(57)【要約】  本発明は、解糖活性化剤に関する。本発明はまた、疾患又は医学的状態、特に免疫関連の疾患又は医学的状態の治療又は予防に関する。特に本発明はまた、疾患又は医学的状態の治療又は予防における使用のための薬剤であって、その治療又は予防が内因性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の輸送を介して介在される、薬剤に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疾患又は医学的状態の治療又は予防における使用のための解糖活性化剤であって、前記治療又は予防が、内因性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の輸送を介して介在される、前記解糖活性化剤。
【請求項２】
疾患又は医学的状態に罹患した又はこれらに罹患するリスクがある対象における内因性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の輸送における使用のための解糖活性化剤。
【請求項３】
内因性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の組織又は臓器への輸送によって緩和される疾患又は医学的状態の治療又は予防における使用のための解糖活性化剤。
【請求項４】
疾患又は医学的状態が、免疫介在性の疾患又は医学的状態である、請求項１〜３のいずれかに記載の使用のための解糖活性化剤。
【請求項５】
免疫介在性の疾患又は医学的状態が、自己免疫障害又は移植関連障害である、請求項４に記載の使用のための解糖活性化剤。
【請求項６】
免疫介在性の疾患又は医学的状態の治療又は予防における使用のための解糖活性化剤。
【請求項７】
免疫介在性の疾患又は医学的状態が、移植拒絶反応、同種移植拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（ＡＩＴＤ）、心筋炎、心筋梗塞（ＭＩ）、アレルギー、ウイルス、細菌又は寄生生物による感染症、がん、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ、自己免疫性胃炎、大腸炎、抗糸球体基底部腎炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、円形脱毛症、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性蕁麻疹、尋常性天疱瘡、自己免疫性多内分泌腺症候群（ＡＰＳ；３型ＡＰＳ、別名ＩＰＥＸ症候群を除く）、自己免疫性膵炎、グレーブス病、シェーグレン症候群、セリアック疾患、潰瘍性大腸炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、悪性貧血、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、乾癬性関節炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ熱、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、ギランバレー症候群、橋本脳症、横断性脊髄炎、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、ベーチェット病、巨細胞性動脈炎、多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、血管炎、及び湿疹から選択される、請求項４〜６のいずれかに記載の使用のための解糖活性化剤。
【請求項８】
免疫介在性の疾患又は医学的状態が、心筋炎である、請求項７に記載の使用のための解糖活性化剤。
【請求項９】
免疫介在性の疾患又は医学的状態が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である、請求項７に記載の使用のための解糖活性化剤。
【請求項１０】
免疫介在性の疾患又は医学的状態が、移植拒絶反応である、請求項７に記載の使用のための解糖活性化剤。
【請求項１１】
免疫介在性の疾患又は医学的状態が、関節リウマチである、請求項７に記載の使用のための解糖活性化剤。
【請求項１２】
対象における免疫応答のモジュレートにおける使用のための解糖活性化剤。
【請求項１３】
対象における免疫応答の抑制における、請求項１２に記載の使用のための解糖活性化剤。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載の使用のための解糖活性化剤及び薬学的に許容される担体、媒体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１５】
対象における免疫介在性の疾患又は状態を治療するか又は予防する方法であって、解糖活性化剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
対象における免疫応答をモジュレートする方法であって、解糖活性化剤を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項１７】
対象の免疫応答を抑制することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象における自己免疫応答を抑制するか又は調節することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
解糖活性化剤がグルコキナーゼ（ＧＣＫ）活性化剤である、請求項１〜１３のいずれかに記載の使用のための解糖活性化剤、又は請求項１４に記載の使用のための組成物、又は請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
ＧＣＫ活性化剤が、ＡＺＤ１６５６、ピラグリアチン、ＡＺＤ６３７０、ＧＫＡ５０、ＹＨ−ＧＫＡ、ＰＳＮ−０１０、ＬＹ２１２１２６０、ガノデランＢ、ユーパチリン、グルコリプシンＡ、グルコリプシンＢ、シノグリアチン、ＧＫＭ−００１、ＴＴＰ−３９９、ＳＹ−００４、ＴＭＧ−１２３、アルビグルチド、ＡＭ−９５１４、ＡＭＧ−０６９６、ＡＭＧ−１６９４、ＡＭＧ−３９６９、ＬＣＺ−９６０、ＡＺＤ−１０９２、ＡＺＤ−５６５８、ＡＲＲＹ−４０３、ＢＭＳ−８２０１３２、ＧＫＭ−００２、ＬＹ−２６０８２０４、ＭＫ−０９４１、Ｒ−１５１１、ＲＯ−２８１６７５、ＺＹＧＫ−１、ＯＰ−２８６ＣＲ、ＣＭ−３、ＤＳ−７３０９、ＬＹ−２５９９５０６、ＰＦ−０４９３７３１９、ＰＦ−０４９９１５３２、及びＴＡＫ−３２９から選択される、請求項１９に記載の使用のための解糖活性化剤若しくは組成物、又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＧＣＫ活性化剤が、ＡＺＤ１６５６：
【化１】
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又はその薬学的に許容される塩である、請求項１９に記載の使用のための解糖活性化剤若しくは組成物、又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＧＣＫ活性化剤がＧＫＡ５０である、請求項１９に記載の使用のための解糖活性化剤若しくは組成物、又は請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
Ｔｒｅｇ細胞が、疾患のある組織若しくは臓器又は移植された組織若しくは臓器へ遊走する、請求項１〜１３若しくは１９〜２２のいずれかに記載の使用のための解糖活性化剤、又は請求項１４に記載の使用のための組成物、又は請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
解糖活性化剤が、１又は２以上のさらなる治療剤と一緒に投与され、好ましくは前記さらなる治療剤が、免疫抑制剤、細胞療法、寛容原性樹状細胞療法、抗炎症剤及びホルモン補充療法からなる群から選択される、請求項１〜１３若しくは１９〜２３のいずれかに記載の使用のための解糖活性化剤、又は請求項１４に記載の使用のための組成物、又は請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
解糖活性化剤が、１ｍｇ〜５００ｍｇ、例えば、１、１０、２０、５０、１００、２００、２５０又は５００ｍｇの単位剤形で、例えば、約１００ｍｇの単位剤形で投与される、請求項１〜１３若しくは１９〜２４のいずれかに記載の使用のための解糖活性化剤、又は請求項１４に記載の使用のための組成物、又は請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
解糖活性化剤が、経口経路を介して投与される、請求項１〜１３若しくは１９〜２５のいずれかに記載の使用のための解糖活性化剤、又は請求項１４に記載の使用のための組成物、又は請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
解糖活性化剤が、１日１回、２回、３回又は４回、好ましくは１日２回投与される、請求項１〜１３若しくは１９〜２６のいずれかに記載の使用のための解糖活性化剤、又は請求項１４に記載の使用のための組成物、又は請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
解糖活性化剤が、１週間〜６カ月間、例えば、１〜６カ月間、例えば、２〜４カ月間、例えば、約３カ月間投与される、請求項１〜１３若しくは１９〜２７のいずれかに記載の使用のための解糖活性化剤、又は請求項１４に記載の使用のための組成物、又は請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
解糖活性化剤が、約３カ月間、１日２回、約１００ｍｇの単位剤形で経口経路を介して投与される、請求項１〜１３若しくは１９〜２８のいずれかに記載の使用のための解糖活性化剤、又は請求項１４に記載の使用のための組成物、又は請求項１５〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
Ｔｒｅｇ細胞を輸送又は動員するｅｘ  ｖｉｖｏでの方法であって、前記Ｔｒｅｇ細胞を解糖活性化剤と接触させることによって前記Ｔｒｅｇ細胞における解糖を活性化するステップを含む、前記方法。
【請求項３１】
Ｔｒｅｇ細胞を炎症部位に局在化させる効率を増加させるｅｘ  ｖｉｖｏでの方法であって、自己及び／又は同種異系Ｔｒｅｇ細胞を、ＧＣＫ活性化剤を用いて前処理するステップを含む、前記方法。
【請求項３２】
免疫介在性の疾患又は医学的状態を治療する方法であって、
ａ）治療されることになる対象からＴｒｅｇ細胞を単離する及び／又は別の対象若しくは供給源からＴｒｅｇ細胞を単離するステップ、
ｂ）ステップ（ａ）からの前記Ｔｒｅｇ細胞を増幅させ、治療法に十分な数を得るステップ、
ｃ）ステップ（ｂ）からの前記Ｔｒｅｇ細胞を、ＧＣＫ活性化剤と接触させるか又はそれで前処理するステップ、
ｄ）ステップ（ｃ）からの前記Ｔｒｅｇ細胞を、前記治療されることになる対象に投与するステップ
を含む、前記方法。
【請求項３３】
単離された、解糖活性化Ｔｒｅｇ細胞。
【請求項３４】
医薬品における使用のための、解糖活性化Ｔｒｅｇ細胞。
【請求項３５】
疾患又は医学的状態が、移植後糖尿病及び虚血再灌流傷害からなる群から選択される、請求項１〜３、１２、１３若しくは１９〜２９のいずれかに記載の使用のための解糖活性化剤、又は請求項１６〜１８のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全般的に医薬品の分野に関する。さらに、さまざまな実施形態は、医薬品に関する。特に本発明は、内因性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の疾患又は医学的状態、特に免疫関連の疾患及び医学的状態に罹患した又はこれらに罹患するリスクがある対象における輸送において有用な薬剤及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔ細胞として定義される胸腺制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、自己抗原に対する寛容性を維持するための手段である。Ｔｒｅｇは、リンパ系と非リンパ系組織の両方に局在することによって免疫モジュレートの役割を果たす。
【０００３】
Ｔｒｅｇ細胞の炎症組織への遊走は、その免疫モジュレート機能の鍵である。Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞に対するＴｒｅｇの急速な蓄積（浸潤性リンパ球の３０％超がＴｒｅｇである）は、免疫調節中に炎症組織において発生する（Tang, Q., Bluestone, J.A., and Kang, S.M. (2012). CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cell therapy in transplantation. J Mol Cell Biol 4, 11-21）。対照的に、末梢血液におけるＴｒｅｇの割合が小さい（２〜５％）ことは、Ｔｒｅｇの顕著な遊走能力をさらに強調している。
【０００４】
Ｔｅｆｆ及びＴｒｅｇの機能、増幅及び生存の生体エネルギー論は広く研究されている。Ｔｅｆｆ及びＴｒｅｇ細胞は、それらの生存及び分化を支えるための個別の代謝プログラムが必要であり、ヘルパーＴ（Ｔｈ）１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７細胞は、表面に多量のグルコーストランスポーターＧｌｕｔ１を発現し、解糖性が高く、一方でＴｒｅｇ細胞は、少量のＧｌｕｔ１を発現し、インビトロでの脂質酸化率が高い（Michalek, R.D., Gerriets, V.A., Jacobs, S.R., Macintyre, A.N., MacIver, N.J., Mason, E.F., Sullivan, S.A., Nichols, A.G., and Rathmell, J.C. (2011). Cutting edge: distinct glycolytic and lipid oxidative metabolic programs are essential for effector and regulatory CD4+ T cell subsets. J Immunol 186, 3299-3303）。ラパマイシンの哺乳類の標的（ｍＴＯＲ）は、Ｔ細胞代謝応答を調節することによる細胞運命の決定において鍵となる役割を果たす。Ｔ細胞が活性化すると、ｍＴＯＲを刺激し、解糖を増加させ、脂質酸化を低減する（Wieman, H.L., Wofford, J.A., and Rathmell, J.C. (2007). Cytokine stimulation promotes glucose uptake via phosphatidylinositol-3 kinase/Akt regulation of Glut1 activity and trafficking. Molecular biology of the cell 18, 1437-1446）。対照的に、解糖をブロックすると、Ｔｒｅｇ細胞の生成を促進し、これは、転写因子である低酸素誘導因子（ＨＩＦ１α）のｍＴＯＲ介在性誘導の阻害を介して生じる（Dang, E.V., Barbi, J., Yang, H.Y., Jinasena, D., Yu, H., Zheng, Y., Bordman, Z., Fu, J., Kim, Y., Yen, H.R., et al. (2011). Control of T(H)17/T(reg) balance by hypoxia-inducible factor 1. Cell 146, 772-784、Shi, L.Z., Wang, R., Huang, G., Vogel, P., Neale, G., Green, D.R., and Chi, H. (2011). HIF1alpha-dependent glycolytic pathway orchestrates a metabolic checkpoint for the differentiation of TH17 and Treg cells. The Journal of experimental medicine 208, 1367-1376）。しかし、Ｔｒｅｇは、酸化的代謝に主に依存するが、いくつかの特定の機能は、解糖への選択的なスイッチに依存する場合がある。Ｔｒｅｇ代謝は、環境要因に応答して、ｍＴＯＲ依存的経路とｍＴＯＲ非依存的経路との間を行き来するようである（Procaccini, C., De Rosa, V., Galgani, M., Abanni, L., Cali, G., Porcellini, A., Carbone, F., Fontana, S., Horvath, T.L., La Cava, A., et al. (2010). An oscillatory switch in mTOR kinase activity sets regulatory T cell responsiveness. Immunity 33, 929-941）。Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）シグナルは、ｍＴＯＲＣ１シグナル伝達、解糖及びＧｌｕｔ１上方調節を介してＴｒｅｇ細胞増殖を促進することが示されている。対照的にＴＬＲ誘発ｍＴＯＲＣ１シグナルも、Ｔｒｅｇ抑制能力を低下させる（Gerriets, V.A., Kishton, R.J., Johnson, M.O., Cohen, S., Siska, P.J., Nichols, A.G., Warmoes, M.O., de Cubas, A.A., MacIver, N.J., Locasale, J.W., et al. (2016). Foxp3 and Toll-like receptor signaling balance Treg cell anabolic metabolism for suppression. Nat Immunol 17, 1459-1466）。
【０００５】
運動性は最もエネルギーを消費する細胞活動であり得るにもかかわらず（Bernstein, B.W., and Bamburg, J.R. (2003). Actin-ATP hydrolysis is a major energy drain for neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 23, 1-6）、Ｔ細胞の遊走に必要な代謝は一部が研究されているのみである。本発明者らは、Ｔｅｆｆの遊走は、解糖経路に依存することを既に示している（Haas, R., Smith, J., Rocher-Ros, V., Nadkarni, S., Montero-Melendez, T., D'Acquisto, F., Bland, E.J., Bombardieri, M., Pitzalis, C., Perretti, M., et al. (2015). Lactate Regulates Metabolic and Pro-inflammatory Circuits in Control of T Cell Migration and Effector Functions. PLoS biology 13, e1002202）。しかし、Ｔｒｅｇの遊走を促進する代謝プログラムは未知のままである。
【０００６】
ＬＦＡ−１などのインテグリンが介在する分子相互作用は、Ｔ細胞輸送の標準的なレギュレーターである。さらに、共刺激性及び共阻害性受容体ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４によって生成されるシグナルはそれぞれ、Ｔ細胞輸送の調節に積極的に関与する。リンパ節においてＣＤ２８が活性化すると、メモリーＴ細胞が出現し、標的組織に遊走するのを促進し（Jain, N., Miu, B., Jiang, J.K., McKinstry, K.K., Prince, A., Swain, S.L., Greiner, D.L., Thomas, C.J., Sanderson, M.J., Berg, L.J., et al. (2013). CD28 and ITK signals regulate autoreactive T cell trafficking. Nat Med 19, 1632-1637、Mirenda, V., Jarmin, S.J., David, R., Dyson, J., Scott, D., Gu, I., Lechler, R.I., Okkenhaug, K., and Marelli-Berg, F.M. (2007). Physiological and aberrant regulation of memory T cell trafficking by the costimulatory molecule CD28. Blood 109, 2968-2977）、同時にＣＴＬＡ−４は、ＣＤ２８遊走促進（pro-migratory）シグナルに拮抗する（Mirenda, V., Jarmin, S.J., David, R., Dyson, J., Scott, D., Gu, I., Lechler, R.I., Okkenhaug, K., and Marelli-Berg, F.M. (2007). Physiological and aberrant regulation of memory T cell trafficking by the costimulatory molecule CD28. Blood 109, 2968-2977）。エフェクターＴｒｅｇ細胞遊走も、ＣＤ２８シグナルによって調節される（Muller, N., van den Brandt, J., Odoardi, F., Tischner, D., Herath, J., Flugel, A., and Reichardt, H.M. (2008). A CD28 superagonistic antibody elicits 2 functionally distinct waves of T cell activation in rats. J Clin Invest 118, 1405-1416）。重要なことには、共刺激受容体は、Ｔ細胞代謝リプログラミングも調節し、解糖を強化するが（Frauwirth, K.A., Riley, J.L., Harris, M.H., Parry, R.V., Rathmell, J.C., Plas, D.R., Elstrom, R.L., June, C.H., and Thompson, C.B. (2002). The CD28 signaling pathway regulates glucose metabolism. Immunity 16, 769-777、Parry, R.V., Chemnitz, J.M., Frauwirth, K.A., Lanfranco, A.R., Braunstein, I., Kobayashi, S.V., Linsley, P.S., Thompson, C.B., and Riley, J.L. (2005). CTLA-4 and PD-1 receptors inhibit T-cell activation by distinct mechanisms. Molecular and cellular biology 25, 9543-9553）、Ｔｒｅｇ細胞の解糖と遊走との間の関係は、まだ示唆されていない。
