(57)【要約】  本発明は、植物細胞のミトコンドリアにおいてニトロゲナーゼポリペプチドを産生させる方法および手段に関する。本開示は、１もしくは複数のＭＴＰ−Ｎｉｆ融合体、および／または翻訳的なＮｉｆＤ−ＮｉｆＫおよびＮｉｆＥ−ＮｉｆＮ融合体を発現する植物細胞を提供する。本開示はまた、これらの融合体をコードする核酸構築物、ならびにその融合体の発現および植物細胞のミトコンドリアへの標的化のための発現構築物を提供する。本開示はまた、本発明の植物細胞、およびそこから得られた生成物を含むトランスジェニック植物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ミトコンドリアと、以下の：
（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）、
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有するＮｉｆＤポリペプチド（ＮＤ）、
（ｉｉｉ）オリゴペプチドリンカー、および
（ｉｖ）Ｎ末端を有するＮｉｆＫポリペプチド（ＮＫ）、
を含み、
ここで、該ＭＴＰのＣ末端が、該ＮＤのＮ末端に翻訳的に融合され、および
ここで、該リンカーが、該ＮＤのＣ末端と該ＮＫのＮ末端に翻訳的に融合される、
融合ポリペプチドとを含む植物細胞。
【請求項２】
前記融合ポリペプチドのＣ末端が、ＮＫのＣ末端である、任意選択で、ＮＫのＣ末端が、野生型ＮｉｆＫＣ末端である、請求項１に記載の植物細胞。
【請求項３】
前記オリゴペプチドリンカーが、８〜５０アミノ酸の長さである、請求項２または請求項３に記載の植物細胞。
【請求項４】
前記融合ポリペプチド中のＮｉｆＤポリペプチドおよびＮｉｆＫポリペプチドが、２つの別個のポリペプチドとして存在したときのＮｉｆＤポリペプチドおよびＮｉｆＫポリペプチドと同じ機能を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の植物細胞。
【請求項５】
ミトコンドリアと、以下の：
（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）、
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有するＮｉｆＥポリペプチド（ＮＥ）、
（ｉｉｉ）オリゴペプチドリンカー、および
（ｉｖ）Ｎ末端を有するＮｉｆＮポリペプチド（ＮＮ）
を含み、
ここで、該ＭＴＰのＣ末端が、翻訳的に該ＮＥのＮ末端に融合され、および
ここで、該リンカーが、該ＮＥのＣ末端と該ＮＮのＮ末端に翻訳的に融合される、
融合ポリペプチドとを含む植物細胞。
【請求項６】
前記オリゴペプチドリンカーが、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約３０アミノ酸、少なくとも約４０アミノ酸、または約２０アミノ酸〜約７０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約７０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約６０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸、または約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約３５アミノ酸、約４０アミノ酸、約４５アミノ酸、約４６アミノ酸、約５０アミノ酸、または約５５アミノ酸の長さである、請求項５に記載の植物細胞。
【請求項７】
前記融合ポリペプチド中のＮｉｆＥポリペプチドおよびＮｉｆＮポリペプチドが、２つの別個のポリペプチドとして存在したときのＮｉｆＥポリペプチドおよびＮｉｆＮポリペプチドと同じ機能を有し、好ましくは、それぞれ、野生型ＮｉｆＥポリペプチドおよび野生型ＮｉｆＮポリペプチドと同じ機能を有する、請求項５または請求項６に記載の植物細胞。
【請求項８】
前記ＭＴＰが、該融合ポリペプチドがＭＰＰによって切断されて、Ｎ末端切断ペプチドおよび（ｉｉ）〜（ｉｖ）を含んでいるプロセシングされた融合ポリペプチド（ＣＦ）を作製することができるような、マトリックスプロセシングプロテアーゼ（ＭＰＰ）のためのプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の植物細胞。
【請求項９】
前記ＣＦが、ＭＴＰのＣ末端アミノ酸の、すべてではなく、いくつか、好ましくはＭＴＰのＣ末端アミノ酸のうちの５〜４５アミノ酸を含む、請求項８に記載の植物細胞。
【請求項１０】
前記ＭＴＰが、Ｆ１−ＡＴＰアーゼγ−サブユニットＭＴＰの約５１アミノ酸を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の植物細胞。
【請求項１１】
前記植物細胞が、１もしくは複数のＮＦ融合ポリペプチド（ＮＦ）をさらに含み、そして、各ＮＦが、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を含み、ここで、該ＭＴＰのＣ末端が、該ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合され、およびここで、それぞれのＭＴＰが、独立に同じであるかまたは異なっており、かつ、それぞれのＮＰが、独立に同じであるかまたは異なっており、およびここで、ミトコンドリアが、１もしくは複数のＮＦ、および／またはそのプロセシングされた生成物（ＣＦ）を含み、ここで、各ＣＦが、存在する場合、そのＭＴＰ内の対応するＮＦの切断によって作製される、請求項１〜１０に記載の植物細胞。
【請求項１２】
前記ＮＦポリペプチドのうち少なくとも１つが、ＮｉｆＨである、請求項１１に記載の植物細胞。
【請求項１３】
前記ミトコンドリアが、（ｉ）ＮｉｆＤ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＮ、または（ｉｉ）ＮｉｆＤ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＫまたはＮｉｆＳから成る群から選択されるＮｉｆポリペプチドのうちの１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、またはそのすべてを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の植物細胞。
【請求項１４】
前記ＭＴＰが、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは１０〜８０アミノ酸を含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の植物細胞。
【請求項１５】
少なくとも１つ、複数、すべてのＭＴＰが、ミトコンドリアタンパク質前駆体のＭＴＰ、またはその変異体、好ましくは、植物ＭＴＰを含んでいる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の植物細胞。
【請求項１６】
融合ポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドが、細胞の核ゲノム内に組み込まれる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の植物細胞。
【請求項１７】
前記細胞が、アラビドプシス・サリアナのプロトプラスト以外の細胞である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の細胞植物。
【請求項１８】
前記トランスジェニック植物が、融合ポリペプチドをコードする１もしくは複数の外来ポリヌクレオチドのトランスジェニックである、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の細胞を含むトランスジェニック植物。
【請求項１９】
１つ、複数、またはすべての外来ポリヌクレオチドが、植物の根で発現されており、好ましくは、植物の葉よりも植物の根で優れたレベルで発現されている、請求項１８に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２０】
前記トランスジェニック植物が、例えばコムギ、コメ、トウモロコシ、トリティカーレ、オートムギ、またはオオムギ、好ましくはコムギなどの穀物用植物である、請求項１８または請求項１９に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２１】
前記トランスジェニック植物が、外来ポリヌクレオチドのホモ接合体またはヘテロ接合体である、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２２】
前記トランスジェニック植物が、田畑に生えている、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物。
【請求項２３】
田畑に生えている、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の植物の少なくとも１００本の集団。
【請求項２４】
以下の：
（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）、
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有するＮｉｆＤポリペプチド（ＮＤ）、
（ｉｉｉ）オリゴペプチドリンカー、および
（ｉｖ）Ｎ末端を有するＮｉｆＫポリペプチド（ＮＫ）、
を含み、
ここで、該ＭＴＰのＣ末端が、該ＮＤのＮ末端に翻訳的に融合され、および
ここで、該リンカーが、該ＮＤのＣ末端と該ＮＫのＮ末端に翻訳的に融合される、
融合ポリペプチド。
【請求項２５】
前記融合ポリペプチドのＣ末端が、ＮＫのＣ末端であり、任意選択で、ＮＫのＣ末端が、野生型ＮｉｆＫのＣ末端である、請求項２４に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２６】
以下の：
（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）、
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有するＮｉｆＥポリペプチド（ＮＥ）、
（ｉｉｉ）オリゴペプチドリンカー、および
（ｉｖ）Ｎ末端を有するＮｉｆＮポリペプチド（ＮＮ）、
を含み、
ここで、該ＭＴＰのＣ末端が、翻訳的に該ＮＥのＮ末端に融合され、および
ここで、該リンカーが、該ＮＥのＣ末端と該ＮＮのＮ末端に翻訳的に融合される、
融合ポリペプチド。
【請求項２７】
前記オリゴペプチドリンカーが、約４６アミノ酸の長さである、請求項２６に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２８】
前記融合ポリペプチドが、マトリックスプロセシングプロテアーゼ（ＭＰＰ）によって切断されて、（ｉｉ）〜（ｉｖ）を含んだ、１もしくは複数のプロセシングされたＮｉｆポリペプチド生成物を作製することができる、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項２９】
前記融合ポリペプチドが、植物細胞または細菌細胞の中、好ましくは植物細胞のミトコンドリアの中に存在する、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３０】
請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドから、該融合ポリペプチドのＭＴＰ内の切断によって作製された、プロセシングされたＮｉｆポリペプチド。
【請求項３１】
植物細胞のミトコンドリアマトリックス中のＭＰＰによる融合ポリペプチドの切断によって作製された、請求項３０に記載のプロセシングされたＮｉｆポリペプチド。
【請求項３２】
植物細胞または細菌細胞の中、好ましくは植物ミトコンドリアの中、より好ましくは植物細胞ミトコンドリアのミトコンドリアマトリックス（ＭＭ）の中に存在する、請求項３０または請求項３１に記載のプロセシングされたＮｉｆポリペプチド。
【請求項３３】
好ましくは、ＮＰＣがニトロゲナーゼ活性を有するように、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの他のＮｉｆポリペプチドと結合して、Ｎｉｆタンパク質複合体（ＮＰＣ）を形成することができる、請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドまたは請求項３０〜３２のいずれか１項に記載のプロセシングされたＮｉｆポリペプチド。
【請求項３４】
請求項２４〜２９のいずれか１項に記載の融合ポリペプチドのうちの１もしくは複数をコードするポリヌクレオチド。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチドが、細菌の対応するＮｉｆタンパク質をコードする天然のポリヌクレオチドに対して、植物細胞における発現のためにコドン修飾された、請求項３４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項３４または請求項３５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３７】
植物細胞内または細菌細胞内に存在する、好ましくは、該植物細胞の核ゲノム内に組み込まれた、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
請求項３４〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むか、またはコードするキメラベクター。
【請求項３９】
請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のトランスジェニック植物を作製する方法であって、以下のステップ：
ｉ）請求項３４〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、および／または請求項３８に記載のベクター植物細胞内に導入し、
ｉｉ）該細胞からトランスジェニック植物を再生し、および
ｉｉｉ）任意選択で、該植物から種子を採取し、および／または
ｉｖ）任意選択で、該トランスジェニック植物から１もしくは複数の子孫植物を作製し、それによって、トランスジェニック植物を作製すること、
を含む方法。
【請求項４０】
請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の植物の植物部分。
【請求項４１】
請求項３４〜３７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含む種子である、請求項４０の植物部分。
【請求項４２】
フラワー、全粒粉、デンプン、油脂、シードミールまたは種子から得られる他の製品を製造する方法であって、以下のステップ：
ａ）請求項４１に記載の種子を得、および
ｂ）フラワー、全粒粉、デンプン、油脂もしくは他の製品を抽出するか、またはシードミールを製造すること、
を含む方法。
【請求項４３】
請求項１８〜２２のいずれか１項に記載の植物、および／また請求項４０または請求項４１に記載の植物部分から製造される製品。
【請求項４４】
食品を調製する方法であって、請求項４１に記載の種子、または種子からのフラワー、全粒粉もしくはデンプンを、別の食品成分と混合することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、植物細胞のミトコンドリアにおいてニトロゲナーゼポリペプチドを産生するための方法および手段に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
窒素固定細菌は、酵素複合体、ニトロゲナーゼによって触媒された、生物窒素固定（ＢＮＦ）を介してＮ2ガスからアンモニアを産生する。それにもかかわらず、近代農業の需要はこの固定窒素供給源を大きく上回り、その結果、農業において、工業的に製造された窒素肥料が大々的に使用されている（Smil, 2002）。しかしながら、肥料製造および適用の両方が、汚染の原因となり（Good and Beatty, 2011）、そして持続可能ではないと見なされている（Rockstrom et al., 2009）。世界中で適用された肥料の大部分が、作物によって吸収されることなく（Cui et al., 2013; de Bruijn, 2015）、肥料流出、雑草の助長そして水路の富栄養化につながっている（Good and Beatty, 2011）。結果として生じる藻類ブルームが酸素レベルを低下させ、そして、局所的および珊瑚礁全体にわたる沖合の環境破壊の原因となっている（De'ath et al., 2012; Glibert et al., 2014; Sutton et al., 2008）。さらに、過剰施肥は多くの先進国において問題であるが、特定の地域では、その利用可能度が、作物収量を制限している（Mueller et al., 2012）。肥料自体の製造には、相当なエネルギー入力を必要とするので、概算で１００ＵＳＤビロン／年を要する。
【０００３】
明らかに、工業的に製造された窒素への依存性を低減するストラテジーが必要とされている。このために、生物窒素固定が可能な遺伝子操作植物の概念は、長い間、相当な注目を集めており（Merrick and Dixon, 1984）、かつ、最近のレビューの中心になっていた（e Bruijn, 2015; Oldroyd and Dixon, 2014）。期待されるアプローチとしては、ｉ）マメ類から穀類へのジアゾ栄養生物の共生関係の拡大（Santi et al., 2013）、ｉｉ）窒素固定を可能にするような内部共生微生物のリエンジニアリング（Geddes et al., 2015）、およびｉｉｉ）植物細胞内のニトロゲナーゼの遺伝子操作（Curatti and Rubio, 2014）が挙げられる。これらのアプローチのすべてが、技術的困難のため野心的かつ投機的である。
【０００４】
ニトロゲナーゼ（ジアゾ栄養細菌において生物窒素固定を可能にする酵素複合体）は、その生合成および機能のために多重遺伝子集合経路を必要とし、広く概説されている（Hu and Ribbe, 2013; Rubio and Ludden, 2008; Seefeldt et al., 2009）。標準的な鉄−モリブデンニトロゲナーゼの成分としては、ＮｉｆＤやＮｉｆＫと示される触媒タンパク質および電子供与体ＮｉｆＨが挙げられる。約１２種類の他のタンパク質、具体的には、ＮｉｆＭ、ＮｉｆＳ、ＮｉｆＵ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＸ、ＮｉｆＶ、ＮｉｆＪ、ＮｉｆＹ、ＮｉｆＦ、ＮｉｆＺおよびＮｉｆＱが、錯体の成熟、足場および補因子挿入を含めたジアゾ栄養細菌におけるニトロゲナーゼ集合に関与している。遺伝子損傷、非ジアゾ栄養原核生物に対するジアゾ栄養生物の間の補完性アッセイ、および発生分析（Dos Santos et al., 2012; Temme et al., 2012; Wang et al., 2013）では、Ｎｉｆタンパク質のサブセット（ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＮ）が中核的な構成要素であるとみなされるに至り、一方、他の構成要素は、最適化された活性に必要であると考えられるので、補助的であると見なされる。特定の生化学的条件もまた、ニトロゲナーゼ集合および機能に必要である。その中でも第一に、ニトロゲナーゼは、酸素に非常に感受性である（Robson and Postgate, 1980）。さらに、大量のＡＴＰ、還元体、容易に利用可能なＦｅ、Ｍｏ、Ｓ−アデノシルメチオニンおよびホモクエン酸が、メタロプロテイン触媒中心の生合成および機能に必要である（Hu and Ribbe, 2013; Rubio and Ludden, 2008）。これらの因子のすべてが、植物細胞内の機能的なニトロゲナーゼ複合体を製造することの技術的困難に寄与する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、植物細胞内でＮｉｆＤを産生する際に観察された困難を考慮して、植物細胞内に等量のＮｉｆＤおよびＮｉｆＫを有する重要さを究明した。ポリペプチドの詳細分析は、それらが融合タンパク質として発現され、機能を維持し得ること、ならびに野生型Ｃ末端を有するＮｉｆＫ成分の重要さを示した。よって一態様において、本発明は、ミトコンドリアと、以下の：
（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）、
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有するＮｉｆＤポリペプチド（ＮＤ）、
（ｉｉｉ）オリゴペプチドリンカー、および
（ｉｖ）Ｎ末端を有するＮｉｆＫポリペプチド（ＮＫ）、
を含み、
ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＤのＮ末端に翻訳的に融合され、および
ここで、該リンカーは、該ＮＤのＣ末端と該ＮＫのＮ末端に翻訳的に融合される、
融合ポリペプチドとを含む植物細胞を提供する。
【０００６】
ある実施形態において、融合ポリペプチドのＣ末端は、ＮＫのＣ末端である。好ましい実施形態において、ＮＫのＣ末端は野生型ＮｉｆＫポリペプチドのＣ末端と同じである、すなわち、ＮＫは、どんな人工的に付加されたＣ末端伸長も有していない。野生型Ｃ末端を有することは、ＮｉｆＫ活性を維持するのに重要である。
【０００７】
別の実施形態において、リンカーは、植物細胞または細菌細胞内で機能的な形状で、ＮＤとＮＫとが結合することを可能にするのに十分な長さのものである。ある実施形態において、リンカーは、長さが８〜５０アミノ酸である。好ましくは、リンカーは、長さが少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、または少なくとも約３０アミノ酸である。より好ましくは、リンカーは、長さが２５〜３５アミノ酸である。最も好ましくは、リンカーは、長さが約３０アミノ酸である。これに関連して、「約３０」とは、２７、２８、２９、３０、３１、３２または３３アミノ酸を意味する。
【０００８】
ある実施形態において、融合ポリペプチド中のＮｉｆＤポリペプチドおよびＮｉｆＫポリペプチドは、２つの別個のポリペプチドとして存在したときのＮｉｆＤポリペプチドおよびＮｉｆＫポリペプチドと同じ機能を有する。好ましくは、融合ポリペプチドの生化学的活性は、野生型ＮｉｆＤポリペプチドおよび野生型ＮｉｆＫポリペプチドと同じである。
【０００９】
本発明者らはまた、等量のＮｉｆＥおよびＮｉｆＮを植物細胞内に有する重要さを究明した。ポリペプチドの詳細分析は、それらが融合タンパク質として発現され、機能を維持し得ること、ならびにＮｉｆポリペプチドが機能的であるには、リンカーが存在することが必要であることを示した。よって、さらなる態様において、本発明は、ミトコンドリアと、以下の：
（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）、
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有するＮｉｆＥポリペプチド（ＮＥ）、
（ｉｉｉ）オリゴペプチドリンカー、および
（ｉｖ）Ｎ末端を有するＮｉｆＮポリペプチド（ＮＮ）
を含み、
ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、翻訳的に該ＮＥのＮ末端に融合され、および
ここで、該リンカーは、該ＮＥのＣ末端と該ＮＮのＮ末端に翻訳的に融合される、
融合ポリペプチドとを含む植物細胞を提供する。
【００１０】
上記の態様のある実施形態において、リンカーは、植物細胞または細菌細胞内で機能的な形状で、ＮＥとＮＮとが結合することを可能にするのに十分な長さのものである。例えば、ある実施形態において、リンカーは、少なくとも約７０Å、少なくとも約１００Å、約７０Å〜約１５０Å、または約１００Å〜約１２０Å、または約１００Å、または約１０４Åの長さである。ある実施形態において、オリゴペプチドリンカーは、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約３０アミノ酸、少なくとも約４０アミノ酸、または約２０アミノ酸〜約７０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約７０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約６０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸、または約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約３５アミノ酸、約４０アミノ酸、約４５アミノ酸、約４６アミノ酸、約５０アミノ酸、または約５５アミノ酸の長さである。
【００１１】
ある実施形態において、融合ポリペプチド中のＮｉｆＥポリペプチドおよびＮｉｆＮポリペプチドは、２つの別個のポリペプチドとして存在したときのＮｉｆＥポリペプチドおよびＮｉｆＮポリペプチドと同じ機能を有する。好ましくは、融合ポリペプチドの生化学的活性は、野生型ＮｉｆＥポリペプチドおよび野生型ＮｉｆＮポリペプチドと同じである。
【００１２】
ある実施形態において、ＭＴＰは、該融合ポリペプチドがＭＰＰによって切断されて、Ｎ末端切断ペプチドおよび（ｉｉ）〜（ｉｖ）を含んでいるプロセシングされた融合ポリペプチド（ＣＦ）を作製することができるような、マトリックスプロセシングプロテアーゼ（ＭＰＰ）のためのプロテアーゼ切断部位を含む。ある実施形態において、ＣＦは、ＭＴＰのＣ末端アミノ酸の、すべてではなく、いくつか、好ましくはＭＴＰのＣ末端アミノ酸のうちの５〜４５アミノ酸を含む。ある実施形態において、ＭＰＰによる切断は、融合ポリペプチドから５〜５０アミノ酸を取り除いて、ＣＦを作製する。好ましい実施形態において、ＣＦは、ＭＴＰのＣ末端から約５〜約１１アミノ酸残基、例えば、ＭＴＰのＣ末端から６または７アミノ酸、７または８アミノ酸、８または９アミノ酸、９または１０アミノ酸、あるいは、１１または１２アミノ酸ほどを含む。
【００１３】
上記の２つの態様のある実施形態において、植物細胞は、１もしくは複数のＮＦ融合ポリペプチド（ＮＦ）をさらに含み、そして、各ＮＦは、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を含み、ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合され、およびここで、それぞれのＭＴＰは、独立に同じであるかまたは異なっており、かつ、それぞれのＮＰは、独立に同じであるかまたは異なっており、およびここで、ミトコンドリアは、１もしくは複数のＮＦ、および／またはそのプロセシングされた生成物（ＣＦ）を含み、ここで、各ＣＦは、存在する場合、そのＭＴＰ内の対応するＮＦの切断によって作製される。好ましくは、ＮＦポリペプチドのうちの少なくとも１つが、ＮｉｆＨである。好ましい実施形態において、各ＣＦは、独立に、ＭＴＰのＣ末端から約５〜約１１アミノ酸残基、例えば、ＭＴＰのＣ末端から６または７アミノ酸、７または８アミノ酸、８または９アミノ酸、９または１０アミノ酸、あるいは、１１または１２アミノ酸ほどを含む。
【００１４】
ある実施形態において、（単数もしくは複数の）融合ポリペプチドをコードする（単数もしくは複数の）外来ポリヌクレオチドが、細胞のゲノムの中に組み込まれる。
【００１５】
本発明者らはまた、１６種類のクレブシエラ・ニューモニア（Klebsiella pneumoniae）の生合成、かつ、機能的なニトロゲナーゼ（Ｎｉｆ）タンパク質のすべてが、例えばニコチアナ・ベンサミアナ（Nicotiana benthamiana）の葉などの、植物細胞内にミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）−Ｎｉｆ融合物として個別に発現され得ることを示した。本発明者らは、これらの融合物が、ニトロゲナーゼ機能の生化学的および遺伝子特徴を潜在的に支持する細胞内位置である、ミトコンドリアマトリックス（ＭＭ）が正確に標的化されることを実証した。ＮｉｆＪ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＹ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＸ、ＮｉｆＵ、ＮｉｆＳ、ＮｉｆＶ、ＮｉｆＭ、ＮｉｆＦ、ＮｉｆＢおよびＮｉｆＱポリペプチドは、ウエスタンブロット分析で検出可能であった。しかしながら、ＮｉｆＤ（触媒作用にかかわる中核的な構成要素）は、最も少なかった。ニトロゲナーゼＮｉｆＤ−ＮｉｆＫヘテロ二量体の結晶構造は、発現レベルが改善されたＮｉｆＤ−ＮｉｆＫの翻訳的な融合タンパク質を設計するのに使用された。最終的に、４種類のＮｉｆ融合ポリペプチド（ＮｉｆＢ、ＮｉｆＳ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＹ）が首尾よく同時発現され、そして、ニトロゲナーゼの複数の成分がミトコンドリアに標的化され得ることを実証した。これらの結果は、アンモニアへの窒素ガスの還元を補助するために細胞内環境内においてニトロゲナーゼ構成要素を再構成することの実現可能性を確立する。
【００１６】
すべてのＮｉｆタンパク質のうち、ニトロゲナーゼ触媒錯体の必須成分（ＮｉｆＤ）は発現させるのが最も難しかった。低レベルのＮｉｆＤタンパク質は、高レベルのＮＩＦＤ ＲＮＡとは対照的であり、翻訳速度またはタンパク質安定性が、ＮｉｆＤタンパク質量を制限していたことを示唆した。触媒作用におけるＮｉｆＤの決定的な重要性を考えて、その要件は、細菌内で高度に発現されること、そして好ましくはＮｉｆＫと等モル比で、発現されることであり（Poza-Carrion et al., 2014）、本発明者らは、一緒にこれらの２つの極めて重要な成分を融合し、そして、ＮｉｆＤの豊富さがこのストラテジーを通して高められ得ることを見出した。このＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ融合はまた、単一カセットによる発現で連結され、そして、天然ヘテロ四量体の化学量論性をまねた、理想的な１：１比での両サブユニットの翻訳を可能にする利点があった。さらに、リンカー自体は、２つのサブユニットが、触媒作用に必要とされる正確なα2β2ヘテロ四量体構造を形成するのに十分な柔軟性を可能にするように設計された。本発明者らは、ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ融合ポリペプチドが、以前に実証されたより優れた有効性をもって、少なくとも個別のＮｉｆＤおよびＮｉｆＫ発現を機能上置換すると予測した。
【００１７】
よって、一態様において、本発明は、ミトコンドリアと、ＮｉｆＤ融合ポリペプチド（ＮＤＦ）をコードする外来ポリヌクレオチドとを含む植物細胞であって、該ＮＤＦが、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆＤポリペプチド（ＮＤ）を含み、ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＤのＮ末端に翻訳的に融合され、ここで、該ミトコンドリアは、ＮＤＦおよび／またはそのプロセシングされたＮｉｆＤ生成物（ＣＤＦ）を含み、およびここで、該ＣＤＦは、存在する場合、ＭＴＰ内のＮＤＦの切断によって作製される、植物細胞を提供する。
【００１８】
一実施形態において、ＭＴＰは、ＮＤＦがＭＰＰによって切断されて、Ｎ末端切断ペプチドとＣＤＦを作製することができるような、マトリックスプロセシングプロテアーゼ（ＭＰＰ）のためにプロテアーゼ切断部位を含む。ある実施形態において、ＣＤＦは、ＭＴＰのＣ末端から約５〜約１１アミノ酸残基、例えば、ＭＴＰのＣ末端から６または７アミノ酸、７または８アミノ酸、８または９アミノ酸、９または１０アミノ酸、あるいは、１１または１２アミノ酸ほどを含む。
【００１９】
一態様において、本発明は、１もしくは複数のＮＦ融合ポリペプチド（ＮＦ）を含む植物細胞であって、各ＮＦが、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を含み、該ＮＰが、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＦ、ＮｉｆＪ、ＮｉｆＭ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＱ、ＮｉｆＳ、ＮｉｆＵ、ＮｉｆＶ、ＮｉｆＷ、ＮｉｆＸ、ＮｉｆＹおよびＮｉｆＺから成る群から選択され、ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合され、ここで、それぞれのＭＴＰは、独立に同じであるかまたは異なっており、それぞれのＮＰは、独立に同じであるかまたは異なっており、およびここで、該ミトコンドリアは、１もしくは複数のＮＦおよび／またはそのプロセシングされた生成物（ＣＦ）を含み、そしてここで、各ＣＦは、存在する場合、ＭＴＰ内の対応するＮＦの切断によって作製される、植物細胞を提供する。ある実施形態において、ＮＦポリペプチドは、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＨおよびＮｉｆＫから成る群から選択されるＮｉｆポリペプチドの１もしくは複数、または好ましくはそのすべてをさらに含む。好ましい実施形態において、ＮｉｆＫおよび／またはＮｉｆＮのＣ末端は、それぞれ、野生型ＮｉｆＫポリペプチドまたは野生型ＮｉｆＮポリペプチドのＣ末端と同じである、すなわち、ＮｉｆＫおよび／またはＮｉｆＮは、好ましくは両方とも、どんな人工的に付加されたＣ末端伸長も有していない。
【００２０】
好ましい実施形態において、各ＣＦは、独立にＭＴＰのＣ末端から約５〜約１１アミノ酸残基、例えば、ＭＴＰのＣ末端から６または７アミノ酸、７または８アミノ酸、８または９アミノ酸、９または１０アミノ酸、あるいは、１１または１２アミノ酸ほどを含む。
【００２１】
別の態様において、本発明は、ミトコンドリアと、第一のＮｉｆ融合ポリペプチド（ＮＦ）をコードする第一の外来ポリヌクレオチド、および第二のＮＦをコードする第二の外来ポリヌクレオチドとを含む植物細胞であって、各ＮＦが、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を含み、ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合され、ここで、それぞれのＭＴＰは、独立に同じであるかまたは異なっており、かつ、それぞれのＮＰは独立に同じであるかまたは異なっており、およびここで、ミトコンドリアは、（ａ）第一のＮＦおよび／またはそのプロセシングされた生成物（第一のＣＦ）および（ｂ）第二のＮＦおよび／またはそのプロセシングされた生成物（第二のＣＦ）を含み、そしてここで、各ＣＦが、存在する場合、ＭＴＰ内の対応するＮＦの切断によって作製される、植物細胞を提供する。好ましい実施形態において、第一および第二のＮＦは、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＦ、ＮｉｆＪ、ＮｉｆＭ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＱ、ＮｉｆＳ、ＮｉｆＵ、ＮｉｆＶ、ＮｉｆＷ、ＮｉｆＸ、ＮｉｆＹおよびＮｉｆＺから成る群から選択される。好ましい実施形態において、ＮｉｆＫ（存在する場合）および／またはＮｉｆＮのＣ末端は、それぞれ、野生型ＮｉｆＫポリペプチドまたは野生型ＮｉｆＮポリペプチドのＣ末端と同じである、すなわちＮｉｆＫおよび／またはＮｉｆＮは、好ましくは両方とも、どんな人工的に付加されたＣ末端伸長も有していない。
【００２２】
好ましい実施形態において、各ＣＦは、独立にＭＴＰのＣ末端から約５〜約１１アミノ酸残基、例えば、ＭＴＰのＣ末端から６または７アミノ酸、７または８アミノ酸、８または９アミノ酸、９または１０アミノ酸、あるいは、１１または１２アミノ酸ほどを含む。
【００２３】
一実施形態において、植物細胞は、１もしくは複数のＮＦをコードする１もしくは複数の外来ポリヌクレオチドをさらに含み、各ＮＦは、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を含み、ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合され、ここで、それぞれのＭＴＰは、独立に同じであるかまたは異なっており、かつ、それぞれのＮＰは、独立に同じであるかまたは異なっており、およびここで、ミトコンドリアは、１もしくは複数のＮＦおよび／またはそのプロセシングされた生成物（ＣＦ）を含み、そしてここで、各ＣＦは、存在する場合、ＭＴＰ内の対応するＮＦの切断によって作製される。好ましい実施形態において、１もしくは複数のＮＦが、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＦ、ＮｉｆＪ、ＮｉｆＭ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＱ、ＮｉｆＳ、ＮｉｆＵ、ＮｉｆＶ、ＮｉｆＷ、ＮｉｆＸ、ＮｉｆＹおよびＮｉｆＺから成る群から選択される。好ましい実施形態において、ＮｉｆＫ（存在する場合）および／またはＮｉｆＮのＣ末端は、それぞれ、野生型ＮｉｆＫポリペプチドまたは野生型ＮｉｆＮポリペプチドのＣ末端と同じである、すなわち、ＮｉｆＫおよび／またはＮｉｆＮは、好ましくは両方とも、どんな人工的に付加されたＣ末端伸長も有していない。
【００２４】
一またはさらなる実施形態において、少なくとも１つのＭＴＰ、２以上のＭＴＰ、またはそれぞれのＭＴＰが、ＭＰＰのためにプロテアーゼ切断部位を含むそれぞれのＮＦがＭＰＰによって切断されて、Ｎ末端切断ペプチドおよび対応するＣＦを作製することができるように、マトリックスプロセシングプロテアーゼ（ＭＰＰ）のためにプロテアーゼ切断部位を含む。好ましい実施形態において、各ＣＦは、独立にＭＴＰのＣ末端から約５〜約１１アミノ酸残基、例えば、ＭＴＰのＣ末端から６または７アミノ酸、７または８アミノ酸、８または９アミノ酸、９または１０アミノ酸、あるいは、１１または１２アミノ酸ほどを含む。
【００２５】
さらなる態様において、本発明は、ミトコンドリアと、以下の：
（ａ）ＮｉｆＤ融合ポリペプチド（ＮＤＦ）をコードする第一の外来ポリヌクレオチド、該ＮＤＦは、（ｉ）Ｃ末端有する第一のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ１）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆＤポリペプチド（ＮＤ）を含み、ここで、該ＭＴＰ１のＣ末端は、該ＮＤのＮ末端に翻訳的に融合され、
（ｂ）ＮｉｆＨ融合ポリペプチド（ＮＨＦ）をコードする第二の外来ポリヌクレオチド、該ＮＨＦは、（ｉ）Ｃ末端を有する第二のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ２）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆＨポリペプチド（ＮＨ）を含み、ここで、該ＭＴＰ２のＣ末端は、該ＮＨのＮ末端に翻訳的に融合され、ならびに
（ｃ）ＮｉｆＫ融合ポリペプチド（ＮＫＦ）をコードする第三の外来ポリヌクレオチド、該ＮＫＦは、（ｉ）Ｃ末端を有する第三のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ３）および（ｉｉ）がＮ末端を有するＮｉｆＫポリペプチド（ＮＫ）を含み、ここで、第三のＭＴＰのＣ末端は、該ＮＫのＮ末端に翻訳的に融合される、
とを含み、
ここで、ＭＴＰ１、ＭＴＰ２およびＭＴＰ３のそれぞれは、独立に同じであるかまたは異なっており、そして、
ここで、該植物細胞は、第一の外来ポリヌクレオチドを含んでおり、かつ、第二および第三の外来ポリヌクレオチドを有していない対応する植物細胞におけるＮＤＦおよび／またはＣＤＦのレベルより優れたレベルのＮＤＦおよび／またはそのプロセシングされた生成物（ＣＤＦ）を含み、およびここで、該ＣＤＦが、存在する場合、ＭＴＰ１内のＮＤＦの切断によって作製される、植物細胞を提供する。好ましい実施形態において、植物細胞は、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＦ、ＮｉｆＪ、ＮｉｆＭ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＱ、ＮｉｆＳ、ＮｉｆＵ、ＮｉｆＶ、ＮｉｆＷ、ＮｉｆＸ、ＮｉｆＹ、およびＮｉｆＺから成る群から選択される１もしくは複数のＮＦをコードする１もしくは複数の外来ポリヌクレオチドをさらに含む。好ましい実施形態において、ＮｉｆＫおよび／またはＮｉｆＮ（存在する場合）のＣ末端は、それぞれ、野生型ＮｉｆＫポリペプチドまたは野生型ＮｉｆＮポリペプチドのＣ末端と同じである、すなわち、ＮｉｆＫおよび／またはＮｉｆＮは、好ましくは両方とも、どんな人工的に付加されたＣ末端伸長も有していない。
【００２６】
一実施形態において、ＣＤＦは、ミトコンドリア内に存在する。
さらなる実施形態において、ミトコンドリアは、ＮＨＦ（ＣＨＦ）およびＮＫＦ（ＣＫＦ）の一方または両方のプロセシングされた生成物をさらに含み、ここで、該ＣＨＦおよびＣＫＦは、存在する場合、それぞれＭＴＰ２およびＭＴＰ３内のＮＨＦおよびＮＫＦの切断によって作製される。好ましい実施形態において、ＣＨＦおよび／またはＣＫＦは、独立にＭＴＰのＣ末端から約５〜約１１アミノ酸残基、例えば、ＭＴＰのＣ末端から６または７アミノ酸、７または８アミノ酸、８または９アミノ酸、９または１０アミノ酸、あるいは、１１または１２アミノ酸ほどを含む。
【００２７】
さらなる実施形態において、植物細胞は、以下の：（ｉ）ＭＴＰ１は、ＮＤＦがＭＰＰによって切断されて、Ｎ末端切断ペプチドおよびＣＤＦを作製することができるような、ＭＰＰのためにプロテアーゼ切断部位を含み、（ｉｉ）ＭＴＰ２は、ＮＨＦがＭＰＰによって切断されて、Ｎ末端切断ペプチドおよびプロセシングされたＮｉｆＨ生成物（ＣＨＦ）を作製することができるような、ＭＰＰのためにプロテアーゼ切断部位を含み、ならびに（ｉｉｉ）ＭＴＰ３は、ＮＫＦがＭＰＰによって切断されて、Ｎ末端切断ペプチドおよびプロセシングされたＮｉｆＫ生成物（ＣＫＦ）を作製することができるような、ＭＰＰのためにプロテアーゼ切断部位を含む、のうちの１つ、複数またはすべてを特徴とし、ここで、ミトコンドリアは、ＣＤＦ、ＣＨＦおよびＣＫＦの１つ、複数またはすべてを含む。好ましい実施形態において、ＣＤＦ、ＣＨＦおよび／またはＣＫＦのそれぞれは、独立にＭＴＰのＣ末端から約５〜約１１アミノ酸残基、例えば、ＭＴＰのＣ末端から６または７アミノ酸、７または８アミノ酸、８または９アミノ酸、９または１０アミノ酸、あるいは、１１または１２アミノ酸ほどを含む。
【００２８】
さらなる態様において、本発明は、ミトコンドリアと、ＮｉｆＤポリペプチド（ＮＤ）をコードする第一の外来ポリヌクレオチドおよびＮｉｆＫポリペプチド（ＮＫ）をコードする第二の外来ポリヌクレオチドとを含む植物細胞であって、ここで、ＮＤとＮＫのいずれか一方または両方が、そのＮ末端でＣ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）に翻訳的に融合され、ここで、ＮＤとＮＫの両方が、該ＭＴＰに翻訳的に融合される場合、それぞれのＭＴＰは、独立に同じであるかまたは異なっており、およびここで、第二の外来ポリヌクレオチドは、第一の外来ポリヌクレオチドに共有結合で結合されるかまた共有結合で結合されず、そしてここで、該植物細胞が、ほぼ同じくらいであるＮＤのレベルとＮＫのレベルを含む、植物細胞を提供する。
【００２９】
好ましい実施形態において、ＮｉｆＫのＣ末端は、野生型ＮｉｆＫポリペプチドのＣ末端と同じである、すなわち、ＮｉｆＫは、どんな人工的に付加されたＣ末端伸長も有していない。好ましい実施形態において、ＮＤおよび／またはＮＫの切断は、ＭＴＰのＣ末端から約５〜約１１アミノ酸残基、例えば、ＭＴＰのＣ末端から６または７アミノ酸、７または８アミノ酸、８または９アミノ酸、９または１０アミノ酸、あるいは、１１または１２アミノ酸ほどを有する切断生成物であるポリペプチドをもたらす。
【００３０】
一実施形態において、ＮＤのレベルとＮＫのレベルは、ＭＴＰ−Ｎｉｆ融合物とそのプロセシングされた生成物とを含む。
【００３１】
さらなる態様において、本発明は、ミトコンドリアと、ＮｉｆＨ融合ポリペプチド（ＮＨＦ）をコードする外来ポリヌクレオチドとを含む植物細胞であって、該ＮＨＦは、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆＨポリペプチド（ＮＨ）を含み、ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＨのＮ末端に翻訳的に融合され、ここで、該ミトコンドリアは、ＮＨＦおよび／またはそのプロセシングされたＮｉｆＨ生成物（ＣＨＦ）を含み、そしてここで、該ＣＨＦが、存在する場合、ＭＴＰ内のＮＨＦの切断によって作製される、植物細胞を提供する。
【００３２】
一実施形態において、ＭＴＰは、ＮＨＦがＭＰＰによって切断されて、Ｎ末端切断ペプチドおよびＣＨＦを作製することができるような、マトリックスプロセシングプロテアーゼ（ＭＰＰ）のためにプロテアーゼ切断部位を含む。ある実施形態において、ＣＨＦは、ＭＴＰのＣ末端から約５〜約１１アミノ酸残基、例えば、ＭＴＰのＣ末端から６または７アミノ酸、７または８アミノ酸、８または９アミノ酸、９または１０アミノ酸、あるいは、１１または１２アミノ酸ほどを含む。
【００３３】
さらなる態様において、本発明は、ミトコンドリアと、Ｎｉｆ融合ポリペプチド（ＮＦ）をコードする外来ポリヌクレオチドを含む植物細胞であって、該ＮＦが、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を含み、ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合され、ここで、該ミトコンドリアは、ＮＦおよび／またはそのプロセシングされたＮＰ生成物（ＣＦ）を含み、およびここで、該ＣＦは、存在する場合、ＭＴＰ内のＮＦの切断によって作製され、そしてここで、ＮＦおよび／またはＣＦは、好ましくはその両方のＮＦおよびＣＦは、対応する野性型Ｎｉｆポリペプチドに関連した天然のＣ末端を有する、植物細胞を提供する。
【００３４】
好ましい実施形態において、ＮＰは、ＮｉｆＤポリペプチド、ＮｉｆＫポリペプチド、およびＮｉｆＮポリペプチドから成る群から選択される。好ましくは、ＮｉｆＫおよびＮｉｆＮの両方である。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、ミトコンドリアと、ＮｉｆＤ融合ポリペプチド（ＮＤＦ）をコードする第一の外来ポリヌクレオチド（該ＮＤＦは、（ｉ）Ｃ末端を有する第一のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ１）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆＤポリペプチド（ＮＤ）を含み、ここで、該ＭＴＰ１のＣ末端は、該ＮＤのＮ末端に翻訳的に融合される）と、以下の：
【００３６】
（ａ）ＮｉｆＨ融合ポリペプチド（ＮＨＦ）をコードする第二の外来ポリヌクレオチド、該ＮＨＦは、（ｉ）Ｃ末端を有する第二のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ２）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆＨポリペプチド（ＮＨ）を含み、ここで、該ＭＴＰ２のＣ末端は、該ＮＨのＮ末端に翻訳的に融合され、ならびに
（ｂ）ＮｉｆＫ融合ポリペプチド（ＮＫＦ）をコードする第三の外来ポリヌクレオチド、該ＮＫＦは、（ｉ）Ｃ末端を有する第三のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ３）および（ｉｉ）がＮ末端を有するＮｉｆＫポリペプチド（ＮＫ）を含み、ここで、ＭＴＰ３のＣ末端は、該ＮＫのＮ末端に翻訳的に融合され、好ましくは、ここで、該ＮＫＦは、野生型ＮｉｆＫポリペプチドに関連した天然のＣ末端を有し、ならびに
（ｃ）ＮＤＦ、ＮＨＦおよびＮＫＦを除くＮｉｆ融合ポリペプチド（ＮＦ）をコードする第四のポ外来リヌクレオチド、該ＮＦは、（ｉ）Ｃ末端を有する第四のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ４）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を含み、ここで、該ＭＴＰ４のＣ末端は、該ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合される、
のうちの１つ、複数、またはそのすべてを含む植物細胞であって、
【００３７】
ここで、ＭＴＰ１、ＭＴＰ２、ＭＴＰ３およびＭＴＰ４のそれぞれが、独立に同じであるかまたは異なっている、植物細胞を提供する。ある実施形態において、第四の外来ポリヌクレオチドは、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＦ、ＮｉｆＪ、ＮｉｆＭ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＱ、ＮｉｆＳ、ＮｉｆＵ、ＮｉｆＶ、ＮｉｆＷ、ＮｉｆＸ、ＮｉｆＹおよびＮｉｆＺから成る群から選択される１もしくは複数のＮＰをコードする。好ましい実施形態において、ＮｉｆＫおよび／またはＮｉｆＮ（存在する場合）のＣ末端は、それぞれ、野生型ＮｉｆＫポリペプチドまたは野生型ＮｉｆＮポリペプチドのＣ末端と同じである、すなわち、ＮｉｆＫおよび／またはＮｉｆＮは、好ましくは両方とも、どんな人工的に付加されたＣ末端伸長も有していない。
【００３８】
一実施形態において、各ＮＦは、ミトコンドリア内に移行されることが可能である。
上記の態様のいずれかの一実施形態において、ミトコンドリアは、（ｉ）ＮｉｆＤ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＮ、または（ｉｉ）ＮｉｆＤ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＫまたはＮｉｆＳから成る群から選択されるＮｉｆポリペプチドのうちの１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、またはそのすべてを含む。
【００３９】
さらなる実施形態において、１つ、複数、またはすべてのＮｉｆ融合ポリペプチドが、植物細胞内のマトリックスプロセシングプロテアーゼ（ＭＰＰ）によってＭＴＰ内で切断され、好ましくは、ここで、少なくともＮｉｆＤ融合ポリペプチドまたはＮｉｆＨ融合ポリペプチドが、ＭＰＰによって切断される。
【００４０】
一またはさらなる実施形態において、ＮＤ、ＮＤＦ、ＣＤＦ、ＮＨ、ＮＨＦ、ＣＨＦ、ＮＫ、ＮＫＦ、ＣＫＦ、ＮＦ、ＣＦＮＢ、ＮＥ、ＮＮおよびＮＳから成る群から選択される１もしくは複数のポリペプチドが、好ましくは、ＮＰＣがニトロゲナーゼ活性を有するように、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの他のＮｉｆポリペプチドと結合して、Ｎｉｆがタンパク質複合体（ＮＰＣ）を形成することができる。
【００４１】
一またはさらなる実施形態において、ＣＤＦ、ＣＫＦ、ＣＨＦまたはＣＦは、それぞれ、ＮＤ、ＮＫ、ＮＨ、またはＮＰよりサイズが大きく、好ましくは、５〜５０アミノ酸残基大きく、および／またはここで、ＣＤＦ、ＣＫＦ、ＣＨＦ、またはＣＦは、それぞれ、ＮＤＦ、ＮＫＦ、ＮＨＦ、またはＮＦよりサイズが小さく、好ましくは、５〜４５アミノ酸残基小さい。好ましい実施形態において、それぞれＣＤＦ、ＣＫＦ、ＣＨＦ、またはＣＦは、独立にＭＴＰのＣ末端から約５〜約１１アミノ酸残基、例えば、ＭＴＰのＣ末端から６または７アミノ酸、７または８アミノ酸、８または９アミノ酸、９または１０アミノ酸、あるいは、１１または１２アミノ酸ほどを含む。
【００４２】
一またはさらなる実施形態において、ＭＴＰは、少なくとも１０アミノ酸、好ましくは１０〜８０アミノ酸を含む。
一またはさらなる実施形態において、少なくとも１つ、複数、すべてのＭＴＰが、ミトコンドリアタンパク質前駆体のＭＴＰ、またはその変異体、好ましくは、植物ＭＴＰを含んでいる。
一またはさらなる実施形態において、（単数もしくは複数の）外来ポリヌクレオチドが、細胞のゲノム内に組み込まれる。
【００４３】
一またはさらなる実施形態において、細胞は、プロトプラストではない。
一またはさらなる実施形態において、細胞は、アラビドプシス・サリアナ（Arabidopsis thaliana）のプロトプラスト以外の細胞である。
さらなる態様において、本発明は、本発明による細胞を含むトランスジェニック植物を提供し、ここで、該トランスジェニック植物は、（単数もしくは複数の）外来ポリヌクレオチドのトランスジェニックであり、および／または該トランスジェニック植物は、（単数もしくは複数の）融合ポリペプチドをコードする（単数もしくは複数の）外来ポリヌクレオチドのトランスジェニックである。
【００４４】
一実施形態において、１つ、複数、またはすべての外来ポリヌクレオチドが、植物の根で発現されており、好ましくは、植物の葉よりも植物の根で優れたレベルで発現されている。
一またはさらなる実施形態において、トランスジェニック植物は、対応する野生型植物に対する増収、バイオマス、成長速度、生命力、生物窒素固定から得られる窒素獲得、窒素利用効率、非生物的ストレス寛容性、および／または栄養素欠乏に対する寛容性である、対応する野生型植物に対して変更された表現型を有する。
【００４５】
代替の実施形態において、トランスジェニック植物は、対応する野生型植物に対して同じ成長速度および／または表現型を有する。
一またはさらなる実施形態において、トランスジェニック植物は、例えばコムギ、コメ、トウモロコシ、トリティカーレ、オートムギ、またはオオムギ、好ましくはコムギなどの穀物用植物である。
【００４６】
一実施形態において、トランスジェニック植物は、（単数もしくは複数の）外来ポリヌクレオチドのホモ接合体またはヘテロ接合体である。
一またはさらなる実施形態において、トランスジェニック植物は、田畑に生えている。
さらなる態様において、本発明は、田畑に生えている本発明による少なくとも１００本の植物集団を提供する。
【００４７】
さらなる態様において、本発明は、ＮｉｆＤ融合ポリペプチド（ＮＤＦ）を提供し、該ＮＤＦは、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆＤポリペプチド（ＮＤ）を含み、ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＤのＮ末端に翻訳的に融合される。
【００４８】
さらなる態様において、本発明は、ＮｉｆＨ融合ポリペプチド（ＮＨＦ）を提供し、該ＮＨＦは、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆＨポリペプチド（ＮＨ）を含み、ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＨのＮ末端に翻訳的に融合される。
【００４９】
さらなる態様において、本発明は、Ｎｉｆ融合ポリペプチド（ＮＦ）を提供し、該ＮＦは、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を含み、ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合され、およびここで、該ＮＦは、対応する野生型Ｎｉｆポリペプチドに関連した天然のＣ末端を有する。
【００５０】
好ましい実施形態において、ＮＰは、ＮｉｆＤポリペプチド、ＮｉｆＫポリペプチド、およびＮｉｆＮポリペプチドから成る群から選択される。
【００５１】
さらなる態様において、本発明は、ＮｉｆＫ融合ポリペプチド（ＮＫＦ）およびＮｉｆＮ融合ポリペプチド（ＮＮＦ）を含むＮｉｆ融合ポリペプチド（ＮＦ）の組み合わせを提供し、各ＮＦは、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を含み、ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合され、ここで、それぞれのＮＦのＭＴＰは、独立に同じであるかまたは異なっており、およびここで、ＮＫＦおよびＮＮＦのそれぞれが、対応する野生型Ｎｉｆポリペプチドに関連した天然のＣ末端を有する。
【００５２】
さらなる態様において、本発明は、以下の：
（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）、
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有するＮｉｆＤポリペプチド（ＮＤ）、
（ｉｉｉ）オリゴペプチドリンカー、および
（ｉｖ）Ｎ末端を有するＮｉｆＫポリペプチド（ＮＫ）、
を含み、
ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＤのＮ末端に翻訳的に融合され、および
ここで、該リンカーは、該ＮＤのＣ末端と該ＮＫのＮ末端に翻訳的に融合される、
融合ポリペプチドを提供する。
【００５３】
一実施形態において、リンカーは、植物細胞または細菌細胞内で機能的な形状で、ＮＤとＮＫとが結合することを可能にするのに十分な長さのものである。ある実施形態において、リンカーは、長さが８〜５０アミノ酸である。好ましくは、リンカーは、長さが少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約２５アミノ酸、または少なくとも約３０アミノ酸である。
【００５４】
ある実施形態において、融合ポリペプチドのＣ末端は、ＮＫのＣ末端である。
別の態様において、本発明は、以下の：
（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）、
（ｉｉ）Ｎ末端およびＣ末端を有するＮｉｆＥポリペプチド（ＮＥ）、
（ｉｉｉ）オリゴペプチドリンカー、および
（ｉｖ）Ｎ末端を有するＮｉｆＮポリペプチド（ＮＮ）
を含み、
ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、翻訳的に該ＮＥのＮ末端に融合され、および
ここで、該リンカーは、該ＮＥのＣ末端と該ＮＮのＮ末端に翻訳的に融合される、
融合ポリペプチドを提供する。
【００５５】
一実施形態において、リンカーは、植物細胞または細菌細胞内で機能的な形状で、ＮＥとＮＮとが結合することを可能にするのに十分な長さのものである。例えば、ある実施形態において、リンカーは、少なくとも約７０Å、少なくとも約１００Å、約７０Å〜約１５０Å、または約１００Å〜約１２０Å、または約１００Å、または約１０４Åの長さである。上記の態様のさらなる実施形態において、オリゴペプチドリンカーは、少なくとも約２０アミノ酸、少なくとも約３０アミノ酸、少なくとも約４０アミノ酸、または約２０アミノ酸〜約７０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約７０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約６０アミノ酸、約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸、または約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約３５アミノ酸、約４０アミノ酸、約４５アミノ酸、約４６アミノ酸、約５０アミノ酸、または約５５アミノ酸の長さである。
【００５６】
一実施形態において、上記の態様のいずれかの（単数もしくは複数の）融合ポリペプチドは、マトリックスプロセシングプロテアーゼ（ＭＰＰ）によって切断されて、１もしくは複数のプロセシングされたＮｉｆポリペプチド生成物を作製することができる。
【００５７】
さらなる実施形態のうちの１つにおいて、（単数もしくは複数の）融合ポリペプチドは、植物細胞または細菌細胞の中、好ましくは植物細胞のミトコンドリアの中に存在する。
【００５８】
さらなる態様において、本発明は、本発明による（単数もしくは複数の）融合ポリペプチドから、該（単数もしくは複数の）融合ポリペプチドのＭＴＰ内の切断によって、作製されたプロセシングされたＮｉｆポリペプチドを提供する。
【００５９】
一実施形態において、プロセシングされたＮｉｆポリペプチドは、植物細胞のミトコンドリアマトリックス中のＭＰＰによる融合ポリペプチドの切断によって作製された。
【００６０】
一またはさらなる実施形態において、プロセシングされたＮｉｆポリペプチドは、植物細胞または細菌細胞の中、好ましくは植物ミトコンドリアの中、より好ましくは植物細胞ミトコンドリアのミトコンドリアマトリックス（ＭＭ）の中に存在する。
【００６１】
一またはさらなる実施形態において、融合ポリペプチドまたはプロセシングされたＮｉｆポリペプチドには、任意選択で細菌細胞の中で測定されるように、好ましくは対応する野生型Ｎｉｆポリペプチドとしての生化学的活性のほぼ同じくらいのレベルを有して、対応する野生型Ｎｉｆポリペプチドと同じ生化学的活性がある。
【００６２】
一またはさらなる実施形態において、（単数もしくは複数の）融合ポリペプチドまたはプロセシングされたＮｉｆポリペプチドは、好ましくは、ＮＰＣがニトロゲナーゼ活性を有するように、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの他のＮｉｆポリペプチドと結合して、Ｎｉｆタンパク質複合体（ＮＰＣ）を形成することができる。
【００６３】
さらなる態様において、本発明は、本発明による融合ポリペプチドまたはプロセシングされたＮｉｆポリペプチドのうちの１つ、複数、またはそのすべてをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００６４】
一実施形態において、ＮＦはＮｉｆＤ融合ポリペプチド（ＮＤＦ）であって、そして、該ポリヌクレオチドは、以下の：
（ｉ）ＮｉｆＨ融合ポリペプチド（ＮＨＦ）、該ＮＨＦは、Ｃ末端有する第二のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ２）およびＮ末端を有するＮｉｆＨポリペプチド（ＮＨ）を、該ＭＴＰ２のＣ末端が、該ＮＨのＮ末端に翻訳的に融合されるように含み、
（ｉｉ）ＮｉｆＫ融合ポリペプチド（ＮＫＦ）、該ＮＫＦは、Ｃ末端を有する第三のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ３）およびＮ末端を有するＮｉｆＫポリペプチド（ＮＫ）を、該ＭＴＰ３のＣ末端が、該ＮＫのＮ末端に翻訳的に融合されるように含み、ならびに
【００６５】
（ｉｉｉ）ＮＤＦ、ＮＨＦおよびＮＫＦ以外のＮｉｆ融合ポリペプチド（ＮＦ）、該ＮＦは、Ｃ末端を有する第四のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ４）およびＮ末端を有するＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を、該ＭＴＰ４のＣ末端が、該ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合されるようにを含む、
のうちの１つ、複数、またはそのすべてをコードする１もしくは複数のヌクレオチド配列をさらにを含み、
ここで、ＭＴＰ１、ＭＴＰ２、ＭＴＰ３およびＭＴＰ４のそれぞれが、独立に同じであるかまたは異なっている。
【００６６】
一またはさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、植物細胞内での発現のためにコドン修飾された。
一またはさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドまたは融合ポリペプチドをコードするその中の各配列に作動可能に連結されたプロモーター、および／または該ポリヌクレオチドに作動可能に連結された翻訳的な調節エレメントを含む。
【００６７】
一実施形態において、プロモーターは、植物の根、葉および／または茎におけるポリヌクレオチドの発現をもたらし、好ましくは、プロモーターは、植物の種子に関連した植物の根、葉または茎のうちの１つ、複数、またはそのすべてにおける該ポリヌクレオチドの発現をもたらす。
【００６８】
一またはさらなる実施形態において、ポリヌクレオチドは、植物細胞または細菌細胞の中に存在し、好ましくは植物細胞のゲノム内に組み込まれる。
さらなる態様において、本発明は、第一のＮｉｆが融合ポリペプチド（ＮＦ）をコードする第一のポリヌクレオチドおよび第二のＮＦをコードする第二のポリヌクレオチドを含む核酸構築物であって、各ＮＦが、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を含み、ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合され、およびここで、それぞれのＭＴＰが、独立に同じであるかまたは異なっている、核酸構築物を提供する。
【００６９】
一実施形態において、核酸構築物は、１もしくは複数のＮＦをコードする１もしくは複数の外来ポリヌクレオチドをさらに含み、各ＮＦは、（ｉ）Ｃ末端を有するミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を含み、ここで、該ＭＴＰのＣ末端は、該ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合され、ここで、それぞれのＭＴＰは、独立に同じであるかまたは異なっており、かつ、それぞれのＮＰは、独立に同じであるかまたは異なっている。
【００７０】
さらなる態様において、本発明は、ＮｉｆＤ融合ポリペプチド（ＮＤＦ）をコードする第一のポリヌクレオチド（該ＮＤＦは、（ｉ）Ｃ末端を有する第一のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ１）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆＤポリペプチド（ＮＤ）を含み、ここで、該ＭＴＰ１のＣ末端は、該ＮＤのＮ末端に翻訳的に融合される）と、以下の：
【００７１】
（ａ）ＮｉｆＨ融合ポリペプチド（ＮＨＦ）をコードする第二のポリヌクレオチド、該ＮＨＦは、（ｉ）Ｃ末端を有する第二のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ２）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆＨポリペプチド（ＮＨ）を含み、ここで、該ＭＴＰ２のＣ末端は、該ＮＨのＮ末端に翻訳的に融合され、ならびに
（ｂ）ＮｉｆＫ融合ポリペプチド（ＮＫＦ）をコードする第三のポリヌクレオチド、該ＮＫＦは、（ｉ）Ｃ末端を有する第三のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ３）および（ｉｉ）がＮ末端を有するＮｉｆＫポリペプチド（ＮＫ）を含み、ここで、ＭＴＰ３のＣ末端は、該ＮＫのＮ末端に翻訳的に融合され、好ましくは、ここで、該ＮＫＦは、野生型ＮｉｆＫポリペプチドに関連した天然のＣ末端を有し、ならびに
【００７２】
