(57)【要約】本発明は、ヒト肝細胞様細胞（HLC）を生成するのに有用な組成物および方法ならびに肝細胞数または機能の欠如に関連する疾患の処置のためにそのような細胞を使用する方法を特徴とする。2020533025.tif 000007
2020533025.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）アガロースを含む丸底凸型ウェルにおいて人工多能性幹細胞をインキュベートし、球形の胚様体を生成する工程、
（b）該胚様体を、塩基性FGF、アクチビン-AおよびTGF-βからなる群より選択される1つまたは複数の分化因子と接触させ、胚体内胚葉細胞を含む胚様体を形成する工程、
（c）工程bの胚様体をFGF4および／またはBMP-4と接触させ、前腸内胚葉細胞を含む胚様体を形成する工程、
（d）工程cの胚様体をWnt経路阻害剤と接触させ、肝芽細胞を含む胚様体を形成する工程、
（e）工程dの胚様体をHGFおよび／またはオンコスタチンAと接触させ、成熟肝細胞様細胞を含む胚様体を形成する工程
を含む、肝細胞様細胞を生成する方法。
【請求項２】
（a）アガロースを含む丸底凸型ウェルにおいて人工多能性幹細胞および脂肪組織由来内皮細胞をインキュベートし、球形の胚様体を生成する工程、
（b）該胚様体を、塩基性FGF、アクチビン-AおよびTGF-βからなる群より選択される1つまたは複数の分化因子と接触させ、胚体内胚葉細胞を含む胚様体を形成する工程、
（c）工程bの胚様体をFGF4および／またはBMP-4と接触させ、前腸内胚葉細胞を含む胚様体を形成する工程、
（d）工程cの胚様体をWnt経路阻害剤と接触させ、肝芽細胞を含む胚様体を形成する工程、
（e）工程dの胚様体をHGFおよび／またはオンコスタチンAと接触させ、成熟肝細胞様細胞を含む胚様体を形成する工程
を含む、肝細胞様細胞を生成する方法。
【請求項３】
胚体内胚葉細胞が、SOX17およびFOXA2を発現する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前腸内胚葉細胞が、HHEXおよびGATA4を発現する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
肝芽細胞が、AFPおよびHNF-4αを発現する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項６】
肝細胞様細胞が、アルブミン、HNF-1α、C-METおよびCK-18のうちの1つまたは複数のマーカーを発現する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項７】
工程bが、胚様体を塩基性FGF、アクチビン-AおよびTGF-βと接触させることを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項８】
工程cが、工程bの胚様体をFGF4およびBMP-4と接触させることを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項９】
工程cが、工程cの胚様体をWIF-1およびDKK-1と接触させることを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１０】
肝細胞様細胞が、5つのP450アイソフォームCyp1B1、Cyp2C9、Cyp3A4、Cyp2B6およびCyp3A7を発現する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１１】
肝細胞様細胞が、アルファ・フェトプロテイン、アルブミンおよびCK18を発現する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１２】
工程dの肝細胞様細胞が、800〜1,000μmであるが内部壊死を示さないクラスターを形成する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１３】
肝細胞様細胞が、アセチル化低密度リポタンパク質（DiI-ac-LDL）取り込み、インドシアニングリーン（ICG-Cardiogreen）吸収および6時間後放出、グリコーゲン貯蔵、ならびに中性トリグリセリドおよび脂質の細胞質蓄積のうちの1つまたは複数の機能的活性を示す、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１４】
肝細胞様細胞が、アンモニウム代謝を行うことができる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１５】
肝細胞様細胞が、CYPアイソフォーム遺伝子の発現の増加によって測定される解毒を行うことができる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１６】
肝細胞様細胞が、アルブミン、アルファ・フェトプロテインおよび／またはフィブリノゲンを分泌する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１７】
肝細胞様細胞が細胞内尿素を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１８】
80％またはそれ以上の肝細胞様細胞を生成する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項１９】
人工多能性幹細胞および脂肪組織由来内皮細胞が、哺乳動物細胞である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２０】
人工多能性幹細胞および脂肪組織由来内皮細胞が、げっ歯類またはヒトの細胞である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２１】
人工多能性幹細胞が、羊膜細胞由来である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２２】
肝細胞様細胞が、クラスターを形成する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２３】
前記クラスターをヒドロゲルでコーティングする工程、およびコーティングされたクラスターを間葉系幹細胞と共に培養し、クラスター周囲に間葉系細胞層を形成する工程をさらに含む、請求項23に記載の方法。
【請求項２４】
人工多能性幹細胞および脂肪組織由来内皮細胞が、自己細胞または異種細胞である、請求項22に記載の方法。
【請求項２５】
肝細胞様細胞が、肝臓第1相解毒経路および／または肝臓第2相解毒経路において機能することができる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２６】
肝細胞様細胞がグルタチオンを分泌することができる、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２７】
肝細胞様細胞が凝固因子を分泌する、請求項1または2に記載の方法。
【請求項２８】
凝固因子が、フォン・ヴィルブランド因子（vWF）、第IX因子、プロテインC、第X因子、プロテインS、第V因子、第VIII因子、アンチトロンビン、第VII因子、第XI因子、C反応性タンパク質、第XII因子、プロトロンビンおよび第XIII因子である、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
血液凝固障害を有する対象に、請求項1または2に記載の方法にしたがい生成された肝細胞様細胞を投与する工程を含む、血液凝固障害を処置する方法。
【請求項３０】
肝細胞様細胞が凝固因子を分泌する、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
凝固因子が、フォン・ヴィルブランド因子（vWF）、第IX因子、プロテインC、第X因子、プロテインS、第V因子、第VIII因子、アンチトロンビン、第VII因子、第XI因子、C反応性タンパク質、第XII因子、プロトロンビンおよび第XIII因子である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
血液凝固障害が血友病である、請求項29に記載の方法。
【請求項３３】
肝疾患または機能不全を有する対象に、請求項1または2に記載の方法にしたがい生成された肝細胞様細胞を投与する工程を含む、肝疾患または機能不全を処置する方法。
【請求項３４】
対象が、急性肝不全、肝硬変、B型またはC型肝炎感染、肝細胞癌、クリグラー・ナジャール症候群、尿素回路欠陥、オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素I（CPS-1）欠損症、シトルリン血症（Cit）障害、アルギノコハク酸リアーゼ（ASL）欠損症、家族性高コレステロール血症、血友病、第VII因子、糖原病、フェニルケトン尿症（PKU）、乳児レフサム病、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（PFIC-2）、A1AT欠損症または原発性シュウ酸症を有する、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
対象が末期肝疾患を有する、請求項33に記載の方法。
【請求項３６】
請求項1に記載の方法にしたがい生成された肝細胞様細胞および賦形剤を含む、細胞組成物。
【請求項３７】
請求項2に記載の方法にしたがい生成された肝細胞様細胞および賦形剤を含む、細胞組成物。
【請求項３８】
人工多能性幹細胞が羊膜細胞由来である、請求項36または37に記載の組成物。
【請求項３９】
肝細胞様細胞が凝固因子を分泌する、請求項36または37に記載の組成物。
【請求項４０】
分泌が構成性または誘導性である、請求項39に記載の組成物。
【請求項４１】
凝固因子が、フォン・ヴィルブランド因子（vWF）、第IX因子、プロテインC、第X因子、プロテインS、第V因子、第VIII因子、アンチトロンビン、第VII因子、第XI因子、C反応性タンパク質、第XII因子、プロトロンビンおよび第XIII因子である、請求項39に記載の組成物。
【請求項４２】
請求項1に記載の方法にしたがい生成された肝細胞様細胞と該細胞の投与に関する指示書とを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2017年9月12日出願の以下の米国仮出願番号62/557,533の恩典を主張し、その全内容を参照により本明細書に組み入れる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
細胞移植による急性肝不全の処置は、ヒト肝細胞の不足によって妨げられている。ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）の肝分化のための現在のプロトコルは、収量が低く、細胞が不均一であり、拡張性が限定的である。肝硬変、肝炎または急性肝不全によって引き起こされる肝機能不全は、多くの場合致死的である。現時点で、急性肝不全に対する最も効果的な治療法は、肝臓移植である。しかし、ドナー肝臓の不足および生涯にわたる免疫抑制の必要性が、肝臓移植の利用を制限している。そのため、毒素を除去し、肝機能の持続のために鍵となる生理学的活性分子を供給する活性な肝細胞を含む肝細胞移植およびバイオ人工肝臓（BAL）デバイスは、患者と自然再生または臓器移植を橋渡しするために使用されている。しかし、これらの治療様式は、肝細胞の供給源としてのヒト肝臓の欠如および異種供給源の制約によって制限されている。さらに、肝細胞ベースの治療の実施上の制約は、培養下での初代肝細胞の機能および凍結保存からの回復の際のそれらの生存率の急速な低下を含む。
【０００３】
ヒト人工多能性幹細胞は、それらの多能性、高い増殖指数ならびに拒絶および倫理的議論の不存在のために、個人向け再生医療において大きな期待がよせられている。人工多能性幹細胞（iPSC）は、様々な幹因子の添加を通じて成体の分化した細胞を多能性状態に戻すレトロエンジニアリングによって作製され得る。hiPSCは、三胚葉分化能を示し、肝細胞様細胞（HLC）を含む幅広い様々な細胞型に分化し得る。hiPSC由来のHLCは、肝臓疾患の処置のための細胞療法およびバイオ工学肝臓、薬学的試験、ならびに肝臓形成の発生生物学の研究における肝細胞の有望な、潜在的に無尽蔵の代替供給源となる。理論上、hiPSC由来肝細胞は、自己細胞移植を可能にし、それによって免疫感作および拒絶の悪影響を軽減する能力を有する。幹細胞由来HLCの臨床移行可能性（translational potential）は、移植に必要となる細胞用量の多さのために実現されていなかった。hiPSCからHLCを生成するための現在の分化プロトコルは、収量の低さおよび細胞の不均一さによって制限されている。したがって、再生医療のためのhiPSCからのHLCの生成に関する新しい組成物および方法が求められている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、ヒト肝細胞様細胞（HLC）を生成するのに有用な組成物および方法ならびに肝細胞数または機能の欠如に関連する疾患の処置のためにそのような細胞を使用する方法を特徴とする。
【０００５】
第1の局面において、本発明は、（a）アガロースを含む丸底凸型ウェルにおいて人工多能性幹細胞をインキュベートし、球形の胚様体を生成する工程、（b）該胚様体を、塩基性FGF、アクチビン-AおよびTGF-βからなる群より選択される1つまたは複数の分化因子と接触させ、胚体内胚葉細胞を含む胚様体を形成する工程、（c）工程bの胚様体をFGF4および／またはBMP-4と接触させ、前腸内胚葉細胞を含む胚様体を形成する工程、（d）工程cの胚様体をWnt経路阻害剤と接触させ、肝芽細胞を含む胚様体を形成する工程、および（e）工程dの胚様体をHGFおよび／またはオンコスタチンAと接触させ、成熟肝細胞様細胞を含む胚様体を形成する工程を含む、肝細胞様細胞を生成する方法を特徴とする。
【０００６】
第2の局面において、本発明は、（a）アガロースを含む丸底凸型ウェルにおいて人工多能性幹細胞および脂肪組織由来内皮細胞をインキュベートし、球形の胚様体を生成する工程、（b）該胚様体を、塩基性FGF、アクチビン-AおよびTGF-βからなる群より選択される1つまたは複数の分化因子と接触させ、胚体内胚葉細胞を含む胚様体を形成する工程、（c）工程bの胚様体をFGF4および／またはBMP-4と接触させ、前腸内胚葉細胞を含む胚様体を形成する工程、（d）工程cの胚様体をWnt経路阻害剤と接触させ、肝芽細胞を含む胚様体を形成する工程、および（e）工程dの胚様体をHGFおよび／またはオンコスタチンAと接触させ、成熟肝細胞様細胞を含む胚様体を形成する工程を含む、肝細胞様細胞を生成する方法を提供する。
【０００７】
本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、胚体内胚葉細胞は、SOX17およびFOXA2を発現し、前腸内胚葉細胞は、HHEXおよびGATA4を発現し、肝芽細胞は、AFPおよびHNF-4αを発現し、肝細胞様細胞は、アルブミン、HNF-1α、C-METおよびCK-18のうちの1つまたは複数のマーカーを発現する。本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、工程bは、胚様体を塩基性FGF、アクチビン-AおよびTGF-βと接触させることを含む、工程cは、工程bの胚様体をFGF4およびBMP-4と接触させることを含む、または工程cは、工程cの胚様体をWIF-1およびDKK-1と接触させることを含む。
【０００８】
本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、肝細胞様細胞は、5つのP450アイソフォームCyp1B1、Cyp2C9、Cyp3A4、Cyp2B6およびCyp3A7を発現する。本明細書に記載される任意の局面のいくつかの態様において、肝細胞様細胞は、アルファ・フェトプロテイン、アルブミンおよびCK18を発現する。本明細書に記載される任意の局面の他の態様において、工程ｄの肝細胞様細胞は、800〜1,000μmであるが内部壊死を示さないクラスターを形成する。本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、肝細胞様細胞は、アセチル化低密度リポタンパク質（DiI-ac-LDL）取り込み、インドシアニングリーン（ICG-Cardiogreen）吸収および6時間後放出、グリコーゲン貯蔵、ならびに中性トリグリセリドおよび脂質の細胞質蓄積のうちの1つまたは複数の機能的活性を示す。
【０００９】
本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、肝細胞様細胞は、アンモニウム代謝を行うことができる。本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、CYPアイソフォーム遺伝子の発現の増加によって測定される解毒。いくつかの態様において、肝細胞様細胞は、アルブミン、アルファ・フェトプロテインおよび／またはフィブリノゲンを分泌する。本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、肝細胞様細胞は、細胞内尿素を含む。本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、この方法は、80％またはそれ以上の肝細胞様細胞を生成する。いくつかの態様において、人工多能性幹細胞および脂肪組織由来内皮細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの態様において、人工多能性幹細胞および脂肪組織由来内皮細胞は、げっ歯類またはヒトの細胞である。いくつかの態様において、人工多能性幹細胞は、羊膜細胞由来である。
【００１０】
本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、肝細胞様細胞は、クラスターを形成する。いくつかの態様において、この方法は、前記クラスターをヒドロゲルでコーティングする工程、およびコーティングされたクラスターを間葉系幹細胞と共に培養し、クラスター周囲に間葉系細胞層を形成する工程をさらに含む。いくつかの態様において、人工多能性幹細胞および脂肪組織由来内皮細胞は、自己細胞または異種細胞である。
【００１１】
本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、肝細胞様細胞は、肝臓第1相解毒経路および／または肝臓第2相解毒経路において機能することができる。いくつかの態様において、肝細胞様細胞は、グルタチオンを分泌することができる。
【００１２】
本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、肝細胞様細胞は、凝固因子を分泌する。いくつかの態様において、凝固因子は、フォン・ヴィルブランド因子（vWF）、第IX因子、プロテインC、第X因子、プロテインS、第V因子、第VIII因子、アンチトロンビン、第VII因子、第XI因子、C反応性タンパク質、第XII因子、プロトロンビンおよび第XIII因子である。
【００１３】
本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、本発明は、血液凝固障害を有する対象に、本明細書に記載される局面の任意の1つの方法にしたがい生成された肝細胞様細胞を投与する工程を含む、血液凝固障害を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、肝細胞様細胞は、凝固因子を分泌する。いくつかの態様において、凝固因子は、フォン・ヴィルブランド因子（vWF）、第IX因子、プロテインC、第X因子、プロテインS、第V因子、第VIII因子、アンチトロンビン、第VII因子、第XI因子、C反応性タンパク質、第XII因子、プロトロンビンおよび第XIII因子である。いくつかの態様において、血液凝固障害は、血友病である。
【００１４】
本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、本発明は、肝疾患または機能不全を有する対象に、本明細書に記載される局面の任意の1つの方法にしたがい生成された肝細胞様細胞を投与する工程を含む、肝疾患または機能不全を処置する方法を提供する。いくつかの態様において、対象は、急性肝不全、肝硬変、B型またはC型肝炎感染、肝細胞癌、クリグラー・ナジャール症候群、尿素回路欠陥、オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素I（CPS-1）欠損症、シトルリン血症（Cit）障害、アルギノコハク酸リアーゼ（ASL）欠損症、家族性高コレステロール血症、血友病、第VII因子、糖原病、フェニルケトン尿症（PKU）、乳児レフサム病、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（PFIC-2）、A1AT欠損症または原発性シュウ酸症を有する。いくつかの態様において、対象は、末期肝疾患を有する。
