(57)【要約】  本発明は、患者に投与された免疫療法の効力の評価方法であって、上記免疫療法はＧＡＤの投与を含み、第１の時点において上記患者から得られた血液、血漿、または血清の第１の試料中、および、それより後の第２の時点において上記患者から得られた血液、血漿、または血清の第２の試料中の、ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布、ＧＡＤＡレベル、リンパ球から分泌されるサイトカインの分布、およびＧＡＤまたはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下におけるリンパ球増殖のうち少なくとも１つを測定する工程と、得られた測定値を比較する工程とを含む、方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項２】
患者に投与された免疫療法の効力の評価方法であって、前記免疫療法はＧＡＤの投与を含み、
第１の時点において前記患者から得られた血液、血漿、または血清の第１の試料中、および、それより後の第２の時点において前記患者から得られた血液、血漿、または血清の第２の試料中の、
・ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布、
・ＧＡＤＡレベル、
・リンパ球から分泌されるサイトカインの分布、および
・ＧＡＤまたはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下におけるリンパ球増殖のうち少なくとも１つを測定する工程と、
得られた測定値を比較する工程とを含み、
前記第２の試料中で測定されたものを、前記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、前記ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布における、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／もしくはＩｇＧ４の相対量の増加、またはＩｇＧ１の相対量の減少；ＧＡＤＡレベルの増加；前記リンパ球から分泌されるサイトカインの分布における、ＩＬ−１３および／もしくはＩＬ−５の相対量の増加、またはＩＦＮγおよび／もしくはＴＮＦαの相対量の減少；ならびに／または、ＧＡＤもしくはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下におけるリンパ球増殖の低下は、有効な免疫療法であることを示唆する、方法。
【請求項３】
・ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布、
・ＧＡＤＡレベル、
・リンパ球から分泌されるサイトカインの分布、および
・リンパ球増殖
のうち、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つが、前記血液、血漿、または血清の第１の試料中および前記血液、血漿、または血清の第２の試料中において測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の試料は、前記免疫療法の開始前もしくは開始時、または前記免疫療法の開始後８０〜１００日目、たとえば９０日目に得られる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の試料は、前記免疫療法の開始後１６０〜２００日目、たとえば１８０日目、または１２、１５、２４、３０、もしくは３６か月目に得られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の試料は、前記第１の試料が得られた後１６０〜２００日目、たとえば１８０日目、または１２、１５、２４、３０、もしくは３６か月目に得られる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫療法は、ビタミンＤの投与を１日目に開始して毎日実施することと、ＧＡＤのリンパ内注射を３０、６０、および９０日目に実施することとを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
１日目に開始する前記ビタミンＤの投与は、３か月間以上、たとえば４、５、または６か月間続く、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布が前記第１の試料中および前記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、前記第２の試料中で測定されたものを、前記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、前記ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布におけるＩｇＧ４の相対量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布が前記第１の試料中および前記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、前記第２の試料中で測定されたものを、前記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、前記ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布におけるＩｇＧ１の相対量の減少は、有効な免疫療法であることを示唆する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布が前記第１の試料中および前記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、前記第２の試料中で測定されたものを、前記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、前記ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布におけるＩｇＧ１の量に対するＩｇＧ４の量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ＧＡＤＡレベルが前記第１の試料中および前記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、前記第２の試料中で測定されたものを、前記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、ＧＡＤＡレベルの増加は、有効な免疫療法であることを示唆する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
リンパ球から分泌されるサイトカインの分布が前記第１の試料中および前記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、前記第２の試料中で測定されたものを、前記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、ＩＬ−１３および／またはＩＬ−５の相対量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
リンパ球から分泌されるサイトカインの分布が前記第１の試料中および前記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、前記第２の試料中で測定されたものを、前記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、ＩＦＮγの量に対するＩＬ−１３の量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
リンパ球から分泌されるサイトカインの分布が前記第１の試料中および前記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、前記第２の試料中で測定されたものを、前記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、ＩＦＮγおよび／またはＴＮＦαの相対量の減少は、有効な免疫療法であることを示唆する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ＧＡＤまたはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下におけるリンパ球増殖が前記第１の試料中および前記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、前記第２の試料中で測定されたものを、前記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、ＧＡＤまたはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下におけるリンパ球増殖の低下は、有効な免疫療法であることを示唆する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫療法は、リンパ節内への注射を含むリンパ内注射、皮内注射、皮下注射、または経口投与によるＧＡＤの投与を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
免疫療法による１型糖尿病の治療または予防方法であって、
対象にＧＡＤを投与する工程と、
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法によって、前記免疫療法の効力の評価を得る工程と、
前記評価に基づいて、ＧＡＤの投薬量および／または投与経路を調整する工程とを含む、方法。
【請求項１９】
前記得られた測定値の比較が、有効な免疫療法であることを示唆しない場合、次いで、前記ＧＡＤの投薬量の調整は、リンパ節内への注射によるＧＡＤのさらなる投与を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法は、
ビタミンＤの投与を、１日目に開始して３〜６か月間継続する工程と、
ＧＡＤを前記対象のリンパ節内に、３回、それぞれ３０、６０、および９０日目に投与する工程と、
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法によって、前記免疫療法の効力の評価を得る工程とを含み、
前記得られた測定値の比較が、有効な免疫療法であることを示唆しない場合、次いで、前記ＧＡＤの投薬量の調整は、リンパ節内へのＧＡＤの４回目の投与を、１日目の後１２〜１８か月目に行なうことを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
免疫療法による、対象における１型糖尿病の治療または予防方法であって、
ビタミンＤの投与を、１日目に開始して３〜６か月間継続する工程と、
ＧＡＤをリンパ節内に、３回、それぞれ３０、６０、および９０日目に投与する工程と、
リンパ節内へのＧＡＤの４回目の投与を、１日目の後１２〜１８か月目に行なう工程とを含む、方法。
【請求項２２】
ＨｂＡ１ｃおよび必要インスリン用量が、１回目のＧＡＤ−ａｌｕｍ注射後５〜６か月目に観察されたレベルと比較して、１２〜１８か月目にて上昇した場合、ならびに、任意に、ＩＦＮ／ＩＬ−１３比率が前記観察の間に減少しなかった場合、４回目の、またはさらなる投与が行なわれる、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
１日目の後３０か月目にリンパ節内にＧＡＤのさらなる投与を行なう工程をさらに含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＨｂＡ１ｃおよび／または前記対象の必要インスリン用量が、１回目のＧＡＤ−ａｌｕｍ注射後１５か月目に観察されたレベルと比較して、３０か月目にて上昇した場合、ならびに、任意に、ＩＦＮ／ＩＬ−１３比率が前記観察の間に減少しなかった場合、ＧＡＤ−ａｌｕｍのさらなる投与が行なわれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ＧＡＤを前記対象のリンパ節内に、少なくとも３回、それぞれ３０、６０、および９０日目に投与する工程を含み、かつ、所与の時間におけるＨｂＡ１ｃレベルおよび／または前記対象の必要インスリン用量が、前記所与の時間より６〜２４か月間前に観察されたレベルと比較して増加した場合、リンパ節内への少なくとも１回のさらなる投与が行なわれる、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
ＧＡＤを前記対象のリンパ節内に、少なくとも３回、それぞれ３０、６０、および９０日目に投与する工程を含み、かつ、前記リンパ球から分泌されるサイトカインの分布におけるＩＬ−１３および／またはＩＬ−５の相対量が、所与の時間において、前記所与の時間より６〜２４か月間前に観察されたレベルと比較して変化していないまたは減少した場合、リンパ節内への少なくとも１回のさらなる投与が行なわれる、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ＧＡＤを前記対象のリンパ節内に、少なくとも３回、それぞれ３０、６０、および９０日目に投与する工程を含み、かつ、前記リンパ球から分泌されるサイトカインの分布における比率ＩＦＮγ／ＩＬ−１３が、所与の時間において、前記所与の時間より６〜２４か月間前に観察された同比率と比較して変化していないまたは増加した場合、リンパ節内への少なくとも１回のさらなる投与が行なわれる、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
ＧＡＤを前記対象のリンパ節内に、少なくとも３回、それぞれ３０、６０、および９０日目に投与する工程を含み、かつ、ＧＡＤ特異的抗体の集団におけるＩｇＧ１／ＩｇＧ４の比率が、所与の時間において、前記所与の時間より６〜２４か月間前に観察された前記と同じ比率と比較して変化していないまたは増加した場合、リンパ節内への少なくとも１回のさらなる投与が行なわれる、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ビタミンＤの投与を、リンパ節内へのＧＡＤの４回目の、または任意のさらなる投与より０〜９０日前に開始して、毎日実施することを含む、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ビタミンＤは、１日あたり２０００ＩＵの用量にて投与される、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ビタミンＤは４か月間投与される、請求項１７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
ＧＡＤは、ａｌｕｍ配合ＧＡＤの形態で投与される、請求項１７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の治療方法において使用するためのＧＡＤ。
【請求項３４】
請求項１〜３１のいずれか１項に記載の治療方法において使用するための医薬組成物の製造におけるＧＡＤの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、免疫学、特に免疫療法の分野に関する。より具体的には、本発明は、１型糖尿病または自己免疫性糖尿病などの自己免疫性疾患の予防および／または治療に属する。本発明は、このような疾患の予防および／または治療において特に有用なバイオマーカーおよび投与レジメンを提供する。
【背景技術】
【０００２】
背景
１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）の治療は、生涯続くインスリン投与からなるが、この補充療法では、重篤な合併症が十分に予防されない。疾患の進行を遅延または停止させるための試みがこれまで数十年間継続されているが、発症して間もないＴ１Ｄ患者の臨床介入試験では、効力が無いまたは限定的であることが示されており、このことから、動物モデルからヒトＴ１Ｄへの変換が複雑であることが強調される。自己抗原による免疫調節は、最も特異的かつ安全なＴ１Ｄ治療となり得る。グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）６５を水酸化アルミニウムと共に配合したもの（ＧＡＤ−ａｌｕｍ）が皮下投与された際、Ｔ１Ｄを発症して間もない子供および青年における残存インスリン分泌の保存に効力が示されたが、続いて実施された第ＩＩ相および第ＩＩＩ相の試験は一次転帰（ｐｒｉｍａｒｙ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ）に到達しなかった。しかしながら、第ＩＩＩ相試験にて、あらかじめ指定されたサブグループにおいて著しい効力が示され、かつ、インフルエンザワクチンを間を空けずに投与したこと（ｃｌｏｓｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）が当該試験の転帰に影響を及ぼした可能性が示された。したがって、ＧＡＤ−ａｌｕｍでの治療は、有益である可能性はあるが十分に有効ではなかったと考えるのが最も妥当である。
【０００３】
リンパ節内のＴ細胞におけるＧＡＤ６５抗原の提示を、以前に記載されているよりも高効率とするために、非盲検臨床試験（ＤＩＡＧＮＯＤＥ）に参加した患者６人のリンパ節内にＧＡＤ−ａｌｕｍが投与された。当該患者らにおける結果から、当該患者らにおけるＣ−ペプチドの保存が、他の免疫介入試験の患者らで観察された有望な結果と類似するようであることが示された。
【発明の概要】
【０００４】
驚くべきことに、本発明者らは、免疫療法を受けている患者において測定および分析できる新たなバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせを、当該免疫療法の効力を評価する目的でＧＡＤを投与したことによって見いだした。また、本発明者らは、先行技術に係る免疫療法を受けている何人かの患者は、自己抗原ＧＡＤをさらに投与する必要があることを明らかにした。
【０００５】
したがって、第１の態様において、本発明は、患者に投与された免疫療法の効力の評価方法であって、上記免疫療法はＧＡＤの投与を含み、
第１の時点において上記患者から得られた血液、血漿、または血清の第１の試料中、および、それより後の第２の時点において上記患者から得られた血液、血漿、または血清の第２の試料中の、
・ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布、
・ＧＡＤＡレベル、
・リンパ球から分泌されるサイトカインの分布、および
・ＧＡＤまたはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下におけるリンパ球増殖のうち少なくとも１つを測定する工程と、
