(57)【要約】本明細書では、イオン化脂質と、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターとを含む、脂質ナノ粒子製剤が提供される。イオン化脂質と、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）とを含む、脂質粒子であって、前記ｃｅＤＮＡベクターが、非対称逆位末端反復配列（非対称ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、前記非対称ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、脂質粒子。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イオン化脂質と、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）とを含む、脂質粒子であって、前記ｃｅＤＮＡベクターが、非対称逆位末端反復配列（非対称ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、前記非対称ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、脂質粒子。
【請求項２】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、前記ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化され、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方の電気泳動によって分析されたときに、直鎖状で非連続的なＤＮＡ対照と比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドを示す、請求項１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項３】
前記非対称ＩＴＲ配列のうちの１つ以上が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項１または２に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項４】
前記非対称ＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、請求項３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項５】
前記１つ以上の非対称ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項４に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項６】
前記非対称ＩＴＲ配列のうちの１つ以上が、合成である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項７】
前記ＩＴＲのうちの１つ以上が、野生型ＩＴＲではない、請求項１〜６のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項８】
前記非対称ＩＴＲのうちの１つ以上両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択されるＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項９】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、
ｃ．配列番号１および配列番号５２、ならびに
ｄ．配列番号２および配列番号５１から選択される少なくとも２つの非対称ＩＴＲを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１０】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、
ａ．少なくとも１つのＲｅｐタンパク質の存在下、ｃｅＤＮＡ発現構築物を内包する昆虫細胞の集団をインキュベートするステップであって、前記ｃｅＤＮＡ発現構築物が、前記昆虫細胞内で前記ｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、前記ｃｅＤＮＡベクターをコードする、ステップと、
ｂ．前記ｃｅＤＮＡベクターを前記昆虫細胞から単離するステップと、を含むプロセスから取得される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１１】
前記ｃｅＤＮＡ発現構築物が、ｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡバクミド、およびｃｅＤＮＡバキュロウイルスから選択される、請求項１０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１２】
前記昆虫細胞が、少なくとも１つのＲｅｐタンパク質を発現する、請求項１０または請求項１１に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１３】
少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、請求項１０に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１４】
少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、請求項１３に記載の脂質ナノ粒子。
【請求項１５】
前記ＤＮＡベクターが、ベクターポリヌクレオチドから取得され、前記ベクターポリヌクレオチドが、２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードし、前記２つのＩＴＳが、互いに異なり（非対称）、前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む機能的ＩＴＲであり、前記ＩＴＲのうちの１つが、前記機能的ＩＴＲに対して欠失、挿入、および／または置換を含み、Ｒｅｐタンパク質の存在が、昆虫細胞における前記ベクターポリヌクレオチドの複製および前記ＤＮＡベクターの産生を誘導し、前記ＤＮＡベクターが、
ａ．Ｒｅｐタンパク質の存在下、ウイルスカプシドコード配列を欠いた前記ベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団を、前記昆虫細胞内の前記カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、インキュベートするステップであって、前記昆虫細胞が、前記ベクターの非存在下では、前記昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの産生を含まない、ステップと、
ｂ．前記カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡを前記昆虫細胞から採取し、単離するステップと、を含むプロセスから取得可能である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項１６】
前記昆虫細胞から単離された前記カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、確認され得る、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項１７】
前記昆虫細胞から単離された前記カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、前記昆虫細胞から単離されたＤＮＡを、前記ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および前記消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る、請求項１６に記載の脂質粒子。
【請求項１８】
前記ＤＮＡベクターが、ベクターポリヌクレオチドから取得され、前記ベクターポリヌクレオチドが、第１および第２のＡＡＶ２逆位末端反復ＤＮＡポリヌクレオチド配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードし、前記ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、配列番号１または配列番号５１の対応するＡＡＶ２野生型ＩＴＲに関して少なくとも１つのポリヌクレオチド欠失、挿入、および／または置換を有し、Ｒｅｐタンパク質の存在下で昆虫細胞中の前記ＤＮＡベクターの複製を誘導し、前記ＤＮＡベクターが、
ａ．Ｒｅｐタンパク質の存在下、ウイルスカプシドコード配列を欠いた前記ベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団を、前記昆虫細胞内の前記カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、インキュベートするステップであって、前記昆虫細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、ステップと、
ｂ．前記カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡを前記昆虫細胞から採取し、単離するステップと、を含むプロセスから取得可能である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項１９】
前記昆虫細胞から単離された前記カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、確認され得る、請求項１８に記載の脂質粒子。
【請求項２０】
前記昆虫細胞から単離された前記カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、前記昆虫細胞から単離されたＤＮＡを、前記ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および前記消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る、請求項１９に記載の脂質粒子。
【請求項２１】
前記脂質粒子が、非カチオン性脂質、ＰＥＧ複合脂質、およびステロールのうちの１つ以上をさらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項２２】
前記イオン化脂質が、表１に記載の脂質である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項２３】
前記脂質粒子が、非カチオン性脂質をさらに含み、前記非イオン性脂質が、ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リソホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンからなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項２４】
前記脂質粒子が、複合脂質をさらに含み、前記複合脂質、前記複合脂質が、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ−ＤＡＧ）、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、およびＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩からなる群から選択される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項２５】
前記脂質粒子が、コレステロールまたはコレステロール誘導体をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項２６】
前記脂質粒子が、
（ｖ）イオン化脂質と、
（ｖｉ）非カチオン性脂質と、
（ｖｉｉ）粒子の凝集を阻害する複合脂質と、
（ｖｉｉｉ）ステロールと、を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項２７】
前記脂質粒子が、
（ｅ）前記粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％の量のイオン化脂質と、
（ｆ）前記粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質と、
（ｇ）前記粒子中に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％の量の、粒子の凝集を阻害する複合脂質と、
（ｈ）前記粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％の量のステロールと、を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項２８】
全脂質とＤＮＡベクターとの（質量または重量）比が、約１０：１〜約３０：１である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の脂質粒子。
【請求項２９】
第１の脂質ナノ粒子および追加の化合物を含む組成物であって、前記第１の脂質ナノ粒子が、第１のカプシド不含非ウイルス性ベクターを含み、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の脂質ナノ粒子である、組成物。
【請求項３０】
前記追加の化合物が、第２の脂質ナノ粒子中に包含され、前記第１および第２の脂質ナノ粒子が異なる、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記追加の化合物が、第１の脂質ナノ粒子中に包含される、請求項２８または２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記追加の化合物が、治療剤である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記追加の化合物が、第２のカプシド不含非ウイルス性ベクターであり、前記第１および第２のカプシド不含非ウイルス性ベクターが異なる、請求項２８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１７年９月８日出願の米国仮特許出願第６２／５５６，３３４号、２０１７年９月８日出願の同第６２／５５６，３３３号、２０１７年９月９日出願の同第６２／５５６，３８１号、２０１８年５月２３日出願の同第６２／６７５，３１７号、２０１８年５月２３日出願の同第６２／６７５，３２２号、２０１８年５月２３日出願の同第６２／６７５，３２４号、２０１８年５月２３日出願の同第６２／６７５，３２７号の利益を主張し、各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年９月７日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、０８０１７０−０９０６６０ＷＯＰＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前が付けられ、サイズは６３，７９０バイトである。
【０００３】
本発明は、非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターの脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、および標的細胞、組織、器官、または生物への外因性ＤＮＡ配列の送達のためのそれらの使用を対象とする。
【背景技術】
【０００４】
最近では、ＡＡＶ２  ＩＴＲに隣接した導入遺伝子を含む共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターが報告された。しかしながら、インビトロおよびインビボでの、細胞へのこれらのＤＮＡベクターの標的送達は、依然として難題である。したがって、これらの難題に対処する製剤に対する必要性が、当該技術分野において残っている。
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、イオン化脂質およびカプシド不含非ウイルス性ベクター（ｃｅＤＮＡ）を含む新規の脂質製剤が、本明細書に提供される。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有する相補的ＤＮＡの連続鎖（直鎖状で連続的な非カプシド化構造）およびから形成されたカプシド不含の直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子であり、互いに関して異なるか、または非対称である５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および３’ＩＴＲ配列を含む。一態様では、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターは、好ましくは直鎖状二重鎖分子であり、２つの異なる逆位末端反復配列（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）の間に操作可能に位置づけられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得可能であり、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、末端分解部位および複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）（時として複製的タンパク質結合部位と称される）、例えば、Ｒｅｐ結合部位を含み、ＩＴＲのうちの１つは、他のＩＴＲに関する欠失、挿入、および／または置換を含む。すなわち、ＩＴＲのうちの１つは、他のＩＴＲに対して非対称である。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、ＡＡＶ  ＩＴＲ、例えば、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲまたは修飾型ＡＡＶ  ＩＴＲである。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、他のＩＴＲに対する修飾型ＩＴＲであり、すなわち、ｃｅＤＮＡは、互いに対して非対称であるＩＴＲを含む。
【０００６】
一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、非機能的ＩＴＲである。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの１つ以上は、野生型ＩＴＲではない。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化され、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方の電気泳動によって分析されたときに、直鎖状で非連続的なＤＮＡ対照と比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドを示す。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの非対称ＩＴＲ配列のうちの１つ以上は、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲは、異なるウイルス血清型に由来する。例えば、１つ以上の非対称ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来し得る。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの非対称ＩＴＲ配列のうちの１つ以上は、合成である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲのうちの１つ（例えば、１つまたは両方）が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択されるＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、（ａ）配列番号１および配列番号５２、ならびに（ｂ）配列番号２および配列番号５１から選択される少なくとも２つの非対称ＩＴＲを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、（ａ）少なくとも１つのＲｅｐタンパク質の存在下、ｃｅＤＮＡ発現構築物を内包する昆虫細胞の集団をインキュベートするステップであって、ｃｅＤＮＡ発現構築物が、昆虫細胞内でｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、ｃｅＤＮＡベクターをコードする、ステップと、（ｂ）ｃｅＤＮＡベクターを昆虫細胞から単離するステップと、を含むプロセスから取得される。限定されないが、ｃｅＤＮＡ発現構築物は、ｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡバクミド、またはｃｅＤＮＡバキュロウイルスであり得る。
【００１４】
一般に、昆虫細胞昆虫細胞は、少なくとも１つのＲｅｐタンパク質を発現する。少なくとも１つのＲｅｐタンパク質は、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来し得る。例えば、少なくとも１つのＲｅｐタンパク質は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来し得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、表１に列挙される刊行物に記載される脂質である。
【００１６】
本明細書に開示される様々な態様のいくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡの存在は、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素での消化、および消化されたＤＮＡ材料を変性および非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターは、ベクターポリヌクレオチドから取得され、ベクターポリヌクレオチドは、２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードし、２つのＩＴＳは、互いに異なり（非対称）、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む機能的ＩＴＲであり、ＩＴＲのうちの１つは、機能的ＩＴＲに対して欠失、挿入、または置換を含み、Ｒｅｐタンパク質の存在は、ベクターポリヌクレオチドの複製を誘導する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞内のＤＮＡベクターの産生。例えば、ＤＮＡベクターは、（ａ）Ｒｅｐタンパク質の存在下、ウイルスカプシドコード配列を欠いたベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団を、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、インキュベートするステップであって、昆虫細胞が、ベクターの非存在下では、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの産生を含まない、ステップと、（ｂ）カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡを昆虫細胞から採取し、単離するステップと、を含むプロセスから取得される。いくつかのさらなる実施形態では、昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が確認され得る。例えば、昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在は、昆虫細胞から単離されたＤＮＡを、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡベクターは、ベクターポリヌクレオチドから取得される。例えば、ＤＮＡベクターは、第１および第２のＡＡＶ２逆位末端反復ＤＮＡポリヌクレオチド配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得され、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、配列番号１または配列番号５１の対応するＡＡＶ２野生型ＩＴＲに関して少なくとも１つのポリヌクレオチド欠失、挿入、または置換を有し、Ｒｅｐタンパク質の存在下で昆虫細胞中のＤＮＡベクターの複製を誘導する。このいくつかのさらなる実施形態では、ＤＮＡベクターは、（ａ）Ｒｅｐタンパク質の存在下、ウイルスカプシドコード配列を欠いたベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団を、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、インキュベートするステップであって、昆虫細胞が、ウイルス性カプシドコード配列を含まない、ステップと、（ｂ）カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡを昆虫細胞から採取し、単離するステップと、を含むプロセスから取得可能である。いくつかのさらなる実施形態では、昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が確認され得る。例えば、昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在は、昆虫細胞から単離されたＤＮＡを、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る。
【００２０】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、非カチオン性脂質、ＰＥＧ複合脂質、ステロール、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含み得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、非カチオン性脂質をさらに含み、非イオン性脂質は、ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン（１６−Ｏ−モノメチルＰＥなど）、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン（１６−Ｏ−ジメチルＰＥなど）、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リソホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、および例えば、ＷＯ２０１７／０９９８２３またはＵＳ２０１８／００２８６６４に記載される非カチオン性脂質からなる群から選択される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、複合脂質をさらに含み、この複合脂質、この複合脂質は、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ））、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ−ＤＡＧ）（４−Ｏ−（２’，３’−ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル−１−Ｏ−（ｗ−メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、および表２に記載されるものからなる群から選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／１２７０６０号または米国特許公開第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号に記載されるコレステロールまたはコレステロール誘導体をさらに含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、イオン化脂質、非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻害する複合脂質、およびステロールを含む。イオン化脂質、非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻害する複合脂質、およびステロールの量は、独立して変化し得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％の量のイオン化脂質、粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質、粒子中に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％の量の、粒子の凝集を阻害する複合脂質、および粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％の量のステロールを含む。
【００２５】
全脂質とＤＮＡベクターとの比は、所望の通り変化し得る。例えば、全脂質とＤＮＡベクターとの（質量または重量）比は、約１０：１〜約３０：１であり得る。
【００２６】
第１の脂質ナノ粒子および追加の化合物を含む組成物もまた、本明細書に提供される。第１の脂質ナノ粒子は、イオン化脂質および第１のカプシド不含非ウイルス性ベクターを含む。カプシド不含非ウイルス性ベクターは、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化されたとき、非変性ゲル上で分析したときの直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態では、追加の化合物は、第２の脂質ナノ粒子に包含される。第１および第２の脂質ナノ粒子は、同じであり得るか、または異なり得る。いくつかの実施形態では、第１および第２の脂質ナノ粒子は、異なる。いくつかの実施形態では、第１および第２の脂質ナノ粒子は、同じであり、すなわち追加の化合物は、第１の脂質ナノ粒子に包含される。
【００２８】
任意の所望の分子は、追加の化合物として使用され得る。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、第２のカプシド不含非ウイルス性ベクターである。第１および第２のカプシド不含非ウイルス性ベクターは、同じであり得るか、または異なり得る。いくつかの実施形態では、第１および第２のカプシド不含非ウイルス性ベクターは、異なる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、追加の化合物は、治療剤である。
【００３０】
本発明のこれらおよび他の態様は、下記でさらに詳述される。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
本特許または出願ファイルは、少なくとも１つのカラー図面を含む。カラー図面（複数可）を有するこの特許または特許出願のコピーは、要求に応じ、必要な料金の支払い時に特許局により提供される。
【００３２】
【図１Ａ】ｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。この実施形態では、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを含む。ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位（Ｒ３／Ｒ４）に挿入される。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）−発現カセットの上流（５’端）の野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲによって隣接され、したがって、発現カセットに隣接する２つのＩＴＲは、互いに対して非対称である。
【図１Ｂ】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含有する発現カセットを有するｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）−発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の野生型ＩＴＲによって隣接される。
【図１Ｃ】エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子の挿入のためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含有する発現カセットを有するｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、互いに対して非対称である２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）、発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲによって隣接され、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方は、修飾型ＩＴＲであるが、異なる修飾を有する（すなわち、同じ修飾を有しない）。
【図２Ａ】Ａ−Ａ’アーム、Ｂ−Ｂ’アーム、Ｃ−Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）、および末端分解部位（ｔｒｓ）の特定を有するＡＡＶ２の１つの野生型ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を提供する。ＲＢＥは、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８のいずれかと相互作用すると考えられる一連の４つの二重四量体を含有する。さらに、ＲＢＥ’はまた、構築物中の野生型ＩＴＲまたは変位型ＩＴＲ上で集成したＲｅｐ複合体と相互作用すると考えられる。ＤおよびＤ’領域は、転写因子結合部位および他の保存構造を含有する。
【図２Ｂ】図２Ａの野生型ＩＴＲ中の提案されたＲｅｐ触媒ニッキングおよび結紮活性を示し、Ａ−Ａ’アーム、Ｂ−Ｂ’アーム、Ｃ−Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）、および末端分解部位（ｔｒｓ）の特定を有するＡＡＶ２の野生型ＩＴＲのＴ形ステムループ構造、ならびにいくつかの転写因子結合部位を含むＤおよびＤ’領域、および他の保存構造を含む。
【図３Ａ】野生型左ＡＡＶ２  ＩＴＲ（配列番号５４０）のＡ−Ａ’アームおよびＣ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（ポリヌクレオチド配列）（左）および二次構造（右）を提供する。
【図３Ｂ】左ＩＴＲの例示的な変位型ＩＴＲ（修飾型ＩＴＲとも称される）配列を示す。例示的な変異型左ＩＴＲ（ＩＴＲ−１、左）（配列番号１１３）のＡ−Ａ’アーム、Ｃアーム、およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ部分の一次構造（左）および予測される二次構造（右）が示される。
【図３Ｃ】野生型右ＡＡＶ２  ＩＴＲ（配列番号５４１）のＡ−Ａ’ループ、ならびにＢ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および二次構造（右）を示す。
【図３Ｄ】例示的な右修飾型ＩＴＲを示す。例示的な変異型左ＩＴＲ（ＩＴＲ−１、右）（配列番号１１４）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’およびＣアームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および予測される二次構造（右）が示される。左ＩＴＲが非対称であるか、または右ＩＴＲとは異なる限り、左および右ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲまたは他のウイルス血清型または合成ＩＴＲ）の任意の組み合わせを使用することができる。図３Ａ〜３Ｄポリヌクレオチド配列の各々は、本明細書に記載されるようにｃｅＤＮＡを産生するために使用されるプラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中で使用される配列を指す。プラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中のｃｅＤＮＡベクター構成および予測されたＧｉｂｂ自由エネルギー値から推定される対応するｃｅＤＮＡ二次構造もまた、図３Ａ〜３Ｄの各々に含まれる。
【図４Ａ】図４Ａは、図４Ｂの概略図に記載されるプロセスにおけるｃｅＤＮＡの産生に有用である、バキュロウイルス感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスを示す概略図である。図４Ｃは、ｃｅＤＮＡベクター産生を確認するための生化学方法およびプロセスを示す。図４Ｄおよび図４Ｅは、図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｅはまた、直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に共される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から二番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、分裂後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは単鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、単鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。
【図４Ｂ】図４Ａは、図４Ｂの概略図に記載されるプロセスにおけるｃｅＤＮＡの産生に有用である、バキュロウイルス感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスを示す概略図である。図４Ｃは、ｃｅＤＮＡベクター産生を確認するための生化学方法およびプロセスを示す。図４Ｄおよび図４Ｅは、図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｅはまた、直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に共される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から二番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、分裂後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは単鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、単鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。
【図４Ｃ】図４Ａは、図４Ｂの概略図に記載されるプロセスにおけるｃｅＤＮＡの産生に有用である、バキュロウイルス感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスを示す概略図である。図４Ｃは、ｃｅＤＮＡベクター産生を確認するための生化学方法およびプロセスを示す。図４Ｄおよび図４Ｅは、図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｅはまた、直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に共される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から二番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、分裂後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは単鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、単鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。
【図４Ｄ】図４Ａは、図４Ｂの概略図に記載されるプロセスにおけるｃｅＤＮＡの産生に有用である、バキュロウイルス感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスを示す概略図である。図４Ｃは、ｃｅＤＮＡベクター産生を確認するための生化学方法およびプロセスを示す。図４Ｄおよび図４Ｅは、図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｅはまた、直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に共される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から二番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、分裂後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは単鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、単鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。
【図４Ｅ】図４Ａは、図４Ｂの概略図に記載されるプロセスにおけるｃｅＤＮＡの産生に有用である、バキュロウイルス感染した昆虫細胞（ＢＩＩＣ）を作製するための上流プロセスを示す概略図である。図４Ｃは、ｃｅＤＮＡベクター産生を確認するための生化学方法およびプロセスを示す。図４Ｄおよび図４Ｅは、図４ＢのｃｅＤＮＡ産生プロセス中に取得された細胞ペレットから採取されたＤＮＡ中のｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｅは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｅはまた、直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。図４Ｄは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に共される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から二番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、分裂後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは単鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、単鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性状態で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性状態で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。
【図５】エンドヌクレアーゼでの消化を有する（＋）または有しない（−）ｃｅＤＮＡベクターの変性ゲル流動例の例示的な図である（ｃｅＤＮＡ構築物１および２の場合ＥｃｏＲＩ、ｃｅＤＮＡ構築物３および４の場合ＢａｍＨ１、ｃｅＤＮＡ構築物５および６の場合ＳｐｅＩ、ならびにｃｅＤＮＡベクター７および８の場合ＸｈｏＩ）。アスタリスクで強調されたバンドのサイズを判定し、図の下に示した。