【００１５】
本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、本発明は、本明細書に記載される第1の局面の方法にしたがい生成された肝細胞様細胞および賦形剤を含む細胞組成物を提供する。本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、本発明は、本明細書に記載される第2の局面の方法にしたがい生成された肝細胞様細胞および賦形剤を含む細胞組成物を提供する。本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、人工多能性幹細胞は、羊膜細胞由来である。本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、肝細胞様細胞は、凝固因子を分泌する。いくつかの態様において、分泌は、構成性または誘導性である。いくつかの態様において、凝固因子は、フォン・ヴィルブランド因子（vWF）、第IX因子、プロテインC、第X因子、プロテインS、第V因子、第VIII因子、アンチトロンビン、第VII因子、第XI因子、C反応性タンパク質、第XII因子、プロトロンビンおよび第XIII因子である。
【００１６】
本明細書に記載される任意の局面の様々な態様において、本発明は、請求項1の方法にしたがい生成された肝細胞様細胞と該細胞の投与に関する指示書とを含むキットを提供する。
【００１７】
本発明は、ヒト肝細胞様細胞（HLC）を含む細胞組成物および疾患の処置のためにそのような細胞を使用する方法を提供する。本発明によって定義される組成物および物品は、以下に提供される実施例に関連して単離またはそうでなければ製造した。本発明の他の特徴および利点は、詳細な説明からおよび特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【００１８】
定義
それ以外のことが定義されていない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、本発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されている意味を有する。以下の参考文献は、本発明において使用される用語の多くの一般的定義を当業者に提供する：Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology (2nd ed. 1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology (Walker ed., 1988)；The Glossary of Genetics, 5th Ed., R. Rieger et al. (eds.), Springer Verlag (1991)；およびHale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology (1991)。本明細書で使用される場合、以下の用語は、それ以外のことが示されてない限り、以下のそれらに属する意味を有する。
【００１９】
「薬剤」は、ペプチド、核酸分子または小さな化合物を意味する。移植レシピエントに従来的に投与される薬剤は、任意で、本明細書に記載される細胞組成物と組み合わせて使用され得る。
【００２０】
「改善する」は、肝疾患の発展または進行を減少、抑制、軽減、低下、停止または安定化させることを意味する。
【００２１】
「変動」は、標準的な当技術分野で公知の方法、例えば本明細書に記載されるものによって検出される遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の変化（増加または減少）を意味する。本明細書で使用される場合、変動は、発現レベルの10％の変化、好ましくは発現レベルの25％の変化、より好ましくは40％の変化、最も好ましくは50％またはそれ以上の変化を含む。
【００２２】
「アナログ」は、同一ではないが、同等の機能的または構造的特徴を有する分子を意味する。例えば、ポリペプチドアナログは、対応する天然に存在するポリペプチドの生物学的活性を保持しつつ、天然に存在するポリペプチドと比較してそのアナログの機能を強化する特定の生化学的修飾を有している。そのような生化学的修飾は、例えばリガンド結合性を変動させずに、そのアナログのプロテアーゼ耐性、膜透過性または半減期を増加させ得る。アナログは、非天然アミノ酸を含み得る。
【００２３】
本開示において、「含む（comprises）」、「含む（comprising）」、「含む（containing）」および「有する」等は、米国特許法におけるそれらにしたがう意味を有し得、「含む（includes）」、「含む（including）」等を意味し得；「から本質的になる」または「本質的になる」も同様に、米国特許法における意味を有し、この用語はオープンエンド型であり、それが存在することによって言及されているものの基本的または新規の特徴を変化させない限り、言及されている以上のものが存在することを許容するが、先行技術の態様は除外する。
【００２４】
「検出」は、検出される分析物の存在、非存在または量を同定することを表す。
【００２５】
「疾患」は、細胞、組織または器官、例えば肝臓の正常な機能を損なわせるまたは妨げる任意の状態または障害を意味する。肝疾患の例は、肝硬変、B型またはC型肝炎感染、肝細胞癌、クリグラー・ナジャール症候群、尿素回路欠陥、オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素I（CPS-1）欠損症、シトルリン血症（Cit）障害、アルギノコハク酸リアーゼ（ASL）欠損症、家族性高コレステロール血症、血友病、第VII因子、糖原病、フェニルケトン尿症（PKU）、乳児レフサム病、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（PFIC-2）、A1AT欠損症および原発性シュウ酸症を含む。
【００２６】
「有効量」は、未処置の患者と比較して疾患の症状を改善するのに必要とされる本発明の組成物の量を意味する。疾患の治療的処置のために本発明を実施する上で使用される細胞の有効量は、投与様式、対象の年齢、体重および全体的健康に依存して変化する。最終的には、担当医または獣医が、適切な量および投薬レジメンを決定するであろう。そのような量は、「有効」量と表される。門脈注入によって投与されるヒト肝細胞の適切な用量は、次の通りである：5〜10 ml/kg/時間の注入速度、1〜10 x 106肝細胞／乳酸リンゲル液中デキストロース5％（D5LR）に懸濁された1ml非脂肪性肝細胞の濃度で、患者体重1キログラムあたり30〜100 x 106肝細胞。注入は、30分間をかけて、軽度低体温32℃溶液温度を維持するよう氷上で行われる（Fisher R.A. et al., Cell Transplant 2004; 13(6): 677-689）。脾臓注射および脾動脈注入によって投与されるヒト肝細胞の適切な用量は、次の通りである：上記の門脈注入における注入速度、濃度および温度下で、注入あたり6 x 108肝細胞未満（Fisher R.A. et al., Hepatocyte Review, MN Berry and AM Edwards (eds) 2000: 475-501）。
【００２７】
「単離された」、「精製された」または「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態において見いだされる通常付随する成分を様々な程度で含まない物質を表す。「単離」は、当初供給源またはその周辺からの分離の程度を示す。「精製」は、単離よりも高度な分離の程度を示す。「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、任意の不純物がそのタンパク質の生物学的特性に実質的に影響しないまたはその他の有害な結果をもたらさないよう他の物質を実質的に含まない。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組み換えDNA技術によって生成された場合、細胞物質、ウイルス物質もしくは培養培地を、または化学的に合成された場合、化学的前駆体もしくは他の化合物を実質的に含まない場合に、精製されている。純度および均一度は典型的に、分析化学技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを用いて決定される。「精製された」という用語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルに本質的に1つのバンドを生じることを示すことがある。修飾、例えばリン酸化またはグリコシル化に供され得るタンパク質の場合、異なる修飾が、異なる単離されたタンパク質を生成し得、これらは個別に精製され得る。
【００２８】
「マーカー」は、肝疾患または肝細胞、組織もしくは器官の分化状態に関連して発現レベルまたは活性が変動する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。肝細胞分化の例示的なマーカーは、本明細書に開示されている。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「薬剤を取得する」における「取得」は、薬剤を合成すること、購入することまたはそれ以外の方法で入手することを含む。
【００３０】
「減少」は、少なくとも10％、25％、50％、75％または100％の負の変動を意味する。
【００３１】
「参照」は、標準または対照状態を意味する。
【００３２】
「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジまたはネコを含むがこれらに限定されない哺乳動物を意味する。
【００３３】
本明細書に提供される範囲は、その範囲内の値のすべての簡略表示であることが理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49または50からなる群より選択される任意の数値、数値の組み合わせ、または部分範囲を含むことが理解される。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「処置する（treat）」、「処置する（treating）」、「処置（treatment）」等は、障害および／またはそれに付随する症状を減少させるおよび／または改善することを表す。それを除外しないが、障害または状態の処置は、その障害、状態またはそれらに付随する症状を完全に消滅させることまで必要とするものではない。
【００３５】
個別に示されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「または、もしくは」という用語は、包括的なものと理解される。個別に示されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「a」、「an」および「the」という語は、単数または複数であると理解される。
【００３６】
個別に示されていない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当技術分野における普通交差の範囲内、例えば平均の2標準偏差内と理解される。約は、示されている値の10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％または0.01％内と理解され得る。そうでないことが文脈から明らかでない限り、本明細書に提供されるすべての数値は、約という用語によって修飾される。
【００３７】
本明細書中での任意の可変要素の定義における化学基のリストの記載は、任意の単一の基またはリスト中の基の組み合わせとしてのその可変要素の定義を含む。本明細書における可変要素または局面についての態様の記載は、任意の単一の態様または任意の他の態様もしくはそれらの一部分との組み合わせとしてのその態様を含む。
【００３８】
本明細書に提供される任意の組成物または方法は、本明細書に提供される他の組成物および方法の任意の1つまたは複数と組み合わされ得る。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】図1A〜1Cは、3D培養下でのヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）胚様体（hiPSC-EB）から肝細胞様細胞への分化を示している。図1Aは、4段階分化プロトコルおよび各段階で投与される主要な調節因子の概要を示している。この分化プロトコルは、肝臓の個体発生の段階を再現している。未分化のヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）から出発して、この細胞は、胚体内胚葉（DE）、ついで前腸内胚葉（FE）への分化を起こし、そこから肝前駆細胞（HPC）または肝芽細胞が生じる。その最終成熟工程は、肝細胞様細胞（HLC）を成熟させる。
【図１Ｂ】WIF-1およびDKK-1を用いずに分化させたものと比較して高い肝細胞特異的マーカーの発現を示す、WIF-1およびDKK-1の両方を用いて分化させたhiPSC-EBを示すグラフである。データは、平均±SD（n=3）を示している。
【図１Ｃ】WIF-1およびDKK-1の両方を用いて分化させたものと比較して高い胆管細胞特異的マーカーの発現を示す、WIF-1およびDKK-1を用いずに分化させたhiPSC-EBを示すグラフである。データは、平均±SD（n=3）を示している。
【図２Ａ】図2A〜2Fは、分化プロセスの間の、hiPSC-EBの段階特異的な遺伝子発現およびタンパク質発現を示している。図2Aは、分化プロセスの間の、hiPSC-EBの代表的な免疫蛍光画像を示している。SOX17およびFOXA2は、胚体内胚葉段階のマーカーであり；HHEXおよびGATA4は、前腸内胚葉のマーカーであり；AFPおよびHNF-4αは、肝前駆細胞のマーカーであり；アルブミンおよびCK-18は、成熟HLCのマーカーである。DAPIは、細胞の核を染色する。スケールバー100μm。
【図２Ｂ】リアルタイムPCRによる段階特異的遺伝子発現分析を示すグラフである。分化プロセスの進行を追跡するため、段階特異的遺伝子の相対量をmRNAレベルで測定した。胚体内胚葉マーカーとしてSox17を；前腸内胚葉マーカーとしてGata4を；肝前駆細胞マーカーとしてHNF-4αを；肝細胞様細胞（HLC）の最終的成熟を決定するためにアルブミンを使用した。未分化細胞を、負の対照として用いた。
【図２Ｃ】阻害剤を用いておよび用いずに最終分化させたhiPSC-EB-HLCにおけるAFP、5つのP450アイソフォーム（Cyp3A4、Cyp2C9、Cyp3A7、Cyp1B1およびCyp2B6）、アルブミンならびにCK18のmRNAの存在を示す定量RT-PCRを示すグラフである。試験したいずれの遺伝子についても、阻害剤を用いた条件における遺伝子発現は、阻害剤を用いないものと比較して高かった。
【図２Ｄ】図2Dおよび図2Eは、分化プログラムを追跡する代表的な免疫蛍光画像である。最終分化したhiPSC-EB-HLCは、アルブミンおよびHNF-1α、ならびにアルブミンおよびC-METの共染色により示されるように、成熟肝細胞特異的マーカーを発現していた。スケールバー100μm。
【図２Ｅ】図2Dの説明を参照のこと。
【図２Ｆ】阻害剤を用いる条件下での、阻害剤を用いないものと比較して高いアルブミン産生細胞の比率（80％対68％）を示すアルブミン陽性細胞についてのFACS分析である。
【図３Ａ】図3A〜3Dは、hiPSC-EB-HLCによる肝タンパク質の分泌を示す4つのグラフを示している。阻害剤を用いたおよび用いなかった条件の両方において、分化プロセスの完了から48時間後にhiPSC-EB-HLC由来の馴化培地を収集した。培地中の（図3A）アルブミン、（図3B）アルファ・フェトプロテイン（AFP）および（図3C）フィブリノゲンを検出し、（図3D）細胞内尿素を検出した。阻害剤を用いた条件間の分泌の違いは、阻害剤を用いなかった条件に対して統計学的に有意であった。未分化のhiPSCを、負の対照として使用した。結果は、少なくとも3回の独立した実験の代表である。データは、平均±SD（n=3）として表されている。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001。
【図３Ｂ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｃ】図3Aの説明を参照のこと。
【図３Ｄ】図3Aの説明を参照のこと。
【図４Ａ】図4A〜4Eは、得られたhiPSC-EB-HLCが成熟初代肝細胞に典型的な機能的活性、例えば、阻害剤を用いたおよび用いなかった条件の両方において、（図4A）アセチル化低密度リポタンパク質（DiI-ac-LDL）取り込み；（図4B）インドシアニングリーン（ICG - Cardiogreen）取り込み；（図4C）6時間後のICG放出；（図4D）PAS染色により示されるグリコーゲン貯蔵；および（図4E）オイル・レッドO染色により示される中性トリグリセリドおよび脂質の細胞質蓄積、を示したことを示す代表図を示している。未分化のhiPSCを、負の対照として使用した。スケールバー100μm。
【図４Ｂ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｃ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｄ】図4Aの説明を参照のこと。
【図４Ｅ】図4Aの説明を参照のこと。
【図５Ａ】図5A〜5Dは、阻害剤を用いたおよび用いなかった2つの実験条件を比較するCYP酵素誘導分析を示すグラフを示している。（図5A）阻害剤を用いたおよび用いなかった条件の両方についての、24時間にわたるアンモニウム代謝アッセイ；阻害剤を用いたおよび用いなかった2つの実験条件を比較するチトクロムP450（CYP450）誘導分析。72時間の期間の、異なる誘導因子：（図5B）CYP2B6に対してフェノバルビタール、（図5C）CYP3A4に対してリファンピシンおよび（図5D）CYP1A2に対してオメプラゾール、との細胞のインキュベートを通じて、様々なCYP酵素を評価した。DMSOを、異なるCYP450の基準活性を試験するための対照として使用した。データは、平均±SDを表している（n=3）。*p<0.05；**p<0.001。
【図５Ｂ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｃ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｄ】図5Aの説明を参照のこと。
【図６Ａ】図6A〜6Fは、D-ガラクトサミンにより誘導された急性肝不全のラットモデルにおけるhiPSC-EB-HLCのインビボ機能性を示している。（図6A）アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）の血清レベル。肝臓損傷前のALTの平均値は、53 U/Lであり；損傷後は、3781 U/Lと有意に高くなり；2週間で、2つの阻害剤を用いて処置されたhiPSC-EB-HLCの移植後に78 U/Lとなり、阻害剤を用いなかったhiPSC-EB-HLCについては364 U/Lであった。
【図６Ｂ】細胞移植から14日後にカプラン・マイヤー生存率を決定した。
【図６Ｃ】hiPSC-EB-HLC移植から14日後の生存動物の肝臓切片の組織学的試験は、ヒトアルブミンに関する強い陽性染色を示した；20xおよび40x。
【図６Ｄ】移植後14日におけるhiPSC-EB-HLC移植グループの肝臓におけるヒトアルブミンの陽性染色の代表的パターンを示している。このグループのすべての動物における脾臓切片は、ヒトアルブミン染色に関して陰性であった。
【図６Ｅ】移植後のラット肝臓の免疫蛍光であり、様々なヒト肝タンパク質、例えばHNF-3β、アルブミンおよびC-METの共染色を示している。
【図６Ｆ】3つのヒト肝タンパク質すべての染色を示す陽性対照として使用したヒト肝臓の免疫蛍光を示している。
【図７】図7は、胚葉体が、アガロースマイクロウェルアレイおよびテフロンスタンプを用いて、そしてrho関連キナーゼ阻害剤（ROCKi）および／または遠心分離（Rocki/スピンフリー）を必要とせずに生成されたことを示す画像を示している。1.2x106個の解離したhiPSCを含む80％コンフルエントの6ウェルプレートは、およそ280個の胚様体を生成した。スケールバー600μm。
