(57)【要約】  開示される方法は、一般に、免疫再構築を加速する、ＧＶＭ効果を誘導する、および／または腫瘍細胞を標的化するように設計されたＴ細胞治療の副作用を予防する、処置する、抑制する、管理するまたは他の形で軽減することを対象とする。
2020528455.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
副作用を軽減する一方で、その処置を必要とする患者にリンパ球注入の利益を提供する方法であって、
（ａ）ドナーサンプルからＨＰＲＴ欠損リンパ球を生成するステップ；
（ｂ）改変リンパ球の集団を提供するためにｅｘ  ｖｉｖｏで該ＨＰＲＴ欠損リンパ球をポジティブ選択するステップ；
（ｃ）ＨＳＣグラフトを該患者に投与するステップ；
（ｄ）該ＨＳＣグラフトの投与後に該改変リンパ球の集団を該患者に投与するステップ；および
（ｅ）副作用が生じた場合に、場合によりＭＴＸを投与するステップ
を含む前記方法。
【請求項２】
ＨＰＲＴ欠損リンパ球は、ＨＰＲＴ遺伝子のノックダウンを通じて生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＨＰＲＴ欠損リンパ球は、ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウトを通じて生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ポジティブ選択は、生成されたＨＰＲＴ欠損リンパ球をプリン類似体と接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
プリン類似体は、６ＴＧである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
６ＴＧの量は、約１から約１５μｇ／ｍＬの間である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ポジティブ選択は、生成されたＨＰＲＴ欠損リンパ球をプリン類似体およびアロプリノールの両方と接触させるステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＨＳＣグラフトは、骨髄破壊的前処置後に患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
改変リンパ球は、単一ボーラスとして投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
改変リンパ球の複数用量が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
各用量は、細胞約０．１×１０６個／ｋｇから細胞約２４０×１０６個／ｋｇを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
改変リンパ球の合計投薬量は、細胞約０．１×１０６個／ｋｇから細胞約７３０×１０６個／ｋｇを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
改変リンパ球の投与は、ＨＳＣグラフトの投与の２から４週間後に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＭＴＸは、ＧＶＨＤの診断で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約１００ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ＭＴＸは、用量設定された用量で投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
副作用を軽減する一方で、その処置を必要とする患者にリンパ球注入の利益を提供する方法であって、
（ａ）ドナーサンプルからＨＰＲＴ欠損リンパ球を生成するステップ；
（ｂ）改変リンパ球の集団を提供するためにｅｘ  ｖｉｖｏで該ＨＰＲＴ欠損リンパ球をポジティブ選択するステップ；および
（ｃ）ＨＳＣグラフトの投与と同時にまたはその後に該改変リンパ球の集団を該患者に投与するステップ
を含む前記方法。
【請求項１８】
副作用が生じた場合にＭＴＸを投与するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約１００ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
その処置を必要とする患者において血液学的がんを処置する方法であって、
（ａ）ドナーサンプルからＨＰＲＴ欠損リンパ球を生成するステップ；
（ｂ）改変リンパ球の集団を提供するためにｅｘ  ｖｉｖｏで該ＨＰＲＴ欠損リンパ球をポジティブ選択するステップ；
（ｃ）ＨＳＣグラフトを該患者に投与することによって少なくとも部分的な移植片対悪性腫瘍効果を誘導するステップ；および
（ｄ）残存疾患または疾患再発の検出後に該改変リンパ球の集団を該患者に投与するステップ
を含む前記方法。
【請求項２２】
ＭＴＸの１またはそれ以上の用量を投与するステップをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
その処置を必要とする患者においてがんを処置する方法であって、
（ａ）抗腫瘍性キメラ受容体を含み、ＨＰＲＴ欠損であるＣＡＲ−Ｔ細胞を生成するステップ；
（ｂ）投与のためのＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を提供するためにｅｘ  ｖｉｖｏでＨＰＲＴ欠損ＣＡＲ−Ｔ細胞をポジティブ選択するステップ；
（ｃ）該ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を該患者に投与するステップ
を含む前記方法。
【請求項２４】
ＧＶＨＤまたはＣＲＳの少なくとも１つの症状を抑制するためにＭＴＸの少なくとも１用量を投与するステップをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＨＰＲＴ欠損ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＨＰＲＴ遺伝子のノックダウンを通じて生成される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約１００ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
投与されるＭＴＸの量は、約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
その処置を必要とする患者においてがんを処置する方法であって、
（ａ）ＨＰＲＴ欠損である腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を生成するステップ；
（ｂ）投与のための腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の集団を提供するためにｅｘ  ｖｉｖｏでＨＰＲＴ欠損腫瘍抗原特異的Ｔ細胞をポジティブ選択するステップ；および
（ｃ）該腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の集団を該患者に投与するステップ
を含む前記方法。
【請求項２９】
ＧＶＨＤの少なくとも１つの症状を抑制するためにＭＴＸの少なくとも１用量を投与するステップをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
患者において副作用を軽減する一方で、リンパ球注入の利益を提供する方法であって、
（ｉ）ＨＰＲＴ欠損である改変Ｔ細胞を該患者に投与するステップ；および
（ｉｉ）副作用の発症で該患者にＭＴＸを投与するステップ
を含む前記方法。
【請求項３１】
ＨＰＲＴ欠損であり、抗腫瘍性キメラ受容体を含むリンパ球の集団であって、ＭＴＸおよび／またはＭＰＡの存在下でネガティブ選択に感受性である、前記リンパ球の集団。
【請求項３２】
請求項３１に記載のリンパ球の集団および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／５３３，７０７号、２０１７年７月１８日出願の利益を主張するものであり、その開示はその全体をそれぞれ参照によって本明細書に組み入れる。
【０００２】
開示の分野
本開示は、一般に分子生物学の分野、具体的にはベクターおよびベクターによって形質導入された宿主細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
他では致死性の疾患のための治療選択肢としての同種幹細胞移植（ａｌｌｏ−ＳＣＴ）の使用は、増加し続けている。しかし、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）は、ａｌｌｏ−ＳＣＴの主な合併症であり続けており、約４０〜６０％に至るａｌｌｏ−ＳＣＴ患者を冒している。ＧＶＨＤは、免疫コンピテント細胞、すなわちＴリンパ球が、宿主細胞上の膜抗原を認識する場合に生じると考えられている。これらの膜抗原として、ヒト白血球抗原系によって提示される主要および非主要組織適合性抗原などの一連の宿主ポリペプチドが挙げられる。これらのポリペプチドの多型性はＴ細胞活性化および種々の細胞エフェクター機序を通じて最終的に組織損傷を引き起こすと考えられている。ドナー免疫細胞の活性化は、強い移植前処置に伴う組織損傷部位から放出されるサイトカインによっても増大される（「サイトカインストーム」）。
【０００４】
急性ＧＶＨＤ（ａＧＶＨＤ）は、移植術後の最初の１００日間に通常生じる一方で、慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）の発症は後に観察される。急性および慢性の両方のＧＶＨＤの発症期間における変化が、急性症例が移植術後約１００日で生じ、慢性症例が通常より早期に認められて観察された。急性および慢性ＧＶＨＤの伝統的パターンからのこれらの変化は、前処置強度の低減、および幹細胞供給源としての末梢血液の使用の状況下で特に観察された。本明細書において使用される、用語「ＧＶＨＤ」は、急性および慢性の両方の移植片対宿主病を包含する。
【０００５】
造血前駆細胞または幹細胞移植術（ＨＳＣＴ）の目標は、免疫および／または造血性のキメラ化が生じる、レシピエント宿主内でのドナー細胞の良好な生着を達成することである。典型的にはそのような移植は、白血病、骨髄不全症候群および遺伝性障害（例えば、鎌状赤血球貧血、サラセミア、免疫不全障害およびムコ多糖症などの代謝性蓄積症）ならびに低悪性度リンパ腫などの障害の処置において使用される。キメラ化は、同種または異種ドナー由来の主要組織適合性抗原（ＭＨＣ）分子を保有するドナー細胞集団、およびレシピエント由来の細胞集団を用いた、レシピエントの血液免疫系の種々のコンパートメントの再構築または、代替的に、同種もしくは異種骨髄ドナーだけに由来するＭＨＣ分子を保有する細胞集団を用いて再構成することができるレシピエントの血液免疫系コンパートメントである。キメラ化は、１００％（同種または異種細胞による総置き換え）から分子法によってだけ検出可能である低レベルまで変化してよい。キメラ化レベルは、経時的に変化する場合があり、永続的または「一過性」であってよい。
【０００６】
ドナー白血球輸注入（ＤＬＩ）は、同種移植後に再発または残存疾患を処置するため、混合から完全ドナーキメラ化に転換するため、Ｔ細胞枯渇移植後の「追加輸注」として完全免疫機能を回復させるため、および再発に対する予防としての先制治療として使用されている。ＤＬＩ後の主な合併症として、急性および慢性ＧＶＨＤならびに、骨髄無形成または免疫抑制の使用に伴う感染が挙げられる。ほとんどの治験において、ＤＬＩの評価可能なレシピエントの約６０％に至るまでがＧＶＨＤを発症する。ＧＶＨＤは、すべてではないが一部の研究においてＧＶＴ活性および応答と相関する。
【０００７】
数年にわたって、ＧＶＨＤ予防および処置のために、免疫抑制性薬物療法、移植工学および細胞療法などのいくつかの方法が提案された。実際に、移植後免疫不全を予防もしくは軽減するためにＤＬＩ後のＧＶＨＤを最小化する、または残存もしくは再発疾患において移植片対悪性腫瘍（ＧＶＭ）を誘導するためのいくつかの手法が存在する。例えば、ＧＶＨＤを最小化すると考えられる１つの手法は、低用量ＤＬＩの投与に続く用量漸増を含む。ＤＬＩへの従来の手法は、さまざまな数のＣＤ３＋Ｔ細胞を含有する単一「バルク」用量を注入することであるが、これは、急性および慢性ＧＶＨＤの顕著な発生率および時に死亡と関連すると考えられている。一方、低細胞数で開始し、必要に応じてさまざまな時間間隔で投薬量を漸増させる、複数のアリコートでのドナーリンパ球の輸注は、ＧＶＨＤの発生率を低減できる。（非特許文献１を参照されたい）。用量漸増レジメンの使用の基礎となる前提は、ＧＶＨＤの発生率が投与される総細胞用量と共に増加することである。したがって、寛解を誘導できる最小限の細胞用量の同定は、ＧＶＨＤに対するリスクを低減すると考えられている。
【０００８】
代替的に、ＧＶＨＤは、ＧＶＨＤを媒介する原因となるほとんどの細胞を含むと考えられているＣＤ８＋リンパ球の枯渇を通じて低減できると考えられている（すなわち、ＧＶＨエフェクター細胞の枯渇）。結果は、移植片対白血病活性を最小限のＧＶＨＤを伴って保持できることを示唆している。少数の患者においては、応答の大部分は維持されているが、この手法の臨床的影響全体は、処置されていないＤＬＩとの直接比較を必要としている。
【０００９】
ＧＶＨＤは、ＧＶＨＤエフェクター細胞の不活性化を通じて低減できるとも考えられている。実際に、照射されたドナーＴ細胞ＤＬＩは、細胞が注入時にＧＶＭ効果を誘導するが、ａｌｌｏ−抗原への応答において増殖できないという仮説に基づいている。付加的に、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を発現するドナーＴ細胞の使用に続く、ガンシクロビル処置は、骨髄移植術後に生じるアロ反応性の調節に関係するその効果について研究された。
【００１０】
カルシニューリン阻害剤とメトトレキサート（ＭＴＸ）との組合せ療法は、ＧＶＨＤの発生率および重症度を低減するために良好に使用されており、ＧＶＨＤ予防のための標準治療である。ＧＶＨＤ予防のために使用された最古の薬物の１つＭＴＸは、ジヒドロ葉酸還元酵素ならびにチミジル酸およびプリンの産生を阻害し、それによりＴ細胞応答および増殖ならびに接着分子の発現を抑制すると考えられている。
【００１１】
これらの戦略の一部は、ＧＶＨＤの発生率を低減するために有効であるが、これらの戦略は、しばしばＧＶＭ効果の顕著な低減を伴い、それによりＨＳＣＴの全体的な効能を危うくする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍａｃｋｉｎｎｏｎ  Ｓ，Ｐａｐａｄｏｐｏｕｌｏｓ  ＥＢ，Ｃａｒａｂａｓｉ  ＭＨら、Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ  ｅｓｃａｌａｔｉｎｇ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ｆｏｒ  ｒｅｌａｐｓｅ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｆｔｅｒ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｂｌｏｏｄ．１９９５；８６：１２６１〜１２６８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本開示の一態様は、ドナーサンプルからＨＰＲＴ欠損リンパ球を生成するステップ；改変リンパ球の集団を提供するためにｅｘ  ｖｉｖｏでＨＰＲＴ欠損リンパ球をポジティブ選択するステップ；ＨＳＣグラフトを患者に投与するステップ；ＨＳＣグラフトの投与後に改変リンパ球の集団を患者に投与するステップ；および副作用が生じた場合に、場合によりＭＴＸを投与するステップを含む、副作用を軽減する一方で、その処置を必要とする患者にリンパ球注入の利益を提供する方法である。
【００１４】
一部の実施形態では、ＨＰＲＴ欠損リンパ球は、ＨＰＲＴ遺伝子のノックダウンを通じて生成される。一部の実施形態では、ＨＰＲＴ欠損リンパ球は、ＨＰＲＴ遺伝子のノックアウトを通じて生成される。一部の実施形態では、ポジティブ選択は、生成されたＨＰＲＴ欠損リンパ球をプリン類似体（例えば、６−チオグアニン（６ＴＧ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）またはアザチオプリン（ＡＺＡ））と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、ポジティブ選択は、生成されたＨＰＲＴ欠損リンパ球をプリン類似体および第２の薬剤と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、プリン類似体は６ＴＧである。一部の実施形態では、６ＴＧの量は、約１から約１５μｇ／ｍＬの間である。一部の実施形態では、ＨＳＣグラフトは、骨髄破壊的前処置後に患者に投与される。一部の実施形態では、改変リンパ球は、単一ボーラスとして投与される。一部の実施形態では、改変リンパ球は、複数用量として投与される。一部の実施形態では、各用量は、細胞約０．１×１０６個／ｋｇから細胞約２４０×１０６個／ｋｇを含む。一部の実施形態では、改変リンパ球の合計投薬量は、細胞約０．１×１０６個／ｋｇから細胞約７３０×１０６個／ｋｇを含む。一部の実施形態では、改変リンパ球の投与は、ＨＳＣグラフトの投与の１から１４日後に行われる。一部の実施形態では、改変リンパ球の投与は、ＨＳＣグラフトの投与の２から４週間後に行われる。一部の実施形態では、改変リンパ球の投与は、ＨＳＣグラフトの投与と同時に行われる。一部の実施形態では、ＭＴＸは、ＧＶＨＤの診断で場合により投与される。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、ＭＴＸは用量設定された用量で投与される。
【００１５】
本開示の別の態様は、ドナーサンプルからＨＰＲＴ欠損リンパ球を生成するステップ；改変リンパ球の集団を提供するためにｅｘ  ｖｉｖｏでＨＰＲＴ欠損リンパ球をポジティブ選択するステップ；ＨＳＣグラフトを患者に投与することによって少なくとも部分的な移植片対悪性腫瘍効果を誘導するステップ；残存疾患または疾患再発の検出後に改変リンパ球の集団を患者に投与するステップ；および場合によりＧＶＨＤの少なくとも１つの症状を抑制するためにＭＴＸの少なくとも１用量を投与するステップを含む、その処置を必要とする患者においてがん（例えば、血液学的がん）を処置する方法である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、ＭＴＸは、ＧＶＭ効果の少なくとも一部を維持するための量で投与される。
【００１６】
本開示の別の態様は、抗腫瘍性キメラ受容体を含み、ＨＰＲＴ欠損であるＣＡＲ  Ｔ細胞を生成するステップ；投与のためのＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を提供するためにｅｘ  ｖｉｖｏでＨＰＲＴ欠損ＣＡＲ−Ｔ細胞をポジティブ選択するステップ；ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を患者に投与するステップ；および場合によりＧＶＨＤまたはサイトカイン放出症候群の少なくとも１つの症状を抑制するためにＭＴＸの少なくとも１用量を投与するステップを含む、その処置を必要とする患者においてがんを処置する方法である。一部の実施形態では、ＨＰＲＴ欠損ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＨＰＲＴ遺伝子のノックダウンを通じて生成される。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。
【００１７】
