(57)【要約】  腫瘍を有する対象に、腫瘍増殖または転移を制限するためにエフリンＢ１阻害剤、もしくはその薬学的に許容される塩、および／または腫瘍エクソソーム放出の阻害剤もしくはその薬学的に許容される塩の有効量を投与することを含む腫瘍治療のための組成物および方法を本明細書に開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍増殖または転移を制限するために、
（ａ）エフリンＢ１阻害剤、もしくはその薬学的に許容される塩；および／または
（ｂ）腫瘍エクソソーム放出の阻害剤、もしくはその薬学的に許容される塩
の有効量を、腫瘍を有する対象に投与することを含む腫瘍治療のための方法。
【請求項２】
前記方法が腫瘍神経支配を制限する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法がエフリンＢ１阻害剤の有効量を前記対象に投与することを含み、前記エフリンＢ１阻害剤がエフリンＢ１特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記エフリンＢ１阻害剤がエフリンＢ１特異的抗体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記エフリンＢ１特異抗体が前記エフリンＢ１の細胞外ドメイン内の１または複数のエピトープに結合する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記方法が腫瘍エクソソーム放出の阻害剤の有効量を前記対象に投与することを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記腫瘍エクソソーム放出の阻害剤がＲａｂ２７ａの阻害剤および／またはＲａｂ２７ｂの阻害剤を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｒａｂ２７ａの阻害剤および／またはＲａｂ２７ｂの阻害剤がＲａｂ２７ａおよび／またはＲａｂ２７ｂ特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記方法がＥ６とＰＴＰＮ１３との間の相互作用の阻害剤、またはその薬学的に許容される塩を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法がエフリンＢ１リン酸化の阻害剤、またはその薬学的に許容される塩を前記対象に投与することをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍が神経支配された固形腫瘍である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍が頭部腫瘍、頸部腫瘍、乳腺腫瘍、肺腫瘍、肝腫瘍、卵巣腫瘍、結腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、脳腫瘍、黒色腫、膵腫瘍、骨腫瘍、または前立腺腫瘍からなる群から選択される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍が高リスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性腫瘍である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＰＶ陽性腫瘍が頭部腫瘍または頸部腫瘍である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
頭部または頸部の前記ヒトパピローマウイルス陽性腫瘍が扁平上皮癌を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与することが前記腫瘍への局所送達を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍が対照と比較して、低いレベルのＰＴＰＮ１３発現、低いタンパク質レベル、または低いタンパク質活性レベルを有する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍を治療するための化合物を特定する方法であって、
（ａ）腫瘍細胞の第１の集団を１種または複数種の試験化合物と接触させること、および
（ｂ）腫瘍細胞の前記第１の集団から放出されるエクソソームの神経突起伸長の促進における活性を、腫瘍細胞の対照集団から放出されるエクソソームの神経突起伸長の促進における活性と比較すること
を含み、
前記対照と比較して、エクソソームに促進される神経突起伸長を減少させる試験化合物が腫瘍を治療するための候補化合物である、
方法。
【請求項１９】
腫瘍を治療するための化合物を特定するための方法であって、
（ａ）腫瘍細胞の第１の集団を１種または複数種の試験化合物と接触させること、および
（ｂ）細胞の前記第１の集団からのエクソソーム放出を腫瘍細胞の対照集団からのエクソソーム放出と比較すること
を含み、
前記対照と比較して、エクソソーム放出を減少させる試験化合物が腫瘍を治療するための候補化合物である、
方法。
【請求項２０】
腫瘍細胞の前記第１の集団および腫瘍細胞の前記対照集団がエフリンＢ１を構成的に発現する、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍細胞の前記第１の集団および腫瘍細胞の前記対照集団がヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染している、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）エフリンＢ１阻害剤、またはその薬学的に許容される塩；ならびに
（ｂ）Ｒａｂ２７ａの阻害剤および／もしくはＲａｂ２７ｂの阻害剤、またはその薬学的に許容される塩
を含む、組成物。
【請求項２３】
前記エフリンＢ１阻害剤がエフリンＢ１特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記エフリンＢ１阻害剤がエフリンＢ１特異的抗体を含む、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記エフリンＢ１特異的抗体が前記エフリンＢ１の細胞外ドメイン内の１または複数のエピトープに結合する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記Ｒａｂ２７ａの阻害剤および／または前記Ｒａｂ２７ｂの阻害剤がＲａｂ２７ａおよび／またはＲａｂ２７ｂ特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物がＥ６とＰＴＰＮ１３との間の相互作用の阻害剤、またはその薬学的に許容される塩をさらに含む、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｅ６とＰＴＰＮ１３との間の相互作用の前記阻害剤がＥ６と、ＰＴＰＮ１３への結合を競合するペプチド、またはＰＴＰＮ１３と、Ｅ６への結合を競合するペプチドを含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記組成物がエフリンＢ１リン酸化の阻害剤、またはその薬学的に許容される塩をさらに含む、請求項２３〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
エフリンＢ１リン酸化の前記阻害剤がダサタニブ、またはその薬学的に許容される塩を含む、請求項２９に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は２０１７年２月２３日出願の米国仮特許出願第６２／４６２８２５号、２０１７年８月２１日出願の同第６２／５４８２６４号、および２０１８年１月１１日出願の同第６２／６１６３７６号に対する優先権を主張し、各々を参照によりその全体を本明細書に組み入れる。
【０００２】
連邦資金提供記載
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｐ２０ＧＭ１０３５４８の下で、政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
神経支配された腫瘍は、神経支配されていない腫瘍よりも高悪性である。例えば、前立腺癌において、癌組織への神経線維の動員は、高い腫瘍増殖指数および再発と転移の高いリスクに関連している。前臨床での神経支配除去研究および遺伝子改変マウス癌モデルは、疾患進行における神経要素の機能的寄与を支持する。これらの研究は、神経系がバイスタンダーでなく、それよりも発癌および癌進行の活動的な当事者であることを強く示している。しかし、腫瘍がどのようにそれらの神経要素を得るかという機構理解が、依然として不明瞭である。腫瘍は、神経支配組織内で増殖することによって神経支配を獲得することができる。換言すれば、神経要素は微小環境内にすでに存在しており、腫瘍は、デフォルトでそれらを獲得する。しかし、同じ組織の一部の腫瘍が他よりもさらに神経支配されているという臨床所見は、それよりも、新血管新生およびリンパ脈管新生と類似する活性の腫瘍開始過程を示している。腫瘍が自身の神経支配（新神経発生と称される）を発生させるという可能性は、詳細にわたって調査されていない。
【発明の概要】
【０００４】
一態様において、腫瘍を有する対象に腫瘍増殖または転移を制限するために、以下の有効量を投与することを含む腫瘍治療方法を提供する。
（ａ）エフリンＢ１阻害剤、もしくはその薬学的に許容される塩；および／または
（ｂ）腫瘍エクソソームの放出の阻害剤、もしくはその薬学的に許容される塩。
【０００５】
一実施形態において、本方法は腫瘍の神経支配を制限する。別の実施形態において、本方法は、エフリンＢ１阻害剤の有効量を対象に投与することを含み、エフリンＢ１阻害剤は、エフリンＢ１特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。特定の実施形態において、エフリンＢ１阻害剤は、エフリンＢ１特異的抗体を含む。別の実施形態において、エフリンＢ１特異的抗体は、エフリンＢ１の細胞外ドメイン内の１または複数のエピトープに結合する。一実施形態において、本方法は腫瘍エクソソーム放出の阻害剤の有効量を対象に投与することを含む。さらなる実施形態において、腫瘍エクソソーム放出の阻害剤はＲａｂ２７ａ阻害剤および／またはＲａｂ２７ｂ阻害剤を含む。別の実施形態において、Ｒａｂ２７ａ阻害剤および／またはＲａｂ２７ｂ阻害剤は、Ｒａｂ２７ａおよび／またはＲａｂ２７ｂ特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。さらなる実施形態において、本方法は、Ｅ６とＰＴＰＮ１３との間の相互作用の阻害剤、またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することをさらに含む。一実施形態では、方法はエフリンＢ１リン酸化の阻害剤、またはその薬学的に許容される塩を対象に投与することをさらに含む。種々のさらなる実施形態において、腫瘍は神経支配された固形腫瘍であり得、該腫瘍は、頭部腫瘍、頸部腫瘍、乳腺腫瘍、肺腫瘍、肝腫瘍、卵巣腫瘍、結腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、脳腫瘍、黒色腫、膵腫瘍、骨腫瘍、または前立腺腫瘍からなる群から選択されることができ、該腫瘍は、高リスクのヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性腫瘍であり得、ＨＰＶ陽性腫瘍は、頭部腫瘍または頸部腫瘍であり得、頭部または頸部のヒトパピローマウイルス陽性腫瘍は、扁平上皮癌を含むことがあり、および／または、投与は腫瘍への局所送達を含み得る。一実施形態において、治療される腫瘍は、対照と比較して、ＰＴＰＮ１３発現レベル、タンパク質レベル、またはタンパク質活性レベルが低い。