【図６Ａ】Ｒｅｐタンパク質Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ７８の核酸配列を含むｐＦＢＤＬＳＲプラスミド中の例示的なＲｅｐ−バクミドである。この例示的なＲｅｐ−バクミドは、ＩＥ１プロモーター断片（配列番号６６）、Ｋｏｚａｋ配列を含むＲｅｐ７８ヌクレオチド配列（配列番号６７）、Ｒｅｐ５２（配列番号６８）およびＫｏｚａｋ配列（ｇｃｃｇｃｃａｃｃ）で始まるＲｅｐ５８ヌクレオチド配列（配列番号６９）のポリヘドロンプロモーター配列を含む。
【図６Ｂ】ｗｔ−Ｌ  ＩＴＲ、ＣＡＧプロモーター、ルシフェラーゼ導入遺伝子、ＷＰＲＥおよびポリアデニル化配列、ならびにｍｏｄ−Ｒ  ＩＴＲを有する、例示的なｃｅＤＮＡ−プラスミド−１の概略図である。
【図７Ａ】ｘ軸上で特定された４００ｎｇ（黒色）、２００ｎｇ（灰色）、または１００ｎｇ（白色）の構築物（構築物−１、構築物−３、構築物−５、構築物−７）のトランスフェクション後４８時間のＨＥＫ２９３細胞中のルシフェラーゼ活性（ｙ軸、ＲＱ（Ｌｕｃ））を測定するインビトロタンパク質発現アッセイからの結果を示す（実施例１の表５）。
【図７Ｂ】ｘ軸上で特定された４００ｎｇ（黒色）、２００ｎｇ（灰色）、または１００ｎｇ（白色）の構築物（構築物−２、構築物−４、構築物−６、構築物−８）のトランスフェクション後４８時間のＨＥＫ２９３細胞中で測定されたルシフェラーゼ活性（ｙ軸、ＲＱ（Ｌｕｃ））を示す（表５）。いかなるプラスミドも含まないＦｕｇｅｎｅで処理したＨＥＫ２９３細胞中（「Ｆｕｇｅｎｅ」）または未処理のＨＥＫ２９３細胞中（「未処理」）で測定されたルシフェラーゼ活性もまた提供される。
【図８Ａ】ｘ軸上で特定された４００ｎｇ（黒色）、２００ｎｇ（灰色）、または１００ｎｇ（白色）の構築物（構築物−１、構築物−３、構築物−５、構築物−７）のトランスフェクション後４８時間のＨＥＫ２９３細胞（ｙ軸）の生存能力を示す。
【図８Ｂ】ｘ軸上で特定された４００ｎｇ（黒色）、２００ｎｇ（灰色）、または１００ｎｇ（白色）の構築物（構築物−２、構築物−４、構築物−６、構築物−８）のトランスフェクション後４８時間のＨＥＫ２９３細胞（ｙ軸）の生存能力を示す。
【図９】図９〜１１は、一定Ｎ／Ｐ比（図９）または可変Ｎ／Ｐ比（図１０および１１）で異なる塩を含む緩衝液で調製されたいくつかの例示的な脂質ナノ粒子の平均脂質ナノ粒子サイズおよびｃｅＤＮＡ封入を示す棒グラフである。
【図１０】図９〜１１は、一定Ｎ／Ｐ比（図９）または可変Ｎ／Ｐ比（図１０および１１）で異なる塩を含む緩衝液で調製されたいくつかの例示的な脂質ナノ粒子の平均脂質ナノ粒子サイズおよびｃｅＤＮＡ封入を示す棒グラフである。
【図１１】図９〜１１は、一定Ｎ／Ｐ比（図９）または可変Ｎ／Ｐ比（図１０および１１）で異なる塩を含む緩衝液で調製されたいくつかの例示的な脂質ナノ粒子の平均脂質ナノ粒子サイズおよびｃｅＤＮＡ封入を示す棒グラフである。
【図１２】例示的な脂質ナノ粒子中の封入に対する血清／ＢＳＡの効果を示す棒グラフである。
【図１３】ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）リポソームの存在下での、例示的な脂質ナノ粒子からのｃｅＤＮＡの放出を示す棒グラフである。
【図１４】例示的な脂質ナノ粒子中の封入に対する血清／ＢＳＡの効果を示す棒グラフである。
【図１５】ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）リポソームの存在下での、例示的な脂質ナノ粒子からのｃｅＤＮＡの放出を示す棒グラフである。
【図１６】いくつかの例示的な脂質ナノ粒子のＡｐｏＥ結合を示す。
【図１７】例示的なｃｅＤＮＡのＨＥＫ２９３発現を示す棒グラフである。
【図１８】例示的なｃｅＤＮＡのＨＥＫ２９３発現を示すゲル電気泳動写真である。
【図１９】例示的なｃｅＤＮＡのＨＥＫ２９３発現を示す棒グラフである。
【図２０】実施例１０に記載される式（Ｉ）および式（ＩＩ）のいくつかの例示的な化合物を示す。
【図２１】実施例１０に開示される式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物の合成のための一般的な合成スキームである。
【図２２】実施例１０に開示される式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物の合成のための一般的な合成スキームである。
【図２３】実施例１１に記載される式（ＩＩＩ）のいくつかの例示的な化合物を示す。
【図２４】実施例１１に記載される式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、および式（Ｖ）の化合物の合成のための一般的な合成スキームを描く。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関して使用される科学的および技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。免疫学および分子生物学における共通用語の定義は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．，２０１１（ＩＳＢＮ  ９７８−０−９１１９１０−１９−３）、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２０１３），Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９９９−２０１２（ＩＳＢＮ  ９７８３５２７６００９０８）、およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｌｕｔｔｍａｎｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ‘ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ  Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ  Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ  ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ  Ｇｅｎｅｓ  ＸＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０１４（ＩＳＢＮ−１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ  １９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ  ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ  Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ  ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ  ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ  Ｍ  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ  Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ  ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出すことができ、それらの内容は、参照によりそれら全体がすべて本明細書に組み込まれる。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「脂質ナノ粒子」という用語は、１つ以上の脂質構成成分によって形成された小胞を指す。脂質ナノ粒子は、典型的に、製剤開発の文脈において核酸送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。一般に、そのような送達のための脂質ナノ粒子組成物は、合成イオン化またはカチオン性脂質、リン脂質（特にホスファチジルコリン基を有する化合物）、コレステロール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。脂質の組成物全体は、典型的に、表面特徴、およびしたがって生物系におけるタンパク質（オプソニン化）含有量を示し、したがって体内分布および細胞取り込み特性を駆動する。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「リポソーム」という用語は、水性外部から分離された内部水液量を封入する球状構成で集成した脂質分子を指す。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、典型的に、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「イオン化脂質」という用語は、少なくとも１つのプロトン付加可能な基またはプロトン遊離可能な基を有する脂質を指し、それにより脂質は、生理学的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）以下のｐＨで正に電荷され、第２のｐＨで、好ましくは生理学的ｐＨ以上で中性である。ｐＨの関数としてのプロトンの付加または除去が、平衡プロセスであること、および電荷または中性脂質に対する言及が、優性腫の性質を指し、脂質のすべてが電荷または中性形態で存在する必要がないことは、当業者によって理解されるであろう。一般に、イオン化脂質は、約４〜約７の範囲のプロトン付加可能な基のｐＫａを有する。イオン化脂質はまた、本明細書ではカチオン性脂質と称される。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「非カチオン性脂質」という用語は、任意の両親媒性脂質ならびに任意の他の中性脂質またはアニオン性脂質を指す。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、またはアニオン性脂質であり得る。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「複合脂質」という用語は、ＰＥＧ、ポリオキサゾリン、ポリアミド、またはポリマー（例えば、カチオン性ポリマー）などの非脂質分子と複合された脂質分子を指す。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、ＡＰＩ、例えば剤形を産生するときに、製剤を嵩増しおよび／または安定化するためのｃｅＤＮＡおよび／または脂質ナノ粒子を有する製剤に含まれる、薬理学的不活性成分を指す。賦形剤の一般的なカテゴリーとしては、例えば、嵩高剤、充填剤、希釈剤、抗接着剤、結合剤、コーティング、崩壊剤、香味剤、色、潤滑剤、滑剤、吸着剤、保存剤、甘味剤、および薬物吸収もしくは可溶性を促進するため、または他の薬力学的考慮のために使用される製品が挙げられる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」および「導入遺伝子」は、交換可能に使用され、本明細書で開示されるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、それによって送達および発現され得る、関心対象の（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外の）核酸を指す。関心対象の導入遺伝子としては、ポリペプチドをコードする核酸、好ましくは治療剤（例えば、医療、診断、もしくは獣医用途用）、または免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、関心対象の核酸としては、治療的ＲＮＡに転写される核酸が挙げられる。本発明のｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために含まれる導入遺伝子としては、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、アプタマー、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｍｉＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、またはそれらの任意の組み合わせを発現させる、またはコードするものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」および「転写カセット」という用語は、交換可能に使用され、導入遺伝子の転写を配向するのに十分な１つ以上のプロモーターまたは他の調節配列に操作可能に連結された導入遺伝子を含むが、カプシドをコードする配列、他のベクター配列、または逆位末端反復領域を含まない核酸の直鎖状ストレッチを指す。発現カセットは、追加として、１つ以上のシス作用性配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー）、１つ以上のイントロン、および１つ以上の転写後調節エレメントを含んでもよい。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「末端反復」または「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、および回文ヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端配列または合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「ＲＢＳ」）および末端分解部位（「ＴＲＳ」）は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳおよび少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補鎖であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」または「ＩＴＲ］と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルスパッケージング、統合、およびプロウイルスレスキューを媒介する。本明細書で本発明において予想外に見出されたように、全長にわたって逆相補鎖でないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を行うことができ、したがって、ＩＴＲという用語は、本明細書において、ｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介することができるｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター中のＴＲを指すように使用される。複合ｃｅＤＮＡ構成中、２つより多くのＩＴＲまたは非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ＩＴＲは、ＡＡＶ  ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ  ＩＴＲであり得るか、またはＡＡＶ  ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ  ＩＴＲに由来し得る。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルスおよびディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ−１９）を包含するパルボウイルス科に由来し得るか、またはＳＶ４０複製の起源として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によってさらに修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。パルボウイルス科ウイルスは、２つの亜科、脊椎動物に感染するパルボウイルス亜科、および無脊椎動物に感染するデンソウイルス亜科からなる。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、ヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーを含む。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆相補鎖でない単一ｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、ヌクレオチド付加、欠失、切断、または点突然変異に起因し得る。一実施形態では、対の１つのＩＴＲは、野生型ＡＡＶ配列であり得、もう１つは非野生型または合成配列であり得る。別の実施形態では、対のいずれのＩＴＲも、野生型ＡＡＶ配列でなく、２つのＩＴＲは、互いに配列が異なる。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域をさらに組み込む発現カセットを指す。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミドまたはウイルスゲノムに組み込まれる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡスペーサー領域」という用語は、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡゲノム中の機能的エレメントを分離する介在配列を指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、最適機能性のための所望の処理で２つの機能的エレメントを保持する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、例えば、プラスミドまたはバキュロウイルス内のｃｅＤＮＡゲノムの遺伝的安定性を提供する、または増大させる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、クローニング部位等に便利な位置を提供することによって、ｃｅＤＮＡゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」、または既知のタンパク質（例えば、転写因子）結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をｃｅＤＮＡゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、末端分解部位と、上流転写調節エレメントとの間に６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒ等を挿入する。同様に、スペーサーを、ポリアデニル化シグナル配列と３’末端分解部位との間に組み込むことができる。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」、「Ｒｅｐ結合エレメント」、「ＲＢＥ」、および「ＲＢＳ」は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８またはＡＡＶ  Ｒｅｐ６８）の結合部位を指し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実行できるようにする。ＲＢＳ配列およびその逆相補鎖は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたＲＢＳ配列である５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）を含む。任意の既知のＲＢＳ配列は、他の既知のＡＡＶ  ＲＢＳ配列および他の天然に既知のまたは合成ＲＢＳ配列を含む、本発明の実施形態において使用され得る。理論に束縛されるものではないが、Ｒｅｐタンパク質のヌクレアーゼドメインは、二重鎖ヌクレオチド配列ＧＣＴＣに結合し、したがって２つの既知のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質は、二重鎖オリゴヌクレオチド、５’−（ＧＣＧＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）−３’（配列番号５３１）に直接結合し、安定に集成すると考えられる。加えて、可溶性凝集配座異性体（すなわち、不定数の相互関連Ｒｅｐタンパク質）は解離し、Ｒｅｐ結合部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合する。各Ｒｅｐタンパク質は、各鎖上の窒素塩基およびホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は、配列特異性を提供するが、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非配列特異性または低配列特異性であり、タンパク質−ＤＮＡ複合体を安定させる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「末端分解部位」および「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ  ｐｏｌ  δまたはＤＮＡ  ｐｏｌ  εを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン−ホスホジエステル結合を形成する領域を指す。代替として、Ｒｅｐ−チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、最小限で非塩基対チミジンを包含する。いくつかの実施形態では、ＴＲＳのニッキング効率は、ＲＢＳからの同じ分子内のその距離によって少なくとも部分的に制御され得る。受容体基質が相補的ＩＴＲであるとき、得られる産生物は、分子間二重鎖である。ＴＲＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたヘキサヌクレオチド配列である５’−ＧＧＴＴＧＡ−３’（配列番号４５）を含む。他の既知のＡＡＶ  ＴＲＳ配列、ＡＧＴＴ（配列番号４６）、ＧＧＴＴＧＧ（配列番号４７）、ＡＧＴＴＧＧ（配列番号４８）、ＡＧＴＴＧＡ（配列番号４９）などの他の天然に既知のまたは合成ＴＲＳ配列、およびＲＲＴＴＲＲ（配列番号５０）などの他のモチーフを含む、任意の既知のＴＲＳ配列を、本発明の実施形態において使用することができる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−プラスミド」という用語は、分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むプラスミドを指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして操作し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指す。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス感染昆虫細胞」および「ｃｅＤＮＡ−ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」、「ｃｅＤＮＡベクター」、および「ｃｅＤＮＡ」は、交換可能に使用され、少なくとも１つの共有結合性閉端を有する非ウイルスカプシド不含ＤＮＡベクター（すなわち、分子間二重鎖）を指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの共有結合性閉端を含む。
【００５３】
本明細書で定義される場合、「レポーター」は、検出可能な読み出しを提供するために使用され得るタンパク質を指す。レポーターは、一般に、蛍光、色、または発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞または生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定波長の光で励起されたときに細胞を蛍光させ、ルシフェラーゼは、細胞に光を生成する反応を触媒させ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産生物に変換する。実験または診断目的のために有用な例示的なレポーターポリペプチドとしては、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリンホスファターゼ（ＡＰ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および他の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ならびに当該技術分野において周知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」という用語は、例えば、レポーターポリペプチドとして、あるいはより適切には、細胞を殺傷するポリペプチド、例えば毒素、または選択された薬剤もしくはその欠失で細胞を殺傷しやすくする薬剤として、検出可能な読み出しを提供するポリペプチドを指す。エフェクタータンパク質は、宿主細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを直接標的または損傷する任意のタンパク質またはペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質としては、宿主細胞ＤＮＡ配列を標的とする制限エンドヌクレアーゼ（ゲノム因子であるか染色体外因子であるかにかかわらず）、細胞生存に必要なポリペプチドを標的とするプロテアーゼ、ＤＮＡギラーゼ阻害剤、およびリボヌクレアーゼ型毒素が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成生物的回路によって制御されるエフェクタータンパク質の発現は、別の合成生物的回路における因子として関与し得、それによって生物的回路系の反応性の範囲および複雑性を拡張する。
【００５５】
転写調節因子は、関心対象の遺伝子の転写を活性化または抑制する、転写アクチベーターおよびリプレッサーを指す。プロモーターは、特定遺伝子の転写を開始する核酸の領域である。転写アクチベーターは、典型的に、転写プロモーターの近くに結合し、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を直接開始する。リプレッサーは、転写プロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨害する。他の転写調節因子は、それらが結合する場所、ならびに細胞条件および環境条件に応じて、アクチベーターまたはリプレッサーのいずれかとして役立ち得る。転写調節因子クラスの非限定例としては、ホメオドメインタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、翼状らせん（フォークヘッド）タンパク質、およびロイシン−ジッパータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「リプレッサータンパク質」または「誘導因子タンパク質」は、調節配列エレメントに結合するタンパク質であり、調節配列エレメントに操作可能に連結した配列の転写をそれぞれ抑制または活性化する。本明細書に記載される好ましいリプレッサーおよび誘導因子タンパク質は、少なくとも１つの入力剤または環境入力の存在または非存在に敏感である。本明細書に記載される好ましいタンパク質は、例えば、分離可能なＤＮＡ結合および入力剤結合、または反応性エレメントもしくはドメインを含む形態のモジュールである。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「担体」としては、任意かつすべての溶媒、分散媒質、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイド等が挙げられる。薬学的活性物質に対するそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されたときに、毒性反応、アレルギー性反応、または同様の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「入力剤反応性ドメイン」は、条件または入力剤に結合するか、またはそうでなければ連結ＤＮＡ結合融合ドメインをその条件もしくは入力の存在に対して反応性にするように、条件または入力剤に反応する転写因子のドメインである。一実施形態では、条件または入力の存在は、入力剤反応性ドメインまたはそれが融合するタンパク質の立体構造変化をもたらし、それが転写因子の転写調節活性を修飾する。
【００５９】
「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中または生物内で起こるアッセイまたはプロセスを指す。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法または使用は、細菌などの単細胞生物が使用されるときに「インビボで」起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物または植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞および細胞株を含む）、形質転換細胞株、および抽出組織または細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実行される方法および使用を指す。「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイおよび方法を指し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞または細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、タンパク質またはＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指す。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る、遺伝子エレメントを含有し得る。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーター自体の発現、または本明細書に記載される合成生物的回路の別のモジュール構成成分において使用される別のプロモーターの発現を調節する、転写因子の発現を駆動し得る。プロモーター配列内では、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、１つ以上のタンパク質（例えば、活性因子タンパク質または転写因子）に結合して、核酸配列の転写活性化を増加させるシス作用性調節配列（例えば、５０〜１，５００塩基対）を指す。エンハンサーは、それらが調節する遺伝子開始部位の上流または遺伝子開始部位の下流で最大１，０００，０００塩基対に位置付けられ得る。エンハンサーは、非関連遺伝子のイントロン領域内またはエクソン領域内に位置付けられ得る。
【００６２】
プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、または転写を駆動すると言うことができる。「操作可能に連結された」、「操作可能に位置付けられた」、「作動可能に連結された）、「制御下」、および「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置および／または配向にあり、その配列の転写開始および／または発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節する。加えて、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。
【００６３】
プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子または配列と天然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは、「内因性」と称され得る。同様に、いくつかの実施形態では、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組み換えプロモーター」または「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方が、その自然環境において操作可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。組み換えまたは異種エンハンサーは、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス性、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しない合成プロモーターまたはエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を変更する突然変異を含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路およびモジュールに関して、ＰＣＲを含む組み換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照、各々が参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ミトコンドリア、クロロプラスト等の非核性細胞小器官内の配列の転写および／または発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。
【００６５】
本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子または誘導剤の存在下、それによって影響されるとき、またはそれによって接触されるときに、転写活性を開始または強化することによって特徴付けられるものである。本明細書に定義される場合、「誘導因子」または「誘導剤」は、内因性であり得るか、または誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方法で投与される、通常は外因性の化合物またはタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、誘導因子または誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、またはタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写または発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の構成成分またはモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が誘導性プロモーターの制御下であり得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサーなどのある特定の薬剤の非存在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、およびマウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ））、ならびに他のステロイド反応性プロモーター、ラパマイシン反応性プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明によるｃｅＤＮＡベクターでの予防的治療を含む治療が提供される、ヒトまたは動物を指す。通常、動物は、限定されないが、霊長類、齧歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。齧歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。飼育動物および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚、例えば、トラウト、ナマズ、およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳類、例えば、霊長類またはヒトである。対象は、男性または女性であり得る。追加として、対象は、幼児または子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児または胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、または牛であり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、疾患および障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。追加として、本明細書に記載される方法および組成物は、飼育動物および／またはペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、または民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、スペイン人、中東人等であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者または他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、既に治療を受けている。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含むが、これらに限定されない。「抗体断片」は、無傷抗体が結合する同じ抗原に結合する無傷抗体の部分を含む、無傷抗体以外の分子を指す。一実施形態では、抗体または抗体断片は、免疫グロブリン鎖またはその断片、および少なくとも１つの免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。抗体および抗体断片の例としては、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’−ＳＨ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、重鎖、軽鎖、重鎖および軽鎖、完全抗体（例えば、Ｆｃ、Ｆａｂ、重鎖、系さ、可変領域等の各々を含む）、二重特異性抗体、ダイアボディ、直鎖状抗体、単鎖抗体、細胞内抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、多特異性抗体、または多量体抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体または抗体断片は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含むが、これらに限定されない任意のクラス、またはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２を含むが、これらに限定されない任意のサブクラスであり得る。追加として、抗体は、任意の哺乳類、例えば霊長類、ヒト、ラット、マウス、ウマ、ヤギ等に由来し得る。一実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化である。いくつかの実施形態では、抗体は、修飾抗体である。いくつかの実施形態では、抗体の構成成分は、抗体自体が、タンパク質構成成分の発現に続いて集成するように別々に発現され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、疾患または疾患の症状を治療する目的のために、所望の機能、例えば、所望のタンパク質の相互作用および阻害を有する。一実施形態では、抗体または抗体断片は、フレームワーク領域またはＦｃ領域を含む。
【００６８】
本明細書で使用される場合、抗体分子の「抗原結合ドメイン」という用語は、抗原結合に関与する抗体分子、例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の一部を指す。実施形態では、抗原結合部位は、重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）の可変領域（Ｖ）のアミノ酸残基によって形成される。超可変領域と称される、重鎖および軽鎖の可変領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された隣接するストレッチの間に配設される。ＦＲは、免疫グロブリン中の超可変領域間およびそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列である。実施形態では、抗体分子中に、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、３次元空間内に互いに対して配設され、抗原結合表面を形成し、これは結合した抗原の３次元表面に相補的である。重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。フレームワーク領域およびＣＤＲは、例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７において定義され、説明されている。各可変鎖（例えば、可変重鎖および可変軽鎖）は、典型的に、アミノ末端からカルボキシ末端までアミノ酸順序、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４で配置された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで形成される。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「全長抗体」という用語は、例えば、天然に存在し、正常な免疫グロブリン遺伝子断片リコンビナトリアルプロセスによって形成される免疫グロブリン（Ｉｇ）分子（例えば、ＩｇＧ抗体）を指す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「機能的抗体断片」という用語は、無傷（例えば、全長）抗体によって認識されるものと同じ抗原に結合する断片を指す。「抗体断片」または「機能的断片」という用語はまた、可変領域からなる単離された断片、例えば重鎖および軽鎖、または軽鎖および重鎖可変領域がペプチドリンカー（「ｓｃＦｖタンパク質」）によって接続されるリコンビナント単鎖ポリペプチド分子の可変領域からなる「Ｆｖ」断片を含む。いくつかの実施形態では、抗体断片は、Ｆｃ断片または単一アミノ酸残基などの抗原結合活性のない抗体の部分を含まない。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成し得る、アミノ酸配列を指す。例えば、配列は、天然に存在する可変ドメインのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含み得る。例えば、配列は、１つ、２つ、もしくはそれ以上のＮ末端もしくはＣ末端アミノ酸を含んでも含まなくてもよく、またはタンパク質構造の形成に対応した他の変更を含んでもよい。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、方法または組成物に必須であるが、必須であるか否かにかかわらず、不特定要素の包含に対して開かれている、その組成物、方法、およびそれぞれの構成成分（複数可）に関して使用される。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。
【００７４】
「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されてない任意の要素を除いて、本明細書に記載される組成物、方法、およびそれらそれぞれの構成成分を指す。
