(57)【要約】  本発明は、ＣＸＣＲ５を過剰発現する間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）、その製造方法及び使用を提供する。
2020533981.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＸＣＲ５を過剰発現する間葉系幹細胞。
【請求項２】
炎症性疾患を治療する医薬品の製造における請求項１に記載の間葉系幹細胞の使用。
【請求項３】
移植拒絶、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、糖尿病、骨／軟骨疾患、心血管疾患、神経系疾患のうちの１種を治療する医薬品の製造における請求項１に記載の間葉系幹細胞の使用。
【請求項４】
請求項１に記載の間葉系幹細胞を含む医薬品。
【請求項５】
ＣＸＣＲ５のｍＲＮＡを間葉系幹細胞に導入し、前記ＣＸＣＲ５を過剰発現する間葉系幹細胞を得る請求項１に記載の間葉系幹細胞の製造方法。
【請求項６】
前記導入方法は、電気穿孔法である請求項５に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ＣＸＣＲ５のｍＲＮＡの製造方法は、
健常者の末梢血中の単核細胞を採取し、培養して末梢血単核細胞を得るステップ（１）と、
末梢血単核細胞ＲＮＡを抽出するステップ（２）と、
逆転写するステップ（３）と、
ＰＣＲ反応を行い、ＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡ断片を回収するステップ（４）と、
ＣＸＣＲ５  ｍＤＮＡを転写するＤＮＡ断片を構築するステップ（５）と、
インビトロでｍＲＮＡを転写するステップ（６）と、
を含む請求項５に記載の製造方法。
【請求項８】
前記ステップ（４）のＰＣＲ反応に用いるプライマーは、
上流プライマー：ＡＴＧＡＡＣＴＡＣＣＣＧＣＴＡＡＣＧＣＴＧＧ、
下流プライマー：ＣＴＡＧＡＡＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＧＣＡ
である請求項７に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ステップ（５）において、ＤＮＡ断片は、ステップ（４）のＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡ断片をプラスミドに結合して得られる請求項７に記載の製造方法。
【請求項１０】
前記ステップ（５）において、ＤＮＡ断片は、ステップ（４）のＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡ断片をテンプレートとし、プロモーターを有するＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡ上流プライマー及びＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡ下流プライマーをそれぞれ上流プライマー及び下流プライマーとしてＰＣＲ反応を行うことにより得られる請求項７に記載の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＸＣＲ５を過剰発現する間葉系幹細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）、その製造方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）は、骨髄で発見された最初の非造血幹細胞であり（Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ,１９７４）、骨髄造血微小環境の構成に関与し、造血幹細胞の増殖と分化に対して顕著な促進作用を有する（Ｍｅｎｄｅｚ−Ｆｅｒｒｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。ＭＳＣは、全身のさまざまな組織や臓器に広く分布し、骨髄に加えて、臍帯、臍帯血、歯茎、骨格筋などから分離して得られる。ＭＳＣは、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、心筋細胞などへ分化する能力を有する。ＭＳＣは、特異的マーカーを有さず、主にＣＤ２９、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５及びＣＤ１６６などの間葉系マーカーを発現し、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５などの造血に関連するマーカーを発現せず、ＨＬＡ−Ｉ系分子を発現しないか又は低発現し、ＨＬＡ−ＩＩ系分子を発現しない。
【０００３】
近年、ＭＳＣの独特な免疫調節作用が注目を集めている。インビトロ実験により、ＭＳＣは特異的刺激による混合リンパ球反応（ＭＬＲ）又は非特異的な分裂促進因子であるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）により刺激誘導されるＴリンパ球の増殖を抑制できることが実証された（Ｄｉ  Ｎｉｃｏｌａ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２）。ＭＳＣは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増幅を誘導し、キラーＴ細胞の細胞毒性機能を阻害することができる（Ａｇｇａｒｗａｌ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＭＳＣはＢ細胞の活性化、増殖、遊走及びその抗体の産生に影響を与える（Ｃｏｒｃｉｏｎｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＭＳＣは、ＤＣの生成及び増殖を抑制し、ＤＣの成熟及び分化を遮断することで、ＤＣの抗原提示能力を低下させることができる（Ｂｅｙｔｈ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ＭＳＣは、ＩＬ−２が活性化したＮＫ細胞の増殖、細胞因子の分泌及びその殺傷機能を強く抑制することができる。