(57)【要約】  本発明は、モノクローナル抗体抗ＦＧＦＲ４ならびに医薬品および診断用薬剤としてのその使用に関する。特定には、本発明は、ＦＧＦＲ４の酸ボックスドメインおよびその特定の一部分と特異的に結合する抗体に関する。また、前記抗体をコードする核酸、その発現および産生のためのベクターおよび宿主細胞、前記抗体を含む抗体−薬物コンジュゲートおよび医薬組成物も本発明の範囲内にある。また、本発明は、結腸がん幹細胞を検出する、致死させる、その発生および／または分化に影響を与える、または阻害するために使用するための、抗体抗ＦＧＦＲ４にも関する。
2020537490.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸１１９〜１５６に含まれるＦＧＦＲ４の酸ボックスドメイン内のエピトープを認識し、ＦＧＦ１９とＦＧＦＲ４との結合を阻害するモノクローナル抗体。
【請求項２】
ヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸１２７〜１５４に含まれるエピトープを認識する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
エピトープとして配列番号２７を有するアミノ酸配列を認識する、請求項１から２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４】
ＦＧＦＲ４の酸ボックスまたはその一部分と結合し、
（ｉ）配列番号５もしくは６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および／または
（ｉｉ）配列番号７もしくは８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および／または
（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、および／または
（ｉｖ）配列番号１４もしくは１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および／または
（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および／または
（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３
を含み、抗体がその結合特異性を保持する条件で、前記ＣＤＲのうちのいずれか１つが、上述の配列のうちの少なくとも１つと比較して１つまたは２つのアミノ酸が異なっていてもよい、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
ＦＧＦＲ４の酸ボックスまたはその一部分と結合し、抗体がその結合特異性を保持する条件で、その重鎖の可変領域が、配列番号１８〜２２または配列番号９２〜９６を有する配列のうちのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされており、その軽鎖の可変領域が、配列番号２３〜２６または配列番号９７〜９９を有する配列のうちのいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされている、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号１〜４もしくは配列番号８４〜８８のいずれか１つのアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１０〜１３もしくは配列番号８９〜９１のいずれか１つのアミノ酸配列または前記配列のいずれかと少なくとも８５％の同一性を有する配列を含む軽鎖可変領域とを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
配列番号６に示すＣＤＲＨ１、配列番号７に示すＣＤＲＨ２、および配列番号９に示すＣＤＲＨ３を含む重鎖と、配列番号１４に示すＣＤＲＬ１、配列番号１６に示すＣＤＲＬ２、および配列番号１７に示すＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含むヒト抗体であり、ＣＤＲのうちの１つまたは複数は、上記の配列と、１つまたは２つのアミノ酸が異なっていてもよい、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号６に示すＣＤＲＨ１、配列番号７に示すＣＤＲＨ２、および配列番号９に示すＣＤＲＨ３を含む重鎖と、配列番号１５に示すＣＤＲＬ１、配列番号１６に示すＣＤＲＬ２、および配列番号１７に示すＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含むヒト抗体であり、ＣＤＲのうちの１つまたは複数は、上記の配列と、１つまたは２つのアミノ酸が異なっていてもよい、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号６に示すＣＤＲＨ１、配列番号８に示すＣＤＲＨ２、および配列番号９に示すＣＤＲＨ３を含む重鎖と、配列番号１４に示すＣＤＲＬ１、配列番号１６に示すＣＤＲＬ２、および配列番号１７に示すＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含むヒト抗体であり、ＣＤＲのうちの１つまたは複数は、上記の配列と、１つまたは２つのアミノ酸が異なっていてもよい、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
配列番号６に示すＣＤＲＨ１、配列番号８に示すＣＤＲＨ２、および配列番号９に示すＣＤＲＨ３を含む重鎖と、配列番号１５に示すＣＤＲＬ１、配列番号１６に示すＣＤＲＬ２、および配列番号１７に示すＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含むヒト抗体であり、ＣＤＲのうちの１つまたは複数は、上記の配列と、１つまたは２つのアミノ酸が異なっていてもよい、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
配列番号５に示すＣＤＲＨ１、配列番号７に示すＣＤＲＨ２、および配列番号９に示すＣＤＲＨ３を含む重鎖と、配列番号１４に示すＣＤＲＬ１、配列番号１６に示すＣＤＲＬ２、および配列番号１７に示すＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含むラットまたはキメラモノクローナル抗体であり、前記ＣＤＲのうちの１つまたは複数は、上記の配列と、１つまたは２つのアミノ酸が異なっていてもよい、請求項１から６のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体によって認識される抗原またはエピトープを認識する抗体。
【請求項１３】
請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体が結合するエピトープと特異的に結合するために必要な、請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体の超可変領域のアミノ酸を含む、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
（ａ）請求項１から１１のいずれか一項に記載の抗体、その断片または誘導体をコードする核酸配列、
（ｂ）配列番号１８〜２６、配列番号２８〜３４、および配列番号９２〜９９のいずれか１つに示す核酸配列、
（ａ）または（ｂ）の配列のいずれか１つに相補的な核酸配列、ならびに
ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズすることができる核酸配列
からなる群から選択される、単離した核酸分子。
【請求項１５】
配列番号１８〜２２または配列番号９２〜９６に示す配列のうちの少なくとも１つと、配列番号２３〜２６または配列番号９７〜９９に示す配列のうちの少なくとも１つとを含む、請求項１４に記載の核酸分子。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の核酸配列を含むベクター、好ましくは発現ベクターであって、核酸配列が制御配列と作動可能に連結している、ベクター。
【請求項１７】
請求項１４または１５に記載の核酸配列または請求項１６に記載のベクターを含む、宿主、特定には組換え細胞。
【請求項１８】
ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、および／または活動過剰に関連する疾患のインビボ診断、防止、および／または処置のために使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、および／または活動過剰に関連する疾患のインビトロ診断のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２０】
前記疾患が、がん疾患、好ましくは結腸がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、乳がん、胃がん、結腸がん、横紋筋肉腫、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、下垂体がん、卵巣がん、軟組織肉腫、黒色腫、頭頸部扁平上皮癌、肺腺癌から選択される、または腫瘍転移の形成である、請求項１８または１９に記載の使用のための抗体。
【請求項２１】
前記疾患が、代謝性疾患、心血管病、または慢性腎臓病である、請求項１８または１９に記載の使用のための抗体。
【請求項２２】
前記疾患が、代謝症候群、糖尿病、および肥満症から選択される代謝性疾患であるか、または、心室肥大、心肥大、高血圧、鬱血性心不全、左心室肥大、尿毒症性心筋症、糖尿病性心筋症、および原発性心筋症から選択される心血管病である、請求項２１に記載の使用のための抗体。
【請求項２３】
結腸がん幹細胞を、インビボで検出する、および／または致死させる、および／またはその発生および／または分化に影響を与える、および／または阻害するために使用するための、ＦＧＦＲ４に対する抗体、特定には請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
結腸がん幹細胞を、インビトロで検出する、および／または致死させる、および／またはその発生および／または分化に影響を与える、および／または阻害するための、ＦＧＦＲ４に対する抗体、特定には請求項１から１３のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項２５】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体抗ＦＧＦＲ４と、少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルおよび／または賦形剤とを含む医薬組成物であって、追加の抗新生物剤、小分子阻害剤、抗腫瘍剤、または化学療法剤などの１つまたは複数のさらなる活性成分を含んでいてもよい、医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【請求項２７】
抗体に付着させる薬物構成成分が、アウリスタチン、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ツブリシン、デュオカルマイシン、カンプトテシン類似体、ベンゾジアゼピン、ドキソルビシン、α−アマニチン誘導体、アントラサイクリン、リゾキシン、タイランスタチン、スプライソスタチン、クリプトフィシン、およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤からなる群から選択される毒素である、請求項２６に記載の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【請求項２８】
以下の式（Ｉ）：
【化１】
2020537490.tif 000052
［式中、Ｒは、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｘ−（Ａ）ｎ−Ｂであり、
Ｘは、ＮＲａからなる群から選択され、Ｒａは、ＨおよびＣ１〜Ｃ１０アルキル、ならびにＯからなる群から選択され、
Ａは、存在または非存在であってもよく、自己犠牲リンカーであり、
ｎは、０または１であり、
Ｂは、請求項１から１３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体である］
および薬学的に許容されるその塩を有する、請求項２７に記載の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、モノクローナル抗体の分野に関し、特定には、モノクローナル抗体抗ＦＧＦＲ４ならびに医薬品および診断用薬剤としてのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは西欧諸国において数が増え続けている、最も一般的な疾患の１つであり、世界中で高まる社会経済的な負担を表している。がんの生物学に関する理解が相当向上しているにもかかわらず、固形転移性腫瘍を有する患者は本質的に治癒不能であり、処置の結果、生活の質はしばしば著しい影響を受ける。２０１２年に世界中で１４１０万件の新規がん症例および８２０万件の死亡があり、２０３５年までに毎年２４００万件の新規症例が推定されていることで、がんは依然として世界中で重要な公衆衛生問題である（Ferlay et al. 2015）。
【０００３】
進行がんを治療上効率的に対処できないことは、最近になって新しい理論的な基礎を得た。有力な証拠により、様々な血液腫瘍および固形腫瘍ならびに多くの正常組織において細胞の階層的構成が存在しており、その基部には、分化したがん細胞子孫を生じることができ、その元の位置および離れた位置において腫瘍を効率的に増殖させることができる、高い腫瘍形成能を有するユニークな未分化細胞のサブセットがあることが裏付けられている（Bonnet & Dick, 1997、Brittan & Wright, 2004、Barker et al., 2007、Lapidot  et al., 1994、Reya et al., 2001、Singh et al., 2003、Al-Hajj et al., 2003）。これらの一般的にがん幹細胞（ＣＳＣ）と呼ばれるものは、特定の表面マーカーの発現に基づいて同定され、その自己複製の能力、ならびに非対称的に分裂して２つの異なる娘細胞（一方は幹細胞性特長を保持しており、他方は一過的に増幅されている前駆体から最終分化したがん細胞へと進行的に分化している）を生じる能力に基づいて定義される（Valent et al., 2012）。さらに、単離したＣＳＣは慣用の化学療法および放射線療法に対して耐性が強いことが証明された（Maugeri-Sacca et al., 2011、Bao et al., 2006、Diehn et al., 2009）。すべての腫瘍細胞の主要源として定義されるこれらは、持続的な原発性腫瘍の成長、再発、および転移に必須であり、治療耐性の主要な機構を表す。直接の臨床的結果として、幹細胞区画に影響を与えずに分化した前駆体にのみ作用することによって腫瘍の大部分を排除することは、一時的な成功しか生じず、次いで再発および／または転移が起こるであろうため、有効な治療はＣＳＣも標的とするべきである。
【０００４】
結腸直腸がん（ＣＲＣ）は世界中で罹患率および死亡率の主要な原因である。これはすべてのがん発生率の１３％より多くを占め、３番目に一般的に診断される悪性腫瘍であり、がん関連死の４番目の原因であり、世界中で毎年約１４０万件の新規症例の発生率および７００，０００件の死亡がある。さらに、その世界的な負担は６０％上昇して、２０３０年までに２２０万件を超える新規症例および１１０万件のがん死亡となると予想されている（Arnold et al., 2017）。初期のＣＲＣは手術単独によってまたは手術と化学療法の組合せによって治癒することができる一方で、転移性疾患は大抵の場合は治癒不能であり、相当な医学的課題と医療制度への負担を表している。患者の約３０％がその最初の診断で転移性疾患を示し、他方では、限局性疾患を診断された者のうち２５％が数年後に転移を発生する（米国がん学会）。したがって、最終的には、腫瘍を排除するための新規治療戦略の開発が重要である。
【０００５】
本発明者らのうち数名は、ＣＲＣ腫瘍検体からＣＳＣを初めて単離した一員であり（Ricci-Vitiani et al. 2007、Dalerba et al., 2007）、その単離およびインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）培養、特徴づけおよびインビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）増殖のための標準プロトコールを開発した。特定には、これらの細胞は、免疫不全マウスにおいて、それらが元々単離された腫瘍の組織学的および遺伝学的な表現型模写を行う異種移植片を形成する能力を示す（Baiocchi et al.,2010）。
【０００６】
現時点では、結腸ＣＳＣを選択的に標的とする薬物は存在せず、臨床試料中におけるその検出を可能にする頑強なアッセイも存在しない（Zeuner et al. 2014）。
【０００７】
本発明者らは今回、結腸ＣＳＣがチロシンキナーゼ線維芽細胞成長因子受容体４（ＦＧＦＲ４）を発現していること、およびこのタンパク質が結腸ＣＳＣのいくつかの重要な機能を制御していることを見出した。
【０００８】
続いて、本発明者らは、遺伝子的免疫化のための既知の技術を使用してこの抗原に対するモノクローナル抗体を作製した（たとえば以下の参考文献を参照されたい：Bioprocessing - Genetic Immunization for Antibody Production. Tutorial: Genovac's Technological Shortcut From Gene to Antibody. By John Thompson, Ph.D., and Stefan Lang, Ph.D., published in Genetic Engineering News, Vol. 22, No. 17, October 1, 2002、Custom-made antibodies produced by genetic immunisation: Applications in drug development, therapy and diagnosis. By Stefan Lang and John Thompson, published in Global Outsourcing Review, Vol. 5, No. 1, Spring 2003、A shortcut from genomics to drug development. By Jens Lohrmann, Stefan Lang and John Thompson, published in Current Drug Discovery, October 2003）。
【０００９】
これらの抗体は患者検体において結腸ＣＳＣを検出するために有用であり、ＣＳＣ集団に対する新規ＣＲＣ処置の効果の測定を目的とした臨床グレードのアッセイに応用される。
【００１０】
より重要なことには、ＣＳＣの生存および増殖に影響を与えることができ、したがって治療的価値を有する抗体が見出されている。
【００１１】
腫瘍化における重大な参加者として出現した成長因子シグナル伝達経路のうち、ＦＧＦが腫瘍の発生、進行、および転移において最近高い注目を集めている（Dienstmann et al. 2014、Hierro et al., 2015）。受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）として機能する２２個のヒトＦＧＦおよび４種類のＦＧＦ受容体（ＦＧＦＲ）が存在する（Goetz & Mohammadi, 2013）。活性化された後、ＦＧＦ／ＦＧＦＲシグナル伝達は、細胞増殖を調節するＲＡＳ−ＭＡＰＫまたは細胞生存を制御するＰＩ３Ｋ−ＡＫＴなどの複数の下流経路を進行する（Beenken & Mohammadi, 2009）。
【００１２】
プロトタイプＦＧＦＲの細胞外領域は、柔軟なリンカーによって接続された３つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（ＩｇＩ、ＩｇＩＩ、およびＩｇＩＩＩ）からなる。ＦＧＦＲのユニークな特徴は、ＩｇＩ−ＩｇＩＩリンカーに位置する、酸ボックス（ＡＢ）と呼ばれる、グルタメート−、アスパルテート、およびセリンに富んだ配列のストレッチである。ＡＢ／リンカーの損失は、ＦＧＦに対するＦＧＦＲの親和性を増強させ、ＦＧＦＲのシグナル伝達能力を増加させ、受容体のこの部分がＦＧＦＲの自己阻害を制御していることを実証している（Kalinina et al., 2012）。酸ボックスの柔軟な性質は、ＦＧＦＲのそのリガンドに対する親和性が低下している「閉じた」低活性状態にＦＧＦＲを保つ、分子内相互作用を促進する（Olsen et al., 2004）。この領域の損失ががんに関係づけられている（Onwuazor et al., 2003）。
【００１３】
ますます多くの最近発表されたデータが新生物の大きなパネルにおいてＦＧＦＲ４の役割を示唆しており、これは、肝細胞癌（ＨＣＣ）、横紋筋肉腫、ならびに結腸直腸、前立腺、乳房、下垂体、肺（ＮＳＣＬＣ）、胃、および卵巣の腫瘍を含めた様々な固形新生物のサブセットにおけるこの受容体および／またはそのリガンドＦＧＦ１９の過剰発現を示している（Lin & Desnoyers, 2012、Wu & Li, 2012、Katoh & Nakagama, 2014、Crose et al., 2012、Li et al. 2014、Sahadevan et al., 2007、Andre & Cortes, 2015、Abbass et al., 1997、Huang et al., 2015、Chen H et al., 2015、Zaid et al., 2013）。これらの腫瘍型の一部では、ＦＧＦＲ４は好ましくない予後バイオマーカーとして同定されており、その遺伝子中のいくつかの多型性が腫瘍進行および予後不良のどちらとも正に相関しており、そのうち最も研究されているのはｒｓ３５１８５５（Ｇｌｙ３８８Ａｒｇ）である（Spinola et al., 2005a, 2005b、Taylor et al., 2009、Cho et al., 2016、Xu et al., 2011、Streit et al., 2004、Yang et al., 2012、Frullanti et al., 2011）。前臨床研究により、細胞増殖（肝臓、結腸直腸、卵巣、および前立腺の癌）（Ho et al., 2009、Wu et al., 2010、Desnoyers et al., 2008、Pai et al. 2008、Pelaez-Garcia et al., 2013、Zaid et al., 2013、Yu et al., 2011）、細胞生存（横紋筋肉腫、ならびに肝臓、結腸直腸、乳房、胃の癌）、細胞多剤耐性（結腸直腸および乳房の癌）（Ho et al., 2009、Turkington et al., 2014、Zaid et al., 2013、Ye et al., 2013、Roidl et al. 2009）の誘導におけるＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４軸の腫瘍プロモーターの役割が強調されている。さらに、細胞の運動性、侵襲性、および上皮間葉転換（ＥＭＴ）を促進することにおけるＦＧＦＲ４の役割もＣＲＣにおいて強調されている（Pelaez-Garcia et al., 2013、Liu et al., 2013）。
【００１４】
この証拠に基づいて、ＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４軸の阻害が近年、様々な腫瘍型に対する、特定には肝細胞癌（ＨＣＣ）に対する新規治療戦略として考慮されている。
【００１５】
肝臓がんは世界中で５番目に一般的に診断される悪性腫瘍であるが、高い致死率が原因で死因としては２位に位置づけられる（Ferlay et al. 2015）。ＨＣＣは、初期では通常無症候性であり、症状を引き起こす頃には通常は既に進行期に到達しているため、処置が困難である（Fong et al., 2001、Bruix & Sherman 2005）。外科的切除および肝移植が実行されているが、ほとんどの患者が診断時に後期であることが部分的な理由で、５年生存率は有意な改善を全く示していない（Trovato et al., 2015）。さらに、多くのＨＣＣ患者は標準の放射線療法および化学療法に対して低い感度を示す（Llovet et al., 2015、Worns & Galle, 2014）。
【００１６】
したがって、ＨＣＣにおいて異常に活性化されている分子経路を標的とする非細胞毒性剤が緊急に必要となっていることが共通の見解である（Hoofnagle 2004）。
【００１７】
ＨＣＣの進行の分子基盤は、同じ腫瘍内においてでも不均一性が高い（El-Serag & Rudolph, 2007、Thorgeirsson & Grisham, 2002）。近年では、いくつかの証拠が、一部の遺伝子および細胞シグナル伝達経路がＨＣＣの発生および進行において重要な役割を果たすと定義している（Chen & Wang, 2015）。さらに、表皮成長因子（ＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、および線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）などの一部の成長因子シグナル伝達経路が、肝がん発症を含めた腫瘍化における重大な参加者として出現している（Enguita-German & Fortes, 2014、Yoshida et al., 2014、Hopfner et al., 2008）。ＦＧＦ受容体のうち、ＦＧＦＲ４がヒト肝細胞において一般的なアイソフォームであり、ヒトＨＣＣおよびＨＣＣ細胞系において過剰発現されている（Lin et al., 2007、Ho et al., 2009）。さらに、自発性ＨＣＣを発生する傾向があるＦＧＦ１９トランスジェニックマウスはＦＧＦＲ４ノックアウトマウスと交雑させた後に肝臓腫瘍を発生できなかったことから、ＦＧＦＲ４が肝臓がん形成に必要であることが実証されている（French et al., 2012）。さらに、内在性回腸ＦＧＦ１５が、臨床的に関連のあるマウスモデルにおいて線維症関連の肝細胞癌発症に寄与していることが示されている（Uriarte et al., 2015）。
【００１８】
正常な肝細胞では、ＦＧＦ１９は、胆汁酸の合成における最初の律速工程である、Ｃｙｐ７ａ１をコードする遺伝子の抑圧を通じて肝臓の胆汁酸代謝を調節する（Inagaki et al., 2005、Chiang et al., 2009）。腸によって分泌されたＦＧＦ１９（およびそのネズミ相同体ＦＧＦ１５）は、肝細胞上のＦＧＦＲ４と結合することによって内分泌ホルモンとして作用し、したがってＣｙｐ７ａ１の活性化を防止し、それによって胆汁酸の合成を阻害する。ＦＧＦＲ４  ＫＯマウスは、より大きな胆汁酸プール、増加した胆汁酸の排出、および胆汁酸が枯渇した胆嚢を有しており、これはコレステロールおよび胆汁酸合成の負の調節を示している（Xie et al., 1999、Yu et al., 2000）。予測されるキナーゼ活性を有さない膜貫通タンパク質であるＫｌｏｔｈｏベータ（ＫＬＢ）が、ＦＧＦ１９の肝臓特異的活性に必要な補因子として同定されており（Lin et al., 2007）、胆汁酸合成の損なわれた負のフィードバック抑制がｋｌｏｔｈｏベータ欠損マウスにおいて記載されている（Ito et al., 2005）。
【００１９】
以前の研究により、ＦＧＦ１９トランスジェニックマウスにおいて、抗ＦＧＦ１９抗体を用いた処置が結腸腫瘍異種移植片の成長を低下させ、肝細胞癌を防止したことが示されている（Desnoyers et al., 2008）。しかし、カニクイザルにおける反復投薬安全性研究では、抗ＦＧＦ１９処置（３〜１００ｍｇ／ｋｇ）は重篤な下痢および低摂食量を伴う用量関連の肝毒性を実証した（Pai et al. 2012）。
【発明の概要】
【００２０】
したがって、有効で良好な治療指数を有する、すなわち低いまたは少なくとも許容される毒性を有する、ＦＧＦＲ４とそのリガンドとの相互作用を有効に阻害することができる抗体または治療剤の必要性が依然として存在する。
【００２１】
ＦＧＦＲ４を標的とする治療的抗体および小分子の抗腫瘍効果に関するより最近の研究により、動物モデルにおけるＨＣＣおよび他の腫瘍アイソタイプに対する有効性が証明されており、一部は現在臨床治験において評価中である。
【００２２】
本発明の根底にある問題は、ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、および／または活動過剰に関連する疾患の診断、防止、および／または処置に使用することができる抗ＦＧＦＲ４抗体を提供することであった。
【００２３】
いくつかの抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体は、ＨＣＣおよび活性化されたＦＧＦＲ４経路を有する他の腫瘍型のマウスモデルにおいて治療上の有効性を示した（French et al., 2012、Bumbaca et al., 2011、Bartz et al., 2016、ＵＳ９２６６９５５号Ｂ２、ＷＯ２０１４／１０５８４９号Ａ１、ＷＯ２０１６／０２３８９４号Ａ１）。さらに、これらの抗体のうちの１つ（Ｕ３−１７８４、Ｕ３／Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ、ＮＣＴ０２６９０３５０）の第Ｉ相研究が、進行性の固形腫瘍および肝臓がんを有する患者において進行中である。
【００２４】
さらに、ＦＧＦＲ４に特異性の高い次世代チロシンキナーゼ受容体阻害剤が、ＨＣＣのマウスモデルにおいて妥当性確認されており（Hagel et al., 2015、ＷＯ２０１４／０１１９００号Ａ２、ＷＯ２０１６／１５１４９９号Ａ１、ＵＳ２０１６／０２４４４５０号Ａ１）、そのうちの２つが現在、ＨＣＣおよび胆管癌患者において（ＢＬＵ−５５４、Ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ、ＮＣＴ０２５０８４６７）、ならびに陽性のＦＧＦＲ４およびＫＬＢ発現によって特徴づけられたＨＣＣおよび固形腫瘍において（ＦＧＦ４０１、Ｎｏｖａｒｔｉｓ、ＮＣＴ０２３２５７３９）において、その許容性および有効性について臨床第Ｉ相／第ＩＩ相で評価されている。
【００２５】
さらに、ＦＧＦ受容体の標的化に関する特許文献は以下のものである：ＵＳ２００５０１４７６１２号、ＵＳ２００７０２４８６０５号、ＵＳ８２６３０７４号、ＵＳ２０１４０３０１９４６号、ＵＳ２０１１０２１２０９１号、ＵＳ２０１６００１７０２７号、ＵＳ９２８４３７９号、ＵＳ２０１００１４３３８６号、ＵＳ７５３１３０４号、ＷＯ２０１０００４２０４号、ＷＯ２０１５１０７１７１号。
【００２６】
しかし、上述の文献中に開示されている抗体または阻害剤のいずれについても、結腸がん幹細胞に対する活性は示されていない。
【００２７】
したがって、結腸がん幹細胞（結腸ＣＳＣ）を標的化してそれらを致死させる、またはその成長、増殖、および分化を少なくとも実質的に阻害することができる薬剤の強い必要性が存在している。
【００２８】
また、診断的アッセイにおいて結腸ＣＳＣを明らかにするためにそれらを検出することができる薬剤の強い必要性も存在する。
【００２９】
今では、インビトロおよびインビボのどちらにおいても、ＦＧＦＲ４が結腸がん幹細胞の治療的標的であり、ＣＳＣにおけるＦＧＦＲ４の存在がより高い増殖速度およびクローン原性効率ならびにより高い移動性向と相関していることが見出され、妥当性確認されている。
【００３０】
したがって、ＦＧＦＲ４に向けられており、その活性を阻害することができる薬剤は、結腸がん幹細胞を致死させる、またはその活性を阻害するために、結腸がんにおいて有利に使用することができる。ＦＧＦＲ４が結腸ＣＳＣ上に存在することが見出されているため、この抗原に向けられた薬剤も、前記細胞を検出および認識するために有利に使用することができる。
【００３１】
また、ＦＧＦＲ４に対して選択的であり、リガンドとのその相互作用を有効に阻害することができ、有効な抗腫瘍剤として作用する、モノクローナル抗体の強い必要性も存在する。
【００３２】
また、結腸ＣＳＣに対して有効なモノクローナル抗体抗ＦＧＦＲ４の必要性も存在する。
【００３３】
別の特に強い必要性は、それだけには限定されないが肝細胞癌（ＨＣＣ）などのＦＧＦＲ４依存性腫瘍を処置するためのモノクローナル抗体抗ＦＧＦＲ４である。
【００３４】
今では、培養細胞に対しておよびインビボで高い抗増殖活性を示す、本明細書中ＢＭＫ−３Ｂ６−Ｅ４とも呼ばれるモノクローナル抗体ならびにそのキメラ（ｃｈ３Ｂ６）およびヒト化（ｈｕ３Ｂ６）形態が、同じ細胞内でＦＧＦＲ４シグナル伝達構成成分を変調することにおける高い効率の点で似ていることが見出されている。
【００３５】
この抗体は、インビトロでリガンドとＦＧＦＲ４との結合を阻害することが示されている。
【００３６】
驚くべきことに、本発明の前記抗体が、リガンド結合に関与しないことで知られている細胞外領域である、ＦＧＦＲ４の自己阻害性の酸ボックスドメイン内のエピトープと結合することが見出されている（Kalilina et al., 2012）。むしろ、このドメインはＦＧＦＲ４に対して自己阻害性作用を有することが知られており、実際に、この領域の損失は受容体とそのリガンドとの結合を増強させることが知られている。したがって、本発明の抗体は、リガンド相互作用および受容体活性化に対してコンホメーション的に影響を与えるユニークなモードでＦＧＦＲと結合することが見出されている。
【００３７】
また、ＦＧＦＲ４の「酸ボックス」と呼ばれるドメインを特異的に認識して結合することができる抗体は、受容体とリガンドとの相互作用を阻害し、抗腫瘍効果を有することも見出されている。
【００３８】
これら予想外の特長は、ヒト化抗体、糖鎖操作した抗体、および結腸ＣＳＣに対する抗体−薬物コンジュゲートの臨床開発、ならびにＦＧＦＲ４依存性がんの処置において価値がある。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
本発明の一目的は、結腸がん幹細胞を、検出する、および／または致死させる、および／またはその発生および／または分化に影響を与える、および／または阻害するために使用するモノクローナル抗体抗ＦＧＦＲ４である。
【００４０】
本発明の一目的は、ヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸１１９〜１５６、好ましくはヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸１２７〜１５４のエピトープと特異的に結合し、ＦＧＦ１９とＦＧＦＲ４との結合を阻害するモノクローナル抗体である。
【００４１】
特定には、前記抗体はＦＧＦＲ４の酸ボックスドメインと特異的に結合する。
【００４２】
好ましくは、抗体は、エピトープとして配列番号２７を有するアミノ酸配列を特異的に認識する。
【００４３】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号２７を有するアミノ酸配列内の以下のアミノ酸を特異的に認識する：Ｄ１２７、Ｐ１３０、Ｋ１３１、Ｐ１３６、Ｓ１３７、Ｒ１３９、Ｈ１４０、Ｓ１４１、Ｑ１４４、Ｙ１４８、Ｗ１４９、Ｔ１５０、Ｑ１５３、Ｒ１５４。アミノ酸の付番は、シグナルペプチド（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１３４１９１３）を含めたヒトＦＧＦＲ４前駆体を参照している。
【００４４】
