(57)【要約】本発明は、結合部分および薬物とコンジュゲートした直鎖脂肪族コポリマー主鎖を含む、生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲート提供する。結合部分は、コポリマー主鎖の末端にコンジュゲートし、薬物の標的送達を容易にする。フリーラジカル重合技術、例えば可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合によるこのようなポリマーコンジュゲートの製造方法、および診断または治療におけるこのようなポリマーコンジュゲートの使用もまた提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
2つの末端を有し、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされる直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖；
コポリマー主鎖の末端にコンジュゲートした結合部分；および
コポリマー主鎖にコンジュゲートした少なくとも1つの薬物
を含む、生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲート。
【請求項２】
異なるモノマー各々が、異なるエチレン性不飽和基を有する、請求項1に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
異なるモノマーが、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミドおよびビニルエステルより選択されるモノマーのクラスに属する、請求項2に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
コポリマー主鎖が、3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされるターポリマーであり、各モノマーが、異なるエチレン性不飽和基を有する、請求項1〜3のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
コポリマー主鎖が、
(a)N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドおよびN-(2-ヒドロキシプロピル)アクリルアミドより選択される、第1モノマー；
(b)2-ヒドロキシエチルアクリレート、2-メトキシエチルアクリレート、2-(ジエチレングリコール)エチルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)アクリレート、ポリ(エチレングリコール)メタクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、N-アクリロイルアミド-エトキシエタノール、N,N-ジメチルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)メタクリルアミド、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アクリルアミド、アクリルアミド、N-アクリロイルモルホリン、N-プロピルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、メタクリルアミド、ジ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、2-(ジメチルアミノ)エチルアクリレート、2-(ジエチルアミノ)エチルアクリレート、3-(ジメチルアミノ)プロピルアクリレート、(3-アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸2-アミノエチル塩酸塩、[3-(メタクリロイルアミノ)プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド、2-カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、N-カルボキシエチルアクリルアミド、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸ナトリウム、3-スルホプロピルメタクリレートカリウム塩、メタクリル酸、3-[[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチルアンモニオ]プロピオネート、[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、および2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、3-[[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-アンモニオ]プロピオネート、2-アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、N-(2-プロピニル)-アクリルアミド、N-(3-アジドプロピル)-アクリルアミド、N-(3-アジドプロピル)-メタクリルアミド、およびビニルエステルより選択される、第2モノマー；ならびに
(c)薬物含有分子と反応できる官能基を含むアクリロイルまたはメタクリロイルモノマー、およびモノマーとコンジュゲートした薬物を含むアクリロイルまたはメタクリロイルモノマーより選択される、第3モノマー
からもたらされる、請求項1〜4のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
薬物が、コポリマー主鎖の末端にコンジュゲートし、ただし、薬物および結合部分が、異なる末端にコンジュゲートする、請求項1〜5のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
薬物が、コポリマー主鎖にコンジュゲートし、側鎖である、請求項1〜6のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
コポリマー主鎖が、約40 kDa以下の分子量、好ましくは約15〜35 kDaの範囲の分子量を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
コポリマー主鎖が、約1.5以下、好ましくは約1.3以下の多分散度を有する、請求項1〜8のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
結合部分が、抗体、抗体断片および抗原結合断片からなる群より選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
結合部分が、Fab'断片である、請求項1〜10のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
結合部分が、式(I)：
【化１】
2020502226.tif 000044
(I)
［式中、
Qが、結合部分を表し；
Raが、リンカーの残りの部分を表し；そして
【化２】
2020502226.tif 000045
が、コポリマー主鎖の末端への結合部位を表す］
で示される部分を含むリンカーによりコポリマー主鎖にコンジュゲートする、請求項1〜11のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
コポリマー主鎖にコンジュゲートした診断薬または治療薬を含む、請求項1〜12のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
生分解性リンカーによりコポリマー主鎖にコンジュゲートした治療薬を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
生分解性リンカーが、バリン-シトルリン-パラ-アミノ安息香酸（Val-Cit-PABA）、バリン-アラニン（Val-Ala）およびフェニルアラニン-リシン（Phe-Lys）からなる群より選択される部分を含む、請求項14に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲートの製造方法であって、下記工程：
(a)2つの末端、コポリマー主鎖の第1末端にて結合部分をコンジュゲートさせるための第1官能基と、コポリマー主鎖の第2末端およびコポリマー主鎖からの側鎖より選択される位置にて薬物をコンジュゲートさせるための第2官能基を有する直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖を形成するフリーラジカル重合の条件下で、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーを含むモノマー組成物を重合させる工程；
(b)第1官能基を結合部分含有分子と共有結合反応させ、結合部分をコポリマー主鎖の第1末端にコンジュゲートさせる工程；および
(c)第2官能基を薬物含有分子と共有結合反応させ、コポリマー主鎖の第2末端およびコポリマー主鎖からの側鎖より選択される位置にて薬物をコポリマー主鎖にコンジュゲートさせる工程
を含む、製造方法。
【請求項１７】
モノマー組成物中の異なるモノマーが、異なるエチレン性不飽和基を有する、請求項16に記載の製造方法。
【請求項１８】
異なるモノマーが、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミドおよびビニルエステルより選択されるモノマーのクラスに属する、請求項17に記載の製造方法。
【請求項１９】
モノマー組成物が、リビングフリーラジカル重合、好ましくは可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合の条件下で重合する、請求項16〜18のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２０】
モノマー組成物が、
(a)N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドおよびN-(2-ヒドロキシプロピル)アクリルアミドより選択される、第1モノマー；
(b)2-ヒドロキシエチルアクリレート、2-メトキシエチルアクリレート、2-(ジエチレングリコール)エチルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)アクリレート、ポリ(エチレングリコール)メタクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、N-アクリロイルアミド-エトキシエタノール、N,N-ジメチルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)メタクリルアミド、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アクリルアミド、アクリルアミド、N-アクリロイルモルホリン、N-プロピルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、メタクリルアミド、ジ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、2-(ジメチルアミノ)エチルアクリレート、2-(ジエチルアミノ)エチルアクリレート、3-(ジメチルアミノ)プロピルアクリレート、(3-アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸2-アミノエチル塩酸塩、[3-(メタクリロイルアミノ)プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド、2-カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、N-カルボキシエチルアクリルアミド、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸ナトリウム、3-スルホプロピルメタクリレートカリウム塩、メタクリル酸、3-[[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチルアンモニオ]プロピオネート、[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、および2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、3-[[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-アンモニオ]プロピオネート、2-アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、N-(2-プロピニル)-アクリルアミド、およびN-(3-アジドプロピル)-アクリルアミドより選択される、第2モノマー；および
(c)薬物をコポリマー主鎖とコンジュゲートさせるために薬物含有分子と反応できる官能基を含む親水性アクリロイルまたはメタクリロイルモノマーである、第3モノマー
を含む、請求項16〜19のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２１】
第3モノマーが、アクリロイルオキシスクシンイミドである、請求項20に記載の製造方法。
【請求項２２】
結合部分含有分子が、抗体、抗体断片および抗原結合断片を含む、請求項16〜21のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２３】
生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲートの製造方法であって、下記工程：
(a)少なくとも2つの異なるエチレン性不飽和モノマーおよびエチレン性不飽和モノマー-薬物コンジュゲートを含むモノマー組成物をフリーラジカル重合の条件下で重合させ、これによりコポリマー主鎖の一方または両方の末端にて側鎖薬物および末端官能基を有する直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖を形成させる工程；
(b)コポリマー主鎖の第1末端にて結合部分含有分子を第1末端官能基と共有結合反応させ、結合部分を第1末端にコンジュゲートさせる工程；および
所望により(c)コポリマー主鎖の第2末端にて薬物含有分子を第2末端官能基と共有結合反応させ、薬物を第2末端にコンジュゲートさせる工程
を含む、製造方法。
【請求項２４】
エチレン性不飽和モノマーおよびモノマー-薬物コンジュゲートが、異なるエチレン性不飽和基を有する、請求項23に記載の製造方法。
【請求項２５】
モノマー組成物が、リビングフリーラジカル重合、好ましくは可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合の条件下で重合する、請求項23または24に記載の製造方法。
【請求項２６】
モノマー組成物が、
(a)N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドおよびN-(2-ヒドロキシプロピル)アクリルアミドより選択される、第1モノマー；
(b)2-ヒドロキシエチルアクリレート、2-メトキシエチルアクリレート、2-(ジエチレングリコール)エチルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)アクリレート、ポリ(エチレングリコール)メタクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、N-アクリロイルアミド-エトキシエタノール、N,N-ジメチルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)メタクリルアミド、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アクリルアミド、アクリルアミド、N-アクリロイルモルホリン、N-プロピルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、メタクリルアミド、ジ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、2-(ジメチルアミノ)エチルアクリレート、2-(ジエチルアミノ)エチルアクリレート、3-(ジメチルアミノ)プロピルアクリレート、(3-アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸2-アミノエチル塩酸塩、[3-(メタクリロイルアミノ)プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド、2-カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、N-カルボキシエチルアクリルアミド、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸ナトリウム、3-スルホプロピルメタクリレートカリウム塩、メタクリル酸、3-[[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチルアンモニオ]プロピオネート、[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、および2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、3-[[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-アンモニオ]プロピオネート、2-アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、N-(2-プロピニル)-アクリルアミド、およびN-(3-アジドプロピル)-アクリルアミドより選択される、第2モノマー；および
(c)式(III)：
【化３】
2020502226.tif 000046
(III)
［式中、
Rcが、HまたはCH3であり；
Xが、OまたはNより選択され；
L2が、連結部分を表し；
Aが、薬物を表し；そして
nが、Xに結合する(-L2-A)基の数を表し、1または2である］
で示されるモノマー-薬物コンジュゲートである、第3モノマー
を含む、請求項23〜25のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２７】
式(III)において、Aが、治療薬であり、L2が、生分解性連結部分である、請求項26に記載の製造方法。
【請求項２８】
結合部分含有分子が、抗体、抗体断片および抗原結合断片を含む、請求項23〜27のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２９】
対象体において疾患または障害を軽減、処置または予防する方法であって、請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲートの有効量を対象体に投与する過程を含む、方法。
【請求項３０】
対象体における標的細胞または組織部位へ薬物を送達する方法であって、請求項1〜15のいずれか一項に記載のポリマーコンジュゲートの有効量を対象体に投与する過程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結合部分および薬物にコンジュゲートされる直鎖脂肪族コポリマー主鎖を含む、生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲートに関する。結合部分は、コポリマー主鎖の末端にコンジュゲートし、薬物の標的送達を容易にする。本発明はまた、フリーラジカル重合技術、例えば可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合によるこのようなポリマーコンジュゲートの製造方法、および診断または治療におけるこのようなポリマーコンジュゲートの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリマーは、治療薬（drug）、診断薬（diagnostic agent）および造影剤（imaging agent）を含む様々な薬物（agent）のための担体として用いられている。種々の化学組成および構造の多数のポリマーが、潜在的な担体として研究されてきた。
【０００３】
治療薬などの薬物の送達として報告されているポリマーの1つのクラスは、ポリマー-薬物コンジュゲートである。これらのコンジュゲートは、一般的に、治療薬（therapeutic agent）または診断薬などの薬物と共有結合するポリマーから構成される。薬物は、適切な刺激に応答してポリマーから切断され、放出され得る。
【０００４】
ポリマーにコンジュゲートしている薬物は、長い循環半減期を有し得る。また、患者へ投与される薬物の量は、薬物をポリマーにコンジュゲートさせたとき、減少させ得る。ポリマーコンジュゲート薬物に関連するこれらの利点は、薬物の有効性の増大および有害な副作用の可能性の減少に寄与し得る。
【０００５】
ポリマー-薬物コンジュゲートにおいて用いられるポリマーは、生物学的環境にあるとき、分解性または非分解性であってもよく、分解性は、ポリマー鎖の化学的構造および組成によって影響を受ける。例えば、分解性ポリマーは、ポリマー鎖の一部を形成する、分解性結合、例えばエステル、アミド、無水物、ウレタンまたはカルボネート結合によりカップリングしたモノマー単位を含み得る。このような分解性ポリマーは、適切な官能化モノマーを共有結合反応させ、モノマー単位を分解性結合によりカップリングさせることにより合成され得る。結合は、インビボで切断されやすく、ポリマー鎖の分解および低分子量断片の形成を引き起こす。対して、非分解性ポリマーは、炭素-炭素結合により連結したモノマー単位から構成されるポリマー鎖を有し得る。炭素-炭素結合は、不飽和モノマーの重合により形成され得て、インビボで分解されにくい。
【０００６】
多数のポリマー-薬物コンジュゲートが報告されているが、薬物の標的組織への送達向上を提供し得るポリマーコンジュゲートを提供することが未だ必要とされている。
【０００７】
文書、行為、材料、装置、物品などの議論は、単に本発明の状況を提供する目的のため本明細書に含まれる。本願の各請求項の優先日前に存在していたとして、これらの事項のいずれかまたはすべてが先行技術の基礎の一部を形成するか、または本発明に関連する分野における技術常識であることは示唆も表明もされない。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、薬物の標的送達を提供し得る、結合部分および薬物を有する生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲートに関する。このようなポリマーコンジュゲートは、本明細書において「ポリマー-薬物コンジュゲート」または「ポリマーコンジュゲート」とも称する。
