(57)【要約】  本発明は、ＣＤ６の過剰なリン酸化を直接低減させること、および、Ｔ細胞活性化およびシグナル伝達と関連する主要な分子のドッキングを防止することによる、活性化ＡＬＣＡＭ−ＣＤ６共刺激シグナルの減少を伴う、イトリズマブの作用の主要なメカニズムを開示する。【選択図】図４
2020504597.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のリン酸化を低減させる方法であって、
宿主細胞を、配列番号１および２にそれぞれ記述されたとおりの重鎖および軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗ＣＤ６抗体と接触させることを含み、ＣＤ６上のＤ１受容体へのモノクローナル抗ＣＤ６抗体の結合が、ＡＬＣＡＭとＣＤ６のＤ３受容体との相互作用にとっての立体障害を引き起こし、それによってＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のＣＤ６受容体のリン酸化の低減を引き起こす、
前記方法。
【請求項２】
モノクローナル抗ＣＤ６がイトリズマブである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のＣＤ６のリン酸化の低減が、ＺＡＰ７０とＳＬＰ−７６とのドッキングの低減をもまた引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のＣＤ６受容体の、低減したリン酸化が、ホスファターゼＳＨＰ１およびＳＨＰ２の発現の低減を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
宿主細胞がヒト対象におけるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
イトリズマブ抗体が、ＣＤ６へのＤ３でのＡＬＣＡＭの結合を阻害しないが、免疫シナプスでの立体障害に起因して、形成されたＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体の完全相互作用を阻害する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
免疫シナプスでの立体障害に起因して、形成されたＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体の完全相互作用を阻害する方法であって、
宿主細胞を、配列番号１および２にそれぞれ記述されたとおりの重鎖および軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗ＣＤ６抗体と接触させることを含み、ＣＤ６上のＤ１受容体へのモノクローナル抗ＣＤ６抗体の結合は、ＡＬＣＡＭとＣＤ６のＤ３受容体との相互作用にとっての立体障害を引き起こし、それによってＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のＣＤ６受容体のリン酸化の低減を引き起こす、
前記方法。
【請求項８】
モノクローナル抗ＣＤ６がイトリズマブである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のＣＤ６のリン酸化の低減が、ＺＡＰ７０とＳＬＰ−７６とのドッキングの低減をもまた引き起こす、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のＣＤ６受容体の、低減したリン酸化が、ホスファターゼＳＨＰ１およびＳＨＰ２の発現の低減を引き起こす、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
宿主細胞がヒト対象におけるものである、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
イトリズマブ抗体が、ＣＤ６へのＤ３でのＡＬＣＡＭの結合を阻害しないが、免疫シナプスでの立体障害に起因して、形成されたＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体の完全相互作用を阻害する、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
ホスファターゼＳＨＰ１およびＳＨＰ２の発現を阻害する方法であって、
宿主細胞を、配列番号１および２にそれぞれ記述されたとおりの重鎖および軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗ＣＤ６抗体と接触させることを含み、ＣＤ６上のＤ１受容体へのモノクローナル抗ＣＤ６抗体の結合が、ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のＣＤ６受容体のリン酸化の低減を引き起こし、それによってホスファターゼＳＨＰ１およびＳＨＰ２の発現を低減させる、
前記方法。
【請求項１４】