ＭＳＣが免疫細胞を調節するメカニズムはまだ完全には明らかになっていないが、その免疫調節作用はＭＨＣに制限されず、直接接触の作用方法及び可溶性因子であるトランスフォーミング増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β、ＴＧＦ−β）、インターロイキン−１０（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１０、ＩＬ−１０）、プロスタグランジンＥ２（ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２、ＰＧＥ２）、肝細胞増殖因子（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＨＧＦ）、腫瘍壊死因子α刺激遺伝子−６（ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅ−６、ＴＳＧ−６）などを分泌して作用する方法を含む（Ｇｅｂｌｅｒ，Ａ．，Ｏ．  Ｚａｂｅｌ  ａｎｄ  Ｂ．  Ｓｅｌｉｇｅｒ，２０１２）。ＭＳＣは、分離して増幅されやすく、免疫原性が低く、パラクリン及び免疫調節の機能を有するので、細胞治療において幅広い応用の見通しを有する。現在、間葉系幹細胞の臨床試験は６００件以上もあり（Ａｐｒｉｌ  ２０１５，ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）、適応症は、自己免疫疾患、移植拒絶、骨／軟骨疾患、心血管疾患、神経系疾患などを含む。本発明者らは、以前に慢性移植片対宿主病の治療有効性により疾患に対するＭＳＣの免疫調節機能を実証した（Ｐｅｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。報告によると、ＭＳＣは、多発性硬化症（Ｌｉ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）、潰瘍性大腸炎（Ｄｕｉｊｖｅｓｔｅｉｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、糖尿病（Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４）などの治療にも適用できる。
【０００４】
しかしながら、臨床治療では、ＭＳＣによる治療効果が理想的でない場合があることが認められている。一部の研究者は、ＭＳＣはインビトロで良好な免疫調節機能を有し、例えば、Ｔ細胞の増殖を効果的に抑制できるが、静脈内注入されたＭＳＣはマウスｃＧＶＨＤを完全には治療できないと考えている（Ｓｕｄｒｅｓ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，２００６）。一部の研究者は、ＭＳＣを用いて肝損傷を治療するとき、損傷部位に集まったＭＳＣの数が少ないことを発見し、これはＭＳＣの治療効果が限られている主な原因であると推測している（Ｇａｏ  Ｊ．ｅｔｃ，２００１）。一部の研究者は、追跡によりＭＳＣが生体内に入った後、肺、肝臓、骨髄などの多くの臓器に散在することを発見し（Ｐａｕｌ  Ｌｉｎ．ｅｔ  ａｌ．，２０１３）、ＭＳＣは生体内で「希釈」されるので、重要な部位に実質的に到達して作用するＭＳＣの数はそれほど多くなく、免疫調節機能が大幅に低下すると考えている。従って、ＭＳＣが臨床治療において直面する主な問題は、ＭＳＣが注入された後、生体内に無秩序に分布することである。
【０００５】
ケモカインは、疾患の発症、進行の過程において非常に重要である。しかし、ＭＳＣ表面で発現するケモカイン受容体は、例えば、ＣＣＲ１、ＣＣＲ４、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ６、ＣＸ３ＣＲなど数多くあり、それ自体の発現量が低いだけでなく、増幅継代後、ＭＳＣはこれらの受容体をほとんど発現しなくなる（Ｓａｒｋａｒ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。また、骨髄中のＭＳＣの含有量は０．００１−０．０１％にすぎないため、健康なドナーから一度に提供された骨髄から分離された初代ＭＳＣの数は少ない。一般に、ｃＧＶＨＤ患者の治療において、１回に注入すべき細胞の量は体重１キロあたり０．４−９×１０６個であり、１回の治療に必要な細胞の量は約０．２−４．５×１０８個となる。従って、インビトロでのＭＳＣ大量増幅は、現在、臨床応用に必要な細胞の量に達するための基本的な方法である。この方法では、ＭＳＣ受容体発現の喪失により、治療の不安定性をもたらす恐れがある。
【０００６】
現在、多くの研究者が、ＭＳＣ治療の標的性を研究方向としている。例えば、ウイルストランスフェクションの方法によりＣＸＣＲ４を過剰発現し、脳損傷部位へのＭＳＣの遊走を促進する方法（Ｗａｎｇ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１５）；ＩＧＦ−１でＭＳＣを前処理し、ＭＳＣでのＣＸＣＲ４の発現を増加させる方法（Ｘｉｎａｒｉｓ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）；接着分子ＰＳＧＬ−１及びＳＬｅＸを増加させることにより、炎症性内皮細胞に対するＭＳＣの接着能力を増強する方法（Ｌｅｖｙ，Ｏ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）；ＭＳＣ上のＣＤ４４分子をＥ−ｓｅｌｅｃｔｉｎ／Ｌ−ｓｅｌｅｃｔｉｎに変換し、骨髄へのＭＳＣの遊走を促進する方法（Ｓａｃｋｓｔｅｉｎ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）などがある。
【０００７】
