(57)【要約】  試料が無収差固体浸漬レンズの平面の上にまたは平面に隣接して配置されて極低温環境に置かれる超解像光学顕微鏡法技術を記載する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に対して超解像光学顕微鏡法を実行する方法であって、
平面を有する無収差固体浸漬レンズを提供することと、
前記無収差固体浸漬レンズの前記平面の上にまたは前記平面に隣接して前記試料を配置することと、
前記試料を極低温環境に配置することと、
超解像光学顕微鏡法技術を用いて前記無収差固体浸漬レンズを介して前記試料を撮像して、前記試料の超解像画像を提供することとを備える、方法。
【請求項２】
前記極低温環境は、２００ケルビン未満の温度の環境、１００ケルビン未満の温度の環境、液体窒素を用いて維持される環境、および窒素蒸気を用いて維持される環境のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料は前記無収差固体浸漬レンズに接触している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記超解像光学顕微鏡法技術は、単一分子局在化光学顕微鏡法技術である、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記単一分子局在化光学顕微鏡法技術は、
発光体で前記試料をラベリングすることと、
複数の発光の各々を別個に検出することとを備え、各発光は前記発光体のうちの１つからであり、前記発光は、前記試料が前記極低温環境に配置されている間に前記無収差固体浸漬レンズを介して検出器において受光され、前記単一分子局在化光学顕微鏡法技術はさらに、
別個に検出された前記発光から前記試料の前記超解像画像を構築することを備える、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記発光体は、有機染料、蛍光タンパク質および量子ドットなどの蛍光体を備える、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
各蛍光体は、前記試料の分子に結合する蛍光体分子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記単一分子局在化光学顕微鏡法技術は、確率的光学再構築顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）技術、光活性化局在性顕微鏡法（ＰＡＬＭ）技術、構造化照明顕微鏡法技術、および誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡法技術のうちの１つ以上である、請求項４から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
超解像顕微鏡法技術を用いて前記試料を撮像することは、前記平面において前記無収差固体浸漬レンズの内部の全内部反射を受けるプローブ光を用いて前記試料を照らすことを備える、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記無収差固体浸漬レンズのアレイを提供することと、
各試料を、前記無収差固体浸漬レンズのうちの対応する１つのレンズの平面の上にまたは前記平面に隣接して配置し、前記試料を極低温環境に配置することと、
超解像光学顕微鏡法技術を用いて、隣接するそれぞれの前記無収差固体浸漬レンズを介して各試料を連続的に撮像することとによって、試料のアレイに対して超解像光学顕微鏡法を実行することを備える、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記無収差固体浸漬レンズのアレイは、基板構造と一体形成された、または基板構造に接合された前記無収差固体浸漬レンズを備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基板構造を含む前記無収差固体浸漬レンズのアレイは、単一の材料片からの機械加工によって形成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記または各無収差固体浸漬レンズの上のまたは前記レンズに隣接した前記または各試料は、超解像撮像の前にクライオスタット内に装填される、前述の請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記または各試料を超解像撮像のために前記極低温環境で維持するために、液体または気体寒剤がクライオスタットに入れられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記または各試料は、超解像撮像のためにガラス化状態で維持される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
相関撮像の方法であって、
前述の請求項のいずれか１項に記載のステップを実行して前記または各試料の超解像光学画像を提供するステップと、
前記または各試料に対して電子顕微鏡法またはＸ線顕微鏡法を実行して前記または各試料のさらなる画像を提供するステップと、
各試料の前記超解像光学画像と前記さらなる画像とを相関付けて前記試料の相関画像を提供するステップとを備える、方法。
【請求項１７】
前記電子顕微鏡法またはＸ線顕微鏡法は前記超解像光学撮像の後に実行される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記電子顕微鏡法またはＸ線顕微鏡法技術は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、および軟Ｘ線顕微鏡法のうちの１つである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
試料に対して超解像光学顕微鏡法を実行するための装置であって、
平面を有する無収差固体浸漬レンズと、
前記無収差固体浸漬レンズの平面の上のまたは前記平面に隣接した試料と、
前記試料が配置される極低温環境と、
前記試料の超解像光学画像を提供するように配置された超解像光学顕微鏡とを備える、装置。
【請求項２０】