【０００７】
解糖のプロセスは、酵素グルコキナーゼ（ＧＣＫ又はＧＬＫ）によって一部制御される。グルコースの取り込み速度は、グルコースからグルコース−６−ホスフェート（Ｇ６Ｐ）へのリン酸化速度によって制限され、これは、ＧＣＫによって触媒されるプロセスである。
【０００８】
国際公開第２００８０５０１０１号パンフレットでは、有利な身体的及び／若しくは薬物動態特性、並びに／又は良好な毒性プロファイルを有するＧＣＫ活性化因子であるベンゾイルアミノヘテロシクリル化合物のグループが記載されている。
【０００９】
国際公開第２００８０５０１１７号パンフレットでは、水溶性が高く、透過性が高く、及び／又は血漿タンパク質結合性が低いＧＣＫ活性化因子としてのベンゾイルアミノヘテロシクリル化合物が記載されている。
【００１０】
国際公開第２００８０７５０７３号パンフレットでは、ＧＣＫ活性化因子であり、インスリン分泌のためのグルコース閾値を減少させるのに有用である結晶形態が記載されている。
【００１１】
国際公開第００５８２９３号パンフレット及び国際公開第０１４４２１６号パンフレットにおいて、一連のベンジルカルバモイル化合物が、グルコキナーゼ活性化因子として記載されている。そのような化合物がＧＣＫを活性化する機序は、ＧＣＫ活性がＮＡＤＨ産生と関連しておりＮＡＤＨ産生が光学的に測定されるアッセイにおいてそのような化合物の直接的な効果を測定することによって評価される。
【００１２】
さらなるＧＣＫ活性化因子は、国際公開第０３０９５４３８号パンフレット（置換フェニルアセトアミド）、国際公開第０３０５５４８２号パンフレット（カルボキサミド及びスルホンアミド誘導体）、国際公開第２００４００２４８１号パンフレット（アリールカルボニル誘導体）、及び国際公開第０３０８０５８５号パンフレット（アミノ置換ベンゾイルアミノ複素環）に記載されている。
【００１３】
国際公開第０３０００２６７号パンフレットでは、ＧＣＫの活性化因子であるベンゾイルアミノピリジルカルボン酸のグループが記載されている。国際公開第０３０１５７７４号パンフレットでは、式（Ａ）の化合物
【００１４】
【化１】
2020533346.tif 000003
【００１５】
（式中、Ｒ３は、フェニル、又はカルボン酸置換ピリジル以外の置換複素環である）が記載されている。
【００１６】
国際公開第２００４０７６４２０号パンフレットでは、概して、国際公開第０３０１５７７４号パンフレットに記載されているものの一部である化合物（例えば、Ｒ１は（置換）アルキルエーテルであり、Ｒ２は（置換）フェノキシである化合物）が記載されている。
【００１７】
Grewal, A.S., Sekhon, B.S., and Lather, V. (2014). Recent Updates on Glucokinase Activators for the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus. Mini Rev Med Chem 14, 585-602では、２型糖尿病を治療するためのいくつかのＧＣＫ活性化因子（ＧＫＡ）が記載されている。１型糖尿病とグルコキナーゼ遺伝子との間に関連がないことは既に認められている（Bain, S.C., Barnett, A.H. and Todd J.A. (1992). Lack of association between type 1 diabetes and the glucokinase gene. Lancet 340: 54-55）。
【００１８】
Ｔｒｅｇは、いくつかの病態において、標的部位にて認められているか又は標的部位に遊走することが示されている。Ｔｒｅｇは、いくつかの病態の解消においても重要な役割を果たす。そのような病態としては、多発性硬化症（Denning, T.L., Kim, G. and Kronenberg, M. (2005). Cutting edge: CD4+CD25+ regulatory T cells impaired for intestinal homing can prevent colitis. J Immunol 174, 7487-91）、心筋炎（Stephenson, E., Savvatis, K., Mohiddin, S.A. and Marelli-Berg, F.M. (2016). T-cell immunity in myocardial inflammation: pathogenic role and therapeutic manipulation. Br J Pharmacol DOI: 10.1111/bph.13613  ）、心筋梗塞（ＭＩ）（Weirather, J., Hofmann, U.D.W., Beyersdorf, N., Ramos, G.C., Vogel, B. Frey, A. Ertl., G., Kerkau, T and Frantz., S (2014) Foxp3+ CD4+ T Cells Improve Healing After Myocardial Infarction by Modulating Monocyte/Macrophage Differentiation. Circ Res 115: 55-67）、Ｉ型糖尿病（Chen, Z., Herman, A.E., Matos, M., Mathis, D. and Benoist, C. (2005). Where CD4+CD25+ T reg cells impinge on autoimmune diabetes. J Exp Med 202, 1387-97）、関節リウマチ（ＲＡ）（Cooles, F.A.H., Isaacs, J.D. and Anderson, A.E. (2013). Treg Cells in Rheumatoid Arthritis: An Update. Curr Rheumatol Reports 15: 352）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）（Humrich, J.Y and Riemekasten, G. (2016). Restoring regulation - IL-2 therapy in systemic lupus erythematosus. Exp Rev Clin Immunol 12, 1153-1160）、乾癬（Deng, Y., Chang, C. and Lu, Q. (2016). The Inflammatory Response in Psoriasis: a Comprehensive Review. Clin Rev Allergy Immunol 50, 377-389）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（Zorn, E., Kim, H.T., Lee, S.J., Floyd, B.H., Litsa, D., Arumugarajah, S., Bellucci, R., Alyea, E.P., Antin, J.H., Soiffer, R.J. et al. (2005). Reduced frequency of FOXP3+ CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with chronic graft-versus-host disease. Blood 106, 2903-2911）、大腸炎（Ding, Y., Xu, J. and Bromberg, J.S. (2012). T regulatory cell migration during an immune response. Trends Immunol 33, 174-180）及びアレルギー性疾患（Denning, T.L., Kim, G. and Kronenberg, M. (2005). Cutting edge: CD4+CD25+ regulatory T cells impaired for intestinal homing can prevent colitis. J Immunol 174, 7487-91）がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１９】
【特許文献１】国際公開第２００８０５０１０１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００８０５０１１７号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２００８０７５０７３号パンフレット
【特許文献４】国際公開第００５８２９３号パンフレット
【特許文献５】国際公開第０１４４２１６号パンフレット
【特許文献６】国際公開第０３０９５４３８号パンフレット
【特許文献７】国際公開第０３０５５４８２号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００４００２４８１号パンフレット
【特許文献９】国際公開第０３０８０５８５号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第０３０００２６７号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第０３０１５７７４号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第２００４０７６４２０号パンフレット
【非特許文献】
【００２０】
【非特許文献１】Tang, Q., Bluestone, J.A., and Kang, S.M. (2012). CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cell therapy in transplantation. J Mol Cell Biol 4, 11-21
【非特許文献２】Michalek, R.D., Gerriets, V.A., Jacobs, S.R., Macintyre, A.N., MacIver, N.J., Mason, E.F., Sullivan, S.A., Nichols, A.G., and Rathmell, J.C. (2011). Cutting edge: distinct glycolytic and lipid oxidative metabolic programs are essential for effector and regulatory CD4+ T cell subsets. J Immunol 186, 3299-3303
【非特許文献３】Wieman, H.L., Wofford, J.A., and Rathmell, J.C. (2007). Cytokine stimulation promotes glucose uptake via phosphatidylinositol-3 kinase/Akt regulation of Glut1 activity and trafficking. Molecular biology of the cell 18, 1437-1446
【非特許文献４】Dang, E.V., Barbi, J., Yang, H.Y., Jinasena, D., Yu, H., Zheng, Y., Bordman, Z., Fu, J., Kim, Y., Yen, H.R., et al. (2011). Control of T(H)17/T(reg) balance by hypoxia-inducible factor 1. Cell 146, 772-784
【非特許文献５】Shi, L.Z., Wang, R., Huang, G., Vogel, P., Neale, G., Green, D.R., and Chi, H. (2011). HIF1alpha-dependent glycolytic pathway orchestrates a metabolic checkpoint for the differentiation of TH17 and Treg cells. The Journal of experimental medicine 208, 1367-1376
【非特許文献６】Procaccini, C., De Rosa, V., Galgani, M., Abanni, L., Cali, G., Porcellini, A., Carbone, F., Fontana, S., Horvath, T.L., La Cava, A., et al. (2010). An oscillatory switch in mTOR kinase activity sets regulatory T cell responsiveness. Immunity 33, 929-941
【非特許文献７】Gerriets, V.A., Kishton, R.J., Johnson, M.O., Cohen, S., Siska, P.J., Nichols, A.G., Warmoes, M.O., de Cubas, A.A., MacIver, N.J., Locasale, J.W., et al. (2016). Foxp3 and Toll-like receptor signaling balance Treg cell anabolic metabolism for suppression. Nat Immunol 17, 1459-1466
【非特許文献８】Bernstein, B.W., and Bamburg, J.R. (2003). Actin-ATP hydrolysis is a major energy drain for neurons. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 23, 1-6
【非特許文献９】Haas, R., Smith, J., Rocher-Ros, V., Nadkarni, S., Montero-Melendez, T., D'Acquisto, F., Bland, E.J., Bombardieri, M., Pitzalis, C., Perretti, M., et al. (2015). Lactate Regulates Metabolic and Pro-inflammatory Circuits in Control of T Cell Migration and Effector Functions. PLoS biology 13, e1002202
【非特許文献１０】Jain, N., Miu, B., Jiang, J.K., McKinstry, K.K., Prince, A., Swain, S.L., Greiner, D.L., Thomas, C.J., Sanderson, M.J., Berg, L.J., et al. (2013). CD28 and ITK signals regulate autoreactive T cell trafficking. Nat Med 19, 1632-1637
【非特許文献１１】Mirenda, V., Jarmin, S.J., David, R., Dyson, J., Scott, D., Gu, I., Lechler, R.I., Okkenhaug, K., and Marelli-Berg, F.M. (2007). Physiological and aberrant regulation of memory T cell trafficking by the costimulatory molecule CD28. Blood 109, 2968-2977
【非特許文献１２】Muller, N., van den Brandt, J., Odoardi, F., Tischner, D., Herath, J., Flugel, A., and Reichardt, H.M. (2008). A CD28 superagonistic antibody elicits 2 functionally distinct waves of T cell activation in rats. J Clin Invest 118, 1405-1416
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【非特許文献１４】Parry, R.V., Chemnitz, J.M., Frauwirth, K.A., Lanfranco, A.R., Braunstein, I., Kobayashi, S.V., Linsley, P.S., Thompson, C.B., and Riley, J.L. (2005). CTLA-4 and PD-1 receptors inhibit T-cell activation by distinct mechanisms. Molecular and cellular biology 25, 9543-9553
【非特許文献１５】Grewal, A.S., Sekhon, B.S., and Lather, V. (2014). Recent Updates on Glucokinase Activators for the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus. Mini Rev Med Chem 14, 585-602
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【非特許文献２４】Zorn, E., Kim, H.T., Lee, S.J., Floyd, B.H., Litsa, D., Arumugarajah, S., Bellucci, R., Alyea, E.P., Antin, J.H., Soiffer, R.J. et al. (2005). Reduced frequency of FOXP3+ CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with chronic graft-versus-host disease. Blood 106, 2903-2911
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【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】解糖は、Ｔｒｅｇの遊走を促進する。表記の薬物又は媒体を用いて４時間前処理され、ｅｘ  ｖｉｖｏで増幅されたＴｒｅｇを、ＩＦＮ−γ処理された同系ＥＣ単層（Ａ〜Ｂ）と層をなす３μｍ孔のトランスウェルを通して遊走させるか、又はケモカインＣＣＬ２２に応答してベアフィルターである５μｍ孔のトランスウェル（Ｃ〜Ｄ）を通して遊走させた。結果は、２４時間後（Ａ〜Ｂ、ｎ＝４、Ｎ＝２）又は表記の時点（Ｃ、ｎ＝３）における遊走した細胞の百分率±ＳＤとして示される。遊走における増加倍率±ＳＤは、実験的遊走を、３連で行われた２つの同一設計の実験において６時間目に測定された自発的遊走で除算することによって算出した。
【図２】活性化されたＴｒｅｇ表現型及び機能及び代謝改良薬物への曝露の効果。Ｔｒｅｇを、既に記載の通りに増幅させた（Fu, H., Kishore, M., Gittens, B., Wang, G., Coe, D., Komarowska, I., Infante, E., Ridley, A.J., Cooper, D., Perretti, M., et al. (2014). Self-recognition of the endothelium enables regulatory T-cell trafficking and defines the kinetics of immune regulation. Nat Commun 5, 3436）。Ａ−ＢＴｒｅｇを、代謝を標的とする表記の薬物で４〜６時間処理し、非常によく洗浄した。薬物に曝露されたＴｒｅｇの、ＣＸＣＬ１０（３００ｎｇ／ｍｌ）に応答した遊走を、トランスウェルベースのアッセイによって評価した。結果は、表記の時点において遊走した細胞の平均百分率±ＳＤとして示される。３つの独立した同一設計の実験から６時間目に得られ、自発的遊走によって正規化されたデータ±ＳＤを、パネルＢに示す。＊Ｐ＜０．０５。
【図３】蛍光生体内色素ＰＫＨ２６で標識された、薬物又は媒体処理されたＴｒｅｇを、ＩＦＮ−γで４８時間前にｉ．ｐ．処理された同系レシピエントにｉ．ｖ．注射した。細胞を、表記の組織から２４時間後に採取し、フローサイトメトリーによって分析した。３匹の動物からの代表的なドットプロットを、パネルＡ及びＣに示す。４匹の動物において回収された標識細胞の平均絶対数±ＳＤを、パネルＢ及びＤに示す。（Ｎ＝１）
【図４】Ａ：Ｔｒｅｇを、代謝を表記の標的とする薬物で４〜６時間処理してから、表記の表面分子の発現を、フローサイトメトリーによって分析した。表記の表面分子の代表的なヒストグラム及び平均蛍光強度を示す。Ｎ＝２。Ｂ〜Ｃ：表記の代謝を標的とする薬物で６時間処理されたＴｒｅｇのアポトーシス／壊死を、アネキシンＶ及びヨウ化プロピウム（ＰＩ）染色で分析することによって測定した。未処理のＴｒｅｇ及び熱誘発性アポトーシスを受けたＴｒｅｇを、それぞれ陰性及び陽性対照として使用した。棒グラフ（Ｃ）は、アポトーシス及び壊死Ｔｒｅｇ細胞の平均百分率±ＳＤを示す。（ｎ＝４、Ｎ＝３）。
【図５】Ｔｒｅｇを、表記の代謝を標的とする薬物で４〜６時間処理し、非常によく洗浄し、培地単独中で一晩培養した。薬物に曝露されたＴｒｅｇの、ＣＣＬ２２（３００ｎｇ／ｍｌ、Ａ〜Ｂ）ＣＸＣＬ１０（３００ｎｇ／ｍｌ、Ｃ〜Ｄ）に応答した遊走を、６時間のケモキネシストランスウェルアッセイ（１０６／ウェル）によって評価した。結果は、３連で行った典型的な実験における遊走した細胞の平均百分率±ＳＤ（Ａ、Ｃ）として示される。３つの独立した同一設計の実験から６時間目に得られ、自発的遊走によって正規化されたデータ±ＳＤを、パネルＢ及びＤに示す。＊Ｐ＜０．０５。
【図６】Ｔｒｅｇを、２−ＤＧ（Ａ）又はエトモキシル（Ｂ）で４〜６時間処理し、非常によく洗浄し、培地単独中で一晩培養した。次いで、Ｔｒｅｇを、血清不含非緩衝ＸＦアッセイ培地（Seahorse biosciences社）中で１時間静止させてから、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４細胞プレート中に播種して（６×１０５／ウェル）、フラックスメトリック分析(fluxometric analysis)を行った。最初にウェルにグルコースを注入した。さらに表記の時点（矢印）で表記の物質の注入を続けた。ＥＣＡＲ＝細胞外酸性化速度、これは解糖を示す。
【図７】Ａ：プラスチック結合組換え（ｒ）ＩＣＡＭ−１又はヒトＩｇＧＦｃフラグメント（Ｆｃ）で４５分間刺激され、次いでグルコース取り込み指標６−ＮＢＤＧ（代謝されないために取り込まれた場合に細胞を蛍光性にする、蛍光標識されたグルコースアナログ）を含む培地中に１０分間再懸濁されたＴｒｅｇの代表的なヒストグラムである。３つの独立した実験からの平均ＭＦＩ±ＳＤをパネルＢに示す。（ｎ＝３）。ＩＣＡＭ−１−（Ｃ）又はＣＣＬ２２刺激（Ｄ）ＴｒｅｇのＥＣＡＲを、細胞外フラックスアナライザー（Seahorse社）によって測定した。ＩｇＦｃ又は培地を、対照として使用し、組換え分子及びグルコースを、表記の時点において添加した（±ＳＤ  ｎ＝５、Ｎ＝２）、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．００５。