モノクローナル抗ＣＤ６がイトリズマブである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のＣＤ６のリン酸化の低減が、ＺＡＰ７０とＳＬＰ−７６とのドッキングの低減をもまた引き起こす、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
宿主細胞がヒト対象におけるものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
イトリズマブ抗体が、ＣＤ６へのＤ３でのＡＬＣＡＭの結合を阻害しないが、免疫シナプスでの立体障害に起因して、形成されたＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体の完全相互作用を阻害する、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１０月１８日にインド特許庁に出願されたインド仮特許出願第２０１６４１０３５６０２号の利益および優先権を主張するものである。２０１６年１０月１８日に出願された当該出願の内容は、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書中に組み込まれ、これは、ＰＣＴの規則４．１８の規定による、ＰＣＴの規則２０．５（ａ）において言及された、本明細書に含まれない明細書、請求の範囲または図面のあらゆる要素または部分を包含する。
【０００２】
技術分野
本発明は、胸腺上皮細胞、単球、活性化Ｔ細胞および種々の他の細胞種の表面に存在するＣＤ６のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン１（Ｄ１）に結合するヒト化ＩｇＧ１アイソタイプ抗ＣＤ６モノクローナル抗体（Ｔ１ｈ）に関する。本発明は、ＴヘルパーおよびＴリンパ球細胞によって媒介される疾患状態の防止を包含する処置のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
本発明の背景
Ｔ細胞活性化、分化および機能は、多様な発現、構造および機能を有する共刺激および共阻害受容体によって制御され、大きく状況に依存する。ＴＣＲの活性化およびその後のＺＡＰ７０のリン酸化は、ＴＣＲ複合体へのＣＤ６の会合（ここでＣＤ６は、アダプターまたはドッキングタンパク質であるＬＡＴとは独立してＳＬＰ−７６およびグアニンヌクレオチド因子Ｖａｖ１のリクルートを許容するスキャフォールドタンパク質のように作用する）を促進した（Roncagalli R et al, 2016）。加えて、ＣＤ６の細胞質尾部上のチロシン、セリンおよびトレオニン残基での過剰なリン酸化が、ＳＬＰ−７６などのアダプター分子へのＣＤ６の結合をもたらし、これに続いて時間および用量依存的なＭＡＰＫ活性化が起こる（Nair P et al, 2010）。
【０００４】
ＣＤ６は、その単独の発現のみで、すなわち、リガンド関与の非存在下においてさえも、Ｔ細胞におけるシグナル伝達を抑制するのに充分である、シグナル伝達アテニュエーターとして同定された（Oliveira L et al, 2012）。さらに最近、Orta-Mascaro M et al., 2016は、ＣＤ６が無効化されたマウスでは、胸腺における負の選択と、末梢における自己または環境抗原に応答した活性化の増大があることを示していた。この知見は、メモリーおよび制御性の表現型を持つＴ細胞サブセットの拡大によって示唆され、ＣＤ６について阻害機能を示唆している。
【０００５】
ＣＤ６は、Ｔ細胞の調節と関連し、複数の自己免疫疾患に関係している。WO/2009/113083は、ヒト化ＩｇＧ１アイソタイプ抗ＣＤ６抗体（Ｔ１ｈ）が、胸腺上皮細胞、単球、活性化Ｔ細胞および種々の他の細胞種の表面に存在するＣＤ６のスカベンジャー受容体システインリッチ（ＳＲＣＲ）ドメイン１（Ｄ１）に結合することを示した。両方ともスカベンジャー受容体システインリッチドメインスーパーファミリー（ＳＲＣＲ−ＳＦ）のメンバーであり相当の構造上および機能上の相同性を共有するＣＤ６およびＣＤ５は、それぞれ個別に、ナイーブＴ細胞をプライミングしてＴｈ１７細胞へと分化させるための古典的なＣＤ２８媒介性の抗ＣＤ３との共刺激よりも優れていることが見出された。
【０００６】
WO/2015/011658は、ＣＤ６ドメイン１特異的なヒト化モノクローナル抗体であるイトリズマブが、抗ＣＤ３抗体で刺激されたかまたはＡＬＣＡＭと共刺激されたときに、Ｔリンパ球の増殖およびサイトカイン生産を、阻害したことを実証した。イトリズマブはまた、ＩＬ−１７が引き金となる発病機序を有することが知られているヒトの疾患における有効性をも実証している。
【０００７】
