(57)【要約】  本発明は、生成後流中の生成物の生体触媒酸化を低減するためのプロセスを提供する。より具体的には、本発明は、生成物流中のアルコールの生体触媒酸化を低減するためのプロセスを提供し、該生成物流は、アルコール生成物と、溶存二酸化炭素と、アルコールを酸化することができる少なくとも１つの酵素と、を含む。本発明は、発酵プロセスにおける適用可能性を見出し、ここでは、Ｃ１固定微生物がＣ１含有基質を利用して、発酵生成物を生成する。
2020523026.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルコールの生体触媒酸化を低減するためのプロセスであって、
ａ．ブリード流をバイオリアクタから抜き取ることであって、前記ブリード流が、ＣＯ２、アルコール、および前記アルコールを酸化することができる少なくとも１つの酵素を含む、抜き取ることと、
ｂ．前記ブリード流を処理して、前記酵素による前記アルコールの酸化を低減することと、を含む、プロセス。
【請求項２】
前記アルコールが、エタノールである、請求項１に記載のプロセス。
【請求項３】
（ｂ）の処理工程が、（ｉ）前記生成物流に窒素ガスを注入すること、（ｉｉ）前記生成物流の温度を上昇させること、および（ｉｉｉ）前記生成物流を減圧することのうちの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のプロセス。
【請求項４】
前記アルコールを酸化することができる少なくとも１つの酵素が、ＮＡＤＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）、ＮＡＤＰＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）、アルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素（ＥＣ１．２．７．５）、酢酸キナーゼ（ＥＣ２．１．２．１）、およびホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）からなる群から選択される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項５】
前記酵素が、Ｃ１固定細菌によって生成される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項６】
前記酵素が、非Ｃ１固定細菌によって生成される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項７】
前記酵素が、Ｃ１固定細菌内に存在する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項８】
前記酵素が、非Ｃ１固定細菌内に存在する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項９】
前記Ｃ１固定細菌が、前記ブリード流中に存在する、請求項５に記載のプロセス。
【請求項１０】
前記非Ｃ１固定細菌が、前記ブリード流中に存在する、請求項６に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記ブリード流の温度が、前記酵素が変性する温度まで上昇される、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１２】
前記ブリード流の温度が、少なくとも６０℃まで上昇される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１３】
前記ブリード流が、少なくとも５秒間、少なくとも６０℃の温度に維持される、請求項１１に記載のプロセス。
【請求項１４】
前記処理工程が、前記ブリード流に窒素ガスを注入することを含み、前記窒素ガスが、前記ブリード流から前記ＣＯ２の少なくとも一部を置換する、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記窒素ガスが、前記ブリード流から前記ＣＯ２の実質的にすべてを置換する、請求項１４に記載のプロセス。
【請求項１６】
前記処理工程が、前記ブリード流を減圧することを含み、前記ブリード流からの前記ＣＯ２の少なくとも一部が、フラッシュオフされる、請求項１に記載のプロセス。
【請求項１７】
生成物流中のエタノールの生体触媒酸化を低減するためのプロセスであって、前記生成物流が、第一級アルコールと、溶存ＣＯ２と、前記アルコールを酸化することができる少なくとも１つの酵素と、を含み、前記プロセスが、
ａ．反応器から生成物流を抜き取ることと、
ｂ．前記生成物流を処理して前記アルコールの前記酸化を低減させることと、を含む、プロセス。
【請求項１８】
前記Ｃ１固定が、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される、請求項５または７に記載のプロセス。
【請求項１９】
前記アルコールが、エタノール、ブタノール、１−プロパノール、および１−オクタノールからなる群から選択される、請求項１７に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
二酸化炭素（ＣＯ２）は人間の活動による世界の温室効果ガス排出の約７６％を占め、メタン（１６％）、亜酸化窒素（６％）、およびフッ素化ガス（２％）が残りを占めている（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｇｅｎｃｙ）。工業および林業の施業も大気中にＣＯ２を放出するが、ＣＯ２の大部分は化石燃料を燃焼させてエネルギーを生成することに由来する。温室効果ガス排出、特にＣＯ２の削減は、地球温暖化の進行ならびにそれに伴う気候および天候の変化を止めるのに重要である。
【０００２】
フィッシャー−トロプシュ法などの触媒法を使用して、産業廃ガスまたは合成ガスなどの二酸化炭素（ＣＯ２）、一酸化炭素（ＣＯ）、および／または水素（Ｈ２）を含有するガスを様々な燃料および化学物質に変換することができることが長い間認識されている。しかしながら、近年、ガス発酵がこのようなガスにおける炭素の生物学的固定のための代替的なプラットフォームとして浮上してきた。特に、Ｃ１固定微生物は、ＣＯ２、ＣＯ、および／またはＨ２を含有するガスをエタノールおよび２，３−ブタンジオールなどの生成物に変換することが示されている。
【０００３】
化石燃料の温室効果ガス（ＧＨＧ）排出に関する環境上の懸念は、再生可能エネルギー源への重要性の高まりをもたらしてきた。その結果、エタノールは急速に、世界中の主要な水素に富む液体の輸送燃料になりつつある。欧州、日本、米国、および数か国の発展途上国でのエタノール製造の重要性が高まっていることに基づいて、燃料エタノール産業の世界市場での継続的な成長は、近い将来予想される。例えば、米国では、エタノールを使用して、ガソリンにエタノールを１０％混合したＥ１０を製造している。Ｅ１０配合物において、エタノール成分は酸素化剤として作用し、燃焼の効率を改善し、大気汚染物質の生成を低減する。ブラジルでは、エタノールは輸送用燃料の需要のおよそ３０％を満たしており、これは、ガソリンに配合される酸素化剤と、それ自体が純粋な燃料であるためである。さらに、欧州連合（ＥＵ）は、各加盟国に対して、バイオマス由来エタノールなどの持続可能な輸送燃料の消費目標を義務付けてきた。
【０００４】
燃料エタノールの大部分は、サトウキビから抽出されたスクロースまたは穀物作物から抽出されたデンプンなどの作物由来の炭水化物を主な炭素源として使用する従来の酵母系発酵プロセスによって製造される。しかしながら、これらの炭水化物原料のコストは、競合する用途、つまりヒトと動物の両方の食料源としての市場での価値によって影響される。さらに、エタノール製造のためのデンプンまたはスクロース生成作物の栽培は、これが地元の地価および気候の両方の関数であるので、すべての地域において経済的に持続可能ではない。これらの理由から、より低コストおよび／またはより豊富な炭素資源を燃料エタノールに変換する技術を開発することが特に関心対象である。この点において、一酸化炭素（ＣＯ）は、石炭、石油、石油由来製品などの有機材料の不完全燃焼のエネルギーに富む主要な副産物である。ＣＯに富む廃ガスは、様々な産業プロセスから結果的に生じる。例えば、オーストラリアの鉄鋼業は、年間５００，０００トンを超えるＣＯを生成し、大気中に放出すると報告されている。
【０００５】
より近年では、工業規模でＣＯからエタノールを製造するための微生物（細菌）系の代替法が商業的関心および投資の対象になってきた。ＣＯが唯一の炭素源である微生物培養物の成長能力は、１９０３年に初めて発見された。この特徴は後に、生物の独立栄養成長のアセチル補酵素Ａ（アセチルＣｏＡ）生化学的経路（ウッズ−ユングダール経路および一酸化炭素デヒドロゲナーゼ／アセチルＣｏＡシンターゼ（ＣＯＤＨ／ＡＣＳ）経路としても既知）の使用にあると判断された。カルボキシド栄養、光合成、メタン生成、および酢酸生成生物を含む多数の嫌気性生物は、それ以来、ＣＯを代謝することが示されてきた。クロストリジウム属に由来するものなどの嫌気性細菌は、アセチルＣｏＡ生化学経路を介してＣＯ、ＣＯ２およびＨ２からエタノールを生成することが既知である。例えば、ガスからエタノールを生成するＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの種々の株がＷＯ００／６８４０７、ＥＰ１１１７３０９Ａ１、ＵＳ５，１７３，４２９、ＵＳ５，５９３，８８６、ＵＳ６，３６８，８１９、ＷＯ９８／００５５８、およびＷＯ０２／０８４３８において説明されている。細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ属も、ガスからエタノールを生成することが既知である（Ａｂｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １６１：３４５−３５１（１９９４））。
【０００６】
生物の酵素特異性により、特定の生成物に対する選択性が非常に高い（１００％）場合があり、微生物合成経路でフィッシャー・トロプシュ（ＦＴ）触媒よりも高い収量を達成することができる。ＦＴ触媒を上回る他の利点には、外界温度付近および大気圧付近での動作、ならびにＣＯ、Ｈ２、およびＣＯ２の様々な比率を使用する能力が含まれる。さらに、反応媒体中の不純物による触媒の被毒に対する懸念が軽減される。ＣＯからのエタノールの微生物合成と関係するこれらの明らかな利点にもかかわらず、このようなプロセスは、製造率の競争力を確保するという点で、他の技術と競合しなければならない。ＣＯを炭素およびエネルギー源として使用するとき、上述の嫌気性細菌は、発酵によってエタノールを生成するが、少なくとも１つの他の代謝産物、例えばＣＯ２、メタン、ｎ−ブタノール、および／または酢酸も生成する。これらの代謝物のうちのいずれかの形成は、利用可能な炭素が代謝産物（複数可）に失われ、所望の最終生成物の生成効率が損なわれるので、所与のプロセスの生産性および全体的な経済的実現可能性に有意に影響する可能性がある。さらに、代謝産物（例えば、酢酸）自体が微生物発酵プロセスの時間および場所で価値を持たない限り、廃棄物処理の問題を引き起こす可能性がある。エタノールを製造するためのＣＯ含有ガスの嫌気性発酵における所望の最終生成物以外の生成物の形成に対処するための様々な提案が、ＷＯ２００７／１１７１５７、ＷＯ２００８／１１５０８０およびＷＯ２００９／０２２９２５において考察されている。