【００７５】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載される、および／または本開示等を読むことにより当業者に明らかとなるであろうタイプの１つ以上の方法、および／またはステップを含む。同様に、「または」という語は、文脈が別途明らかに示されない限り、「および」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記で説明される。省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定例を示すように使用される。したがって、省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。
【００７６】
作動例または別途示される場合を除いて、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。「約」という用語は、パーセンテージに関して使用される場合、±１％を意味し得る。本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、本発明の範囲は、それに限定されてはならない。
【００７７】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬等に限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００７８】
無制限に、本発明の脂質ナノ粒子は、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターを関心対象の標的部位（例えば、細胞、組織、器官等）を送達するように使用され得る脂質製剤を含む。一般に、脂質ナノ粒子は、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターおよびイオン化脂質またはその塩を含む。
【００７９】
したがって、いくつかの態様では、本開示は、ｃｅＤＮＡおよびイオン化脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、実施例１のプロセスまたは本明細書に開示される他の方法によって取得されたｃｅＤＮＡで作製され、負荷された脂質ナノ粒子。これは、イオン化脂質をプロトン化し、粒子のｃｅＤＮＡ／脂質会合および核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低ｐＨでのエタノール脂質と水性ｃｅＤＮＡとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈および有機溶媒の除去によってさらに安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。
【００８０】
一般に、脂質粒子は、約１０：１〜３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ（質量または重量）比で調製される。いくつかの実施形態では、脂質対ｃｅＤＮＡ比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１〜約２５：１、約１０：１〜約１４：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲内であり得る。脂質およびｃｅＤＮＡの量を調整して、所望のＮ／Ｐ比、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のＮ／Ｐ比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
【００８１】
イオン化脂質は、典型的に、核酸カーゴ、例えばｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、および膜会合および膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、イオン化脂質は、正に電荷される、または例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。イオン化脂質はまた、本明細書ではカチオン性脂質と称される。
【００８２】
例示的なイオン化脂質は、表１に列挙されるＰＣＴおよび米国特許公開に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【表１−１】
2020537493.tif 000003
【表１−２】
2020537493.tif 000004
【表１−３】
2020537493.tif 000005
【００８３】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１６／０３１１７５９（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｘ）
【化１】
2020537493.tif 000006
の化合物である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１５／０３７６１１５またはＵＳ２０１６／０３７６２２４（それら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化２】
2020537493.tif 000007
の化合物である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１６／０１５１２８４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化３】
2020537493.tif 000008
または式（ＩＩ）
【化４】
2020537493.tif 000009
または式（ＩＩＩ）
【化５】
2020537493.tif 000010
の化合物である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１７／０２１０９６７（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化６】
2020537493.tif 000011
または式（ＩＡ）
【化７】
2020537493.tif 000012
または式（ＩＩ）
【化８】
2020537493.tif 000013
または式（ＩＩＡ）
【化９】
2020537493.tif 000014
の化合物である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１５／０１４００７０（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式Ｉ−ｃ
【化１０】
2020537493.tif 000015
の化合物である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１３／０１７８５４１（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式Ａ
【化１１】
2020537493.tif 000016
の化合物である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１３／０３０３５８７またはＵＳ２０１３／０１２３３３８（それら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化１２】
2020537493.tif 000017
の化合物である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１５／０１４１６７８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化１３】
2020537493.tif 000018
の化合物である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１５／０２３９９２６（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（ＩＩ）
【化１４】
2020537493.tif 000019
、式（ＩＩＩ）
【化１５】
2020537493.tif 000020
、式（ＩＶ）
【化１６】
2020537493.tif 000021
、または式（Ｖ）
【化１７】
2020537493.tif 000022
の化合物である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１７／０１１９９０４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化１８】
2020537493.tif 000023
の化合物である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物であり、各々が、ＷＯ２０１７／１１７５２８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、構造
【化１９】
2020537493.tif 000024
を有する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１２／０１４９８９４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式Ａ
【化２０】
2020537493.tif 000025
の化合物である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１５／００５７３７３（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式Ａ
【化２１】
2020537493.tif 000026
の化合物である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１３／１１６１２６（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式Ａ
【化２２】
2020537493.tif 000027
の化合物である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１３／００９０３７２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式Ａ
【化２３】
2020537493.tif 000028
の化合物である。
【００９８】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１３／０２７４５２３（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式Ａ
【化２４】
2020537493.tif 000029
の化合物である。
【００９９】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１３／０２７４５０４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式Ａ
【化２５】
2020537493.tif 000030
の化合物である。
【０１００】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１３／００５３５７２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式Ａ
【化２６】
2020537493.tif 000031
の化合物である。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１３／０１６０５８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式Ａ
【化２７】
2020537493.tif 000032
の化合物である。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１２／１６２２１０（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式Ａ
【化２８】
2020537493.tif 000033
の化合物である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２００８／０４２９７３（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化２９】
2020537493.tif 000034
の化合物である。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１２／０１２８７６７０（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化３０】
2020537493.tif 000035
、式（ＩＩ）
【化３１】
2020537493.tif 000036
、式（ＩＩＩ）
【化３２】
2020537493.tif 000037
、または式（ＩＶ）
【化３３】
2020537493.tif 000038
の化合物である。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物であり、各々が、ＵＳ２０１４／０２００２５７（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、構造
【化３４】
2020537493.tif 000039
を有する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）の式（ＩＩＩ）の化合物であり、各々が、ＵＳ２０１５／０２０３４４６（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、構造
【化３５】
2020537493.tif 000040
を有する。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１５／０００５３６３（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化３６】
2020537493.tif 000041
または式（ＩＩＩ）
【化３７】
2020537493.tif 000042
の化合物である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１４／０３０８３０４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化３８】
2020537493.tif 000043
、式（ＩＡ）
【化３９】
2020537493.tif 000044
、式（ＩＢ）
【化４０】
2020537493.tif 000045
、式（ＩＣ）
【化４１】
2020537493.tif 000046
、式（ＩＤ）
【化４２】
2020537493.tif 000047
、式（ＩＩ）
【化４３】
2020537493.tif 000048
、式（ＩＩＡ）
【化４４】
2020537493.tif 000049
、式（ＩＩＢ）
【化４５】
2020537493.tif 000050
、式（ＩＩＣ）
【化４６】
2020537493.tif 000051
、式（ＩＩＤ）、または式（ＩＩＩ）〜（ＸＸＩＶ）の化合物である。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１３／０３３８２１０（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式
【化４７】
2020537493.tif 000052
の化合物である。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２００９／１３２１３１（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化４８】
2020537493.tif 000053
、式（ＩＩ）
【化４９】
2020537493.tif 000054
、式（ＩＩＩ）
【化５０】
2020537493.tif 000055
、または式（ＩＶ）
【化５１】
2020537493.tif 000056
の化合物である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１２／０１０１１４７８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式Ａ
【化５２】
2020537493.tif 000057
の化合物である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１２／００２７７９６（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化５３】
2020537493.tif 000058
または式（ＸＸＸＶ）
【化５４】
2020537493.tif 000059
の化合物である。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１２／００５８１４４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（ＸＩＶ）
【化５５】
2020537493.tif 000060
または式（ＸＶＩＩ）
【化５６】
2020537493.tif 000061
の化合物である。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１３／０３２３２６９（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式
【化５７】
2020537493.tif 000062
、または
【化５８】
2020537493.tif 000063
の化合物である。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１１／０１１７１２５（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化５９】
2020537493.tif 000064
の化合物である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１１／０２５６１７５（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化６０】
2020537493.tif 000065
、式（ＩＩ）
【化６１】
2020537493.tif 000066
、または式（ＩＩＩ）−
【化６２】
2020537493.tif 000067
の化合物である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１２／０２０２８７１（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化６３】
2020537493.tif 000068
、式（ＩＩ）
【化６４】
2020537493.tif 000069
、式（ＩＩＩ）
【化６５】
2020537493.tif 000070
、式（ＩＶ）
【化６６】
2020537493.tif 000071
、式（Ｖ）
【化６７】
2020537493.tif 000072
、式（ＶＩ）
【化６８】
2020537493.tif 000073
、式（ＶＩＩ）
【化６９】
2020537493.tif 000074
、式（ＶＩＩＩ）
【化７０】
2020537493.tif 000075
、式（ＩＸ）
【化７１】
2020537493.tif 000076
、式（Ｘ）
【化７２】
2020537493.tif 000077
、−式（ＸＩ）
【化７３】
2020537493.tif 000078
、または式（ＸＩＩ）
【化７４】
2020537493.tif 000079
の化合物である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１１／００７６３３５（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化７５】
2020537493.tif 000080
、式（ＩＩ）
【化７６】
2020537493.tif 000081
、式（ＩＩＩ）
【化７７】
2020537493.tif 000082
、式（ＩＶ）
【化７８】
2020537493.tif 000083
、式（Ｖ）
【化７９】
2020537493.tif 000084
、式（ＶＩ）
【化８０】
2020537493.tif 000085
、式（ＶＩＩ）
【化８１】
2020537493.tif 000086
、式（ＶＩＩＩ）
【化８２】
2020537493.tif 000087
、式（ＩＸ）
【化８３】
2020537493.tif 000088
、式（Ｘ）
【化８４】
2020537493.tif 000089
、式（ＸＩ）
【化８５】
2020537493.tif 000090
、式（ＸＩＩ）
【化８６】
2020537493.tif 000091
、式（ＸＩＩＩ）
【化８７】
2020537493.tif 000092
、式（ＸＩＶ）
【化８８】
2020537493.tif 000093
、式（ＸＶ）
【化８９】
2020537493.tif 000094
、または式（ＸＶＩ）
【化９０】
2020537493.tif 000095
の化合物である。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２００６／００８３７８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化９１】
2020537493.tif 000096
または式（ＩＩ）
【化９２】
2020537493.tif 000097
の化合物である。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１３／０１２３３３８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化９３】
2020537493.tif 000098
の化合物である。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１５／００６４２４２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）、Ｘ−Ａ−Ｙ−Ｚの化合物である。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１３／００２２６４９（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（ＸＶＩＸ）
【化９４】
2020537493.tif 000099
、式（ＸＶＩＩ）
【化９５】
2020537493.tif 000100
、または式（ＸＶＩＩＩ）
【化９６】
2020537493.tif 000101
の化合物である。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１３／０１１６３０７（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化９７】
2020537493.tif 000102
、式（ＩＩ）
【化９８】
2020537493.tif 000103
、または式（ＩＩＩ）
【化９９】
2020537493.tif 000104
の化合物である。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１０／００６２９６７（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化１００】
2020537493.tif 000105
または式（ＩＩ）
【化１０１】
2020537493.tif 000106
の化合物である。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、式（Ｉ）〜（Ｘ）の化合物であり、各々が、ＵＳ２０１３／０１８９３５１（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、構造
【化１０２】
2020537493.tif 000107
を有する。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１４／００３９０３２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化１０３】
2020537493.tif 000108
の化合物である。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１８／００２８６６４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｖ）
【化１０４】
2020537493.tif 000109
の化合物である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１６／０３１７４５８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化１０５】
2020537493.tif 000110
の化合物である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＵＳ２０１３／０１９５９２０（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化１０６】
2020537493.tif 000111
の化合物である。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、実施例９に記載されるＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡまたはＭＣ３）である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、実施例１０に記載される脂質ＡＴＸ−００２である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、実施例１１に記載される（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（化合物３２）である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、実施例１２に記載される化合物６または化合物２２である。
【０１３４】
無制限に、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の２０〜９０％（ｍｏｌ）を構成し得る。例えば、イオン化脂質モル含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の２０〜７０％（ｍｏｌ）、３０〜６０％（ｍｏｌ）、または４０〜５０％（ｍｏｌ）であり得る。いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％を含む。
【０１３５】
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、非カチオン性脂質をさらに含み得る。非イオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、およびアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、またはアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を強化するために用いられる。
【０１３６】
例示的な非カチオン性脂質としては、ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン（１６−Ｏ−モノメチルＰＥなど）、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン（１６−Ｏ−ジメチルＰＥなど）、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リソホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。他のジアシルホスファチジルコリンおよびジアシルホスファチジルエタノールアミンリン脂質もまた使用され得ることが理解される。これらの脂質中のアシル基は、好ましくは、Ｃ１０〜Ｃ２４炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基、例えば、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイル、またはオレオイルである。
【０１３７】
脂質ナノ粒子中での使用に好適な非カチオン性脂質の他の例としては、例えば、ステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、リシノール酸グリセロール、ステアリン酸ヘキサデシル、ミリスチン酸イソプロピル、両性アクリル系ポリマー、トリエタノールアミン−硫酸ラウリル、アルキル−アリールサルフェートポリエチルオキシル化脂肪酸アミド、ジオクタデシルジメチル臭化アンモニウム、セラミド、スフィンゴミエリン等の非亜リン脂質が挙げられる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、リン脂質である。いくつかの実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＯＰＥ、およびＳＭから選択される。いくつかの好ましい実施形態では、非カチオン性脂質は、ＤＰＳＣである。
【０１３９】
例示的な非カチオン性脂質は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／０９９８２３号および米国特許公開第ＵＳ２０１８／００２８６６４号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
いくつかの実施例では、非カチオン性脂質は、オレイン酸、またはＵＳ２０１８／００２８６６４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（Ｉ）
【化１０７】
2020537493.tif 000112
、式（ＩＩ）
【化１０８】
2020537493.tif 000113
、または式（ＩＶ）
【化１０９】
2020537493.tif 000114
の化合物である。
【０１４１】
非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０〜３０％（ｍｏｌ）を構成し得る。例えば、非カチオン性脂質含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の５〜２０％（ｍｏｌ）または１０〜１５％（ｍｏｌ）である。様々な実施形態では、イオン化脂質対中性脂質のモル比は、約２：１〜約８：１の範囲である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を全く含まない。
【０１４３】
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、膜統合性を提供するために、ステロールなどの構成成分をさらに含み得る。
【０１４４】
脂質ナノ粒子中で使用され得る１つの例示的なステロールは、コレステロールおよびその誘導体である。コレステロール誘導体の非限定例としては、５α−コレスタノール、５β−コプロスタノール、コレステリル−（２’−ヒドロキシ）−エチルエーテル、コレステリル−（４’−ヒドロキシ）−ブチルエーテル、および６−ケトコレスタノールなどの極性類似体、５α−コレスタン、コレステノン、５α−コレスタノン、５β−コレスタノン、およびデカン酸コレステリルなどの非極性類似体、ならびにそれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、コレステロール誘導体は、コレステリル−（４’−ヒドロキシ）−ブチルエーテルなどの極性類似体である。
【０１４５】
例示的なコレステロール誘導体は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００９／１２７０６０号および米国特許公開第ＵＳ２０１０／０１３０５８８に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４６】
ステロールなどの膜統合性を提供する構成成分は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０〜５０％（ｍｏｌ）を構成し得る。いくつかの実施形態では、そのような構成成分は、脂質ナノ粒子の全脂質含有量の２０〜５０％（ｍｏｌ）、３０〜４０％（ｍｏｌ）である。
【０１４７】
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または複合脂質分子をさらに含み得る。一般に、これらを使用して、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、かつ／または立体安定化を提供する。例示的な複合脂質としては、ＰＥＧ−脂質複合体、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質複合体、ポリアミド−脂質複合体（ＡＴＴＡ−脂質複合体など）、カチオン性−ポリマー脂質（ＣＰＬ）複合体、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、複合脂質分子は、ＰＥＧ−脂質複合体、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）−複合脂質である。
【０１４８】
例示的なＰＥＧ−脂質複合体としては、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ））、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ−ＤＡＧ）（４−Ｏ−（２’，３’−ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル−１−Ｏ−（ｗ−メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ−脂質複合体は、例えば、ＵＳ５，８８５，６１３、ＵＳ６，２８７，５９１、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００５／０１７５６８２、ＵＳ２００８／００２００５８、ＵＳ２０１１／０１１７１２５、ＵＳ２０１０／０１３０５８８、ＵＳ２０１６／０３７６２２４、ＵＳ２０１７／０１１９９０４、およびＵＳ／０９９８２３に記載されており、それらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−脂質は、ＵＳ２０１８／００２８６６４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（ＩＩＩ）
【化１１０】
2020537493.tif 000115
、式（ＩＩＩ−ａ−Ｉ）
【化１１１】
2020537493.tif 000116
、式（ＩＩＩ−ａ−２）
【化１１２】
2020537493.tif 000117
、式（ＩＩＩ−ｂ−１）
【化１１３】
2020537493.tif 000118
、式（ＩＩＩ−ｂ−２）
【化１１４】
2020537493.tif 000119
、または式（Ｖ）
【化１１５】
2020537493.tif 000120
の化合物である。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−脂質は、ＵＳ２０１５／０３７６１１５またはＵＳ２０１６／０３７６２２４（それら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式（ＩＩ）
【化１１６】
2020537493.tif 000121
のである。
【０１５１】
ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ−脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ−ジステリルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスト−５−エン−３［β］−オキシ）カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［ω］−メチル−ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［ω］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］のうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施例では、ＰＥＧ−脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］、
【化１１７】
2020537493.tif 000122
からなる群から選択され得る。
【０１５２】
ＰＥＧ以外の分子と複合した脂質は、ＰＥＧ−脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質複合体、ポリアミド−脂質複合体（ＡＴＴＡ−脂質複合体など）、およびカチオン性−ポリマー脂質（ＣＰＬ）複合体を、ＰＥＧ−脂質の代わりに、またはそれに加えて使用することができる。
【０１５３】
例示的な複合脂質、すなわち、ＰＥＧ−脂質、（ＰＯＺ）−脂質複合体、ＡＴＴＡ−脂質複合体、およびカチオン性ポリマー−脂質は、表２に列挙されるＰＣＴおよび米国特許出願に記載されており、それらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【表２−１】
2020537493.tif 000123
【表２−２】
2020537493.tif 000124
【０１５４】
ＰＥＧまたは複合脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０〜２０％（ｍｏｌ）を構成し得る。いくつかの実施形態では、ＰＥＧまたは複合脂質含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０．５〜１０％または２〜５％（ｍｏｌ）である。
【０１５５】
イオン化脂質、非カチオン性脂質、ステロール、およびＰＥＧ／複合脂質のモル比は、必要に応じて変化し得る。例えば、脂質粒子は、組成物のモルまたは全重量で３０〜７０％のイオン化脂質、組成物のモルまたは全重量で０〜６０％のコレステロール、組成物のモルまたは全重量で０〜３０％の非カチオン性脂質、および組成物のモルまたは全重量で１〜１０％の複合脂質を含み得る。好ましくは、組成物は、組成物のモルまたは全重量で３０〜４０％のイオン化脂質、組成物のモルまたは全重量で４０〜５０％のコレステロール、および組成物のモルまたは全重量で１０〜２０％の非カチオン性脂質を含む。いくつかの他の実施形態では、組成物は、組成物のモルまたは全重量で５０〜７５％のイオン化脂質、組成物のモルまたは全重量で２０〜４０％のコレステロール、および組成物のモルまたは全重量で５〜１０％の非カチオン性脂質、および組成物のモルまたは全重量で１〜１０％の複合脂質である。組成物は、組成物のモルまたは全重量で６０〜７０％のイオン化脂質、組成物のモルまたは全重量で２５〜３５％のコレステロール、および組成物のモルまたは全重量で５〜１０％の非カチオン性脂質を含有してもよい。組成物はまた、組成物のモルまたは全重量で最大９０％のイオン化脂質、および組成物のモルまたは全重量で２〜１５％の非カチオン性脂質を含有してもよい。製剤はまた、例えば、組成物のモルもしくは全重量で８〜３０％のイオン化脂質、組成物のモルもしくは全重量で５〜３０％の非カチオン性脂質、および組成物のモルもしくは全重量で０〜２０％のコレステロール；組成物のモルもしくは全重量で４〜２５％のイオン化脂質、組成物のモルもしくは全重量で４〜２５％の非カチオン性脂質、組成物のモルもしくは全重量で２〜２５％のコレステロール、組成物のモルもしくは全重量で１０〜３５％の複合脂質、および組成物のモルもしくは全重量で５％のコレステロール；または組成物のモルもしくは全重量で２〜３０％のイオン化脂質、組成物のモルもしくは全重量で２〜３０％の非カチオン性脂質、組成物のモルもしくは全重量で１〜１５％のコレステロール、組成物のモルもしくは全重量で２〜３５％の複合脂質、および組成物のモルもしくは全重量で１〜２０％のコレステロール；またはさらには組成物のモルもしくは全重量で最大９０％のイオン化脂質、および組成物のモルもしくは全重量で２〜１０％の非カチオン性脂質；またはさらには組成物のモルもしくは全重量で１００％のカチオン性脂質を含む、脂質ナノ粒子であってもよい。いくつかの実施形態では、脂質粒子製剤は、イオン化脂質、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。いくつかの他の実施形態では、脂質粒子製剤は、イオン化脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を６０：３８．５：１．５のモル比で含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、イオン化脂質、非カチオン性脂質（例えば、リン脂質）、ステロール（例えば、コレステロール）、およびＰＥＧ化脂質を含み、脂質のモル比は、イオン化脂質の場合、２０〜７０モルパーセントの範囲であり（目標４０〜６０）、非カチオン性脂質のモルパーセントは、０〜３０の範囲であり（目標０〜１５）、ステロールのモルパーセントは、２０〜７０の範囲であり（目標３０〜５０）、ＰＥＧ化脂質のモルパーセントは、１〜６の範囲である（目標２〜５）。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、脂質粒子は、イオン化脂質／非カチオン性脂質／ステロール／複合脂質を、５０：１０：３８．５：１．５のモル比で含む。
【０１５８】
他の態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンを含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の化合物もまた含まれ得る。それらの化合物は、別々に投与され得るか、または追加の化合物は、本発明の脂質ナノ粒子中に含まれ得る。言い換えれば、脂質ナノ粒子は、ｃｅＤＮＡに加えて他の化合物、または少なくとも第１のものとは異なる第２のｃｅＤＮＡを含有し得る。無制限に、他の追加の化合物は、小さいまたは大きい有機または無機分子、単糖類、二糖類、三糖類、オリゴ糖類、多糖類、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体およびそれらの誘導体、ペプチド模倣体、核酸、核酸類似体および誘導体、生体物質から作製される抽出物、またはそれらの任意の組み合わせからなる群から選択され得る。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、所望の治療目的および生物作用に従って選択され得る。例えば、ＬＮＰ内のｃｅＤＮＡが、癌を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗癌剤（例えば、化学療法剤、標的癌療法（小分子、抗体、または抗体−薬物複合体を含むが、これらに限定されない）であり得る。別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗菌剤（例えば、抗生物質または抗ウイルス化合物）であり得る。さらに別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、免疫疾患または障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫反応を調節する化合物（例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、または１つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物）であり得る。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質または異なる化合物（治療剤など）をコードするｃｅＤＮＡなどの、異なる化合物を含有する異なる脂質ナノ粒子の異なるカクテルを、本発明の組成物および方法で使用することができる。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激性である。