（ｃ）ＮＤＦ、ＮＨＦおよびＮＫＦを除くＮｉｆ融合ポリペプチド（ＮＦ）をコードする第四のポ外来リヌクレオチド、該ＮＦは、（ｉ）Ｃ末端を有する第四のミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ４）および（ｉｉ）Ｎ末端を有するＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を含み、ここで、該ＭＴＰ４のＣ末端は、該ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合される、
のうちの１つ、複数、またはそのすべてを含む核酸構築物であって、
【００７３】
ここで、ＭＴＰ１、ＭＴＰ２、ＭＴＰ３およびＭＴＰ４のそれぞれが、独立に同じであるかまたは異なっている、核酸構築物を提供する。
【００７４】
一実施形態において、各ＮＦは、植物細胞のミトコンドリア内に移行されることができる。
さらなる態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドまたは本発明による核酸構築物を含むか、またはコードするキメラベクターを提供する。
一実施形態において、ポリヌクレオチド、または融合ポリペプチドをコードするその中のそれぞれの配列は、プロモーターおよび任意選択で、転写終止配列に作動可能に連結される。
【００７５】
一実施形態において、プロモーターは、植物の根、葉および／または茎における１つ、複数、またはすべてのポリヌクレオチドの発現をもたらし、好ましくは、該ポリヌクレオチドは、植物の種子に関連する植物の根、葉または茎のうちの１つ、複数、またはそのすべてにおいて優先的に発現される。
【００７６】
さらなる態様において、本発明は、本発明による融合ポリペプチドまたはプロセシングされたＮｉｆポリペプチドのうちの１つ、複数、またはそのすべて、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による核酸構築物、および／または本発明によるベクターのうちの１つ、複数、またはそのすべてを含む細胞を提供する。
【００７７】
一実施形態において、細胞は、植物細胞または細菌細胞である。
さらなる実施形態において、植物細胞は、例えばコムギ細胞、イネ細胞、トウモロコシ細胞、トリティカーレ細胞、オートムギ細胞、またはオオムギ細胞、好ましくはコムギ細胞などの穀物植物細胞である。
さらなる態様において、本発明は、本発明による（単数もしくは複数の）融合ポリペプチドまたは（単数もしくは複数の）プロセシングされたＮｉｆポリペプチドを作製する方法を提供し、該方法は、細胞内で本発明によるポリヌクレオチドを発現することを含む。
さらなる態様において、本発明は、方法による細胞を作製する方法を提供し、該方法は、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による核酸構築物、および／または本発明によるベクターを細胞内に導入するステップを含む。
【００７８】
さらなる態様において、本発明は、本発明によるトランスジェニック植物を作製する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
ｉ）本発明によるポリヌクレオチド、本発明による核酸構築物、および／または本発明によるベクター植物細胞内に導入し、
ｉｉ）該細胞からトランスジェニック植物を再生し、および
ｉｉｉ）任意選択で、該植物から種子を採取し、および／または
ｉｖ）任意選択で、該トランスジェニック植物から１もしくは複数の子孫植物を作製し、それによって、トランスジェニック植物を作製すること、
を含む。
【００７９】
さらなる態様において、本発明は、そのゲノム内に本発明によるポリヌクレオチド、または本発明による核酸構築物のいずれか一つで規定したポリヌクレオチドを組み込んだ植物を作製する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
ｉ）２つの親植物を交配し、ここで、少なくとも一方の植物が（単数もしくは複数の）該ポリヌクレオチドを含み、
ｉｉ）（単数もしくは複数の）該ポリヌクレオチドの有無に関して交配からの１もしくは複数の子孫植物をスクリーニングし、
ｉｉｉ）（単数もしくは複数の）該ポリヌクレオチドを含む子孫植物を選択して、それによって、その植物を作製すること、
を含む。
【００８０】
一実施形態において、（単数もしくは複数の）ポリヌクレオチドは、植物にニトロゲナーゼ活性をもたらす（単数もしくは複数の）ポリペプチドをコードする。
一またはさらなる実施形態において、少なくとも一方の親植物が、四倍体または六倍体コムギ植物である。
一またはさらなる実施形態において、ステップｉｉ）は、（単数もしくは複数の）該ポリヌクレオチドに関して、１もしくは複数の子孫植物からのＤＮＡを含むサンプルを分析することを含む。
【００８１】
一またはさらなる実施形態において、ステップｉｉｉ）は、以下の：
ｉ）（単数もしくは複数の）該ポリヌクレオチドに関してホモ接合である子孫植物を選択し、および／または
ｉｉ）（単数もしくは複数の）該ポリヌクレオチドの存在および／または発現に関して、あるいは、先に規定したような変更された表現型に関して、１もしくは複数の子孫植物を分析すること、
を含む。
【００８２】
一またはさらなる実施形態において、前記方法は、以下の：
ｉｖ）最初の親の遺伝子型の大部分を有するが、該ポリヌクレオチドを含む植物を作製するのに十分な回数にわたり、（単数もしくは複数の）該ポリヌクレオチドを有していない第一の親株として同じ遺伝子型の植物を用いて、ステップｉ）の交配の子孫を戻し交配し、および
ｉｖ）該ポリヌクレオチドを含む、および／または先に規定した変更された表現型を有する子孫植物を選択すること、
をさらに含む。
【００８３】
一またはさらなる実施形態において、前記方法は、他の少なくとも１つの遺伝子マーカーについて植物または子孫植物を分析するステップをさらに含む。
さらなる態様において、本発明は、本発明による方法を使用して作製された植物を提供する。
【００８４】
さらなる態様において、本発明は、組み換え細胞および／またはトランスジェニック植物を作製するための、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による核酸構築物、および／または本発明によるベクターの使用を提供する。
一実施形態において、トランスジェニック植物は、外来ポリヌクレオチド、核酸構築物、および／またはベクターを有していない対応植物と比較したときに、先に規定した変更された表現型を有する。
【００８５】
さらなる態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むか、または本発明による核酸構築物のいずれか一つにおいて規定されるポリヌクレオチドを含む植物を同定するための方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
ｉ）植物から核酸のサンプルを入手し、および
ｉｉ）（単数もしくは複数の）該ポリヌクレオチドの有無に関して該サンプルをスクリーニングすること、
を含む。
【００８６】
一実施形態において、（単数もしくは複数の）該ポリヌクレオチドの存在は、（単数もしくは複数の）外来ポリヌクレオチドを有していない対応植物と比較したときに、その植物が、先に規定した変更された表現型を有することを示唆している。
一またはさらなる実施形態において、本発明による、前記方法は、植物を同定する。
一またはさらなる実施形態において、前記方法は、ステップｉ）の前に種子から植物を作製することをさらに含む。
【００８７】
さらなる態様において、本発明は、本発明による植物の植物部分を提供する。
一実施形態において、前記植物部分は、本発明によるポリヌクレオチドを含むか、または本発明による核酸構築物のいずれか一つにおいて規定されるポリヌクレオチドを含む種子である。
【００８８】
さらなる態様において、本発明は、植物部分を製造する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
ａ）本発明による植物を栽培し、および
ｂ）該植物部分を採取すること、
を含む。
【００８９】
さらなる態様において、本発明は、フラワー、全粒粉、デンプン、油脂、シードミールまたは種子から得られる他の製品を製造する方法を提供し、該方法は、以下のステップ：
ａ）本発明による種子を得、および
ｂ）フラワー、全粒粉、デンプン、油脂もしくは他の製品を抽出するか、またはシードミールを製造すること、
を含む。
【００９０】
さらなる態様において、本発明は、本発明による植物および／または植物部分から製造される製品を提供する。
一実施形態において、前記部分とは、種子である。
一またはさらなる実施形態において、前記製品は、食品または飲料製品である。
【００９１】
好ましくは、ｉ）食品は：フラワー、デンプン、油脂、発酵もしくは無発酵パン、パスタ、ヌードル、家畜飼料、朝食用シリアル、スナック食品、ケーキ、モルト、ペストリー、およびフラワーベースのソースを含む食品から成る群から選択され、またはｉｉ）飲料製品は、ジュース、ビールまたはモルトである。斯かる製品を製造する方法は、当業者にとって周知である。
【００９２】
代替の実施形態において、前記製品は、非食品である。非食品の例としては、これだけに限定されるものではないが、フィルム、被覆材、接着剤、建築材料および包装材が挙げられる。斯かる製品を製造する方法は、当業者にとって周知である。
【００９３】
さらなる態様において、本発明は、本発明による食品を調製する方法を提供し、該方法は、種子、または種子からのフラワー、全粒粉もしくはデンプンを、別の食品成分と混合することを含む。
【００９４】
さらなる態様において、本発明は、本発明による種子を発芽させるステップを含めた、モルトを調製する方法を提供する。
【００９５】
さらなる態様において、本発明は、動物の飼料としての、または動物の飼料用もしくはヒトの食用の食料を製造するための、本発明による植物またはその部分の使用を提供する。
【００９６】
さらなる態様において、本発明は、（単数もしくは複数の）融合ポリペプチドまたは（単数もしくは複数の）プロセシングされたＮｉｆポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明による核酸構築物、本発明によるベクター、または本発明による細胞、および１もしくは複数の許容される担体を含む組成物を提供する。
【００９７】
さらなる態様において、本発明は、植物細胞内でのニトロゲナーゼタンパク質複合体の再構成のための方法を提供し、該方法は、細胞内に、本発明による２以上のポリヌクレオチド、本発明による２以上の核酸構築物、および／または本発明によるベクターを導入し、そして、該ポリヌクレオチドまたはベクターが発現されるのに十分な時間にわたり該植物細胞を培養することを含む。
【００９８】
さらなる態様において、本発明は、植物または植物細胞内に、本発明による２以上のポリヌクレオチド、本発明による２以上の核酸構築物、および／または本発明によるベクターを導入することを含めた、増収、バイオマス、成長速度、生命力、生物窒素固定から得られる窒素獲得、窒素利用効率、非生物的ストレス寛容性、および／または植物の栄養素欠乏に対する寛容性を増強する方法を提供する。
【００９９】
本発明は、本明細書中に記載した特定の実施形態によって範囲を制限されるものではなく、それらは、例示だけを目的とすることが意図されている。機能的に同等な産物、組成物、および方法は、本明細書中に記載したように、明らかに、本発明の範囲内にある。
【０１００】
本願明細書を通じて、特定の別段の記載または文脈上の別段の必要性が無い限り、単独のステップ、物質の組成物、ステップ群または物質の組成物群に対する言及は、それらのステップ、物質の組成物、ステップ群または物質の組成物群の１および複数（すなわち、１もしくは複数）を包含すると解釈されるべきである。
本発明は、以下の非限定的な実施例により、および添付の図面に対する参照により以下に説明される。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】ｐＣＷ４４０のＴ−ＤＮＡの遺伝子マップ。標識：３５ＳＰ、完全長ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、転写の方向を示す；Ｔ７プロモーター、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター；ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰ、ｄＣｏｘＩＶミトコンドリア標的化ペプチド；ＡｓｃＩ、ＭＴＰとのインフレーム融合を挿入するためのＡｓｃＩの制限酵素部位；Ｔ７ターミネータ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの転写終止部位；修飾ｎｏｓポリＡ、ｎｏｓ３’ポリアデニル化シグナル。
【図２】細菌およびＮ．ベンサミアナの葉において産生されたＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫおよびＮｉｆＹ融合ポリペプチドのウエスタンブロット分析の写真、各ポリペプチドは、ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰに融合され、そして、Ｃ末端伸長はＨＡまたはＦＬＡＧエピトープを含む。レーンの内容：１、対照葉抽出物（ｐ１９浸潤物のみ）およびポリペプチド分子量マーカー；黒塗り矢印＝７２ｋＤａ、次の矢印（白抜き）は、５５、４０、３３、２５および１７ｋＤａである；レーン２〜５、細菌ＢＬ２１−Ｇｏｌｄ（レーン２）または２つの別個の葉浸潤物（レーン３、４）で発現されたｐＣＷ４４６ ｄＣｏｘＩＶ−ＮｉｆＨ−ＨＡ；レーン５−７、細菌（レーン５）または２つの別個の葉浸潤物（レーン６、７）で発現されたｐＣＷ４４７−ｄＣｏｘＩＶ−ＮｉｆＤ−ＦＬＡＧ。レーン８〜１０、細菌（レーン８）または２つの別個の葉浸潤物（レーン９、１０）で発現されたｐＣＷ４４８−ｄＣｏｘＩＶ−ＮｉｆＫ−ＨＡ；レーン１１〜１３、細菌（レーン１１）または２つの別個の葉浸潤物（レーン１２、１３）で発現されたｐＣＷ４４９−ｄＣｏｘＩＶ−ＮｉｆＹ−ＨＡ；レーン１４〜１５、葉浸潤物で発現された４つのベクターｐＣＷ４４６、ｐＣＷ４４７、ｐＣＷ４４８、およびｐＣＷ４４９がの組み合わせ。レーン１５はまた、細胞質に局在するＬｂｈを発現する、ベクターｐＣＷ４４４の浸潤物も含む。ブロットＡは、２つの一次抗体、抗ＨＡおよび抗ＦＬＡＧで探査された；ブロットＢは、抗ＨＡだけで探査された。ブロットＡのより長い曝露（レーン１４）は、ＮｉｆＤではなく、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＫおよびＮｉｆＹポリペプチドのシグナルを明らかにした。
【図３】Ｎ．ベンサミアナの葉におけるｐＦＡγ：：ＧＦＰ融合ポリペプチドの一過性発現に使用される構築物の概略図。野生型ｐＦＡγアミノ酸配列が上に示されており、および変異アミノ酸配列（ｍＦＡγ）は下に示されている。矢印は、ＭＰＰによる予測切断点を示す。３５Ｓ Ｐｒ、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター；Ｔ７Ｐ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ＭＴＰ、ｐＦＡγまたはｍＦＡγ領域；ＧＦＰ、ＧＦＰポリペプチド；Ｔ７Ｔ、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写ターミネータ；ＮＯＳ、ｎｏｓ遺伝子の３’転写ターミネータ／ポリアデニル化領域。
【図４】ｐＦＡγ：：ＮｉｆＦ：：ＨＡまたはｐＦＡγ：：ＮｉｆＺ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドをコードする構築物を発現するＮ．ベンサミアナまたはＥ．コリ（E.coli）細胞からのタンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の、ＨＡ（左のパネル）またはＦＬＡＧ（右のパネル）に対する抗体を用いて探査されたウエスタンブロットの写真。レーン上の＋および−記号は、それぞれ、レーンに適用されたＮ．ベンサミアナまたはＥ．コリのタンパク質抽出物の存在または不存在を示す；細菌抽出物に使用される抽出物の希釈係数を大かっこ内に示す。
【図５】Ｎ．ベンサミアナの葉細胞においてｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡを発現するのに使用した遺伝子構築物の図解。ヌクレオチド配列で下線が引かれた残基は、トリプシンによるタンパク質分解的切断（カルボキシル側）の部位を示す。矢印は、ミトコンドリアプロセシングペプチダーゼ（ＭＰＰ）による切断点を示す。ペプチドＩＳＴＱＶＶＲ（配列番号４４）およびＡＶＱＧＡＰＴＭＲ（配列番号４５）が質量分析法によって検出された。
【図６】ｐＦＡγ：：Ｎｉｆ：：ＨＡまたはｐＦＡγ：：Ｎｉｆ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドをコードする構築物を発現するＮ．ベンサミアナ細胞からのタンパク質抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ後の、ＨＡ（左上のパネル）またはＦＬＡＧ（右上のパネル）に対する抗体を用いて探査されたウエスタンブロットの写真。レーン上の文字（Ｋ、Ｂ、Ｓ、Ｅなど）は、遺伝子構築物によってコードされた融合ポリペプチドの中に含まれるＮｉｆポリペプチドを示す。ｐＦＡγ：：ＮｉｆＪ：：ＦＬＡＧのブロット上部近くの微かなバンドをアスタリスク（＊）で示す。分子量マーカー（ｋＤａ）のサイズを左に示す。下のパネルは、クーマシー染色後の対応するゲルを示す。
【図７】ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧをコードする同じ構築物を含むＮ．ベンサミアナの葉またはＥ．コリから抽出したタンパク質のウエスタンブロットの写真。ブロットは、ＦＬＡＧエピトープに対する抗体で探査された。第一のレーンのマーカーの分子量を示す。Ｅ．コリ抽出物の希釈係数が、大かっこ内に示されている。
【図８】それぞれ、レーン２および３の陽性および陰性対照としてｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ、ｍＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡまたはｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ：：ＨＡおよびｐＦＡγ：：ＧＦＰをコードする構築物を含有する（図の上部に示した）Ｅ．コリまたはＮ．ベンサミアナの葉からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットの写真。使用した構築物およびコードされたＮｉｆポリペプチド（ＤまたはＫ）を各レーンの上に示す。ブロットは、ＨＡエピトープに対する抗体で探査された。第一のレーンのマーカーの分子量を示す。下のパネルは、クーマシー染色したゲルを示す。クーマシー染色ゲルの主要なバンドは、Ｎ．ベンサミアナの葉のサンプルからのルビスコである。
【図９】ＮｉｆＫおよびＮｉｆＨポリペプチドの同時発現は、植物体のＮｉｆＤ融合ポリペプチド濃度を高める。ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫおよびＮｉｆＨ融合ポリペプチドの同時発現のための構築物の葉細胞内への導入後に産生されたポリペプチドのウエスタンブロットの写真。レーン１、ｐＲＡ２４＋ｐＲＡ１０＋ｐＲＡ２５；レーン２、ｐＲＡ２２＋ｐＲＡ１０＋ｐＲＡ２５；レーン３、ｐＲＡ１９＋ｐＲＡ１０＋ｐＲＡ２５；レーン４、ｐＲＡ１９＋ｐＲＡ２５；レーン５、ｐＲＡ１０＋ｐＲＡ２５；レーン６、ｐＲＡ１０；レーン７、ｐＲＡ１１；レーン８、ｐＲＡ２５；レーン９、ｐＲＡ２２；レーン１０、ｐＲＡ２４；レーン１１、ｐＲＡ１９；レーン１２、分子量マーカー、右側の数字は、ｋＤａを示す。構築物およびコードされたポリペプチドの一覧に関しては、表４を参照、そしてそれはまた、ブロットの上にも示した。レーン１のアスタリスクは、ＮｉｆＤの特有のバンドの位置を示す。
【図１０】ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ、ＮｉｆＫ（Ｃ末端伸長なし）、ＮｉｆＳ：：ＨＡおよびＮｉｆＨ：：ＨＡ融合ポリペプチドの発現のための葉細胞内への構築物の組み合わせの導入後に産生されたポリペプチドのウエスタンブロットの写真。上のパネルは抗ＦＬＡＧ抗体で探査され、下のパネルは抗ＨＡ抗体で探査された。レーン１および１２は、表示サイズ（ｋＤａ）を伴った分子量マーカーを示す。レーン２のシングルアスタリスクは、ＮｉｆＤ特有のバンド位置を示し、ダブルアスタリスクは、より小さい分解ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧポリペプチドまたは内部翻訳開始ポリペプチドの位置を示す。大かっこ内の数字は、バックグラウンドＦＬＡＧバンドに対するＮｉｆＤ特有のバンドの数量を表す。ＮｉｆＫ：：ＨＡ、ＮｉｆＳ：：ＨＡおよびＮｉｆ：：Ｈ融合ポリペプチドの位置は、下のパネルに示されている。構築物の組み合わせとコードされたポリペプチドを、それぞれのレーンの上に示す。略語：Ｄ−ＦＬＡＧ（ｐＲＡ０７；ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ）、Ｈ−ＨＡ（ｐＲＡ１０；ｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ）、Ｋ（ｐＲＡ２５；ｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ）、Ｋ−ＨＡ（ｐＲＡ１１、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ：：ＨＡ）、Ｓ−ＨＡ（ｐＲＡ１６；ｐＦＡγ：：ＮｉｆＳ：：ＨＡ）、Ｄ−ＨＡ（ｐＲＡ１９、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ）。
【図１１】ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ、ＮｉｆＫ（Ｃ末端伸長なし）またはＮｉｆＫ：：ＨＡおよびＮｉｆＨ：：ＨＡ融合ポリペプチドの発現のための葉細胞内への単独または組み合わせでの構築物の導入後に産生されたポリペプチドのウエスタンブロットの写真。導入された構築物は、各レーンの上に示されており、およびコードされた融合ポリペプチドは、各レーンの下に示されている。ブロットは、切断され、そして、抗ＨＡ抗体（レーン１〜７）または抗ＦＬＡＧ抗体（レーン９〜１２）のいずれかで探査された。アスタリスクは、レーン１１および１２のＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧの特有のバンドを示す。ウエスタンブロットのより長い曝露が、ｐＲＡ１９およびｐＲＡ０７（レーン２および３）の微かなＮｉｆＤバンドを観察するのに必要であった。
【図１２】それぞれ、緑色および青色としてＮｉｆＤおよびＮｉｆＫサブユニットを示す、ＮｉｆＤ：：リンカー：：ＮｉｆＫヘテロ二量体のモデル。空間充填モデルは、ＮｉｆＫのＮ末端にＮｉｆＤのＣ末端を連結する、リンカーペプチドを赤色で示す。
【図１３】含有されたＮｉｆＨサブユニット（紫色）のＡ．ビネランジイ（A.vinlandii）アミノ酸配列を伴ったＮｉｆＤ（緑色）およびＮｉｆＫ（青色）のＫ．ニューモニエ（K. pneumoniae）アミノ酸配列を使用した、２つのＮｉｆＨポリペプチドと複合体化した二量体としてのＮｉｆＤ：：リンカー：：ＮｉｆＫ融合ポリペプチドの相同モデル。設計されたリンカーは、赤色のファンデルワ−ルス原子表示で示される。左右の画像は、互いに対して縦軸の周りを９０度回転する。
【図１４】上のパネル：ｐＲＡ０１（レーン２、ＧＦＰ）、ｐＲＡ１１（レーン３、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ：：ＨＡ）、ｐＲＡ１９（レーン４、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ）およびｐＲＡ２０（レーン５、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ−リンカー（ＦＬＡＧ）−ＮｉｆＫ：：ＨＡ）から製造されるポリペプチドに関する、ＨＡエピトープを検出する抗体を使用したウエスタンブロットの写真。分子量マーカー（レーン１、ｋＤａ）のサイズは、左に示されている。下のパネルは、クーマシー染色ゲルを示す。
【図１５】マルチカセットベクターｐＫＴ１００およびｐＫＴ−ＨＣの構造の図解。ＬＢ：Ｔ−ＤＮＡの左縁；ＲＢ：右縁；Ｐ１−５／Ｔ１−５：発現カセット１〜５のプロモーター／ターミネータ；ＰＳ／ＴＳ：選択遺伝子を含有する発現カセットのプロモーター／ターミネータ；ＭＡＲ：マトリックス結合領域。制限酵素部位の位置に矢印を付した。
【図１６】上のパネル：遺伝子構築物を受容したＮ．ベンサミアナの葉サンプルからのタンパク質抽出物のゲル電気泳動後に、抗ＨＡおよび抗ＧＦＰ抗体の組み合わせで探査したウエスタンブロットの写真。レーン１、ポリペプチド分子量マーカー（ｋＤａ）。導入ベクター：レーン２、ｐＲＡ０１（ｐＦＡγ：：ＧＦＰ）；レーン３〜７、ｐＲＡ０１に加えて、カセット１〜５からｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡを発現するためのベクター。下のパネル：同じ膜のＰｏｎｃｅａｕ染色。ｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡバンドおよびｐＦＡγ：：ＧＦＰのバンドの二重線を示す。
【図１７】Ａ．上のパネル：遺伝子構築物を受容したＮ．ベンサミアナの葉サンプルからのタンパク質抽出物のゲル電気泳動後に、抗ＨＡ抗体で探査されたウエスタンブロットの写真。レーン１および３、ポリペプチド分子量マーカー（ｋＤａ）。導入ベクター：レーン２、ｐＲＡ０１（ｐＦＡγ：：ＧＦＰ）；レーン４、ＨＣ１３。下のパネル：同じ膜のＰｏｎｃｅａｕ染色。バンドの同一性を示す。Ｂ．抗ＭＹＣ抗体で探査された同一のウエスタンブロット。
【図１８】上のパネル：ｐＲＡ０１（ｐＦＡγ：：ＧＦＰ、Ｇで印を付したレーン）、ｐＲＡ１６（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＳ：：ＨＡ、Ｓで印を付したレーン）およびｐＲＡ１９（ヒトコドンで最適化されたｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ、Ｄで印を付したレーン）の組み合わせを用いた浸潤の４日後の、Ｎ．ベンサミアナの葉からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットの写真。ウエスタンブロットは、抗ＨＡおよび抗ＧＦＰ抗体で探査された。過飽和なしにＮｉｆＳおよびＧＦＰを解像するように、曝露を制限した。ＮｉｆＤ：：ＨＡ検出は、ブロットのより長い曝露を必要とした。分子量マーカー（ｋＤａ）のサイズはレーン１に示した。下のパネル：ｐＲＡ０１（ｐＦＡγ：：ＧＦＰ、Ｇで印を付したレーン）、ｐＲＡ２２（ヒトコドンで最適化されたｍＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ、Ｄ−ｍＭＴＰで印を付したレーン）、ｐＲＡ１９（ヒトコドンで最適化されたｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ、Ｄ−ＨＡで印を付したレーン）、ｐＲＡ２６（ヒトコドンで最適化されたΔＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ、Ｄ−ｓｔｏｐで印を付したレーン）およびｐＲＡ２４（アラビドプシス（Arabidopsis）コドンで最適化されたｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ、Ｄ−ａｌｔで印を付したレーン）の組み合わせでの浸潤の４日後の、Ｎ．ベンサミアナの葉からのタンパク質抽出物のウエスタンブロットの写真。ブロットは、抗ＨＡおよび抗ＧＦＰ抗体で探査された。ＮｉｆＤ−ＨＡ検出は、ブロットのより長い曝露を必要とした。
【図１９】ｐＲＡ２５と共にまたはそれなしに、ＮｉｆＤ：：ＨＡを発現するＰ１９およびＳＮ６、ＳＮ７またはＳＮ８構築物（実施例２０）を同時発現する構築物での浸潤後の、Ｎ．ベンサミアナの葉細胞からのタンパク質抽出物のＳＤＡ−ＰＡＧＥ後の、抗ＨＡ抗体を使用したウエスタンブロットの写真。Ｕｎｐｒｏ／ｐｒｏ：ＦＡγ51：：ＮｉｆＤのプロセシングされたまたは未プロセシング形態。ｄｅｇｒ ｐｒｏｄ：サイズが約４８ｋＤａのＮｉｆＤ−特異的分解産物。
【０１０２】
配列表のポイント
配列番号１−シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶの天然ＭＴＰのアミノ酸配列（ＣｏｘＩＶ ＭＴＰ）。
配列番号２−シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶの誘導体ＭＴＰアミノ酸配列（ｄＣｏｘＩＶ）。
配列番号３−ＭＴＰの移入および処理に関与するｄＣｏｘＩＶのモチーフｘＲｘｘｘＳＳｘ内の保存されたアルギニンおよびセリン残基。
【０１０３】
配列番号４−成分Ｔ−ＤＮＡ右縁（ヌクレオチド１〜１６４）、ＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｈｏＩ部位が両側に配置された３５Ｓプロモーター（ヌクレオチド２１９〜１５６４）、ＣＴＣＧＡＧ（ＸｈｏＩ）、Ｔ７プロモーター（ヌクレオチド１５７１〜１５８７）、ＡＴＧから始まるｄＣｏｘＩＶコード配列（ヌクレオチド１６５０〜１７４２）、ＡｓｃＩ部位（ヌクレオチド１７４３〜１７５０）、Ｔ７ターミネータ（ヌクレオチド１８１０〜１８５６）、ｎｏｓ３’ターミネータ（ヌクレオチド１８６１〜２０８４）およびＴ−ＤＮＡ左縁（ヌクレオチド２１８６〜２３４６）を有するｐＣＷ４４０のＴ−ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列。
【０１０４】
配列番号５−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＨのアミノ酸配列。
配列番号６−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＤのアミノ酸配列。
配列番号７−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＫのアミノ酸配列。
配列番号８−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＹのアミノ酸配列。
配列番号９−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＢのアミノ酸配列。
配列番号１０−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＥのアミノ酸配列。
配列番号１１−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＮのアミノ酸配列。
配列番号１２−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＱのアミノ酸配列。
配列番号１３−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＳのアミノ酸配列。
配列番号１４−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＵのアミノ酸配列。
配列番号１５−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＸのアミノ酸配列。
配列番号１６−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＦのアミノ酸配列。
配列番号１７−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＺのアミノ酸配列。
配列番号１８−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＪのアミノ酸配列。
配列番号１９−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＭのアミノ酸配列。
配列番号２０−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＶのアミノ酸配列。
【０１０５】
配列番号２１−ＨＡエピトープ（アミノ酸７〜１５）を含むＣ末端伸長（１７ａａ）のアミノ酸配列。
配列番号２２−ＦＬＡＧエピトープを含むＣ末端伸長（１２ａａ）のアミノ酸配列。
配列番号２３−ｐＣＷ４４６によってコードされたｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜３１はｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰに相当し、アミノ酸３２〜３４は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸３５〜３２６は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＨアミノ酸（開始コドンＭｅｔを取り除いた）であり、およびアミノ酸３２７〜３４３は、ＨＡエピトープを含む。
配列番号２４−ｐＣＷ４４７によってコードされたｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜３１は、ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰに相当し、アミノ酸３２〜３４は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸３５〜５１５は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＤアミノ酸（２つのＮ末端Ｍｅｔ残基を取り除いた）であり、およびアミノ酸５１６〜５２７は、ＦＬＡＧエピトープを含む。
【０１０６】
配列番号２５−ｐＣＷ４４８によってコードされたｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＫ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜３１は、ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰに相当し、アミノ酸３２〜３４は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸３５〜５５３は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＫアミノ酸であり、およびアミノ酸５５４〜５７０は、ＨＡエピトープを含む。
配列番号２６−ｐＣＷ４４９によってコードされたｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＹ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜３１は、ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰに相当し、アミノ酸３２〜３４は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸３５〜２５３は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＹアミノ酸（開始コドンＭｅｔなし）であり、およびアミノ酸２５４〜２７０はＨＡエピトープを含む。
配列番号２７−ＮｉｆＨ：：ＨＡをコードするＡｓｃＩ断片のヌクレオチド配列、ＡｓｃＩ−ＮｉｆＨ−ＨＡ−ＡｓｃＩ。
【０１０７】
配列番号２８−ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧをコードするＡｓｃＩ断片のヌクレオチド配列、ＡｓｃＩ−ＮｉｆＤ−ＦＬＡＧ−ＡｓｃＩ。
配列番号２９−ＮｉｆＫ：：ＨＡをコードするＡｓｃＩ断片のヌクレオチド配列、ＡｓｃＩ−ＮｉｆＫ−ＨＡ−ＡｓｃＩ。
配列番号３０−ＮｉｆＹ：：ＨＡをコードするＡｓｃＩ断片のヌクレオチド配列、ＡｓｃＩ−ＮｉｆＹ−ＨＡ−ＡｓｃＩ。
【０１０８】
配列番号３１−ｐＣＷ４５２によってコードされたｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＢ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜３１は、ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰに相当し、アミノ酸３２〜３４は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸３５〜５０１は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＢアミノ酸（開始コドンＭｅｔなし）であり、およびアミノ酸５０２〜５１８は、ＨＡエピトープを含む。
【０１０９】
配列番号３２−ｐＣＷ４５４によってコードされたｄＣｏｘＩＶ：：ｎｉｆＥ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜３１は、ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰに相当し、アミノ酸３２〜３４は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸３５〜４９０は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＥアミノ酸（開始コドンＭｅｔなし）であり、およびアミノ酸４９１〜５０７は、ＨＡエピトープを含む。
【０１１０】
配列番号３３−ｐＣＷ４５５によってコードされたｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＮ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜３１は、ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰに相当し、アミノ酸３２〜３４は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸３５〜４９３は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＮアミノ酸（開始コドンＭｅｔなし）であり、およびアミノ酸４９４〜５０５はＦＬＡＧエピトープを含む。
【０１１１】
配列番号３４−ｐＣＷ４５６によってコードされたｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＱ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜３１は、ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰに相当し、アミノ酸３２〜３４は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸３５〜２００は、クレブシエラ属（Klebsiella sp.）ＮｉｆＱアミノ酸（開始コドンＭｅｔなし）であり、およびアミノ酸２０１〜２１７は、ＨＡエピトープを含む。
【０１１２】
配列番号３５−ｐＣＷ４５０によってコードされたｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＳ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜３１は、ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰに相当し、アミノ酸３２〜３４は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸３５〜４３３は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＳアミノ酸（開始コドンＭｅｔなし）であり、およびアミノ酸４３４〜４５０は、ＨＡエピトープを含む。
【０１１３】
配列番号３６−ｐＣＷ４５１によってコードされたｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＵ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜３１は、ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰに相当し、アミノ酸３２〜３４は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸３５〜４９３は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＵアミノ酸（開始コドンＭｅｔなし）であり、およびアミノ酸４９４〜５０５は、ＦＬＡＧエピトープを含む。
【０１１４】
配列番号３７−ｐＣＷ４５３によってコードされたｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＸ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜３１は、ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰに相当し、アミノ酸３２〜３４は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸３５〜１８９は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＸアミノ酸（開始コドンＭｅｔなし）であり、およびアミノ酸１９０〜２０１は、ＦＬＡＧエピトープを含む。
【０１１５】
配列番号３８−クローニングストラテジーの結果としてｐＲＡ００に付加されたｐＦＡγ ＭＴＰ（アミノ酸１〜７７）およびアミノ酸トリプレットＧＡＰ（７８〜８０）を含むＮ末端伸長のアミノ酸配列。ＭＰＰによる切断は、アミノ酸残基４２と４３の間に起こる。
【０１１６】
配列番号３９−クローニングストラテジーの結果としてｐＲＡ２１に付加されたｍＦＡγ配列（アミノ酸１〜７７）およびアミノ酸トリプレットＧＡＰ（７８〜８０）を含む、ベクターｐＲＡ２１でコードされた、修飾Ｎ末端伸長のアミノ酸配列。配列番号３８に対してアミノ酸１２〜１８、２４〜３３および３９〜４５におけるアラニンアミノ酸置換が、ＭＰＰによる切断を無効にするように設計された。
【０１１７】
配列番号４０−ｐＲＡ０５によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＦ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位でのＫ．ニューモニエＮｉｆＸのクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜２５６は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＦアミノ酸（配列番号１６）であり、およびアミノ酸２５７〜２６７は、ＨＡエピトープを含む。
【０１１８】
配列番号４１−ｐＲＡ０４によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＺ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜２２８は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＺアミノ酸（配列番号１７）であり、およびアミノ酸２２９〜２３８は、ＦＬＡＧエピトープを含む。
【０１１９】
配列番号４２−ｐＲＡ１０によってコードされたｐＦＡγ：：ｉｆＨ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜３７２は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＨアミノ酸（イニシエーターＭｅｔなしの配列番号５）であり、およびアミノ酸３７３〜３８９は、ＨＡエピトープを含む。
【０１２０】
配列番号４３−未プロセシングｐＦＡγからのトリプシンペプチドのアミノ酸配列。
配列番号４４−ＭＰＰによって処理後のｐＦＡγからのトリプシンペプチドのアミノ酸配列。
配列番号４５−ＭＰＰによって処理後のｐＦＡγからのトリプシンペプチドのアミノ酸配列。
【０１２１】
配列番号４６−ｐＲＡ０３によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＢ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜５４７は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＢアミノ酸（イニシエーターＭｅｔなしの配列番号９）であり、アミノ酸５４８〜５６４はＨＡエピトープを含む。
【０１２２】
配列番号４７−ｐＲＡ０７によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜５６１は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＤアミノ酸（イニシエーターＭｅｔおよび次のＭｅｔなしの配列番号６）であり、およびアミノ酸５６２〜５７３はＦＬＡＧエピトープを含む。
【０１２３】
配列番号４８−ｐＲＡ０９によってコードされたｐＦＡγ：：ｎｉｆＥ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜５３６は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＥアミノ酸（イニシエーターＭｅｔなしの配列番号１０）であり、およびアミノ酸５３７〜５５３は、ＨＡエピトープを含む。
【０１２４】
配列番号４９−ｐＲＡ０６によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＪ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜１２５１は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＪアミノ酸（配列番号１８）であり、およびアミノ酸１２５２〜１２６１は、ＦＬＡＧエピトープを含む。
【０１２５】
配列番号５０−ｐＲＡ１１によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜５９９は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＫアミノ酸（イニシエーターＭｅｔなしの配列番号７）であり、およびアミノ酸６００〜６１６は、ＨＡエピトープを含む。
【０１２６】
配列番号５１−ｐＲＡ１８によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＭ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜３４６は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＭアミノ酸（配列番号１９）であり、およびアミノ酸３４７〜３５７は、ＨＡエピトープを含む。
【０１２７】
配列番号５２−ｐＲＡ１３によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＮ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜５３９は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＮアミノ酸（イニシエーターＭｅｔなしの配列番号１１）であり、およびアミノ酸５４０〜５５１は、ＦＬＡＧエピトープを含む。
【０１２８】
配列番号５３−ｐＲＡ０８によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＱ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜２４６は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＱアミノ酸（イニシエーターＭｅｔなしの配列番号１２）であり、およびアミノ酸２４７〜２６３は、ＨＡエピトープを含む。
【０１２９】
配列番号５４−ｐＲＡ１６によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＳ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜４７８は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＳアミノ酸（イニシエーターＭｅｔなしの配列番号１３）であり、およびアミノ酸４７９〜４９６は、ＨＡエピトープを含む。
【０１３０】
配列番号５５−ｐＲＡ１５によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＵ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜３５３は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＵアミノ酸（イニシエーターＭｅｔなしの配列番号１４）であり、およびアミノ酸３５４〜３６５は、ＦＬＡＧエピトープを含む。
【０１３１】
配列番号５６−ｐＲＡ１７によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＶ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜４６１は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＶアミノ酸（配列番号２０）であり、およびアミノ酸４６２〜４７１は、ＦＬＡＧエピトープを含む。
【０１３２】
配列番号５７−ｐＲＡ１４によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＸ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜２３５は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＸアミノ酸（イニシエーターＭｅｔなしの配列番号１５）であり、およびアミノ酸２３６〜２４７は、ＦＬＡＧエピトープを含む。
【０１３３】
配列番号５８−ｐＲＡ１２によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＹ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜２９９は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＹアミノ酸（イニシエーターＭｅｔなしの配列番号８）であり、およびアミノ酸３００〜３１６は、ＨＡエピトープを含む。
【０１３４】
配列番号５９−ｐＲＡ１９によってコードされたｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜５６１は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＤアミノ酸（イニシエーターＭｅｔおよび次のＭｅｔなしの配列番号６）であり、およびアミノ酸５６２〜５７４は、ＨＡエピトープを含む。
【０１３５】
配列番号６０−いずれのＣ末端伸長も有していない、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ融合ポリペプチドのアミノ酸配列（ｐＲＡ２５）。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、およびアミノ酸８１〜５９９は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＫアミノ酸（イニシエーターＭｅｔなしの配列番号７）であった。
【０１３６】
配列番号６１−ハイポクレア・ジェコリーナ（Hypocrea jecorina）セロビオヒドロラーゼＩＩ（受入番号ＡＡＧ３９９８０．１）からの既知の非構造リンカー領域からの１１残基部分のアミノ酸配列。
【０１３７】
配列番号６２−８残基のＦＬＡＧエピトープのアミノ酸配列。
配列番号６３−リンカーのアミノ酸配列。前記リンカーは、長さが３０残基であり、そして、アラニンによって置換される最終的なアルギニンを有するハイポクレア・ジェコリーナのセロビオヒドロラーゼＩＩ（受入番号ＡＡＧ３９９８０．１、ＡＴＰＰＰＧＳＴＴＴＲ、配列番号６１）からの既知の非構造リンカー領域からの１１残基部分、次に、８残基のＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号６２）と、最後にそれに続く、アラニンによって置換されるアルギニンを有する該１１残基の非構造リンカー配列の別のコピーから成る。
【０１３８】
配列番号６４−ＮｉｆＫのいずれのＣ末端伸長も有していない、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫ融合ポリペプチド（ｐＲＡ０２）のアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜５６１は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＤアミノ酸（イニシエーターＭｅｔおよび次のＭｅｔなしの配列番号６）であり、アミノ酸５６２〜５９２は、３０アミノ酸のリンカーであり、およびアミノ酸５９３〜１１１０は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＫアミノ酸（イニシエーターＭｅｔなしの配列番号７）であった。
【０１３９】
配列番号６５−ＮｉｆＫのいずれのＣ末端伸長も有していない、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫ：：ＨＡ融合ポリペプチド（ｐＲＡ２０）のアミノ酸配列。アミノ酸１〜７７は、ｐＦＡγ ＭＴＰに相当し、アミノ酸７８〜８０（ＧＡＰ）は、ＡｓｃＩ部位のクローニングの成果物であり、アミノ酸８１〜５６１は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＤアミノ酸（イニシエーターＭｅｔおよび次のＭｅｔなしの配列番号６）であり、アミノ酸５６２〜５９２は、３０アミノ酸のリンカーであり、アミノ酸５９３〜１１１０は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＫアミノ酸（イニシエーターＭｅｔなしの配列番号７）であり、およびアミノ酸１１１１〜１１１９は、ＨＡエピトープを含む。
【０１４０】
配列番号６６−配列番号６７のアミノ酸３４７〜３５６に相当する、ＭＹＣエピトープを含むＣ末端伸長のアミノ酸配列。
配列番号６７−ｐＦＡγ：：ＮｉｆＭ：：ＭＹＣ融合ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号６８−翻訳開始コドンで始まる、ｐＲＡ１９のｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
配列番号６９−Ｋ．ニューモニエからのＮｉｆＫポリペプチドのＣ末端における最後の４つアミノ酸残基のアミノ酸配列。
【０１４１】
配列番号７０−ｐＦＡγ−ＣポリペプチドをコードするＤＮＡ断片のヌクレオチド配列。
配列番号７１−ｐＦＡγ−Ｃポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号７２−オリゴヌクレオチドプライマーＮｉｆＤ−Ｆ。
配列番号７３−オリゴヌクレオチドプライマーＮｉｆＤ−Ｒ。
配列番号７４−野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＷのアミノ酸配列。
配列番号７５−ＭＴＰ−ＦＡγ51ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号７６−ＦＡγ−ｓｃａｒ9ポリペプチドのアミノ酸配列。
配列番号７７−ＣＰＮ６０ ＭＴＰのアミノ酸配列。
配列番号７８−ＣＰＮ６０／Ｎｏ ＧＧリンカーＭＴＰのアミノ酸配列。
【０１４２】
配列番号７９−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）ＭＴＰ（Ａｔ３Ｇ１０９２０）のアミノ酸配列。
配列番号８０−スーパーオキシドジスムターゼ二倍（２ＳＯＤ）ＭＴＰ（Ａｔ３Ｇ１０９２０）のアミノ酸配列。
配列番号８１−スーパーオキシドジスムターゼ修飾型（ＳＯＤｍｏｄ）ＭＴＰ（Ａｔ３ｇ１０９２０）のアミノ酸配列。
配列番号８２−スーパーオキシドジスムターゼ修飾型二倍（２ＳＯＤｍｏｄ）ＭＴＰ（Ａｔ３ｇ１０９２０）のアミノ酸配列。
【０１４３】
配列番号８３−Ｌ２９ ＭＴＰ（Ａｔ１Ｇ０７８３０）のアミノ酸配列。
配列番号８４−ニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）Ｆ０ ＡＴＰアーゼサブユニット９（ＳＵ９）ＭＴＰのアミノ酸配列。
配列番号８５−ｇＡＴＰアーゼガンマサブユニット（ＦＡγ51）ＭＴＰのアミノ酸配列。
配列番号８６−ＣｏｘＩＶツインｓｔｒｅｐ（ＡＢＭ９７４８３）ＭＴＰのアミノ酸配列。
【０１４４】
配列番号８７−ＣｏｘＩＶ １０ｘＨｉｓ（ＡＢＭ９７４８３）ＭＴＰのアミノ酸配列。
配列番号８８−スーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）ＭＴＰ（配列番号８０）の予測される痕跡のアミノ酸配列。
【０１４５】
配列番号８９−スーパーオキシドジスムターゼ二倍（２ＳＯＤ）ＭＴＰ（配列番号８１）の予測される痕跡のアミノ酸配列。
配列番号９０−Ｌ２９ ＭＴＰ（配列番号８４）の予測される痕跡のアミノ酸配列。
配列番号９１−ニューロスポラ・クラッサのＦ０ ＡＴＰアーゼサブユニット９（ＳＵ９）ＭＴＰ（配列番号８５）の予測される痕跡のアミノ酸配列。
【０１４６】
配列番号９２−ｇＡＴＰアーゼガンマサブユニット（ＦＡγ51）ＭＴＰ（配列番号８６）の予測される痕跡のアミノ酸配列。
配列番号９３−ＣｏｘＩＶツインｓｔｒｅｐ ＭＴＰ（配列番号８７）の予測される痕跡のアミノ酸配列。
配列番号９４−ＣｏｘＩＶ １０ｘＨｉｓ ＭＴＰ（配列番号８８）の予測される痕跡のアミノ酸配列。
【０１４７】
配列番号９５−変異型ＮｉｆＤのアミノ酸配列。
配列番号９６−変異型ＮｉｆＳのアミノ酸配列。
配列番号９７−ＮｉｆＫ９アミノ酸Ｃ末端伸長。
配列番号９８−オリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号９９−オリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１００−オリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１０１−オリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１０２−オリゴヌクレオチドプライマーＢＯ１。
配列番号１０３−オリゴヌクレオチドプライマーＢＯ２。
配列番号１０４−リンカーのアミノ酸配列。
【０１４８】
配列番号１０５−オリゴヌクレオチドプライマーｐＲＡ３１ＤＫ−ＦＷ。
配列番号１０６−オリゴヌクレオチドプライマーｐＲＡ３１ＤＫ−ＲＶ。
配列番号１０７−オリゴヌクレオチドプライマーＤ＿ｓｔａｒｔ＿ＲＶ。
配列番号１０８−オリゴヌクレオチドプライマーＫ＿ｅｎｄ＿ＦＷ。
配列番号１０９−オリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１１０−オリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１１１−ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫポリペプチドの９アミノ酸配列のＮ末端伸長。
【０１４９】
配列番号１１２−ＨＡエピトープのアミノ酸配列。
配列番号１１３−ＮｉｆＥ−ＮｉｆＮ ＨＡポリペプチドリンカーのアミノ酸配列。
配列番号１１４−オリゴヌクレオチドプライマーｐＲＡＥＮ−ＦＷ。
配列番号１１５−オリゴヌクレオチドプライマーｐＲＡＥＮ−ＲＶ。
配列番号１１６−オリゴヌクレオチドプライマーＥ＿ｓｔａｒｔ＿ＲＶ。
配列番号１１７−オリゴヌクレオチドプライマーＮ＿ｅｎｄ＿ＦＷ。
配列番号１１８−オリゴヌクレオチドプライマー。
配列番号１１９−オリゴヌクレオチドプライマー。
【０１５０】
配列番号１２０−ＳＣＳＶ−Ｓ４バージョン１プロモーターのヌクレオチド配列。
配列番号１２１−ＳＣＳＶ−Ｓ４バージョン２プロモーターのヌクレオチド配列。
配列番号１２２−ＳＣＳＶ−Ｓ７プロモーターのヌクレオチド配列。
配列番号１２３−ＣａＭＶ−３５Ｓの長バージョンプロモーターのヌクレオチド配列。
配列番号１２４−ＣａＭＶ−２ｘ２５Ｓプロモーターのヌクレオチド配列。
配列番号１２５−Ｐ１９ウイルス性サプレッサタンパク質のアミノ酸配列。
配列番号１２６−Ｐ１９ペプチドのアミノ酸配列。
配列番号１２７−Ｐ１９ペプチドのアミノ酸配列。
【０１５１】
配列番号１２８〜１４３−ＮｉｆＫペプチドのアミノ酸配列。
配列番号１４４〜１５４−ＮｉｆＨペプチドのアミノ酸配列。
配列番号１５５〜１６０−ＮｉｆＢペプチドのアミノ酸配列。
配列番号１６１〜１６５−ＮｉｆＪペプチドのアミノ酸配列。
配列番号１６６〜１７４−ＮｉｆＳペプチドのアミノ酸配列。
配列番号１７５〜１８２−ＮｉｆＸペプチドのアミノ酸配列。
配列番号１８３〜１８６−ＮｉｆＦペプチドのアミノ酸配列。
【発明を実施するための形態】
【０１５２】
本発明の詳細な説明
一般的手法および定義
別段具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝子学、植物分子生物学、タンパク質化学、および生化学における）によって一般的に理解されているのと同じ意味を有すると解釈されるものとする。
【０１５３】
別段指示されない限り、本発明において用いられる組み換えタンパク質、細胞培養、および免疫学的手法は、当業者に周知の標準的な手順である。斯かる手法は、例えば、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T.A. Brown (編者), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D.M. Glover and B.D. Hames (編者), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995および1996), およびF.M. Ausubel et al. (編者), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 現在までのすべての最新版を含む), Ed Harlow and David Lane (編者) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), and J.E. Coligan et al. (編者) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (現在までのすべての最新版を含む)などの出典文献全体を通じて記述され、説明されている。
【０１５４】
「および／または」、例えば、「Ｘおよび／またはＹ」という用語は、「ＸおよびＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると解釈され、両方の意味またはいずれかの意味への明示的な支持を提供すると解釈されるものとする。
【０１５５】
本明細書全体を通じて、「含む（comprise）」という用語、または「含む（comprises）」もしくは「含むこと（comprising）」などの変形は、記述される要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群の包含を示唆するが、任意の他の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群の排除を示唆しないことが理解されるであろう。
【０１５６】
ニトロゲナーゼは、アンモニア（ＮＨ3）を産生するように窒素（Ｎ2）の強い、三重結合の還元を触媒する真正細菌および古細菌の酵素である。ニトロゲナーゼは通常、細菌だけに見られる。それは、別々に精製され得る２種類の酵素、すなわち、ジニトロゲナーゼとジニトロゲナーゼレダクターゼの複合体である。成分Ｉまたはモリブデン−鉄（ＭｏＦｅ）タンパク質とも呼ばれるジニトロゲナーゼは、２つの「Ｐ−クラスタ」および２つの「ＦｅＭｏ補因子」（ＦｅＭｏ−Ｃｏ）も含有する２つのＮｉｆＤおよび２つのＮｉｆＫポリペプチド（α2β2）の四量体である。ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫサブユニットのそれぞれの組は、１つのＰ−クラスタおよび１つのＦｅＭｏ−Ｃｏを含有する。ＦｅＭｏ−Ｃｏは、ホモクエン酸分子と複合体化したＭｏＦｅ3−Ｓ3クラスタから構成されたメタロクラスタであり、そしてそれは、モリブデン原子に配位結合されて、そして、３つの硫黄リガンドによってＦｅ4−Ｓ3クラスタに架橋される。ＦｅＭｏ−Ｃｏは、細胞内で別々に組み立てられ、その後、アポ−ＭｏＦｅタンパク質内に組み込まれる。Ｐ−クラスタもまたメタロクラスタであり、ＦｅＭｏ−Ｃｏに類似しているが、それとは異なる構造を有する８つのＦｅ原子と７つの硫黄原子を含んでいる。そのＰ−クラスタは、ジニトロゲナーゼのαβサブユニット境界面に位置していて、両方のサブユニットからのシステイニル残基によって配位結合されている。
【０１５７】
成分ＩＩまたは「Ｆｅタンパク質」とも呼ばれるジニトロゲナーゼレダクターゼは、サブユニット境界面の単独のＦｅ4−Ｓ4クラスタ、および各サブユニットに１つずつ、２つのＭｇ−ＡＴＰ結合部位も含有するＮｉｆＨポリペプチドの二量体である。この酵素は、ジニトロゲナーゼへの電子供与体であり、そしてそこでは、電子が、Ｆｅ4−Ｓ4クラスタからＰ−クラスタに、そして、順番にＮ2還元の部位であるＦｅＭｏ−Ｃｏまで輸送される。
【０１５８】
Ｍｏ含有ニトロゲナーゼは、細菌で最も一般的に見られるニトロゲナーゼであるが、遺伝的に異なるが、類似の補因子およびサブユニット組成を有する２つの相同ニトロゲナーゼ、すなわち、それぞれ、Ｖｎｆ（バナジウム窒素固定）およびＡｎｆ（代替窒素固定）遺伝子によってコードされるバナジウム含有ニトロゲナーゼおよびＦｅのみのニトロゲナーゼ、が存在する。自然の一部の細菌が、３タイプのニトロゲナーゼをすべて所有していて、他の細菌、例えば、クレブシエラ・ニューモニエは、ＭｏおよびＶ含有酵素だけまたはＭｏ含有酵素だけを含有している。
