(57)【要約】  本開示によれば、様々なリンカーユニット及び分子構築物が提供される。各リンカーユニットは、標的化成分及び標的化成分に結合されたエフェクター成分を有する。このようなリンカーユニット及び分子構築物を用いて様々な疾患を治療する方法も開示される。【選択図】図１Ａ
2020510097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアと、複数のリンクアームを含むリンカーユニットであって、
前記コアは、複数のリジン（Ｋ）残基、１つ以上のスペーサー及び第１結合部分を含み、
任意の２つの前記Ｋ残基は、互いに隣接するか、又は１つのスペーサーによって分離され、
各前記スペーサーは、それぞれ独立して（１）１つ以上の非Ｋアミノ酸残基、又は（２）２〜１２個のエチレングリコール（ＥＧ）の繰り返し単位を有するＰＥＧ化アミノ酸を含み、
少なくとも１つの前記スペーサーは、Ｎ末端から始まる最初のＫ残基のＮ末端、又はＮ末端から始まる最後のＫ残基のＣ末端に結合され、
前記第１結合部分は、カルボキシル基又はアミン基、及び結合基を含み、前記結合基がアジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基及びシクロオクチン基からなる群より選択される基であり、
前記スペーサーが前記最初のＫ残基のＮ末端に結合される場合、前記第１結合部分は、カルボキシル基を含み、前記スペーサーのα−アミン基とアミド結合を形成することで前記スペーサーに結合され、或いは、
前記スペーサーが前記最後のＫ残基のＣ末端に結合される場合、前記第１結合部分は、アミン基を有し、前記スペーサーのカルボキシル基とアミド結合を形成することで前記スペーサーに結合され、
複数のリンクアームにおいて、
各前記リンクアームは、その一方の末端に反応基を有し、その他方の末端に官能基を有し、前記リンクアームの反応基と前記コアのＫ残基前記のアミン基との間でアミド結合を形成することで前記コアのＫ残基に結合され、
前記官能基は、アミン基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）基、マレイミド基、ビニルスルホン基、モノスルホン基、メチルスルホニルベンゾチアゾール基、ヨード基、ヨードアセトアミド基、アジド基、アルキン基、シクロオクチン基、テトラジン基、及びシクロオクテン基からなる群より選択され、ただし、前記結合がアジド基、アルキン基又はシクロオクチン基である場合、前記官能基は、テトラジン基又はシクロオクテン基であり、前記結合基がテトラジン又はシクロオクテン基である場合、前記官能基は、アジド基、アルキン基又はシクロオクチン基である、リンカーユニット。
【請求項２】
前記コアは、２〜２０個のＫ残基を含む、請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項３】
前記スペーサーは、１つ以上のグリシン（Ｇ）及び／又はセリン（Ｓ）残基を含む、請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項４】
前記反応基は、スクシンイミジルエステル（ＳＥ）基、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル基又はカルボキシル基である、請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項５】
前記コアは、それぞれ前記最初のＫ残基のＮ末端及び前記最後のＫ残基のＣ末端に結合された２つのスペーサーを含む、請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項６】
前記コアは、第２結合部分をさらに含み、前記第２結合部分は、カルボキシル基又はアミン基、及び結合基を有し、前記結合基は、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基及びシクロオクチン基からなる群より選択され、
前記第１結合部分及び第２結合部分のうちの一方は、前記最初のＫ残基のＮ末端に結合された前記スペーサーのＮ末端に結合され、
前記第１結合部分及び第２結合部分のうちの他方は、前記最後のＫ残基のＣ末端に結合された前記スペーサーのＣ末端に結合される、請求項５に記載のリンカーユニット。
【請求項７】
前記官能基は、マレイミド基、ビニルスルホン基、モノスルホン基、ヨード基又はヨードアセトアミド基であり、
前記第１結合部分及び第２結合部分のうちの一方の結合基は、アジド基、アルキン基又はシクロオクチン基であり、
前記第１結合部分及び第２結合部分のうちの他方の結合基は、テトラジン基又はシクロオクテン基である、請求項６に記載のリンカーユニット。
【請求項８】
各前記リンクアームは、２〜１２個の非Ｋアミノ酸残基を含むペプチド、又は２〜２４個のＥＧの繰り返し単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である、請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項９】
前記リンクアームの前記ペプチドは、それぞれ独立してＧ、Ｓ、グルタミン酸（Ｅ）残基、及びアルギニン（Ｒ）残基からなる群より選択される５〜１０個のアミノ酸残基を含む、請求項８に記載のリンカーユニット。
【請求項１０】
前記シクロオクテン基は、ノルボルネン基又はトランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）基であり、
前記シクロオクチン基は、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）基、ジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ）基、ビシクロノニン（ＢＣＮ）基又はジベンゾアザシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ）基であり、或いは
前記テトラジン基は、１，２，３，４−テトラジン基、１，２，３，５−テトラジン基、１，２，４，５−テトラジン基、又はその誘導体である、請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項１１】
前記コアは、複数の第１成分をさらに含み、
複数の前記第１成分は、それぞれ複数の前記リンクアームとの間でアミド結合又はエステル結合を形成すること、或いはチオール−マレイミド反応、ＳＮ２反応、銅触媒型アジド−アルキン環状付加（ＣｕＡＡＣ）反応、ひずみ促進型アジド−アルキンクリックケミストリー（ＳＰＡＡＣ）反応又は逆電子要請型ディールス・アルダー（ｉＥＤＤＡ）反応により複数の前記リンクアームに結合される、請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項１２】
前記コアは、ＣｕＡＡＣ反応、ＳＰＡＡＣ反応又はｉＥＤＤＡ反応により前記結合基に結合される第２成分をさらに含む、請求項１１に記載のリンカーユニット。
【請求項１３】
各前記第１成分は、第１細胞表面抗原に特異的な第１抗体断片であり、
前記第２成分は、細胞毒性薬物又は第２細胞表面抗原に特異的な第２抗体断片である、請求項１２に記載のリンカーユニット。
【請求項１４】
前記第１細胞表面抗原は、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ７２ａ、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８及びＣＤ３１９からなる群より選択され、