【０１６２】
例示的な免疫調節薬としては、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１２）、サイトカイン（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターフェロン）、ケモカイン（例えば、ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ７）、免疫調節性イミド薬（ＩＭｉＤ）（例えば、サリドマイドおよびその類似体（レナリドミド、ポマリドミド、およびアプレミラスト）、他の免疫調節薬（リン酸シトシン−グアノシン、オリゴデオキシヌクレオチド、グルカンを含むが、これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、免疫調節薬は、免疫抑制薬であり得る。例示的な免疫抑制薬としては、グルココルチコイド、細胞増殖抑制剤、抗体、イムノフィリン上で作用する薬物、および他の薬物が挙げられるが、これらに限定されない。グルココルチコイドとしては、プレドニゾン、デキサメタゾン、およびヒドロコルチゾンが挙げられるが、これらに限定されない。細胞増殖抑制剤の例としては、アルキル化剤、例えばナイトロジェンマスタード（例えば、シクロホスファミド）、ニトロソウレア、および白金化合物が挙げられる。細胞増殖抑制剤としては、抗代謝剤、例えばギ酸類似体（例えば、メトトレキサート）、プリン類似体（例えば、アザチオプリンおよびメルカプトプリン）、ピリミジン類似体（例えば、フルオロウラシル）、およびタンパク質合成阻害剤を挙げることもできる。他の細胞増殖抑制剤としては、細胞毒性抗生物質、例えばダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、およびミトラマイシンが挙げられる。
【０１６４】
免疫抑制のための抗体としては、ウマ血清から取得されるＡｔｇａｍ、およびサイモグロブリン、ＩＬ−２受容体−（ＣＤ２５−）に配向された抗体、および／またはＣＤ３配向抗体、ＭＵＲＯＭＯＮＡＢ−ＣＤ３（商標）（Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ  ＯＫＴ３）、バシリキシマブ（ＳＩＭＵＬＥＣＴ（商標））、ダクリズマブ（ＺＥＮＡＰＡＸ（商標））、およびムロモナブが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６５】
イムノフィリン上で作用する薬物としては、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン（ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ（商標））、およびエベロリムスが挙げられるが、これらに限定されない。生物製剤の例としては、アバタセプト、アナキンラ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、イキセキズマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、およびベドリズマブが挙げられる。
【０１６６】
免疫調節薬または免疫抑制剤として有用な他の薬物としては、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−β）、オピオイド、ＴＮＦ結合タンパク質（例えば、ＴＮＦ−α（腫瘍壊死因子−α）結合タンパク質、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（商標））、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標））、またはアダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（商標））、クルクミン（ターメリック中の成分）およびカテキン（緑茶中）、ミコフェノール酸塩、フィンゴリモド、ミリオシン、抗増殖剤（例えば、ミリオシン、タクロリムス、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム、アザチオプリン）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムスおよびエベロリムス）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンおよびタクロリムス）、ＩＭＤＳ阻害剤（例えば、アザチオプリン、レフルノミド、およびミコフェノール酸塩）、フィンゴルモド、アバタセプト、アナキンラ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、イキセキズマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、セクキヌマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、およびベドリズマブが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物および方法で有用な免疫抑制剤は、以下の化合物、ミコフェノール酸、シクロスポリン、アザチオプリン、タクロリムス、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ラパマイシン、レフルノミド、デオキシスペルグアリン、プレドニゾン、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、ＯＫＴ３、ＡＴＡＧ、またはミゾリビンのうちの１つから選択され得る。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、免疫抑制剤は、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、ケナログ、Ｍｅｄｒｏｌ（経口）、Ｍｅｄｒｏｌ（Ｐａｋ）（経口）、Ｄｅｐｏ−Ｍｅｄｒｏｌ（注入）、プレドニゾロン（経口）、Ｓｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（注入）、ヒドロコルチゾン（経口）、Ｃｏｒｔｅｆ（経口）、Ｓｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（ＩＶ）、コルチゾン（経口）、Ｃｅｌｅｓｔｏｎｅ  Ｓｏｌｕｓｐａｎ（注入）、Ｏｒａｐｒｅｄ  ＯＤＴ（経口）、Ｏｒａｐｒｅｄ（経口）、Ｐｒｅｌｏｎｅ（経口）、メチルプレドニゾロン（注入）、酢酸メチルプレドニゾロン（注入）、Ｐｒｅｄｎｉｓｏｎｅ  Ｉｎｔｅｎｓｏｌ（経口）、酢酸ベタメタゾンおよびリン酸ナトリウム（注入）、Ｖｅｒｉｐｒｅｄ、Ｃｅｌｅｓｔｏｎｅ（経口）、メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム（ＩＶ）、メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム（注入）、Ｍｉｌｌｉｐｒｅｄ（経口）、Ｓｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（ＰＦ）（注入）、Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ（注入）、Ａｒｉｓｔｏｓｐａｎ（関節内注入）、ヒドロコルチゾンコハク酸ナトリウム（注入）、プレドニゾロンリン酸ナトリウム（経口）、メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム（ＰＦ）（ＩＶ）、Ｓｏｌｕ−Ｍｅｄｒｏｌ（ＰＦ）（ＩＶ）、トリアムシノロンヘキサセトニド（注入）、Ａ−ヒドロコルチゾン（注入）、Ａ−Ｍｅｔｈａｐｒｅｄ（注入）、Ｍｉｌｌｉｐｒｅｄ  ＤＰ（経口）、Ｆｌｏ−Ｐｒｅｄ（経口）、Ａｒｉｓｔｏｓｐａｎ（病変内注入）、ベタメタゾン（経口）、メチルプレドニゾロンコハク酸ナトリウム（ＰＦ）（注入）、ヒドロコルチゾンコハク酸ナトリウム（ＰＦ）（注入）、Ｓｏｌｕ−Ｃｏｒｔｅｆ（ＰＦ）（注入）、酢酸プレドニゾロン（経口）、０．９％  ＮａＣｌ中のデキサメタゾン（ＩＶ）、Ｒａｙｏｓ、レボチロキシンからなる群から選択される。当然のことながら、この一覧は、網羅的または限定的であると考慮されてはならないため、当業者に知られている免疫抑制剤は、容易に置き換えることができる。
【０１６９】
免疫抑制剤は、対象における免疫細胞の低減、例えば、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４、ＣＤ８のうちの少なくとも１つ以上を発現する免疫細胞の低減、および／または限定されないが、ＴＮＦαもしくはＭＣＰ−１から選択される炎症促進性サイトカインの低減をもたらし得る。いくつかの実施形態では、炎症促進性サイトカインは、サイトカイン、リンホカイン、モノカイン、幹細胞成長因子、リンホトキシン、造血因子、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、インターフェロン（ＩＦＮ）、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、黄体ホルモン（ＬＨ）、肝成長因子、プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、エリスロポエチン、トロンボポエチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ミュラー阻害物質（ＭＩＳ）、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、インテグリン、インターロイキン（ＩＬ）、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、Ｓ１因子、ＩＬ−１、ＩＬ−１ｃｃ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３、ＩＬ−２５、ＬＩＦ、キット−リガンド、ＦＬＴ−３、アンジオスタチン、トロンボスポンジン、およびエンドスタチンのうちのいずれか１つまたは組み合わせから選択される。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、炎症促進性サイトカインは、インターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、単球化学誘引物質タンパク質−１（ＭＣＰ−１）、ＲＡＮＴＥＳ、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ２（ＭＭＰ２）、ＩＰ−１０、マクロファージ炎症性タンパク質１α（ＭＩＰ１α）、および／またはマクロファージ炎症性タンパク質１β（ＭＩＰ１β）のうちのいずれかまたは組み合わせから選択され得る。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、ＮＬＲＰ３アゴニストである。例示的なＮＬＲＰ３アゴニストとしては、イマダゾキノリン；イミダゾナフチリジン；ピラゾロピリジン；アリール置換イミダゾキノリン；１−アルコキシ１Ｈ−イミダゾ環系を有する化合物；オキサゾロ［４，５−ｃ］−キノリン−４−アミン；チアゾロ［４，５−ｃ］−キノリン−４−アミン；セレナゾロ［４，５−ｃ］−キノリン−４−アミン；イミダゾナフチリジン、イミダゾキノリナミン；１置換、２置換１Ｈ−イミダゾ［４，５−Ｃ］キノリン−４−アミン；融合シクロアルキルイミダゾピリジン；１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；１置換１Ｈ−イミダゾ−［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；イミダゾ−［４，５−Ｃ］キノリン−４−アミン；２−エチル１Ｈ−イミダゾ［４，５−シキノリン−４−アミン；オレフィン１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン；６，７−ジヒドロ−８−（イミダゾール−１−イル）−５−メチル−１−オキソ−１Ｈ，５Ｈ−ベンゾ［ｉｊ］キノリジン−２−カルボン酸；ピリドキノキサリン−６−カルボン酸；６，７−ジヒドロ−８−（イミダゾール−１−イル）−５−メチル−１−オキソ−１Ｈ，５Ｈ−ベンゾ［ｉｊ］キノリジン−２−カルボン酸；置換ナフト［ｉｊ］キノリジン；置換ピリドキノキサリン−６−カルボン酸；７−ヒドロキシ−ベンゾ［ｉｊ］キノリジン−２−カルボン酸誘導体；置換ベンゾ［ｉｊ］キノリジン−２−カルボン酸；７−ヒドロキシ−ベンゾ［ｉｊ］キノリジン−２−カルボン酸；置換ピリド［１，２，３，−ｄｅ］−１，４−ベンゾキサジン；およびテトラヒドロキノリンのＮ−メチレンマロン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＮＬＲＰ３アゴニストは、ＵＳ２０１７／００５６４４８Ａ１（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式
【化１１８】
2020537493.tif 000125
の化合物である。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、ＴＬＲ７および／またはＴＬＲ８リガンドである。いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、イミキモド（１−イソブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）またはレシキモドである。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、ＵＳ９０３４３３６Ｂ２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、式
【化１１９】
2020537493.tif 000126
のイムキダゾールキノリン系化合物である。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、ＳＭＡＤ７調節薬である。例えば、ＳＭＡＤ７調節薬は、ＷＯ２０１７／０５９２２５Ａ１（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に定義されている、ＳＭＡＤ７アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＯＮ）であり得る。
【０１７５】
免疫調節剤は、ＴＬＲ調節薬であり得る。例えば、免疫調節剤は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、もしくはＴＬＲ９調節薬、例えばＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、もしくはＴＬＲ９アゴニスト、またはＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、もしくはＴＬＲ９アンタゴニストであり得る。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ３調節薬である。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ４調節薬である。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ７調節薬である。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ８調節薬である。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ９調節薬である。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ３アゴニストである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ４アゴニストである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ７アゴニストである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ８アゴニストである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ９アゴニストである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ３アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ４アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ７アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ８アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＴＬＲ９アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＴＬＲ調節薬は、２つ以上のＴＬＲを調節することができる。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、１つ以上のＴＬＲを活性化し、１つ以上のＴＬＲを阻害することができる。いくつかの実施形態では、ＴＬＲ調節薬は、ＫＡＰＰＡＰＲＯＣＴ（登録商標）またはＭＯＮＡＲＳＥＮ（登録商標）などのＴＬＲ９調節薬である。いくつかの例示的なＴＬＲ調節薬は、例えば、ＷＯ２０１７／０５９２２５Ａ１に記載されている。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、ＷＯ２０１７／０５９２２５Ａ１に記載されている、ＣｐＧ−ＡまたはＣｐｇ−Ｂオリゴヌクレオチドである。
【０１７７】
病原体由来ＤＮＡのサイトゾル検出は、ＴＡＮＫ結合キナーゼ１（ＴＢＫ１）およびその下流転写因子ＩＦＮ調節因子３（ＩＲＦ３）を通じたシグナル伝達を必要とする。ＳＴＩＮＧと呼ばれる膜貫通タンパク質（ＩＦＮ遺伝子の刺激因子、ＭＩＴＡ、ＥＲＩＳ、ＭＰＹＳ、およびＴＭＥＭ１７３としても知られる）は、これらの環状プリンジヌクレオチドのシグナル伝達受容体として機能し、ＴＢＫ１−ＩＲＦ３シグナル伝達軸の刺激およびＳＴＩＮＧ依存性Ｉ型インターフェロン反応を引き起こす。したがって、いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、ＳＴＩＮＧ調節薬である。ＳＴＩＮＧは、環状ジグアニル酸一リン酸に調節結合するが、他の非関連ヌクレオチドまたは核酸には結合しない。したがって、いくつかの実施形態では、ＳＴＩＮＧ調節薬は、環状プリンジヌクレオチドである。例示的な環状プリンジヌクレオチドおよびＳＴＩＮＧ調節薬は、例えば、ＵＳ９５４９９４４Ｂ２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１７８】
追加の例示的な免疫抑制剤としては、アバタセプト；アダリムマブ；アデノシン受容体アゴニスト；アナキンラ；アリール炭化水素受容体阻害剤；オートファジー阻害剤、例えば３−メチルアデニン；カルシニューリン阻害剤；カルシニューリン阻害剤、例えばシクロスポリンおよびタクロリムス；カスパーゼ−１阻害剤；セルトリズマブ；ｃＧＡＳ阻害剤；コルチコステロイド；コルチコステロイド、例えばプレドニゾン、ブデソニド、プレドニゾロン；サイトカイン阻害剤；サイトカイン受容体活性化剤；サイトカイン受容体阻害剤；エタネルセプト；グルココルチコイド；ゴリムマブ；Ｇ−タンパク質連結受容体アゴニスト；Ｇ−タンパク質連結受容体アンタゴニスト；ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤；ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、例えばトリコスタチンＡ；ＩＭＤＨ阻害剤、例えばアザチオプリン、レフルノミド、およびミコフェノール酸塩；インフリキシマブ；ミトコンドリア機能の阻害剤、例えばロテノン；イキセキズマブ；キナーゼ阻害剤；メチルプレドニゾロン；モノクローナル抗体、例えばバシリキシマブ、ダクリズマブ、およびムロモナブ；ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシンまたはラパマイシン類似体、シロリムス、およびエベロリムス；ナタリズマブ；ＮＦ−κβ阻害剤、例えば６Ｂｉｏ、デキサメタゾン、ＴＣＰＡ−１、ＩＫＫ  ＶＩＩ；ＯＴＫ３；酸化ＡＴＰ、例えばＰ２Ｘ受容体遮断薬；Ｐ３８阻害剤；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アゴニスト；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アンタゴニスト；ホスファターゼ阻害剤；ホスホジエステラーゼ阻害剤、例えばホスホジエステラーゼ４阻害剤（ＰＤＥ４）、例えばロリプラム；ＰＩ３  ＫＢ阻害剤、例えばＴＧＸ−２２１；プロスタグランジンＥ２アゴニスト（ＰＧＥ２）、例えばミソプロストール；プロテアソーム阻害剤Ｉ（ＰＳＩ）；プロテアソーム阻害剤；レチノイド；リツキシマブ；セクキヌマブ；スタチン；ＴＧＦ−β受容体アゴニスト；ＴＧＦ−βシグナル伝達剤；サイモグロブリン；ＴＬＲ９アンタゴニスト；トシリズマブ；ウステキヌマブ；ならびにベドリズマブが挙げられるが、これらに限定されない。免疫抑制剤としては、ＩＤＯ、ビタミンＤ３、シクロスポリン、例えばシクロスポリンＡ、アリール炭化水素受容体阻害剤、レスベラトロール、アザチオプリン（Ａｚａ）、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、ＦＫ５０６、ｓａｎｇｌｉｆｅｈｒｉｎ  Ａ、サルメテロール、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、アスピリン、および他のＣＯＸ阻害剤、ニフルミン酸、エストリオール、およびトリプトリド、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−１０）、シクロスポリンＡ、ｓｉＲＮＡ標的サイトカインまたはサイトカイン受容体等を挙げることもできる。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、３−メチルアデニン、６−Ｂｉｏ、６−メルカプトプリン（６−ＭＰ、６−チオグアニン（６−ＴＧ）、ＦＫ５０６、ｓａｎｇｌｉｆｅｈｒｉｎ  Ａ、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、アリール炭化水素受容体阻害剤、アスピリン、オートファジー阻害剤、アザチオプリン、バシリキシマブ、ブデソニド、カルシニューリン阻害剤、カスパーゼ−１阻害剤、セルトリズマブ、ｃＧＡＳ阻害剤、ＣＯＸ阻害剤、ニフルミン酸、シクロスポリン、サイトカイン阻害剤、サイトカイン受容体活性化因子、サイトカイン受容体阻害剤、ダクリズマブ、デキサメタゾン、エストリオール、エタネルセプト、エベロリムス、グルココルチコイド、ゴリムマブ、Ｇ−タンパク質連結受容体アゴニスト、Ｇ−タンパク質連結受容体アンタゴニスト、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、ＩＤＯ、ＩＫＫ  ＶＩＩ、インフリキシマブ、インターロイキン−１、インターロイキン−１０、イキセキズマブ、キナーゼ阻害剤、レフルノミド、メチルプレドニゾロン、ミソプロストール、ムロモナブ、ミコフェノール酸塩、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、ナタリズマブ、ＯＴＫ３、酸化ＡＴＰ、Ｐ２Ｘ受容体遮断薬、Ｐ３８阻害剤、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アゴニスト、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アンタゴニスト、ホスファターゼ阻害剤、ＰＩ３  ＫＢ阻害剤、プレドニゾロン、プレドニゾン、プロテアソーム阻害剤Ｉ（ＰＳＩ）、プロテアソーム阻害剤、ラパマイシンおよびラパマイシン類似体、レスベラトロール、レチノイド、リツキシマブ、ロリプラム、ロテノン、サルメテロール、セクキヌマブ、シロリムス、スタチン、タクロリムス、ＴＣＰＡ−１、ＴＧＸ−２２１、サイモグロブリン、ＴＬＲ９アンタゴニスト、トシリズマブ、トリコスタチンＡ、トリプトリド、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、ビタミンＤ３、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０１８０】
本明細書に記載される免疫調節剤のうちのいずれか１つを、脂質ナノ粒子、ｃｅＤＮＡベクター、および／または本明細書に開示される組成物とともに使用することができることに留意されたい。例えば、免疫調節剤は、単独で使用するか、または本明細書に記載される１つ以上の（例えば、１、２、３、４、５、もしくはそれ以上の）他の免疫調節剤と組み合わせることができる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、免疫調節剤は、アリール炭化水素受容体阻害剤；カスパーゼ−１阻害剤；ｃＧＡＳ阻害剤；サイトカイン阻害剤；Ｇ−タンパク質連結受容体アゴニスト；Ｇ−タンパク質連結受容体アンタゴニスト；ミトコンドリア機能の阻害剤；ｍＴＯＲ阻害剤；ＮＦ−κβ阻害剤；ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アゴニスト；ホスファターゼ阻害剤；ホスホジエステラーゼ阻害剤、ＴＧＸ−２２１；プロスタグランジンＥ２アゴニスト（ＰＧＥ２）；ＴＬＲ９アンタゴニスト；プロテアソーム阻害剤；ＴＧＦ−β受容体アゴニスト、およびＴＧＦ−βシグナル伝達剤からなる群から選択される。上記の薬剤のうちのいずれか１つ以上を単独で、またはｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰとの組み合わせで使用することができる。
【０１８２】
本明細書では、脂質ナノ粒子および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物もまた提供される。
【０１８３】
いくつかの態様では、本開示は、１種以上の薬学的賦形剤をさらに含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、および／またはグリシンをさらに含む。
【０１８４】
いくつかの例示的なＬＮＰ特徴
一般に、本発明の脂質ナノ粒子は、意図した治療効果を提供するように選択された平均直径を有する。したがって、いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、約３０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、より典型的には約６０ｎｍ〜約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ〜約１１０ｎｍ、最も典型的には約８５ｎｍ〜約１０５ｎｍ、好ましくは約１００ｎｍの平均直径を有する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０〜２５０ｎｍのサイズである脂質粒子を提供する。脂質ナノ粒子粒径は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）システムを使用して準弾性光散乱によって判定され得る。
【０１８５】
脂質粒子の意図した使用に応じて、構成成分の割合は変化し得、特定の製剤の送達効率は、例えば、エンドソーム放出パラメーター（ＥＲＰ）アッセイを使用して測定され得る。
【０１８６】
ｃｅＤＮＡは、粒子の脂質部分と複合され得るか、または脂質ナノ粒子の脂質位置に封入され得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、脂質ナノ粒子の脂質位置に完全に封入され得、それによって例えば水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、または６０分間のヌクレアーゼへの脂質ナノ粒子の曝露後に実質的に分解されない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、４５、もしくは６０分、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。
【０１８８】
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子製剤は、凍結乾燥粉末である。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、非二層構造、すなわち非ラメラ（すなわち、非二層）形態を有する。無制限に、非二層形態としては、例えば、３次元管、棒、立方対称性等を挙げることができる。脂質粒子の非ラメラ形態（すなわち、非二層構造）は、当業者に既知であり、当業者によって使用される分析技法を使用して判定され得る。そのような技法としては、低温透過型電子顕微鏡（「Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ」）、示差走査熱量計（「ＤＳＣ」）、Ｘ線回折等が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、脂質ナノ粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、容易に評価され、ＵＳ２０１０／０１３０５８８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＣｒｙｏ−ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特性化され得る。
【０１９０】
いくつかのさらなる実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質ナノ粒子は、高電子密度である。
【０１９１】
いくつかの態様では、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかである脂質ナノ粒子を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含む脂質ナノ粒子を提供する。
【０１９２】
脂質構成成分の組成物および濃度を制御することによって、脂質複合体が脂質粒子外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。さらに、例えば、ｐＨ、温度、またはイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を変化および／または制御することができる。脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質複合体の組成物および濃度を制御することによって、脂質粒径を制御できることも明らかとなるであろう。
【０１９３】
製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９−８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，１７２−１７６（２０１０）を参照。それら両方は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。ｐＫａの好ましい範囲は、約５〜約７である。カチオン性脂質のｐＫａは、２−（ｐ−トルイジノ）−６−ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で判定され得る。
【０１９４】
脂質粒子中のｃｅＤＮＡの封入は、核酸と会合したときに蛍光を強化した色素を使用する、膜不透過性蛍光色素排除アッセイ、例えばＯｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイまたはＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）アッセイを実施することによって判定され得る。一般に、封入は、脂質粒子製剤に色素を添加し、得られた蛍光を測定し、それを少量の非イオン性界面活性剤の添加時に観察される蛍光と比較することによって判定される。脂質二層の界面活性剤媒介性崩壊は、封入されたｃｅＤＮＡを放出し、それが膜不透過性色素と相互作用できるようにする。ｃｅＤＮＡの封入は、Ｅ＝（Ｉ０−Ｉ）／Ｉ０として計算することができ、ＩおよびＩ０は、界面活性剤の添加前および添加後の蛍光強度を指す。
【０１９５】
いくつかの態様では、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物（複数可）に対する親水性および疎水性を提供し、かつ／または治療的に有効な投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を有する１つ以上の化合物（いわゆる「ＰＥＧ化化合物」）を含む、リポソーム製剤を提供する。他の態様では、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを追加の構成成分として含み得る。そのような態様では、ＰＥＧまたはＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ〜約５，０００Ｄａであり得る。
【０１９６】
いくつかの態様では、本開示は、延長放出または制御放出プロファイルを有するｃｅＤＮＡを、数時間〜数週間の期間にわたって送達するリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間〜数週間の期間にわたってｃｅＤＮＡを放出する高温で物理的移行を経る追加の構成成分を有するｃｅＤＮＡを封入する。
【０１９７】
いくつかの態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリンおよび本明細書に開示される１つ以上の脂質を含む。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、Ｏｐｔｉｓｏｍｅを含む。
【０１９８】
いくつかの態様では、本開示は、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）複合脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＤＳＰＥ（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）；ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）；ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）；ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）；ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）；ＳＭ（スフィンゴミエリン）；ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）；ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＥ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、硫酸コレステリル（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリン）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。
【０１９９】
いくつかの態様では、本開示は、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、２〜１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、エタノールアミン官能基、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基およびコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである。いくつかの態様では、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質複合体、およびコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
【０２００】
いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１つ以上の脂質、およびエタノールアミン官能基を含有する１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、および／またはステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ、およびＤＯＰＥを含む。
【０２０１】
いくつかの態様では、本開示は、１種以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロースおよび／またはグリシンをさらに含むリポソーム製剤を提供する。
【０２０２】
いくつかの態様では、本開示は、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０〜２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。
【０２０３】
いくつかの態様では、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱塩基を付加することにより、実施例１のプロセスまたは本明細書に開示される他の方法で得られたｃｅＤＮＡベクターで作製され、負荷されたリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３に増加させ、ｃｅＤＮＡをリポソーム中に駆動する。いくつかの態様では、本開示は、リポソームの内側で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、ｐＨ４〜６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマーまたは非ポリマー高電荷アニオンおよびリポソーム内捕捉剤、例えばポリリン酸塩またはオクタ硫酸スクロースが利用される。
【０２０４】
他の態様では、本開示は、リン脂質、レシチン、ホスファチジルコリン、およびホスファチジルエタノールアミンを含むリポソーム製剤を提供する。
【０２０５】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡは、対象の細胞、組織、または器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。典型的に、薬学的組成物は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡおよび薬学的に許容される担体を含む。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターは、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。治療目的のための薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせに組み込み、濾過滅菌することによって調製され得る。
【０２０６】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、局所、全身、羊水内、髄腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管支、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝臓内、腎臓内、脳内）、髄腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、後眼窩、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、基質内、前房内、および硝子体内）、蝸牛内、および粘膜（例えば、経口、直腸、鼻腔）投与に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。
【０２０７】
ｃｅＤＮＡベクターを含む薬学的に活性な組成物は、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達し、その中で導入遺伝子の治療的発現をもたらすために製剤化することができる。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
【０２０８】
本明細書に提供される組成物およびベクターを使用して、様々な目的のために導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産生物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳類対象における疾患状態の治療、改善、予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。導入遺伝子は、臨床状況において、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象に移され得る（例えば、発現され得る）。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、発現の増加、遺伝子産物の活性、または遺伝子の不適切な上方調節（導入遺伝子がその発現を抑制する、または他の方法でその発現を低減させる）に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象に移され得る（例えば、発現され得る）。
【０２０９】
治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高ｃｅＤＮＡベクター濃度に好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量のｃｅＤＮＡベクター化合物を、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせに組み込み、濾過滅菌することによって調製され得る。
【０２１０】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、インビボでの細胞の形質導入のために生物に投与され得る。
【０２１１】
一般に、投与は、分子を導入して最終的に血液または組織細胞と接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによる。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって使用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時であり、効果的な反応をもたらし得る。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格、横隔膜、および／または心筋への投与を含む］、胸膜内、脳内、および動脈内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚および粘膜表面への、ならびに経皮投与）、リンパ内等、ならびに直接組織または器官注入（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜、筋肉、もしくは脳への）が挙げられる。
【０２１２】