【０１５９】
さまざまな窒素固定（Ｎｉｆ）遺伝子が、ＦｅＭｏ−Ｃｏの生合成と、ニトロゲナーゼ成分のそれらの触媒的に活性形態への成熟を必要としている。ＦｅＭｏ−Ｃｏ合成におけるＮｉｆＢ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＱ、ＮｉｆＶおよびＮｉｆＸポリペプチドの役割が記載されている（Rubio and Ludden, 2005）。
【０１６０】
原核生物酵素であるニトロゲナーゼによって触媒された生物学的なＮ2固定は、合成Ｎ2肥料の使用に対する代替手段である。酸素に対するニトロゲナーゼの感受性が、植物内への、例えば直接的なＮｉｆ遺伝子移入による穀類作物への、生物窒素固定の遺伝子操作に対する主要な障壁である。
【０１６１】
本発明者らは、植物細胞のミトコンドリアマトリックス（ＭＭ）に対するＮｉｆポリペプチドの標的化が、酸素感受性の問題を克服するだろうと考えた。ＭＭは、酸素感応性Ｆｅ−Ｓクラスタを含有する他の酵素が機能できるようにする酵素を消費する酸素を所有している。ミトコンドリアのＦｅ−Ｓクラスタ集合機構は、ジアゾ栄養同等物に類似している（Balk and Pilon, 2011; Lill and Muhlenhoff, 2008）。そのため、ニトロゲナーゼ生合成のための必要物のいくつかが、ＭＭ内の適所に既に存在するので、そして再構成に必要とされるＮｉｆ遺伝子の数を低減される可能性がある。補因子ホモクエン酸は、ＴＣＡサイクルの一部として産生される。ニトロゲナーゼ酵素触媒作用の両方の前提条件であるＡＴＰの潜在力および濃度もまた、大きく軽減される（Geigenberger and Fernie, 2014; Mackenzie and McIntosh, 1999）。さらに、ミトコンドリア内のグルタミン酸シンターゼの存在は、ニトロゲナーゼによって固定されたすべてのアンモニウムが植物代謝に参加するためのエントリーポイントも提供する。これらの特徴、およびミトコンドリア自体がα−プロテオバクテリア起源のものであるという事実を考慮すると、本発明者らは、このオルガネラがニトロゲナーゼの機能的再構成を試みるための場所として非常に適していると考えた。
【０１６２】
植物細胞ミトコンドリア内でのニトロゲナーゼの再構成に向けた第１ステップとして、個々のＮｉｆタンパク質がＭＭに対して正確に標的化されるという証拠が必要であった。このために、本発明者らは、単独で、または、より重要なことには、組み合わせでの導入遺伝子の発現を提供するための発現プラットフォーム（Wood et al., 2009）としてモデル植物ニコチアナ・ベンサミアナを選んだ。ＭＭに位置するタンパク質の大部分は核にコードされているので、本発明者らは、細胞内シグナル伝達および輸送プロセスを理解する際には、最近の進歩を頼りにして（Huang et al., 2009; Murcha et al., 2014）、以前に特徴づけされたＮ末端ペプチド標的化シグナルを使用した（Lee et al., 2012）。
【０１６３】
モデル細菌であるジアゾ栄養生物クレブシエラ・ニューモニアは、ニトロゲナーゼの生合成および触媒機能のために１６個の特有のタンパク質を使用する。本発明者らは、植物ＭＭに対して標的化するために、およびＮ．ベンサミアナの葉におけるそれらの発現およびプロセシングを評価するために、Ｋ．ニューモニエからの１６個のＮｉｆタンパク質のすべてをリエンジニアリングした。１６個のＮｉｆポリペプチドのすべてを、一時的に発現させ、そして、配列特異的ＭＭプロセシングについて試験した。本発明者らは、１６個のＮｉｆポリペプチドのすべてが、植物葉細胞内でＭＴＰ：Ｎｉｆ融合ポリペプチドとして個別に発現されることを確認した。さらに、本発明者らは、これらのタンパク質が、ニトロゲナーゼ機能のための潜在的に適合する細胞内位置であるミトコンドリアマトリックス（ＭＭ）に対して標的化されることができ、かつ、ミトコンドリアのプロセシングプロテアーゼ（ＭＰＰ）によって切断され得る証拠を提供する。これは、斯かるアプローチの実現可能性に関する最初の実用的な実証であり、植物における内因性窒素固定化の遺伝子操作の目的に向けた重要な経過を表す。
【０１６４】
ミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）−Ｎｉｆ融合ポリペプチド
本発明は、ミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）−Ｎｉｆ融合ポリペプチドおよびそれらの切断ポリペプチド産物に関する。本発明のＭＴＰ−Ｎｉｆ融合ポリペプチドが植物細胞内で発現されるとき、ＭＴＰ−Ｎｉｆ融合ポリペプチドおよび／または切断ポリペプチド産物が、ミトコンドリアマトリックス（ＭＭ）に対して標的化される。好ましくは、融合ポリペプチドは、植物細胞にニトロゲナーゼレダクターゼおよび／またはニトロゲナーゼ活性をもたらすか、または細菌の対応する野生型Ｎｉｆポリペプチドによって与えられるそれと同じ活性をもたらす。
【０１６５】
本明細書中に使用される場合、用語「融合ポリペプチド」は、ペプチド結合によって共有結合で結合される２以上の機能性ポリペプチドドメインを含むポリペプチドを意味する。典型的には、融合ポリペプチドは、本発明のキメラポリヌクレオチドによって単一ポリペプチド鎖としてコードされる。ある実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、ミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）およびＮｉｆポリペプチド（ＮＰ）を含む。この実施形態において、ＭＴＰのＣ末端は、ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合される。代替の実施形態において、本発明の融合ポリペプチドは、ＭＴＰおよびＮＰのＣ末端部分を含み、ここで、該Ｃ末端部分は、ＭＰＰによるＭＴＰの切断からもたらされる。この実施形態において、ＭＴＰのＣ末端部分のＣ末端は、ＮＰのＮ末端に翻訳的に融合される。
【０１６６】
本明細書中に使用される場合、用語「Ｎ末端に翻訳的に融合される」とは、ＭＴＰポリペプチドのＣ末端が、ＮＰのＮ末端アミノ酸にペプチド結合によって共有結合で結合され、それによって、融合ポリペプチドになることを意味する。ある実施形態において、ＮＰは、対応する野生型ＮＰに関連するその天然翻訳開始メチオニン（Ｍｅｔ）残基またはその２つのＮ末端Ｍｅｔ残基を含まない。代替の実施形態において、ＮＰは、例えばＮｉｆＤなどに関して、野生型ＮＰポリペプチドの翻訳開始Ｍｅｔ、または２つのＮ末端Ｍｅｔ残基のうちの一方もしくは両方を含む。
【０１６７】
斯かるポリペプチドは、ＭＴＰをコードするヌクレオチドの翻訳的な読み枠が、ＮＰをコードするヌクレオチドの読み枠と枠内に結合されている、キメラタンパク質コード領域の発現によって典型的には産生される。当業者は、ＭＴＰのＣ末端が、リンカーなしで、または１もしくは複数アミノ酸残基、例えば１〜５アミノ酸残基のリンカーを介して、ＮＰのＮ末端アミノ酸に翻訳的に融合されることを理解する。斯かるリンカーはまた、ＭＴＰの一部であると見なすこともできる。タンパク質コード領域の発現は、植物細胞のＭＭ内でのＭＴＰの切断がその後に続いてもよく、斯かる切断は（起こる場合には）、本発明の融合ポリペプチド製造の概念に含まれる。
【０１６８】
融合ポリペプチドまたはプロセシングされたＮｉｆポリペプチドは、好ましくは、対応する野生型Ｎｉｆポリペプチドのものに匹敵する機能的なＮｉｆ活性を有する。融合ポリペプチドまたはプロセシングされたＮｉｆポリペプチドの機能的活性は、細菌および生化学的補完性アッセイによって測定されてもよい。好ましい実施形態において、融合ポリペプチドまたはプロセシングされたＮｉｆポリペプチドは、野性型Ｎｉｆ活性の約７０〜１００％をの活性を有する。
【０１６９】
融合ポリペプチドは、２つ以上のＭＴＰおよび／または２以上のＮＰを含んでもよい、例えば、融合ポリペプチドは、ＭＴＰ、ＮｉｆＤポリペプチドおよびＮｉｆＫポリペプチドを含んでもよい。融合ポリペプチドはまた、例えば、２つのＮＰを連結する、オリゴペプチドリンカーを含んでもよい。好ましくは、そのリンカーは、２以上の機能ドメイン、２つのＮＰ、例えばＮｉｆＤやＮｉｆＫなどが、植物細胞内で機能的な形状で結合できるために十分な長さのものである。斯かるリンカーは、８〜５０アミノ酸残基の長さ、好ましくは２５〜３５アミノ酸の長さ、より好ましくは約３０アミノ酸残基の長さであってもよい。融合ポリペプチドを、従来の手段、例えば、好適な細胞における前記融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の遺伝子発現によって得てもよい。
【０１７０】
本明細書中に使用される場合、「実質的に精製されたポリペプチド」とは、例えば細胞内において、通常、該ポリペプチドに結合している成分（例えば、脂質、核酸、炭水化物）を実質的に含まないポリペプチドを意味する。好ましくは、実質的に精製されたポリペプチドは、前記成分を少なくとも９０％含まない。
【０１７１】
本発明の植物細胞、トランスジェニック植物およびその構成要素は、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明のポリペプチドは、植物細胞内に天然に生じない、特に植物細胞のミトコンドリア内に存在しないので、そのため、該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、それが植物細胞内で天然に生じることはないが、植物細胞または前駆細胞内に導入されたので、本明細書中では外来ポリヌクレオチドとも呼ばれる。そのため、本発明のポリペプチドを産生する本発明の細胞、植物および植物部分は、組み換えポリペプチドを産生すると言われることもある。ポリペプチドとの関連において、「遺伝子組み換え」という用語は、細胞によって産生されるとき、外来ポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドを指し、そしてそのポリヌクレオチドは、例えば、形質転換などの組み換えＤＮＡまたはＲＮＡ技術によって該細胞または前駆細胞内に導入される。典型的には、植物細胞、植物または植物部分は、植物細胞または植物の生活環の中で少なくともいつか産生されるかなりの量のポリペプチドの原因となる非内因性遺伝子を含む。
【０１７２】
ある実施形態において、本発明のポリペプチドは、天然に存在するポリペプチドでない。代替の実施形態において、本発明のポリペプチドは、天然に存在するが、植物細胞内、好ましくは植物細胞のミトコンドリア内には存在せず、そしてそこでは、天然に生じない。
【０１７３】
Ｎｉｆポリペプチド
本明細書中に使用される場合、用語「Ｎｉｆポリペプチド」および「Ｎｉｆタンパク質」は、互換的に使用され、そして、アミノ酸配列でニトロゲナーゼ活性にかかわる天然のポリペプチドに関連するポリペプチドを意味し、ここで、本発明のポリペプチドは、ＮｉｆＤポリペプチド、ＮｉｆＨポリペプチド、ＮｉｆＫポリペプチド、ＮｉｆＢポリペプチド、ＮｉｆＥポリペプチド、ＮｉｆＮポリペプチド、ＮｉｆＦポリペプチド、ＮｉｆＪポリペプチド、ＮｉｆＭポリペプチド、ＮｉｆＱポリペプチド、ＮｉｆＳポリペプチド、ＮｉｆＵポリペプチド、ＮｉｆＶポリペプチド、ＮｉｆＷポリペプチド、ＮｉｆＸポリペプチド、ＮｉｆＹポリペプチドおよびＮｉｆＺポリペプチドから成る群から選択され、そしてそのそれぞれが本明細書中に規定されるとおりである。本発明のＮｉｆポリペプチドとしては、本明細書中に使用される場合、対応する天然のＮｉｆポリペプチドに対してＮ末端もしくはＣ末端、またはその両方に結合された追加アミノ酸残基を有する天然のＮｉｆポリペプチドのポリペプチド相同体を意味する「Ｎｉｆ融合ポリペプチド」が挙げられる。先に触れたように、Ｎｉｆ融合ポリペプチドは、対応する野生型Ｎｉｆポリペプチドに関連する翻訳開始Ｍｅｔまたは２つのＮ末端Ｍｅｔ残基を欠いてもよい。天然のＮｉｆポリペプチドに対応する、すなわち、Ｎ末端もしくはＣ末端、またはその両方に結合された追加アミノ酸残基を有していない、Ｎｉｆ融合ポリペプチドのアミノ酸残基もまた、この場合「ＮＰ」またはＮｉｆＤポリペプチド（「ＮＤ」）などと略呼ばれる、Ｎｉｆポリペプチドと、本明細書中で呼ばれる。好ましい実施形態において、「Ｎ末端もしくはＣ末端、またはその両方に結合された追加アミノ酸残基」は、ＮＰのＮ末端に結合されたミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）またはプロセシングされたＭＴＰを含むか、またはＮＰに対してＮ末端もしくはＣ末端、またはその両方であるエピトープ配列（「タグ」）、あるいは、ＭＴＰまたはプロセシングＭＴＰ、およびエピトープ配列の両方を含む。
【０１７４】
天然のＮｉｆポリペプチドは、自由生活性窒素固定細菌、半共生的（associative）窒素固定細菌および共生的窒素固定細菌を含めた窒素固定細菌を含めた一部の細菌だけに生じる。自由生活性窒素固定細菌は、他の生物体との直接的な相互作用なしで有意水準の窒素を固定できる。これだけに限定されるものではないが、前記自由生活性窒素固定細菌としては、アゾトバクター（Azotobacter）属、ベイエリンキア（Beijerinckia）属、クレブシエラ（Klebsiella）属、シアノバクテリア（Cyanobacteria）属（好気性生物として分類される）のメンバー、およびクロストリジウム（Clostridium）属、デスルホビブリオ（Desulfovibrio）属のメンバー、ならびに紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌および緑色硫黄細菌と命名されたものが挙げられる。半共生的窒素固定細菌は、イネ科（草本）のいくつかのメンバーと密接な関係を形成することができる原核生物である。これらの細菌は、宿主植物の根圏の中にかなりの量の窒素を固定する。アゾスピリラム（Azospirillum）属のメンバーは、半共生的窒素固定細菌の代表である。共生的窒素固定細菌は、宿主植物とパートナーを組むことによって共生的に窒素を固定する細菌である。その植物は、それが窒素固定のために必要とされるエネルギーのために窒素固定細菌によって利用される光合成からの糖を提供する。リゾビア（Rhizobia）属のメンバーは、半共生的窒素固定細菌の代表である。
【０１７５】
本発明のＮｉｆポリペプチドまたはＮｉｆ融合ポリペプチドは、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＦ、ＮｉｆＪ、ＮｉｆＭ、ＮｉｆＱ、ＮｉｆＳ、ＮｉｆＵ、ＮｉｆＶ、ＮｉｆＷ、ＮｉｆＸ、ＮｉｆＹおよびＮｉｆＺポリペプチドから成る群から選択される。
【０１７６】
ポリペプチドまたはポリペプチドのクラスは、基準のアミノ酸配列に対してそのアミノ酸配列の同一性の程度（％同一性）により、または１つの基準のアミノ酸配列に対して、別に対するよりもより高い％同一性を有することにより、定義され得る。ポリペプチドまたはポリペプチドの種類もまた、配列の同一性の程度に加えて、天然のＮｉｆポリペプチドと同じ生物学的活性を有することによって、規定され得る。
【０１７７】
ポリペプチドの％同一性は、ギャップクリエーションペナルティ＝５およびギャップエクステンションペナルティ＝０．３を用いたＧＡＰ（Needleman and Wunsch, 1970）分析（ＧＣＧプログラム）、またはＢｌａｓｔｐバージョン２．５またはその更新バージョン（Altschul et al, 1997）によって測定され、その都度、分析は、参照配列の全長にわたる参照配列を含めた２つの配列をアラインする。本明細書中に使用される場合、参照配列としては、Ｋ．ニューモニエ、配列番号１〜２０からの天然のＮｉｆポリペプチドのために提供されたものが挙げられる。
【０１７８】
以下の定義において、配列番号として提供された参照配列に対するアミノ酸配列の同一性の程度は、１０，０００に設定された標的配列の最大数以外、初期設定パラメーターを使用した、Ｂｌａｓｔｐ、バージョン２．５またはその更新バージョン（Altschul et al, 1997）によって測定され、そして、参照アミノ酸配列の完全長に沿って測定される。
【０１７９】
天然の細菌のＮｉｆＨポリペプチドは、ニトロゲナーゼ複合体の構造成分であり、鉄（Ｆｅ）タンパク質と呼ばれることも多い。それは、サブユニットと２つのＡＴＰ結合ドメインの間のＦｅ4Ｓ4クラスタ結合を有するホモ二量体を形成する。ＮｉｆＨは、ＭｏＦｅタンパク質に対する偏性電子供与体（ＮｉｆＤ／ＮｉｆＫヘテロ四量体）であり、そのため、ニトロゲナーゼレダクターゼ（ＥＣ１．１８．６．１）としての機能である。ＮｉｆＨはまた、ＦｅＭｏ−Ｃｏ生合成およびアポ−ＭｏＦｅタンパク質成熟にも関与する。本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＨポリペプチド」は、その配列が配列番号５として提供されたアミノ酸配列に対して少なくとも４１％同一であり、かつ、ドメインＴＩＧＲ０１２８７、ＰＲＫ１３２３６、ＰＲＫ１３２３３およびｃｄ０２０４０の１もしくは複数を含む、アミノ酸を含むポリペプチドを意味する。ＴＩＧＲ０１２８７ドメインは、モリブデン−鉄ニトロゲナーゼレダクターゼ（ＮｉｆＨ）、バナジウム−鉄ニトロゲナーゼレダクターゼ（ＶｎｆＨ）、および鉄−鉄ニトロゲナーゼレダクターゼ（ＡｎｆＨ）のそれぞれに存在するが、光非依存型プロトクロロフィリドレダクターゼからの相同タンパク質を除く。本明細書中に使用される場合、そのため、ＮｉｆＨポリペプチドとしては、その配列が配列番号５に対して少なくとも４１％同一であるアミノ酸を含む鉄結合性ポリペプチド、ＶｎｆＨ鉄結合性ポリペプチドおよびＡｎｆＨ鉄結合性ポリペプチドのサブクラスが挙げられる。天然のＮｉｆＨポリペプチドには、２６０〜３００アミノ酸の長さが典型的にあり、そして天然のモノマーは、約３０ｋＤａの分子量を有する。数多くのＮｉｆＨポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＨポリペプチドは、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）（受入番号ＷＰ＿０４９１２３２３９．配列番号５に対して１、９９％同一）、ブレンネリア・ゴオドウィニイ（Brenneria goodwinii）（ＷＰ＿０４８６３８８１７．１、９３％同一）、シデロキシダンス・リトトロフィクス（Sideroxydans lithotrophicus）（ＷＰ＿０１３０２９０１７．１、８４％同一）、デニトロビブリオ・アセチフィルス（Denitrovibrio acetiphilus）（ＷＰ＿０１３０１０３５３．１、８０％同一）、デスルホビブリオ・アフリカヌス（Desulfovibrio africanus）（ＷＰ＿０１４２５８９５１．１、７２％同一）、クロロビウム・ファエオバクテロイデス（Chlorobium phaeobacteroides）（ＷＰ＿０１１７４４６２６．１、６９％同一）、メタノサエタ・コンシリイ（Methanosaeta concilii）（ＷＰ＿０１３７１８４９７．１、６４％同一）、ロドバクター（Rhodobacter）（ＷＰ＿００９５６５９２８．１、６１％同一）、メタノカルドコックス・インフェルヌス（Methanocaldococcus infernus）（ＷＰ＿０１３０９９４７２．１、４２％同一）およびデスルホスポロシヌス・ヨウンギア（Desulfosporosinus youngiae）（ＷＰ＿００７７８１８７４．１、４１％同一）で報告された。ＮｉｆＨポリペプチドは、Thiel et al., (1997), Pratte et al., (2006), Boison et al., (2006)およびStaples et al., (2007)で記載および概説された。
【０１８０】
本明細書中に使用される場合、機能的なＮｉｆＨポリペプチドは、他の必要なサブユニット、例えば、ＮｉｆＤおよびＮｉｆＫ、ならびにＦｅＭｏまたは他の補因子と一緒に、機能的なニトロゲナーゼタンパク質複合体を形成することができるＮｉｆＨポリペプチドである。
【０１８１】
本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＤポリペプチド」は、その配列が配列番号６として提供されたアミノ酸配列に対して少なくとも３３％同一であるアミノ酸を含むポリペプチドを意味し、そして、（ｉ）ドメインＴＩＧＲ０１２８２およびＣＯＧ２７１０の一方または両方、そしてその両方が、配列番号６に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む鉄−モリブデン結合ポリペプチド内に見られ、または（ｉｉ）その場合には、ＮｉｆＤポリペプチドがＶｎｆＤポリペプチドのサブクラス内にある、鉄−バナジウム結合ドメインＴＩＧＲ０１８６０、または（ｉｉｉ）その場合には、ＮｉｆＤポリペプチドがＡｎｆＤポリペプチドのサブクラス内にある、鉄−鉄結合ドメインＴＩＧＲ１８６１、を含む。
【０１８２】
本明細書中に使用される場合、ＮｉｆＤポリペプチドとしては、その配列が配列番号６に対して少なくとも３３％同一である、アミノ酸を含む鉄−モリブデン（ＦｅＭｏ−Ｃｏ）結合ポリペプチドのサブクラス、該ＶｎｆＤ鉄−バナジウムポリペプチドおよびＡｎｆＤポリペプチド、が挙げられる。天然のＮｉｆＤポリペプチドには、典型的に４７０〜５４０アミノ酸の長さがある。数多くのＮｉｆＤポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＤポリペプチドは、ラオウルテラ・オルニチノリチカ（Raoultella ornithinolytica）（受入番号ＷＰ＿０４４３４７１６１．１、配列番号６に対して９６％同一）、クルイベラ（Kluyvera）中間体（ＷＰ＿０４７３７０２７３．１、９３％同一）、ジッケヤ・ダダンチイ（Dickeya dadantii）（ＷＰ＿０３８９０２１９０．１、８９％同一）、トルモナス属（Tolumonas sp.）ＢＲＬ６−１（ＷＰ＿０２４８７２６４２．１、８１％同一）、マグネトスピリルム・グリフィスワルデンス（Magnetospirillum gryphiswaldense）（ＷＰ＿０２４０７８６０１．１、６８％同一）、テルモアナエロバクテリウム・テルモサッカロリチクム（Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum）（ＷＰ＿０１３２９８３２０．１、４２％同一）、メタノテルモバクテル・テルマウトトロフィクス（Methanothermobacter thermautotrophicus）（ＷＰ＿０１０８７７１７２．１、３８％同一）、デスルホビブリオ・アフリカヌス（Desulfovibrio africanus）（ＷＰ＿０１４２５８９５３．１、３７％同一）、デスルホトマクルム属（Desulfotomaculum sp.）ＬＭａ１（ＷＰ＿０６６６６５７８６．１、３７％同一）、デスルホミクロビウム・バクラツム（Desulfomicrobium baculatum）（ＷＰ＿０１５７７３０５５．１、３６％同一）、フィスケレラ・ムシコラ（Fischerella muscicola）のＶｎｆＤポリペプチド（ＷＰ＿０１６８６７５９８．１、３４％同一）およびオピツタセア（Opitutaceae）細菌ＴＡＶ５からのＡｎｆＤポリペプチド（ＷＰ＿００９５１２８７３．１、３３％同一）で報告された。
【０１８３】
ＮｉｆＤポリペプチドは、Lawson and Smith (2002), Kim and Rees (1994), Eady (1996), Robson et al., (1989), Dilworth et al., (1988), Dilworth et al., (1993), Miller and Eady (1988), Chiu et al., (2001), Mayer et al., (1999),およびTezcan et al., (2005)で記載および概説された。
【０１８４】
鉄−モリブデンサブクラスのＮｉｆＤポリペプチドは、ニトロゲナーゼ複合体の重要なサブユニットであり、そして、ニトロゲナーゼのコアにおけるα2β2ＭｏＦｅタンパク質複合体のαサブユニットであり、かつ、ＦｅＭｏ補因子による基質還元の部位である。
【０１８５】
本明細書中に使用される場合、機能的なＮｉｆＤポリペプチドは、他の必要なサブユニット、例えば、ＮｉｆＨおよびＮｉｆＫ、ならびにＦｅＭｏまたは他の補因子と一緒に、機能的なニトロゲナーゼタンパク質複合体を形成することができるＮｉｆＤポリペプチドである。
【０１８６】
本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＫポリペプチド」は、その配列が配列番号７として提供されたアミノ酸配列に対して少なくとも３１％同一であり、かつ、その場合には、ＮｉｆＫポリペプチドが、ＶｎｆＫポリペプチドのサブクラス内にある、保存ドメインｃｄ０１９７４、ＴＩＧＲ０１２８６、またはｃｄ０１９７３の１もしくは複数を含むアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。本明細書中に使用される場合、ＮｉｆＫポリペプチドとしては、鉄−バナジウムニトロゲナーゼからのＶｎｆＫがポリペプチドが挙げられる。天然のＮｉｆＫポリペプチドには、典型的に４３０〜５３０アミノ酸の長さがある。数多くのＮｉｆＫポリペプチドが同定された、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＫポリペプチドは、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）（受入番号ＷＰ＿０４９０８０１６１．１、配列番号７に対して９９％同一）、ラオウルテラ・オルニチノリチカ（Raoultella ornithinolytica）（ＷＰ＿０４４３４７１６３．１、９６％同一）、クレブシエラ・バリイコラ（Klebsiella variicola）（ＳＢＭ８７８１１．１、９４％同一）、クルイベラ（Kluyvera）中間体（ＷＰ＿０４７３７０２７２．１、８９％同一）、ラーネラ・アクアチリス（Rahnella aquatilis）（ＷＰ＿０１４３３３９１９．１、８２％同一）、トルモナス・アウエンシス（Tolumonas auensis）（ＷＰ＿０１２７２８８８０．１、７５％同一）、シュードモナス・スツトゼリ（Pseudomonas stutzeri）（ＷＰ＿０１１９１２５０６．１、６８％同一）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Vibrio natriegens）（ＷＰ＿０６５３０３４７３．１、６５％同一）、アゾアルクス・トルクラスチクス（Azoarcus toluclasticus）（ＷＰ＿０１８９８９０５１．１、５４％同一）、フランキア属（Frankia sp.）（ｐｒｆ｜｜２１０６３１９Ａ、５０％同一）およびメタノサルシナ・アセチボランス（Methanosarcina acetivorans）（ＷＰ＿０１１０２１２３９．１、３１％同一）で報告された。配列番号７に対して３１％未満の同一性を有するが、先に列挙したドメインのいずれも含んでいなくて、そのため、本明細書中ではＮｉｆＫポリペプチドに含まれない、「ＮｉｆＫ」と注釈されたデータベースには、ポリペプチドに関するいくつかの例が存在する。ＮｉｆＫポリペプチドは、Kim and Rees (1994), Eady (1996), Robson et al., (1989), Dilworth et al., (1988), Dilworth et al., (1993), Miller and Eady (1988), Igarashi and Seefeldt (2003), Fani et al., (2000)およびRubio and Ludden (2005)で記載および概説された。
【０１８７】
鉄−モリブデンサブクラスのＮｉｆＫポリペプチドは、ニトロゲナーゼ複合体の重要なサブユニットであり、そして、ニトロゲナーゼのコアにおけるα2β2ＭｏＦｅタンパク質複合体のβサブユニットである。本明細書中に使用される場合、機能的なＮｉｆＫポリペプチドは、他の必要なサブユニット、例えば、ＮｉｆＤおよびＮｉｆＨ、ならびにＦｅＭｏまたは他の補因子と一緒に、機能的なニトロゲナーゼタンパク質複合体を形成することができるＮｉｆＫポリペプチドである。好ましい実施形態において、アミノ酸配列番号７とアラインされるとき、本発明のＮｉｆＫポリペプチドのアミノ酸配列は、そのＣ末端にアミノ酸ＤＬＶＲ（配列番号７の残基５１７〜５２０）を有し、そして、該アルギニンがＣ末端アミノ酸である、すなわち、本発明のＮｉｆＫポリペプチドおよびＮｉｆＫ融合ポリペプチドには、好ましくは、天然のＮｉｆＫポリペプチドと同じＣ末端を有する、すなわち、それにはＣ末端への人工的な付加がない。斯かる好ましいＮｉｆＫポリペプチドは、実施例に示されているように、ＮｉｆＤおよびＮｉｆＨポリペプチドとの機能的なニトロゲナーゼ複合体をよりよく形成することができる。
【０１８８】
天然の細菌のＮｉｆＢポリペプチドは、ＦｅＭｏ−Ｃｏ合成に関与するタンパク質であり、そして、［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスタを、ＦｅＭｏ−Ｃｏの前駆体としての役割を果たす中心Ｃ原子を伴ったより高い核性のＦｅ−Ｓクラスタ、ＮｉｆＢ−ｃｏに変換する（Guo et al., 2016）。そのため、ＮｉｆＢは、ＦｅＭｏ−Ｃｏ合成経路の第一の関与ステップを触媒する。ＮｉｆＢのＮｉｆＢ−ｃｏ産物は、ＮｉｆＥ−ＮｉｆＮ複合体に結合でき、そして、メタロクラスタ担体タンパク質ＮｉｆＸによって、ＮｉｆＢからＮｉｆＥ−ＮｉｆＮまで往復輸送され得る。
【０１８９】
本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＢポリペプチド」は、そのアミノ酸配列が（その配列が配列番号９として提供されたアミノ酸配列に対して少なくとも２７％同一である）アミノ酸を含むポリペプチドを意味する。大部分のＮｉｆＢポリペプチドが、１もしくは複数の保存ドメインＴＩＧＲ０１２９０、ＮｉｆＢ保存ドメインｃｄ００８５２、ＮｉｆＸ−ＮｉｆＢスーパーファミリ保存ドメインｃｌ００２５２およびＲａｄｉｃａｌ＿ＳＡＭ保存ドメインｃｄ０１３３５を含む。本明細書中に使用される場合、ＮｉｆＢポリペプチドとしては、ＮｉｆＢ機能を有していると注釈されたが、これらのドメインの１つを含んでいない天然のポリペプチドが挙げられる。天然のＮｉｆＢポリペプチドには、典型的に４４０〜５００アミノ酸の長さがあり、そして、天然のモノマーは、約５０ｋＤａの分子量を有する。数多くのＮｉｆＢポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＢポリペプチドは、ラオウルテラ・オルニチノリチカ（Raoultella ornithinolytica）（受入番号ＷＰ＿０４１１４５６０２．１、配列番号９に対して９１％同一）、コサコニア・ラジシンシタンス（Kosakonia radicincitans）（ＷＰ＿０４３９５３５９２．１、８０％同一）、ディケヤ・クリサンテミ（Dickeya chrysanthemi）（ＷＰ＿０４０００３３１１．１、７６％同一）、ペクトバクテリウム・アトロセプチクム（Pectobacterium atrosepticum）（ＷＰ＿０１１０９４４６８．１、７０％同一）、ブレンネリア・ゴオドウィニイ（Brenneria goodwinii）（ＷＰ＿０４８６３８８４９．１、６３％同一）、ハロロドスピラ・ハロフィラ（Halorhodospira halophila）（ＷＰ＿０１１８１３０９８．１、５９％同一）、メタノサルシナ・バーケリ（Methanosarcina barkeri）（ＷＰ＿０４８１０８８７９．１、５０％同一）、クロストリジウム・プリニリチクム（Clostridium purinilyticum）（ＷＰ＿０５０３５５１６３．１、４０％同一）、ゲオフィルム・ルビクンズム（Geofilum rubicundum）（ＧＡＯ２８５５２．１、３５％同一）およびデスルホビブリオ・サレキシゲンス（Desulfovibrio salexigens）（ＷＰ＿０１５８５０３２８．１、２７％同一）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＢポリペプチド」は、［４Ｆｅ−４Ｓ］クラスタからＮｉｆＢ−ｃｏを形成することができるＮｉｆＢポリペプチドである。ＮｉｆＢポリペプチドは、Curatti et al., (2006)およびAllen et al., (1995)で記載および概説された。
【０１９０】
ＮｉｆＥＮ複合体は、ジニトロゲナーゼの正確な集合に必要とされる骨格複合体であり、そして、それはまた、ジニトロゲナーゼに構造的に類似している（Fay et al., 2016）。ＮｉｆＥＮ複合体は、それぞれ、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＮのそれぞれの２個のサブユニットから成り、そして、本明細書中でＥＮα2β2と呼ばれる、ヘテロ四量体を形成する。天然の細菌のＮｉｆＥポリペプチドは、ＮｉｆＮポリペプチドを伴ったＥＮα2β2四量体のαサブユニットであるポリペプチドであり、そして、このＥＮα2β2四量体は、ＦｅＭｏ−Ｃｏ合成に必要とされ、かつ、そこでＦｅＭｏ−Ｃｏが合成される足場として機能することが提案される。
【０１９１】
本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＥポリペプチド」は、その配列が配列番号１０として提供されたアミノ酸配列に対して少なくとも３２％同一であり、そして、それが、ドメインＴＩＧＲ０１２８３およびＰＲＫ１４４７８の一方または両方を含むアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。ＴＩＧＲ０１２８３ドメインタンパク質ファミリーのメンバーはまた、スーパーファミリーｃｌ０２７７５のメンバーでもある。天然のＮｉｆＥポリペプチドには、典型的に４４０〜４９０アミノ酸の長さがあり、そして、天然のモノマーは、約５０ｋＤａの分子量を有する。数多くのＮｉｆＥポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＥポリペプチドは、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）（受入番号ＷＰ＿０４９１１４６０６．１、配列番号１０に対して９９％同一）、クレブシエラ・バリイコラ（Klebsiella variicola）（ＳＢＭ８７７５５．１、９２％同一）、ディケア・パラディシアカ（Dickeya paradisiaca）（ＷＰ＿０１２７６４１２７．１、８９％同一）、トルモナス・アウエンシス（Tolumonas auensis）（ＷＰ＿０１２７２８８８３．１、７５％同一）、シュードモナス・スツトゼリ（Pseudomonas stutzeri）（ＷＰ＿００３２９７９８９．１、６９％同一）、アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）（ＷＰ＿０１２６９８９６５．１、６２％同一）、トリコルムス・アゾラ（Trichormus azollae）（ＷＰ＿０１３１９０６２４．１、５５％同一）、パエニバシルス・ズルス（Paenibacillus durus）（ＷＰ＿０２５６９８３１８．１、５０％同一）、スルフリクルブム・クジエンス（Sulfuricurvum kujiense）（ＷＰ＿０１３４６０１４９．１、４４％同一）、メタノバクテリウム・フォルミシカム（Methanobacterium formicicum）（ＡＩＳ３１０２２．１、３９％同一）、アナエロムサ・アシダミノフィラ（Anaeromusa acidaminophila）（ＷＰ＿０１８７０１５０１．１、３５％同一）およびメガスフェラ・セレビシエ（Megasphaera cerevisiae）（ＷＰ＿０４８５１４０９９．１、３２％同一）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＥポリペプチド」は、その複合体がＦｅＭｏ−Ｃｏを合成できるように、ＮｉｆＮと一緒に、機能的な四量体を形成することができるＮｉｆＥポリペプチドである。ＮｉｆＥポリペプチドは、Fay et al., (2016), Hu et al., (2005), Hu et al., (2006)およびHu et al., (2008)で記載および概説された。
【０１９２】
天然の細菌のＮｉｆＦポリペプチドは、ＮｉｆＨへの電子供与体であるフラボドキシンである。本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＦポリペプチド」は、その配列が配列番号１６として提供されるアミノ酸配列に対して少なくとも３４％同一であるアミノ酸を含むポリペプチドを意味し、そして、フラボドキシン長ドメインであるドメインＴＩＧＲ０１７５２、ならびにアゾバクター（Azobacter）および他の細菌ＰＲＫ０９２６７属からのＮｉｆタンパク質に見られるフラボドキシンＦＬＤＡドメインの一方またはその両方を含む。ＮｉｆＦポリペプチドは、ピルビン酸ギ酸リアーゼ活性化に関連するフラボドキシンおよび非窒素固定細菌のコバラミン依存性メチオニンシンターゼ活性を含むが、より広い機能に関与する他のフラボドキシンを除く。天然のＮｉｆＦポリペプチドには、典型的に１６０〜２００アミノ酸の長さがあり、そして、天然のモノマーは、約１９ｋＤａの分子量を有する。数多くのＮｉｆＦポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＦポリペプチドは、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）（受入番号ＷＰ＿００４１２２４１７．１、配列番号１６に対して９９％同一）、クレブシエラ・バリイコラ（Klebsiella variicola）（ＷＰ＿０４０９６８７１３．１、８５％同一）、コサコニア・ラジシンシタンス（Kosakonia radicincitans）（ＷＰ＿０３５８８５７６０．１、７６％同一）、ディケヤ・クリサンテミ（Dickeya chrysanthemi）（ＷＰ＿０３９９９９４３８．１、７２％同一）、ブレンネリア・ゴオドウィニイ（Brenneria goodwinii）（ＷＰ＿０４８６３８８３８．１、６２％同一）、メチロモナス・メタニカ（Methylomonas methanica）（ＷＰ＿０６４００６９７７．１、５６％同一）、アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）（ＷＰ＿０１２６９８８６２．１、５０％同一）、クロロバクルム・テピズム（Chlorobaculum tepidum）（ＷＰ＿０１０９３３３９９．１、３９％同一）、カンピロバクター・ショワエ（Campylobacter showae）（ＷＰ＿００２９４９１７３．１、３７％同一）、およびアゾトバクター・クロモコッカム（Azotobacter chromococcum）（ＷＰ＿０３９８０１７２５．１、３４％同一）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＦポリペプチド」は、ＮｉｆＨポリペプチドへの電子供与体であるＮｉｆＦポリペプチドである。ＮｉｆＦポリペプチドは、Drummond (1985)で記載および概説された。
【０１９３】
天然の細菌のＮｉｆＪポリペプチドは、ＮｉｆＨへの電子供与体であるピルバート：フラボドキシン（フェレドキシン）オキシドレダクターゼである。本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＪポリペプチド」は、その配列が配列番号１８として提供されたアミノ酸配列に対して少なくとも４０％同一であり、そして、保存ドメインＴＩＧＲ０２１７６を含むアミノ酸を含むポリペプチドを意味する。天然のＮｉｆＪポリペプチドには、典型的に１１００〜１２００アミノ酸の長さがあり、そして、天然のモノマーは、約１２８ｋＤａの分子量を有する。数多くのＮｉｆＪポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＪポリペプチドは、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）（受入番号ＷＰ＿０２４３６０００６．１、配列番号１８に対して９９％同一である）、ラオウルテラ・オルニチノリチカ（Raoultella ornithinolytica）（ＷＰ＿０４４３４７１５７．１、９５％同一）、クレブシエラ・クアシプノイモニア（Klebsiella quasipneumoniae）（ＷＰ＿０５０５３３８４４．１、９２％同一）、コサコニア・オリゼ（Kosakonia oryzae）（ＷＰ＿０６４５６６５４３．１、８２％同一）、ディケア・ソラニ（Dickeya solani）（ＷＰ＿０５７０８４６４９．１、７８％同一）、ラーネラ・アクアチリス（Rahnella aquatilis）（ＷＰ＿０１４６８３０４０．１、７２％同一）、サーモアナエロバクター・マトラニイ（Thermoanaerobacter mathranii）（ＷＰ＿０１３１４９８４７．１、６４％同一）、クロストリジウム・ボツリナム（Clostridium botulinum）（ＷＰ＿０５３３４１２２０．１、６０％同一）、スピロヘータ・アフリカーナ（Spirochaeta africana）（ＷＰ＿０１４４５４６３８．１、５２％同一）およびビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）（ＣＳＡ８３０２３．１、４０％同一）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＪポリペプチド」は、ＮｉｆＨポリペプチドに対する電子供与体であることができるＮｉｆＪポリペプチドである。ＮｉｆＪポリペプチドは、Schmitz et al., (2001)で記載および概説された。
【０１９４】
天然の細菌のＮｉｆＭポリペプチドは、ＮｉｆＨの成熟に必要とされるポリペプチドである。ＮｉｆＭの不存在下、ＮｉｆＨが、異種発現され、そして、ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫに電子を供与できなかったとき、Ｅ．コリおよび酵母において低レベルでのみ存在した。本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＭポリペプチド」は、その配列が配列番号１９として提供されたアミノ酸配列に対して少なくとも２６％同一であり、そして、ドメインＴＩＧＲ０２９３３を含む、アミノ酸を含むポリペプチドを意味する。ＮｉｆＭポリペプチドは、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼに相同であり、ＮｉｆＨのアクセサリータンパク質であると思われる。天然のＮｉｆＭポリペプチドには、典型的に２４０〜３００アミノ酸の長さがあり、そして、天然のモノマーは、約３０ｋＤａの分子量を有する。数多くのＮｉｆＭポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＭポリペプチドは、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）（受入番号ＷＰ＿０６４３４２９４０．１、配列番号１９に対して９９％同一）、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）（ＷＰ＿００４１２２４１３．１、９７％同一）、ラオウルテラ・オルニチノリチカ（Raoultella ornithinolytica）（ＷＰ＿０４４３４７１８１．１、８５％同一）、クレブシエラ・バリイコラ（Klebsiella variicola）（ＷＰ＿０６３１０５８００．１、７５％同一）、コサコニア・ラジシンシタンス（Kosakonia radicincitans）（ＷＰ＿０３５８８５７５９．１、５９％同一）、ペクトバクテリウム・アトロセプチクム（Pectobacterium atrosepticum）（ＷＰ＿０１１０９４４７２．１、４２％同一）、ブレンネリア・ゴオドウィニイ（Brenneria goodwinii）（ＷＰ＿０４８６３８８３７．１、３３％同一）、シュードモナス・エルギノーサ（Pseudomonas aeruginosa）ＰＡＯ１（ＣＡＡ７５５４４．１、２８％同一）、マリノバクテリウム属（Marinobacterium sp.）ＡＫ２７（ＷＰ＿０５１６９２８５９．１、２７％同一）およびテレジニバクテル・ツルネラ（Teredinibacter turnerae）（ＷＰ＿０１８４１５１５７．１、２６％同一）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＭポリペプチド」は、ＮｉｆＨポリペプチドの成熟のためのＮｉｆＨポリペプチドと複合体形成できるＮｉｆＭポリペプチドである。ＮｉｆＭポリペプチドは、Petrova et al., (2000)で記載および概説された。
【０１９５】
天然の細菌のＮｉｆＮポリペプチドは、ＮｉｆＥポリペプチドを伴ったＥＮα2β2四量体のβサブユニットであり、そして、該ＥＮα2β2四量体は、ＦｅＭｏ−Ｃｏ合成に必要であり、かつ、そこでＦｅＭｏ−Ｃｏが合成される足場として機能することが提案される。本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＮポリペプチド」は、（ｉ）その配列が配列番号１１として提供された配列に対して少なくとも７６％同一であるアミノ酸を含むポリペプチド、および／または（ｉｉ）その配列が配列番号１１として提供された配列に対して少なくとも３４％同一であるアミノ酸を含み、そして、保存ドメインＴＩＧＲ０１２８５、ｃｄ０１９６６およびＰＲＫ１４４７６の１もしくは複数を含むポリペプチド、を意味する。ＮｉｆＮは、構造がモリブデン−鉄タンパクβ鎖ＮｉｆＫに関連する。保存されたＴＩＧＲ０１２８５を含むポリペプチドは、ＮｉｆＮポリペプチドの大部分の例を網羅するが、例えばクロロビウム・テピズムの推定上のＮｉｆＮなどの、一部のＮｉｆＮポリペプチドが除かれる、そのため、ＮｉｆＮの定義は、保存されたＴＩＧＲ０１２８５ドメインを含むポリペプチドに制限されない。ＰＲＫ１４４７６ドメインタンパク質ファミリーのメンバーはまた、スーパーファミリーｃｌ０２７７５のメンバーでもある。天然のＮｉｆＮポリペプチドには、典型的に４１０〜４７０アミノ酸の長さがあるが、自然にＮｉｆＢに融合されたとき、それは、約９００アミノ酸残基を有する可能性があり、天然のモノマーは、約５０ｋＤａの分子量を有する。数多くのＮｉｆＮポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＮポリペプチドは、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）（受入番号ＷＰ＿０６４３９１７７８．１、配列番号１１に対して９７％同一）、クルイベラ（Kluyvera）中間体（ＷＰ＿０４７３７０２６８．１、８０％同一）、ラーネラ・アクアチリス（Rahnella aquatilis）（ＷＰ＿０１４６８３０２６．１、７０％同一）、ブレンネリア・ゴオドウィニイ（Brenneria goodwinii）（ＷＰ＿０４８６３８８３０．１、６５％同一）、メチロバクター・ツンドリパルズム（Methylobacter tundripaludum）（ＷＰ＿０２７１４７６６３．１、４６％同一）、カロトリキス・パリエチナ（Calothrix parietina）（ＷＰ＿０１５１９５９６６．１、４１％同一）、ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）（ＷＰ＿０２３５９３６０９．１、３７％同一）、パエニバシルス・マッシリエンシス（Paenibacillus massiliensis）（ＷＰ＿０２５６７７４８０．１、３５％同一）およびデスルフィトバクテリウム・ハフニエンス（Desulfitobacterium hafniense）（ＷＰ＿０１８３０６２６５．１、３４％同一）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＮポリペプチド」は、その複合体がＦｅＭｏ−Ｃｏを合成できるように、ＮｉｆＥと一緒に機能的な四量体を形成することができるＮｉｆＮポリペプチドである。ＮｉｆＮポリペプチドは、Fay et al., (2016), Brigle et al., (1987), Fani et al., (2000),およびHu et al., (2005)で記載および概説された。
【０１９６】
天然の細菌のＮｉｆＱポリペプチドは、ＦｅＭｏ−Ｃｏ合成と、恐らく初期のＭｏＯ42-プロセシングに関与するポリペプチドである。保存されたＣ末端システイン残基が、金属結合に関与し得る。本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＱポリペプチド」は、その配列が配列番号１２として提供されたアミノ酸配列に対して少なくとも３４％同一であるアミノ酸を含み、そして、ＣＬ０４８２６ドメインタンパク質ファミリーのメンバーであり、かつ、ｐｆａｍ０４８９１ドメインタンパク質ファミリーのメンバーであるポリペプチドを意味する。天然のＮｉｆＱポリペプチドには、典型的に１６０〜２５０アミノ酸の長さがあり、あるいは、それらは、３５０アミノ酸残基と同じくらい長くてもよく、そして、天然のモノマーは、約２０ｋＤａの分子量を有する。数多くのＮｉｆＱポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＱポリペプチドは、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）（受入番号ＷＰ＿０６４３９１７６５．１、配列番号１２に対して９５％同一）、クレブシエラ・バリイコラ（Klebsiella variicola）（ＣＴＱ０６３５０．１、７５％同一）、クルイベラ（Kluyvera）中間体（ＷＰ＿０４７３７０２５７．１、６３％同一）、ペクトバクテリウム・アトロセプチクム（Pectobacterium atrosepticum）（ＷＰ＿０４３８７８０７７．１、５９％同一）、メソリゾビウム・メタルリデュランス（Mesorhizobium metallidurans）（ＷＰ＿００８８７８１７４．１、４６％同一）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）（ＷＰ＿０１１５０１５０４．１、４２％同一）、パラブルコルデリア・スプレンチア（Paraburkholderia sprentiae）（ＷＰ＿０２７１９６５６９．１、４１％同一）、バークホルデリア・スタビリス（Burkholderia stabilis）（ＧＡＵ０６２９６．１、３９％同一）およびクプリアビズス・オキサラチクス（Cupriavidus oxalaticus）（ＷＰ＿０６３２３９４６４．１、３４％同一）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＱポリペプチド」は、ＭｏＯ42-のプロセシングを可能にするＮｉｆＱポリペプチドである。ＮｉｆＱポリペプチドは、Allen et al., (1995)およびSiddavattam et al., (1993)で記載および概説された。
【０１９７】
天然の細菌のＮｉｆＳポリペプチドは、鉄−硫黄（ＦｅＳ）クラスタ生合成に関与するシステインデスルフラーゼであり、例えば、Ｆｅ−Ｓクラスタ合成および修復のための硫黄の動員に関与する。本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＳポリペプチド」は、（ｉ）その配列が配列番号１３として提供されたアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸を含むポリペプチド、および／または（ｉｉ）その配列が配列番号１３として提供された配列に対して少なくとも３６％同一であるアミノ酸を含み、かつ、保存ドメインＴＩＧＲ０３４０２とＣＯＧ１１０４の一方または両方を含む、ポリペプチドを意味する。ＴＩＧＲ０３４０２ドメインタンパク質ファミリーは、伸長された窒素固定系でほとんど常に見られる分岐に加えて、ＩｓｃＳよりも第一のものとより密接に関係し、かつ、ＮｉｆＳ様／ＮｉｆＵ様システムの一部でもある第二の分岐を含む。ＴＩＧＲ０３４０２ドメインタンパク質ファミリーは、ＴＩＧＲ０３４０３においてに代わりに構築されている、文献でＮｉｆＳとも呼ばれる、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）などのイプシロンプロテオバクテリアで見られるより遠方の分岐まで伸長されない。ＣＯＧ１１０４ドメインタンパク質ファミリーは、システインスルフィン酸デスルフィナーゼ／システインデスルフラーゼまたは関連酵素を含む。一部のＮｉｆＳポリペプチドは、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼドメインｃｌ１８９４５を含む。天然のＮｉｆＳポリペプチドには、典型的に３７０〜４４０アミノ酸の長さがあり、そして、天然のモノマーは、約４３ｋＤａの分子量を有する。数多くのＮｉｆＳポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＳポリペプチドは、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）（受入番号ＷＰ＿００４１３８７８０．１、配列番号１３に対して９９％同一）、ラオウルテラ・テルリゲナ（Raoultella terrigena）（ＷＰ＿０４５８５８１５１．１、８９％同一）、クルイベラ（Kluyvera）中間体（ＷＰ＿０４７３７０２６５．１、８０％同一）、ラーネラ・アクアチリス（Rahnella aquatilis）（ＷＰ＿０１４３３３９１１．１、７３％同一）、アガリボランス・ギルブス（Agarivorans gilvus）（ＷＰ＿０５５７３１５９７．１、６４％同一）、アゾスピリラム・ブラジレンス（Azospirillum brasilense）（ＷＰ＿０１４２３９７７０．１、６０％同一）、デスルホサルシナ・セトニカ（Desulfosarcina cetonica）（ＷＰ＿０５４６９１７６５．１、５５％同一）、クロストリジウム・インテスティナレ（Clostridium intestinale）（ＷＰ＿０２１８０２２９４．１、４７％同一）、クロストリジイサリバクテル・パウシボランス（Clostridiisalibacter paucivorans）（ＷＰ＿０２６８９４０５４．１、３６％同一）およびバチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）（ＷＰ＿０６１５７５６２１．１、４２％同一、かつ、ＣＯＧ１１０４内に存在）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＳポリペプチド」は、鉄−硫黄（ＦｅＳ）クラスタ生合成および／または修復において機能できるＮｉｆＳポリペプチドである。ＮｉｆＳポリペプチドは、Clausen et al., (2000), Johnson et al., (2005), Olson et al., (2000)およびYuvaniyama et al., (2000)で記載および概説された。
【０１９８】
天然の細菌のＮｉｆＵポリペプチドは、ニトロゲナーゼ成分のための鉄−硫黄（ＦｅＳ）クラスタ生合成に関与する分子足場ポリペプチドである。本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＵポリペプチド」は、その配列が配列番号１４として提供された配列に対して少なくとも３１％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ドメインＴＩＧＲ０２０００を含む、ポリペプチドを意味する。そのＴＩＧＲ０２０００ドメインタンパク質ファミリーのメンバーは、ニトロゲナーゼ成熟に特異的に関与する。ＮｉｆＵは、Ｎ末端ドメイン（ｐｆａｍ０１５９２）とＣ末端ドメイン（ｐｆａｍ０１１０６）を含む。３つの異なるが、部分的に相同のＦｅ−Ｓクラスタアセンブリ系が説明された：Ｉｓｃ、Ｓｕｆ、およびＮｉｆ。Ｎｉｆ系（ＮｉｆＵがその一部である）は、多くの窒素固定種におけるニトロゲナーゼへのＦｅ−Ｓクラスタの供与に関連する。ヘリコバクター（Helicobacter）およびカンピロバクター（Campylobacter）と同等なドメイン構造を有するＩｓｃおよびＳｕｆ相同体は、本明細書中のＮｉｆＵの定義から除かれる。そのため、ＮｉｆＵは、ニトロゲナーゼ成熟に関与するＮｉｆＵポリペプチドに特異的である。ＮｉｆＵのＮ末端領域の相同体を含む（例えば、エシェリキア・コリ、サッカロミセス・セレビシエおよびホモ・サピエンスからの）ＩｓｃＵタンパク質である、関連ＴＩＧＲ０１９９９ドメインタンパク質ファミリーのメンバーもまた、本明細書中のＮｉｆＵの定義から除かれる。天然のＮｉｆＵポリペプチドには、典型的に２６０〜３１０アミノ酸の長さがあり、そして、天然のモノマーは、約２９ｋＤａの分子量を有する。数多くのＮｉｆＵポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＵポリペプチドは、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）（受入番号ＷＰ＿０４９１３６１６４．１、配列番号１４に対して９７％同一）、クレブシエラ・バリイコラ（Klebsiella variicola）（ＷＰ＿０５０８８７８６２．１、９０％同一）、ディケア・ソラニ（Dickeya solani）（ＷＰ＿０５７０８４６５７．１、８０％同一）、ブレンネリア・ゴオドウィニイ（Brenneria goodwinii）（ＷＰ＿０４８６３８８３３．１、７３％同一）、トルモナス・アウエンシス（Tolumonas auensis）（ＷＰ＿０１２７２８８８９．１、６６％同一）、アガリボランス・ギルブス（Agarivorans gilvus）（ＷＰ＿０５５７３１５９６．１、５８％同一）、デスルホクルブス・ベキシネンシス（Desulfocurvus vexinensis）（ＷＰ＿０２８５８７６３０．１、５４％同一）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）（ＷＰ＿０４４４１７３０３．１、４９％同一）、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）（ＷＰ＿００１０５１９８４．１、３１％同一）およびスルフロブム属（Sulfurovum sp.）ＰＣ０８−６６（ＫＩＭ０５０１１．１、３１％同一）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＵポリペプチド」は、鉄−硫黄（ＦｅＳ）クラスタ生合成に関与する分子足場ポリペプチドとして機能できるＮｉｆＵポリペプチドである。ＮｉｆＵポリペプチドは、Hwang et al., (1996), Muhlenhoff et al., (2003)およびOuzounis et al., (1994)で記載および概説された。
【０１９９】
天然の細菌のＮｉｆＶポリペプチドは、ホモクエン酸シンターゼ（ＥＣ２．３．３．１４）であり、そして、アセチル補酵素Ａ（アセチル−ＣｏＡ）から２−オキソグルタル酸へのアセチル基の移動によってホモクエン酸を産生する。次に、ホモクエン酸は、ＦｅＭｏ−Ｃｏの合成に使用される。本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＶポリペプチド」は、その配列が配列番号２０として提供されたアミノ酸配列に対して少なくとも３９％同一であるアミノ酸を含み、かつ、ドメインＴＩＧＲ０２６６０およびＤＲＥ＿ＴＩＭの一方または両方を含む、ポリペプチドを意味する。ＴＩＧＲ０２６６０ドメインタンパク質ファミリーのメンバーは、窒素固定以外のプロセスに関連する２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ、（Ｒ）−シトラマル酸シンターゼ、およびホモクエン酸シンターゼを含む酵素に対して相同である。ｃｄ０７９３９ドメインタンパク質ファミリーはまた、ヘリオバクテリウム・クロラム（Heliobacterium chlorum）およびグルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）のＮｉｆＶタンパク質を含み、そしてそれは、ＦｒｂＣに対してオルソロガスであると思われる。このファミリーは、ＤＲＥ−ＴＩＭメタロリアーゼスーパーファミリーに属する。ＤＲＥ−ＴＩＭメタロリアーゼとしては、２−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＩＰＭＳ）、α−イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ＬｅｕＡ）、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡリアーゼ、ホモクエン酸シンターゼ、シトラマル酸シンターゼ、４−ヒドロキシ−２−オキソ吉草酸アルドラーゼ、ｒｅ−クエン酸シンターゼ、トランスカルボキシラーゼ５Ｓ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、ＡｋｓＡ、およびＦｒｂＣが挙げられる。これらのメンバーはすべて、８つのαへリックスによって囲まれた閉鎖バレルを形成する８つの平行ベータ鎖を有するコアβ（８）−α（８）モチーフから成る保存トリオース−リン酸イソメラーゼ（ＴＩＭ）バレルドメインを共有する。そのドメインには、バレルのコアを覆うクラスタの不変残基によって形成された二価の陽イオン結合部位を含有する触媒中心を有する。加えて、触媒部位は、ドメイン名「ＤＲＥ−ＴＩＭ」の根拠である３つの不変残基−アスパルタート（Ｄ）、アルギニン（Ｒ）およびグルタミン酸（Ｅ）−を含む。天然のＮｉｆＶポリペプチドには、典型的に３６０〜３９０アミノ酸の長さがあるが、一部のメンバーには、約４９０アミノ酸残基の長さがあり、そして、天然のモノマーは、約４１ｋＤａの分子量を有する。数多くのＮｉｆＶポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＶポリペプチドは、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）（受入番号ＷＰ＿０４９０８３３４１．１、配列番号２０に対して９５％同一）、ラオウルテラ・オルニチノリチカ（Raoultella ornithinolytica）（ＷＰ＿０４５８５８１５４．１、８６％同一）、クルイベラ（Kluyvera）中間体（ＷＰ＿０４７３７０２６４．１、８１％同一）、ディケヤ・ダダンチイ（Dickeya dadantii）（ＷＰ＿０３８９１２０４１．１、７０％同一）、ブレンネリア・ゴオドウィニイ（Brenneria goodwinii）（ＷＰ＿０４８６３８８３５．���、５９％同一）、マグネトコックス・マリヌス（Magnetococcus marinus）（ＷＰ＿０１１７１２８５６．１、４６％同一）、スフィンゴモナス・ウィッチキイ（Sphingomonas wittichii）（ＷＰ＿０３７５２８７０３．１、４３％同一）、フランキア属（Frankia sp.）ＥＩ５ｃ（ＯＡＡ２９０６２．１、４１％同一）およびクロストリジウム属（Clostridium sp.）Ｍａｄｄｉｎｇｌｅｙ ＭＢＣ３４−２６（ＥＫＱ５６００６．１、３９％同一）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＶポリペプチド」は、ホモクエン酸シンターゼとして機能できるＮｉｆＶポリペプチドである。ＮｉｆＶポリペプチドは、Hu et al., (2008), Lee et al., (2000), Masukawa et al., (2007)およびZheng et al., (1997)で記載および概説された。
【０２００】
天然の細菌のＮｉｆＸポリペプチドは、ＮｉｆＢからＮｉｆＥ−ＮｉｆＮにＦｅＭｏ−Ｃｏ前駆体が移行する際に少なくとも助けとなる、ＦｅＭｏ−Ｃｏ合成に関与するポリペプチドである。本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＸポリペプチド」は、その配列が配列番号１５として提供されたアミノ酸配列に対して少なくとも２９％同一であるアミノ酸を含み、かつ、保存ドメインＴＩＧＲ０２６６３およびｃｄ００８５３の一方または両方を含む、ポリペプチドを意味する。ＮｉｆＸは、ＮｉｆＢおよびＮｉｆＹを含めた鉄−モリブデンクラスタ結合タンパク質のより大きなファミリー内に含まれる、すなわち、ＮｉｆＸおよびＮａｆＹ、そしてＮｉｆＢのＣ末端ドメインはすべて、ｐｆａｍ０２５７９ドメインを含み、かつ、それぞれＦｅＭｏ−Ｃｏの合成に関与する。そのため、一部のＮｉｆＸポリペプチドは、ＮｉｆＹとしてデータベース内に注釈され、そして、逆もまた同様である。天然のＮｉｆＸポリペプチドには、典型的に１１０〜１６０アミノ酸の長さがあり、そして、天然のモノマーは、約１５ｋＤａの分子量を有する。数多くのＮｉｆＸポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＸポリペプチドは、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）（受入番号ＷＰ＿０４９０７０１９９．１、配列番号１５に対して９７％同一）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）（ＷＰ＿０６４３４２９３７．１、９７％同一）、ラオウルテラ・オルニチノリチカ（Raoultella ornithinolytica）（ＷＰ＿０４４３４７１７３．１、９１％同一）、クレブシエラ・バリイコラ（Klebsiella variicola）（ＷＰ＿０４４６１２９２２．１、８３％同一）、コサコニア・ラジシンシタンス（Kosakonia radicincitans）（ＷＰ＿０４３９５３５８３．１、７５％同一）、ディケヤ・クリサンテミ（Dickeya chrysanthemi）（ＷＰ＿０３９９９９４１６．１、６８％同一）、ラーネラ・アクアチリス（Rahnella aquatilis）（ＷＰ＿０４７６０８０９７．１、５８％同一）、アゾトバクター・クロオコッカム（Azotobacter chroococcum）（ＷＰ＿０３９８００８４８．１、３４％同一）、ベギアトア・レプトミチホルミス（Beggiatoa leptomitiformis）（ＷＰ＿０６２１４９０４７．１、３３％同一）およびメチルオベルサチリス・ジシプロルム（Methyloversatilis discipulorum）（ＷＰ＿０２０１６５９７２．１、２９％同一）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＸポリペプチド」は、ＮｉｆＢからＮｉｆＥ−ＮｉｆＮにＦｅＭｏ−Ｃｏ前駆体を移行できるＮｉｆＸポリペプチドである。ＮｉｆＸポリペプチドは、Allen et al., (1994)およびShah et al., (1999)で記載および概説された。
【０２０１】
