(57)【要約】対象から採取した罹患細胞試料の複数のシグナル伝達経路の機能状態を同時に明らかにし、それにより、対象の治療に使用するための、対象の細胞における異常な活性のレベルが最も高いシグナル伝達経路に影響を及ぼす標的化治療剤を選択する方法が本明細書に提供される。また、あるシグナル伝達経路が対象からの罹患細胞試料において超感受性であるかどうかを判定し、対象の治療に使用する効果的な標的化治療剤の選択も可能にする方法も提供される。選択した標的化治療剤を対象に投与する方法も提供される。具体的には、癌であると診断されたヒト対象の治療であって、シグナル伝達経路の活性化因子の存在下の生存癌細胞の培養において、標的化治療剤が細胞の接着または付着に何らかの効果を生じさせることによってこの経路に影響を及ぼすかどうかを明らかにすることにより、癌治療のための治療剤を選択することを含む、方法が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
前記対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
前記試料と、各組が、標的化治療剤である第一の薬剤と、前記第一の薬剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている活性化因子である第二の薬剤とからなり、薬剤対の組がそれぞれ異なるシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも２組の薬剤対とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定される前記シグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも２組の薬剤対と接触させた試料を作製することと、
薬剤対の各組と接触させた前記試料中の前記生存癌細胞の細胞接着または付着を、前記対象から採取し前記第一の薬剤のそれぞれまたは前記第二の薬剤のそれぞれのみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
前記薬剤対の組と接触させた前記試料に前記第一の薬剤または前記第二の薬剤のみと接触させた前記試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける各組の薬剤対の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
全被験組のうち絶対出力値が最も高いことが明らかになった薬剤対の組の前記第一の薬剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を前記対象に投与し、投与した前記標的化治療剤が、前記対象の癌細胞の前記細胞シグナル伝達経路において、絶対出力値がこれより低い前記薬剤対の組（１つまたは複数）の前記標的化治療剤（１つまたは複数）より高い治療活性があることを示すことと
を含む方法によって前記対象の癌細胞でシグナル伝達を測定した前記シグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記試料と１０組以上の薬剤対の組とを接触させ、薬剤対の各組が、異なるシグナル伝達経路に影響を及ぼすものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記シグナル伝達経路が、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＮｏｔｃｈからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記薬剤対の組とシグナル伝達経路が、以下に示す表：
【表１】
2020514379.tif 000045
から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記シグナル伝達経路が、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、Ｍｅｒ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｔｃｈ、ＭＡＰＫ、ＲＯＮ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、Ｍｏｓ、Ｅｒｋ、ＭＬＫ、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ｐ３８、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＨ３、カスパーゼ、ｐ５３、ＮＩＫ、ＮＦｋＢ、ＲＯＣＫ、ＸＩＡＰ、ＭＯＭＰ、ＩＬＫ、ＰＤＫ、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦＲ、ｍＴＯＲ、Ｊａｋ、ＰＩＫＫ、４Ｅ−ＢＰ１、Ｒａｐｔｏｒ、ＫＭＴ、ＭＬＬ、ＫＤＭ、ＵＴＸ、ＤＯＴ１Ｌ、ＢＲＤ、ＴＥＴ、ＳｉｒＴ１、Ｈａｔ、ＳＮＦ、ＤＮＭＴ、ＥＺＨ、ＡＭＰＫ、ＰＬＣ、ＣａＭＫＫ、グルコース輸送体、ＰＦＫ、ＦＡＳ、クレブス回路、解糖、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤ、ＴＲＡＦ、ＴＡＢ、ＮＥＭＯ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｋＢ、ＩＬ１Ｒ、ＩＲＡＫ、Ｍｙｄ８８、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＰｓ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＰＡＲＰ、ラミン、ＺＮＲＦ、ＷｎｔＲ、ＰＡＲ、ＧＳＫ、Ｄｓｈ、ＬＧＲ、カテニン、ＷＴＸ、ＡＰＣ、Ｓｒｃ、ＣＢＰ、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｆｕｒｉｎ、Ｄｅｌｔａ  Ｊａｇｇｅｄ、ＮＩＣ、プレセニリン、ＣＤＯ、ＢＯＣ、Ｇｌｉ、ＫＩＦ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＳＡＲＡ、Ｓｍａｄ、Ｓｍｕｒｆ、ＮＬＫ、ｐ２８、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＬＩＭＫ、コフィリン、ＣＤ４４、ＦＡＴ、ＫＩＢＲＡ、ＦＲＭＤ、Ｍｓｔ、ＹＡＰ、ＬＡＴＳ、ＭＯＢ、ＳＡＶ、ＴＥＡＤ、Ｍｅｒ、ＳＡＢ、ＴＡＺ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＰＡＫ、ＣＲＥＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＶＥＧＦ受容体、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスからなる群より選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
薬剤対の各組が、異なるＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
薬剤対の各組が、表１２に記載される薬剤対の組から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
（ｉ）全被験組のうち出力値が最も高いことが明らかになった前記薬剤対の組の前記標的化治療剤および（ｉｉ）前記標的化治療剤が前記対象の癌細胞の前記細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す出力値を有することが明らかになった前記薬剤対の組少なくとも１つの追加の標的化治療剤の少なくとも２つの標的化治療剤を前記対象に投与する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
前記少なくとも１つの追加の標的化治療剤が、前記標的化治療剤が前記対象の癌細胞の前記細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す５０％超の出力値パーセントを有することが明らかになっている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
薬剤対の各組の前記第二の薬剤である活性化因子が、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せである、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象に投与する前記標的化治療剤が、出力値が最も高いことが明らかになった前記薬剤対の組の前記第一の薬剤である、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記対象に投与する前記少なくとも１つの標的化治療剤が、出力値が最も高いことが明らかになった前記薬剤対の組の前記第一の薬剤とは異なるものであるが、前記第一の薬剤と同じシグナル伝達経路を標的とする、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
前記対象の癌細胞の異常に活性なシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を前記対象に投与することを含み、
前記シグナル伝達経路が、
前記対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
前記試料と、シグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている活性化因子とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定される前記シグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、前記試料の一部を濃度が高い方の前記活性化因子と接触させ、前記試料の一部を濃度が低い方の前記活性化因子と接触させることと、
濃度が高い方の前記活性化因子と接触させた前記試料の一部における前記生存癌細胞の細胞接着または付着を前記濃度が低い方の活性化因子と接触させた前記試料の一部と比較して連続的に測定することと、
前記活性化因子に対する前記シグナル伝達経路の感受性を連続測定値の数理解析によって求めることと、
前記シグナル伝達経路が前記活性化因子に超感受性である場合、前記活性化因子が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を前記対象に投与し、前記シグナル伝達経路が前記対象の癌細胞において異常に活性であることを示すことと
を含む方法によって前記対象の癌細胞において異常に活性であることが明らかにされている、方法。
【請求項１８】
濃度が高い方の前記活性化因子と接触させた前記試料の一部における前記生存癌細胞の細胞接着または付着を、濃度が低い方の前記活性化因子と接触させた前記試料の一部と比較し、前記活性化因子と接触させていない前記試料の一部と比較して連続的に測定することと、
前記活性化因子に対する前記試料の感受性および前記活性化因子と接触させた前記試料の一部に前記活性化因子と接触させなかった前記試料の一部と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける前記活性化因子の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
前記シグナル伝達経路が前記活性化因子に超感受性であり、前記シグナル伝達経路が前記対象の癌細胞において異常に活性であることがわかる場合、または前記活性化因子の前記出力値が所定のカットオフ値より大きい場合、前記活性化因子が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を前記対象に投与することと
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記活性化因子の高い方の濃度がＥＣ９０であり、前記活性化因子の低い方の濃度がＥＣ１０である、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＥＣ９０：ＥＣ１０比が８１未満であることが、前記シグナル伝達経路が前記活性化因子に超感受性であることを示す、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ヒルの式を用いてヒル係数を求め、前記活性化因子に対する前記シグナル伝達経路の感受性を求める、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２２】
ヒル係数の値が１より大きいことが、前記シグナル伝達経路が前記活性化因子に超感受性であることを示す、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記シグナル伝達経路が、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＮｏｔｃｈからなる群より選択される、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記シグナル伝達経路が、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、Ｍｅｒ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｔｃｈ、ＭＡＰＫ、ＲＯＮ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、Ｍｏｓ、Ｅｒｋ、ＭＬＫ、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ｐ３８、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＨ３、カスパーゼ、ｐ５３、ＮＩＫ、ＮＦｋＢ、ＲＯＣＫ、ＸＩＡＰ、ＭＯＭＰ、ＩＬＫ、ＰＤＫ、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦＲ、ｍＴＯＲ、Ｊａｋ、ＰＩＫＫ、４Ｅ−ＢＰ１、Ｒａｐｔｏｒ、ＫＭＴ、ＭＬＬ、ＫＤＭ、ＵＴＸ、ＤＯＴ１Ｌ、ＢＲＤ、ＴＥＴ、ＳｉｒＴ１、Ｈａｔ、ＳＮＦ、ＤＮＭＴ、ＥＺＨ、ＡＭＰＫ、ＰＬＣ、ＣａＭＫＫ、グルコース輸送体、ＰＦＫ、ＦＡＳ、クレブス回路、解糖、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤ、ＴＲＡＦ、ＴＡＢ、ＮＥＭＯ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｋＢ、ＩＬ１Ｒ、ＩＲＡＫ、Ｍｙｄ８８、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＰｓ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＰＡＲＰ、ラミン、ＺＮＲＦ、ＷｎｔＲ、ＰＡＲ、ＧＳＫ、Ｄｓｈ、ＬＧＲ、カテニン、ＷＴＸ、ＡＰＣ、Ｓｒｃ、ＣＢＰ、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｆｕｒｉｎ、Ｄｅｌｔａ  Ｊａｇｇｅｄ、ＮＩＣ、プレセニリン、ＣＤＯ、ＢＯＣ、Ｇｌｉ、ＫＩＦ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＳＡＲＡ、Ｓｍａｄ、Ｓｍｕｒｆ、ＮＬＫ、ｐ２８、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＬＩＭＫ、コフィリン、ＣＤ４４、ＦＡＴ、ＫＩＢＲＡ、ＦＲＭＤ、Ｍｓｔ、ＹＡＰ、ＬＡＴＳ、ＭＯＢ、ＳＡＶ、ＴＥＡＤ、Ｍｅｒ、ＳＡＢ、ＴＡＺ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＰＡＫ、ＣＲＥＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＶＥＧＦ受容体、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスからなる群より選択される、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記シグナル伝達経路がＨＥＲファミリーシグナル伝達経路である、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路がＨＥＲ２シグナル伝達経路である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記活性化因子が、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せである、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの標的化治療剤が、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、ＭＥＤＩ４２７６、ＯＮＴ−３８０、ネラチニブ、アファチニブ、デュリゴツズマブ、ダコミチニブ、サピチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＭＭ−１１１  ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ７１６、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ルムレツズマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＡＶ−２０３、ＡＺＤ５３６３、アフレセルチブ、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ、リダホロリムス、テムシロリムス、セレメチニブ（Ｓｅｌｅｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ、ＧＤＣ−０９９４、タセリシブ、アルペリシブ、ブパルリシブ、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、オシメルチニブ、ロシレチニブ、ＡＺＤ５３６３、ＳＧＸ−５２３、オナルツズマブ、カボザンチニブ、ボリチニブ、チバンチニブ、カプマチニブ、エミベツズマブ、リロツムマブ、フィクラツズマブ、ＳＡＲ１２５８４４、エミベツズマブ、Ｓｙｍ０１５、ＡＭＧ３３７、ＪＮＪ−６１１８６３７２、グレサチニブ、１２０２、ＬＹ３０２３４１４、ジェダトリシブ、ＪＩ−１０１、ポナチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、アレクチニブ、ＢＧＪ３９８、リンシチニブ、キザルチニブ、Ｒ４２８（ＢＧＢ３２４）、ギルテリチニブ、ビスモデギブ、イトラコナゾール、５Ｅ１、ＬＧＫ９７４、セマガセスタット、コビメチニブ、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ダロツズマブ、ＭＥＤＩ−５７３、ガニツマブ、ソニデジブ、バンチクツマブ、イパフリセプト、タレクスツマブ、ブロンチクツズマブ、ＳＢ４３１５４２、ＥＷ−７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、アブラキサン、ブレンツキシマブベドトン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｏｎ）、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ビカルタミド、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、ロミデプシン、カブラジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、ニロチニブ、テモゾロミド、ボルテゾミブ、アザシチジン、テポチニブ、ロルラチニブ、メレスチニブ、ＲＧ６１１４、ツカンチニブ（ｔｕｃａｎｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣体、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、イキサベピロン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イルブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニブ、トラメチニブ、アキシチ��ブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される、請求項１７〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する、請求項１７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
前記対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
前記試料と、各三つ組が、第一の薬剤である標的化治療剤と、前記標的化治療剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている少なくとも２つの第二の薬剤である活性化因子とからなる少なくとも１つの薬剤の三つ組とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定される前記シグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料を作製することと、
前記少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた前記試料中の前記生存癌細胞の細胞接着または付着を、前記対象から採取し前記第一の薬剤である標的化治療剤または前記第二の薬剤である活性化因子のそれぞれのみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
前記薬剤の三つ組と接触させた前記試料に前記第一の薬剤である標的化治療剤または前記第二の薬剤である活性化因子のみと接触させた前記試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける前記少なくとも１つの薬剤の三つ組の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
前記出力値が、前記標的化治療剤が対象の癌細胞の前記細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す所定のカットオフ値より大きい場合、前記薬剤の三つ組の前記第一の薬剤である標的化治療剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を前記対象に投与することと
を含む方法によって前記対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３４】
前記シグナル伝達経路が、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＮｏｔｃｈからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記シグナル伝達経路が、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、Ｍｅｒ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｔｃｈ、ＭＡＰＫ、ＲＯＮ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、Ｍｏｓ、Ｅｒｋ、ＭＬＫ、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ｐ３８、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＨ３、カスパーゼ、ｐ５３、ＮＩＫ、ＮＦｋＢ、ＲＯＣＫ、ＸＩＡＰ、ＭＯＭＰ、ＩＬＫ、ＰＤＫ、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦＲ、ｍＴＯＲ、Ｊａｋ、ＰＩＫＫ、４Ｅ−ＢＰ１、Ｒａｐｔｏｒ、ＫＭＴ、ＭＬＬ、ＫＤＭ、ＵＴＸ、ＤＯＴ１Ｌ、ＢＲＤ、ＴＥＴ、ＳｉｒＴ１、Ｈａｔ、ＳＮＦ、ＤＮＭＴ、ＥＺＨ、ＡＭＰＫ、ＰＬＣ、ＣａＭＫＫ、グルコース輸送体、ＰＦＫ、ＦＡＳ、クレブス回路、解糖、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤ、ＴＲＡＦ、ＴＡＢ、ＮＥＭＯ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｋＢ、ＩＬ１Ｒ、ＩＲＡＫ、Ｍｙｄ８８、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＰｓ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＰＡＲＰ、ラミン、ＺＮＲＦ、ＷｎｔＲ、ＰＡＲ、ＧＳＫ、Ｄｓｈ、ＬＧＲ、カテニン、ＷＴＸ、ＡＰＣ、Ｓｒｃ、ＣＢＰ、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｆｕｒｉｎ、Ｄｅｌｔａ  Ｊａｇｇｅｄ、ＮＩＣ、プレセニリン、ＣＤＯ、ＢＯＣ、Ｇｌｉ、ＫＩＦ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＳＡＲＡ、Ｓｍａｄ、Ｓｍｕｒｆ、ＮＬＫ、ｐ２８、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＬＩＭＫ、コフィリン、ＣＤ４４、ＦＡＴ、ＫＩＢＲＡ、ＦＲＭＤ、Ｍｓｔ、ＹＡＰ、ＬＡＴＳ、ＭＯＢ、ＳＡＶ、ＴＥＡＤ、Ｍｅｒ、ＳＡＢ、ＴＡＺ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＰＡＫ、ＣＲＥＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＶＥＧＦ受容体、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスからなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記シグナル伝達経路がＨＥＲファミリーシグナル伝達経路である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記第一の薬剤である標的化治療剤が、前記第一の薬剤である標的化治療剤の影響を受ける前記シグナル伝達経路が前記対象の癌細胞において活性であることを示す５０％超の出力値パーセントを有することが明らかになっている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
三つ組それぞれの前記第二の薬剤である活性化因子が、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せである、請求項３３〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する、請求項３３〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される、請求項３３〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する、請求項３３〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象に投与する前記標的化治療剤が、前記第一の薬剤である標的化治療剤である、請求項３３〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象に投与する前記標的化治療剤が、前記第一の薬剤である標的化治療剤とは異なるものであるが、前記第一の薬剤である標的化治療剤と同じシグナル伝達経路を標的とする、請求項３３〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
前記対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
前記試料と、（ｉ）シグナル伝達経路に影響を及ぼし、活性化結合部位を有する、第一の薬剤である活性化因子および（ｉｉ）前記活性化因子と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼすが、前記活性化結合部位の下流、上流または側方にある結合部位で影響を及ぼす、第二の薬剤である標的化治療剤とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定される前記シグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、前記第一の薬剤および前記第二の薬剤と接触させた試料を作製することと、
前記第一の薬剤および前記第二の薬剤と接触させた前記試料中の前記生存癌細胞の細胞接着または付着を、前記対象から採取し前記第一の薬剤または前記第二の薬剤のみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
前記第一の薬剤および前記第二の薬剤の両方と接触させた前記試料に前記第一の薬剤または前記第二の薬剤のみと接触させた前記試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
前記第二の薬剤である標的化治療剤が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を前記対象に投与し、前記細胞の接着または付着の変化を特徴付ける前記出力値が、前記シグナル伝達経路が前記対象の癌細胞において活性であることを示すカットオフ値以上であることと
を含む方法によって前記対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４６】
前記シグナル伝達経路が、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、Ｍｅｒ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｔｃｈ、ＭＡＰＫ、ＲＯＮ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、Ｍｏｓ、Ｅｒｋ、ＭＬＫ、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ｐ３８、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＨ３、カスパーゼ、ｐ５３、ＮＩＫ、ＮＦｋＢ、ＲＯＣＫ、ＸＩＡＰ、ＭＯＭＰ、ＩＬＫ、ＰＤＫ、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦＲ、ｍＴＯＲ、Ｊａｋ、ＰＩＫＫ、４Ｅ−ＢＰ１、Ｒａｐｔｏｒ、ＫＭＴ、ＭＬＬ、ＫＤＭ、ＵＴＸ、ＤＯＴ１Ｌ、ＢＲＤ、ＴＥＴ、ＳｉｒＴ１、Ｈａｔ、ＳＮＦ、ＤＮＭＴ、ＥＺＨ、ＡＭＰＫ、ＰＬＣ、ＣａＭＫＫ、グルコース輸送体、ＰＦＫ、ＦＡＳ、クレブス回路、解糖、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤ、ＴＲＡＦ、ＴＡＢ、ＮＥＭＯ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｋＢ、ＩＬ１Ｒ、ＩＲＡＫ、Ｍｙｄ８８、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＰｓ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＰＡＲＰ、ラミン、ＺＮＲＦ、ＷｎｔＲ、ＰＡＲ、ＧＳＫ、Ｄｓｈ、ＬＧＲ、カテニン、ＷＴＸ、ＡＰＣ、Ｓｒｃ、ＣＢＰ、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｆｕｒｉｎ、Ｄｅｌｔａ  Ｊａｇｇｅｄ、ＮＩＣ、プレセニリン、ＣＤＯ、ＢＯＣ、Ｇｌｉ、ＫＩＦ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＳＡＲＡ、Ｓｍａｄ、Ｓｍｕｒｆ、ＮＬＫ、ｐ２８、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＬＩＭＫ、コフィリン、ＣＤ４４、ＦＡＴ、ＫＩＢＲＡ、ＦＲＭＤ、Ｍｓｔ、ＹＡＰ、ＬＡＴＳ、ＭＯＢ、ＳＡＶ、ＴＥＡＤ、Ｍｅｒ、ＳＡＢ、ＴＡＺ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＰＡＫ、ＣＲＥＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＶＥＧＦ受容体、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスからなる群より選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記第一の薬剤である活性化因子が、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せである、請求項４５または４６に記載の方法。
【請求項４８】
インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される、請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する、請求項４５〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象に投与する前記少なくとも１つの標的化治療剤が、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、ＭＥＤＩ４２７６、ＯＮＴ−３８０、ネラチニブ、アファチニブ、デュリゴツズマブ、ダコミチニブ、サピチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＭＭ−１１１  ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ７１６、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ルムレツズマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＡＶ−２０３、ＡＺＤ５３６３、アフレセルチブ、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ、リダホロリムス、テムシロリムス、セレメチニブ（Ｓｅｌｅｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ、ＧＤＣ−０９９４、タセリシブ、アルペリシブ、ブパルリシブ、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、オシメルチニブ、ロシレチニブ、ＡＺＤ５３６３、ＳＧＸ−５２３、オナルツズマブ、カボザンチニブ、ボリチニブ、チバンチニブ、カプマチニブ、エミベツズマブ、リロツムマブ、フィクラツズマブ、ＳＡＲ１２５８４４、エミベツズマブ、Ｓｙｍ０１５、ＡＭＧ３３７、ＪＮＪ−６１１８６３７２、グレサチニブ、１２０２、ＬＹ３０２３４１４、ジェダトリシブ、ＪＩ−１０１、ポナチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、アレクチニブ、ＢＧＪ３９８、リンシチニブ、キザルチニブ、Ｒ４２８（ＢＧＢ３２４）、ギルテリチニブ、ビスモデギブ、イトラコナゾール、５Ｅ１、ＬＧＫ９７４、セマガセスタット、コビメチニブ、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ダロツズマブ、ＭＥＤＩ−５７３、ガニツマブ、ソニデジブ、バンチクツマブ、イパフリセプト、タレクスツマブ、ブロンチクツズマブ、ＳＢ４３１５４２、ＥＷ−７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、アブラキサン、ブレンツキシマブベドトン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｏｎ）、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ビカルタミド、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、ロミデプシン、カブラジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、ニロチニブ、テモゾロミド、ボルテゾミブ、アザシチジン、テポチニブ、ロルラチニブ、メレスチニブ、ＲＧ６１１４、ツカンチニブ（ｔｕｃａｎｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣体、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、イキサベピロン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イルブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニブ、トラ��チニブ、アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項４５〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記対象に投与する前記標的化治療剤が、前記第二の薬剤である標的化治療剤である、請求項４５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象に投与する前記標的化治療剤が、前記第二の薬剤である標的化治療剤とは異なるものであるが、前記第二の薬剤と同じシグナル伝達経路を標的とする、請求項４５〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
前記対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
前記試料と、（ｉ）シグナル伝達経路に影響を及ぼし、それぞれが活性化結合部位を有する、２つ以上の第一の薬剤である活性化因子および（ｉｉ）前記２つ以上の第一の薬剤である活性化因子と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼすが、前記活性化因子の前記活性化結合部位の下流、上流または側方にある結合部位で影響を及ぼす、第二の薬剤である標的化治療剤とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定される前記シグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、前記第一の薬剤および前記第二の薬剤と接触させた試料を作製することと、
前記第一の薬剤および前記第二の薬剤と接触させた前記試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、前記対象から採取し前記第一の薬剤または前記第二の薬剤のみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
前記第一の薬剤および前記第二の薬剤の両方と接触させた前記試料に前記第一の薬剤または前記第二の薬剤のみと接触させた前記試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
前記第二の薬剤である標的化治療剤が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を前記対象に投与し、前記細胞の接着または付着の変化を特徴付ける前記出力値が、前記シグナル伝達経路が前記対象の癌細胞において活性であることを示すカットオフ値以上であることと
を含む方法によって前記対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法。
【請求項５６】
前記シグナル伝達経路が、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、Ｍｅｒ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｔｃｈ、ＭＡＰＫ、ＲＯＮ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、Ｍｏｓ、Ｅｒｋ、ＭＬＫ、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ｐ３８、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＨ３、カスパーゼ、ｐ５３、ＮＩＫ、ＮＦｋＢ、ＲＯＣＫ、ＸＩＡＰ、ＭＯＭＰ、ＩＬＫ、ＰＤＫ、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦＲ、ｍＴＯＲ、Ｊａｋ、ＰＩＫＫ、４Ｅ−ＢＰ１、Ｒａｐｔｏｒ、ＫＭＴ、ＭＬＬ、ＫＤＭ、ＵＴＸ、ＤＯＴ１Ｌ、ＢＲＤ、ＴＥＴ、ＳｉｒＴ１、Ｈａｔ、ＳＮＦ、ＤＮＭＴ、ＥＺＨ、ＡＭＰＫ、ＰＬＣ、ＣａＭＫＫ、グルコース輸送体、ＰＦＫ、ＦＡＳ、クレブス回路、解糖、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤ、ＴＲＡＦ、ＴＡＢ、ＮＥＭＯ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｋＢ、ＩＬ１Ｒ、ＩＲＡＫ、Ｍｙｄ８８、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＰｓ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＰＡＲＰ、ラミン、ＺＮＲＦ、ＷｎｔＲ、ＰＡＲ、ＧＳＫ、Ｄｓｈ、ＬＧＲ、カテニン、ＷＴＸ、ＡＰＣ、Ｓｒｃ、ＣＢＰ、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｆｕｒｉｎ、Ｄｅｌｔａ  Ｊａｇｇｅｄ、ＮＩＣ、プレセニリン、ＣＤＯ、ＢＯＣ、Ｇｌｉ、ＫＩＦ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＳＡＲＡ、Ｓｍａｄ、Ｓｍｕｒｆ、ＮＬＫ、ｐ２８、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＬＩＭＫ、コフィリン、ＣＤ４４、ＦＡＴ、ＫＩＢＲＡ、ＦＲＭＤ、Ｍｓｔ、ＹＡＰ、ＬＡＴＳ、ＭＯＢ、ＳＡＶ、ＴＥＡＤ、Ｍｅｒ、ＳＡＢ、ＴＡＺ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＰＡＫ、ＣＲＥＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＶＥＧＦ受容体、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスからなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記第一の薬剤である活性化因子が、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せである、請求項５５または５６に記載の方法。
【請求項５８】
インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する、請求項５５〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される、請求項５５〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する、請求項５５〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記対象に投与する前記少なくとも１つの標的化治療剤が、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、ＭＥＤＩ４２７６、ＯＮＴ−３８０、ネラチニブ、アファチニブ、デュリゴツズマブ、ダコミチニブ、サピチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＭＭ−１１１  ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ７１６、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ルムレツズマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＡＶ−２０３、ＡＺＤ５３６３、アフレセルチブ、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ、リダホロリムス、テムシロリムス、セレメチニブ（Ｓｅｌｅｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ、ＧＤＣ−０９９４、タセリシブ、アルペリシブ、ブパルリシブ、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、オシメルチニブ、ロシレチニブ、ＡＺＤ５３６３、ＳＧＸ−５２３、オナルツズマブ、カボザンチニブ、ボリチニブ、チバンチニブ、カプマチニブ、エミベツズマブ、リロツムマブ、フィクラツズマブ、ＳＡＲ１２５８４４、エミベツズマブ、Ｓｙｍ０１５、ＡＭＧ３３７、ＪＮＪ−６１１８６３７２、グレサチニブ、１２０２、ＬＹ３０２３４１４、ジェダトリシブ、ＪＩ−１０１、ポナチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、アレクチニブ、ＢＧＪ３９８、リンシチニブ、キザルチニブ、Ｒ４２８（ＢＧＢ３２４）、ギルテリチニブ、ビスモデギブ、イトラコナゾール、５Ｅ１、ＬＧＫ９７４、セマガセスタット、コビメチニブ、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ダロツズマブ、ＭＥＤＩ−５７３、ガニツマブ、ソニデジブ、バンチクツマブ、イパフリセプト、タレクスツマブ、ブロンチクツズマブ、ＳＢ４３１５４２、ＥＷ−７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、アブラキサン、ブレンツキシマブベドトン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｏｎ）、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ビカルタミド、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、ロミデプシン、カブラジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、ニロチニブ、テモゾロミド、ボルテゾミブ、アザシチジン、テポチニブ、ロルラチニブ、メレスチニブ、ＲＧ６１１４、ツカンチニブ（ｔｕｃａｎｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣体、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、イキサベピロン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イルブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニブ、トラ��チニブ、アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項５５〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記対象に投与する前記標的化治療剤が、前記第二の薬剤である標的化治療剤である、請求項５５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象に投与する前記標的化治療剤が、前記第二の薬剤である標的化治療剤とは異なるものであるが、前記第二の薬剤と同じシグナル伝達経路を標的とする、請求項５５〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
前記対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
前記試料を、少なくとも２組の薬剤対であって、各組が、少なくとも１つの標的化治療剤である第一の薬剤と、前記第一の薬剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている少なくとも１つの活性化因子である第二の薬剤とからなり、薬剤対の組がそれぞれ異なるシグナル伝達経路に影響を及ぼす薬剤対と同時に接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定される前記シグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも２組の薬剤対と接触させた試料を作製することと、
薬剤対の各組と接触させた前記試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、前記対象から採取し前記第一の薬剤のそれぞれまたは前記第二の薬剤のそれぞれのみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
前記薬剤対の組と接触させた前記試料に前記第一の薬剤または前記第二の薬剤のみと接触させた前記試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける各組の薬剤対の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
全被験組のうち出力値が最も高いことが明らかになった前記薬剤対の組の前記第一の薬剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を前記対象に投与し、投与した前記標的化治療剤が、前記対象の癌細胞の前記細胞シグナル伝達経路において、出力値がこれより低い前記薬剤対の組（１つまたは複数）の前記標的化治療剤（１つまたは複数）より高い治療活性があることを示すことと
を含む方法によって前記対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法。
【請求項６６】
前記シグナル伝達経路が、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、Ｍｅｒ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｔｃｈ、ＭＡＰＫ、ＲＯＮ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、Ｍｏｓ、Ｅｒｋ、ＭＬＫ、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ｐ３８、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＨ３、カスパーゼ、ｐ５３、ＮＩＫ、ＮＦｋＢ、ＲＯＣＫ、ＸＩＡＰ、ＭＯＭＰ、ＩＬＫ、ＰＤＫ、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦＲ、ｍＴＯＲ、Ｊａｋ、ＰＩＫＫ、４Ｅ−ＢＰ１、Ｒａｐｔｏｒ、ＫＭＴ、ＭＬＬ、ＫＤＭ、ＵＴＸ、ＤＯＴ１Ｌ、ＢＲＤ、ＴＥＴ、ＳｉｒＴ１、Ｈａｔ、ＳＮＦ、ＤＮＭＴ、ＥＺＨ、ＡＭＰＫ、ＰＬＣ、ＣａＭＫＫ、グルコース輸送体、ＰＦＫ、ＦＡＳ、クレブス回路、解糖、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤ、ＴＲＡＦ、ＴＡＢ、ＮＥＭＯ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｋＢ、ＩＬ１Ｒ、ＩＲＡＫ、Ｍｙｄ８８、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＰｓ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＰＡＲＰ、ラミン、ＺＮＲＦ、ＷｎｔＲ、ＰＡＲ、ＧＳＫ、Ｄｓｈ、ＬＧＲ、カテニン、ＷＴＸ、ＡＰＣ、Ｓｒｃ、ＣＢＰ、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｆｕｒｉｎ、Ｄｅｌｔａ  Ｊａｇｇｅｄ、ＮＩＣ、プレセニリン、ＣＤＯ、ＢＯＣ、Ｇｌｉ、ＫＩＦ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＳＡＲＡ、Ｓｍａｄ、Ｓｍｕｒｆ、ＮＬＫ、ｐ２８、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＬＩＭＫ、コフィリン、ＣＤ４４、ＦＡＴ、ＫＩＢＲＡ、ＦＲＭＤ、Ｍｓｔ、ＹＡＰ、ＬＡＴＳ、ＭＯＢ、ＳＡＶ、ＴＥＡＤ、Ｍｅｒ、ＳＡＢ、ＴＡＺ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＰＡＫ、ＣＲＥＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＶＥＧＦ受容体、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスからなる群より選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記第二の薬剤である活性化因子が、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せである、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
少なくとも１組の薬剤対が、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼし、少なくとも１組の薬剤対が、前記ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路以外のシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
少なくとも１組の薬剤対が、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼし、少なくとも１組の薬剤対が、前記ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
少なくとも１組の薬剤対が、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼし、少なくとも１組の薬剤対が、前記エストロゲン受容体（ＥＲ）シグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
少なくとも１組の薬剤対が、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼし、少なくとも１組の薬剤対が、前記ＦＧＦＲシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
少なくとも１組の薬剤対が、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼし、少なくとも１組の薬剤対が、前記ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
少なくとも１組の薬剤対が、前記エストロゲン受容体（ＥＲ）シグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼし、少なくとも１組の薬剤対が、前記ＥＲシグナル伝達経路以外のシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす、請求項６５〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
