(57)【要約】本発明は、対象の皮膚が生理的老化の兆候を示すかどうかを判定するインビトロ法、美容の方法、及び生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能な物質を同定する方法に言及する。本発明はさらに、捕捉リガンドを含むキット及び皮膚サンプルにおいて、本発明の文脈において同定された皮膚の老化のマーカーの発現レベルを判定するためのキットの使用に言及する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定するインビトロ法であって、
ａ）前記対象の皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びにＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｂ）皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定する
工程を含む、方法。
【請求項２】
前記第１のタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較し、前記少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
対象の生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能な美容処置の方法であって、
ａ）前記対象の皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びにＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｂ）工程ａ）で判定した前記第１のタンパク質の発現レベル及び前記少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルから皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを推定し、及び
ｃ）皮膚が生理的老化の兆候を示すと判定されると、前記対象を生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させる美容組成物で処置する
工程を含む、方法。
【請求項４】
生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能な物質を同定する方法であって、
ａ）皮膚サンプルを候補物質で処置し、
ｂ）工程ａ）の前記皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１か
らなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びにＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｃ）前記第１のタンパク質及び前記少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを前記候補物質で処置されていない皮膚サンプルにおける前記第１のタンパク質及び前記少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルと比較し、
ｄ）生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させる物質としての前記候補物質を同定する
工程を含む、方法。
【請求項５】
工程ａ）の前記皮膚サンプル及び工程ｃ）の前記候補物質で処置されていない前記皮膚サンプルを皮膚の老化を引き起こす環境にさらす、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記皮膚サンプルが角化細胞、好ましくは初代角化細胞を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記対象が白人である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記対象が女性である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第１のタンパク質の発現レベルを前記第１のタンパク質の参照発現レベルで割り前記第１のタンパク質の発現比を判定することにより、及び前記少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを前記少なくとも１つのさらなるタンパク質の参照発現レベルで割り前記少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現比を判定することにより、前記第１のタンパク質及び前記少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを参照発現レベルと比較する、請求項１〜２及び４〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた前記第１のタンパク質に対し、前記発現比が１より高い又は低い場合、前記対象の皮膚が生理的老化の兆候を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた前記少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、前記発現比が１より高い場合、前記対象の皮膚が生理的老化の兆候を示す、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、Ｇ
ＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、及びＳＲＳＦ７からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた前記少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、前記発現比が１より低い場合、前記対象の皮膚が生理的老化の兆候を示す、請求項９又は１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベルを判定するための少なくとも１つの捕捉リガンド、並びに
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定するための少なくとも１つの捕捉リガンド
を含むキット。
【請求項１４】
前記捕捉リガンドが抗体である、請求項１３に記載のキット。
【請求項１５】
皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びに
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定するための、請求項１３及び１４に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象の皮膚が生理的老化の兆候を示すかどうかを判定するインビトロ法、美容処置の方法、及び生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能な物質を同定する方法に言及する。本発明はさらに、捕捉リガンドを含むキット及び皮膚サンプルにおいて、本発明の文脈において同定された皮膚の老化のマーカーの発現レベルを判定するためのキットの使用に言及する。
【背景技術】
【０００２】
先進諸国の平均余命は過去２世紀にわたって著しく長くなっており、２１世紀もこの傾向が続けば、そのような国々で２０００年以降に誕生した多くの赤ちゃんは１００歳になるであろう。また、２０３０年までに世界中の８人のうち１人が６５歳以上になり、人口の世界的高齢化がいくつかの社会的、経済的、そして医療的課題を引き起こすと見込まれている（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９，  Ｌａｎｃｅｔ  ３７４，  １１９６−１２０８）。
【０００３】
老化は、複数の遺伝及び環境要因に影響される複雑なプロセスであり、複数の生理的機能の進行性の低下を特徴とする。他の臓器と同様に、皮膚はＵＶ照射などの環境要因により加速され得る老化の影響を受ける。経時的老化とも呼ばれる内因性の皮膚の老化は、太陽にさらされていない皮膚で観察され、生物全体の老化の過程を反映する（Ｍａｋｒａｎｔｏｎａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｅｘｐ．  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．  ４２，  ８７９−８８６）。よって、内臓や細胞と比較して簡単にアクセスできるため、皮膚は内因性の老化の過程を解明するための興味深い代替的アプローチである。皮膚は、小じわ形成、表皮及び真皮の菲薄化、脆弱性やもろさの上昇、乾燥、弾力性低下、バリア機能の障害などの内因性老化を有するいくつかの形態的及び生理的変化を受ける（Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｋｒａｎｔｏｎａｋｉ，  ２０１１，  Ｃｌｉｎ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２９，  ３−１４）。内因性老化の発症機序は、細胞の老化及び増殖能の低下、テロメアの短縮、ＤＮＡ損傷の増加及びＤＮＡ修復過程の減少、ミトコンドリア及びゲノムＤＮＡ変異、ホルモン低下及び酸化ストレスなど複数ある（Ｐｏｌｊｓａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍａｔｏｖｅｎｅｒｏｌ．  Ａｌｐ．  Ｐａｎｎｏｎｉｃａ  Ａｄｒｉａｔ．  ２１，  ３３−３６）（Ｍａｋｒａｎｔｏｎａｋｉ  ａｎｄ
Ｚｏｕｂｏｕｌｉｓ，  ２００７，  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  Ｂａｓｅｌ  Ｓｗｉｔｚ．
２１４，  ３５２−３６０）。
【０００４】
皮膚の老化は複雑なプロセスであり、皮膚の老化の生物学をより理解し、皮膚の老化及び関連する病理学を診断し、予防し、処置するのに役立てることのできる新たな特定の標的を同定するためにたくさんの努力がなされてきた。過去１０年間で、いくつかのトランスクリプトミクス研究により、いくつかの生物モデル及びヒトにおける遺伝子発現への老化の影響が調べられてきた（Ｚａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．  ３，  ｅ２０１）（Ｚａｈｎ  ａｎｄ  Ｋｉｍ，  ２００７，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８，  ３５５−３５９）。
【０００５】
皮膚の老化に関して、ヒトにおいては４つの研究のみが行われてきた。第１の研究は、高齢及び若年のヒトの男性の皮膚において異なって発現した遺伝子が代謝、シグナル伝達、アポトーシス、転写調節などの様々な細胞プロセスに関与していたことを示している（Ｌｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｅｘｐ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．  ４１，  ３８７−３９７）。さらに最近では、研究は、両方の性における老化に応じた太陽にさらされていない皮膚からの遺伝子発現プロフィールを比較してきた。両方の性において３９の遺
伝子のみが共通して異常調節され、それらのうち４つが反対の様式で調節されるという、両方の性において加齢とともに著しく異なる反応があった。これらの結果から、ＷＮＴシグナル経路は両方の性において加齢とともに主要下方調節経路として現れた（Ｍａｋｒａｎｔｏｎａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７）。そして最近は、ヒトの表皮において年齢状況にしたがって異なって発現した７５の遺伝子が同定された（Ｒａｄｄａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ６，  ３６）。経路分析は、これらの遺伝子が主に細胞移動、がん、皮膚疾患、及び細胞増殖に関与したことを明らかにした。また、表皮の形成に関与した遺伝子は有意に強化され、角化細胞の分化の全体の下方調節が観測された。
【０００６】
タンパク質は細胞の馬車馬であり、多数の細胞プロセスの主要なエフェクターである。複雑なプロセスを解明し、細胞の標準状態及び病理状態を説明するため、定量的質量分析を基にしたプロテオミクスがそのタンパク質動力学の説明に対する有用性を証明した。それらの最近の技術的進歩、特に質量分析においては、プロテオームの大規模な調査を可能にした。これらの研究はタンパク質発現調節の一般的な理解を変え、ｍＲＮＡ濃度などの遺伝子転写物の濃度が必ずしも対応するタンパク質の濃度及び活性に反映しないことを証明した。
【０００７】
比較的まれな研究では皮膚の老化を調べるためプロテオミクスを用いてきており、それらは全て、プロテオームの包括度がより低くなる２次元ゲル電気泳動アプローチを用いてきた。結果としてごく少数の異常調節されたタンパク質が同定された一方で、ゲルのないアプローチでは老化のプロテオミクスの特徴を提供することができた（Ｌａｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １９，  ９１２−９１８）（Ｄｅｌａｔｔｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  ２１，  ２０５−２１０）（Ｇｒｏｍｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
【０００８】
皮膚はいくつかの細胞層からなり、以前の研究では、皮膚全体又は角質層サンプルにおけるタンパク質の発現レベルを調べていた。しかし、異なる細胞層は大きく異なった振る舞いをし、老化に対して異なった反応を示す。角化細胞は、皮膚の最も表面にありアクセスできる層である表皮の主要構成要素である。培養下の角化細胞に重点を置くことは、皮膚の老化におけるより深い洞察を得、表皮の増殖区画にアクセスするのを助ける。
【０００９】
本発明の発明者らは、若年及び高齢の白人女性から得られた太陽にさらされていない皮膚由来のヒト初代角化細胞におけるタンパク質発現プロフィールの変化を調べた。老化に影響を与える１つの主要因子であるホルモンを考慮すると、血中ホルモンが若年女性では高いレベルとなり高齢女性では最も低いレベルとなるように年齢カテゴリーが選択された。
【００１０】
本発明の発明者らは、その発現が有意に異常調節された、若年及び高齢のヒト初代角化細胞の定量的プロテオミクスアプローチを用いた内因性の皮膚の老化の推定の候補バイオマーカーである５８のタンパク質を同定した。
【００１１】
特に、本発明の発明者らは、生理的老化の兆候を示す皮膚を同定するために特によく適したバイオマーカーとして、タンパク質ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、及びＨＭＧＮ１を同定した。