【０００６】
別の態様において、腫瘍を治療するための化合物を特定する方法が提供され、該方法は
（ａ）腫瘍細胞の第１の集団を１種または複数種の試験化合物と接触させること、および
（ｂ）腫瘍細胞の第１の集団から放出されるエクソソームの神経突起伸長の促進における活性を、腫瘍細胞の対照集団から放出されるエクソソームの神経突起伸長の促進における活性と比較すること
を含み、
対照と比較して、エクソソームに促進される神経突起伸長を減少させる試験化合物は腫瘍を治療するための候補化合物である。
【０００７】
別の態様において、腫瘍を治療するための化合物を特定する方法が提供され、該方法は、
（ａ）腫瘍細胞の第１の集団を１種または複数種の試験化合物と接触させること、および
（ｂ）腫瘍細胞の第１の集団からのエクソソーム放出を腫瘍細胞の対照集団からのエクソソーム放出と比較すること
を含み、
対照と比較して、エクソソーム放出を減少させる試験化合物は腫瘍を治療するための候補化合物である。
【０００８】
これらの態様のいずれかの種々の実施形態において、腫瘍細胞の第１の集団および腫瘍細胞の対照集団は、エフリンＢ１を構成的に発現し、および／または腫瘍細胞の第１の集団および腫瘍細胞の対照集団はヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染し得る。
【０００９】
さらなる態様において、以下を含む組成物が提供される。
（ａ）エフリンＢ１阻害剤、またはその薬学的に許容される塩、ならびに
（ｂ）Ｒａｂ２７ａの阻害剤および／もしくはＲａｂ２７ｂの阻害剤、またはその薬学的に許容される塩。
【００１０】
一実施形態において、エフリンＢ１阻害剤は、エフリンＢ１特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。特定の実施形態において、エフリンＢ１阻害剤は、エフリンＢ１特異的抗体を含む。別の実施形態において、エフリンＢ１特異的抗体は、エフリンＢ１の細胞外ドメイン内の１または複数のエピトープに結合する。さらなる実施形態において、Ｒａｂ２７ａ阻害剤および／またはＲａｂ２７ｂ阻害剤は、Ｒａｂ２７ａおよび／またはＲａｂ２７ｂ特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、および／またはアンチセンスオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。別の実施形態において、組成物は、Ｅ６とＰＴＰＮ１３との間の相互作用の阻害剤、またはその薬学的に許容される塩をさらに含むことができる。一実施形態においては、Ｅ６とＰＴＰＮ１３との間の相互作用の阻害剤は、Ｅ６とＰＴＰＮ１３への結合を競合するペプチド、またはＰＴＰＮ１３とＥ６への結合を競合するペプチドを含む。さらなる実施形態において、組成物はエフリンＢ１リン酸化の阻害剤またはその薬学的に許容される塩をさらに含むことができる。一実施形態において、エフリンＢ１リン酸化の阻害剤は、ダサタニブ、またはその薬学的に許容される塩を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】患者データを示す。Ａ）頭頚部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）：β−ＩＩＩチューブリン（スケールバー、５０μｍ）、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）、血管作動性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）および一過性受容体電位バニロイド１型（ＴＲＰＶ１）（スケールバー、２０μｍ）についての神経の「支脈」および「束」の免疫組織化学（ＩＨＣ）。エクソソーム走査電子顕微鏡写真（スケールバー、２００ｎｍ）（Ｂ）、原子間力顕微鏡観察の振幅トレース（スケールバー、５００ｎｍ）（Ｃ）およびナノ粒子トラッキング分析（Ｄ）。Ｅ）対照（Ｃｎｔｌ）、患者（Ｐｔ）の血漿と組織（Ｔｉｓｓ）エクソソーム（Ｅｘｏｓ）ウエスタンブロット。血漿エクソソーム刺激に続く神経突起伸長（Ｆ）、または組織エクソソーム刺激に続く神経突起伸長（Ｇ）。Ｎｌ１、Ｎｌ２、Ｎｌ３対照；Ｐｔ１、Ｐｔ２、Ｐｔ３、患者；ＴＬ（扁桃）。スチューデントｔ検定。＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．００１。エラーバー、標準偏差。
【図２】ｍＥＥＲＬエクソソームおよび神経突起伸長を示す。Ａ）ｍＥＥＲＬ腫瘍、チロシン水酸化酵素（ＴＨ）、血管作動性腸管ポリペプチド（ＶＩＰ）および一過性受容体電位バニロイド１型（ＴＲＰＶ１）のＩＨＣ。スケールバー、２０μｍ。Ｂ）エクソソーム処理に続く神経突起伸長の定量化。統計解析：一元配置分散分析、テューキー検定による事後分析。＊＊＊、ｐ＜０．０５；ｎｓ、有意差なし。Ｎ＝４反復実験／状態；実験は、２回繰り返した。Ｃ）エクソソーム刺激に続くβ−ＩＩＩチューブリン陽性免疫蛍光ＰＣ１２細胞（さらに核をＤａＰｉで染色）。Ｄ）ウエスタンブロット解析。全細胞溶解物（ＷＣＬ）；エクソソーム（Ｅｘｏ）。Ｅ）エクソソームのウエスタンブロット解析。エフリンＢ１−Ｅｘ、エフリンＢ１細胞外エピトープ抗体。エフリンＢ１−Ｉｎ、エフリンＢ１細胞内エピトープ抗体。エラーバー、標準偏差。
【図３】ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）および神経突起伸長を示す。以下によるエクソソーム刺激に続く神経突起伸長：Ａ）ＨＰＶ陰性（−）または陽性（＋）のヒト細胞；４細胞株をＨＰＶ−群と＋群との間の相違についての事後テューキー検定と比較する一元配置分散分析による統計的分析。＊、ｐ＜０．００１。Ｂ）ＨＴＥ、ヒト扁桃上皮；ＨＴＥ  Ｅ６ΔＥ７、そのＰＤＺＢＭ（Δ）を欠失したＨＰＶ１６Ｅ６およびＥ７を発現する細胞；ＨＴＥ  Ｅ６Ｅ７、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７を発現する細胞。スチューデントのｔ検定による統計分析。＊＊、ｐ＜０．０５；ｎｓ、有意差なし。エラーバー、標準偏差。すべてのアッセイ：Ｎ＝４反復実験／状態；実験は、２回繰り返した。
【図４】ｉｎ  ｖｉｖｏで神経支配されているマウス腫瘍を示す。Ａ）示した腫瘍についてのβ−ＩＩＩチューブリンおよびＧＡＰＤＨのウエスタンブロット解析。Ｂ）Ａにおけるβ−ＩＩＩチューブリンウエスタンブロットの濃度測定定量化。β−ＩＩＩチューブリンシグナルをＧＡＰＤＨに対して正規化した。Ｎ＝４腫瘍／状態を解析した。スチューデントのｔ検定による統計解析；＊＊、ｐ＜０．０５；＊、ｐ＜０．０１；ｎｓ、有意差なし。エラーバー、標準偏差。
【図５−１】エクソソーム、神経支配および増殖を示す。Ａ）エクソソームのウエスタンブロット；Ｎ＝４回繰り返し、同様の結果を得た。Ｂ）産生細胞数あたりの粒子；Ｎ＝６回繰り返し、同様の結果を得た。Ｃ）ＣＦＤＡ−ＳＥ標識したエクソソームの相対蛍光単位。Ｎ＝２試料／状態。Ｄ）エクソソーム刺激に続く神経突起伸長。Ｎ＝４反復実験／状態；実験は、２回繰り返した。Ｅ）腫瘍増殖曲線；Ｎ＝７マウス／状態。Ｆ）増殖アッセイ。Ｎ＝３回繰り返し、同様の結果を得た。Ｇ）全腫瘍溶解物ウエスタンブロット。Ｈ）Ｇの濃度測定定量化。産生細胞数に対してエクソソームを正規化した。スチューデントのｔ検定による統計解析；ｎｓ＝有意差なし；示したｐ値；エラーバー、ＳＥＭ。
【図５−２】エクソソーム、神経支配および増殖を示す。Ａ）エクソソームのウエスタンブロット；Ｎ＝４回繰り返し、同様の結果を得た。Ｂ）産生細胞数あたりの粒子；Ｎ＝６回繰り返し、同様の結果を得た。Ｃ）ＣＦＤＡ−ＳＥ標識したエクソソームの相対蛍光単位。Ｎ＝２試料／状態。Ｄ）エクソソーム刺激に続く神経突起伸長。Ｎ＝４反復実験／状態；実験は、２回繰り返した。Ｅ）腫瘍増殖曲線；Ｎ＝７マウス／状態。Ｆ）増殖アッセイ。Ｎ＝３回繰り返し、同様の結果を得た。Ｇ）全腫瘍溶解物ウエスタンブロット。Ｈ）Ｇの濃度測定定量化。産生細胞数に対してエクソソームを正規化した。スチューデントのｔ検定による統計解析；ｎｓ＝有意差なし；示したｐ値；エラーバー、ＳＥＭ。
【図６】ＰＣ１２細胞は、ＣＴ２６（結腸直腸癌細胞株）、Ｂ１６（黒色腫癌細胞株）、または４Ｔ１（乳癌細胞株）からの条件培地とともに２４時間処置し、次いで神経突起伸長を定量化した。組換えＮＧＦ（ＮＧＦ）で処置したＰＣ１２細胞は陽性対照として役立ち、一方無処置ＰＣ１２細胞（ＰＣ１２）は陰性対照として役立った。
【図７】（Ａ）ＨＰＶ陰性扁平上皮癌細胞株において過剰発現するエフリンＢ１の神経突起伸長に対する効果を示すグラフである。（Ｂ）ＳＣＣ１細胞またはＳＣＣ１−エフリンＢ１細胞のいずれかを移植した免疫がないＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍増殖速度を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本明細書で用いる場合、特に明記しない限り、用語「ａ」および「ａｎ」は、「１つ」、「少なくとも１つ」または「１または複数」を意味するとみなされる。文脈上別段の必要がない限り、本明細書で用いる単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は単数を含むものとする。
【００１３】
本出願で用いられるすべての科学的および技術的用語は、別段の定めがない限り、当技術分野で一般的に使用されている意味を有する。
【００１４】
本明細書で用いる場合、「約」とは、記載された寸法または単位の±５％を意味する。
【００１５】
文脈上明確に指示しない限り、本開示のいずれの態様のすべての実施形態は、組み合わせで用いることができる。
【００１６】
第１の態様において、本開示は、腫瘍を治療する方法を提供し、腫瘍増殖または転移を制限するために
（ａ）エフリンＢ１阻害剤、および／または
（ｂ）腫瘍エクソソーム放出の阻害剤
の有効量を、腫瘍を有する対象に投与することを含む。
【００１７】
以下に続く実施例に示すように、本発明者らは、腫瘍由来エクソソームが腫瘍の新神経支配を引き起こし、さらに、エクソソーム内のエフリンＢ１が直接、または間接的にこの活性を調節することを発見した。したがって、エフリンＢ１、および／または腫瘍エクソソーム放出の他の阻害剤は、腫瘍増殖または転移を制限するのに有用である。
【００１８】
本明細書で用いる場合、用語「腫瘍増殖を処置する」とは、（ｉ）腫瘍サイズを制限すること、（ｉｉ）腫瘍サイズの増加速度を制限すること、（ｉｉｉ）腫瘍の神経支配を減少させること、（ｉｖ）腫瘍の神経支配の増加速度を制限すること、（ｖ）腫瘍転移を制限すること、（ｖｉ）腫瘍転移の増加速度を制限すること、（ｖｉｉ）腫瘍に起因する副作用（すなわち、疼痛、疾病行動など）を制限すること、および／または（ｖｉｉｉ）腫瘍に起因する副作用の増加速度を制限することを意味する。
【００１９】