少なくとも１組の薬剤対が、前記ＥＲシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼし、少なくとも１組の薬剤対が、前記ＩＧＦＲシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する、請求項６５〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される、請求項６５〜７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する、請求項６５〜７６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記対象に投与する前記少なくとも１つの標的化治療剤が、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、ＭＥＤＩ４２７６、ＯＮＴ−３８０、ネラチニブ、アファチニブ、デュリゴツズマブ、ダコミチニブ、サピチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＭＭ−１１１  ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ７１６、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ルムレツズマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＡＶ−２０３、ＡＺＤ５３６３、アフレセルチブ、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ、リダホロリムス、テムシロリムス、セレメチニブ（Ｓｅｌｅｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ、ＧＤＣ−０９９４、タセリシブ、アルペリシブ、ブパルリシブ、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、オシメルチニブ、ロシレチニブ、ＡＺＤ５３６３、ＳＧＸ−５２３、オナルツズマブ、カボザンチニブ、ボリチニブ、チバンチニブ、カプマチニブ、エミベツズマブ、リロツムマブ、フィクラツズマブ、ＳＡＲ１２５８４４、エミベツズマブ、Ｓｙｍ０１５、ＡＭＧ３３７、ＪＮＪ−６１１８６３７２、グレサチニブ、１２０２、ＬＹ３０２３４１４、ジェダトリシブ、ＪＩ−１０１、ポナチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、アレクチニブ、ＢＧＪ３９８、リンシチニブ、キザルチニブ、Ｒ４２８（ＢＧＢ３２４）、ギルテリチニブ、ビスモデギブ、イトラコナゾール、５Ｅ１、ＬＧＫ９７４、セマガセスタット、コビメチニブ、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ダロツズマブ、ＭＥＤＩ−５７３、ガニツマブ、ソニデジブ、バンチクツマブ、イパフリセプト、タレクスツマブ、ブロンチクツズマブ、ＳＢ４３１５４２、ＥＷ−７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、アブラキサン、ブレンツキシマブベドトン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｏｎ）、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ビカルタミド、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、ロミデプシン、カブラジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、ニロチニブ、テモゾロミド、ボルテゾミブ、アザシチジン、テポチニブ、ロルラチニブ、メレスチニブ、ＲＧ６１１４、ツカンチニブ（ｔｕｃａｎｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣体、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、イキサベピロン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イルブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニブ、トラ��チニブ、アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項６５〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記対象に投与する前記標的化治療剤が、前記第一の薬剤である標的化治療剤である、請求項６５〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記対象に投与する前記標的化治療剤が、前記第一の薬剤である標的化治療剤とは異なるものであるが、前記第一の薬剤と同じシグナル伝達経路を標的とする、請求項６５〜７９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
前記対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
前記試料を、各三つ組が、第一の薬剤である標的化治療剤と、前記第一の薬剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている第二の薬剤である活性化因子と、前記第一の薬剤とは異なるシグナル伝達経路または前記第一の薬剤が影響を及ぼす前記シグナル伝達経路内にある異なる部位に影響を及ぼす第三の薬剤である標的化治療剤とからなる少なくとも１つの薬剤の三つ組と同時に接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定され、前記第一の薬剤が影響を及ぼす前記シグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料を作製することと、
前記少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた前記試料中の前記生存癌細胞の細胞接着または付着を、前記対象から採取し前記第一の薬剤である標的化治療剤のみ、前記第二の薬剤である活性化因子のみまたは前記第三の薬剤である標的化治療剤のみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
前記薬剤の三つ組と接触させた前記試料に前記第一の薬剤である標的化治療剤のみ、前記第二の薬剤である活性化因子のみまたは前記第三の薬剤である標的化治療剤のみと接触させた前記試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける前記少なくとも１つの薬剤の三つ組の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
前記出力値が、前記第一の薬剤である標的化治療剤が前記対象の癌細胞の前記細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す所定のカットオフ値より大きい場合、前記薬剤の三つ組の前記第一の薬剤である標的化治療剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を前記対象に投与することと
を含む方法によって前記対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項８３】
前記第一の薬剤または前記第三の薬剤の影響を受ける前記シグナル伝達経路が、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、Ｍｅｒ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｔｃｈ、ＭＡＰＫ、ＲＯＮ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、Ｍｏｓ、Ｅｒｋ、ＭＬＫ、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ｐ３８、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＨ３、カスパーゼ、ｐ５３、ＮＩＫ、ＮＦｋＢ、ＲＯＣＫ、ＸＩＡＰ、ＭＯＭＰ、ＩＬＫ、ＰＤＫ、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦＲ、ｍＴＯＲ、Ｊａｋ、ＰＩＫＫ、４Ｅ−ＢＰ１、Ｒａｐｔｏｒ、ＫＭＴ、ＭＬＬ、ＫＤＭ、ＵＴＸ、ＤＯＴ１Ｌ、ＢＲＤ、ＴＥＴ、ＳｉｒＴ１、Ｈａｔ、ＳＮＦ、ＤＮＭＴ、ＥＺＨ、ＡＭＰＫ、ＰＬＣ、ＣａＭＫＫ、グルコース輸送体、ＰＦＫ、ＦＡＳ、クレブス回路、解糖、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤ、ＴＲＡＦ、ＴＡＢ、ＮＥＭＯ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｋＢ、ＩＬ１Ｒ、ＩＲＡＫ、Ｍｙｄ８８、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＰｓ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＰＡＲＰ、ラミン、ＺＮＲＦ、ＷｎｔＲ、ＰＡＲ、ＧＳＫ、Ｄｓｈ、ＬＧＲ、カテニン、ＷＴＸ、ＡＰＣ、Ｓｒｃ、ＣＢＰ、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｆｕｒｉｎ、Ｄｅｌｔａ  Ｊａｇｇｅｄ、ＮＩＣ、プレセニリン、ＣＤＯ、ＢＯＣ、Ｇｌｉ、ＫＩＦ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＳＡＲＡ、Ｓｍａｄ、Ｓｍｕｒｆ、ＮＬＫ、ｐ２８、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＬＩＭＫ、コフィリン、ＣＤ４４、ＦＡＴ、ＫＩＢＲＡ、ＦＲＭＤ、Ｍｓｔ、ＹＡＰ、ＬＡＴＳ、ＭＯＢ、ＳＡＶ、ＴＥＡＤ、Ｍｅｒ、ＳＡＢ、ＴＡＺ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＰＡＫ、ＣＲＥＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＶＥＧＦ受容体、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスからなる群より選択される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記第二の薬剤である活性化因子が、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せからなる群より選択される、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する、請求項８２〜８４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８６】
前記癌が、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される、請求項８２〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する、請求項８２〜８６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
前記生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記対象に投与する前記少なくとも１つの標的化治療剤が、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、ＭＥＤＩ４２７６、ＯＮＴ−３８０、ネラチニブ、アファチニブ、デュリゴツズマブ、ダコミチニブ、サピチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＭＭ−１１１  ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ７１６、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ルムレツズマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＡＶ−２０３、ＡＺＤ５３６３、アフレセルチブ、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ、リダホロリムス、テムシロリムス、セレメチニブ（Ｓｅｌｅｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ、ＧＤＣ−０９９４、タセリシブ、アルペリシブ、ブパルリシブ、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、オシメルチニブ、ロシレチニブ、ＡＺＤ５３６３、ＳＧＸ−５２３、オナルツズマブ、カボザンチニブ、ボリチニブ、チバンチニブ、カプマチニブ、エミベツズマブ、リロツムマブ、フィクラツズマブ、ＳＡＲ１２５８４４、エミベツズマブ、Ｓｙｍ０１５、ＡＭＧ３３７、ＪＮＪ−６１１８６３７２、グレサチニブ、１２０２、ＬＹ３０２３４１４、ジェダトリシブ、ＪＩ−１０１、ポナチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、アレクチニブ、ＢＧＪ３９８、リンシチニブ、キザルチニブ、Ｒ４２８（ＢＧＢ３２４）、ギルテリチニブ、ビスモデギブ、イトラコナゾール、５Ｅ１、ＬＧＫ９７４、セマガセスタット、コビメチニブ、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ダロツズマブ、ＭＥＤＩ−５７３、ガニツマブ、ソニデジブ、バンチクツマブ、イパフリセプト、タレクスツマブ、ブロンチクツズマブ、ＳＢ４３１５４２、ＥＷ−７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、アブラキサン、ブレンツキシマブベドトン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｏｎ）、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ビカルタミド、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、ロミデプシン、カブラジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、ニロチニブ、テモゾロミド、ボルテゾミブ、アザシチジン、テポチニブ、ロルラチニブ、メレスチニブ、ＲＧ６１１４、ツカンチニブ（ｔｕｃａｎｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣体、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、イキサベピロン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イルブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニブ、トラ��チニブ、アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブおよびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項８２〜８８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記対象に投与する前記少なくとも１つの標的化治療剤が、前記第一の薬剤である標的化治療剤、前記第三の薬剤である標的化治療剤または前記第一の薬剤である標的化治療剤および前記第三の薬剤である標的化治療剤の両方である、請求項８２〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９１】
前記対象に投与する前記少なくとも１つの標的化治療剤が、前記第一の薬剤である標的化治療剤および／または前記第三の薬剤である標的化治療剤とは異なるものであるが、前記第一の薬剤である標的化治療剤または前記第三の薬剤である標的化治療剤と同じシグナル伝達経路を標的とする、請求項８２〜８９のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１７年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／４７３，９３６号および２０１７年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／５８７，５７２号の優先日の利益を主張するものであり、上記出願はそれぞれ、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
癌は重大な医学的問題の１つであり、米国の男女の約４０％にのぼる者が生涯のある時点で癌であると診断されるものと推定されている。様々な種類の癌に対して様々な治療選択肢を用いることができるが、いかなる治療でも必ずしも患者が応答するわけではないのは極めて明らかである。患者にある治療を実施し、それが治療上有益ではないことがわかれば、それはいくつかの理由で有害であると言える。例えば、患者がその治療による有害な副作用に曝される可能性があると同時に、何ら治療利益を享受しない。さらに、患者が治療上の有益性が高いと思われる代替治療を受けるのが遅れる。さらには、医療コストへの懸念が高まり、効果のない治療が経済的負担となる。このため、患者に治療を実施する前に、特定の治療が特定の患者に対して有益である可能性を評価し正確に予測できるかどうかに大きな関心がもたれている。このような関心から、各患者がその疾患に合わせた治療レジメンを受けることが可能となる個別化医療（精密医療または層別化医療とも呼ぶ）を中心とする一大事業分野が生まれた。しかし、この理想的な方法は、現在用いられている予後判定手段に大きな欠点があることを主な理由に未だ妥当性が認められていない。
【０００３】
これまでに、多種多様な癌を含めた多数の様々な種類の疾患に関して広範囲にわたるデータが収集され解析されてきた。この過程で、少なくとも２つの重要な事実が明らかになってきた。第一に、乳癌のような「疾患」は、乳癌の遺伝子構成およびタンパク質発現レベルが個体間で全く異なり得ることを１つの理由に不均質であることが明らかにされており、このことが、治療剤に対する応答の指標となる可能性のある遺伝子およびタンパク質の「バイオマーカー」の特定につながった。第二に、その一方で、現在の主要な遺伝子バイオマーカーおよびタンパク質バイオマーカーの検出はほとんどの場合、治療応答を予測するうえでの価値が極めて低いことがわかっている。
【０００４】
例えば、患者には個体差があり、複数の治療法を用いても正の応答を引き出すことができないことが繰り返されるという認識に対する１つの対応として、コンパニオン診断が開発された。このタイプの診断試験は、現在のバイオマーカー検出手段を用いて特定の薬物に応答する可能性の高い患者を特定するべく考案されたものである。この試験では、特定の遺伝子の遺伝子数増加、遺伝子変異または発現レベルの変化を探索する。例えば、多くの癌は現在、疾患に関連する特異的遺伝子変異または過剰発現受容体タンパク質の有無を判定する試験を用いて診断する。しかし、ほとんどのバイオマーカー試験では、疾患およびその根本原因に関して間接的で推論的な情報が得られるに過ぎない。このため、これらの試験のほとんどは、有意な治療応答の予測に成功する割合が５０％をはるかに下回ることが多い。
【０００５】
単に患者細胞によって特定の遺伝子バイオマーカーまたはタンパク質バイオマーカーの発現を検出しても治療応答性を予測するうえで効果の高い予測因子とはならないというこの観察結果から、治療的な治療レジメンを選択するのにさらに効果的な手段が必要であることがわかる。特に、医師には現在、特定の患者細胞が機能する、さらに適切に言えば機能障害を起こす仕組み、ひいてはそれらが疾患の治療に用い得る多数の治療剤のうちの１つに応答する仕組みに関する知識が不足している。特定の患者に異常な遺伝子が存在するのはわかるが、それが疾患過程に影響を及ぼす仕組みについてはわからないことがある。ある薬物が作用する「はずである」仕組みについては具体的にわかっているが、特定の患者がその薬物活性に対して非応答性または耐性であり得る理由についてはわからないことがある。したがって、患者には、特定の疾患の原因を機能レベルで詳細に特定し、効果的な治療過程について情報に基づいたより良い決定を下す必要がある。
【０００６】
特定の患者の細胞が機能する、または機能障害を起こす仕組みに取り組むべく実施されてきた１つの方法は、シグナル伝達経路の活性またはその欠如を示す細胞接着などの生理応答パラメータの変化を評価することにより、患者の細胞のシグナル伝達経路の活性を検討することであった。この方法によって、検討するシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす標的化治療剤の効果を正確に予測することが可能になった（国際公開第２０１３／１８８５００号に記載されている）。
【０００７】
個体に対する治療剤、特に標的化治療剤の効果の予後を代替的により良く示す指標を提供することが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、１つまたは複数の標的化治療剤で患者を治療する方法であって、１つまたは複数の標的化治療剤の選択が、患者の細胞の１つまたは複数のシグナル伝達経路の機能的活性に関して詳細な情報が得られ、それにより患者の治療に最も適した標的化治療剤（１つまたは複数）の選択が改善される方法を用いるものである、方法を提供する。
【０００９】
本発明の一態様では、癌患者の治療に標的化治療剤を選択するのに用いる方法は、患者の癌細胞の複数（２つ以上）のシグナル伝達経路の機能的活性を評価することを含む。患者の癌細胞の複数のシグナル伝達経路の機能的活性は、本明細書に記載されるように、並行して（すなわち、同じ細胞試料を異なる部に分けて様々な経路を個別に並行して評価することによる）または同時に（すなわち、同じ細胞内で様々な経路を同時に評価することによる）、あるいは並行解析および同時解析を組み合わせることによって評価することができる。
【００１０】
複数のシグナル伝達経路を評価するこの方法により、腫瘍の複数の異なるシグナル伝達経路の活性を個別に、または同時に評価し、その結果を比較することにより、患者の腫瘍において特定の最も活性な疾患シグナル伝達経路（１つまたは複数）および経路の活性化または治療的介入の間の予期せぬ相乗効果を明らかにすることが可能になる。次いで、患者を活性レベルが最も高いシグナル伝達経路（１つまたは複数）に影響を及ぼす１つまたは複数の標的化治療剤で治療する。この方法は、患者の細胞の単一のシグナル伝達経路のみを評価する方法より優れている。単一の経路のみを評価し、その活性が正常であることがわかっても、患者の腫瘍を駆動する異常なシグナル伝達経路の特定は明らかにされないままである。さらに、評価した単一の経路が異常なものであることがわかった場合、次に、治療にあたってこの経路に影響を及ぼす標的化治療剤を選択することになる。しかし、この単一のシグナル伝達経路の異常な活性からは、この異常なシグナル伝達経路が最も重要なものであり、実際に、それ以上またはそれと同程度に異常である可能性のあるシグナル伝達と関連して疾患過程（例えば、腫瘍の成長）を駆動しているかどうかに関して十分な情報が得られない。したがって、患者の単一の経路のみを試験することにより標的化治療剤を選択することが可能ではあるものの、依然としてその治療剤が疾患過程を弱める効果がない、あるいは別の経路に影響を及ぼす標的化治療剤より効果が少ないこともある。さらに、１つの経路の異常な活性が第二の経路の異常なシグナル伝達の結果であり、かつ／またはその経路同士が相乗的に、クロストークによって、またはその他の生化学的機序によって結びついている可能性もあるため、複数の経路を試験することによってのみ、個々の患者に対して最も精度の高い標的療法（１つまたは複数）を決定することができる。本開示の方法では、患者の癌細胞の同じ試料の複数のシグナル伝達経路を個別に、または同時に評価することによって、疾患を駆動し活性レベルが最も高いシグナル伝達経路を特定し、それにより、患者の癌細胞で活性レベルが最も高いシグナル伝達経路（１つまたは複数）を標的とする治療剤（１つまたは複数）の選択または患者の癌細胞で活性レベルが最も高いシグナル伝達経路を標的とする２つ以上の治療剤の選択を可能にすることができる。
【００１１】
さらに、本発明の選択方法では、ある特定の治療剤が活性であるかどうかのみならず、患者の細胞のシグナル伝達経路の活性レベルも明らかになるため、本発明の選択方法により、この方法で試験した特定の治療剤のみならず、同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす薬剤のパネル内で１つまたは複数の標的化治療剤を治療に使用するかどうかを選択することも可能になる。したがって、本発明の選択方法により、選択される可能性のある治療剤について、単一の薬剤のみを試験するより大きいパネルを特定することができる。例えば、本発明の選択方法を用いて、（本明細書に詳細に記載するように）同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす標的化治療剤を用いることにより、患者の癌細胞のいずれのシグナル伝達経路が疾患を駆動しているのかを明らかにすることができる。治療に使用する標的化治療剤（１つまたは複数）の最終的な選択は、患者の疾患を駆動していることが明らかになった同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす薬剤であって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した薬剤（１つまたは複数）と同じまたは異なる薬剤であり得る。
【００１２】
したがって、一態様では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、少なくとも２組の薬剤対であって、各組が、標的化治療剤である第一の薬剤と、第一の薬剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている活性化因子である第二の薬剤とからなり、薬剤対の組がそれぞれ異なるシグナル伝達経路に影響を及ぼす薬剤対とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも２組の薬剤対と接触させた試料を作製することと、
各組の薬剤対と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤のそれぞれまたは第二の薬剤のそれぞれのみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
薬剤対の組と接触させた試料に第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける各組の薬剤対の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
全被験組のうち出力値が最も高いことが明らかになった薬剤対の組の第一の薬剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与し、投与した標的化治療剤が、対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において、出力値がこれより低い薬剤対の組（１つまたは複数）の標的化治療剤（１つまたは複数）より高い治療活性があることを示すことと
を含む方法によって対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法に関する。
【００１３】
別の実施形態では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料を、少なくとも少なくとも２組の薬剤対であって、各組が、少なくとも１つの標的化治療剤である第一の薬剤と、第一の薬剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている少なくとも１つの活性化因子である第二の薬剤とからなり、薬剤対の組がそれぞれ異なるシグナル伝達経路に影響を及ぼす薬剤対と同時に接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも２組の薬剤対と接触させた試料を作製することと、
各組の薬剤対と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤のそれぞれまたは第二の薬剤のそれぞれのみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
薬剤対の組と接触させた試料に第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける各組の薬剤対の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
全被験組のうち出力値が最も高いことが明らかになった薬剤対の組の第一の薬剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与し、投与した標的化治療剤が、対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において、出力値がこれより低い薬剤対の組（１つまたは複数）の標的化治療剤（１つまたは複数）より高い治療活性があることを示すことと
を含む方法によって対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法に関する。
【００１４】
したがって、全被験組のうち最も高い出力値が得られる薬剤対から、出力値がこれより低い薬剤対のシグナル伝達経路活性と比較して、対象の癌細胞を駆動するシグナル伝達経路（すなわち、疾患過程に関して最も活性の高い経路）が明らかになる。次いで対象の投与に選択する標的化治療剤は、最も高い出力値が得られた薬剤対の第一の薬剤であり得る（すなわち、次いで、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの試験で第一の薬剤として使用した標的化治療剤を対象への投与に選択し得る）か、または最も高い出力値が得られた薬剤対の第一の薬剤とは異なるが、最も高い出力値が得られた薬剤対と同じシグナル伝達経路を標的とする（例えば、選択的に影響を及ぼす）標的化治療剤である薬剤であり得る。
【００１５】
一実施形態では、試料と３組以上の薬剤対、例えば１０組以上の薬剤対などとを接触させ、薬剤対の各組は異なるシグナル伝達経路に影響を及ぼすものである。適切なシグナル伝達経路および薬剤対の組ならびにシグナル伝達経路が本明細書（例えば、表２、１２、１３）に開示される。
【００１６】
一実施形態では、少なくとも１組の薬剤対がＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすものであり、少なくとも１組の薬剤対がＨＥＲファミリーシグナル伝達経路以外のシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすものである。例えば、様々な実施形態では、少なくとも１組の薬剤対がＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすものであり、少なくとも１組の薬剤対がｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦシグナル伝達経路、エストロゲン受容体（ＥＲ）シグナル伝達経路、ＦＧＦＲシグナル伝達経路またはＰＤＧＦＲシグナル伝達経路のいずれかに選択的に影響を及ぼすものである。
【００１７】
一実施形態では、少なくとも１組の薬剤対がエストロゲン受容体（ＥＲ）シグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすものであり、少なくとも１組の薬剤対がＥＲシグナル伝達経路以外のシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすものである。例えば、一実施形態では、少なくとも１組の薬剤対がＥＲシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすものであり、少なくとも１組の薬剤対がＩＧＦＲシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすものである。
【００１８】
一実施形態では、少なくとも２つの標的化治療剤、すなわち、（ｉ）全被験組のうち出力値が最も高いことが明らかになった薬剤対の組の標的化治療剤および（ｉｉ）標的化治療剤が対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す出力値を有することが明らかになった薬剤対の組の少なくとも１つの追加の標的化治療剤を対象に投与する。一実施形態では、少なくとも１つの追加の標的化治療剤は、活性化剤によって惹起されるシグナル伝達活性を５０％超変化させることが明らかにされており、対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において治療活性があることが示されているものである。同じく、様々な実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した薬剤の組の対に使用される同じ標的化治療剤であり得るか、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験したものとは異なるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した標的化治療剤と同じシグナル伝達経路を標的とする（例えば、選択的に影響を及ぼす）標的化治療剤であり得る。
【００１９】
薬剤対の各組に使用するのに適した標的化治療剤および活性化因子ならびに適切なシグナル伝達経路については本明細書に詳細に記載する。
【００２０】
一実施形態では、インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する。
【００２１】
一実施形態では、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される。
【００２２】
一実施形態では、生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する。一実施形態では、生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する。
【００２３】
本発明の別の態様では、癌患者の治療に標的化治療剤を選択するのに用いる方法は、患者の細胞の超感受性シグナル伝達経路を特定し、次いで、この超感受性シグナル伝達経路に影響を及ぼす標的化治療剤で患者を治療することを含む。超感受性経路とは、極めて低レベルのシグナル伝達経路活性化因子（例えば、受容体リガンド）などの細胞入力のみで極めて高レベルの経路活性化または応答性（例えば、９０％の細胞出力）を引き起こすが可能な経路のことである。患者の癌細胞の超感受性シグナル伝達経路はこれまでに、癌細胞内にほかにも異常なシグナル伝達経路が存在する場合でも疾患過程（例えば、腫瘍成長）の駆動に関与する可能性が高いことが明らかにされている。したがって、患者の癌細胞の超感受性シグナル伝達経路を特定し、次いで、このシグナル伝達経路を標的とする標的化治療剤を選択することは、治療有効性のある治療レジメンの選択に有効な手段となる。
【００２４】
したがって、別の態様では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象の癌細胞の異常に活性なシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含み、
シグナル伝達経路が、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、シグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている活性化因子とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、試料の一部を濃度が高い方の活性化因子と接触させ、試料の一部を濃度が低い方の活性化因子と接触させることと、
濃度が高い方の活性化因子と接触させた試料の一部における生存癌細胞の細胞接着または付着を、濃度が低い方の活性化因子と接触させた試料の一部と比較して連続的に測定することと、
活性化因子に対するシグナル伝達経路の感受性を連続測定値の数理解析によって求めることと、
シグナル伝達経路が活性化因子に超感受性である場合、活性化因子が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与し、シグナル伝達経路が対象の癌細胞において異常に活性であることを示すことと
を含む方法によって対象の癌細胞において異常に活性であることが明らかにされている、
方法に関する。
【００２５】
一実施形態では、この方法は、
濃度が高い方の活性化因子と接触させた試料の一部における生存癌細胞の細胞接着または付着を、濃度が低い方の活性化因子と接触させた試料の一部と比較し、活性化因子と接触させていない試料の一部と比較して連続的に測定することと、
活性化因子に対する試料の感受性および活性化因子と接触させた試料の一部に活性化因子と接触させなかった試料の一部と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける活性化因子の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
シグナル伝達経路が活性化因子に超感受性であり、シグナル伝達経路が対象の癌細胞において異常に活性であることがわかる場合、または活性化因子の出力値が所定のカットオフ値より大きい場合、活性化因子が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することと
を含む。
【００２６】
一実施形態では、活性化因子の高い方の濃度はＥＣ９０であり、活性化因子の低い方の濃度はＥＣ１０である。一実施形態では、ＥＣ９０：ＥＣ１０比が８１未満であることが、シグナル伝達経路が活性化因子に超感受性であることを示す。
【００２７】
一実施形態では、ヒルの式を用いてヒル係数を求め、活性化因子に対するシグナル伝達経路の感受性を求める。一実施形態では、ヒル係数の値が１より大きいことが、シグナル伝達経路が活性化因子に超感受性であることを示す。
【００２８】
様々な適切なシグナル伝達経路、活性化因子および標的化治療剤については本明細書に詳細に記載する。
【００２９】
一実施形態では、インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する。
【００３０】
一実施形態では、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される。
【００３１】
一実施形態では、生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する。一実施形態では、生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する。
【００３２】
本発明の別の態様では、癌患者の治療に標的化治療剤を選択するのに用いる方法は、最初に、シグナル伝達経路が超感受性である患者（例えば、５例、１０例、２０例、４０例、５０例またはそれ以上）のグループの同じシグナル伝達経路に対する特定の活性レベル（例えば、平均値、算術平均値、上位四分位点など）に相当する特定のシグナル伝達経路の活性のカットオフ値を求めることを含む。シグナル伝達経路活性のレベルがカットオフ値を上回る患者には、カットオフ値を上回る活性を有する同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす標的化治療剤による治療を実施する。
【００３３】
本発明の別の態様では、癌患者の治療に標的化治療剤を選択するのに用いる方法は、単一の標的化治療剤で阻害し得る少なくとも２つのシグナル伝達経路活性化因子によって患者の細胞内で同時に惹起される活性の量を評価することを含む。あるシグナル伝達経路の活性が、２つ以上の細胞表面受容体および共通の経路ノードを通る前記シグナルによって惹起される別の経路からの上流作用、下流作用、側方作用、クロストーク作用、フィードバック作用またはフィードフォワード作用によって駆動され得ることから、そのような共通の経路ノードまたはノードの組合せを標的とする治療法のアンタゴニスト効果を評価するのが有利である。この方法により、共通の下流経路ノード（例えば、ＡＫＴ、ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ｍＴＯＲ）を標的とする治療剤が複数の細胞表面受容体の下流にあるシグナル伝達経路の活性に及ぼす影響を測定することが可能になる。患者の細胞内での２つ以上のシグナル伝達経路活性化因子の同時効果を細胞表面受容体の下流で評価することにより、この方法は、１対のシグナル伝達経路活性化因子と標的化治療剤が患者の細胞に及ぼす効果を評価する方法より優れたものとなる。さらに、本発明は、複数のノードまたは標的と結合して調節する既知の見つけることができる治療剤（例えば、ネラチニブ、デュリゴツズマブ、クリゾチニブ、パゾパニブ、ピクチリシブ）を含む。本発明は、このタイプの併用治療剤を特定し、それらから利益を享受することがほぼ確実な患者にマッチさせるのに理想的なものである。
【００３４】
したがって、別の態様では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、それぞれが第一の薬剤である標的化治療剤と、標的化治療剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている少なくとも２つの第二の薬剤である活性化因子とからなる、少なくとも１つの薬剤の三つ組とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料を作製することと、
少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤である標的化治療剤または第二の薬剤である活性化因子のそれぞれのみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
薬剤の三つ組と接触させた試料に第一の薬剤である標的化治療剤または第二の薬剤である活性化因子のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける少なくとも１つの薬剤の三つ組の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
出力値が、標的化治療剤が対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す所定のカットオフ値より大きい場合、薬剤の三つ組の第一の薬剤である標的化治療剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することと
を含む方法によって対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性のある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法に関する。
【００３５】
一実施形態では、第一の薬剤である標的化治療剤は、第一の薬剤である標的化治療剤の影響を受けるシグナル伝達経路が対象の癌細胞において活性であることを示す５０％超の出力値パーセントを有することが明らかになっている。
【００３６】
別の実施形態では、試料と、２つ以上の第二の薬剤である活性化因子により対処する同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている少なくとも２つの第一の薬剤である標的化治療剤とを接触させる。
【００３７】
様々な適切なシグナル伝達経路、活性化因子および標的化治療剤については本明細書に詳細に記載する。
【００３８】
一実施形態では、インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する。
【００３９】
一実施形態では、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される。
【００４０】
一実施形態では、生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する。一実施形態では、生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する。
【００４１】
本発明の別の態様では、癌患者の治療に標的化治療剤を選択するのに用いる方法は、１つのシグナル伝達経路活性化因子によって患者の細胞内に惹起され、活性化因子と同じ近接した結合部位を直接標的としない標的化治療剤によって阻害される活性の量を評価することを含む。２つ以上のシグナル伝達経路が複数の収束点、クロストークおよびフィードバックループで相互につながっていることがあるため、活性化因子結合部位（例えば、細胞表面受容体）で惹起される経路の活性を阻害するよう設計された標的化治療剤が、シグナル伝達経路の活性を阻害するのに最も効果的な方法とはならないこともある。活性化因子薬剤によって惹起されるシグナル伝達経路の活性を、活性化因子と同じ近接した結合部位を直接標的とするマッチしたシグナル伝達経路阻害剤によって阻害することができない場合、活性化因子の結合部位とは異なる結合部位を標的とする治療法により、惹起されるシグナル伝達経路の活性を阻害することが可能であり得る。この方法により、活性化因子薬剤の結合部位の下流（例えば、ＡＫＴ、ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ｍＴＯＲ）、上流（例えば、ＲＡＳ、ＲＡＦ）または側方（例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｎｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、ｃ−ＭＥＴ、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＦＧＦＲ）にある結合部位を標的とする治療剤が、活性化因子薬剤によって惹起されるシグナル伝達経路の活性に及ぼす影響を測定することが可能になる。シグナル伝達経路阻害剤の効果を患者の細胞の活性化因子薬剤の活性化結合部位の下流、上流または側方で評価することにより、この方法は、１対のシグナル伝達経路活性化因子と標的化治療剤が患者の細胞の同じ近接した結合部位で及ぼす効果を評価する方法より優れたものとなる。さらに、本発明は、複数のノードまたは標的と結合して調節する既知の見つけることができる治療剤を含む。したがって、活性化因子薬剤とは異なる結合部位と結合する標的化治療剤で患者を治療すれば、優れた有効性およびより良好な臨床転帰をもたらすことができる。
【００４２】
したがって、別の態様では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、（ｉ）シグナル伝達経路に影響を及ぼし、活性化結合部位を有する、第一の薬剤である活性化因子および（ｉｉ）活性化因子と同じシグナル伝達経路であるが、活性化結合部位の下流、上流または側方にある結合部位で影響を及ぼす、第二の薬剤である標的化治療剤とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料を作製することと、
第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
第一の薬剤および第二の薬剤の両方と接触させた試料に第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
第二の薬剤である標的化治療剤が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与し、細胞の接着または付着の変化を特徴付ける出力値が、シグナル伝達経路が対象の癌細胞において活性であることを示すカットオフ値以上であることと
を含む方法によって対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性のある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法に関する。
【００４３】
一実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した同じ第二の薬剤である標的化治療剤である。あるいは、別の実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した第二の薬剤である標的化治療剤とは異なるものであるが、シグナル伝達経路において、試験した第二の薬剤である標的化治療剤と同じ地点（すなわち、第一の薬剤である活性化因子の活性化結合部位の下流、上流または側方）で第二の薬剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす標的化治療剤である。
【００４４】
様々な適切なシグナル伝達経路、活性化因子および標的化治療剤については本明細書に詳細に記載する。
【００４５】
一実施形態では、インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する。
【００４６】
一実施形態では、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される。
【００４７】
一実施形態では、生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する。一実施形態では、生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する。
【００４８】
本発明のさらに別の態様では、癌患者の治療に標的化治療剤を選択するのに用いる方法は、２つ以上のシグナル伝達経路活性化因子によって患者の細胞内に惹起され、両活性化因子と同じ近接した結合部位を直接標的としない標的化治療剤によって阻害される活性の量を評価することを含む。２つ以上のシグナル伝達経路が複数の収束点、クロストークおよびフィードバックループで相互につながっていることがあるため、それぞれの活性化因子結合部位（例えば、異なる細胞表面受容体）で惹起される経路の活性を阻害するよう設計された標的化治療剤が、シグナル伝達経路の活性を阻害するのに最も効果的なものとはならないこともある。２つ以上の活性化因子薬剤によって惹起されるシグナル伝達経路の活性を、活性化因子と同じ近接した結合部位を直接標的とする２つのマッチしたシグナル伝達経路阻害剤によって阻害することができない場合、両活性化因子の結合部位とは異なる結合部位を標的とする治療法により、惹起されるシグナル伝達経路の活性を阻害することが可能であり得る。この方法により、活性化因子薬剤の結合部位の下流（例えば、ＡＫＴ、ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ｍＴＯＲ）、上流（例えば、ＲＡＳ、ＲＡＦ）または側方（例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｎｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、ｃ−ＭＥＴ、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＦＧＦＲ）にある結合部位を標的とする治療剤が、活性化因子薬剤によって惹起されるシグナル伝達経路の活性に及ぼす影響を測定することが可能になる。シグナル伝達経路阻害剤の効果を患者の細胞の２つ以上の活性化因子薬剤の活性化結合部位の下流、上流または側方で評価することにより、この方法は、１対のシグナル伝達経路活性化因子と標的化治療剤が患者の細胞の同じ近接した結合部位で及ぼす効果を評価する方法より優れたものとなる。さらに、本発明は、複数のノードまたは標的と結合して調節する既知の見つけることができる治療剤を含む。したがって、活性化因子薬剤とは異なる結合部位と結合する標的化治療剤で患者を治療すれば、優れた有効性およびより良好な臨床転帰をもたらすことができる。
【００４９】
したがって、別の態様では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、（ｉ）シグナル伝達経路に影響を及ぼし、それぞれが活性化結合部位を有する、２つ以上の第一の薬剤である活性化因子および（ｉｉ）２つ以上の第一の薬剤である活性化因子と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼすが、活性化因子の活性化結合部位の下流、上流または側方にある結合部位で影響を及ぼす、第二の薬剤である標的化治療剤とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料を作製することと、
第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
第一の薬剤および第二の薬剤の両方と接触させた試料に第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
第二の薬剤である標的化治療剤が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与し、細胞の接着または付着の変化を特徴付ける出力値が、シグナル伝達経路が対象の癌細胞において活性であることを示すカットオフ値以上であることと
を含む方法によって対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性のある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法に関する。
【００５０】
一実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した同じ第二の薬剤である標的化治療剤である。あるいは、別の実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した第二の薬剤である標的化治療剤とは異なるものであるが、シグナル伝達経路において、試験した第二の薬剤である標的化治療剤と同じ地点（すなわち、第一の薬剤である活性化因子の活性化結合部位の下流、上流または側方）で第二の薬剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす標的化治療剤である。
【００５１】
様々な適切なシグナル伝達経路、活性化因子および標的化治療剤については本明細書に詳細に記載する。
【００５２】
一実施形態では、インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する。
【００５３】
一実施形態では、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される。
【００５４】
一実施形態では、生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する。一実施形態では、生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する。
【００５５】
本発明のさらに別の態様では、癌患者の治療に標的化治療剤を選択するのに用いる方法は、１つの活性化剤と２つ以上の治療剤とを含む１組の薬剤を用いて患者の癌細胞の１つのシグナル伝達経路の機能的活性を評価することを含み、ここでは、活性化剤と治療剤のうちの１つが同じシグナル伝達経路と結合し、その他の治療剤（１つまたは複数）が異なるシグナル伝達経路または細胞部位と結合する。したがって、別の態様では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料を、各組が第一の薬剤である標的化治療剤と、第一の薬剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている第二の薬剤である活性化因子と、第一の薬剤とは異なるシグナル伝達経路または第一の薬剤が影響を及ぼすシグナル伝達経路内にある異なる部位に影響を及ぼす第三の薬剤である標的化治療剤とからなる少なくとも１つの薬剤の三つ組と同時に接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定され、第一の薬剤が影響を及ぼすシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料を作製することと、
少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤である標的化治療剤のみ、第二の薬剤である活性化因子のみまたは第三の薬剤である標的化治療剤のみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