ケモカインＣＸＣＬ１３は、炎症反応において重要な役割を果たす。例えば、自己免疫性滑膜炎の炎症性滑液でＣＸＣＬ１３のｍＲＮＡ高発現が検出されている（Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。マウス回腸炎の疾患モデルにおいても炎症部位でケモカインＣＸＣＬ１３が高発現することが認められている（Ａ  Ｖｉｅｊｏ−Ｂｏｒｂｏｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。神経ライム病において、脳脊髄液中のＣＸＣＬ１３の含有量は発作急性期の高感度指標とされ得る（Ｋａｔｉｅ  Ｋｉｎｇｗｅｌｌ，２０１１）。本発明者らは、マウス接触過敏反応（ｃｏｎｔａｃｔ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ、ＣＨＳ）モデルにおいて、耳の局所炎症の進行に伴いＣＸＣＬ１３が徐々に増加する傾向を示し、かつこのモデルは発症が速く、炎症反応が限られているので、結果の観察に便利であることを発見した。
【０００８】
そこで、本発明者らはこの特徴を利用し、ケモカインＣＸＣＬ１３に対応する受容体ＣＸＣＲ５のプラスミドを構築し、ｍＲＮＡ修飾法によりＭＳＣに受容体ＣＸＣＲ５を発現させ、疾患のピーク期にＣＸＣＲ５を過剰発現するＭＳＣを注入し、観察した結果、ＣＸＣＲ５を過剰発現するＭＳＣは治療効果が高く、生体内において病変部位まで特異的に遊走することができ、ＭＳＣが生体内で免疫調節能力を発揮する効率が大幅に向上することを発見した。また、本発明者らは、炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）モデルを構築し、ＣＸＣＲ５を過剰発現するＭＳＣは他の疾患モデルにおいても類似の作用を発揮できるか否かを検討した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明では、ＣＸＣＲ５のｍＲＮＡをＭＳＣに直接導入し、ＭＳＣに受容体ＣＸＣＲ５を過剰発現させることにより、ＭＳＣは生体内に静脈内注入された後、生体内の各部位に散在するのではなく、病変部位まで特異的に遊走することができ、これにより、ＭＳＣが生体内で免疫調節能力を発揮する効率が大幅に向上する。
【００１０】
上記目的を達成するために、本発明では、ＣＸＣＲ５を過剰発現する間葉系幹細胞が提供される。
【００１１】
本発明では、炎症性疾患を治療する医薬品の製造における前記間葉系幹細胞の使用が提供される。好ましくは、前記炎症性疾患部位にケモカインＣＸＣＬ１３が含まれる。
【００１２】
本発明では、移植拒絶、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、糖尿病、回腸炎のうちの１種の疾患を治療する医薬品の製造における前記間葉系幹細胞の使用が提供される。
【００１３】
本発明では、前記間葉系幹細胞を含む医薬品が提供される。
【００１４】
本発明では、ＣＸＣＲ５のｍＲＮＡを間葉系幹細胞に導入し、前記ＣＸＣＲ５を過剰発現する間葉系幹細胞を得る前記間葉系幹細胞の製造方法が提供される。
【００１５】
好ましくは、前記導入方法は、電気穿孔法である。
【００１６】
好ましくは、前記ＣＸＣＲ５のｍＲＮＡの製造方法は、
健常者の末梢血中の単核細胞を採取し、培養して末梢血単核細胞を得るステップ（１）と、
末梢血単核細胞ＲＮＡを抽出するステップ（２）と、
逆転写するステップ（３）と、
ＰＣＲ反応を行い、ＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡ断片を回収するステップ（４）と、
ＣＸＣＲ５  ｍＤＮＡを転写するＤＮＡ断片を構築するステップ（５）と、
インビトロでｍＲＮＡを転写するステップ（６）と、を含む。
【００１７】
好ましくは、前記ステップ（４）のＰＣＲ反応に用いるプライマーは、
上流プライマー：ＡＴＧＡＡＣＴＡＣＣＣＧＣＴＡＡＣＧＣＴＧＧ、
下流プライマー：ＣＴＡＧＡＡＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＧＣＡである。
【００１８】
好ましくは、前記ステップ（５）において、ＤＮＡ断片は、ステップ（４）のＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡ断片をプラスミドに結合して得られる。
【００１９】
好ましくは、前記ステップ（５）において、ＤＮＡ断片は、ステップ（４）のＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡ断片をテンプレートとし、プロモーターを有するＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡ上流プライマー及びＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡ下流プライマーをそれぞれ上流プライマー及び下流プライマーとしてＰＣＲ反応を行うことにより得られる。
【００２０】
本発明の有益な効果は以下の通りである。
本発明では、ＣＸＣＲ５を発現するプラスミドを構築し、ＣＸＣＲ５のｍＲＮＡ修飾法を使用することによりＭＳＣにＣＸＣＲ５を過剰発現する特性を有するとともに、レンチウイルス感染などの他の方法と比べて、より効率的で安全である。通常のＭＳＣと異なり、ＭＳＣＣＸＣＲ５は、生体内の各部位にランダムに分布するのではなく、病変部位に迅速かつ効果的に遊走して免疫調節の能力を発揮することができ、一方、ＭＳＣ自体の発現量が低く、増幅継代後に、ＭＳＣがＣＸＣＲ５受容体をほとんど発現しなくなるという問題を解決できる。具体的には、本発明は、ＭＳＣそれ自体の表現型、分化能力及び免疫調節能力に影響を与えずに、ＣＸＣＲ５を過剰発現することにより、ＭＳＣＣＸＣＲ５は生体内で病変部位まで特異的に遊走し、標的治療の目的をより効果的に発揮することができる。特に、本発明によれば、自己免疫疾患の治療方法が最適化され、ＣＸＣＲ５遺伝子で修飾されたＭＳＣを用いて治療することにより、標的性及び有効性が高くなり、ＭＳＣの治療効果がさらに改善される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ＭＳＣＣＸＣＲ５とＭＳＣＥＧＦＰのＣＸＣＲ５発現ｍＲＮＡ及びタンパク質のレベルを示す。