前記超解像光学顕微鏡は、前記平面において前記無収差固体浸漬レンズの内部の全内部反射を用いて前記試料を照らして撮像するように配置される、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
極低温超解像光学顕微鏡法で用いる無収差固体浸漬レンズのアレイであって、前記アレイは、基板と一体形成された、または基板に接合された複数の無収差固体浸漬レンズを備える、アレイ。
【請求項２２】
前記基板の平面は、前記無収差固体浸漬レンズの各々の光学平面を提供する、請求項２１に記載のアレイ。
【請求項２３】
各無収差固体浸漬レンズの前記平面の上にまたは前記平面に隣接して別個の試料が提供される、請求項２１または２２に記載の無収差固体浸漬レンズのアレイを備える、請求項１９または２０に記載の装置。
【請求項２４】
複数の試料に対して超解像光学顕微鏡法を実行する際に用いるクライオスタットであって、前記クライオスタットは、請求項２１から２３のいずれか１項に記載の無収差固体浸漬レンズのアレイを受けるように配置されたフレームを備え、前記無収差固体浸漬レンズの前記アレイは前記クライオスタットの床を形成し、前記レンズは外側を向き、前記試料は前記クライオスタットの内部に配置される、クライオスタット。
【請求項２５】
請求項２１から２３のいずれか１項に記載の無収差固体浸漬レンズのアレイと組合された、かつ請求項１９または２０に記載の装置と組合された、請求項２４に記載のクライオスタット。
【請求項２６】
前記または各試料はガラス化された試料である、請求項１９から２５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２７】
前記極低温環境は、２００ケルビン未満の温度の環境、１００ケルビン未満の温度の環境、液体窒素を用いて維持される環境、および窒素蒸気を用いて維持される環境のうちの少なくとも１つである、請求項１９から２６のいずれか１項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、たとえば単一分子局在化技術を用いて試料に対して超解像顕微鏡法を実行するための方法および装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
導入
従来の顕微鏡法の解像度は光の回折のために制限され、達成可能な空間解像度はアッベ回折限界によって近似的に定まる。したがって、達成可能な空間解像度は対物レンズの開口数などの光学パラメータに依存しており、これは、高屈折率の液体を用いて対物レンズを撮像される試料に光結合させる液浸技術を用いることによるなどのさまざまな方法で高めることができる。
【０００３】
光学構成を変更する以外に光学撮像系の空間解像度限界を克服するためのその他のさまざまな技術も先行技術において開発されており、一般に超顕微鏡法の技術と称され得る。そのような技術として、たとえば、発光体を分離し、点広がり関数を用いてそれらの位置を適合させる単一分子局在化技術がある。
【０００４】
そのような超解像顕微鏡法技術は、たとえばガラス化した生物試料を正確に撮像できるように、極低温で実行することが望ましい場合が多い。したがって本発明は先行技術のこれらのおよび他の局面に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
発明の概要
極低温で超解像顕微鏡法技術の解像度をさらに向上させることは、湿式浸漬対物レンズを用いる困難さのためにさらに困難になることがわかっている。というのも、通常の顕微鏡法の湿式浸漬に用いられる流体はそのような低温に適していないためである。したがって本発明は、極低温で超解像顕微鏡法において固体浸漬レンズを用いることを提案する。有利には、この目的のために無収差固体浸漬レンズを用いることによって、湿式対物浸漬流体を用いる困難さを伴わずに、選択された超解像顕微鏡法技術を用いて得られる解像度をさらに高めることができる。
【０００６】
本発明は、たとえば単一分子局在化顕微鏡法技術などの超解像技術に適用可能である。提案する固体浸漬レンズは、対物−固体浸漬レンズ系の開口数を高めることによって、顕微鏡法技術の利用可能な解像度を向上させる。
【０００７】
極低温での単一分子局在化顕微鏡法技術またはその他の超解像光学顕微鏡法技術と無収差固体浸漬レンズとをこのように組合せることによって、数十ナノメートルの画像解像度を極低温状態で達成することができ、したがって、相関撮像動作において同様の解像度で同じ試料の電子顕微鏡法画像と組合せるのに好適な画像解像度が提供される。これら２つの技術同士の間のこのような相関撮像は、ガラス化技術を用いてほぼ天然状態に保存されている生物試料を撮像する際に特に有利であり得る。
【０００８】
本発明はさらに、そのようなレンズのアレイを利用して上述の無収差固体浸漬レンズを用いて高スループット撮像を提供し、そのようなアレイは、必要であれば、相関撮像処理の超解像ステージおよび電子顕微鏡ステージの双方で用いられる。
【０００９】
したがって本発明は、試料に対して超解像顕微鏡法を実行する方法であって、無収差固体浸漬レンズを提供することと、無収差固体浸漬の上にまたはそれに隣接して試料を提供または配置することと、試料を極低温環境に配置することと、超解像顕微鏡法技術を用いて無収差固体浸漬レンズを介して試料を撮像することとを含む方法を提供する。このように、試料の超解像画像は典型的にデジタルデータとして生成され得、当該デジタルデータは、そのような画像の画素を表わしており、典型的に乾式対物レンズとともに、試料の光学撮像のために用いられる無収差固体浸漬レンズを含む光学配置の回折限界よりも大きい解像度を有する。試料は特に、固体浸漬レンズの平面状の切頭面に配置され得る。切頭面はその他の場合は、典型的に精密なジオメトリを有する反対の球面によって規定される。
【００１０】
典型的に、試料は、無収差固体浸漬レンズの平面上に接触して配置されることになる。
極低温環境は、たとえば２００ケルビン未満の温度、もしくは１００ケルビン未満の温度などの１つ以上の温度の範囲もしくは限界によって規定されてもよいし、または、たとえば試料に近接もしくは接触している液体窒素もしくは窒素蒸気などの寒剤を用いて当該環境が作成および維持される方法によって規定されてもよい。無収差固体浸漬レンズは、試料および無収差固体浸漬レンズが極低温環境を維持するためにクライオスタットまたは他の配置に関してどのように配置および装着されるかに依存して、部分的にまたは完全に極低温環境内にあってもよい。