薬剤の三つ組と接触させた試料に第一の薬剤である標的化治療剤のみ、第二の薬剤である活性化因子のみまたは第三の薬剤である標的化治療剤のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける少なくとも１つの薬剤の三つ組の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
出力値が、第一の薬剤である標的化治療剤が対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す所定のカットオフ値より大きい場合、薬剤の三つ組の第一の薬剤である標的化治療剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することと
を含む方法によって対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性のある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法に関する。
【００５６】
一実施形態では、対象に投与する少なくとも１つの標的化治療剤は、第一の薬剤である標的化治療剤、第三の薬剤である標的化治療剤または第一の薬剤である標的化治療剤と第三の薬剤である標的化治療剤の両方である。別の実施形態では、対象に投与する少なくとも１つの標的化治療剤は、第一の薬剤である標的化治療剤および／または第三の薬剤である標的化治療剤とは異なるものであるが、前記第一の薬剤である標的化治療剤または第三の薬剤である標的化治療剤と同じシグナル伝達経路を標的とする。
【００５７】
様々な適切なシグナル伝達経路、活性化因子および標的化治療剤については本明細書に詳細に記載する。
【００５８】
一実施形態では、インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する。
【００５９】
一実施形態では、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される。
【００６０】
一実施形態では、生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する。一実施形態では、生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】Ｃ２１腫瘍細胞を異種移植し、溶媒対照、ネラチニブ単独、テポチニブ単独またはネラチニブとテポチニブの組合せで治療したマウスの平均腫瘍体積を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、細胞（例えば、癌細胞）内のシグナル伝達経路の活性を詳細に探索し、それにより、例えば、活性が正常である、もしくは活性が異常であるシグナル伝達経路、一群の被験経路のなかで最も活性が高いシグナル伝達経路および／または超感受性のシグナル伝達経路を明らかにすることを可能にする。本発明の方法により、シグナル伝達経路の活性に関する詳細な情報を得られるため、多種多様な標的化治療剤の選択および治療的使用（すなわち、投与）が可能になる。それらの方法はシグナル伝達経路そのものの状態を評価するものであるため、治療的使用に選択する標的化治療剤がｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法で試験する同じ標的化治療剤である必要はない。むしろ、被験標的化治療剤と同じシグナル伝達経路を（例えば、シグナル伝達経路内の同じ地点または異なる地点で）標的とする（例えば、選択的に影響を及ぼす）標的化治療剤も治療的使用に選択することができる。さらに、シグナル伝達経路が複数の収束点、クロストークおよびフィードバックループならびに経路間の予想外の相乗作用で互いにつながっている可能性があることから、本発明の方法により、標的化治療剤および同じシグナル伝達経路に影響を及ぼすが、経路内の異なる地点または結合部位で影響を及ぼす活性化因子薬剤をスクリーニングし、それにより、標的化治療剤による治療的介入の標的とするのに最も適したシグナル伝達経路内の地点または結合部位を明らかにすることが可能になる。
【００６３】
本発明がさらに容易に理解されるように、最初に特定の用語を定義する。さらなる定義については詳細な説明全体を通して記載する。
【００６４】
Ａ．定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で参照される特許、出願、公開された出願およびその他の刊行物はいずれも、その全体が参照により組み込まれる。このセクションに記載される定義が、参照により本明細書に組み込まれる特許、出願、公開された出願およびその他の刊行物に記載される定義に反する、または別の形で矛盾する場合、参照により本明細書に組み込まれる定義よりこのセクションに記載される定義の方を優先する。本明細書で使用される以下の用語は、以下の定義を有するものとする。
【００６５】
本明細書で使用される「約〜」という用語は、〜前後、〜辺り、およそ〜、または〜程度を意味する。「約」という用語が数値範囲とともに使用される場合、同用語は、記載される数値の上限および下限を広げることによってその範囲を修正する。「約」という用語は、本明細書では一般に、ある数値を記載される値の上下１０％の変動で修正するのに使用される。一態様では、「約」という用語は、同用語とともに使用する数値のプラス２０％またはマイナス２０％を意味する。したがって、約５０％というのは、４５％〜５５％の範囲内にあることを意味する。本明細書に終点によって記載される数値範囲には、その範囲内に含まれるあらゆる数および分数が包含される（例えば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４および５が包含される）。
【００６６】
「活性化因子」、「活性化する」、「活性化」、「攪乱物質（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ）」、「攪乱する」および「攪乱」という用語は、細胞に関して使用される場合、細胞に対して何らかの効果を示す当業者に周知の試薬、承認薬、実験的化合物および薬物様分子ならびに開発中の実験的薬物、有機分子、成長因子、シグナル伝達因子、生化学物質、核酸、サイトカイン、ケモカインまたはタンパク質を用いた細胞の生理学的操作の特定の対象または活性を指す。操作は、細胞の生理活性のあらゆる調節を指し、特に限定されないが上方制御または下方制御が含まれ得る。活性化因子薬剤または攪乱物質（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ）には、特に限定されないが、以下のいずれかの単一の薬剤またはそれらの組合せがさらに含まれ得る：メンバーおよびメンバーの組合せ、特に限定されないが、以下のリストのメンバーまたはメンバーの組合せを含めた特定の成長因子：血管内皮成長因子、ホスファチジルイノシトール、上皮成長因子およびＥＧＦペプチド配列を有する因子、肝細胞成長因子、ｍ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫリガンド、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、インスリン成長因子、トランスフォーミング成長因子、肝細胞成長因子、ニューレグリンまたはニューラルレグリン（ｎｅｕｒａｌ  ｒｅｇｕｌｉｎ）、ヘレグリンおよびＥｒｂＢ受容体ファミリー関連因子、エストロゲンならびにそのホルモン前駆体および分解産物（例えば、ＤＨＥＡ、エストロン、アンドロステンジオン）、プロゲステロン、テストステロン、葉酸塩、アデノシン三リン酸、ＡＭＰ、環状ＡＭＰおよびＦＡＳリガンド、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、あるいは細胞内経路またはシグナル伝達を攪乱するその他の薬剤、例えば対象の血漿もしくは血清または患者細胞（特に線維芽細胞および上皮）に由来する上清画分など、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋、Ｃｌ−、Ｃａ＋２、グルコース、グルタミン、ヒスチジン、マンニトールおよびトリプトファン、抗生物質（ラパマイシン）、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、その他の有機化合物、微量ミネラルおよび無機塩、亜セレン酸ナトリウム、血清、細胞抽出物、分画した細胞抽出物または分画した血清、細胞外シグナル伝達因子、細胞内シグナル伝達因子、インスリン、トランスフェリン、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、ホスホホリルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、トリイドサイロニン（ｔｒｉｉｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、ピルビン酸ナトリウム、マイトジェン、オキシトシン、イソプロテレノール、Ｌ−グルタミン。
【００６７】
「接着」という用語は、細胞とＥＣＭまたは他の細胞とを直接的に、間接的に、および／または経路伝達によって間接的に接続するのに関与する任意の数の分子を含む過程を包含し得る。例えば、インテグリンは、細胞骨格構築、細胞運動、細胞周期の調節、細胞のインテグリン親和性の調節、細胞とウイルスとの付着、細胞と他の細胞またはＥＣＭとの付着に関与する。インテグリンは、細胞がある種類のシグナルまたは刺激をまた別の細胞に、細胞内に、および細胞間に変換する過程であるシグナル伝達にも関与する。インテグリンは、ＥＣＭから細胞に、および細胞から他の細胞に（例えば、他の細胞上にあるインテグリンを介して）またはＥＣＭに情報を伝達することができる。αサブユニットとβサブユニットの組合せによってインテグリンのリガンド特異性が決まる。インテグリンの多くが同じリガンドに対して結合特異性を有し、ｉｎ  ｖｉｖｏでの相互作用を規定するのはインテグリンの発現／活性化パターンと利用できるリガンドの組合せである。接着は細胞領域内または細胞集団の領域内で密度が変化し得る。接着は、細胞内または細胞集団内で量が変化し得る。接着は、特異性または接着過程に関与するタンパク質のタイプによって性質が変化し得る。接着は極性が変化し得る。
【００６８】
「アッセイ」または「アッセイすること」という用語は、例えば、標的の存在、不在、量、程度、動態、動力学または種類、例えば外部刺激（例えば、治療剤またはリガンド）による活性化に対する細胞の光学的応答または生体インピーダンス応答などを明らかにする解析を指す。
【００６９】
「付着する」または「付着」という用語は、物理的吸収、化学結合、化学的引力およびこれに類似した過程またはそれらの組合せなどによって表面に接続された、例えば、表面修飾物質、細胞、リガンド候補化合物およびこれに類似した本開示の実体を指す。特に「細胞付着」、「細胞接着」または「細胞試料付着」は、培養または細胞係留材料との相互作用などによる細胞同士または表面と相互作用する細胞の結合を指す。
【００７０】
「付着パターン」という用語は、細胞または細胞試料と表面との接続にみられる特色または特徴を指す。付着パターンは量的なもの、例えば付着部位の数であり得る。付着パターンは、質的なもの、例えば細胞外マトリックスへの付着に好ましい分子部位でもあり得る。
【００７１】
「細胞付着シグナル（ＣＡＳ）」という用語は、細胞をマイクロプレートのウェルに入れ、インピーダンスバイオセンサーで解析したときに細胞によって生じる細胞付着の定量的測定値を指す。通常、薬剤の不在下での細胞のＣＡＳを、特定のシグナル伝達経路に影響を及ぼす活性化因子単独の存在下での細胞のＣＡＳおよび／または特定のシグナル伝達経路に影響を及ぼす活性化因子薬剤とその特定のシグナル伝達経路の特異的阻害剤との組合せの存在下での細胞のＣＡＳと比較し得る。細胞のＣＡＳは通常、オームで測定する。
【００７２】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ヒト化抗体、キメラ抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および所望の生物活性または機能を示す抗体フラグメントがこれに含まれる。
【００７３】
抗体は、例えばキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であり得、その抗原結合フラグメントであり得る。「抗体フラグメント」は、完全長抗体の一部分、一般的にはその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、例えば抗体フラグメントから形成される、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子；ならびに二重特異性抗体などの多重特異性抗体が挙げられる。「機能的フラグメント」は、実質的に完全長抗体の抗原との結合を保持し、生物活性を保持するものである。抗体は、共有結合またはその他の結合を介して１つまたは複数の他の薬物と組み合わせることにより「武装」または「コンジュゲート」して、個々の薬物分子で個別に得られるよりも大きい効力、特異性および有効性を得ることができる。
【００７４】
本明細書で使用される「確認剤」という用語は、本明細書に記載される試験に用いる目的とする経路活性を妨害する、またはこれに影響を及ぼすことがわかっている小分子、機能既知の特異的リガンドまたは抗体もしくは親和性／特異性試薬を指す。確認剤は、目的とする経路活性に直接関連する活性を特異的に惹起する活性化因子薬剤を細胞試料に導入したときに生じる特定の作用機序に関連する経路活性を確認し、それを定量化するため試験に使用するものである。例えば、活性化因子が細胞表面受容体に対する既知のリガンドである場合、確認剤の導入後に変化し、本明細書に記載される方法で測定される活性は、方法が解析しようとする経路に関連する活性の量を表すものとなる。さらなる例では、リガンド結合領域と受容体二量体化領域と受容体チロシンキナーゼ領域とからなる受容体の場合と同様に、活性化因子薬剤が、受容体リガンド結合部位と結合するリガンドとなり得る。その場合、確認試薬は、リガンド結合前に、またはリガンド結合後に起こる事象（１つまたは複数）、すなわち、受容体二量体化または受容体二量体化に続く受容体チロシンキナーゼ活性を阻害した薬剤であり得る。さらに、確認試薬は、目的とする患者で活性化されている、または機能不全に陥っている下流シグナル伝達経路の特定の部分を改善する薬剤であり得る。
【００７５】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、個々の抗体が、天然に起こる可能性がありわずかに存在し得る変異を除いては同一である集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体が含まれるのが通常である従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体は、それぞれが抗原上の単一の決定基に対するものとなっている。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の性質を示すものであって、何らかの特定の方法によって抗体を作製する必要があるものとして解釈されるべきではない。
【００７６】
「免疫捕捉試薬」という用語は任意の種類の抗体を指し、さらに、合成の塩基バリアントまたは任意の合成分子が含まれるＲＮＡ、ＤＮＡおよびポリマーからなるアプタマーを包含し、ここでは、アプタマーまたは試薬は、別の分子を特異的に認識して結合し、その存在、量および／または性質を知らせるよう構築され選択されたものである。
【００７７】
「培養」という用語は、本発明を実施するために細胞を調製することを指す。調製は、本発明を実施する様々な時点で、様々な培地、培地添加物、温度、湿度、ＣＯ２の％、播種密度、細胞タイプの純度または混合物といった様々な条件および細胞培養の当業者に公知のその他の条件を含み得る。調製は、細胞が増殖し、静止状態になり、老化し、細胞周期の様々な段階に入る、経過する、またはチェックされるのを可能にする条件を含み得る。培養は、当業者に公知の任意の数の培地または添加物、例えば、特に限定されないが、本発明の理想的な実施を可能にし、かつ／または最適化するビタミン、サイトカイン、成長因子、血清（例えば、入手源の動物がウシ、ウシ胎仔、ヒト、ウマまたはその他の哺乳動物である）、代謝産物、アミノ酸、微量ミネラル、イオン、ｐＨ緩衝剤および／またはグルコースなどを含み得る。本発明による活性化の前または後に、細胞の培養を無血清かつ／または無活性化因子の培地で実施し得る。培養は理想的には、患者の腫瘍微小環境を模倣するよう設計された条件を含み得る。培養調製は理想的には、特定の経路を基底レベルまたは高レベルにして経路活性のアゴニズムまたはアンタゴニズムの測定を可能にするよう設計された条件を含み得る。
【００７８】
「基本培地」という用語は、明確に定められた量の無機塩、必須アミノ酸、グルコース、ビタミンおよびｐＨ緩衝剤を含有するタイプの培地を指し、この培地には、方法が解析しようとするシグナル伝達経路を刺激する薬剤は含まれていない。多数の基本培地が当業者に公知であり、例えば、ＤＭＥＭ、Ｆ１２、ＭＥＭ、ＭＥＧＭ、ＲＰＭＩ−１６４０およびそれらの組合せが挙げられる。例えば、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を解析する場合、基本培地には、ＥｒｂＢ経路を攪乱することがわかっている試薬は含まれていない。基本培地は、細胞集団が生存可能な状態であり、その個々の細胞タイプの多様性および細胞周期の様々な相を代表する細胞の正常な分布が保持されるように細胞培養を維持するために用いられる。基本培地は、本明細書に記載される方法において、罹患細胞の試料と活性化因子薬剤とを接触させる段階の直前に対象から採取した疾患細胞の試料を培養するために用いられる。
【００７９】
材料に対して使用する「新鮮な」という用語は、未だ使用していない材料を指す。したがって、新鮮な基本培地とは未だ使用していない基本培地のことである。既に基本培地で培養されている疾患細胞の試料の入った容器に新鮮な基本培地を加えて、細胞培養物の入った容器の基本培地の体積を増加させることができる。あるいは、罹患細胞の試料の培養に使用した容器内の基本培地の一部を細胞培養容器から取り出し、新鮮な基本培地と入れ換えることができる。いずれの場合も、細胞培養容器中の基本培地の総体積の５０％超が新鮮な基本培地であれば、その細胞培養容器には新鮮な基本培地が入っているとされる。同じ基本培地で長時間（例えば、７２時間超）にわたって培養した細胞では、個々の細胞タイプの多様性が失われ、細胞の大部分が細胞周期のＧ０／Ｇ１期に入り、シグナル伝達経路の活性の測定に干渉することがある。新鮮な培地に入れた細胞試料には、細胞試料に元の細胞試料にみられた個々の細胞タイプの多様性および細胞周期の様々な相を代表する細胞の正常な分布が反映されるよう新たな培地に適応する時間（例えば、少なくとも１２時間）が必要となる。
【００８０】
「緩衝培地」という用語は、ｐＨ緩衝液と等張溶液とを含有する溶液を指す。緩衝培地は通常、細胞試料を飢餓状態にする、または細胞が休止しているのは細胞周期Ｇ０／Ｇ１であることがわかるように、細胞を静止または老化状態にするために用いられる。
【００８１】
「キメラ」抗体（免疫グロブリン）は、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である重鎖および／または軽鎖の一部を含むものであり、鎖（１つまたは複数）の残りの部分は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体およびそのような抗体のフラグメントの対応する配列と同一または相同である（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５）。
【００８２】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む抗体のことである。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、可変ドメイン超可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種に由来し（ドナー抗体）所望の特異性、親和性および能力を有する超可変領域の残基に置き換わったヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体またはアクセプター抗体）である。超可変領域は、配列によって定められる相補性決定領域（ＣＤＲ）（例えば、Ｋａｂａｔ  １９９１、１９８７、１９８３を参照されたい）もしくは構造によって定められる超可変ループ（ＨＶＬ）（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ  １９８７を参照されたい）またはその両方であり得る。
【００８３】
「生体分子コーティング」とは、天然の生体分子もしくは生化学物質または１つもしくは複数の天然の生体分子もしくは生化学物質に由来するかこれに基づく生化学物質である分子を含む、表面上のコーティングのことである。例えば、生体分子コーティングは、細胞外マトリックス成分（例えば、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、その他の糖タンパク質、ペプチド、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、ビトロネクチン、細胞間ＣＡＭ、血管ＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ）またはその誘導体を含み得るか、天然の生化学物質であるリジンおよびオルニチンに基づく高分子であるポリリジンまたはポリオルニチンなどの生化学物質を含み得る。アミノ酸などの天然の生化学物質に基づく高分子は、天然の生化学物質の異性体または鏡像異性体を用いることができる。コーティングは、細胞表面受容体または細胞表面コグネイト結合タンパク質または前記細胞表面タンパク質に対する親和性を有するタンパク質も含み得る。
【００８４】
「ベースライン測定」という用語は、試験する細胞の組の生理学的開始点を指し、薬物を加える前の一定時間にわたる測定の評価に基づくものである。これには、外因性の活性化の前の基礎細胞代謝測定またはＣＲｅＭＳ読取りが含まれ得る。あるいは、特に限定されないが、外因性の活性化がある場合またはない場合の正常な健常細胞の代謝機能のＣＲｅＭＳ測定がこれに含まれ得る。
【００８５】
「細胞応答測定システム」または「ＣＲｅＭＳ」という用語は、細胞内、複数の細胞内と細胞間および複数の細胞間の生理応答または細胞応答パラメータの変化を定量的に求めることができる装置または計装機器を指す。諸実施形態では、細胞は無標識全細胞である。生理応答または細胞応答パラメータの変化は、グルコース、酸素、二酸化炭素、アミン含有物質、例えばタンパク質、アミノ酸などの分析物、細胞外マトリックス、細胞シグナル伝達分子、細胞増殖、細胞形態または細胞骨格再構築の変化を求めることによって測定される。ＣＲｅＭＳの例にはバイオセンサーがある。
【００８６】
本明細書で使用される「ＣＲｅＭＳシグナル」という用語は、細胞を化学・電気ＣＲｅＭＳにより解析したときの細胞の生理学的変化の尺度と定義される。ＣＲｅＭＳシグナルおよびＣＲｅＭＳシグナルの変化には、生理学的変化を測定する特定の化学・電気トランスデューサーと関係のある様々な単位を有し得る。例えば、ＣＲｅＭＳシグナルは、特に限定されないが、細胞指数、インピーダンス、波長の単位、ｐＨ単位、電圧、電流の単位を有し得るか、単位の比を用いることによって無次元になり得る。これらの単位のいずれかは時間成分を有するものであり得る。ＣＲｅＭＳシグナルは、解釈を明確にするため、生物学、生化学および生物物理学の当業者が頻繁に実施するように、例えば、正規化、ベースライン設定、曲線減算またはその任意の組合せを含め数学的に修正することができる。ＣＲｅＭＳシグナルは、単一の時点で、またはより好ましくは、細胞の生理応答の全パターンを表す連続する時点で測定し得る。
【００８７】
ＣＲｅＭの「光学的シグナル」という用語は、細胞を置いたフォトニック結晶バイオセンシングＣＲｅＭＳから光が反射されるときに測定される波長値または波長値の変化と定義される。単位は通常、ピコメートルまたはナノメートルであるが、変化の比を報告する場合、無次元であってもよい。「光学的シグナル」は、前記単位と時間を組み合わせてもので表すこともできる。反射される光の波長のシフトは、フォトニック結晶表面にある質量に比例する。したがって、「光学的シグナル」はＣＲｅＭＳ上の細胞数の定量的測度の１つである。さらに、例えば細胞形態、細胞接着、細胞生存能、細胞構造の再構築によって、波長のシフトとして検出されるセンサー上の質量の大きさに差が生じることから、「光学的シグナル」は細胞の生理学的状態の尺度の１つとなる。
【００８８】
本明細書で使用される「細胞指数」という用語は、インピーダンスの測定値と定義され、例えば１０ｋＨｚに固定した電気的周波数と固定電圧で測定することによって本発明の一例に適用することができる。
【００８９】
また、細胞指数ｉ＝（Ｒｔｎ−Ｒｔ０）／Ｆの式によって算出され、式中、
ｉ＝１つ、２つまたは３つの時点であり、
機器を周波数１０ｋＨｚで稼働させる一例では、Ｆ＝１５オームであり、
Ｒｔ０は、時点Ｔ０で測定したバックグラウンド抵抗であり、
Ｒｔｎは、細胞の添加、細胞の生理学的変化または細胞の活性化からの時点Ｔｎで測定した抵抗である。
【００９０】
細胞指数は、細胞の状態を表す電気インピーダンス測定値の相対的変化として得られる無次元パラメータである。細胞が存在しないか、電極に十分に接着していない場合、ＣＩは０となる。同じ生理学的条件下で、電極に付着する細胞が多くなると、ＣＩ値は大きくなる。したがって、ＣＩはウェル中に存在する細胞数の定量的測度の１つとなる。さらに、細胞の生理学的状態、例えば、細胞形態、細胞接着または細胞生存能が変化すると、ＣＩが変化する。
【００９１】
「測定量」という用語は、臨床試験で測定しようとする量と定義される。本明細書に記載される本発明では、測定しようとする量とは活性化に対する細胞の生理応答の変化のことである。活性化に対する細胞の生理応答の測定値の変化は、様々なユークリッド数理解析を用いて数学的に求めることが可能であり、定量試験の場合は数値として報告することができ、定性試験の場合は陽性または陰性で報告することができる。定量試験および定性試験ではともに、測定量（例えば、試験結果）と、上回る場合と下回る場合とで異なる臨床的判断または臨床的解釈が下されるカットオフ値とを比較する。
【００９２】
「出力値」という用語は、測定量の一種であり、シグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす１つもしくは複数の活性化因子薬剤および／または活性化因子薬剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす１つもしくは複数の治療剤と接触させた対象由来の生存細胞試料に起こる細胞の接着または付着の測定値などのＣＲｅＭＳシグナルの差を指す。出力値は、一定時間にわたって取得したＣＲｅＭＳシグナルの様々なユークリッド数理解析を用いて求めることができ、定量試験の場合は数値として報告することができ、定性試験の場合は陽性または陰性で報告することができる。例えば、活性化因子薬剤のみと接触させた対象由来の細胞試料では１，０００単位のＣＲｅＭＳシグナルが発生し、活性化因子薬剤および治療剤と接触させた同じ対象由来の細胞試料では１００単位のＣＲｅＭシグナルが発生し得る。この例の出力値は９００ＣＲｅＭＳシグナル単位と等しくなり、この値は、活性化因子薬剤のみと接触させた細胞試料ならびに活性化因子薬剤と治療剤を組み合わせて接触させた細胞試料で測定したＣＲｅＭＳシグナル単位の差である。定量試験および定性試験ではともに、出力値（例えば、試験結果）と、上回る場合と下回る場合とで異なる臨床的判断または臨床的解釈が下されるカットオフ値とを比較し得る。
【００９３】
「出力値パーセント」という用語は、シグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす１つまたは複数の活性化因子薬剤および活性化因子薬剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす１つまたは複数の治療剤と接触させた患者細胞試料由来の生存細胞試料に、１つもしくは複数の活性化因子薬剤または１つもしくは複数の治療剤のみと接触させた試料と比較したときにみられるＣＲｅＭＳシグナルのパーセント変化を指す。例えば、活性化因子薬剤のみと接触させた対象由来の細胞試料では１，０００単位のＣＲｅＭＳシグナルが発生し、活性化因子薬剤および治療剤と接触させた同じ対象由来の細胞試料では１００のＣＲｅＭｓが発生し得る。この例の出力値パーセントは９０％と等しくなり、この値は、活性化因子薬剤のみと接触させた細胞試料ならびに活性化因子薬剤と治療剤を組み合わせて接触させた細胞試料で測定したＣＲｅＭＳシグナル単位の差を、活性化因子薬剤のみと接触させた細胞試料で測定したＣＲｅＭＳシグナル単位で除したものである。定量試験および定性試験ではともに、出力値パーセントと、上回る場合と下回る場合とで異なる臨床的判断または臨床的解釈が下されるカットオフ値パーセントとを比較し得る。
【００９４】
「基本形態」という用語は、活性化因子または刺激を導入する前の細胞または細胞試料の形態および構造を指す。
【００９５】
「細胞接着」（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ）（「ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ」（細胞接着）、「ｃｅｌｌ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ」または「ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ」（ともに細胞付着）と互換的に使用される）という用語は、細胞と別の細胞、細胞外マトリックス成分または表面（例えば、マイクロタイタープレート）との結合を指す。
【００９６】
「バイオマーカー」という用語は、最も一般的な意味では、細胞の状態または患者の健康状態もしくは疾患状態の生物学的の測定基準を指す。一般的なバイオマーカーの非限定的なリストには、哺乳動物にみられる生体由来分子、哺乳動物の細胞または組織の生物活性、遺伝子コピー数、遺伝子変異、一塩基多型、遺伝子発現レベル、ｍＲＮＡレベル、スプライスバリアント、転写修飾、転写後修飾、エピジェネティック修飾、細胞表面マーカー、タンパク質または核酸（あらゆる形態の機能性ＲＮＡを含む）の差次的発現、核酸の増幅、細胞形態、翻訳後修飾、タンパク質短縮、リン酸化、脱リン酸化、ユビキチン化、脱ユビキチン化、代謝産物、任意の生合成段階のホルモン、サイトカイン、ケモカインおよびそれらの組合せが含まれる。病理学者が疾患を診断し医師が治療法を指示するのを補助するために診断および治療法を選択するには、バイオマーカーのサブセットを使用する。バイオマーカーは通常、固定しマウントした組織の遺伝子コピー数、遺伝子変異またはタンパク質のレベルをタンパク質の状態も活性も明らかにせずに測定するものである。本発明は、新たなタイプのバイオマーカー、生存している患者細胞試料の活性または動態に関する結果である生理応答パラメータを含む。
【００９７】
「バイオマーカーの状態」という用語は、患者または患者の細胞のバイオマーカー（１つまたは複数）の評価を指し、通常、バイオマーカーが存在する場合は「バイオマーカー陽性」と報告し、バイオマーカーが存在しない場合は「バイオマーカー陰性」と報告する。タンパク質受容体をバイオマーカー（例えば、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２またはＥＲ）として使用する場合、バイオマーカー陽性の結果を受容体が過剰発現している、または増幅されているとも言い、バイオマーカー陰性の結果を受容体が通常に発現している、または増幅されていないと言う。バイオマーカーまたはバイオマーカーシグネチャーが疾患進行の予後指標となる、または治療有効性を予測するものである疾患では、現在の診療は、患者をバイオマーカー陰性またはバイオマーカー陽性に分類することによって患者の診断の精度を高めるため、バイオマーカーまたはそれに関連する変異の量を測定することに依存している。バイオマーカーの状態の判定は多くの場合、患者を治療する薬物治療の選択の指針とするために用いられる。バイオマーカー陽性とバイオマーカー陰性の患者を鑑別するのに使用するバイオマーカー測定値のカットオフ値は、バイオマーカーによって異なる。バイオマーカーが薬物標的である場合、カットオフ値は、上回れば患者にそのバイオマーカーを標的とする治療薬を投与し、下回ればそのバイオマーカーを標的とする治療薬を投与しない条件となる。バイオマーカーの臨床的関連性を確認するには通常、臨床試験が必要となる。
【００９８】
「バイオセンサー」という用語は、分析物または分析物もしくは細胞の生理学的状態の変化を測定する装置を指す。諸実施形態では、バイオセンサーには通常、３つの部分、すなわち、分析物（細胞外マトリックス、細胞シグナル伝達分子、または細胞増殖、組織、細胞、代謝産物、異化産物、生体分子、イオン、酸素、二酸化炭素、炭水化物、タンパク質などの非限定的な例を含む）と結合する、またはこれを認識する生体構成要素または生体素子、検知素子（物理化学的方法、例えば光学的方法、圧電気的方法、電気化学的方法、温度測定学的方法または磁気的方法で稼働する）およびこの２つの構成要素に関連するトランスデューサーが含まれている。
【００９９】
「光学バイオセンサー」という用語は、光の蛍光、吸収、透過率、密度、屈折率および反射を測定する装置を指す。諸実施形態では、光学バイオセンサーは、生細胞、病原体またはそれらの組合せにおける分子認識または分子活性化事象を定量化可能なシグナルに変換する光学的トランスデューサーを含み得る。さらに、諸実施形態は、フォトニック結晶装置、光学的導波管装置および表面プラズモン共鳴装置を含み得る。
【０１００】
「インピーダンスバイオセンサー」という用語は、生きた患者細胞の複素インピーダンスの変化（デルタＺまたはｄＺ）を測定する装置を指し、ここでは、インピーダンス（Ｚ）は、オームの法則によって記載される電圧と電流の比と関係がある（Ｚ＝Ｖ／Ｉ）。インピーダンスバイオセンサーは、電極と細胞との界面における局所的イオン環境に対する感度が高く、これらの変化を電圧と電流の変動の関数として検出する。細胞の正常な機能または活性化による細胞の生理学的変化が、電極周囲の電流の流れに定量化可能な変化を生じさせ、測定されるシグナルの大きさおよび特徴に影響を及ぼす。諸実施形態では、インピーダンスバイオセンサーは、生細胞、病原体またはそれらの組合せにおける分子認識または分子活性化事象を定量化可能なシグナルに変換する電極または電気回路を含み得る。諸実施形態では、ＩＳＦＥＴバイオセンサーは、生細胞、病原体またはそれらの組合せにおける分析物認識または細胞活性化事象を定量化可能なシグナルに変換するイオン選択電界効果電気トランスデューサーを含み得る。ＩＳＦＥＴバイオセンサー内の分析物濃度が変化すると、トランジスタ内の電流が変化して定量化シグナルが発生する。
【０１０１】
「細胞シグナル伝達」という用語は、細胞内または細胞間の情報伝達を指す。細胞シグナル伝達は、細胞間の直接的な接触によって、またはある細胞から物質が放出され、それが別の細胞に取り込まれることによって達成され得る。細胞間シグナル伝達は、２つの分子（例えば、リガンドと受容体）の間の相互作用を介して起こり得る。受容体結合により細胞内シグナル伝達のカスケードが誘発され得る（例えば、細胞内での生化学的変化または膜電位の変更の惹起）。
【０１０２】
「シグナル伝達経路」という用語は、細胞内または細胞間のコミュニケーションまたは情報伝達に関与する一連の細胞成分を指し、細胞表面受容体、核内受容体、シグナル調節タンパク質および細胞内シグナル伝達がこれに含まれる。本明細書で使用される特定の「シグナル伝達経路」は、細胞内シグナル伝達のカスケードを誘発する細胞表面受容体に従って、または細胞内シグナル伝達に関与するいずれかの成分に従って命名され得る。例えば、ＥＧＦとＥＧＦＲが結合すると、ＭＡＰＫおよび／またはＰＩ３Ｋを含み得るシグナル伝達経路活性化が惹起される。したがって、「ＥＧＦＲシグナル伝達経路」、「ＭＡＰＫシグナル伝達経路」および「ＰＩ３Ｋシグナル伝達」という用語はそれぞれ、ＥＧＦとＥＧＦＲとの結合によって惹起されるシグナル伝達経路を包含するよう使用され得る。
【０１０３】
「シグナル伝達活性」、「経路活性」、「細胞シグナル伝達活性」および「シグナル伝達経路活性」という用語は互換的に使用され、シグナル伝達経路の機能が異常または正常であるときに起こる事象を指す。シグナル伝達活性は、主として１つの細胞表面受容体（例えば、ＥＧＦ経路を惹起するＥＧＦ受容体）によるものであることが多い。ただし、ある経路のシグナル伝達活性が、シグナル伝達経路の細胞表面受容体の上流、下流または側方にある他のシグナル伝達経路の経路メンバーによるシグナル伝達活性によって駆動されることがある。このことは、シグナル伝達活性が互いにつながっており、複数の経路収束点、経路間のクロストークおよび経路間のフィードバックループによって、ある経路のシグナル伝達活性が別の経路のシグナル伝達活性に影響を及ぼすことが可能になるという性質を反映している（Ｇｉｕｌｌｉａｎｏら，Ｂｉｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｒｏｓｓｔａｌｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｒｅ（Ｂａｓｅｌ）．２０１３  Ａｕｇ；８（４）：２５６−２６２を参照されたい）。したがって、互いにつながった２つ以上の経路のシグナル伝達活性によって腫瘍が駆動される癌患者が、異常に機能している経路の活性化地点とは異なる標的と結合する標的療法に応答することがある。癌の性状および複雑さのため、癌患者のシグナル伝達経路機能不全に、健常な正常集団では一般に記載されていない固有の他の経路との相互のつながりが含まれていることがある。
【０１０４】
「ＨＥＲファミリー関連シグナル伝達経路」は、ＨＥＲファミリー受容体（ＨＥＲ１／ＥｒｂＢ１／ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ３およびＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４）を介するシグナル伝達に関連する細胞内シグナル伝達経路を指す。ＨＥＲファミリー受容体および各受容体と結合することがわかっている対応するリガンドの非限定的な例を下の表１にまとめる：
【表１】
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【０１０５】
ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２には特異的リガンドがあることは明らかにされていないが、例えばＨＥＲ１／ＨＥＲ３リガンドを組み合わせて使用することにより、ＨＥＲ２によるシグナル伝達活性を評価することが可能であることが当該技術分野で公知である。
【０１０６】
「ＥＲ関連シグナル伝達経路」という用語は、ＥＲαおよびＥＲβを含めたエストロゲン受容体（ＥＲ）を介するシグナル伝達に関連する細胞内シグナル伝達経路を指す。ＥＲに対する既知のリガンド（ＥＲのアルファアイソフォームまたはベータアイソフォームに対する親和性が異なり得る）としては、エストラジオール、エストロン、ラロキシフェン、エストリオールおよびゲニステインが挙げられる。
【０１０７】
「細胞骨格構築」という用語は、細胞の内部の足場の配置を指す。細胞の細胞骨格は、細胞質もしくは膜要素および／または細胞内小器官を支える役割を果たすフィラメントを含む。細胞骨格は細胞形状の維持も補助する。
【０１０８】
「細胞増殖」という用語は、細胞成長および細胞分裂による細胞数の増加を指す。
【０１０９】
「細胞生存能」という用語は、代謝、成長、運動、増殖、何らかの形の応答および順応性などの特定の機能を発揮する能力を特徴とする細胞の生存能を指す。
【０１１０】
「有効性」という用語は、特定の介入により有益な結果が得られる程度を指す。諸実施形態では、介入は、既知のタンパク質に対して介入の親和性および特性が高い小分子、抗体または有機試薬の標的化ペプチドなどの治療剤であり得る。有益な結果としては、特に限定されないが、症状の抑制、細胞成長の低下、細胞殺作用の増大、客観的な腫瘍応答、患者の生存期間の増大、患者の無進行生存期間の増大、患者の無病生存期間の増大、炎症の軽減および免疫応答性の増大が挙げられる。
【０１１１】
「細胞外マトリックス成分」とは、動物の細胞外マトリックスにみられる分子のことである。細胞外マトリックス成分は、任意の種および任意の組織タイプの細胞外マトリックスの成分であり得る。細胞外マトリックス成分の非限定的な例としては、ラミニン、コラーゲン、フィブロネクチン、その他の糖タンパク質、ペプチド、グリコサミノグリカン、プロテオグリカンなどが挙げられる。細胞外マトリックス成分には成長因子も含まれ得る。
【０１１２】
「包括的表現型」という用語は、細胞または細胞試料全体に観察される複数の特性または複合的な特性を指し、発生、生化学的または生理学的特性、生物季節学、行動および行動の産物を反映するものである。包括的表現型としては、特に限定されないが、細胞の大きさ、細胞形状、独特の隆起、増生、拡散、付着病巣密度、細胞骨格の配置、細胞増殖パターン、受容体食作用または付着病巣数、ｐＨ、代謝産物、シグナル伝達タンパク質および成長因子の取込みまたは流出、酸素、ＣＯ２、グルコース、ＡＴＰおよびイオン、例えばマグネシウム、カルシウム、カリウムなどの変化が挙げられる。
【０１１３】
「事象特異性」という用語は、細胞の特異的特性の物理的観察結果を指す。このような特定の特性は、特定の活性化因子または治療剤に対して意図および／または予想される細胞の生理応答の一部としての特異的細胞機能、外因性活性化または経路アゴニズム／アンタゴニズムと関係がある。活性化因子および治療剤は、細胞骨格構造または細胞内経路などの細胞機能のある特定の側面に影響を及ぼすよう標的化されていることがわかっているものであり得る。活性化因子または治療剤の存在下で細胞に物理的に観察される事象は、活性化因子または治療剤が細胞に及ぼすことが意図および／または予想される効果を反映していることから、物理的に観察可能な事象は事象特異性と呼ばれる。例えば、付着バイオセンサー型のＣＲｅＭＳ上のほとんどの細胞試料にビンブラスチンを加えると、シグナルが大幅に減少する。ビンブラスチンは細胞の細胞骨格足場を破壊する。このシグナルの減少は、微小管分子に対する薬物の作用によって引き起こされる細胞形状および付着の喪失と特異的に結びついた細胞の物理的に観察可能な事象である。
【０１１４】
「相乗効果」または「相乗的」という用語は、細胞試料を２つ以上の活性化剤および／または２つ以上の治療剤で試験して測定されたＣＲｅＭＳシグナル、出力値または出力値パーセントが、細胞試料を活性化因子薬剤および／または治療剤で個別に試験して得られた対応する測定結果の合計より大きい場合の試験結果を指す。２つの活性化剤と接触させた細胞試料に２つの治療剤を同時に加えることにより、２つの活性化因子薬剤を同時に用いて各治療剤を個別に試験して得られるＣＲｅＭｓシグナル、出力値または出力値パーセントより大きいＣＲｅＭＳシグナル、出力値または出力値パーセントが得られるとき、相乗的結果が起こると思われる。例えば、ある細胞試料において、活性化因子薬剤ＥＧＦとＨＧＦの組合せおよび単独のＥＧＦＲ阻害剤を用いて細胞試料の一部を試験した後に測定した出力値は２５０である。同じ活性化因子薬剤の組合せ（ＥＧＦおよびＨＧＦ）および単独のＨＧＦＲ阻害剤で同じ細胞試料の異なる一部を試験すると、出力値は１５０となる。しかし、同じ細胞試料の異なる一部を活性化因子薬剤ＥＧＦとＨＧＦの組合せおよびＥＧＦＲ阻害剤とＨＦＧＲ阻害剤の組合せで試験した後に測定した出力値は９００である、つまり、２つの活性化因子薬剤を用いて各阻害剤を単独で試験した試験の２つの出力値の合計（２５０＋１５０）より５００大きい。２つの治療剤を個別ではなく、組合せで試験して得られる出力値の方が大きいことは、２つの治療剤が、活性化因子薬剤によって活性化されるシグナル伝達経路に対して相乗的阻害効果を示すことを示唆している。したがって、相乗効果は、シグナル伝達経路が単独で活性化または阻害される場合に観察することができない細胞シグナル伝達活性の変化を表すものである。
【０１１５】
本明細書で使用される「インピーダンス」という用語は、電圧と電流を式：インピーダンス（オーム）＝電圧（ボルト）／電流（アンペア）またはＺ＝Ｖ／Ｉによって結びつける物理法則により定義される。
【０１１６】
治療または治療法を目的とする「哺乳動物」は、ヒト、家畜および農業動物ならびに動物園の動物、競技用動物または愛玩動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含めた哺乳動物に分類される任意の動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１１７】
「マイクロカンチレバー装置」、「マイクロカンチレバーアレイ」または「マイクロカンチレバー器」という用語は、用途に応じて棒状、Ｖ字状であるか、その他の形状を有し得る柔軟な梁であるカンチレバーを少なくとも１つ備えたＣＲＥＭＳ機器の一種を指す。マイクロカンチレバーの一方の端は支持土台に固定され、もう一方の端は自由な状態で立っている。マイクロカンチレバーにより、電気的方法を用いて濃度を測定して位相差シグナルを検出し、それを自然な共鳴周波数とマッチさせ（参照により本明細書に組み込まれる２０００年３月２８日に発行された米国特許第６，０４１，６４２号に記載されている例）、既知の分子、例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質などの高分子生体分子を配置したマイクロカンチレバーの共鳴特性の変化を用いて標的種の濃度を求めることができる。光学的および圧電的方法を用いて偏向を測定する。
【０１１８】
「正常な機能」という用語は、細胞が不自然なレベルのシグナル伝達、複製、接触阻害の喪失ならびに異常な遺伝子コピーおよび増幅により機能不全に陥るのを防ぐチェックおよびバランスの明確なシステムを有する細胞内の経路を指す。経路が何らかの静止状態または安定な基底状態から始まる多くの場合、経路のメンバーのＥＣ５０濃度で活性化因子を少量加えても、細胞システムが活性化因子を認識し、経路活性を惹起し、次いで活性化因子の効果を下方制御して他の細胞機能とのバランスを維持するため、小さな一過性の効果を示すにとどまる。病的な機能は多くの場合、活性化因子に対する過剰反応、経路に沿った活性亢進／低下、活性化因子の効果を調節する経路間の不適切な活性および最小限の活性化因子の効果を下方制御できないこととして認識することができる。さらに、いくつかの疾患状態では、経路のいくつかの経路メンバーの基底状態に達することができない。これらのシステムは恒常的に活性化されていると記載されている。
【０１１９】
「正常基準範囲」という用語は、本明細書では、健常対象（例えば、目的とする疾患のない対象）の集団から得られる値の特定の割合が含まれると推定される基準上限値および基準下限値の２つの数値を含めたその間の区間とし定義される。ほとんどの分析物では、基準上限値および基準下限値はそれぞれ、基準集団の試験結果の分布の第２．５百分位数および第９７．５百分位数であると推定される。いくつかの場合には、一方の基準限界値、通常は上限値、すなわち第９７．５百分位数のみが医学的に重要なものである。基準範囲の限界値の推定値の信頼区間は、基準集団、一般には約１２０例の対象の無作為抽出を仮定して構築することができる。各信頼区間の幅は、基準対象の数および観察された基準値の分布に左右される。
【０１２０】
正常基準範囲カットオフは、基準個体、それらの基準個体に適用する分析方法の選択過程により決定および設定され、刊行物のＣｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ａｐｐｒｏｖｅｄ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ＥＰ２８−Ａ３Ｃ「Ｄｅｆｉｎｉｎｇ，Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ，ａｎｄ  Ｖｅｒｉｆｙｉｎｇ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｒｖａｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ」（その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる）によって定められるデータ収集および解析により結論を導く。
【０１２１】
一実施形態では、基準個体は、疾患、特にあらゆる形態の癌のない個体となり得る。正常基準範囲は、本明細書に記載される方法を用いて正常な基準個体を試験することによって求め得る。正常基準範囲の上限値は正常な経路活性の上限値となり得る。一実施形態では、陽性の試験結果と陰性の試験結果の間を鑑別するカットオフ値が正常基準範囲の上限値となり得る。他の実施形態では、カットオフ値は、正常基準範囲の上限値に以下の値：検出限界値、ブランク限界値、定量限界値、測定量の標準偏差の１つ、組合せまたはすべてのいずれか、組合せ、すべてまたは複数のものを加えたものとなり得る。
【０１２２】
疾患に罹患のない基準個体のグループは、目的とする疾患以外の様々な特徴によってさらに定義され得る。例えば、本発明を乳癌に適用するにあたっては、疾患のない基準女性のグループは、以下の特徴：閉経前または閉経後であること、授乳中である、もしくは授乳中でないこと、出産経験があること、ＢＲＣＡ遺伝子変異を有すること、糖尿病、ＢＭＩ（体格指数）によって判定される肥満症が認められること、ホルモンなどの薬物による離脱症状もしくはその他の薬物中毒、アルコールなどの食物物質による離脱症状および／または癌の家族歴のいずれか、組合せまたはすべて含むものとさらに定義され得る。
【０１２３】
「異常なシグナル伝達経路」または「機能不全のシグナル伝達経路」という用語は、互換的に使用され、細胞がその正常な機能を発揮する能力が損なわれるよう崩壊した細胞シグナル伝達経路を指す。細胞シグナル伝達の崩壊およびそれによる機能不全の発生源は通常、シグナル伝達経路の正常な機能に干渉するゲノムまたはプロテオームの損傷の結果である。この損傷は、例えば、ＤＮＡ複製の誤りなどの内因性過程、特定のＤＮＡ塩基の内因性の化学的不安定性、腫瘍微小環境、動的システムの調整もしくは選択、または代謝過程で生じたフリーラジカルによる攻撃の結果であり得る。ゲノムの完全性の維持を担う遺伝子にいくつかの不活性化変異が起こり、さらなる変異を獲得させる。ゲノムレベルの細胞制御に影響を及ぼすさらなる機序には、ヒストンタンパク質の機能の変化によって特定の遺伝子の発現が変化するエピジェネティックな機序が含まれる。エピゲノム機能は、疾患の原因および伝播に関与する条件を含めた多数の様々な環境条件に対する適応性または応答性が高いことが明らかにされている。経路機能不全に関する様々なＲＮＡベースの機序が転写レベル、転写後レベル、翻訳レベルおよび翻訳後レベルで記載されている。
【０１２４】
さらに、タンパク質レベルでの経路機能不全の作用が多数、細胞分子生物学の当業者に知られている。経路機能不全は、経路の１つもしくは複数のメンバーもしくは補因子の過剰発現もしくは過小発現、不自然な細胞タイプもしくは細胞部位にみられるタンパク質活性、経路交差反応性としても知られるタンパク質と異常な経路メンバーとの相互作用、機能不全のフィードバックループもしくはフィードフォワードループまたは翻訳後修飾の結果であり得る。経路機能不全はさらに、プロテオーム、プロテアソーム、カイノーム、メタボローム、核タンパク質および核因子、細胞質タンパク質および細胞質因子ならびに／あるいはミトコンドリアタンパク質およびミトコンドリア因子の活性の結果であり得る。
【０１２５】
機能不全の経路を有する細胞が複製されるとき、その子孫に異常が伝わり、それにより細胞が疾患を有するようになる可能性が高くなり得る。生細胞の細胞シグナル伝達経路の活性を解析することにより、その細胞のシグナル伝達経路が正常に機能しているのか、異常に機能しているのかを判定することが可能である。
【０１２６】
「超感受性シグナル伝達経路」または「機能亢進性シグナル伝達経路」という用語は、互換的に使用され、極めて低レベルのシグナル伝達経路活性化因子などの細胞入力の差（例えば、受容体リガンド濃度の１ｎＭ〜１０ｎＭの差）があるだけでも、低レベルの活性（例えば、１０％の細胞入力）を極めて高レベルの経路活性化応答性（例えば、９０％の細胞入力）に変化させることが可能な細胞シグナル伝達経路を指す。超感受性または機能亢進性シグナル伝達経路内の成分（例えば、酵素）が、活性を１０％の最大応答から９０％の最大応答にするのに８１倍未満の刺激の増加を必要とする場合、それを超感受性または機能亢進性であるとするのが通常である。シグナル伝達経路の超感受性については、Ｆｅｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．およびＨａ，Ｓ．Ｈ．（２０１４）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３９：４９６−５０３；Ｆｅｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．およびＨａ，Ｓ．Ｈ．（２０１４）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３９：５５６−５６９；Ｆｅｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．およびＨａ，Ｓ．Ｈ．（２０１４）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．３９：６１２−６１８；Ｈｕａｎｇ，Ｃ．Ｙ．およびＦｅｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９３：１００７８−１００８３；Ｋｉｍ，Ｓ．Ｙ．およびＦｅｒｒｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．（２００７）Ｃｅｌｌ  １２８：１１３３−１１４５；Ｔｒｕｎｎｅｌｌ，Ｎ．Ｂ．ら（２０１１）Ｃｅｌｌ  ４１：２６３−２７４に詳細に記載されており、その全体が参照により組み込まれている。
【０１２７】
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡがこれに含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基および／またはその類似体、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、または合成反応によってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドなどの修飾ヌクレオチドおよびその類似体を含み得る。ヌクレオチド構造の修飾がある場合、それは、ポリマーの組立ての前または後に施され得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、合成後、標識とのコンジュゲーションによってさらに修飾され得る。その他のタイプの修飾としては、例えば、「キャップ」、１つまたは複数の天然のヌクレオチドの類似体による置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマートなど）を有する修飾および荷電結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアートなど）を有する修飾、例えばタンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジンなど）などのペンダント部分を含む修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）による修飾、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含む修飾、アルキル化剤を含む修飾、修飾結合を有する修飾（例えば、アルファアノマー核酸など）および未修飾形態のポリヌクレオチド（１つまたは複数）などが挙げられる。さらに、糖内に通常存在するいずれかのヒドロキシル基を、例えばホスホン酸基、リン酸基によって置換するか、標準的な保護基によって保護するか、または活性化させて追加のヌクレオチドとの追加の結合を準備し得るか、あるいは固体または半固体の担体とコンジュゲートし得る。５’末端および３’末端のＯＨをリン酸化するか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子からなる有機キャッピング基部分で置換し得る。他のヒドロキシルを標準的な保護基に誘導体化してもよい。ポリヌクレオチドは、例えば２’−Ｏ−メチル−リボース、２’−Ｏ−アリル−リボース、２’−フルオロ−リボースまたは２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、アルファアノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環状類似体およびメチルリボシドなどの塩基ヌクレオシド類似体を含めた当該技術分野で一般に知られている類似形態のリボース糖またはデオキシリボース糖を含んでいてもよい。１つまたは複数のホスホジエステル結合を代替的連結基に置き換え得る。これらの代替的連結基としては、特に限定されないが、リン酸がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオアート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオアート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ’、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）に置き換わっており、ＲまたはＲ’がそれぞれ独立に、Ｈであるか、または置換されている、もしくは置換されていない、任意選択でエーテル（−−Ｏ−−）結合を含むアルキル（１〜２０Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルもしくはアラルジルである、実施形態が挙げられる。ポリヌクレオチド内の結合がすべて同一である必要はない。上記の説明は、本明細書で言及されるＲＮＡおよびＤＮＡを含めたあらゆるポリヌクレオチドに適用される。