【図２】感作後の右耳（感作）ＣＸＣＬ１３のｍＲＮＡ経時変化図である。
【図３】ＣＨＳマウスモデル構築及び治療の模式図である。
【図４】治療後のマウスの耳の浮腫程度の折れ線グラフである。
【図５】病変部位切片の染色結果を示す。
【図６】ＣＨＳマウスの耳のＭＰＯ活性のヒストグラムである。
【図７】局所組織炎症性サイトカインの発現レベルを示す。
【図８】ＭＳＣＣＸＣＲ５がＩＢＤの炎症反応（結腸の長さ）を著しく軽減することを示す。
【図９】ＭＳＣＣＸＣＲ５がＩＢＤの炎症反応（マウス体重）を著しく軽減することを示す。
【図１０】局所組織炎症性サイトカインの発現レベルを示す。
【図１１】病変部位切片の染色結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明の技術的手段及び利点をより明確にするために、以下、図面及び具体的な実施例により本発明を詳しく説明する。
【００２３】
以下の実施例において、条件が明記されていない実験方法は、一般に、従来の条件又は製造業者が推奨する条件に従う。実施例に記載の「室温」とは、試験を行う操作室の温度をいい、通常２５℃である。
【００２４】
特に明記しない限り、以下の実施例で使用される試薬は、化学若しくは生物学試薬の店又は供給業者から購入することができ、使用される機器も当技術分野における従来の機器である。
【００２５】
実施例１
１、ＭＳＣ培養及び表現型の同定
健康なボランティアから骨髄を２０ｍｌ採取し、１×ＰＢＳと１：１で混合して希釈した後、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅリンパ球分離溶液を用い、密度勾配遠心分離法により骨髄から単核細胞を分離し（２０００ｒｐｍ、３０分間）、収集した単核細胞を１×１０５／ｃｍ２の密度で７５ｃｍ２培養瓶に接種して培養した。Ｌ−ＤＭＥＭ培地を用い、３７℃、５％ＣＯ２の条件下で３日培養した後、懸濁細胞を除去し、培養液を交換して培養を継続した。細胞が８０％密度に増殖した後、培地を吸引除去し、ＰＢＳで２回洗浄し、０．１２５％トリプシンで１−２分間消化し、１：３の割合で継代した。ＭＳＣは、健康なドナーから提供された骨髄から分離して得られたものであり、臨床用ＭＳＣの分離、増幅、凍結保蔵、回復などは、いずれもＧＭＰ（ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）標準を満たす条件下で行なった。倒立顕微鏡下で初代と継代細胞の増殖状況及び形態特徴を毎日観察し、撮影して記録した。インビトロで培養したＭＳＣを取り、単細胞懸濁液に消化し、０．１％ＢＳＡ＋０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で１回洗浄し、上清を取り除き、フローチューブに入れて細胞密度を１０６／ｍｌに調整し、フロー抗体ＣＤ２９、ＣＤ３４、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６でＭＳＣを標識し、十分に振盪して均一に混合した後、４℃、暗所で３０分間インキュベートし、０．１％ＢＳＡ＋０．０５％ＮａＮ３を含むＰＢＳ（ｐＨ７．４）で２回洗浄して過剰な抗体を除去した。上清を捨て、２００ｕｌの１％ＰＦＡで細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーによりＭＳＣ細胞の表現型（ＣＤ２９＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４４＋、ＣＤ４５−、ＣＤ７３＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ１０５＋、ＣＤ１６６＋）を検出した結果、インビトロ培養はＭＳＣ細胞の表現型に影響を与えないことを実証した。
【００２６】
Ｐ２継代細胞を６ウェルプレートに移し、約６０％に増殖させ、使用に備えた。
【００２７】
２、末梢血単核細胞の取得
健康なボランティアから新鮮な末梢血を２０ｍｌ採取し、１×ＰＢＳと１：１で混合して希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅリンパ球分離溶液を用い、密度勾配遠心分離法により分離し、バフィーコートの単核細胞を全部収集し、無菌ＰＢＳと１：４で混合して希釈した。２０００ｒｐｍで、１０分間遠心分離した後、上清を捨てた。さらに十分量のＰＢＳを加えて２回洗浄した。ＲＰＭＩ−１６４０完全培地で細胞を懸濁することにより、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得た。
【００２８】
３、Ｔｒｉｚｏｌ法による末梢血単核細胞ＲＮＡの抽出
得られたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１ｍｌのＴｒｉｚｏｌ溶液に加え、ピペッティングして均一に混合し、細胞を十分に溶解させ、５分間静置した。２００μｌのクロロホルムを加え、水相と有機相とが十分に接触するように２０秒間激しく振盪して均一に混合した後、室温で１５分間静置した。４℃、１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離すると、３層に分離することが分かる。ＲＮＡは上層の水相にあった。新しいＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  ＥＰチューブに慎重に移した。０．５ｍｌのイソプロパノールを加え、均一に軽く混合し、室温で１０分間静置してＲＮＡを沈殿させた。４℃、１２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、ＲＮＡ沈殿を収集し、上清を捨てた。７５％エタノールでチューブ壁を２回洗浄し、クリーンベンチ内で風乾させ、５０μｌのＤＥＰＣ水を加えて沈殿を溶解し、ＮａｎｏＤｒｏｐ超微量分光光度計で濃度を測定した。
【００２９】
４、逆転写