【００１１】
本発明を実現するためにさまざまな超解像顕微鏡法技術が用いられ得るが、特に単一分子局在化顕微鏡法技術であってもよい。そのような技術は、たとえば、蛍光体などの発光体で試料をラベリングすることと、発光体からの複数の発光の各々を別個に検出することとを含んでもよく、発光は、試料が極低温環境に配置されている間に無収差固体浸漬レンズを介して検出器において受光され、上記技術はさらに、検出された発光から試料の超解像画像を構築することを含んでもよい。たとえば、試料の画像内に検出された各発光は、顕微鏡配置の回折限界によって定まる精度よりも高い精度まで発光体の位置を求めるために、点広がり関数に適合されてもよい。典型的に試料の多数の画像が経時的に撮像されて十分な密度の検出発光が蓄積される。
【００１２】
そのような方法では、各蛍光体は典型的に、試料調製中に試料の分子に結合する蛍光体分子である。細胞および細胞小器官などの生物試料とともに用いられ得る典型的な蛍光体としてAlexa FluorまたはAtto染料がある。
【００１３】
特に、単一分子局在化顕微鏡法技術は、先行技術では一般にＳＴＯＲＭ技術と称される確率的光学再構築顕微鏡法技術であってもよい。
【００１４】
超解像光学顕微鏡法技術を用いて試料を撮像することは、平面において無収差固体浸漬レンズの内部の全内部反射を受けるプローブ光を用いて試料を照らすことを含んでもよい。このように、撮像される試料の部分は、平面に対する深さが数十ナノメートルに、たとえば１００ｎｍに限定されてもよい。
【００１５】
本発明の方法は、無収差固体浸漬レンズのアレイを単一ユニットとして扱うことができるように提供することによって、試料のアレイに対してそのような超解像顕微鏡法を実行することを含んでもよい。典型的に、アレイは、たとえばレンズおよび基板の両方を含む単一の材料片からのミリングもしくは鋳造によってまたは当該単一の材料片として、平面基板などの基板と一体形成された無収差固体浸漬レンズを含むことになるが、レンズは好適なサブレンズ部品を好適な平面基板に接合または結合することによって形成されてもよい。
【００１６】
本発明は次に、各試料を、無収差固体浸漬レンズのうちの対応する１つのレンズの平面の上にまたは平面に隣接して配置または装着し、このように装着された試料を極低温環境に配置することと、超解像顕微鏡法技術を用いて、隣接するそれぞれの無収差固体浸漬レンズを用いて複数の試料の各々を撮像することとによって実現されてもよい。典型的に、複数の試料の各々は連続的に撮像されることになるが、配置によっては同時並列撮像が可能な場合もある。
【００１７】
個々の無収差固体浸漬レンズを用いるか、アレイ内のそのようなレンズを用いるかに係わらず、当該または各無収差固体浸漬レンズの上のまたは当該レンズに隣接した当該または各試料は、超解像撮像の前にクライオスタット内に装填されてもよい。次に、当該または各試料を超解像撮像のために極低温環境で維持するために、寒剤がクライオスタットに入れられてもよい。当該または各試料は、たとえば、生物試料が以下に記載するような相関電子顕微鏡法または軟Ｘ線技術を用いて撮像された場所またはさらには撮像予定の場所などでそのような試料の撮像の改善をもたらすために、超解像撮像用にガラス化されてもよいし、またはガラス化状態で維持されてもよい。
【００１８】
したがって本発明はさらに、相関撮像の方法であって、上述のステップを実行して当該または各試料の超解像光学画像を提供するステップと、当該または各試料に対して電子顕微鏡法またはＸ線顕微鏡法を実行して当該または各試料の電子顕微鏡法またはＸ線画像を提供するステップと、各試料の超解像光学画像と電子顕微鏡法画像とを組合せるまたは整列させるまたは相関付けることによって試料の１つまたは複数の相関画像を提供するステップとを含む方法を提供する。
【００１９】
電子顕微鏡法は典型的に超解像光学撮像の後に実行され得るが、代わりにその前に実行されてもよい。電子顕微鏡法技術は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）または走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）などの多くの利用可能な技術のうちの１つであってもよい。軟Ｘ線顕微鏡法技術を用いて相関光学画像およびＸ線画像を生成してもよい。当該または各試料は、電子またはＸ線顕微鏡法のためにガラス化状態で維持されてもよい。
【００２０】
本発明はさらに、本明細書に記載の方法に対応および関連する装置、たとえば試料に対して超解像顕微鏡法を実行するための装置であって、平面状の切頭面を有する無収差固体浸漬レンズと、平面の上にまたは平面に隣接して配置された試料と、試料が配置される極低温環境と、試料の超解像画像を提供するように配置された超解像光学顕微鏡とを含む装置を提供する。
【００２１】
本発明はさらに、極低温超解像顕微鏡法で用いる無収差固体浸漬レンズのアレイであって、基板と一体形成されたまたは基板に接合された複数の無収差固体浸漬レンズを含むアレイを提供する。典型的に、基板の平面は、試料が配置される予定の無収差固体浸漬レンズの各々の光学平面を提供してもよく、各無収差固体浸漬レンズの平面の上にまたは平面に隣接して別個の試料が提供されてもよい。
【００２２】
本発明はさらに、複数の試料に対して超解像顕微鏡法を実行する際に用いるクライオスタットであって、上述のように、基板上に配置されたまたは基板と一体形成された無収差固体浸漬レンズのアレイを受けるように配置されたフレームを含み、無収差固体浸漬レンズのアレイがクライオスタットの床を形成するように構成されたクライオスタットを提供する。そして、典型的に、各レンズの球面はクライオスタットから外側にまたは下方に向くかまたは突出し、試料はクライオスタットの内部に配置される。次にクライオスタットに液体窒素などの寒剤が流されて、試料が顕微鏡法プロセスのために必要な極低温環境に維持され得る。
【００２３】
添付の図面を参照して、本発明の実施形態を一例としてのみ以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】極低温環境に配置された試料に対して超解像顕微鏡法を実行するための装置の概略図である。
【図２Ａ】図１の配置で用いる無収差固体浸漬レンズのアレイを示す図である。
【図２Ｂ】図１の配置で用いる無収差固体浸漬レンズのアレイを示す図である。