ｃｅＤＮＡベクターの投与は、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、および眼からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。ｃｅＤＮＡベクターの投与はまた、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節内またはその付近）に対するものであり得る。任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療、改善、および／または予防される病態の性質および重症度、ならびに使用されている特定のｃｅＤＮＡベクターの性質に依存する。追加として、ｃｅＤＮＡは、単一のベクターまたは複数のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡカクテル）中に複数の導入遺伝子を投与できるようにする。
【０２１３】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの、骨格筋への投与としては、肢（例えば、上腕、下腕、上肢、および／または下肢）、腰、首、頭（例えば、舌）、咽頭、腹部、骨盤／会陰、および／または指の骨格筋への投与が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内、四肢灌流（任意に、脚および／もしくは腕の単離された四肢灌流、例えば、Ａｒｒｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０５：３４５８−３４６４を参照）ならびに／または直接筋肉内注入によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）に、四肢灌流、任意に単離された四肢灌流（例えば、静脈内または動脈内投与による）によって投与される。実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、「流体力学的技法」を用いることなく投与され得る。
【０２１４】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの、心筋への投与としては、左心房、右心房、左心室、右心室、および／または中隔への投与が挙げられる。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、大動脈内投与などの動脈内投与、直接心臓注入（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）、および／または冠動脈灌流によって心筋に送達され得る。横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。一実施形態では、投与は、平滑筋内、その付近、および／またはその上に存在する内皮細胞に対して行われ得る。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、本発明によるｃｅＤＮＡベクターは、骨格筋、横隔膜筋、および／または心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィーまたは心疾患（例えば、ＰＡＤもしくはうっ血性心不全）を治療、改善、および／または予防するため）。
【０２１６】
本発明によるｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ（例えば、脳または眼）に投与され得る。ｃｅＤＮＡベクターは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、および前頭葉、皮質、基底核、海馬、および偏桃体を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、ならびに下丘中に導入されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターはまた、網膜、角膜、および／または視神経などの眼の異なる領域に投与されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターは、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターは、さらに、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与されてもよい。
【０２１７】
ｃｅＤＮＡベクターは、当該技術分野において既知の任意の経路によってＣＮＳの所望の領域（複数可）に投与され得、髄腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、および眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋肉内送達を含むが、これらに限定されない。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ中の所望の領域または区画への直接注入（例えば、定位的注入）によって、液体製剤中で投与される。他の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、所望の領域への局所適用によって、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によって行われてもよい。さらなる代替例として、ｃｅＤＮＡベクターは、固体の徐放性製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照）。さらに追加の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを、逆行性輸送に使用して、運動ニューロンが関与する疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）等）を治療、改善、および／または予防することができる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、筋組織に送達され、そこからニューロン中に移動し得る。
【０２１９】
エクスビボ治療
いくつかの実施形態では、細胞を対象から除去し、ｃｅＤＮＡベクターをその中に導入した後、細胞を対象に戻す。エクスビボでの治療のために対象から細胞を除去し、続いて対象に戻す方法は、当該技術分野において既知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。代替として、ｃｅＤＮＡベクターは、別の対象からの細胞中に、培養細胞中に、または任意の他の好適な源からの細胞中に導入され、これらの細胞は、それを必要とする対象に投与される。
【０２２０】
ｃｅＤＮＡベクターで形質導入された細胞は、好ましくは薬学的担体と組み合わせて、「治療有効量」で対象に投与される。当業者であれば、いくらかの利益が対象にもたらされる限り、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。
【０２２１】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、望ましくはインビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞中で産生される任意のポリペプチドである、導入遺伝子（時には異種ヌクレオチド配列と呼ばれる）をコードすることができる。例えば、治療方法におけるｃｅＤＮＡベクターの使用とは対照的に、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、例えば、抗原またはワクチンの産生のために、培養した細胞、およびそれから単離された発現遺伝子産物中に導入されてもよい。
【０２２２】
ｃｅＤＮＡベクターは、獣医用途および医療用途の両方に使用することができる。上記のエクスビボ遺伝子送達方法に好適な対象としては、鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、七面鳥、およびキジ）および哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、およびウサギ類）が挙げられ、哺乳動物が好ましい。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は、新生児、幼児、少年、および成人を含む。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセット、発現構築物、またはｃｅＤＮＡベクター中に存在する導入遺伝子は、宿主細胞に対して最適化されたコドンであり得る。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」または「コドン最適化」という用語は、関心対象の脊椎動物、例えばマウスまたはヒト（例えば、ヒト化）の細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、または相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的には、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化およびカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）または別の公的に入手可能なデータベースを使用して判定され得る。
【０２２４】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、対象の宿主細胞中で導入遺伝子を発現する。いくつかの実施形態では、対象の宿主細胞は、ヒト宿主細胞であり、例えば、血液細胞、幹細胞、造血細胞、ＣＤ３４＋細胞、肝細胞、癌細胞、血管細胞、筋細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼もしくは網膜細胞、上皮もしくは内皮細胞、樹状細胞、線維芽細胞、または哺乳類起源の任意の他の細胞（無制限に、肝（すなわち、肝臓）細胞、肺細胞、心臓細胞、膵臓細胞、腸細胞、横隔膜細胞、腎（すなわち、腎臓）細胞、ニューロン細胞、血液細胞、骨髄細胞、もしくは遺伝子療法が企図される対象の任意の１つ以上の選択された組織を含む）が挙げられる。一態様では、対象宿主細胞は、ヒト宿主細胞である。
【０２２５】
本明細書に記載される技術の一態様は、導入遺伝子を細胞に送達する方法に関する。典型的には、インビトロ方法の場合、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される方法ならびに当該技術分野において既知の他の方法を使用して導入され得る。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは生物学的有効量で細胞に投与される。ｃｅＤＮＡベクターがインビボで細胞に（例えば、対象に）投与される場合、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的有効量は、標的細胞における導入遺伝子の形質導入および発現をもたらすのに十分な量である。
【０２２６】
用量範囲
インビボおよび／またはインビトロアッセイを任意に用いて、使用のための最適投与量範囲を特定するのを助けることができる。製剤に用いられる正確な用量はまた、投与経路および病態の重症度に依存し、当業者の判断および各対象の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から推定され得る。
【０２２７】
ｃｅＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の副作用なしに十分なレベルの遺伝子移入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、「投与」セクションで上述されるもの、例えば選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻腔内および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与経路は、所望の場合、組み合わせることができる。
【０２２８】
特定の「治療効果」を達成するために必要なｃｅＤＮＡベクターの量の用量は、核酸投与の経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子またはＲＮＡ発現のレベル、治療される特定の疾患または障害、および遺伝子（複数可）、ＲＮＡ産物（複数可）、または得られる発現タンパク質（複数可）の安定性を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に基づいて変化する。当業者は、前述の因子ならびに当該技術分野において周知の他の因子に基づいて、特定疾患または障害を有する対象を治療するためのｃｅＤＮＡベクター用量範囲を容易に判定することができる。
【０２２９】
最適な治療反応を提供するように、投与量レジームを調整することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、繰り返し投与することができ、例えば、いくつかの用量が毎日投与され得るか、または治療状況の急迫によって示されるように、用量を比例的に低減することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドが細胞に投与されるか、または対象に投与されるかにかかわらず、対象オリゴヌクレオチドの投与の適切な用量およびスケジュールを容易に判定することができる。
【０２３０】
「治療有効量」は、臨床治験を通じて判定され得る比較的広い範囲内に含まれ、特定の用途に依存する（神経細胞は、極少量を必要とするが、全身注入は、多量を必要とする）。例えば、ヒト対象の骨格筋または心筋への直接インビボ注入の場合、治療有効量は、およそ約１μｇ〜１００ｇのｃｅＤＮＡベクターとなる。ｃｅＤＮＡベクターを送達するためにエキソソームまたは微粒子が使用される場合、治療有効量は、経験的に判定され得るが、１μｇ〜約１００ｇのベクターを送達することが予想される。
【０２３１】
薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の配合は、様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するための好適な投与および治療レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。
【０２３２】
インビトロトランスフェクションの場合、細胞（１×１０６細胞）に送達されるｃｅＤＮＡベクターの有効量は、およそ０．１〜１００μｇのｃｅＤＮＡベクター、好ましくは１〜２０μｇ、より好ましくは１〜１５μｇまたは８〜１０μｇとなる。より大きなｃｅＤＮＡベクターは、より多い用量を必要とする。エキソソームまたは微粒子が使用される場合、有効なインビトロ用量は、経験的に判定されるが、一般に同量のｃｅＤＮＡベクターを送達することが意図される。
【０２３３】
治療は、単一用量または複数用量の投与を必要とし得る。特定の実施形態では、２つ以上の投与（例えば、２、３、４、またはそれ以上の投与）を用いて、様々な間隔の期間、例えば、毎日、毎週、毎月、毎年等にわたって、所望の遺伝子発現レベルを達成することができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の用量を対象に投与することができ、実際、ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシドの非存在に起因して抗カプシド宿主免疫反応を誘起しないため、必要に応じて複数の用量を投与することができる。そのようなものとして、当業者は、適切な用量数を判定することができる。投与される用量数は、例えば、およそ１〜１００、好ましくは２〜２０用量であり得る。
【０２３４】
任意の特定の理論に束縛されるものではないが、本開示によって記載されるｃｅＤＮＡベクターの投与によって誘起される典型的な抗ウイルス免疫反応の欠失（すなわち、カプシド構成成分の非存在）は、複数の場合にｃｅＤＮＡベクターを宿主に投与できるようになる。いくつかの実施形態では、異種核酸が対象に送達される場合の数は、２〜１０回の範囲内（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回）である。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１０回より多く対象に送達される。
【０２３５】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦日（例えば、２４時間）あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２、３、４、５、６、または７暦日あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴週（例えば、７歴日）あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、２週間に１回（例えば、２暦週期間に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦月あたり１回（例えば、３０歴日に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、６暦月あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴年（例えば、３６５日または閏年では３６６日）あたり１回だけ対象に投与される。
【０２３６】
単位剤形
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単位剤形で便宜的に提示され得る。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の１つ以上の投与経路に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、蒸発器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、または舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内または脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と複合され得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となる。
【０２３７】
脂質ナノ粒子の調製
脂質ナノ粒子は、ｃｅＤＮＡベクターおよび脂質（複数可）の混合と同時に形成し得る。所望の粒径分布に応じて、得られるナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐｅｘ  Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレル押出機を使用し、膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出され得る。場合によっては、押出ステップが省略され得る。エタノール除去および同時緩衝液交換は、例えば、透析またはタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションによって達成され得る。
【０２３８】
一般に、脂質ナノ粒子は、以下を含む当該技術分野において既知の任意の方法によって形成され得る。例えば、脂質ナノ粒子は、例えば、ＵＳ２０１３／００３７９７７、ＵＳ２０１０／００１５２１８、ＵＳ２０１３／０１５６８４５、ＵＳ２０１３／０１６４４００、ＵＳ２０１２／０２２５１２９、およびＵＳ２０１０／０１３０５８８（各々の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される方法によって調製され得る。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、連続混合方法、直接希釈プロセス、またはインライン希釈プロセスを使用して調製され得る。直接希釈およびインライン希釈プロセスを使用して脂質ナノ粒子を調製するための装置のためのプロセスおよび装置は、ＵＳ２００７／００４２０３１（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。段階希釈プロセスを使用して脂質ナノ粒子を調製するためのプロセスおよび装置は、ＵＳ２００４／０１４２０２５（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０２３９】
１つの非限定例では、脂質ナノ粒子は、衝突噴流プロセスによって調製され得る。一般に、粒子は、アルコール（例えば、エタノール）に溶解した脂質を、緩衝液、例えば、クエン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、酢酸ナトリウムおよび塩化マグネシウム緩衝液、リンゴ酸緩衝液、リンゴ酸および塩化ナトリウム緩衝液、またはクエン酸ナトリウムおよび塩化ナトリウム緩衝液中に溶解したｃｅＤＮＡと混合することによって形成される。脂質とｃｅＤＮＡとの混合比は、約４５〜５５％の脂質および約６５〜４５％のｃｅＤＮＡであり得る。
【０２４０】
脂質溶液は、イオン化脂質、非カチオン性脂質（例えば、ＤＰＳＣなどのリン脂質）、ＰＥＧまたはＰＥＧ複合分子（例えば、ＰＥＧ−脂質）、およびステロール（例えば、コレステロール）を、アルコール中、例えばエタノール中５〜３０ｍｇ／ｍＬ、より好ましくは５〜１５ｍｇ／ｍＬ、最も好ましくは９〜１２ｍｇ／ｍＬの全脂質濃度で含有し得る。
【０２４１】
脂質溶液中の脂質のモル比は、カチオン性脂質の場合は約２５〜９８％、好ましくは約３５〜６５％；非イオン性脂質の場合は約０〜１５％、好ましくは約０〜１２％；ＰＥＧまたはＰＥＧ複合分子の場合は約０〜１５％、好ましくは約１〜６％；およびステロールの場合は約０〜７５％、好ましくは約３０〜５０％の範囲であり得る。
【０２４２】
ｃｅＤＮＡ溶液は、３．５〜５の範囲のｐＨを有する緩衝溶液中０．３〜１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは０．３〜０．９ｍｇ／ｍＬの濃度範囲でｃｅＤＮＥを含み得る。
【０２４３】
ＬＮＰを形成するために、１つの例示的であるが非限定的な実施形態では、２つの液体を約１５〜４０℃、好ましくは約３０〜４０℃の範囲の温度に加熱し、次いで例えば、衝突噴流混合器中で混合され、即時にＬＮＰを形成する。混合流量は、１０〜６００ｍＬ／分の範囲であり得る。チューブＩＤは、０．２５〜１．０ｍｍの範囲および１０〜６００ｍＬ／分の全流量を有し得る。流量とチュービングＩＤとの組み合わせは、３０〜２００ｎｍの間のＬＮＰの粒径を制御する作用を有し得る。次いで、溶液を、より高いｐＨで、１：１〜１：３ｖｏｌ：ｖｏｌ、好ましくは約１：２ｖｏｌ：ｖｏｌの範囲の混合比で緩衝液と混合することができる。必要な場合、この緩衝液は、１５〜４０℃または３０〜４０℃の範囲の温度であり得る。次いで混合したＬＮＰは、アニオン交換濾過ステップを受け得る。アニオン効果の前に、混合したＬＮＰは、例えば３０分〜２時間の期間にわたってインキュベートすることができる。インキュベート中の温度は、１５〜４０℃または３０〜４０℃の範囲であり得る。インキュベート後、溶液を０．８μｍフィルターなどのフィルターで濾過し、アニオン交換分離ステップを含む。このプロセスは、１ｍｍ  ＩＤ〜５ｍｍ  ＩＤの範囲のチュービングＩＤおよび１０〜２０００ｍＬ／分の流量を使用することができる。
【０２４４】
形成後、ＬＮＰは、超濾過プロセスを介して濃縮およびダイアフィルターされ得、ここでアルコールが除去され、緩衝液が最終緩衝液、例えば約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換される。
【０２４５】
超濾過プロセスは、３０〜５００ＫＤの膜公称分子量カットオフ範囲を使用する、タンジェンシャル・フロー・フィルトレーション・フォーマット（ＴＦＦ）を使用することができる。膜フォーマットは、中空繊維またはフラットシートカセットである。適正分子量カットオフを用いるＴＦＦプロセスは、ＬＮＰを残余分中に保持することができ、濾過液または透過液は、アルコール、クエン酸緩衝液、および最終液緩衝液廃棄物を含有する。ＴＦＦプロセスは、多段階プロセスであり、１〜３ｍｇ／ｍＬのｃｅＤＮＡ濃度に対する初期濃度を有する。濃縮に続いて、ＬＮＰ溶液を、１０〜２０体積の最終緩衝液に対してダイアフィルターして、アルコールを除去し、緩衝液交換を実施する。次いで、材料をさらに１〜３倍濃縮することができる。濃縮したＬＮＰ溶液を、無菌濾過することができる。
【０２４６】
ｃｅＤＮＡ
様々な実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有する相補的ＤＮＡの連続鎖（直鎖状で連続的な非カプシド化構造）およびから形成されたカプシド不含の直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子であり、互いに関して異なるか、または非対称である５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および３’ＩＴＲ配列を含む。ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能的末端分解部位および複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）（時として複製的タンパク質結合部位と称される）、例えば、Ｒｅｐ結合部位を含む。一般に、ｃｅＤＮＡベクターは、少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）、すなわち、他のＩＴＲおよび発現可能な導入遺伝子に関して欠失、挿入、および／または置換を含む。
【０２４７】
一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、ＡＡＶ  ＩＴＲ、例えば、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲである。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、他のＩＴＲに対する修飾型ＩＴＲであり、すなわち、ｃｅＤＮＡは、互いに対して非対称であるＩＴＲを含む。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、非機能的ＩＴＲである。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、（１）シス調節エレメント、プロモーター、および少なくとも１つの導入遺伝子を含む発現カセット、または（２）少なくとも１つの導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、および（３）２つの自己相補的配列、例えば、前述の発現カセットに隣接するＩＴＲを含み、ｃｅＤＮＡベクターは、カプシドタンパク質と関連していない。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶゲノム中で見出される２つの自己相補的配列を含み、少なくとも１つは、操作的Ｒｅｐ結合エレメント（ＲＢＥ）およびＡＡＶの末端分解部位（ｔｒｓ）またはＲＢＥの機能的変異形、および１つ以上の導入遺伝子に操作可能に連結されたシス調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、導入遺伝子の発現を制御および調節するための調節スイッチを含み、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、２つの自己相補的配列は、任意の既知のパルボウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ１２）などのディペンドウイルスからのＩＴＲ配列であり得る。ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）などのＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を保持する修飾型ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列を含むが、これらに限定されない任意のＡＡＶ血清型を使用することができる。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、合成であり得る。一実施形態では、合成ＩＴＲは、２つ以上のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列に基づいている。別の実施形態では、合成ＩＴＲは、ＡＡＶ系配列を含まない。さらに別の実施形態では、合成ＩＴＲは、上記のＩＴＲ構造を保存するが、わずかなＡＡＶ源配列を有するか、または全く有しない。いくつかの態様では、合成ＩＴＲは、野生型Ｒｅｐまたは特定血清型のＲｅｐと選好的に相互作用し得るか、または場合によっては、野生型Ｒｅｐによって認識されず、突然変異型Ｒｅｐによってのみ認識される。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号５３１）などの機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ＴＲＳ）を保持する合成ＩＴＲ配列である。いくつかの実施例では、修飾型ＩＴＲ配列は、ＲＢＳ、ｔｒｓの配列、ならびに野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲの対応する配列からのＩＴＲヘアピン二次構造の１つの末端ループ部分を形成するＲｅｐ結合エレメントの構造および位置を保持する。ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための例示的なＩＴＲ配列は、表２〜９、１０Ａおよび１０Ｂに開示され、配列番号２、５２、１０１〜４４９、および５４５〜５４７、ならびに部分ＩＴＲ配列は、２０１８年９月７日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の図２６Ａ〜２６Ｂに示されている。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、２０１８年９月７日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表２、３、４、５、６、７、８、９、１０Ａ、および１０Ｂのうちのいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列またはＩＴＲ部分配列の修飾のうちのいずれかに対応するＩＴＲの修飾を有するＩＴＲを含み得る。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、閉端ＤＮＡベクターは、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを含み、ｃｅＤＮＡは、カプシドタンパク質を欠いており、（ａ）そのヘアピン二次構成（好ましくは、これらの参照配列と比較して、この構成での任意のＡＡＡまたはＴＴＴ末端ループの欠失を除外する）において配列番号２と同数の分子内的に二重化した塩基対を有する突然変異型右側ＡＡＶ２  ＩＴＲまたは配列番号５１と同数の分子内的に二重化した塩基対を有する突然変異型左側ＡＡＶ２  ＩＴＲをコードするｃｅＤＮＡ−プラスミドから産生され、（ｂ）実施例１における未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるｃｅＤＮＡの特定のためのアッセイを使用して、ｃｅＤＮＡとして特定される。
【０２５１】
ｃｅＤＮＡベクターは、本開示を読むことにより、熟練者に既知のいくつかの手段によって取得可能である。例えば、カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターは、第１の５’逆位末端反復（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）、発現カセット、および３’ＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）をこの順に含むポリヌクレオチド発現構築物テンプレートを含むプラスミド（本明細書では「ｃｅＤＮＡ−プラスミド」と称される）から取得することができ、５’および３’ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、修飾型ＩＴＲであるか、または５’および３’ＩＴＲの両方が修飾されているとき、それらは互いに異なる修飾を有し、同じ配列ではない。無制限に、ｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド発現構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスであり得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡ−プラスミドは、ＩＴＲの間に操作可能に位置付けられた制限クローニング部位（例えば、配列番号７）を含み、例えば、導入遺伝子、例えばレポーター遺伝子および／または治療的遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを含む発現カセットを挿入することができる。
【０２５２】
例えば、非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターは、２つの異なる逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた異種遺伝子を含有する発現構築物（例えば、プラスミド、バキュロウイルス、または統合型細胞株）からの許容宿主細胞中で産生され得る。ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）と比較した欠失、挿入、および／または置換によって修飾され、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能的末端分解部位（ｔｒｓ）およびＲｅｐ結合部位を含む。ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセットなどの分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である。例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、１時間以上３７℃でエキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩまたはエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。
【０２５３】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、５’〜３’方向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ  ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、互いに関して非対称であり、すなわち、それらは互いに異なる。例示的な実施形態では、第１のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、突然変異型または修飾型ＩＴＲであり得る。いくつかの実施形態では、第１のＩＴＲは、突然変異型または修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲである。別の実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、両方とも修飾されているが、異なる配列であるか、または異なる修飾を有するか、または同一の修飾型ＩＴＲではない。言い換えれば、ＩＴＲは、１つのＩＴＲの任意の変化が他のＩＴＲに反映されていない非対称であるか、あるいはＩＴＲは、互いに関して異なる。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、発現カセットは、２つのＩＴＲ間に位置し、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター、転写後調節エレメント、ならびにポリアデニル化および終結シグナルのうちの１つ以上をこの順に含む。一実施形態では、プロモーターは、調節可能−誘導可能または抑制可能である。プロモーターは、導入遺伝子の転写を促進する任意の配列であり得る。一実施形態では、プロモーターは、ＣＡＧプロモーター（例えば、配列番号０３）またはその変形である。転写後調節エレメントは、導入遺伝子の発現を調節する配列、非限定例として、導入遺伝子の発現を強化する三次構造を作成する任意の配列である。
【０２５５】
一般に、ｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシド内の限定空間によって課されるパッケージング制約を有しない。封入されたＡＡＶゲノムとは対照的なｃｅＤＮＡベクターは、封入されたＡＡＶゲノムとは対照的な原核細胞的に産生されたプラスミドＤＮＡベクターに対する可変の真核細胞的に産生された代替物を表す。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子等の挿入を許可する。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、第１のＩＴＲは、突然変異型または修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲである。別の実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、両方とも修飾されているが、異なる配列であるか、または異なる修飾を有するか、または同一の修飾型ＩＴＲではない。言い換えれば、ＩＴＲは、１つのＩＴＲの任意の変化が他のＩＴＲに反映されていない非対称であるか、あるいはＩＴＲは、互いに関して異なる。ｃｅＤＮＡベクター中の、ｃｅＤＮＡ−プラスミドを生成するために使用するための例示的なＩＴＲは、２０１８年９月７日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号に開示されている。
【０２５７】
ＩＴＲは、明細書において例証されており、本明細書における例は、ＡＡＶ２  ＩＴＲであるが、当業者であれば、上述のように、任意の既知のパルボウイルス、例えば、ディペンドウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ、およびＡＡＶ−ＤＪ８ゲノムからのＩＴＲを使用できることを認識する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７；ＮＣ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ００６２６０；ＮＣ００６２６１）、キメラＩＴＲ、または任意の合成ＡＡＶからのＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、温血動物、例えば、鳥類（ＡＡＡＶ）、ウシ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、およびヒツジアデノ関連ウイルスに感染し得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、Ｂ１９パルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ０００８８３）、マウスからの微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）、ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１７０１）、ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）に由来する。
【０２５８】
パルボウイルスおよびパルボウイルス科ファミリーの他のメンバーは、一般に、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，″Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，″Ｃｈａｐｔｅｒ  ６９  ｉｎ  ＦＩＥＬＤＳ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ（３ｄ  Ｅｄ．１９９６）に記載されている。
【０２５９】
熟練者であれば、ＩＴＲ配列は、二本鎖ホリデージャンクションの一般構造を有し、典型的には、Ｔ形またはＹ形ヘアピン構造であり（例えば、図２Ａおよび３Ａ）、各ＩＴＲは、より大きなパリンドロームアーム（Ａ−Ａ’）に埋め込まれた２つのパリンドロームアームまたはループ（Ｂ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’）、ならびに一本鎖Ｄ配列によって形成され（これらのパリンドローム配列の順序は、ＩＴＲのフリップまたはフロップ配向を定義する）、本明細書に提供される例示的なＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に基づいて、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡ−プラスミドにおける使用のための、任意のＡＡＶ血清型からの対応する修飾型ＩＴＲ配列を容易に判定することができる。例えば、異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜ＡＡＶ６）からのＩＴＲの構造分析および配列比較を参照されたい。Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６−４３９、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５；３６４−３７９、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９；２６１；８−１４に記載されている。ＩＴＲにおける例示的な特定の変更および突然変異は、２０１８年９月７日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号に詳述されている。明確にするために、ＩＴＲの文脈において、「変更型」または「突然変異型」は、ヌクレオチドが、野生型配列、参照配列、または元のＩＴＲ配列に対して挿入、欠失、および／または置換されており、２つの隣接するＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクター中の他の隣接するＩＴＲに対して変更され得ることを示す。変更型または突然変異型ＩＴＲは、操作されたＩＴＲであり得る。本明細書で使用される場合、「操作された」とは、人の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの少なくとも１つの態様、例えば、その配列が、人の手によって操作され、それが天然に存在するときの態様とは異なるとき、「操作された」とみなされる。
【０２６０】