【図８】図8は、分化後のヒトアルブミン産生細胞（染色）を示す代表的な顕微鏡図を示している。スケールバー200μm。
【図９】図9は、hiPSC-EB-HLCが、それらの形成から24時間後のおよそ500μmから分化プロセス終了時の800〜1,000μmまでサイズを増加させ、いずれの時点においても内部壊死が見られなかったことを示す代表的な顕微鏡図を示している。画像は、分化プロセス終了時の代表的なhiPSC-EB-HLCの生死染色を示している。スケールバー200μm。
【図１０】図10は、hiPSC-EB-HLCが形態学的に多角形であり、密集した細胞質顆粒（矢印）を有することを示す2つの光学顕微鏡画像を示している。分化クラスターを、形態学的試験用のコーティングされたプレートに接着させた。接着から1週間後の上図、接着から2週間後の下図。スケールバー100μm。
【図１１Ａ】図11A〜11Cは、各機能的活性についてシグナルの均一な分布を示した、マトリゲルコートプレート上での拡散後の3つのクラスター画像を示している。図11A）インドシアニングリーン；図11B）グリコーゲン貯蔵；図11C)中性トリグリセリドおよび脂質の細胞質蓄積。スケールバー200μm。
【図１１Ｂ】図11Aの説明を参照のこと。
【図１１Ｃ】図11Aの説明を参照のこと。
【図１２Ａ】図12A〜12Dは、成熟肝細胞様細胞への分化を追跡および確認するために使用した様々なマーカーの免疫蛍光を示している。SOX17およびFOXA2は、内胚葉段階のマーカーであり、HHEXおよびGATA4は前腸内胚葉用；AFPおよびHNF-4aは肝前駆細胞用；アルブミンおよびCK-18は成熟肝細胞様細胞用である。図12Aおよび12B：段階特異的マーカーの存在を示す、ヒト胚様体（hEB）およびhiPSC単独（図12A）とhEBおよびヒト内皮細胞（hEC）と組み合わされたhiPSC（図12B）の間の成熟工程の比較。
【図１２Ｂ】図12Aの説明を参照のこと。
【図１２Ｃ】hECを用いたおよび用いなかった2つの実験条件間でのアルブミンのFACS分析である。
【図１２Ｄ】遺伝子発現に対する内皮細胞の効果を示す定量RT-PCRの結果を提供する。
【図１３Ａ】図13A〜13Dは、アルブミン（図13A）、フィブリノゲン（図13B）およびアルファ・フェトプロテイン（AFP）（図13C）が内皮細胞の存在下および非存在下で培地中に分泌されたことを示す棒グラフである。図13Dは、分化後に内皮細胞の存在下および非存在下で検出された尿素の細胞内濃度を示している。
【図１３Ｂ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１３Ｃ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１３Ｄ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１４Ａ】図14A〜14Eは、異なる条件（hiPSC-EB-HLC  hECあり、左カラム；hiPSC-EB-HLC  hECなし、中央カラム；未分化hiPSC、右カラム）下でのICG取り込み（図14A）、ICG放出（図14B）、オイル・レッドO染色（図14C）、PAS染色（図14D）およびDil-Ac-LDL取り込み（図14E）を示す画像である。スケールバー100μm。
【図１４Ｂ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｃ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｄ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１４Ｅ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１５Ａ】図15A〜15Dは、アンモニウム代謝アッセイ（図15A）、または異なる実験条件を比較するCYP酵素誘導分析（図15B、図15C、図15D）の結果を示すグラフである。図15Aは、アンモニウム代謝アッセイの結果を示している。両方の条件（hiPSC-EB-HLC  hECなし、hiPSC-EB-HLC  hECあり）について、アンモニウム濃度を、24時間の期間にわたって細胞培養上清において測定した。図15B〜15Dは、72時間の期間にわたって細胞を異なる誘導因子：CYP1A2に対するオメプラゾール（図15B）、CYP3A4に対するリファンピシン（図15C）およびCYP2B6に対するフェノバルビタール（図15D）と共にインキュベートすることによって、様々なチトクロムP450酵素を評価したことを示している。DMSOを、異なるCYP450の基準活性を試験するための対照として使用した。
【図１５Ｂ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｃ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１５Ｄ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１６Ａ】図16A〜16Iは、動物モデルにおける急性肝不全におけるhiPSC-EB-HLCの治療効果を示している。図16Aは、移植を行わないモデル評価についてのカプラン・マイヤー生存曲線を示している。
【図１６Ｂ】hECありおよびなしのhiPSC-EB-HLC移植の後の動物のカプラン・マイヤー生存率プロットを示している。
【図１６Ｃ】図16C、図16D、図16Eおよび図16Fは、免疫組織化学染色を用いた、hiPSC-EB-HLCおよびhECの移植後の屠殺した動物からの代表的な肝臓および脾臓切片の画像を示している。ヘマトキシリンを用いたバックグラウンド染色。スケールバー2.5μm。
【図１６Ｄ】図16Cの説明を参照のこと。
【図１６Ｅ】図16Cの説明を参照のこと。
【図１６Ｆ】図16Cの説明を参照のこと。
【図１６Ｇ】図16G、図16Hおよび図16Iは、免疫蛍光染色を用いた代表的な肝臓および脾臓切片を示している。DAPIを用いた核染色。スケールバー100μm。
【図１６Ｈ】図16Gの説明を参照のこと。
【図１６Ｉ】図16Gの説明を参照のこと。
【図１７Ａ】図17A〜17Gは、HLCにおいて分析した凝固因子を示すグラフである。iPSCをiPSC＋ECと比較した。分析した凝固因子は、フォン・ヴィルブランド因子（vWF）および第IX因子（図17A）、プロテインCおよび第X因子（図17B）、プロテインSおよび第V因子（図17C）、第VIII因子およびアンチトロンビン（図17D）、第VII因子および第XI因子（図17E）、C反応性タンパク質および第XII因子（図17F）、ならびにプロトロンビンおよび第XIII因子（図17G）を含む。
【図１７Ｂ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｃ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｄ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｅ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｆ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１７Ｇ】図17Aの説明を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒト肝細胞様細胞（HLC）を生成するのに有用な組成物および方法、ならびに肝細胞数または機能の欠如に関連する疾患の処置のためにそのような細胞を使用する方法を特徴とする。
【００４１】
本発明は、少なくとも一部、2つの新規のWnt経路阻害剤を使用する、ヒト肝細胞様細胞（HLC）の確実な大量生産のための、hiPSCの胚様体（hiPSC-EB）から開始する新規の多細胞スフェロイドベースの肝分化プロトコルの発見に基づいている。得られるhiPSC-EB-HLCは、肝特異的遺伝子を発現し、肝タンパク質、例えばアルブミン、アルファ・フェトプロテインおよびフィブリノゲンを分泌し、アンモニアを代謝し、チトクロムP450活性および成熟初代肝細胞に典型的な機能的活性、例えばLDL貯蔵および取り込み、ICG取り込みおよび放出、ならびにグリコーゲン貯蔵を示した。急性肝不全のラットモデルにおけるhiPSC-EB-HLCの細胞移植は、非移植対照動物と比較してその平均生存時間を有意に延長し、肝臓損傷を解消した。移植されたhiPSC-EB-HLCは、試験期間（2週間）を通してヒトアルブミンを宿主の血漿中に分泌した。移植は、急性肝不全後の生存にとって重要な期間を通じて動物をつなぎ止めることに成功し、WIF-1およびDKK-1を用いた処置後のこれらの細胞の統合および完全なインビボ機能に関する見込みのある証拠を提供した。
【００４２】
他の局面において、本発明は、少なくとも一部、内皮細胞と組み合わされたhiPSCを用いてヒト胚様体（hEB）を生成することができるという発見に基づいている。有利なことに、これらの胚様体を、rho関連キナーゼ阻害剤（ROCKi）および／または遠心分離（ROCKi/スピンフリー）を必要とせずに生成した。4段階肝細胞分化プロトコルを、内皮細胞を用いておよび用いずに生成された胚様体に適用した。この胚様体を、インビトロで肝機能およびマーカーについて特徴づけ、D-ガラクトサミン誘導急性肝不全ラットモデルをインビトロ研究に使用した。
【００４３】
HLCの分化を、様々な肝細胞マーカー、例えばアルブミン、C-Met、CK-18、HNF-4αおよび様々なCYP450アイソフォームの遺伝子発現および免疫蛍光の存在によって確認した。hiPSC+EC-EB-HLCは、hiPSC-EB-HLCと比較してインビトロで増加した量のアルブミン分泌を示した。hiPSC+EC-EB-HLCは、hiPSC-EB-HLCと比較して少ないアルファ・フェトプロテインの分泌を示した。インビトロでの肝細胞機能、例えばアセチル化低密度リポタンパク質の取り込み、インドシアニングリーンの吸収および6時間後の放出、グリコーゲン貯蔵、ならびに中性トリグリセリドおよび脂質の細胞質蓄積は、hiPSC+EC-EB-HLCとhiPSC-EB-HLCの間で同等であった。異なる誘導因子を用いた様々なチトクロムP450の誘導は、hiPSC-EB-HLCと比較してhiPSC+EC-EB-HLCにおいて試験したすべてのCYP450の活性の増加を示した。分化した細胞は、内因性および外因性凝固因子のすべての遺伝子発現および分泌を示し、HLCおよびhECの両方が1つのオルガノイド単位として機能する能力を示した。hiPSC+EC-EB-HLCの移植は、hiPSC-EB-HLCグループの移植3日後と比較して、移植14日後でも持続するラット血清ヒトアルブミンを示した。特に、hEBにhiPSCと共にhECを組み込むことにより、移植後にインビボでより持続的な肝細胞機能が提供された。
【００４４】
他の局面において、本発明は、少なくとも一部、ヒト内皮細胞と組み合わされたおよび組み合わされていないHLCが、インビボで初代肝細胞および内皮細胞の両方によって通常産生される凝固因子を産生および分泌することができるという発見に基づいている。これらの凝固因子は、フォン・ヴィルブランド因子（vWF）、第IX因子、プロテインC、第X因子、プロテインS、第V因子、第VIII因子、アンチトロンビン、第VII因子、第XI因子、C反応性タンパク質、第XII因子、プロトロンビンおよび第XIII因子を含む。ヒト内皮細胞と組み合わされたおよび組み合わされていないHLCは、本明細書に開示される分化プロトコルを用いて生成される。これらのHLCは、血液凝固障害、例えば血友病を患った患者の処置を可能にする。
【００４５】
ヒト内皮細胞と組み合わされたおよび組み合わされていないHLCは、肝臓第2相解毒経路（すなわち、結合経路（conjugation pathway）とも称される肝臓第2相）において機能することができ、それによってこの肝細胞は有毒化合物または薬物に別の物質（例えば、システイン、グリシンまたは硫黄分子）を付与して弱毒化する。このプロセスはまた、液体（例えば、胆汁または尿）を通じて体内から排出できるよう、毒物または薬物を水溶性にすることができる。この発見は、クリグラー・ナジャール症候群を患った患者の治癒の可能性をもたらすであろう。
【００４６】
別の態様において、本明細書に開示されるHLCは、肝臓第1相解毒経路に関連する様々なチトクロムP450酵素活性を有する。肝臓第1相経路は、有毒化合物を有害性の低い化合物に変換する。開示されるHLCのこの特徴は、急性肝不全を患った患者の処置を可能にし、これらの同じ患者と全臓器移植を橋渡しする。したがって、開示されるHLCは、初代肝細胞で起こることとは異なり、それらの解毒能力を時間と共に失わないだけでなく、このHLCは毒物を代謝するそれらの能力を維持および改善する。
【００４７】
したがって、本発明は、本発明の方法にしたがい生成される移植用の肝細胞様細胞を含む細胞組成物、および肝機能の消失により特徴づけられる疾患の処置のためにそのような細胞を使用する方法を提供する。
【００４８】
肝疾患および機能障害
hiPSC-EB-HLCを含む本発明の細胞組成物は、肝機能の消失により特徴づけられる任意の疾患または障害の処置に有用である。そのような疾患は、肝不全、末期肝疾患、肝硬変、B型またはC型肝炎感染、肝細胞癌、クリグラー・ナジャール症候群、尿素回路欠陥、オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素I（CPS-1）欠損症、シトルリン血症（Cit）障害、アルギノコハク酸リアーゼ（ASL）欠損症、家族性高コレステロール血症、血友病、第VII因子、糖原病、フェニルケトン尿症（PKU）、乳児レフサム病、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（PFIC-2）、A1AT欠損症および原発性シュウ酸症を患った患者を含むがこれらに限定されない。
【００４９】
末期肝疾患患者は、以下の基準の任意の1つまたは複数を用いて、本発明の組成物による処置のために選択され得る：（a）肝硬変の組織学的（生検）診断または超音波検査、CT走査もしくはMRIにより得られる肝硬変の結節パターンの証拠；（b）肝性脳症の病歴または門脈高血圧の臨床的証拠、例えば食道静脈瘤および腹水；ならびに（c）15〜24の末期肝疾患モデル（MELD）スコア。これらの患者は、肝内血管が視認可能な明白な門脈を有し得る（経頸静脈肝内門脈大循環短絡術（TIPSS）を行った患者が該当する）。
【００５０】
非劇症肝不全（慢性疾患）患者は、以下の基準の任意の1つまたは複数を用いて本発明の組成物を用いた処置のために選択され得る：およそ6〜18月の余命。いくつかの態様において、選択される患者は、全臓器移植に不適合の者である。
【００５１】
American Liver Study Group Modified Tumor - Node-Metastasis (TNM) Staging Classificationにしたがい切除不能肝細胞癌ステージT3の診断をうけた患者は、任意で、細胞移植前に、腫瘍のTheraSphere（登録商標）アブレーションにより処置され得る。"A Humanitarian Device Exemption Use Protocol of TheraShere（登録商標） For Treatment of Unresectable Hepatocellular Carcinoma", VCUMC, IRB # HM 10046を参照のこと。
【００５２】
劇症肝不全（急性／劇症疾患）患者は、本発明の方法を用いて処置され得る。
【００５３】
任意で、移植前に、第-2日の午前から開始し第-1日まで続ける12時間間隔で投与される2回の分割用量（すなわち、0.25 mg/kg）で摂取すべき0.5 mg/kg/日の用量のタクロリムスが、患者に処方される。第-1日における2回目の投薬分のタクロリムスは、（翌朝の病院での12時間トラフ血中レベル（8〜12 ng/mL）の決定を容易にするために）可能な限り午後6時近くで投与されるべきである。（注意：タクロリムスの使用がその患者に適さない場合、代わりに6 mg/kg/日の初期用量のシクロスポリンが、12時間間隔で投与される2回の分割用量で処方され得る。その後のトラフシクロスポリン血中レベルのモニタリングおよび200〜300 ng/mLのトラフ血中レベルを維持するための用量調節が、タクロリムスに関して実施されることが推奨される。）
【００５４】
移植用肝細胞様細胞
移植用細胞は、「肝細胞様細胞」と呼ばれているが、真の肝細胞の特徴を示す。多数の研究がヒト胚性幹細胞（hESC）またはhiPSCの肝分化を調査し、分化戦略に関する考察を提供した。これらの研究は、概ね、分化の収量および培養物の均一性が、出発hiPSCの形態、分化基質、誘導スキームおよびプロトコルの拡張性を含む、培養下の様々な可変要素の影響を受けるという結論に達した。hESCまたはhiPSCの肝分化は、通常、3つの方法、すなわち、その後に別個の基材上にプレーティングされる胚葉体（EB）、マウス胚性線維芽細胞フィーダー層上での分化、または接着・フィーダーフリー培養による分化、の1つによって開始する（(Rambhatla, L. et al., Cell Transplant 12, 1-11 (2003); Schwartz, R. E. et al. Stem Cells Dev 14, 643-655 (2005); Hay, D. C. et al. Cloning Stem Cells 9, 51-62 (2007)）。EBは、3つの胚葉（内胚葉、外胚葉および中胚葉）のすべての細胞に分化することができる3次元（3-D）hiPSC細胞凝集体である。
【００５５】
EB内でのインビトロ系統特異的分化プロセスにおける現象は、インビボで発生胚において見られるものを再現し、それがインビトロ培養条件下でhPSCのインビボ分化をシミュレートするモデルとしてのEBの使用を正当化している（Bratt-Leal, A. M. et al., Biotechnol Prog 25, 43-51 (2009)）。EBから出発する分化プロトコルは、クラスター内で許容される細胞密度の高さおよび懸濁培養下で維持される能力のために、拡張性が高い。hiPSCまたはhESCから胚葉体を再現可能に生成する以前に記載された技術は、異種因子であるrho関連キナーゼ阻害剤（ROCKi）および／または遠心分離を使用するものであった（Subramanian, K. et al., Stem Cells Dev 23, 124-131 (2014)）。本明細書に報告されるように、本発明は、非接着性丸底親水性マイクロウェルアレイを用いる、かつROCKi異種因子および／または遠心分離の両方を用いない、単離されたhPSCからの均一かつ同期されたhEBの確実で拡張可能な生成を提供する。この新しい技術は、我々が、所望の細胞系統への直接分化のためのhiPSC由来の同期されたhEBを大量に生成できるようにする。
【００５６】
胚の肝発生は、胚体内胚葉（DE）の形成、肝芽細胞の拡張および増殖、ならびに肝芽細胞から成熟、機能性肝細胞への分化により特徴づけられる3つの相を経るものである。肝芽細胞は、肝臓の主要な系統である肝細胞および胆管上皮細胞（胆管細胞）の両方を生成することができる両能性幹細胞である（Duncan, S. A. Dev Dyn 219, 131-142 (2000)）。Wntおよびβ-カテニンは、生後の肝発生の制御において個別的および協調的効果を示す（Han, S. et al., Stem Cells 29, 217-228 (2011)）。β-カテニンの核移動の増加は、細胞増殖の増加に関連し（Apte, U. et al. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 292, G1578-G1585 (2007)）、Wnt経路は、極性および細胞運命決定の主要な調節因子であると考えられている（Cadigan, K. M. et al., Genes Dev 11, 3286-3305 (1997)）。肝臓胚発生に対するWntおよびβ-カテニンの影響は、高度に時間的に調節されたプロフィールにしたがう（Hoeflich, K. P. et al. Nature 406, 86-90 (2000); Monga, S. P. et al. Gastroenterology 124, 202-216 (2003)）。Wnt/β-カテニン経路は、組み合わさったとき、肝細胞への肝胆道分化において重要な役割を果たし（Nejak-Bowen, K. et al., Organogenesis 4, 92-99 (2008); McLin, V. A. et al., Development 134, 2207-2217 (2007)）、β-カテニンの安定化は、単独で、肝細胞よりも胆管細胞への傾向を高める（Decaens, T. et al. Hepatology 47, 247-258 (2008)）。Wnt/β-カテニン阻害を通じて、肝胆道分化段階において肝細胞への進行を促進することが可能である。
