(57)【要約】  屈折率整合（ＲＩＭ）製剤、生物学的標本（例えば、細胞および組織）を基材にマウントするためのそれらの使用、およびＲＩＭ製剤に組み込まれた生物学的標本を視覚化する方法について説明する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
屈折率整合（ＲＩＭ）溶液であって、
ａ）水溶性ポリマーであって、前記ポリマーが、０．２７〜０．３４のモル屈折率（ＲLL）対モル体積（Ｖm）比を有する、水溶性ポリマーと、
ｂ）ポリオールと、
ｃ）水または緩衝液と
を含み、
前記水溶性ポリマー対前記ポリオールの質量比が０．３１８：１〜４：１であり、
１．３６以上の屈折率を有する、前記ＲＩＭ溶液。
【請求項２】
前記屈折率が、１．６０以下である、請求項１に記載のＲＩＭ溶液。
【請求項３】
生物学的標本を基材にマウントする方法であって、
前記基材上に前記生物学的標本を配置することと、
前記生物学的標本を請求項１または請求項２に記載のＲＩＭ溶液と接触させて、マウントされた試料を提供することとを含む、方法。
【請求項４】
前記マウントされた試料を乾燥させることをさらに含み、それにより前記水溶性ポリマーが固化して、固化したポリマーを提供する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記水溶性ポリマーが、室温で約４８時間以内、室温で２４時間以内、または約４０℃の温度で約４時間以内に固化する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記固化したポリマーの前記屈折率が、１．４７を超える、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
顕微鏡で前記基材上の前記生物学的標本を視覚化することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
水溶性ポリマー及びポリオールを含む、固化したマウンタントであって、前記ポリマーが、０．２７〜０．３４のモル屈折率（ＲLL）対モル体積（Ｖm）比を有し、前記水溶性ポリマー対前記ポリオールの質量比が、０．３１８：１〜４：１であり、前記固化したマウンタントが、１．４８以上の屈折率を有する、固化したマウンタント。
【請求項９】
前記水溶性ポリマー対前記ポリオールの質量比が、０．５：１以上である、請求項８に記載の固化したマウンタント。
【請求項１０】
前記屈折率が、１．４７より大きい、請求項８または９に記載の固化したマウンタント。
【請求項１１】
前記水溶性ポリマーが、非荷電性である、請求項１に記載のＲＩＭ溶液または請求項８に記載の固化したマウンタント。
【請求項１２】
前記非荷電性水溶性ポリマーが、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メチルビニルエーテル）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、またはポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）である、請求項１１に記載のＲＩＭ溶液。
【請求項１３】
前記非荷電性水溶性ポリマーが、Ｎ−ＲアクリルアミドまたはＮ−Ｒメタクリルアミド（ここでＲが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはＨである）；Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎジエチルメタクリルアミド；Ｎ−２−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）；またはそれらの組み合わせ、のモノマー残基を含む、請求項１１に記載のＲＩＭ溶液。
【請求項１４】
前記非荷電性水溶性ポリマーが、ポリ（Ｎ−メチルメタクリルアミド）（ＰＭＭＡｍ）である、請求項１に記載のＲＩＭ溶液または請求項８に記載の固化したマウンタント。
【請求項１５】
前記水溶性ポリマーが、荷電性である、請求項１に記載のＲＩＭ溶液または請求項８に記載の固化したマウンタント。
【請求項１６】
前記荷電性水溶性ポリマーが、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（ナトリウム−４−スチレンスルホネート）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルエチルアミノアクリレート）、ポリ（アリルアミン）、ポリ［ビス（２−クロロエチル）エーテル−ｃｏ−１，３−ビス［３−（ジメチルアミノ）プロピル］尿素］、またはポリ（ビニルスルホン酸、ナトリウム塩）である、請求項１に記載のＲＩＭ溶液または請求項８に記載の固化したマウンタント。
【請求項１７】
前記水溶性ポリマーが、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの重量平均分子量を有する、請求項１に記載のＲＩＭ溶液または請求項８に記載の固化したマウンタント。
【請求項１８】
前記水溶性ポリマーが、約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａの重量平均分子量を有する、請求項１に記載のＲＩＭ溶液または請求項８に記載の固化したマウンタント。
【請求項１９】
前記水溶性ポリマーが、約２０ｋＤａ〜約１００ｋＤａの重量平均分子量を有する、請求項１に記載のＲＩＭ溶液または請求項８に記載の固化したマウンタント。
【請求項２０】
前記水溶性ポリマーが、約４８ｋＤａ〜約８０ｋＤａの重量平均分子量を有する、請求項１に記載のＲＩＭ溶液または請求項８に記載の固化したマウンタント。
【請求項２１】
前記屈折率が、１．４８〜１．５０、または１．５０〜１．５２、または１．５２〜１．５４である、請求項８に記載の固化したマウンタント。
【請求項２２】
前記固化したマウンタントの前記屈折率が、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス、またはイマージョンオイルの屈折率と整合する、請求項８に記載のＲＩＭ固化したマウンタント。
【請求項２３】
前記水溶性ポリマーが、ポリオールではない、請求項１に記載のＲＩＭ溶液または請求項８に記載の固化したマウンタント。
【請求項２４】
前記ポリオールが、ポリビニルアルコール、グリセロール、ジグリセロール、ポリグリセロール、マンニトール、ソルビトール、エリスリトール、チオジエタノール、チオジプロパノール、またはそれらの組み合わせである、請求項２３に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
【請求項２５】
酸化防止剤をさらに含む、請求項１に記載のＲＩＭ溶液または請求項８に記載の固化したマウンタント。
【請求項２６】
１質量％以下の前記酸化防止剤を含む、請求項２５に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
【請求項２７】
前記酸化防止剤が、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、３−カルボキシプロキシル、ヒドロキノン、メキノール、亜硫酸ナトリウム、エリソルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、カフェ酸、パラフェニレンジアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、またはそれらの組み合わせである、請求項２５に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
【請求項２８】
基材上に配置された生物学的標本を含む、マウントされた生物学的標本であって、前記生物学的標本が、請求項８に記載の固化したマウンタントに組み込まれている、マウントされた生物学的標本。
【請求項２９】
生物学的標本を基材にマウントするためのキットであって、
ｃ）請求項１に記載の屈折率整合（ＲＩＭ）溶液と、
ｄ）前記生物学的標本を前記基材にマウントするための指示書と
を含む、キット。
【請求項３０】
前記基材が、顕微鏡スライド、キュベット、ウェルまたはディッシュである、請求項３に記載の方法、請求項２８に記載のマウントされた生物学的標本、または請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記生物学的標本が、細胞、組織、３Ｄ細胞培養物、または生物全体である、請求項３に記載の方法、請求項２８に記載のマウントされた生物学的標本、または請求項２９に記載のキット。
【請求項３２】
前記生物学的標本が、蛍光染料または蛍光タンパク質で標識されている、請求項３に記載の方法、請求項２８に記載のマウントされた生物学的標本、または請求項２９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年９月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／５５７，０２８号からの優先権を主張し、これはあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
屈折率整合(refractive index matching)（ＲＩＭ）製剤、生物学的標本（例えば、細胞および組織）を基材にマウントするためのそれらの使用、およびＲＩＭ製剤に組み込まれた生物学的標本を視覚化する方法について説明する。
【背景技術】
【０００３】
生物学的標本は、多くの場合、光学顕微鏡による検査のために、ガラス顕微鏡スライドなどの光学的に透明な基材上にマウントされる。典型的に、マウントプロセスは、「封入剤(mounting medium)」または「マウンタント(mountant)」とも呼ばれるマウント溶液(mounting solution)に生物学的標本（例えば、固定細胞または組織）を懸濁し、次いで標本を基材の表面上に堆積させ、それにより標本をマウント溶液に組み込むことを必要とする。マウント溶液および組み込まれた標本は、典型的にカバースライドの下で調査の前に任意に乾燥される。封入剤は、標本を物理的な損傷から保護し、標本の長期保存を可能にする。
【０００４】
封入剤の選択は、試料および基材の種類によって決まる。封入剤は、液体であり得るか、または硬化して永続的なマウンタントになり得る。さらに、封入剤は、理想的には標本と反応せず、経時的に結晶化または暗転しない。標本が染料で染色されている場合、マウンタントはまた、染料を退色または漂白させることもない。蛍光染料で標識された生物学的標本の場合、好適なマウンタントの選択は、多くの場合、光漂白を最小限に抑える能力によって決まる。好適なマウンタントは、初期蛍光強度の消光を最小限に抑えながら、フルオロフォアの光漂白を効果的に低減する必要がある。不可逆的な光漂白による蛍光の損失は、特に標的分子の存在量が少ない場合、または励起光が高強度もしくは長時間の場合、感度の大幅な低減につながる可能性がある。適切なマウンタントの選択における別の要因は、その光学的透明度である。光学的透明度は、マウンタントの透明度だけでなく、マウンタント、試料、およびガラス、または他の基材の屈折率（ＲＩ）の整合度によっても影響される。生物学的標本の場合、水性封入剤が一般に選択される。しかしながら、市販の水性封入剤は、標本の屈折率に適切に整合しない。例えば、細胞および組織は、典型的に１．３５〜１．４２のＲＩを有する。これらの封入剤のＲＩは、顕微鏡のスライドおよびカバースリップで使用されるガラスのＲＩ（１．５０〜１．５４）を下回り、生物学的標本のＲＩとも整合しないため、これらの封入剤では最適な光学的透明度が得られない。したがって、調査中のガラスおよび／または生物学的標本のＲＩにより密接に整合するＲＩを有する生物学的標本をマウントするための改良された製剤が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