任意のパルボウイルスＩＴＲを、ＩＴＲとして、または塩基ＩＴＲとして修飾に使用することができる。好ましくは、パルボウイルスは、ディペンドウイルスである。より好ましくは、ＡＡＶである。選択される血清型は、その血清型の組織向性に基づき得る。ＡＡＶ２は、広い組織向性を有し、ＡＡＶ１は、ニューロンおよび骨格筋を選好的に標的し、ＡＡＶ５は、ニューロン、網膜色素上皮、および光受容体を標的とする。ＡＡＶ６は、骨格筋および肺を選好的に標的とする。ＡＡＶ８は、肝臓、骨格筋、心臓、および膵臓組織を選好的に標的とする。ＡＡＶ９は、肝臓、骨格、および肺組織を選好的に標的とする。一実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲに基づいている。例えば、それは、配列番号２および配列番号５２からなる群から選択される。これらの態様の各々の一実施形態では、ベクターポリヌクレオチドは、配列番号１および配列番号５２、ならびに配列番号２および配列番号５１からなる群から選択されるＩＴＲの対を含む。これらの態様の各々の一実施形態では、ベクターポリヌクレオチドまたは共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクターは、配列番号１０１および配列番号１０２、配列番号１０３および配列番号１０４、配列番号１０５および配列番号１０６、配列番号１０７および配列番号１０８、配列番号１０９および配列番号１１０、配列番号１１１および配列番号１１２、配列番号１１３および配列番号１１４、ならびに配列番号１１５および配列番号１１６からなる群から選択される異なるＩＴＲの対を含む。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、配列番号２、５２、６３、６４、１０１〜４９９のうちのいずれかから選択され、２０１８年９月７日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号に開示されている。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に提供される、配列番号５００〜５２９からなる、または本質的になる任意の配列から選択される修飾型ＩＴＲを有しない。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５００〜５２９から選択される任意の配列から選択されるＩＴＲを有しない。
【０２６１】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、分子内二重鎖二次構造を形成し得る。第１のＩＴＲおよび非対称の第２のＩＴＲの二次構造は、野生型ＩＴＲ（例えば、図２Ａ、３Ａ、および３Ｃを参照）ならびに修飾型ＩＴＲ構造（例えば、図２Ｂ、３Ｂ、および３Ｄを参照）の文脈において例証されている。二次構造は、ｃｅＤＮＡベクターを産生するために使用されるプラスミドのＩＴＲ配列に基づいて推定または予測される。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの左ＩＴＲは、野生型（ｗｔ）ＡＡＶ  ＩＴＲ構造に関して修飾または突然変異され、右ＩＴＲは、野生型ＩＴＲである。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターの右ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ構造に関して修飾され、左ＩＴＲは、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲである。そのような実施形態では、ＩＴＲ（左または右ＩＴＲ）の修飾は、ＡＡＶゲノムに由来する野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換によって生成され得る。
【０２６３】
本明細書で使用されるＩＴＲは、分解可能および非分解可能であり得、ｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために選択され、好ましくはＡＡＶ配列であり、血清型１、２、３、４、５、６、７、８、および９が好ましい。分解可能なＡＡＶ  ＩＴＲは、末端反復が所望の機能、例えば、複製、ウイルスパッケージング、統合、および／またはプロウイルスレスキュー等を媒介する限り、野生型ＩＴＲ配列を必要としない（例えば、内在性または野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ配列は、挿入、欠失、切断、および／またはミスセンス突然変異によって変更され得る）。典型的には、必須ではないが、ＴＲは、同じＡＡＶ血清型からのものであり、例えば、ｃｅＤＮＡベクターの両方のＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２からのものである。ＩＴＲは、ＡＡＶ逆位末端反復として機能する合成配列であってもよい。必須ではないが、ＩＴＲは、同じパルボウイルスからのものであり得、例えば、両方のＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２からのものである。
【０２６４】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、Ｒｅｐ結合および／またはＲｅｐニッキングに関して欠陥のあるＩＴＲである。一実施形態では、欠陥は、野生型還元ＩＴＲに対して少なくとも３０％であり、他の実施形態では、少なくとも３５％…、５０％…、６５％…、７５％…、８５％…、９０％…、９５％…、９８％…であるか、またはその間の関数または任意の点を完全に欠いている。宿主細胞は、ウイルスカプシドタンパク質を発現せず、ポリヌクレオチドベクターテンプレートは、任意のウイルスカプシドコード配列を欠いている。一実施形態では、ＡＡＶカプシド遺伝子を欠いたポリヌクレオチドベクターテンプレートおよび宿主細胞、ならびに得られるタンパク質もまた、他のウイルスのカプシド遺伝子をコードまたは発現しない。追加として、特定の実施形態では、核酸分子はまた、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。
【０２６５】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲの構造エレメントは、ＩＴＲとＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ  ７８またはＲｅｐ  ６８）との機能的相互作用に関与する任意の構造エレメントであり得る。ある特定の実施形態では、構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質との相互作用に対する選択性を提供する。すなわち、少なくとも部分的に、どのＲｅｐタンパク質がＩＴＲと機能的に相互作用するかを判定する。他の実施形態では、構造エレメントは、Ｒｅｐタンパク質がＩＴＲに結合されたとき、大きなＲｅｐタンパク質と物理的に相互作用する。各構造エレメントは、例えば、ＩＴＲの二次構造、ＩＴＲのヌクレオチド配列、２つ以上のエレメント間の空間、または上記のうちのいずれかの組み合わせであり得る。一実施形態では、構造エレメントは、ＡおよびＡ’アーム、ＢおよびＢ’アーム、ＣおよびＣ’アーム、Ｄアーム、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＥ）およびＲＢＥ’、ならびに末端分解部位（ｔｒｓ）からなる群から選択される。
【０２６６】
より具体的には、構造エレメントが特定の大きなＲｅｐタンパク質と機能的に相互作用する能力は、構造エレメントを修飾することによって変更され得る。例えば、構造エレメントのヌクレオチド配列は、ＩＴＲの野生型配列と比較して修飾され得る。一実施形態では、ＩＴＲの構造エレメント（例えば、Ａアーム、Ａ’アーム、Ｂアーム、Ｂ’アーム、Ｃアーム、Ｃ’アーム、Ｄアーム、ＲＢＥ、ＲＢＥ’、およびｔｒｓ）を除去し、異なるパルボウイルスからの野生型構造エレメントと置き換えることができる。例えば、置換構造は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、または昆虫ＡＡＶからのものであり得る。例えば、ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲであり得、ＡもしくはＡ’アームまたはＲＢＥは、ＡＡＶ５からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＩＴＲは、ＡＡＶ５  ＩＴＲであり得、ＣまたはＣ’アーム、ＲＢＥ、およびｔｒｓは、ＡＡＶ２からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ５  ＩＴＲであり得、ＢおよびＢ’アームは、ＡＡＶ２  ＩＴＲ  ＢおよびＢ’アームで置き換えられる。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、構造エレメントのヌクレオチド配列を修飾して（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０以上のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲）、修飾型構造エレメントを産生することができる。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、構造エレメントの構造は、修飾され得る。例えば、構造エレメントは、ステムの高さおよび／またはループ内のヌクレオチドの数の変化。例えば、ステムの高さは、約２、３、４、５、６、７、８、もしくは９ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ステム高さは、約５ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用する。別の実施形態では、ステム高さは、約７ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用する。別の実施例では、ループは、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、ＲＢＥまたは伸長ＲＢＥ内のＧＡＧＹ結合部位またはＧＡＧＹ関連結合部位の数は、増加または減少され得る。一実施例では、ＲＢＥまたは伸長ＲＢＥは、１、２、３、４、５、もしくは６以上のＧＡＧＹ結合部位、またはその中の任意の範囲を含み得る。各ＧＡＧＹ結合部位は、独立して、配列がＲｅｐタンパク質に結合するのに十分である限り、正確なＧＡＧＹ配列またはＧＡＧＹと同様の配列であり得る。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、２つのエレメント（限定されないが、ＲＢＥおよびヘアピンなど）の間の空間を変更して（例えば、増加または減少）、大きなＲｅｐタンパク質との機能的相互作用を変更することができる。例えば、空間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。
【０２７１】
図２Ａおよび２Ｂは、ｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造部分内のｔｒｓ部位の操作のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ−結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’、配列番号５３１）および末端分解部位（ＴＲＳ、５’−ＡＧＴＴ、配列番号４６）を含む１つ以上の機能的ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲ（野生型または修飾型ＩＴＲ）は、機能的である。ｃｅＤＮＡベクターが、互いに異なるか、または非対称である２つの修飾型ＩＴＲを含む代替実施形態では、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、機能的であり、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、非機能的である。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、ループアーム、切断アーム、またはスペーサー内の修飾を有する。ループアーム、切断アーム、またはスペーサー内の修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、２０１８年９月７日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表２〜９、１０Ａおよび１０Ｂに列挙されている。
【０２７３】
ｃｅＤＮＡベクターは、シス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含む発現構築物から産生され得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、２０１８年９月７日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号に記載される調節スイッチを含み、導入遺伝子、またはｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチの発現を調節する。
【０２７４】
発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号８）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後処理エレメント、例えば、単純ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後エレメントを使用することができる。分泌配列は、導入遺伝子、例えば、ＶＨ−０２およびＶＫ−Ａ２６配列、例えば、配列番号２５および配列番号２６に連結され得る。発現カセットは、当該技術分野において既知のポリアデニル化配列またはその変形、例えば、ウシＢＧＨｐＡ（例えば、配列番号７４）もしくはウイルスＳＶ４０ｐＡ（例えば、配列番号１０）から単離された天然に存在する配列、または合成配列（例えば、配列番号２７）を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含み得る。ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡまたは異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。
【０２７５】
発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、もしくは２０，０００ヌクレオチド、もしくは３０，０００ヌクレオチド、もしくは４０，０００ヌクレオチド、または５０，０００ヌクレオチド、または約４０００〜１０，０００ヌクレオチド、もしくは１０，０００〜５０，０００ヌクレオチドの間の任意の範囲、または５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜５０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜７５，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜１０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１０００〜１０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜５，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子または核酸を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限を有さず、したがって、大サイズの発現カセットの送達が導入遺伝子の効率的な発現をもたらすようにすることができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。いくつかの実施形態では、５’〜３’配向の発現カセット長は、ＡＡＶビリオン中でカプシド化されることが知られている最大長を超える。いくつかの実施形態では、長さは、４．６ｋｂ超、または５ｋｂ超、または６ｋｂ超、または７ｋｂ超である。
【０２７６】
図１Ａ〜１Ｃは、非限定の例示的なｃｅＤＮＡベクター、またはｃｅＤＮＡプラスミドの対応する配列の概略図を示す。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド不含であり、第１のＩＴＲ、発現可能な導入遺伝子カセットおよび第２のＩＴＲをこの順にコードするプラスミドから取得され、第１および／または第２のＩＴＲ配列のうちの少なくとも１つは、対応する野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に関して突然変異される。発現可能な導入遺伝子カセットは、好ましくは、エンハンサー／プロモーター、ＯＲＦレポーター（導入遺伝子）、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、ならびにポリアデニル化および終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ）のうちの１つ以上をこの順に含む。
【０２７７】
発現カセットは、関心対象の任意の導入遺伝子を含み得る。関心対象の導入遺伝子としては、ポリペプチドをコードする核酸、または非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲｓ等）、好ましくは治療剤（例えば、医療、診断、もしくは獣医用途用）、または免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、発現カセット中の導入遺伝子は、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、治療的遺伝子またはマーカータンパク質である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、アゴニストまたはアンタゴニストである。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、抗体の模倣体、または抗体断片、またはその抗原結合断片、例えば、中和抗体または抗体断片等である。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に定義されるように、全長抗体または抗体断片を含む、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義されるように、抗原結合ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列である。
【０２７８】
具体的には、導入遺伝子は、例えば、疾患、機能不全、傷害、および／または障害の１つ以上の症状の治療、予防、および／または改善における使用のための、タンパク質（複数可）、ポリペプチド（複数可）、ペプチド（複数可）、酵素（複数可）、抗体、抗原結合断片、ならびにその変異型および／または活性断片を含むが、これらに限定されない１種以上の治療剤（複数可）をコードすることができる。
【０２７９】
プラスミド系発現ベクターとは異なるｃｅＤＮＡベクターの多くの構造特徴が存在する。ｃｅＤＮＡベクターは、以下の特徴：元の（すなわち、挿入されていない）細菌ＤＮＡの欠失、原核細胞複製起源の欠失、自蔵である（すなわち、Ｒｅｐ結合および末端分解部位（ＲＢＳおよびＴＲＳ）を含む２つのＩＴＲ以外のいかなる配列も、ＩＴＲ間の外因性配列も必要としない）、真核起源（すなわち、それらは真核細胞中で産生される）のヘアピンを形成するＩＴＲ配列の存在、ならびに細菌型ＤＮＡメチル化、または実際に哺乳動物宿主によって異常であるとみなされる任意の他のメチル化の非存在のうちの１つ以上を有し得る。一般に、本ベクターは、いかなる原核細胞ＤＮＡも含有しないことが好ましいが、いくつかの原核細胞ＤＮＡが、外因性配列として、非限定例としてプロモーターまたはエンハンサー領域に挿入されてもよいことが企図される。ｃｅＤＮＡベクターをプラスミド発現ベクターと区別する別の重要な特徴は、ｃｅＤＮＡベクターが、閉端を有する一本鎖直鎖状ＤＮＡであるが、プラスミドは、常に二本鎖ＤＮＡである。
【０２８０】
ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、制限酵素消化アッセイによって判定して、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する（図４Ｄ）。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組み換えられて突然変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造は、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクターおよびｃｅＤＮＡ−プラスミドは、構造（具体的には、直鎖状対環状）およびこれらの異なる対象物を産生および精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ−プラスミドの場合は原核細胞タイプおよびｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。
【０２８１】
本明細書に記載されるＤＮＡベクターを細胞から採取するための時間は、ＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために選択され、最適化され得る。例えば、採取時間は、生存性、細胞形態、細胞増殖等に関して選択され得る。通常、細胞は、ＤＮＡ−ベクターを産生するためのバキュロウイルス感染後に十分な時間が経過しているが、ウイルス毒性のために細胞の大半が死滅し始める前に採取され得る。ＤＮＡ−ベクターは、例えば、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏ−Ｆｒｅｅ（商標）プラスミドキットなどのプラスミド精製キットを使用して単離され得る。プラスミド単離のために開発された他の方法はまた、ＤＮＡ−ベクターに対して適合され得る。一般に、当該技術分野において既知の任意の核酸精製方法が採用され得る。
【０２８２】
プロモーター：上記のものを含む好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得るため、ウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは、原核生物または真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端配列（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６、例えば、配列番号１８（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，４９７−５００（２００２））、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）（例えば、配列番号１９）、ＣＡＧプロモーター、ヒトα１−抗チプシン（ＨＡＡＴ）プロモーター（例えば、配列番号２１）等が挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、これらのプロモーターは、それらの下流イントロン含有端で変更され、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位（複数可）を含有するＤＮＡは、プロモーターＤＮＡに対して外来である。
【０２８３】
プロモーターは、さらに発現を強化し、かつ／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１つ以上の特異的転写調節配列を含むことができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対も離れた位置にあり得る、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、心筋、植物、昆虫、および動物を含む起源に由来し得る。プロモーターは、遺伝子構成成分の発現を、発現が起こる細胞、組織、もしくは器官に関して、または発現が起こる発達段階に関して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に反応して、構成的にまたは示差的に調節することができる。プロモーターの代表的な例としては、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、またはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ならびに下記に列挙されるプロモーターが挙げられる。そのようなプロモーターおよび／またはエンハンサーは、関心対象（例えば、遺伝子編集分子、ドナー配列、治療タンパク質等）の任意の遺伝子の発現のために使用され得る。例えば、ベクターは、治療タンパク質をコードする核酸配列に操作可能に連結されたプロモーターを含み得る。治療タンパク質をコードする配列に操作可能に連結されたプロモーターは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）からのプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、トリ白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒト遺伝子からのプロモーター、例えばヒトユビキチンＣ（ｈＵｂＣ）、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、またはヒトメタロチオニンであり得る。プロモーターはまた、組織特異的プロモーター、例えば肝臓特異的プロモーター、例えばヒトα１抗チプシン（ＨＡＡＴ）（天然または合成）であり得る。一実施形態では、肝臓への送達は、肝細胞の表面上に存在する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体を介した肝細胞への、ｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の内因性ＡｐｏＥ特異的標的を使用して達成され得る。
【０２８４】
一実施形態では、使用されるプロモーターは、治療タンパク質をコードする遺伝子の未変性プロモーターである。治療タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子のプロモーターおよび他の調節配列は既知であり、特徴付けられている。使用されるプロモーター領域は、１つ以上の追加の調節配列（例えば、未変性）、例えば、エンハンサー（例えば、配列番号２２および配列番号２３）をさらに含み得る。
【０２８５】
本発明に従う使用のための好適なプロモーターの非限定例としては、例えば、ＣＡＧプロモーター（配列番号３）、ＨＡＡＴプロモーター（配列番号２１）、ヒトＥＦ１−αプロモーター（配列番号６）、またはＥＦ１ａプロモーター（配列番号１５）およびラットＥＦ１−αプロモーター（配列番号２４）の断片が挙げられる。
【０２８６】
ポリアデニル化配列：ポリアデニル化配列をコードする配列は、ｃｅＤＮＡベクターから発現されたｍＲＮＡを安定化するため、および核輸送および翻訳を助けるために、ｃｅＤＮＡベクター中に含まれ得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、ベクターは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、またはそれ以上のアデニンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約４３ヌクレオチド、約４０〜５０ヌクレオチド、約４０〜５５ヌクレオチド、約４５〜５０ヌクレオチド、約３５〜５０ヌクレオチド、またはその間の任意の範囲を含む。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの異なる逆位末端反復配列（ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得され得、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、末端分解部位および複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）、例えば、Ｒｅｐ結合部位（例えば、ＡＡＶ２のｗｔ  ＡＡＶ  ＩＴＲ配列番号１または配列番号２）を含み、ＩＴＲのうちの１つは、他のＩＴＲ、例えば、機能的ＩＴＲに関して欠失、挿入、および／または置換を含む。
【０２８８】
宿主細胞は、ウイルスカプシドタンパク質を発現せず、ポリヌクレオチドベクターテンプレートは、任意のウイルスカプシドコード配列を欠いている。一実施形態では、ポリヌクレオチドベクターテンプレートは、ＡＡＶカプシド遺伝子だけでなく、他のウイルスのカプシド遺伝子を欠いている。追加として、特定の実施形態では、核酸分子はまた、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質コード配列を欠いている。したがって、好ましい実施形態では、本発明の核酸分子は、機能的ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子およびＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子の両方を欠いている。
【０２８９】
本発明のある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５４８、５４９、５５１、５５２、５５３、５５３、５５４、５５５、５５６、および５５７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む修飾型ＩＴＲを有しない。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書（または２０１８年９月７日出願のＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号）に開示される調節スイッチと、配列番号５４８、５４９、５５１、５５２、５５３、５５３、５５４、５５５、５５６、および５５７からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する修飾型ＩＴＲとを含む。
【０２９１】
無制限に、上記の権利放棄の留保は、少なくとも本出願の特許請求の範囲１〜３３、ならびに［００２９３］および［００２９４］に記載されるパラグラフに適用される。
【０２９２】
本明細書に開示される様々な態様のいくつかの実施形態は、以下のパラグラフのうちのいずれか１つによって定義され得る。
１．ｃｅＤＮＡベクターを封入するリポソームを含む、リポソームｃｅＤＮＡベクターであって、ｃｅＤＮＡベクターが、
シス調節エレメントを含む発現カセットであって、転写後調節エレメントおよびＢＧＨポリＡシグナルからなる群から選択される、シス調節エレメントと、
発現カセットの上流（５’端）の野生型ＩＴＲであって、配列番号５１のポリヌクレオチドを含む、野生型ＩＴＲと、
発現カセットの下流（３’端）の修飾型ＩＴＲであって、配列番号２のポリヌクレオチドを含む、修飾型ＩＴＲと、を含み、
当該ＤＮＡベクターが、原核細胞特異的メチル化を欠いており、ＡＡＶカプシドタンパク質中でカプシド化されない、リポソームｃｅＤＮＡベクター。
２．ＤＮＡベクターが、直鎖状で連続的な構造を有する、パラグラフ１に記載のＤＮＡベクター。
３．転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、パラグラフ１または２に記載のＤＮＡベクター。
４．発現カセットは、クローニング部位をさらに含む、パラグラフ１〜３のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
５．発現カセットが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択されるプロモーターを含む、パラグラフ１〜４のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
６．発現カセットが、配列番号３、配列番号７、配列番号８、および配列番号９のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ１に記載のＤＮＡベクター。
７．発現カセットは、クローニング部位と、そのクローニング部位に挿入された外因性配列と、をさらに含む、パラグラフ１〜６のいずれかに記載のＤＮＡベクター。
８．外因性配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドを含む、パラグラフ７に記載のＤＮＡベクター。
９．外因性配列が、タンパク質をコードする、パラグラフ７に記載のＤＮＡベクター。
１０．外因性配列が、レポータータンパク質をコードする、パラグラフ７に記載のＤＮＡベクター。
【０２９３】
本明細書に開示される様々な態様のいくつかの実施形態は、以下のパラグラフのうちのいずれか１つによって定義され得る。
１．イオン化脂質と、共有結合性閉端を有する非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）とを含む、脂質粒子であって、ｃｅＤＮＡベクターが、非対称逆位末端反復配列（非対称ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、非対称ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む、脂質粒子。
２．ｃｅＤＮＡベクターが、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化され、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方の電気泳動によって分析されたときに、直鎖状で非連続的なＤＮＡ対照と比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドを示す、パラグラフ１に記載の脂質ナノ粒子。
３．非対称ＩＴＲ配列のうちの１つ以上が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、パラグラフ１または２に記載の脂質ナノ粒子。
４．非対称ＩＴＲが、異なるウイルス血清型に由来する、パラグラフ３に記載の脂質ナノ粒子。
５．１つ以上の非対称ＩＴＲが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、パラグラフ４に記載の脂質ナノ粒子。
６．非対称ＩＴＲ配列のうちの１つ以上が、合成である、パラグラフ１〜３のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
７．ＩＴＲのうちの１つ以上が、野生型ＩＴＲではない、パラグラフ１〜６のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
８．非対称ＩＴＲのうちの１つ以上両方が、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、Ｄ、およびＤ’から選択されるＩＴＲ領域のうちの少なくとも１つにおける欠失、挿入、および／または置換によって修飾されている、パラグラフ１〜７のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
９．ｃｅＤＮＡベクターが、
ａ．配列番号１および配列番号５２、ならびに
ｂ．配列番号２および配列番号５１から選択される少なくとも２つの非対称ＩＴＲを含む、パラグラフ１〜８のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
１０．ｃｅＤＮＡベクターが、
ａ．少なくとも１つのＲｅｐタンパク質の存在下、ｃｅＤＮＡ発現構築物を内包する昆虫細胞の集団をインキュベートするステップであって、ｃｅＤＮＡ発現構築物が、昆虫細胞内でｃｅＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、ｃｅＤＮＡベクターをコードする、ステップと、
ｂ．ｃｅＤＮＡベクターを昆虫細胞から単離するステップと、を含むプロセスから取得される、パラグラフ１〜９のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子。
１１．ｃｅＤＮＡ発現構築物が、ｃｅＤＮＡプラスミド、ｃｅＤＮＡバクミド、およびｃｅＤＮＡバキュロウイルスから選択される、パラグラフ１０に記載の脂質ナノ粒子。
１２．昆虫細胞が、少なくとも１つのＲｅｐタンパク質を発現する、パラグラフ１０またはパラグラフ１１に記載の脂質ナノ粒子。
１３．少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、パルボウイルス、ディペンドウイルス、およびアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）から選択されるウイルスに由来する、パラグラフ１０に記載の脂質ナノ粒子。
１４．少なくとも１つのＲｅｐタンパク質が、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、およびＡＡＶ１２から選択されるＡＡＶ血清型に由来する、パラグラフ１３に記載の脂質ナノ粒子。
１５．ＤＮＡベクターが、ベクターポリヌクレオチドから取得され、ベクターポリヌクレオチドが、２つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードし、２つのＩＴＳが、互いに異なり（非対称）、ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、機能的末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む機能的ＩＴＲであり、ＩＴＲのうちの１つが、機能的ＩＴＲに対して欠失、挿入、および／または置換を含み、Ｒｅｐタンパク質の存在が、昆虫細胞におけるベクターポリヌクレオチドの複製およびＤＮＡベクターの産生を誘導し、ＤＮＡベクターが、
ａ．Ｒｅｐタンパク質の存在下、ウイルスカプシドコード配列を欠いたベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団を、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、インキュベートするステップであって、昆虫細胞が、ベクターの非存在下では、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの産生を含まない、ステップと、
ｂ．カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡを昆虫細胞から採取および単離するステップと、を含むプロセスから取得可能である、パラグラフ１〜１５のいずれか１つに記載の脂質粒子。
１６．昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、確認され得る、パラグラフ１０〜１５のいずれか１つに記載の脂質粒子。
１７．昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、昆虫細胞から単離されたＤＮＡを、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る、パラグラフ１６に記載の脂質粒子。
１８．ＤＮＡベクターが、ベクターポリヌクレオチドから取得され、ベクターポリヌクレオチドが、第１および第２のＡＡＶ２逆位末端反復ＤＮＡポリヌクレオチド配列（ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードし、ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、配列番号１または配列番号５１の対応するＡＡＶ２野生型ＩＴＲに関して少なくとも１つのポリヌクレオチド欠失、挿入、および／または置換を有し、Ｒｅｐタンパク質の存在下で昆虫細胞中のＤＮＡベクターの複製を誘導し、ＤＮＡベクターが、
ａ．Ｒｅｐタンパク質の存在下、ウイルスカプシドコード配列を欠いたベクターポリヌクレオチドを内包する昆虫細胞の集団を、昆虫細胞内のカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡベクターの産生を誘導するために効果的な条件下、かつそのために十分な時間にわたって、インキュベートするステップであって、昆虫細胞が、ウイルスカプシドコード配列を含まない、ステップと、
ｂ．カプシド不含非ウイルス性ＤＮＡを昆虫細胞から採取および単離するステップと、を含むプロセスから取得可能である、パラグラフ１〜１７のいずれか１つに記載の脂質粒子。
１９．昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、確認され得る、パラグラフ１８に記載の脂質粒子。
２０．昆虫細胞から単離されたカプシド不含非ウイルス性ＤＮＡの存在が、昆虫細胞から単離されたＤＮＡを、ＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、および消化されたＤＮＡ材料を非変性ゲル上で分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的な直鎖状で連続的なＤＮＡのバンドの存在を確認することによって確認され得る、パラグラフ１９に記載の脂質粒子。
２１．脂質粒子が、非カチオン性脂質、ＰＥＧ複合脂質、およびステロールのうちの１つ以上をさらに含む、パラグラフ１〜２０のいずれか１つに記載の脂質粒子。
２２．イオン化脂質が、表１に記載の脂質である、パラグラフ１〜２１のいずれか１つに記載の脂質粒子。
２３．前記脂質粒子が、非カチオン性脂質をさらに含み、前記非イオン性脂質が、ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、モノメチル−ホスファチジルエタノールアミン（１６−Ｏ−モノメチルＰＥなど）、ジメチル−ホスファチジルエタノールアミン（１６−Ｏ−ジメチルＰＥなど）、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、水素化ダイズホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、卵ホスファチジルコリン（ＥＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルセリン（ＤＯＰＳ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジエルコイルホスファチジルコリン（ＤＥＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）、ジエライドイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リソレシチン、リソホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、卵スフィンゴミエリン（ＥＳＭ）、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジカシド、セレブロシド、ジセチルホスフェート、リソホスファチジルコリン、およびジリノレオイルホスファチジルコリンからなる群から選択される、パラグラフ１〜２２のいずれか１つに記載の脂質粒子。
２４．脂質粒子は、複合脂質をさらに含み、この複合脂質、この複合脂質は、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ））、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、ペグ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ−ＤＡＧ）（４−Ｏ−（２’，３’−ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル−１−Ｏ−（ｗ−メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、およびＮ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩からなる群から選択される、パラグラフ１〜２３のいずれか１つに記載の脂質粒子。
２５．脂質粒子が、コレステロールまたはコレステロール誘導体をさらに含む、パラグラフ１〜２４のいずれか１つに記載の脂質粒子。
２６．脂質粒子が、
（ｉ）イオン化脂質と、
（ｉｉ）非カチオン性脂質と、
（ｉｉｉ）粒子の凝集を阻害する複合脂質と、
（ｉｖ）ステロールと、を含む、パラグラフ１〜２５のいずれか１つに記載の脂質粒子。
２７．脂質粒子が、
（ａ）粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％の量のイオン化脂質と、