【０００９】
本発明は、概して、
2つの末端を有する直鎖脂肪族コポリマー主鎖；
コポリマー主鎖の末端にコンジュゲートした結合部分；および
コポリマー主鎖にコンジュゲートした少なくとも1つの薬物
を含む、生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲートに関する。
【００１０】
ポリマーコンジュゲートの直鎖コポリマー主鎖は、少なくとも3つの異なるモノマーからもたらされる。
【００１１】
本発明の一要件は、ポリマーコンジュゲートの直鎖コポリマー主鎖がブロックコポリマーでないことである。
【００１２】
一態様において、
2つの末端を有し、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされる直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖；
コポリマー主鎖の末端にコンジュゲートした結合部分；および
コポリマー主鎖にコンジュゲートした少なくとも1つの薬物
を含む、生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲートを提供する。
【００１３】
本明細書に記載のポリマーコンジュゲートは、薬物の標的送達に適し得る。
【００１４】
薬物は、主鎖の末端および主鎖からの側鎖より選択される位置にてコポリマー主鎖にコンジュゲートし、ただし、薬物が末端位置にてコンジュゲートするとき、薬物および結合部分は、異なる末端にコンジュゲートする。
【００１５】
特定の実施態様において、コポリマー主鎖は、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされ、ここで、異なるモノマー各々は、異なるエチレン性不飽和基を有する。
【００１６】
一実施態様において、異なるモノマーは、アクリル酸、メタクリル酸、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミドおよびビニルエステルより選択されるモノマーのクラスに属する。
【００１７】
いくつかの実施態様において、コポリマー主鎖は、ターポリマーである。当業者は、ターポリマーが3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされるコポリマーであることを理解する。
【００１８】
一実施態様において、ポリマーコンジュゲートにおいてコポリマー主鎖として適切なターポリマーは、3つの異なるモノマーからもたらされ、ここで、各モノマーは、異なるエチレン性不飽和基を有する。
【００１９】
ポリマーコンジュゲートのコポリマー主鎖は、好ましくは、親水性エチレン性不飽和モノマーからもたらされる。
【００２０】
本明細書に記載のポリマーコンジュゲートは、直鎖コポリマー主鎖の末端にコンジュゲートした結合部分を含む。いくつかの実施態様において、結合部分は、タンパク質であり、抗体、抗体断片および抗原結合断片からなる群より選択され得る。特定の実施態様において、結合部分は、Fab'断片である。
【００２１】
別の一態様において、生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲートの製造方法であって、下記工程：
(a)2つの末端、コポリマー主鎖の第1末端にて結合部分をコンジュゲートさせるための第1官能基と、コポリマー主鎖の第2末端およびコポリマー主鎖からの側鎖より選択される位置にて薬物をコンジュゲートさせるための第2官能基を有する直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖を形成するフリーラジカル重合の条件下で、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーを含むモノマー組成物を重合させる工程；
(b)第1官能基を結合部分含有分子と共有結合反応させ、結合部分をコポリマー主鎖の第1末端にコンジュゲートさせる工程；および
(c)第2官能基を薬物含有分子と共有結合反応させ、コポリマー主鎖の第2末端およびコポリマー主鎖からの側鎖より選択される位置にて薬物をコポリマー主鎖にコンジュゲートさせる工程
を含む、製造方法を提供する。
【００２２】
一実施態様において、モノマー組成物は、リビングフリーラジカル重合、好ましくは可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合の条件下で重合する。
【００２３】
更なる態様において、生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲートの製造方法であって、下記工程：
(a)少なくとも2つの異なるエチレン性不飽和モノマーおよびエチレン性不飽和モノマー-薬物を含むモノマー組成物をフリーラジカル重合の条件下で重合させ、これによりコポリマー主鎖の一方または両方の末端にて側鎖薬物および末端官能基を有する直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖を形成させる工程；
(b)コポリマー主鎖の第1末端にて結合部分含有分子を第1末端官能基と共有結合反応させ、結合部分を第1末端にコンジュゲートさせる工程；および
所望により(c)コポリマー主鎖の第2末端にて薬物含有分子を第2末端官能基と共有結合反応させ、薬物を第2末端にコンジュゲートさせる工程
を含む、製造方法を提供する。
【００２４】
本明細書に記載の製造方法のいくつかの実施態様において、モノマー組成物は、式(III)：
【化１】
2020502226.tif 000002
(III)
［式中、
Rcは、HまたはCH3であり；
Xは、OまたはNより選択され；
L2は、連結部分を表し；
Aは、薬物を表し；そして
nは、Xに結合する(-L2-A)基の数を表し、1または2である］
で示されるモノマー-薬物コンジュゲートを含む。
【００２５】
また更なる態様において、対象体において疾患または障害を軽減、処置または予防する方法であって、本明細書に記載の実施態様のいずれか1つのポリマーコンジュゲートの有効量を対象体に投与する過程を含む、方法を提供する。
【００２６】
また更なる態様において、対象体における標的細胞または組織部位へ薬物を送達する方法であって、本明細書に記載の実施態様の本明細書に記載の実施態様のいずれか1つのポリマーコンジュゲートの有効量を対象体に投与する過程を含む、方法を提供する。
【００２７】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲の全体にわたって、文脈が他を必要としない限り、用語「含む（comprise）」、ならびに「含む（comprises）」および「含む（comprising）」などの変形は、記載する整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の包含を意味するが、他の整数もしくは工程または整数もしくは工程の群の排除を意味するものではないと理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
次に、本発明の実施態様を、以下の非限定的な図面を参照して説明する。
【図１】図1は、Eu-EGFの存在下で可溶性EGFRへの結合と競合する528 Fab'-ポリマーコンジュゲートの能力と比較するユウロピウム-リガンド競合アッセイを表す図を示す。
【図２】図2は、10 kDaのPEGを有する528 Fab'-ポリマーコンジュゲート（比較）および10 kDaのp(HPMA)RAFTポリマーを有する528 Fab'-ポリマーコンジュゲートによるACHN癌細胞におけるEGFRチロシンリン酸化の用量反応阻害を表す図を示す。
【図３】図3は、ラットへの5 mg/kgポリマーのIV投与後に試験した異なる脂肪族ポリマーについての時間関数としての血漿濃度の変化を表す図を示す。
【図４】図4は、(A)ポリマーの分子量または(B)そのゲルろ過溶出量の関数としての試験した異なる脂肪族ポリマーのクリアランス率を表す図を示す；
【図５】図5は、様々なFab'-結合ポリマーについての薬物動態プロファイルを表し、各データ点は3匹のラットの平均である図を示す。
【図６】図6は、42日間にわたって無胸腺ヌードscidマウスにおいて増殖させたA431細胞に由来するヒト類表皮癌腫体積（mm3）に関する様々なFab'-ポリマー-薬物コンジュゲート（APDC）の有効性を表す図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本明細書で用いられる単数形「a」、「an」および「the」は、単数形のみを指すと明確に断らない限り、単数形および複数形の両方を指す。
【００３０】
用語「約」および用語約によって修飾されているかどうかにかかわらず一般的な範囲の使用は、包含される数が本明細書に記載される正確な数に限定されず、本発明の範囲から逸脱しないで実質的に引用範囲内の範囲を指すことを意図されることを意味する。本明細書で用いられる「約」は、当業者より理解され、それが用いられる文脈上ある程度変化する。該用語が使用される文脈を考慮して当業者に明確でないその使用がある場合、「約」は、特定の用語の±10％までを意味する。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「処置する」および「処置」は、状態または症状を緩和させるか、またはそうでなければ状態もしくは疾患またはいかなる形であれ他の望ましくない症状の進行を妨げるか、遅らせるか、抑制するかまたは反転させる、あらゆる使用を指す。したがって、用語「処置する」および「処置」などは、その最も広い文脈において考慮されるべきである。例えば、処置は、患者が完全回復まで処置されることを必ずしも意味しない。本開示の文脈において、「処置」は、障害に関連する症状または極めて望ましくない事象または障害の進行の不可逆的結果の発生を低減または改善することを含み得るが、それ自体が事象または結果の最初の発生を防止し得ない。したがって、処置は、特定の障害の1つ以上の症状を改善すること、または特定の障害を発生する危険性を予防するかまたはその他の方法で低下させることを含む。
【００３２】
本発明は、概して、局所部位への薬物の標的送達に有用である、結合部分および薬物を含む生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲートに関する。
【００３３】
本発明は、概して、
2つの末端を有する直鎖脂肪族コポリマー主鎖；
コポリマー主鎖の1つの末端にコンジュゲートした結合部分；および
コポリマー主鎖にコンジュゲートした少なくとも1つの薬物
を含む、生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲートに関する。
【００３４】
本明細書に記載のポリマーコンジュゲートにおいて、直鎖脂肪族コポリマー主鎖がブロックコポリマーでないことが条件である。すなわち、コポリマー主鎖は、各別個のブロックが異なる重合化モノマーから構成される、異なる組成の分離した別個のブロックを有するものである。
【００３５】
適切には、直鎖脂肪族ポリマー主鎖は、少なくとも3つのコモノマーからもたらされる統計コポリマーである。
【００３６】
第1態様において、本発明は、
2つの末端を有し、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされる直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖；
コポリマー主鎖の末端にコンジュゲートした結合部分；および
コポリマー主鎖にコンジュゲートした少なくとも1つの薬物
を含む、生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲート提供する。
【００３７】
本発明のポリマーコンジュゲートは、生体適合性の親水性であり、薬物の標的送達が望まれる生物学的用途における使用に適する。
【００３８】
「生体適合性」は、ポリマーコンジュゲートが、生物学的環境、例えば生存組織または生存生物体に対して最小限の毒性または無毒性であることを意味する。
【００３９】
「親水性」は、ポリマーコンジュゲートが、水に対して親和性を有し、それ故に水性溶媒に適合し、水性溶媒中に可溶であり得ることを意味する。好ましくは、ポリマーコンジュゲートは、水に可溶である。いくつかの実施態様において、ポリマーコンジュゲートは、25℃にて水100g当たり少なくとも10gのポリマーの水中溶解度を有し得る。
【００４０】
本発明の「ポリマーコンジュゲート」は、コポリマーと少なくとも1つの結合部分と少なくとも1つの薬物の共有結合コンジュゲートである。薬物は、治療薬、診断薬または研究試薬であり得る。
【００４１】
本発明のポリマーコンジュゲートは、好ましくは、自己会合しないか、または構造化会合体、例えばミセルに会合しない。
【００４２】
本発明のポリマーコンジュゲートは、統計コポリマー主鎖を含む。このような実施態様において、コポリマー主鎖は、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和コモノマーからもたらされる統計的に分布した重合化残基から構成される直鎖脂肪族分子である。当業者は、種々のコモノマーが、重合が進むとコモノマーの連鎖付加により直鎖ポリマーの構造へ組み込まれることを理解する。組み込まれたモノマーは、得られたコポリマーにおいて重合化残基を形成する。重合化残基は、コポリマーのモノマー単位とみなされ得る。
【００４３】
当業者は、「統計コポリマー」は、モノマー単位の連鎖分布が公知の統計法則に従う巨大分子であることを理解する。統計コポリマーの例は、モノマー単位の連鎖分布がマルコフ統計に従う巨大分子である。
【００４４】
統計コポリマーは、異なるコモノマーがフリーラジカル重合条件下で同時に共重合化されるとき、形成される。このような条件下で、コモノマーのエチレン性不飽和部分は、コモノマーを互いに共有炭素-炭素結合により連結するように反応する。したがって、統計コポリマーにおけるコモノマーの組込みおよび分布は、種々のコモノマーの相対的反応性（反応性比率）により規定される。したがって、コモノマー反応性は、コポリマーの組成に影響を及ぼす。
【００４５】
本明細書に記載のエチレン性不飽和コモノマーは、統計コポリマーの形成を促進する反応性比率を有するものより選択され得る。
【００４６】
いくつかの実施態様において、統計コポリマーは、種々のコモノマーからもたらされるモノマー単位のランダム分布を有し得る。
【００４７】
ブロックコポリマーは、しばしば、コポリマーにおいてモノマー単位の予め決められ、制御された分布を達成するためにモノマー付加および重合を制御することを必要とし、これによりブロック組成物を生成するため、本明細書に記載の統計コポリマーは、ブロックコポリマーと区別される。
【００４８】
コポリマー主鎖は、直鎖分子であり、2つの末端を有する。2つの末端は、端の反対側の末端であり、本明細書においてコポリマーのアルファ(α)およびオメガ(ω)末端と称することもある。コポリマーの2つの末端はまた、それらが直鎖分子の異なる末端であることを示すために、本明細書においてコポリマーの第1末端および第2末端と称することもある。
【００４９】
ポリマーコンジュゲートのコポリマー主鎖はまた、脂肪族分子である。「脂肪族」は、コポリマー主鎖が、直鎖（すなわち、非分岐鎖）、分岐鎖または環式（縮合、架橋およびスピロ縮合多環式を含む）であってもよく、そして完全に飽和していてもよく、または1つ以上の不飽和単位を含んでいてもよいが、芳香族でない、炭化水素部分であることを意味する。したがって、コポリマー主鎖は、炭素-炭素結合に互いに連結する炭素原子から形成される。コポリマー主鎖を形成する炭素原子鎖は、一般的に、ヘテロ原子、例えば酸素、窒素または硫黄原子が割り込まない。一実施態様において、コポリマー主鎖は、直鎖炭化水素部分である。
【００５０】
したがって、直鎖脂肪族コポリマー主鎖は、炭素-炭素結合によりその直鎖軸に沿って連結されるモノマー単位から構成される巨大分子であると当業者により理解される。直鎖コポリマー鎖の長さは、コポリマー中に組み込まれるモノマー単位の数により規定される。
【００５１】
ポリマーコンジュゲートのコポリマー主鎖は、フリーラジカル重合条件下での少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和コモノマーの重合により形成される。したがって、コポリマー主鎖は、種々のコモノマーからもたらされる重合化残基を含有する。
【００５２】
いくつかの実施態様において、コポリマーは、3つの異なるエチレン性不飽和コモノマーの重合により形成されるターポリマーである。
【００５３】
いくつかの他の実施態様において、コポリマーは、3つを超える異なるエチレン性不飽和コモノマーの重合により形成され得る。
【００５４】
一連の実施態様において、直鎖コポリマー主鎖は、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和親水性モノマーの統計的に分布した重合化残基を含む。親水性モノマーは、ポリマーコンジュゲートに親水性特性を付与するのを補助し得る。
【００５５】
本明細書に記載のエチレン性不飽和基は、エチレン性不飽和部分を含む。エチレン性不飽和部分は、炭素-炭素二重結合または炭素-炭素三重結合であり得る。エチレン性不飽和部分は、環状構造または末端基の一部であり得る。
【００５６】
本明細書に記載のエチレン性不飽和モノマーは、フリーラジカル重合条件下で重合可能である、少なくとも1つのエチレン性不飽和基を含む。一つの好ましい例において、モノマー各々は、1つの重合可能なエチレン性不飽和基を含有する。1つの重合可能なエチレン性不飽和基の存在は、架橋反応の発生を最小限にするのを助け得て、それ故に重合反応が直鎖コポリマーを生じることを確実にするのを助け得る。
【００５７】
重合可能なエチレン性不飽和基を有するエチレン性不飽和モノマーはまた、一置換モノマーとみなされ得る。
【００５８】
エチレン性不飽和コモノマーは、モノマーのエチレン性不飽和部分を囲む異なる化学的環境を有することにより互いに異なるとみなされ得る。
【００５９】
例えば、異なるコモノマーのエチレン性不飽和部分の炭素原子と直接共有結合した異なる化学置換基があってもよい。したがって、エチレン性不飽和部分と結合した異なる置換基は、化学構造が同一でないエチレン性不飽和基を生じ得る。したがって、このようなコモノマーは、一般的に、互いに異なるとみなされる。
【００６０】
適切なエチレン性不飽和モノマーの範囲は、当業者に知られている。好ましいエチレン性不飽和モノマーは、ビニル、アクリロイルまたはメタクリロイルモノマーであり得る。
【００６１】
アクリロイルおよびメタクリロイルモノマーの例としては、アクリル酸、メタクリル酸、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミドおよびメタクリルアミドモノマーが挙げられる。
【００６２】
一実施態様において、本発明のポリマーコンジュゲートは、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和コモノマーからもたらされる直鎖コポリマーを含み、ここで、コモノマーは、アクリル酸、メタクリル酸、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミドおよびビニルエステルモノマーより選択される。
【００６３】
アクリル酸、メタクリル酸、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミドおよびビニルエステル基は各々、異なる重合可能なエチレン性不飽和基であるとみなされる。
【００６４】
アクリル酸、メタクリル酸、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミドおよびビニルエステル基を含有するモノマーは、異なるタイプの重合可能基をもたらす、エチレン性不飽和基の異なる化学構造を参照することにより定義される、異なるクラスに分類され得る。
【００６５】
当業者は、アクリル酸、メタクリル酸、アクリレートモノマー、メタクリレートモノマー、アクリルアミドモノマーおよびメタクリルアミドモノマーが、炭素-炭素二重結合である、モノマーのエチレン性不飽和部分と直接共有結合するカルボニル（-C=O）官能基を有することを理解する。
【００６６】
しかしながら、上記アクリロイルおよびメタクリロイルモノマーは互いに異なり、アクリレートおよびメタクリレートモノマーがエステルであり、カルボニルと共有結合する酸素原子含有置換基（-OR）を有する。対して、アクリルアミドおよびメタクリルアミドモノマーは、カルボニルと共有結合してアミドを形成する窒素原子含有置換基（-NR）を有する。アクリル酸およびメタクリル酸モノマーは、カルボン酸であり、カルボニルと共有結合するヒドロキシル部分（-OH）を有する。
【００６７】
アクリル酸、アクリレートおよびアクリルアミドモノマーはまた、後者の3つのモノマークラスが、カルボニルに対してアルファである炭素原子にて炭素-炭素二重結合と直接共有結合するメチル置換基を有する点でメタクリル酸、メタクリレートおよびメタクリルアミドモノマーと異なる。アクリル酸、アクリレートおよびアクリルアミドにおいて、メチル置換基は存在しない。
【００６８】
アクリレート、メタクリレート、アクリルアミドおよびメタクリルアミドモノマーは、これらのモノマーのエステル部分の酸素原子またはアミド部分の窒素原子のいずれかと結合する1つ以上の置換基（すなわちR基）を有し得る。1つまたは複数の置換基は、コポリマー主鎖からの側鎖官能基を提供し得る。当業者は、このような置換基が、モノマーのエチレン性不飽和部分（例えば炭素-炭素二重結合）と直接共有結合しないが、1つ以上の原子（例えば酸素、炭素または窒素原子）により不飽和部分から空間的に分離され得ることを理解する。
【００６９】
アクリレートモノマーのクラスに属するモノマーとしては、アクリロイルエステル、例えば2-ヒドロキシエチルアクリレート、2-メトキシエチルアクリレート、2-(ジエチレングリコール)エチルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)アクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルアクリレート、2-(ジエチルアミノ)エチルアクリレート、3-(ジメチルアミノ)プロピルアクリレート、N-アクリロキシスクシンイミド、3-[[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチルアンモニオ]プロピオネート、2-アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、および[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