水溶性ポリマーであって、当該ポリマーが、０．２７〜０．３４のモル屈折率（ＲLL）対モル体積（Ｖm）比を有する、水溶性ポリマーと、ポリオールと、を含む屈折率整合（ＲＩＭ）溶液が提供される。一態様では、水溶性ポリマーであって、当該ポリマーが、０．２７〜０．３４のモル屈折率（ＲLL）対モル体積（Ｖm）比を有する、水溶性ポリマーと、ポリオールと、を含む屈折率整合（ＲＩＭ）溶液が提供され、水溶性ポリマー対ポリオールの質量比が、０．１２５：１〜４：１である。ある特定の実施形態では、水溶性ポリマー対ポリオールの質量比は、０．３１８：１〜４：１である。ＲＩＭ溶液は、水または緩衝液をさらに含むことができる。ＲＩＭ溶液は、１．３３以上（例えば、１．３３３〜１．５３０、または１．３３０〜１．４２０）の屈折率（ＲＩ）を有することができる。ある特定の実施形態では、ＲＩＭ溶液のＲＩは、１．３６以上である。ある特定の実施形態では、ＲＩＭ溶液のＲＩは、１．３８以上である。さらに他の実施形態では、ＲＩＭ溶液のＲＩは、１．４７以上である。典型的に、ＲＩＭ溶液のＲＩは、１．６０以下である。
【０００６】
別の態様では、生物学的標本を基材上に堆積させることと、生物学的標本を本明細書に開示されるＲＩＭ溶液と接触させて、マウントされた試料を提供することと、を含む、生物学的標本を基材上にマウントする方法が提供される。本明細書に記載される方法、マウントされた生物学的標本、またはキットのいずれにおいても、基材は、顕微鏡スライド、キュベット、ウェル、イメージングチャンバー、またはディッシュであり得る。生物学的標本の代表例としては、細胞、組織、３Ｄ細胞培養物（例えば、スフェロイド／オルガノイド）、または生物全体（例えば、ミバエ、虫、ゼブラフィッシュ）が挙げられる。任意に、生物学的標本は、蛍光染料または蛍光タンパク質で標識される。この方法は、マウントされた試料を乾燥させることをさらに含み、それにより水溶性ポリマーが固化して、固化したポリマーを提供する。水溶性ポリマーは、約４８時間以内、または室温で２４時間以内、または約４０°Ｃの温度で約４時間以内に固化し得る。固化したポリマーのＲＩは、１．４７を超えることがある。ある特定の実施形態では、固化したポリマーのＲＩは、１．４８〜１．５４である。ある特定の実施形態では、固化したポリマーのＲＩは、１．５０〜１．５２５である。この方法は、顕微鏡で基材上の生物学的標本を視覚化することをさらに含み得る。
【０００７】
さらに別の態様では、水溶性ポリマーであって、当該ポリマーが、０．２７〜０．３４のモル屈折率（ＲLL）対モル体積（Ｖm）比を有する、水溶性ポリマーと、ポリオールと、を含む固化したマウンタントが提供され、水溶性ポリマー対ポリオールの質量比が、０．１２５：１〜４：１である。固化したマウンタント中の水溶性ポリマー対ポリオールの質量比は、０．５：１以上であり得る。固化したマウンタントは、１．４７以上の屈折率を有し得る。いくつかの実施形態では、固化したマウンタントの屈折率は、１．４７より大きい。ある特定の実施形態では、水溶性ポリマーであって、当該ポリマーが、０．２７〜０．３４のモル屈折率（ＲLL）対モル体積（Ｖm）比を有する、水溶性ポリマーと、ポリオールと、を含む固化したマウンタントが提供され、水溶性ポリマー対ポリオールの質量比が、０．３１８：１〜４：１であり、固化したマウンタントが、１．４８以上の屈折率を有する。本明細書に開示されているＲＩＭ溶液または固化したマウンタントのＲＩは、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス、またはイマージョンオイルの屈折率（例えば、１．４８〜１．５０、または１．５０〜１．５２、または１．５２〜１．５４）に整合させるのに理想的である。
【０００８】
開示された製剤に使用される水溶性ポリマーは、非荷電性であり得る。例えば、非荷電性水溶性ポリマーは、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メチルビニルエーテル）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、またはポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）であり得る。ある特定の実施形態では、非荷電性水溶性ポリマーは、Ｎ−ＲアクリルアミドまたはＮ−Ｒメタクリルアミド（ここでＲは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはＨである）；Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎジエチルメタクリルアミド；Ｎ−２−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）；またはそれらの組み合わせ、のモノマー残基を含む。ある特定の実施形態では、非荷電性水溶性ポリマーは、ポリ（Ｎ−メチルメタクリルアミド）（ＰＭＭＡｍ）である。あるいは、開示された製剤に使用される水溶性ポリマーは、荷電性であり得る。代表的な荷電性水溶性ポリマーとしては、例えば、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（ナトリウム−４−スチレンスルホネート）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルエチルアミノアクリレート）、ポリ（アリルアミン）、ポリ［ビス（２−クロロエチル）エーテル−ｃｏ−１，３−ビス［３−（ジメチルアミノ）プロピル］尿素］、またはポリ（ビニルスルホン酸、ナトリウム塩）が挙げられる。ある特定の実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリオールではない。水溶性ポリマーは、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの重量平均分子量を有し得る。ある特定の実施形態では、重量平均分子量は、約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａ、または約２０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、または約４８ｋＤａ〜約８０ｋＤａである。水溶性ポリマーはまた、本明細書に記載される荷電性または非荷電性モノマーの２つ以上から形成されるコポリマーであり得、コポリマーは、例えば、ランダム、勾配、ブロック、またはグラフトコポリマーであり得る。
【０００９】
本明細書に開示されるマウント製剤はまた、ポリオール、例えばポリビニルアルコール、グリセロール、ジグリセロール、ポリグリセロール、マンニトール、ソルビトール、エリスリトール、チオジエタノール、チオジプロパノール、またはそれらの組み合わせを含むこともできる。任意に、製剤は、酸化防止剤（例えば、約１質量％以下）、例えば、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、３−カルボキシプロキシル、ヒドロキノン、メキノール、亜硫酸ナトリウム、エリソルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、カフェ酸、パラフェニレンジアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。
【００１０】
さらに別の態様では、基材上に配置された生物学的標本を含む、マウントされた生物学的標本が提供され、この生物学的標本は、本明細書に開示されるように、固化したマウンタントに組み込まれる。
【００１１】
さらに別の態様では、本明細書に開示されるような屈折率整合（ＲＩＭ）溶液と、生物学的標本を基材上にマウントするための指示書と、を含む、生物学的標本を基材上にマウントするためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】試料８および１３について、屈折率の変化を時間の関数として示すプロットである。
【図２】試料８、１０、および１３について、軸方向分解能を焦点深度の関数として示すプロットである。
【図３】試料８、１０、および１３について、横方向分解能を焦点深度の関数として示すプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で言及された全ての特許、出願、公開された出願、および他の刊行物は、それら全体が参照により組み込まれる。このセクションに記載の定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開された出願および他の刊行物に記載の定義と相反する、またはそうでなければ矛盾する場合、このセクションに記載の定義は、参照により本明細書に組み込まれる以下の定義よりも優先される。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」のことを意味する。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、数値を記載するために使用されるとき、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、その数値の最大±１５％までの範囲を包含する。
【００１６】
組成物および方法は、様々な構成要素または工程を「含む」（「含むがこれに限定されない」と解釈される）という意味で説明されるが、組成物および方法は様々な構成要素および工程「から本質的になる」または「からなる」こともでき、そのような用語は、本質的に閉じたメンバー群を定義するものとして解釈されるべきである。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「屈折率」または「ＲＩ」は、光が特定の媒体を通ってどれだけ速く移動するかの尺度である。空気および水など、異なるＲＩ値を有する２つの媒体間を光が移動すると、光が移動する経路が曲がり、画像を歪める。屈折率はまた、真空内の光の波長に対して放射の速度および波長がどれだけ低減するかの尺度でもある。ＲＩは、２つの速度の比であるため、無次元である。
【００１８】