本発明の特に好ましい抗体は、ＦＧＦ１９リガンドとヒトＦＧＦＲ４との結合を、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％または８７％遮断することができる。特に好ましいものは、ＦＧＦ１９とヒトＦＧＦＲ４との結合を、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、または少なくとも９０％遮断する本発明の抗体である。リガンドとヒトＦＧＦＲ４との結合の遮断はＦＧＦＲ４シグナル伝達の阻害をもたらす。
【００４５】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、たとえば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３（Zhang et al., 2006）を含めたさらなるＦＧＦＲ４リガンドの結合を、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％または８７％遮断することもできる。
【００４６】
本発明の一目的は、本明細書中に開示したモノクローナル抗体が結合するエピトープと特異的に結合するために必要な、本明細書中に開示した抗体の超可変領域のアミノ酸を含む、抗体またはその抗原結合断片である。
【００４７】
このような状況において、「超可変領域」には、アミノ酸配列（ＣＤＲ）の非連続的な可変領域のトリプレットに由来する三次構造を意図する。
【００４８】
本発明の一目的は、抗原またはエピトープ、特定には、結腸がん幹細胞によって発現され、本明細書中に開示したモノクローナル抗体によって認識されるものと結合する抗体である。たとえば、特定の実施形態では、配列番号１〜４の重鎖可変領域（ＶＨ）配列および配列番号１０〜１３の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列、または以下に開示する１つもしくは複数のＣＤＲを含む抗ＦＧＦＲ４抗体と同じエピトープと結合する抗体を提供する。
【００４９】
本発明の一目的は、ＦＧＦＲ４の酸ボックスまたはその一部分と結合し、（ｉ）配列番号５〜６のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ１、および／または（ｉｉ）配列番号７〜８のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ２、および／または（ｉｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ３、および／または（ｉｖ）配列番号１４〜１５のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１、および／または（ｖ）配列番号１６のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ２、および／または（ｖｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ３を含み、抗体がその結合特異性を保持する条件で、前記ＣＤＲのうちのいずれか１つが上述の配列のうちの少なくとも１つと比較して１つまたは２つのアミノ酸が異なっていてもよい、抗体またはその抗原結合断片である。
【００５０】
本発明の一目的は、抗体がその結合特異性を保持する条件で、その重鎖の可変領域が、配列番号１８〜２２または配列番号９２〜９６の配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされており、その軽鎖の可変領域が、配列番号２３〜２６または配列番号９７〜９９の配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされている、ＦＧＦＲ４の酸ボックスと結合する抗体またはその抗原結合断片である。
【００５１】
本出願の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＦＧＦＲ４の「酸ボックス」ドメインを認識して結合すると同時に、受容体とリガンドＦＧＦ１９との相互作用を阻害してリガンド依存性ＦＧＦＲ４シグナル伝達を損なわせることができる。
【００５２】
本発明の抗ＦＧＦＲ４抗体は、ＦＧＦリガンド、特定にはＦＧＦ１９とＦＧＦＲ４との結合を効率的に阻害することができ、また、ＦＧＦＲ４依存性シグナル伝達経路、特定にはＨＣＣ細胞系におけるものを妨害できることが見出された。
【００５３】
これにより、これは肝細胞癌などのＦＧＦＲ４に依存性の腫瘍の処置に特に有利となる。
【００５４】
特定には、本発明の抗体は、有効な腫瘍細胞阻害を、特定にはＦＧＦＲ４を発現する腫瘍において示す。
【００５５】
さらに、本発明の抗体は結腸ＣＳＣ上で高い結合活性を示し、したがって結腸がんの処置において特に有用である。
【００５６】
また、本発明の抗体は、ＦＧＦＲ４に対して高く特異的な結合親和性を有する一方で、他のＦＧＦ受容体とは結合しない。このことは、がん病理学に関与していない他のＦＧＦ受容体上での活性が原因の副作用の可能性を下げるため、有利である。
【００５７】
本発明の特定の実施形態では、抗体は、ＢＭＫ−３Ｂ６−Ｅ４として本明細書中に示す抗体、ならびにそのキメラ（ｃｈ３Ｂ６）およびヒト化（ｈｕ３Ｂ６）形態である。この抗体は、がん幹細胞および高いＦＧＦＲ４発現レベルを有する腫瘍細胞系、特に肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞系のどちらにおいても、高い、用量依存的な反応性を示す。
【００５８】
対照群と比較して、この抗体で処置したマウスにおいて腫瘍容量の低下が観察されている。
【００５９】
さらに、本発明の抗体は、ＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞において過剰発現されるＦＧＦＲ４  Ｙ３６７Ｃ突然変異体とも効率的に結合する。この突然変異型の受容体は、優性、リガンド非依存性の、構成的活性化される変異体であり、既知の拮抗性抗体を用いた阻害に対して非感受性であると記載されている（Roidl et al., 2010）。このことは、本発明による抗体を、既知の拮抗性抗体を用いた治療に応答しない前記突然変異を有する対象においても使用できるという利点を提供する。
【００６０】
本発明のさらなる実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
【００６１】
本発明のさらなる実施形態では、抗体はヒト抗体である。
【００６２】
本発明の抗体は、ＦＧＦＲ４酸ボックスに対する結合特異性を示し、リガンドと受容体との結合を阻害する。このことは、酸ボックスはリガンドの結合に関与しないことで知られているという既に上述した事実のため、予想外であった。むしろ、酸ボックスは受容体の自己阻害に関与していることが知られている。
【００６３】
また、本発明は、本明細書中に記載した抗体が含まれるコンジュゲートも提供する。特定には、抗体薬物コンジュゲートが本発明の好ましい主題である。
【００６４】
本発明のさらなる目的は、発現制御配列と作動可能に連結させてもよい、抗体をコードする核酸分子である。
【００６５】
前記単離した核酸は、典型的には、どちらも可変領域および定常領域を含む、重鎖をコードする配列および軽鎖をコードする配列を含む。前記重鎖をコードする配列は、好ましくは、配列番号２８〜３１の配列または前記配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列からなる群から選択され、前記軽鎖をコードする配列は、好ましくは、配列番号３２〜３４の配列または前記配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列からなる群から選択される。
【００６６】
本発明のさらなる目的は、本明細書中に開示した１つまたは複数の核酸配列を含むベクターであり、好ましくは発現ベクターである。たとえば、前記ベクターは、抗体、またはその軽鎖および／もしくは重鎖、定常領域および／もしくは可変領域、またはそのＣＤＲをコードする核酸配列を含むことができる。
【００６７】
本発明のさらなる態様は、核酸分子を含む宿主、特定には組換え細胞である。細胞は抗体の調製に使用し得る。
【００６８】
本発明のさらなる態様は、ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、および／または活動過剰に関連する疾患の診断、防止、および／または処置に使用する、本発明の抗体である。
【００６９】
好ましくは、前記疾患はがん疾患、より好ましくは結腸がんまたは肝細胞癌（ＨＣＣ）である。
【００７０】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体は、結腸がん幹細胞を致死させる、またはその発生および／または分化に影響を与える、または阻害するために使用する。
【００７１】
本発明の一目的は、本明細書中に開示したモノクローナル抗体抗ＦＧＦＲ４を含む医薬組成物である。
【００７２】
本発明の一目的は、本明細書中に開示したモノクローナル抗体を含む抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、それを含む医薬組成物、および医薬品としてのその使用であり、特定には腫瘍を処置するためのものである。
【００７３】
本発明のこれらおよび他の目的を、図および実施例も参照しながら本明細書中以下に詳述する。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】遺伝子選択漏斗。
【図２】図Ａ〜Ｂは、特定の市販の一次抗体を使用したウエスタンブロットによって分析した、ＡＴＣＣ腫瘍細胞系および正常な結腸組織と比較した、ＣＳＣにおける選択されたタンパク質抗原の優先的な発現である。
【図３】５つの異なるＣＳＣ系統のすべての上清で得られたＦＡＣＳ分析データの要約である。変化の倍数（ＦＣ）は、それぞれの上清で測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）の、陰性対照（骨髄腫細胞馴化培地）に対する比である。それぞれのＣＳＣ系統のＦＣ値に基づいてスコアを割り当て（３Ａ）、個々のスコアを合計することによって最終ランクを計算した（３Ｂ）。簡単にするために、抗ＦＧＦＲ４上清で得られたデータのみを示す。
【図４】異なるＦＧＦＲ４表面発現レベルを有する２つの部分集団を分離するために行ったフローサイトメトリー細胞選別の前および後の、ＣＳＣ系統ＣＴＳＣ８５のＦＡＣＳ分析である。
【図５】ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）アッセイ（ｎ＝３）によって評価した、対照（偽選別（ｍｏｃｋ  ｓｏｒｔｅｄ）、正方形）、ＦＧＦＲ４高（三角形）、およびＦＧＦＲ４低（逆三角形）のＣＴＳＣ８５細胞集団の成長曲線である。データは０日目に対して正規化している。
【図６】３つのＣＴＳＣ８５細胞集団で計数された軟寒天中のコロニー数である。３つの異なる実験の平均値を±標準偏差で示す。ＦＧＦＲ４高とＦＧＦＲ４低の細胞部分集団の間のコロニー数の差異（＊＊＊ｐ＝０．００１）、ならびにＦＧＦＲ４高と偽選別集団の間（＊＊ｐ＝０．００７）およびＦＧＦＲ４低と偽選別集団の間の差異（＊＊＊＊ｐ＝０．０００１５）は、統計的に有意であった。
【図７】４８時間後のトランスウェル移動アッセイおよびＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ蛍光染色によって評価した、ＦＧＦＲ４高、ＦＧＦＲ低、および偽選別ＣＴＳＣ８５細胞集団の移動効率（ｎ＝３）である。上パネル、３つの集団のそれぞれの平均蛍光細胞数を、ＩｍａｇｅＪソフトウェアの支援により計数した。下パネル、３つの集団のそれぞれにおける、移動した細胞に関連する平均蛍光強度値を相対蛍光単位（ＲＬＵ）で表す。（＊）ｐ＜０．０４、（＊＊）ｐ＜０．００４、（＊＊＊）ｐ＜０．００１。
【図８】選別後に収集した２つのＣＴＳＣ８５細胞部分集団に由来する異種移植片の様々な腫瘍成長である。ＦＧＦＲ４高（正方形）およびＦＧＦＲ４低（三角形）の腫瘍成長曲線を示す。データは中間腫瘍容量±標準偏差として表す。
【図９】ＨＣＴ１１６結腸腫瘍細胞の異種移植片に対する、ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９抗体による抗腫瘍効果である。データは平均腫瘍容量±標準偏差として表す。ビヒクル対照と比較して（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊）ｐ＜０．０１。
【図１０】結腸ＣＴＳＣ８５の異種移植片に対する、ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９抗体による抗腫瘍効果である。上パネルでは、曲線は処置期間中の平均腫瘍容量±標準偏差の増加を表し、下パネルでは、−１日目と比較した平均腫瘍容量の増加分を±標準偏差で示す。ビヒクル対照に対して（＊）ｐ＜０．０５、（＊＊）ｐ＜０．０１。
【図１１】固相ＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４結合アッセイ（ｎ＝３）から得られた４５０ｎｍでの吸光度値から導いた、表示した上清のそれぞれの容量の関数としての、ＦＧＦ１９とＦＧＦＲ４との残留結合の用量応答曲線である。阻害曲線は、増大する上清容量での４５０ｎｍでの残留吸光度（馴化培地対照の％）に基づいた、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを用いた実験データの４Ｐロジスティック当てはめによって得られた。
【図１２】様々な抗ＦＧＦＲ４抗体で処理したＨＣＣ  ＨｅｐＧ２細胞のｑＲＴ−ＰＣＲアッセイである。新しい抗体の一部はＣＹＰ７Ａ１発現の抑圧（上パネル）およびＣＴＧＦ発現の誘導（下パネル）を阻害し、これらはどちらもＨｅｐＧ２細胞においてＦＧＦ１９に媒介されるＦＧＦＲ４の活性化に依存する。２つの遺伝子のｍＲＮＡレベルを、それぞれＦＧＦ１９の非存在下（ＣＹＰ７Ａ１）または存在下（ＣＴＧＦ）におけるＰＢＳ対照値の百分率として表す。斜線のバーは活性ｍＡｂを表し、点描のバーは不活性ｍＡｂを表す。
【図１３】ウエスタンブロットによって分析した、様々な抗ＦＧＦＲ４抗体で処理したＨｅｐ３Ｂ細胞におけるＦＧＦ１９依存性ＦＲＳ２リン酸化の阻害である。（＊）活性抗体。
【図１４】ＨＣＣ  Ｈｕｈ７細胞によるコロニー形成効率に対する抗ＦＧＦＲ４抗体の阻害効果である。２４ウェルプレートのウェル１つあたり３００個の細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で１０日間、５０ｕｇ／ｍＬおよび１００ｕｇ／ｍＬの濃度の表示した抗体の存在下または非存在下（ＰＢＳもしくはＤＭＳＯ中の陰性対照）で、あるいは表示した増大する濃度の化合物ＢＬＵ９９３１と共にインキュベートした。培養物に、抗体、ＢＬＵ９９３１、またはビヒクルを含有する新鮮な培地を２日毎に補充した。コロニーを倒立光学顕微鏡下でモニタリングし、実験の最後に２０％メタノール中の０．５％クリスタルバイオレットの溶液で染色した。実験的４つ組のそれぞれにおけるコロニー数を決定し、複製の平均をビヒクル対照（抗体ではＰＢＳ、ＢＬＵ９９３１ではＤＭＳＯ）のものの百分率として表した。
【図１５】図１５Ａ〜Ｃは、ヒト−ラットキメラ抗体ｃｈ３Ｂ６、ｃｈ６Ｃ９、およびｃｈ５Ｂ５の重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターである。同様の発現ベクターが他の抗体で得られた。
【図１６】抗体ｃｈ３Ｂ６の品質管理である。左：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、右：ＨＰＬＣ−ＳＥＣ。同様の結果が抗体ｃｈ６Ｃ９およびｃｈ５Ｂ５で得られた。
【図１７】ＨＣＣ細胞系ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７ならびに乳がん細胞系ＭＤＡ−ＭＢ４５３に対するキメラｍＡｂｃｈ３Ｂ６、ｃｈ６Ｃ９、およびｃｈ５Ｂ５のＦＡＣＳ分析によって得られた抗体濃度の関数としてのＦＣ値のグラフである。実線は実験のものである一方で、破線は、実験データを「一部位結合」方程式に当てはめることによって得られたものである。
【図１８】抗ＦＧＦＲ４抗体の濃度の関数としてＦＧＦＲ−Ｆｃ依存性固相結合アッセイから得られた４５０ｎｍでの吸光度値のグラフである。それぞれの抗体の連続的１：３希釈機（０．００１４ｕｇ／ｍＬから９ｕｇ／ｍＬまでの９個の実験点）を、ＦＧＦＲ１α  ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ１β  ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ２α  ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２α  ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ２β  ＩＩＩｂ、ＦＧＦＲ２β  ＩＩＩｃ、ＦＧＦＲ３、およびヒトＦｃと融合させたＦＧＦＲ４の細胞外領域に対して３つ組で試験した。陰性対照として、ヒトＦｃと融合させたＩＬ１７Ｂ受容体の細胞外領域を含めた。実線は実験のものである一方で、破線は、実験データを「一部位結合」方程式に当てはめることによって得られたものである。
【図１９】固相ＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４結合アッセイ（ｎ＝３）から得られた４５０ｎｍでの吸光度値から導いた、ｃｈ３Ｂ６およびｃｈ６Ｃ９の濃度の関数としてのＦＧＦ１９とＦＧＦＲ４との残留結合の用量応答曲線である。阻害曲線は、増大する抗体濃度（０．０１４から３０ｕｇ／ｍＬまでの１：３の段階希釈）での４５０ｎｍでの残留吸光度（ＰＢＳ対照の％）に基づいた、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを用いた実験データの４Ｐロジスティック当てはめによって導いた。
【図２０】ＨＣＣ  Ｈｕｈ７細胞によるコロニー形成効率に対する抗ＦＧＦＲ４キメラ抗体の阻害効果である。２４ウェルプレートのウェル１つあたり６００個の細胞を、３７℃、５％のＣＯ２で１０日間、３０ｕｇ／ｍＬおよび１００ｕｇ／ｍＬの濃度の表示した抗体の存在下または非存在下（ＰＢＳもしくはＤＭＳＯ中の陰性対照）で、あるいは表示した増大する濃度の化合物ＢＬＵ９９３１と共にインキュベートした。培養物に、抗体、ＢＬＵ９９３１、またはビヒクルを含有する新鮮な培地を２日毎に補充した。コロニーを倒立光学顕微鏡下でモニタリングし、実験の最後に２０％メタノール中の０．５％クリスタルバイオレットの溶液で染色した。実験的４つ組のそれぞれにおけるコロニー数を決定し、複製の平均をビヒクル対照（抗体ではＰＢＳ、ＢＬＵ９９３１ではＤＭＳＯ）のものの百分率として表した。
【図２１】ウエスタンブロットによって分析した、抗ＦＧＦＲ４キメラ抗体で処理したＨｕｈ７細胞におけるＦＧＦ１９依存性ＦＧＦＲ４およびＦＲＳ２リン酸化の阻害である。実施例８に記載の実験条件下でＦＧＦ１９／ヘパリンを加える前に、細胞を１００もしくは２００ｕｇ／ｍＬのそれぞれの抗体、０．１ｕＭもしくは１ｕＭのＢＬＵ９９３１、またはＰＢＳで処理した。ウエスタンブロット分析は、抗ホスホ−ＦＲＳ２抗体（Ｔｙｒ１９６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、抗ＦＲＳ２抗体（ＬＳＢｉｏ）、抗ホスホ−ＦＧＦＲ４抗体（ＦＧＦＲ４［ホスホ−Ｔｙｒ６４２］抗体、Ｂｉｏｒｂｙｔ）、抗ＦＧＦＲ４抗体ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９、および抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して行った。
【図２２】Ｈｕｈ７肝臓腫瘍細胞の異種移植片に対する３つの抗ＦＧＦＲ４キメラ抗体の抗腫瘍効果である。データは１１日目と比較した平均腫瘍容量の増加分±標準偏差として表す。ビヒクル対照に対して（＊）ｐ＜０．０５。
【図２３】抗ＦＧＦＲ４キメラ抗体のＨｕｈ７異種移植片のインビボ処理は、ビヒクルで処理した腫瘍に対して、ＣＹＰ７Ａ１発現を抑圧解除し（左パネル）、ＣＴＧＦ発現を阻害した（右パネル）。単一腫瘍中のｍＲＮＡレベルが２＾（−ΔΔｃ−ｔ）として表されるドットプロットを示す。ベータグルクロニダーゼ（ＧＵＳ）のヒト遺伝子を正規化群として使用し、対照群マウスのうちの１つに対応するΔΔＣｔ値を相対参照として選択し、１に等しく設定した。処置マウスと対照マウスとの間の統計的に有意な差異は、ＣＹＰ７Ａ１（＊ｐ≦０．０５）およびＣＴＧＦ（＊＊ｐ＝０．００３）のデータの両方のｔ検定分析から生じたものである。
【図２４】抗体ｃｈ３Ｂ６またはＰＢＳで処理したＨｕｈ７異種移植片におけるＦＧＦＲ４（上パネル）およびＥＲＫ１／２リン酸化の阻害である。腫瘍タンパク質抽出物のウエスタンブロット分析は、抗ホスホ−ＦＧＦＲ４抗体（ＦＧＦＲ４［ホスホ−Ｔｙｒ６４２］抗体、Ｂｉｏｒｂｙｔ）、抗ＦＧＦＲ４抗体ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９、抗ホスホ−ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、抗ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、および抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して行った。
【図２５】ＢＯＳＣ２３レポーター細胞においてＦＡＣＳ分析によって測定した、ＦＬ  ＦＧＦＲ４およびＦＧＦＲ４欠失突然変異体ｄ１、ｄ２、およびｄ３に対するキメラ抗体の反応性である。アッセイは実施例８に記載のように行った。
【図２６】様々な抗ＦＧＦＲ４抗体のエピトープマッピングである。パネルＡでは、抗体ｃｈ５Ｂ５（陽性、黒色バー）およびｃｈ６Ｃ９（陰性、斜線バー）とＩｇＩＩドメインペプチドコレクションとの結合を分析した、２つの独立したＥＬＩＳＡ実験の代表的ヒストグラムを示す。この分析から推測されるｃｈ５Ｂ５結合配列も示す。パネルＡでは、図２６はそれぞれ配列番号３５〜５７を出現順に開示する。パネルＢでは、抗体ｃｈ３Ｂ６（陽性、黒色バー）およびｃｈ６Ｃ９（陰性、斜線バー）と酸ボックスペプチドコレクションとの結合を分析した、３つの独立したＥＬＩＳＡ実験の代表的ヒストグラムを示す。この分析から推測されるｃｈ３Ｂ６結合配列も示す。下線を引いたものは結合に寄与する残基であり、太字ものは最も高いピークに対応する残基である。パネルＢでは、図２６はそれぞれ配列番号５８〜８３および２７を出現順に開示する。パネルＣでは、酸ボックス領域内でのヒトＦＧＦＲ４タンパク質配列（配列番号１００）（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１３４１９１３）とマウスオーソロガス配列（配列番号１０１）（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０３２０３７）とのアラインメントを示し、実験により同定されたヒト受容体上のｃｈ３Ｂ６結合領域が表示されている（配列番号１０２）。下線を引いたものは結合に寄与する残基であり、太字のものはヒトとマウス間の保存残基である。
【図２７】抗ＦＧＦＲ４抗体３Ｂ６のヒト化である。（Ａ）３Ｂ６のヒト化の戦略のスキームである。（Ｂ）選択されたヒト生殖系列ＩｇＧの３Ｄモデルである。ラット残基によって置換された生殖系列残基は左パネルに表示する一方で、最適な解決策（ヒトまたはラットのアミノ酸）を実験的に決定する必要があった位置を右パネルに表示する。
【図２８】３Ｂ６ヒト化重鎖および軽鎖変異体をコードする発現ベクターである。
【図２９】表示した発現ベクターで形質移入させた２９３Ｆ細胞の上清の、還元（上）および非還元（下）条件下でのウエスタンブロット分析である。
【図３０】固相ＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４結合アッセイ（ｎ＝３）から得られた４５０ｎｍでの吸光度値から導いた、６個のヒト化３Ｂ６変異体の濃度の関数としてのＦＧＦ１９とＦＧＦＲ４との残留結合の用量応答曲線である。阻害曲線は、増大する抗体濃度（０．０１から３０ｕｇ／ｍＬまでの１：３の段階希釈）の４５０ｎｍでの残留吸光度（ＰＢＳ対照の％）に基づいた、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを用いた実験データの４Ｐロジスティック当てはめによって導いた。（Ａ）対応する阻害曲線から、０．１３ｕｇ／ｍＬ（０．８７ｎＭ）、０．４ｕｇ／ｍＬ（２．７ｎＭ）、および０．０７ｕｇ／ｍＬ（０．４７ｎＭ）のＩＣ５０値を、それぞれＨｕ３Ｂ６ａ、Ｈｕ３Ｂ６ｂ、およびＨｕ３Ｂ６ｃについて推定した。（Ｂ）対応する阻害曲線から、０．０３ｕｇ／ｍＬ（０．２ｎＭ）、０．１６ｕｇ／ｍＬ（１ｎＭ）、および０．０９ｕｇ／ｍＬ（０．６ｎＭ）のＩＣ５０値を、それぞれＨｕ３Ｂ６ｄ、Ｈｕ３Ｂ６ｅ、およびＨｕ３Ｂ６ｆについて推定した。（Ｃ）対応する阻害曲線から、０．０９ｕｇ／ｍＬ（０．６ｎＭ）および０．２ｕｇ／ｍＬ（１．３ｎＭ）のＩＣ５０値を、それぞれｃｈ３Ｂ６および陽性対照抗体ｈＬＤ１．ｖ２２について推定した。アイソタイプ対照では阻害曲線は得られなかった。
【図３１】ｃｈ３Ｂ６および市販の抗体ａｂ４１９４８の比較分析である。（Ａ）ａｂ４１９４８の濃度の関数としてＦＧＦＲ４−Ｆｃ依存性固相結合アッセイから得られた４５０ｎｍでの吸光度値のグラフである。連続的１：３希釈液（０．００００５ｕｇ／ｍＬから１ｕｇ／ｍＬまでの１０個の実験点）を、ヒトＦｃと融合させたＦＧＦＲ４の細胞外領域に対して３つ組で試験した。実線は実験のものである一方で、破線は実験データを「一部位結合」方程式に当てはめることによって得られたものである。（Ｂ）固相ＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４結合アッセイ（ｎ＝３）から得られた４５０ｎｍでの吸光度値から導いた、ｃｈ３Ｂ６およびａｂ４１９４８の濃度の関数としてのＦＧＦ１９とＦＧＦＲ４との残留結合の用量応答曲線である。阻害曲線は、増大する抗体濃度（０．００１から１０ｕｇ／ｍＬまでの１：３の段階希釈）の４５０ｎｍでの残留吸光度（ＰＢＳ対照の％）に基づいた、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを用いた実験データの４Ｐロジスティック当てはめによって導いた。（Ｃ）ウエスタンブロットによって分析した、ｃｈ３Ｂ６またはａｂ４１９４８で処理したＨｕｈ７細胞におけるＦＧＦ１９依存性ＦＲＳ２リン酸化の阻害である。実施例８に記載の実験条件下でＦＧＦ１９／ヘパリンを加える前に、細胞を１００ｕｇ／ｍＬのそれぞれの抗体またはＰＢＳで処理した。ウエスタンブロット分析は、抗ホスホ−ＦＲＳ２抗体（Ｔｙｒ−４３６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）および抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して行った。
【図３２】結腸ＣＴＳＣ８５の異種移植片に対する、ｃｈ３Ｂ６抗体による抗腫瘍効果である。上パネルでは、曲線は処置中の平均腫瘍容量±標準偏差の増加を表し、下パネルでは、−１日目と比較した平均腫瘍容量の増加分を±標準偏差で示す。ビヒクル対照に対して（＊＊）ｐ＜０．０１、（＊＊＊）ｐ＜０．００５、（＊＊＊＊）ｐ＜０．０００５。
【図３３】結腸ＣＴＳＣ８５由来の肝臓転移に対する、ｃｈ３Ｂ６およびｃｈ６Ｃ９抗体による抗腫瘍効果である。曲線は処理中および続く観察期間中の平均光子計数の増加を表す。ビヒクル対照に対して（＊）ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
定義
【００７６】
本発明の意味の範囲内において、「抗体」とは、一般に、特定の目的抗原標的と免疫特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位を含有する分子を意図する。したがって、用語「抗体」には、それだけには限定されないが、ネイティブ抗体およびその変異体、ネイティブ抗体およびその変異体の断片、ぺプチボディおよびその変異体、ならびに、単鎖抗体およびその断片を含めた抗体もしくは指定した断片またはその一部分の構造および／または機能を模倣する抗体模倣体が含まれる。したがって、用語「抗体」には、完全長抗体および／またはその変異体、ならびにその断片が含まれる。抗体と少なくとも１つの標的抗原との結合は様々な効果を引き起こすことができ、たとえば、それだけには限定されないが、そのような結合は、少なくとも１つの標的抗原活性、特定には標的受容体活性を、インビトロ、インサイツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）、および／またはインビボで変調する、減少させる、増加させる、拮抗する、刺激する、軽減する、緩和させる、遮断する、阻害する、抑止する、および／または妨害する。したがって、本発明には、それだけには限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｆａｃｂ、ｐＦｃ’、Ｆｄ、ＦｖまたはｓｃＦｖ断片（たとえばColligan et al. eds., John Wiley & Sons, Inc., NY, 1994-2001を参照）、ジアボディ、直鎖抗体（Zapata et al. (1995) Protein Eng. 8(10): 1057）、単鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成された多特異性抗体を含めた、生体分子（抗原もしくは受容体など）またはその一部分と結合することができる抗体断片が包含される。したがって、抗体とは、最も広い意味で使用され、たとえば、単一抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体（作用剤、拮抗剤、および中和抗体が含まれる）、ポリエピトープ特異性を有する抗ＦＧＦＲ４抗体組成物、単鎖抗ＦＧＦＲ４抗体、ならびに抗ＦＧＦＲ４抗体の断片が具体的にかカバーされる。また、本発明には抗体誘導体も包含される。本発明のモノクローナル抗体の誘導体は、たとえば、抗体断片、放射標識したモノクローナル抗体、およびモノクローナル抗体と酵素、蛍光マーカー、細胞毒性薬物とのコンジュゲートなどである。用語「誘導体」にはさらに、少なくとも１つのアミノ酸の付加、欠失、および／または置換によって異なる抗体コンストラクトの任意の突然変異体が包含される。抗体の断片または誘導体のエピトープと結合する能力は、たとえば以下のセクションに記載のように直接ＥＬＩＳＡによって決定することができる。
【００７７】
本発明の意味の範囲内において、「モノクローナル抗体」とは、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を意図し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る天然に存在する突然変異の可能性以外は同一である。モノクローナル抗体は「ｍＡｂ」と略記し得る。
【００７８】
本発明の意味の範囲内において、用語「キメラ抗体」とは、可変領域が異なる種の定常領域と連結されている、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属するように、定常領域またはその一部分が変更、置き換、または交換されている抗体をいう。また、用語「キメラ抗体」とは、定常領域が異なる種の可変領域と連結されている、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属するように、可変領域またはその一部分が変更、置き換、または交換されている抗体もいう。キメラ抗体を生産する方法は当業者に知られている。たとえば、Morrison, 1985, Science, 229:1202、Oi and al., 1986, Bio Techniques, 4:214、Gillies and al., 1989, J. Immunol. Methods, 125:191 -202、米国特許第５，８０７，７１５号、第４，８１６，５６７号、および第４，８１６，３９７号を参照されたい。抗体のこれらのキメラバージョンは、キメラモノクローナル抗体を作製するための、ネズミＶＬおよびＶＨ可変領域とヒト起源のＣＬ（カッパ）およびＣＨ（ＩｇＧ１）定常ドメインとの融合を含み得る。
【００７９】
本発明の意味の範囲内において、「ヒト化抗体」とは、ヒトにおいて自然に生成される抗体変異体に対するその類似度を増加させるためにそのタンパク質配列が改変されている、非ヒト種からの抗体を意図する。「ヒト化」のプロセスは、通常はヒトに投与するために開発されたモノクローナル抗体に適用する。
【００８０】
本発明の意味の範囲内において、「ヒト抗体」とは、人間において自然に存在し得る抗体を意図する。用語「ヒト抗体」には、一般に、完全ヒト抗体またはヒト化抗体が包含される。
【００８１】
本発明の意味の範囲内において、用語抗体の「結合する」または「結合」とは、標的抗原との少なくとも一時的な相互作用または会合を意味する。
【００８２】
本発明の意味の範囲内において、「阻害する」または「阻害」とは、生物学的薬剤の作用または機能を制限、防止、および／または遮断することを意図する。また、「遮断すること」も本明細書中で同義語として使用する。
【００８３】
本発明の意味の範囲内において、がん幹細胞（ＣＳＣ）とは、正常な幹細胞に関連づけられている特徴、特定には、特定のがん試料中に見つかる全細胞種へと分化する能力、および無限に自己複製する能力を有するがん細胞である。
【００８４】
本発明の意味の範囲内において、「処置」、「処置すること」とは、所望の薬理学的効果および／または生理的効果を得ることを意図する。効果は、疾患の部分的もしくは完全な治癒および／または疾患に起因し得る有害作用に関して治療的であり得る。本明細書中で使用する「処置」には、哺乳動物、特にヒトにおいて疾患または状態を処置するための、本発明の化合物の投与が含まれ、（ａ）疾患の阻害、すなわちその発生を停止させること、（ｂ）緩和ケアの提供、すなわち患者の苦痛を縮小させるおよび防止すること、ならびに（ｃ）疾患の解放、すなわち疾患もしくは障害の回帰を引き起こすまたはその症状もしくは合併症を軽減することが含まれる。投薬レジメンは、最適な所望の応答が提供されるように調節し得る。
【００８５】
本発明の意味の範囲内において、「エピトープ」とは、それに対して抗体が産生され、それに対して抗体が結合する、抗原分子の一部分を意図する。「ＦＧＦＲ４エピトープ」とは、抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体が特異的に結合する、ＦＧＦＲ４タンパク質の部分をいう。エピトープは、直鎖状アミノ酸残基（すなわち、エピトープ内の残基が直線様式で連続的に次々と配置されている）、非線形アミノ酸残基、または直鎖状および非線形のアミノ酸残基の両方を含むことができる。典型的には、直線状エピトープは一般に短いアミノ酸配列である（たとえば約５個のアミノ酸の長さ）。
【００８６】
本発明の意味の範囲内において、「医薬組成物」とは、対象への投与に適切にするために、有効量の本発明の抗体が少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルおよび／または少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤と混合されている組成物を意図する。
【００８７】
本発明の意味の範囲内において、「実質的に」とは、大きなおよび／または顕著な程度までを意図する。
【００８８】
本発明の意味の範囲内において、「抗体薬物コンジュゲート」または「ＡＤＣ」とは、モノクローナル抗体が薬物、一般に細胞毒性が高い薬物と連結されている化合物を意図する。
【００８９】
本発明は、ＦＧＦＲ４またはその機能的断片もしくは機能的誘導体に向けられた抗体、特定にはヒト抗体に言及する。