（ｂ）粒子中に存在する全脂質の約５ｍｏｌ％〜約３０ｍｏｌ％の量の非カチオン性脂質と、
（ｃ）粒子中に存在する全脂質の約０．５ｍｏｌ％〜約２０ｍｏｌ％の量の、粒子の凝集を阻害する複合脂質と、
（ｄ）粒子中に存在する全脂質の約２０ｍｏｌ％〜約５０ｍｏｌ％の量のステロールと、を含む、パラグラフ１〜２６のいずれか１つに記載の脂質粒子。
２８．全脂質とＤＮＡベクターとの（質量または重量）比が、約１０：１〜約３０：１である、パラグラフ１〜２７のいずれか１つに記載の脂質粒子。
２９．第１の脂質ナノ粒子および追加の化合物を含む組成物であって、第１の脂質ナノ粒子が、第１のカプシド不含非ウイルス性ベクターを含み、パラグラフ１〜２８のいずれか１つに記載の脂質ナノ粒子である、組成物。
３０．当該追加の化合物が、第２の脂質ナノ粒子中に包含され、第１および第２の脂質ナノ粒子が異なる、パラグラフ２９に記載の組成物。
３１．当該追加の化合物が、第１の脂質ナノ粒子中に包含される、パラグラフ２８または２９に記載の組成物。
３２．追加の化合物が、治療剤である、パラグラフ２８〜３０のいずれか１つに記載の組成物。
３３．追加の化合物が、第２のカプシド不含非ウイルス性ベクターであり、第１および第２のカプシド不含非ウイルス性ベクターが異なる、パラグラフ２８に記載の組成物。
【０２９４】
以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。
【実施例】
【０２９５】
実施例１：ｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法
ｃｅＤＮＡプラスミドの構成
ポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用したｃｅＤＮＡベクターの産生について説明する。例えば、本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つのＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも１つが修飾されている）および発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡベクターを産生するように複合する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスゲノム等）からのテンプレートの切除（レスキュー）、および第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。
【０２９６】
ｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ−プラスミドに由来する。図１Ａおよび１Ｂを参照して、ｃｅＤＮＡ−プラスミドの各々のポリヌクレオチド構築物テンプレートは、左ＩＴＲおよび右突然変異型ＩＴＲの両方を含み、ＩＴＲ配列の間に以下を有する。（ｉ）エンハンサー／プロモーター、（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位、（ｉｉｉ）転写後反応エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、および（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨｐＡ由来）。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１〜Ｒ６）（図１Ａおよび１Ｂに示される）もまた、各構成成分の間に導入して、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成成分の導入を促進した。Ｒ３（ＰｍｅＩ）ＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号７）およびＲ４（ＰａｃＩ）ＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号５４２）酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位の中に設計される。これらの配列を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得したｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴ  Ｂプラスミドにクローニングした。
【０２９７】
要するに、一連のｃｅＤＮＡベクターは、図４Ａ〜４Ｃに示されるプロセスを使用して、表３に示されるｃｅＤＮＡ−プラスミド構築物から取得した。表５は、導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターの各末端上の複製タンパク質部位（ＲＰＳ）として活性な配列を含む、各構成成分の対応するポリヌクレオチド配列の数を示す。表３の番号は、各構成成分の配列に対応する、本文書中の配列番号を指す。
【表３】
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【０２９８】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを作成するための構築物は、調節スイッチ、例えば、誘導性プロモーターである、プロモーターを含む。他の構築物を使用して、ルシフェラーゼ導入遺伝子に操作可能に連結されたＭＮＤまたはＨＬＣＲプロモーターを含む、ｃｅＤＮＡベクターを作製した。
【０２９９】
ｃｅＤＮＡ−バクミドの産生：
図４Ａを参照して、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミドまたは制御プラスミドのいずれかで形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドを生成した。バクミドおよびトランスポサーゼの形質転換体および維持のために選択する抗生物質とともに、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニングに基づいて（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する）、正の選択をスクリーニングすることによって、組み換えバクミドを選択した。β−ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、１０ｍＬの培地中で培養した。
【０３００】
組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドをＥ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用してＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着性Ｓｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、Ｔ２５フラスコ内の５０ｍＬの培地中２５℃で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含有する）を細胞から取り除き、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性バキュロウイルス粒子を細胞または細胞残屑から分離した。
【０３０１】
任意に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０〜５００ｍＬの培地中で増幅させた。オービタルシェーカー培養器内の懸濁液培養物中の細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で維持し、細胞が（１４〜１５ｎｍのナイーブ直径から）１８〜１９ｎｍの直径に到達するまで、細胞直径および生存性、ならびに約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度を監視した。感染３日後〜８日後の間に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に収集し、細胞および残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。
【０３０２】
試験構築物を含むｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性または力価を判定した。具体的に、２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ  Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈：１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、２５〜２７℃でインキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存性の変化によって、４〜５日間にわたって毎日判定した。
【０３０３】
図４Ａを参照して、図６Ａによる「Ｒｅｐ−プラスミド」を、Ｒｅｐ７８（配列番号１３）またはＲｅｐ６８（配列番号１２）およびＲｅｐ５２（配列番号１４）の両方を含むｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）−二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏｒＦｉｓｈｅｒ）中で産生した。
【０３０４】
Ｒｅｐ−プラスミドを、製造元によって提供されるプロトコルに従って、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ−プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えバクミド（「Ｒｅｐ−バクミド」）を生成した。Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する）を含む正の選択によって、組み換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍＬの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラシクリン）中に播種した。組み換えバクミド（Ｒｅｐ−バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ−バクミドをＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。
【０３０５】
Ｓｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍＬの培地中で４日間培養し、感染性組み換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ−バキュロウイルス）を、培養物から単離した。任意に、第１世代のＲｅｐ−バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０〜５００ｍＬの培地中で培養した。感染３日後〜８日後の間に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、または濾過もしくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ−バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を判定した。具体的には、２．５×１０６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ  Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存性の変化によって４〜５日間にわたって毎日判定した。
【０３０６】
ｃｅＤＮＡベクター生成および特徴付け
図４Ｂを参照して、次に、（１）ｃｅＤＮＡ−バクミドを含有する試料またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス、および（２）上記のＲｅｐ−バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ昆虫細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬ、２０ｍＬ）の新鮮な培養物に、それぞれ１：１０００および１：１０，０００の比で添加した。次に、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。共感染の４〜５日後、細胞直径および生存性を検出する。細胞直径が１８〜２０ｎｍに到達し、生存性が約７０〜８０％であったとき、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを収集した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水または緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ｃｅＤＮＡベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＭＩＤＩ  ＰＬＵＳ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カラムあたり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。
【０３０７】
Ｓｆ９昆虫細胞から産生および精製されるｃｅＤＮＡベクターの収率は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定した。ＵＶ吸光度に基づいて判定された様々なｃｅＤＮＡベクターの収率を表４に提供する。
【表４】
2020537493.tif 000128
【０３０８】
図４Ｄに示される未変性または変性条件下、アガロースゲル電気泳動によって特定されることによって、ｃｅＤＮＡベクターを評価することができ、ｃｅＤＮＡベクターは、未変性ゲルに基づいて複数のバンドを精製する。図４Ｄを参照されたい。各バンドは、異なる構造、例えば、単量体、二量体等を有するベクターを表し得る。変性条件下での単一バンドおよび非変性条件下での二重バンド（単量体および二量体形態に対応する）の存在は、ｃｅＤＮＡベクターの存在に特徴的である。
【０３０９】
単離されたｃｅＤＮＡベクターの構造を、共感染Ｓｆ９細胞から得られたＤＮＡ（本明細書に記載される）を、制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ａ）ｃｅＤＮＡベクター内の単一切断部位のみの存在、およびｂ）０．８％変性アガロースゲル（＞８００ｂｐ）上で分画したときに明らかに見えるほど十分に大きい、得られる断片についてさらに分析した。図４Ｅに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状ＤＮＡベクターおよび直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するＤＮＡベクターは、１ｋｂおよび２ｋｂ断片を産生することが期待されるが、連続的な構造を有する非カプシド化ベクターは、２ｋｂおよび４ｋｂ断片を産生することが期待される。
【０３１０】
したがって、定義によって必要とされるように、単離されたｃｅＤＮＡベクターが共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、特定のＤＮＡベクター配列の文脈において、単一制限部位を有すると特定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ（例えば、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐ）の２つの切断産物をもたらす。変性ゲル（２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する）上の消化および電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的に閉じたＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖が連結され、展開されて２倍の長さであるとき（但し、一本鎖である）、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐのサイズで溶解するが、共有結合的に閉じたＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡベクター）は、２倍サイズ（２０００ｂｐおよび４０００ｂｐ）で溶解するであろう。さらに、ＤＮＡベクターの単量体、二量体、およびｎ量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片としてすべて溶解する（図４Ｄを参照）。
【０３１１】
図５は、エンドヌクレアーゼによる消化を伴う（＋）または伴わない（−）、次のようなｃｅＤＮＡベクター：構築物−１、構築物−２、構築物−３、構築物−４、構築物−５、構築物−６、構築物−７、および構築物−８（すべて上記の表３に記載される）を有する変性ゲルの例示的な図を提供する。構築物−１〜構築物−８の各ｃｅＤＮＡベクターは、エンドヌクレアーゼ反応後に２つのバンド（＊）を産生した。サイズマーカーに基づいて判定されたそれら２つのバンドサイズは、図の下部に提供される。バンドサイズは、構築物−１〜構築物−８を含むプラスミドから産生されたｃｅＤＮＡベクターの各々が、連続的な構造を有することを確認する。
【０３１２】
本明細書で使用される場合、「未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡベクターの特定のためのアッセイ」という語句は、制限エンドヌクレアーゼ消化に続いて、消化産物の電気泳動的評価を実施することによって、ｃｅＤＮＡの閉端性を評価するためのアッセイを指す。１つのそのような例示的アッセイを以下に示すが、当業者であれば、この実施例に関する当該技術分野において既知の多くの変形が可能であることを理解するであろう。およそ１／３×および２／３×のＤＮＡベクター長の産生物を生成するであろう関心対象のｃｅＤＮＡベクターに対する単一切断酵素であるように、制限エンドヌクレアーゼが選択される。これは、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットまたは脱塩「スピンカラム」、例えば、ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ  ＩＬＵＳＴＲＡ（商標）  ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ（商標）  Ｇ−２５カラムは、エンドヌクレアーゼ消化のための当該技術分野において既知のいくつかのオプションである。アッセイは、例えば、ｉ）ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼ（複数可）で消化すること、２）例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットに適用し、蒸留水で溶出すること、ｉｉｉ）１０×変性溶液（１０×＝０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、１０×色素を添加し、緩衝せず、１０×変性溶液を、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２００ｍＭ  ＮａＯＨで以前にインキュベートされた０．８〜１．０％ゲル上で４×に添加することによって調製されたＤＮＡラダーと一緒に分析して、ＮａＯＨ濃度が、ゲルおよびゲルボックス中で均一であり、１×変性溶液（５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の存在下でゲルを流動させることを保証することを含む。当業者であれば、サイズおよび所望のタイミングの結果に基づいて、電気泳動を実行するために使用する電圧を理解すであろう。電気泳動後に、ゲルを排出し、１×ＴＢＥまたはＴＡＥ中で中和し、蒸留水または１×ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄを含む１×ＴＢＥ／ＴＡＥに移す。次いで、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染料（ＤＭＳＯ中１０，０００Ｘ濃縮物）および落射蛍光灯（青色）またはＵＶ（３１２ｎｍ）を用いてバンドを可視化することができる。
【０３１３】
生成されたｃｅＤＮＡベクターの純度は、任意の当該技術分野において既知の方法を使用して評価され得る。１つの例示的な非限定的方法として、試料の全体ＵＶ吸光度に対するｃｅＤＮＡ−プラスミドの寄与は、ｃｅＤＮＡベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定され得る。例えば、ＵＶ吸光度に基づいて、４μｇのｃｅＤＮＡベクターをゲル上に負荷し、ｃｅＤＮＡベクター蛍光強度が、１μｇであることが知られている２ｋｂバンドに相当する場合、１μｇのｃｅＤＮＡベクターが存在し、ｃｅＤＮＡベクターは、全ＵＶ吸光材料の２５％である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全ｃｅＤＮＡベクターが８ｋｂであり、切除された比較バンドが２ｋｂである場合、バンド強度は、全インプットの２５％としてプロットされ、この場合、１．０μｇのインプットに対して０．２５μｇとなる。ｃｅＤＮＡベクタープラスミド滴定を使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、ｃｅＤＮＡベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、ｃｅＤＮＡベクターにより表される全インプットのパーセント、または純度パーセントを判定することができる。
【０３１４】
実施例２：ｃｅＤＮＡベクターは、ルシフェラーゼ導入遺伝子をインビトロで発現する
構築物は、ルシフェラーゼレポーター遺伝子をコードするオープンリーディングフレームを、ｃｅＤＮＡ−プラスミド構築物：構築物−１、構築物−３、構築物−５、および構築物−７のクローニング部位に導入することによって生成された。ルシフェラーゼコーティング配列を含むｃｅＤＮＡ−プラスミド（表３の上記を参照）は、それぞれプラスミド構築物１−Ｌｕｃ、ｃプラスミド構築物−３−Ｌｕｃ、プラスミド構築物−５−Ｌｕｃ、およびプラスミド構築物７−Ｌｕｃと呼ばれている。
【０３１５】
ＨＥＫ２９３細胞を培養し、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）をトランスフェクション剤として使用し、１００ｎｇ、２００ｎｇ、または４００ｎｇのプラスミド構築物１、３、５、および７でトランスフェクトした。プラスミドの各々からのルシフェラーゼの発現を、各細胞培養物中のルシフェラーゼ活性に基づいて判定し、結果を図７Ａに提供する。ルシフェラーゼ活性は、未処理の対照細胞（「未処理」）またはＦｕｇｅｎｅ単独で処理した細胞（「Ｆｕｇｅｎｅ」）から検出されず、そのルシフェラーゼ活性がプラスミドからの遺伝子発現から生じたことを確認する。図７Ａおよび７ＢＢに示されるように、ルシフェラーゼのロバストな発現は、構築物１および７から検出された。構築物−７からの発現は、ルシフェラーゼを発現し、ルシフェラーゼ活性の容量依存的増加が検出された。
【０３１６】
プラスミドの各々でトランスフェクトした細胞の増殖および生存性もまた判定し、図８Ａおよび８Ｂに提示した。トランスフェクト細胞の細胞増殖および生存性は、異なる構築物で処理された細胞の異なる群間で有意に異ならなかった。
【０３１７】
したがって、各群において測定され、細胞増殖および生存性に基づいて正規化されたルシフェラーゼ活性は、正規化なしにルシフェラーゼ活性とは異ならなかった。構築物１−Ｌｕｃを有するｃｅＤＮＡ−プラスミドは、正規化を伴う、または伴わないルシフェラーゼの最もロバストな発現を示した。
【０３１８】
したがって、図７Ａ、７Ｂ、８Ａ、および８Ｂに提示されるデータは、５’〜３’−ＷＴ−ＩＴＲ（配列番号５１）、ＣＡＧプロモーター（配列番号３）、Ｒ３／Ｒ４クローニング部位（配列番号７）、ＷＰＲＥ（配列番号８）、ＢＧＨｐＡ（配列番号９）、および修飾ＩＴＲ（配列番号２）を含む構築物１が、ｃｅＤＮＡベクター内で導入遺伝子のタンパク質を発現し得るｃｅＤＮＡベクターを産生する際に有効であることを実証する。
【０３１９】
実施例３：脂質（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）
ｃｅＤＮＡを含む脂質粒子は、脂質（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）−ブタノエート（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ）（本明細書では「ＭＣ３」とも称され、以下の構造を有する）
【化１２０】
2020537493.tif 000129
と組み合わせて調製または製剤化され得る。
【０３２０】
脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９−８５３３（その内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。以下のように合成される。
【０３２１】
メタンスルホン酸オクタデカ−９，１２−ジエニルエステルの合成ジクロロメタン（１００ｍＬ）中のアルコール１（２６．６ｇ、１００ｍｍｏｌ）の溶液に、トリエチルアミン（１３．１３ｇ、１３０ｍｍｏｌ）を添加し、この溶液を氷浴中で冷却する。この冷たい溶液に、ジクロロメタン（６０ｍＬ）中の塩化メシル（１２．６ｇ、１１０ｍｍｏｌ）の溶液を滴下添加し、添加の完了後に、反応混合物を周囲温度まで温め、一晩撹拌した。反応混合物のＴＬＣは、反応の完了を示す。反応混合物をジクロロメタン（２００ｍＬ）で希釈し、水（２００ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３（２００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）、および乾燥（ＮａＳＯ４）で洗浄した。有機層を濃縮して、ヘキサン中の０〜１０％  Ｅｔ２Ｏを使用するカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）によって精製された粗産生物を得る。純産生物分画を組み合わせ、濃縮して、純産生物メタンスルホン酸オクタデカ−９，１２−ジエニルエステルを無色の油として取得する。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ５．４２−５．２１（ｍ，４Ｈ），４．２０（ｔ，２Ｈ），３．０６（ｓ，３Ｈ），２．７９（ｔ，２Ｈ），２．１９〜２．００（ｍ，４Ｈ），１．９０〜１．７０（ｍ，２Ｈ），１．０６〜１．１８（ｍ，１８Ｈ），０．８８（ｔ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１３０．７６，１３０．５４，１２８．６，１２８．４，７０．６７，３７．９，３２．０５，３０．１２，２９．８７，２９．８５，２９．６８，２９．６５，２９．５３，２７．７２，２７．７１，２６．１５，２５．９４，２３．０９，１４．６０。ＭＳ．Ｃ１９Ｈ３６Ｏ３Ｓの分子量算出値、３４４．５３。
【０３２２】
１８−ブロモ−オクタデカ−６，９−ジエンの合成：メシレート（メタンスルホン酸オクタデカ−９，１２−ジエニルエステル、１３．４４ｇ、３９ｍｍｏｌ）は、無水エーテル（５００ｍＬ）に溶解し、それにＭｇＢｒ．Ｅｔ２Ｏ複合体（３０．７ｇ、１１８ｍｍｏｌ）をアルゴン下で添加し、混合物をアルゴン下で２６時間再還流させ、その後ＴＬＣは、反応の完了を示す。反応混合物は、エーテル（２００ｍＬ）で希釈し、氷冷水（２００ｍＬ）をこの混合物に添加して、層を分離する。有機層を１％水性Ｋ２ＣＯ３（１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、乾燥させる（無水Ｎａ２ＳＯ４）。有機層の濃縮は、粗産生物を提供し、それをヘキサン中の０〜１％  Ｅｔ２Ｏを使用するカラムクロマトグラフィー（シリカゲル）によってさらに精製して、産生物１８−ブロモ−オクタデカ−６，９−ジエンを無色の油として単離する。１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，４００ＭＨｚ）δ５．４１−５．２９（ｍ，４Ｈ），４．２０（ｄ，２Ｈ），３．４０（ｔ，Ｊ＝７Ｈｚ，２Ｈ），２．７７（ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ），２．０９−２．０２（ｍ，４Ｈ），１．８８−１．００（ｍ，２Ｈ），１．４６−１．２７（ｍ，１８Ｈ），０．８８（ｔ，Ｊ＝３．９Ｈｚ，３Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ１３０．４１，１３０．２５，１２８．２６，１２８．１２，３４．１７，３３．０５，３１．７５，２９．８２，２９．５７，２９．５４，２９．３９，２８．９５，２８．３８，２７．４２，２７．４０，２５．８４，２２．７９，１４．２８。
【０３２３】
（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−オール（ＤＬｉｎ−ＭｅＯＨ）の合成：火炎乾燥させた５００ｍＬのＲＢフラスコに、新たに活性化したＭｇ切屑（２．４ｇ、１００ｍｍｏｌ）を添加し、フラスコは、磁気撹拌棒、添加漏斗、および還流冷却器を備える。このセットアップを脱気し、アルゴンで充填し、１０ｍＬの無水エーテルを、シリンジを介してフラスコに添加する。１８−ブロモ−オクタデカ−６，９−ジエン（２６．５ｇ、８０．４７ｍｍｏｌ）を、無水エーテル（５０ｍＬ）に溶解し、添加漏斗に添加する。約５ｍＬのこのエーテル溶液を、激しく撹拌しながらＭｇ切屑に添加する。発熱反応が認められ（グリニャール試薬形成を確認／加速するために、５ｍｇのヨウ素を添加し、即時脱色が観察され、グリニャール試薬の形成を確認する）、エーテルが還流し始める。フラスコを水中で冷却することによって、緩やかな還流下で反応を保持しながら、ブロミドの溶液の残りを滴下添加する。添加の完了後、反応混合物を３５℃で１時間保持し、次いで氷浴で冷却する。ギ酸エチル（２．６８ｇ、３６．２ｍｍｏｌ）を、無水エーテル（４０ｍＬ）に溶解し、添加漏斗に移し、撹拌しながら反応混合物を滴下添加する。発熱反応が観察され、反応混合物が還流し始める。反応の開始後、ギ酸のエーテル性溶液の残りをストリームとして速やかに添加し、反応混合物を周囲温度でさらに１時間撹拌する。１０ｍＬのアセトンに続いて氷冷却水（６０ｍＬ）を滴下添加することによって反応をクエンチする。反応混合物を、溶液が均質になり、層が分離されるまで、水性Ｈ２ＳＯ４（１０体積％、３００ｍＬ）で処理する。水相をエーテル（２×１００ｍＬ）で抽出する。複合エーテル層を乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮して粗産生物を得て、これを室温で一晩メタノール（２００ｍＬ）中１ｇのナトリウムで処理する。反応の完了時、溶媒の大部分を蒸発させる。得られる混合物を１５０ｍＬの５％塩酸溶液に注ぐ。水相をエーテル（２×１５０ｍＬ）で抽出する。複合エーテル抽出物を、水（２×１００ｍＬ）、ブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。溶媒の蒸発により粗産生物が生じ、これをカラム（シリカゲル、ヘキサン中０〜１０％エーテル）クロマトグラフィーによって精製し、純産生物分画を蒸発させて、産生物ＤＬｉｎ−ＭｅＯＨを無色の油として産生する。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．４７−５．２４（ｍ，８Ｈ），３．５６（ｄｄ，Ｊ＝６．８，４．２，１Ｈ），２．８５−２．６６（ｍ，４Ｈ），２．１２−１．９１（ｍ，９Ｈ），１．５０−１．１７（ｍ，４６Ｈ），０．９８−０．７６（ｍ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ１３０．４１，１３０．３７，１２８．１８，１２８．１５，７７．５４，７７．２２，７６．９１，７２．２５，３７．７３，３１．７５，２９．９４，２９．８９，２９．８３，２９．７３，２９．５８，２９．５３，２７．４６，２７．４３，２５．８９，２５．８６，２２．８０，１４．３０。
【０３２４】
６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）の合成：ＤＬｉｎ−ＭｅＯＨ（１４４ｇ、２７２ｍｍｏｌ）を、１Ｌのジクロロメタンに溶解し、それにジメチルアミノ酪酸７の塩酸塩（５５ｇ、３２８ｍｍｏｌ）、続いてジイソプロピルエチルアミン（７０ｍＬ）およびＤＭＡＰ（４ｇ）を添加する。５分間周囲温度で撹拌した後、ＥＤＣＩ（８０ｇ、４１７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を室温で一晩撹拌し、その後ＴＬＣ（シリカゲル、ＣＨ２Ｃｌ２中の５％  ＭｅＯＨ）分析は、出発アルコールの完全な消失を示す。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５００ｍＬ）で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３（４００ｍＬ）、水（４００ｍＬ）、およびブライン（５００ｍＬ）で洗浄する。複合有機層を、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を真空で除去する。そのように得られた粗産生物を、フラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して［２．５Ｋｇシリカゲル、次の溶離液：ｉ）ＤＣＭ中６Ｌの０．１％  ＮＥｔ３でパックされたカラム；添加後、ｉｉ）ＤＣＭ中４Ｌの０．１％  ＮＥｔ３；ｉｉｉ）ＤＣＭ中１６Ｌの２％  ＭｅＯＨ−９８％の０．１％  ＮＥｔ３；ｉｖ）ＤＣＭ中４Ｌの２．５％  ＭｅＯＨ−９７．５％の０．１％  ＮＥｔ３；ｖ）ＤＣＭ中１２Ｌの３％  ＭｅＯＨ−９７％の０．１％  ＮＥｔ３］、純産生物ＭＣ３を無色の油として単離する。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ５．４６−５．２３（ｍ，８Ｈ），４．９３−４．７７（ｍ，１Ｈ），２．８３−２．６６（ｍ，４Ｈ），２．３７−２．２２（ｍ，４Ｈ），２．２０（ｓ，６Ｈ），２．１０−１．９６（ｍ，９Ｈ），１．８５−１．６９（ｍ，２Ｈ），１．４９（ｄ，Ｊ＝５．４，４Ｈ），１．３９−１．１５（ｍ，３９Ｈ），０．９５−０．７５（ｍ，６Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１７３．５６，１３０．３８，１３０．３３，１２８．１７，１２８．１４，７７．５４，７７．２２，７６．９０，７４．４４，５９．１７，４５．６４，３４．３６，３２．６９，３１．７３，２９．８７，２９．７６，２９．７４，２９．７０，２９．５６，２９．５０，２７．４４，２７．４１，２５．８４，２５．５５，２３．３８，２２．７８，１４．２７。ＥＩ−ＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ４３Ｈ７９ＮＯ２のＭＷ算出値（Ｍ＋Ｈ）＋：６４２．６。
【０３２５】
実施例４：脂質ＡＴＸ−００２
ｃｅＤＮＡを含む脂質粒子は、以下の構造を有する脂質ＡＴＸ−００２と組み合わせて調製または製剤化され得る。
【化１２１】
2020537493.tif 000130
【０３２６】
脂質ＡＴＸ−００２は、ＷＯ２０１５／０７４０８５（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。以下のように合成される。
【０３２７】
メチル８−ブロモオクタノエートの合成：Ｎ２雰囲気下、８−ブロモオクタン酸（６０ｇｍ，１等量）を、４００ｍＬの乾燥メタノールに溶解する。１０滴の濃縮Ｈ２ＳＯ４を滴下添加し、反応混合物を還流下で３時間撹拌した。
【０３２８】
反応を、完了するまで薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって監視する。溶媒を真空下で完全に除去する。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水で洗浄する。水層を酢酸エチルで再抽出する。全有機層を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄する。有機層を水で再度洗浄し、最後にブラインで洗浄する。産生物を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮する。
【０３２９】
ジメチル８，８’−（ベンザンジイル）ジオクタノエートの合成：乾燥Ｋ２ＣＯ３（１０４．７ｇｍ，６等量）を取り、Ｎ２下で乾燥ジメチルホルムアミドに添加する。ジメチルホルムアミド中のベンジルアミン（１３．５４ｇｍ，１等量）をゆっくり添加する。次いで、ジメチルホルムアミドに溶解したメチル８−ブロモオクタノエート（６０ｇｍ，２等量）を室温で添加する。反応混合物を８０℃に加熱し、反応を３６時間にわたって撹拌しながら維持する。
【０３３０】
反応を、完了するまで薄層クロマトグラフィーによって監視する。反応産生物を室温に冷却し、水を添加する。化合物を酢酸エチルで抽出する。水層を酢酸エチルで再抽出する。全有機層を水で洗浄し、最後にブライン溶液で洗浄する。産生物を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮する。
【０３３１】
反応産生物を、クロロホルム中の３％メタノール中のシリカゲルカラムクロマトグラフィーによって精製する。クロロホルム中の１０％メタノールのＴＬＣ系を使用すると、産生物は、Ｒｆ：０．８で移動し、ニンヒドリン中で炭化することによって可視化する。化合物は、薄茶色の液体である。構造は、１Ｈ−ＮＭＲによって確認される。
【０３３２】
ジメチル８，８’−アザネジイルジオクタノエートの合成：ジメチル８，８’−（ベンザンジイル）ジオクタノエート（３．５ｇｍ，１等量）を、水素化ガラス容器に移し、９０ｍＬのエタノール、続いて１０％  Ｐｄ／Ｃ（７００ｍｇ）を添加する。反応混合物を、Ｐａｒｒ撹拌装置において、５０ｐｓｉのＨ２大気圧下で２時間、室温で撹拌する。反応産生物をセライトで濾過し、熱い酢酸エチルで洗浄する。濾過液を真空下で濃縮する。
【０３３３】
ジメチル８，８’−（（ｔｅｒｔブトキシカルボニル）アザネジル）ジオクタノエートの合成：ジメチル８，８’−アザネジイル−ジオクタノエート（３２ｇｍ、１等量）を、反応質量まで乾燥ＤＣＭ（７００ｍＬ）および乾燥Ｅｔ３Ｎ（９ｇｍ、４等量）に移し、０℃に冷却する。ＤＣＭ中で希釈したＢｏｃ無水物（３１．３ｇｍ、１．５等量）を上記の反応に滴下添加する。添加が完了した後、反応混合物を室温で３時間撹拌する。
【０３３４】
反応を水でクエンチし、ＤＣＭ層を分離する。水相をＤＣＭで再抽出し、複合ＤＣＭ層をブライン溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させる。濃縮後、粗化合物を収集する。粗反応産生物を、ヘキサン中の０〜１２％酢酸エチルを使用するカラムクロマトグラフィーによって精製する。単一産生物は、ヘキサン中の２０％酢酸エチル中の薄層クロマトグラフィーによって移動し、Ｒｆは０．５であり、ニンヒドリンで炭化する。
【０３３５】
８，８’−（（ｔｅｒｔブトキシカルボニル）アザネジイル）ジオクタン酸の合成：ジメチル８，８’−（（ｔｅｒｔブトキシ−カルボニル）アザネジイル）ジオクタノエート（２１ｇｍ、１等量）を乾燥ＴＨＦ（２００ｍＬ）に移す。６Ｎの水酸化ナトリウム水溶液（１７５ｍＬ）を室温で添加する。室温で一晩撹拌しながら反応を維持する。
【０３３６】
反応質量を真空下２５℃で蒸発させて、ＴＨＦを除去する。反応産生物を５Ｎ  ＨＣｌで酸性化する。酢酸エチルを水層に添加する。分離した有機層を水で洗浄し、水層を酢酸エチルで再抽出した。複合有機層をブライン溶液で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させる。溶液の濃縮は、粗産生物を生じる。
【０３３７】
ジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）８，８’（（ｔｅｒｔブトキシカルボニル）アザネジイル）の合成：８，８’−（（ｔｅｒｔブトキシカルボニル）アザネジイル）ジオクタン酸（１８ｇｍ、１等量）を乾燥ＤＣＭ（１５０ｍＬ）に溶解する。ＨＡＴＵ（２６．１５ｇｍ、２．１等量）をこの溶液に添加する。Ｄ−イソプロピルエチルアミン（１４．８１ｇｍ、３．５等量）を、室温で反応混合物にゆっくり添加する。内部温度は４０℃に上昇し、淡黄色の溶液が形成される。ＤＭＡＰ（４００ｍｇ、０．１等量）、続いて乾燥ＤＣＭ中のシス−２−ノネン−１−オール溶液（９．３１ｇｍ、２等量）を反応混合物に添加する。反応は茶色に変化する。反応を室温で５時間撹拌する。
【０３３８】
反応を、完了するまで薄層クロマトグラフィーによってチェックする。水を反応産生物に添加し、これをＤＣＭで抽出する。ＤＣＭ層を水、続いてブライン溶液で洗浄する。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して粗化合物を得る。
【０３３９】
ＡＴＸ−００２の合成：ジ（（Ｚ）−ノン−２−エン−１−イル）８，８’（（ｔｅｒｔブトキシカルボニル）アザネジイル）ジオクタノエート（１３．８５ｍｍｏｌ、９グラム）を、乾燥ＤＣＭ（１５０ｍＬ）に溶解する。ＴＦＡを０℃で添加して反応を開始する。反応温度を、撹拌しながら３０分間にわたって室温までゆっくり温める。薄層クロマトグラフィーは、反応が完了したことを示す。反応産生物を真空下４０℃で濃縮し、粗残渣をＤＣＭで希釈し、１０％  ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄する。水層をＤＣＭで再抽出し、複合有機層をブライン溶液で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮する。収集した粗産生物を、窒素ガス下で乾燥ＤＣＭ（８５ｍＬ）に溶解する。トリホスゲンを添加し、反応混合物を０℃に冷却し、Ｅｔ３Ｎを滴下添加する。反応混合物を室温で一晩撹拌する。この層クロマトグラフィーは、反応が完了したことを示す。ＤＣＭ溶媒を、Ｎ２下の蒸留によって反応質量から除去される。反応産生物を０℃に冷却し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）で希釈し、２−（ジメチルアミノ）エタンチオールＨＣｌ（０．０６３ｍｏｌ、８．３ｇ）、続いてＥｔ３Ｎ（乾燥）を添加する。次いで、反応混合物を室温で一晩撹拌する。薄層クロマトグラフィーは、反応が完了したことを示す。反応産生物を０．３Ｍ  ＨＣｌ溶液（７５ｍＬ）で希釈し、有機層を分離する。水層をＤＣＭで再抽出し、複合有機層を１０％  Ｋ２ＣＯ３水溶液（７５ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させる。溶媒の濃縮は、粗産生物を生じる。粗化合物は、３％  ＭｅＯＨ／ＤＣＭを使用するシリカゲルカラム（１００〜２００メッシュ）によって精製する。
実施例５：（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（化合物３２）
【０３４０】
ｃｅＤＮＡを含む脂質粒子は、以下の構造を有する（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（化合物３２）と組み合わせて調製または製剤化され得る。
【化１２２】
2020537493.tif 000131
【０３４１】
化合物３２は、ＷＯ２０１２／０４０１８４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。以下のように合成される。
【０３４２】
α，β−不飽和アミド（ｖｉｉ）の合成：
【化１２３】
2020537493.tif 000132
【０３４３】