投与される阻害剤の有効量は、腫瘍を治療する目標を達成し、およびあらゆる状況の観点（例えば、これに限定されないが、腫瘍の種類、対象の状態、対象が受けている他の治療処置（すなわち、化学療法、放射線療法、腫瘍摘出手術など）、使用している特定の阻害剤、および他のすべての要因）から当業者（主治医など）によって決定され得るいずれの量である。
【００２０】
本明細書で用いる場合、用語「対象」または「患者」とは、治療が望まれるあらゆる対象、例えばヒト、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ニワトリ等を意味する。最も好ましくは、対象はヒトである。
【００２１】
一実施形態において、方法は腫瘍の神経支配を制限するのに役立つ。本明細書で用いる場合、「腫瘍の神経支配」とは、腫瘍塊内に、その周辺および／またはその中に浸潤する神経線維と定義される。本明細書で用いる場合、「神経支配を制限する」とは、阻害剤による処置がない場合と比較して、新神経支配、または既存の神経支配におけるいずれの減少（すなわち、１％、２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、またはそれ以上の減少）を含むと定義される。
【００２２】
一実施形態において、方法はエフリンＢ１の阻害剤を投与することを含む。エフリンＢ１の任意の適切な阻害剤を使用してもよい。種々の非限定的実施形態において、エフリンＢ１阻害剤は、エフリンＢ１特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはエフリンＢ１の低分子阻害剤を含み得るが、これに限定されるものではない。特定の実施形態において、阻害剤はエフリンＢ１特異的抗体を含む。一非限定的実施形態において、エフリンＢ１特異的抗体は、エフリンＢ１の細胞外ドメイン内の１または複数のエピトープに結合する。他の実施形態において、エフリンＢ１特異的抗体は、ＰＤＺ結合ドメインおよび／または細胞質チロシン（すなわち、細胞外ドメイン内に存在しないもの）に結合することができる。
【００２３】
一実施形態において、エフリンＢ１特異的抗体は、以下の配列番号１または配列番号２として示す配列を有するエフリンＢ１タンパク質に結合する。
【００２４】
マウスエフリンＢ１アミノ酸配列
細胞外ドメインを太文字／下線で示す；細胞質ドメインをイタリック体で示す；膜貫通ドメインを拡大／アウトラインフォントで示す。
【化１】
2020514325.tif 000002
【００２５】
ヒトエフリンＢ１アミノ酸配列
細胞外ドメインを太文字／下線で示す；細胞質ドメインをイタリック体で示す；膜貫通ドメインを拡大／アウトラインフォントで示す。
【化２】
2020514325.tif 000003
【００２６】
別の実施形態において、エフリンＢ１特異的抗体は、エフリンＢ１タンパク質の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）内の１または複数のエピトープに結合し、ＥＣＤ配列は、以下の配列番号３または配列番号４に示す配列を含む、またはからなる。
ＭＡＲＰＧＱＲＷＬＳＫＷＬＶＡＭＶＶＬＴＬＣＲＬＡＴＰＬＡＫＮＬＥＰＶＳＷＳＳＬＮＰＫＦＬＳＧＫＧＬＶＩＹＰＫＩＧＤＫＬＤＩＩＣＰＲＡＥＡＧＲＰＹＥＹＹＫＬＹＬＶＲＰＥＱＡＡＡＣＳＴＶＬＤＰＮＶＬＶＴＣＮＫＰＨＱＥＩＲＦＴＩＫＦＱＥＦＳＰＮＹＭＧＬＥＦＫＫＹＨＤＹＹＩＴＳＴＳＮＧＳＬＥＧＬＥＮＲＥＧＧＶＣＲＴＲＴＭＫＩＶＭＫＶＧＱＤＰＮＡＶＴＰＥＱＬＴＴＳＲＰＳＫＥＳＤＮＴＶＫＴＡＴＱＡＰＧＲＧＳＱＧＤＳＤＧＫＨＥＴＶＮＱＥＥＫＳＧＰＧＡＧＧＧＧＳＧＤＳＤＳＦＦＮＳＫ（配列番号３；マウスエフリンＢ１細胞外ドメイン）；
ＭＡＲＰＧＱＲＷＬＧＫＷＬＶＡＭＶＶＷＡＬＣＲＬＡＴＰＬＡＫＮＬＥＰＶＳＷＳＳＬＮＰＫＦＬＳＧＫＧＬＶＩＹＰＫＩＧＤＫＬＤＩＩＣＰＲＡＥＲＰＹＥＹＹＫＬＹＬＶＲＰＥＱＡＡＡＣＳＴＶＬＤＰＮＶＬＶＴＣＮＲＰＥＱＥＩＲＦＴＩＫＦＱＥＦＳＰＮＹＭＧＬＥＦＫＫＨＨＤＹＹＩＴＳＴＳＮＧＳＬＥＧＬＥＮＲＥＧＧＶＣＲＴＲＴＭＫＩＩＭＫＶＧＱＤＰＮＡＶＴＰＥＱＬＴＴＳＲＰＳＫＥＡＤＮＴＶＫＭＡＴＱＡＰＧＳＲＧＳＬＧＤＳＤＧＫＨＥＴＶＮＱＥＥＫＳＧＰＧＡＳＧＧＳＳＧＤＰＤＧＦＦＮＳＫ（配列番号４；ヒトエフリンＢ１細胞外ドメイン）。
【００２７】
別の実施形態において、エフリンＢ１特異的抗体は、配列番号２のアミノ酸配列を有するエフリンＢ１タンパク質に結合するが、配列番号２のアミノ酸配列と比較して以下のアミノ酸変化の１または複数を有する：
２７位ＰがＲに
５４位ＰがＬに
６２位ＩがＴに
９８位ＬがＳに
１１１位ＴがＩに
１１５位ＱがＰに
１１９位ＰがＴに
１１９位ＰがＳに
１３７位ＴがＡに
１３８位ＳがＦに
１５１位ＧがＳに
１５１位ＧがＶに
１５３位ＣがＳに
１５３位ＣがＹに
１５５位ＴがＰに
１５８位ＭがＩに
１５８位ＭがＶに
１８２位ＳがＲに
【００２８】
これらの位置の変化は、ヒトエフリンＢ１タンパク質（配列番号２）の変異体、例えば頭蓋前頭鼻骨症候群に関連する変異体に存在する。
【００２９】
別の実施形態において、本開示の方法は、腫瘍エクソソーム放出の阻害剤の有効量を対象に投与することを含む。腫瘍エクソソーム放出の阻害剤は、単独で、またはエフリンＢ１阻害剤と組み合わせて用いることができる。腫瘍エクソソーム放出のあらゆる適切な阻害剤は、例えばＲａｂ２７ａおよび／またはＲａｂ２７ｂの阻害剤を用いることができるが、これに限定されるものではない。Ｒａｂ２７ａおよびＲａｂ２７ｂは、エクソソームの放出に機能する低分子ＧＴＰアーゼＲａｂファミリーのメンバーである。この実施形態において、Ｒａｂ２７ａの阻害剤および／またはＲａｂ２７ｂの阻害剤としては、Ｒａｂ２７ａおよび／またはＲａｂ２７ｂ特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および／または低分子阻害剤が挙げられるがこれに限定されるものではない。ヒトおよびマウスのＲａｂ２７ａおよびＲａｂ２７ｂのアミノ酸配列を以下に示す。
【００３０】
ヒトＲａｂ２７ａ：
ＭＳＤＧＤＹＤＹＬＩＫＦＬＡＬＧＤＳＧＶＧＫＴＳＶＬＹＱＹＴＤＧＫＦＮＳＫＦＩＴＴＶＧＩＤＦＲＥＫＲＶＶＹＲＡＳＧＰＤＧＡＴＧＲＧＱＲＩＨＬＱＬＷＤＴＡＧＱＥＲＦＲＳＬＴＴＡＦＦＲＤＡＭＧＦＬＬＬＦＤＬＴＮＥＱＳＦＬＮＶＲＮＷＩＳＱＬＱＭＨＡＹＣＥＮＰＤＩＶＬＣＧＮＫＳＤＬＥＤＱＲＶＶＫＥＥＥＡＩＡＬＡＥＫＹＧＩＰＹＦＥＴＳＡＡＮＧＴＮＩＳＱＡＩＥＭＬＬＤＬＩＭＫＲＭＥＲＣＶＤＫＳＷＩＰＥＧＶＶＲＳＮＧＨＡＳＴＤＱＬＳＥＥＫＥＫＧＡＣＧＣ（配列番号：５）
【００３１】
マウスＲａｂ２７ａ：
ＭＳＤＧＤＹＤＹＬＩＫＦＬＡＬＧＤＳＧＶＧＫＴＳＶＬＹＱＹＴＤＧＫＦＮＳＫＦＩＴＴＶＧＩＤＦＲＥＫＲＶＶＹＲＡＮＧＰＤＧＡＶＧＲＧＱＲＩＨＬＱＬＷＤＴＡＧＱＥＲＦＲＳＬＴＴＡＦＦＲＤＡＭＧＦＬＬＬＦＤＬＴＮＥＱＳＦＬＮＶＲＮＷＩＳＱＬＱＭＨＡＹＣＥＮＰＤＩＶＬＣＧＮＫＳＤＬＥＤＱＲＡＶＫＥＥＥＡＲＥＬＡＥＫＹＧＩＰＹＦＥＴＳＡＡＮＧＴＮＩＳＨＡＩＥＭＬＬＤＬＩＭＫＲＭＥＲＣＶＤＫＳＷＩＰＥＧＶＶＲＳＮＧＨＴＳＡＤＱＬＳＥＥＫＥＫＧＬＣＧＣ（配列番号：６）
【００３２】
ヒトＲａｂ２７ｂ：
ＭＴＤＧＤＹＤＹＬＩＫＬＬＡＬＧＤＳＧＶＧＫＴＴＦＬＹＲＹＴＤＮＫＦＮＰＫＦＩＴＴＶＧＩＤＦＲＥＫＲＶＶＹＮＡＱＧＰＮＧＳＳＧＫＡＦＫＶＨＬＱＬＷＤＴＡＧＱＥＲＦＲＳＬＴＴＡＦＦＲＤＡＭＧＦＬＬＭＦＤＬＴＳＱＱＳＦＬＮＶＲＮＷＭＳＱＬＱＡＮＡＹＣＥＮＰＤＩＶＬＩＧＮＫＡＤＬＰＤＱＲＥＶＮＥＲＱＡＲＥＬＡＤＫＹＧＩＰＹＦＥＴＳＡＡＴＧＱＮＶＥＫＡＶＥＴＬＬＤＬＩＭＫＲＭＥＱＣＶＥＫＴＱＩＰＤＴＶＮＧＧＮＳＧＮＬＤＧＥＫＰＰＥＫＫＣＩＣ（配列番号：７）
【００３３】
マウスＲａｂ２７ｂ：
ＭＴＤＧＤＹＤＹＬＩＫＬＬＡＬＧＤＳＧＶＧＫＴＴＦＬＹＲＹＴＤＮＫＦＮＰＫＦＩＴＴＶＧＩＤＦＲＥＫＲＶＶＹＤＴＱＧＡＤＧＡＳＧＫＡＦＫＶＨＬＱＬＷＤＴＡＧＱＥＲＦＲＳＬＴＴＡＦＦＲＤＡＭＧＦＬＬＭＦＤＬＴＳＱＱＳＦＬＮＶＲＮＷＭＳＱＬＱＡＮＡＹＣＥＮＰＤＩＶＬＩＧＮＫＡＤＬＰＤＱＲＥＶＮＥＲＱＡＲＥＬＡＥＫＹＧＩＰＹＦＥＴＳＡＡＴＧＱＮＶＥＫＳＶＥＴＬＬＤＬＩＭＫＲＭＥＫＣＶＥＫＴＱＶＰＤＴＶＮＧＧＮＳＧＫＬＤＧＥＫＰＡＥＫＫＣＡＣ（配列番号：８）
【００３４】
本開示の方法を用いて、あらゆる適切な腫瘍の種類を治療することができる。一実施形態において、腫瘍はあらゆる神経支配された固形腫瘍であり得る。種々の非限定的実施形態において、該方法を用いて、頭部腫瘍、頸部腫瘍、乳腺腫瘍、肺腫瘍、肝腫瘍、卵巣腫瘍、結腸腫瘍、結腸直腸腫瘍、黒色腫、脳腫瘍、または前立腺腫瘍を治療することができる。さらなる実施形態において、腫瘍は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）陽性腫瘍であり得、例えば頭部または頸部のＨＰＶ＋腫瘍が挙げられるがこれに限定されない。さらに非限定的実施形態において、頭部または頸部のＨＰＶ＋腫瘍は、扁平上皮癌を含む。別の実施形態において、腫瘍は高リスクＨＰＶ、例えばＨＰＶ１６、１８、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９または６８に対して陽性である。高リスクＨＰＶ亜型はすべて、タンパク質チロシンホスファターゼ非受容体１３型（ＰＴＰＮ１３）などのＰＤＺドメイン含有タンパク質に結合する、Ｃ末端ＰＤＺ結合モチーフ（ＰＤＺＢＭ）を含有するＥ６タンパク質を有する。ＨＰＶ１６  Ｅ６腫瘍性タンパク質は、細胞ホスファターゼおよび腫瘍抑制因子（ＰＴＰＮ１３）と相互作用し、この相互作用は、ＰＴＰＮ１３の分解をもたらす。ＰＴＰＮ１３は、さらにホスファターゼ基質であるエフリンＢ１と相互作用する。エフリンＢ１は、同族のＥｐｈ受容体チロンシンキナーゼを結合して、活性化する１回膜貫通タンパク質リガンドである。加えて、エフリンＢ１自体は、リン酸化されて、それ自体の下流シグナル伝達イベントを開始する。ＨＰＶ感染細胞において、ＰＴＰＮ１３発現が損なわれ、したがって、エフリンＢ１リン酸化は持続し、悪性表現型および疾患進行の原因となる。したがって、さらなる実施形態において、方法は、Ｅ６とＰＴＰＮ１３（Ｅ６は、ＰＴＰＮ１３のＰＤＺＢＭ＃４で、ＰＴＰＮ１３に結合する）との間の相互作用の阻害剤を対象に投与することをさらに含む。任意の適切な阻害剤を用いることができ、これに限定されないが、ＰＴＰＮ１３への結合をＥ６と競合する、またはＥ６への結合をＰＴＰＮ１３と競合するペプチドが含まれる。別の実施形態において、方法は対象にエフリンＢ１リン酸化の阻害剤を投与することをさらに含み得る。任意の適切な阻害剤を用いることができ、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤に限定されないが、ダサタニブ（以下に示す化学構造）、またはその薬学的に許容される塩が含まれる。
【００３５】
【化３】
2020514325.tif 000004
【００３６】