イトリズマブは、ＡＬＣＡＭとＣＤ６ドメイン３の結合を妨げることなくＣＤ６のドメイン１に結合する、ヒト化ＩｇＧ１の非枯渇型（non-depleting）モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。最近のイトリズマブでの臨床試験は、乾癬および関節リウマチの患者における有効性を実証しており、この薬物は、インドにおいて乾癬の処置のために承認されている（Krupashankar DS et al, 2014）。しかしながら、この薬物の作用機序は明確には理解されていない。ゆえに、イトリズマブについての作用機序を発見することが有益となる。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ＣＤ６の過剰なリン酸化を直接低減させること、および、Ｔ細胞シグナル伝達、活性化および増殖と関連する主要な分子のドッキングを防止することによる、活性化ＡＬＣＡＭ−ＣＤ６共刺激シグナルの減少を伴う、イトリズマブの作用の主要なメカニズムを開示する。
【０００９】
１つの側面において、本発明は、ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のリン酸化を低減させる方法を提供し、方法は：
宿主細胞を、配列番号１および２にそれぞれ記述されたとおりの重鎖および軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗ＣＤ６抗体と接触させることを含み、ここで、ＣＤ６上のＤ１受容体へのモノクローナル抗ＣＤ６抗体の結合は、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）とＣＤ６のＤ３受容体との相互作用にとっての立体障害を引き起こし、それによってＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のＣＤ６受容体のリン酸化の低減を引き起こす。好ましくは、モノクローナル抗ＣＤ６は、イトリズマブである。
【００１０】
重要なことに、ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のＣＤ６のリン酸化の低減は、ＺＡＰ７０（Ｔ細胞応答を開始させるのに不可欠な役割を担う細胞質タンパク質チロシンキナーゼ）とＳＬＰ−７６（ドッキング分子）とのドッキングの低減をもまた引き起こし、それによってホスファターゼＳＨＰ１およびＳＨＰ２の発現を低減させる。
【００１１】
さらに別の側面において、本発明は、免疫シナプスでの立体障害に起因して、形成されたＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体の完全相互作用を阻害する方法を提供し、方法は：
宿主細胞を、配列番号１および２にそれぞれ記述されたとおりの重鎖および軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗ＣＤ６抗体と接触させることを含み、ここで、ＣＤ６上のＤ１受容体へのモノクローナル抗ＣＤ６抗体の結合は、ＡＬＣＡＭとＣＤ６のＤ３受容体との相互作用にとっての立体障害を引き起こし、それによってＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のＣＤ６受容体のリン酸化の低減を引き起こす。好ましくは、モノクローナル抗ＣＤ６は、イトリズマブである。
【００１２】
さらなる側面において、本発明は、ＣＤ６のＤ３へのＡＬＣＡＭの結合によって誘導されるＣＤ６受容体のリン酸化の低減を提供し、方法が：
宿主細胞を、ＣＤ６のＤ１に結合する抗ＣＤ６抗体と接触させることを含み、ここで、抗ＣＤ６抗体は、配列番号１および２にそれぞれ記述されたとおりの重鎖および軽鎖可変領域を含み、ここで、ＣＤ６上のＤ１受容体へのモノクローナル抗ＣＤ６抗体の結合は、ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のＣＤ６受容体のリン酸化の低減を引き起こさせる。
【００１３】
またさらなる側面において、本発明は、ホスファターゼＳＨＰ１およびＳＨＰ２の発現を阻害する方法を提供し、方法は：
宿主細胞を、配列番号１および２にそれぞれ記述されたとおりの重鎖および軽鎖可変領域を含むモノクローナル抗ＣＤ６抗体と接触させることを含み、ここで、ＣＤ６上のＤ１受容体へのモノクローナル抗ＣＤ６抗体の結合は、ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体のＣＤ６受容体のリン酸化の低減を引き起こし、それによってホスファターゼＳＨＰ１およびＳＨＰ２の発現を低減させる。
【００１４】
上で論じた方法における宿主細胞は、好ましくは、乾癬、関節リウマチ、または、患者における自己免疫反応、例えば多発性硬化症または移植拒絶反応と関連する有害反応、移植片対宿主病、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、甲状腺炎および他のＴ細胞媒介性自己免疫疾患のような、炎症状態を調整するための処置を必要とする、ヒト対象におけるものである。
【００１５】
