(57)【要約】  全身型若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）を有する患者を診断し、該患者と川崎病（ＫＤ）および他の熱性疾患を有する患者と識別するための方法、組成物、キットなどを提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における全身型若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）を診断する方法であって、（ｉ）前記対象から得られた生体試料中の複数のバイオマーカーの各々のレベルを決定する工程であって、前記複数のバイオマーカーがカルプロテクチンおよびフォリスタチン関連タンパク質１（ＦＳＴＬ−１）を含む、工程と、（ｉｉ）前記複数のバイオマーカーの各々のレベルを対応する所定の診断閾値と比較し、それによって前記対象におけるｓＪＩＡの診断を提供する工程と、を含む、方法。
【請求項２】
前記複数のバイオマーカーが、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、およびＳ１００Ａ１２のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複数のバイオマーカーが、アルファ−２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、およびアポリポタンパク質Ａ１のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数のバイオマーカーが３つ以下のバイオマーカーを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のバイオマーカーが４つ以下のバイオマーカーを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記対象においてｓＪＩＡの診断と川崎病（ＫＤ）の診断とを識別することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象においてｓＪＩＡの診断と熱性疾患（ＦＩ）の診断とを識別することをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記生体試料が血液または血漿である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
各バイオマーカーのレベルを決定する前記工程が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、サンドイッチアッセイ、磁気捕捉アッセイ、微小球捕捉アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、フローサイトメトリー、および質量分析からなる群から選択されるアッセイを行うことを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
対象における全身型若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）、川崎病（ＫＤ）、および熱性疾患（ＦＩ）の診断を識別する方法であって、（ｉ）前記対象から得られた生体試料中の複数のバイオマーカーの各々のレベルを決定する工程であって、前記複数のバイオマーカーがカルプロテクチンおよびフォリスタチン関連タンパク質１（ＦＳＴＬ−１）を含む、工程と、（ｉｉ）前記複数のバイオマーカーの各々のレベルを対応する所定の診断閾値と比較し、それによって前記対象におけるＳＪＩＡ、ＫＤ、またはＦＩの診断を提供する工程と、を含む、方法。
【請求項１１】
前記複数のバイオマーカーが、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、およびＳ１００Ａ１２のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記複数のバイオマーカーが、アルファ−２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、およびアポリポタンパク質Ａ１のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１０または１１記載の方法。
【請求項１３】
前記複数のバイオマーカーが３つ以下のバイオマーカーを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数のバイオマーカーが４つ以下のバイオマーカーを含む、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体試料が血液または血漿である、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
各バイオマーカーのレベルを決定する前記工程が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、サンドイッチアッセイ、磁気捕捉アッセイ、微小球捕捉アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、フローサイトメトリー、および質量分析からなる群から選択されるアッセイを行うことを含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＳＪＩＡ、ＫＤ、またはＦＩの診断を有することが疑われる対象における治療の必要性についての医師による決定を容易にする方法であって、（ｉ）前記対象から得られた生体試料中の複数のバイオマーカーの各々のレベルを決定する工程であって、前記複数のバイオマーカーがカルプロテクチンおよびフォリスタチン関連タンパク質１（ＦＳＴＬ−１）を含む、工程と、（ｉｉ）前記対象におけるＳＪＩＡ、ＫＤ、およびＦＩの診断を識別するために、前記複数のバイオマーカーの各々のレベルを対応する所定の診断閾値と比較し、それによってＳＪＩＡ、ＫＤ、またはＦＩの治療を前記対象に行う必要性についての医師による決定を容易にする工程と、を含む、方法。
【請求項１８】
前記複数のバイオマーカーが、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、およびＳ１００Ａ１２のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数のバイオマーカーが、アルファ−２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、およびアポリポタンパク質Ａ１のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項１７または１８記載の方法。
【請求項２０】
前記複数のバイオマーカーが３つ以下のバイオマーカーを含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記複数のバイオマーカーが４つ以下のバイオマーカーを含む、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記生体試料が血液または血漿である、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
各バイオマーカーのレベルを決定する前記工程が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、サンドイッチアッセイ、磁気捕捉アッセイ、微小球捕捉アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、フローサイトメトリー、および質量分析からなる群から選択されるアッセイを行うことを含む、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＳＪＩＡの治療が、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、生物学的薬剤、ならびに関節内および経口ステロイドからなる群から選択される１つ以上の薬剤を含む、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＫＤの治療が免疫グロブリン静注（ＩＶＩＧ）を含む、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
対象におけるｓＪＩＡを診断するためのキットであって、前記キットは、対象から得られた生体試料中の複数のバイオマーカーのレベルを決定するのに有効な結合作用物質を含み、前記複数のバイオマーカーがカルプロテクチンおよびフォリスタチン関連タンパク質１（ＦＳＴＬ−１）を含む、キット。
【請求項２７】
前記複数のバイオマーカーが、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、およびＳ１００Ａ１２のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
前記複数のバイオマーカーが、アルファ−２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、およびアポリポタンパク質Ａ１のうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記複数のバイオマーカーが３つ以下のバイオマーカーを含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３０】
前記複数のバイオマーカーが４つ以下のバイオマーカーを含む、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
前記結合作用物質が抗体またはその結合断片である、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記キットが、前記対象においてｓＪＩＡの診断と川崎病（ＫＤ）の診断とを識別するのに有効である、請求項２６〜３１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３３】
前記キットが、前記対象においてｓＪＩＡの診断と熱性疾患（ＦＩ）の診断とを識別するのに有効である、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
前記キットがラテラルフロー装置を含む、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３５】
前記キットが、複数のバイオマーカーに特異的な抗体またはその抗原結合断片を含むラテラルフロー装置を含む、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３６】
治療の必要性についての医師による決定を容易にするために、対象におけるＳＪＩＡの進行をモニタリングする方法であって、（ｉ）前記対象から生体試料を得る工程と、（ｉｉ）前記生体試料において、複数のバイオマーカーの各々のレベルを決定する工程であって、前記複数のバイオマーカーが少なくともＳ１００Ａ１２、ＣＲＰ、およびカルプロテクチンを含む、工程と、（ｉｉｉ）前記複数のバイオマーカーの各々のレベルを対応する所定の診断閾値と比較し、それによって前記対象におけるＳＪＩＡをモニタリングする工程と、を含む、方法。
【請求項３７】
前記対象におけるＳ１００Ａ１２、ＣＲＰ、およびカルプロテクチンのレベルの、それらの所定の診断閾値に対する上昇が、休止ＳＪＩＡ段階から活性ＳＪＩＡフレア段階への進行を予測する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生体試料が血液または血漿である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
各バイオマーカーのレベルを決定する前記工程が、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、サンドイッチアッセイ、磁気捕捉アッセイ、微小球捕捉アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、フローサイトメトリー、および質量分析からなる群から選択されるアッセイを行うことを含む、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１９条（ｅ）の下で、２０１６年１１月１１日に出願された米国特許出願第６２／４２０，９９１号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に対しての優先権を主張するものである。
【０００２】
本開示の実施形態は、全身型若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）を有する患者を診断し、川崎病（ＫＤ）および他の熱性疾患を有する患者と識別するための方法、組成物、キットなどに関する。
【背景技術】
【０００３】
若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）は、１０００人の小児うちの１人に起こる自己免疫疾患であり、小児における関節痛（関節炎）であることを特徴とする（２）。ＪＩＡは、全身型若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）を含む小児におけるいくつかの異なる種類の関節炎を包含し、全てのＪＩＡケースの１０％を占める希少疾患であり、その全身作用ゆえに最も重篤な形態である（３、４）。希少疾患は、２００，０００人未満の個人が罹患している疾患として定義される（５）。ｓＪＩＡの発症は、患者の特定の年齢または性別に分けて扱うことはないが、１歳または２歳ぐらいの若い小児において、歩行または這ったときに関節痛のために最初に確認されることが多い（６）。罹患患者の約４０％において、疾患の経過は単周期的（ｍｏｎｏｃｙｃｌｉｃ）であり、変動的な持続期間を伴う。しかしながら、ｓＪＩＡ患者のうちの約６０％において、疾患は多周期的（ｐｏｌｙｃｙｃｌｉｃ）な経過として現れ、休止期間（ｓＪＩＡの不活性状態）およびフレア期間（ｓＪＩＡの活性状態）を伴う（７）。
【０００４】
ｓＪＩＡに関連する身体を衰弱させるフレアに加えて、ポリシリックなｓＪＩＡ患者のうちの１０％はまた、ｓＪＩＡの重篤な合併症であるマクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）に罹患し、これは疾患の活動期中に発症する。ＭＡＳは、活性化Ｔ細胞およびマクロファージからのサイトカインの放出によって引き起こされ、その結果、ｓＪＩＡフレアと同様の症状が生じ、この２つを識別することが困難となる。ＭＡＳは、ｓＪＩＡを有する小児における死亡の最も重篤で重大な原因の１つであり、全てのｓＪＩＡ関連死の２／３を引き起こす（８）。ｓＪＩＡは、小児の関節炎の中で最大の罹患率を占め、発育不全および重篤な関節破壊をもたらす。ＭＡＳに加えて、活性ｓＪＩＡおよび心臓病併発のために患者のうちの７％が死亡する（９）。