【図８】インビトロで増幅させたＴｒｅｇを、血清不含非緩衝ＸＦアッセイ培地（Seahorse biosciences社）中で１時間最初に静止させてから、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４細胞プレート中に播種して（６×１０５／ウェル）、フラックスメトリック分析を行った。最初にウェルに、組換えＩＣＡＭ−１（又は対照としてヒトＦｃ、パネルＡ）又はＣＣＬ２２（又は対照としてグルコース不含培地、パネルＢ）を注入した。さらに表記の時点（矢印）で表記の物質の注入を続けた。＊Ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図９】ＣＤ２８及びＣＴＬＡ４は、Ｔｒｅｇ細胞遊走を差次的に調節する。Ｔｒｅｇを、アゴニスト抗体をライゲーションすることによって刺激し（Schneider, H., Valk, E., da Rocha Dias, S., Wei, B., and Rudd, C.E. (2005). CTLA-4 up-regulation of lymphocyte function-associated antigen 1 adhesion and clustering as an alternate basis for coreceptor function. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 12861-12866、Wells, A.D., Walsh, M.C., Bluestone, J.A., and Turka, L.A. (2001). Signaling through CD28 and CTLA-4 controls two distinct forms of T cell anergy. J Clin Invest 108, 895-903）、３７ｏＣで４５分間、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４を認識した。Ａ〜Ｃ：ＩＦＮ−γ処理された同系内皮細胞（ＥＣ）単層を通した（Ａ）又はＣＸＣＬ１０ケモカインに応答した（Ｂ〜Ｃ）抗体刺激Ｔｒｅｇの遊走を、トランスウェルベースのアッセイにおいてモニターした。パネルＡでは、結果は、３つの独立した同一設計の実験における遊走した細胞の平均百分率±ＳＤとして示される。パネルＢでは、結果は、３連で行った典型的な実験における遊走した細胞の平均百分率±ＳＤとして示される。３つの独立した同一設計の実験から６時間目に得られ、自発的遊走によって正規化されたデータ±ＳＤを、パネルＣに示す。
【図１０】Ｔｒｅｇを、ＣＤ２８及び／又はＣＴＬＡ−４抗体で刺激してから、それをＩＦＮ−γで４８時間前にｉ．ｐ．処理され、局部的な動員が促進された同系レシピエントに養子移植した（Fu, H., Kishore, M., Gittens, B., Wang, G., Coe, D., Komarowska, I., Infante, E., Ridley, A.J., Cooper, D., Perretti, M., et al. (2014). Self-recognition of the endothelium enables regulatory T-cell trafficking and defines the kinetics of immune regulation. Nat Commun 5, 3436）。Ｔｒｅｇの腹膜腔への遊走を、１６時間後に評価した。受動的様式で侵入が生じる脾臓への局在化を（Fu, H., Ward, E.J., and Marelli-Berg, F.M. (2016). Mechanisms of T cell organotropism. Cell Mol Life Sci 73, 3009-3033）対照として測定した。Ｔｒｅｇ母集団が養子移植されたことを考慮し、標識細胞の絶対数をデータ分析において使用した。有意に多数のＴｒｅｇが、ＣＤ２８刺激後に腹膜腔に蓄積した。ＣＴＬＡ−４同時刺激は、ＣＤ２８誘発性遊走を阻害し、同時にそれ自体が引き金となるＣＴＬＡ−４は効果を一切有していなかった。３匹の動物からの代表的なドットプロットを、上のパネルに示す。下のグラフは、４匹の動物において回収された標識細胞の平均絶対数±ＳＤを示す。（Ｎ＝３）。
【図１１】Ｔｒｅｇの遊走は、解糖の誘発を介した共刺激性受容体によって調節される。Ａ〜Ｂ：分析の前に６−ＮＢＤＧと１０分間インキュベートされた抗体刺激Ｔｒｅｇの代表的なヒストグラムである。非蛍光性グルコースアナログ２−ＤＧを、陰性対照として使用した。３つの独立した実験からの平均ＭＦＩ±ＳＤをパネルＢに示す。
【図１２】抗体刺激ＴｒｅｇのＥＣＡＲ±ＳＤを、フラックスメトリー(fluxometry)によって測定した。抗体（Ａｂ）及びＤ−グルコースを、表記の時点において注射した（Ａ）。ＥＣＡＲ（±ＳＤ）を、刺激されていないＷＴ又はＣＴＬＡ−４ＫＯＴｒｅｇにおいて測定した（Ｂ）。Ｄ−グルコースは、矢印で示される通りに注射した。
【図１３】ＥＣＡＲ（±ＳＤ）を、組換えＣＤ８０又はＦｃフラグメントで３０分間予め刺激されたＷＴ（Ａ）又はＣＴＬＡ−４ＫＯ（Ｂ）Ｔｒｅｇにおいて測定した。Ｄ−グルコースは、矢印で示される通りに注射した。
【図１４】Ａ：ｒＣＤ８０−又はＦｃ刺激ＣＴＬＡ−４ＫＯ及びＷＴ  Ｔｒｅｇの、同系ＩＦＮ−γ処理されたＥＣ単層を通過した遊走である。結果は、２４時間で遊走した細胞の平均百分率±ＳＤとして示される。ｎ＝３、Ｎ＝４。Ｂ：グルコース不含又はグルコース復元培地中のいずれかに再懸濁された抗体刺激Ｔｒｅｇの、ＩＦＮ−γ処理された同系ＥＣ単層を通過した遊走であり、２４時間後に遊走した細胞の百分率±ＳＤとして示される。（ｎ＝３、Ｎ＝４）。
【図１５】ＰＫＨ２６で標識化された抗体刺激Ｔｒｅｇ（２列目）を、４８時間前にＩＦＮ−γをｉ．ｐ．で与えられたＣ５７ＢＬ／６マウスにｉ．ｐ．注射した。直後に６−ＮＢＤＧ（３列目）をｉ．ｐ．注射した。腹膜を１時間後に取り出し、ＤＡＰＩを用いて対比染色し、広視野蛍光顕微鏡によって画像化し、浸潤細胞の数及び浸潤細胞による６−ＮＢＤＧ取り込みを判定した。代表的な画像を、パネルＡに示す。４匹のレシピエントからの１０個の１０×視野で計数された細胞の平均数±ＳＤ及び３つの１０×視野からの１０〜１２個の細胞からの６−ＮＢＤＧの平均総細胞蛍光±ＳＤを、パネルＢ及びＣにそれぞれ示す。（ｎ＝４、Ｎ＝２）、＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００５。
【図１６】遊走促進刺激は、Ｔｒｅｇの代謝リプログラミングを誘発する。Ａ〜Ｂ：Ｔｒｅｇにおける表記の酵素の発現を、抗体刺激の４時間後にウエスタンブロット法によって測定した。パネルＢでは、３つの独立した実験において濃度分析によって測定される平均相対発現±ＳＤを示す。
【図１７】Ａ：ＣＤ２８又はＬＦＡ−１刺激Ｔｒｅｇによる表記の酵素の発現を、表記の時点においてウエスタンブロット法によって測定した。Ｂ〜Ｃ：抗体刺激ＴｒｅｇによるＧＣＫ（Ｂ）及びＧＣＫＲ（Ｃ）の相対ｍＲＮＡ発現レベルを、ＲＴ−ＰＣＲによって測定した。ＧＣＫＲ＝グルコキナーゼ調節タンパク質；ＧＣＫに結合し、酵素活性をブロックする。
【図１８】Ａ〜Ｂ：ＣＤ２８又はＬＦＡ−１刺激Ｔｒｅｇによる表記の酵素の発現を、表記の時点において共焦点顕微鏡検査によって測定した。抗体刺激Ｔｒｅｇによる細胞タンパク質発現を、共焦点顕微鏡検査によって測定した。パネルＢでは、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを使用して測定された平均ＭＦＩ±ＳＥＭを示す。Ｎ＝３。スケールバー２０μｍ。
【図１９】抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体を用いて２４時間刺激されたＣＤ４＋Ｔ細胞のＥＣＡＲ及びＯＣＲのリアルタイム分析を、フラックスメトリーを使用して行った。最初にウェルにＣＬＴ又は媒体を注入した。表記の時点で第２の注入を続け（破線）、Ｄ−グルコースをウェルに導入した。その後、解糖（Ａ）又は細胞呼吸（Ｂ）のモジュレーターを表記の時点において連続的に注入した。（Ｎ＝２）、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５。ＯＣＲ＝酸素消費速度：ミトコンドリア呼吸及び脂肪酸酸化（ＦＡＯ）の間接的な測定。
【図２０】Ａ：ＡＺＤ１６５６（ＧＣＫ活性化因子、１μＭ）及び媒体処理されたＴｒｅｇ（インスリン不含培地中で２時間）を、異なる生体内蛍光色素を用いて標識し、４８時間前にＩＦＮ−γをｉ．ｐ．で与えられた同系レシピエントに同時に注射した。細胞を、腹膜又は脾臓から２４時間後に回収し、フローサイトメトリーによって分析した。代表的なドットプロットを示す。棒グラフは、回収された標識細胞の平均絶対数±ＳＤを示す（ｎ＝４  Ｎ＝２）。Ｂ〜Ｃ：ＡＺＤ１６５６（Ｂ）又はクロトリマゾール（ＣＬＴ、１μＭ、２時間、Ｃ）又は媒体単独のいずれかを用いた処理後に同種異系ＤＣで刺激されたＴｒｅｇによるＰＣＮＡの発現を、フローサイトメトリーによって測定した。ＮＳ、非刺激対照Ｔｒｅｇ。代表的なヒストグラムを示す。（ｎ＝３、Ｎ＝３）。
【図２１】Ａ：Ｔｒｅｇ細胞のＥＣＡＲは、組換えＩＣＡＭ−１又はＦｃ対照を用いて活性化された。ＣＬＴ又は媒体、及び他の解糖に影響を与える薬物を、表示の通りに添加した。Ｂ：ＣＬＴ又は媒体処理されたＴｒｅｇは、ＣＤ２８又はアイソタイプが一致する抗体刺激を受け、異なる生体内蛍光色素を用いて標識化され、４８時間前にＩＦＮ−γをｉ．ｐ．で与えられた同系レシピエントにｉ．ｖ．注射された。細胞は、２４時間後に腹膜（Ｐ）又は脾臓（Ｓ）から回収し、フローサイトメトリーによって分析した。代表的なドットプロットを示す。棒グラフは、回収された標識細胞の平均絶対数±ＳＤを示す。（ｎ＝３、Ｎ＝２）。＊ｐ＜０．０５＊＊＊ｐ＜０．００５；＊＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図２２】ＧＣＫの薬理学的活性化は、皮膚同種移植拒絶反応を有意に遅延させる。Ｃ５７Ｂｌ６マウスに、Ｂ６Ｋｄ皮膚移植片又は対照として同系皮膚を与えた。一部のレシピエントは、移植後に、ＧＣＫ活性化因子ＡＺＤ１６５６（２０ｍｇ／ｋｇで毎日）で２週間処理した。Ｎ＝９。
【図２３】ＧＣＫＲ対立遺伝子の機能喪失を有するＴｒｅｇ細胞は、強化された運動性を示す。Ａ：ＷＴ対立遺伝子（Ｐ４４６）を保有する個体と比較した、対立遺伝子Ｐ４４６ＬのキャリアにおけるＴｒｅｇの細胞数／ｍＬ（ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗ）である。代表的なドットプロットを、パネルＢに示す。ｎ＝２５。２つの研究母集団におけるナイーブとして定義されるＣＤ４＋リンパ球亜集団（ＣＤ４５ＲＡ＋）、セントラルメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＣＲ７＋）及びエフェクターメモリー（ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ−、ＣＣＲ７−）をパネルに示す。
【図２４】８名のＰ４４６Ｌ−ＧＣＫＲキャリア又はＷＴ−ＧＣＫＲ個体からのＴｒｅｇ（Ａ）及びＴｃｏｎｖ（Ｂ）のケモカインＣＣＬ１９／２１に対する遊走応答を、トランスウェルで測定した。
【図２５】パネルＡ〜Ｂでは、Ｐ４４６Ｌ−ＧＣＫＲキャリア（ｎ＝８）及びＷＴ−ＧＣＫＲ（ｎ＝８）対象からの、図２４における遊走アッセイで使用したケモカインＣＣＬ１９／２１に対する受容体であるＣＣＲ７を発現するＴ細胞の百分率を示す。＊ｐ＜０．０５。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２２】
活性化制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の炎症組織への遊走は、それらの免疫モジュレート機能にとって重要である。Ｔｒｅｇが分化する間の代謝リプログラミングは広く研究されているが、Ｔｒｅｇ輸送の生体エネルギー論ははっきりとは分かっていないままである。本発明者らは、Ｔｒｅｇ遊走の代謝要求性を、インビトロ及びインビボで研究した。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
ＬＦＡ−１及びＣＤ２８介在性遊走促進シグナルを研究モデルとして比較することによって、本発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞遊走のインビトロ及びインビボでの生体エネルギー論を研究した。したがって、本発明者らは、Ｔｒｅｇの遊走中に行われる代謝リプログラミングの新規な特異的経路をマウスとヒトの両方において本明細書で明らかにする。
【００２４】
本発明者らは、解糖は、Ｔｒｅｇの遊走の手段となり、酵素グルコキナーゼ（ＧＣＫ）の誘導をもたらす遊走促進刺激によって開始されることを見出した。その後、ＧＣＫは、アクチンと結合することによって細胞骨格再構成を促進する。この経路がないＴｒｅｇは、機能的に抑制性であるが、皮膚同種移植片に遊走し、拒絶反応を阻害することができない。同様に、ＧＣＫ調節タンパク質遺伝子において機能喪失変異し、ＧＣＫ活性が増加したヒトキャリアは、循環する活性化Ｔｒｅｇの数が減少している。これらのＴｒｅｇは、強化された遊走活性を示すが、同様の抑制機能を示し、同時に通常型Ｔ細胞(conventional T-cells)は影響を受けない。したがって、ＧＣＫ依存的解糖は、Ｔｒｅｇの遊走を調節する。したがって、本発明は、疾患及び医学的状態、特に免疫介在性のものを治療するか又は予防するためのＴｒｅｇにおける解糖の活性化に関する。
【００２５】
したがって、１つの態様において、本発明は、疾患又は医学的状態の治療又は予防における使用のための解糖活性化剤であって、その治療又は予防が、内因性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の輸送を介して介在される、解糖活性化剤を提供する。
【００２６】
別の態様において、本発明は、疾患又は医学的状態に罹患した又はこれらに罹患するリスクがある対象における内因性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の輸送における使用のための解糖活性化剤を提供する。
【００２７】
別の態様において、本発明は、内因性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の組織又は臓器への輸送によって緩和される疾患又は医学的状態の治療又は予防における使用のための解糖活性化剤を提供する。
【００２８】
別の態様において、本発明は、対象における免疫応答のモジュレートにおける使用のための解糖活性化剤を提供する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載される使用のための解糖活性化剤及び薬学的に許容される担体、媒体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００３０】
別の態様において、本発明は、対象における免疫介在性の疾患又は状態を治療するか又は予防する方法であって、解糖活性化剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【００３１】
さらに別の態様において、本発明は、対象における免疫応答をモジュレートする方法であって、解糖活性化剤を対象に投与することを含む方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
本明細書において使用する場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、単数形と複数形の両方の指示対象を含む。
【００３３】
本明細書において使用する「含んでいる（comprising）」、「含む（comprises）」及び「から構成される（comprised of）」という用語は、「含んでいる（including）」、「含む（includes）」又は「含んでいる（containing）」、「含む（contains）」と同義であり、包含的又はオープンエンドであり、追加の列挙されない部材、要素又は方法ステップを除外しない。「含んでいる（comprising）」、「含む（comprises）」及び「から構成される（comprised of）」という用語は、「からなる（consisting of）」という用語も含む。
【００３４】
解糖活性化剤
本発明の文脈において、「解糖活性化剤」は、細胞において解糖の生化学的プロセスを活性化、刺激、誘発、触媒又はその速度を増加することができる任意の薬剤又は化合物である。薬剤又は化合物は、本質的に、例えば生物学的又は化学的なもの、例えば小分子又は抗体であってもよい。薬剤又は化合物は、例えば、解糖プロセスを直接的に若しくは間接的に標的としてもよく、又は解糖経路に関与する酵素のうちの１若しくは２以上に直接作用してもよい。
【００３５】
解糖プロセスに関与する１つのそのような酵素は、グルコキナーゼ（ＧＣＫ、ＧＬＫ又はＧＫ）である。したがって、１つの実施形態において、本発明の解糖活性化剤はＧＣＫ活性化剤である（グルコキナーゼ活性化因子又はＧＫＡとしても知られる）。１つの実施形態において、ＧＫＡは、ＧＣＫとＧＣＫ調節タンパク質（ＧＣＫＲ）との間の相互作用を予防するか又は阻害する。
【００３６】
ＧＣＫなどの酵素の活性を判定するための方法及びアッセイは当業者に周知である。例えば、ＧＣＫ活性を測定するための特定のアッセイは、国際公開第２００８０５０１０１号パンフレットに記載されており、そこでは、組換えＧＣＫの酵素活性を、ＧＣＫをＡＴＰ及びグルコースとインキュベートすることによって測定している。生成物の形成速度は、アッセイをＧ６Ｐデヒドロゲナーゼ、ＮＡＤＰ／ＮＡＤＰＨシステムと合わせることによって判定し、３４０ｎｍにおける光学密度の経時的線形増加を測定してもよい。
【００３７】
いくつかのＧＣＫ活性化因子が当技術分野において公知であり、本明細書において引用する参考文献に記載されている。
【００３８】
本発明の１つの実施形態において、ＧＣＫ活性化剤は、式（Ｉ）の化合物
【００３９】
【化２】
2020533346.tif 000004
【００４０】
又はその薬学的に許容される塩である
（式中、
Ｒ１は、イソプロピル、ブタ−２−イル、シクロペンチル、ｌ，ｌ，ｌ−トリフルオロプロパ−２−イル、１，３−ジフルオロプロパ−２−イル、ブタ−ｌ−イン−３−イル、ｌ−ヒドロキシプロパ−２−イル、２−ヒドロキシブタ−３−イル、ｌ−ヒドロキシブタ−２−イル、テトラヒドロフリル、テトラヒドロピラニル、ｌ−メトキシプロパ−２−イル、ｌ−メトキシブタ−２−イル、２−ヒドロキシプロパ−１−イル、２−メトキシプロパ−ｌ−イル、２−ヒドロキシブタ−ｌ−イル、２−メトキシブタ−ｌ−イル、１−フルオロメトキシプロパ−２−イル、ｌ，ｌ−ジフルオロメトキシプロパ−２−イル及びｌ−トリフルオロメトキシプロパ−２−イルから選択され、
ＨＥＴ−１は、２位において窒素原子を含み、Ｏ、Ｎ及びＳから独立して選択される１又は２個のさらなる環ヘテロ原子を含んでいてもよい５又は６員Ｃ結合ヘテロアリール環であり、その環は、任意の窒素原子上でＲ７から選択される置換基で及び／又は１つ若しくは２つの利用可能な炭素原子上でＲ６から独立して選択される置換基で置換されていてもよく（ただし、それによって四級化されない）、
Ｒ２は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ４Ｒ５及び−ＳＯ２ＮＲ４Ｒ５から選択され、
Ｒ３は、メチル、トリフルオロメチル及びハロから選択され、
Ｒ４及びＲ５は、それらが結合する窒素原子とともに、Ｏ、Ｎ及びＳから独立して選択される１つ又は２つのさらなるヘテロ原子（結合しているＮ原子に加えて）を含んでいてもよい４〜７員飽和又は部分不飽和ヘテロシクリル環を形成し、−ＣＨ２−基は、−Ｃ（Ｏ）−で置き換えられていてもよい場合があり、環中の硫黄原子は、Ｓ（Ｏ）又はＳ（Ｏ）２基に酸化されていてもよい場合があり、その環は、利用可能な炭素原子上でＲ８から独立して選択される１つ若しくは２つの置換基で及び／又は利用可能な窒素原子上でＲ９から選択される置換基で置換されていてもよいか、又はＲ４及びＲ５は、それらが結合する窒素原子とともに、１つのさらなる窒素原子を含んでいてもよい（結合しているＮ原子に加えて）６〜１０員二環式飽和又は部分不飽和ヘテロシクリル環を形成し、−ＣＨ２−基は、−Ｃ（Ｏ）−で置き換えられていてもよい場合があり、この環は、利用可能な炭素上でヒドロキシ及びＲ３から選択される１つの置換基で又は利用可能な窒素原子上でメチルで置換されていてもよく、
Ｒ６は、（ｌ−４Ｃ）アルキル、ハロ、ヒドロキシ（ｌ−４Ｃ）アルキル、（ｌ−４Ｃ）アルコキシ（ｌ−４Ｃ）アルキル、（ｌ−４Ｃ）アルキルＳ（Ｏ）ｐ（ｌ−４Ｃ）アルキル、アミノ（ｌ−４Ｃ）アルキル、（ｌ−４Ｃ）アルキルアミノ（ｌ−４Ｃ）アルキル及びジ（ｌ−４Ｃ）アルキルアミノ（ｌ−４Ｃ）アルキルから独立して選択され、
Ｒ７は、（ｌ−４Ｃ）アルキル、ハロ（ｌ−４Ｃ）アルキル、ジハロ（ｌ−４Ｃ）アルキル、トリハロ（ｌ−４Ｃ）アルキル、ヒドロキシ（ｌ−４Ｃ）アルキル、（ｌ−４Ｃ）アルコキシ（ｌ−４Ｃ）アルキル、（ｌ−４Ｃ）アルキルＳ（０）ｐ（ｌ−４Ｃ）アルキル、アミノ（ｌ−４Ｃ）アルキル、（ｌ−４Ｃ）アルキルアミノ（ｌ−４Ｃ）アルキル及びジ（ｌ−４Ｃ）アルキルアミノ（ｌ−４Ｃ）アルキルから独立して選択され、
Ｒ８は、ヒドロキシ、（ｌ−４Ｃ）アルコキシ、（ｌ−４Ｃ）アルキル、アミノカルボニル、（１−４Ｃ）アルキルアミノカルボニル、ジ（ｌ−４Ｃ）アルキルアミノカルボニル、（ｌ−４Ｃ）アルキルアミノ、ジ（ｌ−４Ｃ）アルキルアミノ、（ｌ−４Ｃ）アルコキシ（ｌ−４Ｃ）アルキル、ヒドロキシ（ｌ−４Ｃ）アルキル及び−Ｓ（Ｏ）ｐ（ｌ−４Ｃ）アルキルから選択され、
Ｒ９は、（ｌ−４Ｃ）アルキル、−Ｃ（Ｏ）（ｌ−４Ｃ）アルキル、アミノカルボニル、（１−４Ｃ）アルキルアミノカルボニル、ジ（１−４Ｃ）アルキルアミノカルボニル、（１−４Ｃ）アルコキシ（１−４Ｃ）アルキル、ヒドロキシ（ｌ−４Ｃ）アルキル及び−Ｓ（Ｏ）ｐ（ｌ−４Ｃ）アルキルから選択され、
Ｘ１、Ｘ２及びＸ３のそれぞれは、ＣＨ、Ｎ、Ｓ及びＯから独立して選択され、Ｘ４は、存在しない（５員環を構成する）か、又はＣＨ、Ｎ、Ｏ及びＳから選択され、ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３及びＸ４のうちの少なくとも１つはＣＨであり、ただし、環内にＯ−Ｏ、Ｏ−Ｓ又はＳ−Ｓ結合は存在しない）。
【００４１】
本発明の１つの実施形態において、ＧＣＫ活性化剤は、ＡＺＤ１６５６、ピラグリアチン（別名Ｒ１４４０又はＲＯ４３８９６２０）、ＡＺＤ６３７０、ＧＫＡ５０、ＹＨ−ＧＫＡ、ＰＳＮ−０１０、ＬＹ２１２１２６０、ガノデランＢ、ユーパチリン、グルコリプシンＡ、グルコリプシンＢ、シノグリアチン(sinogliatin)、ＧＫＭ−００１、ＴＴＰ−３９９、ＳＹ−００４、ＴＭＧ−１２３、アルビグルチド、ＡＭ−９５１４、ＡＭＧ−０６９６、ＡＭＧ−１６９４、ＡＭＧ−３９６９、ＬＣＺ−９６０、ＡＺＤ−１０９２、ＡＺＤ−５６５８、ＡＲＲＹ−４０３、ＢＭＳ−８２０１３２、ＧＫＭ−００２、ＬＹ−２６０８２０４、ＭＫ−０９４１、Ｒ−１５１１、ＲＯ−２８１６７５、ＺＹＧＫ−１、ＯＰ−２８６ＣＲ、ＣＭ−３、ＤＳ−７３０９、ＬＹ−２５９９５０６、ＰＦ−０４９３７３１９、ＰＦ−０４９９１５３２、ＴＡＫ−３２９、及びそれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される。
