陽の紫外線と赤外線により熱と反応性酸素種（ＲＯＳ）を発生させることである。特に、赤外線は、平均３７度で維持される皮膚の温度を４０度以上に増加させて熱衝撃を発生し、ずっと高い温度が持続する場合、色素沈着及びしわ生成を増加させる。これを熱老化（Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｓｋｉｎ  Ａｇｉｎｇ）と言う。また、最近の研究で、紫外線以外に赤外線による熱老化が光老化を加速化させるという多数の実験結果と論文（Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（２００６）２、Ｓ１３−Ｓ２２「Ｔｈｅｒｍａｌ  ａｇｉｎｇ：Ａ  ｎｅｗ  ｃｏｎｃｅｐｔ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ａｇｉｎｇ」、Ｐｈｏｔｏｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｐｈｏｔｏｉｍｍｕｎｏｌ  Ｐｈｏｔｏｍｅｄ（２００６）２２、１４８−１５２「Ｍｉｎｉｍａｌ  ｈｅａｔｉｎｇ  ｄｏｓｅ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｕｎｉｔ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ｉｎｆｒａｒｅｄ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ」）などが発表されており、これに対する学界の関心が大きい実情である。
【０００５】
一方、細胞内に持続的な熱発生によりストレスが誘導されると、７０  ｋＤａサイズの熱衝撃タンパク質（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であるＨＳＰ７０の発現が増加し、これは、ストレス誘導による細胞損傷を阻んで皮膚を保護すると報告されている。したがって、熱衝撃タンパク質７０を効果的に誘導すると、熱による皮膚老化を改善することができる。
【０００６】
皮膚の色は、皮膚内部のメラニン細胞（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）が合成したメラニン（ｍｅｌａｎｉｎ）の量と分布によって決定される。メラニン色素は、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ；α−ＭＳＨ）信号伝逹メカニズムによって合成が調節されるが、α−メラニン細胞刺激ホルモンとＭＣ１Ｒ受容体（ｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）の結合によってｃＡＭＰ（ｃｙｃｌｉｃ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）が増加してＰＫＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ａ）が活性化され、それによって、メラニンの形成において重要な要素であるチロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）を生成する転写因子であるＭＩＴＦ（Ｍｉｃｒｏｐｈｔｈａｌｍｉａ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ）が活性化される。チロシナーゼは、メラニン細胞内でチロシン（ｔｙｒｏｓｉｎｅ）をドーパ（ＤＯＰＡ）、ドーパキノン（Ｄｏｐａｑｕｉｎｏｎｅ）に変えて非酵素的酸化反応を経てメラニンを生成する。
【０００７】
最近の化粧品開発は、熱老化及び皮膚美白、抗酸化活性を全て有した複合機能性化粧品素材の開発を追求しており、安定性が保障された天然素材から抽出及び活性物質の高含有分画製造を通じた化粧品の開発が増加している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、天然物に由来する皮膚美白又は熱老化改善効果を示すフラボノイド成分を抽出するための研究を行った結果、オオキンケイギク (Coreopsis lanceolata)から８−メトキシブチン（８−Ｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔｉｎ）分離し、これに対する皮膚美白又は熱老化改善活性を確認することで、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一つの目的は、８−メトキシブチン（８−ｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔｉｎ）又はその化粧品学的に許容可能な塩を有効成分で含む皮膚美白又は熱老化改善用化粧料組成物を提供することである。
【００１０】
本発明の他の目的は、８−メトキシブチン又はその許容可能な塩を有効成分で含む皮膚美白又は熱老化改善用皮膚外用剤を提供することである。
【００１１】
本発明のまた他の目的は、８−メトキシブチン又はその食品学的に許容可能な塩を有効成分で含む皮膚美白又は熱老化改善用健康機能食品を提供することである。
【００１２】