本明細書では、「水溶性」は、化合物が、当業者によって知られている生物学的または分子検出システムにおいて使用されるものを含む、水または水系溶液または緩衝液などの水性溶液に溶解または分散できることを意味するように使用される。化合物は、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で水性製剤に溶解できる場合、水溶性とみなされる。１００ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で水性系に溶解できる化合物は、水溶性が高いとみなされる。１ｍｇ／ｍＬ以下の濃度で水性系に溶解できる化合物は、不良な水溶性を有するとみなされる。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「生物学的標本」または「生物学的試料」は、細胞、３Ｄ細胞培養物（例えば、スフェロイドおよびオルガノイド）、組織、生物全体（例えば、ハエ、虫、ゼブラフィッシュ）、無細胞抽出物などの血液学的、細胞学的、および組織学的標本、または体液試料（例えば、血液または喀痰）を包含する。組織標本は、器官組織を含む、任意の種類の神経組織、上皮組織、筋肉組織、および結合組織であり得る。生物学的試料は、植物または動物（例えば、ヒト、マウス、ハエ、虫、魚、カエル、真菌等）からのものであり得る。
【００２０】
本明細書では、基材上に標本をマウントする際に使用するための製剤について説明する。記載されている製剤は、標本の保護および保存のための硬化封入剤を提供する水性基剤系である。製剤は、基材上の、任意に蛍光標識され得る細胞および組織試料に直接適用することができ、乾燥すると硬化し得る。製剤は、カバースリップなしで硬化し得るため、マウントされた標本を保護するためにカバースリップを使用する必要がなくなる。本明細書に開示されるマウント製剤は、標本を基材上の所定の位置に保持し、それにより、その後の調査のために基材上の生物学的標本を安定化し、保存する。例えば、マウントした後、生物学的標本を顕微鏡下で撮像することができる。開示された製剤は、これらの製剤を生物学的試料の封入剤として使用するのに理想的なものにする、好ましい光学特性を有する。特に、開示された製剤は、高い屈折率を呈する。標本および封入剤のＲＩが、画質に大きな影響を与え得ることが知られている。例えば、標本と周囲のマウンタントとの間のＲＩの差は、標本が顕微鏡下でどのように見えるかに影響を及ぼし得る。標本と周囲の媒体との間のＲＩの差が大きい場合、標本と封入剤との界面で光の強い屈折が生じる可能性がある。ＲＩの大きな差は、光が屈折するためアーチファクトを引き起こす可能性があり、標本の詳細を不明瞭にし得る。対照的に、標本と封入剤との間のＲＩのわずかな差は、光の屈折を低減することができ、多くの種類の標本を顕微鏡下でより明るく、かつ／またはより透明に見えるようにする。
【００２１】
本明細書では、生物学的試料の屈折率、ならびに顕微鏡で一般的に使用される基材、レンズ、カバースリップ、および他の構成要素の屈折率と整合し得る製剤が提供される。したがって、本明細書に記載される製剤は、顕微鏡の対物レンズのガラス、ならびに顕微鏡カバースリップのガラス、またはイマージョンオイルなどの試料の顕微鏡撮像で一般的に使用される他のコンポーネントのＲＩと整合する屈折率（ＲＩ）を有する。高いＲＩを有することにより、開示された製剤は、光の屈折に起因する顕微鏡画像の歪みを最小限に抑え、これらの製剤を、顕微鏡画像の歪みを最小限に抑えるために典型的に使用されるような高倍率および／またはイマージョンオイルでの使用に好適なものにする。乾燥した後、本製剤は、既存のハードマウント製剤の硬いＲＩを超えるＲＩを有するが、試料と染料（存在する場合）の光漂白を低減する。例えば、本明細書に記載される特定の製剤は、１．４７以上のＲＩを有することができ、これは当業者に知られている標準的なハードマウント製剤よりも著しく高い。
【００２２】
本明細書で提供される製剤は、乾燥した後も光学的に透明であり、生物学的標本と化学的に適合性があり、長期間保存した後でも生物学的標本を傷つけたり分解したりしない。記載される製剤はまた、高倍率および３Ｄ再構成（Ｚスタック）画像の明瞭さを改善し、球面収差または散乱光を低減することができ、それにより複数深度でのより明瞭な画像の取り込みを可能にする。好ましい物理的および光学的特性により、本製剤は、標本内の深度でのフルオロフォアの視覚化に使用されるもの（例えば、共焦点蛍光顕微鏡）などの一連の顕微鏡技法を使用し、様々な種類の生物学的標本（例えば、組織および細胞）の３次元撮像で実装され得る。さらに、開示された製剤はまた、低泡形成を呈し、乾燥時に他の市販の硬化マウンタントよりも収縮が少なく、乾燥および／または凍結時にひび割れない。マウンタントは、硬化しても変色または収縮しないため、スライドをマウントしてから数週間〜数ヶ月でも高品質の画像を撮影可能にする。本明細書に開示される製剤はまた、細胞撮像用途で一般的に使用される蛍光染料の消光を最小限に抑えることができる。例えば、退色防止試薬を含む製剤は、染料の消光に耐えることができ、蛍光プローブで染色された細胞および組織を撮像するために特に有用である。上記の属性のユニークな組み合わせにより、記載された製剤は、染色された生物学的試料の長期保存に特に有用である。
【００２３】
本明細書で提供される屈折率整合（ＲＩＭ）製剤は、１つ以上の水溶性成分（例えば、水溶性ポリマー）を含み得る。本明細書で提供されるＲＩＭ製剤は、２つ以上の水溶性成分を含み得る。ある特定の実施形態では、製剤は、少なくとも２つの水溶性成分を含む。水溶性成分は、水性媒体に含まれ得るため、製剤は生物学的標本での使用に適している。生物学的標本を含む製剤は、直接撮像され得るか、または撮像の前に乾燥させて製剤から水を除去することができる。
【００２４】
本明細書で提供されるＲＩＭ製剤は、撮像用途（例えば、ソーダ石灰ガラスもしくはホウケイ酸ガラスから作製されたものなどの顕微鏡スライド）で典型的に使用される基材またはイマージョンオイルの屈折率と整合する屈折率を呈する。本明細書に記載される製剤のＲＩＭ特性は、画質を改善することができ、記載された製剤を撮像用途での使用に理想的なものにする。本明細書で提供されるＲＩＭ製剤は、当業者に知られている標準的なマウント製剤と比較して非常に高いＲＩを呈する。典型的に、開示された製剤が固化した後の屈折率は、１．４５を超える。驚くべきことに、開示された製剤は、１．４５以上のＲＩを有する光学的に透明なマウント製剤を提供することができる。ある特定の実施形態では、マウンタントのＲＩは、１．４５〜１．４７である。他の実施形態では、１．４７以上（例えば、１．４７〜１．５０、または１．５０〜１．５２、または１．５２〜１．５４）のＲＩを有するマウンタントが提供される。ある特定の実施形態では、製剤のＲＩは、約１．４７〜約１．５３である。ある特定の実施形態では、マウンタントのＲＩは、約１．５０〜約１．５２である。
【００２５】
約１．５０〜１．５２のＲＩ範囲を呈する組織などの生物学的試料の場合、同じＲＩ範囲を有する硬化したマウンタントを提供できる製剤を利用することが望ましい場合がある。したがって、開示されたＲＩＭ組成物で使用するのに好適な水溶性成分は、乾燥した後、典型的に１．４５以上、例えば１．４５〜１．６０のＲＩを有する。いくつかの実施形態では、ＲＩは、１．４５〜１．５０である。他の実施形態では、ＲＩは、１．５０〜１．５３である。他の実施形態では、ＲＩは、１．５３〜１．５５である。さらに他の実施形態では、水溶性成分のＲＩは、１．５５〜１．６０である。典型的に、マウンタントの調製に使用される溶液のＲＩは、硬化したマウンタントのＲＩよりわずかに低い。したがって、本明細書ではまた、ＲＩＭ溶液も提供され、ＲＩＭ溶液は、１．３３以上の屈折率（例えば、１．３３３〜１．５３０、または１．３３０〜１．４２０）を有する。
【００２６】
水溶性成分（複数可）は、水溶性ポリマーであり得る。ある特定の実施形態では、製剤は、ポリオールをさらに含み得る。多くの種類のポリマーのＲＩ値は、文献に見出すことができる。ＲＩデータが利用できない場合、特定のポリマーのＲＩは、式１を使用してローレンツ・ローレンツ理論に基づいて測定または計算することができ、式中、ｎは屈折率であり、ＲLLおよびＶmは、それぞれポリマーの繰り返し単位のモル屈折およびモル体積である。式１から計算されるＲＩは、波長に依存し、典型的に５８９ｎｍ（ナトリウムｄ−ライン）の波長で報告される。
ＲLL／Ｖm＝（ｎ2−１）／（ｎ2＋２）（式１）
【００２７】
多くの種類のポリマーのＲLLおよびＶm値は、文献に見出され得るか、または当業者に知られている方法を使用してグループ寄与効果から推定され得る。本明細書に記載されるように、ＲＩＭ製剤での使用に好適な水溶性ポリマーのＲLL／Ｖm比は、典型的に、約０．２７〜約０．３４の範囲である。ある特定の実施形態では、水溶性ポリマーを含む屈折率整合（ＲＩＭ）製剤が本明細書で提供され、ポリマーは、０．２７〜０．３４のモル屈折（ＲLL）対モル体積（Ｖm）比を有し、それによりＲＩＭ溶液は、１．４５〜１．６０の屈折率を有する。ある特定の実施形態では、０．２８４〜０．３１４の範囲のＲLL／Ｖm比を有する水溶性ポリマーを含む製剤は、約１．４８〜約１．５４の屈折率を有するＲＩＭ製剤を提供する。
【００２８】
開示されたＲＩＭ製剤で使用するための水溶性ポリマーおよびコポリマーは、中性または荷電性であり得る。例えば、水溶性ポリマーは、中性（すなわち、非荷電性）ポリマーであり得、それにより試料中に存在する染料および／または細胞タンパク質との相互作用が最小限になる。例示的な中性の水溶性ポリマーとしては、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メチルビニルエーテル）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、およびポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）が挙げられる。例示的なアクリルアミドおよびメタクリル系ポリマーは、例えば、Ｎ−ＲアクリルアミドまたはＮ−Ｒメタクリルアミド（ここでＲは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、もしくはＨ；Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎジエチルメタクリルアミド、Ｎ−２−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）などのモノマー単位の残基、あるいはこれらのモノマー単位の組み合わせを含み得る。ある特定の実施形態では、非荷電性水溶性ポリマーは、ポリ（Ｎ−メチルメタクリルアミド）（ＰＭＭＡｍ）である。例えば、ＰＭＭＡｍなどの中性ポリマーを含む製剤は、既存の市販のハードマウント製剤でよく見られるように、発泡しないか、または長期気泡を形成しないため、気泡形成のリスクが非常に少ない試料の上にピペットで移すことができる。中性ポリマーを含む製剤は、２４時間未満で硬化する可能性があり、そのようなポリマーを、本明細書に開示されるように、ＲＩＭ溶液の調製に特に有用にする。例えば、ＰＭＭＡｍを含む製剤は、およそ３時間で固化して、１．５２のＲＩを有する硬化したマウンタントを提供することができる。
【００２９】