得られた測定値を比較する工程とを含み、
上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、上記ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布における、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／もしくはＩｇＧ４の相対量の増加、またはＩｇＧ１の相対量の減少；ＧＡＤＡレベルの増加；上記リンパ球から分泌されるサイトカインの分布における、ＩＬ−１３および／もしくはＩＬ−５の相対量の増加、またはＩＦＮγおよび／もしくはＴＮＦαの相対量の減少；ならびに／または、ＧＡＤもしくはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下におけるリンパ球増殖の低下は、有効な免疫療法であることを示唆する、方法に関する。
【０００６】
一態様において、本発明は、免疫療法による１型糖尿病の治療または予防方法であって、
対象にＧＡＤを投与する工程と、
上述される方法によって上記免疫療法の効力の評価を得る工程と、
上記評価に基づいて、ＧＡＤの投薬量および／または投与経路を調整する工程とを含む、方法に関する。
【０００７】
一態様において、本発明は、免疫療法による、対象における１型糖尿病の治療または予防方法であって、
ビタミンＤの投与を、１日目に開始して３〜６か月間継続する工程と、
ＧＡＤをリンパ節内に、３回、それぞれ３０、６０、および９０日目に投与する工程と、
リンパ節内へのＧＡＤの４回目の投与を、１日目の後１２〜１８か月目に行なう工程を含む、方法に関する。
【０００８】
本発明は、本発明に係る方法において使用するためのＧＡＤ、および本発明に係る方法において使用するための医薬組成物の製造におけるＧＡＤの使用にも関する。
【０００９】
本発明のいくつかの実施形態について、以下と、付属の請求項とに、さらに記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
図面の説明
【図１】ＧＡＤ−ａｌｕｍ治療の全体像。（ａ）１型糖尿病患者（ｎ＝６）に、リンパ節（ＬＮ）内にＧＡＤ−ａｌｕｍ（４μｇ）の１回目の注射をし、続いて追加免疫注射を１か月間隔で２回注射した。別の研究に参加した患者のコントロール群（ｎ＝６）には、１回目の皮下（ＳＣ）ＧＡＤ−ａｌｕｍ投与（２０μｇ）に続き、１か月後に２回目の注射を行なった。平行して、すべての患者に、ＬＮ患者には最初の１２０日間、ＳＣ群には４５０日間、ビタミンＤ（カルシフェロール）を与えた。
【図２】ａ）リンパ節内（ＬＮ、ｎ＝６）または皮下（ＳＣ、ｎ＝６）にＧＡＤ−ａｌｕｍを注射した患者のＧＡＤＡタイターの平均値。（ｂ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４ＧＡＤＡサブクラスの頻度の変化（％）。頻度は、各試料について、４種のサブクラスの合計（すなわち、総ＩｇＧ）に対して計算した。各サブクラスについて、総ＩｇＧに対する中央値の割合を示す。（ｃ）ＬＮ群およびＳＣ群について、ベースライン、９０日目、および１８０日目におけるＧＡＤＡサブクラスの相対的寄与。
【図３】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＭＢＣを刺激した際のＧＡＤ６５誘発性のサイトカイン分泌。患者に、リンパ節内（ＬＮ、ｎ＝６）または皮下（ＳＣ、ｎ＝６）にＧＡＤ−ａｌｕｍを注射した。（ａ）ＬＮ（黒丸）およびＳＣ（白丸）患者について、ベースライン、９０日目、および１８０日目における、ＩＬ−１３、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１７、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γの中央値レベル（ｐｇ／ｍｌ）を、Ｌｕｍｉｎｅｘを用いて、培地またはＧＡＤ６５（５μｇ／ｍｌ）の存在下において７日間培養後に採取した上清中にて検出した。各個体について自発性分泌を差し引いて、ＧＡＤ６５誘発性サイトカイン分泌を求める。（ｂ）９０日目および１８０日目におけるリンパ節患者（ＬＮ）および皮下群（ＳＣ）でのサイトカインの相対的寄与（％）。
【図４】ＧＡＤ６５およびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに対する増殖応答。患者に、リンパ節内（ＬＮ、ｎ＝６）または皮下（ＳＣ、ｎ＝６）にＧＡＤ−ａｌｕｍを注射した。ＧＡＤ６５（５μｇ／ｍｌ）、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、または培地と共にＰＢＭＣを３日間培養し、その後、細胞に、［３Ｈ］チミジンを瞬間適用して、回収した。増殖については、３通りの平均を培地単独の３通りの平均で除したものを計算して、刺激指標（ＳＩ）として表す。
【図５】ＧＡＤ６５に誘発されたＴ細胞活性化。リンパ節内（ｎ＝６、ＬＮ、黒丸）および皮下（ｎ＝６、ＳＣ、白丸）にＧＡＤ−ａｌｕｍを投与した患者由来の、ベースライン（１日目）、９０日目、および１８０日目のＰＢＭＣを、ＧＡＤ６５（５μｇ／ｍｌ）または培地で７日間刺激した。（ａ）ＧＡＤ６５活性化ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７＋Ｔ細胞および（ｂ）ＣＤ８＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７＋Ｔ細胞の割合。（ｃ）安静時試料（培地単独）中のＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＦＯＸＰ３＋（Ｔｒｅｇ）の割合の平均および（ｄ）ＧＡＤ６５刺激による誘発。（ｅ）安静時試料（培地単独）中、および（ｆ）ＧＡＤ６５刺激試料中における、ＦＯＸＰ３ｌｏＣＤ４５ＲＡ非抑制制御性Ｔ細胞の割合の平均。
【図６】ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の分化状態の変化（％）。リンパ節内（ｎ＝６、ＬＮ、黒丸）および皮下（ｎ＝６、ＳＣ、白丸）にＧＡＤ−ａｌｕｍを投与した患者由来の、ベースライン（１日目）、９０日目、および１８０日目のＰＢＭＣを、ＧＡＤ６５（５μｇ／ｍｌ）または培地と共に７日間培養した。ＧＡＤ６５によって、（ａ）ナイーブ（ＴＮ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）、（ｂ）セントラルメモリー（ＴＣＭ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）、（ｃ）エフェクターメモリー（ＴＥＭ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−）、および（ｄ）高分化エフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）ＣＤ４  Ｔ細胞において、変化が誘発された。ＧＡＤ−ａｌｕｍによって、（ｅ）ナイーブ（ＴＮ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）、（ｆ）セントラルメモリー（ＴＣＭ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）（ｇ）割合エフェクターメモリー（ＴＥＭ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−）、および（ｈ）高分化エフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）ＣＤ８  Ｔ細胞において変化が誘発された。線は平均の傾向を表す。
【図７】ＧＡＤ−ａｌｕｍをリンパ節に注射した患者１人の代表的なフローサイトメトリー解析。試料を１８０日目に採取し、ＰＢＭＣを、ＧＡＤ６５（５μｇ／ｍｌ）または培地の存在下において７日間培養した。安静時（培地単独）およびＧＡＤ６５刺激試料中のＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＴｒｅｇの割合を評価した。
【図８】ＧＡＤ−ａｌｕｍ治療によって誘発される免疫学的変化を表すために、ヒートマップを作成した。変化を、ベースラインの値に対する９０日目および１８０日目の値の比率として計算した。患者のリンパ節内（ＬＮ、ｎ＝６）または皮下（ＳＣ、ｎ＝６）にＧＡＤ−ａｌｕｍを注射して、１８０日目における臨床転帰に従って左から右に階層化した。臨床変数を、ベースラインからの変化の割合（％）として表す。９０日目では、食事耐性試験を行なわなかったため、最大刺激およびＡＵＣ  ｃ−ペプチドは計算せず、「ｘ」と表す。グレイスケールは、ベースライン値に対する治療後の免疫学的変数の増加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本明細書中において使用されるすべての用語および表現は、他の表現が本開示の文脈から明らかである場合以外は、本出願の出願日において当業者により与えられた意味を有することが意図される。しかしながら、明確さを期して、いくつかの用語および表現が、以下に明白に定義される。
【００１２】
「自己抗体」は、それを産生する生物の自己抗原と反応する抗体である。
【００１３】
「自己抗原」または「自己の抗原」は、自己抗体と相互作用して免疫応答を引き起こす能力を有する、内在性の組織構成要素である。「ベータ細胞自己抗原」は、膵ベータ細胞に由来する自己抗原である。
【００１４】
本明細書中において使用される場合、「同時投与」は、本発明に係るレジメンの複数の化合物を、それぞれの投与レジメンが部分的に重なり合うように投与することを指す。当該化合物は、同じ時点で投与される必要はない。
【００１５】
用語「シクロオキシゲナーゼ阻害剤」、または「ｃｏｘ阻害剤」は、シクロオキシゲナーゼと結合して、そのアラキドン酸との基質−酵素結合と、エイコサノイド、プロスタグランジン、およびトロンボキサンの形成とを防止する化合物に関する。シクロオキシゲナーゼ阻害剤のサブグループはシクロオキシゲナーゼ−２阻害剤であり、シクロオキシゲナーゼ−２に対する特異性を有する。
【００１６】
治療方法の「１日目」は、治療レジメンに含まれる化合物の１回目の投与が行なわれる日であるとみなされる。本発明の文脈において、一般的に、患者への１回目のビタミンＤまたはＧＡＤの投与により、本発明に係る治療方法が開始される。
【００１７】
本明細書中において使用される場合、サイトカインまたは抗体などの化合物のクラスの「分布」は、そのクラスに属するすべての化合物の総量または総濃度に対する、そのクラスに属する特定の化合物の相対的な量または濃度に関する。
【００１８】
「エピトープ」は、免疫応答を顕在化させることができ、かつ、この応答に対抗するために産生される抗体と結合できる、抗原の表面部分、またはＴ細胞受容体である。
【００１９】
「ＧＡＤ」はグルタミン酸デカルボキシラーゼに関し、「ＧＡＤ−ａｌｕｍ」は、水酸化アルミニウムと共に配合されたグルタミン酸デカルボキシラーゼに関する。ＧＡＤ６５は、ＧＡＤの６５ｋＤａの形態である。
【００２０】
用語「ガンマ−アミノ酪酸類似体」は、ビガバトリンおよびバクロフェンを含む。
【００２１】
用語「必要インスリン用量」は、糖尿病患者が血糖レベルを制御するのに必要な毎日の平均のインスリン用量を指す。
【００２２】
用語「ビタミンＤ」は、ビタミンＤ２およびビタミンＤ３を含む。「ビタミンＤ類似体」は、権利関係に不利益を与えることなく、エルゴカルシフェロール、ジヒドロタキステロール、アルファカルシドール、カルシトリオール、コレカルシフェロール、およびカルシフェジオール、およびそれらの組み合わせ、ならびに、解剖治療化学分類法のＡ１１ＣＣ群に分類される任意の他のビタミンＤ類似体を含む。
【００２３】
用語「ＴＮＦアルファ阻害剤」は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦアルファ）の作用を阻害する化合物に関し、アダリムマブ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、および解剖治療化学分類法のＬ０４ＡＢ群に分類される任意の他の化合物を含む。
【００２４】
単数形「ａ」および「ａｎ」などを用いた表現は、複数形を含むものと解釈される。
【００２５】
省略形
ＧＡＢＡ：ガンマ−アミノ酪酸
ＧＡＤＡ：グルタミン酸デカルボキシラーゼ自己抗体
ＬＮ：リンパ節
ＰＢＭＣ：末梢血単核細胞
ＳＣ：皮下
Ｔｈ：Ｔヘルパー
Ｔ１Ｄ：１型糖尿病
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明者らは、多くのバイオマーカーと、ＧＡＤを使用する免疫療法の臨床転帰とが、どのような相関関係にあるのかについて研究した。実験部分に記載される結果から、ＧＡＤを使用する療法の効力の評価に使用できる複数のバイオマーカーが特定される。この研究に含まれるバイオマーカーについて、治療前には特異的免疫シグネチャは特定されなかったが、代謝転帰が改善された患者、すなわち、ＨｂＡ１ｃおよびインスリン要求が低下してＣ−ペプチド分泌の保存が良好となった患者は、何らかの共通した免疫上の相関を有するようであった。
【００２７】
Ｔ１Ｄ介入試験における主な未解決事項は、治療の背景にある機序の特定、ならびに治療前および治療後の免疫シグネチャの定義である。Ｔ１Ｄは耐性の不足または欠如と自己反応性Ｔ細胞の関与とによって生じる、という一般的なコンセンサスに基づくと、自己抗原を用いた免疫療法の効力には、耐性の誘発と、問題の自己抗原に対する免疫応答の低下または喪失とが伴われるべきである、ということが予期されている。ここで、本発明者らが観察したところによると、ＬＮ注射後に臨床転帰が改善した個体は、ＩｇＧサブクラスのシフトとＧＡＤ誘発性のサイトカイン分泌とによって裏付けられた、ＧＡＤＡの上昇、増殖の低下、および支配的なＴｈ２様応答の誘発（特に、ＩＬ−１３の増加）を特徴とする免疫応答を有していた。
【００２８】
ＬＮ群において、ＧＡＤ６５に対する免疫応答の方向はＴｈ２に偏っているが、しかしながら、個体差が大きい。印象的であることには、ＬＮ群において、１８０日後に、臨床転帰が最も良好な患者のみにおいて、ＧＡＤ６５誘発性サイトカインが検出された。
【００２９】
特に関心深いことに、臨床転帰の改善を示す患者は、ＳＣおよびＬＮの治療後のいずれにおいても、Ｔｈ２サイトカインプロファイルの方に偏移したＧＡＤ誘発性Ｔ細胞応答が特徴的であった。ＬＮ患者におけるＴ細胞応答は、免疫寛容原性の偏移を示さなかったが、むしろ、Ｔｈ２関連プロファイル、およびいくつかのＴｈ１サイトカインも産生された。しかしながら、Ｔｈ２サイトカインは、ＳＣ患者よりもＬＮ群の応答患者において、より支配的であった。本発明者らは、以前に、サイトカイン分泌は、ＧＡＤ−ａｌｕｍの２回用量をＳＣ注射してから少し後に広いサイトカインプロファイルを示す特徴があったこと、および、サイトカイン分泌は、より支配的なＴｈ２関連プロファイルに経時的に切り換わる傾向があったことを示した。その研究において、さらなる用量を投与したところ、分泌レベルは増加したが、サイトカイン応答の質は影響を受けず、サイトカインプロファイルは、ＧＡＤ−ａｌｕｍを２回用量または４回用量投与した患者間で類似していた。したがって、３回目のＬＮ注射の後に生じたＩＬ−１３の支配的な分泌は、用量を追加したことでは説明できず、むしろ投与経路で説明し得る。リンパ内投与によって、より多くの抗原が免疫応答誘発部位に運搬され、かつ、さらに、抗原特異的Ｔ細胞の刺激に使われる抗原用量が異なるためにＴｈ２応答の増大が導かれているのかもしれない。アジュバントであるアルミニウムの作用は、Ｔｈ２応答の誘発に関連しており、細胞性免疫応答よりもむしろ体液性免疫応答を優先的に誘発する。そのため、ＧＡＤ６５を用いた促進介在性ｂ細胞破壊（ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂ−ｃｅｌｌ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）の可能性を最小限にするアジュバントとして、ａｌｕｍを選択した。
【００３０】
このようにして、臨床転帰性の複数のバイオマーカーを特定した。
【００３１】
ＧＡＤ−ａｌｕｍ治療により誘発された個々の免疫学的変化を、治療前の特異的免疫応答に対する、９０日目および１８０日目におけるＧＡＤ６５誘発性免疫応答の比率として計算し、患者を、各人の代謝およびＣ−ペプチド保存に応じて階層化した（図８）。
【００３２】
ベースラインの免疫学的パラメータは、臨床転帰に関すると考えられた治療前の特徴を１つも示さなかった。
【００３３】
治療後の抗原誘発性サイトカイン分泌において誘発された変化を提示したことによって、ほとんどの患者における９０日後のＧＡＤ６５刺激により、投与経路とは独立して、Ｔｈ１およびＴｈ２関連サイトカインが誘発されたことが示された。しかしながら、１８０日目に、最も良好な臨床応答（すなわち、ＨｂＡｃ１の低下、インスリン取り込みの減少、およびＣ−ペプチド分泌の最も良好な保存）を示したＬＮ患者（ｎ＝３）において、ＧＡＤ６５誘発性サイトカインの変化を検出できた。印象的であることには、上述された３人の患者において、活性化されたＣＤ４細胞が観察されたが、ＣＤ８は観察されなかった。ＩｇＧ１の減少ならびにＩｇＧ２およびＩｇＧ４の増大は、臨床応答が最も良好であった患者（患者１）において最も顕著であり、この患者は、ＬＮ群で観察されたＩｇＧ４の増加を説明するものであった（図８）。
【００３４】
ＳＣ群のうち臨床応答が最も良好であった患者（患者１）における、ＧＡＤ６５誘発性サイトカイン分泌は、応答が最も良好であったＬＮ患者において観察されたものと類似していたが、ＳＣ治療患者においては、ＩｇＧ１が支配的ＧＡＤＡサブクラスであり、活性化されたＣＤ４細胞とＣＤ８細胞とが両方とも検出された。
【００３５】
両群で良好な応答を示した個体（ＬＮにおいてｎ＝２、およびＳＣにおいてｎ＝１）についての、１８０日目におけるＴｈ２（ＩＬ−１３およびＩＬ−５）／Ｔｈ１（ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α）サイトカインの比率を計算したところ、ＬＮ患者におけるＴｈ２応答はＳＣ群の３倍強い（比率は、ＬＮで６．４４に対し、ＳＣで２．２４）ことが明らかとなった。
【００３６】
したがって、一態様において、本発明は、患者に投与された免疫療法の効力の評価方法であって、上記免疫療法はＧＡＤの投与を含み、
第１の時点において上記患者から得られた血液、血漿、または血清の第１の試料中、および、それより後の第２の時点において上記患者から得られた血液、血漿、または血清の第２の試料中の、
・ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布、
・ＧＡＤＡレベル、
・リンパ球から分泌されるサイトカインの分布、および
・ＧＡＤまたはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下におけるリンパ球増殖のうち少なくとも１つを測定する工程と、
得られた測定値を比較する工程とを含み、
上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、上記ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布における、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、および／もしくはＩｇＧ４の相対量の増加、またはＩｇＧ１の相対量の減少；ＧＡＤＡレベルの増加；上記リンパ球から分泌されるサイトカインの分布における、ＩＬ−１３および／もしくはＩＬ−５の相対量の増加、またはＩＦＮγおよび／もしくはＴＮＦαの相対量の減少；ならびに／または、ＧＡＤもしくはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下におけるリンパ球増殖の低下は、有効な免疫療法であることを示唆する、方法に関する。
【００３７】
試料が「第１」および「第２」の試料として指定されているが、これは、最初の第１の時点およびそれより後の第２の時点において得られるまたは得られたという、試料間の関係を定義することのみを意図しており、第１の試料より前に、または、第１の試料が得られた時点と第２の試料が得られた時点との間に、さらなる試料が得られていてかつ任意に分析されている可能性を除外しない。
【００３８】
一実施形態において、
・ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布、
・ＧＡＤＡレベル、
・リンパ球から分泌されるサイトカインの分布、および
・リンパ球増殖
のうち、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つが、上記血液、血漿、または血清の第１の試料中および上記血液、血漿、または血清の第２の試料中において測定される。
【００３９】
一実施形態において、上記第１の試料は、上記免疫療法の開始前もしくは開始時、または上記免疫療法の開始後８０〜１００日目、たとえば９０日目に得られる。
【００４０】
一実施形態において、上記第２の試料は、上記免疫療法の開始後１６０〜２００日目、たとえば１８０日目、または１２、１５、２４、３０、もしくは３６か月目に得られる。
【００４１】
一実施形態において、上記第２の試料は、上記第１の試料が得られた後１６０〜２００日目、たとえば１８０日目、または１２、１５、２４、３０、もしくは３６か月目に得られる。
【００４２】
一実施形態において、上記免疫療法は、ビタミンＤの投与を１日目に開始して毎日実施することと、ＧＡＤのリンパ内注射を３０、６０、および９０日目に実施することとを含む。
【００４３】
一実施形態において、１日目に開始する上記ビタミンＤの投与は、３か月間以上、たとえば４、５、または６か月間続く。
【００４４】
一実施形態において、ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、上記ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布におけるＩｇＧ２の相対量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００４５】
一実施形態において、ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、上記ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布におけるＩｇＧ３の相対量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００４６】
一実施形態において、ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、上記ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布におけるＩｇＧ４の相対量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００４７】
一実施形態において、ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、上記ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布におけるＩｇＧ１の相対量の減少は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００４８】
一実施形態において、ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、上記ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布におけるＩｇＧ１の量に対するＩｇＧ４の量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００４９】
一実施形態において、ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、上記ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布におけるＩｇＧ１の量に対するＩｇＧ２の量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００５０】
一実施形態において、ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、上記ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラスの分布におけるＩｇＧ１の量に対するＩｇＧ１の量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００５１】
一実施形態において、ＧＡＤＡレベルが上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、ＧＡＤＡレベルの増加は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００５２】
一実施形態において、リンパ球から分泌されるサイトカインの分布が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、ＩＬ−１３および／またはＩＬ−５の相対量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００５３】
一実施形態において、リンパ球から分泌されるサイトカインの分布が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、ＩＦＮγおよび／またはＴＮＦαの相対量の減少は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００５４】
一実施形態において、リンパ球から分泌されるサイトカインの分布が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、ＩＦＮγの量に対するＩＬ−１３の量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００５５】
一実施形態において、リンパ球から分泌されるサイトカインの分布が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、ＩＦＮγの量に対するＩＬ−５の量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００５６】
一実施形態において、リンパ球から分泌されるサイトカインの分布が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、ＴＮＦαの量に対するＩＬ−１３の量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００５７】
一実施形態において、リンパ球から分泌されるサイトカインの分布が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、ＴＮＦαの量に対するＩＬ−５の量の増加は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００５８】
一実施形態において、ＧＡＤまたはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下におけるリンパ球増殖が上記第１の試料中および上記第２の試料中で測定され、得られた測定値が比較される、かつ、上記第２の試料中で測定されたものを、上記第１の試料中で測定されたものと比較した際の、ＧＡＤまたはＣＤ３／ＣＤ２８ビーズの存在下におけるリンパ球増殖の低下は、有効な免疫療法であることを示唆する。
【００５９】
一実施形態において、上記免疫療法は、リンパ節内への注射を含むリンパ内注射、皮内注射、皮下注射、または経口投与によるＧＡＤの投与を含む。
【００６０】
さらなる一態様において、本発明は、免疫療法による１型糖尿病の治療または予防方法であって、
対象にＧＡＤを投与する工程と、
上述される方法によって上記免疫療法の効力の評価を得る工程と、
上記評価に基づいて、ＧＡＤの投薬量および／または投与経路を調整する工程とを含む、方法に関する。
【００６１】
一実施形態において、上記得られた測定値の比較が、有効な免疫療法であることを示唆しない場合、上記ＧＡＤの投薬量の調整は、リンパ節内への注射によるＧＡＤのさらなる投与を含む。
【００６２】
一実施形態において、上記方法は、
ビタミンＤの投与を、１日目に開始して３〜６か月間継続する工程と、
ＧＡＤを上記対象のリンパ節内に、３回、それぞれ３０、６０、および９０日目に投与する工程と、
上述される方法によって上記免疫療法の効力の評価を得る工程とを含み、
上記得られた測定値の比較が、有効な免疫療法であることを示唆しない場合、次いで、上記ＧＡＤの投薬量の調整は、リンパ節内へのＧＡＤの４回目の投与を、１日目の後１２〜１８か月目に行なうことを含む。
【００６３】
さらに、ＧＡＤ−ａｌｕｍのリンパ節内への直接投与が大きな成功を収めているが、本発明者らは、何人かの治療患者におけるインスリン産生が、治療レジメンの開始後１５か月〜３０か月目に減少したことを見いだした（刺激Ｃ−ペプチドＡＵＣ（３２％減少）により測定）。しかしながら、ＨｂＡ１ｃおよびインスリン使用は、治療開始時よりも減少していた（それぞれ１５％および２２％減少）。
【００６４】
この結果、本発明者らは、リンパ節内へのＧＡＤ−ａｌｕｍのさらなる投与が有益である可能性があることを見いだした。たとえば、ＧＡＤ−ａｌｕｍのリンパ節内への４回目の投与を、治療開始後１２〜１８か月目、たとえば１５か月目に行なうことができる。
【００６５】
したがって、一態様において、本発明は、免疫療法による、対象における１型糖尿病の治療または予防方法であって、
ビタミンＤの投与を、１日目に開始して３〜６か月間継続する工程と、
ＧＡＤをリンパ節内に、３回、それぞれ３０、６０、および９０日目に投与する工程と、
リンパ節内へのＧＡＤの４回目の投与を、１日目の後１２〜１８か月目に行なう工程とを含む、方法に関する。
【００６６】
ＧＡＤの４回目の投与は、上述される本発明に係る免疫療法の効力の評価の実施後に行なわれてよい。同様に、ＧＡＤのさらなる投与は、上述される本発明に係る免疫療法の効力の評価の実施後で、かつ、対象に提供される免疫療法中の任意の所与の時間にて、行なわれてよい。
【００６７】
一実施形態において、ＨｂＡ１ｃおよび必要インスリン用量が、１回目のＧＡＤ−ａｌｕｍ注射後５〜６か月目に観察されたレベルと比較して、１日目の後１２〜１８か月目に上昇した場合、ならびに、任意に、ＩＦＮ／ＩＬ−１３比率が上記観察の間に減少しなかった場合、４回目の投与が行なわれる。
【００６８】
一実施形態において、ＨｂＡ１ｃおよび必要インスリン用量が、１回目のＧＡＤ−ａｌｕｍ注射後１５か月目に観察されたレベルと比較して、３０か月目にて上昇した場合、ならびに、任意に、ＩＦＮ／ＩＬ−１３比率が上記観察の間に減少しなかった場合、ＧＡＤ−ａｌｕｍのさらなる投与が、１日目の後３０か月目に行なわれる。
【００６９】
一実施形態において、本発明に係る治療方法は、ＧＡＤを上記対象のリンパ節内に、少なくとも３回、それぞれ３０、６０、および９０日目に投与する工程を含み、かつ、所与の時間におけるＨｂＡ１ｃレベルおよび／または上記対象の必要インスリン用量が、上記所与の時間より６〜２４か月間前に観察されたレベルと比較して増加した場合、リンパ節内への少なくとも１回のさらなる投与が行なわれる。
【００７０】
一実施形態において、本発明に係る治療方法は、ＧＡＤを上記対象のリンパ節内に、少なくとも３回、それぞれ３０、６０、および９０日目に投与する工程を含み、かつ、上記リンパ球から分泌されるサイトカインの分布におけるＩＬ−１３および／またはＩＬ−５の相対量が、所与の時間において、上記所与の時間より６〜２４か月間前に観察されたレベルと比較して変化していないまたは減少した場合、リンパ節内への少なくとも１回のさらなる投与が行なわれる。
【００７１】
一実施形態において、本発明に係る治療方法は、ＧＡＤを上記対象のリンパ節内に、少なくとも３回、それぞれ３０、６０、および９０日目に投与する工程を含み、かつ、上記リンパ球から分泌されるサイトカインの分布における比率ＩＦＮγ／ＩＬ−１３が、所与の時間において、上記所与の時間より６〜２４か月間前に観察された上記と同じ比率と比較して変化していないまたは増加した場合、リンパ節内への少なくとも１回のさらなる投与が行なわれる。
【００７２】
一実施形態において、本発明に係る治療方法は、ＧＡＤを上記対象のリンパ節内に、少なくとも３回、それぞれ３０、６０、および９０日目に投与する工程を含み、かつ、ＧＡＤ特異的抗体の集団におけるＩｇＧ１／ＩｇＧ４の比率が、所与の時間において、上記所与の時間より６〜２４か月間前に観察された上記と同じ比率と比較して変化していないまたは増加した場合、リンパ節内への少なくとも１回のさらなる投与が行なわれる。
【００７３】
一実施形態において、本発明に係る治療方法は、ビタミンＤの投与を、リンパ節内へのＧＡＤの４回目のまたは任意のさらなる投与より０〜９０日前に開始して、毎日実施することを含む。
【００７４】
一実施形態において、本発明に係る治療方法において、ビタミンＤは、１日あたり２０００ＩＵの用量にて投与される。
【００７５】
一実施形態において、本発明に係る治療方法において、ビタミンＤは４か月間投与される。
【００７６】
一実施形態において、本発明に係る治療方法において、ＧＡＤは、ａｌｕｍ配合ＧＡＤの形態で投与される。
【００７７】
一態様において、本発明は、本発明に係る治療方法において使用するためのＧＡＤを提供する。
【００７８】
一態様において、本発明は、本発明に係る治療方法において使用するための医薬組成物の製造におけるＧＡＤの使用を提供する。
【００７９】
本発明に係る治療方法は、概してＷＯ２０１５／１８７０８７（その開示内容を引用により本明細書に援用する）中に記載される組成物、方法、および投与レジメンを用いて、ベータ細胞自己抗原ＧＡＤを使用する１型糖尿病の治療に適用してよい。全面的開示を目的として、こうした方法が以下に記載される。
【００８０】
一態様において、本発明は、自己免疫性疾患の予防および／または治療方法であって、血清ビタミンＤレベルが５０ナノモル／リットルを超える対象に組成物を投与する工程を含み、組成物は少なくとも１種のベータ細胞自己抗原を含む、方法を用いる。この結果、これら少なくとも２種の分子の各々は、これら抗原が提示された適応免疫細胞の反応に影響を及ぼし得る。
【００８１】
対象は、血清Ｄ−ビタミンレベルが、５０〜１５０ナノモル／リットル、たとえば６０〜１００ナノモル／リットル、７５〜１００ナノモル／リットル、または１００〜１５０ナノモル／リットルであってよい。
【００８２】
上記方法は、血清ビタミンＤレベルを調整するための対象の前治療を含んでよく、このような前治療は、ビタミンＤおよび／もしくはビタミンＤ類似体の投与、ならびに／またはＵＶＢ放射線曝露を、好ましくは、少なくとも１種のベータ細胞自己抗原を含む組成物を上記対象に投与する７〜９０日前に、行なうことを含んでよい。
【００８３】
上記方法は、ビタミンＤおよび／またはビタミンＤ類似体を、７０００〜７００００ＩＵ／週の量にて、３〜４８か月間投与することをさらに含んでよい。
【００８４】
上記ベータ細胞自己抗原は、上記に定義されるとおりの、ＧＡＤである。
【００８５】
上記方法は、以下に見出し「シクロオキシゲナーゼ阻害剤」の下に記載されるとおりのシクロオキシゲナーゼ阻害剤の投与をさらに含んでよい。
【００８６】
上記方法は、以下に見出し「ＣＴＬＡ４化合物」の下に記載されるとおりのＣＴＬＡ４化合物の投与をさらに含んでよい。
【００８７】
上記方法は、以下に見出し「ＴＮＦアルファ阻害剤」の下に記載されるとおりのＴＮＦアルファ阻害剤の投与をさらに含んでよい。
【００８８】
本発明は、それを必要とする個体における、自己免疫性疾患の予防および／または治療方法であって、上記個体に、
ａ）特異的抗原を寛容化するために、少なくとも１種の自己抗原もしくはその断片、または、上記に列記される自己免疫性および炎症性疾患のうち少なくとも１種に関する分子をコードする核酸、プラスミド、もしくはベクターを投与する工程と（一実施形態において、自己抗原は、血清ビタミンＤレベルが５０〜１５０ｎＭ／ｌ、より好ましくは７５〜１００ｎＭ／ｌ、最も好ましくは１００〜１５０ｎＭ／ｌである場合に投与される。）、
ｂ）ＡＰＣの能力の成熟を妨げるために、上記に列記される、ビタミンＤ、ビタミンＤ類似体、ガンマ−アミノ酪酸、ガンマ−アミノ酪酸類似体、およびチロシンキナーゼ阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種のＩＬ−１０誘発性化合物を上記個体に投与する工程と（一実施形態において、ＩＬ−１０誘発は、ＵＶＢ光曝露の使用によって増大または達成される。）、
ｃ）免疫系の能力によって、ナイーブなＴＣおよびＢＣが活性化され、活性化されたメモリーリンパ球からの応答が呼び戻されるのを妨げるために、上記に列記される、ＮＳＡＩＤ化合物、ＣＴＬＡ−４化合物、またはＴＮＦアルファ阻害剤などの化合物を投与する工程と
を含む、方法を提供する。
【００８９】
本発明は、Ｔ１Ｄおよび自己免疫性糖尿病などの自己免疫性疾患の治療方法であって、上記疾患を有する対象に、
（ａ）抗原提示樹状細胞（ｄｅｎｄｒｉｔｒｉｃ  ｃｅｌｌｓ）が免疫系に対して寛容様式で抗原ペプチドを提示する能力を強化するための、ビタミンＤ（Ｖｉｔ  Ｄ）の複数回投与と、
ｂ）当該自己抗原に対する耐性の回復または誘発に十分な量にて投与される、製薬学的担体中に配合されたＧＡＤ６５などの自己抗原と、任意に、