【００５７】
肝発生の第II相の間に、肝芽細胞または肝前駆体は、それらの未分化状態を維持しつつ拡張する。肝臓運命への拘束は、第III相の間に存在する多数の肝臓に豊富な転写因子によって調節される（Darlington, G. J. et al., Curr Opin Genet Dev 5, 565-570 (1995); Odom, D. T. et al., Science 303, 1378-1381 (2004)）。現在の従来的な分化プロトコルは、Wnt/β-カテニン阻害の重要な役割を考慮せずに、肝前駆細胞の誘導を通じて成熟肝臓表現型へと向かう初期の内胚葉形成からの段階的プロセスを経るものである。異なる分化段階で投与される可溶性因子は、内胚葉形成のためのアクチビンA、いくつかの例ではBMP4の添加を伴う、肝前駆体特化のためのFGFファミリー因子、ならびに最後の、成熟工程のためのオンコスタチンMおよびHGF（Si-Tayeb, K. et al., Hepatology 51, 297-305 (2010); Chen, Y. F. et al., Hepatology 55, 1193-1203 (2012); Song, Z. et al., Cell Res 19, 1233-1242 (2009); Sullivan, G. J. et al., Hepatology 51, 329-335 (2010); Takata, A. et al. Hepatol Int 5, 890-898 (2011); Touboul, T. et al., Hepatology 51, 1754-1765 (2010)）を含む。現在のプロトコルにおける大きな制約は、低い拡張性、分化後の微量の未成熟遺伝子型、および移植後の乏しい長期的細胞機能を含む（Wu, X. B. et al., Hepatobiliary Pancreat Dis Int 11, 360-371 (2012)）。
【００５８】
hEBから出発し、インビボでの肝発生の間の分化段階を模倣するようWnt/β-カテニン経路の2つの阻害剤を用いる三次元多細胞球形培養ベースの肝分化プロトコルを提供する組成物および方法が、本明細書に開示される。このインビトロ肝分化プロトコルの拡張性は、移植療法のためのヒト肝細胞の大量生産を可能にする。hiPSC由来HLCの機能を、急性肝不全の動物モデルにおいて特徴づけた。
【００５９】
移植用の細胞の選択
患者を移植の候補者として選択した後、移植に使用する細胞を選択しなければならない。肝細胞移植に適合する細胞の選択に関して、様々な基準が本明細書に開示されている。そのような基準は、レシピエントに特化した移植適合細胞の利用可能性を含む。1つの態様において、適合細胞は、レシピエントが抗体を有するHLAクラスI抗原を有さないABO適合ドナー由来のそれらである。血液O型ドナー（「ユニバーサルドナー」）由来の細胞は、血液A、B、ABおよびO型の患者に提供され得る。EBV陽性またはCMV陽性ドナー由来の肝細胞は、そのレシピエントが標準的な移植センターの全臓器CMV/EBV予防を受けることができる場合、EBV陰性またはCMV陰性レシピエントに投与され得る。以下の表1および2を参照のこと。
【００６０】
（表１）CMV感染予防
2020533025.tif 000003
【００６１】
（表２）EBV感染予防
2020533025.tif 000004
【００６２】
投薬スキームおよび原理に関して、移植に使用される肝細胞数は、各患者と血液型が適合する利用可能な肝細胞の総数により決定される。最適には、各患者につき一人のドナー由来の肝細胞を使用することが推奨される。
【００６３】
肝細胞様細胞の特徴づけ
本発明は、インビトロで多数の肝細胞様細胞を成長させる方法を提供する。本発明の方法にしたがい生成される細胞は、それらを成熟肝細胞様細胞と同定するマーカーの発現に関して特徴づけられるまたはモニタリングされる。1つの態様において、本発明の細胞は、内胚葉段階のマーカーであるSOX17およびFOXA2；前腸内胚葉のマーカーであるHHEXおよびGATA4；肝前駆細胞のマーカーであるAFPおよびHNF-4a；ならびに成熟肝細胞様細胞のマーカーであるアルブミンおよびCK-18の発現に関して（例えば、免疫組織化学を用いて）特徴づけられる。
【００６４】
他の態様において、本発明の細胞は、培地へのアルブミン、フィブリノゲンおよびアルファ・フェトプロテイン（AFP）の分泌に関して特徴づけられる。他の態様において、本発明の細胞は、分化後に検出される尿の細胞内濃度に関して特徴づけられる。他の態様において、本発明の細胞は、インドシアニングリーン取り込みおよび／または放出；例えば、オイル・レッドO染色によって測定される、中性トリグリセリドおよび脂質（例えば、LDL）の細胞質蓄積；例えば、PAS染色によって測定されるグリコーゲン貯蔵、アセチル化低密度リポタンパク質（DiI-ac-LDL）取り込み；例えば、細胞を異なる誘導因子：CYP1A2に対してはオメプラゾール、CYP3A4に対してはリファンピシンおよびCYP2B6に対してはフェノバルビタール、と共にインキュベートすることによって測定される、チトクロムP450酵素活性；ならびに代謝されたアンモニアに関して特徴づけられる。他の態様において、本発明の細胞は、分化後に肝臓第II相機能を示した。肝臓第II相は、尿中でのそれらの最終的排出のための代謝産物の結合を表す。いくつかの態様において、分化クラスターは、クリグラー・ナジャール症候群、肝硬変、B型またはC型肝炎感染、肝細胞癌、クリグラー・ナジャール症候群、尿素回路欠陥、オルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）欠損症、カルバモイルリン酸合成酵素I（CPS-1）欠損症、シトルリン血症（Cit）障害、アルギノコハク酸リアーゼ（ASL）欠損症、家族性高コレステロール血症、血友病、第VII因子、糖原病、フェニルケトン尿症（PKU）、乳児レフサム病、進行性家族性肝内胆汁うっ滞症（PFIC-2）、A1AT欠損症および原発性シュウ酸症のための治療剤としての使用に適している。
【００６５】
肝細胞様細胞の送達
1つの態様において、本発明の肝細胞様細胞は、門脈注入により送達される。送達される細胞の用量は、患者の個々のニーズに基づき医師によって決定されるであろう。1つの態様において、患者体重1キログラムあたり10〜200（例えば、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200） x 106個の肝細胞が、5〜10 ml/kg/時間の注入速度および1〜10 x 106肝細胞/1 mlの濃度で送達される。1つの態様において、肝細胞様細胞は、乳酸リンゲル溶液中デキストロース5％（D5LR）に懸濁される。1つの態様において、注入は、30分の期間にわたって行われ、細胞混合物は、軽度低体温32℃溶液温度を維持するために、溶けかけの氷上で維持されるべきである。
【００６６】
1つの態様において、本発明の肝細胞様細胞は、脾動脈注入によって送達される。1つの態様において、1回の注入あたり、6 x 108個以下の肝細胞が送達される。5〜10 ml/kg/時間の注入速度および1〜10 x 106肝細胞/1 mlの濃度、D5LR中に懸濁された肝細胞である、門脈注入の場合と同じ速度、濃度および温度方針を使用する。1つの態様において、注入は、30分の期間にわたって行われ、細胞混合物は、軽度低体温32℃溶液温度を維持するために、溶けかけの氷上で維持されるべきである。
【００６７】
肝細胞投与の様々な経路が、本明細書に開示されている。肝細胞は、門脈内または脾臓内経路を通じて移植され得る。注入部位は、患者の安全、首尾良い肝細胞の生着、機能および生存性に対して最大の効果を提供するよう選択されるべきである。投与経路に関して考慮される具体的要因は：（a）肝疾患の病因；（b）門脈、脾静脈および脾動脈の開存性；（c）門脈高血圧の証拠；（d）肝臓構造の相対的正常性；（e）肝硬変のステージ；（f）肝臓のサイズ；（g）脾臓のサイズ；（h）患者の年齢およびサイズ；（i）過去の腹腔内手術；ならびに（j）患者の機能状態、を含む。
【００６８】
細胞の移植および医療用調製に関する様々なガイドラインが本明細書に開示されている：（a）患者は、第-1日の午後にまたは第1日の深夜直後に入院すべきである；（b）患者は、午後のタクロリムス投与を受けるべきである。移植前に、医師は、以下の医薬の任意の1つまたは複数を投与してもよい：フルコナゾール、400 mg、ファモチジン、20 mg、メチルプレドニゾロン、250 gm。劇症肝不全患者は、必要に応じてビタミンK、ラニチジン、広域抗生物質N-アセチル-システインを投与されてもよい。
【００６９】
肝細胞の移植および画像下治療に関する様々な基準が本明細書に開示されている。移植は、画像下治療状況で実施され得る。1つの態様において、患者は、カテーテル挿入の1時間前に、適切な用量の抗生物質ピペラシリン／タゾバクタム（Zosyn）を投与され、第2の用量が6時間以内に投与され得る。患者がアレルギーの病歴を有する場合、適切な代替処置がなされ得る。患者は、カテーテルプロセスを通じて血圧、心拍数、呼吸数、酸素飽和度に関して継続的にモニタリングされるべきである。意識下鎮静を誘導するために、以下の医薬が投与され得る：（i）25 mg/分の速度でIV投与される50 mgジフェンヒドラミン；（ii）3〜5分間かけてIV注入される50μgフェンタニル；（iii）所望のレベルの鎮静が達成されるまで2分間ごとの1.0〜1.5 mgミダゾラム。
【００７０】
滅菌条件の下で、肝細胞は、経皮シースから大腿動脈へと挿入した4もしくは6フレンチの血管造影用カテーテルまたは蛍光透視観察下で経肝経路を通じて脾動脈または門脈に注入される。血管の開存性は、造影色素（Visipaque（登録商標））注射または同等物を用いて2回確認され得る。注入手順を通じて、気道内圧、頭蓋内圧（指定されている場合）、心モニタリング、血圧、心拍数、呼吸および酸素飽和度のモニタリングは、従来どおり、文書によると少なくとも15分ごとに、行われるべきである。
【００７１】
カテーテルは、肝細胞の注入（および洗い流し）の完了ならびに血管開存性の最終注入後評価の後に除去され得る。カテーテルを引き抜く直前に、出血の可能性を減らすために、Gelformプラグおよび／またはコラーゲン／トロンビンペーストを使用して末端カテーテル路全体が閉塞され得る。患者は、この手順の後、放射線学的状況下で最低2時間モニタリングされるべきである。画像下治療部門から一般臨床研究センターまたは適切な施設（ICU）への転院は、患者が意識清明であり、見当識が保たれており、安定な生命兆候および呼吸機能を維持していると評価された後に行われ得る。
【００７２】
生命兆候、覚醒レベルおよびカテーテル挿入部位の定期的評価が、この手順の後に行われるべきである。知見に関する書類は、手順後1時間の間15分ごとに、2時間の間30分ごとに、4時間の間1時間ごとに、およびその後、退院まで2時間ごとに記録されるべきである。手順前に与えられた初期投与から6時間後に、抗生物質投与を繰り返すことが推奨される。医師は、移植後に以下の医薬の任意の1つまたは複数を投与してもよい：タクロリムスおよびプレドニゾン。
【００７３】
併用療法
任意で、本発明の細胞組成物は、肝疾患の処置で従来的に使用されている任意の治療と組み合わせて投与され得る。特定の態様において、タクロリムス、シクロスポリン、ガンシクロビルおよび／またはアシクロビルが、本発明の細胞組成物の投与前、投与と同時、または投与後に投与される。別の態様において、B型肝炎ウイルス患者は、ラミブジン、トルバダもしくは最良の抗ウイルス／個人向けptならびに／またはB型肝炎免疫グロブリンで処置される。
【００７４】
細胞組成物
本発明の組成物は、肝細胞様細胞、またはそれらの前駆体、および任意で内皮細胞、ならびに薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物を含む。いくつかの態様において、内皮細胞は、HLCを取得する分化プロセスの前にhiPSCと組み合わされる。投与は、自己または異種であり得る。例えば、1名の対象から取得し、同一対象または異なる適合する対象に投与することができる。
【００７５】
肝細胞様細胞は、カテーテル投与を含む局所注射を通じて投与され得る。特定の態様において、細胞組成物は、門脈、脾静脈または脾動脈を通じて投与される。本発明の治療組成物（例えば、薬学的組成物）を投与する場合、通常、単位剤形の注射可能な形態に配合されるであろう。
【００７６】
本発明の細胞組成物は、適宜、選択されたpHで緩衝化され得る滅菌液体調製物、例えば、等張性水溶液、懸濁液、乳濁液、分散液または粘性組成物として供され得る。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物および固形組成物よりも調製が容易である。さらに、液体組成物はある程度、特に注射により投与するのにより好都合である。粘性組成物は、他方、特定組織とのより長い接触期間を提供するよう適切な粘性範囲内で配合され得る。液体または粘性組成物は、例えば、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であり得る担体を含み得る。
【００７７】
滅菌注射溶液は、所望の場合、様々な量の他の成分を含む必要量の適切な溶媒中に、本発明を実施するのに利用される細胞を添加することによって調製され得る。そのような組成物は、適切な担体、希釈剤または賦形剤、例えば滅菌水、生理学的食塩水、グルコース、デキストロース等と混合され得る。組成物はまた、凍結乾燥され得る。組成物は、投与経路および望まれる調製物によって、補助物質、例えば湿潤剤、分散剤または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、pH緩衝剤、ゲル化または増粘添加物、保存剤、芳香剤、着色剤等を含み得る。標準的な参考文献、例えば、参照により本明細書に組み入れられる"REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17th edition, 1985が、過度の実験を行うことなく適切な調製物を調製するために参照され得る。
【００７８】
抗菌保存剤、抗酸化物質、キレート剤および緩衝剤を含む、組成物の安定性および滅菌性を強化する様々な添加物が添加され得る。微生物の活動の抑制は、様々な抗菌および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等によって達成され得る。注射可能な医薬形態の長期間吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらされ得る。しかし、本発明にしたがい、使用されるあらゆるビヒクル、希釈剤または添加物は、細胞と適合するものである必要があろう。
【００７９】
組成物は、等張性であり得る、すなわち、血液および涙液と同じ浸透圧を有し得る。本発明の組成物の望まれる等張性は、塩化ナトリウムまたは他の薬学的に許容される薬剤、例えばデキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコールまたは他の無機もしくは有機溶質を用いて達成され得る。ナトリウムイオンを含む緩衝液には、塩化ナトリウムが特に好ましい。
【００８０】
組成物の粘性は、所望の場合、薬学的に許容される増粘剤を用いて選択されたレベルで維持され得る。即時にかつ経済的に入手可能であり、利用が容易であるという理由から、メチルセルロースが好ましい。他の適切な増粘剤は、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマー等を含む。増粘剤の好ましい濃度は、選択される薬剤に依存するであろう。重要な点は、選択された粘性を達成するであろう量を使用することである。明らかに、適切な担体および他の添加物の選択は、正確な投与経路および個々の剤形、例えば液体剤形の性質（例えば、その組成物が溶液に配合されるのか、懸濁液に配合されるのか、ゲルに配合されるのか、または別の液体形態、例えば時間放出形態もしくは液体充填形態に配合されるのか）に依存するであろう。
【００８１】
本発明の肝細胞様細胞の治療利用に関する1つの考慮すべき点は、最適な効果を達成するために必要となる細胞の量である。投与される細胞の量は、処置される対象によって異なるであろう。好ましい態様にいて、104〜108、より好ましくは105〜107、さらにより好ましくは3 x 107個の本発明の肝細胞様細胞が、ヒト対象に投与され得る。
【００８２】
本発明の肝細胞様細胞は、成熟肝細胞と一致するマーカーを発現し、機能的活性を有する精製された細胞集団を含み得る。当業者は、様々な周知の方法、例えば、蛍光活性化細胞選別（FACS）を用いて集団内の肝細胞様細胞の比率を容易に決定することができる。肝細胞様細胞を含む集団の好ましい純度範囲は、約70〜約75％、約75〜約80％、約80〜約85％、さらにより好ましくは、純度は約85〜約90％、約90〜約95％および約95〜約100％である。肝細胞様細胞の純度は、集団内におけるマーカープロフィールにしたがい決定され得る。用量は、当業者により容易に調節され得る（例えば、純度の低下は、用量の増加を必要とし得る）。
【００８３】
当業者は、本発明の方法において投与される組成物における細胞および任意の添加物、ビヒクルおよび／または担体の量を容易に決定することができる。典型的に、（活性な肝細胞様細胞および／または薬剤に加えて）任意の添加物が、リン酸緩衝生理食塩水中0.001〜50％（重量）溶液の量で存在し、活性成分は、マイクログラム〜ミリグラムのオーダーで、例えば約0.0001〜約5 wt％、好ましくは約0.0001〜約1 wt％、さらにより好ましくは約0.0001〜約0.05 wt％または約0.001〜約20 wt％、好ましくは約0.01〜約10 wt％、およびさらにより好ましくは約0.05〜約5 wt％で存在する。当然ながら、動物またはヒトに投与されるあらゆる組成物に関して、およびあらゆる具体的投与方法に関して、例えば適切な動物モデル、例えばげっ歯類、例えばマウスにおいて致死用量（LD）およびLD50を決定することにより、毒性を、ならびに組成物の用量、その中の成分の濃度および適切な応答を誘発する組成物の投与のタイミングを決定することが好ましい。そのような決定は、当業者の知識、本開示および本明細書で引用されている文献からみて過度の実験を必要とするものではない。そして、連続投与の時間も、過度の実験なしに確認され得る。
【００８４】
キット
本発明の肝細胞様細胞は、キットとして、さらなる試薬と共に供給され得る。キットは、処置レジメンまたはアッセイ、試薬、器具（試験管、反応容器、針、注射器等）に関する指示書およびその処置またアッセイを較正または実施するための標準を含み得る。本発明にしたがうキットで提供される指示書は、ラベルまたは別個の同封物の形態で、適切な操作パラメータに関するものであり得る。任意で、キットはさらに、一貫性のある結果が達成されるかどうかを決定するために試験サンプルと比較され得る標準または対照情報を含み得る。
【００８５】
本発明の実施においては、それ以外のことが示されていない限り、分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来技術を用い、これらは十分に当業者の技能の範囲内である。そのような技術は、文献で十分に説明されている、例えば、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook, 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (Gait, 1984); "Animal Cell Culture" (Freshney, 1987); "Methods in Enzymology" "Handbook of Experimental Immunology" (Weir, 1996); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (Miller and Calos, 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (Ausubel, 1987); "PCR:  The Polymerase Chain Reaction", (Mullis, 1994); "Current Protocols in Immunology" (Coligan, 1991)。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの生産に適用可能であり、したがって、本発明を製造および実施する際に考慮され得る。特定の態様において特に有用な技術は、以下の節で議論されるであろう。