【０１２８】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸を２つ以上含むペプチドまたはタンパク質を指し、ペプチド、オリギマー（ｏｌｉｇｉｍｅｒ）、タンパク質などを包含する。ポリペプチドは、天然アミノ酸、修飾アミノ酸または合成アミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングまたはアミド化、アシル化、架橋などの化学反応などによって自然に修飾されていてもよい。
【０１２９】
「水晶共振器／水晶振動子マイクロバランス」という用語は、測定しようとするウイルスまたは他の任意の微小な物体などの小さな質量を加えることによって圧電水晶の周波数が乱れるとき、その変化を測定することによって質量を測定するＣＲＥＭＳ装置の一種である。周波数を高精度に測定することが容易であり、このため、小さな質量を測定するのが容易になる。
【０１３０】
本明細書で使用される「試料」は、本開示の装置、マイクロプレートまたは方法を用いて単離、操作、測定、定量化、検出または解析する部分を含有し得るあらゆるものを指す。試料は、生体液または生体組織などの生体試料であり得る。生体液の例としては、細胞培地などの培地に細胞を懸濁させたもの、尿、血液、血漿、血清、唾液、精液、糞便、痰、脳脊髄液、涙、粘液、羊水などが挙げられる。生体組織とは、通常特定の種類の細胞が細胞間物質とともに集合し、ヒト、動物、植物、細菌、真菌またはウイルスの構造の構造材料の１つを形成しているもののことであり、結合組織、上皮組織、筋組織および神経組織がこれに含まれる。生体組織の例としては、臓器、腫瘍、リンパ節、動脈および個々の細胞（１つまたは複数）も挙げられる。生体試料としてはさらに、細胞懸濁物、生体分子（例えば、タンパク質、酵素、核酸、炭水化物、生体分子と結合している化学分子）を含有する溶液が挙げられる。
【０１３１】
「細胞試料」という用語は、特定の対象から単離された細胞を指し、ここでは、細胞は対象の生体液、分泌物または組織から単離したものである。組織から単離された細胞は腫瘍細胞を含み得る。組織から単離した細胞は、ホモジナイズした組織および細胞抽出物ならびにそれらの組合せを含む。細胞試料としては、特に限定されないが、血液、血清、血漿、尿、精液、精漿、前立腺液、先走り液（カウパー腺液）、排泄物、涙、唾液、汗、生検試料、腹水、脳脊髄液、リンパ、骨髄または毛髪からの単離が挙げられる。
【０１３２】
「ＣＥＬｘ」試験という用語は一般に、本明細書に記載される方法の様々な実施形態を指す。
【０１３３】
「疾患細胞試料」という用語は、疾患部位の複数の細胞または疾患の特徴を有する細胞を指す。
【０１３４】
「健常細胞試料」という用語は、細胞が、試験する疾患のないものであるか、または試験する疾患のない組織から抽出したものである、細胞試料を指す。例えば、ある特定の対象の乳癌に対する治療剤の効果についてその対象を試験する場合、非癌性の細胞または非乳腺組織由来の細胞を「健常」であるとする。「健常細胞試料」という用語は、対象全体の健康状態を判定するものでも示すものでもない。正常基準範囲を導き出す目的で、使用する健常細胞試料を試験する疾患のない対象から採取することが多い。
【０１３５】
解析の「感度」という用語は、試験または検出の限界を指し、ゼロと区別される最も少ない量と定義される。（例えば、９５％の信頼区間またはゼロ対照の平均値の２標準偏差（ＳＤ）上側がよく用いられる）。
【０１３６】
臨床「感度」という用語は、標的病態を有し試験結果が陽性である対象の割合または目的とする病態がある場合に試験結果が陽性となる頻度を指す。ある試験の臨床「感度」は、１００％×ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）を計算することによって得られる精度の推定値と定義され、式中、ＴＰは試験する転帰の真陽性事象の数であり、ＦＮは偽陰性、つまり、誤って陰性と判定された事象の数である。
【０１３７】
臨床「特異性」は、標的病態がなく試験結果が陰性である対象の割合または目的とする病態がある場合に試験結果が陰性となる頻度を指す。臨床特異性は、１００％×ＴＮ／（ＦＰ＋ＴＮ）を計算することによって推定され、式中、ＴＮは試験する転帰の真陰性事象の数であり、ＦＰは偽陽性、つまり、誤って陽性と判定された事象の数である。
【０１３８】
「表面プラズモン共鳴装置」という用語は、局所屈折率の変化を検出することによって金属表面での生体分子の結合事象を測定する光学バイオセンサー型のＣＲｅＭＳを指す。
【０１３９】
「治療剤」という用語は、生物体（ヒトまたは非ヒト動物）に投与すると、局所作用および／または全身作用によって所望の薬理効果、免疫原性効果および／または生理学的効果を引き起こす、任意の合成または天然の生物学的に活性な化合物または組成物を指す。この用語は、タンパク質、ペプチド、ホルモン、核酸、遺伝子構築物などの分子を含め、従来、薬物、ワクチンおよびバイオ医薬品とされてきた化合物または化学物質を包含する。薬剤は、獣医学を含めた医学的用途および植物などを用いる農業ならびにその他の領域で使用される生物学的に活性な薬剤であり得る。治療剤という用語は、特に限定されないが、薬物；ビタミン；ミネラルサプリメント；疾患もしくは病気の治療、予防、診断、治癒もしくは軽減に用いる物質；または身体の構造もしくは機能に影響を及ぼす物質；または所定の生理的環境下に置かれると、生物学的に活性な状態もしくは活性が高まった状態になるプロドラッグも包含する。治療剤としては、特に限定されないが、抗癌治療剤、抗精神病剤、抗炎症剤および抗生物質が挙げられる。
【０１４０】
「細胞毒性療法」および「化学療法」という用語は、１つまたは複数の治療剤を用いる治療法であって、薬剤（１つまたは複数）が罹患細胞に対して（可能性として非罹患細胞に対しても）非特異的細胞毒性または非標的化細胞毒性を示す治療法を指す。
【０１４１】
「標的化治療剤」、「標的化経路薬」、「経路薬」または「標的化薬」という用語は、疾患過程に関与する特定の生体分子（例えば、タンパク質）と選択的に結合し、それによりその活性を調節するよう設計された治療性能を有する、任意の分子または抗体を指す。標的化治療剤が結合し得る生体分子の非限定的な例としては、細胞表面受容体ならびに細胞間シグナル伝達経路および細胞内シグナル伝達経路の成分が挙げられる。本明細書に記載される場合、治療のために対象に投与する「標的化治療剤」は、本明細書に記載される通りにｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験して、対象細胞のシグナル伝達経路の状態を明らかにする同じ標的化治療剤であり得るか、あるいは、治療に投与するのに選択する標的化治療剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験したものとは異なる標的化治療剤であるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した標的化治療剤と同じシグナル伝達経路を標的とする（例えば、選択的に影響を及ぼす）（例えば、シグナル伝達経路のうち試験した標的化治療剤と同じ地点またはノードに影響を及ぼす）標的化治療剤であり得る。
【０１４２】
「ＨＥＲ２療法」または「ＨＥＲ２標的療法」という用語は、ＨＥＲ２の分子および／またはシグナル伝達経路（１つまたは複数）を特異的に標的とするよう設計され、特に限定されないが、例えば、ＨＥＲ２の分子および／またはシグナル伝達経路（１つまたは複数）を標的とする抗体および小分子を含めた１つまたは複数の治療剤を用いる治療法を指す。このようなＨＥＲ２療法は、ＨＥＲファミリーの他のメンバーを標的とするもの、例えば、ＨＥＲ１とＨＥＲ２、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２とＨＥＲ４またはＨＥＲ３のみを標的とする治療法であってもよい。
【０１４３】
「ＥＲ療法」、「ＥＲ標的療法」または「ホルモン療法」という用語は、ＥＲの分子および／またはシグナル伝達経路（１つまたは複数）を特異的に標的とするよう設計され、特に限定されないが、アロマターゼ阻害剤、選択的エストロゲン受容体モジュレーターおよび選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーターを含めた１つまたは複数の治療剤を用いる治療法ならびにこのような治療法とサイクリン依存性キナーゼＣＤＫ４およびＣＤＫ６を阻害する治療法との組合せを指す。
【０１４４】
「抗増殖薬」、「抗増殖剤」または「アポトーシス誘導薬」という用語は、細胞分裂を抑える、細胞成長を抑える、または細胞を死滅させるよう機能する治療性能を有する、任意の分子または抗体を指す。多くの場合、これらの薬物の活性は、正常な細胞過程に関与する広範囲にわたるクラスの生体分子に対するもの（例えば、ＤＮＡインターカレーション）であり、このため、薬物は細胞の疾患状態に対する判別能が低いものであり得る。
【０１４５】
「治療活性のある」という用語は、対象の癌細胞と標的化治療剤、例えば既知のタンパク質に対して介入の親和性および特異性が高い小分子、抗体、標的化ペプチドまたは任意の有機試薬などとを接触させたときにシグナル伝達経路に対してみられる効果を指す。治療活性のある標的化治療剤とは、標的化治療剤により影響を及ぼそうとするシグナル伝達経路（１つまたは複数）に影響を及ぼす標的化治療剤のことである。対象の癌細胞において別の標的化治療剤より治療活性の高い標的化治療剤とは、それにより影響を及ぼそうとするシグナル伝達経路に対する効果が、他の治療剤が、それにより影響を及ぼそうとするシグナル伝達経路に対して示す効果より大きい標的化治療剤のことである。少なくとも特定の癌では、２つ以上のシグナル伝達経路が複数の収束点、クロストークおよびフィードバックループで互いにつながっていることがあるため、１つの経路のみを阻害してもなお、それ以外の経路（相互の経路）を介してシグナル伝達が維持され得ることを示す証拠がある（例えば、Ｓａｉｎｉ，Ｋ．Ｓ．ら（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．３９：９３５−９４６を参照されたい）。あるシグナル伝達経路の活性が他のシグナル伝達経路の活性に影響を及ぼすことがあるため、標的化治療剤が標的化治療剤の結合部位と間接的に関係のあるシグナル伝達活性を崩壊させることがある。このような場合、ある標的療法が標的化治療剤の結合部位と直接関係のない経路のシグナル伝達活性を阻害することが明らかになれば、その標的療法は治療活性があるものとされ得る。
【０１４６】
ポリペプチドの「バリアント」は、基準配列とは異なるアミノ酸配列が含まれるポリペプチドを指す。基準配列は、完全長の天然のポリペプチド配列または完全長ポリペプチド配列の他の任意のフラグメントであり得る。いくつかの実施形態では、基準配列は、可変ドメイン重鎖または可変ドメイン軽鎖のコンセンサス配列である。ポリペプチドバリアントは一般に、基準配列と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する。
【０１４７】
Ｂ．複数のシグナル伝達経路を測定する方法
本発明の一態様では、癌患者の治療に標的化治療剤を選択するのに用いる方法は、患者の癌細胞の複数の（２つ以上の）シグナル伝達経路の機能的活性を評価することを含む。この方法により、同時に腫瘍の複数の異なるシグナル伝達経路の活性を評価し結果を比較することによって、患者の腫瘍を駆動する特定の最も活性な疾患シグナル伝達経路を特定することが可能になる。次いで、患者をシグナル伝達経路に影響を及ぼし活性レベルが最も高い標的化治療剤で治療する。治療に用いる標的化治療剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験してシグナル伝達経路の機能状態を明らかにした同じ標的化治療剤であり得るか、あるいは、治療に用いる標的化治療剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験したものとは異なるが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した標的化治療剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす薬剤であり得る。
【０１４８】
患者の細胞の様々なシグナル伝達経路の活性に関する情報が並行して得られるように、患者の癌細胞の（患者の細胞試料の異なる部を用いて各経路を個別に試験することにより）複数のシグナル伝達経路を検討することができる。この複数の異なる経路に関する並行解析の結果を比較して、試験した対で最も高い出力値が得られる標的化治療剤／活性化因子対および治療活性のある標的化治療剤を判定することができる。上記のものに加えて、またはこれに代えて、相乗効果を特定することが有益であることから、試料を同時に複数の標的化治療剤／活性化因子対（各対は異なるシグナル伝達経路に影響を及ぼす）を接触させることによって、複数のシグナル伝達経路を同じ細胞試で同時に検討することができる（下のサブセクションＦで詳細に考察する）。これらの方法の非限定的な例示的実施形態を実施例１（複数の異なるシグナル伝達経路の並行解析）および実施例３（複数の異なるシグナル伝達経路の同時解析）に詳細に記載する。
【０１４９】
したがって、一実施形態では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、少なくとも２組の薬剤対であって、各組が、標的化治療剤である第一の薬剤と、第一の薬剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている活性化因子である第二の薬剤とからなり、薬剤対の組がそれぞれ異なるシグナル伝達経路に影響を及ぼす薬剤対とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも２組の薬剤対と接触させた試料を作製することと、
各組の薬剤対と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤のそれぞれまたは第二の薬剤のそれぞれのみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
薬剤対の組と接触させた試料に第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける各組の薬剤対の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
全被験組のうち出力値が最も高いことが明らかになった薬剤対の組の第一の薬剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与し、投与した標的化治療剤が、対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において、出力値がこれより低い薬剤対の組（１つまたは複数）の標的化治療剤（１つまたは複数）より高い治療活性があることを示すことと、
を含む方法によって対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法に関する。
【０１５０】
別の実施形態では、本発明は、対処しようとするシグナル伝達経路において治療活性のある標的化治療剤を特定する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、少なくとも２組の薬剤対であって、標的化治療剤と、標的化治療剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている活性化因子とからなり、薬剤対の組がそれぞれ異なるシグナル伝達経路に影響を及ぼす薬剤対とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも２組の薬剤対と接触させた試料を作製することと、
各組の薬剤対と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し標的化治療剤のそれぞれまたは活性化因子のそれぞれのみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
薬剤対の組と接触させた試料に標的化治療剤または活性化因子のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける各組の薬剤対の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
全被験組のうち出力値が最も高いことが明らかになった薬剤対の組の標的化治療剤を特定し、その標的化治療剤が、対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において、出力値がこれより低い薬剤対の組（１つまたは複数）の標的化治療剤（１つまたは複数）より高い治療活性があることを示すことと、
を含む、方法に関する。
【０１５１】
一実施形態では、対象に投与する標的化治療剤（１つまたは複数）は、出力値が最も高いことが明らかになった薬剤対の組の第一の薬剤（１つまたは複数）である。別の実施形態では、対象に投与する標的化治療剤（１つまたは複数）は、出力値が最も高いことが明らかになった薬剤対の組の第一の薬剤（１つまたは複数）とは異なるが、前記第一の薬剤（１つまたは複数）と同じシグナル伝達経路を標的とする。
【０１５２】
様々な実施形態では、試料（例えば、細胞試料の異なる部）と、２組、３組、４組、５組、６組、７組、８組、９組、１０組、１５組、２０組、２５組またはそれ以上の薬剤対をと接触させ、薬剤対の各組は異なるシグナル伝達経路に影響を及ぼすものである。一実施形態では、試料と１０組以上の薬剤対とを接触させる。活性化因子または治療剤を２つ以上の薬剤のプールとして同じ部分の細胞試料に同時に加え得る。一実施形態では、例えば、表１６に記載される活性化因子と標的化治療剤の対の組を用いて、表１６に記載される異なるシグナル伝達経路を１１種類並行して試験する（実施例１に詳細に記載する）。
【０１５３】
一実施形態では、薬剤対の組は、１つの標的化治療剤と２つ以上の活性化因子とを含み、活性化因子はそれぞれ、標的化治療剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっているものである。例えば、一実施形態では、薬剤対の組は、１つの標的化治療剤と２つの異なる活性化因子とを含み、活性化因子はそれぞれ、標的化治療剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっているものである。この実施形態については、下のサブセクションＤでも詳細に記載する。
【０１５４】
一実施形態では、シグナル伝達経路は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＮｏｔｃｈからなる群より選択される。
【０１５５】
一実施形態では、薬剤対の組とシグナル伝達経路は、下に示す表２から選択される：
【表２】
2020514379.tif 000003
【０１５６】
一実施形態では、シグナル伝達経路は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ  ３、Ｍｅｒ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｔｃｈ、ＭＡＰＫ、ＲＯＮ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、Ｍｏｓ、Ｅｒｋ、ＭＬＫ、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ｐ３８、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＨ３、カスパーゼ、ｐ５３、ＮＩＫ、ＮＦｋＢ、ＲＯＣＫ、ＸＩＡＰ、ＭＯＭＰ、ＩＬＫ、ＰＤＫ、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦＲ、ｍＴＯＲ、Ｊａｋ、ＰＩＫＫ、４Ｅ−ＢＰ１、Ｒａｐｔｏｒ、ＫＭＴ、ＭＬＬ、ＫＤＭ、ＵＴＸ、ＤＯＴ１Ｌ、ＢＲＤ、ＴＥＴ、ＳｉｒＴ１、Ｈａｔ、ＳＮＦ、ＤＮＭＴ、ＥＺＨ、ＡＭＰＫ、ＰＬＣ、ＣａＭＫＫ、グルコース輸送体、ＰＦＫ、ＦＡＳ、クレブス回路、解糖、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤ、ＴＲＡＦ、ＴＡＢ、ＮＥＭＯ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｋＢ、ＩＬ１Ｒ、ＩＲＡＫ、Ｍｙｄ８８、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＰｓ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＰＡＲＰ、ラミン、ＺＮＲＦ、ＷｎｔＲ、ＰＡＲ、ＧＳＫ、Ｄｓｈ、ＬＧＲ、カテニン、ＷＴＸ、ＡＰＣ、Ｓｒｃ、ＣＢＰ、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｆｕｒｉｎ、Ｄｅｌｔａ  Ｊａｇｇｅｄ、ＮＩＣ、プレセニリン、ＣＤＯ、ＢＯＣ、Ｇｌｉ、ＫＩＦ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＳＡＲＡ、Ｓｍａｄ、Ｓｍｕｒｆ、ＮＬＫ、ｐ２８、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＬＩＭＫ、コフィリン、ＣＤ４４、ＦＡＴ、ＫＩＢＲＡ、ＦＲＭＤ、Ｍｓｔ、ＹＡＰ、ＬＡＴＳ、ＭＯＢ、ＳＡＶ、ＴＥＡＤ、Ｍｅｒ、ＳＡＢ、ＴＡＺ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＰＡＫ、ＣＲＥＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＶＥＧＦ受容体、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスからなる群より選択される。
【０１５７】
一実施形態では、薬剤対の各組は異なるＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす。
【０１５８】
一実施形態では、薬剤対の各組は、表１２に記載される薬剤対の組から選択される。
【０１５９】
様々な適切な標的化治療剤、活性化因子およびシグナル伝達経路については、下のサブセクションおよび実施例でも詳細に記載する。
【０１６０】
別の態様では、対象の癌細胞の複数のシグナル伝達経路を評価することを含む方法は、対象に投与する複数の標的化治療剤（すなわち、併用療法用の標的化治療剤の組合せ）の選択をさらに含み得る。少なくとも特定の癌では、２つ以上のシグナル伝達経路が複数の収束点、クロストークおよびフィードバックループで互いにつながっていることがあり、１つの経路のみを阻害してもなお、それ以外の経路（相互の経路）を介してシグナル伝達が維持され得ることを示す証拠がある（例えば、Ｓａｉｎｉ，Ｋ．Ｓ．ら（２０１３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．３９：９３５−９４６を参照されたい）。したがって、対象の癌細胞において治療活性のあることが明らかになった複数の標的化治療剤で複数の経路を標的化すれば、優れた有効性およびより良好な臨床転帰をもたらすことができる。さらに、現在直面している抗癌剤耐性という課題に対する１つの解決策として、合理的な組合せ標的療法を用いることが提唱されてきた（例えば、Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ．Ｂ．ら（２０１２）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０：６７９−６９２）。
【０１６１】
したがって、別の実施形態では、対象の癌細胞の複数のシグナル伝達経路を評価することを含む方法は、少なくとも２つの治療剤、すなわち、（ｉ）標的化治療剤が対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す５０％超の出力値パーセントを有することが明らかになった薬剤対の組の標的化治療剤および（ｉｉ）標的化治療剤が対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す出力値を有することが明らかになった薬剤対の組の少なくとも１つの追加の治療剤を活性であるものとして特定するか、または対象に投与することをさらに含み得る。例えば、一実施形態では、少なくとも２つの治療剤は、各標的化治療剤が対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す５０％超の出力値パーセントを有することが明らかになっている。
【０１６２】
一実施形態では、対象に投与する少なくとも１つの標的化治療剤は、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、ＭＥＤＩ４２７６、ＯＮＴ−３８０、ネラチニブ、アファチニブ、デュリゴツズマブ、ダコミチニブ、サピチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＭＭ−１１１  ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ７１６、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ルムレツズマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＡＶ−２０３、ＡＺＤ５３６３、アフレセルチブ、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ、リダホロリムス、テムシロリムス、セレメチニブ（Ｓｅｌｅｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ、ＧＤＣ−０９９４、タセリシブ、アルペリシブ、ブパルリシブ、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、オシメルチニブ、ロシレチニブ、ＡＺＤ５３６３、ＳＧＸ−５２３、オナルツズマブ、カボザンチニブ、ボリチニブ、チバンチニブ、カプマチニブ、エミベツズマブ、リロツムマブ、フィクラツズマブ、ＳＡＲ１２５８４４、エミベツズマブ、Ｓｙｍ０１５、ＡＭＧ３３７、ＪＮＪ−６１１８６３７２、グレサチニブ、１２０２、ＬＹ３０２３４１４、ジェダトリシブ、ＪＩ−１０１、ポナチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、アレクチニブ、ＢＧＪ３９８、リンシチニブ、キザルチニブ、Ｒ４２８（ＢＧＢ３２４）、ギルテリチニブ、ビスモデギブ、イトラコナゾール、５Ｅ１、ＬＧＫ９７４、セマガセスタット、コビメチニブ、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ダロツズマブ、ＭＥＤＩ−５７３、ガニツマブ、ソニデジブ、バンチクツマブ、イパフリセプト、タレクスツマブ、ブロンチクツズマブ、ＳＢ４３１５４２、ＥＷ−７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、アブラキサン、ブレンツキシマブベドトン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｏｎ）、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ビカルタミド、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、ロミデプシン、カブラジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、ニロチニブ、テモゾロミド、ボルテゾミブ、アザシチジン、テポチニブ、ロルラチニブ、メレスチニブ、ＲＧ６１１４、ツカンチニブ（ｔｕｃａｎｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣体、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、イキサベピロン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イルブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニ��、トラメチニブ、アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
【０１６３】
対象の癌細胞の複数のシグナル伝達経路の評価、試料の調製および培養、細胞の接着または付着の連続的モニタリングならびに数理解析を含む方法については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０１６４】
一実施形態では、薬剤対の各組の活性化因子は、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せである。適切な活性化因子の例については、下のサブセクションおよび実施例に詳細に記載する。
【０１６５】
一実施形態では、インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する。バイオセンサーの使用については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０１６６】
一実施形態では、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される。ほかの適切な癌については、下のサブセクションに記載する。
【０１６７】
一実施形態では、生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する。別の実施形態では、生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する。細胞の培養条件および培養については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０１６８】
Ｃ．シグナル伝達経路の超感受性を測定する方法
本発明の一態様では、癌患者の治療に標的化治療剤を選択するのに用いる方法は、患者の細胞の異常に超感受性のシグナル伝達経路を特定し、次いで、患者をこの超感受性シグナル伝達経路に影響を及ぼす標的化治療剤で治療することを含む。超感受性経路とは、極めて低いレベルのシグナル伝達経路活性化因子などの入力のみの変化（例えば、受容体リガンド濃度の１ｎＭから１０ｎＭへの変化）で極めて低レベル（例えば、細胞入力の１０％）の経路活性化から極めて高レベルの経路活性化応答性（例えば、細胞入力の９０％）に変化させることが可能な経路のことである。患者の癌細胞の異常に超感受性のシグナル伝達経路は、癌細胞内にほかにも異常なシグナル伝達経路が存在する場合でも疾患過程（例えば、腫瘍成長）の駆動に関与する可能性が高い。したがって、患者の癌細胞の異常に超感受性のシグナル伝達経路を特定し、次いで、このシグナル伝達経路を標的とする標的化治療剤を選択することは、治療有効性のある治療レジメンの選択に有効な手段となる。この方法の非限定的な例示的な実施形態については、実施例２に詳細に記載する。
【０１６９】
したがって、一態様では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象の癌細胞の異常に活性なシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含み、
シグナル伝達経路が、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、シグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている活性化因子とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、試料の一部を濃度が高い方の活性化因子と接触させ、試料の一部を濃度が低い方の活性化因子とを接触させることと、
濃度が高い方の活性化因子と接触させた試料の一部における生存癌細胞の細胞接着または付着を濃度が低い方の活性化因子と接触させた試料の一部と比較して連続的に測定することと、
活性化因子に対するシグナル伝達経路の感受性を連続測定値の数理解析によって求めることと、
シグナル伝達経路が活性化因子に超感受性である場合、活性化因子が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与し、シグナル伝達経路が対象の癌細胞において異常に活性であることを示すことと
を含む方法によって対象の癌細胞において異常に活性であることが明らかにされている、
方法に関する。
【０１７０】
一実施形態では、この方法は、
濃度が高い方の活性化因子と接触させた試料の一部における生存癌細胞の細胞接着または付着を、濃度が低い方の活性化因子と接触させた試料の一部と比較し、活性化因子と接触させていない試料の一部と比較して連続的に測定することと、
活性化因子に対する試料の感受性および活性化因子と接触させた試料の一部に細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける活性化因子の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
シグナル伝達経路が活性化因子に超感受性であり、シグナル伝達経路が対象の癌細胞において異常に活性であることがわかる場合、または活性化因子の出力値が所定のカットオフ値より大きい場合、活性化因子が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することと
を含む。
【０１７１】
別の態様では、本発明は、対象の癌細胞において異常に活性なシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす標的化治療剤を特定する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、シグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている活性化因子とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、試料の一部を濃度が高い方の活性化因子と接触させ、試料の一部を濃度が低い方の活性化因子と接触させることと、
濃度が高い方の活性化因子と接触させた試料の一部における生存癌細胞の細胞接着または付着を、濃度が低い方の活性化因子と接触させた試料の一部と比較して連続的に測定することと、
活性化因子に対するシグナル伝達経路の感受性を連続測定値の数理解析によって求めることと、
シグナル伝達経路が活性化因子に超感受性であり、シグナル伝達経路が対象の癌細胞において異常に活性であることがわかる場合、活性化因子が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす標的化治療剤を特定することと
を含む、方法に関する。
【０１７２】
一実施形態では、この方法は、
濃度が高い方の活性化因子と接触させた試料の一部における生存癌細胞の細胞接着または付着を、濃度が低い方の活性化因子と接触させた試料の一部と比較し、活性化因子と接触させていない試料の一部と比較して連続的に測定することと、
活性化因子に対する試料の感受性および活性化因子と接触させた試料の一部に活性化因子と接触させなかった試料の一部と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける活性化因子の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
シグナル伝達経路が活性化因子に超感受性であり、シグナル伝達経路が対象の癌細胞において異常に活性であることがわかる場合、または活性化因子の出力値が所定のカットオフ値より大きい場合、活性化因子が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす標的化治療剤を特定することと
を含む。
【０１７３】
一実施形態では、活性化因子の高い方の濃度はＥＣ９０（すなわち、有効濃度９０）であり、活性化因子の低い方の濃度はＥＣ１０（すなわち、有効濃度１０）である。本明細書で使用されるＥＣ９０とは、対象の細胞に対する活性化因子の最大応答の９０％をもたらす活性化因子の濃度のことである。本明細書で使用されるＥＣ１０とは、対象の細胞に対する活性化因子の最大応答の１０％をもたらす活性化因子の濃度のことである。一実施形態では、ＥＣ９０：ＥＣ１０比が８１未満であることが、シグナル伝達経路が活性化因子に超感受性であることを示す。
【０１７４】
他の実施形態では、活性化因子の高い方の濃度は、活性化因子の低い方の濃度の２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍またはそれ以上から８０倍までである。
【０１７５】
別の実施形態では、活性化因子の高い方の濃度は、使用する唯一の濃度であり、本明細書に記載されるいずれかの実施形態により、超感受性の患者の小規模集団の結果と超感受性ではない患者の小規模集団の結果を比較することによって求められるものである。したがって、別の実施形態では、シグナル伝達経路の超感受性を測定することを含む本開示の方法は、（培養段階と、細胞の接着または付着を連続的に測定する段階との間に）試料と、シグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている活性化因子とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、使用する活性化因子の濃度が、シグナル伝達経路の超感受性を明らかにするために求めた濃度である、接触段階を含む。
【０１７６】
一実施形態では、ヒルの式を用いてヒル係数を求め、活性化因子に対するシグナル伝達経路の感受性を求める。
【０１７７】
ヒルの式は当該技術分野で公知であり、最も単純には
【数１】
2020514379.tif 000004
で表すことができ、式中、
・入力は入力濃度である。これは、ｐＭ、ｎＭ、μＭ、ｍＭ、Ｍ、ｎｇ／ｍＬ、％などの多数の異なる形で表すことができる。
・Ｋ０．５は半数最大濃度定数である。これはＫｈａｌｆと呼ばれることもある。これは、反応を５０％終了させる基質濃度のことである。
ｎはヒル係数である。
【０１７８】
一実施形態では、ヒル係数の値が１より大きいことが、シグナル伝達経路が活性化因子に超感受性であることを示す。
【０１７９】
別の方法で表したヒルの式が、
【数２】
2020514379.tif 000005
であり、式中、
θは、経路から導かれる活性の割合であり、
［Ｌ］は、遊離（未結合）リガンド（活性化因子）の濃度であり、
Ｋｄは、質量作用の法則から導かれる見かけの解離定数（解離の平衡定数）であり、リガンド−受容体複合体の解離速度とその結合速度の比（Ｋｄ＝ｋｄ／ｋａ）と等しく、
ｎはヒル係数である。
【０１８０】
当業者であれば、上式が、ｌｏｇＬに対するｌｏｇ（θ／（１−θ））の直線プロットを作成し、傾きがヒル係数のｎである直線プロットを得るのに有用であることが認識されよう。
【０１８１】
当業者であれば、ＥＣ９０／ＥＣ１０が８１未満であることが、超感受性のシグナル伝達である場合を表し、ＥＣ９０／ＥＣ１０比が小さいほど超感受性が高いことも認識されよう。
【０１８２】
一実施形態では、シグナル伝達経路は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦＲ、ＡＬＫ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＮｏｔｃｈからなる群より選択される。
【０１８３】
一実施形態では、シグナル伝達経路は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、Ｍｅｒ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｔｃｈ、ＭＡＰＫ、ＲＯＮ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、Ｍｏｓ、Ｅｒｋ、ＭＬＫ、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ｐ３８、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＨ３、カスパーゼ、ｐ５３、ＮＩＫ、ＮＦｋＢ、ＲＯＣＫ、ＸＩＡＰ、ＭＯＭＰ、ＩＬＫ、ＰＤＫ、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦＲ、ｍＴＯＲ、Ｊａｋ、ＰＩＫＫ、４Ｅ−ＢＰ１、Ｒａｐｔｏｒ、ＫＭＴ、ＭＬＬ、ＫＤＭ、ＵＴＸ、ＤＯＴ１Ｌ、ＢＲＤ、ＴＥＴ、ＳｉｒＴ１、Ｈａｔ、ＳＮＦ、ＤＮＭＴ、ＥＺＨ、ＡＭＰＫ、ＰＬＣ、ＣａＭＫＫ、グルコース輸送体、ＰＦＫ、ＦＡＳ、クレブス回路、解糖、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤ、ＴＲＡＦ、ＴＡＢ、ＮＥＭＯ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｋＢ、ＩＬ１Ｒ、ＩＲＡＫ、Ｍｙｄ８８、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＰｓ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＰＡＲＰ、ラミン、ＺＮＲＦ、ＷｎｔＲ、ＰＡＲ、ＧＳＫ、Ｄｓｈ、ＬＧＲ、カテニン、ＷＴＸ、ＡＰＣ、Ｓｒｃ、ＣＢＰ、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｆｕｒｉｎ、Ｄｅｌｔａ  Ｊａｇｇｅｄ、ＮＩＣ、プレセニリン、ＣＤＯ、ＢＯＣ、Ｇｌｉ、ＫＩＦ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＳＡＲＡ、Ｓｍａｄ、Ｓｍｕｒｆ、ＮＬＫ、ｐ２８、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＬＩＭＫ、コフィリン、ＣＤ４４、ＦＡＴ、ＫＩＢＲＡ、ＦＲＭＤ、Ｍｓｔ、ＹＡＰ、ＬＡＴＳ、ＭＯＢ、ＳＡＶ、ＴＥＡＤ、Ｍｅｒ、ＳＡＢ、ＴＡＺ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＰＡＫ、ＣＲＥＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＶＥＧＦ受容体、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスからなる群より選択される。
【０１８４】
一実施形態では、シグナル伝達経路はＨＥＲファミリーシグナル伝達経路である。一実施形態では、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路はＨＥＲ２シグナル伝達経路である。一実施形態では、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路はＨＥＲ３シグナル伝達経路である。一実施形態では、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路はＥＧＦＲシグナル伝達経路である。一実施形態では、シグナル伝達経路はＨＥＲ３シグナル伝達経路であり、活性化因子薬剤として様々な濃度のニューレグリンを用いて超感受性を試験する（実施例２に詳細に記載する）。別の実施形態では、シグナル伝達経路はＥＧＦＲシグナル伝達経路であり、活性化因子薬剤として様々な濃度のアンフィレギュリン、ベータキュルリン（ｂｅｔａｃｕｌｌｕｌｉｎ）、ＨＢ−ＥＧＦまたはＴＧＦアルファを用いて超感受性を試験する（実施例２に詳細に記載する）。
【０１８５】
一実施形態では、少なくとも１つの標的化治療剤は、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、ＭＥＤＩ４２７６、ＯＮＴ−３８０、ネラチニブ、アファチニブ、デュリゴツズマブ、ダコミチニブ、サピチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＭＭ−１１１  ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ７１６、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ルムレツズマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＡＶ−２０３、ＡＺＤ５３６３、アフレセルチブ、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ、リダホロリムス、テムシロリムス、セレメチニブ（Ｓｅｌｅｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ、ＧＤＣ−０９９４、タセリシブ、アルペリシブ、ブパルリシブ、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、オシメルチニブ、ロシレチニブ、ＡＺＤ５３６３、ＳＧＸ−５２３、オナルツズマブ、カボザンチニブ、ボリチニブ、チバンチニブ、カプマチニブ、エミベツズマブ、リロツムマブ、フィクラツズマブ、ＳＡＲ１２５８４４、エミベツズマブ、Ｓｙｍ０１５、ＡＭＧ３３７、ＪＮＪ−６１１８６３７２、グレサチニブ、１２０２、ＬＹ３０２３４１４、ジェダトリシブ、ＪＩ−１０１、ポナチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、アレクチニブ、ＢＧＪ３９８、リンシチニブ、キザルチニブ、Ｒ４２８（ＢＧＢ３２４）、Ｇｉｌｔｅｒｉｔｎｉｂ、ビスモデギブ、イトラコナゾール、５Ｅ１、ＬＧＫ９７４、セマガセスタット、コビメチニブ、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ダロツズマブ、ＭＥＤＩ−５７３、ガニツマブ、ソニデジブ、バンチクツマブ、イパフリセプト、タレクスツマブ、ブロンチクツズマブ、ＳＢ４３１５４２、ＥＷ−７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、アブラキサン、ブレンツキシマブベドトン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｏｎ）、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ビカルタミド、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、ロミデプシン、カブラジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、ニロチニブ、テモゾロミド、ボルテゾミブ、アザシチジン、テポチニブ、ロルラチニブ、メレスチニブ、ＲＧ６１１４、ツカンチニブ（ｔｕｃａｎｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣体、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、イキサベピロン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イルブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニブ、ト��メチニブ、アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
【０１８６】
様々な適切な標的化治療剤、活性化因子およびシグナル伝達経路については、下のサブセクションおよび実施例にも詳細に記載する。
【０１８７】
一実施形態では、薬剤対の各組の活性化因子は、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せである。適切な活性化因子の例については、下のサブセクションに詳細に記載する。
【０１８８】
一実施形態では、インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する。バイオセンサーの使用については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０１８９】
一実施形態では、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される。ほかの適切な癌については、下のサブセクションに記載する。
【０１９０】
一実施形態では、生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する。別の実施形態では，生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する。細胞の培養条件および培養については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０１９１】
Ｄ．同じシグナル伝達経路の複数の活性化因子を用いる方法
本発明の別の態様では、癌患者の治療に標的化治療剤を選択するのに用いる方法は、単一の標的化治療剤で阻害し得る少なくとも２つのシグナル伝達経路活性化因子によって患者の細胞で同時に惹起される活性の量を評価することを含む。シグナル伝達経路活性が、２つ以上の細胞表面受容体によって惹起される上流活性により駆動され得ることから、このような経路ノードを標的とする治療法のアンタゴニスト効果を評価するのが有利である。例えば、この方法により、下流経路ノード（例えば、ＡＫＴ、ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ｍＴＯＲ）を標的とする治療剤が複数の細胞表面受容体の下流にあるシグナル伝達経路の活性に及ぼす影響を測定することが可能になる。患者の細胞内での２つ以上のシグナル伝達経路活性化因子の同時効果をシグナル活性化地点の下流で評価することにより、この方法は、１対のシグナル伝達経路活性化因子と標的化治療剤が患者の細胞に及ぼす効果を評価する方法より優れたものとなる。
【０１９２】
したがって、一態様では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、それぞれが第一の薬剤である標的化治療剤と、標的化治療剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている少なくとも２つの第二の薬剤である活性化因子とからなる、少なくとも１つの薬剤の三つ組とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料を作製することと、
少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤である標的化治療剤または第二の薬剤である活性化因子のそれぞれのみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
薬剤の三つ組と接触させた試料に第一の薬剤である標的化治療剤または第二の薬剤である活性化因子のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける少なくとも１つの薬剤の三つ組の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
出力値が、標的化治療剤が対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す所定のカットオフ値より大きい場合、薬剤の三つ組の第一の薬剤である標的化治療剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することと
を含む方法によって対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法に関する。
【０１９３】
一実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、第一の薬剤である標的化治療剤である。別の実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、第一の薬剤である標的化治療剤とは異なるものであるが、前記第一の薬剤である標的化治療剤と同じシグナル伝達経路を標的とする。
【０１９４】
別の態様では、本発明は、対象の癌細胞の対処しようとするシグナル伝達経路において治療活性のある標的化治療剤を特定する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、それぞれが標的化治療剤と、標的化治療剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている少なくとも２つの活性化因子とからなる、少なくとも１つの薬剤の三つ組とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料を作製することと、
少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し標的化治療剤または活性化因子のそれぞれのみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
薬剤の三つ組と接触させた試料に標的化治療剤または活性化因子のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける少なくとも１つの薬剤の三つ組の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
出力値が、標的化治療剤が対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す所定のカットオフ値より大きい場合、薬剤の三つ組から標的化治療剤を特定することと
を含む、方法に関する。
【０１９５】
一実施形態では、標的化治療剤（例えば、第一の薬剤である標的化治療剤）は、標的化治療剤の影響を受けるシグナル伝達経路が対象の癌細胞において活性であることを示す５０％超の出力値パーセントを有することが明らかになっている。別の実施形態では、標的化治療剤（例えば、第一の薬剤である標的化治療剤）は、標的化治療剤が対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す５０％超の出力値パーセントを有することが明らかになっている。
【０１９６】
一実施形態では、シグナル伝達経路は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１，ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＮｏｔｃｈからなる群より選択される。
【０１９７】