【０００７】
エタノール生成率は、所与の発酵プロセスが経済的に魅力的であるかどうかの鍵となる決定因子であり、細菌の成長に適した条件を管理することに大きく依存している。例えば、ＷＯ２０１０／０９３２６２から、ＣＯ含有基質は、最適な微生物成長および／または所望の代謝産物生成を結果的に生じる速度で微生物培養物に提供されなければならないことが既知である。基質が不十分な場合、微生物の成長が遅くなり、エタノールを犠牲にして発酵生成物の収量が酢酸にシフトする。過剰な基質が提供されると、微生物の成長および／または細胞死が結果的に低下する可能性がある。これらのプロセスにおける作動パラメータ間の関連性に関するさらなる情報は、ＷＯ２０１１／００２３１８において認められる。
【０００８】
ＣＯ、特に産業過程において排出されるガス状排出物などのＣＯ含有廃棄物流からエタノールを生成する生物学的プロセスに関する技術は、プロセスの経済性、それゆえ業界の競争力を改善する解決策を継続的に求めている。関心対象の領域の１つは、生成物回収段階の前に、バイオリアクタの下流の発酵ブロス中で所望の生成物の収量を保存することに関する。エタノールを生成することのできる多くのＣ１固定微生物は、特定の条件下でエタノールを他の生成物へ酸化することもできる。エタノールの酸化を可能にする条件は、エタノール製造施設で発見されることがある。エタノール生成物が回収されるのに先立って、エタノールの微生物酸化は、所望のエタノール生成物の喪失を表す。
【発明の概要】
【０００９】
本発明の態様は、生物学的変換および生成物回収プロセスの改善に関する。
【００１０】
一態様において、本発明は、生成物流中のエタノールの生体触媒酸化を低減するためのプロセスを提供する。一実施形態において、生成物流は、アルコールと、溶存二酸化炭素（ＣＯ２）と、アルコールを酸化することができる少なくとも１つの酵素とを含む。特定の実施形態において、生成物流はバイオリアクタから生成前物回収区域へと流れ、アルコールからその対応するカルボン酸への変換を低減するよう処理される。
【００１１】
一実施形態において、生成物流は、（ｉ）エタノールと、（ｉｉ）溶存二酸化炭素と、（ｉｉｉ）エタノールを酸化することができる少なくとも１つの微生物を含む微生物培養物とを含む。一実施形態において、微生物は、エタノールを酢酸に変換することができる１つ以上の酵素を有するＣ１固定微生物である。
【００１２】
一実施形態において、生成物流を処理すること（すなわち、処理工程）は、生成物流に不活性ガスを注入することを含む。生成物流中へと注入された不活性ガスは、生成物流から溶存ＣＯ２の少なくとも一部を置換する。特定の実施形態において、不活性ガスは、生成物流から実質的にすべての溶存ＣＯ２を置換する。適切な不活性ガスの例としては、窒素およびメタンが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、不活性ガスは窒素である。代替的な実施形態において、水素を使用して、生成物流から溶存ＣＯ２を置換する。
【００１３】
一実施形態において、処理工程は、生成物流の温度を上昇させることを含む。特定の実施形態において、生成物流の温度は、エタノールを酸化することができる酵素が不活性化される温度まで上昇する。一実施形態において、生成物流の温度は、少なくとも５０℃、または少なくとも６０℃、または少なくとも７０℃、または少なくとも７５℃、または少なくとも７８℃まで上昇する。一実施形態において、生成物流の温度は、少なくとも１０秒間、または少なくとも２０秒間、または少なくとも３０秒間、または少なくとも１分間、または少なくとも２分間、または少なくとも３分間、または少なくとも５分間、または少なくとも１０分間、所定の温度より上で維持される。好ましくは、生成物流の温度は、１０秒間〜３０秒間、または１０秒間〜１分間、または１０秒間〜２分間、所定の温度より上で維持される。一実施形態において、生成物流の温度は少なくとも６０℃まで上昇し、この温度で少なくとも１分間維持される。一実施形態において、生成物流の温度は少なくとも７５℃まで上昇し、この温度で少なくとも５分間維持される。
【００１４】
一実施形態において、処理工程は、生成物流の減圧を含む。１つ以上の実施形態において、バイオリアクタは圧力下で作動し、それにより、結果的に加圧された生成物流をもたらす。１つ以上の実施形態において、バイオリアクタが圧力下で作動するとき、生成物流は減圧されることによって処理される。１つ以上の実施形態において、生成物流の減圧は、別個の容器内で発生する。一実施形態において、減圧は、保持タンク内の大気圧で生じる。特定の実施形態においては、減圧は、生成物流からの溶存ＣＯ２の置換を結果的に生じる生成物流からの溶存ＣＯ２のフラッシュを提供する。一実施形態において、生成物流の圧力は、減圧する前で少なくとも０．２５ｂａｒｇ、または少なくとも０．５ｂａｒｇ、または少なくとも１．０ｂａｒｇ、または少なくとも１．５ｂａｒｇ、または少なくとも２．０ｂａｒｇ、または少なくとも２．５ｂａｒｇ、または少なくとも３．０ｂａｒｇである。一実施形態において、生成物流の圧力は、減圧される前の少なくとも１秒間、または少なくとも１０秒間、または少なくとも１５秒間、または少なくとも２０秒間、または少なくとも２５秒間、または少なくとも３０秒間、大気圧より高く維持される。好ましくは、生成物流の圧力は、減圧される前の１〜３０秒間、または１秒間〜１５秒間、または１５秒間〜３０秒間、大気圧よりも上で維持される。一実施形態において、生成物流の圧力は少なくとも２．０ｂａｒｇであり、減圧される前の少なくとも１秒間、この圧力に維持される。一実施形態において、生成物流の圧力は少なくとも０．２５ｂａｒｇであり、減圧される前の少なくとも３０秒間、この圧力に維持される。
【００１５】
一実施形態において、バイオマスは少なくとも１つのＣ１固定微生物を含む。一実施形態において、Ｃ１固定微生物は、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、およびホスホトランスアセチラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を含む。
【００１６】
一実施形態において、バイオマスは、少なくとも１つの非Ｃ１固定微生物を含む。一実施形態において、非Ｃ１固定微生物は、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、酢酸キナーゼ、およびホスホトランスアセチラーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を含む。１つ以上の実施形態において、非Ｃ１固定微生物は、Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒである。
【００１７】
一実施形態において、本発明は、培地およびＣ１固定細菌を含む少なくとも第１のバイオリアクタを備えたバイオリアクタシステムにＣ１含有基質を供給して、Ｃ１含有基質中の炭素源を代謝し、少なくとも１つの発酵生成物を生成することと、細菌を含むブリード流をバイオリアクタシステムから抜き取ることと、ブリード流に窒素を注入して、ブリード流内のＣＯ２成分を置換することと、ＣＯ２枯渇流を生成物回収区域に通過させて、少なくとも１つの発酵生成物を回収することと、を含む。
【００１８】
代替的な実施形態において、本発明は、培地および細菌を含む少なくとも第１のバイオリアクタを備えたバイオリアクタシステムにＣ１含有基質を供給して、基質中の炭素源を代謝し、少なくとも１つの発酵生成物を生成することと、細菌を含むブリード流をバイオリアクタシステムから抜き取ることと、ブリード流を加熱して、ブリード流中に含有される１つ以上の酵素を変性させ、処理した流を提供することと、処理した流を生成物回収区域へと通過させて、少なくとも１つの発酵生成物を回収することと、を含む。
【００１９】
代替的な実施形態において、本発明は、培地および細菌を含む少なくとも第１のバイオリアクタを備えた加圧したバイオリアクタにＣ１含有基質を供給して、基質中の炭素源を代謝し、少なくとも１つの発酵生成物を生成することと、細菌を含むブリード流を加圧したバイオリアクタシステムから抜き取ることと、ブリード流を減圧して、フラッシュを通じてブリード流内のＣＯ２成分を置換することと、ＣＯ２枯渇流を生成物回収区域に通過させて、少なくとも１つの発酵生成物を回収することと、を含む。
【００２０】
一実施形態において、Ｃ１固定細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｍｏｏｒｅｌｌａ、およびＡｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍからなる群から選択される。一実施形態において、Ｃ１固定細菌は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ    ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される。
【００２１】
一実施形態において、生成前物回収区域は、生成区域の下流および生成物回収区域の上流に設けられた１つ以上の容器および／または導管を包含する。一実施形態において、生成区域は、バイオリアクタであり、生成物回収区域は蒸留区域である。一実施形態において、生成前物回収区域は、貯蔵容器である。一実施形態において、貯蔵容器は、保持タンクである。生成前物回収区域は、バイオリアクタから保持タンクへ、および保持タンクから生成物回収モジュールへブリード流を供給するために設けられた１つ以上の液体導管をさらに備えている。一実施形態において、ブリードは、バイオリアクタから導管を経て直接、生成物回収区域へ供給される。特定の実施形態において、ブリードの第１の部分は、生成物回収区域へ直接提供され、ブリードの第２の部分は、保持タンクへ提供される。
【００２２】
第２の態様において、本発明は、生成物流中のエタノールの生体触媒酸化を低減するためのプロセスを提供し、該生成物流は、エタノールと、ＣＯ２と、エタノールを酸化することができる少なくとも１つの酵素と、を含み、該プロセスは、（ｉ）生成物流をバイオリアクタから生成前物回収区域へと流すことと、（ｉｉ）生成物流を処理して、エタノールからアセテートへの変換を低減させることと、を含む。一実施形態において、生成物流は、無細胞系において生成される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】２つのバイオリアクタを利用した代表的なバイオリアクタシステムを図示する。
