(57)【要約】  本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合し、ＡｐｏＣ３機能をアンタゴナイズする抗体を提供する。また、これらの抗体を含む医薬組成物、これらの抗体をコードする核酸、これらの抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらの抗体を使用して対象を治療する方法も提供される。
2020517242.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ７．４での第１の解離定数（ＫＤ）、およびｐＨ５．５での第２のＫＤでＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、前記第２のＫＤと前記第１のＫＤとの比が約５を超える、単離された抗体。
【請求項２】
前記第１のＫＤが、１０ｎＭ未満である、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
ＡｐｏＣ３を発現するマウス内の前記抗体の半減期が、約３日を超える、請求項１または２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
前記抗体が、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項５】
前記抗体が、対象の血液からのＡｐｏＣ３のクリアランスの速度を増加させることができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項６】
前記抗体が、対象の血液からのＡｐｏＢのクリアランスの速度を増加させることができる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項７】
前記抗体が、対象の血液中のＡｐｏＣ３レベルを低減させることができる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項８】
前記抗体が、対象の血液中のＡｐｏＣ３レベルを少なくとも２週間の間に少なくとも４０％低減させることができる、請求項７に記載の単離された抗体。
【請求項９】
前記抗体が、対象の血液中のＡｐｏＢレベルを低減させることができる、請求項１〜８のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、対象の血液中のＡｐｏＢレベルを少なくとも２週間の間に少なくとも２０％低減させることができる、請求項９に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、対象における食後脂肪血症を阻害することができる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、脂質結合ＡｐｏＣ３に結合することができる、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、配列番号２に記載されるアミノ酸配列内のエピトープに結合する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項１４】
前記エピトープが、配列番号２の２、５、６、８、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の単離された抗体。
【請求項１５】
前記エピトープが、配列番号２の５および６位のアミノ酸を含む、請求項１４に記載の単離された抗体。
【請求項１６】
前記エピトープが、配列番号２の２、５、６、および８位のアミノ酸を含む、請求項１４に記載の単離された抗体。
【請求項１７】
前記エピトープが、配列番号２の１０位のアミノ酸を含む、請求項１４に記載の単離された抗体。
【請求項１８】
前記エピトープが、配列番号２の６、８、および１０位のアミノ酸を含む、請求項１４に記載の単離された抗体。
【請求項１９】
前記エピトープが、配列番号２の６および８位のアミノ酸を含む、請求項１４に記載の単離された抗体。
【請求項２０】
前記抗体が、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域と、を含み、
（ａ）ＣＤＲＨ１が、ＴＹＳＭＲ（配列番号３）のアミノ酸配列を含み、
（ｂ）ＣＤＲＨ２が、ＳｌＸ１ＴＤＧＧＧＴＡＹＲＤＳＶＫＧのアミノ酸配列を含み、Ｘ１がＳまたはＨであり（配列番号４）、
（ｃ）ＣＤＲＨ３が、Ｘ２ＧＹＳＤのアミノ酸配列を含み、Ｘ２がＡまたはＨであり（配列番号５）、
（ｄ）ＣＤＲＬ１が、ＫＴＳＱＧＬＶＨＳＤＧＫＴＹＦＹのアミノ酸配列を含み（配列番号６）、
（ｅ）ＣＤＲＬ２が、ＱＶＳＮＲＡＳのアミノ酸配列を含み（配列番号７）、
（ｆ）ＣＤＲＬ３が、ＡＸ３ＧＴＹＹＰＨＴのアミノ酸配列を含み、Ｘ３がＱまたはＨであり（配列番号８）、
かつＸ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つがＨである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２１】
前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３が、それぞれ配列番号３、１１、１０、６、７、および１３；３、９、１２、６、７、および１３；３、９、１０、６、７、および１４；３、１１、１０、６、７、および１４；３、９、１２、６、７、および１４；３、１１、１２、６、７、および１３；または３、１１、１２、６、７、および１３に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の単離された抗体。
【請求項２２】
前記重鎖可変領域が、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の単離された抗体。
【請求項２３】
前記軽鎖可変領域が、配列番号２０に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項２１または２２に記載の単離された抗体。
【請求項２４】
前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号１６および１９、１７および１９、１８および１９、１５および２０、１６および２０、１７および２０、または１８および２０にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む、請求項２０〜２３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項２５】
ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域と、を含み、
（ａ）ＣＤＲＨ１が、ＴＹＳＭＲのアミノ酸配列を含み（配列番号３）、
（ｂ）ＣＤＲＨ２が、ＳｌＸ１ＴＤＧＧＧＴＡＹＲＤＳＶＫＧのアミノ酸配列を含み、Ｘ１がＳまたはＨであり（配列番号４）、
（ｃ）ＣＤＲＨ３が、Ｘ２ＧＹＳＤのアミノ酸配列を含み、Ｘ２がＡまたはＨであり（配列番号５）、
（ｄ）ＣＤＲＬ１が、ＫＴＳＱＧＬＶＨＳＤＧＫＴＹＦＹのアミノ酸配列を含み（配列番号６）、
（ｅ）ＣＤＲＬ２が、ＱＶＳＮＲＡＳのアミノ酸配列を含み（配列番号７）、
（ｆ）ＣＤＲＬ３が、ＡＸ３ＧＴＹＹＰＨＴのアミノ酸配列を含み、Ｘ３がＱまたはＨであり（配列番号８）、
かつＸ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つがＨである、単離された抗体。
【請求項２６】
前記ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３が、
それぞれ配列番号３、１１、１０、６、７、および１３；３、９、１２、６、７、および１３；３、９、１０、６、７、および１４；３、１１、１０、６、７、および１４；３、９、１２、６、７、および１４；３、１１、１２、６、７、および１３；または３、１１、１２、６、７、および１３に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項２５に記載の単離された抗体。
【請求項２７】
ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗体。
【請求項２８】
ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号２０に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離された抗体。
【請求項２９】
ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体が、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、前記重鎖可変領域および前記軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号１６および１９、１７および１９、１８および１９、１５および２０、１６および２０、１７および２０、または１８および２０に記載されるアミノ酸配列を含む、単離された抗体。
【請求項３０】
前記抗体が、ヒトまたはヒト化定常領域をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３１】
前記定常領域が、野生型ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域のバリアントであり、前記バリアントヒト免疫グロブリン重鎖定常領域が、ｐＨ６でのヒト新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）の野生型ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の親和性と比較して、ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対して増加した親和性を有する、請求項３０に記載の単離された抗体。
【請求項３２】
前記定常領域が、ヒトＩｇＧの重鎖定常領域である、請求項３０または３１に記載の単離された抗体。
【請求項３３】
前記定常領域が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４の重鎖定常領域である、請求項３２に記載の単離された抗体。
【請求項３４】
前記定常領域が、ＥＵ位置４３３、４３４、および４３６に、それぞれアミノ酸Ｋ、Ｆ、およびＹを含む、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３５】
前記定常領域が、ＥＵ位置２５２、２５４、および２５６に、それぞれアミノ酸Ｙ、Ｔ、およびＥを含む、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３６】
前記定常領域が、ＥＵ位置４２８および４３４に、それぞれアミノ酸ＬおよびＳを含む、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３７】
前記定常領域が、配列番号２２〜２４、３７〜３９、および４２〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３８】
ＡｐｏＣ３が、ヒトＡｐｏＣ３である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の単離された抗体。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか１項に記載の抗体と薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項４０】
請求項１〜３８のいずれか１項に記載の抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４１】
請求項４０に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項４２】
請求項４１に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４３】
ＡｐｏＣ３に結合する抗体を産生するための方法であって、前記抗体の発現を可能にする条件下で、請求項４２に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項４４】
対象におけるＡｐｏＣ３の活性を阻害するための方法であって、有効量の請求項１〜３９のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４５】
対象の血液中のトリグリセリドレベルを低減させるための方法であって、有効量の請求項１〜３９のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４６】
対象における食後脂肪血症を阻害するための方法であって、有効量の請求項１〜３９のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４７】
対象における高トリグリセリド血症を治療するための方法であって、有効量の請求項１〜３９のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４８】
対象におけるカイロミクロン血症を治療するための方法であって、有効量の請求項１〜３９のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４９】
高トリグリセリド血症を有する対象における心血管疾患のリスクを低減させるための方法であって、有効量の請求項１〜３９のいずれか１項に記載の抗体または医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項５０】
前記心血管疾患が、心筋梗塞である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記心血管疾患が、狭心症である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記心血管疾患が、脳卒中である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記心血管疾患が、アテローム性動脈硬化症である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記抗体が、前記対象の血液中のカイロミクロンまたはカイロミクロンレムナントレベルを低減させる、請求項４４〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が、追加の脂質低下薬を受けている、請求項４４〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記追加の脂質低下薬が、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬が、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、またはシンバスタチンである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記追加の脂質低下薬が、ＰＣＳＫ９阻害薬である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＰＣＳＫ９阻害薬が、アリロクマブ、エボロクマブ、またはボコシズマブである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記追加の脂質低下薬が、エゼチミブである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記追加の脂質低下薬が、エゼチミブとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬との組み合わせである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
前記追加の脂質低下薬が、エゼチミブとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬とＰＣＳＫ９阻害薬との組み合わせである、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年４月２１日出願の米国仮特許出願第６２／４８８，４２５号の利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する抗体、およびそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
上昇した血中トリグリセリドレベル（高トリグリセリド血症）は、アテローム性動脈硬化症の要因であり、心血管死、狭心症、心筋梗塞、および脳卒中などの心血管事象のリスクを高める。
【０００４】
ＡｐｏＣ３は、非常に高い濃度（１０μΜ超）で血中を循環するタンパク質であり、そのほとんどが、高トリグリセリドリポタンパク質（ＴＲＬ）、ＴＲＬレムナント、および高密度リポタンパク質に結合している。ＡｐｏＣ３は、血中トリグリセリドレベルの重要な制御因子であると考えられる。例えば、ヒトにおけるＡｐｏＣ３レベルは、血中トリグリセリドレベルと正に相関し、上昇したＡｐｏＣ３レベルが高トリグリセリド血症と関連することが示されている。さらに、ＡｐｏＣ３は、リポタンパク質リパーゼ（ＴＲＬ中のトリグリセリドを加水分解する酵素）の活性を阻害し、またＴＲＬレムナントの肝摂取を阻害することが示されており、これらはいずれも血中トリグリセリドレベルの上昇を引き起こす。
【０００５】
フィブラート、ニコチン酸、およびω３脂肪酸などの高トリグリセリド血症の治療のためのいくつかの療法が認可されている。しかしながら、これらの療法は、血漿トリグリセリドの低下について中程度にのみ効果的である。したがって、血漿トリグリセリドを低下させるための改善された療法が当該技術分野において必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国仮特許出願第６２／４８８，４２５号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合し、ＡｐｏＣ３機能を阻害する抗体を提供する。また、これらの抗体を含む医薬組成物、これらの抗体をコードする核酸、これらの抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらの抗体を使用して対象を治療する方法も提供される。
【０００８】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、肝細胞によるＴＲＬ摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させることができ、対象に投与された場合、ＡｐｏＣ３およびＡｐｏＢの血清レベルの急速かつ持続的な減少を引き起こすことができる。したがって、開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、高トリグリセリド血症および関連する疾患（例えば、心血管疾患および膵炎）の治療および予防に有用である。
【０００９】
したがって、一態様では、本開示は、ｐＨ７．４での第１の解離定数（ＫＤ）、およびｐＨ５．５での第２のＫＤでＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体を提供し、第２のＫＤと第１のＫＤとの比が、約５、１０、２０、もしくは５０を超えるか、または少なくとも約５、１０、２０、もしくは５０である。ある特定の実施形態では、第１のＫＤは、１０、５、２、１、０．５、０．２、または０．１ｎＭ未満である。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３を発現するマウス内の抗体の半減期は、約３、７、１４、２１、または２８日を超えるか、または少なくとも約３、７、１４、２１、または２８日である。
【００１０】
ある特定の実施形態では、抗体は、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）の肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液からのＡｐｏＣ３のクリアランスの速度を増加させることができる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液からのＡｐｏＢのクリアランスの速度を増加させることができる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液中のＡｐｏＣ３レベルを低減させることができる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液中のＡｐｏＣ３レベルを少なくとも２週間の間に少なくとも４０％低減させることができる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液中のＡｐｏＢレベルを低減させることができる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液中のＡｐｏＢレベルを少なくとも２週間の間に少なくとも２０％低減させることができる。ある特定の実施形態では、抗体は、対象の食後脂肪血症を阻害することができる。ある特定の実施形態では、抗体は、脂質結合ＡｐｏＣ３に結合することができる。
【００１１】
ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号２に記載されるアミノ酸配列内のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の２、５、６、８、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の５および６位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の２、５、６、および８位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の６、８、および１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の６および８位のアミノ酸を含む。
【００１２】
ある特定の実施形態では、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域と、を含み、
（ａ）ＣＤＲＨ１は、ＴＹＳＭＲのアミノ酸配列を含み（配列番号３）、
（ｂ）ＣＤＲＨ２は、ＳＩＸｉＴＤＧＧＧＴＡＹＲＤＳＶＫＧのアミノ酸配列を含み、式中、ＸｉはＳまたはＨであり（配列番号４）、
（ｃ）ＣＤＲＨ３は、Ｘ２ＧＹＳＤのアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ２はＡまたはＨであり（配列番号５）、
（ｄ）ＣＤＲＬ１は、ＫＴＳＱＧＬＶＨＳＤＧＫＴＹＦＹのアミノ酸配列を含み（配列番号６）、
（ｅ）ＣＤＲＬ２は、ＱＶＳＮＲＡＳのアミノ酸配列を含み（配列番号７）、
（ｆ）ＣＤＲＬ３は、ＡＸ３ＧＴＹＹＰＨＴのアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ３はＱまたはＨであり（配列番号８）、
かつＸ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つはＨである。
【００１３】
ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号３、１１、１０、６、７、および１３；３、９、１２、６、７、および１３；３、９、１０、６、７、および１４；３、１１、１０、６、７、および１４；３、９、１２、６、７、および１４；３、１１、１２、６、７、および１３；または３、１１、１２、６、７、および１３に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、軽鎖可変領域は、配列番号２０に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１６および１９、１７および１９、１８および１９、１５および２０、１６および２０、１７および２０、または１８および２０にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体を提供し、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域と、を含み、
（ａ）ＣＤＲＨ１は、ＴＹＳＭＲのアミノ酸配列を含み（配列番号３）、
（ｂ）ＣＤＲＨ２は、ＳＩＸｉＴＤＧＧＧＴＡＹＲＤＳＶＫＧのアミノ酸配列を含み、式中、ＸｉはＳまたはＨであり（配列番号４）、
（ｃ）ＣＤＲＨ３は、Ｘ２ＧＹＳＤのアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ２はＡまたはＨであり（配列番号５）、
（ｄ）ＣＤＲＬ１は、ＫＴＳＱＧＬＶＨＳＤＧＫＴＹＦＹのアミノ酸配列を含み（配列番号６）、
（ｅ）ＣＤＲＬ２は、ＱＶＳＮＲＡＳのアミノ酸配列を含み（配列番号７）、
（ｆ）ＣＤＲＬ３は、ＡＸ３ＧＴＹＹＰＨＴのアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ３はＱまたはＨであり（配列番号８）、
かつＸ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つはＨである。
【００１５】
ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれ配列番号３、１１、１０、６、７、および１３；３、９、１２、６、７、および１３；３、９、１０、６、７、および１４；３、１１、１０、６、７、および１４；３、９、１２、６、７、および１４；３、１１、１２、６、７、および１３；または３、１１、１２、６、７、および１３に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１６〜１８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗体を提供する。
【００１７】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号２０に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離された抗体を提供する。
【００１８】
別の態様において、本開示は、ＡｐｏＣ３に特異的に結合する単離された抗体であって、抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、重鎖可変領域および軽鎖可変領域が、それぞれ配列番号１６および１９、１７および１９、１８および１９、１５および２０、１６および２０、１７および２０、または１８および２０にそれぞれ記載されるアミノ酸配列を含む、単離された抗体を提供する。
【００１９】
前述の態様のうちのいずれか１つのある特定の実施形態では、抗体は、定常領域をさらに含む（例えば、ヒトまたはヒト化定常領域）。ある特定の実施形態では、定常領域は、野生型ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域のバリアントであり、バリアントヒト免疫グロブリン重鎖定常領域は、ｐＨ６でのヒト新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）の野生型ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の親和性と比較して、ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対して増加した親和性を有する。
【００２０】
ある特定の実施形態では、定常領域は、ヒトＩｇＧの重鎖定常領域である。ある特定の実施形態では、定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧの重鎖定常領域である。ある特定の実施形態では、定常領域は、ＥＵ位置４３３、４３４、および４３６に、それぞれアミノ酸Ｋ、Ｆ、およびＹを含む。ある特定の実施形態では、定常領域は、ＥＵ位置２５２、２５４、および２５６に、それぞれアミノ酸Ｙ、Ｔ、およびＥを含む。ある特定の実施形態では、定常領域は、ＥＵ位置４２８および４３４に、それぞれアミノ酸ＬおよびＳを含む。ある特定の実施形態では、定常領域は、配列番号２２〜２４、３７〜３９、および４２〜４７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
本明細書に開示される態様のうちのいずれか１つのある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３は、ヒトＡｐｏＣ３である。
【００２２】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗体と薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００２３】
別の態様では、本開示は、本明細書に開示される抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本開示は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。別の態様では、本開示は、本明細書に開示される発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２４】
別の態様では、本開示は、ＡｐｏＣ３に結合する抗体を産生するための方法を提供し、当該方法は、抗体の発現を可能にする条件下で、本明細書に開示される宿主細胞を培養することを含む。
【００２５】