メタクリレートモノマーのクラスに属するモノマーとしては、メタクリロイルエステル、例えばポリ(エチレングリコール)メタクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、ジ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、メタクリル酸2-アミノエチル塩酸塩、3-スルホプロピルメタクリレートカリウム塩、3-[[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチルアンモニオ]プロピオネート、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、および[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
アクリルアミドモノマーのクラスに属するモノマーとしては、未置換、N-一置換およびN,N-二置換のアクリロイルアミド、例えばN-(2-ヒドロキシプロピル)アクリルアミド、N-アクリロイルアミド-エトキシエタノール、N,N-ジメチルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アクリルアミド、アクリルアミド、N-アクリロイルモルホリン、N-プロピルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、N-(2-プロピニル)-アクリルアミド、N-(3-アジドプロピル)アクリルアミド、(3-アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、N-カルボキシエチルアクリルアミド、および2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸ナトリウムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
メタクリルアミドモノマーのクラスに属するモノマーとしては、未置換、N-一置換およびN,N-二置換のメタクリロイルアミド、例えばN-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)メタクリルアミド、メタクリルアミド、[3-(メタクリロイルアミノ)プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド、およびN-(3-アジドプロピル)メタクリルアミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
ビニルエステルモノマーは、エチレン性不飽和モノマーの別のクラスである。ビニルモノマーは、一般的に、炭素-炭素二重結合である不飽和部分を、炭素-炭素二重結合と共有結合する置換基と共に含有する。ビニルエステルの場合、酸素原子は、炭素-炭素二重結合と直接結合し、続いてカルボニルが酸素原子と結合する。
【００７４】
ビニルエステルのクラスに属するモノマーは、エステルのカルボニルと結合する置換基（R基）の範囲を有し得る。ビニルエステルの一例は、酢酸ビニルである。エステルは、コポリマー主鎖の形成後加水分解され、コポリマーからの側鎖であるヒドロキシ基を生じ得る。
【００７５】
一形態において、ポリマーコンジュゲートは、同一モノマーのクラスに属するが、モノマーのエチレン性不飽和基と連結する置換基に関して互いに異なる、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされるコポリマーを含み得る。一例として、コポリマーは、各々同一タイプのエチレン性不飽和基を有するが、モノマーのアクリルアミド部分の窒素原子と結合する異なるタイプの置換基（すなわちR基）を有する、少なくとも3つのアクリルアミドモノマーからもたらされ得る。これは、下記に示すモデル化合物を参照することにより説明され得て、ここで、同一クラスに属するコモノマーは、不飽和部分と直接結合する同一基A、B、CおよびDを有するが、異なるR置換基を有し得る。基A、B、CおよびDが同一であるため、コモノマーは、同一タイプのエチレン性不飽和基を有し、同一モノマークラスに属する。
【化２】
2020502226.tif 000003
【００７６】
別の形態において、ポリマーコンジュゲートは、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされるコポリマーを含み得て、ここで、異なるモノマー各々は、異なるクラスに属する。したがって、このような実施態様において、コポリマーは、エチレン性不飽和モノマーの少なくとも3つの異なるクラスからもたらされる。異なるクラスに属するモノマーは、モノマーにおけるエチレン性不飽和基のタイプに関して互いに異なる。これは、下記に示すモデル化合物を参照することにより説明され得て、ここで、異なるクラスに属するコモノマーは、エチレン性不飽和部分と直接共有結合する1つ以上の異なる置換基を有する。すなわち、不飽和部分と直接結合する基A、B、CおよびDの少なくとも1つは、異なるタイプのコモノマー間で異なり、これにより異なるエチレン性不飽和基を提供する。
【化３】
2020502226.tif 000004
【００７７】
いくつかの実施態様において、コポリマーは、第1モノマー、第2モノマーおよび第3モノマーからもたらされ得て、ここで、第1、第2および第3モノマーは、エチレン性不飽和基に関して異なり、それ故に本明細書に記載のモノマーの異なるクラスに属する。
【００７８】
エチレン性不飽和基に関して異なることに加えて、異なるクラスに属するコモノマーはまた、モノマーの不飽和基と共有結合する置換基（すなわちR基）に関して異なり得る。
【００７９】
一実施態様において、本発明のポリマーコンジュゲートは、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和親水性モノマーからもたらされるコポリマー主鎖を含む。親水性モノマーからもたらされるコポリマー主鎖は、ポリマーコンジュゲートに親水性特性を付与するのを補助し得る。
【００８０】
モノマーに関して用いられる用語「親水性」は、モノマーが、水に対して親和性を有し、水性溶媒に少なくとも適合することを意味する。好ましくは、モノマーは、水性溶媒、例えば水、または水を含む溶媒混合物（例えば水と水混和性有機溶媒の混合物）中において可溶である。いくつかの実施態様において、親水性モノマーは、25℃にて水100g当たり少なくとも10gのポリマーの水中溶解度を有し得る。
【００８１】
しかしながら、ポリマーコンジュゲートの直鎖コポリマー主鎖は、親水性とみなされないモノマーからもたらされ得ることが企図される。しかしながら、これらのモノマーがポリマーコンジュゲート自体の所望の全体的親水性に悪影響を及ぼさない限り、このようなモノマーは用いられ得る。
【００８２】
いくつかの例において、必要に応じて、非親水性（すなわち疎水性）モノマーからもたらされるコポリマーにおける重合化残基は、親水性残基へそれらを変換するために一連の化学プロセスにより修飾し得る。例えば、疎水性モノマーからもたらされる重合化残基における側鎖置換基（R基）は、親水性部分へそれらを変換するために加水分解または置換反応により修飾し得る。
【００８３】
いくつかの実施態様において、直鎖コポリマー主鎖は、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和親水性モノマーの統計的に分布した重合化残基を含む。
【００８４】
特定の実施態様において、ポリマーコンジュゲートのコポリマー主鎖は、3つの異なるエチレン性不飽和親水性コモノマーの統計的に分布した重合化残基を有する直鎖脂肪族ターポリマーである。好ましくは、異なる親水性コモノマー各々は、異なるタイプのエチレン性不飽和基を有する。
【００８５】
一つの好ましい例において、コポリマー主鎖は、アクリル酸、メタクリル酸、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミドおよびビニルエステルより選択されるモノマーのクラスに属する少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和親水性モノマーからもたらされる重合化残基を含み、ここで、各異なるモノマーは、異なるクラスに属する。これらのクラスに属する親水性モノマーは、上記のものより選択され得る。
【００８６】
本発明のポリマーコンジュゲートの直鎖コポリマー主鎖は、1つ以上の官能基を含んでもよく、好ましくはそれらを含む。
【００８７】
一つの好ましい例において、直鎖コポリマー主鎖は、1つ以上の側鎖官能基を含む。このような官能基は、直鎖コポリマー主鎖の主鎖からの側鎖である。「側鎖」であることにより、官能基は、コポリマー主鎖を形成する炭素原子鎖の一部を直接形成しない。
【００８８】
側鎖官能基は、水との水素結合相互作用に関与することができてもよく、このようにして、コポリマー主鎖、故にポリマーコンジュゲートの親水性を促進するのを助ける。
【００８９】
側鎖官能基はまた、コポリマー主鎖へ薬物、例えば治療薬、診断薬または研究試薬をコンジュゲートおよび結合させ、これによりポリマーコンジュゲートを形成するのを促進する共有結合反応にも参加し得る。
【００９０】
側鎖官能基は、官能基を含む置換基（すなわち「R」基）を有するエチレン性不飽和モノマーがコポリマー主鎖のモノマー単位を形成するとき、導入され得る。したがって、コポリマー主鎖は、モノマーの重合化残基を含み、官能基は主鎖からの側鎖のままである。例示的な官能基は、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェートおよびスクシンイミド、好ましくはヒドロキシル、スクシンイミド、アルキニル、アジド、およびそれらの組合せであり得る。
【００９１】
いくつかの実施態様において、双性イオン官能基、例えばカルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタイン基を含有する置換基がまた企図される。双性イオン官能基は、陽電荷および負電荷の両方を有する部分を含む。双性イオン官能基のいくつかの例を以下に示す：
【化４】
2020502226.tif 000005
カルボキシベタイン
【化５】
2020502226.tif 000006
スルホベタイン
【化６】
2020502226.tif 000007
ホスホベタイン
［式中、Ra、Rb、Rcは、各々独立して、水素およびC1-C6アルキル（好ましくはC1-C2アルキル、より好ましくはメチル）より選択される］
【００９２】
いくつかの他の実施態様において、ポリマーコンジュゲートの直鎖脂肪族コポリマー主鎖は、エチレン性不飽和双性イオンモノマーからもたらされる重合化残基を含まない。したがって、いくつかの実施態様において、直鎖コポリマー主鎖の形成において用いられるモノマーは双性イオンでなく、したがって得られるコポリマーは側鎖双性イオン基を含まないことが条件である。
【００９３】
一形態において、コポリマー主鎖は、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和親水性モノマーからもたらされ、ここで、異なるモノマーは、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、N-(2-ヒドロキシプロピル)アクリルアミド、2-ヒドロキシエチルアクリレート、2-メトキシエチルアクリレート、2-(ジエチレングリコール)エチルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)アクリレート、ポリ(エチレングリコール)メタクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、N-アクリロイルアミド-エトキシエタノール、N,N-ジメチルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)メタクリルアミド、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アクリルアミド、アクリルアミド、N-アクリロイルモルホリン、N-プロピルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、メタクリルアミド、ジ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、2-(ジメチルアミノ)エチルアクリレート、2-(ジエチルアミノ)エチルアクリレート、3-(ジメチルアミノ)プロピルアクリレート、N-アクリロイルオキシスクシンイミド、(3-アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸2-アミノエチル塩酸塩、[3-(メタクリロイルアミノ)プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド、2-カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、N-カルボキシエチルアクリルアミド、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸ナトリウム、3-スルホプロピルメタクリレートカリウム塩、メタクリル酸、N-アクリロキシスクシンイミド、3-[[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチルアンモニオ]プロピオネート、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、3-[[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-アンモニオ]プロピオネート、2-アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、N-(2-プロピニル)-アクリルアミド、N-(3-アジドプロピル)-アクリルアミド、N-(3-アジドプロピル)-メタクリルアミドおよび酢酸ビニルからなる群より選択される。
【００９４】
コポリマー主鎖における重合化モノマー残基が中性であり、生理学的pH（約pH7.4）で正味電荷を帯びないことが望ましいことがある。これは、ポリマーコンジュゲートが生理学的pHで正味電荷を帯びないことを確実にするのを助け得る。これは、荷電ポリマーコンジュゲートが生理学的環境で有害作用を誘発し得るため、望ましいことがある。例えば、カチオン性残基は、細胞毒性を誘発し得る。
【００９５】
一形態において、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされる統計的に分布した重合化残基を含む直鎖脂肪族コポリマー主鎖は、式(Ia)：
【化７】
2020502226.tif 000008
(Ia)
［式中、
X1、X2およびX3は、同一であっても異なっていてもよく、各々独立してHおよびCH3より選択され；
Y1、Y2およびY3は、同一であっても異なっていてもよく、各々独立してOおよびNRより選択され、Rは、HまたはC1-C6アルキル（好ましくはC1-C4アルキル、最も好ましくはメチル）であり；
R1、R2およびR3は、同一であっても異なっていてもよく、各置換基であり；
m、nおよびpは、重合化残基の繰返し単位数を表し、各々少なくとも1の整数であり、
ただし：
(i)X1がHであり、X2がCH3であり、X3がHであるとき、Y1とY3は異なり、
(ii)X1がHであり、X2がHであり、X3がCH3であるとき、Y1とY2は異なり、
(iii)X1がCH3であり、X2がCH3であり、X3がHであるとき、Y1とY2は異なり、
(iv)X1がCH3であり、X2がHであり、X3がCH3であるとき、Y1とY3は異なり、
(v)X1とX2とX3が異なり、Y1とY2とY3が同一であるとき、R1とR2とR3は各々異なる］
で表される一般構造を有し得る。
【００９６】
いくつかの実施態様において、式(Ia)における置換基R1、R2およびR3は、直鎖または環式アルキルまたは直鎖または環式ヘテロアルキルであり得る。直鎖アルキルまたはヘテロアルキルは、分岐または非分岐であり得る。環式アルキルまたはヘテロアルキルは、6〜8個の環原子を含み得る。
【００９７】
置換基R1、R2およびR3の1つ以上は、官能基を含み得る。官能基は、ヒドロキシル、アミノ、アミド、カルボキシル、カルボニル、スルフェート、スルホネート、ホスフェート、スクシンイミド、アルキニル、アジド、およびそれらの組合せより選択され得る。一実施態様において、置換基R1、R2およびR3は、各々独立して、ヒドロキシル、スクシンイミド、カルボキシベタイン、スルホベタインおよびホスホベタインより選択される官能基を含む。
【００９８】
一つの好ましい例において、コポリマー主鎖は、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和親水性モノマーからもたらされる重合化モノマー残基を含み、ここで、異なるモノマーは、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド、N-(2-ヒドロキシプロピル)アクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)アクリレート、ポリ(エチレングリコール)メタクリレート、N-アクリロイルモルホリン、N-イソプロピルアクリルアミド、およびN-アクリロキシスクシンイミドからなる群より選択される。
【００９９】
一実施態様において、直鎖コポリマー主鎖における重合化モノマー残基の少なくとも1つは、それにコンジュゲートする薬物、例えば治療薬または診断薬を含む。
【０１００】
いくつかの実施態様において、コポリマー主鎖のモノマー単位を形成する重合化モノマーの少なくとも1つは、薬物含有分子と共有結合反応して、コポリマー主鎖と薬物のコンジュゲーションを促進することができる官能基を含む。共有結合反応の後、結果物は、モノマー単位にコンジュゲートした薬物を含むモノマー単位を含むコポリマー主鎖である。
【０１０１】
一実施態様において、ポリマーコンジュゲートの直鎖コポリマー主鎖は、
(a)N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドおよびN-(2-ヒドロキシプロピル)アクリルアミドより選択される、第1コモノマー；
(b)2-ヒドロキシエチルアクリレート、2-メトキシエチルアクリレート、2-(ジエチレングリコール)エチルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)アクリレート、ポリ(エチレングリコール)メタクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、N-アクリロイルアミド-エトキシエタノール、N,N-ジメチルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)メタクリルアミド、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アクリルアミド、アクリルアミド、N-アクリロイルモルホリン、N-プロピルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、メタクリルアミド、ジ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、2-(ジメチルアミノ)エチルアクリレート、2-(ジエチルアミノ)エチルアクリレート、3-(ジメチルアミノ)プロピルアクリレート、(3-アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸2-アミノエチル塩酸塩、[3-(メタクリロイルアミノ)プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド、2-カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、N-カルボキシエチルアクリルアミド、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸ナトリウム、3-スルホプロピルメタクリレートカリウム塩、メタクリル酸、3-[[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチルアンモニオ]プロピオネート、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、3-[[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチルアンモニオ]プロピオネート、2-アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、N-(2-プロピニル)-アクリルアミド、N-(3-アジドプロピル)-アクリルアミド、N-(3-アジドプロピル)-メタクリルアミド、および酢酸ビニルより選択される、第2コモノマー；ならびに
(c)薬物含有分子と反応できる官能基を含むアクリロイルまたはメタクリロイルモノマー、およびモノマーとコンジュゲートした薬物を含むアクリロイルまたはメタクリロイルモノマーより選択される、第3コモノマー
からもたらされる重合化残基を含む。
【０１０２】
上記の第1、第2および第3コモノマーは、異なるエチレン性不飽和モノマーであることが条件である。好ましくは、第1、第2および第3コモノマーは、エチレン性不飽和モノマーの異なるクラスに属する。エチレン性不飽和モノマーの異なるクラスの例は、本明細書に記載のとおりである。
【０１０３】
一実施態様において、第3コモノマーは、薬物含有分子と反応することができる官能基を含むアクリロイルモノマーである。このような官能化アクリロイルモノマーの例は、N-アクリロキシスクシンイミドである。当業者は、スクシンイミド官能基は、適切に官能化された薬物含有分子と反応して、薬物（例えば治療薬）を、N-アクリロキシスクシンイミドモノマーからもたらされる重合化残基によりコポリマー主鎖にコンジュゲートできるようにすることを理解する。このようにして、重合後のコポリマー主鎖の官能化は、薬物の負荷およびポリマーコンジュゲートの形成を促進し得る。
【０１０４】
代替的実施態様において、第3コモノマーは、本明細書に記載の式(I)または(II)で示されるモノマー-薬物コンジュゲートである。このような実施態様において、薬物は、第1と第2モノマーが重合したモノマー-薬物コンジュゲートの結果として、ポリマーコンジュゲートへ組み込まれる。
【０１０５】
第1、第2および第3コモノマーは、適切な比率でコポリマー主鎖に存在し得る。
【０１０６】