あるいは、水溶性ポリマーは、荷電性ポリマー（例えば、高分子電解質）であり得る。荷電性ポリマーは、同等の分子量の中性ポリマーよりも水に溶けやすく、粘性が高くなり得る。したがって、荷電性ポリマーは、そのような特性が望まれるマウント製剤に使用されるとき、ある特定の利点を有し得る。荷電性ポリマーは、正または負の全体電荷を帯び得る。例示的な荷電性水溶性ポリマーとしては、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（ナトリウム−４−スチレンスルホネート）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルエチルアミノアクリレート）、ポリ（アリルアミン）、ポリ［ビス（２−クロロエチル）エーテル−ｃｏ−１，３−ビス［３−（ジメチルアミノ）プロピル］尿素］、またはポリ（ビニルスルホン酸、ナトリウム塩）が挙げられる。
【００３０】
水溶性ポリマーの分子量は、マウンタントの望ましい特性およびその意図される用途に基づいて選択され得る。例えば、ポリマーの分子量は、製剤の粘性に影響する。一般に、分子量は、取り扱いが容易でありながら十分に粘性があり、それにより基材上の所定の位置に留まることができる製剤を達成するために選択される。開示された製剤で使用するためのポリマーは、典型的に、ある範囲の分子量を含む。分子量（ＭＷ）範囲の下限は、製剤中のポリマーの所望の溶解度に基づいて選択され得、分子量の範囲の上限は、乾燥時に硬化表面を形成する能力に基づいて選択され得る。例えば、分子量が低すぎる場合、製剤は、乾燥時に硬いフィルムを形成しない場合がある。一般に、水溶性ポリマーは、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａ、例えば１ｋＤａ〜１５ｋＤａ、または１５ｋＤａ〜２０ｋＤａ、または２０ｋＤａ〜４０ｋＤａ、または４０ｋＤａ〜８０ｋＤａ、または８０ｋＤａ〜１００ｋＤａの重量平均分子量を有し得る。ある特定の実施形態では、水溶性ポリマーの重量平均分子量は、約４８ｋＤａ〜約８０ｋＤａである。高分子量ポリマー（例えば、約１５ｋＤａを超える）を含む製剤は、生物学的標本の完全性を維持する穏やかな条件下で容易に固化し得る。いくつかの実施形態では、ＲＩＭ製剤は、より低分子量の水溶性ポリマー（例えば、２０ｋＤａ未満）を実装して、より柔らかく、より粘性のマウンタントを実装することができる。より柔らかいマウンタントは、適用に応じて、ある特定の種類の試料をマウントするためにある特定の利点を提供することができる。例えば、乾燥時間の延長を最小限に抑える必要がある場合、または製剤からの試料の回収が所望される場合は、２００ミクロンを超える厚さの標本に、より柔らかいマウンタントを使用することができる。
【００３１】
ＲＩＭ製剤は、１つ以上のポリオールをさらに含むことができる。「ポリオール」とは、２つ以上のヒドロキシル基を含む化合物を指す。ある特定の実施形態では、ポリオールは、１００以上のヒドロキシル基を有する。他の実施形態では、ポリオールは、１０００以上のヒドロキシル基を有する。ある特定の実施形態では、ポリオールは、２５００以下のヒドロキシル基を有する。ＲＩＭポリマーの可塑化を助けるために、ポリオールを製剤に含めることができ、それによりマウントフィルムが乾燥しても、過度に脆性にならないか、またはひび割れ始めることがない。蒸発しないポリオールは、フィルムにいくらかの永続的な体積を提供することもでき、それによりフィルムが薄くなりすぎるのを防ぐ。理想的には、乾燥フィルムは、未乾燥フィルムと同様の体積を維持する。これにより、乾燥した材料の収縮による標本の変形を防ぐことができる。乾燥したフィルムの構造を維持することは、様々な温度（例えば、室温、４oＣ、および−２０oＣ）での試料の保管および保存にも重要である。ポリオールはまた、生物学的標本および／もしくは基材、またはマウントされたシステム中の他の構成要素のＲＩに近いＲＩを有する必要がある（例えば、１．４６〜１．６０）。いくつかの実施形態では、ＲＩは、１．４７〜１．５４である。例示的なポリオールとしては、グリセロール、ジグリセロール、ポリグリセロール、ポリビニルアルコール、糖、例えばマンニトール、ソルビトール、エリスリトール、チオジエタノール、チオジプロパノール等が挙げられる。典型的に、ポリオールは、水溶性ポリマーとは異なる。しかしながら、ある特定の製剤では、ポリマーおよびポリオールは同じ組成を有すると考えられる。ポリマーおよびポリオールの分子量は、同じでも異なっていてもよい。代表的な実施形態では、例えば、ＰＶＡは、ポリオールおよび水溶性ポリマーの両方として使用され得るが、ＰＶＡの２つの形態の分子量は異なる。
【００３２】
本明細書で提供されるＲＩＭ製剤は、水溶性ポリマーおよびポリオールの組み合わせを含むことができる。製剤中の水溶性ポリマー対ポリオールの比は変化する可能性があり、乾燥したハードマウンタントの屈折率に影響し得る。典型的に、ハードマウンタントの調製を意図した製剤は、０．１２５以上の水溶性ポリマー対ポリオールの質量比を含む。ある特定の実施形態では、水溶性ポリマー対ポリオールの質量比は、０．１２５：１〜４：１の範囲である。ある特定の実施形態では、水溶性ポリマー対ポリオールの質量比は、０．１２５：１〜１：１、１：１〜２：１、２：１〜３：１、または３：１〜４：１である。ある特定の製剤では、水溶性ポリマー対ポリオールの質量比は、１：１〜３：１である。ある特定の製剤では、水溶性ポリマー対ポリオールの質量比は、約０．５：１である。
【００３３】
ＲＩＭ製剤は、水性成分（例えば、水または緩衝液）をさらに含むことができ、水溶性ポリマー（複数可）およびポリオール（複数可）は、水性成分に溶解される。水性成分は、生物学的標本およびマウント製剤の成分を溶解および／または水和するのに役立つ。例えば、トリス、ＰＢＳ、ホウ酸塩等の、当業者に知られている任意の生物学的に適合性の緩衝液を本明細書に記載される製剤に使用することができる。７．４を超える製剤のｐＨを維持する緩衝液は、例えば、蛍光染料が存在する場合など、ある特定の製剤において特に有用である。
【００３４】
記載された製剤は、追加のクリアリング剤を必要とせずに試料の透明度を改善することができる。しかしながら、クリアリング剤を任意に組織試料の撮像に使用して、画質をさらに改善することができる。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるＲＩＭ製剤は、クリアリング剤と組み合わせて使用することができる。蛍光物質を含む試料の場合、多くのフルオロフォアおよび蛍光タンパク質、ならびに本ＲＩＭ製剤との適合性を考慮して、水性クリアリング剤を実装することが好ましい場合がある。例示的なクリアリング剤としては、例えば、有機溶媒系および水性洗剤系の試薬、グリセロールまたはチオグリセロール溶液、単糖類および多糖類（例えば、フルクトースおよびスクロース）、尿素溶液、ならびに市販の試薬が挙げられる。
【００３５】
本明細書で提供されるＲＩＭ製剤は、わずか２〜３日で試料上に沈殿物を形成することが知られている一般的に使用されるマウンタントとは対照的に、沈殿物の形成に抵抗する。本明細書に記載されるＲＩＭ製剤はまた、試料および／または蛍光標識材料が存在する場合、光漂白を防ぐ。蛍光染料で染色された生物学的標本のマウントおよび撮像に好適な製剤は、保存または調査時に染色された試料の劣化または光漂白を最小限に抑えるための退色防止剤をさらに含み得る。したがって、ある特定の実施形態では、本明細書で提供されるＲＩＭ製剤は、任意に１つ以上の退色防止試薬を含み、約１質量％以下でＲＩＭ製剤に含めることができる。退色防止剤は、当業者に周知であり、酸化防止剤、例えば、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、３−カルボキシプロキシル、ヒドロキノン、メキノール、亜硫酸ナトリウム、エリソルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、カフェ酸、パラフェニレンジアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン］、他のニトロキシドなど、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３６】
ＲＩＭ製剤は、長期保存中のポリマーおよび／もしくはポリオールの分解を防止するため、ならびに／または細菌の増殖を防止もしくは最小化するために、例えば防腐剤などの追加の成分をさらに含むことができる。好適な防腐剤としては、かなりの量の可視光を吸収しないか、または製剤のＲＩを低下させないものが挙げられる。代表的な防腐剤としては、例えば、安息香酸ナトリウム、安息香酸、またはアジ化ナトリウムが挙げられ、典型的に２質量％未満の濃度で製剤中に存在する。染料などの追加の成分も、本明細書で提供されるＲＩＭ製剤に含めることができる。ある特定の実施形態では、ＲＩＭ製剤は、細胞を染色するための蛍光染料を含むことができる。ある特定の実施形態では、染料は、例えば、ヘキスト３３３４２またはＤＡＰＩなどの細胞の核を染色することができる。
【００３７】
また本明細書では、ＲＩＭ封入剤中の基材上にマウントされた試料が提供される。例えば、生物学的標本は、本明細書に記載されるように、基材上にマウントされ、ＲＩＭ製剤に組み込まれ得る。基材は、ＲＩＭ溶液を支持または含有するのに好適な表面を有する任意の材料であり得る。例えば、基材は、平滑または粗い表面を有することができ、平坦であり得るか、または空洞もしくはくぼみ（例えば、製剤を収容するためのウェル）を含み得る。ある特定の実施形態では、基材は、ＲＩＭ溶液が基材に吸収されないように、比較的滑らかで無孔質の表面を有する。基材は、光学的に透明または不透明であり得、最終的な最終用途に応じて、様々な材料から作製することができる。顕微鏡用途の場合、例えば、基材は光学的に透明であり得る。基材は、例えば、ガラスまたはポリマーを含む任意の適切な材料から作製することができる。代表的な基材としては、例えば、顕微鏡スライド、キュベット、ウェル、カバースリップ、またはディッシュなどの光学および撮像用途で一般的に使用されるものが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、マウントされた試料は、透明な基材（例えば、顕微鏡スライド）、生物学的標本（例えば、組織）、および試料を取り囲み、それを基材に付着させる固化したＲＩＭ製剤を含むことができる。任意に、カバースリップを固化したマウントされた試料の上に配置することができる。マウントされたスライド上の固化した製剤の量は、生物学的標本を取り囲み、それを基材および／またはカバースリップに付着させるのに十分である。
【００３８】
本明細書に開示されるマウントされた生物学的試料は、存在する場合、試料または蛍光染色剤を劣化または退色させることなく室温以下で保存すると、数ヶ月（例えば、５ヶ月以上）安定であり得る。
【００３９】