【図３】図１の配置で用いる無収差固体浸漬レンズのアレイを受けるためのクライオスタットを示す図である。
【図４】図１の光学配置がどのように提供され得るかをより詳細に示す図である。
【図５】上述の無収差固体浸漬レンズおよび対物レンズを整列させるための光学配置を示す図である。
【図６】相関撮像のための方法のフローチャートを提供する図である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
実施形態の詳細な説明
以下に図１を参照して、極低温環境１２で試料１０に対して超解像光学顕微鏡法を実行するための装置が示されている。試料１０は、無収差固体浸漬レンズ１４（ＡＳＩＬ）の平面に隣接してまたは接触して配置される。１つ以上の光源１６を用いてプローブ光が形成される。プローブ光は典型的にプローブ光光学部品１８を用いて調整または制御されてから、たとえばビームスプリッタ２２によって対物レンズ２０に送られる。対物レンズ２０は、プローブ光を試料に送達するために、かつ試料から画像光を収集してＣＣＤまたはＣＣＤカメラなどの１つ以上の撮像素子２４に送るために、ＡＳＩＬ１４に向けられている。ＡＳＩＬを介した試料１０から１つ以上の撮像素子２４までの画像光の経路は、ビームスプリッタ２２および画像光光学部品２６を介してもよい。
【００２６】
少なくとも試料１０が極低温環境内に含まれているが、以下により詳細に記載するように、ＡＳＩＬ１４の一部またはすべてが都合よく極低温環境内に含まれていてもよい。極低温環境は、試料が２００ケルビン未満、１００ケルビン未満の温度であるようなものであってもよいし、あるいは、液体窒素または別の寒剤、たとえば試料１０および／またはＡＳＩＬ１４に近接または接触しているそのような寒剤などを用いて維持されることによって規定されてもよい。
【００２７】
試料１０は、たとえば、１つ以上の細胞、細胞小器官、または薄膜などの、生物材料もしくはその他の材料からなるまたは当該材料を含む薄い試料または膜であってもよい。あるいは、試料は、たとえば量子ドットを含む検査される無機材料の塊などの、生物材料または非生物材料で形成された素子などの厚い試料素子の表面領域によって提供されてもよい。試料は図１に示されるようにＡＳＩＬに接触していてもよいし、またはＡＳＩＬの表面から僅かに、典型的に１００ｎｍ離れていてもよい。
【００２８】
図１の配置を用いて、極低温環境１２で試料１０に対して超解像顕微鏡法が実行される。超解像顕微鏡法を用いて、使用する光学配置の回折限界を超える試料の画像解像度が達成される。たとえば図１の配置では、超解像顕微鏡法を用いて、対物レンズ２０およびＡＳＩＬ１４を含む配置の回折限界を超える。
【００２９】
多種多様な超解像顕微鏡法技術が用いられ得るが、当該技術は典型的に単一分子局在化技術であってもよい。典型的にそのような技術では、撮像素子を用いて試料を何度も連続的に撮像し、試料内の小さいまたは異なる分子のサブセットのみが各画像に表わされる。このように、単一スポットとして見える個々の分子を各画像で別個に識別することができるので、たとえば、予想される点広がり関数の曲線を各分子の検出画像に適合させてから、対応する重心を求めることによって、個々の分子の場所を光学配置の回折限界よりも良好な位置精度まで特定することができる。この処理を複数のそのような画像について繰返すことによって、解像度がはるかに高い試料の画像を構築することができる。本来、天然状態で時間分解的に撮像可能な分子は、たとえば量子ドットおよび蛍光タンパク質などほんの数種類しかない。大半の試料は、照明時に輝度が変動する蛍光発光体でラベリングされる追加工程を必要とする。
【００３０】
いくつかのそのような技術では、試料の個々の分子はたとえば蛍光発光体などの発光体でラベリングされ得、それらの発光体の小さいサブセットのみが各画像で発光しているように当該発光体による間欠的な蛍光イベントを生じさせるように、プローブ光が用いられて制御される。いくつかの特定の実施形態では、超解像顕微鏡法技術は、ＳＴＯＲＭと称されることが多い確率的光学再構築顕微鏡法技術であってもよい。本発明での使用に好適なそのようなＳＴＯＲＭ技術のいくつかの特定の実現例は、Bo Huang et al., Science 319, 810 (2008), "Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy"およびDoory Kim et al.,PLos ONE 10(4): e0124581, April 2015, "Correlative stochastic optical reconstruction microscopy and electron microscopy"に記載されている。
【００３１】
そのような蛍光撮像技術用の試料を調製する際には、その他の蛍光撮像技術におけるのとほぼ同じ態様で試料の染色およびラベリングが実行され得る。たとえばAlexa Fluor 647などの多くのAlexa FluorまたはAtto染料がＳＴＯＲＭ撮像に使用可能である。有機染料とは別に、mEOSおよびPAmCherryなどの多くの蛍光タンパク質も好適である。
【００３２】
しかし、本発明は、試料を極低温環境に配置することが望ましい場合に画像解像度を向上させるためのさまざまなその他の超解像顕微鏡法技術とともに用いられてもよい。
【００３３】
本発明で用いられるような無収差固体浸漬レンズ１４は、（図１に示されるように）ｒ＋ｒ／ｎの厚みを有する実質的に切頭状の球面ボールレンズであることを特徴とし、ｒはボール半径であり、ｎはボールレンズの材料の屈折率である。これは、実質的に平面状の切頭面の立場にある半球面固体浸漬レンズとは異なり、半球面の場合はレンズの厚みはｒである。試料と実質的に接触している半球面固体浸漬レンズを用いて、対物レンズ２０と組合せて開口数を提供することができ、当該開口数は、対物レンズ２０単独でｎの倍数の開口数を有する。対照的に、対物レンズ２０と組合された無収差固体浸漬レンズは、最高で最大値ｎまでの、対物レンズ２０単独でｎ2の倍数の開口数を有する開口数を達成することができる。
【００３４】
当然のことながら、無収差固体浸漬レンズはそれぞれの光学配置で光学的に用いられる表面によって規定されていればよいので、撮像される試料の遠位の曲面は典型的に実質的に球面であり、撮像される試料の近位の表面は典型的に実質的に平面であるが、無収差固体浸漬レンズの他の部分はボール形状または図１に示される理想的な切頭球面を必ずしも完成させる必要はない。たとえば図２Ａおよび図２Ｂのアレイ構成を参照。