一実施態様において、コポリマー主鎖における第1と第2コモノマーのモル比は、4：1から1：4の範囲であり得て、好ましくは約2：1から1：1の範囲のモル比である。
【０１０７】
いくつかの実施態様において、第1および第2コモノマーは一緒に、モル基準で、コポリマー主鎖中に少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも80％または少なくとも90％の重合化残基を形成し得る。
【０１０８】
第3コモノマーは、所望の量で存在し得る。いくつかの実施態様において、第3コモノマーは、約5〜30 mol％のコポリマー主鎖、好ましくは約10〜20 mol％のコポリマー主鎖の量で存在する。
【０１０９】
一連の実施態様において、直鎖コポリマー主鎖は、
N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドである、第1コモノマー；
2-ヒドロキシエチルアクリレート、2-メトキシエチルアクリレート、2-(ジエチレングリコール)エチルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)アクリレート、ポリ(エチレングリコール)メタクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、N-アクリロイルアミド-エトキシエタノール、N,N-ジメチルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)メタクリルアミド、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アクリルアミド、アクリルアミド、N-アクリロイルモルホリン、N-プロピルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、メタクリルアミド、ジ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、2-(ジメチルアミノ)エチルアクリレート、2-(ジエチルアミノ)エチルアクリレート、3-(ジメチルアミノ)プロピルアクリレート、(3-アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸2-アミノエチル塩酸塩、[3-(メタクリロイルアミノ)プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド、2-カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、N-カルボキシエチルアクリルアミド、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸ナトリウム、3-スルホプロピルメタクリレートカリウム塩、メタクリル酸、3-[[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチルアンモニオ]プロピオネート、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、3-[[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-アンモニオ]プロピオネート、2-アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、N-(2-プロピニル)-アクリルアミド、N-(3-アジドプロピル)-アクリルアミド、N-(3-アジドプロピル)-メタクリルアミド、および酢酸ビニルより選択される、第2コモノマー；ならびに
薬物含有分子と反応できる官能基を含むアクリロイルまたはメタクリロイルモノマー、およびモノマーとコンジュゲートした薬物を含むアクリロイルまたはメタクリロイルモノマーより選択される、第3コモノマー
からもたらされる重合化残基を含む。
【０１１０】
当業者は、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドが、生物医学用途のための薬物の担体として適する、水溶性、生体適合性、非免疫原性および無毒性のポリマーを形成することを理解する。
【０１１１】
一連の実施態様において、第1コモノマーが、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドであるとき、第2コモノマーは、アクリル酸、メタクリル酸、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミドおよびビニルエステルより選択されるクラスに属するモノマーである。
【０１１２】
一形態において、第1コモノマーが、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドであるとき、第2コモノマーは、2-ヒドロキシエチルアクリレート、2-メトキシエチルアクリレート、2-(ジエチレングリコール)エチルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)アクリレート、ポリ(エチレングリコール)メタクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、N-アクリロイルアミド-エトキシエタノール、N,N-ジメチルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、アクリルアミド、N-アクリロイルモルホリン、N-プロピルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、ジ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、2-(ジメチルアミノ)エチルアクリレート、2-(ジエチルアミノ)エチルアクリレート、3-(ジメチルアミノ)プロピルアクリレート、(3-アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸2-アミノエチル塩酸塩、2-カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、N-カルボキシエチルアクリルアミド、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸ナトリウム、3-スルホプロピルメタクリレートカリウム塩、メタクリル酸、N-アクリロキシスクシニド、3-[[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチルアンモニオ]プロピオネート、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、3-[[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-アンモニオ]プロピオネート、2-アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、および[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシドより選択される。
【０１１３】
一連の実施態様において、コポリマー主鎖は、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドと、N-アクリロイルモルホリン、N-イソプロピルアクリルアミド、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルアクリレートおよびポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、好ましくはN-アクリロイルモルホリンおよびN-イソプロピルアクリルアミドからなる群より選択される、第2コモノマーの重合化残基を含む。
【０１１４】
特定の一連の実施態様において、ポリマーコンジュゲートの直鎖コポリマー主鎖は、
N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドである、第1コモノマー；
N-アクリロイルモルホリン、およびN-イソプロピルアクリルアミドより選択される、第2コモノマー；および
それにコンジュゲートする薬物を含むN-アクリロキシスクシンイミドおよびアクリレートモノマーより選択される、第3コモノマー
からもたらされる重合化残基を含む。
【０１１５】
アクリレートモノマー-薬物コンジュゲートの例は、本明細書に記載の式(III)で示され、ここで、これらの式においてRcは、Hであり、Xは、Oである。モノマー-薬物コンジュゲートは、モノマーのアクリロイル部分にコンジュゲートした薬物を有する。コンジュゲートした薬物は、モノマーの重合およびコポリマーへのその組込みの後、直鎖コポリマー主鎖の側鎖基を形成する。
【０１１６】
特定の実施態様において、ポリマーコンジュゲートの直鎖コポリマー主鎖は、ターポリマーである。例示的なターポリマーは、
N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドである、第1コモノマー；
N-アクリロイルモルホリン、およびN-イソプロピルアクリルアミドより選択される、第2コモノマー；および
それにコンジュゲートする薬物を含むN-アクリロキシスクシンイミドおよびアクリレートモノマーより選択される、第3コモノマー
からもたらされる重合化残基からなる。
【０１１７】
一連の実施態様において、コポリマー主鎖は、コモノマーとしてN-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドおよびN-イソプロピルアクリルアミドの重合化残基を含む。有利には、コポリマーの一部としてこれらのモノマーからもたらされる残基を含む直鎖統計コポリマー主鎖を有するポリマーコンジュゲートは、インビボでポリマーコンジュゲートの投与後、予測より高い血漿濃度を示すことが見出された。
【０１１８】
少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされる直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖を含むポリマーコンジュゲートの利点は、ポリマーコンジュゲートの特性を調整するためにコポリマーの組成を調節し得ることである。例えば、コモノマーにおけるエチレン性不飽和基のタイプ、コモノマーに存在する置換基のタイプ、および各コモノマーの相対量は各々、ポリマーコンジュゲートの特性、例えば親水性、流体力学的体積および薬物動態特性に影響を及ぼし得る。したがって、コポリマーがもたらされるモノマーのタイプを調節することによりコポリマーの組成に対して調節がなされ得る。これが、次にポリマーコンジュゲートの特性を調節し、それ故に特定の用途（例えば特定薬物の送達）のためのポリマーコンジュゲートを調整するための手順を提供し得る。
【０１１９】
例えば、直鎖コポリマーの組成は、コポリマーの流体力学的体積に影響を及ぼし得て、これが、次にコポリマーを含むポリマーコンジュゲートの薬物動態に影響を及ぼし得ることが観察された。より大きい流体力学的体積を示す直鎖コポリマー主鎖は、より遅い速度で除去され得て、それ故に、より小さい流体力学的体積を示すものよりインビボでより長い滞留性を有する。本明細書に記載の少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされる直鎖コポリマー主鎖を含むポリマーコンジュゲートは、有利には、コポリマー主鎖の形成において用いられる異なるコモノマーの選択により、異なる流体力学的体積を示すように調整され得る。
【０１２０】
一例として、コポリマーの主構成要素としてN-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド（HPMA）およびN-イソプロピルアクリルアミド（NIPAM）からもたらされる重合化残基を含むコポリマーは、生理学的温度（約37℃）にてコポリマーの細部および組成より予測されるより大きい流体力学的体積を示し得ることが観察された。理論に拘束されることを望むものではないが、この予想外の流体力学的体積は、コポリマーにおけるHPMAとNIPAMの組合せの存在と関連し得ると考えられ、ここで、HPMAは、NIPAMの下限臨界溶液温度（LCST）に影響を及ぼし得る。NIPAMは、温度感受性水膨潤性ポリマーの製造において用いられ、他の水溶性モノマーと組み合わせて、ポリマーの下限臨界溶液温度（LCST）を変更し得る。しかしながら、p(NIPAM)ポリマーは、一般的に約37℃にて収縮し、したがって、温度が室温（約20℃）から上昇するにつれて、NIPAMを含むコポリマーは、収縮を受け、これによりインビボで流体力学的体積が減少したポリマーを形成すると予測され得る。しかしながら、HPMAおよびNIPAMからもたらされる重合化残基を含むコポリマーが、37℃にて流体力学的体積の増加を示すという発見は予想外である。流体力学的体積の変化は、ポリマーコンジュゲートの薬物動態に影響を及ぼし、それ故にインビボにおいてコンジュゲートのより長いまたはより短い循環半減期を提供し得る。
【０１２１】
少なくとも3つの異なるコモノマーからもたらされるコポリマーと関連し得る更なる利益は、少なくとも3つの異なるモノマーが使用されるときに可能である潜在的なモノマー組合せの数がより多いことによるコポリマーの組成の変更におけるより大きな柔軟性である。これは、潜在的にわずかなモノマー組合せしか利用可能ではなく、それ故に、コポリマーの組成を変化させる際に柔軟性が小さいであろう、3つ未満のコモノマーで形成されるコポリマーと対照的である。
【０１２２】
また、直鎖コポリマー主鎖が、3つの異なるコモノマーからもたらされる重合化残基を含むとき、3つのコモノマーのうち2つからもたらされる残基は、第3コモノマーからもたらされるものと比較して比較的大量に存在し得る。したがって、ポリマーコンジュゲートの特性は、コポリマー主鎖の主構成要素である、2つのコモノマーにより大きく影響され得る。したがって、2つのコモノマーは、ポリマーコンジュゲートに所望の物理特性を与えるために選択され得る。第3コモノマーからもたらされるコポリマーにおける残基は、薬物のコンジュゲーションのための部位を提供し得て、それ故に、所望の薬物負荷に応じて、第3コモノマーからもたらされる比較的少量の重合化残基が存在し得る。第3コモノマーのエチレン性不飽和基は、コポリマー主鎖における第3コモノマーのランダム分布を促進する反応性を有するために選択され得る。このようにして、コンジュゲートする薬物のランダム分布は、コポリマー鎖長に沿ってもたらされ得る。
【０１２３】
炭素原子から構成される直鎖脂肪族コポリマー主鎖を含む、本発明のポリマーコンジュゲートはまた、有利にはインビボで安定性を示す。すなわち、脂肪族コポリマー主鎖は、生理学的環境において分解（degraded）または崩壊（broken down）されないが、代わりにポリマー全体として除去される。コポリマー主鎖の分解を制限することにおいて、より小さいポリマー断片と関連し得る、潜在的な蓄積または毒性に関連する問題は、少なくとも軽減または回避し得る。さらに、ADMET（吸収、分布、代謝、排泄、毒性）の観点から、無傷のポリマー分子の全体構造クリアランスは、ポリマー断片のものより予測可能である。したがって、これらの利点は、関連する規制当局から規制当局の承認を得るのを助け得る。
【０１２４】
コポリマー主鎖は、任意の適切なサイズまたは分子量であり得る。好ましくは、コポリマー主鎖は、約1 kDa以上であり得る。一つの好ましい例において、コポリマー主鎖は、約40 kDa以下の分子量、好ましくは約15〜35 kDaの範囲の分子量を有する。適切には、コポリマー主鎖は、インビボにおけるコンジュゲートする薬物および結合部分の滞留性を増加させるのを助けるサイズである。
【０１２５】
いくつかの実施態様において、コポリマー主鎖は、ポリマーコンジュゲートを蓄積させるために許容される循環半減期を促進するのに十分大きいサイズであるが、送達後腎クリアランスを可能とするのに十分小さいサイズである。
【０１２６】
本明細書に記載の直鎖脂肪族コポリマー主鎖は、任意の適切な方法で製造され得る。本明細書で提供されるコポリマー主鎖を製造するために用いられる適切な合成方法は、フリーラジカル重合である。
【０１２７】
当業者は、モノマーのフリーラジカル重合は、種々のコモノマーのエチレン性不飽和部分によるフリーラジカル種の製造を含むことを理解する。これは、種々のコモノマーを一緒に共有結合する炭素-炭素結合の形成をもたらす。
【０１２８】
一連の実施態様において、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされるコポリマー主鎖は、リビングラジカル重合法を用いて形成される。特定の実施態様において、可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）が、本発明のポリマーコンジュゲートのコポリマー主鎖を合成するために用いられる。リビングラジカル重合法、例えばRAFTを用いて製造されるコポリマー主鎖と関連する1つの利点は、得られるポリマーが狭い多分散指数（PDI）を有することである。いくつかの特定の実施態様において、本明細書に記載のポリマーコンジュゲートのコポリマー主鎖は、約1.5以下、好ましくは約1.3以下の多分散指数を有する。
【０１２９】
また、RAFT重合を用いて形成されるコポリマー主鎖は、ポリマーを形成するために用いられるRAFT剤からもたらされる末端基を含む。RAFT末端基は、結合部分を直鎖コポリマー鎖の末端とつなぐために用いられ得る、直鎖ポリマーの一方または両方の末端にて末端官能基を生成するために除去または改変され得る。例えば、RAFT末端基の除去は、結合部分または薬物のコンジュゲーションのために利用され得る、コポリマー主鎖の末端にて末端チオール官能基を提供し得る。直鎖コポリマー主鎖の形成のために使用され得るRAFT剤のいくつかの例は、Macromolecules, 2012, 45, 5321-5342に記載されている。
【０１３０】
本発明のポリマーコンジュゲートはまた、直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖の末端にコンジュゲートした結合部分を含む。結合部分は、コポリマーのアルファ(α)末端およびオメガ(ω)末端より選択されるものにコンジュゲートする。
【０１３１】
薬物（例えば治療薬または診断薬）はまた、コポリマー主鎖にコンジュゲートする。薬物は、結合部分と反対側のコポリマー主鎖の末端、および／またはポリマー主鎖の1つ以上のモノマー単位の側鎖基にコンジュゲートし得る。
【０１３２】
特定の実施態様において、本明細書に記載のポリマーコンジュゲートは、コポリマー主鎖のアルファ末端（α末端）とカップリングする結合部分を含む。このような実施態様において、ポリマーコンジュゲートは、コポリマー主鎖のオメガ末端（ω末端）および／またはコポリマー主鎖のモノマー単位の側鎖基とカップリングし得る、薬物をさらに含む。
【０１３３】
「結合部分」は、特定の疾患状態と関連する細胞表面エピトープなどの標的化合物に対して特異的親和性を有する基である。いくつかの実施態様において、結合部分は、細胞表面抗原を認識するか、または標的細胞の表面上の受容体と結合する。
【０１３４】
結合部分はそれと結合するポリマーコンジュゲートの生体分布特性を向上させ、標的細胞または組織とのコンジュゲートの会合を向上させることにより、コンジュゲートの細胞分布および細胞取り込みを改善し得る。
【０１３５】
結合部分を直鎖コポリマー主鎖の末端と結合することによって、ポリマーの立体的かさ高さにより妨げられることが少なくなり、それ故に標的部位、例えば標的抗原または受容体に結合するために近づくことが容易になると考えられる。
【０１３６】
さらに、結合部分をコポリマー主鎖の末端と結合することによって、主鎖への結合物分の効率的なコンジュゲーションが達成され得る。これは、直鎖コポリマーの末端における末端官能基が、化合物を含有する適切な結合部分と反応するときに、結合部分の結合を促進し得るためである。対して、直鎖コポリマー主鎖の中間位置に結合部分を結合させる化学反応は、反応の有効性に影響を及ぼす立体因子のために、効率が低下し得る。
【０１３７】
ポリマーコンジュゲートの結合部分は、細胞または組織部位を標的とするのに有用な一連の適切な基より選択され得る。当業者は、対象とする特定の細胞または組織部位を標的とすることができる特定の結合部分を選択できる。
【０１３８】
いくつかの実施態様において、結合部分は、タンパク質である。例示的なタンパク質は、抗体である。
【０１３９】
いくつかの特定の実施態様において、結合部分は、抗体、抗体断片および抗原結合断片からなる群より選択される。特定の実施態様において、結合部分は、Fab'断片である。
【０１４０】
完全長のインタクト抗体および抗体断片は、本発明のポリマーコンジュゲートにおいて結合部分として用いられ得る。
【０１４１】
当業者は、抗体断片が、様々なペプチダーゼまたは化学物質での抗体の消化により生成され得ることを理解する。したがって、例えば、ペプシンは、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結の下で抗体を消化して、それ自体がジスルフィド結合によりVH-CH1と結合する軽鎖であるFabのダイマーであるF(ab')2を生成する。F(ab')2は、穏やかな条件下で減少して、ヒンジ領域におけるジスルフィド連結を分解し、これによりF(ab')2ダイマーをFab'断片へ変換する。Fab'断片は、本質的に、還元システイン残基チオールを含有するヒンジ領域の一部を有するFab断片である。抗体断片はまた、Fab、scFvまたは任意の他のよく理解されている抗体断片として直接的に操作され、発現され得る。
【０１４２】
コポリマー主鎖の末端への結合部分の結合は、任意の適切な方法で、例えば多くのバイオコンジュゲーション化学アプローチのいずれか1つにより、達成される。
【０１４３】
一実施態様において、結合部分が、抗体断片、例えばFab'断片であるとき、結合部分は、抗体断片のチオール残基によりコポリマー主鎖にコンジュゲートする。
【０１４４】
一連の実施態様において、結合部分は、リンカーによりコポリマー主鎖にコンジュゲートする。好ましくは、結合部分をコポリマーにコンジュゲートさせるリンカーは、生物学的に安定なリンカーである。不十分な安定性が、早発なまたは望ましくない結合部分の喪失または放出をもたらし、その結果コンジュゲートの標的化能力の喪失をもたらし得るため、コポリマー主鎖および結合部分は、生物学的環境において互いににコンジュゲートしたままであることが重要であり得る。コポリマー-結合部分コンジュゲートの生体内安定性は、コポリマー主鎖と結合部分を架橋するリンカーの化学的性質に依存し得る。
【０１４５】