試料は、組織、細胞、血液等を含むが、これらに限定されない任意の生物学的材料であり得る。生物学的試料は、基材にマウントする前に蛍光染料（複数可）または蛍光タンパク質で染色され得る。生物学的標本の染色に適した蛍光タンパク質は、当技術分野で周知であり、例えば、限定されないが、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ等が挙げられる。生物学的標本に一般的に使用される蛍光染料としては、例えば、ホウ素ジピロメテン（４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン）、シアニン、キサンテン、スルホン化ピレン、ローダミン、クマリン、およびそれらの誘導体が挙げられる。例示的な有機染料としては、ＢＯＤＩＰＹ染料、クマリン（例えば、パシフィックブルー、パシフィックグリーン、およびパシフィックオレンジ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）から入手可能））、ローダミン、ロードール、フルオレセイン、チオフルオレセイン、アミノフルオレセイン、カルボキシフルオレセイン、クロロフルオレセイン、メチルフルオレセイン、スルホフルオレセイン、アミノロードル、カルボキシロードール、クロロロードール、メチルロードール、スルホロードール、アミノローダミン、カルボキシローダミン、クロロローダミン、メチルローダミン、スルホローダミン、シリコンローダミン、およびチオローダミン、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、メロシアニン、シアニン（例えば、シアニン２、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７）、オキサジアゾール誘導体、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾキサジアゾール、ベンゾキサジアゾール、ピレン誘導体、カスケードブルー、オキサジン誘導体、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０、アクリジン誘導体、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー、アリールメチン誘導体、キサンテン染料、スルホン化キサンテン染料、スルホン化ピレン、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン、テトラピロール誘導体、ポルフィリン、フタロシアニン、ビリルビン、およびビス−ベンズイミド（ヘキスト染色）が挙げられる。ある特定の実施形態では、有機染料は、近赤外染料、例えば、ＣＹ５．５（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）、ＩＲＤＹＥ  ８００（Ｌｉ−Ｃｏｒ，Ｌｉｎｃｏｌｎ，ＮＥ）、ＤＹＬＩＧＨＴ  ７５０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）もしくはインドシアニングリーン（ＩＣＧ）など、またはシアニン染料、例えば、シアニン２、シアニン３、シアニン３．５、シアニン５、シアニン５．５、シアニン７などである。ある特定の実施形態では、有機染料は、キサンテンまたはスルホン化キサンテン染料、例えば商品名ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６３３、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６４７、およびＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ７００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で市販されているものである。好適な市販の染料の追加の例としては、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４０５、ＡＬＥＸＡ  ���ＬＵＯＲ  ４８８、およびＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ＰＬＵＳ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。
【００４０】
マウントされた試料は、直接調査され得るか、または本明細書に記載される方法を使用して硬化させて、固化したマウンタントに組み込まれた生物学的標本を提供することができる。有利に、マウントされ、硬化された試料の屈折率は、基材（例えば、顕微鏡スライド）およびカバースリップのＲＩと整合し、通常は１．４７を超え、典型的には１．４８〜１．５４の範囲である。例えば、標本を含む固化したマウンタントは、１．４８〜１．５４（例えば、１．４８〜１．５０、または１．５０〜１．５２、または１．５２〜１．５４）の範囲であり得る屈折率を有し得る。
【００４１】
さらに本明細書では、生物学的標本を基材上にマウントする方法が提供される。代表的な方法には、生物学的標本を基材上に堆積させ、次いで生物学的標本をＲＩＭ溶液と接触させて、マウントされた試料を提供することが含まれる。マウントした後、試料を直接調査（例えば、顕微鏡を使用して撮像）することができる。しかしながら、試料は、典型的に、使用中およびその後の保存中の保護のために（例えば、カバースリップで）覆われている。次いで、生物学的標本を含む製剤を撮像するか、またはその後に乾燥させることができる。試料の乾燥（本明細書では「硬化」とも呼ばれる）は、ＲＩＭ製剤から水を除去し、それによりマウンタントの硬化をもたらす。水溶性ポリマーを含む製剤の場合、水の除去により、本明細書で「ハードマウンタント」または「ハードマウント」製剤と呼ばれる固化した製剤が得られる。硬化したマウンタントは、ある特定のレベルの粘性および／または弾性を依然として維持できるため、過度に脆性にならないか、またはひび割れないことを理解されたい。
【００４２】
製剤の種類および望ましい硬化のレベルに応じて、マウントされた試料は、一連の異なる硬化レジメンに供され得る。特定の製剤を硬化するのに必要な温度および時間は、例えば、製剤中の水溶性成分の種類、分子量、濃度、ならびに望ましい硬化の程度を含む、様々な要因に依存する。さらに、硬化のための条件は、試料がカバースリップで覆われているか、または大気に開放されているかに依存する。
【００４３】
乾燥は、周囲温度（例えば、室温）または高温で実施され得る。ある特定の実施形態では、硬化は、生物学的標本への損傷および／または製剤中の水溶性成分への分解を防ぐために、約４０oＣを下回る温度で起こる。水溶性ポリマーを含む製剤では、ポリマーは、２４時間以内、または場合によっては１０時間以下、または４時間以内でも固化し得る。２０ｋＤａ以上の分子量を有する水溶性ポリマーを含むある特定の製剤では、本明細書に開示されているように、乾燥は、カバースリップの非存在下で４時間以内に約４０oＣを下回る温度で達成され得る。
【００４４】
本明細書で提供されるマウント製剤は、組織および血液を含む顕微鏡スライド上への血液学的、組織学的、および細胞学的試料のマウントを含むがこれらに限定されない、様々な組織化学、免疫化学、および細胞化学適用で使用され得る。記載されたＲＩＭ製剤を使用して、血液、細胞、組織、あるいは他の生体液の試料または材料（研究および／もしくは診断目的のための顕微鏡検査を促進するために染色された材料を含むがこれらに限定されない）などの、基材上にマウントされた標本を提供することができる。本明細書に開示される方法に従って調製されたマウントされた生物学的標本は、当該分野で周知の撮像技法を使用して視覚化され得る。撮像は、例えば、光学顕微鏡を使用して実行され得る。本明細書に記載されるマウント製剤の高いＲＩおよび光学的透明度により、標準的なマウンタントを使用する場合よりも深い深度（例えば、１００μｍ以下、例えば、１〜１００μｍ）および高い解像度で生物学的試料を撮像できる。例えば、蛍光標識された標的は、１００μｍまで検出可能であり、解像度は、同様の深度まで維持される。
【００４５】
試料は、標準のＩＣＣ／ＩＨＣプロトコルを使用して調製され得る。マウントする前にアルコール（例えば、メタノールおよびエタノール）中でさらに脱水すると、乾燥時間を低減することができる。試料をマウントした後、乾燥剤の存在下で乾燥すると、乾燥時間を短縮することもできる。試料をマウンタントでコーティングしてそれを覆い、カバースリップなしで乾燥させることができる。次いで、マウントされた試料は、カバースリップなしで直接撮像され得るか、または少量のグリセロールで覆われ、撮像の前に覆われ得る。溶液または懸濁液ベースの試料および組織試料を含むがこれらに限定されない、任意の好適な生物学的試料を、本明細書に開示される方法を使用して評価することができる。ある特定の実施形態では、試料は、細胞または消化された細胞およびその断片を含む。細胞は死んでいる（例えば、固定されている）か、または生きている可能性がある。本明細書に開示されるＲＩＭ製剤で処理され得る生物学的材料の追加の例としては、３Ｄ細胞培養物（スフェロイド／オルガノイド）または生物全体（例えば、ミバエ、虫、ゼブラフィッシュ）が挙げられる。
【００４６】
本明細書に記載されるＲＩＭ製剤を使用して、限定されないが、植物、微生物、動物、土、血液および血漿試料、ならびに土壌粒子および地質試料を含むが、これらに限定されない他の種類の非生物有機および無機材料を含む異なる材料の特徴を、客観的な構造の明瞭さ、定義、または分解能を失うことなく識別することができる。
【００４７】
細胞中の異なる成分を識別するために、染色を使用して、化学組成に基づいて特定の構造間のコントラストを提供することができる。本明細書に開示されるＲＩＭ溶液は、細胞を染色するために典型的に使用される蛍光染料を干渉しない。したがって、ある特定の実施形態では、生物学的標本は、本明細書に開示されるものを含むがこれらに限定されない蛍光染料で標識され得る。例えば、試料は、特定の親和性分子（例えば、抗体）によって認識され、それに結合され得る表面抗原（例えば、細胞表面受容体）を発現する細胞を含むことができる。細胞は、細胞の表面上の抗原を親和性分子に結合して、複合体で標識された細胞を形成するための条件下で、親和性分子（例えば、抗原）に付着したフルオロフォアを含む複合体で処理することができる。あるいは、フルオロフォアは、細胞内、例えば細胞質内、または細胞小器官もしくは細胞膜内に含まれ得る。さらに、本明細書で提供されるＲＩＭ製剤は、染色された細胞および組織の撮像に使用することができ、蛍光免疫組織化学（ＩＨＣ）用途で特に有用である。
【００４８】
標本を準備する一般的な方法は、標本を溶液内に完全に浸すのに十分な量のマウント溶液に、任意に染色され得る標本を浸すことを必要とする。次いで、標本を基材（例えば、顕微鏡スライド、キュベット、またはウェル）に適用する。任意に、マウントされた標本を、硬化するまで（例えば、室温〜最大約４０℃で）乾燥させることができる。カバースリップを、試料の硬化前または硬化後に標本全体に適用することができる。硬化したマウントされた試料は、無期限に保存することができる。あるいは、マウントされた試料を調査する、例えば、顕微鏡下で視覚化することができる。マウント製剤は、蛍光顕微鏡および対物レンズ、例えば落射蛍光、広視野、共焦点、誘導放出減少（ＳＴＥＤ）、および構造化照明顕微鏡（ＳＩＭ）などに対応している。ＲＩＭ製剤の優れた光学特性により、標本は透明に見え、透明度を損なうことなく細胞および組織のより深い層の視覚化を可能にする。