シリルアミドピーターソン試薬（３．１ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）に溶解し、−６３℃に冷却する。この溶液に、ｎＢｕＬｉ（１６．７ｍｍｏｌ、６．７ｍＬの２．５Ｍ溶液）を添加する。反応を３０分間周囲温度に温める。ケトン（ｉｉｉ）（５．０ｇ、１１．９ｍｍｏｌ）を、第２のフラスコ中のＴＨＦ（２５ｍＬ）に溶解する。温度を−６０℃から−４０℃の間に維持しながら、ケトン溶液を、３０分間にわたってピーターソン試薬に移す。反応を−４０℃まで１時間温め、次いで０℃まで３０分間温める。反応を重炭酸ナトリウムでクエンチし、追加の水で希釈し、水とヘキサンとに分割する。有機物をブラインで洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空で蒸発させる。フラッシュカラムクロマトグラフィー（０〜４０％  ＭＴＢＥ／ヘキサン）による精製は、α，β−不飽和アミド（ｖｉｉ）を生じる。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．７５（ｓ，１Ｈ），５．３６（ｍ，４Ｈ），３．０１（ｓ，３Ｈ），２．９９（ｓ，３Ｈ），２．７８（ｔ，２Ｈ），２．２８（ｔ，２Ｈ），２．０５（ｍ，６Ｈ），１．３５（ｍ，３４Ｈ），０．８９（ｍ，６Ｈ）。
【化１２４】
2020537493.tif 000133
【０３４４】
α，β−不飽和アミド（ｖｉｉ）（１ｇ、２．１ｍｍｏｌ）およびＬＳ−セレクトリド（４．１ｍｍｏｌ、４．１ｍＬの１Ｍ溶液）を密閉管中で組み合わせ、２４時間６０℃に加熱する。反応を周囲温度に冷却し、塩化アンモニウム溶液とヘプタンとに分割する。有機物を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濾過し、真空で蒸発させてアミド（ｖｉｉｉ）を得る。この中間物を、次の反応粗産生物中に直接運び入れる。
【０３４５】
α，β−不飽和アミド（ｖｉｉ）の代替共役還元は、水素化銅還元の使用を伴う。
【化１２５】
2020537493.tif 000134
【０３４６】
５ＬのＲＢにおいて、銅触媒（９．７７ｇ、１７．１３ｍｍｏｌ）を窒素下でトルエン（１７１３ｍＬ）に溶解する。これに、Ａｌｄｒｉｃｈ製のＰＭＨＳ（３０４ｍＬ、１３７１ｍｍｏｌ）を単一量で添加する。反応を５分間劣化させる。この溶液に、α，β−不飽和アミド（ｖｉｉ）（１６７．１６ｇ、３４３ｍｍｏｌ）を添加する。次いで、この混合物に、ｔ−アミルアルコール（１１３ｍＬ、１０２８ｍｍｏｌ）を３時間にわたってシリンジポンプを介して添加する。添加が完了した後、この溶液に、約１７００ｍＬの２０％  ＮＨ４ＯＨを反応に少量ずつ添加する。注意：クエンチの最初に激しい沸騰および発泡があり、それを注意深く監視しなければならず、水酸化アンモニウムを少量ずつゆっくり添加する。反応を水とヘキサンとに分割する。有機物をセライトで濾過し、真空で蒸発させる。得られたゴム固形材料を、機械的撹拌器を使用してヘキサン中で粉砕して、小粒子を生じ、次いでこれらを濾過し、ヘキサンで洗浄する。次いで、有機物を真空で蒸発させ、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカ、０〜１５％酢酸エチル／ヘキサン）によって精製して、所望のアミド（ｖｉｉｉ）を得る。ＬＣ／ＭＳ（Ｍ＋Ｈ）＝４９０．７。
【０３４７】
化合物３２の合成：アミド（ｖｉｉｉ）（２．８５ｇ、５．８ｍｍｏｌ）の溶液に、水素化アルミニウムリチウム（８．７ｍｍｏｌ、８．７ｍＬの１Ｍ溶液）を添加する。反応を周囲温度で１０分間撹拌し、次いで硫酸ナトリウム十水化物溶液をゆっくり添加することによってクエンチする。固体を濾過し、ＴＨＦで洗浄し、濾過液を真空で蒸発させる。粗混合物を、逆相分取クロマトグラフィー（Ｃ８カラム）によって精製して、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（化合物３２）を油として得る。ＨＲＭＳ（Ｍ＋Ｈ）算出値４７６．５１９０。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ５．３７（ｍ，４Ｈ），２．７８（ｔ，２Ｈ），２．４２（ｍ，８Ｈ），２．０５（ｑ，４Ｈ），１．２８（ｍ，４１Ｈ），０．８９（ｍ，６Ｈ）。
【０３４８】
実施例６：化合物６および２２
ｃｅＤＮＡを含む脂質粒子は、以下の構造を有する化合物６または２２と組み合わせて調製または製剤化され得る。
【化１２６】
2020537493.tif 000135
【０３４９】
化合物６および２２は、ＷＯ２０１５／１９９９５２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている。化合物６および２２は、以下のように合成した。
【０３５０】
化合物６の合成：塩化メチレン（８０ｍＬ）中のノナン−１，９−ジオール（１２．６ｇ）の溶液を、２−ヘキシルデカン酸（１０．０ｇ）、ＤＣＣ（８．７ｇ）、およびＤＭＡＰ（５．７ｇ）で処理する。この溶液を２時間撹拌する。反応混合物を濾過し、溶媒を除去する。残渣を温めたヘキサン（２５０ｍＬ）に溶解し、結晶化させる。溶液を濾過し、溶媒を除去する。残渣を塩化メチレンに溶解し、希釈塩酸で洗浄する。有機分画を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去する。残渣を、０〜１２％酢酸エチル／ヘキサンを溶出液として使用するシリカゲルカラム（７５ｇ）に伝え、９−（２’−ヘキシルデカノイルオキシ）ノナン−１−オールを油として得る。
【０３５１】
産生物を塩化メチレン（６０ｍＬ）に溶解し、ピリジニウム塩化クロム（６．４ｇ）で４時間処理する。ジエチルエーテル（２００ｍＬ）を添加し、上澄をシリカゲル床で濾過する。溶媒を濾過液から除去し、得られた油を、酢酸エチル／ヘキサン（０〜１２％）勾配を使用するシリカゲル（７５ｇ）カラムに伝え、９−（２’−エチルヘキサノイルオキシ）ノナナルを油として得る。
【０３５２】
塩化メチレン（２０ｍＬ）中の粗産生物（６．１ｇ）、酢酸（０．３４ｇ）、および２−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアミン（０．４６ｇ）の溶液を、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（２．９ｇ）で２時間処理する。溶液を、塩化メチレンで希釈し、水性水酸化ナトリウム、続いて水で洗浄する。有機相を無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去する。残渣を、メタノール／塩化メチレン（０〜８％）勾配を使用するシリカゲル（７５ｇ）カラム、続いて塩化メチレン／酢酸／メタノール勾配を使用する第２のカラム（２０ｇ）に伝える。精製した分画を塩化メチレンに溶解し、希釈水酸化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウム上で乾燥させ、濾過し、溶媒を除去して、所望の産生物を無色の油として得る。
【０３５３】
化合物２２の合成：ステップ１では、ＤＣＭ（８０ｍＬ）中の６−ブロモヘキサン酸（２０ｍｍｏｌ、３．９０１ｇ）、２−ヘキシル−１−デカノール（１．８等量、３６ｍｍｏｌ、８．７２ｇ）、および４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ０．５等量、１０ｍｍｏｌ、１．２２ｇ）に、ＤＣＣ（１．１等量、２２ｍｍｏｌ、４．５４ｇ）を添加する。得られた混合物を室温で１６時間撹拌する。沈殿物を濾過によって破棄する。濾過液を濃縮する。残渣を、ヘキサン（０〜２％）中の酢酸エチルの勾配混合物で溶出されたシリカゲル上のカラムクロマトグラフィーによって精製する。これにより、所望の産生物を無色の油として得る。
【０３５４】
ステップ２では、冷却器を備えた２５０ｍＬフラスコ中のアセトニトリル（７０ｍＬ）中のステップ１からの臭化物（１．３４等量、７．８８ｇ、１８．８ｍｍｏｌ）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．９６等量、２７．４８ｍｍｏｌ、４．７８ｍＬ）、およびＮ，Ｎ−ジメチルエチレンジアミン（１等量、１４．０２ｍｍｏｌ、１．２３６ｇ、１．５３１ｍＬ）の混合物を、７９℃（油浴）で１６時間加熱する。反応混合物を室温に冷却し、濃縮する。残渣を、酢酸エチルおよびヘキサン（１：９）、ならびに水の混合物中に取る。相を分離し、水（１００ｍＬ）およびブラインで洗浄する。次いで、硫酸ナトリウム上で乾燥させ、濃縮する（８．７ｇの油）。粗産生物（８．７ｇの油）を、シリカゲル（クロロホルム中の０〜３％  ＭｅＯＨ）上のカラムクロマトグラフィーによって精製される。所望の産生物を含有する分画を複合し、濃縮する。残渣を１ｍＬのヘキサンに溶解し、シリカゲルの層（３〜４ｍｍ、８ｍＬのヘキサンで洗浄）で濾過する。濾過液を、Ａｒのストリームを吹き付けて乾燥させ、真空で一晩十分に乾燥させる。所望の産生物を無色の油として得る。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ３．９６（ｄ，５．８Ｈｚ，４Ｈ），２．５５−２．５０（ｍ，２Ｈ），２．４３−２．３９（ｍ，４Ｈ），３．３７−３．３２（ｍ，２Ｈ），２．３０（ｔ，７．５Ｈｚ，４Ｈ），２．２３（ｓ，６Ｈ），１．６３（五重項様，７．６Ｈｚ，６Ｈ），１．４８−１．４０（ｍ，４Ｈ），１．３４−１．２０（５２Ｈ），０．８８（ｔ様，６．８Ｈｚ，１２Ｈ）。
【０３５５】
実施例７：脂質製剤の調製
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、およそ１０：１〜３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ重量比で調製され得る。手短に言えば、イオン化脂質（例えば、ＭＣ３、ＡＴＸ−００２、化合物６、化合物２２、式（Ａ’）もしくは（Ａ″）の化合物、または式（Ｂ’）、（Ｂ’）もしくは（Ｂ″））の化合物、非カチオン性脂質（例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ））、膜融合性をもたらすための構成成分（ステロールなど、例えば、コレステロール）、および複合脂質分子（ＰＥＧ−脂質など、例えば、１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール、２０００（「ＰＥＧ−ＤＭＧ」）の平均ＰＥＧ分子量を有する））を、５０：１０：３８．５：１．５のモル比でアルコール（例えば、エタノール）に可溶化する。ｃｅＤＮＡを緩衝溶液中で所望の濃度に希釈する。例えば、ｃｅＤＮＡを、酢酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび塩化マグネシウム、クエン酸塩、リンゴ酸、またはリンゴ酸および塩化ナトリウムを含む緩衝溶液中０．１ｍｇ／ｍＬ〜０．２５ｍｇ／ｍＬの濃度に希釈することができる。一実施例では、ｃｅＤＮＡは、１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４）中で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈する。アルコール脂質溶液を、例えば、シリンジポンプまたは衝突噴流ミキサーを使用し、約１：５〜１：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比で、１０ｍＬ／分を超える全流量で混合する。一実施例では、アルコール脂質溶液を、約１：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比で、１２ｍＬ／分の流量で混合する。アルコールを除去し、緩衝液を透析によってＰＢＳと置き換える。代替として、緩衝液を、遠心分離管を使用してＰＢＳと置き換えることができる。アルコール除去および同時緩衝液交換は、例えば、透析またはタンジェンシャル・フロー・フィルトレーションによって達成され得る。得られた脂質ナノ粒子を、さらに使用する前に、０．２μｍ孔無菌フィルターで濾過する。
【０３５６】
実施例８：脂質粒子製剤の分析
脂質ナノ粒子粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用する準弾性光散乱によって判定され得、およそ５５〜９５ｎｍの直径またはおよそ７０〜９０ｎｍの直径である。
【０３５７】
製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９−８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，１７２−１７６（２０１０）を参照。それら両方は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。ｐＫａの好ましい範囲は、約５〜約７である。各カチオン性脂質のｐＫａは、２−（ｐ−トルイジノ）−６−ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で判定される。０．４ｍＭ全脂質の濃度でのＰＢＳ中のカチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−脂質（５０／１０／３８．５／１．５ｍｏｌ％）からなる脂質ナノ粒子は、本明細書および他に記載されるインラインプロセスを使用して調製され得る。ＴＮＳは、蒸留水中の１００μＭストック溶液として調製され得る。小胞は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１３０ｍＭのＮａＣｌを含有する２ｍＬの緩衝溶液中の２４μＭ脂質に希釈され得、ｐＨは、２．５〜１１の範囲である。ＴＮＳ溶液のアリコートを添加して、１μＭの最終濃度にすることができ、続いて渦流混合発光強度を、３２１ｎｍの励起波長および４４５ｎｍの発振波長を使用し、ＳＬＭ  Ａｍｉｎｃｏ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２発光分光光度計において室温で測定する。Ｓ字状最良適合分析は、蛍光データに適用することができ、ｐＫａは、半最適蛍光強度を生じるｐＨとして測定される。
【０３５８】
脂質粒子中のｃｅＤＮＡの封入は、Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）アッセイによって判定され得る。Ｏｌｉｇｒｅｅｎ（登録商標）は、溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能）中のオリゴヌクレオチドおよび一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを定量化するための超鋭敏蛍光核酸染色である。代替として、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）を使用することができる。手短に言えば、封入は、核酸と会合したときに強化された蛍光を有する色素を使用する、膜不透過性蛍光色素排除アッセイを実施することによって判定され得る。封入は、脂質粒子製剤に色素を添加し、得られた蛍光を測定し、それを少量の非イオン性界面活性剤の添加時に観察される蛍光と比較することによって判定される。脂質二層の界面活性剤媒介性崩壊は、封入されたｃｅＤＮＡを放出し、それが膜不透過性色素と相互作用できるようにする。ｃｅＤＮＡの封入は、Ｅ＝（Ｉ０−Ｉ）／Ｉ０として計算することができ、／およびＩ０は、界面活性剤の添加前および添加後の蛍光強度を指す。
【０３５９】
相対活性は、尾静脈注入を介した投与の４時間後に肝臓内のルシフェラーゼ発現を測定することによって判定され得る。０．３および１．０ｍｇ  ｃｅＤＮＡ／ｋｇの用量で活性を比較し、投与の４時間後に測定された肝臓１ｇあたりのルシフェラーゼｎｇとして表される。
【０３６０】
実施例９：例示的なｃｅＤＮＡ−ＬＮＰの評価
例示的なｃｅＤＮＡを含む脂質ナノ粒子を、ＭＣ３、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＤＭＧ−ＰＥＧ２０００（モル比５０：１０：３８．５：１．５）を含む脂質溶液を使用して、様々なＮ／Ｐ比（例えば、３、４、５、および６）で調製した。酢酸ナトリウム、酢酸ナトリウムおよび塩化マグネシウム、クエン酸塩、リンゴ酸、またはリンゴ酸および塩化ナトリウムなどの塩を含む緩衝溶液中のｃｅＤＮＡベクターの水溶液を調製した。脂質溶液およびｃｅＤＮＡ溶液を、１：３（ｖ／ｖ）の脂質対ｅＤＮＡの比、１２ｍＬ／分の全流量で、ＮａｎｏＡｓｓｅｍｂｌｅｒ上でインハウス手順を使用して混合した。
【０３６１】
特徴付け
脂質ナノ粒子粒径および脂質ナノ粒子へのｃｅＤＮＡの封入を判定した。動的光散乱（ＺＥＮ３６００、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）によって粒径を判定した。封入効率は、ＬＮＰスラリーへのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加時の蛍光（Ｃ遊離）を測定し、この値を、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によってＬＮＰの溶解時に得られる全ｃｅＤＮＡ含有量（Ｃ全）と比較することにより、非封入ｃｅＤＮＡ含有量を判定することによって計算した。％封入＝（Ｃ全−Ｃ遊離）／Ｃ全×１００。結果を図９〜１１に示す。
【０３６２】
エンドソームエスケープアッセイ
ＬＮＰからのｃｅＤＮＡの封入および放出に対する血清およびＢＳＡの効果を判定した。エンドソーム模倣アニオン性リポソームを、クロロホルム中でＤＯＰＳ：ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ（モル比１：１：２）を混合し、続いて真空で溶媒蒸発させることによって調製した。乾燥脂質フィルムを、短い音波処理でＤＰＢＳ中に再懸濁し、続いて０．４５μｍシリンジフィラーで濾過して、アニオン性リポソームを形成した。
【０３６３】
ｃｅＤＮＡおよびＢＳＡを含有するＬＮＰまたは血清を、等量で一緒に混合した。混合物を、３７℃で２０分間インキュベートした。その後、アニオン性リポソームをＬＮＰ−ＢＳＡまたは血清混合物に、所望のアニオン性／カチオン性脂質モル比で、ｐＨ７．５または６．０のいずれかのＤＰＢＳ中で添加した。次いで、得られた複合体を３７℃でさらに１５分間インキュベートした。対照として、等量のＤＰＢＳを、アニオン性リポソームの代わりにＬＮＰ−ＢＳＡまたは血清混合物に添加した。ｐＨ７．５またはｐＨ６．０での異なる処理による遊離ｃｅＤＮＡは、ＬＮＰスラリーへのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加時の蛍光（Ｃ遊離）を測定し、この値を、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｃ全）によってＬＮＰの溶解時に得られる全ｃｅＤＮＡ含有量と比較することにより、非封入ｃｅＤＮＡ含有量を判定することによって計算した。％遊離＝Ｃ遊離／Ｃ全×１００。アニオン性リポソームでのインキュベーション後に放出された％ｃｅＤＮＡを、以下の等式に基づいて計算した。
％放出ｃｅＤＮＡ＝％遊離ｃｅＤＮＡアニオン性リポソームと混合−％遊離ｃｅＤＮＡＤＰＢＳと混合
【０３６４】
結果を図１２〜１５に示し、表５に要約する。
【表５】
2020537493.tif 000136
【０３６５】
ＡｐｏＥ結合
ＡｐｏＥへの脂質ナノ粒子の結合を判定した。ＬＮＰ（１０μｇ／ｍＬ）を３７℃で２０分間、１×ＤＰＢＳ中の等量の組み換えＡｐｏＥ３（５００μｇ／ｍＬ）でインキュベートした。インキュベーション後、ＬＮＰ試料を、１ｘＤＰＢＳを使用して１０倍に希釈し、下記の条件に従って、ＡＫＴＡピュア１５０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上でヘパリンセファロースクロマトグラフィーにより分析した。
【表６】
2020537493.tif 000137
【０３６６】
結果を図１６に示す。
【０３６７】
ＨＥＫ２９３発現
脂質ナノ粒子中に封入されたｃｅＤＮＡの発現を以下のようにアッセイした。
【０３６８】
ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎仔血清および１％ペニシリン−ストレプトマイシンで補充されたＤＭＥＭ＋ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）培養培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で５％  ＣＯ２、３７℃で維持した。細胞を、トランスフェクションの前日に３０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。リポフェクタミン（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）トランスフェクション試薬を、製造元のプロトコルに従い、１００ｎｇ／ウェルの対照ｃｅＤＮＡをトランスフェクトするために使用した。対照ｃｅＤＮＡを、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に希釈し、Ｐ３０００（商標）試薬を添加した。その後、リポフェクタミン（商標）３０００を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）中３％の最終濃度に希釈した。希釈したリポフェクタミン（商標）３０００を、希釈したｃｅＤＮＡに１：１の比で添加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、所望の量のｃｅＤＮＡ−脂質複合体またはＬＮＰを、細胞を含有する各ウェルに直接添加した。細胞を３７℃、５％  ＣＯ２で７２時間インキュベートした。ＨＥＫ２９３馴化培地中の分泌された第ＩＸ因子の発現レベルを、製造元の指示に従い、ＶｉｓｕＬｉｚｅ  ＦＩＸ抗原ＥＬＩＳＡキット（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）によって判定した。結果を図１７〜１９に示す。
【０３６９】
実施例１０：製剤Ａの化合物
ｃｅＤＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を、式（Ｉ）または（ＩＩ）の１つ以上の化合物と組み合わせて調製または製剤化することができ、好ましくは、ｃｅＤＮＡベクターの保存および治療的送達に好適なリポソームまたは脂質ナノ粒子を形成する。
【０３７０】
脂質粒子製剤の調製に有用な式（Ｉ）の化合物であって、以下の構造を有し、
【化１２７】
2020537493.tif 000138
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル、およびコレステリルからなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、およびＣ２〜Ｃ２０アルキニルからなる群から選択され、
Ｌは、Ｓ、Ｏ、Ｃ１〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｘ１は、非存在、
【化１２８】
2020537493.tif 000139
であり、
Ｘ２は、非存在、
【化１２９】
2020537493.tif 000140
であり、
各Ｒ６は、独立して、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、およびＣ２〜Ｃ２０アルキニルからなる群から選択される、化合物、
またはその塩。
【０３７１】
脂質粒子製剤の調製に有用な式（Ｉ）の化合物であって、以下の構造を有し、
【化１３０】
2020537493.tif 000141
式中、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ４の各々は、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル、およびコレステリルからなる群から選択され、
Ｒ３は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、およびＣ２〜Ｃ２０アルキニルからなる群から選択され、
Ｒ５は、非存在であるか、またはＣ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、およびＣ２〜Ｃ２０アルキニルからなる群から選択され、
Ｌは、Ｓ、Ｏ、Ｃ１〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルケニルからなる群から選択され、
Ｘ１は、非存在、
【化１３１】
2020537493.tif 000142
であり、
Ｘ２は、非存在、
【化１３２】
2020537493.tif 000143
であり、
各Ｒ６は、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、およびＣ２〜Ｃ２０アルキニルからなる群から選択され、
Ｒ５が存在するとき、
【化１３３】
2020537493.tif 000144
は、Ｒ５に対する共有結合であるか、もしくはＲ５が非存在であるとき、
【化１３４】
2020537493.tif 000145
は、非存在である、化合物、
またはその塩。
【０３７２】
式（Ｉ）または式（ＩＩ）のいくつかの例示的な化合物では、Ｒ１は、分岐Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ２は、直鎖Ｃ５〜Ｃ１０アルキルまたは分岐Ｃ１２〜Ｃ２０アルキルであり、Ｒ４およびＲ３は、各々独立して、直鎖Ｃ１〜Ｃ５アルキルであり、各Ｒ６は、独立して、直鎖または分岐Ｃ１〜Ｃ５アルキルであり、Ｌは、直鎖Ｃ１〜Ｃ３アルキルである。
【０３７３】
式（Ｉ）または（ＩＩ）の例示的な化合物は、図２０に示される化合物から選択される１つ以上の化合物であり得る。
【０３７４】
式（Ｉ）および（ＩＩ）の化合物の一般的な合成を図２１および２２に示し、各Ｒ値は、独立して選択される。
【０３７５】
一般に、上記に開示される出発化合物および他の化合物は、商用源から購入され得るか、または当業者に馴染みのある方法に従って調製され得る。熟練者であれば、従来の合成方法を使用し、当業者に既知の化学化合物および化学反応に関する参照書籍およびデータベースを通して、本明細書に記載される化合物中の最も置換された足場を構築することができるであろう。本明細書に開示される化合物の調製に有用な反応物の合成について詳述するか、または本明細書に開示される化合物の調製について説明する論文に参照文献を提供する好適な参照書籍および論文としては、例えば、″Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｓ．Ｒ．Ｓａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，“Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，″ｒｄ．Ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８３、Ｈ．Ｏ．Ｈｏｕｓｅ，″Ｍｏｄｅｍ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，″２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｉｎｃ．Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，Ｃａｌｉｆ．，１９７２、Ｔ．Ｌ．Ｇｌｉｃｈｒｉｓｔ，″Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，″２ｎｄ  Ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２、Ｊ．Ｍａｒｃｈ，″Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，″５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１が挙げられる。特定の類似反応物もまた、大部分の公共および大学のライブラリーにおいて入手可能である、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙによって調製される既知の化学物質の指標を通して、ならびにオンラインデータベース（さらなる詳細については、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）に問い合わせることができる）を通して同定され得る。既知であるが、カタログにおいて商業的に入手可能でない化学物質は、カスタム化学合成企業によって調製されてもよく、標準薬品供給会社の多くは、カスタム合成サービスをさらに提供する。
【０３７６】
実施例１１：製剤Ｂの化合物
ｃｅＤＮＡを含む他の脂質粒子は、この実施例に記載される式（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、または（Ｖ）の１つ以上の化合物と組み合わせて調製または製剤化することができ、好ましくは、ｃｅＤＮＡベクターの保存および治療的送達に好適なリポソームまたは脂質ナノ粒子を形成する。
【０３７７】
脂質粒子製剤の調製に有用な式（ＩＩＩ）の化合物であって、以下の構造を有し、
【化１３５】
2020537493.tif 000146
式中、
【化１３６】
2020537493.tif 000147
は、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロシクロアルキル、Ｃ３からＣ１０ヘテロシクロアルケニル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、およびＣ５〜Ｃ１０ヘテロアリールから選択される環状環を表し、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４の各々は、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル、およびコレステリルからなる群から選択され、
Ｘ１は、非存在、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、
【化１３７】
2020537493.tif 000148
であり、
Ｘ２は、非存在、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、
【化１３８】
2020537493.tif 000149
である、化合物、
またはその塩。
【０３７８】
式（ＩＩＩ）のいくつかの例示的な化合物では、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、およびＲ４のうちの少なくとも１つは、
【化１３９】
2020537493.tif 000150
である。
【０３７９】
式（ＩＩＩ）の化合物は、図２３に示される化合物から選択される化合物であり得る。
【０３８０】
脂質粒子製剤の調製に有用な式（ＩＶ）の化合物であって、以下の構造を有し、
【化１４０】
2020537493.tif 000151
式中、
ｎは、０〜１５０であり、
Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の各々は、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル、およびコレステリルからなる群から選択される、化合物、
またはその塩。
【０３８１】
脂質粒子製剤の調製に有用な式（Ｖ）の化合物であって、以下の構造を有し、
【化１４１】
2020537493.tif 000152
式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５の各々は、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル、およびコレステリルからなる群から選択され、
Ｘ１は、非存在、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、もしくは
【化１４２】
2020537493.tif 000153
であり、
Ｘ２は、非存在、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、
【化１４３】
2020537493.tif 000154
であり、
Ｘ３は、非存在、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、
【化１４４】
2020537493.tif 000155
である、化合物、
またはその塩。
【０３８２】
式（Ｖ）の例示的な化合物であって、限定されないが、以下を含み、
【化１４５】
2020537493.tif 000156
式中、ｎおよびｍは、各々独立して０〜２０であり、
各Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル、Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ２０アルケニル、Ｃ２〜Ｃ２０アルキニル、およびコレステリルからなる群から選択される、化合物、
またはその塩。
【０３８３】
式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、および式（Ｖ）の化合物の一般的な合成を図２４に示し、各Ｒ値は、独立して選択される。
【０３８４】
本明細書に記載されるプロセスにおいて、中間体化合物の官能基が、好適な保護基によって保護される必要があり得ることは、当業者によって理解されるであろう。そのような官能基としては、ヒドロキシ、アミノ、メルカプト、およびカルボン酸が挙げられる。ヒドロキシの好適な保護基としては、トリアルキルシリルまたはジアリールアルキルシリル（例えば、ｔ−ブチルジメチルシリル、ｔ−ブチルジフェニルシリル、またはトリメチルシリル）、テトラヒドロピラニル、ベンジル等が挙げられる。アミノ、アミジノ、およびグアニジノの好適な保護基としては、ｔ−ブトキシカルボニル、ベンジルオキシカルボニル等が挙げられる。メルカプトの好適な保護基としては、−Ｃ（Ｏ）−Ｒ″（式中、Ｒ″は、アルキル、アリール、またはアリールアルキルである）、ｐ−メトキシベンジル、トリチル等が挙げられる。カルボン酸の好適な保護基としては、アルキル、アリール、またはアリールアルキルエステルが挙げられる。保護基は、当業者に既知であり、本明細書に記載される標準技法に従って添加または除去され得る。保護基の使用は、Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｚ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９９９），３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において詳細に説明されている。当業者が理解するように、保護基はまた、Ｗａｎｇ樹脂、Ｒｉｎｋ樹脂、または２−クロロトリチル−クロリド樹脂などのポリマー樹脂であり得る。一般に、出発構成成分は、例えば、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＴＣＩ、およびＦｌｕｏｒｏｃｈｅｍ  ＵＳＡ等の供給元から取得され得るか、または当業者に既知の供給元に従って合成され得る（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０００）を参照。参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０３８５】
実施例１２：脂質製剤の調製
リポソームナノ粒子（ＬＮＰ）を調製することができる。カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、およびＰＥＧ−脂質は、５０：１０：３８．５：１．５のモル比でエタノールに可溶化され得る。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、およそ１０：１〜３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ重量比で調製され得る。手短に言えば、ｃｅＤＮＡは、１０〜５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ４）中で０．２ｍｇ／ｍＬに希釈される。シリンジポンプを使用して、エタノール脂質溶液をｃｅＤＮＡ水溶液と、約１：５〜１：３（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の比で、１５ｍＬ／分を超える全流量で混合することができる。次いで、エタノールを除去することができ、外部緩衝液は、透析によってＰＢＳと置き換えられる。最後に、脂質ナノ粒子を、０．２μｍ孔の無菌フィルターで濾過することができる。脂質ナノ粒子の粒径は、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＫ）を使用する準弾性光散乱によって判定され得るように、およそ５５〜９５ｎｍ直径であり、場合によっては、およそ７０〜９０ｎｍ直径である。
【０３８６】
製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９−８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，１７２−１７６（２０１０）を参照。それら両方は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。ｐＫａの好ましい範囲は、約５〜約７である。各カチオン性脂質のｐＫａは、２−（ｐ−トルイジノ）−６−ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で判定される。０．４ｍＭ全脂質の濃度でのＰＢＳ中のカチオン性脂質／ＤＳＰＣ／コレステロール／ＰＥＧ−脂質（５０／１０／３８．５／１．５ｍｏｌ％）からなる脂質ナノ粒子は、本明細書および他に記載されるインラインプロセスを使用して調製され得る。ＴＮＳは、蒸留水中の１００μＭストック溶液として調製され得る。小胞は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのＭＥＳ、１０ｍＭの酢酸アンモニウム、１３０ｍＭのＮａＣｌを含有する２ｍＬの緩衝溶液中の２４μＭ脂質に希釈され得、ｐＨは、２．５〜１１の範囲である。ＴＮＳ溶液のアリコートを添加して、１μＭの最終濃度にすることができ、続いて渦流混合発光強度を、３２１ｎｍの励起波長および４４５ｎｍの発振波長を使用し、ＳＬＭ  Ａｍｉｎｃｏ  Ｓｅｒｉｅｓ  ２発光分光光度計において室温で測定する。Ｓ字状最良適合分析は、蛍光データに適用することができ、ｐＫａは、半最適蛍光強度を生じるｐＨとして測定される。
【０３８７】
脂質ナノ粒子はまた、以下のモル２５比：５０％カチオン性脂質／１０％ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）／３８．５％コレステロール／１．５％  ＰＥＧ脂質（「ＰＥＧ−ＤＭＧ」、すなわち、（１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール、平均ＰＥＧ分子量２０００）を使用して、製剤化され得る。相対活性は、本明細書に記載される尾静脈注入を介した投与の４時間後に肝臓内のルシフェラーゼ発現を測定することによって判定され得る。０．３および１．０ｍｇ  ｃｅＤＮＡ／ｋｇの用量で活性を比較し、投与の４時間後に測定された肝臓１ｇあたりのルシフェラーゼｎｇとして表される。
【０３８８】
治療的ｃｅＤＮＡ構築物化合物は、以下のモル比：５０％カチオン性脂質／１０％ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）／３８．５％コレステロール／１．５％  ＰＥＧ脂質（「ＰＥＧ−ＤＭＡ」２−［２−（ｗ−メトキシ（ポリエチレングリコール２０００）エトキシ］−Ｎ，Ｎ−ジテトラデシルアセトアミド）を使用して製剤化され得る。相対活性は、上記のように、尾静脈注入を介した投与の４時間後に肝臓内のルシフェラーゼ発現を測定することによって判定され得る。０．３および１．０ｍｇ  ｍＲＮＡまたはＤＮＡ／ｋｇの用量で活性を比較し、上記のように、投与の４時間後に測定された肝臓１ｇあたりのルシフェラーゼｎｇとして表される。
【０３８９】
実施例１３：ｃｅＤＮＡベクターからのルシフェラーゼ導入遺伝子のインビボタンパク質発現
上記の構築物１〜８から産生されるｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子のインビボタンパク質発現は、マウスにおいて評価される。ｃｅＤＮＡ−プラスミド構築物１から取得されるｃｅＤＮＡベクター（実施例１の表５に記載される）を試験し、脂質ナノ粒子に含まれたｃｅＤＮＡベクターを含む組成物の、尾静脈への流体力学的注入後の、マウスモデルにおける持続した耐性のあるルシフェラーゼ導入遺伝子発現を実証した。ルシフェラーゼ導入遺伝子発現を、ＣＤ−１（登録商標）ＩＧＳマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＷＴマウス）への静脈内投与後に、ＩＶＩＳ撮像によって測定した。
【０３９０】
この研究は、ＣＤ−１（登録商標）ＩＧＳマウスにおける静脈内投与後に、ＩＶＩＳによる流体力学的ルシフェラーゼ発現非ウイルス性遺伝子療法ベクターの体内分布を評価する。ビヒクルは、無菌ＰＢＳである。この研究では、５匹のＣＤ−１マウスの２群に、尾静脈への１．２ｍＬの流体力学的注入を介して、ＰＢＳまたは０．３５ｍｇ／ｋｇのルシフェラーゼをコードするｃｅＤＮＡのいずれかを投与した。３、４、７、１４、２１、２８、３１、３５、および４２日目に、ルシフェラーゼ発現をＩＶＩＳ撮像によって評価した。手短に言えば、マウスに１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェリン基質を腹腔内的に注入した後、全身発光をＩＶＩＳ撮像を介して評価した。
【０３９１】
インビボルシフェラーゼ発現：５〜７週齢の雄ＣＤ−１  ＩＧＳマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に、１．２ｍＬ量中０．３５ｍｇ／ｋｇのｃｅＤＮＡベクター構築物１〜４  Ｌｕｃ（群１）を、０日目に静脈内流体力学的投与を介して投与する。各群の一部の動物に、同一用量のｃｅＤＮＡベクター構築物１〜４  Ｌｕｃ（群１）を２８日目に再投与する。
【０３９２】
ｃｅＤＮＡベクターからのルシフェラーゼの発現は、１５０ｍｇ／ｋｇのルシフェラーゼ基質の腹腔内（ｉ．ｐ．）注入後の、ＩＶＩＳ（登録商標）器具を使用するインビボ化学発光によって評価される。ＩＶＩＳ撮像を、３日目、４日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目、３１日目、３５日目、および４２日目に実施し、収集した器官を４２日目の屠殺後にエクスビボで撮像する。
【０３９３】
研究の経過中、動物を計量し、健康全般および幸福について毎日監視する。屠殺後、終端心臓穿刺によって各動物から血液を収集し、および２つの部分に分割し、１）血漿および２）血清に処理し、血漿は急速冷凍し、血清は肝臓酵素パネルに使用した後に急速冷凍する。追加として、肝臓、脾臓、腎臓、および鼠径リンパ節（ＬＮ）を収集し、ＩＶＩＳによってエクスビボで撮像する。
【０３９４】
ルシフェラーゼ発現を、ＭＡＸＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（登録商標）ルシフェラーゼＥＬＩＳＡアッセイ（ＢＩＯＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、肝臓試料のルシフェラーゼのためのｑＰＣＲ、肝臓試料の組織病理学、および／または血清肝臓酵素パネル（ＶｅｔＳｃａｎＶＳ２、Ａｂａｘｉｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｃａｒｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  Ｐｌｕｓ）によって、肝臓において評価する。
【０３９５】
参照文献
特許、特許出願、国際特許出願および公開を含む、明細書および実施例に列挙され、開示されるすべての参照文献は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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