【発明の概要】
【００１２】
本発明の発明者らは、より高齢の皮膚対より若い皮膚で有意に異なって発現する５８のタンパク質を同定した（ｐ値＜０．０５）。
【００１３】
定量的プロテオミクスにより同定されたように、これら５８のバイオマーカーから、加齢とともに４０が下方調節され１８が上方調節された。これらのマーカーの２つ、ＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２の診断価値はさらに、他の対象からの皮膚サンプルを用いたウエスタンブロット分析によって確認された。
【００１４】
したがって、本発明は、対象の皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定するインビトロ法に関し、インビトロ法は
ａ）対象の皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びにＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｂ）皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定する
工程を含む。
【００１５】
本発明はさらに、対象の生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能な美容処置の方法に言及し、美容処置の方法は
ａ）対象の皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びにＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｂ）工程ａ）で判定した第１のタンパク質の発現レベル及び少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルから皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを推定し、及び
ｃ）皮膚が生理的老化の兆候を示すと判定されると、対象を生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させる美容組成物で処置する
工程を含む。
【００１６】
本発明はさらに、生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能な物質を同定する方法に言及し、物質を同定する方法は
ａ）皮膚サンプルを候補物質で処置し、
ｂ）工程ａ）の皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選
択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びにＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｃ）第１のタンパク質及び少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを候補物質で処置されていない皮膚サンプルにおける第１のタンパク質及び少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルと比較し、
ｄ）生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させる物質としての候補物質を同定する
工程を含む。
【００１７】
本発明はさらに、
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベルを判定するための少なくとも１つの捕捉リガンド、並びに
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２*、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定するための少なくとも１つの捕捉リガンド
を含むキットに言及する。
【００１８】
本発明はさらに、
皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びに
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定するための、本明細書において上記で定義したキットの使用に言及する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】サーモフィッシャー又はインビトロジェンから入手できるβ−３チューブリン抗体（２Ｇ１０）ＭＡ１−１１８を使用したウエスタンブロット分析を用いた高齢及び若年者におけるＴＵＢＢ３の発現の判定である。Ａ）はβ−３チューブリン抗体（２Ｇ１０）ＭＡ１−１１８を使用した高齢及び若年者におけるＴＵＢＢ３の発現のウエスタンブロットであり、Ｂ）はＳＤＳｐａｇｅで視覚化した総タンパク質含有量であり、Ｃ）はＴＵＢＢ３によってコードされたタンパク質の正規化量を示すグラフである。正規化は総タンパク質濃度を用いて行った。
【図２】サーモフィッシャー又はインビトロジェンから入手できるβ−３チューブリン抗体（２Ｇ１０）ＭＡ１−１１８を使用したウエスタンブロット分析を用いた高齢及び若年者におけるＴＵＢＢ３の発現の判定である。Ｄ）は若年及び高齢患者におけるβ−３チューブリンの正規化量を示すグラフである。Ｅ）は０．９０４８の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する、対応する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ラホヤ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）である。
【図３】ＨＭＧＡ２抗体ＰＡ５−２５２７６を使用したウエスタンブロット分析を用いた高齢及び若年者におけるＨＭＧＡ２の発現の判定である。Ａ）はＨＭＧＡ２抗体ＰＡ５−２５２７６を使用した高齢及び若年者におけるＨＭＧＡ２の発現のウエスタンブロットであり、Ｂ）はＳＤＳｐａｇｅで視覚化した総タンパク質含有量であり、Ｃ）はＨＭＧＡ２によってコードされたタンパク質の正規化量を示すグラフである。正規化は総タンパク質濃度を用いて行った。
【図４】ＨＭＧＡ２抗体ＰＡ５−２５２７６を使用したウエスタンブロット分析を用いた高齢及び若年者におけるＨＭＧＡ２の発現の判定である。Ｄ）は若年及び高齢患者におけるＨＭＧＡ２の正規化量を示すグラフである。Ｅ）は０．８７７６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する、対応する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ラホヤ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）である。
【図５】Ａ）は０．８０６の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する、若年及び高齢患者におけるβ−チューブリンの発現に対応する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ラホヤ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）である。Ｂ）は０．９３９の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する、若年及び高齢患者におけるＨＭＧＡ２の発現に対応する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ラホヤ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）である。Ｃ）は０．５９２の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する、若年及び高齢患者におけるＨＭＧＮ１の発現に対応する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ラホヤ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）である。
【図６】１の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する、若年及び高齢患者におけるβ−チューブリン、ＨＭＧＡ２、及びＨＭＧＮ１の発現の組み合わせに対応する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、ラホヤ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）である。モデル方程式は以下の通りである。予測＝８３．７６−（９９２．９１×β−チューブリン）−（４９３６．６１×ＨＭＧＡ２）＋（２７３．４０×ＨＭＧＮ１）
【発明を実施するための形態】
【００２０】
発明の詳細な説明
本発明の文脈における「老化」は皮膚の老化作用のことを言い、本明細書では「皮膚の老化」と称する。
【００２１】
「生理的皮膚の老化」とも称する「皮膚の老化」は、しわ、しみ、むらのある皮膚の色、及びたるんだ皮膚などの特徴を有する皮膚として臨床的に記載することができる。継承された遺伝的形質に加えて、多くの他の要因がホルモン状態、並びに気候、労働、社会的及び文化的条件などの老化の過程を修正することができる。皮膚上の老化作用は内因性要因と外因性要因のどちらにも影響を受けることが当業者には理解されよう。他の臓器と同様に、ヒトの皮膚は分子損傷の蓄積により次第に機能低下する。酸化ストレス及び分子損傷は、経時的老化とも呼ばれる内因性老化と外因性老化とも呼ばれる環境要因の結果としての老化の両方の原因となる。結果として、老化した皮膚又は「より高齢の皮膚」は若々しい皮膚と比べると多くの相違点を示し、経時的に起こる構造的及び生理的変化による皮膚疾患に対して著しい感受性も有する。
【００２２】
経時的老化及び外因性老化に加えて、皮膚病の発生が皮膚の生理的老化を引き起こす可能性があり、「皮膚病由来の皮膚の老化」と称され得ることが当業者にはさらに理解されよう。
【００２３】
したがって、本発明の文脈において用いられる「皮膚の老化」又は「生理的皮膚の老化」は、経時的老化、外因性老化及び／又は皮膚病による老化、好ましくは経時的老化及び／又は外因性老化のことを言う。
【００２４】
特定の一実施形態において、皮膚の老化は皮膚病由来の皮膚の老化である。
【００２５】
「経時的老化」又は「内因性老化」は個人の遺伝的背景を反映し、時の経過とともに起こる。内的に老化した皮膚は典型的に滑らかで汚れがない。経時的老化のみでは、高齢者は小じわのある薄い皮膚、軟部組織再分布のある脂肪萎縮、及び骨再形成を示すものである。肌が白いタイプの人に比べて、有色人たちは１０年後に現れる兆候のある重度の内因性顔面老化をあまり示さないことが当業者には知られている。
【００２６】
「外因性老化」は日光暴露、喫煙、食習慣、運動などの個人の習慣に関連する環境暴露、健康、及び生活様式と関係しており、したがって、例えば、光老化を含む。累積日光暴露は、皮膚の老化において最も重要な外因性要因である。肌質によっては、色素沈着症は光老化の最も一般的な特徴の一つである。光老化の一般的な臨床兆候は黒子、しわ、毛細血管拡張症、ダークスポット、及び弾力性低下を含む。年齢を適合させた白人の同等の人々に比べて、有色の皮膚は日光により引き起こされた損傷にあまり影響を受けないため、これらの老化の臨床症状はそれほどひどくなく典型的に１０〜２０年後に起こることが当業者には知られている。喫煙、過度のアルコール、及び栄養不足などの他の外因性要因もまた皮膚の老化の原因になり得る。
【００２７】
皮膚の生理的老化を引き起こすおそれがある「皮膚病」の非限定例は、例えば、アトピー性皮膚炎、脂漏性角化症、後天性表皮水疱症、乾癬、エリテマトーデスにおける皮膚の変化、皮膚筋炎、強皮症、慢性にきび、慢性セルライト、掻痒、及び糖尿病及び早期老化症における異常な又は欠陥のある瘢痕形成である。
【００２８】
本明細書での「早期老化症」は皮膚の早期老化を特徴とする疾病のことを言い、ハッチンソン・ギルフォード早老症候群（ＨＧＰＳ）、非定型早老症候群（ＡＰＳ）、下顎骨異形成（ＭＡＤ）、ウェルナー症候群（ＷＳ）、ブルーム症候群（ＢＳ）、ロスムンド・トムソン症候群（ＲＴＳ）、コケイン症候群（ＣＳ）、色素性乾皮症（ＸＰ）、硫黄欠乏性毛髪発育異常症（ＴＴＤ）、ファンコニ貧血（ＦＡ）、毛細血管拡張性運動失調症（ＡＴ
）、及び先天性角化異常症（ＤＣ）を含むがこれらに限らない。
【００２９】
上記にしたがって、「皮膚の老化の兆候」は、全ての外見上で視覚的及び触覚的に認知できる症状だけでなく皮膚の老化によるその他のマクロ又はミクロの作用を含むがこれに限らない。これらの兆候は、しわ及び粗く深いしわ、小じわ、皮膚のしわ、割れ目、こぶ、大きな毛穴（例えば、汗腺管、皮脂腺、又は毛包などの付属器の構造に関連）、又はむら又は粗さ、皮膚の弾力性低下（機能的な皮膚のエラスチンの低下及び／又は不活性化）、たるみ（目の領域や顎のむくみを含む）、皮膚の堅さの低下、皮膚のつっぱり感の低下、変形からの皮膚の跳ね返りの低下、変色（目の下のくまを含む）、斑点、黄ばみ、年齢によるしみ及びそばかすなどの色素過剰の皮膚領域、角化症、異常な分化、過角化、弾性線維症、コラーゲン分解、及び角質層、真皮、表皮、皮膚の血管系（例えば、毛細血管拡張症又はクモ状血管）、及び特に皮膚に最も近い下層組織（例えば、脂肪及び／又は筋肉）における他の組織学的変化などのテクスチャの不連続性の発達を含むがこれに限らない過程に起因する可能性がある。
【００３０】
「皮膚」は全体重の約１／６を含む最大のヒトの臓器である。皮膚は環境へのバリアとしての機能を果たすなど、ヒトの生理学において複雑な役割を行い、その腺の一部（皮脂腺）によって作られた皮脂は抗感染特性を有する。皮膚は外界への伝達のための経路として働き、我々を水分損失、摩擦による傷、及び衝撃による傷から保護し、太陽の紫外線から我々を保護するために特殊化した色素細胞を用いる。皮膚は、太陽光線にさらされると表皮層にビタミンＤを生成する。皮膚は汗腺を通して体温を調節するのを助け、代謝を調節するのを助ける。皮膚は３つの機能層、表皮、真皮、及び皮下組織から成る。したがって、一実施形態において、皮膚は表皮、真皮、及び皮下組織、好ましくは表皮及び真皮、より好ましくは表皮のことを言う。
【００３１】
したがって、本発明の文脈にあるように「皮膚サンプル」は、好ましくは表皮、真皮、及び皮下組織、好ましくは表皮及び真皮、より好ましくは表皮を含む。
【００３２】
本明細書で使われる「表皮」は皮膚の外層のことを言い、角質層、透明層、顆粒層、有棘層、及び基底層を含む５つの層に分けられる。角質層は多くの死んだ層、基本的にケラチンで満たされた無核角化細胞を含む。健康な皮膚であっても、角質層の最外層は絶えずはがれ落ちている。透明層は２〜３層の無核細胞を含む。顆粒層はケラトヒアリン顆粒を含むデスモソームにより結合した２〜４層の細胞を含む。有棘層は同様にデスモソームにより結合した８〜１０層のやや活性の分裂細胞を含む。基底層は有糸分裂により能動的に分裂し上部の表皮層を通り角質層へ移動することになる細胞を供給する単層の円柱細胞を含む。したがって、表皮の主要細胞型は角化細胞である。これらの細胞は、細胞が角質層を形成する角質細胞又は扁平上皮細胞として知られる細胞に変わる基底層で形成され、表皮層を通り顆粒層まで存在する。この形質転換過程の間、核は消化され、細胞質は消失し、脂質は細胞間隙に放出され、ケラチン中間径フィラメントは集合して微小繊維を形成し、細胞膜は表面に共有結合した脂質を有する架橋タンパクからなる細胞外皮に置き換えられる。