前記第２細胞表面抗原は、ＣＤ３又はＣＤ１６ａである、請求項１３に記載のリンカーユニット。
【請求項１５】
各前記第１成分は、ペプチドホルモン、第１成長因子又は腫瘍関連抗原に特異的な第１抗体断片であり、
前記第２成分は、細胞毒性薬物、トール様受容体アゴニスト、放射性核種と複合体を形成したキレート剤、サイトカイン、又は第２成長因子、細胞表面抗原、ハプテン若しくはサイトカインに特異的な第２抗体断片である、請求項１２に記載のリンカーユニット。
【請求項１６】
前記第１成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、変異型ＥＧＦ、エピレグリン、ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）からなる群より選択され、
前記第２成長因子は、ＥＧＦ、変異型ＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ｂＦＧＦ、及びＨＧＦからなる群より選択され、
前記ペプチドホルモンは、セクレチン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ソマトスタチン、オクトレオチド、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群より選択され、
前記腫瘍関連抗原は、上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ  １９−９）、ＣＡ  １２５、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１（ＭＵＣ  １）、ガングリオシドＧＤ２、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、メソセリン、ムチン関連Ｔｎ、シアリルＴｎ、グロボＨ、段階特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、及び上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）からなる群より選択され、
前記細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）からなる群より選択される、請求項１５に記載のリンカーユニット。
【請求項１７】
前記コアは、複数の第１成分、第２成分及び第３成分をさらに含み、
複数の前記第１成分は、それぞれ複数の前記リンクアームとの間でアミド結合又はエステル結合を形成すること、或いはチオール−マレイミド反応又はＳＮ２反応により複数の前記リンクアームに結合され、
前記第２成分及び第３成分は、それぞれ前記第１結合部分及び第２結合部分の結合基に結合され、
前記第２成分及び第３成分のうちの一方は、ｉＥＤＤＡ反応により１つの結合基に結合され、前記第２成分及び第３成分のうちの他方は、ＳＰＡＡＣ又はＣｕＡＡＣ反応により他の結合基に結合される、請求項７に記載のリンカーユニット。
【請求項１８】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットを含む分子構築物であって、
前記第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、前記第１リンカーユニットと第２リンカーユニットの結合基の間で起きるＣｕＡＡＣ反応、ＳＰＡＡＣ反応又はｉＥＤＤＡ反応により結合される、分子構築物。
【請求項１９】
複数の第１成分及び複数の第２成分をさらに含み、前記複数の第１成分及び複数の第２成分は、それぞれ前記第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットの複数のリンクアームとの間でアミド結合又はエステル結合を形成すること、或いはチオール−マレイミド反応、ＳＮ２反応、ＣｕＡＡＣ反応、ＳＰＡＡＣ反応又はｉＥＤＤＡ反応により前記第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットの複数のリンクアームに結合される、請求項１８に記載の分子構築物。
【請求項２０】
各前記第１成分は、第１細胞表面抗原に特異的な第１抗体断片であり、
各前記第２成分は、細胞毒性薬物又は第２細胞表面抗原に特異的な第２抗体断片である、請求項１９に記載の分子構築物。
【請求項２１】
前記第１細胞表面抗原は、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ７２ａ、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、及びＣＤ３１９からなる群より選択され、
前記第２細胞表面抗原は、ＣＤ３又はＣＤ１６ａである、請求項２０に記載の分子構築物。
【請求項２２】
各前記第１成分は、ペプチドホルモン、第１成長因子又は腫瘍関連抗原に特異的な第１抗体断片であり、
各前記第２成分は、細胞毒性薬物、トール様受容体アゴニスト、放射性核種と複合体を形成したキレート剤、サイトカイン、又は第２成長因子、細胞表面抗原、ハプテン若しくはサイトカインに特異的な第２抗体断片である、請求項１９に記載の分子構築物。
【請求項２３】
前記第１成長因子は、ＥＧＦ、変異型ＥＧＦ、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦからなる群より選択され、
前記第２成長因子は、ＥＧＦ、変異型ＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦからなる群より選択され、
前記ペプチドホルモンは、セクレチン、ＣＣＫ、ソマトスタチン、オクトレオチド及びＴＳＨからなる群より選択され、
前記腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  １２５ＣＥＡ、ＭＵＣ  １、ガングリオシドＧＤ２、ＭＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、メソセリン、ムチン関連Ｔｎ、シアリルＴｎ、グロボＨ、ＳＳＥＡ−４及びＥｐＣＡＭからなる群より選択され、
前記細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１からなる群より選択される、請求項２２に記載の分子構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１７年３月１６日に出願された米国仮出願第６２／４７２，０１１号及び２０１８年１月３日に出願された６２／６１３，４０１の優先権を主張し、その内容が参照によりすべて本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、医薬品分野に関し、より具体的には、多機能分子構築物、例えば、エフェクター、ターゲティング、及び薬物動態の改善などの複数の機能特性を有するものに関する。
【背景技術】
【０００３】