ｃ）たとえば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（イブプロフェンなど）またはより明白にはｃｏｘ−２もしくはｃｏｘ−１阻害剤といった、抗炎症性化合物の治療用量と
を投与する工程を含む、方法を開示する。
【００９０】
ビタミンＤ（Ｖｉｔ  Ｄ）の複数回投与は、好ましくは、自己抗原の投与の１５〜９０日前、または自己抗原の投与の７〜９０日前に開始され、液体または錠剤の形態で、１週間あたり７０００〜７００００ｉｕに対応する用量にて、３〜４８か月間にわたって与えられる。
【００９１】
ビタミンＤでの前治療は、治療対象のビタミンＤの血清レベルを上昇させて、約５０ナノモル／リットルより高く、または６０、７５、もしくは１００ナノモル／リットルより高くすることを目的とする。この前治療は、対象のビタミンＤの血清レベルが既に上記レベルである場合には、不要とされてよい。
【００９２】
本発明の別の一実施形態において、ビタミンＤ（Ｖｉｔ  Ｄ）の血清濃度は、光線療法によって増大させることができる。この場合、対象は、紫外線Ｂ放射線に、好ましくは、自己抗原の投与の１５〜９０日前に毎日１０〜１２０分間曝露されてよい。この光線療法は３〜４８か月間継続されるべきである。
【００９３】
自己抗原の好ましい用量として、注射による場合には、各回に抗原１０〜２００μｇずつを２〜４回、間隔を少なくとも２週間あけて、より好ましくは１か月間あけて、投与される。経口投与の場合には、好ましい用量は、１日５００ｍｇ〜５ｇを３か月〜４８か月間である。イブプロフェンは、好ましくは、１日用量１００〜８００ｍｇにて、自己抗原投与中の６０〜１５０日間にわたって投与される。
【００９４】
自己抗原は、リンパ内注射によって、すなわち、リンパ節内に直接注射することによって、投与できる。抗炎症性化合物および自己抗原は、製薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈剤中にて、またはこれらと共に、投与できる。
【００９５】
一実施形態において、ベータ細胞自己抗原を含有する組成物は、治療初期である３〜４か月目は間隔を１〜４週間あけて、たとえば２〜４週間または２週間あけて、かつ、任意に、継続治療期間である６〜９か月目は間隔を２〜３か月間あけて、投与される。
【００９６】
一実施形態において、ベータ細胞自己抗原の量は、治療期間の始めは投与１回あたり１〜５μｇであるものが、投与の終わりには投与１回あたり約４０〜１００μｇに増加される。
【００９７】
本発明の一実施形態において、自己抗原の投与は、常在性ＡＰＣが免疫系に抗原ペプチドを提示できるよう、リンパ節内またはリンパ系内に直接行なわれる。自己抗原の投与がリンパ節内またはリンパ系内に直接行なわれる場合、その用量は、好ましくは自己抗原１種あたり１〜１５μｇ、より好ましくは自己抗原１種あたり２〜１０μｇまたは自己抗原１種あたり２〜５μｇであってよい。ａｌｕｍ中に配合することが好ましい。
【００９８】
特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種の自己抗原は、鼠蹊内、リンパ節内、またはリンパ内に投与される。いくつかの実施形態において、鼠蹊内注射される抗原の体積は、０．０５〜０．２ｍｌ、より好ましくは０．０５〜０．１５ｍｌである。
【００９９】
特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種の抗原がリンパ節内またはリンパ内注射によって投与される場合、好ましい投薬量は、注射１回あたり、かつ使用される自己抗原１種あたり、１〜１５ｕｇ、より好ましくは２〜１０、最も好ましくは２〜５ｕｇであり、この投与が、少なくとも２回、より好ましくは少なくとも３回、最も好ましくは少なくとも４回、間隔を少なくとも１４日間あけて、より好ましくは少なくとも３０日間あけて、行なわれる。
【０１００】
特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種の抗原が静脈内に投与される場合、各抗原あたり少なくとも１００〜１００００ｕｇが、治療１回あたりに、少なくとも２回で、間隔を少なくとも１週間あけて、投与される。
【０１０１】
特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種の抗原が経口投与される場合、各抗原あたり少なくとも０．５〜５ｇが、治療１回あたりに、１週間に少なくとも１回、投与される。
【０１０２】
特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種の抗原は、他の抗原とは別々に、または場合によっては他の抗原と一緒に、ａｌｕｍ中、生理食塩水中、またはヒト血清アルブミン中に配合される。
【０１０３】
特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種の医薬組成物は、少なくとも２種の抗原を、同一の担体粒子上に含む。特定の他の実施形態によれば、上記少なくとも１種の医薬組成物は、少なくとも２種の抗原を、異なる担体粒子上に含む。特定の実施形態によれば、上記少なくとも２種の抗原は、別々に、かつ、その特定の抗原にとって好適な、異なる時点および頻度、レジメン、および配合で投与される。より好ましくは、上記少なくとも２種の抗原は、同一の医薬組成物中に配合され、その結果、同時に投与される。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、上記少なくとも１種の抗原は、ａｌｕｍなどのアジュバント中に配合される。さらなる具体的な実施形態において、上記少なくとも１種の抗原は、生理食塩水中またはヒト血清アルブミン中に配合される。
【０１０５】
特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種の抗原および上記少なくとも１種のＩＬ−１０誘発性化合物は、同時に投与される。特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種の抗原および上記少なくとも１種のＩＬ−１０誘発性化合物は、別々に投与される。
【０１０６】
特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種のＩＬ−１０誘発性化合物は、上記少なくとも１種の抗原と同時に投与される。特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種のＩＬ−１０誘発性化合物の投与は、上記少なくとも１種の抗原の１回目の投与の１〜１４日前に開始される。特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種のＩＬ−１０誘発性化合物の投与は、上記少なくとも１種の自己抗原の１回目の投与の、少なくとも２週間前、好ましくは少なくとも１０週間に開始される。
【０１０７】
ビタミンＤでの治療期間を含む特定の実施形態によれば、５００〜１００００ＩＵ、より好ましくは１０００〜３０００ＩＵの、ビタミンＤ３などのビタミンＤが、１日あたりに投与される。
【０１０８】
ビタミンＤでの前治療期間を含む特定の実施形態によれば、７，０００〜１００，０００ＩＵの、ビタミンＤ３などのビタミンＤが、１週間あたりに、上記少なくとも１種の抗原の１回目の投与より前に、投与され、その後の維持用量は、１日あたり５００〜２０００ＩＵとされる。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、ビタミンＤでの治療期間は、抗原の１回目の投与後６０〜４２０日目である。
【０１１０】
ナイーブなＴＣおよびＢＣを活性化しかつ活性化されたメモリーリンパ球からの応答を呼び戻す免疫系の能力を低下させる、ＮＳＡＩＤ化合物、ＣＴＬＡ−４化合物、またはＴＮＦα阻害剤などの化合物は、上記少なくとも１種の抗原および／または上記少なくとも１種のＩＬ−１０誘発性化合物と同時に、または、これらとは別々に、投与されてよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、ナイーブなＴＣおよびＢＣを活性化しかつ活性化されたメモリーリンパ球からの応答を呼び戻す免疫系の能力を低下させる化合物は、ＣＯＸ−阻害剤などのＮＳＡＩＤ化合物である。
【０１１２】
特定の実施形態によれば、ＮＳＡＩＤでの治療期間は、上記少なくとも１種の抗原の１回目の投与の少なくとも２週間前に開始される。
【０１１３】
特定の実施形態によれば、ＣＯＸ阻害剤がイブプロフェンである場合、１日あたり少なくとも１回用量の４００〜１０００ｍｇが、ＮＳＡＩＤ治療期間中に投与される。
【０１１４】
ＮＳＡＩＤ治療期間は、少なくとも４〜１４週間、より好ましくは４〜８週間である。
【０１１５】
この方法において、抗炎症性化合物は、経口または注射によって投与されるべきである。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、ナイーブなＴＣおよびＢＣを活性化しかつ活性化されたメモリーリンパ球からの応答を呼び戻す免疫系の能力を低下させる化合物は、ＴＮＦα阻害剤である。
【０１１７】
ＴＮＦアルファの遮断によって、免疫応答の活性化状態が抑制され、ＤＣおよび他の免疫細胞の活性が低下する。さらに、ＴＮＦアルファは、リンパ組織内においてＦＳＣおよびＧＣの構造を破壊し、Ｂ細胞の機能を損なうものであるため、抗原特異的なエフェクターＴ細胞および自己抗体の産生の活性化が低下する。最近の糖尿病前臨床データから、休止状態のＤＣにより運搬されるベータ細胞抗原は、末梢Ｔ細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ）の非応答を誘発でき、進行中のベータ細胞破壊を下方調節でき、ベータ細胞破壊を抑止できる、ということが示される。したがって、自己抗原とＴＮＦアルファ阻害剤との併用療法によれば、自己抗体レベルとエフェクターＴ細胞の活性および数とを比較的低下させることができ、かつ、自己抗原特異的なＴｒｅｇの数および機能を少なくとも維持できる。こうした免疫学的プロセスの変更およびその作用の記録には何か月もかかるが、この間、ＴＮＦアルファ阻害によって、そのベータ細胞保護および代謝作用が急速に生じるために、さらに、ベータ細胞が直接保存され得る。ＧＡＤ６５はＴ１ＤＭにおける主要な自己抗原の１つであるとして知られているため、このアプローチが、糖尿病の自己免疫応答を、十分な限界質量（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｍａｓｓ）の制御的表現型の方に偏移させ、ベータ細胞の保存に対する顕著かつ長期的な作用を導く。
【０１１８】
したがって、本発明の一態様において、たとえばインフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、およびエタネルセプトに限定されないＴＮＦ−アルファ阻害剤が、抗炎症性化合物として使用される。エタネルセプトが使用される場合、好ましい用量は、０．２〜１ｍｇ／ｋｇ  ＳＱ、１週間あたり１回または２回、２〜９か月間である。
【０１１９】
特定の実施形態によれば、ＴＮＦα阻害剤がエタネルセプトである場合、ＦＤＡ承認の投薬量である、０、２、および６週目に５ｍｇ／ｋｇが好ましい。別の一実施形態において、この用量は、第Ｉ相のＴＮＦα阻害剤単独療法試験において用いられるもの（０．４ｍｇ／ｋｇ（最大２５ｍｇ）  ＳＱ、週２回を２６週間）と同一である。最も好ましい別の一実施形態において、投与は２回だけであり、ビタミンＤおよび自己抗原を含む併用治療レジメンにおいて、最大２５ｍｇ／投与である。
【０１２０】
特定の実施形態によれば、ＴＮＦα阻害剤は、上記少なくとも１種の抗原の１回目の投与より前に投与される。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、ナイーブなＴＣおよびＢＣを活性化しかつ活性化されたメモリーリンパ球からの応答を呼び戻す免疫系の能力を低下させる化合物は、アバタセプトなどのＣＴＬＡ−４化合物である。具体的な実施形態によれば、上記化合物がアバタセプトである場合、アバタセプトの投与は、治療１回あたりの用量が少なくとも２〜２０ｍｇ／ｋｇにて、上記少なくとも１種の抗原の１回目投与時点の＋／−７日以内に開始される。
【０１２２】
特定の実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４化合物は、上記少なくとも１種の抗原の１回目の投与と同時に投与される。
【０１２３】
特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種の抗原ならびにナイーブなＴＣおよびＢＣを活性化しかつ活性化されたメモリーリンパ球からの応答を呼び戻す免疫系の能力を低下させる化合物の投与は、ＴＣ上のＣＤ２８を確実に遮断するために、場合によっては１４、２８、および４５日目（＋／−１週間）に繰り返して行なわれ、その際、１日目は、上記少なくとも１種のＩＬ−１０誘発性化合物の１回目の投与日である。
【０１２４】
一態様において、本発明は、Ｔ１Ｄに関連する１つ以上の症状の治療方法を提供する。Ｔ１Ｄに関連する症状は、インスリン産生の低下、インスリン感受性の低下、高い血中グルコースレベル、インスリン産生細胞の破壊、およびＣペプチドレベルの異常を含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
本発明に係る方法は、Ｔ１Ｄだけでなく、一般的に自己免疫性疾患および障害の治療および予防に関するものであってよい。たとえば、対象は、バセドウ病（Ｇｒａｖｅ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）、橋本甲状腺炎、低血糖（ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｉｍｉａ）、多発性硬化症、混合型本態性クリオグロブリン血症、全身性エリテマトーデス（ｅｒｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、関節リウマチ（ＲＡ）、セリアック病、Ｔ１Ｄ、またはそれらの任意の組み合わせに罹患している。こうした場合、上記疾患に関連する自己抗原が、自己抗原として、治療方法に含まれる必要がある。本発明の一態様において、対象は、抗原特異性を有するＴ細胞もしくはＢ細胞、または、自己抗原に対するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）もしくはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）抗原特異性を有するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）および／もしくはＢ細胞に関与する自己免疫応答に罹患している。
【０１２６】
特定の実施形態によれば、本発明に係る治療される個体は、哺乳動物である。具体的な実施形態によれば、本発明に係る治療される個体は、ヒトである。特定の実施形態によれば、本発明に係る治療される個体は、幼児である。具体的な実施形態によれば、本発明に係る治療される個体は、ヒト青年である。具体的な実施形態によれば、本発明に係る治療される個体は、ヒト成人である。
【０１２７】
いくつかの実施形態において、治療されるヒト対象は、４歳を超えている。
【０１２８】
他の実施形態において、治療されるヒト対象は、８歳以上である。
【０１２９】
他の実施形態において、治療されるヒト対象は、１０歳以上である。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、治療されるヒト対象は、１８歳以下である。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、治療されるヒト対象は、４〜１０歳、または４〜１８歳、または８〜１８歳、または１０〜１８歳である。
【０１３２】
他の実施形態において、治療されるヒト対象は、１８歳以上である。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、治療されるヒト対象は、１８〜３０歳である。
【０１３４】
ＩＬ−１０誘発性化合物
いくつかの態様において、本発明に係る方法、組成物、およびキットは、ＩＬ−１０誘発性化合物を使用する。
【０１３５】
特定の実施形態によれば、上記少なくとも１種のＩＬ−１０誘発性化合物は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤなどのビタミンＤである。
【０１３６】
特定の他の実施形態によれば、上記少なくとも１種のＩＬ−１０誘発性化合物は、ＴＸ５２７などのビタミンＤ類似体である。
【０１３７】
特定の他の実施形態によれば、上記少なくとも１種のＩＬ−１０誘発性化合物は、ＵＶＢ放射線による血清ビタミンＤの増大を含む。
【０１３８】
特定の他の実施形態によれば、上記少なくとも１種のＩＬ−１０誘発性化合物は、ダサチニブ、ボスチニブ、サラカチニブ、イマチニブ、スニチニブ、またはそれらの組み合わせなどの、チロシンキナーゼ阻害剤である。
【０１３９】
具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤はダサチニブである。
【０１４０】
他の具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤はボスチニブである。
【０１４１】
他の具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤はサラカチニブである。
【０１４２】
他の具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤はイマチニブである。
【０１４３】
他の具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤はスニチニブである。
【０１４４】
他の具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、ダサチニブ、ボスチニブ、サラカチニブ、イマチニブ、およびスニチニブのうち少なくとも２種の組み合わせである。たとえば、チロシンキナーゼ阻害剤は、ダサチニブおよびボスチニブの組み合わせであってよい。他のさらなる具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、ダサチニブおよびサラカチニブの組み合わせである。他のさらなる具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、ダサチニブおよびイマチニブの組み合わせである。他のさらなる具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、ダサチニブおよびスニチニブの組み合わせである。他のさらなる具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、ボスチニブおよびサラカチニブの組み合わせである。他のさらなる具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、ボスチニブおよびイマチニブの組み合わせである。他のさらなる具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、ボスチニブおよびスニチニブの組み合わせである。他のさらなる具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、イマチニブおよびスニチニブの組み合わせである。他のさらなる具体的な実施形態によれば、チロシンキナーゼ阻害剤は、ダサチニブ、ボスチニブ、およびサラカチニブの組み合わせである。