本開示の別の態様は、ＨＰＲＴ欠損である腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を生成するステップ；投与のための腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の集団を提供するためにｅｘ  ｖｉｖｏでＨＰＲＴ欠損腫瘍抗原特異的Ｔ細胞をポジティブ選択するステップ；改変腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の集団を患者に投与するステップ；および場合によりＧＶＨＤの少なくとも１つの症状を抑制するためにＭＴＸの少なくとも１用量を投与するステップを含む、その処置を必要とする患者においてがんを処置する方法である。
【００１８】
本開示の別の態様は、（ｉ）ＨＰＲＴ欠損である改変Ｔ細胞を患者に投与するステップ（ＨＳＣグラフト後など）；および（ｉｉ）副作用の発症でＭＴＸを患者に投与するステップを含む、患者において副作用を軽減する一方で、リンパ球注入の利益を提供する方法である。一部の実施形態では、副作用は、ａＧＶＨＤまたはｃＧＶＨＤからなる群から選択される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、単一用量で投与される。一部の実施形態では、単一用量で投与される改変Ｔ細胞の量は、約０．１×１０６個／ｋｇ体重から約７３０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、複数用量にわたって投与される。一部の実施形態では、用量あたりに投与される改変Ｔ細胞の量は、約０．１×１０６個／ｋｇ体重から約２４０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である。一部の実施形態では、ＭＴＸは単一用量として投与される。一部の実施形態では、複数用量のＭＴＸが投与される。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。
【００１９】
本開示の別の態様は、（ｉ）ＨＰＲＴ欠損である改変Ｔ細胞を患者（ＨＳＣグラフト後など）に投与するステップ；および（ｉｉ）副作用の発症について患者をモニタリングするステップを含む、幹細胞移植術後に患者において移植片対悪性腫瘍効果を誘導する方法である。一部の実施形態では、副作用はａＧＶＨＤまたはｃＧＶＨＤからなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、副作用の発症でＭＴＸを患者に投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は単一用量で投与される。一部の実施形態では、単一用量で投与される改変Ｔ細胞の量は、約０．１×１０６個／ｋｇ体重から約７３０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、複数用量にわたって投与される。一部の実施形態では、用量あたりに投与される改変Ｔ細胞の量は、約０．１×１０６個／ｋｇ体重から約２４０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である。一部の実施形態では、ＭＴＸは単一用量として投与される。一部の実施形態では、複数用量のＭＴＸが投与される。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。
【００２０】
本開示の別の態様は、（ｉ）ＨＰＲＴ欠損である遺伝子改変養子免疫治療をそれを必要とする対象に投与するステップ；（ｉｉ）副作用の発症について対象をモニタリングするステップ；および（ｉｉｉ）副作用の発症でＭＴＸを投与するステップを含む、がんを処置する方法である。一部の実施形態では、遺伝子改変養子免疫治療は、ＣＡＲ改変細胞、自己および同種ＣＡＲ改変細胞、自己ＴＣＲ改変細胞ならびに同種ＴＣＲ−改変細胞からなる群から選択される。
【００２１】
本開示の別の態様は、（ｉ）ＨＰＲＴ欠損であるＣＡＲ−Ｔ細胞をそれを必要とする対象に投与するステップ；および（ｉｉ）副作用の発症について対象をモニタリングするステップを含む、がんを処置する方法である。一部の実施形態では、副作用は、ａＧＶＨＤまたはｃＧＶＨＤからなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、副作用の発症でＭＴＸを投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、単一用量で投与される。一部の実施形態では、単一用量で投与される改変Ｔ細胞の量は、約０．１×１０６個／ｋｇ体重から約７３０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、複数用量にわたって投与される。一部の実施形態では、用量あたりに投与される改変Ｔ細胞の量は、約０．１×１０６個／ｋｇ体重から約２４０ｘ１０６個／ｋｇ体重の範囲である。一部の実施形態では、ＭＴＸは、単一用量として投与される。一部の実施形態では、複数用量のＭＴＸが投与される。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。
【００２２】
本開示の別の態様は、（ｉ）ＨＰＲＴ欠損であるＴＣＲ−改変Ｔ細胞をそれを必要とする対象に投与するステップ；および（ｉｉ）副作用の発症について対象をモニタリングするステップを含む、がんを処置する方法である。一部の実施形態では、副作用は、ａＧＶＨＤまたはｃＧＶＨＤからなる群から選択される。一部の実施形態では、方法は、副作用の発症でＭＴＸを投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、単一用量で投与される。一部の実施形態では、単一用量で投与される改変Ｔ細胞の量は、約０．１×１０６個／ｋｇ体重から約７３０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、複数用量にわたって投与される。一部の実施形態では、用量あたりに投与される改変Ｔ細胞の量は、約０．１×１０６個／ｋｇ体重から約２４０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である。一部の実施形態では、ＭＴＸは、単一用量として投与される。一部の実施形態では、複数用量のＭＴＸが投与される。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。
【００２３】
本開示の別の態様は、対象に改変Ｔ細胞の治療有効量を投与すること、およびＧＶＨＤの発症でＭＴＸを投与することによって対象において移植片対宿主病を軽減する一方で、移植片対悪性腫瘍効果を保つ方法である。一部の実施形態では、移植片対悪性腫瘍効果は、移植片対白血病効果である。
【００２４】
本開示の別の態様は、ＨＰＲＴ欠損である改変Ｔ細胞（例えばＨＰＲＴ欠損であるもの）の治療有効量を患者に投与するステップ；改変Ｔ細胞の投与から生じる副作用の発症をモニタリングするステップ；および患者におけるがん細胞を除去するまたは数を低減するために有効な移植片対悪性腫瘍反応を維持しながら、副作用を抑制、低減または管理するためにＭＴＸを投与するステップを含む、同種造血細胞移植を受けたがんを有する患者を処置する方法である。一部の実施形態では、方法は、副腎皮質ステロイドの治療有効量を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、「有効量」は、ＤＬＩの結果として生じる移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）に関連する１つまたはそれ以上の望ましくない症状を低減または除去する量である。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、ボーラス輸注として投与される。他の実施形態では、改変Ｔ細胞の複数投与が提供される、すなわち複数輸注が投与される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、図１に例示されるような本明細書に記載の方法により産生される。一部の実施形態では、ＭＴＸの単一投薬量は、投与される。他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、ＧＶＨＤの発症の重症度に依存し、その関連で、ＭＴＸの用量（または投薬量）は、ＧＶＨＤ症状の所望の低減および／または所望のレベルのＧＶＭ効果を達成するように用量設定される。
【００２５】
本開示の別の態様は、（ｉ）がんを有する患者に実質的に精製された、ＨＰＲＴ欠損である改変Ｔ細胞の治療有効量を投与するステップ；ならびに（ｉｉ）がんの存在についておよびＧＶＨＤの発症について患者をモニタリングするステップを含む、がんを処置する方法である。一部の実施形態では、ＭＴＸの治療有効量がＧＶＨＤの発症で投与される。
【００２６】
出願人は、遺伝子改変異種性Ｔ細胞集団が、易感染性移植術患者（例えば、重度のクローン病、過敏性腸症候群または再生不良性貧血を有する者）のためのさらに完全な免疫学的再構築を提供できることを見出した。付加的に、ＧＶＭエフェクター細胞の抗原特異性が完全に明らかでないことから、Ｔ細胞レパートリー全体の使用がＧＶＭ効果を得るための最良の選択肢であると考えられている。
【００２７】
さらに、他の「オフスイッチ」法と比較して、開示された方法により処置された細胞は、「自殺遺伝子」を発現する必要がない（例えば、Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  Ａ，  Ｔｅｙ  ＳＫ，Ｄｏｔｔｉ  Ｇ，Ｆｕｊｉｔａ  Ｙ，Ｋｅｎｎｅｄｙ−Ｎａｓｓｅｒ  Ａ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｃ，Ｓｔｒａａｔｈｏｆ  Ｋ，Ｌｉｕ  Ｅ，Ｄｕｒｅｔｔ  ＡＧ，Ｇｒｉｌｌｅｙ  Ｂ，Ｌｉｕ  Ｈ，Ｃｒｕｚ  ＣＲ，Ｓａｖｏｌｄｏ  Ｂ，Ｇｅｅ  ＡＰ，Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ  Ｊ，Ｋｒａｎｃｅ  ＲＡ，Ｈｅｓｌｏｐ  ＨＥ，Ｓｐｅｎｃｅｒ  ＤＭ，Ｒｏｏｎｅｙ  ＣＭ，Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＭＫ．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｓａｆｅｔｙ  ｓｗｉｔｃｈ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ２０１１  Ｎｏｖ  ３；３６５（１８）：１６７３〜８３；Ｘｕ  Ｋ，Ｚｈｕ  Ｆ，Ｄｕ  Ｂ，Ｇａｏ  Ｆ，Ｃｈｅｎｇ  Ｈ，Ｐａｎ  Ｘ．Ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ  ｏｆ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ−ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２００８  Ｏｃｔ；４０（８）：２６６５〜９；およびＰｈｉｌｉｐ  Ｂ，Ｋｏｋａｌａｋｉ  Ｅ，Ｍｅｋｋａｏｕｉ  Ｌ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｓ，Ｓｔｒａａｔｈｏｆ  Ｋ，Ｆｌｕｔｔｅｒ  Ｂ，Ｍａｒｉｎ  Ｖ，Ｍａｒａｆｉｏｔｉ  Ｔ，Ｃｈａｋｒａｖｅｒｔｙ  Ｒ，Ｌｉｎｃｈ  Ｄ，Ｑｕｅｚａｄａ  ＳＡ，Ｐｅｇｇｓ  ＫＳ，Ｐｕｌｅ  Ｍ．Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｍｐａｃｔ  ｅｐｉｔｏｐｅ−ｂａｓｅｄ  ｍａｒｋｅｒ／ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｅａｓｉｅｒ  ａｎｄ  ｓａｆｅｒ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｂｌｏｏｄ．  ２０１４  Ａｕｇ  ２１；１２４（８）：１２７７〜８７を参照されたい、その開示はそれら全体をそれぞれ参照によって本明細書に組み入れる）。むしろ、開示される方法は、内在性遺伝子のノックダウンまたはノックアウトを提供し、血液細胞に望ましくない作用を生じず、全体的に優れた結果をもたらす。出願人は、遺伝子改変細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの６ＴＧ化学選択により、ＭＴＸ投薬を介したｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の定量的排除を可能にする非常に高い純度の操作された細胞が存在することを提示する。加えて、開示された方法による処置は、「キルスイッチ」が組み込まれていない治療よりもドナーＴ細胞のさらに高い用量の可能性およびさらに攻撃的な治療を提供する。さらに、改変Ｔ細胞の数を制御するためのＭＴＸの使用は、ＧＶＨＤを処置する既存の方法と臨床的に合致する、すなわちＭＴＸは、開示される改変Ｔ細胞を受けていない患者においてＧＶＨＤ症状を軽減することを助けるために使用される。
【００２８】
最後に出願人は、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子を用いて形質導入されたドナーリンパ球と比較して、開示された方法による処置が、細胞の排除を生じ、将来の注入の可能性を妨げる免疫原性を含む制限を軽減することを提示する（その開示はその全体を参照によって本明細書に組み入れるＺｈｏｕ  Ｘ，Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＭＫ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃａｓｐａｓｅ−９  ｇｅｎｅ．Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２０１６  Ｎｏｖ；４４（１１）：１０１３〜１０１９を参照されたい）。同様に本方法は、ＧＶＨＤ以外の同時に発生している臨床状態のためのガンシクロビルの使用を、ＨＳＶ−ｔｋドナーリンパ球の望ましくないクリアランスを生じることなく可能にする（例えばガンシクロビルは、現在記載される方法が利用される場合、ａｌｌｏ−ＨＳＣＴ状況において好発するＣＭＶ感染を管理するために投与されることから排除されない）。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】改変Ｔ細胞を調製するステップおよびこれらの改変Ｔ細胞をそれを必要とする患者に投与するステップを例示するフローチャートである。
【図２】改変Ｔ細胞を調製するステップおよびこれらの改変Ｔ細胞を幹細胞グラフト後の患者に、患者の免疫系が少なくとも部分的に再構築されるように投与するステップを例示するフローチャートである。
【図３】改変Ｔ細胞を調製するステップおよびこれらの改変Ｔ細胞を幹細胞グラフト後の患者に、改変Ｔ細胞がＧＶＭ効果を誘導することを助けるように投与するステップを例示するフローチャートである。
【図４】改変Ｔ細胞（ＨＲＰＴ−欠損であるＣＡＲ−Ｔ細胞）を調製するステップおよびこれらの改変Ｔ細胞をそれを必要とする患者に投与するステップを例示するフローチャートである。
【図５】プリンアサルベージ経路を例示する図である。
【図６】ｄＴＴＰの合成についてのデノボ経路を例示する図である。
【図７】６ＴＧの存在下でのＨＰＲＴ欠損細胞の選択を例示する図である。
【図８】７ｓｋプロモーターによって駆動されるｓｈ７３４（配列番号１）を例示する図である。
【図９Ａ】Ｋ５６２細胞での６ＴＧ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）を用いたポジティブ選択の効果を例示する図である。
【図９Ｂ】Ｋ５６２細胞での６ＴＧ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）を用いたポジティブ選択の効果を例示する図である。
【図１０Ａ】ＣＥＭ細胞での６ＴＧ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）を用いたポジティブ選択の効果を例示する図である。
【図１０Ｂ】ＣＥＭ細胞での６ＴＧ（ｅｘ  ｖｉｖｏ）を用いたポジティブ選択の効果を例示する図である。
【図１１Ａ】Ｋ５６２細胞でのＭＴＸを用いたネガティブ選択の効果を例示する図である。
【図１１Ｂ】Ｋ５６２細胞でのＭＴＸを用いたネガティブ選択の効果を例示する図である。
【図１２Ａ】ＣＥＭ細胞でのＭＴＸを用いたネガティブ選択の効果を例示する図である。
【図１２Ｂ】ＣＥＭ細胞でのＭＴＸを用いたネガティブ選択の効果を例示する図である。
【図１３】Ｋ５６２細胞でのＭＴＸを用いたネガティブ選択の効果を例示する図である。
【図１４】６ＴＧからの毒性代謝物の形成を例示する図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
配列表
本明細書で提供される核酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるヌクレオチド塩基についての標準的略号を使用して示されている。配列表は、参照によって本明細書に組み入れる１ＫＢ未満の２０１８年７月１３日に作成された「２０１８−０７−１３＿Ｃａｌｉｍｍｕｎｅ−０３６ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられたＡＳＣＩＩ  ｔｅｘｔ  ｆｉｌｅとして提出される。
【００３１】
詳細な説明
開示される方法は、一般に、免疫再構築を加速する、ＧＶＭ効果を誘導する、および／または腫瘍細胞を標的化するように設計されたＴ細胞治療の副作用を予防する、処置する、抑制する、管理するまたは他の形で軽減することを対象とする。
【００３２】
定義
本明細書において使用される、単数形用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が他を明確に示さない限り複数の参照対象を含む。同様に、語「または」は、内容が他を明確に示さない限り「および」を含むことが意図される。したがって、例えば「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」を参照することは、複数のそのような細胞を含み、「タンパク質（ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」を参照することは、１つまたはそれ以上のタンパク質および当業者に公知のその等価物を参照することを含むなど。本明細書で使用されるすべての技術的および科学的用語は、他に明確に示されない限り、本開示が属する分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３３】
本明細書において、明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つまたはそれ以上の要素のリストを参照した句「少なくとも１つ」は、要素のリストにおける任意の１つまたはそれ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味するが、要素のリスト内に具体的に列挙されるそれぞれの少なくとも１つおよびすべての要素を必ずしも含まず、要素のリスト中の要素の任意の組合せを排除しないと理解されるべきである。この定義は、句「少なくとも１つの」が指す要素のリスト内に具体的に同定された要素以外に要素が、場合により存在することも、具体的に列挙された要素に関連する、しないに関わらず可能にする。したがって、非限定的例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または同等に「ＡまたはＢの少なくとも１つ」または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一実施形態では、場合により１つより多くを含んで少なくとも１つのＡをＢが存在せずに指す場合があり（および、場合によりＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、場合により１つより多くを含んで少なくとも１つのＢをＡが存在せずに指す場合があり（および、場合によりＡ以外の要素を含む）；さらに別の実施形態では、場合により１つより多くを含んで少なくとも１つのＡ、および場合により１つより多くを含んで少なくとも１つのＢを（および場合により他の要素を含んで）を指す場合がある；など。