一実施形態では、シグナル伝達経路は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、Ｍｅｒ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｔｃｈ、ＭＡＰＫ、ＲＯＮ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、Ｍｏｓ、Ｅｒｋ、ＭＬＫ、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ｐ３８、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＨ３、カスパーゼ、ｐ５３、ＮＩＫ、ＮＦｋＢ、ＲＯＣＫ、ＸＩＡＰ、ＭＯＭＰ、ＩＬＫ、ＰＤＫ、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦＲ、ｍＴＯＲ、Ｊａｋ、ＰＩＫＫ、４Ｅ−ＢＰ１、Ｒａｐｔｏｒ、ＫＭＴ、ＭＬＬ、ＫＤＭ、ＵＴＸ、ＤＯＴ１Ｌ、ＢＲＤ、ＴＥＴ、ＳｉｒＴ１、Ｈａｔ、ＳＮＦ、ＤＮＭＴ、ＥＺＨ、ＡＭＰＫ、ＰＬＣ、ＣａＭＫＫ、グルコース輸送体、ＰＦＫ、ＦＡＳ、クレブス回路、解糖、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤ、ＴＲＡＦ、ＴＡＢ、ＮＥＭＯ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｋＢ、ＩＬ１Ｒ、ＩＲＡＫ、Ｍｙｄ８８、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＰｓ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＰＡＲＰ、ラミン、ＺＮＲＦ、ＷｎｔＲ、ＰＡＲ、ＧＳＫ、Ｄｓｈ、ＬＧＲ、カテニン、ＷＴＸ、ＡＰＣ、Ｓｒｃ、ＣＢＰ、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｆｕｒｉｎ、Ｄｅｌｔａ  Ｊａｇｇｅｄ、ＮＩＣ、プレセニリン、ＣＤＯ、ＢＯＣ、Ｇｌｉ、ＫＩＦ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＳＡＲＡ、Ｓｍａｄ、Ｓｍｕｒｆ、ＮＬＫ、ｐ２８、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＬＩＭＫ、コフィリン、ＣＤ４４、ＦＡＴ、ＫＩＢＲＡ、ＦＲＭＤ、Ｍｓｔ、ＹＡＰ、ＬＡＴＳ、ＭＯＢ、ＳＡＶ、ＴＥＡＤ、Ｍｅｒ、ＳＡＢ、ＴＡＺ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＰＡＫ、ＣＲＥＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＶＥＧＦ受容体、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスからなる群より選択される。
【０１９８】
一実施形態では、シグナル伝達経路はＨＥＲファミリーシグナル伝達経路である。一実施形態では、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路はＨＥＲ２シグナル伝達経路である。
【０１９９】
一実施形態では、少なくとも１つの標的化治療剤は、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェンレトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、ＭＥＤＩ４２７６、ＯＮＴ−３８０、ネラチニブ、アファチニブ、デュリゴツズマブ、ダコミチニブ、サピチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＭＭ−１１１  ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ７１６、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ルムレツズマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＡＶ−２０３、ＡＺＤ５３６３、アフレセルチブ、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ、リダホロリムス、テムシロリムス、セレメチニブ（Ｓｅｌｅｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ、ＧＤＣ−０９９４、タセリシブ、アルペリシブ、ブパルリシブ、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、オシメルチニブ、ロシレチニブ、ＡＺＤ５３６３、ＳＧＸ−５２３、オナルツズマブ、カボザンチニブ、ボリチニブ、チバンチニブ、カプマチニブ、エミベツズマブ、リロツムマブ、フィクラツズマブ、ＳＡＲ１２５８４４、エミベツズマブ、Ｓｙｍ０１５、ＡＭＧ３３７、ＪＮＪ−６１１８６３７２、グレサチニブ、１２０２、ＬＹ３０２３４１４、ジェダトリシブ、ＪＩ−１０１、ポナチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、アレクチニブ、ＢＧＪ３９８、リンシチニブ、キザルチニブ、Ｒ４２８（ＢＧＢ３２４）、ギルテリチニブ、ビスモデギブ、イトラコナゾール、５Ｅ１、ＬＧＫ９７４、セマガセスタット、コビメチニブ、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ダロツズマブ、ＭＥＤＩ−５７３、ガニツマブ、ソニデジブ、バンチクツマブ、イパフリセプト、タレクスツマブ、ブロンチクツズマブ、ＳＢ４３１５４２、ＥＷ−７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、アブラキサン、ブレンツキシマブベドトン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｏｎ）、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ビカルタミド、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、ロミデプシン、カブラジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、ニロチニブ、テモゾロミド、ボルテゾミブ、アザシチジン、テポチニブ、ロルラチニブ、メレスチニブ、ＲＧ６１１４、ツカンチニブ（ｔｕｃａｎｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣体、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、イキサベピロン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イルブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニブ、トラメチニブ��アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
【０２００】
様々な適切な標的化治療剤、活性化因子およびシグナル伝達経路については、下のサブセクションおよび実施例にも詳細に記載する。
【０２０１】
一実施形態では、薬剤の三つ組それぞれの各活性化因子は、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せである。薬剤の三つ組の特定の実施形態では、薬剤の三つ組のうちの１つは、ＨＥＲ３（ＰＩ３Ｋ）経路に影響を及ぼす活性化因子ＮＲＧ１であり、薬剤の三つ組のうちの１つは、ＨＧＦ経路に影響を及ぼす活性化因子ＨＧＦであり、薬剤の三つ組のうちの１つは、ＰＩ３ｋ経路ノードを標的とし、ＨＥＲ３経路およびＨＧＦＲ経路の両方に影響を及ぼす治療剤タセリシブである。適切な活性化因子のほかの例については、下のサブセクションおよび実施例に詳細に記載する。
【０２０２】
一実施形態では、インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する。バイオセンサーの使用については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０２０３】
一実施形態では、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される。ほかの適切な癌については、下のサブセクションに記載する。
【０２０４】
一実施形態では、生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する。別の実施形態では、生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する。細胞の培養条件および培養については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０２０５】
Ｅ．シグナル伝達経路内の異なる結合部位を標的とする方法
本発明の別の態様では、癌患者の治療に標的化治療剤を選択するのに用いる方法は、シグナル伝達経路を刺激するのに使用する活性化因子と同じシグナル伝達経路または異なるシグナル伝達経路内の異なる地点、ノードまたは結合部位に影響を及ぼす標的化治療剤を評価することを含む。癌患者の治療に標的化治療剤を選択するのに用いる方法は、１つまたは複数（例えば、２つ）のシグナル伝達経路活性化因子によって患者の細胞内で惹起され、活性化因子同じ近接した結合部位を直接標的としない標的化治療剤によって阻害される活性の量を評価することを含む。２つ以上のシグナル伝達経路が複数の収束点、クロストークおよびフィードバックループで相互につながっていることがあるため、活性化因子結合部位（例えば、細胞表面受容体）で惹起される経路の活性を阻害するよう設計された標的化治療剤が、シグナル伝達経路の活性を阻害するのに最も効果的なものとはならないこともある。活性化因子薬剤によって惹起されるシグナル伝達経路の活性を、活性化因子と同じ近接した結合部位を直接標的とするマッチしたシグナル伝達経路阻害剤によって阻害することができない場合、活性化因子の結合部位とは異なる結合部位を標的とする治療法により、惹起されるシグナル伝達経路の活性を阻害することが可能であり得る。この方法により、活性化因子薬剤の結合部位の下流（例えば、ＡＫＴ、ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ｍＴＯＲ）、上流（例えば、ＲＡＳ、ＲＡＦ）または側方（例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｎｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、ｃ−ＭＥＴ、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＦＧＦＲ）にある結合部位を標的とする治療剤が、活性化因子薬剤によって惹起されるシグナル伝達経路の活性に及ぼす影響を測定することが可能になる。シグナル伝達経路阻害剤の効果を患者の細胞の活性化因子薬剤の活性化結合部位の下流、上流または側方で評価することにより、この方法は、１対のシグナル伝達経路活性化因子と標的化治療剤が患者の細胞の同じ近接した結合部位で及ぼす影響を評価する方法より優れたものとなる。さらに、本発明は、複数のノードまたは標的と結合して調節する既知の見つけることができる治療剤を含む。したがって、活性化因子薬剤とは異なる結合部位と結合する標的化治療剤で患者を治療すれば、優れた有効性およびより良好な臨床転帰をもたらすことができる。
【０２０６】
したがって、一実施形態では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、（ｉ）シグナル伝達経路に影響を及ぼし、活性化結合部位を有する、第一の薬剤である活性化因子および（ｉｉ）活性化因子と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼすが、活性化結合部位の下流、上流または側方にある結合部位で影響を及ぼす、第二の薬剤である標的化治療剤とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料を作製することと、
第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
第一の薬剤および第二の薬剤の両方と接触させた試料に第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
第二の薬剤である標的化治療剤が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与し、細胞の接着または付着の変化を特徴付ける出力値が、シグナル伝達経路が対象の癌細胞において活性であることを示すカットオフ値以上であることと
を含む方法によって対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０２０７】
一実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、第二の薬剤である標的化治療剤である。別の実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、第二の薬剤である標的化治療剤とは異なるものであるが、前記第二の薬剤と同じシグナル伝達経路を標的とする。
【０２０８】
別の態様では、本発明は、対象の癌細胞の対処しようとするシグナル伝達経路において治療活性がある標的化治療剤を特定する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、（ｉ）シグナル伝達経路に影響を及ぼし、活性化結合部位を有する、第一の薬剤である活性化因子および（ｉｉ）活性化因子と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼすが、活性化結合部位の下流，上流または側方にある結合部位で影響を及ぼす、第二の薬剤である標的化治療剤とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料を作製することと、
第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
第一の薬剤および第二の薬剤の両方と接触させた試料に第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
第二の薬剤である標的化治療剤を対象の癌細胞の対処しようとするシグナル伝達経路において治療活性があるものと特定し、細胞の接着もしくは付着の変化を特徴付ける出力値が、シグナル伝達経路が対象の癌細胞において活性であり、かつ／または第二の薬剤である標的化治療剤が、対象の癌細胞の対処しようとするシグナル伝達経路において治療活性があることを示すカットオフ値以上であることと
を含む、方法を提供する。
【０２０９】
シグナル伝達経路内の異なる結合部位（例えば、地点またはノード）を探索するこれらの方法の別の実施形態では、それぞれ目的とするシグナル伝達経路内に活性化結合部位を有する複数の活性化因子薬剤（２つ以上）と、活性化因子と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼすが、活性化因子の活性化結合部位の下流、上流または側方にある結合部位で影響を及ぼす標的化治療剤とを組み合わせて使用する。したがって、別の実施形態では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、（ｉ）シグナル伝達経路に影響を及ぼし、それぞれが活性化結合部位を有する、２つ以上の第一の薬剤である活性化因子および（ｉｉ）２つ以上の第一の薬剤である活性化因子と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼすが、活性化因子の活性化結合部位の下流、上流または側方にある結合部位で影響を及ぼす、第二の薬剤である標的化治療剤とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料を作製することと、
第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料に第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
第二の薬剤である標的化治療剤が影響を及ぼす同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与し、細胞の接着または付着の変化を特徴付ける出力値が、シグナル伝達経路が対象の癌細胞において活性であることを示すカットオフ値以上であることと
を含む方法によって対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法を提供する。
【０２１０】
一実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、第二の薬剤である標的化治療剤である。別の実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、第二の薬剤である標的化治療剤とは異なるものであるが、前記第二の薬剤と同じシグナル伝達経路を標的とする。
【０２１１】
別の態様では、本発明は、対象の癌細胞の対処しようとするシグナル伝達経路において治療活性がある標的化治療剤を特定する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、（ｉ）シグナル伝達経路に影響を及ぼし、それぞれが活性化結合部位を有する、２つ以上の第一の薬剤である活性化因子および（ｉｉ）２つ以上の第一の薬剤である活性化因子と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼすが、活性化因子の活性化結合部位の下流、上流または側方にある結合部位で影響を及ぼす、第二の薬剤である標的化治療剤とを接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料を作製することと、
第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
第一の薬剤および第二の薬剤と接触させた試料に第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
標的化治療剤を対象の癌細胞の対処しようとするシグナル伝達経路において治療活性がある第二の薬剤であるものとして特定し、細胞の接着もしくは付着の変化を特徴付ける出力値が、シグナル伝達経路が対象の癌細胞において活性であり、かつ／または第二の薬剤である標的化治療剤が、対象の癌細胞の対処しようとするシグナル伝達経路において治療活性があることを示すカットオフ値以上であることと
を含む、方法を提供する。
【０２１２】
一実施形態では、シグナル伝達経路は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＮｏｔｃｈからなる群より選択される。
【０２１３】
これらの方法の様々な実施形態では、シグナル伝達経路は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ３、Ｍｅｒ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｔｃｈ、ＭＡＰＫ、ＲＯＮ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、Ｍｏｓ、Ｅｒｋ、ＭＬＫ、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ｐ３８、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＨ３、カスパーゼ、ｐ５３、ＮＩＫ、ＮＦｋＢ、ＲＯＣＫ、ＸＩＡＰ、ＭＯＭＰ、ＩＬＫ、ＰＤＫ、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦＲ、ｍＴＯＲ、Ｊａｋ、ＰＩＫＫ、４Ｅ−ＢＰ１、Ｒａｐｔｏｒ、ＫＭＴ、ＭＬＬ、ＫＤＭ、ＵＴＸ、ＤＯＴ１Ｌ、ＢＲＤ、ＴＥＴ、ＳｉｒＴ１、Ｈａｔ、ＳＮＦ、ＤＮＭＴ、ＥＺＨ、ＡＭＰＫ、ＰＬＣ、ＣａＭＫＫ、グルコース輸送体、ＰＦＫ、ＦＡＳ、クレブス回路、解糖、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤ、ＴＲＡＦ、ＴＡＢ、ＮＥＭＯ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｋＢ、ＩＬ１Ｒ、ＩＲＡＫ、Ｍｙｄ８８、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＰｓ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＰＡＲＰ、ラミン、ＺＮＲＦ、ＷｎｔＲ、ＰＡＲ、ＧＳＫ、Ｄｓｈ、ＬＧＲ、カテニン、ＷＴＸ、ＡＰＣ、Ｓｒｃ、ＣＢＰ、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｆｕｒｉｎ、Ｄｅｌｔａ  Ｊａｇｇｅｄ、ＮＩＣ、プレセニリン、ＣＤＯ、ＢＯＣ、Ｇｌｉ、ＫＩＦ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＳＡＲＡ、Ｓｍａｄ、Ｓｍｕｒｆ、ＮＬＫ、ｐ２８、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＬＩＭＫ、コフィリン、ＣＤ４４、ＦＡＴ、ＫＩＢＲＡ、ＦＲＭＤ、Ｍｓｔ、ＹＡＰ、ＬＡＴＳ、ＭＯＢ、ＳＡＶ、ＴＥＡＤ、Ｍｅｒ、ＳＡＢ、ＴＡＺ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＰＡＫ、ＣＲＥＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＶＥＧＦ受容体、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスからなる群より選択される。
【０２１４】
様々な実施形態では、第一の薬剤である活性化因子（１つまたは複数）は、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せである。
【０２１５】
一実施形態では、インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する。バイオセンサーの使用については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０２１６】
一実施形態では、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される。ほかの適切な癌については、下のサブセクションに記載する。
【０２１７】
一実施形態では、生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する。一実施形態では、生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する。細胞の培養条件および培養については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０２１８】
一実施形態では、対象に投与する少なくとも１つの標的化治療剤は、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、ＭＥＤＩ４２７６、ＯＮＴ−３８０、ネラチニブ、アファチニブ、デュリゴツズマブ、ダコミチニブ、サピチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＭＭ−１１１  ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ７１６、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ルムレツズマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＡＶ−２０３、ＡＺＤ５３６３、アフレセルチブ、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ、リダホロリムス、テムシロリムス、セレメチニブ（Ｓｅｌｅｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ、ＧＤＣ−０９９４、タセリシブ、アルペリシブ、ブパルリシブ、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、オシメルチニブ、ロシレチニブ、ＡＺＤ５３６３、ＳＧＸ−５２３、オナルツズマブ、カボザンチニブ、ボリチニブ、チバンチニブ、カプマチニブ、エミベツズマブ、リロツムマブ、フィクラツズマブ、ＳＡＲ１２５８４４、エミベツズマブ、Ｓｙｍ０１５、ＡＭＧ３３７、ＪＮＪ−６１１８６３７２、グレサチニブ、１２０２、ＬＹ３０２３４１４、ジェダトリシブ、ＪＩ−１０１、ポナチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、アレクチニブ、ＢＧＪ３９８、リンシチニブ、キザルチニブ、Ｒ４２８（ＢＧＢ３２４）、ギルテリチニブ、ビスモデギブ、イトラコナゾール、５Ｅ１、ＬＧＫ９７４、セマガセスタット、コビメチニブ、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ダロツズマブ、ＭＥＤＩ−５７３、ガニツマブ、ソニデジブ、バンチクツマブ、イパフリセプト、タレクスツマブ、ブロンチクツズマブ、ＳＢ４３１５４２、ＥＷ−７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、アブラキサン、ブレンツキシマブベドトン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｏｎ）、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ビカルタミド、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、ロミデプシン、カブラジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、ニロチニブ、テモゾロミド、ボルテゾミブ、アザシチジン、テポチニブ、ロルラチニブ、メレスチニブ、ＲＧ６１１４、ツカンチニブ（ｔｕｃａｎｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣体、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、イキサベピロン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イルブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニ��、トラメチニブ、アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
【０２１９】
様々な適切な標的化治療剤、活性化因子およびシグナル伝達経路については、下のサブセクションおよび実施例にも詳細に記載する。
【０２２０】
Ｆ．複数のシグナル伝達経路の同時の活性化および阻害
ゲノム解析または組織学的解析を用いて標的化治療剤を選択する際には一般に、個々の患者に対して標的化治療剤を１つずつ処方し、その結果得られた治療患者集団のうち、単一の標的化治療剤により効果を及ぼそうとする疾患過程を有する細胞のある患者の割合は極めて少ないことが多い。これにより、市販されている多数の有効な標的化治療剤の使用が制約を受けるか、場合によっては、標的化治療剤を市販するのに必要な規制当局の承認を得ることが妨げられてきた。製薬会社および医師がとった対応の１つが、標的化治療剤の組合せを試験することであった。２つ以上の標的療法で患者を治療し、各標的療法が単一患者の機能不全のシグナル伝達の異なる側面に影響を及ぼすことを目的とするものである試験が多数進行中である。同時に、これらの多くは成功を収めていない。これまで、ある患者に対する標的療法の組合せを患者に実施する前に評価するための客観的臨床尺度が記載されたことはない。その患者に機能不全のシグナル伝達に関する問題が２つ以上あることを明らかにし、２つ以上の標的化治療剤が有効であると確約されるかどうかを判定する客観的方法が存在しない場合、多数の問題点が浮上する。標的化治療剤の組合せによる患者の治療に関して本発明が対処するよう設計された様々な問題に関する説明を本明細書に記載する。
【０２２１】
単一の薬剤として処方される２つ以上の標的化治療剤がそれぞれ実際に、疾患集団の異なる別個のサブグループにおいてのみ治療活性がある場合、集団全体のなかでの転帰は、２つ以上の治療剤で治療した患者の方が一方の標的化治療剤のみで治療した同じ集団より優れていると考えられる。例えば、２つの標的療法を個別に処方したときの患者集団に対する客観的奏効率がそれぞれ１０％である場合、この２つを組み合わせて処方すれば、客観的奏効率は２０％に増大し得る。標的化治療剤の組合せを投与した集団で得られた転帰の改善は、市販されている各治療剤の使用を増大させる、または治療剤のうち療法または一方のみが別途承認を受けている場合、その併用治療に対する規制当局の承認を受けるのに十分なものであり得る。集団全体としては転帰が改善したが、集団の多数またはすべての患者に腫瘍細胞において治療活性のない少なくとも一方の治療剤を投与し、集団のうち少数ではあるがなおも相当な割合の患者には、ともに腫瘍細胞において治療活性のない２つの治療剤を投与し得る。その転帰は、組合せを投与した全患者に害を及ぼすリスクの増大である。したがって、この方法では、標的化治療剤を投与し治療利益も標的化治療剤による多くの場合は毒性の副作用もみられない患者の数が、単一の標的化治療剤のみで治療した場合にそうなる患者より多くなる可能性がある。このため、患者に２つ以上の標的化治療剤を処方して集団の成功オッズを高めるのが有利であり得るが、特に標的化治療剤を組み合わせて治療する場合、個々の患者の治療にさらに高い精度で標的化治療剤を割り当てる代替的方法が必要とされる。
【０２２２】
本明細書に記載される方法は、１つまたは複数の標的化治療剤が患者の細胞において治療活性があるかどうかを事前に判定して、患者の治療に使用する標的化治療剤の選択を改善することを可能にするものである。本発明の一態様では、癌患者の治療に１つまたは複数の標的化治療剤を選択するのに用いる方法は、少なくとも２つの活性化剤と少なくとも２つの治療剤とを含む薬剤対の組が複数のシグナル伝達経路の活性に及ぼす複合的な同時効果を評価することを含む。この方法は、２つ以上の経路のシグナル伝達活性が互いにつながっており、予想外に相乗性が高い場合に単一の経路のシグナル伝達活性に対する１つまたは複数の活性化剤と治療剤の対の組の効果を評価する方法より有利である。
【０２２３】
第一に、疾患過程を駆動するシグナル伝達経路（１つまたは複数）を特定する目的で、本明細書に記載される方法を用いて患者の腫瘍細胞の複数の経路を個別に評価する場合、あるシグナル伝達経路の活性が別のシグナル伝達経路の活性に及ぼす影響を評価することは不可能である。２つ以上の互いにつながったシグナル伝達経路によって駆動される腫瘍を有する患者では、各経路の異常なシグナル伝達活性が他の経路からのフィードバック活性、フィードフォワード活性またはクロストーク活性の影響を受け得る。例えば、主として１つの細胞表面受容体（例えば、ＥＧＦ経路を惹起するＥＧＦ受容体）によるシグナル伝達経路活性が、異なる細胞表面受容体（例えば、ＥＧＦ経路活性を惹起するＨＧＦ受容体）による活性によって駆動されることがある。その結果、患者の腫瘍細胞と、単一の経路にのみ影響を及ぼすことを目的とする活性化剤と治療剤の対の組（例えば、ＥＧＦリガンドとＥＧＦ阻害剤）とを接触させても、測定されるシグナル伝達活性は、別の経路がその経路（例えば、ＥＧＦ）に対して及ぼす可能性のあるフィードバック効果、側方効果、フィードフォワード効果またはクロストーク効果を反映したものとはならない。このような場合、活性化因子剤と治療剤の対の組により１つまたは複数のシグナル伝達経路を活性化および阻害しても、最も治療活性が高い物質の選択にはつながらないことがある。したがって、上記の場合、２つ以上の活性化剤と２つ以上の治療剤の組が患者の生存腫瘍細胞の少なくとも２つ以上の異なるシグナル伝達経路に対して示す複合的な機能的活性を評価する客観的方法があると有利である。
【０２２４】
この方法により、２つの異なる結合部位（例えば、ＥＧＦＲ、ＨＧＦＲ、ＨＥＲ３、ＰＩ３Ｋ）を標的とする少なくとも２つの異なる治療剤が少なくとも２つの異なる経路のシグナル伝達活性に及ぼす効果を測定することが可能になる。この方法は、活性化剤と治療剤の対の組で複数のシグナル伝達経路の機能的活性を１つずつ測定する代わりに、患者の生存腫瘍細胞を２つ以上の活性化剤および２つ以上の治療剤とそれぞれ同時に接触させ、生じた２つ以上のシグナル伝達経路の機能的活性を測定するものである。例えば、ＥＧＦ経路とＨＧＦ経路（すなわち、それぞれＨＥＲファミリーシグナル伝達経路およびｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦシグナル伝達経路）が互いに機能的につながっているが、それらを対の組のＥＧＦリガンドとＥＧＦＲ阻害剤および対の組のＨＧＦリガンドとＨＧＦＲ阻害剤で別個に評価する場合、各対の組で得られるシグナル伝達減衰の出力値は５０％未満となり得る。このことから、ＥＧＦ阻害剤もＨＧＦ阻害剤も患者の癌細胞において治療活性がなく、したがって、患者の治療に選択されることはないことが示唆されるものと思われる。一方、患者の腫瘍細胞をＨＧＦリガンドとＥＧＦリガンドおよびＨＧＦＲ阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤と同時に接触させることによってＥＧＦ経路とＨＧＦ経路の機能的活性を評価すれば、薬剤対を組み合わせた組の出力値の減衰は５０％をはるかに上回るものとなり得る。このことから、ＥＧＦＲ阻害剤とＨＧＦＲ阻害剤の組合せが患者の癌細胞において治療活性があり、したがって、患者の治療に選択されることが示唆されるものと思われる。したがって、本発明を用いることにより、複数の経路を別個にではなく同時に評価することによって、複数ではあるが別個の標的化治療剤の機能評価に基づいて選択される組合せより治療活性の高い標的化治療剤の組合せを独特の方法で特定することが可能になる。
【０２２５】
第二に、患者の細胞のシグナル伝達経路に対する複数の活性化剤および治療剤の効果を同時に評価することにより、それぞれの経路に対して評価する２つ以上の治療剤それぞれの効力が、治療剤を別個に評価する場合と比較して増幅されるかどうかを明らかにすることが可能になる。現在、２つ以上の標的化治療剤を併用する場合、処方されるそれぞれの用量は、標的化治療剤を単一の薬剤として処方する場合に処方される用量と同じである。本発明を用いる場合、複数の活性化剤および治療剤を患者の細胞で同時に評価することにより、２つ以上の標的化治療剤の組合せが、個別に使用したいずれかの標的化治療剤より治療活性が高く、組合せて評価した２つ以上の標的化治療剤の方が、効力が高くなり、したがって、相乗的に機能することを明らかにすることができる。２つ以上の標的化治療剤が相乗的に機能する場合、本明細書に記載される方法を用いて評価する際に所与の出力値を得るため患者の細胞と接触させる一方または両方の標的化治療剤の濃度は、標的化治療剤をそれぞれ別個に患者の細胞と接触させる場合に必要な濃度より低くなる。例えば、本明細書に記載される方法を用いて、互いにつながった２つの経路の機能的活性を個別に評価すると、各経路の出力値を最大にするのに必要な患者の細胞と接触させる各標的化治療剤の濃度は５００ナノモル濃度となり得る。一方、互いにつながった同じ２つの経路の機能的活性を同時に評価する場合、組合せた経路の出力値を最大にするのに必要な患者の細胞と同時に接触させる一方または両方の標的化治療剤の濃度はわずか５０ナノモル濃度、すなわち、経路を個別の評価する場合に必要とされる濃度より９０％少ない値となり得る。
【０２２６】
本明細書に記載される方法により、２つ以上の標的化治療剤の組合せが患者の細胞において相乗的に機能していることがわかる場合、患者を効果的に治療するのに必要な各標的化治療剤の用量は、一方の標的化治療剤のみで患者を治療する場合に必要な用量より少ないものとなり得る。本明細書に記載される方法を用いて、相乗的に機能する２つ以上の標的化治療剤を特定し、各治療剤の用量を低くしても所望の治療活性が得られることを確認すれば、さらにいくつかの利点が得られる。第一に、ほぼすべての標的化治療剤には毒性があり、それを投与した患者に安全性に関連する副作用をもたらすことから、患者に所望の臨床的有益性が得られる可能な限り低用量の薬物を処方するのが有利である。第二に、標的化治療剤の安全性および毒性副作用は相加的なものであることが多いため、各標的化治療剤に推奨される投与量レベルが単独で処方するときと同じである場合、多くの患者が２つの標的化治療剤による治療に耐えることができない。２つ以上の標的化治療剤が患者の腫瘍細胞において相乗的に機能することを事前に明らかにし、各標的化治療剤に対して少ない用量を選択して患者を治療することができれば、高用量の２つ以上の治療剤であれば耐えることのできない患者に対する副作用の可能性を減じて、それらの治療剤による治療から利益を得ることができる。
【０２２７】
したがって、一実施形態では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料を、少なくとも少なくとも２組の薬剤対であって、各組が、少なくとも１つの標的化治療剤である第一の薬剤と、第一の薬剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている少なくとも１つの活性化因子である第二の薬剤とからなり、薬剤対の組がそれぞれ異なるシグナル伝達経路に影響を及ぼす薬剤対と同時に接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも２組の薬剤対と接触させた試料を作製することと、
薬剤対の各組と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤のそれぞれまたは第二の薬剤のそれぞれのみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
薬剤対の組と接触させた試料に第一の薬剤または第二の薬剤のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける各組の薬剤対の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
全被験組のうち出力値が最も高いことが明らかになった薬剤対の組の第一の薬剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与し、投与した標的化治療剤が、対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において、出力値がこれより低い薬剤対の組（１つまたは複数）の標的化治療剤（１つまたは複数）より高い治療活性があることを示すことと
を含む方法によって対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法に関する。
【０２２８】
別の実施形態では、本発明は、対象の癌細胞の対処しようとするシグナル伝達経路において治療活性がある標的化治療剤を特定する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料と、少なくとも２組の薬剤対であって、各組が、少なくとも１つの標的化治療剤と、標的化治療剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている少なくとも１つの活性化因子とからなり、薬剤対の組がそれぞれ異なるシグナル伝達経路に影響を及ぼす薬剤対とを同時に接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定されるシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも２組の薬剤対と接触させた試料を作製することと、
薬剤対の各組と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し標的化治療剤のそれぞれまたは活性化因子のそれぞれのみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
薬剤対の組と接触させた試料に標的化治療剤または活性化因子のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける各組の薬剤対の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
全被験組のうち出力値が最も高いことが明らかになった薬剤対の組から標的化治療剤を特定し、標的化治療剤が、対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において、出力値がこれより低い薬剤対の組（１つまたは複数）の標的化治療剤（１つまたは複数）より高い治療活性があることを示すことと
を含む、方法に関する。
【０２２９】
一実施形態では、対象に投与する標的化治療剤（１つまたは複数）は、出力値が最も高いことが明らかになった薬剤対の組の第一の薬剤（１つまたは複数）である。別の実施形態では、対象に投与する標的化治療剤（１つまたは複数）は、出力値が最も高いことが明らかになった薬剤対の組の第一の薬剤（１つまたは複数）とは異なるものであるが、前記第一の薬剤（１つまたは複数）と同じシグナル伝達経路を標的とする。
【０２３０】
患者の細胞の複数のシグナル伝達経路を評価する方法は、同じ細胞試料で複数の異なるシグナル伝達経路を同時に評価すること、および細胞試料の異なる部を用いて複数の異なるシグナル伝達経路を並行して評価することの両方と組み合わせることができる。細胞試料の異なる部を用いて複数の異なるシグナル伝達経路を並行して評価することについては、上のサブセクションＢに詳細に記載されている。例えば、Ｘ、ＹおよびＺと称される３つの異なるシグナル伝達経路について、患者の細胞試料の異なる部を、以下に挙げる１つまたは複数の標的化治療剤／活性化因子対（「ＴＴ／Ａ対」と呼ぶ）とを接触させることができる：（ｉ）経路Ｘのみに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対：（ｉｉ）経路Ｙのみに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対；（ｉｉｉ）経路Ｚのみに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対；（ｉｖ）経路Ｘに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対と経路Ｙに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対；（ｖ）経路Ｘに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対と経路Ｚに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対；（ｖｉ）経路Ｙに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対と経路Ｚに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対；および（ｖｉｉ）経路Ｘに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対と、経路Ｙに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対と、経路Ｚに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対。次いで、出力値が最も高い試料により、患者の癌細胞において最も活性が高い標的化治療剤（１つまたは複数）が明らかになる。例えば、経路Ｘに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対および経路Ｚに影響を及ぼす１つのＴＴ／Ａ対と接触させた試料が全被験試料のうち最も高い出力値を示す場合、患者には、２つの異なる標的化治療剤、すなわち、経路Ｘに影響を及ぼす標的化治療剤と経路Ｚに影響を及ぼす標的化治療剤（これらの２つの標的化治療剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した同じ薬剤であり得るか、あるいは同じく経路Ｘおよび経路Ｚに影響を及ぼす異なる薬剤であり得る）を投与し得る。複数の経路の同時評価と並行評価を組み合わせるこのような解析、それに基づく最も適切な標的化治療剤（１つまたは複数）による治療レジメンの選択の非限定的な具体例については、実施例３に詳細に記載する。
【０２３１】
一実施形態では、ＴＴ／Ａ対は、１つの標的化治療剤と、それぞれが標的化治療剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている２つ以上の活性化因子とを含む。例えば、一実施形態では、ＴＴ／Ａ対は、１つの標的化治療剤と、それぞれが標的化治療剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている２つの異なる活性化因子とを含む。
【０２３２】
一実施形態では、患者の細胞試料の異なる部と複数のＴＴ／Ａ対とを接触させ、試験する標的化治療剤のうち１つまたは複数のものの濃度を試料部間で変化させることにより、患者の細胞に最も有効な標的化治療剤（１つまたは複数）の濃度を求める。例えば、患者の細胞試料の一部と、第一の濃度のシグナル伝達経路Ｘに影響を及ぼすＴＴ／Ａ対およびシグナル伝達経路Ｙに影響を及ぼすＴＴ／Ａ対とを同時に接触させることができ、患者の細胞試料のまた別の一部と、第二の濃度のシグナル伝達経路Ｘに影響を及ぼすＴＴ／Ａ対およびシグナル伝達経路Ｙに影響を及ぼすＴＴ／Ａ対とを同時に接触させることができる。一実施形態では、試験する標的化治療剤のうち１つのものの濃度を変化させる（例えば、シグナル伝達経路Ｘに影響を及ぼすＴＴ／Ａ対のＴＴの濃度を変化させる）。別の実施形態では、試験する標的化治療剤のうち２つ以上のものの濃度を変化させる（例えば、シグナル伝達経路Ｘに影響を及ぼすＴＴ／Ａ対のＴＴの濃度およびシグナル伝達経路Ｙに影響を及ぼすＴＴ／Ａ対のＴＴの濃度を変化させる）。このような解析により、患者の細胞に最も有効な標的化治療剤（１つまたは複数）のみならず、最も有効な濃度も求めることができる。一実施形態では、２つ以上の標的化治療剤の組合せについて特定した有効濃度が、単独の標的化治療剤のうち１つまたは複数のものの有効濃度と異なっている。例えば、上で考察し、実施例３で説明するように、有効濃度５００ナノモル濃度の標的化治療剤単独を異なるシグナル伝達経路を標的とする第二の標的化治療剤と組み合わせて試験したところ、５０ナノモル濃度（すなわち、１０分の１の濃度）で有効であることが明らかになった。
【０２３３】
一実施形態では、シグナル伝達経路は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＮｏｔｃｈからなる群より選択される。
【０２３４】
一実施形態では、薬剤対の組とシグナル伝達経路は、表２または表１２に記載される薬剤の組から選択される。
【０２３５】
一実施形態では、シグナル伝達経路は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ  ３、Ｍｅｒ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｔｃｈ、ＭＡＰＫ、ＲＯＮ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、Ｍｏｓ、Ｅｒｋ、ＭＬＫ、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ｐ３８、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＨ３、カスパーゼ、ｐ５３、ＮＩＫ、ＮＦｋＢ、ＲＯＣＫ、ＸＩＡＰ、ＭＯＭＰ、ＩＬＫ、ＰＤＫ、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦＲ、ｍＴＯＲ、Ｊａｋ、ＰＩＫＫ、４Ｅ−ＢＰ１、Ｒａｐｔｏｒ、ＫＭＴ、ＭＬＬ、ＫＤＭ、ＵＴＸ、ＤＯＴ１Ｌ、ＢＲＤ、ＴＥＴ、ＳｉｒＴ１、Ｈａｔ、ＳＮＦ、ＤＮＭＴ、ＥＺＨ、ＡＭＰＫ、ＰＬＣ、ＣａＭＫＫ、グルコース輸送体、ＰＦＫ、ＦＡＳ、クレブス回路、解糖、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤ、ＴＲＡＦ、ＴＡＢ、ＮＥＭＯ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｋＢ、ＩＬ１Ｒ、ＩＲＡＫ、Ｍｙｄ８８、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＰｓ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＰＡＲＰ、ラミン、ＺＮＲＦ、ＷｎｔＲ、ＰＡＲ、ＧＳＫ、Ｄｓｈ、ＬＧＲ、カテニン、ＷＴＸ、ＡＰＣ、Ｓｒｃ、ＣＢＰ、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｆｕｒｉｎ、Ｄｅｌｔａ  Ｊａｇｇｅｄ、ＮＩＣ、プレセニリン、ＣＤＯ、ＢＯＣ、Ｇｌｉ、ＫＩＦ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＳＡＲＡ、Ｓｍａｄ、Ｓｍｕｒｆ、ＮＬＫ、ｐ２８、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＬＩＭＫ、コフィリン、ＣＤ４４、ＦＡＴ、ＫＩＢＲＡ、ＦＲＭＤ、Ｍｓｔ、ＹＡＰ、ＬＡＴＳ、ＭＯＢ、ＳＡＶ、ＴＥＡＤ、Ｍｅｒ、ＳＡＢ、ＴＡＺ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＰＡＫ、ＣＲＥＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＶＥＧＦ受容体、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスからなる群より選択される。
【０２３６】
一実施形態では、薬剤対の各組は、異なるＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす。
【０２３７】
別の実施形態では、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対と、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路以外のシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対とを組み合わせて試験する。例えば、一実施形態では、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対と、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対とを組み合わせて試験する。別の実施形態では、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対と、エストロゲン受容体（ＥＲ）シグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対とを組み合わせて試験する。別の実施形態では、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対と、ＦＧＦＲシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対とを組み合わせて試験する。別の実施形態では、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対と、ＰＤＧＦＲシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対とを組み合わせて試験する。
【０２３８】
別の実施形態では、エストロゲン受容体（ＥＲ）シグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対と、ＥＲファミリーシグナル伝達経路以外のシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対とを組み合わせて試験する。例えば、一実施形態では、ＥＲシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対と、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対とを組み合わせて試験する。別の実施形態では、ＥＲシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対と、ＩＧＦＲシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼす少なくとも１組の薬剤対とを組み合わせて試験する。
【０２３９】
別の実施形態では、汎用ＨＥＲシグナル伝達経路阻害剤を含む少なくとも１組の薬剤対と、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ阻害剤を含む少なくとも１組の薬剤対とを組み合わせて試験する。別の実施形態では、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３シグナル伝達経路の阻害剤を含む少なくとも１組の薬剤対と、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ阻害剤を含む少なくとも１組の薬剤対とを組み合わせて試験する。別の実施形態では、汎用ＨＥＲシグナル伝達経路阻害剤を含む少なくとも１組の薬剤対と、ＰＩ３Ｋ阻害剤を含む少なくとも１組の薬剤対とを組み合わせて試験する。別の実施形態では、ＨＥＲ１／ＨＥＲ３シグナル伝達経路の阻害剤を含む少なくとも１組の薬剤対と、ＰＩ３Ｋ阻害剤を含む少なくとも１組の薬剤対とを組み合わせて試験する。
【０２４０】
一実施形態では、薬剤対の各組は、表１２に記載される薬剤対の組から選択される。
【０２４１】
様々な適切な標的化治療剤、活性化因子およびシグナル伝達経路については、下のサブセクションおよび実施例にも詳細に記載する。
【０２４２】
試料の調製および培養、細胞の接着または付着の連続的モニタリングならびに数理解析については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０２４３】
一実施形態では、インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する。バイオセンサーの使用については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０２４４】
一実施形態では、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される。ほかの適切な癌については、下のサブセクションに記載する。
【０２４５】
一実施形態では、生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する。別の実施形態では、生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する。細胞の培養条件および培養については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０２４６】