【００３３】
いくつかの実施形態において、本発明の方法は皮膚サンプルを得るための工程０）をさらに含む。
【００３４】
一実施形態において、本発明の文脈における皮膚サンプルは皮膚細胞を含む。したがって、本発明の文脈における皮膚サンプルはまた皮膚サンプル細胞と称してもよい。
【００３５】
一実施形態において、皮膚サンプル細胞は角化細胞、好ましくは初代角化細胞である。
【００３６】
したがって、一実施形態において、本発明の文脈における皮膚サンプルは角化細胞、好ましくは初代角化細胞を含む。
【００３７】
皮膚サンプルを得る方法は当業者には広く知られている。一例を挙げると、皮膚サンプルは、典型的に再生皮膚、特に３Ｄ再生皮膚、又は皮膚生検後の皮膚サンプルに含まれる皮膚細胞の単離及び培養、例えば初代角化細胞の単離及び培養を用いて得られる。
【００３８】
一例を挙げると、乳房の形成手術後に典型的に太陽から保護され太陽にさらされていない皮膚の皮膚生検が得られ、ヒト初代角化細胞を２５μｇ／ｍＬのＢＰＥと０．９ｎｇ／ｍＬのＥＧＦが補充されたＫＳＦＭ培地で培養した。
【００３９】
一実施形態において、皮膚サンプルは保護され太陽にさらされていない皮膚に由来する。
【００４０】
一実施形態において、本発明の方法はタンパク質発現レベルを判定する前に皮膚サンプルを準備するさらなる工程を含む。本発明の文脈において、準備は通常タンパク質抽出のことを言う。
【００４１】
したがって、一実施形態において、本発明の方法の文脈において、タンパク質発現レベルを判定する前にタンパク質は皮膚サンプル、好ましくは皮膚サンプル細胞から抽出される。
【００４２】
したがって、一実施形態において、皮膚サンプルは皮膚サンプルのタンパク質抽出物、好ましくは皮膚サンプル細胞のタンパク質抽出物のことを言う。
【００４３】
一例を挙げると、典型的に皮膚サンプルの皮膚細胞の凍結ペレットを３０分間、例えば４°で、例えば４０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ＰＨ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のトリトン、０．０２％のデオキシコール酸ナトリウム、０．２ｍＭのＴＣＥＰ、及びロシュ製のプロテアーゼ及びフォスファターゼの阻害剤混合物（ＰｈｏｓＳＴＯＰ）を含む溶液中で溶解する。典型的に、溶解は氷上での短時間の超音波処理で達成され、溶解物は、例えば１４０００ｒｐｍ、２０分間、４°での遠心分離により除去される。
【００４４】
「角化細胞」は表皮、つまり皮膚の最外層における主要細胞型であり、そこでみられる細胞の９０％を構成する。さらなる分析のため、角化細胞は当業者に知られている方法で分離してもよい。
【００４５】
したがって、一例を挙げると、皮膚サンプルは、例えば６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％の角化細胞のように少なくとも５０％の角化細胞を含む。
【００４６】
本明細書での「初代角化細胞」はヒトの皮膚サンプルから分離された角化細胞のことを言う。
【００４７】
広く使われる「バイオマーカー」と言う表現は、単独で又は集団で生体系の流れを反映又は未来像を予測するあらゆる生体分子（遺伝子、タンパク質、脂質、代謝産物）のことを言う。バイオマーカーとしてのタンパク質は、典型的にｍ−ＲＮＡより長い半減期を有し、したがって一定期間を通して濃度がより安定するという利点を有する。本明細書で使われるように、本明細書で下記の「本発明の方法」の項で記載された異なるタンパク質は、生理的皮膚の老化の指標であるバイオマーカーとして同定される。本発明の文脈において同定されたバイオマーカーの非限定例は、遺伝子ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及び／又はＨ
ＭＧＮ１によってコードされたタンパク質である。本発明のバイオマーカーについては、本発明の方法の文脈において本明細書でさらに以下に記載する。
【００４８】
本明細書で使われる「遺伝子」は、転写及び／又は翻訳制御配列、及び／又はコード領域、及び／又は非翻訳配列（例えば、イントロン、５’−及び３’−非翻訳配列）を含むゲノム遺伝子でもよい。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、又は長鎖及び短鎖非コードＲＮＡなどの機能性ＲＮＡ（例として、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、及びミクロＲＮＡ）でもよい。遺伝子はまた、連鎖した５’−又は３’−非翻訳配列を任意で含む、コード領域に対応したｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ（例えば、エクソン及びミクロＲＮＡ）でもよい。遺伝子はまた、コード領域及び／又は連鎖した５’−又は３’−非翻訳配列の全部又は一部を含む、増幅又は合成核酸分子でもよい。
【００４９】
対象
本発明の文脈において、「対象」は動物、好ましくは非ヒト又はヒト哺乳類のことを言う。非ヒト哺乳類の例としては、齧歯類及び霊長類が挙げられる。最も好ましくは、対象はヒトである。
【００５０】
「ヒト」はさらに様々な人種に区別することができる。３つの主な人種は、アーリア人、ハム族、セム族を含む白色人種、例えば北モンゴル人、中国人及びインドシナ人、日本人及び韓国人、チベット人、マレー人、ポリネシア人、マオリ人、ミクロネシア人、エスキモー、アメリカインディアンを含む蒙古人種、例えばアフリカ人、ホッテントット、メラネシア人／パプア、「ネグリト」、オーストラリア先住民、ドラヴィダ人、シンハラ人を含む黒色人種である。
【００５１】
当業者に知られるように、本明細書において上記で定義した皮膚の老化作用は内因性要因と外因性要因のどちらにも影響を受け、根本的な構造及び機能の違いを考慮すると、種族的出身によって異なることがたびたびある。
【００５２】
したがって、一実施形態において、ヒトは白人、蒙古人、又は黒人、好ましくは白人である。
【００５３】
したがって、一つの好ましい実施形態において、対象は白人である。
【００５４】
「白人」という用語は、ヨーロッパ人、北アフリカ人、及び南西アジア人系統の個人の身体的特徴の組み合わせを言うのに一般的に用いられる。
【００５５】
この「白人対象」のグループは、メラニン量の減少に伴う小さな凝集メラノソームにより証明される色素の少ない皮膚の人々を含む。減少した表皮メラニン成分は、白人に他の集団よりも光老化の早期兆候を示しやすくする。構成的な色素沈着の低いヨーロッパ系アメリカ人は、ヒスパニック及び東アジア人に比べて著しく高い日焼け（ｂｕｒｎ）反応性と低い日焼け（ｔａｎｎｉｎｇ）能力を有する。加えて、白人の皮膚は、加齢に伴うコラーゲンの喪失及び真皮の弾性線維の崩壊とともに薄く凝集力が弱まった角質層、減少した皮膚の伸展性により例示される。これらの特徴が臨床的に脆弱な皮膚をもたらし、老化の過程の原因となる。
【００５６】
ホルモンは老化の一つの要因であり、ホルモンの量及び種類は同じ年齢層の男女の対象間で異なる。
【００５７】
したがって、一実施形態において、本明細書でのヒトは男性又は女性、好ましくは女性のことを言う。
【００５８】
したがって、一実施形態において、対象は女性である。
【００５９】
一実施形態において、対象の年齢は１８〜９５歳、好ましくは例えば４５〜８０歳などの３２〜８０歳、より好ましくは４５〜８０歳である。
【００６０】
本発明の方法
本発明の文脈における「少なくとも１つのさらなるタンパク質」は、１つのさらなるタンパク質、２つのさらなるタンパク質、３つのさらなるタンパク質、４つのさらなるタンパク質、５つのさらなるタンパク質、６つのさらなるタンパク質、７つのさらなるタンパク質、８つのさらなるタンパク質、９つのさらなるタンパク質、又は１０のさらなるタンパク質、好ましくは１つのさらなるタンパク質、２つのさらなるタンパク質、３つのさらなるタンパク質、４つのさらなるタンパク質のことを言う。
【００６１】
本発明の文脈における少なくとも１つのさらなるタンパク質は、ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされる。
【００６２】
本発明の文脈において用いられるこれら５８のバイオマーカーのアミノ酸配列は、本明細書で下記に記載され２０１６年１月１５日にアクセス可能なアクセッションコードでＵｎｉＰｒｏｔＫＢデータベースから入手できる。
【００６３】
【表１−１】
2020502498.tif 000002
【表１−２】
2020502498.tif 000003
【表１−３】
2020502498.tif 000004
【００６４】
一つの好ましい実施形態において、少なくとも１つのさらなるタンパク質はＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、又はＨＭＧＮ１から選択される。関連する実施形態において、本明細書での「少なくとも１つのさらなるタンパク質」は、１つのさらなるタンパク質又は２つのさらなるタンパク質のことを言う。
【００６５】
したがって、一実施形態において、本発明の文脈における第１のタンパク質はＴＵＢＢ３によってコードされ、及び少なくとも１つのさらなるタンパク質はＨＭＧＡ２又はＨＭ
ＧＮ１によってコードされる。
【００６６】
さらなる実施形態において、本発明の文脈における第１のタンパク質はＴＵＢＢ３によってコードされ、並びに２つの少なくとも１つのさらなるタンパク質はＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１によってコードされる。
【００６７】
したがって、さらなる一実施形態において、本発明の文脈における第１のタンパク質はＨＭＧＡ２によってコードされ、及び少なくとも１つのさらなるタンパク質はＴＵＢＢ３又はＨＭＧＮ１によってコードされる。
【００６８】
したがって、さらなる一実施形態において、本発明の文脈における第１のタンパク質はＨＭＧＮ１によってコードされ、少なくとも１つのさらなるタンパク質はＴＵＢＢ３又はＨＭＧＡ２によってコードされる。
【００６９】
本発明の文脈において、第１のタンパク質がＴＵＢＢ３によってコードされる場合、少なくとも１つのさらなるタンパク質はＴＵＢＢ３を除いた遺伝子のリストから選択された遺伝子によってコードされる、すなわち、少なくとも１つのさらなるタンパク質は、ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされることが当業者には理解されよう。
【００７０】
同様に、第１のタンパク質がＨＭＧＡ２によってコードされる場合、少なくとも１つのさらなるタンパク質はＨＭＧＡ２を除いた遺伝子のリストから選択された遺伝子によってコードされる、すなわち、少なくとも１つのさらなるタンパク質は、ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされる。
【００７１】
さらに、第１のタンパク質がＨＭＧＮ１によってコードされる場合、少なくとも１つのさらなるタンパク質はＨＭＧＮ１を除いた遺伝子のリストから選択された遺伝子によってコードされる、すなわち、少なくとも１つのさらなるタンパク質は、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、
ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされる。
【００７２】
本明細書での「発現レベル」は遺伝子産物のタンパク質レベルのことを言い、値とみなしてもよい。
【００７３】
本明細書で使われるように、「判定する」という用語は、制御又は所定の発現レベルへの言及の有無にかかわらず定性的及び／又は定量的検出（すなわち、発現レベルを検出及び／又は測定する）を含む。
【００７４】
本明細書で使われるように、「検出する」は、バイオマーカー、すなわち本明細書において上記で定義した遺伝子によってコードされたタンパク質、が生体サンプル内に存在するか否かを判定することを意味し、「測定する」は、皮膚サンプル内のバイオマーカーの量、すなわち本明細書において上記で定義した遺伝子によってコードされたタンパク質の量、を判定することを意味する。
【００７５】
第１のタンパク質又は少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルは、対象のタンパク質を結合することのできるあらゆる捕捉リガンドを用いた免疫学的方法を用いて、本発明の方法で定義したような遺伝子の翻訳生成物（すなわちタンパク質）を検出することによって判定してもよい。捕捉リガンドは対象のアミノ酸配列を特異的に識別する抗体、アプタマー、及びポリペプチドからなる群から選択してもよく、典型的には捕捉リガンドはポリクローナル又はモノクローナル抗体である。したがって、適切な免疫学的方法は、例えば、本発明の文脈において定義したような遺伝子によってコードされたタンパク質に結合した抗体、抗体フラグメント、受容体リガンド、又は他の作用物質を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチ、直接、間接、又は競合ＥＬＩＳＡ測定法、酵素結合免疫スポット測定法（ＥＬＩｓｐｏｔ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー測定法（ＦＡＣＳ）、ウエスタンブロット、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）測定法、及びタンパク質チップ測定法を含む。
【００７６】
いくつかの実施形態において、発現レベルはまた、質量分析などの生物物理化学的方法を用いて判定することもできる。
【００７７】
当業者に知られるように、適切な免疫学的方法で用いてもよい抗体は市販されている。
【００７８】
例えば、ＴＵＢＢ３によってコードされた第１のタンパク質の発現レベルは、サーモフィッシャー又はインビトロジェンから入手できるβ−３チューブリン抗体（２Ｇ１０）ＭＡ１−１１８を用いたウエスタンブロットなどの適切な免疫学的方法を用いて判定してもよい。
【００７９】
例えば、ＨＭＧＡ２によってコードされた第１のタンパク質の発現レベルは、例えばインビトロジェンから入手できるＨＭＧＡ２抗体ＰＡ５−２５２７６を用いたウエスタンブロットなどの適切な免疫学的方法を用いて判定してもよい。
【００８０】
例えば、ＨＭＧＮ１によってコードされた第１のタンパク質の発現レベルは、例えばアブカムから入手できるＨＭＧＮ１抗体ａｂ５２１２を用いたウエスタンブロットなどの適切な免疫学的方法を用いて判定してもよい。
【００８１】
一実施形態において、第１のタンパク質及び少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルは、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）又はウエスタンブロットを用いて判定される。