天然の細菌のＮｉｆＹポリペプチドは、ＦｅＭｏ−Ｃｏ合成に関与するポリペプチドであり、ＮｉｆＢからＮｉｆＥ−ＮｉｆＮにＦｅＭｏ−Ｃｏ前駆体を移行する際に少なくとも助けとなる。本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＹポリペプチド」は、その配列が配列番号８として提供されたアミノ酸配列に対して少なくとも３４％同一であるアミノ酸を含み、かつ、保存ドメインＴＩＧＲ０２６６３およびｃｄ００８５３の一方または両方を含む、ポリペプチドを意味する。ＮｉｆＹは、ＮｉｆＢおよびＮｉｆＸを含めた鉄−モリブデンクラスタ結合タンパク質のより大きいファミリーに含まれる、すなわち、ＮｉｆＸおよびＮａｆＹ、ならびにＮｉｆＢのＣ末端ドメインのすべてがｐｆａｍ０２５７９ドメインを含み、そして、それぞれがＦｅＭｏ−Ｃｏの合成に関与する。数多くのＮｉｆＹポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＹポリペプチドは、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）（受入番号ＷＰ＿０４９０８９５００．１、配列番号８に対して９９％同一）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）（ＷＰ＿０６４３４２９３５．１、９８％同一）、クレブシエラ・クアシプノイモニア（Klebsiella quasipneumoniae）（ＷＰ＿０４４５２４０５４．１、９０％同一）、クレブシエラ・バリイコラ（Klebsiella variicola）（ＷＰ＿０４９０１０７３９．１、８１％同一）、クルイベラ（Kluyvera）中間体（ＷＰ＿０４７３７０２７０．１、６９％同一）、ディケヤ・クリサンテミ（Dickeya chrysanthemi）（ＷＰ＿０３９９９９４１１．１、６２％同一）、セラチア属（Serratia sp.）ＡＴＣＣ３９００６（ＷＰ＿０３７３８２４６１．１、５７％同一）、ラーネラ・アクアチリス（Rahnella aquatilis）（ＷＰ＿０１４６８３０２４．１、４７％同一）、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）（ＡＥＸ２５７８４．１、３７％同一）およびアゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）（ＷＰ＿０１２６９８８３５．１、３４％同一）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＹポリペプチド」は、ＮｉｆＢからＮｉｆＥ−ＮｉｆＮにＦｅＭｏ−Ｃｏ前駆体を移行することができるＮｉｆＹポリペプチドである。
【０２０２】
天然の細菌のＮｉｆＺポリペプチドは、第二のＦｅ4Ｓ4ペアのカップリングのために特異的に必要とされる、Ｆｅ−Ｓクラスタ合成に関与するポリペプチドである。本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＺポリペプチド」は、その配列が配列番号１７として提供された配列に対して少なくとも２８％同一であるアミノ酸を含み、かつ、保存ドメインｐｆａｍ０４３１９を含む、ポリペプチドを意味する。約７５アミノ酸残基のこのドメインは、一部のメンバーの単離、およびより長いＮｉｆＺタンパク質の半分のアミノ末端で見られる。天然のＮｉｆＺポリペプチドには、典型的に７０〜１５０アミノ酸の長さがあり、そして、天然のモノマーは、約９〜約１６ｋＤａの分子量を有する。数多くのＮｉｆＺポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＺポリペプチドは、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）（受入番号ＷＰ＿０５７１７３２２３．１、配列番号１７に対して９３％同一）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）（ＷＰ＿０６４３４２９３９．１、９５％同一）、クレブシエラ・バリイコラ（Klebsiella variicola）（ＷＰ＿０４３８７５００５．１、７７％同一）、コサコニア・ラジシンシタンス（Kosakonia radicincitans）（ＷＰ＿０４３９５３５８８．１、６７％同一）、コサコニア・サッカリ（Kosakonia sacchari）（ＷＰ＿０６５３６８５５３．１、５８％同一）、フェリファセルス・アムニコラ（Ferriphaselus amnicola）（ＷＰ＿０６２６２７６２５．１、４７％同一）、パラブルコルデリア・キセノボランス（Paraburkholderia xenovorans）（ＷＰ＿０１１４９１８３８．１、４１％同一）、アシジチオバシルス・フェリボランス（Acidithiobacillus ferrivorans）（ＷＰ＿０１４０２９０５０．１、３５％同一）およびブラジリゾビウム・オリゴトロフィクム（Bradyrhizobium oligotrophicum）（ＷＰ＿０１５６６５４２２．１、２８％同一）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＺポリペプチド」は、Ｆｅ−Ｓクラスタ合成においてＦｅ4Ｓ4クラスタを連結することができるＮｉｆＺポリペプチドである。ＮｉｆＺポリペプチドは、Cotton (2009)およびHu et al., (2004)で記載および概説された。
【０２０３】
天然の細菌のＮｉｆＷポリペプチドは、ＮｉｆＺポリペプチドと結合して、高次複合体を形成し（Lee et al., 1998）、かつ、ＭｏＦｅタンパク質（ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ）合成または活性に関与する、ポリペプチドである。ＮｉｆＷおよびＮｉｆＺは、ＭｏＦｅタンパク質の形成または蓄積に関与すると思われる（Paul and Merrick, 1989）。本明細書中に使用される場合、「ＮｉｆＷポリペプチド」は、そのアミノ酸配列がアミノ酸（その配列が配列番号７４として提供されたアミノ酸配列に対して少なくとも２８％同一である）を含み、かつ、保存されたＮｉｆＷスーパーファミリタンパク質ドメイン、アーキテクチャＩＤ番号１０５０５０７７を含み、Ｐｆａｍｉｌｙ ＰＦ０３２０６内に存在する、ポリペプチドを意味する。数多くのＮｉｆＷポリペプチドが同定され、そして、多数の配列が、公的に利用可能なデータベースで入手可能である。例えば、ＮｉｆＷポリペプチドは、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）（受入番号ＷＰ＿０６４３４２９３８．１、配列番号７４に対して９８％同一）、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）（ＷＰ＿０４９０８０１５５．１、９４％同一）、エンテロバクター属（Enterobacter sp.）１０−１（ＷＰ＿０９５１０３５８６．１、９０％同一）、クレブシエラ・クアシプノイモニア（Klebsiella quasipneumoniae）（ＷＰ＿０６５８７７３７３．１、８１％同一）、ペクトバクテリウム・ポラリス（Pectobacterium polaris）（ＷＰ＿０９５６９９９７１．１、６９％同一）、ディケア・パラディシアカ（Dickeya paradisiaca）（ＷＰ＿０１２７６４１３６．１、５８％同一）、ブレンネリア・ゴオドウィニイ（Brenneria goodwinii）（ＷＰ＿０５３０８５５４７．１、３６％同一）、アクワスピリルム属（Aquaspirillum sp.）ＬＭ１（ＷＰ＿０７７２９９８２４．１、４４％同一）、カンジダツス・ムプロテオバクテリア（Candidatus Muproteobacteria）ＲＢＧ＿１６＿６４＿１０（ＯＧＩ４０７２９、３４％同一）、アゾトバクター・ビネランジー（Azotobacter vinelandii）（ＡＣＯ７６４３０．１、３２％同一）およびメチルオカルズム・マリヌム（Methylocaldum marinum）（ＢＢＡ３７４２７．１、２８％同一）で報告された。本明細書中に使用される場合、「機能的なＮｉｆＷポリペプチド」は、ＭｏＦｅタンパク質の形成、蓄積または活性のうちの１もしくは複数を推進または促進するＮｉｆＷポリペプチドである。機能的なＮｉｆＷは、ＮｉｆＺと相互作用し得る、および／またはＭｏＦｅタンパク質の酸素保護の役割を果たし得る（Gavini et al., (1998)）。
【０２０４】
規定したポリペプチドまたは酵素に関し、先に提供したものよりもより高い％同一性の形態が、好ましい実施形態を包含することが理解されるであろう。よって、適用できる場合、最小の％同一性の形態に照らして、ポリペプチドは、関連して挙げられる配列番号と、少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも３５％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも５５％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．９％同一であるアミノ酸配列を含むことが好ましい。
【０２０５】
本明細書中に規定したポリペプチドのアミノ酸配列突然変異体は、本明細書に規定される核酸に適切なヌクレオチドの変更を導入することにより、または所望のポリペプチドのインビトロ合成により調製され得る。斯かる突然変異体は、例えば、１もしくは複数アミノ酸の欠失、挿入、または置換を含む。欠失、挿入および置換突然変異の組み合わせは、最終的な構築物に達するように作製され得るが、ただし、最終的なペプチド産生物が所望の酵素活性を有することを条件とする。
【０２０６】
突然変異（変更された）ポリペプチドは、例えば、指向進化または合理的設計ストラテジーを使用して、当該技術分野で既知の任意の技術を使用して調製され得る（以下を参照）。突然変異／変更ＤＮＡから得られる産物は、植物内でのそれらの発現が対応する野生型植物に対してその表現型を変更する場合、例えば、それらの発現が、対応する野生型植物に対して、増収、バイオマス、成長速度、生命力、生物窒素固定から得られる窒素獲得、窒素利用効率、非生物的ストレス寛容性、および／または栄養素欠乏に対する寛容性をもたらす場合、測定するための本明細書中に記載した技術を使用して容易にスクリーニングされ得る。
【０２０７】
アミノ酸配列の突然変異体を設計する際、突然変異点の場所および突然変異の性質が、変更される特徴（複数を含む）に依存するであろう。突然変異の場所は、例えば、（１）まず保存的なアミノ酸の選択により、その後の達成された結果による革新的な選択により置換し、（２）標的残基を欠失させ、または（３）位置される場所に隣り合う他の残基を挿入することにより、個々にまたは連続して変更され得る。
【０２０８】
アミノ酸配列は、概して約１から１５の残基の範囲、より好ましくは約１から１０残基および典型的には約１から５の連続する残基を欠失する。
【０２０９】
置換突然変異体は、除去されるポリペプチド分子における少なくとも１つのアミノ酸残基およびその場所に挿入される異なる残基を有する。特定の活性を維持することが望ましい場合、保存的置換がないか、または、関連タンパク質ファミリーに高度に保存されるアミノ酸位置においてだけであることが好ましい。保存的置換の例は、「代表的な置換」の見出しの下に、表１に示されている。
【０２１０】
好ましい実施形態において、突然変異体／変異体ポリペプチドは、天然に生じるポリペプチドと比較される場合に、唯一、または、１もしくは２もしくは３もしくは４以下の保存的なアミノ酸変更を有する。保存的なアミノ酸の変更の詳細は、表１に提供される。好ましい実施形態において、その変更は、本発明の異なるポリペプチドの間で高度に保存される１もしくは複数のモチーフまたはドメインに存在しない。当業者が認識しているように、このような微小な変更は、遺伝子組み換え細胞で発現される場合に、ポリペプチドの活性を変更しないことが合理的に予測され得る。
【０２１１】
本発明のポリペプチドの一次アミノ酸配列は、密接に関連するポリペプチドとの比較に基づく変異体／突然変異体を設計するのに使用できる。当業者が理解するように、密接に関連するタンパク質の間で高度に保存された残基は、より低度に保存された残基に比べ維持された活性を、特に非保存的置換で、変更できる可能性が低い（上記を参照）。保存されたアミノ酸残基を同定するためのより高いストリンジェント試験は、同じ機能の関連ポリペプチドをより遠くにアラインするためのものである。高度に保存された残基は、機能を保有するために維持されなければならず、その一方で、非保存残基は、機能を維持しながら、置換または欠失に適している。
【０２１２】
例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化またはタンパク質分解的切断によって、細胞内での合成中または合成後に示差的に修飾される本発明のポリペプチドもまた、本発明の範囲内に含まれる。
【０２１３】
表１．代表的な置換
【表１】
2020510413.tif 000002
【０２１４】
合理的な設計
タンパク質は、タンパク質構造および折り畳みに関する既知の情報に基づいて合理的に設計され得る。これは、一からの設計（デノボ設計）によって達成されても、または天然足場に基づく再設計によって達成されてもよい（例えば、Hellinga, 1997; and Lu and Berry, Protein Structure Design and Engineering, Handbook of Proteins 2, 1153-1157 (2007)を参照）。例えば、本明細書中の実施例１０を参照。タンパク質設計は、典型的に所定のまたは標的構造に折り畳まれた配列を同定することを伴い、そして、コンピュータモデルを使用して実現される。コンピュータによるタンパク質設計アルゴリズムは、標的構造に折り畳まれているとエネルギーが低くなる配列に関して配列配座空間を検索する。コンピュータによるタンパク質設計アルゴリズムは、突然変異がどうタンパク質の構造および機能に影響するかを評価するためにタンパク質エネルギー論のモデルを使用する。これらのエネルギー関数は、典型的に分子機構、統計（すなわち、知識ベース）およびその他の経験項の組み合わせを含む。好適な利用可能なソフトウェアとしては、ＩＰＲＯ（Interative Protein Redesign and Optimization）、ＥＧＡＤ（A Genetic Algorithm for Protein Design）、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｄｅｓｉｇｎ、Ｓｈａｒｐｅｎ、およびＡｂａｌｏｎｅが挙げられる。
【０２１５】
植物におけるミトコンドリアタンパク質の取り込み
ほとんどすべてのミトコンドリアタンパク質が、核にコードされ、そして、サイトゾルに移行され、そのためミトコンドリア内へのそれらの転移を必要とする。ポリペプチド中のシグナル配列は、４つの異なるミトコンドリア内位置：外膜（ＯＭ）、膜間腔（ＩＳ）、内膜（ＩＭ）、またはマトリックス（ＭＭ）、へのそれらの取り込みに向ける。これらのシグナル配列は、それらの生化学的性質によって識別され、そして、４つの位置の１もしくは複数にポリペプチドを向ける少なくとも４つの異なる取り込み経路を介した輸送をガイドする（Chacinska et al., 2009）。これらの４つの経路は以下のとおりである：
（１）ポリペプチドをＭＭ、ＩＳまたはＩＭに向ける、「古典的な」プレ配列経路とも呼ばれる、一般的な取り込み経路；（２）ＩＭへの取り込みのために使用される、担体取り込み経路；（３）ミトコンドリアの膜間腔（ＭＩＡ）集合経路、および（４）ＯＭへのポリペプチドの取り込みのために使用されるソーティングおよび集合機構（ＳＡＭ）経路、である。一般的な取り込み経路はまた、シグナル配列としても知られている切断可能なプレ配列を有するポリペプチドも取り込む。これらのポリペプチドはまた、疎水性ソーティングシグナル（ＨＳＳ）を有してもよい。担体取り込み経路は、シグナルや疎水領域のような内部プレ配列を有するポリペプチドを取り込む。ＭＩＡ経路は、ツインシステイン残基を有するポリペプチドを取り込む。ＳＡＭ経路は、βシグナルおよび推定上のＴＯＭ２０シグナルを含有するポリペプチドを取り込む。これらの経路はすべて、外膜（ＴＯＭ）のトランスロカーゼを使用し、そして、第一および第二の経路はまた、膜間複合体のＴＩＭ２３トランスロカーゼも使用する。第一の経路だけが、マトリックスプロセシングペプチダーゼ（マトリックスプロセシングプロテアーゼ、ＭＰＰ）を使用する。
【０２１６】
すべてのミトコンドリア標的化ポリペプチドに共通する特徴は、正確な位置への移動を導くポリペプチド中の少なくとも１つのドメインの存在である。これらについて最もよく研究されているのは、マトリックス内でＭＰＰによって切断される「古典的な」Ｎ末端プレ配列ドメインである（Murcha et al., 2004）。約７０％の植物および動物ミトコンドリアタンパク質が切断可能なプレ配列を有するにもかかわらず、内部およびＣ末端シグナル配列の両方もまた見出された（Pfanner and Geissler (2001), Schleiff and Soll (2000)に概説された）。アラビドプシスでは、これらのプレ配列は、５０アミノ酸残基の平均長を有する１１〜１０９アミノ酸残基の長さの範囲に及ぶ。第一の経路に関してプレ配列を完全に規定するコンセンサス配列はないが、それらは、高い割合の疎水性、かつ、陽性荷電アミノ酸を含む傾向がある。通常、最初の１０アミノ酸残基以内に始まる両親媒性αヘリックスを形成するそれらの能力が、さらなる特徴である（Roise et al., 1986）。これらのドメインは、疎水性（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ）、ヒドロキシル化（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）および陽性荷電（Ａｒｇ、Ｌｙｓ）アミノ酸残基が豊富であり、かつ、酸性アミノ酸を欠いている。数多くのミトコンドリアタンパク質に関して、セリン（１６〜１７％）およびアラニン（１２〜１３％）が、ミトコンドリアのシグナル・ペプチドの中で多く表されすぎており、およびアルギニンが豊富である（１２％）。ＭＰＰ切断ポイントは、通常、位置Ｐ２（一様に切断される結合から−２ａａ）、または他の大部分の場合、Ｐ３における、保存されたアルギニン残基の存在によって、大部分のプレ配列に関して規定される（Huang et al., 2009）。
【０２１７】
ミトコンドリアのプレ配列は、疎水性残基を通してＴｏｍ２０受容体と相互作用する。研究は、αヘリックスの疎水性表面が、ＴＯＭ取り込み複合体のＴＯＭ２０成分によるペプチドの認識を容易にする一方で、ＴＯＭ２２サブユニットによって陽電荷が認識されることを示した（Abe et al., 2000）。最後に、大部分のプレ配列が、Ｈｓｐ７０と結合するポリペプチドの移動を導くので、したがって、ほとんどすべての植物のプレ配列が、Ｈｓｐ７０分子シャペロンの少なくとも１つの結合モチーフを含んでいる（Zhang and Glaser, 2002）。シャペロンＨｓｐ７０は、タンパク質の折り畳み、タンパク質凝集の予防、および分子モータとしての機能に関与し、そして、ミトコンドリア膜を越えて前駆体を引く。内膜を横切る膜電位（ΔΨ）（〜１００ｍＶ、陰性内部）はまた、電気泳動効果を介して陽性荷電プレ配列の転移を駆動する。
【０２１８】
切断可能なプレ配列を有するタンパク質の大部分が、一般的な取り込み経路を介してミトコンドリアマトリックスに向けられており、そしてそれは、外膜（ＴＯＭ）複合体のトランスポーターおよび内膜２３複合体（ＴＩＭ２３）のトランスポーターを利用する。しかしながら、切断可能なプレ配列を有するタンパク質の一部は、それらがまた疎水性ソーティングシグナル（ＨＳＳ）も含んでいる場合、内膜（Murcha et al., 2005）または膜間腔で集合し得る（Glick et al., 1992）。切断されたそれらのプレ配列を有していないマトリックス局在タンパク質に関してほんのわずかな例が存在する。アラビドプシスでは、グルタミン酸デヒドロゲナーゼだけが、プロセシングされていない完全長プレ配列で、マトリックス内で見られた（Huang et al., 2009）。
【０２１９】
マトリックス標的化されていないタンパク質に関して、さまざまな内在性の非切断可能局所化シグナルが採用される。これらは、典型的に特定の輸送経路に関連し、そして、特定の種類のタンパク質にさらに適合される。植物では、これまでのところ、いずれの試験も、膜間腔タンパク質の内部シグナル配列の正確な構成について測定していない。しかしながら、ツインシステイン残基を有するモチーフが、ミトコンドリアの膜間腔集合経路（ＭＩＡ）を介した移動に関連しているらしい（Carrie et al., 2010; Darshi et al., 2012）。最後に、非切断可能内部配列はまた、担体経路を介して内膜に向けられるタンパク質によって利用され、そしてそれは、複数の膜貫通領域を有するタンパク質を挿入するためにＴＯＭおよびＴＩＭ２２装置を利用する（Kerscher et al., 1997; Sirrenberg et al., 1996）。これらの配列は、典型的に疎水性領域と、それに続く内部配列のようなプレ配列を含み、これにより、Ｎ末端プレ配列に類似しているが、それらの同族タンパク質内のそれらの内部位置によって区別される。
【０２２０】
光合成生物では、ミトコンドリアタンパク質をコードする核は、これらの２つのオルガネラとそれらのプロテオムの間の多くの類似性にもかかわらず、葉緑体とミトコンドリア輸送の間の区別を必要とした。ミトコンドリアプレ配列でほぼ現れるαヘリックスは、通常、葉緑体プレ配列を欠いており（Zhang and Glaser, 2002）、そしてそれは、より非構造化されているので、高度なβシート領域構造を示す傾向がある（Bruce, 2001）。
【０２２１】
植物では、ＭＰＰは内膜結合Ｃｙｔｂｃ1複合体に据えつけられているが、活性ＭＰＰ部位は、マトリックスに面して配置されているので、２つのタンパク質の機能は独立している（Glaser and Dessi, 1999）。
【０２２２】
ミトコンドリア標的化ペプチド
本明細書中に使用される場合、用語「ミトコンドリア標的化ペプチド」または「ＭＴＰ」は、標的タンパク質をミトコンドリアに向け、かつ、Ｎｉｆポリペプチド、Ｇｕｓ、ＧＦＰなどの選択された標的タンパク質をミトコンドリアに向けるためにＭＴＰ−標的タンパク質の翻訳的融合の際に非相同的に使用できる、長さが少なくとも１０アミノ酸、そして好ましくは、１０〜約８０アミノ酸残基のアミノ酸配列を意味する。
【０２２３】
ＭＴＰは、典型的にそれが誘導されるポリペプチドの翻訳イニシエーターであるメチオニンをそのＮ末端に含む。ＭＴＰは、標的タンパク質のイニシエーターＭｅｔに相当するＭｅｔ残基へのペプチド結合によってＮｉｆポリペプチドまたは「標的タンパク質」に翻訳的に融合されるか、あるいは、そのＭｅｔ残基が除かれてもよく、かつ、そのペプチド結合が、野生型の、標的タンパク質の第二アミノ酸であるアミノ酸残基に直接融合される。ＭＴＰは、典型的に塩基性およびヒドロキシル化アミノ酸が豊富であり、通例は、酸性アミノ酸または伸長された疎水性伸長部を欠く。ＭＴＰは、両親媒性ヘリックスを形成してもよい。
【０２２４】
理論によって制限されることを望むものではないが、ＭＴＰは、典型的にミトコンドリアの外膜に対する受容体に結合する取り込み標的化配列を含む。外膜に結合すると、融合ポリペプチドは、チャンネルタンパク質を輸送する膜転移を受け、そして、ミトコンドリアマトリックス（ＭＭ）までミトコンドリアの二重膜を通過することが好ましい。次に、取り込みを標的化配列は、典型的に切断され、そして成熟融合タンパク質は折り畳まれた。
【０２２５】
ＭＴＰは、それに続いて、タンパク質を、例えばミトコンドリアマトリックス（ＭＭ）などのミトコンドリアの異なる領域に標的化する追加のシグナルを含んでもよい。ある実施形態において、取り込み標的化配列は、マトリックス標的化配列である。
【０２２６】
ＭＴＰは、Ｎｉｆポリペプチドに翻訳的に融合されるとき、切断可能であっても、または非切断可能であってもよい。ある実施形態において、細胞で産生されるＭＴＰ−Ｎｉｆ融合ポリペプチドの少なくとも５０％が、細胞内で切断される。代替の実施形態において、ＭＴＰ−Ｎｉｆ融合ポリペプチドの５０％未満が、細胞内で切断される、例えば、ＭＴＰは切断されない。ある実施形態において、ＭＴＰは、ＭＰＰのための切断部位を含まない。ＭＴＰは、（ＭＴＰ配列内の）切断部位を含んでもよい。切断により、結果として得られたプロセシングされた産物（すなわち、成熟ＮＰ）のＮ−末端部分は、ＭＴＰの１もしくは複数のＣ末端アミノ酸を含んでもよい。あるいは、切断部位は、ＭＴＰ配列全体が切断されるように融合ポリペプチド内に位置されてもよく、例えば、そのリンカーは、切断配列を含んでもよい。
【０２２７】
固有のミトコンドリア標的化ペプチドは、前駆タンパク質のＮ末端に局在化されており、そして、Ｎ−末端部分は、典型的にミトコンドリア内への取り込み中または取り込み後に切り落とされる。切断は、典型的に一般的なマトリックスプロセシングプロテアーゼ（ＭＰＰ）によって触媒され、そしてそれは、植物では、呼吸鎖のｂｃ1複合体内に組み込まれている。このプロテアーゼは、わずかな保護を示す幅広いアミノ酸配列を有する約１０００個の前駆タンパク質の切断部位を認識する。ある実施形態において、ＭＴＰは、ＭＰＰのためのプロテアーゼ切断部位を含む。さらなる実施形態において、ＭＰＰによるＭＴＰ内の融合タンパク質の切断によって、プロセシングされた産物を生じる。
【０２２８】
ある実施形態において、ＭＴＰは切断されない。本発明者らは、ＭＴＰの取り込みが、常にＮｉｆタンパク質の完全なプロセシングにつながるわけではなかったことを実証した。場合によっては（ＮｉｆＸ−ＦＬＡＧ、ＮｉｆＤ−ＨＡopt1およびＮｉｆＤＫ−ＨＡ）、プロセシングされたＮｉｆタンパク質およびプロセシングされていないＮｉｆタンパク質の両方が観察された。ＭＴＰに関して一般的なコンセンサス配列が存在しないこと、および内部タンパク質配列がミトコンドリア標的化に影響を及ぼすことができること（Becker et al., 2012）を考慮すると、本発明者らがＮｉｆタンパク質の間のプロセシング効率の差を見つけたこと、驚くべきことではないかもしれない。
【０２２９】
本発明との関連において使用される好適なＭＴＰとしては、これだけに限定されるものではないが、von Heijne (1986)またはRoise and Schatz (1988)によって規定される一般構造を有するペプチドが挙げられる。限定されることのないＭＴＰの例は、von Heijne (1986)の表Ｉで規定したミトコンドリア標的化ペプチドである。
【０２３０】
ある実施形態において、ＭＴＰは、Ｆ１ＡＴＰアーゼγ−サブユニット（ｐＦＡγ）である。好適なｐＦＡγＭＴＰの例は、Ａ．サリアナ（A.thaliana）由来のそれである（Lee et al., 2012）。ある実施形態において、ｐＦＡγＭＴＰは、長さが７７アミノ酸であり、ＭＭＰによるその切断は、融合ポリペプチドのＮ末端にて３８ＭＴＰ残基をあとに残す。好ましい実施形態において、ｐＦＡγＭＴＰは、長さが７７未満アミノ酸である。例えば、ｐＦＡγＭＴＰは、長さが約５１アミノ酸であってもよく、ＭＭＰによるその切断は、融合ポリペプチドのＮ末端にて９ＭＴＰ残基をあとに残す。
【０２３１】
当業者は、ソフトウェアがミトコンドリアタンパク質およびそれらの標的化配列、例えば、ＭｉｔｏＰｒｏｔＩＩ、ＰＳＯＲＴ、ＴａｒｇｅｔＰ、ＮＮＰＳＬ、を予測するために存在することを理解する。
【０２３２】
ＭｉｔｏＰｒｏｔＩＩは、いくつかの生理化学的パラメーター（例えば、Ｎ−末端部分のアミノ酸組成、または１７残基ウィンドウに関する最高の総疎水度）に基づいて配列のミトコンドリア局在を予測するプログラムである。ＰＳＯＲＴは、例えば、配列モチーフの存在やアミノ酸組成などの様々な配列由来の特徴に基づいて細胞内位置を予測するプログラムである。ＴａｒｇｅｔＰは、任意のＮ末端プレ配列：葉緑体輸送ペプチド、ミトコンドリア標的化ペプチドまたは分泌経路シグナルペプチド、の予測される存在に基づいて、真核細胞タンパク質の細胞内位置を予測する。ＴａｒｇｅｔＰは、二層の人工神経回路網（ＡＮＮ）内への入力としてＮ末端配列を必要とし、そして、初期のバイナリの予測因子、ＳｉｇｎａｌＰおよびＣｈｌｏｒｏＰを利用する。Ｎ末端プレ配列を含むと予測される配列に関して、潜在的切断部位もまた、予測できる。ＮＮＰＳＬは、クエリー配列に対して４つの細胞内局在性（サイトゾル、細胞外、核およびミトコンドリア）のうちの１つを割り当てるためにアミノ酸組成を使用する別のＡＮＮベースの方法である。
【０２３３】
当業者は、ルーチン法および本明細書中に開示した方法に基づいて、選ばれたＭＴＰが融合ポリペプチドをミトコンドリアマトリックスに標的化するかどうか、容易に測定することができる。本発明者らは、アラビドプシスプロトプラストにおいてＧＦＰを輸送できることが以前に実証され（Lee et al., 2012）、かつ、プロセシングされたタンパク質の検出を補助するために、比較的長い標的化ペプチドを選んだ。本明細書中の実施例に示したように、選ばれたＭＴＰは、選択されたニトロゲナーゼタンパク質のすべてを、ＭＭに対して標的化した。この結論は、証拠の数行に基づいている。まず第一に、Ｎ．ベンサミアナが発現したＮｉｆポリペプチドについて観察されたサイズは、ＭＭペプチダーゼプロセシングから得られる予想されたサイズと一致していた。これはまた、細菌（完全長の未プロセシング）と、植物ミトコンドリアで発現された小型のＮｉｆｓ（ＮｉｆＦおよびＮｉｆＺ）との間で観察されたサイズ差によっても反映された。さらに、ＮｉｆＤおよびＧＦＰの両方の融合に関してより大きいバンドを生じる、ミトコンドリア取り込み機構によってプロセシングされることができない状態にするＭＴＰの突然変異は、プロセシングされたタンパク質と未プロセシングタンパク質との間のサイズ差と一致した。最後に、代表的な融合ポリペプチドの質量分析法では、ＭＴＰ−ＮｉｆＨが、マトリックス内での特定のプロセシングに関して予測されたように、ＭＴＰの残基４２〜４３の間で切断されたことを決定した。
【０２３４】
本願発明のいくつかの実施形態において、選ばれたＭＴＰの複数のタンデムコピーを使用することが有用であり得る。二重または多重標的化ペプチドのコード配列は、既存のＭＴＰから遺伝子工学によって得てもよい。ＭＴＰの量は、細胞分留によって計測でき、その後に、例えば、定量的なイムノブロット分析が続いた。よって、本発明では、用語「ミトコンドリア標的化ペプチド」または「ＭＴＰ」は、標的Ｎｉｆタンパク質をミトコンドリアに向けるあるアミノ酸ペプチドの１もしくは複数のコピーを包含する。好ましい実施形態において、ＭＴＰは、選ばれたＭＴＰの２コピーを含む。別の実施形態において、ＭＴＰは、選ばれたＭＴＰの３コピーを含む。別の実施形態において、ＭＴＰは、選ばれたＭＴＰの４コピー以上を含む。
【０２３５】
当業者は、ＭＴＰ配列は、天然ＭＴＰ配列に限定されないが、天然のＭＴＰに対するアミノ酸の置換、欠失および／または挿入を含んでもよいが、ただし、その配列変異体がミトコンドリア標的化のために依然として機能することを条件とすることを認識する。
【０２３６】
当業者は、ＭＴＰが、クローニングストラテジーの結果としてそのＮまたはＣ末端にてアミノ酸が両側に配置されてもよく、かつ、リンカーとして機能し得ることを理解する。これらの追加アミノ酸は、ＭＴＰの一部を形成すると見なされ得る。
【０２３７】
当業者はまた、ＭＴＰが、オリゴペプチドリンカーおよび／または、例えば、エピトープタグなどのタグにＮまたはＣ末端で融合されてもよいことを理解する。好ましい実施形態において、植物細胞において産生される、本発明のＮｉｆ融合ポリペプチドの１もしくは複数、またはすべてが、対応する野生型Ｎｉｆポリペプチドに対して追加のエピトープタグを欠いている。
【０２３８】
リンカー
ポリペプチドとの関連において本明細書中に使用される場合、用語「リンカー」または「オリゴペプチドリンカー」は、２以上の機能ドメイン、例えば、ＭＴＰとＮＰ、２つのＮＰ、ＮＰとタグを共有結合で結合する１もしくは複数アミノ酸を意味する。アミノ酸は、リンカー内およびリンカーと機能ドメインの間の両方で、ペプチド結合を通して共有結合で結合される。リンカーは、２以上のドメインの機能に対して実質的な有害効果を引き起こすことなく、もう片方に関して一方の機能ドメインの運動の自由度のために提供され得る。リンカーは、機能ドメインの一方または両方の適切な折り畳みおよび機能の促進を助け得る。当業者は、リンカーのサイズが、経験的に決定できるか、またはタンパク質折り畳み情報に基づいてモデル化できることを理解する。
【０２３９】
リンカーは、例えばＭＰＰなどのプロテアーゼの切断部位を含んでもよい。斯かるリンカーはまた、ＭＴＰの一部であると見なされることもできる。
【０２４０】
当業者は、ＭＴＰのＣ末端が、リンカーなしで、または、１もしくは複数アミノ酸残基、例えば１〜５アミノ酸残基のリンカーを介してＮＰのＮ末端アミノ酸に翻訳的に融合されることを認識する。斯かるリンカーはまた、ＭＴＰの一部であると見なされることもできる。
【０２４１】
実施形態において、リンカーは、少なくとも１アミノ酸、少なくとも２アミノ酸、少なくとも３アミノ酸、少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１２アミノ酸、少なくとも１４アミノ酸、少なくとも１６アミノ酸、少なくとも１８アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸、少なくとも３０アミノ酸、少なくとも３５アミノ酸、少なくとも４０アミノ酸、最少の４５アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも６０アミノ酸、少なくとも７０アミノ酸、少なくとも８０アミノ酸、少なくとも９０アミノ酸、または約１００アミノ酸を含む。実施形態において、リンカーの最大サイズは、１００アミノ酸、好ましくは６０アミノ酸、より好ましくは４０アミノ酸である。
【０２４２】
いくつかの実施形態において、リンカーは、融合ポリペプチドの安定性を増強するために、もう片方に対して一方の機能ドメインの動きを可能にする。所望される場合、リンカーは：ポリグリシンの反復またはグリシン、プロリンおよびアラニン残基の組み合わせ、を包含する。２つのＮｉｆポリペプチドを結合するためのリンカー、例えば、ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫおよびＮｉｆＥ−リンカー−ＮｉｆＮは、いくつかの基準に基づいて、リンカー内のアミノ酸の数および配列に関して選択されるのが好ましい。これらは、以下の：望ましくないジスルフィド連結の形成を避けるためのシステイン残基の欠如、望ましくない表面塩架橋相互作用の可能性の低減のためのわずかな荷電残基（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、好ましくは荷電残基の不存在、斯かる残基がポリペプチドの表面に浸潤する傾向を促進し得る場合、わずかな疎水性残基（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）、または疎水性残基の不存在、ならびに翻訳後修飾され得るアミノ酸の欠如である。
【０２４３】
これに関連して、「わずかな荷電残基」とは、リンカー内のアミノ酸残基の１０％未満を意味し、および「わずかな疎水性残基」とは、リンカー内のアミノ酸残基の１５％未満を意味する。
ある実施形態において、リンカーは、システイン残基を含まない。
ある実施形態において、リンカーは、４、３、２、もしくは１つの荷電残基を含むか、または荷電残基を含まない。好ましくは、リンカーは、グルタミン酸、アスパラギン酸、アルギニン、およびリジン残基を合計で、４、３、２、もしくは１つ含むか、またはそれらを含まない。
【０２４４】
ある実施形態において、リンカーは、４、３、２、もしくは１つの疎水性残基を含むか、または疎水性残基を含まない。好ましくは、リンカーは、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン、メチオニン、バリン、イソロイシン、およびロイシン残基を合計で、４、３、２、もしくは１つ含むか、またはそれらを含まない。
ある実施形態において、リンカーの少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％が、トレオニン、セリン、グリシンおよびアラニンから選択される残基を含む。ポリペプチドを修飾する際のオリゴペプチドリンカーの使用は、Chen et al., (2013)およびZhang et al., (2009)で概説されている。
【０２４５】
タグ
特定の実施形態において、融合ポリペプチドは、融合ポリペプチドまたはそのプロセシングされた産物の検出または精製に適当な少なくとも１つのタグを含む。タグは、典型的に融合ポリペプチドのＣ末端またはＮ末端ドメインに結合される。好ましい実施形態において、タグは、ＮｉｆポリペプチドのＣ末端に結合される。タグは、一般的に、高親和性を有する、１もしくは複数のリガンド、例えば、クロマトグラフィー支持体もしくはビーズ、または抗体などのアフィニティーマトリックスの１もしくは複数のリガンドに結合することができるペプチドまたはアミノ酸配列である。当業者は、タグが、ミトコンドリア内に取り込まれた後に、ＭＴＰが切り落とされた時点で、ＮＰからのタグの除去をもたらさない位置の融合タンパク質内に好ましくは配置されることを理解する。さらに、タグは、ミトコンドリア取り込み機構を妨げてはならない。好ましい実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、Ｎ末端ＭＴＰ、Ｎｉｆポリペプチドおよび検出／精製タグを含む融合ポリペプチドをコードする。代替の実施形態において、融合ポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端の順に、Ｎ末端ＭＴＰ、検出／精製タグおよびＮｉｆポリペプチドを含む。
【０２４６】
融合ポリペプチドまたはそのプロセシングされた産物を検出、単離または精製するために有用なタグの追加的な説明に役立つ、制限されることのない例としては、ヒトインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）タグ、例えば６または８個のヒスチジン残基を含むヒスチジンタグ、蛍光タグ、例えばフルオレセイン、レゾルフィン（resourfin）およびその誘導体など、Ａｒｇタグ、ＦＬＡＧタグ、Ｓｔｒｅｐタグ、抗体によって認識可能なエピトープ、例えばｃ−ｍｙｃタグ（抗ｃ−ｍｙｃ抗体によって認識される）など、ＳＢＰタグ、Ｓタグ、カルモジュリン結合ペプチド、セルロース結合ドメイン、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼタグ、マルトース結合タンパク質、ＮｕｓＡ、ＴｒｘＡ、ＤｓｂＡ、Ａｖｉタグなど、が挙げられる。
【０２４７】
Ｎｉｆポリペプチドに関与する翻訳融合
翻訳融合を、科学文献で報告されているように、いくつかのＮｉｆポリペプチドに対しておこなった。これらは、表２およびBuren and Rubio, (2018)による総説にまとめられている。それらの大部分は、検出と精製目的のために、タンパク質へのエピトープまたは結合ドメイン、例えばヒスチジンタグまたはＳｔｒｅｐタグなど、の人工的な付加を伴い、そして、ほんのいくつかが植物細胞内に発現された。細菌における、Ｎｉｆポリペプチド間の天然の融合に関していくつかの報告が存在する。細菌宿主におけるアッセイのために、異なる長さ（７〜１０ヒスチジン）のＨｉｓタグが、ＮｉｆＤ（クリスチャンソンら、１９９８）、ＮｉｆＥ（グッドウィンら、１９９８）、ＮｉｆＭ（Ｇａｖｉｎｉら、２００６）、ならびに完全長および切断型バージョンの両方のＮｉｆＢ（妖精ら、２０１５）に追加された。各ケースにおいて、Ｎｉｆ機能は、細菌またはインビトロにおけるニトロゲナーゼ再構成アッセイで実証されたように、修飾Ｎｉｆポリペプチドに保持されていた。
【０２４８】
Thiel et al., (1995)は、ラン藻アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）のＮｉｆＥおよびＮｉｆＮ遺伝子の間の遺伝子間領域における、２９ヌクレオチドの天然の欠失とそれによる、９アミノ酸およびＮｉｆＥ終止コドンの欠失を同定した。欠失は、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＮポリペプチドのニトロゲナーゼ機能の少なくともいくつかを保有したＮｉｆＥ−ＮｉｆＮポリペプチド融合をもたらした。ＮｉｆＥ−ＮｉｆＮ融合ポリペプチドはまた、融合接合部の領域に他の１９アミノ酸の置換を有し、そしてそれは、未知の形であるが、Ｎｉｆ機能に影響を及ぼすであろう。融合遺伝子は発現されるが、絶対嫌気性条件下だけであった。非融合遺伝子に対して活性の低減があるかどうかは、報告されなかった。
【０２４９】
Suh et al., (1996)は、ｐＢＧ１４０４と表されるベクターを形成する、ＮｉｆＤの終止コドンおよびＮｉｆＫの翻訳開始コドン（ＡＴＧ）を含む欠失によって、Ａ．ビネランジーの染色体のＮｉｆＤおよびＮｉｆＫ遺伝子との間で人工的な接合部を作製した。欠失は、ＮｉｆＫポリペプチドのアミノ酸２〜１０において、正味３つのアミノ酸の欠失および７つのアミノ酸置換をもたらした。ｐＢＧ１４０４を含有するＡ．ビネランジー宿主細胞は、対応する野生型細菌に対して、低窒素培地中でのそれらの増殖が弱められた。
【０２５０】
Wiig at al (2011)は、クロストリジウム・パスツリアヌム（Clostridium pastuerianum）で見られるＮｉｆＮおよびＮｉｆＢ遺伝子との間の天然の翻訳融合を使用し、そして、それは、細菌および生化学的補完性アッセイにおいて、ＮｉｆＮおよびＮｉｆＢ活性に関して機能的であることを測定した。この融合は、いずれのペプチドリンカーなしに直接的であった、すなわち、ＮｉｆＮのＣ末端が、ＮｉｆＢのＮ末端に直接共有結合で連結された。
【０２５１】
酵母および植物細胞内では、翻訳融合は、核にコードされたタンパク質をミトコンドリアマトリックスに移動させるために使用された。酵母発現アッセイでは、ミトコンドリア標的化ペプチドといくつかのＮｉｆポリペプチド（ＮｉｆＨ、ＮｉｆＭ、ＮｉｆＳおよびＮｉｆＵ）との翻訳融合（ＭＴＰ）が、好気性条件下で増殖するときに機能的になることが示された（Lopez-Torrejon et al., 2016）。これらの融合は、酵母細胞質内への局所化が意図され、かつ、該酵母が嫌気条件下で育ったときにだけ機能的であったが、エピトープ融合（ＦＬＡＧとＨＩＳ）はまた、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＭ、ＮｉｆＳおよびＮｉｆＵに融合されたときに、機能的になることも示された。Buren et al., (2017)は、ＮｉｆＢの可溶性変異体のミトコンドリアマトリックス標的化バージョンが、酵母のミトコンドリアから再単離されたときに、インビトロ補完性アッセイにおいて、機能的であることを示した。このバージョンのＮｉｆＢは、Ｎ末端ＭＴＰ、ＮｉｆＢの切断変異体（ＮｉｆＸ様ドメインなし）およびＣ末端１０×Ｈｉｓエピトープタグを包含する。多数のＭＴＰ−Ｎｉｆ融合もまた、酵母発現アッセイにおいて作り出された。しかしながら、同時発現タンパク質のこの大規模な集団は、酵母において活性を示さなかった（Buren et al., 2017）。
【０２５２】
ＣＰＮ−６０遺伝子からのＭＴＰは、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＭ、ＮｉｆＳおよびＮｉｆＵのＮ末端に融合され、そして、ＦｅＰｒｏｔｅｉｎが１０％酸素での低酸素分圧下で栽培された植物から再単離されたときに、インビトロ補完性アッセイによって機能的であることが示された（ＵＳ２０１６／０３０４８４２）。
【０２５３】
表２．文献で報告されたＮｉｆポリペプチドの遺伝子融合の概要
【表２】
2020510413.tif 000003
【０２５４】
ポリヌクレオチド
「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、本明細書中で互換的に使用される。それらは、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を意味する。本明細書中に規定したポリヌクレオチドは、その起源または操作によって：（１）天然に関連しているポリヌクレオチドのすべてもしくは一部分に関連していないか、（例えば、天然プロモーターコード配列を含まないＮｉｆポリヌクレオチド）、（２）天然に連結するもの以外のポリヌクレオチドに連結するか（例えば、ＭＴＰコードヌクレオチド配列および／または非天然のプロモーターコード配列に連結されたＮｉｆポリヌクレオチド）、または（３）天然に生じない（例えば、本発明のＭＴＰ−Ｎｉｆ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）、ゲノム、ｃＤＮＡ、半合成、または合成起源の、一本鎖、好ましくは二本鎖のものであり得る。以下は、ポリヌクレオチドの非限定例である：遺伝子もしくは遺伝子断片のコードもしくは非コード領域、連鎖解析から規定された遺伝子座（複数を含む）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、任意の配列のキメラＤＮＡ、核酸プローブ、およびプライマー。ポリヌクレオチドは、例えばメチル化ヌクレオチドやヌクレオチド似体などの修飾ヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合には、ヌクレオチド構造に対する修飾は、高分子の集合前または後に付与されてもよい。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分との複合体形成などの重合後にさらに修飾されてもよい。
【０２５５】
「単離されたポリヌクレオチド」は通常、ポリヌクレオチドと連結または結合している成分（例えば、調節配列）を実質的に含まない。よって、単離されたポリヌクレオチドは、遺伝子組み換え技術によって製造されたときには、他の細胞物質、または培地を実質的に含まず、あるいは、化学的に合成されたときには、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。好ましくは、単離されたポリヌクレオチドは、前記の成分を少なくとも６０％含まず、より好ましくは少なくとも７５％含まず、およびより好ましくは少なくとも９０％含まない。
【０２５６】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、その最も広い文脈で解釈されるものとし、構造遺伝子の転写領域および、翻訳される場合、タンパク質コード領域を含み、いずれの末端においても少なくとも約２ｋｂの距離にわたる５’および３’両末端上のコード領域に隣接して位置し、遺伝子の発現に関与する配列を含むデオキシリボヌクレオチド配列を含む。この点に関して、遺伝子は、所定の遺伝子と天然に関連するプロモーター、エンハンサー、翻訳および転写終止、および／またはポリアデニル化シグナル等の制御シグナルを含むか、または異種制御シグナルを含み、その場合、遺伝子は、「キメラ遺伝子」と呼ばれる。タンパク質コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と呼ばれる。タンパク質コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語は、ｃＤＮＡ形態およびゲノム形態の両方の遺伝子を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」、「介在領域」、または「介在配列」と呼ばれる非コード配列で中断され得るコード領域を含む。イントロンは、核ＲＮＡ（ｎＲＮＡ）中に転写される遺伝子のセグメントである。イントロンは、エンハンサー等の調節要素を含むことができる。イントロンは、核内または一次転写生成物から除去または「スプライス」され、したがって、イントロンは、ｍＲＮＡ転写生成物中に存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳中、新生ポリペプチド中におけるアミノ酸の配列または順序を特定するように機能する。「遺伝子」という用語は、本明細書に記載される本発明のタンパク質のすべてまたは一部をコードする合成または融合分子および上記のいずれか１つに対して補完的なヌクレオチド配列を含む。
【０２５７】
本明細書中に使用される場合、「キメラＤＮＡ」はまた、本明細書中では「ＤＮＡ構築物」とも呼ばれ、天然には自然に見られないが、２つのＤＮＡ部分を単一分子に人工的に結合し、そしてその各部分は天然に見られるが、その全体は天然に見られない、任意のＤＮＡ分子を意味する。例えば、ＤＮＡ構築物は、本発明のＭＴＰ−Ｎｉｆ融合ポリペプチドをコードする。典型的には、キメラＤＮＡは、実際には天然には一緒に見出されることのない調節および転写またはタンパク質コード配列を含む（例えば、非天然のプロモーターコード配列に連結したＮｉｆポリヌクレオチド）。したがって、キメラＤＮＡは、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来するが、実際に見出されるものとは異なる方法で配置される調節配列およびコード配列を含むことができる。オープンリーディングフレームは、その天然の上流および下流調節要素に連結されても、連結されなくてもよい。オープンリーディングフレームは、例えば、それが天然には見出されない植物ゲノム中に、または細菌プラスミドまたはウイルスベクター等のそれが天然には見出されないレプリコンまたはベクター中に取り込まれ得る。「キメラＤＮＡ」という用語は、宿主中で複製可能であるＤＮＡ分子に限定されないが、例えば、特定のアダプター配列により、レプリコン中に連結することができるＤＮＡを含む。
【０２５８】
「導入遺伝子」は、形質転換の手法によってゲノムに導入された遺伝子である。その用語は、その前駆細胞のゲノム内に導入していた子孫細胞、植物、種子、非ヒト生物体またはその部分の遺伝子を含む。斯かる子孫細胞などは、初代形質転換細胞であった前駆細胞からの少なくとも第３または第４世代の子孫であってもよい。子孫は、有性生殖または、例えば、ジャガイモの塊茎またはサトウキビの苗条からなどの栄養生殖によって産生されてもよい。「遺伝的に修飾された」という用語およびその変形は、形質転換または形質導入によって遺伝子を細胞に導入することと、細胞中の遺伝子を突然変異させることと、細胞中の遺伝子または上記のように修飾された任意の細胞の子孫の遺伝子の調節を遺伝的に改変または調整することとを含む上位概念である。
【０２５９】
本明細書で使用される「ゲノム領域」は、導入遺伝子または導入遺伝子の群（本明細書では、クラスターとも呼ばれる）が、細胞またはその祖先に挿入される。斯かる領域は、例えば、本明細書中に記載した方法のように、ヒトの介入によって取り込まれたヌクレオチドを含むだけである。
【０２６０】
本発明の「組み換えポリヌクレオチド」は、人工的な組み換え方法によって構築または修飾された核酸分子を指す。組み換えポリヌクレオチドは、その天然状態と比較して、改変された量で細胞中に存在し得るか、または改変された速度で発現され得る（例えば、ｍＲＮＡの場合）。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドを天然に含まない細胞に導入される。典型的には、外因性ＤＮＡは、ｍＲＮＡの転写のための鋳型として使用され、形質転換された細胞内で本発明のポリペプチドをコードするアミノ酸残基の連続する配列に翻訳される。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、細菌細胞に対して内因性であり、その発現は、組み換え手段によって改変され、例えば、外因性制御配列が、着目の内因性遺伝子の上流に導入されて、形質転換された細胞が遺伝子によってコードされたポリペプチドを発現することを可能にする。
【０２６１】
本発明の組み換えポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが存在する細胞ベースのまたは無細胞発現系の他の成分から分離されていないポリヌクレオチドと、この細胞ベースのまたは無細胞発現系において生成され、その後、少なくとも他のいくつかの成分から精製されるポリヌクレオチドとを含む。ポリヌクレオチドは、天然に存在する隣接する一続きのヌクレオチド（例えば、Ｎｉｆポリヌクレオチド）であり得るか、または単一のポリヌクレオチドを形成するように接合した異なる起源（天然および／または合成）に由来する２つ以上の隣接する一続きのヌクレオチド（例えば、ＭＴＰをコードするヌクレオチド配列および／または非天然のプロモーターをコードする配列に連結されたＮｉｆポリヌクレオチド）を含むことができる。典型的には、そのようなキメラポリヌクレオチドは、対象となる細胞中のオープンリーディングフレームの転写を活発にするのに適しているプロモーターに作動可能に連結される本発明のポリペプチドをコードする少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む。
【０２６２】
規定されたポリヌクレオチドに関して、上に提供されたものよりも高い同一性％の数値が好ましい実施形態を包含することを理解されるであろう。したがって、適用できる場合、最小の同一性％の数値を考慮すると、ポリヌクレオチドは、関連する指定された配列番号と少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、より好ましくは少なくとも９９．１％、より好ましくは少なくとも９９．２％、より好ましくは少なくとも９９．３％、より好ましくは少なくとも９９．４％、より好ましくは少なくとも９９．５％、より好ましくは少なくとも９９．６％、より好ましくは少なくとも９９．７％、より好ましくは少なくとも９９．８％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．９％同一であるポリヌクレオチド配列を含むことが好ましい。
【０２６３】
本発明の、または本発明に有用なポリヌクレオチドは、ストリンジェントな条件下で、本明細書に規定されるポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズされ得る。本明細書で使用されるストリンジェントな条件とは、（１）ハイブリダイゼーション中に、ホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃で、０．１％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミン、０．１％のＦｉｃｏｌｌ、０．１％のポリビニルピロリドン、７５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドを用いること、または（２）０．２×ＳＳＣおよび０．１％のＳＤＳ中、４２℃で、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストランを用いること、および／または（３）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、５０℃で、０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のＳＤＳを用いること、である。
【０２６４】
本発明のポリヌクレオチドは、天然の分子と比較する場合、ヌクレオチド残基の欠失、挿入、または置換である１つ以上の突然変異を有し得る。参照配列と比較して突然変異を有するポリヌクレオチドは、天然に存在し得る（つまり、天然源から単離され得る）か、または（例えば、上述のように、核酸上の部位特異的変異誘発もしくはＤＮＡシャフリングを行うことによって）合成であり得る。
【０２６５】
本発明のポリヌクレオチドは、植物細胞内での発現のためにコドン修飾されてもよい。当業者は、タンパク質コード領域が、例えば、窒素固定細菌の天然のポリヌクレオチドのコード領域に対して最適化されたコドンであってもよいことを理解する。
【０２６６】
核酸構築物
本発明は、１もしくは複数の本発明のポリヌクレオチドを含む核酸構築物、ならびにこれらを含むベクターおよび宿主細胞、それらの製造および使用の方法、そしてその使用を含む。本発明は、作動可能に接続または連結される要素を指す。「作動可能に接続された」または「作動可能に連結された」などは、機能的な関係性でのポリヌクレオチド要素の連結を指す。典型的には、作動可能に接続された核酸配列は、隣接して連結され、２つのタンパク質コード領域を結合する必要がある場合には、隣接し、そして、読み枠内にある。ＲＮＡポリメラーゼが２つのコード配列を単一のＲＮＡに転写するとき、コード配列は、別のコード配列に「作動可能に接続され」、そしてそれは、転写される場合、その後、両方のコード配列に由来するアミノ酸を有する単一ペプチドに転写される。発現配列が所望のタンパク質を産生するように最終的にプロセシングされる限り、コード配列は互いに隣接している必要はない。
【０２６７】
本明細書中に使用される場合、「ｃｉｓ作用配列」、「ｃｉｓ作用エレメント」、または「ｃｉｓ調節領域」もしくは「調節領域」という用語、あるいは類似用語は、ヌクレオチドの任意の配列を意味するものであり、そしてそれは、発現可能な遺伝子配列に対して適切に配置および接続されるとき、少なくとも部分的に、遺伝子配列の発現を調整できる。当業者は、ｃｉｓ調節領域が、転写もしくは転写後レベルで遺伝子配列の発現レベル、および／または細胞型特異性および／または成長特異性を活性化、サイレンシング、促進、抑制または他のやり方で変更することを認識している。本発明の好ましい実施形態において、ｃｉｓ作用配列は、発現できる遺伝子配列の発現を促進または刺激するアクチベーター配列である。
【０２６８】
転写可能ポリヌクレオチドにプロモーターまたはエンハンサ要素を「作動可能に接続する」とは、プロモーターの制御調節下に転写可能ポリヌクレオチド（例えば、タンパク質コードポリヌクレオチドまたは他の転写産物）を配置することを意味し、そしてそれは、その後、そのポリヌクレオチドの転写を制御する。異種プロモーター／構造遺伝子組み合わせの構造では、プロモーターまたはその変異体を、プロモーターとタンパク質コード領域との間の距離とほとんど同じである、転写可能ポリヌクレオチドの転写開始部位から離れて配置することが一般的に好ましく、それは、その天然の状況：すなわち、プロモーターがそれに由来する遺伝子、において制御する。当該技術分野で知られているように、この距離でのいくつかのバリエーションが、機能の喪失なしに対応できる。同様に、その制御下で配置されるべき転写可能ポリヌクレオチドに関する調節配列要素（例えば、オペレーター、エンハンサーなど）の好ましい位置は、その天然の状況における、すなわち、それが誘導される遺伝子における、該要素の配置によって規定される。
【０２６９】
本明細書中に使用される場合、「プロモーター」または「プロモーター配列」は、遺伝子の領域、一般的に、ＲＮＡコード領域の上流（５’）を指し、そしてそれは、着目の細胞において転写の開始およびレベルを制御する。「プロモーター」としては、例えばＴＡＴＡボックスやＣＣＡＡＴボックス配列などの、古典的なゲノム遺伝子の転写制御配列、ならびに発生および／または環境刺激に対応した、あるいは、組織特異的または細胞型特異的様式で遺伝子発現を変更する追加調節エレメント（すなわち、上流活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー）が挙げられる。プロモーターは通常、必須ではないが（例えば、一部のＰｏｌＩＩＩプロモーター）、構造遺伝子の上流に配置され、その発現をそれが調整している。さらに、プロモーターを含む調節エレメントは、通常、遺伝子の転写開始部位の２ｋｂ以内にに配置される。プロモーターは、細胞内での発現をさらに促進するために、および／またはそれが作動可能に接続される構造遺伝子の発現のタイミングまたは誘導能を変更するために、開始部位からより遠位に配置された、追加の特異的調節要素を含んでもよい。
【０２７０】
「構成的プロモーター」は、例えば、植物など、の生物体の多くまたはすべての組織で作動可能に連結された転写配列の発現を指示するプロモーターを指す。本明細書中に使用される場合、「構成的な」という用語は、必須ではないが、遺伝子がすべての細胞型において同じレベルで発現され、しかし、該遺伝子が幅広い細胞型において発現されるが、レベルのいくつかのバリエーションが検出可能であることも多いことを示す。「選択的発現」は、本明細書中に使用される場合、専ら、例えば、植物、の特定の器官、例えば、胚乳、胚、葉、果物、塊茎または根、における発現を指す。好ましい実施形態において、プロモーターは、植物、好ましくは穀物用植物、の根、葉および／または茎で選択的または優先的に発現される。そのため、選択的発現は、構成的発現とは対照的であり得、そしてそれは、植物によって経験される大部分またはすべての条件下での、該植物の多くのまたはすべての組織における発現を指す。
【０２７１】
選択的発現はまた、特定の植物組織、器官または生育段階の遺伝子発現産物の区画化をもたらし得る。例えば、色素体、サイトゾル、液胞、またはアポプラストスペースなどの特定の細胞内位置における区画化は、必要な細胞区画への移動のための、適切なシグナルの遺伝子産物、例えば、シグナルペプチド、の構造内への組み込みによって、または半自律性オルガネラ（色素体およびミトコンドリア）の場合には、直接的なオルガネラゲノム内への適切な調節配列を伴った導入遺伝子の封入によって、達成されてもよい。
【０２７２】
「組織特異的プロモーター」または「器官特異的プロモーター」は、例えば、植物において、他の多くの組織または器官、好ましくは、すべてでない場合には、大部分の他の組織または器官、に対して、ある組織または器官で優先的に発現されるプロモーターである。典型的には、プロモーターは、他の組織または器官より特定の組織または器官において、１０倍高いレベルにて発現される。
【０２７３】
ある実施形態において、プロモーターは、茎特異的プロモーター、葉特異的プロモーターまたは植物の気中部分（少なくとも茎と葉）における遺伝子発現を指示するプロモーター（緑色組織特異的プロモーター）、例えば、リブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼのオキシゲナーゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）プロモーターなどである。
【０２７４】
茎特異的プロモーターの例としては、これだけに限定されるものではないが、ＵＳ５，６２５，１３６およびBam et al. (2008)に記載のものが挙げられる。
ある実施形態において、プロモーターは根特異的プロモーターであり、根特異的プロモーターの例としては、これだけに限定されるものではないが、キチナーゼ遺伝子の酸性プロモーターおよびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの特定のサブドメインが挙げられる。
【０２７５】
本発明によって企図されるプロモーターは、形質転換される宿主植物にとって天然のものであってもよく、またはその領域が宿主植物において機能的である場合には、代替の起源に由来してもよい。他の起源としては、アグロバクテリウム（Agrobacterium）Ｔ−ＤＮＡ遺伝子、例えば、ノパリン、オクタピン、マンノピンもしくは他のオピンプロモーターの生合成のための遺伝子のプロモーターなど、組織特異的プロモーター（例えば、ＵＳ５，４５９，２５２およびＷＯ９１／１３９９２を参照）；ウイルスからのプロモーター（宿主特異的ウイルスを含む）、または部分的または完全な合成プロモーター、が挙げられる。例えば、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター（ＣａＭＶ３５Ｓ、１９Ｓ）などの植物およびウイルスから単離された様々なプロモーターを含めた、単子葉および双子葉植物において機能的である多数のプロモーターが、当該技術分野で周知である（例えば、Greve, 1983; Salomon et al., 1984; Garfinkel et al., 1983; Barker et al., 1983を参照）。プロモーター活性を評価するための限定されない方法は、Medberry et al. (1992, 1993), Sambrook et al. (1989, supra)およびUS 5,164,316によって開示されている。
【０２７６】
これに代えてまたはこれに加えて、プロモーターは、例えば、植物において、適切な生育段階で、導入ポリヌクレオチドの発現を駆動できる、誘導プロモーターまたは生育に応じた制御プロモーターであってもよい。利用され得る他のｃｉｓ作用配列としては、転写および／または翻訳エンハンサが挙げられる。エンハンサー領域は、当業者にとって周知であり、ＡＴＧ翻訳開始コドンと隣接配列を含み得る。含まれているときには、開始コドンは、それが翻訳される場合には、全配列の翻訳を確実にするための外来または外因性ポリヌクレオチドに関連するコード配列の読み枠と同調していなければならない。翻訳開始領域は、転写開始領域の起源からか、または外来または外因性ポリヌクレオチドから提供されてもよい。その配列はまた、転写を駆動するために選択されたプロモーターの起源から得られてもよく、ｍＲＮＡの翻訳を増強するために、特異的に修飾され得る。
【０２７７】
本発明の核酸構築物は、転写終止配列を含み得る約５０〜１，０００ヌクレオチド塩基対の３’非翻訳配列を含んでもよい。３’非翻訳配列は、ポリアデニル化シグナルを含んでもよい転写終止シグナルとｍＲＮＡプロセシングに作用できるいかなる他の調節シグナルも含んでもよい。ポリアデニル化シグナルは、ｍＲＮＡ前駆体の３’末端へのポリアデニル酸経路の付加のために機能する。ポリアデニル化シグナルは、バリエーションは珍しくないが、標準形態５’ＡＡＴＡＡＡ−３’に対する相同性の存在によって一般的に認識される。ポリアデニル化シグナルを含まない転写終止配列としては、一連の４つ以上のチミジンを含むＰｏｌＩまたはＰｏｌＩＩＩ ＲＮＡポリメラーゼのターミネータが挙げられる。好適な３’非翻訳配列の例は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）のオクトピンシンターゼ（ｏｃｓ）遺伝子またはノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）遺伝子からのポリアデニル化シグナルを含む３’転写非翻訳領域である（Bevan et al., 1983）。好適な３’非翻訳配列はまた、当業者に既知の他の３’要素を用いることもできるが、例えばリブロース−１，５−二リン酸カルボキシラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝子などの植物遺伝子から誘導されてもよい。
【０２７８】
ＤＮＡ配列が転写開始部位とコード配列の始まりとの間に挿入される場合、すなわち、非翻訳５’リーダー配列（５’ＵＴＲ）は、それが翻訳ならびに転写される場合、遺伝子発現に影響を与える可能性があり、当業者はまた、特定のリーダー配列を利用することもできる。好適なリーダー配列としては、外来または内因性ＤＮＡ配列の最適な発現を指示するように選択された配列のものが挙げられる。例えば、斯かるリーダー配列としては、例えば、Joshi (1987)によって記載された、ｍＲＮＡ安定性を増強または維持し、かつ、翻訳の不適当な開始を予防し得る、好ましいコンセンサスが配列が挙げられる。
【０２７９】
ベクター