別の態様では、本開示は、対象内のＡｐｏＣ３の活性を阻害するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。別の態様では、本開示は、対象の血液中のトリグリセリドレベルを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。別の態様では、本開示は、対象における食後脂肪血症を阻害するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。別の態様では、本開示は、対象における高トリグリセリド血症を治療するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。別の態様では、本開示は、対象におけるカイロミクロン血症を治療するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００２６】
別の態様では、本開示は、高トリグリセリド血症を有する患者における心血管疾患のリスクを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、心血管疾患は、心筋梗塞である。ある特定の実施形態では、心血管疾患は、狭心症である。ある特定の実施形態では、心血管疾患は、脳梗塞である。ある特定の実施形態では、心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症である。
【００２７】
治療方法に関する前述の態様のある特定の実施形態では、抗体は、対象の血液中のカイロミクロンまたはカイロミクロンレムナントレベルを低減させる。ある特定の実施形態では、対象は、追加の脂質低下薬を受けている。ある特定の実施形態では、追加の脂質低下薬は、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬である。ある特定の実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬は、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、またはシンバスタチンである。ある特定の実施形態では、追加の脂質低下薬は、ＰＣＳＫ９阻害薬である。ある特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９阻害薬は、アリロクマブ、エボロクマブ、またはボコシズマブである。ある特定の実施形態では、追加の脂質低下薬は、エゼチミブである。ある特定の実施形態では、追加の脂質低下薬は、エゼチミブとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬との組み合わせである。ある特定の実施形態では、追加の脂質低下薬は、エゼチミブとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬とＰＣＳＫ９阻害薬との組み合わせである。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１Ａ】５Ｅ５ＷＴ（図１Ａ）、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８（図１Ｂ）、ならびに５Ｅ５ＶＨＷＴ＿ＶＬ８（「ＶＬ８」）、５Ｅ５ＶＨ１２＿ＶＬＷＴ（「ＶＨ１２」）、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬＷＴ（「ＶＨ５」）、および５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８（「ＶＨ５＿ＶＬ８」）（図１Ｃ）抗体が、ＨｅｐＧ２細胞による超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させることを示すグラフのセットである。ＨｅｐＧ２細胞をＤｉｌ  ＶＬＤＬおよび精製ＡｐｏＣ３と共に、示されるように単独または抗ＡｐｏＣ３抗体の存在下のいずれかでインキュベートした。ＨｅｐＧ２細胞によって取り込まれたＤｉｌ  ＶＬＤＬをＤｉｌ染料の蛍光分光法によって測定した。Ｄｉｌ  ＶＬＤＬ単独（「ＶＬＤＬ」）と共にインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞は、陽性対照として機能し、抗ＡｐｏＣ３抗体の存在なしで、Ｄｉｌ  ＶＬＤＬおよび精製ＡｐｏＣ３と共にインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞は、陰性対照として機能した。
【図１Ｂ】５Ｅ５ＷＴ（図１Ａ）、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８（図１Ｂ）、ならびに５Ｅ５ＶＨＷＴ＿ＶＬ８（「ＶＬ８」）、５Ｅ５ＶＨ１２＿ＶＬＷＴ（「ＶＨ１２」）、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬＷＴ（「ＶＨ５」）、および５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８（「ＶＨ５＿ＶＬ８」）（図１Ｃ）抗体が、ＨｅｐＧ２細胞による超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させることを示すグラフのセットである。ＨｅｐＧ２細胞をＤｉｌ  ＶＬＤＬおよび精製ＡｐｏＣ３と共に、示されるように単独または抗ＡｐｏＣ３抗体の存在下のいずれかでインキュベートした。ＨｅｐＧ２細胞によって取り込まれたＤｉｌ  ＶＬＤＬをＤｉｌ染料の蛍光分光法によって測定した。Ｄｉｌ  ＶＬＤＬ単独（「ＶＬＤＬ」）と共にインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞は、陽性対照として機能し、抗ＡｐｏＣ３抗体の存在なしで、Ｄｉｌ  ＶＬＤＬおよび精製ＡｐｏＣ３と共にインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞は、陰性対照として機能した。
【図１Ｃ】５Ｅ５ＷＴ（図１Ａ）、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８（図１Ｂ）、ならびに５Ｅ５ＶＨＷＴ＿ＶＬ８（「ＶＬ８」）、５Ｅ５ＶＨ１２＿ＶＬＷＴ（「ＶＨ１２」）、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬＷＴ（「ＶＨ５」）、および５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８（「ＶＨ５＿ＶＬ８」）（図１Ｃ）抗体が、ＨｅｐＧ２細胞による超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させることを示すグラフのセットである。ＨｅｐＧ２細胞をＤｉｌ  ＶＬＤＬおよび精製ＡｐｏＣ３と共に、示されるように単独または抗ＡｐｏＣ３抗体の存在下のいずれかでインキュベートした。ＨｅｐＧ２細胞によって取り込まれたＤｉｌ  ＶＬＤＬをＤｉｌ染料の蛍光分光法によって測定した。Ｄｉｌ  ＶＬＤＬ単独（「ＶＬＤＬ」）と共にインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞は、陽性対照として機能し、抗ＡｐｏＣ３抗体の存在なしで、Ｄｉｌ  ＶＬＤＬおよび精製ＡｐｏＣ３と共にインキュベートしたＨｅｐＧ２細胞は、陰性対照として機能した。
【図２Ａ】ＡＡＶ８−ヒトＡｐｏＣ３マウスモデルにおける２つの抗ＡｐｏＣ３抗体５Ｅ５および５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８、ならびに抗鶏卵リソソームヒトＩｇＧ１抗体（ＨｙＨＥＬ５）の薬物動態および薬力学を示すグラフである。試験抗体を、トランスジェニックヒトＡｐｏＣ３を発現するマウスに静脈内投与した。ヒトＩｇＧ１（図２Ａ）、ヒトＡｐｏＣ３（図２Ｂ）、およびマウスＡｐｏＢ（図２Ｃ）の血清レベルを、注射後の様々な時点で測定し、時間０と比較した絶対レベルまたは相対レベルをプロットした。
【図２Ｂ】ＡＡＶ８−ヒトＡｐｏＣ３マウスモデルにおける２つの抗ＡｐｏＣ３抗体５Ｅ５および５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８、ならびに抗鶏卵リソソームヒトＩｇＧ１抗体（ＨｙＨＥＬ５）の薬物動態および薬力学を示すグラフである。試験抗体を、トランスジェニックヒトＡｐｏＣ３を発現するマウスに静脈内投与した。ヒトＩｇＧ１（図２Ａ）、ヒトＡｐｏＣ３（図２Ｂ）、およびマウスＡｐｏＢ（図２Ｃ）の血清レベルを、注射後の様々な時点で測定し、時間０と比較した絶対レベルまたは相対レベルをプロットした。
【図２Ｃ】ＡＡＶ８−ヒトＡｐｏＣ３マウスモデルにおける２つの抗ＡｐｏＣ３抗体５Ｅ５および５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８、ならびに抗鶏卵リソソームヒトＩｇＧ１抗体（ＨｙＨＥＬ５）の薬物動態および薬力学を示すグラフである。試験抗体を、トランスジェニックヒトＡｐｏＣ３を発現するマウスに静脈内投与した。ヒトＩｇＧ１（図２Ａ）、ヒトＡｐｏＣ３（図２Ｂ）、およびマウスＡｐｏＢ（図２Ｃ）の血清レベルを、注射後の様々な時点で測定し、時間０と比較した絶対レベルまたは相対レベルをプロットした。
【図３Ａ】ＡＡＶ８−ヒトＡｐｏＣ３マウスモデルにおける５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８による絶食トリグリセリドレベルおよび循環食後トリグリセリドレベルの低減を示すグラフである（治療群当たりｎ＝６）。一晩絶食の前後の５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８またはＨｙＨｅｌ５抗体で治療したマウスの血漿トリグリセリドレベルが、図３Ａに示される。オリーブ油負荷後のこれらのマウスの血漿トリグリセリドレベルが、図３Ｂに示され、曲線値下の計算された面積が、図３Ｃにプロットされる。抗体治療、絶食、およびオリーブ油負荷のコースを通じてＡｐｏＣ３レベルが、図３Ｄにプロットされる。
【図３Ｂ】ＡＡＶ８−ヒトＡｐｏＣ３マウスモデルにおける５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８による絶食トリグリセリドレベルおよび循環食後トリグリセリドレベルの低減を示すグラフである（治療群当たりｎ＝６）。一晩絶食の前後の５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８またはＨｙＨｅｌ５抗体で治療したマウスの血漿トリグリセリドレベルが、図３Ａに示される。オリーブ油負荷後のこれらのマウスの血漿トリグリセリドレベルが、図３Ｂに示され、曲線値下の計算された面積が、図３Ｃにプロットされる。抗体治療、絶食、およびオリーブ油負荷のコースを通じてＡｐｏＣ３レベルが、図３Ｄにプロットされる。
【図３Ｃ】ＡＡＶ８−ヒトＡｐｏＣ３マウスモデルにおける５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８による絶食トリグリセリドレベルおよび循環食後トリグリセリドレベルの低減を示すグラフである（治療群当たりｎ＝６）。一晩絶食の前後の５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８またはＨｙＨｅｌ５抗体で治療したマウスの血漿トリグリセリドレベルが、図３Ａに示される。オリーブ油負荷後のこれらのマウスの血漿トリグリセリドレベルが、図３Ｂに示され、曲線値下の計算された面積が、図３Ｃにプロットされる。抗体治療、絶食、およびオリーブ油負荷のコースを通じてＡｐｏＣ３レベルが、図３Ｄにプロットされる。
【図３Ｄ】ＡＡＶ８−ヒトＡｐｏＣ３マウスモデルにおける５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８による絶食トリグリセリドレベルおよび循環食後トリグリセリドレベルの低減を示すグラフである（治療群当たりｎ＝６）。一晩絶食の前後の５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８またはＨｙＨｅｌ５抗体で治療したマウスの血漿トリグリセリドレベルが、図３Ａに示される。オリーブ油負荷後のこれらのマウスの血漿トリグリセリドレベルが、図３Ｂに示され、曲線値下の計算された面積が、図３Ｃにプロットされる。抗体治療、絶食、およびオリーブ油負荷のコースを通じてＡｐｏＣ３レベルが、図３Ｄにプロットされる。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合し、ＡｐｏＣ３機能を阻害する抗体を提供する。また、これらの抗体を含む医薬組成物、これらの抗体をコードする核酸、これらの抗体を作製するための発現ベクターおよび宿主細胞、ならびにこれらの抗体を使用して対象を治療する方法も提供される。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、肝細胞によるＴＲＬ摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させることができ、対象に投与された場合、ＡｐｏＣ３およびＡｐｏＢの血清レベルの急速かつ持続的な減少を引き起こすことができる。したがって、開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、高トリグリセリド血症および関連する疾患（例えば、心血管疾患および膵炎）の治療および予防に有用である。
【００３０】
１．定義
本明細書で使用される場合、「ＡｐｏＣ３」という用語は、アポリポタンパク質Ｃ３タンパク質を指す。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３は、ヒトＡｐｏＣ３である。例示的なヒトＡｐｏＣ３アミノ酸配列は、ＲｅｆＳｅｑ受託番号ＮＰ＿００００３１．１に記載されている。ＮＰ＿００００３１．１の成熟アミノ酸配列は以下の通りである：
ＳＥＡＥＤＡＳＬＬＳＦＭＱＧＹＭＫＨＡＴＫＴＡＫＤＡＬＳＳＶＱＥＳＱＶＡＱＱＡＲＧＷＶＴＤＧＦＳＳＬＫＤＹＷＳ  ＴＶＫＤＫＦＳＥＦＷＤＬＤＰＥＶＲＰＴＳＡＶＡＡ（配列番号１）。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」および「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」という用語には、全長抗体、全長抗体の抗原結合断片、および抗体のＣＤＲ、ＶＨ領域、またはＶＬ領域を含む分子が含まれる。抗体の例としては、モノクローナル抗体、組換え産生された抗体、単一特異性抗体、多重特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２つの重鎖および２つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖−抗体重鎖対、細胞内抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−Ｆｃｓ、ラクダ科抗体（例えば、ラマ抗体）、ラクダ化抗体、アフィボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗−抗Ｉｄ抗体を含む）、ならびに上記のいずれかの抗原結合断片が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ポリクローナル抗体集団を指す。抗体は、任意の種類（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ｌｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｉ、またはＩｇＡ２）、または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａまたはＩｇＧ２ｂ）の免疫グロブリン分子であり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ＩｇＧ抗体、またはそのクラス（例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４）もしくはそのサブクラスである。特定の実施形態では、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「単離された抗体」という用語は、同定され、その天然環境の少なくとも１つの構成要素から分離および／または回収された抗体を指す。「単離された抗体」という用語には、組換え宿主細胞内での原位置の抗体が含まれる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ＣＤＲ」または「相補性決定領域」という用語は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非隣接の抗原結合部位を意味する。これらの特定の領域は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）、およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）によって、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）によって、ならびにＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６）によって記載されており、これらは全て、参照によりそれらの全体が組み込まれており、互いに比較した場合、定義は、アミノ酸残基の重複またはサブセットを含む。ある特定の実施形態では、「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）、およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．（１９９１）によって定義されるようなＣＤＲである。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、重鎖ＣＤＲを示し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、軽鎖ＣＤＲを示す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基」という用語は、免疫グロブリン鎖のフレームワーク領域中のアミノ酸を指す。本明細書で使用される場合、「フレームワーク領域」または「ＦＲ領域」という用語には、可変領域の一部であるが、ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義を使用する）の一部ではないアミノ酸残基が含まれる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「可変領域」および「可変ドメイン」という用語は、交換可能に使用され、当該技術分野において一般的である。可変領域とは、典型的には、抗体の一部、一般に、軽鎖または重鎖の一部、典型的には、成熟重鎖における約アミノ末端１１０〜１２０アミノ酸または１１０〜１２５アミノ酸および成熟軽鎖における約９０〜１１５アミノ酸を指し、これらは、抗体ごとに配列が大きく異なり、それらの特定の抗原に対する特定の抗体の結合および特異性において使用される。配列の可変性は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域に集中している一方、可変ドメイン中のより高度に保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。特定の機構または理論に拘束されることは望まないが、軽鎖および重鎖のＣＤＲは、抗体の抗原との相互作用および特異性に主に関与している。ある特定の実施形態では、可変領域は、ヒト可変領域である。ある特定の実施形態では、可変領域は、げっ歯類またはマウスＣＤＲおよびヒトフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。特定の実施形態では、可変領域は、霊長類（例えば、非ヒト霊長類）可変領域である。ある特定の実施形態では、可変領域は、げっ歯類またはマウスＣＤＲおよび霊長類（例えば、非ヒト霊長類）フレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
【００３６】
「ＶＬ」および「ＶＬドメイン」という用途は、抗体の軽鎖可変領域を指すように、交換可能に使用される。
【００３７】
「ＶＨ」および「ＶＨドメイン」という用語は、抗体の重鎖可変領域を指すように、交換可能に使用される。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「定常領域」および「定常ドメイン」という用語は、交換可能であり、当該技術分野において一般的である。定常領域は、抗体部分、例えば、抗原への抗体の結合に直接関与していないが、Ｆｃ受容体との相互作用などの様々なエフェクター機能を示し得る、軽鎖または重鎖のカルボキシル末端部分である。免疫グロブリン分子の定常領域は、一般に、免疫グロブリン可変ドメインと比べて、より多くの保存されたアミノ酸配列を有する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「重鎖」という用語は、抗体に言及して使用される場合、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、任意の異なる種類、例えば、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、およびミュー（μ）を指し得、それらから抗体のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭクラス（ＩｇＧのサブクラス、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）がそれぞれ生じる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「軽鎖」という用語は、抗体に言及して使用される場合、定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、任意の異なる種類、例えば、カッパ（κ）またはラムダ（λ）を指し得る。軽鎖アミノ酸配列は、当該技術分野で周知である。特定の実施形態では、軽鎖は、ヒト軽鎖である。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「ＥＵ位置」という用語は、Ｅｄｅｌｍａｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，６３，７８−８５（１９６９）、およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ  ，ｉｎ”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１に記載されるように、抗体の定常領域のＥＵ番号付け慣習によるアミノ酸位置を指し、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「に特異的に結合する」という用語は、約１×１０−６Ｍ未満、約１×１０−７Ｍ未満、約１×１０−８Ｍ未満、約１×１０−９Ｍ未満、約１×１０−１０Ｍ未満、約１×１０−１１Ｍ未満、約１×１０−１２Ｍ未満、もしくはそれ以下の解離定数（ＫＤ）で抗原に結合するか、または非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍大きい親和性で抗原に結合する抗体の能力を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「エピトープ」とは、抗体が特異的に結合することができる抗原の局所化領域を指す。エピトープは、例えば、ポリペプチドの隣接したアミノ酸（線状もしくは隣接エピトープ）であり得るか、またはエピトープは、例えば、ポリペプチド（複数可）の２つ以上の非隣接領域（立体構造、非線状、不連続、または非隣接のエピトープ）から形成され得る。ある特定の実施形態では、抗体が結合するエピトープは、例えば、ＮＭＲ分光法、Ｘ線回折結晶学研究、ＥＬＩＳＡアッセイ、質量分析法（例えば、液体クロマトグラフィーエレクトロスプレー質量分析）と組み合わせた水素／重水素交換、ペプチドスキャニングアッセイ、または変異誘発マッピング（例えば、部位特異的変異誘発マッピング）によって判定され得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「治療する」、「治療すること」、および「治療」という用語は、本明細書に開示される治療または予防手段を指す。「治療」の方法は、疾患もしくは障害、または再発性疾患もしくは障害の１つ以上の症状を予防するか、治癒するか、遅延させるか、その重度を低減させるか、それを発症するリスクを低減させるか、または改善させるため、あるいはかかる治療の不在下で予想される対象の生存期間よりも長く延長させるために、疾患もしくは障害を有するか、または疾患もしくは障害にかかりやすい対象への抗ＡｐｏＣ３抗体の投与を用いる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、対象への療法剤の投与の文脈では、所望の予防または治療効果を達成する療法剤の量を指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語には、任意のヒトまたは非ヒト動物が含まれる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「または」という用語は、および／またはを意味する。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「約」および「およそ」という用語は、数値または数的範囲を修飾するために使用される場合、値または範囲を５％〜１０％上回る、および５％〜１０％下回る偏差が、引用された値または範囲の意図される意味の範囲内であることを示す。２．抗ＡｐｏＣ３抗体
【００４９】
本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合し、ＡｐｏＣ３機能を阻害する単離された抗体を提供する。
【００５０】
ある特定の実施形態では、単離された抗体は、哺乳動物のＡｐｏＣ３タンパク質に結合する。ある特定の実施形態では、単離された抗体は、ヒトＡｐｏＣ３に結合する。ある特定の実施形態では、単離された抗体は、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル）ＡｐｏＣ３に結合する。
【００５１】
ある特定の実施形態では、単離された抗体は、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．５〜ｐＨ６）下よりも生理的ｐＨで（例えば、ｐＨ７．４）、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）により高い親和性で結合する。かかるｐＨ依存性抗体を生成するための方法は、当該技術分野で周知である。例えば、１つの例示的な方法では、抗ＡｐｏＣ３抗体の重鎖および／または軽鎖ＣＤＲ内の１つ以上のアミノ残基は、Ｉｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１０）２８（１１）：１２０３−１２０７；Ｃｈａｐａｒｒｏ−Ｒｉｇｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  ＢｉｏｌＣｈｅｍ．（２０１２）２８７（１４）：１１０９０−１１０９７、米国特許第９，０９６，６５１号、および米国特許公開第ＵＳ２０１１／０１１１４０６（Ａ１）
号に記載されるように、ヒスチジン残基で置換され、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。しかしながら、かかる方法は当該技術分野で周知であるが、当業者は、任意の所与の抗体について、抗原に対する抗体の親和性を破壊することなく、抗原へのｐＨ依存性結合を達成するためにヒスチジンに変異され得る正確なＣＤＲアミノ酸が、経験的にのみ判定することができることを理解する（例えば、Ｅｄｇｃｏｍｂ  ａｎｄ  Ｍｕｒｐｈｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（２００２）４９：１−６を参照されたい、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【００５２】
当業者は、抗原に対する抗体の親和性を解離定数（ＫＤ）によって示すことができ、ＫＤが小さいほど親和性が高いことを示すことを理解するであろう。したがって、ある特定の実施形態では、抗ＡｐｏＣ３抗体は、ｐＨ７．４での第１のＫＤ、およびｐＨ５．５での第２のＫＤでＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に結合し、第２のＫＤと第１のＫＤとの比は、１を超えるか、または少なくとも１である（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００を超えるか、または少なくともこれらの値である）。
【００５３】
ある特定の実施形態では、第１のＫＤは、１００ｎＭ未満（例えば、５０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．２、または０．１ｎＭ未満）である。ある特定の実施形態では、第２のＫＤは、１ｎＭを超える（例えば、２、５、１０、２０、もしくは５０ｎＭを超える、または０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、５０、もしくは１００μΜを超える）。ある特定の実施形態では、第１のＫＤは、１００ｎＭ未満（例えば、５０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．２、または０．１ｎＭ未満）、およびＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）を発現する動物（例えば、ヒトまたはマウス）内の抗体の半減期は、約１日を超えるか、または少なくとも約１日である（例えば、約２、約３、約４、約５、約６、もしくは約７日を超えるか、もしくは少なくともこれらの日、または約１、約２、約３、約４、約６、または約８週間を超える）。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３は、ヒトＡｐｏＣ３であり、ＡｐｏＣ３を発現する動物は、ヒトである。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３は、ヒトＡｐｏＣ３であり、ＡｐｏＣ３を発現する動物は、ヒトＡｐｏＣ３を発現するマウスである。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる（インビボまたはインビトロ）。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％減弱させる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を、少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍減弱させる。