【００９０】
用語「抗体」とは、少なくとも１つの免疫グロブリン重鎖および少なくとも１つの免疫グロブリン軽鎖を含む分子を特にいう。それぞれの重鎖および軽鎖は可変ドメインおよび定常ドメインを含み得る。抗原結合部位は重鎖および軽鎖の可変ドメインから形成され得る。可変領域（可変ドメインとも呼ばれる）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）、たとえば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、ならびにＣＤＲに隣接するフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。用語「相補性決定領域」は当業者に容易に理解され（たとえばHarlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSHL press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1988を参照）、最初に抗原と接触して抗体特異性を決定する、抗体の可変ドメイン内のアミノ酸のストレッチをいう。非連続的なＣＤＲのトリプレットに由来する三次構造は超可変領域としても知られている。
【００９１】
本発明の一目的は、結腸がん幹細胞を、検出する、および／または致死させる、および／またはその発生および／または分化に影響を与える、および／または阻害するために使用するための、ＦＧＦＲ４に対する抗体である。
【００９２】
モノクローナル抗体抗ＦＧＦＲ４は当分野で知られており、一般的な方法によって購入または合成することができる。たとえば、French et al., 2012、Bumbaca et al., 2011、Bartz et al., 2016、ＵＳ９２６６９５５号Ｂ２、ＷＯ２０１４／１０５８４９号Ａ１、ＷＯ２０１６／０２３８９４号Ａ１、Ｕ３−１７８４（Ｕ３／Ｄａｉｉｃｈｉ  Ｓａｎｋｙｏ、ＮＣＴ０２６９０３５０）などの、上記の導入中に引用した参考文献を参照されたい。また、ＦＧＦＲ４に対するモノクローナル抗体は、遺伝子的免疫化の既知の技術を使用して得ることもでき、遺伝子的免疫化は当分野で周知であり、当業者によって一般的に使用されている。この技法の参照はTang DC, DeVit M, Johnston SA. Nature. 1992, 356(6365):152-154中に見つけることができる。
【００９３】
本発明によれば、ＦＧＦＲ４に対する抗体を結腸がん幹細胞の検出および認識に使用することができる。特定には、これらは、臨床試料中における結腸がん幹細胞の検出に有利に使用することができ、したがって診断的アッセイに応用される。より特定には、これらは、ＣＳＣ集団に対する新規ＣＲＣ処置の効果の測定を目的とした臨床グレードのアッセイに有利に使用することができる。
【００９４】
本発明によれば、ＦＧＦＲ４に対する抗体は、結腸がん幹細胞を致死させるため、またはその発生もしくはその分化に影響を与えるもしくはそれを阻害するためにも、使用することができる。
【００９５】
特定には、結腸がんを処置するために結腸がん幹細胞を致死させるために、ＦＧＦＲ４に対する抗体を、それを必要としている対象に医薬組成物の形態で投与することができる。また、これは、結腸がん状態を防止または改善するために前記細胞の発生または分化を阻害するために、それを必要としている対象に投与することもできる。
【００９６】
医薬組成物および投与様式は習慣的であり、当分野の技術者、たとえば医師の能力および知識の範囲内にある。
【００９７】
治療的応用に関するさらなる詳細は、本明細書中の下記段落「医薬組成物および医療処置」中に見つけることができる。
【００９８】
また、本願発明者らは、ヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸１１９〜１５６のエピトープまたはその機能的断片もしくは機能的誘導体に向けられた抗体が、治療的および診断的応用に特に有用であることも見出した。ＦＧＦＲ４のこのエピトープは「酸ボックス」ドメインとしても知られている。
【００９９】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸１２７〜１５４のエピトープに向けられている。実際、この特定のエピトープと結合することがＦＧＦＲ４活性の阻害に有利であることが見出されている。
【０１００】
特に好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、ヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸１１９〜１５６、好ましくはヒトＦＧＦＲ４のアミノ酸１２７〜１５４を含むアミノ酸配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるエピトープに向けられている。好ましくは、前記アミノ酸配列は、配列番号２７（ＤＥＤＰＫＳＨＲＤＰＳＮＲＨＳＹＰＱＱＡＰＹＷＴＨＰＱＲ）を有する配列を有する。
【０１０１】
本発明の別の実施形態では、抗体は、以下に開示したモノクローナル抗体によって認識される抗原またはエピトープと結合する。
【０１０２】
別の実施形態では、本発明の抗体は、以下に開示したモノクローナル抗体が結合するエピトープと特異的に結合するために必要な、以下に開示した抗体の超可変領域のアミノ酸を含む。
【０１０３】
そのような抗体は、前記超可変領域をコードするＤＮＡをクローニングし、標準の組換えＤＮＡ手順を使用して、適切な単細胞宿主または他の宿主にてＤＮＡを発現させることによって得られ得る。さらに、ポリペプチドは、化学的手順によってポリペプチドを合成するための周知の技法を使用して合成してもよい。
【０１０４】
本発明の対象は、本明細書中に開示した可変軽鎖および重鎖ならびにＣＤＲを有する抗体に限定されない。また、本発明には、本明細書中に開示した抗体が結合するものと同じエピトープと特異的に結合することができるアミノ酸配列を含む、またはそれから本質的になるポリペプチドも包含される。そのようなポリペプチドを得る１つの方法は、置換された場合にポリペプチドと抗原との結合に影響を与えるまたは影響を与えないアミノ酸を同定するために、前記抗体の超可変領域のアミノ酸を選択的に置換することである。
【０１０５】
これらの技法はすべて当分野で周知であり、当業者の知識の範囲内にある。
【０１０６】
たとえば、図２６Ｂに示すアミノ酸１２７〜１５４を含む酸ボックス内の結合部位を参照することができる。この結合部位に基づいて、当業者は、エピトープと特異的に結合するために必要な、以下に開示した抗体の超可変領域のアミノ酸を同定することができる。
【０１０７】
本発明の抗体は、様々な免疫グロブリン（Ｉｇ）型のもの、たとえば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ型のもの、好ましくは、それだけには限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ１、およびＩｇＭ２型を含めた、ＩｇＧまたはＩｇＭ型のものであり得る。好ましい一実施形態では、抗体はＩｇＧ１型のものである。
【０１０８】
また、軽鎖の定常部分は、カッパ型またはラムダ型のものであることができ、好ましくはカッパ型のものである。
【０１０９】
一部の実施形態では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。
【０１１０】
一部の実施形態では、これはヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である。
【０１１１】
本発明の特定の実施形態では、抗体は、本明細書中以下に記載する特定の重鎖相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、および／またはＣＤＲＨ３を含む。
【０１１２】
一実施形態では、抗体は、配列番号５〜６のいずれか１つに示すアミノ酸配列またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する、重鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＨ１）を含む。
【０１１３】
さらなる実施形態では、抗体は、配列番号７〜８のいずれか１つに示すアミノ酸配列またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する、重鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＨ２）を含む。
【０１１４】
よりさらなる実施形態では、抗体は、配列番号９に示すアミノ酸配列またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する、重鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＨ３）を含む。
【０１１５】
また、本発明による抗体は、特定の軽鎖相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、および／またはＣＤＲＬ３も含み得る。
【０１１６】
したがって、一実施形態では、抗体は、配列番号１４〜１５のいずれか１つに示すアミノ酸配列またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する、軽鎖相補性決定領域１（ＣＤＲＬ１）を含む。
【０１１７】
さらなる実施形態では、抗体は、配列番号１６に示すアミノ酸配列またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する、軽鎖相補性決定領域２（ＣＤＲＬ２）を含む。
【０１１８】
よりさらなる実施形態では、抗体は、配列番号１７に示すアミノ酸配列またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する、軽鎖相補性決定領域３（ＣＤＲＬ３）を含む。
【０１１９】
本発明の抗体は、好ましくは、１本の重鎖内にＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３）の特定の組合せを含む。
【０１２０】
したがって、好ましい一実施形態では、抗体は相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を含む重鎖を含み、ＣＤＲＨ１は、配列番号５〜６に示す配列から選択されるもの、またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列であり、ＣＤＲＨ２は、配列番号７〜８に示す配列から選択されるもの、またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列であり、ＣＤＲＨ３は、配列番号９に示すもの、またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列である。
【０１２１】
最も好ましくは、本発明の抗体は３つのＣＤＲを含む重鎖を含み、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の組合せは、表１に示すものから選択される。この表のそれぞれの行は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の１つの特定の組合せを表すことが理解されよう。
【０１２２】
表1
【表１】
2020537490.tif 000003
【０１２３】
本発明によれば、抗体は、１本の軽鎖内にＣＤＲ（すなわち、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３）の特定の組合せを含むことがさらに好ましい。したがって、好ましい一実施形態では、抗体は相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を含む軽鎖を含み、ＣＤＲＬ１は、配列番号１４〜１５のいずれかに示すアミノ酸配列、またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有しており、ＣＤＲＬ２は、配列番号１６に示すアミノ酸配列、またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有しており、ＣＤＲＬ３は、配列番号１７に示すアミノ酸配列、またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する。
【０１２４】
最も好ましくは、本発明の抗体は３つのＣＤＲを含む軽鎖を含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の組合せは、表２に示すものから選択される。この表のそれぞれの行は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３の１つの特定の組合せを表すことが理解されよう。
【０１２５】
表2
【表２】
2020537490.tif 000004
【０１２６】
上述のように、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）にはフレームワーク領域が隣接していてよい。３つのＣＤＲを含有する抗体の重鎖または軽鎖は、たとえば４つのフレームワーク領域を含有する。
【０１２７】
また、これらの抗体の機能的断片および機能的誘導体も本発明の範囲内にある。
【０１２８】
さらに、本発明には、上記の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲによって特徴づけられた特定の抗体と同じヒトＦＧＦＲ４上のエピトープを認識する抗体も包含される。
【０１２９】
抗体によって認識されるＦＧＦＲ４上のエピトープを決定するために、化学的に調製した、ヒトＦＧＦＲ４の細胞外ドメインのアミノ酸配列に由来する短いペプチドのアレイを使用して、抗体エピトープの位置づけおよび同定を行うことができる（Reinicke W., Methods Mol. Biol. 2004, 248: 443-63）。本発明の抗体によって結合されるＦＧＦＲ４細胞外ドメイン中のエピトープをマッピングするためのさらなる方法はＳｎａｐｓ／ＳＥＬＤＩ（Wang et al, Int. J. Cancer, 2001 , June 15; 92 (6): 871-6）を含み、あるいは、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)中に記載のものなどの慣例の交差遮断アッセイを行うことができる。
【０１３０】
特に好ましい実施形態によれば、本発明の抗体は、
（ａ）配列番号５〜６に示すＣＤＲＨ１またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ１配列、
（ｂ）配列番号７〜８に示すＣＤＲＨ２またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ２配列、および
（ｃ）配列番号９に示すＣＤＲＨ３またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＨ３配列
からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む重鎖、ならびに／あるいは
（ｄ）配列番号１４〜１５に示すＣＤＲＬ１またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ１配列、
（ｅ）配列番号１６に示すＣＤＲＬ２またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ２配列、および
（ｆ）配列番号１７に示すＣＤＲＬ３またはそこから１つもしくは２つのアミノ酸が異なるＣＤＲＬ３配列
からなる群から選択される少なくとも１つのＣＤＲを含む軽鎖を含む。
【０１３１】
本発明の好ましい実施形態では、抗体は、配列番号１〜４もしくは配列番号８４〜８８または前記配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列のいずれか１つに示す重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。さらに、本発明のヒト抗体は、好ましくは、配列番号１０〜１３もしくは配列番号８９〜９１または前記配列と少なくとも８５％の同一性を有する配列のいずれか１つに示す軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。少なくとも８５％の同一性とは、８５〜１００％に含まれる、好ましくは９０、９５、または９９％のアミノ酸同一性百分率を意味する。
【０１３２】
配列番号１〜４を有する上述の配列を本明細書中に開示する。それぞれの配列において、可変鎖内のＣＤＲの位置に下線が引かれている。
【化１】
2020537490.tif 000005
配列番号１−可変重鎖
【化２】
2020537490.tif 000006
配列番号２−可変重鎖
【化３】
2020537490.tif 000007
配列番号３−可変重鎖
【化４】
2020537490.tif 000008
配列番号４−可変重鎖
【０１３３】
配列番号８４〜８８を有する上述の配列を本明細書中に開示する。それぞれの配列において、可変鎖内のＣＤＲの位置に下線が引かれている。
【化５】
2020537490.tif 000009
配列番号８４−可変重鎖
【化６】
2020537490.tif 000010
配列番号８５−可変重鎖
【化７】
2020537490.tif 000011
配列番号８６−可変重鎖
【化８】
2020537490.tif 000012
配列番号８７−可変重鎖
【化９】
2020537490.tif 000013
配列番号８８−可変重鎖
【０１３４】
配列番号１０〜１３を有する上述の配列を本明細書中に開示する。それぞれの配列において、可変鎖内のＣＤＲの位置に下線が引かれている。
【化１０】
2020537490.tif 000014
配列番号１０−可変軽鎖
【化１１】
2020537490.tif 000015
配列番号１１−可変軽鎖
【化１２】
2020537490.tif 000016
配列番号１２−可変軽鎖
【化１３】
2020537490.tif 000017
配列番号１３−可変軽鎖
【０１３５】
配列番号８９〜９１を有する上述の配列を本明細書中に開示する。それぞれの配列において、可変鎖内のＣＤＲの位置に下線が引かれている。
【化１４】
2020537490.tif 000018
配列番号８９−可変軽鎖
【化１５】
2020537490.tif 000019
配列番号９０−可変軽鎖
【化１６】
2020537490.tif 000020
配列番号９１−可変軽鎖
【０１３６】
配列番号２〜４のいずれか１つに示す重鎖可変領域と配列番号１２〜１３のいずれか１つに示す軽鎖可変領域とを含むヒト抗体が特に好ましい。
【０１３７】
ＦＧＦＲ４の酸ボックスと結合する抗体またはその抗原結合断片であって、その重鎖の可変領域が、配列番号１８〜２２または配列番号９２〜９６の配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされており、その軽鎖の可変領域が、配列番号２３〜２６または配列番号９７〜９９の配列と少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされている、抗体またはその抗原結合断片は、抗体がその結合特異性を保持する条件で、依然として本発明の範囲内にある。少なくとも８０％の同一性とは、８０〜１００％に含まれる、好ましくは９０、９５、または９９％のヌクレオチド同一性百分率を意味する。
【０１３８】
配列番号６に示すＣＤＲＨ１、配列番号７に示すＣＤＲＨ２、および配列番号９に示すＣＤＲＨ３を含む重鎖と、配列番号１５に示すＣＤＲＬ１、配列番号１６に示すＣＤＲＬ２、および配列番号１７に示すＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含むヒト抗体（ｈｕ３Ｂ６ａおよびｈｕ３６Ｂｃ）が、特に好ましい。また、ヒトＣＤＲのうちの１つもしくは複数の１つもしくは２つのアミノ酸が異なる抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同じエピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施形態では、ヒト抗体は配列番号２による重鎖可変領域と配列番号１２による軽鎖可変領域（ｈｕ３Ｂ６ａ）とを含む。別の特に好ましい実施形態では、ヒト抗体は配列番号４による重鎖可変領域と配列番号１２による軽鎖可変領域（ｈｕ３Ｂ６ｃ）とを含む。また、重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が配列番号２、４、および１２と少なくとも８５％の同一性を有するヒト抗体も包含される。
【０１３９】
配列番号６に示すＣＤＲＨ１、配列番号８に示すＣＤＲＨ２、および配列番号９に示すＣＤＲＨ３を含む重鎖と、配列番号１５に示すＣＤＲＬ１、配列番号１６に示すＣＤＲＬ２、および配列番号１７に示すＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含むヒト抗体（ｈｕ３Ｂ６ｂ）が、特に好ましい。また、ヒトＣＤＲのうちの１つもしくは複数の１つもしくは２つのアミノ酸が異なる抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同じエピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施形態では、ヒト抗体は配列番号３による重鎖可変領域と配列番号１２による軽鎖可変領域とを含む。また、重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が配列番号３および１２と少なくとも８５％の同一性を有するヒト抗体も包含される。
【０１４０】
配列番号６に示すＣＤＲＨ１、配列番号７に示すＣＤＲＨ２、および配列番号９に示すＣＤＲＨ３を含む重鎖と、配列番号１４に示すＣＤＲＬ１、配列番号１６に示すＣＤＲＬ２、および配列番号１７に示すＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含むヒト抗体（ｈｕ３Ｂ６ｄおよびｈｕ３Ｂ６ｆ）が、特に好ましい。また、ヒトＣＤＲのうちの１つもしくは複数の１つもしくは２つのアミノ酸が異なる抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同じエピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施形態では、ヒト抗体は配列番号２による重鎖可変領域と配列番号１３による軽鎖可変領域（ｈｕ３Ｂ６ｄ）を含む。別の特に好ましい実施形態では、ヒト抗体は配列番号４による重鎖可変領域と配列番号１３による軽鎖可変領域（ｈｕ３Ｂ６ｆ）を含む。また、重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が配列番号２、４、および１３と少なくとも８５％の同一性を有するヒト抗体も包含される。
【０１４１】
配列番号６に示すＣＤＲＨ１、配列番号８に示すＣＤＲＨ２、および配列番号９に示すＣＤＲＨ３を含む重鎖と、配列番号１４に示すＣＤＲＬ１、配列番号１６に示すＣＤＲＬ２、および配列番号１７に示すＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含むヒト抗体（ｈｕ３Ｂ６ｅ）が、特に好ましい。また、ヒトＣＤＲのうちの１つもしくは複数の１つもしくは２つのアミノ酸が異なる抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同じエピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施形態では、ヒト抗体は配列番号３による重鎖可変領域と配列番号１３による軽鎖可変領域を含む。また、重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が配列番号３および１３と少なくとも８５％の同一性を有するヒト抗体も包含される。
【０１４２】
別の好ましい抗体は、配列番号５に示すＣＤＲＨ１、配列番号７に示すＣＤＲＨ２、および配列番号９に示すＣＤＲＨ３を含む重鎖と、配列番号１４に示すＣＤＲＬ１、配列番号１６に示すＣＤＲＬ２、および配列番号１７に示すＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含むラットモノクローナル抗体（ＢＭＫ−３Ｂ６−Ｅ４−Ｃ３）である。また、ＣＤＲのうちの１つもしくは複数の１つもしくは２つのアミノ酸が異なる抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同じエピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施形態では、抗体は配列番号１による重鎖可変領域と配列番号１０による軽鎖可変領域を含む。また、重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が配列番号１および１０と少なくとも８５％の同一性を有する抗体も包含される。
【０１４３】
別の好ましい抗体は、配列番号５に示すＣＤＲＨ１、配列番号７に示すＣＤＲＨ２、および配列番号９に示すＣＤＲＨ３を含む重鎖と、配列番号１４に示すＣＤＲＬ１、配列番号１６に示すＣＤＲＬ２、および配列番号１７に示すＣＤＲＬ３を含む軽鎖とを含むキメラ抗体（ｃｈ３Ｂ６）である。また、ＣＤＲのうちの１つもしくは複数の１つもしくは２つのアミノ酸が異なる抗体、またはヒトＦＧＦＲ４上の同じエピトープを認識する抗体も包含される。特に好ましい実施形態では、抗体は配列番号１による重鎖可変領域と配列番号１１による軽鎖可変領域を含む。また、重鎖および／または軽鎖の可変領域の配列が配列番号１および１１と少なくとも８５％の同一性を有する抗体も包含される。
【０１４４】
本発明の実施形態では、本発明の抗体は軽鎖および重鎖を含み、重鎖の可変領域は配列番号１〜４、８４〜８８を有する配列のいずれか１つから選択される配列を有しており、軽鎖の可変領域は配列番号１０〜１３、８９〜９１を有する配列のいずれか１つから選択される配列を有する。
【０１４５】
本発明の実施形態では、本発明の抗体は軽鎖および重鎖を含み、重鎖の可変領域は、配列番号１８〜２２、９２〜９６を有する配列のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列によってコードされており、軽鎖の可変領域は、配列番号２３〜２６、９７〜９９を有する配列のいずれか１つから選択されるヌクレオチド配列によってコードされている。
【０１４６】
本発明好ましい実施形態では、本発明の抗体は軽鎖および重鎖を含み、可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）の組合せは、以下の表３に示すものから選択される。また、抗体は、好ましくは以下の表３に示すものから選択される、ＣＤＲＨとＣＤＲＬとの組合せも含む。この表のそれぞれの行は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３の１つの特定の組合せ、ならびに可変軽鎖および可変重鎖の特定の組合せを表すことが理解されよう。
【０１４７】
表3. 数字は添付の配列表どおり配列番号を示している。
【表３】
2020537490.tif 000021
【０１４８】
上述のように、本発明の抗体は、その結合特異性および生物活性に関して、特定には、ＦＧＦＲ４の特異的エピトープを認識し、細胞成長および細胞遊走を減少させるその能力に関して、有利な特性を示す。
【０１４９】
特定には、本発明の抗体であるｈｕ３Ｂ６、ｃｈ３Ｂ６、およびＢＭＫ−３Ｂ６−Ｅ４−Ｃ３は抗腫瘍活性を有する。
【０１５０】
また、これらはＦＧＦＲ４と特異的に結合し、好ましくは他のＦＧＦ受容体ＦＧＦＲ１〜３と交差反応性を示さない。
【０１５１】
本発明の抗体はＦＧＦ１９とＦＧＦＲ４との結合を阻害することができる。
【０１５２】
ＦＧＦＲ４とのリガンド結合に対する抗体の効果は固相受容体結合アッセイを使用して決定することができる。ＦＧＦＲ４受容体に対するリガンドの結合親和性を低下させる、またはリガンドとＦＧＦＲ４との結合を遮断する抗体を同定することができる。
【０１５３】
本発明の特に好ましい抗体は、たとえば、ＦＧＦ１、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１８、ＦＧＦ２１、ＦＧＦ２３（Zhang et al., 2006）を含めたさらなるＦＧＦＲ４リガンドの受容体との結合を、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％または８７％遮断することができる。
【０１５４】
リガンドとヒトＦＧＦＲ４との結合の遮断はＦＧＦＲ４シグナル伝達の阻害をもたらす。ＦＧＦＲ４の活性化は、Ｃｙｐ７Ａ１の阻害およびＣＴＧＦ遺伝子転写の誘導、また、受容体自体ならびにＦＲＳ２およびＥｒｋ１／２などの下流エフェクタータンパク質のリン酸化の刺激も含む。遮断抗体を選択するためには、細胞を緩衝液（対照）または抗体を用いてプレインキュベートし、その後、リガンドまたは対照緩衝液で処理することができる。その後、細胞を溶解し、細胞溶解液を、Ｃｙｐ７Ａ１およびＣＴＧＦに特異的なプローブを使用したＲＴ−ＰＣＲによる遺伝子発現分析、または抗ホスホＦＧＦＲ４、抗ホスホＦＲＳ２、および／もしくは抗ホスホＥｒｋ１／２抗体でプローブするＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによる分析のどちらか用に処理することができる。対照（未処理の細胞）と比較してＣｙｐ７Ａ１の阻害を解放する、ＣＴＧＦの発現を抑圧する、ならびに／またはＦＧＦＲ４、ＦＲＳ２、およびＥｒｋ１／２のリン酸化を低下させる抗体が選択される。
【０１５５】
インビトロ実験を実施して、ＦＧＦＲ４依存性細胞増殖を阻害する本発明の抗体の能力を決定することができる。クローン原性アッセイおよび軟寒天コロニー形成アッセイを実施することができる。適切な数の目的の単個細胞を播種し、適切な培地で希釈した抗体で処理するまたは処理しない。抗体は実験の期間中（１０〜１５日間）週に２回交換し、その後、生成されたコロニーを計数する。ＦＧＦＲ４媒介性の細胞遊走を低下させる抗体を選択するために、遊出実験を行うことができる。細胞を抗体と共にインキュベートする。適切な数の細胞を、８μｍ孔を有するコーティングしたトランスウェルプレートの上チャンバーに配置してもよい（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）。刺激の場合、培地単独または化学走性剤を含有するものが、下チャンバーで使用される。細胞を放置して遊走させ、続いて染色する。染色細胞を計数する。パーセント阻害は、対照抗体に対する阻害として表される。
【０１５６】
本発明の抗体は抗腫瘍活性を有することが見出された。
【０１５７】
治療的抗体の抗腫瘍効力はヒト異種移植片腫瘍研究において評価し得る。これらの研究では、ヒト腫瘍は免疫無防備状態のマウスにおいて異種移植片として成長し、治療上の有効性は腫瘍成長阻害の度合によって測定する。本発明のＦＧＦＲ４抗体が免疫無防備状態のマウスにおいてヒトがん細胞の腫瘍成長を妨げるかどうかを決定するために、細胞をマウスに移植する。動物の背中または側腹部で腫瘍を皮下成長させる。処置は即時または腫瘍が特定の平均用量に達した際に開始し得る。処置群にわたって開始腫瘍容量の均一性（平均、中央値、および標準偏差）を保証するために、最初の処置の前にマウスをランダム化し、統計的検定を行う。処置は２５ｍｇ／ｋｇの負荷用量で開始し、次いで、週に２回の２５ｍｇ／ｋｇの注射を腹腔内注射によって行う。
【０１５８】
特定の実施形態では、本明細書中に提供する抗体はキメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、たとえば、米国特許第４，８１６，５６７号およびMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)）に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（たとえば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、またはサルなどの非ヒト霊長類に由来する可変領域）とヒト定常領域とを含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更されている、「クラススイッチした」抗体である。キメラ抗体にはその抗原結合断片が含まれる。
【０１５９】
例示的な一実施形態では、キメラ抗体は、ラット可変重鎖領域をコードするｃＤＮＡをヒトＩｇＧ１定常領域のコード配列とインフレームでクローニングし、ラット可変軽鎖領域をコードするｃＤＮＡをヒトカッパ鎖定常領域のコード配列とインフレームで同じ発現ベクター内にクローニングすることによって調製することができる。その後、ハイブリッド重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを適切な細胞系内に同時形質移入し、所望の抗体が得られる。
【０１６０】
特定の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。典型的には、非ヒト親抗体の特異性および親和性を保持したままでヒトに対する免疫原性を低下させるために、非ヒト抗体をヒト化する。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（またはその一部分）が非ヒト抗体に由来し、ＦＲ（またはその一部分）がヒト抗体配列に由来する、１つまたは複数の可変ドメインを含む。また、ヒト化抗体はヒト定常領域の少なくとも一部分も含んでいてもよい。一部の実施形態では、たとえば抗体の特異性または親和性を回復または改善させるために、ヒト化抗体中の一部のＦＲ残基を非ヒト抗体（たとえばＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換する。
【０１６１】
ヒト化抗体は、既知の技法に従ったモノクローナル抗体のヒト化によって調製し得る。典型的には、非ヒト親抗体の特異性および親和性を保持したままでヒトに対する免疫原性を低下させるために、非ヒト抗体をヒト化する。ヒト化抗体およびそれらを作製する方法はたとえばAlamagro and Fransson, Front. Biosci. 13: 1619-1633 (2008)に総説されており、たとえば、Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)、Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989)、米国特許第５，８２１，３３７号、第７，５２７，７９１号、第６，９８２，３２１号、および第７，０８７，４０９号、Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005)（ＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）移植を説明）、Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991)（「表面再建」を説明）、Dall' Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005)（「ＦＲシャフリング」を説明）、ならびにOsbourn et al., Methods 36:61-68 (2005)およびKlimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000)（ＦＲシャフリングの「誘導選択」手法を説明）にさらに記載されている。
【０１６２】