本発明のまた他の目的は、８−メトキシブチン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分で含む皮膚美白又は熱老化改善用薬学的組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のまた他の目的は、８−メトキシブチン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分で含む皮膚美白又は熱老化改善用医薬外品組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のまた他の目的は、８−メトキシブチン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分で含む組成物を個体の皮膚に塗布するステップを含む皮膚美白又は熱老化改善方法を提供することである。
【発明の効果】
【００１５】
本発明の８−メトキシブチンを有効成分で含む組成物は、細胞毒性を現わさずに、熱老化を防止すると知られた熱衝撃タンパク質７０の発現を増加させ、皮膚色素沈着と関連されたチロシナーゼの活性を阻害する効果を示すことによって、８−メトキシブチンを有効成分で含む組成物は、皮膚美白又は熱老化改善用化粧料組成物、皮膚外用剤又は健康機能食品などで有用に用いられ得る。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、８−メトキシブチンの毒性と細胞の成長に及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】図２は、８−メトキシブチンがチロシナーゼを抑制してメラニン合成を抑制する効果を示すグラフである。
【図３】図３は、８−メトキシブチンに熱が加えられた状況で熱衝撃タンパク質７０の発現を増加させる効果を示すグラフである。
【図４】図４は、シミュレーションを通じてエストロゲン受容体に８−メトキシブチンが結合することを予測した結果を示す図である。
【図５】図５は、エストロゲン受容体のレポーター実験を通じて８−メトキシブチンが植物性エストロゲンの活性を有することを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本発明に開示されたそれぞれの説明及び実施形態はそれぞれの他の説明及び実施形態にも適用できる。すなわち、本発明で開示された多様な要素の全ての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、下記記述された具体的な叙述によって本発明の範疇が制限されるものではない。
【００１８】
また、当該技術分野の通常の知識を有した者は、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本発明の特定様態に対する多数の等価物を認知するか確認することができる。また、このような等価物は本発明に含まれるものと意図される。
【００１９】
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２０】
前記目的を達成するための一つの様態であって、本発明は、８−メトキシブチン（８−ｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔｉｎ）又はその化粧品学的に許容可能な塩を有効成分で含む皮膚美白又は熱老化改善用化粧料組成物を提供する。
【００２１】
【化１】
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【００２２】
本発明で「８−メトキシブチン（８−ｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔｉｎ）」は、前記化学式１で表示され、分子式Ｃ１６Ｈ１４Ｏ６、分子量３０２ｇ／ｍｏｌを有する化合物であって、Ｆｌａｖａｎｏｌａｎｃｅｏｌｅｔｉｎ又は２−（３，４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）−７−ｈｙｄｒｏｘｙ−８−ｍｅｔｈｏｘｙ−２，３−ｄｉｈｙｄｒｏ−４Ｈ−１−ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎ−４−ｏｎｅとも名付けられた。８−メトキシブチンは、オオキンケイギクから抽出でき、オオキンケイギク以外の他の菊から８−メトキシブチンを抽出することができるかに対しては学界では知られていない。また、前記８−メトキシブチンの具体的な薬理活性に対してはまだ研究が進行中であるが、直接的に皮膚美白又は熱老化改善効果を有するか否かに対しては明らかにされていない。
【００２３】
前記８−メトキシブチンの獲得方法は特に限定されず、当業界に公知された方法を用いて化学的に合成するか、市販される物質を用いることができる。
【００２４】
本発明の化学式１で表示される８−メトキシブチンは、溶媒化された形態だけではなく非溶媒化された（ｕｎｓｏｌｖａｔｅｄ）形態で存在してもよい。本発明の８−メトキシブチンは、結晶形又は無定形の形態で存在することができ、このような全ての物理的形態は本発明の範囲に含まれる。
【００２５】
本発明において、「化粧品学的に許容可能な塩」は、８−メトキシブチンが他の物質と結合した塩の形態であって、化粧品学的に８−メトキシブチンと類似した活性を示すことができる物質を意味する。
【００２６】
本発明において、「皮膚美白」とは、メラニン色素の合成を阻害することで肌のトーンを明るくするだけでなく、紫外線、ホルモン又は遺伝に起因したシミやソバカスなどの皮膚過剰色素沈着を改善することを言う。
【００２７】
