(57)【要約】  ドナー構築体、遺伝子ノックアウト方法、そのシステムおよびキットが提供される。前記ドナー構築体は、線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものである。前記遺伝子ノックアウト方法では、ドナー構築体に含まれるマーカー遺伝子は使用されて、遺伝子がノックアウトされた細胞は濃縮され、配列特異的なヌクレアーゼによる遺伝子ノックアウトの生成効率は向上させられる。
2020533017.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるユニバーサルドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、
前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記ユニバーサル標的配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムに存在しない、ユニバーサルドナー構築体。
【請求項２】
線形ドナーＤＮＡ、好ましくは二本鎖線形ドナーＤＮＡであり、
好ましくは、前記線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端のみにおいて前記ユニバーサル標的配列を有するか、または前記線形ドナーＤＮＡは両端にそれぞれ前記ユニバーサル標的配列を有し、
より好ましくは、前記マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である、請求項１に記載のユニバーサルドナー構築体。
【請求項３】
前記保護配列の長さが５〜３０ｂｐであり、もっとも好ましくは２０ｂｐであり、
好ましくは、前記ユニバーサル標的配列は、５’−ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ−３’または５’−ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ−３’を含む、請求項１〜２のいずれか一項に記載のユニバーサルドナー構築体。
【請求項４】
（１）下記の：
（ａ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ；
（ｂ）細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡ；
（ｃ）線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるユニバーサルドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、
前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記ユニバーサル標的配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在しない、ユニバーサルドナー構築体；および
（ｄ）線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｇＲＮＡ
を細胞に導入するステップ；
（２）前記線形ドナーＤＮＡを、非相同末端結合を介して細胞ゲノムの特定の標的部位に挿入するステップ；および
（３）前記マーカーの発現が陽性である細胞をスクリーニングするステップ
を含む、細胞内で遺伝子ノックアウトを生成する方法。
【請求項５】
前記ユニバーサルドナー構築体は、線形ドナーＤＮＡ、好ましくは二本鎖線形ドナーＤＮＡであり、
より好ましくは、前記線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端のみにおいて前記ユニバーサル標的配列を有するか、または前記線形ドナーＤＮＡは両端にそれぞれ前記ユニバーサル標的配列を有する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡが、一種のｇＲＮＡ、または細胞ゲノムの異なる標的配列を認識する複数のｇＲＮＡであり、
好ましくは、前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡがｓｇＲＮＡであり、および／または、前記線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｇＲＮＡがｓｇＲＮＡであり、
より好ましくは、前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｓｇＲＮＡと、前記線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｓｇＲＮＡとは、同じベクターに位置し、または、
前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｓｇＲＮＡと、前記線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｓｇＲＮＡとは、異なるベクターに位置する、
請求項４〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子であり、
好ましくは、薬剤耐性により細胞をスクリーニングするか、またはＦＡＣＳ法により細胞をスクリーニングし、
好ましくは、前記保護配列の長さが５〜３０ｂｐであり、もっとも好ましくは２０ｂｐであり、
より好ましくは、前記ユニバーサル標的配列は、５’−ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ−３’または５’−ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ−３’を含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
（１）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはＣａｓ９ヌクレアーゼを発現することができるベクターまたは細胞；
（２）細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡ；
（３）線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるユニバーサルドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、
前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記ユニバーサル標的配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在しない、ユニバーサルドナー構築体；および
（４）線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｇＲＮＡ
を含む、遺伝子ノックアウトのためのシステムまたはキット。
【請求項９】
前記ユニバーサルドナー構築体は、線形ドナーＤＮＡ、好ましくは二本鎖線形ドナーＤＮＡであり、
好ましくは、前記線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端のみにおいて前記ユニバーサル標的配列を有するか、または前記線形ドナーＤＮＡは両端にそれぞれ前記ユニバーサル標的配列を有し、
より好ましくは、前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡが、一種のｇＲＮＡ、または細胞ゲノムの異なる標的配列を認識する複数のｇＲＮＡであり、
さらに好ましくは、前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡがｓｇＲＮＡであり、および／または、前記線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｇＲＮＡがｓｇＲＮＡであり、
特に好ましくは、前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｓｇＲＮＡと、前記線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｓｇＲＮＡとは、同じベクターに位置し、または、
前記細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｓｇＲＮＡと、前記線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｓｇＲＮＡとは、異なるベクターに位置する、
請求項８に記載のシステムまたはキット。
【請求項１０】
前記マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子であり、
好ましくは、前記保護配列の長さが５〜３０ｂｐであり、もっとも好ましくは２０ｂｐであり、
さらに好ましくは、前記ユニバーサル標的配列は、５’−ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ−３’または５’−ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ−３’を含む、請求項９に記載のシステムまたはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子編集技術に関し、特に遺伝子ノックアウト方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
遺伝子編集技術は、遺伝子機能についての実験的研究を徹底的に変革した。ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）［１］、ＴＡＬＥＮｓ（転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）［２〜４］、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム［５〜７］の３つの主要な技術は、異なるメカニズムを利用して配列特異的な二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ，ＤＳＢｓ）を生成し、そして自然修復システムを誘発して配列特異性修復を完成する［８、９］。これらの技術は、機能的遺伝子研究［１０］、染色体部位の動的およびリアルタイムイメージング［１１、１２］、疾患突然変異の修正［１３］、遺伝子治療［１４］などにおいて広く使用されている。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、その効率と操作の容易さのため特に人気がある。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、もともと細菌免疫システムが外来ウイルスまたはプラスミドを防御するために使用されており、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムでは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼがｓｇＲＮＡに導かれて二本鎖ＤＮＡを切断し、ゲノムの二本鎖の切断を引き起こし、細胞のゲノム修復の不安定性を利用して修復エラー（塩基の欠失または挿入）を生成し、これによって遺伝子編集の効果を生じる。
【０００３】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、設計に基づいた、配列特異的なゲノム研究において未曾有の優勢を持っているが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムによって引き起こされた遺伝子編集は、細胞集団ではまだまれなイベントであり、真に遺伝子が編集されたモノクローンを得るには煩瑣な労力が必要である。そのため、哺乳動物細胞で遺伝子ノックアウトを生成するなどの簡単な作業であっても、このシステムは依然として技術上では困難である［１５］。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを組み込んでＣａｓ９とｓｇＲＮＡを恒久的に発現させたり［１６］、Ｃａｓ９を安定的に発現する細胞株を予め生成したり［１７］、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を増強したり［１８］、特異的な薬剤によるスクリーニングが可能な単独の遺伝子を同時に破壊することによって遺伝子‐標的イベントを濃縮したり［１９］、サロゲートレポーター（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ）を使用して遺伝子ノックアウトを濃縮したり［２０、２１］して、さまざまな努力で遺伝子ノックアウトを生成するスキームの効率を高めている。しかしながら、さまざまな欠点により、これらの技術の広範な使用は制限されている。特に、哺乳動物細胞で複数遺伝子ノックアウトを生成することは困難な作業のままである。従来の方法を使用する時、単一の遺伝子をノックアウトする場合でも、標的遺伝子修復を含む希少なクローンに対する効率的な濃縮が欠けているため、長時間、多くて重く、かつリスクの高い作業である［２２］。
【０００４】
標的遺伝子の破壊が、濃縮に使用可能な表現型変化を引き起こせる場合、遺伝子ノックアウトクローンを簡単に取得できる。例えば、Ｈｅｌａ  ＣＳＰＧ４−／−細胞は、クロストリジウムディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ｂに対する耐性が付与された［２３］。しかしながら、このストラテジーは一般化できない。従来の方法は、抗生物質耐性または蛍光タンパク質を発現するプラスミドをコトランスフェクションすることであるが［２３、２４］、この方法は、標的修飾を含む少数の細胞を濃縮することはない。
【０００５】
外来のｄｓＤＮＡフラグメントは、異なる修復メカニズムを通してＤＳＢｓを有する染色体部位に組み込まれる可能性があることは報告されている。相同組み換え（ＨＲ）による修復には、長いフランキング配列の構築が必要であり、組み込む効率は低いが、非相同末端結合（Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）によるＤＮＡ修復の組み込む効率［２７、２８］は、通常、相同組み換えによる修復の組み込む効率より高い［２９］。遺伝子ノックインの目的を達成するように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９により誘発されたＮＨＥＪを使用して外来線形ドナーＤＮＡの挿入を媒介することは研究されている［３０〜３４］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｋｉｍ，  Ｙ．Ｇ．，  Ｃｈａ，  Ｊ．  ＆  Ｃｈａｎｄｒａｓｅｇａｒａｎ，  Ｓ．  Ｈｙｂｒｉｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ：  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｆｏｋ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｄｏｍａｉｎ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９３，  １１５６−１１６０  （１９９６）．
【非特許文献２】Ｂｏｃｈ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｒｅａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｏｄｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＴＡＬ−ｔｙｐｅ  ＩＩＩ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，  １５０９−１５１２  （２００９）．
【非特許文献３】Ｍｏｓｃｏｕ，  Ｍ．Ｊ．  ＆  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，  Ａ．Ｊ．  Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｃｉｐｈｅｒ  ｇｏｖｅｒｎｓ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６，  １５０１  （２００９）．
【非特許文献４】Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｊ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ＴＡＬＥ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９，  １４３−１４８  （２０１１）．
【非特許文献５】Ｊｉｎｅｋ，  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，  ８１６−８２１  （２０１２）．
【非特許文献６】Ｍａｌｉ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，  ８２３−８２６  （２０１３）．
【非特許文献７】Ｃｏｎｇ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９，  ８１９−８２３  （２０１３）．
【非特許文献８】Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｅ．Ｒ．  ＆  ＭｃＫｉｎｎｏｎ，  Ｐ．Ｊ．  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６，  ７７９９−７８０８  （２００７）．
【非特許文献９】Ｃｈａｐｍａｎ，  Ｊ．Ｒ．，  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｍ．Ｒ．  ＆  Ｂｏｕｌｔｏｎ，  Ｓ．Ｊ．  Ｐｌａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｎｄ  ｇａｍｅ：  ＤＮＡ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｐａｔｈｗａｙ  ｃｈｏｉｃｅ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ４７，  ４９７−５１０  （２０１２）．