ヒト化に使用し得るヒトフレームワーク領域には、それだけには限定されないが、「ベストフィット」方法を使用して選択されたフレームワーク領域（たとえばSims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)を参照）、軽鎖または重鎖可変領域の特定の部分群のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（たとえば、Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)およびPresta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)を参照）、ヒト成熟（体細胞変異した）フレームワーク領域またはヒト生殖系列フレームワーク領域（たとえばAlmagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)を参照）、ならびにＦＲライブラリのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（たとえば、Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997)およびRosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)を参照）が含まれる。
【０１６３】
本発明の例示的な一実施形態では、完全にヒト化した抗体は、キメラ発現ベクターから開始して、元のラット可変重鎖コード配列をヒト化可変重鎖コード配列で置き換え、元のラット可変軽鎖コード配列をヒト化可変軽鎖コード配列で置き換えて作製した、ヒト化発現ベクターを使用して得られる。その後、そのようにして得られた発現ベクターを適切な細胞系内に同時形質移入して、ヒト化抗体を産生させる。
【０１６４】
ヒト抗体は、遺伝子操作した動物、たとえば外因性免疫系を含む動物から、または抗体ディスプレイライブラリから、既知の技法に従って調製し得る。ヒト抗体は一般にvan Dijk and van de Winkel (Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001))およびLonberg (Curr. Opin. Immunol. 20: 450-459 (2008))に記載されている。ヒト抗体は、抗原誘発に応答してインタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製し得る。そのような動物は、典型的には、内在性免疫グロブリン座位を置き換える、または染色対外に存在するもしくは動物の染色体内にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン座位の全体または一部分を含有する。そのようなトランスジェニックマウスでは、内在性免疫グロブリン座位は一般に不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得る方法の総説には、たとえばLonberg, Nat. Biotech. 23: 1117-1125 (2005)を参照されたい。そのような動物によって作製したインタクトな抗体からのヒト可変領域は、たとえば異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに改変し得る。
【０１６５】
また、ヒト抗体はハイブリドーマに基づく方法によっても作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫およびマウス−ヒト異種骨髄腫細胞系が記載されている（たとえば、Kozbor J. Immunol. 133: 3001 (1984)、Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63を参照）。また、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術によって作製されたヒト抗体も記載されているLi et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 103: 3557-3562 (2006)。
【０１６６】
また、ヒト抗体はファージディスプレイ方法によっても作製し得る（たとえば、ＵＳ６，２４８，５１６号、ＵＳ５，４０３，４８４号、ＵＳ５，９６９、１０８号、ＵＳ５，８８５，７９３号、ＵＳ６，６９６，２４８号、ＵＳ５，８４９，５００号を参照）。ヒト抗体を抗体ライブラリから選択するための技法は当分野で知られている。（たとえば、Carmen, S. et al., Briefings in Functional Genomics and Proteomics (2002), 1 (2), p. 189-203およびSiriwardena, D. et al., Ophthalmology (2002) 109 (3), p. 427-431を参照）。たとえば、ヒト抗体可変領域を単鎖抗体（ｓｃＦｖ）としてファージ表面上に発現させ、抗原と結合するファージを選択することを含む、ファージディスプレイ方法を使用することができる（Nature (1991), 352, (6336), p. 624-628、Journal of Molecular Biology (1992), 227, (2), p 381-388、およびNature Biotechnology (2005), 23, (9), p. 1105-1116）。同様に、ヒト抗体Ｆａｂ（抗原結合断片）をファージの表面上に発現させ、抗原と結合するファージを選択することを含む別のファージディスプレイ方法を使用することもできる（ＷＯ９７／０８３２０号およびＷＯ０１／０５９５０号）。抗原結合に基づいて選択されたファージの遺伝子を分析することによって、抗原と結合するヒト抗体可変領域をコードするＤＮＡ配列を決定することができる。抗原と結合するｓｃＦｖまたはＦａｂのＤＮＡ配列が明白になると、それからＣＤＲ配列を抽出し、その配列を有する発現ベクターを調製して適切な宿主内に導入し、次いで遺伝子発現を行ってヒト抗体を得ることができる（ＷＯ９２／０１０４７号、ＷＯ９２／２０７９１号、ＷＯ９３／０６２１３号、ＷＯ９３／１１２３６号、ＷＯ９３／１９１７２号、ＷＯ９５／０１４３８号、ＷＯ９５／１５３８８号、Annu. Rev. Immunol (1994) 12, p. 433-455、およびNature Biotechnology (2005) 23 (9), p. 1105-1116）。また、ヒト抗体は、ヒト由来のファージディスプレイライブラリから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても作製し得る。その後、そのような可変ドメイン配列を所望のヒト定常ドメインと組み合わせ得る。ヒト抗体を抗体ライブラリから選択するための技法は当分野で知られている。
【０１６７】
本発明の特定の実施形態では、抗体ｃｈ３Ｂ６のヒト化を、元のハイブリドーマラットＣＤＲ配列を選択されたヒト免疫グロブリン可変領域内に移植することで得た。ヒト化変異体を最適化するために、元のラット抗体３Ｂ６のものと最も類似しているヒト生殖系列免疫グロブリン可変配列を同定および選択した。既知の免疫グロブリン結晶構造との相同性に基づいて、選択されたヒト生殖系列可変領域の３Ｄモデルを重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のどちらについても作製した。ヒトフレームワーク内のどの追加のアミノ酸残基を、対応する元のネズミ残基によって置換する必要があるかを決定するために、抗原結合またはＶＨ／ＶＬの配向に潜在的に影響を与えているアミノ酸に特に注意しながら、３Ｄモデル内のそれぞれのアミノ酸位置を評価した。ヒト化配列のわずかに異なるバージョン、すなわちそれぞれＶＨ３を３つおよびＶＬを２つ設計し、その組合せにより６つの異なる抗体が生じる（ｈｕ３Ｂ６ａ、ｈｕ３Ｂ６ｂ、ｈｕ３Ｂ６ｃ、ｈｕ３Ｂ６ｄ、ｈｕ３Ｂ６ｅ、ｈｕ３Ｂ６ｆ）。
【０１６８】
また、本発明には、ヒト抗体の断片、たとえば、少なくとも１つの抗原結合部位を含む、上述の抗体の一部分も包含される。抗体断片の例には、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、ジアボディ、または単鎖抗体分子、および、ヒトＦＧＦＲ４と結合する所望の能力を示す限りは他の断片が含まれる。特定の抗体断片の総説にはHudson et al., Nat. Met. 9: 129-134 (2003)を参照されたい。
【０１６９】
特定の実施形態では、ヒトＦＧＦＲ４と結合する所望の能力を示すかがいりは、本明細書中で提供する抗体のアミノ酸配列変異体が企図される。たとえば、抗体の結合親和性および／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、適切な改変を抗体をコードするヌクレオチド配列内に導入することによって、またはペプチド合成によって調製し得る。そのような改変には、たとえば、抗体のアミノ酸配列からの欠失および／またはそれ内への挿入および／またはそれ内の残基の置換が含まれる。最終コンストラクトが所望の特徴、たとえば抗原結合を保有している限りは、欠失、挿入、および置換の任意の組合せを行って最終コンストラクトに到達することができる。
【０１７０】
本発明による抗体は、当分野の共通の一般知識の一部である調製方法によって得ることができる。
【０１７１】
たとえば、"Current protocols in immunology" Colligan et al. eds., John Wiley & Sons, Inc., NYの最新版を参照することができる。
【０１７２】
一実施形態では、本発明によるモノクローナル抗体は、実施例３に示すように遺伝子的免疫化によって調製する。遺伝子的免疫化は当分野で周知であり、当業者によって一般的に使用されている。この技法への参照は、たとえばTang DC, DeVit M, Johnston SA. Nature. 1992, 356(6365):152-154に見つけることができる。
【０１７３】
本発明の抗体は異種基、たとえばエフェクター基とカップリングされていてよい。そのような抗体コンジュゲートは治療的応用に特に適している。用語「エフェクター基」とは、放射性同位元素もしくは放射性核種、毒素、治療剤基、または当分野で知られている別のエフェクター基などの細胞毒性基をいい得る。
【０１７４】
抗体が治療剤基とカップリングされているコンジュゲート、いわゆる抗体−薬物−コンジュゲート（ＡＤＣ）が特に好ましい。
【０１７５】
本発明の抗体は、ＦＧＦＲ４を選択的に標的とするその特性が理由で、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）の構築に特に有用である。好ましい実施形態では、前記ＡＤＣ中、抗体に付着させる薬物構成成分は毒素であり、好ましくは以下からなる群から選択される：アウリスタチン、メイタンシノイド、カリケアマイシン、ツブリシン、デュオカルマイシン、カンプトテシン類似体、ベンゾジアゼピン、ドキソルビシン、α−アマニチン誘導体、アントラサイクリン、リゾキシン、タイランスタチン、スプライソスタチン、クリプトフィシン、およびヒストンデアセチラーゼ阻害剤。この主題の総説には、Beck et al., Nat Rev Drug Discov. 16:315-337 (2017)を参照することができる。
【０１７６】
本発明の一実施形態によれば、本明細書中に開示したモノクローナル抗体とのコンジュゲート（ＡＤＣ）はクリプトフィシン、特定には以下の式のクリプトフィシンを含む。
【０１７７】
【化１７】
2020537490.tif 000022
【０１７８】
本発明の一実施形態によれば、コンジュゲートは、式（Ｉ）：
【０１７９】
【化１８】
2020537490.tif 000023
【０１８０】
［式中、Ｒは、−ＣＯ−ＣＨ２−Ｘ−（Ａ）ｎ−Ｂであり、
Ｘは、ＮＲａからなる群から選択され、Ｒａは、ＨおよびＣ１〜Ｃ１０アルキルならびにＯからなる群から選択され、
Ａは、存在または非存在であってもよく、自己犠牲リンカーであり、
ｎは、０または１であり、
Ｂは、本発明において開示される抗体である］
および薬学的に許容されるその塩を有する。
【０１８１】
本発明の一実施形態では、式（Ｉ）のコンジュゲート中、リンカーＡは式（ＩＩ）の部分である。
【０１８２】
【化１９】
2020537490.tif 000024
【０１８３】
［式中、Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルからなる群から選択され、Ｒ２は、適宜Ｒ１と一緒になって、アミノ酸側鎖の残基であり、Ｒ３は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルからなる群から選択され、Ｒ４は、適宜Ｒ３と一緒になって、アミノ酸側鎖の残基である］。
【０１８４】
本発明の一実施形態では、式（Ｉ）のコンジュゲート中、リンカーＡは以下からなる群から選択される。
【０１８５】
【化２０】
2020537490.tif 000025
【０１８６】
本発明の一実施形態では、上記コンジュゲートは式（Ｖ）を有する：
【０１８７】
【化２１】
2020537490.tif 000026
【０１８８】
［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４は上記定義した通りであり、Ｘは、ＮＨ、Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）−アルキル、Ｏからなる群から選択され、ｍＡｂは本発明中に開示したモノクローナル抗体を表す］。
【０１８９】
本発明の一実施形態では、上記コンジュゲートは式（ＶＩ）を有しており、
【０１９０】
【化２２】
2020537490.tif 000027
【０１９１】
式の左端の記号は本発明中に開示したモノクローナル抗体を表す。
【０１９２】
本発明の一実施形態では、上記コンジュゲートは式（ＶＩＩ）を有する：
【０１９３】
【化２３】
2020537490.tif 000028
【０１９４】
［式中、Ｒ１は、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ１０）アルキルからなる群から選択され、Ｒ４は、適宜Ｒ１と一緒になって、アミノ酸側鎖の残基であり、Ｘは、ＮＨ、Ｎ−（Ｃ１〜Ｃ１０）、アルキル、Ｏからなる群から選択され、ｍＡｂは本発明中に開示したモノクローナル抗体を表す］。
【０１９５】
すべての上記実施形態は、そのそれぞれの薬学的に許容される塩も含む。
【０１９６】
好ましい実施形態では、本発明の抗体はＡＤＣ中に含まれ、薬物部分はＷＯ２０１６１４６６３８号に開示されているクリプトフィシンである。
【０１９７】
別の好ましい実施形態では、本発明の抗体はＡＤＣ中に含まれ、薬物部分はクリプトフィシンであり、リンカーはＷＯ２０１６１４６６３８号に開示されている通りである。
【０１９８】
別の好ましい実施形態では、本発明の抗体は、ＷＯ２０１６１４６６３８号に開示されている式（Ｉ）の化合物のＢ群に対応している。
【０１９９】
また、本発明の抗体は標識基とカップリングされていてよい。そのような抗体コンジュゲートは診断的応用に特に適している。本明細書中で使用する用語「標識基」とは、検出可能なマーカー、たとえば、放射標識したアミノ酸もしくはビオチン部分、蛍光マーカー、酵素、または当分野で知られている任意の他の種類のマーカーをいう。本発明の抗体または抗体断片と放射性同位元素との連結は、たとえば腫瘍処置に対する利点を提供する。化学療法および他のがん処置形態とは異なり、放射線免疫療法または放射性同位元素−抗体の組合せの投与は、周囲の正常な健康組織に対する損傷を最小限にしてがん細胞を標的とする。
【０２００】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、たとえば、抗原結合特性、エフェクター機能、薬物動態学、医薬特性、および安全性問題を改善させるために操作することができる。特定には、抗体の可変領域を操作することができる。特定には上述した効果を得るために抗体を操作することは、免疫学分野において一般的な取り組みである。たとえばIgawa T, Tsunoda H, Kuramochi T, Sampei Z, Ishii S, Hattori K. MAbs. 2011 May-Jun;3(3):243-52, "Engineering the variable region of therapeutic IgG antibodies"の総説を参照することができる。特定には、本発明の抗体の糖鎖操作したバージョンは本発明の範囲内にあり、当分野の一般知識に従って当業者によって得ることができる。
【０２０１】
また、本発明は、上述の抗体をコードする核酸分子にも言及する。
【０２０２】
用語「核酸分子」には、ＤＮＡ、たとえば一本鎖もしくは二本鎖のＤＮＡ、またはＲＮＡが包含される。ＤＮＡは、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成由来のもの、またはその組合せであり得る。本発明の核酸分子は、発現制御配列、すなわち、コード核酸配列の発現をもたらすために必要な配列と作動可能に連結していてよい。そのような発現制御配列には、プロモーター、エンハンサー、リボソーム結合部位、および／または転写終結配列が含まれ得る。適切な発現制御配列の具体的な例は当分野で知られている。
【０２０３】
好ましい実施形態によれば、本発明は、以下からなる群から選択される単離した核酸分子に向けられている：
（ａ）上記定義した抗体、その断片または誘導体をコードする核酸配列、
（ｂ）配列番号１８〜２２、９２〜９６および配列番号２３〜２６、９７〜９９または配列番号２８〜３１および配列番号３２〜３４のいずれか１つに示す核酸配列、
（ａ）または（ｂ）の配列のいずれか１つに相補的な核酸配列、ならびに
ストリンジェントな条件下で（ａ）または（ｂ）とハイブリダイズすることができる核酸配列。
【０２０４】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、核酸分子は、抗体の重鎖の可変領域をコードする配列と軽鎖の可変領域をコードする配列とを含む。
【０２０５】
代替実施形態では、一方の核酸分子が抗体の軽鎖をコードし、他方の核酸分子が抗体の重鎖をコードする、２つの核酸分子の組合せを提供する。
【０２０６】
重鎖の可変領域をコードする核酸配列は、好ましくは、配列番号１８〜２２のいずれか１つに示す配列から選択される。抗体の軽鎖の可変領域をコードする核酸配列は、好ましくは、配列番号２３〜２６のいずれか１つに示す配列から選択される。
【０２０７】
重鎖の可変領域をコードする、配列番号１８〜２２を有する上述の核酸配列を本明細書中に報告する：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTAATTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAAGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAATCCCAGTGGTACCAGAACTTACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCCGATTCACTCTCTCCAGAGATAGTGCAAAGAGCAGCCTATATCTGCAAATGAACAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCACTTTTTACTGTGCAAGGCTTTATAACAACTACGCTTTTGATTACTGGGGCCAGGGAGTCATGGTCACAGTCTCCTCA
配列番号１８−可変重鎖をコードする核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTAATTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAAGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAATCCCAGTGGTACCAGAACTTACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCCGATTCACTCTCTCCAGAGATAGTGCAAAGAGCAGCCTATATCTGCAAATGAACAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCACTTTTTACTGTGCAAGGCTTTATAACAACTACGCTTTTGATTACTGGGGCCAAGGAGTCATGGTCACTGTCTCCTCA
配列番号１９−可変重鎖をコードする核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号２０−可変重鎖をコードする核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号２１−可変重鎖をコードする核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAGCGCCAAGAGCTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号２２−可変重鎖をコードする核酸
【０２０８】
重鎖の可変領域をコードする、配列番号９２〜９６を有する上述の核酸配列を本明細書中に報告する：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号９２−可変重鎖をコードする核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTACCTTCTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号９３−可変重鎖をコードする核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAGCGCCAAGAGCTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTACCTTCTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号９４−可変重鎖をコードする核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCCTCTCCAGAGACAGCGCCAAGAGCTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号９５−可変重鎖をコードする核酸
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTACCTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA
配列番号９６−可変重鎖をコードする核酸
【０２０９】
軽鎖の可変領域をコードする、配列番号２３〜２６を有する上述の核酸配列を本明細書中に報告する：
GATGTCCAGATGACCCAGTCTCCTGCTTTGGCTGTGTCTCCAGGAGAGAGGGTTTCCATCTCCTGTAGGGCCAGTGAAAGTGTCAGTACACTTATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCAACCCAAACTCCTCATCTACGGTACATCCAACCTAGAGTCTGGAGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATAGATCCTGTGGAGGCTGATGACACTGCAACCTATTTCTGTCAGCAGAGTTGGAATGATCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAGTGAAA
配列番号２３−可変軽鎖をコードする核酸
GATGTCCAGATGACCCAGTCTCCTGCTTTGGCTGTGTCTCCAGGAGAGAGGGTTTCCATCTCCTGTAGGGCCAGTGAAAGTGTCAGTACACTTATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCAACCCAAACTCCTCATCTACGGTACATCCAACCTAGAGTCTGGAGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATAGATCCTGTGGAGGCTGATGACACTGCAACCTATTTCTGTCAGCAGAGTTGGAATGATCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAATTGAAA
配列番号２４−可変軽鎖をコードする核酸
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCATTAGCACCCTGTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
配列番号２５−可変軽鎖をコードする核酸
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCGTGAGCACCCTGATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
配列番号２６−可変軽鎖をコードする核酸
【０２１０】
軽鎖の可変領域をコードする、配列番号９７〜９９を有する上述の核酸配列を本明細書中に報告する：
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCATTAGCACCCTGTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAACAGCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTTCTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
配列番号９７−可変軽鎖をコードする核酸
GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCGTGAGCACCCTGATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAACAGCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTTCTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
配列番号９８−可変軽鎖をコードする核酸
GACGTGCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCATTAGCACCCTGTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTTCTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA
配列番号９９−可変軽鎖をコードする核酸
【０２１１】
配列番号１８〜２２、９２〜９６に示す配列のうちの少なくとも１つと、配列番号２３〜２６、９７〜９９に示す配列のうちの少なくとも１つとを含む核酸は、本発明の範囲内にある。
【０２１２】
配列番号１８〜２２に示す配列のうちの少なくとも１つと、配列番号２３〜２６に示す配列のうちの少なくとも１つとを含む核酸配列の組合せが特に好ましい。核酸配列は、１つの単離した核酸分子内または２つの単離した核酸分子の組合せ中に存在し得る。
【０２１３】
好ましい実施形態では（ラット抗体ＢＭＫ−３Ｂ６−Ｅ４−Ｃ３）、前記単離した核酸分子は、重鎖の可変領域をコードする配列として配列番号１８の配列（配列番号１を有するアミノ酸配列をコードする）と、軽鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２３の配列（配列番号１０を有するアミノ酸配列をコードする）とを含む。
【０２１４】
別の好ましい実施形態では（キメラ抗体ｃｈ３Ｂ６）、前記単離した核酸分子は、重鎖の可変領域をコードする配列として配列番号１９の配列（配列番号１を有するアミノ酸配列をコードする）と、軽鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２４の配列（配列番号１１を有するアミノ酸配列をコードする）とを含む。
【０２１５】
重鎖の可変領域をコードする核酸配列が配列番号２０〜２２のいずれか１つに示す配列から選択され、抗体の軽鎖の可変領域をコードする核酸配列が配列番号２５〜２６のいずれか１つに示す配列から選択される、核酸配列の組合せが特に好ましい。核酸配列は、１つの単離した核酸分子内または２つの単離した核酸分子の組合せ中に存在し得る。
【０２１６】
好ましい実施形態では（ヒト抗体Ｈｕ３Ｂ６ａ）、前記単離した核酸分子は、重鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２０の配列（配列番号２を有するアミノ酸配列をコードする）と、軽鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２５の配列（配列番号１２を有するアミノ酸配列をコードする）とを含む。
【０２１７】
好ましい実施形態では（ヒト抗体Ｈｕ３Ｂ６ｄ）、前記単離した核酸分子は、重鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２０の配列（配列番号２を有するアミノ酸配列をコードする）と、軽鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２６の配列（配列番号１３を有するアミノ酸配列をコードする）とを含む。
【０２１８】
好ましい実施形態では（ヒト抗体Ｈｕ３Ｂ６ｂ）、前記単離した核酸分子は、重鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２１の配列（配列番号３を有するアミノ酸配列をコードする）と、軽鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２５の配列（配列番号１２を有するアミノ酸配列をコードする）とを含む。
【０２１９】
好ましい実施形態では（ヒト抗体Ｈｕ３Ｂ６ｅ）、前記単離した核酸分子は、重鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２１の配列（配列番号３を有するアミノ酸配列をコードする）と、軽鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２６の配列（配列番号１３を有するアミノ酸配列をコードする）とを含む。
【０２２０】
好ましい実施形態では（ヒト抗体Ｈｕ３Ｂ６ｃ）、前記単離した核酸分子は、重鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２２の配列（配列番号４を有するアミノ酸配列をコードする）と、軽鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２５の配列（配列番号１２を有するアミノ酸配列をコードする）とを含む。
【０２２１】
好ましい実施形態では（ヒト抗体Ｈｕ３Ｂ６ｆ）、前記単離した核酸分子は、重鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２２の配列（配列番号４を有するアミノ酸配列をコードする）と、軽鎖の可変領域をコードする配列として配列番号２６の配列（配列番号１３を有するアミノ酸配列をコードする）とを含む。
【０２２２】
さらなる実施形態では、前記単離した核酸は、どちらも可変領域および定常領域を含む、重鎖をコードする配列および軽鎖をコードする配列を含む。
【０２２３】
一実施形態では、前記単離した核酸はキメラ抗体を生成するためのものであり、以下に示すように、前記重鎖をコードする配列は配列番号２８の配列であり、軽鎖をコードする配列は配列番号３２の配列である：
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCCTAGTGCAGCCTGGAAGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCAGGATTCACTTTCAGTAATTATTACATGGCCTGGGTCCGCCAGGCTCCAAAGAAGGGTCTGGAGTGGGTCGCAACCATTAATCCCAGTGGTACCAGAACTTACTATCCAGACTCCGTGAAAGGCCGATTCACTCTCTCCAGAGATAGTGCAAAGAGCAGCCTATATCTGCAAATGAACAGTCTGAAGTCTGAGGACACGGCCACTTTTTACTGTGCAAGGCTTTATAACAACTACGCTTTTGATTACTGGGGCCAAGGAGTCATGGTCACTGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号２８−重鎖をコードする核酸
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGATGTCCAGATGACCCAGTCTCCTGCTTTGGCTGTGTCTCCAGGAGAGAGGGTTTCCATCTCCTGTAGGGCCAGTGAAAGTGTCAGTACACTTATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCAACCCAAACTCCTCATCTACGGTACATCCAACCTAGAGTCTGGAGTCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCAACATAGATCCTGTGGAGGCTGATGACACTGCAACCTATTTCTGTCAGCAGAGTTGGAATGATCCTCCGACGTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAATTGAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
配列番号３２−軽鎖をコードする核酸
【０２２４】
別の実施形態では、前記単離した核酸はヒト化抗体を生成するためのものであり、以下に示すように、前記重鎖をコードする配列は配列番号２９〜３１の配列から選択され、軽鎖をコードする配列は配列番号３３〜３４の配列から選択される：
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号２９−重鎖をコードする核酸
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCAACATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号３０−重鎖をコードする核酸
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTAGTAACTATTACATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCCACCATAAACCCTAGCGGAACCAGAACCTACTATCCAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAGCGCCAAGAGCTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGACTGTACAACAATTACGCCTTTGACTACTGGGGCCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGCGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
配列番号３１−重鎖をコードする核酸