本明細書で用いられる「連結部分」または「リンカー」は、分子、例えば結合部分または薬物（例えば治療薬または診断薬）をコンジュゲートのコポリマー主鎖に連結する、化学結合または多官能性（例えば二官能性）残基である。リンカーは、生分解性（すなわち切断可能）または非生分解性（すなわち生物学的安定または切断不能）であり得る。切断可能なリンカーは、とりわけ、加水分解性、酵素切断可能、pH感受性、光分解性またはジスルフィドリンカーであり得る。
【０１４６】
本発明に有用なリンカーは、様々な化合物からもたらされ得る。クリックケミストリー、マレイミドケミストリーおよびNHS-エステルにおいて用いられるリンカーが、用いられ得る。リンカーは、アミド、エステル、エーテル、チオーエーテル、カルバメート、ウレア、アミン、トリアゾール、ジスルフィド、ヒドラゾン、または分子（例えば結合部分または薬物）をコポリマー主鎖にコンジュゲートさせるのに適切な他の連結を提供し得る化合物からもたらされ得る。
【０１４７】
いくつかの実施態様において、結合部分をコポリマー主鎖にコンジュゲートさせるためのリンカー化合物は、生分解性または非生分解性（すなわち生物学的安定な）連結を提供し得る。生分解性連結は、アミド、エステル、カルバメート、ウレアまたはアミン部分を含み得る。一般的に許容される生物学的安定な連結は、トリアゾール、エーテルおよびチオーエーテル部分を含み得る。
【０１４８】
いくつかの実施態様において、結合部分は、チオーエーテル部分を含むリンカーによりコポリマー主鎖にコンジュゲートする。
【０１４９】
いくつかの実施態様において、結合部分は、式(I)：
【化８】
2020502226.tif 000009
(I)
［式中、
Qは、結合部分を表し；
Raは、リンカーの残りの部分を表し；そして
【化９】
2020502226.tif 000010
は、コポリマー主鎖の末端への結合部位を表す］
で示される部分を含むリンカーによりコポリマー主鎖にコンジュゲートする。
【０１５０】
特定の実施態様において、結合部分は、式(II)：
【化１０】
2020502226.tif 000011
(II)
［式中、
Qは、結合部分を表し；
R1は、HまたはC1-C4アルキルであり；
Rbは、結合またはC2アルキルであり；
Lは、連結部分であり；そして
【化１１】
2020502226.tif 000012
は、コポリマー主鎖の末端への結合部位を表す］
で示される部分を含むリンカーによりコポリマー主鎖にコンジュゲートする。
【０１５１】
式(II)のいくつかの特定の実施態様において、連結部分(L)は、C2-C3ポリエーテルを含む。一つの好ましい例において、Lは、ポリ(エチレングリコール)を含む。一例において、Lは、下記構造：
【化１２】
2020502226.tif 000013
で示されるポリ(エチレングリコール)部分を含む。
【０１５２】
式(I)または(II)で示されるリンカーは、適切な官能化リンカー分子をコポリマー主鎖の末端における末端官能基および結合部分に存在する官能基と共有結合反応させることにより形成され得る。そして、リンカーは、コポリマー主鎖と結合部分間を架橋し、それらを結合する。
【０１５３】
一形態において、式(I)または(II)で示される部分は、チオール官能基（例えばチオアルキル）がマレイミド部分と反応して、下記構造：
【化１３】
2020502226.tif 000014
で示されるS-マレイミド基を生成するときに、形成され得る。
【０１５４】
いくつかの実施態様において、式(I)または(II)で示されるリンカーは、適切に二官能化したリンカー分子からもたらされ得る。
【０１５５】
一実施態様において、コポリマー主鎖は、末端チオール官能基を含み、リンカー分子は、コポリマーの末端チオール官能基と共有結合反応するように適合させた官能基を有する二官能性化合物である。二官能性化合物の官能基は、結合部分に存在する官能基と共有結合反応するように適合させ得る。
【０１５６】
一連の実施態様において、リンカー分子は、2つの不飽和官能基を含む二官能性化合物である。このような二官能性分子は、
【化１４】
2020502226.tif 000015
で示されるビスマレイミドであり得る。
【０１５７】
二官能性化合物を反応させてリンカーを形成させるとき、不飽和官能基（すなわちマレイミド部分）は、コポリマー主鎖の末端にて末端チオール官能基でのマイケル付加に関与して、リンカーを主鎖に結合させ得る。リンカーが結合すると、その後、残りの不飽和官能基（すなわちマレイミド部分）は、チオール残基を含む結合部分と共有結合反応し、これによりチオールにより結合部分をコポリマー主鎖にコンジュゲートさせ得る。結合部分とリンカー間の反応は、チオーエーテル部分を形成する。一つの好ましい例において、チオーエーテル部分を含むリンカーは、式(I)または(II)で示されるものであり得る。
【０１５８】
別の一連の実施態様において、リンカーは、コポリマー主鎖の末端官能基を中間体化合物と共有結合反応させ、中間体種を形成させることにより導入され得て、中間体種は、その後コポリマー鎖の末端にて結合部分と反応させるのに適した官能基を導入するために鎖伸長され得る。コポリマー主鎖がジアミン化合物と反応して、アミノ官能基と中間体を形成する例を下記に示す。その後、アミノ官能基は、結合部分のチオール残基との反応のためのマレイミド官能基を導入するために、マレイミド含有化合物と反応し得る。
【化１５】
2020502226.tif 000016
【０１５９】
コポリマー主鎖への結合部分のコンジュゲーションのためのリンカーを導入するのに適した他の中間体化合物およびマレイミド含有化合物は、当業者に公知である。
【０１６０】
結合部分とのコンジュゲーションのための直鎖コポリマー主鎖の末端にてマレイミド官能基を提供する部分のいくつかの例を下記に示す：
【化１６】
2020502226.tif 000017
(A)直鎖コポリマー主鎖の末端チオール上へ導入されるビス-マレイミド
【化１７】
2020502226.tif 000018
(B)直鎖コポリマー主鎖の末端カルボン酸上に導入されるマレイミド-PEG
【化１８】
2020502226.tif 000019
(C)PEG-アミドリンカーにより直鎖コポリマー主鎖の末端チオール上へ導入されるマレイミド
【化１９】
2020502226.tif 000020
(D)PEGアミドリンカーにより直鎖コポリマー主鎖の末端カルボン酸上へ導入されるマレイミド
【０１６１】
当業者は、タンパク質の存在下でよく機能することが示されているチオールと選択的に反応する多くの他の官能基があること理解する（例えばビニルスルホン、ピリジルジスルフィド、ハロアセチル（例えばブロモアセチルまたはヨードアセチル））。これらの化学物質のいずれか1つは、頑健で速く、明白であり、安定な生成物を生じ、生物学的用途に関してよく理解され、許容されている。
【０１６２】
本明細書に記載のポリマーコンジュゲートはまた、直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖にコンジュゲートする薬物を含む。薬物は、コポリマー主鎖の末端および／またはコポリマー主鎖のモノマー単位の側鎖基にコンジュゲートし得る。
【０１６３】
本明細書に記載のポリマーコンジュゲートの一実施態様において、薬物は、直鎖コポリマー主鎖の末端にコンジュゲートする。このような実施態様において、薬物および結合部分がコポリマーの異なる末端にコンジュゲートすることが条件である。すなわち、コンジュゲートが主鎖のα末端にコンジュゲートした結合部分を含む場合、薬物はコポリマー主鎖のω-末端にカップリングし、その逆もある。
【０１６４】
別の一実施態様において、薬物は、コポリマー主鎖にコンジュゲートし、主鎖からの側鎖である。したがって、薬物は、コポリマー主鎖の重合化モノマー単位に結合し、そこからの側鎖である。このような実施態様において、薬物は、コポリマー主鎖からの側鎖である官能基により共有結合的にコンジュゲートし得る。
【０１６５】
本発明のポリマーコンジュゲートは、少なくとも1つの薬物を含み、複数の薬物を含み得る。複数の薬物が存在するとき、それらは各々、同一タイプまたは異なるタイプの薬物であり得る。
【０１６６】
ポリマーコンジュゲートが複数の薬物を含むとき、薬物の各々は、コポリマー主鎖からの側鎖であり得る。あるいは、複数の薬物の1つは、コポリマー主鎖の末端にコンジュゲートし得て、一方、複数の薬物の残りは、コポリマー主鎖からの側鎖である。
【０１６７】
直鎖コポリマー主鎖にコンジュゲートする1つまたは複数の薬物は、治療薬および診断薬より選択され得る。しかしながら、本発明は、いずれかの特定の薬物との使用に限定されるものではなく、多種多様な異なる薬物が、直鎖コポリマー主鎖にコンジュゲートし得る。
【０１６８】
本発明のポリマーコンジュゲートは、異なる薬物の組合せ、例えば2つ以上の治療薬または診断薬の組合せ、または治療薬および診断薬の組合せを含み得る。
【０１６９】
一連の実施態様において、本明細書に記載のポリマーコンジュゲートは、コポリマー主鎖にコンジュゲートした診断薬を含む。診断薬は、疾患または障害の診断を補助する化合物または分子である。一形態において、ポリマーコンジュゲートは、診断薬を含み、ここで、診断薬は、タンパク質またはペプチドであり得る。
【０１７０】
診断薬に関して本明細書で用いられる、用語「ペプチド」および「タンパク質」は、ペプチド結合により共有結合したアミノ酸残基から構成される化合物を指すために用いられる。タンパク質またはペプチドは、少なくとも2つのアミノ酸を含んでいなければならず、タンパク質またはペプチド配列を含み得るアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに結合した2つ以上のアミノ酸を含む、任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で用いられる用語は、例えばペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーを当該技術分野において一般的に指す短鎖と、多くのタイプがあるタンパク質を当該技術分野において一般的に指す長鎖の両方を指す。
【０１７１】
一連の実施態様において、診断薬は、受容体、リガンドおよび酵素からなる群より選択され得る。
【０１７２】
診断薬は、造影剤であり得る。造影剤は、光音響イメージング、蛍光イメージング、超音波、PET、CAT、SPECTおよびMRIを含むがこれらに限定されない、1つ以上のイメージング技術においてコントラストを提供し得る。
【０１７３】
診断薬は、フルオロフォアまたは色素であり得る。
【０１７４】
一連の実施態様において、本明細書に記載のポリマーコンジュゲートは、コポリマー主鎖にコンジュゲートした治療薬を含む。治療薬は、薬物、および治療目的のために設計された医薬活性を有する他の分子を含む。治療薬はまた、プロドラッグを含み得る。プロドラッグは、インビボで治療的に活性な形態に変換可能な薬物の不活性な形態である。
【０１７５】
治療薬は、広範な薬物より選択され得る。治療薬の例としては、親水性または疎水性薬物が挙げられ得る。
【０１７６】
一つの好ましい例において、治療薬は、小分子（すなわち約1000 Da以下の分子量を有する分子）である。
【０１７７】
例示的な小分子は、抗新生物（すなわち抗癌）剤であり得る。抗癌剤としては、モノメチルアウリスタチンE（MME）、メトトレキサート、トリメトレキサート、アドリアマイシン、タキソテール、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パミドロン酸二ナトリウム、シクロホスファミド、エピルビシン、メゲストロール、タモキシフェン、パクリタキセル、ドセタキセル、カペシタビンおよびゴセレリン酢酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７８】
本発明のポリマーコンジュゲートは、極めて芳香族性な化学構造および／または親油性特性のため水に不溶性であり得るか、または難溶性であり得る小分子細胞毒性薬を可溶化することができる。
【０１７９】
さらに、多くの低分子量小分子薬物は、体内から速やかに除去され、数分間で循環を離れる。本発明の実施態様のポリマーコンジュゲートは、より長い時間循環中に残ることができ、標的部位における薬物取込みの潜在的な増加をもたらす。ポリマーコンジュゲートに結合部分が含まれることは、受容体介在性送達により所望の組織部位を標的とすること増加を生じさせ得る。
【０１８０】
本発明のポリマーコンジュゲートの一部を形成する1つまたは複数の薬物は、共有結合またはリンカーにより直鎖脂肪族コポリマー主鎖にコンジュゲートし得る。1つ以上の薬物のコンジュゲートのために用いられるリンカーは、生分解性または非生分解性（すなわち生物学的安定な）リンカーであり得る。生分解性および非生分解性リンカーの例は、本明細書に記載のとおりである。
【０１８１】
結合部分を直鎖コポリマー主鎖にコンジュゲートさせるための本明細書において上記したリンカーはまた、薬物をコポリマー主鎖にコンジュゲートさせるために用いられ得る。
【０１８２】
一連の実施態様において、ポリマーコンジュゲートが診断薬を含むとき、診断薬は、非生分解性リンカーにより直鎖脂肪族コポリマー主鎖にコンジュゲートし得る。非生分解性リンカーは、生物学的環境において切断不能または一般的に生物学的安定であるとみなされる。非生分解性リンカーの使用は、コンジュゲートからの診断薬の損失を標的細胞または組織の近くに制限するために好ましい場合がある。
【０１８３】
一実施態様において、非生分解性リンカーは、トリアゾール部分を含み得て、これは、生分解またはインビボでの切断を受けにくい。当業者は、アルキニルおよびアジド官能基をクリックケミストリー条件下で共有結合反応させたときにトリアゾール部分が形成されること理解する。したがって、診断薬は、アルキニルまたはアジド官能基を含み得て、これは、直鎖コポリマー主鎖からの側鎖である相補的アルキニルまたはアジド官能基とクリックケミストリー条件下で反応し、これによりコポリマー主鎖に診断薬を連結するトリアゾール部分を形成することができる。
【０１８４】
一連の実施態様において、ポリマーコンジュゲートが治療薬を含むとき、治療薬は、生分解性リンカーにより直鎖脂肪族コポリマー主鎖にコンジュゲートし得る。生分解性リンカーは、特定の条件下で分解または切断を受けやすく、これにより、ポリマーコンジュゲートがインビボの所望の部位に到達すると適切な刺激に応じて治療薬の放出を促進するため、有利であり得る。
【０１８５】
一つの好ましい例において、治療薬は、酵素切断可能な生分解性リンカーによりコポリマー主鎖にコンジュゲートする。「酵素切断可能なリンカー」は、1つ以上の酵素により分解を受ける連絡を指す。多くの酵素切断可能なリンカーが用いられ得て、このようなリンカーは当業者に公知である。一実施態様において、生分解性リンカーは、バリン-シトルリン-パラ-アミノ安息香酸（Val-Cit-PABA）、バリン-アラニン（Val-Ala）およびフェニルアラニン-リシン（Phe-Lys）からなる群より選択される部分を含む、酵素切断可能なリンカーである。酵素切断可能なリンカーは、強力な医薬的に活性な形態で治療薬の所望の放出を促進することがわかっている。
【０１８６】
一の特定の実施態様において、本発明によるポリマーコンジュゲートは、
2つの末端を有する直鎖脂肪族統計ターポリマー主鎖；
コポリマー主鎖の末端にコンジュゲートしたFab'断片；および
コポリマー主鎖にコンジュゲートした少なくとも1つの薬物
を含み、ここで該薬物は、ターポリマー主鎖の末端にコンジュゲートするか、またはターポリマー主鎖にコンジュゲートし、その側鎖であるが、ただし、主鎖の末端にコンジュゲートするとき、薬物およびFab'断片は、ターポリマー主鎖の異なる末端にコンジュゲートする。
【０１８７】
本明細書で用いられる「ターポリマー」は、3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされるコポリマーである。したがって、ターポリマーは、3つのコモノマーからもたらされる重合化残基を有する。
【０１８８】
一つの好ましい例において、ターポリマー主鎖がもたらされる3つの異なるエチレン性不飽和モノマーは、各親水性モノマーである。
【０１８９】
いくつかの実施態様において、ターポリマーは、3つの異なるエチレン性不飽和モノマーからもたらされる、ここで、各モノマーは、異なるエチレン性不飽和基を有する。
【０１９０】
一つの好ましい例において、異なるエチレン性不飽和基を有する3つのモノマーは、アクリル酸、メタクリル酸、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミドおよびビニルエステルより選択されるモノマーの異なるクラスに属する。これらのモノマーのクラスに属するモノマーのいつくかの特定の例は、本明細書において上記のとおりである。
【０１９１】
一つの好ましい例において、薬物は、治療薬である。このような実施態様において、治療薬は、生分解性リンカー、例えば本明細書に記載の酵素切断可能なリンカーによりターポリマー主鎖にコンジュゲートし得る。
【０１９２】
本発明のポリマーコンジュゲートは、様々な異なる合成アプローチを用いて製造され得る。
【０１９３】
一実施態様において、ポリマーコンジュゲートは、最初に直鎖脂肪族統計コポリマーを合成し、その後結合部分および薬物をコンジュゲートさせて、コポリマーを予め形成させることにより製造され得る。最初に結合部分をコポリマーにコンジュゲートし、続いて薬物にコンジュゲートしてもよく、またはその逆であってもよい。結合部分および薬物は、コポリマーにおける適切な官能基によりコポリマーにコンジュゲートし得る。
【０１９４】
したがって、第2態様において、本発明は、生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲートの製造方法であって、下記工程：
(a)2つの末端を有し、コポリマー主鎖の第1末端にて結合部分をコンジュゲートさせるための第1官能基と、コポリマー主鎖の第2末端およびコポリマー主鎖からの側鎖より選択される位置にて薬物をコンジュゲートさせるための第2官能基を含む直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖を形成するフリーラジカル重合条件下で、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーを含むモノマー組成物を重合させる工程；
(b)第1官能基を結合部分含有分子と共有結合反応させ、結合部分をコポリマー主鎖の第1末端にコンジュゲートさせる工程；および
(c)第2官能基を薬物含有分子と共有結合反応させ、コポリマー主鎖の第2末端およびコポリマー主鎖からの側鎖より選択される位置にて薬物をコポリマー主鎖にコンジュゲートさせる工程
を含む、製造方法提供する。
【０１９５】
当業者は、上記製造方法における工程(b)および(c)の順序が、逆になってもよく、その結果、薬物が、結合薬物のコンジュゲート前にコポリマー主鎖にコンジュゲートし得ることを理解する。
【０１９６】
本明細書に記載の製造方法に従って形成されるコポリマー主鎖がブロックコポリマーを含まないことが条件である。したがって、本発明のポリマーコンジュゲートのコポリマー主鎖は、ブロックコポリマーでない。適切には、コポリマー主鎖は、統計コポリマーを含む。
【０１９７】
官能基がコポリマー主鎖の末端にあるとき、官能基は、末端官能基であるとみなされる。
【０１９８】
一つの好ましい例において、第2態様のモノマー組成物における異なるエチレン性不飽和コモノマーは、異なるエチレン性不飽和基を有する。コモノマーは、本明細書に記載のモノマーの異なるクラスに属し得る。
【０１９９】
モノマー組成物の重合は、適切には、フリーラジカル重合の条件下で行われる。一実施態様において、モノマー組成物は、リビングフリーラジカル重合、好ましくは可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合の方法により重合する。
【０２００】
フリーラジカル重合法を用いて、適切なコモノマーおよび所望によりフリーラジカルの供給源としての開始剤は、組み合わされ、フリーラジカル重合の条件下での反応が誘発される。特定の場合、コポリマー主鎖を形成するための製造方法は、少なくとも3つの異なるエチレン性不飽和モノマーを含むモノマー組成物を形成させ、モノマー組成物をフリーラジカル重合条件に供することを含む。フリーラジカル重合は、例えば溶液、分散液、懸濁液、エマルジョンまたはバルク中を含む、任意の適切な方法で実施され得る。
【０２０１】
モノマー組成物は、フリーラジカル重合反応を促進する1つ以上の更なる構成要素を含み得る。例えば、モノマー組成物は、ここで含まれるモノマーを溶解させるのに適切な溶媒を含み得る。溶媒は、有機溶媒または水性溶媒であり得る。溶媒の混合物が用いられ得る。溶媒の選択は、コポリマーを形成するのに用いられるコモノマーのタイプおよび用いられる重合条件（RAFT剤を含む）に依存し得る。
【０２０２】
RAFT重合が直鎖脂肪族コポリマー主鎖を製造するために用いられるとき、RAFT剤は、重合を促進するために選択される。様々なRAFT剤が用いられ得て、適切なRAFT剤の選択は、用いられるモノマー、および得られるポリマーが有し得るRAFT末端基のタイプに依存し得る。本発明のポリマーコンジュゲートのコポリマー主鎖の製造に適したRAFT剤の一例は、4-シアノ-4-(フェニルカルボノチオイルチオ)ペンタン酸である。当業者は、所望の組成物および官能基のコポリマーの形成に適したRAFT剤を選択できる。
【０２０３】
上記製造方法に従って製造される予め形成されたコポリマー主鎖は、少なくとも2つの官能基を含み、これらは、本明細書において第1官能基および第2官能基と称され得る。
【０２０４】
第1官能基は、結合部分をコンジュゲートさせるためのものであり、末端官能基であり、かつコポリマー主鎖の第1末端に位置する。第2官能基は、薬物をコンジュゲートさせるためのものであり、コポリマー主鎖の第2末端に位置する末端官能基または側鎖官能基のいずれかであり得る。「側鎖」であることにより、官能基は、コポリマー主鎖の炭素原子鎖の一部を直接形成しない。
【０２０５】
いくつかの実施態様において、直鎖コポリマー主鎖は、コポリマー鎖の一方の末端または両方の末端にて末端官能基を含む。1つまたは複数の末端官能基は、共有結合反応に関与して、結合部分をコポリマーの第1末端にコンジュゲートさせることができ、所望により、薬物をコポリマーの第2末端にコンジュゲートさせることもできる。
【０２０６】
いくつかの他の実施態様において、直鎖コポリマー主鎖は、結合部分をコンジュゲートさせるためにポリマー鎖の一方の末端にて末端官能基を含み、1つ以上の側鎖官能基もまた含む。
【０２０７】
いくつかの他の実施態様において、直鎖コポリマー主鎖は、2つの末端官能基を含み、コポリマー鎖の各末端に一つであり、コポリマー鎖からの側鎖である1つ以上の官能基もまた含む。末端官能基の1つは、結合部分をコンジュゲートさせるためのものである。他の末端官能基および／または1つもしくは複数の側鎖官能基は、治療薬または診断薬などの薬物とコンジュゲートさせるためのものである。