【００３４】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、互換的に用いられ、同じ意味を有する。同様に「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｓ）」なども互換的に用いられ、同じ意味を有する。詳細には、それぞれの用語は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の通常の米国特許法定義と一致して定義され、したがって、オープンタームの意味「少なくとも次のもの」であると解釈され、追加的特性、限定、態様などを排除しないとも解釈される。したがって、例えば「コンポーネントａ、ｂおよびｃを有するデバイス」は、デバイスが少なくともコンポーネントａ、ｂおよびｃを含むことを意味する。同様に句：「ステップａ、ｂおよびｃを含む方法」は、方法が少なくともステップａ、ｂおよびｃを含むことを意味する。さらに、ステップおよび工程は本明細書において特定の順序で説明される場合があるが、当業者はステップおよび工程の順序は変化する場合があることを認識する。
【００３５】
本明細書の、明細書においておよび特許請求の範囲において使用される場合、「または」は、上に定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト中の項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包括的である、すなわち、数または要素のリストの少なくとも１つだけでなく、１つより多くの、および場合により、追加的な列挙されていない項目の含有として解釈されるべきである。「１つだけ」または「厳密に１つ」または、特許請求の範囲において使用される場合「からなる」などのそうでないと明確に示される用語だけが、数または要素のリストの厳密に１つの要素の含有を指す。一般に、本明細書において使用される、用語「または」は、「いずれか」、「の１つ」、「１つだけ」または「厳密に１つなどの」排他的用語が先行する場合、排他的選択肢（すなわち「一方または他方だが両方ではない」）を示しているとして単に解釈されるべきである。「から本質的になる」は、特許請求の範囲において使用される場合、特許法の分野において使用される通常の意味を有する。
【００３６】
本明細書において使用される、用語「投与」は、それが対象もしくは患者、プラセボ対象、研究対象、実験対象、細胞、組織、器官または生物学的液に適用される場合、外来性リガンド、試薬、プラセボ、小分子、医薬品、治療剤、診断剤または組成物の対象、細胞、組織、器官または生物学的液などへの接触を非限定的に指す。「投与」は、例えば、治療用、薬物動態的、診断的、研究、プラセボおよび実験方法を指すことができる。細胞の処置は、試薬の細胞への接触および試薬の液体への接触を包含し、ここで液体は細胞と接触している。「投与」は、例えば、細胞の試薬、診断的、結合組成物によるまたは別の細胞による、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏでの処置も包含する。
【００３７】
「同種Ｔ細胞」は、レシピエントにマッチする組織ＨＬＡ型を有するドナー由来のＴ細胞を指す。典型的には、マッチングは、ＨＬＡ遺伝子の３つ以上の遺伝子座での変動に基づいて実施され、これらの遺伝子座での完全なマッチは好ましい。一部の場合では、同種移植ドナーは、血縁（通常、密接にＨＬＡマッチした同胞）、同系（患者の一卵性の「全く同じ」双生児）または非血縁（血縁ではなく、非常に密接した程度のＨＬＡマッチを有することが見出されているドナー）である場合がある。ＨＬＡ遺伝子は、２つのカテゴリー（Ｉ型およびＩＩ型）に入る。一般にＩ型遺伝子（すなわちＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃ）のミスマッチは、移植片拒絶のリスクを増加させる。ＨＬＡ  ＩＩ型遺伝子（すなわちＨＬＡ−ＤＲまたはＨＬＡ−ＤＱＢ１）のミスマッチは、移植片対宿主病のリスクを増加させる。
【００３８】
本明細書において使用される、用語「ＣＡＲ  Ｔ」または「ＣＡＲ−Ｔ細胞」は、Ｔ細胞表面にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するための方法を通じて改変されたＴ細胞またはその集団を指す。ＣＡＲは、Ｔ細胞活性化ドメインの細胞内部分に作動可能に連結されて（例えば、融合、１つまたはそれ以上のジスルフィド結合によって連結された別々の鎖などとして）発現され、所望の標的に予め定義された結合特異性を有するポリペプチドである。
【００３９】
本明細書において使用される、用語「有効量」または「治療有効量」は、医学的状態または障害の症状または徴候を回復、抑制、管理、逆行、軽減、予防または診断できる量を非限定的に包含する。他に明確にまたは内容から示されない限り、「有効量」は、状態を回復、抑制、管理または逆行させるために十分な最小限の量に限定されない。
【００４０】
本明細書において使用される、用語「造血細胞移植」または「造血細胞移植術」は、骨髄移植術、末梢血幹細胞移植術、臍静脈血移植術または任意の他の多能性造血幹細胞の供給源を指す。同様に、用語「幹細胞移植」または「移植」は、薬学的に許容される担体と接触している（例えば、懸濁されている）幹細胞を含む組成物を指す。そのような組成物は、カテーテルを通じて対象に投与することができる。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「ＨＰＲＴ」は、ＨＰＲＴ１遺伝子によってコードされ、プリン代謝に関与する酵素である。ＨＰＲＴ１は、Ｘ染色体に位置付けられ、それにより男性では単一コピーで存在する。ＨＰＲＴ１は、５−ホスホリボシル１−ピロホスフェートから５−ホスホリボシル基をプリンに移行することによって、ヒポキサンチンのイノシンモノホスフェートへのおよびグアニンのグアノシンモノホスフェートへの転換を触媒するトランスフェラーゼをコードしている。酵素は、新たなプリン合成における使用のために分解されたＤＮＡからプリンをサルベージするように主に機能する（図５を参照されたい）。
【００４２】
本明細書において使用される、用語「ノックダウン（ｋｎｏｃｋ  ｄｏｗｎ）」または「ノックダウン（ｋｎｏｃｋｄｏｗｎ）」は、遺伝子発現へのＲＮＡｉの効果を参照して使用される場合、遺伝子発現のレベルが阻害されている、またはＲＮＡｉの非存在以外は実質的に同じ条件下で検討された場合に一般に観察されるレベル未満に低減されていることを意味する。
【００４３】
本明細書において使用される、用語「ノックアウト（ｋｎｏｃｋ  ｏｕｔ）または「ノックアウト（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）」は、内在性遺伝子の発現の部分的なまたは完全な抑制を指す。これは、一般に、遺伝子の一部を欠失させることによって、または第２の配列を用いて一部を置き換えることによって達成されるが、終止コドンの導入、重要なアミノ酸の変異、イントロン接合部の除去などの遺伝子への他の改変によっても生じる場合がある。したがって「ノックアウト」構築物は、細胞に導入された場合に、細胞中の内在性ＤＮＡによってコードされるポリペプチドまたはタンパク質の発現の抑制（部分的または完全な）を生じるＤＮＡ構築物などの核酸配列である。一部の実施形態では、「ノックアウト」は、点変異、挿入、欠失、フレームシフトまたはミスセンス変異などの変異を含む。
【００４４】
本明細書において使用される、用語「レンチウイルスベクター」は、レンチウイルスに由来し、形質導入を介して細胞に遺伝材料を移行するために使用される核酸の任意の形態を意味して使用される。用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのレンチウイルスベクター核酸、これらの核酸の被包性形態およびウイルスベクター核酸がパッケージされているウイルス粒子を包含する。
【００４５】
本明細書において使用される、用語「対象」または「患者」は、哺乳動物を含む脊椎動物を指す。ヒト、ホモ・サピエンスは、対象または患者であると見なされる。
【００４６】
本明細書において使用される、用語「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、抗原の提示への応答においてＴ細胞の活性化に関与する膜タンパク質の複合体を指す。ＴＣＲは、主要組織適合性抗原分子に結合した抗原の認識に関与すると考えられている。ＴＣＲは、アルファ（ａ）およびベータ（β）鎖のヘテロ二量体からなるが、一部の細胞ではＴＣＲはガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖からなる。ＴＣＲは、アルファ／ベータおよびガンマ／デルタ形態で存在する場合があり、構造的に類似しているが解剖学的位置および機能が異なる。各鎖は、２つの細胞外ドメイン、可変および定常ドメインからなる。一部の実施形態では、ＴＣＲは、例えば、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞およびガンマデルタＴ細胞が挙げられるＴＣＲを含む任意の細胞上で改変される。
【００４７】
本明細書において使用される、用語「ＴＣＲ−改変Ｔ細胞」または「改変ＴＣＴＴＣＲ  Ｔ細胞」は、変化した特異性を有するまたは機能性ＴＣＲの発現を欠いているＴ細胞を意味する。一部の実施形態では、ＴＣＲ−改変Ｔ細胞は、増強された腫瘍殺活性を有するように改変されている、すなわちそれらは、抗原保有腫瘍細胞を効率的に認識するように改変されている。
【００４８】
本明細書において使用される、用語「用量設定」は、患者応答に基づいた用量の連続的調整を指す。例えば、投薬量は、所望の臨床効果が観察されるまたは達成されるまで調整される。
【００４９】
本明細書において使用される、用語「形質導入する」または「形質導入」は、トランスフェクションによってよりむしろ感染の手段によって、ウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用する遺伝子（複数可）の送達を指す。例えば、レトロウイルスベクター（細胞への核酸の導入のためのベクターとして使用される改変レトロウイルス）によって運ばれる抗ＨＩＶ遺伝子は、感染およびプロウイルス組み込みを通じて細胞に形質導入できる。したがって、「形質導入遺伝子」は、レンチウイルスまたはベクター感染およびプロウイルス組み込みを介して細胞に導入された遺伝子である。ウイルスベクター（例えば、「形質導入ベクター」）は、「標的細胞」または宿主細胞に遺伝子を形質導入する。
【００５０】
本明細書において使用される、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置する（ｔｒｅａｔ）」は、具体的な状態に関して、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患またはその症状を完全にもしくは部分的に予防する観点から予防的であってよく、ならびに／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用についての部分的なもしくは完全な治癒の観点から治療的であってよい。本明細書において使用される「処置」は、対象、特にヒトにおける疾患の任意の処置を網羅し：（ａ）疾患の素因を有するがそれを有するとまだ診断されていない対象において疾患発症を予防すること；（ｂ）疾患を阻害する、すなわちその発達を停止させること；ならびに（ｃ）疾患を緩和する、すなわち、疾患の退縮を生じさせる、および／または疾患の１つもしくはそれ以上の症状を緩和することが挙げられる。「処置」は、疾患または状態の非存在でも、薬理学的効果を提供するための薬剤の送達または治療の投与も包含できる。一部の実施形態で使用される用語「処置」は、宿主における、好ましくは哺乳動物対象における、より好ましくはヒトにおける疾患または障害を軽減するための本開示の化合物の投与を指す。したがって、用語「処置」は：特に宿主が疾患にかかる素因を有するが疾患を有するとまだ診断されていない場合、宿主において障害が生じることを予防すること；障害を阻害すること；および／または障害を緩和するもしくは逆行させることを含み得る。本開示の方法が障害を予防するために方向付けられている限り、用語「予防」が、疾患状態が完全に妨げられることを要求しないことは理解される。むしろ本明細書において使用される、用語、予防するは、障害に感受性である集団を同定する当業者の能力を指し、その結果、本開示の化合物の投与は、疾患の発症に先行して行うことができる。用語は、疾患状態が完全に回避されなければならないことを意味しない。
【００５１】
本明細書において使用される、用語「ベクター」は、細胞への別の核酸分子の侵入、例えば、移行、輸送などを媒介できる核酸分子を指す。移行された核酸は、ベクター核酸分子に一般に連結、例えば挿入される。ベクターは、自律的複製を方向付ける配列を含む場合がある、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするために十分な配列を含む場合がある。当業者に明らかであるとおり、ウイルスベクターは、移行された核酸の侵入を媒介する核酸（複数可）に加えて種々のウイルスコンポーネントを含む場合がある。多数のベクターが当技術分野において公知であり、これだけに限らないが、直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物と会合したポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターの例として、これだけに限らないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター（レンチウイルスベクターを含む）などが挙げられる。
【００５２】
ＨＰＲＴ欠損Ｔ細胞（「改変Ｔ細胞」）の調製
本開示の一態様は、ＨＰＲＴ欠損Ｔ細胞（本明細書において「改変Ｔ細胞」とも称される）の産生方法である。図１を参照して、細胞、すなわちリンパ球（Ｔ細胞）は、最初にドナーから回収される（ステップ１１０）。造血幹細胞（ＨＳＣ）もドナーから回収される実施形態では、Ｔ細胞は、ＨＳＣグラフトが回収される同じドナーからまたは異なるドナーから回収される。これらの実施形態では、細胞は、ＨＳＣグラフトのための細胞と同じ時期にまたは異なる時期に回収される。一部の実施形態では、細胞は、同じ動員された末梢血液ＨＳＣ採取物から回収される。一部の実施形態では、これは、ＣＤ３４陰性画分（ＣＤ３４陽性細胞はドナーグラフトのための標準治療により回収される）または、前駆Ｔ細胞グラフトが予測される場合はＣＤ３４陽性ＨＳＣグラフトの一部であってよい。
【００５３】
当業者は、細胞が任意の手段によって回収できることを理解する。例えば、細胞は、アフェレーシス、白血球アフェレーシスまたは単に静脈血採血を通じて回収される。ＨＳＣグラフトが改変のための細胞と同時に回収される実施形態では、ＨＳＣグラフトは、操作および回収されたＴ細胞の試験のための時間を取るために凍結保存される。
【００５４】
細胞の回収後、Ｔ細胞は単離される（ステップ１２０）。Ｔ細胞は、当業者に公知の手段によって回収された細胞の凝集物から単離される。例えば、ＣＤ３＋細胞は、ＣＤ３マイクロビーズおよびＭＡＣＳ分離システム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を介して回収された細胞から単離される。ＣＤ３マーカーは、すべてのＴ細胞上に発現され、Ｔ細胞受容体と会合すると考えられている。ヒト末梢血液リンパ球の約７０から約８０％および胸腺細胞の約６５〜８５％は、ＣＤ３＋であると考えられている。一部の実施形態では、ＣＤ３＋細胞は、ＣＤ３  ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓを用いて磁気的に標識される。次に細胞懸濁物は、ＭＡＣＳ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒの磁場に置かれたＭＡＣＳカラムにロードされる。磁気的に標識されたＣＤ３＋細胞は、カラムに保持される。未標識細胞は、素通りし、この細胞画分は、ＣＤ３＋細胞が枯渇されている。磁場からカラムを外した後、磁気的に保持されたＣＤ３＋細胞は、ポジティブ選択された細胞画分として溶出される。
【００５５】
代替的に、ＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞は、ＩＢＡ  ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＣＤ６２Ｌ  Ｆａｂ  Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを介して回収された細胞から単離できる。ヒトＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の単離は、ポジティブ選択によって実施される。ＰＢＭＣは、ｍａｇｎｅｔｉｃ  ＣＤ６２Ｌ  Ｆａｂ  Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒｓを用いて標識される。標識された細胞は、磁石の側の管壁に向かって移動して強力な磁石で単離される。このＣＤ６２Ｌ陽性細胞画分は回収され、細胞は、強力な磁石中でのビオチンの添加によってすべての標識試薬から開放される。ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｔｒｅｐｔａｍｅｒｓは、管壁に向かって移動し、標識不含有細胞は上清に残る。ビオチンは、洗浄によって除去される。得られた細胞調製物は、９０％を超える純度を有してＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞が高度に濃縮されている。枯渇ステップもカラムも必要ない。
【００５６】
代替的実施形態では、Ｔ細胞は、ステップ１２０で単離されず、むしろステップ１１０で回収された細胞の凝集物が続く改変のために使用される。一部の実施形態では、細胞の凝集物は、続く改変のために使用される一方で、一部の場合では改変法は、細胞の総凝集物内の特定の細胞集団に対して特異的である場合がある。これは、多数の方法；例えば、標的化遺伝子ベクター送達による、または、例えば特定の細胞型、すなわちＴ細胞へのＨＰＲＴに対するｓｈＲＮＡの標的化発現による、特定の細胞型への標的化遺伝子改変で行うことができる。
【００５７】