【０１４５】
本発明に係る組成物は、複数種のＩＬ−１０誘発性化合物を含んでよい。したがって、特定の実施形態によれば、組成物は、少なくとも２種のＩＬ−１０誘発性化合物を含む。特定の他の実施形態によれば、組成物は、少なくとも３種のＩＬ−１０誘発性化合物を含む。特定の他の実施形態によれば、組成物は、少なくとも４種のＩＬ−１０誘発性化合物を含む。
【０１４６】
シクロオキシゲナーゼ阻害剤
いくつかの態様において、本発明に係る方法、組成物、およびキットは、１種以上のシクロオキシゲナーゼ阻害剤を使用する。
【０１４７】
こうしたシクロオキシゲナーゼ阻害剤は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）であってよい。さらなる具体的な実施形態によれば、ＮＳＡＩＤは、イブプロフェン、デクスイブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、デクスケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、アセクロフェナク、ナブメトン、アスピリン（アセチルサリチル酸）、ジフルニサル（Ｄｏｌｏｂｉｄ）、サリチル酸、サルサラート（Ｄｉｓａｌｃｉｄ）、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブ、およびニメスリドからなる群より選択される。
【０１４８】
特定の実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、イブプロフェン、デクスイブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、デクスケトプロフェン、フルルビプロフェン、オキサプロジン、またはロキソプロフェンなどの、プロピオン酸誘導体である。
【０１４９】
特定の実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、インドメタシン、トルメチン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、アセクロフェナク、またはナブメトンなどの、酢酸誘導体である。
【０１５０】
特定の実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、アスピリン（アセチルサリチル酸）、ジフルニサル（Ｄｏｌｏｂｉｄ）、サリチル酸、またはサルサラートなどの、サリチル酸塩である。
【０１５１】
特定の実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、またはイソキシカムなどの、エノール酸（ｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）（オキシカム）誘導体である。
【０１５２】
特定の実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、メフェナム酸、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、またはトルフェナム酸などの、アントラニル酸誘導体である。
【０１５３】
特定の実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、またはエトリコキシブなどの、選択的ＣＯＸ−２阻害剤である。
【０１５４】
さらなる具体的な実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、イブプロフェンである。
【０１５５】
さらなる具体的な実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、デクスイブプロフェンである。
【０１５６】
さらなる具体的な実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、ナプロキセンである。
【０１５７】
さらなる具体的な実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、フェノプロフェンである。
【０１５８】
さらなる具体的な実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、ケトプロフェンである。
【０１５９】
さらなる具体的な実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、デクスケトプロフェンである。
【０１６０】
さらなる具体的な実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、フルルビプロフェンである。
【０１６１】
さらなる具体的な実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、オキサプロジンである。
【０１６２】
さらなる具体的な実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、ロキソプロフェンである。
【０１６３】
さらなる具体的な実施形態によれば、シクロオキシゲナーゼ阻害剤は、インドメタシンである。
【０１６４】
イブプロフェンは、主としてｃｏｘ−２を遮断するが、ある程度はｃｏｘ−１をも遮断する。イブプロフェンは、狭いＩＬ−１遮断薬よりも、免疫系に対する作用がやや広く、かつ、非常に顕著な抗炎症作用を有し、重篤なリスクを伴わない。イブプロフェンを使用することによって、ベータ細胞炎症が抑制され、かつ、ビタミンＤ（Ｖｉｔ  Ｄ）強化されたＤＣが、Ｔ細胞に提示された自己抗原に由来するペプチドに対する耐性を誘発できるようになり、その結果、対象においてベータ細胞を保護できるようになる。
【０１６５】
ＣＴＬＡ４化合物
いくつかの態様において、本発明に係る方法、組成物、およびキットは、細胞毒性Ｔ−リンパ球関連抗原４免疫グロブリンなどの、ＣＴＬＡ−４化合物を使用する。
【０１６６】
さらなる具体的な実施形態によれば、ＣＴＬＡ−４化合物は、アバタセプトである。
【０１６７】
アバタセプト（Ｆｃで改変されたＣＴＬＡ４免疫グロブリン）は、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外部分とヒトＩｇＧ１の重鎖とからなる、Ｔ細胞障害性かつ免疫調節性の融合タンパク質である。ナイーブＴ細胞の活性化に関与する共刺激シグナルを遮断する。これがＡＰＣ上のＣＤ８０／８６とライゲーションすると、ＣＤ８０／８６誘発性ＩＬ−６が妨害かつ低減される可能性があり、これによって、ＩＬ−１ベータ、ＩＦＮガンマ、およびＩＬ−１７などの炎症性サイトカインが下方調節され得る。さらに、アバタセプトのＣＤ８０／８６とのライゲーションによって、ＡＰＣにおいてインドールアミンジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）が誘発される可能性があり、そして、これによって、Ｔ細胞におけるアネルギーが誘発され、かつ、活性化Ｔ細胞によるナイーブＴ細胞の傍分泌活性化が下方調節され得る。Ｂ細胞上に発現しているＣＤ８０／８６は、さらに、アバタセプトが免疫調節機能を発揮するさらなる経路であり得る。
【０１６８】
ＴＮＦアルファ阻害剤
いくつかの態様において、本発明に係る方法、組成物、およびキットは、アダリムマブ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、またはインフリキシマブなどの、ＴＮＦアルファ阻害剤を使用する。さらなる具体的な実施形態によれば、ＴＮＦアルファ阻害剤は、アダリムマブである。他のさらなる具体的な実施形態によれば、ＴＮＦアルファ阻害剤は、セルトリズマブである。他のさらなる具体的な実施形態によれば、ＴＮＦアルファ阻害剤は、エタネルセプトである。他のさらなる具体的な実施形態によれば、ＴＮＦアルファ阻害剤は、ゴリムマブである。他のさらなる具体的な実施形態によれば、ＴＮＦアルファ阻害剤は、インフリキシマブである。
【０１６９】
本発明は、分子生物学分野において通常の知識を有する者に周知されるポリヌクレオチド操作技術を含む従来の分子生物学的手法の理解を前提とする。こうした周知の技術の例は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）中に見いだすことができる。従来の分子生物学的技術の例を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏライゲーション、制限エンドヌクレアーゼ消化、ＰＣＲ、細胞形質転換、ハイブリダイゼーション、電気泳動、ＤＮＡシーケンシングなどを含むが、これらに限定されない。
【０１７０】
本発明は、また、免疫学分野において通常の知識を有する者に周知される従来の免疫生物学的手法の理解を前提とする。基本的な情報および方法を、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｂｉｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，４  ｖｏｌｕｍｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．中に見いだすことができ、これは、実験動物の管理と扱い、免疫応答の誘発、リンパ球機能のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、リンパ球機能のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ、免疫蛍光および細胞選別、サイトカインおよびその細胞受容体、ヒトにおける免疫学的研究、タンパク質、ペプチドの単離および分析、細胞活性化の分子生物学、生化学、補体、自然免疫、自己免疫性および炎症性疾患の動物モデル（ＮＯＤマウスモデル、ＳＬＥマウスモデル（ループスの）、および制御性Ｔ細胞の除去による自己免疫性疾患の誘発についてのチャプターを含む）、抗原のプロセシングおよび提示、免疫性分子および受容体の設計、免疫系におけるリガンド−受容体相互作用、顕微鏡法、ならびに、一般的な免疫系遺伝子およびタンパク質（白血球表面分子のＣＤ分類を含む）についての省略形および専門用語に関する教示を含む。
【０１７１】
実験
以下に提供される実施例は、本発明のいくつかの態様および実施形態を例示することを意図する。これらは、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではなく、本発明の範囲を限定するのは、付属の請求項である。
【実施例】
【０１７２】
実施例１
方法
手順
パイロット試験（ＮＣＴ０２３５２９７４）に参加したＴ１Ｄ患者の群（ｎ＝６）に、４μｇのＧＡＤ−ａｌｕｍ（Ｄｉａｍｙｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ、ストックホルム）を、鼠蹊部のリンパ腺内に１回目注射し、続いて、追加免疫注射を２回、４μｇずつ１か月間隔で注射した。平行して、ビタミンＤ  ２０００Ｕ／ｄを与えた。これとは別の患者のコントロール群（ｎ＝６）で、ＧＡＤ−ａｌｕｍ  各２０μｇを１か月間隔で２回皮下注射し、平行してビタミンＤ  ２０００Ｕ／ｄを与えた群を、暗号開示前の盲検条件下において、年齢および性別を調和させるために、かつ、他に記載される二重盲検プラセボ対照試験（ＮＣＴ０１７８５１０８）（図１）の参加者から試料を入手できるか否かに応じて、選択した。
【０１７３】
臨床検査
臨床分析を、スウェーデンのＬｉｎｋｏｅｐｉｎｇ大学（Ｌｉｎｋｏｅｐｉｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）にて行なった。血液および血清試料を、ベースラインにて、ならびに、ＬＮ群では３０、６０、９０、および１８０日後、ＳＣ群では１５、４５、９０、および１８０日後に採取した。試料は午前中に採取し、２４時間以内に、Ｌｅｕｃｏｓｅｐ（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ  Ｏｎｅ）を製造元の説明書の通りに使用して、ＰＢＭＣを単離した。
【０１７４】
血清抗体およびＩｇＧサブクラス
血清ＧＡＤ自己抗体（ＧＡＤＡ）およびＩＡ−２Ａを、全く同一に、放射性結合アッセイにより、以前に記載される３５Ｓ標識組換えヒトＧＡＤ６５を使用して、推定した。セファロースタンパク質Ａを使用して、遊離体の抗体結合標識ＧＡＤ６５を分離した。この研究室が参加した糖尿病自己抗体標定プログラム（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ）（ＩＡＳＰ）によって、ＧＡＤＡアッセイの感受性は７０％、特異性は１００％であり、ＩＡ−２Ａに対する感受性は９９％、特異性は１００％であったことが示された。
【０１７５】
総血清ＩｇＥを、ＩｍｍｕｎｏＣａｐ１００Ｅ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｄｉａ  ＡＢ、ウプサラ、スウェーデン）を使用して定量した。このアッセイによる測定範囲は２〜５００００ｋＵ／Ｌであり、検量用試料を全く同様に流して、完全な検量線を得た。総ＩｇＥレベル≧８５ｋＵ／Ｌであるものを、ポジティブとみなした。
【０１７６】
リンパ球増殖アッセイ
増殖アッセイ用に、ＰＢＭＣを細胞１０６個／ｍｌにてＡＩＭ−Ｖ培地中に再懸濁し、丸底９６ウェルプレート中において、５μｇ／ｍｌ  ｒｈＧＡＤ６５（Ｄｉａｍｙｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ、ストックホルム、スウェーデン）の存在下、ポジティブコントロールとしてＣＤ３／Ｃ２８ビーズ（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＡＳ，オスロ、ノルウェイ）の存在下、および培地単独中にて、各３通りずつ（細胞２×１０５個／ウェル）、インキュベートした。３日後、細胞に、１８時間かけて０．２μＣｉの［３Ｈ］チミジン／ウェル（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を瞬間適用して、その後回収した。増殖を、１４５０  Ｗａｌｌａｃ  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ｃｏｕｎｔｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、シェルトン、ＣＴ、米国）を使用して記録し、各培養条件について３通りの平均を培地単独の３通りの平均で除したものを計算して、刺激指標（ＳＩ）として表した。
【０１７７】
サイトカイン分泌アッセイ
サイトカイン定量およびフローサイトメトリー用に、百万個のＰＢＭＣを、２０μＭ  β−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、米国）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地１ｍｌ中に希釈して、７日間、３７℃にて、５％ＣＯ２中、５μｇ／ｍｌ  ｒｈ−ＧＡＤ６５の存在下において培養した。さらなるウェルに培地単独およびＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを入れたものを、各試料について、それぞれネガティブコントロールおよびポジティブコントロールとして使用した。７日後、ＰＢＭＣを上清から分離して、上清は、マルチプレックス複数の蛍光色素分析に使用するまで−７０において保存し、細胞は、フローサイトメトリーに直接使用した。
【０１７８】
サイトカインであるインターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、およびインターフェロン（ＩＦＮ）−γを、細胞培養上清中において、Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏサイトカインパネル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ハーキュリーズ、ＣＡ、米国）を製造元の説明書の通りに使用して、測定した。データを、Ｌｕｍｉｎｅｘ  ２００（商標）（Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭＡＰ（商標）Ｃｏｒｐｏｌａｔｉｏｎ、オースティン、ＴＸ、米国）を使用して収集した。検出下限は、ＩＬ−２について１．３８ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−５について１．２７ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−１０について０．１４ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−１３について０．４３ｐｇ／ｍｌ、ＩＬ−１７について１．５４ｐｇ／ｍｌ、ＩＦＮ−γについて２．１ｐｇ／ｍｌ、ＴＮＦ−αについて３．７１ｐｇ／ｍｌであった。特異的抗原誘発性サイトカイン分泌レベルを、自発性分泌（すなわち、培地単独中にて培養したＰＢＭＣからの分泌）をＧＡＤ６５での刺激後の分泌から差し引くことによって、計算した。