【００３５】
また、無収差固体浸漬レンズは半球面固体浸漬レンズよりも広い有効視野を提供することができるが、色収差が多少増加する場合がある。色収差の増加は、さまざまな光波長について対物レンズ２０とＡＳＩＬ１４との間の間隔を僅かに変化させることによって補償することができる。そのような収差および設計上の考慮事項は、たとえばLin Wang et al., Applied Optics, Vol. 49, No. 31, 6160 - 6169に記載されている。
【００３６】
図１の配置におけるＡＳＩＬの使用に起因する開口数の増加は、ＡＳＩＬに用いられる材料の屈折率に直接依存する。したがって、屈折率が２．２の二酸化ジルコニウムなどの高屈折率の材料が用いられ得る。ＡＳＩＬのサイズは、視野および収差効果などの要因同士の折り合いをつけるように選択され得るが、図１の配置については球径が約３ｍｍのＡＳＩＬが用いられ得る。材料が二酸化ジルコニウムの場合は、これによってレンズ深さは約２．１８ｍｍになる。
【００３７】
図１に示されるようにＡＳＩＬ１４を用いて極低温環境１２で試料１０に対して超解像顕微鏡法を実行することによって、光学撮像配置において高開口数を達成することができ、したがって撮像素子２４によって検出される特徴の超解像局在化において高精度を達成することができる。高開口数を達成する代替的な方法は、湿式対物レンズおよび試料に接触してこれらの間の光学空間を埋めている高指数浸漬流体塊の本体とともに湿式対物レンズを用いることであろう。しかし、そのような高指数浸漬流体は極低温環境と関連する低温に対する耐性がない。低温は、たとえば、撮像される試料内の標的構造が、超解像撮像処理を成功させるためにガラス化を必要とする細胞小器官またはその他の生物学的構造である場合など、検査される試料の性質によって必要となることが多い。したがって、ＡＳＩＬを用いる本発明は、超解像顕微鏡法を実行する際に、湿式浸漬レンズを用いて利用可能な開口数よりも高い開口数、および極低温に対する耐性の両方を提供する。対照的に、典型的な顕微鏡浸漬オイルは、ＤＩＮ／ＩＳＯによって規定されているように摂氏約２３°について標準化されている。特殊用途向け浸漬オイルの中には、摂氏１８°、２０°または３７°での使用に得ることができものもある。
【００３８】
乾式対物レンズ２０は、ＡＳＩＬ１４を収容できるように十分長い作動距離を有するべきである。典型的な作動配置では、好適なレンズは50X Mitutoyo Plan Apo Infinity Corrected Long WD Objective（ＮＡ０．５５、作動距離１３ｍｍ）であってもよい。
【００３９】
レイリー基準に従って、対物レンズ２０とＡＳＩＬ１４との組合せの光学分割は
【００４０】
【数１】
2020514822.tif 000003
【００４１】
である。
ここで、λは収集した画像光の波長であり、ｎはＡＳＩＬ材料の屈折率であり、ＮＡは乾式対物レンズの開口数である。なお、ｎ2とＮＡとの積は最大値ｎの影響を受ける。
【００４２】
次に、以下の局在化精度
【００４３】
【数２】
2020514822.tif 000004
【００４４】
を用いて、画像内の別個の分子の検出に基づく超解像技術の分解能を評価することができる。
【００４５】
ここで、Ｎは各単一分子から収集した光子数である。したがって、そのような超解像技術の局在化精度は
【００４６】
【数３】
2020514822.tif 000005
【００４７】
として表わされ得る。
一例として、光波長が５００ｎｍであり、光子数が控えめに見積もって１０００であると仮定すると、典型的な作業配置の局在化精度は１５ｎｍとなる。
【００４８】
図１の装置および関連方法を用いて、たとえば無収差固体浸漬レンズのアレイ３０を提供し、各試料を無収差固体浸漬レンズのうちの異なる１つのレンズの平面に隣接してまたは接触して配置することによって、多数の試料が効率的に撮像され得る。無収差固体浸漬レンズのそのようなアレイ３０は図２Ａの断面図および図２Ｂの平面図に示されている。アレイの無収差固体浸漬レンズ１４の各々は、たとえば単一の材料片からのダイヤモンドミリングによって、または無収差固体浸漬レンズ部品を基板３２に別個に接合してレンズのアレイを形成することによって、そのような基板と一体形成されてもよい。
【００４９】
図１の装置には平行移動機構３４がさらに設けられてもよい。平行移動機構３４は、各無収差固体浸漬レンズを対物レンズ２０に対して所定位置に動かして複数の試料の各々を連続的に撮像して超解像顕微鏡法技術を実行するために、無収差固体浸漬レンズのアレイを対物レンズ２０に対して横方向に平行移動させるように配置される。
【００５０】
図２Ａおよび図２Ｂに示されるような無収差固体浸漬レンズのアレイ３０に用いられ得る好適な構成および寸法は、各レンズの中心間隔が約３．５ｍｍである無収差固体浸漬レンズ１４の正方形または六角形アレイを用いることである。これらの図では、アレイは、直径約２５ｍｍの円形基板の上にまたは当該基板の一部として配置された、矩形アレイ内の２１個のそのような無収差固体浸漬レンズから形成されており、当該基板の厚みは約０．７ｍｍであり、これはアレイの各無収差固体浸漬レンズの厚みに寄与する。
【００５１】
無収差固体浸漬レンズのアレイ３０および試料を本発明の方法および装置とともに用いる利点は、無収差固体浸漬レンズと試料との各組合せを極低温環境内に別個に装填する必要なしに多数の試料を撮像できることである。ＡＳＩＬ同士の間の距離が既知であるため、迅速に顕微鏡の視野の位置を正確に変更するのに都合がよい。したがって高スループット撮像を達成することができる。
【００５２】
本発明に係る方法および装置での使用には、超解像顕微鏡法技術によって撮像される１つ以上の試料に必要な極低温環境を提供するために、１つ以上の別個の無収差固体浸漬レンズ、またはそのようなレンズの１つ以上のアレイ３０をクライオスタット５０内に装填することができる。
【００５３】