【図２】図１のバイオリアクタシステムから透過液流およびブリード流を受け取り、生成物回収モジュールに流れを提供する貯蔵区域を備えた代表的なシステムを図示する。
【図３−１】図３ａ、図３ｂ、図３ｃ、および図３ｄは、ブリード流からＣＯ２を置換するための様々な実施形態による保持タンクの様々な配置を図示する
【図３−２】図３ａ、図３ｂ、図３ｃ、および図３ｄは、ブリード流からＣＯ２を置換するための様々な実施形態による保持タンクの様々な配置を図示する
【図４】バイオリアクタから細胞を３つ組で採取し、ＣＯ２ヘッドスペース内に入れた時の経時的な代謝産物濃度
【図５】バイオリアクタから細胞を３つ組で採取し、Ｎ２ヘッドスペース内に入れた時の経時的な代謝産物濃度。
【図６】アセテートおよびエタノールの力価の経時的な変化、アセテートの増加／エタノールの喪失を相関させること、ならびにエタノールの喪失に及ぼす熱処理の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
商業規模の製造業務において、生成物回収区域に送られるのに先立って生成物流が貯蔵手段に送られるのが一般的である。本発明者らは、生成物流の加工に遅延があるとき、所望の最終生成物から望ましくない生成物への変換を結果的にもたらす可能性がある望ましくない反応が発生する可能性があることを発見した。このような反応を防止することによって、所望の生成物の収量を確保することができる。
【００２５】
本発明者らは、所望の最終生成物から望ましくない生成物への変換を結果的にもたらす可能性がある、生成後流における望ましくない反応を実質的に低減または防止するプロセスを開発した。本発明は、発酵技術、特に酢酸生成細菌を使用するガス発酵プロセスに適用することができる。さらに、本発明を無細胞技法に適用して、無細胞生成プロセスにおける１つ以上の酵素の逆反応を防止することができる。
【００２６】
次の説明はエタノール発酵に関するが、本教示は他の第一級アルコール発酵プロセスおよび精製プロセスにも等しく適用可能であると考えられる。さらに、提供される実施形態はガス発酵プロセスに関するが、本発明は、発酵産物（複数可）と、発酵産物を酸化することができる１つ以上の酵素と、を含有する、発酵ブロスを生成するいずれの発酵プロセスにも適用可能であろうと考えられる。一実施形態において、発酵産物は、第一級アルコールであり、１つ以上の酵素は、第一級アルコールをその対応するカルボン酸へ変換することができる酵素である。例示的な第一級アルコールには、ブタノール、１−プロパノール、および１−オクタノールが含まれるが、これらに限定されない。さらに、本発明は生成株によって生成された発酵産物に適用可能であるが、本発明は、バイオリアクタ内に存在する可能性がある何らかの汚染微生物によって排出された産物にも適用される。
【００２７】
「透過液流」という用語は、バイオマス成分を取り出すために処理されたバイオリアクタから抜き取られた液体流である。典型的には、バイオマスは濾過により取り出され、バイオリアクタに戻される。
【００２８】
「ブリード流」という用語は、バイオリアクタから抜き取られた液体流を指す。典型的には、ブリード流は、濾過されておらず、バイオマスと、液体生成物と、溶存ガスおよび同伴ガスと、を含む。
【００２９】
「生成物流」という用語は、少なくとも１つの生成物、例えばエタノールを含む液体流を指す。好ましくは、生成物流は、生成プロセスを終了した流れである。例えば、生成物流は、生成物回収手段によって受け取られるのに先立って、バイオリアクタを出る液体流であってもよい。生成物流は、透過液流またはブリード流であってもよい。生成物流は、ブリード流と透過液流との組み合わせであってもよい。
【００３０】
「生体触媒酸化」という用語は、この反応が可能な１つ以上の酵素の存在により、第一級アルコール（すなわちエタノール）がその対応する酸（すなわちアセテート）へと酸化されるプロセスを指す。１つ以上の酵素は、無細胞系で提供されてもよく、または細菌培養物中に含有されてもよい。
【００３１】
「生成前物回収区域」という用語は、バイオリアクタの下流かつ生成物回収モジュールの上流の区域を指す。生成前物回収区域は、少なくとも１つの出口を介してバイオリアクタを出るブリード流および／または透過液流のうちの少なくとも１つを受け取り、蒸留手段などの生成物回収手段へ該生成物流を供給する。生成前物回収は、生成物流をバイオリアクタシステムから生成物回収モジュールへと通過させるための少なくとも１つの導管を備えており、生成物流を生成物回収モジュールへ通過させる前に生成物流の一部を保存するよう機能する保持タンクなどの貯蔵容器をさらに備えていてもよい。
【００３２】
「溶存ＣＯ２」という用語は、溶存ガスの形態で液体流中に存在するＣＯ２を指す。溶存ＣＯ２は、発酵ブロス、液体栄養培地、ブリード流、透過液流または生成物流を含むがこれらに限定されないいくつかの液体流中に提供されてもよい。
【００３３】
「同伴ＣＯ２」という用語は、液体流中にＣＯ２の気泡を閉じ込めることを指す。同伴ＣＯ２は、発酵ブロス、液体栄養培地、ブリード流、透過液流または生成物流を含むがこれらに限定されないいくつかの液体流中に提供されてもよい。
【００３４】
典型的には、培養はバイオリアクタ中で実施される。「バイオリアクタ」という用語は、連続撹拌槽反応器（ＣＳＴＲ）、固定化細胞反応器（ＩＣＲ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ）、気泡塔、ガスリフト発酵槽、静的ミキサ、またはガス−液体接触に好適な他の容器もしくは他の装置などの１つ以上の容器、塔、または配管からなる培養／発酵装置を含む。いくつかの実施形態では、バイオリアクタは、第１の増殖反応器および第２の培養／発酵反応器を含んでもよい。基質は、これらの反応器のうちの１つまたは両方に提供されてもよい。本明細書で使用される場合、「培養」および「発酵」という用語は、交換可能に使用される。これらの用語は、培養／発酵プロセスの増殖期および生成物生合成期の両方を包含する。
【００３５】
培養物は概して、微生物の増殖を可能にするのに十分な栄養素、ビタミン、および／または無機物を含有する水性培地中で維持される。好ましくは、水性培地は、最小嫌気性微生物増殖培地などの嫌気性微生物培地である。好適な培地は、当該技術分野において既知である。
【００３６】
培養／発酵は、望ましくは、標的生成物の生成に適切な条件下で実施されるべきである。典型的には、培養／発酵は、嫌気性条件下で実施される。考慮すべき反応条件は、圧力（または分圧）、温度、ガス流速、液体流速、培地ｐＨ、培地酸化還元電位、撹拌速度（連続撹拌槽反応器を使用する場合）、接種レベル、液相中のガスが制限的にならないことを確実にするための最大ガス基質濃度、および生成物阻害を回避するための最大生成物濃度を含む。具体的には、基質の導入速度は、生成物がガス制限条件下での培養によって消費され得るため、液相中のガスの濃度が制限的にならないことを確実にするように制御されてもよい。
【００３７】
バイオリアクタを高圧で操作すると、気液移動速度を上昇させることができる。したがって、概して、大気圧よりも高い圧力で培養／発酵を実施することが好ましい。また、所与のガス変換速度が部分的に基質保持時間の関数であり、かつ保持時間がバイオリアクタの必要な体積を示すため、加圧システムの使用は、必要なバイオリアクタの体積、およびその結果として培養／発酵装置の資本コストを大幅に低減することができる。これはさらに、バイオリアクタ中の液体体積を入力ガス流速で除算したものと定義される保持時間が、バイオリアクタが大気圧よりも上昇した圧力に維持されるときに減少され得ることを意味する。最適反応条件は、使用される特定の微生物に部分的に依存する。しかしながら、一般的には、大気圧より高い圧力で発酵を行うことが好ましい。
【００３８】
特定の実施形態において、発酵は、光の不在下で、または光合成微生物のエネルギー要求を満たすには不十分な量の光の存在下で行われる。特定の実施形態において、本発明の微生物は、非光合成微生物である。
【００３９】
バイオリアクタシステムの通常の作動中、液体生成物の正味の生成では、各バイオリアクタへの蓄積を防止し、それによって定常状態を維持するために、これらの生成物を好ましくは継続的に抜き取る必要がある。抜き取られた液体のすべてがバイオリアクタ内に存在するものと同じバルク組成（同じ濃度の細菌および培養培地成分を含む）を有する場合、バイオリアクタは、エタノールおよび酢酸の濃度に関して定常状態で作動しているが、細菌濃度が着実に枯渇することになるであろう。このような状況下では、細菌の生産性（増殖）と比較してエタノールの生産性が高いと、所与のバイオリアクタからの細菌の枯渇速度が結果的により大きくなるであろう。追加の作動自由度を提供することにより細菌濃度を維持するために、液体生成物は、濾過されていない流れ（すなわち、ブリード流）または濾過された流れ（すなわち、透過液流）のいずれかとして、所与のバイオリアクタから抜き取られることができる。ブリード流とは、バイオリアクタ内に存在する発酵ブロスと実質的に同じバルク組成、または少なくとも実質的に同じ細菌濃度を有する濾過されていない流れである。濾過された流れとは、バイオリアクタから抜き取られ、濾過手段に送られる流れであり、該濾過手段で細菌が濾過されて、バイオリアクタへ戻され、バイオリアクタ内の細菌を維持する保持液と、透過液と、を提供する。バイオマスを実質的に含まない透過液流は、バイオリアクタに再利用されない。次に、この透過液は下流のバイオリアクタに送られるか、または生成物回収区域に送られることがある。
【００４０】
ブリード流および透過液流の両方の抜き取りにより、特に様々なレベルの生産性でバイオリアクタ内の細菌濃度を管理するという点で、全体的なプロセス制御の程度が有意に改善される。エタノール生成速度が上昇するにつれて、ブリード流の流れに対する透過液流の流れを増加させることができ、細菌の保持の増大とともにより多くの濾過された反応器内液体を抜き取ることができる。エタノールはこれらの抜き取られた流れの両方に存在するので、バイオリアクタから、例えば、最終段階のバイオリアクタから（液体流に関して連続して作動する第１および第２のバイオリアクタを備えたバイオリアクタシステムのうちの第２のバイオリアクタなどから）最終的に抜き取られるブリード流および透過液流は通常、エタノール精製のために両方ともさらに加工される。ブリード流および透過液流は、貯蔵区域に送られ、次にこれらのタンクからの流出液は下流の回収ユニットに送られる。
【００４１】
生成物は、例えば、分留、蒸発、浸透蒸発、ガスストリッピング、相分離、および、例えば、液−液抽出を含む抽出発酵を含む、当該技術分野で既知の任意の方法または方法の組み合わせを使用して、貯蔵タンクからの流出液から分離または精製され得る。特定の実施形態において、標的生成物は、ブロスの一部分をバイオリアクタから連続的に取り出し、微生物細胞をブロスから（濾過により簡便に）分離し、１つ以上の標的生成物をブロスから回収することによって、発酵ブロスから回収される。アルコールおよび／またはアセトンは、例えば、蒸留によって回収され得る。酸は、例えば、活性炭上での吸着によって回収され得る。分離された微生物細胞は、好ましくは、バイオリアクタに戻される。標的生成物が取り出された後に残っている無細胞透過液も、好ましくは、バイオリアクタに戻される。追加の栄養素（ビタミンＢなど）が、無細胞透過液に添加されて、培地を補充した後に、バイオリアクタに戻され得る。