本発明は、遺伝子構築物の操作または移動のためのベクターの使用を含む。ベクターは、外来性遺伝子材料を；それが複製または発現され得る別の細胞内に人工的に輸送するために使用できる、核酸分子、好ましくはＤＮＡ分子である。外来ＤＮＡを含有するベクターは「遺伝子組み換えベクター」とも呼ばれる。ベクターの例としては、これだけに限定されるものではないが、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、染色体外因子、ミニクロモソーム、人工染色体が挙げられる。ベクターは、転置エレメントを含んでもよい。
【０２８０】
ベクターは、好ましくは二本鎖ＤＮＡであり、かつ、１もしくは複数の特有の制限部位を含み、そして、標的細胞もしくは組織またはその前駆細胞または組織を含んでいる規定の宿主細胞において自律複製が可能であっても、あるいは、クローン配列が再現できるように、規定の宿主のゲノム、好ましくは核ゲノム内への組み込みが可能であってもよい。したがって、ベクターは、自律増殖ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製から独立している、染色体外存在物として存在するベクター、例えば、直鎖もしくは閉環状プラスミド、染色体外因子、ミニクロモソームまたは人工染色体、であってもよい。ベクターは、自己複製を確実にする任意の手段を含んでもよい。あるいは、ベクターは、細胞内に導入されたときに、受容細胞のゲノム、好ましくは核ゲノム内に組み込まれ、そして、それが組み込まれた（単数もしくは複数の）染色体と一緒に複製されるものであってもよい。ベクターシステムは、単一のベクターもしくはプラスミド、２以上のベクターもしくはプラスミドを含んでもよく、そしてそれは、宿主細胞内に導入される全ＤＮＡ、またはトランスポゾンを一緒に含む。ベクターの選択は、典型的にそのベクターが導入される細胞とベクターとの適合性に依存する。ベクターはまた、例えば、抗生物質耐性遺伝子、除草剤耐性遺伝子または好適な形質転換体の選択に使用される他の遺伝子などの選択マーカーを含んでもよい。斯かる遺伝子の例は、当業者にとって周知である。
【０２８１】
本発明の核酸構築物は、例えばプラスミドなどのベクターに導入されてもよい。プラスミドベクターには典型的に、１つ以上のＴ−ＤＮＡ領域を含む、例えばｐＵＣ由来ベクター、ｐＳＫ由来ベクター、ｐＧＥＭ由来ベクター、ｐＳＰ由来ベクター、ｐＢＳ由来ベクターまたはバイナリーベクターといった、原核細胞および真核細胞における発現カセットの容易な選択、増幅および形質転換を提供する追加の核酸配列を含む。追加の核酸配列には、ベクターの自律複製を提供する複製開始点、好ましくは抗生物質または除草剤耐性をコードする選択マーカー遺伝子、核酸構築物にコードされる核酸配列または遺伝子を挿入するための複数の部位を提供する特有のマルチプルクローニング部位、および、原核および真核（特に植物）細胞の形質転換を強化する配列が含まれる。
【０２８２】
「マーカー遺伝子」は、マーカー遺伝子を発現する細胞に特有の表現型を分け与え、したがってそのような形質転換細胞がマーカーを有さない細胞から区別されることを可能にする遺伝子を意味する。選択マーカー遺伝子は、選択剤（例えば、除草剤、抗生物質、放射、熱または非形質転換細胞を傷つける他の処理）に対する耐性に基づいて「選択」できる特色を提供する。スクリーンマーカー遺伝子（またはレポーター遺伝子）は、観察または試験を通して、すなわち、「スクリーニング」する（例えば、非形質転換細胞には存在しないβ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰまたは他の酵素活性）ことで、同定できる特色を提供する。マーカー遺伝子および対象のヌクレオチド配列は結合していなくてもよい。
【０２８３】
形質転換体の識別を容易にするために、核酸構築物は、外来もしくは外因性ポリヌクレオチドとして、またはそれらに加えて、選択またはスクリーニングマーカー遺伝子を好ましくは含む。宿主細胞、好ましくは植物宿主細胞と組み合わせて機能的である（すなわち、選択的である）限り、マーカーの実際の選択は重要ではない。例えばＵＳ４，３９９，２１６に記載の非連鎖遺伝子の同時形質転換もまた、植物の形質転換において効率的な工程であるので、着目のマーカー遺伝子と外来または外因性ポリヌクレオチドは連結されている必要はない。
【０２８４】
細菌選択マーカーの例には、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールまたはテトラサイクリン耐性、好ましくはカナマイシン耐性といった抗生物質耐性を与えるマーカーが挙げられる。植物形質転換体の選択のための例示的選択マーカーには、ハイグロマイシンＢ耐性をコードするｈｙｇ遺伝子；カナマイシン、パロモマイシン、Ｇ４１８への耐性を与えるネオマイシンホスフォトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）遺伝子；例えばＥＰ２５６２２３に記載されるような除草剤由来のグルタチオンへの耐性を与えるラット肝臓のグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子；例えばＷＯ８７／０５３２７に記載されるようなホスフィノトリシンといったグルタミンシンテターゼインヒビターへの耐性を過剰発現の際に与えるグルタミンシンテターゼ遺伝子；例えばＥＰ２７５９５７に記載されるような選択剤ホスフィノトリシンへの耐性を与えるストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）由来のアセチルトランスフェラーゼ遺伝子；例えばHinchee et al. (1988)が説明するようなＮ−ホスホノメチルグリシンへの耐性を与える５−エノールシキメート−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）をコードする遺伝子；例えばＷＯ９１／０２０７１に記載されるビアラホスに対する耐性を与えるｂａｒ遺伝子；ブロモキシニルへの耐性を与える臭鼻菌由来のｂｘｎといったニトリラーゼ遺伝子（Stalker et al., 1988）；メトトレキセーへの耐性を与えるジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（Thillet et al., 1988）；イミダゾリノン、スルホニルウレアもしくは他のＡＬＳ阻害化学物質への耐性を与える突然変異体アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）（ＥＰ１５４，２０４）；５−メチルトリプトファンへの耐性を与える突然変異したアントラニル酸シンターゼ遺伝子；または除草剤への耐性を与えるダラポンデハロゲナーゼ遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【０２８５】
好ましいスクリーンマーカーには、様々な色素生産性基質が知られるβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）酵素をコードするｕｉｄＡ遺伝子；発色基質が知られる酵素をコードするβ−ガラクトシダーゼ遺伝子；カルシウム感受性生物発光検出に利用され得るエクオリン遺伝子（Prasher et al., 1985）；緑色蛍光タンパク質遺伝子（Niedz et al.、1995）またはその誘導体；生物発光検知を可能にするルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（Ow et al.、1986）、および、当該技術分野で知られる他のものが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「レポーター分子」は、タンパク質産物への参照によってプロモーターの決定を助長する分析的に同定可能なシグナルをその化学的性質で提供る分子を意味する。
【０２８６】
好ましくは、核酸構築物は、例えば植物、のゲノム内に安定に取り込まれる。したがって、核酸は、分子がゲノムに取り込まれることを可能にする適切な成分を含み、または、構築物は、植物細胞の染色体に組み込まれ得る適切なベクター内に配置される。
【０２８７】
本発明の一実施形態は、遺伝子組み換えベクターを含み、そしてそれは、本明細書中に規定した少なくとも１つのポリヌクレオチドを含み、かつ、宿主細胞内にポリヌクレオチドを送達することが可能である。斯かるベクターは、異種核酸配列、すなわち、天然では本発明の核酸分子に隣接して見られることはなく、そこから（単数もしくは複数の）核酸分子が誘導された種以外の種から好ましくは誘導される核酸配列、を含んでいる。ベクターは、ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり、原核生物または真核生物いずれかの、そして典型的に、ウイルスまたはプラスミドである。
【０２８８】
本発明の遺伝子組み換えベクターは、融合タンパク質として核酸分子の発現につながる融合配列を含む。
遺伝子組み換えベクターはまた、本明細書中に規定したポリヌクレオチドの核酸配列の周囲および／またはその中の介在および／または非翻訳配列を含んでもよい。
好ましくは、遺伝子組み換えベクターは、例えば植物細胞などの宿主細胞のゲノム内に安定して組み込まれる。したがって、遺伝子組み換えベクターは、ゲノム内にまたは細胞の染色体内にベクターを組み込むことを可能にする適切な要素を含んでもよい。
【０２８９】
組み換え細胞
本発明の別の実施形態は、組み換え細胞、例えば、組み換え植物細胞を含み、そしてそれは、１もしくは複数の本発明のポリヌクレオチド、構築物、またはベクターので形質転換された宿主細胞、またはその子孫細胞である。「組み換え細胞」という用語は、本明細書中では、「トランスジェニック細胞」という用語と互換的に使用される。
【０２９０】
細胞内への核酸分子の形質転換は、核酸分子が細胞内に挿入される任意の方法でも達成できる。形質転換技術としては、これだけに限定されるものではないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、吸着、およびプロトプラスト融合、が挙げられる。組み換え細胞は、単細胞性を維持していても、または組織、器官または多細胞生物中で増殖してもよい。本発明の形質転換核酸分子は、染色体外性を維持しても、または発現されるためのそれらの能力が保持される様式で、形質転換細胞の染色体中の１もしくは複数の部位に組み込まれてもよい。
【０２９１】
好ましい宿主細胞は、植物細胞であり、より好ましくは穀物用植物の細胞であり、より好ましくはオオムギもしくはコムギ細胞であり、またはより一層好ましくはコムギ細胞である。
【０２９２】
組み換え細胞は、培養細胞、インビトロもしくは、例えば、植物などの生物体中、または、例えば、根、葉もしくは茎などの器官中の細胞でそうであってもよい。好ましくは、細胞は、植物中、より好ましくは植物の根、葉、および／または茎中に存在する。
【０２９３】
ある実施形態において、植物細胞における活性ＮｉｆＤＫの発現は、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、そして任意選択で、ＮｉｆＵ、ＮｉｆＳ、ＮｉｆＯ、ＮｉｆＶ、ＮｉｆＹ、ＮｉｆＷ、および／またはＮｉｆＺの発現を必要とする。
【０２９４】
他の実施形態またはさらなる実施形態において、植物細胞における活性ＮｉｆＨの発現は、ＮｉｆＨおよびＮｉｆＭ、そして任意選択で、ＮｉｆＵおよび／またはＮｉｆＮの発現を必要とする。
【０２９５】
ある実施形態において、植物細胞におけるニトロゲナーゼ活性の再構成は、少なくともＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、およびＮｉｆＭの発現を必要とする。
【０２９６】
当業者は、Ｎｉｆタンパク質の小サブセットが、植物細胞内での機能的なニトロゲナーゼ再構成をもたらし得ることを理解する。本発明者らの知っている限り、いずれかの光合成生物へのニトロゲナーゼ遺伝子の移動に関する唯一の報告は、クラミドモナスの葉緑体ゲノムにおけるＮｉｆＨの導入を説明した（Cheng et al., 2005）。ＮｉｆＨは、ＮｉｆＨ生合成前駆タンパク質であるＮｉｆＭ、ＮｉｆＳおよびＮｉｆＵが同時発現されないという事実にもかかわらず、クロロフィル生合成変異体を補完することができた。これは、内因性真核同等物が、特定のＮｉｆタンパク質を機能的に置換し得ることを実証した。実際に最近の報告での、Ｅ．コリが、８つのＮｉｆタンパク質（ワングら、２０１３）だけを使用してニトロゲナーゼ機能を再構成できることを実証することは、植物における機能の達成が、Ｎｉｆタンパク質の完全な複合体を発現するほど複雑でない可能性があることを含意している。本発明者らはまだ、植物体におけるＮｉｆタンパク質の機能性を確立していないが、生合成および機能的Ｎｉｆタンパク質のレパートリーがニトロゲナーゼ機能を潜在的に支持する環境において発現できることは有望である。
【０２９７】
トランスジェニック植物
「植物」という用語は、本明細書中に名詞として使用される場合、植物全体を指し、かつ、あらゆる植物界のメンバーを指すが、形容詞として使用される場合、例えば、植物器官（例えば、葉、茎、根、花）、単細胞（例えば、花粉）、種子、植物細胞などの、植物中に存在する、植物に由来する、または植物に関係するあらゆる物質を指す。それから根および苗条が出現した小植物および発芽種子もまた、「植物」の意味に含まれる。「植物部位」という用語は、本明細書の用法では、植物から得られる、および植物のゲノムＤＮＡを含む、１つまたは複数の植物組織または器官を指す。植物部位としては、栄養構造体（例えば葉、茎）、根、花器官／構造体、種子（胚、子葉、および種皮をはじめとする）、植物組織（例えば維管束組織、粉砕組織など）、細胞およびその子孫が挙げられる。「植物細胞」という用語は、本明細書の用法では、植物から得られる、または植物中の細胞を指し、プロトプラストまたは植物に由来するその他の細胞、配偶子生成細胞、および植物全体に再生する細胞が挙げられる。植物細胞は、培養中の細胞であってもよい。「植物組織」とは、植物中のまたは植物（「外植片」）から得られる分化組織、または未熟または成熟胚、種子、根、苗条、果実、塊茎、花粉、例えばクラウンゴールなどの腫瘍組織、およびカルスなどの培養中の植物細胞の様々な集合形態に由来する、未分化組織を意味する。種子中のまたは種子からの代表的な植物組織は、子葉、胚および胚軸である。したがって、本発明には、植物、植物部分、およびこれらを含む産物が含まれる。
【０２９８】
本明細書中に使用される場合、「種子」という用語は植物の「成熟種子」を指し、そしてそれは、収穫の準備ができているか、または、例えば、典型的に田畑で商業的に収穫されるなど、植物から収穫されたかのいずれかであるか、あるいは、受精後、ならびに種子の休眠に達する前かつ収穫前に植物で生じる「生育中の種子」として存在する。
【０２９９】
「遺伝子組み換え植物」という用語は、本明細書中に使用される場合、同一の種、変種または栽培品種の野生型植物中には見られない核酸構築物を含有する植物を指す。すなわち、遺伝子組み換え植物（形質転換植物）は、形質転換前には含有しなかった遺伝物質（導入遺伝子）を含有する。導入遺伝子は、植物細胞、または別の植物細胞、または非植物原料、または合成配列から得られ、またはそれに由来する、遺伝子配列を含んでもよい。典型的に、導入遺伝子は、例えば形質転換などによって、人為的操作によって植物に導入されるが、当業者は認識するようにあらゆる方法を使用し得る。遺伝物質は、好ましくは安定して植物のゲノム、好ましくは核ゲノムに組み込まれる。導入遺伝物質は、同種の天然配列を含んでなってもよいが、それは例えばアンチセンス配列などの再配置された順序、または異なる配置である。このような配列を含有する植物は、本明細書において「遺伝子組み換え植物」に含まれる。
【０３００】
好ましい実施形態において、トランスジェニック植物は、それらの子孫が所望の表現型について分離しないように導入されたそれぞれおよびすべての遺伝子（導入遺伝子）についてホモ接合性である。トランスジェニック植物はまた、（単数もしくは複数の）導入された導入遺伝子についてヘテロ接合性、好ましくは、例えば、雑種種子から生育したＦ１子孫の場合などであってよい。斯かる植物は、当技術分野でよく知られている雑種強勢などの利点を提供することができる。
【０３０１】
本発明との関連において規定されるトランスジェニック植物は、遺伝子組み換え技術を使用して遺伝子を組み換えられたその植物の子孫を含み、ここで、該子孫は、着目の導入遺伝子を含む。斯かる子孫は、初代トランスジェニック植物の自家受精によって、または同じ種の別の植物と斯かる植物を交配することによって得てもよい。これは、一般的に、所望の植物または植物器官における、本明細書中に規定した少なくとも１つのタンパク質の産生を調節するためのものであろう。トランスジェニック植物部分としては、導入遺伝子を含む前記植物のすべての部分および細胞、例えば、培養組織、カルスおよびプロトプラストなどが挙げられる。
【０３０２】
トランスジェニック植物は、概ね、A. Slater et al., Plant Biotechnology - The Genetic Manipulation of Plants, Oxford University Press (2003), およびP. Christou and H. Klee, Handbook of Plant Biotechnology, John Wiley and Sons (2004)に記載されているものなどの当技術分野で知られている技術を用いて作製することができる。
【０３０３】
「非遺伝子組み換え植物」とは、組み換えＤＮＡ技術による遺伝物質導入によって遺伝子操作されていないものである。本明細書の用法では、「同質遺伝子植物と比較」という用語、または類似の語句は、ほとんどの特性において同一または同様であって、好ましくは遺伝子組み換え植物に対して同質遺伝子型または準同質遺伝子型であるが、対象導入遺伝子がない植物を指す。好ましくは、対応する非遺伝子組み換え植物は、対象遺伝子組み換え植物の祖先と同一栽培品種または変種であり、または構築物を欠いて「分離個体」と呼ばれることが多い同胞植物系統であり、または「空ベクター」構築物で形質転換された非遺伝子組み換え植物であってもよい、同一栽培品種または変種の植物である。「野生型」は、本明細書の用法では、本発明にしたがって改質されていない細胞、組織または植物を指す。野生型細胞、組織または植物を対照として使用して、本明細書に記載されるように改質された細胞、組織または植物について、外来性核酸の発現レベルまたは形質修飾の程度と性質を比較してもよい。
【０３０４】
本発明との関連において規定されるトランスジェニック植物は、遺伝子組み換え技術を使用して遺伝子を組み換えられたその植物の子孫を含み、ここで、該子孫は、着目の導入遺伝子を含む。斯かる子孫は、初代トランスジェニック植物の自家受精によって、または同じ種の別の植物と斯かる植物を交配することによって得てもよい。トランスジェニック植物部分としては、導入遺伝子を含む前記植物のすべての部分および細胞、例えば、培養組織、カルスおよびプロトプラストなどが挙げられる。
【０３０５】
本発明の実践において使用するために企図された植物には、単子葉植物および双子葉植物の両方が含まれる。標的植物には以下が含まれるが、これらに限定されない：穀物（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、オートムギ、コメ、トウモロコシ、モロコシ、および関連作物）；ブドウ；ビート（テンサイ、飼料ビート）；梨果、核果、小果実（soft fruit）（リンゴ、ナシ、プラム、モモ、アーモンド、サクランボ、イチゴ、ラズベリー、ブラックベリー）；マメ科植物（マメ、レンズマメ、エンドウマメ、ダイズ）；油脂植物（セイヨウアブラナもしくは他のアブラナ属（Brassicas）、カラシナ、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ベニバナ、麻、ココナッツ、トウゴマ、カカオマメ、アメリカホドイモ）；キュウリ植物（cucumber plant）（ペポカボチャ、キュウリ、メロン）；繊維植物（綿、アマ、アサ、ジュート）；柑橘類（オレンジ、レモン、グレープフルーツ、マンダリン）；野菜（ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ、ニンジン、タマネギ、トマト、ジャガイモ、パプリカ）；クスノキ科（アボカド、シナモン、カンフル）；またはトウモロコシ、タバコ、ナッツ、コーヒー、サトウキビ、茶、ブドウ、ホップ、芝生、バナナおよび天然ゴム植物などの植物、ならびに観賞植物（花、灌木、広葉樹およびコニファーなどの常緑樹）。好ましくは、植物は、穀物用植物、より好ましくはコムギ、コメ、トウモロコシ、トリティカーレ、オートムギまたはオオムギ、より一層好ましくはコムギである。
【０３０６】
本明細書の用法では、「コムギ」という用語は、その祖先、ならびにその他の種との交雑によって生じるその子孫をはじめとする、コムギ属（Triticum）のあらゆる種を指す。コムギには、４２本の染色体からなるＡＡＢＢＤＤのゲノム構成を有する「六倍体コムギ」、および２８本の染色体からなるＡＡＢＢのゲノム構成を有する「四倍体コムギ」が含まれる。六倍体コムギとしては、コムギ（T.aestivum）、スペルトコムギ（T.spelta）、マカコムギ（T.macha）、密穂コムギ（T.compactum）、インド矮性コムギ（T.sphaerococcum）、バビロビコムギ（T.vavilovii）、およびそれらの種間交雑が挙げられる。六倍体コムギの好ましい種は、Ｔ．アエスティバム亜種アエスティバム（T. aestivum ssp. aestivum）（「ブレッドウィート」とも呼ばれる）である。四倍体コムギとしては、デュラムコムギ（T.durum）（本明細書中ではデュラムコムギ（durum wheat）またはリベットコムギ・デュラム亜種（Triticum turgidum ssp. durum）とも呼ばれる）、Ｔ．ジコッコイデス（T.dicoccoides）、エンマーコムギ（T.dicoccum）、ポーランドコムギ（T.polonicum）、およびそれらの種間交雑が挙げられる。これに加えて、「コムギ」という用語は、Ａゲノムではウラルツコムギ（T.urartu）（T.uartu）、ヒトツブコムギ（T.monococcum）または野生型ヒトツブコムギ（T.boeoticum）、Ｂゲノムではクサビコムギ（Aegilops speltoides）、Ｄゲノムではタルホコムギ（T.tauschii）（Aegilops squarrosaまたはAegilops tauschiiとしてもまた知られている）などの六倍体または四倍体コムギ種の予測される祖先を含む。特に好ましい前駆細胞は、Ａゲノムのものであり、より一層好ましくは、Ａゲノム前駆細胞がヒトツブコムギ（T.monococcum）である。本発明で使用するためのコムギ栽培品種は、上に列挙した種のいずれかに属してもよいが、これに限定されるものではない。ライムギ（Secale cereale）などのライコムギ（Triticale）をはじめとするが、これに限定されるものではない非コムギ種との有性交雑中で、親としてコムギ種を使用して、従来技術によって生成される植物もまた包含される。
【０３０７】
本明細書の用法では、「オオムギ」という用語は、その祖先、ならびにその他の種との交雑によって生じるその子孫をはじめとする、オオムギ属（Hordeum）のあらゆる種を指す。植物は、例えばオオムギ（Hordeum vulgare）の株または栽培品種または変種などの商業的に栽培されるオオムギ種であり、または穀物の商業生産に適することが好ましい。
【０３０８】
細胞へ遺伝子を直接送達する４つの一般的な方法は、既に記載されている：（１）化学的方法（Graham et al., 1973）；（２）物理的方法、例えばマイクロインジェクション（Capecchi, 1980）、エレクトロポレーション（例えば、ＷＯ８７／０６６１４、ＵＳ５，４７２，８６９、同第５，３８４，２５３、ＷＯ９２／０９６９６およびＷＯ９３／２１３３５参照）、および遺伝子銃（例えば、ＵＳ４，９４５，０５０およびＵＳ５，１４１，１３１参照）など；（３）ウイルスベクター（Clapp, 1993; Lu et al., 1993; Eglitis et al., 1988）；および（４）受容体媒介メカニズム（Curiel et al., 1992; Wagner et al., 1992）。
【０３０９】
使用することのできる加速方法には、例えば、微粒子銃（microprojectile bombardment）などが含まれる。植物細胞に形質転換核酸分子を送達する方法の１つの例は、微粒子銃である。この方法は、Yang et al., Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, Oxford Press, Oxford, England (1994)により概説されている。非生物学的粒子（microprojectile）は核酸で被覆し、推進力により細胞に送達され得る。例示的な粒子には、タングステン、金、白金などからなるものが含まれる。単子葉植物を再現可能に形質転換する有効な手段であることに加え、微粒子銃の特定の利点は、プロトプラストの単離も、アグロバクテリウム感染の感受性も必要ない点である。本発明による使用に適切な粒子送達系は、Bio-Rad Laboratoriesから入手可能なヘリウム加速ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ銃である。照射（bombardment）のため、未熟胚または誘導標的細胞、例えば未熟胚からの胚盤またはカルスなど、を固体培養培地に配置してもよい。
【０３１０】
他の代わりの実施形態で、プラスミドを安定に形質転換することができる。高等植物におけるプラスミド形質転換について開示された方法には、選択マーカーを含有するＤＮＡの粒子銃送達、および相同な組み換えを介したプラスミドゲノムに対する該ＤＮＡの標的化が含まれる（ＵＳ５，４５１，５１３、ＵＳ５，５４５，８１８、ＵＳ５，８７７，４０２、ＵＳ５，９３２４７９、およびＷＯ９９／０５２６５）。
【０３１１】
アグロバクテリウム媒介導入（Agrobacterium-mediated transfer）は、植物細胞への遺伝子導入に幅広く適用可能な系である。なぜなら、ＤＮＡを植物組織全体に導入でき、これによりプロトプラストからインタクトな植物を再生する必要を回避できるためである。ＤＮＡを植物細胞に導入するためのベクターを組込んでいるアグロバクテリウムに媒介された植物の使用は、当技術分野でよく知られている（例えば、ＵＳ５，１７７，０１０、ＵＳ５，１０４，３１０、ＵＳ５，００４，８６３、ＵＳ５，１５９，１３５参照）。さらに、Ｔ−ＤＮＡの組み込みは、結果的に再配列（rearrangement）がほとんどない比較的正確な工程である。導入するＤＮＡ領域は境界配列により確定され、介在ＤＮＡは通常、植物ゲノムに挿入される。
【０３１２】
アグロバクテリウム形質転換ベクターは、大腸菌およびアグロバクテリウムで複製することができ、記載されたように簡便な操作を可能にする（Klee et al., Plant DNA Infectious Agents, Hohn and Schell, (editors), Springer-Verlag, New York, (1985): 179-203）。さらに、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入用ベクターにおける技術的進歩は、ベクターでの遺伝子および制限部位の配列を改善して遺伝子をコードする様々なポリペプチドを発現できるベクターの構築を容易にした。記載されたベクターは、遺伝子をコードする挿入ポリペプチドの直接発現のためのプロモーターおよびポリアデニル化部位に隣接された簡便なマルチリンカー領域を有し、本目的に適切である。さらに、病原性を有する（armed）および病原性の無い（disarmed）Ｔｉ遺伝子の両方を含有するアグロバクテリウムを、形質転換に使用することができる。アグロバクテリウム媒介形質転換が効果的であるような植物種では、これは、遺伝子導入の容易および明確な性質のため最適な方法である。
【０３１３】
アグロバクテリウム形質転換方法を用いて形成されたトランスジェニック植物は、典型的には１つ染色体に単一の遺伝子座を含有する。このようなトランスジェニック植物は、付加された遺伝子に対して半接合性であると言うことができる。付加された構造遺伝子に対してホモ接合性であるトランスジェニック植物、すなわち、２つの付加された遺伝子を含有し、１つの遺伝子が染色体対の各染色体において同じ座にあるトランスジェニック植物がより好ましい。ホモ接合性トランスジェニック植物は、単一の付加された遺伝子を含有する、独立した分離固体のトランスジェニック植物を有性交配（自殖）させ、産生されたいくつかの種子を発芽させ、得られた植物を目的遺伝子について分析することにより得ることができる。
【０３１４】
２つの異なるトランスジェニック植物は、２つの独立に分離する外因性遺伝子を含有する子孫を産生するために交配することもできることも理解されるべきである。適切な子孫の自殖は、両方の外因性遺伝子に対してホモ接合性である植物を産生するこができる。親植物の戻し交配および非トランスジェニック植物との異系交配も、栄養繁殖のように企図される。異なる特質および作物に一般に使用される他の繁殖方法の記載は、Fehr, Breeding Methods for Cultivar Development, J. Wilcox (editor) American Society of Agronomy, Madison Wis. (1987)に見出すことができる。
【０３１５】
植物プロトプラストの形質転換は、リン酸カルシウム沈降、ポリエチレングリコール処理、エレクトロポレーション、およびこれらの処理の組合せに基づく方法を用いて達成することができる。異なる植物種に対するこれらの系の適用は、プロトプラストからこの特定の植物株を再生する能力に依存する。プロトプラストから穀類を再生するための例示的な方法が記載されている（Fujimura et al., 1985; Toriyama et al., 1986; Abdullah et al., 1986）。
【０３１６】
細胞形質転換の他の方法も使用することができ、および花粉への直接ＤＮＡ導入、植物の生殖器官へのＤＮＡの直接導入、または未熟胚の細胞へのＤＮＡ直接注入とこれに続く乾燥胚の再水和による植物への直接ＤＮＡ導入が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１７】
単一の植物プロトプラスト形質転換体からまたは様々な形質転換外植片からの再生、発生、および栽培は、当技術分野でよく知られている（Weissbach et al., Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, San Diego, (1988)）。この再生および成長過程は、典型的には形質転換された細胞の選択ステップ、すなわち胚発達の通常の段階から根の付いた小植物段階を通じてこれらの個別化された細胞を培養することが含まれる。トランスジェニック胚および種子は、同様に再生される。得られた根の付いたトランスジェニック芽は、この後、土壌などの適切な植物成長培地に植えられる。
【０３１８】
外来外因性遺伝子を含有する植物の発生または再生は、当技術分野でよく知られている。好ましくは、再生植物は、ホモ接合性トランスジェニック植物を提供するため自家授粉される。さもなければ、再生植物から得られた花粉は、農学的に重要な系の種子増殖された植物に交配される。反対に、これらの重要な系の植物からの花粉は、再生植物を授粉するのに使用される。所望の外因性核酸を含有する本発明のトランスジェニック植物は、当業者によく知られた方法を用いて栽培される。
【０３１９】
主にアグロバクテリウム・ツメファシエンスの使用による双子葉植物を形質転換し、トランスジェニック植物を得る方法は、綿（ＵＳ５，００４，８６３、ＵＳ５，１５９，１３５、ＵＳ５，５１８，９０８）；ダイズ（ＵＳ５，５６９，８３４、ＵＳ５，４１６，０１１）；アブラナ属（ＵＳ５，４６３，１７４）；ピーナッツ（Cheng et al., 1996）；およびエンドウマメ（Grant et al., 1995）に関して公表されている。
【０３２０】
外因性核酸の導入により植物に遺伝的多様性を導入するための、コムギおよびオオムギなどの穀物植物の形質転換方法、ならびにプロトプラストまたは未熟植物胚からの植物の再生方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、ＣＡ２，０９２，５８８、ＡＵ６１７８１／９４、オーストラリア特許第６６７９３９、ＵＳ６，１００，４４７、ＷＯＰＣＴ／ＵＳ９７／１０６２１、ＵＳ５，５８９，６１７、ＵＳ６，５４１，２５７参照、および他の方法は、特許明細書ＷＯ９９／１４３１４に記載されている。好ましくは、トランスジェニックコムギまたはオオムギ植物は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換手順により産生される。所望の核酸構築物を保有するベクターは、組織培養植物または外植片、またはプロトプラストなどの適切な植物系の再生可能なコムギ細胞に導入することができる。再生可能なコムギ細胞は、好ましくは未熟胚の胚盤、成熟胚、これら由来のカルス、または分裂組織由来である。
【０３２１】
トランスジェニック細胞および植物中のトランス遺伝子の存在を確認するため、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅またはサザンブロット分析を、当業者に知られた方法を用いて実施することができる。トランス遺伝子発現産物は、産物の性質に応じて任意の種々の方法で検出することができ、およびウエスタンブロットおよび酵素アッセイを含む。タンパク質発現を定量し、異なる植物組織における複製を検出するのに、１つの特に有用な方法は、ＧＵＳなどのレポーター遺伝子を使用することである。ひとたびトランスジェニック植物が得られると、所望の表現型を有する植物組織または部分を産生するために育成することができる。植物組織または植物部分は収穫することができ、および／または種子は採取することができる。種子は、所望の特性を有する組織または部分を有する別の植物を育成するための供給源として役立ち得る。
【０３２２】
「ポリメラーゼ連鎖反応」（「ＰＣＲ」）は、「上流」および「下流」プライマーから成る「プライマーの対」または「プライマーのセット」、および重合の触媒、例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、典型的には、熱的に安定なポリメラーゼ酵素を使用して、標的ポリヌクレオチドで複製コピーを作製する反応である。ＰＣＲのための方法は、当技術分野で知られており、例えば、「ＰＣＲ」（M.J. McPherson and S.G Moller (editors), BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford, (2000)）において教示される。ＰＣＲは、本発明のポリヌクレオチドを発現する植物細胞から単離されたｍＲＮＡを逆転写することから得られるｃＤＮＡ上で行われ得る。しかしながら、ＰＣＲが植物細胞から単離されたゲノムＤＮＡ上で行われる場合、それは、概ね、より容易であろう。
【０３２３】
プライマーは、標的配列に配列特異的な様式でハイブリダイズし、ＰＣＲの間に伸長することが可能であるオリゴヌクレオチド配列である。単位複製配列またはＰＣＲ生成物またはＰＣＲ断片または増幅生成物は、プライマーおよび標的配列の新しく合成されたコピーを含む伸長生成物である。多重ＰＣＲ系は、１つを超える単位複製配列の同時生成をもたらす複数セットのプライマーを含む。プライマーは、標的配列と完全に一致するものであってもよいし、特定の標的配列内に制限酵素または触媒核酸認識／切断部位の導入をもたらし得る内部のミスマッチ塩基を含むものであってもよい。また、プライマーは、単位複製配列の捕捉または検出を容易にするために、さらなる配列を含む、および／または修飾もしくは標識されたヌクレオチドを含むものであってもよい。ＤＮＡの熱変性、相補配列へのプライマーのアニーリング、ポリメラーゼによるアニーリングされたプライマーの伸長の反復サイクルは、標的配列の指数関数的に増幅をもたらす。標的または標的配列または鋳型という用語は、増幅される核酸配列を指す。
【０３２４】
ヌクレオチド配列の直接配列決定のための方法は、当業者によく知られており、例えば、Ausubel et al.,（上記参照）およびSambrook et al.,（上記参照）に見出され得る。配列決定は、任意の適切な方法、例えば、ジデオキシ配列決定、化学的配列決定、またはその変形によって実施され得る。直接配列決定は、特定配列のいかなる塩基対の変異も判定するという利点を有する。
【０３２５】
植物／穀物のプロセシング
本発明の穀粒／種子、好ましくは穀物粒、又は本発明の他の植物の部分は、当該分野で公知の何れかの技術を使用して食品成分、食品又は非食品を産生するためにプロセスされ得る。
【０３２６】
一実施形態において、製品は、例えば、超微細粉砕された全穀粒粉末、又は穀粒の約１００％から作られた粉末などの全穀粒粉末である。全穀粒粉末は、精製された粉末構成成分（精製された粉末又は精製された粉末）及び粗画分（超微粉砕された粗画分）を含む。
【０３２７】
精製された粉末は、例えば、洗浄された穀粒、例えば、コムギまたはオオムギ粒など、を粉砕及びボルティング（bolting）することによって、調製される粉末であり得る。精製された粉末の粒のサイズは、「２１２マイクロメートル（Ｕ．Ｓ．Ａ．ワイヤー７０）」と指定された織りワイヤークロスの開口よりも大きくない開口部を有する布を９８％以上通過する粉末として記載される。粗い画分は、糠及び胚芽の少なくとも１つを含む。例えば、胚芽は穀粒のカーネル内にある植物の胚である。胚芽は、脂質、繊維、ビタミン、タンパク質、ミネラル及び植物栄養素（フラボノイドなど）を含む。糠はいくつかの細胞層を含み、脂質、繊維、ビタミン、タンパク質、ミネラル及びフラボノイドなどの植物栄養素の有意な量を有する。さらに、粗画分は、脂質、繊維、ビタミン、タンパク質、ミネラル及びフラボノイドなどの植物栄養素も含む糊粉層を含み得る。糊粉層は、技術的に胚乳の一部と考えられているが、糠と同じ特徴の多くを示すため、典型的には、粉砕プロセス中に糠及び胚芽とともに除去される。糊粉層は、タンパク質、ビタミン及びフェルラ酸などの植物栄養素を含む。
【０３２８】
さらに、粗画分は、精製した粉末と混合され得る。粗画分は、精製された粉末と混合され得、全穀粒粉末を形成することができ、故に精製された粉末と比較して、栄養価、繊維含量及び抗酸化能力が向上した全穀粒粉末を提供する。例えば、粗画分又は全穀粒粉末は、焼成製品、スナック製品、及び食品製品において精製された又は全穀粒粉末を置き換えることで、様々な量で使用され得る。本発明の全穀粒粉末（すなわち、超微粉砕全穀粒粉末）は、それら自家製の焼成製品に使用するために消費者に直接販売されてもよい。例示的な実施形態において、全穀粒粉末の造粒プロファイルは、全穀粒粉末の重量で９８％の粒子が、２１２マイクロメートル未満であるようなものである。
【０３２９】
さらなる実施形態において、全穀粒粉末及び／又は粗画分の糠及び胚芽中に見出される酵素は、全穀粒粉末及び／又は粗画分を安定化させるために不活性化される。安定化は、水蒸気、熱、放射線、又は他の処理を用いて糠及び胚芽層に見出される酵素を不活性化するプロセスである。安定化された粉末は、その調理特性を保持し、及び長い貯蔵寿命を有する。
【０３３０】
さらなる実施形態において、全穀粒粉末、粗画分、又は精製された粉末は、食品の構成要素（成分）であってもよく、食品を産生するために使用されてもよい。例えば、食品製品は、ベーグル、ビスケット、ブレッド、バン、クロワッサン、餃子、イングリッシュマフィン、マフィン、ピタブレッド、クイックブレッド、冷凍／冷凍生地製品、生地、焼いた豆、ブリトー、チリ、タコ、タマレ、トルティーヤ、ポットパイ、インスタントシリアル（ready to eat cereal）、インスタント食品、詰め物、電子レンジ食品、ブラウニー、ケーキ、チーズケーキ、コーヒーケーキ、クッキー、デザート、ペストリー、スイートロール、キャンディーバー、パイクラスト、パイフィリングベビーフード、ベーキングミックス、バター、パン粉、グレービーミックス、肉増量剤、肉代用品、シーズニングミックス、スープミックス、グレービー、ルー、サラダドレッシング、スープ、サワークリーム、ヌードル、パスタ、ラーメン、チョウメイヌードル、ローメインヌードル、アイスクリーム含有物、アイスクリームバー、アイスクリームコーン、アイスクリームサンドイッチ、クラッカー、クルトン、ドーナツ、エッグロール、押出スナック、果物及び穀粒バー、電子レンジ用スナック製品、栄養バー、パンケーキ、パーベイクベーカリー製品、プレッツェル、プリン、グラノーラベースの製品、スナックチップ、スナック食品、スナックミックス、ワッフル、ピザクラスト、動物用食品又はペットフードであり得る。
【０３３１】
別の実施形態において、全穀粒粉末、精製された粉末、又は粗画分は、栄養補助食品の構成成分であり得る。例えば、栄養補助食品は、１つ又は複数の追加成分を含む食物に添加される製品であってもよく、典型的に、ビタミン、ミネラル、ハーブ、アミノ酸、酵素、抗酸化物質、ハーブ、スパイス、プロバイオティクス、抽出物、プレバイオティックス及び繊維を含む。本発明の全穀粒粉末、精製された粉末、又は粗画分は、ビタミン、ミネラル、アミノ酸、酵素、及び繊維を含む。例えば、粗画分は、健康に良い食事に不可欠なＢ−ビタミン類、セレン、クロム、マンガン、マグネシウム、酸化防止剤などの必須栄養素のみならず高濃度の食物繊維を含む。例えば、２２ｇの本発明の粗画分は、個人の一日当たりの繊維推奨消費量の３３％を供給する。栄養補助食品は、個人の全体的な健康を助ける既知の栄養成分が含まれていてもよく、例は、限定されないが、ビタミン、ミネラル、他の繊維成分、脂肪酸、抗酸化物質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ルテイン、リボース、オメガ−３脂肪酸、及び／又は他の栄養成分を含む。栄養補助剤は、限定されないが、以下の形態で供給され得る：インスタント飲料ミックス、飲める状態になっている飲料（ready-to-drink beverages）、栄養バー、ウエハース、クッキー、クラッカー、ジェルショット、カプセル、チューズ、チュアブルタブレット、及び丸剤。一実施形態は、風味の付いたシェイク又はモルトタイプ飲料の形態で繊維栄養補助剤を供給し、この実施形態は、子供のための繊維補助剤として特に魅力的であり得る。
【０３３２】
さらなる実施形態において、粉砕プロセスを使用して、複数の穀粒の粉末又は複数の穀粒の粗画分を作製することが出来る。例えば、穀粒の１つのタイプ由来の糠及び胚芽は、粉砕されてもよく、及び他のタイプの穀物の粉砕された胚乳又は全穀粒穀物粉末とブレンドされてもよい。あるいは、穀粒の１つの種類の糠及び胚芽を粉砕してもよく、及び他のタイプの穀粒の粉砕された胚乳又は全穀粒粉末とブレンドされてもよい。本発明は、１つ又は複数の糠、胚芽、胚乳、及び１つ又は複数の穀粒の全穀粒粉末の何れかの組合せを混合することを包含することが意図される。この複数の穀粒アプローチは、特別注文の粉末を作製し、複数のタイプの穀物粒の品質及び栄養成分を利用することで、１つの粉末を作製することが出来る。
【０３３３】
本発明の全穀粒粉末、粗画分及び／又は穀粒製品は、当該技術分野で知られている何れかの粉砕方法によって製造され得ると考えられる。例示的な実施形態は、穀粒の胚乳、糠及び胚芽を別々の流れに分離することなく、単一の流れで穀粒を粉砕することを含む。洗浄及びテンパー（temper）された穀粒は、ハンマーミル、ローラーミル、ピンミル、インパクトミル、ディスクミル、エアアトリションミル、ギャップミル、及び同様のものなどの第１の通過グラインダーに運ばれる。粉砕後、穀粒は排出され、シフターに運ばれる。さらに、本発明の全穀粒粉末、粗画分及び／又は穀粒製品は、発酵、インスタント化、押出し、カプセル化、トースト、焙煎、又は同様のものなどの多数の他のプロセスによって、改変又は増強され得ることが意図される。
【０３３４】
麦芽製造
本発明によって提供された麦芽ベースの飲料には、開始物質の一部または全体として麦芽を使用することによって製造されるアルコール飲料（蒸留飲料を含む）および非アルコール飲料が含まれる。例としては、ビール、発泡酒（低麦芽ビール飲料）、ウィスキー、低アルコールの麦芽ベースの飲料（例えば、１％未満のアルコールを含む麦芽ベースの飲料）および非アルコール飲料が含まれる。
【０３３５】
麦芽製造は、制御された浸漬および発芽に続き、穀粒、例えばオオムギおよびコムギ穀粒など、を乾燥させる工程である。この連続した事象は、穀粒の改変をもたらす多くの酵素の合成にとって重要であり、主に死滅した内胚乳細胞壁をばらばらにし、穀粒の栄養素を移動させる工程である。後に行う乾燥工程において、香りおよび色を、化学的褐変反応によって産生させる。麦芽の第一の使用は飲料製造のためであるが、他の工業的工程においても利用され、例えば、パン・菓子製造業において酵素源として、食品製造業において芳香剤および着色剤として、例えば、麦芽もしくは麦芽粉として、または間接的に麦芽シロップなどとして利用される。
【０３３６】
一実施態様において、本発明は、麦芽組成物を製造する方法に関する。方法は、好ましくは、以下のステップ：
（ｉ）本発明の穀粒、例えばオオムギまたはコムギ穀粒を準備し、
（ｉｉ）前記穀粒を浸漬し、
（ｉｉｉ）浸漬した穀粒を予め決めた条件下で発芽させ、および
（ｉｖ）前記発芽した穀粒を乾燥させること、
を含む。
【０３３７】
例えば、麦芽は、Hoseney（Principles of Cereal Science and Technology, Second Edition, 1994: American Association of Cereal Chemists, St. Paul, Minn.）において記載された任意の方法によって製造することができる。しかしながら、麦芽を製造するための任意の他の適した方法（例えば、これらに限定されないが、麦芽を焙煎する方法を含む、特殊麦芽の製造方法）も、本発明とともに使用することができる。
【０３３８】
麦芽は、ビール製造のために主に使用されるが、蒸留酒の製造にも使用される。ビール製造は、麦芽汁製造、主発酵および二次発酵、ならびに後処理を含む。最初に、麦芽を粉砕し、水へと攪拌し、加熱する。この「マッシング」の間に、麦芽製造によって活性化した酵素が、穀粒のスターチを、発酵可能な糖へと分解する。産生した麦芽汁を浄化し、酵母を加え、混合物を発酵させ、後処理を実施する。
【０３３９】
ニトロゲナーゼ複合体の検出
ニトロゲナーゼ複合体の検出は、ＮｉｆＤＫタンパク質複合体とＮｉｆＨタンパク質との間の相互作用の検出を可能にする任意の方法によって実施される。ＮｉｆＤＫタンパク質複合体とＮｉｆＨタンパク質との間の相互作用を検出するために好適な方法としては、免疫共沈降、アフィニティーブロッティング、プルダウン、ＦＲＥＴなどを含めた、タンパク質−タンパク質相互作用を検出するための、当該技術分野で知られている任意の方法が挙げられる。
あるいは、ニトロゲナーゼ複合体の検出は、得られたニトロゲナーゼ複合体の活性を計測することによって実施できる。
ニトロゲナーゼ活性を計測するのに好適な方法としては、電子がＮｉｆＨタンパク質からＮｉｆＤＫタンパク質複合体まで移動する、アンモニアへの二窒素の酵素的還元を検出するために、当該技術分野で知られている任意の方法が挙げられる。例えば、窒素固定活性は、アセチレン還元アッセイによって推定されることができる。簡単に言えば、この技術は、ニトロゲナーゼ複合体が三重結合基質を還元する能力を使用する間接法である。ニトロゲナーゼ酵素は、アセチレン（Ｃ2Ｈ2）をエチレン（Ｃ2Ｈ4）に還元する。両方のガスは、ガスクロマトグラフィーを使用して定量化できる。窒素固定はまた、水素放出アッセイで計測されてもよい。Ｈ２は、Ｎ2固定の必須の副産物である。そのため、ニトロゲナーゼ活性の間接的測定は、フロースルー型Ｈ2センサーまたはクロマトグラフを使用したガス流中のＨ2濃度を定量化することによって得られる。
【０３４０】
Ｎ2固定の検出
窒素固定は、１）植物−土壌系の合計Ｎの純増加を測定し（Ｎ出納法）、２）土壌から吸収した画分とＮ2固定から誘導された画分に植物Ｎを分離し（Ｎ差し引き、１５Ｎ天然存在比、１５Ｎアイソタイプ希釈およびウレイド法）、および３）ニトロゲナーゼの活性を計測すること（アセチレン還元および水素放出アッセイ）、によって推定できる。
【実施例】
【０３４１】
実施例１
材料と方法
一過性発現系による植物細胞における遺伝子発現
遺伝子は、Wood et al., (2009)によって本質的に記載されたように、一過性発現系を使用して植物細胞内で発現された。強力な、構成的３５Ｓプロモーターによって植物細胞内で発現されるコード領域を含有するバイナリーベクターを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＡＧＬ１またはＧＶ３１０１に導入した。ｐ１９ウイルス性サイレンシング抑制因子の発現のための、キメラバイナリーベクター、３５Ｓ：ｐ１９を、ＷＯ２０１０／０５７２４６に記載のように、ＡＧＬ１内に別々に導入した。組み換えＡ．ツメファシエンス（A. tumefaciens）細胞を、５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンおよび５０ｍｇ／Ｌのリファンピシンを補足したＬＢブロス中、２８℃にて定常期まで培養した。次に、細菌を、５０００ｇ、室温にて５分間遠心分離することによってペレット化し、その後、１０ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．７、１０ｍＭのＭｇＣｌ2および１００μＭのアセトシリンゴンを含有する浸潤バッファー中にＯＤ６００＝１．０に再懸濁した。次に、細胞を、振盪しながら２８℃にて３時間インキュベートし、その後、ＯＤ６００を計測し、そして、ＯＤ６００＝０．１２５の終濃度に達するように求められる、ウイルス性抑制因子構築物３５Ｓ：ｐ１９を含有しているそれぞれの培養物の一定量を新しいチューブに加えた。終量を、浸潤バッファーで調整した。次に、葉に、培養混合物を浸潤させ、そして、浸潤後に、植物を、典型的にさらに３〜５日間培養し、その後、リーフディスクを分析のために採収した。
組み合わせで、着目の２つ以上の遺伝子の過剰発現のために、各付加遺伝子を、Ａ．ツメファシエンス株に別々に導入し、そして、先と同じように培養した。各細菌株がＯＤ６００＝０．１２５の終濃度になるように、細菌懸濁液を混合した。ウイルス性サイレンシング抑制因子３５Ｓ：ｐ１９をコードする遺伝子を含含有する細菌株を、同じ濃度にてすべての混合物中に含んだ。例えば、一過性リーフアッセイで４つの遺伝子を発現するため、およびウイルス性抑制因子構築物を含む、浸潤混合物の最終的なＯＤ６００は５×０．１２５＝０．６２５ユニットであった。一過性のアッセイ形式での植物細胞内における別々のＴ−ＤＮＡベクターからのそれぞれ少なくとも５つの遺伝子の同時過剰発現は、以前に実証された（Wood et al., 2009）。
【０３４２】
葉組織からのタンパク質抽出
Ｔ−ＤＮＡ導入後に植物細胞内で産生されたポリペプチドを分析するために、ニコチアナ・ベンサミアナの葉サンプルを、（別段明記しない限り）浸潤５日後に浸潤領域から約２×２ｃｍの葉ピースを摘出することによって採取した。これらを、液体窒素中ですぐに冷凍し、２ｍＬのエッペンドルフチューブ内で粉末に粉砕した。３００μＬのバッファーを各粉末サンプルに追加した。該バッファーは、１２５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ６．８、４％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、２０％のグリセロール、６０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含んだ。サンプルを、９５℃にて３分間加熱し、その後、１２０００ｇにて２分間遠心分離した。抽出したポリペプチドを含む上清を取り出し、そして、検出すべきポリペプチドの予想レベルに依存して、１０μＬ〜１００μＬをウエスタンブロッティングに使用した。
【０３４３】
ウエスタンブロット分析
抽出したサンプル中のポリペプチドを、２００Ｖにて約１時間にわたりＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓの４〜１２％ゲル（ThermoFisher）によるＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離した。分離したポリペプチドを、供給業者の取扱説明書（Thermofisher）にしたがって半乾燥装置を使用して各ゲルからＰＶＤＦ膜に移した。ブロッティング後に、ゲルを、クーマシー染色で１時間染色し、次に、保持されているタンパク質の視覚化のために水ですすいで、ポリペプチドの移動があったことを示した。結合したポリペプチドを有する膜を、４℃にて一晩、５％の脱脂乳を含有するＴＢＳＴバッファー中でブロッキングした。ＴＢＳＴバッファーはそうである。抗ＨＡおよび抗ＦＬＡＧ抗体をSigmaから購入した。抗ＧＦＰ抗体は、Leila Blackman（Australian National University, Canberra, Australia）から贈られた。抗体を、５％の脱脂乳の入ったＴＢＳＴ中に１：５０００希釈にて加え、そして、膜を、溶液中で２時間インキュベートした。次に、膜をＴＢＳＴで３×２０分間洗浄した。二次抗体、Immun-Star Goat Anti-Mouse(GAM)-HRPコンジュゲート（Biorad）を、５％の脱脂乳の入ったＴＢＳＴ中で１：５０００にて加え、そして、その膜を１時間インキュベートし、続いてその膜をＴＢＳＴで３×１５分間洗浄した。二次抗体検出のために、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬ試薬を使用し、そして、膜を、Ｘ線現像装置またはAmersham画像表示装置（Amersham）のいずれかにより現像した。
【０３４４】
プロトプラストの調製
葉組織からプロトプラストを単離するために、次のように、プロトコールを、Breuers et al., (2012)から適合させた。浸潤（３ｄｐｉ）の３日後に、浸潤葉の２ｃｍ四方の領域を摘出し、細かく切って、５ｍｌのシリンジに移した。１．５％（ｗ／ｖ）のセルラーゼＲ−１０、０．４％（ｗ／ｖ）のマクロザイムＲ−１０、０．４Ｍのマンニトール、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．６、１０ｍＭのＣａＣｌ2および０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含有する２ｍｌの消化溶液を添加し、そして、軽度の真空を手動で加えて、葉組織の細胞間隙内への該溶液の侵入を容易にした。溶液と葉ピースを２ｍｌのエッペンドルフチューブに移し、そして、その混合物を室温にて１時間インキュベートした。手動でチューブを転倒することによって、得られたプロトプラストを緩やかに抽出した。葉破片は、鉗子を使用して取り除き、そして、プロトプラストを沈殿させ、その後、その溶液を、画像化溶液（０．４Ｍのマンニトール、２０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＭＥＳ ｐＨ５．６、１０ｍＭのＣａＣｌ2、０．１％のＢＳＡ）で置換した。
【０３４５】
共焦レーザー走査顕微鏡とミトコンドリア染色
プロトプラストを、４０×水液対物レンズを備えた正立Ｌｅｉｃａ共焦レーザ走査顕微鏡を使用して画像化した。ＧＦＰを、４８８ｎｍにて励起させ、そして、発光を４９９〜５３５ｎｍにて記録した。ミトコンドリアを、MitoTrackerR Red CMXRos（ThermoFisher Scientific）の１００ｎＭ溶液を使用して１０〜２０分間染色した。MitoTrackerR Red CMXRosを、５６１ｎｍにて励起させ、そして、発光を５７０〜６２４ｎｍにて記録した。
【０３４６】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、および分析
アグロバクテリウムを浸潤させたＮ．ベンサミアナの葉細胞からＲＮＡを抽出するために、そして、約２×２ｃｍの面積の葉ピースを、液体窒素で冷凍し、粉末にすりつぶし、そして、サンプルごとに５００μｌのＴｒｉｚｏｌバッファー（Thermo Fisher Scientific）を添加した。これに続いて、これらの変更点：クロロホルム抽出を反復した、およびＲＮＡを３７℃にて溶解した、を除いて、Ｔｒｉｚｏｌ供給業者の取扱説明書にしたがった。抽出したＲＮＡを、RQ1 DNAse（Promega）で処理して、すべての抽出ＤＮＡを取り除いた。次に、ＲＮＡ調製物を、Plant RNAeasyカラム（Qiagen）を使用してさらに精製した。実施するときには、ｃＤＮＡ合成を、オリゴｄＴプライマーを用いて、供給業者のプロトコールにしたがって、Superscript III逆転写酵素（Thermo Fisher Scientific）を使用して実施した。それぞれのＲＮＡサンプルのＲＴ−ＰＣＲ分析において、３回の別々のｃＤＮＡ合成反応を実施した。２０μｌのｃＤＮＡ反応物を、ヌクレアーゼ不含水中で２０倍希釈した。ｑＲＴ−ＰＣＲを、Qiagen rotor gene Q real-time PCR装置により実施した。９．６μｌのそれぞれのｃＤＮＡを、２０μｌの最終反応容量の、１０μｌの２×sensifast no ROX SYBR Taq（Bioline）、ならびに０．４μｌの、それぞれ１０μｍｏｌでの順方向および逆方向プライマーに添加した。（基準および特定の遺伝子の両方に関する）すべてのｑＰＣＲ反応を、以下のサイクル条件：９５℃／５分で１サイクル、９５℃／１５秒、６０℃／１５秒および７２℃／２０秒で４５サイクル、のもとで三連で実施した。蛍光を７２℃ステップで計測した。次に、５５℃〜９９℃の融解サイクルを実施した。構成的に発現されているＮ．ベンサミアナＧＡＤＰＨ ｍＲＮＡの対照増幅を、rotor遺伝子ソフトウェアパッケージの比較定量化プログラムを使用して遺伝子発現を正規化するために使用した。三連アッセイの平均を表す、３つのｃＤＮＡの各セットの値を平均し、標準誤差（ＳＥＭ）の計算を可能にした。
【０３４７】
タンデム質量分光分析
浸潤Ｎ．ベンサミアナ組織を、液体Ｎ2下で粉砕し、次に、２ｍＬのエッペンドルフチューブ内の５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣＬ ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．２％のＳＤＳ、１０％のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦおよび１％の植物用プロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma、カタログ番号Ｐ９５９９）中でRetsch tissue-lyserを使用して処理した。タンパク質抽出物を、遠心分離によって澄んだ状態にし、そして、その上清を、アガロースビーズ（Sigma、カタログ番号Ａ２０９５）と複合化したモノクローナル抗ＨＡ抗体との一晩インキュベーションのための入力物としてそのまま使用した。非結合タンパク質を、１５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣＬ ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦおよび１％のプロテアーゼインヒビターカクテルを用いた一連の洗浄で取り除いた。結合タンパク質を、９５℃にて１０分間、Laemmliバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、０．１％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー、１０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１００ｍＭのＤＴＴ）中でビーズをインキュベートすることによって溶出した。入力物および免疫沈降タンパク質サンプルを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そして、融合ポリペプチド（ＭＴＰ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ）を含有するゲル領域を、複製ゲルからの同時ウエスタン分析によって決定した。融合ポリペプチドを含有する領域を、摘出し、ゲル内トリプシン分解で処理し、そして、トリプシン分解物を、Agilent Q-TOF 6550質量分析計に連結されたAgilent Chip Cubeシステムを使用したタンデム質量スペクトル解析によって分析した（Campbell et al., 2014）。例えば、添加したトリプシンや角質素などの一般的な混入物からのトリプシンペプチドから得られる質量スペクトルを決定し、その後、残りの質量スペクトルデータを、１５ｐｐｍの前駆体質量寛容性、５０ｐｐｍの産物質量寛容性、デフォルトＱ−ＴＯＦスコアリングおよびストリンジェントデフォルト「オートバリデーション」設定を用いたSpectrumMillソフトウェア（Agilent Rev B.04.01.141SP1）を使用した、ＨＡ配列に加え、ＮＣＢＩ（データベース番号１０／３／２０１５）のニコチアナ種からのすべてのタンパク質配列を含有するデータベースに対して検索するために使用した。アクリルアミドによるシステイン残基の修飾は、必要な修飾であり、そして、メチオニンの酸化を多様な修飾にした。最初に、トリプシン切断を必要とし、そして、最大２つの誤った切断を許容した。ペプチドマッチのバリデーション後に、非トリプシン切断を許容する残りの未合致スペクトルを用いて、検索を繰り返した。
【０３４８】
分子モデリングに使用したソフトウェア
すべての相同モデルを、Accelrys Discovery Studio3.5に実装されたＭＯＤＥＬＬＥＲプログラム（Sali and Blundell, 2013）を使用して構築した。相同モデルを築き上げるのに好適な鋳型を、Brookhaven Protein Databankに対してＢＬＡＳＴ検索を使用して同定した。すべての配列アラインメントを、Discovery Studio3.5に実装されたＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Sali and Blundell, 2013）を使用して実施した。すべての分子動力学シミュレーションを、Ａｍｂｅｒ１２を用いて実施した。
【０３４９】
アゾトバクター・ビネランジーの形質転換
プラスミドを、Dos Santos (2011)の方法にしたがってアゾトバクター・ビネランジーに形質転換した。簡単に言えば、Ａ．ビネランジーＤＪ１２７１を、ＤＭＳＯストックからモリブデートを欠く固形Ｂｕｒｋ培地にぶつけ、そして、さらなる時間をかけて継代培養して、ＤＭＳＯ夾雑物から細胞を取り出した。白金耳量の細胞を、モリブデートを欠いている５０ｍＬの変法Ｂｕｒｋ培地に接種するのに使用し、そして、１２５ｍＬの三角フラスコ内に鉄を加えた。培養物を、１６０ｒｐｍにて振盪しながら２８℃にて２０〜２４時間インキュベートした。１ｎｇの所望のプラスミドＤＮＡを、コンピテント細胞の５０μＬのアリコートに添加し、そして、室温にて２０分間インキュベートした。次に、細胞−ＤＮＡ混合物を、３．８ｍＬの変法Ｂｕｒｋ培地に添加し、そして、１６０ｒｐｍで振盪しながら２８℃にて２４時間回復した。回復細胞のアリコートを、６μｇ／ｍＬのカナマイシンおよび２０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有した固形変法Ｂｕｒｋ培地上で平板培養して、ｐＭＭＢ６６ＥＨおよびその誘導体の保持体を選択した。プレートを、２８℃にて３〜５日間インキュベートした。単一コロニーを、固形の変法Ｂｕｒｋ培地上で再継代して、単一コロニー単離株を得た。アンピシリン耐性を保有した再継代単離株を、ＤＭＳＯストックの調製および追加試験のための固形の変法Ｂｕｒｋ培地の接種に使用した。
【０３５０】
実施例２．植物ミトコンドリアに対してＮｉｆにポリペプチドを標的化するための、酵母ＣｏｘＩＶ遺伝子由来のＭＴＰの使用
本発明者らが知る限り、例えば、植物ミトコンドリアを含め、高等植物における細菌ニトロゲナーゼ（Ｎｉｆ）ポリペプチドの産生に関して公表された報告は存在しない。ミトコンドリアにおける斯かる産生を試験するために、本発明者らは、Ｎｉｆポリペプチドが植物細胞内で産生され、かつ、検出できるか決定するため、および細菌Ｎｉｆポリペプチドに基づく融合ポリペプチドが、ミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）を使用することによって、植物細胞内でミトコンドリアに対して標的化され得る場合があるか否かに試験するために、ニコチアナ・ベンサミアナの葉において、植物ベースの、一過性の発現系を開発した。ミトコンドリアへの局所化を試験するために、酵母シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＩＶ（ＣｏｘＩＶ）タンパク質のＮ末端領域から得られるＭＴＰを選択した。ＣｏｘＩＶ ＭＴＰは、ミトコンドリアの局所化と、植物細胞においてＧＦＰとの融合ポリペプチドのプロセシングを提供することを示した（Kohler et al., 1997）。ＣｏｘＩＶ ＭＴＰ（配列番号１）は、切断前には、たった２９アミノ酸の長さであり、そして、他の多くのＭＴＰより短かった（Huang et al., 2009）。このＭＴＰを酵母細胞内でプロセシングしたとき、１７または２５アミノ酸が取り除かれ（Hurt et al., 1985）、そして、ポリペプチドのＮ末端に結合したＭＴＰからの最小４アミノ酸残基が潜在的に残った。しかしながら、植物細胞におけるより最近の試験（Huang et al, 2009）では、ミトコンドリアマトリックスプロテアーゼ（ＭＭＰ）によるミトコンドリアマトリックス（ＭＭ）におけるプロセシングが、アミノ酸２０〜２１におけるセリン−セリンのすぐ上流のペプチドを切断し、そして、融合ポリペプチドのＮ末端にＭＴＰからの追加の１０アミノ酸残基を伴った、プロセシングされた融合ポリペプチドを作り出すと予測された。特に切断後融合が１０アミノ酸だけを付加する場合、より短いＭＴＰ配列が利点であろうと、本発明者らは考えた。
【０３５１】
本明細書中でｄＣｏｘＩＶ（配列番号２）とも呼ばれる、ＣｏｘＩＶ ＭＴＰの誘導体を設計した。ｄＣｏｘＩＶは、（ミトコンドリア標的化およびプロセシング部位に対するゲノム全般の試験から、植物ミトコンドリアマトリックス（ＭＭ）における取り込みとプロセシングに関して最も重要な残基が、切断部位の３または４残基上流の位置のアルギニン（−３Ｒまたは−４Ｒ）および切断部位直後の２つのセリン残基（＋１Ｓ、＋２Ｓ）であることを見出した）Huang et al., (2009)にしたがってミトコンドリアにおけるポリペプチドの取り込みおよびプロセシングに関与するモチーフｘＲｘｘｘＳＳｘ（配列番号３）の保存されたアルギニンおよびセリン残基を含む。ｄＣｏｘＩＶは、Ｎ末端に向かって挿入された２つの追加アミノ酸を有し、また、天然のＣｏｘＩＶ ＭＴＰの対応するグルタミンよりむしろ、配列番号２の２８位のグルタミン酸も有した。これらの変化は、ｄＣｏｘＩＶペプチドの局在性または切断に影響を及ぼすことは期待されなかった。
【０３５２】
ベクターｐＣＷ４４０およびｐＣＷ４４１の構築