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCATTAGCACCCTGTTACACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
配列番号３３−軽鎖をコードする核酸
ATGAATCTACTTCTGATCCTTACCTTTGTTGCGGCCGCTGTTGCGGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTGAGAGCGTGAGCACCCTGATGCACTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGGCACCTCCAACTTGGAGAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTGGAACGACCCTCCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTGA
配列番号３４−軽鎖をコードする核酸
【０２２５】
好ましくは、前記単離した核酸分子は、重鎖をコードする配列として配列番号２９の配列と、軽鎖をコードする配列として配列番号３３の配列とを含む。
【０２２６】
好ましくは、前記単離した核酸分子は、重鎖をコードする配列として配列番号３０の配列と、軽鎖をコードする配列として配列番号３３の配列とを含む。
【０２２７】
好ましくは、前記単離した核酸分子は、重鎖をコードする配列として配列番号３１の配列と、軽鎖をコードする配列として配列番号３３の配列とを含む。
【０２２８】
好ましくは、前記単離した核酸分子は、重鎖をコードする配列として配列番号２９の配列と、軽鎖をコードする配列として配列番号３４の配列とを含む。
【０２２９】
好ましくは、前記単離した核酸分子は、重鎖をコードする配列として配列番号３０の配列と、軽鎖をコードする配列として配列番号３４の配列とを含む。
【０２３０】
好ましくは、前記単離した核酸分子は、重鎖をコードする配列として配列番号３１の配列と、軽鎖をコードする配列として配列番号３４の配列とを含む。
【０２３１】
用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、たとえばSambrook et al., "Expression of cloned Genes in E. coli" in Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, USAに記載のように、標準化ハイブリダイゼーション条件下で２つの核酸断片が互いにハイブリダイズすることを意味する。そのような条件は、たとえば、６．０×ＳＳＣ（生理食塩水クエン酸ナトリウム）中、約４５℃でのハイブリダイゼーション、次いで２．０×ＳＳＣを用いた５０℃での洗浄工程、好ましくは２．０×ＳＳＣを用いて６５℃または０．２×ＳＳＣを用いて５０℃で、好ましくは０．２×ＳＳＣを用いた６５℃での洗浄工程である。ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションのさらなる例は、０．５ＭのＮａＨＰＯ４、７％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭのＥＤＴＡ中、６５℃での、フィルターに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーション、および０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、６８℃での洗浄である。（Ausubel FM et al. eds., 2003, Current Protocol in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & sons, Inc., New York, at p. 2.20.3）。
【０２３２】
コードされている抗体がその結合特異性を保持する条件で、上記開示した配列のいずれかと少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列は、依然として本発明の範囲内にある。
【０２３３】
特定には、配列番号１８〜２２の配列と少なくとも８０％の同一性を有する可変重鎖をコードするヌクレオチド配列および配列番号２３〜２６の配列と少なくとも８０％の同一性を有する可変軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、依然として本発明の範囲内にある。少なくとも８０％の同一性とは、８０〜１００％に含まれる、好ましくは９０、９５、または９９％のヌクレオチド同一性百分率を意味する。
【０２３４】
本発明の核酸分子は、複製起点および／または選択マーカー遺伝子をさらに含有し得るベクター上に位置していてよい。ベクターの例は、たとえば、プラスミド、コスミド、ファージ、ウイルスなどである。したがって、本発明のさらなる実施形態は、本明細書中に開示した核酸配列を含むベクターである。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。
【０２３５】
前記ベクターは、たとえば、ファージ、プラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスのベクターであり得る。
【０２３６】
レトロウイルスベクターは複製可能または複製欠損であり得る。後者の場合、ウイルスの増殖は一般に相補的宿主／細胞中でのみ起こる。
【０２３７】
本発明の核酸分子は、宿主中での増殖のために、選択マーカーを含有するベクターと連結させ得る。一般に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物もしくは塩化ルビジウム沈殿物などの沈殿物中、または荷電脂質との複合体中もしくはフラーレンなどの炭素系のクラスター中で導入する。ベクターがウイルスである場合は、宿主細胞に施用する前にインビトロで適切なパッケージング細胞系を使用してパッケージングし得る。
【０２３８】
好ましくは、本発明のベクターは発現ベクターであり、核酸分子は、原核および／または真核宿主細胞中での転写および適宜発現を可能にする、１つまたは複数の制御配列と作動可能に連結している。前記核酸分子の発現は、核酸分子の、好ましくは翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞中での発現を確実にする調節要素は当業者に周知である。これらは通常、転写開始を確実にする調節配列を含み、転写の終結および転写物の安定化を確実にするポリＡシグナルを含んでいてもよい。追加の調節要素には転写エンハンサーおよび翻訳エンハンサーが含まれ得る。原核宿主細胞中での発現を許可する、可能な調節要素は、たとえば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でのｌａｃ、ｔｒｐ、またはｔａｃプロモーターを含み、真核宿主細胞中での発現を許可する調節要素の例は、酵母中でのＡＯＸＩもしくはＧＡＬ−１プロモーター、または、哺乳動物および他の動物細胞中でのＣＭＶ（サイトメガロウイルス）−、ＳＶ４０（シミアンウイルス４０）−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサー、もしくはグロビンイントロンである。転写開始を司っている要素以外に、そのような調節要素は、ポリヌクレオチドの下流のＳＶ４０−ポリＡ部位またはｔｋ−ポリＡ部位などの転写終結シグナルも含み得る。このような状況において、適切な発現ベクターは、Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡ３、またはｐＳＰＯＲＴＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）など、当分野で知られている。好ましくは、前記ベクターは発現ベクターおよび／または遺伝子移入もしくは標的ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマウイルスなどに由来する発現ベクターを、本発明のポリヌクレオチドまたはベクターを標的細胞集団内にデリバリーするために使用し得る。当業者に周知の方法を使用して組換えウイルスベクターを構築することができる。たとえば、Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001, 3<rd>edition), N. Y.およびAusubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y. (1994)に記載の技法を参照されたい。あるいは、標的細胞へのデリバリーのために、本発明の核酸分子をリポソーム内に戻すことができる。さらに、本発明は、上述の核酸分子またはベクターを含む宿主をいう。核酸分子またはベクターは、当分野で知られている任意の方法に従って、形質転換、形質移入、または形質導入によって宿主内に導入し得る。
【０２３９】
前記宿主は、原核もしくは真核細胞または非ヒトトランスジェニック動物であり得る。宿主中に存在する本発明のポリヌクレオチドまたはベクターは、宿主のゲノム内に組み込まれたものであってよいか、または染色対外に維持されるものであってもよい。この点において、本発明の核酸分子を、突然変異遺伝子を修復するためまたは相同組換えによって突然変異遺伝子を作製するための「標的遺伝子組換え」および／または「遺伝子置換」に使用できることも理解されよう。たとえば、Mouellic, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 (1990), 4712-4716、Joyner, Gene Targeting, A Practical Approach, Oxford University Pressを参照されたい。
【０２４０】
宿主は、細菌、昆虫、真菌、植物、動物、哺乳動物、または好ましくはヒトの細胞など、任意の原核または真核細胞であることができる。好ましい真菌細胞は、たとえばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のもの、特定にはＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）種のものである。用語「原核」とは、本発明の変異体ポリペプチドを発現させるためにポリヌクレオチドを形質転換または形質移入できるすべての細菌が含まれることを意味する。原核宿主には、グラム陰性およびグラム陽性細菌、たとえば、Ｅ．コリ、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア・マルセセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、およびバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などが含まれ得る。当業者に一般的に知られている技法のうちの任意のものを使用して、本発明の変異体ポリペプチドの突然変異形態をコードするポリヌクレオチドを使用して宿主に形質転換または形質移入できる。融合された作動可能に連結された遺伝子を調製し、細菌または動物細胞中でそれらを発現させる方法は当分野で周知である（Sambrook, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001, 3<rd>edition)。それ中に記載されている遺伝子コンストラクトおよび方法を、たとえば原核宿主中における、本発明の変異抗体、抗体断片、またはその誘導体の発現に利用することができる。一般に、挿入された核酸分子の効率的な転写を促進するプロモーター配列を含有する発現ベクターを、宿主に関連して使用する。発現ベクターは、典型的には、複製起点、プロモーター、およびターミネーター、ならびに形質転換細胞の表現型選択を提供することができる特定の遺伝子を含有する。形質転換させた原核宿主は、最適な細胞成長を達成するために、当分野で知られている技法に従って、発酵槽内で成長させ、培養することができる。その後、本発明の抗体、抗体断片、またはその誘導体を成長培地、細胞溶解物、または細胞膜画分から単離することができる。微生物によってまたは他の方法によって発現させた本発明の抗体、抗体断片、またはその誘導体の単離および精製は、任意の慣用の手段、たとえば、調製用クロマトグラフィー分離、およびモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含むものなどの免疫学的分離などによるものであってよい。
【０２４１】
本発明の一実施形態によれば、宿主は、ヒト、細菌、動物、真菌、両生類、または植物の細胞である。好ましい動物細胞には、それだけには限定されないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎細胞（ＣＯＳ）、マウス胚性線維芽細胞（ＮＩＨ−３Ｔ３）、およびヒト細胞を含めたいくつかの他の細胞系が含まれる。
【０２４２】
別の好ましい実施形態では、前記動物細胞は昆虫細胞である。好ましい昆虫細胞には、それだけには限定されないが、ＳＦ９細胞系からの細胞が含まれる。
【０２４３】
好ましくは、細胞は哺乳動物細胞、たとえば、ハムスター、ウサギ、またはヒト細胞である。最も好ましくは、細胞はヒト細胞である。前記ヒト細胞には、それだけには限定されないが、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３、２９３Ｔ、２９３フリースタイル）が含まれる。さらに、前記ヒト細胞系には、それだけには限定されないが、ＨｅＬａ細胞、ヒト肝細胞癌細胞（たとえば、ＨＥＰＧ２、Ｈｕｈ−７）、Ａ５４９細胞が含まれる。別の実施形態によれば、本発明の宿主は非ヒトトランスジェニック動物である。本発明は、本発明の抗体を産生させるために使用し得る本発明の１つまたは複数の核酸分子を含むトランスジェニック非ヒト動物を提供する。抗体は、組織、または、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、もしくは他の哺乳動物の乳、血液、もしくは尿などの体液中で生成し、それから回収することができる。たとえば、米国特許第５，８２７，６９０号、第５，７５６，６８７号、第５，７５０，１７２号、および第５，７４１，９５７号を参照されたい。上述のように、ヒト免疫グロブリン座位を含む非ヒトトランスジェニック動物は、ＦＧＦＲ４またはその一部分を用いて免疫化することによって生成することができる。本発明の抗体は、本明細書中に上述したように前記抗体が宿主から得られる方法によって調製し得る。したがって、本発明のさらなる実施形態は、前記抗体の合成を可能にする条件下で本発明の宿主を培養し、前記抗体を前記培養物から回収することを含む、抗体を調製する方法である。
【０２４４】
形質転換させた宿主は、最適な細胞成長を達成するために、当分野で知られている技法に従って、発酵槽内で成長させ、培養することができる。発現された後、本発明の全抗体、その二量体、個々の軽鎖および重鎖、または他の免疫グロブリン形態を、硫安塩析、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含めた当分野の標準の手順に従って精製することができる。Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N. Y. (1982)を参照されたい。その後、本発明の抗体またはその対応する免疫グロブリン鎖を成長培地、細胞溶解物、または細胞膜画分から単離することができる。たとえば微生物によって発現させた本発明の抗体または免疫グロブリン鎖の単離および精製は、任意の慣用の手段、たとえば、調製用クロマトグラフィー分離、およびたとえば本発明の抗体の定常領域に向けられたモノクローナルまたはポリクローナル抗体の使用を含むものなどの免疫学的分離によるものであってよい。当業者には、本発明の抗体を、他の部分、たとえば、薬物ターゲッティングおよびイメージングの応用にさらにカップリングさせることができることが明らかであろう。そのようなカップリングは、抗体または抗原の発現後に、付着の側面で化学的に実施し得るか、またはカップリング産物をＤＮＡレベルで本発明の抗体または抗原内に操作し得る。その後、ＤＮＡを適切な宿主系で発現させ、発現されたタンパク質を収集し、必要な場合は再生する。
【０２４５】
一実施形態によれば、上述の組換え細胞を、抗体をコードする核酸分子の発現を可能にする条件下で培養する。抗体を培養細胞または培養上清から収集し得る。好ましくは、抗体は哺乳動物、特にヒト細胞から調製する。
【０２４６】
医薬組成物および医療処置
本発明のさらなる態様は、薬学的に許容される担体と適宜共に、上述の抗体、コンジュゲート、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、または宿主を含む医薬組成物に関する。
【０２４７】
用語「担体」には、用いる用量および濃度において、それに曝露させる細胞または哺乳動物に対して無毒性である薬剤、たとえば、希釈剤、安定化剤、アジュバント、または他の種類の賦形剤が含まれる。薬学的に許容される担体の例は当分野で周知であり、リン酸緩衝生理食塩水、水、油／水乳濁液などの乳濁液、様々な種類の湿潤剤、無菌的溶液などが含まれる。多くの場合、薬学的に許容される担体は、薬物デリバリー、特に抗体分子のデリバリーに有用なｐＨ緩衝水溶液である。医薬組成物は、周知の慣用の方法によって、すなわち、活性薬剤を、担体および適宜、通常配合物内に取り込ませる他の薬剤と混合することによって、配合し得る。たとえば、組成物を、凍結乾燥配合物、水溶液、分散体、または固形調製物の形態で配合し得る。適切な組成物の投与は、様々な方法によって、たとえば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、皮内、鼻腔内、または気管支内の投与によって達成し得る。また、本発明の組成物は、標的部位に直接、たとえば、微粒子銃デリバリーによって、脳などの外部または内部標的部位に投与してもよい。投薬レジメンは担当医および臨床学的因子によって決定される。
【０２４８】
また、本発明には、それを必要としている対象、特に、ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、および／または活動過剰に関連する障害を患っているヒト患者への医薬組成物の投与も包含される。
【０２４９】
医学分野では周知のように、いずれの患者の用量も、患者の大きさ、体表面および面積、年齢、投与する具体的な化合物、性別、投与の時間および経路、全体的な健康、ならびに同時に投与している他の薬物を含めた多くの要因に依存する。処置する状態の種類および重篤度に応じて、約１ｐｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇの活性成分を、それを必要としている患者に、たとえば１つもしくは複数の別々の投与によってまたは持続注入によって投与し得る。典型的な１日用量は、上述の要因に依存して、約１ｐｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。数日間以上にわたる繰返し投与では、処置する状態に応じて、疾患または症状の所望の抑制が起こるまで処置を持続させる。組成物は、任意の適切な経路によって、たとえば、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）、皮下、鼻腔内、血管内、静脈内、動脈内、またはくも膜下腔内の注射または輸液によって投与し得る。進行は定期評価によってモニタリングすることができる。
【０２５０】
本発明の組成物は、局所投与または全身投与し得る。非経口投与用の調製物には、無菌的な水溶液または非水溶液、懸濁液、および乳濁液が含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレン、グリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体には、生理食塩水および緩衝媒体を含めた、水、アルコール／水溶液、乳濁液、または懸濁液が含まれる。非経口用ビヒクルには、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル、または不揮発性油が含まれる。静脈内ビヒクルには、液体および栄養素補充液、電解質補充液（リンゲルデキストロースに基づくものなど）などが含まれる。また、たとえば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどの、保存料および他の添加剤も存在していてもよい。
【０２５１】
本発明による活性薬剤は他の活性薬剤と共に投与し得る。追加の活性薬剤は、別々に、または本発明の医薬組成物の一部として投与し得る。
【０２５２】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の医薬組成物は、医薬組成物の意図する使用に応じてさらなる薬剤を含み得る。
【０２５３】
医薬組成物が、たとえば、追加の抗新生物剤、小分子阻害剤、抗腫瘍剤、または化学療法剤などのさらなる活性薬剤を含むことが特に好ましい。また、本発明は、少なくとも１つのさらなる抗新生物剤と組み合わせた本発明の抗体を含む医薬組成物にも関する。そのような組合せは、たとえば異常細胞成長の阻害において有効である。
【０２５４】
多くの抗新生物剤が現在当分野で知られている。一実施形態では、抗新生物剤は、それだけには限定されないが、抗体または免疫調節性タンパク質を含めた治療的タンパク質の群から選択される。
【０２５５】
別の実施形態では、抗新生物剤は、有糸分裂阻害剤、キナーゼ阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、挿入抗体、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物学的応答調節物質、抗ホルモン、たとえば抗アンドロゲン、および抗血管形成剤からなる小分子阻害剤または化学療法剤の群から選択される。
【０２５６】
上述の追加の活性薬剤は、もちろん、共通の医薬組成物内で本発明の抗体と共に投与することができるだけでなく、これらを別々に投与することもできる。
【０２５７】
配合した後、本発明の組成物を対象に直接投与することができる。処置する対象は動物であることができ、特定にはヒト対象を処置することができる。
【０２５８】
本発明の医薬品は、それだけには限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、くも膜下腔内、脳室内、経真皮もしくは経皮施用、皮下、腹腔内、鼻腔内、経腸、局所、舌下、膣内、または直腸の手段を含めた、多数の経路によって投与し得る。
【０２５９】
これらの方法および配合物はすべて慣用かつ当分野で周知であり、さらなる説明は必要としない。
【０２６０】
さらに別の実施形態では、本発明は、患者組織または患者試料中のＦＧＦＲ４の量および／または局在化を決定することを含む診断方法に関する。この実施形態では、上述の標識基を保有する抗体を使用することが特に好ましい。患者組織または患者試料で得られた結果と参照データとの比較により、ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、および／または活動過剰に関連する疾患の診断が可能となる。本発明の診断方法は、様々な細胞、組織、または他の適切な試料中の、ヒトＦＧＦＲ４の望ましくない発現、過剰発現または活動過剰の検出に有用である。したがって、ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、および／または活動過剰に関連する疾患の発症または病状を評価することができる。また、本発明の診断方法には、得られた結果に基づいて患者の治療レジメンを確立する工程も含まれ得る。
【０２６１】
別の実施形態では、本発明は、本発明の抗体を、その表面上にＦＧＦＲ４を保有することが疑われる細胞または組織と接触させることを含む、ＦＧＦＲ４発現細胞の存在を評価する方法に関する。試料中のＦＧＦＲ４の発現を検出するための適切な方法は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）または免疫組織化学（ＩＨＣ）であり得る。ＥＬＩＳＡアッセイはマイクロタイタープレート様式で実施してよく、たとえば、マイクロタイタープレートのウェルに抗ＦＧＦＲ４抗体を吸着させる。ウェルをすすぎ、乳タンパク質またはアルブミンなどの遮断剤で処理して、分析物の非特異的吸着を防止する。続いて、ウェルを試験試料で処理する。試験試料または標準をすすぎ流した後、ウェルを、たとえばビオチンとのコンジュゲーションによって標識した、第２の抗ＦＧＦＲ４抗体で処理する。過剰な二次抗体を洗い流した後、たとえばアビジンとコンジュゲートさせた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）および適切な発色基質を用いて、標識を検出する。試験試料中のＦＧＦＲ４抗原の濃度は、標準試料から作成した検量線との比較によって決定する。ＩＨＣでは、パラフィン包埋した組織を使用してよく、組織を、たとえば最初にキシレンで脱パラフィンし、その後、たとえばエタノールで脱水し、蒸留水ですすぐ。ホルマリン固定およびパラフィン包埋によってマスキングされていた抗原エピトープは、エピトープアンマスキング、酵素消化、またはサポニンによって露出し得る。エピトープアンマスキングには、パラフィン切片を、スチーマー、水浴、または電子レンジで２０〜４０分間、エピトープ回復溶液、たとえば２ＮのＨＣＬ溶液（ｐＨ１．０）中で加熱し得る。酵素消化の場合、組織切片を３７℃で１０３０分間、プロテイナーゼＫ、トリプシン、プロナーゼ、ペプシンなどの様々な酵素溶液中でインキュベートし得る。エピトープ回復溶液または過剰な酵素をすすぎ流した後、組織切片を遮断緩衝液で処理して非特異的相互作用を防止する。一次抗ＦＧＦＲ４抗体を適切な濃度で加える。過剰な一次抗体をすすぎ流し、切片をペルオキシダーゼ遮断溶液中で１０分間、室温インキュベートする。もう１回の洗浄工程の後、組織切片を二次標識抗体、たとえば酵素のアンカーとして役割を果たし得る基で標識したものと共にインキュベートする。したがって、例は、ストレプトアビジンとカップリングさせた西洋ワサビペルオキシダーゼによって認識される、ビオチン標識した二次抗体である。抗体／酵素複合体の検出は、適切な発色基質と共にインキュベートすることによって達成される。
【０２６２】
追加の実施形態では、本発明は、抗体がＦＧＦＲ４機能を遮断することができる条件下で、本発明の抗体を、その表面上にＦＧＦＲ４を保有することが疑われる細胞または組織と接触させることを含む、ＦＧＦＲ４機能を遮断する方法に関する。接触はインビトロまたはインビボであり得る。
【０２６３】
さらに、本発明は、ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、および／または活動過剰に関連する疾患を診断または処置するためのキットに関する。本発明のキットは、上述の少なくとも１つの抗体、核酸分子、および／またはベクターを含む。さらに、キットは、少なくとも１つの他の活性薬剤またはさらなる構成成分をさらに含み得る。キットが、がんの組合せ療法に有用な１つまたは複数のさらなる治療剤、たとえば、追加の抗新生物剤、小分子阻害剤、抗腫瘍剤、または化学療法剤などをさらに含むことが特に好ましい。多くの抗新生物剤が現在当分野で知られている。一実施形態では、抗新生物剤は、それだけには限定されないが、抗体または免疫調節性タンパク質を含めた治療的タンパク質の群から選択される。別の実施形態では、抗新生物剤は、有糸分裂阻害剤、チロシン（ｔｙｒｏｓｉｎ）キナーゼ阻害剤などのキナーゼ阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗剤、挿入抗体、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物学的応答調節物質、抗ホルモン、たとえば抗アンドロゲン、および抗血管形成剤からなる、小分子阻害剤または化学療法剤の群から選択される。
【０２６４】
本発明の診断キットは、好ましくは、本明細書中に上述した標識抗体を含む。さらに、診断キットは、同じ種類の組織または試料中のＦＧＦＲ４の量および／または局在化に関する参照データを含み得る。参照データは、１人または複数人の健康な対象および／または１人または複数人の既知の症状を有する対象から得られ得る。前記参照データとの比較により、ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、および／または活動過剰に関連する疾患の診断が可能となる。得られた結果に基づいて、患者の治療レジメンを確立し得る。
【０２６５】
本発明の別の目的は、ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、および／または活動過剰に関連する疾患の防止および／または処置に使用するための、本発明の抗体である。
【０２６６】
本発明によれば、ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、および／または活動過剰に関連する疾患は、たとえばがんなどの過剰増殖性疾患である。本発明に従って診断、防止、および／または処置することができるがんは、肝細胞癌、乳がん、胃がん、結腸がん、横紋筋肉腫、結腸直腸がん、前立腺がん、乳がん、下垂体がん、卵巣がん、軟組織肉腫、黒色腫、頭頸部扁平上皮癌、および肺腺癌、ならびに他のＦＧＦＲ４を発現または過剰発現するがんおよび腫瘍転移の形成からなる群から選択され得る。
【０２６７】
当業者は、当分野の一般知識に従って、疾患がＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、または活動過剰に関連しているかどうかを容易に同定することができる。
【０２６８】
たとえば導入部で引用した参考文献を参照することができる（たとえば、Lin & Desnoyers, 2012、Wu & Li, 2012、Katoh & Nakagama, 2014、Crose et al., 2012、Li et al. 2014、Sahadevan et al., 2007、Andre & Cortes, 2015、Abbass et al., 1997、Huang et al., 2015、Chen H et al., 2015、Zaid et al., 2013）。
【０２６９】
本発明の特定の実施形態によれば、本明細書中に開示した抗体は、結腸がんの処置、特定には結腸がん幹細胞を致死させる、またはその成長および／もしくは分化に実質的な影響を与えるために使用するものである。
【０２７０】
本発明の別の特定の実施形態によれば、本明細書中に開示した抗体は、肝臓がんを処置するために使用するものである。
【０２７１】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、結腸がん、特定には結腸がん幹細胞を特異的に標的化するために使用するものである。
【０２７２】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、結腸がん幹細胞を、検出する、および／または致死させる、および／またはその発生および／または分化に影響を与える、および／または阻害するために使用するものである。
【０２７３】
別の実施形態によれば、ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、および／または活動過剰に関連する疾患は、代謝性疾患、特定には代謝症候群または肥満症である。
【０２７４】
本発明のよりさらなる実施形態によれば、ＦＧＦＲ４の発現、過剰発現、および／または活動過剰に関連する疾患は、心室肥大、心肥大、または慢性腎臓病である。
【０２７５】
慢性腎臓病（ＣＫＤ）は時期尚早の死の危険性を増加させ、心血管病がＣＫＤのすべての段階の主な原因である（Go et al. N. Engl. J. Med., 351(13):1296-1305, 2004）。左心室肥大（ＬＶＨ）はＣＫＤにおける心血管病の重要な機構であり、拡張機能障害、鬱血性心不全、不整脈（ａｒｈｙｔｈｍｉａ）、および突然死に寄与する。ＬＶＨにおけるその役割が理由で、ＦＧＦＲ４の阻害が心血管病の防止に有益であることが知られている（たとえば、ＵＳ２０１６００３９９３６号およびそれ中に引用されている参考文献を参照）。
【０２７６】
したがって、特定には心細胞（たとえば、筋細胞、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞）における、ＦＧＦＲ４の活性化を阻害するための本発明の抗体の使用を含む、対象における心血管病（たとえば、原発性心疾患、二次心疾患、心肥大、心不全、左心室肥大）、ＣＫＤ、糖尿病、肥満症の処置または防止も、本発明の範囲内にある。具体的な実施形態では、心血管病は、高血圧、鬱血性心不全、左心室肥大、尿毒症性心筋症、糖尿病性心筋症、または原発性心筋症である。
【０２７７】
以下の実施例は本発明をさらに例示する。
【実施例１】
【０２７８】
結腸がん幹細胞内で選択的に発現される膜タンパク質をコードする遺伝子の生物情報学的同定
新規結腸がん幹細胞（ＣＳＣ）膜抗原を同定するために、専売のＣＳＣ特異的Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイを探索し、利用可能な公的発現データベースの相互クエリーを行うことによって、コンピュータ分析を行った。
【０２７９】
この分析は、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを補充した規定無血清培地中で球状体として増殖させた、またはインビトロで１０％の血清の存在下にて分化させた原発性腫瘍試料および転移から単離した８個の結腸ＣＳＣ系統から得られたデータが含まれる、ゲノムワイド遺伝子発現データバンク（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘマイクロアレイ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  １．０  ＳＴプラットフォーム）の利用可能性を利用した（Ricci-Vitiani et al., 2007）。このデータセットは２６９１７個の異なるヒト遺伝子の明確なプローブ組を含有する。
【０２８０】
潜在的な標的遺伝子のリストを定義するために、以下の全体的なワークフローを採用した。参照結腸ＣＳＣデータセットを使用して、そのインビトロの分化した対応物と比較して未分化結腸ＣＳＣにおいて示差的に上方調節された最初の遺伝子リスト（１３２５）を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ＲａｎｋＰｒｏｄアルゴリズム（Hong et al., 2006 & 2008）を使用して作成した。統計的に有意な示差的発現（ｐ値≦０．１）を有する遺伝子のみが含められた。その後、２つの異なる情報源（http://www.uniprot.org/およびSallman Almen et al., 2009）に従って、標的遺伝子リストを２５０個のエントリーまで減らし、潜在的な膜貫通タンパク質またはグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカータンパク質をコードする遺伝子と注釈をつけた。この遺伝子リスト内で、未分化細胞試料における上方制御レベルは一般に低く、多くの場合は、遺伝子が生物学的競争において上方調節されたと認められる最小限度であるとみなされる値＜２であったことが明らかであって。したがって、追加の優先順位決定戦略として、ＣＳＣ特異性に向かうさらなる選択基準として未分化結腸ＣＳＣ試料を結腸正常組織試料、結腸腫瘍組織試料、および市販の腫瘍細胞系試料と比較した。
【０２８１】