【０００５】
ｓＪＩＡの診断は、現在、臨床所見に基づいており、該所見には、関節痛、２週間にわたる毎日の発熱、および以下の症状のうちの少なくとも１つ：発疹、関節炎、漿膜炎、肝脾腫、および全身性リンパ節腫脹が含まれる。Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）および赤血球沈降速度（ＥＳＲ）は、全身性炎症の現在のマーカーであり、ｓＪＩＡフレア中に上昇する（１０、１１）。ｓＪＩＡの適時診断は、悪性腫瘍、川崎病（ＫＤ）、ならびに他の自己免疫疾患および炎症性疾患と症状が同様であり得るので、非常に困難であり得る。さらに、かなりの数の小児において診断が遅れ、患者の２５％超で３ヶ月を超える遅延がある（１２）。ｓＪＩＡの早期診断により、患者がより迅速に治療を開始することが可能になることによって、疾患によって引き起こされる多くの長期の合併症および恒久的障害が軽減される。
【０００６】
ｓＪＩＡの現在の治療は非常に高価である可能性があり、薬物の多くは持続性があり、多くの場合において有害な副作用を有する。過去には、全身性グルココルチコイドおよび非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）が処方されていたが、これらの薬物は、しばしば疾患の間中にわたって長期間処方され、多くの副作用に関連する（１３）。２０１１年に、抗ＩＬ−６療法「トシリズマブ（ｔｏｃｉｌｉｚｕｍａｂ）」がｓＪＩＡの最初のＦＤＡ認可治療となった。より最近では、「アナキンラ（ａｎａｋｉｎｒａ）」として既知であるインターロイキン−１受容体アンタゴニスト療法がｓＪＩＡの治療として認可されている（１４、１５）。これらの薬物は両方とも、ｓＪＩＡの治療に有効であることが示されている。
【０００７】
小児リウマチ病学コミュニティ内では、ｓＪＩＡを診断すること、また、ｓＪＩＡと川崎病などの他の種類の原因不明の発熱（ＦＩ）病とを識別すること、との両方ができる診断検査に対する重要でまだ満たされていない必要性が存在するとの共同のコンセンサスがある。このような診断検査は、これらの障害を診断を行うのに現在関連している医療費を著しく低減し得る現在、ｓＪＩＡの症状を示す患者は、疾患の原因を決定するために複数の血液検査、精密検査、および侵襲的処置を受け、大抵は入院し、全ての他の診断が考慮から除外されるまで抗生物質で処理される（１６）。
本明細書中にさらに記載するように、本開示は、ｓＪＩＡを有する患者を診断し、ｓＪＩＡとＫＤおよび他の熱性疾患を有する患者と識別するための方法、組成物、キットなどを提供することにより、まだ満たされていない必要性を満たすものである。したがって、本明細書に記載された実施形態は、有利なことに、診断時間および診断費用を実質的に減少し、これにより、患者の痛みを軽減させ、これらの状態に罹患した患者に対する適切な治療の享受および該治療への迅速なアクセスを提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｗｏｏ，Ｐ．（２００６）Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，ａｎｄ  Ｏｕｔｃｏｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ２．
【非特許文献２】Ｈｕａｎｇ，Ｊｉｎｇ−Ｌｏｎｇ．（２０１２）Ｎｅｗ  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，Ｃｈａｎｇ  Ｇｕｎｇ  ＭｅｄＪ３５．
【非特許文献３】Ｐａｓｃｕａｌ，Ｖ．（２００５）Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１（ＩＬ−１）ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｏｎｓｅｔ  Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ＩＬ−１  Ｂｌｏｃｋａｄｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ２０１，１４７９−１４８６．
【非特許文献４】Ａｒｏｎｓｏｎ，Ｊ．Ｋ．（２００６）Ｅｄｉｔｏｒｓ’Ｖｉｅｗ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  Ｏｒｐｈａｎ  Ｄｒｕｇｓ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ６１，２４３−２４５．
【非特許文献５】Ｒｅｉｆｆ，Ａ．（２０１２）Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｊｕｅｖｎｉｌｅ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｏｃｉｌｉｚｕｌｍａｂ−ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｆｔｅｒ  ａ  Ｄｅｃａｄｅ  ｏｆ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ２，１−１２．
【非特許文献６】Ｌｉｎｇ，Ｘ．Ｂ．；Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｌ．；Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｔ．；Ｎｇｕｙｅｎ，Ｋ．Ｄ．；Ｌａｕ，Ｋ．；Ｍａｃａｕｂａｓ，Ｃ．；Ｃｈｅｎ，Ｅ．；Ｌｅｅ，Ｔ．；Ｓａｎｄｂｏｒｇ，Ｃ．；Ｍｉｌｏｊｅｖｉｃ，Ｄ．；Ｋａｎｅｇａｙｅ，Ｊ．Ｔ．；Ｇａｏ，Ｓ．；Ｂｕｒｎｓ，Ｊ．；Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇ，Ｊ．；Ｍｅｌｌｉｎｓ，Ｅ．Ｄ．（２０１０）Ｐｌａｓｍａ  Ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ａｒｔｈｉｔｉｓ：Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＰＲＯＴＥＯＭＩＣＳ１０，４４１５−４４３０．
【非特許文献７】Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ｍａｒｋ  ｅｔ．ａｌ（２０１３）Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｉｔｉｎ／Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ  Ｒａｔｉｏ  ａｒｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ４０，１１９１−１１９９．
【非特許文献８】Ｒａｖｅｌｌｉ，Ａｎｇｅｌｏ；Ｍａｒｔｉｎｉ，Ａｌｂｅｒｔｏ．（２００７）Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ３６．７６７−７７８．
【非特許文献９】Ｖａｓｔｅｒｔ，Ｓ．Ｊ．；Ｋｕｉｓ，Ｗ．；Ｇｒｏｍ，Ａ．Ａ．（２００９）Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ＪＩＡ：Ｎｅｗ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｃｌｉｎ  Ｒｈｕｅｍａｔｏｌ  ２３，６５５−６６４．
【非特許文献１０】Ｍｏｔｔｏｎｅｎ，Ｔ．；Ｈａｎｎｏｎｅｎ，Ｐ．；Ｌｅｉｒｉｓａｌｏ−Ｒｅｐｏ，Ｍ．；Ｎｉｓｓｉｌａ，Ｍ．；Ｋａｕｔｉａｉｎｅｎ，Ｈ．；Ｋｏｒｐｅｌａ，Ｍ．；Ｌａａｓｏｎｅｎ，Ｌ．；Ｊｕｌｋｕｎｅｎ，Ｈ．；Ｌｕｕｋｋａｉｎｅｎ，Ｒ．；Ｖｕｏｒｉ，Ｋ．；Ｐａｉｍｅｌａ，Ｌ．；Ｂｌａｆｉｅｌｄ，Ｈ．；Ｈａｋａｌａ，Ｍ．；Ｉｌｖａ，Ｋ．；Ｙｌｉ−Ｋｅｒｔｔｕｌａ，Ｕ．；Ｐｕｏｌａｋｋａ，Ｋ．；Ｊａｒｖｉｎｅｎ，Ｐ．；Ｈａｋｏｌａ，Ｍ．；Ｐｉｉｒａｉｎｅｎ，Ｈ．；Ａｈｏｎｅｎ，Ｊ．；Ｐａｌｖｉｍａｋｉ，Ｉ．；Ｆｏｒｓｂｅｒｇ，Ｓ．；Ｋｏｏｔａ，Ｋ．；Ｆｒｉｍａｎ，Ｃ．（１９９９）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｅａｒｌｙ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ａ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｔｒｉａｌ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３５３，１５６８−１５７３．
【非特許文献１１】Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｌｌｉａｎｃｅ（ＣＡＲＲＡ）：Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｄａｔａ，２０１３．
【非特許文献１２】Ｐａｓｃｕａｌ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；Ａｌｌａｎｔａｚ，Ｆｌｏｒｅｎｃｅ；Ｐａｔｅｌ，Ｐｉｎａｋｅｅｎ；Ｐａｌｕｃｋａ，Ｋａｒｏｌｉｎａ，Ａ；Ｃｈａｕｓｓａｂｅｌ，Ｄａｍｉｅｎ；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊａｃｑｕｅｓ（２００８）Ｈｏｗ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  Ｗｉｔｈ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ２２３，３９−５９．
【非特許文献１３】Ａｎｇｅｌｏｎｉ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  ｅｔ．ａｌ（２０１３）Ａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｘＭａｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭａｐ  Ｃｏｏｋｂｏｏｋ．１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１−１１６．１５．Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ  Ｔｒａｐｐｉｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅ（２０１２）．
【非特許文献１４】Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ  Ｔｒａｐｐｉｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅ（２０１２）．
【非特許文献１５】ＤｅＪａｇｅｒ，Ｗ．；Ｖｅｌｔｈｕｉｓ，Ｈ．Ｔ．；Ｐｒａｋｋｅｎ，Ｂ．Ｊ．；Ｋｕｉｓ，Ｗ．；Ｒｉｊｋｅｒｓ，Ｇ．Ｔ．（２００３）Ｓｉｍｕｌａｔａｎｅｏｕｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １５  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓａｍｐｌｅ  ｏｆ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０，１３３−１３９．
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本本開示の一般的態様によれば、対象における全身型若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）を診断する方法であって、（ｉ）対象から得られた生体試料中の複数のバイオマーカーの各々のレベルを決定する工程であって、該複数のバイオマーカーがカルプロテクチンおよびフォリスタチン様タンパク質−１（ＦＳＴＬ−１）を含む、工程と、（ｉｉ）該複数のバイオマーカーの各々のレベルを各バイオマーカーについての対応する所定の診断閾値と比較し、それにより、対象におけるｓＪＩＡの診断を提供する工程と、を含む、方法を提供する。ある種のより特定的な実施形態において、カルプロテクチンおよびＦＳＴＬ−１に加えて、複数のバイオマーカーは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、およびＳ１００Ａ１２のうちの少なくとも１つをさらに含む。さらに他のより特定的な実施形態において、複数のバイオマーカーは、アルファ−２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、およびアポリポタンパク質Ａ１のうちの少なくとも１つをさらに含む。有利なことに、本開示の方法は、少数のバイオマーカーのみの発現レベルを評価しながら、ｓＪＩＡに対する非常に高いレベルの診断感度および特異性を提供する。いくつかの実施形態において、例えば、本方法において使用される複数のバイオマーカーは、２つ以下のバイオマーカー、３つ以下のバイオマーカー、４つ以下のバイオマーカー以下、または５つ以下バイオマーカーを含む。
【００１０】
ｓＪＩＡを診断するための非常に有効なアプローチを提供する本開示の方法に加えて、ある種の実施形態において、本方法は、対象におけるｓＪＩＡの診断と川崎病（ＫＤ）の診断とを識別する手段、および／または対象におけるｓＪＩＡの診断と熱性疾患（ＦＩ）の診断とを識別するための手段を有利に提供する。したがって、別の態様によれば、本開示は、対象における全身型若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）、川崎病（ＫＤ）、および熱性疾患（ＦＩ）の診断を識別する方法であって、（ｉ）対象から得られた生体試料中の複数のバイオマーカーの各々のレベルを決定する工程であって、該複数のバイオマーカーがカルプロテクチンおよびフォリスタチン関連タンパク質１（ＦＳＴＬ−１）を含む、工程と、（ｉｉ）該複数のバイオマーカーの各々のレベルを各バイオマーカーについての対応する所定の診断閾値と比較し、それにより、対象におけるＳＪＩＡ、ＫＤ、またはＦＩの診断を提供する工程と、を含む、方法を提供する。より特定的な実施形態において、複数のバイオマーカーは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、およびＳ１００Ａ１２のうちの少なくとも１つをさらに含む。他のより特定的な実施形態において、複数のバイオマーカーは、アルファ−２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、およびアポリポタンパク質Ａ１のうちの少なくとも１つをさらに含む。本開示のこの態様のいくつかの実施形態において、本方法において使用される複数のバイオマーカーは、２つ以下のバイオマーカー、３つ以下のバイオマーカー以下、４つ以下のバイオマーカー、または５つ以下のバイオマーカーを含む。