【０１７９】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリー解析用に、ＰＢＭＣを、β−メルカプトエタノールと共に、ＡＩＭ−Ｖ培地中、３７℃にて、５％ＣＯ２で、７日間、５μｇ／ｍｌ組換えＧＡＤ６５を添加してまたは添加せずに、インキュベートした。インキュベート後、細胞を、０．１％ＢＳＡ含有ＰＢＳ中において洗浄し、続いて、Ａｌｅｘａ−７００標識抗ＣＤ３（クローンＵＣＨＴ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ標識抗ＣＤ４（クローンＲＰＡ−Ｔ４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）−Ｈ７標識抗ＣＤ８（クローンＳＫ１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５標識抗ＣＤ４５ＲＡ（クローンＨＩ１００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、フィコエリトリン（ＰＥ）標識抗ＣＣＲ７（クローンＧ０４３Ｈ７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ１２７（クローンｅＢｉｏＲＤＲ５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、およびＰＥ−Ｃｙ７標識抗ＣＤ２５（クローンＢＣ９６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色した。表面染色後、細胞を固着させて、ＦＯＸＰ３染色バッファーセット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を製造元の説明書の通りに使用して、透過処理した。次いで、細胞を、ＡＰＣ標識抗ＦＯＸＰ３（クローンＰＣＨ１０１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて染色し、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ  ｖ８ソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を実行して取得した。データを、Ｋａｌｕｚａ  ｖ１．３（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して分析した。
【０１８０】
統計学的分析
データ分布を、コルモゴロフ−スミルノフ検定（Ｋｏｍｏｌｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ  ｔｅｓｔ）を使用して試験した。正規分布に従う変数を平均として提示し、群間の差異を、Ｐａｉｒｅｄ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｔｅｓｔによって計算した。群間の差異を、スチューデントＴ検定を使用して計算した。非正規分布の変数については、ノンパラメトリック検定を適用した（ウィルコクソン検定に関する試料およびマン・ホイットニー検定）。カテゴリー変数間の差異を、カイ二乗検定（χ２検定）によって計算した。確率レベルが＜０．０５であった場合に、統計学的に有意とみなした。計算を、ＩＢＭ  ＳＰＳＳ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２３（ＩＢＭ  ＳＰＳＳ、アーモンク、ＮＹ、米国）にて行ない、挿入グラフを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ラホヤ、ＣＡ、米国）を用いて作成した。
【０１８１】
結果
患者を、ＧＡＤ−ａｌｕｍ注射をリンパ節（ＬＮ）に行なった患者と皮下（ＳＣ）に行なった患者とに階層化した。性別分布は両群とも同じであったが、平均年齢は、ＳＣ群（１４歳）よりもＬＮ患者（２２歳）の方が高かった（ｐ＜０．００１）。ベースラインにおいて、両群のベースライン平均Ｃ−ペプチド（空腹時、最大刺激、およびＡＵＣ）は類似していた。治療前のＨｂＡ１ｃ値はＬＮ患者の方が高く、当該患者ではインスリン用量が低かった（ｐ＞０．０５）。ＧＡＤＡおよびＩＡ−２Ａ自己抗体レベルについては、両群間に差はなかった（表１）。
【０１８２】
患者の追跡により、空腹時および刺激ｃ−ペプチド（ＡＵＣ）はＬＮ群においては１８０日目で安定のままであったが、糖化ヘモグロビンレベルおよびインスリン取り込みは減少したことが示された。ＳＣ群の患者は、刺激ｃ−ペプチドの低下がより大きく、かつ、糖化ヘモグロビンレベルがより高く、インスリン取り込みが増加した（表１）。
【０１８３】
ＧＡＤＡタイターおよびＧＡＤＡサブクラスの分析
ＧＡＤＡレベルが、ＳＣおよびＬＮ共に、ＧＡＤ−ａｌｕｍの２回目の注射後に増大した（図２ａ）。しかしながら、低用量のＧＡＤ−ａｌｕｍのＬＮ投与では、より高用量のＳＣ注射よりも、ＧＡＤＡレベルが２９倍高く誘発された。
【０１８４】
次に、ＧＡＤＡ  ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４サブクラス分布を見て、各試料中の全サブクラスの合計（すなわち、総ＩｇＧ）に対する各サブクラスの頻度を計算した。ベースラインＧＡＤＡサブクラス分布は２群で類似しており、ＩｇＧ１が最も頻度が高く、続いてＩｇＧ３＞ＩｇＧ２〜（一重波線、ほぼ等しいの意）ＩｇＧ４であった（図２ｂ）。ＩｇＧ１の割合は、ＬＮ群およびＳＣ群の両方において、ベースラインから９０日間で減少したが、他のサブクラスの割合は増加した。印象的であることに、ＳＣ群における１８０日目のＧＡＤＡサブクラスの分布はベースラインで観察されるものと類似していたが、ＬＮ群におけるＩｇＧ１の割合はさらに減少しており、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４は劇的に増加した（図２ｃ）。
【０１８５】
ＧＡＤ−ａｌｕｍに応答して生じ得るアレルギー関連作用を無視するために、総ＩｇＥを、ベースラインおよび１８０日目に測定した。結果から、リンパ内注射した患者および皮下注射した患者におけるベースラインＩｇＥレベルが類似しており、レベルが治療の影響を受けず、１８０日後も変化しなかったことが示された（データ表示なし）。
【０１８６】
サイトカイン分泌および相対的寄与
次に、培養７日後に採取したＰＢＭＣ上清中のサイトカイン分泌を分析した。ベースラインサイトカイン分泌は２群で類似していた。
【０１８７】
ＩＬ−５、ＩＬ−１３、ＩＦＮ−γ、およびＩＬ−１７のＧＡＤ６５誘発性分泌が、９０日目に、２回目のＧＡＤ−ａｌｕｍのＳＣ投与およびＬＮ投与のいずれの後でも増加し、ＳＣ群におけるＩＬ−２も同様であった。ＬＮ内への３回目のＧＡＤ−ａｌｕｍ注射の結果、ＩＬ−１３分泌が支配的となり、ＩＦＮγの１８０日目（１８０  ｄａｙｓ  ｍｏｎｔｈｓ）におけるレベルが低くなった。一方、ＩＦＮγは、ＳＣ群において同時点において最も多く分泌されたサイトカインであった（図３ａ）。
【０１８８】
さらに、各サイトカインによる総ＧＡＤ６５誘発性サイトカイン分泌に対する相対的寄与を評価した。ＬＮ群において、ＧＡＤ−ａｌｕｍの２回目の注射に続いて９０日目に、広いサイトカインプロファイルが観察され、一方、３回目の注射の後の１８０日目におけるサイトカイン分泌は、Ｔｈ２関連サイトカインＩＬ−１３が支配的であった。ＳＣ群におけるサイトカインプロファイルも、９０日目における広いサイトカイン分泌とＴｈ２サイトカインの支配的分泌とが特徴的であったが、サイトカイン分布は、１８０日目に、支配的なＴｈ−１様応答にシフトした（図３ｂ）。
【０１８９】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＧＡＤ６５による刺激
ＧＡＤ６５誘発性の増殖が、ＬＮおよびＳＣのいずれについても、ＧＡＤ−ａｌｕｍの２回目の注射によって増加した。ＬＮ群への３回目の注射の結果、１８０日目において増殖が減少したが、ＳＣ群においては安定したままであった。ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズでの刺激により誘発された増殖は、ＧＡＤ６５に誘発されたものと同じ分布を示した（図４）。
【０１９０】
Ｔ細胞免疫表現型
Ｔ細胞の分化状態およびＧＡＤ６５誘発性活性化を監視した。ＣＤ８、ＣＤ４、および制御性Ｔ細胞の分析に続くゲート戦略の代表的な例が示される（図５）。
【０１９１】
ＧＡＤ−ａｌｕｍの２回目の注射後に、ＧＡＤ６５刺激により、両群において活性化ＣＤ２５＋ＣＤ１２７＋Ｔ細胞が誘発された。ＬＮにおいて、患者３人において活性化ＣＤ４  Ｔ細胞がより高い頻度で検出されたが、ＣＤ８  Ｔ細胞の活性化は穏やかまたは検出不可能であった。一方、ＳＣ群においては、活性化ＣＤ８  Ｔ細胞の割合がより支配的であり、ＣＤ４細胞のＧＡＤ６５活性化の発現は弱かった（図６ａ〜６ｂ）
【０１９２】
ＣＤ４＋ＦＯＸＰ３＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏｗ／−Ｔｒｅｇの分析から、安静時Ｔｒｅｇは試験期間を通じて変動しなかったが、抗原呼び戻しによって、制御的表現型を有する細胞の増加が、両群において１８０日目に誘発されたことが示された（図６ｃ〜６ｄ）。ＣＤ４５ＲＡを添加したさらなる分析から、両群において非抑制性ＦＯＸＰ３ｌｏＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞の増大が明らかになった（図６ｅ〜６ｆ）。
【０１９３】
ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞を、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７の発現に応じて、ナイーブ（ＴＮ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７＋）、セントラルメモリー（ＴＣＭ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７＋）、エフェクターメモリー（ＴＥＭ、ＣＤ４５ＲＡ−ＣＣＲ７−）、および高分化エフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ、ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＣＲ７−）細胞としてさらに分類した（図７）。ＬＮおよびＳＣの両群ともに、９０日後のナイーブなＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の割合が漸進的に減少したが、メモリー細胞およびエフェクター細胞の頻度は、ＧＡＤ６５刺激ＰＢＭＣにおいて増加した（図７ａ〜７ｈ）。
【０１９４】
【表１】
2020533581.tif 000002
【０１９５】
【表２】
2020533581.tif 000003
【０１９６】
リンパ節内（ＬＮ、ｎ＝６）または皮下（ＳＣ、ｎ＝６）にＧＡＤ−ａｌｕｍを注射した患者の、ベースラインＣ−ペプチド、インスリン取り込み、およびＨｂＡ１ｃ。各患者における、治療前のＧＡＤＡおよびＩＡ−２タイター（Ｕ／ｍｌ）、ＧＡＤＡ  ＩｇＧサブクラス相対的分布（％）、ならびにＧＡＤ６５誘発性サイトカイン分泌レベル（ｐｇ／ｍｌ）。Ｍ：男性、Ｆ：女性、ｎ．ｄ：検出不可能なレベル。
【０１９７】
ベースラインから１８０日目のＣ−ペプチド、インスリン取り込み、およびＨｂＡ１ｃの変化の割合（％）。データは平均値で表し、ＬＮ群およびＳＣ群の間の差異は、スチューデントＴ検定およびカテゴリー変数（性別）のためのχ２によって計算した。差異は、ｐ＜０．０５である場合に有意であると考えた。
【０１９８】
実施例２
下記の実施例は、本発明の多様な態様の安全性および効力を確立するために実施できる研究を開示する。当該実施例において使用されるベータ細胞自己抗原は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）であり、本明細書中において記載される任意の他のベータ細胞自己抗原で置き換えてもよい。
【０１９９】
ＧＡＤ抗原（Ｄｉａｍｙｄ（登録商標））療法をリンパ節内に投与することにより、１型糖尿病を発症して間もない成人における残存インスリン分泌を保存するための、パイロット試験（ＤＩＡＧＮＯＤＥ）
１．１  背景および根拠
世界における子供の１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）発病率は、フィンランドが最も高く、続いてスウェーデンが高く、急速に増加している。Ｔ１Ｄは、我が国の子供および青年にとって、圧倒的に最も一般的、慢性的、重篤、かつ命を脅かす疾患であり、１型糖尿病の発病率は若年成人においても高い。この疾患は、極めて深刻な世界規模の問題になる傾向がある。この疾患は、インスリンの不足または欠如を特徴とする。診断時の残存ベータ細胞機能が良好である患者も数人いるが（１）、すぐに欠損が非常に顕著となり、最終的には完全に欠損する（２、３）。残存インスリン分泌は非常に重要である。稀なケースとして、ベータ細胞の機能が診断後すぐに改善し、グルコース代謝が正常となって、しばらくインスリンが不要となる、すなわち、患者がいわゆる完全寛解に至る場合がある（４）。患者が完全寛解状態にある限り、恐らくは、運動および食事に関する健康的な生活習慣の推奨以外には、積極的な治療は不要である。症状はなく、急性の合併症もなく、完全寛解が続けば、この患者が遅発性合併症を発病する可能性は低い。グルコースまたは脂質代謝にわずかでも異常があると、化学的糖尿病または耐糖能異常の人の場合と同様に、大血管性合併症のリスクが上がる可能性がある。完全寛解は稀であるが、部分寛解は稀ではない（４）。この期間、患者は通常、血中グルコース値が正常に近く、軽度の低血糖さえ示さず、ケトアシドーシス症状も発現しない。生活の質は非常に良好であり、患者は気分良好であると感じ、子供は正常に発育し、制限はほぼ不要で（食事制限があるかもしれないが）、患者は様々な運動をしても低血糖になることはなく、家庭での血中グルコース検査も非常に良好となる。残存インスリン分泌がいくらかでもあれば、ケトアシドーシスのリスクの低減に十分である（５）。さらに、ＤＣＣＴ試験において、中程度の残存インスリン分泌（ベータ細胞刺激に対する応答、血清Ｃペプチド＞０．２０ｐｍｏｌ／ｍｌ）であっても、合併症予防に重要な役割を果たすということが示されている（６）。この作用は、残存インスリン分泌があれば良好な血中グルコース平衡への到達が容易になると考えるのが妥当であろうという事実によるものであり得るが、Ｃペプチド自体が生理的機能を有する可能性もある。Ｃ−ペプチド自体の作用は依然として議論のあるところであるが、実際、Ｃペプチドが血管透過性に影響を及ぼし、網膜血管の漏れを低減し、特に、神経機能に対して好ましい作用を有することが報告されている（７）。
【０２００】
１．１．１  自然の経過に影響を及ぼす因子
Ｔ１Ｄの診断時、膵臓のベータ細胞の８０〜９０％が破壊された状態である、ということが言われている。しかしながら、その証拠は乏しく、主要な問題は機能の低下であろう。さらに、患者間の差異が大きく、残存インスリン分泌が非常に良好な患者もいれば、あまり良好でない患者もいる。診断後すぐに、特に積極的なインスリン治療が行なわれると、Ｃ−ペプチド産生が増加し、これと並行してインスリン感受性が改善する。良好な代謝調節によって、ベータ細胞にとっての環境および代謝が改善されるようであり、ベータ細胞機能が保存され、これが、良好な代謝調節に寄与する（逆の場合も同じである）。自己免疫プロセスの強度が一定の役割を果たし、１型糖尿病の子供の免疫プロセスは１型糖尿病の成人よりも活発であることが明らかであるようであるが、その過程を予測することは依然として困難である。いくつかの研究では、自己抗体が高濃度となるとこれに続いてインスリン分泌の低下または喪失がより急速になることが示唆されているが、他の研究では、このような関連も、ましてやその逆の関連でさえも、見いだされていない。ベータ細胞の減少または喪失を予測できる細胞介在性免疫の特異的な兆候は現在のところ立証されていないが、本発明者らの研究で、疾患プロセスが、ＩＦＮｇなどの特定のサイトカインの増加とＩＬ−１０、ＩＬ−１３の減少とを伴う免疫系のＴ−ヘルパー−１（Ｔｈ−１）の偏移に関連することを示した。
【０２０１】
インスリン治療がベータ細胞の機能に及ぼす作用
ずっと以前に、この疾患の初期における積極的なインスリン治療が部分寛解を延長させたという知見があり、この知見は、残存インスリン分泌の改善によって確認および実証し得た（２）。高強度の治療によって、残存ベータ細胞機能が少なくともある程度の期間にわたって改善されるようであるが（８）、さらに長期にわたって好ましい作用を有する可能性もある（９）。積極的な治療は、実験動物において糖尿病を予防するまたは遅らせることが示されているだけでなく、研究により、こうした治療が高リスクの個体において糖尿病を予防できることが示されている（１０）。しかしながら、糖尿病予防試験（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｔｒｉａｌ）において大規模に試験された際には、非経口インスリン治療では糖尿病が予防されなかった（１１）。インスリンでの経口治療は一定の作用を有するかもしれず（１２）、したがって、さらなる研究が必要である。
【０２０２】
１．１．２  介入
１９７０年代に、Ｔ１Ｄが自己免疫性疾患であることが明らかとなり、その結果、免疫介入が試みられた。本発明者らは、糖尿病の子供に対して世界で最初に免疫介入研究を行なったが、その時すでに、３０年前であるが、新たに診断された子供および青年において血漿交換を使用して、いくらかの好ましい作用を得た（１３）。この治療の結果、予想外にも、重量６４ｋＤの新たなタンパク質を血漿中に発見し（１４）、後に、これがグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）であることを示した。飛躍的な前進（免疫介入の概念の証拠とみなした）はシクロスポリンであり、これが、自己免疫による破壊的プロセスを減速して残存インスリン分泌を改善したことは疑いなく、一方、他の免疫抑制試験では、特に子供において、作用は非常に小さかった（１５、１６、１７）、または、重篤過ぎる有害事象もしくはリスクを示した（１８、１９）。免疫系を調節する試みとして、本発明者らはフォトフェレーシスを使用した。二重盲検プラセボ対照試験において免疫系に対する作用が明らかに示されたが（２０）、臨床作用は非常に小さく、残存ベータ細胞機能の改善はほとんど見られなかった（２１）。その結果、免疫介入が成功しないことを受けて、本発明者らは、作用がないかまたは作用が一過性であるニコチン酸アミドおよびジアゾキシドなどの保護剤に関心を向けた（２２、２３、２４）。
【０２０３】
ベータ細胞破壊に至る免疫プロセスについての認識が高まるにつれて、免疫介入をより正確に方向づけて、重要なＴ細胞を標的とすることができるようになった。破壊的免疫プロセスを遮断する試みとして、抗ＣＤ３抗体を使用する有望な研究が行なわれている。北アメリカおよびフランスにおける、抗ＣＤ３抗体を使用した試験の結果から、破壊的自己免疫プロセスを遮断でき、その結果、ベータ細胞機能の低下を少なくとも遅らせ得ることが示された（２５、２６）。残存インスリン分泌の低下は有意に減速したが、残念なことに、この低下は単に１年遅延されたのみであるようであり、その後、Ｃ−ペプチド曲線の低下は、プラセボ群における低下曲線と平行になった。さらに、患者の大多数は、ある程度のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を経験し、これは非常に重篤となる場合があり、これに加えて、ほとんどの患者において複数の副作用が見られた。本発明者らは、最近実施された２つの第ＩＩＩ相試験のうち１つ（Ｐｒｏｔｅｇｅ  ｔｒｉａｌ）に参加したが（一次エンドポイントには到達できなかった）、最も強力な治療を実施した部門（ａｒｍ）が、実際、ある程度の残存インスリン分泌の保存、およびインスリン要求の低下を示し、ＨｂＡ１ｃが良好となった（２７；Ｓｈｅｒｒｙ，Ｈａｇｏｐｉａｎ，Ｌｕｄｖｉｇｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｌａｎｃｅｔ  ２０１１）。新たな研究が必要であるが、この型の治療が単独で全般的臨床使用に向けた解決策として受け入れられるとは考えにくい。そして、この治療が、糖尿病を発病しないであろう個体を多く含む健康な個体における予防的治療として受け入れられる可能性は、さらに低い。