【非特許文献１０】Ｇｉｌｂｅｒｔ，  Ｌ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  ＣＲＩＳＰＲ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｏｄｕｌａｒ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ．  Ｃｅｌｌ  １５４，  ４４２−４５１  （２０１３）．
【非特許文献１１】Ｍａ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１２，  ３００２−３００７  （２０１５）．
【非特許文献１２】Ｃｈｅｎ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｙｎａｍｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｃｅｌｌ  １５５，  １４７９−１４９１  （２０１３）．
【非特許文献１３】Ｌｉ，  Ｈ．Ｌ．，  Ｇｅｅ，  Ｐ．，  Ｉｓｈｉｄａ，  Ｋ．  ＆  Ｈｏｔｔａ，  Ａ．  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （２０１５）．
【非特許文献１４】Ｓａｖｉｃ，  Ｎ．  ＆  Ｓｃｈｗａｎｋ，  Ｇ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ．  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ：  ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６８，  １５−２１  （２０１６）．
【非特許文献１５】Ｍｉｙａｏｋａ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｂａｓｅ  ｇｅｎｏｍｅ−ｅｄｉｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｉＰＳ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１，  ２９１−２９３  （２０１４）．
【非特許文献１６】Ｆｕ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１，  ８２２−８２６  （２０１３）．
【非特許文献１７】Ｚｈｏｕ，  Ｙ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ｌｉｂｒａｒｙ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５０９，  ４８７−４９１  （２０１４）．
【非特許文献１８】Ｙｕ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｅｎｈａｎｃｅ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １６，  １４２−１４７  （２０１５）．
【非特許文献１９】Ｌｉａｏ，  Ｓ．，  Ｔａｍｍａｒｏ，  Ｍ．  ＆  Ｙａｎ，  Ｈ．  Ｅｎｒｉｃｈｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｃｏ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＨＰＲＴ  ｇｅｎｅ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４３，  ｅ１３４  （２０１５）．
【非特許文献２０】Ｋｉｍ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８，  ９４１−９４３  （２０１１）．
【非特許文献２１】Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ−ｂａｓｅｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  Ｃａｓ９  ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ５，  ３３７８  （２０１４）．
【非特許文献２２】Ｗａｎｇ，  Ｔ．，  Ｗｅｉ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｓａｂａｔｉｎｉ，  Ｄ．Ｍ．  ＆  Ｌａｎｄｅｒ，  Ｅ．Ｓ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｃｒｅｅｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４３，  ８０−８４  （２０１４）．
【非特許文献２３】Ｙｕａｎ，  Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ  ４  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ２５，  １５７−１６８  （２０１５）．
【非特許文献２４】Ｙａｎｇ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  ＵＬｔｉＭＡＴＥ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  Ｃｕｓｔｏｍｉｚｅｄ  ＴＡＬ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，  ｅ７５６４９  （２０１３）．
【非特許文献２５】Ｐｅｒｅｚ，  Ｅ．Ｅ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６，  ８０８−８１６  （２００８）．
【非特許文献２６】Ｋｉｍ，  Ｈ．Ｊ．，  Ｌｅｅ，  Ｈ．Ｊ．，  Ｋｉｍ，  Ｈ．，  Ｃｈｏ，  Ｓ．Ｗ．  ＆  Ｋｉｍ，  Ｊ．Ｓ．  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｖｉａ  ｍｏｄｕｌａｒ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ  １９，  １２７９−１２８８  （２００９）．
【非特許文献２７】Ｌａｃｋｎｅｒ，  Ｄ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｇｅｎｅｒｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｔａｇｇｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ６，  １０２３７  （２０１５）．
【非特許文献２８】Ａｕｅｒ，  Ｔ．Ｏ．  ＆  Ｄｅｌ  Ｂｅｎｅ，  Ｆ．  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ａｎｄ  ＴＡＬＥＮ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｉｎ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  （２０１４）．
【非特許文献２９】Ｌｉ，  Ｋ．，  Ｗａｎｇ，  Ｇ．，  Ａｎｄｅｒｓｅｎ，  Ｔ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｐ．  ＆  Ｐｕ，  Ｗ．Ｔ．  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  Ｓｙｓｔｅｍ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９，  ｅ１０５７７９  （２０１４）．
【非特許文献３０】Ｏｒｌａｎｄｏ，  Ｓ．Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｄｒｉｖｅｎ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｄｏｎｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３８，  ｅ１５２  （２０１０）．
【非特許文献３１】Ｓａｋｕｍａ，  Ｔ．，  Ｎａｋａｄｅ，  Ｓ．，  Ｓａｋａｎｅ，  Ｙ．，  Ｓｕｚｕｋｉ，  Ｋ．Ｔ．  ＆  Ｙａｍａｍｏｔｏ，  Ｔ．  ＭＭＥＪ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｇｅｎｅ  ｋｎｏｃｋ−ｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ  ａｎｄ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＰＩＴＣｈ  ｓｙｓｔｅｍｓ．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  １１，  １１８−１３３  （２０１６）．
【非特許文献３２】Ｎａｋａｄｅ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｉｃｒｏｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｎｉｍａｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ＴＡＬＥＮｓ  ａｎｄ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９．  Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ５，  ５５６０  （２０１４）．
【非特許文献３３】Ｃｒｉｓｔｅａ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｄｏｎｏｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  １１０，  ８７１−８８０  （２０１３）．
【非特許文献３４】Ｃｈｅｎ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｉｇｈ−ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｓｓＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８，  ７５３−７５５  （２０１１）．
【非特許文献３５】Ｐｏｔｔｅｒ，  Ｃ．Ｊ．  ＆  Ｌｕｏ，  Ｌ．  Ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５，  ｅ１０１６８  （２０１０）．
【非特許文献３６】Ｕｒｅｎ，  Ａ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ−ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ４，  ７８９−７９８  （２００９）．
【非特許文献３７】Ｙｉｎ，  Ｂ．  ＆  Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ，  Ｄ．Ａ．  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｔｏ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４３，  ７９−８４  （２００７）．
【非特許文献３８】Ｐｅｎｇ，  Ｊ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｙ．，  Ｚｈｕ，  Ｓ．  ＆  Ｗｅｉ，  Ｗ．  Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９  ｓｙｓｔｅｍ．  ＦＥＢＳ  Ｊ  ２８２，  ２０８９−２０９６  （２０１５）．
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、ドナー構築体、遺伝子ノックアウト方法、そのシステムおよびキットを提供する。本発明の遺伝子ノックアウト方法は、前記ドナー構築体に含まれるマーカー遺伝子を使用して、遺伝子がノックアウトされた細胞を濃縮し、配列特異的なヌクレアーゼによる遺伝子ノックアウトの生成効率を向上させる。
【０００８】
本発明は一態様において、線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；前記配列特異的なヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端の標的配列；および両端の保護配列が含まれ、前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含む、ドナー構築体を提供する。
【０００９】
本発明において、前記線形ドナーＤＮＡは二本鎖線形ドナーＤＮＡである。
【００１０】
好ましい実施形態では、前記ドナー構築体は線形ドナーＤＮＡである。
【００１１】
一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。
【００１２】
もう一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。
【００１３】
もう一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。
【００１４】
もう一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼはＮｇＡｇｏヌクレアーゼである。
【００１５】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端のみにおいて標的配列を有する。
【００１６】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは両端にそれぞれ標的配列を有する。
【００１７】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡの両端の標的配列は同じである。
【００１８】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡの両端の標的配列は異なる。更なる実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡの両端の異なる標的配列は同じ遺伝子に由来する。その他のさらなる実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡの両端の異なる標的配列は異なる遺伝子に由来する。
【００１９】
好ましい実施形態では、前記マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である。
【００２０】
好ましい実施形態では、保護配列の長さは５〜３０ｂｐ、もっとも好ましくは２０ｂｐである。
【００２１】
本発明はもう一態様において、下記のステップを含む、細胞内で遺伝子ノックアウトを生成する方法を提供する：
（１）細胞ゲノムの特定の標的部位を切断できる配列特異的ヌクレアーゼとドナー構築体を細胞に導入するステップ；
前記ドナー構築体は線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであり、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；前記配列特異的ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記線形ドナーＤＮＡを、非相同末端結合を介して細胞ゲノムの特定の標的部位に挿入する；
（２）前記マーカーの発現が陽性である細胞をスクリーニングするステップ。
【００２２】
本発明において、前記線形ドナーＤＮＡは二本鎖線形ドナーＤＮＡである。
【００２３】
好ましい実施形態では、前記ドナー構築体は線形ドナーＤＮＡである。
【００２４】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端のみにおいて標的配列を有する。
【００２５】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは両端にそれぞれ標的配列を有する。
【００２６】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡの両端の標的配列は同じである。
【００２７】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡの両端の標的配列は異なる。更なる実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡの両端の異なる標的配列は同じ遺伝子に由来する。その他のさらなる実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡの両端の異なる標的配列は異なる遺伝子に由来する。
【００２８】
一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。
【００２９】
もう一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。
【００３０】
もう一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。
【００３１】
好ましい実施形態では、前記方法は、細胞ゲノムの特定の標的部位を認識するガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を細胞に導入することをさらに含み、線形ドナーＤＮＡの標的配列は、ｇＲＮＡによって認識される標的部位を含む。
【００３２】
一部の実施形態では、前記ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡである。
【００３３】