Ｔ細胞の単離に続いて、Ｔ細胞は、ＨＰＲＴ活性を減少させる（ステップ１３０）、すなわちＨＰＲＴ遺伝子の発現を減少させるために処置される。Ｔ細胞は、いくつかの方法により改変される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＲＮＡ干渉技術を利用して改変できる。近年ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、配列特異的二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む複雑なマルチステップ酵素工程を通じた相同性転写物の分解を引き起こすことによる、遺伝子発現の転写後サイレンシングのための重要な遺伝的手法になっている。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＨＰＲＴ遺伝子に標的化されたｓｈＲＮＡをコードするベクター、例えばレンチウイルスベクターを用いた形質導入によって改変される。一部の実施形態ではｓｈＲＮＡは、ｍｉＲＮＡフレームワーク（ａｍｉＲＮＡ）内に埋め込まれ、他の実施形態ではｓｈＲＮＡは、ダイサー非依存性Ａｇｏ−ｓｈＲＮＡ設計のものであってよい。本明細書では、前駆体ｓｈＲＮＡ構築物は、ｓｉＲＮＡ二本鎖を生成するように細胞内プロセスされる。レンチウイルスベクターは、それらが、分裂性または非分裂に関わらず、多種多様な主要細胞型に効率的に感染する能力を提供し、標的細胞ゲノムへの安定なベクター組み込みを達成でき、それにより細胞表現型の長期の改変を可能にすることから、この目的のための強力で多目的なツールとして現れた。一部の実施形態では、レンチウイルスベクターは自己不活性型レンチウイルスベクターである。好適なレンチウイルスベクターを調製するための方法は、Ｈａｃｋｅ  Ｋら、Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｈｙｐｏｘａｎｔｈｉｎｅ−Ｇｕａｎｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｃｈｅｍｏｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ６−ｔｈｉｏｇｕａｎｉｎｅ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．２０１３  Ｊｕｎ；４５（５）：２０４０〜４によって記載され、その開示はその全体を参照によって本明細書に組み入れる。代替的実施形態では、Ｔ細胞は、ノンインテグレーティングレンチウイルスベクターまたは他のウイルスベクター（ＡＡＶベクター）を用いる形質導入によって改変できる。
【００５８】
一部の実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１のものに少なくとも８０％配列同一性を有する配列を有する。他の実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１のものに少なくとも９０％配列同一性を有する配列を有する。さらに他の実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１のものに少なくとも９５％配列同一性を有する配列を有する。さらなる実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１のものに少なくとも９７％配列同一性を有する配列を有する。さらにさらなる実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１のものに少なくとも９８％配列同一性を有する配列を有する。またさらなる実施形態では、ｓｈＲＮＡは、配列番号１のものに少なくとも９９％配列同一性を有する配列を有する。他の好適なｓｈＲＮＡ分子は、その開示はその全体を参照によって本明細書に組み入れるＰＣＴ公開第ＷＯ／２０１７／１４３２６６号に記載されている。
【００５９】
他の実施形態では、遺伝子編集手法は、ＨＰＲＴをノックアウトするために使用できる。例えば、単離された細胞は、ＨＰＲＴ−標的化ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＲＮＰを用いて処置される。一部の実施形態では、ＨＰＲＴ−標的化ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９  ＲＮＰは、ナノカプセル内に製剤化できる。Ｍａｅｄｅｒ  ＭＬら、Ｇｅｎｏｍｅ−ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１６  Ｍａｒ；２４（３）：４３０〜４６）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ媒介法を含む、種々の遺伝子編集技術を記載しており、これらの開示はその全体を参照によって本明細書に組み入れる。遺伝子編集ツールも、ＡＡＶベクター、ノンインテグレーティングおよび非逆転写レンチウイルスベクターの方法ならびに他の物理的送達方法（例えば電気穿孔法、セルスクイージング、ソノポレーションなど）が挙げられる当業者に公知の任意の方法を介しても送達できる。トランスフェクション方法として、リン酸カルシウム、リポフェクタミン、フュージーン、デンドリマー、リポソーム（通常カチオン性リポソーム）が挙げられ、他のカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥもしくはＰＥＩ）も利用できる。送達を増加させるために生物学的にまたは化学的に機能化できる、または送達の物理的方法、例えば、マグノフェクションもしくは粒子衝撃において使用できる、ナノ粒子送達系が挙げられる、他の粒子に基づく方法も他に存在する。
【００６０】
一部の実施形態では、電気穿孔法は、物質の取り込みを可能にする細胞膜中に一過性のポアを開くことによってなど核酸を真核細胞に導入するために使用される。電気穿孔法は、それにより、細胞膜にわたる電流が通過することによってＤＮＡ（またはＲＮＡ）が細胞に導入される方法である。
【００６１】
ある特定のヌクレアーゼを使用する他の遺伝子編集技術は、その開示はその全体を参照によって本明細書に組み入れる米国特許第８，８９５，２６４号および第９，２２，１０５号に記載されている。一部の実施形態では、ゲノム中のＨＰＲＴ遺伝子中の標的部位に結合するジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）を利用することができ、ここでＺＦＰは１つまたはそれ以上の操作されたジンクフィンガー結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ＺＦＰは、二量体化し、次に目的の標的ゲノム領域を切断する一対のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）として使用され、ここでＺＦＮは、１つまたはそれ以上の操作されたジンクフィンガー結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。一部の実施形態では、ゲノム中のＨＰＲＴ遺伝子中の標的部位に結合するＴＡＬＥタンパク質（転写活性化様エフェクター）を利用することができ、ここでＴＡＬＥは、１つまたはそれ以上の操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインを含む。一部の実施形態では、ＴＡＬＥは、目的の標的ゲノム領域を切断するヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり、ここでＴＡＬＥＮは、１つまたはそれ以上の操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。ＺＦＮおよび／またはＴＡＬＥＮの切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、種々の制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができる。一部の実施形態では、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｆｏｋ  Ｉ）由来である。
【００６２】
ステップ１３０でＴ細胞が改変された後、ＨＰＲＴ欠損Ｔ細胞の集団は、選択される、および／または増殖される（ステップ１４０）。一部の実施形態では、培養物は、生着のための増強された能力を有する細胞（例えば、セントラルメモリーまたはＴ幹細胞表現型）を同時に選択および増殖させることができる。一部の実施形態では、培養期間は、１４日間未満である。一部の実施形態では、培養期間は、７日間未満である。
【００６３】
一部の実施形態では、細胞を選択および増殖させるステップは、ＨＰＲＴ欠損Ｔ細胞の集団をグアノシン類似体代謝拮抗薬（６−チオグアニン（６ＴＧ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）またはアザチオプリン（ＡＺＡ））などを用いてｅｘ  ｖｉｖｏで処置することを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、６−チオグアニン（「６ＴＧ」）の存在下で培養され、それによりステップ１３０で改変されていない細胞を死滅させる。６ＴＧは、細胞中でｄＧＴＰ生合成を妨害できるグアニン類似体である。Ｔｈｉｏ−ｄＧは、複製中にグアニンの位置でＤＮＡに組み込まれる場合があり、組み込まれると、しばしばメチル化を生じる。このメチル化は、適切なミスマッチＤＮＡ修復を妨害でき、細胞周期停止および／またはアポトーシスの開始を生じる。６ＴＧは、急速に分裂する細胞へのその毒性のためにある特定の種類の悪性腫瘍を有する患者を処置するために臨床で使用されている。６ＴＧの存在下で、ＨＰＲＴは、細胞中のＤＮＡおよびＲＮＡへの６ＴＧの組み込みに関与する酵素であり、適切なポリヌクレオチド合成および代謝の遮断を生じる（図７を参照されたい）。一方、サルベージ経路は、ＨＰＲＴ欠損細胞において遮断されている（図７を参照されたい）。したがって細胞は、プリン合成のためのデノボ経路を使用する（図６を参照されたい）。しかしＨＰＲＴ野生型細胞では、細胞はサルベージ経路を使用し、６ＴＧはＨＰＲＴの存在下で６ＴＧＭＰに転換される。６ＴＧＭＰは、リン酸化によってチオグアニンジホスフェート（ＴＧＤＰ）およびチオグアニントリホスフェート（ＴＧＴＰ）に転換される。同時にデオキシリボシル類似体が酵素リボヌクレオチド還元酵素を介して形成される。６ＴＧが高度に細胞傷害性であることを考えると、それは、機能性ＨＰＲＴ酵素を有する細胞を死滅させるための選択剤として使用することができる。
【００６４】
生成されたＨＰＲＴ欠損細胞は、次にｅｘ  ｖｉｖｏでプリン類似体と接触される。ノックアウト手法について、細胞中に残存ＨＰＲＴがまだある可能性があり、ＨＰＲＴ−ノックダウン細胞はさまざまなプリン類似体に耐容性を示すことができるが、高投薬量／量では殺滅されると考えられている。この状況では、ｅｘ  ｖｉｖｏ選択のために使用されるプリン類似体の濃度は、約１０ｎＭから約５μＭの範囲である。一部の実施形態では、濃度は、約１００ｎＭから約２．５μＭの範囲である。他の実施形態では、濃度は、約２００ｎＭから約２μＭの範囲である。さらに他の実施形態では、濃度は、約２００ｎＭから約１μＭの範囲である。
【００６５】
ノックアウト手法ＨＰＲＴについて、ＨＰＲＴは、ＨＰＲＴ−ノックアウト細胞から完全に除去できる、または完全に近く除去できると考えられており、生成されたＨＰＲＴ欠損細胞は、プリン類似体に高度に耐容性である。この場合ｅｘ  ｖｉｖｏ選択のために使用されるプリン類似体の濃度は、約１０ｎＭから約１００μＭの範囲である。一部の実施形態では、濃度は、約１０ｎＭから約８０μＭの範囲である。他の実施形態では、濃度は、約１０ｎＭから約６０μＭの範囲である。さらに他の実施形態では、濃度は、約２０ｎＭから約４０μＭの範囲である。
【００６６】
他の実施形態では、細胞の改変（例えば、ＨＰＲＴのノックダウンまたはノックアウトを通じて）は、ＨＰＲＴ欠損細胞についてのｅｘ  ｖｉｖｏ選択が必要でない、すなわち６ＴＧまたは他の同様の化合物を用いた選択が必要でないように十分効率的であり得る。
【００６７】
一部の実施形態では、生成されるＨＰＲＴ欠損細胞は、プリン類似体および、キサンチン酸化酵素（ＸＯ）の阻害剤であるアロプリノールの両方と接触される。ＸＯを阻害することによって、より入手しやすい６ＴＧがＨＰＲＴによって代謝される。６ＴＧがＨＰＲＴによって代謝される場合、細胞に毒性の代謝物である６ＴＧＮを形成する（６ＴＧＮは、６−ＴＧモノホスフェート（６ＴＧＭＰ）、ジホスフェート（６−ＴＧＤＰ）およびトリホスフェート（６ＴＧＴＰ）を包含する）。（図１４を参照されたい）。（例えば、Ｃｕｒｋｏｖｉｃら、Ｌｏｗ  ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ  ｄｏｓｅｓ  ａｒｅ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｏ  ｏｐｔｉｍｉｚｅ  ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎａｄｅｑｕａｔｅ  ｔｈｉｏｐｕｒｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１３  Ａｕｇ；６９（８）：１５２１〜３１；Ｇａｒｄｉｎｅｒら、Ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ  ｍｉｇｈｔ  ｉｍｐｒｏｖｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａｚａｔｈｉｏｐｒｉｎｅ  ａｎｄ  ６−ｍｅｒｃａｐｔｏｐｕｒｉｎｅ  ｂｙ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｎｇ  ａｎ  ｕｎｆａｖｏｒａｂｌｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｒａｔｉｏ．Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ．２０１１  Ｊａｎ；２６（１）：４９〜５４；Ｓｅｉｎｅｎら、Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ  ａｎｄ  ｌｏｗ−ｄｏｓｅ  ｔｈｉｏｐｕｒｉｎｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｐｉｖｏｔａｌ  ｔｈｉｏｐｕｒｉｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｚｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ．Ｊ  Ｃｒｏｈｎｓ  Ｃｏｌｉｔｉｓ．２０１３  Ｎｏｖ；７（１０）：８１２〜９；およびＷａｌｌら、Ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｌｏｐｕｒｉｎｏｌ  ｆｏｒ  Ａｌｔｅｒｉｎｇ  Ｔｈｉｏｐｕｒｉｎｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｔｏ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ．２０１８  Ｆｅｂ；３８（２）：２５９〜２７０を参照されたい、各開示はその全体を参照によって本明細書に組み入れる）。
【００６８】
一部の実施形態では、アロプリノールは、生成されたＨＰＲＴ欠損細胞にプリン類似体の導入より前に導入される。他の実施形態では、アロプリノールは、生成されたＨＰＲＴ欠損細胞にプリン類似体の導入と同時に導入される。さらに他の実施形態では、アロプリノールは、生成されたＨＰＲＴ欠損細胞にプリン類似体の導入後に導入される。
【００６９】
選択および増殖後に、改変Ｔ細胞産生物は試験される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞産生物は、標準的放出試験（例えば、活性、マイコプラズマ、生存率、安定性、表現型など；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＆  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｖｏｌ．  ４  Ｍａｒｃｈ  ２０１７  ９２〜１０１を参照されたい、その開示はその全体を参照によって本明細書に組み入れる）により試験される。
【００７０】
他の実施形態では、改変Ｔ細胞産生物は、ＭＴＸまたはミコフェノール酸（ＭＰＡ）への感受性について試験される。ＭＴＸおよびＭＰＡの両方は、プリンのデノボ合成を阻害するが、異なる作用機序を有する。ＭＴＸは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、テトラヒドロ葉酸（ＴＨＦ）合成に関与する酵素を競合的に阻害すると考えられている。ＤＨＦＲは、ジヒドロ葉酸の活性テトラヒドロ葉酸への転換を触媒する。葉酸は、ＤＮＡ合成のために必要なヌクレオシドチミジンのデノボ合成のために必要である。同様に葉酸は、プリンおよびピリミジン塩基生合成のために不可欠であり、それにより合成は阻害される。ミコフェノール酸（ＭＰＡ）は、イノシン−５’−モノホスフェート（ＩＭＰ）からのグアノシン−５’−モノホスフェート（ＧＭＰ）のデノボ合成ために不可欠である酵素イノシン−５’−モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）の強力な、可逆性、非競合的阻害剤である。
【００７１】
ＭＴＸまたはＭＰＡは、したがってＤＮＡ、ＲＮＡ、チミジル酸およびタンパク質の合成を阻害する。ＭＴＸまたはＭＰＡは、ＤＨＦＲを阻害することによってデノボ経路を遮断する。ＨＰＲＴ−／−細胞では、サルベージまたは機能性のデノボ経路はなく、プリン合成に至らず、それにより細胞は死滅する。しかし、ＨＰＲＴ野生型細胞は、機能性サルベージ経路を有し、それらのプリン合成は行われ、細胞は生存する。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞はＨＰＲＴ欠損である。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞集団の少なくとも８５％、ＭＴＸまたはＭＰＡに感受性である。他の実施形態では、改変Ｔ細胞集団の少なくとも９０％は、ＭＴＸまたはＭＰＡに感受性である。さらに他の実施形態では、改変Ｔ細胞集団の少なくとも９５％は、ＭＴＸまたはＭＰＡに感受性である。
【００７２】
ステップ１１０から１４０を通じて産生された改変Ｔ細胞のＭＴＸまたはＭＰＡへの感受性を考慮すると、ＭＴＸまたはＭＰＡは、本明細書に記載されるＨＰＲＴ欠損細胞を選択的に除去するために使用できる。
【００７３】
改変Ｔ細胞を用いた処置
一部の実施形態では、ステップ１１０から１４０により調製された改変Ｔ細胞は、患者に投与される（ステップ１５０）。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞（または本明細書に記載のＣＡＲ  Ｔ細胞もしくはＴＣＲ  Ｔ細胞）は、単一投与（例えば、単一ボーラス、または一定期間にわたる投与、例えば、約１から４時間またはそれ以上にわたる注入）で患者に提供される。他の実施形態では、改変Ｔ細胞の複数回の投与が行われる。改変Ｔ細胞の複数用量が投与される場合、各用量は同じまたは異なっていてよい（例えば、用量を漸増させる、用量を減少させる）。
【００７４】
一部の実施形態では、改変Ｔ細胞の用量の量は、ＣＤ３陽性Ｔ細胞含有量／対象の体重ｋｇに基づいて決定される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞の総用量は、約０．１×１０６／ｋｇ体重から約７３０×１０６／ｋｇ体重の範囲である。他の実施形態では、改変Ｔ細胞の総用量は、約１×１０６／ｋｇ体重から約５００×１０６／ｋｇ体重の範囲である。さらに他の実施形態では、改変Ｔ細胞の総用量は、約１×１０６／ｋｇ体重から約４００×１０６／ｋｇ体重の範囲である。さらなる実施形態では、改変Ｔ細胞の総用量は、約１×１０６／ｋｇ体重から約３００×１０６／ｋｇ体重の範囲である。またさらなる実施形態では、改変Ｔ細胞の総用量は、約１×１０６／ｋｇ体重から約２００×１０６／ｋｇ体重の範囲である。
【００７５】
複数用量が提供される場合、投薬の頻度は、約１週間から約３６週間の範囲であってよい。同様に、複数用量が提供される場合、改変Ｔ細胞の各用量は、約０．１×１０６／ｋｇ体重から約２４０×１０６／ｋｇ体重の範囲である。他の実施形態では、改変Ｔ細胞の各用量は、約０．１×１０６／ｋｇ体重から約１８０×１０６／ｋｇ体重の範囲である。他の実施形態では、改変Ｔ細胞の各用量は、約０．１×１０６／ｋｇ体重から約１４０×１０６／ｋｇ体重の範囲である。他の実施形態では、改変Ｔ細胞の各用量は、約０．１×１０６／ｋｇ体重から約１００×１０６／ｋｇ体重の範囲である。他の実施形態では、改変Ｔ細胞の各用量は、約０．１×１０６／ｋｇ体重から約６０×１０６／ｋｇ体重の範囲である。他の投薬戦略は、Ｇｏｚｄｚｉｋ  Ｊら、Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｄｏｎｏｒ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ａｌｌｏｇｅｎｉｃ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ＳＣＴ  ｉｎ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｐａｔｉｅｎｔｓ，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２０１５  Ｊａｎ；５０（１）：５１〜５）によって記載されており、その開示はその全体を参照によって本明細書に組み入れる。
