(57)【要約】  本出願は、トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分と、有効量の１つ又は複数の加水分解酵素を含む酵素組成物とを混合するステップを含む、湿潤製粉工程におけるトウモロコシ穀粒からの総デンプン収量及び／又はグルテン収量を改善する方法を提供し、前記加水分解酵素の少なくとも１つは、ＧＨ３０ポリペプチド、ＧＨ５ポリペプチド又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分と、有効量の１つ又は複数の加水分解酵素を含む酵素組成物とを混合するステップを含む、湿式製粉工程におけるトウモロコシ穀粒からの総デンプン収量及び／又はグルテン収量を改善する方法であって、前記加水分解酵素の少なくとも１つが、ＧＨ３０ポリペプチド、ＧＨ５ポリペプチド又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
【請求項２】
前記湿式製粉工程における繊維から放出されるデンプン及び／又はグルテンの量が増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ａ）前記トウモロコシ穀粒を水に浸漬して浸漬穀粒を製造するステップと；
ｂ）前記浸漬穀粒を粉砕して、浸漬粉砕穀粒を製造するステップと；
ｃ）前記浸漬粉砕穀粒から胚芽を分離して、繊維、デンプン、及びグルテンを含むトウモロコシ穀粒塊を製造するステップと；
ｄ）前記得られたトウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供するステップと
を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分が、請求項３に記載のステップｄ）の前、最中又は後に、前記１つ又は複数の加水分解酵素と混合される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分が、請求項３に記載のステップｄ）の最中に、前記１つ又は複数の加水分解酵素と混合される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分が、少なくとも１５分間にわたり、前記１つ又は複数の加水分解酵素と反応させられる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記繊維洗浄手順が、１つ又は複数の加水分解酵素の導入のために最適化された繊維洗浄システムの使用を含み、前記繊維洗浄システムが、前記繊維洗浄システムにおける少なくとも３５分間且つ４８時間未満の総保持時間を提供するように構成された空間を含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記繊維洗浄システムに組み込まれた前記空間内のインキュベーション時間が、少なくとも５分間且つ４８時間未満である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記インキュベーション温度が２５℃〜９５℃である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧＨ５ポリペプチドがキシラナーゼ活性を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＨ３０ポリペプチドがキシラナーゼ活性を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＧＨ５ポリペプチドが、エンド−β−１，４−グルカナーゼ／セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）活性及び／又はエンド−β−１，４−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）活性及び／又はβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）活性及び／又はβ−マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２５）活性及び／又はβ−グルコシルセラミダーゼ（ＥＣ３．２．１．４５）活性及び／又はグルカンβ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５８）活性及び／又はリケニナーゼ（ＥＣ３．２．１．７３）活性及び／又はエキソ−β−１，４−グルカナーゼ／セロデキストリナーゼ（ＥＣ３．２．１．７４）活性及び／又はグルカンエンド−１，６−β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７５）活性及び／又はマンナンエンド−β−１，４−マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７８）活性及び／又はセルロースβ−１，４−セロビオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）活性及び／又はステリルβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１０４）活性又はエンドグリコセラミダーゼ（ＥＣ３．２．１．１２３）活性及び／又はキトサナーゼ（ＥＣ３．２．１．１３２）活性及び／又はβ−プリメベロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１４９）活性及び／又はキシログルカン−特定のエンド−β−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．１５１）活性及び／又はエンド−β−１，６−ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．１６４）活性及び／又はヘスペリジン６−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシル−β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１６８）活性及び／又はβ−１，３−マンナナーゼ（ＥＣ３．２．１．−）活性及び／又はアラビノキシラン−特定のエンド−β−１，４−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．−）活性及び／又はマンナントランスグリコシラーゼ（ＥＣ２．４．１．−）活性の１つ又は複数をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＧＨ３０ポリペプチドが、エンド−β−１，４−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）活性及び／又はβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）活性及び／又はβ−グルクロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３１）活性及び／又はβ−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）活性及び／又はβ−フコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３８）活性及び／又はグルコシルセラミダーゼ（ＥＣ３．２．１．４５）活性及び／又はβ−１，６−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．７５）活性及び／又はグルクロノアラビノキシランエンド−β−１，４−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．１３６）活性及び／又はエンド−β−１，６−ガラクタナーゼ（ＥＣ：３．２．１．１６４）活性及び／又は［還元末端］β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．−）活性の１つ又は複数をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＧＨ５ポリペプチドが、
ｉ）配列番号１〜３、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２に記載されるアミノ酸配列の成熟ポリペプチド；
ｉｉ）ｉ）の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有する、成熟ポリペプチド；
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のいずれか１つの成熟ポリペプチドの部分配列
からなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＧＨ３０ポリペプチドが、
ｉ）配列番号４；配列番号５；配列番号６又は配列番号７に記載されるアミノ酸配列の成熟ポリペプチド；
ｉｉ）ｉ）の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有する、成熟ポリペプチド；
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のいずれか１つの成熟ポリペプチドの部分配列
からなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記酵素組成物が、セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）、アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５（非還元末端α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ）；ＥＣ３．２．１．１８５（非還元末端β−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ）セロビオヒドロラーゼＩ（ＥＣ３．２．１．１５０）、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）、セロビオシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１７６）、β−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）又はプロテアーゼ（Ｅ．ＣＸＸＸＸ）からなる群から選択される１つ又は複数の酵素をさらに含む１つ又は複数の加水分解酵素を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記加水分解酵素の１つ又は複数が、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）などのセルラーゼバックグラウンドを有する生物において発現される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ又は複数の加水分解酵素が精製される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ又は複数の加水分解酵素が液体組成物中にある、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ又は複数の加水分解酵素が固体組成物中にある、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記トウモロコシ穀粒塊の１つ又は複数の画分と混合される１つ又は複数の加水分解酵素の有効量が、０．００５〜０．５ｋｇの酵素タンパク質／前記湿潤製粉工程に入るトウモロコシ穀粒の計量トンである、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法によって得られる、トウモロコシ繊維を含む組成物。
【請求項２３】
請求項１〜２１のいずれか一項で定義される湿式製粉工程においてトウモロコシ穀粒からの総デンプン収量及び／又はグルテン収量を改善する方法における、ＧＨ３０ポリペプチド及び／又はＧＨ５ポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好ましくは繊維洗浄中に、トウモロコシ穀粒と、ＧＨ３０ポリペプチド、ＧＨ５ポリペプチド又はそれらの組み合わせを含む酵素組成物とを接触させることによって、湿式製粉工程におけるトウモロコシ穀粒からのデンプン及び／又はグルテン収量を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のトウモロコシの湿式製粉は、デンプンと、胚芽、グルテン（タンパク質）、及び繊維をはじめとするいくつかの副産物との回収及び精製のために設計された方法である。繊維は最も価値のない副産物であるため、産業界では、繊維の割合を減らしながら、デンプンやグルテンなどのより価値の高い製品の収率を増加させることにかなりの努力を注いでいる。高品質デンプンは、乾燥デンプン、改質デンプン、デキストリン、甘味料、及びアルコールなどの製品にさらに加工された後に、様々な商業目的に使用され得るので価値がある。グルテンは通常、コーングルテンミール（約６０％のタンパク質）又はコーングルテンフィード（約２０％のタンパク質）として、動物の飼料のために使用される。
【０００３】
湿式製粉工程は、使用される特定の製粉装置に顕著に依存して変動し得るが、通常、工程は、穀粒洗浄、浸漬、粉砕、胚芽分離、二次粉砕、繊維分離、グルテン分離、及びデンプン分離を含む。トウモロコシ穀粒が洗浄された後、それらは典型的には、時間及び温度が制御された状態下で水又は希釈ＳＯ2溶液に浸漬することによって軟化される。次に、穀粒を粉砕して果皮を砕き、胚芽を穀粒の残りの部分から分離する。主に繊維、デンプン、及びグルテンからなる残留スラリーは、繊維洗浄工程で微粉砕及び篩掛けされ、繊維がデンプン及びグルテンから分離された後、グルテンとデンプンが分離され、デンプンは洗浄／濾過工程で精製され得る。
【０００４】
湿式製粉工程の浸漬ステップのための酵素の使用など、湿式製粉工程のいくつかのステップにおける酵素の使用が示唆されている。市販の酵素製品Ｓｔｅｅｐｚｙｍｅ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓから入手可能）は、湿式製粉工程の第１のステップ、すなわちトウモロコシ穀粒を水に浸す浸漬ステップに適することが示されている。
【０００５】
より最近では、トウモロコシ湿式製粉における全処理時間を顕著に短縮し、処理剤としての二酸化硫黄に対する必要を排除する、修正された湿式製粉である「酵素的製粉」が開発されている。Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ，８１，ｐ．６２６−６３２（２００４）。
【０００６】
米国特許第６，５６６，１２５号明細書は、トウモロコシ穀粒を水に浸漬して浸漬トウモロコシ穀粒を製造し、浸漬トウモロコシ穀粒を粉砕して粉砕トウモロコシスラリーを製造し、粉砕トウモロコシスラリーを酵素（例えば、プロテアーゼ）と共にインキュベートすることを伴う、トウモロコシからデンプンを得る方法を開示する。
【０００７】
米国特許第５，０６６，２１８号明細書は、穀粒を洗浄し、穀粒を水に浸漬して軟化させ、次に穀粒をセルラーゼ酵素と共に製粉することを含む、穀粒、特にトウモロコシを製粉する方法を開示する。
【０００８】
国際公開第２００２／０００７３１号パンフレットは、穀粒を水に１〜１２時間浸漬し、浸漬穀粒を湿式製粉して、穀粒を酸性プロテアーゼなどの１つ又は複数の酵素で処理することを含む、作物穀粒を処理する方法を開示する。
【０００９】
国際公開第２００２／０００９１１号パンフレットは、製粉デンプンを酸性プロテアーゼに曝すことを含む、デンプングルテンを分離する方法を開示する。
【００１０】
国際公開第２００２／００２６４４号パンフレットは、デンプンスラリーを酸性プロテアーゼの有効量を含む水溶液で洗浄することを含む、製粉工程のデンプンとグルテンの分離ステップから得られたデンプンスラリーを洗浄する方法を開示する。
【００１１】
国際公開第２０１４／０８２５６６号パンフレット及び国際公開第２０１４／０８２５６４号パンフレットは、湿式製粉で使用するためのセルロース分解性組成物を開示する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
当該技術分野では、トウモロコシの湿式製粉において、トウモロコシ穀粒の浸漬（ｓｔｅｅｐｉｎｇ）／浸漬（ｓｏａｋｉｎｇ）中、トウモロコシ穀粒の粉砕中、及びデンプンとグルテンの分離中に酵素を使用することの効果が研究されているが、トウモロコシ湿式製粉に関連するエネルギー消費量とコストを低下させ、デンプン及びグルテンの収率増大を与えてもよい、改善された酵素技術に対する必要性がなおもある。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
第１の態様では、本発明は、トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分と、有効量の１つ又は複数の加水分解酵素を含む酵素組成物とを混合するステップを含む、湿潤製粉工程におけるトウモロコシ穀粒から得られ得る総デンプン収量及び／又はグルテン収量を改善する方法に関し、前記加水分解酵素の少なくとも１つは、ＧＨ３０ポリペプチド、ＧＨ５ポリペプチド、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１４】
第２の態様では、本発明は、単離されたＧＨ３０ポリペプチド、単離されたＧＨ５ポリペプチド、又はその双方を含む酵素組成物、並びに湿式製粉工程でトウモロコシ穀粒から得られ得る総デンプン収量及び／又はグルテン収量を改善するためのこのような酵素組成物の使用に関する。
【００１５】
第３の態様では、本発明は、コーンスターチ、コーングルテン又はトウモロコシ繊維を含む組成物に関し、前記組成物は、本発明の第１の態様及び実施形態に記載される方法によって得られる。
【００１６】
その他の態様では、本発明は、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドと、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとに関する。
【００１７】
第４の態様では、本発明は、
（ａ）配列番号１０又は１２の成熟ポリペプチドと、少なくとも８０％の配列同一性を有する、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号９又は配列番号１１成熟ポリペプチドのコード配列と、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド；
（ｃ）１つ又は複数の位置における置換、欠失、及び／又は挿入を含む、配列番号１０又は１２の成熟ポリペプチドの変異型；及び
（ｄ）キシラナーゼ活性を有する、（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、キシラナーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。
【００１８】
第５の態様では、本発明は、本発明の第４の態様に記載のポリペプチドを含む組成物に関する。
【００１９】
本発明はまた、発現宿主でポリペプチドの産生を指示する、１つ又は複数の制御配列に作動可能に連結された本発明の第４の態様のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクト又は発現ベクターにも関する。
【００２０】
本発明、特に本発明による好ましい実施形態を添付の図面を参照して、より詳細に説明する。図面は本発明を具現化する方法を示し、添付の特許請求の範囲内に含まれるその他の可能な実施形態を限定するものとして解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】本発明による向流繊維洗浄システムの第１の実施形態を概略的に示す。
【図２】本発明によるシステムのさらなる実施形態を概略的に示す。
【図３】内蔵インキュベーターを有する篩ユニットを概略的に示す。
【図４】液体サイクロンの形態の篩ユニットを概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の目的は、好ましくは繊維洗浄手順中にトウモロコシ穀粒を加水分解酵素組成物で処理することによって、湿式製粉工程におけるトウモロコシ穀粒から得られ得るデンプン及び／又はグルテン収量を改善する方法を提供することである。本発明者らは、驚くことに、ＧＨ５ポリペプチド又はＧＨ３０ポリペプチド又はそれらの組み合わせによるトウモロコシ穀粒の酵素処理が、繊維からの結合デンプン及びグルテンの放出を改善し、したがって得られ得るデンプン及び／又はグルテン収量を改善することを発見した。
【００２３】
湿式製粉工程：
トウモロコシ穀粒は、穀粒を割って、穀粒をその４つの主要成分であるデンプン、胚芽、繊維、及びグルテンに分離するために、湿式製粉される。
【００２４】
湿式製粉工程は、製粉機毎に顕著に変動し得るが、従来の湿式製粉は通常以下のステップを含む。
１．浸漬及び胚芽分離、
２．繊維洗浄手順、
３．デンプン／グルテン分離、及び
４．デンプン洗浄。
【００２５】
１．浸漬、粉砕、及び胚芽分離
約５０℃、例えば、約４５℃〜６０℃の温度で、約３０分間〜約４８時間、好ましくは３０分間〜約１５時間、例えば、約１時間〜約６時間にわたり、水に浸漬することによってトウモロコシ穀粒を軟化させる。浸漬中に穀粒は水分を吸収し、水分レベルが１５パーセントから４５パーセントに増加してサイズは２倍を超える。例えば、０．１パーセント二酸化硫黄（ＳＯ2）及び／又はＮａＨＳＯ3を水に任意に添加することは、温かい環境内における過剰な細菌増殖を防ぐ。トウモロコシが膨潤して軟化するにつれて、浸漬水の弱酸性がトウモロコシ中のグルテン結合を緩め始め、デンプンを放出する。トウモロコシ穀粒が浸漬された後、それらは挽き割られて胚芽が放出される。胚芽はコーンオイルを含有する。胚芽は、厳密に制御された条件下で、その他の物質を含まない胚芽部分を本質的に「浮遊させる」ことによって、デンプン、グルテン、及び繊維のより高密度の混合物から分離される。この方法は、後時の加工ステップにおける微量のコーンオイルの悪影響を排除するのに役立つ。
【００２６】
２．繊維洗浄手順
最終製品中の繊維を最小限に抑えながら、最大のデンプン及びグルテンの回収率を得るためには、加工中に遊離デンプン及びグルテンを繊維から洗い流す必要がある。繊維は収集されてスラリー化され、スクリーニングされて、あらゆる残留デンプン又はグルテンが回収される。
【００２７】
３．デンプングルテン分離
製粉デンプンと称される、繊維洗浄ステップからのデンプン−グルテン懸濁液は、デンプン及びグルテンに分離される。グルテンは、デンプンと比較して密度が低い。製粉デンプンを遠心分離機に通過させることによって、グルテンは容易に遠心脱水される、
【００２８】
４．デンプン洗浄
デンプン分離ステップからのデンプンスラリーは、いくらかの不溶性タンパク質及び多くの可溶性物質を含む。最高品質のデンプン（高純度デンプン）を製造する前に、それらを除去する必要がある。わずか１又は２パーセントのタンパク質が残留するデンプンは、ヒドロクローン（ｈｙｄｒｏｃｌｏｎｅｓ）内で希釈され、８〜１４回浄洗され、再希釈され、再洗浄されて、最後の微量のタンパク質が除去され、典型的に純度９９．５％を超える高品質デンプンが製造される。
【００２９】
湿式製粉の製品：湿式製粉を使用して、限定されるものではないが、コーンスティープリカー、コーングルテンフィード、胚芽、コーンオイル、コーングルテンミール、コーンスターチ、改質コーンスターチ、コーンシロップなどのシロップ、及びコーンエタノールが製造され得る。
【００３０】
酵素の定義：