より好ましい実施形態では、前記方法は、細胞ゲノムの単一の特定の標的部位を認識するｓｇＲＮＡを細胞に導入することをさらに含み、前記ｓｇＲＮＡによって認識される標的部位を含む標的配列は、線形ドナーＤＮＡの５’末端および／または３’末端に位置する。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡによって認識される標的部位を含む標的配列は、細胞ゲノムの単一の遺伝子に由来する。一部の実施形態では、前記ｓｇＲＮＡによって認識される標的部位を含む標的配列は、細胞ゲノムの２つ以上の遺伝子のコンセンサス配列であり、その条件として、前記コンセンサス配列と、前記２つ以上の遺伝子のいずれか１つの、コンセンサス配列に対応する位置の配列とは、１つ以下の塩基の違いを有する。
【００３４】
もう一部のより好ましい実施形態では、前記方法は、細胞ゲノムの１つの遺伝子上の２つの特定の標的部位を認識する２つのｓｇＲＮＡを細胞に導入することをさらに含み、前記２つのｓｇＲＮＡによって認識される２つの標的部位をそれぞれ含む２つの標的配列はそれぞれ２つの線形ドナーＤＮＡに位置するか、または、それぞれ同一の線形ドナーＤＮＡの両端に位置する。
【００３５】
もう一部のより好ましい実施形態では、前記方法は、細胞ゲノムの２つ以上の特定の標的部位を認識する２つ以上のｓｇＲＮＡを細胞に導入することをさらに含み、前記２つ以上のｓｇＲＮＡによって認識される２つ以上の標的部位をそれぞれ含む２つ以上の標的配列はそれぞれ同一の線形ドナーＤＮＡの両端、または異なる線形ドナーＤＮＡに位置する。前記細胞ゲノムの２つ以上の特定の標的部位はそれぞれ異なる遺伝子に位置する。
【００３６】
もう一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼはＮｇＡｇｏヌクレアーゼである。
【００３７】
好ましい実施形態では、前記方法は、細胞ゲノムの特定の標的部位を認識するガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を細胞に導入することをさらに含み、線形ドナーＤＮＡの標的配列は、ｇＤＮＡによって認識される標的部位を含む。
【００３８】
本発明では、前記遺伝子ノックアウトは、単一遺伝子ノックアウトまたは複数遺伝子ノックアウトであってもよい。前記複数遺伝子ノックアウトは、２つまたはそれ以上の遺伝子のノックアウトであり、例えば、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の遺伝子のノックアウトである。
【００３９】
好ましい実施形態では、前記マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である。
【００４０】
一つの好ましい実施形態では、薬剤耐性により細胞をスクリーニングする。
【００４１】
もう一つの好ましい実施形態では、ＦＡＣＳ法により細胞をスクリーニングする。
【００４２】
好ましい実施形態では、保護配列の長さが５〜３０ｂｐであり、もっとも好ましくは２０ｂｐである。
【００４３】
本発明はもう一態様において、細胞ゲノムの特定の標的部位を切断できる配列特異的ヌクレアーゼとドナー構築体を含む、遺伝子ノックアウトのためのシステムまたはキットを提供し、
前記ドナー構築体は線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであり、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；前記配列特異的ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端の標的配列；および両端の保護配列が含まれ、前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含む。
【００４４】
本発明では、線形ドナーＤＮＡは二本鎖線形ドナーＤＮＡである。
【００４５】
一部の実施形態では、前記ドナー構築体は線形ドナーＤＮＡである。もう一部の実施形態では、前記ドナー構築体は環状ドナー構築体であり、しかも細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができる。
【００４６】
一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。
【００４７】
もう一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼは転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。
【００４８】
もう一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。
【００４９】
好ましい実施形態では、前記システムまたはキットは、細胞ゲノムの特定の標的部位を認識するｓｇＲＮＡをさらに含み、線形ドナーＤＮＡの標的配列は、前記ｓｇＲＮＡによって認識される標的部位を含む。
【００５０】
一部の実施形態では、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡである。
【００５１】
もう一部の実施形態では、前記配列特異的ヌクレアーゼはＮｇＡｇｏヌクレアーゼである。
【００５２】
好ましい実施形態では、前記システムまたはキットは、細胞ゲノムの特定の標的部位を認識するｇＤＮＡを含み、線形ドナーＤＮＡの標的配列は、前記ｇＤＮＡによって認識される標的部位を含む。
【００５３】
好ましい実施形態では、前記マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である。
【００５４】
好ましい実施形態では、保護配列の長さは５〜３０ｂｐ、もっとも好ましくは２０ｂｐである。
【００５５】
本発明では、前記切断は、二本鎖切断（ＤＳＢｓ）を生成することである。
【００５６】
本発明はもう一態様において、線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるユニバーサルドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、
前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記ユニバーサル標的配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在しない、ユニバーサルドナー構築体を提供する。
【００５７】
一部の実施形態では、前記ユニバーサルドナー構築体は線形ドナーＤＮＡである。
【００５８】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは二本鎖線形ドナーＤＮＡである。
【００５９】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端のみにおいて前記ユニバーサル標的配列を有する。
【００６０】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは両端にそれぞれ前記ユニバーサル標的配列を有する。
【００６１】
好ましい実施形態では、前記マーカー遺伝子は抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である。
【００６２】
好ましい実施形態では、保護配列の長さが５〜３０ｂｐであり、もっとも好ましくは２０ｂｐである。
【００６３】
好ましい実施形態では、前記ユニバーサルドナー構築体のユニバーサル標的配列は、５’−ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ−３’または５’−ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ−３’を含む。
【００６４】
本発明はもう一態様において、
（１）下記の：
（ａ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ；
（ｂ）細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡ；
（ｃ）線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるユニバーサルドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、
前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記ユニバーサル標的配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在しない、ユニバーサルドナー構築体；および
（ｄ）線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｇＲＮＡ
を細胞に導入するステップ；
（２）前記線形ドナーＤＮＡを、非相同末端結合を介して細胞ゲノムの特定の標的部位に挿入するステップ；および
（３）前記マーカーの発現が陽性である細胞をスクリーニングするステップ
を含む、細胞内で遺伝子ノックアウトを生成する方法を提供する。
【００６５】
一部の実施形態では、前記ドナー構築体は、線形ドナーＤＮＡである。
【００６６】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは二本鎖線形ドナーＤＮＡである。
【００６７】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端のみにおいて前記ユニバーサル標的配列を有する。
【００６８】
一部の実施形態では、前記線形ドナーＤＮＡは両端にそれぞれ前記ユニバーサル標的配列を有する。
【００６９】
一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｇＲＮＡが、一種のｇＲＮＡ、または細胞ゲノムの異なる標的配列を認識する複数のｇＲＮＡであり、例えば、細胞ゲノムの異なる標的配列を認識する２つ、３つ、またはそれ以上のｇＲＮＡであってもよい。前記異なる標的配列は、同一の遺伝子に位置してもよく、異なる遺伝子に位置してもよい。前記異なる標的配列はそれぞれ異なる遺伝子に位置する場合、複数の遺伝子のノックアウトが実現できる。
【００７０】
そのため、本発明では、前記遺伝子ノックアウトは、単一遺伝子ノックアウトまたは複数遺伝子ノックアウトであってもよい。複数遺伝子ノックアウトは、２つまたはそれ以上の遺伝子のノックアウトであり、例えば、３つ、４つ、５つ、またはそれ以上の遺伝子のノックアウトである。
【００７１】
一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである。
【００７２】
一部の実施形態では、線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識する前記ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである。
【００７３】
一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｓｇＲＮＡと、線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識する前記ｓｇＲＮＡとは、同じベクターに位置する。
【００７４】
一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｓｇＲＮＡと、線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識する前記ｓｇＲＮＡとは、異なるベクターに位置する。
【００７５】
好ましい実施形態では、前記マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である。
【００７６】
一つの好ましい実施形態では、薬剤耐性により細胞をスクリーニングする。
【００７７】
もう一つの好ましい実施形態では、ＦＡＣＳ法により細胞をスクリーニングする。
【００７８】
好ましい実施形態では、保護配列の長さが５〜３０ｂｐであり、もっとも好ましくは２０ｂｐである。
【００７９】
好ましい実施形態では、前記ユニバーサルドナー構築体のユニバーサル標的配列は、５’−ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ−３’または５’−ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ−３’を含む。
【００８０】
本発明はもう一態様において、
（１）Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、またはＣａｓ９ヌクレアーゼを発現することができるベクターまたは細胞；
（２）細胞ゲノムの特定の標的配列を認識するｇＲＮＡ；
（３）線形ドナーＤＮＡ、または細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができるものであるユニバーサルドナー構築体であって、前記線形ドナーＤＮＡには、中央から両端までに順に、発現カセット；発現カセットの５’末端の、逆方向終止コドンからなる短い配列と、発現カセットの３’末端の、順方向終止コドンからなる短い配列；Ｃａｓ９ヌクレアーゼによって切断できる標的部位を含む、５’末端および／または３’末端のユニバーサル標的配列；および両端の保護配列が含まれ、
前記発現カセットは、プロモーターにより駆動されるマーカー遺伝子を含み、
前記ユニバーサル標的配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在しない、ユニバーサルドナー構築体；および
（４）線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識するｇＲＮＡ
を含む、遺伝子ノックアウトのためのシステムまたはキットを提供する。
【００８１】
一部の実施形態では、線形ドナーＤＮＡは二本鎖線形ドナーＤＮＡである。
【００８２】
一部の実施形態では、前記ドナー構築体は線形ドナーＤＮＡである。
【００８３】
もう一部の実施形態では、前記ドナー構築体は環状ドナー構築体であり、しかも細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成することができる。
【００８４】
一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｇＲＮＡが、一種のｇＲＮＡ、または細胞ゲノムの異なる標的配列を認識する複数のｇＲＮＡであり、例えば、細胞ゲノムの異なる標的配列を認識する２つ、３つ、またはそれ以上のｇＲＮＡであってもよい。前記異なる標的配列は、同一の遺伝子に位置してもよく、異なる遺伝子に位置してもよい。前記異なる標的配列はそれぞれ異なる遺伝子に位置する場合、複数の遺伝子のノックアウトが実現できる。
【００８５】
一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである。
【００８６】
一部の実施形態では、線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識する前記ｇＲＮＡがｓｇＲＮＡである。
【００８７】
一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｇＲＮＡと、線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識する前記ｇＲＮＡとは、同じベクターに位置する。
【００８８】
一部の実施形態では、細胞ゲノムの特定の標的配列を認識する前記ｇＲＮＡと、線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列を認識する前記ｇＲＮＡとは、異なるベクターに位置する。
【００８９】
好ましい実施形態では、前記マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子である。
【００９０】
好ましい実施形態では、保護配列の長さが５〜３０ｂｐであり、もっとも好ましくは２０ｂｐである。
【００９１】
本発明では、前記切断は、二本鎖切断（ＤＳＢｓ）を生成することである。
【００９２】
好ましい実施形態では、前記ユニバーサルドナー構築体のユニバーサル標的配列は、５’−ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ−３’または５’−ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ−３’を含む。
【００９３】
本発明は、マーカー遺伝子を、遺伝子ノックアウトされた切断標的部位に挿入することにより、マーカーを介して遺伝子ノックアウトを生成する希少クローンを効果的に濃縮することができる。本発明は、ｓｇＲＮＡｓの設計が困難な遺伝子の標的化、およびいくつかの遺伝子を同時に標的化してノックアウトする必要がある場合に特に有用である。この方法は、ＤＮＡ二本鎖切断を生成する様々な遺伝子編集システム、特にＣＲＩＳＰＲシステムの、遺伝子とその機能の生物医学分野での幅広い応用に寄与する。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】ピューロマイシンによるスクリーニングを介してＨｅＬａ細胞のＡＮＴＸＲ１遺伝子上にＣａｓ９／ｇＲＮＡ標的突然変異を含む細胞を濃縮するドナー設計と実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＡＮＴＸＲ１遺伝子上のｓｇＲＮＡ−またはｐｇＲＮＡ標的部位の、ＮＨＥＪに基づいた線形ドナーのノックインの概略図であり、ゲノム部位と線形ドナーにはｇＲＮＡの切断部位ｓｇ１およびｓｇ２ｇがあり、終止コドンは＊＊＊で標識され、矢印はリーディングフレームの方向を指す。（ｂ）は、ドナー（ｇＲＮＡ添加または非添加）でトランスフェクションした細胞のピューロマイシン耐性クローンのＭＴＴ染色を示す図である。（ｃ）は、ｓｇＲＮＡ／ｐｇＲＮＡ（それらの対応するドナーを添加（暗いバー）または非添加（明るいバー））でトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞のＡＮＴＸＲ１ノックアウト率の比較を示す図であり、ＡＮＴＸＲ１ノックアウト率は、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ耐性を有する細胞の百分比として表される。ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ耐性分析を行う前に、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）で細胞をスクリーニングした。エラーバーはｓ．ｄ．（ｎ＝３）、ｔ−ｔｅｓｔ、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す。（ｄ）は、異なるｇＲＮＡｓおよびそのドナーを使用したＡＮＴＸＲ１ノックアウト細胞の濃縮のまとめを示す図である。