本発明の前記化粧料組成物は、メラニン合成抑制、チロシナーゼ（ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）の活性抑制により達成されるものであってもよい。具体的に、チロシナーゼの活性阻害、活性酸素生成抑制又は過酸化窒酸塩生成を抑制するものであってもよい。
【００２８】
本発明の一実施例では、皮膚色素沈着と関連された８−メトキシブチンのチロシナーゼの活性阻害効果を確認した結果、前記化合物は、チロシナーゼの活性減少効果を示した。特に、対照群で用いられたＧＡＰＤＨに比べて著しいチロシナーゼ活性減少効果を示したことから、８−メトキシブチンを含む組成物は、皮膚美白用化粧料組成物として用いられ得ることを確認した（図２）。
【００２９】
また、本発明の他の一実施例では、８−メトキシブチンのメラニン生成阻害効果を分析した結果、前記化合物は、濃度依存的にメラニン合成を阻害することを確認したことから（図２）、８−メトキシブチンを含む組成物は、皮膚美白用化粧料組成物として用いられ得ることを再確認した。
【００３０】
本発明において「熱老化」とは、皮膚の熱老化を意味し、日光露出（紫外線）により皮膚が老化する生理現象を意味することだけではなく、波長が比較的長い７８０ｎｍ〜３０００ｎｍの赤外線により皮膚の熱が増加して老化が進行されることを意味するもので、長期間の間紫外線又は赤外線に露出されると、顔、首に深いシワが増加して皮膚の乾燥及び皮膚表面が荒れるか斑点、ソバカスなどの色素沈着を起こすことを言う。
【００３１】
本発明において「改善」とは、紫外線又は赤外線に露出されても皮膚のシワが増加する程度を抑制するか皮膚が荒れることを緩和させることができることを含み、皮膚に斑点、ソバカスなどの色素沈着が進行する程度を緩和させることを含む。
【００３２】
本発明の前記化粧料組成物は、熱衝撃タンパク質７０（ｈｅａｔ  ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＨＳＰ７０）の発現増加により達成されるものであってもよい。
【００３３】
熱衝撃タンパク質は、熱を含めたアミノ酸類似体、重金属、毒素、酸化物などの環境的ストレスとウイルスやバクテリアが細胞に侵入する場合、又は老化や炎症が細胞に誘発された場合のような病的ストレス状況でも発現され得る。これら多様なストレスに対して発現する熱衝撃タンパク質のうち熱衝撃タンパク質７０が温度変化に最も多くの反応を示すもので、熱衝撃タンパク質７０は、細胞が急激な温度上昇の条件に処したときに数分以内に細胞内で合成され得る。熱衝撃タンパク質は、細胞にストレスが与えられたときに細胞を保護して過度な外部刺激などの不適切な条件下で細胞の生存力を増加させる機能をする物質である。このうち、熱衝撃タンパク質７０の機能のうち最も重要な機能は、分子シャペロンとして変性された他の酵素タンパク質と結合してタンパク質の適切な折り畳み（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ）を維持させて細胞の損傷を最小化し、細胞膜を通じたタンパク質輸送やタンパク質合成のような細胞内恒常性維持に重要に作用する。したがって、熱衝撃タンパク質７０の発現が増加するほど細胞の損傷を最小化して熱損傷を含めた熱老化から皮膚細胞を保護することができる。
【００３４】
本発明の一実施例では、熱老化改善と関連された８−メトキシブチンの熱衝撃タンパク質７０（ＨＳＰ７０）発現に関する効果を確認した結果、前記化合物は、熱衝撃タンパク質７０の発現を増加させる効果を示した。特に、対照群で用いられたＡＣＴＩＮに比べて著しい熱衝撃タンパク質７０発現増加効果を示したことから、８−メトキシブチンを含む組成物は、熱老化改善用化粧料組成物で用いられ得ることを確認した（図３）。
【００３５】
本発明の化粧料組成物において、８−メトキシブチンは、植物性エストロゲン活性を有するものであってもよい。本発明において「植物性エストロゲン活性」とは、８−メトキシブチンが植物性エストロゲン受容体と結合して植物性エストロゲンが活性化されるようにすることを言う。植物性エストロゲンが活性化される場合、コラーゲンの消失を防止して皮膚の厚さを維持させることで皮膚シワの生成を抑制することができ、皮膚水分を維持させることで皮膚老化を遅延させる得る。
【００３６】
本発明による化粧料組成物は、溶液、外用軟膏、クリーム、フォーム、栄養化粧水、柔軟化粧水、パック、柔軟水、乳液、メイクアップベース、エッセンス、石鹸、液体洗浄料、入浴剤、日焼け止めクリーム、サンオイル、懸濁液、乳濁液、ペースト、ゲル、ローション、パウダー、石鹸、界面活性剤−含有クレンジング、オイル、粉末ファンデーション、乳濁液ファンデーション、ワックスファンデーション、パッチ及びスプレーで構成された群から選択される剤形で製造できるが、これに制限されるものではない。
【００３７】
また、本発明の化粧料組成物は、一般皮膚化粧料に配合される化粧品学的に許容可能な担体を１種以上さらに含んでもよく、通常の成分として、例えば、油分、水、界面活性剤、保湿剤、低級アルコール、増粘剤、キレート剤、色素、防腐剤、香料などを適切に配合してもよいが、これに制限されるものではない。
【００３８】
本発明の化粧料組成物に含まれる化粧品学的に許容可能な担体は、剤形によって多様である。
【００３９】
本発明の剤形が軟膏、ペースト、クリーム又はゲルである場合には、担体成分として、動物性油、植物性油、ワックス、パラフィン、澱粉、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコン、ベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛又はこれらの混合物が用いられ得る。