【００４２】
典型的な製造施設において、エタノールの酸化を可能にする条件は、バイオリアクタの下流および生成物回収手段の上流（すなわち、貯蔵区域）に認められ得る。特に、エタノールという標的生成物は、ブリード流中の生菌の存在によって影響を受けることが発見されている。エタノールを酸化することができる生菌とともにブリード流中にＣＯ２が存在するとき、エタノール生成物は細菌によって酸化されてアセテートを生成する可能性がある。ブリード流および透過液流がバイオリアクタから継続的に取り出され、生成物回収に先立って貯蔵区域に送られるので、これは、標的生成物（すなわちエタノール）の喪失、ならびに／または分離およびもしくは処理を必要とすることがある非標的生成物（すなわちアセテート）の生成のいずれかを表す。本発明者らは、エタノールからアセテートへの変換を低減し、それによりエタノール収量を確保するためのプロセスを特定した。
【００４３】
エタノール酸化反応
典型的には、ウッド−ユングダール経路を使用するＣ１固定微生物において、エタノールの利用および生成は、ＮＡＤ（Ｐ）＋依存性アセトアルデヒドおよびエタノールデヒドロゲナーゼおよび還元型フェレドキシン依存性アルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素（ＡＯＲ）を使用して、アセチルＣｏＡ、アセテート、およびアセトアルデヒドを介して進行する（Ｋｏｐｋｅ  ｅｔ  ａｌ）。エタノールの生成は、ＣＯおよびＨ２の酸化から発生する余剰の還元当量によって促進される。微生物は、還元型生成物（すなわちエタノール）を形成することにより、余剰の還元当量との平衡状態を保つ。還元当量には、還元型フェレドキシン（Ｆｄｒｅｄ）、ＮＡＤＰＨ、およびＮＡＤＨが含まれる。
【００４４】
一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）（Ｆｄｒｅｄ）またはヒドロゲナーゼ（（Ｆｄｒｅｄ）、ＮＡＤＨ、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ、またはこれらの混合物）によるＣＯ酸化反応において還元当量が主に形成される。ＣＯ酸化反応によって形成される還元当量は、エタノールの形成によって消費することができる。エタノール生成には２つの経路がある。第１の経路は、ＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨ依存性反応を介しており、次の化学量論によって示されるように、アセチルＣｏＡはアセトアルデヒドを介してエタノールへ還元される。
アセチルＣｏＡ＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋＜−＞アセトアルデヒド＋ＮＡＤ（Ｐ）＋＋ＣｏＡ
アセトアルデヒド＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋＜−＞エタノール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
【００４５】
第２の経路は、アセテートを介する。アセチルＣｏＡからのアセテートの生成には、次の化学量論によって示されるように、ＡＴＰ生成工程と連関したリン酸の移動が包含される。
アセチルｃｏＡ＋Ｐ＜−＞アセチル−リン酸＋ＣｏＡ
アセチル−リン酸＋ＡＤＰ＜−＞アセテート＋ＡＴＰ
【００４６】
次いで、アセテートはアセトアルデヒドへ還元され、さらにエタノールへ還元される。アセトアルデヒドの形成は、還元型フェレドキシンによって促進され、アセトアルデヒドからのエタノールの形成は、次の化学量論によって示されるように、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存的である。
アセテート−＋Ｆｄｒｅｄ２−＋３Ｈ＋＜−＞アセトアルデヒド＋Ｆｄｏｘ＋Ｈ２Ｏ
アセトアルデヒド＋ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ＋Ｈ＋＜−＞エタノール＋ＮＡＤ（Ｐ）＋
【００４７】
余剰の還元当量がない（つまり、利用可能な基質が少ないためＣＯ酸化が不足している）状態において、エタノールを生成するための駆動力は小さく、微生物はエタノールを基質として消費し、それを酸化して追加のアセチルＣｏＡおよびアセテートを形成し、それによりＮＡＤ、ＮＡＤＰ、およびＦｄｏｘを補充することができる。ブリード流などの発酵後の液体流において、発酵基質が制限されているか、もはや利用できないとき、微生物はエタノールを利用してアセテートを生成することができる。
【００４８】
参照される各反応は、両方向に機能する。いくつかの因子は、反応速度、基質の利用可能性、補因子レベル、およびｐＨを含むがこれらに限定されない、反応が進行する方向を決定する。
【００４９】
ＣＯ２は、次の反応、すなわち、ＣＯ＋Ｈ２Ｏ＋Ｆｄｏｘ＜−＞ＣＯ２＋Ｆｄｒｅｄの原因となる酵素である一酸化炭素デヒドロゲナーゼ（ＣＯＤＨ）、および次の反応、すなわち、アセチルＣｏＡ＋ＣＯ２＋Ｆｄｒｅｄ＜−＞ピルビン酸塩＋ＣｏＡ＋Ｆｄｏｘの原因となる酵素であるピルビン酸塩：フェレドキシン酸化還元酵素（ＰＦＯＲ）の両方の補因子である。ＣＯ２のレベルが上昇すると、ＣＯＤＨの反応平衡がＣＯ酸化から離れ、ＰＦＯＲの反応平衡がピルビン酸塩形成へと移行することになる。これらの移行はいずれも、エタノール酸化を有利にする条件を提供して、より低レベルの還元当量Ｆｄｒｅｄを結果的にもたらす。このことは、ＣＯ２の量を低減するか、ブリード流からＣＯ２を除去することで相殺されることができる。
【００５０】
理論に束縛されることを望むことなく、本発明者らは、エタノール酸化反応が発酵プロセス中に起こると考えているが、発酵条件下ではエタノールを生成する反応はエタノールの酸化よりもはるかに大きな速度で生じ、反応は生成物の力価に対してほとんど影響を及ぼさない。発酵ブロスがバイオリアクタから取り出され、エタノール生成物がもはや微生物によって生成されなくなったとき、エタノール酸化反応は問題となる。
【００５１】
本発明者らは、プロセスの発酵段階後のブリード流中のこれらの望ましくない反応を実質的に低減または防止するプロセスを開発し、それにより、ブリード流が発酵プロセスを出る時点から生成物回収プロセスへ導入される時点まで、ブリード流中の所望の最終生成物の濃度を確保した。
【００５２】
一実施形態において、プロセスは、ブリード流から溶存、同伴または懸濁ＣＯ２を除去することを対象とする。これは、溶液からＣＯ２を置換する窒素ガスをブリード流に注入することによって達成される。エタノールからアセテートへの変換反応にはＣＯ２が不可欠であるので、ブリード流からＣＯ２を除去すると、この機序を介してエタノールの酸化が防止される。
【００５３】
このプロセスを有効にするために、ブリード流中に提供されたＣＯ２の大部分を置換するよう、窒素などの不活性ガスを注入しなければならない。好ましくは、ブリード流中の実質的にすべてのＣＯ２が置換される。理想的には、ブリード流中のＣＯ２の大部分は、５分未満、または１０分未満、または１５分未満、または２０分未満、または３０分未満で置換されるべきである。
【００５４】
窒素は、保持タンク内、またはバイオリアクタから保持タンクへブリード流を供給するための導管内のいずれかでＣＯ２を置換するようブリード流中に注入されてもよい。一実施形態において、窒素は保持タンク内のヘッドスペースに継続的に供給されるのに対し、ガスはヘッドスペースから絶えずパージされる。保持タンクのヘッドスペースに窒素を供給すると、ヘッドスペースのガスと接触している液体由来のＣＯ２を置換することができる。保持タンクを窒素で覆うことができ、これにより、より少量の窒素が反応器に供給され、ＣＯ２がいくらか結果的に置換される。代替的に、保持タンク上で窒素スイープを実施することができ、より多量の窒素が保持タンクに供給され、結果的により高いレベルのＣＯ２置換がもたらされる。代替的な実施形態において、保持タンクの下部に設けられた導管を介して窒素をブリード流中に注入する。保持タンクの底部でまたは底部に向かって窒素ガスを注入すると、ブリード流からのＣＯ２の積極的な置換が促進される。
【００５５】
一実施形態において、窒素は、保持タンクのヘッドスペース内に供給され、ブリード流は、１つ以上のノズルを介して保持タンクのヘッドスペースを経て噴霧される。窒素に富むヘッドスペースにブリード流を噴霧することにより、ブリード流の表面積が増大するにつれて、ブリード流中のＣＯ２のより多くの部分が置換される。ノズルの大きさを調整して、スプレーの液滴径を変更することができる。好ましくは、ブリード流をヘッドスペース内へ噴霧するのに必要とされるエネルギーは、バイオリアクタによって提供される。バイオリアクタを出る液体は、典型的には少なくとも３ｂａｒｇ以上であり、これは保持容器に到達して、標準的なスプレーノズルでの圧力降下を克服するのに十分である。
【００５６】
一実施形態において、窒素は、バイオリアクタから保持タンクにブリード流を供給するための導管内に設けられたインラインスパージャを介してブリード流中に注入される。好ましくは、インライン導管は、保持タンクに対して近位に提供される。
【００５７】
ブリード流が外界圧力であるか、またはそれに近いときに、窒素（または他の不活性ガス）をブリード流中に注入することが好ましい。ＣＯ２は、より高圧でより可溶性であるので、より高圧で窒素をブリード流中に注入すると、ＣＯ２成分を置換することで効率がより低くなる。
【００５８】
好ましくは、ブリード流に供給される不活性ガスは窒素である。代替的に、不活性ガスは、水素またはメタンである。一実施形態において、ブリード流は、空気が注入される。一実施形態において、空気注入されたブリード流は、生成物回収モジュールに送られるのに先立って、１つ以上の追加の処理段階を受ける。
【００５９】
一実施形態において、ブリード流を加熱するためのプロセスが提供される。一実施形態において、方法は、次のうちの少なくとも１つが生じるように、生細胞を含有するブリード流に熱を加えることを含む：（ｉ）エタノールの酸化に必要とされるタンパク質が変性する、（ｉｉ）細菌細胞が溶解する、および（ｉｉｉ）細胞の代謝が妨害される。
【００６０】
好ましくは、ブリード流は、エタノールをアセテートに変換することができる１つ以上の酵素を変性させるのに十分な温度まで加熱される。一実施形態において、１つ以上の酵素は、ＮＡＤＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．１）、ＮＡＤＰＨ依存性アルコールデヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．１．１．２）、アルデヒド：フェレドキシン酸化還元酵素（ＡＯＲ、ＥＣ１．２．７．５）、酢酸キナーゼ（ＥＣ２．１．２．１）、およびホスホトランスアセチラーゼ（ＥＣ２．３．１．８）からなる群から選択される。