【００７６】
改変Ｔ細胞は、単独でまたは全体的処置戦略の一部として投与される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、ＨＳＣ移植の約２から約４週間後などのＨＳＣ移植後に投与される。例えば、一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、移植後免疫不全を予防または軽減することを助けるためにＨＳＣ移植の投与後に投与される。改変Ｔ細胞は、短期間（例えば約３から約９ヵ月）の免疫再構築および／または防御を提供できると考えられている。別の例としておよび他の実施形態では、改変Ｔ細胞は、移植片対悪性腫瘍（ＧＶＭ）効果または移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果を誘導することを助けるためにがん治療の一部として投与される。さらなる例として、改変Ｔ細胞は、ＨＰＲＴ欠損であるＣＡＲ−Ｔ細胞またはＴＣＲ−改変Ｔ細胞であり、がん処置戦略の一部として投与される。これらの処置手段のそれぞれによる改変Ｔ細胞の投与は、本明細書により詳細に記載されている。当然のことながら当業者は、任意の基礎状態のための他の処置が、改変Ｔ細胞の投与に先立って、続いてまたは同時に存在してよいことを理解する。
【００７７】
Ｔ細胞治療の副作用の抑制、管理または軽減
患者へのＴ細胞の投与は、本明細書に列挙されるものを含む望ましくない副作用を生じる場合がある。例えば、移植片対宿主病は、患者が改変Ｔ細胞（例えば、ＨＰＲＴのノックダウンまたはノックアウトを介して）を含むＴ細胞を用いて処置された後に生じる可能性がある。本開示の一部の態様では、ステップ１５０での改変Ｔ細胞の投与後に患者は、これだけに限らないがＧＶＨＤを含むすべての副作用の発症についてモニターされる。ＧＶＨＤ（またはＧＶＨＤの症状）などの副作用が生じたときは、ＭＴＸまたはＭＰＡは、患者に（ｉｎ  ｖｉｖｏで）ステップ１６０で、副作用、例えばＧＶＨＤを抑制する、低減する、管理するまたは他の形で軽減するための努力において改変Ｔ細胞の少なくとも一部を除去するために投与される。一部の実施形態では、ＭＴＸまたはＭＰＡは、単一用量で投与される。他の実施形態では、ＭＴＸおよび／またはＭＰＡの複数用量は投与される。
【００７８】
本開示の改変Ｔ細胞は（ｅｘ  ｖｉｖｏで選択され、患者または哺乳動物対象に投与されると）、ＭＴＸ（またはＭＰＡ）へのそれらの感受性を考慮すると変調可能な「オン」／「オフ」スイッチとして役立ち得ると考えられている。調節可能スイッチは、任意の副作用が生じた患者へのＭＴＸの投与を通じて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの改変Ｔ細胞の少なくとも一部の選択的殺滅によって、免疫系再構築の制御を可能にする。この調節可能スイッチは、副作用が低減されたまたは他の形で軽減された後のさらなる免疫系再構築を可能にするために、ＭＴＸ投与後に患者にさらなる改変Ｔ細胞を投与することによってさらに制御できる。同様に、調節可能スイッチは、副作用が生じたときにＭＴＸの投与を通じたｉｎ  ｖｉｖｏでの改変Ｔ細胞の少なくとも一部の選択的な殺滅によって移植片対悪性腫瘍効果の制御を可能にする。再度、ＧＶＭ効果は、副作用が低減されるまたは他の形で軽減されると、患者への改変Ｔ細胞のさらなるアリコートの続く投薬によって微調整できる。この同じ原理は、ＣＡＲ−Ｔ細胞治療またはＴＣＲ−改変Ｔ細胞を用いた治療に適用され、ここで再びＣＡＲ−Ｔ細胞またはＴＣＲ−改変Ｔ細胞は、ＭＴＸ投与を通じて選択的にオン／オフできる。この観点から、当業者は、患者の処置を監督するすべての医療従事者は、副作用を食い止めるまたは耐容性を示すことができるもしくは許容できる範囲内に保ちながら、免疫系再構築および／またはＧＶＭ効果の平衡を保つことができることを理解する。上の理由から、有害作用を軽減する一方で、患者処置は増強される。
【００７９】
一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約１００ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約９０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約７０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約６０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約５０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約４０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約３０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約２０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約１０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。さらに他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約５ｍｇ／ｍ２／注入である。またさらなる実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約７．５ｍｇ／ｍ２／注入である。
【００８０】
一部の実施形態では、２回から６回の間の注入が行われ、注入は、同じ投薬量または異なる投薬量（例えば、投薬量を漸増させる、投薬量を減少させるなど）をそれぞれ含んでよい。一部の実施形態では、投与は週単位でまたは２ヵ月単位で行われる。
【００８１】
さらに他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、管理されていない副作用、例えばＧＶＨＤが解決される一方で、少なくとも一部の改変Ｔ細胞および、免疫系を再構築する、がんを標的化するまたはＧＶＭ効果を誘導することへのそれらに随伴する効果を維持するように用量設定される。これに関して、副作用、例えばＧＶＨＤを回復させる一方で、改変Ｔ細胞の利益の少なくとも一部はまだ認められると考えられる。一部の実施形態では、追加的改変Ｔ細胞は、ＭＴＸを用いた処置後、すなわち副作用、例えばＧＶＨＤの解決、抑制または管理後に投与される。
【００８２】
一部の実施形態では、対象は、ＨＳＣ移植術後の副作用を管理または予防するなどのために、改変Ｔ細胞の投与に先立ってＭＴＸの投与を受ける。一部の実施形態では、ＭＴＸを用いる既存の処置は、改変Ｔ細胞の投与に先立って停止され、次に、改変Ｔ細胞を用いた処置後の副作用の発症で同じまたは異なる投薬量で（および同じまたは異なる投薬スケジュールを使用して）再開される。これに関して当業者は、必要に応じておよび医療業界において公知の標準治療に一致してＭＴＸを投与する場合がある。
【００８３】
一部の実施形態では、代替的薬剤は、ＭＴＸまたはＭＰＡのいずれかの代わりとして使用することができ、これだけに限らないがリババリン（ＩＭＰＤＨ阻害剤）；ＶＸ−４９７（ＩＭＰＤＨ阻害剤）（Ｊａｉｎ  Ｊ，ＶＸ−４９７：ａ  ｎｏｖｅｌ，ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＩＭＰＤＨ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ａｇｅｎｔ，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．２００１  Ｍａｙ；９０（５）：６２５〜３７を参照されたい）；ロメトレキソール（ＤＤＡＴＨＦ、ＬＹ２４９５４３）（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）；チオフェン類似体（ＬＹ２５４１５５）（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）、フラン類似体（ＬＹ２２２３０６）（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（Ｈａｂｅｃｋら、Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｃｌａｓｓ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｇｌｕｔａｍａｔｅｄ  Ａｎｔｉｆｏｌａｔｅｓ  Ｅｘｈｉｂｉｔｓ  Ｔｉｇｈｔ−ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｅ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ａｎｄ  Ｐｏｔｅｎｔ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５４，１０２１〜２０２６，Ｆｅｂ．１９９４を参照されたい）；ＤＡＣＴＨＦ（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（Ｃｈｅｎｇら、Ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  １０−ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ−ＤＤＡＣＴＨＦ，  １０−ｍｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ−５−ＤＡＣＴＨＦ，ａｎｄ  １０−ｍｅｔｈｙｌｔｈｉｏ−ＤＤＡＣＴＨＦ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ＧＡＲ  Ｔｆａｓｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｐｕｒｉｎｅ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐａｔｈｗａｙ；Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００５  Ｍａｙ  １６；１３（１０）：３５７７〜８５を参照されたい）；ＡＧ２０３４（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（Ｂｏｒｉｔｚｋｉら、ＡＧ２０３４：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｇｌｙｃｉｎａｍｉｄｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒｍｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇｓ．１９９６；１４（３）：２９５〜３０３を参照されたい）；ＬＹ３０９８８７（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（（２Ｓ）−２−［［５−［２−［（６Ｒ）−２−アミノ−４−オキソ−５，６，７，８−テトラヒドロ−１Ｈ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−６−イル］エチル］チオフェン−２−カルボニル］アミノ］ペンタン二酸）；アリムタ（ＬＹ２３１５１４）（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）（Ｓｈｉｈら、ＬＹ２３１５１４，ａ  ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３−ｄ］ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ−ｂａｓｅｄ  ａｎｔｉｆｏｌａｔｅ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｏｌａｔｅ−ｒｅｑｕｉｒｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９９７  Ｍａｒ  １５；５７（６）：１１１６〜２３を参照されたい）；ｄｍＡＭＴ（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）、ＡＧ２００９（ＧＡＲおよび／またはＡＩＣＡＲ阻害剤）；フォロデシン（イムシリンＨ、ＢＣＸ−１７７７；商標ＭｕｎｄｅｓｉｎｅおよびＦｏｄｏｓｉｎｅ）（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ［ＰＮＰ］の阻害剤）（Ｋｉｃｓｋａら、Ｉｍｍｕｃｉｌｌｉｎ  Ｈ，ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ−ｓｔａｔｅ  ａｎａｌｏｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｐｕｒｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ，ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ，ＰＮＡＳ  Ａｐｒｉｌ  １０，２００１．９８（８）４５９３〜４５９８を参照されたい）；ならびにイムシリン−Ｇ（プリンヌクレオシドホスホリラーゼ［ＰＮＰ］の阻害剤）が挙げられる。
【００８４】
移植後免疫不全の予防
ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）マッチ同胞由来の造血幹細胞移植術が多数の血液疾患（悪性および非悪性）のための標準的処置様式になっているが、同種ＨＳＣ移植術（ａｌｌｏ−ＨＳＣＴ）は、慢性骨髄性白血病のための唯一の証明された根治療法のままである。この手順のために必要な多能性造血幹細胞は、血縁または非血縁ドナーの骨髄または末梢血液から通常得られる。歴史的に、同種ＨＣＴの最良の結果は、幹細胞ドナーがＨＬＡマッチ同胞である場合に得られている。しかし、任意の所与の同胞対は、彼らの両親から同じＨＬＡハロタイプを受け継ぐ機会は約２５％しか有さない。これは、患者の約３０％だけがそのようなマッチを有することを意味している。結果として、注目は幹細胞の他の供給源に向いている。ＨＬＡマッチ同胞を欠いている患者に関して、ドナーグラフトの代替的供給源として、適切なＨＬＡマッチ成人非血縁ドナー、臍帯血幹細胞および部分的なＨＬＡミスマッチまたはＨＬＡハプロタイプ一致、血縁ドナーが挙げられる。どのドナー供給源を利用するかの判断は、臨床状況および個々の移植施設で使用される手法に大きく依存する。しかし、ほとんどすべての患者が、ドナーとして即座に利用可能である少なくとも１名のＨＬＡハロタイプ一致ミスマッチ家族員（親、子または同胞）を有すると考えられている。
【００８５】
ＨＬＡハロタイプ一致ＨＳＣＴの主な課題は、移植片拒絶およびＧＶＨＤを高発生率で生じる激しい二方向性アロ反応性である。移植工学およびＧＶＨＤの薬学的予防における進歩は、ＨＬＡハロタイプ一致ＨＣＴ後の移植片不全およびＧＶＨＤのリスクを低減し、この幹細胞供給源をＨＬＡマッチ同胞を欠いている患者のための実行可能な選択肢にしている。しかし、これらの手法の両方が、移植片不全に無関係の死亡率の主な原因であるレシピエントを感染に感受性にする移植後免疫不全期間を生じる可能性があると考えられている。ドナーリンパ球は、特にＴ細胞枯渇マッチ移植のサブセットにおいておよび部分ミスマッチ移植の内容で、免疫再構築の誘導において中心的な治療上の役割を演じると考えられている。実際、ＤＬＩは、感染を予防または軽減するため、および完全ドナーキメラ化を確立するために幹細胞移植術後に使用できると考えられている。ウイルス、真菌および他の日和見感染に対してＴ細胞免疫の幅広いレパートリーを呈する成熟Ｔ細胞の添加は、臨床的利益を提供できる（例えば、Ｌｏｒｅｎ  ＡＷ，Ｐｏｒｔｅｒ  ＤＬ．Ｄｏｎｏｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｕｎｒｅｌａｔｅｄ  ｄｏｎｏｒ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．２００６  Ｍａｒ；１８（２）：１０７〜１４；およびＺｈｏｕ  Ｘら、Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ａｎｄ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｃａｓｐａｓｅ  ９  ｓａｆｅｔｙ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４  Ｊｕｎ  １９；１２３（２５）：３８９５〜９０５を参照されたい、その開示はその全体をそれぞれ参照によって本明細書に組み入れる）。
【００８６】
本明細書に記すとおり、ＧＶＨＤは、患者が幹細胞移植を用いて処置された後に生じる場合がある。これに対抗するために、本開示は、移植後免疫不全を予防または軽減する方法およびＧＶＨＤが生じた場合に低減する、抑制するまたは管理するための薬理学的手法を提供する。開示される手法は、上に記載されるＨＬＡハロタイプ一致ＨＳＣＴの実施と統合されると考えられている。一部の実施形態では、方法は、同種ＨＳＣＴ後の患者で免疫再構築を加速するために、ＨＰＲＴ欠損改変Ｔ細胞の注入を利用し、同時に宿主に少なくともいくらかの免疫を提供する一方で、ＭＴＸを用いる投薬を介してＧＶＨＤを抑制または管理できるようにする。
【００８７】
図２は、症状の発症でＧＶＨＤを低減する、抑制するまたは管理する１つの方法を例示する。最初に、細胞はステップ２１０でドナーから回収される。細胞は、グラフト化のためのＨＳＣを提供した（ステップ２６０を参照されたい）同じドナーから、または異なるドナーから回収される場合がある。次にリンパ球は、回収された細胞から単離され（ステップ２２０）、それらがＨＰＲＴ欠損となるように処置される（ステップ２３０）。単離された細胞を処置する方法は、本明細書に記載されている。ＨＰＲＴ欠損である改変Ｔ細胞の集団に至るように、処置細胞は、本明細書に記載のようにポジティブ選択され、増殖される（ステップ２４０）。次に改変Ｔ細胞は、後の使用のために保存される。
【００８８】
ＨＳＣグラフト（ステップ２６０）を受けることに先立って、患者は、標準治療（例えば、高線量前処置放射線、化学療法および／もしくはプリン類似体を用いる処置；または低線量前処置放射線、化学療法、および／もしくはプリン類似体を用いる処置）により、骨髄破壊的前処置を用いて処置される（ステップ２５０）。
【００８９】
一部の実施形態では、患者は、移植前処置を用いた処置後、約２４から約９６時間の間にＨＳＣグラフト（ステップ２６０）を用いて処置される。他の実施形態では、患者は、移植前処置を用いた処置後、約２４から約７２時間の間にＨＳＣグラフトを用いて処置される。さらに他の実施形態では、患者は、移植前処置を用いた処置後、約２４から約４８時間の間にＨＳＣグラフトを用いて処置される。一部の実施形態では、ＨＳＣグラフトは、ＣＤ３４＋細胞６×１０６個／ｋｇより多くが標的で最小限ＣＤ３４＋細胞２×１０６個／ｋｇを含む。
【００９０】