セルロース分解酵素又はセルラーゼ／セルラーゼ活性又はセルロース分解活性があるポリペプチド：「セルロース分解酵素」、「セルラーゼ」、及びセルラーゼ活性又はセルロース分解活性があるポリペプチドという用語は、本明細書で同義的に使用され、繊維などのセルロースを含む任意の材料を含むセルロース系材料を加水分解する、１つ又は複数の（例えば、いくつかの）酵素を指す。セルロース分解酵素としては、エンドグルカナーゼ（Ｅ．Ｃ３．２．１．４）、セロビオヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ３．２．１．９１及びＥ．Ｃ３．２．１．１５０）、β−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）、又はそれらの組み合わせが挙げられる。セルロース分解酵素活性を測定するための２つの基本的なアプローチとしては、以下が挙げられる：（１）総セルロース分解酵素活性を測定する、及び（２）Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ２４：４５２−４８１で概説されるように、個々のセルロース分解酵素活性（エンドグルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びβ−グルコシダーゼ）を測定する。総セルロース分解酵素活性は、ワットマン＃１濾紙、微結晶セルロース、細菌セルロース、藻類セルロース、綿、前処理リグノセルロースなどの不溶性基質を使用して測定され得る。最も一般的な総セルロース分解活性アッセイは、ワットマン＃１濾紙を基質として使用する濾紙アッセイである。アッセイは、国際純正応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）によって確立された（Ｇｈｏｓｅ，１９８７，Ｐｕｒｅ  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．５９：２５７−６８）。
【００３１】
セルロース分解性酵素活性はまた、以下の条件下における、セルロース分解性酵素によるセルロース系材料の加水分解中の糖生成／放出の増加を測定することによって判定され得る：１〜５０ｍｇのセルロース分解性酵素タンパク質／前処理トウモロコシ茎葉（ＰＣＳ）（又はその他の前処理セルロース系材料）中のセルロースｇ、４０℃〜８０℃、例えば、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、又は８０℃などの適切な温度で３〜７日間、及び４〜９、例えば、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、又は９．０などの適切なｐＨ、セルロース分解性酵素タンパク質の添加なしの対照加水分解との比較。典型的な条件は、１ｍｌの反応物、洗浄又は未洗浄ＰＣＳ、５％不溶性固体（乾燥重量）、５０ｍＭ酢酸ナトリウム５、ｐＨ５、１ｍＭのＭｎＳＯ４、５０℃、５５℃、又は６０℃で７２時間、ＡＭＩＮＥＸ（登録商標）ＨＰＸ−８７Ｈカラムクロマトグラフィー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）による糖分析である。
【００３２】
加水分解酵素又はヒドロラーゼ／加水分解酵素活性があるポリペプチド：「加水分解酵素」及び加水分解酵素活性があるポリペプチドは、本明細書で同義的に使用され、水を使用して基質を分解する任意の触媒タンパク質を指す。加水分解酵素としては、セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５（非還元末端α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ）；ＥＣ３．２．１．１８５（非還元末端β−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ）セロビオヒドロラーゼＩ（ＥＣ３．２．１．１５０）、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）、セロビオシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１７６）、β−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）が挙げられる。
【００３３】
キシラナーゼ／キシラナーゼ活性があるポリペプチド：「キシラナーゼ」及びキシラナーゼ活性があるポリペプチドという用語は、本明細書で同義的に使用され、キシランの１，４−β−Ｄ−キシロシド結合のエンド加水分解を触媒する、１，４−β−Ｄ−キシラン−キシロヒドロラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．８）を指す。キシラナーゼ活性は、０．０１％トリトン（登録商標）Ｘ−１００及び２００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ６、３７℃中で、０．２％ＡＺＣＬ−アラビノキシランを基質として使用して測定され得る。キシラナーゼ活性の１単位は、ｐＨ６の２００ｍＭリン酸ナトリウム中で、基質としての０．２％ＡＺＣＬ−アラビノキシランから、３７℃及びｐＨ６で毎分１．０μモルのアズリンを生成する、キシラナーゼ活性の量として定義される。
【００３４】
その他の定義：
本文脈では、用語は当業者に普通であるように使用される。これらの用語のいくつかを以下で説明する。
【００３５】
接触時間：１つ又は複数の酵素が基質と反応するためには、１つ又は複数の酵素が基質と接触していなければならない。「接触時間」とは、１つ又は複数の酵素の有効量が、基質塊の少なくとも一部と接触している時間を指す。酵素は、接触時間中に全ての基質塊と接触していなくてもよいが、１つ又は複数の酵素を基質塊と混合することで、接触時間中に基質塊の一部が酵素触媒加水分解されるようにする。
【００３６】
トウモロコシ穀粒：例えば、デントコーン、フリントコーン、ポッドコーン、ストライプメイズ、甘味種トウモロコシ、ワキシーコーンなどをはじめとする、様々なトウモロコシ穀粒が知られている。いくつかのトウモロコシ穀粒は、穀粒中の胚芽を保護する「果皮」と称される外被を有する。それは水と水蒸気に抵抗し、昆虫及び微生物にとって望ましくない。「果皮」によって被覆されていない穀粒の唯一の領域は「先端キャップ」であり、これは穀粒の穂軸への付着点である。
【００３７】
トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分：この用語は、湿式製粉工程を通じてトウモロコシ穀粒を記述するために使用される。トウモロコシ穀粒が分解され処理される際にこの用語が使用される場合、トウモロコシ穀粒の全ての分画された部分が包含されると見なされる。この用語には、例えば、浸漬穀粒、粉砕穀粒、トウモロコシ穀粒塊、トウモロコシ穀粒塊の第１の画分、第２の画分、１つ又は複数の画分などが含まれる。
【００３８】
トウモロコシ穀粒塊：好ましくは、繊維、グルテン、及びデンプンを含む塊に言及するために使用され、好ましくは、作物穀粒を蒸煮及び粉砕し、繊維、グルテン及びデンプンを含む塊を胚芽から分離することによって得られる。トウモロコシ穀粒塊が繊維洗浄を通過するにつれて、それは第１の画分（ｓ）及び第２の画分（ｆ）などのいくつかの画分に分離される。したがって、「トウモロコシ穀粒塊の画分」及び「トウモロコシ穀粒塊の１つ又は複数の画分」は、とりわけこれらの第１（ｓ）及び第２の画分（ｆ）を指す。
【００３９】
「ｃＤＮＡ」という用語は、真核細胞又は原核細胞から得られる成熟しスプライスされたｍＲＮＡ分子からの逆転写によって調製され得る、ＤＮＡ分子を意味する。ｃＤＮＡは、対応するゲノムＤＮＡ中に存在してもよい、イントロン配列を欠く。最初の一次ＲＮＡ転写物はｍＲＮＡの前駆体であり、それはスプライシングをはじめとする一連のステップを経てプロセッシングされ、成熟しスプライスされたｍＲＮＡとして出現する。
【００４０】
コード配列：「コード配列」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列を直接特定する、ポリヌクレオチドを意味する。コード配列の境界は一般に、ＡＴＧ、ＧＴＧ、又はＴＴＧなどの開始コドンで始まり、ＴＡＡ、ＴＡＧ、又はＴＧＡなどの停止コドンで終わる、開いた読み枠によって決定される。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、又はそれらの組み合わせであってもよい。
【００４１】
制御配列：「制御配列」という用語は、本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現に必要な核酸配列を意味する。各制御配列は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにとって、天然（すなわち、同一遺伝子に由来する）又は外来性（すなわち、異なる遺伝子に由来する）であってもよく、又は互いに天然又は外来性であってもよい。このような制御配列としては、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、及び転写ターミネーターが挙げられるが、これに限定されるものではない。少なくとも、制御配列には、プロモーター、転写及び翻訳停止シグナルが含まれる。制御配列は、制御配列と、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコード領域とのライゲーションを促進する、特定の制限部位を導入する目的で、リンカーを備えていてもよい。
【００４２】
発現：「発現」という用語は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、及び分泌をはじめとするが、これに限定されるものではない、ポリペプチドの産生に関与するあらゆるステップを含む。
【００４３】
発現ベクター：「発現ベクター」という用語は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、その発現を提供する制御配列に作動可能に連結された、線状又は環状ＤＮＡ分子を意味する。
【００４４】
断片：「断片」という用語は、成熟ポリペプチドのアミノ及び／又はカルボキシル末端に存在しない、１つ又は複数の（例えば、いくつかの）アミノ酸を有するポリペプチドを意味し、断片はペクチンリアーゼ活性を有する。
【００４５】
胚芽：「胚芽」はトウモロコシ穀粒の唯一の生きている部分である。それは、穀粒がトウモロコシ植物に成長するのに不可欠な遺伝情報、酵素、ビタミン、及びミネラルを含有する。黄色デントコーンでは、胚芽の約２５パーセントがコーンオイルである。胚芽に被覆され又は取り囲まれている内胚乳は、穀粒乾燥重量の約８２％を構成し、発芽種子のエネルギー源（デンプン）及びタンパク質源である。内胚乳には、軟質及び硬質の２種類がある。硬質内胚乳では、デンプンはしっかりと詰まっている。軟質内胚乳では、デンプンはほぐれている。
【００４６】
ＧＨ５ポリペプチド：酵素活性があるポリペプチドを指し、ポリペプチドは、炭水化物活性酵素（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ｅｎＺＹｍｅｓ）（ＣＡＺｙｍｅｓ）のデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）中で、グリコシドヒドロラーゼファミリー５のメンバーとして分類されている。
【００４７】
ＧＨ３０ポリペプチドは、酵素活性を有するポリペプチドを指し、ポリペプチドは炭水化物活性酵素（ＣＡＺｙｍｅｓ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）において、グリコシドヒドロラーゼファミリー３０のメンバーとして分類される。
【００４８】
グルテン：グルテンは、２つの小型タンパク質であるグルテニンとグリアジンから構成されるタンパク質である。本明細書において「グルテン」とは、トウモロコシ穀粒に見られるタンパク質の大部分を指す。トウモロコシ湿式製粉からのグルテンの主な製品は、コーングルテンミール（約６０％のタンパク質）とコーングルテンフィード（約２０％のタンパク質）である。
【００４９】
粉砕する又は粉砕：「粉砕」という用語は、トウモロコシ穀粒をより小さな成分に破壊することを指す。
【００５０】
宿主細胞：「宿主細胞」という用語は、本発明のポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクト又は発現ベクターを用いた、形質転換、形質移入、形質導入などを受け易い、任意の細胞型を意味する。「宿主細胞」という用語は、複製中に起こる変異のために親細胞と同一ではない、親細胞の子孫を包含する。
【００５１】
単離された：「単離された」という用語は、天然には存在しない形態又は環境にある物質を意味する。単離された物質の非限定的例としては、（１）任意の非天然物質、（２）それが天然に結合している１つ又は複数の又は全ての天然に存在する構成物から少なくとも部分的に除去された、任意の酵素、変異型、核酸、タンパク質、ペプチド又は補因子をはじめとするが、これに限定されるものではない、任意の物質；（３）天然に見られる物質と比較して、人の手によって修飾された任意の物質；又は（４）それが天然に結合しているその他の構成要素と比較して、物質の量を増やすことによって修飾された任意の物質（例えば、宿主細胞内の組換え生産；物質をコードする遺伝子の複数のコピー；及び物質をコードする遺伝子と天然に結合しているプロモーターよりも、強力なプロモーターの使用）が挙げられる。
【００５２】
インキュベーション時間：トウモロコシ穀粒塊の１つ又は複数の画分が、篩掛けされることなく、繊維洗浄中に加水分解酵素と接触する時間。
【００５３】
多くの好ましい実施形態では、本発明による方法は、空間（Ｖ）又は「インキュベーター」を含むシステムを利用し、その内部では、材料は酵素によって「影響を受けるまま」であり、このような状況では、インキュベーション時間は、
【数１】
2020528748.tif 000003
によって決定されてもよい。代案としては、インキュベーターへの流入が単位時間当たりの容積で表されるならば：
【数２】
2020528748.tif 000004
【００５４】
成熟ポリペプチド：「成熟ポリペプチド」という用語は、翻訳に続く、そしてＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化などの任意の翻訳後修飾に続く、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。一態様では、成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜２０がシグナルペプチドであると予測するコンピュータプログラムＳｉｇｎａｌＰ（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １０：１−６）に基づく、配列番号２のアミノ酸２１〜６７８である。宿主細胞が、同一ポリヌクレオチドによって発現される、２つ以上の異なる成熟ポリペプチド（すなわち、異なるＣ末端及び／又はＮ末端アミノ酸がある）の混合物を産生してもよいことは、当該技術分野で公知である。異なる宿主細胞が異なる方法でポリペプチドをプロセッシングし、したがって、ポリヌクレオチドを発現する１つの宿主細胞が、同一ポリヌクレオチドを発現する別の宿主細胞と比較して、異なる成熟ポリペプチド（例えば、異なるＣ末端及び／又はＮ末端アミノ酸を有する）を産生してもよいこともまた、当該技術分野で公知である。
【００５５】
成熟ポリペプチドコード配列：「成熟ポリペプチドコード配列」という用語は、成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００５６】
製粉装置：「製粉装置」は、製粉で使用される全ての装置を指す。湿式製粉工程は、利用可能な製粉装置に応じて変化する。製粉装置の例は、浸漬タンク、蒸発器、スクリュープレス、回転乾燥機、脱水篩、遠心分離機、液体サイクロンなどであり得る。各製粉装置／製粉ラインのサイズ及び数は、製粉機によって変動し得て、それは製粉工程に影響を及ぼすであろう。例えば、繊維洗浄篩ユニットの数は変動し得て、遠心分離機のサイズについても同様である。
【００５７】
核酸コンストラクト：「核酸コンストラクト」という用語は、１つ又は複数の制御配列を含み、天然に存在する遺伝子から単離されるか、そうでなければ天然には存在せず又は合成である、核酸のセグメントを含むように修飾された、一本鎖又は二本鎖のどちらかである核酸分子を意味する。
【００５８】
作動可能に連結された：「作動可能に連結された」という用語は、制御配列がコード配列の発現を指示するように、制御配列がポリヌクレオチドのコード配列に対して適切な位置に配置された形状を意味する。
【００５９】
保持時間：１つ又は複数の加水分解酵素とトウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分が、繊維洗浄手順中に反応させられる時間。
【００６０】
いくつかの実施形態では、滞留時間は、第１の篩ユニット（Ｓ１）に受け入れられたトウモロコシ穀粒塊及びその１つ又は複数の画分が、繊維洗浄システムを再び出る前に、１つ又は複数の加水分解酵素の有効量と接触する時間である。滞留時間中に、トウモロコシ穀粒塊の１つ又は複数の画分は、最上流篩ユニット（Ｓ１）からの第１の画分（ｓ１）の一部として、又は最下流篩ユニット（Ｓ４）からの第２の画分（ｆ４）の一部として繊維洗浄システムを出る前に、空間（Ｖ）内で１つ又は複数の加水分解酵素と共にインキュベートされる。
【００６１】
保持時間は、本発明に関連して定義されるように、好ましくは、固形物が繊維洗浄システム中で費やす平均時間として推定されてもよい。これは以下の関係によって推定されてもよい：
【数３】
2020528748.tif 000005
代案としては、システムへの流入が単位時間当たりの容積で表されるならば：
【数４】
2020528748.tif 000006
システムの容積は典型的に、システム内の全ての空隙の容積の合計に等しく設定される；しかし、システム内の管材料は典型的には小さく作られるので、管の容積を棄却することが好ましくあってもよい。
【００６２】
篩掛け：「篩掛け」又は「篩掛けする」という用語は、トウモロコシ穀粒塊を第１の画分ｓ及び第２の画分ｆに分離する工程、及び１つの篩ユニットから別のユニットへのこれらの画分の移動を指す。非篩掛け時間は、トウモロコシ穀粒塊又はその画分と酵素とのインキュベーションのために提供される、非分離時間である。
【００６３】
配列同一性：２つのアミノ酸配列間又は２つのヌクレオチド配列間の関連性は、パラメータ「配列同一性」によって記述される。
【００６４】
本発明の目的で、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）を用いて、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７）で実装されているように、好ましくはバージョン３．０．０以降で判定される。バージョン６．１．０が用いられた。
【００６５】
使用されるオプションのパラメータは、１０のギャップオープンペナルティ、０．５のギャップ伸長ペナルティ、及びＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされた（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得された）Ｎｅｅｄｌｅの出力が同一性百分率として使用され、以下のように計算される：（同一残基×１００）／（アラインメント長さ−アラインメント中のギャップ総数）。
【００６６】
デンプン：「デンプン」という用語は、アミロース及びアミロペクチンからなる、貯蔵顆粒の形態で植物組織中に広く存在するグルコース単位からなる、植物の複合多糖類からなる任意の材料を意味し、（Ｃ6Ｈ10Ｏ5）ｎとして表され、式中、ｎは任意の数値である。
【００６７】
浸漬（ｓｔｅｅｐｉｎｇ）又は浸漬（ｓｏａｋｉｎｇ）：「浸漬」という用語は、穀粒を水及び任意選択的にＳＯ2に浸漬することを意味する。
【００６８】
発明の説明：本発明の一態様は、トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分と、有効量の１つ又は複数の加水分解酵素を含む酵素組成物とを混合するステップを含む、湿式製粉工程におけるトウモロコシ穀粒から得られ得る総デンプン収量及び／又はグルテン収量を改善する方法を提供することであり、前記加水分解酵素の少なくとも１つは、ＧＨ３０ポリペプチド、ＧＨ５ポリペプチド又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００６９】
トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分中のデンプン及び／又はグルテンの一部は、繊維画分に結合し、湿式製粉工程中には決して放出されなくてもよい。しかし、トウモロコシ穀粒に存在する基質を水を使用して分解し得る任意の触媒タンパク質が含まれてもよい加水分解酵素の添加は、結合デンプン及び／又はグルテンの一部を放出させてもよく、したがって湿式製粉工程におけるデンプン及び／又はグルテンの総収量が改善される。本発明者らは、驚くことに、ＧＨ５ポリペプチド及びＧＨ３０ポリペプチドが、繊維画分中の結合デンプン及びグルテンの量を減少させるのに特に有効であることを発見した。
【００７０】
一実施形態では、本発明の方法は、繊維洗浄手順中などの工程中に、繊維から放出されるデンプン及び／又はグルテンの量の増加をもたらす。
【００７１】
湿式粉砕工程で用いられる特定の手順及び装置は変動し得るが、工程の主な原理は同じままである（湿式粉砕工程の説明を参照されたい）。
【００７２】
一実施形態では、本発明の方法は、
ａ）トウモロコシ穀粒を水に浸漬して浸漬穀粒を製造するステップと；
ｂ）浸漬穀粒を粉砕して、浸漬粉砕穀粒を製造するステップと；
ｃ）浸漬粉砕穀粒から胚芽を分離して、繊維、デンプン、及びグルテンを含むトウモロコシ穀粒塊を製造するステップと；
ｄ）得られたトウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供するステップと
を含む。
【００７３】
最終製品中の繊維を最小限に抑えながら、最大のデンプン及びグルテンの回収量を得るためには、加工中に遊離デンプン及びグルテンを繊維画分から洗い流す必要がある。典型的には、トウモロコシ穀粒の浸漬、粉砕、胚芽の分離（湿式粉砕工程の説明を参照されたい）後に、繊維が、収集、スラリー化、及び篩い分けされ、トウモロコシ穀粒塊中の残留デンプン又はグルテンが回収される。この工程は、本明細書で繊維洗浄手順と称される。
【００７４】
一実施形態では、前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分は、トウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供するステップの前、最中、又は後に、前記１つ又は複数の加水分解酵素と混合される。
【００７５】
一実施形態では、前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分は、トウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供するステップの前に、前記１つ又は複数の加水分解酵素と混合される。この実施形態によれば、トウモロコシ穀粒は、好ましくは、浸漬中に、粉砕中に、及び／又は胚芽分離中に、前記１つ又は複数の加水分解酵素と混合される。
【００７６】
一実施形態では、前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分は、トウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供するステップの後に、前記１つ又は複数の加水分解酵素と混合される。
【００７７】
好ましい実施形態では、前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分は、トウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供するステップの最中に、前記１つ又は複数の加水分解酵素と混合される。
【００７８】
一実施形態では、前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分は、前記１つ又は複数の加水分解酵素と、少なくとも２０分間、少なくとも２５分間、少なくとも３０分間、少なくとも３５分間、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも５５分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、少なくとも１００分間、少なくとも１１０分間又は少なくとも１２０分間など、少なくとも１５分間反応させられる。