公的な遺伝子発現データ所蔵庫（ＮＣＢＩ  ＧＥＯおよびＥＢＩ  ＡｒｒａｙＥｘｐｒｅｓｓ）を、ヒト結腸組織試料（正常もしくは腫瘍）を含有するデータセットまたは市販の結腸がん細胞系のデータについて検索した。見つかったデータセットの初期検査により、同じマイクロアレイプラットフォーム（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  ＳＴ  １．０）または密に関連するプラットフォームＨｕｍａｎ  Ｅｘｏｎ  ＳＴ  １．０に基づくものは非常にわずかであったことが明らかとなった。特定には、正常または腫瘍の結腸試料を含有するデータセットの大多数がＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォームＵ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０に基づいていた。したがって、結腸ＣＳＣとの比較の基本として、Ｕ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０プラットフォームデータも含めることが必要であった。利用可能なデータを作成するために使用した腫瘍試料の正確な解剖学的位置決定（利用可能な場合）に関して、サブ選択は行わなかった。腫瘍の分類には、すべての同定可能な腺腫試料または他の明白に異なる試料、たとえば炎症性腸疾患患者からの試料は排除して、癌腫試料のみを受け入れた（表４）。
【０２８２】
表４．本分析に含まれる公的ＮＣＢＩ  ＧＥＯデータベース内のデータセット
【表４】
2020537490.tif 000029
【０２８３】
全体で、グローバルデータセットは、合計で２００個の正常試料［そのうち２０個はレーザーキャプチャー顕微解剖切片（ＬＣＭ）によって得られた］、１６個の異なるデータセットからの１１００個の腫瘍試料（そのうち８７個はＬＣＭによって得られた）、および８個の異なるデータセットからの１４５個の結腸腫瘍細胞系試料（７４個のユニークな細胞系）を含んでいた。さらに、ヒトの正常および腫瘍の幹細胞試料を含有する６個の追加のデータセットも含めた。２つのデータセットのみが参照結腸ＣＳＣデータセットとして同じマイクロアレイ構造（ＨｕＧｅｎｅ  ＳＴ  １．０）を有しており、すべての他のデータセットはＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０プラットフォームに基づいていた。すべてのデータセットの生の発現データファイルをＮＣＢＩウェブサイト「遺伝子発現オムニバス（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ）」（ＧＥＯ）（）からダウンロードし、標準の「ロバストマルチアレイ平均（Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｅ」（ＲＭＡ）手順を用いて、Ｒ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒプログラムスイート内で利用可能な方法を使用して処理した（Gentleman et al., 2004、http://www.bioconductor.org/、http://www.r-project.org/）。
【０２８４】
２つの異なるマイクロアレイプラットフォームを使用することから生じる技術的効果を補正するために、以下の戦略を適用した。正常および腫瘍の結腸データセット内のデータを最初にＣｏｍＢａｔアルゴリズム（Johnson & Rabinovic, 2007）で前処理し、明白なバッチ効果を補正した。同じ手順を結腸腫瘍細胞系データセットに適用した。その後、全体的な合わせたデータセットに適用した第２のＣｏｍＢａｔ補正により、２つの異なるマイクロアレイ構造が原因のバイアスを取り除いた。
【０２８５】
正常および腫瘍の結腸データセット中に存在する試料が多数であるため、前処理中に選択手順を適用して、全データ数を減らして正常および腫瘍の結腸試料の数をほぼ同数にした。試料間の平均中央値距離に基づいて、選択手順により、所望数の残りの試料に達するまで試料クラスター（正常または腫瘍）の中央から最も遠い試料を取り除くことに成功した。この手順を適用して、１０５個の正常試料および１７６個の腫瘍試料を副選択した。同等の手順により、データセットＧＳＥ１８１０５内のＬＣＭ試料の数を７７個から１９個まで減らした。その代わりに、データセットＧＳＥ２０９１６からのＬＣＭ試料には選択を適用しなかった。
【０２８６】
また、ＣｏｍＢａｔアルゴリズムはバッチ効果を排除するためにも結腸腫瘍細胞系データに適用した（示さず）。
【０２８７】
その後、これらのバッチ補正したサブデータセットを参照結腸ＣＳＣデータセット（未分化試料のみ）と合わせ、追加の６個の幹細胞関連のデータセットも加えた。特定には、データセットＧＳＥ３３１１２（結腸ＣＳＣ培養試料）は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０プラットフォームで測定し、参照ＣＳＣ試料に密に関連する試料を提供したため、その追加は必須であった。これにより、ＣｏｍＢａｔを最終のグローバルスケールの工程として適用し、２つのＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプラットフォーム（ＨｕＧｅｎｅ  ＳＴ  １．０およびＵ１３３  ｐｌｕｓ  ２．０）間の構造に特異的な差異を補正することが可能となった。ＣｏｍＢａｔ補正を適用する前、グローバルデータセットはマイクロアレイプラットフォームに特異的な試料クラスタリングの明白なパターンを示していた。ＣｏｍＢａｔ補正の後、この効果は強く減じられ、この時点で結腸ＣＳＣ試料はＧＳＥ３３１１２からの同等の試料の近くにクラスタリングされていた。
【０２８８】
その後、グローバルデータセット内で、アルゴリズムＲａｎｋＰｒｏｄを使用して、未分化ＣＳＣ試料を様々なサブセット、すなわち、巨視解剖した結腸正常および腫瘍のデータセット、顕微解剖した結腸正常および腫瘍のデータセット、ならびに結腸腫瘍細胞系データセットと比較した。結腸ＣＳＣ試料とそれぞれのデータセットとの間の平均の変化の倍数（ＦＣ）の差異は、ＲａｎｋＰｒｏｄによってｐ値カットオフ０．０５で計算した。このｐ値カットオフを超えるプローブ組／遺伝子にはＦＣ値を割り当てなかった。
【０２８９】
その後、正常な結腸データセットに対して正のＦＣ差異が観察された遺伝子のみを受け入れることによって、潜在的な標的遺伝子の数をさらに減らした。その後、生じる１０４個の遺伝子のリストを詳細に検査して（膜局在化の予測および文献データ）、膜貫通またはＧＰＩアンカー血漿膜タンパク質としてのその状態を確認または拒否し、したがって選択を５７個の遺伝子に限定した。その後、これらの潜在的な標的を個々に分析し、以下の基準に従って優先順位を決定した：（ｉ）結腸腫瘍組織および細胞系に対してＦＣの差異≧２（ｐ≦０．０５）、（ｉｉ）「ＢｉｏＧＰＳ」（http://biogps.org/）およびＮＣＢＩ  ＧＥＯ所蔵庫内の「Ｂｏｄｙ  Ａｔｌａｓ」データセットＧＳＥ１４９３８（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc =GSE14938）から抽出したデータとの比較による、対応する抗体の潜在的な毒性の予測に関連する、重要臓器に由来する正常組織中での非存在／低発現、（ｉｉｉ）それぞれの遺伝子産物について、選択的スプライシングまたは短い細胞外ドメインの脱硫によって作製された可溶性タンパク質変異体の非存在、（ｉｖ）２つのオンライン情報源（http://www.uniprot.org/、http://www.genecards.org/、http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）および科学出版物に基づいた、様々な腫瘍型におけるそれぞれの遺伝子産物の生物学的機能、関連するシグナル伝達経路、タンパク質相互作用ネットワーク、ならびに発現および役割。いくつかの追加の免疫学的基準により、免疫原性が乏しいものに類似のタンパク質をコードする遺伝子、または異所性の低発現を有する遺伝子、またはヒトパラログおよびネズミ相同分子種に類似しすぎている遺伝子のカウンタースクリーニングがもたらされ、したがって２１個の候補遺伝子の限定されたリストが生じた。
【実施例２】
【０２９０】
結腸ＣＳＣにおける選択された遺伝子発現の特異性の確認
２１個の選択された遺伝子の示差的発現がｑＲＴ−ＰＣＲによって確認および定量された。マイクロアレイデータを作成するために使用した８個の異なる結腸ＣＳＣ系統を、ＥＧＦおよびｂＦＧＦを補充した規定無血清培地中で球状体として増殖させた。比較のために、生物情報学的分析に使用したデータセットに含められたものから選択された１１個の異なる市販の結腸腫瘍細胞系（ＡＴＣＣ）を、ＡＴＣＣの推奨に従って培養した（表５）。
【０２９１】
表５．ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した結腸腫瘍細胞系。
【表５】
2020537490.tif 000030
【０２９２】
ＲＮＡｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造者の推奨に従って、全ＲＮＡを調製した。ＲＮＡ試料を、ＲＮａｓｅを含まない水中で収集し、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＢｉｏＰｈｏｔｏｍｅｔｅｒを使用して２６０ｎｍでの吸光度を測定し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００生物分析機を使用して定性的に制御することによって定量した。それぞれの選択された遺伝子のｍＲＮＡレベルを、未分化ＣＳＣ中および結腸腫瘍細胞系中、定量的逆転写ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって比較した。さらに、結腸ＣＳＣにおける２１個の選択された遺伝子の発現を、ヒト正常な結腸組織からのＲＮＡ試料においてｑＲＴ−ＰＣＲによって測定されたものと比較した（ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅヒト結腸全ＲＮＡ（Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｌｏｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ）、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。
【０２９３】
２つの結腸ＣＳＣ特異的マーカー、ＯＬＦＭ−４およびＬｇｒ５（van der Flier et al., 2009、Barker et al. 2007）も陽性対照として含めた。それぞれグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）およびヘテロ核リボ核タンパク質Ｋ（ＨＮＲＮＰＫ）をコードする、分析した細胞系においてその発現に有意なばらつきがない２つの遺伝子は（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘデータセット）を、正規化群として含めた。アッセイは、３つ組で、ＭｉｃｒｏＡｍｐ９６ウェルプレート中、遺伝子特異的プローブおよびプライマー（ＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子発現アッセイ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙｓ）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して行った。４０ｕＬの反応ミックスを、２５ｕＬの２×マスターミックス（Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）／０．５ｕＬの１００×ＲＴ（Ｑｉａｇｅｎ）、２．５ｕＬのそれぞれのＴａｑＭａｎアッセイ、および１２ｕＬのＨ２Ｏを含有するそれぞれのウェルに分注した。その後、５ｎｇ／ｕＬの濃度の全ＲＮＡ１０ｕＬを最終反応容量５０ｕＬで加え、ｑＲＴ−ＰＣＲを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＡＢＩ  ７９００  ＨＴリアルタイムサーマルサイクラー（５０℃で３０分間、９５℃で１０分間、次いで、４０サイクルの９５℃で１５秒間、６０℃で１分間）を使用して行った。定量的計算２＾（−ΔΔｃ−ｔ）方法を使用して行った。
【０２９４】
上位８個のｑＲＴ−ＰＣＲで妥当性確認した遺伝子（正常な結腸および少なくとも３個の独立したＣＳＣ系統における少なくとも４個の異なる腫瘍細胞系を超える、≧３倍のＣＳＣ選択性）を、その予測される免疫原性に基づいて５個まで減らした（表６）。
【０２９５】
表６．遺伝子的免疫化について選択された結腸がん幹細胞候補抗原。
【表６】
2020537490.tif 000031
【０２９６】
完全な選択プロセスを図１に要約する。
【０２９７】
５つの選択された遺伝子の結腸ＣＳＣにおける優先的な発現をタンパク質レベルで確認するために、追加の実験を行った。
【０２９８】
全タンパク質抽出物を、高いｍＲＮＡレベルのそれぞれの遺伝子を発現する結腸ＣＳＣ系統および低いｍＲＮＡレベルの同じ遺伝子を発現するＡＴＣＣ結腸腫瘍細胞系から調製した。さらに、タンパク質抽出物をヒト正常な結腸粘膜から調製した。その後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって分析した（図２）。この分析により、タンパク質レベルでも、その示差的ｍＲＮＡ発現レベルに基づいて選択された５つの遺伝子の、ＣＳＣにおける優先的な発現が確認された。
【実施例３】
【０２９９】
結腸ＣＳＣ膜抗原に対するモノクローナル抗体の作製
５つの選択された抗原に対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、対応するＤＮＡコード配列を使用してタンパク質標的に対する抗体を直接開発することを可能にする、Ａｌｄｅｖｒｏｎ／ＧＥＮＯＶＡＣコア技術プラットフォームを使用して、ラットの遺伝子的免疫化を行うことによって作製した（http://www.aldevron.com/services/antibody-development/genetic-immunization、たとえば以下の参考文献、すなわち、Bioprocessing - Genetic Immunization for Antibody Production. Tutorial: Genovac's Technological Shortcut From Gene to Antibody. By John Thompson, Ph.D., and Stefan Lang, Ph.D., published in Genetic Engineering News, Vol. 22, No. 17, October 1, 2002、Custom-made antibodies produced by genetic immunisation: Applications in drug development, therapy and diagnosis. By Stefan Lang and John Thompson, published in Global Outsourcing Review, Vol. 5, No. 1, Spring 2003、A shortcut from genomics to drug development. By Jens Lohrmann, Stefan Lang and John Thompson, published in Current Drug Discovery, October 2003を参照されたい）。遺伝子的免疫化は、慣用の免疫化技法と比較していくつか利点を有しており、これは特に、正しく折り畳まれグリコシル化された抗原、または特異的抗原ドメインの発現が、高い親和性および機能的活性に対して高い性向でネイティブエピトープを認識するｍＡｂが作製される確率を高めるためである。
【０３００】
標的ｃＤＮＡ配列を、細胞表面での対応するタンパク質の異所性発現が確実となるように操作された、Ａｌｄｅｖｒｏｎ（ドイツＦｒｅｉｂｕｒｇ）の専売免疫化ベクター（ｐＢ８−ＨＡ）および検出ベクター（ｐＢ１−ｍｙｃ）内に、それぞれ赤血球凝集素（ＨＡ）タグおよびｍｙｃタグと共にインフレームでクローニングした。ＦＧＦＲ４、ＩＬ１７ＲＢ、およびＲＧＭＢでは、コンストラクトは完全長配列を含有していた一方で、ＥＤＡＲおよびＯＲ５１Ｅ１では、異なる細胞外ドメインを挿入した。
【０３０１】
ＨＥＫ２９３誘導体ＢＯＳＣ２３細胞を、選択された抗原発現ベクター（ｐＢ８−ＨＡまたはｐＢ１−ｍｙｃ誘導体のどちらか）および内部陰性対照として同等の空ベクターを用いて、一過的に同時形質移入させた。抗ＨＡ抗体および抗ｍｙｃ抗体の両方を用いたＦＡＣＳ分析により、５つの抗原すべてについて有意で特異的な形質膜発現が確認された。
【０３０２】
免疫化ベクターｐＢ８−ＦＧＦＲ４、ｐＢ８−ＩＬ１７ＲＢ、ｐＢ８−ＲＧＭＢ、ｐＢ８−ＥＤＡＲ−ｈ−ｅｃｄ  ｐＢ８−ＥＤＡＲ−ｈ−ｅｃｄ＋ＴＭ、またはｐＢ８−ＯＲ５１Ｅ１−ｈ−ｓｙｎを用いて、金粒子上に吸着させた対応するＤＮＡの４〜６回の遺伝子施用を行い、生きた動物の細胞内への直接デリバリーのために皮内投与して、ラットを免疫化した。この手順が免疫応答を誘発したかどうかを制御するために、ラット血清を免疫化の２４〜６０日後に収集し、ＰＢＳ／１％のＢＳＡで１：１０００に希釈し、ＦＡＣＳによって、ｐＢ１−ｍｙｃ検出ベクター中でクローニングした対応する抗原ｃＤＮＡを用いて一過的に形質移入させたＢＯＳＣ２３細胞を使用して、試験した。ヤギ抗ラットＩｇＧ  Ｒ−フィコエリスリンコンジュゲート（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１０μｇ／ｍＬで二次抗体として使用した。陰性対照として、同じ発現ベクター中でクローニングした無関係のｃＤＮＡを用いて形質移入させたＢＯＳＣ２３細胞をそれぞれの動物の免疫血清と共にインキュベートし、ＦＡＣＳ分析に供した。さらに、抗ｍｙｃ一次抗体およびヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｒ−フィコエリスリンコンジュゲート（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を１０μｇ／ｍＬで二次抗体として使用して、検出ベクターｐＢ１−ＦＧＦＲ４、ｐＢ１−ＩＬ１７ＲＢ、ｐＢ１−ＲＧＭＢ、ｐＢ１−ＥＤＡＲ−ｈ−ｅｃｄ  ｐＢ１−ＥＤＡＲ−ｈ−ｅｃｄ＋ＴＭ、またはｐＢ１−ＯＲ５１Ｅ１−ｈ−ｓｙｎの細胞表面発現をＦＡＣＳによって制御した。
【０３０３】
様々な抗原で免疫化したラットのすべてのコホートの免疫血清の特異的反応性は、無関係のｃＤＮＡで形質移入させた細胞と比較した場合に、その表面に対応する抗原を発現している細胞に対して検出することができる。様々な抗原の形質膜発現は平行実験で確認された（データ示さず）。
【０３０４】
次の工程は、それぞれの抗原に対して免疫応答性のラットから脾臓Ｂ細胞を単離し、適切な骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを作製することからなっていた。ハイブリドーマの選択およびクローン増殖の後、適切な特異性を有する抗体を産生するものを、ｐＢ１抗原をコードするコンストラクトを用いて一過的に形質移入させたレポーター細胞系ＢＯＳＣ  ２３の表面上に異所的に発現されるその抗原に対する、対応する上清の免疫反応性のフローサイトメトリー評価によって同定した（表７）。
【０３０５】
表７．様々な抗原を発現するｐＢ８免疫化ベクターで免疫化したラットから採取したリンパ球との融合体の収率。
【表７】
2020537490.tif 000032
【０３０６】
単離したハイブリドーマ安定親クローンから、ＦＡＣＳ分析に従って陽性および抗原特異的の結果をもたらした抗体を含有する上清が得られた（１４〜２４個／標的、表７の最終列）。
【実施例４】
【０３０７】
結腸ＣＳＣ内在性抗原に対する対応する上清免疫反応性のフローサイトメトリー評価によるハイブリドーマ親クローンの選択
５つの抗原に対する陽性上清を、５つの異なる細胞系に対するその免疫反応性をＦＡＣＳによって評価することによって、結腸ＣＳＣ表面と結合するその能力について分析した。対応する転写物の発現が低い市販の結腸腫瘍細胞系を、それぞれの抗原について陰性対照として含めた。アッセイは、９６ウェルマイクロプレート中、３×１０４個の細胞／ウェルで、１００ｕＬの試験した上清を加えた５０ｕＬの細胞培地中で行った。ハイブリドーマで使用したネズミ骨髄腫細胞の馴化培地（ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ）を陰性対照として含めた。４℃で１時間後、抗ラット蛍光二次抗体（Ａｌｅｘａ  ＦｌｕｏｒＲ  ６４７ヤギ抗ラットＩｇＧ［Ｈ＋Ｌ］、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、細胞生存度を制御するために細胞を５ｕｇ／ｍＬの７−アミノアクチノマイシン（ａｍｉｎｏａｃｔｉｎｏｍｉｃｉｎ）Ｄ（７−ＡＡＤ）で処理した。二次抗体のみとインキュベートした試料も追加の陰性対照として含めた。フローサイトメトリー評価は細胞蛍光計ＦＡＣＳ  ＬＳＲ  ＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して行った。
【０３０８】
ほとんどの場合、結腸ＣＳＣと市販の結腸腫瘍細胞系との間の選択された抗原のｍＲＮＡ発現の差異はタンパク質レベルで確認された。
【０３０９】
ＦＡＣＳによって分析した５つの結腸ＣＳＣ系統のそれぞれについて（Signore et al., 2016）、生細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を評価パラメータとして使用した。それぞれの上清について、この値を陰性対照のＭＦＩで除算することによって、対照に対する変化の倍数（ＦＣ）値が得られた。それぞれのＣＳＣ系統について、上清を、そのＦＣ値に従ってランク付けし、最も高い反応性を有する上清に最も高いスコアを割り当てた。それぞれのＣＳＣ系統上のそれぞれの上清に割り当てられた評点を加算することによって、最終ランクが得られた（図３）。
【０３１０】
このことに基づいて、最もパフォーマンスの良い上清の優先順位を決定した（５〜１２個／抗原、図３）、タンパク質Ｇ−セファロース上で親和性精製し、５つの結腸ＣＳＣ系統に対する細胞生存度アッセイにおいて分析した。
【０３１１】
親和性精製では、５ｍＬのそれぞれの上清を、２時間、室温（ＲＴ）で、０．５ｍＬのタンパク質Ｇ−セファロース樹脂（ＧａｍｍａＢｉｎｄ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ＧＥ）と共に、０．１Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０、１．５ＭのＮａＣｌ、０．１ＭのＥＤＴＡ（１×ＢＢ）中でインキュベートした。結合工程の後、試料を空のクロマトグラフィーカラム（Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐ（商標）カラム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移し、樹脂を重力によって落ち着かせ、２０倍容量の１×ＢＢで洗浄した。結合した抗体を、それぞれ１ｍＬの０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．３を用いて２工程で溶出させ、ｐＨ中和のために１００ｕＬの１Ｍのトリス、ｐＨ９を含有するチューブ中に収集した。その後、精製したｍＡｂをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって定量および制御した。
【０３１２】
精製したｍＡｂを、それぞれの抗体について２〜４個の結腸ＣＳＣを用いて行った細胞生存度アッセイにおいて評価した。手短に述べると、細胞球状体の酵素的脱凝集の後、４０００個の生きた単個細胞を、９６ウェルマイクロプレートのそれぞれのウェルに、１００ｕＬの培養培地中、３つ組で播いた。２４時間、３７℃、５％のＣＯ２でのインキュベーションの後、１０ｕＬのそれぞれの抗体溶液またはトリス−グリシン、ｐＨ７中の１：５〜１：１０希釈液を加えた。トリス−グリシン、ｐＨ７中に３０ｕｇ／ｍＬのラットＩｇＧ溶液１０ｕＬを陰性対照として含めた。抗体と共に９６時間、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベーションした後、化学発光性ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）試薬を使用して、製造者の推奨に従って、細胞生存度を測定した。マイクロプレートリーダーＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＴＸ  ８８０マルチ検出器（Ｍｕｌｔｉｄｅｔｅｃｔｏｒ）を使用して、細胞ＡＴＰ含有量、したがって細胞生存度に比例するルミネセント強度を測定した。
【０３１３】
２〜８個の抗体／抗原が抗増殖／細胞毒性活性を示し、最も有効なものを対応するハイブリドーマのサブクローニングに選択した（最大で４つのサブクローン／抗原）。
【実施例５】
【０３１４】
選択されたハイブリドーマサブクローンから得られた上清から精製した抗体の特徴づけ
それぞれの抗原に対して最高の特異的抗体を産生する４つの親ハイブリドーマを、細胞系の安定性およびモノクローナル特徴を維持するためにサブクローニングした。
【０３１５】
安定したサブクローン培養物によって産生された抗体の陽性の評価は、実施例３に記載のように、ＢＯＳＣ  ２３レポーター細胞系の表面上に異所的に発現される抗原に対するその免疫反応性のＦＡＣＳ分析によって行った。
【０３１６】
このことに基づいて、３〜４つのサブクローンを抗原ＦＧＦＲ４、ＩＬ１７ＲＢ、ＲＧＭＢ、およびＥＤＡＲのそれぞれについて選択した一方で、５つ目の抗原ＯＲ５１Ｅ１では、サブクローン上清は細胞外ドメイン（免疫化に使用）に対してのみ反応性を示し、完全長タンパク質に対しては示さず、したがって取り置いた（表８）。
【０３１７】
表８．陽性サブクローン
【表８】
2020537490.tif 000033
【０３１８】
対応するモノクローナル抗体を、２００ｍＬの１３個の陽性上清のそれぞれ（無血清培地中）から、タンパク質Ｇ−セファロース高速アフィニティーカラム（ＨｉＴｒａｐ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および高速タンパク質液体クロマトグラフィーＡＫＴＡシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。０．１Ｍのグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．５中で溶出させ、１００ｕＬの１Ｍのトリス、ｐＨ９で中和した１ｍＬのピーク画分をプールし、精製したＩｇＧをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって定量および制御した。
【０３１９】
精製した抗体とその特異的表面抗原との結合を、用量応答アッセイにおいて５つの結腸ＣＳＣ系統に対してＦＡＣＳによって分析した。解離定数および最大結合値は、ＦＡＣＳ分析からＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して推測した。これらの値は、実施例４にｍＡｂ濃度の関数として定義した実験ＦＣ値を「一部位結合」（誇張法）方程式：Ｙ＝Ｂｍａｘ＊Ｘ／（Ｋｄ＋Ｘ）［式中、Ｂｍａｘは最大結合値であり、Ｋｄ（解離定数）は最大半減結合に達するために必要な抗体濃度である］に当てはめることによって得られた。抗ＦＧＦＲ４および抗ＥＤＡＲ  ｍＡｂは少なくとも２つの細胞系に対して有意な、用量依存的な反応性を示し、Ｋｄ値はナノモーラー以下／低いナノモーラーの範囲（０．２〜１．３ｎＭ）であった一方で、抗ＩＬ１７ＲＢ  ｍＡｂはより低い反応性をもたらし（Ｋｄ値は４０〜１２５ｎＭ）、抗ＲＧＭＢ  ｍＡｂは１つのみが陽性であった（表９）。
【０３２０】
表９．結腸ＣＳＣに対する抗ＦＧＦＲ４、抗ＥＤＡＲ、抗ＩＬ１７ＲＢ、および抗ＲＧＭＢ  ｍＡｂの解離定数および最大結合値。
【表９】
2020537490.tif 000034
【０３２１】
一部の選択された抗体の抗原結合特異性を、抗原発現をサイレンシングするために短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードする適切なレンチウイルスベクター（ＧＩＰＺレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ）ｓｈＲＮＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて形質導入した市販の結腸腫瘍細胞系を用いて確認した。比較的高い発現レベルのＦＧＦＲ４、ＩＬ１７ＲＢ、およびＲＧＭＢをそれぞれ示した３つの細胞系、ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８、およびＳＷ４８０を、対応する転写物のレンチウイルスに基づいたノックダウンに使用した。ｑＲＴ−ＰＣＲによって制御される、ＦＧＦＲ４、ＩＬ１７ＲＢ、およびＲＧＭＢをサイレンシングした細胞のＦＡＣＳ分析により、対応する抗原における、抗体に対する特異性が実証された。
【実施例６】
【０３２２】
ＦＧＦＲ４を富化したおよび枯渇させた結腸ＣＳＣの増殖潜在性、細胞運動性、および腫瘍原性の評価
様々な標的に対する選択された抗体が、ＦＡＣＳによって、結腸ＣＳＣ系統ＣＴＳＣ８５に対して試験した場合に二峰性分布の反応性を示したことが観察されている（Signore et al., 2016）。
【０３２３】
ＦＧＦＲ４を結腸ＣＳＣの潜在的な治療的標的として実験的に検証するために、ＣＳＣ系統ＣＴＳＣ８５をフローサイトメトリー細胞選別に供して、抗ＦＧＦＲ４抗体ＢＦＧ−５Ｆ７−Ｄ５との二峰性結合プロフィールに基づいて２つの部分集団、それぞれＦＧＦＲ４高およびＦＧＦＲ４低を分離した（図４）。
【０３２４】
単離の直後、可能性のある機能的差異を強調するために、２つの細胞集団をいくつかのインビトロアッセイで評価した。アッセイは、２つの分離した部分集団の参照として使用した親異種細胞集団（偽選別細胞）と一緒に平行して行った。
【０３２５】
細胞増殖を測定するために、２０００個の細胞を９６ウェルマイクロプレートのそれぞれのウェルに、１００ｕＬの培養培地中で播種し、８個の実験点を３つ組で設定した。細胞増殖速度を１４日間モニタリングし、細胞生存度蛍光定量的アッセイＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者のプロトコールに従って使用して、生細胞数を２日毎に測定した。細胞生存度に比例する蛍光強度をマイクロプレートリーダーＶｉｃｔｏｒ  ２（登録商標）（Ｗａｌｌａｃ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定した。様々な時点に対応する３つ組の蛍光強度値の平均を、細胞を播いた日（０日目）に測定した平均値に対して正規化した（図５）。
【０３２６】
さらに、ＣＴＳＣ８５細胞の２つのＦＧＦＲ４高およびＦＧＦＲ４低の部分集団ならびに対照集団（偽選別）を、限界希釈実験および軟寒天の両方において、そのコロニー形成効率について分析した。
【０３２７】
液体培養物中でのクローン原性アッセイには、１、５、または２５個の単個細胞を、９６ウェルマイクロプレートのそれぞれのウェルに、１００ｕＬの成長培地中で播種した。１４日後、ウェルの合計数に対するコロニー含有ウェルの数をそれぞれの細胞希釈条件について計算することで、コロニー形成頻度が得られた。
【０３２８】
軟寒天中でのコロニー形成アッセイには２４ウェルプレートを使用した。手短に述べると、５００ｕＬの成長培地中に０．９％の低融点アガロース（低融点Ｓｅａ  Ｐｌａｑｕｅ  Ａｇａｒｏｓｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）溶液をそれぞれのウェルに分注し、４℃で少なくとも１時間固化させた（下層）。上層には、等容量の成長培地中に１％の低融点アガロース溶液および５．２×１０４個の細胞／ｍＬの細胞懸濁液を混合し、５００ｕＬの混合物をそれぞれのウェルに移し（１．３×１０４個の細胞／ウェル）、室温で固化させた。その後、１００ｕＬの培養培地をそれぞれのウェルに加えた。それぞれの細胞部分集団の３つ組を播き、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートし、２日毎に新鮮な培地を培養物に加えた。細胞コロニー形成を倒立光学顕微鏡下でモニタリングし、１２日間のインキュベーション後、コロニーを計数した。３０個以上の細胞を含有していたコロニーをスコア付けした（図６）。
【０３２９】
全体的に、ＦＧＦＲ４高ＣＴＳＣ８５細胞部分集団は、ＦＧＦＲ４低細胞部分集団と比較してより高い増殖速度およびクローン原性効率を示した。
【０３３０】
また、３つのＣＴＳＣ８５細胞集団の移動効率も評価した。トランスウェル移動アッセイはＣｏｒｎｉｎｇ（商標）ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋ９６ウェルマイクロプレートを使用して行い、３０００個の細胞をそれぞれのウェルの上チャンバー（インサート）に４つ組で播種し、２００ｕＬの完全成長培地を下チャンバーに加えた。４８時間、３７℃、５％のＣＯ２でのインキュベーションの後、細胞を、下チャンバーに加えた４μＭのＣａｌｃｅｉｎ  ＡＭ蛍光色素（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で３０分間、ＲＴで染色した。膜を通って遊走した生細胞に関連する蛍光を、底のマイクロプレートリーダーＭｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＤＴＸ  ８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で、４８５／５３５ｎｍ（Ｅｘ／Ｅｍ）で測定した。デジタル顕微鏡カメラ（Ｎｉｋｏｎ）を備えた倒立蛍光顕微鏡を使用して画像を捕らえ、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して染色細胞を計数した。
【０３３１】
図７では、３つの独立した実験の代表的な結果を示し、ＦＧＦＲ４高ＣＴＳＣ８５細胞はＦＧＦＲ４低細胞と比較してより高い移動性向を有することが示された。
【０３３２】
インビトロアッセイで得られた実験的証拠に基づいて、２つのＦＧＦＲ４高およびＦＧＦＲ４低ＣＴＳＣ８５細胞部分集団を免疫不全マウスに注射して、インビボでのその腫瘍形成能を評価した。
【０３３３】
実験は、同数の２つの細胞部分集団を右および左の脇腹に皮下接種した６匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）で行った。腫瘍成長は、腫瘍の最初の出現後、３週間の間、週に２回、バーニアカリパスで腫瘍の大きさ（長軸および短軸）を測定することによって評価した。腫瘍容量は以下の式を使用して計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝ｄ２×Ｄ／２（式中、ｄおよびＤはそれぞれ最短および最長の直径をいう）。
【０３３４】
インビボ実験の結果（図８）により、ＦＧＦＲ４発現を富化したＣＳＣ細胞部分集団は、ＦＧＦＲ４を枯渇させた細胞部分集団と比較して腫瘍形成能が増加していると考えられることが示され、これは機能的インビトロデータと一致している。
【実施例７】
【０３３５】
抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体の特徴づけ
本発明者らは、ＦＧＦＲ４を腫瘍学的標的として優先順位を決定し、さらに、この抗原に対して作製された新規モノクローナル抗体を特徴づけた。
【０３３６】