【図２】ドナー媒介のピューロマイシン耐性スクリーニングによる、混合コロニーおよびモノクローンにおけるＡＮＴＸＲ１ノックアウト細胞の濃縮の実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ処理を使用したまたは使用しなかった、異なるＨｅＬａ細胞群の画像である。ｓｇＲＮＡまたはｐｇＲＮＡによりそれらに対応する線形ドナーの添加もしくは非添加で、トランスフェクションして混合細胞を取得し、スケールは２００μｍである。（ｂ）は、ピューロマイシン耐性（ｐｕｒо＋）を有するモノクローンの線形ドナーが組み込まれたＡＮＴＸＲ１部位のＰＣＲ検証を示す図であり、クローンは、ｓｇＲＮＡ２ＡＮＴＸＲ１／ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ２（左）またはｐｇＲＮＡＡＮＴＸＲ１／ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｐｇ（右）でトランスフェクションされたＨｅＬａ細胞から得られた。
【図３】ピューロマイシンスクリーニングによりＨｅＬａ細胞でのＨＥＢＧＦ破壊イベントを濃縮したドナー設計と実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＨＢＥＧＦ遺伝子を標的とするドナー設計を示す図である。（ｂ）は、線形ドナーＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ１（Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡ添加または非添加）でトランスフェクションした細胞におけるピューロマイシン耐性クローンのＭＴＴ染色を示す図である。（ｃ）は、ＤＴ（４０ｎｇ／ｍｌ）処理を使用したまたは使用しなかった、異なるＨｅＬａ細胞群の画像である。ｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１ＨＢＥＧＦ）（その対応する線形ドナー（ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ１）添加または非添加）でトランスフェクションして混合細胞を取得し、スケールは２００μｍである。（ｄ）は、ｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１ＨＢＥＧＦ）、Ｃａｓ９を発現するプラスミド、およびピューロマイシン耐性遺伝子（明るいバー）を含むレポータープラスミド、または、ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９を発現するプラスミド、および線形ドナー（ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ１）（暗いバー）でトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞のＨＢＥＧＦノックアウト率を示す図であり、ＨＢＥＧＦノックアウト率は、ＤＴ耐性を有する細胞に対する百分比として表される。ＤＴ耐性分析を行う前に、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）で細胞をスクリーニングした。エラーバーはｓ．ｄ．（ｎ＝３）、ｔ−ｔｅｓｔ、＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す。
【図４】ＥＧＦＰによりＨＥＫ２９３Ｔ細胞でのＨＥＢＧＦ破壊イベントを濃縮したドナー設計と実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＨＢＥＧＦ遺伝子を標的とするドナー設計を示す図である。（ｂ）は、ＤＴ（４０ｎｇ／ｍｌ）処理を使用したまたは使用しなかった、異なるＨＥＫ２９３Ｔ細胞群の画像である。ｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ２ＨＢＥＧＦ）（その対応する線形ドナー（ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ２）添加または非添加）でトランスフェクションして混合細胞を取得し、スケールは２００μｍである。（ｃ）ｍＣｈｅｒｒｙを発現するｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ２ＨＢＥＧＦ）プラスミド、およびＣａｓ９を発現するプラスミド（明るいバー）、または、ｓｇＲＮＡ、Ｃａｓ９を発現するプラスミド、および線形ドナー（ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ２、ＥＧＦＰ）（暗いバー）でトランスフェクションしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＨＢＥＧＦノックアウト率を示す図であり、ＨＢＥＧＦノックアウト率は、ＤＴ耐性を有する細胞に対する百分比として表される。ＤＴ耐性分析を行う前に、ＦＡＣＳで細胞をスクリーニングした。エラーバーはｓ．ｄ．（ｎ＝３）、ｔ−ｔｅｓｔ、＊＊＊Ｐ＜０．０５を表す。
【図５】ピューロマイシンによるスクリーニングを介してＨｅＬａＯＣ細胞のＡＮＴＸＲ１破壊イベントを濃縮するドナー設計と実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＡＮＴＸＲ１を標的とするドナー設計である。ドナーは、５’末端に一つのｓｇＲＮＡ切断部位（ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ１またはＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ２）を含み、または、両端に二つのｇＲＮＡｓ（ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｐｇ）を含む。（ｂ）は、ドナー（ｇＲＮＡ添加または非添加）でトランスフェクションした細胞のピューロマイシン耐性クローンのＭＴＴ染色を示す図である。（ｃ）は、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ処理を使用したまたは使用しなかった、異なるＨｅＬａＯＣ細胞群の画像である。ｓｇＲＮＡまたはｐｇＲＮＡにより、それらに対応する線形ドナーの添加もしくは非添加でトランスフェクションして混合細胞を取得し、スケールは２００μｍである。（ｄ）は、ｓｇＲＮＡｓによりそれらの対応するドナーの添加または非添加でトランスフェクションしたＨｅＬａＯＣ細胞のＡＮＴＸＲ１ノックアウト率を示す図であり、ＡＮＴＸＲ１ノックアウト率は、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ耐性を有する細胞の百分比として表される。ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ耐性分析を行う前に、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）で細胞をスクリーニングした。エラーバーはｓ．ｄ．（ｎ＝３）、ｔ−ｔｅｓｔ、＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す。（ｅ）は、ピューロマイシン耐性モノクローンの線形ドナーが組み込まれたＡＮＴＸＲ１部位のＰＣＲ検証を示す図である。（ｆ）は、異なるｇＲＮＡｓおよびそのドナーを使用したＡＮＴＸＲ１ノックアウト細胞の濃縮のまとめを示す図である。
【図６】ＨｅＬａＯＣ細胞でのｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ  ＰＣＲ（ｓｐＰＣＲ）分析によるドナー挿入のオフターゲット評価を示す図である。（ａ）は、ｓｐＰＣＲ分析用のアダプター（ａｄａｐｔоｒ）とプライマーの設計を示す図である。Ｓｐｌｉｎｋ１およびＳｐｌｉｎｋ２プライマーはアダプター配列とマッチングし、プライマーＲ１およびＲ２は、線形ドナー配列とマッチングした。（ｂ）は、ｓｐＰＣＲ反応結果を示す図である。
【図７】ピューロマイシンによるスクリーニングを介してＨｅＬａＯＣ細胞のＨＢＥＧＦ破壊イベントを濃縮するドナー設計と実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＨＢＥＧＦを標的とするドナー設計である。ドナーは、５’末端に一つのｓｇＲＮＡ切断部位（ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ１またはＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ２）を含み、または、両端に二つのｇＲＮＡｓ（ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｐｇ）を含む。（ｂ）は、ドナー（ｓｇＲＮＡ／ｐｇＲＮＡ添加または非添加）でトランスフェクションした細胞のピューロマイシン耐性クローンのＭＴＴ染色を示す図である。（ｃ）は、ピューロマイシン耐性モノクローンの線形ドナーが組み込まれたＨＢＥＧＦ部位のＰＣＲ検証を示す図である。（ｄ）は、異なるｇＲＮＡｓおよびそのドナーを使用したＨＢＥＧＦノックアウト細胞の濃縮のまとめを示す図である。
【図８】ＨｅＬａＯＣ細胞において、１ステップで２つ以上の遺伝子ノックアウトを生成したドナー設計と実験的検証を示す図である。（ａ）は、ＰＳＥＮ１およびＰＳＥＮ２遺伝子上のｓｇＲＮＡ−またはｐｇＲＮＡ標的部位での、ＮＨＥＪに基づいた線形ドナーのノックインの概略図である。（ｂ〜ｃ）は、ゲノム内のＰＳＥＮ１およびＰＳＥＮ２の一部のコード配列であり、ｓｇＲＮＡコード領域（下線が付いている）および突然変異対立遺伝子を含むシーケンシング分析を示す図である。クローン１（ｂ）は、ｐｇＲＮＡＰＳＥＮ１＋ＰＳＥＮ２／ＤｏｎｏｒＰＳＥＮ１＋ＰＳＥＮ２でトランスフェクションしたＨｅＬａＯＣ細胞に由来する。クローン２（ｃ）は、ｐｇＲＮＡＰＳＥＮ１＋ＰＳＥＮ２／ＤｏｎｏｒＰＳＥＮ１＋ＰＳＥＮ２でトランスフェクションしたＨｅＬａＯＣ細胞に由来する。影付きの領域のヌクレオチドは、Ｃａｓ９を導いてＤＮＡ認識及び切断を行うＰＡＭ配列を表す。破線は欠失を示し、長い文字はヌクレオチドの挿入を示し、背景の明るい灰色の矢印はドナーのＣＭＶプロモーターの方向を示す。（ｄ）は、ＨＳＰＡ遺伝子ファミリーの複数配列アライメント解析を示す図であり、そのコンセンサス配列、５つのＨＳＰＡファミリー遺伝子のコンセンサス配列を標的とするｓｇＲＮＡ、および複数の遺伝子突然変異を含む細胞を濃縮するためのユニバーサル線形ドナー（ＤｏｎｏｒＨＳＰＡ）の設計が示されている。黒い影付きのヌクレオチドは、５つのＨＳＰＡ遺伝子のコンセンサス配列を表す。暗い灰色の影付きのヌクレオチドは、３つまたは４つのＨＳＰＡ遺伝子のコンセンサス配列を表し、明るい灰色の影付きのヌクレオチドは、非コンセンサス配列を表す。（ｅ）は、ＤｏｎｏｒＨＳＰＡが欠失または存在している条件下で、ピューロマイシンによりスクリーニングした後、ｓｇＲＮＡＨＳＰＡが５つの標的遺伝子上で誘発したｉｎｄｅｌｓを示す図である。エラーバーはｓ．ｄ．（ｎ＝３）、ｔ−ｔｅｓｔ、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１を表す。（ｆ）は、ｓｇＲＮＡ標的領域（下線が付いている）を含むＨｅＬａクローン３のゲノム内のＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＳＰＡ１Ｌ、およびＨＳＰＡ６遺伝子の一部のコード配列を示す図である。クローン３は、ｓｇＲＮＡＨＳＰＡ／ＤｏｎｏｒＨＳＰＡでトランスフェクションしたＨｅＬａＯＣ細胞に由来する。影付きのヌクレオチドは、ＰＡＭ配列を表し、破線は欠失していることを表す。背景の明るい灰色の矢印は、ドナーのＣＭＶプロモーターの方向を示す。
【図９】ＨｅＬａＯＣ細胞におけるＰＳＥＮ１及びＰＳＥＮ２  ｓｇＲＮＡ効率の評価と単一クローンの認識を示す図である。（ａ）は、Ｔ７Ｅ１分析を使用して、ＰＳＥＮ１及びＰＳＥＮ２部位でｓｇＲＮＡＰＳＥＮ１、ｓｇＲＮＡＰＳＥＮ２、およびｐｇＲＮＡＰＳＥＮによるｉｎｄｅｌｓ効率に対する評価を示す図である。エラーバーは、ｓ．ｄ．（ｎ＝３）を表す。（ｂ）は、ドナー（ｐｇＲＮＡＰＳＥＮ添加または非添加）でトランスフェクションした細胞のピューロマイシン耐性クローンのＭＴＴ染色を示す図である。（ｃ）は、ピューロマイシン耐性モノクローンの線形ドナーが組み込まれたＰＳＥＮ１（Ｌ３／Ｒ３）とＰＳＥＮ２（Ｌ４／Ｒ４）との二つの部位のＰＣＲ結果を示す図である。
【図１０】ドナーを使用して、または使用せずにトランスフェクションした混合細胞におけるＨＳＰＡファミリー遺伝子の標的領域のシーケンシングを示す図である。ｓｇＲＮＡ標的部位は影で示されており、これらのシーケンシング分析には、ドナー挿入を含む標的領域は含まれていない。
【図１１】ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ６、およびＨＳＰＡ２の５つのＨＳＰＡファミリー遺伝子の標的部位上でドナーが挿入されたモノクローン同定を示す図である。（ａ）は、ピューロマイシン耐性モノクローンの５つの遺伝子部位上で線形ドナーが組み込まれたことのＰＣＲ検証結果を示す図である。（ｂ）は、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＳＰＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ６の４つの遺伝子部位にドナー挿入の結果のまとめを示す図である。
【図１２】ユニバーサルｓｇＲＮＡを含むドナーを利用した遺伝子ノックアウトの実験のフローチャートである。
【図１３】ユニバーサルｓｇＲＮＡを含むドナーを利用した遺伝子ノックアウトの効率の検証を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
本発明は、新しいドナー構築体および遺伝子ノックアウト方法を提供し、当該方法は、線形ドナーＤＮＡを利用して配列特異的ヌクレアーゼによる遺伝子ノックアウトの生成効率を向上させる。本発明の線形ドナーＤＮＡは、配列特異的ヌクレアーゼにより切断できる少なくとも１つの標的部位を含む。細胞ゲノムの標的部位に基づいて線形ドナーＤＮＡに含まれる標的部位を設計し、これによって、細胞ゲノムの標的部位を切断できる配列特異的ヌクレアーゼも、線形ドナーＤＮＡに含まれる標的部位を切断できるようになる。配列特異的ヌクレアーゼとドナー構築体を細胞に導入した後、配列特異的ヌクレアーゼが細胞の特定の標的部位に二本鎖切断（ＤＳＢｓ）を生成する時、線形ドナーＤＮＡに含まれる少なくとも一つの標的部位を同時に切断し、これによって、線形ドナーＤＮＡは高い効率で非相同末端結合（Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）経路を通して細胞ゲノムの切断された標的部位に挿入される。そして、マーカーを介して細胞をスクリーニングし、ゲノムの特定の標的部位で切断されて遺伝子ノックアウトを生成した細胞を効果的に濃縮することができ、配列特異的ヌクレアーゼを介して遺伝子ノックアウトを生成した効率を大幅に高めることができる。
【００９６】
細胞ゲノムの標的部位に基づいて線形ドナーＤＮＡに含まれる標的部位を設計し、得られた線形ドナーＤＮＡは特異的線形ドナーであり、細胞ゲノムの異なる標的部位で遺伝子ノックアウトを行う必要がある時、当該標的部位の配列に基づいて、組み合わせて使用するための線形ドナーＤＮＡを構築する。したがって、本発明をさらに最適化するために、発明者は本発明においてさらにユニバーサル線形ドナーＤＮＡを提供し、このユニバーサル線形ドナーＤＮＡは、配列特異的ヌクレアーゼにより切断できるユニバーサル標的配列を含み、このユニバーサル標的配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在せず、すなわち、このユニバーサル標的配列と同じの、配列特異的ヌクレアーゼにより切断できる配列は、遺伝子ノックアウトの必要がある細胞のゲノムには存在しない。この場合、配列特異的ヌクレアーゼとユニバーサル線形ドナーＤＮＡを細胞に導入した後、配列特異的ヌクレアーゼが細胞の特定の標的部位に二本鎖切断（ＤＳＢｓ）を生成する時、ユニバーサル線形ドナーＤＮＡに含まれるユニバーサル標的配列も当該標的配列のユニバーサルｇＲＮＡを認識することにより前記配列特異的ヌクレアーゼにより切断され、この時、線形ドナーＤＮＡは依然として高い効率で非相同末端結合（Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ、ＮＨＥＪ）経路を通して細胞ゲノムの切断された標的部位に挿入されることができる。そして、マーカーを介して細胞をスクリーニングし、ゲノムの特定の標的部位で切断されて遺伝子ノックアウトを生成した細胞を効果的に濃縮することができるとともに、配列特異的ヌクレアーゼを介して遺伝子ノックアウトを生成した効率を大幅に高めることができる。前記ユニバーサル線形ドナーＤＮＡの標的配列は、ノックアウトされる細胞とは関係なく、ユニバーサルドナーとして異なる細胞の異なる目標遺伝子のノックアウトに使用でき、いずれも配列特異的ヌクレアーゼによって遺伝子ノックアウトを生成する効率を高めることができる。ユニバーサル線形ドナーは特に、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを使用した遺伝子のノックアウトに使用することができ、このシステムはｇＲＮＡ（好ましくはｓｇＲＮＡ）を用いて目標配列を標的とし、遺伝子ノックアウトを行う場合、細胞ゲノムの特定の標的部位に対するｇＲＮＡを構築するだけで済み、組み合わせて使用するための線形ドナーＤＮＡを特別に構築する必要はなく、ユニバーサル線形ドナーＤＮＡおよびこのユニバーサル線形ドナーＤＮＡを標的とするｇＲＮＡを直接に使用すればよい。これによって、操作の複雑さが低下され、効率は向上した。
【００９７】
相同対立遺伝子の一つが修飾されると、標的対立遺伝子の突然変異の頻度は通常高いことは報告されている［２５、２６］。したがって、理論に拘束されることを望まないが、標的対立遺伝子の一つの特定の部位にドナーを挿入して、ドナーに含まれるマーカー遺伝子を発現するクローンをスクリーニングできれば、すべての対立遺伝子が修飾される希少イベントを濃縮することができると本発明者は推測する。