【００７９】
繊維洗浄手順で使用される特定の機器は変動し得るが、工程の主な原則は同じままである。
【００８０】
一実施形態では、前記繊維洗浄手順は、１つ又は複数の加水分解酵素の導入のために最適化された繊維洗浄システムの使用を含み、繊維洗浄システムは、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、少なくとも１００分間、少なくとも１１０分間又は少なくとも１２０分間など、少なくとも３５分間、及び４０時間未満、３６時間未満、３０時間未満、２４時間未満、２０時間未満、１２時間未満、１０時間未満、８時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満など、４８時間未満の繊維洗浄システム中の総反応時間（保持時間）を提供するように構成された空間（Ｖ）を含む。一実施形態では、繊維洗浄システム中の総保持時間は、３５分間〜２４時間、３５分間〜１２時間、３５分間〜６時間、３５分間〜５時間、３５分間〜４時間、３５分間〜３時間、３５分間〜２時間、４５分間〜４８時間、４５分間〜２４時間、４５分間〜時間、４５分間〜６時間、４５分間〜５時間、４５分間〜４時間、４５分間〜３時間、４５分間〜２時間１〜４８時間、１〜２４時間、１〜１２時間、１〜６時間、１〜５時間、１〜４時間、１〜３時間、１〜２時間など、３５分間〜４８時間である。
【００８１】
一実施形態では、繊維洗浄システムは、以下を含む：
−向流洗浄構成で流体連結された複数の篩ユニット（Ｓ１．．．Ｓ４）；各篩ユニットは、トウモロコシ穀粒塊と液体の流れを第１の画分（ｓ）と第２の画分（ｆ）の２つの画分に分離するように構成されており、前記第２の画分（ｆ）は、重量％繊維での測定で第１の画分（ｓ）よりも多い量を含有し；
−空間（Ｖ）がシステム内に配置され、前記第１の画分の（ｓ）、前記第２の画分（ｆ）、又は混合された第１及び第２の画分（ｓ、ｆ）、好ましくは第２の画分（ｆ）のみを受け入れるように流体連結され、前記空間内に受け入れられた片方又は双方の画分に対してインキュベーション時間を提供するように構成されており；それによってインキュベートされた片方又は双方の画分を下流の篩ユニット（Ｓ４）に排出し、
システムは、以下のために構成されている：
−トウモロコシ穀粒塊及び液体を最上流の篩ユニット（Ｓ１）に注入し、
−最上流の篩ユニットｔ（Ｓ１）からの第１の画分（ｓ１）をデンプンを含有する生成流として排出し、
−プロセス水を注入し、好ましくはプロセス水を最下流の篩ユニット（Ｓ４）に注入するように配置され、
−最下流の篩ユニット（Ｓ４）から、前記第２の画分（ｆ４）を、前記最初のトウモロコシ穀粒塊よりも少ない量のデンプン及びグルテンを含有する洗浄されたトウモロコシ穀粒塊として排出し、
−前記システムに加水分解酵素を導入する。
【００８２】
図１は、上述のように繊維洗浄システムの実施形態を概略的に示す。図１に示されるように、繊維洗浄システムは、向流洗浄構成で流体的に接続されている複数の篩ユニットＳ１、Ｓ２、Ｓ３、Ｓ４を含む。流体連結は、典型的には、篩ユニット間で物質を輸送するためのパイプなどの流路を使用して、篩ユニットが連結されていることを意味する。篩ユニットＳ１〜Ｓ４のそれぞれは、トウモロコシ穀粒塊と液体の流れを２つの画分、すなわち第１の画分ｓ（ｓ１、ｓ２、ｓ３、ｓ４）と第２の画分ｆ（ｆ１、ｆ２、ｆ３、ｆ４）とに分離するように構成される。当業者は理解するであろうように、繊維洗浄システムにおいて生成される第１の画分の数は、システムに含まれる篩ユニットの数に左右される。システム内の篩ユニットの数は、好ましくは２〜８であり、このような実施形態では、第１及び第２の画分の数もまた２〜８である。篩ユニットは、典型的には、固体が別の流れ中で分離され、それによって第２の画分ｆは、重量％繊維での測定で第１の画分ｓよりも多い量を含有するように構成される。図において、表記「ｓ」は、好ましくは繊維のない流れ（デンプンを含有する）を指し、表記「ｆ」は、好ましくは繊維を含有する流れを指す。ｆ及びｓの指数は、流れの起源を指す。第１の画分ｓがいかなる繊維も含まないことが好ましいが、これは実用的設定では達成し難いことに留意されたい。
【００８３】
システム内の流れは、下流方向と上流方向に、各篩ユニットを有し、例えば篩ユニットＳ３は、例えばＳ２の上流の篩ユニットから、例えばｆ２の流れを受け入れ、例えばｓ３の流れを例えばＳ２の上流篩ユニットへ送達する。同様に、篩ユニットＳ３は、下流篩ユニットＳ４から流れｓ４を受け入れ、流れｆ３を下流篩ユニットＳ４に送達する。
【００８４】
図１に示されるように、典型的にはシステム内の洗浄水として使用される水であるプロセス水は、最下流の篩ユニットＳ４に供給され、プロセス水は典型的には繊維を含有しない水である。トウモロコシ穀粒塊は、典型的には最上流の篩ユニットＳ１に供給される、液体懸濁液（典型的には水中懸濁液）である。これは図１では、「製粉から」と表示される矢印によって示される。それによって、そして篩ユニット間の流体連結によって、トウモロコシ穀粒塊及びその画分ｆはシステムの下流に流れ、プロセス水はシステムの上流に移動する。したがって、システム内の流体構成は、トウモロコシ穀粒塊が、最上流篩ユニットＳ１内で大量のデンプンを含有する流体によって洗浄され、最下流篩ユニットＳ４内で少量のデンプンを含有する流体によって洗浄されると見なされ得る。さらに、最上流篩ユニットＳ１内のトウモロコシ穀粒塊は、最下流篩ユニットＳ４内のトウモロコシ穀粒塊の画分ｆよりも、多量のデンプンを含有する。
【００８５】
上述した繊維洗浄システムを使用する１つの目的は、繊維からのデンプン除去効率を高めるために、システム中で、トウモロコシ穀粒塊又はその画分と酵素との間に、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、少なくとも１００分間、少なくとも１１０分間又は少なくとも１２０分間など、少なくとも３５分間の接触時間を提供することである。繊維洗浄システム中における酵素とトウモロコシ穀粒塊又はその画分との接触時間／反応時間は、滞留時間とも称される。空間（Ｖ）内の酵素と、トウモロコシ穀粒塊又はその画分との接触時間／反応時間は、インキュベーション時間と称される。
【００８６】
一実施形態では、繊維洗浄システムに組み込まれた前記空間（Ｖ）内のインキュベーション時間は少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、少なくとも１００分間、少なくとも１１０分間又は少なくとも１２０分間など、少なくとも５分間、及び４０時間未満、３６時間未満、３０時間未満、２４時間、２０時間未満、１２時間未満、１０時間未満、８時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満など、４８時間未満である。
【００８７】
一実施形態では、前記空間（Ｖ）内のインキュベーション時間は、３５分間〜２４時間、３５分間〜時間、３５分間〜６時間、３５分間〜５時間、３５分間〜４時間、３５分間〜３時間、３５分間〜２時間、４５分間〜４８時間、４５分間〜２４時間、４５分間〜１２時間、４５分間〜６時間、４５分間〜５時間、４５分間〜４時間、４５分間〜３時間、４５分間〜２時間１〜４８時間、１〜２４時間、１〜１２時間、１〜６時間、１〜５時間、１〜４時間、１〜３時間、１〜２時間など、３５分間〜４８時間である。
【００８８】
一実施形態では、前記空間（Ｖ）内のインキュベーション温度は、２５〜９０℃、２５〜８５℃、２５〜８０℃、２５〜７５℃、２５〜７０℃、２５〜６５℃、２５〜６０℃、２５〜５５℃、２５〜５３℃、２５〜５２℃、３０〜９０℃、３０〜８５℃、３０〜８０℃、３０〜７５℃、３０〜７０℃、３０〜６５℃、３０〜６０℃、３０〜５５℃、３０〜５３℃、３０〜５２℃、３５〜９０℃、３５〜８５℃、３５〜８０℃、３５〜７５℃、３５〜７０℃、３５〜６５℃、３５〜６０℃、３５〜５５℃、３５〜５３℃、３５〜５２℃、３９〜９０℃、３９〜８５℃、３９〜８０℃、３９〜７５℃、３９〜７０℃、３９〜６５℃、３９〜６０℃、３９〜５５℃、３９〜５３℃、３９〜５２℃など、２５〜９５℃である。
【００８９】
最上流篩ユニットＳ１の下流且つ最下流篩ユニットＳ４の上流の位置に、酵素を添加することが有利であることが分かった；図１の実施形態では、酵素の添加は、篩ユニットＳ３の流体位置にあるものとして示されている（「酵素」と表示された図１の矢印によって示される。
【００９０】
繊維洗浄システムの最適点で酵素を添加することによって、滞留時間が延長され得て、それは繊維からのデンプンの除去又は分離の効率を高めてもよい。典型的な製粉機によって提供されるよりも長い滞留時間を提供するために、空間Ｖ（図１では図示されない）がシステム内に配置され、前記第１の画分ｓの１つ、前記第２の画分ｆの１つ、又は混合された第１及び第２の画分ｓ、ｆ、好ましくは第２の画分ｆのみを受け入れるように流体連結され、空間内に受け入れられた片方又は双方の画分にインキュベーション時間を提供し；それによってインキュベートされた画分を下流篩ユニットＳ４に排出するように構成されてもよい。システム内に配置された別個のインキュベーターユニットを有することが好ましくあってもよい一方で、篩ユニットを連結する流路もまた、空間を提供するために使用されてもよいことに留意されたい。
【００９１】
繊維洗浄システムが２つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第１と第２の篩ユニットとの間で、又は篩ユニット１と篩ユニット２との間に構成された空間内で行われることが好ましい。
【００９２】
繊維洗浄システムが３つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第２の篩ユニット内で、又は篩ユニット１と篩ユニット３との間に構成された空間内で、最も好ましくは篩ユニット２内で、又は篩ユニット２と３の間に構成された空間内で行われることが好ましい。
【００９３】
繊維洗浄システムが４つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第２又は第３の篩ユニット内で、又は篩ユニット１と篩ユニット４との間に構成された空間内で、最も好ましくは篩ユニット２内で、又は篩ユニット２と３の間に構成された空間内で行われることが好ましい。
【００９４】
繊維洗浄システムが５つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第２、第３又は第４の篩ユニット内で、又は篩ユニット１と篩ユニット５との間に構成された空間内で、最も好ましくは篩ユニット３内で、又は篩ユニット３と４の間に構成された空間内で行われることが好ましい。
【００９５】
繊維洗浄システムが６つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第２、第３、第４、又は第５の篩ユニット内で、又は篩ユニット１と篩ユニット６との間に構成された空間内で、最も好ましくは篩ユニット４内で、又は篩ユニット４と５の間に構成された空間内で行われることが好ましい。
【００９６】
繊維洗浄システムが７つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第２、第３、第４、第５又は第６の篩ユニット内で、又は篩ユニット１と篩ユニット７との間に構成された空間内で、最も好ましくは篩ユニット４内で、又は篩ユニット４と５の間に構成された空間内で行われることが好ましい。
【００９７】
繊維洗浄システムが８つの篩ユニットを含む実施形態によれば、投入は、第２、第３、第４、第５、第６又は第７の篩ユニット内で、又は篩ユニット１と篩ユニット８との間に構成された空間内で、最も好ましくは篩ユニット５内で、又は篩ユニット５と６の間に構成された空間内で行われることが好ましい。
【００９８】
したがって、本発明の好ましい実施形態に記載のシステムは、以下のために構成される。
−好ましくは物質を最上流篩ユニットＳ１に供給するシステムへの入口を含むことによって、トウモロコシ穀粒塊及び液体を最上流の篩ユニットＳ１に注入する；
−好ましくはシステムからの繊維のない流れを供給する最上流篩ユニットからの出口を含むことによって、デンプンを含有する生成流として、第１の画分ｓ１を最上流篩ユニットＳ１から排出する；
−好ましくはプロセス水を最下流篩ユニットＳ４に注入するように配置されてプロセス水を注入し；プロセス水の入口が、好ましくは最下流篩ユニットＳ４の入口である；
−好ましくは最下流篩ユニットからの出口を含むことによって、元のトウモロコシ穀粒塊よりも少量のデンプン及びグルテンを含有する洗浄されたトウモロコシ穀粒塊として、第２の画分ｆ４を最下流篩ユニットＳ４から排出する。
【００９９】
システムはまた、システム内に加水分解酵素を導入するようにも構成され、それは、トウモロコシ穀粒塊又はその画分と１つ又は複数の加水分解酵素との接触を可能にするために、好ましい位置に配置された入口であってもよい。
【０１００】
本発明によるシステムのさらなる実施形態を概略的に示す、図２を参照する。図１で使用されたのと同じ表記法が、図２で使用される。図２に示されるように、篩ユニットＳ１〜Ｓ４は、全て篩ユニットの内側に傾斜した点線で示される篩要素（篩）を含む。この傾斜した点線は、繊維を含有する画分と、好ましくはいかなる繊維も含有しない画分とを分離するように構成された装置を図示し；これは、例えば、内壁部分に配置されて篩ユニットの内部空隙を画定する、バンドフィルター又はフィルター全般によって提供され得る。
【０１０１】
図２に示される実施形態では、混合されるべき様々な画分は、篩ユニットＳ１〜Ｓ４の外側で混合されるように示されている。しかし、それらは篩ユニット内で混合されてもよい。
【０１０２】
これもまた図２に示されるように、空間Ｖは篩ユニットＳ３に流体連結された別個の容器であり、それによって篩ユニットＳ３は、空間Ｖ内で繊維及び酵素を含む流体がインキュベーション時間を経た後に、繊維及び酵素を含む流体を受け入れる。図２に概略的に示されるように、空間Ｖは、流体が容器の入口から出口へ直線的に流れないことを確実にするための邪魔板を有してもよく、それはショートカットを防いでインキュベーション時間を提供し得る。
【０１０３】
図２はまた、酵素が、空間Ｖに入る流れｆ２及びｓ４に適用されることも示す。示される実施形態では、酵素は、クランク軸によって駆動されるピストンポンプとして概略的に示される投入ポンプ１０によって投入され、投入される酵素の量はクランク軸の回転によって制御される（一方向入口及び出口弁がシリンダー又はシリンダーヘッドに存在するが図示されない）。
【０１０４】
したがって、本発明によるシステムは、好ましくは、加水分解酵素を前記第１の画分に（ｓ）、及び／又は前記第２の画分に（ｆ）、及び／又は混合された第１及び第２の画分に及び／又はシステムに供給されるプロセス水流に導入するように構成される。
【０１０５】
篩ユニットＳの数は、例えば２つの流れに分離するための容積容量及び／又は他の設計目的に従って選択されてもよい。しかし、本発明によるシステムは、一般に、最上流篩ユニット、最下流篩ユニット、及び好ましくは最上流篩ユニットと最下流篩ユニットとの間に流体配置された１つ又は複数の中間篩ユニットを有するであろう。すなわち、図１及び２を参照すると、好ましいシステムは、最上流篩ユニットＳ１及び最下流篩ユニットＳ４と、それらの間に配置されたいくつか（例えば２個）の篩ユニットを含み、間に配置されたとは、図１及び２に示されるように流体連結されていることを指す。
【０１０６】
詳細には、図１及び図２に開示されるような流体連結向流洗浄構成は、典型的には、上流篩ユニットＳ１によって生成される第２の画分ｆ１が、下流篩ユニットＳ３によって生成される第１の画分ｓ３と混合され、前記混合された画分が、前記上流及び前記下流篩ユニットＳ１、Ｓ３の中間にある篩ユニットＳ２によって第１の画分ｓ２と第２の画分ｆ２とに分離されるように配置された、複数の篩ユニットＳ１…Ｓ４を含む。
【０１０７】
本開示は、篩ユニットＳ３を参照してなされている一方で、篩Ｓ２などの任意の中間篩ユニット又はその他の中間篩ユニットにも同じ説明が当てはまり、中間篩ユニットは、最上流篩ユニットの下流且つ最下流の篩ユニットの上流に配置された、篩ユニットを指す。
【０１０８】
図２に示されるように、いくつかの実施形態では、第２の画分ｆ１と第１の画分ｓ３との混合は、中間篩ユニットＳ２へ注入される前に行われることが好ましい。このような混合は、典型的には流体の激しい撹拌を提供する撹拌手段を含む混合チャンバーに、２つの画分を注入することによって提供されてもよく、又は混合は、それぞれの流れのための入口と、混合された流れのための出口とを有するマニホルドによって提供されてもよい。
【０１０９】
篩ユニットへの注入前の混合の代案として、第２の画分ｆ１及び第１の画分３との混合は、中間篩ユニットＳ２の内部で行われてもよい。これは、例えば、篩ユニットの内部に、典型的には篩ユニット内の流体を激しく撹拌する撹拌手段を装着することによって、達成されてもよい。
【０１１０】
図１及び２で開示される実施形態は、２つを超える篩ユニットを含むように示されているが、システムは、わずか２つの篩ユニットで完全に動作可能であると考えられる。したがって、典型的には、図１又は２に示されるように配置された、２〜８個の篩ユニットを含むシステムが好ましい。
【０１１１】
さらに、空間の寸法（ｍ3）は、好ましくは、少なくとも１０分間、少なくとも１５分間、少なくとも２０分間、少なくとも２５分間、少なくとも３０分間、少なくとも３５分間、少なくとも４０分間、少なくとも４５分間、少なくとも５０分間、少なくとも５５分間、少なくとも６０分間、少なくとも７０分間、少なくとも８０分間、少なくとも９０分間、少なくとも１００分間、少なくとも１１０分間、少なくとも１２０分間などの少なくとも少なくとも５分間のインキュベーション時間を提供するように構成される。インキュベーションのために指定された空間（Ｖ）は、好ましくは少なくとも３０ｍ3、少なくとも４０ｍ3、少なくとも５０ｍ3、少なくとも６０ｍ3、少なくとも７０、ｍ3、少なくとも８０、ｍ3、少なくとも９０、ｍ3、少なくとも１００ｍ3、少なくとも１１０ｍ3、少なくとも１２０ｍ3、少なくとも１３０ｍ3、少なくとも１４０ｍ3、少なくとも１５０ｍ3、少なくとも１６０ｍ3、少なくとも１７０ｍ3、少なくとも１８０ｍ3、少なくとも１９０ｍ3、少なくとも２００ｍ3、少なくとも２１０ｍ3、少なくとも２２０ｍ3、少なくとも２３０ｍ3、少なくとも２４０ｍ3、少なくとも２５０ｍ3、少なくとも２６０ｍ3、少なくとも２７０ｍ3、少なくとも２８０ｍ3、少なくとも２９０ｍ3、少なくとも３００ｍ3、少なくとも４００ｍ3、又は少なくとも５００ｍ3の体積を有する。インキュベーション時間はまた、総容積又は合わせた容積が、少なくとも１００ｍ3、少なくとも１１０ｍ3、少なくとも１２０ｍ3、少なくとも１３０ｍ3、少なくとも１４０ｍ3、少なくとも１５０ｍ3、少なくとも１６０ｍ3、少なくとも１７０ｍ3、少なくとも１８０ｍ3、少なくとも１９０ｍ3、少なくとも２００ｍ3、少なくとも２１０ｍ3、少なくとも２２０ｍ3、少なくとも２３０ｍ3、少なくとも２４０ｍ3、少なくとも２５０ｍ3、少なくとも２６０ｍ3、少なくとも２７０ｍ3、少なくとも２８０ｍ3、少なくとも２９０ｍ3、少なくとも３００ｍ3、少なくとも４００ｍ3、少なくとも５００ｍ3である２つ以上の空間Ｖにあってもよい。
【０１１２】
インキュベーション時間中、空間Ｖに受け入れられた流体は、篩掛けされないことが好ましい。したがって、空間Ｖを出る流体は、空間Ｖに受け入れられる流体と、例えばデンプン及び繊維の同一組成を有するが、好ましくは繊維から放出されたより高い比率のデンプンを含有する。
【０１１３】
酵素と繊維間の密着を確実にするために、ローター又はインペラを含むことなどによって、前記空間Ｖに含有される物質の撹拌のために空間Ｖを構成することが好ましくあってもよい。
【０１１４】
図２に示されるように、空間Ｖが最上流篩ユニットＳ１の下流且つ前記最下流篩ユニットＳ４の上流に配置されることが好ましく；特に、図２の実施形態は、空間Ｖが最下流から２番目の篩ユニットＳ３に流体を供給するように配置されることを示す。
【０１１５】
本明細書で開示されるように、空間は、様々な様式で提供されてもよく、図２に示されるように、空間Ｖは、好ましくは別個のインキュベーターユニットとして提供されてもよい。インキュベーターユニットは、第１の画分ｓ、第２の画分ｆ、又は第１及び第２の画分の組み合わせｓ、ｆ、好ましくは第２の画分ｆのみを受け入れ、それによってインキュベートされた材料を下流篩ユニットＳ３に送り出す、適切な流体ラインによって構成されてもよい。
【０１１６】
内蔵インキュベーター／空間Ｖを有する篩ユニットを概略的に示す、図３を参照する。図示されるように、篩ユニット／インキュベーターは下端に篩要素１４を含み、その上に空間Ｖがある。空間内には、（図３の開示された実施形態では分画ｆ１及びｓ３を受け入れる）上端部から、篩要素１４に向かう流体の流れのショートカットを回避するように、邪魔板が配置される。これもまた図示されているように、繊維を含まない流れｓ２が篩分けされて、繊維含有画分ｆ２が提供される。
【０１１７】
トウモロコシ穀粒塊からデンプンを放出させるのに使用される酵素は、典型的には、酵素放出が最も効率的である温度範囲を有し、したがって空間Ｖなどのシステム内の選択された位置で温度を制御できることが有利であってもよい。これについては、本発明によるシステムは、好ましくは熱電対を含み、前記空間（Ｖ）内部で、好ましくは３５〜７０℃の範囲、例えば４０〜６０℃の範囲、例えば３９〜５３℃の範囲、例えば４５〜５３℃の範囲、例えば３９〜４８℃の範囲、例えば４７℃の流体のインキュベーション温度を提供してもよい。（図２のように）空間が別個のインキュベーションユニットとして提供される実施形態では、熱電対は、インキュベーションユニットの内側に、及び／又はインキュベーションユニットの囲壁を画定するシェル上に配置されてもよい。
【０１１８】
熱電対は、好ましくは、温度を測定し、空間への／空間からの熱流束を変化させ、空間に含有される材料の温度を既定の範囲内に制御するように適応された、温調可能な加熱／冷却要素である。
【０１１９】
いくつかの好ましい実施形態では、温調可能な加熱エレメントは、電気加熱／冷却素子又は液体加熱／冷却素子及び温度センサーを含む。
【０１２０】
本明細書に提示されるように、篩ユニットは２つの画分ｓ及びｆへの流体の分離を提供し、篩ユニットは典型的には機械的様式で篩掛けし、全ての篩ユニットなどの１つ又は複数の篩ユニットは、既定サイズ未満の固体を通過させるように構成された（例えば、図２では傾斜した点線で示されている）開口部を有する、１つ又は複数の篩要素を含む。規定サイズは、いくつかの設計基準に従って定義されてもよい。しかし、典型的には、いかなる繊維も開口部を通過しないことが好ましい。他方、小さな開口部はブロックされる傾向を有することもあり、多くの場合、開口部の実際のサイズは、ブロッキング側面及び篩掛け側面を考慮することによって選択され、その結果、少量の繊維が通過することもある。
【０１２１】
いくつかの好ましい実施形態では、全ての篩ユニットなどの１つ又は複数の篩ユニットは、前記２つの画分ｓ、ｆを提供するように構成された、ローターブレード及び／又は篩を含む。全ての篩ユニットのような１つ又は複数の開口部によって構成された篩要素の代案は、図４に概略的に示されるような液体サイクロン１６であってもよい。
【０１２２】
上で開示されるように、システムは、投入装置の手段によって、加水分解酵素を前記第１の画分ｓに及び／又は前記第２の画分ｆに及び／又は混合された第１及び第２の画分に及び／又はプロセス水に導入するように構成されており、図２を参照されたい。
【０１２３】
このような投入装置は典型的には、好ましくは酵素量とトウモロコシ穀粒塊の供給量との間の所定の特定の比率に従って、制御可能な投入量の酵素をシステムに供給するように適応されている。これを達成するために、投入装置１０は、図２のピストンポンプによって示されるような定量ポンプであり得る。
【０１２４】
代案としては、投入装置は、流動バルブを通って流れる酵素の量を調節するように構成された、制御可能な流出バルブを有する重力流計量分配装置であってもよい。
【０１２５】
一実施形態では、本発明のＧＨ５ポリペプチドはキシラナーゼ活性を有する。
【０１２６】
一実施形態では、本発明のＧＨ３０ポリペプチドはキシラナーゼ活性を有する。