【０２０４】
１．１．３  自己抗原による免疫療法
アレルギー性疾患の治療において、少量の疾患特異的抗原による免疫療法が、長年にわたって効率的に使用されてきた。この治療の機序はよく分かっていないが、免疫応答の免疫調節および制御性細胞の誘発が示唆された。自己免疫性疾患において、こうした治療が成功したことはないが、試みられるべきである（２８）。糖尿病易発性の動物における実験から、熱ショックタンパク質での治療によって糖尿病の発病を遅延できるまたは遅らせ得ることが示された。成人での研究におけるＤｉａｐｅｐ２７７ペプチドの使用によって、有害事象をほとんど生じることなく、インスリン分泌の顕著な保存が示された（２９）。しかしながら、後に実施された、Ｔ１Ｄを有する子供および青年における試験では（３０）、作用は示されなかった。いわゆるＬＡＤＡ（成人の潜伏自己免疫性糖尿病）におけるＤｉａｐｅｐ２７７治療での研究が進行中であり、予備試験での結果（２０１１年１２月のドバイでのＩＤＦの報告、および２０１２年６月のＡＤＡでの報告）から、Ｄｉａｐｅｐ２７７での治療によって軽度１型糖尿病の成人におけるベータ細胞機能を保存できることが示唆される。しかしながら、この結果はやや不確かである、というのは、弱いＣ−ペプチド保存がグルカゴン刺激後にのみ見られたが、混合食負荷試験後には全く作用が見られず、積極的に治療した群とプラセボとの間に免疫マーカーの差異は全く見られなかったためである。インスリンでの積極的治療が実験動物において糖尿病を予防するまたは遅らせるということだけでなく、予備的な非盲検研究によって、こうした治療により、高リスクの個体において糖尿病を予防できることが示された（１０）。インスリン（ベータ細胞特異的自己抗原であることが明らかである）が、高リスクの個体における糖尿病の予防を目的として非経口（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）投与されたが（ＤＰＴ）、作用はなく、同じ目的での経口インスリン投与はわずかな作用を有し得る（１２）。
【０２０５】
１．１．４  ＧＡＤ−Ａｌｕｍでの以前の臨床研究
１．１．４．１  ＧＡＤワクチン接種
ＧＡＤ（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）は自己抗原とみなされ得る、というのは、ベータ細胞刺激に対する応答として、島において産生されて、放出が増加するためである。このタンパク質は、自己免疫の免疫プロセスに重大な影響を及ぼすことが示されている（３１、３２、３３、３４）。いくつかの研究によって、実際にＧＡＤが実験動物において糖尿病を予防できることが示されている（３５〜４２）。ＧＡＤとウイルスタンパク質との相似点は、治療的作用にとって重要であり得る。観察される作用（免疫プロセスの開始後であっても）から、ヒトにおいても免疫プロセス開始後に同様の作用を予期できる可能性のあることが示唆される。ＬＡＤＡ患者における第ＩＩ相研究において、低用量（Ｄｉａｍｙｄ  ２０μｇ）の１回投与によって、プラセボ治療群と比較して、ベータ細胞機能が最長２年間にわたり改善され、副作用はなかった。これ以外の用量も試みられ、４μｇは作用を示さず、１００μｇは２０μｇと類似する作用を示したが、５００μｇは作用を示さなかった。これらの用量はいずれも、何年間かの追跡後にも、有害事象を全く示さなかった（４３）。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋／ＣＤ４−  ＣＤ２５−細胞における比率の変化との関係が見られ、このことから、この作用の機序が示された。こうした有望な背景から、本発明者らは、発症して間もない１０〜１８歳の１型糖尿病患者における第ＩＩ相研究を開始した。以前に、この治療が緩徐進行ＬＡＤＡ患者において作用を有したという考えに基づいて、本発明者らは、介入時にＴ１Ｄ糖尿病持続期間が最長で１８か月間である患者を含めた。当該患者らを、１日目および３０日目に２０μｇ  ＧＡＤ−ａｌｕｍ（Ｄｉａｍｙｄ）をｓｃ投与するものと、プラセボとに、無作為に分けた。作用は３０か月後にも著しく、統計学的にも臨床的にも明らかに有意であり（４４）、プラセボ群と比較してＧＡＤ治療群ではＣ−ペプチド低下がおよそ半分であった。糖尿病持続期間が＜３か月である患者は、追跡初期の１５か月間、顕著に良好な作用を有し、ベータ細胞機能の低下はないか、または非常に小さかった。ワクチン接種時に持続期間が＜６か月間であった患者において、ほぼすべての作用が見られた。さらに、他の介入治療とは異なり、この作用は有害事象を全く伴わなかったため、この治療は非常に有望なものとなった。４８か月後でも、持続期間が＜６か月間である治療患者は、Ｃ−ペプチドが顕著に保存されており、その時点でも有害事象はなかった（４５）。ここまで、ＧＡＤ治療は非常に期待のもてるものであった。２つの第ＩＩＩ相試験が実施され、その一方は、欧州での試験でＪｏｈｎｎｙ  Ｌｕｄｖｉｇｓｓｏｎ（ＪＬ）が主任研究員（ＰＩ）を務めたものであり、もう一方は、米国での試験でＪｅｒｒｙ  Ｐａｌｍｅｒが主任研究員（ＰＩ）を務めＪＬが共同研究者を務めたものであった。欧州での試験では、３３４人の患者を募集して３つの部門に分け、１つ目の部門は１、３０、９０、および２７０日目にＧＡＤ−ａｌｕｍ（Ｄｉａｍｙｄ）２０μｇ、２つ目の部門は１日目および３０日目にＧＡＤａｌｕｍ  ２０μｇと９０日目および２７０日目にプラセボ、３つ目の部門は１、３０、９０、および２７０日目にプラセボとした。一��エンドポイントである、混合食負荷試験（ＭＭＴＴ）後の１５か月目における血清Ｃ−ペプチドＡＵＣは、達成できなかった（Ｃ−ペプチドＡＵＣ  ｐ＝０．１；空腹時Ｃ−ペプチド  ｐ＝０．０７）（４６）。このことがきっかけとなり、参加企業（Ｄｉａｍｙｄ  ＭｅｄｉｃａｌおよびＪｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）は、第ＩＩＩ相試験を早々に打ち切った。しかしながら、この第ＩＩＩ相試験によって、いくつかの好ましい作用が示された。それは、いくつかのあらかじめ指定されたサブグループにおいて、統計学的に有意な効力が見られたことであった。さらに、スウェーデン人患者４５人は、研究停止の時点で、３０か月間目の来診を済ませており、ＧＡＤ−ａｌｕｍ（Ｄｉａｍｙｄ）２０μｇを２回投与した患者１５人は、３０か月後に、プラセボと比較して、顕著なＣ−ペプチド保存を示した。このことは特に注目すべきである、というのは、非北欧国では１５か月後に効力が見られていたが、スウェーデン人患者では１５か月後には効力が見られていなかったからである。
【０２０６】
１．１．４．２  第ＩＩ相と第ＩＩＩ相とで結果が異なった理由として想定されるもの
第ＩＩＩ相の無作為化において、活性薬剤を投与した患者は、１６〜１８歳年齢群よりも１０〜１１歳年齢群に多く、一方、年齢が高い方の群においては、活性薬剤よりもプラセボの人数の方が多かった。このことが結果に影響を及ぼした可能性がある。第ＩＩ相の患者は３月〜４月に治療を受けており、３月〜４月に治療を受けた第ＩＩＩ相の患者も、ＧＡＤ治療によって顕著な作用を示した。第ＩＩ相試験においては、ワクチン接種は許可されなかったが、第ＩＩＩ相においては、インフルエンザワクチン接種が許可された。残念なことに、Ｈ１Ｎ１−ｆｌｕの流行のために、患者のほぼ全員がワクチン接種を受け、そのうちの多くはＧＡＤワクチン接種に関連があった。
【０２０７】
スウェーデンおよびフィンランドにおいて、このワクチンはスクワレンを含有するため、免疫系に影響を及ぼして自己免疫の方に偏らせる恐れがあると推測されており、ＧＡＤ治療は当該２か国では効力を示さなかったが、他の欧州国では顕著な効力が見られた。ＧＡＤ治療に近い時期にインフルエンザワクチン接種を受けていないスウェーデンの患者での方が、ＧＡＤ治療の効力が良好であった（４６）。
【０２０８】
１．１．４．３  進行中のＤＩＡＢＧＡＤ−１試験
２０１３年１月から、第ＩＩ相ＤＩＡＢＧＡＤ−１試験がスウェーデンにおいて進行中である。これは、１型糖尿病を発症して間もない１０〜１８歳の患者６０人を、二重盲検プラセボ対照無作為化試験において、ＧＡＤ−ａｌｕｍを３０日間隔で２回各２０μｇ（４０μｇ）投与して治療し、これと組み合わせて、ビタミンＤ  ２０００単位を４５０日間毎日、およびイブプロフェン４００ｍｇを９０日間毎日投与する試験である。募集は完了しており、打ち切られている。患者６０人が無作為化され、それ以外に患者４人がスクリーニング中で、スクリーニング結果を待っている。現時点で、試験している薬物に関連すると判断される重篤な有害事象はなく、ＧＡＤ−ａｌｕｍ注射部位における軽度かつ一過性の反応以外には、当該治療に関係のない有害事象がごくわずかにあるのみである。全患者について６か月間追跡した後に仮分析することが既に予定されており、さらに長期の分析を１５および３０か月後に行なう予定である。
【０２０９】
１．１．５．リンパ節内免疫療法
抗原療法は、リンパ節内のＴ細胞に抗原を提示して、抗原に対する免疫系と耐性との新たな平衡をつくりだすことを目的とする。これまでの自己免疫性疾患の治療においては、抗原提示／樹状細胞に抗原を提示する（その結果、この抗原提示／樹状細胞が、免疫系のＴ細胞に抗原を提示することが予期される）目的で、抗原を、経口、鼻腔内、または皮下のいずれかに投与するものであった。しかしながら、動物実験により、リンパ内注射が、強くかつ関連のあるＴ細胞応答を誘発することが示され（４７、４８）、アレルギー分野での臨床研究により、リンパ節内への直接の抗原／アレルゲン提示の方が、慣習的な投与よりも有効なようであることが示された（４９）。使用するアレルゲンの用量をより少なくすることができ、治療回数を大幅に少なくでき、かつ、これまで治療に関連する有害事象は示されていない。患者の鼠蹊部のリンパ節は容易に到達でき、注射に関連する疼痛は、静脈穿刺よりも小さいとされる（５０）。この背景から、本発明者らは、自己免疫形態の１型糖尿病の患者にも同じアプローチを使用できるか否かを調べることを目的としている。倫理的な理由から、本発明者らは、１回目のパイロット試験を成人において行う。
【０２１０】
１．２  仮説
第ＩＩ相ＧＡＤ試験の有望な結果と、欧州での第ＩＩＩ相試験の一部前向きな結果は、ＧＡＤ−ａｌｕｍ（Ｄｉａｍｙｄ）の投与により自己免疫プロセスを低下させることができ、残存インスリン分泌の保存に寄与し得るという概念を裏付けるものである。以前の研究により、Ｄｉａｍｙｄの用量範囲は２０〜１００μｇとするべきであると示されているとおり、リンパ節内への直接投与の場合には、３μｇという低用量の３回投与が十分とされるべきである。リンパ節内へのＧＡＤ−ａｌｕｍ（Ｄｉａｍｙｄ）の直接の注射によって、重篤な有害事象は生じず、所望の免疫学的作用が得られ、かつ効力が改善される（後続の研究で示される）と考えられる。
【０２１１】
２．リスクと利益の分析
１型糖尿病の発病率は、世界中の他のどの国よりもフィンランドにおいて高く、続いてスウェーデンにおいて高い。発病率は数十年間上昇し続けている。この疾患は、治癒不可能であり、予防も不可能である。非常に激しく強力で高価な治療を受けても、多くの患者は、命にかかわる重篤な急性および遅発性合併症を生じ、死亡率が大幅に上昇する。診断時、多くの患者は、わずかな残存インスリン分泌を有している。そうである限り、血中グルコースを安定に維持するのは大幅に容易となり、低血糖の発病率およびケトアシドーシスのリスクも低下する。糖尿病患者および糖尿病の子供の親にとっての生活の質は、残存インスリン分泌がある場合の方が良好である。
【０２１２】
成人における１型糖尿病は、子供および青年における当該疾患とは異なり、多くの場合、疾患プロセスが軽度で、残存インスリン分泌の低下が遅く、血中グルコースの制御が容易である。しかしながら、類似点も多く、治療および合併症が類似しており、ベータ細胞機能の保存は成人にとっても非常に重要である。
【０２１３】
残存インスリン分泌を保存することが非常に有利であることは明らかであり、したがって、この機能の保存を目的とする療法にあっては、非常に激しく、さらには危険かつ高価でさえある治療も正当であると認められる。したがって、ＣＤ３受容体は、主に全患者において有害事象を引き起こし、非常に重篤な有害事象およびリスクをも引き起こす場合があるが、このＣＤ３受容体に対するモノクローナル抗体といった薬剤での１型糖尿病の発症時の治療が正当であると認められている。純粋な細胞増殖抑制剤でさえ、使用されている。
【０２１４】
本発明者らが提案する研究においては、ＧＡＤ−ａｌｕｍ（Ｄｉａｍｙｄ）  ４μｇ×３を使用するが、この治療は、子供および成人に対してこれより大幅に高い用量で使用されていて、数千人の患者を何年間も追跡した結果、有害事象がほとんど見られていない。本発明者らは、当該研究において、非常に低用量で使用することを計画しており、これは、全般的なリスクのさらなる低下を予期できることを意味するが、その投与は、リンパ節内に直接行なうため、局所的反応が生じる可能性はある。免疫系に対する作用はより顕著となる可能性があるが、有害作用を引き起こすものではないと考える。アレルギーにおける以前の研究では（共同研究者の１人であるＨｅｌｅｎｅ  Ｚａｃｈｒｉｓｓｏｎが、ａｌｕｍ配合アレルゲンをリンパ節内に注射した）、全身性か局所的かを問わず、有害作用は全く見られていない。この試験は、リンパ節内へのこの型の自己抗原治療を伴う全く最初のパイロット試験であるため、安全性の理由から、本発明者らは、まず、インフォームドコンセントを自由に提供できる成人において試みる。成人における１型糖尿病は若年患者の場合よりもやや軽度ではあるが、ベータ細胞機能の保存は非常に大きな価値があり、したがって、ここで提案される治療は、成人患者にとっても治療的価値が大きなものであり得る。
【０２１５】
利点と欠点とについて概要を示すとき、参加した患者にとっても、将来的な研究における患者にとっても、非常に重要な治療的利益を有する可能性が明らかであり、リスクは非常に小さい。こうした研究が、良い治療の開発に寄与すれば、多くの患者にとって非常に大きな価値があると考えられる。
【０２１６】
３．提示する研究の目的
本発明者らが提示するパイロット研究の目的は、治療に関連した重篤な有害事象を伴わずにＧＡＤ−ａｌｕｍをリンパ節内に投与できるか否かについて情報を得ること、および、同じ技術による将来的な第ＩＩ相試験において１型糖尿病における残存インスリン分泌の保存における効力を改善できるようにすること、である。したがって、本発明者らは、この治療が有害事象を伴うか否か、および、治療レジメンがどのように免疫系に影響するのか、所望のＴｈ−２偏移、Ｔ制御性細胞の増加をどのように引き起こすのか、および、望ましくは、残存ベータ細胞機能の保存の指標について知りたいと考える。このパイロット研究において短期間で得られた結果に基づいて（追跡６か月）、本発明者らは、次いで、より大規模の第ＩＩ相試験を設計して、若年患者を含めて、さらに確かな情報を得たいと考える可能性がある。次いで、主要な長期的目標は、患者にとって許容可能で、安全で、残存インスリン分泌を保存でき、患者の生活の質を改善でき、急性の合併症が少なく、長期的に見て遅発性合併症のリスクが少ない、若年患者における１型糖尿病の発症時の治療を見い出すことである。
【０２１７】
４．目的
目的：
Ｄｉａｍｙｄをリンパ腺内に直接投与することにおける安全性の評価、ならびに、免疫応答（５１〜５４）、および内因性インスリン分泌の保存に対する作用の評価（ベースライン、ならびに６、１５、および３０か月後において測定）。
【０２１８】
５．集団
Ｌｉｎｋｏｅｐｉｎｇ大学病院において１型糖尿病を発症して間もない成人患者に、当該研究についての情報を提供し、試験への参加を依頼する。
【０２１９】
５．１  含める基準
１．患者および保護者／親より提供されるインフォームドコンセント
２．ＡＤＡ分類法に準ずる１型糖尿病、糖尿病持続期間＜６か月間
３．１型糖尿病診断時に年齢１８．００〜２９．９９歳
４．空腹時Ｃ−ペプチド≧０．１２ｎｍｏｌ／ｍｌ
５．Ｐｏｓ  ＧＡＤＡであるが＜５００００無作為の単位
６．女性については、妊娠回避に対する合意、および尿妊娠検査で陰性であることが必要
７．ＧＡＤ−Ａｌｕｍ／プラセボの最後の投与後１年間にわたり適切に避妊することについての患者の合意が必要
【０２２０】
５．２  除外する基準
１．免疫抑制剤療法による治療を以前にまたは現時点で受けている（ただし、局所的または吸入型ステロイドは許容される）
２．あらゆる炎症薬（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｒｕｇ）での連続的治療（たとえば、頭痛のため、または発熱に関連して、２〜３日間実施される散発的な治療は許容され得る）
３．インスリン以外のあらゆる経口または注入型の抗糖尿病薬物による治療
４．貧血の病歴、またはスクリーニング時における顕著かつ異常な血液検査結果
５．癲癇、頭部外傷、もしくは脳血管事故の病歴、または近位の筋肉における連続的な運動単位活動の臨床的特徴
６．過去のワクチンまたは他の薬剤に対する急性反応の臨床的に顕著な病歴
７．予定された１回目の研究薬剤投与または予定された任意のワクチンでの治療の４か月前から、研究薬剤の最後の注射から最長４か月後までの間の、インフルエンザワクチンを含むあらゆるワクチンによる治療
８．過去３か月間の、新しい化学物質を用いた他の臨床試験への参加
９．本プロトコールの規定に従えない、または従う意思がない
１０．アルコールまたは薬物乱用の病歴
１１．１回目投与前の２週間以内における糖尿病以外の顕著な疾病
１２．既知のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）または肝炎
１３．授乳中または妊娠中の女性（妊娠の可能性は、ＧＡＤ−ａｌｕｍ治療前２４時間以内における施設での尿βＨＣＧによって除外されなければならない）
１４．ＧＡＤ−ａｌｕｍ治療の最後の投与後１年間にわたり適切に避妊する意思のない男性または女性
１５．皮膚感染症に罹患中で皮下注射不可能であるケースを含む、関連する重篤な疾患または状態が存在し、研究者が、当該患者は当該研究に参加資格がないと判断した場合
１６．説明書に従えない、および／または研究プロトコールに従えないと研究者がみなした場合
【０２２１】
５．３  募集およびスクリーニング
有資格である対象は、当該研究についての説明を受け、患者情報を書面で受け取る。当該対象は、研究の性質について確認した後、研究チームに質問する機会を与えられる。その後、対象が参加に同意したら、対象は個人としてサインして、インフォームドコンセント書の書面に日付けを記入する。次いで、患者は、このサインと日付を記入した患者情報／インフォームドコンセント書のコピーを受け取る。