【００９８】
本発明では、「遺伝子ノックアウト」は、遺伝子編集による遺伝子機能の喪失である。通常追求される遺伝子ノックアウトの効果は、２つの対立遺伝子が同時にノックアウトされ、その時点で対応するタンパク質が機能を喪失し、遺伝子ノックアウト細胞株が得られることである。１つの対立遺伝子のみがノックアウトされた場合、タンパク質は依然として一部の役割を果たすことができ、タンパク質機能が低下するに過ぎない。本発明の線形ドナーＤＮＡおよび本発明の方法により、２つの対立遺伝子がノックアウトされた細胞を効率的に濃縮することができる。
【００９９】
本発明のドナー構築体は二本鎖ＤＮＡである。本発明のドナー構築体自身は線形ドナーＤＮＡであってもよく、あるいは、本発明のドナー構築体は、線形ドナーＤＮＡを含む環状ＤＮＡ分子であってもよく、細胞に導入されると、細胞内で切断されて線形ドナーＤＮＡを生成する。細胞内で環状ドナー構築体を切断して線形ドナーＤＮＡを生成する方法は、本分野で周知である。例えば、環状構築体は、線形ドナーＤＮＡの５’末端の上流および３’末端の下流において、別の配列特異的ヌクレアーゼの切断部位をさらに含んでもよい。
【０１００】
本発明の方法では、線形ドナーＤＮＡを生成するように、細胞内で環状構築体の線形ドナーＤＮＡの５’末端上流および３’末端下流の配列を切断する、別の配列特異的ヌクレアーゼを細胞に導入することをさらに含んでもよい。
【０１０１】
本発明の線形ドナーＤＮＡにおいて、「逆方向終止コドン」とは、コドンの方向が発現カセットのリーディングフレームの方向と反対であることを指す。「順方向終止コドン」とは、コドンの方向が発現カセットのリーディングフレームの方向と同じであることを指す。終止コドンの役割は、線形ドナーが順方向または逆方向のどちらでゲノムに挿入されていても、２つのトリプレット終止コドンが内因性および外因性遺伝子の発現を停止させることができることである。
【０１０２】
本発明の線形ドナーＤＮＡの「保護配列」は任意の配列であってもよく、好ましくは、保護配列と、同一の線形ドナーＤＮＡの標的配列とは異なる。保護配列の長さは５〜３０ｂｐであってもよく、好ましくは２０ｂｐである。保護配列の役割は、細胞内の酵素（例えば、エキソヌクレアーゼ）によって線形ドナーＤＮＡの標的配列が切断されるのを防ぐことである。
【０１０３】
本文に記載の「マーカー遺伝子」とは、その発現がスクリーニングまたは濃縮されることができる任意のマーカー遺伝子を指し、すなわち、当該マーカー遺伝子が細胞で発現される場合、当該マーカー遺伝子を発現する細胞をある方式でスクリーニングして濃縮することができる。本発明に使用可能なマーカー遺伝子は、発現後にＦＡＣＳによりソーティングできる蛍光タンパク質遺伝子、または抗生物質でスクリーニングできる耐性遺伝子、または発現後に対応する抗体によって認識され、かつ免疫染色あるいは磁気ビーズ吸着によってスクリーニングできるタンパク質遺伝子を含むが、これらに限られていない。本発明に使用可能な耐性遺伝子は、ブラスチシジン（Ｂｌａｓｔｉｃｉｄｉｎ）、ジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、Ｇ−４１８）、ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ  Ｂ）、ミコフェノール酸（Ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）、ブレオマイシン（Ｚｅｏｃｉｎ）またはネオマイシン（Ｎｅｏｍｙｃｉｎ）に対する耐性遺伝子を含むが、これらに限定されていない。本発明に使用可能な蛍光タンパク質遺伝子は、青色蛍光タンパク質（Ｃｙａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、黄色蛍光タンパク質（Ｙｅｌｌｏｗ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、オレンジ蛍光タンパク質（Ｏｒａｎｇｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、赤色蛍光タンパク質（Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、遠赤色蛍光タンパク質（Ｆａｒ−Ｒｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）、または切り替え可能な蛍光タンパク質（Ｓｗｉｔｃｈａｂｌｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）の遺伝子を含むが、これらに限られていない。
【０１０４】
配列特異的ヌクレアーゼの例として、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）が含まれる。ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ジンクフィンガータンパク質ドメインと非特異的エンドヌクレアーゼドメインからなる、天然に存在しない人工的に改造されたエンドヌクレアーゼである。ジンクフィンガータンパク質ドメインは、一連のＣｙｓ２−Ｈｉｓ２ジンクフィンガータンパク質がタンデムで構成され、各ジンクフィンガータンパク質は、３’から５’への方向のＤＮＡ鎖上の一つの特異的トリプレット塩基および５’から３’への方向の一つの塩基を認識して結合する。複数のジンクフィンガータンパク質はタンデムで接続して、一段の特異的塩基配列を認識する一つのジンクフィンガープロテオームを形成することができ、強い特異性を持っている。ジンクフィンガープロテオームにリンクされた非特異的エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩカルボキシル末端の９６のアミノ酸残基からなるＤＮＡ切断ドメインに由来する。各ＦｏｋＩモノマーは一つのジンクフィンガープロテオームに接続され、特定の部位を認識する一つのＺＦＮを形成し、二つの認識部位間の距離が適切である場合（６〜８ｂｐ）、二つのモノマーＺＦＮは互いに作用して酵素消化機能を果たしてＤＮＡ固定点切断の目的を達成する。標的配列に対して８〜１０個のジンクフィンガードメインを設計し、これらの亜鉛ドメインをＤＮＡヌクレアーゼに接続すると、標的配列の二本鎖切断（Ｄｏｕｂｌｅ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ、ＤＳＢｓ）を実現でき、さらにＤＳＢｓ修復メカニズムを誘発してゲノム内の特定の部位に対して指向性変換を行うことができる。
【０１０５】
配列特異的ヌクレアーゼの別の例として、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が含まれる。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼは主にＦｏｋＩエンドヌクレアーゼドメインとＴＡＬＥタンパク質のＤＮＡ結合ドメインとから組み合わせてなる。ＴＡＬＥタンパク質は、３３〜３５のアミノ酸からなる複数の反復ペプチドセグメントを含み、各ペプチドセグメントは一つの塩基を認識することができる。ＺＦＮと同様に、ＴＡＬＥＮはＤＮＡ標的配列を切断してＤＳＢｓを形成し、さらにＤＮＡ損傷修復メカニズムを活性化してゲノムに対して特定の部位を変換することができる。
【０１０６】
本発明に使用可能な配列特異的ヌクレアーゼシステムの別の例として、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート、クリスパー）システムが含まれる。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムは、ＲＮＡによるＤＮＡ結合を利用して標的ＤＮＡの配列特異的切断を行い、ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＲＮＡ）が塩基対合を介してｔｒａｃｒＲＮＡ（ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ＲＮＡ）に結合してｔｒａｃｒＲＮＡ／ｃｒＲＮＡ複合体を形成し、この複合体はヌクレアーゼＣａｓ９タンパク質をガイドしてｃｒＲＮＡに対合した標的配列上の特定の位置で二本鎖ＤＮＡを切断する。ｃｒＲＮＡに対合した標的配列は通常、ゲノムＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）部位（ＮＮＧ）の上流の約２０個のヌクレオチドの配列である。
【０１０７】
標的部位に対するＣａｓ９タンパク質の切断には、ガイドＲＮＡが必要である。用語の「ガイドＲＮＡ」は、ｇＲＮＡ（ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）とも呼ばれ、ｇＲＮＡは通常、ｃｒＲＮＡ上の、標的配列に相補的なヌクレオチド、およびｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡが塩基対合によって形成されるＲＮＡ  Ｓｃａｆｆｏｌｄを含み、ｃｒＲＮＡと対合する標的配列を認識することができる。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質と一緒に複合体を形成し、Ｃａｓ９タンパク質を標的配列にガイドしてその中の標的部位を切断することができる。
【０１０８】
通常、ｇＲＮＡはｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）として使用される。ｓｇＲＮＡは「一本鎖ガイドＲＮＡ」とも呼ばれ、ｃｒＲＮＡとｔｒａｎｃｒＲＮＡとが融合してなる一本のＲＮＡ鎖である。
【０１０９】
本発明に使用可能な配列特異的ヌクレアーゼシステムの別の例として、ＮｇＡｇｏヌクレアーゼおよびそのｇＤＮＡが含まれる。ＮｇＡｇｏヌクレアーゼは、５’末端リン酸化された一本鎖ガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合して、ｇＤＮＡに相補的な標的配列を切断してＤＮＡ二本鎖切断を引き起こすことができる。
【０１１０】
本発明の線形ドナーＤＮＡは、一端にのみ標的配列を有していてもよく、両端にそれぞれ標的配列を有していてもよい。線形ドナーＤＮＡの両端の標的配列は異なってもよい。細胞ゲノムの二つの異なる標的部位で切断によって遺伝子ノックアウトを生成する必要がある場合、それぞれ一つの対応する標的配列を含む、二つの線形ドナーＤＮＡを提供してもよく、各端に一つの対応する標的配列が含まれている、一つの線形ドナーＤＮＡを提供してもよい。細胞ゲノムの複数の異なる標的部位で切断によって遺伝子ノックアウトを生成する必要がある場合、適切な数の線形ドナーＤＮＡを提供してもよく、各線形ドナーＤＮＡの一端または両端にそれぞれ複数の異なる対応する標的配列の中の一つが含まれている。例えば、標的部位の数と同じの数の線形ドナーＤＮＡを提供し、各線形ドナーＤＮＡは一つの対応する標的配列を含む。あるいは、標的部位の数より少ない線形ドナーＤＮＡを提供し、そのすべてまたはその一部の線形ドナーＤＮＡの両端はそれぞれ、複数の異なる対応する標的配列の中の一つを含み、その他の線形ドナーＤＮＡはそれぞれ、他の対応する標的配列の中の一つを含む。
【０１１１】
ユニバーサル標的配列を含むユニバーサル線形ドナーＤＮＡの場合、そのいずれか一端または両端に前記ユニバーサル標的配列を含んでもよい。このユニバーサル線形ドナーＤＮＡの標的配列は、細胞ゲノム内の切られる標的部位には依存しないため、細胞ゲノムの任意の一つの標的部位、任意の二つの標的部位、またはそれ以上の標的部位に対して切断して遺伝子ノックアウトを生成する場合に普遍的に適用できる。
【０１１２】
本発明に記載の「ユニバーサル標的配列」とは、配列特異的ヌクレアーゼにより切断できる配列を指すが、このユニバーサル標的配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在せず、すなわち、このユニバーサル標的配列と同じの、配列特異的ヌクレアーゼにより切断できる配列は、遺伝子ノックアウトされる細胞のゲノムには存在しなく、ユニバーサル標的配列は、細胞ゲノム上に存在する、同一の配列特異的ヌクレアーゼにより切断できる標的配列とは異なる。このユニバーサル標的部位を含む線形ドナーＤＮＡは、細胞ゲノム上の標的部位に対して特異性を持っていないため、ノックアウトする必要がある遺伝子およびその上の標的部位に対して特定の線形ドナーＤＮＡを構築する必要がなく、細胞内の任意の遺伝子の遺伝子ノックアウトに普遍的に適用できる。
【０１１３】
配列特異的ヌクレアーゼは、タンパク質の形、またはそれをコードする核酸配列（例えば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の形で細胞に導入することができる。配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸は、プラスミドまたはウイルスベクターに含まれて細胞に導入することができ、例えば、トランスフェクションにより細胞に導入することができる。また、配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸は、エレクトロポレーション、リポソーム、マイクロインジェクションなどによって細胞に直接に送達することもできる。
【０１１４】
ドナー構築体は、核酸を細胞に導入するのに適した任意の方法で送達することができ、例えば、トランスフェクションにより細胞に導入することができる。
【０１１５】
Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムとＮｇＡｇｏヌクレアーゼを使用して遺伝子ノックアウトを生成する場合、ｓｇＲＮＡまたはｇＤＮＡを細胞に導入する必要がある。ＲＮＡまたはＤＮＡを細胞に導入するのに適した任意の方法でｓｇＲＮＡまたはｇＤＮＡを送達することができる。ｓｇＲＮＡは、単離されたＲＮＡの形で細胞に導入できる。単離されたｓｇＲＮＡは、本分野で既知の任意のインビトロ転写システムを使用してインビトロ転写により調製することができる。また、ｓｇＲＮＡをコードする配列とプロモーターを含むベクターを通してｓｇＲＮＡを細胞に導入することができる。前記ベクターは、ウイルスベクターまたはプラスミドであってもよい。細胞を導入する方法は、トランスフェクションであってもよい。
【０１１６】
Ｃａｓ９を誘導して細胞ゲノムの二つ以上の異なる標的部位で切断して遺伝子ノックアウトを生成するように、異なる標的部位に対する二つ以上のｓｇＲＮＡを細胞に導入することができる。この二つ以上のｓｇＲＮＡは、異なるベクターに含まれていてもよく、ｇＲＮＡペア（ｐａｉｒｅｄ  ｇＲＮＡ）を含むベクター、またはそれ以上のｓｇＲＮＡを含むベクターのような同一のベクターに含まれていてもよい。
【０１１７】
本発明の方法では、異なる標的部位に対する二つ以上のｓｇＲＮＡを細胞に導入する場合、これらのｓｇＲＮＡによって認識される標的配列を含む線形ドナーＤＮＡをも同時に導入する。線形ドナーＤＮＡは５’末端または３’末端にのみ標的配列を含むことができ、または両端にそれぞれ標的配列を含むことができるので、ｓｇＲＮＡの数と線形ドナーＤＮＡの数とは異なってもよく、一つのｓｇＲＮＡが一つの線形ドナーＤＮＡに対応してもよく、二つのｓｇＲＮＡが二つの線形ドナーＤＮＡに対応してもよい。
【０１１８】
Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムと本発明のユニバーサル線形ドナーＤＮＡを使用して遺伝子ノックアウトを行う場合、ユニバーサル線形ドナーＤＮＡとＣａｓ９ヌクレアーゼを細胞に導入する他、Ｃａｓ９を誘導して細胞ゲノムの特定の標的配列とユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列を切断するように、細胞ゲノムの特定の標的配列に対するｓｇＲＮＡ、ユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列に対するｓｇＲＮＡを細胞に導入する必要がある。細胞ゲノムの特定の標的配列に対するｓｇＲＮＡと、ユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列に対するｓｇＲＮＡとは、異なるベクターに含まれていてもよく、同一のベクターに含まれていてもよい。
【０１１９】
細胞ゲノムの特定の標的配列に対するｓｇＲＮＡは、一つまたは複数のｓｇＲＮＡ、例えば、２つ、３つ、またはそれ以上のｇＲＮＡであってもよい。これらの一つを超えるｓｇＲＮＡは、細胞ゲノム上の異なる標的部位に対して同時に切断することを実現するように、細胞ゲノムにおける異なる特定の標的配列に対することができる。これらの異なる標的部位は異なる遺伝子に位置する場合、複数の遺伝子のノックアウト、例えば、２つ、３つ、またはそれ以上の遺伝子のノックアウトを実現することができる。具体的に言えば、複数遺伝子ノックアウトを行う時、Ｃａｓ９を誘導して細胞ゲノムの複数の特定の標的配列とユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列を切断するように、細胞ゲノムにおける複数の特定の標的配列に対しての複数のｓｇＲＮＡと、ユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列に対してのｓｇＲＮＡとをそれぞれ細胞に導入することができる。前記複数の特定の標的配列は異なる遺伝子に位置し、それによって複数遺伝子ノックアウトを実現する。前記細胞ゲノムにおける複数の特定の標的配列に対しての複数のｓｇＲＮＡは異なるベクターに含まれていてもよく、同一のベクターに含まれていてもよい。前記細胞ゲノムにおける複数の特定の標的配列に対しての複数のｓｇＲＮＡのいずれか一つ以上のｓｇＲＮＡとユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列に対してのｓｇＲＮＡとは、異なるベクターに含まれていてもよく、同一のベクターに含まれていてもよい。
【０１２０】
本発明によれば、前記ユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列は好ましくは、５’−ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ−３’または５’−ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ−３’である。
【０１２１】