本発明の他の側面、目的、特徴および利点は、本発明の好ましい態様を説明する下記の詳細な説明から当業者には明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、イトリズマブがＣＤ６−ＡＬＣＡＭ共刺激シグナル変換経路を阻害することを示す。ヒトＰＢＭＣを、ＡＬＣＡＭ（１０μｇ／ｍｌ）で被覆されたプレート上に、４０分間、イトリズマブまたはＩｓｏ Ａｂとともにプレーティングした。（Ａ）ＣＤ６を、イトリズマブまたはＩｓｏ Ａｂのいずれかとともに免疫沈降させ、ＣＤ６、ｐ−Ｔｙｒ、Ｚａｐ７０およびＳＬＰ−７６について免疫ブロッティングした（上部のパネル）。下部のパネルは、ＣＤ６、ＺＡＰ７０、およびＳＬＰ−７６についての対応する１０％のインプット対照試料を示す。代表的なブロットは、少なくとも３つの独立した、異なるドナーからの実験からのものである。（Ｂ−Ｄ）３つの独立した実験からの、図Ａに表したとおりのｐ−Ｔｙｒ、Ｚａｐ７０およびＳＬＰ−７６の強度の全体的な定量化が、棒グラフとして示されている。結果は、平均値±ＳＤで表現されている。（Ｅ）（Ａ）に記載されたものと同様の実験を、今度は、ＣＤ６、ｐ−Ｔｙｒについて、およびホスファターゼｐ−ＳＨＰ１、ＳＨＰ１、ｐＳＨＰ２およびＳＨＰ２について免疫ブロッティングして行った。ブロットは、少なくとも３つの独立した、異なるドナーからの実験の代表的なものである。（ＦおよびＧ）３つの独立した実験からの、図Ｅに表したとおりのｐ−ＳＨＰ１およびｐ−ＳＨＰ２の強度の全体的な定量化が、棒グラフとして示されている。結果は、平均値±ＳＤで表現されている。
【００１７】
【図２】図２は、ＭＥＭ−９８抗体を使用してＣＤ６で免疫沈降した試料のＣＤ６ウェスタンブロットを示す。
【図３】図３は、（Ａ）ヒトＰＢＭＣを、０．５ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）で２４時間、イトリズマブまたはＩｓｏ Ａｂの存在下または非存在下で処置したところを示す。ＣＤ６を、イトリズマブとともに免疫沈降させ、ＣＤ６、ｐ−Ｔｙｒ、Ｚａｐ７０およびＳＬＰ−７６について免疫ブロッティングした。対応する１０％のインプット試料を、陰性対照としてランした。代表的なブロットは、２つの独立した実験からである。（Ｂ−Ｄ）ｐ−Ｔｙｒ、Ｚａｐ７０、ＳＬＰ−７６の相対強度の定量化（平均値±ＳＤ）。グラフは、異なる実験条件において倍率の違いを算出するために、２つの独立した実験から導き出された。
【００１８】
【図４】図４は、提唱されるイトリズマブの作用のメカニズムを描いた絵を示す。ここには、ＡＬＣＡＭ−ＣＤ６の最適相互作用が、イトリズマブにより引き起こされる立体障害によって阻害されることが示されている。ＡＬＣＡＭ−ＣＤ６相互作用の阻害は、ＣＤ６の、その細胞質ドメインにおけるリン酸化を減少させ、Ｔ細胞活性化シグナル伝達カスケードの下方制御をもたらす。
【図５】図５は、イトリズマブ抗体の軽鎖可変アミノ酸配列（配列番号１）、重鎖可変アミノ酸配列（配列番号２）、重鎖可変および定常アミノ酸配列（配列番号５）および軽鎖可変および定常アミノ酸配列（配列番号６）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の詳細な記載
本発明は、ＣＤ６のドメイン1（Ｄ１）に結合し、ＡＬＣＡＭによって誘導されるＣＤ６受容体のリン酸化を直接阻害し又は低減させ、その後の関連するＺＡＰ７０（キナーゼ）とドッキングタンパク質ＳＬＰ７６とのドッキングを減少させることを可能とする、抗ＣＤ６モノクローナル抗体を提供する。さらに、ＣＤ６のリン酸化および関連するシグナル伝達分子の、かかる阻害および／または低減は、Ｔ細胞活性化および分化の減少をもたらす。
【００２０】
本発明の実施は、他に指示しない限り、当分野の技術の範囲内である免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学および組換えＤＮＡの、従来技術を採用する。例として、Sambrook, et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 第２版 (1989)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY (F. M. Ausubel, et al. eds., (1987))；METHODS IN ENZYMOLOGYのシリーズ (Academic Press, Inc.): PCR 2: A PRACTICAL APPROACH (M. J. MacPherson、B. D. HamesおよびG. R. Taylor eds. (1995)), HarlowおよびLane, eds. (1988) ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, およびANIMAL CELL CULTURE (R. I. Freshney, ed. (1987))を参照。
【００２１】
定義
本明細書中において他に定義しない限り、本発明に関して使用する科学および技術用語は、当業者に普通に理解されている意味を有するものとする。さらに、別様に文脈から要求されない限り、単数形の用語は複数形を包含するものとし、複数形の用語は単数形を包含するものとする。
本発明を記載およびクレームすることにおいては、以下の専門用語を、本明細書中に定めた定義に従って使用する。