【０２２２】
５．４  患者の離脱
ヘルシンキ宣言に従って、研究者は、患者に、研究からいつでも離脱できる権利があること、および、離脱しても当該患者の将来的な治療に損害が及ばないことを説明しなければならない。しかしながら、安全性の問題が生じない限り、本発明者らは、研究を離脱した患者についても、効力および安全性変数を分析する目的で、当該研究の全期間にわたって追跡する予定である。いかなる種類の離脱についても、その理由を適切なＣＲＦに記録しなければならない。
【０２２３】
研究からの離脱には様々な分類があり得る。完全な離脱（すなわち、研究薬品を停止し、効力および安全性の評価は継続）
【０２２４】
当該研究へのさらなる参加から、および追跡来診（および、たとえば、血液検査）から離脱する標準的な理由には、以下があり得る。
・患者の決断（参加同意の撤回）
・患者を追跡不能
・研究薬品のさらなる投与からは離脱するが、追跡来診および安全性評価は継続する標準的な理由には、以下があり得る。
・許容できない有害事象
・患者の希望
・研究者の判断
・患者を追跡不能／患者が現れない
・介入性の疾病
・患者の妊娠
【０２２５】
したがって、患者が、当該研究に含められた後に以下に該当した場合は、当該患者にリンパ節内ＧＡＤ−ａｌｕｍ投与を行なうべきではない。
・脳損傷、癲癇、頭部外傷、神経疾患
・１型糖尿病以外の、あらゆる活性型かつ重篤なホルモン疾患
・他の重症の自己免疫性疾患（セリアック病は除く、当該研究に含めることが許容されるため）
・免疫抑制治療
・がん、がん治療
・インスリン以外のあらゆる他の糖尿病薬剤
・あらゆるワクチン接種
・薬物／アルコール乱用
または、患者が、
・当該研究の間に、妊娠した場合、もしくは、安全な避妊薬を使用する意思がなくなった場合。
【０２２６】
しかしながら、患者が研究から離脱する際にはいつでも、または、さらなる来診に来ない理由が何であっても、当該研究からの離脱理由を提示して、その患者（来診＜＞）についての最終的な研究評価を完了しなければならない。当該患者に関するすべての書類は、できる限り完全なものでなければならない。現れないというのが理由で離脱した場合には、研究者は、現れない理由を知るために追跡しなければならない。介入性の疾病または有害事象が理由で離脱した場合には、症例記録の形態で十分な記録を取らなければならず、補助的な情報が入手できれば、および／またはそうした情報が適切であれば、それを追加する。
【０２２７】
６．治療手順
６．１  研究設計および治療
試験は、男性または女性で、１８．００〜２９．９９歳で、スクリーニング（来診１回目）時にＴ１Ｄ診断から６か月以内であり、かつ、空腹時Ｃ−ペプチドレベルが０．１２ｎｍｏｌ／Ｌ以上である、ＧＡＤＡポジティブＴ１Ｄ患者における、単施設非盲検パイロット研究である。合計約５人の患者を、スウェーデンのＬｉｎｋｏｅｐｉｎｇの一施設にて募集する。当該患者が資格を有するか否かを、治療開始の１０〜２１日前に、スクリーニング来診（来診１回目）時に評価する。スクリーニングした患者に、連続するスクリーニング番号を割り当て、このスクリーニング番号を、研究期間全体を通して、患者確認用に使用する。
【０２２８】
当該研究に含められた有資格患者は、次いで、研究に登録して、その後の来診時に下記表１の研究用薬剤の投与を受ける。当該患者を、施設への来診８回を含む３０か月間の研究期間全体にわたって追跡する。
【０２２９】
研究来診の全体像については、下記表１を参照のこと。
【０２３０】
【表３】
2020533581.tif 000004
【０２３１】
本発明によれば、ＧＡＤ−ａｌｕｍのさらなる投与を、上述されるように、来診７回目、任意に８回目に実施してよい。
【０２３２】
６．２  評価および手順
１．新たに診断された１型糖尿病患者に対する、標準的なインスリン治療、教育、および心理社会的サポート。
２．体液、電解質、および酸塩基バランスの正常化。
３．当該研究についてのその後の情報。
４．患者がインフォームドコンセントを提供した場合、診断から遅くとも１２０日後に、Ｃ−ペプチドおよびＧＡＤＡ濃度以外の基準により有資格となった患者からの空腹時静脈試料を用いて、スクリーニングを行なう（来診１回目）。
５．ベースライン（来診２回目）、６、１５、および３０か月目において、ＭＭＴＴによって残存内因性インスリン分泌を評価する。研究来診時に毎回、ＨｂＡ１ｃ、安全性（血液学的および化学的）、自己抗体タイター（ＧＡＤ６５、ＩＡ−２）、免疫学に続いて、血液試料を採取する。研究来診時に毎回、外因性インスリン用量／２４時間、Ａｅ、および併用薬物を記録する。
６．研究来診時に毎回、自己申告による低血糖（他者の補助を必要とすること、および／または発作、および／または意識消失として定義される）を記録する。
７．他の医学上の問題のあらゆる症状または兆候は、臨床医の判断によって治療されるべきである。
【０２３３】
検査を、下記のセクション７の表２に従い、症例報告書（ＣＲＦ）に記載された順序で行なう。
【０２３４】
６．２．１  全来診、来診１回目〜７回目
注意すべきは、患者は、すべての研究来診に、一晩絶食（＞１０時間、水は許容される）後の翌朝に参加すべきであるということである。感染（発熱を含む）のエビデンスのある患者については、完全な来診は、５日間、または患者が回復するまで、延期されるべきである。
【０２３５】
６．２．２  ＧＡＤ−Ａｌｕｍの投与、来診２、３、および４回目
投与後、患者は、研究施設付近に１時間留まるものとし、注射して１時間後に、研究者／研究看護師が投与部位を検査する。
【０２３６】
６．２．３  混合食負荷試験（ＭＭＴＴ）、来診２、５、６、および７回目
・ＭＭＴＴは、ＣＲＦに記載される説明に従って行なわなければならない。患者は、
・一晩絶食後（＞１０時間）（すなわち、患者は、食事を摂ってはならないが、水を飲むことは許容される）、研究施設に来る。
・ＭＭＴＴ前の６時間は短時間作用型／直接作用型インスリンの投与を受けてはならない。患者は、前日／前夜の基礎インスリンの投与が許容されるが、ＭＭＴＴ前の朝にはこれが許容されない。
・ＣＳＩＩ（インスリンポンプ）を用いる患者は、基礎用量インスリンを継続しなければならないが、ＭＭＴＴ直前の６時間にはボーラス用量を追加してはならない。
・試験当日朝に患者の家庭用血中グルコース計で計測した空腹時血漿グルコースレベルが、４〜１２ｍｍｏｌ／Ｌの範囲内でなければならない。患者が、上記の基準のうちいずれかを満たさない場合には、ＭＭＴＴの日程を変更するべきであり、患者は可能であれば５日以内に研究施設に戻るべきである。
【０２３７】
安全性の理由から、対象が食事またはインスリンを必要とする場合には、来診の日程を変更するべきである。
【０２３８】
６．３  臨床検査および検査：
１．免疫学的試験：
ａ．自己抗体（抗ＧＡＤ６５、抗インスリン、抗ＩＡ−２、ＺｎＴ８）
ｂ．関連するサイトカインおよびケモカインの決定（下記を参照のこと）
ｃ．Ｔ細胞の分類および研究（下記を参照のこと）
２．遺伝学：
ａ．ＨＬＡの決定を実施、および、糖尿病の発病に関する遺伝子
ｂ．糖尿病関連遺伝子の重要性を解明するためのアレイ研究
３．ウイルスアッセイ：
ａ．遺伝学的、免疫学的、および微生物学的な試験を使用してよい。
４．糖尿病の状態：
ａ．ＨｂＡ１ｃ
ｂ．空腹時血糖および空腹時Ｃ−ペプチド
ｃ．食事刺激性グルコースおよびＣ−ペプチド
５．安全性を調べるための血液試料採取：
ａ．血液学
ｂ．化学
【０２３９】
６．４  既往歴
対象の過去の既往歴を、研究者がすべて確認し、既往歴ＣＲＦに記録する。
【０２４０】
スクリーニング来診（来診１回目）時、すべての既往症／疾患を既往歴ＣＲＦページにて報告する。
【０２４１】
対象の１型糖尿病診断日および１型糖尿病の家族歴についても記録する。
【０２４２】
６．５  神経学的検査を含む身体検査
スクリーニング来診（来診１回目）時、患者は全身の身体検査および神経学的検査を受け、所見があれば、既往歴ＣＲＦページにて既往症として報告する。
【０２４３】
以降の研究来診では、患者は、新たな医学的状態があるかどうか、または既往症が悪化していないかについて、検査を受ける。既往症に変化がある場合、または新たな状態がある場合には、これをＣＲＦのＡＥページに記入しなければならず、薬物が投与されていれば、それを併用薬物のページに記入しなければならない。
【０２４４】
医師による身体検査には限界があるため、患者は、標準臨床神経学的検査を、スクリーニング時、０、６、１５、および３０か月目に受ける。この神経学的検査は、力、バランス、および協調の乱れといった、神経筋疾患の軽度の兆候の可能性を検出するために行なう。
【０２４５】
神経学的検査は以下を含む。
・四肢の反射
・ロンベルク（バランスおよび協調）
・まっすぐな歩行、２メートル（バランスおよび協調）
・片脚で立つ、左および右、片足につき１５秒間（バランスおよび協調）
・指鼻（協調）
・模倣（脳神経）
・バビンスキー反射（中枢機能）
・筋力（握手）、二頭筋、三頭筋、遠位伸筋、および屈筋
【０２４６】
こうした検査は、予定された来診時に、研究者の判断によって、繰り返し実施してよい。脳波（ＥＥＧ）による神経疾患のスクリーニングは、感受性および特異性が低いため、含まれない。しかしながら、神経機能不全の兆候が検出された場合には、患者は、さらなる評価のために、神経内科医への紹介を受けるべきである。
【０２４７】
６．７  併用薬物
当該研究の間に使用されたすべての併用薬物は、それが当該研究に関連するものであると研究者が考えるか否かにかかわらず、ＣＲＦの併用薬物の記録上に報告されなければならない。下記セクション８．５も参照のこと。
【０２４８】
【表４】
2020533581.tif 000005
【０２４９】
本発明において、上述されるとおり、ＧＡＤ−ａｌｕｍのさらなる投与を、来診７回目、任意に８回目に、行なってよい。
【０２５０】
７．１  来診
１回目の来診であるスクリーニング来診（来診１回目）を、予定された来診２回目（ベースライン）の１０〜２１日前に行なうべきである。次いで、来診３回目および４回目（２回目および３回目のＧＡＤ−Ａｌｕｍの投与）を来診ウィンドウ±３日にて予定し、来診５回目、６回目を±１４日にて、来診７回目を±３０日にて予定するべきである。すべての来診は、来診スケジュールに従って、ベースライン来診（来診２回目）を起点として計算しなければならないことにも注意する。研究プロトコールに従うためには、来診を来診ウィンドウの範囲内にて行なわなければならないことについても注意する。
【０２５１】
患者来診、来診ウィンドウ、および研究薬剤投与のスケジュールについては、上記表１および２を参照のこと。
【０２５２】
８．研究薬物
８．１  研究薬物
以下の薬物品目を当該研究において使用する。
研究薬物：ＧＡＤ−Ａｌｕｍ（Ｄｉａｍｙｄ）、４μｇ×３（１か月間隔で３回投与）
ＩＭＰ供給元：Ｄｉａｍｙｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＢ、ストックホルム、スウェーデン。
【０２５３】
８．２  供給
ＧＡＤ−ａｌｕｍ（Ｄｉａｍｙｄ）配合、Ｄｉａｍｙｄ  Ｍｅｄｉｃａｌより供給。これは、あらかじめ包装された薬物として、Ｄｉａｍｙｄ  Ｍｅｄｉｃａｌから地元の薬局に供給される。すべての投与は、病院で行ない、訓練を受けて承認された研究員のみが扱う。この研究薬物には、地域の規制に従った情報が表示される。ＧＡＤ−ａｌｕｍは、安全な場所（たとえば、施錠されたキャビネットまたは薬剤保管室）の冷蔵庫内で２〜８℃において保存し、意図されない使用から保護する。すべての研究薬物には、地域の規制に従った情報が表示される。
【０２５４】
８．３  投薬量および投与
ＧＡＤ−Ａｌｕｍ：４μｇ、鼠蹊部分のリンパ節内に投与（超音波技術を用いて）、１か月間隔で３回
【０２５５】
８．４  治療の持続期間
８．３を参照のこと。
【０２５６】
８．５  併用薬物
全身免疫調節薬物、およびインスリン以外の糖尿病薬（市販されているか否かにかかわらず）は、一切許容されない。
【０２５７】
９．応答変数および転帰
９．１  効力の探索的評価
９．１．１．効力変数
この研究はパイロット第Ｉ相試験であるため、一次効力エンドポイントはないが、本発明者らは以下のことを追跡する。
・空腹時Ｃ−ペプチドおよびＭＭＴＴ中のＣ−ペプチド（９０分値およびＡＵＣ平均０〜１２０分）の、ベースラインからの変化（それぞれ６か月目、１５か月目から、３０か月目まで）。
・たとえば、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１７と比較したＩＬ−５、１０、１３の比率の増加、およびＴ−制御性細胞の増加として見られる、細胞介在免疫応答のＴｈ２−偏差。ベースラインとその後の来診との間の変化。
・炎症マーカー、たとえば、ＴＮＦ−アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７。ベースラインとその後の来診との間の変化。
・ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）、ベースラインとその後の来診との間の変化
・体重１ｋｇあたりかつ２４時間あたりの外因性インスリン用量、ベースラインとその後の来診との間の変化
【０２５８】
１０．統計学的方法論およびデータ管理
１０．１  研究設計
このＤＩＡＧＮＯＤＥ−１研究は、非盲検のパイロット第Ｉ相介入試験である。
【０２５９】
研究参加者：新たに診断された古典的な１型糖尿病の患者：Ｎ＝５。年齢１８〜２９．９９歳。スウェーデンの内分泌科診療所１か所から募集。
【０２６０】
１０．２  試料サイズの推定
検出力分析：このパイロット研究について、正式な検出力分析は実施されていない。
【０２６１】
１０．３  統計学的分析計画
簡潔には、下記の分析を計画している。
すべての連続型変数は、下記に表示された記述統計学を有する：観察回数（ｎ）、平均値、標準偏差、最小値、中央値、および最大値。すべてのカテゴリー型の変数を、頻度および割合と共に表示する。記述統計学の図表化を、来診毎に分割する。必要に応じて、ベースライン（スクリーニング）の記述統計学をさらに含める。
【０２６２】
人口統計的および他のベースライン特徴
人口統計学およびベースライン特徴を、記述統計学（要約表）を使用して提示する。
【０２６３】
安全性変数および効力データ
ＡＥ／ＳＡＥデータを、観察されたすべてのＡＥ／ＳＡＥの頻度および発病率を標準的に図表化したものを使用して提示する。頻度および発病率を、患者１人あたりで計算する。有害事象は、その概要を、身体組織（ｂｏｄｙ  ｓｙｓｔｅｍ）、因果関係、および重症度によって示す。他の安全性データは、記述統計学によって提示する。
【０２６４】
Ｃ−ペプチドおよび免疫系に関する効力データ、ならびに有害事象、ならびに他の安全性データは、その概要を記述する。
【０２６５】
安全性データを６か月間分析した後。（結果を、第ＩＩ相ＤＩＡＧＮＯＤＥ試験の設計に使用する）。
【０２６６】
１０．４  研究集団
治療企図集団
患者を、効力分析を目的とした一次治療企図集団に含める（当該患者が、その部門におけるすべての研究薬剤を少なくとも１回用量投与されていて、後の来診時に評価を受ける場合）。
【０２６７】
パープロトコール集団
厳密なパープロトコール集団に有資格となるためには、対象は、大きな違反をすることなく研究プロトコールに準じていなければならない。検査に欠席した場合には、最後に観測された値で補完することによって置き換えられるが、検査を欠席する来診回数は１回を超えてはならない。
【０２６８】
総集団
少なくとも１回の治療（来診２回目）を受けた後で離脱した患者を、安全性分析（有害事象および安全性パラメータ）に含める。全患者についてのデータを列記し、離脱患者の一覧に、すべての離脱理由を添えて提供する。
【０２６９】
１０．５  データ収集／症例報告書
各患者からのデータを記録するために、症例報告書（ＣＲＦ）を提供する。適時かつ適切なデータ収集が重要であるため、研究者、または任命かつ指名された者は、ＣＲＦを迅速に完成させるものとする。監視者が、ＣＲＦのためにさらなるデータまたはデータの説明を要求した場合には、しかるべき時に十分に当該要求に応じなければならない。
【０２７０】
こうした症例報告書を確実に適切に完成させることは、研究者の責任である。研究者は、症例報告書が正確かつ完全であることを認めるという意味で、明示されたサインページにサインする。
【０２７１】
読みやすさのために、ＣＲＦは、すべて、黒または青色のボールペン（鉛筆、フェルトペン、万年筆は不可）を使ってブロック体の大文字で記入されるべきである。ＣＲＦを修正する場合には、研究者または指定代理人が修正しなければならない。元の記載に線を１本引かなければならない。修正には、日付とイニシャルを記入しなければならない。誤りの記載を修正液で隠してはならず、消したり、いかなる方法で判読不能としたりしてもいけない。前回検査から全く変化がない場合でも、データ取得の完全性を期す目的で、ＣＲＦの各セクションで繰り返される質問事項には完全に回答するべきである。データが欠落しているすべての箇所について、研究者は妥当な説明を提供しなければならない。
【０２７２】
１０．６  データ管理
データを暗号化して、コンピュータデータベースに入力する。データ品質管理を含むデータの取り扱いは、規制ガイドライン（たとえば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ［ＩＣＨ］および良き臨床上の基準（Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）［ＧＣＰ］）に従う。
【０２７３】
１１．規制および行政上の手順
規制上の要求があれば、研究開始前にそれを満たさなければならない。スポンサーは、適切な当局に申請して規制当局の承認を受ける。研究施設、設備、研究所、ならびにすべてのデータ（原始データを含む）および書類は、当局による調査に応じることが可能でなければならない。
【０２７４】
１１．２  患者情報／インフォームドコンセント
研究者は、研究の性質、目的、生じ得るリスク、および利益に関する完全かつ適切な情報を口頭および書面にて患者に提供する責任がある。さらに、患者に、研究からいつでも自由に離脱できることを通知しなければならない。患者は、サインする前に、当該情報を読んで理解するのに十分な時間を与えられるべきである。研究者は、いかなる研究関連手順に患者を含める場合にも、その前に、すべての患者からサイン済のインフォームドコンセントを入手する責任がある。患者情報のコピーおよびインフォームドコンセント書のコピーを、患者に提供する。
【０２７５】
１１．４  患者治療計画
すべての患者は、研究の間も、１型糖尿病の標準的なケアを継続して受ける。各々の研究の完了後、患者は、研究参加前に受けていた標準的な治療に戻る。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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