【００８６】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療方法を構築および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために示されるものであり、本発明者らが本発明とみなすものの範囲を限定することは意図されていない。
【実施例】
【００８７】
実施例1：3D培養下でのhiPSC胚葉体（hiPSC-EB）から肝細胞様細胞（HLC）への分化
胚様体を、アガロースマイクロウェルアレイおよびテフロンスタンプを用いて、高い生存率で、確実かつ効率的に生成した。1.2 x 106個の解離させたhiPSCを含む80％コンフルエントの6ウェルプレートは、およそ280個の胚様体を生成した（図7）。hiPSC-EBは、継続的な3D培養の下で、4段階肝分化プロセスを起こした。この分化プロトコルは、インビボで胚発生中に起こる発生段階を再現するものである（図1A）。多能性幹細胞（PS）から始まり、4つの段階は、胚体内胚葉（DE）、前腸内胚葉（FE）、肝前駆細胞または肝芽細胞（HPC）および成熟肝細胞（MH）であった。分化プロトコルの各段階は4日間継続し、その間に1日おきの培地交換を2回行った。このプロトコルは、2つの新規のWnt阻害因子を使用した。HPC段階におけるWnt阻害因子1（WIF-1）およびDickkopf-1（DKK-1）。WIF-1およびDKK-1の有効濃度は、示唆されている製造元の範囲ならびにマウスおよびヒト細胞株における研究の文献レビューにしたがった。それらの研究においてWNT阻害に関して最大の効果を示した濃度を使用した。
【００８８】
肝分化に対する2つのWnt阻害剤の効果を評価するためおよび我々の研究の再現性を確認するため、すべての実験を、未分化hiPSC-EBおよび成体ヒト肝細胞（陰性および陽性対照）と共に、処置および未処置対照（阻害剤ありおよびなし）の両方において同じバッチのhiPSC-EBから開始し、平行して行った。
【００８９】
分化プロセス終了時に、半定量PCRを使用して胆管細胞および肝細胞特異的遺伝子発現のマーカーを分析した。分化プロトコルにおける2つのWnt阻害剤の存在は、2つの異なる系統に分化するhiPSC-EBの傾向を増加させた。WIF-1およびDKK-1の両方を用いて分化させたhiPSC-EBは、この2つのWnt阻害剤を用いずに分化させたものよりもずっと高い肝細胞特異的マーカーの発現を示した（図1B）。WIF-1およびDKK-1を用いずに分化させたhiPSC-EBは、胆管細胞特異的マーカーのより高い発現を示した（図1C）。遺伝子発現におけるWIF-1およびDKK-1を用いたおよび用いなかった条件の間の相違はすべて、統計学的に有意であった（p＜0.0001）。
【００９０】
この実施例のプロトコルを用いたhiPSC-EBの段階的分化を確認するため、個々の段階の終了後に段階特異的タンパク質分析を行った。分化するhiPSC-EBは、各々の個々の段階の終了後に、胚体内胚葉段階終了後のFOXA2およびSOX17、前腸内胚葉段階終了後のHHEXおよびGATA-4、肝性内胚葉段階終了後のHNF-4αおよびAFP、ならびに成熟肝細胞段階終了後のアルブミンおよびCK-18を含む、段階特異的細胞内肝タンパク質発現の時間的に調節されたパターンを示した（図2A）。
【００９１】
分化するhiPSC-EBの遺伝子発現プロフィールを決定するために、分化プロトコルの間の様々な時点で定量RT-PCR（qRT-PCR）を使用して、段階特異的遺伝子の相対量をmRNAレベルで測定した（図2B）。未分化hiPSCを陰性対照として使用した。未分化hiPSCのmRNAは、4つすべての分化段階のマーカーに関して陰性であった。全体として、分化するhiPSC-EBによる段階特異的遺伝子の発現は、各段階でピークとなり、その段階の後に徐々に低下した。唯一の例外は、段階II（前腸内胚葉）のマーカーであるGATA-4であり、これは段階Iで早くも誘導され、段階IVでピークに達した。段階IVにおいて、アルブミンmRNA発現が確認された。WIF-1およびDKK-1を用いたおよび用いなかった条件の両方に関する定量RT-PCRは、最終分化したhiPSC-EB-HLCにおいて5つのP450アイソフォーム（Cyp1B1、Cyp2C9、Cyp3A4、Cyp2B6およびCyp3A7）、アルファ・フェトプロテイン、アルブミンおよびCK18のmRNAの存在を示した（図2C）。特に、WIF-1およびDKK-1を含むプロトコルで処置されたhiPSC-EBは、これらの2つの阻害剤を用いないプロトコルで処置されたhiPSC-EBと比較して、すべてのマーカーに関して高い発現パターンを示した。未分化hiPSCを陰性対照として使用し、ヒト初代肝細胞を陽性対照として使用した。分化プログラムの後、最終分化したhiPSC-EB-HLCは、アルブミンおよびHNF-1α、ならびにアルブミンおよびC-METの免疫組織化学共染色により示されるように、成熟肝細胞特異的タンパク質のレパートリーを発現した（図2D、図2E）。WIF-1およびDKK-1を用いたおよび用いなかった2つのプロトコル間の肝分化収量の比較を、参照マーカーとしてアルブミン陽性細胞を用いるFACS分析により評価した。その結果は、2つの阻害剤を用いたプロトコルで処置されたhiPSC-EBにおいて、阻害剤を用いなかったものと比較して増加したアルブミン陽性細胞の収量を示した（それぞれ、80％対68％）（図2F）。両方の阻害剤を用いたプロトコルに関するこの結果の確認は、共焦点顕微鏡下で、各光学的断面においてアルブミン陽性細胞の画分を計数し、これを各クラスターにつき最小10の顕微鏡野、分化条件あたり最小50の異なるクラスターで平均化することによって得た。Wnt阻害剤WIF-1およびDKK-1の両方を用いたこの実施例の分化プロトコルは、他の分化プロトコルを用いた場合に通常見られる70％の肝分化収量を比較して、一貫して80％を超える高純度の肝細胞集団を生成した。図8は、肝分化収量を決定するための細胞計数に使用した代表的画像を示している。
【００９２】
実施例2：hiPSC-EB-HLCは形態学的なおよびインビトロで機能的な肝細胞の特性を示した
3D培養下で分化を起こしたhiPSC-EBの形態学的評価は、分化終了時までクラスターサイズがおよそ500μmから800〜1,000μmに漸増し、いかなる時点でも内部壊死が見られなかったことを明らかにした（図9）。分化プロトコルの終了時の細胞形態をさらに評価するため、3D培養下のhiPSC-EB-HLCを、マトリゲルコーティングされたプレートに置き、接着させた。1週間の期間にわたって、hiPSC-EB-HLCはプレートの表面に接着し、単層で拡散し始めた。光学顕微鏡は、形態学的に多角形であり、細胞顆粒が豊富であることを示し（図10）、hiPSC-EB-HLCが、多角形の小胞を有する初代ヒト肝細胞の形態学的特徴を再現した。この結果は、研究した両方の条件で観察された。
【００９３】
馴化培養培地の試験は、WIF-1およびDKK-1を用いたおよび用いなかった我々のプロトコルを用いた分化プロトコルの完了から48時間後のhiPSC-EB-HLCによる肝タンパク質の分泌を示した。hiPSC-EB-HLCは、阻害剤を用いた条件と用いなかった条件の間で試験されたすべてのタンパク質について異なる分泌パターンを示し、阻害剤を用いた場合に分泌が増加した。特に、阻害剤を用いた条件は、アルブミン分泌の増加を示した（5 x 105個の細胞につき、それぞれ、120〜130 ng/ml対76〜80 ng/ml；p = 0.0046）。これは、初代ヒト肝細胞によるアルブミン産生の、それぞれ、およそ60％および40％に相当するものであった（128 ng/ml対199 ng/ml、p＜0.0009；80 ng/ml対199 ng/ml、p＜0.0001）。2つの阻害剤を用いた条件は、阻害剤を用いなかった条件と比較して、アルファ・フェトプロテイン（AFP）（0.18 ng/ml対0.15 ng/ml、p＝0.0007）およびフィブリノゲン（0.062 ng/ml対0.055 ng/ml、p＝0.0175）の両方の統計学的に有意に高い分泌を示した。WIF-1およびDKK-1を用いた条件下でのAFPおよびフィブリノゲンは両方とも、初代ヒト肝細胞のそれらと同等のレベルの総タンパク質濃度を示した（AFP:0.18 ng/ml対0.19 ng/ml、p＝0.69；フィブリノゲン：0.062対0.064、p＝0.0015）（図3A、図3B、図3C）。加えて、阻害剤を用いた条件下のhiPSC-EB-HLCは、阻害剤を用いなかった条件下のhiPSC-EB-HLCのそれと比較して統計学的に有意に高い細胞内尿濃度を示した（0.0388 nmol対0.024 nmol、p＜0.0001）（図3D）。未分化のhiPSCを陰性対照として使用し、これはすべての時点でタンパク質の産生を示さなかった（p＜0.01）（図3）。
【００９４】
hiPSC-EB-HLCの機能的活性を評価するため、3D培養下で分化したhiPSC-EB-HLCをマトリゲルでコーティングされたプレートに置き、接着させ、単層で拡散させた（図11A、11B、11C）。WIF-1およびDKK-1を用いたおよび用いなかった両方の条件のhiPSC-EB-HLCは、成熟初代肝細胞に典型的な同様の機能的活性、例えば、アセチル化低密度リポタンパク質（DiI-ac-LDL）取り込み（図4A）、インドシアニングリーン（ICG - Cardiogreen）吸収および6時間後の放出（図4B、図4C）、グリコーゲン貯蔵（図4D）ならびに中性トリグリセリドおよび脂質の細胞質蓄積（図4E）を示した。未分化のhiPSCを陰性対照として使用し（図4の右パネル）、これは上記の活性のいずれも示さなかった。
【００９５】
尿回路を通じたアンモニア代謝は、肝細胞の必須機能である。アンモニア代謝を、既知濃度の塩化アンモニウムの添加後24時間にわたる両実験条件の細胞培養上清におけるアンモニウム濃度の変化によって、評価した。WIF-1およびDKK-1を用いたおよび用いなかったプロトコルを用いて分化させたhiPSCから得られた懸濁物中に100個の分化したhEBを含む培養皿に、1 mMの塩化アンモニウム標準を添加した。塩化アンモニウム添加後1、6および24時間間隔で、上清を収集し、アンモニウム濃度を測定した。両条件ともに、24時間の期間にわたって上清においてアンモニウム濃度の着実な低下が見られた（図5A）。特に、2つの阻害剤で処置したサンプルとそれらなしのものの間で統計学的に有意なアンモニウム濃度の減少は見られなかった。しかし、24時間での塩化アンモニウムのレベルは、2つの阻害剤を用いたhiPSC-EB-HLCにより代謝された添加アンモニウムの比率が、阻害剤を用いずに処置された細胞と比較して高いことを示した（それぞれ、70.15±5.12％対60.32±3.25％）。
【００９６】
次に、解毒を行う主要な肝酵素であるチトクロムP450（CYP450）酵素の活性を特徴づけることによって、hiPSC-EB-HLCの解毒能力をインビトロで試験した。3つのCYPアイソフォームを、それら各々の誘導因子に対する72時間暴露に応じたCYPアイソフォームの遺伝子発現の増加を測定することによって、試験した。3つの誘導因子およびCYPアイソフォームは、オメプラゾール（CYP1A2）、フェノバルビタール（CYP2B6）およびリファンピシン（CYP3A4）であった。DMSOを、異なるCYP450の基準活性を試験するための細胞共培養物における対照として使用した。この実験の結果は、DMSO対照と比較して細胞培養物中のすべての試験したCYP450アイソフォームの活性の有意な増加を示した（図5B、図5C、図5D）。WIF-1およびDKK-1を含むプロトコルを用いて処置したhiPSC-EB-HLCは、フェノバルビタール（28.16±2.58％対14.23±3.48％、p＝0.001）、リファンピシン（78.51±6.82％対67.31±5.73％、p＝0.062）およびオメプラゾール（54.26±4.21％対22.12±2.34％、p＝0.0002）に応じて、阻害剤を用いなかったものと比較して増加したCPY発現を示した。誘導後、2つの阻害剤で処置したhiPSC-EB-HLCは、CYP3A4に関しては初代肝細胞と同等のCYP活性を示したが（78対82、p＝0.417）、CYP2B6およびCYP1A2に関しては、初代肝細胞と比較して統計学的に有意に低いCYP活性を示した（それぞれ、28対98、p＜0.0001および54対98、p＝0.0007）。比較すると、2つの誘導因子を用いずに処置したhiPSC-EB-HLCは、初代肝細胞と比較した場合、すべてのアイソフォームに関して統計学的に有意に低いCYP活性を示した（CYP3A4：67対82、p＝0.0232；CYP2B6：14対98、p＜0.0001；CYP1A2：22対98、p＜0.0001）。未分化のhiPSC-EBは、試験したCYP450アイソフォームのいずれの活性も示さなかった。
【００９７】
実施例3：hiPSC-EB-HLCの移植は長期間の生存およびヒトアルブミン放出をもたらす
ラットにおける急性肝不全のd-ガラクトサミン誘導モデルは、損傷から24〜48時間以内に広範囲の肝臓壊死を生じる。死は、肝不全の誘導から2〜3日後という早期に見られ、誘導後9〜10日以内にほぼ100％の死亡率に達した。肝臓損傷の誘導から14〜16時間後に細胞移植を行った。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）を、肝臓損傷のマーカーとして使用した。平均ALT値（3781 U/L）は、損傷前状態（53 U/L）と比較して有意に増加し、これはその後、阻害剤を用いて処置したhiPSC-EB-HLCの移植後に78 U/Lまで、および阻害剤を用いなかったhiPSC-EB-HLCの場合は364 U/Lまで正常化し、これにより両実験条件において致死的な肝臓損傷の解消が示された（図6A）。
【００９８】
細胞移植後の14日間について、カプラン・マイヤー生存率を決定した。ほぼすべての無細胞培地対照動物および未分化hiPSC-EBを投与した動物が、肝不全の誘導後5〜8日以内に死亡した（図6B）。実験期間（14日間）を通して、阻害剤で処置したhiPSC-EB-HLCを投与された動物は、阻害剤を用いなかったhiPSC-EB-HLCを投与されたものと比較してより高い平均生存率を示す傾向が見られた（図6B）（9.0±4.76対8.33±5.98 p＝0.7902）（表1）。
【００９９】
表１
2020533025.tif 000005
【０１００】
表1は、移植後14日まで、阻害剤を用いて処置したhiPSC-EB-HLCを投与した動物の平均生存が阻害剤を用いなかったhiPSC-EB-HLCと比較してより長い傾向が見られたが、統計学的有意性には達しなかった（9.0対8.33日、p＝0.7902）ことを示している。両方の試験時点、すなわち、移植後72時間および14日において、2つの阻害剤で処置したhiPSC-EB-HLCを投与された生存動物の血清中で、阻害剤を用いなかったhiPSC-EB-HLCを投与したものと比較して多量のヒトアルブミンが検出された。ヒトアルブミンは、いかなる時点でも対照動物のいずれの血清においても検出されなかった。
【０１０１】
細胞移植後のラットの血清におけるヒトアルブミンの試験は、阻害剤を用いたまたは用いなかったhiPSC-EB-HLCを投与された動物におけるヒトアルブミンの持続的な分泌を示した。特に、移植から72時間後に、阻害剤を用いたまたは用いなかったクラスターを投与された両方のラットグループは、それらの血清において、それぞれ1.63±0.43 ng/mLおよび0.20±0.05 ng/mLの濃度のヒトアルブミンを示した。細胞移植から14日後に、ラットの血清におけるヒトアルブミンの濃度は、阻害剤を用いたおよび用いなかった両方の実験グループにおいて増加し、それぞれ28.20±7.8 ng/mLおよび18.80±5.4 ng/mLの値に達した。両方の実験グループにおける総合結果は、WIF-1およびDKK-1で処置したhiPSC-EB-HLCを投与された生存動物のほぼ80％ならびにこれらの2つの阻害剤を用いずに分化させたhiPSC-EB-HLCを移植されたラットの66％においてヒトアルブミンが検出されたことを示した。対照グループは、いずれの時点においても、それらの血清中でヒトアルブミンを示さなかった（表1）。
【０１０２】
図6Cおよび6Dは、移植後14日のhiPSC-EB-HLC移植グループの肝臓におけるヒトアルブミンの代表的な陽性染色パターンを示している。このグループのすべての動物の脾臓切片は、ヒトアルブミン染色について陰性であった。移植後14日間の試験期間を通して、これらのラット肝臓における移植されたhiPSC-EB-HLCによる3つの肝タンパク質（HNF-3β、ヒトアルブミンおよびC-MET）のすべての共発現が、その総肝臓の免疫組織化学染色を用いて確認された（図6E）。染色特異性は、陽性対照としてヒト肝臓を用いて確認した（図6F）。
【０１０３】
生理学的な肝発生に関与する現象および段階特異的誘導因子の理解の向上は、インビトロでhiPSCからHLCに誘導する分化培養プロトコルの開発に貢献した。全体として、hESCまたはhiPSCからHLCに分化させる既存のプロトコルは、得られる細胞集団の低い分化効率および高い異質性という2つの問題による制約を受けている。1つの研究（Agarwal, S. et al., Stem Cells 26, 1117-1127 (2008)）において、MEFフィーダー層上の接着培地にプレーティングされたhESCは、初期および後期肝発生に関与する誘導因子の段階的添加を通じて、無血清培地中のコラーゲンIマトリクス上で、まず胚体内胚葉へ、次に肝細胞へという2段階分化を起こした。分化培養物は、段階特異的肝遺伝子の連続的な発現、ほぼ70％の肝分化収量、インビトロでの機能的な肝細胞の特徴および肝臓損傷のマウスモデルにおける残りの肝臓の再生を示した。分化プロセスの間、分化した細胞は、初期段階の肝タンパク質であるSox17、FoxA2およびGata4、その後の後期段階の肝タンパク質であるアルブミン、CD26およびAATの強い発現を獲得しつつ、多能性マーカーであるOct4の発現の漸減を示し、これは肝系統への特化の進行を示すものである。これらの知見にもかかわらず、インビトロ接着培養ベースのhESC由来HLCは、胎児肝細胞の未成熟マーカーの発現を維持し、いくつかの機能的欠如（例えば、低いP450活性）を示し、これにより記載された条件下での不完全な分化または細胞成熟が示唆された。この研究と同様に、他にも既存のプロトコルの限界に関する報告がある（Song, Z. et al. Cell Res 19, 1233-1242 (2009); Sullivan, G. J. et al. Hepatology 51, 329-335 (2010); Takata, A. et al., Hepatol Int 5, 890-898 (2011); Touboul, T. et al., Hepatology 51, 1754-1765 (2010)）。現時点で、hiPSCから初代肝細胞と等価な細胞への分化は、達成されていない。
【０１０４】
2D接着培養に基づく従来の肝分化は、初代肝細胞とは異なる細胞集団を生成する（Song, Z. et al. Cell Res 19, 1233-1242 (2009); Sullivan, G. J. et al. Hepatology 51, 329-335 (2010); Takata, A. et al., Hepatol Int 5, 890-898 (2011); Touboul, T. et al., Hepatology 51, 1754-1765 (2010)）。平面的な基材上での2D分化は、天然組織における3D細胞外環境の複雑な構造を捕捉することができず、したがってそれがインビボで初代細胞を正確に模倣する表現型および特性の細胞を生成する能力を制限している。肝臓の器官形成において、肝芽は、発生の間に複数の細胞型間で動的な細胞・細胞相互作用が行われる3D構造体である。特にE-カドヘリンを通じた、細胞・細胞相互作用は、肝細胞の成熟に正の影響を与える。以前の研究は、3D培養下で成長させた初代肝細胞およびhiPSC由来HLCが、2D培養下のそれらの対応物と比較してそれらの肝臓的特徴をより保持していたことを示した（Vosough, M. et al. Stem Cells Dev 22, 2693-2705 (2013); Glicklis, R. et. al., Biotechnol Bioeng 67, 344-353 (2000); Ramaiahgari, S. C. et al., Arch Toxicol 88, 1083-1095 (2014); Sivertsson, L. et al., Stem Cells Dev 22, 581-594 (2013)）。hiPSCまたはhESCからHLCへの肝分化に関する公開されているプロトコルのほとんどは、初期分化段階の間の2D培養と、その後の、最終成熟のための分化した細胞の集合を促進する3D培養を組み合わせたものである。本明細書に開示される分化プロトコルを、新しいEB形成用のROCKiフリーおよびスピンフリー技術を用いて、完全に3D培養下で実施した。2D接着培養ベースの分化と比較すると、hiPSC-EBを用いる3D培養ベースの分化は、2D下での細胞・細胞接触阻害および成長表面積制限を排除し、細胞・細胞接触によりHLCの成熟を促進することによる高い高細胞密度化能力を含む、様々な利点を提供する。加えて、クラスターの形態にある分化した細胞は、使用前に酵素的または機械的解離を必要とせず、したがってさらなる処理に起因する細胞の損傷／喪失の可能性を低下させる。3D培養下で生成される分化細胞のクラスターは、視認性が高く、移送が容易であり、直ちに注射可能である。クラスターの形態の我々の分化したhiPSC-EB-HLCは、最大1,000μmの直径で、いかなる内部壊死も示さず、これによりこのクラスターの透過性レベルが酸素／栄養素交換および拡散に十分であることが示唆された。