図３は、クライオスタット５０が、この場合は無収差固体浸漬レンズ１４のアレイ３０がクライオスタット５０内に装填された状態でどのように構築され得るかの例を示す。この目的で、クライオスタット５０はフレーム５２を含み、フレーム５２自体がベース５４、本体５６および蓋５８を含む。ベース５４には開口５５が設けられており、これを通って試料（図示されていないが、典型的に各無収差固体浸漬レンズの平面に配置される）を無収差固体浸漬レンズを介して撮像することができる。本体５６はクライオスタット５０の側壁を提供するようにベース５４に取付けられており、レンズアレイは、本体部によって提供される側壁内に着座するように、かつベースと本体との間の接合部に位置する封止リング６０に接して着座するように、クライオスタット内に装填される。封止リング６０は、たとえば、本体５６の内面よりもやや小さいベースの開口５５によって形成される肩部に接して配置され得る。
【００５４】
この構造または同様の構造を用いて、レンズアレイ３０は寒剤を保持するためにクライオスタットのベースを形成する。寒剤は、レンズアレイ３０の上にとどまるかまたは試料に接触するためにレンズアレイ３０の上を流れることができる。図３では液体窒素などの寒剤が入口通路６２を用いてクライオスタットに入れられ、出口通路６４を通って出ることができる。これらの入口および出口通路はさまざまな方法で設けられ得るが、図３ではフレーム５２の蓋５８を貫通する管によって設けられている。このように液体窒素を用いることによって、約７７ケルビン以下の典型的な試料温度を提供することができる。
【００５５】
使用時、たとえば窒素蒸気を用いて７７ケルビンまで冷却することなどによって、まずレンズアレイ３０が必要に応じて好適に準備され、次にレンズアレイの平面に試料が塗布される。次にベースを形成するためにレンズアレイがクライオスタット内に装填され、次に蓋５８がボルト締めされるかまたはその他の方法で固定されてフレーム５２が閉じられる。次に、レンズアレイ３０がすでに装填されたクライオスタットおよび試料が、図１のまたは後述の光学部品などの光学部品に対して所定位置に装填され得、必要な超解像顕微鏡法技術を実行するために寒剤供給が入口および出口通路６２，６４に接続される。多数の試料がクライオスタット内にすでに装填されており、無収差固体浸漬レンズに対して必要な位置にすでに配置されているため、多数の試料をより急速にかつ容易に撮像することができる。
【００５６】
図４は、図１の光学部品が、たとえば図３と同様のクライオスタット装置を用いて、極低温環境で１つ以上の試料に対して超解像顕微鏡法を実行するためにどのように実現され得るかをより詳細に示す。図４では、光源１６はレーザ１６０によって提供され、レーザ１６０は、たとえば試料中の分子をラベリングするのに用いた蛍光体を励起するのに好適な波長で動作する。プローブ光を調整するプローブ光光学部品１８は次にビームエキスパンダ装置１８１を含み、その後にミラーおよびステアリングレンズを含むステアリング装置１８３が続く。ステアリング装置は、ステアリング装置の平行移動によってダイクロイックビームスプリッタ２２上へのプローブ光の入射位置が制御され、したがって対物レンズ２０へのプローブ光の入射経路が制御されるように構成される。プローブ光は次に対物レンズを通過して、図３に示されるようなクライオスタット装置を用いて保持され得る無収差固体浸漬レンズおよび試料に到達する。長移動範囲ｘ−ｙ−ｚ顕微鏡平行移動ステージシステムなどの平行移動機構３４を用いてクライオスタット５０の位置を制御してもよく、したがって対物レンズ２０に対する無収差固体浸漬レンズおよび関連の試料を制御してもよい。
【００５７】
対物レンズの中心光軸から径方向に大きくずれて対物レンズ２０に入るプローブ光は、対物レンズ２０が向けられている無収差固体浸漬レンズに増加した入射角で入射する。この入射角が十分大きければ、プローブ光ビームは無収差固体浸漬レンズを通過して、無収差固体浸漬レンズ内で全内部反射を生じさせるのに十分な入射角でそのレンズの遠位平面に到達する。この場合、無収差固体浸漬レンズの平面上に配置された試料はプローブ光のエバネッセント波によってのみ照らされる。エバネッセント波は、当該平面からのプローブ光の波長の何分の１かのオーダの距離内でのみ大きい出力を有する。このように、プローブ光がレンズの平面から試料内に数十ナノメートルのみ蛍光を励起するように全内部反射構成を用いることができる。対物レンズ２０および無収差固体浸漬レンズを通過するプローブ光ビームのジオメトリを微調整して必要な全内部反射または他の照明ジオメトリを達成することは、ステアリング装置１８３またはプローブ光光学部品１８のその他の局面を調整することによって達成することができる。
【００５８】
試料からの画像光は、無収差固体浸漬レンズおよび対物レンズ２０を通過して、ビームスプリッタ２２を通過し、ＥＭＣＣＤ（電子増倍型電荷結合素子）カメラなどの撮像素子２４に到達する。ビームスプリッタ２２と撮像素子２４との間のこの経路に沿って、試料をラベリングするために用いられる蛍光体の特定の発光波長を通過させるように選択された発光フィルタ２６２、および撮像素子に集光する結像レンズ２６４などの画像光光学部品２６が設けられている。
【００５９】
対物レンズ２０と無収差固体浸漬レンズとの正確な整列は、試料の最良解像度画像を得るために重要である。したがって、無収差固体浸漬レンズ１４および対物レンズ２０を正確に整列させるための方式を図５に示す。レーザダイオード２００によって生成された平行ビームは、第１のビームエキスパンダ装置２０２を用いて、無収差固体浸漬レンズ１４と対物レンズ２０との組合せの後焦点面の全開口に及ぶように拡張される。無収差固体浸漬レンズ１４と対物レンズ２０との間の距離が正確または理想的であるように調整されると、入射ビームは無収差固体浸漬レンズ１４の平坦な遠位面２０４に反射し、入射光路に沿って伝搬して戻る。この反射はビームスプリッタ２０６によって分割され、その半分は第２のビームエキスパンダ装置２０８内に反射する。出力ビームは拡張された平行ビームであり、次に明暗の縞として見える平行の干渉パターンがシアプレート２１０内に観察され得る。
【００６０】
本発明を用いて、上述の極低温超解像顕微鏡法技術を用いて取得された画像データが、同様に極低温環境に配置された１つまたは複数の試料を用いて実行される電子顕微鏡法および／もしくはＸ線顕微鏡法を用いて取得された画像データと組合されるかまたは相関付けられる、試料の相関撮像または試料のアレイの相関撮像が実現され得る。この目的で、図６は相関撮像の方法を示すフローチャートである。
【００６１】