【００５５】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、食前、食中、または食後に対象に投与された場合、対象における食後脂肪血症を阻害することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象における食後脂肪血症を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％阻害することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象における食後脂肪血症を少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍阻害することができる。
【００５６】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、食前、食中、または食後に対象に投与された場合、対象における食後カイロミクロンレベルまたはカイロミクロンレムナントレベルを低減させることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象における食後カイロミクロンレベルまたはカイロミクロンレムナントレベルを少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％低減させることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象における食後カイロミクロンレベルまたはカイロミクロンレムナントレベルを少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍低減させることができる。
【００５７】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、対象の血液からのＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）のクリアランスの速度を増加させることができる。ある特定の実施形態では、抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象の血液からのＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）のクリアランスの速度を少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％増加させることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象の血液からのＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）のクリアランスの速度を少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍増加させることができる。ＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）のクリアランスを評価するための方法には、限定することなく、同位体トレーサー技術が含まれ、同位体は、放射性または安定のいずれであってもよい。
【００５８】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルを低減させることができる。ある特定の実施形態では、抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルを少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％低減させることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルを少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍低減させることができる。ある特定の実施形態では、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルの低減は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０日間、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、もしくは８週間維持される。
【００５９】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、脂質結合ＡｐｏＣ３（例えば、トリグリセリド、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）、またはＴＲＬレムナントに結合したＡｐｏＣ３）に結合することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、脂質またはリポタンパク質へのＡｐｏＣ３の結合を阻害しない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ＡｐｏＣ３と脂質またはリポタンパク質との結合について競合しない。ある特定の実施形態では、脂質は、脂肪酸鎖を含む。ある特定の実施形態では、脂質は、ホスファチジル基を含む。ある特定の実施形態では、脂質は、ホスファチジルコリン（例えば、ＤＭＰＣ）、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、またはホスファチジルグリセロールを含む。ある特定の実施形態では、脂質は、トリグリセリドである。ある特定の実施形態では、リポタンパク質は、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントである。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体の存在下での、ＡｐｏＣ３の脂質およびリポタンパク質（例えば、トリグリセリド、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）、またはＴＲＬレムナント）への結合の能力は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、抗ＡｐｏＣ３抗体の非存在下での、ＡｐｏＣ３の同じ脂質およびリポタンパク質への結合の能力の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。
【００６０】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体の存在下での、肝細胞（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）によるＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの摂取は、抗ＡｐｏＣ３抗体の非存在下での、肝細胞（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）によるＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの摂取よりも、少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５倍高い。
【００６１】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させ、かつ脂質結合ＡｐｏＣ３（例えば、トリグリセリド、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）、またはＴＲＬレムナントに結合したＡｐｏＣ３）に結合することができる。
【００６２】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、アミノ酸配列ＦＳＥＦＷＤＬＤＰＥ（配列番号２）内のＡｐｏＣ３のエピトープに結合する。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２内の少なくとも１つのアミノ酸を含み、任意で、配列番号２と隣接した配列番号１からの１つ以上のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の２、５、６、８、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも１つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の２、５、６、８、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも２つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の２、５、６、８、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも３つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の２、５、６、８、または１０位のアミノ酸のうちの少なくとも４つを含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の５および６位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の２、５、および６位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の２、５、および８位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の２、５、６、および８位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の６および１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の８および１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の６および８位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、エピトープは、配列番号２の６、８、および１０位のアミノ酸を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、脂質結合ＡｐｏＣ３（例えば、トリグリセリド、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）、またはＴＲＬレムナントに結合したＡｐｏＣ３）に結合することができる。ある特定の実施形態では、抗体は、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）のリポタンパク質リパーゼ媒介性脂質分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させることはできない。ある特定の実施形態では、抗体はまた、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）またはＴＲＬレムナントの肝細胞摂取を阻害するＡｐｏＣ３の能力も減弱させる。ある特定の実施形態では、抗体はまた、食前、食中、または食後に対象に投与された場合、対象における食後脂肪血症を阻害することもできる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体はまた、食前、食中、または食後に対象に投与された場合、対象における食後カイロミクロンレベルまたはカイロミクロンレムナントレベルを低減させることもできる。
【００６３】
任意の好適なアッセイを使用して、本明細書に開示される抗体の前述の機能活性を測定することができる。例示的なアッセイには、本明細書の実施例に開示される機能アッセイが含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
例示的な抗ＡｐｏＣ３抗体のアミノ酸配列は、本明細書の表１〜７に記載される。
【００６５】
【表１】
2020517242.tif 000003
【００６６】
【表２】
2020517242.tif 000004
【００６７】
【表３】
2020517242.tif 000005
【００６８】
【表４】
2020517242.tif 000006
【００６９】
【表５】
2020517242.tif 000007
【００７０】
【表６−１】
2020517242.tif 000008
【表６−２】
2020517242.tif 000009
【表６−３】
2020517242.tif 000010
【表６−４】
2020517242.tif 000011
【００７１】
【表７−１】
2020517242.tif 000012
【表７−２】
2020517242.tif 000013
【表７−３】
2020517242.tif 000014
【００７２】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、本明細書の表３に記載されるＶＨドメインのＣＤＲのうちの１つ、２つ、または３つ全てを含むＶＨドメインを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表３に記載されるＶＨドメインのうちの１つのＣＤＲＨ１を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表３に記載されるＶＨドメインのうちの１つのＣＤＲＨ２を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表３に記載されるＶＨドメインのうちの１つのＣＤＲＨ３を含む。
【００７３】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、本明細書の表４に開示されるＶＬドメインのＣＤＲのうちの１つ、２つ、または３つ全てを含むＶＬドメインを含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表４に記載されるＶＬドメインのうちの１つのＣＤＲＬ１を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表４に記載されるＶＬドメインのうちの１つのＣＤＲＬ２を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、表４に記載されるＶＬドメインのうちの１つのＣＤＲＬ３を含む。
【００７４】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域と、を含み、表５に記載される抗体の、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、それぞれＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３のアミノ酸配列を含む。
【００７５】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５２，６６０９−６６１６（１９７７）およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９９１）に従って判定することができる。ある特定の実施形態では、抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って判定され、抗体の重鎖ＣＤＲは、ＭａｃＣａｌｌｕｍ（上記）に従って判定される。
【００７６】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲは、免疫グロブリン構造ループの位置を指すＣｈｏｔｈｉａ付番スキームに従って判定することができる（Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ＆Ｌｅｓｋ  ＡＭ，（１９８７），Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１−９１７；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２７３：９２７−９４８；Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２７：７９９−８１７；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ  Ａ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５（１）：１７５−８２；および米国特許第７，７０９，２２６号を参照されたい）。典型的には、Ｋａｂａｔ付番の慣習を使用する場合、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＨ１ループは、重鎖アミノ酸２６〜３２、３３、または３４に存在し、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＨ２ループは、重鎖アミノ酸５２〜５６に存在し、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＨ３ループは、重鎖アミノ酸９５〜１０２に存在する一方、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＬ１ループは、軽鎖アミノ酸２４〜３４に存在し、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＬ２ループは、軽鎖アミノ酸５０〜５６に存在し、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＬ３ループは、軽鎖アミノ酸８９〜９７に存在する。Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲＨ１ループの末端は、Ｋａｂａｔ付番の慣例を使用して付番する場合、ループの長さに応じてＨ３２〜Ｈ３４の間で変動する（これは、Ｋａｂａｔ付番スキームが、Ｈ３５ＡおよびＨ３５Ｂに挿入を配置するためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終結し、３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終結し、３５Ａおよび３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終結する）。
【００７７】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲは、Ｌｅ  ｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐ，（１９９９）Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ  ７：１３２−１３６、およびＬｅｆｒａｎｃ  Ｍ−Ｐ  ｅｔ  ａｌ，（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７：２０９−２１２に記載されるように、ＩＭＧＴ付番システムに従って判定することができる。ＩＭＧＴ付番スキームによると、ＣＤＲＨ１は、２６〜３５位にあり、ＣＤＲＨ２は、５１〜５７位にあり、ＣＤＲＨ３は、９３〜１０２位にあり、ＣＤＲＬ１は、２７〜３２位にあり、ＣＤＲＬ２は、５０〜５２位にあり、ＣＤＲＬ３は、８９〜９７位にある。
【００７８】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲは、ＡｂＭ超可変領域を指すＡｂＭ付番スキームに従って判定することができ、これは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の折衷案を表し、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ  ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）に使用されている。
【００７９】
ある特定の実施形態では、抗体のＣＤＲは、ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２６２：７３２−７４５に従って判定することができる。また、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｉｉｂｅｌ，ｅｄｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３１，ｐｐ．４２２−４３９，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ（２００１）におけるＭａｒｔｉｎ  Ａ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ」も参照されたい。
【００８０】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、表３に記載されるＶＨドメインのＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域アミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、表４に記載されるＶＬドメインのＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域アミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含み、各ＣＤＲは独立して、本明細書に開示されるように、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ、ＭａｃＣａｌｌｕｍ、またはＡｂＭによるＣＤＲの定義に従って定義される。
【００８１】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域と、を含み、
（ａ）ＣＤＲＨ１は、ＴＹＳＭＲのアミノ酸配列を含み（配列番号３）、
（ｂ）ＣＤＲＨ２は、ＳｌＸ１ＴＤＧＧＧＴＡＹＲＤＳＶＫＧのアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ１はＳまたはＨであり（配列番号４）、
（ｃ）ＣＤＲＨ３は、Ｘ２ＧＹＳＤのアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ２はＡまたはＨであり（配列番号５）、
（ｄ）ＣＤＲＬ１は、ＫＴＳＱＧＬＶＨＳＤＧＫＴＹＦＹのアミノ酸配列を含み（配列番号６）、
（ｅ）ＣＤＲＬ２は、ＱＶＳＮＲＡＳのアミノ酸配列を含み（配列番号７）、および／または（ｆ）ＣＤＲＬ３は、ＡＸ３ＧＴＹＹＰＨＴのアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ３はＱまたはＨである（配列番号８）。
【００８２】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、抗体は、相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３を有する重鎖可変領域と、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３を有する軽鎖可変領域と、を含み、
（ａ）ＣＤＲＨ１は、ＴＹＳＭＲのアミノ酸配列を含み（配列番号３）、
（ｂ）ＣＤＲＨ２は、ＳｌＸｉＴＤＧＧＧＴＡＹＲＤＳＶＫＧのアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ１はＳまたはＨであり（配列番号４）、
（ｃ）ＣＤＲＨ３は、Ｘ２ＧＹＳＤのアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ２はＡまたはＨであり（配列番号５）、
（ｄ）ＣＤＲＬ１は、ＫＴＳＱＧＬＶＨＳＤＧＫＴＹＦＹのアミノ酸配列を含み（配列番号６）、
（ｅ）ＣＤＲＬ２は、ＱＶＳＮＲＡＳのアミノ酸配列を含み（配列番号７）、
（ｆ）ＣＤＲＬ３は、ＡＸ３ＧＴＹＹＰＨＴのアミノ酸配列を含み、式中、Ｘ３はＱまたはＨであり（配列番号８）、
かつＸ１、Ｘ２、およびＸ３のうちの少なくとも１つはＨである。
【００８３】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号９もしくは１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号１０もしくは１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１、
（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および／または
（ｆ）配列番号１３もしくは１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３、を含む。
【００８４】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、
（ａ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ１、
（ｂ）配列番号９または１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ２、
（ｃ）配列番号１０または１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲＨ３、
（ｄ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ１
（ｅ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ２、および
（ｆ）配列番号１３または１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲＬ３、を含み、
単離された抗体は、それぞれ配列番号３、９、１０、６、７、および１３に記載されているＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３配列を含まない。
【００８５】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、それぞれ配列番号３、９、および１０；３、１１、および１０；３、９、および１２；または３、１１、および１２に記載されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含むＶＨドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＶＨドメインは、それぞれ配列番号３、１１、および１０に記載されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨドメインは、それぞれ配列番号３、９、および１２に記載されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＶＨドメインは、それぞれ配列番号３、１１、および１２に記載されるＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３アミノ酸配列を含む。
【００８６】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、それぞれ配列番号６、７、および１３；または６、７、および１４に記載されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。ある特定の実施形態では、ＶＬドメインは、それぞれ配列番号６、７、および１４に記載されるＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３アミノ酸配列を含む。
【００８７】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体を提供し、当該抗体は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３領域を含む重鎖可変領域と、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域を含む軽鎖可変領域と、を含み、当該ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域は、それぞれ配列番号３、１１、１０、６、７、および１３；３、９、１２、６、７、および１３；３、９、１０、６、７、および１４；３、１１、１０、６、７、および１４；３、９、１２、６、７、および１４；３、１１、１２、６、７、および１３；または３、１１、１２、６、７、および１３に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域は、それぞれ配列番号３、１１、１０、６、７、および１４に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３領域は、それぞれ配列番号３、９、１２、６、７、および１４に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００８８】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１５、１６、１７、または１８に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（例えば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１５、１６、１７、または１８に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１６に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む。