【００４０】
本発明の剤形がパウダー又はスプレーである場合には、担体成分として、ラクトース、タルク、シリカ、アルミニウムヒドロキシド、カルシウムシリケート、ポリアミドパウダー又はこれらの混合物が用いられ得、特に、スプレーである場合には、追加的にクロロフルオロヒドロカボン、プロパン／ブタン又はジメチルエーテルのような推進剤を含むことができる。
【００４１】
本発明の剤形が溶液又は乳濁液である場合には、担体成分として、溶媒、溶解化剤又は乳化剤が用いられ、例えば、水、エタノール、イソプロパノール、エチルカーボネート、エチルアセテート、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチルグリコールオイルが用いられ得、特に、綿実油、ピーナッツオイル、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油及びゴマ油、グリセロール脂肪族エステル、ポリエチレングリコール又はソルビタンの脂肪酸エステルが用いられ得る。
【００４２】
本発明の剤形が懸濁液である場合には、担体成分として、水、エタノール又はプロピレングリコールのような液状の希釈剤、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールエステル及びポリオキシエチレンソルビタンエステルのような懸濁剤、微小結晶セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天又はトラガカントなどが用いられ得る。
【００４３】
本発明の剤形が石鹸である場合には、担体成分として、脂肪酸のアルカリ金属塩、脂肪酸ヘミエステル塩、脂肪酸タンパク質加水分解物、イセチオネート、ラノリン誘導体、脂肪族アルコール、植物性油、グリセロール、糖などが用いられ得る。
【００４４】
本発明の他の一つの様態は、８−メトキシブチン（８−ｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔｉｎ）又はその許容可能な塩を有効成分で含む皮膚美白又は熱老化改善用皮膚外用剤を提供する。
【００４５】
本発明において「８−メトキシブチン」は、上述した通りである。
【００４６】
本発明において「許容可能な塩」とは、８−メトキシブチンが他の物質と結合した塩の形態であって、８−メトキシブチンと類似した活性を示すことができる物質を意味する。
【００４７】
本発明の用語「皮膚外用剤」は、一般的に、皮膚外用に用いる物質全般を含む包括する概念であって、皮膚外用剤の剤形の非制限的な例としては、硬膏剤（ＰＬＡＳＴＥＲＳ）、ローション剤（ＬＯＴＩＯＮＳ）、リニメント剤（ＬＩＮＩＭＥＮＴＳ）、液剤（ＬＩＱＵＩＤＳ  ＡＮＤ  ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ）、エアロゾール剤（ＡＥＲＯＳＯＬＳ）、エキス剤（ＥＸＴＲＡＣＴＳ）軟膏剤（ＯＩＮＴＭＥＮＴＳ）、流エキス剤（ＦＬＵＩＤＥＸＴＲＡＣＴＳ）、乳剤（ＥＭＵＬＳＩＯＮＳ）、懸濁剤（ＳＵＳＰＥＳＩＯＮＳ）、カプセル剤（ＣＡＰＳＵＬＥＳ）、クリーム剤（ＣＲＥＡＭＳ）、軟質、硬質ゼラチンカプセル、貼付剤又は徐放化剤がある。
【００４８】
本発明の一実施例では、上記したように、８−メトキシブチンがチロシナーゼ活性減少効果を示すことから、８−メトキシブチンを含む組成物は、皮膚美白用皮膚外用剤で用いられ得ることを確認した（図２）。
【００４９】
また、本発明の他の一実施例では、上記したように、８−メトキシブチンが濃度依存的にメラニン合成を阻害することを確認し（図２）、その結果から、８−メトキシブチンを含む組成物は、皮膚美白用皮膚外用剤で用いられ得ることを再確認した。
【００５０】
また、本発明の一実施例では、上記したように、８−メトキシブチンが熱衝撃タンパク質７０の発現を増加させる効果を示し、その結果から、８−メトキシブチンを含む組成物は、皮膚熱老化改善用皮膚外用剤で用いられ得ることを確認した（図３）。
【００５１】
本発明による皮膚外用剤は、常用される無機又は有機の担体、賦形剤及び希釈剤を加えて固体、半固体又は液状の形態に製剤化された非経口投与剤であってもよい。前記非経口投与のための製剤としては、点滴剤、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、パッチ、スプレー、懸濁剤及び乳剤からなる群より選択される経皮投与型剤形であってもよいが、これに制限されない。
【００５２】
前記外用剤に含まれ得る担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、オリゴ糖、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチロール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油が挙げられる。
【００５３】
各剤形による皮膚外用剤組成物において、上記した本発明の組成物以外の他の成分をその他皮膚外用剤の剤形又は使用目的などに応じて当業者が困難なく適宜選定して配合することができ、この場合、他の原料と同時に適用する場合に相乗効果が発生できる。
【００５４】
本発明のまた他の一つの様態は、８−メトキシブチン（８−ｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔｉｎ）又はその食品学的に許容可能な塩を有効成分で含む皮膚美白又は熱老化改善用健康機能食品を提供する。