【００１１】
本開示のさらに別の一般的態様によれば、ＳＪＩＡ、ＫＤ、またはＦＩの診断を有することが疑われる対象における治療の必要性についての医師による決定を容易にする方法であって、（ｉ）対象から得られた生体試料中の複数のバイオマーカーの各々のレベルを決定する工程であって、該複数のバイオマーカーがカルプロテクチンおよびフォリスタチン関連タンパク質１（ＦＳＴＬ−１）を含む、工程と、（ｉｉ）対象におけるＳＪＩＡ、ＫＤ、およびＦＩの診断を識別するために、該複数のバイオマーカーの各々のレベルを各バイオマーカーについての対応する所定の診断閾値と比較し、それにより、ＳＪＩＡ、ＫＤ、またはＦＩの治療を対象に行う必要性についての医師による決定を容易にする工程と、を含む、方法を提供する。より特定的な実施形態において、複数のバイオマーカーは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、およびＳ１００Ａ１２のうちの少なくとも１つをさらに含む。他の特定の実施形態において、複数のバイオマーカーは、アルファ−２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、およびアポリポタンパク質Ａ１のうちの少なくとも１つをさらに含む。有利なことに、ある種の特定の実施形態において、複数のバイオマーカーは、２つ以下のバイオマーカー、３つ以下のバイオマーカー以下、４つ以下のバイオマーカー以下、または５つ以下バイオマーカーを含む。本開示の方法に従ってｓＪＩＡ、ＫＤ、および／またはＦＩの陽性診断をする際に、医師には、治療の決定に関する明確性が提供される。例えば、ｓＪＩＡの陽性診断は、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、生物学的薬剤、ならびに関節内および経口ステロイドからなる群から選択される１つ以上の薬剤などの、ｓＪＩＡに好適な１つ以上の治療介入を対象に行うための決定を容易にすることができる。対照的に、本開示の方法によるＫＤの陽性診断は、免疫グロブリン静注（ＩＶＩＧ）を行うようなＫＤに好適な１つ以上の治療介入を対象に行うための医師による治療決定を容易にすることができる。
【００１２】
一般的に、本開示の方法のいずれかに従って、生体試料（例えば、血液試料、血漿試料、または他の種類の試料）中のバイオマーカーのレベルを決定する工程は、当該技術分野で既知の利用可能な様々な技術のいずれかによって行うことができる。ある種の特定の実施形態において、例えば、各バイオマーカーのレベルを決定する工程は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、サンドイッチアッセイ、磁気捕捉アッセイ、微小球（ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅ）捕捉アッセイ、ウェスタンブロットアッセイ、表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）、フローサイトメトリー、および質量分析からなる群から選択されるアッセイを行うことを含む。
【００１３】
さらに別の一般的態様によれば、本開示は、対象におけるｓＪＩＡ、ＫＤ、および／またはＦＩを診断または識別するのに好適な診断キットであって、例えば、対象から得られる生体試料中の複数のバイオマーカーのレベルを決定するのに有効な作用物質（例えば、結合作用物質）を含む、キットを提供する。ある種の特定の実施形態において、キットは、少なくともカルプロテクチンおよびフォリスタチン関連タンパク質１（ＦＳＴＬ−１）のレベルを決定するための作用物質を含む。他のある種の実施形態において、キットは、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、およびＳ１００Ａ１２のうちの少なくとも１つのレベルを決定するための作用物質をさらに含むことができる。さらに他の特定の実施形態において、キットは、アルファ−２マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、およびアポリポタンパク質Ａ１のうちの少なくとも１つのレベルを決定するための作用物質をさらに含む。多くの実施形態において、評価中のバイオマーカーのレベルを決定するのに有効な作用物質は、抗体、その結合断片、および／または評価中のバイオマーカーに特異的であり、そのレベルを定量化するのに有効な他の好適な結合作用物質を含む。例えば、いくつかの実施形態において、本開示のキットは、検査する複数のバイオマーカーに特異的な抗体またはその抗原結合断片を含む、ラテラルフロー装置または他の同等の装置を含む。
【００１４】
本開示のさらに別の一般的態様は、治療の必要性についての医師による決定を容易にするために、対象におけるＳＪＩＡの進行をモニタリングする方法であって、（ｉ）対象から生体試料を得る工程と、（ｉｉ）生体試料において複数のバイオマーカーの各々のレベルを決定する工程であって、該複数のバイオマーカーが少なくともＳ１００Ａ１２、ＣＲＰ、およびカルプロテクチンを含む工程と、（ｉｉｉ）該複数のバイオマーカーの各々のレベルを対応する所定の診断閾値と比較し、それにより、対象におけるＳＪＩＡをモニタリングする工程と、を含む、方法を提供する。例えば、対象におけるＳ１００Ａ１２、ＣＲＰ、およびカルプロテクチンの、それらの所定の診断閾値に対するレベルの上昇は、休止ｓＪＩＡ段階から活性ｓＪＩＡフレア段階への進行を予測することが有利に見出された。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】群間の平均値の統計的有意差（ｐ値＜０．０５）を示す、８つのバイオマーカーの分散分析（ＡＮＯＶＡ）データを示している。
【図１Ｂ】群間の平均値の統計的有意差（ｐ値＜０．０５）を示す、８つのバイオマーカーの分散分析（ＡＮＯＶＡ）データを示している。
【図１Ｃ】群間の平均値の統計的有意差（ｐ値＜０．０５）を示す、８つのバイオマーカーの分散分析（ＡＮＯＶＡ）データを示している。
【図１Ｄ】群間の平均値の統計的有意差（ｐ値＜０．０５）を示す、８つのバイオマーカーの分散分析（ＡＮＯＶＡ）データを示している。
【図１Ｅ】群間の平均値の統計的有意差（ｐ値＜０．０５）を示す、８つのバイオマーカーの分散分析（ＡＮＯＶＡ）データを示している。
【図１Ｆ】群間の平均値の統計的有意差（ｐ値＜０．０５）を示す、８つのバイオマーカーの分散分析（ＡＮＯＶＡ）データを示している。
【図１Ｇ】群間の平均値の統計的有意差（ｐ値＜０．０５）を示す、８つのバイオマーカーの分散分析（ＡＮＯＶＡ）データを示している。
【図１Ｈ】群間の平均値の統計的有意差（ｐ値＜０．０５）を示す、８つのバイオマーカーの分散分析（ＡＮＯＶＡ）データを示している。
【図２Ａ】カルプロテクチン（Ａ）、ＦＳＴＬ−１（Ｂ）、血清アミロイドタンパク質（Ｃ）、およびＣ反応性タンパク質（Ｄ）の分散分析（ＡＮＯＶＡ）データを示している。ＫＤおよび／またはｓＪＩＡにおけるタンパク質発現は、他の疾患状態（ＦＣ（熱性疾患）、ＫＤ、および健常な対照）と比較してアップレギュレートしている。
【図２Ｂ】カルプロテクチン（Ａ）、ＦＳＴＬ−１（Ｂ）、血清アミロイドタンパク質（Ｃ）、およびＣ反応性タンパク質（Ｄ）の分散分析（ＡＮＯＶＡ）データを示している。ＫＤおよび／またはｓＪＩＡにおけるタンパク質発現は、他の疾患状態（ＦＣ（熱性疾患）、ＫＤ、および健常な対照）と比較してアップレギュレートしている。
【図２Ｃ】カルプロテクチン（Ａ）、ＦＳＴＬ−１（Ｂ）、血清アミロイドタンパク質（Ｃ）、およびＣ反応性タンパク質（Ｄ）の分散分析（ＡＮＯＶＡ）データを示している。ＫＤおよび／またはｓＪＩＡにおけるタンパク質発現は、他の疾患状態（ＦＣ（熱性疾患）、ＫＤ、および健常な対照）と比較してアップレギュレートしている。
【図２Ｄ】カルプロテクチン（Ａ）、ＦＳＴＬ−１（Ｂ）、血清アミロイドタンパク質（Ｃ）、およびＣ反応性タンパク質（Ｄ）の分散分析（ＡＮＯＶＡ）データを示している。ＫＤおよび／またはｓＪＩＡにおけるタンパク質発現は、他の疾患状態（ＦＣ（熱性疾患）、ＫＤ、および健常な対照）と比較してアップレギュレートしている。
【図３−１】タンパク質の様々な組み合わせを使用した異なる診断パネルを使用して、４つのグループ（フレア、ＫＤ、ＦＣ（熱性疾患）、および健常な対照）を互いに識別できることを示している。各組み合わせは、ＷＲＴＫＤ、ＦＣ（熱性疾患）、および健常な対照の感度および特異性に変動がある。しかしながら、ｓＪＩＡフレア試料の感度および特異性は、評価された全ての組み合わせに対して１００％で維持されている。ＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ１、Ａ２Ｍ、Ａｐｏ−Ａ１、Ｓ１００Ａ１２、ＳＡＡ、およびＳＡＰを含む８つのバイオマーカーパネル（Ａ）、ＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ１、ＳＡＰを含む４つのバイオマーカーパネル（Ｂ）、ＣＲＰ、カルプロテクチン、およびＦＳＴＬ１を含む３つのバイオマーカーパネル（Ｃ）、ＦＳＴＬ１を含む１つのバイオマーカーパネル（Ｄ）、カルプロテクチンおよびＦＳＴＬ１を含む２つのバイオマーカーパネル（Ｅ）、ＦＳＴＬ１、カルプロテクチン、およびＳＡＰを含む３つのバイオマーカーパネル（Ｆ）、およびカルプロテクチン、ＣＲＰ、Ｓ１００Ａ１２、およびＦＳＴＬ１を含む４つのバイオマーカーパネル（Ｇ）が含まれる。
【図３−２】タンパク質の様々な組み合わせを使用した異なる診断パネルを使用して、４つのグループ（フレア、ＫＤ、ＦＣ（熱性疾患）、および健常な対照）を互いに識別できることを示している。各組み合わせは、ＷＲＴＫＤ、ＦＣ（熱性疾患）、および健常な対照の感度および特異性に変動がある。しかしながら、ｓＪＩＡフレア試料の感度および特異性は、評価された全ての組み合わせに対して１００％で維持されている。ＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ１、Ａ２Ｍ、Ａｐｏ−Ａ１、Ｓ１００Ａ１２、ＳＡＡ、およびＳＡＰを含む８つのバイオマーカーパネル（Ａ）、ＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ１、ＳＡＰを含む４つのバイオマーカーパネル（Ｂ）、ＣＲＰ、カルプロテクチン、およびＦＳＴＬ１を含む３つのバイオマーカーパネル（Ｃ）、ＦＳＴＬ１を含む１つのバイオマーカーパネル（Ｄ）、カルプロテクチンおよびＦＳＴＬ１を含む２つのバイオマーカーパネル（Ｅ）、ＦＳＴＬ１、カルプロテクチン、およびＳＡＰを含む３つのバイオマーカーパネル（Ｆ）、およびカルプロテクチン、ＣＲＰ、Ｓ１００Ａ１２、およびＦＳＴＬ１を含む４つのバイオマーカーパネル（Ｇ）が含まれる。
【図３−３】タンパク質の様々な組み合わせを使用した異なる診断パネルを使用して、４つのグループ（フレア、ＫＤ、ＦＣ（熱性疾患）、および健常な対照）を互いに識別できることを示している。各組み合わせは、ＷＲＴＫＤ、ＦＣ（熱性疾患）、および健常な対照の感度および特異性に変動がある。しかしながら、ｓＪＩＡフレア試料の感度および特異性は、評価された全ての組み合わせに対して１００％で維持されている。ＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ１、Ａ２Ｍ、Ａｐｏ−Ａ１、Ｓ１００Ａ１２、ＳＡＡ、およびＳＡＰを含む８つのバイオマーカーパネル（Ａ）、ＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ１、ＳＡＰを含む４つのバイオマーカーパネル（Ｂ）、ＣＲＰ、カルプロテクチン、およびＦＳＴＬ１を含む３つのバイオマーカーパネル（Ｃ）、ＦＳＴＬ１を含む１つのバイオマーカーパネル（Ｄ）、カルプロテクチンおよびＦＳＴＬ１を含む２つのバイオマーカーパネル（Ｅ）、ＦＳＴＬ１、カルプロテクチン、およびＳＡＰを含む３つのバイオマーカーパネル（Ｆ）、およびカルプロテクチン、ＣＲＰ、Ｓ１００Ａ１２、およびＦＳＴＬ１を含む４つのバイオマーカーパネル（Ｇ）が含まれる。
【図３−４】タンパク質の様々な組み合わせを使用した異なる診断パネルを使用して、４つのグループ（フレア、ＫＤ、ＦＣ（熱性疾患）、および健常な対照）を互いに識別できることを示している。各組み合わせは、ＷＲＴＫＤ、ＦＣ（熱性疾患）、および健常な対照の感度および特異性に変動がある。しかしながら、ｓＪＩＡフレア試料の感度および特異性は、評価された全ての組み合わせに対して１００％で維持されている。ＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ１、Ａ２Ｍ、Ａｐｏ−Ａ１、Ｓ１００Ａ１２、ＳＡＡ、およびＳＡＰを含む８つのバイオマーカーパネル（Ａ）、ＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ１、ＳＡＰを含む４つのバイオマーカーパネル（Ｂ）、ＣＲＰ、カルプロテクチン、およびＦＳＴＬ１を含む３つのバイオマーカーパネル（Ｃ）、ＦＳＴＬ１を含む１つのバイオマーカーパネル（Ｄ）、カルプロテクチンおよびＦＳＴＬ１を含む２つのバイオマーカーパネル（Ｅ）、ＦＳＴＬ１、カルプロテクチン、およびＳＡＰを含む３つのバイオマーカーパネル（Ｆ）、およびカルプロテクチン、ＣＲＰ、Ｓ１００Ａ１２、およびＦＳＴＬ１を含む４つのバイオマーカーパネル（Ｇ）が含まれる。
【図３−５】タンパク質の様々な組み合わせを使用した異なる診断パネルを使用して、４つのグループ（フレア、ＫＤ、ＦＣ（熱性疾患）、および健常な対照）を互いに識別できることを示している。各組み合わせは、ＷＲＴＫＤ、ＦＣ（熱性疾患）、および健常な対照の感度および特異性に変動がある。しかしながら、ｓＪＩＡフレア試料の感度および特異性は、評価された全ての組み合わせに対して１００％で維持されている。ＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ１、Ａ２Ｍ、Ａｐｏ−Ａ１、Ｓ１００Ａ１２、ＳＡＡ、およびＳＡＰを含む８つのバイオマーカーパネル（Ａ）、ＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ１、ＳＡＰを含む４つのバイオマーカーパネル（Ｂ）、ＣＲＰ、カルプロテクチン、およびＦＳＴＬ１を含む３つのバイオマーカーパネル（Ｃ）、ＦＳＴＬ１を含む１つのバイオマーカーパネル（Ｄ）、カルプロテクチンおよびＦＳＴＬ１を含む２つのバイオマーカーパネル（Ｅ）、ＦＳＴＬ１、カルプロテクチン、およびＳＡＰを含む３つのバイオマーカーパネル（Ｆ）、およびカルプロテクチン、ＣＲＰ、Ｓ１００Ａ１２、およびＦＳＴＬ１を含む４つのバイオマーカーパネル（Ｇ）が含まれる。