【００８２】
本明細書において特定の遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルだけでなく特定の遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベルは、その遺伝子によってコードされた全てのアイソフォームのことを言うことが当業者には理解されよう。
【００８３】
本発明の方法の工程ａ）又はｂ）において、皮膚サンプルにおいて判定された第１のタンパク質及び少なくとも１つのさらなるタンパク質の量が、用いられた皮膚サンプルに含まれる細胞の量、質、及び代表性（representativity）に依存することが当業者にはさらに理解されよう。
【００８４】
したがって、一実施形態において、工程ａ）における第１のタンパク質及び少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルは典型的に正規化発現レベルのことを言うことが当業者には理解されよう。
【００８５】
本明細書での「正規化」は、例えば、異なるサンプルに対して得られた異なるデータセットを比較できるようにデータをスケーリングすることを言う。一例を挙げると、サンプル内で測定されたタンパク質の総量を用いて正規化を行ってもよい。しかしながら、正規化を当業者に知られている他の方法で、例えば、いわゆる参照遺伝子又はハウスキーピング遺伝子によってコードされたタンパク質の量を用いて行ってもよい。
【００８６】
したがって、一実施形態において、本発明の文脈にあるように「発現レベル」は正規化発現レベルである。
【００８７】
一実施形態において、皮膚サンプルにおいて判定されたタンパク質の総量を用いて発現レベルを正規化する。
【００８８】
タンパク質の総量を判定する方法は当業者に知られている。一例を挙げると、皮膚サンプルのタンパク質の総量をＢＣＡタンパク質定量キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック、イリノイ州、アメリカ合衆国）を用いて判定する。
【００８９】
本発明の文脈における皮膚サンプルは、本明細書において上記の「定義」の項で定義している。
【００９０】
本発明の方法はさらに、第１のタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較し、少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較する工程を含む。
【００９１】
一実施形態において、本発明の文脈における「参照発現レベル」は、対象、好ましくはより若年の対象、より好ましくは若年対象の皮膚サンプルにおける同じ遺伝子によってコードされたタンパク質の参照発現レベルのことを言う。
【００９２】
好ましくは、参照発現レベルは、同じ皮膚領域から得られ、本発明の方法の工程ａ）の対象の皮膚サンプルと同じ方法で得られた皮膚サンプルで測定される。
【００９３】
一例を挙げると、それら参照発現レベルは所定の参照発現レベルであり、特定の値又は範囲であり得る。
【００９４】
参照発現レベルは、例えば、より若い皮膚、好ましくは若い皮膚を示す特定の遺伝子の発現のレベルの間を区別する様々な統計的尺度であり得る。
【００９５】
したがって、いくつかの実施形態において、参照発現レベルは対象から、好ましくはより若年の対象から、より好ましくは若年対象から得られた皮膚サンプルにおける特定の遺伝子のタンパク質発現レベルである。
【００９６】
したがって、いくつかの実施形態において、参照発現レベルは対象、好ましくはより若年の対象、より好ましくは若年対象、又は対象の人口、好ましくはより若年の対象の人口、より好ましくは若年対象の人口から得られた皮膚サンプルにおける特定の遺伝子のタンパク質発現レベルの中央値である。
【００９７】
一実施形態において、参照発現レベルは受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線により判定したような閾値である。
【００９８】
一実施形態において、参照発現レベルは少なくとも２、４、１０、３０、５０、又は１００のサンプルを用いて判定してもよく、それらのサンプルは異なる対象由来であることが好ましい。
【００９９】
一実施形態において、参照発現レベルは少なくとも２つのサンプルを用いて判定してもよく、それらのサンプルは異なる対象由来であることが好ましい。
【０１００】
本明細書での「より若い」、「若い」、「高齢の」、及び「より高齢の」という用語は実年齢のことを言い、例えば「より若い」は、本発明の方法を適用する対象、すなわち、対象の皮膚が生理的老化の兆候を示すかどうかを判定する対象、の実年齢と比較した参照サンプルが由来する対象の実年齢のことを言う。
【０１０１】
本明細書において上記で定義した「皮膚の老化」は、老化を加速する外因性老化の要因を考慮しなければ通常実年齢３２歳から始まる。
【０１０２】
したがって、一実施形態において、本明細書での「若い」は１８歳から３２歳、好ましくは３２歳未満、より好ましくは３０歳未満のことを言う。
【０１０３】
一実施形態において、「高齢の」は４０歳から６５歳又はそれ以上、好ましくは４０歳超え、４５歳超え、５０歳超え、５５歳超え、より好ましくは６５歳超えのことを言う。
【０１０４】
発現レベルを参照発現レベルと比較した場合、その発現レベルは参照発現レベルよりも高いか低いかのどちらかであることが当業者には理解されよう。本発明の文脈におけるタンパク質の発現レベルが参照発現レベルよりも高い場合、そのレベルが参照発現レベルより有意に高いことが好ましい。本発明の文脈におけるタンパク質の発現レベルが参照発現レベルよりも低い場合、そのレベルが参照発現レベルより有意に低いことが好ましい。
【０１０５】
本明細書での「有意に」は統計的に有意なことを言う。
【０１０６】
一実施形態において、ｐ＜０．０５値を統計的に有意とみなす。
【０１０７】
一実施形態において、第１のタンパク質の発現レベルと少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルをそれらの参照発現レベルと比を用いて比較する。ここで、特に定義されなければ、本発明の方法の工程ａ）又はｂ）において測定した発現レベルを参照発現レベルで割る。
【０１０８】
したがって、一実施形態において、本発明の文脈における発現比が１より高い場合、発現比は１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．８、２、２．２、２．３、２．４、２．６、２．８、３．０、３．２、３．４など、１より有意に高い。
【０１０９】
比がタンパク質発現レベルを同じタンパク質の参照発現レベルで割ることにより得られる場合、１より高い発現比はタンパク質が参照発現レベルと比較して上方調節されている（過剰発現している）ことを示すことが当業者にはさらに理解されよう。
【０１１０】
関連する実施形態において、本発明の文脈における発現比が１より低い場合、発現比は０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１など、１より有意に低い。
【０１１１】
比がタンパク質発現レベルを同じタンパク質の参照発現レベルで割ることにより得られる場合、１より低い発現比はタンパク質が参照発現レベルと比較して下方調節されていることを示すことが当業者には理解されよう。
【０１１２】
対象の皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定する方法
一実施形態において、対象の皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定するインビトロ法は、第１のタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較し、少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較する工程をさらに含む。
【０１１３】
したがって、一実施形態において、対象の皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定するインビトロ法は、
ａ）対象の皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びにＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｂ）第１のタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較し、少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較し、及び
ｃ）皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定する
工程を含む。
【０１１４】
参照レベルは、本明細書において上記の「本発明の方法」の項で定義している。
【０１１５】
特定の一実施形態において、工程ａ）で得られた第１のタンパク質の発現レベルを参照発現レベルで割り第１のタンパク質の発現比を判定することにより、工程ｂ）で第１のタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較し、及び
工程ａ）で得られた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを参照発現レベルで割り少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現比を判定することにより、工程ｂ）で少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較する。
【０１１６】
一実施形態において、第１のタンパク質の発現レベルを第１のタンパク質の参照レベルと比較し、少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを少なくとも１つのさらなるタンパク質の参照レベルと比較する。
【０１１７】
したがって、一つの好ましい実施形態において、工程ａ）で得られた第１のタンパク質の発現レベルを第１のタンパク質の参照発現レベルで割り第１のタンパク質の発現比を判定することにより、及び工程ａ）で得られた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを少なくとも１つのさらなるタンパク質の参照発現レベルで割り少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現比を判定することにより、第１のタンパク質及び少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを参照発現レベルと比較する。
【０１１８】
したがって、さらなる一実施形態において、本発明は、対象の皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定するインビトロ法に関し、インビトロ法は
ａ）対象の皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びにＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｂ）工程ａ）で得られた第１のタンパク質の発現レベルを第１のタンパク質の参照発現レベルで割ることで第１のタンパク質の発現比を判定し、及び工程ａ）で得られた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを少なくとも１つのさらなるタンパク質の参照発現レベルで割ることで少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現比を判定し、及び
ｃ）皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定する
工程を含む。
【０１１９】
一実施形態において、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された発現比が１より高く又は低く、
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より高い又は低い場合、
対象の皮膚が老化の兆候を示す。
【０１２０】
さらなる実施形態において、ＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された発現比が１より高く、及び
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より高い場合、又は
ＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より高く、及び
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、及びＳＲＳＦ７からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より低い場合、又は
遺伝子ＨＭＧＮ１によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より低く、及び
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より高い場合、又は
遺伝子ＨＭＧＮ１によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より低く、及び
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、及びＳＲＳＦ７からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より低い場合、
対象の皮膚が老化の兆候を示す。
【０１２１】
したがって、一実施形態において、本発明は、対象の皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定するインビトロ法に言及し、インビトロ法は
ａ）対象の皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベルを判定し、対象の皮膚サンプルにおいて、ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｂ）工程ａ）で得られた第１のタンパク質の発現レベルを第１のタンパク質の参照発現レベルで割ることで第１のタンパク質の発現比を判定し、及び工程ａ）で得られた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを少なくとも１つのさらなるタンパク質の参照発現レベルで割ることで少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現比を判定し、及び
ｃ）皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定する
工程を含み、
ＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された発現比が１より高く、及び
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より高い場合、又は
ＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より高く、及び
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、及びＳＲＳＦ７からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より低い場合、又は
遺伝子ＨＭＧＮ１によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より低く、及び
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より高い場合、又は
遺伝子ＨＭＧＮ１によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より低く、及び
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、及びＳＲＳＦ７からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より低い場合、
対象の皮膚が老化の兆候を示す。
【０１２２】
一実施形態において、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ
３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１．４より高い場合、対象の皮膚が生理的老化の兆候を示す。
【０１２３】
さらなる実施形態において、ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、及びＳＲＳＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が０．７より低い場合、対象の皮膚が生理的老化の兆候を示す。
【０１２４】
美容処置の方法
本発明はさらに、上記の「発明の概要」の項で定義した美容処置の方法に言及する。
【０１２５】
本明細書での美容処置は、生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能な処置のことを言う。本明細書において上記で説明したように、皮膚の老化は、経時的老化などの内因性要因及び環境要因などの外因性要因に影響を受けた、又は皮膚病に起因した可能性のあるしわ、しみ、むらのある皮膚の色、及びたるんだ皮膚などの特徴のことを言う。
【０１２６】
当業者に知られているように、老化の目に見える兆候のない滑らかな皮膚が美しいと考えられている。したがって、一実施形態において、人の見た目を改善するために、生理的皮膚の老化の目に見える兆候の減少又は回復が行われる。したがって、一実施形態において、本発明は、人の見た目を改善するために行われる「美容処置」に言及しており、よって、非治療的である。
【０１２７】
本明細書において上記で述べたように、皮膚の生理的老化はまた、本明細書において上記の「定義」の項で定義したように皮膚病により引き起こされる可能性があり、「皮膚病由来の皮膚の老化」と称され得る。そのような場合、美容処置の方法は、例えば、皮膚科医により指示される。
【０１２８】
したがって、特定の一実施形態において、生理的皮膚の老化は皮膚病由来の皮膚の老化である。
【０１２９】
一実施形態において、本明細書において上記で定義した美容処置の方法及びその使用は、本明細書において上記の「対象の皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定する方法」の項で定義したように、第１のタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較し、少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較する工程をさらに含む。
【０１３０】
参照レベルは、本明細書において上記の「本発明の方法」の項で定義している。
【０１３１】
したがって、一実施形態において、本発明は、対象の生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能な美容処置の方法に言及し、美容処置の方法は
ａ）対象の皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びにＨＭＧＮ１、Ｈ
ＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｂ）第１のタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較し、少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較し、
ｃ）工程ｂ）の比較から皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを推定し、及び
ｄ）皮膚が生理的老化の兆候を示すと判定されると、対象を生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させる美容組成物で処置する
工程を含む。
【０１３２】
「生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させる美容組成物」は、抗酸化物質及び／又はレチノール及びそれらの誘導体を含む組成物などの生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させ得る、当業者から知られるあらゆる組成物のことを言い、例えば、Ｇａｎｃｅｖｉｃｕｉｅｎｅ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．２０１２（Ｄｅｒｍａｔｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２０１２  Ｊｕｌ  １；４（３）：３０８−１９）に記載されている。
【０１３３】
「抗酸化物質」は、ビタミンＣ、レスベラトロル、及びポリフェノールなどの抗酸化物質を含むがこれに限らない。
【０１３４】
また「ビタミンＡ」として知られる「レチノール」は、コラーゲンの生合成をし、及びＭＭＰ１（コラゲナーゼ１）の発現を減少させ、よって外因性及び内因性の皮膚の老化へ良い影響を与えるものとして当業者に知られている。
【０１３５】
「レチノールの誘導体」は、例えばトレチノイドである。
【０１３６】
「第１のタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較し、少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較する」及び「参照発現レベル」の工程ｂ）は、本明細書において上記で定義している。
【０１３７】
特定の一実施形態において、工程ａ）で得られた第１のタンパク質の発現レベルを参照発現レベルで割り第１のタンパク質の発現比を判定することにより、工程ｂ）で第１のタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較し、及び
工程ａ）で得られた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを参照発現レベルで割り少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現比を判定することにより、工程ｂ）で少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを参照レベルと比較する。
【０１３８】
一実施形態において、第１のタンパク質の発現レベルを第１のタンパク質の参照レベルと比較し、少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを少なくとも１つのさらなるタンパク質の参照レベルと比較する。
【０１３９】
したがって、一実施形態において、本発明は、対象の生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能な美容処置の方法に言及し、美容処置の方法は
ａ）対象の皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びにＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｂ）工程ａ）で得られた第１のタンパク質の発現レベルを第１のタンパク質の参照発現レベルで割ることで第１のタンパク質の発現比を判定し、及び工程ａ）で得られた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを少なくとも１つのさらなるタンパク質の参照発現レベルで割ることで少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現比を判定し、
ｃ）工程ｂ）の比較から皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを推定し、及び
ｄ）皮膚が生理的老化の兆候を示すと判定されると、対象を生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させる美容組成物で処置する
工程を含む。
【０１４０】
対象の皮膚が老化の兆候を示す場合を定義する実施形態は、本明細書において上記の「対象の皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを判定する方法」の項で定義しており、美容処置の方法に準用する。
【０１４１】
上記により、一実施形態において、本発明は、対象の生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能な美容処置の方法に言及し、美容処置の方法は
ａ）対象の皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びにＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｂ）工程ａ）で得られた第１のタンパク質の発現レベルを第１のタンパク質の参照発現レベルで割ることで第１のタンパク質の発現比を判定し、及び工程ａ）で得られた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを少なくとも１つのさらなるタンパク質の参照発現レベルで割ることで少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現比を判定し、
ｃ）工程ｂ）で得られた比から皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示すかどうかを推定し、
ここで、ＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より高く、及び
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より高い場合、又は
ＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より高く、及び
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、及びＳＲＳＦ７からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より低い場合、又は
遺伝子ＨＭＧＮ１によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より低く、及び
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より高い場合、又は
遺伝子ＨＭＧＮ１によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より低く、及び
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、及びＳＲＳＦ７からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１より低い場合、
皮膚が生理的皮膚の老化の兆候を示し、
ｄ）皮膚が生理的老化の兆候を示すと判定されると、対象を生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させる美容組成物で処置する
工程を含む。
【０１４２】
一実施形態において、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が１．４より高い場合、対象の皮膚が生理的老化の兆候を示す。
【０１４３】
さらなる実施形態において、ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、
及びＳＲＳＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質に対し、工程ｂ）で判定された比が０．７より低い場合、対象の皮膚が生理的老化の兆候を示す。
【０１４４】
物質を同定する方法
発明者らは、より若い皮膚における同じタンパク質の発現と比較して、老化すると、いろいろなタンパク質の発現が変化し上方又は下方調節されると証明した。
【０１４５】
したがって、生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能な物質は、より若い皮膚と比較して、タンパク質発現におけるこれらの違いを再調整又はそれらのタンパク質のいくつかの上方又は下方調節を減少させることができる。
【０１４６】
本明細書での工程ａ）における「皮膚サンプルを候補物質で処置する」は、例えば、皮膚サンプル、好ましくは皮膚サンプル細胞を候補物質に２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２４時間など１分間〜４８時間、好ましくは１〜３０時間、１〜２４時間、２〜２４時間、４〜２４時間、６〜２４時間、７〜２４時間、８〜２４時間、８〜１２時間接触させることを言う。
【０１４７】
当業者は、皮膚サンプル、好ましくは皮膚サンプル細胞を候補物質に接触させる時間が候補物質の濃度や皮膚サンプル、特に皮膚サンプル細胞の培養条件などの要因に依存することを知っている。
【０１４８】
一実施形態において、皮膚サンプルを候補物質に少なくとも５分間、少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも４０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間接触させる。
【０１４９】