一実施形態では、対象に投与する少なくとも１つの標的化治療剤は、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、ＭＥＤＩ４２７６、ＯＮＴ−３８０、ネラチニブ、アファチニブ、デュリゴツズマブ、ダコミチニブ、サピチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＭＭ−１１１  ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ７１６、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ルムレツズマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＡＶ−２０３、ＡＺＤ５３６３、アフレセルチブ、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ、リダホロリムス、テムシロリムス、セレメチニブ（Ｓｅｌｅｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ、ＧＤＣ−０９９４、タセリシブ、アルペリシブ、ブパルリシブ、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、オシメルチニブ、ロシレチニブ、ＡＺＤ５３６３、ＳＧＸ−５２３、オナルツズマブ、カボザンチニブ、ボリチニブ、チバンチニブ、カプマチニブ、エミベツズマブ、リロツムマブ、フィクラツズマブ、ＳＡＲ１２５８４４、エミベツズマブ、Ｓｙｍ０１５、ＡＭＧ３３７、ＪＮＪ−６１１８６３７２、グレサチニブ、１２０２、ＬＹ３０２３４１４、ジェダトリシブ、ＪＩ−１０１、ポナチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、アレクチニブ、ＢＧＪ３９８、リンシチニブ、キザルチニブ、Ｒ４２８（ＢＧＢ３２４）、ギルテリチニブ、ビスモデギブ、イトラコナゾール、５Ｅ１、ＬＧＫ９７４、セマガセスタット、コビメチニブ、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ダロツズマブ、ＭＥＤＩ−５７３、ガニツマブ、ソニデジブ、バンチクツマブ、イパフリセプト、タレクスツマブ、ブロンチクツズマブ、ＳＢ４３１５４２、ＥＷ−７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、アブラキサン、ブレンツキシマブベドトン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｏｎ）、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ビカルタミド、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、ロミデプシン、カブラジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、ニロチニブ、テモゾロミド、ボルテゾミブ、アザシチジン、テポチニブ、ロルラチニブ、メレスチニブ、ＲＧ６１１４、ツカンチニブ（ｔｕｃａｎｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣体、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、イキサベピロン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イルブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニ��、トラメチニブ、アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
【０２４７】
一実施形態では、薬剤対の各組の活性化因子は、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せである。
【０２４８】
様々な適切な標的化治療剤、活性化因子、シグナル伝達経路および標的化治療剤／活性化因子対については、上のサブセクションＢ、下のサブセクションおよび実施例に詳細に記載されている。
【０２４９】
Ｇ．特異的治療剤と非特異的治療剤の組合せを用いて経路を評価する方法
本発明の別の態様では、癌患者の治療に１つまたは複数の治療剤を選択するのに用いる方法は、１つの活性化剤と２つ以上の治療剤とを含む１組の薬剤を用いて患者の癌細胞の１つのシグナル伝達経路の機能的活性を評価することを含み、ここでは、活性化剤と治療剤のうちの１つが同じシグナル伝達経路と結合し、その他の治療剤（１つまたは複数）が異なるシグナル伝達経路または細胞部位と結合する。
【０２５０】
あるシグナル伝達経路が他のシグナル伝達経路および細胞活性と複数の収束点、クロストークおよびフィードバックループでつながっているため、活性化因子結合部位（例えば、細胞表面受容体）で惹起される経路の活性を阻害するよう設計された標的化治療剤では、その経路に関連するシグナル伝達活性の大部分を阻害するのに十分ではないことがある。活性化因子薬剤によって惹起されるシグナル伝達経路の活性の大部分を、活性化因子と同じ近接した結合部位を直接標的とするマッチしたシグナル伝達経路阻害剤によって阻害することができない場合、活性化因子の結合部位とは異なる結合部位を標的とする治療法により、患者の細胞において惹起されるシグナル伝達経路の活性の大部分が阻害され得るよう標的療法の効果を増強することが可能であり得る。したがって、活性化剤および治療剤の結合部位とは異なる結合部位と結合する治療剤を加えることにより、標的化治療剤が活性化されるシグナル伝達活性を阻害する能力を相乗的に増大させることができる。この方法により、活性化因子薬剤の結合部位の下流（例えば、ＡＫＴ、ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ｍＴＯＲ、ＤＮＡ塩基、核酸、微小管、プリン）、上流（例えば、ＥＲ、ＲＡＳ、ＲＡＦ）または側方（例えば、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｎｏｔｃｈ、Ｗｎｔ、ｃ−ＭＥＴ、ＡＬＫ、ＡＸＬ、ＦＧＦＲ）にある結合部位を標的とする治療剤が、活性化因子薬剤によって惹起され、活性化因子薬剤と同じ近接した結合部位と結合する標的化治療剤で阻害されるシグナル伝達経路の活性に及ぼす効果を測定することが可能になる。例えば、本明細書に記載される方法を用いて、患者の腫瘍細胞とＭＥＴ標的化治療剤のテポチニブとを接触させると、ＨＧＦ（ＭＥＴリガンド）によって惹起されるＭＥＴシグナル伝達経路の活性がわずか４０％阻害されるにとどまり得る。しかし、患者の細胞をＣＤＫ４／６阻害剤のパルボシクリブなどの治療剤とも接触させると、ＨＧＦによって惹起されるＭＥＴシグナル伝達の活性が８０％阻害され得る。患者の細胞において活性化因子と治療剤の対の組の活性化結合部位および阻害結合部位の下流、上流または側方にある部位と結合する治療剤を評価することにより、この方法は、シグナル伝達経路活性化因子と標的化治療剤の対が患者の細胞に及ぼす効果のみを評価する方法より優れたものとなる。
【０２５１】
したがって、一実施形態では、本発明は、癌であると診断されたヒト対象を治療する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料を、各組が第一の薬剤である標的化治療剤と、第一の薬剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている第二の薬剤である活性化因子と、第一の薬剤とは異なるシグナル伝達経路または第一の薬剤が影響を及ぼすシグナル伝達経路内にある異なる部位に影響を及ぼす第三の薬剤である標的化治療剤とからなる少なくとも１つの薬剤の三つ組と同時に接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定され、第一の薬剤が影響を及ぼすシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料を作製することと、
少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤である標的化治療剤のみ、第二の薬剤である活性化因子のみまたは第三の薬剤である標的化治療剤のみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
薬剤の三つ組と接触させた試料に第一の薬剤である標的化治療剤のみ、第二の薬剤である活性化因子のみまたは第三の薬剤である標的化治療剤のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける少なくとも１つの薬剤の三つ組の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
出力値が、第一の薬剤である標的化治療剤が対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す所定のカットオフ値より大きい場合、薬剤の三つ組の第一の薬剤である標的化治療剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することと
含む方法によって対象の癌細胞でシグナル伝達を測定したシグナル伝達経路において治療活性がある少なくとも１つの標的化治療剤を対象に投与することを含む、方法に関する。
【０２５２】
一実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、第一の薬剤である標的化治療剤である。別の実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、第一の薬剤である標的化治療剤とは異なるものであるが、前記第一の薬剤である標的化治療剤と同じシグナル伝達経路を標的とする。別の実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、第三の薬剤である標的化治療剤である。別の実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、第三の薬剤とは異なるものであるが、前記第三の薬剤である標的化治療剤と同じシグナル伝達経路を標的とする。別の実施形態では、対象に投与する標的化治療剤は、第一の薬剤である標的化治療剤と第三の薬剤である標的化治療剤の両方である。別の実施形態では、第一の薬剤である標的化治療剤および第三の薬剤である標的化治療剤とは異なる２つの標的化治療剤を対象に投与するが、投与する２つの標的化治療剤は、前記第一の薬剤である標的化治療剤および第三の薬剤である標的化治療剤と同じシグナル伝達経路を標的とする。
【０２５３】
別の態様では、本発明は、対象の癌細胞の対処しようとするシグナル伝達経路において治療活性がある標的化治療剤を特定する方法であって、
対象から採取した生存癌細胞を含む試料を培養することと、
試料を、各組が第一の薬剤である標的化治療剤と、第一の薬剤により対処しようとする同じシグナル伝達経路に選択的に影響を及ぼすことがわかっている第二の薬剤である活性化因子と、第一の薬剤とは異なるシグナル伝達経路または第一の薬剤が影響を及ぼすシグナル伝達経路内にある異なる部位に影響を及ぼす第三の薬剤である標的化治療剤とからなる少なくとも１つの薬剤の三つ組と同時に接触させて、細胞の接着または付着に対する効果によって測定され、第一の薬剤が影響を及ぼすシグナル伝達経路を上方制御または下方制御し、少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料を作製することと、
少なくとも１つの薬剤の三つ組と接触させた試料中の生存癌細胞の細胞接着または付着を、対象から採取し第一の薬剤である標的化治療剤のみ、第二の薬剤である活性化因子のみまたは第三の薬剤である標的化治療剤のみと接触させた生存癌細胞の試料と比較して連続的に測定することと、
薬剤の三つ組と接触させた試料に第一の標的化治療剤のみ、第二の薬剤である活性化因子のみまたは第三の薬剤である標的化治療剤のみと接触させた試料と比較して細胞の接着または付着の変化が起こったかどうかを特徴付ける少なくとも１つの薬剤の三つ組の出力値を連続測定値の数理解析によって求めることと、
出力値が、第一の薬剤である標的化治療剤が対象の癌細胞の細胞シグナル伝達経路において治療活性があることを示す所定のカットオフ値より大きい場合、薬剤の三つ組から第一の薬剤である標的化治療剤を特定することと
を含む、方法に関する。
【０２５４】
一実施形態では、標的化治療剤（例えば、第一の薬剤である標的化治療剤）は、標的化治療剤の影響を受けるシグナル伝達経路が対象の癌細胞において活性であることを示す５０％超の出力値パーセントを有することが明らかになっている。別の実施形態では、標的化治療剤（例えば、第一の薬剤である標的化治療剤）は、標的化治療剤が対象の癌細胞のシグナル伝達経路において治療活性があることを示す５０％超の出力値パーセントを有することが明らかになっている。
【０２５５】
一実施形態では、第一の薬剤である標的化治療剤、第二の薬剤である活性化因子ならびに第一の薬剤および第二の薬剤の影響を受けるシグナル伝達経路は、表２に記載される薬剤対から選択される。別の実施形態では、薬剤対の各組は、表１２に記載される薬剤対の組から選択される。
【０２５６】
第三の薬剤である標的化治療剤は、第一の薬剤とは異なるシグナル伝達経路または第一の薬剤が影響を及ぼすシグナル伝達経路内にある異なる部位に影響を及ぼす。したがって、一実施形態では、第一の薬剤である標的化治療剤と第三の薬剤である標的化治療剤は異なるシグナル伝達経路に影響を及ぼす。別の実施形態では、第三の薬剤である標的化治療剤は、第一の標的化治療剤と同じシグナル伝達経路に影響を及ぼすが、第一の薬剤が影響を及ぼすシグナル伝達経路内にある異なる位置で影響を及ぼす（例えば、第三の薬剤である標的化治療剤の結合部位は、第一の薬剤である標的化治療剤の結合部位の上流、下流または側方にあり得る）。
【０２５７】
一実施形態では、シグナル伝達経路は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＮｏｔｃｈからなる群より選択される。
【０２５８】
一実施形態では、シグナル伝達経路は、ＨＥＲ２／ＨＥＲ１、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２／ＨＥＲ３、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ／ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＲＯＳ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、Ｔｙｒｏ  ３、Ｍｅｒ、ＰＤＧＦＲ、ＳＭＯ、Ｐａｔｃｈｅｄ  １、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ、Ｎｏｔｃｈ、ＭＡＰＫ、ＲＯＮ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＭＥＫ、ＭＥＫＫ、Ｍｏｓ、Ｅｒｋ、ＭＬＫ、ＭＬＫ３、ＴＡＫ、ＤＬＫ、ｐ３８、ＡＳＫ、ＳＡＰＫ、ＪＮＫ、ＢＭＫ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、Ｂａｄ、Ｂｃｌ、Ｂａｋ、Ｂａｘ、ＢＩＤ、Ｂｉｍ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、ＢＨ３、カスパーゼ、ｐ５３、ＮＩＫ、ＮＦｋＢ、ＲＯＣＫ、ＸＩＡＰ、ＭＯＭＰ、ＩＬＫ、ＰＤＫ、インスリン受容体（ＩＲ）、ＩＧＦＲ、ｍＴＯＲ、Ｊａｋ、ＰＩＫＫ、４Ｅ−ＢＰ１、Ｒａｐｔｏｒ、ＫＭＴ、ＭＬＬ、ＫＤＭ、ＵＴＸ、ＤＯＴ１Ｌ、ＢＲＤ、ＴＥＴ、ＳｉｒＴ１、Ｈａｔ、ＳＮＦ、ＤＮＭＴ、ＥＺＨ、ＡＭＰＫ、ＰＬＣ、ＣａＭＫＫ、グルコース輸送体、ＰＦＫ、ＦＡＳ、クレブス回路、解糖、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤ、ＴＲＡＦ、ＴＡＢ、ＮＥＭＯ、ＮＩＫ、ＩＫＫ、ＲｅｌＡ、ＲｅｌＢ、ｋＢ、ＩＬ１Ｒ、ＩＲＡＫ、Ｍｙｄ８８、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、ＦＬＩＰｓ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＰＡＲＰ、ラミン、ＺＮＲＦ、ＷｎｔＲ、ＰＡＲ、ＧＳＫ、Ｄｓｈ、ＬＧＲ、カテニン、ＷＴＸ、ＡＰＣ、Ｓｒｃ、ＣＢＰ、Ｆｒｉｎｇｅ、Ｆｕｒｉｎ、Ｄｅｌｔａ  Ｊａｇｇｅｄ、ＮＩＣ、プレセニリン、ＣＤＯ、ＢＯＣ、Ｇｌｉ、ＫＩＦ、サイクリンＤ、サイクリンＥ、ＳＡＲＡ、Ｓｍａｄ、Ｓｍｕｒｆ、ＮＬＫ、ｐ２８、Ｍｙｃ、Ｍａｘ、Ｆｏｓ、Ｊｕｎ、ＬＩＭＫ、コフィリン、ＣＤ４４、ＦＡＴ、ＫＩＢＲＡ、ＦＲＭＤ、Ｍｓｔ、ＹＡＰ、ＬＡＴＳ、ＭＯＢ、ＳＡＶ、ＴＥＡＤ、Ｍｅｒ、ＳＡＢ、ＴＡＺ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、ＰＡＫ、ＣＲＥＢ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＧＰＥＲ３０、ＶＥＧＦ受容体、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスからなる群より選択される。
【０２５９】
一実施形態では、第一の薬剤である標的化治療剤はＭＥＴシグナル伝達経路に影響を及ぼすもの（例えば、テポチニブ）であり、第二の薬剤である活性化因子はＭＥＴシグナル伝達経路を活性化するもの（例えば、ＨＧＦなどのＭＥＴリガンド）であり、第三の薬剤である標的化治療剤はＥＧＦＲ阻害剤（例えば、エルロチニブ）である。別の実施形態では、第一の薬剤である標的化治療剤はＭＥＴシグナル伝達経路に影響を及ぼすもの（例えば、テポチニブ）であり、第二の薬剤である活性化因子はＭＥＴシグナル伝達経路を活性化するもの（例えば、ＨＧＦなどのＭＥＴリガンド）であり、第三の薬剤である標的化治療剤はＣＤＫ４／６阻害剤（例えば、パルボシクリブ）である。
【０２６０】
試料の調製および培養、細胞の接着または付着の連続的モニタリングならびに数理解析については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０２６１】
一実施形態では、インピーダンスバイオセンサーまたは光学バイオセンサーを用いて細胞の接着または付着を測定する。バイオセンサーの使用については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０２６２】
一実施形態では、癌は、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、腎臓癌、卵巣癌および白血病からなる群より選択される。ほかの適切な癌については、下のサブセクションに記載する。
【０２６３】
一実施形態では、生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する。別の実施形態では、生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する。細胞の培養条件および培養については、下のサブセクションにさらに詳細に記載する。
【０２６４】
一実施形態では、対象に投与する少なくとも１つの標的化治療剤は、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、ＭＥＤＩ４２７６、ＯＮＴ−３８０、ネラチニブ、アファチニブ、デュリゴツズマブ、ダコミチニブ、サピチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＭＭ−１１１  ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ７１６、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ルムレツズマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＡＶ−２０３、ＡＺＤ５３６３、アフレセルチブ、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ、リダホロリムス、テムシロリムス、セレメチニブ（Ｓｅｌｅｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ、ＧＤＣ−０９９４、タセリシブ、アルペリシブ、ブパルリシブ、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、オシメルチニブ、ロシレチニブ、ＡＺＤ５３６３、ＳＧＸ−５２３、オナルツズマブ、カボザンチニブ、ボリチニブ、チバンチニブ、カプマチニブ、エミベツズマブ、リロツムマブ、フィクラツズマブ、ＳＡＲ１２５８４４、エミベツズマブ、Ｓｙｍ０１５、ＡＭＧ３３７、ＪＮＪ−６１１８６３７２、グレサチニブ、１２０２、ＬＹ３０２３４１４、ジェダトリシブ、ＪＩ−１０１、ポナチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、アレクチニブ、ＢＧＪ３９８、リンシチニブ、キザルチニブ、Ｒ４２８（ＢＧＢ３２４）、ギルテリチニブ、ビスモデギブ、イトラコナゾール、５Ｅ１、ＬＧＫ９７４、セマガセスタット、コビメチニブ、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ダロツズマブ、ＭＥＤＩ−５７３、ガニツマブ、ソニデジブ、バンチクツマブ、イパフリセプト、タレクスツマブ、ブロンチクツズマブ、ＳＢ４３１５４２、ＥＷ−７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、アブラキサン、ブレンツキシマブベドトン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｏｎ）、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ビカルタミド、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、ロミデプシン、カブラジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、ニロチニブ、テモゾロミド、ボルテゾミブ、アザシチジン、テポチニブ、ロルラチニブ、メレスチニブ、ＲＧ６１１４、ツカンチニブ（ｔｕｃａｎｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣体、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、イキサベピロン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イルブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニ��、トラメチニブ、アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブおよびそれらの組合せからなる群より選択される。
【０２６５】
一実施形態では、薬剤対の各組の活性化因子は、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せである。
【０２６６】
様々な適切な標的化治療剤、活性化因子、シグナル伝達経路および標的化治療剤／活性化因子対については、上のサブセクションＢ、下のサブセクションおよび実施例に詳細に記載されている。
【０２６７】
Ｈ．シグナル伝達経路、活性化因子および標的化治療剤
患者が特定の疾患または病態を有すると診断された場合、様々な治療選択肢が存在することが多い。場合によっては、治療が極めて高額なものとなる、または治療による副作用が重篤なものであるため、患者が治療に対する応答者または非応答者のいずれである可能性が高いかを明らかにするのが有用であることがある。さらに、患者に耐性が生じた場合、患者の罹患細胞が耐性になったため、有効であると思われる他の治療法を明らかにするのが有用であるものと考えられる。
【０２６８】
ある特定の実施形態では、患者によって応答の可否が異なる病態の治療に称する任意の治療剤または薬剤を本明細書に記載される方法で解析することができる。例えば、癌には、多数の様々なキメラ抗体およびヒト化抗体を含めた多数の標的化免疫療法を用いることができる。自己免疫病態には、炎症性サイトカインまたはその受容体に標的化した分子などの分子を解析し得る。炎症性サイトカインに標的化した薬剤の例には、抗ＴＮＦ−α剤、インターフェロンアルファ、インターロイキンなどを標的とする薬剤がある。免疫抑制剤、例えば副腎皮質ステロイド、タクロリムス（ＦＫ−５０６またはＴＡＣＲ）（Ｔ細胞の代謝および増殖を阻害する）、シロリムス（ＳＩＲＯ／８１７６８）、ミオコフェノール酸（ｍｙｏｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、カルシニューリン阻害剤（ＣＩ）、シクロスポリン（ＣｓＡ）およびラパマイシン（ｍＴＯＲ阻害剤）など。
【０２６９】
他の実施形態では、この方法は、１つまたは複数の治療剤、攪乱剤（例えば、活性化因子薬剤）、確認剤またはそれらの組合せが個々の対象の罹患細胞の生理的パラメータを変化させることができるかどうかを試験することを含む。諸実施形態では、治療剤も無標識である。いくつかの実施形態では、同じ患者の罹患細胞の別個の試料で２つ以上の治療剤を別個に、または組み合わせて試験し得る。他の治療剤より低用量で細胞応答または生理的特徴を最も大きく変化させる治療剤を選択する。最も高い治療有効性が得られる化合物の組合せを決定し得る。諸実施形態では、決定は、患者の健常細胞または非罹患患者もしくは非罹患患者のプールの健常細胞の結果と比較して治療指数ならびにその他の個々の安全性および許容効果を求めた場合のものであり得る。
【０２７０】
シグナル伝達経路活性化因子および治療剤の標的となる経路の例としては、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ｃ−ＭＥＴ、ＨＧＦ、ＡＬＫ、ＦＧＦＲ、ＩＧＦＲ、ＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＦＬＴ３、Ａｘｌ、ＳＭＯ、Ｆｚ、γ−セクレターゼ、ＭＡＰＫ−ＰＫ、ＲＡＳ／ＲＡＦ、ＲＨＯキナーゼ、ＦＡＫ１、ＭＥＫ／ＭＡＰＫ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＡＫＴ、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮおよびＶＥＧＦＲ、細胞接着、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｎｏｔｃｈ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスが挙げられる。いくつかの実施形態では、薬剤は細胞周期の調節に関与する細胞内経路を標的とする。細胞周期の調節に影響を及ぼす例示的薬剤としては、サイクリン依存性キナーゼ、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６およびサイクリン（例えば、サイクリンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦおよびＧ１／Ｓサイクリン）およびＢＣＲ−ＡＢＬに標的化したものが挙げられる。いくつかの実施形態では、薬剤はアロマターゼ酵素を標的とする。
【０２７１】
例示的実施形態では、シグナル伝達経路活性化因子および標的化治療剤は、以下の細胞過程、すなわち、ＭＡＰキナーゼシグナル伝達、アポトーシス、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達、クロマチン／エピジェネティック調節、細胞代謝、細胞周期制御、免疫および炎症、発生および分化ならびに／あるいは細胞骨格の調節および接着のうちの少なくとも１つに関与する細胞内経路に作用する。
【０２７２】
例示的シグナル伝達経路活性化因子およびそれが標的とする経路を下の表３〜１２に記載する。
【０２７３】
【表３】
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【０２７４】
【表４】
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【０２７５】
【表５】
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２つのＴＯＲＣおよびＡｋｔ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  １２（４），４８７−５０２（２００７）
【０２７６】
【表６】
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【０２７７】
【表７】
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【０２７８】
【表８】
2020514379.tif 000012
【０２７９】
【表９】
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2020514379.tif 000014
2020514379.tif 000015
【０２８０】
【表１０】
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【０２８１】
【表１１】
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【０２８２】
【表１２】
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【０２８３】
治療剤には、特に限定されないが、特定の細胞内経路を標的とする薬剤および／または細胞増殖を阻害するか細胞殺作用を引き起こす薬剤が含まれ得る。治療剤が標的とする経路の例としては、ＭＡＰＫ−ＰＫ、ＲＡＳ／ＲＡＦ、ＲＨＯ、ＦＡＫ１、ＭＥＫ／ＭＡＰＫ、ＭＡＫ、ＭＫＫ、ＡＫＴ、ＥＧＦ受容体、Ｈｅｒ２受容体、Ｈｅｒ３受容体、Ｈｅｒ４受容体、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、アンドロゲン受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＧＰＥＲ３０、ＰＩＫ３／ＰＴＥＮ、ＶＥＧＦ受容体経路阻害剤、細胞接着、ＴＧＦベータ／ＳＭＡＤ、ＷＮＴ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ／ＧＬＩ、ＨＩＦ１アルファ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、Ｎｏｔｃｈ、Ｇ１／Ｓ遷移の制御、ＤＮＡ損傷制御およびアポトーシスが挙げられる。いくつかの実施形態では、治療剤は細胞周期の調節に関与する細胞内経路を標的とする。細胞周期の調節に影響を及ぼす例示的な標的化治療剤としては、ＣＤＫ４、ＣＤＫ６、ＰＤ−１およびサイクリン（例えば、サイクリンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、ＥまたはＦおよびＧ１／Ｓサイクリン）を標的とするものが挙げられる。いくつかの実施形態では、標的化治療剤はアロマターゼ酵素を標的とする。
【０２８４】
他の実施形態では、治療剤は、多数の小分子および抗体薬物、例えばセツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、ＭＥＤＩ４２７６、ＯＮＴ−３８０、ネラチニブ、アファチニブ、デュリゴツズマブ、ダコミチニブ、サピチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＭＭ−１１１  ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ７１６、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ルムレツズマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＡＶ−２０３、ＡＺＤ５３６３、アフレセルチブ、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ、リダホロリムス、テムシロリムス、セレメチニブ（Ｓｅｌｅｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ、ＧＤＣ−０９９４、タセリシブ、アルペリシブ、ブパルリシブ、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、オシメルチニブ、ロシレチニブ、ＡＺＤ５３６３、ＳＧＸ−５２３、オナルツズマブ、カボザンチニブ、ボリチニブ、チバンチニブ、カプマチニブ、エミベツズマブ、リロツムマブ、フィクラツズマブ、ＳＡＲ１２５８４４、エミベツズマブ、Ｓｙｍ０１５、ＡＭＧ３３７、ＪＮＪ−６１１８６３７２、グレサチニブ、１２０２、ＬＹ３０２３４１４、ジェダトリシブ、ＪＩ−１０１、ポナチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、アレクチニブ、ＢＧＪ３９８、リンシチニブ、キザルチニブ、Ｒ４２８（ＢＧＢ３２４）、ギルテリチニブ、ビスモデギブ、イトラコナゾール、５Ｅ１、ＬＧＫ９７４、セマガセスタット、コビメチニブ、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ダロツズマブ、ＭＥＤＩ−５７３、ガニツマブ、ソニデジブ、バンチクツマブ、イパフリセプト、タレクスツマブ、ブロンチクツズマブ、ＳＢ４３１５４２、ＥＷ−７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、アブラキサン、ブレンツキシマブベドトン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｏｎ）、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ビカルタミド、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、ロミデプシン、カブラジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、ニロチニブ、テモゾロミド、ボルテゾミブ、アザシチジン、テポチニブ、ロルラチニブ、メレスチニブ、ＲＧ６１１４、ツカンチニブ（ｔｕｃａｎｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣体、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、イキサベピロン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イルブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニ��、トラメチニブ、アキシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブおよびそれらの組合せなどから選択される。これらの治療剤の標的は既知である。ＣｈｏｕとＴａｌａｌａｙの方法（Ｃｈｏｕ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，７０（２）：４４０−４４６（２０１０））を用いて治療剤のほかの組合せを選択することができる。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、治療剤は、細胞内経路のメンバーである細胞表面受容体を標的とする。これらの試料を経路の活性化因子薬剤または攪乱物質（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ）で活性化させる前に治療剤と接触させることができる。他の実施形態では、活性化因子薬剤または攪乱物質（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ）は、特定の成長因子、血管内皮成長因子、ホスファチジルイノシトール、上皮成長因子、肝細胞成長因子、ｍ−ＣＳＦ、ＲＡＮＫリガンド、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）、ニューレグリン、エストロゲン、プロゲステロン、葉酸塩、アデノシン三リン酸およびＦＡＳリガンド、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）または細胞内経路もしくはシグナル伝達を攪乱するその他の薬剤、例えば対象の血漿もしくは血清、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋、Ｃｌ−、Ｃａ＋２、グルコース、グルタミン、ヒスチジン、マンニトールおよびトリプトファン、抗生物質（ラパマイシン）、必須アミノ酸および非必須アミノ酸、ビタミン、その他の有機化合物、微量ミネラルおよび無機塩、血清、細胞抽出物、分画した細胞抽出物もしくは分画した血清、細胞外シグナル伝達因子、細胞内シグナル伝達因子、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、ホスホホリルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、トリイドサイロニン（ｔｒｉｉｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンなどを含む。他の実施形態では、治療剤は、細胞増殖を阻害すること、細胞殺作用を増強することおよび罹患状態を引き起こすシグナルに対して細胞を非応答性または低応答性にすることによって、罹患細胞に影響を及ぼすものである。このような治療剤の例としては、シクロホスファミド、５−ＦＵ、カペシタビンおよびその他のピリミジン薬、その他のＳＮ−３８代謝産物類似体（例えば、イリノテカン）、タキソールならびに白金含有薬物（例えば、シスプラチン）が挙げられる。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、細胞増殖を攪乱する成長因子または抗アポトーシス剤の存在下または不在下で、上記の薬剤のうちの１つまたは複数のものに対する試料の応答を測定することもできる。細胞増殖を攪乱する成長因子としては、成長ホルモン、上皮成長因子、血管内皮成長因子、血小板由来成長因子、肝細胞成長因子、トランスフォーミング成長因子、線維芽細胞成長因子、神経成長因子および当業者に公知のその他の成長因子が挙げられる。抗アポトーシス剤としては、抗アポトーシスタンパク質または経路を調節する化合物（例えば、Ｂｃｌ−２タンパク質活性に対するｔａｘｏｌおよび抗アポトーシスＲａｓシグナル伝達カスケードを制御するゲフィチニブ）が挙げられる。
【０２８７】
ＥＲαシグナル伝達経路に影響を及ぼす適切な活性化因子薬剤、例えばエストラジオールなどのなどは当該技術分野で公知であり、本明細書に開示される。別の実施形態では、生存癌細胞をさらに、エストロゲン関連シグナル伝達経路の活性を阻害する確認剤、例えば選択的エストロゲン受容体ダウンレギュレーターなどと接触させる。別の実施形態では、癌細胞をさらに、ＥＲαシグナル伝達経路を標的とする標的化治療剤と接触させ、細胞の接着または付着に対する標的化治療剤の効果を測定する。ＥＲαシグナル伝達経路を標的とする適切な標的化治療剤、例えばフルベストラントおよびタモキシフェンなどは当該技術分野で公知であり、本明細書に開示される。この方法は、対象に標的化治療剤を投与することをさらに含み得る。
【０２８８】
ＥｒｂＢシグナル伝達経路に影響を及ぼす適切な活性化因子薬剤は当該技術分野で公知であり、本明細書に開示される。一実施形態では、生存癌細胞と、ＥｒｂＢ関連シグナル伝達経路のシグナル伝達を阻害することがわかっている確認剤、例えば２Ｃ４マウスモノクローナル抗体またはチロシンキナーゼ阻害剤などとを接触させる。別の実施形態では、生存癌細胞をさらに、ＥｒｂＢシグナル伝達経路を標的とする標的化治療剤と接触させ、細胞の接着または付着に対する標的化治療剤の効果を測定する。ＥｒｂＢシグナル伝達経路を標的とする適切な標的化治療剤は当該技術分野で公知であり、本明細書に開示される。この方法は、対象に標的化治療剤を投与することをさらに含み得る。
【０２８９】
下の表１３に、ＥｒｂＢシグナル伝達経路の癌を治療することを目的とする経路、薬物標的および標的化療法剤をまとめる。
【０２９０】
【表１３】
2020514379.tif 000025
【０２９１】
様々な実施形態では、シグナル伝達経路は、ＭＡＰＫ、ＲＨＯ、ＡＫＴ、ＦＡＫ１、ＲＡＳ／ＲＡＦ、ＰＩ３Ｋ／ＰＴＥＮ、ＭＡＫ、ＭＫＫおよびＭＥＫからなる群より選択される。ほかの適切なシグナル伝達経路としては、本明細書に開示されるその他のシグナル伝達経路が挙げられる。様々な実施形態では、活性化因子薬剤は、例えば、タンパク質、ペプチド、核酸、代謝産物、リガンド、試薬、有機分子、シグナル伝達因子、成長因子、生化学物質またはそれらの組合せであり得る。
【０２９２】
標的化治療剤の非限定的な例としては、セツキシマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、パゾパニブ、トラスツズマブ、フルベストラント、タモキシフェン、レトロゾール、アナストロゾール、エキセメスタン、エベロリムス、アビラテロン、ビカルタミド、ボルテゾミブ、ベムラフェニブ、イピリムマブ、ペルツズマブ、ＭＥＤＩ４２７６、ＯＮＴ−３８０、ネラチニブ、アファチニブ、デュリゴツズマブ、ダコミチニブ、サピチニブ、ポジオチニブ、ＡＳＬＡＮ００１、ＭＭ−１１１  ＭＭ−１２１、ＭＭ−１４１、ＬＪＭ７１６、Ｕ３−１２８７（ＡＭＧ８８８）、ＴＫ−Ａ３／ＴＫ−Ａ４、ルムレツズマブ、ＲＥＧＮ１４００、ＡＶ−２０３、ＡＺＤ５３６３、アフレセルチブ、ＭＫ−２２０６、イパタセルチブ、リダホロリムス、テムシロリムス、セレメチニブ（Ｓｅｌｅｍｅｔｉｎｉｂ）、コビメチニブ、ＧＤＣ−０９９４、タセリシブ、アルペリシブ、ブパルリシブ、ＡＺＤ８１８６、ＡＺＤ８８３５、パニツムマブ、ＲＥＧＮ９５５、ＭＭ−１５１、オシメルチニブ、ロシレチニブ、ＡＺＤ５３６３、ＳＧＸ−５２３、オナルツズマブ、カボザンチニブ、ボリチニブ、チバンチニブ、カプマチニブ、エミベツズマブ、リロツムマブ、フィクラツズマブ、ＳＡＲ１２５８４４、エミベツズマブ、Ｓｙｍ０１５、ＡＭＧ３３７、ＪＮＪ−６１１８６３７２、グレサチニブ、１２０２、ＬＹ３０２３４１４、ジェダトリシブ、ＪＩ−１０１、ポナチニブ、スニチニブ、クリゾチニブ、セリチニブ、ブリガチニブ、アレクチニブ、ＢＧＪ３９８、リンシチニブ、キザルチニブ、Ｒ４２８（ＢＧＢ３２４）、Ｇｉｌｔｅｒｉｔｎｉｂ、ビスモデギブ、イトラコナゾール、５Ｅ１、ＬＧＫ９７４、セマガセスタット、コビメチニブ、ＡＺＤ４５４７、ＪＮＪ−４２７５６４９３、ダロツズマブ、ＭＥＤＩ−５７３、ガニツマブ、ソニデジブ、バンチクツマブ、イパフリセプト、タレクスツマブ、ブロンチクツズマブ、ＳＢ４３１５４２、ＥＷ−７１９７、ＲｅｐＳｏｘ、ＡＺＤ９２９１、ロシレチニブ、アブラキサン、ブレンツキシマブベドトン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｏｎ）、オファツムマブ、ベバシズマブ、アレムツズマブ、ビカルタミド、ゲムシタビン、イマチニブ、イキサベピロン、ロミデプシン、カブラジタキセル（ｃａｂｒａｚｉｔａｘｅｌ）、ソラフェニブ、インフリキシマブ、レナリドマイド、リツキシマブ、ダサチニブ、ニロチニブ、テモゾロミド、ボルテゾミブ、アザシチジン、テポチニブ、ロルラチニブ、メレスチニブ、ＲＧ６１１４、ツカンチニブ（ｔｕｃａｎｔｉｎｉｂ）、パゾパニブ、クリゾチニブ、ベムラフェニブ、ゴセレリン酢酸塩、アビラテロン、ＢＨ３模倣体、ナビトクラックス、アナストロゾール、レトロゾール、アロマターゼ阻害剤、イキサベピロン、アフリベルセプト、テムシロリムス、イルブリツモマブ（ｉｒｂｒｉｔｕｍｏｍａｂ）、アビラテロン、クスチルセン、エンザルタミド、ニボルマブ、パルボシクリブ、レゴラフェニブ、エンチノスタット、ＡＲＮ−５０９、ＡＲＮ−８１０、ＢＩＮＤ−０１４、ダブラフェニブ、ダラツムマブ、ランブロリズマブ、ＬＤＫ３７８、ｓｙｍ００４、トラスツズマブエムタンシン、チボザニブ、トラメチニブ、��キシチニブ、ＬＹ２８３５２１９、ＭＰＤＬ３２０Ａ、オビヌツズマブ、Ｓｙｍ００４、トシツモマブ、トラメチニブ、ネシツムマブ、ラムシルマブおよびそれらの組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、この方法は、対象に標的化治療剤を投与することをさらに含む。
【０２９３】
Ｉ．試料の調製および培養
本発明の諸実施形態は、対象の罹患細胞に投与したときの治療剤の効果を判定する、効果をモニターする、または治療剤の用量を明らかにするシステム、キットおよび方法を含む。
【０２９４】
疾患は従来、それが影響を及ぼす組織または器官によって分類されてきた。根底にある機序（例えば、遺伝、自己免疫応答など）に関する知識が増えたことにより、現在では、同じ組織／器官に影響を及ぼす、または同じ症状を呈する疾患でも、原因が異なる場合および遺伝子発現プロファイルが不均一である場合があることがわかっている。さらに、多くの疾患では、治療剤に対する応答者と非応答者が存在することが明らかにされている。諸実施形態では、薬物の特定の治療配合剤が特定の個体に効果を示すかどうか、例えば、その個体が応答者であるか非応答者であるかの判定を予測または予後予測するため、応答者と非応答者が特定される任意の疾患タイプを本明細書の方法に用いることができる。
【０２９５】
正常が不均一であり、応答者と多数の非応答者があることがわかっている疾患タイプの１つの例が癌である。癌は通常、組織タイプに従って分類される。しかし、癌の不均一性をさらに正確に説明するものとなると、それは癌によって変異が異なることに反映される。癌の不均一性をさらになお正確に説明するのが、特定の患者の細胞の変異による実際の機能的な生理的結果である。例えば、乳癌には様々なタイプがあり、この器官に癌を引き起こす変異も様々である。癌の原因となっている変異が機能獲得（例えば、タンパク質産生増大を引き起こす癌原遺伝子）または機能欠損型変異（例えば、腫瘍抑制因子）のいずれであるのか、またいずれの遺伝子の変異であるのかによって転帰および治療が異なるものとなり得る。ある特定の癌が不均一なものであるため、特定の治療剤に対して不均一な応答がみられることが予想されるものと思われる。本発明の諸実施形態は、特定の対象の癌細胞を治療剤または治療剤のパネルに対し試験して、特定の対象の癌に対する特定の治療剤の有効性または最も効果的な治療剤を明らかにし、対象の治療法を選択することを可能にするものである。
【０２９６】
本発明の諸実施形態は、個々の対象の癌細胞の疾患細胞試料を含む。このような癌細胞は、特に限定されないが、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、基底細胞癌、肝外胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨肉腫、悪性線維性組織球腫、脳幹神経膠腫、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、中枢神経系胚芽腫、中枢神経系胚細胞腫瘍、頭蓋咽頭腫、上衣芽腫、上衣腫、髄芽腫、髄様上皮腫、乳癌、中間型松果体実質腫瘍、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、松果体芽腫、気管支腫瘍、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性疾患、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、子宮内膜癌、食道癌、鼻腔神経芽細胞腫、ユーイング肉腫、性腺外胚細胞腫瘍、眼内黒色腫、網膜芽細胞腫、線維性組織球腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、妊娠性絨毛性腫瘍、神経膠腫、有毛細胞性白血病、心臓癌、肝細胞癌、ランゲルハンス細胞組織球症、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、島細胞腫、カポジ肉腫、腎細胞癌、喉頭癌、口唇癌、肝臓癌、非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）、肺癌、メルケル細胞癌、黒色腫、中皮腫、口腔癌、多発性骨髄腫、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、中咽頭癌、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫、傍神経節腫、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体実質腫瘍、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、扁平上皮癌、小腸癌、精巣癌、咽喉癌、甲状腺癌、尿管癌、尿道癌、子宮癌、腟癌、外陰癌ならびにウィルムス腫瘍に由来するものであり得る。
【０２９７】
自己免疫疾患は、自己抗原に対する免疫系の活性化による炎症の亢進を特徴とする。現在用いられている治療法は、Ｂ細胞などの免疫系細胞および抗ＴＮＦαなどの炎症性分子を標的とするものである。治療法は大きく免疫調節剤または免疫抑制剤と特徴付けられる。薬物は、ＴＮＦアルファ、インテグリン、スフィンゴシン受容体およびインターロイキンなどの特定の分子に標的化されたものであり得る。その他の薬物は副腎皮質ステロイド剤などの抗炎症剤として作用する。また別の場合には、薬物はメルカプトプリンおよびシクロホスファミドなどの免疫抑制剤である。自己免疫病態に関しては、ある特定の治療剤に対する末梢血細胞の応答を検討し得る。他の実施形態では、炎症部位の組織試料、例えば、関節リウマチの滑膜組織または潰瘍性大腸炎の大腸組織。
【０２９８】
例えば、一部の関節リウマチ患者は抗ＴＮＦα抗体に応答しないことがわかっている。一実施形態では、ＲＡであることが疑われる患者から末梢血細胞を採取し、患者のＴＮＦ受容体およびそれに関連するＭＡＰＫ経路の細胞シグナル伝達能の低下を用いて、その患者が免疫調節化合物または免疫抑制化合物に応答する可能性が高いか、応答しない可能性が高いかを判定することができる。同様に、ＩＬ−６、インターフェロンアルファ、インターフェロンガンマなどを標的とする治療剤などの他の治療剤を同じ方法で試験し得る。他の実施形態では、多発性硬化症を有する患者はインターフェロンベータに応答しないことがわかっている。対象の細胞試料を薬物のパネルに対し試験して、薬物のうち細胞の生理的パラメータの変化を引き起こすことによって特定の対象に対して効果を示すものがあるかどうかを確認することができる。有利な転帰の例として、アメリカリウマチ学会（ＡＣＲ）の基準によって求められる細胞性炎症パラメータの減少、または血液脳関門機能を強化する細胞接着の増大が考えられる。
【０２９９】
他の実施形態では、患者は、微生物、異物または外来病原体による細胞感染を原因とする疾患を有し得る。微生物に感染した血液細胞または組織試料の様々な抗生物質、抗ウイルス剤またはその他の治療剤候補に対する応答性を評価し得る。例えば、Ｃ型肝炎感染に対して、ウイルス機能を低下させる多数の様々な治療剤が存在し、感染組織試料を１つまたは複数の治療剤と接触させ、細胞の生理的パラメータの変化を検出することができる。感染組織の細胞の生理的パラメータを変化させる治療剤および／または最も低い用量で細胞の生理的パラメータを変化させる治療剤を選択する。細胞生存能の増大または細胞成長の増大などの転帰が有利であると考えられる。治療剤が特定の受容体タイプからのウイルス侵入阻止または細胞内経路の活性化などによってヒト細胞に直接影響を及ぼすよう設計されたものである他の実施形態では、本明細書の他の実施形態に記載されているように、患者の細胞を前記治療剤による受容体結合または経路活性化について試験することができる。
【０３００】
諸実施形態では、治療開始前、治療期間中、治療後、寛解期間中および再発時に細胞試料を採取することができる。本明細書に記載される方法は、治療前、治療期間中、患者に耐性が発現したときおよび再発時に治療有効性を予測するのに有用である。本開示の方法は、治療剤または薬剤の組合せに対する応答者または非応答者を予測するのにも有用である。
【０３０１】
ある特定の実施形態では、細胞をいかなる種類の固定液と接触させる、またはこれで処理することも、パラフィンまたはその他の材料に包埋することも、いかなる検出可能な標識と接触させる、またはこれで処理することもない。他の実施形態では、細胞が細胞全体であり、生存しており、かつ／または無標識であるのが好ましい。したがって、生存初代細胞を細胞試料として使用することができる。他のいくつかの実施形態では、患部組織および健常組織の両方の細胞試料を準備する。いくつかの実施形態では、生存形態および固定形態の両方の細胞試料を準備する。固定形態で準備する細胞試料は、本明細書に記載される方法に従って、特にほかのバイオマーカーの特定および相関の改善を解析する生細胞との比較対照としての役割を果たし得る。
【０３０２】
本発明の他の実施形態では、個々の対象の細胞を用いて治療有効性を判定する。周知の方法（例えば、スワブ、生検など）により細胞を採集および単離することができる。罹患細胞および非罹患細胞の両方を用いることができる。非罹患細胞は、陰性対照、ベースライン測定、経時的測定の比較などに用いることができる。諸実施形態では、同じ対象の組織細胞の対照試料を採取してもよい。対照試料は、対象の別の健常組織または患部組織試料と同じ器官の健常組織から採取し得るか、より好ましくは、疾患のない個体から健常組織を採取する。罹患細胞とは、活動性疾患のある組織から抽出した細胞のことである。一実施形態では、罹患細胞は乳癌細胞などの腫瘍細胞であり得る。癌性細胞は、必ずしも腫瘍から抽出する必要はない。例えば、白血病患者の血液から白血病細胞を収集することができる。様々な組織部位、例えば転移部位、循環腫瘍細胞、原発腫瘍部位および再発腫瘍部位などから細胞を収集し、細胞の応答性を相互に比較することができる。別の実施形態では、関節リウマチなどの自己免疫疾患の部位から罹患細胞を抽出することができる。ある特定の実施形態では、各組織試料中の細胞数は、少なくとも約５０００個であるのが好ましい。他の実施形態では、組織試料中の細胞数は、約５０００個〜１００００００個以上の範囲であり得る。細胞試料としては、特に限定されないが、血液、血清、血漿、尿、精液、精漿、前立腺液、先走り液（カウパー腺液）、排泄物、涙、唾液、汗、生検試料、腹水、脳脊髄液、リンパ、骨髄または毛髪からの単離が挙げられる。他のいくつかの実施形態では、細胞試料は、患者の血清、その画分、類器官、線維芽細胞、間質細胞、間葉細胞、上皮細胞、白血球、赤血球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、免疫細胞、幹細胞または組合せを含有するか、これに由来するものであり得る。
【０３０３】
一実施形態では、シグナル伝達経路活性を評価する方法（例えば、本明細書に記載されるＣＲｅＭＳシステム）と同じ場所（例えば、検査室、病院）で対象からの細胞の抽出を実施する。したがって、対象からバイオセンサーまでの時間を埋めるため、細胞を周知の移送培地に懸濁させる、またはこれに入れて保存することができる。別の実施形態では、シグナル伝達経路活性を評価する方法（例えば、本明細書に記載されるＣＲｅＭＳシステム）とは異なる場所で対象からの細胞の抽出を実施する。細胞試料を採取した後、細胞生存能を保持する培地で維持する。解析場所までの輸送時間の長さに応じて、様々な培地を用い得る。諸実施形態では、組織試料の輸送に必要な時間が１０時間以内になり得る場合、培地は、重量オスモル濃度が４００ｍｏｓｍ／Ｌ未満であり、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋、Ｃｌ−、Ｃａ＋２、グルコース、グルタミン、ヒスチジン、マンニトールおよびトリプトファン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含み、必須アミノ酸含有し、さらに、ヒト初代細胞の増殖および平板効率を支えるため非必須アミノ酸、ビタミン、その他の有機化合物、微量ミネラルおよび無機塩、血清、細胞抽出物、または成長因子、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、ホスホホリルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、トリヨードチロニン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンを含有し得る。このような培地の例としては、初代細胞を管理するためのセルシオ培地、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、ハンクス緩衝生理食塩水およびマッコイ５Ａ、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、リーボビッツＬ−１５またはその改変培地が挙げられる。諸実施形態では、培地および容器は、無内毒素、非発熱性、無ＤＮアーゼかつ無ＲＮアーゼのものである。
【０３０４】
他の実施形態では、個々の対象の組織検体から採取する罹患細胞を、組織検体の細切および酵素消化、抽出細胞の細胞タイプによる分離ならびに／あるいは抽出細胞の培養を含む段階を用いて抽出する。培養試薬は、様々なサプリメント、例えば患者の血清または患者由来の諸因子を含み得る。