【０１０５】
異なる段階を通じたhiPSCの分化を誘導する生理学的な肝発生に関与する誘導性成長因子の連続投与にもかかわらず、以前に公開された肝分化プロトコルはいずれも、インビボでの肝臓の器官形成の間に起こるWnt経路の阻害に注目していない。肝細胞を含む特定の系統への細胞特化に対するWnt/β-カテニンシグナルの効果は、種をまたいで胚発生時に広く観察される。初期肝発生の間、β-カテニン発現は、E10〜E12で最も高く、E16後に減少する。肝発生において、Wntの調整は、細胞分化の後期段階で行われ、β-カテニンと共に、肝細胞または胆管細胞への肝前駆細胞（すなわち、肝芽細胞）の分化の指定に重要である。活性化されると、Wnt/β-カテニン経路は肝芽細胞を胆管細胞に誘導し、阻害されると、肝芽細胞を肝細胞に誘導する。Wnt/β-カテニン経路のこれらの効果は、1つまたは他の表現型の収量を増加させる、分化の間の運命を決定する肝・胆道段階での操作を可能にした。Wnt/β-カテニン経路の阻害剤を分化プロトコルに組み込むことにより、肝細胞対胆管細胞の運命特化のバランスをオフセットさせ、それによって肝細胞産生を強化することが可能となる。Wnt/β-カテニン経路は、2つのクラスのアゴニストによって調節される。1つは、Wntタンパク質への結合を通じてWntシグナル伝達を阻止する分泌型frizzled関連タンパク質（sFRP）ファミリー（例えば、WIF-1）であり、他は、Wnt誘導Frizzled-LPR5/6複合体の形成の阻害を通じてWntシグナル伝達を阻止するDickkopf（DKK）クラス（例えば、DKK-1）である。Wntタンパク質はまた、細胞株におけるそれらの活性およびインビボアッセイに基づき、カノニカルおよび非カノニカルの2つのクラスに分類される。学説上、sFRPファミリーは、カノニカルおよび非カノニカルの両方の経路を阻害し、DKKクラスは、カノニカル経路を特異的に阻害する。特に、DKK-1は、β-カテニンのWnt誘導安定化を阻害し、Wnt/β-カテニン経路に特異的であり得る。本明細書に開示されているように、Wnt/β-カテニン経路の阻止において相乗作用的に作用することを期待して、両方のクラスの阻害剤、すなわちWIF-1およびDKK-1を投与した。
【０１０６】
我々のhiPSC-EB-HLCの段階特異的な一時的な遺伝子およびタンパク質発現プロフィールは、以前の報告と一致するものであり、これにより我々のプロトコルを用いた成熟肝細胞への段階的分化が確認される。本明細書に開示されるプロトコルは、多能性状態（PS）から開始し、胚体内胚葉（DE）、前腸内胚葉（FE）、肝前駆体または肝芽細胞（HP）、および成熟肝細胞（MH）という、正常な胚発生の間の肝発生において見られる4つの段階をインビトロで再現するものである。各段階の遺伝子発現には重複が見られた。hEBベースの3D肝分化プログラムの間の後期段階における2つのWnt/β-カテニン経路阻害剤の添加は、他の細胞型、特に胆管細胞の産生を抑制しつつ、成熟肝細胞への肝芽細胞の分化拘束を増加させた。両方のWnt阻害剤（WIF-1およびDKK-1）の存在下での分化後に、ヒトアルブミン産生の存在により強調される両方のWnt阻害剤の非存在下の分化細胞と比較して有意に高い成熟肝細胞収量（80％超）が見られた。Wnt阻害剤はまた、従来的なプロトコルに付随する不完全な分化および成熟の問題にも対処する。インビトロで、hiPSC-EB-HLCは、WIF-1およびDKK-1を用いたおよび用いなかった両方のグループにおいて、アルブミン分泌、P450酵素ファミリーを通じた解毒および代謝、AFP分泌、フィブリノゲン分泌、ならびに脂質およびグリコーゲン貯蔵を含む成熟肝細胞の幅広い機能を示した。その中には、成熟肝細胞の鍵となる機能、例えば、脂質生成のための脂肪酸吸収を示すLDL取り込み、グリコーゲン取り込みおよび貯蔵、エネルギー貯蔵庫としてのトリグリセリド貯蔵、ならびに特定の物質を代謝する能力を示すICG取り込みおよびその後のクリアランスが含まれる。ICGは、専ら肝臓によって除去される有機アニオン性色素である。肝細胞の最も重要な機能の1つは、P450酵素ファミリーを通じた解毒および代謝である。この機能は、薬物の毒性および耐性の決定を助けることから、インビボおよびインビトロでの薬学的スクリーニングに必須となる。構成的活性に加えて、両実験グループのhiPSC-EB-HLCは、特定の誘導因子に応答して特定のP450ファミリーCYP酵素アイソフォームを上方調節する能力を示した。本明細書の実施例により開示される研究において、3つの一般的かつ生理学的に重要なP450アイソフォームを試験した。これらの知見は、細胞が、成熟肝細胞表現型への成熟を起こし、解毒および代謝の点で機能的であり、主要な外部刺激に対して応答することを強く示唆している。
【０１０７】
本明細書に開示される3D培養下で生成されたhiPSC-EB-HLCは、拡張可能な様式で、ラットモデルにおいて急性肝不全から動物を救済することができる。肝不全は、生理学的に重度の肝機能低下を引き起こし、世界で高い死亡率および罹患率を示している。現時点で唯一の有効な処置は、肝臓細胞および臓器全体の移植である。肝臓ドナーの不足および初代肝細胞細胞移植療法の効率の低さが、処置にとって乗り越えられない障害となっている。本明細書に開示される実施例において、移植後2週間で、hiPSC-EB-HLC（ヒトアルブミン陽性細胞）は、もともとの注射部位である脾臓内で確認されず多数のhiPSC-EB-HLCがレシピエントラットの肝臓内ではっきりと確認された。これらの知見は、ヒトまたは動物起源の脾臓内移植された初代肝細胞が肝索における生着のために脾臓を離れるという以前の研究と一致しており、これは、hiPSC-EB-HLCによる初代肝細胞の鍵となる特徴の再現を示唆している。移植されたhiPSC-EB-HLCは、試験期間（72時間および14日間）を通して宿主血漿中にヒトアルブミンを持続的に分泌し、生存に重要な期間を通じて急性肝不全にさらされた動物つなぎとめることに成功し、これらの細胞の統合および完全なインビボ機能化に関する見込みのある証拠を提供した。特に、2つの阻害剤で処置したhiPSC-EB-HLCを移植された動物は、阻害剤なしのhiPSC-EB-HLCを移植されたものと比較してそれらの血清中でより高濃度のヒトアルブミンを示した。
【０１０８】
WIF-1およびDKK-1を用いるおよび用いない２つのプロトコルを用いて分化させたhiPSC-EB-HLCを比較する上記実験を行った。２つの条件間の比較は、WIF-1およびDKK-1を添加した場合、得られるhiPSC-EB-HLCの改善された肝機能によって示されるように、分化プロセスが強化されたことを示した。
【０１０９】
まとめると、分化の後期段階において2つのWnt/β-カテニン経路阻害剤を用いる本明細書に開示される段階的3D球形培養ベースの肝分化プロトコルは、成体初代ヒト肝細胞の遺伝子的およびタンパク質的特徴だけでなく、インビトロおよびインビボの両方で成熟肝細胞様機能を有するhiPSC-EB-HLCを生成した。この分化プログラムは、容易に拡張可能でありかつ高効率である。得られる細胞集団は均一であり、十分に分化しており、成熟している。これらの細胞は、再生医療および病態生理学研究、ならびに薬理学的スクリーニングおよび創薬において初代ヒト肝細胞の生きた代替物を提供すると考えられる。
【０１１０】
実施例4：胚様体の形成
本発明は、移植に適した多量の成熟肝細胞を再現可能に生成する方法を提供する。この実施例は、そのような方法の詳細な説明を提供する。ヒト人工多能性肝細胞（hiPSC）は、WiCell Research Institute（Madison, WI - カタログ番号WB0002）から購入した包皮線維芽細胞由来細胞株iPS（包皮）-3であり、これをビトロネクチンコートプレート（Stem Cell Technologies, Ontario, Canada）上でTeSR2サプリメント（Stem Cell Technologies, Ontario, Canada）を含む化学的に定義された幹細胞培地であるTeSR2基本培地中で培養する。
【０１１１】
ヒト胚様体の形成のために、専用のアガロースモールドを使用した。Aether（商標）アガロースモールドは、PDMSマイクロモールドを使用することによって作製し、0.5 mLの2％溶融アガロース溶液（Sigma-Aldrich、カタログ番号A2929）をこのマイクロモールドにピペット注入し、完全に満たした。このアガロースを、約2分間ゲル化させ、ついで滅菌環境下の24マルチウェルプレートに入れた。Aetherアガロースモールドは、1.2 x 106/モールド/3.5 x 104/ウェルの単一細胞懸濁物の特定の細胞播種密度濃度から始めて生成される完全に球形の胚様体の形成を可能にする特別な丸底凸部を有する。
【０１１２】
Aether（商標）アガロースモールドに播種されたhiPSCの単一細胞懸濁物を、12時間から最大24時間（24時間を超過しない）の期間インキュベートした。一般的に使用されている他の技術と異なり、本明細書に開示されるプロトコルは、Y-27632 RHO/ROCK経路阻害剤を使用せず、hiPSC単一細胞懸濁物を凝集させるためにいかなる遠心分離力も使用しない。本発明の方法は、ROCKiまたは遠心分離がヒト細胞療法におけるそれらの将来の使用に与えるいかなる副作用も有さないヒト胚様体を得ることを可能にする。インキュベート時間の終了後に、形成されたhEBをAether（商標）アガロースモールドから取り出し、F-12栄養混合物（Ham）、100 U/ml-1ペニシリンおよび0.1 mg ml-1ストレプトマイシン（Gibco、カタログ番号15140122）を補充したイスコーブ改変ダルベッコ培地（IMDM）ならびに100μg/mlのオレオイル-L-α-リゾホスファチジン酸ナトリウム塩（LPA）（Sigma-Aldrich、カタログ番号L7260-5MG）、1 gr/L組み換えヒトインスリン（Sigma-Aldrich、カタログ番号91077C-100MG）、0.55 gr/L組み換えヒトトランスフェリン（Sigma-Aldrich、カタログ番号T3705-1G）、0.00067 g/Lセレン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich、カタログ番号S5261-100G）および11 gr/Lピルビン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich、カタログ番号S8636-100ML）を補充した55μM 1-チオグリセロールから構成される特別なAether（商標）の化学的に定義され無血清配合された培地を用いた懸濁培養中に入れた。そのような化学的に定義された無血清の培地は、細胞が、異種物質非含有条件下でヒト胚様体を生成することを可能にする。
【０１１３】
実施例5：ヒト胚様体の形成：ヒト脂肪組織由来内皮細胞（hATEC）と組み合わせたhiPSC
別の態様において、本発明は、hiPSCおよびhATECを含むヒト胚様体を提供する。このアプローチは、分化したヒト胚様体のインビトロでの成熟／分化およびインビボでの翻訳後生着を改善する。ヒト胚様体の形成は、1：3のhiPSCとhATECの間の特定の比となる8.16 x 105/モールド/2.3 x 104/ウェルのhiPSC単一細胞懸濁物と4.08 x 105/モールド/1.16 x 104/ウェルのhATEC単一細胞懸濁物の組み合わせを用いて実施した。そのような比により、hiPSCおよびhATECの分化プロセスの間に最大の併用効果を得ることができる。実施例4に記載されるAether（商標）の化学的に定義された無血清の培地を用いてこのヒト胚様体形成のバリエーションも実施した。この例において、ヒト胚様体形成を促進するため、hiPSCおよびhATECを、24時間インキュベートした。
【０１１４】
実施例6：ヒト間葉系幹細胞（hMSC）でコーティングされたhiPSC+ATECを含むヒト胚様体
本発明はさらに、hATECを含むまたは含まない、かつhMSCでコーティングされたhiPSCを含むヒト胚様体を取得する方法を提供する。実施例7に記載される分化プロトコルの完了後、移植後の宿主免疫系の攻撃から分化したヒト胚様体（hATECを含むまたは含まない）を保護するために、分化したヒト胚様体を、経時的に分解し、分化した胚様体へのhMSCの浸潤を防ぐ分解性かつ生体適合性のヒドロゲルの薄層でコーティングした。このヒドロゲル構造体は、以下のようにして調製した：（1）炭酸P-ニトロフェニル化デキストラン（Dex-PNC）およびチオール化デキストラン（Dex-SH）を合成した。（2）ついでジスルフィド結合含有アミノ化デキストランDex-SS-NH2を、デキストラン-SHおよび塩酸S-(2-ピリジルチオ)システアミン（PDA）のチオール・ジスルフィド交換反応を通じて調製した。（3）ついで酸化還元反応応答性両親媒性デキストラン（Dex-SSDCA）を、デオキシコール酸（DCA）のカルボキシルとDex-SS-NH2のアミンの間の縮合反応により合成した。その後、ヒドロゲルの分解が、DCAの分子量および置換度を制御することにより、3日間〜2週間まで微調整され得る。ついで、hATECと共にまたはそれなしでhiPSCを含むヒト胚様体を10 mg/mLの濃度の2 mLのDMSO中Dex-SSDCA溶液と混合する。この混合物を一晩撹拌する。
【０１１５】
2020533025.tif 000006
Dex-SSDCAの合成
【０１１６】
ついで、コーティングされた分化ヒト胚様体層を含むヒドロゲルを、Aether（商標）アガロースモールドに移し、保護性hMSCコーティング外層を生成するために4.4 x 105/モールドのhMSCと24時間共培養した。hMSCは足場依存的細胞なので、これらの細胞は、生存のために表面に接着させる必要がある。hMSCに対して利用可能な唯一の接着可能な表面は、分化ヒト胚様体の表面であった。この単純な方法を用いて、hMSCの単一細胞の厚い層（約26μm）を、分化ヒト胚様体上にコーティングした。hMSCが回転楕円体を囲むカプセルとして配置されていることを確実にするため、第2の分解性・生体適合性ヒドロゲル層を、hMSCコーティングされた島様クラスターの外層上に添加した。この第2のヒドロゲル層は、hMSCコーティングされた島様クラスターからのヒト胚様体の離脱を防止する。
【０１１７】
実施例7：ヒト脂肪組織内皮細胞（hATEC）と組み合わされたhiPSC由来のヒト胚様体から肝細胞様クラスターへの分化
4段階インビトロ肝分化プロトコルは、胚発生の間に起こる変化を再現することを追求するものであった。肝分化の4段階は、胚体内胚葉、前腸内胚葉、肝胆道前駆体および分化拘束された肝細胞である。分化プロトコルの各段階は、4日間続け、2回の1日おきの培地交換および可溶性分化因子の添加を行う。詳細は、本明細書の以下に提供されている。培養に使用した基準分化培地は、F-12栄養混合物（Ham）、100 U/ml-1ペニシリンおよび0.1 mg ml-1ストレプトマイシン（Gibco、カタログ番号15140122）を補充したIMDMならびに100μg/mlのオレオイル-L-α-リゾホスファチジン酸ナトリウム塩（LPA）（Sigma-Aldrich、カタログ番号L7260-5MG）、1 gr/L組み換えヒトインスリン（Sigma-Aldrich、カタログ番号91077C-100MG）、0.55 gr/L組み換えヒトトランスフェリン（Sigma-Aldrich、カタログ番号T3705-1G）、0.00067 g/Lセレン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich、カタログ番号S5261-100G）および11 gr/Lピルビン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich、カタログ番号S8636-100ML）を補充した55μM 1-チオグリセロールから構成される特別なAether（商標）の化学的に定義され無血清配合された培地であった。
【０１１８】
胚体内胚葉段階への分化を、ソニック・ヘッジホック（Shh）経路の阻害を通じて促進した。活性化されると、Shh経路は、前腸細胞の分化を促進し、阻害されると、Shh経路は、細胞を胚体内胚葉表現型に誘導する。アクチビンAは、TGF-βスーパーファミリーに属する可溶性因子であり、このスーパーファミリーの他のメンバーと同様、それらの細胞質ドメインに固有のセリン／スレオニンキナーゼ活性を有する細胞表面上の2つのタイプの膜貫通受容体（IおよびII型）と相互作用する。アクチビンAは、II型受容体に結合し、I型受容体の動員、リン酸化および活性化をもたらすカスケード反応を開始する。活性化されたI型受容体は、その後、II型受容体と相互作用し、共にSmad2およびSmad3をリン酸化する。Smad3は、その後、核に移動し、そこで多量体化を通じてSmad4と相互作用し、それによってそれらが多種の遺伝子の発現を担う転写因子の複合体として調整される。この転写因子の複合体の作用に対する研究は、アクチビンAが、所定の濃度で、Shh経路を阻害することを示した。したがって、アクチビンAの作用を通じて、胚体内胚葉表現型へのhiPSCの分化を行うことが可能である。アクチビンAが胚体内胚葉への分化を誘導することが示された濃度は、4日の期間の100 ng/mlである。低濃度（50 ng/ml）で、アクチビンAは、TGF-βスーパーファミリーの別の成分であるbFGFと同様の多能性維持活性を有するようである。胚体内胚葉形成の促進におけるアクチビンAの活性を強化するため、同じスーパーファミリーに属する2つの可溶性因子であるTGF-β1およびbFGFを添加した。これらの因子を、胚様体形成直後に4日間添加した（以下の、肝分化手順を参照のこと）。これらの3つの因子の相乗作用により、より多くの胚体内胚葉が形成された。これらの3つの因子を使用した用量は、以下の通りであった：100 ng ml-1アクチビンA、10 ng ml-1 塩基性FGFおよび10 ng ml-1TGF-β（すべてPeproTech, Rocky Hill, NJ製）。
【０１１９】
内分泌表現型へと導く肝分化における次の工程は、Notch経路によって管理され、これは活性状態で、肝前駆細胞を「スタンバイ」状態で維持することによりそれらの分化を抑制し、一方、阻止された場合、内分泌肝細胞を形成させる。ニューロゲニン3（Ngn3）は、内分泌細胞の発生に関与する塩基性ヘリックス・ループ・ヘリックス（bHLH）転写因子ファミリーに属する。それらの発生の初期においてNgn3を過剰発現するトランスジェニックマウスは、内分泌細胞の形成の顕著な増加を示すことが示されており、これはNgn3が肝細胞前駆体の分化を誘導することを示している。Ngn3活性は、Notch経路阻害にも関与するようである。Ngn3の活性化に重要な役割を果たす2つの因子は、BMP4およびFGF4である。このプロトコルの第2段階においてこれらの2つの因子を添加することにより、Ngn3の発現が上方調節され、それによってNotch経路が調整および阻止された。BMP4およびFGF4を添加した具体的用量は、10 ng ml-1 FGF-4（PeproTech）および10 ng ml-1 BMP-4（Invitrogen）であった。これらの2つの因子、BMP4およびFGF4を、アクチビンA処置の開始から4日後に、4日間添加した（以下の肝分化手順を参照のこと）。
【０１２０】