【００５５】
本発明において「８−メトキシブチン」は、上述した通りである。
【００５６】
本発明において「健康機能食品」とは、人体に有用な機能性を有した原料や成分を用いて錠剤、カプセル、粉末、顆粒、液状及び丸などの形態で製造及び加工した食品を言う。ここで、「機能性」とは、人体の構造及び機能に対して栄養素を調節したり生理学的作用などのような保健用途に有用な効果を得ることを意味する。本発明の健康機能食品は、当業界で通常的に用いられる方法によって製造が可能であり、前記製造時には、当業界で通常的に添加する原料及び成分を添加して製造することができる。また、前記健康機能食品の剤形も健康機能食品と認められる剤形であれば、制限なしに製造され得る。本発明の健康機能食品は、多様な形態の剤形で製造され得、一般薬品とは異なり、食品を原料にして薬品の長期服用時に発生し得る副作用などがないなどの長所があり、携帯性に優れるので、本発明の健康機能食品は、熱老化抑制及び皮膚美白効果を増進させるための補助剤で摂取が可能である。
【００５７】
本発明の一実施例では、上記したように、８−メトキシブチンがチロシナーゼ活性減少効果を示すことから、８−メトキシブチンを含む組成物は、皮膚白用健康機能食品で用いられ得ることを確認した（図２）。
【００５８】
また、本発明の他の一実施例では、上記したように、８−メトキシブチンが濃度依存的にメラニン合成を阻害することを確認したことから（図２）、８−メトキシブチンを含む組成物は、皮膚美白用健康機能食品で用いられ得ることを再確認した。
【００５９】
また、本発明の一実施例では、上記したように、８−メトキシブチンが熱衝撃タンパク質７０の発現を増加させる効果を示すことから、８−メトキシブチンを含む組成物は、皮膚熱老化改善用健康機能食品で用いられ得ることを確認した（図３）。
【００６０】
本発明の健康機能食品は、多様な香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含有することができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサカライド、マルトース、スクロースのようなジサカライド及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。甘味剤としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤やサッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを用いることができる。
【００６１】
上記外に本発明の健康機能食品は、さまざまな栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色剤、ペクト酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含むことができる。このような成分は、独立的に又は組み合わせて用いることができる。このような添加剤の割合は、それほど重要ではないが、本発明の健康食品１００重量部当たり０．０１〜０．１重量部の範囲で選択されることが一般的である。
【００６２】
本発明の他の一つの様態は、８−メトキシブチン（８−ｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔｉｎ）又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分で含む皮膚美白又は熱老化改善用薬学的組成物を提供する。
【００６３】
本発明のまた他の一つの様態は、８−メトキシブチン（８−ｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔｉｎ）又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分で含む皮膚美白又は熱老化改善用医薬外品組成物を提供する。
【００６４】
本発明において「８−メトキシブチン」は、上述した通りである。
【００６５】
本発明において「薬学的に許容可能な塩」とは、８−メトキシブチンが他の物質と結合した塩の形態であって、薬学的に８−メトキシブチンと類似した活性を示すことができる物質を意味する。
【００６６】
本発明の一実施例では、上記したように、８−メトキシブチンがチロシナーゼ活性減少効果を示したことから、８−メトキシブチンを含む組成物は、皮膚美白用薬学的組成物で用いられ得ることを確認した（図２）。
【００６７】
また、本発明の他の一実施例では、上記したように、８−メトキシブチンが濃度依存的にメラニン合成を阻害することを確認したことから（図２）、８−メトキシブチンを含む組成物は、皮膚美白用薬学的組成物で用いられ得ることを再確認した。
【００６８】
また、本発明の一実施例では、上記したように、８−メトキシブチンが熱衝撃タンパク質７０の発現を増加させる効果を示すことから、８−メトキシブチンを含む組成物は、皮膚熱老化改善用薬学的組成物で用いられ得ることを確認した（図３）。
【００６９】
本発明の薬学的組成物は、美白の用途、すなわち、皮膚色素沈着を予防して治療するための通常の方法によって錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、エアロゾール、滅菌注射溶液などの形態で剤形化が可能である。
【００７０】