ＨＳＣグラフト化後、ステップ２４０からの改変Ｔ細胞は、標準的輸注プロトコールに従って患者に投与される（ステップ２７０）。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、ＨＳＣグラフト後、約２から約８週間の間に投与される。他の実施形態では、改変Ｔ細胞は、ＨＳＣグラフト後、約２から約６週間の間に投与される。さらに他の実施形態では、改変Ｔ細胞は、ＨＳＣグラフト後、約２から約４週間の間に投与される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、ＨＳＣグラフト後、約１日から約２１日の間に投与される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、ＨＳＣグラフト後、約１日から約１４日の間に投与される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、ＨＳＣグラフト後、約１日から約７日の間に投与される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、ＨＳＣグラフト後、約２日から約４日の間に投与される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、ＨＳＣグラフトと同時に、またはＨＳＣグラフトの数時間以内（例えばＨＳＣグラフト後１、２、３または４時間）に投与される。
【００９１】
改変Ｔ細胞は、単一投与で輸注される。代替的に、改変Ｔ細胞は、一連の複数回投与にわたって輸注される。改変Ｔ細胞の複数回投与が行われる実施形態では、本明細書に記載のように同じまたは異なる量の改変Ｔ細胞が各投与で輸注される。
【００９２】
改変Ｔ細胞の投与に続いて、患者はＧＶＨＤの発症についてモニターされる。症状が現れたら、ＭＴＸは、ＧＶＨＤを逆行させる、抑制するまたは管理するために投与される（ステップ２８０）。ＭＴＸは、単一用量または複数用量で投与される。複数回のＭＴＸ投与が行われる場合、投薬量は、改変Ｔ細胞によって免疫系に提供される保護の一部を維持しながら、ＧＶＨＤのバランスを保つように用量設定される。
【００９３】
一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約１００ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約９０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約７０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約６０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約５０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約４０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約３０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約２０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約１０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。さらに他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約５ｍｇ／ｍ２／注入である。またさらなる実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約７．５ｍｇ／ｍ２／注入である。
【００９４】
一部の実施形態では、２回から６回の間の注入が行われ、注入は、同じ投薬量または異なる投薬量（例えば、投薬量を漸増させる、投薬量を減少させるなど）をそれぞれ含んでよい。他の実施形態では、２回から４回の間の注入が行われる。一部の実施形態では、投与は週単位でまたは２ヵ月単位で行われる。
【００９５】
残存または再発疾患における移植片対悪性腫瘍の誘導
白血病、リンパ腫およびミエローマを含む血液悪性腫瘍の処置は、通常化学療法および／または放射線治療の１つまたはそれ以上の形態を含む。これらの処置は、悪性細胞を破壊するが身体の健康な血液細胞も同様に破壊する。同種骨髄移植術（ＢＭＴ）は、多数の血液悪性腫瘍の処置において有用で有効な治療である。同種ＢＭＴでは、非血縁または血縁（しかし、一卵性双生児ではない）ドナーからの骨髄（または、一部の場合では末梢血液）は、がん患者における健康な血液細胞を置き換えるために使用される。骨髄（または末梢血液）は、血液において見出されるすべてのさまざまな細胞型（例えば、赤血球、貪食細胞、血小板およびリンパ球）への前駆体である幹細胞を含有する。同種ＢＭＴは、回復性効果および治癒的効果の両方を有すると考えられている。回復性効果は、血液の細胞性コンポーネントを再配置する幹細胞の能力から生じる。同種ＢＭＴの治癒特性は、移植片対悪性腫瘍（ＧＶＭ）効果（移植片対腫瘍効果（ＧＶＴ）とも称される）に大きく由来する。ドナー由来の造血性細胞（具体的には、Ｔリンパ球）は、がん性細胞を攻撃すると考えられており、他の形態の処置の抑制効果を増強する。本質的にＧＶＭ効果はＢＭＴに由来する血液細胞による残存腫瘍細胞への攻撃を含み、移植後に悪性腫瘍が戻りにくくしている。
【００９６】
血液悪性腫瘍のための同種造血幹細胞移植術の効能は、移植片対悪性腫瘍効果を損なうことなく移植片対宿主病を抑制することの困難さによって限定される。ＤＬＩは、同種移植後に再発または残存疾患を処置するため、混合から完全ドナーキメラ化に転換するため、Ｔ細胞枯渇移植後の「追加輸注」として完全免疫機能を回復させるためにおよび先制治療として再発に対する予防として使用されている。実際にドナーリンパ球注入は、すべての細胞傷害性治療が失敗した場合でさえも多数の患者において完全で維持された寛解を誘導できるＧＶＭの強力な劇的な例を提供した。ＤＬＩは、第２の同種ＨＳＣＴよりもさらに安全な代替的選択肢であり得る一方で、ＧＶＨＤは、著しい罹患率および死亡率を生じる一般的な合併症である（Ｐｏｒｔｅｒ  Ｄ，Ｌｅｖｉｎｅ  ＪＥ．Ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｆｔｅｒ  ｄｏｎｏｒ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ．Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００６  Ｊａｎ；４３：５３〜６１；Ｃｉｃｅｒｉ  Ｆ，Ｂｏｒｄｉｇｎｏｎ  Ｃ．  Ｓｕｉｃｉｄｅ−ｇｅｎｅ−Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｄｏｎｏｒ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｈｏｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｇｒａｆｔ−ｖｅｒｓｕｓ−ｔｕｍｏｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００２  Ｎｏｖ；７６：３０５〜９を参照されたい）。不運なことにおよび本明細書に記載のとおり、急性ＧＶＨＤは、患者の死のおよそ１０％の原因になっている。実際に一部の場合では、ＤＬＩ誘導ＧＶＨＤは、非常に重症である場合があり、ＤＬＩレシピエントの約２０％から約３５％の間は、グレードＩＩＩからＩＶ急性ＧＶＨＤを発症すると考えられている。このように、ＧＶＭ効果を管理することは、ＧＶＭ効果のＧＶＨＤへの深刻化を予防すると述べることができる。したがって、有益なＧＶＭ効果を最大化しながらＧＶＨＤの驚異を管理することは、同種ＢＭＴ手順の範囲および有用性を広げる。
【００９７】
本明細書に記載のとおり、ＧＶＨＤを低減する従来の方法は、ドナーリンパ球注入の際に投与されるＴ細胞の数を管理することを含む。しかし、この方法は、ＧＶＭ効果の減少を生じるだけでなく、免疫回復を遅らせる可能性があり、移植片拒絶の割合も増加させる可能性がある。これに対抗するため本開示の一部の態様は、少なくとも部分的にＨＰＲＴ欠損であるように改変されたリンパ球を、患者に投与することによってＧＶＭ効果を刺激するまたは促すことによってがんを処置し、次いでＧＶＨＤの発症をモニタリングする方法である。ＧＶＨＤの発症で、ＭＴＸの１回またはそれ以上の治療有効用量は、ＧＶＨＤを抑制する、低減する、管理するまたは他の形で軽減するために投与される。一部の実施形態では、ＭＴＸの単一投薬量が投与される。他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、ＧＶＨＤの発症の重症度に依存し、その関連で、ＭＴＸの用量（または投薬量）は、ＧＶＨＤ症状の所望の低減を達成するように用量設定される（再度、任意のＧＶＭ効果の平衡をとることを意図して）。一部の実施形態では、ＧＶＭは、移植片対白血病効果（ＧＶＬ）である。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、単一投与の際に提供される。他の実施形態では、改変Ｔ細胞の複数回投与が提供される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、図１に例示されるような本明細書に記載の方法（ステップ１１０から１４０まで）により産生される。
【００９８】
図３は、症状の発症でＧＶＨＤを低減する、抑制するまたは管理する１つの方法を例示する。最初に、細胞をステップ３１０でドナーから回収される。細胞は、グラフト化のためのＨＳＣを提供した（ステップ３３５を参照されたい）同じドナーから、または異なるドナーから回収される。次にリンパ球は、回収された細胞から単離され（ステップ３２０）、それらがＨＰＲＴ欠損（ステップ３３０）になるように処置される。単離された細胞を処置する方法は、本明細書に記載されている。ＨＰＲＴ欠損である改変Ｔ細胞の集団に至るように、処置細胞は、本明細書に記載のように選択され、増殖される（ステップ３４０）。次に改変Ｔ細胞は、後の使用のために保存される。
【００９９】
がん、例えば血液学的がんを有する患者は、提示およびがんのステージ分類時に患者に利用可能な標準治療により処置される（例えば、放射線および／またはバイオ医薬品を含む化学療法）（ステップ３１５）。患者は、ＨＳＣ移植術についての候補であり、その場合、移植前処置（ステップ３２５）が実行される（例えば、高線量前処置放射線または化学療法による）。悪性腫瘍について、血液系を完全に、または可能な限り完全に近く「一掃」し、それにより可能な限り多くの悪性細胞を殺滅することが望まれると考えられている。そのような移植前処置の目標は、がん細胞を強く処置し、それによりがんを再発しにくくし、幹細胞移植片拒絶の機会を低減するように免疫系を不活性化し、ドナー細胞が骨髄に移動できるようにすることである。一部の実施形態では、前処置は、シクロホスファミド、シタラビン（ＡｒａＣ）、エトポシド、メルファラン、ブスルファンまたは高線量全身照射の１つまたはそれ以上の投与を含む。次に患者は、同種ＨＳＣグラフト（ステップ３３５）を用いて処置される。一部の実施形態では、同種ＨＳＣグラフトは、少なくとも部分的なＧＶＭ、ＧＶＴまたはＧＶＬ効果を誘導する。
【０１００】
グラフト化後、患者は、残存または再発疾患についてモニターされる（ステップ３５０）。そのような残存または再発疾患自体が存在したら、改変Ｔ細胞（ステップ３４０で産生）は、ＧＶＭ、ＧＶＴまたはＧＶＴ効果が誘導されるように、患者に投与される（ステップ３６０）。改変Ｔ細胞は、数回投与のコースでの単一投与で注入することができる。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞はＨＳＣグラフト後約１日から約２１日の間に投与される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞はＨＳＣグラフト後、約１日から約１４日の間に投与される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞はＨＳＣグラフト後、約１日から約７日の間に投与される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞はＨＳＣグラフト後、約２日から約４日の間に投与される。一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、ＨＳＣグラフトと同時にまたはＨＳＣグラフトの数時間以内（例えばＨＳＣグラフト後１、２、３または４時間）に投与される。
【０１０１】
ＧＶＨＤの症状が現れたら、ＭＴＸは、患者に単一用量または複数用量にわたって投与される。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、ＧＶＨＤ発症の重症度に依存し、その関連でＭＴＸの用量（または投薬量）は、ＧＶＨＤ症状の望ましい低減および／または望ましいレベルのＧＶＭ、ＧＶＴもしくはＧＶＬ効果を達成するために用量設定される。
【０１０２】
一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約１００ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約９０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約７０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約６０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約５０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約４０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約３０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約２０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約１０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。さらに他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約５ｍｇ／ｍ２／注入である。またさらなる実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約７．５ｍｇ／ｍ２／注入である。
【０１０３】
一部の実施形態では、２回から６回の間の注入が行われ、注入は、同じ投薬量または異なる投薬量（例えば、投薬量を漸増させる、投薬量を減少させるなど）をそれぞれ含んでよい。一部の実施形態では、投与は週単位でまたは２ヵ月単位で行われる。
【０１０４】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変Ｔ細胞の選択および除外における使用のための調節可能スイッチ
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原結合ドメインを膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に繋ぐことによって養子免疫治療のために設計される。これは、腫瘍細胞上に提示されている特定の抗原を認識し、これらの腫瘍細胞を特異的に溶解するようにＴ細胞を活性化するキメラ抗原受容体を発現しているＴ細胞の養子移行によって腫瘍細胞を根絶するための有用な抗腫瘍手法である。このＣＡＲ戦略の重要な態様は、腫瘍上に特異的または選択的に発現され、すべての腫瘍細胞上に存在し、細胞表面から脱落または調節されない膜エピトープである標的エピトープの選択である。しかし、理想的にはＣＡＲＴ  Ｔ細胞は、任意の哺乳動物（ヒトなど）レシピエントのために好適な一般的試薬または薬物として使用することができる。そのような様式で細胞を使用するために、ＣＡＲ依存性エフェクター機能を損なうことなく、移植片対宿主応答におけるそれらの拒絶は予防されなければならない。
【０１０５】
対象におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の使用の１つの欠点は、一部のレシピエントにおけるサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）の惹起である。「サイトカインストーム」または近年、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、とも称されるサイトカイン関連毒性は、ＣＡＲ−Ｔ細胞治療の一般的で潜在的に致死性の合併症である。ＣＲＳは、ＣＡＲ−Ｔ細胞移行などの現代の免疫治療を使用する臨床的利益を媒介するために典型的に必要とされる高レベルのＣＡＲ  Ｔ細胞増殖および免疫活性化の結果として生じる場合がある非抗原特異的毒性である。症状発症の時期およびＣＲＳ重症度は、誘導剤および免疫細胞活性化の規模に依存する。症状発症は、Ｔ細胞注入後、典型的には数日から時に数週間で、最大ｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｔ細胞増殖と同時に生じる。がんのための養子Ｔ細胞治療後のＣＲＳの近年の報告において、症候群の発生率および重症度は、患者が大きな腫瘍負荷を有する場合に大きく、養子で移行され、増殖および活性化したＣＡＲ−Ｔ細胞集団によるＴＮＦ−ｃｃなどの炎症誘発性サイトカイン産生物の発現による。養子Ｔ細胞治療に伴うＣＲＳは、ＩＦＮｙ、ＩＬ−６およびＴＮＦａレベルの上昇に一貫して関連しており、ＩＬ−２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、ＩＬ−１０、ＩＬ−８、ＩＬ−５およびフラクタルカインにおける増加も報告されている。
【０１０６】
本開示の別の態様は、ＨＰＲＴ欠損である改変ＣＡＲ  Ｔ細胞をそれを必要とする患者に投与することによる、がんを有する患者を処置する方法である。図４は、がんを有する患者を処置し、次いで任意の有害な副作用を低減する、抑制するまたは管理する１つの方法を例示する。最初に細胞は、ステップ４１０でドナーから回収される。次にリンパ球は、回収された細胞から単離され（ステップ４２０）、ＨＰＲＴ欠損であるＣＡＲ−Ｔ細胞を提供するために改変される。
【０１０７】
Ｔ細胞へのＣＡＲ構築物の導入のための遺伝子改変は、例えばベクターなどの組換えＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を用いてＴ細胞組成物を形質導入する（または他の形で送達する）ことによって達成される。適切なＤＮＡ配列は、種々の手順によってベクターに挿入されるが、一般にＤＮＡ配列は、当技術分野において公知の手順によって適切な制限エンドヌクレアーゼ部位（複数可）に挿入される。ＣＡＲ構築物の導入に加えて、ＨＰＲＴ遺伝子をノックアウトするためのｓｈＲＮＡも（本明細書に記載などの）ＨＰＲＴ活性を同時にノックアウトするために使用できる他の方法に含まれる。
【０１０８】
米国特許第５，３５９，０４６号、第５，６８６，２８１号および第６，１０３，５２１号（その開示はその全体を参照によって本明細書に組み入れる）に記載されるとおり、キメラ受容体の細胞外ドメインは、任意の多種多様な細胞外ドメインまたは、リガンド結合および／もしくはシグナル伝達に関連する分泌タンパク質から得ることができる。細胞外ドメインは、モノマー、ホモ二量体、ヘテロ二量体または、非共有結合複合体中の多数のタンパク質と会合しているタンパク質の一部であってよい。具体的には細胞外ドメインは、次にＣＨＩおよびヒンジ領域の存在のためにＩｇ軽鎖に共有結合で結合できる、またはヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの存在により他のＩｇ重／軽鎖複合体に共有結合で結合できる、Ｉｇ重鎖からなってよい。後者の場合、キメラ構築物に連結する重／軽鎖合体は、キメラ構築物の抗体特異性とは異なる特異性を有する抗体を構成できる。抗体の機能、望ましい構造およびシグナル伝達に応じて鎖全体を使用でき、または切断された鎖を使用でき、ここでＣＨＩ、ＣＨ２またはＣＨ３ドメインの全体または一部は除去できる、またはヒンジ領域の全体もしくは一部は除去できる。