内胚葉への分化拘束の後、Wntシグナルの不存在は、肝前駆細胞（肝芽細胞）から肝細胞への分化拘束に必須となる。Wntおよびβ-カテニンは、生後肝発生の制御において個別および組み合わせ効果を示す。核へのβ-カテニン転移の増加は、細胞増殖の増加に関連し、Wnt経路は、極性および細胞運命の決定の主要な調節因子であるとみなされる。肝臓の胚発生に対するWntおよびβ-カテニンの効果は、高度に時間的に調節されたプロフィールにしたがう。組み合さったとき、Wnt/β-カテニン経路は、肝細胞に向かう肝胆道分化において重要な役割を果たし、β-カテニンの安定化は、単独で、肝細胞よりも胆管細胞への傾向を増大させる。Wnt/β-カテニン阻害を通じて、肝胆道分化段階で肝細胞への進行を促進することが可能である。肝発生の第II相の間に、肝芽細胞または肝前駆体は、それらの未分化状態を維持しつつ拡張される。肝臓運命への分化拘束は、第III相の間に存在する多数の肝臓に豊富な転写因子によって調節される。現在の従来的な分化プロトコルは、Wnt/β-カテニン阻害の重要な役割を考慮せずに、肝前駆細胞の誘導を通じて成熟肝臓表現型へと向かう初期の内胚葉形成からの段階的プロセスにしたがうものである。肝細胞を含む特定の系統への細胞特化に対するWnt/β-カテニンのシグナルの効果は、種をまたいで胚発生時に広く観察される。初期肝発生の間、β-カテニン発現は、E10〜E12で最も高く、E16後に減少する。肝発生において、Wntの調整は、細胞分化の後期段階で行われ、β-カテニンと共に、肝細胞または胆管細胞への肝前駆細胞（すなわち、肝芽細胞）の分化の指定に重要である。活性化されると、Wnt/β-カテニン経路は肝芽細胞を胆管細胞に誘導し、阻害されると、肝芽細胞を肝細胞に誘導する。Wnt/β-カテニン経路のこれらの効果は、1つまたは他の表現型の収量を増加させる、分化の間の運命を決定する肝・胆道段階での操作を可能にした。Wnt/β-カテニン経路の阻害剤を分化プロトコルに組み込むことにより、肝細胞対胆管細胞の運命特化のバランスをオフセットし、それによって肝細胞産生を強化することが可能となる。Wnt/β-カテニン経路は、2つのクラスのアゴニストによって調節される。1つは、Wntタンパク質への結合を通じてWntシグナルを阻止する分泌型frizzled関連タンパク質（sFRP）ファミリー（例えば、WIF-1）であり、他は、Wnt誘導Frizzled-LPR5/6複合体の形成の阻害を通じてWntシグナルを阻害するDickkopf（DKK）クラス（例えば、DKK-1）である。Wntタンパク質はまた、細胞株におけるそれらの活性およびインビボアッセイに基づき、カノニカルおよび非カノニカルの2つのクラスに分類される。学説上、sFRPファミリーは、カノニカルおよび非カノニカルの両方の経路を阻害し、DKKクラスは、カノニカル経路を特異的に阻害する。特に、DKK-1は、β-カテニンのWnt誘導安定化を阻害し、Wnt/β-カテニン経路に特異的であり得る。本発明のプロトコルにおいて、Wnt/β-カテニン経路の阻止において相乗作用的であり得るという理由から、両方のクラスからの阻害剤、すなわちWIF-1およびDKK-1を投与した。
【０１２１】
2つのWnt経路阻害剤が有効な具体的用量は、我々の分化プロトコルの第3段階においてWntのシグナルを抑制し、肝芽細胞から肝細胞様細胞への分化を促進するよう機能する1μg ml-1のWIF-1（R&D System, Minneapolis, MN）および0.1μg ml-1のDKK-1（PeproTech）である。これらの2つの因子、WIF-1およびDKK-1を、BMP4およびFGF4の投与直後に、4日間投与した（以下の肝分化手順を参照のこと）。
【０１２２】
肝細胞様細胞の最終成熟に関しては、HGFおよびオンコスタチンMの存在が、成熟肝細胞への最終分化を決定する。オンコスタチンMは、インビトロで胎生第14.5日（E14.5）の肝臓由来の胎児肝細胞の成熟を誘導する。オンコスタチンMによって誘導される肝成熟は、肝分化マーカーの発現が胎児肝臓培養物でSTAT3阻害剤の発現によって効果的に阻害されることから、STAT3を通じて行われる。例えば、STAT3阻害剤は、SH2ドメイン阻害剤または二量体化阻害剤（SDI、B部位）、DNA結合ドメイン阻害剤（DBDI、C部位）、N末端ドメイン阻害剤（NDI、D部位）およびSTAT3経路の上流成分の間接的ターゲティング（A部位、チロシンリン酸化阻害剤、TPI）を含む。肝細胞成長因子（HGF）は、インビトロで成体肝細胞の増殖を直接刺激することが示された。しかし、HGFは、胎児肝細胞においてSTAT3を活性化せず、STAT3の発現は、HGFによって誘導される肝分化マーカー遺伝子の発現を阻害しなかった。OSMおよびHGFの両方とも肝分化を誘導するものの、それらのシグナル伝達機構は全く異なっている。HGFによって活性化されるシグナル分子は、肝臓発生においてOSMの機能を完全にし、したがってオンコスタチンMとHGFの相乗効果が、分化プロトコルにおいて肝細胞様細胞の成熟を誘導するために必要とされる。オンコスタチンMおよびHGFが有効な具体的用量は、HGF（PeproTech）については50 ng ml-1、オンコスタチンM（PeproTech）については30 ng ml-1であった。分化プロセス全体を、懸濁培養下で行った。得られた分化した肝細胞様クラスターは、インビトロ試験および臨床的治療の両方の任意のタイプの用途で利用できる状態であった。
【０１２３】
実施例8：WIF-1およびDKK-1はhiPSC-EBから肝細胞様細胞への分化を誘導する
この実施例の研究は、hECと組み合わせたhiPSC胚様体の3D懸濁培養と共にWIF-1およびDKK-1を用いるこの新規の分化プロトコルが、拡張可能な様式でhiPSC-EBから肝細胞様細胞への分化を誘導することができることを示している。この実施例の分化したhiPSC-EB-HLCは、インビトロおよびインビボの両方で、それらをインビトロ研究ならびに薬物試験および細胞療法に適したものにする、成熟ヒト肝細胞の主要な生理学的機能の大部分を示した。
【０１２４】
ヒト胚様体（hEB）を、拡張可能な生産および多量での均一なhEBを可能にする以前に開発されたROCKiフリー/スピンフリー技術（Pettinato, G. Sci. Reports, 4:7402, Dec. 10 2014）を用いて得た。この実施例の研究のために、hiPSCを、同じhEB中でヒト内皮細胞（hEC）と組み合わせた。hEB形成の24時間後に、hiPSCおよびhECの両方を、同じhEB内で、鮮やかな色素、例えばDiO（緑色）およびDiI（赤色）を用いて可視化した。
【０１２５】
この分化プロトコルは、インビボでの胚発生の間の肝臓の発生段階を再現するよう設計された（Pettinato, G., et al. Sci Rep. 2016 Sep 12; 6:32888）。2つの新規のWnt/ベータ-カテニン阻害剤WIF-1およびDKK-1を使用して、肝芽細胞が成熟肝細胞様細胞になるよう誘導した。
【０１２６】
hECと組み合わせたhiPSC-EB-HLCから成熟肝細胞様細胞への段階的分化を確認するため、様々なマーカーの免疫蛍光を使用してhiPSC-EB-HLCプラスhECから成熟肝細胞様細胞への分化を実証した（図12A、図12B、図12C）。染色は、内胚葉段階のマーカーであるSOX17およびFOXA2；前腸内胚葉のマーカーであるHHEXおよびGATA4；肝前駆細胞のマーカーであるAFPおよびHNF-4a；ならびに成熟肝細胞様細胞のマーカーであるアルブミンおよびCK-18について観察した。図12Aおよび12Bは、段階特異的マーカーの存在を示す、hEBおよびhiPSCのみ（A）とhEBおよびhECと組み合わせたhiPSC（B)の間の成熟工程の比較を提供する。図12Cは、hECを用いたおよび用いなかった2つの実験条件間のアルブミンについてのFACS分析を提供する。この分析は、hECの存在下でアルブミン陽性細胞の比率がより高いことを示した。図12Dは、hECをhiPSCと組み合わせたときに様々な遺伝子のより高い発現を見出した定量RT-PCR分析の結果を示している。
【０１２７】
細胞培地を、両方の条件（すなわち、阻害剤（WIF-1およびDKK-1）を用いた条件または用いなかった条件と称される2つの条件）においてhiPSC-EB-HLCにより培地に分泌されたアルブミン（図13A）、フィブリノゲン（図13B）およびアルファ・フェトプロテイン（AFP）（図13C)の存在についてアッセイし；また、この実験を、hECと共におよびそれなしでhiPSC-EB-HLCを用いて実施した。分化後に尿素の細胞内濃度も検出した（図13D）。すべてのマーカーの分析から得られた結果は、ヒト初代肝細胞（HPH）と比較して同等のレベルを示した。
【０１２８】
hECありおよびなしのhiPSC-EB-HLCを、インドシアニングリーン（ICG - Cardiogreen）取り込み（図14A）；6時間後のICG放出（図14B）；中性トリグリセリドおよび脂質の細胞質蓄積の評価を提供するオイル・レッドO染色（図14C）についてアッセイし；グリコーゲン貯蔵をPAS染色によって確認し（図14D）；ならびにアセチル化低密度リポタンパク質（DiI-ac-LDL）取り込みは分化細胞におけるLDL小胞の存在を示し（図14E）、試験した条件のいずれにおいても陽性染色を示さなかった（右側）。スケールバー100μm。
【０１２９】
尿回路を通じたアンモニア代謝は、肝細胞の必須機能である。アンモニア代謝を、既知濃度の塩化アンモニウムの添加後24時間にわたる両実験条件における細胞培養上清中のアンモニウム濃度の変化をアッセイすることによって評価した。様々なサイトカインP450酵素を、72時間にわたり細胞を異なる誘導因子：CYP1A2についてはオメプラゾール；CYP3A4についてはリファンピシンおよびCYP2B6についてはフェノバルビタール、と共にインキュベートすることによって評価した。DMSOを、異なるCYP450の基準活性を試験するための対照として使用した。hECと組み合わせたhEBは、すべてのチトクロムP450酵素のより高い誘導を示した（図15A〜15D）。
【０１３０】
次に、急性肝不全のd-ガラクトサミン誘導ラット動物モデルを用いて、hECを用いたおよび用いなかった両条件のhiPSC-EB-HLCの治療効果を決定した。アラニンアミノトランスフェラーゼ（ALT）を、肝臓損傷のマーカーとして用いた。図16Aは、移植なしのモデル評価のためのカプラン・マイヤー生存曲線を示している。d-ガラクトサミン注射1日後のALTレベルが＞3,000 U/Lの肝臓損傷を起こした9匹の動物のうちの8匹が、ALTが＜3,000 U/Lであった5匹の動物のうちの2匹との比較で、3日死亡を示した。hECありのhiPSC-EB-HLCの移植を受けた動物は、hECなしのグループと比較してより高い生存率を示した（P＜.05）（図16B）。免疫組織化学染色を用いて、肝臓および脾臓切片におけるhECありのhiPSC-EB-HLCを、移植後に屠殺した動物において検出することができた（図16C、図16D、図16E、図16F、図16G、図16H、図16I）。これらの実験は、肝臓損傷状況下で生存率を向上させるhECありのhiPSC-EB-HLCの移植の治療効果を確認した。
【０１３１】
実施例9：HLCおよび凝固因子の分泌
この実施例の研究は、ヒト内皮細胞と組み合わせたまたは組み合わせなかったHLCが、通常インビボで初代肝細胞および内皮細胞の両方によって産生される凝固因子を産生および分泌することができることを示している。これらの凝固因子は、フォン・ヴィルブランド因子（vWF）および第IX因子（図17A）、プロテインCおよび第X因子（図17B）、プロテインSおよび第V因子（図17C）、第VIII因子およびアンチトロンビン（図17D）、第VII因子および第XI因子（図17E）、C反応性タンパク質および第XII因子（図17F）、ならびにプロトロンビンおよび第XIII因子（図17G）を含む。ヒト内皮細胞と組み合わせたまたは組み合わせなかったHLCは、本明細書に開示される分化プロトコルを用いて生成される。これらのHLCは、血液凝固障害、例えば血友病に罹患した患者の処置を可能にする。
【０１３２】
上記結果は、以下の方法および材料を用いて得た。
【０１３３】
細胞供給源および培養条件
ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）は、包皮線維芽細胞由来細胞株iPS（包皮）-3（WiCell Research Institute, Madison, WI - カタログ番号WB0002から購入）であり、これをMatrigelマトリクス（BD Biosciences, San Jose, CA）において化学的に定義された幹細胞培地（mTeSR1サプリメントを含むmTeSR1基準培地、Stem Cell Technologies, Ontario, Canada）中で培養した。iPSCコロニーを、室温で8分間、Versene（EDTA）（Lonza, Allendale, NJ）を用いて継代した。
【０１３４】
胚様体（EB）形成
現場開発したテフロンスタンプおよび低融点アガロース（Sigma-Aldrich）を用いてアガロースマイクロウェルアレイを作製した。アガロース、40 g L-1を、100℃でリン酸緩衝生理食塩水（PBS）に溶解させ、培養用具にピペットで入れた。このテフロンスタンプを、およそ5分間、アガロース溶液に押し付けた。約2分でゲル化したアガロースおよびスタンプを引き抜き、アガロースゲル基材内のマイクロウェルアレイを得た。アガロースがゲル化した後、アレイを、EB分化培地（1：1混合IMDMおよびF-12栄養混合物（Ham）（Invitrogen）、5％ウシ胎仔血清（Invitrogen）、1％(vol/vol)インスリントランスフェリンセレニウムAサプリメント（Invitrogen）、55μMモノチオグリセロール（Sigma-Aldrich）、100 U L-1ペニシリンおよび0.1 mg L-1ストレプトマイシン（Invitrogen））と共に37℃および5％ CO2の下で一晩インキュベートすることによって事前準備した。
【０１３５】
hiPSC-EB形成のために、50μl懸濁物中の1.2 x 10個の解離したhiPSCを、各マイクロウェルアレイに入れ、マイクロウェルに堆積させた。37℃で24時間のインキュベート後、3次元EBをマイクロウェルから吸引し、35mm組織培養皿（BD Biosciences）に移した。この細胞を、37℃および5％CO2でオービタルシェーカーにより穏やかに撹拌しつつ、基準肝細胞培地中での懸濁培養下で維持し、1日おきに培地を交換した。
【０１３６】
肝分化手順
我々の4段階インビトロ肝分化プロトコルは、胚発生の間に起こる変化を再現することを追求するものであった。その4段階は、胚体内胚葉、前腸内胚葉、肝胆道前駆体および分化拘束された肝細胞である。分化プロトコルの各段階は、4日間続き、2回の1日おきの培地交換および可溶性分化因子の添加を行った。
【０１３７】
基準分化培地は、F-12栄養混合物（Ham）、5％ウシ胎仔血清、1％(vol/vol)インスリントランスフェリンセレニウムAサプリメント、55μMモノチオグリセロール、100 U ml-1ペニシリンおよび0.1 mg ml-1ストレプトマイシン（Sigma-Aldrich）を含むIMDMからなるものであった。胚体内胚葉段階への分化は、10 ng ml-1塩基性FGF、100 ng ml-1アクチビン-Aおよび10 ng ml-1 TGF-β（すべてPeproTech, Rocky Hill, NJ製）の添加を通じて促進した。第2の前腸内胚葉段階は、10 ng ml-1 FGF-4（PeproTech）および10 ng ml-1 BMP-4（Invitrogen）の添加を通じて促進した。内胚葉への分化拘束後、Wntシグナルの不存在は、肝胆道分化に必須である。Wnt経路阻害剤である1μg ml-1 WIF-1（R&D System, Minneapolis, MN）および0.1μg ml-1 DKK-1（PeproTech）の添加は、Wntシグナルを抑制し、分化の第3段階を促進する役割を果たした。肝胆道分化拘束の後、HGFおよびオンコスタチンの存在が、胆管細胞または肝細胞への分化を決定する。50 ng ml-1 HGF（PeproTech）および30 ng ml-1オンコスタチンA（PeproTech）を添加することにより、我々は、第4段階で肝胆道細胞を肝細胞経路に誘導した。
【０１３８】
胚様体分化のために、すべての因子を細胞培養培地に添加し、胚様体を穏やかに軌道運動の撹拌を行いつつ懸濁下で維持した。分化プロトコルを適用する前に、陰性対照として使用する未分化のhEBをサンプルバッチから収集した。阻害剤を用いたおよび用いなかった肝分化についてのすべての実験を、同じhiPSC-EBのバッチから開始して行い、サンプルは、我々の結果の再現性を確保するよう分化プロセスの終了時にすべて同時に分析した。
【０１３９】
hEB生存率
分化プロセスの終了後に、製造元の指示にしたがい内部壊死の存在を決定する生／死染色（カタログ番号L-7013、Molecular Probes）によって細胞生存率を評価した。Olympus IX81を用いた共焦点顕微鏡によって蛍光画像を取得した。
【０１４０】
遺伝子発現アッセイ
逆転写酵素PCR（RT-PCR）を行い、分化に特徴的な遺伝子マーカーの存在を検証した。RNAを、Trizol試薬（Invitrogen）を用いて抽出し、分光分析（NanoDrop 2000, Thermo-Scientific）によって定量した。MMLV酵素（Maloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase, Promega, Madison, WI）を用いてRNAをcDNAに逆転写した。以下のパラメータによりTaqポリメラーゼを用いてcDNAを増幅した：94℃で4分間を1サイクル、94℃で30秒間の変性および60℃で30秒間のアニーリングを30〜35サイクル。以下の遺伝子を評価した：アルファ・フェトプロテイン（AFP）、アルブミン、サイトケラチン18、およびP450酵素Cyp3a4、Cyp2c9、Cyp3a7、Cyp1b1、Cyp2b6、Cyp1a2、CK-7、HNF-1β、EpCAM、NCAM、アニオンエクスチェンジャー2（AE2）、SALL4およびCyp3a7。GAPDHを、参照ハウスキーピング遺伝子として使用した。値を、グリセルアルデヒド-3-リン酸（GAPDH）ハウスキーピング遺伝子に対して正規化し、報告した。エラーバーは、3回の独立した実験の標準偏差を表す。データは、平均±SDとして表されている。
【０１４１】
定量RT-PCR（qRT-PCR）のために、抽出したRNAを、RNaseフリーDNase（Promega）で処理し、iScript cDNA合成キット（Bio-Rad）を製造元の指示にしたがい用いて逆転写した。関心対照の凍結乾燥プライマーを含むCustom PrimePCRプレート（Bio-Rad、96ウェル、9つの固有のアッセイを含むSYBRプレート、カタログ番号10025217）を、SsoAdvanced Universal SYBRグリーンと共に使用し、製造元の指示にしたがい運用した。5秒／ステップの65〜95℃での30秒溶解曲線（0.5℃増分）のために、以下の増幅条件を合計40サイクル使用した：95℃で2分間の活性化、95℃で5秒間の変性、60℃でのアニーリング。CFX96 Touch（Bio-Rad）を増幅に使用し、CFX Manager 3.1（Bio-Rad）を用いてデータを処理した。値を、グリセルアルデヒド-3-リン酸（GAPDH）ハウスキーピング遺伝子に対して正規化し、報告した。
【０１４２】
免疫蛍光アッセイ
各段階の終了後に、分化を起こした胚様体を、段階特異的マーカーの免疫蛍光分析のために収集した。胚様体を、4％(wt/vol)パラホルムアルデヒドで90分間固定し、PBS中0.3％(vol/vol)Triton-X 100で1時間透過処理し、PBS中0.5％(vol/vol)ヤギ血清（Sigma-Aldrich）で1時間ブロックした。サンプルを、4℃で3日間、一次抗体と共にインキュベートした。数回の洗浄後、サンプルを、室温で2時間、二次抗体と共にインキュベートした。上記インキュベート時間は、おそらくEBクラスターの大きな半径および拡散時間の増加が理由で、完全の染色のために必要であった。
【０１４３】
以下のヒト特異的一次抗体を使用した：ウサギ抗SOX17（Santa Cruz、sc-20099；1:100）；マウス抗FOXA2（Abcam、ab60721）；5μg ml-1、ヤギ抗Hhex（Santa Cruz、sc-15128；1:100）；マウス抗GATA-4（Santa Cruz、sc-25310；1:100）；マウス抗AFP（Santa Cruz、sc-166325；1:100）；マウス抗HNF-4α（Santa Cruz、sc-8987；1:100）；ヤギ抗アルブミン（Santa Cruz、Santa Cruz、CA、sc-46293；1:100）；マウス抗サイトケラチン18（CK-18）（Abcam、ab82254、5μg ml-1）；マウス抗HNF1-α（Santa Cruz、sc-135939；1:100）；およびウサギ抗ヒトC-MET（Santa Cruz、sc-10；1:100）。以下の二次抗体を使用した：Cy2-AffiniPureヤギ対マウスIgG；Fcサブクラス1特異的（Jackson ImmunoResearch、1:100）；Cy3-AffiniPureヤギ対ウサギIgG (H + L)（Jackson ImmunoResearch、1:100）およびCy5結合AffiniPureウサギ対ヤギIgG（Jackson ImmunoResearch、1:100）。核を、PBS中の4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）で1時間対比染色した。Olympus IX 81を用いた共焦点顕微鏡により、蛍光画像を取得した。我々の分化プロトコルを用いて得られたアルブミン産生細胞の収量は、共焦点顕微鏡を用いて各光学断面における総細胞数に対するアルブミン陽性細胞数を計数することによって決定し、各クラスターにつき最小10の顕微鏡野および分化条件ごとに最小50の異なるクラスター間で平均化した。