標的効果及び治療効果を兼ね備える医薬品の開発は、非常に人気のある研究分野となっている。例えば、国際特許出願第ＷＯ２０１６１１２８７０（Ａ１）号に開示されたマルチアームリンカーユニット及びその関連出願に開示された主要な化学物質は、２つ以上の機能部位を有する分子の構築に適用できる。しかし、ＷＯ２０１６１１２８７０公開において、クリックケミストリー反応では組み込み官能基（テトラジン、シクロオクテン及びシクロオクチン）を有するアミノ酸を使用するが、これらのアミノ酸は、固相ペプチド合成中にペプチドコアに組み込むことはできない。さらに、ＷＯ２０１６１１２８７０公開に基づいて、テトラジン、シクロオクテン又はシクロオクチン基を有するカップリングアームは、システイン残基のチオール基とヘテロ二官能性リンカーのマレイミド基との反応により組み込まれる。上記ヘテロ二官能性リンカーは、その一方の末端にマレイミド基、他方の末端にテトラジン基、シクロオクテン基又はシクロオクチン基を含む。チオール−マレイミドの反応生成物は不安定であることが知られており、隣接するチオール基含有分子と逆反応又は交換反応を起こし、保存中の結合リンカーの安定性に影響を与える可能性がある。さらに、ＷＯ２０１６１１２８７０公開に記載のように、ペプチドコアがシステイン残基を含む場合、リンクアームとペプチドコア上のチオール基と反応する可能性のある官能基との連続固相合成（ペプチドの分岐）を実行することができない。また、ペプチドコアのＮ末端のα−アミン基は、別途のブロックステップを必要とすることにより、ペプチドコア又はリンカーユニットの収率及び純度が低下する。
【０００４】
上記に鑑みて、当分野では、上記問題の少なくとも１つを解決できる新しいマルチアームリンカーユニットが望まれている。例えば、この新しいマルチアームリンカーユニットは、連続固相合成により合成することができ、より望ましい安定性及び／又は機能成分（例えば、標的化成分、エフェクター成分及び／又は薬物動態学的特性を改善する成分）に対する結合効率を示す。
【発明の概要】
【０００５】
以下は、読者に基本的な理解を提供するために本開示の簡略化された概要を提示する。この概要は、開示の広範な概要ではなく、本開示の重要な／決定的な要素を特定するものでも、本開示の範囲を描写するものでもない。その唯一の目的は、後に提示されるより詳細な説明の前置きとして、本明細書に開示されるいくつかの概念を簡略化した形で提示することである。
【０００６】
＜Ｉ＞マルチアームリンカーユニット
第１態様において、本開示は、機能成分に結合するための複数のリンクアームを有する新しいペプチドコアに基づくマルチアームリンカーユニットに関する。
本開示の実施形態によれば、本発明のコアは、複数のリンクアミノ酸残基、１つ以上のスペーサー、及び１つ又は２つの結合部分を含む。各リンクアミノ酸残基は、側鎖アミン基（例えば、リジン（Ｋ）残基）又はカルボキシル基（例えば、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）残基）を有する天然又は非天然アミノ酸残基であり得る。様々な実施形態において、任意の２つのリンクアミノ酸残基は、互いに隣接するか、又は１つのスペーサーによって分離される。
上記スペーサーは、それぞれ独立して（１）１つ以上の非Ｋアミノ酸残基（即ち、Ｋ残基ではないアミノ酸残基）、又は（２）２〜１２個のエチレングリコール（ＥＧ）の繰り返し単位を有するＰＥＧ化アミノ酸を含む。いくつかの例示的な実施形態によれば、上記スペーサーは、１つ以上のグリシン（Ｇ）及び／又はセリン（Ｓ）残基を含み得る。いくつかの例では、上記スペーサーは、１〜２０のアミノ酸残基、好ましくは２〜５のアミノ酸残基から構成される。
【０００７】
本開示のいくつかの実施形態によれば、スペーサーの１つは、Ｎ末端から始まる最初のリンクアミノ酸残基のＮ末端に連結することでＮ末端スペーサーを形成する。追加又は代替として、スペーサーの１つは、Ｎ末端から始まる最後のリンクアミノ酸残基のＣ末端に連結することでＣ末端スペーサーを形成する。
【０００８】
結合部分は、一方の末端にカルボキシル基（即ち、−ＣＯ２Ｈ基）又はアミン基（即ち、−ＮＨ２基）を有し、他方の末端に結合基を有する。例えば、上記結合基は、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基又はシクロオクチン基である。具体的には、スペーサーが最初のリンクアミノ酸残基のＮ末端に連結する（即ち、Ｎ末端スペーサーとする）場合、上記結合部分は、カルボキシル基を有することにより、Ｎ末端スペーサーのα−アミン基とアミド結合を形成することでＮ末端スペーサーのＮ末端に結合される。或いは、スペーサーが最後のリンクアミノ酸残基のＣ末端に連結する（即ち、Ｃ末端スペーサーとする）場合、上記結合部分は、アミン基を有することにより、Ｃ末端スペーサーのカルボキシル基とアミド結合を形成することでＣ末端スペーサーのＣ末端に結合される。このように結合した結合部分は、その遊離末端（即ち、Ｎ／Ｃ末端スペーサーと反応しない末端）に結合基を有する。
【０００９】
上記リンクアームは、ペプチドコアのリンクアミノ酸残基から伸びたものである。本開示の実施形態によれば、各リンクアームは、その一方の末端に反応基を有し、その他方の末端に官能基を有する。上記反応基は、スクシンイミジルエステル（ＳＥ；例えば、ヒドロキシスクシンイミドエステル又はＮ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）エステル）、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、カルボキシル基又はヒドロキシル基（即ち、−ＯＨ基）であり得る。上記官能基は、アミン基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基、（ＴＢＤＭＳ）、ＮＨＳ、マレイミド基、ビニルスルホン基、モノスルホン基、メチルスルホニルベンゾチアゾール基、ヨード基、ヨードアセトアミド基、アジド基、アルキン基、シクロオクチン基、テトラジン基及びシクロオクテン基からなる群より選択される。
【００１０】
構造的には、各リンクアームは、リンクアームの反応基とリンクアミノ酸残基のアミン基又はカルボキシル基との間でアミド結合を形成することにより１つのリンクアミノ酸残基に結合される。いくつかの実施形態において、本発明のコアが複数のＫ残基を含む場合、各リンクアームは、アミン−反応基（例えば、スクシンイミジルエステル、ＴＦＰエステル又はカルボキシル基）を有する。この場合には、リンクアームは、Ｋ残基のアミン基とアミド結合を形成することによりＫ残基に結合され得る。或いは、本発明のコアが複数のＤ及び／又はＥ残基を含む場合、各リンクアームは、カルボキシル−反応基（例えば、ヒドロキシル基）を有し、これによって、リンクアームは、Ｄ及び／又はＥ残基のカルボキシル基とアミド結合を結合することによりＤ及び／又はＥ残基に結合され得る。本発明のコアに結合された各リンクアームは、その遊離末端（即ち、本発明のコアに接続されていない末端）に官能基を有する。
結合基及び官能基を選択する際に、結合部分の結合基とリンクアームの官能基は互いにクリックケミストリー反応を起こさないことが望ましい。例えば、結合部分の結合基がアジド基、アルキン基又はシクロオクチン基である場合、リンクアームの官能基は、テトラジン基又はシクロオクテン基である。或いは、結合部分の結合基がテトラジン基又はシクロオクテン基である場合に、リンクアームの官能基は、アジド基、アルキン基又はシクロオクチン基である。上記のような設計は、リンカーユニットがそれぞれＮ末端及びＣ末端スペーサーに結合された結合部分を含む場合にも適用可能である。つまり、リンクアームの官能基と２つの結合部分の結合基とは、互いにクリックケミストリー反応を起こしてはならない。従って、この場合には、リンクアームの官能基は、マレイミド基、ビニルスルホン基、モノスルホン基、ヨード基又はヨードアセトアミド基であり、１つの結合部分の結合基は、アジド基、アルキン基又はシクロオクチン基であり、もう１つの結合部分の結合基は、テトラジン基又はシクロオクテン基であり得る。理解され得るように、２つの結合部分を単一種の元素に結合させようとする場合、２つの結合部分の結合基は、同じであっても、同じクリックケミストリー反応を起こしてもよい。