【００４２】
ピラグリアチンは、以下の構造式
【００４３】
【化３】
2020533346.tif 000005
【００４４】
を有し、化学名（２Ｒ）−２−（３−クロロ−４−メチルスルホニルフェニル）−３−［（１Ｒ）−３−オキソシクロペンチル］−Ｎ−ピラジン−２−イルプロパンアミドで知られている。
【００４５】
ＡＺＤ１６５６は、以下の構造式
【００４６】
【化４】
2020533346.tif 000006
【００４７】
を有し、化学名３−［５−（アゼチジン−１−カルボニル）ピラジン−２−イル］オキシ−５−［（２Ｓ）−１−メトキシプロパン−２−イル］オキシ−Ｎ−（５−メチルピラジン−２−イル）ベンズアミドで知られている。
【００４８】
本発明の１つの実施形態において、ＧＣＫ活性化剤は、３−｛［５−（アゼチジン−１−イルカルボニル）ピラジン−２−イル］オキシ｝−５−｛［（１Ｓ）−１−メチル−２−（メチルオキシ）エチル］オキシ｝−Ｎ−（５メチルピラジン−２−イル）ベンズアミドである。
【００４９】
ＡＺＤ６３７０は、以下の構造式
【００５０】
【化５】
2020533346.tif 000007
【００５１】
を有し、化学名３−（（（１Ｓ）−２−ヒドロキシ−１−メチルエチル）オキシ）−Ｎ−（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−３−イル）−５−（４−（メチルスルホニル）フェノキシ）ベンズアミドで知られている。
【００５２】
ＧＫＡ５０は、以下の構造式
【００５３】
【化６】
2020533346.tif 000008
【００５４】
を有し、化学名６−［［３−［（１Ｓ）−２−メトキシ−１−メチルエトキシ］−５−［（１Ｓ）−１−メチル−２−フェニルエトキシ］ベンゾイル］アミノ−３−ピリジンカルボン酸で知られている。
【００５５】
ＹＨ−ＧＫＡは、以下の構造式
【００５６】
【化７】
2020533346.tif 000009
【００５７】
を有する。
【００５８】
ＰＳＮ−０１０は、以下の構造式
【００５９】
【化８】
2020533346.tif 000010
【００６０】
を有する。
【００６１】
ＬＹ２１２１２６０は、以下の構造式
【００６２】
【化９】
2020533346.tif 000011
【００６３】
を有し、化学名（１Ｒ，２Ｓ）−２−シクロヘキシル−１−（４−メチルスルホニルフェニル）−Ｎ−（１，３−チアゾール−２−イル）シクロプロパン−１−カルボキサミドで知られている。
【００６４】
ユーパチリンは、以下の構造式
【００６５】
【化１０】
2020533346.tif 000012
【００６６】
を有し、アルテミシア・プリンセプス（Artemisia princeps）から誘導することができるフラボンである。
【００６７】
グルコリプシンＡは、以下の構造式
【００６８】
【化１１】
2020533346.tif 000013
【００６９】
を有し、ストレプトマイセス・パープロゲニスクレオティクス（Streptomyces purpurogeniscleroticus）から誘導することができる糖脂質である。
【００７０】
グルコリプシンＢは、以下の構造式
【００７１】
【化１２】
2020533346.tif 000014
【００７２】
を有し、ノカルディア・ワクチニイ（Nocardia vaccinii）から誘導することができる糖脂質である。
【００７３】
好ましい実施形態において、ＧＣＫ活性化剤はＡＺＤ１６５６である。好ましい実施形態において、ＧＣＫ活性化剤はＧＫＡ５０である。
【００７４】
米国特許出願公開第２０１３０２５２９７３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１３０１６５４５２Ａ１号明細書、国際公開第２０１３０８６３９７Ａ１号パンフレット、米国特許出願公開第２０１３０１３１１１３Ａ１号明細書、欧州特許出願公開第２５８２７０６Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１３００２９９３９Ａ１号明細書、欧州特許出願公開第２５４３６６７Ａ１号明細書、国際公開第２０１２１５０２０２Ａ１号パンフレット、米国特許出願公開第２０１２０２７７２４２Ａ１号明細書、欧州特許出願公開第２５１３１０３Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２５２８１４Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２２５８８７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０２１４７３５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０１８４５４４Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０１７８７６５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０１６５３７５Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０１４９７０４Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１２０１４２６３６Ａ１号明細書、欧州特許出願公開第２４４４３９７Ａ１号明細書、米国特許出願公開第２０１２００８８７６０Ａ１号明細書、欧州特許出願公開第２４０６２３０Ａ１号明細書及びGrewal, A.S., Sekhon, B.S., and Lather, V. (2014). Recent Updates on Glucokinase Activators for the Treatment of Type 2 Diabetes Mellitus. Mini Rev Med Chem 14, 585-602で挙げられるグルコキナーゼ活性化因子（ＧＫＡ）も、当業者に公知であり、本発明において使用するものであり、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
本発明の解糖活性化剤の細胞標的は、アルドラーゼ、ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰキナーゼ）、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＴＬＡ−４、エノラーゼ、ＧＣＫ、ＧＣＫ調節タンパク質（ＧＣＫＲ）、ヘキソキナーゼＩ（ＨＫＩ）、ヘキソキナーゼＩＩ（ＨＫＩＩ）、ＩＣＡＭ−１及びＬＦＡ−１からなる群から選択される１又は２以上であってもよい。
【００７６】
疾患又は医学的状態
本発明の解糖活性化剤及び化合物は、疾患及び医学的状態の治療又は予防における使用を見出す。
【００７７】
１つの実施形態において、疾患又は医学的状態は免疫介在性の疾患又は医学的状態である。そのような疾患又は状態は、望ましくない又は異常な免疫応答の存在によって示される。したがって、１つの実施形態において、免疫介在性の疾患又は医学的状態は、自己免疫障害である。「自己免疫障害」は、それ自身の健常細胞又は組織に対する生物の免疫応答に起因する任意の疾患又は状態を意味するために本明細書において使用する。別の実施形態において、疾患又は医学的状態は、移植関連障害である。「移植関連障害」は、臓器、組織又は細胞移植を受けた患者又は対象の結果と関連する又は結果として生じる任意の障害を意味するために本明細書おいて使用し、これらとしては、モノクローナル抗体などの生物学的医薬品の免疫拒絶反応がある。移植関連障害の例としては、移植拒絶反応、同種移植拒絶反応、血管新生同種移植拒絶反応、細胞移植拒絶反応（すなわち幹細胞、膵臓ベータ細胞）及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）がある。
【００７８】
１つの実施形態において、免疫介在性の疾患又は医学的状態、例えば、自己免疫障害は、移植拒絶反応、同種移植拒絶反応、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、乾癬、Ｉ型糖尿病、橋本甲状腺炎、自己免疫性甲状腺炎（ＡＩＴＤ）、心筋炎、心筋梗塞（ＭＩ）、アレルギー、ウイルス、細菌又は寄生生物による感染症、がん、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、関節リウマチ、自己免疫性胃炎、大腸炎、抗糸球体基底部腎炎、自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、円形脱毛症、自己免疫性プロゲステロン皮膚炎、自己免疫性蕁麻疹、尋常性天疱瘡、自己免疫性多内分泌腺症候群（ＡＰＳ；３型ＡＰＳ、別名ＩＰＥＸ症候群を除く）、自己免疫性膵炎、グレーブス病、シェーグレン症候群、セリアック病、潰瘍性大腸炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少性紫斑病、悪性貧血、混合性結合組織疾患（ＭＣＴＤ）、未分化結合組織疾患（ＵＣＴＤ）、乾癬性関節炎、再発性多発性軟骨炎、リウマチ熱、皮膚筋炎、重症筋無力症、多発性筋炎、急性播種性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、ギランバレー症候群、橋本脳症、横断性脊髄炎、サルコイドーシス、自己免疫性ブドウ膜炎、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、ベーチェット病、巨細胞性動脈炎、多発血管炎性肉芽腫症（ＥＧＰＡ）、血管炎、湿疹から選択される。
【００７９】
１つの実施形態において、免疫介在性の疾患又は医学的状態は心筋炎である。１つの実施形態において、免疫介在性の疾患又は医学的状態は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。１つの実施形態において、免疫介在性疾の患又は医学的状態は移植拒絶反応である。１つの実施形態において、免疫介在性の疾患又は状態は関節リウマチである。１つの実施形態において、免疫介在性の疾患又は医学的状態は１型糖尿病である。別の実施形態において、自己免疫障害などの免疫介在性の疾患又は医学的状態は１型糖尿病ではない。
【００８０】
別の実施形態において、治療されることになる疾患又は医学的状態は、移植後糖尿病及び虚血再灌流傷害からなる群から選択される。
【００８１】
自己免疫
インビボでは、Ｔｒｅｇは、自己反応性Ｔ細胞の活性化を制限し、したがってそのエフェクター機能の分化及び獲得を予防する。活性病原性細胞の供給を制限することによって、Ｔｒｅｇは自己免疫疾患の進行を予防するか又は減速する。しかし、この防御機序は、おそらくＴｒｅｇ細胞の欠乏（特定の部位において）並びに／又は長期の疾患経過にわたるＴｒｅｇ耐性病原性Ｔ細胞の発生及び蓄積のために、自己免疫個体において不十分であるようである。したがって、これらの患者における自己寛容の回復は、疾患部位にＴｒｅｇをホーミングするか又は病原性Ｔ細胞をパージし、Ｔｒｅｇを注入し、進行中の組織傷害を制御する能力を高めることによって達成される場合がある。臓器特異的自己免疫状態、例えば甲状腺炎及びインスリン依存性糖尿病は、この寛容機序のブレークダウンに起因している。
【００８２】
１型糖尿病
１型（若年性）糖尿病は、インスリン産生膵臓ベータ−細胞の破壊に起因する臓器特異的自己免疫疾患である。非糖尿病患者では、島細胞抗原特異的Ｔ細胞は、胸腺での発生において取り除かれるか、又は島細胞抗原に対するエフェクター応答を盛んに抑制する制御性Ｔ細胞へ変換される。若年性糖尿病患者では、かつ若年性糖尿病のＮＯＤマウスモデルでは、これらの寛容機序は失われている。それらが無ければ、島細胞抗原は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ及びＩＩ分子によって提示され、ＣＤ８（＋）及びＣＤ４（＋）自己反応性Ｔ細胞によって認識される。これらの自己反応性細胞によって島細胞が破壊されると、最終的にはグルコース不寛容につながる。Ｔｒｅｇのホーミング及び／又は現存する抗原特異的エフェクターＴ細胞の制御性表現型への変換によって、有害な自己免疫応答の方向性が変更され、抗原特異的適応寛容の誘発につながる。抗原特異的寛容の誘発によって自己エピトープに対する自己免疫応答をモジュレートすると、進行中のベータ細胞破壊を予防することができる。
【００８３】
したがって、本発明は、１型糖尿病を予防するか又は治療するための方法において有用である。１型糖尿病を治療する場合、本発明の解糖活性化剤又はＧＣＫ活性化剤は、インスリン投与レジメンの一部として投与してもよい。別の実施形態において、薬剤は、インスリンと共に（例えば、同時に、連続的に又は個別に）投与されない。したがって、薬剤は、インスリン療法の代替であってもよい。
【００８４】
移植
臓器特異的自己免疫を治療するためのＡｇ特異的Ｔｒｅｇ細胞を誘導することは、重要な治療開発であり、全身的な免疫抑制を回避する。骨髄移植のネズミモデルでは、Ｔｒｅｇは、ドナー骨髄生着を促進し、有益な移植片対腫瘍免疫学的効果を無効にすることなく移植片対宿主病の発生及び重症度を減少させる。これらの発見は、マウス及びヒトにおけるＴｒｅｇは、表現型及び機能特性を共有するという知見と合わせて、ヒト造血細胞移植と関連する合併症を減少させるためのこれらの細胞の使用を積極的に調査することにつながっている。Ｔｒｅｇ及びエフェクターＴ細胞の不均衡は、移植片対宿主病が発症する一因となる。しかし、Ｔｒｅｇの免疫調節、特にアロ認識特性の機序、他の免疫細胞に対するその効果及びそれらとの相互作用、並びにそれらの抑制活性部位は、十分に理解されていない。
【００８５】
ヒトと実験動物モデルの両方からのエビデンスの蓄積は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の発症におけるＴｒｅｇの関与を示唆している。Ｔｒｅｇは、移植片対腫瘍（ＧＶＴ）活性からＧＶＨＤを区別することができるという実証によって、その免疫抑制の潜在力を操作し、ＧＶＴ効果に対して有害な結果を与えることなくＧＶＨＤを減少させることができることが示唆される。
【００８６】
１つの実施形態において、本発明の薬剤は、対象における移植の成功率を増加させるために、又は対象における移植拒絶反応を遅延させるために使用してもよい。移植は、皮膚移植であってもよい。したがって、薬剤は、移植片生着率を増加させるか、又は対象における皮膚移植片拒絶反応を遅延させるために有用であり得る。１つの実施形態において、成功率の増加又は拒絶反応の遅延は、プラセボ、媒体、薬剤不含対照又は他の（従来の）免疫抑制薬剤、例えばエフェクター免疫機序（細胞性又は体液性）の作用を阻害することを目的とするものとの比較で測定される。
【００８７】
移植後糖尿病
２型糖尿病は、英国における末期腎不全の最も一般的な原因である。腎臓移植は、末期腎疾患を有する患者に対する腎代替療法の最適な形態であることが広く認められており、透析を継続したものと比較して、腎移植を受けた患者における生存が長期となり、クオリティオブライフが改善される（Reese, P.P., Shults, J., Bloom, R.D., Mussell, A., Harhay, M.N., Abt, P., Levine, M., Johansen, K.L., Karlawish, J.T., and Feldman, H.I. Functional Status, Time to Transplantation, and Survival Benefit of Kidney Transplantation Among Wait-Listed Candidates. American journal of kidney diseases : the official journal of the National Kidney Foundation. 7 July 2015）。
【００８８】
しかし移植によって、患者におけるグルコース負荷は高くなる。これは、急性拒絶反応、敗血症及び転帰の悪化と関連しており、患者は、移植後期間の初期に患者の抗糖尿病薬を頻繁に増加させる必要がある。このことに関する１つの理由は、免疫抑制薬（ステロイド及びカルシニューリン阻害剤）が、高血糖を直接もたらす場合があるということである。さらに、腎機能が改善するにつれ、抗糖尿病剤の腎クリアランスが高くなり、これらの医薬品の効力が低下する。これらの影響は移植後期間の初期に最も顕著である。この時期が、免疫抑制の負荷が最も強く、腎機能における変化が最も顕著である期間であるためである。
【００８９】
解糖活性化剤（ＡＺＤ１６５６など）の短期のクールは、免疫抑制負荷、したがって糖新生が最大である場合に、腎移植直後の糖尿病の制御において利点となる場合がある。さらに、解糖活性化剤は、免疫機能への影響を含むその抗糖尿病作用とは無関係の作用において、腎移植後に追加の利点を有する場合がある。
【００９０】
理論に束縛されることを望むものではないが、解糖活性化剤（ＡＺＤ１６５６など）を用いた治療は、術後クールの初期においてより多くのＴｒｅｇ輸送をもたらすことになり、その免疫抑制効果を通して虚血再灌流傷害を減少させ、続いて、改善された移植片の生着に関するマーカーである、移植された臓器（例えば腎臓）におけるＴｒｅｇの存在を増加させ、同時に初期の移植後糖尿病制御を制御する助けとなると考えられる。
【００９１】
したがって、本発明は、移植後糖尿病、特に腎移植後糖尿病を予防するか又は治療するための方法において有用である。本発明は、腎移植を受けた患者における糖尿病を予防するか又は治療するための方法において有用である。１つの実施形態において、糖尿病に罹患した患者は、さらなる抗糖尿病薬を投与されている。本発明は、虚血再灌流傷害を予防するか又は治療するための方法において有用である。本発明は、移植後の移植片生着を改善するための方法において有用である。本発明は、治療中の臓器移植組織（腎移植組織など）においてＴｒｅｇの母集団を増加させるための方法において有用である。
【００９２】
したがって、本項に記載のそのような予防／治療の有効性は、Ｔｒｅｇ遊走、例えば、腎移植組織におけるＴｒｅｇ浸潤の変化、例えば３カ月の治療にわたってＦＡＣＳ分析を使用して測定される、例えば末梢のＴｒｅｇ母集団における変化、又は当業者に公知の任意の適切な遊走アッセイを使用して測定されるインビトロでのＴｒｅｇの遊走における変化を検討することによって評価してもよい。
【００９３】
したがって、効果的な治療法の副次的評価項目としては、ベースラインと治療生検終了時との間の腎生検組織におけるＴｒｅｇ細胞に対する組織学的染色、マーカーとしてＨｂＡ１ｃを使用したベースラインと治療終了時との間の糖尿病制御、ベースラインと治療終了時との間の他の抗糖尿病薬の用量、安全性評価項目、すなわち低血糖エピソード、ＨＯＭＡ  ＩＲ定量化を使用したインスリン抵抗性、ベースラインと治療終了時との間の移植片機能、急性拒絶反応のエピソード、日和見感染症（細菌性とウイルス性の両方）のエピソード、１２カ月目の移植片機能、及び遺産効果を評価するための糖尿病制御があり得る。
【００９４】
免疫モジュレート
本発明の解糖活性化剤は、対象における免疫応答をモジュレートする(modulate)か又は調節する(regulate)ために、例えば、対象における免疫応答を抑制する(suppress)か又はリプレッスする(repress)ために使用してもよい。
【００９５】
本発明の解糖活性化剤は、対象における自己免疫応答を抑制するか又は調節するために使用してもよい。
【００９６】
特に、疾患又は医学的状態の治療又は予防は、内因性制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の、例えば組織又は臓器への、例えば疾患のある組織若しくは臓器又は移植された組織若しくは臓器への輸送を介して介在してもよい。
【００９７】
したがって、本発明の解糖活性化剤及び化合物は、例えば、疾患又は医学的状態に罹患した又はこれらに罹患するリスクがある対象における（疾患）組織又は臓器への内因性レギュレーターＴ細胞（Ｔｒｅｇ）の輸送における使用を見出す。
【００９８】
さらに、本発明の解糖活性化剤及び化合物は、内因性制御性Ｔ細胞の組織又は臓器、例えば疾患のある組織又は臓器への輸送によって緩和される疾患又は医学的状態の治療又は予防における使用を見出す。
【００９９】
「疾患のある組織又は臓器」は、任意の異常な又は病理学的状態における組織又は臓器を意味する。例えば、組織又は臓器は、免疫疾患、障害又は医学的状態、例えば、自己免疫障害又は本明細書に記載される疾患又は状態のうちのいずれかによって影響を受ける場合がある。
【０１００】
１つの実施形態において、Ｔｒｅｇは、胸腺内で生成される自然発生Ｔｒｅｇ（ナチュラルＴｒｅｇ）である。別の実施形態において、Ｔｒｅｇは、末梢で生成される誘導性Ｔｒｅｇ（誘導性Ｔｒｅｇ）である。
【０１０１】
関連する実施形態において、解糖活性化剤は、エフェクターＴ細胞応答、ヘルパーＴ細胞応答又はＢ細胞応答のうちのいずれかを同時に抑制する場合がある。有利には、解糖活性化剤は、エフェクターＴ細胞応答、ヘルパーＴ細胞応答又はＢ細胞応答のうちのいずれかを抑制する薬剤と共に投与してもよい。
【０１０２】
Ｔｒｅｇの輸送
「Ｔｒｅｇの輸送」という用語は、Ｔｒｅｇの移動に全般的に関連し、例えば、その運動性又は遊走に関連し得る。そのような輸送、ホーミング又は遊走は、特定の方向であっても、又は特定の位置若しくは部位に向かっていてもよい。
【０１０３】
本発明の効果は、Ｔｒｅｇの疾患部位への、例えば炎症組織への又は疾患のある組織若しくは臓器への、輸送、ホーミング又は遊走によって主に達成され得る。好ましい実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞は、疾患のある組織又は臓器に遊走する。１つの実施形態において、Ｔｒｅｇ細胞は、脾臓又は腹膜に、有利には腹膜に遊走する。この様式でＴｒｅｇの輸送を可能にする細胞機序は当業者に公知である。
【０１０４】
Ｔｒｅｇの遊走アッセイは当業者に公知であり、本明細書においてさらに詳細に記載する。
【０１０５】
治療方法
本発明は、対象における免疫介在性の障害又は状態を治療するか又は予防する方法であって、解糖活性化剤を対象に投与することを含む方法も包含する。
【０１０６】
「治療すること又は予防すること」という用語は、治療、予防又は診断の任意の形態を包含することを意図し、疾患を治癒するための治療と予防するための治療の両方を含む。したがって、健常対象の治療は治療法とみなすことができる。治療又は予防は、疾患のための治癒的治療に加えて、症状の緩和も含む。
【０１０７】
投与量及び投与
本発明は、本発明による使用のための解糖活性化剤、及び薬学的に許容される担体、媒体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１０８】
本発明の組成物は、経口使用（例えば、錠剤、トローチ剤、硬若しくは軟カプセル剤、水性若しくは油性懸濁剤、エマルション剤、分散性散剤（dispersible powders）若しくは顆粒剤、シロップ剤又はエリキシル剤として）、局所使用（例えば、クリーム剤、軟膏剤、ゲル剤、又は水性若しくは油性液剤若しくは懸濁剤として）、吸入による投与（例えば、微粉化された粉末状又は液状エアロゾル剤として）、吹入剤による投与（例えば、微粉化された散剤として）又は非経口投与（例えば、静脈内、皮下、筋肉内若しくは筋肉内投薬用の滅菌水性若しくは油性液剤として、又は直腸投薬用の坐剤として）に適切な形態であってもよい。経口使用に適切な剤形が好ましい。