図６のステップ３００において、試料が、たとえば本文書の他の箇所でより詳細に記載したように、無収差固体浸漬レンズの平面に接触してまたは直接隣接して調製される。この調製ステップは複数の試料について繰返されてもよく、各試料は、さまざまな無収差固体浸漬レンズまたは図２Ａに示されるようなアレイなどのレンズアレイの平面に接触してまたは直接隣接して配置される。無収差固体浸漬レンズまたはレンズアレイは次に、調製された試料とともに、図６のステップ３１０に示されるように、図３に示されるようなクライオスタット５０内に装填され得る。
【００６２】
当該試料または試料のアレイ内の各試料は次に、試料の超解像画像データ３６０を得るために本文書の他の箇所で説明したような極低温超顕微鏡法技術を受ける。
【００６３】
超解像画像データ３６０が得られると、当該試料または各試料は次に、試料の電子顕微鏡法画像データ３７０を得るために図６のステップ３３０において電子顕微鏡法技術を受ける。便利なことに、超解像顕微鏡法ステップ３２０で用いられる無収差固体浸漬レンズに接触または隣接するように各試料を調製しているので、無収差固体浸漬レンズは電子顕微鏡法ステップ３３０の間、試料の支持台として機能し続けることができる。無収差固体浸漬レンズのアレイを用いる場合は、同じレンズのアレイを調製した試料とともに、図１のような超解像顕微鏡法装置から電子顕微鏡装置に、試料を大きく乱すことなく移すことができる。図３のようなクライオスタット５０を用いて超解像顕微鏡法プロセス時に無収差固体浸漬レンズまたはレンズアレイおよび関連の試料を収容する場合は、レンズまたはレンズアレイは電子顕微鏡装置への移送時および電子顕微鏡装置内での使用時に同じクライオスタット内の所定位置に残ってもよい。
【００６４】
電子顕微鏡装置は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）および透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）装置などの試料を撮像するための多種多様な電子顕微鏡法を提供し得る。いくつかのこのような技術については、たとえばＴＥＭ撮像のために試料を重金属染色するなどの１つまたは複数の試料のさらなる調製が、超解像顕微鏡法ステップ３２０の前および電子顕微鏡法ステップ３３０の前に適切であり得る。必要であれば、図６の超解像顕微鏡法ステージと電子顕微鏡法ステージとを逆にしてもよく、ならびに／または、たとえば、同じもしくは異なる顕微鏡法、超顕微鏡法、および電子顕微鏡法技術のその他の撮像ステージを含むその他の顕微鏡法ステージが用いられてもよい。軟Ｘ線顕微鏡法技術などのＸ線顕微鏡法技術が電子顕微鏡法技術に加えてまたは電子顕微鏡法技術の代わりに用いられてもよい。
【００６５】
１つまたは複数の同じ試料の超解像画像データ３６０および電子顕微鏡法画像データ３７０が得られると、これらの画像データ対は、試料内の構造的特徴が一致するように、たとえば基準マーカまたは特徴検出アルゴリズムを用いて整列または相関付けられ得る。次にそのような整列を用いて、必要であれば、超解像画像データ３６０と電子またはＸ線顕微鏡法画像データ３７０とを組合せて、組合わされたまたは相関的な試料の画像３８０が形成され得る。
【００６６】
そのような組合わされたまたは相関的な試料の画像３８０は、別々に考慮される超顕微鏡法画像３６０または電子もしくはＸ線顕微鏡法画像のいずれに対しても大きな利点を提供し得る。たとえば、相関的な光および電子またはＸ線顕微鏡法は、細胞の超微細構造の文脈において特定の生体分子の分子分布および構成のマルチモーダリティ撮像解決策を提供する。
【００６７】
本発明の特定の実施形態を説明したが、当業者であれば本発明の範囲から逸脱することなくさまざまな修正および変更がなされ得ることを理解するであろう。たとえば、単一分子局在化顕微鏡法とは別に、構造化照明顕微鏡法および誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡法などの他の既定の超解像顕微鏡法技術を固体浸漬レンズ顕微鏡法と組合せることもできる。
【図１】
2020514822.tif 000006
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月3日(2020.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料に対して超解像光学顕微鏡法を実行する方法であって、
平面を有する無収差固体浸漬レンズを提供することと、
前記無収差固体浸漬レンズの前記平面の上にまたは前記平面に隣接して前記試料を配置することと、
前記試料を極低温環境に配置することと、
超解像光学顕微鏡法技術を用いて前記無収差固体浸漬レンズを介して前記試料を撮像して、前記試料の超解像画像を提供することとを備える、方法。
【請求項２】
前記極低温環境は、２００ケルビン未満の温度の環境、１００ケルビン未満の温度の環境、液体窒素を用いて維持される環境、および窒素蒸気を用いて維持される環境のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料は前記無収差固体浸漬レンズに接触している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記超解像光学顕微鏡法技術は、単一分子局在化光学顕微鏡法技術である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記単一分子局在化光学顕微鏡法技術は、
発光体で前記試料をラベリングすることと、
複数の発光の各々を別個に検出することとを備え、各発光は前記発光体のうちの１つからであり、前記発光は、前記試料が前記極低温環境に配置されている間に前記無収差固体浸漬レンズを介して検出器において受光され、前記単一分子局在化光学顕微鏡法技術はさらに、
別個に検出された前記発光から前記試料の前記超解像画像を構築することを備える、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記発光体は、有機染料、蛍光タンパク質および量子ドットなどの蛍光体を備える、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