【０１０９】
ＣＡＲの細胞外ドメインは、しばしば免疫グロブリンに由来する。本明細書において使用される場合、用語「抗体」は、１つまたはそれ以上の免疫グロブリン遺伝子（複数可）または、抗原もしくはエピトープに特異的に結合できるその断片に由来する、それをモデルにしているまたは実質的にそれによってコードされているペプチドまたはポリペプチドを指す。例えばＦｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）；Ｗｉｌｓｏｎ（１９９４；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １７５：２６７〜２７３；Ｙａｒｍｕｓｈ  （１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：８５〜９７を参照されたい。用語、抗体は、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨＩドメインからなる一価断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨＩドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４〜５４６）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む抗原結合部分、すなわち抗原に結合する能力を保持している「抗原結合部位」（例えば、断片、サブ配列、相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む。１本鎖抗体も用語「抗体」に参照により含まれる。
【０１１０】
抗腫瘍性キメラ受容体が利用される場合、腫瘍は、キメラ受容体によって認識される細胞表面抗原を有する限り任意の種類であってよい。具体的な実施形態では、キメラ受容体は、特異的モノクローナル抗体が存在するまたは生成することができる任意のがんに対してであってよい。具体的には、神経芽細胞腫、小細胞肺がん、メラノーマ、卵巣がん、腎細胞癌、結腸がん、ホジキンリンパ腫および急性リンパ性白血病（例えば、小児急性リンパ性白血病）などのがんは、キメラ受容体によって標的化される抗原を有する。この組成物および方法は、がんの処置、具体的には肺がん、メラノーマ、乳がん、前立腺がん、結腸がん、腎細胞癌、卵巣がん、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、白血病およびリンパ腫の処置における免疫治療において使用できる。本明細書に記載される組成物および方法は、本明細書以下に記載の化学療法、手術、放射線、遺伝子治療などのがんのための他の種類の治療と併せて利用できる。
【０１１１】
ＨＰＲＴ欠損である改変ＣＡＲ  Ｔ細胞の集団に至るために、処置された細胞は、本明細書に記載のように選択され、増殖される（ステップ４４０）。ＨＰＲＴ欠損である改変ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ある特定の腫瘍細胞を標的化するために患者に投与できる（ステップ４５０）。ＣＡＲＴ  Ｔ治療のいかなる副作用が生じても、ＭＴＸは、副作用を抑制、低減または管理するために患者（４６０）に投与される。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、副作用の種類および／または重症度に依存し、その関連でＭＴＸの用量（または投薬量）は、現れた副作用の望ましい低減を達成するために用量設定することができる。
【０１１２】
一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約１００ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約９０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約７０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約６０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約５０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約４０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約３０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約２０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約１０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。さらに他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約５ｍｇ／ｍ２／注入である。またさらなる実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約７．５ｍｇ／ｍ２／注入である。
【０１１３】
一部の実施形態では、２回から６回の間の注入が行われ、注入は、同じ投薬量または異なる投薬量（例えば、投薬量を漸増させる、投薬量を減少させるなど）をそれぞれ含んでよい。一部の実施形態では、投与は週単位でまたは２ヵ月単位で行われる。
【０１１４】
Ｔ細胞受容体改変（ＴＣＲ）Ｔ細胞の選択および除外における使用のための調節可能スイッチ
本開示はＨＰＲＴ欠損でもあるＴＣＲ−改変Ｔ細胞を使用して、疾患および障害を低減または回復または予防または処置する方法も対象とする。最初に細胞は、ドナーから回収される。次にリンパ球は、回収された細胞から単離され、ＨＰＲＴ欠損であるＴＣＲ−改変Ｔ細胞を提供するために改変される。ＴＣＲ−改変Ｔ細胞治療のいかなる副作用が生じた場合も、ＭＴＸは、副作用を抑制、低減または管理するために患者に投与される。
【０１１５】
Ｔ細胞（Ｔリンパ球としても公知）は、組織および腫瘍環境に広く分布していることが見出されている。それらは、細胞性免疫において中心的役割を演じており、長く続く、抗原特異的なエフェクターおよび免疫メモリー応答を媒介できる。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって他のリンパ球から識別される。ＴＣＲは、マルチサブユニット膜貫通複合体であり、Ｔ細胞の抗原特異的活性化を媒介する。ＴＣＲは、２つの異なるポリペプチド鎖、ＴＣＲαおよびβ鎖からなる。両鎖は、Ｎ末端可変領域および定常領域を有する。鎖は、ジスルフィド結合によって連結されており、各受容体は、単一の抗原結合部位を提供している。ＴＣＲの刺激は、抗原ペプチドをＴ細胞に提示し、ＴＣＲ複合体に結合し、一連の細胞内シグナル伝達カスケードを誘導する抗原提示細胞上の主要組織適合性抗原分子（ＭＨＣ）（高度に多型の遺伝子のファミリーを包含する遺伝子座によってコードされ、免疫応答を管理するタンパク質）によって引き起こされる。
【０１１６】
さらに詳細には、ＴＣＲは、一般に、リガンド認識に関与するＴＣＲヘテロ二量体を形成する６個の異なる膜結合鎖からなる。ＴＣＲは、アルファ／ベータおよびガンマ／デルタ形態で存在し、構造的に類似しているが解剖学的位置および機能が異なる。一実施形態では、ＴＣＲをコードする核酸がＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータ鎖をコードする核酸を含むなど、ＴＣＲは、ＴＣＲアルファおよびベータ鎖を含む。別の実施形態では、アルファもしくはベータ鎖または両方は、少なくとも１つのＮ−脱グリコシル化を含む。各鎖は、２つの細胞外ドメイン、可変および定常ドメインからなる。一実施形態では、ＴＣＲは、少なくとも１つのマウス定常領域を含む。定常ドメインは、細胞膜に近位であり、膜貫通ドメインおよび短い胞質側末端が続く。一実施形態では、同時刺激シグナル伝達ドメインは、４−ＩＢＢ同時刺激シグナル伝達ドメインである。可変ドメインは、ＴＣＲが結合特異性を有する特定の抗原およびＭＨＣ分子の決定に寄与する。次に、固有の抗原ＭＨＣ複合体に対するＴ細胞の特異性は、Ｔ細胞によって発現される特定のＴＣＲに存在する。定常および可変ドメインそれぞれは、鎖内ジスルフィド結合を含む場合がある。一実施形態では、ＴＣＲは、少なくとも１つのジスルフィド結合を含む。可変ドメインは、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）に類似している高度に多型のループを含む。ＴＣＲ配列の多様性は、連結された可変（Ｖ）、多様性（Ｄ）、連結（Ｊ）および定常遺伝子の体細胞再編成を介して生成される。機能性アルファおよびガンマ鎖ポリペプチドは、再編成されたＶ−Ｊ−Ｃ領域によって形成される一方で、ベータおよびデルタ鎖は、Ｖ−Ｄ−Ｊ−Ｃ領域からなる。細胞外定常ドメインは、膜近位領域および免疫グロブリン領域を含む。
【０１１７】
ＴＣＲは、主要組織適合性抗原分子によって標的細胞上に提示されるタンパク質の短い近接アミノ酸配列を含む抗原リガンドを認識することによって、抗原性特異性をＴ細胞に付与する。ＭＨＣクラスＩＩについてのＣＤ４およびＭＨＣクラスＩについてのＣＤ８などの、Ｔ細胞によって発現されるアクセサリー接着分子も関与する。ＴＣＲは、ＭＨＣ分子および抗原ペプチドの両方と接触することによってこのリガンドと相互作用する。シグナル伝達は、２つのヘテロ二量体（ＣＤ３δεおよびＣＤ３γε）ならびに１つのホモ二量体（ＣＤ３ζζ）を形成する４つの異なるＣＤ３タンパク質からなる会合したインバリアントなＣＤ３複合体を通じてである。
【０１１８】
ＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるそれらの同族ペプチドとの接触に続いて、未処置ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞は、活発に増殖し、それらがエフェクターＴ細胞として作用できるようにする表現型特性および機能的特性を獲得する；これらは、アポトーシス誘導リガンドまたは溶解性顆粒の放出を通じて抗原を発現している細胞を除去する。加えて、自己複製できる持続性メモリーＴ細胞が生成され、標的抗原の存在下での急速な増殖を可能にし、再曝露の際に持続性で、耐久性のある応答を提供する。適応免疫応答のオーケストレーターおよびエフェクターとしてのＴ細胞の機能は、ＴＣＲの特異性によって方向付けられる。
【０１１９】
Ｔ細胞は、複合体としてＴ細胞受容体全体を、内部移行し、選別し、静止Ｔ細胞では約１０時間、刺激されたＴ細胞では３時間の半減期で分解する（ｖｏｎ  Ｅｓｓｅｎ，  Ｍ．ら、２００４．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：３８４〜３９３）。ＴＣＲ複合体の適切な機能性化は、ＴＣＲ複合体を構成するタンパク質の適切な化学量論比を必要とする。ＴＣＲ機能もＩＴＡＭモチーフを有する２つの機能的ＴＣＲゼータタンパク質を必要とする。そのＭＨＣ−ペプチドリガンドとの会合でのＴＣＲの活性化は、すべて適切にシグナルを伝達するはずである、同じＴ細胞上でのいくつかのＴＣＲの会合を必要とする。したがって、ＴＣＲ複合体が、適切に会合しないまたは最適にシグナルを伝達できないタンパク質で不安定化されると、Ｔ細胞は、細胞応答を開始するために十分には活性化されなくなる。
【０１２０】
遺伝子的に改変されたＴＣＲ治療は、抗原認識工程を媒介する特異的ＴＣＲαおよびβ鎖の発現を通じてＴ細胞特異性を変更することに基づいている。腫瘍特異的ＴＣＲαおよびβ鎖は同定され、単離され、形質導入ベクターにクローニングされ、Ｔ細胞の形質導入は、腫瘍抗原特異的Ｔ細胞を作出する。一部の実施形態では、ＴＣＲ発現は、特異的ＴＣＲ（例えば、ＴＣＲ−αおよびＴＣＲ−β）および／または初代Ｔ細胞中のＣＤ３鎖をコードする核酸を標的化するｓｈＲＮＡを使用して改変される。これらのタンパク質の１つまたはそれ以上の発現を遮断することによって、Ｔ細胞は、ＴＣＲ複合体の１つまたはそれ以上の重要なコンポーネントをもはや産生しない。初代Ｔ細胞中のｓｈＲＮＡの発現は、任意の従来の発現系、例えばレンチウイルス発現系を使用して達成できる。ＴＣＲ−アルファ、ＴＣＲ−ベータ、ＴＣＲ−ガンマ、ＴＣＲ−デルタ、ＣＤ３−ガンマ、ＣＤ３−デルタ、ＣＤ３−イプシロンまたはＣＤ３−ゼータｍＲＮＡは、種々の標的化ｓｈＲＮＡを使用して別々にまたは一緒に標的化できる。一部の実施形態では、遺伝子的に改変されたＴＣＲ  Ｔ細胞は、本明細書に記載の抗ＨＰＲＴ  ｓｈＲＮＡを用いてＨＰＲＴ遺伝子をノックダウンすることによってなどでＨＰＲＴ欠損にされる。
【０１２１】
他の実施形態では、良好に腫瘍特異的なＴＣＲを生成するために、適切な標的配列が最初に同定される。これは、微量の腫瘍反応性Ｔ細胞から単離できる、またはこれが不可能な場合、代替的技術を高度に活性の抗腫瘍Ｔ細胞抗原を生成するために使用できる。１つの手法は、ヒト抗原に対するＴＣＲを発現するＴ細胞を生成するために、ヒト腫瘍タンパク質と共にヒト白血球抗原（ＨＬＡ）系を発現するトランスジェニックマウスを免疫化することである（Ｓｔａｎｉｓｌａｗｓｋｉら、２００１）。代替的手法は、同種ＴＣＲ遺伝子移行であり、ここで腫瘍特異的Ｔ細胞は、腫瘍寛解を経験している患者から単離され、反応性ＴＣＲ配列は、同じ疾患を有するが非応答性である別の患者由来のＴ細胞に移行される（Ｇａｏら、２０００；ｄｅ  Ｗｉｔｔｅら、２００６）。最終的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術は、ＴＣＲの配列を変更するために使用することができ、弱く反応性の腫瘍特異的ＴＣＲと標的抗原との相互作用（アビディティー）の強度を増加させることによってそれらの殺腫瘍活性を増強する（Ｒｏｂｂｉｎｓら、２００８；Ｓｃｈｍｉｄら、２０１０）。
【０１２２】
遺伝的に改変されたＴＣＲ  Ｔ細胞の生成に続いて、改変細胞は、その処置を必要とする患者に投与される。処置から副作用が生じた場合、ＭＴＸは、そのような副作用（例えばＧＶＨＤまたはＧＶＨＤの症状）を和らげるまたはなくすために投与される。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約１００ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約９０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約７０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約６０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約５０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約４０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約３０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約２０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約１０ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。一部の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である。さらに他の実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約５ｍｇ／ｍ２／注入である。またさらなる実施形態では、投与されるＭＴＸの量は、約７．５ｍｇ／ｍ２／注入である。
【０１２３】
一部の実施形態では、２回から６回の間の注入が行われ、注入は、同じ投薬量または異なる投薬量（例えば、投薬量を漸増させる、投薬量を減少させるなど）をそれぞれ含んでよい。一部の実施形態では、投与は週単位でまたは２ヵ月単位で行われる。
【実施例１】
【０１２４】
ＣＡＲ−Ｔ細胞をＣＡＲ構築物をＨＰＲＴに対するｓｈＲＮＡと共に用いて細胞に感染させることによって産生した。これは、異なるプロモーター（それぞれＰｏｌ  ＩＩおよびＰｏｌ  ＩＩＩ）によって駆動されるＣＡＲおよびｓｈＲＮＡを含む単一のレンチウイルスベクター中においてであった。ＨＰＲＴを標的化するｓｈＲＮＡがｍｉＲＮＡフレームワーク中にある場合、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーター（恐らくまさに同じプロモーター）からも発現できると考えられている。
【０１２５】
次に形質導入されたＣＡＲ−Ｔ  ｓｈＨＰＲＴ細胞を、白血病患者に注入し、抗白血病応答を必要な場合モニターし、６ＴＧを用いてＣＡＲ−Ｔ  ｓｈＨＰＲＴ細胞を増殖させた。効果が影響を与えたら、形質導入されたＣＡＲ−Ｔ  ｓｈＨＰＲＴ細胞を殺滅するためにメトトレキサートを使用するターンオフ戦略が検討される。このキルオフ戦略は、炎症性応答またはＣＡＲ−Ｔ  ｓｈＨＰＲＴ細胞の過度のクローン増殖が見られた場合に実行された。一部の抗白血病抗原が、通常の健康な細胞にも存在し、有害な作用を生じる場合があることは記されるべきである。したがって、この選択／自殺戦略を適用することは、効能／安全性プロファイルを増加させる。
【実施例２】
【０１２６】
血液学的悪性腫瘍のための同種骨髄移植では、ドナーＴ細胞は抗腫瘍効果のために骨髄移植に含まれる。移植前処置後に残存疾患を除去することは重要である。本実施例では、ドナーＴ細胞を、ＨＰＲＴに対するｓｈＲＮＡを含有するレンチウイルスベクターを用いて、注入前に形質導入し、注入されたドナーＴ細胞の影響を評価した。移植片対白血病（ＧＶＬ）効果をモニターし、結果として移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）がある場合、メトトレキサートを用いた「キル」スイッチを使用してこれを回復させることができた。これは、結果としてのＧＶＨＤを伴わないＧＶＬを可能にした。
【実施例３】
【０１２７】
同種骨髄移植術では、外来性の病原体感染のリスクを伴う免疫回復の遅れがある。これを警戒し、Ｔ細胞活性を維持するために、ＨＰＲＴを含有するレンチウイルスベクターを用いて形質導入されたドナーＴ細胞を与えた。これは、骨髄移植された幹細胞由来のＴ細胞が造血系を再構築するまで、潜在的感染の補助的管理を長期間提供する。有害な炎症性応答またはＡＥに関連する任意の他のドナーＴ細胞がある場合、それらは、メトトレキサートを使用して除去された。これは、ＧＶＨＤを伴わない抗感染免疫管理を可能にした。
【実施例４】
【０１２８】
患者は、白血病を有した。彼自身のまたはマッチした同種のＴ細胞を採取し、成長支持サイトカイン、例えばＩＬ２またはＩＬ７を含む組織培養物中で、増殖させ、その際３つのエレメント、すなわち腫瘍標的化、細胞溶解機序および、ＨＰＲＴをノックダウンするためのコンポーネントを含むベクターを含有する自己不活性型レンチウイルスベクターを用いて形質導入した（導入遺伝子発現を導くように感染させた）。細胞１×１０６から２×１０８個／平方センチメートルでのこれらの遺伝子改変細胞を、１用量のＩＶ  Ｃｙｔｏｘａｎ、例えば５００ｍｇ／平方メートルＩＶ（導入されるＣＡＲ  Ｔ細胞の場所を作るため）後、に患者に注入した。この例では、遺伝子改変ＣＡＲ  Ｔ細胞は、白血病にいくらかの効果を有した。白血病細胞負荷を、例えば差次的血球数によってモニターし、医師がさらなる腫瘍細胞殺滅を求める場合、これらの細胞を選択することによって腫瘍標的化ＣＡＲ  Ｔ細胞の相対数を増加させるために０．４ｍｇ／ｋｇ  ６ＴＧを患者にＩＶで与えた。ＣＡＲ  Ｔ細胞がそれらのポジティブ抗白血病効果を発揮したが、例えば炎症性サイトカインストームを生じる「過活性化」があった場合、次にメトトレキサートのＩＶ注入、例えば総用量１００ｍｇを使用してＣＡＲ−Ｔ細胞がキルオフされる逆行が生じさせることができる。
【実施例５】
【０１２９】