植物細胞への遺伝子の導入のために、汎用植物／細菌発現ベクターを設計し、作製した、ｐＣＷ４４０。これは、エシェリキア・コリおよびアグロバクテリウム・ツメファシエンス細菌の両方における複製および選択を可能にするためにバイナリーベクターに基づき、ならびにＡ．ツメファシエンスから植物細胞内への遺伝子移動のためのＴ−ＤＮＡ領域を含有する。ｐＣＷ４４０を作製するために、植物選択マーカー遺伝子を取り除くために、ｐＯＲＥ１（Coutu et al., 2007）を処理して、ｐＯＲＥ１−ｎｕｌｌを作製した。このベクターは、３５Ｓプロモーターおよびｎｏｓ３’転写ターミネータ領域を含んだ。ＤＮＡ断片を、順番に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター、５’ＵＴＲ配列、ＡＴＧの開始コドンによって開始されるｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰをコードするヌクレオチド配列、制限酵素ＡｓｃＩのクローニング部位、およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの転写終止部位、を含むように合成した。この断片の配列は、ｐＥＴ１４ｂベクター（Novogene）に一部基づいた。断片には、両脇に制限部位を配置し、３５Ｓプロモーターとｎｏｓ３’領域との間のｐＯＲＥ−ヌルに連結させ、これによりｐＣＷ４４０を作製した。ｐＣＷ４４０のＴ−ＤＮＡ領域のヌクレオチド配列を、配列番号４として提供する。
ベクターのＴ−ＤＮＡ中の発現カセットの成分は、転写の向きに順に、融合ポリペプチドを産生するための植物細胞内で下流タンパク質コード領域の発現を駆動するための、クローニング目的のためのＨｉｎｄＩＩＩ部位およびＸｈｏＩ部位を両側に配置した、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（配列番号４のヌクレオチド２１９〜１５６４）、次に、同じポリペプチドを産生するためのコード領域の、好適なＥ．コリ細胞における発現を可能にするＴ７プロモーター（ヌクレオチド１５７１〜１５８７）、次に、ＡＴＧ開始コドンによって開始されるｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰをコードするがヌクレオチド（ヌクレオチド１６５０〜１７４２）、続いて、タンパク質コード領域の挿入のためのクローニング部位としてのＡｓｃＩの制限酵素部位（ヌクレオチド１７４３〜１７５０）、次に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ転写終止配列（ヌクレオチド１８１０〜１８５６）および最後に、ｎｏｓ３’ 植物転写終止配列（ヌクレオチド１８６１〜２０８４）、である。ｐＣＷ４４０の遺伝子マップを、図１に図式的に示す。
【０３５３】
ＭＴＰをコードするヌクレオチド配列を、翻訳されたポリペプチド中のｄＣｏｘＩＶアミノ酸のＣ末端へのコード化タンパク質のインフレーム融合を提供するために、ＡｓｃＩ部位内のいずれかの所望のタンパク質コード領域の挿入を可能にする様式でｐＣＷ４４０内に挿入した。ベクターおよびその誘導体は、Ｅ．コリで安定しているので、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター系によってタンパク質を産生するために使用する（Studier and Moffatt, 1986）。そのため、汎用ｐＣＷ４４０を、Ｔ７プロモーターおよびターミネータが融合タンパク質の発現を制御するＢＬ２１ ｇｏｌｄなどの商業的に利用可能なＴ７リボ核酸ポリメラーゼ細胞株を使用して、細菌で融合ポリペプチドを発現するためのベースベクターとして設計した。細菌はミトコンドリアを有していないので、ＭＴＰを含む完全長の融合ポリペプチドのプロセシングは、Ｅ．コリにおいて起こらない。同じベクターを、植物細胞において内因性の転写機構を使用して遺伝子発現を制御する、３５Ｓプロモーターおよびｎｏｓ３’ターミネータ制御下で同じ融合ポリペプチドを発現するために植物細胞内で使用できる。
【０３５４】
ｐＣＷ４４１を作製するために、その最初のメチオニン残基を含まないＧＦＰ（Brosnan et al., 2007）のオープンリーディングフレームをコードするＤＮＡ断片を、ＰＣＲによって増幅し、ＡｓｃＩ部位を両側に配置して、ｐＣＷ４４０のＡｓｃＩ部位内に挿入させ、そして、ｄＣｏｘＩＶとＧＦＰとの間で翻訳融合を許可した。ＡｓｃＩ部位における挿入は、融合ポリペプチドの接合部において３つの追加アミノ酸を導入した。ＤＮＡ断片を、ｐＣＷ４４０内に挿入して、ｐＣＷ４４１を作製した。
【０３５５】
ｄＣｏｘＩＶ領域が、ＧＵＳ融合ポリペプチドを植物ミトコンドリアに向かわせることができたか試験するために、ｐＣＷ４４１（ｄＣｏｘＩＶ：：ＧＦＰ）を含むＡ．ツメファシエンス細胞を、実施例１に記載の方法を使用して、Ｎ．ベンサミアナの葉の中に浸潤させた。一般的に、ＧＦＰへのＮ末端融合がその蛍光活性に影響しないのが知られているので（Kohler et al., 1997）、そのため、ｄＣｏｘＩＶ：：ＧＦＰポリペプチドを、それが発現した場合に、蛍光活性を保持すると予想した。対照浸潤を、細胞質に位置するＧＦＰを発現するための構築物、ｐＵＱ２１４（Brosnan et al., 2007）を含有するＡ．ツメファシエンスで同時におこなった。すべての浸潤が、単独で対照浸潤物として使用した、サイレンシングのウイルス性抑制因子、ｐ１９、をコードする構築物を含むＡ．ツメファシエンス細胞を含んだ。浸潤の４日後に、浸潤させた葉の区域を、４８８ｎｍでの青色光励起および任意のＧＦＰポリペプチドを検出するためのＧＦＰフィルターを備えた光学顕微鏡検査によって、蛍光発光について調べた。蛍光発光を、ｐＣＷ４４１を浸潤させた葉の細胞で観察した。顕微鏡下では、多数の小さい細胞内構造が蛍光を発するのが観察され、結果は、以前の報告と一致した（Kohler et al., 1997）。それらの構造は、高度に流動性であり、細胞の縁部に集まる傾向があり、ミトコンドリアにあるそれらと一致した。対照的に、導入された細胞質ＧＦＰをコードする遺伝子は、より均等に蛍光を発した。植物細胞内の小さいミトコンドリア様粒子の動きによって明白なとおり、ｄＣｏｘＩＶは、植物ミトコンドリア内にｄＣｏｘＩＶ：：ＧＦＰポリペプチドを向けるのに十分であると結論づけられた。
【０３５６】
ベクターｐＣＷ４４６、ｐＣＷ４４７、ｐＣＷ４４８およびｐＣＷ４４９の設計と構築
ｄＣｏｘＩＶ：：ＧＦＰ融合ポリペプチドが、一過性発現後に植物細胞内で産生され、ミトコンドリアに局限するという観察に基づいてｄＣｏｘＩＶ：：Ｎｉｆ融合ポリペプチドの発現を提供するために、一連のベクターを設計し、構築した。最初に、遺伝子構築物を設計し、クレブシエラ・ニューモニエＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫおよびＮｉｆＹへの融合物を発現させた。野生型Ｋ．ニューモニエＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫおよびＮｉｆＹのアミノ酸配列を、それぞれは配列番号５、６、７および８として提供する。翻訳効率を改善する試みでは、これらのポリペプチドのタンパク質コード領域を、ヒトコドンバイアスを使用してコドン修飾し、そして、潜在スプライス部位、潜在ポリアデニル化シグナル、および内部反復配列を、市販の供給業者（Geneart）によるヌクレオチド配列から取り除いた。それぞれの融合ポリペプチドに関しては、Ｎｉｆイニシエーターメチオニンを除いた。さらに、オープンリーディングフレームは、各ポリペプチドに対するＣ末端伸長をコードするヌクレオチド配列をそれぞれ含み、商業的供給源からのエピトープに対する抗体を使用したポリペプチドのより簡単な検出を提供するために、該伸長は、ＨＡまたはＦＬＡＧエピトープのいずれかを含む（例えば、Wood et al., 2006）。移したポリペプチドが類似したサイズを有したとき、（市販されている）様々なエピトープを、様々な抗体の使用によってタンパク質が識別されるのを可能にするために添加した。例えば、ＮｉｆＤおよびＮｉｆＫ融合ポリペプチドは、類似のサイズを有しており、そのため、ＮｉｆＤをＦＬＡＧエピトープに融合し、およびＮｉｆＫをＨＡエピトープに融合した。各Ｃ末端に添加したアミノ酸配列を、ＨＡエピトープについては配列番号２１として、およびＦＬＡＧエピトープについては配列番号２２として提供する。ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰおよびエピトープを含む融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号２３、２４、２５および２６としてそれぞれ提供する。
【０３５７】
ＮｉｆＨ：：ＨＡ、ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ、ＮｉｆＫ：：ＨＡおよびＮｉｆＹ：：ＨＡにポリペプチドをコードするコドン最適化ヌクレオチド配列を、それぞれ配列番号２７、２８、２９および３０として提供する。隣接ＡｓｃＩ制限部位をそれぞれ含み、これらのヌクレオチド配列を有するＤＮＡ断片を、市販の供給業者によって合成し、そして、それぞれを、ｐＣＷ４４０のＡｓｃＩ部位に挿入して、ベクターｐＣＷ４４６（ｐＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ）、ｐＣＷ４４７（ｐＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ）、ｐＣＷ４４８（ｐＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＫ：：ＨＡ）、およびｐＣＷ４４９（ｐＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＹ：：ＨＡ）を作製した。
【０３５８】
細菌における融合ポリペプチドの発現
これらのベクターの汎用性質は、好適な細菌細胞における遺伝子の発現および融合ポリペプチドの産生を可能にして、ゲル電気泳動および免疫検出実験における対照として使用できるポリペプチドの起源を提供する。そのため、これらのベクターは、３７℃にてOvernight Express培地（EMD-Millipore）中での培養によって、誘導後に遺伝子構築物のＴ７プロモーターからの発現を可能にするＥ．コリ株ＢＬ２１．１−Ｇｏｌｄ（Stratagene）に導入した。ｐＣＷ４４６、ｐＣＷ４４７、ｐＣＷ４４８またはｐＣＷ４４９を担持する細菌培養物を、遠心分離して、細胞を回収した。細胞を、半倍量のBugBuster試薬（EMD-Millipore）中で室温にて溶解した。溶解物をさらに遠心分離して、封入体を回収し、そしてそれを、半倍量のBugBuster試薬でさらに２回洗浄した。封入体を、ＳＤＳを含有した標準的なLaemmliバッファーで溶解し、ウエスタンブロットにおいて明確なシグナルを生じるのに必要なくらいさらに希釈した。ウエスタンブロットを、最終的な検出溶液としてＣｈｅｍＳｔａｒ化学発光試薬（Amersham）を用いて、１：５０００希釈で、ＨＡまたはＦＬＡＧエピトープを認識する市販の抗体およびウサギ抗マウスＨＲＰ二次抗体で探査した。
【０３５９】
植物細胞における融合ポリペプチドの発現
ｄＣｏｘＩＶ：：Ｎｉｆ：：ＨＡまたはＦＬＡＧタグ付与融合ポリペプチドの発現のためのそれぞれ遺伝子構築物を、実施例１に記載の方法を使用して、別々にＮ．ベンサミアナの葉に導入した。前述のように、すべての浸潤物が、遺伝子サイレンシング応答を低減するための、サイレンシングのウイルス性抑制因子をコードする構築物、ｐ１９を含むＡ．ツメファシエンス細胞を含んだ。５日後に、浸潤させた区域を採取し、そして、ＨＡまたはＦＬＡＧエピトープを結合する抗体を使用したウエスタンブロッティングによって、細菌により産生された抽出物を、実施例１に記載のとおりおよび上述のとおり処理した。これは、ポリペプチドを検出し、かつ、それらのサイズおよび相対発現レベルをアッセイした。ゲル電気泳動ステップでは、細菌および植物抽出物のアリコートを、隣接しているレーンに適用して、ポリペプチドのサイズにおける見込まれる小さな変化を検出できるようにし、そしてそれでｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰが切断されかを予測する。例えば、完全長のｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＹ：：ＨＡポリペプチドのサイズが約３０ｋＤａであるのに対して、プロセシングｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＹ：：ＨＡポリペプチドのサイズは、２８ｋＤａであると予測した。
【０３６０】
ウエスタンブロット（図２）を調べたとき、ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡポリペプチドに相当するバンドの存在は、ｐＣＷ４４６のＴ−ＤＮＡが導入されたサンプルに関して容易に観察された。バンドの強度に基づいて、このＮｉｆＨ融合ポリペプチドが、葉細胞においてＮｉｆＫおよびＮｉｆＹ融合ポリペプチドより強く発現されたことを観察した。植物細胞内で産生されたＮｉｆＨ融合ポリペプチドのサイズは、ゲル電気泳動において約４０ｋＤａにて、細菌で発現されたポリペプチドのサイズと同一であるように見えた。このサイズは、完全長のｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ融合タンパク質に関して予想されたとおりであった。同じような様式で、ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＫ：：ＨＡポリペプチドに相当するバンドを、葉細胞内にｐＣＷ４４８のＴ−ＤＮＡを導入したサンプルに関して観察し、およびｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＹ：：ＨＡに相当するバンドを、ｐＣＷ４４９のＴ−ＤＮＡを導入したサンプルに関して観察した。その都度、植物で発現されたポリペプチドは、ＮｉｆＫポリペプチドに関しては約６０ｋＤａであり、かつ、ＮｉｆＹポリペプチドに関しては約３０ｋＤａである、対応する細菌で発現されたポリペプチドと同じサイズに見えた。細菌で発現されたポリペプチドと植物で発現されたポリペプチドの移動に顕著な差がないことに基づいて、本発明者らは、それぞれの場合のｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰが、植物細胞内で任意の有意な程度まで切断されていなかったと結論づけた。
【０３６１】
ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドに関して、細菌細胞と比較した植物細胞に関して、まったく異なる結果を観察した。融合ポリペプチドを、細菌においてｐＣＷ４４７から発現させ、そして、そのサンプルを、ＦＬＡＧタグ付与ポリペプチドを検出するための抗体を使用してウエスタンブロットによってアッセイしたとき、強いバンドを、完全長の融合ポリペプチドに関して予想される、５５ｋＤａにて観察した（図２）。しかしながら、ｐＣＷ４４７からのＴ−ＤＮＡを植物細胞内に導入したとき、映像技術によるウエスタンブロットの延長された曝露後でさえ、ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧポリペプチドに関して検出可能なバンドは存在しなかった。これは、ＮｉｆＤ配列を含む融合ポリペプチドの産生の欠如またはその非常に急速な代謝回転を示唆した。
【０３６２】
ＮｉｆＤ構築物を用いた実験を、結果をチェックするために数回繰り返した。この場合も同様に、ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧポリペプチドは、ウエスタンブロットの延長された曝露後でさえ、植物細胞からの抽出物質中で検出されなかった。遺伝子構築物を、ＮｉｆＤ特異的および３５Ｓ特異的プライマーを用いたシークエンシングによってチェックして、ｐＣＷ４４０骨格内のプロモーターおよびＮｉｆＤ断片の正しい配列を確認した。同じ構築物がＥ．コリ株においてうまく発現されたので、オープンリーディングフレームが完全であることは明確になった。
【０３６３】
植物細胞における他のＮｉｆ融合ポリペプチドの発現
いずれの場合にも、Ｋ．ニューモニエ配列を使用し、かつ、ベースベクターとしてｐＣＷ４４０を使用して、より大きいセットのＮｉｆ融合ポリペプチドをコードする類似の遺伝子構築物を作製した。これには、タンパク質コード領域のコドン最適化、天然のＮｉｆイニシエーターメチオニンの省略、およびそれぞれの融合ポリペプチドにＨＡまたはＦＬＡＧエピトープタグを含むＣ末端伸長の付加が含まれた。これらの構築物は、ｐＣＷ４５２（ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＢ：：ＨＡ；アミノ酸配列番号３１）；ｐＣＷ４５４（ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＥ：：ＨＡ；配列番号３２）；ｐＣＷ４５５（ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＮ：：ＦＬＡＧ；配列番号３３）；ｐＣＷ４５６（ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＱ：：ＨＡ；配列番号３４）；ｐＣＷ４５０（ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＳ：：ＨＡ；配列番号３５）；ｐＣＷ４５１（ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＵ：：ＦＬＡＧ；配列番号３６）およびｐＣＷ４５３（ｄＣｏｘＩＶ：  ＮｉｆＸ：：ＦＬＡＧ；配列番号３７）であった。
【０３６４】
これらのそれぞれについて、Ｎ．ベンサミアナ細胞における完全長の融合ポリペプチドの産生を、アグロバクテリウムからの関連するＴ−ＤＮＡの導入後に容易に検出した。いずれの場合にも、検出された完全長のポリペプチドのサイズは、対応する細菌で産生されたポリペプチドのサイズと同じであり、そして、植物細胞におけるＭＭＰによるＭＴＰの切断の欠如を示唆した。場合によっては、複数のバンドを、ウエスタンブロットで観察した。特に、ＮｉｆＨ：：ＨＡ、ＮｉｆＳ：：ＨＡおよびＮｉｆＮ：：ＦＬＡＧへのｄＣｏｘＩＶ翻訳融合ポリペプチドの発現は、もしかすると、潜在の、オープンリーディングフレーム内の内部開始コドンにて開始された翻訳のため、またはＣ末端のエピトープが検出バンドの中にまだ存在しているような、植物細胞におけるもしくは抽出中のポリペプチドの切断のためかもしれない、ウエスタンブロットにおけるいくつかのより小さいバンドを生じさせた。この分析から、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＹ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＢおよびＮｉｆＱ融合ポリペプチドは、他のものよりより高いレベルにあるように思われ、それに対して、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＳ、ＮｉｆＵ、およびＮｉｆＸ融合ポリペプチドの産生は、中〜低レベルにて検出された。今度の場合も、植物細胞におけるＮｉｆＤ融合ポリペプチドの産生は検出されなかった。本発明者らは、ＮｉｆＤポリペプチド以外のＮｉｆ融合ポリペプチドのすべてが、このアプローチを使用して、植物細胞において発現され得るか、あるいは、類似のコドン利用パラメータ、ならびに同一のプロモーターおよびポリアデニル化調節配列にもかかわらず、異なるレベルで発現されたか、または異なる存在量で蓄積している、と結論づけた。重要なことには、本発明者らは、それが明らかに際立っていたので、ＮｉｆＤの構築物または融合ポリペプチドに関して何か特別なことがあったと結論づけた。
【０３６５】
実施例３．植物細胞におけるＮｉｆＤ融合ポリペプチドの産生を検出するためのさらなる試み
実施例２に記載のｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドの検出の欠如を前提として、本発明者らは、このＮｉｆ融合ポリペプチドが、恐らく酸素濃度、葉細胞における光合成、または潜在的ミスフォールディング、ひいては、恐らく、推定上のシャペロンタンパク質の欠損によるポリペプチドの不安定性に関連して、分解に対して感受性であろうと仮定した（Ribbe and Burgess, 2001）。これらの仮説を試験するために、そのＴ−ＤＮＡがｐＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧポリペプチドをコードしたベクターｐＣＷ４４７を含むＡ．ツメファシエンスを、Ｎ．ベンサミアナの葉に浸潤させた。浸潤させた植物組織を、摘出し、そして、様々な条件下、液体培地上で２４時間維持した。これらのバリエーションのそれぞれの組み合わせもまた、試験した。そのバリエーションのは、暗所中または明所中、２１％（雰囲気酸素濃度）、５％または１％の酸素濃度で植物組織を維持することが含まれた。ＧｒｏＥＬポリペプチド（Ribbe and Burgess, 2001）またはレグヘモグロビン（Ott et al., 2005）を発現する遺伝子構築物の同時導入もまた、一部の浸潤物で実施した（Ｌｈｂ；図６および３）。これを、ｐＯＲＥ１−３５Ｓ発現ベクターへのＧｒｏＥＬ−およびＬｂｈ−コード配列の挿入（Wood et al., 2009）、そして、それぞれ、ｐＣＷ−ＧｒｏＥＬおよびｐＣＷ４４４構築物の作製によって達成した。両方の構築物を、以前に記載したように、アグロバクテリアに形質転換し、そして、一過性の葉発現に使用した。
【０３６６】
対照浸潤物が、例えばｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＮ：：ＦＬＡＧポリペプチドなどの他のＮｉｆ融合ポリペプチドの強い産生をもたらしたにもかかわらず、条件または遺伝子におけるこれらのバリエーションのいずれも、Ｎ．ベンサミアナ細胞におけるｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドの検出をもたらさなかった。
【０３６７】
本発明者らは、これらの実験から、植物細胞におけるＮｉｆＤ融合ポリペプチドの発現が解決する必要がある問題を提起したと結論づけた。
【０３６８】
実施例４．植物細胞におけるＮｉｆポリペプチドの組み合わせを発現する多重ベクターの発現
本発明者らはまた、４つのＮｉｆ融合ポリペプチドがＮ．ベンサミアナ葉系で同時発現され得るか、およびこれがｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＤポリペプチドの産生レベルを改善するか、試験した。これを、それぞれ発現のための異なる遺伝子を含有する、４つのＡ．ツメファシエンス細胞懸濁液、すなわち、ＮｉｆＹ：：ＨＡ、ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ、ＮｉｆＫ：：ＨＡおよびＮｉｆＨ：：ＨＡへのｄＣｏｘＩＶの融合、ｐ１９構築物を含有するＡ．ツメファシエンス単独、を混合することによって試験した。浸潤させた葉組織からの抽出物を、先と同じようにウエスタンブロッティングによってアッセイしたとき、この４つのＮｉｆ遺伝子の同時浸潤実験では、ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＫ、ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＹおよびｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＨの結合を生じるが、単独で発現されたときに比べて、それぞれを非常に低いレベルで検出し、しかし、ｄＣｏｘＩＶＮｉｆＤに関して検出可能なバンドは存在しなかった。そのため、今回もまた、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドは、他のＮｉｆポリペプチドと異なるように見えた。ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＫ：：ＨＡ、ｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡおよびｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＹ：：ＨＡの組み合わせは、同時発現されたｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧの産生を検出可能なレベルまで高めなかった。
【０３６９】
考察
先に記載した実験では、１０個の異なるＮｉｆポリペプチドに別々に融合した、それぞれ、酵母ミトコンドリア標的化ペプチドの誘導体（ＭＴＰ）、ｄＣｏｘＩＶをコードする、遺伝子構築物を、合成し、そして、使用した。これらもまた、細菌または植物細胞において産生されたときに、そのポリペプチドを検出するために、各Ｃ末端にてＨＡまたはＦＬＡＧエピトープタグのいずれかに融合され、そして、Ａ．ツメファシエンスによるＴ−ＤＮＡの導入後の葉組織で発現されることを示した。ミトコンドリア中のＭＴＰのプロセシングを、細菌およびＮ．ベンサミアナ細胞から抽出したポリペプチドのサイズを慎重に比較することによって試験した。１０個のｄＣｏｘＩＶ−Ｎｉｆ融合ポリペプチドのすべてが、Ｅ．コリ細菌において産生された後にウエスタンブロットアッセイで容易に検出されたが、しかし、９つのポリペプチドしか、Ｎ．ベンサミアナ細胞への導入後に検出されなかったことを観察した。例外は、一貫して検出されなかったｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧポリペプチドであった。植物組織が維持された環境条件の変化は、ポリペプチド−低下した酸素濃度、暗所対明所における植物組織の維持、または同時発現されたレグヘモグロビンもしくはＧｒｏＥＬ分子シャペロンタンパク質の存在、の検出をもたらさなかった。
【０３７０】
ＮｉｆＤは、ニトロゲナーゼ酵素複合体の欠くことのできない構成要素である。そのため、以下の実施例における実験を、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドの欠損を緩和する試みで実施した。
【０３７１】
実施例５．タンパク質を植物ミトコンドリアに向かわせるためのｐＦＡγ ＭＴＰのバリデーション
実施例２〜４に記載のとおり、１１個の試験したＮｉｆ融合ポリペプチドのうち１０個の産生を、ｄＣｏｘＩＶ ＭＴＰを使用してＮ．ベンサミアナ葉細胞において実証し、そして、唯一の例外がＮｉｆＤ融合ポリペプチドであった。いずれの場合にも、標的化ペプチドのプロセシングは観察されなかった。そのため、本発明者らは、ＮｉｆＤおよび他のＮｉｆポリペプチドと融合した様々なＭＴＰ配列が、植物細胞において検出可能な発現および融合ポリペプチドの切断を提供するか試験した。その目的のために、本発明者らは、Ａ．サリアナＦ１−ＡＴＰアーゼγ−サブユニット（ｐＦＡγ）からのＭＴＰを選択した。長さ７７アミノ酸残基のＭＴＰを、ＧＦＰレポーターポリペプチドとの融合によって、アラビドプシスプロトプラスト（Lee et al., 2012）において機能的にバリデーションした。マトリックスプロセシングプロテアーゼ（ＭＰＰ）によるｐＦＡγ ＭＴＰ配列の切断は、アミノ酸４２の後において起こり、そして、ポリペプチドのＮ末端に融合した３５アミノ酸のＣ末端部分を切り離した。ミトコンドリアの局所化およびＮ．ベンサミアナ葉細胞におけるプロセシングのために３５アミノ酸がいくつ必要なのか知られていないので、そのため、本発明者らは、全７７アミノ酸配列を使用することを決定した。そのため、融合Ｎｉｆポリペプチドを手つかずの植物葉細胞のＭＭに輸送するｐＦＡγ ＭＴＰの能力を、Ｎ．ベンサミアナの一過性リーフアッセイシステムを使用して試験した。
【０３７２】
３つのアミノ酸ｇｌｙ−ａｌａ−ｐｒｏ（ＧＡＰ）によって切り離され、そしてまた、隣接ＮｃｏＩおよびＡｓｃＩ制限部位も含む、ＧＦＰ（ＧＦＰ ６５Ｔ、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ４３２８４；Haas et al., 1996）に融合したｐＦＡγ ＭＴＰ（配列番号３８アミノ酸１〜７７）の７７アミノ酸から成る３１９アミノ酸ポリペプチドをコードする、９７０ｂｐのＤＮＡ断片を化学的に合成した。ＮｃｏＩおよびＡｓｃＩ（部分的）消化後に、その断片を、ｐＣＷ４４１のＮｃｏＩ〜ＡｓｃＩ部位に挿入して、ベクターｐＲＡ０１を作製した。ＡｓｃＩを用いたｐＲＡ０１の消化は、ＧＦＰコード領域を摘出したが、ｐＦＡγ ＭＴＰ配列およびＧＡＰアミノ酸を残し、そして、Ｎｉｆ融合ポリペプチドのクローニングにおけるベースベクターとして使用されるベクターｐＲＡ００を作製した。Ｎｉｆまたは他のポリペプチドを、ＡｓｃＩ部位におけるＤＮＡ配列の挿入によってｐＦＡγＭＴＰおよびＧＡＰアミノ酸の下流に融合したとき、得られた遺伝子構築物は、融合の接合部にｐＦＡγ ＭＴＰおよびＧＡＰアミノ酸をコードし、それによって、Ｎｉｆまたは他のポリペプチドに８０アミノ酸のＮ末端伸長を付加する（配列番号３８）。ミトコンドリアのｐＦＡγＭＴＰのプロセシングは、イニシエーターメチオニンを含む、Ｎ末端から４２アミノ酸を切り落とし、そして、発現ポリペプチドのサイズを約４．６ｋＤａに削減すると予想された。そのため、ＭＴＰの切断は、Ｎｉｆまたは他のポリペプチドのＮ末端に融合されたＣ末端伸長から３８アミノ酸を残すと予想された。
【０３７３】
同じ長さがＮ末端伸長をコードするが、ＭＰＰによるミトコンドリアのプロセシングを提供しないであろう対照ベクターとして、ｐＦＡγＭＴＰの無効化バージョンをコードする第二のベクターを作製した。このベクターでは、２４アミノ酸の置換を、そのミトコンドリア認識およびプロセシングに必要とされるＭＴＰの領域内に導入し（Lee et al., 2012）、そして、ｐＦＡγの切断部位にアミノ酸を含んだ。各置換では、ｐＲＡ１のｐＦＡγ ＭＴＰ中の野生型アミノ酸を、アラニン残基で置換した（図３）。そのため、本明細書中でｍＦＡγとも呼ばれる、ｐＦＡγ ＭＴＰのこの修飾バージョンは、正確にプロセシングされないで、代わりに、対応する未プロセシングｐＦＡγ融合ポリペプチドと同じ数のアミノ酸残基を有する完全長融合ポリペプチドをもたらすであろう。そのため、この修飾ベクターを、ウエスタンブロット分析において未プロセシング分子量対照を提供するための融合ポリペプチドを発現するためのベースベクターとして使用した。ベクターｐＲＡ００およびそのｍＦＡγ誘導体は両方とも、バイナリーベクターであり、そして、Ａ．ツメファシエンスから植物細胞へのそれらのＴ−ＤＮＡの移動を提供した。そのＣ末端にＧＡＰトリプレットを含む、修飾ｍＦＡγのＮ末端伸長のアミノ酸配列を、配列番号３９として提供する。
【０３７４】
植物細胞のミトコンドリアに融合ポリペプチドを局限するｐＦＡγ ＭＴＰの能力を試験するために、ｐＲＡ０１を、一過性のＮ．ベンサミアナリーフアッセイで利用した。植物細胞におけるｐＦＡγ：：ＧＦＰ融合ポリペプチドのマトリックスプロセシングを検出するための対照として、ｍＦＡγ：：ＧＦＰ融合ポリペプチドをコードする対応するベクターもまた作製し、ｐＲＡ２１と呼んだ（表３）。ｐＲＡ０１またはｐＲＡ２１のいずれかを含有するＡ．ツメファシエンスを用いた葉の浸潤５日後に、浸潤区域からの葉サンプルを採取し、そして、タンパク質抽出物を、実施例１に記載のとおり調製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングを、ＧＦＰ抗体を使用して、タンパク質抽出物において実施した。ｐＲＡ０１（ｐＦＡγ：：ＧＦＰ）の導入から、予測された部位にて切断されたＧＦＰポリペプチドに関して、ポリペプチドバンドが、予測されたサイズ（〜３０ｋＤａ）を有することをウエスタンブロットで観察した一方で、ｐＲＡ２１（ｍＦＡγ：：ＧＦＰ）に関して、未プロセシング融合ポリペプチドの予測されたサイズに関して、より大きいバンド（〜３５ｋＤａ）を観察した（図４）。ＧＦＰポリペプチドをコードするいずれの遺伝子も有していない陰性対照で観察されなかった、〜２８ｋＤａにてより微かなバンドを、ｐＲＡ０１およびｐＲＡ２１の両方について観察した。これは、多分、ＧＦＰポリペプチドまたは代替転写もしくは翻訳から生じたものの分解産物を表していた。切断型のバンドが、非切断型のバンドよりはるかに強かったので（図４）、ｐＦＡγ：：ＧＦＰ融合ポリペプチドのプロセシングが、効果的であると思われた。本発明者らは、ｐＦＡγ：：ＧＦＰ融合ポリペプチドが、手つかずのＮ．ベンサミアナ葉細胞のＭＭにおいてプロセシングされており、そしてそれは、融合ポリペプチドの少なくともＭＴＰ部分が、ＭＭ中に輸送され、そして、ＭＰＰにアクセス可能であることを含意していると結論づけた。
【０３７５】
ＧＦＰポリペプチドの局所化を可視化するために、プロトプラストを、ｐＲＡ０１（ｐＦＡγ：：ＧＦＰ）を含有する葉組織から、実施例１に記載のとおり調製し、そして、共焦点顕微鏡によって調べた。プロトプラストを、４０×水液対物レンズを備えた正立Ｌｅｉｃａ共焦レーザ走査顕微鏡を使用して画像化した。ＧＦＰを、４８８ｎｍにて励起させ、そして、発光を４９９〜５３５ｎｍにて記録した。ミトコンドリアを同定するための対比染色として、プロトプラストも同様に、MitoTrackerR Red CMXRos（ThermoFisher Scientific, Cat No.M7512）の１００ｎＭ溶液を使用して１０〜２０分間染色した。MitoTrackerR Red CMXRosを、５６１ｎｍにて励起させ、そして、発光を５７０〜６２４ｎｍにて記録した。このように、両フルオロフォアの蛍光画像を重ねることもある。これらの手段により、ＧＦＰ蛍光が、MitoTrackerRと同時局在し、そのため、ミトコンドリアに局在したことを観察した。そのため、本発明者らは、少なくともｐＦＡγ：：ＧＦＰに関して、ＭＴＰが、Ｎ．ベンサミアナ葉細胞のＭＭに融合ポリペプチドを移動させ、かつ、ＭＰＰによるその切断も提供したと結論づけた（図４）。この結論は、ＭＰＰによるＭＴＰのプロセシングが、ＭＭにおいてだけ起こるという知識に基づいた。
【０３７６】
表３．Ｎｉｆ融合ポリペプチドをコードする遺伝子構築物
【表３】
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【０３７７】
実施例６
植物ミトコンドリアへのＮｉｆ融合ポリペプチドの転移
本発明者らは、次に、ｐＦＡγ ＭＴＰが、Ｎｉｆ融合ポリペプチドをＭＭに転移することができるか、およびそれが、ＭＰＰによるＭＴＰの切断を提供し得るか、試験することを望んだ。これを最初に試験するために、それらの比較的小さい分子量であり、そしてそれが、ウエスタンブロッティングによる切断および非切断ポリペプチドの識別を明確にできるので、２つのＮｉｆタンパク質（ＮｉｆＦおよびＮｉｆＺ）を、融合ポリペプチドの構築のために選択した。Ｃ末端融合としてＨＡまたはＦＬＡＧエピトープのいずれかに融合したクレブシエラ・ニューモニエＮｉｆＦおよびＮｉｆＺポリペプチドのタンパク質コード領域を、ヒトコドン最適化し、そして、商業的の供給業者によって合成した。ＤＮＡ断片を、ＮｉｆオープンリーディングフレームがＮ末端ｐＦＡγ ＭＴＰに翻訳的に融合されて、ベクターｐＲＡ０５およびｐＲＡ０４（表３）を作製するように、ｐＲＡ００のＡｓｃＩ部位に挿入した。ＨＡおよびＦＬＡＧエピトープを、それぞれ、ＮｉｆＦおよびＮｉｆＺポリペプチドのＣ末端に組み込んで、対応する抗体による検出を可能にした。対照としてのこれらのｐＦＡγ：：Ｎｉｆ融合ポリペプチドの未プロセシングバージョンを作製するために、同じ構築物を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによってＥ．コリで発現させた。ＭＴＰが、ＭＰＰをもたない細菌でプロセシングされないことを前提として、植物で発現されたポリペプチドと細菌で発現されたポリペプチドとの間のサイズ差は、ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングで検出されるプロセシングを可能にした。それぞれプロセシング前のｐＦＡγ：：ＮｉｆＦ：：ＨＡおよびｐＦＡγ：：ＮｉｆＺ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号４０および４１として提供する。
【０３７８】
ウエスタンブロット（図４）は、Ｎ．ベンサミアナの葉から検出されるポリペプチドのサイズが、Ｅ．コリで産生される対応するポリペプチドより、各場合においてより小さいことを明らかにした。ｐＲＡ０５（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＦ：：ＨＡ）およびｐＲＡ０４（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＺ：：ＦＬＡＧ）のそれぞれについて、植物細胞から検出されるポリペプチドが、それらのＭＴＰの融合ポリペプチドの切断に関して予測されるサイズに対応したのに対して、Ｅ．コリ抽出物から検出したポリペプチドは、未プロセシングｐＦＡγ：：Ｎｉｆ融合ポリペプチドに関して予測されたサイズのものであった。本発明者らは、これらのデータから、ｐＦＡγ ＭＴＰは、少なくともＮｉｆ融合ポリペプチドのＭＴＰ部分をＭＭに輸送し、そして、植物細胞におけるＭＰＰによるＭＴＰの切断を提供することができると結論づけた。
【０３７９】
実施例７．質量分析法によるＭＴＰ切断の証明
融合ポリペプチドのｐＦＡγ部分の中の予測されるＭＴＰプロセシング部位が、ＭＰＰによってミトコンドリア内で切断されたことを立証するために、ペプチド産物を質量分析法によって分析した。これをおこなうために、本発明者らは、ｐＲＡ１０と呼ばれる、融合ポリペプチドｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡをコードする、ｐＲＡ００に基づく遺伝子構築物を設計し、作製した（表３）。プロセシング前のこの融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号４２として提供する。ＮｉｆＨ融合ポリペプチドは、ニトロゲナーゼ酵素複合体の中核的な構成要素としてのＮｉｆＨの重要さ、および植物細胞において以前に観察されたｄＣｏｘＩＶ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡポリペプチドの高度な発現（実施例２）のため選択した。ｐＲＡ１０構築物を、Ｎ．ベンサミアナの葉細胞に導入し、そして、浸潤組織を４日後に採取した。その組織を、液体窒素下で粉砕し、次に、５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０％のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦおよび植物向けの１％のプロテアーゼインヒビターカクテル（Sigma、カタログ番号Ｐ９５９９）を含有する、タンパク質抽出バッファー（ＰＥＢ）の存在下、２ｍＬのエッペンドルフチューブ内でRetsch tissuelyserを使用して処理した。ミトコンドリアに対して標的化したＮｉｆＨ融合ポリペプチドの溶解性を改善するために、０．２％（ｗ／ｖ）のＳＤＳをＰＥＢに添加した。未精製のタンパク質抽出物を、遠心分離で澄んだ状態にし、次に、ＨＡ含有ポリペプチドを免疫沈降させるために、アガロースビーズ（Sigma、カタログ番号Ａ２０９５）に結合したモノクローナル抗ＨＡ抗体の存在下でインキュベートした。非結合タンパク質を、１５０ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、５％のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴ、０．５ｍＭのＰＭＳＦおよび植物向けの１％のプロテアーゼインヒビターカクテルを用いた一連の洗浄によって取り除いた。そのビーズをLaemmliバッファー中で９５℃にて１０分間インキュベートし、次に、変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる電気泳動によってさらに精製することによって、結合タンパク質を溶出した。同時ウエスタンブロット分析によるｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ融合ポリペプチドを含有することを測定したゲルの領域を摘出し、そして、トリプシンを用いたゲル内消化に供し、それに続いて、Agilent Q-TOF 6550質量分析計（Campbell et al., 2014）に合わせたAgilent Chip Cubeシステムを使用して、実施例１に記載の得られたペプチドのタンデム質量スペクトル解析に供した。この分析では、ＮｉｆＨ中の領域と同一である５つの完全に消化されたトリプシンペプチド、および残基４２と４３との間のＭＴＰの正確な切断と一致した６つの準トリプシンペプチドを見出した（図５）。未プロセシングＭＴＰから入手されたであろうトリプシンペプチドＳＩＳＴＱＶＶＲ（配列番号４３）は、観察されなかった。代わりに、検出された最も多くのＮ末端ペプチドが、準トリプシンＩＳＴＱＶＶＲ（配列番号４４）であり、そのＭＳ／ＭＳスペクトルにおけるｙ−イオンの全系列によって確認した。
【０３８０】
これらのデータは、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡポリペプチドの少なくともＭＴＰ部分が、ＭＭに移動し、そして、ＭＰＰによってＮ末端伸長内のＭＴＰのあらかじめ選択された部位にて切断されたことを最終的に実証した。そのデータは、ｐＦＡγ ＭＴＰが、転移およびＭＭにおけるプロセシングに必要であるシグナルのすべてを含んでいることを含意した。
【０３８１】
実施例８．植物のミトコンドリアマトリックスにおける複数のニトロゲナーゼタンパク質の発現
Ｎ．ベンサミアナ葉細胞におけるＧＦＰ、ｐＦＡγ ＭＴＰに融合したＮｉｆＦ、ＮｉｆＺおよびＮｉｆＨポリペプチドのミトコンドリアでの発現およびプロセシングの成功を前提として、本発明者らは、ｐＦＡγ ＭＴＰへの融合ポリペプチドとして残りの１３個のＮｉｆポリペプチドを発現することを試みた。モデルジアゾ栄養生物、クレブシエラ・ニューモニエにおいて、１６個のＮｉｆタンパク質は、ニトロゲナーゼ生合成または機能に関与し、その一方で、４つの他のものが、未知の機能のものであるか、または転写制御に関与する（Oldroyd and Dixon, 2014）。本発明者らは、実施例２〜４で提示したデータを考慮すると、ｐＦＡγ ＭＴＰがＮｉｆＤ融合ポリペプチドの産生および切断を提供するかに特に興味があった。
【０３８２】
Ｋ．ニューモニエの１６個のＮｉｆポリペプチドをコードするＤＮＡ断片のコドン最適化バージョンを得、そして、それぞれを、ｐＲＡ００のＡｓｃＩ部位に別々に挿入して、一連の遺伝子構築物を作製した（表３）。それぞれの遺伝子構築物は、Ｎ末端ｐＦＡγ ＭＴＰを有する融合ポリペプチド、次に、Ｎｉｆ配列（そのイニシエーターメチオニンありまたはなし）、および次に、適切な抗体による検出のためのＨＡまたはＦＬＡＧエピトープのいずれかを含むＣ末端伸長をコードした。植物発現のために、各構築物は、タンパク質コード領域の両側に配置された、３５Ｓプロモーターおよびｎｏｓ３’転写ターミネータ領域を含む。１６個の融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号４０〜４２および４６〜５８で提示する。
【０３８３】
１６個の遺伝子構築物を含有するＡ．ツメファシエンス細胞を、別々にＮ．ベンサミアナの葉に浸潤させ、そして、４日後に、先と同じように、タンパク質抽出物を調製し、そして、ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングによって分析した。ＨＡタグ付与ｐＦＡγ−Ｎｉｆポリペプチドをコードする構築物のそれぞれに関して、ＭＰＰに関して予測されるおおまかなサイズであるバンドを、ウエスタンブロットにより検出した（表３、図６）。タンパク質量は、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＳおよびＮｉｆＹ融合ポリペプチドであることを検出するために最も簡単である、ＨＡタグ付与ポリペプチドの中で変更した。ＮｉｆＦ、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＭポリペプチドは、低レベルで存在したが、その一方で、ＮｉｆＱポリペプチドの検出は、可視化されるべきブロットのより長い曝露を必要とした。興味深いことに、追加の、より高い分子量バンドは、個々のＮｉｆ：：ＨＡ構築物のそれぞれに対してサイズ特異的であるＮｉｆＢ、ＮｉｆＳ、ＮｉｆＨおよびＮｉｆＹ構築物での浸潤のために検出した（図６）。これらの追加バンドは、最初のバンドと比較して、分子量がほぼ２倍であり、そして、ゲル電気泳動中の変性条件にもかかわらず、これらのポリペプチドが二量体化していたことを本発明者らに示唆した。細菌におけるホモダイマーとしてのＮｉｆＢ、ＮｉｆＳおよびＮｉｆＨタンパク質の機能が報告された（Rubio and Ludden, 2008; Yuvaniyama et al., 2000）。
【０３８４】
ＦＬＡＧタグ付与ｐＦＡγ：：Ｎｉｆ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドを、ＮｉｆＪ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＶ、ＮｉｆＵ、ＮｉｆＸおよびＮｉｆＺ配列を含む構築物それぞれについて、ウエスタンブロットで観察した（図６、右上のパネル）。ＦＬＡＧ抗体は、ＨＡ抗体に比べ、Ｎ．ベンサミアナ抽出からより高いバックグラウンドバンドをもたらした。それにもかかわらず、その結果は、ＨＡタグ付与タンパク質のそれに類似していた。かなりのバリエーションが、さまざまなＮｉｆ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドのシグナル強度で見られた。ＮｉｆＵ構築物に特異的である、追加の、より高分子量バンドが観察された（図６）。ｐＦＡγ：：ＮｉｆＸ：：ＦＬＡＧ構築物ではまた、追加の、予測された、プロセシングされた分子量に比べて、より高い強度のより小さいバンドももたらした。
【０３８５】
意外なことに、１６個の遺伝子構築物のうち１５個が検出可能なポリペプチド産生をもたらしたことを考えれば、さらに、浸潤物の頻繁な複製にもかかわらず、本発明者らは、予測された分子量の可視バンドを容易にもたらしたＥ．コリにおける同じ遺伝子構築物の発現であったとしても、これらの植物アッセイにおいて、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ構築物（ｐＲＡ０７）のいずれの特有のバンドも検出できなかった（図７）。実際には、細菌で産生された抽出物の１：１００希釈でさえ、ウエスタンブロットにおいて容易に観察されるバンドをもたらした。細菌抽出物からの結果は、遺伝子構築物ｐＲＡ０７が、少なくともタンパク質コード領域に関しては、機能的であることを裏づけた。そのため、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧポリペプチドの注目に値する例外で、ニトロゲナーゼ生合成および機能に必要とされる、不可欠なＮｉｆポリペプチドの完全なセットのうちのすべてが、ｐＦＡγ ＭＴＰへの融合を使用して植物葉細胞において首尾よく発現された。さらに、観察したバンドの分子量は、ＭＭにおける融合ポリペプチドのプロセシングと一致していた（表３）。
【０３８６】
ニトロゲナーゼ活性には多くのＮｉｆタンパク質の協調作用を必要とするので、植物における機能的なニトロゲナーゼの再構成は、生合成および機能のためにジアゾ栄養細菌によって利用される多くのＮｉｆタンパク質を必要とすると予期した。そのため、本発明者らは、複数のＮｉｆタンパク質が、ｐＦＡγ ＭＴＰを使用してＮ．ベンサミアナＭＭで発現されるか決定することを望んだ。この概念を試験するために、得られたポリペプチドがウエスタンブロット分析によって同定できる、異なるサイズの４つのＮｉｆ融合ポリペプチドをコードする遺伝子構築物、すなわち、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＢ：：ＨＡ（ｐＲＡ０３）、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＳ：：ＨＡ（ｐＲＡ１６）、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ（ｐＲＡ１０）およびｐＦＡγ：：ＮｉｆＹ：：ＨＡ（ｐＲＡ１２）をコードする構築物、を選択した。これらの構築物で形質転換される４つのＡ．ツメファシエンス培養物を、等量で混合し、そして次に、その混合物を、Ｎ．ベンサミアナの葉に浸潤させた。各培養物を別々に浸潤させたときに、蓄積したポリペプチド濃度を比較した。４つの遺伝子の組み合わせに比べて、単一の構築物から発現されたときに、それぞれのポリペプチドがより豊富であったことが観察された。それにもかかわらず、４つのＮｉｆ融合ポリペプチドはすべて、遺伝子組み合わせからのタンパク質抽出物で容易に検出され、そして、各ポリペプチドについて観察した分子量は、個別の浸潤物や組み合わせた浸潤物と同一であった。これは、Ｎｉｆ融合ポリペプチドの組み合わせが、ミトコンドリアへの所望の標的化およびそれぞれのＮｉｆ融合ポリペプチドのプロセシングを伴って、植物細胞における産生され得ることを示した。
【０３８７】
実施例９．Ｎ．ベンサミアナにおける改善されたＮｉｆＤ融合ポリペプチド産生の試み
ニトロゲナーゼの触媒能におけるＮｉｆＤの重要な役割を前提として、本発明者らは、ＮｉｆＤ融合ポリペプチド産生の不足の理由を確認しようと試み、そして、植物アッセイにおけるその存在量を改善するためにいくつかのアプローチを試験した。まず、彼らは、ＮｉｆＤ融合ポリペプチド産生／蓄積の不足が、低い導入遺伝子転写またはｍＲＮＡ不安定性に寄与する可能性があるか、ｍＲＮＡ発現レベルを計測することによって試験した。これをおこなうために、まず、ｐＲＡ０７からの浸潤Ｎ．ベンサミアナ細胞におけるｍＲＮＡレベルを、実施例１に記載のｑＲＴ−ＰＣＲによって計測し、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＵ：：ＦＬＡＧ（ｐＲＡ１５）をコードする構築物から転写したｍＲＮＡのレベルと比較した。この第二の構築物は、先に記載したように、植物細胞において高レベルのポリペプチド産生を提供するので、対照として使用した。増幅効率におけるあらゆる偏りを取り除くために、両方のＮｉｆ融合遺伝子によって共有されるｐＦＡγ ＭＴＰ領域内にアニールするオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。ＲＴ−ＰＣＲアッセイからの結果は、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＵ：：ＦＬＡＧ ｍＲＮＡが、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ ｍＲＮＡのレベルに比べて、３倍超多いことを示した。第二に、ｃＤＮＡを、ｐＲＡ０７から転写した植物で産生されたｍＲＮＡから合成し、クローニングし、そして、配列決定すると、そのヌクレオチド配列が塩基完全性を立証した。そのため、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドの蓄積の不足は、低いｍＲＮＡ発現または不安定性のためでなかった。これらの実験はまた、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧをコードするｐＲＡ０７のＴ−ＤＮＡが、完全に機能的であり、かつ、その構築物の３５Ｓプロモーターも同様に機能的であることを示した。そのため、Ｎ．ベンサミアナ細胞においてＮｉｆＤ融合ポリペプチドを検出できなのは、ｍＲＮＡの発現におけるいずれかの障害によるものではなかった。
【０３８８】
ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧをコードする遺伝子の転写およびｍＲＮＡ蓄積が、ＮｉｆＤ融合ポリペプチド産生を明らかに制限していなかったので、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドの蓄積の不足を克服する試みで、いくつかの修飾を遺伝子構築物におこなった。まず、Ｃ末端伸長中のＦＬＡＧエピトープの存在が、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドの産生の不足または不安定性のいずれかを引き起こしている可能性を考慮し、試験した。この可能性を試験するために、ＦＬＡＧエピトープをＨＡエピトープによって置換し、ｐＲＡ１９（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ）と称する構築物を設計し、作製した。ＨＡエピトープは、そのエピトープによって試験したタグ付与Ｎｉｆ融合ポリペプチドのそれぞれの蓄積および検出を可能にした（表３）。この融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号５９として提供する。第二に、ＮｉｆＤ：：ＨＡオープンリーディングフレームのコドン利用を、異なるｍＲＮＡ配列が翻訳効率を改善するか決定するための試みにおいて、ヒト細胞における翻訳のために最適化したよりむしろ、Ａ．サリアナにおけるコドン利用により密接に類似するように修飾した。その構築物はｐＲＡ２４と呼ばれ；それは、ｐＲＡ１９と同じｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡポリペプチド（配列番号５９）をコードした。さらに、実施例５（ｍＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ）に記載のｐＦＡγよりむしろ突然変異ｍＦＡγＮ末端伸長を有するＮｉｆＤ融合ポリペプチドのバージョンをコードする遺伝子構築物を作製した。ミトコンドリア標的化および／またはプロセシングは、それが生じる場合には、ＮｉｆＤ融合ポリペプチド産生の不足に少なくとも部分的に関与するか試験するために、この構築物（ｐＲＡ２２）を作製した。これらの質問に対処するように設計した３つの構築物を、表３で列挙する。
【０３８９】
Ｎベンサミアナの葉に、これらの構築物を含有するＡ．ツメファシエンスを浸潤させ、そして、その浸潤組織からタンパク質抽出物を調製し、そして、分析した。意外なことに、ウエスタンブロットは、ｐＲＡ１９またはｐＲＡ２４（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ）構築物のいずれかを導入したとき、マトリックスプロセシングおよびと未プロセシングＮｉｆＤ融合ポリペプチドの両方について予測された分子量のＨＡ含有バンドを示した（図８）。ｐＲＡ２２の導入は、より大きい（未プロセシング）融合ポリペプチドだけをもたらした。この実験では、植物細胞内へのｐＲＡ１９の導入は、ウエスタンブロットにおいてｐＲＡ２４より強いＮｉｆＤ：：ＨＡ融合ポリペプチドバンドをもたらしたが、続く反復実験では、強度の差は有意でなかった。マトリックスプロセシングは、ｐＲＡ２２（ｍＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ）から産生されたものおよび細菌で産生されたポリペプチドとバンドの位置を比較することによって確認した（図８）。サイズがプロセシング済および未プロセシング形態のｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡに対応する２つのバンドの観察は、このＮｉｆＤ融合ポリペプチドのプロセシングが、先に記載した他のＮｉｆ融合ポリペプチドのそれほど効果的でないことを示した。ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡポリペプチドの観察されたレベルは、同じ発現構築物設計および発現条件にもかかわらず、正の対照として使用されるｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ：：ＨＡ融合ポリペプチド（レーン２）のレベルよりはるかに低かった。さらに、３つの修飾ＮｉｆＤ：：ＨＡ構築物のそれぞれに関して、対分子量の追加バンドが、ウエスタンブロットで観察され、そしてそのいくつかは、特定のｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡバージョンに特異的であった。例えば、約５０ｋＤａの強いバンドは、修飾ＮｉｆＤ：：ＨＡ構築物のすべてに存在するにもかかわらず、異なっており、約４０ｋＤａの強いバンドは、ｐＲＡ２２が導入されたとき、サンプルに独特であるように見えた。これらのバンドがｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ：：ＨＡまたはＧＦＰ対照のいずれかに存在しないので、それらが、ＮｉｆＤ：：ＨＡ分解産物またはもしかすると代替の転写産物または翻訳開始シグナルを表す可能性がある。
【０３９０】
本発明者らは、ＨＡエピトープを用いたＦＬＡＧエピトープの置換が、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドの蓄積を改善するために少なくとも部分的に関与していると結論づけた。
【０３９１】
考察
先に記載した実験では、本発明者らは、クレブシエラにおけるニトロゲナーゼ機能のために必要とされる１６個のＮｉｆポリペプチドすべてが、ＭＴＰ：：Ｎｉｆ融合ポリペプチドとして植物葉細胞において遺伝子構築物から発現されることができ、かつ、そのポリペプチドがプロセシング形態でミトコンドリアに蓄積されることを実証した。さらに、その実験は、これらのタンパク質が、ニトロゲナーゼ機能のために潜在的に対応する細胞内位置であるＭＭに標的化され得ることを示した。本発明者らは、これらの実験が、斯かるアプローチに関する実現可能性の最初の実際的照明であると考える。
【０３９２】
ＭＭへのＮｉｆ融合ポリペプチドの標的化に対する結論は、証拠のうちの数行に基づいた。まず、植物で発現されたＮｉｆポリペプチドのそれぞれのサイズは、ＭＰＰによるプロセシングからもたらされるであろう予測されたサイズと一致していた。細菌で産生されたポリペプチド（完全長、未プロセシング）と比較して、植物で発現されたＮｉｆ融合ポリペプチドについて観察されたより小さい分子量は、ＭＰＰによるＮｉｆ融合ポリペプチドのプロセシングを示した。さらに、ＭＴＰ配列を突然変異させたとき、ＭＴＰがミトコンドリア取り込み機構によってプロセシングされることができない状態にあることで、より大きいポリペプチドが、ＮｉｆＤおよびＧＦＰ融合ポリペプチドの両方について観察され、プロセシング済ポリペプチドと未プロセシングポリペプチドとの間のサイズ差と一致していた。最後におよび最終的に、質量分析法では、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＨが、マトリックスにおける特異的プロセシングについて予測されるように、ＭＴＰの残基４２−４３の間で切断されることを測定し、そして、そのＭＴＰ配列がＮｉｆポリペプチドと融合したときに切断され得ることを示した。
【０３９３】
ＭＴＰの存在は、常にＮｉｆタンパク質の完全なプロセシングにつながるわけではなかった。例えば、ＮｉｆＸ：：ＦＬＡＧ構築物および２つのＮｉｆＤ：：ＨＡ構築物は、プロセシング済融合ポリペプチドおよび未プロセシング融合ポリペプチドの両方の融合ポリペプチドの蓄積をもたらした。そのうえ、強力な、構成的３５Ｓプロモーターの使用にもかかわらず、ポリペプチド蓄積レベルの非常に大きな変動度が、様々なＮｉｆ融合ポリペプチドで観察された。追加的な、予測されたより短いポリペプチドが、該ポリペプチドのＣ末端におけるエピトープの存在によって検出された、一部のＮｉｆ融合ポリペプチドについて観察された。
【０３９４】
すべてのＮｉｆ融合ポリペプチドについて、検出可能なレベルでＮｉｆＤポリペプチドを産生させることが最も難しかった。これは、ＮｉｆＤ遺伝子発現の不足またはｍＲＮＡの不安定性のためではなく、少ない翻訳およびタンパク質の不安定性が、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドの存在量を制限した可能性がある。細菌で高度に発現されるためのその要件を含めた（Poza-Carrion et al., 2014）、ニトロゲナーゼ機能におけるＮｉｆＤの決定的な重要性を前提として、この問題を克服する必要がある。
【０３９５】
実施例１０．インシリコモデリングを使用したニトロゲナーゼポリペプチド構造および機能の調査
細菌のニトロゲナーゼは、活性酵素を形成するために結合する必要がある複数の、異なるＮｉｆポリペプチドから成るメタロプロテイン複合体である。本発明者らは、それぞれの対応する野生型ポリペプチドに対するそれぞれのＮｉｆポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにおけるアミノ酸伸長が、それぞれの個々のポリペプチドの生化学的機能および集合、ならびに植物細胞内での酵素複合体の機能を妨げるかどうか考えた。先に記載した例では、植物細胞に導入した導入遺伝子によってコードされるＮｉｆ融合ポリペプチドは、ミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）を使用してミトコンドリアマトリックスに向けられた。しかしながら、それはプロセスは、ＭＰＰによる切断前のより長い配列、または切断後のより短い配列のいずれかにより、それぞれのニトロゲナーゼポリペプチドのＮ末端を伸長した。伸長が、触媒中心または機能に必要なタンパク質−タンパク質接触面を妨げることによって、ニトロゲナーゼ複合体の機能に影響するか試験するために、本発明者らは、最初に、ニトロゲナーゼポリペプチドＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮ、ＮｉｆＳおよびＮｉｆＵに対するＮおよびＣ末端伸長の影響を予測するために、細菌ニトロゲナーゼサブユニットの相同モデルを使用した。同様に、細胞抽出物からの検出または精製を可能にするために、例えばＦＬＡＧ、ＨＡおよびＭＹＣエピトープなどのエピトープタグを、ポリペプチドのＣ末端に普通に追加する。野生型細菌ニトロゲナーゼを形成する個々の成分およびタンパク質複合体の多くを結晶化し、そして、単一ペプチドまたは多タンパク質複合体としてのそれらの構造を調査した。そのため、本発明者らは、Ｋ．ニューモニエアミノ酸配列に基づいて、例えば、伸長およびそれぞれのＮｉｆポリペプチドへの翻訳融合などの様々な変化の影響をモデル化するために、これらの高分解能構造を使用した。
【０３９６】
方法：分子モデリングに使用したソフトウェア
それぞれのＮｉｆポリペプチドおよびこれらのポリペプチドを含む複合体の相同モデルを、Accelrys Discovery Studio3.5に実装されたＭＯＤＥＬＬＥＲプログラム（Sali and Blundell, 2013）を使用して構築した。相同モデルを築き上げるのに好適な鋳型を、Brookhaven Protein Databankに対してＢＬＡＳＴ検索を使用して同定した。鋳型ポリペプチドを表４に列挙したが、それらの大部分がＡ．ビネランジー由来である。配列アラインメントを、Discovery Studio3.5に実装されたＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Sali and Blundell, 2013）を使用して実施した。すべての分子動力学シミュレーションを、Ａｍｂｅｒ１２を用いて実施した。
【０３９７】
表４．分子モデリングに使用した鋳型ポリペプチド
【表４】
2020510413.tif 000005
【０３９８】
結果：ＮｉｆＨ構造
ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ−ＮｉｆＨ複合体からのＡ．ビネランジーＮｉｆＨ構造は、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＨ配列と比較して、Ｃ末端が１７アミノ酸残基短かったが、その他の点では、２つのＮｉｆＨポリペプチドは、試験した他のＮｉｆポリペプチドに比べて、高度に相同であった（表４）。そのため、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＨポリペプチド配列を使用して、以下に記載したように構築した相同モデルは、その配列からこれらの１７残基を除いた後に構築した。
【０３９９】
ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫおよびＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ−ＮｉｆＨ複合体
Ｋ．ニューモニエからのＮｉｆＤおよびＮｉｆＫポリペプチドを使用したＮｉｆＤ−ＮｉｆＫα2β2ヘテロ四量体の構造のモデルを、分子動力学シミュレーションで構築し、試験した。モデルを、鋳型としてＡ．ビネランジー（ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＰ４、ＮｉｆＤおよびＮｉｆＫのみ）からのＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ複合体の結晶構造を使用して、Accelrys Discovery Studio3.5で実装されたＭＯＤＥＬＬＥＲアルゴリズムを使用して構築した。Ｋ．ニューモニエとＡ．ビネランジーとの間のＮｉｆＤの同一性は７３．２％であり、そして、ＮｉｆＫに関しては６５％であった。次に、第二のモデルを、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＤ、ＮｉｆＫおよびＮｉｆＨポリペプチド（ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ−ＮｉｆＨα2β2γ4ヘテロ八量体）の３つすべてを含む複合体についてＰＤＢ ＩＤ：１Ｎ２Ｃを使用して構築した。第二のモデルが、ＣまたはＮ末端伸長によって悪影響を受けるＮｉｆＨサブユニットとＮｉｆＤ−ＮｉｆＫの相互作用を明らかにしたか試験するために、これをおこなった。本発明者らは、ＮｉｆＫサブユニットのＣ末端が、複合体のコアに埋もれ、そして、ＮｉｆＫの５つのＣ末端残基と隣接するサブユニットとの間の水素結合および塩架橋を含めた、隣接するＮｉｆＫおよびＮｉｆＤサブユニットの両方のいくつかの残基と接触することを第二のモデルから観察した。これは、ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫモデルで観察したことと一致していた。本発明者らは、野生型Ｋ．ニューモニエ配列に対するＮｉｆＫポリペプチドへのいずれかのＣ末端伸長が、複合体の破壊をもたらし、そして、安定形態の喪失またはニトロゲナーゼ活性に関して完全な無機能性複合体のいずれかにつながると結論づけた。対照的に、ＮｉｆＤおよびＮｉｆＨサブユニットのＣ末端は、複合体の表面にあるので、そのため、伸長が、酵素複合体の形成および機能を破壊することなく、ＮｉｆＤおよびＮｉｆＨポリペプチドのＣ末端になされ得ると予測される。Ａ．ビネランジーＮｉｆＨ構造のモデルは、Ｋ．ニューモニエのＣ末端から除かれた１７アミノ酸残基もまた、１７残基伸長の範囲内にあったＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ−ＮｉｆＨ複合体の「くぼみ」がなかった場合、表面で終止するであろうと予測した。同様に、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫおよびＮｉｆＨサブユニットのＮ末端もまた、複合体の表面にあるので、これらのＮ末端が伸長の付加に適しているはずであると結論づけられた。