ゲノムＤＮＡの除去：ＲＮＡ（１μｇ）＋ＤＮａｓｅ  Ｉ（１μｌ）＋Ｂｕｆｆｅｒ  ＤＮａｓｅ  Ｉ  ｗｉｔｈ  ＭｇＣｌ２（１μｌ）＋ＤＥＰＣ水（１０μｌ）を３７℃で３０分間インキュベートし、ＥＤＴＡ（１μｌ）を加え、６５℃で１０分間インキュベートし、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）（１μｌ）を加え、６５℃で１０分間インキュベートし、最後に５×Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（５μｌ）、ＲＮａｓｅ−Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（１μｌ）、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（２μｌ）、Ｍ−ＭＬＶ  ＲＴ（１μｌ）、ＲＮａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ（合計２５μｌ）を加え、４２℃で６０分間インキュベートした後、ｃＤＮＡ生成物を収集した。
【００３０】
５、ＰＣＲ反応及びＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡ断片の回収
ＰＣＲ反応：２×Ｓｔａｒ  ｍｉｘ（Ｔａｑ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ｄＮＴＰｓ、Ｍｇ２＋、反応緩衝液及び安定化剤などを含む）１０μｌ、ＤＥＰＣ水７μｌ、上流プライマー１μｌ、下流プライマー１μｌ、ｃＤＮＡ  １μｌ（合計２０ｕｌ）、ＣＸＣＲ５断片サイズ１１１９ｂｐ。ゲルによる回収：鋭いメスで標的断片バンドを切断し、アガロースゲルＤＮＡ回収キットによりゲルを破砕してＰＣＲ標的遺伝子ＣＸＣＲ５の断片を回収した。
【００３１】
ＰＣＲ反応により得られた標的遺伝子ＣＸＣＲ５の断片に用いたプライマーの配列は、
上流プライマー：ＡＴＧＡＡＣＴＡＣＣＣＧＣＴＡＡＣＧＣＴＧＧ（配列番号１）、
下流プライマー：ＣＴＡＧＡＡＣＧＴＧＧＴＧＡＧＡＧＡＧＧＴＧＧＣＡ（配列番号２）である。
【００３２】
６、インビトロｍＲＮＡ転写
ＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡをシームレスクローニング法（Ｙｅａｓｅｎ，１０９１２）によりｐＣＭ−Ｔ７プラスミドに結合し、インビトロ転写に用いるテンプレートｐＣＭ−Ｔ７−ＣＸＣＲ５プラスミドを構築した。または、Ｔ７プロモーター配列及びＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡの５’配列を上流プライマーとし、ＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡの３’配列を下流プライマー（Ｔ７  ｐｒｏｍｏｔｅｒ：  ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ（配列番号３））とし、ＣＸＣＲ５  ｃＤＮＡをテンプレートとし、ＰＣＲ増幅生成物をインビトロ転写のテンプレートとした。構築したｐＣＭ−Ｔ７−ＣＸＣＲ５  プラスミドを線形化（Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ−ＨＦ  ｅｎｚｙｍｅ  ｉｎ  ＮＥＢ  ｃｕｔｓｍａｒｔ  ｂｕｆｆｅｒ；３７℃、６時間）した後、精製して回収し、またはＰＣＲの生成物を精製して回収し（Ｑｉａｇｅｎ）、ＲＮＡｓｅ−ｆｒｅｅ  ｗａｔｅｒで溶解した。
【００３３】
インビトロ転写系：テンプレートとしての５００ｎｇ−１μｇ線形化プラスミド（又はＴ７−ＣＸＣＲ５  ＰＣＲ生成物）、１０×Ｔ７  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、Ｔ７  ２×ＮＴＰ／ＡＲＣＡ、Ｔ７  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｘ（３時間、３７℃、Ａｍｂｉｏｎ  ｋｉｔ：  ＡＭ１３４５）を用いた。３０μｌ系転写生成物用Ａｍｂｉｏｎ  ｋｉｔ：  ＡＭ１９０８で精製し、最終収量は１５−２０ｕｇであった。
【００３４】
７、標的ｍＲＮＡによるＭＳＣの修飾（標的ｍＲＮＡをＭＳＣに導入）
ｈＭＳＣ細胞を８０−９０％コンフルエンスするまで培養した後、０．１２５％トリプシンで消化し、ＰＢＳで３回洗浄し、収集し（細胞数１０６個）、５μｇのＲＮＡ生成物が混合されたＭＳＣ無血清培地５００μｌで細胞を再懸濁し、ｂｉｏｒａｄ０．４ｃｍピッチの電気ショックカップ（３００Ｖ、３００μＦ）に１回電気ショックを与え、常温で３分間放置した後、６ウェルプレートに加え、引き続き２４時間培養した。
【００３５】
８、ＣＸＣＲ５  ｍＲＮＡとタンパク質の発現状況の検出
２４時間後、２群のｍＲＮＡ修飾細胞を収集し、フローサイトメーターにより精製されたトランスジェニック細胞株を選別して増幅させた。
【００３６】
定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ）による感染後のＭＳＣのＣＸＣＲ５発現ｍＲＮＡの含有量の測定
【００３７】
（１）ＲＮＡの抽出と逆転写：手順は実施例１のステップ３、４を参照されたい。
【００３８】
（２）ＰＣＲ増幅反応系
ｃＤＮＡ：１μｌ
ＳＹＢＲ  ｍｉｘ：１０μｌ
１０μＭ上流プライマー：１μｌ
１０μＭ下流プライマー：１μｌ
ｄｄＨ２Ｏ：７μｌ
合計：２０μｌ
反応条件：９５℃、１０分間；３ステップ法、４０サイクル：９５℃１５ｓ、６０℃３０ｓ、７２℃１５ｓ；融解曲線：５５℃−９５℃、１分間１回読み取り。
【００３９】
ＰＣＲ増幅反応系に用いたプライマーは、以下の通りである。
ＧＡＰＤＨ：
上流プライマー：ＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡＧＴＣ（配列番号４）
下流プライマー：ＧＡＡＧＡＴＧＧＴＧＡＴＧＧＧＡＴＴＴＣ（配列番号５）
ＣＸＣＲ５：
上流プライマー：ＣＣＴＴＧＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＧＡＧ（配列番号６）
下流プライマー：ＴＡＡＣＧＣＴＧＧＡＡＡＴＧＧＡＣＣＴＣ（配列番号７）
Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔによる標的ｍＲＮＡで修飾した後のＭＳＣのＣＸＣＲ５発現タンパク質のレベルの検出
【００４０】
（１）タンパク質抽出：培養中のＣＸＣＲ５過剰発現ＭＳＣ（ＭＳＣＣＸＣＲ５）及び対照群ＭＳＣ（ＭＳＣＥＧＦＰ）を取り、氷上に置き、培養液を除去し、予冷したＰＢＳで２回洗浄した後、５％ＤＴＴを含む１×ＳＤＳローディングバッファー（６２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、０．１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルー）を加えた直後、１ｍｌのピペットでピペッティングし（約１０回）、細胞を十分に溶解した。ピペッティング後、液体を１．５ｍＬのＥｐｐｅｎｄｏｒｆ遠沈管に入れ、４℃で超音波で３回破砕し（１秒ごとに１回）、１００℃で５分間煮沸した後、４℃で冷却し、４℃、１５０００ｇで５分間遠心分離し、電気泳動を準備し、又は−８０℃で保存し、使用に備えた。
【００４１】
（２）ゲル電気泳動によるサンプル分離：変性ポリアクリルアミドゲル（ｄｅｎａｔｕｒｅｄ  ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）：分離ゲルを４．１ｍＬ加え、脱イオン水で封止し、明らかな境界面が現れたら、水封止層を捨て、調製した濃縮ゲルを短いガラスブロックの頂端に加えた。櫛を挿入し、ゲル面に不規則な形状が現れたら、ゼラチンが重合したことを示しているので、この場合、櫛を抜き出し、試料を注入することができる。
レーンに１００℃で５分間煮沸した試料１５μＬを順に加え、ＳＤＳ電気泳動緩衝液において定電圧１２０Ｖで約４５分間電気泳動した。
【００４２】
（３）膜転移：電気泳動と同時に、膜転移に必要な材料、例えば、スポンジ、ろ紙、ＰＶＤＦ膜などを膜転移緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｂａｓｅ、０．２Ｍ  ｇｌｙｃｉｎｅ、２０％ｍｅｔｈａｎｏｌ  ｐＨ８．５）に浸漬した。電気泳動終了後、ゲルを取り外し、上の濃縮ゲル部分を除去した。ゲルを膜転移液に入れて１５〜３０分間バランスさせてゲル表面に付着したＳＤＳを除去した。次に、膜転移積層ボックスを組み立てた。具体的には、負極から正極へ、スポンジ、１層のろ紙、ゲル、ＰＶＤＦ膜、一層のろ紙及びスポンジをこの順で取り付け、固定した後、ＰＶＤＦ膜面が正極に向くように転移タンク内に置いた。積層ボックス及びアイスボックスを転移タンク内に入れ、６００ｍＬの転移緩衝液を注入し、定電流２００ｍＡで２時間処理した。
【００４３】
（４）抗原抗体反応
膜転移終了後、ＰＶＤＦ膜を取り外し、２５ｍＬのＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で１０分間洗浄した後、２０ｍＬブロッキング溶液［５％脱脂乳を含む１×ＴＢＳＴ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０  ｉｎ  ＴＢＳ  ）］に移し、室温で１時間振盪してブロックし、対応する５％（ｗ／ｖ）脱脂乳で希釈した一次抗体希釈液を加えた。４℃で一晩軽く振盪した。翌日に、１×ＴＢＳＴで膜を５分間／回で３回洗浄し、その後、ブロッキング溶液で希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）標識二次抗体（１：２０００）を１５ｍＬ加え、室温で１時間振盪した。その後、１×ＴＢＳＴで１０分間／回で３回膜を洗浄し、暗室内で現像、定着した。具体的には、ＥＣＬキットＡ、Ｂ液で作業液を調製し、ＰＶＤＦ膜の表面に均一に塗布し、１分間インキュベートした後、できるだけ膜表面の反応残液を除去し、Ｘ線感光ボックス内でラップで膜を固定し、Ｘ線フィルムを入れて適度に露出し、Ｘ線フィルムを取り出して現像液中で１分間反応させ、現像したフィルムを清水中で複数回洗浄し、さらに定着液中で１分間反応させた後、清水冲で洗浄し、乾燥させた。
【００４４】
結果を図１に示す。ＭＳＣＣＸＣＲ５はタンパク質ＣＸＣＲ５を発現し、ＭＳＣＥＧＦＰはＣＸＣＲ５を低発現し、両者はいずれも緑色蛍光タンパク質ＥＧＦＰを発現した。ＭＳＣの特異的な遊走能力に対するＣＸＣＲ５の影響を検討するために、ＣＸＣＲ５を過剰発現するプラスミド及び対照群プラスミドを構築した。ＣＸＣＲ５を過剰発現するＭＳＣはＭＳＣＣＸＣＲ５、対照群ＭＳＣはＭＳＣＥＧＦＰと記す。ＭＳＣＥＧＦＰに比べて、ＭＳＣＣＸＣＲ５細胞はＣＸＣＲ５のｍＲＮＡ及びタンパク質レベルを大幅に向上させた（図１）。
【００４５】
実施例２：ＤＮＦＢ誘導マウス接触過敏反応
ＤＮＦＢ（２，４−ｄｉｎｉｔｒｏ−１−ｆｌｕｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ、２，４−ジニトロ−１−フルオロベンゼン）誘導マウス接触過敏反応モデルの構築は以下の通りである。
１、６−８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウス、１６−１８ｇ、ＳＰＦ環境で飼育。
【００４６】
２、試薬調製
（１）ＤＮＦＢ前感作溶液
混合液（アセトン：オリーブオイル４：１）を調製し、激しく振盪して均一に混合した。
前感作混合液の調製：混合液を用いて０．５％のＤＮＦＢ混合液、即ち、前感作混合液を調製した。
（２）ＤＮＦＢ感作溶液：混合液を用いて０．２％のＤＮＦＢ混合液、即ち、感作混合液を調製した。
【００４７】
３、前感作：１日目に、電気シェーバーを用いてマウス背部の頭部に近い皮膚において１．５×１．５ｃｍ領域を剃り、２０μのｌ０．５％ＤＮＦＢ前感作混合液を剃った皮膚に塗布し、処理した後、規定通りに飼育した。
【００４８】
４、感作：５日目に、０．２％のＤＮＦＢ混合液をマウスの耳の両面にそれぞれ１０μｌ塗布した。
【００４９】
５、動物を８匹／群で４群に分けた。
（１）ブランク対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）群