【図４】フレア「活性ｓＪＩＡ」および休止「不活性ｓＪＩＡ」試料に関するタンパク質発現を評価するモニタリング研究の結果を示している。評価された３つのバイオマーカーは、疾患状態（Ａ〜Ｃ）の変化、典型的にはフレアの増加および休止の減少を伴った、発現の変化を示している。タンパク質変化は、異なる種類の治療によって影響を受ける可能性があると思われる（Ｄ）。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本明細書にさらに記載するように、本開示は、一般的に、対象における全身型若年性特発性関節炎（ｓＪＩＡ）、川崎病（ＫＤ）、および熱性疾患（ＦＩ）を診断および識別するための方法および組成物に関する。典型的には、本方法は、対象から得られた生体試料中の特定のバイオマーカーのレベルを決定し、そのレベルを各バイオマーカーについての対応する所定の診断閾値と比較し、それにより、その比較に基づいて対象におけるＳＪＩＡ、ＫＤ、および／またはＦＩの診断を識別することを含む。したがって、本明細書に記載されたバイオマーカーおよび方法は、他では状態を区別するのが難しい３つの診断し、それらを識別するための、簡単で、迅速で、信頼性があり、費用効果が高い手段の基礎を形成する。
【００１７】
本開示の実施は、別段の指示がない限り、当該技術分野範囲内である薬理学、化学、生化学、組換えＤＮＡ技術、および免疫学の従来方法を使用する。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．  Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）を参照のこと。
【００１８】
上記または後述に関わらず、本明細書に引用された全ての公表物、特許、および特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１９】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」」、および「ｔｈｅ」は、内容がそうでないことを明確に示していない限り、複数の対象を含む。
【００２０】
「約」との用語は、特に所与の量に関して、±５％の偏差を包含することを意味する。
【００２１】
「ポリペプチド」および「タンパク質」との用語は、アミノ酸残基のポリマーを指し、対象由来の好適な生体試料において検出可能である限り、最小の長さに限定されない。したがって、ペプチド、オリゴペプチド、二量体、多量体など、ならびに完全長タンパク質およびその断片が含まれる。これらの用語には、例えば、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、ヒドロキシル化、酸化などが含まれる。
【００２２】
「対象」、「個体」、および「患者」との用語は、本明細書において互換的に使用され、診断、予後、治療、または療法が所望される任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。他の対象には、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどが含まれ得る。いくつかの場合において、本発明の方法は、限定するものではないが、マウス、ラット、およびハムスターを含むげっ歯類ならびに霊長類を含む、実験動物、獣医学的応用、および疾患用動物モデルの開発における使用を見出す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「生体試料」とは、対象から単離された組織または流体の試料を指し、限定するものではないが、例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、骨髄、胆汁、髄液、リンパ液、皮膚試料、皮膚の外分泌物、呼吸器、腸、および泌尿生殖路、涙、唾液、乳、血液細胞、器官、生検、ならびに限定するものではないが、培養培地中の細胞および組織、例えば、組換え細胞、および細胞成分の増殖に由来する馴化培地を含む、インビトロ細胞培養成分の試料が含まれる。
【００２４】
「実質的に精製された」とは、天然の環境から取り出され、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、またはそれ以上、天然に関連する他の成分から単離または分離された核酸分子、タンパク質、抗体、または他の生体成分を指す。
【００２５】
バイオマーカーおよび検出方法
本開示は、ｓＪＩＡ、ＫＤ、および／またはＦＩの診断および識別において有利に使用することができる特定のバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせの発見に基づく。一般的に言えば、本開示のバイオマーカーは、ＳＪＩＡ、ＫＤ、およびＦＩを有する患者から得られた試料中で示差的に発現される生体化合物、特にタンパク質を含む。より特定的には、本開示のバイオマーカーは、典型的には、健常な対照と比較したときのおよび／または互いに比較したとき（例えばｓＪＩＡ対ＫＤ対ＦＩ）の、ＳＪＩＡ、ＫＤ、およびＦＩを有する対象から得られた試料中の量および／または頻度の差を示す。
【００２６】
本開示の実施において使用することができるバイオマーカーは、本明細書にさらに記載および例示されており、限定するものではないが、アルファ−２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ−Ｉ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、カルプロテクチン、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、Ｓ１００Ａ１２、ＦＳＴＬ−１、および／またはそれらの組み合わせが含まれる。例えば、一実施形態において、本開示に従って使用されるバイオマーカーの組み合わせは、少なくともＦＳＴＬ−１を含む。別の実施形態において、本開示に従って使用されるバイオマーカーの組み合わせは、少なくともカルプロテクチンおよびＦＳＴＬ−１を含む。さらに別の実施形態において、本開示に従って使用されるバイオマーカーの組み合わせは、ＣＲＰ、カルプロテクチン、およびＦＳＴＬ−１を含む。さらに別の実施形態において、本開示に従って使用されるバイオマーカーの組み合わせは、少なくともカルプロテクチン、ＦＳＴＬ−１、およびＳＡＰを含む。さらなる実施形態において、本開示の文脈で使用されるバイオマーカーの組み合わせは、少なくともＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ１、およびＳＡＰを含む。別の実施形態において、本開示の文脈で使用されるバイオマーカーの組み合わせは、少なくともＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ−１、およびＳ１００Ａ１２を含む。さらなる実施形態において、本開示の文脈で使用されるバイオマーカーの組み合わせは、少なくともＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ−１、Ａ２Ｍ、Ａｐｏ−Ａ１、Ｓ１００Ａ１２、ＳＡＡ、およびＳＡＰを含む。
【００２７】
ある種の実施形態において、本開示（例えば、本開示の方法、キット、装置、および／または他の態様）に従って使用されるバイオマーカーの組み合わせは、ｓＪＩＡ、ＫＤ、およびＦＩを診断または識別するために本明細書に開示された２つ以下、３つ以下、４つ以下、または５つ以下のバイオマーカーを含む。
【００２８】
一般的に、一方の試料中のポリペプチドの量が他方の試料中のポリペプチドの量と統計的に有意に異なる場合、２つの試料間でバイオマーカーが示差的に発現されている。例えば、ある種の実施形態において、ポリペプチドが、比較される他の試料中で存在しているものよりも、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％以上多い場合、あるいは一方の試料中で検出可能であり、他方では検出可能でない場合、ポリペプチドは２つの試料において示差的に発現されている。
【００２９】
さらに、一般的には、ｓＪＩＡ、ＫＤ、またはＦＩに罹患している患者の試料においてポリペプチドを検出する頻度が、対照試料のものよりも統計的に有意に高いまたは低い場合、ポリペプチドは２組の試料において示差的に発現されている。例えば、ある種の実施形態において、ポリペプチドが、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約５００％、少なくとも約７００％、少なくとも約９００％、または少なくとも約１０００％以上高い頻繁または低い頻度で、他方の組の試料よりも一方の組の試料で観察される場合、ポリペプチドは２組の試料において示差的に発現されている。
【００３０】
診断対象から得られる生体試料は、多くの実施形態において、血液または血漿であるが、該生体試料はまた、本質的には、発現されたバイオマーカーを含む体液、組織、または細胞由来の任意の試料であり得る。本明細書で使用される「対照」試料とは、罹患していない血液、血漿、組織、または細胞などの生体試料を指す。すなわち、対照試料は、健常な対象（例えば、ｓＪＩＡ、ＫＤ、ＦＩ、またはこれらの状態に関連する状態もしくは症状を有していないことが既知である個体）から得られる。生体試料は、従来技術により対象から得ることができる。例えば、静脈穿刺により、血液を得ることができる。既知の方法に従って全血を分画することにより、血漿および血清を得ることができる。固体組織試料を得るための外科技術はまた、当該技術分野で周知である。
【００３１】
一般的に、バイオマーカーの「対照量」は、ｓＪＩＡ、ＫＤ、および／またはＦＩを診断または識別するために、マーカーの検査量に対して比較される任意の量または量の範囲であることができる。例えば、バイオマーカーの対照量は、ｓＪＩＡ、ＫＤ、および／またはＦＩを有さない人におけるバイオマーカーの量であり得る。対照量は、絶対量（例えば、ｇ／ｍｌ）または相対量（例えば、シグナルの相対強度）であり得る。
【００３２】
バイオマーカーの「検査量」とは、検査される試料中に存在するバイオマーカーの量を指す。検査量は、絶対量（例えば、ｇ／ｍｌ）または相対量（例えば、シグナルの相対強度）のいずれかであり得る。
【００３３】
バイオマーカーの「診断量」とは、一般的に、単独で検討される場合またはバイオマーカーの特定の組み合わせとの併用で検討される場合のいずれかにおいて、ｓＪＩＡ、ＫＤ、および／またはＦＩの特定の診断または示差診断と合致する対象試料中のバイオマーカーの量（例えば、閾値量または範囲）を指す。診断量は、絶対量（例えば、ｇ／ｍｌ）または相対量（例えば、シグナルの相対強度）のいずれかであり得る。
【００３４】
本明細書の方法を実施するために使用される好適な対照および診断値または範囲の決定は、本開示を考慮した当業者によって容易に決定され得ることが理解されるであろう。
【００３５】
試料中のバイオマーカーの発現レベルを決定することはまた、当該技術分野で既知の利用可能な任意の好適な方法を用いて実施することができることも理解されるであろう。さらに、バイオマーカーの発現レベルの測定は直接的または間接的であり得る。例えば、ＲＮＡまたはタンパク質のレベルは、既知の技術によって直接的に定量化することができる。あるいは、バイオマーカーの量は、ｃＤＮＡ、増幅されたＲＮＡもしくはＤＮＡのレベルを測定することにより、または関心のあるバイオマーカーの発現レベルを示すＲＮＡ、タンパク質、もしくは他の分子（例えば、代謝物）の量もしくは活性を測定することによって間接的に決定することができる。
【００３６】
ある種の実施形態において、バイオマーカーの発現レベルは、関心のあるタンパク質またはポリペプチドもしくはペプチド断片を特異的に認識する抗体（または他の結合作用物質）を用いて、バイオマーカータンパク質またはポリペプチドもしくはそのペプチド断片のレベルを測定することによって決定される。そのようなアッセイには、限定するものではないが、免疫組織化学染色（ＩＨＣ）、ウェスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、免疫沈降アッセイが含まれ、その実施は当該技術分野で周知である（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，ｅｄｓ，１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと）。
【００３７】
バイオマーカーが試料中に存在する場合、バイオマーカーは、好適なインキュベーション条件下でバイオマーカーに特異的に結合する抗体と抗体−バイオマーカー複合体を形成する。それにより、生体試料中の抗体−バイオマーカー複合体の量を決定し、所定の診断閾値量または範囲と比較し、決定されたレベルが陽性または示差診断を示すかどうかを決定することができる。
【００３８】
本開示による１つ以上のバイオマーカーのレベルを決定するために抗体を使用する場合、そのような抗体は、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を用いて調製することができる（例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９９１）；Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８８）；Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｄ  ｅｄ．１９８６）；およびＫｏｈｌｅｒ＆Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ２５６：４９５−４９７（１９７５）を参照のこと）。例えば、バイオマーカー抗原を使用してマウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル、またはヒトなどの哺乳動物を免疫化して、ポリクローナル抗体を産生することができる。所望する場合、バイオマーカー抗原をウシ血清アルブミン、チログロブリン、およびキーホールリンペットヘモシアニンなどの担体タンパク質に結合させることができる。宿主種に応じて、様々なアジュバントを使用して免疫学的応答を増加させることができる。そのようなアジュバントには、限定するもではないが、フロイントアジュバント、無機ゲル（例えば水酸化アルミニウム）、および界面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、およびジニトロフェノールなど）が含まれる。ヒトに使用されるアジュバントの中で、ＢＣＧ（バシル・カルメット・ゲラン（ｂａｃｉｌｌｉｃａｌｍｅｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ））およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が特に有用である。