【００１１】
本開示のいくつかの実施例によれば、各リンクアームは、２〜１２の非Ｋアミノ酸残基を含むペプチド、又は２−２４個のＥＧの繰り返し単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である。具体例では、各リンクアームは、それぞれ独立してＧ、Ｓ、Ｅ及びアルギニン（Ｒ）残基からなる群より選択される５−１０のアミノ酸残基を含むペプチドである。別の例では、各リンクアームは、６−１２個のＥＧの繰り返し単位を有するＰＥＧ鎖である。
【００１２】
目的に応じて、異なる機能成分（標的化成分又はエフェクター成分）をそれぞれ本発明のリンクアームの遊離末端及びリンカーユニットの結合基に結合することができる。本開示の特定の実施形態によれば、本発明のリンカーユニットは、複数のリンクアーム及び１つの結合部分を含む。複数の第１成分は、複数のリンクアームとの間でアミド結合若しくはエステル結合を形成すること、又はチオール−マレイミド反応、ＳＮ２反応、銅触媒型アジド−アルキン環状付加（ＣｕＡＡＣ）反応、ひずみ促進型アジド−アルキンクリックケミストリー（ＳＰＡＡＣ）反応若しくは逆電子要請型ディールス・アルダー（ｉＥＤＤＡ）反応により複数のリンクアームに結合される。第２成分は、ＣｕＡＡＣ反応、ＳＰＡＡＣ反応又はｉＥＤＤＡ反応により結合基に結合される。或いは、本発明のリンカーユニットは、複数のリンクアーム及び２つの結合部分を含み得る。これによって、複数の成分は、それぞれ上記リンクアーム及び２つの上記結合部分に結合され得る。具体的には、複数の第１成分は、リンクアームとの間でアミド結合若しくはエステル結合を形成すること、又はチオール−マレイミド反応若しくはＳＮ２反応によりそれぞれリンクアームに結合され、第２成分は、ＳＰＡＡＣ反応又はｉＥＤＤＡ反応により１つの結合部分の結合基に結合され、第３成分は、ＣｕＡＡＣ反応、ＳＰＡＡＣ反応又はｉＥＤＤＡ反応によりもう１つの結合部分の結合基に結合される。理解され得るように、上記第２成分及び第３成分は、同じであっても異なっていてもよい。第１成分がリンクアームを介してペプチドコアのリンクアミノ酸残基（例えば、Ｋ残基）に結合されるため、リンクアミノ酸残基の数を変更することによりリンカーユニットが有する第１成分の数を調整することができる。このように、第２成分（又は第２成分及び第３成分）に対する第１成分の数の比率は、必要に応じて変更することができる。
【００１３】
本開示の任意の実施形態によれば、上記シクロオクテン基は、ノルボルネン基、トランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）基、又はその誘導体である。シクロオクチン基の例示的な例は、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）基、ジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ）基、ビシクロノニン（ＢＣＮ）基、ジベンゾアザシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ又はＤＢＣＯ）基及びその誘導体を含む。テトラジン基の例は、１，２，３，４−テトラジン基、１，２，３，５−テトラジン基、１，２，４，５−テトラジン基及びその誘導体を含むが、これらに限定されない。
【００１４】
＜ＩＩ＞２つ以上のリンカーユニットを有する分子構築物（ジョイント−リンカー）
他の態様において、本開示は、分子構築物に関する。少なくとも２つのリンカーユニットは、それぞれの結合基を介して互いに結合される。各リンカーユニットは、１つ以上の成分を有することができることにより、互いに結合して得られた分子構築物は、異なる機能（例えば、標的化機能、治療機能又は薬物動態学的機能）を有する成分を含み得る。この場合には、異なる機能成分の数の比率は、それぞれのリンカーユニットのペプチドコアのリンクアミノ酸残基の数を変更することにより調整することができる。
【００１５】
本開示の特定の実施形態によれば、上記分子構築物は、第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットを含む。第１リンカーユニット又は第２リンカーユニットの基本構造は、本開示の第１の態様で記載された構造と実質的に同じである。具体的には、第１リンカーユニットは、第１コア及びそれぞれ第１コアに結合された複数のリンクアーム（以下、第１リンクアーム）を含む。上記第１コアは、そのＮ末端又はＣ末端に結合された結合部分（以下、第１結合部分）を含む。上記第２リンカーユニットは、第２コア及びそれぞれ第２コアに結合された複数のリンクアーム（以下、第２リンクアーム）を含む。上記第２コアは、そのＮ末端又はＣ末端に結合された結合部分（以下、第２結合部分）を含む。第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、第１結合部分と第２結合部分の結合基の間で起きるｉＥＤＤＡ、ＳＰＡＡＣ又はＣｕＡＡＣ反応を介して互いに結合される。
【００１６】
治療の目的のために、異なる機能成分（標的化成分及びエフェクター成分）は、それぞれ第１リンクアーム及び第２リンクアームに、第１リンクアーム及び第２リンクアームとアミド結合若しくはエステル結合を形成すること、又はチオール−マレイミド反応、ＳＮ２反応、ＣｕＡＡＣ反応、ＳＰＡＡＣ反応又はｉＥＤＤＡ反応により結合され得る。
【００１７】
このような設計により、複雑な構造を有する分子構築物の合成は容易になる。このように、当業者は、それぞれ異なる機能成分を有する分子構築物のライブラリーを構築し、必要及び／又は用途に応じてこのライブラリーから２つの分子構築物（又はリンカーユニット）を選択して組み合わせることで所望な構築物を調製することができる。さらに、リンカーユニットの機能成分の数は、コアのリンクアミノ酸残基の数を調整することにより制御される。
【００１８】
＜ＩＩＩ＞疾患治療における本発明のリンカーユニット又は分子構築物の使用
本発明のリンカーユニット及び分子構築物は、いずれも様々な疾患（例えば、びまん性腫瘍及び固形腫瘍）を治療するための医薬分子の構築に適用できる。従って、本開示の別の態様によれば、本発明のリンカーユニット及び分子構築物を含む医薬組成物、本発明のリンカーユニット及び分子構築物又はそれらを含む医薬組成物を用いる疾患の治療方法、並びに疾患治療のための医薬品の調製における本発明のリンカーユニット及び分子構築物が提供される。
【００１９】
びまん性腫瘍を治療するための医薬分子を構築する際に、第１成分は、第１細胞表面タンパク質に特異的な抗体断片、例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）などであり、第２成分は、細胞毒性薬物又は第２細胞表面タンパク質に特異的な抗体断片であり得る。びまん性腫瘍を治療するための標的化成分として適用可能な第１細胞表面抗原は、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ７２ａ、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、及びＣＤ３１９を含むが、これらに限定されない。一方、エフェクター成分として適用可能な第２細胞表面抗原の非限定的な例は、ＣＤ３及びＣＤ１６ａを含む。或いは、第１細胞表面抗原及び第２細胞表面抗原は、それぞれＣＤ７９ａ及びＣＤ７９ｂである。