本明細書での工程ｂ）における「皮膚サンプルにおいて発現レベルを判定する」は、例えば、本明細書において上記で定義したように、皮膚サンプルを候補物質に接触させた後少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１４時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間で発現レベルを判定することを言う。
【０１５０】
「皮膚サンプルを候補物質に接触させた後」の「後」という言葉は皮膚サンプルと物質が接触した時点を言うことが当業者には理解されよう。例えば、皮膚サンプルを候補物質に接触させた後８時間で発現を判定し物質を細胞に６時間接触させた場合、６時間の工程ａ）の接触時間の後、工程ｂ）で発現を２時間で判定することになる。
【０１５１】
好ましくは、候補物質で処置された工程ａ）の皮膚サンプル及び候補物質で処置されていない工程ｃ）の皮膚サンプルは工程ａ）の前では同一であることが当業者には理解されよう。本明細書での「同一」は、典型的に１回の生検で得られた皮膚サンプルのことを言い、生検ではサンプル及びそれに含まれる細胞が、最終的にサンプルの凍結を含む同じ処置を受け最終的に細胞単離及び細胞培養される。典型的に、皮膚サンプル、特に皮膚サンプル細胞は本発明の方法の工程ａ）の前に２つの部分に分けられる。
【０１５２】
好ましくは、物質を同定する方法の文脈における皮膚サンプルは再生皮膚、好ましくは３Ｄ再生皮膚であることが当業者にはさらに理解されよう。
【０１５３】
一実施形態において、候補物質で処置された工程ａ）の皮膚サンプル及び候補物質で処置されていない工程ｃ）の皮膚サンプルはさらに皮膚の老化を引き起こす環境にさらされる。
【０１５４】
関連する実施形態において、候補物質を同定する方法はさらに、皮膚サンプルを皮膚の老化を引き起こす環境にさらす工程ａ２）を含む。同じ実施形態において、工程ａ）の皮膚サンプルとして、候補物質で処置されていない皮膚サンプルを皮膚の老化を引き起こす同じ環境にさらす。
【０１５５】
本明細書での「皮膚の老化を引き起こす環境」は、例えば、酸化ストレス誘導因子、炎症誘発性サイトカイン、汚染物質、及びＵＶ照射、より詳細にはＵＶ−Ａ照射への暴露のことを言う。
【０１５６】
「炎症誘発性サイトカイン」は当業者に知られており、ＩＬ１β及びＴＮＦを含むがこれに限らない。
【０１５７】
「生理的皮膚の老化の目に見える兆候」は本明細書において上記で定義している。
【０１５８】
特定の一実施形態において、工程ｃ）で候補物質で処置されていない皮膚サンプルにおいて判定した第１のタンパク質の発現レベルを工程ｂ）で得られた第１のタンパク質の発現レベルで割り第１のタンパク質の発現比を判定することにより、及び工程ｃ）で得られた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを工程ｂ）で得られた発現レベルで割り少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現比を判定することにより、工程ｂ）で判定した第１のタンパク質及び少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを候補物質で処置されていない皮膚サンプルにおける第１のタンパク質及び少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルと工程ｃ）において比較する。
【０１５９】
したがって、一実施形態において、本発明は、生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能な物質を同定する方法に言及し、物質を同定する方法は
ａ）皮膚サンプルを候補物質で処置し、
ｂ）皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びにＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｃ）処置されていない皮膚サンプルにおいて判定した第１のタンパク質の発現レベルを工程ｂ）で得られた第１のタンパク質の発現レベルで割り第１のタンパク質の発現比を判定し、及び処置されていない皮膚サンプルにおいて判定した少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを工程ｂ）で得られた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルで割り少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現比を判定し、
ｄ）生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させる物質としての候補物質を同定する
工程を含む。
【０１６０】
一実施形態において、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３
及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された発現比が１より高く又は低く、
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より高い又は低い場合、
工程ｄ）で生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能であるとして物質が同定される。
【０１６１】
さらなる実施形態において、ＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された発現比が１より高く、及び
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より高い場合、又は
ＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より高く、及び
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、及びＳＲＳＦ７からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より低い場合、又は
遺伝子ＨＭＧＮ１によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より低く、及び
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より高い場合、又は
遺伝子ＨＭＧＮ１によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より低く、及び
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、Ｎ
ＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、及びＳＲＳＦ７からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より低い場合、
工程ｄ）で生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能であるとして物質が同定される。
【０１６２】
したがって、特定の一実施形態において、本発明は、生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能な物質を同定する方法に言及し、物質を同定する方法は
ａ）皮膚サンプルを候補物質で処置し、
ｂ）皮膚サンプルにおいて、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベル、並びにＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定し、
ｃ）処置されていない皮膚サンプルにおいて判定した第１のタンパク質の発現レベルを工程ｂ）で得られた第１のタンパク質の発現レベルで割り第１のタンパク質の発現比を判定し、及び処置されていない皮膚サンプルにおいて判定した少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを工程ｂ）で得られた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルで割り少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現比を判定し、
ｄ）ＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より高く、及び
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より高い場合、又は
ＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より高く、及び
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、及びＳＲＳＦ７からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より低い場合、又は
遺伝子ＨＭＧＮ１によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より低く、及び
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲ
ＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より高い場合、又は
遺伝子ＨＭＧＮ１によってコードされた第１のタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より低く、及び
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、及びＳＲＳＦ７からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１より低い場合、
生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させる物質としての候補物質を同定する
工程を含む。
【０１６３】
さらなる実施形態において、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が１．４より高い場合、工程ｄ）で生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能であるとして物質が同定される。
【０１６４】
さらなる実施形態において、ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、及びＳＲＳＦ７からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質に対し、工程ｃ）で判定された比が０．７より低い場合、工程ｄ）で生理的皮膚の老化の目に見える兆候を減少又は回復させることが可能であるとして物質が同定される。
【０１６５】
キット
「捕捉リガンド」は、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質を結合することのできるリガンド、又はＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質を結合することのできるリガンドを意味する。
【０１６６】
したがって、捕捉リガンドは、本明細書において上記で参照した遺伝子によってコードされたタンパク質のアミノ酸配列に特異的に結合する。「本明細書で上記に記載した遺伝子の１つによってコードされたアミノ酸配列に特異的に結合する」は、典型的にそのアミノ酸配列のエピトープに特異的に結合することを意味する。
【０１６７】
好ましくは、捕捉リガンドは、本明細書で上記に記載した遺伝子の１つによってコードされたタンパク質のアミノ酸配列を特異的に識別する抗体、アプタマー、及びポリペプチドからなる群から選択される。
【０１６８】
この文脈において、「抗体」という用語はあらゆるポリクローナル又はモノクローナル抗体のことを言う。
【０１６９】
フラグメントｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２もラクダ科一本鎖抗体も本明細書で上記に記載した遺伝子の１つによってコードされたタンパク質のアミノ酸配列を特異的に識別する抗体フラグメントの例である。
【０１７０】
「アプタマー」は当業者にはよく知られている。アプタマーはヌクレオチド、特にリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド、又は標的、特にタンパク質標的に特異的に結合できるペプチド様の化合物である。ヌクレオチド様のアプタマー及びその生産物は、特にＥｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４６：８１８−２２及びＢｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：５６４−６に記載されている。ペプチド様のアプタマー及びその生産物は、特にＨｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．  ７８：４２６−３０に記載されている。
【０１７１】
リガンドはまた、化学合成又は遺伝子工学により得ることができる。
【０１７２】
一つの好ましい実施形態において、捕捉リガンドは抗体である。
【０１７３】
本明細書で上に記載した遺伝子の１つによってコードされたタンパク質のアミノ酸配列に対する抗体は市販されている。
【０１７４】
例えば、ＴＵＢＢ３によってコードされたタンパク質に対する抗体は、サーモフィッシャー又はインビトロジェンから入手できるβ−３チューブリン抗体（２Ｇ１０）ＭＡ１−１１８である。
【０１７５】
例えば、ＨＭＧＡ２によってコードされたタンパク質に対する抗体は、例えばインビトロジェンから入手できるＨＭＧＡ２抗体ＰＡ５−２５２７６である。
【０１７６】
例えば、ＨＭＧＮ１によってコードされたタンパク質に対する抗体は、例えばアブカムから入手できるＨＭＧＮ１抗体ａｂ５２１２である。
【０１７７】
本発明の文脈における「少なくとも１つの捕捉リガンド」は、１つの捕捉リガンド、２つの捕捉リガンド、３つの捕捉リガンド、４つの捕捉リガンド、５つの捕捉リガンド、６つのさらなる捕捉リガンド、７つの捕捉リガンド、８つの捕捉リガンド、９つの捕捉リガンド、又は１０の捕捉リガンド、好ましくは１つの捕捉リガンド、２つの捕捉リガンド、３つの捕捉リガンド、４つの捕捉リガンドのことを言う。
【０１７８】
「少なくとも１つのさらなるタンパク質」は、本明細書において上記で定義している。
【０１７９】
特定の一実施形態において、キットは、
ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２及びＨＭＧＮ１、好ましくはＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２、より好ましくはＴＵＢＢ３からなる群から選択される遺伝子によってコードされた第１のタンパク質の発現レベルを判定するための少なくとも１つの捕捉リガンド、並びに