【０１０９】
本発明の組成物は、当技術分野において周知の従来の医薬賦形剤を使用し、従来の手順によって得てもよい。したがって、経口使用を意図する組成物は、例えば、１又は２以上の着色剤、甘味料、香味料及び／又は保存剤を含んでいてもよい。
【０１１０】
錠剤製剤のための適切な薬学的に許容される賦形剤としては、例えば、不活性希釈剤、例えばラクトース、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム又は炭酸カルシウム、造粒及び崩壊剤、例えばコーンスターチ又はアルギン酸；結合剤、例えばデンプン；滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸又はタルク；保存剤、例えばｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル又はプロピル、並びに抗酸化剤、例えばアスコルビン酸がある。錠剤製剤は、コーティングされていなくても、その崩壊及びその後の胃腸管内での活性成分の吸収を改良するために、又はその安定性及び／若しくは外観を改善するためにコーティングされていてもよく、いずれの場合も、従来のコーティング剤及び当技術分野において周知の手順を使用する。
【０１１１】
経口使用のための組成物は、活性成分が、不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム又はカオリンと混合されている硬ゼラチンカプセル剤の形態であっても、活性成分が、水又は油、例えば落花生油、液体パラフィン、又はオリーブ油と混合されている軟ゼラチンカプセル剤としての形態であってもよい。
【０１１２】
水性懸濁剤は、１又は２以上の懸濁化剤、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴム；分散又は湿潤剤、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸との濃縮生成物（例えば、ステアリン酸ポリオキシエチレン）、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの濃縮生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの濃縮生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの濃縮生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールに由来する部分エステルとの濃縮生成物、例えばモノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来する部分エステルとの濃縮生成物、例えば、モノオレイン酸ポリエチレンソルビタンとともに、活性成分を微粉末状形態で一般的に含む。水性懸濁剤は、１又は２以上の保存料（Ｑ−ヒドロキシ安息香酸エチル又はプロピルなど）、抗酸化剤（アスコルビン酸など）、着色剤、香味剤、及び／又は甘味剤（スクロース、サッカリン又はアスパルテームなど）も含んでいてもよい。
【０１１３】
油性懸濁剤は、植物油（落花生油、オリーブ油、ゴマ油又はココナツ油など）中に又は鉱油（液体パラフィンなど）中に活性成分を懸濁することによって製剤化してもよい。油性懸濁剤は、増粘剤、例えば蜜蝋、固形パラフィン又はセチルアルコールも含んでいてもよい。上記のものなどの甘味剤、及び香味剤は、味の良い経口調製物を提供するために添加してもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸などの抗酸化剤を添加することによって保存してもよい。
【０１１４】
水を添加することによる水性懸濁剤の調製に適切な分散性散剤及び顆粒剤は、分散又は湿潤剤、懸濁化剤及び１又は２以上の保存料とともに、活性成分を一般的に含む。適切な分散又は湿潤剤及び懸濁化剤は、既に上述のものによって例示されている。
【０１１５】
追加の賦形剤、例えば甘味剤、香味剤及び着色剤も存在していてもよい。
【０１１６】
本発明の医薬組成物はまた、水中油エマルションの形態であってもよい。油性相は、植物油、例えばオリーブ油若しくは落花生油、又は鉱油、例えば、液体パラフィン若しくはこれらのうちのいずれかの混合物であってもよい。適切な乳化剤は、例えば、天然に存在するゴム、例えばアカシアゴム又はトラガカントゴム、天然に存在するホスファチド、例えばダイズ、レシチン、脂肪酸及びヘキシトール無水物に由来するエステル又は部分エステル（例えば、モノオレイン酸ソルビタン）及び前記部分エステルとエチレンオキシドとの濃縮生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。エマルションは、甘味剤、香味剤及び保存剤も含んでいてもよい。
【０１１７】
シロップ剤及びエリキシル剤は、甘味剤、例えばグリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、アスパルテーム又はスクロースを用いて製剤化してもよく、粘滑剤、保存剤、香味剤及び／又は着色剤も含んでいてもよい。
【０１１８】
医薬組成物はまた、滅菌注射用水性又は油性懸濁剤の形態であってもよく、これらは、上述の適切な分散又は湿潤剤及び懸濁化剤のうちの１又は２以上を使用して、公知の手順に従って製剤化してもよい。滅菌注射用調製物はまた、非毒性の非経口で許容される希釈剤又は溶媒中の滅菌注射用溶液又は懸濁剤、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液であってもよい。
【０１１９】
吸入による投与のための組成物は、微粉化された固形物又は液滴を含むエアロゾルとして活性成分を分注するように構成された従来の加圧エアロゾルの形態であってもよい。従来のエアロゾル噴射剤、例えば揮発性フッ化炭化水素又は炭化水素を使用してもよく、エアロゾルデバイスは、定量の活性成分を分注するように好都合に構成される。
【０１２０】
製剤のさらなる情報に関しては、Chapter 25.2 in Volume 5 of Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990を参照されたい。
【０１２１】
単一の剤形を製造するために１又は２以上の賦形剤と組み合わせられる活性成分の量は、治療される宿主及び特定の投与経路によって必然的に変わる。例えば、ヒトへの経口投与を意図する製剤は、例えば、全組成物の約５重量パーセントから約９８重量パーセントまで変わり得る適切なかつ好都合な量の賦形剤と混合された０．５ｍｇ〜２ｇの活性薬剤を一般的に含むであろう。本発明の解糖活性化剤の単位剤形は、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分、例えば１、１０、２０、５０、１００、２００、２５０又は５００ｍｇの活性成分を一般的に含むであろう。好ましくは、単位剤形は、約１００ｍｇの活性成分を含む。投与経路及び投与量レジメンに対するさらなる情報に関しては、Chapter 25.3 in Volume 5 of Comprehensive Medicinal Chemistry (Corwin Hansch; Chairman of Editorial Board), Pergamon Press 1990を参照されたい。
【０１２２】
治療又は予防目的の用量サイズは、周知の医療原理に従って、状態の性質及び重症度、動物又は患者の年齢及び性別、並びに投与経路によって当然異なる。１つの実施形態において、患者の年齢は１８〜７５歳である。
【０１２３】
治療又は予防目的で、解糖活性化剤、例えば、ＧＣＫ活性化剤、例えばＡＺＤ１６５６を使用する場合、例えば体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ〜７５ｍｇ、例えば体重１ｋｇ当たり１ｍｇ〜５０ｍｇ、例えば体重１ｋｇ当たり５ｍｇ〜３０ｍｇ、例えば体重１ｋｇ当たり１０〜２５ｍｇ、例えば体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの範囲の１日用量を与えられるように一般的に投与され、必要に応じて分割用量で与えられるであろう。非経口経路が用いられる場合、一般的に低用量が投与されることになる。したがって、例えば、静脈内投与に関しては、例えば体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ〜３０ｍｇの範囲の用量が一般的に使用されることになる。同様に、吸入による投与に関しては、例えば体重１ｋｇ当たり０．５ｍｇ〜２５ｍｇの範囲の用量が使用されることになる。しかし、経口投与が好ましい。好ましい実施形態において、本発明の解糖活性化剤（ＡＺＤ１６５６など）は、体重１ｋｇ当たり２０ｍｇの投与量で毎日又は１日２回、１〜３週間、例えば２週間投与してもよい。
【０１２４】
好ましい実施形態において、本発明の解糖活性化剤（ＡＺＤ１６５６など）は、１日１回、２回、３回又は４回投与してもよい。解糖活性化剤のクールは、任意の期間であってもよいが、好ましい実施形態において、本発明の解糖活性化剤（ＡＺＤ１６５６など）は、１週間〜６カ月間、例えば、１〜６カ月間、例えば、２〜４カ月間、例えば３カ月間投与してもよい。
【０１２５】
好ましい実施形態において、本発明の解糖活性化剤（ＡＺＤ１６５６など）は、経口経路を介して、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、例えば約１００ｍｇの単位剤形で、１日１回、２回、３回又は４回、１週間〜６カ月間、例えば１〜６カ月間、例えば２〜４カ月間、例えば３カ月間投与してもよい。特に好ましい実施形態において、本発明の解糖活性化剤（ＡＺＤ１６５６など）は、経口経路を介して１００ｍｇの単位剤形で、１日２回、３カ月間投与される。
【０１２６】
塩
化合物は、塩、特に薬学的に許容される塩又はエステルとして存在していてもよい。
【０１２７】
化合物の薬学的に許容される塩としては、これらの適切な酸付加塩又は塩基塩がある。適切な薬学的塩のレビューは、Berge et al, J Pharm Sci, 66, 1-19 (1977)で見出すことができる。塩は、例えば、強無機酸、例えば鉱酸、例えば硫酸、リン酸又はハロゲン化水素酸を用いて；強有機カルボン酸、例えば置換されていないか又は（例えばハロゲンで）置換された１〜４個の炭素原子のアルカンカルボン酸、例えば酢酸を用いて；飽和又は不飽和ジカルボン酸、例えば、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、フタル酸又はテトラフタル酸を用いて；ヒドロキシカルボン酸、例えば、アスコルビン酸、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸又はクエン酸を用いて；アミノ酸、例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸を用いて；安息香酸を用いて；又は有機スルホン酸、例えば置換されていないか又は（例えばハロゲンで）置換された（Ｃ１−Ｃ４）−アルキル−又はアリール−スルホン酸、例えばメタン−又はｐ−トルエンスルホン酸を用いて形成される。
【０１２８】
鏡像異性体／互変異性体
前述の本発明の全ての態様において、本発明は、必要に応じて本発明の化合物の全ての鏡像異性体及び互変異性体を含む。当業者であれば、光学特性（１又は２以上のキラル炭素原子）又は互変異性特性を有する化合物を認識するであろう。対応する鏡像異性体及び／又は互変異性体は、当技術分野において公知の方法によって単離／調製してもよい。
【０１２９】
立体異性体及び幾何異性体
本発明の化合物のうちのいくつかは、立体異性体及び／又は幾何異性体として存在していてもよく、例えばこれらは、１又は２以上の不斉及び／又は幾何中心を有していてもよく、したがって２又は３以上の立体異性体及び／又は幾何学的形態で存在する場合がある。本発明は、これらの阻害剤の全ての個々の立体異性体及び幾何異性体、並びにこれらの混合物の使用を企図する。特許請求の範囲において使用する用語は、前記形態が適切な機能活性を保持するという条件で（必ずしも同程度ではないが）これらの形態を包含する。
【０１３０】
本発明はまた、薬剤の全ての適切な同位体の変形形態又はその薬学的に許容される塩を含む。本発明の薬剤の同位体の変形形態は又はその薬学的に許容される塩は、少なくとも１つの原子が、同じ原子番号を有するが、自然界で通常認められる原子質量とは異なる原子質量を有する原子で置き換えられているものとして定義される。薬剤及びそれらの薬学的に許容される塩に組み込むことができる同位体の例としては、水素、炭素、窒素、酸素、リン、硫黄、フッ素及び塩素の同位体、例えばそれぞれ２Ｈ、３Ｈ、１３Ｃ、１４Ｃ、１５Ｎ、１７Ｏ、１８Ｏ、３１Ｐ、３２Ｐ、３５Ｓ、１８Ｆ及び３６Ｃｌがある。薬剤のある特定の同位体の変形形態及びそれらの薬学的に許容される塩、例えば放射性同位体、例えば３Ｈ又は１４Ｃが組み込まれたものは、薬物及び／又は基質の組織分布研究において有用である。トリチウム化、すなわち、３Ｈ、及び炭素−１４、すなわち１４Ｃ、同位体は、その調製が容易で検出可能であるために特に好ましい。さらに、同位体、例えばジューテリウム、すなわち２Ｈで置換すると、より優れた代謝安定性に起因するある特定の治療的利点、例えばインビボでの半減期の増加又は必要投与量の減少が得られ、したがって、一部の状況で好ましいことがある。本発明の薬剤の同位体の変形形態及び本発明のそれらの薬学的に許容される塩は、適切な試薬の適切な同位体の変形形態を使用した従来の手順によって一般的に調製することができる。
【０１３１】
溶媒和物
本発明はまた、本発明の化合物の溶媒和物形態を含む。特許請求の範囲において使用する用語は、これらの形態を包含する。
【０１３２】
多形
本発明は、さらにそれらのさまざまな結晶形態、多形形態及び（無）水和形態の本発明の化合物に関する。化学的化合物は、そのような化合物の合成的調製において使用する溶媒から精製及び又は単離する方法をわずかに変更することによってそのような形態のうちのいずれかとして単離することができることが医薬産業界で十分に確立されている。
【０１３３】
プロドラッグ
本発明における使用のための化合物は、プロドラッグの形態で投与してもよい。プロドラッグは、本発明の化合物を生成するために体内において分解可能であるバイオ前駆体又は薬学的に許容される化合物である（本発明の化合物のエステル又はアミド、特にインビボ加水分解性エステルなど）。プロドラッグのさまざまな形態が当技術分野において公知である。
【０１３４】
プロドラッグの例は、以下の通りである。カルボキシ又はヒドロキシ基を含む本発明の化合物のインビボ加水分解性エステルは、例えば、ヒト又は動物体内で加水分解され、親酸又はアルコールを生成する薬学的に許容されるエステルである。カルボキシに適切な薬学的に許容されるエステルとしては、Ｃ１−Ｃ６アルコキシメチルエステル、例えば、メトキシメチル、Ｃ１−Ｃ６アルカノイルオキシメチルエステル、例えば、ピバロイルオキシメチル、フタリジルエステル、Ｃ３−Ｃ８シクロアルコキシカルボニルオキシ、Ｃ１−Ｃ６アルキルエステル、例えば、１−シクロヘキシルカルボニルオキシエチル；１，３−ジオキソレン−２−オンイルメチルエステル、例えば、５−メチル−１，３−ジオキソレン−２−オンイルメチル；及びＣｌ−６アルコキシカルボニルオキシエチルエステルがある。
【０１３５】
ヒドロキシル基を含む本発明の化合物のインビボ加水分解性エステルとしては、無機エステル、例えばホスフェートエステル（ホスホロアミド環式エステルを含む）及びα−アシルオキシアルキルエーテル及び関連化合物があり、これらは、エステルのインビボ加水分解の結果的として分解して、親ヒドロキシ基を与える。α−アシルオキシアルキルエーテルの例としては、アセトキシメトキシ及び２，２−ジメチルプロピオニルオキシ−メトキシがある。
【０１３６】
ヒドロキシのための基を形成するインビボ加水分解性エステルの選択としては、アルカノイル、ベンゾイル、フェニルアセチル並びに置換ベンゾイル及びフェニルアセチル、（炭酸アルキルエステルを与えるための）アルコキシカルボニル、（カルバメートを与えるための）ジアルキルカルバモイル及びＮ−（ジアルキルアミノエチル）−Ｎ−アルキルカルバモイル、ジアルキルアミノアセチル並びにカルボキシアセチルがある。
【０１３７】
組合せ療法
本明細書に記載される解糖活性化活性は、単独療法として又は治療される適応症のための１若しくは２以上の他の物質及び／又は治療と組み合わせて適用することがある。そのような併用（conjoint）治療は、治療の個々の構成成分を同時に、連続的に又は個別に投与することによって達成される場合がある。同時治療は、単一の錠剤又は個別の錠剤とすることができる。
【０１３８】
１つの実施形態において、本発明の解糖活性化剤は、免疫抑制剤、細胞療法、寛容原性樹状細胞療法、抗炎症剤及び／又はホルモン補充療法、例えばインスリン又は甲状腺ホルモンと組み合わせて又は一緒に投与される。ホルモン補充療法は自己免疫障害の治療に特に有利であり、例えばＩ型糖尿病の治療のためのインスリンである。
【０１３９】
本明細書において使用する場合、「同時に」は、２つの薬剤が同時に投与されることを意味するために使用する。したがって、「連続的に」投与することは、最初に投与される薬剤の循環半減期が、治療有効量で両方とも同時に存在するようなものであるという条件で、１つの薬剤を、例えば、もう一方を投与してから５分、１０分又は数時間以内に投与することを許容する場合がある。構成成分の投与間の時間の遅延は、構成成分の正確な性質、それらの間の相互作用、及びそれらのそれぞれの半減期によって変わることになる。
【０１４０】
「連続的に」とは対照的に、「個別に」は、一方の薬剤の投与ともう一方の投与との間の間隔が顕著であること、すなわち第２の薬剤を投与するときには、最初に投与された薬剤がもはや治療有効量で血流に存在しない場合があることを意味するために本明細書において使用する。１つの好ましい実施形態において、第２の薬剤は、第１の薬剤の少なくとも２時間、より好ましくは少なくとも４時間、さらにより好ましくは少なくとも８時間、またさらにより好ましくは少なくとも１２又は２４又は４８又は７２時間後に投与する。１つの特に好ましい実施形態において、第２の薬剤は、第１の薬剤の少なくとも２４時間後に投与する。
【０１４１】
追加の態様
本明細書に記載される使用及び方法は、内因性Ｔｒｅｇ細胞に全般的に適用可能であるが、解糖経路の活性化を介するＴｒｅｇの輸送又は遊走の誘発は、自己及び／又は同種異系Ｔｒｅｇ細胞の初回抗原刺激における使用を見出すことも考えられる。
【０１４２】
例えば、患者自身のＴｒｅｇ細胞を単離し、解糖活性化剤を使用して活性化させ、患者に再導入できることが考えられる。Ｔｒｅｇは、任意で増幅させてもよい。
【０１４３】
したがって、Ｔｒｅｇ細胞を輸送又は動員するｅｘ  ｖｉｖｏでの方法であって、Ｔｒｅｇ細胞を解糖活性化剤と接触させることによってＴｒｅｇ細胞における解糖を活性化するステップを含む方法も本明細書において提供される。方法は、例えば解糖を活性化する前にＴｒｅｇの増殖を誘発するステップを含んでいてもよい。
【０１４４】
したがって、Ｔｒｅｇ細胞（例えば養子移植されるＴｒｅｇ）を炎症部位に局在化させる効率を増加させるｅｘ  ｖｉｖｏでの方法であって、自己及び／又は同種異系Ｔｒｅｇ細胞を、ＧＣＫ活性化剤を用いて前処理するステップを含む方法も本明細書において提供される。そのような前処理のステップは、Ｔｒｅｇ細胞とＧＣＫ活性化剤を含む培養培地とを、例えば３７℃で少なくとも２時間インキュベートすることとして定義してもよい。方法は、例えば解糖を活性化する前に、Ｔｒｅｇ細胞の増殖を誘発する又はＴｒｅｇ細胞を増幅するステップを含んでいてもよい。増幅及び増殖のそのような方法は確立されており、当業者に公知である。
【０１４５】
上記の方法は、例えば治療されることになる対象から（すなわち自己の）又は別の対象若しくは供給源から（すなわち同種異系の）Ｔｒｅｇ細胞を任意で単離するステップを含んでいてもよい。
【０１４６】
したがって、本発明は、本明細書に記載される免疫介在性の疾患又は医学的状態を治療する方法であって、
ａ）治療されることになる対象からＴｒｅｇ細胞を単離する及び／又は別の対象若しくは供給源からＴｒｅｇ細胞を単離するステップ、
ｂ）ステップ（ａ）からのＴｒｅｇ細胞を増幅させ、治療法に十分な数を得るステップ、
ｃ）ステップ（ｂ）からのＴｒｅｇ細胞を、ＧＣＫ活性化剤と接触させるか又はそれで前処理するステップ、
ｄ）ステップ（ｃ）からのＴｒｅｇ細胞を、治療されることになる対象に投与するステップ
を含む方法も提供する。
【０１４７】
ステップ（ｃ）からのＴｒｅｇ細胞は、任意の適切な投薬レジメンを使用して対象に投与又は注入してもよい。例えば、Ｔｒｅｇは、体重１ｋｇ当たりのＴｒｅｇ数（ｎｏ．Ｔｒｅｇ）で測定された投与量で、かつさまざまな投薬スケジュール（例えばさまざまな間隔の注入での１又は２以上の注入）で投与してもよい。
【０１４８】
したがって、単離された解糖活性化Ｔｒｅｇ細胞も本明細書において提供される。医薬品における使用のための解糖活性化Ｔｒｅｇ細胞であって、Ｔｒｅｇが任意で単離されるＴｒｅｇ細胞も本明細書において提供される。１つの実施形態において、解糖活性化Ｔｒｅｇは、ＧＣＫ活性化Ｔｒｅｇ又はＡＺＤ１６５６処理Ｔｒｅｇである。これらの態様の単離されたＴｒｅｇ細胞は、自己Ｔｒｅｇ細胞であってもよい。単離されたＴｒｅｇ細胞は、ＧＣＫＲ遺伝子において変異、例えばＧＣＫＲ遺伝子において欠失を含んでいてもよく、例えば、ＧＣＫＲ遺伝子全体が欠失していることがある。そのような変異は、ＧＣＫ及びＴｒｅｇの遊走の脱抑制につながる。
［実施例］
【０１４９】
本発明は、以下の非限定的な例によってここで説明することになる。
【０１５０】
材料
マウス。この研究の実験で使用する全てのマウスは、７〜１１週齢であった。Ｃ５７ＢＬ／６、ＢＡＬＢ／ｃ及びＣＢＡ／Ｃａマウスを、Charles River社（ＵＫ）から購入した。４週齢のＣＴＬＡ−４ＫＯマウス（Ｈ−２ｕハプロタイプの）から切除した二次リンパ器官は、Prof D Wraith（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）により提供された。
【０１５１】
微小血管内皮細胞の単離。ネズミ肺微小血管内皮細胞を、既に記載の通りに（Marelli-Berg, F.M., Peek, E., Lidington, E.A., Stauss, H.J., and Lechler, R.I. (2000). Isolation of endothelial cells from murine tissue. J Immunol Methods 244, 205-215）単離した。
【０１５２】
骨髄由来樹状細胞（ＢＭＤＣ）の単離。骨髄由来ＤＣを、ＷＴ  ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ２−ｄ）マウスから得た。７〜１０週齢の雌マウスから大腿骨及び脛骨を取り出し、ＢＭ細胞を、２７ゲージ針（Becton Dickinson社、カタログ番号３０２２００）を使用してＰＢＳで洗い流した。溶解緩衝液（Sigma-Aldrich社、カタログ番号Ｒ７７５７）を用いて細胞懸濁液から赤血球を溶解した。１ウェル当たりＢＭ細胞（５×１０６）を、６ウェルプレート（Helena bioscience社、カタログ番号９２００６）のＤＣ培地中に下記の通りに播種した。
【０１５３】