【００２２】
本明細書中において使用する「抗ＣＤ６抗体」は、一般的に、ヒトＣＤ６（ｈＣＤ６）のＳＲＣＲドメイン１（Ｄ１）に特異的に結合する抗体である。本発明の好ましい側面において、ネイティブおよび人工的に改変された抗体および抗体フラグメントを包含する、抗体およびその他の免疫グロブリンであって、ＣＤ６のヒトＳＲＣＲドメイン１に特異的に結合するが、ＣＤ６に活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）が結合することを妨げないものが提供される。
【００２３】
本明細書中において使用する「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）は、実質的に同質である抗体の集団の抗体を指し；つまり、その集団中における個々の抗体は、少量存在し得る自然発生突然変異以外では同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原決定基「エピトープ」に対して向けられている。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、同一のエピトープに向けられた実質的に同質である抗体の集団を意味するが、いかなる特定の方法による抗体の生産を要求すると解されるものでもない。当技術分野において知られているあらゆる手法または方法論によってモノクローナル抗体を作ることができることが理解されるべきであり；例として、当技術分野において知られている組換えＤＮＡ法、またはファージ抗体ライブラリーを使用して組換え技術により生産されたモノクローナルの単離の方法が包含される。
【００２４】
本明細書中において使用する「治療有効量」は、所望の治療結果を達成するための、必要な投薬量及び期間での、有効な量を指す。
本明細書中において記載された本発明の側面は、「からなる」および「から本質的になる」という側面もまた包含することが理解される。
【００２５】
本発明は、配列番号１および配列番号２を含む、ＣＤ６へのＡＬＣＡＭの結合を妨げることなくＣＤ６のＤ１ドメインに特異的に結合することを可能とする抗ＣＤ６モノクローナル抗体を提供する。抗ＣＤ６モノクローナル抗体をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号３および配列番号４を包含するか、または、ヌクレオチド配列は、それらと少なくとも９０％同一性を有し、配列番号１および配列番号２をコードする。
【００２６】
本発明の抗ＣＤ６モノクローナル抗体を生産するための方法
本発明はさらに、開示されている抗ＣＤ６抗体を生産するための方法を提供する。これらの方法は、本発明の抗体をコードする単離された核酸（単数または複数）を含有する宿主細胞を培養することを網羅する。当業者には当然認識される通り、これは、抗体の性質に応じて種々のやり方によって行うことができる。
【００２７】
一般に、本発明の抗体をコードする、核酸が提供される。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡの形とすることができる。ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、核酸類似体、および合成ＤＮＡの形でのポリヌクレオチドは、本発明の範囲内にある。ＤＮＡは、二重鎖または一重鎖であり得、一重鎖であれば、コード（センス）鎖または非コード(アンチセンス)鎖であり得る。抗ＣＤ６モノクローナル抗体をコードするコード配列は、本明細書中において提供されるコード配列と同一であり得、または、その配列が、遺伝子コードの重複もしくは縮退の結果として、本明細書中において提供されるＤＮＡと同じポリペプチドをコードする、異なるコード配列であり得る。
【００２８】
いくつかの態様において、本発明の抗ＣＤ６モノクローナル抗体をコードする核酸（単数または複数）は、染色体外であるかまたはそれが導入される宿主細胞のゲノム中へと組み入れられるように設計されたものであり得る、発現ベクター中へと組み込まれている。発現ベクターは、いくつもの適切な調節配列（転写および翻訳制御配列、プロモーター、リボソーム結合部位、エンハンサー、複製の起点等を包含するが、これに限られない）または他の構成成分（選択遺伝子等）を含有することができ、それらの全てが、当技術分野においてよく知られているとおりに作動可能に（operably）連結している。
【００２９】
いくつかの場合において、２つの核酸が使用され、および各々が異なる発現ベクター中に（例として、重鎖が第１の発現ベクター中に、軽鎖が第２の発現ベクター中に）入れられるか、またはこれに代えて、それらが同じ発現ベクター中に入れられることができる。調節配列の選択を包含する、発現ベクター（単数または複数）の設計は、宿主細胞の選定、所望のタンパク質の発現のレベル等の、かかる因子に依存し得ることが、当業者には当然認識される。
【００３０】