好ましくは、本発明では、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して遺伝子ノックアウトを生成する場合、Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡ、および線形ドナーＤＮＡを同時に細胞に導入してもよく、または、例えば、まずＣａｓ９を細胞に導入し、そしてｓｇＲＮＡと線形ドナーＤＮＡを細胞に導入してもよい。一部の実施形態では、Ｃａｓ９を含むベクター、ｓｇＲＮＡを含むベクター、および線形ドナーＤＮＡを用いて細胞をコトランスフェクションする。もう一部の実施形態では、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡをインビトロでタンパク質とＲＮＡ複合体に組み立てて線形ドナーＤＮＡと一緒に細胞をコトランスフェクションする。もう一部の実施形態では、Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡをレンチウイルスによって細胞内に安定的発現し、線形ドナーＤＮＡで細胞をトランスフェクションする。他の一部の実施形態では、まずＣａｓ９を細胞内で安定的に発現し、そしてｓｇＲＮＡを含むベクターと線形ドナーＤＮＡで細胞をコトランスフェクションする。
【０１２２】
本発明により提供される遺伝子ノックアウトに用いられるシステムまたはキットにおいて、配列特異的ヌクレアーゼは、タンパク質の形、またはそれをコードする核酸配列（例えば、ｍＲＮＡまたはｃＤＮＡ）の形、例えば、配列特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含むプラスミドまたはウイルスベクターの形であってもよい。Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを使用する場合、ｓｇＲＮＡは単離されたＲＮＡの形、またはｓｇＲＮＡをコードする配列とプロモーターを含むベクターの形、例えば、ウイルスベクターまたはプラスミドベクターであってもよい。
【０１２３】
本文に記載の細胞は、任意の真核細胞であってもよく、例えば、全能性細胞、多能性細胞、成体幹細胞、受精卵または体細胞などの単離された動物細胞であってもよい。一部の実施形態では、前記細胞は脊椎動物の細胞である。一部の実施形態では、前記細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記細胞はヒト細胞である。一部の実施形態では、前記細胞は、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウマ、げっ歯類動物、魚、霊長類動物の細胞である。一部の実施形態では、げっ歯類動物は、マウス、ラット、ウサギを含む。
【０１２４】
本発明の方法は、細胞内の単一の遺伝子または複数の遺伝子に対して標的遺伝子ノックアウトを行うことに使用でき、例えば、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の遺伝子を標的としてノックアウトすることに使用できる。複数の遺伝子に対しての標的遺伝子ノックアウトは、同時に行ってもよいし、前後に行ってもよい。例えば、２つ以上の標的遺伝子に対する配列特異的ヌクレアーゼまたは配列特異的ヌクレアーゼシステムをすべて細胞に導入してから、濃縮スクリーニングすることができる。あるいは、一つ以上の標的遺伝子に対する配列特異的ヌクレアーゼまたは配列特異的ヌクレアーゼシステムを細胞に導入してから濃縮スクリーニングし、そしてその他の標的遺伝子に対する配列特異的ヌクレアーゼまたは配列特異的ヌクレアーゼシステムを細胞に導入してから濃縮スクリーニングしてもよい。異なる標的遺伝子に対して異なるマーカー／マーカー遺伝子を使用することができる。例えば、前述のように、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを使用して遺伝子ノックアウトを生成する場合、それぞれ異なる標的部位に対する二つ以上のｓｇＲＮＡを細胞に導入する時、これらｓｇＲＮＡによって認識される標的配列を含む線形ドナーＤＮＡを同時に導入することができる。これらの異なる標的部位が異なる遺伝子上に位置する時、複数の遺伝子の遺伝子ノックアウトを実現することができる。また、細胞ゲノム内の二つ以上の遺伝子のコンセンサス配列を使用してｓｇＲＮＡと線形ドナーＤＮＡ内の標的配列を設計することができ、この場合、細胞ゲノム内の単一の特定の標的部位を認識するｓｇＲＮＡを細胞に導入すると同時に、前記ｓｇＲＮＡによって認識される標的配列を含む線形ドナーＤＮＡを導入することができ、前記ｓｇＲＮＡによって認識される標的配列は、細胞ゲノム内の２つ以上の遺伝子のコンセンサス配列であり、その条件として、前記コンセンサス配列と、前記２つ以上の遺伝子のいずれか１つの、コンセンサス配列に対応する位置の配列とは、１つ以下の塩基の違いを有する。実施例７で証明されたように、二つの塩基の違いはｓｇＲＮＡによる認識を混乱させる可能性がある。
【０１２５】
本発明の線形ドナーＤＮＡによる遺伝子編集のための標的遺伝子は、Ｃａｓ９／ＣＲＩＳＰＲシステムを介して二本鎖切断を生成できる限り、特に限定されていない。標的遺伝子は、エクソン、イントロン、または調節配列、若しくはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【０１２６】
本発明で使用される「含む」または「含有する」という用語は、「含むがこれらに限られていない」、「基本的に…からなる」、または「…からなる」を意味する。
【実施例】
【０１２７】
以下の実施例および図面を合わせて本発明についてさらに説明するが、これらは例示な説明のために過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。特に指定のない限り、実施例はいずれも、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの分子クローニング実験マニュアル（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ＤＷ，Ｍоｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌоｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂоｒａｔоｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２００１）などの従来の実験条件、またはメーカーにより提供されたプロトコルに従って行われた。
【０１２８】
実施例１  線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨｅＬａ細胞におけるＡＮＴＸＲ１遺伝子上のノックアウトイベントの濃縮
【０１２９】
１、ｓｇＲＮＡの設計
ＨｅＬａ細胞におけるＡＮＴＸＲ１遺伝子の第一エクソンを標的とする２つのｓｇＲＮＡを設計し、それらが標的部位で欠失または挿入突然変異（Ｉｎｄｅｌｓ）を生成する効率をＴ７Ｅ１アッセイで検証し、検証の結果は表１に示される。ｓｇＲＮＡ１ＡＮＴＸＲ１の標的配列は、本実施例ではｓｇ１と呼ばれ、ｓｇＲＮＡ２ＡＮＴＸＲ１の標的配列は、本実施例ではｓｇ２と呼ばれる。
【０１３０】
【表１】
2020533017.tif 000003
【０１３１】
２、線形ドナーＤＮＡの構築
２つの線形ドナーＤＮＡ（ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ２とＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｐｇ）を構築した。その構造を図１ａに示す。
ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ２は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ２、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｐｇは５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、ｓｇ２、２０ｂｐの保護配列を含む。
対照としての線形ドナーＤＮＡ（Ｄｏｎｏｒｎо  ｃｕｔ）は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、２０ｂｐのランダム配列、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。ランダム配列はｓｇ１またはｓｇ２とは異なる。
【０１３２】
３、トランスフェクション
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｓｇＲＮＡ２ＡＮＴＸＲ１またはｐｇＲＮＡＡＮＴＸＲ１、およびそれらに対応するドナーでＨｅＬａ細胞をコトランスフェクションし、対照として、線形ドナーＤＮＡ（ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ２、ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｐｇ、およびＤｏｎｏｒｎо  ｃｕｔ）のみでＨｅＬａ細胞をトランスフェクションし、ピューロマイシンを加えて耐性によりスクリーニングして、混合コロニー（ｐооｌｅｄ  ｐоｐｕｌａｔｉоｎ）と単一のクローン（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｌｏｎｅｓ）を得て、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）で染色した。その結果は図１ｂに示される。
ｓｇＲＮＡ２ＡＮＴＸＲ１とその対応するドナーＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ２を受けたサンプル、およびｐｇＲＮＡＡＮＴＸＲ１とその対応するドナーＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｐｇを受けたサンプルから、ピューロマイシン耐性（ｐｕｒо＋）を有する多くの細胞クローンを得た。ドナーのみでトランスフェクションすると、わずかのピューロマイシン耐性クローンしか生じなかった。これは、染色体への線形ドナーの組み込むはまれでランダムであるからかもしれない。また、対照ドナーＤｏｎｏｒｎо  ｃｕｔと、Ｃａｓ９を発現するプラスミドおよびｓｇＲＮＡ２ＡＮＴＸＲ１のコトランスフェクションも、有意な量のｐｕｒо＋クローンを生成できなかった（図１ｂの一番右の図参照）。これは、ｓｇＲＮＡにより媒介されたＣａｓ９がドナー上での切断は、効果的なドナーの組み込むに対して重要であることを示している。ｐｇＲＮＡＡＮＴＸＲ１により媒介された二重切断ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｐｇの組み込むは、ｓｇＲＮＡ２ＡＮＴＸＲ１とＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ２との和よりも効率的である。しかしながら、どの線形ドナーＤＮＡを使用しても、十分なｐｕｒо＋クローンが生成され、後続の突然変異体の同定に使用できる。
【０１３３】
４、遺伝子ノックアウトの効率の検証
また、Ｃａｓ９を発現するプラスミドとｓｇＲＮＡ２ＡＮＴＸＲ１またはｐｇＲＮＡＡＮＴＸＲ１を用い、それらの対応するドナーの添加または非添加で、ＨｅＬａ細胞をコトランスフェクションし、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を用いて混合コロニーおよびモノクローンをスクリーニングして取得した。その中で、対応するドナーを添加しなかった場合に、ピューロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドと一緒にコトランスフェクションした。ＨｅＬａ細胞におけるＡＮＴＸＲ１遺伝子のノックアウトにより、細胞がキメラ炭疽毒素（ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ）に対して耐性が生じ［１７］、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡ（ＰＡ：１５０ｎｇ／ｍｌ；ＬＦｎＤＴＡ：１００ｎｇ／ｍｌ）を用いて、ピューロマイシンによりスクリーニングして取得した混合コロニーとモノクローンを処理して、線形ドナーＤＮＡがＡＮＴＸＲ１ノックアウト効率に対する影響を比較した。ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡで処理した異なる細胞の画像は図２ａに示される。ｐｕｒо＋混合コロニー中の、当該毒素耐性を有する細胞の百分比を計算することによってＡＮＴＸＲ１ノックアウト効率を確定し、図１ｃに示すように、ｓｇＲＮＡ２ＡＮＴＸＲ１またはｐｇＲＮＡＡＮＴＸＲ１を単独に用いる場合より、線形ドナーＤＮＡの使用は、遺伝子ノックアウト効率を６〜８倍にも高めた。ｐｕｒо＋モノクローンの線形ドナーが組み込まれたＡＮＴＸＲ１部位についてＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅に使用されたＬ１／Ｒ１プライマー配列は表２に示される。その結果は図２ｂに示す。これから分かるように、ｐｕｒо＋細胞混合物から単離された大部分のクローンは、ｓｇＲＮＡ標的部位にドナー挿入物を含んでいる（図１ｄも参照）。図１ｄから、ドナーフラグメントを有する細胞のほぼ９０％が真の遺伝子ノックアウトクローンであることも分かる。
【０１３４】
【表２】
2020533017.tif 000004
【０１３５】
実施例２  線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨｅＬａ細胞におけるＨＢＥＧＦ遺伝子上のノックアウトイベントの濃縮
【０１３６】
単一または二重切断部位を有するドナーはいずれも、標的部位に修飾を有する細胞に対するスクリーニングを大幅に改善することができるため、便宜上、本実施例では、単一切断ドナーのみを使用した。
【０１３７】
１、ｓｇＲＮＡの設計
ＨｅＬａ細胞におけるＨＢＥＧＦ遺伝子を標的とする２つのｓｇＲＮＡを設計し、それらが標的部位でＩｎｄｅｌｓを生成する効率をＴ７Ｅ１アッセイで検証した。検証結果を表３に示す。ｓｇＲＮＡ１ＨＢＥＧＦの標的配列は本実施例ではｓｇ１と呼ばれ、ｓｇＲＮＡ２ＨＢＥＧＦの標的配列は本実施例ではｓｇ２と呼ばれる。
【０１３８】
【表３】
2020533017.tif 000005
【０１３９】
２、線形ドナーＤＮＡの構築
線形ドナーＤＮＡ（ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ１）を構築した。その構造は図３ａに示される。
ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ１は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
【０１４０】
３、トランスフェクション
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｓｇＲＮＡ１ＨＢＥＧＦ、およびそれに対応するドナーＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ１でＨｅＬａ細胞をコトランスフェクションし、対照として、ドナーＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ１のみでＨｅＬａ細胞をトランスフェクションし、ピューロマイシンを加えて耐性でスクリーニングして、混合コロニー（ｐооｌｅｄ  ｐоｐｕｌａｔｉоｎ）と単一のクローン（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｌｏｎｅｓ）を得て、ＭＴＴで染色した。その結果は図３ｂに示される。
実施例１の結果と同様に、ドナープラスｓｇＲＮＡでしか大量のｐｕｒо＋クローンを取得しなかった。この結果により再び証明されたように、ドナー挿入は、特異的なｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｓｇＲＮＡにより媒介されたＤＳＢｓによって決められる。
【０１４１】
４、遺伝子ノックアウトの効率の検証
また、Ｃａｓ９を発現するプラスミドとｓｇＲＮＡ１ＨＢＥＧＦを用い、それに対応するドナーＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ１の添加または非添加で、ＨｅＬａ細胞をコトランスフェクションし、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を用いて混合コロニーおよびモノクローンをスクリーニングして取得した。その中で、対応するドナーを添加しなかった場合に、ピューロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドと一緒にコトランスフェクションした。ＨＢＥＧＦ遺伝子はジフテリア毒素（ＤＴ）受容体をコードするので、ＨｅＬａ細胞においてそれをノックアウトすると、細胞がＤＴに対して耐性が生じ［１７］、ＤＴ（４０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、ピューロマイシンによりスクリーニングして取得した混合コロニーとモノクローンを処理して、線形ドナーＤＮＡがＨＢＥＧＦノックアウト効率に対する影響を比較した。ＤＴで処理した異なる細胞の画像は図３ｃに示される。図３ｄに示すように、ｐｕｒо＋混合コロニー中の、ＤＴ耐性を有する細胞の百分比を計算することによってＨＢＥＧＦノックアウト効率を確定した。図３ｃと図３ｄから分かるように、ｓｇＲＮＡ１ＨＢＥＧＦを単独に用いる場合より、線形ドナーＤＮＡの使用は、ＨＢＥＧＦ遺伝子ノックアウト効率を大幅に高めた。
【０１４２】
実施例３  線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＢＥＧＦ遺伝子上のノックアウトイベントの濃縮
【０１４３】
１、ｓｇＲＮＡの設計および線形ドナーＤＮＡの構築
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＨＢＥＧＦ遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ２ＨＢＥＧＦを設計し、線形ドナーＤＮＡ（ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ２）を構築した。ドナーは５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ２、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるＥＧＦＰ遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。図４ａを参照することができる。