【０３０５】
さらなる態様は、組織検体から類器官を抽出し、次いで、それを用いて個々の対象における治療剤の有効性を判定することができる方法を含む。このような方法は、細切および酵素消化の段階を含む。さらなる態様は、組織検体の類器官を培養し、次いで、それを用いて個々の対象における治療剤の有効性を判定することができる方法を含む。このような方法は、細切、酵素消化、細胞タイプによる分離および培養の段階を含む。さらなる態様は、本明細書に記載される方法を実施するための上記のように分離した細胞の特定の組合せを含み得る。
【０３０６】
ある特定の実施形態では、対象の生細胞の試料のシグナル伝達経路活性を評価する前に、最初に、血清および評価するシグナル伝達経路（すなわち、対象の細胞で効果を評価する標的化治療剤により対処するシグナル伝達経路）を攪乱する可能性のある薬剤を含まない培地で細胞を培養し、それにより、細胞の生理学的状態および経路活性化を合わせる。ある特定の実施形態では、血清および成長因子を含まない培地で細胞試料を培養する。他の実施形態では、ヒト初代細胞の増殖および平板効率を支えるため、機能的細胞内環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）、機能的甲状腺受容体および／または機能的Ｇタンパク質共役受容体（あるいは上記の特性のうち２つまたは３つの特性の任意の組合せ）を維持する培地で細胞を培養する。
【０３０７】
一実施形態では、生存癌細胞の試料を、成長因子を含み血清を含まない培地で培養する。別の実施形態では、生存癌細胞の試料を、抗アポトーシス剤を含み血清を含まない培地でも培養する。抗アポトーシス剤の非限定的な例としては、キナーゼ阻害剤、プロテアーゼ阻害剤、ストレス阻害剤、細胞死受容体阻害剤、シトクロームＣ阻害剤、Ｒｈｏ結合キナーゼ阻害剤を含めたアノイキス阻害剤、ＡＬＫ５阻害剤、カスパーゼ阻害剤、マトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤、酸化還元緩衝剤、活性酸素種阻害剤、ＴＮＦα阻害剤、ＴＧＦβ阻害剤、シトクロームＣ放出阻害剤、カルシウムチャネル活性化を伴わない炭酸脱水酵素アンタゴニスト、インテグリン安定剤、インテグリンリガンド、Ｆａｓ阻害剤、ＦａｓＬ阻害剤、Ｂａｘ阻害剤およびＡｐａｆ−１阻害剤が挙げられる。
【０３０８】
初代細胞試料、例えば対象から採取した生存癌細胞試料の調製に適したほかの培養条件については、内容全体が明示的に参照により本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７９２３号に詳細に記載されている。
【０３０９】
Ｊ．試料の解析
本発明のシステムおよび方法では、本明細書で細胞応答測定システム（ＣＲｅＭＳ）と呼ぶシステムを用いる。ＣＲｅＭＳは、細胞内、細胞内と細胞間および細胞と計装機器との間の生理的パラメータの変化を定量的に求めることができる装置（例えば、バイオセンサー）を指す。生理的パラメータの変化は、分析物（細胞外マトリックス、細胞シグナル伝達分子、または細胞増殖、組織、細胞、代謝産物、異化産物、生体分子、イオン、酸素、二酸化炭素、炭水化物、タンパク質などの非限定的な例を含む）の変化を求めることによって測定される。諸実施形態では、バイオセンサーは、単離した無標識生細胞全体の生理的パラメータの変化を測定するものである。諸実施形態では、治療剤および／または活性化因子薬剤のタイプによって予測される変化を測定することができるバイオセンサーを選択する。
【０３１０】
ＣＲｅＭＳの例の１つにバイオセンサーがある。バイオセンサーの例として、電気化学バイオセンサー、電気バイオセンサー、光学バイオセンサー、質量感知バイオセンサー、熱バイオセンサーおよびＩＳＦＥＴバイオセンサーがある。電気化学バイオセンサーは、電位差特性、電流特性および／または電圧特性を測定するものである。電気バイオセンサーは、表面伝導率、インピーダンス、抵抗または電解質伝導率を測定するものである。光学バイオセンサーは、蛍光、吸収、透過、密度、屈折率および反射を測定するものである。質量感知バイオセンサーは圧電結晶の共鳴周波数を測定するものである。熱バイオセンサーは反応熱および吸着熱を測定するものである。ＩＳＦＥＴバイオセンサーは、酸素、二酸化炭素、グルコースのようなイオン、元素および単純分子ならびに生命科学で目的とされるその他の代謝産物を測定するものである。諸実施形態では、バイオセンサーは、インピーダンス装置、フォトニック結晶装置、光学的導波管装置、表面プラズモン共鳴装置、水晶共振器／水晶振動子マイクロバランスおよびマイクロカンチレバー装置からなる群より選択される。諸実施形態では、光学バイオセンサーは、生細胞、病原体またはそれらの組合せにおける分子認識または分子活性化事象を変換する光学的トランスデューサーを含み得る。特定の実施形態では、装置はインピーダンス装置である。
【０３１１】
タンパク質またはその他のｉｎ  ｖｉｔｒｏの生体分子相互作用を測定するのに使用するバイオセンサーの例では、特定のタンパク質質量の捕捉を意味のある生化学的および生物物理学的値に変換する。捕捉した特定のタンパク質の分子量を含む捕捉質量に単純な計算をあてはめてモル数を評価し、平衡結合定数およびその他の相互作用を表す値を導き出す。細胞アッセイに使用するバイオセンサーの例では、外部の化学物質または特定の細胞内経路を介するその他の刺激を加えると、細胞表面の特定の接着分子がセンサー表面および付近の他の細胞の近くでその接着および形態を変化させる。
【０３１２】
バイオセンサーは、刺激および刺激に応答するのに用いられる細胞内経路に特有のものになるよう選択することが可能なこれらの変化を検出することができる。バイオセンサーを適切に設計すれば、前記細胞アッセイのバイオセンサーの結果は分子および機能に関して極めて定量的なものとなり得る。前記バイオセンサーの結果は、さらなる特有性のための経時的応答パターンであり得る。細胞内の特定の経路のスイッチをオン／オフすることがわかっている生体分子活性化因子または攪乱物質（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ）をＣＲｅＭＳバイオセンサーシグナルの特異性を判定するための対照として使用することができる。バイオセンサーの結果の経時的応答の曲線デコンボリューションを実施する方法（例えば、対照応答との非線形ユークリッド比較）を適用して、さらに精密に特定の細胞応答の詳細を明らかにすることができる。細胞バイオセンサーアッセイの外部刺激を漸増させることにより、さらなる生化学的および生物物理学的パラメータに関する記述も可能になる。
【０３１３】
無標識センサーの１つに高周波水晶共振器または水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）または共振カンチレバーがある。共振器は、表面にパターン化された金属電極を有する水晶振動子を備えている。水晶材は、電圧を加えると、よく特徴付けられた共振特性を示す。電極に特定の周波数の交流電圧を加えると、水晶が特徴的な周波数で振動する。センサー表面で質量が捕捉されると振動周波数が定量的に変化し、質量が加わると共振器周波数が低下する。したがって、水晶振動子の共鳴周波数のわずかな変化を測定することにより、被験生体分子または細胞に標識を結合させなくても付着質量のごくわずかな変化を測定することができる。
【０３１４】
イオン感応性電界効果型トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）装置は、酸素、二酸化炭素、グルコースのようなイオン、元素および単純分子ならびに生命科学で目的とされるその他の代謝産物を選択して測定することが可能なナノスケールの小型装置である。ＩＳＦＥＴ装置については電気機械的操作レベルおよび生物学的応用レベルで広範囲にわたって記載されている。同装置を特定の患者の細胞に用いて、提案される治療的介入に対する応答もしくは耐性またはその経時的パターンを識別することについては、これまでに記載されたことはない。
【０３１５】
光学バイオセンサーは、センサー表面と連動した何らかの光の特性の測定可能な変化を生じさせるよう設計されている。この方法の利点は、励起源（センサーの照射源）、検出トランスデューサー（反射光または透過光を集める装置）およびトランスデューサー表面自体の間の直接的な物理的接続が必要でない点にある。換言すれば、光学バイオセンサーとの電気的接続が不要であり、センサーと大部分の生体系の安定化および試験に必要な液体とをつなぐ方法が簡略化される。いずれの光学バイオセンサーも、直接質量を検出するのではなく、検出する物質の誘電体誘電率を利用して測定可能なシグナルを発生させる。誘電体誘電率の変化は、自由空間での光の速度と媒体中での光の速度の比の差と関係がある。この変化は実質的には媒体の屈折率を表す。屈折率は、正式には媒体の比誘電率の平方根と定義される（この関係のさらに明確な扱い方についてはマクスウェル方程式を参照されたい）。光学バイオセンサーは、タンパク質、細胞およびＤＮＡなどのあらゆる生物学的材料の比誘電率が自由空間の比誘電率より高いことを利用する。したがって、これらの材料にはいずれも、その中を通過する光の速度を低下させる固有の能力を有する。光学バイオセンサーは、生物学的材料が含まれる媒体中での光の伝播速度の変化をセンサー表面で捕捉された生物学的材料の量に比例する定量化可能なシグナルに変換するよう設計されている。
【０３１６】
様々なタイプの光学バイオセンサーとしては、特に限定されないが、エリプソメーター、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）装置、イメージングＳＰＲ装置、回折格子連動イメージングＳＰＲ装置、ホログラフィーバイオセンサー、干渉バイオセンサー、反射型干渉分光法（ＲＩＦＳ）、比色干渉バイオセンサー、差干渉計、ハートマン干渉計、二面偏波式干渉計（ＤＰＩ）、導波管センサーチップ、集積グレーティングカップラ装置、チャープ導波管格子装置、フォトニック結晶装置、ウッドのアノマリに基づく導波モード共鳴フィルター装置が挙げられる。トリアングルラー（Ｔｒｉａｎｇｌｕｌａｒ）銀粒子アレイが挙げられる。さらに、特に限定されないが、可視線、紫外線、近赤外線および赤外線を含めた様々な波長の電磁波スペクトルを測定する装置が挙げられる。動作モードとしては、特に限定されないが、散乱、非弾性散乱、反射、吸収、ラマン、透過、電気的横波および磁気的横波が挙げられる。
【０３１７】
表面プラズモン共鳴装置は、局所屈折率の変化を検出することによって金属表面での生体分子の結合事象を検出する光学バイオセンサーである。一般に、ハイスループットＳＰＲ機器は、オートサンプリングロボットと、高解像度ＣＣＤ（電荷結合素子）カメラと、それぞれがプラスチック製支持プラットフォームに埋め込まれた５アレイ以上のセルを有し、金または銀でコートされたスライドガラスチップとからなる。ＳＰＲ技術は、特定の金属界面、とりわけ銀および金の界面で励起することができる表面プラズモン（特殊な電磁波）を利用するものである。入射光が臨界角より大きい角度で金属界面とカップリングすると、入射光から表面プラズモンへのエネルギー共鳴移動によって反射光の反射率が急激に減衰する（ＳＰＲ極小値）。表面で生体分子が結合すると局所屈折率が変化し、それによりＳＰＲ極小値のシフトが起こる。ＳＰＲシグナルの変化をモニターすることにより表面での結合活性をリアルタイムで測定することが可能である。
【０３１８】
ＳＰＲ測定は屈折率の変化に基づくものであるため、分析物の検出は無標識で直接的なものである。分析物は特性も標識（放射性標識または蛍光標識）も一切必要とせず、多段階の検出プロトコルを必要とせずに直接検出することができる。測定はリアルタイムで実施することができ、動力学的データおよび熱力学的データの収集が可能になる。最後に、ＳＰＲは広範囲にわたる分子量および結合親和性の多数の分析物を検出することが可能である。したがって、ＳＰＲ技術は細胞応答測定システムとして極めて有用なものである。
【０３１９】
この実施形態では、生きた患者細胞の複素インピーダンスの変化（デルタＺまたはｄＺ）を測定するＣＲｅＭＳについて記載し、ここでは、インピーダンス（Ｚ）は、オームの法則によって記載される電流と電圧の比と関係がある（Ｚ＝Ｖ／Ｉ）。例えば、患者細胞が付着した電極に定電圧を加えると、細胞周囲、細胞間および細胞内で異なる周波数で流れる電流が発生する。このＣＲｅＭＳは、電極と細胞との界面における局所的イオン環境に対する感度が高く、これらの変化を電圧と電流の変動の関数として検出する。細胞の正常な機能または活性化による細胞の生理学的変化が、電極周囲の電流の流れに定量化可能な変化を生じさせ、このようなＣＲｅＭＳで測定されるシグナルの大きさおよび特徴に影響を及ぼす。
【０３２０】
ある特定の実施形態では、バイオセンサーは、事象特異性を示す包括的表現型の変化を検出する。包括的表現型は、ｐＨ、細胞接着、細胞付着パターン、細胞増殖、細胞シグナル伝達、細胞生存能、細胞密度、細胞の大きさ、細胞形状、細胞極性、Ｏ２、ＣＯ２、グルコース、細胞周期、同化作用、異化作用、小分子の合成および生成、代謝回転および呼吸、ＡＴＰ、カルシウム、マグネシウムおよびその他の荷電イオン、タンパク質、特定の経路メンバー分子、様々な細胞区画内のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、ゲノミクスおよびプロテオミクス、翻訳後修飾および機序、二次メッセンジャーのレベル、ｃＡＭＰ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ生理的機能を有するその他のＲＮＡならびにそれらの組合せからなる群より選択される１つまたは複数の細胞応答パラメータを含む。事象特異性に関して、そのタイプの治療剤および／または活性化因子薬剤で予想される変化である細胞試料の変化を反映する細胞パラメータを選択する。例えば、治療剤が細胞骨格要素を標的とすることがわかっている場合、そのような薬剤と接触させた細胞は、その薬剤の存在下で細胞接着の変化を示すことが予想され得る。
【０３２１】
他の実施形態では、付着パターンの変化は細胞接着の変化である。いくつかの場合には、細胞接着の変化は屈折率の変化またはインピーダンスの変化によって示される。また別の実施形態では、細胞接着パターンの変化は、基本的形態の変化、細胞密度の変化または細胞の大きさもしくは細胞形状の変化である。特定の実施形態では、基本的形態の変化は細胞極性の変化である。諸実施形態では、細胞シグナル伝達の減少が細胞骨格構築の変化を示す。
【０３２２】
他の実施形態では、本開示の方法は、無標識であり、リアルタイムで測定することができる細胞試料の解析を提供する。一実施形態では、解析する細胞試料は、無標識であり、生存しており、細胞を固定する処理を一切実施していないものである。別の実施形態では、本開示の方法およびキットに用いる治療剤および／または活性化因子薬剤も無標識である。これまでに、治療有効性を判定するのに無標識の方法が効果的な方法で適用されたことはない。
【０３２３】
無標識アッセイでは、標識アッセイの時間および誤解を招く複雑な要素を減じることにより、スクリーニングキャンペーンの時間とコストを削減することができる。遺伝子発現、遺伝子変異およびタンパク質機能を特定および定量化することができるアッセイを大規模な並列処理が可能なフォーマットで実施する。無標識アッセイで数万〜数百万通りのタンパク質間またはＤＮＡ間相互作用を同時に、より経済的に実施し得る。
【０３２４】
標識を用いる方法には様々なものがあるのとは対照的に、標識を用いずに分子相互作用の検出が可能な方法は比較的少なく、細胞機能を対象とするものはさらに少ない。無標識検出であれば、治療剤および活性化因子薬剤による分子フォールディングに対する標識の影響、細胞上の活性部位の遮断、または実験であらゆる分子に同じように機能し、細胞内に効率的に配置することができる適切な標識を見つけることができないことによって発生する実験的不確実性が排除される。無標識検法により、アッセイ開発に要する時間および労力が大幅に簡素化されると同時に、消光、有効期間およびバックグラウンド干渉による実験的アーティファクトが排除される。
【０３２５】
標識は生化学アッセイおよび細胞ベースのアッセイの主力となっている。標識はあらゆるアッセイ法の大部分を構成し、特に生きたヒト細胞の複雑な動的活性に関する研究では、克服すべき問題がいくつある。放射性標識を用いると大量の汚染物質が発生し、放射性標識を使用する者に（細胞レベルで）害を及ぼすのを防ぐ制御方法を備えた特殊な施設で使用しなければならない。フルオロフォアは時間および光曝露によって励起／発光効率が低下し、標識を高精度で正確なものにする能力が低下し、アッセイを１つのエンドポイントで１回のみ読み取る必要があるため、経時的情報を得ることができない。標識ベースのアッセイはいずれも、標識を均等かつ一様に付着させる工程を開発し、標識が線形定量性を示し、測定する相互作用および過程に干渉することも影響を及ぼすこともないことを明らかにするのに相当な時間を要する。複雑な混合物に標識を一様に加えることは、過程を自然に進行させるのに必要なあらゆる分子の存在によって複雑なものとなる。標識を加えても、その分子機能を間接的に可視化することができるだけであり、システム全体の機能を直接可視化することはできない（すなわち、ある程度幅のある仮定が必要となり得る）。細胞活性を標識で高精度に測定するのはさらに困難である。有用な試験というものは、標識が細胞のしかるべき部位において、しかるべき方法で、しかるべき分子に移る仕組みが明らかであり、その標識が正常な細胞過程を妨害しないことが確実なものでなければならない。
【０３２６】
無標識検出では一般に、ＤＮＡ分子、ペプチド、タンパク質または細胞などの生体化合物または生物学的実体の何らかの物理的特性を直接測定することが可能なトランスデューサーを使用する。あらゆる生化学分子および細胞には、ある種のセンサーを用いて有無、増減および変化を明らかにするのに用いることができる、体積、質量、粘弾性、誘電体誘電率、熱容量および伝導率に関する有限の物理値がある。さらに、生物系は有限の期間にわたって、諸分子を用いてエネルギーを得、周囲のｐＨに測定可能な変化を引き起こすＯ２／ＣＯ２の消費／生成、グルコースの産生／消費、ＡＴＰの産生／消費などの生存過程を遂行している。センサーは、これらの物理的特性のうちの１つを定量化可能なシグナル、例えば測定可能な電流または電圧などに変換することができるトランスデューサーとして機能する。
【０３２７】
いくつかの場合には、トランスデューサーをバイオセンサーとして使用するためには、トランスデューサーの表面が、タンパク質などの特定の物質または特性の細胞タイプを選択的に捕捉すると同時に、望ましくない物質は付着させないことが可能なものでなければならない。選択的検出性能は、トランスデューサーの表面に化学分子からなる特定のコーティング層を構築することによって得られる。センサー表面に付着させる材料をセンサーコーティングと呼び、検出する物質を分析物と呼ぶ。したがって、いくつかの場合には、バイオセンサーは、トランスデューサーに付着する材料から測定可能なシグナルを発生させることができるトランスデューサーと、被験試料の標的分析物と結合することができる受容体リガンドを含有する特異的認識表面コーティングとを組み合わせたものである。
【０３２８】
ある特定の実施形態では、バイオセンサーには特定の細胞成分または経路と関連するコーティングを選択する。例えば、細胞の生理的パラメータが細胞接着の変化である場合、細胞試料中の細胞がバイオセンサー表面に接着するコーティングを選択する。諸実施形態では、バイオセンサーへの細胞の付着を促進するコーティングとしては、細胞外マトリックス、フィブロネクチン、インテグリンなどが挙げられる。他の実施形態では、細胞表面マーカーに基づき特定の細胞タイプと結合するコーティングを選択する。諸実施形態では、このような細胞表面マーカーとしては、分化抗原群（ＣＤ）、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２受容体、ＨＥＲ３受容体、ＨＥＲ４受容体、ＶＥＧＦＲおよびその他の細胞表面癌バイオマーカーが挙げられる。
【０３２９】
他の実施形態では、バイオセンサーを生体分子コーティングでコートする。細胞と接触するＣＲｅＭＳ表面は、細胞添加前、細胞添加時または細胞添加後に生体分子コーティングを含み得る。コーティング材料は、合成材料、天然材料、動物由来材料、哺乳動物材料またはセンサー上に配置した細胞によって作られる材料であり得る。例えば、生体分子コーティングは、アドへリン、カドヘリンおよびその他の細胞接着分子ならびに細胞表面タンパク質（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲン、細胞間ＣＡＭ、血管ＣＡＭ、ＭＡｄＣＡＭ）またはその誘導体と結合することがわかっている細胞外マトリックス成分を含み得るか、天然の生化学物質であるリジンおよびオルニチンに基づく高分子であるポリリジンまたはポリオルニチンなどの生化学物質を含み得るものであり、アミノ酸などの天然の生化学物質に基づく高分子は、バイオセンサーに特定の細胞表面タンパク質を付着させるよう設計した天然の生化学物質の異性体または鏡像異性体、抗体、抗体のフラグメントまたはペプチド誘導体、相補性決定領域（ＣＤＲ）を用いることができる。
【０３３０】
生細胞をマイクロプレートに付着させる方法は、例えば、センサーマイクロプレート表面を、一方の端がバイオセンサーの表面と相互作用するよう設計され、もう一方の端がペプチド上の官能基と反応するよう設計された反応性分子でコートすることを含み得る。例えば、金コートバイオセンサーを用いる場合、反応性分子は、バイオセンサー表面と化学的に相互作用するよう設計された硫黄原子またはその他の化学的部分を含み得る。分子のもう一方の端は、例えば、ペプチド上のアミド基またはカルボキシ基と特異的に反応することができる。
【０３３１】
生細胞（例えば、初代細胞）をバイオセンサー表面に付着させる方法については、内容全体が明示的に参照により本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７９０２３号にも詳細に記載されている。
【０３３２】
また別の例では、バイオセンサー表面を、ファンデルワールス力、水素結合、静電引力、疎水性相互作用または当業者がタンパク質に適用するような上記のものの任意の組合せを介して接着する分子でコートする。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分子を最初の表面分子コーティングに添加することもできる。Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ  ２００６  Ｉｎｔｅｇｒｉｎ  Ｌｉｇａｎｄｓ  ａｔ  ａ  Ｇｌａｎｃｅ。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １１９（１９）ｐ３９０１−０３には本発明に有用な接着分子が記載されている。特定の細胞接着分子を接触させるのに使用することができるほかのＥＣＭ分子としては、Ｔａｋａｄａら，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８：２１５（２００７）の表１に記載されているものが挙げられる。この例は、細胞−ＥＣＭ間および細胞間の接着に関与するインテグリンのものである。生理学的制御および応答と関係のある特性を有する接着分子がほかにも多数記載されている（下の表１４を参照されたい）。
【表１４】
2020514379.tif 000026
2020514379.tif 000027
【０３３３】
追加のコーティングは、本明細書に記載される方法を実施する目的で患者細胞をバイオセンサーに接近させるように、患者細胞の表面タンパク質に対する親和性を有することがわかっている抗体またはその他のタンパク質を含み得る。これは、患者細胞が所望の方法でマイクロプレートに付着していることを確認するのに有益なものでもある。さらに、特定のバイオセンサーコーティングを用い、センサーコーティングを特定の細胞内経路と結びつけることによって、特定の患者細胞タイプからの特定の細胞シグナルならびに活性化および治療剤に対する細胞シグナル伝達応答を増強、改善、明確化、分離または検出することができる（例えば、Ｈｙｎｅｓ，Ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ，Ｃｅｌｌ，１１０：６７３−６８７（２００２）を参照されたい）。バイオセンサーは細胞を播種する領域を含む。例えば、バイオセンサーは、細胞を播種するウェルを含むマイクロタイタープレートを含み得る。１つまたは複数の細胞試料をバイオセンサーの独立した場所に表面への物理的吸着によって播種することができる。バイオセンサーは、独立した場所を１か所、１０か所、２４か所、４８か所、９６か所、３８４か所またはそれ以上含み得る。細胞試料は、約１００〜約１００，０００個またはその間の任意の細胞数の個々の細胞を含み得る。最適な細胞試料は、バイオセンサー上の独立した場所の大きさおよび性状によって決まる。細胞試料は、約５０００個以下の細胞；約１０，０００個以下の細胞；約１５，０００個以下の細胞；約２０，０００個以下の細胞；約２５，０００個以下の細胞；または約５０，０００個以下の細胞を含み得る。細胞試料は、約１０００〜約２５００個の細胞；約１０００〜約５０００個の細胞；５０００〜約１０，０００個の細胞；約５０００〜約１５，０００個の細胞；約５０００〜約２５，０００個の細胞；約１０００〜約１０，０００個の細胞；約１０００〜約５０，０００個の細胞；および約５０００〜約５０，０００個の細胞を含み得る。ある特定の実施形態では、細胞応答または生理的パラメータの変化を一定時間にわたって測定する。他の実施形態では、一定時間とは、対照細胞が生理的パラメータの出力の変化の変動が２０％以下の定常状態になるのにかかる時間の長さのことである。他の実施形態では、細胞の変化を１時間以内で観察する。他の実施形態では、細胞の変化を少なくとも１分〜約６０分間にわたって１分毎に観察する。他の実施形態では、細胞応答の変化を１０分〜約１週間または２００時間測定する。他の実施形態では、治療剤が細胞内経路を標的とするものである場合、細胞応答を約１０分〜約５時間、約１０分〜約４時間、約１０分〜約３時間、約１０分〜約２時間、約１０分〜約１時間もしくは約１０分〜約３０分またはその間の任意に時点で測定する。他の実施形態では、治療剤が細胞増殖または細胞殺作用または細胞の耐性に影響を及ぼすものである場合、細胞応答を約１時間〜約２００時間測定する。また別の実施形態では、１分から２００時間の間の応答の組合せ（ほかにも全経時的パターンと呼ばれる）を用いて、細胞に対する化合物の治療有効性および細胞が耐性を発現することができるかどうかを判定する。この時間枠には、患者に推定される応答およびその維持を評価するのに重要な短時間経路シグナル伝達、動的再プログラミングおよび長期間の細胞応答の重要な過程が含まれている。
【０３３４】
特定の対象の細胞をバイオセンサー上に播種した後、ベースライン測定値を求めることができる。ベースライン測定値は、同じ細胞試料または対照細胞試料で取得することができる。対照試料は、同じ患者および／または同じ組織の健常細胞または罹患細胞を含み得る。対照試料は、活性化因子も薬剤も投与しない罹患細胞を含み得る。対照試料は、薬剤に応答することがわかっている疾患細胞を含み得る。他の実施形態では、対照試料は、薬剤に応答することが明らかにされていない疾患細胞を含む。対照試料は、細胞の健康状態、細胞の代謝または細胞の経路活性に関係する標準的な応答を誘発するよう設計された活性化因子薬剤を特定の患者の健常細胞または罹患細胞に加えることを含み得る。
【０３３５】
それぞれの疾患および／または薬物タイプに対して対照を決定し得る。一実施形態では、これには同じ患者の健常細胞対照との比較または非罹患患者のプールの結果（例えば、正常基準範囲）との比較が含まれる。例えば、細胞死滅薬に関して、この方法は、健常細胞よりも疾患細胞を死滅させて有意な治療指数が得られるという有益性を示す。その他の実施形態は、薬物による経路の機能および制御を明らかにする経路手段の使用を含む。標的化治療剤では、この手段は、経路を攪乱し標的化薬物が活性化を崩壊させる能力を判定する対照として使用する活性化因子薬剤（例えば、活性化因子薬剤）、バイオ試薬または小分子であり得る。また別の実施形態では、例えば酸素消費の経時的パターンまたは速度、酸性化、イオン流動または代謝産物の代謝回転の速度または経時的パターンに注目して、活性化因子薬剤によって外部から攪乱させることなく細胞に対する薬物の生理学的効果を測定する。
【０３３６】
特定の実施形態では、連続的な時間経過に沿ってバイオセンサーシグナルを測定する。時間対バイオセンサーシグナルのプロットには、薬物治療に対する患者細胞の応答を示す独特のパターンがある。これらのパターンを評価することは、効果的な事象の存在を確認するのに有用である。生存し完全に機能する細胞の変化を経時的に、または常時測定することは、ある時点のみを示す典型的な全細胞アッセイに現在用いられている作業より有益である。本明細書に記載される方法は、動的システムを患者に起こる通りに測定するものであり、患者の応答を判定する最も精度の高い手段となる。経路応答の場合、時間経過全体にわたるパターンまたは経時的パターンを記録する方が、より複雑な解析を支えることができる点で優れており、１回の測定に最適な時点を選択する必要もなくなる。
【０３３７】
対照との比較は、経時的な最大値、最小値で、または最大シグナルと最小シグナルの差の形で実施するか、被験ウェルと陽性対照もしくは陰性対照ウェルとの経時プロットの総曲線下面積（ＡＵＣ）の比較またはその他の非線形比較（例えば、差分ベクトルの総和）によって、または同じ患者の生存罹患細胞について攪乱したウェルと攪乱していないウェルとを比較することによって実施することができる。バイオセンサーで測定することによってのみ支えられる解析としてほかにも、最大値／最小値に達するまでの時間およびその他の経時的変化の派生物がある。比較的長期間にわたる応答の場合、比較時間は、数日もしくは１週間の治療または複数回の薬物添加の後の特定の時点のものであり得る。比較的長い経時的変化ではこのほか、傾きの変化を比較するか、１週間の薬物治療の開始時、中間の時点または終了時の時間対バイオセンサーシグナルのプロットの二次派生物を比較し得る。対照と比較した有意な変化には、細胞代謝の低下によるバイオセンサーシグナルの絶対的低下が含まれ得る。あるいは、低下ののち、アッセイ期間中に薬物に対する耐性が発現したことを示すと考えられる増大がみられることもある。さらに、非線形ユークリッド解析を用いて、時間経過全体にわたる対照と患者試料の差の合計からなる尺度を求めることができる。このことは、患者の転帰を予測するうえで重要なものとなり得る。
【０３３８】
ある特定の実施形態では、一定時間にわたるバイオセンサーの出力を細胞指数として表す。細胞指数とは、試験開始時点からのインピーダンスの変化のことである。細胞指数は、インピーダンスの測定値と定義され、一定の電気的周波数、例えば１０ｋＨｚおよび定電圧で測定することによって本発明の１つの場合に適用することができる。また、細胞指数ｉ＝（Ｒｔｎ−Ｒｔ０）／Ｆの式によって算出され、式中、
ｉ＝１つ、２つまたは３つの時点であり、
機器を１０ｋＨｚの周波数で稼働させる１つの例では、Ｆ＝１５オームであり、
Ｒｔ０は、時点Ｔ０で測定したバックグラウンド抵抗であり、
Ｒｔｎは、細胞の添加、細胞の生理学的変化または細胞の攪乱からの時点Ｔｎで測定した抵抗である。
【０３３９】
細胞指数は、細胞の状態を表すために測定した電気インピーダンスの相対的変化として得られる無次元パラメータである。細胞が存在しないか、電極に十分に接着していない場合、ＣＩは０となる。同じ生理学的条件下で、電極に付着する細胞が多くなると、ＣＩ値は大きくなる。したがって、ＣＩはウェル中に存在する細胞数の定量的測度の１つとなる。さらに、細胞形態を含めた細胞の生理学的状態の変化、基本的状態、安定状態もしくは静止状態または細胞接着もしくは細胞生存能が変化するとＣＩが変化する。
【０３４０】
細胞指数は、存在、密度、付着または開始時点もしくはベースラインのインピーダンス測定値に基づくその変化の定量的測度となる。ベースラインの開始時点インピーダンスは、物理的に観察可能な特徴であり、薬物またはその他の活性化因子による任意の処理の前の細胞の健康状態、生存能および生理学的状態の指標となる。ベースラインの開始時点をＣＥＬｘ試験の定性的対照として用いることができる。薬物または活性化因子を添加すると、インピーダンスが、細胞に起こる細胞内の生理学的変化の特異性を反映する経時的パターンで変化する。細胞の生理学的状態、例えば、細胞形態、細胞数、細胞密度、細胞接着または細胞生存能が変化すると細胞指数が変化する。
【０３４１】
生理応答パラメータは、細胞周期の解析をさらに含むものであり得、患者細胞の機能的な経路および機能不全の経路に関連するコンジュゲートもしくは非コンジュゲート蛍光色素またはその他の比色変化などの任意の数の化学バイオセンサーを用いて測定することができる。例えば、ＤＮＡ内に挿入され細胞パラメータと相関することがわかっているヨウ化プロピジウムまたはこれに類似した色素を用い、成長および複製のＧ０期、Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期、Ｇｍ期を通じてＤＮＡ量の変化を評価することにより、ある細胞集団に非コンジュゲート色素を用いた細胞周期の変化を定量化することができる。色素の一種であるヨウ化プロピジウムでは、Ｇ２／Ｍ期の細胞の蛍光がＧ０／Ｇ１期の細胞の蛍光の２倍となる。ヨウ化プロピジウムはＲＮＡ内にも挿入され、多くの場合、ＤＮＡの蛍光シグナルをＲＮＡと比較して識別するのにリボヌクレアーゼを用いる。例としてほかにも、細胞周期チェックポイントと関係のある特定のタンパク質に特異的な色素が挙げられ、細胞周期状態をさらに測定することができる。これらの測定を実施するのに有用でよく用いられる機器として、ここに挙げるものに限定されないが、蛍光顕微鏡法、共焦点レーザー走査顕微鏡法、フローサイトメトリー、蛍光定量法、蛍光偏光法、均一時間分解蛍光および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）がある。
【０３４２】
本発明に非コンジュゲート色素を細胞または経路の生理学的状態の化学バイオセンサーとして用いて、同化作用、異化作用、小分子の合成および生成、代謝回転ならびに呼吸などの代謝パラメータを測定することができる。ワールブルク効果と呼ばれるよく知られた細胞生理応答は、腫瘍およびその他の罹患細胞でのエネルギー生成のための酸化的リン酸化から乳酸産生へのシフトを示すものであり、本明細書に記載されるいずれかの化学バイオセンサー法または光電子バイオセンサーによって、重要なシグナル伝達経路、発癌遺伝子および腫瘍抑制因子（例えば、特に限定されないが、Ａｋｔ、ｍＴｏｒ、ｃ−ｍｙｃ、ｐ５３）を測定することができる。細胞応答時の細胞の酸素消費または呼吸および解糖によってプロトンが生じ、容易に測定できる急速な溶存酸素および遊離プロトンの濃度または酸性度の変化が起こる。
【０３４３】
化学バイオセンサーを用いる生理応答パラメータのほかの非限定的な例として、代謝的に活性な細胞機能および不活性な細胞機能の指標であるＡＴＰ存在量の定量化（例えば、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏおよびこれに類似したルシフェラーゼによるアッセイ）に基づく、培養細胞によって利用されるＡＴＰの量がある。
【０３４４】
生理応答によって、生体分子のフォールディングおよび機能に重要なカルシウム、マグネシウムおよびその他の荷電イオンが流動する。これらも化学バイオセンサー、例えば特定のイオン錯体形成および測定のためのＣａｌ−５２０、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ  ＢＡＰＴＡ−１、ｆｕｒａ−２、ｉｎｄｏ−１、ｆｌｕｏ−３、ｆｌｕｏ−４、Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｇｒｅｅｎ−１およびその他のＥＧＴＡまたはＥＤＴＡ用化学物質などによって測定することができる。これらの生理応答パラメータは、多数のタイプの非コンジュゲート型の反応性色素もしくは結合色素またはその他の電子的または分光学的手段を用いて測定することができる。これらの方法の多くは、細胞を破壊することがなく、同じ細胞集団の生理的機能を経時的に反復して常時測定することができるように準備することができる。
【０３４５】
コンジュゲート色素、例えば天然の細胞タンパク質結合リガンドまたは免疫粒子（抗体もしくは抗体のフラグメントまたはアプタマーなどの高特異性高親和性合成分子）と結合させた色素あるいは核酸ポリマーハイブリダイゼーションプローブなどは、タンパク質、特定の経路メンバー分子、様々な細胞区画内のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、ゲノミクスならびにプロテオミクスに関連する生理応答パラメータの測定に用いることができ、特定の翻訳後修飾および機序を測定することが可能なものである。細胞制御の翻訳後修飾およびエピジェネティックな手段には、特に限定されないが、リボザイム、キナーゼ、ホスファターゼ、ユビキチナーゼ、デユビキチナーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼおよびプロテアーゼを含めた経路機能を遂行する多数の酵素による調節が含まれ得る。ホルマリンで固定しパラフィンでマウントした死細胞試料の染色に使用されるこれらの分子の例をＤＡＫＯ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｇｕｉｄｅ−Ｓｉｘｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎまたはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｅｌｌｓｉｇｎａｌ．ｃｏｍ／ｃｏｍｍｏｎ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｃｏｎｔｅｎｔ．ｊｓｐ？ｉｄ＝ｔｕｔｏｒｉａｌｓ−ａｎｄ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ−ｇｕｉｄｅｓのＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｔｕｔｏｒｉａｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｓにみることができる。この２つの例は、生細胞の応答を測定するのにさらに有用なものであり得る。この測定を実施するのに有用なよく用いられる機器には、特に限定されないが、蛍光顕微鏡、共焦点レーザー走査顕微鏡法、フローサイトメトリー、蛍光定量法、均一時間分解蛍光、蛍光偏光法および蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【０３４６】
本発明では、細胞の生理応答を測定するのにコンジュゲート色素と非コンジュゲート色素の組合せを用いることもできる。活性化した後に生理応答の制御を担う受容体のタイプの１つにＧＰＣＲがある。ＧＰＣＲは、２つのシグナル伝達経路、すなわち、二次メッセンジャーのｃＡＭＰのレベルの変化または二次メッセンジャーのイノシトール（１，４，５）三リン酸（ＩＰ３）によって遊離する細胞内Ｃａ２＋のレベルの変化を介して情報を伝達し細胞を制御する。ｃＡＭＰの検出は、例えば、クリプタート標識抗ｃＡＭＰ抗体（またはその他の免疫捕捉分子）およびＧＰＣＲ反応とそれに続く抗体結合に関して細胞内ｃＡＭＰと競合するｄ２標識ｃＡＭＰを用いる競合イムノアッセイを主体とするものであり得る。特定のシグナル（すなわち、エネルギー伝達）は標準品または試料中のｃＡＭＰの濃度に反比例する。
【０３４７】
ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ生理的機能を有するその他のＲＮＡを定量化することによる生理応答の測定は、本発明を実施して細胞の変化の活性化を転写レベルで求めるのに用いられる極めて感度の高い方法の１つであり得る。例えば、ここに挙げるものに限定されないが、いずれも化学センサーを用いるｒｔＰＣＲ法、ｑＰＣＲ法、選択的配列探索法、選択的配列捕捉法および配列ハイブリダイゼーション法によってＲＮＡを定量化することができる。
【０３４８】
免疫捕捉法およびハイブリダイゼーション法としては、Ｌｕｍｉｎｅｘなどのビーズベースの方法、Ｉｌｌｕｍｉｎａなどのファイバー光学チップ技術または特異的捕捉試薬を固体表面に固定化し、細胞から生理応答分子（１つまたは複数）を探し出し、単離し、精密に測定するタンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡもしくはその他のハイブリダイゼーションマイクロアレイ技術を用いるものが挙げられる。これらの方法により、単一の実験で多数の応答パラメータが測定されるという便益性が得られる。
【０３４９】
ベースライン測定値と比較することによって細胞応答または生理的パラメータの変化を求める。細胞パラメータまたは生理応答の変化はＣＲｅＭＳのタイプによって決まる。例えば、細胞応答の変化を光学的に求める場合、例えば、化学的吸光または透過のスペクトル波長における吸光度、表面プラズモン測定装置の変化またはフォトニック結晶装置によって検出される変化の関数として物理学的に観察可能な変化を測定することが可能である。細胞パラメータまたは生理応答の変化を電気的に求める場合、例えば、電極に接着した細胞のミリレベルまたはマイクロレベルのインピーダンス変化を用いて、物理的に観察可能な変化を測定することが可能である。イオン感応性電界効果型トランジスタ（ＩＳＦＥＴ）を用いてｐＨ、グルコース、二酸化炭素またなイオンの変化を電子的に測定することが可能である。
【０３５０】
他の実施形態では、治療剤に対する細胞の生理応答の差を求めるのに必要な時間にわたってＣＲｅＭＳ応答を測定する方法によって、変化の速度を求める。変化の速度は、経時的データの様々な解釈によって記載され、速度またはさらには速度の加速度を含めた速度の導関数として表され得る。
【０３５１】
患者の生理学的状態を測定する試験により、上回る場合と下回る場合とで患者に異なる臨床的転帰が認められることが予測される１つまたは複数のカットオフ値を求めることができる。諸実施形態では、既知の応答細胞試料由来の試料の組と既知の非応答患者由来の試料の組の統計的有意性に対する適切な信頼区間を求めるための標準偏差、シグナル・ノイズ比、標準誤差、分散分析または当業者に公知のその他の統計的検定値を求めること；およびその２つの間の差を求め、両群の信頼区間の間のカットオフ値を設定することを含む方法によって、細胞応答の変化を判定する１つまたは複数のカットオフ値を求める。ほかの実施形態では、罹患していないことがわかっている患者のＣＲｅＭＳ応答によって定めた正常基準範囲から求めたカットオフを用いる。この実施形態では、本発明の他の箇所に詳細に記載するように、攪乱した生存癌細胞の結果および攪乱していない生存癌細胞の結果を非罹患基準範囲の区間と比較することによって、単一の患者の疾患材料に関する試験結果を報告する。
【０３５２】
健常対象の正常組織を用いて試験を実施することにより、正常（健常）基準範囲の試験結果から「正常な」経路活性を確立する。次いで、試験結果により、罹患経路を有さないと予測される患者（例えば、バイオマーカー陰性患者）が、正常基準範囲に関する試験から求めた値と比較したときに実際に異常な経路活性を有するかどうかを評価する。また、本発明の結果について、バイオマーカー陰性患者に観察された異常な測定値と、現時点で疾患を有すると診断される対照（バイオマーカー陽性患者）から得た測定値とを比較して、バイオマーカー陰性の患者が、異常であり、かつバイオマーカー陽性患者の経路活性と同程度である経路活性を有するかどうかを確認する。このようにして、現時点で経路活性を崩壊させることを目的とする治療を受け、その利益を享受している患者の経路活性と同程度の異常な経路活性を有する患者を、経路疾患を有すると診断し、したがって、その経路活性を崩壊させるため、そのバイオマーカーを標的とする薬物で治療するべきである。
【０３５３】
したがって、本発明により、医師が罹患経路の機能的活性に基づき疾患を診断するさらに精度の高い手段を作出することが可能になる。このことは、因果関係モデルではなく相関関係モデルに依存し、単一のバイオマーカーを測定する場合に採用される方法とは対照的である。現在用いられているバイオマーカー法は、偽陰性および偽陽性の結果の割合が高くなる可能性がある。本発明により誤った結果が減少する。
【０３５４】
好ましい実施形態は８０〜９０％の信頼区間を含み、より好ましい実施形態は９０％超の信頼区間を含み、最も好ましい実施形態は９５％超または９９％超の信頼区間を含む。
【０３５５】
諸実施形態では、カットオフ値を用いて、応答者または非応答者であることがわかっている盲検試料の状態を求め、試料を盲検化し、試料の状態を予測する精度を判定することによって、カットオフ値を検証する。単一のカットオフ値の場合、カットオフ値未満になる出力値または既知の応答者の出力値に近い出力値は、患者試料に治療剤に対する応答性が認められることを示す。出力値がカットオフ出力値以上であるか、既知の非応答者の出力値の出力値に近い場合、細胞試料は治療剤に非応答性であることが確認される。いくつかの実施形態では、一定時間におけるバイオセンサーの出力値を無応答性、弱応答性または応答性に分類する。
【０３５６】
好ましい実施形態では、カットオフ値を用いて、疾患経路応答を示すことがわかっている盲検試料（例えば、ＥＧＦシグナル伝達が異常な癌患者）または疾患経路応答を示さないことがわかっている盲検試料（例えば、ＥＧＦシグナル伝達が正常な癌患者）の状態を求め、試料を盲検化し、試料の状態を予測する精度を判定することによって、カットオフ値を検証する。単一のカットオフ値の場合、カットオフ値未満になる出力値または疾患経路応答を示さない試料の出力値に近い出力値は、患者試料に経路疾患が認められないことを示す。出力値がカットオフ値以上であるか、既知の罹患経路試料の値の出力値に近い場合、細胞試料に罹患経路が存在することが確認される。いくつかの実施形態では、一定時間におけるバイオセンサーの出力値を疾患が存在しない経路、疾患未確定の経路または疾患が存在する経路に分類する。
【０３５７】
出力をいくつかの種類に分類するため、一定時間における出力値を選択する。他の実施形態では、一定時間は、細胞をバイオセンサーで常時モニターした時間の終点である。他の実施形態では、時間は、少なくとも６０分、２４０分、３００分、１０時間、２４時間、６０時間または１２０時間である。好ましい実施形態では、一定時間における出力は３０分〜１０時間である。より好ましい実施形態では、一定時間における出力は１８０分〜６００分であるか、または２４０分である。
【０３５８】
他の実施形態では、無作為に選択した癌患者集団の癌細胞を本明細書に記載される方法を用いて試験する。癌患者集団から採取した癌細胞は広範囲にわたるシグナル伝達の活性レベルまたは出力値を示すことが予想される。シグナル伝達の活性レベルまたは出力値の集団分布の特徴を明らかにするため、統計解析ソフトウェア（例えば、有限混合モデルを解析するためのＲパッケージであるｍｉｘｔｏｏｌ）を用いる個々の出力値の有限混合モデル解析またはその他の統計解析を実施する。解析した癌患者集団内に２つ以上のグループが確認された場合、１つのグループの平均出力値と第二のグループまたはその他のグループの平均出力値の間にあるカットオフ値を選択する。
【０３５９】
諸実施形態では、無応答性に分類される出力値は、治療剤を投与する前のベースラインまたは治療剤で処理していない対照細胞の出力値との差が少なくとも２０％以下、１５％以下、１０％以下または５％以下を超えない出力値によって示される。
【０３６０】
他の実施形態では、弱応答性に分類される出力値は、治療剤を投与する前のベースラインまたは治療剤で処理していない対照細胞の出力値との差が少なくとも５０％以下かつ５％超である出力値によって示される。他の実施形態では、応答性に分類される出力値パーセントは、治療剤を投与する前のベースラインまたは治療剤で処理していない対照細胞との差が少なくとも５０％超である出力値によって示される。諸実施形態では、対照試料は、同じ対象に由来し、治療剤で処理していない疾患細胞の試料である。
【０３６１】
本明細書に記載される方法のさらなる態様は、個々の対象における治療剤の有効性を予測するのに用いることができるアルゴリズムの開発を含む。アルゴリズムには、本明細書に記載される方法を用いて求めた値と、個々の対象の健康状態の様相を定める１つまたは複数の患者の特徴に割り当てた値とを組み合わせて組み込む。患者の特徴としては、特に限定されないが、転移の有無、転移の部位、結節の状態、最初に癌であると診断されてから転移があると診断されるまでの無病期間、補助化学療法の有無、他の薬物療法の有無、放射線療法の有無、主要疾患部位、腫瘍塊の大きさ、体格指数、圧痛関節数、腫脹関節数、疼痛、機能障害指数、医師による包括的評価、患者による包括的評価、バース強直性脊椎炎機能指数、バース強直性脊椎炎疾患活動性指数、バース強直性脊椎炎計量指数、Ｃ反応性タンパク質、全背部痛、炎症、全般的状態、他の疾患の既往、その他の重要な健康状態の統計的状態およびその任意の組合せが挙げられる。これらの値を組み込むアルゴリズムは、治療剤で治療しようとする疾患を有する患者の集団における疾患進行との相関に従ってこれらの値に重みを付け得る。応答の差と何ら相関がみられなかった疾患の特徴はアルゴリズムには含めない。
【０３６２】
一実施形態では、試験結果（すなわち、本明細書に記載される治療剤、活性化因子薬剤、治療剤（１つまたは複数）と活性化因子薬剤（１つまたは複数）の組合せなどに対する応答性を求める方法から得た値）、患者の特徴および試験した患者集団の臨床的転帰の回帰分析から患者の特徴を示す数値を求めることができる。１つの例では、試験出力値を０．１０から始まる幅０．１０の等間隔の９個のカットポイントに基づく１０個の区間に分けることにより、試験結果と、患者の特徴に関するデータに基づく変数とを組み合わせて用いるアルゴリズムの最適化を実施することができる。各カットポイントについて、対象のアルゴリズム値がカットポイント以下である場合は値を「１」とし、それ以外の場合は「０」とする指標変数を用いてコックス回帰を実施することができる。各カットポイントについて、カットオフ以下のものとカットオフ超のものとを比較したハザード比を求める。次いで、推定ハザード比が最小となるカットポイントの値を選択する。
【０３６３】
例えば、患者の全腫瘍量がある特定の値を上回る場合、本明細書に記載される方法によって求められる薬物に対する応答性は、患者の将来の無進行期間を薬物に応答性を示さない患者の結果の中央値より長くするのに十分なものではないことが明らかになり得る。試験結果から、薬物が患者において機能性であり、そうでなければ患者がその薬物から利益を享受することが予想されることがわかる場合、患者の特徴に関する変数を含むアルゴリズムは、腫瘍量変数が試験結果値を相殺するため、その値は不確定なものであると報告し得る。
【０３６４】
本明細書に記載される方法のまた別の態様は、患者が標的化治療剤に応答する可能性があるかどうかを確認する試験のカットオフ値を求める方法を提供する。この方法は、ａ）各患者が同じ疾患を有し、同じ治療剤が処方されている患者のグループを選択すること、ｂ）本明細書に記載される方法を用いて患者グループ内の各対象の試験値を求めること、ｃ）全被験患者のうち相当な割合の患者が所定の臨床エンドポイントに達するのに十分な期間にわたって被験患者グループの各メンバーの健康状態を観察し、患者が所定の臨床エンドポイントに達した場合、各患者がそれに達するのに要した期間の長さを記録すること、ｄ）他方に対して値が等距離にある２つ以上の候補カットオフ値を特定し、各候補カットオフ値が、下回れば患者が応答するか応答しないと予測される値および上回れば患者がスコアがカットオフ値未満である患者とは逆の方法で応答することが予測される値を表すこと、ｅ）統計学的方法を用いて、試験値がカットオフ以下であった患者の臨床エンドポイント期間と試験値がカットオフを上回った患者の臨床エンドポイント期間の間の差を解析すること、ならびにｆ）カットオフ値を上回る患者のグループと下回る患者のグループとの間に統計的有意差が認められることを示す候補カットオフ値のうち、治療剤に応答しないと予測される患者の割合が最も大きくなるカットオフ値を選択することを含む。
【０３６５】
本明細書に記載される方法を用いて、個々の対象の数値による試験結果値を得、それを細胞を同じ治療剤で試験した同じ疾患を有する他の個体から得た試験値と比較することが可能である。これにより、ａ）同じ疾患を有し同じ治療剤で試験したグループの個々の対象の試験結果値を記録し、ｂ）それらの値をリストにまとめ、ｃ）試験した個々の対象の試験結果値に基づくリストを個々の対象それぞれの試験値の絶対値に基づいて整理し、ｄ）個々の対象の試験値の百分位数順位を求めることによって個々の対象に対する治療剤の有効性を予測することが可能になり、ここでは、個々の対象の試験値の百分位数順位から、個々の対象の疾患に対する治療剤の有効性が予測される。
【０３６６】
また別の実施形態は、同じ治療法の有効性を試験する臨床試験から得た結果を解析して特定の結果の百分位数順位を推定し、次いで、個々の対象の試験値の百分位数順位を特定し、同じ百分位数順位に対応する臨床試験エンドポイントの結果を特定することを含み、ここでは、個々の対象の試験値と同じ百分位数順位の臨床試験エンドポイントの結果から、個々の対象が疾患に対する治療剤から得る可能性の高い臨床結果が予測される。臨床試験エンドポイントには、例えば、無増悪期間、無増悪生存期間、全生存期間、客観的奏効期間、ＡＣＲ奏効、Ｔ総シャープスコア、骨びらんスコアおよび関節裂隙狭小化関節の変化、臨床応答、疼痛、機能障害指数、臨床寛解、病変体表面積、医師による包括的評価ならびに乾癬の面積および重症度指数を含め得る。
【０３６７】
また別の実施形態は、被験治療剤を投与した個体について、本明細書に記載される方法から得た試験結果値と臨床的転帰との間の統計学的相関を判定する方法を含む。この方法は、ａ）各患者が同じ疾患を有し、同じ治療剤を処方されている患者グループを選択すること、ｂ）本明細書に記載される方法を用いて個体の試験結果値を得ること、ｃ）同じ疾患を有し、同じ治療剤で試験した患者グループ内の各対象の試験結果値のリストを作成すること、ｄ）全被験患者のうち相当な割合の患者が所定の臨床エンドポイントに達するのに十分な期間にわたって被験患者グループの各メンバーの健康状態を観察すること、ｅ）患者が所定の臨床エンドポイントに達した場合、各患者がそれに達するのに要した時間の長さを記録すること、ｆ）エンドポイントの結果と試験値との間の統計学的関係が明らかになる方法でエンドポイントデータ（例えば、無増悪期間、無増悪生存期間、ＡＣＲ奏効）を解析することを含む。
【０３６８】
例として、臨床試験の結果が入手できた後、カットオフ値の推定値「Ｃ＊」の決定を以下の通りに進める。コックス回帰検定が、試験値から無増悪期間（ＴＴＰ）などの患者転帰が予測されることを示すと仮定して、試験値を０．１０から始まる幅０．１０の等間隔の９個のカットポイントに基づく１０個の区間に分ける。各カットポイントについて、対象のアッセイ値がカットポイント以下である場合は値を「１」とし、それ以外の場合は「０」とする指標変数を用いてコックス回帰を実施する。各カットポイントについて、カットオフ以下のものとカットオフ超のものとを比較したハザード比を求める。推定ハザード比が最大となるカットポイントの値を選択してのちの極めて重要な試験相に用いる。最終的な解析では、指標変数（カットポイント未満対カットポイント超）を用いてコックス比例ハザード回帰を実施することができる。最終的な解析には、その他のＴＴＰの推定予測患者特徴変数を含めることもできる。
【０３６９】
治療剤が、細胞表面受容体と結合する標的化治療剤である場合、その受容体と結合する活性化因子薬剤または攪乱物質（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ）の不在下または存在下で細胞応答性の変化を測定する。諸実施形態では、活性化因子または攪乱物質（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ）の前に、それと同時に、またはその後に治療剤を細胞試料に投与する。諸実施形態では、活性化因子薬剤または攪乱物質（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ）は無標識である。細胞表面受容体の密度と関係なく、ベースライン測定値と比較して、さらに任意選択で、他の治療剤と比較して活性化因子薬剤または攪乱物質（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ）に対する細胞応答性を阻害する治療剤を選択する。いくつかの実施形態では、細胞受容体の密度とは無関係に活性化因子薬剤または攪乱物質（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ）の作用を阻害する治療剤を選択する。