経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを交ぜて調剤され得る。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような滑剤も用いられ得る。経口投与のための液状製剤には、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが含まれ、よく用いられる単純希釈剤である水、流動パラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが用いられ得る。
【００７１】
非経口投与のための製剤は、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤などを含むことができる。非水性溶剤と懸濁用剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルなどのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが用いられ得る。
【００７２】
また、本発明の薬学的組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含むことができる。担体、賦形剤又希釈剤としては、ラクトース、テキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルジネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム、二酸化珪素などの鉱物油などが用いられ得る。
【００７３】
本発明による薬学的組成物の具体的な投与量は、製剤化方法、患者の状態及び体重、患者の性別、年齢、重症度、薬物形態、投与経路及び期間、排泄速度、反応感応性などのような要因によって当業者により多様に選択され得、投与量及び回数は如何なる面でも本発明の範囲を制限するものではない。
【００７４】
本発明の薬学的組成物は、ラット、マウス、家畜、人間などの哺乳動物に多様な経路を通じて投与され得る。投与の全ての方式は予想され得、例えば、経口、静脈、筋肉又は皮下注射により投与され得る。
【００７５】
本発明のまた他の一つの様態は、８−メトキシブチン又はその薬学的に許容可能な塩を有効成分で含む組成物を個体の皮膚に塗布するステップを含む皮膚美白又は熱老化改善方法を提供する。
【００７６】
本発明のまた他の一つの様態は、８−メトキシブチン又はその薬学的に許容可能な塩の皮膚美白又は熱老化改善用途を提供する。
【００７７】
前記８−メトキシブチン、皮膚美白及び熱老化改善に対しては、上述した通りである。
【００７８】
本発明の８−メトキシブチン又はその薬学的に許容可能な塩を含む組成物は、如何なる形態や経路でも投与され得るが、本発明の目的が皮膚状態の改善であるため、好ましくは、皮膚に塗布する形態で投与され得る。また、８−メトキシブチン又はその薬学的に許容可能な塩は、その自体で投与又は塗布され得、組成物の形態で投与又は塗布され得る。
【００７９】
前記「個体」は、皮膚状態の改善、具体的には、皮膚美白又は熱老化改善が必要な人間を含んだ全ての動物、具体的には、ラット、マウス、家畜、人間などの哺乳動物を含んだ全ての動物を意味することができる。
【実施例】
【００８０】
＜発明の実施のための形態＞
以下、本発明を実施例を通じてより詳細に説明する。しかし、これら実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されるものではない。
【００８１】
実施例１：実験準備
１−１：細胞培養
ＨＥＫ  ２９３Ａ、Ｂ１６Ｆ１０細胞は、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）と１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含んだＤｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）を栄養供給源で用い、３７℃で５％の二酸化炭素を維持する培養器で培養した。
【００８２】
１−２：抗体
抗体は、それぞれの製造社から購入した。Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ、１４−３−３ζ、ＬＡＭＩＮ  Ｂ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＭＩＴＦ（Ａｂｃａｍ）、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＭＩＴＦ（Ｓｉｇｍａ）、ＥＲＫ、ｐｈｏｓｐｈｏ−ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＡＣＴＩＮ（ＭＰＢＩＯ）、ＧＡＰＤＨ（Ｂｅｔｈｙｌ）を用いた。
【００８３】
実施例２：８−メトキシブチン（８−Ｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔｉｎ）の細胞毒性及び細胞分裂に及ぼす影響の確認
植物から抽出した天然物質は、場合によって強い毒性を有することができ、細胞分裂能力に影響を与えることができるので、８−メトキシブチンの毒性と細胞分裂に及ぼす影響を確認した。
【００８４】
２−１：細胞毒性の実験（ＭＴＴ実験）