【００３９】
培地での継代細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術を用いて、バイオマーカー抗原に特異的に結合するモノクローナル抗体を調製することができる。これらの技術には、限定するものではないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２５６，４９５−９７，１９８５；Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ８１，３１４２，１９８５；Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０，２０２６−３０，１９８３；Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６２，１０９−２０，１９８４）が含まれる。
【００４０】
さらに、「キメラ抗体」の産生のために開発された技術を使用することができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８１，６８５１−５５，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１２，６０４−０８，１９８４；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３１４，４５２−５４，１９８５）。キメラ抗体は、例えばＷＯ９３／０３１５１およびその他に記載されるようにして構築することができる。ＷＯ９４／１３８０４に記載されている「ダイアボディー」などの多価および多重特異的な（ｍｕｌｔｉ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ）免疫グロブリン由来の結合タンパク質も使用することができる。所望する場合、モノクローナル抗体および他の抗体も「ヒト化」することができる。ヒト化抗体は、当該技術分野で既知の確立されている組換え法を使用して作製することができる（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；ＰＬｏＳ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ４（５），９２８−３６，２００７）。
【００４１】
あるいは、単鎖抗体の産生について記載された技術を当技術分野で既知の方法を使用して適合させて、特定の抗原に特異的に結合する単鎖抗体を産生することができる。関連する特異性を有するが異なるイディオタイプ組成を有する抗体を、コンビナトリアル免疫グロブリンライブラリーからの鎖シャフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）によって作製することができる（Ｂｕｒｔｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，１１１２０−２３，１９９１）。ハイブリドーマｃＤＮＡを鋳型として使用したＰＣＲなどのＤＮＡ増幅法を使用して、単鎖抗体を構築することもできる（Ｔｈｉｒｉｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．５，５０７−１１，１９９６）。単鎖抗体は、単一特異性または二重特異性であり得、２価または４価であり得る。４価の二重特異性単鎖抗体の構築は、他例えば、Ｃｏｌｏｍａ＆Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５，１５９−６３，１９９７に教示されている。２価の二重特異性単鎖抗体の構築は、Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ＆Ｖｏｓｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，１９９−２０６，１９９４に教示されている。
【００４２】
下記に記載するように、単鎖抗体をコードするヌクレオチド配列は、手動または自動ヌクレオチド合成を用いて構築され、標準的な組換えＤＮＡ法を用いて発現構築物にクローニングされ、細胞内に導入されて、コード配列を発現する。あるいは、例えば繊維状ファージ技術を使用して、単鎖抗体を直接作製することができる（Ｖｅｒｈａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ６１，４９７−５０１，１９９５；Ｎｉｃｈｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１６５，８１−９１，１９９３）。
【００４３】
バイオマーカー抗原に特異的に結合する抗体は、リンパ球集団中でのインビボ産生を誘導することにより作製するか、あるいは文献に開示されるように（Ｏｒｌａｎｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６，３８３３  ３８３７，１９８９；Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３４９，２９３  ２９９，１９９１）、高度に特異的な結合試薬の免疫グロブリンライブラリーまたはパネルをスクリーニングすることにより作製することができる。
【００４４】
抗体は、当該技術分野で周知の方法によって精製することができる。例えば、関連する抗原が結合したカラムを通過させることにより、抗体をアフィニティー精製することができる。次いで、高い塩濃度の緩衝液を用いて、結合した抗体をカラムから溶出させることができる。
【００４５】
バイオマーカーに「特異的に（または選択的に）結合する」または「特異的に（または選択的に）免疫反応性を示す」抗体とは、タンパク質および他の生物製剤の不均一な集団中におけるタンパク質の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定された免疫測定条件下で、抗体（または他の結合作用物質）は一般的に、バックグラウンドの少なくとも２倍で特定のタンパク質に結合し、試料中に存在する他のタンパク質には有意な量で実質的には結合しない。典型的には、特定のまたは選択的な反応は、バックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的にはバックグラウンドの１０〜１００倍より大きい。
【００４６】
生体試料中のバイオマーカーの存在の検出またはその定量化のための抗体またはその断片の使用は周知であり、理解されている。そのような方法は、一般的に、例えば、（ｉ）生体試料を抗体と接触させること、ここで、該試料は、組織（例えば、ヒト、動物など）、生体液（例えば、血液、尿、痰、精液、羊水、唾液など）、生体抽出物（例えば、組織または細胞ホモジネートなど）、タンパク質マイクロチップ（例えば、Ａｒｅｎｋｏｖ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７８（２）：１２３−１３１（２０００）を参照のこと）、またはクロマトグラフィーカラムなどである、および（ｉｉ）基質に結合した抗体を定量化することを含む。この方法は、上記および本明細書のその他の箇所で定義したような試料に抗体を供する前に、抗体を固体支持体に共有的、静電的、または可逆的に結合させる予備工程をさらに含んでもよい。
【００４７】
様々な診断アッセイ技術が当該技術分野で既知であり、例えば、競合的結合アッセイ、直接的または間接的サンドイッチアッセイ、および不均一相または均一相のいずれかで行われる免疫沈降アッセイがある（Ｚｏｌａ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７），ｐｐ１４７−１５８）。
【００４８】
ある種の実施形態において、低含量の血漿タンパク質について試料を濃縮し、それによりバイオマーカーの検出を容易にするために、分析前に生体試料を分画することができる。試料中のタンパク質の結合特性または試料中のタンパク質の特性に基づいて試料の複雑性を低減する多くの方法がある。
【００４９】
一実施形態において、例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用し、試料中のタンパク質サイズに応じて試料を分画することができる。利用可能な試料の量が少ない生体試料については、サイズ選択スピンカラムを使用することが好ましい。一般的に、カラムから溶出する第１の画分（「画分１」）は、最も高い割合の高分子量タンパク質を有し、画分２は、低い割合の低分子量タンパク質を有し、画分３は、さらにより低い割合の高分子量タンパク質を有し、画分４は、最低量の大きなタンパク質を有する、などである。次いで、バイオマーカーの検出のために、各画分をイムノアッセイ、気相イオン分光測定（ｇａｓ  ｐｈａｓｅ  ｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）などによって分析することができる。
【００５０】
別の実施形態において、試料を陰イオン交換クロマトグラフィーによって分画することができる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、試料中のタンパク質をその電荷特性に従って大まかに分画することを可能にする。例えば、Ｑ陰イオン交換樹脂を使用することができ（例えば、Ｑ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆ、Ｂｉｏｓｅｐｒａ）、試料を異なるｐＨを有する溶出液で連続的に溶出させることができる。陰イオン交換クロマトグラフィーは、より大きな負電荷を持った試料中のバイオマーカーを他の種類のバイオマーカーから分離することを可能にする。高ｐＨの溶出液で溶出されるタンパク質は弱い負電荷を持ちやすく、低ｐＨの溶出液で溶出するタンパク質は強い負電荷を持ちやすい。したがって、試料の複雑性を低減することに加え、陰イオン交換クロマトグラフィーは、タンパク質をそれらの結合特性に応じて分離する。
【００５１】
さらに別の実施形態において、試料をヘパリンクロマトグラフィーによって分画することができる。ヘパリンクロマトグラフィーは、ヘパリンとの親和性相互作用および荷電特性に基づいて試料中のバイオマーカーの分画を可能にする。硫酸化ムコ多糖であるヘパリンは正電荷を有する部分を有するバイオマーカーに結合し、試料を異なるｐＨまたは塩濃度を有する溶出液で連続的に溶出することができる。低ｐＨの溶出液で溶出されたバイオマーカーは、弱い正電荷をより持ちやすい。高ｐＨの溶出液で溶出したバイオマーカーは、強い正電荷をより持ちやすい。したがって、ヘパリンクロマトグラフィーはまた、試料の複雑性を低減し、バイオマーカーをその結合特性に応じて分離する。
【００５２】
さらに別の実施形態において、特定の特性、例えばグリコシル化を有するタンパク質を単離することによって、試料を分画することができる。例えば、試料をレクチンクロマトグラフィーカラム（糖に対して高い親和性を有する）に通過させることによって、試料を分画することができる。グリコシル化タンパク質はレクチンカラムに結合し、非グリコシル化タンパク質はフロースルーを通過する。次いで、グリコシル化タンパク質を、糖、例えば、Ｎ−アセチル−グルコサミンを含有する溶出液でレクチンカラムから溶出し、さらなる分析に利用可能である。
【００５３】
別の実施形態において、連続抽出プロトコルを用いて試料を分画することができる。連続抽出では、試料を一連の吸着剤に暴露して、試料から異なる種類のバイオマーカーを抽出する。例えば、試料を第１の吸着剤に適用してある種のタンパク質を抽出し、非吸着タンパク質（すなわち、第１の吸着剤に結合しなかったタンパク質）を含有する溶出液を収集する。次いで、この画分を第２の吸着剤に暴露する。これにより、この画分から様々なタンパク質がさらに抽出される。次いで、この第２の画分を第３の吸着剤に暴露するなどする。
【００５４】
任意の好適な材料および方法を用いて、試料の連続抽出を行うことができる。例えば、異なる吸着剤を含む一連のスピンカラムを使用することができる。別の例において、底部に異なる吸着剤を含むマルチウェルを使用することができる。別の例において、気相イオン分光測定における使用に適合されたプローブ上で連続抽出を行うことができ、プローブの表面はバイオマーカーを結合するための吸着剤を含む。この実施形態において、試料をプローブ上の第１の吸着剤に適用し、その後に吸着剤を溶出液で洗浄する。第１の吸着剤に結合しないバイオマーカーを溶出液で除去する。この画分中に存在するバイオマーカーをプローブ上の第２の吸着剤に適用するなどできる。気相イオン分光測定計プローブで連続抽出を行う利点は、連続抽出プロトコルの各工程で様々な吸着剤に結合するバイオマーカーを気相イオン分光測定計を用いて直接分析することができることである。
【００５５】
さらに別の実施形態において、試料中のバイオマーカーを高分解能電気泳動、例えば、一次元または二次元ゲル電気泳動によって分離することができる。バイオマーカーを含む画分を単離し、さらに気相イオン分光測定計により単離することができる。二次元ゲル電気泳動を用いて、バイオマーカー用スポットの二次元アレイを作成することが好ましい。例えば、Ｊｕｎｇｂｌｕｔ  ａｎｄ  Ｔｈｉｅｄｅ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒ．Ｒｅｖ．１６：１４５−１６２（１９９７）を参照されたい。
【００５６】