別の実施形態において、腫瘍は、低ＰＴＰＮ１３発現レベル、または低タンパク質／タンパク質活性レベルを有し、そのような腫瘍では、ＰＴＰＮ１３発現レベルまたはタンパク質レベル／活性がプロモーターメチル化、ｍＲＮＡ分解などに起因して低い。この実施形態において、ＰＴＰＮ１３発現またはタンパク質レベル／活性が閾値レベル以下（例えば、ＰＴＰＮ１３発現が正常レベルの対照）の腫瘍は本開示の方法で治療される。この実施形態において、エフリンＢ１リン酸化が持続し、本開示の方法は、そのような腫瘍を治療するのに有効である。ＰＴＰＮ１３発現が低いまたは無い例示的な腫瘍の種類としては、特定の乳癌（例えば、三種陰性乳癌：Ｒｅｖｉｌｌｉｏｎ  Ｆ，  Ｐｕｅｃｈ  Ｃ，  Ｒａｂｅｎｏｅｌｉｎａ  Ｆ，  Ｃｈａｌｂｏｓ  Ｄ，  Ｐｅｙｒａｔ  ＪＰ，  Ｆｒｅｉｓｓ  Ｇ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．  ２００９  Ｆｅｂ  １；１２４（３）：６３８−４３；Ｖｅｒｍｅｅｒ  ＰＤ，  Ｂｅｌｌ  Ｍ，  Ｌｅｅ  Ｋ，  Ｖｅｒｍｅｅｒ  ＤＷ，  Ｗｉｅｋｉｎｇ  ＢＧ，  Ｂｉｌａｌ  Ｅ，  Ｂｈａｎｏｔ  Ｇ，  Ｄｒａｐｋｉｎ  ＲＩ，  Ｇａｎｅｓａｎ  Ｓ，  Ｋｌｉｎｇｅｌｈｕｔｚ  ＡＪ，  Ｈｅｎｄｒｉｋｓ  ＷＪ，  Ｌｅｅ  ＪＨ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１２；７（１）：ｅ３０４４７）が挙げられるが、これに限定されるものではない。ＰＴＰＮ１３は結腸直腸癌、肺癌、乳癌、および胃癌において変異し得る（Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ２００４  Ｍａｙ  ２１；３０４（５６７４）：１１６４−６も参照されたい）。
【００３７】
阻害剤（複数可）は、任意の適切な経路によって、これに限定されないが経口投与、局所投与、非経口投与、経鼻腔内投与、経肺投与、または経直腸投与で、従来の無毒な薬学的に許容される担体、アジュバントおよび賦形剤を含有する投与単位製剤で投与されることができる。一実施形態において、阻害剤（複数可）は、局所送達を介して、例えば、腫瘍中または腫瘍周辺に（すなわち、双方とも治療標的であるエクソソームを有する腫瘍に隣接して、腫瘍周囲の微小環境に接触して）直接注射によって投与される。
【００３８】
阻害剤は、１種または複数種の無毒な薬学的に許容される担体および／または希釈剤および／またはアジュバントと組み合わせて投与されてもよい。阻害剤（複数可）は、単独療法として投与されることができ、または他の治療法（すなわち、化学療法、放射線療法、腫瘍の外科的切除など）と組み合わせて投与されてもよい。
【００３９】
別の態様において、本開示は、腫瘍を治療するための化合物を特定する方法を提供し、該方法は、
（ａ）腫瘍細胞の第１の集団を１種または複数種の試験化合物と接触させること、および
（ｂ）腫瘍細胞の第１の集団から放出されるエクソソームの神経突起伸長の促進における活性を、腫瘍細胞の対照集団から放出されるエクソソームの神経突起伸長の促進における活性と比較すること
を含み、
対照と比較して、エクソソームに促進される神経突起伸長を減少させる試験化合物は腫瘍を治療するための候補化合物である。
【００４０】
さらなる態様において、本開示は、腫瘍を治療するための化合物を特定する方法を提供し、該方法は、
（ａ）腫瘍細胞の第１の集団を１種または複数種の試験化合物と接触させること、および
（ｂ）細胞の第１の集団からのエクソソーム放出を腫瘍細胞の対照集団からのエクソソーム放出と比較すること
を含み、
対照と比較して、エクソソーム放出を減少させる試験化合物は腫瘍を治療するための候補化合物である。
【００４１】
本開示の方法は、腫瘍エクソソーム放出および／または腫瘍エクソソーム促進神経突起伸長を減少させる化合物を特定するのに役立ち、そのような化合物を用いて、本明細書で述べたように腫瘍を治療することができる。
【００４２】
神経突起伸長を促進することにおいて腫瘍細胞の第１の集団からのエクソソーム放出を測定すること、および／または放出されたエクソソームの活性を測定することを当技術分野で標準の方法、例えば、これに限定されないが、以下の実施例に述べる方法によって行うことができる。化合物（複数可）が、試験化合物の非存在下で見られる上記の神経突起伸長を促進することにおいて、腫瘍細胞の第１の集団からのエクソソーム放出および／または放出されたエクソソームの活性の測定の減少を促進する限り、方法は、神経突起伸長を促進することにおいて、対照と比較して、腫瘍細胞の第１の集団からのエクソソーム放出の減少の特定量、および／または放出されたエクソソーム活性を測定することを必要としない。
【００４３】
接触はいずれの適切な条件下で行われてもよく、当業者は、本明細書の教示を考慮して特定の実験設計の観点から適切な条件を決定することができる。接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、実験動物モデルにおいて）であり得る。特定の実施形態において、接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【００４４】
一実施形態において、腫瘍細胞の第１の集団および腫瘍細胞の対照集団は構成的にエフリンＢ１を表す。腫瘍細胞は、任意の適切な腫瘍の種類からでよい。一非限定的実施形態において、腫瘍細胞の第１の集団および腫瘍細胞の対照集団は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に感染している。
【００４５】
本開示はさらに、以下を含む組成物を提供する：
（ａ）エフリンＢ１阻害剤、またはその薬学的に許容される塩；ならびに
（ｂ）Ｒａｂ２７ａの阻害剤および／もしくはＲａｂ２７ｂの阻害剤、またはその薬学的に許容される塩。
【００４６】
本開示の組成物は、例えば、本発明の方法において用いることができる。種々の非限定的実施形態において、エフリンＢ１阻害剤は、エフリンＢ１特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはエフリンＢ１の低分子阻害剤を含み得るが、これに限定されるものではない。特定の実施形態において、阻害剤はエフリンＢ１特異的抗体を含む。一非限定的実施形態において、エフリンＢ１特異的抗体は、エフリンＢ１の細胞外ドメイン内の１または複数のエピトープに結合する。他の実施形態において、エフリンＢ１特異抗体は、ＰＤＺ結合ドメインおよび／または細胞質チロシン（すなわち、細胞外ドメイン内に存在しないもの）に結合することができる。
【００４７】
種々のさらなる非限定的実施形態において、Ｒａｂ２７ａの阻害剤および／またはＲａｂ２７ｂの阻害剤は、Ｒａｂ２７ａおよび／またはＲａｂ２７ｂ特異的抗体、アプタマー、低分子干渉ＲＮＡ、低分子内部セグメント化干渉ＲＮＡ、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および／または低分子阻害剤を含むが、これに限定されるものではない。
【００４８】
さらなる実施形態において、組成物は、Ｅ６とＰＴＰＮ１３の間の相互作用の阻害剤、またはその薬学的に許容される塩をさらに含むことができる。任意の適切な阻害剤を用いることができ、これに限定されないが、ＰＴＰＮ１３への結合をＥ６と競合する、またはＥ６への結合をＰＴＰＮ１３と競合するペプチドが含まれる。別の実施形態において、組成物はエフリンＢ１リン酸化の阻害剤をさらに含むことができる。任意の適切な阻害剤を用いることができ、Ｓｒｃキナーゼ阻害剤に限定されないが、ダサタニブ、またはその薬学的に許容される塩が含まれる。
【００４９】
組成物は、使用目的に適当であると思われる任意のさらなる成分を含むことができる。種々の実施形態において、組成物は（ａ）凍結乾燥保護剤；（ｂ）界面活性剤；（ｃ）増量剤；（ｄ）等張剤；（ｅ）安定剤；（ｆ）保存剤および／または（ｇ）緩衝液をさらに含み
得る。一部の実施形態において、組成物中の緩衝液は、Ｔｒｉｓ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液または酢酸緩衝液である。組成物は、凍結乾燥保護剤、例えばショ糖、ソルビトールまたはトレハロースをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、組成物は、保存剤、例えば塩化ベンザルコニウム、ベンゼトニウム、クロロヘキシジン、フェノール、ｍ−クレゾール、ベンジルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロロブタノール、ｏ−クレゾール、ｐ−クレゾール、クロロクレゾール、硝酸フェニル水銀、チメロサール、安息香酸、およびそれらの種々の混合物を含む。他の実施形態において、組成物は、グリシンなどの増量剤を含む。さらに他の実施形態において、組成物は界面活性剤、例えば、ポリソルベート−２０、ポリソルベート−４０、ポリソルベート−６０、ポリソルベート−６５、ポリソルベート−８０、ポリソルベート−８５、ポロクサマー−１８８、モノラウリン酸ソルビタン、モノパルミチン酸ソルビタン、モノステアリン酸ソルビタン、モノオレイン酸ソルビタン、トリラウリン酸ソルビタン、トリステアリン酸ソルビタン、トリオレイン酸ソルビタン、またはそれらの組み合わせを含む。組成物は、等張剤、例えば、調製物をヒト血液と実質的に等張にする、または等浸透圧にする化合物をさらに含み得る。例示的な等張剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、メチオニン、マンニトール、デキストロース、イノシトール、塩化ナトリウム、アルギニン、および塩酸アルギニンが挙げられる。他の実施形態において、医薬組成物は、さらに、安定剤、例えば、目的のタンパク質と組み合わせると、冷凍乾燥形態または液体形態で、目的のタンパク質の化学的および／または物理的不安定性を実質的に予防する、または減少させる分子を含む。例示的な安定剤としては、スクロース、ソルビトール、グリシン、イノシトール、塩化ナトリウム、メチオニン、アルギニンおよび塩酸アルギニンが挙げられる。
【００５０】
組成物は一般的に、医薬組成物として、例えば、上記で、従来の薬学的に許容される担体、ジュバント、および賦形剤を含有する投与単位製剤で開示されたものが調製される。
【００５１】
実施例
安定してＨＰＶ１６ウィルスの癌遺伝子、Ｅ６とＥ７、Ｈ−Ｒａｓとルシフェラーゼ（ｍＥＥＲＬ細胞）を発現するＣ５７Ｂ１／６中咽頭上皮細胞からなる、ヒトパピローマウイルス誘発（ＨＰＶ＋）中咽頭扁平上皮癌（ＯＰＳＣＣ）のマウスモデルを利用する［１８〜２１］。ＨＰＶ１６  Ｅ６腫瘍性タンパク質は、細胞ホスファターゼおよび腫瘍抑制因子（ＰＴＰＮ１３）と相互作用し、この相互作用は、ＰＴＰＮ１３の分解をもたらす［１９、２０］。これは、ＰＴＰＮ１３が多くの細胞タンパク質（例えば、エフリンＢ１、これもホスファターゼ基質である）と相互作用するので、関連している。エフリンＢ１は、Ｅｐｈ受容体チロシンキナーゼを結合し、活性化する１回膜貫通タンパク質リガンドである。ここでは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、腫瘍放出エクソソームがエフリンＢ１をパッケージし、ＰＣ１２細胞の神経突起伸長を刺激することを示す。エフリンＢ１発現または機能が損なわれると、この活性がかなり軽減する。さらに、ヒト扁平上皮癌細胞株、および頭頸部癌患者の血漿と腫瘍から精製されたエクソソームも、エクソソームカーゴとしてエフリンＢ１をパッケージし、神経突起伸長の活性を内部に有する。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの発見と一致して、エフリンＢ１を過剰発現しているｍＥＥＲＬ腫瘍は、エフリンＢ１機能または発現が損なわれている腫瘍よりもかなり神経支配されている。加えて、エクソソーム放出において遺伝子的に損なわれているｍＥＥＲＬ腫瘍はｉｎ  ｖｉｖｏで、低密度で神経支配されており、対照よりも増殖が遅い。まとめると、これらのデータは、腫瘍放出エクソソームが新神経発生の原因となり、エクソソーム  エフリンＢ１はこの活性を増強することを示している。
【００５２】
結果：