３つの抗ＦＧＦＲ４精製抗体ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９、ＢＦＧ−５Ｅ５−Ｂ５、およびＢＦＧ−５Ｆ７−Ｄ５の細胞蛍光測定（ｃｙｔｏｆｌｕｏｒｉｍｅｔｒｉｃ）分析を、５つすべての結腸ＣＳＣ系統（１．１、１．２、１８、８５、ＣＲＯ１）ならびに結腸（ＨＣＴ１１６、ＳＷ４８、ＳＷ６２０、ＨＴ２９、ＤＬＤ１）および肝臓（Ｈｕｈ７、ＨｅｐＧ２）ＡＴＣＣ腫瘍細胞系のパネルまで拡張した。それぞれの抗体を増大する濃度で試験して、内在性表面受容体とのその結合の用量依存性を評価した。アッセイは、９６ウェルマイクロプレート中、２００ｕＬの細胞培地中に１０５個の細胞／ウェルで行い、試験した抗体をそれ中で段階希釈した。４℃で１時間のインキュベーションの後、抗ラット蛍光二次抗体（ヤギ抗ラットＩｇＧ  Ｒ−フィコエリスリン［Ｒ−ＰＥ］コンジュゲート、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加え、細胞生存度を制御するために細胞を１ｕｇ／ｍＬのＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二塩酸塩）で処理した。二次抗体のみとインキュベートした試料を陰性対照として含めた。フローサイトメトリー評価は細胞蛍光計ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（商標）ＶＹＢ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して行った。
【０３３７】
得られた実験データに基づいて、それぞれの抗体の結合親和性を、それぞれの実験点の平均蛍光強度対対照試料のそれの比（変化の倍数、ＦＣ）をパラメータとして使用して決定した。ＦＣ値はｍＡｂ濃度の関数としてプロットしてｕｇ／ｍＬで表し、ＢｍａｘおよびＫｄ定数は実施例５に記載のようにＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して計算した。
【０３３８】
表１０に要約したように、抗ＦＧＦＲ４抗体は、ＣＳＣおよび高いＦＧＦＲ４発現レベルを有する腫瘍細胞系のどちらに対しても、特に２つの肝細胞癌（ＨＣＣ）細胞系ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７に対して、高い、用量依存的な反応性を示し、Ｋｄ値はナノモーラー以下／低いナノモーラーの範囲（０．４〜１２ｎＭ）であった。対照的に、ＣＴＳＣ１８およびＤＬＤ１細胞系は、はるかにより低い応答性をもたらし、これはその低いＦＧＦＲ４発現レベルと一貫している。
【０３３９】
表１０．結腸ＣＳＣならびに結腸（ＣＲＣ）および肝臓（ＨＣＣ）ＡＴＣＣ腫瘍細胞系に対する抗ＦＧＦＲ４  ｍＡｂの解離定数および最大結合値。Ｋｄ値は、Ｂｍａｘ≧２を有する曲線から内挿した場合にのみ信頼性があるとみなした。
【表１０】
2020537490.tif 000035
【０３４０】
抗ＦＧＦＲ４抗体の結合親和性および特異性を、ヒトＩｇＧ  Ｆｃと融合させた組換えヒトＦＧＦＲ４細胞外ドメインに対するインビトロ結合アッセイにおいて試験した（固相受容体結合アッセイ）。手短に述べると、９６ウェルマイクロプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ（商標）ＥＬＩＳＡプレート）を、ＰＢＳ、ｐＨ７中に２ｕｇ／ｍＬで希釈した抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）５０ｕＬを用いて、終夜、４℃でコーティングした。その後、非特異的結合部位を２００ｕＬのＰＢＳ／３％のＢＳＡで１時間飽和させ、次いでＰＢＳで５回洗浄した。次に、ヒトキメラ受容体ＦＧＦＲ４−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳ／０．３％のＢＳＡ中、１ｕｇ／ｍＬで１時間加えた。その後、マイクロプレートをＰＢＳで５回洗浄し、５０ｕＬのＰＢＳ／０．３％のＢＳＡ中に１：３の段階希釈の抗ＦＧＦＲ４抗体またはアイソタイプ対照（ラットＩｇＧ２ａｋ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）と共に１時間インキュベートした。それぞれの実験点の３つ組を含めた。ＰＢＳで５回洗浄した後、１：４０００に希釈して１時間インキュベートした、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗ラットＩｇＧ二次抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用し、次いで発色基質ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を３〜１０分間加えて、結合した抗体を検出した。１００ｕＬの２Ｍの硫酸を加えることによって反応を停止させ、マイクロプレートリーダーＭｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＤＴＸ  ８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０３４１】
このアッセイでは、抗ＦＧＦＲ４抗体ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９およびＢＦＧ−５Ｆ７−Ｄ５はどちらもキメラ受容体に対して高く同一の結合親和性を示した一方で（５ｎｇ／ｍＬ、０．０３ｎＭ）、対照免疫グロブリンでは、試験した最大濃度まで結合は検出されなかった。
【０３４２】
抗体ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９の潜在的な治療的抗腫瘍効果を、ＡＴＣＣ細胞系ＨＣＴ１１６またはＣＳＣ系統ＣＴＳＣ８５のどちらかを移植した免疫不全マウスを使用した２つの異なる結腸がんインビボモデルにおいて評価した。
【０３４３】
第１の異種移植片モデルでは、５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に１．８×１０６個のＨＣＴ１１６細胞の懸濁液を、２０匹の５週齢のＣＤ−１ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）のそれぞれの脇腹に皮下接種した。移植の９日後、測定可能な腫瘍を示したマウスを２つの群、すなわち抗体群および対照群にランダムに割り当て（ｎ＝７）、どちらの群でも平均腫瘍容量は１１０ｍｍ３であった。マウスを、腹腔内（ＩＰ）注射によって、週に１回、３週間投与したＰＢＳ中に５０ｍｇ／ＫｇのＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９抗体で処置した。対照群には対応する容量のブランク注射（ＰＢＳ）を与えた。マウスの重量を週に２回制御し、腫瘍の大きさ（長軸および短軸）をバーニアカリパスで週に２回測定した。腫瘍容量は以下の式を使用して計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝ｄ２×Ｄ／２（式中、ｄおよびＤはそれぞれ最短および最長の直径をいう）。
【０３４４】
対照群と比較して、抗体で処置したマウスにおいて腫瘍容量の低下が観察され、これは、処置の１４日目から統計的に有意となり始めた差異である（図９）。対照的に、体重減少または臨床的有害作用は観察されなかった（示さず）。
【０３４５】
第２の異種移植片モデルでは、１×１０６個のＣＴＳＣ８５細胞の懸濁液を、２２匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）のそれぞれの脇腹に皮下接種した。移植の約３週間後、測定可能な腫瘍を示したマウスを３つの群、すなわち、抗ＦＧＦＲ４抗体ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９群、無関係の抗体１Ｈ４（アイソタイプ対照）群、およびビヒクル対照群にランダムに割り当て（ｎ＝７）、それぞれの群で平均腫瘍容量は７０ｍｍ３であった。マウスを、ＩＰ注射によって、週に１回、５週間投与したＰＢＳ中に５０ｍｇ／ＫｇのＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９または１Ｈ４抗体で処置した。対照群には対応する容量のブランク注射（ＰＢＳ）を与えた。マウスの重量を週に２回制御し、腫瘍の大きさ（長軸および短軸）をバーニアカリパスで週に２回測定した。腫瘍容量は以下の式を使用して計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝ｄ２×Ｄ／２（式中、ｄおよびＤはそれぞれ最短および最長の直径をいう）。
【０３４６】
図１０に示すこの実験の結果により、他のインビトロおよびインビボのモデルで観察された、結腸がん細胞の成長を阻害する抗ＦＧＦＲ４抗体ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９の能力が確認された。ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９で処置した群の腫瘍成長速度を対照群のそれと比較すると、差異は統計的に有意な結果をもたらした。体重減少または臨床的有害作用は処置の期間中に観察されなかった（示さず）。
【実施例８】
【０３４７】
ネズミＦＧＦＲ４受容体と交差反応し、リガンド−受容体の相互作用を阻害する追加の抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体の選択および特徴づけ
ＦＧＦと受容体との結合を阻害することができ、したがって、既に記載されているものよりも良好な、リガンド−受容体の相互作用を遮断する生物学的効果を有する、新規抗ＦＧＦＲ４抗体を同定することを目的として、２つの異なる戦略に従った。
【０３４８】
第１戦略：
第１戦略は、受容体の細胞外領域上の抗体結合ドメインを同定すること、およびネズミ受容体に対するその交差反応性を試験することの両方による第１のスクリーニングにおいて陽性を示した元の１４個の親ハイブリドーマ上清を再検査することからなる。実際、リガンドおよびヘパラン硫酸との相互作用に必要かつ十分なＦＧＦＲ４のＩｇＩＩおよびＩｇＩＩＩドメイン（Goetz & Mohammadi, 2013）は、様々な種にわたって最も保存的である。さらに、ＩｇＩＩおよびＩＩＩにおいてヒトとネズミの受容体間で異なるアミノ酸残基は、ＦＧＦ結合ポケットの反対側の表面上に位置している。その結果、ネズミ受容体との交差反応性ならびにドメインＩｇＩＩおよびＩＩＩとの結合は、リガンド−受容体の相互作用を妨げることができる抗体の明白な特長である可能性がある。
【０３４９】
ヒトＦＧＦＲ４受容体の細胞外領域３つの欠失突然変異体（ｄ１、ｄ２、ｄ３）を作製した。ｄ１では、ＩｇＩドメインに対応するアミノ酸１〜１１８を含む領域が欠失していた、ｄ２では、ＩｇＩおよび酸ボックスの両方に対応するアミノ酸１〜１５１を含む領域が欠失していた。ｄ３では、ＩｇＩ、酸ボックス、およびＩｇＩＩに対応するアミノ酸１〜２４８を含む領域が欠失していた（アミノ酸の付番はシグナルペプチドを含めた完全長（ＦＬ）受容体を参照している）。ＦＧＦＲ４  ＦＬおよび切断型をコードするｃＤＮＡを、ｍｙｃタグと共にインフレームでｐＢ１−ｍｙｃ発現ベクター内にクローニングした（実施例３に記載）。ｐＢ１−ＦＧＦＲ４  ＦＬ、ｄ１、ｄ２、およびｄ３を用いて一過的に形質移入させ、１４個の親ハイブリドーマ上清を用いて試験したレポーター細胞ＢＯＳＣ２３のＦＡＣＳ分析により、完全長受容体に対するその反応性が確認された。そのうち１０個がｄ１突然変異体に対して完全な反応性を保持しており、そのうち、ＢＦＧ−５Ａ５およびＢＦＧ  ７Ｈ９はｄ２突然変異体に対する陽性を完全に失っていた。最後に、既に記載したＢＦＧ−２Ｆ７、ＢＦＧ−５Ｅ５、およびＢＦＧ−５Ｆ７を含めた残り８つの上清すべて、ｄ３突然変異体に対して陰性の結果をもたらし、したがって、ドメインＩｇＩＩに対して結合特異性を示す。
【０３５０】
同じ上清を、対応するｐＢ１−ｍｙｃコンストラクトを用いて形質移入した後にヒト、サル、またはネズミＦＬ  ＦＧＦＲ４を異所的に発現する、一過的に形質移入させたＢＯＳＣ２３細胞に対して、ＦＡＣＳによって分析した。１３個の上清がサル受容体に対して交差反応性を示した一方で、そのうち３個のみがネズミ受容体に対しても陽性の結果をもたらした。興味深いことに、既に記載した抗体ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９、ＢＦＧ−５Ｅ５−Ｂ５、およびＢＦＧ−５Ｆ７−Ｄ５を単離した上清が代わりにヒトＦＧＦＲ４に特異的な結果をもたらした。
【０３５１】
ネズミ受容体に対して最も交差反応性が高く、ＩｇＩＩドメインに対して陽性であるものの１つであるＢＦＧ−５Ｂ５上清を、対応するハイブリドーマのサブクローニングに選択し、したがって抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７を産生する細胞サブクローンが得られ、これを実施例５に記載のようにタンパク質Ｇ−セファロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０３５２】
５つの異なる結腸ＣＳＣ系統（１．１、１．２、１８、８５、ＣＲＯ１）およびＨＣＣ細胞系Ｈｕｈ７に対する抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７の反応性を、実施例７に記載のように用量応答実験においてＦＡＣＳ分析によって評価した。既に記載したＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９抗ＦＧＦＲ４抗体および無関係の抗体１Ｈ４を参照として含めた。対照（二次抗体のみ）と比較した変化の倍数（ＦＣ）値はｍＡｂ濃度の関数としてプロットしてｕｇ／ｍＬで表し、ＢｍａｘおよびＫｄ定数は、実施例５に記載のようにＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、「一部位結合方程式」を適用することによって計算した。
【０３５３】
表１１に要約したように、抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７は、高いＦＧＦＲ４レベルを発現するすべての細胞系に対して、ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９で測定されたものに類似の高い結合活性を示した一方で、低いＦＧＦＲ４発現を有するＣＴＳＣ１８細胞系では応答性ははるかにより低いことが確認された。対照的に、無関係の抗体１Ｈ４は試験したすべての細胞系に対して陰性の結果をもたらした。ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７について計算したＫｄ値はすべてナノモーラー以下の範囲であり、ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９で計算されたものに匹敵していたまたはそれよりわずかに低かった。
【０３５４】
表１１．５つの結腸ＣＳＣ系統およびＨＣＣ細胞系Ｈｕｈ７に対する抗ＦＧＦＲ４  ｍＡｂ  ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７およびＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９の解離定数および最大結合値。
【表１１】
2020537490.tif 000036
【０３５５】
その後、ＦＧＦＲ４に対するＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７の結合親和性および特異性を、実施例７に記載の固相受容体結合アッセイおよびヒトキメラ受容体ＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−Ｆｃ、ＦＧＦＲ４−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、インビトロで測定した。様々なＦＧＦＲ−Ｆｃでコーティングしたマイクロプレートを増大する濃度のＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７またはアイソタイプ対照（ラットＩｇＧ２ａ）と共にインキュベートした。このアッセイでは、抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７はＦＧＦＲ４に対して高く特異的な結合親和性を示した一方で（Ｋｄ＝０．０２ｕｇ／ｍＬ、０．１ｎＭ）、他のＦＧＦ受容体に対して、またはアイソタイプ対照では結合は検出されなかった。
【０３５６】
その後、ＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４複合体の形成を防止する／それと競合する抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７の能力を、実施例７に記載のＦＧＦＲ４−Ｆｃ依存性固相結合アッセイにおいて分析し、それに以下の修正を導入した。３つ組での抗体の１：３の段階希釈と共に１時間インキュベーションした後、組換えＦＧＦ１９（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および低分子量ヘパリン（Ｃｌｅｘａｎｅ、平均ＭＷ４．５ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を２３ｎＭの等モル濃度で加えた（以前の用量応答結合実験から推測されるｋｄ値に対応する、示さず）。２時間のインキュベーションの後、マイクロプレートをＰＢＳで５回洗浄し、ＰＢＳ／０．３％のＢＳＡ中で１：１０００に希釈した抗ＦＧＦ１９ビオチン標識抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共に１時間インキュベートした。ＰＢＳで５回洗浄した後、固定した受容体と結合した残留ＦＧＦ１９を、３％のＢＳＡおよび０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ中に５０ｕＬのＨＲＰとコンジュゲートさせたストレプトアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｐｉｅｒｃｅ）を加えることによって検出した。３０分間のインキュベーション後、過剰なストレプトアビジンを、ＰＢＳ／０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０での３回の洗浄およびＰＢＳでさらに２回の洗浄にて除去し、次いで発色基質ＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を１２分間加えた。１００ｕＬの２Ｍの硫酸を加えることによって反応を停止させ、マイクロプレートリーダーＭｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＤＴＸ  ８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して４５０ｎｍでの吸光度を測定した。
【０３５７】
アッセイは、他のＦＧＦＲと比較したＦＧＦＲ４に対するＦＧＦ１９結合選択性、および別のＦＧＦＲ４高親和性リガンドであるＦＧＦ１の、ＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４の相互作用を阻害する能力の両方を試験することによって、事前に妥当性確認されている。
【０３５８】
続いて、抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７の１１個の１：２の段階希釈（０．０１５ｕｇ／ｍＬから１５ｕｇ／ｍＬまで）を、既に記載した実験条件下にて３つ組で試験した。無関係の抗体１Ｈも陰性対照として同じ濃度で試験した。
【０３５９】
この結果は、既に記載した抗ＦＧＦＲ４  ｍＡｂ  ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９および無関係の抗体１Ｈ４（示さず）とは異なり、抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７はＦＧＦ１９とＦＧＦＲ４との結合を効率的に阻害することができたことを示しており、これは、ネズミ受容体に対するその反応性およびＦＧＦＲドメインＩｇＩＩに対するその結合特異性と一致している。
【０３６０】
コレステロール７ａ−ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ７Ａ１）および結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）の発現は、正常および腫瘍の肝細胞のどちらにおいても、ＦＧＦＲ４シグナル伝達経路のＦＧＦ１９依存性活性化によって転写レベルで変調される（Inagaki et al., 2005、Chiang et al., 2009、Uriarte et al., 2015）。抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７およびＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９の、ＦＧＦ１９媒介性の遺伝子変調を阻害する能力を、８時間の血清飢餓の後に、抗ＦＧＦＲ４  ｍＡｂと共に終夜、無血清培地中でプレインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞に対して評価した。その後、ＦＧＦ１９を、１００ｎｇ／ｍＬ（４．６ｎＭ）の濃度で、等モル濃度のヘパリン量と一緒に、細胞溶解の６時間前に加えた。ＰＢＳで処理した陰性対照試料を含めた。陽性対照として、ＦＧＦＲ４チロシンキナーゼ特異的阻害剤ＢＬＵ９９３１を（Hagel et al., 2015）、０．１ｕＭ、０．３ｕＭ、または１ｕＭの濃度で、細胞溶解の７時間前に加えた。全ＲＮＡをＨｅｐＧ２細胞から抽出し、遺伝子に特異的なプローブおよびプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＴａｑＭａｎ（商標）遺伝子発現アッセイ）ならびに正規化群としてＧＡＰＤＨを使用して、実施例２に記載のようにｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを３つ組で行った。
【０３６１】
公開データと一致して、ＦＧＦ１９の添加は、ＣＹＰ７Ａ１発現を低下させ（約５倍）、ＣＴＧＦ発現を増加させた（約２．５倍）。ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７を用いた処理は、３０ｕｇ／ｍＬ（０．２ｕＭ）の濃度で既にこれらの効果を部分的に復帰させ、同様の濃度の化合物ＢＬＵ９９３１で観察されたものに匹敵するレベルでＣｙｐ７Ａ１  ｍＲＮＡの増加およびＣＴＧＦ  ｍＲＮＡの減少を引き起こした。
【０３６２】
これらのデータは、ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７は、ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９とは異なり（示さず）、この抗体を用いたＦＡＣＳによって高い陽性を示した肝細胞癌細胞においてＦＧＦＲ４依存性シグナル伝達経路を妨げることができることを示している。
【０３６３】
続いて、ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７およびＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９を、ＦＧＦ１９を用いたＨｕｈ７およびＨｅｐ３Ｂ肝細胞癌細胞系の処置によって誘導された、線維芽細胞成長因子受容体基質２（ＦＲＳ２）のＦＧＦＲ４依存性リン酸化を阻害するその能力について評価した。
【０３６４】
８時間の血清飢餓の後、細胞を終夜、無血清培地中、７．５ｕｇ／ｍＬ、１５ｕｇ／ｍＬ、および３０ｕｇ／ｍＬの濃度のＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７、ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９、または対照抗体１Ｈ４と共にインキュベートした一方で、ＦＧＦ１９およびヘパリンを等モル濃度（４．６ｎＭ）で細胞溶解の１０分前に加えた。ＢＬＵ９９３１を陽性対照として細胞溶解の１時間前に１００または３００ｎＭの濃度で含めた。ＳＤＳ中の全タンパク質溶解物を調製し、抗ホスホ−ＦＲＳ２抗体（Ｔｙｒ１９６、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ）、抗ＦＲＳ２抗体（ＬＳＢｉｏ）、および抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、ウエスタンブロットによって分析した。
【０３６５】
抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７は、どちらの細胞系においても、用量依存的な様式でＦＧＦ１９誘導性のＦＲＳ２リン酸化を阻害することにおいてＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９よりも顕著に効率的であった一方で、陰性対照抗体１Ｈ４は完全に不活性であった。
【０３６６】
その後、抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７を、２つのＦＧＦＲ４陽性結腸ＣＳＣ系統（ＣＴＳＣ１．２およびＣＲＯ１）の軟寒天においてコロニー形成効率を減少させるその能力について試験した。実験手順は実施例６に詳述したものであり、以下の修正を行った。ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７または無関係の抗体１Ｈ４を、上の軟寒天層および上部を覆う培養培地の両方中に、７．５、１５、または３０ｕｇ／ｍＬの最終濃度で含めた。陽性対照として、ＦＧＦＲ４阻害剤ＢＬＵ９９３１を１００ｎＭの濃度で平行して試験した。それぞれの実験点の４つ組を播き、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートし、抗体または化合物を含有する新鮮な培地を２日毎に加えた。
【０３６７】
細胞コロニー形成を倒立光学顕微鏡下でモニタリングし、１４日間のインキュベーション後、３０個以上の細胞を含有するコロニー数を決定した。ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７を用いた２つのＣＳＣ系統の連続的な処理は、ＣＴＳＣ１．２に対してはすべての濃度で、ＣＴＳＣ  ＣＲＯ１に対しては試験した最高濃度で統計的有意性に達した対照と比較して、コロニー数の減少を引き起こした。
【０３６８】
第２戦略：
ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９よりも潜在的に高い抗腫瘍活性を有する新規抗ＦＧＦＲ４抗体を同定するために、新しいハイブリドーマ細胞系を、実施例３に記載のｐＢ８−ＨＡ−ＦＧＦＲ４発現ベクターで最初に免疫化したラットから単離した凍結保存リンパ球から作製した。この第２のスクリーニングでは、（ｉ）ネズミ受容体との交差反応性の初期評価、および（ｉｉ）対応する上清によるＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４の相互作用を妨げる能力の初期評価からなる、２つの新しい選択基準を導入した。
【０３６９】
実施例３のように、新しいハイブリドーマ細胞系を作製し、ハイブリドーマの選択および拡大工程の後、ヒトおよびネズミ受容体の両方に対する対応する上清の反応性を、どちらかの発現ベクターで形質移入させたＢＯＳＣ２３細胞のＦＡＣＳ分析によって評価した。
【０３７０】
このことに基づいて、ヒトＦＧＦＲ４に対して陽性の結果をもたらした抗体を産生する７０個のハイブリドーマ細胞系を選択し（ＢＭＫ融合体）、そのうち５０個がネズミ受容体に対しても反応性であり、２０個がヒトＦＧＦＲ４に特異的であった。
【０３７１】
第１のスクリーニング（実施例４）については、７０個の選択された上清を、結腸ＣＳＣ表面と結合するその効率について、ＦＡＣＳによって分析した。既に同定された抗ＦＧＦＲ４抗体に対して高い反応性を有する４つの結腸ＣＳＣ系統（ＣＴＳＣ１．１、ＣＴＳＣ１．２、ＣＴＳＣ８５、およびＣＴＳＣ  ＣＲＯ１）、ならびに同じ抗体に対して低い反応性を有するＣＳＣ系統ＣＴＳＣ１８の両方に対して実験を行った。アッセイは、９６ウェルマイクロプレート中で、１０５個の細胞／ウェルを播種することによって行い、これに２００ｕＬのそれぞれの上清を加えた。ハイブリドーマ融合体に使用したネズミ骨髄腫細胞の馴化培地（ＤＭＥＭ／１０％のＦＢＳ）を陰性対照としてそれぞれのプレートに加えた一方で、抗ＦＧＦＲ４  ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９抗体を３ｕｇ／ｍＬの濃度で陽性対照として含めた。４℃で１時間のインキュベーションの後、抗ラット蛍光二次抗体（ヤギ抗ラットＩｇＧ  Ｒ−フィコエリスリン［Ｒ−ＰＥ］コンジュゲート、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を加え、細胞生存度を制御するために細胞を０．２５ｕｇ／ｍＬ（１ｕＭ）のＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、二塩酸塩）で処理した。フローサイトメトリー評価は細胞蛍光計ＭＡＣＳＱｕａｎｔ（商標）ＶＹＢ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して行った。
【０３７２】
２つ以外のすべての上清がＣＴＳＣ１８細胞系に対して陰性の結果をもたらし、実施例４に記載のように、そのＦＣ値に従って、他のＣＳＣ系統に対するその陽性に基づいてランク付けした。高いＦＧＦＲ４発現を有する４つのＣＳＣ系統のそれぞれに対してそれぞれの上清に割り当てられた個々の評点を加算することによって、最終ランクが得られ（表１２）、ここで最小の数値が最高の反応性に対応する。
【０３７３】
表１２．５つの異なるＣＳＣ系統に対して７０個の上清で得られたＦＡＣＳ分析データの要約。変化の倍数（ＦＣ）は、それぞれの上清で測定された平均蛍光強度（ＭＦＩ）の、陰性対照（骨髄腫細胞馴化培地）に対する比である。スコアはそれぞれのＦＧＦＲ４陽性ＣＳＣ系統に対するＦＣ値に基づいて割り当てられ、最終ランクは個々のスコアを加算することによって計算した（総合ランク）。ネズミ受容体と交差反応性を示さなかった上清に下線を引く。
【表１２】
2020537490.tif 000037
【０３７４】
平行して、７０個の上清の反応性を既に記載した固相受容体結合アッセイにおいて測定した。ＦＧＦＲ４−Ｆｃでコーティングしたマイクロプレートウェルを、骨髄腫細胞馴化培地で最終容量を５０ｕＬにした、０．０８ｕＬから１０ｕＬまでの増大する容量のそれぞれの上清と共にインキュベートした。異なる標的に対して作製された抗体（ＢＧＣ−６Ｈ７）を陰性対照としてそれぞれのプレートに加えた一方で、抗ＦＧＦＲ４  ＢＦＧ−２Ｆ７−Ｂ９抗体を６ｕｇ／ｍＬの濃度で陽性対照として含めた。馴化培地バックグラウンド値を減算することによって４５０ｎｍでの吸光度値が得られた。表１３に要約したように、ＢＭＫ−７Ｅ４、ＢＭＫ−８Ｈ９、およびＢＭＫ−８Ｈ１０以外のすべての上清は、様々な程度ではあるが用量依存的な受容体結合活性を示した。試験した最小容量においてさえも４５０ｎｍでの吸光度の減少が観察されなかった１４個の上清を、より低い容量範囲を使用した第２の試験において評価し、ここではすべての上清が用量応答活性を示した。また、これの事例では、表１３に要約したように２ｕＬおよび０．０８ｕＬの上清容量で得られたデータに基づいて、それぞれの上清に最終ランクも割り当てた。
【０３７５】
表１３．固相ＦＧＦＲ４依存性アッセイ（ｎ＝３）において７０個の上清で得られた結合データの要約。最小の数値が最高の反応性に対応する。最良の１８個の上清を（＋）マークで表示する。
【表１３】
2020537490.tif 000038
【０３７６】
さらに特徴づけるいくつかの上清を選択するために、全体的なデータを評価した。結腸ＣＳＣに対するＦＡＣＳ分析に由来する最良の１７個の上清の優先順位を決定し、そのうち１３個はネズミ受容体に対しても反応性であった一方で、他の４つはヒトＦＧＦＲ４に特異的であった。これらの上清がもたらした結果は、組換え受容体に対する２つの結合アッセイのうちの少なくとも１つにおいて、すなわち、ＦＧＦＲ４依存性固相アッセイにおいて、およびその表面上に受容体を異所的に発現するＢＯＳＣ２３細胞に対して、最良のもの一部であった。
【０３７７】
１７個の上清を、既に記載した固相アッセイにおいてＦＧＦ１９と固定した受容体との結合を阻害するその能力について、用量応答実験において評価した。ＦＧＦ１９およびヘパリンを加える前に、固定したＦＧＦＲ４−Ｆｃを増大する容量（０．１８５ｕＬから１６．６ｕＬまで）のそれぞれの上清と共にプレインキュベートし、骨髄腫細胞馴化培地で最終容量を５０ｕＬにした。３つの結合アッセイすべてにおいて非反応性の結果をもたらした上清を陰性対照として含めた一方で、ＦＧＦ１を陽性対照として５ｎＭの濃度で使用した。
【０３７８】
図１１に示すように、１７個の分析した上清のうちの７個は、ＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４の結合の明白な用量依存的な阻害を引き起こした。これらのうち、５つがネズミ受容体と交差反応性であった一方で（ＢＭＫ−１Ｅ７、３Ｂ６、５Ｈ９、６Ｃ９、１０Ｇ１１）、２つのみがヒトＦＧＦＲ４に特異的であった（ＢＭＫ−８Ｄ４およびＢＭＫ−８Ｅ３）。興味深いことに、これら７つの上清がもたらした結果は、内在性および組換え受容体の両方と結合することにおいて、最も効率的なものの一部であった。
【実施例９】
【０３７９】
抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体の特徴づけ
７つの選択された上清を産生する親ハイブリドーマ細胞系をサブクローニングし、ＦＧＦＲ４を異所的に発現するＢＯＳＣ２３細胞に対して反応性である抗体を産生する、安定したサブクローンがそれのそれぞれについて得られた（実施例３に詳述）。対応するモノクローナル抗体は、実施例５に記載のようにタンパク質Ｇ−セファロースアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。
【０３８０】
３つの異なる結腸ＣＳＣ系統（ＣＴＳＣ１．２、ＣＴＳＣ８５、およびＣＴＳＣ  ＣＲＯ１）ならびにＨＣＣ細胞系Ｈｕｈ７に対する７つの抗体の反応性を、実施例７に記載のように用量応答実験においてＦＡＣＳ分析によって評価した。参照として、既に記載したＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７抗体も試験した。対照（二次抗体のみ）と比較した変化の倍数（ＦＣ）値はｍＡｂ濃度の関数としてプロットしてｕｇ／ｍＬで表し、ＢｍａｘおよびＫｄ定数は、実施例５に記載のようにＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用し、「一部位結合方程式」を適用することによって計算した。
【０３８１】
表１４に要約したように、ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７ではｍ以前の実験で示された高い結合効率が確認された。新規ｍＡｂのうち、ＢＭＫ−３Ｂ６−Ｅ４およびＢＭＫ−６Ｃ９−Ｃ１１は、すべての細胞系に対してＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７で測定されたものに類似の高い結合効率を示した。対照的に、抗体ＢＭＫ−１Ｅ７−Ｃ４、ＢＭＫ−５Ｈ９−Ｄ１、ＢＭＫ−８Ｄ４−Ｅ２、ＢＭＫ−８Ｅ３−Ｅ４、およびＢＭＫ−１０Ｇ１１−Ｆ３は反応性が健著に低い結果をもたらし、ＢＭＫ−８Ｅ３−Ｅ４では、曲線は分析した細胞系の一部において飽和に到達せず、したがって、特定の度合の非特異的オフターゲット結合を示唆している。