【０１２７】
一実施形態では、本発明のＧＨ５ポリペプチドは、
ｉ．トウモロコシの湿式製粉工場からの圧搾繊維のサンプルを提供するステップと；
ｉｉ．サンプルを緩衝液（ｐＨ４、０．０２Ｍの酢酸Ｎａ）に再懸濁し、５％の乾燥固形物を含有するスラリーを提供するステップと；
ｉｉｉ．乾燥固体基質１ｇ当たり２８０μｇの酵素タンパク質（ＥＰ）に対応する量のセルロース分解酵素と組み合わせて、乾燥固体基質１ｇ当たり７０μｇの酵素タンパク質（ＥＰ）など、乾燥固体基質１ｇ当たり３５μｇの酵素タンパク質（ＥＰ）に対応する量のＧＨ５ポリペプチドをスラリーに添加するステップと；
ｉｖ．１２０分間にわたり絶えず振盪しながら、空気加熱インキュベーター中で４０又は５２℃の温度でサンプルをインキュベートするステップと；
ｖ．処理前に氷水（５℃）中でサンプルを急速冷却するステップと；
ｖｉ．スラリーを１５０ミクロンの篩に移し、通過した濾液を収集するステップと；
ｖｉｉ．篩上に保持された繊維を圧搾し、通過した濾液を収集し、収集された濾液を第１の濾液と合わせるステップと；
ｖｉｉｉ．圧搾された繊維を２００ｍｌの水を含有するビーカーに移し、混合物を撹拌するステップと；
ｉｘ．スラリーを１５０ミクロンの篩に移し、通過した濾液を収集し、収集された濾液を第１の濾液と合わせるステップと；
ｘ．篩上に保持された繊維を圧搾し、通過した濾液を収集し、収集された濾液を第１の濾液と合わせるステップと；
ｘｉ．ステップｖｉｉｉ〜ｘをもう１回繰り返すステップと；
ｘｉｉ．１５０ミクロンの篩を通過した繊維から放出される溶性固形物を保持するガラスマイクロ濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ）を介して、合わせた濾液を真空濾過するステップと；
ｘｉｉｉ．２００ｍｌの水を濾紙に通過させ、あらゆる痕跡量の可溶物を除去するステップと；
ｘｉｖ．濾紙上に保持された総不溶性固形物を乾燥させて秤量し、繊維乾物から放出されたデンプン及びグルテン（ｗ／ｗ）として報告するステップと
を含む手順において、繊維乾物の少なくとも１６％、１７％、１８％、１９％、２０％２１％又は少なくとも２２％（ｗ／ｗ）などの繊維乾物の少なくとも１５％（ｗ／ｗ）の量のデンプン及びグルテンを放出するのに十分な量のキシラナーゼ活性を有する。
【０１２８】
一実施形態では、本発明のＧＨ５ポリペプチドは、以下の活性の１つ又は複数をさらに含む：エンド−β−１，４−グルカナーゼ／セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）活性、エンド−β−１，４−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）活性、β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）活性、β−マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２５）活性、β−グルコシルセラミダーゼ（ＥＣ３．２．１．４５）活性、グルカンβ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５８）活性、リケニナーゼ（ＥＣ３．２．１．７３）活性、エキソ−β−１，４−グルカナーゼ／セロデキストリナーゼ（ＥＣ３．２．１．７４）活性及び／又はグルカンエンド−１，６−β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７５）活性、マンナンエンド−β−１，４−マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７８）活性、セルロースβ−１，４−セロビオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）活性、ステリルβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１０４）活性、エンドグリコセラミダーゼ（ＥＣ３．２．１．１２３）活性、キトサナーゼ（ＥＣ３．２．１．１３２）活性、β−プリメベロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１４９）活性、キシログルカン−特異的エンド−β−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．１５１）活性、エンド−β−１，６−ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．１６４）活性、ヘスペリジン６−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシル−β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１６８）活性、β−１，３−マンナナーゼ（ＥＣ３．２．１．−）活性及びアラビノキシラン−特異的エンド−β−１，４−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．−）活性及びマンナントランスグリコシラーゼ（ＥＣ２．４．１．−）活性。
【０１２９】
一実施形態では、本発明のＧＨ３０ポリペプチドは、以下の活性の１つ又は複数をさらに含む：エンド−β−１，４−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）活性、β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）活性、β−グルクロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３１）活性、β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）活性、β−フコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３８）活性、グルコシルセラミダーゼ（ＥＣ３．２．１．４５）活性、β−１，６−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．７５）活性、グルクロノアラビノキシランエンド−β−１，４−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．１３６）活性、エンド−β−１，６−ガラクタナーゼ（ＥＣ：３．２．１．１６４）活性、及び［還元末端］β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．−）活性。
【０１３０】
一実施形態では、本発明のＧＨ５ポリペプチドは、
ｉ）配列番号１〜３、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列の成熟ポリペプチド；
ｉｉ）ｉ）の成熟ポリペプチドと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性などの少なくとも６０％の配列同一性を有する、成熟ポリペプチド；
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の成熟ポリペプチドのいずれか１つの部分配列
からなる群から選択され、好ましくは、部分配列はキシラナーゼ活性を有する。
【０１３１】
一実施形態では、本発明のＧＨ３０ポリペプチドは、
ｉ）配列番号４；配列番号５；配列番号６又は配列番号７に記載されるアミノ酸配列の成熟ポリペプチド；
ｉｉ）ｉ）の成熟ポリペプチドと、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性などの少なくとも６０％の配列同一性を有する、成熟ポリペプチド；
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）の成熟ポリペプチドのいずれか１つの部分配列
からなる群から選択され、好ましくは、部分配列はキシラナーゼ活性を有する。
【０１３２】
「成熟ポリペプチド」という用語は、翻訳に続く、そしてＮ末端プロセシング、Ｃ末端切断、グリコシル化、リン酸化などの任意の翻訳後修飾に続く、その最終形態にあるポリペプチドを意味する。
【０１３３】
一実施形態では、配列番号１の成熟ポリペプチドは、アミノ酸１〜６５５を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号１の成熟ポリペプチドは、配列番号１の２８〜６５５アミノ酸を含む／からなる／から本質的になり、配列番号１のアミノ酸１〜２７はシグナルペプチドである。別の実施形態では、配列番号１の成熟ポリペプチドは、配列番号３６の１〜６５５アミノ酸を含む／からなる／から本質的になり、配列番号１のアミノ酸２８〜３５はｈｉｓ−ｔａｇである。別の実施形態では、配列番号１の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号１のアミノ酸３７〜６５５を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号１の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号１のアミノ酸４０〜６５５を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号１の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号１のアミノ酸４５〜６５５を含む／からなる／から本質的になる。
【０１３４】
一実施形態では、配列番号２の成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜５５５を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号２の成熟ポリペプチドは、配列番号２の７〜５５５アミノ酸を含む／からなる／から本質的になり、配列番号２のアミノ酸１〜６はｈｉｓ−ｔａｇである。別の実施形態では、配列番号２の成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１０〜５５５を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号２の成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸１５〜５５５を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号２の成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸２０〜５５５を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号２の成熟ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸３０〜５５５を含む／からなる／から本質的になる。
【０１３５】
一実施形態では、配列番号３の成熟ポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸１〜５８５を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号３の成熟ポリペプチドは、配列番号３の２８〜５８５アミノ酸を含む／からなる／から本質的になり、配列番号３のアミノ酸１〜２７はシグナルペプチドである。別の実施形態では、配列番号３の成熟ポリペプチドは、配列番号３の３６〜５８５アミノ酸を含む／からなる／から本質的になり、配列番号３のアミノ酸２８〜３５はｈｉｓ−ｔａｇである。別の実施形態では、配列番号３の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号３のアミノ酸３７〜５８５を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号３の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号３のアミノ酸４０〜５８５を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号３の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号３のアミノ酸４５〜５８５を含む／からなる／から本質的になる。
【０１３６】
一実施形態では、配列番号４の成熟ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１〜３９１を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号４の成熟ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸５〜３９１を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号４の成熟ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１０〜３９１を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号４の成熟ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸１５〜３９１を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号４の成熟ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸２０〜３９１を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号４の成熟ポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸３０〜３９１を含む／からなる／から本質的になる。
【０１３７】
一実施形態では、配列番号５の成熟ポリペプチドは、配列番号５のアミノ酸１〜４１７を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号５の成熟ポリペプチドは、配列番号５の２７〜４１７アミノ酸を含む／からなる／から本質的になり、配列番号５のアミノ酸１〜２６はシグナルペプチドである。
【０１３８】
一実施形態では、配列番号６の成熟ポリペプチドは、配列番号６のアミノ酸１〜４１７を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号６の成熟ポリペプチドは、配列番号６の２７〜４１７アミノ酸を含む／からなる／から本質的になり、配列番号６のアミノ酸１〜２６はシグナルペプチドである。
【０１３９】
一実施形態では、配列番号７の成熟ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸１〜４１７を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号７の成熟ポリペプチドは、配列番号７の２７〜４１７アミノ酸を含む／からなる／から本質的になり、配列番号７のアミノ酸１〜２６はシグナルペプチドである。
【０１４０】
一実施形態では、配列番号８の成熟ポリペプチドは、アミノ酸１〜５５７を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号８の成熟ポリペプチドは、配列番号８の８〜５５７アミノ酸を含む／からなる／から本質的になり、配列番号８のアミノ酸１〜７はｈｉｓ−ｔａｇである。別の実施形態では、配列番号８の成熟ポリペプチドは、少なくとも配列番号８のアミノ酸２８〜５５７を含む／からなる／から本質的になる。
【０１４１】
一実施形態では、配列番号１０の成熟ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸１〜５７６を含む／からなる／から本質的になる。別の実施形態では、配列番号１０の成熟ポリペプチドは、配列番号１０の２４〜５７６アミノ酸を含む／からなる／から本質的になり、配列番号１０のアミノ酸１〜２３はシグナルペプチドである。
【０１４２】
一実施形態では、配列番号１２の成熟ポリペプチドは、配列番号１２のアミノ酸１〜５６５を含む／からなる／から本質的になる。
【０１４３】
本発明の文脈において、「部分配列」という用語は、成熟ポリペプチドのアミノ（Ｎ−）末端及び／又はカルボキシ（Ｃ−）末端に、１つ又は複数の（例えば、いくつかの）アミノ酸残基が存在しないポリペプチドを意味し；部分配列はキシラナーゼ活性を有する。いくつかの実施形態では、「部分配列」中に存在しないアミノ酸残基の数は、最大１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は最大でも１アミノ酸残基など、最大でも２０である。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、任意の１つの成熟ポリペプチドの部分配列は、少なくとも１５０アミノ酸長又は少なくとも２００アミノ酸長又は少なくとも２５０アミノ酸長又は少なくとも３００アミノ酸長又は少なくとも３５０アミノ酸長又は少なくとも４００アミノ酸長又は少なくとも４５０アミノ酸長又は少なくとも５００アミノ酸長又は少なくとも５５０アミノ酸長又は少なくとも６００アミノ酸長又は少なくとも６５０アミノ酸長であってもよい。
【０１４５】
一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号１の部分配列は、少なくとも２００アミノ酸長又は少なくとも２５０アミノ酸長又は少なくとも３００アミノ酸長又は少なくとも３５０アミノ酸長又は少なくとも４００アミノ酸長又は少なくとも４５０アミノ酸長又は少なくとも５００アミノ酸長又は少なくとも５５０アミノ酸長又は少なくとも６００アミノ酸長又は少なくとも６５０アミノ酸長であってもよい。
【０１４６】
一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号２の部分配列は、少なくとも２００アミノ酸長又は少なくとも２５０アミノ酸長又は少なくとも３００アミノ酸長又は少なくとも３５０アミノ酸長又は少なくとも４００アミノ酸長又は少なくとも４５０アミノ酸長又は少なくとも５００アミノ酸長又は少なくとも５５０アミノ酸長であってもよい。
【０１４７】
一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号３の部分配列は、少なくとも２００アミノ酸長又は少なくとも２５０アミノ酸長又は少なくとも３００アミノ酸長又は少なくとも３５０アミノ酸長又は少なくとも４００アミノ酸長又は少なくとも４５０アミノ酸長又は少なくとも５００アミノ酸長又は少なくとも５５０アミノ酸長又は少なくとも５６０アミノ酸長又は少なくとも５７０アミノ酸長又は少なくとも５８０アミノ酸長であってもよい。
【０１４８】
一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号４の部分配列は、少なくとも１５０アミノ酸長又は少なくとも２００アミノ酸長又は少なくとも２５０アミノ酸長又は少なくとも３００アミノ酸長又は少なくとも３５０アミノ酸長又は少なくとも３６０アミノ酸長又は少なくとも３７０アミノ酸長又は少なくとも３８０アミノ酸長又は少なくとも３９０アミノ酸長であってもよい。
【０１４９】
一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号５の部分配列は、少なくとも１５０アミノ酸長又は少なくとも２００アミノ酸長又は少なくとも２５０アミノ酸長又は少なくとも３００アミノ酸長又は少なくとも３５０アミノ酸長又は少なくとも３６０アミノ酸長又は少なくとも３７０アミノ酸長又は少なくとも３８０アミノ酸長又は少なくとも３９０アミノ酸長であってもよい。
【０１５０】
一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号６の部分配列は、少なくとも１５０アミノ酸長又は少なくとも２００アミノ酸長又は少なくとも２５０アミノ酸長又は少なくとも３００アミノ酸長又は少なくとも３５０アミノ酸長又は少なくとも３６０アミノ酸長又は少なくとも３７０アミノ酸長又は少なくとも３８０アミノ酸長又は少なくとも３９０アミノ酸長であってもよい。
【０１５１】
一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号７の部分配列は、少なくとも１５０アミノ酸長又は少なくとも２００アミノ酸長又は少なくとも２５０アミノ酸長又は少なくとも３００アミノ酸長又は少なくとも３５０アミノ酸長又は少なくとも３６０アミノ酸長又は少なくとも３７０アミノ酸長又は少なくとも３８０アミノ酸長又は少なくとも３９０アミノ酸長であってもよい。
【０１５２】
一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号８の部分配列は、少なくとも２００アミノ酸長又は少なくとも２５０アミノ酸長又は少なくとも３００アミノ酸長又は少なくとも３５０アミノ酸長又は少なくとも４００アミノ酸長又は少なくとも４５０アミノ酸長又は少なくとも５００アミノ酸長又は少なくとも５５０アミノ酸長又は少なくとも６００アミノ酸長又は少なくとも６５０アミノ酸長であってもよい。
【０１５３】
一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号１０の部分配列は、少なくとも２００アミノ酸長又は少なくとも２５０アミノ酸長又は少なくとも３００アミノ酸長又は少なくとも３５０アミノ酸長又は少なくとも４００アミノ酸長又は少なくとも４５０アミノ酸長又は少なくとも５００アミノ酸長又は少なくとも５５０アミノ酸長又は少なくとも６００アミノ酸長又は少なくとも６５０アミノ酸長であってもよい。
【０１５４】
一実施形態では、成熟ポリペプチドの配列番号１２の部分配列は、少なくとも２００アミノ酸長又は少なくとも２５０アミノ酸長又は少なくとも３００アミノ酸長又は少なくとも３５０アミノ酸長又は少なくとも４００アミノ酸長又は少なくとも４５０アミノ酸長又は少なくとも５００アミノ酸長又は少なくとも５５０アミノ酸長又は少なくとも６００アミノ酸長又は少なくとも６５０アミノ酸長であってもよい。
【０１５５】
一実施形態では、酵素組成物は、セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）、アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５（非還元末端α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ）；ＥＣ３．２．１．１８５（非還元末端β−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ）セロビオヒドロラーゼＩ（ＥＣ３．２．１．１５０）、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）、セロビオシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１７６）、β−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）又はプロテアーゼ（Ｅ．Ｃ３．４）からなる群から選択される１つ又は複数の酵素をさらに含む、１つ又は複数の加水分解酵素を含む。
【０１５６】
一実施形態では、加水分解酵素の１つ又は複数は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）などのセルラーゼバックグラウンドを有する生物において発現される。これらの実施形態によれば、本発明により定義されるＧＨ５及び／又はＧＨ３０ポリペプチドは、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）からの内因性セルラーゼと共に発現される。
【０１５７】
一実施形態では、１つ又は複数の加水分解酵素を含む酵素組成物は、精製又は半精製形態で酵素組成物に添加される、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）で発現されるセルラーゼ、及びその他の加水分解酵素を含んでもよい。
【０１５８】