【０３７０】
生理的パラメータの変化は、ベースラインまたは健常細胞もしくは未攪乱細胞対照と比較したパラメータの増大または減少であり得る。変化は、完全アゴニズム、スーパーアゴニズム、不可逆的アゴニズム、選択的アゴニズム、共アゴニズム、逆アゴニズムまたは部分的限定アゴニズム、可逆的および不可逆的アンタゴニズム、競合的アンタゴニズム、非競合的アンタゴニズム、不競合的アンタゴニズムを表すものであり得る。変化は適切な対照と比較して、早くもしくは遅く生じるか、または全く生じない。変化は、より長時間または短時間にわたって生じるよう選択することが可能である。変化は、可逆的または不可逆的なものを選択することが可能である。
【０３７１】
例えば、自己免疫病態の治療には、細胞シグナル伝達の減少をもたらす治療剤を選択し得る。サイトカインの作用を阻害する薬剤に応答する末梢血細胞では細胞シグナル伝達の減少がみられる。また別の例では、Ｈｅｒ２のような受容体を標的とするヒト化抗体などの抗癌剤に応答する疾患細胞では、ＥＧＦファミリー経路のシグナル伝達の有意な減少がみられ得る。また別の場合、抗血管新生剤に応答する疾患細胞では、ＶＥＧＦ経路のシグナル伝達の減少または増殖能の低下がみられ得る。各タイプの薬剤について測定するＣＲｅＭＳ応答または物理的に観察可能な特徴は、誘発するよう薬物を設計した目的とする生理応答によって決まり、必要に応じて特異的または一般的なものであり得る。重要なのは、ＣＲｅＭＳを用いて生細胞を一定時間にわたって生理学的に測定し、薬物によって変化させようとする応答を試験することである。
【０３７２】
罹患細胞および任意選択で健常細胞に１つまたは複数の特定の治療剤を投与して、その１つまたは複数の特定の治療剤の効果を判定することができる。罹患細胞および／または健常細胞に処置を実施せず、それにより、処置した罹患細胞および／または健常細胞ならびに未処置の罹患細胞および／または健常細胞に対するその１つまたは複数の治療剤の効果を比較することもできる。単一の治療剤を投与して、対象がその治療剤にどのように応答するかを明らかにすることができる。別の実施形態では、様々な治療剤のパネルを特定の対象の細胞に投与することができる。
【０３７３】
ある特定の実施形態では、細胞内経路の活性化を阻害する治療剤の有効性のカットオフ値を一実施形態では薬物を添加し生理応答を測定することによって求める。別の実施形態では、薬物による前治療を用いて、および用いずに経路を攪乱する。薬物により、８５％信頼区間、理想的には９０％超の信頼区間、またはさらに理想的には９５％もしくは９９％超の信頼区間で生理的ベースラインシグナルの変化または活性化シグナルの低下がみられれば有効であるとする。諸実施形態では、細胞増殖を阻害する、または細胞殺作用を増強する治療剤の有効性のカットオフ値を、生理応答を経時的に記録することによって求める。薬物により、８５％の信頼区間、理想的には９０％超の信頼区間、またはより理想的には９５％もしくは９９％超の信頼区間で、生理的ベースラインシグナルまでの低下または未処置細胞もしくは健常細胞と比較した経時的パターンからの逸脱あるいはそれらの組合せがみられれば有効であるとする。
【０３７４】
ＣＲｅＭＳにより測定した細胞の生理的経路応答を比較して、薬物が特定の標的に対して設計した通りに作用することを明らかにし、有効性のカットオフ値が達成されたこと明らかにすることによって、個々の対象の疾患を治療する治療剤の感受性および特異性を判定する。
【０３７５】
いくつかの実施形態では、活性化因子薬剤および／または治療剤を漸増させて、いずれかの薬剤のヒル勾配、ＥＣ５０またはＩＣ５０の値を求める。活性化剤の漸増および／または治療剤の漸増から得たデータを用いて、いずれかの薬剤の効力（半数最大効果が得られる濃度）および／または有効性（得られる最大の効果）を評価し得る。さらなる態様は、対象から採取した罹患細胞を用い、活性化因子薬剤または治療剤を漸増させてＩＣ５０値を求めることによって、個々の対象における治療剤の有効性を予測する方法を含み、ここでは、活性化剤は細胞内経路の活性を低下させるものであり、治療剤は細胞内経路の活性を刺激するものである。
【０３７６】
一実施形態では、個々の対象の疾患に対する薬剤の治療有効性を判定する方法は、細胞応答測定システム（ＣＲｅＭＳ）中の個々の対象由来の少なくとも１つの単離疾患細胞試料に薬剤を投与すること；および薬剤に対する細胞試料の細胞応答パラメータにベースライン測定値と比較して変化が起こるかどうかを判定することを含み、ここでは、細胞応答の変化から、薬剤が個々の対象の疾患に対して治療有効性を示すことがわかる。諸実施形態では、方法は、細胞応答測定システム中の個々の対象由来の少なくとも１つの単離疾患細胞試料に治療剤を投与する前または後に、細胞応答経路を攪乱する活性化因子薬剤または攪乱物質（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ）を投与することをさらに含む。
【０３７７】
試験では、１ｎＭ未満から１００ｕＭ超までの様々な濃度の薬物の効果を一般には標準偏差２０％未満、最適には標準偏差５％未満で測定することができる。化合物の試験範囲は、薬物包装ラベルに定められている最大耐量として知られる投与レベルに対応するものとなる。試験に用いる実際の細胞の組に含まれる生細胞の数を確認することができない大部分の試験とは異なり、この試験は、品質管理および試験開始時のベースラインの生理学的測定で判定される生細胞でのみ正常に機能するものである。このような特徴があるため、試験結果のばらつきが小さくなる。試験は、細胞生存に一般に許容され当業者に一般的に知られている温度、酸素、湿度および二酸化炭素の範囲を用いて実施することができる。いくつかの場合には、好ましい温度範囲は２５℃〜４０℃である。別の場合には、標準的な温度制御インキュベーターキャビネットを用いて、特定の攪乱に対してこの範囲内で温度をさらに±０．５℃まで最適化し維持し得る。
【０３７８】
本発明の方法は、対象の細胞に候補治療剤を投与して、安全性を判定し治療効果を判定することを含む。さらに、対象の罹患細胞への候補治療剤の投与を、第２相または第３相臨床試験に適した患者集団を選択する方法として用い得る。本発明の方法は、罹患細胞を既知の治療剤の組合せに対して試験することを含む。さらに、本発明の本発明は既知の治療剤および候補治療剤を試験することを含む。
【０３７９】
本発明の方法は、治療剤の組合せを投与して、特定の薬剤の組合せによってさらに効果的な結果（すなわち、疾患症状の改善または治癒）が得られるかどうかを判定することも含む。治療剤の組合せとは、同じ細胞試料に投与する２つ以上の治療剤のことである。本発明の一実施形態では、治療剤の組合せを同時に細胞試料に投与する。一実施形態では、少なくとも１つの治療剤を組合せの少なくとも１つの他の治療剤の投与とは異なる時間に細胞試料に投与する。
【０３８０】
治療剤を細胞試料に投与した後、細胞試料の複数の様相に関してリアルタイムのデータを収集することができる。例えば、ｐＨおよび温度を測定することができる。さらに、「細胞死因子」などの他の因子を明らかにすることができる。ＣＲｅＭＳによって明らかになる細胞死因子は、ＣＲｅＭＳによって測定される物理化学的特性の変化であり得る。例えば、癌細胞が表面に付着し、屈折率のベースライン読取り値が得られる。癌細胞の死滅を促進する治療剤を投与することにより、試料中の癌細胞が集まって表面から離れるため屈折率の変化が起こる。このことは、表面プラズモン共鳴を用いる光学バイオセンサーにより連続的にリアルタイムで測定することが可能である。
【０３８１】
ある特定の実施形態では、方法は、特定の治療剤の至適用量範囲を決定することを含む。用量範囲を決定することにより、臨床試験の適切なデザインが可能になり、かつ／または医師が有効性と有害副作用のバランスを試験することが可能になる。諸実施形態では、方法は、同じ患者の別個の試料に様々な用量の治療剤を投与し、本明細書に記載される細胞の生理的パラメータにベースラインおよび／または健常対照細胞と比較して変化をもたらす用量範囲を決定することを含む。
【０３８２】
本明細書に記載されるいずれかの方法を用いて、個々の対象の疾患細胞が１つまたは複数の治療剤に応答するかどうかを判定した後、その結果を医療従事者に伝えて対象の治療に治療剤を選択できるようにする。諸実施形態では、方法は、選択した治療剤を対象に投与することをさらに含む。
【０３８３】
シグナル伝達経路活性を測定することにより、疾患と一致する異常の存在を検出することができる。これを遂行するため、細胞シグナル伝達経路の稼働と細胞接着過程の間の密接な関係を利用するプラットフォームが開発されている。細胞外マトリックス内または他の細胞上でのインテグリン、カドヘリン、Ｉｇ  ＣＡＭおよびセレクチンなどの膜貫通細胞接着受容体とそのコグネイト結合部位との相互作用には、複数の細胞シグナル伝達過程と関係があることが明らかにされている。接着よる結合が、細胞内シグナル伝達カスケードと直接関係のある構築された膜近位ドメイン細胞骨格構造を介して伝わる。これにより、経路活性化因子を加えて特定の細胞内経路を介して特定の接着分子に影響を及ぼすことが可能になる。
【０３８４】
細胞内経路の活性化が細胞接着を引き起こす程度を測定するため、微小電極をコートしている特定の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）材料に付着させた生きた患者細胞の複素インピーダンスの変化を測定する装置を使用する。細胞インピーダンスバイオセンサーとして知られるこの装置は、各ウェルの底を覆っている薄い金電極を有する標準的なマイクロプレートからなる。選択的細胞外マトリックスとともに用いるウェルが、生細胞をマイクロプレートウェルの電極に特異的に付着させる。ウェル電極の上部に生細胞が存在すると、電極／細胞界面の局所的イオン環境が影響を受け、電極インピーダンスが増大する。細胞を攪乱または刺激してその機能を変化させると、それに伴う細胞接着の変化がインピーダンスを変化させる。特異的ＥＣＭまたは経路の様々な地点に作用することがわかっているツール化合物もしくは薬物の添加によって接着応答の特異性を判定することができる。インピーダンスの経時的パターンによって示される時点での特異的プロテオーム変化の免疫検出により、インピーダンスの結果をさらに裏付ける。システムでは、サブナノメートルからマイクロメートルまでの範囲の接着の変化を検出することが可能であり、生細胞に対する様々な経路薬理作用を分類するためのデータが得られる。細胞付着シグナル（ＣＡＳ）と呼ばれ、オームで表される測定したインピーダンスの量を用いて、細胞生存能、接着およびシグナル伝達経路活性化をモニターすることができる。得られるデータは時間に対するインピーダンスである。
【０３８５】
したがって、本発明の診断試験では、分析物は、生きた患者細胞をマイクロプレートのウェルに入れ、インピーダンスバイオセンサーなどのバイオセンサーで解析したとき、単独で、または細胞活性化因子の存在下で細胞が発する細胞付着シグナル（ＣＡＳ）である。いずれの試験でも、２つのグループの患者細胞試料についてＣＡＳを測定し、解析する。
１）患者細胞単独（Ｃ）
２）患者細胞＋活性化因子経路因子（１つまたは複数）（ＣＦ）
３）患者細胞＋活性化因子経路因子（１つまたは複数）＋確認剤（ＣＣＦ）
【０３８６】
シグナル伝達経路が正常に機能しているのか、異常に機能しているのかを検出するため、患者の罹患細胞のシグナル伝達経路を１つまたは複数の経路因子および確認剤で攪乱し、得られた活性を活性化因子および／または確認剤がカットオフ値に及ぼす効果と比較する。カットオフ値は、癌のない対象から採取した健常細胞の試料の組のシグナル伝達経路活性を解析することを含む試験から求めることができる。アッセイ測定量は、患者の罹患細胞のＣＦ細胞とＣ細胞の間のＣＡＳの変化およびＣＦ罹患細胞とＣＣＦ罹患細胞の間のＣＡＳの変化を反映する。シグナル伝達経路が異常である場合、ＣＦ罹患細胞とＣ罹患細胞の間のＣＡＳ変化および／またはＣＦ罹患細胞とＣＣＦ罹患細胞の間のＣＡＳ変化はカットオフ値を上回る。カットオフ値は通常、目的の経路活性の正常基準範囲の上限値を上回る。簡略化した実施形態では、経路因子または確認剤で活性化させた時点の後にＣＦ試料およびＣＣＦ試料のＣＡＳの測定値を活性化直前の時点のＣＡＳと比較したものも有用な測定量となり得る。
【０３８７】
本発明の診断試験は、実質的に任意の臨床状況、特に、現在疾患の指標として、ひいては治療剤決定の指標として、遺伝子またはタンパク質バイオマーカーが使用されている臨床状況に用いることができる。下の表１５に、ＦＤＡ承認治療剤のリストをその様々な疾患病態の治療への使用と関連するバイオマーカーとともに示す。本発明の方法に従って、本明細書に記載される方法を用いて治療剤の影響を受ける罹患シグナル伝達経路の活性を検討し、それにより、標準的なバイオマーカーアッセイを用いた結果が陽性であるかどうかに関係なく、患者にその治療剤による治療を指示するべきかどうかを判断することができる。
【０３８８】
【表１５】
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【０３８９】
連続測定値を解析して細胞試料に生理応答パラメータの変化が起こるかどうかを判定する方法が本明細書に記載される（例えば、応答の大きさ（陽性または陰性）、最大値または最小値までの時間、応答時系列の任意の時点における時間対大きさの傾きなど）。上記の方法およびその他の非線形解析の方法を用いて、活性化因子薬剤の存在下で生理応答パラメータの変化が起こるかどうかを判定することができる。
【０３９０】
ベースラインおよび対照を用いて細胞内経路の状態を判定することができる。適切なベースラインとしては、特に限定されないが、活性化因子薬剤を含まない試料、無限希釈の活性化因子薬剤の試料、活性化因子薬剤の添加前または活性化因子薬剤を添加してから十分に長い時間が経過した後の同じ試料および細胞ベースのアッセイの当業者に公知の他のこのようなベースライン活性が挙げられる。
【０３９１】
適切な対照としては、特に限定されないが、同じ患者の健常材料の試料、正常基準範囲を求めるため目的とする疾患のない十分な数の患者から得た健常材料の試料の組、類似しているが異なる活性化剤を含む試料、陽性または陰性の応答を示すことがわかっている細胞系、活性化剤の逆活性により処理した試料、１例または複数例の患者の罹患材料の試料ならびに細胞ベースのアッセイの当業者に公知の他のこのような陽性対照および陰性対照が挙げられる。
【０３９２】
Ｋ．試験結果の解析および解釈
本明細書に記載される方法を用いて得た試験結果を様々な方法で解析および解釈して、臨床医および／または患者に情報を提供することができる。特定の実施形態を以下に記載する。
【０３９３】
（ｉ）罹患経路の解析。この解析では、患者に罹患経路の活性がｅｘ  ｖｉｖｏでみられるかどうかを明らかにする。この解析は、患者の罹患細胞に疾患過程が認められるかどうかに関する動的評価を医師に初めて提供するものである。この実施形態では、被験経路を４つのグループカテゴリー、すなわち、恒常的活性、過活性、不活性（低活性）または通常活性のうちの１つに分類することができる。経路が罹患しており、したがって、目的の経路活性を阻害することがわかっている標的療法での治療に適しているかどうかを判定するため、疾患を有することが疑われる患者について本明細書に記載される方法によって判定される経路活性と、無作為に選択した疾患を有することが疑われる患者集団のその経路活性に関する統計解析から求めたカットオフ値とを比較する。異常のある（例えば、異常な経路活性および正常な経路活性を表すカットオフを上回る）経路活性を有することが明らかになった経路を標的とする薬物であれば、その活性を妨害し、それにより患者に目的とする効果をもたらすことが予想される。
【０３９４】
（ｉｉ）薬物の機能性の解析。この解析では、薬物のｅｘ  ｖｉｖｏでの機能性の尺度が２種類得られる。
１）応答スコア（ＲＳ）：応答スコアは、被験薬が標的経路に及ぼす機能的効果の特徴を明らかにするものである。このスコアは０〜１のスケールで報告することができ、スコアが高いほど薬物の機能性が高いことを示す。
２）応答スコア百分位数順位（ＲＳＰＲ）：ＲＳＰＲは、患者の応答スコアが、同じ薬剤で試験した他の患者が得たスコアと比較してどのように順位付けされるかを明らかにするものである。各患者について、その応答スコアのグループ全体のなかでの百分位数を求める。百分位数順位を割り当てた後、患者を３つのグループ、すなわち、ａ）中央値未満、ｂ）中央値付近またはｃ）中央値超のうちの１つに分類することができる。特定の薬物について、無進行期間（ＴＴＰ）などの臨床エンドポイントによって測定される患者の薬物応答の広範囲にわたるばらつきが応答スコアのばらつきに反映される。臨床試験で第７５百分位数の患者のＴＴＰ期間が第２５百分位数の患者のＴＴＰ期間の５〜１０倍になる場合が多いことから、医師に患者の応答スコアの相対順位を提供すれば、解釈する際の重要な背景となる。例えば、個々の患者の応答スコアの百分位数に対応する患者の臨床試験での百分位数範囲のＴＴＰ期間に基づき、医師が個々の患者のＴＴＰ期間を推定することが可能である。
【０３９５】
（ｉｉｉ）推定臨床的転帰の予測。この解析では、臨床試験で問題の薬剤を投与した後に試験し観察した患者の応答スコアと臨床エンドポイントの間にみられる相関が反映される。この相関を用いれば、臨床試験である特定の応答スコアを得た患者と一致する臨床的転帰を明らかにすることが可能になる。例えば、ＴＴＰが測定した臨床的転帰である場合、患者の結果を３つのカテゴリーのうちの１つに分類することが可能である。
推定ＴＴＰ期間−最低：この亜集団に該当する患者は、患者集団全体でみたＴＴＰ期間中央値をはるかに下回るＴＴＰ期間となる可能性が高い。
推定ＴＴＰ期間−中間：このカテゴリーに該当する応答スコアの患者については評価を提供しない。
推定ＴＴＰ期間−最高ｔ：この亜集団に該当する患者は、患者グループ全体でみたＴＴＰ期間中央値をはるかに上回るＴＴＰ期間となる可能性が高い。
【０３９６】
臨床医であれば、選択する薬物療法を決定する際にＣＥＬｘプロファイル試験の結果を用いることが考えられる。患者の細胞を複数の活性化剤および標的化治療剤で試験する場合、各薬物または薬物の組合せに関する推定臨床的転帰を比較し、それにより、医師は試験結果が最も良好な推定臨床的転帰と相関する薬物または薬物の組合せを選択することができる。
【０３９７】
Ｌ．キット
本発明の別の態様では、キットが提供される。ある特定の実施形態では、キットは、輸送培地の入った個々の対象の疾患細胞試料の容器；輸送培地の入った個々の対象の対照細胞試料の容器；バイオセンサー；バイオセンサーのデータを出力に変換し、出力が一定時間にわたる細胞生理応答パラメータの変化を示し、細胞生理応答パラメータが、ｐＨ、細胞接着、細胞付着パターン、細胞増殖、細胞シグナル伝達、細胞生存能、細胞密度、細胞の大きさ、細胞形状、細胞極性、Ｏ２、ＣＯ２、グルコース、細胞周期、同化作用、異化作用、小分子の合成および生成、代謝回転および呼吸、ＡＴＰ、カルシウム、マグネシウムおよびその他の荷電イオン、タンパク質、特定の経路メンバー分子、様々な細胞区画内のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ、ゲノミクスおよびプロテオミクス、翻訳後修飾および機序、二次メッセンジャーのレベル、ｃＡＭＰ、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、マイクロＲＮＡ生理的機能を有するその他のＲＮＡならびにそれらの組合せからなる群より選択され；出力を、状態を応答者もしくは非応答者として示すカットオフ値を上回るものもしくは下回るものに分類し、かつ／または試料を無応答性、弱応答性および応答性に分類し；分類を含むレポートを作製するためのコンピュータで実行可能な指示を含む、一時的でないコンピュータ読取り可能媒体を含む。
【０３９８】
疾患細胞試料のタイプおよび量についてここに記載する。ある特定の実施形態では、疾患細胞試料は、細胞が少なくとも５，０００個入った全細胞無標識生細胞試料である。諸実施形態では、対照細胞試料は、同じ対象の疾患細胞試料、同じ対象の健常細胞試料、疾患がないことがわかっている対象の健常細胞試料、正常基準範囲を求めるための目的とする疾患のない十分な数の患者から得た健常材料の試料の組、治療剤に応答することがわかっている細胞試料、治療剤に応答しないことがわかっている細胞試料およびそれらの組合せからなる群より選択される。
【０３９９】
容器および輸送培地は、細胞生存能を維持し、細胞活性化を最小限に抑えるよう設計されたものである。諸実施形態では、培地および容器は、無内毒素、非発熱性、無ＤＮアーゼかつ無ＲＮアーゼのものである。細胞試料を採取地した後、細胞生存能を保持する輸送培地で維持する。解析場所までの輸送時間の長さに応じて、様々な培地を用い得る。諸実施形態では、組織試料の輸送に必要な時間が１０時間以内になり得る場合、培地は、重量オスモル濃度が４００ｍｏｓｍ／Ｌ未満であり、Ｎａ＋、Ｋ＋、Ｍｇ＋、Ｃｌ−、Ｃａ＋２、グルコース、グルタミン、ヒスチジン、マンニトールおよびトリプトファン、ペニシリン、ストレプトマイシンを含み、必須アミノ酸を含み、さらに、ヒト初代細胞の増殖および平板効率を支えるため非必須アミノ酸、ビタミン、その他の有機化合物、微量ミネラルおよび無機塩、血清、細胞抽出物、または成長因子、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ヒドロコルチゾン、エタノールアミン、ホスホホリルエタノールアミン（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｙｌｅｔｈａｎｏｌｏａｍｉｎｅ）、トリドサイロニン（ｔｒｉｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ）、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミンを含有し得る。このような培地の例としては、初代細胞を管理するためのセルシオ培地、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）、ハンクス緩衝生理食塩水およびマッコイ５Ａ、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、リーボビッツＬ−１５またはその改変物が挙げられる。
【０４００】
バイオセンサーについてここに記載する。ある特定の実施形態では、バイオセンサーは、細胞接着、細胞付着、細胞形態、細胞表現型、細胞増殖、細胞シグナル伝達、細胞密度、細胞極性、ｐＨ、Ｏ２、ＣＯ２、グルコースおよびそれらの組合せからなる群より選択される細胞パラメータを検出するバイオセンサーからなる群より選択される。諸実施形態では、装置はインピーダンス装置または光学装置である。バイオセンサーは任意選択で、本明細書に記載される通りにコートしてよい。諸実施形態では、本明細書に記載される治療剤および／または活性化因子薬剤のタイプに関連する生理的パラメータの変化を測定するバイオセンサーを選択する。
【０４０１】
他の実施形態では、キットは、バイオセンサーのデータを出力に変換し、出力が一定時間にわたる細胞生理応答パラメータの変化を示し、細胞生理応答パラメータが、細胞生理応答パラメータが、ｐＨ、細胞接着、細胞付着パターン、細胞増殖、細胞シグナル伝達、細胞の生存、細胞密度、細胞の大きさ、細胞形状、細胞極性、Ｏ２、ＣＯ２、グルコースおよびそれらの組合せからなる群より選択され；出力を応答者または非応答者ならびに／あるい無応答性、弱応答性および応答性に分類し；分類を含むレポートを作成するためのコンピュータで実行可能な指示を含む、一時的でないコンピュータ読取り可能媒体を含む。
【０４０２】
他の実施形態では、本発明は、本開示の方法を実施するための指示を含むコンピュータ装置またはコンピュータ読取り可能媒体を提供する。コンピュータ読取り可能媒体としは、一時的でないＣＤ、ＤＶＤ、フラッシュドライブ、外付けハードドライブおよびモバイル機器が挙げられる。
【０４０３】
本明細書に記載されるキットおよび方法には、プロセッサ／コンピュータシステムを用いることができる。例えば、プロセッサと、この方法を実施するためのプログラムメモリ保存コンピュータプログラムコード、ワーキングメモリ、従来のコンピュータスクリーン、キーボード、マウスおよびプリンタなどのインターフェースならびにネットワークインターフェースおよびデータベースインターフェースを含めたソフトウェアインターフェースなどの他のインターフェースを含む汎用コンピュータシステムが本明細書に記載される一実施形態に用いられる。
【０４０４】
コンピュータシステムは、キーボード、入力データファイルもしくはネットワークインターフェースなどのデータ入力装置または例えば一定時間にわたってバイオセンサーにより得られたデータを解釈するシステムなどの別のシステムからユーザー入力を受け取り、プリンタ、ディスプレイ、ネットワークインターフェースまたはデータ保存装置などの出力装置に出力する。入力装置、例えばネットワークインターフェースは、本明細書に記載される細胞の生理的パラメータの変化および／またはこれらの変化の定量化の結果を含む入力を受け取る。出力装置は、細胞パラメータの変化の検出結果および／または定量化の結果を示す１つまたは複数の数値および／またはグラフを含めた出力、例えば表示などを提供する。
【０４０５】
コンピュータシステムは、本明細書に記載される方法によって得たデータを保存するデータ保存と連動させることができる。このデータを測定ごとおよび／または対象ごとに保存し；任意選択で、これらのタイプのデータそれぞれの複数のセットを各対象に対応させて保存する。１つまたは複数のコンピュータ／プロセッサは、例えば別個の機械として、例えばネットワークを介してコンピュータシステムと連動させて使用し得るか、コンピュータシステムで作動する別個の、もしくは統合したプログラムを含み得る。いずれの方法を用いても、これらのシステムは、データを受け取り、それと引き換えに検出／診断に関するデータを提供する。
【０４０６】
いくつかの実施形態では、コンピュータ装置はサーバコンピュータなどの単一のコンピュータ装置を含み得る。他の実施形態では、コンピュータ装置は、ネットワークを介して相互に通信するよう構成された複数のコンピュータ装置を含み得る（不掲載）。コンピュータ装置はメモリ内に複数のデータベースを保存することができる。コンピュータ装置に保存するデータベースは、診療所、開業臨床医、プログラマー識別コードまたは他の任意の所望のカテゴリー別に整理することができる。
【０４０７】
バイオセンサーからのデータを遠隔コンピュータシステムまたは別のデータ保存装置に送信することができる。通信プロセスが開始モジュールを初期化して始まり、接続操作に進む。接続操作により、健康管理提供者が保存した情報が例えばケーブル接続、無線ローカルエリアネットワーク（ＷＬＡＮまたはＷｉ−Ｆｉ）接続、セルラーネットワーク、無線パーソナルエリアネットワーク（ＷＰＡＮ）接続、例えばＢＬＵＥＴＯＯＴＨ（登録商標）または任意の所望の通信回線を介して通信的に遠隔コンピュータシステムと連動する。
【０４０８】
転送操作によりバイオセンサーからコンピュータ装置にデータが送信される。一実施形態では、装置間でデータを送信する前に転送操作によってデータが暗号化される。通信プロセスは停止モジュールを完了させて終了し得る。バイオセンサーのデータが遠隔コンピュータ装置に移動した後、データが経時的な細胞指数測定値などの出力に変換される。ある特定の実施形態では、定められたエンドポイントが選択され、細胞試料を本明細書に記載されるように無応答性、弱応答性または応答性に分類するのに用いられる。諸実施形態では、試料解析の状態が応答者または非応答者として、ケーブル接続、無線ローカルエリアネットワーク（ＷＬＡＮまたはＷｉ−Ｆｉ）接続、セルラーネットワーク、無線パーソナルエリアネットワーク（ＷＰＡＮ）接続、例えばＢＬＵＥＴＯＯＴＨ（登録商標）または任意の所望の通信回線を介する同様のプロセスを用いて健康管理提供者に返信される。
【０４０９】
ある特定の実施形態では、コンピュータ読取り可能記憶媒体にコンピュータで実行可能な指示が含まれており、その指示がコンピュータ装置によって実行されると、コンピュータ装置が、バイオセンサーからのデータを出力に変換し、出力が、一定時間にわたる細胞生理応答パラメータの変化を示し、細胞生理応答パラメータが、治療剤の存在下および／または不在下でのｐＨ、細胞接着、細胞付着パターン、細胞増殖、細胞シグナル伝達、細胞生存能、細胞密度、細胞の大きさ、細胞形状、細胞極性、Ｏ２、ＣＯ２、グルコースおよびそれらの組合せからなる群より選択されること；定められたエンドポイントで、治療剤存在下で細胞試料から得たバイオセンサーの出力と、治療剤不在下で細胞試料から得たバイオセンサーの出力とを比較することによって、出力を無応答性と応答性に分類すること；ならびに分類を含むレポートを作成することを含む段階を遂行する。諸実施形態では、コンピュータで実行可能な指示は、健康管理提供者に分類を送信するための指示を含む。
【０４１０】
他の実施形態では、コンピュータ読取り可能記憶媒体は、対象の疾患細胞試料において稼働している経路を特定するための指示を含み得る。コンピュータ装置によって実行されるときの指示は、第一の活性化剤または攪乱剤で治療した対象の疾患細胞試料から得たバイオセンサーデータの出力と、第一の活性化剤または攪乱剤で治療した同じ対象の第二の疾患細胞試料から得たバイオセンサーデータの出力との間に差があるかどうかを判定して、第一の活性化因子または攪乱物質剤（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ  ａｇｅｎｔ）に応答性の経路が疾患細胞試料において活性であるかどうかを判定すること；出力の差の存在を経路の活性を示すものとして認識し、経路の活性を健康管理提供者に送信することを含む。活性化因子または攪乱物質剤（ｐｅｒｔｕｒｂａｎｔ  ａｇｅｎｔ）およびその経路については本明細書に記載されている。
【０４１１】
（実施例）
以下の実施例を参照することによって本発明がさらに十全に理解されよう。ただし、これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例および実施形態は単に例示を目的とするものであり、それを踏まえて様々な修正または改変が当業者に示されるとともに本願の趣旨および範囲ならびに添付の請求項の範囲に含まれることが理解される。
【０４１２】
実験デザインに関する考察
本開示に記載されるシグナル伝達経路の活性化または阻害によって惹起される細胞接着の変化を測定する方法は、患者の腫瘍細胞で最も活性の高いシグナル伝達経路の特定または超感受性のシグナル伝達経路の特定に基づき治療を決定するのに用いられる。タンパク質結合の生化学的原則が細胞タイプ全体に共通するものであることを踏まえれば、本明細書に記載される方法は、タンパク質およびその他の生体分子の結合が起こり得るあらゆる細胞および細胞経路に広く適用できるものである。
【０４１３】
現在の最新技術の診断試験では、患者の腫瘍細胞の様々なシグナル伝達経路の活性レベルを直接比較することも、ある特定のシグナル伝達経路が超感受性であるかどうかを判定することもできない。このため、上記の方法では、患者に有益である可能性がもっとも高い標的療法で患者を治療する方法を導き出すことはできない。最も活性の高いシグナル伝達経路を特定するか、異常に超感受性のシグナル伝達経路を特定することによって、最も活性の高い経路または超感受性経路に影響を及ぼす標的療法を選択し、患者に実施することができる。
【０４１４】
以下に記載する４つの実施例は、患者を治療する目的に最適な標的療法を選択する指針とするべくシグナル伝達経路活性の特徴を明らかにする方法の様々な実施形態を示すものである。具体的には、これらの実施例では、１）患者の腫瘍細胞で最も活性の高いシグナル伝達経路（例えば、ＨＥＲ１，ＨＧＦＲ，ＦＧＦＲなど）を特定し、そのシグナル伝達経路が同じタイプの癌（例えば、乳癌，肺癌，結腸癌など）を有する異なる患者では活性レベルが異なることを明らかにすること；２）患者の腫瘍細胞の異常に超感受性のシグナル伝達経路を特定すること；および３）同時に活性化され、ＣＥＬｘ試験の出力値を最も大きくするのに薬物の組合せを必要とする経路を特定することが可能であることを示す。これらの実施例は、本発明によって判定される患者の腫瘍細胞のシグナル伝達経路活性の状態（例えば、最も活性が高い、または超感受性である）を用いて治療を決定することが可能であることを裏付けるものである。
【０４１５】
実施例１：複数の経路に関する試験
方法：
バイオセンサーおよびトランスデューサー：９６ウェルインペンデンス（ｉｍｐｅｎｄｅｎｃｅ）Ｅ−Ｐｌａｔｅ（ＡＣＥＡ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  ＲＴＣＡ  ＭＰ  Ｓｔａｔｉｏｎインペンデンス（ｉｍｐｅｎｄｅｎｃｅ）バイオセンサー（ＡＣＥＡ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）の上に設置した。バイオセンサーは各ウェルのインピーダンスを同時に測定するものであった。特定のウェルのインピーダンス変化は、細胞数およびその細胞がインピーダンスマイクロプレートに対して示す付着のタイプに比例する。インピーダンス変化は、これらの小さな細胞集団の攪乱に対する応答を示す。
【０４１６】
コーティング：９６−Ｅ−Ｐｌａｔｅのウェルをフィブロネクチンおよび／またはコラーゲンでコートした。コラーゲンはＡｄｖａｎｃｅｄ  ＢｉｏＭａｔｒｉｘ社（カールスバド、カリフォルニア州）から購入し、フィブロネクチンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ州）から購入する。
【０４１７】
組織および細胞試料：乳癌、肺癌、結腸癌、卵巣癌、腎臓癌、膀胱癌由来のヒト腫瘍細胞の試料を計１８例試験した。これらの６つの異なる癌のタイプのそれぞれについて、３例の異なる患者の腫瘍細胞試料を試験した。各患者について、標的療法選択の指針として用いるバイオマーカーがあれば表１８に挙げる。
【０４１８】
シグナル伝達経路活性化因子薬剤と標的化治療剤の対：
各ヒト腫瘍細胞試料を対象に、１０対の異なるシグナル伝達経路活性化因子薬剤と標的化治療剤の対を用いて、１１種類の異なるシグナル伝達経路を試験した。シグナル伝達経路活性化因子薬剤と標的化治療剤の対はそれぞれ同じシグナル伝達経路に影響を及ぼすものである。各シグナル伝達経路活性化因子薬剤は、よく特徴付けられたものであるとともに、その関連するシグナル伝達経路の特異的アゴニストであり、各標的化治療剤は、よく特徴付けられたものであるとともに、同じ関連するシグナル伝達経路の特異的アンタゴニストである。関連するシグナル伝達経路の活性レベルの特徴を明らかにするのに用いたシグナル伝達経路活性化因子薬剤および標的化治療剤を下の表１６にまとめる：
【表１６】
2020514379.tif 000034
【０４１９】
その他の試薬：標準培地抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）およびその他の緩衝剤をＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州、米国）またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（グランドアイランド、ニューヨーク州）から購入し、配達されたときの状態で使用した。
【０４２０】
手順：シグナル伝達経路活性化因子と標的化治療剤の対を用いた患者細胞試料に関する各試験では、培地１２０ｕＬに入れた約１５，０００個の細胞を６つのウェルに播種した。シグナル伝達経路活性化因子薬剤を添加する１８時間前、各患者の細胞の２つのウェルに標的化治療剤を２０マイクロリットル添加し、それ以外の各患者の４つのウェルに標準培地を２０マイクロリットル添加した。標的化治療剤を加えた２つのウェルおよび標的化治療剤を加えていない各患者の細胞の組のほかの２つのウェルにシグナル伝達経路活性化因子薬剤２０ｕｌを加えてシグナル伝達経路の刺激を開始した。付着および接着の変化に関するインピーダンスの記録を３７℃、５％ＣＯ２で実施した。試験全体を通じて連続的にデータを記録し、ここでは、示されるデータは、１８例の異なる患者試料について、最初のベースラインの細胞付着レベルと、標的化治療剤およびシグナル伝達経路活性化因子薬剤を添加した後の効果とを比較して得られたものである。
【０４２１】
結果：
上記の方法を用いて実施した１６７件の試験それぞれについて、出力値で表した結果を表１７に示す。１８例の患者試料それぞれについて、最大１１種類の異なるシグナル伝達経路を試験した。出力値は、シグナル伝達経路活性化因子薬剤の添加によって生じた細胞接着の変化の量と、標的化治療剤の添加によって生じた細胞接着の変化の量の間の差を表している。試験した患者はそれぞれ、少なくとも１種類のシグナル伝達経路の活性が、試験した他の９種類のシグナル伝達経路より有意に高い値を示した。最も活性の高いシグナル伝達経路に関連する標的化治療剤が、患者に投与する標的化治療剤である。
【０４２２】
【表１７】
2020514379.tif 000035
【０４２３】
考察：
患者について、その細胞に存在し（存在する場合）標的療法選択の指針として用い得るバイオマーカーを下の表１８に挙げる。バイオマーカーが存在する場合に患者の治療に用い得る対応する標的療法も表に挙げる。患者の多くは治療に関連するバイオマーカーがみられず、したがって、本発明を用いなければ標的療法を受けるのに適格であるとはならないものと思われる。さらに、本発明によって記載される方法に基づいて患者に投与することが推奨される可能性のある標的化治療剤を表に挙げる。
【０４２４】
試験した患者１８例のうち１７例では、本明細書に記載されるこの方法の結果を用いて投与される標的化治療剤が、現在の標準治療ガイドラインが推奨する標的療法とは異なるものである。多くの場合、現在の治療ガイドラインに基づいて標的化治療剤が処方されることはないものと思われる。多くの場合、指示される現在の標準治療が根底にある疾患機序、すなわち、その患者で明らかになった特定のシグナル伝達経路の機能不全を治療するものではないことから、この実施例は、癌の患者のシグナル伝達経路の活性を測定することの重要性を裏付けるものである。
【０４２５】
【表１８】
2020514379.tif 000036
2020514379.tif 000037
【０４２６】
実施例２：経路の超感受性に関する試験
方法：
バイオセンサーおよびトランスデューサー：９６ウェルインペンデンス（ｉｍｐｅｎｄｅｎｃｅ）Ｅ−Ｐｌａｔｅ（ＡＣＥＡ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  ＲＴＣＡ  ＭＰ  Ｓｔａｔｉｏｎインペンデンス（ｉｍｐｅｎｄｅｎｃｅ）Ｅ−Ｐｌａｔｅバイオセンサー（ＡＣＥＡ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）の上に設置した。バイオセンサーは各ウェルのインピーダンスを同時に測定するものであった。特定のウェルのインピーダンス変化は、細胞数およびその細胞がインピーダンスマイクロプレートに対して示す付着のタイプに比例する。インピーダンス変化は、これらの小さな細胞集団の活性化に対する応答を示す。
【０４２７】
コーティング：９６−Ｅ−Ｐｌａｔｅのウェルをフィブロネクチンおよび／またはコラーゲンでコートした。コラーゲンはＡｄｖａｎｃｅｄ  ＢｉｏＭａｔｒｉｘ社（カールスバド、カリフォルニア州）から購入し、フィブロネクチンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ州）から購入する。
【０４２８】
組織および細胞試料：乳腺腫瘍由来ヒト細胞の５例の異なる試料（Ｒ１３１、Ｒ３９、Ｒ３６、Ｒ２０、Ｒ８２）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腫瘍由来ヒト細胞の２例の異なる試料（Ｃ１５およびＣ２３）を試験した。各患者について、標的療法選択の指針として用いるバイオマーカーがあれば表２０に挙げる。
【０４２９】
シグナル伝達経路活性化因子：
ＨＥＲ３アゴニストであるＮＲＧ１を用いて、５例の乳癌細胞試料それぞれのＨＥＲ３経路を刺激した。各乳癌試料についてシグナル伝達経路活性化因子薬剤のＥＣ９０濃度およびＥＣ１０濃度も求めた。表１９にまとめを示す。
【０４３０】
【表１９】
2020514379.tif 000038
【０４３１】
２例のＮＳＣＬＣ細胞試料ではそれぞれ、４種類の異なる活性化剤を用いてＥＧＦ経路またはＨＥＲ３経路を刺激した。各ＮＳＣＬＣ細胞試料についてシグナル伝達経路活性化因子薬剤のＥＣ９０濃度およびＥＣ１０濃度も求めた。表２０にまとめを示す。
【０４３２】
【表２０】
2020514379.tif 000039
【０４３３】
その他の試薬：標準培地抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）およびその他の緩衝剤をＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州、米国）またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（グランドアイランド、ニューヨーク州）から購入し、配達されたときの状態で使用した。
【０４３４】
手順：２種類の異なる濃度のシグナル伝達経路活性化因子を用いた患者細胞試料に関する各試験では、１２０ｕＬの培地に入れた約１５，０００個の細胞を６つのウェルに播種した。各患者の細胞の２つのウェルにほぼＥＣ９０濃度に相当するシグナル伝達経路活性化因子薬剤２０マイクロリットルを添加し、各患者の細胞の２つのウェルにほぼＥＣ１０濃度に相当するシグナル伝達経路剤２０マイクロリットルを添加し、各患者の上記以外の２つのウェルに標準培地２０マイクロリットルを添加した。付着および接着の変化に関するインピーダンスの記録を３７℃、５％ＣＯ２で実施した。試験全体を通じて連続的にデータを記録し、ここでは、示されるデータは、１２例の異なる患者試料について、最初のベースラインの細胞付着レベルと、２種類の濃度のシグナル伝達経路活性化因子薬剤を添加した後の効果とを比較して得られたものである。
【０４３５】
結果：
表２１、２２および２３に結果をまとめる。試験した患者細胞試料それぞれについて、２種類の異なる濃度のシグナル伝達経路活性化因子薬剤の添加後に測定したシグナル伝達経路活性の出力値を算出した。シグナル伝達経路活性化因子薬剤に対するシグナル伝達経路の感受性を判定するため、この２種類の出力値を用いて感受性を算出した。ＥＣ１０に対するＥＣ９０の比が８１未満である場合、経路は超感受性であるものとし、それ以外の場合、経路は通常の感受性であるものとした。
【０４３６】
被験乳癌細胞試料の結果を表２１に示す。ここで試験した５例の乳癌患者試料のうち４例はＥＣ１０に対するＥＣ９０が８１未満であり、このことは、この被験シグナル伝達経路が超感受性であったことを意味する。超感受性であることがわかった同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす標的化治療剤が特定されたため、患者のバイオマーカーの状態に基づいた場合に患者に処方されたと思われる治療剤と比較することができた。
【０４３７】
【表２１】
2020514379.tif 000040
【０４３８】
被験ＮＳＣＬＣ細胞試料の結果を表２２および２３に示す。ＮＳＣＬＣ細胞試料ではともに、ここで試験した４つの活性化剤はそれぞれ、ＥＣ１０に対するＥＣ９０の比が８１未満であり、このことは、被験シグナル伝達経路が超感受性であったことを意味する。超感受性であることがわかった同じシグナル伝達経路に影響を及ぼす標的化治療剤が特定されたため、患者のバイオマーカーの状態に基づいた場合に患者に処方されたと思われる治療剤と比較することができた。
【０４３９】
【表２２】
2020514379.tif 000041
【０４４０】
【表２３】
2020514379.tif 000042
【０４４１】
考察：
試験した患者細胞６例のうち５例は、関連するシグナル伝達経路の超感受性の状態に基づいて投与され得る標的化治療剤が、現在の標準治療ガイドラインが推奨する標的療法とは異なるものである。多くの場合、ゲノムバイオマーカーの状態に基づいて指示される現在の標準治療が根底にある疾患機序、すなわち、超感受性シグナル伝達経路の機能を治療するものではないことから、この実施例は、シグナル伝達経路が超感受性であるかどうかを判定することの重要性を裏付けるものである。
【０４４２】
実施例３：複数の経路に関する同時試験
方法：
バイオセンサーおよびトランスデューサー：９６ウェルインペンデンス（ｉｍｐｅｎｄｅｎｃｅ）Ｅ−Ｐｌａｔｅ（ＡＣＥＡ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）をｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  ＲＴＣＡ  ＭＰ  Ｓｔａｔｉｏｎインペンデンス（ｉｍｐｅｎｄｅｎｃｅ）Ｅ−Ｐｌａｔｅバイオセンサー（ＡＣＥＡ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）の上に設置した。バイオセンサーは全ウェルのインピーダンスを同時に測定するものであった。特定のウェルのインピーダンス変化は、細胞数およびその細胞がインピーダンスマイクロプレートに対して示す付着のタイプに比例する。インピーダンス変化は、これらの小さな細胞集団の攪乱に対する応答を示す。
【０４４３】
コーティング：９６−Ｅ−Ｐｌａｔｅのウェルをフィブロネクチンおよび／またはコラーゲンでコートした。コラーゲンはＡｄｖａｎｃｅｄ  ＢｉｏＭａｔｒｉｘ社（カールスバド、カリフォルニア州）から購入し、フィブロネクチンはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社（セントルイス、ミズーリ州）から購入する。
【０４４４】
組織および細胞試料：乳癌由来ヒト腫瘍細胞の試料６例を試験した（Ｃ１８１５、Ｃ１５９６、Ｃ１８３８、Ｃ１３５、Ｃ４２、Ｃ２６４）。各患者について、標的療法選択の指針として用いるバイオマーカーがあれば表２２に挙げる。
【０４４５】
シグナル伝達経路活性化因子薬剤と標的化治療剤の対：
各ヒト腫瘍細胞試料を対象に、３つの活性化因子薬剤（ＥＧＦ、ＮＲＧ１、ＨＧＦ）の組合せによって惹起されるＨＥＲ１経路、ＨＥＲ３経路およびｃ−Ｍｅｔ経路のシグナル伝達活性全体を定量化した。さらに、活性化因子薬剤によって惹起され、５つの異なる薬物（ネラチニブ、２Ｃ４、ＨＥＲ１＋ＨＥＲ３  ｍＡｂ、テポチニブ、タセリシブ）、計１１の異なる単一薬物または複数の薬物の組合せによって阻害されるシグナル伝達経路活性の量を定量化した。各シグナル伝達経路活性化因子薬剤は、よく特徴付けられたものであると同時に、その関連するシグナル伝達経路の特異的アゴニストである。被験標的化治療剤のうちネラチニブ、２Ｃ４、ＨＥＲ１＋ＨＥＲ３  ｍＡｂおよびテポチニブの４つの治療剤は、よく特徴付けられたものであると同時に、成長因子によって活性化されるシグナル伝達経路のうちの少なくとも１つの経路の特異的アンタゴニストである。５つ目の被験標的化治療剤であるタセリシブは、ＨＥＲファミリー受容体およびｃ−Ｍｅｔ受容体の下流にあるＰＩ３ｋと結合する阻害剤である。
【０４４６】
その他の試薬：標準培地、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）およびその他の緩衝剤をＡＴＣＣ（マナッサス、バージニア州、米国）またはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（グランドアイランド、ニューヨーク州）から購入し、配達されたときの状態で使用した。
【０４４７】
手順：シグナル伝達経路活性化因子（１つまたは複数）および標的化治療剤（１つまたは複数）を用いた患者細胞試料に関する各試験では、培地１２０ｕＬに入れた約１５，０００個の細胞を６つまたは８つのウェルに播種し、単一の薬物のみを評価する場合は６つのウェルに播種し、２つの薬物を評価する場合は８つのウェルには播種した。単一の薬物のみを評価する場合、各患者の細胞の２つのウェルに標的化治療剤を２０ｕＬ添加し、単一の治療剤を入れる２つのウェルの治療剤の最終濃度を５００ナノモルとした。２つの治療剤を評価する場合、患者細胞の２つのウェルに５００ナノモルの濃度の各治療剤を組み合わせたもの２０ｕＬを加え、患者細胞のほかの２つのウェルには、５０ナノモルの濃度の各治療剤を組み合わせたもの２０ｕＬを加えた。それ以外の各患者の４つのウェルには、シグナル伝達経路活性化因子薬剤（１つまたは複数）を添加する１８時間前に標準培地を２０マイクロリットル添加した。標的化治療剤（１つまたは複数）を加えた２つまたは４つのウェルおよび各患者の細胞の組のほかの２つのウェルにシグナル伝達経路活性化因子薬剤（１つまたは複数）２０ｕｌを加えてシグナル伝達経路の刺激を開始した。付着および接着の変化に関するインピーダンスの記録を３７℃、５％ＣＯ２で実施した。試験全体を通じて連続的にデータを記録し、ここでは、示されるデータは、９例の異なる患者試料について、最初のベースラインの細胞付着レベルと、標的化治療剤（１つまたは複数）およびシグナル伝達経路活性化因子薬剤（１つまたは複数）を添加した後の効果とを比較した得られたものである。
【０４４８】
結果：
上記の方法を用いて実施した１０２件の試験それぞれについて、出力値で表した結果を表２４に示す。６例の患者試料でそれぞれ、３種類の異なるシグナル伝達経路（ＨＥＲ１、ＨＥＲ３、ｃ−Ｍｅｔ）を同時に活性化させた。出力値は、シグナル伝達経路活性化因子薬剤（１つまたは複数）の添加によって生じた細胞接着の変化の量と、標的化治療剤（１つまたは複数）の添加によって生じた細胞接着の変化の量の間の差を表している。刺激したシグナル伝達経路活性を単独で、または複数のシグナル伝達経路活性化因子薬剤とともに最も阻害した標的化治療剤（１つまたは複数）が、患者の治療に選択される治療剤となる。
【０４４９】
【表２４】
2020514379.tif 000043
【０４５０】
各患者について、その細胞に存在するバイオマーカーおよびそれに対応し患者に治療に使用され得る標的療法を下の表２５に挙げる。表２５にはさらに、本開示によって記載される方法に基づいて患者に投与することが推奨される可能性のある標的化治療剤を挙げる。
【０４５１】
【表２５】
2020514379.tif 000044
【０４５２】
考察：
試験した患者６例では、本明細書に記載されるこの方法の結果を用いて選択され投与される標的化治療剤が、現在の標準治療ガイドラインが推奨する標的療法とは異なるものである。各患者では、５０ナノモルの濃度で試験した２つの薬物で記録された出力値が、同じ２つの薬物を５００ナノモルの濃度で試験した場合の出力値とほぼ同じであった。４例の患者では、２つの薬物を同時に試験した場合、同じ２つの薬物を個別に評価したときの出力値の合計より大きい出力値が得られた。以上の結果は、同時に活性化される経路を治療する場合に薬物を組み合わせて用いることの相乗効果を示している。指示される現在の標準治療が根底にある疾患機序、すなわち、その患者で明らかになった特定のシグナル伝達経路の機能不全を治療するものではないことから、この実施例は、癌の患者のシグナル伝達経路の活性を測定することの重要性を裏付けるものである。この実施例から、複数の活性化因子および治療剤を同時に試験することの有益性も裏付けられる。最後に、ＰＩ３ｋ阻害剤のタセリシブを用いた試験は、活性化因子薬剤の結合部位の下流におけるシグナル伝達活性に対するノード阻害剤の効果を示している。
【０４５３】
実施例４：２つの経路を治療する２つの薬物に関するマウス異種移植試験
ｃ−Ｍｅｔ受容体とＥｒｂＢファミリー受容体との間のクロストークを含めた異常なｃ−Ｍｅｔシグナル伝達が様々なタイプの癌に何らかの役割を演じているのではないかと考えられる。しかし、乳癌および肺癌を対象に被験抗Ｍｅｔ療法を単独で、および他の標的療法と組み合わせて評価する臨床試験では、ほとんどの場合、否定的な結果が得られている。これらの試験にはｃ−ＭＥＴタンパク質の過剰発現または遺伝子増幅がみられる対象が参加しており、受容体の状態と目的とする治療反応との間の相関が低いことがわかっている。本発明に生存腫瘍細胞を用いて複数のシグナル伝達経路の活性を測定することの利点を示すため、マウス異種移植試験を実施し、その結果と、本発明によって記載されるＣＥＬｘ試験で得た結果とを比較した。
【０４５４】
方法：
上の実施例１および３に記載したものと実質的に同じ方法を用いて、ＨＥＲ２＋腫瘍細胞試料Ｃ２１を試験し、ｃ−Ｍｅｔ経路、ＥＧＦＲ経路、ＨＥＲ２経路およびＨＥＲ３経路の状態を評価した。細胞にＮＲＧ１活性化剤、ＥＧＦ活性化剤およびＨＧＦ活性化剤を同時に添加する試験も実施し、同じ試料のまた別の一部については、これらの組み合わせた活性化剤をネラチニブ（汎用ＨＥＲ阻害剤）、テポチニブ（ｃ−Ｍｅｔ阻害剤）およびネラチニブとテポチニブの組合せとともに試験して、同時に活性化させたときにこれらの標的療法が上記の経路に及ぼす効果を測定した。この細胞試料は、ＨＥＲ２シグナル伝達が正常であり、ＥＧＦＲシグナル伝達が異常であり、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達が異常であることがわかった。したがって、この細胞試料については、ＣＥＬｘ試験においてｅｘ  ｖｉｖｏでｃ−Ｍｅｔ阻害剤およびＥＧＦＲ阻害剤に応答性であることがわかった細胞が、同じ細胞試料のまた別の一部を異種移植マウスモデルに移植したときにこれらの同じ阻害剤に応答するかどうかを評価するのが適切であった。
【０４５５】
異種移植試験には、雌ＮＳＧマウス４０匹にそれぞれ２００万個のＣ２１細胞を注射した。マウスを４つのマウス１０匹からなる治療群のうちの１つに無作為に割り付け、以下の通りに治療した：１）溶媒を投与した対照群；２）汎用ＨＥＲ阻害剤ネラチニブ；２）ｃ−Ｍｅｔ阻害剤テポチニブ；または３）ネラチニブとテポチニブ。マウスは１６日間治療した。
【０４５６】
結果：
ＣＥＬｘ  ｅｘ  ｖｉｖｏ試験では、Ｃ２１試料をＨＧＦ（ｃ−Ｍｅｔリガンド）のみで刺激すると、高特異的ｃ−Ｍｅｔ阻害剤であるテポチニブによって阻害されるｃ−Ｍｅｔシグナル伝達活性の割合はほぼ１００％になることが明らかになった。このことから、測定されたｃ−Ｍｅｔ活性の特異性が明らかになった。Ｃ２１細胞試料をＮＲＧ１、ＥＧＦおよびＨＧＦで同時に刺激（すなわち、ＨＥＲファミリーシグナル伝達経路とｃ−Ｍｅｔシグナル伝達経路の同時活性化）し、テポチニブ単独（ｃ−Ｍｅｔ阻害剤）で拮抗したところ、全シグナル伝達の１０％未満が阻害された。一方、Ｃ２１細胞試料をＮＲＧ１、ＥＧＦおよびＨＧＦで同時に刺激し、テポチニブ（ｃ−Ｍｅｔ阻害剤）とネラチニブ（ＥＧＦＲシグナル伝達経路を阻害する汎用ＨＥＲ阻害剤）の組合せで拮抗したところ、阻害されたｃ−Ｍｅｔシグナル伝達活性およびＥＧＦＲシグナル伝達活性の割合はほぼ１００％であった。ＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせたテポチニブによってｃ−Ｍｅｔシグナル伝達およびＥＧＦＲシグナル伝達の阻害が増大したことから、ｃ−Ｍｅｔシグナル伝達活性がＥＧＦＲシグナル伝達活性と同時に活性化されることが示唆される。この試験結果は、いずれの受容体の受容体状態とも遺伝子増幅状態とも関係がなく、シグナル伝達活性を単独で測定しても観察されないものである。このことは、生細胞で複数のシグナル伝達経路を同時に評価することの利点を強調するものである。
【０４５７】
これらのｅｘ  ｖｉｖｏの結果を踏まえれば、Ｃ２１細胞によるマウス異種移植では、ネラチニブなどのＥＧＦＲ阻害剤とテポチニブなどのｃ−Ｍｅｔ阻害剤の組合せで治療したとき、薬物応答のレベルが最大になることが予想される。このことを検証するため、上記の４つの治療群のマウス異種移植試験を実施し、その結果を図１に示す。１６日間の治療後の対照群とテポチニブ単独治療群の腫瘍体積の差は１０％であった。一方、対照と比較した腫瘍体積は、ネラチニブ単独治療群では５２％、テポチニブ＋ネラチニブ治療群では７３％減少していた。したがって、以上の結果は、単一薬剤のテポチニブがネラチニブなどのＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせたときほど効果的ではないことが明らかになったＣＥＬｘシグナル伝達解析の結果と一致している。
【０４５８】
考察：
異種移植試験でテポチニブとネラチニブの薬物組合せがテポチニブ単独より優れた腫瘍減少効果を示したことは、薬物治療を選択するには、本発明によって記載される複数の経路に関するＣＥＬｘ解析を用いる方がゲノムバイオマーカー解析より有利であることを裏付けている。Ｃ２１細胞を用いてｃ−Ｍｅｔシグナル伝達活性およびＥＧＦＲシグナル伝達活性を単独で、および同時にＣＥＬｘで解析しなければ、ｃ−Ｍｅｔ阻害剤が患者に何らかの利益をもたらすのではないかと考える根拠、ましてやｃ−Ｍｅｔ阻害剤をＥＧＦＲ阻害剤と組み合わせると有効性が改善されるのではないかと考える根拠は存在しなかったものと思われる。
【図１】
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【国際調査報告】
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