【０１４４】
２、遺伝子ノックアウトの効率の検証
Ｃａｓ９を発現するプラスミドとｓｇＲＮＡ２ＨＢＥＧＦを用い、それに対応するドナーＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ２の添加または非添加で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をコトランスフェクションし、ＦＡＣＳで細胞をスクリーニングし、ドナーが添加された群についてＦＡＣＳでＥＧＦＰ陽性細胞をスクリーニングし、ドナーが添加されなかった群についてＦＡＣＳでｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をスクリーニングした。ＤＴ（４０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、ＦＡＣＳにより選択された細胞を処理して、線形ドナーＤＮＡがＨＢＥＧＦノックアウト効率に対する影響を比較した。ＤＴで処理した異なる細胞の画像は図４ｂに示される。図４ｄに示すように、ＥＧＦＰ陽性細胞中の、ＤＴ耐性を有する細胞の百分比を計算することによってＨＢＥＧＦノックアウト効率を確定した。ｓｇＲＮＡ２ＨＢＥＧＦを単独に用いる場合より、線形ドナーＤＮＡの使用は、ＨＢＥＧＦ遺伝子ノックアウト効率を大幅に高めた。
【０１４５】
実施例４  線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨｅＬａＯＣ細胞におけるＡＮＴＸＲ１遺伝子上のノックアウトイベントの濃縮
【０１４６】
１、ＨｅＬａＯＣ細胞株の確立
Ｃａｓ９を安定的に発現するＨｅＬａＯＣ細胞株を既存の方法に従って確立した［１７］。
【０１４７】
２、ｓｇＲＮＡの設計および線形ドナーＤＮＡの構築
図５ａに示すように、ＨｅＬａＯＣ細胞におけるＡＮＴＸＲ１遺伝子を標的とする２つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１ＡＮＴＸＲ１とｓｇＲＮＡ２ＡＮＴＸＲ１）を設計し、三つの線形ドナーＤＮＡ（ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ１、ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ２、およびＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｐｇ）を構築した。ｓｇＲＮＡ１ＡＮＴＸＲ１の標的配列は、本実施例ではｓｇ１と呼ばれ、ｓｇＲＮＡ２ＡＮＴＸＲ１の標的配列は、本実施例ではｓｇ２と呼ばれる。
ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ１は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ２は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ２、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｐｇは５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、ｓｇ２、２０ｂｐの保護配列を含む。
【０１４８】
３、トランスフェクション
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｓｇＲＮＡ１ＡＮＴＸＲ１またはｓｇＲＮＡ２ＡＮＴＸＲ１またはｐｇＲＮＡＡＮＴＸＲ１、およびそれらに対応するドナーでＨｅＬａＯＣ細胞をコトランスフェクションし、対照として、線形ドナーＤＮＡ（ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ１、ＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ２、およびＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｐｇ）のみでＨｅＬａＯＣ細胞をトランスフェクションし、ピューロマイシンを加えて耐性でスクリーニングして、ＭＴＴで染色した。その結果は図５ｂに示される。
ＨｅＬａ細胞における結果と同様に、ドナープラスｓｇＲＮＡでしか大量のｐｕｒо＋クローンを取得しなかった。
【０１４９】
４、遺伝子ノックアウトの効率の検証
また、Ｃａｓ９を発現するプラスミドとｓｇＲＮＡ１ＡＮＴＸＲ１またはｓｇＲＮＡ２ＡＮＴＸＲ１またはｐｇＲＮＡＡＮＴＸＲ１を用い、それらに対応するドナーの添加または非添加で、ＨｅＬａＯＣ細胞をコトランスフェクションし、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を用いてスクリーニングした。スクリーニングして取得した細胞をＰＡ／ＬＦｎＤＴＡで処理し、ＰＡ／ＬＦｎＤＴＡで処理した異なる細胞の画像は図５ｃに示される。ｐｕｒо＋混合コロニー中の、当該毒素耐性を有する細胞の百分比を計算することによってＡＮＴＸＲ１ノックアウト効率を確定し、図５ｄに示すように、ｓｇＲＮＡを単独に用いる場合より、線形ドナーＤＮＡの使用は、ＡＮＴＸＲ１遺伝子ノックアウト効率を大幅に高めた。
ｐｕｒо＋の単一クローンについて、ＡＮＴＸＲ１遺伝子上のドナーＤｏｎｏｒＡＮＴＸＲ１−ｓｇ１の組み込む部位でＰＣＲ検証をした結果、ｐｕｒо＋の大部分のクローンはｓｇＲＮＡ標的部位にドナー挿入物を含み（図５ｅと図５ｆ）、ドナーフラグメントを有する細胞の大部分が真の遺伝子ノックアウトクローンである（図５ｆ）ことが分かった。
〜５００ｂｐ（長さは、野生型ＡＮＴＸＲ１遺伝子に対応する）のＰＣＲフラグメントおよび〜１．８ｋｂ（長さは、野生型ＡＮＴＸＲ１遺伝子プラスドナー挿入物に対応する）のＰＣＲフラグメントについてゲノムシーケンシングを行った。結果を表４に示す。
【０１５０】
【表４】
2020533017.tif 000006
【０１５１】
ＰＣＲ検証結果（図５ｅ）とシーケンシング結果（表４）から見えるように、大部分のクローンにはドナー挿入が一つしか含まれていない。ただし、ドナー陽性クローンでは、ほとんどの対立遺伝子が標的部位で編集（または突然変異が発生するという）されるが、ドナーを使用せずに濃縮する場合、単独のｓｇＲＮＡに挿入または欠失突然変異（ｉｎｄｅｌｓ）が生じる効率は低い。この発見は明らかに、ドナー挿入とｓｇＲＮＡまたはｐｇＲＮＡの役割と密接に関連していることを示している。
【０１５２】
５、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのオフターゲット効果に対するドナーの影響
外部ドナーの使用がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのオフターゲット効果に影響を与えるかどうかを検査するために、ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ  ＰＣＲ分析によって全ゲノムの組み込む部位を見つけた［３５〜３７］。
本実施例では、ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ  ＰＣＲ分析によって、ピューロマイシンによりスクリーニングした後に単一クローンおよび混合細胞クローン内のオフターゲットの挿入を検証した。ＡＮＴＸＲ１遺伝子上に正しいドナー挿入がある場合、プライマーＳｐｌｉｎｋ２／Ｒ１とＳｐｌｉｎｋ２／Ｒ２で増幅するとそれぞれ７１１−と９２７−ｂｐの産物が生じる（図６ａ参照）。
ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ  ＰＣＲ分析を行うために、ＨｅＬａＯＣ細胞においてＡＮＴＸＲ１を標的とした、ドナー挿入を有する１０つの単一クローンと、４つのｐｕｒо＋混合クローンとをランダムに選択した。ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ  ＰＣＲの結果（図６ｂ）によれば、ドナーでトランスフェクションされなかったクローンと同様に、ドナーによって濃縮された単一クローンまたは混合コロニーには、検測可能なオフターゲット効果はなかった。
【０１５３】
実施例５  線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨｅＬａＯＣ細胞におけるＨＢＥＧＦ遺伝子上のノックアウトイベントの濃縮
【０１５４】
１、ｓｇＲＮＡの設計および線形ドナーＤＮＡの構築
図７ａに示すように、ＨｅＬａＯＣ細胞におけるＨＢＥＧＦ遺伝子を標的とする２つのｓｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ１ＨＢＥＧＦとｓｇＲＮＡ２ＨＢＥＧＦ）を設計し、三つの線形ドナーＤＮＡ（ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ１、ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ２、およびＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｐｇ）を構築した。ｓｇＲＮＡ１ＨＢＥＧＦの標的配列は、本実施例ではｓｇ１と呼ばれ、ｓｇＲＮＡ２ＨＢＥＧＦの標的配列は、本実施例ではｓｇ２と呼ばれる。
ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ１は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ２は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ２、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｐｇは５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、ｓｇ２、２０ｂｐの保護配列を含む。
【０１５５】
３、トランスフェクション
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｓｇＲＮＡ１ＨＢＥＧＦまたはｓｇＲＮＡ２ＨＢＥＧＦまたはｐｇＲＮＡＨＢＥＧＦ、およびそれらに対応するドナーでＨｅＬａＯＣ細胞をコトランスフェクションし、対照として、線形ドナーＤＮＡ（ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ１、ＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ２、およびＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｐｇ）のみでＨｅＬａＯＣ細胞をトランスフェクションし、ピューロマイシンを加えて耐性でスクリーニングした。その結果は図７ｂに示される。
ＨｅＬａ細胞における結果と同様に、ドナープラスｓｇＲＮＡでしか大量のｐｕｒо＋クローンを取得しなかった。
【０１５６】
４、遺伝子ノックアウトの効率の検証
ｐｕｒо＋の単一クローンについて、ＨＢＥＧＦ遺伝子上のドナーＤｏｎｏｒＨＢＥＧＦ−ｓｇ１の組み込む部位でＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅に使用されたＬ２／Ｒ２プライマー配列は表５に示される。これから分かるように、ｐｕｒо＋の大部分のクローンは、ｓｇＲＮＡ標的部位にドナー挿入物を含んでおり（図７ｃと図７ｄ）、ドナーフラグメントを有する細胞の大部分は真の遺伝子ノックアウトクローンである（図７ｄ）。
【０１５７】
【表５】
2020533017.tif 000007
【０１５８】
実施例６  線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨｅＬａＯＣ細胞での二重遺伝子ノックアウト
１、ｓｇＲＮＡの設計
【０１５９】
ＨｅＬａＯＣ細胞におけるＰＳＥＮ１とＰＳＥＮ２との２つの標的遺伝子を選択し、この二つの標的遺伝子をそれぞれ標的とする二つのｓｇＲＮＡを設計し、それらが標的部位でＩｎｄｅｌｓを生成する効率をＴ７Ｅ１アッセイで検証し、検証の結果は表６に示される。ｓｇＲＮＡ１ＰＳＥＮ１の標的配列は、本実施例ではｓｇＰＳＥＮ１と呼ばれ、ｓｇＲＮＡＰＳＥＮ２の標的配列は、本実施例ではｓｇＰＳＥＮ２と呼ばれる。
【０１６０】
【表６】
2020533017.tif 000008
【０１６１】
２、線形ドナーＤＮＡの構築
２種類のドナーを構築した。図８ａに示すように、１種類は二つの単独のドナー（ＤｏｎｏｒＰＳＥＮ１＋ＤｏｎｏｒＰＳＥＮ２）を有し、各ドナーは、対応するｓｇＲＮＡの標的配列を有し、もう１種類のドナー（ＤｏｎｏｒＰＳＥＮ）は両端にそれぞれ２つのｓｇＲＮＡ標的配列を有する。ＤｏｎｏｒＰＳＥＮ１またはＤｏｎｏｒＰＳＥＮ２は、その５’末端にｓｇＲＮＡＰＳＥＮ１またはｓｇＲＮＡＰＳＥＮ２の切断部位を有する。ＤｏｎｏｒＰＳＥＮ１＋ＰＳＥＮ２はその５’末端にｓｇＲＮＡＰＳＥＮ１の切断部位を有し、３’末端にｓｇＲＮＡＰＳＥＮ２の切断部位を有する。
ＤｏｎｏｒＰＳＥＮ１は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇＰＳＥＮ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
ＤｏｎｏｒＰＳＥＮ２は５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇＰＳＥＮ２、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
ＤｏｎｏｒＰＳＥＮは５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇＰＳＥＮ１、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、ｓｇＰＳＥＮ２、２０ｂｐの保護配列を含む。
【０１６２】
３、トランスフェクションおよび遺伝子ノックアウトの効率の検証
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｓｇＲＮＡＰＳＥＮ１またはｐｇＲＮＡＰＳＥＮ２でＨｅＬａＯＣ細胞をコトランスフェクションし、または、Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｐｇＲＮＡＰＳＥＮでＨｅＬａＯＣ細胞をコトランスフェクションし、これによってＰＳＥＮ１とＰＳＥｎ２遺伝子の特定の部位にｉｎｄｅｌｓを生成した。ｉｎｄｅｌｓの生成効率をＴ７Ｅ１により分析し［２６］（使用されたプライマーについて表７参照）、その結果は図９ａに示される。それらのコトランスフェクションはいずれも一般的な活性のみを示した。
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｐｇＲＮＡＰＳＥＮ、およびＤｏｎｏｒＰＳＥＮでＨｅＬａＯＣ細胞をコトランスフェクションし、または、Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｐｇＲＮＡＰＳＥＮ、およびＤｏｎｏｒＰＳＥＮ１＋ＤｏｎｏｒＰＳＥＮ２でＨｅＬａＯＣ細胞をコトランスフェクションし、ピューロマイシンを加えて耐性でスクリーニングして、ｐｕｒо＋クローンを得ることができた（図９ｂ参照）。前の実施例の結果と同様に、ドナープラスｐｇＲＮＡでは大量のｐｕｒо＋クローンを得た。
各トランスフェクションの結果について、ｐｕｒо＋の単一クローンを取って、ＰＳＥＮ１とＰＳＥＮ２遺伝子上の、ドナーＤｏｎｏｒＰＳＥＮ、およびＤｏｎｏｒＰＳＥＮ１＋ＤｏｎｏｒＰＳＥＮ２の組み込む部位についてＰＣＲ検証を行い、ＰＣＲ増幅に使用されたプライマー配列は表７に示される。その中で、Ｌ３／Ｒ３は、ＰＳＥＮ１上の組み込む部位を増幅するためのものであり、Ｌ４／Ｒ４は、ＰＳＥＮ２上の組み込む部位を増幅するためのものであり、ＰＣＲ検証結果は図９ｃに示す。２つの遺伝子がいずれもドナー挿入を含むクローンは、枠で表示され、クローン１とクローン２を選択してさらにゲノムシーケンシング解析をした結果、２つのクローンがいずれもＰＳＥＮ１とＰＳＥＮ２の破壊を示した（図８ｂと図８ｃ）。
【０１６３】
【表７】
2020533017.tif 000009
【０１６４】
実施例７  線形ドナーＤＮＡを利用した、ＨｅＬａＯＣ細胞での多遺伝子ノックアウト
【０１６５】
１、標的遺伝子の選択およびｓｇＲＮＡの設計
ＨｅＬａＯＣ細胞のＨＳＰＡ遺伝子ファミリーを選択した。この遺伝子ファミリーは、ＨＳＡＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、ＨＳＢＡ１Ｌ、ＨＳＰＡ６、およびＨＳＰＡ２の５つの遺伝子を有し、これらは相同性を有する。図８ｄに示すように、ＨＳＡＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、およびＨＳＢＡ１Ｌを同時に標的とするｓｇＲＮＡＨＳＰＡを設計し、このｓｇＲＮＡの標的配列には、ＨＳＰＡ６の対応する配列と１つのミスマッチが有、ＨＳＰＡ２と２つのミスマッチがある。
【０１６６】
２、線形ドナーＤＮＡの構築
線形ドナーＤｏｎｏｒＨＳＰＡを構築し、５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇＨＳＰＡ、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む（図８ｄ）。
【０１６７】
３、トランスフェクションおよび遺伝子ノックアウトの効率の検証
Ｃａｓ９を発現するプラスミド、ｓｇＲＮＡＨＳＰＡを使用し、それに対応するドナーＤｏｎｏｒＨＳＰＡが添加または非添加で、ＨｅＬａＯＣ細胞をコトランスフェクションしてｉｎｄｅｌｓを誘発し、ピューロマイシンを介して耐性でスクリーニングした。ドナーが添加されなかった群について、ピューロマイシン耐性遺伝子を発現するプラスミドと一緒にコトランスフェクションした。すべての５つの遺伝子のｉｎｄｅｌｓ効率をＴ７Ｅ１アッセイ（使用されたプライマーについて表８参照）により評価し、その結果は図８ｅに示される。単独のｓｇＲＮＡＨＳＰＡと比べて、ドナーＨＳＰＡを使用することにより、ＨＳＰＡ１Ａ部位での突然変異率は約５．５倍増加し、ＨＳＰＡ１Ｂ部位での突然変異率は約６．１倍増加し、ＨＳＰＡ１Ｌ部位での突然変異率は約３．４倍増加し、ＨＳＰＡ６部位での突然変異率は約６．６倍増加した。興味深いことに、ドナーを使用してもしなくても、ＨＳＰＡ２遺伝子上にはｉｎｄｅｌｓは検出されなかった。これは、２つのミスマッチがｓｇＲＮＡＨＳＰＡの認識を完全に混乱させてしまい、さらに重要なことに、ドナーによるスクリーニングは、オフターゲット効果のリスクを増加しなかったことを示している。