【００６１】
理想的には、ブリードセルは、バイオリアクタを出た後、短い時間内に所望の温度まで加熱される。例えば、ブリード流は、バイオリアクタから出て３０分以内、またはバイオリアクタから出て２０分以内、またはバイオリアクタから出て１０分以内、またはバイオリアクタから出て５分以内、またはバイオリアクタから出て１分以内に所望の温度まで加熱される。
【００６２】
生成物流の所望の温度は、少なくとも５０℃、または少なくとも６０℃、または少なくとも７０℃、または少なくとも７５℃、または少なくとも７８℃まで上昇する。一実施形態において、生成物流の温度は、少なくとも１０秒間、または少なくとも２０秒間、または少なくとも３０秒間、または少なくとも１分間、または少なくとも２分間、または少なくとも３分間、または少なくとも５分間、または少なくとも１０分間、所定の温度を超えて維持される。
【００６３】
ブリード流は、プレート熱交換器および炎光熱交換器、ならびにシェル熱交換器およびチューブ熱交換器を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の従来の手段によって加熱することができる。ブリード流は、加熱された水流、低圧流（例えば、１．５ｂａｇ以下）、または代替的な低温の穏やかな熱源によって間接的に加熱されることが好ましい。好ましくは、必要とされる熱の少なくとも一部は、工場の集積部分から供給される。例えば、蒸留モジュールから、またはバイオリアクタにＣ１含有基質を提供する工業プロセスから熱を供給することができる。
【００６４】
好ましくは、ブリード流に供給される熱は、高圧熱蒸気ではない。高圧または他の攻撃的な形態の加熱を使用すると、微生物が変性し、結果的にバイオマスが凝集する可能性がある。バイオマスの凝集は、導管または保持タンク内のファウリングを結果的にもたらし、システムの作動を損なう可能性がある。生成物流は、生成物回収（すなわち蒸留プロセス）のために加熱されることを必要とし、工学的解決策を使用して熱処理のコストを最小限にすることができる。好ましくは、ブリード流は、エタノールからアセテートへの酸化の原因となる酵素を変性させるのに十分だが、バイオマスの凝集を結果的にもたらすであろう温度よりも低い温度まで加熱される。
【００６５】
一実施形態において、ブリード流を減圧するためのプロセスが提供される。一実施形態において、ブリード流中の溶存、同伴、または懸濁ＣＯ２は、ブリード流の減圧を経て除去される。エタノールからアセテートへの変換にはＣＯ２が必要であることにより、ブリード流からＣＯ２を除去することで、この機序を介してエタノールの酸化が生じるのを防止する。
【００６６】
このプロセスを有効にするには、十分な圧力で作動するバイオリアクタからブリード流を抜き取り、次いでブリード流中に提供されるＣＯ２の大部分がフラッシュオフされるように減圧されなければならない。好ましくは、ブリード流中の実質的にすべてのＣＯ２がフラッシュオフされる。理想的には、ブリード流中のＣＯ２の大部分は、３０秒未満、２０秒未満、または１０秒未満、または５秒未満、または３秒未満、または２秒未満、または１秒未満でフラッシュオフされるべきである。
【００６７】
理想的には、ブリード流は、外界圧を上回る圧力に少なくとも１秒間、または少なくとも３秒間、または少なくとも５秒間、または少なくとも１０秒間、または少なくとも１５秒間、または少なくとも２０秒間、または少なくとも２５秒間、または少なくとも３０秒間供された後に減圧される。好ましくは、ブリード流の圧力は、外界圧を上回る圧力に１〜３０秒間、または１〜１５秒間、または１５〜３０秒間維持された後に減圧される。一実施形態において、ブリード流は少なくとも２．０ｂａｒｇの圧力へ供され、この圧力で少なくとも１秒間維持された後に減圧される。一実施形態において、生成物流の圧力は、少なくとも０．２５ｂａｒｇに上昇し、この圧力で少なくとも３０秒間維持された後に減圧される。
【００６８】
特定の実施形態において、外界圧を上回る圧力で発酵が生じる場合、加圧容器から外界圧での容器へブリード流を通過させると、ＣＯ２の適切なフラッシュを提供するのに十分な圧力低下を提供し得る。特定の実施形態において、バイオリアクタを出る液体は少なくとも０．２５ｂａｒｇ以上の圧力であり、外界圧で容器に送られ、このような圧力低下は、液体から溶存ＣＯ２の少なくとも一部を除去するのに十分である。
【００６９】
一実施形態において、ブリード流中に含有される微生物は、Ｃ１固定微生物である。特定の実施形態において、Ｃ１固定微生物は、ウッド−ユングダール経路を有するアセトゲンである。一実施形態において、Ｃ１固定微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉからなる群から選択される。
【００７０】
一実施形態において、微生物は、天然に生成される生成物中にＣ１炭素源を固定する。一実施形態において、天然に生成される生成物はエタノールである。代替的な実施形態において、微生物とは、（ｉ）１つ以上の非天然に生成される生成物を生成する、いずれか１つ以上の外在性酵素を含む組換え微生物、または（ｉｉ）１つ以上の内在性酵素が過剰発現している組換え微生物、または（ｉｉｉ）１つ以上の酵素の発現および／もしくは活性を中断する少なくとも１つの遺伝子修飾を含む組換え微生物である。例えば、本発明の微生物は、エタノール（ＷＯ２００７／１１７１５７）、アセテート（ＷＯ２００７／１１７１５７）、ブタノール（ＷＯ２００８／１１５０８０およびＷＯ２０１２／０５３９０５）、酪酸塩（ＷＯ２００８／１１５０８０）、２，３−ブタンジオール（ＷＯ２００９／１５１３４２）、乳酸塩（ＷＯ２０１１／１１２１０３）、ブテン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、ブタジエン（ＷＯ２０１２／０２４５２２）、メチルエチルケトン（２−ブタノン）（ＷＯ２０１２／０２４５２２およびＷＯ２０１３／１８５１２３）、エチレン（ＷＯ２０１２／０２６８３３）、アセトン（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、イソプロパノール（ＷＯ２０１２／１１５５２７）、脂質（ＷＯ２０１３／０３６１４７）、３−ヒドロキシプロピオネート（３−ＨＰ）（ＷＯ２０１３／１８０５８１）、イソプレン（ＷＯ２０１３／１８０５８４）、脂肪酸（ＷＯ２０１３／１９１５６７）、２−ブタノール（ＷＯ２０１３／１８５１２３）、１，２−プロパンジオール（ＷＯ２０１４／０３６１５２）、および１−プロパノール（ＷＯ２０１４／０３６９１５２）を生成し得るか、または生成するように操作され得る。
【００７１】
代謝工学は費用および時間がかかる（Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３０：１３５５−１３５８，２０１２）。細胞内外へのフラックスの完全な平衡を必要とする細胞膜の制約により、代謝ネットワーク全体を考慮することなく生合成経路を発現させることは困難である。代謝フラックス分析、ゲノム工学など、エンジニアが細胞をより良好に操作することができる多くの技術があるものの、細胞の複雑性のため、制限がある（Ｌｅｅ，Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，８：５３６−５４６，２０１２、Ｙａｄａｖ，Ｍｅｔａｂｏｌ  Ｅｎｇ，１４：２３３−２４１，２０１２）。さらに、転写、翻訳、およびゲノムを調節しなければならないツールは、関心対象の生合成を最適化するために必要とされる時間および労力を増大させる多くのデザインビルドテスト（ＤＢＴ）サイクルを必要とする（Ｂｏｙｌｅ，Ｍｅｔａｂｏｌ  Ｅｎｇ，１４：２２３−２３２，２０１２）。現行のＤＢＴサイクルは非常に高価だが、インビトロの系は、細胞内容物へ直接アクセスすることによって多くのインビボでの制限を迂回するので、ＤＢＴサイクルの高速化を約束することを示す（Ｓｕｎ，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ，３：３８７−３９７，２０１４、Ｙｏｕ，Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１３１：８９−１１９，２０１３、Ｓｉｅｇａｌ−Ｇａｓｋｉｎｓ，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ  Ｂｉｏｌ，３：４１６−４２５，２０１４）。これらのインビトロの系には、例えば、粗細胞抽出物を使用した無細胞代謝工学（Ｋａｙ，Ｍｅｔａｂｏｌ  Ｅｎｇ，２０：８４−９１，２０１５）またはインビトロでの酵素発現のための無細胞タンパク質合成（ＵＳ２００６／０３６２７０８）が含まれ得る。本明細書では、これらの種類の系を「無細胞の系」と呼ぶ。特定の実施形態において、本発明を無細胞の系に適用して、生成物から前駆体への望ましくない逆反応を防止することができる。
【００７２】
微生物に関して使用されるとき、「非天然」という用語は、微生物が、参照される種の野生型株を含む参照される種の天然の株において通常認められない少なくとも１つの遺伝子修飾を有することを意味することが意図される。
【００７３】
「遺伝子修飾」、「遺伝子改変」、または「遺伝子操作」という用語は、幅広く微生物のゲノムまたは核酸の操作を指す。同様に、「遺伝子操作された」という用語は、操作されたゲノムまたは核酸を含む微生物を指す。遺伝子修飾の方法は、例えば、異種遺伝子発現、遺伝子またはプロモーターの挿入または欠失、核酸変異、修飾遺伝子発現または不活性化、酵素工学、指向性進化、知識ベース設計、ランダム変異導入法、遺伝子シャフリング、およびコドン最適化を含む。
【００７４】
「組換え」は、核酸、タンパク質、または微生物が、遺伝子修飾、操作、または組換えの生成物であることを示す。一般に、「組換え」という用語は、微生物の２つ以上の異なる株または種など、複数の源から誘導される遺伝物質を含有するか、またはそれによってコードされる核酸、タンパク質、または微生物を指す。本明細書で使用される場合、「組換え」という用語は、また、内在性核酸またはタンパク質の変異形態を含む、変異した核酸またはタンパク質を含む微生物を説明するために使用され得る。
【００７５】
「野生型」は、変異体または変異形とは区別されるように天然に存在する、生物、株、遺伝子、または特性の典型的な形態を指す。
【００７６】
「内在性」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物に存在または発現する核酸またはタンパク質を指す。例えば、内在性遺伝子は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物に天然に存在する遺伝子である。一実施形態では、内在性遺伝子の発現は、外在性プロモーターなどの外在性調節エレメントによって制御され得る。