【００２０】
本発明のリンカーユニット及び／又は分子構築物によって治療可能なびまん性腫瘍の例は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び骨髄腫を含むが、これらに限定されない。
【００２１】
固形腫瘍を治療するための分子構築物を構築する際に、第１成分（即ち、標的化成分）は、ペプチドホルモン、成長因子及び腫瘍関連抗原に特異的な第１抗体断片から選択され得る一方、第２成分（即ち、エフェクター成分）は、細胞毒性薬物、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、放射性核種と複合体を形成したキレート剤、サイトカイン、又は第２成長因子、細胞表面抗原、ハプテン若しくはサイトカインに特異的な第２抗体断片であり得る。
【００２２】
例えば、上記ペプチドホルモンは、セクレチン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ソマトスタチン及びその類似体（例えば、オクトレオチド）、又は甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）であり得る。第１成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、変異型ＥＧＦ、エピレグリン、ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、又は肝細胞成長因子（ＨＧＦ）であり得る。腫瘍関連抗原の例示的な例は、上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ  １９−９）、糖鎖抗原１２５（ＣＡ  １２５）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１（ＭＵＣ  １）、ガングリオシドＧＤ２、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、メソセリン、ムチン関連Ｔｎ、シアリルＴｎ、グロボＨ、段階特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、及び上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）を含む。
【００２３】
びまん性腫瘍又は固形腫瘍を治療するためのリンカーユニット又は分子構築物に適用される細胞毒性薬物は、メルタンシン、オーリスタチン、メイタンシン、ドキソルビシン、カリケアマイシン及びカンプトテシンを含むが、これらに限定されない。非限定的なＴＬＲアゴニストは、リポ多糖（ＬＰＳ）、モノホスホリル脂質Ａ、モトリモード、イミキモッド、レスキモッド、ガリコイモッド、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＤＯＮ）、リポテイコ酸、β−グルカン、及びザイモサンを含む。キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−四酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４，７−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７−トリアザシクロノナン−１，４−二酢酸（ＮＯＤＡ）、及びジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）からなる群から選択される。放射性核種は、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、又は１７７Ｌｕである。サイトカインは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β又は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）からなる群から選択され得る。第２抗体断片によって特異的に識別及び結合可能な第２成長因子は、ＥＧＦ、変異型ＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ｂＦＧＦ又はＨＧＦであり得る。第２抗体断片によって特異的に識別及び結合可能な細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４又はＣＤ１５２）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１又はＣＤ２７９）、及びプログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１又はＣＤ２７４）からなる群から選択され得る。第２抗体断片によって特異的に識別及び結合可能なサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αからなる群から選択され得る。これらの場合において、第２抗体断片は、非中和抗体断片である。ハプテンは、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、トリニトロフェノール（ＴＮＰ）、及びＷＡＤＷＰＧＰＰ（配列番号２３）のアミノ酸配列を有する短いペプチドからなる群から選択され得る。
【００２４】
本発明のリンカーユニット及び／又は分子構築物によって治療可能な例示的な固形腫瘍は、メラノーマ、食道がん、胃がん、脳腫瘍、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、乳がん、膵臓がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、腎がん、肝細胞がん、卵巣がん、前立腺がん、甲状腺がん、精巣がん、及び頭頸部扁平上皮がんを含む。
【００２５】
本開示の付随する特徴及び利点の多くは、添付の図面に関連して考慮される以下の詳細な説明を参照してよりよく理解されるようになる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
本発明は、以下に簡単に説明する添付図面に照らして読まれた以下の詳細な説明からよりよく理解されるであろう。
【図１Ａ−１Ｈ】本開示の特定の実施形態に係るコアを説明する模式図である。
【図２Ａ−２Ｆ】本開示の特定の実施形態に係るリンカーユニットを説明する模式図である。
【図３Ａ−３Ｃ】本開示のいくつかの実施形態に係る機能成分が結合されたリンカーユニットを説明する模式図である。
【図４Ａ−４Ｃ】本開示のいくつかの実施形態に係る異なる機能成分を含むリンカーユニットを説明する模式図である。
【図５Ａ−５Ｃ】本開示のいくつかの実施形態に係る分子構築物を説明する模式図である。
【図６】本開示のいくつかの実施形態に係る分子構築物を説明する模式図である。
【図７】本開示の種々の実施形態に係る３つのリンカーユニットを含む分子構築物を示す模式図である。
【図８Ａ−８Ｂ】本開示の実施例１に係るノルボルネン修飾ペプチド４のＨＰＬＣ及び質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図９Ａ−９Ｂ】本開示の実施例２に係るアジド修飾ペプチド５のＨＰＬＣ及び質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図１０Ａ−１０Ｂ】本開示の実施例３に係るＤＢＣＯ修飾ペプチド７のＨＰＬＣ及び質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図１１Ａ−１１Ｂ】それぞれ本開示の実施例３に係るアルキン修飾ペプチド９及びアジド修飾ペプチド１０の分析結果を示す。