樹状細胞の培養。骨髄由来樹状細胞を、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、５０ＩＵ／ｍＬペニシリン、５０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、５０μＭ２−ＭＥ、及びＧＭＣＳＦハイブリドーマ（Dr.Jian-Guo Chai、Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫから寄贈）の上澄みから得られた２％ネズミ顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）が補充されたＲＰＭＩ１６４０培地（Gibco社、カタログ番号２１８７５−０３４）中で培養した。細胞を、５％ＣＯ２の存在下、３７℃で培養した。３日及び５日目に、新鮮な培養培地をプレートに添加した。
【０１５４】
Ｔｒｅｇ−ＤＣ共培養物に関しては、未成熟ＢＭＤＣを収集し、培養の６日目に使用した。機能アッセイに関しては、未成熟ＤＣを、１００ｎｇ／ｍｌリポポリサッカライド（ＬＰＳ）（Invivogen社、カタログ番号ｔｌｒｌ−３ｐｅｌｐｓ）とともに一晩成熟させ、単離してから７〜１０日の間で使用した。
【０１５５】
Ｈ２−ｄ自己特異的Ｔｒｅｇの培養。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ＦｌｏｗＣｏｍｐ（商標）マウスＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞キット（Invitrogen Dynal社、カタログ番号１１４６３Ｄ）を使用して脾臓及びリンパ節から単離した。極めて高純度のＴｒｅｇ細胞（＞９９％）に関しては、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋細胞を、蛍光活性化細胞ソーティングを介してＦｏｘｐ３−ＧＦＰレポーターマウスから得た。増幅に関しては、Ｃ５７ＢＬ／６（Ｈ２−ｂ）マウスから単離したＴｒｅｇ細胞を、放射線照射又はマイトマイシンＣ（Sigma-Aldrich社、カタログ番号Ｍ４２８７）のいずれかで不活性化した未成熟ＢＡＬＢ／ｃ由来（Ｈ２−ｄ）ＤＣを５：１（Ｔｒｅｇ：ＤＣ）の比率で用いて毎週刺激した（Fu, H., Kishore, M., Gittens, B., Wang, G., Coe, D., Komarowska, I., Infante, E., Ridley, A.J., Cooper, D., Perretti, M., et al. (2014). Self-recognition of the endothelium enables regulatory T-cell trafficking and defines the kinetics of immune regulation. Nat Commun 5, 3436）。共培養物を、１０Ｕ／ｍｌ  ＩＬ−２が補充された完全Ｔ細胞培地中で維持した。細胞を収集し、２４ウェル組織培養プレート（Helena bioscience社、カタログ番号９２０２４）に１ウェル当たり１．５×１０６Ｔｒｅｇの最適な密度で毎週播種した。２週間の培養後のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋細胞の百分率は、９５％超であった。機能アッセイにおいて使用するために、Ｔｒｅｇを刺激してから６〜８日後に使用した。
【０１５６】
抗体介在性Ｔ細胞活性化。活性化Ｔ細胞は、ＬＮ細胞を、２０Ｕ／ｍｌの組換えＩＬ−２（Roche社、ＷｅｓｔＳｕｓｓｅｘ、ＵＫ）が補充された完全Ｔ細胞培地中でプレート結合抗ＣＤ３（１μｇ／ｍｌ、eBiosciences社、カタログ番号１６−００３２−８５）及びプレート結合抗ＣＤ２８（５μｇ／ｍｌ、eBiosciences社、カタログ番号１６−０２８１−８６）を用いて、３７℃で７日間ポリクローナル刺激することによって得た。組織培養プレートの抗体コーティングを、トリス緩衝液（ｐＨ８．５）２００μｌ中で抗体を３７℃で１時間インキュベートすることによって行った。
【０１５７】
方法
リンパ球の経内皮遊走及び走化性アッセイ。ＩＦＮ−γで４８〜７２時間処理した一次微小血管ＥＣを播種し（３×１０４）、ＥＣ培地中に３μｍ孔径（Costar社、カタログ番号ＣＬＳ３４７２−４８ＥＡ）ポリカーボネート膜を含む２％ゼラチン被覆トランスウェルインサート（直径、６．５ｍｍ）上で１６時間培養し、単層を形成した。遊走培地（２％ウシ胎仔血清が補充されたＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁したＴ細胞（５×１０５）を、各インサートに添加し、単層を通して遊走させ、ウェルの内容物も新鮮な遊走培地で置き換えた。遊走したＴ細胞の数を、２４時間にわたる異なる時点においてウェル培地に存在する細胞を血球計で計数することによって判定した。走化性を測定するために、Ｔ細胞を、５又は３μｍ孔径（Costar社、カタログ番号ＣＬＳ３４２１−４８ＥＡ）ポリカーボネート膜を備えたＴｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）ベアフィルター組織培養ウェルインサート（直径、６．５ｍｍ）上に播種し、ケモカイン含有遊走培地をウェルの底部に入れた。遊走した細胞の数を血球計によって判定した。
【０１５８】
ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４及びＬＦＡ−１シグナル伝達の誘発。抗体刺激によるＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４シグナル伝達の誘発を、既に記載の通りに行った（Schneider, H., Valk, E., da Rocha Dias, S., Wei, B., and Rudd, C.E. (2005). CTLA-4 up-regulation of lymphocyte function-associated antigen 1 adhesion and clustering as an alternate basis for coreceptor function. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 12861-12866、Wells, A.D., Walsh, M.C., Bluestone, J.A., and Turka, L.A. (2001). Signaling through CD28 and CTLA-4 controls two distinct forms of T cell anergy. J Clin Invest 108, 895-903）。ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４共受容体を介した共刺激性シグナルを誘発して機能アッセイを行うために、細胞を、共受容体の機能ドメインを標的とする抗体とともにインキュベートした。ＣＤ２８シグナル伝達を誘発するために、Ｔ細胞を、各図に個別に記載するように異なる時点で、ハムスター抗マウスＣＤ２８（５μｇ／５×１０６細胞）（クローン：３７．５２、Bio-Rad社、カタログ番号ＭＣＡ１３６３）及びヤギ抗ハムスター免疫グロブリン（Ｉｇ）（２．５μｇ／５×１０６細胞）（Bio-Rad社、カタログ番号ＳＴＡＲ１０４）の混合物で処理した。同様に、ＣＴＬＡ−４シグナル伝達は、Ｔ細胞を、ハムスター抗マウスＣＴＬＡ−４（５μｇ／５×１０６細胞）（クローン：ＵＣ１０−４Ｆ１０−１１、Becton Dickinson社、カタログ番号５５３７１８）及びヤギ抗ハムスター免疫グロブリン（Ｉｇ）（２．５μｇ／５×１０６細胞）（Bio-Rad社、カタログ番号ＳＴＡＲ１０４）の混合物とインキュベートすることによって達成した。ハムスターＩｇＧアイソタイプ対照を使用し、抗体刺激（Bio-Rad社、カタログ番号ＭＣＡ２３５６）の任意の非特異的効果を観察した。ＬＦＡ−１シグナル伝達を誘発するために、細胞を、各図に個別に記載するように異なる時点で、マウス抗ヒトＩｇＧ（１μｇ／ｍｌ、ＭＫ１Ａ６、Bio-Rad社、カタログ番号ＭＣＡ６４７Ｇ）とプラスチック結合又はライゲーションされた、２μｇ／５×１０６細胞組換えマウスＩＣＡＭ−１−ヒトＩｇＧＦｃキメラ（２μｇ／ｍｌ、R&D Systems社、カタログ番号７９６−ＩＣ−０５０）又は対照としてヒトＩｇＧ−Ｆｃフラグメント（R&D Systems社、カタログ番号１１０−ＨＧ）とインキュベートした。Ｔ細胞を、ＰＢＳ中で洗浄してから、実験に使用した。
【０１５９】
生存可能なＴ細胞の蛍光標識化。蛍光プローブを用いたＴ細胞の標識化に関しては、Ｔ細胞をＰＢＳで洗浄し、計数し、１０７／ｍｌの最終濃度でＰＢＳ中に再懸濁した。必要であれば、死滅細胞を、Ficoll-Paqueを用いた密度勾配遠心分離を使用して取り出してから再懸濁した。細胞膜用の細胞リンカー色素であるＰＫＨ２６（Sigma-Aldrich社、カタログ番号ＰＫＨ２６ＧＬ−１ＫＴ）を用いたＴ細胞の標識化を、製造業者の使用説明書を使用して行った。ＰＫＨ２６を、５μΜの最終濃度で添加し、細胞を室温で５分間インキュベートした。反応を、等体積のＦＢＳを細胞懸濁液に添加することによって不活性化し、細胞を、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ中で１０分間洗浄した。スクシンイミジルエステル色素ＣＦＳＥ（Invitrogen社、カタログ番号Ｃ１１５７）又はＤＤＡＯ−ＳＥ（Invitrogen社、カタログ番号Ｃ３４５５３）を用いたＴ細胞の標識化は、最終濃度の３．３μｍＣＦＳＥ又は１．３μｍＤＤＡＯ−ＳＥを含むＰＢＳ中でＴ細胞を室温で１０〜１５分間インキュベートすることによって行った。反応を、等体積のＦＢＳを添加することによって終了させ、次いで細胞を、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳを用いて１０分間洗浄した。
【０１６０】
腹膜におけるＴ細胞動員。インビボでのＴ細胞動員を観察するために、既に記載のＴ細胞動員モデルを使用した（Mirenda, V., Jarmin, S.J., David, R., Dyson, J., Scott, D., Gu, I., Lechler, R.I., Okkenhaug, K., and Marelli-Berg, F.M. (2007). Physiological and aberrant regulation of memory T cell trafficking by the costimulatory molecule CD28. Blood 109, 2968-2977）。ＰＫＨ２６又はＣＦＳＥ又はＤＤＡＯ−ＳＥのいずれかで標識化されたＴ細胞（１０７）を、４８〜７２時間前に腹腔内注射（ｉ．ｐ．）を介してＩＦＮ−γ（６００Ｕ）が与えられたマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。腹腔洗浄を介して回収された標識されたＴ細胞を、フローサイトメトリーを使用して１６時間後に分析した。さらに、侵入が受動的様式で生じるＴｒｅｇの脾臓への局在化（Fu, H., Ward, E.J., and Marelli-Berg, F.M. (2016). Mechanisms of T cell organotropism. Cell Mol Life Sci 73, 3009-3033）を分析し、同じ数／割合の標識された細胞が全てのレシピエント（内部対照）に注射されること又は同時に注射されることを確実にした。
【０１６１】
ザイモサン誘発腹膜炎。０日目に、マウスに滅菌生理食塩溶液中のザイモサンの腹腔内注射を与え（１ｍｇ／マウス、カタログ番号４２５０  ＳＩＧＭＡ）、腹膜炎を誘発した。マウスを、注射してから７２時間後に屠殺し、組織試料を得て、フローサイトメトリー分析を行った。
【０１６２】
広視野デコンボリューション蛍光顕微鏡検査。組織試料を切除し、Optimal Cutting Temperatureコンパウンド（ＯＣＴ、Thermo Fisher Scientific社、カタログ番号１２６７８６４６）に埋め込み、急速凍結（snap-frozen）し、分析を行うまで貯蔵した。凍結した組織切片を、Ｐｏｌｙｓｉｎｅ被覆顕微鏡スライド（VWR International社、カタログ番号４７１００）上に載せ、空気乾燥し、次いで氷冷アセトン（Sigma社、カタログ番号５３４０６４）を用いて１０分間固定した。組織切片をＰＢＳ中で洗浄し、血清を用いて３時間ブロックし、記載の一次抗体を使用して４℃で２４時間染色した。過剰な抗体を、ＰＢＳを用いて洗い流し、組織を、表記の二次抗体及びＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）（Invitrogen/Life Technologies社、カタログ番号Ｄ１３０６）を用いて室温で３０分間染色した。スライドを洗浄し、ProLong Gold Antifade試薬（Invitrogen/Life Technologies社、カタログ番号Ｐ３６９３０）に載せ、AxioCam MRm Cooledモノクロデジタルカメラ及びApotome2イメージングユニットを備えたZeiss Z1蛍光顕微鏡（Carl Zeiss社、ＵＫ）を使用して可視化した。画像は、Plan Apochromat20×/0.8NA対物レンズ及びＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎソフトウェアバージョン４．８（Carl Zeiss社、ＵＫ）を使用して得た。染色に関しては、Ｔｒｅｇを、Ｒ１０培地中で培養し、３．７％ホルムアルデヒドを用いて固定した。固定した後、これらを抗ＧＣＫ、抗Ｎａ，Ｋ−ＡＴＰａｓｅ及び１ｎｇ／ｍｌテトラメチルローダミンＢイソチオシアネートコンジュゲートファロイジン（Sigma-Aldrich社、カタログ番号Ｐ１９５１）を用いて３７℃で３０分間それぞれ染色した。続いて二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５ヤギ抗マウスＩｇ（Biolegend社、カタログ番号４０５３２４）及びＦＩＴＣ  ロバ抗ウサギＩｇＧ（最小ｘ−反応性（minimal x-reactivity））抗体（Biolegend社、４０６４０３）を用いた。カバーガラスを非常によく洗浄し、空気乾燥し、ガラススライド上でＤＡＰＩ（Vector Laboratories社、カタログ番号ｚ０６０３）を用いて蛍光用Vectorshield封入剤に載せた。
【０１６３】
インビトロでの６−ＮＢＤＧ取り込みアッセイ。単離したばかりのＴ細胞又は培養したＴ細胞をＰＢＳ中で洗浄し、さまざまな記載のシグナル伝達抗体を含むグルコース不含Ｔ細胞培地（Gibco社、カタログ番号１１８７９−０２０）中に再懸濁し、５％ＣＯ２を用い、３７℃で４５分間インキュベートした。次いで、グルコース不含Ｔ細胞培地中の最終濃度の４００μＭ６−ＮＢＤＧ（Life Technologies社、カタログ番号Ｎ２３１０６）を細胞に添加し、細胞を追加で１０〜１５分間さらにインキュベートした。最後に、細胞を加温ＰＢＳで２回洗浄し、フローサイトメトリー緩衝液中に再懸濁し、氷上に置いた。即時分析を、フローサイトメトリーを使用して行い、Ｔ細胞による蛍光取り込みを観察した。
【０１６４】
インビトロでの６−ＮＢＤＧ取り込みアッセイ（ヒト研究）。単離したばかりのＣＤ３＋Ｔ細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、組換えＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１（２００ｎｇ／ｍＬ、Peprotech社、カタログ番号３００−２９Ｂ及び３００−３５）を含むＲ２（２％ウシ胎仔血清が補充されたＲＰＭＩ１６４０）中、５％ＣＯ２を用いて３７℃で１０６／ｍＬで培養した。最終濃度の４００μＭ６−ＮＢＤＧ（Life Technologies社、カタログ番号Ｎ２３１０６）を細胞に添加し、０、１５、３０及び６０分間インキュベートした。最後に、細胞を加温ＰＢＳで２回洗浄し、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＴｒｅｇを染色し、氷上に置いた。即時分析を、フローサイトメトリーを使用して行い、Ｔｒｅｇによる蛍光取り込みを観察した。
【０１６５】
インビボでの６−ＮＢＤＧ取り込みアッセイ。Ｔ細胞のグルコース取り込み活性をインビボで測定するために、ＰＫＨ２６標識化Ｔ細胞（３×１０６）をマウスにｉ．ｐ．注射した。その直後に２回目の６ＮＢＤＧ（滅菌水中４００μＭ）のｉ．ｐ．注射をマウスに与えた。１時間後にマウスを屠殺し、フローサイトメトリーによる分析のために腸間膜（流入領域）リンパ節及び脾臓を収集した。腹膜の広視野顕微鏡検査を行い、標識化されたＴ細胞の腹膜への流入を観察した。膜に浸潤するＰＫＨ２６＋Ｔ細胞を、画像分析ソフトウェアＩｍａｇｅＪを使用して、６ＮＢＤＧ取り込み（緑色蛍光）に関してさらに分析した。倍率１０倍の視野画像における標識化された細胞の数を手動で計数し、Ｔ細胞浸潤における差異を判定した。
【０１６６】
ＥＣＡＲ及びＯＣＲの測定。抗体刺激を受けたＴ細胞の細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）及び酸素消費速度（ＯＣＲ）のリアルタイム生体エネルギー分析を、ＸＦアナライザー（Seahorse biosciences社）を使用して行った。Ｔ細胞を、血清不含非緩衝ＸＦアッセイ培地（Seahorse biosciences社、カタログ番号１０２３６５−１００）中で１時間培養した。次いで、分析のために、細胞をｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４細胞プレートに播種した（６×１０５／ウェル）。Ｔ細胞による代謝経路の使用の変動（Perturbation）プロファイリングを、オリゴマイシン（１μＭ）、ＦＣＣＰ（１μＭ）、アンチマイシンＡ（１μＭ）、ロテノン（１μＭ）、Ｄ−グルコース（１０ｍＭ）、２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２ＤＧ、５０ｍＭ、全てSeahorse biosciences社製、カタログ番号１０３０２０−１００及び１０３０１５−１００）を添加することによって達成した。Seahorseシステムを用いた実験を次のアッセイ条件：２分混合、２分待機、及び４〜５分測定で行った。代謝パラメーターを算出した。実験を少なくとも３つのウェルで行った。
【０１６７】
表面染色。表面染色に関しては、細胞を再懸濁し（１０７／ｍｌ）、０．１％アジ化ナトリウム（Sigma-Aldrich社、カタログ番号Ｓ２００２−２５Ｇ）及び１％ＦＢＳを含むＰＢＳで作製されたフローサイトメトリー緩衝液１００μｌ中の蛍光色素コンジュゲート抗体を用いて４℃で３０分間染色した。ＣＣＲ７抗体染色を、３７℃で３０分間行った。染色に最適な抗体濃度を、製造業者の使用説明書に基づいて算出した。染色後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー緩衝液を用いて再懸濁し、ただちに分析した。あるいは、分析が遅くなる場合は、細胞を、固定緩衝液（１％ホルムアルデヒド（Sigma-Aldrich社、カタログ番号１５，８１２−７）を含むフローサイトメトリー緩衝液）中、４℃で３０分間固定し、洗浄し、フローサイトメトリー緩衝液中、４℃で貯蔵した。
【０１６８】
細胞内染色。細胞内Ｆｏｘｐ３染色に関しては、eBioscience社の抗マウス／ラットＦｏｘｐ３染色セットＡＰＣ（クローンＦＪＫ−１６Ｓ、Thermo Fisher Scientific社、カタログ番号１７−５７７３−８２）キットを使用した。細胞を再懸濁し（１０７／ｍｌ）、上述のように表面抗原を用いて染色し、次いで１部の固定／透過処理濃縮液（eBioscience社、カタログ番号００−５１２３）を３部の固定／透過処理希釈液（eBioscience社、カタログ番号００−５２２３）に混合して作製した固定／透過処理希釈標準溶液を使用して４℃で３０分間固定／透過処理を行った。次いで細胞を１×透過処理緩衝液（eBioscience社、カタログ番号００−８３３３）中で２回洗浄し、１×透過処理緩衝液中の蛍光色素コンジュゲートＦｏｘｐ３抗体を用いて４℃で３０分間染色した。最終的な洗浄を、１×透過処理緩衝液を用いて行い、次いで細胞を遠心分離し、フローサイトメトリー緩衝液２００μｌ中に再懸濁した。Ｔ細胞増殖研究に関しては、Ｔｒｅｇを未成熟Ｂａｌｂ／ｃＤＣを用いて刺激した。３時間後にＴｒｅｇを固定し、氷冷７０％エタノールを用いて透過処理してから、増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ、クローンＰＣ１０、BioLegend社、カタログ番号３０７９０８）を染色した。
【０１６９】
インビトロでのＡＫＴリン酸化（ヒト研究）。単離したばかりの通常型ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋（Ｔｒｅｇ）Ｔ細胞を、ＰＢＳ中で洗浄し、Ｒ２（２％ウシ胎仔血清が補充されたＲＰＭＩ１６４０）中で５×１０６／ｍＬで培養した。０．５×１０６ＣＤ４＋ＣＤ２５−（Ｔｃｏｎｖ）及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋（Ｔｒｅｇ）を、９６ウェルプレート中に播種し、ケモカインＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１（１μｇ／ｍＬ、Peprotech社、カタログ番号３００−２９Ｂ及び３００−３５）を用いて５％ＣＯ２、３７℃で１５分間刺激するか、又は刺激しなかった。細胞をただちに固定し、刺激を、２％ホルムアルデヒドを用いて暗所において室温で１０分間中止した。細胞を洗浄し、１００％氷冷メタノール中に再懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ２％ＦＢＳで２回洗浄し、ｐＡＫＴ−ｓ４７３（eBioscience社、カタログ番号１７−９７１５−４１）を、暗所において４℃で３０分間染色した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ中で再懸濁し、ただちにフローサイトメトリーによって分析した。
【０１７０】