【０２０８】
側鎖官能基は、水との水素結合相互作用に関与できる場合があり、このようにして、コポリマー主鎖、したがってポリマーコンジュゲートの親水性を促進するのを助ける。側鎖官能基はまた、コポリマー主鎖への薬物のコンジュゲートおよび結合を促進してポリマーコンジュゲートを形成する共有結合反応に参加できる場合がある。
【０２０９】
直鎖コポリマー主鎖の第1官能基および第2官能基は、同一タイプまたは異なるタイプであり得る。
【０２１０】
第1官能基は、RAFT重合法が用いられて直鎖コポリマーを形成するとき導入される、RAFT末端基からもたらされ得る。あるいは、官能基は、RAFT末端基の除去または変換の際に形成され得る。例えば、チオカルボニルチオRAFT末端基は、チオール官能基へ変換され得る。当業者は、RAFT重合法を用いて製造される直鎖ポリマーは、2つのRAFT末端基を含み得て、RAFT末端基のいずれか1つは、結合部分とのコンジュゲートに適した官能基を形成してもよく、またはそれに変換されてもよいことを理解する。
【０２１１】
一連の実施態様において、直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖は、チオール末端官能基およびカルボン酸末端官能基を含み、ここで、チオールおよびカルボン酸官能基は、直鎖コポリマー鎖の異なる末端にある。
【０２１２】
いくつかの他のタイプの末端官能基は、RAFT末端基から生成し得る。他のタイプの末端官能基の例としては、ジチオカルバメート、スクシンイミジル、アジド、アルキニル、マレイミド、および環状アセタール官能基が挙げられるが、これらに限定されない。上記より選択される末端官能基は、末端チオール官能基に加えて、直鎖コポリマー主鎖に存在し得る。このような末端官能基は、末端チオールとはコポリマー鎖の異なる末端にある。
【０２１３】
当業者は、異なるRAFT剤が直鎖コポリマー鎖の1つまたは複数の末端にて異なるタイプの官能基を生成し得ることを理解する。直鎖コポリマー主鎖の1つ以上の末端に結合部分および薬物（必要に応じて）を結合させるための合成方法は、コポリマーの末端に存在する官能基のタイプに合わせて、および／または特定の結合部分または薬物に存在する官能基に合わせて選択され得る。
【０２１４】
直鎖コポリマーへの結合部分のコンジュゲーションは、結合部分含有分子とコポリマー鎖の末端にて第1官能基を共有結合反応させることにより進め得る。これは、コポリマーの末端と結合部分の直接カップリングをもたらす。
【０２１５】
あるいは、第1官能基は、リンカー分子と反応させ、官能基により直鎖コポリマーとリンカーをカップリングさせ得る。次いで、リンカー分子は、結合部分含有分子と共有結合反応させて、結合部分を中間リンカーにより直鎖コポリマーにコンジュゲートさせるのに利用可能である末端官能基を有する。一つの好ましい例において、リンカー分子は、直鎖コポリマーに結合部分をカップリングさせる非生分解性リンカーを提供する。非生分解性リンカーの例は、本明細書に記載のとおりである。
【０２１６】
結合部分をコポリマー主鎖にコンジュゲートさせるための特定のリンカー分子は、マレイミド含有リンカー分子であり、これは、コポリマー主鎖の第1末端にて第1官能基と反応して、コポリマーの第1末端にマレイミド官能基を導入し得る。リンカー分子との第1官能基のその後の反応を生じ得るマレイミド含有リンカーのいくつかの例を、下記に示す。
【化２０】
2020502226.tif 000021
【０２１７】
様々な結合部分含有分子が用いられ得る。いくつかの実施態様において、結合部分含有分子は、タンパク質、好ましくは、抗体、抗体断片または抗原結合断片を含む。一実施態様において、結合部分含有分子は、Fab'-SHである。
【０２１８】
直鎖コポリマーの末端に位置するとき、第2官能基は、RAFT末端基からもたらされ得る。
【０２１９】
あるいは、第2官能基が側鎖官能基であるとき、第2官能基は、官能化直鎖コポリマーを形成するために、モノマー組成物において適切に官能化されたコモノマーを加え、重合させることにより導入され得る。例示的な側鎖官能基は、ヒドロキシル、アミノ、カルボキシル、アルキニル、アジドおよびスクシンイミドであり得て、好ましくはスクシンイミドである。
【０２２０】
直鎖コポリマーへの薬物のコンジュゲーションは、第2官能基（コポリマーの末端および／またはコポリマーからの側鎖に位置する）を直接薬物含有分子と共有結合反応させることにより進められ得る。このような実施態様において、薬物含有分子は、直鎖コポリマーの第2官能基に相補的である官能基を含み得て、その結果、官能基間の反応は、コポリマー主鎖への薬物のカップリングをもたらす共有結合を形成する。
【０２２１】
一実施態様において、薬物含有分子は、診断薬または治療薬を含む。
【０２２２】
いくつかの実施態様において、薬物含有分子との第2官能基の共有結合反応は、リンカーにより進み得る。リンカーは、適切なリンカー分子からもたらされる生分解性（すなわち切断可能な）リンカーまたは非生分解性（すなわち切断不能な）リンカーであり得る。生分解性および非生分解性リンカーの例は、本明細書に記載のとおりである。
【０２２３】
一実施態様において、薬物含有分子は、治療薬および治療薬にカップリングした生分解性リンカーを含む。このような実施態様において、コポリマー主鎖における第2官能基は、薬物含有分子のリンカー部分における相補的な官能基と共有結合反応させて、生分解性リンカーによりコポリマー主鎖と治療薬を共有結合的にカップリングさせ得る。適切な生分解性リンカーは、酵素切断可能なリンカーであり得て、この例は、本明細書に記載のとおりである。
【０２２４】
あるいは、コポリマー主鎖における第2官能基は、最初にリンカー分子と共有結合反応させて、第2官能基により直鎖コポリマーとリンカーをカップリングさせ得る。次いで、カップリングしたリンカーは、薬物含有分子における相補的な官能基と共有結合反応させて、これにより中間リンカーにより直鎖コポリマーに薬物をコンジュゲートさせるのに利用可能である末端官能基を有する。いくつかの実施態様において、リンカーは、生分解性リンカー、例えば酵素切断可能なリンカーであり、この例は、本明細書に記載のとおりである。
【０２２５】
いくつかの実施態様において、モノマー組成物は、3つの異なるエチレン性不飽和コモノマーを含み、モノマー組成物の重合は、3つの異なるコモノマーからもたらされる重合化残基を含む直鎖脂肪族統計ターポリマーを生成する。
【０２２６】
本明細書に記載の本発明の第2態様の製造方法の一実施態様において、モノマー組成物は、
(a)N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドおよびN-(2-ヒドロキシプロピル)アクリルアミドより選択される、第1コモノマー；
(b)2-ヒドロキシエチルアクリレート、2-メトキシエチルアクリレート、2-(ジエチレングリコール)エチルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)アクリレート、ポリ(エチレングリコール)メタクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、N-アクリロイルアミド-エトキシエタノール、N,N-ジメチルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)メタクリルアミド、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アクリルアミド、アクリルアミド、N-アクリロイルモルホリン、N-プロピルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、メタクリルアミド、ジ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、2-(ジメチルアミノ)エチルアクリレート、2-(ジエチルアミノ)エチルアクリレート、3-(ジメチルアミノ)プロピルアクリレート、(3-アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸2-アミノエチル塩酸塩、[3-(メタクリロイルアミノ)プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド、2-カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、N-カルボキシエチルアクリルアミド、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸ナトリウム、3-スルホプロピルメタクリレートカリウム塩、メタクリル酸、3-[[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチルアンモニオ]プロピオネート、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、[2-(メタクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、3-[[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-アンモニオ]プロピオネート、2-アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、N-(2-プロピニル)-アクリルアミド、N-(3-アジドプロピル)-アクリルアミド、N-(3-アジドプロピル)-メタクリルアミド、および酢酸ビニルより選択される、第2コモノマー；および
(c)薬物含有分子と共有結合反応させるのに適合した官能基を含むアクリロイルまたはメタクリロイルモノマーである、第3コモノマー
を含む。
【０２２７】
重合化コモノマーは、得られたコポリマーにおいて重合化残基（すなわちモノマー単位）を形成する。
【０２２８】
第3コモノマーの官能基は、得られた直鎖脂肪族コポリマーにおいて側鎖官能基を形成し得る。側鎖官能基は、薬物含有分子と共有結合反応させて、薬物をコポリマー主鎖にコンジュゲートさせるのを補助することができる。
【０２２９】
一の特定の実施態様において、第3コモノマーは、N-アクリロイルオキシスクシンイミド（NAS）である。
【０２３０】
少なくとも3つの異なるコモノマーから直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖を形成するための一の例示的な製造方法を下記に示す。
【化２１】
2020502226.tif 000022
【０２３１】
第3コモノマーにおける官能基は、得られた直鎖脂肪族コポリマーにおける側鎖官能基を形成し得て、これは、診断薬または治療薬などの薬物のコンジュゲーションに利用可能である。側鎖官能基は、コポリマーの第2官能基であるとみなされ得る。
【０２３２】
したがって、第3コモノマーの組込み後にコポリマー主鎖上に提供される側鎖官能基は、主鎖上へ薬物を付加するための薬物含有分子と反応することができる。
【０２３３】
薬物を1つ以上のコポリマー側鎖官能基にコンジュゲートさせた後、任意の残存側鎖官能基（すなわち薬物とコンジュゲートしていない）は、反応して、側鎖官能基を非反応性部分へ変換し得て、これは、生物学的環境により適合性であり得る。例えば、直鎖コポリマー鎖からの側鎖である残存スクシンイミド官能基は、アルキルアミン、例えばプロピルアミンまたはイソプロピルアミンと反応して、側鎖基をアルキルアミド基へ変換し得る。この反応はまた、第3コモノマーからもたらされる重合化残基（例えばNAS）をアミド残基（例えばアクリルアミド残基）へ変換し得る。
【０２３４】
別の一実施態様において、ポリマーコンジュゲートは、複数の異なるエチレン性不飽和モノマーを含むモノマー組成物を重合させることにより製造され得て、ここで、モノマーの少なくとも1つは、それにコンジュゲートした薬物を含む。モノマー組成物の重合は、1つ以上の側鎖薬物を有する直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖を形成する。その後、薬物含有コポリマー分子は、結合部分とカップリングして、本発明のポリマーコンジュゲートを形成し得る。
【０２３５】
別の一態様において、本発明は、生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲートの製造方法であって、下記工程：
(a)少なくとも2つの異なるエチレン性不飽和モノマーおよびエチレン性不飽和モノマー-薬物コンジュゲートを含むモノマー組成物をフリーラジカル重合の条件下で重合させ、これによりコポリマー主鎖の一方または両方の末端にて側鎖薬物および官能基を有する直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖を形成させる工程；および
(b)ポリマー主鎖の第1末端にて結合部分含有分子を第1官能基と共有結合反応させ、結合部分を第1末端にコンジュゲートさせる工程
を含む、製造方法提供する。
【０２３６】
一実施態様において、製造方法は、(c)薬物を含む薬物含有分子を、コポリマー主鎖の第2末端で第2官能基と共有結合反応させて、薬物を第2末端にコンジュゲートさせる工程をさらに含み得る。
【０２３７】
第3態様において、本発明は、生体適合性の親水性ポリマーコンジュゲートの製造方法であって、下記工程：
(a)少なくとも2つの異なるエチレン性不飽和モノマーおよびエチレン性不飽和モノマー-薬物コンジュゲートを含むモノマー組成物をフリーラジカル重合の条件下で重合させ、これによりコポリマー主鎖の一方または両方の末端にて側鎖薬物および官能基を有する直鎖脂肪族統計コポリマー主鎖を形成させる工程；
(b)ポリマー主鎖の第1末端にて結合部分含有分子を第1官能基と共有結合反応させ、結合部分を第1末端にコンジュゲートさせる工程；および
所望により(c)薬物を含む薬物含有分子を、コポリマー主鎖の第2末端で第2官能基と共有結合反応させ、薬物を第2末端にコンジュゲートさせる工程
を含む、製造方法提供する。
【０２３８】
本明細書に記載される、コポリマー主鎖の1つまたは複数の末端に位置する1つまたは複数の官能基は、末端官能基であるとみなされる。
【０２３９】
第3態様のモノマー組成物におけるエチレン性不飽和モノマーおよびモノマー-薬物コンジュゲートは、好ましくは、異なるエチレン性不飽和基を有する。
【０２４０】
いくつかの実施態様において、上記第3態様のモノマー組成物は、リビングフリーラジカル重合、好ましくは可逆的付加開裂連鎖移動（RAFT）重合の条件下で重合する。
【０２４１】
一実施態様において、モノマー組成物は、式(III)：
【化２２】
2020502226.tif 000023
(III)
［式中、
Rcは、HまたはCH3であり；
Xは、OまたはNより選択され；
L2は、連結部分を表し；
Aは、薬物を表し；そして
nは、Xに結合する(-L2-A)基の数を表し、1または2である］
で示されるモノマー-薬物コンジュゲートを含む。
【０２４２】
本明細書に記載の発明の第3態様の特定の実施態様において、モノマー組成物は、
(i)N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミドおよびN-(2-ヒドロキシプロピル)アクリルアミドより選択される、第1コモノマー、
(ii)2-ヒドロキシエチルアクリレート、2-メトキシエチルアクリレート、2-(ジエチレングリコール)エチルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)アクリレート、ポリ(エチレングリコール)メタクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルアクリレート、ポリ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、N-アクリロイルアミド-エトキシエタノール、N,N-ジメチルアクリルアミド、N,N-ジエチルアクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)アクリルアミド、N-(2-ヒドロキシエチル)メタクリルアミド、N-[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アクリルアミド、アクリルアミド、N-アクリロイルモルホリン、N-プロピルアクリルアミド、N-イソプロピルアクリルアミド、メタクリルアミド、ジ(エチレングリコール)メチルエーテルメタクリレート、2-ヒドロキシエチルメタクリレート、2-(ジメチルアミノ)エチルアクリレート、2-(ジエチルアミノ)エチルアクリレート、3-(ジメチルアミノ)プロピルアクリレート、(3-アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、メタクリル酸2-アミノエチル塩酸塩、[3-(メタクリロイルアミノ)プロピル]トリメチルアンモニウムクロリド、2-カルボキシエチルアクリレート、アクリル酸、N-カルボキシエチルアクリルアミド、2-アクリルアミド-2-メチル-1-プロパンスルホン酸ナトリウム、3-スルホプロピルメタクリレートカリウム塩、3-[[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-アンモニオ]プロピオネート、2-アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、[2-(アクリロイルオキシ)エチル]ジメチル-(3-スルホプロピル)アンモニウムヒドロキシド、N-(2-プロピニル)-アクリルアミド、N-(3-アジドプロピル)-アクリルアミド、およびメタクリル酸より選択される、第2コモノマー、ならびに
(iii)式(III)：
【化２３】
2020502226.tif 000024
(III)
［式中、
Rcは、HまたはCH3であり；
Xは、OまたはNより選択され；
L2は、連結部分を表し；
Aは、薬物を表し；そして
nは、Xに結合する(-L2-A)基の数を表し、1または2である］
で示されるモノマー-薬物コンジュゲートである、第3コモノマー
を含む。
【０２４３】
一実施態様において、式(III)で示されるモノマー-薬物コンジュゲートは、アクリレートモノマーであり、式中、Rcは、Hであり、Xは、Oである。
【０２４４】
式(III)で示されるモノマー-薬物コンジュゲートにおいて、Aは、診断薬または治療薬であり得る。
【０２４５】
一実施態様において、Aは、治療薬であり、L2は、生分解性連結部分、例えば本明細書に記載の酵素切断可能な連結部分である。適切な酵素切断可能な連結部分は、バリン-シトルリン-パラ-アミノ安息香酸（Val-Cit-PABA）、バリン-アラニン（Val-Ala）、またはフェニルアラニン-リシン（Phe-Lys）であり得る。
【０２４６】
第3態様の製造方法はまた、ポリマー主鎖の第1末端にて結合部分含有分子を第1末端官能基と共有結合反応させて、結合部分を第1末端にコンジュゲートさせる工程を含む。直接またはリンカーを介して結合部分とコンジュゲートするのに適する末端官能基は、本明細書に記載のとおりである。
【０２４７】
いくつかの実施態様において、結合部分含有分子は、タンパク質、好ましくは、抗体、抗体断片および抗原結合断片を含む。
【０２４８】
第4態様において、本発明は、対象体において疾患または障害を軽減、処置または予防する方法であって、本明細書に記載の実施態様のいずれか1つのポリマーコンジュゲートの有効量を対象体に投与する過程を含む、方法を提供する。
【０２４９】
特定の実施態様において、本発明のポリマーコンジュゲートは、抗新生物剤を含む。このような実施態様において、本発明は、対象体において癌を処置する方法であって、抗新生物剤を含む本明細書に記載の実施態様のいずれか1つのポリマーコンジュゲートの有効量を対象体に投与する過程を含む、方法を提供し得る。
【０２５０】
本発明はまた、所望の細胞または組織部位への薬物の標的送達のための、本明細書に記載の実施態様のいずれか1つのポリマーコンジュゲートの使用を提供する。特定の実施態様において、薬物は、診断薬または治療薬である。
【０２５１】
本発明はまた、対象体における標的細胞または組織部位へ薬物を送達する方法であって、本明細書に記載の実施態様の本明細書に記載の実施態様のいずれか1つのポリマーコンジュゲートの有効量を対象体に投与する過程を含む、方法を提供する。このような方法において、結合部分は、所望の細胞または組織部位を標的とするように選択され、これにより、ポリマーコンジュゲートによる薬物の部位特異的送達を促進し得る。薬物は、診断薬または治療薬であり得て、これは、標的部位にて所望の効果を発揮し得る。
【実施例】
【０２５２】
ポリマー主鎖の合成
酢酸-酢酸ナトリウム緩衝液pH5.2（ホモポリマーを製造する場合）またはエタノール（コポリマーを製造する場合）のいずれかにおいて開始剤（4,4'-アゾビス(N,N,-シアノペンタン酸)、またはV501）およびRAFT剤（4-シアノ-4-(フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタン酸）とのRAFT重合を用いて、直鎖コポリマーを製造した。好ましくは生物学的に適合性である様々なホモポリマー（コントロールとして）および統計コポリマー（ターポリマー）を含むポリマーのサブセットを選択した。選択したモノマーは、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド（HPMA）；N-アクリロイルモルホリン（NAM）；N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAM）；ポリエチレングリコールメチルエーテルアクリレート（PEGA）；N-(2-プロピニル)-アクリルアミド；およびN-(2-ヒドロキシプロピル)アクリルアミド（HPAm）であった。
【０２５３】
多くのモデルコポリマーを、初期のバイオコンジュゲーション、細胞毒性および薬物動態試験のために、2つの異なるコモノマーの統計混合物から製造した。
【０２５４】
1：1.4（HPMA：NIPAM）の比のHPMAおよびNIPAMならびにN-アクリロイルスクシンイミド（NAS）で製造したターポリマー主鎖を有するポリマーコンジュゲートもまた、最終の薬物負荷試験のために製造した。NASモノマーは、RAFT剤に対して10％または20％いずれかの供給比でターポリマー主鎖に組み込まれた。
【０２５５】
製造した各ポリマーは、水溶性モノマーから構成され、それ故に、最終ポリマーは、すべて親水性の性質であった。用いられた重合方法は、1つの反応容器中において一度に適切な比ですべてのモノマーを組み合わせて、モノマー混合物を開始剤およびRAFT剤に曝露し、これにより成長しているポリマー鎖に沿ってモノマーの統計的分布をもたらすものであった。
【０２５６】