二次元ゲル電気泳動は、当該技術分野で既知の方法を用いて行うことができる。（例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  ｅｄ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．１８２を参照のこと）。典型的には、試料中のバイオマーカーは、例えば等電点電気泳動によって分離され、その際、試料中のバイオマーカーは、その正味電荷がゼロ（すなわち等電点）であるスポットに達するまでｐＨ勾配で分離される。この第１の分離工程は、バイオマーカーの一次元アレイをもたらす。一次元アレイ中のバイオマーカーは、第１の分離工程で使用されるものとは一般的に異なる技術を用いてさらに分離される。例えば、二次元において、等電点電気泳動によって分離されたバイオマーカーが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）の存在下で電気泳動によるポリアクリルアミドゲルを用いてさらに分離される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、分子量に基づいてさらなる分離を可能にする。典型的には、二次元ゲル電気泳動は、１０００〜２００，０００Ｄａの範囲の分子質量を有する化学的に異なるバイオマーカーを複合混合物中にあっても分離することができる。
【００５７】
二次元アレイ中のバイオマーカーは、当該技術分野で既知の任意の好適な方法を用いて検出することができる。例えば、ゲル中のバイオマーカーを標識または染色することができる（例えば、クマシーブルーまたは銀染色）。ゲル電気泳動により、本開示の１つ以上のバイオマーカーの分子量に対応するスポットが生じる場合、このスポットをデンシトメトリー分析または気相イオン分光測定によってさらに分析することができる。例えば、スポットをゲルから切り出して、気相イオン分光測定によって分析することができる。あるいは、バイオマーカーを含有するゲルを、電場をかけることにより不活性膜にトランスファーすることができる。次いで、バイオマーカーの分子量におおよそ対応する膜上のスポットを気相イオン分光測定によって分析することができる。気相イオン分光測定では、スポットをＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩなどの任意の好適な技術を用いて分析することができる。気相イオン分光測定分析の前に、プロテアーゼ（例えばトリプシン）などの切断試薬を用いて、スポット中のバイオマーカーをより小さな断片に切断することが望ましい場合がある。バイオマーカーを小さな断片に消化することにより、スポット中のバイオマーカーのマスフィンガープリントが提供され、所望する場合、これを使用してバイオマーカーの同一性を決定することができる。
【００５８】
さらに別の実施形態において、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ））を使用して、試料中のバイオマーカーの混合物を極性、電荷、サイズなどのそれらの異なる物理的性質に基づいて分離することができる。ＨＰＬＣ機器は、典型的には、リザーバ、移動相、ポンプ、インジェクタ、分離カラム、および検出器からなる。試料中のバイオマーカーは、試料のアリコートをカラムに注入することによって分離される。混合物中の異なるバイオマーカーは、移動液相と固定相との間の分配挙動の相違に起因して異なる速度でカラムを通過する。１つ以上のバイオマーカーの分子量および／または物理的性質に対応する画分を収集することができる。次いで、この画分を気相イオン分光測定により分析して、バイオマーカーを検出することができる。
【００５９】
任意選択により、バイオマーカーを分析前に改変して、その分解能を向上させ、またはその同一性を決定することができる。例えば、バイオマーカーを分析前にタンパク質分解消化に供してもよい。任意のプロテアーゼを使用することができる。バイオマーカーを別個の数の断片に切断する可能性が高いトリプシンなどのプロテアーゼが特に有用である。消化から生ずる断片はバイオマーカーのフィンガープリントとして機能し、それにより、それらの検出を間接的に可能にする。これは、問題のバイオマーカーについて混同され得る同様の分子質量を有するバイオマーカーが存在する場合に特に有用である。
【００６０】
また、タンパク質分解の断片化は高分子量バイオマーカーに有用であるが、その理由は、より小さなバイオマーカーは、質量分析により、より簡単に分解されるからである。別の例において、バイオマーカーを改変して検出分解能を向上することができる。例えば、ノイラミニダーゼを用いて、糖タンパク質から末端シアル酸残基を除去し、陰イオン吸着剤への結合性を向上させ、検出分解能を向上させることができる。別の例において、バイオマーカーは、分子バイオマーカーに特異的に結合する特定の分子量のタグを結合させることによって改変することができ、さらにそれらを区別する。任意選択により、そのように改変されたバイオマーカーを検出した後、改変されたバイオマーカーの物理的特性および化学的特性をタンパク質データベース（例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ）でマッチングさせることによって、バイオマーカーの同一性をさらに決定することができる。
【００６１】
調製後、試料中のバイオマーカーは典型的には検出用基板上で捕捉される。従来の基板には、タンパク質の存在についてその後に探査される、抗体がコーティングされた９６ウェルプレートまたはニトロセルロース膜が含まれる。あるいは、微小球、微粒子、マイクロビーズ、ビーズまたは他の粒子に結合されたタンパク質結合分子を、バイオマーカーの捕捉および検出に使用することができる。タンパク質結合分子は、抗体、ペプチド、ペプトイド、アプタマー、小分子リガンド、または粒子表面に結合された他のタンパク質結合捕捉作用物質であり得る。各タンパク質結合分子は「固有の検出可能な標識」を含むことができ、該標識は、他のタンパク質結合分子に結合された他の検出可能な標識から区別することができるように固有にコード化され、多重アッセイにおいてバイオマーカーの検出を可能にする。例には、限定するものではないが、既知の蛍光強度を有するカラーコード（ｃｏｌｏｒ−ｃｏｄｅｄ）微小球（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）により作製されたｘＭＡＰ技術を有する微小球を参照のこと；量子ドットナノ結晶を含有する、例えば、異なる比率および組み合わせの量子ドットカラーを有する微小球（例えば、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）によって作製されたＱｄｏｔナノ結晶；ガラスコーティング金属ナノ粒子（例えば、Ｎａｎｏｐｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）によって作製されたＳＥＲＳナノタグを参照のこと；バーコード材料（例えば、Ｎａｎｏｐｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって作製されたナノバーコードなどのサブミクロンサイズのストライプ金属ロッドを参照のこと）、カラーバーコードを有するコード化微粒子（例えば、Ｖｉｔｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｉｔｒａｂｉｏ．ｃｏｍにより作製されたＣｅｌｌＣａｒｄを参照のこと）、デジタルホログラフィックコードイメージを伴うガラス微粒子（例えば、ｌｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）により作製されたＣｙＶｅｒａマイクロビーズを参照のこと）；化学発光色素、色素化合物の組み合わせ；および検出可能に異なるサイズのビーズが含まれる。例えば、米国特許第５，９８１，１８０号、米国特許第７，４４５，８４４号、米国特許第６，５２４，７９３号、Ｒｕｓｌｉｎｇら（２０１０）Ａｎａｌｙｓｔ１３５（１０）：２４９６−２５１１；Ｋｉｎｇｓｍｏｒｅ（２００６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．５（４）：３１０−３２０，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  Ｖｏｌ．５７０５  Ｎａｎｏｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ＩＩ，Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  Ｎ．Ｃａｒｔｗｒｉｇｈｔ；Ｍａｒｅｋ  Ｏｓｉｎｓｋｉ，Ｅｄｉｔｏｒｓ，ｐｐ．１１４−１２２；Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００５，Ｖｏｌｕｍｅ３０３（これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【００６２】
上述のように、捕捉試薬は周知であり、ある種の実施形態において有利に使用することができる。捕捉試薬は、一般的に、特定の標的分子または標的分子群に特異的に結合する分子または分子群を指す。例えば、捕捉試薬は２つ以上の抗体を含むことができ、その各抗体は別個の標的分子に対する特異性を有する。捕捉試薬は、標的分子に特異的に結合することができる、有機もしくは無機化学物質または生体分子、ならびにすべてのそれらの断片、類似体、相同体、結合体、および誘導体の任意の組み合わせであり得る。
【００６３】
捕捉試薬は、複数の標的と複合体を形成することができる単一の分子、例えば、異なる標的に対して複数の結合部位を有する多量体融合タンパク質を含むことができる。捕捉試薬は、各々が異なる標的に対する特異性を有する複数の分子を含むことができ、それにより、複数の捕捉試薬−標的複合体をもたらす。ある種の実施形態において、捕捉試薬は、抗体などのタンパク質から構成される。
【００６４】
捕捉試薬は、検出可能な部分で直接標識することができる。例えば、抗バイオマーカー抗体を検出可能な部分に直接結合させて、本発明の方法、装置、およびキットで使用することができる。あるいは、捕捉試薬−バイオマーカー複合体の検出は、バイオマーカーまたは捕捉試薬−バイオマーカー複合体に特異的に結合する二次試薬によって行うことができる。二次試薬は、任意の生体分子であり得、好ましくは抗体である。二次試薬は、典型的には検出可能な部分で標識される。いくつかの実施形態において、捕捉試薬または二次試薬はビオチンに結合され、検出可能な部分タグを有するアビジンまたはストレプトアビジンと接触させる。
【００６５】
抗体、捕捉試薬、または他の分子とともに使用される検出可能な部分または標識は、一般的に、検出可能なシグナルを直接的または間接的のいずれかで生じさせることができる。本開示で使用するのに好適な検出可能な部分および標識には、限定するものではないが、放射性同位体、蛍光色素、例えば、フルオレセイン、フィコエリトリン、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、アロフィコシアニン、ＤＡＰＩ、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、ローダミン、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ）、ルシファーイエローなど、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）、青色蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、セリアンサスオレンジ（Ｃｅｒｉａｎｔｈｕｓ  Ｏｒａｎｇｅ）蛍光タンパク質（ｃＯＦＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ−ラクタマーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ、Ｇ４１８ｒ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ハイグロマイシン−Ｂ−ホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＨ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、ｌａｃＺ（α−ガラクトシダーゼをコードしている）、およびキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＰＲＴ）、ベータ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）、胎盤性アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）、分泌型胎盤アルカリホスファターゼ（Ｓｅｃｒｅｔｅｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）（ＳＥＡＰ）、またはホタルもしくは細菌ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）が含まれる。酵素タグは、それらの同族の基質とともに使用される。この用語はまた、既知の蛍光強度のカラーコード微小球（例えば、Ｌｕｍｉｎｅｘ（Ａｕｓｔｉｎ、Ｔｅｘ．）により作製されたｘＭＡＰ技術を有する微小球を参照のこと；量子ドットナノ結晶を含有する、例えば、異なる比率および組み合わせの量子ドットカラーを有する微小球（例えば、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）によって作製されたＱｄｏｔナノ結晶；ガラスコーティング金属ナノ粒子（例えば、Ｎａｎｏｐｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆ．）によって作製されたＳＥＲＳナノタグを参照のこと；バーコード材料（例えば、Ｎａｎｏｐｌｅｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．によって作製されたナノバーコードなどのサブミクロンサイズのストライプ金属ロッドを参照のこと）、カラーバーコードを有するコード化微粒子（例えば、Ｖｉｔｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｉｔｒａｂｉｏ．ｃｏｍにより作製されたＣｅｌｌＣａｒｄを参照のこと）、およびデジタルホログラフィックコードイメージを伴うガラス微粒子（例えば、ｌｌｌｕｍｉｎａ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）により作製されたＣｙＶｅｒａマイクロビーズを参照のこと）が含まれる。本開示の実施に関連する標準的な手順の多くと同様に、当業者は、さらなる標識を使用できることを理解するであろう。
【００６６】