【００８９】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１９、または２０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（例えば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号２０に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。
【００９０】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号１５、１６、１７、または１８に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（例えば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列番号１９、または２０に記載されるアミノ酸配列と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％（例えば、少なくとも８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％）同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域と、を含む、単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、抗体は、配列番号１５、１６、１７、または１８に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域、および配列番号１９、または２０に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１６および１９、１７および１９、１８および１９、１５および２０、１６および２０、１７および２０、または１８および２０に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１６および２０に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ある特定の実施形態では、抗体は、それぞれ配列番号１７および２０に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。
【００９１】
任意のＩｇ定常領域を本明細書に開示される単離された抗体に使用することができる。ある特定の実施形態では、Ｉｇ定常領域は、ヒトＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、またはＩｇＹ免疫グロブリン分子（Ｉｇ）分子の定常領域であり、かつ／または免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｈ、およびＩｇＡ２）、もしくは任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ）の定常領域である。ある特定の実施形態では、Ｉｇ定常領域は、ヒトまたはヒト化Ｉｇ定常領域である。
【００９２】
ある特定の実施形態では、定常領域は、野生型ヒトＩｇ（例えば、ＩｇＧ）重鎖定常領域のバリアントであり、バリアントヒトＩｇ重鎖定常領域は、同条件下でのヒト新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）の対応する野生型ヒトＩｇ重鎖定常領域の親和性と比較して、酸性ｐＨ（例えば、ｐＨ５．５〜ｐＨ６）でのヒトＦｃＲｎに対して増加した（例えば、少なくとも１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０倍増加した）親和性を有する。ある特定の実施形態では、バリアントヒトＩｇ重鎖定常領域は、同条件下でのヒト新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）の野生型ヒトＩｇ重鎖定常領域の親和性と比較して、生理的ｐＨ（例えば、ｐＨ７．４）でのヒトＦｃＲｎの同様のまたは減少した（例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２倍以下の、同様の、または減少した）親和性を有する。ある特定の実施形態では、定常領域は、野生型Ｉｇ（例えば、ＩｇＧ）定常領域またはそのＦｃＲｎ−結合断片（例えば、Ｆｃまたはヒンジ−Ｆｃドメイン断片）から、１つまたは２つ以上のアミノ酸（例えば、１つ以上の置換、挿入、または削除を有する）を含む。ある特定の実施形態では、インビボでの野生型定常ドメインまたはそのＦｃＲｎ−結合断片を有する対応する抗体の半減期に対して、インビボでのバリアント定常領域を有する抗体の半減期は増加する。例えば、インビボでの抗体の半減期を増加させる変異の例に関して、国際公開第ＷＯ  ０２／０６０９１９号、同第ＷＯ  ９８／２３２８９号、および同第ＷＯ  ９７／３４６３１号、ならびに米国特許第５，８６９，０４６号、同第６，１２１，０２２号、同第６，２７７，３７５号、同第６，１６５，７４５号、同第８，０８８，３７６号、および同第８，１６３，８８１号を参照されたい、これらは全て、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、１つ以上の異なるアミノ酸は、ＥＵ付番システムに従って番号付けされた、第２の定常（ＣＨ２）ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基２３１−３４０）、および／または第３の定常（ＣＨ３）ドメイン（ヒトＩｇＧ１の残基３４１−４４７）である。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体のＩｇＧの定常領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４）は、ＥＵ付番システムに従って番号付けされた、それぞれ２５２、２５４、および２５６位のアミノ酸チロシン（Ｙ）、スレオニン（Ｔ）、およびグルタミン酸（Ｅ）を含む。米国特許第７，６５８，９２１号を参照されたい。これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。「ＹＴＥ  ＩｇＧ」と称されるこのＩｇＧ型は、同じ抗体の野生型バージョンと比較して、４倍に増加した半減期を表示することが示されている（Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ＷＦ  ｅｔ  ａｌ，（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：２３５１４−２４を参照されたい、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体のＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１）の定常領域は、ＥＵ付番システムに従って番号付けされた、４３４位のアミノ酸アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、ま���はフェニルアラニン（Ｆ）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体のＩｇＧの定常領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧｔ）は、ＥＵ付番システムに従って番号付けされた、それぞれ４３３、４３４、および４３６位のアミノ酸リジン（Ｋ）、フェニルアラニン（Ｆ）、およびチロシン（Ｙ）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体のＩｇＧの定常領域（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧｔ）は、ＥＵ付番システムに従って番号付けされた、それぞれ、４２８および４３４位のアミノ酸ロイシン（Ｌ）およびセリン（Ｓ）を含む。酸性条件下でＦｃＲｎに対して増加した親和性を有し得る追加のＩｇＧ定常領域は、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５）６７（２００）：１３１−４１に記載され、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ある特定の実施形態では、抗体は、ＥＵ付番システムに従って番号付けされた、２５１〜２５７、２８５〜２９０、３０８〜３１４、３８５〜３８９、および４２８〜４３６位のアミノ酸残基の１つ、２つ、または３つ以上のアミノ酸置換を含むＩｇＧ定常ドメインを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、配列番号２１、２２、２３、２４、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、または４７に記載されるアミノ酸配列を有する重鎖定常領域を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される単離された抗体は、配列番号２５または２６に記載されるアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む。
【００９３】
ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体であって、配列番号３５に記載されるアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、単離された抗体を提供する。ある特定の実施形態では、本開示は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する単離された抗体であって、それぞれ、配列番号２７および３５、２８および３５、２９および３５、３０および３５、３１および３５、３２および３５、３３および３５、または３４および３５に記載されるアミノ酸配列を含む重鎖および軽鎖を含む、単離された抗体を提供する。
【００９４】
３．使用方法
ＡｐｏＣ３は、肝細胞によるＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）およびＴＲＬレムナントの摂取およびクリアランスを阻害し、ＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）のリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解を阻害し、それにより対象の血液中のトリグリセリドレベルを増加させるように機能する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、肝細胞によるＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）およびＴＲＬレムナントの摂取およびクリアランスを阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させるか、またはＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）のリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解を阻害するＡｐｏＣ３の能力を減弱させることができる。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象の血液中のＡｐｏＣ３の活性を阻害するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３の活性は、肝細胞によるＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）およびＴＲＬレムナントの摂取およびクリアランスの阻害である。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３の活性は、ＴＲＬのリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解の阻害である。ある特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３の活性は、肝細胞によるＴＲＬ（例えば、ＶＬＤＬ）およびＴＲＬレムナントの摂取およびクリアランスの阻害、ならびにＴＲＬのリポタンパク質リパーゼ媒介性脂肪分解の阻害である。
【００９５】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、対象の血液からのＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）のクリアランスの速度を増加させるために有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象の血液からのＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）のクリアランスの速度を増加させる方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００９６】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルを低減させるために有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／ＡｐｏＢ１００）レベルを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本方法は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルを少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％低減させる。ある特定の実施形態では、本方法は、本明細書に開示される方法によって、または当業者に既知の方法によって評価した場合、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルを少なくとも約１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍低減させる。ある特定の実施形態では、対象の血液中のＡｐｏＣ３および／またはＡｐｏＢ（例えば、ＡｐｏＢ４８および／またはＡｐｏＢ１００）レベルの低減は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、もしくは５０日間、または少なくとも１、２、３、４、５、６、７、もしくは８週間維持される。
【００９７】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、対象の血液中のトリグリセリドレベルを低減させるために有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象の血液中のトリグリセリドレベルを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００９８】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、高トリグリセリド血症の治療に有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象における高トリグリセリド血症を治療するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本出願は、対象におけるカイロミクロン血症を治療するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。ある特定の実施形態では、本開示は、対象におけるカイロミクロン血症症候群を治療するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。
【００９９】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、対象における食後脂肪血症の治療および予防に有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象における食後脂肪血症を阻害するための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。抗ＡｐｏＣ３抗体は、食前、食中、または食後に対象に投与され得る。
【０１００】
理論に拘束されることを望むものではないが、出願人らは、ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、食前、食中、または食後に対象に投与された場合、対象における食後カイロミクロンまたはカイロミクロンレムナントレベルを低減させることができると考える。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、対象における食後カイロミクロンまたはカイロミクロンレムナントレベルを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。抗ＡｐｏＣ３抗体は、食前、食中、または食後に対象に投与され得る。
【０１０１】
高トリグリセリド血症を有する患者の血中のトリグリセリドレベルの低減は、膵炎の発症のリスクを低減させ得る。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、高トリグリセリド血症を有する患者における膵炎のリスクを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。
【０１０２】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、対象の心血管疾患のリスクを低減させるために有用である。したがって、ある特定の実施形態では、本開示は、高トリグリセリド血症を有する患者における心血管疾患のリスクを低減させるための方法を提供し、当該方法は、有効量の本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物を対象に投与することを含む。高トリグリセリド血症または過剰な食後脂肪血症に関連するかまたはそれらによって引き起こされる任意の心血管疾患を発症するリスクは、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物の投与によって低減され得る。リスクが低減され得る心血管疾患には、環状動脈疾患、アテローム性動脈硬化症、狭心症、心筋梗塞、および脳梗塞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０３】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物は、単独で、または追加の治療剤と組み合わせて投与され得る。ある特定の実施形態では、追加の治療剤は、別の脂質低下薬である。任意の１つ以上の脂質滴下薬が、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物と組み合わせて使用され得る。好適な脂質低下薬には、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬（例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、またはシンバスタチン）、フィブラート、ニコチン酸、胆汁酸封鎖剤（例えば、コレスチラミン、コレスチポール、およびコレセベラム）、食事性コレステロール吸収阻害剤（例えば、エゼチミブ）、ミクロソームトリグリセリド輸送タンパク質（ＭＴＰ）阻害剤（例えば、ロミタピド）、フィトステロール、膵リパーゼ阻害剤（例えば、オルリスタット）、コレステリルエステル転送タンパク質阻害剤、スクアレン合成酵素阻害薬（例えば、ＴＡＫ−４７５、サラゴジン酸、およびＲＰＲ  １０７３９３）、ＡｐｏＡ−１  Ｍｉｌａｎｏ、サクシノブコール（ＡＧＩ−１０６７）、アポタンパク質Ｂ阻害薬（例えば、ミポメルセン）、およびプロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシンタイプ９（ＰＣＳＫ９）阻害薬（例えば、アリロクマブ、エボロクマブ、およびボコシズマブ）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、追加の脂質低下薬は、エゼチミブとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬との組み合わせである。ある特定の実施形態では、脂質低下薬は、エゼチミブとＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬とＰＣＳＫ９阻害薬との組み合わせである。
【０１０４】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物は、多様な経路で対象に送達され得る。これらには、非経口、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、および皮下経路が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体または医薬組成物は、皮下または静脈内に送達される。
【０１０５】
状態の治療または予防に有効となる、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３または医薬組成物の量は、疾患の性質に依存することになり、標準的な臨床技術によって経験的に判定することができる。組成物に用いられる正確な用量はまた、投与経路、および感染症またはそれによって引き起こされる疾患の重度に依存することになり、医師の判断および各対象の状況に従って決定されるべきである。例えば、有効用量はまた、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態（年齢、体重、および健康状態を含む）、患者がヒトであるか動物であるか、投与された他の薬物、または治療が予防的であるか療法的であるかに応じて異なる場合がある。本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または医薬組成物は、任意の頻度（例、約１週間ごと、約２週間ごと、約３週間ごと、約４週間ごと、約１か月、または約２か月ごと）で投与することができる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物を治療することもできる。治療投薬量およびレジメンは、安全性および有効性を最適化するために、最適に滴定される。
【０１０６】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体はまた、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、またはウェスタンブロッティングなどの免疫測定法を含む、当業者に既知である古典的な免疫組織学的方法を使用して生体試料中のＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）タンパク質レベルをアッセイするために使用することもできる。好適な抗体アッセイ標識は当該技術分野で既知であり、これには、グルコース酸化酵素などの酵素標識、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム３  １２１  ９９（Ｈ）、インジウム（Ｉｎ）、およびテクニチウム（Ｔｃ）などの放射性同位体、ルミノールなどの発光標識、ならびにフルオレセインおよびローダミン、およびビオチンなどの蛍光標識が含まれる。かかる標識は、本明細書に開示される抗体を標識付けするために使用され得る。代替的には、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体を認識する第２の抗体が標識されてもよく、これを抗ＡｐｏＣ３抗体と組み合わせて使用してＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）タンパク質レベルを検出する。
【０１０７】
ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）タンパク質の発現レベルについてアッセイすることは、直接的（例えば、絶対的タンパク質レベルを判定もしくは予測することによって）、または相対的に（例えば、第２の生体試料中の疾患関連タンパク質レベルと比較することによって）のいずれかで、第１の生体試料中のＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）レベルを定性的または定量的に測定または予測することを含むように意図される。第１の生体試料中のＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）ポリペプチド発現レベルは、測定または予測され、標準ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）タンパク質レベルと比較されてもよく、この標準は、障害を有しない個体から得られた第２の生体試料から取るか、または障害を有しない個体集団からのレベルを平均化することによって判定される。当該技術分野で理解されるように、「標準」ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）ポリペプチドレベルがいったん知られると、これを比較のための標準として繰り返し使用することができる。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「生体試料」という用語は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）を発現する可能性がある対象、細胞株、組織、または他の細胞源から得られた任意の生体試料を指す。組織生検および体液を動物（例えば、ヒト）から得る方法は、当該技術分野で周知である。生体試料には、末梢血単核細胞が含まれる。
【０１０９】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、予後診断、診断、監視、およびスクリーニング用途に使用することができ、これには、当業者に周知および標準的であり、かつ本明細書に基づくインビトロおよびインビボ用途が含まれる。免疫系状態または免疫応答のインビトロ評価および査定のための予後診断、診断、監視、およびスクリーニングアッセイおよびキットを利用して、予測、診断、および監視して、上昇したＡｐｏＣ３活性を有することが知られているか、またはそれを有することが疑われるものを含む、患者試料を査定することができる。一実施形態では、抗ＡｐｏＣ３抗体は、生検試料の免疫組織化学的検査に使用され得る。別の実施形態では、抗ＡｐｏＣ３抗体を使用して、ある特定の疾患症状に繋がり得る、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）レベルを検出することができる。本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、検出可能な標識または機能標識を保有し得る。蛍光標識が使用される場合、現在利用可能な顕微鏡法および経口蛍光標識細胞分取分析（ＦＡＣＳ）、または当該技術分野で既知である両方の方法手順の組み合わせを利用して、特異的結合メンバーを同定および定量化することができる。本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、蛍光標識を保有し得る。例示的な蛍光標識としては、例えば、反応性およびコンジュゲートされたプローブ、例えば、アミノクマリン、フルオレセイン、およびテキサスレッド、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ染料、Ｃｙ染料、およびＤｙＬｉｇｈｔ染料が挙げられる。抗ＡｐｏＣ３抗体は、同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６ＣＩ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６７Ｃｕ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１１７Ｌｕ、１２１Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１９８Ａｕ、２１１Ａｔ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、および１８６Ｒｅなどの放射性標識を保有し得る。放射性標識が使用される場合、当該技術分野で既知である現在利用可能な計数手順を利用して、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）への抗ＡｐｏＣ３抗体の特異的結合を同定および定量化した。標識が酵素である場合には、検出は、当該技術分野で既知である現在利用されている比色分析、分光光度法、蛍光分光光度法、電流測定法、または気体定量技術のいずれかによって達成され得る。これは、抗体とＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）との複合体の形成を可能にする条件下で、試料または対照試料を抗ＡｐｏＣ３抗体と接触させることによって達成することができる。抗体とＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）との間で形成される任意の複合体が試料および対照において検出され、比較される。また、本明細書に開示される抗体を使用して、免疫親和性精製を介してＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）を精製することもできる。また、例えば、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）の存在の程度の定量分析のための試験キットの形態で調製され得るアッセイシステムも本明細書に含まれる。システムまたは試験キットは、標識成分、例えば、標識ＡｐｏＣ３抗体と、１つ以上の追加の免疫化学的試薬とを含み得る。