【００４９】
記載されたＲＩＭ製剤はまた、組織試料を基材上にマウントするためにも理想的である。試料の厚さ、細胞外物質の存在、および試薬の浸透は、バックグラウンド蛍光、および不良な画像解像度、および撮像深度の減少をもたらし得るため、組織全体のマウントおよび撮像はこれまで困難であった。記載された製剤は、それがカバースリップおよび組織試料を通過する際に光の屈折を減少させることができ、より高い解像度およびより深い深度への撮像を可能にする。開示された製剤は、試料の透明性を改善するため、組織試料での使用に特に有利である。
【００５０】
本明細書に記載されるように、ＲＩＭ製剤を使用して顕微鏡スライド上に組織試料をマウントするための代表的な方法が提供される。組織は、固定または非固定であり得る切片化試料または全体試料であり得る。一般に、組織試料は、顕微鏡スライドの表面上に堆積され、本明細書に開示されるＲＩＭ製剤が、試料に適用される。次いで、マウントされた試料を乾燥させて、過剰な水分を除去し、それにより製剤が固化する。この方法で使用される封入剤の量は異なり得るが、一般的には組織の表面を濡らすように選択される。必要に応じて、既知の方法を使用して、余分な封入剤を除去することができる。スライド表面上にマウントされた後、マウントされた試料は、熱の印加を伴うか、または伴わずに（例えば、室温または高温で）乾燥させることができる。真空ポンプおよび／または乾燥剤を使用することによって、乾燥を促進することができる。乾燥した後、組織はスライドにしっかりと付着し、試料はマウンタント内に組み込まれる。必要に応じて、追加量の製剤を添加し、乾燥プロセスを繰り返すことができる。
【００５１】
さらに本明細書では、試料のその後の撮像および／または保存のために、生物学的試料を基材にマウントするためのキットが提供される。したがって、さらに別の態様では、本明細書に開示されるような屈折率整合（ＲＩＭ）溶液と、生物学的標本を基材上にマウントするための指示書と、を含む、生物学的標本を基材上にマウントするためのキットが提供される。任意に、例えばグリセロールなどの共マウンタントを含む追加の成分をキットに含めることができる。
【００５２】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を実証するために含まれている。以下の実施例に開示されている技法は、本発明の実施において十分に機能することが発明者（複数可）によって発見された技法を表しており、したがってその実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることを当業者は理解されたい。しかしながら、当業者であれば、本開示に照らして、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、また本明細書の範囲から逸脱することなく、同様のまたは類似する結果をさらに得ることができることを理解されたい。
【実施例】
【００５３】
本明細書で提供される実施例は、特に明記しない限り、以下の一般的な方法を利用する。乾燥前後の全てのマウンタント製剤の屈折率を、ランプ動作波長ナトリウムＤライン（５８９．３ｎｍ）を備えたＡＢＢＥ−３Ｌ屈折計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で測定した。ポリ（Ｎ−メチルメタクリルアミド）（ＰＭＭＡｍ）の分子量は、５ｍＭのＬｉＢｒをメタノール／ジメチルホルムアミド（５０／５０ｖ／ｖ％）を溶離液として、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのｍｉｎｉＤＡＷＮ（登録商標）ＴＲＥＯＳ（登録商標）多角度光散乱（ＭＡＬＳ）を備えたＴＳｋｇｅｌ（登録商標）ＨHr有機サイズ排除カラム（ＴＯＳＯＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＬＬＣ，Ｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）、およびＯｐｔｉｌａｂ（登録商標）Ｔ−ｒＥＸ示差屈折計検出器（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を使用する使用標準ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法によって測定される、重量平均分子量（Ｍw）として報告されている。
【００５４】
実施例１
マウンタント試料の屈折率を測定する
乾燥試料に関する屈折率測定は、３００μＬの試料を屈折計プリズム上に慎重に広げた後、マウンタントを最大２４時間乾燥させることによって測定した。マウンタント溶液を乾燥させて透明フィルムにした後、屈折率を測定した。
【００５５】
実施例２
マウント手順
生物学的標本（例えば、３０μｍ未満の厚さを有する培養された単層細胞および組織切片）は、十分な量のマウンタント、典型的には１〜３滴（３０〜１００μＬ）を、完全に覆われるかまたは浸されるまで基材上に配置された標本に適用することによって基材上にマウントされる。生物学的標本は、非染色であり得るか、または当業者に周知の手順を使用して、マウントする前に染色することができる。次いで、標本を１８ｍｍ×１８ｍｍのカバースリップで覆い、余分なマウンタントをカバースリップの端から拭き取るか、ピペットで取り除く。マウントされた標本は、室温で２４〜９６時間乾燥させることができるが、４０℃もの高い温度が許容される。マウントされた標本が完全に乾燥した後、標本を、当業者に周知の蛍光顕微鏡法を使用して撮像することができる。あるいは、カバースリップを適用する前に、マウントされた標本を乾燥させることができる。カバースリップなしで乾燥させると、ハードセットマウンタントの乾燥を促進することができる。カバースリップなしでは、乾燥には４０℃で約３０分、室温で約４時間を要し得る。マウンタントが乾燥した後、水、さらなるマウンタント、エタノール、またはグリセロールなどの接触液を乾燥したマウンタント上に置き、次いでカバースリップを標本上に置くことによって、カバースリップをマウントされた標本上に適用することができる。
【００５６】
以下のプロトコルを、３０〜１００μｍ、およびより厚い生物学的標本をマウントするために使用することができる。カバースリップをマウントする前に、マウンタントを室温まで２時間温める。カバースリップの端を軽く叩くか、または実験用ワイプ上でスライドさせることによって、試料から余分な液体を除去する。スライドマウント標本の場合、２〜３滴または６０〜１００μＬのマウンタントを標本に直接適用し、気泡が入らないように慎重にカバースリップをマウンタントの上に下ろす。ウェルプレートまたは培養ディッシュで染色された標本の場合は、試料を顕微鏡スライドに慎重に移動させる。スライドへの１０μＬのマウンタントの添加は、試料を所定の位置に操作するのに役立ち得る。３−Ｄ培養細胞またはスフェロイドの場合、チップの端部を除去した１ｍＬピペットを使用して、３−Ｄ培養物またはスフェロイドを顕微鏡スライドに移動させる。試料の完全性を確保するために、適切なスペーサーを備えた顕微鏡スライド上に緩衝液とともに３−Ｄ培養物を置く。スペーサーは、必要なマウンタントの量を最小限に抑えながら、試料に十分なスペースを確保する必要がある。縁部が開いているスペーサーは、試料の硬化時間を減少させる。必要に応じて、カバースリップを軽く叩いて気泡を除去する。マウンタントがカバースリップの縁部まで満たされない場合は、ピペットを使用して、カバースリップの下に追加のマウンタントを適用する。軽く叩いて、試料の周囲から気泡を除去する。試料を十分に覆うことができないと、マウンタントの収縮につながり、撮像領域を低減し得る。マウントされた試料を平らで乾燥した表面上に置き、暗所で室温で硬化させる。最適な結果を得るために、試料を少なくとも４８時間硬化させる。
【００５７】
３０〜１００μｍ、およびより厚い標本は、以下のプロトコルを使用してより迅速に硬化させることができる。カバースリップをマウントする前に、マウンタントを室温まで２時間温める。カバースリップの端を軽くたたくか、または実験用ワイプ上でスライドさせることによって、試料から余分な液体を除去する。スライドマウント標本の場合は、２〜３滴または６０〜１００μＬのマウンタントを標本に直接適用する。スライドを慎重に前後に傾けて、マウンタントを標本上に均一に分散させる。１８ｍｍ×１８ｍｍの領域に２〜３滴または６０〜１００μＬのマウンタントを広げるようにする。ピペット先端の縁部を使用して、気泡を除去し、マウンタントを広げるのをやさしく助けることができる。ウェルプレートまたは培養ディッシュで染色された標本の場合は、試料を顕微鏡スライドに慎重に移動させる。スライドへの１０μＬのマウンタントの添加は、試料を所定の位置に操作するのに役立ち得る。３−Ｄ培養細胞またはスフェロイドの場合、チップの端部を除去した１ｍＬピペットを使用して、３−Ｄ培養物またはスフェロイドを顕微鏡スライドに移動させる。試料の完全性を確保するために、適切なスペーサーを備えた顕微鏡スライド上に緩衝液とともに３−Ｄ培養物を置く。スペーサーは、必要なマウンタントの量を最小限に抑えながら、試料に十分なスペースを確保する必要がある。培養液から余分な緩衝液を除去し、スペーサーの高さと表面積に応じて、２〜３滴または６０〜１００μＬのマウンタントを標本に直接適用する。この時点ではカバースリップを適用しない。試料をカバースリップなしで室温で１６〜２４時間、光から保護して硬化させる。１６〜２４時間後、硬化したマウンタントおよび標本の上部に１０μＬのグリセロールを適用する。カバースリップを適用し、所定の位置に押し込み、存在する場合は叩いて泡を除去する。カバースリップを１〜３時間、またはカバースリップが動かなくなるまで硬化させる。
【００５８】
実施例３
ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を用いた封入剤の配合
０．５０ｇのグリセロール（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｆａｉｒ  Ｌａｗｎ，ＮＪ）、１．００ｇのＰＶＰ（Ｍw＝５５，０００ｇ／ｍｏｌ、ＴＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）、６１ｍｇの２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３，プロパンジオール（ＴＲＩＳ塩基、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、および３．８ｍＬの脱イオン水を、２０ｍＬの磁気攪拌棒を備えたシンチレーションバイアルに添加することによって、封入剤を配合した。溶液を、６０℃の水浴中で５００ｒｐｍで撹拌し、ＰＶＰの完全な溶解が観察されるまで加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。ＲＩは、実施例１に記載されるように測定した（表１、試料２を参照）。
【００５９】
実施例４
ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）を用いた封入剤の配合