ウエスタンブロット法及び共免疫沈降。全細胞溶解物を、Nonidet P-40溶解緩衝液［５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ８．０）、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Nonidet P-40、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭ  ＮａＦ、２０ｍＭグリセロール−２−ホスフェート、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０μｇ／ｍＬアプロチニン、１０μｇ／ｍＬロイペプチン、及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche社、カタログ番号１１８３６１４５００１）中に溶解した。標準的なブラッドフォードアッセイ（Bio-Rad社、カタログ番号５０００００１）によって判定された当量のタンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロース膜（GE Healthcare Life Sciences社、カタログ番号１０６００００２）に転写した。膜を５％ミルク／ＴＢＳ−Tween20（Sigma社、カタログ番号Ｐ１３７９）中、室温で２時間ブロックし、以下に挙げる一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。その後、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：５０００、Amersham Bioscience社、カタログ番号ＮＡ９３４）を添加した。次いで、膜を展開した。バンドの強度を、ＩｍａｇｅＪ（NIH社）を使用して定量化した。共免疫沈降実験に関しては、細胞抽出物をＲＩＰＡ緩衝液中で調製した。全タンパク質抽出物２５０μｇを、タンパク質Ｇ−アガロースビーズ（Sigma社、カタログ番号Ｐ３２９６）を用いて４℃で１時間、最初に予め清澄化し、抗ＧＣＫ  Ａｂ（Santa Cruz Biotechnology社、カタログ番号ＳＣ７９０８）５μｇと４℃で一晩、次いでタンパク質Ｇビーズと４℃でさらに１６時間インキュベートした。最終的なペレットを、１ｍＭ  ＰＭＳＦが補充されたｐＨ７．４の１０ｍＭトリスＨＣｌ中に再懸濁し、Ｂアクチン（Santa Cruz社、カタログ番号ＳＣ１６１）に対するウエスタンブロットによって分析した。
【０１７１】
定量リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。組織を採取し、プロセシングするまでRNA-later（Qiagen社、カタログ番号７６１０４）中、−８０℃で貯蔵した。ＲＮＡを、製造業者の使用説明書に従ってTrizol試薬（Life Technologies社、カタログ番号１５５９６）を使用して精製し、吸収測定値を使用して品質及び量に関して評価した。製造業者の使用説明書（Applied Biosystems社、カタログ番号４３７４９６６）に従って逆転写を行った。遺伝子発現分析を、CFX connect light cycler（Biorad社、カタログ番号１８５５２００）においてSYBR Green Supermix（Biorad社、カタログ番号１７２５１２０）を使用して行った。発現を、ΔΔＣｔ法（Livak, K.J., and Schmittgen, T.D. (2001). Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25, 402-408）を使用して算出し、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化した。オンラインツール（Ｐｒｉｍｅｒ  ３Ｐｌｕｓ）の助けを借り、少なくとも１つのエクソン接合結合部位を用いてプライマー対ごとにｑＰＣＲ用プライマーを設計した。増幅に関する熱サイクリングプロファイルは、９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間及び５４℃で１分間を４０サイクルであった。増幅は、９５℃で１０分間、続いて９５℃で１５秒間を４０サイクル及び６０℃で１分間であった。増幅特異性を確実にするために、融解曲線プログラムを次の通りに設定した：９５℃で１５秒間、６０℃で１分間、及び９５℃で１５秒間、ＰＣＲサイクルの直後。実験を３連で行った。
【０１７２】
遺伝子サイレンシングのためのレンチウイルスの調製。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０ｃｍ細胞培養皿で７０％コンフルエンスまで増殖させ、上記プラスミドを用い、リン酸カルシウム法を使用してトランスフェクトした。上澄みを、トランスフェクトしてから４８及び７２時間後に収集し、超遠心分離機で１００分の１に濃縮した。アリコートを−８０℃で貯蔵した。Ｔｒｅｇの伝達に関しては、細胞を６ウェルプレートに播種し、ＤＭＥＭ中で６０〜７０％コンフルエンスまで培養した。レンチウイルスを、５μｇ／ｍＬポリブレン（Sigma-Aldrich社、カタログ番号１０７６８９）の存在下で細胞に添加し、６ウェルプレートを２，３００ｒｐｍ、室温で９０分間遠心分離し、続いて５％ＣＯ２、３７℃で８時間インキュベートした。ウイルスを２４時間後に除去し、Ｔ細胞をＰＢＳで２回洗浄し、完全ＤＭＥＭ（Life Technologies社、カタログ番号１８５２７３０）中で２４時間インキュベートした。
【０１７３】
研究母集団。頸動脈内膜病変進行（ＰＬＩＣ，Progressione della Lesione Intimale Carotidea）研究（ＣＨＥＣＫ研究のサブ研究）は、Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  Ｂａｓｓｉｎｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｃｉｎｉｓｅｌｌｏ  Ｂａｌｓａｍｏ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）で追跡されたミラノ北部の一般的な母集団の（ｎ＝２．６０６）（Baragetti, A., Palmen, J., Garlaschelli, K., Grigore, L., Pellegatta, F., Tragni, E., Catapano, A.L., Humphries, S.E., Norata, G.D., and Talmud, P.J. (2015). Telomere shortening over 6 years is associated with increased subclinical carotid vascular damage and worse cardiovascular prognosis in the general population. Journal of internal medicine 277, 478-487、Lorenz, M.W., Polak, J.F., Kavousi, M., Mathiesen, E.B., Volzke, H., Tuomainen, T.P., Sander, D., Plichart, M., Catapano, A.L., Robertson, C.M., et al. (2012). Carotid intima-media thickness progression to predict cardiovascular events in the general population (the PROG-IMT collaborative project): a meta-analysis of individual participant data. Lancet 379, 2053-2062、Norata, G.D., Garlaschelli, K., Grigore, L., Tibolla, G., Raselli, S., Redaelli, L., Buccianti, G., and Catapano, A.L. (2009). Circulating soluble receptor for advanced glycation end products is inversely associated with body mass index and waist/hip ratio in the general population. Nutrition, metabolism, and cardiovascular diseases : NMCD 19, 129-134、Norata, G.D., Garlaschelli, K., Ongari, M., Raselli, S., Grigore, L., and Catapano, A.L. (2006). Effects of fractalkine receptor variants on common carotid artery intima-media thickness. Stroke 37, 1558-1561）の大規模調査である。研究は、ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａ  ｄｅｇｌｉ  Ｓｔｕｄｉ  ｄｉ  Ｍｉｌａｎｏ（"Cholesterol and Health: Education, Control and Knowledge - Studio CHECK ((SEFAP/Pr.0003) - reference number Fa-04-Feb-Ol)によって２００１年２月４日に承認された。インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言に従って対象から得た。
【０１７４】
ゲノムＤＮＡを、既に記載の通りにFlexigene DNAキット（Qiagen社、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）を使用して抽出した（Norata, G.D., Ongari, M., Garlaschelli, K., Tibolla, G., Grigore, L., Raselli, S., Vettoretti, S., Baragetti, I., Noto, D., Cefalu, A.B., et al. (2007). Effect of the -420C/G variant of the resistin gene promoter on metabolic syndrome, obesity, myocardial infarction and kidney dysfunction. Journal of internal medicine 262, 104-112）。ｐ．Ｌｅｕ４４６Ｐｒｏ  ＧＣＫＲミスセンス変異に関する遺伝子タイピングは、ＴａｑＭａｎ対立遺伝子識別試験を使用して全母集団において利用可能であった。実験分析は、１６名の対象のサブグループで行い、８名のＬｅｕ  ４４６−ＧＣＫＲ及び８名のＰｒｏ  ４４６−ＧＣＫＲが、年齢及び性別に関して一致した。病歴及び継続中の治療法に関する情報を得、ボディマス指数（ＢＭＩ、Ｋｇ／ｍ２）を算出し、一晩の絶食後、肘前静脈から血液試料を採取して、脂質プロファイル、グルコースレベル、肝臓酵素、白血球数及びサブフラクションの判定を既に記載の通りに行った（Ammirati, E., Cianflone, D., Vecchio, V., Banfi, M., Vermi, A.C., De Metrio, M., Grigore, L., Pellegatta, F., Pirillo, A., Garlaschelli, K., et al. (2012). Effector Memory T cells Are Associated With Atherosclerosis in Humans and Animal Models. Journal of the American Heart Association 1, 27-41、Baragetti, A., Palmen, J., Garlaschelli, K., Grigore, L., Pellegatta, F., Tragni, E., Catapano, A.L., Humphries, S.E., Norata, G.D., and Talmud, P.J. (2015). Telomere shortening over 6 years is associated with increased subclinical carotid vascular damage and worse cardiovascular prognosis in the general population. Journal of internal medicine 277, 478-487、Norata, G.D., Garlaschelli, K., Ongari, M., Raselli, S., Grigore, L., and Catapano, A.L. (2006). Effects of fractalkine receptor variants on common carotid artery intima-media thickness. Stroke 37, 1558-1561）。
【０１７５】
血液表面及び細胞内染色（ヒト研究）。表面染色に関しては、全血１００μＬを、２％ＦＢＳ及び２μＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで作製されたＭＡＣＳ緩衝液５０μＬ中の蛍光色素コンジュゲート抗体を用いて暗所において、ＲＴ（室温）で３０分間染色した。染色に最適な抗体濃度を、製造業者の使用説明書に基づいて算出した。染色後、赤血球を、１ステップ固定／溶解溶液（eBioscience社、カタログ番号００−５３３３−５４）２ｍＬを用いて室温で２０分間溶解し、洗浄し、ＭＡＣＳ緩衝液を用いて再懸濁し、ただちに分析した。
【０１７６】
あるいは、細胞内染色に関しては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し（下記の通りに）、染色のために使用した（１ステップ固定／溶解溶液はいくつかの細胞内染色に適合しない）。細胞を再懸濁し（１０７／ｍＬ）、表面抗原を含むＭＡＣＳ緩衝液５０μＬ中で染色した。細胞内Ｆｏｘｐ３及びＫｉ６７染色に関しては、eBioscience社の抗マウス／ラットＦｏｘｐ３染色キットを使用した（カタログ番号７７−５７７５−４０）。細胞は、１部の固定／透過処理濃縮物を３部の固定／透過処理希釈液と混合して作製した固定／透過処理希釈標準溶液を使用して終夜４℃で固定／透過処理を行った。次いで細胞を１×透過処理緩衝液で２回洗浄し、１×透過処理緩衝液中の蛍光色素コンジュゲート−Ｆｏｘｐ３及び−Ｋｉ６７抗体を用いて４℃で３０分間染色した。最終的な洗浄を、１×透過処理緩衝液を用いて行い、次いで細胞を遠心分離し、ＭＡＣＳ緩衝液２００μＬ中に再懸濁した。
【０１７７】
ＰＢＭＣ単離及びＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ精製（ヒト研究）。各対象に関しては、血液（ＥＤＴＡが補充された）３０ｍＬを、１５ｍＬの２つのファルコン（falcon）に分割し、１０００×ｇで１２分間回転させた。血漿を廃棄し、白血球及び血小板が豊富な血漿と赤血球との間の界面（バフィーコート）を、慎重に収集し、冷却ＰＢＳで希釈し、Ficoll-Plaque（商標）PREMIUM（GE-Healthcare社、カタログ番号１７−５４４２−０３）３ｍＬで層を形成した。２５０×ｇで３５分の遠心分離後、ＰＢＭＣ層を慎重に収集し、冷却ＰＢＳ１０ｍＬを用いて３回１８０×ｇで１２分間行い、血小板を除去した。ＰＢＭＣを計数し、製造業者の使用説明書に従ってＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞単離キット、ヒト（Miltenyi Biotec.社、カタログ番号１３０−０９−３０１）を用いてＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ精製のために使用した。精製したＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ又はＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔｃｏｎｖを、血球計を用いて計数し、遊走及び抑制アッセイのために使用した。
【０１７８】
Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ遊走アッセイ（ヒト研究）。各対象のＴｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ（１×１０５）３００μＬを、遊走培地（２％ウシ胎仔血清が補充されたＲＰＭＩ１６４０）中に再懸濁し、５μｍ孔径（Costar社、カタログ番号ＣＬＳ３４２１−４８ＥＡ）ポリカーボネート膜を有するＴｒａｎｓｗｅｌｌ（商標）インサート（直径、６．５ｍｍ）上で培養した。細胞を、ウェルの底部に置かれた遊走培地又はケモカインＣＣＬ１９及びＣＣＬ２１（２００ｎｇ／ｍＬ、Peprotech社、カタログ番号３００−２９Ｂ及び３００−３５）に対して１、２、４及び１２時間遊走させた。遊走した細胞の数を、血球計によって判定し、データを、培養した細胞と比較した遊走の百分率として示した。
【０１７９】
Ｔｒｅｇ抑制アッセイ（ヒト研究）。ＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔｃｏｎｖを、ＭＡＣＳ緩衝液（１０７／ｍＬ）中に再懸濁し、スクシンイミジルエステル色素ＣＦＳＥ（２μＭ、Invitrogen社、カタログ番号Ｃ１１５７）を用いて暗所において室温で１０分間標識した。細胞を、ＭＡＣＳ緩衝液で３回洗浄し、３６０×ｇで５分間遠心分離した。９６ウェルＵ底プレートを、抗ヒトＣＤ３精製抗体（５μｇ／ｍＬ、eBioscience社、カタログ番号１４−００３９−８２）を用いて３７℃で１時間被覆した。Ｔｃｏｎｖを、完全培地（１０％ＦＢＳ、１ｍＭ  ピルビン酸Ｎａ、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、５０μＭβ−ＭｅＯＨ及びｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ／グルタミンが補充されたＲＰＭＩ  １６４０）及びＩＬ−２（Peprotech社、カタログ番号２００−０２）５０Ｕ／ｍＬ、抗ヒトＣＤ２８精製抗体（eBioscience社、カタログ番号１４−０２８９−８２）２μｇ／ｍＬ中に再懸濁し（１０６／ｍＬ）、播種した（１×１０５／１００μＬ）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを洗浄し、完全培地中に再懸濁し、完全培地を用いてＴｒｅｇの連続希釈を行うことによって次の割合（Ｔｃｏｎｖ：Ｔｒｅｇ）：１：１、１：０．５、１：０．２５及び１：０に従ってＴｃｏｎｖに添加した。９６ウェルプレートを、１２０×ｇで１分回転させ、細胞を底部に収集し、４日間増殖させた。次いで細胞を収集し、各対象に関しては、Ｔｒｅｇの存在下で増殖した細胞の百分率を、Ｔｃｏｎｖ：Ｔｒｅｇ１：０（１００％増殖）の状態と比較した。
【０１８０】
定量化及び統計分析。ｑＰＣＲデータは、ハウスキーピング遺伝子から目的の遺伝子のＣＴ値を得、続いて野生型対照試料に対して正規化することによってデルタデルタＣＴ法を使用して分析した。結果をプリズムに転送してから、グラフィック表示及び統計分析を行った。結果は、１群当たりの平均±ＳＤとして得られる。データは、両側不対スチューデントｔ検定（two-tailed unpaired Student's t test）及びマンホイットニー試験を使用して分析した。０．０５未満のｐ値を有意と考えた。seahorseからの実験データセットを、ボンフェローニ補正を用いた一元ＡＮＯＶＡ、又はダンの事後検定を用いたクラスカルウォリスを使用して分析し、多重比較を考慮した。表記の「ｎ」は生物学的複製の数を表す。ヒトデータは、ｒｓ１２６０３２６ＧＣＫＲ多型のＴＴ遺伝子型とＣＣ遺伝子型との間のＡＮＣＯＶＡ（共分散分析法）モデルによって分析した（年齢及び性別によって調整する）。変数は、正規分布の場合は平均（標準偏差、Ｓ．Ｄ．）として又は非正規分布の場合は中央値（四分位範囲、ＩＱＲ）として示される（シャピロウィルク試験）。正規分布変数を比較するためのＴ検定及び非正規分布変数のためのマンホイットニーのＵ検定を行った（各変数に関するＰ値を報告する、ｐ０．０５未満は有意である）。外れ値を検出するためのグラブの検定を各変数に関して行った。ヒトの結果に関しては、データを、群当たりの平均±ＳＥＭとして報告する。データは、両側不対スチューデントのｔ検定及びマンホイットニー検定を使用して分析した。０．０５未満のｐ値を有意と考えた。
【実施例１】
【０１８１】
解糖経路の関与は、Ｔｒｅｇの遊走に必須である
Ｔｒｅｇが通常型Ｔ細胞（Ｔｃｏｎｖ）のように遊走するために解糖を利用する可能性を、グルコースアナログ２−デオキシグルコース（２−ＤＧ）を用いてこの経路を阻害することによって検討した。２−ＤＧに曝露されたＴｒｅｇは、インビトロ（図１Ａ、Ｃ〜Ｄ及び図２Ａ〜Ｂ）とインビボ（図３Ａ〜Ｂ）の両方で非効率的に遊走した。薬物に曝露した後の広範な洗浄に加えて、被覆されていないトランスウェルを介したＴｒｅｇ走化性の阻害によって、これらの条件における内皮に対する薬物の間接的な効果を除外する。対照的に、ＡＭＰキナーゼを介して解糖を刺激するメトホルミンを使用して解糖を活性化すると、Ｔｒｅｇの運動性（図１Ｂ、Ｃ〜Ｄ及び図２Ａ〜Ｂ）及び輸送（図３Ｃ〜Ｄ）が増加した。どの薬物も、使用した用量において、遊走関連受容体のＴｒｅｇ発現又は生存率に影響を与えなかった（図４Ａ〜Ｃ）。これらの化合物のそれぞれの効果は、インビトロで処理されたＴ細胞がレシピエントマウスに一度注射されると保持されることを確認するために、Ｔｒｅｇ細胞を、さまざまな薬物に４時間曝露し、非常によく洗浄し、培養培地単独中でさらに１６時間インキュベートした。薬物処理されたＴｒｅｇ運動性に対する効果は、化合物無しでの長期にわたるインキュベート後でも依然として明白であった（図５Ａ〜Ｄ、図６Ａ〜Ｂ）。エトモキシルはアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）リン酸化阻害剤であり、Ｔｒｅｇの遊走が脂肪酸酸化（ＦＡＯ）を必要としないことを示すのに役立つ。
【０１８２】
遊走促進刺激による解糖経路の誘発を確認するために、その後、ＴｒｅｇにおけるＴ細胞遊走の鍵となるメディエーターである接着分子インテグリンＬＦＡ−１の好気的解糖に対する関与の効果を試験した。ＬＦＡ−１のリガンドである、固定化又は抗体連結組換えマウスＩＣＡＭ−１（ｒＩＣＡＭ−１）をこの目的のために使用した。
【０１８３】
最初に、ヘキソキナーゼによってリン酸化されず、その蛍光形態で細胞質中に蓄積するグルコースアナログ６−［Ｎ−（７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシグルコース（６−ＮＢＤＧ）を使用して、ＬＦＡ−１誘発性グルコース取り込みを評価した。Ｔｒｅｇを、プラスチック結合ｒＩＣＡＭ−１又はヒトＩｇＧＦｃフラグメント（対照）を用いて刺激し、３０分後、６−ＮＢＤＧ取り込みをフローサイトメトリーで測定した。図７Ａ〜Ｂで示すように、ＬＦＡ−１を刺激すると、６−ＮＢＤＧ取り込みが顕著に増加した。
【０１８４】
次に、乳酸産生の代用としてのプロトン産生を定量化し、したがって全体的な解糖フラックス(glycolytic flux)を反映する、細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）に対するＬＦＡ−１の関与又はケモカインＣＣＬ２２（ＣＣＲ４リガンド）への曝露の影響を測定した。ＥＣＡＲは、ＬＦＡ−１又はＣＣＲ４（図７Ｃ〜Ｄ）刺激の後にグルコース供給が顕著に強化された場合に増加した。ミトコンドリア呼吸の測定値である酸素消費速度（ＯＣＲ）は影響を受けなかった（図８Ａ〜Ｂ）。
【実施例２】
【０１８５】
ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４は、解糖経路のモジュレートを介してＴｒｅｇ遊走を調節する
最初に、ＣＤ２８の抗体活性化は、関連する受容体の発現に影響を与えることなく、Ｔｒｅｇ  ＴＥＭのｅｘ  ｖｉｖｏでの増幅（図９Ａ）及びインビトロでの走化性（図９Ｂ〜Ｃ）及びインビボでの遊走（図１０）を促進することを確認した（データは示さない）。また、ＣＴＬＡ−４トリガー単独ではＴｒｅｇの遊走に影響を与えないが、ＣＤ２８とコライゲーションすると、ＣＤ２８誘発性遊走が予防されることを観察した（図９Ａ〜Ｂ）。