６ＴＧ選択を用いたＨＰＲＴノックダウン対ノックアウト
ゼロ（０）日目にＫ５６２細胞をＨＰＲＴをノックダウンするように設計した核酸配列および緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質導入した（ＭＯＩ＝１／２／５）；またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＨＰＲＴに対するｓｇＲＮＡを含むナノカプセルを用いてトランスフェクトした（１００ｎｇ／細胞５×１０４個）。６−ＴＧを３日目から１４日目に培地に添加した。培地は３から４日ごとに交換した。ＧＦＰをフローマシンおよびＴ７Ｅ１アッセイを用いて分析したＩｎＤｅｌ％で分析した。図９Ａは、形質導入したＫ５６２細胞のＧＦＰ＋集団が６ＴＧの処置下で３日目から１４日目に増加した；一方、ＧＦＰ＋集団は、６−ＴＧ処置を伴わずにほとんど一定であったことを例示している。図９Ｂは、Ｋ５６２細胞のＨＰＲＴノックアウト集団が６ＴＧの処置下で３日目から１４日目に増加し、６ＴＧのより高い投薬量（９００ｎＭ）は、３００／６００ｎＭの６ＴＧの投薬量と比較してより早い選択をもたらしたことを例示している。６ＴＧ選択工程は、３００ｎＭの６ＴＧの同じ濃度、３日目から１４日目でのＨＰＲＴノックダウン細胞（ＭＯＩ＝１）と比較してＨＰＲＴノックアウト細胞でさらに早く生じたことは記されるべきである。ノックダウンとノックアウトとの間の差異は、ノックアウト手法によるＨＰＲＴの完全な排除と比較して、ＲＮＡｉノックダウン手法によるあるレベルの残存ＨＰＲＴによって説明できた。したがって、ＨＰＲＴ−ノックアウト細胞は６ＴＧに対してより高い耐容性を有すると考えられ、ＨＰＲＴ−ノックダウン細胞と比較して６ＴＧ（９００ｎＭ）のより高い投薬量でさらに早く増殖すると考えられる。
【０１３０】
０日目にＣＥＭ細胞をＨＰＲＴをノックダウンするように設計した核酸配列および緑色蛍光タンパク質をコードする核酸配列を含むベクターを用いて形質導入した、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＨＰＲＴに対するｓｇＲＮＡを含むナノカプセルを用いてトランスフェクトした。６−ＴＧを３日目から１７日目に培地に添加した。培地は３から４日ごとに交換した。ＧＦＰをフローマシンで分析し、ＩｎＤｅｌ％をＴ７Ｅ１アッセイによって分析した。図１０Ａは、形質導入したＫ５６２細胞のＧＦＰ＋集団が６ＴＧの処置で３日目から１７日目に増加した；一方、ＧＦＰ＋集団は、６−ＴＧを伴わずにほとんど一定であったことを例示している。図１０Ｂは、ＣＥＭ細胞のＨＰＲＴノックアウト集団が６ＴＧの処置下で３日目から１７日目に増加し、６ＴＧのより高い投薬量（９００ｎＭ）は、３００／６００ｎＭの６ＴＧの投薬量と比較してより早い選択をもたらしたことを示している。６ＴＧ選択工程は、６ＴＧの同じ濃度、３日目から１７日目でのＨＰＲＴノックダウン細胞（ＭＯＩ＝１）よりむしろＨＰＲＴノックアウト細胞でさらに早く生じたことは記されるべきである。
【実施例６】
【０１３１】
ＭＴＸまたはＭＰＡを用いたネガティブ選択
形質導入またはトランスフェクトしたＫ５６２細胞（実施例６からのものなど）をＭＴＸを用いてまたは用いずに０日目から１４日目まで培養した。培地は３から４日ごとに交換した。ＧＦＰをフローマシンで分析し、ＩｎＤｅｌ％をＴ７Ｅ１アッセイによって分析した。図１１Ａは、形質導入したＫ５６２細胞のＧＦＰ−集団が０．３ｕＭのＭＴＸの処置下で減少し；細胞の集団は、ＭＴＸを用いずに一定であったことを示している。図１１Ｂは、トラスフェクとしたＫ５６２細胞が０．３ｕＭのＭＴＸ処置下でＨＰＲＴ−ＫＤ集団と比較してより早いペースで除去されたことを例示している。
【０１３２】
形質導入またはトランスフェクトしたＣＥＭ細胞（実施例６からのものなど）をＭＴＸを用いてまたは用いずに０日目から１４日目まで培養した。培地は３から４日ごとに交換した。ＧＦＰをフローマシンで分析し、ＩｎＤｅｌ％をＴ７Ｅ１アッセイによって分析した。図１２Ａは、形質導入したＫ５６２細胞のＧＦＰ−集団が１ｕＭのＭＰＡまたは０．３ｕＭのＭＴＸまたは１０ｕＭのＭＰＡの処置下で減少し、一方細胞の集団は、未処置群について一定であったことを示している。図１２Ｂは、ＣＥＭ細胞のＨＰＲＴノックアウト集団が１ｕＭのＭＰＡまたは０．３ｕＭのＭＴＸまたは１０ｕＭのＭＰＡの処置下でより早いペースで除去されたことを例示している。
【実施例７】
【０１３３】
Ｋ５６２細胞に対するＭＴＸを用いたネガティブ選択
Ｋ５６２細胞を、それぞれ、希釈係数１６でのＴＬ２０ｃｗ−ＧＦＰウイルススープ、希釈係数１６でのＴＬ２０ｃｗ−Ｕｂｃ／ＧＦＰ−７ＳＫ／ｓｈ７３４（ＧＦＰおよび、ＨＰＲＴをノックダウンするように設計したｓｈＲＮＡを連続的にコードするもの）ウイルススープおよび希釈係数１６でのＴＬ２０ｃｗ−７ＳＫ／ｓｈ７３４−ＵＢＣ／ＧＦＰ（ＨＰＲＴおよびＧＦＰをノックダウンするように設計したｓｈＲＮＡを連続的にコードするもの）ウイルススープのいずれかを用いて形質導入した（図１３を参照されたい）。３日後、すべての細胞を０．３ｕＭのＭＴＸを含有する培地で培養した。同様に、図１３に示されるのは、希釈係数１０２４でのＴＬ２０ｃｗ−７ＳＫ／ｓｈ７３４−ＵＢＣ／ＧＦＰ（ＨＰＲＴをノックダウンするために設計されたｓｈＲＮＡをコードする核酸をコードするもの）ウイルススープによって１ヵ月前に形質導入されたＫ５６２細胞であり、ここでＧＦＰ−ｓｈ７３４−形質導入細胞を３００ｎＭの６ＴＧを用いてポジティブ選択した。６−ＴＧは、９０％を超えるＧＦＰ＋集団に達する時までの間での選択であった。図１３に例示されるとおり、＞９０％のＧＦＰ＋集団から開始して、ＧＦＰまたはＧＦＰ−ｓｈ７３４形質導入細胞は、ＧＦＰ＋集団の低減を示さなかった一方で、高希釈および低希釈レベルでのｓｈ７３４−ＧＦＰ形質導入細胞は、ＧＦＰ＋集団の除外を示した。ｓｈ７３４−ＧＦＰ−形質導入細胞およびＧＦＰ−ｓｈ７３−形質導入細胞についてＶＣＮあたりの相対的ｓｈ７３４発現を測定した。結果は、メトトレキサートがｓｈ７３４高発現レンチウイルスベクター（ＴＬ２０ｃｗ−７ＳＫ／ｓｈ７３４−ＵＢＣ／ＧＦＰ）を用いて形質導入された細胞だけを除外でき、ｓｈ７３４低発現レンチウイルスベクター（ＴＬ２０ｃｗ−ＵＢＣ／ＧＦＰ−７ＳＫ／ｓｈ７３４）を用いたものはできなかったことを示唆している。本実施例は、異なるベクター設計（同じｓｈＲＮＡを有するものであっても）は、ｓｈＲＮＡヘアピンの発現に影響を有し、形質導入された細胞がＭＴＸによって除外されるかどうかを決定できることを実証している。
【０１３４】
産業的適用可能性の提示
本開示は、医薬の分野、例えば遺伝子治療における産業的適用可能性を有する。
【０１３５】
追加的実施形態
追加的実施形態１．（ｉ）ＨＰＲＴ欠損である改変Ｔ細胞を患者に投与するステップ；および（ｉｉ）副作用の発症でＭＴＸを患者に投与するステップを含む、患者において副作用を軽減する一方で、リンパ球注入の利益を提供する方法。
【０１３６】
追加的実施形態２．副作用がａＧＶＨＤまたはｃＧＶＨＤからなる群から選択される、追加的実施形態１の方法。
【０１３７】
追加的実施形態３．改変Ｔ細胞が単一用量で投与される、追加的実施形態１の方法。
【０１３８】
追加的実施形態４．単一用量で投与される改変Ｔ細胞の量が、細胞約０．１×１０６個／ｋｇ体重から細胞約７３０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である、追加的実施形態３の方法。
【０１３９】
追加的実施形態５．改変Ｔ細胞が複数用量にわたって投与される、追加的実施形態１の方法。
【０１４０】
追加的実施形態６．投与される改変Ｔ細胞の量が、用量あたり細胞約０．１×１０６個／ｋｇ体重から細胞約２４０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である、追加的実施形態５の方法。
【０１４１】
追加的実施形態７．ＭＴＸが単一用量として投与される、追加的実施形態１の方法。
【０１４２】
追加的実施形態８．複数用量のＭＴＸが投与される、追加的実施形態１の方法。
【０１４３】
追加的実施形態９．投与されるＭＴＸの量が約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である、追加的実施形態１の方法。
【０１４４】
追加的実施形態１０．投与されるＭＴＸの量が約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である、追加的実施形態９の方法。
【０１４５】
追加的実施形態１１．（ｉ）副作用の低減についてモニタリングするステップ、および（ｉｉ）ＨＰＲＴ欠損である追加的改変Ｔ細胞を患者に投与するステップをさらに含む、追加的実施形態１の方法。
【０１４６】
追加的実施形態１２．（ｉ）ＨＰＲＴ欠損である改変Ｔ細胞を患者に投与するステップ；（ｉｉ）副作用の発症について患者をモニタリングするステップ；および（ｉｉｉ）副作用の発症でＭＴＸを患者に投与するステップを含む、幹細胞移植術後に患者において移植片対悪性腫瘍効果を誘導する方法。
【０１４７】
追加的実施形態１３．副作用がａＧＶＨＤまたはｃＧＶＨＤからなる群から選択される、追加的実施形態１２の方法。
【０１４８】
追加的実施形態１４．改変Ｔ細胞が単一用量で投与される、追加的実施形態１２の方法。
【０１４９】
追加的実施形態１５．単一用量で投与される改変Ｔ細胞の量が、細胞約０．１×１０６個／ｋｇ体重から細胞約７３０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である、追加的実施形態１４の方法。
【０１５０】
追加的実施形態１６．改変Ｔ細胞が複数用量にわたって投与される、追加的実施形態１２の方法。
【０１５１】
追加的実施形態１７．投与される改変Ｔ細胞の量が、用量あたり細胞約０．１×１０６個／ｋｇ体重から細胞約２４０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である、追加的実施形態１６の方法。
【０１５２】
追加的実施形態１８．ＭＴＸが単一用量として投与される、追加的実施形態１２の方法。
【０１５３】
追加的実施形態１９．複数用量のＭＴＸが投与される、追加的実施形態１２の方法。
【０１５４】
追加的実施形態２０．投与されるＭＴＸの量が約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である、追加的実施形態１２の方法。
【０１５５】
追加的実施形態２１．投与されるＭＴＸの量が約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である、追加的実施形態２０の方法。
【０１５６】
追加的実施形態２２．幹細胞移植後に改変Ｔ細胞の治療有効量を対象に投与するステップ、ＧＶＨＤの発症について患者をモニタリングするステップ、およびＧＶＨＤの発症でＭＴＸを投与するステップを含む、対象における移植片対宿主病を軽減する一方で、移植片対悪性腫瘍効果を保つ方法。
【０１５７】
追加的実施形態２３．移植片対悪性腫瘍効果が移植片対白血病効果である、追加的実施形態２２の方法。
【０１５８】
追加的実施形態２４．（ｉ）ＨＰＲＴ欠損である遺伝子改変養子免疫治療をそれを必要とする対象に投与するステップ；（ｉｉ）副作用の発症について対象をモニタリングするステップ；および（ｉｉｉ）副作用の発症でＭＴＸを投与するステップを含む、がんを処置する方法。
【０１５９】
追加的実施形態２５．副作用がａＧＶＨＤまたはｃＧＶＨＤからなる群から選択される、追加的実施形態２４の方法。
【０１６０】
追加的実施形態２６．改変Ｔ細胞が単一用量で投与される、追加的実施形態２４の方法。
【０１６１】
追加的実施形態２７．単一用量で投与される改変Ｔ細胞の量が、細胞約０．１×１０６個／ｋｇ体重から細胞約７３０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である、追加的実施形態２６の方法。
【０１６２】
追加的実施形態２８．改変Ｔ細胞が複数用量にわたって投与される、追加的実施形態２４の方法。
【０１６３】
追加的実施形態２９．投与される改変Ｔ細胞の量が、用量あたり細胞約０．１×１０６個／ｋｇ体重から細胞約２４０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である、追加的実施形態２８の方法。
【０１６４】
追加的実施形態３０．ＭＴＸが単一用量として投与される、追加的実施形態２４の方法。
【０１６５】
追加的実施形態３１．複数用量のＭＴＸが投与される、追加的実施形態２４の方法。
【０１６６】
追加的実施形態３２．投与されるＭＴＸの量が約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である、追加的実施形態２４の方法。
【０１６７】
追加的実施形態３３．投与されるＭＴＸの量が約２．５ｍｇ／ｍ２／注入から約７．５ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である、追加的実施形態３２の方法。
【０１６８】
追加的実施形態３４．遺伝子改変養子免疫治療が、ＣＡＲ改変細胞、自己および同種ＣＡＲ改変細胞、自己ＴＣＲ改変細胞ならびに同種ＴＣＲ改変細胞からなる群から選択される、追加的実施形態２４の方法。
【０１６９】
追加的実施形態３５．ＨＰＲＴ欠損である改変Ｔ細胞の治療有効量を患者に投与するステップ；改変Ｔ細胞の投与から生じる副作用の発症をモニタリングするステップ；および患者におけるがん細胞を除去するまたは数を低減するために有効な移植片対悪性腫瘍反応を維持しながら、副作用を抑制、低減または管理するためにＭＴＸを投与するステップを含む、同種造血細胞移植を受けたがんを有する患者を処置する方法。
【０１７０】
追加的実施形態３６．副腎皮質ステロイドの治療有効量を投与するステップをさらに含む、追加的実施形態３５の方法。
【０１７１】
追加的実施形態３７．がんを処置する方法であって、（ｉ）がんを有する患者に実質的に精製された、ＨＰＲＴ欠損である改変Ｔ細胞の治療有効量を投与するステップ；ならびに（ｉｉ）がんの存在についておよびＧＶＨＤの発症について患者をモニタリングするステップを含み、ＭＴＸの治療有効量がＧＶＨＤの発症で投与される方法。
【０１７２】
追加的実施形態３８．幹細胞移植後の患者における移植後免疫不全を予防するまたは軽減する方法であって、（ｉ）ＨＰＲＴ欠損である改変Ｔ細胞を患者に投与するステップ；（ｉｉ）副作用の発症について患者をモニタリングするステップ；および（ｉｉ）副作用の発症で患者にＭＴＸを投与するステップを含み、投与されるＭＴＸの量が約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲である方法。
【０１７３】
追加的実施形態３９．ＭＴＸが単一用量で投与される、追加的実施形態３８の方法。
【０１７４】
追加的実施形態４０．複数用量のＭＴＸが投与される、追加的実施形態３８の方法。
【０１７５】
追加的実施形態４１．ＭＴＸの用量が用量設定される、追加的実施形態４０の方法。
【０１７６】
追加的実施形態４２．ＭＴＸを用いた処置後に追加的改変Ｔ細胞を投与するステップをさらに含む、追加的実施形態３８の方法。
【０１７７】
追加的実施形態４３．ＭＴＸを用いた処置後に投与される追加的改変Ｔ細胞の量が細胞約０．１×１０６個／ｋｇ体重から細胞約２４０×１０６個／ｋｇ体重の範囲である、追加的実施形態４２の方法。
【０１７８】
追加的実施形態４４．両方とも幹細胞翻訳後に、（ａ）ＭＴＸに感受性である改変Ｔ細胞を患者に投与するステップ；（ｂ）副作用の発症について患者をモニタリングするステップ；および（ｃ）副作用の発症でＭＴＸを患者に投与するステップを含む、（ｉ）患者の免疫系を再構築すること、または（ｉｉ）ＧＶＭ効果を誘導するまたは維持することの安全性を増強する方法。
【０１７９】
追加的実施形態４５．（ｉ）ドナーから回収された細胞からリンパ球を単離すること；（ｉｉ）単離されたリンパ球の少なくとも一部に６−チオグアニン細胞傷害性に対する化学防御を付与すること；（ｉｉｉ）単離されたリンパ球を６ＴＧに接触させることによって６−チオグアニンに対する化学防御を有する単離されたリンパ球を選択するおよびその一部を増殖させることによってＭＴＸに感受性である改変Ｔ細胞が産生される、追加的実施形態４４の方法。
【０１８０】
追加的実施形態４６．（ｉ）ドナーから回収された細胞からリンパ球を単離すること；（ｉｉ）単離されたリンパ球の全集団内のＨＰＲＴ欠損細胞の少なくとも集団を提供するように単離されたリンパ球を処理すること；ならびに（ｉｉｉ）単離されたリンパ球の全集団を６ＴＧに接触させることによってＨＰＲＴ欠損細胞の集団を選択および増殖させることによって産生される改変Ｔ細胞。
【０１８１】
追加的実施形態４７．単離されたリンパ球の処置のステップが、単離されたリンパ球を、配列番号１のものに少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列をコードする自己不活性型レンチウイルスベクターに接触させるステップを含む、追加的実施形態４６の改変Ｔ細胞。
【０１８２】
追加的実施形態４８．単離されたリンパ球を処置するステップが、単離されたリンパ球をＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＲＮＰ、ジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＯＮＳおよびＡＲＵＣＳからなる群から選択される遺伝子編集ツールと接触させることを含む、追加的実施形態４６の改変Ｔ細胞。
【０１８３】
追加的実施形態４９．ｅｘ  ｖｉｖｏ選択を実施するステップであって、ｅｘ  ｖｉｖｏ選択がＨＰＲＴ欠損である遺伝子改変Ｔ細胞の集団を６ＴＧを用いて処置するステップ；ｅｘ  ｖｉｖｏで選択された改変Ｔ細胞をそれを必要とする患者に投与するステップ；およびｉｎ  ｖｉｖｏ選択を実施するステップであって、ｉｎ  ｖｉｖｏ選択がＭＴＸを患者に投与するステップを含む、患者において副作用を軽減する一方で、リンパ球注入の利益を提供する方法。
【０１８４】
追加的実施形態５０．遺伝子改変Ｔ細胞が、配列番号１のものに少なくとも８０％配列同一性を有する核酸配列をコードする自己不活性型レンチウイルスベクターを用いて単離リンパ球を処置することによって調製される、追加的実施形態４９の方法。
【０１８５】
追加的実施形態５１．遺伝子改変Ｔ細胞が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ＲＮＰまたはジンクフィンガータンパク質からなる群から選択される遺伝子編集ツールを用いて単離されたリンパ球を処置することによって調製される、追加的実施形態４９の方法。
【０１８６】
追加的実施形態５２．ＭＴＸが、ｅｘ  ｖｉｖｏで選択された改変Ｔ細胞を用いる処置由来の副作用の発症後に患者に投与される、追加的実施形態４９の方法。
【０１８７】
追加的実施形態５３．ＭＴＸを用いた処置後にｅｘ  ｖｉｖｏで選択された改変Ｔ細胞の少なくとも１つの追加用量を投与するステップをさらに含む、追加的実施形態４９の方法。
【０１８８】
追加的実施形態５４．（ｉ）ＨＰＲＴ欠損である改変Ｔ細胞を患者に投与するステップであって、改変Ｔ細胞の量が細胞約０．１×１０６個／ｋｇ体重から細胞約７３０×１０６個／ｋｇ体重の範囲であるステップ；（ｉｉ）副作用の発症について患者をモニタリングするステップ；および（ｉｉｉ）副作用の発症で患者にＭＴＸを投与するステップであって、投与されるＭＴＸの量が約２ｍｇ／ｍ２／注入から約８ｍｇ／ｍ２／注入の範囲であるステップを含む、幹細胞移植後の患者における移植後免疫不全を予防するまたは軽減する方法。
【図１】
2020528455.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
2020528455.tif 000019
【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020528455.tif 000022
2020528455.tif 000023
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