０．５０ｇのグリセロール、６１ｍｇのＴＲＩＳ塩基、１．００ｇのＰＶＡ（Ｍw約２３，０００ｇ／ｍｏｌ、Ｓｅｋｉｓｕｉ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｅｃａｕｃｕｓ，ＮＪ，ＵＳＡ）、および３．８ｍＬの脱イオン水を、２０ｍＬの磁気攪拌棒を備えたシンチレーションバイアルに添加することによって、封入剤を配合した。ＰＶＡの完全な溶解が観察されるまで、実施例３に記載されるように溶液を撹拌し、加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。ＲＩは、実施例１に記載されるように測定した（表１、試料８を参照）。
【００６０】
実施例５
ポリ（Ｎ−メチルメタクリルアミド）（ＰＭＭＡｍ）を用いた封入剤の配合
０．５０ｇのグリセロール、６１ｍｇのＴＲＩＳ塩基、１．００ｇのＰＭＭＡｍ（Ｍw＝１００，０００ｇ／ｍｏｌ）、および３．８ｍＬの脱イオン水を、２０ｍＬの磁気攪拌棒を備えたシンチレーションバイアルに添加することによって、封入剤を配合した。ＰＭＭＡｍの完全な溶解が観察されるまで、実施例３に記載されるように溶液を撹拌し、加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。ＲＩは、実施例１に記載されるように測定した（表１、試料１４を参照）。
【００６１】
実施例６
様々なポリマー／グリセロール質量比を用いた封入剤の配合
実施例３〜５に記載されているように、水溶性ポリマーとしてＰＶＰ、ＰＶＡ、およびＰＭＭＡｍを使用して、封入剤を配合した。さらに、ポリマー対グリセロールの質量比は、０．５〜２．０まで変化した。マウンタントの最終体積を希釈して、ＤＩ水で５ｍＬの一定体積にした。ポリマーの完全な溶解が観察されるまで、実施例３に記載されるように溶液を撹拌し、加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。ＲＩは、実施例１に記載されるように測定した（ＰＶＰについては表１、試料１、２、３および４；ＰＶＡについては試料７、８および１０；ならびにＰＭＭＡｍについては試料１４、１５、１７、１８および２０を参照）。表１の試料１、２、３、４、７、８、１０、１４、１５、１７、１８、および２０のデータを参照すると、乾燥した封入剤のＲＩは、ポリマー対グリセロールの比が増加するにつれて著しく増加し、これは、文献に報告されている試験したポリマーのＲＩ（すなわち、１．５３０  ＰＶＰ、１．５０  ＰＶＡ、および１．５４０  ＰＭＭＡｍ）が純粋なグリセロールのＲＩ（２５℃で１．４７２２）を超えるため予想されていた。しかしながら、ポリマー濃度がある特定の閾値を超えると、乾燥したマウンタントの物理的および光学的特性が大幅に低下し、ポリマーに応じて、顕微鏡用途に使用できなくなるフィルムになることもある（例えば、試料２３を参照）。しかしながら、製剤中のポリオールが多すぎると、乾燥した材料が脂性または油性になり、カバースリップが試料に十分に付着しなくなる。ある特定のポリマーの場合、この閾値は、約０．１２５：１以上（例えば、ＰＶＰおよびＰＶＡ）であり、ごく少量のポリマーのみが、使用可能な高ＲＩＭフィルムを製造するために必要とされる。しかしながら、他のポリマーの場合、製剤中のポリマーが多すぎると、フィルムの品質が低下し、他の欠点が生じる可能性がある。例えば、ＰＭＭＡｍを実装する製剤の場合、製剤中のいくらかのポリオールの存在は、ポリマーを可塑化するのに役立ち、それにより特に低温で保存した場合にポリマーが過度に脆性にならないか、またはひび割れない。したがって、ＰＭＭＡｍ系製剤の場合、水溶性ポリマー対ポリオールの質量比は、約４：１以下（例えば、０．１２５：１〜４：１）である。ポリマーの種類に関係なく、ポリオールはまた、乾燥したマウンタントに一定レベルの永続的な体積を与え、生物学的試料（例えば、細胞）が過度に圧縮されるのを防ぐことができる。例えば、ポリオールを含まないＰＶＡフィルムは、典型的に乾燥してもひび割れないが、フィルムは非常に収縮するため、細胞が圧縮される。
【００６２】
実施例７
様々なポリマー／ジグリセロール質量比での封入剤の配合
ポリオールとしてグリセロールの代わりにジグリセロール（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ）を使用したことを除いて、実施例６に記載されるように封入剤を配合した。ポリマー対ジグリセロールの質量比は、０．５〜２．０まで変化した。マウンタントの最終体積を、ＤＩ水で５ｍＬの一定体積にした。ポリマーの完全な溶解が観察されるまで、実施例３に記載されるように溶液を撹拌し、加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。ＲＩは、実施例１に記載される手順に従って測定した（ＰＶＰについては表１、試料５および６；ＰＶＡについては試料９、１１および１２；ならびにＰＭＭＭＡｍについては試料１３、１６、および１９を参照）。表１を参照すると、試験されたポリマーのＲＩは、純粋なジグリセロールのＲＩ（２０℃で１．４８５０）を超えるため、ポリマー対ジグリセロールの比が増加するにつれて、乾燥封入剤のＲＩは増加した。さらに、ジグリセロールで調製した封入剤は、グリセロールを使用して調製した場合よりもわずかに高いＲＩを有していた。
【００６３】
実施例８
様々なポリマー分子量を有する封入剤の配合
ポリマーの重量を以下のように変化させたことを除いて、実施例３〜５に記載されるように封入剤を配合した。ＰＶＰ（１０，０００ｇ／ｍｏｌ〜５５，０００ｇ／ｍｏｌ）、ＰＶＡ（１３，０００ｇ／ｍｏｌ〜３１，０００ｇ／ｍｏｌ）、およびＰＭＭＡｍ（３３，０００ｇ／ｍｏｌ〜１００，０００ｇ／ｍｏｌ）。ポリマー対ポリオールの質量比は、０．５〜２．０まで変化した。マウンタントの最終体積を希釈して、ＤＩ水で５ｍＬの一定体積にした。ポリマーの完全な溶解が観察されるまで、実施例３に記載されるように溶液を撹拌し、加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。ＲＩは、実施例１に記載される手順に従って測定した（ＰＶＰについては表１、試料１〜６；ＰＶＡについては試料７〜１２；ならびにＰＭＭＭＡｍについては試料１３〜２０を参照）。興味深いことに、ポリマーの分子量は、ポリオールの種類およびポリマー対ポリオールの比が一定に保たれた場合、ＲＩに統計的に有意な影響を与えなかった。
【００６４】
実施例９
ポリマーのみを用いた封入剤の配合
グリセロールまたはジグリセロール添加剤を製剤から省いたことを除いて、実施例３〜５に記載されるように封入剤を配合した。マウンタントの最終体積を希釈して、ＤＩ水で５ｍＬの体積にした。ポリマーの完全な溶解が観察されるまで、実施例３に記載のように溶液を撹拌および加熱した。ポリマーの溶解後、使用前にバイアルを室温まで冷却させた。ＲＩは、実施例１に記載の手順に従って測定された（表１、試料２１〜２３を参照）。試料２３のＲＩは、乾燥したマウンタントのひび割れのために測定できなかった（ＮＭ）。グリセロールまたはジグリセロールを含まない試料のデータは、製剤中のポリオールの存在により、恐らく乾燥したポリマーフィルムが可塑化または軟化するために、フィルムが過度に脆性になるか、または収縮しすぎるのを防ぐことができることを示している。
【表１】
2020533652.tif 000003
【００６５】
実施例１０
ポリマーおよび退色防止剤を用いた封入剤の配合
０．５５ｇのグリセロール、１．１０ｇのＰＭＭＡｍ（Ｍw＝６０，０００ｇ／ｍｏｌ）、１２２ｍｇの２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３，プロパンジオール（ＴＲＩＳ塩基）、および５．０ｍＬの脱イオン水を、２０ｍＬの磁気攪拌棒を備えたシンチレーションバイアルに添加することによって、封入剤を配合した。ＰＭＭＡｍの完全な溶解が観察されるまで、実施例３に記載されるように溶液を撹拌し、加熱した。ポリマーの完全溶解後、９．７ｍｇの安息香酸（７．９４ｍｍｏｌ）および１９ｍｇの亜硫酸ナトリウム（１５ｍｍｏｌ）を、それぞれ防腐剤および退色防止剤として添加した。全ての安息香酸が溶解するまで、溶液を６０℃でさらに３０分間撹拌した。溶解した後、バイアルを室温まで冷却し、体積をＤＩ水で１０ｍＬまで希釈した。実施例１に記載される手順に従ってＲＩを測定した（２４時間後、２１℃でＲＩ＝１．５１４６）。この製剤のＲＩ値は、表１に提示される試料１８または試料１３に最も類似している。実施例８は、ＭＷが統計的にＲＩ値に影響を与えないこと、およびジグリセロール対グリセロールの使用がＲＩ値をわずかに増加させることを示している。試料１３および試料１８と比較して、現在の試料の１．５１４６のＲＩ値は、退色防止剤および防腐剤の添加が最終的なＲＩ値に与える影響があったとしてもごくわずかであることを示唆している。
【００６６】
実施例１１
経時的な屈折率測定
ＲＩの変化を時間の関数として追跡するために、屈折率を５日間にわたって監視した。実施例１に記載されるように、様々なマウント製剤を評価し、５日間にわたって様々な時点で測定を繰り返した。屈折率は、最初の５時間で劇的に増加し、その後プラトーになり、２４時間後も同様のままであった（試料８および１３の図１を参照）。
【００６７】
実施例１２
共焦点顕微鏡を使用した軸方向分解能測定のためのサブミクロン蛍光微小球のマウント
本明細書に開示されたマウント製剤の様々な焦点深度での軸方向分解能は、サブ分解能蛍光微小球の点広がり関数を使用して共焦点顕微鏡で検出される。ＰＳ−Ｓｐｅｃｋ（商標）顕微鏡ポイントソースキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）からの１．７μＬの１７５ｎｍ緑色蛍光微小球（５０５／５１５励起／放射）を、２００μＬのマウンタント試料に分散させ、次いで２０分間超音波処理する。超音波処理の後、１００μＬの各試料をエタノールで洗浄した１８ｍｍ×１８ｍｍのカバースリップ上にピペットで移し、カバースリップをピンセットで前後に傾けることによって全体に広げる。封入剤試料を、カバースリップ上で４０℃で１時間乾燥させた。乾燥した後、１０μＬのグリセロールをスライド上に置き、次いで各カバースリップをグリセロール液滴上に静かに置くことによって、カバースリップを標準顕微鏡スライド上に固定化した。カバースリップを、室温で約２０分間スライド上に固定化させた。
【００６８】