一実施形態では、１つ又は複数の加水分解酵素は精製される。精製された酵素は、本発明のその他の実施形態に記載される酵素組成物で使用されてもよい。
【０１５９】
一実施形態では、１つ又は複数の加水分解酵素は、液体組成物である。組成物は、同種又は異種であってもよい。
【０１６０】
一実施形態では、１つ又は複数の加水分解酵素は、固体組成物である。
【０１６１】
一実施形態では、前記トウモロコシ穀粒塊の１つ又は複数の画分と混合される１つ又は複数の加水分解酵素の有効量は、０．０１０〜０．５ｋｇＥＰ／ＭＴトウモロコシ穀粒など、０．０５〜０．５ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒など、又は０．０７５〜０．５ｋｇ／ＭＴ又は０．１〜０．５ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．００５〜０．４ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．０１〜０．４ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．０５〜０．４ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．０７５〜０．４ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．１〜０．４ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．００５〜０．３ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．０１〜０．３ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．０５〜０．３ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．０７５〜０．３ｋｇ／ＭＴ又は０．１〜０．３ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．００５〜０．２ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．０１０〜０．２ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．０５〜０．２ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．０７５〜０．２ｋｇ／ＭＴ又は０．１〜０．２ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒又は０．０７５〜０．１０ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒など、又は０．０７５〜０．１１ｋｇ／ＭＴトウモロコシ穀粒など、０．００５〜０．５ｋｇの酵素タンパク質（ＥＰ）／湿式製粉工程に入るトウモロコシ穀粒の計量トン（ＭＴ）である。
【０１６２】
少なくとも１つのＧＨ５ポリペプチド、又は少なくとも１つのＧＨ３０ポリペプチド、又は少なくとも１つのＧＨ５と、少なくとも１つのＧＨ３０ポリペプチドとの組み合わせを含む加水分解酵素組成物を用いた、トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分の酵素処理は、当該技術分野で公知のその他の方法によって生産された製品と異なる、コーンスターチ、コーングルテン及びトウモロコシ繊維製品を提供する。
【０１６３】
一態様では、本発明は、本発明の方法によって得られるコーンスターチを含む組成物に関する。
【０１６４】
一態様では、本発明は、本発明の方法によって得られるコーングルテンを含む組成物に関する。
【０１６５】
一態様では、本発明は、本発明の方法によって得られるトウモロコシ繊維を含む組成物に関する。
【０１６６】
一態様では、本発明は、本明細書で定義される単離されたＧＨ３０ポリペプチドを含む酵素組成物に関する。
【０１６７】
一態様では、本発明は、本明細書で定義される単離されたＧＨ５ポリペプチドを含む酵素組成物に関する。
【０１６８】
一態様では、本発明単明細書で定義される単離されたＧＨ３０ポリペプチドと、本明細書で定義される単離されたＧＨ５ポリペプチドとを含む、酵素組成物に関する。
【０１６９】
一実施形態では、前記加水分解酵素の少なくとも１つが、ＧＨ３０ポリペプチド、ＧＨ５ポリペプチド、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、本発明による酵素組成物は、セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５（非還元末端α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ）；ＥＣ３．２．１．１８５（非還元末端β−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ）セロビオヒドロラーゼＩ（ＥＣ３．２．１．１５０）、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）、セロビオシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１７６）、β−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）又はプロテアーゼ（Ｅ．Ｃ３．４）からなる群から選択される、１つ又は複数の酵素をさらに含む。
【０１７０】
好ましい実施形態では、酵素組成物は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＡＴＣＣ２６９２１の培養物などのトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の培養物から得られるセルラーゼを含む。例えば、ＮｏｖｏｚｙｍｅｓＡ／Ｓからの商品名Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ（登録商標）などの適切なセルラーゼが利用できる。
【０１７１】
本発明のさらなる態様は、トウモロコシ湿式製粉におけるＧＨ３０ポリペプチドの使用に関する。
【０１７２】
ＧＨ３０ポリペプチドは、特に、本明細書で上記に定義されるポリペプチドであってもよい。好ましくは、トウモロコシ湿式粉砕は、上記で定義される湿式粉砕工程を使用して実施される。
【０１７３】
別の態様では、本発明は、トウモロコシ湿式製粉におけるＧＨ５ポリペプチドの使用を提供する。ＧＨ５ポリペプチドは、特に、本明細書で上記に定義されるポリペプチドであってもよい。好ましくは、トウモロコシ湿式粉砕は、上記のいずれかで定義される湿式粉砕工程を使用して実施される。
【０１７４】
本発明のなおも別の態様は、トウモロコシ湿式製粉における、好ましくは上記で定義されるトウモロコシ湿式製粉工程における、上記で定義される酵素組成物の使用を提供する。
【０１７５】
好ましくは、本発明による使用に際して、ＧＨ３０ポリペプチド、ＧＨ５ポリペプチド及び／又は酵素組成物は、湿式製粉工程におけるトウモロコシ穀粒からの総デンプン収量及び／又はグルテン収量を増加させる目的で使用される。
【０１７６】
キシラナーゼ活性を有するポリペプチド
一実施形態では、本発明は、配列番号１０の成熟ポリペプチドと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、キシラナーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。一態様では、ポリペプチドは、配列番号１０の成熟ポリペプチドと、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０など、最大１０個のアミノ酸が異なる。
【０１７７】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号１０のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異型；又はキシラナーゼ活性を有するその断片を含み、又はそれからなる。別の態様では、ポリペプチドは、配列番号１０の成熟ポリペプチドを含み、又はそれからなる。別の態様では、ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸２４〜５７６を含み、又はそれからなる。
【０１７８】
一実施形態では、本発明は、配列番号１２の成熟ポリペプチドと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する、キシラナーゼ活性を有する単離されたポリペプチドに関する。一態様では、ポリペプチドは、配列番号１２の成熟ポリペプチドと、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０など、最大１０個のアミノ酸が異なる。
【０１７９】
本発明のポリペプチドは、好ましくは、配列番号１２のアミノ酸配列又はその対立遺伝子変異型；又はキシラナーゼ活性を有するその断片を含み、又はそれからなる。別の態様では、ポリペプチドは、配列番号１２の成熟ポリペプチドを含み、又はそれからなる。
【０１８０】
別の実施形態では、本発明は、配列番号９又は配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列又はそのｃＤＮＡ配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされるペクチンリアーゼ活性を有する単離ポリペプチドに関する。
【０１８１】
別の実施形態では、本発明は、１つ又は複数の（例えば、いくつかの）位置における、置換、消去、及び／又は挿入を含む、配列番号１０又は配列番号１２の成熟ポリペプチドの変異型に関する。一実施形態では、配列番号１０又は配列番号１２の成熟ポリペプチドに導入される、アミノ酸置換、欠失及び／又は挿入の数は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０など、最大１０である。アミノ酸変化は、タンパク質の折り畳み及び／又は活性に有意な影響を及ぼさない、典型的には１〜３０アミノ酸の小規模な欠失；アミノ末端メチオニン残基などの小型のアミノ末端又はカルボキシル末端延長；最大２０〜２５残基の小型のリンカーペプチド；又は、正味電荷又はポリヒスチジントラクト、抗原性エピトープ又は結合ドメインなどの別の機能を変化させることによって、精製を容易にする小規模な延長などの保存的アミノ酸置換又は挿入である、軽微な性質のものであってもよい。
【０１８２】
保存的置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン、及びチロシン）、及び小型アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、及びメチオニン）のグループ内にある。通常、比活性を変質させないアミノ酸置換は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，１９７９，Ｉｎ，Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋによって記載される。一般的な置換は、Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、及びＡｓｐ／Ｇｌｙである。
【０１８３】
あるいは、アミノ酸の変化は、ポリペプチドの物理化学的特性が変化するような性質のものである。例えば、アミノ酸の変化は、ポリペプチドの熱的安定性を改善し、基質特異性を改変させ、最適ｐＨ値を変化させるなどしてもよい。
【０１８４】
ポリペプチド中の必須アミノ酸は、部位特異的変異誘発又はアラニンスキャニング変異誘発などの当該技術分野で公知の手順によって同定し得る（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，１９８９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５）。後者の技術では、分子中の各残基に単一アラニン変異を導入し、結果として生じる変異分子をペクチンリアーゼ活性について試験して、分子活性に重要なアミノ酸残基を同定する。Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：４６９９−４７０８もまた参照されたい。酵素の活性部位又はその他の生物学的相互作用はまた、推定接触部位アミノ酸の変異と併せて、核磁気共鳴、結晶構造解析、電子回析、又は光親和性標識などの技術による判定で、構造の物理的分析によって判定し得る。例えば、ｄｅ  Ｖｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２；Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４；Ｗｌｏｄａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３０９：５９−６４を参照されたい。必須アミノ酸のアイデンティティーはまた、関連ポリペプチドのアラインメントから推論し得る。
【０１８５】
単一又は複数アミノ酸置換、欠失、及び／又は挿入を作製して、変異誘発、組換え、及び／又はシャフリングの公知の方法と、それに続く、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７；Ｂｏｗｉｅ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：２１５２−２１５６；国際公開第９５／１７４１３号パンフレット；又は国際公開第９５／２２６２５号パンフレットによって開示されるものなどの妥当なスクリーニング手順を使用して試験し得る。利用し得るその他の方法としては、誤りがちなＰＣＲ、ファージディスプレイ（例えば、Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３７；米国特許第５，２２３，４０９号明細書；国際公開第９２／０６２０４号パンフレット）、及び領域特異的変異誘発（Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ  ４６：１４５；Ｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＤＮＡ  ７：１２７）が挙げられる。
【０１８６】
変異誘発／シャッフリング法は、高スループットの自動スクリーニング法と組み合わされて、宿主細胞によって発現されたクローン化され変異誘発されたポリペプチドの活性が検出され得る（Ｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：８９３−８９６）。活性ポリペプチドをコードする変異誘発されたＤＮＡ分子は、宿主細胞から回収され、当該技術分野の標準法を使用して迅速に配列決定され得る。これらの方法は、ポリペプチドの個々のアミノ酸残基の重要性の迅速な判定を可能にする。
【０１８７】
ポリペプチドは、１つのポリペプチドの領域が、別のポリペプチドの領域のＮ末端又はＣ末端で融合する、雑種ポリペプチドであってもよい。
【０１８８】
ポリペプチドは、別のポリペプチドが、本発明ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で融合する、融合ポリペプチド又は切断可能融合ポリペプチドであってもよい。融合ポリペプチドは、別のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを本発明のポリヌクレオチドに融合させることによって生成される。融合ポリペプチドを生産する技術は当該技術分野で公知であり、それらがインフレームになり、融合ポリペプチドの発現が同一プロモーター及びターミネーターの制御下になるように、ポリペプチドをコードするコード配列をライゲートすることが挙げられる。融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドが翻訳後に生成されるインテイン技術を用いて、構築されてもよい（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：２５７５−２５８３；Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：７７６−７７９）。
【０１８９】
融合ポリペプチドは、２つのポリペプチド間に切断部位をさらに含み得る。融合タンパク質の分泌に際して、部位が切断されて２つのポリペプチドが放出される。切断部位の例としては、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｎｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：５６８−５７６；Ｓｖｅｔｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７６：２４５−２５１；Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ−Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：３４８８−３４９３；Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：４９８−５０３；ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：３７８−３８１；Ｅａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５０５−５１２；Ｃｏｌｌｉｎｓ−Ｒａｃｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：９８２−９８７；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：２４０−２４８；及びＳｔｅｖｅｎｓ，２００３，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｏｒｌｄ  ４：３５−４８で開示される部位が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１９０】
キシラナーゼ活性を有するポリペプチドの供給源
本発明のキシラナーゼ活性を有するポリペプチドは、任意の属の微生物から得られてもよい。本発明の目的のために、所与の供給源に関連して本明細書で使用される「から得られる」という用語は、ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドが、供給源によって、又は供給源由来のポリヌクレオチドが挿入された株によって、産生されることを意味するものとする。一態様では、所与の供給源から得られるポリペプチドは、細胞外に分泌される。
【０１９１】
ポリペプチドは、細菌ポリペプチドであってもよい。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドペクチンリアーゼ活性を有するバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、腸球菌属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、オセアノバシラス属（Ｏｃｅａｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、又はストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）などのグラム陽性細菌ポリペプチド、又はカンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、フラボバクテリウム（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属、フゾバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、イリオバクター属（Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、又はウレアプラスマ属（Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ）ポリペプチドなどのグラム陰性細菌ポリペプチドであってもよい。
【０１９２】
一態様では、ポリペプチドは、バチルス・アルカロフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バチルス・サークランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バチルス・クラウシイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バチルス・ラウタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｕｔｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、又はバチルス・チューリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）ポリペプチドである。
【０１９３】
別の態様では、ポリペプチドは、ストレプトコッカス・エクイシミリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトコッカス・ユベリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｕｂｅｒｉｓ）、又はストレプトコッカス・エクイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）亜株ズーエピデミクス（Ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ）ポリペプチドである。
【０１９４】
別の態様では、ポリペプチドは、ストレプトミセス・アクロモゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）、ストレプトミセス・アベルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）、ストレプトミセス・コエリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、又はストレプトミセス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ）ポリペプチドである。
【０１９５】