ドナーとコトランスフェクションして、およびドナーとコトランスフェクションせずに得られた混合細胞のＨＳＰＡファミリー遺伝子の標的配列についてシーケンシングし、その結果は図１０に示される。その結果、ＨＳＰＡファミリー遺伝子部位上にドナートランスフェクションがあるかないかを問わず、細胞混合シーケンシングの結果は、Ｔ７Ｅ１アッセイの結果と一致している。
なお、Ｔ７Ｅ１アッセイは、スクリーニングされたコロニーが標的突然変異を有する細胞を高度に濃縮し、ドナーを使用しない従来の方法と比べて、濃縮係数は約７５３（５．５＊６．１＊３．４＊６．６）であることを示した。この計算ではドナー挿入を有する遺伝子は考慮されてないことに鑑み、実際の効率向上はさらに大きい。
ピューロマイシン耐性を有する単一クローンについて、５つの標的部位上でＰＣＲ検証を行った。５つの遺伝子の標的部位を増幅するために使用された特異的プライマー（Ｌ５／Ｒ５、Ｌ６／Ｒ６、Ｌ７／Ｒ７、Ｌ８／Ｒ８、Ｌ９／Ｒ９）は表８に示される。その結果は図１１ａと１１ｂに示される。少なくとも２つの標的遺伝子上にドナー挿入を有する６つのクローン（図において枠で表示され、それぞれ１〜６と番号付けられた）を選択してゲノム配列分析をして、その結果を図１１ｂに示される。クローン３は４つの遺伝子の対応する部位上で修飾があり、ＨＳＰＡ１Ａ、ＨＳＰＡ１Ｂ、およびＨＳＰＡ１Ｌ上にフレームシフト突然変異を有し、完全なノックアウトを生成し、ＨＳＰＡ６上に２つのフレーム内突然変異を有する（図８ｆ）。
【０１６８】
【表８】
2020533017.tif 000010
【０１６９】
実施例８  ユニバーサルｓｇＲＮＡを含む線形ドナーＤＮＡを利用した、ＳＣ−８細胞のＣＳＰＧ４遺伝子上のノックアウトイベントの濃縮
【０１７０】
１、ユニバーサルｓｇＲＮＡのスクリーニング
下記表に示すように、次の１０つのｓｇＲＮＡをスクリーニングの候補配列として選択した。
【０１７１】
【表９】
2020533017.tif 000011
【０１７２】
２、線形ドナーＤＮＡの構築
上記１０つのユニバーサルｓｇＲＮＡに基づいて１０つの線形ドナーＤＮＡ（ＤｏｎｏｒｓｇＲＮＡ＿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１〜１０−ｐｕｒо）を構築した。
これらの線形ドナーＤＮＡは５’から３’末端へそれぞれ、２０ｂｐの保護配列、ｓｇＲＮＡＵｎｉｖｅｒｓａｌ＿１〜１０の標的配列、逆方向終止コドン、ＣＭＶプロモーターにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子、順方向終止コドン、２０ｂｐの保護配列を含む。
【０１７３】
３、タンデムｓｇＲＮＡプラスミドの構築
上記１０つの線形ドナーに基づいて１０つのタンデムｓｇＲＮＡプラスミド（ＰｌａｓｍｉｄｐｇＲＮＡ＿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１〜１０）を構築し、その構造は図１２に示す。
タンデムで接続する２つのｓｇＲＮＡはそれぞれｓｇＲＮＡＣＳＰＧ４とｓｇＲＮＡＵｎｉｖｅｒｓａｌ＿１〜１０である。ｓｇＲＮＡＣＳＰＧ４はＴｃｄＢ毒素の受容体ＣＳＰＧ４を標的とし、ｓｇＲＮＡＵｎｉｖｅｒｓａｌ＿１〜１０は、対応するドナーＤＮＡ（ＤｏｎｏｒｓｇＲＮＡ＿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１〜１０−ｐｕｒо）における標的配列を標的とする。
【０１７４】
４、トランスフェクション
トランスフェクション実験で使用した細胞株は、Ｃａｓ９を安定的に発現する細胞株（ＳＣ−８）であり、１０つのタンデムプラスミドＰｌａｓｍｉｄｐｇＲＮＡ＿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１〜１０と、対応するドナーＤＮＡ（ＤｏｎｏｒｓｇＲＮＡ＿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１〜１０−ｐｕｒо）とでＳＣ−８細胞をコトランスフェクションし、対照として、１０つの線形ドナーＤＮＡ（ＤｏｎｏｒｓｇＲＮＡ＿Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ＿１〜１０−ｐｕｒо）のみでＳＣ−８細胞をトランスフェクションした。そして、ピューロマイシンを加えて耐性でスクリーニングして、混合コロニー（ｐооｌｅｄ  ｐоｐｕｌａｔｉоｎ）を得た。スクリーニングの結果は下記表に示される。
【０１７５】
【表１０】
2020533017.tif 000012
【０１７６】
上記の結果によると、ｓｇＲＮＡＵｎｉｖｅｒｓａｌ＿１、ｓｇＲＮＡＵｎｉｖｅｒｓａｌ＿３、ｓｇＲＮＡＵｎｉｖｅｒｓａｌ＿６、およびｓｇＲＮＡＵｎｉｖｅｒｓａｌ＿９の４つのｓｇＲＮＡの効果が良好であったため、これら４つのｓｇＲＮＡに対応する混合コロニーを実験対象として後続実験で使用した。
【０１７７】
４、遺伝子ノックアウト効率の検証
ＴｃｄＢ毒素を４つの混合コロニーに加えてスクリーニングし、２３時間後に細胞の生存を観察し、実験の結果を図１３に示す。ＴｃｄＢ毒素を加えて２３時間後、ｓｇＲＮＡＵｎｉｖｅｒｓａｌ＿１とｓｇＲＮＡＵｎｉｖｅｒｓａｌ＿９を加えた実験群に対応する細胞生存率は、その他の２つの群よりも有意に高いことが分かり、これは、ｓｇＲＮＡＵｎｉｖｅｒｓａｌ＿１とｓｇＲＮＡＵｎｉｖｅｒｓａｌ＿９の遺伝子ノックアウト効率がより高いことを示している。
【０１７８】
上記実施例１〜７で使用された材料および方法は下記通りである。
細胞培養とトランスフェクション
ＨｅＬａ、ＨｅＬａＯＣ、およびＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、蘭州百霊生物技術有限公司、蘭州、中国）が添加されたＤｕｌｂｅｃｃｏ‘ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＤＭＥＭ、１０−０１３−ＣＶ、Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）に保持され、温度は３７℃で、５％ＣＯ２が導入された。トランスフェクションのために、すべての細胞を６ウェルプレートに播種し、Ｘ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ＨＰ（０６３６６５４６００１，Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でメーカーのプロトコルに従ってトランスフェクションした。簡単に説明すると、２μｇのＤＮＡと４μｌのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ＨＰを２００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉｕｍ（３１９８５０８８，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ，ＵＳＡ）に加えた。混合物を室温で１５分間インキュベーションした後、細胞に加えた。
【０１７９】
ｇＲＮＡ発現プラスミドのクローニング
ｓｇＲＮＡを発現するプラスミドについて、各ｓｇＲＮＡコード配列のオリゴヌクレオチドを個別に設計し（表９参照）、合成した（北京睿博興科生物技術有限公司）。
【０１８０】
【表１１】
2020533017.tif 000013
【０１８１】
オリゴヌクレオチドを１×ＴＥで１０μＭの濃度に溶解し、Ｔｒａｎｓ  Ｔａｑ  ＨｉＦｉ  Ｂｕｆｆｅｒ  ＩＩ（Ｋ１０２２２、北京全式金生物技術有限公司）を使用してペアになったオリゴヌクレオチドを混合し、９５℃に加熱して３分間保持してから、４℃までゆっくり冷却した。これらのアニーリングされたオリゴヌクレオチドペアを３７℃で３０分間リン酸化し、加熱して不活性化させた後、「Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ」法を使用して生成物をｓｇＲＮＡ骨格ベクターにライゲーションした。ｐｇＲＮＡを発現するプラスミドについて、２つのｇＲＮＡコード配列を含むプライマーでｇＲＮＡのｓｃａｆｆｏｌｄ配列とＵ６プロモーターを増幅し（表５）、そしてＰＣＲ産物を精製し、「Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ」法を使用してｓｇＲＮＡ骨格ベクターにライゲーションした。以前に報告されたｓｇＲＮＡ骨格ベクター［１７］と比べて、本発明のｓｇＲＮＡ骨格ベクターはｓｇＲＮＡ骨格を改変し［３８］、ＥＧＦＰ配列をｍＣｈｅｒｒｙコード配列に置き換えた。
【０１８２】
Ｔ７Ｅ１アッセイ
ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（６９５０４、Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出し、ｇＲＮＡ標的配列を含むゲノム領域に対してＰＣＲ増幅をした。アッセイに使用したプライマー配列は表２、表５、表７、表８に示される。使用されたプライマー配列について、５０μｌシステムから３００〜５００ｎｇのＰＣＲ産物を取り、１０×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ２と混合し、９５℃で３分間加熱してから、室温までゆっくり冷却した。得られた生成物に０．５μｌのＴ７Ｅ１を加え、３７℃で１５分間インキュベーションした後、アガロースゲル電気泳動にかけた。電気泳動画像について、バンド切断の効率をＩｍａｇｅ  Ｊ画像分析ソフトウェアで分析し、ｓｇＲＮＡがＩｎｄｅｌｓを生成する効率を示した。
【０１８３】
線形ドナーの構築
ＣＭＶにより駆動されるピューロマイシン耐性遺伝子またはＥＧＦＰ遺伝子を含むドナーおよび終止コドンの配列を予め生成し、ｐＥＡＳＹ−Ｔ５−Ｚｅｒоクローンベクター（ＣＴ５０１−０２、北京全式金生物技術有限公司）にクローニングしてユニバーサルテンプレートとした。ｓｇＲＮＡ切断標的部位と保護配列を含むプライマーを用いてテンプレートを増幅した。プライマー配列は表１０に示される。
【０１８４】
【表１２】
2020533017.tif 000014
【０１８５】
【表１３】
2020533017.tif 000015
【０１８６】
ＮＨＥＪに基づいたドナー挿入および細胞スクリーニング
ＨｅＬａＯＣ細胞では、１μｇの精製された線形ドナーＰＣＲ産物と１μｇのｓｇＲＮＡ／ｐｇＲＮＡとを用いて細胞をトランスフェクションした。トランスフェクションの２週間後、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンで細胞を処理した。ＨｅＬａとＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、１μｇのドナー、０．５μｇのｓｇＲＮＡ／ｐｇＲＮＡ、および０．５μｇのＣａｓ９プラスミドで細胞をトランスフェクションした。そして、トランスフェクションの２週間後、使用するドナーの種類に応じて、１μｇ／ｍｌのピューロマイシで細胞を処理するか、または、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によってＥＧＦＰ陽性を確定した。
【０１８７】
Ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ  ＰＣＲ
Ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ  ＰＣＲ法は以前に報告されている（Ｐｏｔｔｅｒ，  Ｃ．Ｊ．  ＆  Ｌｕｏ，  Ｌ．  Ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ  ＰＣＲ  ｆｏｒ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｒａｎｓｐｏｓａｂｌｅ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ．  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５，  ｅ１０１６８  （２０１０）；    Ｕｒｅｎ，  Ａ．Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｐｌｉｎｋｅｒｅｔｔｅ−ＰＣＲ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ．  Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ４，  ７８９−７９８  （２００９）；Ｙｉｎ，  Ｂ．  ＆  Ｌａｒｇａｅｓｐａｄａ，  Ｄ．Ａ．  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｔｏ  ｉｓｏｌａｔｅ  ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｓｉｔｅｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４３，  ７９−８４  （２００７））。使用されたプライマーとアダプター（ａｄａｐｔоｒ）の配列は表１１に示される。
【０１８８】
【表１４】
2020533017.tif 000016
【図１】
2020533017.tif 000017
【図２】
2020533017.tif 000018
【図３】
2020533017.tif 000019
【図４】
2020533017.tif 000020
【図５】
2020533017.tif 000021
【図６】
2020533017.tif 000022
【図７】
2020533017.tif 000023
【図８】
2020533017.tif 000024
【図９】
2020533017.tif 000025
【図１０】
2020533017.tif 000026
【図１１】
2020533017.tif 000027
【図１２】
2020533017.tif 000028
【図１３】
2020533017.tif 000029
【配列表】
2020533017000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月7日(2020.4.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６３】
好ましい実施形態では、前記ユニバーサルドナー構築体のユニバーサル標的配列は、５’−ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）または５’−ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）を含む。 
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
好ましい実施形態では、前記ユニバーサルドナー構築体のユニバーサル標的配列は、５’−ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）または５’−ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）を含む。 
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２０】
本発明によれば、前記ユニバーサル線形ドナーＤＮＡ上のユニバーサル標的配列は好ましくは、５’−ＧＴＡＣＧＧＧＧＣＧＡＴＣＡＴＣＣＡＣＡ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１）または５’−ＡＡＴＣＧＡＣＴＣＧＡＡＣＴＴＣＧＴＧＴ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２）である。 
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
【表１】
2020533017.tif 000030
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
【表２】
2020533017.tif 000031
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３８】
【表３】
2020533017.tif 000032
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５７】
【表５】
2020533017.tif 000033
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
【表６】
2020533017.tif 000034
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６３】
【表７】
2020533017.tif 000035
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６８】
【表８】
2020533017.tif 000036
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７１】
【表９】
2020533017.tif 000037
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８０】
【表１１】
2020533017.tif 000038
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
【表１２】
2020533017.tif 000039
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８５】
【表１３】
2020533017.tif 000040
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
【表１４】
2020533017.tif 000041
【国際調査報告】
2020533017.tif 000042
2020533017.tif 000043
2020533017.tif 000044
2020533017.tif 000045