【図１２Ａ−１２Ｂ】それぞれ本開示の実施例５及び６に係るＣＣＫ８含有ペプチド及びＣＣ８含有リンクアームの質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図１３Ａ−１３Ｂ】本開示の実施例８に係る特定のコア及びリンクアームを含むリンカーユニットの質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図１４】本開示の実施例９に係る特定のコア及びリンクアームを含むリンカーユニットの質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図１５】本開示の実施例１０に係る特定のコア及びリンクアームを含むリンカーユニットの質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図１６】本開示の実施例１２に係るマレイミド修飾リンクアームを有するアルキン含有リンカーユニットの逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図１７】本開示の実施例１２に係るリンカーユニットの質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図１８】本開示の実施例１４に係る５つの細胞毒性薬物を含むリンカーユニットの逆相ＨＰＬＣ分析の結果を示す。
【図１９】本開示の実施例１５に係る５つの細胞毒性薬物を含むリンカーユニットの逆相ＨＰＬＣの結果を示す。
【図２０】本開示の実施例１５に係る５つの細胞毒性薬物を含むリンカーユニットの質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図２１】本開示の実施例１６に係るＣＣＫ８を標的化成分として含むリンカーユニットの逆相ＨＰＬＣの結果を示す。
【図２２】本開示の実施例１６に係るＣＣＫ８を標的化成分として含むリンカーユニットの質量分析法ＥＳＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図２３Ａ−２３Ｃ】それぞれ本開示の実施例１７−１９に係る特定のｓｃＦｖの純度及びそのＴ細胞に対する結合親和性を示す。
【図２４】本開示の実施例２０に係るＤＢＣＯ結合抗ＣＤ３  ｓｃＦｖのフローサイトメトリー分析のデータである。
【図２５】本開示の実施例２２に係るリンカーユニット及び分子構築物の質量分析の結果を示す。
【図２６Ａ−２６Ｂ】本開示の実施例２３に係るリンカーユニットの質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析の結果を示す。
【図２７】本開示の実施例２５に係る腫瘍細胞に対する５つの細胞毒性薬物を含むリンカーユニットの細胞毒性効果の結果を示す。
【００２７】
一般的な実施に従って、説明された種々の特徴／要素は、縮尺通りに描かれておらず、代わりに、本発明に関連する特定の特徴／要素を最もよく例示するために描かれている。また、種々の図面における同様の参照番号及び名称は、同様の要素／部品を示すために使用される。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明として意図されており、本実施例が構築又は利用され得る唯一の形態を表すものではない。この説明は、この実施例の機能と、この実施例を構成し動作させるための一連のステップを示す。しかし、同じ又は同等の機能及び順序は、異なる実施例によって達成されてもよい。
【００２９】
便宜上、本明細書、実施例及び添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語をここに集める。本明細書中で他に定義されない限り、本開示において使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解され使用される意味を有するものとする。
【００３０】
文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は複数の形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。具体的には、本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、文脈が明らかに他に示されない限り、単数形「ａ」及び「ａｎ」は複数の言及を含む。また、本明細書及び特許請求の範囲で使用する「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」という用語は、同じ意味を有し、１，２，３又はそれ以上を含む。同様に、「少なくとも２」という用語は、２、３、４、又はそれ以上を含む。さらに、「Ａ、Ｂ及び／又はＣの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ又はＣの少なくとも１つ」、及び「Ａ、Ｂ及び／又はＣの少なくとも１つ」という表現は、本明細書及び特許請求の範囲で使用されるように、Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、ＡとＢ、ＢとＣ、ＡとＣ、及びＡとＢとＣ、をカバーすることを意図している。
【００３１】
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメータが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は可能な限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も本質的に、各試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含む。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の１０％、５％、１％又は０．５％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合、許容可能な標準誤差内にあることを意味する。操作例／実施例以外で、又は特に明記しない限り、本明細書中に開示される材料の量、時間、温度、操作条件、量の比などについての、数値範囲、量、値及びパーセンテージの全てが、すべての場合において、用語「約」により修飾されているものと理解されるべきである。したがって、反対に示されない限り、本開示及び添付の請求項に記載される数値パラメータは、所望に応じて変化することのできる近似値である。少なくとも、各数値パラメータは、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。範囲は、本明細書では、１つのエンドポイントから別のエンドポイントまで、又は２つのエンドポイント間で表現することができる。特に明記しない限り、本明細書中に開示される全ての範囲は、エンドポイントを包含する。
【００３２】
本開示は、一般に分子構築物に関する。各分子構築物は、標的化成分（Ｔ）及びエフェクター成分（Ｅ）を含む。本明細書において、これらの分子構築物は、「Ｔ−Ｅ分子」、「Ｔ−Ｅ医薬品」又は「Ｔ−Ｅ薬物」と呼ばれる場合がある。