【０１１０】
４．医薬組成物
薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定化剤中で所望の純度を有する本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体を含む医薬組成物が本明細書に提供される（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は、用いられる投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒であり、これらには、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどの親水性ポリマー；単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０１１１】
特定の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体中で、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体と、任意で、１つ以上の追加の予防または治療剤とを含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体中で、有効量の本明細書に開示される抗体と、任意で、１つ以上の追加の予防または治療剤とを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、医薬組成物中に含まれる唯一の活性成分である。本明細書に開示される医薬組成物は、ＡｐｏＣ３活性の阻害、および癌または感染性疾患などの状態の治療に有用であり得る。
【０１１２】
非経口調製物に使用される薬学的に許容される担体には、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌薬、等張化剤、緩衝液、抗酸化剤、局所麻酔薬、懸濁化剤および分散剤、乳化剤、封鎖剤またはキレート剤、ならびに他の薬学的に許容される物質が含まれる。水性ビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンガー液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロースおよび乳酸加リンガー液が挙げられる。非水性経口ビヒクルには、植物由来の不揮発性油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油、およびピーナッツ油が含まれる。複数用量容器にパッケージ化された経口調製物に、静菌的または静真菌的濃度の抗菌薬が添加されてもよく、これには、フェノールまたはクレゾール、水銀、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウムが含まれる。等張化剤には、塩化ナトリウムおよびデキストロースが含まれる。緩衝液には、リン酸およびクエン酸が含まれる。抗酸化剤には、重硫酸ナトリウムが含まれる。局所麻酔薬には、塩酸プロカインが含まれる。懸濁化剤および分散剤には、カルボキシメチルセルオースナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｏｓｅ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンが含まれる。乳化剤には、Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ  ８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０）が含まれる。金属イオンの封鎖剤またはキレート剤には、ＥＤＴＡが含まれる。また、薬学的担体には、水混和性ビヒクルのためのエチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール、ならびにｐＨ調節のための水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸、または乳酸も含まれる。
【０１１３】
医薬組成物は、対象への人の投与経路用に製剤化され得る。投与経路の具体的な例としては、鼻腔内、経口、肺、経皮、皮内、および非経口が挙げられる。皮下、筋肉内、または静脈内注射のいずれかを特徴とする非経口投与も本明細書において企図される。注射剤は、液体溶液もしくは懸濁液としての従来の形態で、注射前の液体中での溶解もしくは懸濁化に好適な固体形態で、または乳濁液として調製することができる。注射剤、溶液、および乳濁液は、１つ以上の賦形剤も含有する。好適な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールである。さらに、所望の場合、投与される医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、可溶性増強剤、ならびに例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、およびシクロデキストリンなどの他のかかる薬剤も含有し得る。
【０１１４】
抗体の非経口投与のための調製物には、注射用の滅菌溶液、使用直前に溶媒と合わせるための凍結乾燥粉末などの乾燥した滅菌可溶性生成物（皮下錠剤を含む）、注射用の滅菌懸濁液、使用直前にビヒクルと合わせるための乾燥した滅菌不溶性生成物、および滅菌乳濁液が含まれる。溶液は、水性であっても非水性であってもよい。
【０１１５】
静脈内に投与される場合、好適な担体には、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ならびにグルコース、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコール、およびこれらの混合物などの増粘剤および可溶化剤が含まれる。
【０１１６】
抗体を含む局所混合物は、局所および全身投与について記載されるように調製される。得られた混合物は、溶液、懸濁液、乳濁液などであり得、クリーム、ゲル、軟膏、乳濁液、溶液、エリキシル剤、ローション、懸濁液、チンキ剤、ペースト、泡状物質、エアロゾル、潅注剤、スプレー、坐薬、包帯、皮膚パッチ、または局所投与に好適な任意の他の製剤として製剤化され得る。
【０１１７】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、例えば吸入による局所投与のためにエアロゾルとして製剤化され得る（例えば、炎症性疾患、特に喘息の治療に有用なステロイドの送達のためのエアロゾルについて記載する、米国特許第４，０４４，１２６号、同第４，４１４，２０９号、および同第４，３６４，９２３号を参照されたい）。呼吸器への投与のためのこれらの製剤は、単独で、またはラクトースなどの不活性担体と組み合わせた、ネブライザー用のエアロゾルもしくは溶液の形態、または吹送のための微小粉末であり得る。かかる場合において、製剤の粒子は、一実施形態では５０ミクロン未満、一実施形態では１０ミクロン未満の直径を有することになる。
【０１１８】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体は、局所（ｌｏｃａｌ）または局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与用に、例えば、皮膚、および眼の中などの粘膜への局所適用のためにゲル、クリーム、およびローションの形態で、ならびに眼への適用または槽内もしくは脊髄内の適用のために、製剤化され得る。局所投与は、経皮送達について企図され、そして眼もしくは粘膜への投与、または吸入療法についても企図される。抗体単独の、または他の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた鼻腔用溶液も投与され得る。
【０１１９】
イオン振とうデバイスおよび電気泳動デバイスを含む経皮パッチは、当該技術分野で周知であり、抗体を投与するために使用され得る。例えば、かかるパッチは、米国特許第６，２６７，９８３号、同第６，２６１，５９５号、同第６，２５６，５３３号、同第６，１６７，３０１号、同第６，０２４，９７５号、同第６，０１０，７１５号、同第５，９８５，３１７号、同第５，９８３，１３４号、同第５，９４８，４３３号、および同第５，８６０，９５７号に開示されている。
【０１２０】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるものを含む医薬組成物は、溶液、乳濁液、および他の混合物として投与のために再構築され得る、凍結乾燥した粉末である。また、再構築し、固体またはゲルとして製剤化することもできる。凍結乾燥した粉末は、本明細書に開示される抗体またはその薬学的に許容される誘導体を好適な溶媒中に溶解することによって調製される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥した粉末は、滅菌である。溶媒は、安定性を改善させる賦形剤、または粉末もしくは粉末から調製された再構築された溶液の他の薬理成分を含有し得る。使用され得る賦形剤には、デキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロース、または他の好適な薬剤が含まれるが、これらに限定されない。溶媒はまた、一実施形態では約中性ｐＨの、緩衝液、例えば、クエン酸、リン酸ナトリウムもしくはカリウム、または当業者に既知である他の緩衝液も含有し得る。当業者に既知である標準条件下でのその後の溶液の滅菌濾過に続く凍結乾燥によって、所望の製剤が提供される。一実施形態では、得られた溶液は、凍結乾燥用のバイアルに配分される。各バイアルは、単回投薬量または複数回投薬量の化合物を含有することになる。凍結乾燥した粉末は、約４℃〜室温などの適切な条件下で保管され得る。この凍結乾燥した粉末を注射用に水で再構築することにより、非経口投与における使用のための製剤が提供される。再構築のために、凍結乾燥した粉末は、滅菌水または他の好適な担体に添加される。正確な量は、選択される化合物によって異なる。かかる量は、経験的に判定され得る。
【０１２１】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体および本明細書に提供される他の組成物はまた、特定の組織、受容体、または治療される対象の身体の他の領域を標的化するように製剤化され得る。多くのかかる標的化の方法は、当業者には周知である。全てのかかる標的化の方法は、本組成物における使用のために本明細書において企図される。標的化の方法の非限定的な例については、例えば、米国特許第６，３１６，６５２号、同第６，２７４，５５２号、同第６，２７１，３５９号、同第６，２５３，８７２号、同第６，１３９，８６５号、同第６，１３１，５７０号、同第６，１２０，７５１号、同第６，０７１，４９５号、同第６，０６０，０８２号、同第６，０４８，７３６号、同第６，０３９，９７５号、同第６，００４，５３４号、同第５，９８５，３０７号、同第５，９７２，３６６号、同第５，９００，２５２号、同第５，８４０，６７４号、同第５，７５９，５４２号、および同第５，７０９，８７４号を参照されたい。
【０１２２】
インビボ投与に使用される組成物は、滅菌であり得る。これは、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。
【０１２３】
５．ポリヌクレオチド、ベクター、および抗ＡｐｏＣ３抗体を産生する方法
別の態様では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体（例えば、軽鎖可変領域または重鎖可変領域）をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、ならびにベクター、例えば、宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよび哺乳動物細胞）における組換え発現のためのかかるポリヌクレオチドを含むベクターが本明細書に提供される。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「単離された」ポリヌクレオチドまたは核酸分子は、核酸分子の天然源において（例えば、マウスまたはヒトにおいて）存在する他の核酸分子から分離したものである。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、他の細胞形質成分、もしくは組換え技術によって産生された場合には培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合には化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まないことがある。例えば、「実質的に含まない」という表現は、約１５％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満（特に、約１０％未満）の他の物質、例えば、細胞形質成分、培養培地、他の核酸分子、化学的前駆体、または他の化学物質を有するポリヌクレオチドまたは核酸分子の調製物を含む。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体をコードする核酸分子（複数可）は、単離または精製されている。
【０１２５】
具体的な態様では、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）ペプチドに特異的に結合し、本明細書に開示されるアミノ酸配列を含む抗体、ならびにＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）ポリペプチドへの結合についてかかる抗体と競合する（例えば、用量依存的な様式で）か、またはかかる抗体と同じエピトープに結合する抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本明細書に提供される。
【０１２６】
ある特定の態様では、本明細書に開示される抗体の軽鎖または重鎖をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドが本明細書に提供される。ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される抗体のＶＨ、ＶＬ、またはＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含み得る（例えば、本明細書の表１〜４を参照されたい）。
【０１２７】
また、例えば、コドン／ＲＮＡ最適化、異種シグナル配列での置き換え、およびｍＲＮＡ不安定要素の排除によって最適化されている、抗ＡｐｏＣ３抗体をコードするポリヌクレオチドも本明細書に提供される。コドン変化を導入するか、またはｍＲＮＡにおける阻害領域を排除することによって、組換え発現のための抗ＡｐｏＣ３抗体（例えば、軽鎖、重鎖、ＶＨドメイン、またはＶＬドメイン）をコードする最適化された核酸を生成する方法は、例えば、米国特許第５，９６５，７２６号、同第６，１７４，６６６号、同第６，２９１，６６４号、同第６，４１４，１３２号、および同第６，７９４，４９８号に記載される最適化方法を適宜適応させることによって実施することができる。例えば、ＲＮＡ内の潜在的なスプライス部位および不安定要素（例えば、Ａ／ＴまたはＡ  Ｕに富む要素）は、核酸配列によってコードされたアミノ酸配列を改変せずに変異されて、組換え発現のためのＲＮＡの安定性を増加させることができる。改変は、例えば、同一のアミノ酸の代替的なコドンを使用して、遺伝暗号の縮重を利用する。いくつかの実施形態では、１つ以上のコドンを改変して、保存的変異、例えば、元のアミノ酸と類似の化学構造および特性または機能を有する類似のアミノ酸をコードすることが望ましい場合がある。かかる方法は、最適化されていないポリヌクレオチドによってコードされた抗ＡｐｏＣ３抗体の発現と比べて、抗ＡｐｏＣ３の発現を少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、または１００倍以上増加させることができる。
【０１２８】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体（例えば、ＶＬドメインまたはＶＨドメイン）をコードする最適化されたポリヌクレオチド配列は、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体（例えば、ＶＬドメインまたはＶＨドメイン）をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンス（例えば、補体）ポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体または断片をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー条件下で、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体をコードする最適化されていないポリヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体をコードする最適化されたヌクレオチド配列は、高ストリンジェンシー、中または低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体の最適化されていないヌクレオチド配列のアンチセンスポリヌクレオチドにハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件に関する情報は記載されており、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４８５４９号（例えば、段落７２〜７３）を参照されたい。
【０１２９】
当該技術分野で既知の任意の方法によって、ポリヌクレオチドを得ることができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を判定することができる。本明細書に開示される抗体、例えば、表１に記載される抗体、およびこれらの抗体の修飾バージョンをコードするヌクレオチド配列は、当該技術分野で周知の方法を使用して、すなわち、特定のアミノ酸をコードすることが知られているヌクレオチドコドンを、抗体をコードする核酸を生成するように集合させて、判定することができる。抗体をコードするかかるポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから集合させることができ（例えば、Ｋｕｔｍｅｉｅｒ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４），ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １７：２４２−６に記載されるように）、これは簡潔には、抗体をコードする配列の一部を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、ならびにその後の、ライゲートされたオリゴヌクレオチドのＰＣＲによる増幅を伴う。
【０１３０】
代替的には、本明細書に開示される抗体をコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法（例えば、ＰＣＲおよび他の分子クローニング法）を使用して、好適な供給源（例えば、ハイブリドーマ）由来の核酸から生成することができる。例えば、目的の抗体を産生するハイブリドーマ細胞から得たゲノムＤＮＡを使用して、既知の配列の３’および５’末端にハイブリダイズすることができる合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅を実施することができる。かかるＰＣＲ増幅法を使用して、抗体の軽鎖または重鎖をコードする配列を含む核酸を得ることができる。かかるＰＣＲ増幅法を使用して、抗体の可変軽鎖領域または可変重鎖領域をコードする配列を含む核酸を得ることができる。増幅した核酸は、宿主細胞における発現のため、ならびに例えば、キメラおよびヒト化抗体を生成するためのさらなるクローニングのためにベクター内にクローニングすることができる。
【０１３１】
特定の抗体をコードする核酸を含有するクローンが入手できないが、抗体分子の配列が既知である場合、免疫グロブリンをコードする核酸は、配列の３’および５’末端にハイブリダイズすることができる合成プライマーを使用したＰＣＲ増幅によって、または例えば、抗体をコードするｃＤＮＡライブラリ由来のｃＤＮＡクローンを同定するための特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを使用したクローニングによって、好適な供給源（例えば、抗体ｃＤＮＡライブラリ、または本明細書に開示される抗体を発現するために選択されたハイブリドーマ細胞などの、抗体を発現する任意の組織または細胞から生成された抗体ｃＤＮＡライブラリ、もしくはそれから単離された核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から化学的に合成されるか、またはそれから得ることができる。ＰＣＲによって精製された増幅した核酸は、その後、当該技術分野で周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０１３２】
本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定され得る。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの供給源として機能し得る。いったん単離されると、ＤＮＡは発現ベクター内に置かれ、これは次いで、別様に免疫グロブリンタンパク質を産生しない、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（例えば、ＣＨＯ  ＧＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）由来のＣＨＯ細胞）、または骨髄腫細胞などの宿主細胞内にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞中の抗ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗体の合成を得る。
【０１３３】
完全抗体を生成するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護する隣接配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、ｓｃＦｖクローンのＶＨまたはＶＬ配列を増幅させることができる。当業者に既知のクローニング技術を利用して、ＰＣＲ増幅したＶＨドメインを、重鎖定常領域、例えば、ヒトガンマ４定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、ＰＣＲ増幅したＶＬドメインを、軽鎖定常領域例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。ある特定の実施形態では、ＶＨまたはＶＬドメインを発現するためのベクターは、ＥＦ−１αプロモーター、文筆シグナル、可変領域のためのクローニング部位、定常領域、およびネオマイシンなどの選択マーカーを含む。ＶＨおよびＶＬドメインはまた、必要な定常領域を発現する１つのベクターにクローニングされてもよい。次いで、当業者に既知である技術を使用して、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞株に同時にトランスフェクトして、全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定または一過性細胞株を生成する。
【０１３４】
ＤＮＡはまた、例えば、マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することによって、または免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全てもしくは一部を共有結合させることによって修飾され得る。
【０１３５】
本明細書に開示される抗体をコードするポリヌクレオチドに、高、中、または低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも提供される。特定の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、高、中、または低ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、本明細書に提供されるＶＨドメインまたはＶＬドメインをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズする。
【０１３６】
ハイブリダイゼーション条件は、当該技術分野で記載されており、当業者には既知である。例えば、ストリンジェント条件下のハイブリダイゼーションは、約４５℃の６ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのフィルター結合ＤＮＡへのハイブリダイゼーション、続いて約５０〜６５℃の０．２ｘＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄を伴い得る。高ストリンジェント条件下でのハイブリダイゼーションは、約４５℃の６ｘＳＳＣ中でのフィルター結合核酸へのハイブリダイゼーション、続いて約６８℃の０．１ｘＳＳＣ／０．２％ＳＤＳ中での１回以上の洗浄を伴い得る。他のストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でのハイブリダイゼーションは、当業者には既知であり、記載されており、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，（１９８９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．Ｉ，Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの６．３．１〜６．３．６および２．１０．３頁を参照されたい。
【０１３７】
ある特定の態様では、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する本明細書に開示される抗体を発現する（例えば、組換えで）細胞（例えば、宿主細胞）、ならびに関連するポリヌクレオチドおよび発現ベクターが本明細書に提供される。宿主細胞、好ましくは哺乳動物細胞における組換え発現のための抗ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗体または断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを含むベクター（例えば、発現ベクター）が本明細書に提供される。また、本明細書に開示されるＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗体（例えば、ヒトまたはヒト化抗体）を組換え発現するためのかかるベクターを含む宿主細胞も提供される。特定の態様では、宿主細胞由来のかかる抗体を発現させることを含む、本明細書に開示される抗体を産生するための方法が本明細書に提供される。
【０１３８】
ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する本明細書に開示される抗体（例えば、本明細書に開示される全長抗体、抗体の重鎖もしくは軽鎖、または一本鎖抗体）の組換え発現は、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を伴う。本明細書に開示される抗体分子、抗体の重鎖または軽鎖（例えば、重鎖または軽鎖可変領域）をコードするポリヌクレオチドが得られると、抗体分子の産生のためのベクターは、当該技術分野で周知の技術を使用した組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。したがって、ヌクレオチド配列をコードする抗体または抗体断片（例えば、軽鎖または重鎖）を含有するポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製するための方法が本明細書に開示される。当業者に周知である方法を使用して、配列ならびに転写および翻訳制御シグナルをコードする抗体または抗体断片（例えば、軽鎖または重鎖）を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。また、プロモーターに操作可能に連結した、本明細書に開示される抗体分子、抗体の重鎖もしくは軽鎖、抗体の重鎖もしくは軽鎖可変領域、または重鎖もしくは軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターも提供される。かかるベクターは、例えば、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列（例えば、国際公開第ＷＯ  ８６／０５８０７号および同第ＷＯ８９／０１０３６号、ならびに米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）を含んでもよく、抗体の可変領域は、重鎖全体、軽鎖全体、または重鎖および軽鎖全体の両方の発現のためのかかるベクターにクローニングされてもよい。
【０１３９】