抗体を検出可能な部分に結合するための当該技術分野で既知の任意の方法を用いることができ、Ｈｕｎｔｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ，１４４：９４５（１９６２）；Ｄａｖｉｄら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１３：１０１４（１９７４）；Ｐａｉｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，４０：２１９（１９８１）；およびＮｙｇｒｅｎ，Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．，３０：４０７（１９８２）ならびにその他で記載されるものが含まれる。
【００６７】
いくつかの実施形態において、バイオチップをタンパク質の捕捉および検出に使用することができる。多くのタンパク質バイオチップが当該技術分野で記述されている。これらには、例えば、Ｐａｃｋａｒｄ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｅｒｉｄｅｎ  Ｃｏｎｎ．）、Ｚｙｏｍｙｘ（Ｈａｙｗａｒｄ、Ｃａｌｉｆ．），Ｐｈｙｌｏｓ（Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）その他により作製されたタンパク質バイオチップが含まれる。一般的に、タンパク質バイオチップは表面を有する基板を含む。捕捉試薬または吸着剤は基板表面に結合される。しばしば、表面は複数のアドレス可能な（ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ）位置を含み、その各々がその位置に結合された捕捉試薬を有する。捕捉試薬は、他のバイオマーカーを特定の様式で捕捉するポリペプチドまたは核酸などの生体分子であり得る。あるいは、捕捉試薬は、陰イオン交換材料または親水性材料などのクロマトグラフィー材料であり得る。そのようなタンパク質バイオチップの例は、以下の特許または特許出願に記載されている：米国特許第６，２２５，０４７号（Ｈｕｔｃｈｅｎｓ  ａｎｄ  Ｙｉｐ，“Ｕｓｅ  ｏｆ  ｒｅｔｅｎｔａｔｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｍａｐｓ，”Ｍａｙ１，２００１）、国際公開第ＷＯ９９／５１７７３号（Ｋｕｉｍｅｌｉｓ  ａｎｄ  Ｗａｇｎｅｒ，“Ａｄｄｒｅｓｓａｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｒａｙｓ，”Ｏｃｔ．１４，１９９９）、国際公開第ＷＯ００／０４３８９号（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｒｒａｙｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃａｐｔｕｒｅ  ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ，”Ｊｕｌ．２７，２０００）、国際公開第ＷＯ００／５６９３４号（Ｅｎｇｌｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｐｏｒｏｕｓ  ｍａｔｒｉｘ  ａｒｒａｙｓ，”Ｓｅｐ．２８，２０００）。
【００６８】
一般的に、バイオマーカーを含有する試料は、結合を可能にするのに十分な時間バイオチップの活性表面上に留置される。次いで、結合していない分子を好適な溶出液を用いて表面から洗浄する。一般的に、溶出液がよりストリンジェントであるほど、洗浄後に、より強固にタンパク質が結合して保持されなければならない。次いで、保持されたタンパク質バイオマーカーは、例えば、質量分析、蛍光、表面プラズモン共鳴、エリプソメトリー、または原子間力顕微鏡などの任意の好適な手段によって検出することができる。
【００６９】
質量分析、特に、ＳＥＬＤＩ質量分析は、本開示のバイオマーカーの検出に特に有用な方法である。いくつかの実施形態において、レーザー脱離飛行時間型質量分析計を使用することができる。レーザー脱離質量分析において、バイオマーカーを含む基板またはプローブが入口系統に導入される。イオンマーカーは、イオン化源からのレーザーによって気相に脱離され、イオン化される。生成したイオンは、イオン光学アセンブリによって収集され、次いで飛行時間型質量分析器において、イオンは短い高電圧領域を介して加速され、高真空チャンバ内にドリフト（ｄｒｉｆｔ）される。高真空チャンバの遠端において、加速されたイオンは、異なる時間で、感度が高い検出器表面に衝突する。飛行時間はイオンの質量の関数であるので、イオン形成とイオン検出器衝撃との間の経過時間を使用して、特定の質量電荷比のマーカーの有無を同定することができる。
【００７０】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）をまた、本明細書に記載のバイオマーカーを検出するのに使用することができる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳは、プローブ表面からタンパク質を完全に脱離するためのマトリックスとしばしば呼ばれるエネルギー吸収分子の使用を含む、質量分析方法である。ＭＡＬＤＩは、例えば、米国特許第５，１１８，９３７号（Ｈｉｌｌｅｎｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．）および米国特許第５，０４５，６９４号（Ｂｅａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｉｔ）に記載されている。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、試料が典型的にはマトリックス材料と混合され、不活性プローブの表面上に留置される。例示的なエネルギー吸収分子には、ケイ皮酸誘導体、シナピン酸（「ＳＰＡ」）、シアノヒドロキシ桂皮酸（「ＣＨＣＡ」）、およびジヒドロキシ安息香酸が含まれる。他の好適なエネルギー吸収分子は当業者に既知である。マトリックスが乾燥すると、分析物分子を封入する結晶が形成される。次いで、分析物分子がレーザー脱離／イオン化質量分析によって検出される。
【００７１】
表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析またはＳＥＬＤＩ−ＭＳは、複合混合物中のタンパク質などの生体分子の分画および検出のためにＭＡＬＤＩを改善したものを表す。ＳＥＬＤＩは、タンパク質などの生体分子をタンパク質バイオチップの表面上へと、該表面上に結合された捕捉試薬を使用して捕捉する、質量分析方法である。典型的には、非結合分子は、解析前にプローブ表面から洗浄される。ＳＥＬＤＩは、例えば、米国特許第５，７１９，０６０号（“Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｅｓ，”Ｈｕｔｃｈｅｎｓ  ａｎｄ  Ｙｉｐ，Ｆｅｂ．１７，１９９８）、米国特許第６，２２５，０４７号（“Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｒｅｔｅｎｔａｔｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｔｏ  Ｇｅｎｅｒａｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｐｓ，”Ｈｕｔｃｈｅｎｓ  ａｎｄ  Ｙｉｐ，Ｍａｙ１，２００１）、およびＷｅｉｎｂｅｒｇｅｒら，“Ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，”ｉｎ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｒ．Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ，ｅｄ．，ｐｐ１１９１５−１１９１８  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｃｈｉｃｈｅｓｈｅｒ，２０００に記載されている。
【００７２】
基板表面上のバイオマーカーを、気相イオン分光測定を使用して脱離およびイオン化することができる。基板上のバイオマーカーを分解する（ｒｅｓｏｌｖｅｄ）ことが可能である限り、任意の好適な気相イオン分光測定計を使用することができる。気相イオン分光測定計により、バイオマーカーの定量化が可能となることが好ましい。一実施形態において、気相イオン分光測定計は質量分析計である。典型的な質量分析計では、バイオマーカーを表面上に含む基板またはプローブが質量分析計の入口系統に導入される。次いで、バイオマーカーは、レーザー、高速原子衝撃、高エネルギープラズマ、エレクトロスプレーイオン化、サーモスプレーイオン化、液体二次イオン質量分析、電界脱離などの脱離源によって脱離される。生成された脱離および気化した種は、脱離事象の直接的な結果としてイオン化される、プリフォームドイオン（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ  ｉｏｎ）または中性種（ｎｅｕｔｒａｌ）からなる。生成したイオンはイオン光学アセンブリによって収集され、次いで質量分析器により、通過イオンが分散および分析される。質量分析器から抜け出るイオンが検出器によって検出される。次いで、検出器により、検出されたイオンの情報が質量電荷比に変換される。バイオマーカーまたは他の物質の存在の検出は、典型的にはシグナル強度の検出を含む。これは、今度は、基板に結合したバイオマーカーの量および特性を反映することができる。質量分析計の構成要素（例えば、脱離源、質量分析装置、検出器など）のいずれかを、本明細書に記載された他の好適な構成要素または当該技術分野で既知の構成要素と組み合わせることができる。
【００７３】
対象におけるＳＪＩＡ、ＫＤ、およびＦＩの診断または識別を容易にすること加えて、本開示によるバイオマーカーの検出はまた、有益な代替的な用途をもたらす。例えば、いくつかの実施形態において、ｓＪＩＡ、ＫＤ、またはＦＩの治療的処置に対する対象の応答または応答性をモニタリングする方法を提供する。さらに、さらなる実施形態において、開示された方法およびバイオマーカーを使用して、インビボまたはインビトロでバイオマーカーの発現を調節する化合物をスクリーニングし、同定することができる。
【００７４】
キットおよび装置
さらに別の態様において、本開示は、ｓＪＩＡ、ＫＤおよび／またはＦＩを診断または識別するためのキットおよび装置であって、対象から得られた生体試料中の本明細書に記載されるバイオマーカーのレベルを検出および決定するために必要なまたは所望される作用物質を含有する、キットを提供する。
【００７５】
例えば、キットは、バイオマーカー検出のための１つ以上の作用物質、ヒト対象から単離された生体試料を収容するための容器、作用物質を生体試料と反応させて生体試料中の少なくとも１つのバイオマーカーの存在を検出しおよび／またはそのレベルを決定するための指示印刷物といったものを含むことができる。これらの作用物質は、別個の容器中に包装することができる。キットはさらに、免疫測定などの好適なアッセイを行うための１つ以上の対照試料および試薬を含んでもよい。
【００７６】
いくつかの実施形態において、キットは、アルファ−２−マクログロブリン（Ａ２Ｍ）、アポリポタンパク質Ａ１（ＡＰＯＡ−Ｉ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、カルプロテクチン、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）、Ｓ１００Ａ１２、およびＦＳＴＬ−１からなる群から選択されるバイオマーカーなどの本明細書に開示される１以上のバイオマーカーに特異的に結合する抗体またはその結合断片を含む。より特定的な実施形態において、キットは、カルプロテクチンおよびＦＳＴＬ−１に特異的な抗体または他の結合作用物質を含む。さらに別の実施形態において、キットは、ＣＲＰ、カルプロテクチン、およびＦＳＴＬ−１に特異的な抗体または他の結合作用物質を含む。さらに別の実施形態において、キットは、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ−１、およびＳＡＰに特異的な抗体または他の結合作用物質を含む。さらなる実施形態において、キットは、ＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ１、およびＳＡＰに特異的な抗体または他の結合作用物質を含む。別の実施形態において、キットは、ＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ−１、およびＳ１００Ａ１２に特異的な抗体または他の結合作用物質を含む。さらなる実施形態において、キットは、ＣＲＰ、カルプロテクチン、ＦＳＴＬ−１、Ａ２Ｍ、Ａｐｏ−Ａ１、Ｓ１００Ａ１２、ＳＡＡ、およびＳＡＰに特異的な抗体または他の結合作用物質を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、キットは、本明細書に記載のバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせに特異的な抗体または他の結合作用物質を含む、ＥＬＩＳＡアッセイを行うための成分を含む。ある種の他の実施形態において、キットは、本明細書に記載のバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせに特異的な抗体または他の結合作用物質を含む、ラテラルフロー装置を含む。
【００７８】
ある種の実施形態において、キットまたは装置は、本明細書中に開示された２つ以下、３つ以下、４つ以下、または５つ以下のバイオマーカーに特異的であり、ｓＪＩＡ、ＫＤ、およびＦＩを診断または識別するのに有効である、抗体を含む。
【００７９】
キットまたは装置はまた、キットに含まれる組成物のための１つ以上の容器を含むことができる。組成物は、液体形態であってもよく、または凍結乾燥されていてもよい。組成物のための好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックを含む様々な材料から形成することができる。キットまたは装置はまた、ｓＪＩＡ、ＫＤ、およびＦＩを診断および識別する方法のための指示書を含む添付文書を含むことができる。
【００８０】
したがって、ある種の実施形態において、キットおよび装置を使用して、対象がｓＪＩＡまたは例えば感染性疾患、特に、急性熱性疾患もしくは川崎病に起因するいくつかの他の炎症状態を有するかどうかを決定し、ｓＪＩＡの診断と他の若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）疾患サブタイプとを区別することができる。別の例において、キットおよび装置を使用して、対象における臨床症状に先立つ初期ｓＪＩＡ炎症性フレアを予測することができる。別の例において、キットおよび装置を使用して、ｓＪＩＡを有する患者の治療の有効性をモニタリングすることができる。さらなる例において、キットおよび装置を使用して、インビトロまたはインビボ動物モデルでのバイオマーカーのうちの少なくとも１つの発現を調節する化合物を同定し、治療の効果を決定することができる。