本明細書において、用語「標的化成分」とは、対象となる標的（例えば、細胞表面上の受容体、又は組織内のタンパク質）に直接的又は間接的に結合することにより、本発明の分子構築物の対象となる標的への輸送を容易にする分子構築物の部分を指す。いくつかの例において、標的化成分は、分子構築物を標的細胞の近傍に誘導する。他の場合には、標的化成分は、標的細胞表面に存在する分子、又は細胞表面に存在する分子に特異的に結合する第２分子に特異的に結合する。いくつかの場合において、標的化成分は、対象となる標的に結合されると、本発明の分子構築物とともに内部に移行することができることにより、標的細胞の細胞基質に移転される。標的化成分は、細胞表面の受容体に対する抗体若しくはリガンドであり得るか、又は、そのような抗体若しくはリガンドに結合する分子であることで、本発明の分子構築物を標的部位（例えば、選択した細胞の表面）に標的化してもよい。標的化機能を有しない治療薬に比べて、本発明の分子構築物は、疾患部位でのエフェクター（治療剤）の局在化を強化でき、又は該局在化に有利である。上記局在化は、程度又は相対的な割合をいい、疾患部位へのエフェクターの全体的又は完全な局在化を意味しない。
【００３３】
本発明によれば、用語「エフェクター成分」とは、分子構築物が標的部位に誘導されると、生物学的活性（例えば、免疫活動の誘発又は抑制、細胞毒性効果の発揮、酵素の阻害等を含む）又は他の機能的活性（例えば、免疫細胞又は他の治療分子の動員）を誘発する分子構築物の部分を意味する。「エフェクト」は、治療的又は診断的であり得る。エフェクター成分は、細胞、及び／又は、細胞外免疫調節因子に結合するものを包含する。エフェクター成分は、タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、糖ペプチド、薬物部分（小分子薬物及び生物製剤の両方）、化合物、元素、及び同位体、並びにそれらの断片等の薬剤を含む。
使用される第１、第２、第３等の用語は、本明細書において、種々の成分、構成要素、領域、及び／又は、セクションを説明するために使用することができるが、これらの成分（並びに、構成要素、領域、及び／又は、セクション）は、これらの用語によって制限されない。また、そのような順序番号の使用は、文脈によって明白に示されない限り、順番や順序を意味するものではない。むしろ、これらの用語は、単にある要素を別の要素と区別するために使用される。従って、以下に説明する第１成分は、例示的な実施形態の教示から逸脱することなく、第２成分と呼ぶことができる。
【００３４】
ここで、用語「リンク」、「カップル」及び「接合」は、交換可能に使用され、直接結合又は間接結合により２つの要素を結合することを指すものである。
ここで使用される用語「ポリペプチド」とは、少なくとも２つのアミノ酸残基を有するポリマーを意味する。典型的には、ポリペプチドは、２〜約２００残基、好ましくは２〜５０残基の長さのアミノ酸残基を含む。本明細書でいうアミノ酸配列は、該配列の、Ｌ−、Ｄ−、又はβ−アミノ酸の構成を含む。ポリペプチドは、アミノ酸ポリマーも含む。該アミノ酸ポリマーにおいて、１つ又は複数のアミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸に対応する人工化学類似体、又は天然に存在するアミノ酸ポリマーである。さらに、該用語は、ペプチド結合、又は他の「修飾された結合」、例えば、ペプチド結合がα−エステル、β−エステル、チオアミド、ホスホンアミド、カーボネート、ヒドロキシレート等に置換されたものにより結合されたアミノ酸に適用される。
【００３５】
特定の実施形態において、本明細書に記載された配列を含むアミノ酸の保存的置換も含まれる。種々の実施形態において、１、２、３、４、又は５つの異なる残基が置換される。用語「保存的置換」とは、アミノ酸の置換が分子の活性（例えば、生物学的若しくは機能的活性、及び／又は、特異性）を実質的に変更しないことをいう。典型的には、保存的アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、類似の化学的性質（例えば、電荷又は疎水性）を有する他アミノ酸で置換することである。ある保存的置換は、標準アミノ酸が親残基と僅かに異なる非標準アミノ酸（例えば、希アミノ酸、合成アミノ酸等）に置換された「類似体置換」を含む。アミノ酸類似体は、親アミノ酸の構造を大幅に変化させず、標準アミノ酸から合成的に得ることができ、異性体、又は代謝産物前駆体である。本発明において、（１）側鎖にアミン基を含むリジン、（２）側鎖にチオール基を含むシステイン、（３）側鎖にヒドロキシル基を含むセリン及びスレオニン、並びに（４）側鎖にカルボキシル基を含むアスパラギン酸及びグルタミン酸のアミノ酸残基は、４つの独特のアミノ酸グレープであると考えられる。これらの４つのアミノ酸のグループは、それぞれの側鎖に様々な化学成分に結合するためのユニークな官能基を含む。側鎖に同じ官能基を含む非天然アミノ酸を使用することにより、類似する目的を達成することができる。
【００３６】
特定の実施形態において、本明細書に記載されている配列のいずれかと少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％又は９０％、より好ましくは少なくとも９５％又は９８％の配列同一性を有するポリペプチドも含む。
本明細書でいうポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」は、特定のポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列におけるポリペプチド残基のパーセンテージとして定義される。上記配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入することにより、最大パーセント配列同一性が得られる。なお、保存的置換は、配列同一性の一部として考慮されていない。配列同一性パーセンテージを決定するためのアライメントは、当分野内の様々な方法、例えば、公然に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ又はガリン（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアにより達成することができる。当業者であれば、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。上記パラメータは、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要である任意のアルゴリズムを含む。本明細書の目的を達成するために、２つのポリペプチド配列間の配列比較は、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）によってオンラインで提供されるコンピュータプログラムＢｌａｓｔｐ（タンパク質−タンパク質ＢＬＡＳＴ）により実施される。所与のポリペプチド配列Ｂに対する所与のポリペプチド配列Ａのアミノ酸配列同一性パーセンテージ（本明細書において、所与のポリペプチド配列Ｂと特定の％アミノ酸配列同一性を有する所与のポリペプチド配列Ａとも呼ばれる）は、以下の式により計算される。
2020510097.tif 000003
ここで、Ｘは、配列アライメントプログラムＢＬＡＳＴにより、配列Ａ、Ｂをアライメントすることで同一のマッチとして得られたアミノ酸残基の数である。Ｙは、配列Ａ又はＢのいずれか短い方のアミノ酸残基の総数である。