患者エクソソームは、神経突起伸長を誘発する。患者のＨＮＳＣＣが神経支配されているかどうかを、β−ＩＩＩチューブリン（ニューロン特異的チューブリンイソ型）についてホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織を免疫組織化学的に（ＩＨＣ）染色して試験した。β−ＩＩＩチューブリン陽性線維は、組織をくまなく巡っていることが見いだされており、これらの腫瘍が実際に神経支配されていることを示した（図１Ａ、「神経の支脈」）。これらのβ−ＩＩＩチューブリン陽性神経の「支脈」は、神経周囲浸潤（ＰＮＩ）と混同できない。ＰＮＩは、神経周囲空間に沿って神経に浸潤している腫瘍を指し、新神経発生は、腫瘍に浸潤している神経を指す。神経周囲鞘内のβ−ＩＩＩチューブリン陽性線維は、非常に組織化された様式で互いに密に詰まっている（図１Ａ、「神経束」）。特定したβ−ＩＩＩチューブリン陽性神経線維は、その代わりに、神経周囲鞘がない個別の組織化されていない支脈として巡っている（図１Ａ「神経の支脈」）。さらなるＩＨＣ染色により、ＨＮＳＣＣがチロシン水酸化酵素（交感神経マーカー）およびＶＩＰ（副交感神経マーカー）に対して陰性であるが、ＴＲＰＶ１（感覚神経マーカー）（図１Ａ）に対して陽性であり、腫瘍の感覚性新神経支配を示していることを明らかにする。
【００５３】
新神経発生へのエクソソームの寄与を試験する前に、我々の分画超遠心分離エクソソーム精製技術の確認を行った。ヒト血液試料のために、エクソソームを血漿から精製した。ヒト組織試料のために、エクソソームを４８時間の培養後に収集した条件培地から同様に精製した。正常なドナー血漿から精製した我々のエクソソーム調製物のスキャニング電子顕微鏡分析により、エクソソームと形状およびサイズ（３０〜１５０ｎｍ）が一致する小胞を得た（図１Ｂ）。さらに、原子間力顕微鏡法により、６５〜１１０ｎｍのサイズ（図１Ｃ）を確認し、エクソソーム計数およびサイズ分類のためのナノ粒子トラッキング分析も、サイズ分布がエクソソームと一致することを示した（図１Ｄ）。まとめると、これらのデータは、我々の精製方法によりサイズおよび形状がエクソソームと一致する小胞が得られることを示している。
【００５４】
腫瘍放出エクソソームが新神経発生を誘発するという我々の仮説を試験するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーンとしてＰＣ１２細胞（ラット褐色細胞腫細胞株）を利用した。ＮＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）で刺激すると、ＰＣ１２細胞は神経様細胞に分化し、神経突起を伸長する。３人の頭頸部癌患者（患者試料Ｐｔ１、Ｐｔ２、Ｐｔ３）から、マッチした腫瘍組織とともに１０ｍＬの血液を採血した。３人の健康なボランティア（Ｎｌ１、Ｎｌ２、Ｎｌ３）から血液、ならびに成人扁桃組織（ＴＬ）を同様に採取した。大多数のＨＰＶ＋  ＯＰＳＣＣが扁桃で生じるので、対照組織として扁桃を選択した。エクソソームを精製し、ＢＣＡタンパク質アッセイによって定量化し、次いでエクソソームマーカーＣＤ９およびＣＤ８１についてウエスタンブロット解析で確認した（図１Ｅ）。エクソソームが神経突起伸長活性を内部に有するかどうかを試験するために、ＰＣ１２細胞を３μｇのエクソソームで処理し、４８時間後、固定し、β−ＩＩＩチューブリンを免疫染色した。神経突起伸長は、ＣｅｌｌＩｎＳｉｇｈｔ（商標）ＣＸ７  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍを使用して定量化し、次いで神経突起の数を比較した。患者Ｐｔ１から得たエクソソームは少なく、わずかに１反復実験の分析が可能であったが、一方、患者Ｐｔ２およびＰ３からの量は、技術的反復実験に十分な量であった。文献と一致して、非処理ＰＣ１２細胞はβ−ＩＩＩチューブリン陽性神経突起をほとんど伸長しないが、ＮＧＦで刺激されたものは非常に強く伸長することがわかった。３人の患者すべてから（血漿および腫瘍の両方）のエクソソームは、ＰＣ１２細胞の神経突起伸長をかなり刺激したが、一方正常な血漿および扁桃からのエクソソームは最小の神経突起伸長活性を有した（図１Ｆ、Ｇ）。これらのデータは、頭頸部癌患者からのエクソソームが健康対照者において存在しない神経突起伸長活性を内部に有することを示す。
【００５５】
ｍＥＥＲＬエクソソームは、神経突起伸長を誘発する。新神経発生のプロセスをモデル化するために、マウスの後肢にｍＥＥＲＬ細胞を注射し、その後、終了時に腫瘍を収集し、固定、包埋し、β−ＩＩＩチューブリン、ＴＨ、ＶＩＰおよびＴＲＰＶ１をＩＨＣ染色した。ＨＮＳＣＣ患者と同様に、ｍＥＥＲＬ腫瘍は、本来感覚性であるβ−ＩＩＩチューブリン陽性神経の支脈（ＴＲＰＶ１陽性）を内部に有していた（図２Ａ）。ｍＥＥＲＬ放出エクソソームが新神経発生の原因となるかどうかを試験するために、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養し、エクソソームを条件培地から精製し、ＰＣ１２細胞上で試験した。このプロセスにおけるエフリンＢ１の機能を試験するために、エフリンＢ１修飾ｍＥＥＲＬ細胞株を生成した。野生型エフリンＢ１の安定した過剰発現は、ｍＥＥＲＬ  エフリンＢ１と呼ばれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を利用して、エフリンＢ１の機能または発現が損なわれているｍＥＥＲＬ細胞株を遺伝子操作した。エフリンＢ１欠失細胞は、ｍＥＥＲＬエフリンＢ１  Ｎｕｌｌ１またはＮｕｌｌ２として表わされるが、細胞外欠失エフリンＢ１細胞はｍＥＥＲＬエフリンＢ１ΔＥＣＤとして表わされる。ｍＥＥＲＬ親細胞からのエクソソームは、ＰＣ１２細胞の神経突起伸長をかなり誘発した。エフリンＢ１の過剰発現により、この活性を増加させた。興味深いことに、ｍＥＥＲＬエフリンＢ１ΔＥＣＤ、Ｎｕｌｌ１およびＮｕｌｌ２細胞からのエクソソームは、神経突起伸長を誘発する能力を保持している（図２Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ｍＥＥＲＬ放出エクソソームが神経突起伸長を促進するが、エフリンＢ１はこの活性のために必要とされず、活性をかなり増強することを示している。
【００５６】
エクソソームは、ＮＧＦなしで神経突起伸長を誘発する。ｍＥＥＲＬ細胞がＮＧＦを生成することができるので、ＮＧＦについて、ｍＥＥＲＬ親細胞およびエフリンＢ１細胞からの全細胞溶解物をウエスタンブロットで解析し、エクソソームを精製した。ｍＥＥＲＬ親細胞およびエフリンＢ１過剰発現細胞がＮＧＦ（全細胞溶解物（ＷＣＬ）に存在する）を生成するが、ＣＤ９＋エクソソーム内にパッケージされていないことを示す（図２Ｄ）ことを確認した。これらのデータは、ＮＧＦがエクソソーム媒介神経突起伸長活性のために必要とされないことを示している。ｍＥＥＲＬエフリンＢ１細胞から精製されたエクソソームがＰＣ１２細胞の神経突起伸長を増強することを考慮に入れ、それがエクソソームカーゴとしてパッケージされたかどうかを試験した。エクソソームのウエスタンブロット解析は、エフリンＢ１がエクソソーム内で実際にパッケージされていることを示した（図２Ｅ）。さらに、エフリンＢ１の細胞外ドメインはｍＥＥＲＬエフリンＢ１ΔＥＣＤエクソソームに存在しなく、細胞内ドメインはカーゴのままである。重要なことに、エフリンＢ１は患者エクソソームにも見出された（図１Ｅ）。ヒトエクソソームを確認したように、ｍＥＥＲＬ細胞から精製したエクソソームを同様に確認し、それらが同様にエクソソームのサイズおよび形状と一致していることを見いだした（データ不図示）。
【００５７】
エクソソーム精製から他の小胞および壊死細胞片を除去するために、より厳密な方法が重要であることが示唆されている。そのような方法の１つに、密度勾配遠心分離の追加を必要とする。このより厳密な方法が神経突起伸長活性によりエクソソームを精製するかどうかを試験するために、ｍＥＥＲＬエフリンＢ１細胞から条件培地を収集し、分画超遠心分離に続いて密度勾配遠心分離に掛けた。１５の画分を収集し、画分４〜１３をＣＤ９およびＣＤ８１についてウエスタンブロットによって解析した。公開されている文献と整合して、ＣＤ９＋およびＣＤ８１＋の小胞は、画分８に存在し、分画超遠心分離だけで精製したエクソソーム（「粗」試料）もＣＤ９＋／ＣＤ８１＋であった（データ不図示）。次に、どの画分が神経突起伸長活性を保持しているかを決定するために、ＰＣ１２細胞上で画分４、５、８および１３を試験した。「粗」エクソソームも、試験した。画分８および「粗」エクソソームが神経突起伸長活性を示すが、ＣＤ９陰性画分４、５および１３にはこの活性がなかった（データ不図示）。これらのデータは、密度勾配遠心分離を包含することでＣＤ９＋／ＣＤ８１＋エクソソームを、神経突起伸長活性を保持する単一の画分に濃縮することを示している。データは、神経突起伸長活性がエフリンＢ１陽性ＣＤ９＋／ＣＤ８１＋エクソソームに保持されていることも示している。
【００５８】
高リスクＨＰＶ  Ｅ６および神経突起伸長。上記の試験は、ｍＥＥＲＬ細胞またはそれらの誘導体（これらすべては、ＨＰＶ＋である）からの神経突起伸長活性を試験した。次に、２種のＨＰＶ＋（ＳＣＣ４７と９３−ＶＵ−１４７Ｔ−ＵＰ−６）および２種のＨＰＶ−（ＳＣＣ１とＳＣＣ１９）ヒト扁平上皮癌細胞株からのエクソソームをＰＣ１２細胞上で試験し、ＨＰＶ−エクソソームがＨＰＶ＋エクソソームよりもかなり低い神経突起伸長活性を内部に有することがわかった（図３Ａ）。ＨＰＶ１６はＯＰＳＣＣを誘発するので、高リスクＨＰＶと考えられる。低リスクＨＰＶは、癌をまれに発生させる。高リスクＨＰＶと低リスクＨＰＶとの間の重要な差の１つは、それらのＥ６タンパク質に見いだされている。高リスクＥ６だけが、発癌性形質転換のかなりの原因となるＣ末端ＰＤＺ結合モチーフ（ＰＤＺＢＭ）を含有する。神経突起伸長へのＨＰＶ１６  Ｅ６の寄与を試験するために、初代ヒト扁桃上皮（ＨＴＥ）からのエクソソーム、ならびにＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７（ＨＴＥ  Ｅ６Ｅ７）を安定して発現するエクソソーム、またはＥ６のＰＤＺＢＭが欠失されている（ＨＴＥ  Ｅ６ΔＥ７）細胞からのエクソソームを試験した。Ｅ７と共に完全長のＥ６の発現が神経突起伸長活性を誘発するのに十分であったが、一方Ｅ６のＰＤＺＢＭの欠失はこの効果を抑制したことがわかった（図３Ｂ）。まとめると、これらのデータは、ＨＰＶ１６  Ｅ６が神経突起伸長活性の原因となることを示唆する。
【００５９】
エクソソームは、腫瘍神経支配および増殖を促進する。エフリンンＢ１発現がｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍神経支配に影響を及ぼすかどうかを試験するために、マウスにｍＥＥＲＬ親細胞、エフリンＢ１、ΔＥＣＤ、Ｎｕｌｌ１またはＮｕｌｌ２細胞のいずれかを移植した。移植から１０日目、腫瘍が触知できるようになったとき、腫瘍を収集し、腫瘍可溶化液をβ−ＩＩＩチューブリンについてのウエスタンブロット解析に掛けた。β−ＩＩＩチューブリンシグナルをＧＡＰＤＨに対して正規化し、濃度測定によって定量化した。エフリンＢ１およびエフリンＢ１ΔＥＣＤ腫瘍は、ｍＥＥＲＬの元の腫瘍と比較して、β−ＩＩＩチューブリンを大幅に内部に有する（図４Ａ、４Ｂ）。腫瘍神経支配を誘発するこのｉｎ  ｖｉｖｏでの能力は、エフリンＢ１ΔＥＣＤエクソソームがｍＥＥＲＬの元のエクソソームよりもＰＣ１２細胞からかなり少ない神経突起伸長を誘発するｉｎ  ｖｉｔｒｏと異なっていた（図２Ｂ）。この相違は、腫瘍神経支配にも影響を及ぼす腫瘍微小環境（ｉｎ  ｖｉｔｒｏで存在しない）内の成分に反映する可能性がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータと同様に、Ｎｕｌｌ１腫瘍およびＮｕｌｌ２腫瘍はｍＥＥＲＬの元の腫瘍と変わらなかった（図２Ｂ、４Ａ、４Ｂ）。まとめると、これらのデータは、完全長および切断型エフリンＢ１がｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍神経支配を増強するのに十分であるが、その完全な欠失はできないことを示している。