【００７７】
「外在性」は、本発明の微生物が誘導される野生型または親微生物に存在しない核酸またはタンパク質を指す。一実施形態では、外在性遺伝子または酵素は、異種（すなわち、異なる）株または種から誘導されて、本発明の微生物に導入または発現され得る。別の実施形態では、外在性遺伝子または酵素は、本発明の微生物に、人工的にまたは組換えられて作製および導入されるか、または発現され得る。外在性核酸は、本発明の微生物のゲノムに組み込まれるように、または本発明の微生物、例えばプラスミド中で染色体外の状態にとどまるように適合され得る。
【００７８】
「酵素活性」または単に「活性」は、広範には、酵素の活性、酵素の量、または反応を触媒するための酵素の可用性を含むがこれらに限定されない、酵素的な活性を指す。したがって、酵素活性を「増大させること」は、酵素の活性を増大させること、酵素の量を増大させること、または反応を触媒するための酵素の可用性を増大させることを含む。同様に、酵素活性を「低下させること」は、酵素の活性を低下させること、酵素の量を低下させること、または反応を触媒するための酵素の可用性を低下させることを含む。
【００７９】
「微生物」は、顕微鏡生物、特に細菌、古細菌、ウイルス、または真菌である。本発明の微生物は、典型的には細菌である。本明細書で使用される場合、「微生物」の引用は、「細菌」を網羅するものと解釈されるべきである。
【００８０】
本発明の微生物は、機能特性に基づいてさらに分類され得る。例えば、本発明の微生物は、Ｃ１固定微生物、嫌気性細菌、アセトゲン、エタノロゲン、カルボキシド栄養生物、および／もしくはメタン資化性菌であり得るか、またはそれらから誘導され得る。表１は、微生物の代表的なリストを提供し、微生物の機能特性を特定する。
【表１】
2020523026.tif 000003
2020523026.tif 000004
【００８１】
「Ｃ１」は、１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１酸素化物」は、少なくとも１つの酸素原子も含む１炭素分子、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、またはＣＨ３ＯＨを指す。「Ｃ１炭素源」は、本発明の微生物のための部分的または唯一の炭素源として機能する１炭素分子を指す。例えば、Ｃ１炭素源は、ＣＯ、ＣＯ２、ＣＨ４、ＣＨ３ＯＨ、またはＣＨ２Ｏ２のうちの１つ以上を含み得る。好ましくは、Ｃ１炭素源は、ＣＯおよびＣＯ２のうちの１つまたは両方を含む。「Ｃ１固定微生物」は、Ｃ１炭素源から１つ以上の生成物を生成する能力を有する微生物である。典型的には、本発明の微生物はＣ１固定細菌である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるＣ１固定微生物から誘導される。
【００８２】
「嫌気性細菌」は、増殖のために酸素を必要としない微生物である。嫌気性細菌は、酸素が特定の閾値を超えて存在する場合、負の反応を起こし得るか、もしくは死滅し得る。典型的には、本発明の微生物は嫌気性細菌である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定される嫌気性細菌から誘導される。
【００８３】
「アセトゲン」は、嫌気呼吸の生成物としてアセテート（もしくは酢酸）を生成する、または生成することが可能である微生物である。典型的には、アセトゲンは、エネルギー節約のため、ならびにアセチル−ＣｏＡおよびアセテートなどのアセチル−ＣｏＡ誘導生成物の合成のためのそれらの主要機構として、ウッド・ユングダール経路を使用する、偏性嫌気性細菌である（Ｒａｇｓｄａｌｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１７８４：１８７３−１８９８，２００８）。アセトゲンは、アセチル−ＣｏＡ経路を、（１）ＣＯ２からのアセチル−ＣｏＡの還元合成のための機構、（２）最終電子を受容する、エネルギー節約プロセス、（３）細胞炭素の合成におけるＣＯ２の固定（同化）のための機構として使用する（Ｄｒａｋｅ，Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，Ｉｎ：Ｔｈｅ  Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐ．３５４，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００６）。天然に存在する全てのアセトゲンは、Ｃ１固定、嫌気性、独立栄養性、および非メタン資化性である。典型的には、本発明の微生物は、アセトゲンである。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるアセトゲンから誘導される。
【００８４】
「エタノロゲン」は、エタノールを生成する、または生成することが可能である微生物である。典型的には、本発明の微生物は、エタノロゲン（ｅｔｈａｎｏｌｏｇｅｎ）である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるエタノロゲンから誘導される。
【００８５】
「独立栄養生物」は、有機炭素の不在下でも増殖することが可能な微生物である。代わりに、独立栄養生物は、ＣＯおよび／またはＣＯ２などの無機炭素源を使用する。典型的には、本発明の微生物は、独立栄養生物である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定される独立栄養生物から誘導される。
【００８６】
「カルボキシド栄養生物」は、炭素の唯一の供給源としてＣＯを利用することが可能な微生物である。典型的には、本発明の微生物は、カルボキシド栄養生物である。好ましい実施形態において、本発明の微生物は、表１で特定されるカルボキシド栄養生物から誘導される。
【００８７】
「メタン資化性菌」は、炭素とエネルギーの唯一の供給源としてメタンを利用することが可能な微生物である。特定の実施形態では、本発明の微生物は、メタン資化性菌であるか、またはメタン資化性菌から誘導される。他の実施形態では、本発明の微生物は、メタン資化性菌ではないか、メタン資化性菌から誘導されない。
【００８８】
より広くは、本発明の微生物は、表１で特定される何らかの属または種に由来し得る。
【００８９】
好ましい実施形態において、本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ種、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ種、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ種を含むＣｌｏｓｔｒｉｄｉａのクラスターから得られる。これらの種は、Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、およびＨｕｈｎｋｅ，ＷＯ２００８／０２８０５５（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉ）によって最初に報告され、かつ特徴付けられた。
【００９０】
これらの３つの種は、多くの類似点を有する。特に、これらの種は全て、Ｃ１固定、嫌気性、アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属メンバーである。これらの種は、同様の遺伝子型および表現型ならびにエネルギー節約および発酵代謝のモードを有する。さらに、これらの種は、９９％を超えて同一である１６Ｓ  ｒＲＮＡ  ＤＮＡを有するクロストリジウムｒＲＮＡホモロジー群Ｉ内に群生し、約２２〜３０モル％の含有量でＤＮＡ  Ｇ＋Ｃを有し、グラム陽性であり、同様の形態およびサイズを有し（０．５〜０．７×３〜５μｍの対数増殖細胞）、中温性であり（３０〜３７℃で最適に増殖する）、約４〜７．５の同様のｐＨ範囲を有し（約５．５〜６の最適ｐＨ）、シトクロムを欠いており、Ｒｎｆ複合体を介してエネルギーを節約する。また、カルボン酸のそれらの対応するアルコールへの還元が、これらの種において示されている（Ｐｅｒｅｚ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ，１１０：１０６６−１０７７，２０１２）。重要なことに、これらの種はまた、全て、ＣＯ含有ガスで強い独立栄養性増殖を示し、主要な発酵生成物としてエタノールおよびアセテート（または酢酸）を生成し、特定の条件下で少量の２，３−ブタンジオールおよび乳酸を生成する。
【００９１】
しかしながら、これら３つの種は、いくつかの違いも有する。これらの種は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍはウサギの腸から、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉは養鶏場の廃棄物から、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉは淡水堆積物からというように、異なる供給源から単離された。これらの種は、種々の糖（例えば、ラムノース、アラビノース）、酸（例えば、グルコン酸塩、クエン酸塩）、アミノ酸（例えば、アルギニン、ヒスチジン）、および他の基質（例えば、べタイン、ブタノール）の利用において異なる。さらに、これらの種は、特定のビタミン（例えば、チアミン、ビオチン）に対する栄養要求性において異なる。これらの種は、ウッド・ユングダール経路遺伝子およびタンパク質の核酸およびアミノ酸配列において違いを有するが、これらの遺伝子およびタンパク質の一般的構成および数は、全ての種において同じであることが分かっている（Ｋｏｐｋｅ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２２：３２０−３２５，２０１１）。
【００９２】
したがって、要約すると、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの特性の多くは、その種に特有なのではなく、むしろＣ１固定、嫌気性、アセトゲン系、エタノロゲン系、およびカルボキシド栄養性のＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ属メンバーのこのクラスターの一般的な特性である。しかしながら、これらの種は、実際は、全く異なるため、これらの種のうちの１つの遺伝子修飾または操作は、これらの種のうちの別のものにおいては同一の効果を有しない場合がある。例えば、増殖、性能、または生成物生成における違いが観察され得る。
【００９３】