発現ベクターは、従来の技術によって細胞（例えば、宿主細胞）に転送され得、得られた細胞はその後、本明細書に開示される抗体を産生するために従来の技術によって培養され得る。したがって、宿主細胞におけるかかる配列の発現のためのプロモーターに操作可能に連結した、本明細書に開示される抗体、またはその重鎖もしくは軽鎖、またはその断片、または本明細書に開示される一本鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞が本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、二本鎖抗体の発現の場合、重鎖および軽鎖の両方をコードするベクターは個々に、以下に詳述されるように、免疫グロブリン分子全体の発現のための宿主細胞中で共発現され得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示される抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含有する。特定の実施形態では、宿主細胞は、本明細書に開示される抗体またはその断片の重鎖または重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、本明細書に開示される抗体またはその断片の軽鎖または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターと、の２つの異なるベクターを含有する。他の実施形態では、第１の宿主細胞は、本明細書に開示される抗体またはその断片の重鎖または重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターを含み、第２の宿主細胞は、本明細書に開示される抗体の軽鎖または軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターを含む。特定の実施形態では、第１の細胞によって発現された重鎖／重鎖可変領域は、第２の細胞の軽鎖／軽鎖可変領域と会合して、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体を形成した。ある特定の実施形態では、かかる第１の宿主細胞と、かかる第２の宿主細胞とを含む宿主細胞集団が本明細書に提供される。
【０１４０】
特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体の軽鎖軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第１のベクターと、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体の重鎖／重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む第２のベクターとを含むベクター集団が本明細書に提供される。
【０１４１】
多様な宿主発現ベクター系を利用して、本明細書に開示される抗体分子を発現させることができる（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）。かかる宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、その後精製され得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合に本明細書に開示される抗体分子をインサイツで発現することができる細胞も表す。これらには、抗体コード配列を含有する、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの微生物；抗体コード配列を含有する、組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母菌（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；抗体コード配列を含有する、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したか、もしくは組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系（例えば、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉなどの緑藻類）；または哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）もしくは哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１もしくはＣＯＳ）、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ  ２９３、ＮＳＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＣＲＬ７０３０、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨｅＬａ、およびＮＩＨ  ３Ｔ３、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、およびＢＭＴ１０細胞）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体を発現させるための細胞は、ＣＨＯ細胞、例えば、ＣＨＯ  ＧＳ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）（Ｌｏｎｚａ）由来のＣＨＯ細胞である。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体を発現させるための細胞は、ヒト細胞、例えば、ヒト細胞株である。特定の実施形態では、哺乳動物発現ベクターは、ｐＯｐｔｉＶＥＣ（商標）またはｐｃＤＮＡ３．３である。特定の実施形態では、特に、全組換え抗体分子の発現の場合、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどの細菌細胞または真核細胞（例えば、哺乳動物細胞）が、組換え抗体分子の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間体である初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと併せて、抗体のための有効な発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ＭＫ＆Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ  Ｈ（１９８６）Ｇｅｎｅ  ４５：１０１−５、およびＣｏｃｋｅｔｔ  ＭＩ  ｅｔ  ａｌ，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８（７）：６６２−７）。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、ＣＨＯ細胞また��ＮＳＯ細胞によって産生される。特定の実施形態では、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する本明細書に開示される抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成型プロモーター、誘導性プロモーター、または組織特異的プロモーターによって制御されている。
【０１４２】
細菌系において、発現される抗体分子について意図される用途に応じて、いくつかの発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、大量のかかる抗体が産生される場合、抗体分子の医薬組成物の生成のために、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましいことがある。かかるベクターには、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列がｌａｃ  Ｚコード領域を有するフレーム中でベクター内に個々にライゲーションされ得る、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｅｔｈｅｒ  Ｕ＆Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｌｌ  Ｂ（１９８３）ＥＭＢＯ  Ｊ  ２：１７９１−１７９４）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  Ｓ＆Ｉｎｏｕｙｅ  Ｍ（１９８５）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  Ｇ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ  ＳＭ（１９８９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２４：５５０３−５５０９）などが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ｐＧＥＸベクターを使用して、グルタチオン５−転移酵素（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現させることができる。一般に、かかる融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、続いて遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングされた標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るようにトロンビンまたは因子Ｘａプロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０１４３】
昆虫系において、異種遺伝子を発現させるためのベクターとして例えば、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を使用することができる。ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞中で増殖する。抗体コード配列は、ウイルスの非本質的な領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）内へ個々にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。
【０１４４】
哺乳動物宿主細胞において、いくつかのウイルスベースの発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが使用される場合、目的の抗体コード配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび３つに分かれた（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）リーダー配列にライゲーションされ得る。その後、インビトロまたはインビボ組換えによりこのキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非本質的な領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染した宿主において生存可能であり、抗体分子を発現することができる組換えウイルスをもたらすことになる（例えば、Ｌｏｇａｎ  Ｊ＆Ｓｈｅｎｋ  Ｔ（１９８４）ＰＮＡＳ  ８１（１２）：３６５５−９を参照されたい）。また、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために特定の開始シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。さらに、挿入全体の翻訳を確実にするために、開始コドンは所望のコード配列のリーディングフレームと一致していなければならない。これらの外因性制御シグナルおよび開始コドンは、様々な起源のもの（天然および合成の両方）であり得る。発現の有効性は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含むことによって増強され得る（例えば、Ｂｉｔｔｅｒ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照されたい）。
【０１４５】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望される特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質産物のかかる修飾（例えば、糖鎖付加）およびプロセシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴および特定の機構を有する。発現された異種タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目的で、一次転写産物の適切なプロセシング、糖鎖付加、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を保有する真核宿主細胞を使用することができる。かかる哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ  ２９３、ＮＩＨ  ３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＮＳＯ（一切の免疫グロブリン鎖を外因的に産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７０３０、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ１またはＣＯＳ）、ＰＥＲ．Ｃ６、ＶＥＲＯ、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ、ＨＥＫ−２９３Ｔ、ＨｅｐＧ２、ＳＰ２１０、Ｒ１．１、Ｂ−Ｗ、Ｌ−Ｍ、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、ＹＢ／２０、ＢＭＴ１０、ならびにＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗体は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞において産生される。
【０１４６】
特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、低減されたフコース含量を有するか、またはフコース含量を有しない。かかる抗体は、当業者に既知である技術を使用して産生され得る。例えば、抗体は、フコシル化の能力を不足または欠損している細胞において発現され得る。特定の例では、ａｌ，６−フコシル転移酵素の両方のアレルのノックアウトを有する細胞株を使用して、低減したフコース含量を有する抗体を産生することができる。Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）システム（Ｌｏｎｚａ）は、低減したフコース含量を有する抗体を産生するために使用され得るシステムの一例である。
【０１４７】
組換えタンパク質の長期的な高収量の産生のために、安定的な発現細胞が生成され得る。例えば、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体を安定的に発現する細胞株は、操作され得る。特定の実施形態では、本明細書に提供される細胞は、本明細書に開示される抗体を形成するために会合する軽鎖／軽鎖可変領域および重鎖／重鎖可変領域を安定的に発現する。
【０１４８】
ある特定の態様では、ウイルス複製開始点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞は、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーによって制御されたＤＮＡで形質転換され得る。異種ＤＮＡ／ポリヌクレオチドの導入後、操作された細胞を、富化された培地中で１〜２日間成長させ、その後、選択培地に切り替えることができる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する抵抗を付与し、細胞がそれらの染色体内にプラスミドを安定的に組み込み、成長して増殖巣を形成することを可能にし、これを細胞株へとクローニングおよび増殖させることができる。この方法を有利に使用して、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体を発現する細胞株を操作することができる。かかる操作された細胞株は、抗体分子と直接または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価においてとりわけ有用であり得る。
【０１４９】
いくつかの選択システムを使用することができ、これには、それぞれｔｋ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞、またはａｐｒｔ細胞中の単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９７７）Ｃｅｌｌ  １  １（１）：２２３−３２）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＥＨ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ  Ｗ（１９６２）ＰＮＡＳ  ４８（１２）：２０２６−２０３４）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  Ｉ  ｅｔ  ａｌ，（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２２（３）：８１７−２３）遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。また、以下の遺伝子の選択の基準として抗代謝抵抗を使用することができる：メトトレキサートに対する抵抗を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９８０）ＰＮＡＳ  ７７（６）：３５６７−７０；Ｏ’Ｈａｒｅ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ，（１９８１）ＰＮＡＳ  ７８：１５２７−３１）；ミコフェノール酸に対する抵抗を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＲＣ＆Ｂｅｒｇ  Ｐ（１９８１）ＰＮＡＳ  ７８（４）：２０７２−６）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する抵抗を付与するｎｅｏ（Ｗｕ  ＧＹ＆Ｗｕ  ＣＨ（１９９１）Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  Ｐ（１９９３）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ３２：５７３−５９６、Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＲＣ（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２、およびＭｏｒｇａｎ  ＲＡ＆Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＷＦ（１９９３）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６２：１９１−２１７、Ｎａｂｅｌ  ＧＪ＆Ｆｅｉｇｎｅｒ  ＰＬ（１９９３）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１（５）：２１１−５）；ならびにハイグロマイシンに対する抵抗を付与するハイグロ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ＲＦ  ｅｔ  ａｌ，（１９８４）Ｇｅｎｅ  ３０（１−３）：１４７−５６）。組換えＤＮＡ技術の当該技術分野で一般的に既知な方法が所望の組換えクローンを選択するために日常的に適用され得、かかる方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ  Ｍ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）、ならびにＤｒａｃｏｐｏｌｉ  ＮＣ  ｅｔ  ａｌ，（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌの第１２および１３章、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）、Ｃｏｌｂｅｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，（１９８１）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５０：１−１４に記載され、これらの全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５０】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる（概説について、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ＣＲ＆Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ  ＣＣＧ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照されたい）。抗体を発現するベクター系におけるマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させることになる。増幅された領域が抗体遺伝子に関連するため、抗体の産生も増加することになる（Ｃｒｏｕｓｅ  ＧＦ  ｅｔ  ａｌ，（１９８３）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３：２５７−６６）。
【０１５１】
宿主細胞を、重鎖由来のポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクターの、本明細書に記載される２つ以上の発現ベクターで同時にトランスフェクトすることができる。２つのベクターは同一の選択マーカーを含有し得、これは重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする。宿主細胞を、異なる量の２つ以上の発現ベクターで同時にトランスフェクトすることができる。例えば、宿主細胞は、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１２、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、または１：５０の第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターの比のうちのいずれか１つでトランスフェクトすることができる。
【０１５２】
代替的には、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、かつこれらを発現することができる単一のベクターを使用してもよい。かかる状況では、過剰な毒性を有しない重鎖を回避するために、重鎖の前に軽鎖が置かれるべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ  ＮＪ（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５６２−５６５およびＫｏｈｌｅｒ  Ｇ（１９８０）ＰＮＡＳ  ７７：２１９７−２１９９）。重鎖および軽鎖のコード配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。発現ベクターは、モノシストロン性であってもマルチシストロン性であってもよい。マルチシストロン性核酸構築物は、ヌクレオチド当たり、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、もしくはそれ以上、または２〜５、５〜１０、もしくは１０〜２０個の範囲の遺伝子をコードすることができる。例えば、バイシストロン性核酸構築物は、以下の順序で、プロモーター、第１の遺伝子（例えば、本明細書に開示される抗体の重鎖）、および第２の遺伝子および（例えば、本明細書に開示される抗体の軽鎖）を含み得る。かかる発現ベクターにおいて、両方の遺伝子の転写はプロモーターによって駆動され得る一方、第１の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、キャップ依存性スキャニング機構によるものであり得、第２の遺伝子からのｍＲＮＡの翻訳は、キャップ依存性機構、例えばＩＲＥＳによるものであり得る。
【０１５３】
いったん本明細書に開示される抗体分子が組換え発現によって産生されると、これは、免疫グロブリン分子の精製のための当該技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にタンパク質Ａの後の特定の抗原に対する親和性、およびサイズカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、差次的溶解度、またはタンパク質の精製のための任意の他の標準的技術によって精製され得る。さらに、本明細書に開示される抗体を、本明細書に開示されるか、または他の様式で当該技術分野において既知である異種ポリペプチド配列に融合させて、精製を容易にすることができる。
【０１５４】
特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、単離または精製されている。一般に、単離された抗体は、単離された抗体とは異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まないものである。例えば、特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体の調製物は、細胞形質成分または化学的前駆体を実質的に含まない。「細胞形質を実質的に含まない」という表現は、抗体が、それがそこから単離または組換え産生された細胞の細胞形質成分から分離されている抗体の調製物を含む。したがって、細胞形質成分を実質的に含まない抗体には、約３０％、２０％、１０％、５％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満（乾燥重量で）の異種タンパク質（本明細書において「混在タンパク質」とも呼ばれる）を有する抗体の調製物、または抗体のバリアント、例えば、抗体の異なる翻訳後修飾形態もしくは抗体の他の異なるバージョン（例えば、抗体断片）が含まれる。抗体が組換え産生された場合、これはまた培養培地も概して実質的に含まず、すなわち、培養培地は、タンパク質調製物の容積の約２０％、１０％、２％、１％、０．５％、または０．１％未満に相当する。抗体が化学的合成によって産生された場合、これは化学的前駆体または他の化学物質を概して実質的に含まず、すなわち、これは、タンパク質の合成に関与する化学的前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、抗体のかかる調製物は、約３０％、２０％、１０％、または５％未満（乾燥重量で）の化学的前駆体または目的の抗体以外の化合物を有する。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、単離または精製されている。
【０１５５】
ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する抗体は、抗体の合成のための当該技術分野で既知の任意の方法によって、例えば、化学的合成によって、または組換え発現技術によって産生され得る。本明細書に開示される方法は、別途示されない限り、分子生物学、微生物学、遺伝子解析、組換えＤＮＡ、有機化学、生化学、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド合成および修飾、核酸ハイブリダイゼーション、ならびに当該技術分野内の関連分野における従来の技術を用いる。これらの技術は、例えば、本明細書に引用される参考文献に記載され、文献において十分に説明されている。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ，（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７  ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（１９８７  ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ）Ｇａｉｔ（ｅｄ．）（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ．）（１９９１）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｒｒｅｎ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ，（ｅｄｓ．）（１９９９）Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ。
【０１５６】
特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体は、例えば合成、遺伝子操作を介したＤＮＡ配列の作製を伴う任意の手段によって調製、発現、作製、または単離された抗体（例えば、組換え抗体）である。ある特定の実施形態では、かかる抗体は、インビボで動物または哺乳動物（例えば、ヒト）の抗体生殖系列レパートリー内に天然で存在しない配列（例えば、ＤＮＡ配列またはアミノ酸配列）を含む。
【０１５７】