一般に、核酸および／または発現は、選択された宿主細胞に適切なあらゆる方法（例として、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）を使用して組換え宿主細胞を作り出すために、核酸分子（単数または複数）が１つ以上の発現制御エレメントに（例として、ベクター中において、細胞中のプロセスによって作り出されるコンストラクト中、宿主細胞ゲノム中へと組み入れられて）作動可能に連結するように、適切な宿主細胞中へと導入されることができる。結果として生じる組換え宿主細胞は、発現に適切である環境下（例として、インデューサーの存在下で、適切な非ヒト動物中において、適当な塩、増殖因子、抗生物質、栄養補助剤等を補充された適切な培地中において）で維持されることができ、これにより、コードされているポリペプチド（単数または複数）が生産される。いくつかの場合において、１つの細胞中で重鎖が生産され、別の１つの中で軽鎖が生産される。
【００３１】
組換え宿主細胞中においてモノクローナル抗体の合成が得られるように、発現ベクターを、E. coli細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のシミアンＣＯＳ細胞などの哺乳動物細胞、Bacillus、StreptomycesおよびSaccharomycesなどの宿主細胞中へとトランスフェクトすることができる。酵母、昆虫、および植物細胞もまた、組換え抗体を発現するために使用することができる。いくつかの態様において、抗体は、ウシまたはニワトリなどのトランスジェニック動物において生産することができる。
【００３２】
抗体分子生物学、発現、精製、およびスクリーニングについての、一般的な方法は、例えば、Antibody Engineering、Kontermann & Dubel, Springer, Heidelbergによって編集、2001および2010年、において記載されている。
【００３３】
投与方法
以下に記載される使用の方法における投与のために、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、かかる処置を必要とするヒト対象への投与の前に、非毒性の薬学的に許容し得る担体物質（例として、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）と混合されてもよく、あらゆる医学上適当な手順、例として、非経口投与（例として、注入）、例えば静脈内または動脈内注入などによって投与されることとなる。
【００３４】
本発明に従って使用される抗ＣＤ６モノクローナル抗体の処方物は、所望の純度を有する抗体を、任意に、凍結乾燥製剤または水溶液のいずれかの形での薬学的に許容し得る担体、賦形剤または安定化剤とともに、混合することによって調製し得る。
【００３５】
許容し得る担体、賦形剤または安定化剤は、採用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンなどを包含する抗酸化物質；塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムなどの保存料；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノールおよびｍ−クレゾール；低分子（約１０よりも少ない残基の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを包含する単糖類、二糖類、およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例として、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはTWEEN（商標）、PLURONICS（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤、を包含する。
【００３６】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体はまた、コアセルベーション手法により、または界面重合により、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリラート）マイクロカプセルで、それぞれ、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中においてまたはマイクロエマルジョン中において、調製されたマイクロカプセル中に封入されてもよい。かかる手法は、当技術分野においてよく知られている。
【００３７】
徐放性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例は、抗ＣＤ６モノクローナル抗体を含有する固体の疎水性ポリマーの半透過性のマトリックスであって、そのマトリックスが、成形品、例として、フィルムまたはマイクロカプセルの形であるものを包含する。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル、Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性酢酸エチレンビニルおよび分解性乳酸−グリコール酸コポリマーを包含する。