【０４００】
ＮｉｆＥＮ複合体
Ｋ．ニューモニエＮｉｆＥ−ＮｉｆＮ配列に対して妥当な相同性を有する、ＮｉｆＥ−ＮｉｆＮα2β2ヘテロ四量体構造は、Brookhaven Protein Databankで入手可能であったが、入手可能であった同等なＮｉｆＤ−ＮｉｆＫα2β2ヘテロ四量体構造に見られるように、複合体のコア内に埋め込まれるであろうＮｉｆＮ構造のＣ末端から２３残基が欠けている。さらに、そのモデルに不要な不確実性を加えるであろうＮｉｆＥ構造のＮ末端から２２残基が欠けている。ＮｉｆＥ−ＮｉｆＮα2β2ヘテロ四量体は、Ａ．ビネランジー（ＰＤＢ ＩＤ：ＮｉｆＨ−ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ−ＮｉｆＨ複合体を含む１Ｎ２Ｃ、ＮｉｆＥ−ＮｉｆＮおよびＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ複合体の４Åの重ね合わせＲＭＳＤ）からのＮｉｆＤ−ＮｉｆＫα2β2ヘテロ四量体と同じ折り畳みを共有した場合、ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ構造を、代わりにＮｉｆＥ−ＮｉｆＮ相同モデルを築き上げる鋳型として使用した。この追加利点は、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＮ配列の末端のほとんど完全なカバー率であった。これはまた、それらが存在すべきとき、ＮｉｆＥ−ＮｉｆＮ末端とＮｉｆＨとの見込まれる相互作用の調査を可能にし、そして、任意のサブユニットの末端領域の改変が、複合体形成または活性部位アクセス可能性を潜在的に妨げるであろう。
【０４０１】
そのため、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＥ−ＮｉｆＮα2β2ヘテロ四量体モデルを、Ａ．ビネランジーＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ構造を介して構築した。ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫモデルと類似して、構造のコアで終止したＮｉｆＮのＣ末端以外、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＮサブユニットのＣおよびＮ末端は、複合体の表面にて終止した。隣接するＮｉｆＫサブユニット（相同モデルにおけるＮｉｆＮ）に接触させた適当な１９残基の十分に保存された伸長により、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＥ配列のＮ末端はＮｉｆＤのＮ末端より１８アミノ酸残基だけ短かった。モデルから、ＮｉｆＥのＣまたはＮ末端の伸長が、複合体の構造または機能に関する有害な影響を有しないと予測されたが、ＮｉｆＮのＣ末端は、伸長を許容しそうにないと結論づけられた。５１アミノ酸残基の比較的長い配列が、Ａ．ビネランジーＮｉｆＫ構造Ｎ末端に存在するが、対応配列が、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＮ配列には存在しなかった。モデルでは、追加のアミノ酸残基が、ＮｉｆＤおよびＮｉｆＫユニットとの間の接触面沿いに置かれた。触媒コアはこの配列から隠された。これらの観察から、ＭＰＰによる切断後に、生理的ｐＨにて陽性荷電（＋８）した３５残基のＮ末端伸長を残すｐＦＡγ ＭＴＰ配列は、恐らく非構造態様を維持し、かつ、晒された溶媒のままであろうと結論づけられた。さらに、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＮのＮ末端における追加的なアミノ酸残基が許容され得るという結論が支持されたという、ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ鋳型構造からの前例があった。ＮｉｆＮの斯かるＮ末端伸長が、任意のユニットの触媒機能または集合を妨げるであろうことを示唆するものはなかった。その一方、ＮｉｆＮのＣ末端が、酵素のコアの中に埋め込まれると予測された。とりわけ、それが、高度に保存されたＮｉｆＫのＣ末端より６残基長く、それで、これらの残基が関与するであろう相互作用の正確な性質が不明なままである。Ａ．ビネランジーＮｉｆＤ−ＮｉｆＫα2β2ヘテロ四量体とＫ．ニューモニエＮｉｆＥ−ＮｉｆＮα2β2ヘテロ四量体との間の折り畳みの類似性に基づいて、ＮｉｆＮのＣ末端、特に伸長、への改変が、複合体の二次構造および四次構造に対する有害効果を有すると予測される。野生型ＮｉｆＮポリペプチドと同じＣ末端が使用されるべきであると結論づけた。
【０４０２】
ＮｉｆＳモデル
Ｋ．ニューモニエＮｉｆＳの相同モデルを、その構造機能単位がホモ二量体であるＥ．コリからのシステインデスルフラーゼを介して構築した。Ｋ．ニューモニエＮｉｆＳのＣ末端における最後の１１アミノ酸残基は、モデリングにおいて含まれなかった。Ｋ．ニューモニエＮｉｆＳの相同モデルを、ホモ二量体として構築し、そして、ＮおよびＣ末端が構造表面にあるか観察した。分析したＮｉｆポリペプチドの大部分に関する場合、ＭＰＰによるプロセシング後に残留するｐＦＡγ ＭＴＰアミノ酸残基が、ホモ二量体に対して有害影響を有しないであろうことが予測される。ＮｉｆＵおよびＮｉｆＳポリペプチドが相互作用し得るがことは示された（Yuvaniyama et al., 2000）、しかしながら、その相互作用の正確な物理的性質が不明なままである。ＮまたはＣ末端のいずれかの伸長が、一方が存在している場合に、ＮｉｆＵとＮｉｆＳと間の物理的相互作用を妨害し得る可性がある。
【０４０３】
ＮｉｆＵモデル
Ｋ．ニューモニエＮｉｆＵに対してBrookhaven Protein Databankにおける最も緊密な合致は、ホモ三量体として結晶化されたアキフェクス・エオリクス（Aquifex aeolicus）からのＰＤＢ ＩＤ：２Ｚ７Ｅ、鉄−硫黄クラスタタンパク質（ＩｓｃＵ）であった。アラインメントでは、２Ｚ７Ｅのモノマー（１２０残基）に関して良好な相同性を示したが、ＮｉｆＵ配列はかなり長く（２７１残基）、そして、Ｃ末端の約１５０残基をモデル化しないままにした。そのため、Ｃ末端の１５１残基を除いた、Ｋ．ニューモニエＮｉｆＵの相同モデルを、鋳型としてアキフェクス・エオリクスからの鉄−硫黄クラスタタンパク質（ＩｓｃＵ）を使用して構築した。Ｎ末端は、十分にカバーされており、かつ、サブユニットの「上部」においてクラスタリングされた。ＮｉｆＵポリペプチドのＮ末端がＭＴＰ配列に融合された場合、その構造が、ＮｉｆＳポリペプチドとの相互作用を許容するかどうかは、確信をもって予測できない。
【０４０４】
概要では、Ｎｉｆポリペプチドの大部分のＮ末端におけるアミノ酸伸長が、機能喪失の必要なしに許容されると予測されると結論づけた。ＮｉｆＫおよびＮｉｆＮのＣ末端への伸長は、複合体形成および機能の破壊に対して最も感受性であると予測される。次に、これらの結果は、核ゲノムにおける導入遺伝子からの発現および植物ミトコンドリアのマトリックス内への転移のための機能的なニトロゲナーゼポリペプチドの設計を導く助けとなるように、本発明者らによって使用された。
【０４０５】
実施例１１．ＮｉｆＤおよび他のＮｉｆ融合ポリペプチドの同時発現
本発明者らは、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドの産生および蓄積を改善するためにさらなるアプローチを試みた。窒素固定細菌では、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、およびＮｉｆＨは、ニトロゲナーゼ複合体の触媒コアを形成するために、水素結合形成、静電的相互作用および疎水性相互作用によって強く相互作用する。実施例１０に記載のタンパク質構造モデリングは、ＮｉｆＫと他の２つのポリペプチド、ＮｉｆＤおよびＮｉｆＨ、との間の有効な複合体形成が、ＮｉｆＫの野生型Ｃ末端アミノ酸、すなわち、Ｃ末端における最後の４残基（例えば、配列番号７の残基５１７〜５２０）としてのアミノ酸残基ＤＬＶＲ（配列番号６９）、の存在に依存していることを明らかにした。先に記載した実験では、本発明者らは、９アミノ酸のＨＡエピトープを含めた１７アミノ酸の追加Ｃ末端配列を有するＮｉｆＫ融合ポリペプチドを使用した。実施例１０に記載のモデリングは、ＮｉｆＫ配列が、Ｃ末端伸長のため、ＮｉｆＤとの相互作用に最適でないであろうと予測した。そのため、本発明者らは、野生型Ｃ末端を有するＮｉｆＫポリペプチドと、ＮｉｆＤ構築物との同時発現が、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドの同時蓄積を改善するか試験することを決めた。
【０４０６】
ベースベクターとしてｐＲＡ００を使用して、Ｃ末端伸長なしでｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ融合をコードする遺伝子構築物を、作製した。この構築物をｐＲＡ２５と呼んだ（表３）。そのポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号６０として提供する。ｐＲＡ２５（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ）とｐＲＡ２４（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ）の組み合わせを用いて、Ｎ．ベンサミアナの葉の浸潤を実施し、そして、先に使用したｐＲＡ１１（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ：：ＨＡ）をｐＲＡ２４と比較した。ＮｉｆＤポリペプチドのレベルを、ＨＡ抗体を使用して、ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングで比較した。驚いたことに、ｐＲＡ２５（Ｃ末端伸長またはエピトープを伴わないｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ）との同時浸潤は、ｐＲＡ１１（Ｃ末端伸長を有するｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ）との同時浸潤と比較して、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドの蓄積を実質的に増強した。この実験では、ミックス中へのｐＲＡ１１の包含は、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドの蓄積を高めるように見えなかったが、反復実験では、ｐＲＡ１１を使用して増加したものがいくつか存在した。単独またはＮｉｆＫおよびＮｉｆＨ構築物と組み合わせたＮｉｆＤ構築物の浸潤が続く、ウエスタンブロットの写真を図９に示した。図９に示したブロットについて、ｐＲＡ１９をそれ自身に浸潤させたとき（レーン１１）、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドのバンドを見るには、より長い曝露が必要であった。
【０４０７】
他の浸潤物に関して、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ構築物、ｐＲＡ１０を、ＮｉｆＤとＮｉｆＫの組み合わせに付加した（図９のレーン１〜３）。これは、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドの蓄積のレベルをさらに高めた。これは、野生型Ｃ末端を有するＮｉｆＫポリペプチドの存在が、ｐＲＡ１９からＮｉｆＤ翻訳産物を安定化させること、および、ＮｉｆＨの追加が、恐らくプロテアーゼ活性からそれを保護することによって、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドの蓄積をさらに高めたこと、を示した。
【０４０８】
ＮｉｆＤ融合ポリペプチドの改善された蓄積が、ミトコンドリアマトリックスで起こったか試験するために、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ（ｐＲＡ１０）およびｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ（ｐＲＡ２５）構築物を、無機能性ＭＴＰ（ｐＲＡ２２、ｍＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ）を有するＮｉｆＤのバージョンと共に同時発現させた。その融合ポリペプチドは、Ｎ末端ドメインのアミノ酸だけがｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡと異なっていた。
非マトリックス標的化ｍＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ融合ポリペプチドが、マトリックス標的化ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡポリペプチドと同じレベルまで蓄積しなかったこと（レーン２と３を比較、図９）を観察した。これは、ＮｉｆＤポリペプチドの改善された蓄積が、恐らくＭＭで起きていることが確認され、かつ、それらが、タンパク質複合体を形成するために相互作用していたことが示唆された。この結論は、ＮｉｆＤ：：ＨＡに融合したＭＴＰ配列のプロセシングの程度が、ＮｉｆＫおよびＮｉｆＨポリペプチドの存在下で増強されたという観察によって強化された。
【０４０９】
コドンで最適化構築物ｐＲＡ２４を、ＮｉｆＫ（Ｃ末端伸長なし）およびＮｉｆＨ構築物と共に使用したとき、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドは、より高いレベルに蓄積した（レーン１、図９）。別の浸潤物では、ＮｉｆＫおよびＮｉｆＨ構築物からの同時発現が、切断：非切断ｐＦＡ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ融合γポリペプチドの比を増強することが観察された。
【０４１０】
Ｃ末端伸長を伴うかまたは伴わない、ＮｉｆＫをコードする構築物の同時発現が、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ蓄積もまた高め得るかどうか決定するために、ｐＲＡ２５とｐＲＡ０７の組み合わせを、葉細胞内に導入した。ｐＲＡ１０とのさらなる組み合わせもまた、一部の浸潤において実施した。ＦＬＡＧエピトープを検出する抗体を使用して、ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧポリペプチドを、ウエスタンブロットで検出し（上のパネル、図１０）、そして、ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドの蓄積が、ＮｉｆＫ：：ＨＡ融合ポリペプチドとの同時発現によって高められたことを示した。本発明者らがＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドを検出したのは、これが初めてであった；それまでの検出の欠如については、実施例２〜５に報告した結果を参照。ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧポリペプチド蓄積のレベルは、Ｃ末端伸長を欠くＮｉｆＫをコードする構築物の同時発現によってより高い程度まで高められた。ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ融合ポリペプチドの最大レベルは、ＮｉｆＨおよびＮｉｆＫ（Ｃ末端伸長なし）構築物を同時浸潤させたときに観察された（レーン１、図１０）。すなわち、ＮｉｆＨ融合ポリペプチドの組み合わせへの追加が、ＮｉｆＤ融合ポリペプチド濃度をより一層高めた。この結果は、エピトープタグ（ＨＡまたはＦＬＡＧ）にかかわらず、ＮｉｆＤ蓄積が、ＮｉｆＨ：ＨＡおよびＣ末端伸張を伴わないＮｉｆＫによって高められたことを実証した。
【０４１１】
さらなる浸潤からのウエスタンブロットを、図１１に示す。この実験はまた、ｐＲＡ０７からのｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ蓄積のレベルが、ｐＲＡ１０（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ）とｐＲＡ２５（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ）の同時導入によって増強されたことも示した。ｐＲＡ２５との組み合わせを、ｐＲＡ１１（ＮｉｆＫ、Ｃ末端伸長を有する）との組み合わせと再び比較した、図１１のレーン１０および１１を参照。ＮｉｆＤバンドの強度を定量し、そして、バックグラウンドのうちの１つの強度に対して正規化したとき、ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ蓄積のレベルが、ｐＲＡ１１と比較して、ｐＲＡ２５との同時発現によって約５０％増強されたことを決定した。そのため、ＮｉｆＫ（Ｃ末端伸長なし）とＮｉｆＨの組み合わせは、ＨＡタグ付与ＮｉｆＤポリペプチド以外のＮｉｆＤ融合ポリペプチドの蓄積を補助し、そして、Ｃ末端伸長を有するＮｉｆＫポリペプチドよりＮｉｆＤ融合ポリペプチドの蓄積を増強した。
【０４１２】
総合すれば、これらの結果は、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＫおよびＮｉｆＤポリペプチドの組み合わせが、植物のミトコンドリアにおけるＮｉｆＤ融合ポリペプチドの蓄積を改善したことを示した。本発明者らが知っている限り、これは、ＮｉｆＨおよびＮｉｆＫとの同時発現によって、植物細胞において、特に、ミトコンドリアに対して標的化されたときの、ＮｉｆＤ蓄積の増強に関する最初の報告である。ＮｉｆＫの野生型Ｃ末端が、ＮｉｆＤの蓄積に有益であり、およびＮｉｆＨがＮｉｆＤ融合ポリペプチドの存在量をさらに増強したとも結論づけた。ＮｉｆＤ蓄積に対するＮｉｆＨおよびＮｉｆＫポリペプチドの正の効果は、ＮｉｆＤコード領域のコドン最適化によってさらに高められた。図９のレーン１のＮｉｆＤ融合ポリペプチドの存在量が、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ：：ＨＡポリペプチドの存在量に近づいていることにも留意した。本発明者らは、これらの２つの主要成分の等モル存在量が、植物細胞におけるニトロゲナーゼ機能に有益であると考えた。
【０４１３】
ＮｉｆＤ融合ポリペプチドレベルに対するＮｉｆＫおよびＮｉｆＨの有益な効果に基づいて、本発明者らは次に、ＮｉｆＳ融合ポリペプチドの同時発現が、ＮｉｆＤ蓄積を高めるかどうか試験した。ＮｉｆＳは、ニトロゲナーゼ集合の初期段階に関与するシステインデスルフラーゼであり、それによって、それが、Ｆｅ−Ｓクラスタ形成のために硫黄（Ｓ）を動員する。これらのＦｅ−Ｓクラスタは、ニトロゲナーゼ複合体に不可欠である。これをおこなうために、それぞれが構築物のうちの１つを含むＡ．ツメファシエンスの組み合わせを、Ｎ．ベンサミアナの葉内に同時浸潤させた。ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ（ｐＲＡ０７）融合ポリペプチドをコードする構築物を、この実験に使用した。驚いたことに、ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ構築物と、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＳ：：ＨＡ構築物（ｐＲＡ１６）の組み合わせもまた、後者のポリペプチドの蓄積を増強した（図１０のレーン６と１１を比較）。ＮｉｆＳ融合ポリペプチドの同時産生が、ＮｉｆＤ融合ポリペプチドの蓄積を増強したと結論づけた。
【０４１４】
本発明者らは、この実験における別の驚くべき、かつ、予想外の現象について観察した。図１０で見られるように、それらの対応する構築物から検出されるＮｉｆＨ：：ＨＡ、ＮｉｆＫ：：ＨＡおよびＮｉｆＳ：：ＨＡ融合ポリペプチドのそれぞれのレベルは、構築物を単独で導入したときと比較して、ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ構築物もまた同時導入したとき、実質的に低下した。レーン５と７、６と９および３と８を比較して、パーセンテージ減少は、ＮｉｆＨ：：ＨＡでは４２％、ＮｉｆＳ：：ＨＡでは３７％およびＮｉｆＫ：：ＨＡでは３６％であった。ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧ構築物（ｐＲＡ０７）の同時導入は、同時導入した第二のＮｉｆ融合構築物の発現に対してマイナスの影響があったように見えた。この現象をさらに調査した。
【０４１５】
植物細胞においてこれらのポリペプチドが関連することを示すために、ｐＲＡ０７を含む遺伝子組み合わせの導入後のタンパク質抽出物を、ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧポリペプチドおよびそれに結合するあらゆる他のポリペプチドを免疫沈降させるために、ＦＬＡＧエピトープを結合した抗体と共にインキュベートする。沈殿した（単数もしくは複数の）ポリペプチドを、電気泳動し、そして、そのブロットを、ＨＡエピトープに対する抗体を用いて探査した。免疫沈降された、およびＨＡエピトープを含むポリペプチド、例えばｐＦＡ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡなど、を検出する。非変性条件下でのサイズ排除クロマトグラフィーもまた、マルチポリペプチドタンパク質複合体の形成、特にＮｉｆＤ、ＮｉｆＨおよびＮｉｆＫ融合ポリペプチドの関連性を実証するために使用できる。
【０４１６】
実施例１２．ＮｉｆＤＫ融合ポリペプチドの構築
ＮｉｆＨおよびＮｉｆＫ融合ポリペプチドの同時発現が、植物細胞におけるＮｉｆＤレベルを安定させることに効果があったという知見は、本発明者らが、ニトロゲナーゼにおけるＮｉｆＤのヘテロ四量体パートナーであるＮｉｆＫをＮｉｆＫポリペプチドに融合する方法を設計するように導いた。このストラテジーはまた、見込まれるプロテアーゼ活性からＮｉｆＤポリペプチドを保護することもあると考えられ、そしてそれが低レベルのＮｉｆＤ蓄積に関与するであろうと本発明者らは考えた。さらに、細菌では、ＮｉｆＤおよびＮｉｆＫポリペプチドがほとんど等量で存在し（Poza-Carrion et al., 2014）、かつ、ニトロゲナーゼの結晶構造において、サブユニットが１：１の比で見られる（Schmid et al., 2002）。本発明者らは、２つのポリペプチドの直接的な融合が、そのポリペプチドの等しい比を確実にすると考えた。
【０４１７】
しかしながら、このストラテジーは、次のように、単一ペプチド鎖の適切なタンパク質折り畳みを提供するために、ＮｉｆＤおよびＮｉｆＫユニットを結合するためのアミノ酸リンカーの挿入を必要とすることがわかった。Ｋ．ニューモニエからのＮｉｆＤ−Ｋα2β2ヘテロ四量体の相同モデルを、鋳型としてアゾトバクター・ビネランジーからのＮｉｆＤ−Ｋ複合体の結晶構造を使用して構築した（ＰＤＢ ＩＤ：１ＦＰ４（Schmid et al., 2002））。Ｋ．ニューモニエと対応するＡ．ビネランジーのポリペプチドをアラインすると、アミノ酸配列同一性は、ＮｉｆＤポリペプチドでは７２．２％およびＮｉｆＫポリペプチドでは６７．３％であった。Ｋ．ニューモニエＤ2Ｋ2ヘテロ四量体の構造モデルでは、それぞれのＮｉｆＤサブユニットのＣ末端は、ＮｉｆＫパートナーのＮ末端から約４７Åであった。そのため、その長さのリンカーを、２個のユニットを接続するために設計した。そのリンカーは、長さが３０残基であり、そして、アラニンによって置換される最終的なアルギニンを有するハイポクレア・ジェコリーナのセロビオヒドロラーゼＩＩ（受入番号ＡＡＧ３９９８０．１、ＡＴＰＰＰＧＳＴＴＴＲ；配列番号６１）からの既知の非構造リンカー領域からの１１残基の部分、次に、８残基のＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号６２）と最後に続く、アラニンによって置換されるアルギニンを有する、１１残基の非構造リンカー配列の別のコピー（完全なリンカー配列：ＡＴＰＰＰＧＳＴＴＴＡＤＹＫＤＤＤＤＫＡＴＰＰＰＧＳＴＴＴＡ；配列番号６３）から成った。アルギニンの置換を、リンカーの中央のＦＬＡＧエピトープにおける陰性荷電残基との見込まれる静電相互作用を低減するように設計した。それらの本来の向きで結合するＤおよびＫユニットの能力に対して有害である、明白な相互作用または立体構造の傾向が、いずれのＮｉｆＤ−ＮｉｆＫユニットと融合ポリペプチドのリンカーとの間に、またはリンカー自体の中に存在しないことを確実にするために、形状の最適化および平衡化を、
１０．０Åの溶液からの最小境界距離を有する八面体ＴＩＰ３Ｐウォーターボックス中で定圧にて複合融合ポリペプチド（あらゆる金属中心の包含なし）の二量体により実施した。計算を、２ｆｓの時間ステップとＳＨＡＫＥ制約条件を使用した、合計５ｎｓにわたり２９８Ｋにてｆｆ９９ＳＢ力場を用いるＡｍｂｅｒ１２を使用して実施した。
【０４１８】
その３０アミノ酸リンカーを含めた、ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫ複合ポリペプチドの予測される構造（図１２）を試験し、そして、リンカーの追加は、完全な融合ポリペプチドが天然ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ複合体を模倣した構造に折り畳まれることを可能にすることを示した。ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫポリペプチドの二量体に結合した２つのＮｉｆＨサブユニットをさらに含む第二のモデルを結集し（図１３）、そしてそれは、リンカーの追加がＮｉｆＨサブユニットの結合を妨げるように見えなかったことを示した。そのため、融合ポリペプチドをコードする構築物を、ｐＦＡγＭＴＰを含むＮ末端伸長を有したｐＲＡ００に基づいて設計し、作製した（ｐＲＡ０２）。ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫ融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号６４として提供する。
【０４１９】
第二の構築物では、ＨＡエピトープを含むＣ末端伸長を、ＨＡ抗体を用いた融合タンパク質の検出を可能にするように、コードされたポリペプチドのＮｉｆＫユニットのＣ末端に追加したが、それ以外の点では、コードされたポリペプチドの残りの部分は、ｐＲＡ０２と同じであった。第二の構築物を、ｐＲＡ２０と呼んだ。ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫ：：ＨＡ融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号６５として提供する。最初にコードされた融合ポリペプチドは、構造成分ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ−リンカー（ＦＬＡＧ）−ＮｉｆＫを有したが、それに対して、第二のものは、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ−リンカー（ＦＬＡＧ）−ＮｉｆＫ：：ＨＡであった。
【０４２０】
ｐＲＡ２０をＮ．ベンサミアナ細胞内に導入し、そして、タンパク質抽出物をウエスタンブロッティングによって試験したとき（図１４）、２つの特有のバンドを、約１２０ｋＤａにて、ポリペプチドについて予測されるサイズ範囲内で検出した。２つのバンドの近さが、ＭＴＰプレ配列の未プロセシングおよびプロセシング済形態の両方が存在していることを示唆した。上のバンドは下のバンドより高い強度のものであり、プロセシングが一部にだけ起こったことを示唆した。ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ−リンカー（ＦＬＡＧ）−ＮｉｆＫ：：ＨＡポリペプチドの蓄積のレベルは、並行浸潤におけるｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡのレベルより実質的に高かったが、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ：：ＨＡのレベルよりずっと少なかった（図１４）。
【０４２１】
実施例１３．植物体におけるニトロゲナーゼポリペプチドの同時発現のための多重遺伝子構築物の作出
植物細胞において機能的なニトロゲナーゼを作製するために、３つのコア構造タンパク質ＮｉｆＤ、ＮｉｆＨおよびＮｉｆＫをコードする遺伝子、ならびにＮｉｆＢ、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＮを含めた多くのアクセサリーＮｉｆタンパク質が、細胞において協調的に導入され、そして、発現されることが必要である。複数の導入遺伝子のゲノム組み込みは、異なるＮｉｆポリペプチドの発現をそれぞれ指示する、１つのＴ−ＤＮＡの中に複数の発現カセットを含有する形質転換構築物を使用して達成してもよい。所望であれば、斯かる設計を、一カ所の遺伝子位置へのＴ−ＤＮＡの組み込みのために提供されるであろう。そのため、本発明者らは、一回の形質転換事象で組み合わせられる場合、植物ゲノムにおける１５個の導入遺伝子を含む３つのＴ−ＤＮＡの組み込みを可能にする３つの独立した多重遺伝子構築物を設計し、作製した。その３つのＴ−ＤＮＡは、以下のように、それらが独立して選択され得るように、異なる選択マーカー遺伝子をそれぞれ含んだ。
【０４２２】
Dr Thomas Vanhercke（CSIRO Agriculture and Food, Canberra, Australia）から入手したバイナリーベクターｐＤＣＯＴを、出発ベクターとして使用した。それには、バイナリーベクターｐＯＲＥ＿Ｏ４（Coutu et al., 2007；ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ５６２５４２．１）と同じ骨格配列、ならびに左縁および右縁Ｔ−ＤＮＡ配列がある。選択マーカー遺伝子カセットに加えて、ｐＤＣＯＴのＴ−ＤＮＡ領域は、４つの発現カセットを含有し、そして、各カセットは、強力な、構成的プロモーター、およびクローニング目的の特有の制限部位を両側に配置した、転写ターミネータ／ポリアデニル化領域を含んだ。各プロモーターに続いて、各発現カセットはまた、植物細胞において産生されるであろうｍＲＮＡからの最適化翻訳のための特有のクローニング部位直前のタバコモザイクウイルスΩリーダー配列（ＴＭＶΩ）を含んだ。異なるカセットのプロモーターおよびターミネータ配列を、ベクター内での配列の反復を制限するように変更し、そして、これが形質転換に続く植物内での発現のサイレンシングを低減すると考えた。さらに、カセット１および２、ならびにカセット４、そして、選択マーカーカセットは、ある発現カセットから別のものへの転写干渉を低減するために、それぞれマトリックス関連領域（ＭＡＲ）配列によって区切られた。ｐＤＣＯＴの選択マーカー遺伝子カセットは、抗生物質カナマイシンに対する耐性をもたらすＮＰＴＩＩ遺伝子であった。ｐＤＣＯＴベクターは、発現カセットの配置においてモジュールであり、順に、プロモーター、ＴＭＶΩ、クローニング部位およびターミネータ／ポリアデニル化配列を含む各発現カセットは、特有の制限部位が両側に配置され、そして、カセットの直接的な交換を可能にした。
【０４２３】
形質転換ベクター内の個々の遺伝子発現カセットの数を増やすために、以下のように、本来のｐＤＣＯＴベクターに存在する特有のＫｐｎＩ／ＡａｔＩＩ部位の間のｐＤＣＯＴ内に、第五の発現カセットを挿入した。第五の発現カセットのＤＮＡ断片を、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、それに続いてＴＭＶΩリーダー配列、次に、導入遺伝子の挿入のための特有のクローニング部位（Ｂｓｔｚ１７１／ＳｂｆＩ）、最後にｎｏｓ３’ターミネータ領域、を含むように設計し、合成した。５’ＫｐｎＩ部位と３’ＡａｔＩＩ部位が両側に配置された選択カセット全体を、ｐＤＣＯＴへの方向性クローニングのための制限部位を使用して、ｐＤＣＯＴ内に挿入した。これは、ＭＡＲ配列と選択マーカー遺伝子カセットとの間に第五の発現カセットを挿入した。ｐＫＴ１００の構造を、図１５に図式的に示す。
【０４２４】
ｐＤＣＯＴおよびその誘導体ｐＫＴ１００の一部のプロモーターは、
明所における緑色組織での導入遺伝子発現のために提供されたＡ．サリアナのルビスコ小型サブユニット遺伝子（Arath-Rubisco/SSU）由来のであったが、それに対し、ベクターの他のカセットは、構成的発現のためのＣａＭＶ３５Ｓプロモーター配列を使用した。Ｎｉｆポリペプチドの発現のための最初の構築物に関して、Ａｒａｔｈ−ルビスコ／ＳＵＵプロモーターが、他の植物ウイルスベースの構成的プロモーターに置換され、一方、最終的なベクター内の配列の反復を削減するように、すべてが構成的に発現されるよう所望した。選択される代替の構成的プロモーターは、ケストルム・イエロー・リーフ・カーリングウイルス（Cestrum Yellow Leaf Curling Virus）（ＣｍＹＬＣＶ）プロモーターＣｍ４（Sahoo et al., 2014）、ならびにサブタレニアン・クローバー・スタント・ウイルス（Subterranean Clover Stunt Virus）（ＳＣＳＶ）プロモーターＳ７およびＳ４（Schunmann et al., 2003）の誘導体であった。使用したＣｍ４プロモーター配列は、５末端のＭｌｕＩ部位およびいずれかの不必要な３’ＵＴＲ配列の存在を避けるために、ＣｍＹＬＣＶ転写開始部位（Sahoo et al., 2014）に対して−２７１〜＋５のヌクレオチドを含んだ。各プロモーター配列は、５’ＵＴＲのＴＭＶリーダー配列を含み、かつ、それらが置換するプロモーターに使用されるものに合致した特有の制限部位、具体的には、ＣｍＹＬＣＶ Ｃｍ４向けのＭｌｕＩ／ＢａｍＨＩ、ＳＣＳＶ Ｓ７向けのＮｒｕＩ／ＡｐａＩおよびＳＣＳＶ Ｓ４向けのＸｍａＩ／ＮｏｔＩ、が両側に配置された。各プロモーター配列は、商業的な供給業者によって合成された。標準的な制限消化および方向性クローニングを、ｐＫＴ−ＨＣを作製するための連続した様式で各プロモーター配列を交換するために使用した。
【０４２５】
３つのベクターを使用して、植物細胞において最大１５個の導入遺伝子を協調的に発現するために、各ベクターが異なる選択マーカー遺伝子を有することが所望された。ｐＤＣＯＴ選択カセットの選択マーカー遺伝子は、カナマイシン耐性をもたらすＮｐｔＩＩ酵素をコードした（Bevan et al., 1983）。それぞれ、ハイグロマイシンＢおよびグルホシネート・アンモニウム／フォスフィノスリシン（ＢＡＳＴＡ）への耐性をもたらす、Ｈｐｔ（Waldron et al., 1985）およびＢａｒ（Block et al., 1987）をコードする代替の遺伝子を、これらが選択した植物に使用するのに好適であったので選択した。ｐＤＣＯＴの選択カセットのコード領域のＮｐｔＩＩ制限部位を両側に配置した制限部位に合致するＦｓｅＩ／ＡｓｃＩ制限部位が両側に配置された、これらのポリペプチドをコードするＤＮＡ断片は、商業的な供給業者によって作製された。標準的な制限消化および方向性クローニングを、ｐＫＴ−ＨＣのＮｐｔＩＩコード領域をＨｐｔコード領域またはＢａｒコード領域のいずれかで置き換えるのに使用し、そして、ｐＫＴ−ＨＣ、ｐＫＴ−ＩＣおよびｐＫＴ−ＪＣとも呼ばれる一連の３つの多重遺伝子ベクター作出した。それぞれ、図１５に示す遺伝構造、および表５に概略した成分を有した。
【０４２６】
表５．Ｔ−ＤＮＡベクター内のマルチ発現カセットの成分
【表５】
2020510413.tif 000006
【０４２７】
実施例１４．植物細胞における多重遺伝子ベクターからのＮｉｆポリペプチドの発現
多重遺伝子ベクター内のそれぞれの発現カセットの導入遺伝子発現能力を実証および比較するために、タンパク質コード領域が発現カセットのそれぞれに別々に挿入されたｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ融合ポリペプチドをコードする、一連の５つの構築物を作製した。ＭＴＰ−ＮｉｆＨ−ＨＡの正確な挿入を伴った構築物を、それらのＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素消化産物パターンによって同定し、そして、アグロバクテリウム・ツメファシエンス株ＧＶ３１０１を形質転換するのに使用した。次に、それぞれ３５Ｓプロモーターによって駆動される、３つのＧＶ３１０１株、すなわち、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ構築物を含有するもの、第二のｐＲＡ０１、およびｐ１９サイレンシングサプレッサタンパク質の発現のためのベクターを含有する第三の株、の混合物で浸潤した葉を用いた、Ｎ．ベンサミアナの葉の一過性発現系（実施例１）を、タンパク質発現を評価するのに使用した。この実験では、ｐＲＡ０１は、ＧＦＰ蛍光によるタンパク質合成の正の対照としての役割を果たした。４日後に葉組織を採取し、そして、先に記載したように、タンパク質抽出物を、ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングによって分析した。ウエスタンブロットを、抗ＨＡおよび抗ＧＦＰ一次抗体と、西洋ワサビペルオキシダーゼ（BioRad）に連結したヤギ抗マウス二次抗体を用いて探査した。化学発光シグナルを、Amersham ECL Western Blotting Detection Reagent（GE Healthcare Life Sciences）を適用することによって発生させ、そして、ＣＣＤ撮像装置を使用して記録した。ｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡの発現は、それぞれの個々の発現カセットから観察され（図１６）、それによって、Ｔ−ＤＮＡの一過性の導入後の葉細胞において強力な、構成的様式でＮｉｆ融合ポリペプチドを発現する、多重遺伝子ベクターのそれぞれのプロモーターの能力の妥当性を確認する。
【０４２８】
次に、ｐＫＴ−ＨＣベクターに基づいて、５つの個々のＮｉｆが融合ポリペプチドを１つのＴ−ＤＮＡにコードする多重遺伝子ベクターを構造した。それぞれのＮｉｆコード領域を、各発現カセットの特有のクローニング部位によって連続様式で挿入した。ｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡのコード領域をカセット１に挿入し、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＳ：：ＨＡのコード領域をカセット２に挿入し、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＭ：：ＭＹＣのコード領域をカセット３に挿入し、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＵ：：ＨＡのコード領域をカセット４に挿入し、およびｐＦＡγ：：ＮｉｆＺ：：ＭＹＣのコード領域をカセット５に挿入した（図４）。ｐＦＡγ：：ＮｉｆＭ：：ＭＹＣ融合ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号６７として提供する。ＨＣ１３とも呼ばれる、最終的な構築物を、Ａ．ツメファシエンス株ＧＶ３１０１を形質転換するために使用し、そして、形質転換細胞を、先に記載した方法を使用して、Ｎ．ベンサミアナの葉を浸潤するために使用した。ウエスタンブロット分析は、ＨＣ１３から発現されたポリペプチドが、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＭ：：ＭＹＣ、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＳ：：ＨＡおよびｐＦＡγ：：ＮｉｆＵ：：ＨＡについて予測されたサイズにて明確に検出され得ることを示した（図１７）。ＮｉｆＭおよびＮｉｆＵ融合ポリペプチドは、ＮｉｆＨおよびＮｉｆＳ融合ポリペプチドより低レベルにて蓄積したが、しかし、まだはっきりと検出できた。対照ｐＦＡγ：：ＧＦＰ（レーン２）のレーンでもまた観察された、バックグラウンドシグナルは、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＺ：：ＭＹＣについて予測されたバンドと同じ位置にあったが（図１７Ｂ）、レーン４のシグナル強度は、レーン２よりはるかに強かった。本発明者らは、５つのＮｉｆ融合ポリペプチドすべてが、単独の、隣接した遺伝子構築物から発現されたと結論づけた。
【０４２９】
植物の安定した形質転換
遺伝子構築物を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス株を、浸漬法（Bechtold et al., 1993）、具体的には、ＨＣ１３によってＡ．サリアナを形質転換するために使用した。種子を、処理した植物から採取した。種子を、安定に形質転換された植物を選択するための適切な選択剤を含む組織培養培地に播種し、そしてそれを、成熟するまで栽培するために土壌に移す。トランスジェニックであることが示されている植物からの種子を、採集し、そして、子孫植物を作製するために播種する。導入遺伝子のホモ融合体である子孫植物を同定し、選択する。導入遺伝子の発現レベルを、標準的なｑＲＴ−ＰＣＲ法で分析し、そして、エピトープを含有する融合ポリペプチドの蓄積レベルを、先に記載した一過性発現実験のようにウエスタンブロッティングで測定する。
【０４３０】
実施例１５．同時発現された導入遺伝子に対するＮｉｆＤ構築物の効果
実施例１１に記載のように、特定のＮｉｆＤが融合ポリペプチド（ｐＲＡ０７、ｐＲＡ１９）をコードする構築物を、他のＮｉｆ発現構築物と同時浸潤させたとき、すべてのＮｉｆ発現構築物のすべての発現が、有意に低減されたことを予想外に観察した（図１０）。特定の構築物ｐＲＡ１９は、ヒトコドン利用にしたがって最適化したヌクレオチド配列を有した。そのため、本発明者らは、それを回避する試みにおいて、低減された発現の範囲と原因を理解しようと考えた。
【０４３１】
まず、この効果がｐＲＡ１９とｐＲＡ０１の組み合わせに特異的であったか調べるために、ｐＲＡ０１からのＴ−ＤＮＡ（ｐＦＡγ：：ＧＦＰ）を、単独またはｐＲＡ１９（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ、最適化したヒトコドン）もしくはｐＲＡ１６（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＳ：：ＨＡ）と組み合わせて、Ｎ．ベンサミアナ葉細胞に導入したか、あるいは、３つのｐＲＡ０１、ｐＲＡ１９およびｐＲＡ１６すべてを組み合わせた。先にあるとおり、サイレンシング抑制因子ｐ１９を発現する構築物を含むＡ．ツメファシエンスを、対照を含めたすべての浸潤物に含んだ。浸潤の４日後に、浸潤させたＮ．ベンサミアナの葉の背軸面を、紫外線（ＵＶ）光に晒し、そして、ＧＦＰ発現の強度を測定するために写真撮影した。ｐＲＡ０１を用いて浸潤した領域に見られた蛍光と比較して、ほとんど見ることができない蛍光を有する、ｐＲＡ１９＋ｐＲＡ０１のＧＦＰ蛍光の有意な低減があった。対照的に、ｐＲＡ１６＋ｐＲＡ０１に関して、蛍光は明確に見えたが、２つのＴ−ＤＮＡを使用したときに希釈から予想できるように、ｐＲＡ０１単独と比較して、蛍光のいくらかの低減が観察された。次に、ＧＦＰおよびＮｉｆＳ融合ポリペプチド蓄積のレベルを、抗ＨＡおよび抗ＧＦＰ抗体を使用した、ゲル電気泳動およびウエスタンブロッティングによって比較した。観察したＧＦＰ蛍光レベルと一致して、ｐＲＡ１９がｐＲＡ０１と共に同時浸潤させたとき、ｐＦＡγ：：ＧＦＰ蓄積のレベルは低下したが、その一方で、ｐＲＡ１６とｐＲＡ０１を同時導入したとき、ｐＦＡγ：：ＧＦＰのレベルはわずかだけ下がった（図１８）。３つの構築物すべてを同時導入したとき、ｐＲＡ１９が含まれなかったときと比較して、ｐＦＡγ：：ＮｉｆＳ：：ＨＡ蓄積のレベルもまたかなり下がった。そのため、ｐＲＡ１９からのＴ−ＤＮＡの導入によって引き起こされる低減は、ｐＲＡ０１からのｐＦＡγ：：ＧＦＰの低減に限定されなかった。
【０４３２】
この下方調節の範囲および様式をさらに調べるために、追加の構築物を、単独で、もしくはｐＲＡ１９と組み合わせて、またはＮｉｆＤ融合ポリペプチドをコードする他の構築物と共に導入し、そして、タンパク質とｍＲＮＡ導入遺伝子発現レベルの両方を分析し、ならびにＵＶ光下での蛍光強度も分析した。先と同じように、ｐＲＡ１９からのＴ−ＤＮＡの導入は、ＧＦＰ蛍光、ならびにＧＦＰと、同時導入したｐＲＡ１６からのｐＦＡγ：：ＮｉｆＳ：：ＨＡ融合ポリペプチドの両方のタンパク質レベルの低減につながった。しかしながら、これは、ｐＲＡ２４（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ、アラビドプシスコドン利用によるコドン最適化）またはｐＲＡ２０が同時導入されたときに、ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ融合ポリペプチド（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫ：：ＨＡ）をコードする場面ではなかった。とりわけ、ｐＲＡ２４およびｐＲＡ２０は、ｐＲＡ１９に対して同一のＮｉｆＤアミノ酸配列をコードしたが、それらがアラビドプシスコドン利用に基づいてコドン最適化されたので、異なるヌクレオチド配列を使用した。これらの観察に基づいて、本発明者らは、ｐＲＡ１９の下方調節効果が、ｐＲＡ１９のＴ−ＤＮＡから転写される特定のＮｉｆＤコードＲＮＡ配列によって引き起こされる可能性があると考えた。
【０４３３】
下方調節効果がタンパク質および／またはＲＮＡレベルで起こるか特定するために、ＲＮＡを、同じ浸潤領域から抽出し、そして、ｑＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＧＦＰ特異的プライマーを使用して、ｐＲＡ１９＋ｐＲＡ０１組み合わせのＧＦＰ ｍＲＮＡのレベルが、ｐＲＡ０１単独のレベルに対して約２５％以下まで低減したことがわかった。ｐＲＡ１６とｐＲＡ０１を組み合わせたとき、低減は、２つの構築物を組み合わせたときに予測されるとおり、ｐＲＡ０１単独と比較して５０％未満であった。次に、ｐＦＡγペプチドをコードするＲＮＡの一部にアニールするプライマーを使用することで、該プライマーが同時に発現された両方の導入遺伝子からｍＲＮＡ領域を増幅する場合、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイは、導入遺伝子低減のレベルが、ｐＲＡ１６＋ｐＲＡ０１と比較して、ｐＲＡ１９＋ｐＲＡ０１組み合わせに関して約５０％超であったことを測定した。総合すれば、これらの結果は、Ｎ．ベンサミアナ葉細胞へのｐＲＡ１９の導入が、同時発現された導入遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルの両方を低減する効果を有したことを示した。対照遺伝子（ＧＡＤＰＨ）の発現レベルがすべての浸潤実験を通じて一定であり、かつ、総タンパク質合成のレベルは、ゲルのクーマシー染色によって証明されたとおり、すべての浸潤物について類似しているように見えたので、これが、一般的なｍＲＮＡ／タンパク質の下方調節効果でないと思われた。総合すれば、これらの結果は、ｐＲＡ１９のＴ−ＤＮＡから産生されるＮｉｆＤポリペプチドをコードするｍＲＮＡの固有特性が、ｍＲＮＡおよびタンパク質レベルにて同時導入された導入遺伝子の下方調節につながったことを示唆した。
【０４３４】
ＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングの十分に確立された様式の一つは、相補配列またはほぼ相補的配列を有するポリヌクレオチドの発現を低減するアルゴノート（Argonaute）タンパク質を誘導する２１〜２４ヌクレオチドの長さのｓｉＲＮＡによって影響を受けること、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれるプロセス、が知られている。しかしながら、ｐＲＡ０１（ＧＦＰ）またはｐＲＡ１６（ＮｉｆＳ）によってコードされるＲＮＡ配列と、ｐＲＡ１９からのヒトコドン最適化コード領域のＲＮＡ配列のアラインメントが、アルゴノート媒介性サイレンシングに必要とされる配列相補性を提供するのに十分な相同性の範囲にないことがわかった。この知見に基づいて、特定のＮｉｆＤ ＲＮＡ配列が、同時導入した導入遺伝子のサイレンシングを始動したが、サイレンシングエフェクターが、ｐＲＡ１９構築物内−ＧＦＰおよび他の導入遺伝子と配列相補性を共有する領域内のほかの場所に常駐していると仮定した。この仮説を試験するために、ｐＲＡ１９と同一であるが、ｍＭＴＰを含有し、そのため、ＭＴＰ領域の部分で異なるＲＮＡ配列と評価されるｐＲＡ２２（ｍＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ）を、ｐＲＡ０１と同時導入した。比較のために、ｐＲＡ１９＋ｐＲＡ０１とｐＲＡ２４＋ｐＲＡ０１組み合わせもまた導入した。蛍光強度から、ｐＲＡ２２＋ｐＲＡ０１組み合わせは、ｐＲＡ２４＋ｐＲＡ０１組み合わせとほぼ同じレベルにてＧＦＰを発現したように見えた。ウエスタンブロッティングから、ｐＲＡ２４＋ｐＲＡ０１およびｐＲＡ２２＋ｐＲＡ０１組み合わせの両方が、ＧＦＰタンパク質の蓄積の低減をほとんど示さなかったが、その一方で、ｐＲＡ１９＋ｐＲＡ０１は、ＧＦＰタンパク質の有意な減少を示した。これらの結果は、ＭＴＰ配列を、他の導入遺伝子に対して低い相補性を有する配列に修飾することが、ヒトコドン最適化ＮｉｆＤ配列による下方調節を緩和することを実証した。これは、ｐＦＡγ配列と組み合わせた、ｐＲＡ１９のヒトコドン最適化ＮｉｆＤ ＲＮＡが導入遺伝子の下方調節を始動したことを示唆した。あるいは、しかし、相互排他的ではなく、ＮｉｆＤヌクレオチド配列自体は、下方調節の開始を始動するのに十分であるが、ＮｉｆＤ ＲＮＡの領域上流が、それらの下方調節を引き起こすために、導入遺伝子に対して相補的であることが必要であった。
【０４３５】
他の導入遺伝子に対するヒトコドン最適化ＮｉｆＤの下方調節効果が、ＮｉｆＤタンパク質ではなく、ＮｉｆＤ ＲＮＡの特性であることを確認するために、
ｐＲＡ１９とほとんど同一のＲＮＡ配列であるが、未成熟終止コドンおよびＭＴＰ内のフレームシフトを作り出す２つのヌクレオチド変更を有した構築物を設計した。これは、ｐＲＡ２６（ΔＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ）と呼ばれた。下方調節の機構がタンパク質媒介性ではなく、ＲＮＡ媒介性である場合、ｐＲＡ２６が、ＧＦＰおよびｐＲＡ１９に類似した他のＮｉｆ構築物を下方制御すると予測される。追加試験として、ヒトコドン最適化ＮｉｆＤ構築物ｐＲＡ０７（ｐＦＡγ：：ｎｉｆＤ：：ＦＬＡＧ）もまた同時導入した。ｐＲＡ０７は、ＨＡエピトープはＦＬＡＧによって置換されるので、エピトープ領域ではなく、ＮｉｆＤ領域のｐＲＡ１９に対して同一のＲＮＡ配列を発現する。５日後に、蛍光のレベルを、浸潤区域で観察した。先の実験と一致して、ＧＦＰ蛍光は、ｐＲＡ１９＋ｐＲＡ０１組み合わせに関して低減した。蛍光はまた、ｐＲＡ２６＋ｐＲＡ０１およびｐＲＡ７＋ｐＲＡ０１組み合わせの両方に関して有意に減少した。ウエスタンブロッティングは、ｐＲＡ２６が、ｐＲＡ１９と比較したＧＦＰ発現を低減する際に類似効果を有したことを示した。ヒトコドン最適化ＮｉｆＤ ｍＲＮＡは、ＮｉｆＤタンパク質が産生されないときであっても、またはエピトープが変更された場合であっても、他の導入遺伝子の発現を低減できると結論づけた。ヒトコドン最適化ＮｉｆＤ ＲＮＡ配列の変更が導入遺伝子の下方調節を妨げたことを示す以前の結果と組み合わせて、ｐＲＡ１９のＮｉｆＤ配列による導入遺伝子発現の低減は、特定のＮｉｆＤヒトコドン最適化ＲＮＡ配列の結果として起こったことを、最終的に実証した。ｐＲＡ１９のｐＦＡγ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ融合ポリペプチドコード領域のヌクレオチド配列を、配列番号６８として提供する。
【０４３６】
実施例１６．Ｎｉｆポリペプチド機能を試験するための細菌発現実験
先の実施例に記載したとおり、遺伝構築物を作製し、植物細胞におけるＮｉｆ融合ポリペプチドの産生について試験し、そして、Ａ．ツメファシエンスによる合成遺伝子の導入を用いたＮ．ベンサミアナ葉細胞系を使用して例示した。融合ポリペプチドを、ＮｉｆポリペプチドのＮ末端に付加されたミトコンドリア標的化ペプチド（ＭＴＰ）、およびＣ末端伸長に付加されたエピトープタグのインフレーム融合を有するように設計した。タンパク質の折り畳みおよび関連のモデリング（実施例１０）では、Ｎ末端およびＣ末端伸長の大部分が、複合体形成および機能を妨げるはずであると予測したが、本発明者らは、これらの伸長が天然Ｎｉｆポリペプチドに関連した融合ポリペプチドの機能に影響するかどうか、インビトロ生物系で試験したかった。
【０４３７】
植物細胞における発現およびミトコンドリアへの転移、ならびにそれらのプロセシングポリペプチド産物のために設計したＮｉｆ融合ポリペプチドを、細菌ニトロゲナーゼ発現系におけるそれらの機能に関して試験した。本発明者らは、ニトロゲナーゼ系への添加によって個別に、または繰り返してもしくは他の修飾Ｎｉｆポリペプチドと組み合わせであっても、それぞれの修飾ポリペプチドをアッセイすることを可能にするシステムを設定した。この系は、Ｅ．コリにおいて、野生型Ｎｉｆポリペプチドをコードする対応遺伝子に代わって、試験するＮｉｆ融合ポリペプチドをコードする単一のＮｉｆの遺伝子を交換することによって修飾した野生型ニトロゲナーゼ遺伝子クラスタを使用した。この後には、Ｎｉｆ融合ポリペプチドが、対応する野生型Ｎｉｆポリペプチドに代わって機能するかどうか特定するために、それぞれエチレンおよび水素産生アッセイを使用したニトロゲナーゼまたはニトロゲナーゼレダクターゼ活性のアッセイが続いた。Smanski et al. (2014)の系に基づく細菌ニトロゲナーゼベクター系が、このベースであった。この系では、ニトロゲナーゼ活性に必要とされる野生型遺伝子のすべてを、単一の、幅広い宿主範囲の発現ベクター、ｐＭＩＴ２．１の中に含有し、ここで、遺伝子の発現は、第二のプラスミド、ｐＮ２４９からの誘導プロモーター／Ｔ７−ＲＮＡポリメラーゼ系を用いて制御した。Ｅ．コリで発現されるとき、野生型細菌Ｎｉｆポリペプチドの完全なセットが産生され、標準的なアセチレン還元アッセイにおけるアセチレンからのエチレンの産生によって、またはニトロゲナーゼレダクターゼ活性に代わる水素産生によって（ＡＲＡ、ニトロゲナーゼ活性の事実上の計測）、その活性がアッセイされ得るニトロゲナーゼ酵素複合体を一緒に提供した。
【０４３８】
ｐＭＩＴ２．１およびその誘導体と一緒に使用する方法は、以下のとおりであった。Ｅ．コリ株ＤＨ５αの細胞を、それぞれ抗生物質クロラムフェニコールおよびスペクチノマイシンへの耐性を与える２つのプラスミドｐＭＩＴ２．１およびｐＮ２４９で形質転換した。形質転換細胞を、クロラムフェニコール（３４ｍｇ／Ｌ）およびスペクチノマイシン（８０ｍｇ／Ｌ）を含有するＬＢ培地（１０ｇ／Ｌのトリプトン、５ｇ／Ｌの酵母抽出物、１０ｇ／ＬのＮａＣｌ）上で培養することによって選択した。形質転換細胞を、抗生物質の入ったＬＢ培地中、３７℃にて一晩、１．０の吸光度まで好気的に培養した。培養物を１０，０００ｇにて１分間遠心分離し、そして、上清を取り除いた。その細胞を、１．５のｍＬ／Ｌの１０％セリンを補った、Ｎ源不含の、２５ｇ／ＬのＮａ2ＨＰＯ4、３ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、０．２５ｇ／ＬのＭｇＳＯ4．７Ｈ2Ｏ、１ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．１ｇ／ＬのＣａＣｌ2．２Ｈ2Ｏ、２．９ｍｇ／ＬのＦｅＣｌ3、０．２５ｍｇ／ＬのＮａ2ＭｏＯ4．２Ｈ2Ｏおよび２０ｇ／Ｌのスクロース（最少培地）を含有する誘導培地１倍量中に再懸濁した。原液を、濾過滅菌した。Ｎｉｆ遺伝子発現の誘導のために、培地には、０．１ｍＭ、０．５ｍＭまたは１．０ｍＭ、特に明記しない限り、概して１．０ｍＭの終濃度にて、イソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（IPTG;Gold Bio#I2481C25 259）を補った。細胞懸濁液を、１３ｃｃの培養フラスコに移し、そして、クリンプ−ロックシステムを備えた気密ゴムシールを用いて蓋をし、ヘッドスペースを２０分間、純Ｎ2ガスでスパージした。次に、懸濁液を、２００ｒｐｍで振盪しながら、３０℃にて５時間インキュベートした。この後、アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）を、１．５ｃｃの純Ｃ2Ｈ2（ＢＯＣガス、装置グレード）の注入と３時間からその後１８時間までのさらなるインキュベーションによって開始した。両時点のエチレン産生を、Agilent 6890N GC装置を使用した炎イオン化検出（ＧＣ−ＦＩＤ）を用いたガスクロマトグラフィーで計測した。ヘッドスペースサンプル（０．５ｃｃ）を、１０：１分割モードによりスプリット／スプリットレス注入口に手動で注入した。装置を、以下のパラメーターで操作した：２００℃の注入口およびＦＩＤ温度、３５ｃｍ／秒の担体Ｈｅの平均速度、１２０℃の等温オーブン温度。ＲＴアルミナＢｏｎｄ／ＭＡＰＤカラム（３０ｍ×０．３２ｍｍ×５μｍ）を、検出装置の末端に連結した５ｍの粒子トラップカラムと共に使用した。装置の分析性能を、好適なブランクおよび標準を実施することによって評価した。これらの条件下では、エチレンは、約２．３分でカラムから放出され、およびアセチレンは約３．１分でカラムから放出された。このＧＣシステムは、この様式で唯一の他の検出可能ピークとしてアセチレンからの明確な分解能で０．００００１％ａｔｍまで低いレベルにてエチレンを検出可能であり、それほど高感度であった。エチレン産生に関して、０．５ｃｃのヘッドスペースサンプルをＩＰＴＧ添加後に様々な時点、通常、３時間および１８時間で採取した。
【０４３９】
正の対照としてＥ．コリ株ＤＨ５αの野生型ｐＭＩＴ２．１およびｐＮ２４９を使用したアッセイシステムは、成長培地にＩＰＴＧが添加されなかったときには、痕跡レベルのエチレンしか産生せず、それに対して、成長培地への０．１ｍＭ、０．５ｍＭまたは１．０ｍＭのＩＰＴＧの添加が、エチレン産生量を大きく増強した。エチレン産生速度は、３時間のサンプリングから１８時間まで大いに増加し、またＩＰＴＧ濃度が増加するにつれても増加し、そして、増加したＮｉｆ遺伝子発現に伴う増加したニトロゲナーゼ活性を示した。これらの結果は、ＩＰＴＧが、この発現系においてＮｉｆ遺伝子発現およびニトロゲナーゼ形成を急速に誘発したことを示し、Smanski et al., (2014)の報告と一致した。
【０４４０】
先の実施例に記載のとおり、ｐＦＡγ ＭＴＰアミノ酸配列は、植物ミトコンドリア内で切断されて、プロセシングＮｉｆ融合ポリペプチドのＮｉｆポリペプチドのＮ末端に融合した３８アミノ酸残基を残した。斯かるＮ末端伸長が融合ポリペプチドの機能を変更するか試験するために、および微生物アッセイシステムが動作するか実証するために、１１７ｂｐのＤＮＡ断片（配列番号７０）を、鋳型としてｐＲＡ１０ ＤＮＡを使用したＰＣＲによって合成した。このＤＮＡ断片は、翻訳開始のためのＭｅｔによるＮ末端のＩｌｅ残基の置換、およびＣ末端におけるＴｈｒ残基の追加を除いて、ｐＦＡγ ＭＴＰのＣ末端部分と同じ配列の３８個のアミノ酸をコードした。それを、Ｎｉｆポリペプチドのいずれか１つをコードする遺伝子の開始コドンの上流に直接インフレーム融合されたときに、キメラ遺伝子が、選択されたＮｉｆポリペプチドへの翻訳融合をコードするように設計した。以降、ｐＦＡγ−Ｃと呼ばれる、３９アミノ酸ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号７１として提供する。
【０４４１】
ｐＦＡγ−ＣのＤＮＡ断片を、平滑末端連結反応、スプライスオーバラップＰＣＲおよび誘導リガーゼサイクル技術（de Kok et al., 2014）を含めた様々な技術によって、ｐＭＩＴ２．１内のＮｉｆＨ、ＮｉｆＭ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＮまたはＮｉｆＢをコードする遺伝子の翻訳開始コドンのすぐ上流に挿入した。例として、１１７ｂｐのＤＮＡ断片を、次のようにして、ｐＭＩＴ２．１上のＮｉｆＤ遺伝子のタンパク質コード領域とインフレーム融合した。ｐＭＩＴ２．１のＤＮＡを、ＮｉｆＤ遺伝子の開始コドン（ＡＴＧ）が５’末端に存在し、かつ、翻訳開始コドンの５’のすぐ近くのＮｉｆＤ遺伝子のヌクレオチド配列が、その産物の３’末端を形成するような、直鎖ＤＮＡ産物を作製するためのプライマーを使用して増幅した。これを達成するために、ＰＣＲを、プライマーＮｉｆＤ−Ｆ ５’ＡＴＧＡＴＧＡＣＴＡＡＴＧＣＴＡＣＴＧＧＣＧＡＡＣＧＴＡＡＣＣＴＧ−３’（配列番号７２）およびＮｉｆＤ−Ｒ ５’ＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＣＴＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴＧＴＧＡ−３’（配列番号７３）を使用して実施した。増幅を、ｐＭＩＴ２．１ ＤＮＡ鋳型と共に、Phusion-HF Proofreadingポリメラーゼ（NEB、カタログＭ０５０８１Ｌ）を使用し、９６℃にて３０秒間、次に、９２℃にて２０秒間、５５℃にて２０秒間、そして７２℃にて６分間を３０サイクル、次に、７２℃にて１０分間、のＰＣＲプロトコールを用いて実施した。反応産物を、ＤｐｎＩと共に処理して、ベクター鋳型ＤＮＡを取り除いた。ＰＣＲ産物は、実質的に、ＮｉｆＤ翻訳開始コドンのすぐ上流で開環された、ｐＭＩＴ２．１の線状形態であった。１１７ｂｐの断片を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを使用して線状化ｐＭＩＴ２．１に連結して、ｐＣＷ１００１を作製した。１１７ｂｐの断片の連結はまた、Illumina Ampligase（Illumina, A8101）およびKok et al. (2014)に概説された条件を使用した連結サイクル反応条件（ＬＣＲ）を使用して実現した。
【０４４２】
ｐＭＩＴ２．１ ＤＮＡに対する増幅反応の信頼性と精度を測定し、そして、野生型Ｎｉｆ遺伝子におけるヌクレオチド置換が起こっていないことを実証するために、線状化ｐＭＩＴ２．１ ＤＮＡのサンプルを、環状分子を作り直すように連結し、そして、Ｅ．コリがＤＨ５αを形質転換するのに使用した。再連結ｐＭＩＴ２．１を含有する約１０個の別々のコロニーを、先に記載したように、アセチレンからのエチレン産生についてアッセイして、不活性化突然変異が、ＰＣＲ増幅によってＤＮＡ内に組み込まれないことを実証する。構築物の精度と信頼性を確実にするために、ベクターはまた配列決定されてもよい。
【０４４３】
ベクターｐＣＷ１００１およびｐＮ２４９を、ＤＨ５αに導入し、クロラムフェニコールおよびスペクチノマイシンによって形質転換細胞を選択した。誘導培地中でこれらの細胞から培養した培養物を、基質としてのアセチレンガスの添加を伴った、遺伝子発現を誘発するための１ｍＭのＩＰＴＧおよびヘッドスペースとしてのＮ2ガスを使用したＡＲＡアッセイにおいてエチレン産生について試験する。エチレンの産生は、他の野生型ＮｉｆＤポリペプチドへの３９アミノ酸Ｎ末端伸長が、ニトロゲナーゼ活性を許容することを示す。
【０４４４】
翻訳開始コドンのすぐ上流の位置に、いずれの場合にもｐＭＩＴ２．１ ＤＮＡを線状化し、そして、その位置に１１７ｂｐの断片を挿入する適切なプライマー対を使用した類似のアプローチを、ｐＭＩＴ２．１の、例えばＮｉｆＨ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＥ、ＮｉｆＭおよびＮｉｆＮを含めた、他のＮｉｆ遺伝子を修飾するために使用する。修飾Ｎｉｆ融合ポリペプチドの組み合わせが、他の野生型ニトロゲナーゼ複合体において機能を保持するか試験するために、Ｎｉｆ遺伝子修飾の連続したラウンドもまた、単一のベクターへの２以上のＮｉｆ遺伝子修飾の組み合わせを産生するために実施する。
【０４４５】
Ｎｉｆ融合ポリペプチドの生物学的機能を試験するための代替のアッセイシステムは、特定のＮｉｆ遺伝子の突然変異体であるＡ．ビネランジーの変異体を使用した細菌補完性アッセイである。これを達成するために、Ｎｉｆ融合ポリペプチドをコードする遺伝子配列を、例えば、細菌Ａ．ビネランジーの菌株において伝播されるｐＭＭＢ６６ＥＨ（Furste et al. 1986）などの広域宿主プラスミド内に個別に挿入する。ＮｉｆＨ融合ポリペプチドの機能を試験するために、それぞれの得られた遺伝子構築物を、Ａ．ビネランジーの突然変異株、例えば、内因性ｎｉｆＨ遺伝子の５’末端から２００ｂｐを欠いた菌株ＤＪ１２７１、に導入する。個々のＮｉｆ活性を欠く他の突然変異株を、表６で列挙する。これらの突然変異は、適切な生育条件下で空中窒素を固定できない変異体をもたらす。ＤＪ１２７１における機能的なＮｉｆＨ遺伝子の発現は、例えば、ニトロゲナーゼ活性を復元する。そのため、これは、他のＮｉｆポリペプチドに結合したときに、機能について修飾ＮｉｆＨ融合ポリペプチドを評価するのに有用な試験系である。
【０４４６】
これらのポリペプチドの機能を評価するために、形質転換体の成長を、無窒素培地において評価する。成長培地における追加の窒素源がない状態で、Ａ．ビネランジーは、成長のために空中窒素を固定しなければならない。修飾ＮｉｆＨ融合ポリペプチドが機能的である場合、そのとき、ＤＪ１２７１におけるこれらのポリペプチドの過剰発現が、追加の窒素を欠いている固形培地上で成長する能力を復元するはずである。あるいは、ニトロゲナーゼ機能は、先に概説した方法の中の、アセチレン還元アッセイ（ＡＲＡ）によってアッセイできる。ＡＲＡ測定は、窒素不含培地上での培養に比べて、より高い感度でニトロゲナーゼ活性を計測する。
【０４４７】
ニトロゲナーゼ機能に必要とされる他のＮｉｆ成分のすべてが細菌にコードされているこれらの発現系では、細菌におけるＮｉｆ融合ポリペプチドの機能を試験する。
【０４４８】
表６．ニトロゲナーゼ機能（細菌の補完性）に関してＮｉｆ融合ポリペプチドを試験するのに使用できるＡ．ビネランジーの突然変異株
【表６】
2020510413.tif 000007
【０４４９】
実施例１７．ＭＴＰ配列の修飾とＮｉｆポリペプチドを伴ったその利用