【００６０】
腫瘍放出エクソソームはｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍神経支配を誘発するという仮説をより厳密に試験するために、および腫瘍増殖へのその寄与を明らかにするために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を利用して、ｍＥＥＲＬの親細胞においてＲａｂ２７Ａおよび／またはＲａｂ２７Ｂの遺伝子を組み換えた。これらの２つの低分子量ＧＴＰアーゼはエクソソーム放出の原因となり、それらのノックダウンによりＣＤ９＋エクソソームの放出が損なわれる。生成されるクローンは、Ｒａｂ２７Ａに対してヘテロ接合であり、Ｒａｂ２７Ｂに対して欠失されたホモ接合である（ｍＥＥＲＬ  Ｒａｂ２７Ａ−／＋Ｒａｂ２７Ｂ−／−）。エクソソーム試料を産生細胞の数に対して正規化した。ウエスタンブロットによって、ｍＥＥＲＬの親細胞およびＲａｂ２７Ａ−／＋Ｒａｂ２７Ｂ−／−細胞からのエクソソームを精製し、ＣＤ９およびＣＤ８１を解析した。Ｒａｂ２７Ａ−／＋Ｒａｂ２７Ｂ−／−から精製したエクソソームはＣＤ９の発現が少なかった。これは、ＣＤ９発現の低下によって反映されるＲａｂ２７Ａ／Ｂの発現が損なわれている細胞によるエクソソームを放出する能力の低下を実証している以前の試験と一貫している（図５Ａ）。ナノ粒子トラッキング解析により、エクソソームを放出するｍＥＥＲＬ  Ｒａｂ２７Ａ−／＋Ｒａｂ２７Ｂ−／−細胞の能力の低下が確認された（図５Ｂ）。さらに、ＣＦＤＡ−ＳＥ（細胞透過性フルオレセイントレーサー）でエクソソームを標識し、蛍光を定量化した。ｍＥＥＲＬ  Ｒａｂ２７Ａ−／＋Ｒａｂ２７Ｂ−／−細胞からのエクソソームは、ｍＥＥＲＬの元のエクソソームと比較して、蛍光を減少させた（図５Ｃ）。全体として、これらのデータは、Ｒａｂ２７Ａ／Ｂ発現の調節がエクソソーム放出の低下をもたらしたことを確認する。損なわれたエクソソーム放出がＰＣ１２細胞の神経突起伸長に影響を及ぼすかどうかを試験するために、ｍＥＥＲＬの元のエクソソームおよびｍＥＥＲＬ  Ｒａｂ２７Ａ−／＋Ｒａｂ２７Ｂ−／−エクソソームを、ＰＣ１２細胞に適用されるプロデューサー細胞数および相当量に対して正規化した。ｍＥＥＲＬ  Ｒａｂ２７Ａ−／＋Ｒａｂ２７Ｂ−／−エクソソームの神経突起伸長活性は、ｍＥＥＲＬの親細胞からのエクソソームのそれと比較すると、かなり減弱した（図５Ｄ）。損なわれたエクソソーム放出がｉｎ  ｖｉｖｏで神経支配を変化させるかどうかを試験するために、マウスにｍＥＥＲＬ親細胞またはＲａｂ２７Ａ−／＋Ｒａｂ２７Ｂ−／−細胞を移植し、腫瘍増殖をモニターした。Ｒａｂ２７Ａ−／＋Ｒａｂ２７Ｂ−／−腫瘍がｉｎ  ｖｉｖｏでｍＥＥＲＬの元の腫瘍よりも、かなりゆっくり増殖した（図５Ｅ）。重要なことに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖アッセイは、細胞倍加時間がｍＥＥＲＬ親細胞とＲａｂ２７Ａ−／＋Ｒａｂ２７Ｂ−／−細胞との間で有意差がなかったことを示している（図５Ｆ）。エクソソームを放出するこの能力の低下がｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍神経支配に影響を及ぼすかどうかを決定するために、腫瘍をマウスから収集し、３０μｇの全腫瘍可溶化液をβ−ＩＩＩチューブリンについてウエスタンブロットで定量化した（図５Ｇ）。ｍＥＥＲＬ  Ｒａｂ２７Ａ−／＋Ｒａｂ２７Ｂ−／−の増殖が遅れたために、腫瘍を２１日���に収集した。我々の仮説と整合して、Ｒａｂ２７Ａ−／＋Ｒａｂ２７Ｂ−／−腫瘍は、ｍＥＥＲＬの元の腫瘍と比較して、β−ＩＩＩチューブリンがかなり低下した（図５Ｈ）。これらのデータは、腫瘍放出エクソソームが新神経発生の原因となるという我々の仮説を裏づけており、さらに新神経発生が腫瘍増殖に影響を及ぼすことを示唆している。
【００６１】
考察
調査結果は、腫瘍誘発新神経発生のための新しい機構を提示している。ヒトおよびマウスのＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣがＴＲＰＶ１陽性感覚神経によって新規に神経支配されることが明らかになる。さらに、ｍＥＥＲＬ腫瘍はＮＧＦを分泌するが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＮＧＦは神経突起伸長活性には必要でなく、エクソソーム内にパッケージされていない。機構的に、エクソソソームカーゴとしての完全長のエフリンＢ１のパッケージングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経突起伸長を、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍神経支配をかなり増強し、およびその欠失により、これらの活性の両方ともかなり減弱する。ＣＤ９＋エクソソームの放出を損なうと、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍増殖および神経支配がかなり減少する。これらの前臨床試験は、ＨＮＳＣＣ患者血漿および腫瘍のエクソソームが神経突起伸長活性を内部に有するというヒトＨＮＳＣＣ試料による調査結果を裏付けている。まとめると、これらのデータは、ＨＰＶ＋腫瘍細胞によって放出されるＣＤ９＋エクソソームがｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍神経支配および腫瘍増殖を促進することを示している。エフリンＢ１含有エクソソームは、さらにこの活性を増強する。ＨＰＶ感染はエクソソームカーゴを調節することができ、このように、神経突起伸長活性に影響を及ぼし得る。あるいは、ＨＰＶおよびエフリンＢ１の効果が関連していることがあり得る。ＨＰＶ感染細胞において、ＰＴＰＮ１３とのＥ６の相互作用は、このホスファターゼの分解をもたらす。結果として、エフリンＢ１リン酸化は持続する。リン酸化エフリンＢ１は結合相手と相互作用し、次いでそれとともにエクソソームに往復し得る。この理論は我々のエフリンＢ１ΔＥＣＤデータが裏付けている。新神経発生および疾患進行へのＨＰＶの寄与は、この機構を介してであるならば、頭頚癌がＰＴＰＮ１３またはエフリンＢの両方ではなく、いずれかに変異を有することは理にかなっている。実際に、Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓが、ＰＴＰＮ１３およびエフリンＢ１の変化がＨＮＳＣＣにおいて相互排他的で、両立しないことを示している。この相互排他性は、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、肺癌に及ぶ。したがって、我々の調査結果は、他の癌にとって意味がある。
【００６２】
豊富な血液供給を提供し、腫瘍増殖を促進するよう腫瘍がそれ自体の神経支配を誘発することは可能である。我々のデータは、この仮説を裏づけている。あるいは、腫瘍神経支配は、局所免疫応答を調節することができる。神経免疫相互作用は、進化的に保存されており、恒常性維持のために重要である。迷走神経の電気刺激を使用する最近の臨床試験は、自己免疫疾患である関節リウマチにおける、重症度の減衰を実証している。これらおよび他のデータは、神経免疫相互作用の変化が疾病病因に関与し、これらの相互作用の治療的調節により恒常性を回復することができるという概念を裏付けている。したがって、腫瘍は免疫応答を弱め、腫瘍耐性、疾患進行、および播種を促進する手段として自身の神経支配を促進し得る。
【００６３】
方法：
抗体
ウエスタンブロット解析のために利用する抗体としては、以下が挙げられる：抗ＣＤ９（Ａｂｃａｍ、１：１，０００）、抗ＣＤ８１（クローンＢ−１１、１：１，０００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、抗エフリンＢ１（ＥＣＤ  エピトープ，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１：５００）、抗ヒトエフリンＢ１（ＩＣＤエピトープ、ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、１：５００）、抗β−ＩＩＩチューブリン（２Ｇ１０、１：５，０００、Ａｂｃａｍ）、抗ＧＡＰＤＨ（Ａｍｂｉｏｎ、１：５，０００）。ＨＲＰ結合二次抗体は、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒから購入した。
ＩＨＣのために利用する抗体：抗β−ＩＩＩチューブリン（２Ｇ１０、１：２５０，Ａｂｃａｍ）、抗チロシン水酸化酵素（Ａｂ１１２、１：７５０、Ａｂｃａｍ）、抗ＴＲＰＶ１（カタログ＃ＡＣＣ−０３０、１：１００、Ａｌｏｍｏｎｅ  ｌａｂｓ）、抗ＶＩＰ（ａｂ２２７３６、１：１００、Ａｂｃａｍ）。
ＣＸ７上で定量化のために利用する抗体：抗β−ＩＩＩチューブリン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ９３５４）。
【００６４】
細胞株：すべての細胞株は、ＳＴＲ（ＢｉｏＳｙｎｔｈｅｓｉｓ）によって立証されている。加えて、すべての細胞株は、Ｕｐｈｏｆｆ  ａｎｄ  Ｄｒｅｘｌｅｒ（Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ａｎｉｍ，  ２００２．  ３８（２）：ｐ．７９−８５）によりマイコプラズマを含まないことが確認されている。
【００６５】
ヒト細胞株：ＵＭ−ＳＣＣ１およびＵＭ−ＳＣＣ４７細胞株は、１０％のウシ胎児血清と１％のペニシリン／ストレプトマイシンとを含むＤＭＥＭで維持した。
【００６６】
初代ヒト扁桃上皮を承認されたＩＲＢプロトコル下で収集し、ＫＳＦＭ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃１０７２４−０１１）とともに維持した。ＨＴＥ  Ｅ６／Ｅ７およびＨＴＥ  Ｅ６Δ／Ｅ７は、レトロウイルス形質導入により生成し、上述のＥ培地中で維持した。
【００６７】
マウス細胞株：ｍＥＥＲＬ細胞（親誘導体とすべての誘導体）は、Ｅ培地（ＤＭＥＭ  （Ｃｏｒｎｉｎｇ，カタログ＃１０−０１７−ＣＶ）／Ｈａｍｓ  Ｆ１２（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ＃１０−０８０−ＣＶ）、１０％のエクソソーム除去ウシ胎児血清、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、０．５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾン、８．４ｎｇ／ｍＬのコレラ毒素、５μｇ／ｍＬのトランスフェリン、５μｇ／ｍＬのインスリン、１．３６ｎｇ／ｍＬのトリヨードチロニン、および５ｎｇ／ｍＬのＥＧＦ）で維持した。