【００３８】
抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、処置を必要とするヒト対象などの哺乳動物に、ボーラスでまたはある期間にわたる持続注入によっての静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳髄腔内、皮下、関節内、滑液内、クモ膜下腔内、または経口経路などの知られている方法に沿って投与され得る。抗ＣＤ６モノクローナル抗体の静脈内または皮下投与が、好ましい。
【００３９】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例として、治療反応）を提供するように加減される。例えば、単回のボーラスが投与されてもよく、複数の分割用量が時間をかけて投与されてもよく、または用量が、治療状況の緊急事態により示唆されるとおりに比例的に低減させられるかもしくは増大させられてもよい。本発明において使用される抗ＣＤ６モノクローナル抗体のための効率的な投薬量および投薬レジメンは、狼瘡型疾患の重症度に依存し、および当業者によって決定され得る。
【００４０】
本発明において使用する抗ＣＤ６モノクローナル抗体の治療有効量の、例示の、限定されない範囲は、対象の体重あたり約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇなど、例えば、約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇである。当技術分野における通常の技術を有する医療専門家は、要求される医薬組成物の有効量を容易に決定し、処方し得る。例えば、医師は、抗ＣＤ６モノクローナル抗体の用量を、所望の治療効果を達成するために必要なそれよりも低いレベルで始めて、所望の効果が達成されるまで投薬量を徐々に増大させることができる。
【００４１】
１つの態様において、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、対象の体重あたり１〜５００ｍｇ／ｋｇ、例えば２０〜２００ｍｇ／ｋｇなどの週間投薬量で、注入により投与される。かかる投与は、繰り返されてもよく、例として、１〜８回、例えば３〜５回などである。代替において、投与は、２〜２４時間の、例えば２〜１２時間などの期間にわたる、持続注入により行われてもよい。
【００４２】
別の態様において、抗ＣＤ６モノクローナル抗体は、１０ｍｇ〜２００ｍｇの週間投薬量で、７回まで、例えば４〜６回など、投与される。投与は、２〜２４時間の、例えば２〜１２時間などの期間にわたる、持続注入により行われてもよい。かかるレジメンは、例えば６か月または１２か月後に、必要に応じて１回以上繰り返されてもよい。
【００４３】
以下の例は、本発明の理解を補助するために記述されているが、いかなるやり方でもその範囲を限定するものと意図するものではなく、またそのように解されてはならない。例は、アッセイ手順において採用されている従来型の方法についての詳細な記載を含んでいない。かかる方法は、当業者によく知られており、ほんの例として包含する多数の刊行物において記載されている。
【００４４】
例
今回の発明者らによる以前の研究は、イトリズマブ（配列番号３および４によってコードされている配列番号１〜２）の添加が、ＣＤ６のドメイン１に結合して、活性化およびＴ細胞のＴｈ１７への分化を低減させ、ＩＬ−１７の生産を減少させることを描いた。これらの効果は、主要な転写因子ｐＳＴＡＴ３およびＲＯＲγＴの低減と関連する。今回の例においては、阻害のメカニズムを理解するために、ＡＬＣＡＭ−ＣＤ６に媒介されるＴ細胞活性化へのイトリズマブの影響を評価した。
【００４５】
イトリズマブおよびニモツズマブ（ヒト化抗ＥＧＦＲであり、Ｆｃ領域がイトリズマブと同一）ｍＡｂの、両方のモノクローナル抗体を、Biocon Ltd（Bangalore, India）にて生産し、全ての実験において、可溶の形で使用した。ニモツズマブは、全ての実験において、非特異的アイソタイプ対照抗体として使用した（Ｉｓｏ Ａｂ）。
【００４６】
イトリズマブはＣＤ６−ＡＬＣＡＭに媒介される共刺激シグナル変換経路を阻害する
イトリズマブに媒介されるＴ細胞活性化の阻害の生理学的基礎を理解するために、活性化ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ相互作用を阻害することにおいて、イトリズマブの役割を調査した。ＣＤ６の下流のシグナル変換を評価するために、プレートに結合されたＡＬＣＡＭの存在下で、ＰＢＭＣをイトリズマブありおよびなしで処置した。
【００４７】
この実験において、６ウェルプレートを、ＴＳＭ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１×プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を添加済）中のＦｃ−ＡＬＣＡＭ（１０μｇ／ｍｌ）で終夜被覆した。実験当日に、被覆されたプレートを、ＴＳＭ緩衝液中の１％ＢＳＡでブロッキングした。ヒトＰＢＭＣ（６ウェルプレート中５×１０６／ウェル）をプレーティングし、４０分間、イトリズマブまたはＩｓｏ Ａｂで処置した。