【０１８６】
次に、Ｔｒｅｇにおける解糖経路に対するＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４シグナルの影響を測定した。ＣＤ２８トリガーは、アイソタイプ対照及び二次抗体を用いた治療と比較して、６−ＮＢＤＧ取り込み（図１１Ａ〜Ｂ）及び解糖フラックス（図１２Ａ）を顕著に増加させた。しかし対照的に、ＣＴＬＡ−４刺激は、単独では、グルコース取り込みにもＥＣＡＲにも影響を与えなかったが、コライゲーションされた場合、ＣＴＬＡ−４シグナルは、ＣＤ２８誘発性グルコース取り込み及びＥＣＡＲ増加を阻害した。酸素消費速度（ＯＣＲ）は、どの共刺激受容体のトリガーによる影響も受けなかった（データは示さない）。
【０１８７】
ＣＴＬＡ−４欠損Ｔｒｅｇの代謝活性及び遊走を分析することによって、共刺激シグナルと運動性の代謝調節との間の関連性をさらに検討した。これらの実験において、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４によって共有されるリガンドである組換え（ｒ）ＣＤ８０を刺激因子として使用した。ＷＴ  Ｔｒｅｇと比較して、ＣＴＬＡ−４欠損Ｔｒｅｇは、酸性化ベースラインが高いことを考慮したとしても、グルコースに応答したＥＣＡＲの長期にわたる増加を自然に示した（図１２Ｂ）。予想通り、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４が同時に関与するために、組換えＣＤ８０で活性化されたＷＴ  Ｔｒｅｇ細胞のＥＣＡＲは変化しないままであるが（図１３Ａ）、ＣＴＬＡ−４−欠損Ｔｒｅｇは、グルコース添加に対するその解糖応答をさらに増加させた（図１３Ｂ）。ＣＴＬＡ−４  ＫＯ  Ｔｒｅｇ  ＯＣＲは、そのＷＴ同等物のものよりも自然に高いにもかかわらず、ＣＤ２８又はＣＴＬＡ−４シグナルによる影響を受けなかった（データは示さない）。
【０１８８】
並行して、ＩＦＮ−γ活性同系ＥＣを介したｒＣＤ８０刺激ＣＴＬＡ−４  ＫＯ  ＴｒｅｇによるＴＥＭを試験した。図１４Ａで示すように、組換えＣＤ８０で刺激されたＣＴＬＡ−４ＫＯ  Ｔｒｅｇは、ＥＣを介して強化された遊走を示したが、ＣＴＬＡ−４発現Ｔｒｅｇは、そのような刺激に対して応答せず、ＣＴＬＡ−４シグナルは、ＣＤ２８誘発性解糖及び遊走を阻害するという結論を支持した。
【０１８９】
ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４によるＴｒｅｇの遊走の制御は、解糖のモジュレートを介して生じるかどうかを調べるために、グルコース枯渇培地におけるＴＥＭ中のＣＤ２８及び／又はＣＴＬＡ−４刺激の効果を分析した。図１４Ｂで示すように、グルコースの枯渇は、ＣＤ２８シグナルにより誘発される運動性の増加を予防した。ベースラインの低レベルの遊走は、グルコースが十分な状態と欠損状態の両方において同じままであるため、結果はグルコース欠乏と関連する細胞ディストレスによる影響を受けなかった。
【０１９０】
インビボで、ＣＤ２８−解糖−遊走系を、ＣＤ２８刺激遊走Ｔｒｅｇによる６−ＮＢＤＧ取り込みをモニタリングすることによって分析した。この目的のために、腹膜腔に注射されたＴｒｅｇが腹膜に浸潤する能力を定量化する組織浸潤モデルを使用した（Mirenda, V., Jarmin, S.J., David, R., Dyson, J., Scott, D., Gu, I., Lechler, R.I., Okkenhaug, K., and Marelli-Berg, F.M. (2007). Physiological and aberrant regulation of memory T cell trafficking by the costimulatory molecule CD28. Blood 109, 2968-2977）。６−ＮＢＤＧ蛍光が時間とともに急速に損失し、静脈内で長期にわたり移動したＴ細胞を追跡することが技術的に不可能であるために、このモデルを選択した。Ｔｒｅｇは、４８時間前にＩＦＮ−γで処理された同系マウスにおいてｉ．ｐ．注射する前に、ＰＫＨ２６を用いて標識し（赤色蛍光、図１５Ａ、２列目）、次いでＣＴＬＡ−４トリガーとともに若しくは無しでＣＤ２８ライゲーションを行うか、又はアイソタイプ一致及び二次抗体を対照として与えられた。６−ＮＢＤＧ（緑色蛍光、図１５Ａ、３列目）を、細胞の直後にｉ．ｐ．注射し、したがって標識されたＴｒｅｇによる組織浸潤及びグルコース取り込みをインビボで並行して評価することができる。図１５Ａ〜Ｃで示すように、ＣＤ２８を活性化すると、腹膜に浸潤するＴｒｅｇの数が実質的に増加し、６−ＮＢＤＧ取り込みを示し（黄色蛍光、マージ、図１５Ａ、４列目）、Ｔｒｅｇの遊走は、インビボでのグルコース取り込みと直接相関することを示す。これら両方の効果は、ＣＴＬＡ−４コライゲーションによって予防された。
【実施例３】
【０１９１】
遊走促進刺激は代謝リプログラミングを誘発する
本発明者らは、Ｔｃｏｎｖ細胞では、遊走中の解糖の活性化は、酵素ヘキソキナーゼ（ＨＫ）Ｉの転写及び転写後調節を介して生じることを以前に示している（Haas, R., Smith, J., Rocher-Ros, V., Nadkarni, S., Montero-Melendez, T., D'Acquisto, F., Bland, E.J., Bombardieri, M., Pitzalis, C., Perretti, M., et al. (2015). Lactate Regulates Metabolic and Pro-inflammatory Circuits in Control of T Cell Migration and Effector Functions. PLoS biology 13, e1002202）。したがって、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４で刺激してから４時間後の、増幅したＴｒｅｇによるいくつかの解糖酵素の発現を分析した。ＣＤ２８刺激は、ＴｒｅｇによるＨＫＩ、エノラーゼ及びアルドラーゼ発現において中程度の増加をもたらした（図１６Ａ〜Ｂ）。予想外に、肝細胞及び膵臓ベータ細胞機能に対して鍵となる律速酵素であり、Ｔ細胞によるその発現はまだ報告されていないＨＫアイソエンザイムグルコキナーゼ（ＨＫＩＶ又はＧＣＫ）の発現において最も顕著な増加が観察された。付随するＣＴＬＡ−４トリガーは、ＣＤ２８誘発性酵素発現を阻害した。
【０１９２】
分析を、ＨＫＩＩにまでも広げ、この酵素の実質的に強化された発現は、ＧＣＫのそれと同様に、ＣＤ２８シグナルによる刺激後だけではなく、組換えＩＣＡＭ−１によるＬＦＡ−１トリガーからも早ければ５分で生じることを観察し（図１７Ａ）、これは、両刺激が、転写後の機序によっても酵素発現を強化することを示唆した。
【０１９３】
次いで、ＬＦＡ−１又はＣＤ２８刺激によって実際に増加したＧＣＫ、ＨＫＩ及びＨＫＩＩ遺伝子の転写を測定した（図１７Ｂ、ＨＫＩ及びＨＫＩＩに関するデータは示していない）。予想通り、ＣＤ２８による酵素誘発は、ＣＴＬＡ−４トリガーによって予防された。この一連の実験では、遊離細胞質ＧＣＫをブロックする（Farrelly, D., Brown, K.S., Tieman, A., Ren, J., Lira, S.A., Hagan, D., Gregg, R., Mookhtiar, K.A., and Hariharan, N. (1999). Mice mutant for glucokinase regulatory protein exhibit decreased liver glucokinase: a sequestration mechanism in metabolic regulation. Proc Natl Acad Sci U S A 96, 14511-14516）転写後レギュレーターであるＧＣＫ調節タンパク質（ＧＣＫＲ）遺伝子の転写（図１７Ｃ）。ＣＤ２８及びＬＦＡ−１活性化後の、ＧＣＫ及びＧＣＫＲの発現及び同時局在化の共焦点分析によって、ＣＤ２８とＬＦＡ１の両方の刺激が、ＧＣＫアベイラビリティーの実質的な増加に付随してＧＣＫＲ発現を減少させることが確認された（図１８Ａ〜Ｂ）。
【０１９４】
Ｔｒｅｇ運動性に対するＨＫＩＩ及びＧＣＫ活性の相対的な寄与に取り組むために、Ｔｒｅｇを、ＣＤ３／ＣＤ２８刺激Ｔｃｏｎｖ細胞における解糖フラックス及び呼吸を阻害するＧＣＫ活性化因子ＡＺＤ１６５６（Bonn, P., Brink, D.M., Fagerhag, J., Jurva, U., Robb, G.R., Schnecke, V., Svensson Henriksson, A., Waring, M.J., and Westerlund, C. (2012). The discovery of a novel series of glucokinase activators based on a pyrazolopyrimidine scaffold. Bioorganic & medicinal chemistry letters 22, 7302-7305）又はＨＫＩＩ選択的阻害剤クロトリマゾール（ＣＬＴ）（van der Windt, G.J., O'Sullivan, D., Everts, B., Huang, S.C., Buck, M.D., Curtis, J.D., Chang, C.H., Smith, A.M., Ai, T., Faubert, B., et al. (2013). CD8 memory T cells have a bioenergetic advantage that underlies their rapid recall ability. Proc Natl Acad Sci U S A 110, 14336-14341）のいずれかで処理した（図１９Ａ〜Ｂ）。ＧＣＫ活性化は、炎症組織へのＴｒｅｇの遊走を顕著に強化したが（図２０Ａ）、Ｔｒｅｇ分裂には影響を与えなかった（図２０Ｂ）。逆もまた同様、ＣＬＴは、同種異系ＤＣに応答したＴｒｅｇによるＰＣＮＡ上方調節の阻害に効果的であったが（図２０Ｃ）、解糖のｒＩＣＡＭ−１介在性誘発（図２１Ａ）、又はインビボでの炎症腹膜へのＴｒｅｇの遊走（図２１Ｂ）には影響を与えなかった。
【実施例４】
【０１９５】
皮膚移植片拒絶反応に対するＧＣＫ活性化の効果
その運動性を持続するためのＴｒｅｇによるＧＣＫ使用の選択性を確立するために、Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントに移植されたＢ６Ｋｄ由来皮膚移植片の生着に対するＧＣＫの薬理学的活性化の効果を比較した。一部のレシピエントを、選択的ＧＣＫ活性化因子ＡＺＤ１６５６（１０ｍｇ／ｋｇ１日２回）を用いて移植後２週間毎日治療した。このスケジュールは、異種応答（alloresponse）の初期ステージ中の内因性Ｔｒｅｇの遊走を促進するために設計された。対照群は、媒体を単独で含む生理食塩溶液が与えられた。図２２で示すように、ＡＺＤ１６５６単独による短期治療は、皮膚移植片拒絶反応を顕著に遅延させるのに十分であった。
【実施例５】
【０１９６】
機能喪失ＧＣＫＲ遺伝子のホモ接合性キャリアからのヒトＴｒｅｇは、運動性の強化を示す
ヒト系における上記同定された経路の生理学的関連性を試験するために、ＧＣＫＲ遺伝子（Ｃ〜Ｔ、Ｐ４４６Ｌ）における機能喪失多型のホモ接合性キャリアからの循環Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５ｈｉｇｈＣＤ１２７ｌｏｗとして定義される）の数及び機能的挙動を分析した。Ｐ４４６Ｌ−ＧＣＫＲ遺伝子は、ＧＣＫに対する阻害活性が低く、空腹時血漿グルコースの低下及び肝臓におけるＧＣＫ活性の増加を介したトリグリセリド合成の強化と関連していた（Beer, N.L., Tribble, N.D., McCulloch, L.J., Roos, C., Johnson, P.R., Orho-Melander, M., and Gloyn, A.L. (2009). The P446L variant in GCKR associated with fasting plasma glucose and triglyceride levels exerts its effect through increased glucokinase activity in liver. Hum Mol Genet 18, 4081-4088）。
【０１９７】
循環するＴｒｅｇの数は、ＷＴ対立遺伝子のキャリアと比較して、ＧＣＫＲ遺伝子の希少対立遺伝子Ｐ４４６Ｌのキャリアにおいて顕著に減少したが（図２３Ａ〜Ｂ）、他のＣＤ４＋Ｔ細胞母集団は影響を受けなかった（データは示さない）。重要なことには、Ｐ４４６Ｌ−ＧＣＫＲ  Ｔｒｅｇは、ＷＴ−ＧＣＫＲ  Ｔｒｅｇと比較してケモカイン誘発性運動の顕著な増加を示したが、Ｔｃｏｎｖ細胞遊走は影響を受けなかった（図２４Ａ〜Ｂ）。遊走アッセイにおいて使用されるケモカインに対する受容体であるＣＣＲ７の発現を含むＰ４４６Ｌ−ＧＣＫＲ  Ｔｒｅｇの抑制能力及び表現型は、ＷＴ−ＧＣＫＲ  Ｔｒｅｇのもの（データは示さない）と顕著に異なることはなかった（図２５Ａ〜Ｂ）。さらに、グルコース取り込み及びセリン４７３におけるＲｉｃｔｏｒ依存的ＡＫＴリン酸化を含む、ＧＣＫ活性化の上流にあるケモカイン誘発分子イベントは、Ｐ４４６Ｌ−及びＷＴ−ＧＣＫＲ  Ｔｒｅｇ及びＴｃｏｎｖ（データは示さない）において同等であり、これは、Ｐ４４６Ｌ  Ｔｒｅｇ運動性の強化におけるＧＣＫアベイラビリティーの増加の鍵となる役割をさらに支持する。
【０１９８】
考察
本発明者らは、胸腺Ｔｒｅｇの遊走を維持する代謝経路、及びこれらの経路がどのように遊走促進シグナルに関与するかを研究した。
【０１９９】
データによって、遊走刺激が、Ｔｒｅｇの好気的解糖へ向かう代謝リプログラミングを誘発することが示される。Ｔｒｅｇ増殖中の解糖の調節と遊走との間の二分性は、これらの細胞応答に関与する酵素的過程に反映される。通常型Ｔ細胞の抗原活性化に続く代謝リプログラミングは、ＨＫＩからＨＫＩＩへのＨＫアイソザイム発現における転写スイッチに依存し、グルコースに対するより高い親和性を有するヘキソキナーゼ活性の実質的な増加を含む（Bosca, L., Mojena, M., Diaz-Guerra, J.M., and Marquez, C. (1988). Phorbol 12,13-dibutyrate and mitogens increase fructose 2,6-bisphosphate in lymphocytes. Comparison of lymphocyte and rat-liver 6-phosphofructo-2-kinase. Eur J Biochem 175, 317-323、Marjanovic, S., Eriksson, I., and Nelson, B.D. (1990). Expression of a new set of glycolytic isozymes in activated human peripheral lymphocytes. Biochim Biophys Acta 1087, 1-6、Wang, R., Dillon, C.P., Shi, L.Z., Milasta, S., Carter, R., Finkelstein, D., McCormick, L.L., Fitzgerald, P., Chi, H., Munger, J., et al. (2011). The transcription factor Myc controls metabolic reprogramming upon T lymphocyte activation. Immunity 35, 871-882）。さらに、おそらくｍＴＯＲＣ２活性化の結果として、遊走促進シグナルは、ＧＣＫ発現を実質的に強化する。ＧＣＫは、肝臓におけるｍＴＯＲＣ２介在性シグナル伝達の下流の主要な標的のうちの１つであることが示されている（Hagiwara, A., Cornu, M., Cybulski, N., Polak, P., Betz, C., Trapani, F., Terracciano, L., Heim, M.H., Ruegg, M.A., and Hall, M.N. (2012). Hepatic mTORC2 activates glycolysis and lipogenesis through Akt, glucokinase, and SREBP1c. Cell Metab 15, 725-738）。
【０２００】
本発明者らは、この経路がヒト免疫系において操作可能であるというエビデンスを提供する。循環Ｔｒｅｇの数は、ＧＣＫＲ機能喪失バリアントのキャリアにおいて顕著に減少し、変異体Ｔｒｅｇは顕著に強化された運動性を示し、組織における局在化の増加を示唆する。重要なことには、Ｔｃｏｎｖの遊走は、ＧＣＫＲ阻害の損失及びＧＣＫ活性の増加による影響を受けない。
【０２０１】
Ｔｒｅｇの遊走によるＧＣＫの優先的な利用は興味深い特徴である。他のヘキソキナーゼとは異なり、ＧＣＫは、グルコースに対してさらに低い親和性を有し、これは生理学的血漿グルコースの範囲（Ｓ０．５≒７ｍＭ）内にあり、解糖代謝産物グルコース６−ホスフェートによる阻害に対する感受性が低い（Lenzen, S. (2014). A fresh view of glycolysis and glucokinase regulation: history and current status. The Journal of biological chemistry 289, 12189-12194）。ＴｒｅｇによるＧＣＫの使用は、ＣＤ２８刺激に応答したＴｒｅｇ細胞の分極速度がＴｃｏｎｖ細胞と比較して遅いという以前の報告を説明することができる（Muller, N., van den Brandt, J., Odoardi, F., Tischner, D., Herath, J., Flugel, A., and Reichardt, H.M. (2008). A CD28 superagonistic antibody elicits 2 functionally distinct waves of T cell activation in rats. J Clin Invest 118, 1405-1416）。ＣＤ２８刺激Ｔｒｅｇでは、遊走の早い波と遅い波とが起きることが示された。これは、本発明者らが観察したＧＣＫ発現における転写後及び転写の増加を反映する可能性がある。
【０２０２】
免疫応答中、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４が代謝スイッチとして機能する能力は、少なくとも部分的にＴ細胞分裂及び機能に対するそれらの反対の効果を説明する。例えば、活性化後の一過性のＣＴＬＡ−４発現は、解糖を停止させる働きをし、したがって寿命が長いメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のＦＡＯへのリプログラミングを支持し（O'Sullivan, D., van der Windt, G.J., Huang, S.C., Curtis, J.D., Chang, C.H., Buck, M.D., Qiu, J., Smith, A.M., Lam, W.Y., DiPlato, L.M., et al. (2014). Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development. Immunity 41, 75-88）、したがってＴ細胞応答の収縮期を促進し、アネルギーの誘発に有利に働くことによってホメオスタシス維持する（Zheng, Y., Delgoffe, G.M., Meyer, C.F., Chan, W., and Powell, J.D. (2009). Anergic T cells are metabolically anergic. J Immunol 183, 6095-6101）。
【０２０３】
エフェクター免疫の調節におけるＣＴＬＡ−４の機能的効果は、十分に確立されたが、ＣＴＬＡ−４のＴｒｅｇ機能への寄与は完全に理解されていない。ＣＴＬＡ−４欠損マウスは、正常な数のＴｒｅｇを示すが、インビボではその抑制機能に欠損があり（Wing, K., Onishi, Y., Prieto-Martin, P., Yamaguchi, T., Miyara, M., Fehervari, Z., Nomura, T., and Sakaguchi, S. (2008). CTLA-4 control over Foxp3+ regulatory T cell function. Science 322, 271-275）、しかしインビトロではこの欠損は無い（Tang, Q., Boden, E.K., Henriksen, K.J., Bour-Jordan, H., Bi, M., and Bluestone, J.A. (2004). Distinct roles of CTLA-4 and TGF-beta in CD4+CD25+ regulatory T cell function. European journal of immunology 34, 2996-3005）ようである。本明細書における観察は、ＣＤ２８誘発性遊走シグナルに拮抗することによって、ＣＴＬＡ−４が、それらの抑制活性にではなく、むしろインビボでのＴｒｅｇ局在化の組織保持に（例えば）必須であることを示す。
【０２０４】
自然免疫の活性化に対する応答におけるＣＤ２８Ｙ１７０ＦＴｒｅｇ遊走障害も、ＣＤ２８シグナルが、ＣＤ２８の関与が活性化ＤＣとの相互作用中に生じる可能性が高いリンパ系組織から、血流へのＴｒｅｇ動員及び再分布を指示することを示す。
【０２０５】
要約すると、この研究では、遊走促進刺激によってＴｒｅｇにおいて誘発される運動性及び遊走の代謝調節に関する新規な経路を記載する。増殖Ｔｒｅｇ細胞の代謝リプログラミングに関与するシグナル伝達メディエーターは、運動性を調節するものとは異なるため、これらの酵素を選択的に標的化すると、治療背景において異なるＴｒｅｇ機能のモジュレートが可能になる。
【０２０６】
（参考文献）
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
2020533346.tif 000030
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020533346.tif 000033
【図１６】
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【図１７】
2020533346.tif 000035
【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2020533346.tif 000038
【図２１−１】
2020533346.tif 000039
【図２１−２】
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【図２２】
2020533346.tif 000041
【図２３−１】
2020533346.tif 000042
【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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