実施例５〜９に記載し、かつ、使用した長さ７７アミノ酸残基のｐＦＡγ ＭＴＰ配列（配列番号３８のアミノ酸１〜７７）は、アラビドプシス・サリアナＦ１ＡＴＰアーゼ−γ−サブユニット（Lee et al, 2012）由来であり、その断片を本明細書中ではＭＴＰ−ＦＡγ77と呼んだ。ＭＴＰ−ＦＡγ77と遠位Ｎｉｆポリペプチドとの間の翻訳融合をコードする遺伝子配列を作製するために実施例５で使用したクローニングプロトコールは、ＡｓｃＩクローニング部位および読み枠を維持するための追加的な塩基から成る融合接合部にて介在９ヌクレオチドリンカーを使用した。このリンカーの使用は、ＭＴＰ−ＦＡγ77のＣ末端と着目のポリペプチド（例えば、ＧＦＰまたはＮｉｆ）のＮ末端の間で、さらなる３つのアミノ酸、すなわち、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ（ＧＡＰ）をもたらした。そのため、コードされたポリペプチドには、ミトコンドリアにおける切断前に、融合ポリペプチドのミトコンドリアへの移動、およびミトコンドリアマトリックスペプチダーゼ（ＭＭＰ）による予測された部位での切断に影響することが示された８０アミノ酸のＮ末端伸長が含まれた。実施例５〜９に記載のとおり、ＭＴＰ−ＦＡγ77が、１６個の異なるＮｉｆ融合ポリペプチドを植物ミトコンドリアマトリックスに向かわせることができ、かつ、ＭＴＰ−ＦＡγ77配列が、ミトコンドリア内でＭＭＰによってプロセシングされたと結論づけた。切断は、４２アミノ酸の後ろで起き、そして、ＧＦＰまたは着目のＮｉｆポリペプチドに融合した３８アミノ酸残基のＮ末端伸長、ＭＴＰ−ＦＡγ77由来の３５残基およびＧＡＰを残した。このＮ末端伸長は、本明細書中でＦＡγ−ｓｃａｒ38と呼ばれる。
【０４５０】
本発明者らは、植物細胞におけるＮｉｆポリペプチドとの使用のためにＭＴＰ−ＦＡγ77の７７アミノ酸からのＭＴＰ配列を短くしようと考えたが、それでも、ＭＴＰ機能を保持したままであった。本発明者らは、ＭＴＰ−ＦＡγ51（配列番号７５）と呼ばれるＭＴＰを作製するために、２６アミノ酸がＭＴＰ−ＦＡγ77のＣ末端から切り取られ得るか調べた。本発明者らは、ＭＴＰ−ＦＡγ51が、アミノ酸４２の後ろでＭＰＰによって切断され、そして、プロセシング融合ポリペプチドのＮ末端にてＭＴＰ−ＦＡγ51から９つのアミノ酸（ＩＳＴＱＶＶＲＮＲ；配列番号７６）を残すと予測した。この９アミノ酸配列を、ＦＡγ−ｓｃａｒ9と呼んだ。
【０４５１】
ＭＴＰ−ＦＡγ51の機能を試験するために、ＮｉｆＨまたはＧＦＰに融合したこのＭＴＰをコードする遺伝子構築物を作製した。これらの構築物は、ＭＴＰ−ＦＡγ51を、ＭＴＰ−ＦＡγ77およびＧＡＰよりむしろ、それぞれのポリペプチドのＮ末端に融合したことを除いて、ｐＲＡ１０（配列番号４２）のＮｉｆＨの遺伝子またはｐＲＡ０１（配列番号３８）のＧＦＰ遺伝子と同一である修飾ＮｉｆＨまたはＧＦＰ遺伝子を含んだ。得られた構築物を、ｐＲＡ３４（ＭＴＰ−ＦＡγ51：：ＮｉｆＨ）およびｐＲＡ３５（ＭＴＰ−ＦＡγ51：：ＧＦＰ）と呼んだ。切断を、例としてｐＲＡ０１を使用した、連結サイクル反応（de Kok et al 2014）によって実施した。ＭＴＰ−ＦＡγ77のＣ末端の２９アミノ酸をコードするヌクレオチドおよびＧＡＰのアミノ酸をコードする追加の９ヌクレオチドを含まないｐＲＡ０１を、プライマー５’−ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧ−３’（配列番号ｘｘｘ）および５’−ＧＣＧＧＴＴＡＣＧＣＡＣＣＡＣＴＴＧＡＧＴＴＧ−３’（配列番号ｘｘｘ）ならびに鋳型としてのｐＲＡ０１を使用したＰＣＲによって増幅した。得られたＰＣＲ産物を、de Kok et al. (2014)で概説された条件で、架橋オリゴ５’−ＣＴＣＣＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＣＧＧＴＴＡＣＧＣＡＣＣＡＣＴＴＧＡＧＴＴＧ−３’およびIllumina Ampligase（Illumina, A8101）を用いて連結した。これらの構築物を、Ｎ．ベンサミアナ葉システムで試験し、そして、ＭＴＰ−ＦＡγ77およびＧＡＰを有する対応する構築物と比較した。ｐＲＡ３４およびｐＲＡ１０に関しては、タンパク質抽出物を、浸潤葉組織から産生した。抽出物を、ＨＡ抗体を使用したＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析に供し、比較のためにタンパク質発現レベルおよびＭＰＰプロセシング効率を評価した。
【０４５２】
未プロセシング融合ポリペプチドの対照として使用されるＭＴＰ−ＦＡγ51：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ（ｐＲＡ３４）およびＭＴＰ−ＦＡγ77+GAP：：ＮｉｆＨ：：ＨＡ（ｐＲＡ１０）をコードする構築物を発現するＥ．コリからのタンパク質抽出物は、未プロセシングＭＴＰ：：ＮｉｆＨについて予測されたサイズのポリペプチドバンドをもたらした。これらの構築物を浸潤させたＮ．ベンサミアナ葉組織からのタンパク質抽出物は、対応する細菌抽出物より小さいサイズのポリペプチドバンドをもたらし、そしてそれは、プロセシングポリペプチドについて予測されたサイズに相当した。例えば、ＭＴＰ−ＦＡγ51：：ＮｉｆＨ：：ＨＡポリペプチドの発現は、これらの２つのポリペプチドの間の予測されたサイズの差にしたがって、ＭＴＰ−ＦＡγ77+GAP：：ＮｉｆＨ：：ＨＡより小さいＭＷにおいてバンドをもたらした。そのため、ＭＴＰ−ＦＡγ51アミノ酸配列は、Ｎｉｆポリペプチドを植物細胞のミトコンドリアマトリックスに対して標的化することができ、かつ、ＭＰＰによるプロセシングを提供すると結論づけた。そのポリペプチド発現レベルとプロセシング効率は、より長いＭＴＰのように良好であった。さらに、分解産物を示すと考えられる、より小さいサイズのより少数のポリペプチドバンドが、ｐＲＡ３４のブロットでＨＡ抗体を用いて検出された。本発明者らは、より短いＭＴＰ配列は、予想外に破壊されたＮ末端 ＭＴＰ：：Ｎｉｆ分解物であると結論づけた。
【０４５３】
実験はまた、融合ＧＦＰポリペプチドをコードするｐＲＡ３５を用いて、それをｐＲＡ０１と比較するためにも実施された。蛍光によってポリペプチドの局所化を可視化するために、ｐＲＡ０１（ｐＦＡγ77+GAP：：ＧＦＰ）またはｐＲＡ３５（ＦＡγ51：：ＧＦＰ）をコードする構築物を用いて浸潤した葉組織を、共焦点顕微鏡によって試験した。葉サンプルを、４０×浸水対物レンズを備えた正立Ｌｅｉｃａ顕微鏡を使用して画像化した。ＧＦＰを４８８ｎｍにて励起させ、そして蛍光放出を記録した。両方の構築物に関して、ＧＦＰ蛍光は、同一の局所化パターンで、小さい非細胞体内に局限することが観察された。実施例１に記載のミトコンドリア局所化について試験したｐＲＡ０１との比較に基づいて、かつ、ｐＲＡ３４のプロセシングデータから、本発明者らは、短縮ＭＴＰ−ＦＡγ51が、合成融合ポリペプチドを植物細胞のミトコンドリアに向かわせることができ、かつ、ミトコンドリアにおけるＭＰＰによるそれらのプロセシングを提供できると結論づけた。
【０４５４】
さまざまな異なるＭＴＰ配列を、Ｎｉｆポリペプチドを植物細胞のミトコンドリアマトリックスに転移させるそれらの性能を評価するために試験した。GoldenGateクローニングシステム（Weber et al., 2011）を、プロモーター、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ、ＮおよびＣ末端伸長、ならびにターミネータを含めたさまざまな遺伝子要素を組み立てるために使用した。各要素は、モジュールの集合および要素の簡単な交換を可能にする境界を規定した。そのため、Engler et al., (2014)によって説明された成分を用いたこのクローニングシステムを、ＭＴＰ：：Ｎｉｆ融合ポリペプチドの産生のためのさまざまな異なる遺伝子構築物を試験するために使用した。GoldenGateクローニングシステムは、それらの認識配列の外側で切断するＩＩＳ型制限酵素を利用したので、接合部配列内の制限酵素クローニング部位の使用を避けることができた。これは、ｐＲＡ００内に存在するＧｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ配列なしにＭＴＰ：：Ｎｉｆ融合をコードする遺伝子の構築を可能にし、かつ、実施例５〜９に記載のＡｓｃＩ制限部位の使用を回避した。ＭＴＰ：：ポリペプチド融合の接合部におけるＧｌｙ−Ｇｌｙ架橋を、GoldenGateシステムを適合させるために、代わりに使用した。ＭＴＰ配列の−１位におけるその共通した発生のため、グリシンを、この連結の標準的なアミノ酸として選択した。
【０４５５】
異なる長さ（３０〜７０アミノ酸残基）のさまざまな異なるＭＴＰを選択し、ＭＰＰによる切断後にＮｉｆポリペプチドのＮ末端に融合した様々な残留アミノ酸残基（「痕跡」）が残ると予測した（表７）。痕跡配列は、長さが０〜３６アミノ酸残基の範囲に及んだ。GoldenGateクローニングシステムを使用することで、植物細胞における発現のための数個のＮｉｆｓとこれらのＭＴＰの組み合わせを使用して、１７個の異なる遺伝子構築物を組み立てた（表８）。これらの融合物に使用されるＮｉｆＤおよびＮｉｆＳポリペプチド配列は、Temme et al., (2012)による配列を使用する代わりに、実施例５〜９で使用した配列の変異体であった。変異型アミノ酸配列を、それぞれ配列番号９５および配列番号９６で提供する。４８３アミノ酸の配列と異なる変異型ＮｉｆＤアミノ酸配列（配列番号９５）を、３９、４１、８７、９６、３５５および４８３位における６つのアミノ酸置換によって、配列番号６として提供した。これらのすべてのベクターに関して、プロモーター、５’および３’ＵＴＲ、ならびにターミネータは同一であった。それぞれＰ１９サイレンシングサプレッサタンパク質を産生する構築物と混合された、これらの構築物を含有するアグロバクテリウム培養物を、Ｎ．ベンサミアナ葉内に個別に導入し、そして、タンパク質抽出物を、浸潤の５日後に製造した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析を、そのタンパク質抽出物に対して実施した。ＭＴＰ：：ＮｉｆＤ構築物を用いた浸潤のために、Ｃ末端伸長のないＮｉｆＫの同時発現がＮｉｆＤ存在量を高めることを示したので（実施例１１）、ｐＲＡ２５（ｐＦＡγ：：ＮｉｆＫ）を同時浸潤させた。表８は、それぞれのＭＴＰ：：Ｎｉｆ融合ポリペプチドに関する、植物細胞において産生されたポリペプチドの検出およびＭＰＰによる切断（プロセシング）の結果について概略する。
【０４５６】
表７．GoldenGateシステムを使用した植物での試験に用いたＭＴＰの詳細、接合部のＧｌｙ−Ｇｌｙ残基（ＣＰＮ６０／リンカーなし以外）を太字で強調した。ｋＤＡ Ｆ／Ｐ：プロセシング済、未プロセシングＭＴＰのサイズ。
【表７】
2020510413.tif 000008
【０４５７】
表８．ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＭ、ＮｉｆＳおよびＮｉｆＵの発現のための葉細胞内への構築物（ＳＮ番号によって示される）の導入後に産生されるポリペプチドのウエスタンブロット分析。Ｐｒｏ：プロセシング済。（ｐ）＝部分的−ウエスタンブロットによって検出された５０％未満のプロセシング形態。ＵＤ：バンドサイズに基づいてプロセシングを見分けられない。
【表８】
2020510413.tif 000009
【０４５８】
ＭＴＰ：：Ｎｉｆ融合のように翻訳的に融合されたとき、ＭＴＰ−ＦＡγ51は、試験したＮｉｆポリペプチドのすべてに関して、切断ＭＴＰ：：Ｎｉｆポリペプチドをもたらした（表７）。ＮｉｆＭ融合ポリペプチドは、ＦＡγ51に融合したときには、部分的にしかプロセシングされなかったが、それに対して、他のＮｉｆ融合ポリペプチドは、より効率的にプロセシングされ、そして、様々なＮｉｆｓのプロセシング効率が、同じＭＴＰによっても変化し得ることを実証した。ＭＴＰのＣ末端でＨＡエピトープを融合し、次に、ＮｉｆＨに融合した（ＳＮ２９）、ＦＡγ51のバージョンを試験した。この構築物から発現されたポリペプチドを、ウエスタンブロット分析で検出した（表８）。
【０４５９】
ＮｉｆＤに融合したＣＰＮ６０ ＭＴＰの２つのバージョンを試験した。一方のバージョンでは、ＭＴＰを、Ｇｌｙ−ＧｌｙリンカーがＣＰＮ６０ ＭＴＰ（配列番号７７）とＮｉｆＤ（ＳＮ１１）の間に配置されるように融合した。もう片方のバージョン（ＳＮ４）では、ＣＰＮ６０ ＭＴＰ（配列番号７８）をＮｉｆＤポリペプチドの第一のメチオニンに直接融合した。ＣＰＮ６０が、そのアミノ酸配列のＣ末端チロシンの直後で切断される予測された場合、この構築物は、理論上、野生型Ｎ末端を有するＮｉｆＤポリペプチド、すなわち、「痕跡」なし、を生じるが、それに対して、ＳＮ１１構築物は、ＭＴＰ（ＧｌｙＧｌｙ）：：ＮｉｆＤ融合の切断後にＧｌｙ−Ｇｌｙ伸長を残すと予測された。驚いたことに、これらの非常に類似した構築物は、ウエスタンブロット分析によって証明した場合に、異なる結果を生じさせた：ＳＮ１１は、未プロセシングＣＰＮ６０（ＧｌｙＧｌｙ）：：ＮｉｆＤについて予測されたサイズでポリペプチドバンドをもたらしたが、それに対して、ＳＮ４は、プロセシング済ポリペプチドに比べて、より多くの未プロセシングポリペプチドが存在する、プロセシング済ポリペプチドと未プロセシングポリペプチドの両方に相当するバンドをもたらした。さらに、ＳＮ４を用いた浸潤からのタンパク質を、ウエスタンブロットによって、並行ｐＲＡ２４＋ｐＲＡ２５（ＦＡγ77+GAP：：ＮｉｆＤ：：ＨＡ＋ＦＡγ77+GAP：：ＮｉｆＫ）浸潤（実施例１１も参照）から抽出したタンパク質と比較したとき、ＳＮ４構築物が、ｐＲＡ２４構築物よりかなり少ない正確にプロセシングされたポリペプチドを生じたことは、明らかであった。そのため、ＣＰＮ６０ ＭＴＰは、融合ポリペプチドを標的化することができ、かつ、野生型ＮｉｆＤポリペプチドを作製するマトリックスプロセシングを許容したが、発現レベルとプロセシング効率が低かった（ＵＳ２０１６／０３０４８４２）。ＳＮ１１に関しては、ＣＰＮ６０とＮｉｆＤの間のＧｌｙ−Ｇｌｙ連結が、ＭＴＰのプロセシングを妨げた可能性があった。
【０４６０】
単独またはタンデムＭＴＰとして、およびＧｌｙ−Ｇｌｙ連結前にＣ末端のＩｌｅおよびＧｌｎの包含を伴うかまたは伴わない、スーパーオキサイドジスムターゼポリペプチドからのさまざまなＭＴＰもまた試験した。ポリペプチドは、ＩｌｅおよびＧｌｎ残基を含有しなかったＳＯＤ ＭＴＰ（ＳＮ１５、配列番号８１およびＳＮ１６、配列番号８２）を含むバージョンについてのウエスタンブロット解析によって検出されなかったが、それに対して、ＩｌｅおよびＧｌｎ残基（ＳＮ１２、配列番号７９およびＳＮ１３、配列番号８０）を保持したバージョンは、検出可能なポリペプチドを産生したが、しかし、それらはＭＰＰによってプロセシングされなかったように見えた。対照的に、試験した別のＭＴＰ、Ｌ２９（ＳＮ１７、配列番号８３）は、ＮｉｆＤに融合すると、強力なポリペプチドシグナルをもたらした。このＭＴＰでのプロセシング済形態と未プロセシング形態の間のサイズのわずかな差のため、プロセシング効率を決定するために、追加実験が必要とされる。Ｌ２９ ＭＴＰが、効果的な様式で切断Ｎｉｆポリペプチドをもたらしたと予測される。最後に、本発明者らは、Ｃ末端であるが、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ連結の上流（ＳＮ１９、配列番号８６）にて融合したツインｓｔｒｅｐタグ（Buren et al. 2017）を用いてＣｏｘＩＶ ＭＴＰを試験した。ＮｉｆＤに融合したとき、このＭＴＰは、ミトコンドリアマトリックスプロセシングと一致したサイズの、ウエスタンブロット分析による強いシグナルをもたらした。
【０４６１】
細菌系におけるＮｉｆポリペプチドに融合した様々な痕跡配列の機能試験
Ｎｉｆポリペプチド機能に対する、様々なＭＴＰの取り込みと切断後にＮｉｆ融合ポリペプチドのＮ末端に残った配列との因果関係を、ＭＩＴ２．１系で評価した。例えば、Ｉｌｅの代わりに第一アミノ酸としてＭｅｔを有する、ｐＦＡγ−ｓｃａｒ9をコードするＤＮＡ断片を、誘導リガーゼサイクル技術（de Kok et al., 2014）によりｐＭＩＴ２．１のＮｉｆ遺伝子の翻訳開始コドンのすぐ上流に挿入した。構築物を作製するのに使用した方法は、実施例１６のＮｉｆＢについて記載したとおりであった。ｐＦＡγ−ｓｃａｒ9をコードする２７ｂｐのＤＮＡ断片を、ｐＭＩＴ２．１の様々なＮｉｆ遺伝子の５’末端に融合した。Ｅ．コリの形質転換とアセチレン還元アッセイを使用したニトロゲナーゼ機能の試験を、実施例１６にしたがって実施した。これらのアッセイは、ＮｉｆＢのＮ末端への９アミノ酸伸長の付加が、未修飾ｐＭＩＴ２．１を用いて見られたエチレン産生のレベルと比較したときに、ニトロゲナーゼ機能を変更しなかったことを示した。類似の様式では、ＮｉｆＨでは完全活性を有するが、他の場合では、活性のいくらかの低減を伴ったて、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＮもまた、それらのそれぞれのＮ末端での９アミノ酸伸長を許容した。ＮｉｆＤ、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＮのＮ末端への９アミノ酸伸長は、それぞれ未修飾ｐＭＩＴ２．１のものと比較して、５０％、７０％、３０％、および５０％であるアセチレン還元活性のレベルをもたらした。他のＮｉｆポリペプチド、すなわち、ＮｉｆＪ、ＮｉｆＹ、ＮｉｆＱ、ＮｉｆＦ、ＮｉｆＵ、ＮｉｆＳ、ＮｉｆＶ、ＮｉｆＷ、ＮｉｆＺおよびＮｉｆＭを、同じ様式で試験する。斯かるアッセイを使用して、最適なＭＴＰ配列を、それぞれのＮｉｆポリペプチドについて選択する。
【０４６２】
実施例１８．ＮｉｆＫのＣ末端への付加は、その活性を破壊する
実施例１０に記載のとおり、本発明者らは、Ｋ．ニューモニエからのＮｉｆＫポリペプチドの構造のモデリングから、ＮｉｆＫサブユニットのＣ末端が、ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ−ＮｉｆＨタンパク質複合体のコアの中に埋め込まれる、および野生型配列に対するＮｉｆＫポリペプチドへの任意のＣ末端伸長が、その複合体の破壊を恐らくもたらす、と結論づけた。これは、ｐＭＩＴ２．１プラスミドの修飾によって実施例１６に記載の細菌ニトロゲナーゼ系を機能的に使用するか試験した。そのプラスミドを、以下のように、アミノ酸配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号９７）の付加によって、野生型配列に対して９アミノ酸Ｃ末端伸長を有する修飾ＮｉｆＫポリペプチドを発現するために修飾した。
【０４６３】
ＮｉｆＫ修飾を導入するために、Ｅ．コリにおける発現のために最適化したコドンであるアミノ酸ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号９７）をコードするヌクレオチド配列を、ＮｉｆＫの３’末端にて逆方向プライマーの５’に付加した。そのプライマー、５’−ＴＣＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＡＧＧＡＡＣＡＴＣＧＴＡＧＧＧＧＴＡＡＣＧＡＡＣＣＡＧＡＴＣＧＡＡＡＧＡＡＴＡＧＴＣＧＧ−３’（配列番号９８）、および順方向プライマー５’−ＡＡＧＧＧＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＡＣＴＧＧ−３’（配列番号９９）を、ｐＭＩＴ２．１の前半を含有する、鋳型としてのｐＴｏｐｏＨ−Ｊ（実施例１６）ＤＮＡと共にＰＣＲに使用し、７９０９ｂｐの産物を得た。残った７２２２ｂｐもまた、プライマー５’−ＣＣＴＧＡＴＴＧＴＡＴＣＣＧＣＡＴＣＴＧＡＴＧＣＴＡＣ−３’（配列番号１００）および５’−ＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＣＡＣＧＧＡＣＡＡＡＡＡＡＣＣ−３’（配列番号１０１）を使用したＰＣＲによって増幅した。実施例１６に記載と類似の様式では、次に、２つのＰＣＲ断片を、de Kok et al., (2014) の方法を使用して、プライマーＢＯ１、５’−ＧＧＴＡＧＣＡＴＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＡＣＡＡＴＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＡＧＣＧＴＡＡＴＣＡＧＧＡＡＣＡＴＣＧＡＧＧ−３’（配列番号１０２）およびＢＯ２、５’−ＣＣＡＧＴＧＴＧＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＡＣＣＴＧＣＡＧＧＧＣＴＡＡＣＴＡＡＣＴＡＡＣＣＡＣＧ−３’ （配列番号１０３）を用いた連結サイクル反応（ＬＣＲ）を使用して一つに連結した。連結したＤＮＡ断片を、ＳｂｆＩで消化し、未修飾ＮｉｆＢＱＦＵＳＶＷＺＭ遺伝子を含有するｐＢ−ｏｒｉからのＳｂｆＩ断片に連結し、そして、ＮｉｆＫに付加されたＣ末端伸長を有する融合ポリペプチドをコードする修飾ＭＩＴ２．１ベクターをもたらした。
【０４６４】
得られた遺伝子構築物を、ｐＮ２４９を含有するＥ．コリ株ＤＨ５αに導入し、そして、両方のベクターで形質転換した細胞の培養物を、実施例１６に記載ように培養した。その培養物を、アセチレン還元アッセイにおいてエチレン産生について試験した。その結果は、ＮｉｆＫに添加した９アミノ酸Ｃ末端伸長が、エチレン産生を完全に無効にしたことを示した。対照である、無変性ｐＭＩＴ２．１は、陽性エチレン産生をもたらした。本発明者らは、アセチレンの還元よって計測した場合に、実施例１０に記載のモデル化試験と一致して、野生型Ｃ末端に対するＮｉｆＫのＣ末端に翻訳融合された伸長が、ニトロゲナーゼ活性を無効にしたと結論づけた。
【０４６５】
ＮｉｆＫのＣ末端への伸長がニトロゲナーゼ機能を無効にすることを実証した先の生化学的試験、および、先の植物体内実験が、野生型Ｃ末端を伴ったＮｉｆＤおよびＮｉｆＫの同時発現が、ＮｉｆＤ存在量を高めることを示した（実施例１１）ことを前提に、本発明者らは、ＮｉｆＫポリペプチド中の野生型Ｃ末端が、ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫヘテロ四量体の安定性および機能の両方、したがって、ニトロゲナーゼ活性に重要であると結論づけた。
【０４６６】
これは、野生型Ｃ末端（ｐＲＡ２５）を有するＮｉｆＫと一緒にＮｉｆＤを発現する遺伝子の様々なバリエーションを発現させ、そして、ＮｉｆＤ存在量を評価することによって、さらに調査した。実施例２０は、Ｎ．ベンサミアナにおけるＮｉｆＤ存在量を評価するために作製されたＮｉｆＤ遺伝子をそれぞれ含む一連の遺伝子構築物を記載している。
この実験におけるＮｉｆＤには、Ｃ末端ＨＡエピトープが含まれた。
すべてのＮ．ベンサミアナ浸潤のために使用される場合、同時浸潤させたｐＲＡ２５（ＮｉｆＫ）を伴うかまたは伴わずに、サイレンシング抑制因子Ｐ１９を発現するための遺伝子構築物の存在下、これらの構築物（表８）の同時浸潤後に、ＮｉｆＤ：：ＨＡのタンパク質存在量およびＭＰＰプロセシングを、抗ＨＡ抗体を使用したＳＤＳ ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析で評価した。分析（図１９）は、いずれの場合にも、ｐＲＡ２５の追加が、特にＳＮ７とｐＲＡ２５の組み合わせに関して、ＮｉｆＤ存在量を大いに高めたことを示した。最も重要なことには、プロセシング済ＮｉｆＤ対未プロセシングＮｉｆＤの比が、ｐＲＡ２５の追加によって高められた。これらの結果は、ＮｉｆＫによるＮｉｆＤの安定化がミトコンドリアマトリックスにおいて起こり、そして、決定的には、これを達成するために、野生型Ｃ末端を有するＮｉｆＫポリペプチドに依存するという結論をさらに支持した。
【０４６７】
さらに注目すべきは、約４８ｋＤａおよびＮｉｆＤの分解産物と考えられるポリペプチドバンドが、試験した構築物のすべてで観察された。このポリペプチドは、抗ＨＡ抗体で検出され、そして、ゲル上ではっきりと規定されるポリペプチドバンドとして観察されたので、それは、ＮｉｆＤのＣ末端を含む特異的切断産物を表すはずであった。予想外なことに、この産物の量もまた、ｐＲＡ２５（ＮｉｆＫ）の同時発現で高められた。これは、ＮｉｆＤポリペプチドとＮｉｆＫポリペプチドとの相互作用を示した。これらの観察に基づいて、本発明者らは、ＮｉｆＤ分解が、ミトコンドリアマトリックス特異的であり、かつ、ＭＭにおけるＮｉｆＤとＮｉｆＫの相互作用への支持を提供したと考えた。
【０４６８】
ＮｉｆＤ：：ＨＡをコードする構築物を、植物細胞に導入したときに産生される約４８ｋＤａのポリペプチドに関して試験した一つの可能性は、その４８ｋＤａのポリペプチドが、第二の、下流の翻訳開始から産生されたということであった。ＮｉｆＤ遺伝子は、４８ｋＤａ翻訳産物に通じる領域のＭｅｔ残基に対応する多くのＡＴＧコドンを有した。この可能性を試験するために、ＮｉｆＤ開始コドンの第二〜第五のＭｅｔコドン下流をＡｌａコドンで置換したことを除いて、ｐＲＡ２４と同一であった遺伝子構築物を作製した（ｐＲＡ３０）。Ｎ．ベンサミアナの葉へのｐＲＡ３０およびｐＲＡ２４の別々の浸潤、そして、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによる分析後に、ｐＲＡ２４およびｐＲＡ３０のバンド化パターンは、約４８ｋＤａポリペプチド産物がまだ存在していて、同じであった。この観察は、ＮｉｆＤ：：ＨＡ遺伝子が発現されたときに、４８ｋＤａのサイズのバンドが見られるのは、選択的翻訳開始のためであるという仮説を否定した。このポリペプチドが、ＭＭにおける未知の分解過程によって作製されたと結論づけた。
【０４６９】
実施例１９．ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫおよびＮｉｆＥ−ＮｉｆＮ融合ポリペプチドの評価
実施例１２は、ＮｉｆＤのＣ末端とＮｉｆＫのＮ末端の間の３０個のアミノ酸残基から成るリンカーを使用した、ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫ融合ポリペプチドをコードする遺伝子の設計および構造を説明する。そのリンカーは、ポリペプチドの検出のためのＦＬＡＧエピトープを含んだ。ＦＬＡＧエピトープがＨＡエピトープに置換されたこと除いて、ＮｉｆＤ−（ＦＬＡＧ）リンカー−ＮｉｆＫの同じ配置を有する、第二の遺伝子を、ここで設計し、そして、組み立てた。同様に３０アミノ酸残基の、この第二の遺伝子のリンカーによってコードされる、アミノ酸配列は、そのリンカーのアミノ酸１２〜２０としてＨＡエピトープを伴う、ＡＴＰＰＰＧＳＴＴＴＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＴＰＰＰＧＳＴＴＴＡ（配列番号１０４）であった。これらの融合ポリペプチドの両方を、機能性について、以下のように、実施例１６に記載のｐＭＩＴ２．１ベクターベースの細菌系におけるアセチレン還元アッセイで試験した。
【０４７０】
最初に、ｐＲＡ３１からのＮｉｆＤ：：ＨＡリンカー：：ＮｉｆＫの遺伝子を、プライマーｐＲＡ３１ＤＫ−ＦＷ ５’−ＡＴＧＡＴＧＡＣＴＡＡＣＧＣＴＡＣＡＧＧＡＧＡＡ−３’（配列番号１０５）およびｐＲＡ３１ＤＫ−ＲＶ ５’−ＴＣＡＴＣＡＴＣＴＡＡＣＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＣＴＧＴＡＡＴＣＴＧ−３’（配列番号１０６）を使用してＰＣＲ増幅した。その遺伝子中のヌクレオチド配列を、アラビドプシス・サリアナにおける発現のためにコドンで最適化をおこなった。ｎｉｆＤおよびｎｉｆＫ遺伝子を伴わないｐＭＩＴ２．１の前半もまた、プライマーＤ＿ｓｔａｒｔ＿ＲＶ ５’−ＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＣＴＡＧＡＴＡＡＡＡＡＴＧＴＧＡＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＧＣＡＧＣＣ−３’（配列番号１０７）およびＫ＿ｅｎｄ＿ＦＷ ５’−ＣＣＴＧＡＴＴＧＴＡＴＣＣＧＣＡＴＣＴＧＡＴＧＣＴＡＣＣＧＴＧＧＴＴＧＡ−３’（配列番号１０８）を使用してＰＣＲによって作製した。増幅したＰＣＲ産物を、架橋オリゴ ５’−ＴＴＣＴＣＣＴＧＴＡＧＣＧＴＴＡＧＴＣＡＴＣＡＴＣＣＧＧＣＴＣＣＴＣＣＧＣＴＡ−３’（配列番号１０９）および５’−ＣＡＧＡＴＧＣＧＧＡＴＡＣＡＡＴＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＴＣＴＡＡＣＣＡＡＡＴＣＡＡＡＡＣＴＧ−３’（配列番号１１０）を使用した連結サイクル反応によって連結し、そして、ＳｂｆＩで消化した。消化したＤＮＡ断片を、同様にＳｂｆＩで消化したｐＢ−ｏｒｉ ＤＮＡに連結し、ＮｉｆＤ：：ＨＡリンカー：：ＮｉｆＫ融合遺伝子を含むｐＭＩＴ２．１の修飾形態を作製した。
【０４７１】
Ｅ．コリ（ＤＨ５α）細胞における機能試験は、ＮｉｆＤ：：ＨＡリンカー：：ＮｉｆＫ遺伝子を含む修飾ｐＭＩＴ２．１ベクターが、未修飾ｐＭＩＴ２．１のレベルの約１０％にて、アセチレンをエチレンに還元し得ることを示した。すなわち、他の野生型ＮｉｆＤおよびＮｉｆＫポリペプチドの間の３０アミノ酸リンカーを伴った融合ポリペプチドは、細菌系において１０倍低い活性ではあるが、明らかに機能的であった。
【０４７２】
融合ポリペプチドのニトロゲナーゼ活性を増強する試みでは、２つの変更をおこない、そして、その実験を、事実上反復した。その変更は、第一に、ＮｉｆＤ（Temme et al., 2012）、実施例１７を参照、の変異型アミノ酸配列を使用するためであり、および第二に、Ａ．サリアナよりむしろＫ．ニューモニエのためのヌクレオチド配列のコドン最適化を使用するためであった。その構築物を、先に記載したのと同じ様式で作製した。すなわち、別々のＮｉｆＤおよびＮｉｆＫポリペプチドをコードする、未修飾ｐＭＩＴ２．１のｎｉｆＤおよびｎｉｆＫの間のオペロン構造を、ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫの翻訳融合をコードするヌクレオチド配列で置換し、これにより、ＦＬＡＧおよびＨＡ含有リンカーのそれぞれについて修飾ｐＭＩＴ２．１のＮｉｆＤ：：リンカー：：ＮｉｆＫ遺伝子を形成する。Ｅ．コリ（ＤＨ５α）細胞における機能試験は、ｐＭＩＴ２．１の修飾ＮｉｆＤ：：ＦＬＡＧリンカー：：ＮｉｆＫおよびＮｉｆＤ：：ＨＡリンカー：：ＮｉｆＫ遺伝子が、未修飾ｐＭＩＴ２．１の量に対して、それぞれ約１００％および８０％の量、エチレンを作製するためのアセチレンを低減することを示した。第一のＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫ融合体に関する活性低下は、まり理想的ではないＮｉｆＤアミノ酸配列、もしくは植物最適化コドンの利用、またはその両方のためであったと結論づけた。これは、適切なポリペプチド配列の使用と宿主細胞に応じたコドン最適化の重要性を実証した。
【０４７３】
植物細胞における発現およびミトコンドリアマトリックスへの取り込みのために、ＭＴＰ配列が必要であり、およびＮ末端伸長は、切断後にＭＴＰの中に残留すると予測される。例えば、ＭＰＰによる切断があとに続く、ＭＴＰ−ＦＡγ51（実施例１７）の使用は、Ｎｉｆポリペプチドに融合した９アミノ酸Ｎ末端伸長を残す。そのため、ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫポリペプチドへの斯かる９アミノ酸伸長を追加する効果を、９（Ｉｌｅ）の最初の残基をＭｅｔ残基に置換して、効果的な翻訳が提供されることを除いて、試験した。９アミノ酸配列を、先に記載したように、クローニングアプローチを使用して、ＮｉｆＤ：：リンカー：：ＮｉｆＫ融合ポリペプチドのＮｉｆＤ部分のＮ末端に追加した。これらの２つの修飾の組み合わせに関するアセチレン還元能力を、ｐＭＩＴ２．１系で試験した。
【０４７４】
構築物を作製するために、９アミノ酸伸長（ＭＳＴＱＶＶＲＮＲ、配列番号１１１）をコードする２７ヌクレオチドのＤＮＡ配列を、リンカーのＦＬＡＧおよびＨＡエピトープのそれぞれについて、ＮｉｆＤ：：リンカー：：ＮｉｆＫ融合遺伝子の５’末端に付加した。その構築物を含むＥ．コリにおけるアセチレン還元アッセイは、ＮｉｆＤ：：ＨＡリンカー：：ＮｉｆＫポリペプチドへの９アミノ酸Ｎ末端伸長の追加が、Ｎ末端に９アミノ酸伸長を有していないＮｉｆＤ：：ＨＡリンカー：：ＮｉｆＫとほとんど同じレベルのエチレン産生をもたらした、すなわち、Ｎ末端伸長が、十分に許容され、ニトロゲナーゼ活性を低減しなかった、ことを示した。これは、９アミノ酸伸長が、その活性を低減せずに野生型ＮｉｆＤに付加され得るという先の知見と一致していた。
【０４７５】
本発明者らはまた、ｎｉｆＤ遺伝子の終止コドン、未修飾ＭＩＴ２．１からのｎｉｆＫコード領域のスペーサ配列およびリボソーム結合部位を除去することによって、ＭＩＴ２．１系においてあらゆるリンカー配列なしにＮｉｆＤおよびＮｉｆＫの間の翻訳融合の機能も試験した。ＮｉｆＤ−ＮｉｆＫポリペプチド（本明細書中でＮｉｆＤ−リンカーなし−ＮｉｆＫと呼ばれる）をコードするためのリーディングフレームのこの直接的な融合は、正の対照と比較して、アセチレン還元活性を５％低減した。ＮｉｆＤ−リンカーなし−ＮｉｆＫの機能におけるこの低減は、融合ポリペプチドのＮｉｆＤおよびＮｉｆＫ部分の間の適切な立体結合が、機能的なジニトロゲナーゼ構造を形成することを可能にした、約３０アミノ酸残基のフレキシブルリンカーを含むことの利益を示した。
【０４７６】
ｎｉｆＥ−ＮｉｆＮ融合
ＮｉｆＤおよびＮｉｆＫと同様に、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＮは、ヘテロ四量体を形成することが知られている。ニトロゲナーゼ活性に関するこの複合体の機能は、ＦｅＭｏ補因子コア成熟のために、ＮｉｆＢからのＦｅＭｏ補因子コア、ＮｉｆＱからのモリブデン、およびＮｉｆＶからのホモクエン酸を受け入れることである（Hu and Ribbe, 2011）。本発明者らは、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＮが、最適なニトロゲナーゼ機能のために等モルレベルで発現されなければならないこと、および２つのポリペプチドを融合すると、ニトロゲナーゼの組み換え発現に必要とされるプロモーター、ＭＴＰおよびターミネータの数が減少することがわかった。そのため、ＮｉｆＥおよびＮｉｆＮの間の融合ポリペプチドをコードする遺伝子を、ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫ融合ポリペプチドの３０アミノ酸残基の代わりに４６アミノ酸残基のリンカーを使用したことを除いて、ＮｉｆＤおよびＮｉｆＫ融合の理論的根拠（上記）にしたがって、設計し、作製した。これを、以下のように設計し、構築し、そして、試験した。
【０４７７】
Ｋ．ニューモニエからのＮｉｆＥ−ＮｉｆＮα2β2ヘテロ四量体の相同モデルを、鋳型としてアゾトバクター・ビネランジーからのＮｉｆＥ−ＮｉｆＮ複合体の結晶構造を使用して構築した（ＰＤＢ ＩＤ：３ＰＤＩ（Kaiser et al., 2011））。Ｋ．ニューモニエと対応するＡ．ビネランジーのポリペプチドをアラインすると、アミノ酸配列同一性は、ＮｉｆＥポリペプチドでは６８．１％およびＮｉｆＮポリペプチドでは４４．２％であった。本発明者らは、Ｋ．ニューモニエα2β2ヘテロ四量体の構造モデルでは、それぞれのＮｉｆＥサブユニットのＣ末端は、ＮｉｆＮパートナーのＮ末端から約７０Åであることがわかった。そのため、好適な長さのリンカーを、２個のユニットを接続するために設計し、そして、４６アミノ酸残基を有していた。本発明者らは、リンカーは、ヘテロ四量体の表面を囲むように曲がり、かつ、約１０４Åの長さを有していなければないと考え、そのため、多くの４６アミノ酸残基が選択された。本発明者らはまた、リンカーは、柔軟性を含めた他のいくつかの特徴を最適に有していなければならないと考えた。
【０４７８】
選択された４６残基リンカーのアミノ酸配列は、タラロマイセス・フニクロスス（Talaromyces funiculosus）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＷＺＪ４）からのセロビオヒドラーゼの炭水化物結合ドメインと触媒ドメインの間の天然のリンカーに基づいた。それは、望ましくないジスルフィド結合の形成を避けるためのシステイン残基の欠如、望ましくない表面塩架橋相互作用の傾向を低減するための低荷電または無荷電残基（Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）、斯かる残基はポリペプチドの表面を貫通する傾向を促進するので、低疎水性または非疎水性残基（Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ）および翻訳後修飾アミノ酸を欠いたリンカー配列を含めたいくつかの基準に基づいて選択された−Ｕｎｉｐｒｏｔエントリーwww.uniprot.org/uniprot/Q8WZJ4（そこのリンカーは残基４５７〜４９３である）を参照。セロビオヒドラーゼ配列の２位のＰｈｅ残基を、疎水度を低減するためにＳｅｒに置換した。ＨＡエピトープ配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１１２）を、リンカーのアミノ酸１６と１７の間に挿入し、単に、融合ポリペプチドの検出および定量化を補助した−リンカーは、機能のために斯かるエピトープを必要としない。ＨＡエピトープは、保持された単一の、陽性荷電リジン残基からそれを遠ざけるためにリンカーの中心よりＮ末端の近くに配置された。得られたリンカー配列は、アミノ酸１７〜２５としてＨＡエピトープを含有し、かつ、位置３２にリジンを保持した、ＴＳＳＧＧＴＳＴＧＧＳＴＴＴＴＡＹＰＹＤＶＰＤＹＡＳＧＴＴＳＴＫＡＳＴＴＳＴＳＳＴＳＴＧＴＧ（配列番号１１３）であった。
【０４７９】
遺伝子構築物を作製し、かつ、ＮｉｆＥ−リンカー−ＮｉｆＮ融合ポリペプチドの機能を試験するために、ｐＭＩＴ２．１のＮｉｆＥおよびＮｉｆＮシストロンの間の領域を、修飾ｐＭＩＴ２．１における先の構築物のためのものと同じクローニングアプローチを使用して、４６残基リンカーを含む翻訳融合をコードするヌクレオチド配列で置換した。融合遺伝子をＥ．コリで試験したが、ヌクレオチド配列は、アラビドプシス・サリアナ向けにコドン最適化した。ｎｉｆＥ：：ＨＡリンカー：：ｎｉｆＮ遺伝子を、プライマーｐＲＡＥＮ−ＦＷ ５’−ＡＴＧＡＡＧＧＧＡＡＡＴＧＡＧＡＴＴＣＴＴＧＣＴＣＴＴ−３’（配列番号１１４）およびｐＲＡＥＮ−ＲＶ ５’−ＴＣＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＡＡＧＣＡＣＣ−３’（配列番号１１５）を使用して、ｐＲＡ０１−ＥＮからＰＣＲ増幅した。ｎｉｆＥおよびｎｉｆＮを伴わない、ｐＭＩＴ２．１の前半を、プライマーＥ＿ｓｔａｒｔ＿ＲＶ ５’−ＴＴＧＴＡＡＴＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＡＡＴＴＧＡＡＴＡ−３’（配列番号１１６）およびＮ＿ｅｎｄ＿ＦＷ ５’−ＣＴＡＧＡＧＡＴＴＡＡＴＡＴＧＧＡＧＡＡＡＴＴＡＡＧＣＡＴＧ−３’（配列番号１１７）を使用したＰＣＲによって作製した。増幅したＰＣＲ産物を、架橋オリゴ ５’−ＡＡＧＡＧＣＡＡＧＡＡＴＣＴＣＡＴＴＴＣＣＣＴＴＣＡＴＴＴＧＴＡＡＴＡＡＣＣＴＣＣＡＧＴＧＡＴＧＡＡＴＴＧＡＴＡＧＴＧ−３’（配列番号１１８）および５’−ＴＡＧＴＴＴＴＣＡＴＧＣＴＴＡＡＴＴＴＣＴＣＣＡＴＡＴＴＡＡＴＣＴＣＴＡＧＴＣＡＴＣＡＡＴＣＡＧＣＡＧＣＡＴＡＡＧＣＡＣＣ−３’（配列番号１１９）を使用した連結サイクル反応を使用して連結し、その後、両方のＤＮＡをＳｂｆＩで消化した後に、未修飾であるｐＭＩＴ２．１（ｐＢ−ｏｒｉ）の後半を、修飾した前半と連結した。得られた構築物は、ＡｔＮｉｆＥ：：リンカー：：ＮｉｆＮ／ＭＩＴ２．１と呼ばれた。
【０４８０】
アセチレン還元アッセイによる、Ｅ．コリ細胞における、ＡｔＮｉｆＥ：：リンカー：：ＮｉｆＮ遺伝子を含む修飾ＭＩＴ２．１ベクターの機能試験は、未修飾ＭＩＴ２．１に対して約４０％のレベルのエチレン産生を示した。
【０４８１】
植物細胞における発現およびミトコンドリアマトリックスへの取り込みのために、ＭＴＰ配列が必要であり、かつ、Ｎ末端伸長は、ＭＰＰによるＭＴＰ配列内での切断後に、恐らく維持された。例えば、ＭＰＰによる切断を有するＭＴＰ−ＦＡγ77の使用は、融合ポリペプチドに３８アミノ酸Ｎ末端伸長を残す。そのため、効果的な翻訳のために提供されるＭｅｔ残基による第一のＩｌｅ残基の置換を伴った、斯かる３８アミノ酸伸長を追加する効果を、それをコードするヌクレオチド配列をＡｔｎｉｆＥ：：リンカー：：ｎｉｆＮ遺伝子に追加することによって試験した。それによって、遺伝子の翻訳は、ＮｉｆＥ：：リンカー：：ＮｉｆＮ融合ポリペプチドのＮｉｆＥのＮ末端に３８アミノ酸伸長を追加する。ニトロゲナーゼ活性に対するこれらの２つの修飾の組み合わせの効果を、先と同じクローニングアプローチを使用して、ｐＭＩＴ２．１系で試験した。
【０４８２】
Ｅ．コリにおいて、３８ａａ：：ＡｔＮｉｆＥ：：リンカー：：ＮｉｆＮ遺伝子を含む修飾ｐＭＩＴ２．１ベクターは、未修飾ｐＭＩＴ２．１に対して、約２５％のレベルにてエチレン産生をもたらした。すなわち、Ｎ末端における３８アミノ酸伸長の使用は、未修飾ｐＭＩＴ２．１に対して、プラスの、あるいは、低減したニトロゲナーゼ活性をもたらした。本発明者らは、低減は、Ｅ．コリにおける効果的な翻訳のために、準最適であるＡ．サリアナコドン利用に少なくとも一部は起因したはずであり、そしてそれは、細菌コドン最適化と、天然クレブシエラＮｉｆＥおよびＮｉｆＮの翻訳融合を作製することによって容易に試験できると考えた。本発明者らは、以下のような、ＮｉｆＥ−リンカー−ＮｉｆＮ融合ポリペプチド機能を最適化できる他のやり方を考えた。ヘテロ四量体のＮｉｆＥサブユニットのＮ末端は、ＦｅＭｏ補因子がある腔に極めて近いので（Kaiser et al., 2011）、ＮｉｆＥのＮ末端における３８アミノ酸伸長が、ＮｉｆＥ2ＮｉｆＮ2ヘテロ四量体からの効果的なＦｅＭｏ補因子の放出を妨げるであろう。ＮｉｆＥ2ＮｉｆＮ2ヘテロ四量体活性は、ＭＰＰプロセシングにより完全に取り除かれるＭＴＰの使用によるか、または完全に取り除かれなかったＭＴＰ配列を使用したときに、追加的な伸長を収容するようにＮｉｆＥのＮ末端コード領域を切断することによって、増強され得る。４６アミノ酸リンカーが、ＦｅＭｏ補因子腔の入り口を部分的に塞ぐようにループアウトする可能性があり、これにより、ＮｉｆＢからのＦｅＭｏ補因子コアの受け入れまたは成熟ＦｅＭｏ補因子の放出に干渉する可能性があると考えた。この場合、リンカー領域が腔を妨げるのを回避するために、リンカーを短縮しても、またはＮｉｆＥのＣ末端を切断しても、あるいは、その両方であってもよい。これらのストラテジーによる変異体は、ｐＭＩＴ２．１系を使用して容易に試験および最適化できる。
【０４８３】
概要
ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫおよびＮｉｆＥ−リンカー−ＮｉｆＮ融合ポリペプチドの両方は、ｐＭＩＴ２．１細菌におけるアセチレンの還元を補助できる、すなわち、ニトロゲナーゼ活性を提供のに機能的であった。ＮｉｆＤ−リンカー−ＮｉｆＫへの９アミノ酸Ｎ末端伸長の追加は、完全なニトロゲナーゼ活性を提供した。ＮｉｆＥ−リンカー−ＮｉｆＮ融合ポリペプチドへのより長い、３８アミノ酸Ｎ末端伸長の追加もまた、Ｎ末端伸長のないポリペプチドに対して活性を低減したが、機能的であることを示した。本発明者らは、他の必要なＮｉｆポリペプチドと組み合わせて、植物細胞においてＮ末端ＭＴＰ配列を使用してこれらの融合ポリペプチドを発現するストラテジーが、ニトロゲナーゼ活性の発現を可能にするであろうと結論づけた。ここで例示したＮｉｆＤ−ＮｉｆＫおよびＮｉｆＥ−ＮｉｆＮ融合ストラテジーの追加の利点は、最適なニトロゲナーゼ機能のための等モルレベルでのサブユニットの産生、および２つのポリペプチド、または２組のポリペプチドの融合が、植物細胞におけるニトロゲナーゼの組み換え発現に必要とされるプロモーター、ＭＴＰおよびターミネータの数を削減することを含んだ。
【０４８４】
実施例２０．植物細胞におけるＮｉｆ融合ポリペプチド発現のための様々なプロモーターの試験
幅広い様々なプロモーターを、Ｎ．ベンサミアナ葉細胞で例示した、植物細胞におけるＮｉｆポリペプチドを産生するためにＮｉｆ遺伝子を発現する際のそれらの有効性を評価した。５つの異なるプロモーター、すなわち、サブタレニアン・クローバー・スタント・ウイルスからのＳ４プロモーター（ＳＣＳＶ−Ｓ４）の２つのバージョン（Schunmann et al., 2003a; Schunmann et al., 2003b）、ＳＣＳＶ−Ｓ７プロモーター（Schunmann et al., 2003a）、およびＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの２つのバージョン、すなわち、遺伝子発現を最大化するための３５Ｓプロモーターのより長い形態、および重複エンハンサーを含む強化形態（２×３５Ｓ）をこの目的のために選択した（表９）。ＳＣＳＶプロモーターは、ほとんどの植物組織で強力に発現されるので、構成的プロモーターであると見なされる。Ｎｉｆポリペプチドの例としてこれらの試験に使用されるＮｉｆＤポリペプチドは、実施例１７で使用したバージョン（配列番号９５）であった。試験したすべてのＮｉｆポリペプチド（実施例５〜９）のうちで、それを発現させるのが最も難しかったので、ＮｉｆＤを、この実験におけるＮｉｆポリペプチドの例として選択した。それぞれ異なるプロモーターを使用した５つのベクターを作製したが、しかしながら、転移および植物ミトコンドリアにおけるプロセシングのためのＦＡγ51 ＭＴＰをコードする配列（表９）を含めて、他のものは同一である。モジュール式遺伝子集合アプローチを可能にするGoldenGateクローニング法（Weber et al., 2011, Engler et al., 2014）を使用して５つの構築物を作製した。
【０４８５】
それぞれＰ１９サイレンシングサプレッサタンパク質を産生する構築物を含有するアグロバクテリウム細胞と混合された、これらのベクターを含有するアグロバクテリウム細胞を、Ｎ．ベンサミアナ葉内に個別に導入し、そして、タンパク質抽出物を、浸潤の５日後に製造した。Ｃ末端伸長のないＮｉｆＫの同時発現がＮｉｆＤ存在量を高めることを示したので（実施例１１）、対応する、対をなす浸潤を、ｐＲＡ２５（ｐＦＡγ77+GAP：：ＮｉｆＫ）の追加を伴うかまたは伴わない上記の構築物を用いて実施した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＨＡ抗体を使用したウエスタンブロット分析を、そのタンパク質抽出物に対して実施した（図１９−実施例１８を参照）。表９は、それぞれのＦＡγ51：：ＮｉｆＤ融合ポリペプチドに関する、植物細胞において産生されたポリペプチドの検出およびＭＰＰによる切断（プロセシング）の結果について概略する。
【０４８６】
植物細胞に導入したとき、５つの構築物すべてが、抗体で検出されるポリペプチドを産生した（図１９）。いずれの場合にも、ポリペプチドバンドを、ＦＡγ51：：ＮｉｆＤのプロセシング済および未プロセシング形態の両方と一致したサイズについて観察したが、両方のポリペプチド存在量、およびプロセシング済：未プロセシングの比、すなわち、プロセシング効率においてかなりのバリエーションが存在した（表９）。最も顕著なことには、それぞれ構築物ＳＮ６、ＳＮ７およびＳＮ８に関して、ｐＲＡ２５からのｐＦＡγ77+GAP：：ＮｉｆＫの包含が、ＮｉｆＤの絶対レベル、および予想外なことに、ＮｉｆＤタンパク質のプロセシング済対未プロセシング形態の比の両方を高めた。これは、構築物ＳＮ７に関して最も明白であり、ここで、未プロセシングＮｉｆＤのレベルは、ｐＦＡγ77+GAP：：ＮｉｆＫを伴うかまたは伴わなくても同じであったが、プロセシングＮｉｆＤのレベルは、ＮｉｆＫポリペプチドの存在によって大いに増強された。
【０４８７】
これらの結果は、驚いたことに、それぞれの構築物での同じＭＴＰの使用にもかかわらず、様々なプロモーターが、タンパク質発現レベルだけではなく、ミトコンドリアマトリックス標的化Ｎｉｆタンパク質のプロセシング効率にも実質的に影響を及ぼし得ることを実証した。これらの結果ではまた、Ｃ末端伸長を伴わないＮｉｆＫの発現のＮｉｆＤ存在量に対する増強の役割も確認した。
【０４８８】
表９．Ｎ．ベンサミアナにおけるＭＴＰ：：ＮｉｆＤ：：ＨＡの発現、および融合ポリペプチドのプロセシング効率を評価するために試験した様々なプロモーター
【表９】
2020510413.tif 000010
【０４８９】
実施例２１．ニトロゲナーゼ機能に関するＮｉｆＳおよびＮｉｆＵの冗長性の試験
ニトロゲナーゼの機能のために、それらのそれぞれの鉄硫黄（Ｆｅ−Ｓ）クラスタ生合成のための様々なニトロゲナーゼ成分に対して鉄−硫黄断片を提供する２つのＮｉｆタンパク質が存在する。ＮｉｆＳは、スルフィドを供給するために硫黄を活性化するピリドキサールＰ依存性システインデスルフラーゼであり（Zheng et al., 1993）、そして、ＮｉｆＵは、ＮｉｆＳから硫化物を受け入れて、Ｆｅ−Ｓクラスタを構築する分子足場である（Agar et al., 2000）。それらは一緒に、ＮｉｆＺ（Lee et al., 2009）の補助による［４Ｆｅ−４の］および連続Ｐ−クラスタ（［Ｆｅ８−Ｓ７］）形成のためのペプチジルプロリルｃｉｓ／ｔｒａｎｓイソメラーゼＮｉｆＭ（Gavini et al., 2006）の支援を伴って、ＦｅＭｏ補因子コアのためのＮｉｆＢ（Ｌ−クラスタ）集合（Hu and Ribbe 2011）、ならびにＦｅタンパク質（ＮｉｆＨ）にＦｅ−Ｓクラスタを供給する。真核生物では、Ｆｅ−Ｓクラスタを含む様々な酵素にＦｅ−Ｓ断片を提供するＮｉｆＳおよびＮｉｆＵのオルソログが存在する（Couturier et al., 2013）。特に、植物ミトコンドリアは、ＮｉｆＳおよびＮｉｆＵのオルソログとして、それぞれＮｆｓＩ（Ａｔ５ｇ６５７２０）およびＩｓｕＩ（Ａｔ４ｇ２２２２０）ポリペプチドを有し、一方、色素体Ｎｆｓ２（Ａｔ１ｇ０８４９０）およびＳｕｆＢ（Ａｔ４ｇ０４７７０）は、それぞれＮｉｆＳおよびＮｉｆＵの機能的な同等物である。ミトコンドリアおよび色素体系の両方が、それらの天然オルガネラ環境において、Ｆｅ−Ｓクラスタ集合およびそれらの標的酵素への移動を実現するために、追加のアクセサリータンパク質によって支援されている。ＮｉｆＳおよびＮｉｆＵは組み換えＦｅタンパク質活性に必要でないことが、酵母ミトコンドリアおよびタバコ色素体において、最近実証された（Lopez-Torrejon et al., 2016; Ivleva et al., 2016）。
【０４９０】
Ｅ．コリのｐＭＩＴ２．１系においてＮｉｆＳおよびＮｉｆＵの植物オルソログの機能性を試験するために、クレブシエラＮｉｆＳおよびＮｉｆＵ遺伝子を、単独でまたは組み合わせた２つの置換で、植物ＮｆｓＩおよびＩｓｕＩ遺伝子で置換する。修飾ｐＭＩＴ２．１のニトロゲナーゼ機能を、アセチレン還元アッセイで評価する。また、細菌Ｎｉｆ酵素がこれらの植物突然変異を補完できるか確認するために、Ａ．サリアナｎｆｓＩ変異体（ＳＡＬＫ＿０８３６８１）およびｉｓｕＩ変異体（ＳＡＬＫ＿００６３３２）を、ミトコンドリアマトリックスに対して標的化された、それぞれ、クレブシエラＮｉｆＳおよびＮｉｆＵの遺伝子を含む遺伝子構築物を用いて形質転換する。この実験は、細菌Ｎｉｆタンパク質が植物同等物を機能的に置換できるか実証することを意図する（Frazzon et al., 2007）。良好な補完性は、選択されたＭＴＰが、機能状態においてミトコンドリアにニトロゲナーゼタンパク質を標的化する能力を実証する。この実験は、植物におけるＮｉｆポリペプチド、この場合ＮｉｆＳおよびＮｉｆＵについて、ニトロゲナーゼ関連機能に関する最初の実証を提供する。
実施例２２．質量分析法を使用したＮｉｆポリペプチド発現の計測
ウエスタンブロットおよび抗体検出法を使用しないので、そのため、Ｎｉｆポリペプチドに追加されるエピトープの使用を回避した、Ｎｉｆポリペプチド検出および定量化技術を開発するために、本発明者らは、質量分光分析法を使用して、具体的には、タンパク分解性消化ボトムアップＭＳ／ＭＳプロトコールを使用して、直接的に様々なＮｉｆタンパク質を検出および定量化しようと考えた。これは、完全スキャンの際に親イオンのOrbitrap質量分析装置を用いた高質量分解能および質量精度を提供するために並行して動作する３つの質量分析装置を有するOritrap Fusion Tribrid質量分析計（ThermoFisher）を利用した。この装置の方法論および感度は、現在利用可能な他の装置より複雑で、精製されていないタンパク質混合物からより多くのタンパク質およびペプチドの同定を達成できると考えられた。この装置を、細菌で発現されたＮｉｆタンパク質、具体的には、１６個の異なるＮｉｆポリペプチドをコードするｐＭＩＴ２．１で形質転換し、そして、発現するＥ．コリ細胞の、ペプチドいタンパク質の比標的検出を可能にするように、データ依存様式でサンプルを分析することによって最初に試験した。未精製タンパク質混合物を、トリプシンで処理して、検出のための分子量範囲内のペプチドを準備した。Ｎｉｆポリペプチドのトリプシン分解によって製造された特異的ペプチドをいったん同定すると、それらの予測される保持時間における着目のペプチドの元の質量を具体的に単離した標的化リストを作製できる。この標的化アプローチは、低い存在量のためＮｉｆタンパク質からのペプチドを逃す可能性、または多数の内因性細菌もしくは植物トリプシンペプチドのためデータ依存方法によって選択されなかった可能性、を排除する助けとなった。
【０４９１】
この質量分析ベースのプロトコールは、ｐＭＩＴ２．１プラスミドで形質転換したＥ．コリで発現された１６個の異なるＮｉｆタンパク質の完全な集団を検出することに成功した。少なくとも１つの特異的ペプチドを、１６個のＮｉｆポリペプチドの一つ一つについて検出した。複数の特異的トリプシンペプチドを、全Ｎｉｆポリペプチド配列の４〜５５％を網羅する、ほとんどＮｉｆポリペプチド、Ｎｉｆポリペプチドに関しては最大１９個のペプチドまで検出した（表１０）。多くのＮｉｆポリペプチドのＳｕｍ ＰＥＰスコアは非常に高く（表１０）、Ｎｉｆにポリペプチドのレベルを特異的に検出および計測するこの方法の能力における全幅の信頼を示している。このような関係においては、合計事後誤差確率（ＰＥＰ）スコアは、ペプチドスペクトルマッチに関するＰＥＰ値の負の対数の合計である。Ｓｕｍ ＰＥＰ値が大きいほど、検出の偽陽性の可能性が低い。
【０４９２】
次に、その方法を、着目のベクターを含有するアグロバクテリウムを浸潤させた植物葉サンプルを処理するのに以下に記載した方法を使用して、様々なＭＴＰ：：Ｎｉｆ遺伝子構築物を発現するＮ．ベンサミアナ細胞からの未精製抽出物質に対して試験した。すべての浸潤物が、Ｐ１９サイレンシングサプレッサタンパク質（配列番号１２５）の同時発現のための遺伝子構築物を含有したアグロバクテリウムとの混合物を含んでいた。Ｐ１９ウイルスサプレッサタンパク質からの２つの特異的トリプシンペプチド（配列番号１２６；配列番号１２７）の検出を、一過性発現系の成功に関する正の対照として使用した。
【０４９３】
その方法は、植物細胞において一過性に発現されたときに、ＮｉｆＫ、ＮｉｆＢ、ＮｉｆＨ、ＮｉｆＦ、ＮｉｆＪ、ＮｉｆＳおよびＮｉｆＸポリペプチドのそれぞれからの３〜１６個の特異的トリプシンペプチドを特異的に検出することに成功した。例えば、これらのＮｉｆ融合ポリペプチドから植物細胞において検出される特異的ペプチドを、以下に列挙する。それらの一過性発現実験のそれぞれに関して、Ｐ１９からの２つの特異的ペプチドもまた検出した。特異的Ｎｉｆペプチドが検出されなかった、他のＮｉｆポリペプチドを発現するための遺伝子を使用したいくつかの実験では、Ｐ１９からの２つの特異的ペプチドもまた検出されなかった。恐らく準最適な植物の健康状態のため、それらの実験において低い形質転換効率を示した。その実験を、より良好な植物を用いて繰り返した。
【０４９４】
表１０．ｐＭＩＴ２．１を含有するＥ．コリにおいて発現されたＮｉｆポリペプチドの検出
【表１０】
2020510413.tif 000011
【０４９５】
植物細胞において検出されるＮｉｆＫ由来の代表的な、特異的ペプチド：
ＩＮＳＣＹＰＬＦＥＱＤＥＹＱＥＬＦＲ（配列番号１２８）
ＱＬＥＥＡＨＤＡＱＲ（配列番号１２９）
ＥＡＬＴＶＤＰＡＫ（配列番号１３０）
ＴＦＴＡＤＹＱＧＱＰＧＫ（配列番号１３１）
ＬＰＫＬＮＬＶＴＧＦＥＴＹＬＧＮＦＲ（配列番号１３２）
ＭＭＥＱＭＡＶＰＣＳＬＬＳＤＰＳＥＶＬＤＴＰＡＤＧＨＹＲ（配列番号１３３）
ＭＹＳＧＧＴＴＱＱＥＭＫ（配列番号１３４）
ＥＡＰＤＡＩＤＴＬＬＬＱＰＷＱＬＬＫ（配列番号１３５）
ＦＧＬＹＧＤＰＤＦＶＭＧＬＴＲ（配列番号１３６）
ＤＳＥＶＦＩＮＣＤＬＷＨＦＲ（配列番号１３７）
ＱＰＤＦＭＩＧＮＳＹＧＫ（配列番号１３８）
ＡＦＥＶＰＬＩＲ（配列番号１３９）
ＬＧＦＰＬＦＤＲ（配列番号１４０）
ＱＴＴＷＧＹＥＧＡＭＮＩＶＴＴＬＶＮＡＶＬＥＫ（配列番号１４１）
ＬＤＳＤＴＳＱＬＧＫ（配列番号１４２）
ＴＤＹＳＦＤＬＶＲ（配列番号１４３）
【０４９６】
植物細胞において検出されるＮｉｆＨ由来の特異的ペプチド：
ＬＧＴＱＭＩＨＦＶＰＲ（配列番号１４４）
ＭＴＶＩＥＹＤＰＡＣＫ（配列番号１４５）
ＶＭＩＶＧＣＤＰＫ（配列番号１４６）
ＣＡＥＳＧＧＰＥＰＧＶＧＣＡＧＲ（配列番号１４７）
ＳＴＴＴＱＮＬＶＡＡＬＡＥＭＧＫ（配列番号１４８）
ＳＴＴＴＱＮＬＶＡＡＬＡＥＭＧＫＫ（配列番号１４９）
ＱＴＤＲＥＤＥＬＩＩＡＬＡＥＫ（配列番号１５０）
ＡＱＥＩＹＩＶＣＳＧＥＭＭＡＭＹＡＡＮＮＩＳＫ（配列番号１５１）
ＡＶＱＧＡＰＴＭＲ（配列番号１５２）
ＬＧＧＬＩＣＮＳＲ（配列番号１５３）
ＡＱＮＴＩＭＥＭＡＡＥＶＧＳＶＥＤＬＥＬＥＤＶＬＱＩＧＹＧＤＶＲ（配列番号１５４）
【０４９７】
植物細胞において検出されるＮｉｆＢ由来の特異的ペプチド：
ＬＣＬＳＴＮＧＬＶＬＰＤＡＶＤＲ（配列番号１５５）
ＦＡＡＩＬＥＬＬＡＤＶＫ  （配列番号１５６）
ＧＥＳＥＡＤＤＡＣＬＶＡＶＡＳＳＲ（配列番号１５７）
ＡＶＱＧＡＰＴＳＣＳＳＦＳＧＧＫ（配列番号１５８）
ＩＮＳＶＬＩＰＧＩＮＤＳＧＭＡＧＶＳＲ（配列番号１５９）
ＱＶＡＱＡＩＰＱＬＳＶＶＧＩＡＧＰＧＤＰＬＡＮＩＡＲ（配列番号１６０）
【０４９８】
植物細胞において検出されるＮｉｆＪ由来の特異的ペプチド：
ＩＡＧＥＬＬＰＧＶＦＨＶＳＡＲ（配列番号１６１）
ＧＴＡＱＮＰＤＩＹＦＱＥＲ（配列番号１６２）
ＩＰＦＶＮＦＦＤＧＦＲ（配列番号１６３）
ＩＥＶＬＥＹＥＱＬＡＴＬＬＤＲＰＡＬＤＳＦＲ（配列番号１６４）
ＳＧＧＩＴＶＳＨＬＲ（配列番号１６５）
【０４９９】
植物細胞において検出されるＮｉｆＳ由来の特異的ペプチド：
ＥＫＥＩＤＹＶＶＡＴＬＰＰＩＩＤＲ（配列番号１６６）
ＥＩＤＹＶＶＡＴＬＰＰＩＩＤＲ（配列番号１６７）
ＩＡＶＤＧＥＧＡＬＤＭＡＱＦＲ（配列番号１６８）
ＥＩＩＴＳＶＶＥＨＰＡＴＬＡＡＣＥＨＭＥＲ（配列番号１６９）
ＩＤＭＬＳＣＳＡＨＫ（配列番号１７０）
ＡＭＮＩＰＹＴＡＡＨＧＴＩＲ（配列番号１７１）
ＱＶＹＬＤＮＮＡＴＴＲ（配列番号１７２）
ＩＰＩＡＶＧＱＴＲ（配列番号１７３）
ＧＶＧＣＬＹＬＲ（配列番号１７４）
【０５００】
植物細胞において検出されるＮｉｆＸ由来の特異的ペプチド：
ＶＰＡＤＴＴＩＶＧＬＬＱＥＩＱＬＹＷＹＤＫ（配列番号１７５）
ＱＦＤＭＶＨＳＤＥＷＳＭＫ（配列番号１７６）
ＶＶＤＦＳＶＥＮＧＨＱＴＥＫ（配列番号１７７）
ＲＡＧＤＹＫＤＤＤＤＫＰＧ（配列番号１７８）
ＡＲＧＤＹＫＤＤＤＤＫＰＧ（配列番号１７９）
ＨＶＤＱＨＦＧＡＴＰＲ（配列番号１８０）
ＶＡＦＡＳＳＤＹＲ（配列番号１８１）
ＬＬＱＥＱＥＷＨＧＤＰＤＰＲ（配列番号１８２）
【０５０１】
植物細胞において検出されるＮｉｆＦ由来の特異的ペプチド：
ＬＡＳＷＬＥＥＩＫＲ（配列番号１８３）
ＶＬＧＳＷＴＧＤＳＶＮＹＡＡＳＲ（配列番号１８４）
ＱＬＧＥＬＡＤＡＰＶＮＩＮＲ（配列番号１８５）
ＦＶＧＬＶＬＤＱＤＮＱＦＤＱＴＥＡＲ（配列番号１８６）
【０５０２】
方法
植物葉サンプルを、液体窒素を用いて冷凍し、そして、液体窒素下で乳鉢と乳棒ですりつぶした。２倍量（ｖ／ｖ）の尿素／ＳＤＳバッファー（６Ｍの尿素、２％のＳＤＳ、６２．５ｍＭのＴｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ６．８、６５ｍＭのＤＴＴ）を、粉末リーフディスクに加え、そして、細胞溶解とＤＴＴによるタンパク質の還元のために室温にて静置した（３０分間）。サンプルを、１６，０００ｇにて５分間遠心分離した。１０〜２０μｌの可溶性画分を、１００μｌの尿素バッファーと共にmicrocon-30 MWCOフィルターに適用し、そして、１０，０００ｇにて１０分間遠心分離した。１００μｌの尿素バッファーおよび３．５μｌの４０％アクリルアミドを添加することによって、アクリルアミドでシステイン残基を不活性化し、室温にて３０分間インキュベートし、続いて、１０，０００ｇにて１０分間遠心分離した。１００μｌの重炭酸アンモニウム（水中に２５ｍＭ）の２回の洗浄ステップおよび先のような遠心分離が、６０μｌのＡＢＣ中の０．５μｇのトリプシン（Promega）を用いたトリプシン分解に先行し、続いて、３７℃にて一晩インキュベートした。トリプシン分解からのペプチドを、１０，０００ｇにて１０分間の遠心分離によって溶出した。２８０ｎｍにおける吸光度を使用して、ペプチド濃度を決定し（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）、そして、サンプルを、５０ｎｇ／μｌまでＬＣＭＳローディングバッファーで希釈した。
【０５０３】
各サンプルからの２５０ｎｇのトリプシン消化産物を、Orbitrap Fusion Tribrid Mass Spectrometerに直接連結されたDionex Nanomate 3000（ThermoFisher）ナノＬＣシステムに注入した。ペプチドを、ローディングバッファーを用いて１０μＬ／分の流量にてAcclaim PepMap C18（３００Å、５ｍｍ×３００μｍ）トラップカラムにより５分間脱塩し、そして、３５℃、０．３μＬ／分の流量にて、Acclaim PepMap C18（１００Å、１５０ｍｍ×０．０７５ｍｍ）カラムにより分離した。６０分間かけて５％から４０％への溶媒Ｂのリニアグラジエントを利用し、続いて、洗浄および５分間かけて４０から９９％へのＢ、９９％のＢにて５分間の保持、６分間かけて５％のＢに戻し、そして、７分間保して再平衡化した。使用した溶媒は：（Ａ）０．１％のギ酸、９９．９％の水；（Ｂ）０．０８％のギ酸、８０％のアセトニトリル、１９．９２％の水、であった。ナノＬＣは、Orbitrap Fusion MSのNanospray Flex Ion供給源に直接連結されていた。イオン噴霧電圧を２４００Ｖに設定し、スイープガスを１Ａｒｂに設定し、およびイオン輸送チューブ温度を３００℃に設定した。データを、Orbitap-MS調査スキャンとそれに続く、１２０，０００分解度での高分解性Orbitrapスキャンの並行捕捉および３秒間にわたるリニアイオントラップにおける複数のＭＳ／ＭＳ事象から成るデータ依存収集モードにより獲得した。第一段階のＭＳ分析を、４×１０5のＡＧＣ標的および５０ｍｓの最大射出時間を用いた、ｍ／ｚ ４００〜１５００の質量範囲にわたる正イオンモードで実施した。タンデム質量スペクトルを、荷電状態２〜７で１０００カウントの強度閾値を超えた前駆イオンによりイオントラップで取得した。スペクトルを、最適なペプチド断片化のための前駆イオンのサイズおよび荷電に基づいて、１．６ｍ／ｚの分離ウィンドウおよび２８％にセットした（高いエネルギー衝突解離）ＨＣＤを用いた四重極分離を使用して獲得した。イオントラップ走査速度を、４×１０3のＡＧＣ標的および３００ｍｓの最大射出時間による急速に設定し、装置を、orbitrapが高分解性ＭＳスペクトルを回収している間、３秒のウィンドウ中のトラップへのイオン注入を最大並行化可能時間利用するように設定した。動的排除を、１５秒間間隔および１０ｐｐｍの質量寛容性で１回出現後に前駆イオンを排除するように設定した。
【０５０４】
タンパク質分析を、Proteome Discoverer v2.1（ThermoFisher）のSequestアルゴリズムを使用して実施した。カルバミドメチルをアルキル化剤として選択し、トリプシンを消化酵素として選択し、Ｈ、Ｍ、Ｗ、ならびに脱アミド化ＮおよびＱに対する酸化のために、最大３つの修飾を有する動的修飾を選択した。タンデム質量分析データを、Ｎｉｆ構築物に関する自家データベース、UniProtから注釈された、一般的な混入物および生物体に固有なデータベースに対して検索した。データベース検索結果を、手動でキュレートして、Proteome Discovererソフトウェア内の構築中のＦＤＲツールによって決定された１％の包括的偽発見率（ＦＤＲ）を使用したタンパク質同定をもたらした。
【０５０５】
本開示の広く一般的な範囲から逸脱することなく、先に記載の本発明への種々の変更および／または改変がなされ得ることは、当業者に明らかであろう。したがって、本発明の実施形態は、すべての点で例示であって、制限的なものではないと考えられるべきである。
【０５０６】
本明細書において論じられるおよび／または言及されたすべての刊行物は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０５０７】
本明細書に含まれた文書、法令、材料、装置、物品などのいかなる考察も、単に本発明についての文脈を提供する目的のためのものである。これらの事柄のいずれか、もしくはすべてが先行技術ベースの一部を形成するか、または本出願のそれぞれの特許請求の範囲の優先日以前に存在したため、本発明に関する分野における共通の一般的知識であったことの承認と解釈されるべきではない。
【０５０８】
参考文献
【化１−１】
2020510413.tif 000012
【０５０９】
【化１−２】
2020510413.tif 000013
【０５１０】
【化１−３】
2020510413.tif 000014
【０５１１】
【化１−４】
2020510413.tif 000015
【０５１２】
【化１−５】
2020510413.tif 000016
【図１】
2020510413.tif 000017
【図２】
2020510413.tif 000018
【図３】
2020510413.tif 000019
【図４】
2020510413.tif 000020
【図５】
2020510413.tif 000021
【図６】
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【図７】
2020510413.tif 000023
【図８】
2020510413.tif 000024
【図９】
2020510413.tif 000025
【図１０】
2020510413.tif 000026
【図１１】
2020510413.tif 000027
【図１２】
2020510413.tif 000028
【図１３】
2020510413.tif 000029
【図１４】
2020510413.tif 000030
【図１５】
2020510413.tif 000031
【図１６】
2020510413.tif 000032
【図１７】
2020510413.tif 000033
【図１８】
2020510413.tif 000034
【図１９】
2020510413.tif 000035
【配列表】
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【国際調査報告】
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2020510413.tif 000037
2020510413.tif 000038
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