抽出物の安定性を検証するためにＭＴＴ実験を実施した。これは、細胞内で還元により３−（４，５−ジメチルーチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（３−（４，５−ｄｉｍｅｔｈｙｌ−ｔｈｉａｚｏｌ−２−ｙｌ）−２，５−ｄｉｐｈｅｎｙｌ  ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ；ＭＴＴ）が紫色のホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）に変わることを通じて生きている細胞の量を測定する実験である。細胞を９６ウェル細胞培養板に３×１０３の密度で分注した。２４時間後に８−メトキシブチンが含まれた培養液に交替した後、２４時間をさらに培養した後に５ｍｇ／ｍｌ濃度のＭＴＴを処理し、光を遮断した状態で１時間の間３７℃で培養した。その後、培養液を除去し、結晶化されたホルマザンをとかすことができる溶媒を入れて溶解させ、溶解が終わったサンプルは、５７０ｎｍ波長で吸光度を測定した。
【００８５】
２−２：実験結果
８−メトキシブチンを低濃度だけではなく高濃度で処理した場合にも細胞生存率が１００％程度に高く維持されることを確認することができた。このような結果から、８−メトキシブチンが高濃度である１００μＭを処理した場合にも細胞分裂は活発に行われ、細胞毒性がほとんど現われないことを確認することができた（図１）。
【００８６】
実施例３：メラニン合成阻害の確認
８−メトキシブチンの美白効果を確認するために、Ｂ１６Ｆ１０細胞に８−メトキシブチンを処理して速度制限酵素であるチロシナーゼの活性程度及びメラニン合成程度を測定した。
【００８７】
３−１：細胞レベルのチロシナーゼ活性程度の実験
Ｂ１６Ｆ１０マウスの黒色腫細胞をウェル当たり１ｘ１０５の密度で６ウェル細胞培養板に分注した。分注された細胞に８−メトキシブチンを処理した後、メラニン合成を誘導するために、１００ｎＭのメラニン酵素刺激ホルモン（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）を４８時間の間処理した。獲得した細胞は、破砕後に遠心分離を通じて上層液を別に分離した。上層液のタンパク質濃度を測定して、サンプル当たり５０μｇのタンパク質を５０μｌ体積で統一させて９６ウェルプレートに入れた。そして、反応基質としてサンプル当たり０．１％のＬ−ＤＯＰＡを１００μｌ入れて３７℃で１時間反応させた後、４７５ｎｍ波長で吸光度を測定した。
【００８８】
３−２：メラニン量の測定実験
６ウェル細胞培養板にＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞をウェル当たり１ｘ１０５の密度で分注した。分注された細胞は、８−メトキシブチンを処理した後、メラニン合成を誘導するために、１００ｎＭのメラニン細胞刺激ホルモン（ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ）を４８時間の間処理した。獲得した細胞は、破砕後に遠心分離を通じて細胞沈殿物を得て、１０％のＤＭＳＯを含んだ１Ｎ  ＮａＯＨを入れた。その後、６０℃で１時間を反応させ、４０５ｎｍ波長で吸光度を測定した。
【００８９】
３−３：実験結果
メラニン細胞刺激ホルモンを処理してメラニン合成を誘導したＢ１６Ｆ１０細胞に８−メトキシブチンを処理したとき、チロシナーゼの活性が１１０％以上、メラニン合成量が５０％以上減少したことが分かった（図２の（Ａ）））。また、このとき、チロシナーゼのタンパク質量が顕著に減少したことを観察することができた（図２の（Ｂ）。このような減少は、ｍＲＮＡレベルでの減少によることであるのを確認した（図２の（Ｃ））。次に、８−メトキシブチンの量を増やしながらチロシナーゼの活性とメラニン合成を観察したとき、８−メトキシブチンの量に比例してチロシナーゼの活性とメラニン合成量が減少することで現われ（図２の（Ｄ））、このとき、チロシナーゼタンパク質も８−メトキシブチンの量に比例して減少することが分かった（図２の（Ｅ））。このような結果から、８−メトキシブチンを処理する場合、チロシナーゼ活性が減少することによって、メラニンの合成量が減少して美白効果が現われることを確認することができた。
【００９０】
実施例４：熱衝撃タンパク質７０（ＨＳＰ７０）の発現増加の確認
８−メトキシブチンの熱老化改善効果を確認するために、皮膚細胞に熱を加えてそれから発生する熱衝撃タンパク質７０の量及び熱衝撃タンパク質７０  ｍＲＮＡ量を測定した。
【００９１】
４−１：実験方法
８−ｍｅｔｈｏｘｙｂｕｔｉｎ及び対照群であるＤＭＳＯをそれぞれ処理したＢ１６Ｆ１０細胞に４２℃で１時間の間熱ストレスを加えた。細胞をＴＮＥバッファーを用いて全体タンパク質を抽出した後、ブラッドフォード試薬（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｒｅａｇｅｎｔ）でタンパク質の量を測定した。また、タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分離し、抗体を用いてタンパク質を確認した後、定量分析を実施した。抗体は、それぞれの製造社から購入し、ＨＳＰ７０（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）とａｃｔｉｎ（ＭＰＢＩＯ）を用いた。
【００９２】
４−２：実験結果
８−メトキシブチンを処理した場合、熱が加えられる状況（４２℃で１時間）で熱衝撃タンパク質７０（ＨＳＰ７０）のタンパク質量が対照群より３倍以上増加することがわかった（図３の（Ａ））。また、ＨＳＰ７０のｍＲＮＡ量を観察したとき、８−メトキシブチンを処理したサンプルで対照群よりもっと多い量の熱衝撃タンパク質７０  ｍＲＮＡ量を観察することができた（図３の（Ｂ））。このような結果から、８−メトキシブチンを処理した場合、熱衝撃タンパク質７０の量が増加するようになり、熱老化が抑制される皮膚改善効果があることが分かった。