【０１４４】
FACS分析および細胞選別
分化プロトコルの完了後、阻害剤ありおよびなしの100個のhiPSC-EB-HLCを、37℃で15分間、トリプシンを用いて消化した。Live/Dead Yellow Fixable Stainを用いて生存率を評価した。細胞内アルブミン染色を、Fixation/Permeabilization Staining Buffer Set（eBioscience, San Diego, CA）を用いて行った。FACS分析のために、以下のモノクローナル抗体を使用した；抗ヒト血清アルブミンAPC結合抗体（R & D SYSTEMS）。データ取得は、BD FACS Aria II機器において行った。選別後の純度は、およそ＞95％であった。我々は、生存について染色（生／死染色）されたがアルブミンについては染色されなかった対照サンプルに基づいてしきいを設定した。ゲートは、この対照サンプルの出現率がゼロとみなされるよう線引きした。染色したサンプルにおけるしきいを超えるすべての現象を、陽性とみなした。分析は、FlowJoソフトウェアを用いて行った。FlowJoにおける適切な蛍光チャンネルの幾何学平均を用いて平均蛍光強度（MFI）を計算した。内蔵されているFlowJoアルゴリズムを用いて拡張指数を決定した。
【０１４５】
アルブミン、AFPおよびフィブリノゲンの分泌アッセイ
最後の培地交換の24時間後に、十分に分化したhEBから馴化培地を収集し、-80℃で保存した。分化した胚様体から培養培地中に分泌されたアルブミンを、Human Albumin ELISAキット（Abcam ab108788）を製造元の指示にしたがい用いて定量した。アルファ・フェトプロテイン分泌アッセイの場合、定量は、Alpha Fetoprotein Human SimpleStep ELISAキット（Abcam ab193765）を製造元の指示にしたがい用いて行った。培養上清へのフィブリノゲン分泌は、Fibrinogen Human SimpleStep ELISA Kit（abcam-ab171578）を製造元の指示にしたがい用いて定量した。すべてのサンプルを三連にして行った。
【０１４６】
細胞内尿含量アッセイ
分化したhEB内の総尿含量は、市販のUrea Assay Kit（abcam-ab83362）の特別な緩衝液を製造元の指示にしたがい用いて消化した総クラスターを用いて行った。
【０１４７】
インドシアニングリーン取り込みおよび放出アッセイ
十分に分化したhEBを、製造元の指示にしたがい、37℃で1時間、基準培地中でインドシアニングリーン（IGC、Sigma-Aldrich）と共にインキュベートした。IGCの取り込みを、Olympus IX81を用いた光学顕微鏡により検出した。すべての陽性細胞がIGCを放出したことを確認するため、IGCの放出を6時間後に検出した。
【０１４８】
低密度リポタンパク質（LDL）取り込みアッセイ
分化プロトコルの完了後に、Dil-Ac-LDLを製造元の指示にしたがい用いてLDL取り込みアッセイを行った（Alfa Aesar-J65597）。簡潔に説明すると、細胞を、0.1％ BSAを含む無血清プレインキュベート培地中で一晩インキュベートした。翌日に、分化したhEBを、37℃で5時間、プレインキュベート培地中でDil-Ac-LDL 10μg/mLと共にインキュベートした。インキュベート後、細胞を、プレインキュベート培地で数回洗浄し、4％パラホルムアルデヒドで1時間固定した。固定後に、室温で1時間、核に対するDAPI染色を行った。Olympus IX 81を用いた共焦点顕微鏡により、蛍光画像を取得した。
【０１４９】
過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色
分化したhEBのグリコーゲン貯蔵を、PAS染色を製造元の指示（Sigma-Aldrich）にしたがい用いて評価した。簡潔に説明すると、クラスターを4％パラホルムアルデヒドで1時間固定し、ついで過ヨウ素酸溶液を用いて5分間酸化させ、ついで数回洗浄した。洗浄後、シッフ試薬との15分間のインキュベートを行い、その後にdH2Oを用いて5分間発色させた。染色を、Olympus IX81を用いた光学顕微鏡により検出した。
【０１５０】
オイル・レッド染色
分化後、細胞を、オイル・レッドO染色を製造元のプロトコル（abcam-ab150678）にしたがい用いて脂質小胞貯蔵について試験した。簡潔に説明すると、クラスターを4％パラホルムアルデヒドで1時間固定し、ついでプロピレングリコールと共に2分間インキュベートし、その後にオイル・レッドO溶液と共に6分間インキュベートした。染色後、85％プロピレングリコールとの1分間のインキュベートを行い、その後にdH2Oで2回洗浄した。染色は、Olympus IX81を用いた光学顕微鏡により検出した。
【０１５１】
CYP活性アッセイ
チトクロムP450酵素活性を、P450-Glo（商標）Assay Kit （Promega, Madison, WI）を製造元の指示にしたがい用いて測定した。我々は、異なるP450酵素、特にCYP2B6（450-Glo CYP2B6 - V8321/2 - Promega, Madison, WI）、CYP3A4（P450-Glo CYP3A4 (Luciferin-IPA) - V9001/2 - Promega, Madison, WI）およびCYP1A2（P450-Glo CYP1A2 Induction/Inhibition - V8421/2 - Promega, Madison, WI）の活性を、それらを異なる誘導因子と共にインキュベートすることにより試験した。CYP2B6活性アッセイの場合、未分化のhiPSC、初代肝細胞および分化したHLCを、1000μMフェノバルビタール溶液（Sigma）またはDMSO（0.1％）を含む基準培地と共に48時間インキュベートした。CYP3A4活性アッセイの場合、未分化のhiPSC、初代肝細胞および分化したHLCを、20μMリファンピシン溶液（Sigma）またはDMSO（0.1％）を含む基準培地と共に48時間インキュベートした。CYP1A2活性アッセイの場合、未分化のhiPSC、初代肝細胞および分化したHLCを、50μMオメプラゾール溶液（Sigma）またはDMSO（0.1％）を含む基準培地と共に48時間インキュベートした。各酵素の活性の測定は、ルミノメーター（Synergy H1 Hybrid Reader - Biotek）を製造元の指示にしたがい用いて発光を読み取ることによって行った。すべての実験を三連で行った。
【０１５２】
アンモニア代謝アッセイ
アンモニア代謝を、塩化アンモニウムの添加後24時間にわたる細胞培養上清におけるアンモニア濃度の変化により評価した。1 mMの塩化アンモニウム標準を、懸濁物中に100個の分化した胚葉体を含む培養皿に添加した。塩化アンモニウム添加後1、6および24時間の間隔で、上清を収集し、比色アンモニアアッセイキット（BioVision, Milpitas, CA）を用いてアンモニウム濃度を測定した。
【０１５３】
細胞移植
The Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)が、本研究における実験のための動物の使用を承認した。Hanks Balanced Salt Solution（Sigma-Aldrich）に溶解させた950 mg kg-1の滅菌D-ガラクトサミンの腹腔内注射によって、270〜350 gの無胸腺ヌードラット（Crl:NIH-Foxn1rnu, Charles River Laboratories, Wilmington, MA）において急性肝不全を誘導した。最初に、3Dクラスター（オルガノイド）を上記の培養条件から収集し、D5LR溶液で洗浄した。このクラスターは、hiPSCのみ、またはhiPSC+EC+MSCの混合物を含むものであり得る。Rock阻害剤を使用せずに3Dクラスターを調製した。吸入麻酔の下、80〜100個のhiPSC-EB-HLCを、3Dクラスターとして、脾臓の尾極を通じて脾臓本体に注射した。注射後、尾極を結紮した。この実験グループは、阻害剤で処置されたhiPSC-EB-HLCを移植された動物および阻害剤を用いずに処置されたhiPSC-EB-HLCを移植された動物からなるものであった。陰性対照は、肝細胞培地のみを投与された動物および未分化hiPSC胚様体を移植された動物からなるものであった。健常対照は、hiPSC-EBを移植された肝臓損傷を有さない動物からなるものであった。これらの動物を、毎日モニタリングし、標準的な食事および水を自由に与えた。動物の生存を、主要評価項目として追跡した。14日後にまたは瀕死の見た目もしくは30％超の体重減を示した場合はそれより早く、既定の人道的処置基準にしたがって屠殺した。すべての実験を、承認されたIACUCガイドラインにしたがい行った。
【０１５４】
血清分析
移植前、移植48〜72時間後、および屠殺時に、尾静脈から瀉血した。全血における血清アラニントランスアミナーゼ（ALT）の濃度を、VetScan 2.0（Abaxis, Union City, CA）を用いて測定した。ラット血清におけるヒトアルブミンの存在を、ラットアルブミンに対して非交差反応性であるHuman Albumin ELISA Quantitation Set（Bethyl Laboratories）を用いて評価した。
【０１５５】
組織学および免疫組織化学
肝臓および脾臓サンプルを、屠殺時または死亡時に収集し、10％中性緩衝化ホルマリンで固定した。その後、細胞をパラフィンで包埋し、切片化し、組織学的評価のためにヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。
【０１５６】
パラフィン包埋したスライドを、キシレン置換およびエタノールを用いて脱パラフィン化し、ラット肝臓および脾臓切片において免疫組織化学を行いヒトアルブミンの存在を同定した。脱パラフィン化後、内因性ペルオキシダーゼ活性を4％過酸化水素でブロックした。
【０１５７】
ヒトアルブミン検出のために、非特異的結合を2％ロバ血清で60分間ブロックし（Sigma-Aldrich）、このスライドをヒトアルブミン一次抗体に対する非交差反応性ヤギ抗体（Bethyl Laboratories；1:500）と共に60分間インキュベートした。使用した二次抗体は、60分間の、ヤギIgGに対するHRP結合ロバ抗体（Santa Cruz; 1:200）であった。
【０１５８】
ラット肝臓切片の免疫蛍光染色のために、スライドを4％(wt/vol)パラホルムアルデヒドで30分間固定し、PBS中0.3％(vol/vol)Triton-X 100で30分間透過処理し、PBS中0.5％(vol/vol)ヤギ血清（Sigma-Aldrich）を用いて室温で1時間ブロックした。サンプルを、4℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートした。数回の洗浄後、サンプルを、室温で1時間、二次抗体と共にインキュベートした。以下のヒト特異的一次抗体を使用した：マウス抗ヒトHNF-3β（RY-7）（Santa Cruz, sc-101060; 1:100）およびウサギ抗ヒトC-MET（Santa Cruz, sc-10; 1:100）。
【０１５９】
統計学的分析
量的データは、平均±標準偏差で表されている。比較は、カテゴリー変数についてはフィッシャーの正確確率検定またはカイ二乗検定、連続型変数についてはスチューデントt検定または分散分析を用いて行った。すべての統計学的分析を、JMP 9.0（Stata Corp LP, College Station, TX）を用いて行った。
【０１６０】
移植用の肝細胞様細胞を調製するプロトコル
分化の後直ちに、肝細胞様細胞を、5％デキストロースを含む乳酸リンゲル液（D5LR+5％デキストロース）である移植培地に再懸濁する。再懸濁の後、トリパンブルー除去アッセイを使用して細胞生存率を決定する。生存対非生存細胞比は、正確な細胞数を提供した。（灌流および単離後の）移植が意図されているヒト肝細胞様細胞を、最終細胞混合物として調製し、ついで細胞を移植培地に再懸濁した。
【０１６１】
担当医および担当放射線医が調製されたヒト肝細胞を送達する部位を決定した後、その部位において、調製された肝細胞の注射の準備をする。患者の疾患および細胞注入に最適な部位の決定に基づき、担当医が、画像下治療医に、肝細胞および肝細胞様細胞（HLC）の脾臓または門脈内のいずれかへの投与のためにカテーテルを挿入および設置する場所を指示する。ついで滅菌細胞を慎重に滅菌ガラス管に移動させ、D5LR+5％を含む緩衝液中に細胞を均一に分布させる穏やかな揺動動作の下、ゆっくりと注射する。門脈および脾動脈への細胞混合物の流れをモニタリングする。担当医および担当放射線医は、ヒト肝細胞移植実務に関して以前に記載されたように細胞投与およびカテーテル導入にとって最も安全かつ最適な経路を決定する（Strom S.C. et al., Transplantation. 63(4):559-569, 1997）。
【０１６２】
ヒト肝細胞の凍結保存。直ちに調査または臨床細胞移植に使用しない肝細胞様細胞は、凍結保存され得る。細胞を凍結保存するために、細胞を、ウィスコンシン大学（ベルザー）溶液（VIASPAN）中で凍結させ、これに10％ DMSO（Sigma）を補充した。ついで、肝細胞／細胞凍結溶液混合物を、冷凍バイアル（2 ml、5 mlもしくは13 ml）または冷凍バッグに入れ、この肝細胞／細胞凍結溶液混合物のこれらのバイアル／バッグを、2〜3時間、-20冷凍庫に直接入れる。ついでこのバイアル／バッグを-70〜-80℃冷凍庫に移す。臨床状況下での将来の患者への細胞移植のための細胞の出荷の承認の下、凍結させた肝細胞は、それらの細胞が6ヶ月以内に使用されない場合、長期保存のためにCryoplus液体窒素タンク（LN2）に入れることができる。
【０１６３】
23. 幹細胞ロット出荷基準は以下の通りである：
a.  生存性試験＝トリパンブルーアッセイ＝≧70％。ロット出荷前。
b.  収量試験＝トリパンブルーアッセイ＝≧250 x 10^6の総細胞量。ロット出荷前。
c.  グラム染色試験＝グラム法（クリスタルバイオレット、グラムヨウ素）＝陰性。ロット出荷前。
d.  滅菌性＝USP 71および21 CFR 610.12準拠。陰性。24時間レポート時に陰性。第7日および第14日の結果も追跡する。
e.  細胞の同一性＝顕微鏡試験（10倍および40倍コンピュータ画像）。細胞の同一性。ロット出荷前。
f.  細胞の機能＝CYP P450発光アッセイ。機能の決定。後で。
g.  内毒素＝定量カブトガニ（Limulus Amebocyte）溶解産物試験≦最終産物ボリュームのEU/kgレシピエント体重、ロット出荷前に組織内で実施。（2011年時点で、これはFDA推奨ロット出荷試験としてもはや必要とされていないが、なおも試験として推奨される。）
【０１６４】
他の態様
上記から、本明細書に記載される発明に対して、それを様々な用途および条件に適合させるよう変更および改変が加えられ得ることが明らかであろう。そのような態様もまた、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【０１６５】
本明細書中での任意の可変要素の定義における要素のリストの記載は、任意の単一の要素またはリスト中の要素の組み合わせ（もしくは部分的組み合わせ）としてのその可変要素の定義を含む。本明細書における態様の記載は、任意の単一の態様または任意の他の態様もしくはそれらの一部分との組み合わせとしてのその態様を含む。
【０１６６】
本明細書で言及されているすべての特許および刊行物は、各々個々の特許および刊行物が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ】
2020533025.tif 000008
【図１Ｂ】
2020533025.tif 000009
【図１Ｃ】
2020533025.tif 000010
【図２Ａ】
2020533025.tif 000011
【図２Ｂ】
2020533025.tif 000012
【図２Ｃ】
2020533025.tif 000013
【図２Ｄ】
2020533025.tif 000014
【図２Ｅ】
2020533025.tif 000015
【図２Ｆ】
2020533025.tif 000016
【図３Ａ】
2020533025.tif 000017
【図３Ｂ】
2020533025.tif 000018
【図３Ｃ】
2020533025.tif 000019
【図３Ｄ】
2020533025.tif 000020
【図４Ａ】
2020533025.tif 000021
【図４Ｂ】
2020533025.tif 000022
【図４Ｃ】
2020533025.tif 000023
【図４Ｄ】
2020533025.tif 000024
【図４Ｅ】
2020533025.tif 000025
【図５Ａ】
2020533025.tif 000026
【図５Ｂ】
2020533025.tif 000027
【図５Ｃ】
2020533025.tif 000028
【図５Ｄ】
2020533025.tif 000029
【図６Ａ】
2020533025.tif 000030
【図６Ｂ】
2020533025.tif 000031
【図６Ｃ】
2020533025.tif 000032
【図６Ｄ】
2020533025.tif 000033
【図６Ｅ】
2020533025.tif 000034
【図６Ｆ】
2020533025.tif 000035
【図７】
2020533025.tif 000036
【図８】
2020533025.tif 000037
【図９】
2020533025.tif 000038
【図１０】
2020533025.tif 000039
【図１１Ａ】
2020533025.tif 000040
【図１１Ｂ】
2020533025.tif 000041
【図１１Ｃ】
2020533025.tif 000042
【図１２Ａ】
2020533025.tif 000043
【図１２Ｂ】
2020533025.tif 000044
【図１２Ｃ】
2020533025.tif 000045
【図１２Ｄ】
2020533025.tif 000046
【図１３Ａ】
2020533025.tif 000047
【図１３Ｂ】
2020533025.tif 000048
【図１３Ｃ】
2020533025.tif 000049
【図１３Ｄ】
2020533025.tif 000050
【図１４Ａ】
2020533025.tif 000051
【図１４Ｂ】
2020533025.tif 000052
【図１４Ｃ】
2020533025.tif 000053
【図１４Ｄ】
2020533025.tif 000054
【図１４Ｅ】
2020533025.tif 000055
【図１５Ａ】
2020533025.tif 000056
【図１５Ｂ】
2020533025.tif 000057
【図１５Ｃ】
2020533025.tif 000058
【図１５Ｄ】
2020533025.tif 000059
【図１６Ａ】
2020533025.tif 000060
【図１６Ｂ】
2020533025.tif 000061
【図１６Ｃ】
2020533025.tif 000062
【図１６Ｄ】
2020533025.tif 000063
【図１６Ｅ】
2020533025.tif 000064
【図１６Ｆ】
2020533025.tif 000065
【図１６Ｇ】
2020533025.tif 000066
【図１６Ｈ】
2020533025.tif 000067
【図１６Ｉ】
2020533025.tif 000068
【図１７Ａ】
2020533025.tif 000069
【図１７Ｂ】
2020533025.tif 000070
【図１７Ｃ】
2020533025.tif 000071
【図１７Ｄ】
2020533025.tif 000072
【図１７Ｅ】
2020533025.tif 000073
【図１７Ｆ】
2020533025.tif 000074
【図１７Ｇ】
2020533025.tif 000075
【国際調査報告】
2020533025.tif 000076