ポリペプチドは、真菌ポリペプチドであってもよい。例えば、ポリペプチドは、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、クルイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス属（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、又はヤロウィア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ポリペプチドなどの酵母ポリペプチド；又はアクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アガリクス属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ボトリオスファエリア属（Ｂｏｔｒｙｏｓｐａｅｒｉａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、ケトミジウム属（Ｃｈａｅｔｏｍｉｄｉｕｍ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、麦角菌属（Ｃｌａｖｉｃｅｐｓ）、コクリオボルス属（Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ）、ヒトヨタケ属（Ｃｏｐｒｉｎｏｐｓｉｓ）、イエシロアリ属（Ｃｏｐｔｏｔｅｒｍｅｓ）、コリナスカス属（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ）、クリフォネクトリア属（Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ジプロディア属（Ｄｉｐｌｏｄｉａ）、エクシデイア属（Ｅｘｉｄｉａ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、ジベレラ属（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）、ホロマスチゴトイデス属（Ｈｏｌｏｍａｓｔｉｇｏｔｏｉｄｅｓ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、イルペックス属（Ｉｒｐｅｘ）、シイタケ属（Ｌｅｎｔｉｎｕｌａ）、レプトスパエリア属（Ｌｅｐｔｏｓｐａｅｒｉａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、メラノカルパス属（Ｍｅｌａｎｏｃａｒｐｕｓ）、メリピルス属（Ｍｅｒｉｐｉｌｕｓ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ポイトラシア属（Ｐｏｉｔｒａｓｉａ）、シュードプレクタニア属（Ｐｓｅｕｄｏｐｌｅｃｔａｎｉａ）、シュードトリコニンファ属（Ｐｓｅｕｄｏｔｒｉｃｈｏｎｙｍｐｈａ），リゾムコール属（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）、スエヒロタケ属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、シタリジウム属（Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、トリコファエア属（Ｔｒｉｃｈｏｐｈａｅａ）、ベルチシリウム属（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ）、フクロタケ属（Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ）、又はクロサイワイタケ属（Ｘｙｌａｒｉａ）ポリペプチドなどの糸状菌ポリペプチドであってもよい。
【０１９６】
別の態様では、ポリペプチドは、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、又はサッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）ポリペプチドであってもよい。
【０１９７】
別の態様では、ポリペプチドは、アクレモニウム・セルロリティカス（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）、アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ラクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クロソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クィーンズランディカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウエレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・グリセア（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｇｒｉｓｅａ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（���ｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ウスバタケ（Ｉｒｐｅｘ  ｌａｃｔｅｕｓ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、チエラビア・アクロマチカ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｃｈｒｏｍａｔｉｃａ）、チエラビア・アルボミセス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｍｙｃｅｓ）、チエラビア・アルボピロサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｌｂｏｐｉｌｏｓａ）、チエラビア・アウストラレインシス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ａｕｓｔｒａｌｅｉｎｓｉｓ）、チエラビア・フィメチ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｆｉｍｅｔｉ）、チエラビア・ミクロスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ）、チエラビア・オビスポラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｏｖｉｓｐｏｒａ）、チエラビア・ペルビアナ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｐｅｒｕｖｉａｎａ）、チエラビア・セトサ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｅｔｏｓａ）、チエラビア・スペデドニウム（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｐｅｄｅｄｏｎｉｕｍ）、チエラビア・サブサーモフィラ（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｕｂｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）ポリペプチドである。
【０１９８】
前述の種について、本発明は、それらがその知られている種の名称に関係なく、完全状態及び不完全状態の双方と、例えば無性世代などのその他の分類学的均等物とを包含することが理解されるであろう。当業者は、適切な均等物の同一性を容易に認識するであろう。
【０１９９】
これらの種の株は、米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物細胞培養コレクション（ＤＳＭＺ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ）、及び北部地域研究センター（ＮＲＲＬ）の農業研究用特許培養株コレクションなどのいくつかの培養コレクションで一般に容易にアクセスできる。
【０２００】
ポリペプチドは、自然界（例えば、土壌、堆肥、水など）から単離された微生物をはじめとするその他の供給源から、又は前述したプローブを使用して天然材料（例えば、土壌、堆肥、水など）から直接得られたＤＮＡサンプルから、同定され得られてもよい。微生物及びＤＮＡを自然生息地から直接単離する技術は、当該技術分野で周知である。次にポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、別の微生物又は混合されたＤＮＡサンプルのゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリを同様にスクリーニングすることによって、得られてもよい。ひとたびポリペプチドをコードするポリヌクレオチドがプローブで検出されると、当業者に知られている技術を利用することによって、ポリヌクレオチドが単離又はクローン化され得る（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照されたい）。
【０２０１】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、本明細書に記載の本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドにも関する。
【０２０２】
ポリヌクレオチドを単離又はクローン化するために使用される技術は当該技術分野で公知であり、ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ、又はそれらの組み合わせからの単離が挙げられる。ゲノムＤＮＡからのポリヌクレオチドのクローニングは、例えば、良く知られているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は発現ライブラリの抗体スクリーニングを使用して、共有構造的特徴があるクローン化ＤＮＡ断片を検出することによって、もたらされ得る。例えば、Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，ＰＣＲ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ライゲーション活性化転写（ＬＡＴ）、及びポリヌクレオチドベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）などのその他の核酸増幅手順が使用されてもよい。
【０２０３】
本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの修飾は、ポリペプチドに実質的に類似したポリペプチドを合成するために必要であってもよい。ポリペプチドに「実質的に類似」という用語は、ポリペプチドの天然に存在しない形態を指す。これらのポリペプチドは、例えば、比活性、熱安定性、最適ｐＨ値などが異なる変異型など、何らかの操作された様式で、その天然原料から単離されたポリペプチドと異なってもよい。変異型は、配列番号９又は配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列として提示されるポリヌクレオチド、又は例えば、それらの部分配列などのそのｃＤＮＡ配列に基づいて、及び／又はポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらさないが、酵素の産生が意図される宿主生物のコドン使用頻度に対応するヌクレオチド置換の導入によって、又は異なるアミノ酸配列を生じてもよいヌクレオチド置換の導入によって、構築されてもよい。ヌクレオチド置換の一般的な説明については、Ｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ２：９５−１０７を参照されたい。
【０２０４】
核酸コンストラクト
本発明はまた、制御配列に適合する条件下で適切な宿主細胞におけるコード配列の発現を指示する、１つ又は複数の制御配列に作動可能に連結された、本発明のポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクトにも関する。
【０２０５】
ポリヌクレオチドは様々な方法で操作されて、ポリペプチドの発現が提供されもよい。ベクターへの挿入に先だつポリヌクレオチドの操作は、発現ベクター次第で望ましくあっても又は必要であってもよい。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドを修飾する技術は、当技術分野で周知である。
【０２０６】
制御配列は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識されるポリヌクレオチドである、プロモーターであってもよい。プロモーターは、ポリペプチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、短縮型、及び雑種のプロモーターをはじめとする、宿主細胞内で転写活性を示す任意のポリヌクレオチドであってもよく、宿主細胞と同種又は異種の細胞外又は細胞内ポリペプチドのどちらかをコードする遺伝子から得られてもよい。
【０２０７】
糸状菌宿主細胞における本発明の核酸コンストラクトの転写を指示する適切なプロモーターの例は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）酸安定性α−アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）又はアスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）アルカリプロテアーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）アミログルコシダーゼ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）Ｄａｒｉａ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）Ｑｕｉｎｎ（国際公開第００／５６９００号パンフレット）、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、及びトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）翻訳伸長因子、並びにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（未翻訳リーダーがアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子からの未翻訳リーダーによって置換されている、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）中性α−アミラーゼ遺伝子からの修飾プロモーター；非限定的例としては、未翻訳リーダーがアスペルギルス・ニデュランス（Ａ���ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子からの未翻訳リーダーによって置換されている、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性α−アミラーゼ遺伝子からの修飾プロモーターが挙げられる）；及びそれらの変異体、短縮型、及び雑種プロモーターの遺伝子から得られるプロモーターである。その他のプロモーターは、米国特許第６，０１１，１４７号明細書に記載される。
【０２０８】
制御配列は、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる、転写ターミネーターであってもよい。ターミネーターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結される。宿主細胞内で機能する任意のターミネーターが、本発明で使用されてもよい。
【０２０９】
糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アセトアミダーゼ、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）エンドグルカナーゼＶ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）キシラナーゼＩＩＩ、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）β−キシロシダーゼ、及びトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）翻訳伸長因子遺伝子から得られる。
【０２１０】
制御配列はまた、プロモーターの下流且つ遺伝子の発現を増加させる遺伝子のコード配列の上流である、ｍＲＮＡ安定化領域であってもよい。
【０２１１】
制御配列は、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域であるリーダーでもあってもよい。リーダーは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５’末端に作動可能に連結される。宿主細胞内で機能する任意のリーダーが、使用されてもよい。
【０２１２】
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ及びアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）トリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
【０２１３】
制御配列はまた、ポリアデニル化配列、ポリヌクレオチドの３’末端に作動可能に連結された配列であってもよく、転写される場合は、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして、宿主細胞によって認識される。宿主細胞内で機能する任意のポリアデニル化配列が、使用されてもよい。
【０２１４】
糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）アントラニル酸シンターゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）α−グルコシダーゼアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、及びフザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）トリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【０２１５】
制御配列はまた、ポリペプチドのＮ末端に連結するシグナルペプチドをコードしてポリペプチドを細胞の分泌経路に誘導する、シグナルペプチドコード領域であってもよい。ポリヌクレオチドのコード配列の５’末端は、翻訳読み枠内でポリペプチドをコードするコード配列のセグメントと天然に連結された、シグナルペプチドコード配列を本質的に含有してもよい。代案としては、コード配列の５’末端は、コード配列にとって外来性のシグナルペプチドコード配列を含有してもよい。コード配列がシグナルペプチドコード配列を天然に含まない場合、外来性シグナルペプチドコード配列が必要であってもよい。代案としては、ポリペプチドの分泌を増強するために、外来性シグナルペプチドコード配列が、天然シグナルペプチドコード配列を単純に置換してもよい。しかし、発現されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に誘導する、あらゆるシグナルペプチドコード配列が使用されてもよい。
【０２１６】
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード配列は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）中性アミラーゼ、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼ、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡアミラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）セルラーゼ、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）エンドグルカナーゼＶ、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）リパーゼ、及びリゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
【０２１７】
制御配列は、ポリペプチドのＮ末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード配列であってもよい。結果として得られたポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド（又は場合によってはチモーゲン）として知られる。プロポリペプチドは一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的切断によって、活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード配列は、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）ラッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、及びサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）α因子の遺伝子から得られてもよい。
【０２１８】
シグナルペプチド配列とプロペプチド配列の双方が存在する場合、プロペプチド配列はポリペプチドのＮ末端の隣に位置し、シグナルペプチド配列はプロペプチド配列のＮ末端の隣に位置する。
【０２１９】
宿主細胞の成長に対してポリペプチドの発現を調節する調節配列を付加することもまた、望ましくあってもよい。調節配列の例は、調節化合物の存在をはじめとする化学的又は物理的刺激に応答して、遺伝子の発現をオン又はオフにするものである。糸状菌においては、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）グルコアミラーゼプロモーター、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、及びアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）グルコアミラーゼプロモーター、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩプロモーター、及びトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セロビオヒドロラーゼＩＩプロモーターが使用されてもよい。調節配列のその他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらの調節配列としては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、及び重金属によって増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、調節配列に作動可能に連結されるであろう。
【０２２０】
発現ベクター
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモーター、転写及び翻訳停止シグナルを含む、組換え発現ベクターに関する。種々のヌクレオチド及び制御配列が共に結合され、１つ又は複数の都合良い制限部位を含んでもよい組換え発現ベクターが生成されて、このような部位における、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの挿入又は置換が可能になってもよい。代案としては、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド、又はポリヌクレオチドを含む核酸コンストラクトを発現のための適切なベクターに挿入することによって発現されてもよい。発現ベクターを作成する際、コード配列は、コード配列が発現に適した制御配列と作動的に連結するように、ベクター内に位置する。
【０２２１】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に供されてポリヌクレオチドの発現をもたらし得る、任意のベクター（例えば、プラスミド又はウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターがその中に導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状又は閉環状プラスミドであってもよい。
【０２２２】
ベクターは、自律的に複製するベクター、すなわち、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、又は人工染色体など、その複製が染色体の複製と無関係な染色体外実体として存在する、ベクターなどであってもよい。ベクターは、自己複製を保証するための任意の手段を含有してもよい。代案としては、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれて、それがその中に組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。さらに、宿主細胞又はトランスポゾンのゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含有する、単一ベクター若しくはプラスミド又は２つ以上のベクター若しくはプラスミドが使用されてもよい。