各蛍光体は、前記試料の分子に結合する蛍光体分子である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記単一分子局在化光学顕微鏡法技術は、確率的光学再構築顕微鏡法（ＳＴＯＲＭ）技術、光活性化局在性顕微鏡法（ＰＡＬＭ）技術、構造化照明顕微鏡法技術、および誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡法技術のうちの１つ以上である、請求項４から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
超解像顕微鏡法技術を用いて前記試料を撮像することは、前記平面において前記無収差固体浸漬レンズの内部の全内部反射を受けるプローブ光を用いて前記試料を照らすことを備える、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記無収差固体浸漬レンズのアレイを提供することと、
各試料を、前記無収差固体浸漬レンズのうちの対応する１つのレンズの平面の上にまたは前記平面に隣接して配置し、前記試料を極低温環境に配置することと、
超解像光学顕微鏡法技術を用いて、隣接するそれぞれの前記無収差固体浸漬レンズを介して各試料を連続的に撮像することとによって、試料のアレイに対して超解像光学顕微鏡法を実行することを備える、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記無収差固体浸漬レンズのアレイは、基板構造と一体形成された、または基板構造に接合された前記無収差固体浸漬レンズを備える、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基板構造を含む前記無収差固体浸漬レンズのアレイは、単一の材料片からの機械加工によって形成される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記または各無収差固体浸漬レンズの上のまたは前記レンズに隣接した前記または各試料は、超解像撮像の前にクライオスタット内に装填される、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記または各試料を超解像撮像のために前記極低温環境で維持するために、液体または気体寒剤がクライオスタットに入れられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記または各試料は、超解像撮像のためにガラス化状態で維持される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
相関撮像の方法であって、
前述の請求項のいずれか１項に記載のステップを実行して前記または各試料の超解像光学画像を提供するステップと、
前記または各試料に対して電子顕微鏡法またはＸ線顕微鏡法を実行して前記または各試料のさらなる画像を提供するステップと、
各試料の前記超解像光学画像と前記さらなる画像とを相関付けて前記試料の相関画像を提供するステップとを備える、方法。
【請求項１７】
前記電子顕微鏡法またはＸ線顕微鏡法は前記超解像光学撮像の後に実行される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記電子顕微鏡法またはＸ線顕微鏡法技術は、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、および軟Ｘ線顕微鏡法のうちの１つである、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
試料に対して超解像光学顕微鏡法を実行するための装置であって、
平面を有する無収差固体浸漬レンズと、
前記無収差固体浸漬レンズの平面の上のまたは前記平面に隣接した試料と、
前記試料が配置される極低温環境と、
前記試料の超解像光学画像を提供するように配置された超解像光学顕微鏡とを備える、装置。
【請求項２０】
前記超解像光学顕微鏡は、前記平面において前記無収差固体浸漬レンズの内部の全内部反射を用いて前記試料を照らして撮像するように配置される、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
極低温超解像光学顕微鏡法で用いる無収差固体浸漬レンズのアレイであって、前記アレイは、基板と一体形成された、または基板に接合された複数の無収差固体浸漬レンズを備える、アレイ。
【請求項２２】
前記基板の平面は、前記無収差固体浸漬レンズの各々の光学平面を提供する、請求項２１に記載のアレイ。
【請求項２３】
各無収差固体浸漬レンズの前記平面の上にまたは前記平面に隣接して別個の試料が提供される、請求項２１または２２に記載の無収差固体浸漬レンズのアレイを備える、請求項１９または２０に記載の装置。
【請求項２４】
複数の試料に対して超解像光学顕微鏡法を実行する際に用いるクライオスタットであって、前記クライオスタットは、請求項２１から２３のいずれか１項に記載の無収差固体浸漬レンズのアレイを受けるように配置されたフレームを備え、前記無収差固体浸漬レンズの前記アレイは前記クライオスタットの床を形成し、前記レンズは外側を向き、前記試料は前記クライオスタットの内部に配置される、クライオスタット。
【請求項２５】
請求項２１から２３のいずれか１項に記載の無収差固体浸漬レンズのアレイと組合された、かつ請求項１９または２０に記載の装置と組合された、請求項２４に記載のクライオスタット。
【請求項２６】
前記または各試料はガラス化された試料である、請求項１９から２５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２７】
前記極低温環境は、２００ケルビン未満の温度の環境、１００ケルビン未満の温度の環境、液体窒素を用いて維持される環境、および窒素蒸気を用いて維持される環境のうちの少なくとも１つである、請求項１９から２６のいずれか１項に記載の装置。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2020514822.tif 000013
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2020514822.tif 000014
【国際調査報告】
2020514822.tif 000015
2020514822.tif 000016
2020514822.tif 000017
2020514822.tif 000018