ポリマーを形成するために、典型的な反応溶液を、1時間窒素バブリングすることにより脱気し、その後70℃にて撹拌した。モノマー変換を1H NMRによりモニターし、ポリマーの数平均分子量を計算した。9時間後、室温に冷却し、空気に開放することにより反応を停止させた。コントロールHPMAホモポリマー、p(HPMA)をメタノールからジエチルエーテルへ沈殿させ、その後、H2Oに対して透析することにより精製した。コポリマーおよびターポリマーをメタノールからジエチルエーテルへ沈殿させることにより精製した。
【０２５７】
ポリマーへの結合部分の結合
結合部分へのコンジュゲーションのためのポリマー末端いずれかにおけるリンカーの導入
結合タンパク質をポリマーと結合させるために、マレイミドなどのリンカーを、その後のタンパク質コンジュゲーションのためのポリマーに導入することが必要である。マレイミド含有リンカーを導入するための3つの異なる手順を検討した。スキーム1を示す。
【化２４】
2020502226.tif 000025
【０２５８】
選択肢1：ポリマーのチオール末端におけるビス-マレイミドリンカーの導入
二官能性ビス-マレイミド（スキーム1(a)参照）の使用が、最初に開発された。ポリマーにおけるRAFT末端基は、ヘキシルアミンとの反応により除去され、チオールが露出される。
【０２５９】
ビス-マレイミドリンカーの導入は、チオール末端ポリマーを20当量の過量のPEG2 ビス-マレイミドと、DMF中10 eqのジイソプロピルエチルアミンの存在下で反応させることにより達成された。その後、マレイミド改変ポリマーを透析により精製して、過剰なビス-マレイミドを除去した。
【０２６０】
緩衝液（PBS）において、RAFTポリマーおよび抗体断片と結合する元のビス-マレイミドリンカーは、時間とともに分解し得て、それ故に、いくつかの臨床環境では望ましくない場合があるFab'の放出をもたらすことをポリマー-Fab'コンジュゲートの初期安定性試験（サイズ排除クロマトグラフィーによる分析）は示した。
【０２６１】
選択肢2：ポリマーのチオール末端におけるマレイミドリンカーの導入
結合タンパク質へのコンジュゲーションのためのリンカーを導入する別の選択肢を、スキーム1(b)に示す。この選択肢は、ポリマーを、RAFT末端基除去後に露出される末端チオール（SH基）で、SHと反応するアクリレートまたはハロ-アルキルを含有し、カルボン酸基も有する化合物と反応させることにより製造される、アミド連結の使用を含む。その後、カルボン酸をPEGジアミンと反応させて、PEG-ジアミンの一方の末端をポリマーとカップリングさせ、一方、ジアミンの他方の末端は、NHSエステルおよびマレイミド官能基を含有する化合物と反応するために遊離のままである。
【０２６２】
この手順を用いて、ジイソプロピルエチルアミン（0.0486 mmol、4 eq）および(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロホスフェート（COMU、0.0147 mmol、1.1 eq）を、DMF（5 mL）中の末端チオール基を有するRAFTコポリマーへ室温にて撹拌しながら加えた。2分後、PEG2-ジアミン（0.243 mmol、20 eq）を加えた。4時間後、ジイソプロピルエチルアミン（0.728 mmol、60 eq）およびN-スクシンイミジル3-マレイミドプロピオネート（マレイミド-NHS)（0.728 mmol、60 eq）を、撹拌を続けながら加えた。溶液をさらに2時間室温にて撹拌し、生成物を水に対して透析することにより精製した。
【０２６３】
選択肢3：ポリマーのカルボン酸末端におけるマレイミドリンカーの導入
ポリマーのCO2H末端へマレイミドを導入する別の方法。この選択肢において、スキーム1(b)に示すものと同様のリンカーが、直鎖コポリマーのカルボン酸末端にて用いられ得る。この選択肢は、末端カルボン酸（CO2H）基を一方の末端に有するポリマーをPEGジアミンと反応させて、PEG-ジアミンの一方の末端をポリマーとカップリングさせ、一方、ジアミンの他方の末端は、NHSエステルおよびマレイミド官能基を含有する化合物と反応させるために遊離のままであることにより製造される、アミド連結の使用を含み得る。ポリマーの他方の末端におけるRAFT末端基および得られたチオールはまた、完全に除去され得る（スキーム1(c))。
【０２６４】
マレイミドリンカーの導入は、次亜リン酸塩で処理することによりRAFT末端基を完全に除去することにより達成され、その後、ポリマーのR末端におけるカルボン酸を、COMUにより活性化させ、過量のPEG2-ジアミンと反応させた。透析または沈殿の後、アミン-PEG化ポリマー末端基を、N-スクシンイミジル3-マレイミドプロピオネートと反応させ、ポリマーのカルボン酸末端にてマレイミドを導入した。
【０２６５】
ポリマーと結合部分を結合するために用いられる上記のものと同様のリンカーストラテジーはまた、薬物、例えば細胞毒性薬、イメージング剤、色素または治療的もしくは生物学的関連性のある任意の小分子をポリマー末端と結合させるために用いられ得る。
【０２６６】
ポリマーの末端への結合部分（タンパク質Fab'）のコンジュゲーション
結合部分、例えば標的とする抗体断片をコポリマーの末端へ加えることにより、得られたコンジュゲートは、受容体介在性送達により腫瘍標的化の増加をもたらす。有効性のために、コポリマーは、無毒性で非免疫原性であることが必要であり、分子量は、循環半減期の関連する増加を保証し、蓄積を可能とするのに十分高いが、薬物送達後に腎クリアランスが可能であることが必要である。コポリマー-タンパク質末端リンカーが処置期間を通じて生物学的に安定であることもまた重要である。
【０２６７】
タンパク質（すなわち結合部分）は、薬物の結合前または後に、コポリマーに結合／コンジュゲートし得る。
【０２６８】
下記に示す実験において、タンパク質コンジュゲーションは、臨床的に関連のある薬物の結合前に生じる。
【０２６９】
コポリマーの末端におけるタンパク質の結合を示すために、十分に定義された臨床的に関連のある抗体である、抗EGFR抗体mAb 528（セツキシマブと同じ方法でEGFRに結合し、リガンド結合および受容体活性化をブロックする）を選択した。mAb 528をATCC HB8509馴化培地からアフィニティ精製（AbCapcher、Cosmobio）により精製し、ペプシンで切断し、Fab'2断片を得て、これをゲルろ過クロマトグラフィーにより精製した。メルカプトエタノール、DTTおよびTCEPでの還元試験は、528 Fab'鎖間ジスルフィドが特に還元しやすいことを示した。最良条件は、1molのFab'2断片当たり1.5 molのTCEPであり、約50％Fab'が得られ、鎖間ジスルフィド結合の検出可能な還元がなく、Fab'断片を非還元Fab'2からゲルろ過クロマトグラフィーにより分離した。コンジュゲーション反応生成物が、Fab'2と同様の量でゲルろ過カラムからしばしば溶出するため、コンジュゲーション前のFab'断片のゲルろ過単離は、いくつかの例において必要であった。コンジュゲーション前のFab'のゲルろ過単離でも、いくつかのFab'2は、コンジュゲーション条件下で再形成し、この材料は、ゲルろ過によりコンジュゲートからほとんど分離されなかった。Fab'断片の単離のためのこの要件、および保存中におけるFab'のFab'2への段階的酸化は、所与のコンジュゲーション実験のために製造され得るFab'の量に上限があることを意味した（GE Healthcare Superdex S200 2660 カラムを用いて約50 mgのFab'）。
【０２７０】
より多量の材料を生成させ、Fab'-コンジュゲートからのFab'2の分離を向上させるために、分離の前に還元混合物におけるFab'への直接コンジュゲーションを実施した。これは、カチオン交換クロマトグラフィーを用いて達成され、Fab'-コンジュゲートがカラムから最も早く溶出し、Fab'2が最も長く保持された。
【０２７１】
スキーム2に示すように種々のマレイミド含有リンカーを用いて様々なモデルポリマーを製造した。モデルポリマーには、RAFTポリマーの末端チオール上へ導入されるビス-マレイミドリンカー（スキーム2(A)）、ポリマーの末端に導入されるマレイミドを有する比較PEGポリマー（20 kDa）（スキーム2(B)）、PEG-アミドリンカーによりRAFTコポリマーの末端チオールへ導入されるマレイミド（スキーム2(C)）、およびPEG-アミドリンカーによりRAFTコポリマーの末端カルボン酸上へ導入されるマレイミド（スキーム2(D)）が含まれた。
【化２５】
2020502226.tif 000026
【０２７２】
モデルRAFTポリマーのチオール末端またはカルボキシル末端のいずれかにてマレイミド含有リンカーを導入するための手順は、上記のとおりである。
【０２７３】
タンパク質-ポリマーバイオコンジュゲーション試験のために、ポリマーのカルボン酸末端にてマレイミド含有リンカーを有するモデルRAFTポリマーを製造した。これらを表1に詳述する。また、市販のPEG-MALを、比較コントロールPEG-Fab'ポリマーを製造するために用いた（表1）。
【表１】
2020502226.tif 000027
【０２７４】
ポリマーとのタンパク質Fab'コンジュゲーション
マレイミド含有モデルRAFTポリマーおよび比較PEG-MALを、マレイミド官能基によりFab'-SHとコンジュゲートした。マレイミド含有ポリマーとのFab'コンジュゲーションを、1当量のFab'を0.5〜2当量のマレイミド含有ポリマーで最大40時間4℃にて、pHをpH6〜8で変化させながら、処理することにより行った。
【０２７５】
Fab'-コンジュゲートの最高収率は、1.5〜2当量のポリマーでのものであったが、これらの条件は、より高い分子量の二重にコンジュゲートしたFab'をいくらか生成した（例えば、10 mLにて溶出すると、このような高量のコポリマーは試験されなかった）。反応は、1時間後に完了することが分かり、pH7〜7.5にて生成物の収率が最高となることが分かった。
【０２７６】
モデルFab'-RAFTポリマーは、比較Fab'-PEGポリマーより安定性が低いことが分かり、Fab'-RAFTポリマーコンジュゲートの分解が4℃にて5日後に観察された。RAFTおよびPEGポリマーの両方は、Fab'における遊離チオールとの反応のために、ポリマーの一方の末端にて導入されるマレイミドを有する。
【０２７７】
マレイミドケミストリーを用いる抗体-薬物コンジュゲートが、臨床的に用いられるが、不安定性の潜在的な問題を有し得る。マレイミドがコンジュゲートするチオールの正確な局所環境は、マレイミド連結の安定性に極めて影響を及ぼすことが示されている。PEGにおけるマレイミドが、RAFTポリマーにおける連結より安定であるため、安定性におる相違は、マレイミド-タンパク質連結によるのではなくマレイミド-ポリマー連結によるものである可能性があると考えられる。
【０２７８】
モデルコポリマーの末端におけるカルボン酸官能基へのタンパク質Fab'のコンジュゲーションおよび流体力学的体積の評価
種々の組成の一連のモデルトリチウム化RAFTポリマー（表2）を、大規模で製造し、上記ようにコポリマーのカルボン酸末端にてマレイミドを導入し、これらはFab'-SHにコンジュゲートした（スキーム3）。ポリマーの組成および分子量を、PBSにおいてほぼ同様のゲルろ過溶出量が得られるように選択し、これは、Fab'-コンジュゲートの流体力学的半径を示し、それ故にクリアランス量を示す。
【０２７９】
1.5当量のTCEPで2時間25℃にて還元したPBS中のFab'2（173 mg、1.7 mmol）に、1.5当量のマレイミド含有モデルRAFTポリマーまたは比較PEGポリマーを加え、混合物を1時間4℃にて混合しながら反応させた。混合物を10 mM MES pH6で10倍希釈し、直列に接続した2つの5 mL HiTrap SP HP カラム（GE Healthcare）に適用した。未結合材料を洗浄し、タンパク質を同一緩衝液中0〜1 M NaClの直線グラジェントで溶出させた。初期溶出材料をプールし、Superdex S 200 2660カラムでのゲルろ過に供した。プールした材料を濃縮し、ゲルろ過プロファイル（Superdex S200 1030カラム）により判断して純度が95％を超えることが分かった。RAFT由来モデルコポリマーについてのコンジュゲーション収率は、PEGに匹敵するものであった（表2）。
【化２６】
2020502226.tif 000028
【表２】
2020502226.tif 000029
【０２８０】
上記表において、試料A〜Gは、1つのモノマーまたは2つのコモノマーからもたらされる種々の組成のモデルRAFT由来ポリマーであり、一方Hは、マレイミド-PEG 20 kDaである。純度を分析ゲルろ過により推定した。エンドトキシンを、Endosafe PTSシステム（Charles River Laboratories）を用いてアッセイした。
【０２８１】
ゲルろ過溶出量は、流体力学的体積を示し、これは、ポリマー組成とポリマーが薬物動態に対して有する影響間の比較を理解するために重要である。ゲルろ過試験のために選択されるポリマーは、1H NMRにより決定されたサイズでなく、むしろ水（すなわち血漿）中の「サイズ」に一致する。これは、ポリマーを循環におけるサイズの点での比較のためにより現実的に一致させることができる。したがって、観察された薬物動態における相違は、単にポリマーのサイズによるものではなく、むしろポリマー組成によるものである。
【０２８２】
モデルFab'-RAFTポリマーコンジュゲートのインビトロ試験（薬物成分なし)
モデルFab'-RAFTポリマーおよび比較Fab'-PEGコンジュゲートのインビトロ試験（コンジュゲート内のポリマーのFab'活性および細胞毒性)：
mAb 528の作用メカニズムは、EGFRとの直接結合に関与し、これにより、リガンドの同族EGFファミリーの結合をブロックする。インビトロ競合に基づく結合アッセイにおいて、固定化EGFRへの結合におけるユウロピウム標識EGFと競合するコンジュゲートFab'断片の能力を、種々の分子量の多くのモデルFab'-RAFTポリマー（Fab'-p(HPMA)）およびサイズを一致させた比較Fab'-PEGコンジュゲートについてアッセイした。5、10、20および40 kDaのMWを有するモデルRAFT由来ポリマーについて、4つの用量反応競合結合アッセイから得られた結果を例として示す（図1）。種々のMWモデルFab'-ポリマーコンジュゲートの各々は、未コンジュゲートFab'および個々の比較Fab'-PEGコンジュゲートの両方と同様の親和性を有してEGFRと結合した。これらのデータセットの分析は、様々な分子量モデルRAFTポリマーおよびPEGポリマーのFab'へのコンジュゲーションが、抗原認識の立体障害を生じさせないことを明確に示した。
【０２８３】
リガンド結合により、細胞表面上のEGFRは二量体化され、受容体のチロシンキナーゼ活性の活性化およびその後の下流シグナル伝達イベントを生じさせる構造変化を誘発する。同族リガンドの結合をブロックすることにより、mAb 528およびその断片は、この受容体の二量体化およびその後の受容体また他の物質のリン酸化を防止し得る。
【０２８４】
精製EGF受容体への結合におけるモデルFab'-RAFTポリマーコンジュゲートの有効性を、その細胞表面に高レベルのEGFRを発現するヒトACHN腎癌細胞を用いて細胞シグナル伝達システムによりアッセイした。受容体リン酸化の定量的推定値は、細胞単層を溶解させ、抗体被覆ウェルにおいてEGFRを捕捉することによる細胞のリガンド刺激後に得られることができる。チロシンリン酸化のレベルを、ユウロピウム標識抗ホスホチロシン抗体とインキュベートすることにより測定し得る。
【０２８５】
図2に示すように、重ね合わせ可能な方法で時間分解蛍光TRFの減少（チロシンリン酸化EGFRを表す）により示されるように、遊離Fab'および比較Fab'-PEGコンジュゲートの両方が効果的にリガンド誘導シグナル伝達を阻害した。モデルFab'-RAFTポリマーコンジュゲートはまた、おそらくFab'-PEGコンジュゲートよりも受容体活性化の阻害に有効であった。また、これらの結果は、RAFTを用いて製造されるポリマーのmAb 528 Fab'断片へのコンジュゲーションは、抗体認識およびその後の受容体複合体の下流リン酸化を含まないことを確認した。
【０２８６】
PEGポリマーと比較したp(HPMA)RAFTポリマーの潜在的毒性を、マウスL929線維芽細胞を用いて細胞ベースの毒性アッセイにおいてアッセイした。簡潔に言うと、細胞を96ウェルプレートに播種し、一晩付着させた。翌日、細胞をウシ胎児血清添加培養培地中の異なる濃度のポリマーに曝露させた。毒性の測定として細胞増殖に対するポリマーの影響を、細胞生存率の比色試験を用いて20〜24時間後にアッセイした。RAFT由来およびPEGポリマー間で観察された毒性プロファイルの差異は極めて小さく、高濃度のポリマー（＞1 mg/mL）のみにて明白な細胞死が観察された。
【０２８７】
モデルRAFTコポリマーのインビボ試験
末端マレイミド官能基を有するトリチウム標識モデルRAFTポリマーの製造
トリチウム（3H）で標識し、シンチレーション計数により放射性同位体をモニターすることは、例えばADMET（吸収、分布、代謝、排泄、毒性）試験において、インビボで化合物をモニターするために用いられる標準的な方法である。3H標識を、ポリマーのR基、またはカルボン酸末端における3H放射標識グリシン残基の導入によりモデルRAFTポリマーへ導入した（スキーム4）。これは、カップリング技術を用いてなされて、続いてさらに3HグリシンのCO2Hをジアミン（PEG2-ジアミン）で修飾し、その後ジアミンからの遊離アミンをとN-スクシンイミジル3-マレイミドプロピオネート反応させて、ポリマーのカルボン酸末端にて末端反応性官能基（マレイミド）を含有する放射標識ポリマーを得て、これは抗体へのコンジュゲーションに適する。
【０２８８】
コントロールおよびモデルポリマーの比較として、同様の流体力学的体積を有するポリ(エチレングリコール)（PEG）ポリマーを用いた。PEGを、3H-グリシンとの反応により同様に放射標識し、末端反応性マレイミドをFab'-SHへのコンジュゲーションのために導入した。マレイミド官能化を、グリシン残基を過量のPEG2-ジアミンと（COMUカップリング剤と）反応させることにより達成し、透析し過剰なジアミンを除去した後、末端アミンをこのN-スクシンイミジル3-マレイミドプロピオネートと反応させ、マレイミド官能化PEGポリマーを得た。
【化２７】
2020502226.tif 000030
【０２８９】
実験：
(a)RAFTポリマー
室温にて、RAFTポリマー（0.024 mmol）を秤量し、DMF（8 ml）に溶解させた。ジイソプロピルエチルアミン（DIEA、0.1 mmol）およびCOMU（0.0264 mmol）をポリマー溶液へ加えた。3分後、脱イオン水（0.1 ml）中のトリチウム化グリシン（0.024 mmol）を反応溶液へ加えた。その後、反応溶液を室温にて一晩放置した。0.1 N HCl（1 ml）を加え、反応溶液を酸性化した。トリチウム標識ポリマーを脱イオン水に対する透析により精製し、その後凍結乾燥した。
【０２９０】
精製したポリマーをDMF（8 ml）に溶解させた。DIEA（0.1 mmol）、NHS（0.048 mmol）およびCOMU（0.048 mmol）をポリマー溶液へ加えた。反応溶液を一晩放置した。2,2'-(エチレンジオキシ)ビス(エチルアミン)（EDEA、0.48 mmol）およびDIEA（0.96 mmol）を反応溶液へ加えた。4時間後、N-スクシンイミジル3-マレイミドプロピオネート（1.44 mmol）を反応溶液へ加えた。さらに1時間後、酢酸（2.16 mmol）を加え、反応溶液を酸性化した。最終生成物を脱イオン水に対する透析により精製し、その後凍結乾燥した。
【０２９１】
(b)PEGコントロール
N-スクシンイミジル3-マレイミドプロピオネート（0.03 mmol）およびDIEA（0.048 mmol）をDMF（3 ml）に溶解させた。トリチウム化グリシン（0.024 mmol）を加え、その後一晩室温にて放置した。COMU（0.029 mmol）およびDIEA（0.048 mmol）を反応溶液へ加えた。3分後、PEG-NH2（MW 約20000、0.024 mmol）およびDIEA（0.024 mmol）を反応溶液へ加えた。さらに2時間後、酢酸（0.24 mmol）を加え、反応溶液を酸性化した。最終生成物を脱イオン水に対する透析により精製し、その後水をRotavaporにより除去した。
【０２９２】
合成したポリマーを表3に示す。
結果：
【表３】
2020502226.tif 000031
【０２９３】
モデルRAFTコポリマー単独（Fab'にコンジュゲートしていない）のADMETを示すインビボ試験：
トリチウム標識モデルRAFTポリマーの選択を上記のように準備し、ADMETプロファイリングに供した。これらのモデルポリマーを表4に示す。
【表４】
2020502226.tif 000032
【０２９４】
ポリマーをSprague-Dawleyラット（5 mg/kg）に投与し、血中に残っている放射活性をシンチレーション計数により決定した。血中に残っているポリマーの濃度は、経時的に低下し、最高MWポリマーであるポリマー13（p(HPMA-NAM)、35 kDa）が血漿からの最も遅いクリアランス率を有し（3.1±0.1 mL/h）、一方、最も小さいポリマーであるポリマー8（p(HPMA-PEG)、13 kDa）が最も早く除去された（15.7±1.2 mL/h）。興味深いことに、MWがわずか18 kDaのポリマー16（p(HPMA-NIPAM)）（5.5±0.5 mL/h）が、極めてより大きいポリマー6A（pHPMA、27 kDa）（9.1±0.2 mL/h）より極めてゆっくり除去された。図3参照。
【０２９５】
ポリマーのクリアランス時間がポリマーの分子量に緩くしか依存しないが、ポリマーのクリアランス時間とサイズ排除カラムからのそれらの溶出量の間にはるかに強い相関があったことに注目すべきである（図4）。サイズ排除における溶出量は、ポリマーの流体力学的半径に関連しており、それは、腎臓ろ過および排泄の程度をより予測すると予想される分子量ではなくむしろ流体力学的半径であるため、これはおそらく驚くべきことではない。
【０２９６】
おそらくサイズにより、ポリマー13は、最長滞留性を有し、一方、ポリマー8は、最短滞留性を有することをこの試験は示した。しかしながら、ポリマー6Aは、そのサイズより予測されるより短い滞留性を有し、ポリマー16は、そのサイズより予測されるより長い滞留性を有することもまた見出された。
【０２９７】
モデルFab'-RAFTポリマーおよび比較Fab'-PEGコンジュゲートのADMETを示すインビボ試験：