本発明の微生物は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、またはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの分離株または変異体から得ることもできる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍの分離株および変異体としては、ＪＡ１−１（ＤＳＭ１００６１）（Ａｂｒｉｎｉ，Ａｒｃｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，１６１：３４５−３５１，１９９４）、ＬＢＳ１５６０（ＤＳＭ１９６３０）（ＷＯ２００９／０６４２００）、およびＬＺ１５６１（ＤＳＭ２３６９３）が挙げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの分離株および変異体としては、ＡＴＣＣ４９５８７（Ｔａｎｎｅｒ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，４３：２３２−２３６，１９９３）、ＰＥＴＣＴ（ＤＳＭ１３５２８、ＡＴＣＣ５５３８３）、ＥＲＩ−２（ＡＴＣＣ５５３８０）（ＵＳ５，５９３，８８６）、Ｃ−０１（ＡＴＣＣ５５９８８）（ＵＳ６，３６８，８１９）、Ｏ−５２（ＡＴＣＣ５５９８９）（ＵＳ６，３６８，８１９）、およびＯＴＡ−１（Ｔｉｒａｄｏ−Ａｃｅｖｅｄｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｅｔｈａｎｏｌ  ｆｒｏｍ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｇａｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ，ＰｈＤ  ｔｈｅｓｉｓ，Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，２０１０）が挙げられる。Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの分離株および変異体としては、ＰＩ  １（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−６２２、ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−７８２６）（ＷＯ２００８／０２８０５５）が挙げられる。
【００９４】
「基質」は、本発明の微生物のための炭素および／またはエネルギー源を指す。典型的には、基質は、ガス状であり、Ｃ１炭素源、例えば、ＣＯ、ＣＯ２、および／またはＣＨ４を含む。好ましくは、基質は、ＣＯまたはＣＯ＋ＣＯ２のＣ１炭素源を含む。基質は、Ｈ２、Ｎ２、または電子などの他の非炭素構成要素をさらに含み得る。
【００９５】
基質は、概して、約１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００モル％のＣＯなどの少なくともいくらかの量のＣＯを含む。基質は、約２０〜８０、３０〜７０、または４０〜６０モル％のＣＯなど、ある範囲のＣＯを含み得る。好ましくは、基質は、約４０〜７０モル％のＣＯ（例えば、製鋼または高炉ガス）、約２０〜３０モル％のＣＯ（例えば、塩基性酸素高炉ガス）、または約１５〜４５モル％のＣＯ（例えば、合成ガス）を含む。いくつかの実施形態において、基質は、約１〜１０または１〜２０モル％のＣＯなどの比較的低い量のＣＯを含み得る。本発明の微生物は、典型的には、基質中のＣＯの少なくとも一部を生成物に変換する。いくつかの実施形態において、基質は、ＣＯを含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【００９６】
基質は、いくらかの量のＨ２を含み得る。例えば、基質は、約１、２、５、１０、１５、２０、または３０モル％のＨ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約６０、７０、８０、または９０モル％のＨ２など、比較的多量のＨ２を含み得る。さらなる実施形態において、基質は、Ｈ２を含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【００９７】
基質は、いくらかの量のＣＯ２を含み得る。例えば、基質は、約１〜８０または１〜３０モル％のＣＯ２を含み得る。いくつかの実施形態において、基質は、約２０、１５、１０、または５モル％未満のＣＯ２を含み得る。別の実施形態において、基質は、ＣＯ２を含まないか、または実質的に含まない（１モル％未満）。
【００９８】
基質は典型的にはガス状であるが、基質はまた、代替的な形態で提供されてもよい。例えば、基質は、マイクロバブル分散物発生装置を使用して、ＣＯ含有ガスで飽和した液体中に溶解されてもよい。さらなる例として、基質は、固体支持体上に吸着されてもよい。
【００９９】
基質および／またはＣ１炭素源は、自動車の排出ガスまたはバイオマスガス化からなど、産業プロセスの副生成物として得られる、または何らかの他の源からの廃ガスであってもよい。特定の実施形態において、産業プロセスは、鉄鋼製造などの鉄金属生成物製造、非鉄金属生成物製造、石油精製、石炭ガス化、電力生成、カーボンブラック生成、アンモニア生成、メタノール生成、およびコークス製造からなる群から選択される。これらの実施形態では、基質および／またはＣ１炭素源は、任意の簡便な方法を使用して、それが大気中に放出される前に産業プロセスから捕捉されてもよい。
【０１００】
基質および／またはＣ１炭素源は、石炭もしくは精錬残渣のガス化、バイオマスもしくはリグノセルロース物質のガス化、または天然ガスの改質によって得られる合成ガスなど、合成ガスであってもよい。別の実施形態において、合成ガスは、一般廃棄物または産業廃棄物のガス化から得てもよい。
【０１０１】
基質の組成は、反応の効率および／または費用に著しい影響を及ぼし得る。例えば、酸素（Ｏ２）の存在は、嫌気性発酵プロセスの効率を低減し得る。基質の組成に応じて、基質を処理、スクラブ、または濾過して、毒素、望ましくない成分、またはちり粒子などのいかなる望ましくない不純物も除去すること、および／または所望の成分の濃度を増加させることが望ましくあり得る。
【０１０２】
特定の実施形態において、発酵は、糖、デンプン、リグニン、セルロース、またはヘミセルロースなどの炭水化物基質の不在下で実施される。
【０１０３】
１つ以上の標的生成物に加えて、本発明の微生物は、１つ以上の副産物も生成し得る。例えば、標的生成物に加えて、本発明は、アセテート、２，３−ブタンジオール、ブタノール、ブチレート、ラクテート、ブテン、ブタジエン、メチルエチルケトン、エチレン、アセトン、イソプロパノール、脂質、３−ヒドロキシプロピオネート、イソプレン、脂肪酸、２−ブタノール、１，２−プロパンジオール、および／または１−プロパノールを生成し得る。特定の実施形態において、微生物バイオマス自体が、生成物または副産物とみなされ得る。
【０１０４】
「天然生成物」は、遺伝子修飾されていない微生物によって生成される生成物である。例えば、エタノール、アセテート、および２，３−ブタンジオールは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｒａｇｓｄａｌｅｉの天然生成物である。「非天然生成物」は、遺伝子修飾された微生物によって生成されるが、遺伝子修飾された微生物が由来する遺伝子修飾されていない微生物によって生成されない生成物である。
【０１０５】
「効率を増大させること」、「増大した効率」などは、増殖速度、生成物生成速度もしくは体積、消費される基質の体積あたりの生成物体積、または生成物選択性を増大させることを含むが、これらに限定されない。効率は、本発明の微生物が誘導される親微生物の性能に対して測定され得る。
【０１０６】
図１は、第１のバイオリアクタ１０と第２のバイオリアクタ２０とを備えた代表的なバイオリアクタシステムを図示する。バイオリアクタシステムは、Ｃ１含有基質１２を受け取る。Ｃ１含有基質は、第１のバイオリアクタガス入口流１４と第２のバイオリアクタガス入口流１４‘とに分けられ、それぞれ、それぞれのガス入口１６、１６’を経て第１および第２のバイオリアクタ１０、２０に供給される。
【０１０７】
バイオリアクタ１０、２０の液相区域１８、１８’の細菌濃度は、液体の濾過部分および未濾過部分を抜き取ることができる手段を提供することにより、様々なレベルのエタノール生産性で維持することができる。液体は、細菌を除去するために濾過システム２５によって濾過される透過液流２８、および濾過されず、第１のバイオリアクタ１０の連続液相区域１８内にある発酵ブロスと実質的に同じ濃度でＣ１固定細菌（バイオマス）を含有するブリード流２６を介して、第１のバイオリアクタ１０から抜き取られる。濾過された細菌は、導管３６を介して第１のバイオリアクタ１０に戻される。それゆえ、第１のバイオリアクタ１０から抜き取られた液体生成物は、透過液流２８およびブリード流２６の両方を含み得る。同じ様式で、第２の濾過システム２５’は、連続液相区域１８’と連通して提供され、バイオリアクタシステムの最終バイオリアクタからのブリード流４０および透過液流５０の抜き取りを可能にし、濾過された細菌３６’を第２のバイオリアクタ２０の連続液相区域１８’まで戻す。
【０１０８】
液体培養培地は、培地入口３４を介してバイオリアクタシステム、特に第１のバイオリアクタ１０に供給され、細菌の増殖を維持するための栄養素を供給し、第１のバイオリアクタ１０から抜き取られた中間液体生成物３２において喪失された液体量を補充するために供給され得、その全部または一部を第２バイオリアクタ２０に送ることができる。任意選択的に、液体培養培地は、培地入口３４’を介して第２のバイオリアクタ２０に供給されてもよい。任意選択的に、ブリード流２６および／または透過液流２８の一部は、第２のバイオリアクタ２０に通さずに、バイオリアクタシステムから（例えば、プロセスのモニタリングおよび分析のために）抜き取ることができる。
【０１０９】
ガス出口流３８、３８’は、バイオリアクタヘッドスペース２２、２２’と流体連通している導管から抜き取られ得る。ガス出口流３８、３８’は、バイオリアクタシステムから個別に抜き取られ得るか、または組み合わされてからガス状生成物出口２４として抜き取られ得る。
【０１１０】
したがって、図１は、ガス状のＣ１含有基質１２を第１および第２のバイオリアクタ１０、２０に並列供給することができる一方、Ｃ１固定細菌（バイオマス）を含むことができる液体生成物を第１のバイオリアクタ１０から第２のバイオリアクタ２０へと継続的に供給することができるバイオリアクタシステムを図示している。図１の実施形態において、ブリード流４０および透過液流５０がバイオリアクタシステム１００から抜き取られる最終的なバイオリアクタは、すなわち第２のバイオリアクタ２０である。追加のバイオリアクタ（例えば、３つまたは４つのバイオリアクタ）、具体的には第１のバイオリアクタの下流および最終的なバイオリアクタの上流にある１つ以上の中間バイオリアクタを備えたバイオリアクタシステムを有する代替的な実施形態において、ガスおよび液体の供給物を類似の様式でこのような中間バイオリアクタに導入し得、ガスおよび液体の生成物は、類似の様式でこのような中間バイオリアクタから抜き取られ得る。ブリード流および透過液流を含む液体生成物流は、類似の様式で、連続したバイオリアクタとやり取りされ得る。