【００６８】
ｍＥＥＲＬエフリンＢ１  ＣＲＩＳＰＲクローン：エクソン１〜５に及ぶｇＤＮＡの大部分を除去するために同時二重標的化を用いる戦略、および早期終了となるインデルを引き起こすフレームシフトを生成するための単一標的化を利用する戦略の２つの異なる戦略を活用して、エフリンＢ１  ｎｕｌｌ  ｍＥＥＲＬ細胞株を生成した。標的選択およびガイド配列クローニングは、Ｒａｎら（Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ，  ２０１３．  ８（１１）：ｐ．２２８１−２３０８）のツールおよびプロトコルを使用して行った。二重標的化戦略のＰＣＲアッセイでは、予想される欠失部位（表１）の外部（１〜５ΔＥｘｔ．）または欠失部位内（１〜５ΔＩｎｔ．）のプライマーを用いた。外部アッセイは、１０，４８５ｂｐのｗｔアンプリコンと、２２９ｂｐのΔアンプリコンとをもたらすことになるが、内部アッセイは３３０ｂｐのｗｔアンプリコンを生成するが、Δアンプリコンは生成しない。単一標的スクリーニングは、標的部位周囲の３３０ｂｐ領域を増幅し、続いてＢｓｌｌによる制限酵素消化を伴うＰＣＲを利用した。二重鎖切断が正確に修復されないと、その認識部位は、破壊されることになる（表１）。
【００６９】
クローンｍＥＥＲＬ  エフリンＢ１ΔＥＣＤ：このクローンは、二重標的化戦略から生成された。ＰＣＲアッセイは、標的領域の外部のプライマーを用いる予想される欠失産物と、該欠失内のプライマーを用いるアンプリコンの欠如を示す。配列データは、エクソン２〜４が欠失しており、これらのエクソンがエフリンＢ１の細胞外ドメインの大部分を含む（データ不図示）ことを示した。エクソン１の欠失の５’末端がシグナルペプチドの直後に起こり、一方エクソン５の欠失の３’末端は膜貫通（ＴＭ）ドメイン内にある。しかし、ＴＭドメイン内の８個のアミノ酸は欠失し、追加の２個の疎水性アラニンは組み込まれている。
【００７０】
クローンｍＥＥＲＬエフリンＢ１  Ｎｕｌｌ１およびＮｕｌｌ２。ｍＥＥＲＬエフリンＢ１  Ｎｕｌｌ１およびＮｕｌｌ２のクローンを単一標的化戦略で生成した。これらのクローンからの配列データは、１ｂｐ挿入（Ｎｕｌｌ２）および１０ｂｐ欠失（Ｎｕｌｌ１）を示し、両方ともフレームシフトおよび初期の終止コドンとなる。使用したＣＲＩＳＰＲ戦略では、陽性クローンは、制限酵素ＢｓＩＩによる切断の欠如を示す。ｍＥＥＲＬエフリンＢ１  Ｎｕｌｌ１およびＮｕｌｌ２のクローンは、この酵素で切断しない（データ不図示）。
【００７１】
【表１】
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【００７２】
ｍＥＥＲＬ  Ｒａｂ２７  ＣＲＩＳＰＲクローン：ｍＥＥＲＬ細胞中のＲａｂ２７のノックアウトは、Ｒａｎらの一般プロトコルを使用して作成した。手短に言うと、ＲＡＢ２７Ａ、ＲＡＢ２７Ｂまたは両方のエクソンを標的にするガイド配列をｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−Ｚｅｏにクローニングし、インデルまたは大規模な欠失を生成するために単独で、または組み合わせでそれぞれ１遺伝子、または両遺伝子に遺伝子導入した。Ｚｅｏｃｉｎ選択から５日間、単細胞を伸長させ、インデルに起因する、または二重標的化により誘発された大規模な欠失についてＰＣＲで制限酵素部位の消失のスクリーニングを行った。この戦略を使用して、単一クローンを配列決定および追加特徴のために特定した。
【００７３】
クローンｍＥＥＲＬ  Ｒａｂ２７Ａ−／＋Ｒａｂ２７Ｂ−／−：ＲＡＢ２７Ａのエクソン４、ＲＡＢ２７Ｂのエクソン４をｓｇＲＮＡが標的化し、ＲＡＢ２７ＡおよびＲＡＢ２７Ｂが共有するエクソン３の配列を同時導入されたＲＡＢ２７ＡおよびＲＡＢ２７Ｂの二重ノックアウトのための戦略から生じた。ＰＣＲは、Ｒａｂ２７Ａに対してヘテロ接合の切断型欠失産物を明らかにし、Ｒａｂ２７Ｂに対して予想されたホモ接合の欠失アンプリコンを明らかにした（データ不図示）。ＲＡＢ２７Ｂ配列データは、欠失部位で異なる修復産物を示した。１アレルが直ちに終止コドンを示しているが、他ＲＡＢ２７Ａがどこで終了し得るかは不明である。しかし、ウエスタンブロット法により、検出可能なタンパク質の欠如が確認される（データ不図示）。
【００７４】
ＰＣ１２細胞：ＰＣ１２細胞はＡＴＣＣから購入し、１０％のウマ血清（Ｇｉｂｃｏ、カタログ＃２６０５０−０８８）および５％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで維持した。神経突起伸長アッセイで使用するとき、１％のウマ血清および０．５％のウシ胎児血清を含むＤＭＥＭで維持した。
【００７５】
画像診断：
電子顕微鏡観察：エクソソーム試料は、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃで顕微鏡観察およびＣｅｌｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｃｏｒｅによって処理し、分析した。
【００７６】
原子間力顕微鏡観察（ＡＦＭ）：精製エクソソームを脱イオン水で１：１０に希釈し、新しいガラス皿に入れ、２時間風乾させてから、穏やかな窒素気流下で乾燥させた。ガラス皿に析出したエクソソームをＡＦＭ（モデル：ＭＦＰ−３Ｄ  ＢＩＯ（商標）、Ａｓｙｌｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ、ＣＡ）を使用して特性を明らかにした。７０ｋｚの一般的な共振周波数および２Ｎｍ−１のばね定数とともにシリコンプローブ（ＡＣ２４０ＴＳ−Ｒ３、Ａｓｙｌｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、画像を大気中、ＡＣモードで取得した。高さ像および振幅像は、０．６Ｈｚの走査速度、５１２×５１２ピクセルで同時に記録した。Ｉｇｏｒ  Ｐｒｏ６．３４（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ、Ｐｏｒｔｌａｎｄ、ＯＲ）を使用して画像処理を行い、Ｉｍａｇｅ  Ｊ．で分析した。
【００７７】
免疫組織化学。組織を１０％の中性緩衝ホルマリンで固定し、Ｌｅｉｃａ３００ＡＳＰ組織プロセッサ上で処理した。ヒト腫瘍ブロック（Ｎ＝３０）およびマウス腫瘍ブロック（Ｎ＝２０）を５μｍの切片にした。自動スライド染色システム、ＢｅｎｃｈＭａｒｋ（登録商標）ＸＴ（Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｉｎｃ．）を用いて、最適化および染色を行った。色素原としてＶｅｎｔａｎａ  ｉＶｉｅｗ  ＤＡＢ検出キットを使用し、スライドをヘマトキシリンで対比染色した。一次抗体の省略は、陰性対照として役立った。
【００７８】
ＰＣ１２アッセイおよびＣＸ７によるβ−ＩＩＩチューブリン定量化。ＣｅｌｌＩｎＳｉｇｈｔ  ＣＸ７  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｔｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｌａｔｆｏｒｍは、神経突起伸長を定量化するために利用した定量顕微鏡の自動細胞イメージングを行う。９６ウェル黒色光学底の平底プレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に７．５ｘ１０４  ＰＣ１２細胞を播種し、処理から４８時間後、４％のパラホルムアルデヒドで固定し、次いでブロックにし、３％のロバ血清、１％ＢＡＳ、および０．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００含有溶液で透過処理した。β−ＩＩＩチューブリン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ９３５４）の染色を、続いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８ヤギ抗ニワトリＩｇＧおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２で行った。ＰＢＳを用いて洗浄を行った。神経突起伸長解析は、Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  Ｓｃａｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（第６．６．０版、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）のＮｅｕｒｏｎａｌ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ（第４．２版）を使用して、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ（商標）ＣＸ７  ＨＣＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上で行った。１ウェルあたり２５の撮像視野を２ｘ２ビニング、１０ｘ対物で収集した。核をＨｏｅｃｈｓｔ陽性染色によって特定し、一方細胞体および神経突起はβ−ＩＩＩチューブリン陽性免疫標識によって特定した。細胞がＨｏｅｃｈｓｔ陽性核ならびにβ−ＩＩＩチューブリン陽性細胞体の両方を有する場合、それらをニューロンと分類した。２０μｍよりも長い神経突起だけを分析に組み入れた。細胞株からのエクソソームを利用するすべてのアッセイを１状態あたりＮ＝４反復実験で行い、少なくとも２回繰り返し、同様の結果を得た。ヒト試料を利用するアッセイを材料で限定し、テキストに記述するように可能な程度まで反復実験を行った。
【００７９】
エクソソーム精製：
分画超遠心分離。５００，０００の細胞を１５０ｍｍ２のプレート上に播種し、エクソソームを除去した１０％のウシ胎児血清含有培地中でインキュベートした。ウシ胎児血清エクソソームの除去は、１００，０００×ｇでの終夜の超遠心分離からなった。４８時間後、条件培地を収集し、Ｋｏｗａｌら（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，  ２０１６．  １１３（８）：ｐ．Ｅ９６８−７７）により何らかの修飾をして記載された分画超遠心分離によってエクソソームを精製した。手短に言うと、条件培地を３００×ｇで、４℃で１０分間遠心分離して、細胞をペレット化した。上清を２，０００×ｇで、４℃で２０分間遠心分離して、新しいチューブに移し、次いで１０，０００×ｇで、３０分間遠心分離し、最終的にＳｕｒｅＳｐｉｎ  ６３０／１７ローター中で１２０分間、１００，０００×ｇで遠心分離した。すべてのペレットをＰＢＳで洗浄し、同じ速度で、再遠心分離し、２００μＬの無菌ＰＢＳ／１５０ｍｍディッシュに再懸濁させた。
【００８０】