（２）モデル（ＣＨＳ）群
（３）ＭＳＣＥＧＦＰ治療（ＣＨＳ＋ＭＳＣＥＧＦＰ）群
（４）ＭＳＣＣＸＣＲ５治療（ＣＨＳ＋ＭＳＣＣＸＣＲ５）群
モデル構築後の２日目に、ＣＨＳ＋ＭＳＣＥＧＦＰ群にＭＳＣＥＧＦＰを静脈注射し（１×１０６個の細胞／匹）、ＣＨＳ＋ＭＳＣＣＸＣＲ５群にＭＳＣＣＸＣＲ５を静脈注射した（１×１０６個の細胞／匹）。
【００５０】
６、治療後の１、２、３、４、５目のマウスの耳の厚さを記録し、マイクロメーターで測定した。
【００５１】
結果
１、感作後、マウスの右耳（感作）に炎症が生じた後、ケモカインＣＸＣＬ１３のｍＲＮＡは上昇し続け（図２）、耳の厚さは徐々に厚くなり、浮腫程度はひどくなった。
【００５２】
２、図３に示すように、５日前（−５日目）に、２０μｌの０．５％ＤＮＦＢ前感作混合液を背部に塗布し、０日目に、マウスの右耳に感作し、感作後の２日目に、ＣＸＣＬ１３の分泌が増加し、マウス尾静脈にＭＳＣを注射して治療した。
ＣＨＳ＋ＭＳＣＥＧＦＰ群：ＭＳＣＥＧＦＰを静脈注射した（１×１０６個の細胞／匹）。
ＣＨＳ＋ＭＳＣＣＸＣＲ５群：ＭＳＣＣＸＣＲ５を静脈注射した（１×１０６個の細胞／匹）。
対照群：ＰＢＳを注射した。
【００５３】
３、治療後の１、２、３、４、５日目のマウスの耳の厚さを記録し、マイクロメーターで耳の外縁の厚さを測定し、毎日、同じオペレータが同じ時刻に３回測定し平均値を算出した。結果を図４に示す。ＣＨＳ＋ＭＳＣＣＸＣＲ５群は、マウスの耳の厚さの減少速度が最も速く、治療効果が最も高かった。ＣＨＳ＋ＭＳＣＥＧＦＰ群の治療効果は、ＣＨＳ群とＣＨＳ＋ＭＳＣＣＸＣＲ５群の間であった。
【００５４】
４、切片染色によりマウスの耳のＭＳＣの数を観察
凍結切片：マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、各実験群マウスの耳を取り、耳体積の１０倍のパラホルムアルデヒドで６時間固定した後、３０％ショ糖に移して脱水し、４℃で一晩放置し、ＯＣＴで固定し、凍結切片作製装置を用いて−２０℃で７μｍの切片を作製した。
【００５５】
免疫蛍光染色：切片を６０℃で３０分間乾燥させ、ＯＣＴを剥がし、０．０１ＭのＰＢＳで５分間×３回溶出し、免疫組織化学用パップペンで組織がある部分の周囲にサークルを作り、ヤギ血清を滴下し、３０分間ブロッキングし、一次抗体を加え、４℃で一晩インキュベートし、室温で３０分間静置し、０．０１ＭのＰＢＳで５分間×３回溶出し、二次抗体を加え、３０分間静置し、０．０１ＭのＰＢＳで５分間×３回溶出し、ＤＡＰＩを加え、１０分間静置し、０．０１ＭのＰＢＳで５分間×３回溶出し、切片をブロッキングした。
【００５６】
図５から分かるように、治療後、ＭＳＣＣＸＣＲ５群の耳の厚さは、ＭＳＣＥＧＦＰ群の耳の厚さよりも著しく薄く、ＭＳＣＣＸＣＲ５群の耳のＭＳＣの数は、ＭＳＣＥＧＦＰ群よりも著しく多い。これは、ＭＳＣＣＸＣＲ５が、炎症部位まで特異的に遊走できることを示している。
【００５７】
５、局所炎症細胞の浸潤−ミエロペルオキシダーゼ（ｍｙｅｌｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ，ＭＰＯ）検出
ミエロペルオキシダーゼは、ペルオキシダーゼとも呼ばれ、ヘム補欠分子のヘムプロテアーゼであり、ヘムペルオキシダーゼスーパーファミリーのメンバーである。ミエロペルオキシダーゼは、好中球に特有であり、強い食作用を有するマクロファージには、このような酵素は極めて少ないか、又は全くない。細胞化学において、一般的に、このミエロペルオキシダーゼを好中球の標識とし、各細胞に含まれる酵素の重量は一定であり、細胞乾燥重量の５％を占める。この酵素は、過酸化水素を還元する能力を有し、この特徴を利用して酵素活性を分析し、好中球の数を定量的に測定することができる。
【００５８】
ＭＰＯ検出：測定サンプル−各群マウスの耳を用意し、重量を測り、キットにおける試薬をホモジネートメディアとして、重量体積比１：１９でホモジネートメディアを加えて５％の組織ホモジネートを調製し、その後、キットの手順に従ってＭＰＯ活性を検出した。結果を図６に示す。ＣＨＳ＋ＭＳＣＣＸＣＲ５群のＭＰＯ活性は、ＣＨＳ＋ＭＳＣＥＧＦＰ群及びＣＨＳ群よりも著しく低い。
【００５９】
結果から分かるように、ＭＳＣＣＸＣＲ５群の好中球の浸潤はＭＳＣＥＧＦＰ群よりも著しく低く、ＭＳＣＣＸＣＲ５は炎症部位まで特異的に遊走し、免疫機能を発揮し、炎症性浸潤を軽減できることを示している。
【００６０】
６、局所炎症性サイトカインの分泌
ＥＬＩＳＡ検出：９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１×ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで２回洗浄し、標準物質、測定試料を１００ｕｌ／ウェルで加え、室温、暗所で２時間インキュベートし、液体を捨て、１×ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、検出抗体を１００ｕｌ／ウェルで加え、室温、暗所で１時間インキュベートし、液体を捨て、１×ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、過剰な抗体を除去し、酵素コンジュゲート作業液を１００ｕｌ／ウェルで加え、室温、暗所で３０分間インキュベートし、液体を捨て、１×ｗａｓｈｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒで５回洗浄し、表示基質を５０ｕｌ／ウェルで加え、暗所で２０分間インキュベートし、停止液を５０ｕｌ／ウェルで加え、均一に混合した後、マイクロプレートリーダーで４５０ｎｍのＯＤ値を測定した。
【００６１】
図７の結果から分かるように、ＣＨＳ＋ＭＳＣＣＸＣＲ５群の局所の炎症性サイトカインＴＮＦα及びＩＦＮγの浸潤は、ＣＨＳ＋ＭＳＣＥＧＦＰ群及びＣＨＳ群よりも著しく低く、ＭＳＣＣＸＣＲ５は炎症部位まで特異的に遊走し、免疫機能を発揮し、炎症性浸潤を軽減できることを示している。
【００６２】
実施例３：ＴＮＢＳ誘導マウス炎症性腸疾患モデル