表2に示される8つのモデルFab'-コンジュゲートポリマー改変体の取込みおよび分布の評価を、ラットにおいて単回動脈内投与後に行った。無作為に8群に分け、各群3つの下位群を有する（下位群当たり4匹の動物）雌性Sprague-Dawleyラットにおいて試験を行った。コンジュゲートを5 mg Fab'-コンジュゲート/kgの割合で単回IV注射により投与した。動物からいくつかの時間間隔で採血した。放射性標識ポリマーを用いたため、これらの試料は、血漿中のFab'-ポリマーコンジュゲートの濃度を明らかにする（シンチレーション計数による、Perkin Elmer）。材料がラットの臓器全体にわたって分布し（α期）、その後予想される1次反応速度で消失（β期）ため、血漿中のFab'-ポリマーコンジュゲートの濃度は、最初の8時間で急速に低下する。24〜72時間のデータ点から、消失速度（k）を決定した（図5）。消失半減期（T1/2β）をln2/kとして計算した（表5）。
【表５】
2020502226.tif 000033
【０２９８】
すべてのモデルFab'-ポリマーコンジュゲートが、未修飾のFab'について予想されるものより長く血漿中で保持され、75〜100 kDaの比較Fab'-PEGコンジュゲートのものに匹敵する半減期を有する（表6）。モデルポリマーは、同様の流体力学的半径（水性緩衝液中のポリマーのゲルろ過クロマトグラフィーから推測される）を有するように選択され、モデルFab'-ポリマーコンジュゲートの溶出量は、220 kDa（Fab'-p(HPMA)）から360 kDa（Fab'-PEG）までのコンジュゲートの見かけのMWに応じて11.6〜12.6 mLで変化する。最長T1/2βを有するモデルFab'-ポリマーコンジュゲートのp(HPMA-NIPAM)（比率1および2）およびp(HPMA-NAM）が、MW75〜85 kDaおよびゲルろ過による見かけのMW約300 kDaを有するため、消失半減期は、MW（ポリマーのNMRにより判断される)または見かけのMW（ゲルろ過により推測される）のいずれにも直接関連しない。比較Fab'-PEGは、ゲルろ過による見かけのMWがはるかに大きい362 kDa（ただし実際のMWはわずか70 kDaである）であるが、半減期が有意に短いわずか23時間である。
【表６】
2020502226.tif 000034
【０２９９】
6時間で尿中に排泄されるFab'-コンジュゲートの量を、モデルFab'-ポリマーコンジュゲートの各々について決定した。48〜56時間の尿中のFab'-コンジュゲートの量は、同じ時間で血漿から消失した材料の50〜100％を占めると推測された。
【０３００】
モデル薬物（色素）-コポリマー-Fab'コンジュゲートの合成および評価
色素（Texas Red）標識モデルポリマーコンジュゲートを、モデルp(HPMA)主鎖またはモデルp(HPMA-co-N-2-プロピニルアクリルアミド）主鎖上の種々の位置にて色素を導入することにより製造した。その後、Fab'への色素-標識モデルポリマーのコンジュゲーションを行った。
【０３０１】
色素のコンジュゲーションはまた、コンジュゲートの安定性を確認するのにも役立つ。PBSおよびラット血清中で色素コンジュゲートをインキュベートすることにより安定性試験を実施し、コンジュゲートの分解を、サイズ排除クロマトグラフィーにおけるタンパク質（Amax 280 nm）および色素（Amax 589 nm）最大吸光度を同時に分析することにより検出した（下記インビトロ結果のセクション参照）。
【０３０２】
一実験において、色素を直鎖コポリマー主鎖の末端に結合させる。この実験において、モデルポリ(ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（p(HPMA)）ポリマーを上記の一般手順に従ってRAFT重合により形成した。ポリマーの分子量は、20〜30 kDaであった。p(HPMA)形成後、ポリマーのCO2H末端をアミン-官能化Alexa Fluor 488色素と反応させた。透析または沈殿による精製後、RAFT末端基を過量のヘキシルアミンでの処理により除去して、ポリマー鎖の末端にて末端チオールを露出させた。その後、チオールを20倍過剰のPEG2-ビズマレイミドと反応させ、透析後、MAL官能化色素負荷ポリマーを得た（スキーム6(a)）。
【０３０３】
別の実験において、色素を直鎖コポリマー主鎖と結合させ、側鎖とする。この実験において、モデルp(HPMA-co-N-2-プロピニルアクリルアミド）主鎖を上記の一般手順に従ってHPMA（1 eq.）およびN-2-プロピニルアクリルアミド（10 eq.）のRAFT重合により製造した。コポリマーの形成後、RAFT末端基を次亜リン酸塩での処理により完全に除去し、ポリマーのCO2H末端を、COMUをカップリング剤として用いてペプチドカップリング条件下でPEG2-ジアミンと反応させた。その後、アミン官能化コポリマーを透析または沈殿により精製した。その後、アミン末端ポリマーをN-スクシンイミジル 3-マレイミドプロピオネートと反応させて、ポリマーの末端にてマレイミドリンカー（MAL）を導入した。色素（アジドTexas Red）をコポリマーにおける側鎖アルキン官能基にコンジュゲートさせ、これは、N-2-プロピニルアクリルアミドコモノマーからもたらされる重合化残基により提供される。側鎖アルキン基への色素のコンジュゲーションは、クリックケミストリー条件下で進めた（スキーム6(b)）。
【化２８】
2020502226.tif 000035
【０３０４】
その後、種々のMALリンカータイプを有し、ポリマー主鎖のいずれかの末端に位置するMALリンカーを有する色素標識MAL導入比較およびモデルポリマーを抗体断片にコンジュゲートさせた。生理学的に関連する安定性を評価するために、コンジュゲートを、PBSまたは血清とのインキュベート前に最初にゲルろ過クロマトグラフィー（GFC）により精製した。
【０３０５】
結果は、抗体断片をコンジュゲートさせるビス-マレイミドリンカーを用いたポリマーコンジュゲートは、代替MALリンカーより安定性が低いことを示した。さらに、代替MALリンカーを用いるとき、代替リンカーがポリマーのいずれの末端に結合するかは問題にならなかった。その後、色素コンジュゲートポリマーを、ポリマーのMAL末端にてタンパク質（すなわち結合部分）と反応させ得た。
【０３０６】
薬物（agent）（治療薬（drug））-ターポリマー-Fab'コンジュゲートの合成
治療薬（色素シナリオとは対照的である）の生物学的標的送達を調べるために、細胞毒性薬モノメチルアウリスタチンE（MMAE）（合成小分子、抗新生物剤である）を、ターポリマーであるRAFTコポリマーへの結合のために選択した。この治療薬／薬物を酵素切断可能なリンカーケミストリー（ValCitPABA）によりポリマーに結合させ、これにより遊離未修飾MMAEが、主要部位にて特定の酵素により攻撃されるジペプチドリンカーの選択的切断時に放出された。この標的化薬物負荷試験に適するコポリマーは、第1モノマーとしてN-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド（HPMA）を含み、これはその生物学的適応性のために選択された。第2モノマーは、N-イソプロピルアクリルアミド（NIPAM）であった。HPMAおよびNIPAM残基を有するコポリマーは、最長滞留性を有し、一方、HPMAおよびPEGを有するコポリマーは、最短滞留性を有することがADMET試験から見出された。p(HPMA)は、そのサイズから予測されるより短い滞留性を有するが、p(HPMA-NIPAM)は、そのサイズから予測されるより長い循環滞留性を有することもまた見出された。これらの結果を考慮して、HPMAおよびNIPAMを第1および第2モノマーとして形成されたターポリマーを薬物負荷試験のために選択した。
【０３０７】
薬物（治療薬）を運ぶための第3コモノマーをコポリマーへ導入した。
【０３０８】
薬物をコポリマーにコンジュゲートさせるためのリンカー分子を、以下に示す種々の合成法により製造した：
【０３０９】
方法1  固相ペプチド合成手順を用いるBoc-PEG-Val-Cit-OH 1の製造（スキーム7）。
【化２９】
2020502226.tif 000036
【０３１０】
方法2  2-クロロトリチル樹脂にFmoc-Cit-PABAを結合させ、その後標準的手順（スキーム8）を用いてFmoc-Val-OHおよびBoc-PEG-COOHをカップリングさせることによる固相合成を行った。生成物を2％TFAで切断し、分析HPLCおよびMSにより特性評価した。標的とするBoc-PEG4-Val-Cit-PABA 2が低収率で得られた。
【化３０】
2020502226.tif 000037
【０３１１】
方法3  完全にソリューションベースのアプローチである第3方法もまた、良好な収率で用いた（スキーム9）。NHSエステル 1を対応するカルボン酸から製造し、その後L-バリンとカップリングさせて、2を得た。Fmoc L-シトルリンを文献条件下でPABAとカップリングさせて、4を良好な収率で得た。Fmoc切断後、クロマトグラフィー精製により5を得て、これを従来の条件下でバリン誘導体3とカップリングさせて、2を得て、これをシリカゲルクロマトグラフィーにより精製した。その後、2のベンジルヒドロキシル基をp-ニトロフェニルクロロホルメートと反応させて、活性カルボネート6を得た。1H NMRおよびLCMS分析は、2および6の両方における少量のジアステレオマー不純物を明らかにし、これは、順相シリカゲルクロマトグラフィーにより分離不能であったが、慎重な分取RP-HPLCにより6から最終的に除去した。この不純物の起源は、確立されておらず、a)アミノ酸出発物質の1つにエナンチオマーのいくつかが存在すること、またはb)カップリング工程の1つの間にアミノ酸の1つが部分的にエピマー化することのいずれかから生じ得る。ジアステレオ異性の起源を決定するための可能なアプローチは、アミン-反応性ホモキラルFLEC試薬（Camerino et al. 2013およびその参考文献参照）を用いて、バリン出発物質および／またはシトルリン誘導体5を誘導体化し、従来のHPLC（LC-MS）によりジアステレオマー不純物を定量化することである。
【化３１】
2020502226.tif 000038
【０３１２】
p-ニトロフェニルカルボネート6をジイソプロピルエチルアミン（DIPEA）の存在下MMAEで処理して、コンジュゲート7を得た（スキーム10）。コンジュゲート7を精製しないが、Boc-脱保護に直接供し、その後、RP-HPLCにより精製して、アミノ-末端PEG-Val-Cit-PABA-MMAE構築物8を得た。このペプチド-リンカー-MMAE構築物(8)が、均一な形態（HPLCによる＞95％単離純度）で得られ、MSデータは理論データと一致した。その後、この構築物を、下記で説明するコポリマーへの負荷のために用いた。
【化３２】
2020502226.tif 000039
【０３１３】
ターポリマー-薬物コンジュゲートの製造
薬物コンジュゲーションを重合後、3つの異なるモノマー、HPMA、NIPAMおよび低割合の第3モノマー、N-アクリロキシスクシンイミド（NAS）を含有するモノマー組成物の重合からのターポリマーの形成後に行った。最適化重合反応は、HPMA対NIPAM（1：1または1.4：1いずれか）の所望の比率を提供し、NAS 10またはNAS 20いずれかが主鎖に含まれた（スキーム11）。NAS 20が、低PDIと、高MWと、そして重要なターポリマーにおいて反応可能なスクシンイミド基の最大数の最良の組合せを提供した。略語NAS 10またはNAS 20は、NAS対RAFT剤の供給比（10％または20％いずれか）を指す。
【化３３】
2020502226.tif 000040
【０３１４】
ターポリマー主鎖の合成：
ターポリマー主鎖を形成するために、3つのモノマーのHPMAノマー、NIPAMモノマーおよびNASモノマー（10％または20％いずれか）を、4-シアノ-4-(チオベンゾイルチオ)ペンタン酸（RAFT剤）および4,4'-アゾビス(4-シアノ吉草酸)（開始剤；V501）と一緒にDMFに溶解させた。反応溶液を、30分間窒素バブリングすることにより脱気し、その後70℃にて撹拌した。モノマー変換を1H NMRによりモニターし、ポリマー全分子量を制御した。11時間後、室温に冷却することにより反応を停止させた。ターポリマーをジエチルエーテルに沈殿させることにより精製した。得られたターポリマーの分子量（MW）は、約30 kDaであった。
【０３１５】
ターポリマーに下記のように薬物（1つの薬物負荷または複数の薬物負荷のいずれか）を負荷させた：
【０３１６】
1つの薬物負荷：
1つの薬物を負荷するために、薬物をスキーム12にしたがってチオール官能化ターポリマー（RAFT末端基除去後）の末端に結合させる。
【化３４】
2020502226.tif 000041
【０３１７】
上記のマレイミド官能化一薬物負荷ターポリマーを、下記のように製造した：
【０３１８】
工程1：
pHPMA-NiPAM-NASターポリマーを上記のように製造した。ターポリマーを過量のヘキシルアミンで処理して、RAFT末端基を除去し、ターポリマーの末端における末端チオール（SH）官能基を得た。
【０３１９】
工程2：
ターポリマーからぶら下がるNHS-エステル官能基（NASモノマーを用いて導入した）をDMF中の過量のプロピルアミン（20 eq.）と反応させて、NHS-エステルを非反応性アルキルアミド側鎖基へ変換させた。
【０３２０】
工程3：
ターポリマーの末端における末端チオール官能基をDMF中の過剰なフェニルアクリレート（10 eq.）と反応させて、末端活性エステルを得た。末端エステル基を過剰なPEGジアミンと反応させ、ポリマーの末端にて末端アミンを残した。その後、アミン末端ターポリマーをスクシンイミジル3-マレイミドプロピオネート（マレイミド-NHS）と反応させて、抗体断片（Fab'）へのコンジュゲーションのためにポリマーの一方の末端にてマレイミド基を導入した。得られたMAL-官能化ターポリマーを水に対して透析することにより精製した。
【０３２１】
工程4：
ターポリマーの他方の末端におけるカルボン酸官能基をペプチドカップリング剤の存在下で薬物-リンカー-アミンと反応させて、Fab'にコンジュゲートするポリマーのマレイミドに対して他方の末端にて薬物を導入した。
【０３２２】
工程5：
その後、工程3からのマレイミド官能化ターポリマーをアミノ-末端薬物含有化合物としてPEG-Val-Cit-PABA-MMAE(8)と反応させて、薬物を末端カルボン酸官能基とターポリマーの他方の末端にてカップリングさせた。この工程において、マレイミド含有ターポリマー（0.012 mmol、1 eq）、PEG-Val-Cit-PABA-MMAE(8)（0.06 mmol、5 eq）およびジイソプロピルエチルアミン（0.12 mmol、10 eq）および1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロホスフェート（COMU、0.0147 mmol、1.1 eq）を5 mLのジメチルホルムアミド（DMF）に溶解させた。混合物を5日間室温にて撹拌して、1つの薬物をターポリマーの末端にコンジュゲートさせた。
【０３２３】
複数の薬物負荷：
複数の薬物を負荷するために、薬物をスキーム13にしたがってターポリマー（RAFT末端基除去後）への側鎖に結合させる。
【化３５】
2020502226.tif 000042
【０３２４】
工程1：
pHPMA-NiPAM-NASターポリマー（0.0243 mmol、1 eq）、アゾビスイソブチロニトリル（AIBN、0.0365 mmol、1.5 eq）およびN-エチルピペリジン次亜リン酸塩（EPHP、1.22 mmol、50 eq）を50 mLのジメチルアセトアミドに溶解させた。混合物を40分間N2バブリングすることにより脱気し、その後80℃に16時間加熱した。得られたターポリマーをメタノールからジエチルエーテルへ3回沈殿させることにより精製した。
【０３２５】
工程2：
工程1からのターポリマー（0.012 mmol、1 eq）、アミノ-末端薬物含有化合物としてのアミノ末端PEG-Val-Cit-PABA-MMAE(8)（0.06 mmol、5 eq）およびジイソプロピルエチルアミン（0.12 mmol、10 eq）を5 mLのジメチルホルムアミド（DMF）に溶解させた。混合物を5日間室温にて撹拌した。イソプロピルアミン（12 mmol、100 eq）を撹拌溶液へ加え、一晩放置した。その後、プロピルアミン（12 mmol、100 eq）を撹拌溶液へ加えた、一晩放置した。これら最後の2工程は、ターポリマーにおけるNASからのNHSエステルが小分子アミンでキャップされたことを確実にするためである。生成物を水に対して透析することにより精製した。
【０３２６】
工程3：
室温にて、(1-シアノ-2-エトキシ-2-オキソエチリデンアミノオキシ)ジメチルアミノ-モルホリノ-カルベニウムヘキサフルオロホスフェート（COMU、0.0147 mmol、1.1 eq）およびジイソプロピルエチルアミン（0.0486 mmol、4 eq）を、DMF（5 mL）中の工程2からの生成物へ撹拌しながら加えた。2分後、PEG2-ジアミン（0.243 mmol、20 eq）を加えた。4時間後、ジイソプロピルエチルアミン（0.728 mmol、60 eq）およびスクシンイミジル 3-マレイミドプロピオネート（マレイミド-NHS)（0.728 mmol、60 eq）を、撹拌を続けながら加えた。溶液をさらに2時間室温にて撹拌し、生成物を水に対して透析することにより精製した。
【０３２７】
NIPAMモノマー対HPMAモノマーの最終比率は、およそ2対3（NIPAM DP 103対HPMA DP 147）であった。NASモノマー（NHSエステルを含有する）は、DP 20であった。
【０３２８】
上記で製造した1つの薬物および複数の薬物を負荷したターポリマーの両方について、マレイミド含有リンカーを、上記と同様の化学反応を用いてターポリマーの末端にて導入した。約400 mgの1つの薬物を負荷したターポリマーおよび複数の薬物を負荷したターポリマーの各々を、Fab'へのバイオコンジュゲーションのために製造した。
【０３２９】
薬物負荷ポリマーの末端へのタンパク質Fab'のコンジュゲーション
1.5当量のTCEPで2時間25℃にて還元したPBS中のFab'2（173 mg、1.7 mmol）に、上記で製造した1つまたは複数の薬物を負荷した1.5当量のマレイミド含有RAFTターポリマーを加えた。混合物を1時間4℃にて混合しながら反応させた。混合物を10 mM MES pH6で10倍希釈し、直列に接続した2つの5 mL HiTrap SP HP カラム（GE Healthcare）に適用した。未結合材料を洗浄し、タンパク質を同一緩衝液中0〜1 M NaClの直線グラジェントで溶出させた。初期溶出材料をプールし、Superdex S 200 2660カラムでのゲルろ過に供した。プールした材料を濃縮し、ゲルろ過プロファイル（Superdex S200 1030カラム）により判断して純度が95％を超えることが分かった。
【０３３０】
腫瘍減少動物試験のためには、コンジュゲートを精製して、未コンジュゲート薬物および／またはFab'を除去することが重要であった。単離をイオン交換、続いてゲルろ過により行った。表7は、動物試験のために作製された様々なコンジュゲートを要約する。
【表７】
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表7において：
・群1、2および5は、陽性および陰性抗体コントロールである。
・群3は、複数側鎖薬物を有しFab'断片（結合部分）を有しないターポリマー-薬物コンジュゲートを表す。
・群4、6および7は、1つの薬物または複数の薬物負荷いずれかを有する本発明の薬物-ターポリマー-Fab'コンジュゲートを表し、これを異なる用量で評価した。薬物は、ターポリマー(MMAEA)x-Fabにおける側鎖およびMMAE-ターポリマー-Fabにおける末端にあった。
・群8は、ターポリマーを有しない薬物-抗体コンジュゲートを表す。
【０３３１】
腫瘍減少試験
薬物負荷ターポリマー-抗体コンジュゲート
1つまたは複数の薬物負荷を有する薬物-ポリマー-Fab'コンジュゲートを上記手順にしたがって製造し、腫瘍負荷動物試験において評価した。
【０３３２】
有効性試験：
平均腫瘍体積が約119 mm3（2.7％の変動）である場合、接種10日後（試験0日目）に、皮下接種A431類表皮腫瘍を有する75匹の雌性FoxN1 nuマウスを8群へ無作為に割り当てた。動物を8つの異なる群に割り当てた。各群の動物は、コントロール抗体または試験抗体コンジュゲートの1つでの静脈内尾静脈処置を受けた。処置を試験0、3、6、9および12日目に実施した。倫理的制約のため早期に安楽死させなかった動物については、試験43日目に試験を終了した。終了時に、腫瘍をすべての動物から摘出し、秤量した。
【０３３３】
試験群は次のとおりであった：
・群1：陽性コントロール抗体、mAb 528；11.21 mL/kg中20 mg/kg（n＝10）；
・群2：陰性コントロール抗体（mAb コントロール；10.14 mL/kg中20 mg/kg（n＝10）；
・群3：ポリマー-薬物4、RAFT-MMAE-DAR4（14.4 mL/kg中14.4 mg/kg（n＝10）；
・群4：（ターポリマー）Fab-ターポリマー-薬物4、Fab-RAFT-MMAE-DAR4（15.61 mL/kg中33.4 mg/kg）（n＝9）；
・群5：陽性コントロール抗体、mAb 528；5.61 mL/kg中10 mg/kg（n＝10）；
・群6：（ターポリマー）Fab-ターポリマー-薬物1、Fab-RAFT-MMAE-DAR1（13.41 mL/kg中32 mg/kg）（n＝9）；
・群7：（ターポリマー）Fab-ターポリマー-薬物4、Fab-RAFT-MMAE-DAR4（4.35 mL/kg中9.3 mg/kg（n＝10）；
・群8：Fab-薬物1、Fab-PEG24-MMAE（19.86 mL/kg中20 mg/kg）（n＝7）。
【０３３４】
結果を図6に示す。
【０３３５】
図6から分かるように、陽性コントロール；mAb 528（群1および5）、Fab-ポリマー-薬物1：Fab-RAFT-MMAE-DAR1（群6 - 1つの薬物負荷）、Fab-ポリマー-薬物4：Fab-RAFT-MMAE-DAR4（群7 - 複数の薬物負荷）およびFab-薬物1；Fab-PEG24-MMAE、群8）での処置は、試験20日目において、陰性コントロールAb；mAbコントロール（群2）と比較して腫瘍増殖の顕著な阻害をもたらした。
【０３３６】
図6はまた、陽性コントロールAb（群1）と比較して、陽性コントロール（群5）、Fab-ポリマー-薬物1、Fab-RAFT-MMAE-DAR1（群6）、Fab-ポリマー-薬物4、Fab-RAFT-MMAE-DAR4（群7）およびFab-薬物1；Fab-PEG24-MMAE（群8）で処置された群において腫瘍増殖阻害に差異がないことを示す。
【０３３７】
本明細書で概説される本発明の精神から逸脱することなく他の様々な改良物および／または変形物がなされ得ることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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