【０２２３】
ベクターは、好ましくは、形質転換、形質移入、又は形質導入などを受けた細胞の容易な選択を可能にする、１つ又は複数の選択可能マーカーを含有する。選択可能マーカーは、その産物が、殺生剤又はウイルス耐性、重金属耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。
【０２２４】
糸状菌宿主細胞内で使用するための選択可能マーカーとしては、ａｄｅＡ（ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼ）、ａｄｅＢ（ホスホリボシル−アミノイミダゾールシンターゼ）、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、及びｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、並びにそれらの均等物が挙げられるが、これに限定されるものではない。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞で使用するのに好ましいのは、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）又はアスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）ａｍｄＳ及びｐｙｒＧ遺伝子及びストレプトミセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ｂａｒ遺伝子である。トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞で使用するのに好ましいのは、ａｄｅＡ、ａｄｅＢ、ａｍｄＳ、ｈｐｈ、及びｐｙｒＧ遺伝子である。
【０２２５】
選択可能マーカーは、国際公開第２０１０／０３９８８９号パンフレットに記載されるような二重選択可能マーカーシステムであってもよい。一態様では、二重選択可能マーカーは、ｈｐｈ−ｔｋ二重選択可能マーカーシステムである。
【０２２６】
ベクターは、好ましくは、ベクターの宿主細胞ゲノムへの組み込みを可能にし、又はゲノムとは無関係の細胞内のベクターの自律複製を可能にする、要素を含有する。
【０２２７】
宿主細胞ゲノムへの組み込みでは、ベクターは、相同又は非相同組換えによるゲノムへの組み込みのために、ポリペプチド又はベクターの任意のその他の要素をコードする、ポリヌクレオチドの配列に依存してもよい。代案としては、ベクターは、染色体の正確な位置における、宿主細胞ゲノムへの相同組換えによる組み込みを指示するための追加的なポリヌクレオチドを含有してもよい。正確な位置における組み込みの可能性を高めるために、組み込み要素は、対応する標的配列と高度な配列同一性を有して相同組換えの可能性を高める、１００〜１０，０００塩基対、４００〜１０，０００塩基対、８００〜１０，０００塩基対などの十分な数の核酸を含有すべきである。組み込み要素は、宿主細胞ゲノム中の標的配列と相同的な任意の配列であってもよい。さらに、組み込み要素は、非コード化又はコード化ポリヌクレオチドであってもよい。他方、ベクターは、非相同組換えによって、宿主細胞ゲノムに組み込まれてもよい。
【０２２８】
自律複製では、ベクターは、ベクターが当該宿主細胞内で自律的に複製できるようにする、複製起点をさらに含んでもよい。複製起点は、細胞内で機能する自律複製を媒介する、任意のプラスミドレプリケーターであってもよい。「複製起点」又は「プラスミドレプリケーター」という用語は、プラスミド又はベクターが生体内で自己複製できるようにするポリヌクレオチドを意味する。
【０２２９】
糸状菌細胞で有用な複製起点の例は、ＡＭＡ１とＡＮＳ１である（Ｇｅｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ９８：６１−６７；Ｃｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：９１６３−９１７５；国際公開第００／２４８８３号パンフレット）。ＡＭＡ１遺伝子の単離、及び同遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、国際公開第００／２４８８３号パンフレットで開示される方法に従って達成され得る。
【０２３０】
本発明のポリヌクレオチドの２つ以上のコピーを宿主細胞に挿入して、ポリペプチドの産生を増加させてもよい。ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加的なコピーを宿主細胞ゲノムに組み込むことによって、又は増幅可能な選択可能マーカー遺伝子をポリヌクレオチドに含めることによって得られ得て、細胞は選択可能マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有し、その結果、適切な選択可能薬剤の存在下で細胞を培養することによって、ポリヌクレオチドの追加的なコピーが選択され得る。
【０２３１】
上述した要素を連結し本発明の組換え発現ベクターを構築するのに使用される手順は、当業者に良く知られている（例えば、前出のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照されたい）。
【０２３２】
宿主細胞
本発明はまた、本発明のポリペプチドの産生を指示する１つ又は複数の制御配列に作動可能に連結された、本発明のポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞にも関する。コンストラクト又はベクターが、染色体の組み込み体として維持され、又は前述の自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、ポリヌクレオチドを含むコンストラクト又はベクターが、宿主細胞に導入される。「宿主細胞」という用語は、複製中に起こる変異のために親細胞と同一ではない、親細胞の子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ポリペプチドをコードする遺伝子及びその供給源に大きく依存する。
【０２３３】
宿主細胞は、真菌細胞であってもよい。「真菌」には、本明細書の用法では、子嚢菌門、担子菌門、糸状菌門、及び接合菌門、並びに卵菌類及び全ての栄養胞子形成菌が含まれる。（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ，Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９５，ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによって定義される通り）。
【０２３４】
真菌宿主細胞は、糸状菌細胞であってもよい。「糸状菌」には、真菌類及び卵菌類亜門の全ての糸状体が含まれる（前出のＨａｗｋｓｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５によって定義される通り）。糸状菌は一般に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及びその他の複合多糖類から構成される菌糸体壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸伸長によるもので、炭素異化作用は偏性好気性である。
【０２３５】
糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム属（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アウレオバシジウム属（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、ヤケイロタケ属（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ）、セリポリオプシス属（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ）、クリソスポリウム属（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コプリナス属（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ）、カワラタケ属（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、フィリバシジウム属（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ属（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ属（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ属（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス属（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロミセス属（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ファネロカエテ属（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ）、シワウロコタケ属（Ｐｈｌｅｂｉａ）、ピロミセス属（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、ヒラタケ属（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ）、スエヒロタケ属（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロミセス属（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスクス属（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア属（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、カワラタケ属（Ｔｒａｍｅｔｅｓ）、又はトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）細胞であってもよい。
【０２３６】
例えば、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・フミガーツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、ヤケイロタケ（Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ  ａｄｕｓｔａ）、セリポリオプシス・アネイリナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ａｎｅｉｒｉｎａ）、セリポリオプシス・カレジエナ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｃａｒｅｇｉｅａ）、セリポリオプシス・ジルベセンス（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｇｉｌｖｅｓｃｅｎｓ）、セリポリオプシス・パンノシンタ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｐａｎｎｏｃｉｎｔａ）、セリポリオプシス・リブロサ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｒｉｖｕｌｏｓａ）、セリポリオプシス・スブルファ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｒｕｆａ）、セリポリオプシス・スブベルミスポラ（Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ  ｓｕｂｖｅｒｍｉｓｐｏｒａ）、クリソスポリウム・イノプス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｉｎｏｐｓ）、クリソスポリウム・ケラチノフィルム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｋｅｒａｔｉｎｏｐｈｉｌｕｍ）、クリソスポリウム・ラクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、クロソスポリウム・メルダリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｍｅｒｄａｒｉｕｍ）、クリソスポリウム・パンニコラ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｐａｎｎｉｃｏｌａ）、クリソスポリウム・クィーンズランディカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｑｕｅｅｎｓｌａｎｄｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・トロピカム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｔｒｏｐｉｃｕｍ）、クリソスポリウム・ゾナタム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｚｏｎａｔｕｍ）、ウシグソヒトヨタケ（Ｃｏｐｒｉｎｕｓ  ｃｉｎｅｒｅｕｓ）、アラゲカワラタケ（Ｃｏｒｉｏｌｕｓ  ｈｉｒｓｕｔｕｓ）、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルックウエレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レチクラツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムブシヌム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム���サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロスム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、ファネロカエテ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ  ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、コガネシワウロコタケ（Ｐｈｌｅｂｉａ  ｒａｄｉａｔａ）、エリンギ（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ  ｅｒｙｎｇｉｉ）、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、フルイカワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｉｌｌｏｓａ）、カワラタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、又はトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）細胞であってもよい。
【０２３７】
真菌細胞は、それ自体既知の様式での、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生が関与するプロセスによって、形質転換されてもよい。アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）及びトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主細胞の形質転換に適した手順は、欧州特許第２３８０２３号明細書、Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１４７０−１４７４、及びＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１４１９−１４２２に記載される。フザリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種の形質転換に適した方法は、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６、及び国際公開第９６／００７８７号パンフレットによって記述される。
【０２３８】
生産方法
本発明はまた、（ａ）ポリペプチドの産生に寄与する条件下で、本発明の組換え宿主細胞を培養するステップと；任意選択的に、（ｂ）ポリペプチドを回収するステップとを含む、本発明のポリペプチドを生産する方法にも関する。
【０２３９】
宿主細胞は、当該技術分野で公知の方法を使用して、ポリペプチドの産生に適した栄養培地で培養される。例えば、細胞は、適切な培地でポリペプチドの発現及び／又は単離を可能にする条件下において、振盪フラスコ培養、又は実験用若しくは工業用発酵槽内の小規模若しくは大規模発酵（継続的、バッチ、供給バッチ、又は固体発酵をはじめとする）によって、培養されてもよい。培養は、当該技術分野で公知の手順を用いて、炭素及び窒素源及び無機塩を含む適切な栄養培地で行われる。適切な培地は、商業的供給業者から入手可能であり、又は公開された組成（例えば、米国微生物系統保存機関のカタログにある）に従って調製されてもよい。ポリペプチドが栄養培地に分泌される場合、ポリペプチドは培地から直接回収され得る。ポリペプチドが分泌されない場合、それは細胞溶解産物から回収され得る。
【０２４０】
ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な当該技術分野で公知の方法を使用して検出されてもよい。これらの検出法としては、特異的抗体の使用、酵素産物の形成、又は酵素基質の消失が挙げられるが、これに限定されるものではない。例えば、酵素アッセイを使用して、ポリペプチドの活性が判定されてもよい。
【０２４１】
ポリペプチドは、当該技術分野で公知の方法を使用して回収されてもよい。例えば、ポリペプチドは、収集、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈殿をはじめとするが、これに限定されるものではない、従来の手順によって、栄養培地から回収されてもよい。一態様では、ポリペプチドを含む発酵ブロスが回収される。
【０２４２】
ポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除）、電気穿孔手順（例えば、分取用等電点電気泳動）、示差溶解度（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、又は抽出（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｊａｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｒｙｄｅｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９を参照されたい）をはじめとするが、これに限定されるものではない、当該技術分野で公知の様々な手順によって精製され、実質的に純粋なポリペプチドが得られてもよい。
【０２４３】
代案の態様では、ポリペプチドは回収されず、むしろポリペプチドを発現する本発明の宿主細胞が、ポリペプチドの供給源として使用される。
【０２４４】
酵素組成物
本発明はまた、本発明のポリペプチドを含む組成物にも関する。
【０２４５】
組成物は、例えば、単一成分組成物などの本発明のポリペプチドを主要な酵素成分として含んでもよい。代案としては、組成物は、例えば、α−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルコシダーゼ、β−キシロシダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エンドグルカナーゼ、エステラーゼ、グルコアミラーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、フィターゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、又はキシラナーゼなどの、加水分解酵素、異性化酵素、連結酵素、脱離酵素、酸化還元酵素、又は転移酵素からなる群から選択される１つ又は複数の（例えば、いくつかの）酵素などの複数の酵素活性を含んでもよい。
【０２４６】
組成物は、当該技術分野で公知の方法に従って調製されてもよく、液体又は乾燥組成物の形態であってもよい。組成物は、当該技術分野で公知の方法に従って安定化されてもよい。
【０２４７】
好ましい実施形態
本発明は、以下の番号付けされた実施形態によってさらに説明される：
１．トウモロコシ穀粒又はトウモロコシ穀粒画分と、有効量の１つ又は複数の加水分解酵素を含む酵素組成物とを混合するステップを含む、湿式製粉工程におけるトウモロコシ穀粒からの総デンプン収量及び／又はグルテン収量を改善する方法であって、前記加水分解酵素の少なくとも１つが、ＧＨ３０ポリペプチド、ＧＨ５ポリペプチド又はそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
【０２４８】
２．湿式製粉工程における繊維から放出されるデンプン及び／又はグルテンの量が増加する、実施形態１に記載の方法。
【０２４９】
３．
ａ）トウモロコシ穀粒を水に浸漬して浸漬穀粒を製造するステップと；
ｂ）浸漬穀粒を粉砕して、浸漬粉砕穀粒を製造するステップと；
ｃ）浸漬粉砕穀粒から胚芽を分離して、繊維、デンプン、及びグルテンを含むトウモロコシ穀粒塊を製造するステップと；
ｄ）得られたトウモロコシ穀粒塊を繊維洗浄手順に供するステップと
を含む、実施形態１〜２のいずれかに記載の方法。
【０２５０】
４．前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分が、実施形態３に記載のステップｄ）の前、最中又は後に、前記１つ又は複数の加水分解酵素と混合される、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
【０２５１】
５．前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分が、実施形態３に記載のステップｄ）の最中に、前記１つ又は複数の加水分解酵素と混合される、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
【０２５２】
６．前記トウモロコシ穀粒又は前記トウモロコシ穀粒画分が、少なくとも１５分間にわたり、前記１つ又は複数の加水分解酵素と反応させられる、実施形態１〜５のいずれかに記載の方法。
【０２５３】
７．前記繊維洗浄手順が、１つ又は複数の加水分解酵素の導入のために最適化された繊維洗浄システムの使用を含み、繊維洗浄システムが、繊維洗浄システムにおける少なくとも３５分間且つ４８時間未満の総保持時間を提供するように構成された空間を含む、実施形態３〜６のいずれかに記載の方法。
【０２５４】
８．繊維洗浄システムに組み込まれた前記空間内のインキュベーション時間が、少なくとも５分間且つ４８時間未満である、実施形態１〜７のいずれかに記載の方法。
【０２５５】
９．インキュベーション温度が２５℃〜９５℃である、実施形態１〜８のいずれかに記載の方法。
【０２５６】
１０．前記ＧＨ５ポリペプチドがキシラナーゼ活性を有する、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。
【０２５７】