【００８１】
以下に、本開示を実施するための特定の実施形態の例を示す。実施例は、例示目的のためにのみ提供し、本開示の範囲を決して限定することを意図するものではない。
【実施例】
【００８２】
実施例１
ＳＪＩＡおよびＫＤの識別に有効なバイオマーカーの同定
合計３９人の健常な対照対象、４２人のＫＤ対象、４２人のＦＩ対象、４２人のｓＪＩＡフレア対象、および４２人のｓＪＩＡ休止対象由来の血漿試料を、５点希釈系列を使用して、タンパク質マイクロアレイにより検査した。アレイの設計は、各バイオマーカーに対する捕捉抗体の３つのスポットを含み、各試料について３つ組でのデータ収集が可能となるようにした。各アレイはまた、陽性対照およびブランク対照を含んだ。データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン１１を用いて処理し、統計的分析をＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．のＪＭＰｐｒｏバージョン１２で行った。
【００８３】
分散分析（ＡＮＯＶＡ）をスチューデントのｔ検定とともに使用し、これらの５つの群に対する統計学的に有意な平均値差（ｐ値＜（０．０５））について、バイオマーカーを分析した。この分析により、１つ以上の群の平均値の中で、８つのタンパク質が統計学的な有意差を有していた。この分析の結果を図１および図２に図示する。さらに、これらの８つのタンパク質を用いた名義ロジスティック回帰分析により、８％の誤分類率で、５つの群全ての患者を互いに分けるできることが明らかになった。特に重要なことは、ｓＪＩＡフレア試料と他の群の全てとを明確に識別できることである。正確に診断された試料の数を提供する名義ロジスティック回帰から作成された混同行列を使用したところ、診断ｓＪＩＡフレア試料パネルの感度および特異性は１００％であった。健常な対照群もまた、１００％の感度および特異性を有していた。他の全ての群を識別するための感度および特異性は、少なくとも９５％であった（図３）。
【００８４】
これらの状態を識別可能に診断することについての明確性を提供できる有効かつ低費用のアッセイを提供するために、簡便性および使用の容易性が非常に重要である。したがって、高い感度および特異性を維持しつつ、他の群からｓＪＩＡフレアを分けるのに必要な最少数のバイオマーカーを同定することを模索した。以下の４つのバイオマーカータンパク質、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、カルプロテクチン、フォリスタチン関連タンパク質１（ＦＳＴＬ１）、および血清アミロイドＰ（ＳＡＰ）について行った名義ロジスティック回帰は、ｓＪＩＡフレア群および健常な対照群の両方に対して、１００％に維持された感度および特異性をもたらした。ＫＤおよびＦＩ群に対する感度および特異性は、４つのバイオマーカーパネルについてそれぞれ、８６％、９６％、および８８％、９５％へと、わずかに減少しただけであった。以下の３つのバイオマーカー、ＣＲＰ、カルプロテクチン、およびＦＳＴＬ−１について行った同じ分析はまた、ｓＪＩＡフレアおよび健常な対照群に対して、１００％に維持された感度および特異性をもたらしたが、ＫＤおよびＦＩ群に対する感度および特異性は８０％超で維持された。さらなるバイオマーカーの組み合わせについて行った同様の分析を図３に示す。
【００８５】
実施例２
患者のモニタリングおよびフレア発生の予測
この例では、ｓＪＩＡの活性（フレア）および不活性（休止）段階中の患者でバイオマーカーを評価した。分析する血漿試料は、フレアおよび休止の明確なサイクルを経た同じ対象から収集した。この手法を使用して、３つの特定のバイオマーカー、ＣＲＰ、カルプロテクチン、およびＳ１００Ａ１２が、疾患状態の変化に関連する明確な発現パターン、すなわち、フレアが増加し、休止が減少することを示すことが見出された（図４）。したがって、これらのようなバイオマーカーは、例えば、ｓＪＩＡを有する対象をモニタリングするための方法および／または活性フレアの開始を予測するための方法で使用し得る。
【００８６】
参考文献
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８．Ｇｏｒｅｌｉｋ，Ｍａｒｋ  ｅｔ．ａｌ（２０１３）Ｆｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ−ｌｉｋｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｉｔｉｎ／Ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ  Ｓｅｄｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ  Ｒａｔｅ  Ｒａｔｉｏ  ａｒｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ４０，１１９１−１１９９．
９．Ｒａｖｅｌｌｉ，Ａｎｇｅｌｏ；Ｍａｒｔｉｎｉ，Ａｌｂｅｒｔｏ．（２００７）Ｊｕｖｅｎｉｌｅ  Ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ３６．７６７−７７８．
１０．Ｖａｓｔｅｒｔ，Ｓ．Ｊ．；Ｋｕｉｓ，Ｗ．；Ｇｒｏｍ，Ａ．Ａ．（２００９）Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ＪＩＡ：Ｎｅｗ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｅｓｔ  Ｐｒａｃｔ  Ｃｌｉｎ  Ｒｈｕｅｍａｔｏｌ  ２３，６５５−６６４．１１．Ｍｏｔｔｏｎｅｎ，Ｔ．；Ｈａｎｎｏｎｅｎ，Ｐ．；Ｌｅｉｒｉｓａｌｏ−Ｒｅｐｏ，Ｍ．；Ｎｉｓｓｉｌａ，Ｍ．；Ｋａｕｔｉａｉｎｅｎ，Ｈ．；Ｋｏｒｐｅｌａ，Ｍ．；Ｌａａｓｏｎｅｎ，Ｌ．；Ｊｕｌｋｕｎｅｎ，Ｈ．；Ｌｕｕｋｋａｉｎｅｎ，Ｒ．；Ｖｕｏｒｉ，Ｋ．；Ｐａｉｍｅｌａ，Ｌ．；Ｂｌａｆｉｅｌｄ，Ｈ．；Ｈａｋａｌａ，Ｍ．；Ｉｌｖａ，Ｋ．；Ｙｌｉ−Ｋｅｒｔｔｕｌａ，Ｕ．；Ｐｕｏｌａｋｋａ，Ｋ．；Ｊａｒｖｉｎｅｎ，Ｐ．；Ｈａｋｏｌａ，Ｍ．；Ｐｉｉｒａｉｎｅｎ，Ｈ．；Ａｈｏｎｅｎ，Ｊ．；Ｐａｌｖｉｍａｋｉ，Ｉ．；Ｆｏｒｓｂｅｒｇ，Ｓ．；Ｋｏｏｔａ，Ｋ．；Ｆｒｉｍａｎ，Ｃ．（１９９９）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｅａｒｌｙ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ：ａ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  Ｔｒｉａｌ．Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３５３，１５６８−１５７３．
１２．Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  Ａｌｌｉａｎｃｅ（ＣＡＲＲＡ）：Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｄａｔａ，２０１３．
１３．Ｐａｓｃｕａｌ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ；Ａｌｌａｎｔａｚ，Ｆｌｏｒｅｎｃｅ；Ｐａｔｅｌ，Ｐｉｎａｋｅｅｎ；Ｐａｌｕｃｋａ，Ｋａｒｏｌｉｎａ，Ａ；Ｃｈａｕｓｓａｂｅｌ，Ｄａｍｉｅｎ；Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ，Ｊａｃｑｕｅｓ（２００８）Ｈｏｗ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  Ｗｉｔｈ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−α  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔａｒｇｅｔｓ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ２２３，３９−５９．
１４．Ａｎｇｅｌｏｎｉ，Ｓｔｅｐｈｅｎ  ｅｔ．ａｌ（２０１３）Ａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ａｓｓａｙｓ  ｗｉｔｈ  ｘＭａｐ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｌｕｍｉｎｅｘ  ｘＭａｐ  Ｃｏｏｋｂｏｏｋ．１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１−１１６．
１５．Ｍｉｃｒｏｂｅａｄ  Ｔｒａｐｐｉｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅ（２０１２）．
１６．ＤｅＪａｇｅｒ，Ｗ．；Ｖｅｌｔｈｕｉｓ，Ｈ．Ｔ．；Ｐｒａｋｋｅｎ，Ｂ．Ｊ．；Ｋｕｉｓ，Ｗ．；Ｒｉｊｋｅｒｓ，Ｇ．Ｔ．（２００３）Ｓｉｍｕｌａｔａｎｅｏｕｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １５  Ｈｕｍａｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｓａｍｐｌｅ  ｏｆ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ１０，１３３−１３９．
１７．Ｌａｗｓｏｎ，Ｓ．；Ｌｕｎｎｅｙ，Ｊ．；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｆ．；Ｆｅｒｎ；Ｏｓｏｒｉｏ，Ｏ．；Ｎｅｌｓｏｎ，Ｅ．；Ｗｅｌｂｏｎ，Ｃ．；Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｔ．；Ｆａｎｇ，Ｙ．；Ｗｏｎｇ，Ｓ．；Ｋｕｌａｓ，Ｋ．；Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ−Ｈｅｎｎｉｎｇｓ，Ｊ．；Ｏｓｏｒｉｏ，Ｆ．（２０１０）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ８−ｐｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｓｗｉｎｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｆｔｅｒ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｖｉｒｕｓ（ＰＲＲＳＶ）Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ２８，５３５６−５３６４．
１８．Ｂｊｅｒｒｅ，Ｍ．；Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｋ．；Ｆｌｙｖｂｊｅｒｇ，Ａ．；Ｔｏｎｎｅｓｅｎ，Ｅ．（２００９）Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｒｃｉｎｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｂｙ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｂｉｏｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １３０，５３−５８．
１９．Ｆｕｎｄｉｎｇ，Ｍ．；Ｈａｎｓｅｎ，Ｔ．Ｋ．；Ｇｊｅｄｓｔｅｄ，Ｊ．；Ｅｈｌｅｒｓ，Ｎ．（２００６）Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  １７  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｉｎ  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｈｕｍｏｕｒ  ｆｒｏｍ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｃｏｒｎｅａｌ  Ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ．Ａｃｔａ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ  Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉｃａ  ８４，７５９−７６５．
【００８７】
他の実施形態および使用は、本開示および先行例に照らして当業者に明らかであろう。さらに、多くの変更および改変を本開示の実施形態に対して行うことができ、本開示から逸脱することなくそのような変更および改変を行うことができることを当業者ならば理解するであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本開示の真意および範囲内に含まれる全てのそのような等価の変形物を包含することを意図している。
【図１Ａ】
2020502541.tif 000003
【図１Ｂ】
2020502541.tif 000004
【図１Ｃ】
2020502541.tif 000005
【図１Ｄ】
2020502541.tif 000006
【図１Ｅ】
2020502541.tif 000007
【図１Ｆ】
2020502541.tif 000008
【図１Ｇ】
2020502541.tif 000009
【図１Ｈ】
2020502541.tif 000010
【図２Ａ】
2020502541.tif 000011
【図２Ｂ】
2020502541.tif 000012
【図２Ｃ】
2020502541.tif 000013
【図２Ｄ】
2020502541.tif 000014
【図３−１】
2020502541.tif 000015
【図３−２】
2020502541.tif 000016
【図３−３】
2020502541.tif 000017
【図３−４】
2020502541.tif 000018
【図３−５】
2020502541.tif 000019
【図４】
2020502541.tif 000020
【国際調査報告】
2020502541.tif 000021
2020502541.tif 000022