ＴＮＢＳ（２，４，６−ＴｒｉｎｉｔｒｏｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃＡｃｉｄ、２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸）誘導マウス炎症性腸疾患モデルの構築は、以下の通りである。
１、ＩＢＤ動物の準備
（１）マウス種類の選択：ＢＡＬＢ／ｃ
（２）マウスの週齢：６週
（３）右側背中部の毛を２ｃｍ２剃った。
（４）ピクリン酸でマウスを標識した。
【００６３】
２、試薬の準備
（１）アセトンとオリーブオイルを４：１で混合して混合液を調製した。
（２）２，４，６−トリニトロベンゼンスルホン酸（ＴＮＢＳ）を混合液に溶解し、感作剤を調製した。
（３）４％抱水クロラール。
【００６４】
３、ＩＢＤモデル構築
（１）４％抱水クロラールでマウスを軽度に麻酔した。
（２）電気シェーバーで背中の２×２ｃｍの領域を剃り、１５０μｌのＴＮＢＳ前感作混合液を塗布した。
（３）規定通りに６日間飼育し、７日目に２４時絶食させた。
（４）８日目に、４％抱水クロラールでマウスを軽く麻酔し、体重を測った。直径約２ｍｍのシリコーンチューブをゆっくりとマウス肛門に挿入し、４ｃｍ入ったときに、注射器で１００μｌのＴＮＢＳ混合液をゆっくりと注入し（操作前に排気する必要がある）、対照群に対して同じ方法で１００μｌの５０％エタノールを注入した。シリコーンチューブをゆっくりと引き出し、感作溶液をゆっくりと結腸に流入させるために、マウスを約１分間倒置した。
（５）マウスの状態を観察し、規定通りに飼育した。
（６）マウスの症状、体重などの指標を毎日観察した。
【００６５】
４、動物を４群に分けた（８匹／群）。
（１）ブランク対照（Ｃｏｎｔｒｏｌ）群
（２）モデル（ＣＨＳ）群
（３）ＭＳＣＥＧＦＰ治療（ＣＨＳ＋ＭＳＣＥＧＦＰ）群
（４）ＭＳＣＣＸＣＲ５治療（ＣＨＳ＋ＭＳＣＣＸＣＲ５）群
モデル構築後の２日目に、ＣＨＳ＋ＭＳＣＥＧＦＰ群にＭＳＣＥＧＦＰを静脈注射し（１×１０６個の細胞／匹）、ＣＨＳ＋ＭＳＣＣＸＣＲ５群にＭＳＣＣＸＣＲ５を静脈注射した（１×１０６個の細胞／匹）。
【００６６】
結果
１、病変部位に遊走したＭＳＣＣＸＣＲ５がＩＢＤの炎症反応を軽減できるか否かを検討するために、ＭＳＣＣＸＣＲ５及びＭＳＣＥＧＦＰを発症ピーク期（発症後の２日目）に尾静脈からＩＢＤマウス（１×１０６／匹）に注入し、２４時間ごとにマウス体重を記録し、疾患が改善されたときに結腸の長さを測定した。
結腸の長さが短くなったのは、結腸が炎症反応により浮腫、拘縮したからである。細胞注入後２日目に、図８に示すように、ＭＳＣＣＸＣＲ５治療後の結腸の長さは、ＭＳＣＥＧＦＰ群及びＩＢＤ群よりも著しく長く、ＭＳＣＥＧＦＰ群とＩＢＤ群との違いは大きくない。
【００６７】
２、ＭＳＣＣＸＣＲ５群では、治療後のマウス結腸の炎症症状は軽減し、具体的には、体重減少はＭＳＣＥＧＦＰ群及びＩＢＤ群よりも小さく、ＭＳＣ注入後から体重が増加し、ＭＳＣＥＧＦＰ群では、体重上昇は比較的遅く、ＩＢＤ群では、体重は発症から減少傾向にあった（図９）。
【００６８】
３、ＩＢＤ病変組織の炎症状況を検討するために、各群マウスの結腸組織を取り、局所炎症性サイトカインのｍＲＮＡレベルを検出した。ＭＳＣＣＸＣＲ５群の炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１β）のレベルは、ＩＢＤ群よりも著しく低く、ＭＳＣＥＧＦＰ群はＩＢＤ群よりも僅かに低かった（図１０）。
【００６９】
４、切片染色によりマウス結腸のＭＳＣの数を観察
凍結切片：マウスを頸椎脱臼により安楽死させ、各実験群マウスの結腸を取り、結腸体積の１０倍のパラホルムアルデヒドで６時間固定した後、３０％ショ糖に移して脱水し、４℃で一晩放置し、ＯＣＴで固定し、凍結切片作製装置を用いて−２０℃で１０μｍの切片を作製した。
【００７０】
免疫蛍光染色：切片を６０℃で３０分間乾燥させ、ＯＣＴを剥がし、０．０１ＭのＰＢＳで５分間×３回溶出し、免疫組織化学用パップペンで組織がある部分の周囲にサークルを作り、ヤギ血清を滴下し、３０分間ブロッキングし、一次抗体を加え、４℃で一晩インキュベートし、室温で３０分間静置し、０．０１ＭのＰＢＳで５分間×３回溶出し、二次抗体を加え、３０分間静置し、０．０１ＭのＰＢＳで５分間×３回溶出し、ＤＡＰＩを加え、１０分間静置し、０．０１ＭのＰＢＳで５分間×３回溶出し、切片をブロッキングした。
【００７１】
図１１から分かるように、治療後、ＭＳＣＥＧＦＰ群では、比較的明確な腸粘膜層が観察され得るが、粘膜下層には依然として比較的多くの細胞浸潤がある。ＭＳＣＣＸＣＲ５群では、ＭＳＣが病巣部位に遊走し、腸粘膜の構造がはっきりと見え、粘膜下層における炎症性細胞浸潤の数は少ない。
【００７２】
以上の実施例は、本発明の技術内容を説明するためのものに過ぎず、本発明の保護範囲を制限するものではない。好ましい実施例により本発明を詳しく説明したが、当業者であれば、本発明の技術内容の趣旨及び範囲から逸脱しない限り、本発明の技術内容に修正又は同等の変更を行うことができる。
【図１】
2020533981.tif 000003
【図２】
2020533981.tif 000004
【図３】
2020533981.tif 000005
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020533981.tif 000009
【図８】
2020533981.tif 000010
【図９】
2020533981.tif 000011
【図１０】
2020533981.tif 000012
【図１１】
2020533981.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月22日(2020.4.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020533981000001.app
【国際調査報告】
2020533981.tif 000014
2020533981.tif 000015
2020533981.tif 000016
2020533981.tif 000017