１１．前記ＧＨ３０ポリペプチドがキシラナーゼ活性を有する、実施形態１〜１０のいずれかに記載の方法。
【０２５８】
１２．前記ＧＨ５ポリペプチドが、エンド−β−１，４−グルカナーゼ／セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）活性及び／又はエンド−β−１，４−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）活性及び／又はβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）活性及び／又はβ−マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２５）活性及び／又はβ−グルコシルセラミダーゼ（ＥＣ３．２．１．４５）活性及び／又はグルカンβ−１，３−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５８）活性及び／又はリケニナーゼ（ＥＣ３．２．１．７３）活性及び／又はエキソ−β−１，４−グルカナーゼ／セロデキストリナーゼ（ＥＣ３．２．１．７４）活性及び／又はグルカンエンド−１，６−β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７５）活性及び／又はマンナンエンド−β−１，４−マンノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．７８）活性及び／又はセルロースβ−１，４−セロビオシダーゼ（ＥＣ３．２．１．９１）活性及び／又はステリルβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１０４）活性又はエンドグリコセラミダーゼ（ＥＣ３．２．１．１２３）活性及び／又はキトサナーゼ（ＥＣ３．２．１．１３２）活性及び／又はβ−プリメベロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１４９）活性及び／又はキシログルカン−特異的エンド−β−１，４−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．１５１）活性及び／又はエンド−β−１，６−ガラクタナーゼ（ＥＣ３．２．１．１６４）活性及び／又はヘスペリジン６−Ｏ−α−Ｌ−ラムノシル−β−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．１６８）活性及び／又はβ−１，３−マンナナーゼ（ＥＣ３．２．１．−）活性及び／又はアラビノキシラン−特異的エンド−β−１，４−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．−）活性及び／又はマンナントランスグリコシラーゼ（ＥＣ２．４．１．−）活性の１つ又は複数をさらに含む、実施形態１〜１１のいずれかに記載の方法。
【０２５９】
１３．前記ＧＨ３０ポリペプチドが、エンド−β−１，４−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）活性及び／又はβ−グルコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．２１）活性及び／又はβ−グルクロニダーゼ（ＥＣ３．２．１．３１）活性及び／又はβ−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）活性及び／又はβ−フコシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３８）活性及び／又はグルコシルセラミダーゼ（ＥＣ３．２．１．４５）活性及び／又はβ−１，６−グルカナーゼ（ＥＣ３．２．１．７５）活性及び／又はグルクロノアラビノキシランエンド−β−１，４−キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．１３６）活性及び／又はエンド−β−１，６−ガラクタナーゼ（ＥＣ：３．２．１．１６４）活性及び／又は［還元末端］β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．−）活性の１つ又は複数をさらに含む、実施形態１〜１２のいずれかに記載の方法。
【０２６０】
１４．ＧＨ５ポリペプチドが、
ｉ）配列番号１〜３、配列番号８、配列番号１０又は配列番号１２に記載されるアミノ酸配列の成熟ポリペプチド；
ｉｉ）ｉ）の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有する、成熟ポリペプチド；
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のいずれか１つの成熟ポリペプチドの部分配列
からなる群から選択される、実施形態１〜１３のいずれかに記載の方法。
【０２６１】
１５．ＧＨ３０ポリペプチドが、
ｉ）配列番号４；配列番号５；配列番号６；又は配列番号７に記載されるアミノ酸配列の成熟ポリペプチド；
ｉｉ）ｉ）の成熟ポリペプチドと少なくとも６０％の同一性を有する、成熟ポリペプチド；
ｉｉｉ）ｉ）及びｉｉ）のいずれか１つの成熟ポリペプチドの部分配列からなる群から選択される、実施形態１〜１４のいずれかに記載の方法。
【０２６２】
１６．前記酵素組成物が、セルラーゼ（ＥＣ３．２．１．４）、キシラナーゼ（ＥＣ３．２．１．８）、アラビノフラノシダーゼ（ＥＣ３．２．１．５５（非還元末端α−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ）；ＥＣ３．２．１．１８５（非還元末端β−Ｌ−アラビノフラノシダーゼ）セロビオヒドロラーゼＩ（ＥＣ３．２．１．１５０）、セロビオヒドロラーゼＩＩ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．９１）、セロビオシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１７６）、β−グルコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．２１）、β−キシロシダーゼ（ＥＣ３．２．１．３７）又はプロテアーゼ（Ｅ．ＣＸＸＸＸ）からなる群から選択される１つ又は複数の酵素をさらに含む１つ又は複数の加水分解酵素を含む、実施形態１〜１５のいずれかに記載の方法。
【０２６３】
１７．加水分解酵素の１つ又は複数が、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）などのセルラーゼバックグラウンドを有する生物において発現される、実施形態１〜１６のいずれかに記載の方法。
【０２６４】
１８．１つ又は複数の加水分解酵素が精製される、実施形態１〜１７のいずれかに記載の方法。
【０２６５】
１９．１つ又は複数の加水分解酵素が液体組成物中にある、実施形態１〜１８のいずれかに記載の方法。
【０２６６】
２０．１つ又は複数の加水分解酵素が固体組成物中にある、実施形態１〜１９のいずれかに記載の方法。
【０２６７】
２１．前記トウモロコシ穀粒塊の１つ又は複数の画分と混合される１つ又は複数の加水分解酵素の有効量が、０．００５〜０．５ｋｇの酵素タンパク質／湿潤製粉工程に入るトウモロコシ穀粒の計量トンである、実施形態１〜２０のいずれかに記載の方法。
【０２６８】
２２．実施形態１〜２１のいずれかに記載の方法によって得られる、トウモロコシ繊維を含む組成物。
【０２６９】
２３．実施形態１〜２１のいずれかで定義される湿式製粉工程においてトウモロコシ穀粒からの総デンプン収量及び／又はグルテン収量を改善する方法における、ＧＨ３０ポリペプチド及び／又はＧＨ５ポリペプチドの使用。
【０２７０】
２４．（ａ）配列番号１０又は配列番号１２の成熟ポリペプチドと、少なくとも８０％の配列同一性を有する、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号９又は配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列又はそれらのｃＤＮＡ配列と、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、ポリペプチド；
（ｃ）１つ又は複数の位置に置換、欠失、及び／又は挿入を含む、配列番号１０又は配列番号１２の成熟ポリペプチドの変異型；及び
（ｄ）ペクチンリアーゼ活性を有する、（ａ）、（ｂ）、又は（ｃ）のポリペプチドの断片
からなる群から選択される、キシラナーゼ活性を有する単離ポリペプチド。
【０２７１】
２５．配列番号１０又は配列番号１２の成熟ポリペプチドと、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する、実施形態２４のポリペプチド。
【０２７２】
２６．中〜高ストリンジェンシー条件から非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号９又は配列番号１１の成熟ポリペプチドコード配列、（ｉｉ）それらのｃＤＮＡ配列、又は（ｉｉｉ）（ｉ）又は（ｉｉ）の全長補体とハイブリッド形成するポリヌクレオチドによってコードされた、実施形態２４又は２５のポリペプチド。
【０２７３】
２７．配列番号１０又は配列番号１２の成熟ポリペプチドコード配列又はそれらのｃＤＮＡ配列と、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチドによってコードされる、実施形態２４〜２６のいずれかに記載のポリペプチド。
【０２７４】
２８．配列番号１０又は配列番号１２；又は配列番号０又は配列番号１の成熟ポリペプチドを含み又はそれからなる、実施形態２４〜２７のいずれかに記載のポリペプチド。
【０２７５】
２９．実施形態２４〜２８のいずれかに記載のポリペプチドを含む、組成物。
【０２７６】
３０．実施形態２４〜２８のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【０２７７】
３１．発現宿主におけるポリペプチドの産生を誘導する１つ又は複数の制御配列に作動可能に連結された、実施形態３０に記載のポリヌクレオチドを含む、核酸コンストラクト又は発現ベクター。
【０２７８】
３２．ポリペプチドの産生を誘導する１つ又は複数の制御配列に作動可能に連結された、実施形態３０に記載のポリヌクレオチドを含む、組換え宿主細胞。
【０２７９】
３３．ａ）ポリペプチドの産生に寄与する条件下で、実施形態３２に記載の宿主細胞を培養するステップと；任意選択的に
ｂ）ポリペプチドを回収するステップと
を含む、キシラナーゼ活性を有するポリペプチドを生産する方法。
【実施例】
【０２８０】
実施例１：
本実施例では、酵素存在下及び非存在下でインキュベーション後に、繊維から分離されたデンプン及びグルテンの量を測定した。
【０２８１】
繊維サンプルは、２０％の総乾物含量で繊維圧搾後に湿式製粉工場から得た。サンプルを緩衝液（ｐＨ４、０．０２Ｍ酢酸ナトリウム）中に５％乾燥固体を含有する１００ｇのスラリーに再懸濁した。このスラリーに、１ｇの乾燥固形物基質（ＤＳ）当たり３５０μｇの最終比で酵素を添加した。表１のサンプルの詳細を参照されたい。
【０２８２】
【表１】
2020528748.tif 000007
【０２８３】
サンプルは、空気加熱式インキュベーター内で、５２℃及び４０℃の温度で（表１を参照されたい）、絶えず振盪しながら１２０分間インキュベートした。インキュベーション後、加工前にサンプルを氷水（５℃）中で迅速に冷却した。通過した濾液を収集しながら、スラリーを１５０ミクロンの篩に移した。篩の上に保持された繊維をスパチュラを用いて圧搾し、できるだけ多くの濾液を回収した。次に、圧搾した繊維を２００ｍｌの水を入れたビーカーに移して撹拌した。このスラリーを１５０ミクロンの篩に通過させ、収集された濾液を最初のものと合わせた。上記の圧搾、洗浄、及び濾過ステップをもう一度繰り返し、最終濾液を回収して最初の２つと合わせた。次に、合わせた濾液を今度は、ガラスマイクロ濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ）を通して真空濾過し、それは繊維から放出されて１５０ミクロンの篩を通過した不溶性固体を保持した。濾紙上に２００ｍｌの水を通過させてあらゆる微量の可溶性物質を除去した後、ろ紙上に保持された全不溶性固体を乾燥して秤量した。乾燥重量は、出発基質の繊維乾物の百分率（Ｗ／Ｗ）として、放出されたデンプン＋グルテンとして報告された。結果は、表２に示される。
【０２８４】
【表２】
2020528748.tif 000008
【０２８５】
ＧＨ５及び／又はＧＨ３０酵素添加の効果は、４０℃及び５２℃におけるデンプン及びグルテン収量の増加から明らかである。
【０２８６】
実施例２：
酵素
ＧＨ３０キシラナーゼＡ：バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号５）由来のＧＨ３０キシラナーゼ
ＧＨ３０キシラナーゼＢ：バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号６）由来のＧＨ３０キシラナーゼ
ＧＨ３０キシラナーゼＣ：バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）（配列番号７）由来のＧＨ３０キシラナーゼ
Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ／Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔ  １．５Ｌ：市販のセルラーゼ組成物（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。
【０２８７】
１０ｇ繊維アッセイは、Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔと組み合わされた、ＧＨ３０キシラナーゼＡ、ＧＨ３０キシラナーゼＢ又はＧＨ３０キシラナーゼＣを含有する酵素配合物を使用して、トウモロコシ１グラム当たり３５μｇの酵素タンパク質の用量で、５２℃で１時間のインキュベーションによってｐＨ３．８で実施した。配合物は、２０％（ｗ／ｗ）のＧＨ３０キシラナーゼＡ、ＧＨ３０キシラナーゼＢ又はＧＨ３０キシラナーゼＣ、残りの８０％（ｗ／ｗ）はＣｅｌｌｕｃｌａｓｔからなった。比較のために、Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔのみを含有する酵素組成物を含めた。繊維中１５．５２％の残留デンプン及び１２．００％の残留タンパク質があるトウモロコシ繊維を繊維アッセイの基質として使用した。規定の投与量でのトウモロコシ繊維からのデンプン＋グルテン（乾燥物質）の放出を測定した；結果は下の表に提供される。
【０２８８】
【表３】
2020528748.tif 000009
【０２８９】
Ｃｅｌｌｕｃｌａｓｔなどのセルラーゼ酵素と組み合わされた、ＧＨ３０キシラナーゼＡ、ＧＨ３０キシラナーゼＢ、及びＧＨ３０キシラナーゼＣの添加は、トウモロコシの湿式製粉工程におけるデンプン＋グルテンの収量を有意に増加させ得る。
【０２９０】
実施例３：ＧＨ５キシラナーゼによる実験用トウモロコシ湿式製粉繊維の処理
酵素
ＧＨ５キシラナーゼ：配列番号８（国際公開第２０１６／００５５２２号パンフレットの配列番号２６）の成熟タンパク質のアミノ酸配列を有する、クリセオバクテリウム属（Ｃｒｙｓｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種由来のＧＨ５＿２１キシラナーゼ。
【０２９１】
酵素カクテルＤ：主に、外因性ドナー由来のセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨＩ及びＩＩ）と、天然トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主由来のエンドグルカナーゼ（ＥＧ１及び２）とからなる。
【０２９２】
酵素カクテルＴ：主に、（約８０％）天然トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主由来のセロビオヒドロラーゼとエンドグルカナーゼとからなり、総タンパク質残りの約２０％は外因性ドナー由来のキシラナーゼＧＨ１０からなる。
【０２９３】
Ｆｒｏｎｔｉａ  Ｆｉｂｅｒｗａｓｈ（登録商標）は、キシラナーゼ及びセルラーゼのカクテルからなる市販品である。（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）。
【０２９４】
１０ｇ繊維アッセイは、一般に、処理に妥当な条件（ｐＨ３．５〜４、温度約５２℃）で１時間〜４時間にわたり、酵素の存在下で、湿式製粉工場から得られた湿潤繊維サンプルをインキュベートするステップを含む。インキュベーション後、繊維を（典型的には７５ミクロン以下の）篩に移し入れて圧搾し、主に分離されたデンプンとグルテンからなる濾液を収集する。篩上で何回かの洗浄を行い、洗浄液を最初の濾液と共に収集する。次に、収集した濾液を漏斗フィルター（開口部０．４５ミクロンのガラスフィルター）に通過させ、残りの濾液（主に溶解固形分）から不溶性固形物（主にデンプン及びグルテン）をさらに分離する。これらの回収された不溶性固形物を洗浄し、次に乾燥するまでオーブン乾燥する。不溶性乾燥質量を秤量し、次にＥｗｅｒｓ法の変法（酸加水分解とグルコースの液体クロマトグラフィーによる測定）を用いて、デンプン含有量を分析する。
【０２９５】
１０ｇ繊維アッセイは、以下に記載されるような異なる酵素処理を用いて、繊維を５０℃で２時間インキュベートして、ｐＨ４で実施する。対照は、いかなる酵素も添加されない繊維インキュベーションである。Ｆｒｏｎｔｉａ  Ｆｉｂｅｒｗａｓｈ（登録商標）は、キシラナーゼとセルラーゼのカクテルからなる、この工業用途のために使用される市販製品である。ＧＨ５は、そのどちらもトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）の発酵に由来する、２つの異なる酵素カクテルと組み合わせて投入する。ＧＨ５は、添加された総酵素タンパク質の２０％で投入し、残りの８０％は酵素カクテルのバックグラウンドからなった。全ての処理で添加された酵素タンパク質の総量は、乾燥繊維１グラム当たり５００マイクログラムであった。酵素カクテルＤ：主に、外因性ドナー由来のセロビオヒドロラーゼ（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｒｏｌａｓｅｓ）（ＣＢＨＩ及びＩＩ）と、天然トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主由来のエンドグルカナーゼ（ＥＧ１及び２）とからなる。酵素カクテルＴ：主に（約８０％）天然トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）宿主由来のセロビオヒドロラーゼとエンドグルカナーゼとからなり、総タンパク質の残りの約２０％は外因性ドナー由来のキシラナーゼＧＨ１０からなる。結果は、下の表に報告される。
【０２９６】
【表４】
2020528748.tif 000010
【０２９７】
実施例４：
１５ｍＬ繊維洗浄アッセイの方法説明
１５ｍＬ微細繊維アッセイは、一般に、Ｃｏｍｂｉ  Ｄ−２４ハイブリダイゼーションインキュベーター内で完全に混合しながら、処理に妥当な条件（ｐＨ４．０、温度およそ４０℃）で１時間にわたり、酵素の存在下で、トウモロコシ湿式製粉工場から得られた濡れた微細繊維サンプルをインキュベートするステップを含む。インキュベーション後、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｓｔｅｒｉｆｌｉｐチューブトップ濾過装置を通して、繊維を真空濾過する。繊維を蒸留水で３０ｍＬの体積に再懸濁し、徹底的にボルテックスして２回目の真空濾過に供する。収集された濾液は、抽出されたデンプン及びグルテンからなる。濾液をＡｖａｎｔｉ  Ｊ−Ｅ内で５，０００ｒｐｍで７分間遠心分離し、デンプンをペレット化する。デンプンとグルテンとのペレットを乱さないように、５０ｍＬの血清用ピペットを使用して上清を緩慢に除去する。この洗浄及び遠心分離手順をさらに２回繰り返し、可溶化オリゴマーを除去する。
【０２９８】
洗浄後、デンプンペレットを含めて５ｍＬの総容積が残される。ＥＺ−２  Ｅｌｉｔｅ溶媒蒸発器を使用して（方法：水性、最大６５℃、３時間、３，０００ｒｐｍ、１２０ミリバール）、過剰な水を除去する。この後、ペレット（デンプン及びグルテンを含有する）を５００μＬの１．６Ｍ塩酸に再懸濁し、９０℃で４５分間、１，０００ｒｐｍで加熱する。このインキュベーションは、デンプン顆粒を糖モノマーに分解する。酸加水分解後、６２５μＬの１．４Ｍ水酸化ナトリウムを使用して反応をクエンチし、室温まで冷却する。次に３４５μＬのジニトロサリチル（ｄｉｎｉｔｒｏｓａｌｉｃｙｃｌｉｃ）酸試薬（ＤＮＳ）の添加によって、還元糖の量を判定する。サンプルを９５℃、３００ｒｐｍで１０分間インキュベートする。利用可能な還元糖はＤＮＳと反応し、赤橙スペクトルの増加を引き起こす（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９５９）。次に、サンプルを５，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離して縮合物を収集し、周囲温度まで冷却する。８００μＬの各サンプルを９６深型ウェルプレートに移し入れ、マルチチャンネルピペットを使用して蒸留水で希釈する。次に、マルチチャンネルピペットを使用して、２００μＬをＮｕｎｃ  Ｆ９６ウェルプレートに移し入れる。Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００を用いて、５６０ナノメートル（ｎｍ）の吸光度を読み取る
【０２９９】
Ｆｒｏｎｔｉａ  Ｆｉｂｅｒｗａｓｈ（登録商標）に対するＧＨ５の改善
１５ｍＬ微細繊維アッセイは、繊維を４０℃で１時間にわたり、異なる酵素処理を用いてインキュベートし、ｐＨ４で実施する。対照は、酵素なしの繊維インキュベーションである。Ｆｒｏｎｔｉａ  Ｆｉｂｅｒｗａｓｈ（登録商標）は、湿式製粉工程で繊維からデンプンを放出させるために使用される、市販の酵素である。ＧＨ５配合物は、完全なトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｅｍａ  ｒｅｅｓｅｉ｝セルロース複合体（８０％）と、配列番号８の成熟タンパク質のアミノ酸配列を有するＧＨ５キシラナーゼ（２０％）とから構成される。全ての酵素配合物に、乾燥繊維固形物１グラム当たり合計５００マイクログラム（μｇ／ｇＤＳ）の酵素タンパク質を添加した。全ての処理は、三連で実施した。５６０ｎｍで吸光度を読み取り、グルコース標準を使用してグルコース（ｇ／Ｌ）に変換した。次に、計算されたグルコースを繊維乾燥固形物を使用して正規化し、繊維から放出されたデンプンとして報告した。吸光度及び繊維から放出されたデンプン（％）は、表５に報告される。
【０３００】
【表５】
2020528748.tif 000011
【０３０１】
実施例５−ＧＨ５多様性
１５ｍＬ微細繊維アッセイは、繊維を４０℃で１時間にわたり、表６の異なる酵素処理を用いてインキュベートし、ｐＨ４で実施する。対照は、酵素なしの繊維インキュベーションである。全ての酵素配合物は、４００μｇ／ｇＤＳのＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）（対照）を含有した。表６に示されるように、助剤ＧＨ５を２５μｇ／ｇＤＳで、適切な処理に添加した。５６０ｎｍで吸光度を読み取り、グルコース標準を使用してグルコース（ｇ／Ｌ）に変換した。次に、計算されたグルコースを繊維乾燥固形物を使用して正規化し、繊維から放出されたデンプンとして報告した。吸光度及び繊維から放出されたデンプン（％）は、表７に報告される。
【０３０２】
【表６】
2020528748.tif 000012
【０３０３】
【表７】
2020528748.tif 000013
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2020528748.tif 000017
【配列表】
2020528748000001.app
【国際調査報告】
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