【００４８】
この技術を使用して、ＡＬＣＡＭ依存のＣＤ６のリン酸化、および免疫沈降したＣＤ６タンパク質からのＣＤ６相互作用分子について調査した。イトリズマブによる等しいＣＤ６のプルダウンを、イトリズマブおよびＭＥＭ−９８の２つの異なる抗体を使用したＣＤ６免疫ブロットによって確認した（図１および図２）。プルダウンされたＣＤ６タンパク質のチロシンリン酸化を調査し、結果は、ＡＬＣＡＭ−ＣＤ６相互作用がＣＤ６のチロシンリン酸化を、２．５倍を超えて増大させたことを示した。このリン酸化の増大は、イトリズマブによって阻害された。既知のＣＤ６の結合パートナーであるＺａｐ７０（キナーゼ）およびＳＬＰ−７６（シグナル伝達および／またはドッキングタンパク質）を、免疫沈降したＣＤ６とのそれらの会合について検査した。ＡＬＣＡＭ−ＣＤ６相互作用は、ＳＬＰ−７６およびＺａｐ７０のＣＤ６との会合を３〜４倍増大させ、および、先と同様に、これはイトリズマブによって阻害された（図１）。
【００４９】
受容体のリン酸化は、ホスファターゼの発現によって制御される。ＳＨＰ１およびＳＨＰ２は、受容体タンパク質と関連し、それらのリン酸化を制御し、それによってシグナル伝達を調整することが知られている主要なホスファターゼである。免疫沈降したＣＤ６との、これらのタンパク質の会合およびリン酸化を、イトリズマブに媒介される阻害について調査した。
【００５０】
図２に示すとおり、ＡＬＣＡＭ−ＣＤ６相互作用の結合複合体は、ＣＤ６に関連するＳＨＰ１およびＳＨＰ２のリン酸化を３〜４倍増大させた。しかしながら、しかも驚くべきことに、イトリズマブの使用は、ＣＤ６と関連する全体のおよびリン酸化した（活性化した）ＳＨＰ１およびＳＨＰ２の両方を阻害し、それによってそれらの発現をベースラインのレベルまで持っていった（図１）。これらの結果は、イトリズマブによるＴ細胞活性化の阻害が、ホスファターゼの過剰発現または活性化を通じてではなく、ＳＨＰ１およびＳＨＰ２とは独立した、ＣＤ６の過剰なリン酸化の直接的な減少によってであるということを提案する。
【００５１】
ＡＬＣＡＭ−ＣＤ６の効果をより生理学的に適した条件で証明するために、ＴＣＲ活性化の実験を使用した。これらの実験において、ＰＢＭＣを０．５ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）で２４時間、イトリズマブまたはＩｓｏ Ａｂ抗体の存在下または非存在下で処置した。細胞を収穫し、ＣＤ６をイトリズマブまたはＩｓｏ Ａｂとともに免疫沈降させた。１０％の全ライセートは、インプット対照試料として用いられた。免疫沈降した試料およびインプット対照試料の両方を、免疫ブロッティングして分析した。
【００５２】
ここに、結果は、抗ＣＤ３によって媒介される活性化は、ＣＤ６のリン酸化、Ｚａｐ７０およびＳＬＰ−７６のＣＤ６との会合を、それぞれ２．５〜３倍増大させたことを示す。図３に示すとおり、全ての場合において、これらの活性化シグナルはイトリズマブの存在下で完全に阻害された。これらの結果は、全体として、イトリズマブの作用の主要なメカニズムは、ＣＤ６の過剰なリン酸化を直接低減させることおよびＴ細胞シグナル伝達、活性化および増殖と関連する主要な分子のドッキングを防止することによる、活性化ＡＬＣＡＭ−ＣＤ６共刺激シグナルの減少を伴うものであるということを示唆する。
【００５３】
本発明は、分子レベルで、イトリズマブが、Ｔ細胞活性化にとって不可欠であるＣＤ６−ＡＬＣＡＭの最適な関与を防止するということを示す。かかる相互作用についての理論モデルは、図４に示されている。クラスター化とは、Ｔ細胞の膜上のＣＤ６受容体の蓄積を指す。
【００５４】
免疫シナプスでのＣＤ６の蓄積（クラスター化）は、抗原提示細胞上のＡＬＣＡＭと相互作用することによるＣＤ６受容体の活性化を開始させ、それによってＣＤ６−ＡＬＣＡＭ複合体を形成する。このモデルにおいて、イトリズマブは、ＣＤ６のドメイン１に結合すると、立体障害を提供し、ＣＤ６のドメイン３（Ｄ３）とのＡＬＣＡＭの最適な相互作用を防止するということが提案される。この立体障害は、この共刺激分子ＣＤ６により媒介されるＴ細胞シグナル伝達の減弱を、結果としてもたらす。ＣＤ６がクラスター化されていない、他の状況下では、先に報告されたとおり、イトリズマブはＡＬＣＡＭ−ＣＤ６相互作用を防止も妨げもしない。これは、それによって活性化ＡＬＣＡＭ−ＣＤ６相互作用がブロックされる、イトリズマブの作用の主要なメカニズムを説明づける。
【００５５】
参考
本明細書中において引用されているあらゆる参考文献の内容は、全ての目的のために参照により本明細書中に組み込まれる。
【００５６】
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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