【００９３】
実施例５：植物性エストロゲンの活性の確認
５−１：ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、ＲＴ−ＰＣＲ及び定量的ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ
全体ＲＮＡは、それぞれの細胞からＴＲＩ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）を用いて抽出した。抽出したＲＮＡは、ＩｍＰｒｏｍ−ＴＭ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を通じて逆転写した。ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＴＭ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて測定した。
【００９４】
５−２：ＤＮＡ遺伝子の伝達
ＤＮＡプラスミドをＨＥＫ  ２９３Ａ細胞に伝達するために、マイクロポレート（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｎｅｏｎ（登録商標）  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いた。１回に、１μｇのレポータープラスミドは、１００万個の細胞に伝達した。ＤＮＡが伝達した細胞を一般的な培養液を通じて培養した。
【００９５】
５−３：発光酵素実験
ホタルとウミシイタケ発光酵素の活性は、Ｄｕａｌ−Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ（登録商標）  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ)の基質を用いて測定した。エストロゲン受容体（Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ；ＥＲ）レポーターの活性を測定するために、ＥＲリガンドドメインに特定物質が結合すると、ＧＡＬ４が特定ＤＮＡ配列に結合してホタル発光酵素が発現されるシステムを用い、ウミシイタケ発光酵素は、ＤＮＡ伝達効率の補正のために一緒に伝達した。エストロゲン受容体レポーターの活性は、ホタル発光酵素の値をウミシイタケ発光酵素の値で割ったもので決定された。
【００９６】
５−４：実験結果
まず、天然物由来有効物質である８−メトキシブチンがエストロゲン受容体に結合することをコンピュータ結合予測プログラムを通じて確認した（図４）。
【００９７】
ＧＡＬ４発光酵素レポーターを活用して８−メトキシブチンがエストロゲン受容体に結合する可能性を確認した結果、ＥＲαリガンド結合ドメインは、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインと連結されており、８−メトキシブチンがＥＲαリガンド結合ドメインに結合すると、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメインが特定ＤＮＡに結合しながらホタル発光酵素の発現を増加させた（図５の（Ａ））。レポーターＤＮＡが伝達されたＨＥＫ  ２９３Ａ細胞に５０μＭの抽出物を処理したとき、対照群に比べて発光酵素の発現が３．５倍近く増加された結果を確認した（図５の（Ｂ））。このような結果から、８−メトキシブチンが実際細胞内のエストロゲン受容体に結合することが分かった。
【００９８】
次に、８−メトキシブチンの濃度によって発光酵素の発現が変わるかを確認した結果、１０μＭの濃度から濃度を増加させるとき、統計的に有意に発光酵素の発現が増加するものとして現われた（図５の（Ｃ））。また、エストロゲン受容体が発現することで知られたＨＥＫ  ２９３Ａ細胞に８−メトキシブチンを処理したとき、標的遺伝子のｍＲＮＡの量が増加することが分かった（図５の（Ｄ））。その結果から、８−メトキシブチンが実際細胞内のエストロゲン受容体のリガンドとして作用してエストロゲン受容体の信号伝達過程を活性化させることで皮膚老化改善効果があることを確認することができた。
【００９９】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。それと関連して、以上で記述した実施例は、全ての面で例示的なものであり、限定的なものでないこと理解すべきである。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求範囲の意味及び範囲とその等価概念から導出される全ての変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものとして解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
2020537670.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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2020537670.tif 000011
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