ＨＭＧＮ１、ＨＩＳＴ１Ｈ２ＢＫ、ＰＰＦＩＡ２、ＣＯＸ５Ａ、ＭＴ１Ｅ、ＨＭＧＮ２、ＥＥＡ１、ＣＤＶ３、ＺＣ３Ｈ１１Ａ、ＨＭＧＡ１、ＰＴＭＡ、ＳＥＲＢＰ１、ＰＤＡＰ１、ＴＭＳＢ１０、ＰＳＭＤ９、ＣＡＬＭ１、ＭＴ１Ｇ、ＴＰＭ４、ＳＰＲＲ１Ｂ、ＧＢＦ１、ＨＤＧＦ、ＨＳＰＥ１、ＤＢＩ、ＴＲＩＭ６、ＰＴＭＳ、ＩＭＵＰ、ＳＨ３ＢＧＲＬ３、ＲＰＳ２８、ＳＴＭＮ１、ＡＨＳＧ、ＰＦＤＮ６、ＳＵＭＯ２、ＰＦＤＮ２、ＮＥＢ、ＨＭＧＢ１、ＴＭＳＢ４Ｘ、ＣＬＴＢ、ＭＹＨ１１、ＳＲＳＦ７、ＴＵＢＢ３、ＨＭＧＡ２、ＡＴＰ６Ｖ１Ａ、ＳＱＲＤＬ、ＩＤＨ３Ａ、ＰＦＫＰ、ＰＲＤＸ３、ＲＰＳ１３、ＰＤＩＡ４、ＧＳＴＯ１、ＧＳＴＰ１、ＡＣＴＲ３、ＳＬＣ２Ａ１、ＣＣＴ５、ＰＳＭＢ２、ＰＬＳ３、ＰＳＭＤ２、ＩＧＨＧ４、及びＲＰＬ１３からなる遺伝子の群から選択される遺伝子によってコードされた少なくとも１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定するための少なくとも１つの捕捉リガンド
を含む。
特定のいくつかの実施形態において、キットは、
ＴＵＢＢ３によってコードされた１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定するための少なくとも１つの捕捉リガンド、
ＨＭＧＡ２によってコードされた１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定するための少なくとも１つの捕捉リガンド、及び／又は
ＨＭＧＮ１によってコードされた１つのさらなるタンパク質の発現レベルを判定するための少なくとも１つの捕捉リガンド
を含む。
【０１８０】
一実施形態において、捕捉リガンドは固相に固定される。
【０１８１】
固相の非限定例として、デンマークのヌンクから販売されているものなどのマイクロプレート、特にポリスチレンマイクロプレートを用いることができる。ディナル、メルク−ユーロラボ（フランス）（ＥｓｔａｐｏｒＴＭという商標）及びポリマー・ラボラトリーで製造されたものなどの固形の粒子又はビーズ、常磁性ビーズ、又は平らなポリスチレン又はポリプロピレン試験管、ガラス、プラスチック又はシリコンチップなどもまた用いてもよい。
【０１８２】
一実施形態において、これらのキットは、例えば試薬及び／又は説明書などの他の要素を追加的に含んでもよい。
【０１８３】
本出願全体を通して、「及び／又は」という用語は、接続する事例の１つ又は複数が起こり得ることを包含すると解釈されるべき文法上の接続詞である。例えば、「「判定する」という用語は定性的及び／又は定量的検出を含む」という語句における「定性的及び／又は定量的検出」という表現は、判定するという用語が定性的検出、又は定量的検出、又は定性的検出及び定量的検出に言及し得ることを示す。
【０１８４】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において用いられるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、内容が別途明確に指示しない限り、言及された複数の対象などの複数の言及を含む。
【０１８５】
本出願全体を通して、「含む」という用語は、全ての具体的に述べられた特徴及び任意の追加の特定されていない特徴を包含すると解釈されるべきである。本明細書において用
いられるように、「含む」という用語の使用は、具体的に述べられた特徴以外の特徴が存在しない（すなわち「からなる」）実施形態も開示する。
【０１８６】
ここで、以下の実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。本明細書で引用されている全ての文献及び特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。上記の説明で本発明を詳細に例示し説明しているが、実施例は、実例又は典型例であり限定的でないとみなされるべきである。
【実施例】
【０１８７】
実施例１
１．材料及び方法
１．１  細胞培養
初代角化細胞の単離及び培養：健康な人の承諾書を受けて、乳房の形成手術後、皮膚生検を得た。提供者は、以下、それぞれ高齢及び若年を意図する２つの年齢層に分類された６０及び６５歳（ｎ＝２）と２７及び３２歳（ｎ＝２）のヨーロッパの白人女性である（Ｃｏｄｅｃｏｈ（Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｄ’Ｅｌｅｍｅｎｔ  ｄｕ  Ｃｏｒｐｓ  Ｈｕｍａｉｎ）からの承諾番号ＤＣ−２００８−４４４）。皮膚生検は太陽から保護され太陽にさらされていない皮膚である。ヒト初代角化細胞を２５μｇ／ｍＬのＢＰＥと０．９ｎｇ／ｍＬのＥＧＦが補充されたＫＳＦＭ培地で培養した。
【０１８８】
１．２  タンパク質抽出
凍結細胞ペレットを３０分間、４°で、４０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐｈ７．４、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．０２％のトリトン、０．０２％のデオキシコール酸ナトリウム、０．２ｍＭのＴＣＥＰ、及びロシュ製のプロテアーゼ及びフォスファターゼの阻害剤混合物（ＰｈｏｓＳＴＯＰ）を含む溶液中で溶解した。溶解は氷上での短時間の超音波処理で達成され、溶解物は、１４０００ｒｐｍ、２０分間、４°での遠心分離により除去された。タンパク質抽出物の濃度は、ＢＣＡタンパク質定量キット（サーモフィッシャーサイエンティフィック、イリノイ州、アメリカ合衆国）を用いて判定した。
【０１８９】
１．３  タンパク質消化及びｉＴＲＡＱ標識
製造業者の説明書に従って８プレックスセットのｉＴＲＡＱ試薬（ｉＴＲＡＱ試薬８プレックスアプリケーションキット；エービー・サイエックス、フレーミングハム、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）でタンパク質サンプルを標識した。手短に言うと、若年提供者由来の細胞から得られたタンパク質抽出物の等量を計１００μｇとするためプールした。同じ手順を高齢提供者からの細胞に適用した。サンプルを３７℃で１時間、２０ｍＭのＴＣＥＰ（トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン）で還元し、システイン残基を室温で１０分間、１０ｍＭのＭＭＴＳ（メタンチオスルホン酸メチル）でブロックし、続いて３７℃で一晩中、１：１０（トリプシン：タンパク質）の割合でトリプシン（プロメガ）消化を行った。それぞれのペプチド溶液を１つのｉＴＲＡＱ試薬で標識した：ｉＴＲＡＱレポーターイオンのｍ／ｚは若年者が１１３．１、高齢者が１１７．１であった。ｉＴＲＡＱ標識は全ての反応に対して検証され、ＯＦＦＧＥＬペプチド分画の前にサンプルを１：１の割合でプールし真空遠心分離で乾燥した。
【０１９０】
１．４  ペプチドＯＦＦＧＥＬ等電点電気泳動法
製造業者の説明書の通り、ｐＩに従ったペプチド分画を３１００  ＯＦＦＧＥＬ分画装置及びＯＦＦＧＥＬ  Ｋｉｔ  ｌｉｎｅａｒ  ｐＨ３−１０（アジレント・テクノロジー）で２４ウェルの構成で行った。２４のフラクションの分離のために３〜１０までの直線的なｐＨ勾配を有する２４ｃｍの長さのＩＰＧゲル片を用いて装置を構成した。ｉＴＲＡＱで標識したペプチド混合物を真空遠心分離で乾燥し、２４のウェルそれぞれへのローディング前にｆｏｃｕｓｉｎｇ  ＯＦＦＧＥＬ緩衝液で再懸濁した。５０ｋＶｈに達するま
でペプチドを５０μＡの定電流で泳動した。分画完了後、ペプチドサンプルを各ウェルから回収し、真空濃縮器内で乾燥した後、Ｃ１８ＺｉｐＴｉｐｓ（ミリポア、マサチューセッツ州、アメリカ合衆国）を用いて脱塩した。
【０１９１】
１．５  逆相ナノ液体クロマトグラフィー
Ｃｈｒｏｍｅｌｅｏｎ  ｖ．  ６．８０ソフトウェア（ダイオネクス／サーモサイエンティフィック／ＬＣパッキング、アムステルダム、オランダ）により制御され、μＣａｒｒｉｅｒ  ２．０ソフトウェア（ダイオネクス／サーモサイエンティフィック／ＬＣパッキング、アムステルダム、オランダ）により制御されたＰＲＯＢＯＴ  ＭＡＬＤＩスポッティング装置と連動したＵｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  Ｃ１８逆相ナノ液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ｎａｎｏＬＣ）システム（Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００、ダイオネクス／サーモサイエンティフィック）でさらなるペプチド分離を行った。
【０１９２】
流速２０μＬ／分で５分間、２％ＡＣＮ及び０．０５％ＴＦＡを流したナノトラップカラム（Ｃ１８、３μｍ、細孔径１００Å；ＬＣパッキング）への注入前に、真空乾燥させたフラクションを緩衝液Ａ（９８％水、２％ＡＣＮ、及び０．０５％ＴＦＡ）で再懸濁した。その後、流速０．３μＬ／分で緩衝液Ａ（２％ＡＣＮ及び０．０５％ＴＦＡ）及び緩衝液Ｂ（８０％ＡＣＮ及び０．０４％ＴＦＡ）のバイナリ勾配を有する逆相クロマトグラフィー（Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ３００  ７５μｍ、１５ｃｍ、ｎａｎｏＶｉｐｅｒ  Ｃ１８、３μｍ、細孔径１００Å；サーモサイエンティフィック）により、捕捉されたペプチドを分離した。分離操作を全体で６０分間続け、ナノＬＣ勾配を次のように構成した：５〜３５分、８〜４２％Ｂ；３５〜４０分、４２〜５８％Ｂ、４０〜５０分、５８〜９０％Ｂ、及び５０〜６０分、９０％Ｂ。溶出した溶液からのフラクションを回収し、１５秒ごとに１スポットの頻度でＭＡＬＤＩサンプルプレート（エービー・サイエックス、レ・ジュリス、フランス）にスポットした。α−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸マトリクス（ＨＣＣＡ、７０％ＡＣＮ及び０．１％ＴＦＡ中２ｍｇ／ｍＬ）を流速０．９μＬ／分で連続してカラム溶出液に添加したことで、ＭＡＬＤＩサンプルプレートの各スポットになじませた。
【０１９３】
１．６  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ分析
ナノＬＣ−オフラインスポットしたペプチドサンプルのＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析を４０００  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウェア  ｖ．  ３．５により制御された４８００  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（エービー・サイエックス、レ・ジュリス、フランス）を用いて行った。質量分析計をポジティブリフレクターモードで操作した。各スペクトルをＰｅｐｔｉｄｅ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ
ＩＩ（ブルカー・ダルトニクス、ブレーメン、ドイツ）を用いて外部較正し、ペプチド質量公差を５０ｐｐｍに設定した。ＭＳスペクトルはｍ／ｚ７００〜４０００の範囲で得た。ＭＳ／ＭＳ分析のために、４０より高いＳ／Ｎ（信号／雑音）比を特徴とするスポット位置ごとに３０までの最も強いイオンが選択された。これらのペプチドの配列を判定しそれらを定量化するのに必要な対応するＭＳ／ＭＳスペクトルを得るためにＣＩＤ（衝突誘起解離）活性化モードを用いて選択されたイオンを断片化した。
【０１９４】
１．７  ｉＴＲＡＱデータの分析
同定及び相対定量のために、Ｐａｒａｇｏｎ（商標）アルゴリズムを有するＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ（商標）ソフトウェア  ｖ  ４．０（エービー・サイエックス、レ・ジュリス、フランス）及びＭａｓｃｏｔを用いることでＭＳ及びＭＳ／ＭＳスペクトルを用いた。分析はＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１５＿０６−Ｊｕｎｅ，  ２０１５のヒトデータベース／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（欧州バイオインフォマティクス研究所、ヒンクストン、イギリス）で行った。ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ検索に関しては、ｓｅａｒｃｈ  ｅｆｆｏｒｔを「Ｔｈｏｒｏｕｇｈ  ＩＤ」に設定し、１％の偽発見率分析（Ｆ
ＤＲ）を適用した。定量化のため、バイアス及びバックグラウンド補正を適用し、ペプチド信頼度が９５％の少なくとも１つのペプチドを有する定量化されたタンパク質のみを含めた。Ｍａｓｃｏｔ検索に対しては、ＦＤＲを１％より低く設定し、３０より高いスコアを有するペプチドのみを考慮した。ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ及びＭａｓｃｏｔ分析の後、データをペプチドレベルで併合した。定量的分析での高い品質を得るために、発明者らはデータをタンパク質／ペプチド調節の統計的有意性の判定を可能にするＲパッケージアイソバー（Ｂｒｅｉｔｗｉｅｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １０，  ２７５８−２７６６）で分析した。ノーマルフィットを用い、その後、ｐ値比及びｐ値サンプル＜０．０５の比を有するタンパク質のみを年齢によって有意に異なって発現したものとみなした。我々の定量的ｉＴＲＡＱの結果の出力には、タンパク質の相対的定量化比を表すために全てのタンパク質比を若年者分の高齢者（１１７：１１３）として表した。質量データ分析に適用されたパラメータの要約を本明細書において下記の表１に示す。
【０１９５】
【表２】
2020502498.tif 000005
【０１９６】
１．８  遺伝子オントロジー及び経路分析
ＰＡＮＴＨＥＲ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐａｎｔｈｅｒｄｂ．ｏｒｇ／）（Ｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４１，  Ｄ３７７−Ｄ３８６）を用いて異常調節されたタンパク質のリストを取り込むことにより遺伝子オントロジー及び経路分析を行い、タンパク質をＰＡＮＴＨＥＲファミリー；タンパク質クラス；ＧＯ−Ｓｌｉｍ分子機能、生物学的プロセス、及び細胞の構成要素、及び経路に関する１つ又はいくつかのカテゴリーに分類した（データ示さず）。
【０１９７】
１．９  ウエスタンブロット分析