各試料の軸方向および横方向の分解能は、共焦点顕微鏡によって決定した。個々の微小球のＺ−スタックを、Ｐｌａｎ−Ａｐｏｃｈｒｏｍａｔ  ６３×／１．４  ＮＡ  Ｏｉｌ対物レンズを使用し、Ｚｅｉｓｓ（商標）ＬＳＭ  ７１０共焦点顕微鏡上で収集し、ｘ、ｙ方向に４２ｎｍ、およびｚ方向に１００ｎｍの速度でサンプリングした。各試料を撮像する前に、対物レンズを、最初に１．５１８のＲＩ（２３℃でｅ−ライン（５４６ｎｍ）により測定）を有するＣａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｉｍｍｅｒｓｏｌ（商標）５１８Ｆイマージョンオイル（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ）で覆った。各試料について、カバースリップから１００μｍまでの範囲の焦点深度で、組み込まれた微小球を撮像した。マウントされた試料の領域全体（すなわち、左、中央、および右）の異なる位置で、各試料の全ての焦点深度で３つの微小球を撮像した。ＩｍａｇｅＪ  ＭｅｔｒｏｌｏＪプラグインを使用して、各試料の軸方向（ｚ）および横方向（ｘ、ｙ）の分解能を計算した。プロットされたデータ（図２および図３）は、試料８、１０、および１３の焦点深度の関数としての軸方向および横方向の分解能を示す。図２に見られるように、軸方向分解能は、ＲＩがイマージョンオイルのＲＩに近いほど改善される（すなわち、値が低くなる）。改善された軸方向分解能は、試料１３（１．５１７２）＞試料８（１．４９２７）＞試料１０（１．４６８７）に従い、試料１３は、１００μｍの焦点深度で試料１０に対して軸方向分解能を１．５４倍改善した。予想されたように、各焦点深度での各試料間の横方向分解能にほとんど差はない（図３）。この実施例では、イマージョンオイルのＲＩに整合するポリマーの種類およびポリマー／ポリオール比の操作により、乾燥した封入剤の完全性を維持しながら、最大軸方向分解能を達成するためのＲＩの調整が示されている。
【００６９】
本明細書で言及された米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願および非特許公開の全ては、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。さらなる実施形態を提供するために必要に応じて様々な特許、出願および刊行物の概念を採用するために、実施形態の態様を修正することができる。
【００７０】
上記の詳細な説明に照らして、これらおよび他の変更を実施形態に加えることができる。一般に、以下の条項および特許請求の範囲において、使用される用語は、条項および特許請求の範囲を明細書および特許請求の範囲に開示された特定の実施形態に限定するように解釈されるべきではなく、全ての可能な実施形態とともに、このような条項および特許請求の範囲が権利を保有する等価物の全範囲を含むように解釈されるべきである。したがって、条項および特許請求の範囲は、本開示によって限定されない。実施形態は、以下の番号付き条項に従ってもよい。
１．屈折率整合（ＲＩＭ）溶液であって、
ａ）水溶性ポリマーであって、ポリマーが、０．２７〜０．３４のモル屈折率（ＲLL）対モル体積（Ｖm）比を有する、水溶性ポリマーと、
ｂ）ポリオールであって、水溶性ポリマーのポリオールに対する質量比が０．３１８：１〜４：１である、ポリオールと、
ｃ）水または緩衝液とを含み、
１．３６以上の屈折率を有する、ＲＩＭ溶液。
２．屈折率が、１．６０以下である、条項１に記載のＲＩＭ溶液。
３．生物学的標本を基材にマウントする方法であって、
基材上に生物学的標本を配置することと、
生物学的標本を条項１または条項２に記載のＲＩＭ溶液と接触させて、マウントされた試料を提供することと、を含む、方法。
４．マウントされた試料を乾燥させることをさらに含み、それにより水溶性ポリマーが固化して、固化したポリマーを提供する、条項３に記載の方法。
５．水溶性ポリマーが、室温で約４８時間以内、または室温で２４時間以内、または約４０°Ｃの温度で約４時間以内に固化する、条項４に記載の方法。
６．固化したポリマーの屈折率が、１．４７（例えば、１．４８〜１．５４、または１．５０〜１．５２５）を超える、条項４に記載の方法。
７．顕微鏡を用いて基材上の生物学的標本を視覚化することをさらに含む、条項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
８．水溶性ポリマー及びポリオールを含む、固化したマウンタントであって、ポリマーが、０．２７〜０．３４のモル屈折率（ＲLL）対モル体積（Ｖm）比を有し、水溶性ポリマーのポリオールに対する質量比が、０．３１８：１〜４：１であり、固化したマウンタントが、１．４８以上の屈折率を有する、固化したマウンタント。
９．水溶性ポリマー対ポリオールの質量比が、０．５：１以上である、条項８に記載の固化したマウンタント。
１０．屈折率が、１．４７より大きい、条項８または９に記載の固化したマウンタント。
１１．水溶性ポリマーが、非荷電性である、条項１〜１０のいずれか１項に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
１２．非荷電性水溶性ポリマーが、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メチルビニルエーテル）、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリ（２−エチル−２−オキサゾリン）、またはポリ（２−メチル−２−オキサゾリン）である、条項１１に記載のＲＩＭ溶液。
１３．非荷電性水溶性ポリマーが、Ｎ−ＲアクリルアミドまたはＮ−Ｒメタクリルアミド（ここでＲが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはＨである）；Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルメタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジエチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎジエチルメタクリルアミド；Ｎ−２−ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）；またはそれらの組み合わせ、のモノマー残基を含む、条項１１に記載のＲＩＭ溶液。
１４．非荷電性水溶性ポリマーが、ポリ（Ｎ−メチルメタクリルアミド）（ＰＭＭＡｍ）である、条項１１に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
１５．水溶性ポリマーが、荷電性である、条項１〜１４のいずれか１項に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
１６．荷電性水溶性ポリマーが、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）、ポリ（ナトリウム−４−スチレンスルホネート）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルアクリレート）、ポリ（Ｎ，Ｎ−ジエチルエチルアミノアクリレート）、ポリ（アリルアミン）、ポリ［ビス（２−クロロエチル）エーテル−ｃｏ−１，３−ビス［３−（ジメチルアミノ）プロピル］尿素］、またはポリ（ビニルスルホン酸、ナトリウム塩）である、条項１５に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
１７．水溶性ポリマーが、約１ｋＤａ〜約１００ｋＤａの重量平均分子量を有する、条項１〜１６のいずれか１項に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
１８．水溶性ポリマーが、約１ｋＤａ〜約２０ｋＤａの重量平均分子量を有する、条項１〜１７のいずれか１項に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
１９．水溶性ポリマーが、約２０ｋＤａ〜約１００ｋＤａの重量平均分子量を有する、条項１〜１８のいずれか１項に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
２０．水溶性ポリマーが、約４８ｋＤａ〜約８０ｋＤａの重量平均分子量を有する、条項１〜１９のいずれか１項に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
２１．屈折率が、１．４８〜１．５０、または１．５０〜１．５２、または１．５２〜１．５４である、条項１〜２０のいずれか１項に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
２２．ＲＩＭ溶液または固化したマウンタントの屈折率が、ソーダ石灰ガラス、ホウケイ酸ガラス、またはイマージョンオイルの屈折率と整合する、条項１〜２１のいずれか１項に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
２３．水溶性ポリマーが、ポリオールではない、条項１〜２２のいずれか１項に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
２４．ポリオールが、ポリビニルアルコール、グリセロール、ジグリセロール、ポリグリセロール、マンニトール、ソルビトール、チオジエタノール、チオジプロパノール、またはそれらの組み合わせである、条項１〜２３のいずれか１項に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
２５．酸化防止剤をさらに含む、条項１〜２４のいずれか１項に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
２６．１質量％以下の酸化防止剤を含む、条項２５に記載のＲＩＭ溶液または固化したマウンタント。
２７．酸化防止剤が、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、３−カルボキシプロキシル、ヒドロキノン、メキノール、亜硫酸ナトリウム、エリソルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、没食子酸プロピル、カフェ酸、パラフェニレンジアミン、１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン、またはそれらの組み合わせである、条項２６に記載のＲＩＭ溶液。
２８．基材上に配置された生物学的標本を含む、マウントされた生物学的標本であって、生物学的標本が、条項１〜２７のいずれか１項に記載の固化したマウンタントに組み込まれている、マウントされた生物学的標本。
２９．生物学的標本を基材にマウントするためのキットであって、
ａ）条項１〜２８のいずれか１項に記載の屈折率整合（ＲＩＭ）溶液と、
ｂ）生物学的標本を基材にマウントするための指示書と、を含む、キット。
３０．基材が、顕微鏡スライド、キュベット、ウェル、またはディッシュである、条項１〜２９のいずれか１項に記載の方法、マウントされた生物学的標本、またはキット。
３１．生物学的標本が、細胞、組織、３Ｄ細胞培養（例えば、スフェロイド／オルガノイド）、または生物全体（例えば、ミバエ、虫、ゼブラフィッシュ）である、条項１〜３０のいずれか１項に記載の方法、マウントされた生物学的標本、またはキット。
３２．生物学的標本が、蛍光染料または蛍光タンパク質で標識されている、条項１〜３１のいずれか１項に記載の方法、マウントされた生物学的標本、またはキット。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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