一態様では、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する抗体を作製する方法であって、本明細書に開示される細胞または宿主細胞を培養することを含む、方法が本明細書に提供される。ある特定の態様では、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する抗体を作製する方法であって、本明細書に開示される細胞または宿主細胞（例えば、本明細書に開示される抗体をコードするポリヌクレオチドを含む細胞または宿主細胞）を使用して抗体を発現させる（例えば、組換え発現させる）ことを含む、方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、細胞は、単離された細胞である。特定の実施形態では、外因性ポリヌクレオチドが細胞内に導入されている。特定の実施形態では、本方法は、細胞または宿主細胞から得た抗体を精製するステップをさらに含む。
【０１５８】
ポリクローナル抗体を産生するための方法は、当該技術分野で既知である（例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ  Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋの第１１章を参照されたい）。
【０１５９】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはこれらの組み合わせの使用を含む、当該技術分野で既知の幅広い技術を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、当該技術分野で既知であり、かつ例えば、Ｈａｒｌｏｗ  Ｅ＆Ｌａｎｅ  Ｄ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）、Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ＧＪ  ｅｔ  ａｌ，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３  ６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）に教示されるものを含む、ハイブリドーマ技術を使用して産生され得る。本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、ハイブリドーマ技術によって産生された抗体に限定されない。例えば、モノクローナル抗体は、本明細書に開示される抗体、例えば、かかる抗体の軽鎖または重鎖を外因的に発現する宿主細胞から組換え産生され得る。
【０１６０】
特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」は、単一の細胞（例えば、組換え抗体を産生するハイブリドーマまたは宿主細胞）によって産生され、抗体は、例えば、ＥＬＩＳＡ、または当該技術分野で既知であるか、もしくは本明細書に提供される実施例における他の抗原結合もしくは競合結合アッセイによって判定されるように、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体であり得る。ある特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、一価抗体または多価（例えば、二価）抗体である。特定の実施形態では、モノクローナル抗体は、単一特異性または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）であり得る。本明細書に開示されるモノクローナル抗体は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５に記載されるようなハイブリドーマ法によって作製されてもよく、または例えば、本明細書に開示される技術を使用してファージライブラリから、例えば単離されてもよい。クローン細胞株、およびそれにより発現されたモノクローナル抗体の調製のための他の方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，（２００２）５ｔｈ  Ｅｄ．，Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭ  ｅｔ  ａｌ，（上記）の第１１章を参照されたい）。
【０１６１】
ハイブリドーマ技術を使用して特定の抗体を産生およびスクリーニングするための方法は、慣例的であり、当該技術分野で周知である。例えば、ハイブリドーマ法において、マウス、またはヒツジ、ヤギ、ウサギ、ラット、ハムスター、もしくはマカクザルなどの他の適切な宿主動物に免疫付与して、免疫付与に使用されるタンパク質（例えば、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３））に特異的に結合することになる抗体を産生するか、またはそれを産生することができるリンパ球を誘発する。代替的には、リンパ球は、インビトロで免疫付与され得る。その後、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用してリンパ球を骨髄腫細胞に融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ  ＪＷ（Ｅｄ），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。さらに、ＲＩＭＭＳ（繰り返し免疫複数部位）技術を使用して、動物に免疫付与することができる（Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋ  ＫＥ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １６：３８１−９、参照によりその全体が組み込まれる）。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、マウス（またはラット、サル、ロバ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、もしくはイヌなどの他の動物）に抗原（例えば、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３））で免疫付与することができ、いったん免疫応答が検出される（例えば、抗原に対して特異的な抗体がマウス血清中で検出される）と、マウス脾臓を採取し、脾細胞を単離した。次いで、周知の技術によって脾細胞を任意の好適な骨髄腫細胞、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ（登録商標））（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な細胞株ＳＰ２０に融合させて、ハイブリドーマを形成する。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によってクローニングする。ある特定の実施形態では、免疫付与したマウスのリンパ節を採取し、ＮＳＯ骨髄腫細胞と融合させる。
【０１６３】
このように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは、未融合の親骨髄腫細胞の成長または生存を阻害する１つ以上の物質を含有する好適な培養培地中で播種および増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含むことになり（ＨＡＴ培地）、これらの物質は、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。
【０１６４】
特定の実施形態は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定的な高レベルの産生を支持し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感応性である骨髄腫細胞を用いる。これらの骨髄腫細胞株の中には、マウス骨髄腫細胞株、例えば、ＮＳＯ細胞株、またはＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍、ならびにＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡ）から入手可能なＳＰ−２もしくはＸ６３−Ａｇ８．６５３細胞に由来するものがある。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株はまた、ヒトモノクローナル抗体の産生について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ  Ｄ（１９８４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３３：３００１−５；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７））。
【０１６５】
ハイブリドーマ細胞を増殖させている培養培地を、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞によって産生されたモノクローナル抗体の結合特異性は、当該技術分野で既知の方法、例えば、免疫沈降法によって、または放射免疫測定法（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）などのインビトロ結合アッセイによって判定される。
【０１６６】
所望の特異性、親和性、または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞の同定後、クローンは、限界希釈手順によりサブクローニングされ、標準方法によって増殖され得る（Ｇｏｄｉｎｇ  ＪＷ（Ｅｄ），Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（上記））。この目的のために好適な培養培地には、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ  １６４０培地が含まれる。さらに、ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖され得る。
【０１６７】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、好適には、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、透析、または親和性クロマトグラフィーなどの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地、腹水液、または血清から分離される。
【０１６８】
本明細書に開示される抗体には、特異的ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）を認識し、かつ当業者に既知である任意の技術によって生成され得る抗体断片が含まれる。例えば、本明細書に開示されるＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、パパイン（Ｆａｂ断片を産生するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生するため）などの酵素を使用して、免疫グロブリンのタンパク質切断によって産生され得る。Ｆａｂ断片は、抗体分子の２つの同一のアームのうちの一方に対応し、重鎖のＶＨおよびＣＨＩドメインと対になった完全な軽鎖を含有する。Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域においてジスルフィド結合によって結合した抗体分子の２つの抗原結合アームを含有する。
【０１６９】
さらに、本明細書に開示される抗体はまた、当該技術分野で既知の様々なファージディスプレイ法を使用して生成することもできる。ファージディスプレイ法では、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に提示される。特に、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列は、動物ｃＤＮＡライブラリ（例えば、患部組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリ）から増幅される。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡをＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーと共に組換え、ファージミドベクターにクローニングする。ベクターをＥ．ｃｏｌｉ中に電気穿孔し、Ｅ．ｃｏｌｉは、ヘルパーファージに感染させる。これらの方法に使用するファージは、典型的には、ｆｄおよびＭｌ  ３を含む繊維状ファージであり、ＶＨおよびＶＬドメインは通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのいずれかに組換え融合されている。特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識抗原、または固体表面もしくはビーズに結合もしくは捕捉された抗原を使用して、抗原により選択または同定され得る。本明細書に開示される抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ法の例としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０、Ａｍｅｓ  ＲＳ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８４：１７７−１８６、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ＣＡ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２４：９５２−９５８、Ｐｅｒｓｉｃ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８、Ｂｕｒｔｏｎ  ＤＲ＆Ｂａｒｂａｓ  ＣＦ（１９９４）Ａｄｖａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５７：１９１−２８０、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＧＢ９１／００１１３４号、国際公開第ＷＯ９０／０２８０９号、同第ＷＯ９１／１０７３７号、同第ＷＯ９２／０１０４７号、同第ＷＯ９２／１８６１９号、同第ＷＯ９３／１１２３６号、同第ＷＯ９５／１５９８２号、同第ＷＯ９５／２０４０１号、および同第ＷＯ  ９７／１３８４４号、ならびに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号、および同第５，９６９，１０８号に開示されるものが挙げられる。
【０１７０】
上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージ由来の抗体コード領域は、単離され、ヒト抗体を含む全抗体、または任意の他の所望の抗原結合断片を生成するために使用され、例えば、以下に記載されるように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母菌、および細菌を含む任意の所望の宿主において発現され得る。ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／２２３２４号、Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ，（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １２（６）：８６４−９、Ｓａｗａｉ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３４：２６−３４、およびＢｅｔｔｅｒ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０４１−１０４３に開示されものなどの当該技術分野で既知の方法を使用して、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体断片を組換え産生する技術も用いられ得る。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、完全抗体を生成するために、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護する隣接配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、鋳型、例えばｓｃＦｖクローンからＶＨまたはＶＬ配列を増幅させることができる。当業者に既知のクローニング技術を利用して、ＰＣＲ増幅したＶＨドメインを、ＶＨ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができ、ＰＣＲ増幅したＶＬドメインを、ＶＬ定常領域例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローニングすることができる。ＶＨおよびＶＬドメインはまた、必要な定常領域を発現する１つのベクターにクローニングされてもよい。次いで、当業者に既知である技術を使用して、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞株に同時にトランスフェクトして、全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定または一過性細胞株を生成する。
【０１７２】
キメラ抗体は、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。例えば、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域に融合した、マウスまたはラットモノクローナル抗体の可変領域を含有し得る。キメラ抗体を産生するための方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−７；Ｏｉ  ＶＴ＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＳＬ（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４−２２１；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；および米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、同第４，８１６，３９７号、および同第６，３３１，４１５号を参照されたい。
【０１７３】
ヒト化抗体は、所定の抗原位結合することができ、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域と、非ヒト免疫グロブリン（例えば、マウス免疫グロブリン）のアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲとを含む。特定の実施形態では、ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）（典型的には、ヒト免疫グロブリンのもの）の少なくとも一部を含む。抗体はまた、重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域を含んでもよい。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＥを含む、任意のクラスの免疫グロブリン、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプから選択され得る。ヒト化抗体は、ＣＤＲ移植（欧州特許第ＥＰ２３９４００号、国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号、および米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、および同第５，５８５，０８９号）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または表面最古構成（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（欧州特許第ＥＰ５９２１０６号および同第ＥＰ５１９５９６号、Ｐａｄｌａｎ  ＥＡ（１９９１）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２８（４／５）：４８９−４９８、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ＧＭ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４、およびＲｏｇｕｓｋａ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４）ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３）、鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、ならびに例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開第ＷＯ９３／１７１０５号、Ｔａｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９：１１１９−２５、Ｃａｌｄａｓ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ，（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１３（５）：３５３−６０、Ｍｏｒｅａ  Ｖ  ｅｔ  ａｌ，（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０（３）：２６７−７９、Ｂａｃａ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２（１６）：１０６７８−８４、Ｒｏｇｕｓｋａ  ＭＡ  ｅｔ  ａｌ，（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  ９（１０）：８９５  ９０４、Ｃｏｕｔｏ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５５（２３  Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ、Ｃｏｕｔｏ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５５（８）：１７１７−２２、Ｓａｎｄｈｕ  ＪＳ（１９９４）Ｇｅｎｅ  １５０（２）：４０９−１０、およびＰｅｄｅｒｓｅｎ  ＪＴ  ｅｔ  ａｌ，（１９９４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２３５（３）：９５９−７３に開示される技術を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の多様な技術を使用して産生され得る。参照によりその全体が組み込まれる米国出願公開第ＵＳ２００５／００４２６６４（Ａ１）号（２００５年２月２４日）も参照されたい。
【０１７４】
多重特異性（例えば、二重特異性抗体）を作製するための方法は記載されており、例えば、米国特許第７，９５１，９１７号、同第７，１８３，０７６号、同第８，２２７，５７７号、同第５，８３７，２４２号、同第５，９８９，８３０号、同第５，８６９，６２０号、同第６，１３２，９９２号、および同第８，５８６，７１３号を参照されたい。
【０１７５】
単一ドメイン抗体、例えば、軽鎖を欠く抗体は、当該技術分野で周知の方法によって産生され得る。Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ＆Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３１：２５−３８；Ｎｕｔｔａｌｌ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ，（２０００）Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １（３）：２５３−２６３；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ，（２００１）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７４（４）：２７７−３０２；米国特許第６，００５，０７９号；および国際公開第ＷＯ９４／０４６７８号、同第ＷＯ９４／２５５９１号、および同第ＷＯ０１／４４３０１号。
【０１７６】
さらに、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合する抗体を利用して、当業者に周知の技術を使用して抗原を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成することができる。（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ  ＮＳ＆Ｂｏｎａ  ＣＡ（１９８９）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ７（５）：４３７−４４４；およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ  Ａ（１９９１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４７（８）：２４２９−２４３８を参照されたい）。
【０１７７】
特定の実施形態では、本明細書に開示される抗ＡｐｏＣ３抗体と同じＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）のエピトープに結合する本明細書に開示される抗体は、ヒト抗体である。特定の実施形態では、本明細書に開示される抗体のいずれか１つのＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）への結合を競合的にブロックする本明細書に開示される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当業者に既知である任意の方法を使用して産生され得る。例えば、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを使用することができる。特に、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体は、ランダムに、または相同組換えによって、マウス胚幹細胞内に導入され得る。代替的には、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域がマウス胚幹細胞内に導入されてもよい。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と別に、または同時に非機能性となってもよい。特に、１／２領域のホモ接合性欠失は、内因性抗体産生を防止する。修飾された胚肝細胞を増殖させ、胚盤胞に微量注入して、キメラマウスを産生する。その後、キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を産生する。トランスジェニックマウスに通常の様式で、選択された抗原、例えば、抗原（例えば、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３））の全てまたは一部で免疫付与する。従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫付与したトランスジェニックマウスから抗原に対するモノクローナル抗体を得ることができる。トランスジェニックマウスによって保有されるヒト免疫グロブリントランス遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再構成し、その後、クラススイッチおよび体細胞変異を受ける。このように、かかる技術を使用して、治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、およびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  Ｎ＆Ｈｕｓｚａｒ  Ｄ（１９９５）Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５−９３を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術、ならびにかかる抗体を産生するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば、国際公開第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、および同第ＷＯ９６／３３７３５号、ならびに米国特許第５，４１３，９２３号、同第５，６２５，１２６号、同第５，６３３，４２５号、同第５，５６９，８２５号、同第５，６６１，０１６号、同第５，５４５，８０６号、同第５，８１４，３１８号、および同第５，９３９，５９８号を参照されたい。ヒト抗体を産生することができるマウスの例としては、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ、米国特許第６，０７５，１８１号および同第６，１５０，１８４号）、ＨｕＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄｅｒｅｘ，Ｉｎｃ．／Ｇｅｎ  Ｐｈａｒｍ、米国特許第５，５４５，８０６号および同第５，５６９，８２５号）、Ｔｒａｎｓ  Ｃｈｒｏｍｏ  Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｋｉｒｉｎ）、ならびにＫＭ  Ｍｏｕｓｅ（商標）（Ｍｅｄａｒｅｘ  Ｋｉｒｉｎ）が挙げられる。
【０１７８】
ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）に特異的に結合するヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリを使用する上記のファージディスプレイ法を含む、当該技術分野で既知の多様な方法によって作製され得る。米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、および同第５，８８５，７９３号、ならびに国際公開第ＷＯ９８／４６６４５号、同第ＷＯ９８／５０４３３号、同第ＷＯ９８／２４８９３号、同第ＷＯ９８／１６６５４号、同第ＷＯ９６／３４０９６号、同第ＷＯ９６／３３７３５号、および同第ＷＯ９１／１０７４１号も参照されたい。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、マウス−ヒトハイブリドーマを使用してヒト抗体を産生することができる。例えば、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）で形質転換されたヒト末梢血リンパ球をマウス骨髄腫細胞と融合させて、ヒトモノクローナル抗体を分泌するマウス−ヒトハイブリドーマを産生することができ、これらのマウス−ヒトハイブリドーマをスクリーニングして、標的抗原（例えば、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３））に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を分泌するものを判定することができる。かかる方法は既知であり、当該技術分野で記載されている（例えば、Ｓｈｉｎｍｏｔｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ，（２００４）Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４６：１９−２３；Ｎａｇａｎａｗａ  Ｙ  ｅｉ  ｏ／．，（２００５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １４：２７−３１を参照されたい）。
【０１８０】
６．キット
１つ以上の本明細書に開示される抗体またはその医薬組成物もしくはコンジュゲートを含むキットも提供される。特定の実施形態では、本明細書に提供される１つ以上の抗体などの、本明細書に開示される医薬組成物の１つ以上の成分で充填した１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示される医薬組成物と、本明細書に開示されるものなどの任意の予防剤または治療剤とを含有する。医薬製品または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知が、かかる容器（複数可）と任意で関連付けられ得、この通知は、ヒトへの投与についての当該機関による製造、使用、または販売の承認を示す。
【０１８１】
また、上記の方法に使用され得るキットも提供される。一実施形態では、キットは、本明細書に開示される抗体、好ましくは精製された抗体を１つ以上の容器に含む。特定の実施形態では、本明細書に開示されるキットは、実質的に単離されたＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗原を対照として含有する。別の特定の実施形態では、本明細書に開示されるキットは、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）と反応しない対照抗体をさらに含む。別の特定の実施形態では、本明細書に開示されるキットは、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗原への抗体の結合を検出するために１つ以上の要素を含有する（例えば、抗体は、蛍光化合物、酵素基質、放射性化合物、または発光化合物などの検出可能な基質にコンジュゲートされ得るか、第１の抗体を認識する第２の抗体は、検出可能な基質にコンジュゲートされ得る）。特定の実施形態では、本明細書に提供されるキットは、組換え産生されたか、または化学的に合成されたＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗原を含んでもよい。キットに提供されるＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗原はまた、固体支持体に結合していてもよい。より具体的な実施形態では、上記のキットの検出手段は、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗原が結合している固体支持体を含む。かかるキットはまた、非結合リポーター標識抗ヒト抗体または抗マウス／ラット抗体を含んでもよい。この実施形態では、ＡｐｏＣ３（例えば、ヒトＡｐｏＣ３）抗原への抗体の結合は、当該リポーター標識抗体の結合によって検出され得る。
【実施例】
【０１８２】
以前に同定された抗体クローン５Ｅ５は、ｐＨ７．４での高い親和性、およびｐＨ５．５での若干低減した親和性でＡｐｏＣ３に結合する（米国仮出願第６２／３６０，０８４号を参照されたい）。本開示は、５Ｅ５に比較して、ｐＨ７．４でのＡｐｏＣ３への高親和性結合、しかしｐＨ５．５でのＡｐｏＣ３へのより低減した親和性を示すクローン５Ｅ５の新規誘導体を提供する。以下の実施例は、新規５Ｅ５誘導体の特性評価について記載する。５Ｅ５のアミノ酸配列は、米国仮出願第６２／３６０，０８４号に記載されおり、新規５Ｅ５誘導体のアミノ配列は、本明細書の表１〜７に記載される。
【０１８３】
このセクション中の実施例は、本出願の利点および特徴をさらに明瞭にするために提供されるが、本出願の範囲を限定することは意図しない。実施例は、例示目的のみのためのものである。
【０１８４】
実施例１：抗ＡｐｏＣ３  ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体のインビトロ特性評価。
この実施例は、抗ＡｐｏＣ３  ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体のｐＨ７．４およびｐＨ５．５の両方での抗原−結合速度を判定するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベース実験を記載する。
【０１８５】
抗体クローン５Ｅ５の新規誘導体のパネルを、５Ｅ５のＶＨおよびＶＬ内で、ヒスチジンと共に１種以上のＣＤＲアミノ酸の置換によって生成した。各５Ｅ５誘導体のｐＨ７．４およびｐＨ５．５の両方での抗原−結合速度を、ＳＰＲベース法を使用して評価した。５Ｅ５に比較して、ｐＨ７．４でのＡｐｏＣ３への高親和性結合、しかしｐＨ５．５でのＡｐｏＣ３へのより低減した親和性を示すクローンを、さらなる特性評価のために選択した。例示的な５Ｅ５誘導体５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬＷＴ、５Ｅ５ＶＨ１２＿ＶＬＷＴ、および５Ｅ５ＶＨＷＴ＿ＶＬ８の結合速度を表８に記載する。
【０１８６】
試験抗体を、５０ｍｌの小規模培養でトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞から産生し、ΑΚΤΑ純粋クロマトグラフィーシステムを使用してタンパク質Ａクロマトグラフィーによって精製した。精製された抗体断片の品質および収量を、分光光度法およびＳＤＳ−ＰＡＧＥによって判定した。
【０１８７】
ＳＰＲベース法を用い、ビオチン化ヒトＡｐｏＣ３を、ストレプトアビジン（ＳＡ）でコーティングしたチップ上に捕捉し、コーティングしたチップに対する試験抗体の結合速度を、ｐＨ７．４およびｐＨ５．５の両方で測定した。簡潔には、約５００ＲＵの表面密度に達するように２０μｌのビオチン化ヒトＡｐｏＣ３を、１０μｇ／ｍｌの濃度で注入した。６０μｌの各試験抗体を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ，ｃａｔ．ｎｒ．ＢＲ−１００８−２６；０．０１０  Ｍ  ＨＥＰＥＳ，０．１５０Ｍ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０，ｐＨ  ７．４）中で希釈し、１〜１００ｎＭの濃度で注入した。試験抗体を、３０μｌ／分の流速でフローセルに通し、続いてｐＨ７．４またはｐＨ５．５で５分間オフ速度洗浄した。ラングミュア１：１結合モデルを適用するＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ４．１ソフトウェアを使用して、得られたセンサグラムを分析して、結合速度を得た。データをゼロ調節し、参照セルセンサグラムを減じた。
【０１８８】
【表８】
2020517242.tif 000015
【０１８９】
試験される全てのｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体は、ｐＨ５．５よりもｐＨ７．４でＡｐｏＣ３に対しより高い親和性を示し、抗体５Ｅ５ＶＨ１２＿ＶＬＷＴは、最も顕著なｐＨ依存性結合を示した（表８を参照されたい）。ｐＨ依存性結合の大きさは、酸性条件下で解離速度と正の相関関係にあった。
【０１９０】
実施例２：抗ＡｐｏＣ３ヒトＩｇＧ１抗体のインビトロ特性評価。
実施例１の結果に基づいて、試験ｓｃＦｖ−Ｆｃ抗体を、ヒトＩｇＧ１抗体として生成した。ＳＰＲベースアッセイを用い、ヒトＡｐｏＣ３タンパク質を、ＣＭ５チップ上に固定し、コーティングしたチップに対する試験抗体の結合速度を、ｐＨ７．４およびｐＨ５．５の両方で測定した。簡潔には、１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．５）中、５０μｇ／ｍｌの天然ヒトＡｐｏＣ３の溶液を調製し、表面密度が約５００ＲＵに達するまで注入した。６０μｌの各試験抗体を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（ＧＥ，ｃａｔ．ｎｒ．ＢＲ−１００８−２６；０．０１０  Ｍ  ＨＥＰＥＳ，０．１５０Ｍ  ＮａＣｌ，３ｍＭ  ＥＤＴＡ，０．０５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０，ｐＨ７．４）中で希釈し、表９に記載される濃度で注入した。試験抗体を、３０μｌ／分の流速でフローセルに通し、続いてｐＨ７．４またはｐＨ５．５で５分間オフ速度洗浄した。ラングミュア１：１結合モデルを適用するＢｌＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ４．１ソフトウェアを使用して、得られたセンサグラムを分析して、結合速度を得た。データをゼロ調節し、参照セルセンサグラムを減じた。
【０１９１】
【表９】
2020517242.tif 000016
【０１９２】
ｐＨ７．４でのヒトＡｐｏＣ３に結合する、かつｐＨ５．５でのＡｐｏＣ３への低減した親和性を有する試験される全ての抗体（表９を参照されたい）。５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬＷＴ、５Ｅ５ＶＨ１２＿ＶＬＷＴ、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８、および５Ｅ５ＶＨ１２  ＶＬ８は、部分的に顕著なｐＨ依存性結合を示した。
【０１９３】
実施例３：肝細胞によるＶＬＤＬ摂取に対する抗ＡｐｏＣ３抗体の影響。
この実施例では、肝細胞によるＶＬＤＬの取り込みを減衰させるための抗ＡｐｏＣ３抗体の能力が、判定される。
【０１９４】
簡潔には、ＨｅｐＧ２細胞（ＡＴＣＣ  Ｈｂ−８０６５）を、１０％ＦＣＳを補充した完全最小必須培地（ＭＥＭ）中、２４時間、かつ０．０１２５％ウシ血清アルブミン（ＭＥＭ−ＢＳＡ培地）を補充した完全ＭＥＭ中、さらに２４時間、ポリ−ｄ−リジンでコーティングした表面で培養した。細胞を、新鮮なＭＥＭ−ＢＳＡ培地中で、３μΜヒトＡｐｏＣ３タンパク質（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、およびＩｇＧ１フォーマットの３μΜ試験抗体で１５分間プレインキュベートし、３０μｇ／ｍＬのＡｐｏＣ３枯渇Ｄｉｌ標識ＶＬＤＬ（Ｋａｌｅｎ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，ＬＬＣ  ＃７７０１３０−９）を、培地に添加した。４時間のインキュベーション後、細胞を、１％イントラリピドを補充した新鮮な完全ＭＥＭで２０分間さらにインキュベートした。細胞によって取り込まれるＤｉｌ標識ＶＬＤＬの量を、室温で１５分間、細胞をイソプロパノールで溶解し、ライセート（ｅｘ＝５２０ｎｍ、ｅｍ＝５８０）中でＤｉｌラベルの蛍光を測定し、標準曲線を使用してＤｉｌ標識ＶＬＤＬの量を計算し、ライセート中の全タンパク質量に基づいてデータを正規化することにより判定した。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用してグラフ化され、平均＋／−ＳＥＭとして報告される。
【０１９５】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用して複数の比較を伴う一元配置分散分析を計算した。図１Ａ、ＩＢ、および１Ｃに示されるように、５Ｅ５ＷＴ、５Ｅ５ＶＨＷＴ＿ＶＬ８、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬＷＴ、５Ｅ５ＶＨ１２＿ＶＬＷＴ、および５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８抗体は、ＨｅｐＧ２細胞によるＶＬＤＬ摂取を増加させた。特に、５Ｅ５ＶＨＷＴ＿ＶＬ８、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬＷＴ、５Ｅ５ＶＨ１２＿ＶＬＷＴ、および５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８抗体は、全て完全にＡｐｏＣ３の存在下で、ＶＬＤＬ摂取を回復した。
【０１９６】
実施例４：抗ＡｐｏＣ３抗体の薬物動態および薬力学。
この実施例は、ヒトＡｐｏＣ３のトランスジェニック発現によってトリグリセリドクリアランスが正常に機能しないマウスモデルを使用して、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８抗体のインビボ特性評価を記載する。
【０１９７】
４．１マウスモデルの生成
標準的な食物の食餌で維持される６０〜６３日齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスを、腹腔内投与によって、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター（ＲｅｇｅｎＸＢｉｏ）に操作可能に連結した、ヒトＡｐｏＣ３遺伝子を保有する３×ｌ０ｎ個のＡＡＶ８ベクターのウイルス粒子で感染させた。投与後１２日間、血液試料を後眼窩洞から採集し、血液試料中のヒトＡｐｏＣ３のレベルを、一次抗ＡｐｏＣ３抗体（Ａｂｅａｍウサギポリクローナル抗ヒトＡｐｏＣ３  ＃ａｂ２１０３２）、および二次ＡｐｏＣ３抗体（ＡｂｅａｍヤギポリクローナルビオチンコンジュゲートＡｐｏＣ３＃ａｂ２１０２４）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。感染マウスにおいて、ヒトＡｐｏＣ３の平均血清レベルは、９．９μΜであった。４時間の絶食後の平均循環トリグリセリドレベルは、これらのマウスにおいて１６３ｍｇ／ｄＬであり、一方対象の平均循環トリグリセリドレベルは、１０９ｍｇ／ｄＬ（ｐ＝０．００６５）であった。
【０１９８】
その後、全ての群が１２日後で同様の平均ＡｐｏＣ３レベルを有するようにマウスを群分けした。ＡＡＶ感染の１４日後に、後眼窩洞から血液試料を採集して、ベースライン（Ｔ＝０）ＡｐｏＣ３レベルを確立した。２５ｍｇ／ｋｇの試験抗ＡｐｏＣ３ヒトＩｇＧ１抗体を、背部皮下腔内への注射により各マウスに投与した。抗鶏卵リソソームヒトＩｇＧ１抗体（ＨｙＨＥＬ５）をアイソタイプ対照として使用した。試験抗体の投与の０、２、４、８、および２４時間後、ならびにその後３０日間にわたり２日ごとに血液試料を後眼窩洞から採集した。全ての動物実験は、ｔｈｅ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにおける推奨に従って実施した。全ての手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｍａｂ，ＬＬＣによって承認された。
【０１９９】
４．２  抗ＡｐｏＣ３抗体の薬物動態
ヒトＡｐｏＣ３を発現するマウスを生成し、セクション４．１に記載されるように処置した。ＥＬＩＳＡアッセイを用いてヒトＩｇＧ１抗体の血漿レベルを判定した。具体的には、９６ウェルプレート（Ｇｒｉｅｎｅｒ＃６５５０６１）を、ＰＢＳ中で希釈した５０μＬの一次ＩｇＧ抗体（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  ４１−ＸＧ５７ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃポリクローナル）で、４℃で一晩コーティングした。２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、ＰＢＳ中の、３％ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ  ＢＳＡ画分Ｖプロテアーゼ不含＃０３  １１７  ３３２  ００１）およびクリアミルク（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｌｅａｒ  Ｍｉｌｋ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＃３７５８７）からなる２００μＬのブロック緩衝液（ＰＢＳ中のＰｉｅｒｃｅ  Ｃｌｅａｒ  Ｍｉｌｋ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＃３７５８７）を用いて３０℃で９０分間ブロックした。ブロック緩衝液を除去し、ブロック緩衝液中で希釈した５０μＬの試験試料を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で２時間インキュベートさせた。２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、ブロック緩衝液中で希釈した５０μＬの二次抗体（Ａｂｅａｍヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ（ビオチン）ポリクローナル＃ａｂ９７２２３）を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で１時間インキュベートさせた。ＴＢＳ−Ｔでプレートを１回洗浄し、ＰＢＳ中で１００倍希釈した５０μＬのＳＡ−ＨＲＰ（Ａｂｅａｍ＃６４２６９）を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で３０分間インキュベートさせた。次いで、２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、８０μＬのＴＭＢで開発した。５０μＬの０．５Ｎ  ＨＣＬにより発色反応を停止させた。吸光度を波長４５０ｎｍで読み出した。精製された試験抗体を使用して構築した標準曲線（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の４パラメータ適合から試験ウェル中のヒトＩｇＧの量を計算した。この方法は、ヒトＡｐｏＣ３を特異的に検出し、マウスＡｐｏＣ３と交差反応しない。
【０２００】
図２Ａに示されるように、５Ｅ５抗体はヒトＡｐｏＣ３を発現するマウス内で急速に分解された。これは、ＡｐｏＣ３含有脂質粒子の摂取を通して、ＡｐｏＣ３の急速な交代によって説明することができる。より低いｐＨでのＡｐｏＣ３への低減した親和性を有する５Ｅ５ＶＨ５  ＶＬ８抗体は、酸性オルガネラ中でＡｐｏＣ３から解離し得、エンドソーム再利用を介して血流に戻り得る。５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８の半減期は、約１週間であり、アイソタイプ対照抗体ＨｙＨｅｌ５の半減期と同様である（マウス内の特定の抗原に結合しない抗体）。５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８の血漿レベルは、注射後約１か月でベースラインに戻る。５Ｅ５ＶＨ５  ＶＬ８の延長された半減期は、血清中の抗体の治療レベルを維持するために必要な低い投与頻度のため、この抗体を臨床用途の優れた候補にする。
【０２０１】
４．３  抗ＡｐｏＣ３抗体の薬力学
ヒトＡｐｏＣ３を発現するマウスを生成し、セクション４．１に記載されるように処置した。ＥＬＩＳＡアッセイを用いてヒトＡｐｏＣ３およびＡｐｏＢの血漿レベルを判定した。具体的には、９６ウェルプレート（Ｇｒｉｅｎｅｒ＃６５５０６１）を、ＰＢＳで希釈した５０μＬの一次ＡｐｏＣ３抗体（Ａｂｅａｍウサギポリクローナル抗ヒトＡｐｏＣ３＃ａｂ２１０３２）または５０μＬの一次ＡｐｏＢ抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓヤギポリクローナル抗ヒトＡｐｏＢ＃Ｋ４５２５３Ｇ）で、４℃で一晩コーティングした。２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、２００μＬのブロック緩衝液（ＰＢＳ中のＰｉｅｒｃｅ  Ｃｌｅａｒ  Ｍｉｌｋ  Ｂｌｏｃｋｅｒ＃３７５８７）を用いて３０℃で９０分間ブロックした。ブロック緩衝液を除去し、ブロック緩衝液中で希釈した５０μＬの試験試料を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で２時間インキュベートさせた。２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、ブロック緩衝液中で希釈した５０μＬの二次抗体（ＡｂｅａｍヤギポリクローナルビオチンコンジュゲートＡｐｏＣ３＃ａｂ２１０２４）または二次ＡｐｏＢ抗体（Ｍｅｒｉｄｉａｎ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅｓヤギポリクローナルビオチンコンジュゲートＡｐｏＢ４８／１００＃３４００３Ｇ）を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で１時間インキュベートさせた。ＴＢＳ−Ｔでプレートを１回洗浄し、ＰＢＳ中で１００倍希釈した５０μＬのＳＡ−ＨＲＰ（Ａｂｅａｍ＃６４２６９）を添加し、３００ｒｐｍでの回転と共に室温で３０分間インキュベートさせた。次いで、２００μＬのＴＢＳ−Ｔでプレートを４回洗浄し、８０μＬのＴＭＢ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ＃３４０２８）、続いて５０μＬの０．５Ｎ  ＨＣＬで開発した。吸光度を４５０ｎｍで読み出した。精製されたＡｐｏＣ３（Ａｔｈｅｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して構築した標準曲線（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の４パラメータ適合から試験ウェル中のＡｐｏＣ３の量を計算した。遠心分離によって単離したマウスＶＬＤＬを使用して構築した標準曲線（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）の４パラメータ適合から、試験ウェル中のＡｐｏＢの量を計算した（ＡｐｏＢ含量は全タンパク質含量の２０％であると想定する）。データを計算し、ＨｙＨｅｌ５対照抗体で治療したマウスにおける対応するレベルと比べて、パーセンテージ値としてプロットした。
【０２０２】
図２Ｂおよび２Ｃに示されるように、５Ｅ５抗体は、初めにヒトＡｐｏＣ３およびＡｐｏＢの血漿レベルを低減させたが、レベルは、約２日後正常に戻った。対照的に、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８は、約１か月間ヒトＡｐｏＣ３およびＡｐｏＢの血漿レベルを低減させた。この長い有効期間は、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８の長い半減期に一致し、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８は、優れた臨床候補であろうことを確認した。
【０２０３】
実施例５：抗ＡｐｏＣ３抗体による絶食トリグリセリドレベルおよび循環食後トリグリセリドレベルの低減。
この実施例は、ヒトＡｐｏＣ３のトランスジェニック発現によってトリグリセリドクリアランスが正常に機能しないマウスモデルを使用する５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８抗体による、絶食トリグリセリドレベルおよび循環食後トリグリセリドレベルの低減を記載する。
【０２０４】
標準的な食物の食餌で維持される６０〜６３日齢の野生型Ｃ５７ＢＬ／６雄マウスを、腹腔内投与によって、サイロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）プロモーター（ＲｅｇｅｎＸＢｉｏ）に操作可能に連結した、ヒトＡｐｏＣ３遺伝子を保有する３×ｌ０ｎ個のＡＡＶ８ベクターのウイルス粒子で感染させた。投与後１４日間、血液試料を後眼窩洞から採集し、血液試料中のヒトＡｐｏＣ３のレベルを、一次抗ＡｐｏＣ３抗体（Ａｂｅａｍウサギポリクローナル抗ヒトＡｐｏＣ３  ＃ａｂ２１０３２）、および二次ＡｐｏＣ３抗体（ＡｂｅａｍヤギポリクローナルビオチンコンジュゲートＡｐｏＣ３＃ａｂ２１０２４）を使用してＥＬＩＳＡによって測定した。その後、全ての群が１４日後で同様の平均ＡｐｏＣ３レベルを有するようにマウスを群分けした。
【０２０５】
１７日目に、血液試料を後眼窩洞から採集し、マウスに３０ｍｇ／ｋｇの５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８またはＨｙＨｅｌ５対照抗体を摂食状態で皮下注射した（ｔ＝−２４時間）。さらに６時間の食物の食餌の提供後、マウスを１８時間絶食させ、ｔ＝０での血液試料を後眼窩洞から採集した。次いで、マウスに１０ｍＬ／ｋｇのオリーブオイルの経口ボーラスを投与した。後眼窩洞の血液試料を、オリーブ油負荷１、２、３、および４時間後に得た。
【０２０６】
血漿トリグリセリドのレベルを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴＲ２２４２１）を使用して比色アッセイによって判定した。簡潔には、１０μＬの希釈血漿試料を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  ９０１７）内で、１８０μＬのＴｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｓ  Ｒｅａｇｅｎｔを用いて、３７℃で１０分間インキュベートした。５４０ｎｍでの吸光度をＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で読み出し、トリグリセリド濃度をグリセロール標準曲線の線状適合（Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）から計算した。血漿トリグリセリドの曲線値下の面積（ＡＵＣ）を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用して計算した。ＡｐｏＣ３のレベルを、上記セクション４．２に記載されている方法によって判定した。
【０２０７】
図３Ａに示されるように、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８で、２４時間治療したマウスの絶食トリグリセリドレベルは、ＨｙＨｅｌ５対照抗体で治療したマウスにおけるレベルよりも、著しく低かった（２２％、ｐ＝０．００４）。オリーブ油負荷後、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８で治療したマウスは、血漿トリグリセリドレベルにおいて低い増加を示し（図３Ｂ）、平均ＡＵＣ値は、ＨｙＨｅｌ５対照抗体で治療したマウスの平均ＡＵＣ値に比較して、４７％（ｐ＝０．０４）低減した（図３Ｃ）。ヒトＡｐｏＣ３の循環レベルは、ＨｙＨｅｌ５対照抗体で治療したマウスの循環レベルに比較して、５Ｅ５ＶＨ５＿ＶＬ８で治療したマウスでも著しく低減した（ｔ＝オリーブオイル投与０、１、２、３、および４時間後でのｐ値＜０．００１）（図３Ｄ）。
＊  ＊  ＊
【０２０８】
本発明は、本明細書に開示される特定の実施形態によって範囲を限定されるものではない。実際に、記載されているものに加えた、本発明の様々な修正は、前述の説明および添付の図面から当業者には明らかとなるであろう。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【０２０９】
本明細書に引用される全ての参考文献（例えば、出版物または特許または特許出願）は、各個々の参考文献（例えば、出版物または特許または特許出願）が具体的かつ個々に全ての目的でその全体が参照により組み込まれると示されているのと同程度に、全ての目的でそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１０】
他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１Ａ】
2020517242.tif 000017
【図１Ｂ】
2020517242.tif 000018
【図１Ｃ】
2020517242.tif 000019
【図２Ａ】
2020517242.tif 000020
【図２Ｂ】
2020517242.tif 000021
【図２Ｃ】
2020517242.tif 000022
【図３Ａ】
2020517242.tif 000023
【図３Ｂ】
2020517242.tif 000024
【図３Ｃ】
2020517242.tif 000025
【図３Ｄ】
2020517242.tif 000026
【配列表】
2020517242000001.app
【国際調査報告】
2020517242.tif 000027
2020517242.tif 000028
2020517242.tif 000029