８人の若年提供者（年齢：１８；２１；２４；２６；２７（２人の提供者）；３０；３２）及び１０人の高齢提供者（５７；５９；６０；６２（２人）；６５（２人）；６６；６８；７１）の皮膚生検からヒト初代角化細胞を採取し培養した。初期継代（２回又は３回、細胞がまだ増殖型である時）で、プロテアーゼ阻害剤（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤混合物、ロシュ、スイス）、１ｍＭのＤＴＴ、及び１００μＭのＰＭＳＦを含むＲＩＰＡ緩衝液（シグマアルドリッチ）内で振とうすることにより細胞を溶解した。その後、サンプルを１５分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離し、上清を回収した。ＭｉｃｒｏＢＣ  Ａｓｓａｙ（インターチム）でタンパク質濃度を判定し、２０μｇの総タンパク質をＴＧＸ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ（商標）ＦａｓｔＣａｓｔ（商標）１２％アクリルアミドゲル（バイオラッド）にロードした。タンパク質をＴｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）転写システム（バイオラッド）を用いてニトロセルロース膜上に移した。５％の無脂肪乳を含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．５％で膜をブロックした。一次抗体を５％の無脂肪乳を含むＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．５％内、一晩中４℃で以下の希釈：チューブリンβ−３鎖抗体（ＭＡ１−１１８；サーモサイエンティフィック）に対し１／１０００及びコーニフィン−Ｂ抗体（ＰＡ５−２６０６２；サーモサイエンティフィック）に対し１／１０００、でインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．５％で洗浄後、膜を１時間室温でＨＲＰ結合二次抗体（アマシャムＥＣＬ抗マウス及び抗ウサギＩｇＧ  ＨＲＰ結合、全抗体、ＧＥヘルスケア）でインキュベートした。その後、膜をＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ０．５％で洗浄し、ブロットの画像をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃ  ＸＲ＋及びＣｈｅｍｉｄｏｃ  ＸＲＳ＋システム（バイオラッド）上で得た。特定の検出されたバンドをＩｍａｇｅ  ＬＡｂ  ２．０ソフトウェア（バイオラッド）で定量化し、対応する強度を総タンパク質含有量で正規化し、比として表した。
【０１９８】
ＴＵＢＢ３及びＨＭＧＡ２のウエスタンブロットの結果をボックスプロットで示し、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ曲線）をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ、（グラフパッドソフトウェア、ラホヤ、カリフォルニア州、アメリカ合衆国、ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ）を用いることにより作成した。
【０１９９】
２．結果
２．１  プロテオミクス分析による年齢状況により異なって発現した５８のタンパク質の同定
高齢及び若年提供者由来の角化細胞の定量的なプロテオミクスマップを得るため、前に述べたようにＯＦＦＧＥＬ分画及びオフラインナノＬＣ／ＭＳ／ＭＳと併用したｉＴＲＡＱ標識を用いた（Ｍａｒｔｉｎ−Ｂｅｒｎａｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，  Ｊ．  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．  １３，  ４６９５−４７０）。ＰｒｏｔｅｉｎＰｉｌｏｔ及びＭａｓｃｏｔを用いた生物情報分析では、１％のＦＤＲを用い、信頼度が≧９５％及びスコアが＞３０の少なくとも１つのペプチドを有するタンパク質のみを考慮して、５１７の固有のタンパク質の同定という結果となった。アイソバーパッケージと定量化された４４６のタンパク質を用いた統計的分析が行われた。高齢者の細胞をｉＴＲＡＱｍ／ｚ１１７タグで標識し、若年者の細胞をｉＴＲＡＱｍ／ｚ１１３タグで標識した。したがって、比１１７：１１３（高齢者：若年者）は、高齢者と若年者の細胞サンプル間のタンパク質の相対存在度を示している。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号、ＩＤ、タンパク質及び遺伝子の名前、ペプチド数、スペクトル数、配列包括度、高齢者の細胞対若年者の細胞に対するｉＴＲＡＱ比、ｐ値比、及びｐ値サンプルを含む、同定されたタンパク質を網羅したリストを捕捉データに提供する（データ示さず）。
【０２００】
ｐ値比及びｐ値サンプルがいずれも＜０．０５の場合、タンパク質を有意に異なって発現したものとみなした。これらの基準を適用し、有意に異なって発現した５８のタンパク質を年齢状況により同定した。これらから、加齢とともに４０が下方調節され１８が上方
調節された（表２及び表３）。
【０２０１】
【表３−１】
2020502498.tif 000006
【表３−２】
2020502498.tif 000007
【表３−３】
2020502498.tif 000008
【表３−４】
2020502498.tif 000009
【表３−５】
2020502498.tif 000010
【０２０２】
【表４−１】
2020502498.tif 000011
【表４−２】
2020502498.tif 000012
【０２０３】
２．２  遺伝子オントロジー分析
すでに同定された５８のタンパク質をＰＡＮＴＨＥＲ（Ｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ４１，  Ｄ３７７−Ｄ３８６）を用いて分析し、以下の遺伝子オントロジー及びＰＡＮＴＨＥＲのカテゴリー：タンパク質ファミリー；タンパク質クラス；分子機能；生物学的プロセス；細胞の構成要素及び経路に分類した（データ示さず）。主に代表的な生物学的プロセスのカテゴリーは、代謝（３０％）、細胞プロセス（２１％）、細胞の構成要素の組織化及び生物学的調節（１０％）、局在化及び発達プロセス（８％）、刺激に対する反応（４％）、多細胞生物プロセス及び免疫システムプロセス（３％）、及び生物学的接着（１％）である。タンパク質クラスに関しては、異常調節されたタンパク質は主に以下のタンパク質クラス：核酸結合（２５％）、細胞骨格タンパク質（１３％）、酵素調節因子（１２％）、酸化還元酵素及びシグナル伝達分子（８％）、シャペロン（６％）、トランスフェラーゼ及び転写因子（４％）、細胞外基質タンパク質、加水分解酵素、キャリアタンパク質、膜輸送タンパク質、細胞間結合タンパク質、キナーゼ、イソメラーゼ及び受容体（２％）に属する（グラフ表示せず）。
【０２０４】
２．３  プロテオミクス分析を有効にする候補タンパク質のウエスタンブロット分析
個人間変動を排除しより多くの提供者のプロテオミクスの結果を有効にするため、同じ提供者のみならずさらに１０人の他の提供者からのヒト初代角化細胞で、対象の２つの候補タンパク質をウエスタンブロットによりさらに分析した。プロテオミクスの実験により得られた対応する比を有する選択されたタンパク質は、比が２．６のチューブリンβ−３鎖（ＴＢＢ３＿ＨＵＭＡＮ）及び比が０．５２の高移動度グループタンパク質ＨＭＧＩ−Ｃ（ＨＭＧＡ２＿ＨＵＭＡＮ）である。ウエスタンブロットの画像及び定量化の結果はそれぞれ図２及び図４に示す。
【０２０５】
３．考察
皮膚の老化は、定量的プロテオミクスなどの新たな技術的アプローチを用いて解明することのできる多元的な原因を持つ複雑なプロセスである。若年及び高齢提供者からのヒト初代角化細胞プロテオームにおける変化を同定し定量化するため、ｉＴＲＡＱ−ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ  ＭＳ及びＭＳ／ＭＳ分析を行った。５１７のタンパク質が、コーニフィン−Ｂや角化細胞の活性化、増殖、及び角質化に関連するケラチン−２ｅなどの角化細胞で主に見られるタンパク質を含むと同定された（Ｃｏｌｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２，  Ｅｘｐ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２０２，  １３２−１４１）。ロバスト統計的分析を適用した後、５８のタンパク質が年齢状況により有意に異なって発現したことが分かり、そのうち加齢とともに４０が下方調節され１８が上方調節された。
【０２０６】
発明者らは、女性における遺伝子発現の研究（Ｍａｋｒａｎｔｏｎａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ７）からの以前の結果と一致して、加齢とともに上方調節（１８）よりも多くのタンパク質が下方調節（４０）されることに気付いた。発現が年齢によって影響を受けるタンパク質の大半は代謝（３０％）及び核酸結合（２５％）に関与する。同様の結果が以前のトランスクリプトミクス研究で観察されてきた（Ｌｅｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６，  Ｅｘｐ．  Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．  ４１，  ３８７−３９７）。
【０２０７】
本研究において、女性の表皮（Ｒａｄｄａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ６，  ３６）及び皮膚生検（ＭｃＧｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １６６  Ｓｕｐｐｌ
２，  ９−１５）を用いた２つのトランスクリプトミクス研究において以前に報告されたように、コーニフィン−Ｂが加齢とともに下方調節されることが分かってきた。コーニフィン−Ｂは角化細胞の分化のマーカーであり（Ｔｅｓｆａｉｇｚｉ  ａｎｄ  Ｃａｒｌｓｏｎ，  １９９９，  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  ３０，  ２４３−２６５）、加齢に伴う角化細胞の分化の下方調節はすでに観察されている（Ｒａｄｄ
ａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３，  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ６，  ３６）。
【０２０８】
我々の研究では、ペルオキシレドキシン３（ＰｒｘＩＩＩ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）ペルオキシダーゼの抗酸化物質ファミリーのミトコンドリアメンバー、は加齢とともに上方調節されることが分かっている。以前の報告において、２つの他のファミリーメンバー、ペルオキシレドキシン１及び２もまた上方調節されている（Ｌａｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０，  Ｅｘｐ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．  １９，  ９１２−９１８）。ペルオキシレドキシンは重要な細胞抗酸化物質であり、実際に過酸化水素及び有機ヒドロペルオキシドスカベンジャーとして働く（Ｎｙｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ２６，  ２００１−２００８）。加齢とともに活性酸素種（ＲＯＣ）の生産が増加し、抗酸化活性が減少し、どちらも経時的老化の要因となることは確立されている（Ｐｏｌｊｓａｋ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍａｔｏｖｅｎｅｒｏｌ．  Ａｌｐ．  Ｐａｎｎｏｎｉｃａ  Ａｄｒｉａｔ．  ２１，  ３３−３６）。酸化的ストレス条件において、ＰｒｘＩＩＩは過酸化しそれに続く不可逆的失活を受ける。そしてラットにおいては、この修飾ＰｒｘＩＩＩフォームが加齢とともに蓄積することが示されてきた（Ｍｕｓｉｃｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。本分析において、スルホン酸に過酸化したシステインを含むペプチドは同定されておらず、したがって、２つのフォームは判別されていないため、その結果なぜタンパク質の全体的な上方調節が観察されたのかを説明する。
【０２０９】
我々の研究では、６−ホスホフルクトキナーゼ、血小板型（ＰＦＫＡＰ＿ＨＵＭＡＮ）が加齢とともに上方調節されている。この酵素は、解糖の最初の関与工程であるＡＴＰによるフルクトース１、６−ビスリン酸へのＤ−フルクトース６−リン酸のリン酸化反応を触媒する。高齢提供者由来のヒト初代角化細胞が、解糖の増加に向かう代謝の変化の指標であるより高いグルコースの取り込み及び乳酸産生の増加を示すことが示されてきた（Ｐｒａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  ＢｉｏＦａｃｔｏｒｓ  Ｏｘｆ．  Ｅｎｇｌ．
３２，  ２４５−２５５）。よって、観察されたＰＦＫＡＰの上方調節は初代角化細胞における解糖の増加と関連している。
【０２１０】
我々の結果を皮膚の老化のバイオマーカーの同定を目的とする他の研究と比較すると、皮膚サンプルの異なるタイプ／起源、性、ワークフロー全体にわたるサンプル処理の違い、及びｍＲＮＡとタンパク質発現レベルの間の可変相関により説明できるいくつかの相違点を示す（Ｓｃｈｗａｎｈａｕｓｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１，  Ｎａｔｕｒｅ  ４７３，  ３３７−３４２）。
【０２１１】
加齢とともに異なったタンパク質の特徴を定義すると、たとえこれらの変化が起因となるとしても、適応又は代償的事象は皮膚の老化の我々のさらなる知識に不可欠である。この研究は、皮膚の老化の生物学をより理解し、皮膚の老化及び関連する病理学を診断し、予防し、処置するのに役立てることのできる新たな特定の標的を同定するための新たな努力をもたらす。
【０２１２】
実施例２
上記の実施例１に開示した方法を用い、発明者らは、本発明のマーカーの組み合わせを用いた場合に得られた感度及び特異性の改善をさらに証明した。
【０２１３】
図５Ａ、Ｂ、及びＣは、それぞれβ−チューブリン、ＨＭＧＡ２、及びＨＭＧＮ１に対し、それぞれ０．８０６、０．９３９、及び０．５９２の曲線下面積を示す。
【０２１４】
しかしながら、図６に示すように、β−チューブリン、ＨＭＧＡ２、及びＨＭＧＮ１を
組み合わせて用いた場合、１の曲線下面積に対応する１００％の感度及び特異性を達成することができる。そのような感度及び特異性を得るために用いられるモデル方程式は以下の通りであった。
予測＝８３．７６−（９９２．９１×チューブリン）−（４９３６．６１×ＨＭＧＡ２）＋（２７３．４０×ＨＭＧＮ１）
【図１】
2020502498.tif 000013
【図２】
2020502498.tif 000014
【図３】
2020502498.tif 000015
【図４】
2020502498.tif 000016
【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
2020502498.tif 000019
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