分画超遠心分離およびＯｐｔｉＰｒｅｐ密度勾配。上述のように、分画超遠心分離の後、不連続イオジキサノール密度勾配を利用した。５、１０、２０および４０％のイオジキサノール溶液を、適量の均質化緩衝液［０．２５Ｍスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ７．４）］と、イオジキサノール溶液とを混合することによって作製した。この溶液を、ＯｐｔｉＰｒｅｐ（商標）の保存溶液（６０重量％イオジキサノール水溶液、Ｓｉｇｍａ）と、緩衝液［０．２５Ｍスクロース、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、６０ｍＭ  Ｔｒｉ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）］とを混合することによって調製した。勾配は、１５．５ｍＬのオープントップポリアロマーチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）の上部に４０％溶液４ｍＬ、２０％溶液４ｍＬ、１０％溶液４ｍＬ、および５％溶液３ｍＬを各々層にすることで形成した。４００μＬの粗エキソソーム（分画超遠心分離によって単離した）を勾配の上に重層し、次いでそれを１００，０００×ｇで、４℃で１８時間遠心分離した（ＳｕｒｅＳｐｉｎ  ６３０／１７ローター、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｓｏｒｖａｌｌ（商標））。１ｍＬの勾配画分を自己形成勾配の上部から収集し、ＰＢＳで１４ｍＬに希釈し、次いで１００，０００×ｇで、４℃で３時間遠心分離した。生じたペレットを１００μＬのＰＢＳに再懸濁させて、−８０℃で保存した。
【００８１】
ヒト血漿からのエクソソーム精製。１０ｍＬの全血をＦｉｃｏｌｌ充填Ｌｅｕｃｏｓｅｐチューブに直接ピペットで移し、室温、ブレーキオフ、８００×ｇで３０分間遠心分離した。回収した血漿からエクソソームを記載のように分画超遠心分離によって単離した。
【００８２】
ヒト腫瘍からのエクソソーム精製。新鮮な腫瘍組織を小片に切断し、Ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ含有ＫＳＦＭ（ケラチノサイト血清を含まない培地）とともに培養物に入れ、培養中で４８時間維持した。条件培地を収集し、次いで記載のように分画超遠心分離によってエクソソームを収集した。
【００８３】
タンパク質分析。
エクソソームのＢＣＡタンパク質アッセイ。エクソソーム調製物から低タンパク質収率に適応するよう修飾して、標準ＢＣＡタンパク質アッセイを利用した。手短に言うと、５μＬの１０％  ＴＸ−１００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を精製エクソソームの５０μＬアリコートに加え、室温で１０分間インキュベートした。１：１１の作用比を使用し、９６ウェルプレート中３７℃で１時間インキュベートした。次いで５６２ｎｍでの吸光度を測定（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（商標）Ｐｌｕｓ３８４）し、４次モデルから推定したタンパク質濃度をＢＳＡ標準曲線に適合させた。
【００８４】
ウエスタンブロット解析。試料タンパク質の濃度を記載のようにＢＣＡタンパク質アッセイによって決定した。等しい総タンパクをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＰＶＤＦ膜（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ（商標）−Ｐ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、５％ウシアルブミン画分Ｖ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または５％ミルク（Ｃａｒｎａｔｉｏｎノンファットドライミルク）のいずれかでブロックし、ＴＴＢＳ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、１．３７Ｍ  Ｎａｃｌ、２７ｍＭ  ＫＣｌ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩基）中で洗浄し、次いで一次抗体中でインキュベートした。洗浄した膜をＨＲＰ複合二次抗体とともにインキュベートし、化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ）とともにインキュベートし、ＵＶＰ  ＢｉｏＩｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して画像化した。
【００８５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験。すべての動物試験は、承認された施設内ＩＡＣＵＣプロトコル下で、施設ガイドライン内で行われた。すべての動物実験は、ＵＳＤＡガイドライン従ってＳａｎｆｏｒｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで維持された４〜８週齢のオスのＣ５７Ｂｌ／６マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を利用した。
【００８６】
マウス腫瘍実験：腫瘍を以下のように開始した：２３−ゲージ針を使用して、ｍＥＥＲＬ細胞（１×１０５細胞）をマウスの右後肢に皮下移植した。腫瘍増殖をキャリパー測定によって毎週モニターした。腫瘍体積がいずれの寸法で１．５ｃｍを超えたとき、マウスを安楽死させた。ウエスタンブロットによるβ−ＩＩＩチューブリンの定量化についてＮ＝４マウス／群。腫瘍増殖についてＮ＝７マウス／群。
【００８７】
全腫瘍可溶化液。移植後１０日目または２１日目（テキストに従って）、腫瘍を収集し、氷上の溶解緩衝液中で組織ホモジナイザー（Ｏｍｎｉ  ＴＨ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を用いてホモジナイズした。次いで、ホモジネートを超音波処理し、２０００×ｇで５分間、遠心分離した。生じた上清を収集し、さらに１３０００×ｇで１０分間遠心分離して、ＢＣＡタンパク質濃度推定を行った。ウエスタンブロットは、３０μｇのインプットを使用して行った。Ｎ＝４腫瘍／状態からの全腫瘍可溶化液のβ−ＩＩＩチューブリンウエスタンブロット。ＶｉｓｉｏｎＷｏｒｋｓ（商標）ＬＳソフトウェアを使用して、濃度測定によりシグナルを定量化し、ＧＡＰＤＨに対して正規化した。群平均をスチューデントのｔ検定を使用して比較した。
【００８８】
ヒト試料。すべてのヒト試料は、署名されたインフォームドコンセントとともに承認された施設内倫理委員会プロトコルの下で採取された。試料は、原発性、局所進行性の頭頸部（解剖学的部位：口腔、中咽頭、下咽頭、および咽頭）扁平上皮細胞の癌を診断された、男女、およびすべての人種の成人（年齢≧１８歳）患者を含んでいた。
【００８９】
統計分析。データは、ＰｒｉｓｍＧｒａｐｈ（商標）を用いて分析し、グラフで示した。記述統計は、平均±標準誤差、または標準偏差として示す（図説明を参照されたい）。図説明に示すように、対応のないスチューデントのｔ検定または一元配置分散分析を統計解析で利用した。細胞株からのエクソソームを利用するＰＣ１２アッセイを各状態に対して技術的反復実験を４回行い、実験を少なくとも２回繰り返した。ヒト試料（血液または腫瘍）からのエクソソームを利用するＰＣ１２アッセイは、これらの試料が非常に限定されていたので、異なって処理した。したがって、各ヒト試料のためのエクソソームは、可能な場合、二つ組で試験した。試料が限定されている場合（テキストに記述）、１ウェルのみを試験した。
【００９０】
実施例２
本実施例は、他の固形腫瘍（結腸直腸腫瘍、黒色腫および乳腺腫瘍で例証した）も、エクソソームも含み得る因子を放出し、これらの因子が腫瘍神経支配の原因となることを実証する。結腸直腸腫瘍（ＣＴ２６）、黒色腫（Ｂ１６）および乳腺腫瘍（４Ｔ１）の細胞株からの条件培地を収集して、ＰＣ１２細胞上で試験した。ＣＴ２６は、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチルウレタンで処置されたＢＡＬＢ／ｃマウスに由来する細胞株である。この細胞株は、結腸直腸癌を調べるために広く用いられている。Ｂ１６は、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスで自然発生的に生じた黒色腫マウス癌細胞株である。黒色腫を調べるために広く用いられている。４Ｔ１は、突然変異原処理なしで４１０．４（マウス乳腺腺癌細胞株）腫瘍から選択される６−チオグアニン耐性細胞株である。ＢＡＬＢ／ｃマウスに移植されると、４Ｔ１細胞は転移性が高く、肺、肝臓、リンパ節および脳に進行する。この細胞株は、ＩＶ期のヒト乳癌の動物モデルとして、高頻度で用いられている。ＰＣ１２はラット褐色細胞腫細胞株であり、神経成長因子などの成長因子に刺激されない限り、この細胞は未分化である。分化後、細胞はニューロン様細胞に変わる。ＣＴ２６、Ｂ１６および４Ｔ１細胞株を約４０％コンフルエンスで播種し、４８時間後（細胞が約９０％コンフルエントになったら）、条件培地を収集した。次いで、条件培地を用いて、ＰＣ１２細胞を２４時間処理した。処理後、ＰＣ１２細胞を固定し、β−ＩＩＩチューブリンを染色し、次いでＣＸ７上で定量化した。
【００９１】
このアッセイにおいて、結腸直腸腫瘍、黒色腫および乳腺腫瘍細胞株によって放出され、ＰＣ１２細胞の神経分化を誘発することができる何かがあるかどうかを見るためにＰＣ１２細胞上に条件培地をのせた。異なる細胞株からの条件培地による刺激（２４時間）の後、ＰＣ１２細胞を固定し、β−ＩＩＩチューブリンを染色した。β−ＩＩＩチューブリン染色の程度をＣＸ７上で定量化した。各状態に対してウェルあたりのβ−ＩＩＩチューブリン陽性神経突起の総数を図６にグラフで示す。すべてのそのような実験において、ＰＣ１２細胞は多くの神経突起を伸長しないので、無刺激ＰＣ１２細胞（ＰＣ１２）は陰性対照として役立つ。陽性対照は、強い神経突起伸長をもたらす、１００ｎｇ／ｍＬの組換えＮＧＦで刺激されたＰＣ１２細胞からなる。染色したβ−ＩＩＩチューブリンの定量化の後、ＮＧＦ状態は１００％に設定し、他の状態はそれと比較する。
【００９２】
異なる細胞株からの条件培地を用いて実験を行った。その後これらの細胞株からエクソソームを精製し、同様に試験した。結果（データ不図示）は、エクソソームも神経突起伸長を促進するが、完全条件培地で可能なレベルまでではないことを実証し、エクソソームと他の放出因子（例えば、神経栄養因子）との組み合わせがこうした腫瘍の種類から神経突起伸長を誘発することを示した。
【００９３】
実施例３
Ｅ６のＰＴＰＮ１３およびエフリンＢ１の活性化に対する効果を考慮に入れ、ＨＰＶ陰性扁平上皮癌細胞株において単に過剰発現するエフリンＢ１は神経突起伸長の増加を促進するのに十分ではないかと思われた。したがって、ＳＣＣ１細胞中でエフリンＢ１を安定して過剰発現させ、ＰＣ１２細胞上でエクソソームを試験した。ＳＣＣ１−エフリンＢ１細胞からのエクソソームは、ＳＣＣ１親細胞からのそれらよりも大幅に神経突起伸長を誘発した（図７Ａ）。この活性増加が同様に腫瘍神経支配に影響を及ぼすかどうかを決定するために、免疫がないＮＯＤ  ＳＣＩＤマウスにＳＣＣ１細胞またはＳＣＣ１−エフリンＢ１細胞（Ｎ＝５マウス／群）を移植して、１０日間腫瘍増殖をモニターした。ＳＣＣ１エフリンＢ１腫瘍は、ＳＣＣ１の元の腫瘍よりもかなり急速に増殖した（図７Ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月8日(2019.11.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2020514325.tif 000015
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