【０１１１】
概して、バイオリアクタシステム１００の１つ以上の代謝産物（例えば、エタノール）は、図１の実施形態における第２のバイオリアクタ２０から抜き取られたブリード流４０および透過液流５０などの最終バイオリアクタから抜き取られたブリード流および透過液流、またはその一部から回収される。任意選択的に、このような代謝産物は、最終バイオリアクタ以外の１つ以上のバイオリアクタから抜き取られたブリード流および／もしくは透過液流、またはその一部から回収することもできる。
【０１１２】
図２に示すように、バイオリアクタからの透過液流５０およびブリード流４０は貯蔵区域に供給される。透過液流は、透過液保持タンク６２に供給される。透過液は、導管６４を介して透過液生成物回収モジュール６６に送られるのに先立って、清澄化工程などの１つ以上の処理工程を受けてもよい。ブリード流は、ブリード保持タンク７２に供給され、ブリード流は、ブリード流中のエタノールからアセテートへの変換を防止するために、１つ以上の処理工程を受ける。処理工程は、ブリード流の加熱、ブリード流の減圧、またはブリード流からのＣＯ２の置換を含んでもよい。処理された流れの加熱は、保持タンク内で、またはバイオリアクタと保持タンクとの間に設けられた導管内でのいずれかで実施され得る。優先的に、ブリード流を加熱するためのエネルギーは、バイオリアクタシステムに隣接して位置する工業プロセスから供給される。次いで、処理された流れ４２は、ブリード生成物回収モジュール９０に供給され、エタノールは、処理された流れから回収される。任意選択的に、透過液流５０およびブリード流４０が組み合わされ、貯蔵区域は、単一の保持タンク（図示せず）に供給される組み合わされた流れを受け取る。
【０１１３】
図３ａは、本発明の一態様によるブリード保持タンク７２を図示する。ブリード流４０は、ブリード保持タンク７２に供給される。一実施形態において、窒素などの不活性ガス８０は、ブリード保持タンク７２のヘッドスペース７６内へと継続的に注入されるのに対し、ヘッドスペースの一部は、ベント（図示せず）を介して継続的に排出される。
【０１１４】
図３ｂは、窒素８０がブリード保持タンク７８の液体部分７８内に設けられた入口８２を介してブリード流に供給される代替的なシステムを示す。
【０１１５】
図３ｃは、ブリード流４０が１つ以上のノズル８４を介してブリード保持タンク７２の窒素含有ヘッドスペース７６内へ噴霧される実施形態を示す。
【０１１６】
図３ｄは、窒素８０が保持タンク７２の上流に設けられたインラインスパージャ８６内でブリード流中に注入される実施形態を示す。
【実施例】
【０１１７】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、当然のことながら、いかなる方法によってもその範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【０１１８】
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３（ＤＳＭ１００６１の派生物）は、ＤＳＭＺ（Ｔｈｅ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｈｏｆｆｅｎｓｔｒａβｅ  ７Ｂ，３８１２４  Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から取得した。厳密な嫌気性条件および技術を使用して３７℃で増殖を実施した（Ｈｕｎｇａｔｅ，Ｍｅｔｈ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３Ｂ：１１７−１３２，１９６９、Ｗｏｌｆｅ，Ａｄｖ  Ｍｉｃｒｏｂ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，６：１０７−１４６，１９７１）。酵母エキスを含有しない化学的に定義されたＰＥＴＣ培地を使用した。唯一の炭素源およびエネルギー源として、３０ｐｓｉのＣＯ含有ガス混合物（４４％ＣＯ、３２％Ｎ２、２２％ＣＯ２、２％Ｈ２）。
【表２】
2020523026.tif 000005
2020523026.tif 000006
【０１１９】
実施例１：エタノールの酸化を防止するためのＣＯ２置換
Ｃ．ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ  ＤＳＭ２３６９３を用いた発酵を、１．５Ｌバイオリアクタで３７℃で実施した。嫌気性を達成するために、反応容器に窒素を注入した。接種に先立って、ガスを反応器に継続的に供給される純粋なガスに切り替えた。（４２％ＣＯ、１．５％ＣＯ２、１１％Ｎ２、４２％Ｈ２）、ｐＨを、水酸化アンモニウム（５Ｍ）を用いて５．０に調整した。撹拌を２００ｒｐｍから８００ｒｐｍに上げながら、ガス流量を最初は５９ｍｌ／分／Ｌに設定し、中間指数相中に１１８ｍｌ／分／Ｌに上げた。Ｎａ２Ｓ（０．５Ｍ）をバイオリアクタ内へと０．２ｍｌ／時で添加した。ＯＤ６００が１．１に到達したら、バイオリアクタを１．９５ｄ−１の希釈率および１．０ｄ−１の細菌希釈率で連続モードに切り替えた。連続モード中、ガスおよび撹拌をそれぞれ２６７ｍｌ／分／Ｌおよび９５０ｒｐｍに調整し、細菌希釈率を０．３５ｄ−１に調整した。Ｎａ２Ｓを０．５ｍｌ／時に上昇させた。バイオマスおよび代謝産物を測定するために培地試料を採取し、流入ガスおよび流出ガスのヘッドスペース分析を定期的に実施した。１６．０日までに、発酵代謝産物およびバイオマスは、エタノールおよびアセテートの濃度が２６．５ｇ／Ｌおよび４．７５ｇ／Ｌ、ＣＯ取り込みが５．９ｍｏｌ／Ｌ／日、Ｈ２取り込みが３．４５ｍｏｌ／Ｌ／日で安定していた。
【０１２０】
１６．９５日後に発酵ブロス試料（２５ｍＬ）を３つ組で採取し、模倣保持タンク（嫌気性血清ボトル）内に入れ、血清ボトルのヘッドスペースを交換し、ＣＯ２またはＮ２で加圧した。このプロセス中にＯ２が導入されないように注意を払った。次に、代謝産物試料を３時間かけて採取し、ＨＰＬＣで測定した。
【０１２１】
図４および図５は、２つの条件下でのエタノールおよびアセテートの変化を示す。ＣＯ２ヘッドスペースを使用した例（図４）において、アセテートは５．５ｇ／Ｌから１０．６７ｇ／Ｌに増加し、エタノールは２６．４ｇ／ｌから２３．８ｇ／Ｌに減少する。これは、著しいエタノール酸化を実証している。
【０１２２】
図５は、同じセルをＮ２ヘッドスペースに配置したとき、代謝産物濃度に著しい変化がなく、エタノール酸化がないことを示す。代謝産物濃度は、発酵において測定されたものと同じままである。
【０１２３】
実施例２：エタノールの酸化を防止するための熱処理
実施例１に説明した実験と類似の条件下で操作されたＣＳＴＲ実験から単一の試料を収集し、小口試料に分けた。小口試料を、生成物回収に先立って、発酵後の生成物流を含有するバイオマスについての条件を表す条件下で保存した。これらの条件下で、アセテートへのエタノールの変換が予想された。
【０１２４】
小口試料を、０〜２４０分の様々な時間間隔で独立して熱処理した。熱処理では、試料を８０℃で５分間保持することを包含した。
【０１２５】
熱処理後、ＨＰＬＣによりアセテートおよびエタノールの力価を測定し、対応する時間ゼロの熱処理試料と比較した。
【０１２６】
図６は、異なる時点で熱処理された小口試料間の比較を示す。グラフ上の実線は、小口試料がすぐに熱処理されなかった場合の経時的なエタノールの個々の喪失を示す。２つのデータ点の差は、その期間に生じた変換の量を示す。時間ゼロと時間２４０との差は、熱処理の絶対的な利点を概算する。示すように、６０分〜２４０分間に、さらなる変換はほとんどない。したがって、２４０分を超えると、さらなる変換はおそらくほとんど発生しないであろう。
【０１２７】
本明細書に列挙される公表文献、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献があたかも参照により組み込まれることが個々にかつ具体的に示され、かつその全体が本明細書中に記載された場合と同じ程度まで、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書における任意の先行技術への言及は、その先行技術が任意の国における努力傾注分野の共通の一般的知識の一部をなすという承認ではなく、かつそのように解釈されるべきではない。
【０１２８】
本発明の記載との関連で（特に、以下の特許請求の範囲との関連で）、用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるものとする。用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有すること」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「含有すること」は、特に断りのない限り、非限定的な用語（すなわち、「〜を含むがこれらに限定されないこと」を意味する）と解釈されるものとする。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書に別段の指示がない限り、範囲内に入る各それぞれの値を個々に言及する省略法としての機能を果たすことを単に意図し、各それぞれの値は、あたかも本明細書に個々に記載されたかのように、本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、任意の好適な順序で実施され得る。本明細書に提供されるありとあらゆる実施例または例示的な用語（例えば、「など」）の使用は、本発明をよりよく理解することを単に意図し、別段特許請求の範囲に記載されない限り、本発明の範囲を制限しない。本明細書におけるいかなる文言も、本発明の実施に不可欠な任意の特許請求されていない要素を示すものと解釈するべきではない。
【０１２９】
本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変化形は、上記の説明を読むことによって当業者に明らかとなり得る。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変化形を採用することを予想し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されるものとは別の方法で実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許可された通り、本明細書に添付される特許請求の範囲に記載される主題の全ての修正物および均等物を含む。さらに、上記の要素のそれらの全ての考えられる変化形における任意の組み合わせは、本明細書中に他に指示がない限り、または文脈によって明らかに相反することがない限り、本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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