【０３８２】
表１４．３つの結腸ＣＳＣ系統およびＨＣＣ細胞系Ｈｕｈ７に対する、７つの抗ＦＧＦＲ４  ｍＡｂおよびＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７の解離定数および最大結合値。
【表１４】
2020537490.tif 000039
【０３８３】
また、新規ｍＡｂでは、実施例８に記載の受容体依存性固相アッセイにおいてＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４複合体の形成を防止する／それと競合する能力も確認された。参照として含めた抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７として、追加のｍＡｂは低いナノモーラーの阻害定数を示した（表１５）。
【０３８４】
表１５．増大する抗体濃度（０．０１４から３０ｕｇ／ｍＬまでの１：３の段階希釈、ｎ＝３）での、４５０ｎｍでの残留吸光度（ＰＢＳ対照の％）に基づいて、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを用いた実験データの４Ｐロジスティック当てはめによって計算したＩＣ５０値。
【表１５】
2020537490.tif 000040
【０３８５】
その後、ＨＣＣ細胞系ＨｅｐＧ２からの全ＲＮＡを用いたｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを行って、Ｃｙｐ７Ａ１およびＣＴＧＦ遺伝子のＦＧＦ１９／ＦＧＦＲ４依存性発現を変調する抗体の能力を評価した。ＦＧＦ１９（１００ｕｇ／ｍＬ）を加える前に、参照として含めた抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７について実施例８に記載した実験条件下で、細胞を６０ｕｇ／ｍＬのそれぞれの抗体またはＰＢＳで処理した。ＲＮＡの抽出およびｑＲＴ−ＰＣＲプロトコールは既に記載したものと同じであった。
【０３８６】
２＾（−ΔΔｃ−ｔ）計算方法で得られたこの分析の結果を図１２に示す。以前の実験の同様、ＦＧＦ１９の添加は、ＣＹＰ７Ａ１発現を低下させ（約５倍）、ＣＴＧＦ発現を増加させた（約２．５倍）。ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７は、これらの効果を部分的に復帰させることができることが確認され、新しい抗体ＢＭＫ−１Ｅ７−Ｃ４、ＢＭＫ−３Ｂ６−Ｅ４、およびＢＭＫ−６Ｃ９−Ｃ１１も同様であり、それぞれＣｙｐ７Ａ１  ｍＲＮＡレベルの増加およびＣＴＧＦ  ｍＲＮＡレベルの減少を引き起こした。
【０３８７】
続いて、抗体を、ＨＣＣ細胞系Ｈｅｐ３ＢをＦＧＦ１９で処理することによって誘導された、ＦＲＳ２のＦＧＦＲ４依存性リン酸化を阻害するその能力について評価した。参照として含めた抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７について実施例８に記載した実験条件下でＦＧＦ１９／ヘパリンを加える前に、細胞を６０ｕｇ／ｍＬのそれぞれの抗体またはＰＢＳで処理した。
【０３８８】
この分析の結果を図１３に示す。抗体ＢＭＫ−１Ｅ７−Ｃ４、ＢＭＫ−３Ｂ６−Ｅ４、ＢＭＫ−６Ｃ９−Ｃ１１、およびＢＭＫ−１０Ｇ１１−Ｆ３、ならびに陽性対照ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７は、様々な程度ではあるがＦＧＦ１９誘導性のＦＲＳ２リン酸化を阻害することができる。
【０３８９】
最後に、ＨＣＣ細胞系Ｈｕｈ７に対する抗体の抗増殖活性を、液体中でのクローン原性アッセイにおいて評価した。抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７およびＦＧＦＲ４阻害剤ＢＬＵ９９３１を参照として含めた。
【０３９０】
代表的な結果を図１４に示す。すべての抗体およびＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７を用いたＨｕｈ７細胞の連続的処理は、様々な程度ではあるが、対照と比較してコロニー数の減少を引き起こした。５０〜１００ｕｇ／ｍＬ（０．３〜０．６ｕＭ）濃度での、ＢＭＫ−３Ｂ６−Ｅ４、ＢＭＫ−５Ｈ９−Ｄ１、ＢＭＫ−６Ｃ９−Ｃ１１、ＢＭＫ−８Ｄ４−Ｅ２、およびＢＭＫ−８Ｅ３−Ｅ４、ならびに参照抗体ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７によって示された抗増殖効果は、同様の濃度のＦＧＦＲ４阻害剤ＢＬＵ９９３１で観察されたものに匹敵していたまたはそれよりも高かった。
【０３９１】
結論として、その免疫学的および機能的特性に基づいて、３つの抗ＦＧＦＲ４モノクローナル抗体、すなわち、以下の３つの条件すべてを満たしたＢＭＫ−３Ｂ６−Ｅ４、ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７、およびＢＭＫ−６Ｃ９−Ｃ１１を、さらなる特徴づけに選択した：ｉ．結腸ＣＳＣおよびＨＣＣ細胞の表面上に発現された受容体との、低いナノモーラー範囲の解離定数での結合、ｉｉ．高い受容体レベルを発現する細胞におけるＦＧＦＲ４シグナル伝達経路阻害、ｉｉｉ．標準の治療的用量の抗体薬物に匹敵する濃度での、ＦＧＦＲ４陽性細胞に対する抗増殖活性。
【実施例１０】
【０３９２】
抗ＦＧＦＲ４ヒト−ラットキメラ抗体の生成および特徴づけ
ラットハイブリドーマＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７、ＢＭＫ−１Ｅ７−Ｃ４、ＢＭＫ−３Ｂ６−Ｅ４、ＢＭＫ−５Ｈ９−Ｄ１、ＢＭＫ−６Ｃ９−Ｃ１１、ＢＭＫ−８Ｄ４−Ｅ２、ＢＭＫ−８Ｅ３−Ｅ４、およびＢＭＫ−１０Ｇ１１−Ｆ３によって発現された免疫グロブリン遺伝子のＶＨおよびＶＬ領域を、Ａｌｄｅｖｒｏｎの（ドイツＦｒｅｉｂｕｒｇ）の専売プライマー組を用いて、標準のＲＴ−ＰＣＲプロトコールを使用してハイブリドーマ細胞から産生させたｃＤＮＡから増幅させた。標準の色素−ターミネーターキャピラリーシーケンシング方法を使用してシーケンシングした後、ＶＨ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒトＩｇＧ１定常領域のコード配列とインフレームでｇＷＩＺ発現ベクター（Ａｌｄｅｖｒｏｎ）内にクローニングした一方で、ＶＬ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒトカッパ鎖定常領域のコード配列とインフレームで同じ発現ベクター内にクローニングした（図１５）。
【０３９３】
簡単にするためにｃｈ３Ｂ６、ｃｈ６Ｃ９、およびｃｈ５Ｂ５と定義する３つのキメラ抗体、ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７、ＢＭＫ−３Ｂ６−Ｅ４、およびＢＭＫ−６Ｃ９−Ｃ１１のそれぞれの重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、細胞系２９３Ｆ内に一過的に同時形質移入させ、抗体を、ＰＢＳ、ｐＨ７．２中、タンパク質Ａセファロースアフィニティークロマトグラフィーによって、≧２Ｌの細胞上清から、２〜３ｍｇ／ｍＬの最終濃度で精製した。収率は、抗体および調製方法に応じて、２０および３０ｍｇ／リットルの上清からのものである。品質管理により組換え抗体の純度および単量体状態が確認された（図１６）。
【０３９４】
キメラ抗体を、ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ７肝細胞癌細胞の表面上に発現されるＦＧＦＲ４と結合するその能力について、ＦＡＣＳによって制御した。ｃｈ３Ｂ６を、高レベルのＦＧＦＲ４  Ｙ３６７Ｃ突然変異体を発現すると記載されている乳がん細胞系ＭＤＡ−ＭＢ４５３に対しても試験した（Roidl et al., 2010）。アッセイは実施例７に記載のように行ったが、この事例では抗ヒト蛍光二次抗体（ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｒ−フィコエリスリン［Ｒ−ＰＥ］コンジュゲート、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用した。
【０３９５】
代表的なデータを図１７に報告する。
【０３９６】
キメラ抗体は、低いｎＭ範囲の同様の解離定数で対応するラットｍＡｂの結合活性を保持していることが確認された。さらに、ｃｈ３Ｂ６はＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞において過剰発現されるＦＧＦＲ４  Ｙ３６７Ｃ突然変異体とも効率的に結合することが示された。この突然変異型の受容体は、優性、リガンド非依存性の、構成的活性化される変異体であり、既知の拮抗性抗体を用いた阻害に対して非感受性であると記載されている（Roidl et al., 2010）。
【０３９７】
その後、ＦＧＦ受容体ファミリーの他のメンバーと比較した、ＦＧＦＲ４に対するキメラ抗体の結合親和性および特異性を、固相受容体結合アッセイならびにヒトキメラ受容体ＦＧＦＲ１−Ｆｃ、ＦＧＦＲ２−Ｆｃ、ＦＧＦＲ３−Ｆｃ、およびＦＧＦＲ４−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、インビトロで測定した。ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２では、アルファおよびベータのスプライシング変異体をどちらも試験した。さらに、２つのＦＧＦＲ２変異体のそれぞれについて、ＩｇＩＩＩドメインが異なる２つの追加の選択的スプライシング変異体ＩＩＩｂおよびＩＩＩｃを試験した。これおよび以下に記載した他方の固相結合アッセイは、以下の修正を用いて、本質的に実施例７に記載のように行った。９６ウェルマイクロプレートを、ＰＢＳ中に２ｕｇ／ｍＬのヒトキメラ受容体ＦＧＦＲ−Ｆｃを用いて、終夜、４℃で直接コーティングした。増大する抗体濃度と共にインキュベートした後、ＨＲＰとコンジュゲートさせたヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆａｂ特異的、二次抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を１：２５００希釈で検出に使用した。
【０３９８】
代表的な用量応答結合曲線を図１８に示す。
【０３９９】
このアッセイにおいて、キメラ抗体ではＦＧＦＲ４に対してナノモーラー以下の親和性が確認された一方で、他のＦＧＦ受容体に対しては顕著な結合は測定されなかった。
【０４００】
次に、本発明者らは、増大する抗体濃度と共にインキュベーションした後に、２３ｎＭの等モル濃度のＦＧＦ１９／ヘパリンを加えることによって、実施例８のように行った固相アッセイにおいて、ＦＧＦ１９とＦＧＦＲ４−Ｆｃとの結合を防止する／それと競合することにおけるキメラ抗体の効率を確認した。
【０４０１】
代表的な用量応答阻害曲線を図１９に示す。
【０４０２】
その後、ＨＣＣ細胞系Ｈｕｈ７に対するキメラ抗体の抗増殖活性を、液体中でのクローン原性アッセイにおいて評価した。ＦＧＦＲ４阻害剤ＢＬＵ９９３１を、０．２ｕＭから５ｕＭまでの増大する濃度で、参照として含めた。
【０４０３】
代表的な結果を図２０に示す。
【０４０４】
３つの抗体を用いたＨｕｈ７細胞の連続的処理は、様々な程度ではあるが、対照と比較してコロニー数の減少を引き起こした。３０および１００ｕｇ／ｍＬ（それぞれ０．２ｕＭおよび０．６ｕＭ）の濃度での抗体ｃｈ３Ｂ６によって示された抗増殖効果は、同じ濃度の化合物ＢＬＵ９９３１で観察されたものに匹敵していた。他の２つの抗体はより顕著でない阻害効果を示した。
【０４０５】
観察された抗増殖効果の特異性を確認するために、３つの抗ＦＧＦＲ４キメラ抗体を、感受性ＨＣＣ細胞系Ｈｕｈ７においてＦＧＦＲ４シグナル伝達経路の活性化を妨げるその能力について評価した。この目的のために、ＦＧＦ１９を用いた細胞処理によって誘導された、ＦＧＦＲ４およびアダプタータンパク質ＦＲＳ２のリン酸化に対する阻害効果を、ウエスタンブロットによって分析した（図２１）。
【０４０６】
３つの抗体すべておよび陽性対照ＢＬＵ９９３１が、Ｈｕｈ７細胞においてＦＧＦ１９誘導性のＦＧＦＲ４およびＦＲＳ２のリン酸化を阻害することができた。
【０４０７】
インビトロの実験的証拠に基づいて、３つのキメラ抗体の潜在的な治療的抗腫瘍効果を、インビボモデルにおいて、ＨＣＣ細胞系Ｈｕｈ７を移植した免疫不全マウスを使用して評価した。５０％のＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中に５×１０６個のＨｕｈ７細胞の懸濁液を、３５匹の５〜６週齢の無胸腺症ヌードマウス（Ｅｎｖｉｇｏ）のそれぞれの脇腹に皮下接種した。移植の１２日後、測定可能な腫瘍を示したマウスを４つの群、すなわち、ＢＭＫ−３Ｂ６−Ｅ４、ＢＭＫ−６Ｃ９−Ｃ１１、ＢＦＧ−５Ｂ５−Ｇ７（ｎ＝８）、および対照（ｎ＝７）の群にランダムに割り当て、すべての群で平均腫瘍容量は１０７ｍｍ３であった。マウスを、ＩＰ注射によって、週に２回、３週間投与したＰＢＳ中に２５ｍｇ／Ｋｇのそれぞれの抗体で処置した。対照群には対応する容量のブランク注射（ＰＢＳ）を与えた。マウスの重量を週に２回制御し、腫瘍の大きさ（長軸および短軸）をバーニアカリパスで週に２回測定した。腫瘍容量は以下の式を使用して計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝ｄ２×Ｄ／２（式中、ｄおよびＤはそれぞれ最短および最長の直径をいう）。
【０４０８】
対照群と比較して、それぞれの抗体で処置したマウスにおいて腫瘍容量の低下が観察され、これは、処置の１６日目から統計的に有意となり始めた差異である（図２２）。対照的に、体重減少または臨床的有害作用は観察されなかった（示さず）。
【０４０９】
研究の最後に、生存マウスを屠殺し、残留腫瘍塊を収集し、それぞれｑＲＴ−ＰＣＲ、ウエスタンブロット、および免疫組織化学によって特異的バイオマーカーを評価するために３つの断片に分割した。
【０４１０】
最初に、本発明者らは、実施例８に詳述するように、処置したマウス腫瘍において、抗体の、正常および腫瘍の肝細胞の両方においてｍＲＮＡレベルでＦＧＦＲ４シグナル伝達経路のＦＧＦ１９依存性活性化によって調節される２つのＦＧＦＲ４および肝臓に特異的なバイオマーカー、すなわちＣＹＰ７Ａ１およびＣＴＧＦの転写を変調する能力を評価した。本発明者らは、肝細胞癌細胞培養物を対応するラット抗ＦＧＦＲ４抗体で処理することで、これら２つの遺伝子の発現のＦＧＦ１９依存性変調が部分的に復帰したことを既に示している（実施例８および９）。
【０４１１】
このエクスビボ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）研究では、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイを、実施例８に詳述した実験手順を使用して、３つの抗ＦＧＦＲ４キメラ抗体のそれぞれまたはＰＢＳで処置したマウスから収集した腫瘍試料から抽出した全ＲＮＡを用いて行った。
【０４１２】
この分析の結果を図２３に示す。
【０４１３】
キメラ抗ＦＧＦＲ４抗体の治療的投与は腫瘍中の分析したバイオマーカーの変調を引き起こし、これは、この肝臓異種移植片モデルにおけるＦＧＦＲ４シグナル伝達経路の活性化に対する拮抗効果と一貫している。
【０４１４】
観察された抗腫瘍活性の特異性をさらに確認するために、処理した腫瘍におけるＦＧＦＲ４ならびにＭＡＰキナーゼＥＲＫ１／２（細胞外調節キナーゼ１および２）のリン酸化に対する抗体の阻害効果を評価した。処置マウスおよび対照マウスから収集した腫瘍試料から調製したタンパク質抽出物を、ウエスタンブロットによって分析した（図２４）。
【０４１５】
抗体ｃｈ３Ｂ６は、処置マウスからの腫瘍において、対照腫瘍において測定されたＦＧＦＲ４およびＥＲＫ１／２のリン酸化レベルを顕著に減少させることが示された。
【０４１６】
全体的に、エクスビボの実験的証拠は、抗ＦＧＦＲ４キメラ抗体を用いた治療処置が、それに対して成長阻害効果が示されたＨｕｈ７腫瘍において、ＦＧＦＲ４シグナル伝達の様々な構成成分を変調することを示している。
【０４１７】
その後、抗体の受容体媒介性の細胞内内部移行をＨｕｈ７において評価した。細胞表面受容体との結合を促進するために、細胞を、３つの抗ＦＧＦＲ４キメラ抗体のそれぞれまたは無関係の抗体１Ｈ４を用いて、１時間、４℃で処理した。インキュベーションの最後（時刻０）に試料を収集し、その後、抗体−受容体複合体の内部移行を育成するために細胞を３７℃で移し、様々な時点で収集して、既に記載のようにＦＡＣＳ分析を行った。結果を表１６に要約する。
【０４１８】
表１６．Ｈｕｈ７細胞における３つのキメラ抗体のＦＧＦＲ４依存性内部移行。細胞を、抗ＦＧＦＲ４抗体または無関係の抗体１Ｈ４を用いて１時間、４℃で処理し（時刻０）、その後、３７℃でインキュベートした。表示した時点で試料を収集し、ＦＡＣＳ分析に供した。データは時刻０で測定された相乗平均蛍光値の百分率として表す。
【表１６】
2020537490.tif 000041
【０４１９】
分析により、抗ＦＧＦＲ４抗体で処理した試料において膜シグナルの時間依存性の減少が示されたが、陰性対照抗体では示されず、したがって、特異的な受容体媒介性の細胞内部移行が示唆される。
【０４２０】
次に、本発明者らは、３つの抗体のＦＧＦＲ４細胞外領域内の抗原結合部位の同定に進んだ。この目的のために、ＦＬ  ＦＧＦＲ４または実施例８に詳述した３つのＦＧＦＲ４欠失突然変異体（ｄ１、ｄ２、ｄ３）を異所的に発現するＢＯＳＣ２３レポーター細胞を、それぞれの抗体で処理し、既に記載のようにＦＡＣＳによって分析した。結果を図２５に模式的に報告する。
【０４２１】
３つの抗体すべてで、完全長受容体に対するその反応性が確認され、ｄ１突然変異体に対しても陽性の結果をもたらし、したがって、ＩｇＩドメインと相互作用しないことが示された。抗体ｃｈ３Ｂ６は、ｄ２突然変異体に対する陽性を完全に失い、したがって、酸ボックスに対する結合特異性が示された。ｄ２突然変異体に対する反応性を保持していた他の２つの抗体は、ｄ３に対して陰性の結果をもたらし、したがって、ＩｇＩＩドメインに対する結合特異性が示され、ｃｈ５Ｂ５の場合は、対応するラット抗体で得られた結合データが確認された。
【０４２２】
抗原結合部位の同定は、完全な標的タンパク質アミノ酸配列をカバーする、重複する合成ペプチドのライブラリの、目的抗体を用いた走査に基づいたエピトープマッピングＥＬＩＳＡ技術を使用して確認した。
【０４２３】
この目的のために、２３および２２個の、１１個のアミノ酸の配列重複を有する１５個のアミノ酸のペプチドを、それぞれＦＧＦＲ４ドメインＩｇＩ（ａａ２２〜１１８）およびＩｇＩＩ（ａａ１５７〜２４１）の配列に基づいて合成した。２６個の追加の、１３個のアミノ酸の配列重複を有する１５個のアミノ酸のペプチドを、ＦＧＦＲ４酸ボックスドメインの配列（ａａ１１９〜１５６）（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に基づいて合成した。すべてのペプチドを、Ｎ末端で化学的スペーサーを介してビオチンとコンジュゲートさせて、ストレプトアビジンでコーティングしたマイクロプレートと結合させた。３つのキメラ抗体の結合特異性を、ＥＬＩＳＡによって、陽性対照としてキメラ抗ｍｙｃ抗体（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ）および対応する合成ビオチン化ペプチドエピトープ（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含めた、ＩｇＩ、ＩｇＩＩ、および酸ボックスドメインに対応する３つのペプチドライブラリに対して評価した。ストレプトアビジンでコーティングした高結合能の９６ウェル白色マイクロプレート（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のそれぞれのウェルを、２００ｕＬの遮断緩衝液（０．１％のＢＳＡおよび０．５％のＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、ウェルを１００ｕＬのそれぞれのペプチドでコーティングし、室温で２時間振盪して、５０ｕＭの濃度の遮断緩衝液に懸濁させた。２００ｕＬの遮断緩衝液で３回洗浄した後、遮断緩衝液に１５０ｕｇ／ｍＬの濃度で希釈した１００ｕＬのそれぞれの抗体を加え、室温で１．５時間振盪してインキュベートした。２００ｕＬの遮断緩衝液で３回洗浄した後、１００ｕＬのＨＲＰとコンジュゲートさせたヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆａｂ特異的二次抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を遮断緩衝液中に１：１００００希釈で加え、室温で１時間振盪してインキュベートした。２００ｕＬの遮断緩衝液で４回洗浄した後、１００ｕＬの化学発光性ＨＲＰ基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ化学発光性基質、Ｐｉｅｒｃｅ／Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を加え、１分後にマイクロプレートリーダーＭｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ＤＴＸ  ８８０（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してルミネセンスを測定した。
【０４２４】
ＦＧＦＲ４欠失分析から予想されたように、どのキメラ抗体もＩｇＩドメインに対応するペプチドに対して特異的反応を示さず（示さず）、抗体ｃｈ６Ｃ９およびｃｈ５Ｂ５は酸ボックスに対応するペプチドに対しても陰性の結果をもたらした。ｃｈ６Ｃ９は、ＩｇＩＩドメインに対応するペプチドに対して、複数のピークに分配された低い反応性を示し、これがこの領域中の非連続的／コンフォメーションエピトープを認識することを示唆している。対照的に、ｃｈ５Ｂ５は、ドメインＩｇＩＩ内の３つの重複ペプチドに対して高く特異的な反応性を示し、したがって２３個のアミノ酸の直線状エピトープを定義している（図２６Ａ）。
【０４２５】
他の抗体とは異なり、ｃｈ３Ｂ６は酸ボックスに対応する特異的ペプチドに対して明白な陽性を示し、したがってＦＧＦＲ４欠失データが確認されている。この事例でも反応性は離散的なピーク数内で分配されているが、この抗体について、アミノ酸１２７〜１５４を含む酸ボックス内で非連続的な結合部位を定義することが可能であった（図２６Ｂ）。図２６Ｃに示すヒトＦＧＦＲ４タンパク質配列とマウスオーソロガス配列とのアラインメントは、実験により同定されたｃｈ３Ｂ６エピトープ内の結合に寄与する残基が対応するマウス配列において保存されていることを示しており、したがってネズミ受容体に対する抗体の観察された交差反応性を支持している。
【実施例１１】
【０４２６】
抗ＦＧＦＲ４抗体ｃｈ３Ｂ６のヒト化
その後、本発明者らは、元のハイブリドーマラットＣＤＲ配列を選択されたヒト免疫グロブリン可変領域内に移植することによる抗体ｃｈ３Ｂ６のヒト化に進んだ。ヒト化変異体を最適化するために、元のラット抗体３Ｂ６のものと最も類似しているヒト生殖系列免疫グロブリン可変配列を同定および選択した。既知の免疫グロブリン結晶構造との相同性に基づいて、選択されたヒト生殖系列可変領域の３Ｄモデルを重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）のどちらについても作製した。ヒトフレームワーク内のどの追加のアミノ酸残基を、対応する元のネズミ残基によって置換する必要があるかを決定するために、抗原結合またはＶＨ／ＶＬの配向に潜在的に影響を与えているアミノ酸に特に注意しながら、３Ｄモデル内のそれぞれのアミノ酸位置を評価した。いくつかの位置では、ヒトまたはラットのアミノ酸の間の理論的に最適な選択肢は自明でなく、したがって実験により試験する必要があった。そのため、ヒト化配列のわずかに異なるバージョン、すなわちそれぞれＶＨを３つおよびＶＬを２つ設計し、その組合せにより６つの異なる抗体が生じる。このプロセスを図２７に図式化する。
【０４２７】
さらに、本発明者らは、本発明者らの実験においてベンチマークとして含める既知のヒト化抗ＦＧＦＲ４抗体（ｈＬＤ１．ｖ２２  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、ＵＳ９２６６９５５号Ｂ２）およびアイソタイプ対照として使用する無関係の抗体ベズロトクスマブ（Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ）を選択した。３Ｂ６ヒト化ＶＨおよびＶＬ変異体のアミノ酸配列を表１７に列挙する。
表１７．ヒト化可変配列の、ＶＨの３つの変異体およびＶＬの２つの変異体を示す。元のラット３Ｂ６配列と比較したアミノ酸の変更を太字で示した一方で、移植に選択したヒト生殖系列配列と比較した変更に下線を引いた。表１７は、それぞれ配列番号２〜４および１２〜１３を出現順に開示している。
【０４２８】
【表１７】
2020537490.tif 000042
【０４２９】
抗体３Ｂ６に提案されている５つのアミノ酸変異体をコードするＤＮＡ配列を、必要な場合にラットアミノ酸のコドンを移植および導入するために選択した、ヒト生殖系列免疫グロブリン可変領域のヌクレオチド配列に基づいて決定した。対照抗体では、ＤＮＡ配列は、代わりに、オンラインで利用可能なコドン最適化方法（http://eu.idtdna.com/CodonOpt）の支援により決定した。
【０４３０】
これらの断片のそれぞれをｃｈ３Ｂ６重鎖および軽鎖発現ベクター内にクローニングするために適した、ユニークな制限酵素認識部位を末端に有する、５つの３Ｂ６変異体および対照抗体の合成ＤＮＡ断片を生成した（実施例１０）。完全にヒト化した発現ベクターは、発現ベクターｇＷｉｚ−３Ｂ６−Ｅ４−Ｇ１中の元のラットＶＨコード配列を、３つのヒト化３Ｂ６ＶＨコード配列のそれぞれで置き換えることによって、および発現ベクターｇＷｉｚ−３Ｂ６−Ｅ４−ｋ中の元のラットＶＬコード配列を、２つのヒト化３Ｂ６ＶＬコード配列のそれぞれで置き換えることによって、作製した（図２８）。同一のクローニング戦略を使用して、対照抗体の重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを作製した。すべてのＤＮＡコンストラクトはシーケンシングによって制御した。
【０４３１】
６つの３Ｂ６ヒト化変異体のそれぞれ（表１８）および陽性と陰性対照抗体の重鎖および軽鎖をコードする発現ベクターを、細胞系２９３Ｆ内に一過的に同時形質移入させ、ｃｈ３Ｂ６の重鎖および軽鎖を発現するベクターも同様とした。
【０４３２】
表１８．  ＶＨおよびＶＬ配列の組合せ、ならびに対応するＣＤＲＨおよびＣＤＲＬ配列の組合せで作製された６つのヒト化抗体変異体を列挙する。数値は配列番号に対応する。
【表１８】
2020537490.tif 000043
【０４３３】
細胞上清ウエスタンブロット分析により、すべての異なる３Ｂ６ヒト化変異体がキメラ３Ｂ６抗体よりも高いレベルで発現されたことが示された（図２９）。
【実施例１２】
【０４３４】
６つの３Ｂ６ヒト化変異体の特徴づけ
表１８に列挙した６つの３Ｂ６ヒト化変異体を、実施例８のように行った既に記載した固相アッセイにおいて、ＦＧＦ１９と固定した受容体との結合を阻害するその能力について用量応答実験で評価した。
【０４３５】
ＦＧＦ１９およびヘパリンを加える前に、固定したＦＧＦＲ４−Ｆｃを増大する濃度のそれぞれの抗体と共にプレインキュベートした。キメラｃｈ３Ｂ６抗体および実施例１１に記載のｈＬＤ１．ｖ２２抗体を陽性対照として含めた一方で、無関係の抗体ベズロトクスマブをアイソタイプ対照として使用した。
【０４３６】
図３０に示すように、アイソタイプ対照を例外として、すべての試験した抗体が、ｃｈ３Ｂ６および陽性対照抗体について計算されたものに非常に類似した、ｎＭ以下／低ｎＭの範囲のＩＣ５０値でＦＧＦ１９−ＦＧＦＲ４の結合の明白な用量依存的な阻害を引き起こした。
【実施例１３】
【０４３７】
ｃｈ３Ｂ６および市販の抗体ａｂ４１９４８の比較分析
オンラインで利用可能なデータシートによれば、Ａｂｃａｍによって販売されているウサギポリクローナル抗体ａｂ４１９４８は、ヒトＦＧＦＲ４の残基１００〜２００内から由来する非開示の配列の合成ペプチドに対して産生されたものである。この抗体は、ヒト受容体と特異的に反応し、ＷＢ、ＩＣＣ／ＩＦ、およびＩＨＣの応用に適していると記載されている。利用可能なデータに基づくと、ｃｈ３Ｂ６とは異なり、ａｂ４１９４８はネズミ受容体と交差反応しない。
【０４３８】
ａｂ４１９４８がｃｈ３Ｂ６といくらかの生物学的特性を共有するかどうかを評価するために、本発明者らは２つの抗体の比較分析を行った。
【０４３９】
最初に、本発明者らは、市販の抗体ａｂ４１９４８が本発明者らの固相受容体結合アッセイにおいてｈＦＧＦＲ４−Ｆｃ組換えタンパク質と結合できることを制御した。アッセイは本質的に実施例１０に記載のように行った。増大する抗体濃度と共にインキュベーションした後、ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＬ）−ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して、１：２０００希釈で検出した。
【０４４０】
図３１ａの代表的な用量応答結合曲線によって示されるように、ａｂ４１９４８はナノモーラー以下の親和性で受容体と効率的に結合することができた。
【０４４１】
次に、本発明者らは、増大する抗体濃度と共にインキュベーションした後に、２３ｎＭの等モル濃度のＦＧＦ１９／ヘパリンを加えることによって、実施例８のように行った固相アッセイにおいて、ＦＧＦ１９とＦＧＦＲ４−Ｆｃとの結合を防止する／それと競合する、ａｂ４１９４８の能力を評価した。ｃｈ３Ｂ６を陽性対照として平行して再試験した。
【０４４２】
代表的な用量応答阻害曲線を図３１ｂに示す。ｃｈ３Ｂ６はＦＧＦ１９と受容体との結合を０．２ｕｇ／ｍＬ（１．３ｎＭ）のＩＣ５０値で効率的に阻害することが確認された一方で、ａｂ４１９４８は完全に不活性の結果をもたらした。
【０４４３】
最後に、ａｂ４１９４８抗体を、ｃｈ３Ｂ６と並べて、感受性ＨＣＣ細胞系Ｈｕｈ７においてＦＧＦＲ４シグナル伝達経路の活性化を妨げるその能力について評価した。この目的のために、ＦＧＦ１９を用いた細胞処理によって誘導された、下流エフェクタータンパク質ＦＲＳ２のリン酸化に対する阻害効果を、ウエスタンブロットによって分析した（図３１ｃ）。
【０４４４】
ｃｈ３Ｂ６とは対照的に、ａｂ４１９４８は、Ｈｕｈ７細胞においてＦＧＦ１９誘導性のＦＲＳ２リン酸化を阻害することができないという結果をもたらした。
【０４４５】
結論として、主要な機能的アッセイにおいてａｂ４１９４８抗体によって示された生物活性の欠如に基づいて、２つの抗体はＦＧＦＲ４酸ボックス領域内で同じエピトープと結合しないと結論づけることができる。
【実施例１４】
【０４４６】
結腸ＣＳＣ由来の異種移植片モデルに対するｃｈ３Ｂ６抗腫瘍活性
本発明者らは、免疫不全マウスにおける結腸ＣＳＣの注射によって作製された皮下腫瘍に対する抗体ｃｈ３Ｂ６の効果をアッセイした。
【０４４７】
ＣＴＳＣ８５細胞を冷ＰＢＳに再懸濁させ、懸濁液を、等容量の冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と５×１０６個の細胞／ｍＬの最終細胞濃度で混合した。２６匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に０．２ｍＬの細胞／Ｍａｔｒｉｇｅｌ懸濁液を皮下注射した。移植の３週間後、測定可能な腫瘍を示したマウスを２つの処置群、すなわち抗ＦＧＦＲ４抗体ｃｈ３Ｂ６群およびビヒクル対照群にランダムに割り当て（ｎ＝９）、それぞれの群で平均腫瘍容量は６５ｍｍ３であった。
【０４４８】
マウスを、ＩＰ注射によって、週に２回、２週間投与したＰＢＳ中に２５ｍｇ／Ｋｇのｃｈ３Ｂ６抗体で処置した。対照群には対応する容量のブランク注射（ＰＢＳ）を与えた。マウスの重量を週に２回制御し、腫瘍の大きさ（長軸および短軸）をバーニアカリパスで週に２回測定した。腫瘍容量は以下の式を使用して計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝ｄ２×Ｄ／２（式中、ｄおよびＤはそれぞれ最短および最長の直径をいう）。
【０４４９】
ビヒクルで処理した対照と比較して、ｃｈ３Ｂ６は腫瘍の成長速度を顕著に低下させた（図３２）。体重減少または臨床的有害作用は処置の期間中に観察されなかった。
【実施例１５】
【０４５０】
結腸ＣＳＣ由来の肝臓転移モデルに対するｃｈ３Ｂ６およびｃｈ６Ｃ９の抗腫瘍活性
本発明者らは、免疫不全マウスの肝臓における結腸ＣＳＣの注射によって作製された肝臓転移に対する、抗体ｃｈ３Ｂ６およびｃｈ６Ｃ９の効果をアッセイした。
【０４５１】
この目的のために、レポーターＣＴＳＣ８５  ＬＵＣ−ＧＦＰ細胞系を使用した。ＣＴＳＣ８５  ＬＵＣ−ＧＦＰ細胞は、ｐＲＲＬｓｉｎ−ｃＰＰＴ−ｈＣＭＶ−ｈＰＧＫ−ＧＦＰ−Ｗｐｒｅベクターを使用したレンチウイルス感染によって作製した（Ricci-Vitiani et al., 2004）。ルシフェラーゼｃＤＮＡをＧＦＰレンチウイルスベクター内にクローニングした（Ricci-Vitiani et al., 2004）。レンチウイルス粒子は、以前に記載されているように、パッケージングヒト胎児腎臓細胞系２９３Ｔ中のリン酸カルシウム形質移入プロトコールによって生成した（Ricci-Vitiani et al., 2004）。ウイルス上清を形質移入の４８時間後に収集し、０．４５μｍ孔径のフィルターを通して濾過し、８μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で細胞に加えた。細胞を３０分間、１８００ｒｐｍで遠心分離した。感染後、形質導入細胞の蛍光をＦＡＣＳＣａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって評価した。
【０４５２】
ＣＴＳＣ８５  ＬＵＣ−ＧＦＰ細胞を冷ＰＢＳに再懸濁させ、懸濁液を等容量の冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）と１．２５×１０７個の細胞／ｍＬの最終細胞濃度で混合した。２０ｕＬの細胞／Ｍａｔｒｉｇｅｌ懸濁液（２５００００個の細胞）を、３０匹のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）のそれぞれの肝実質内に注射した。腫瘍成長を、ルシフェラーゼ標識したがん細胞の生物発光イメージングによって、ＩＶＩＳ  スペクトル撮像装置（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用してモニタリングした。移植の１０日間後、マウスを３つの群、すなわち、ｃｈ３Ｂ６群、ｃｈ６Ｃ９群、および対照群にランダムに割り当て（ｎ＝７）、すべての群で同様の平均光子数／秒の値であった。マウスを、ＩＰ注射によって、週に２回、４週間投与したＰＢＳ中に２５ｍｇ／Ｋｇのそれぞれの抗体で処置した。対照群には対応する容量のブランク注射（ＰＢＳ）を与えた。マウスの体重および腫瘍成長を週に１回測定した。処置マウスを、腫瘍シグナルおよび体重の測定以外は２週間までさらなる処置を全く用いずに維持し、その後、頸椎脱臼によって屠殺した。
【０４５３】
ビヒクルで処理した対照と比較して、ｃｈ３Ｂ６およびｃｈ６Ｃ９はどちらも腫瘍の成長速度を低下させることができた（図３３）。特定には、ｃｈ３Ｂ６によって示された抗腫瘍効果は統計的有意性に到達した。
【０４５４】
体重減少または臨床的有害作用は処置の期間中に観察されなかった。
【０４５５】
参考文献
【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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