本明細書で使用される用語「ＰＥＧ化アミノ酸」は、１つのアミン基及び１つのカルボキシル基を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である。一般的には、ＰＥＧ化アミノ酸の一般式は、ＮＨ２−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＯＯＨである。本開示において、ｎの値は、１〜２０、好ましくは、２〜１２である。
【００３７】
本明細書において、用語「結合部分」は、１つ以上の官能基を含む分子をいい、上記官能基は、化学反応性を有し、他の化学単位に共有結合できる。上記官能基の非限定的な例は、ヒドロキシル基、カルボニル基、カルボキシル基、チオール基、アミン基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基（ＴＢＤＭＳ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）、マレイミド基、ビニルスルホン基、モノスルホン基、メチルスルホニルベンゾチアゾール基、ヨード基、ヨードアセトアミド基、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基及びシクロオクチン基を含む。本開示の実施形態によれば、本発明のリンカーユニットの結合部分は、２つの官能基を含む。１つの官能基は、アミド結合を形成することでα−アミン又はスペーサーのカルボキシル基に結合されることにより、結合部分をスペーサーのＮ末端又はＣ末端に結合させるカルボキシル基又はアミン基であり、もう１つの官能基は、ＣｕＡＡＣ、ｉＥＤＤＡ又はＳＰＡＡＣ反応により成分又は他のリンカーユニットに結合されるアジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基又はシクロオクチン基である。
【００３８】
本明細書において、ポリペプチドについては、用語「末端」は、ポリペプチドのＮ端又はＣ端にあるアミノ酸残基を指す。ポリマーについては、用語「末端」は、ポリマー（例えば、本開示のポリエチレングリコール）におけるポリマー骨格の端に位置する構成単位を指す。本明細書及び特許請求の範囲において、用語「遊離末端」は、他の分子に化学的に結合していない末端アミノ酸残基又は構成単位を指す。
【００３９】
本明細書において、用語「抗原」又は「Ａｇ」は、互換的に使用され、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答は、分泌性、体液性、及び／又は、細胞性抗原−特異的応答を含む。本開示において、用語「抗原」は、タンパク質、ポリペプチド（その変異型又は生物学的活性断片を含む）、多糖類、糖タンパク質、糖脂質、核酸、又はそれらの組合せでありえる。
本明細書及び特許請求の範囲において、用語「抗体」は最も広い意味で使用され、完全に集合した抗体、抗原に結合する抗体断片、例えば、抗原結合断片（Ｆａｂ／Ｆａｂ'）、Ｆ（ａｂ'）２断片（互いにジスルフィド結合により結合された２つの抗原結合Ｆａｂ部分を有する）、可変断片（Ｆｖ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、二重特異的性一本鎖可変領域断片（ｂｉ−ｓｃＦｖ）、ナノボディ（単一ドメイン抗体、ｓｄＡｂとも呼ばれる）、ユニボディ及びダイアボディを包含する。「抗体断片」は、完全抗体の一部、好ましくは、完全抗体の抗原結合領域又は可変領域を含む。典型的には、「抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又は免疫グロブリン遺伝子の断片により実質的にコードされる１つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。よく知られている免疫グロブリン遺伝子には、カッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びミュー定常領域遺伝子、並びに、ミリアド免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、カッパ又はラムダに分類される。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタ、又はイプシロンに分類される。これにより、免疫グロブリン：ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥをそれぞれ定義する。典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体である。各四量体は、２つの同一の１対のポリペプチド鎖から構成され、各１対のポリペプチド鎖は、１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（約５０−７０ｋＤａ）を含む。各鎖のＮ末端は、抗原認識主に関与する約１００〜１１０又はそれ以上のアミノ酸を含む可変領域を定義する。用語可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）は、それぞれ上述した軽鎖及び重鎖を指す。本開示の実施形態によれば、抗体断片は、天然抗体を改変することによって、又は組換えＤＮＡ技術を使用して新規合成によって調製され得る。本開示の特定の実施形態において、抗体、及び／又は、抗体断片は、二重特異性であり得、且つ様々な構造であり得る。例えば、二重特異性抗体は、２つの異なる抗原結合部位（可変領域）を含み得る。種々の実施形態において、二重特異性抗体は、ハイブリドーマ技術又は組換えＤＮＡ技術によって調製されることができる。特定の実施形態において、二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対し結合特異性を有する。抗体断片を使用する多くの分子構成において、抗体断片の代わりに、抗体と同様に抗原と特異的に結合することができる抗体ミメティックを使用することができる。抗体ミメティックは、アンチカリン、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、フィロマー、アンキリン、アビマーなどを含む。
2020510097.tif 000004
【００４０】
本明細書において、用語「治療」は、予防的（例えば、予防薬）、治癒的又は緩和的治療を含む。本明細書で使用される「治療」行為も、予防的（例えば、予防薬）、治癒的又は緩和的治療を含む。特に、本明細書において、用語「治療」は、本発明の分子構築物又はそれを含む医薬組成物を、症状、症状に関連した病状、症状に関連した二次的な疾患若しくは障害、又は症状を引き起こす素因を有する被験体に、上記特定の疾患、障害及び／又は症状の１つ以上の病状又は特徴の、部分的若しくは完全な緩和、改善、軽減、発症の遅延、進行の阻害、重症度の軽減、及び／又は、罹患率の低減を達成する目的で、適用又は投与することを指す。治療は、疾患、障害及び／又は症状の徴候を示していない被験体、及び／又は、疾患、障害及び／又は症状の初期徴候のみを示す被験体にも、疾患、障害及び／又は症状に関連した病理学変化の発展リスクを減少させる目的で施すことができる。
【００４１】
本明細書において、用語「有効量」とは、所望の治療応答を生じるのに十分な本発明の分子構築物の量を指す。薬剤の有効量は、疾患又は症状を治癒する必要はないが、疾患若しくは症状の発症を遅延、妨害又は予防し、又は疾患若しくは症状を緩和し、疾患若しくは症状を治療することができる。有効量は、適切な投薬形態で１回、２回又はそれ以上の用量に分割されることで、所定の期間内で１回、２回又はそれ以上で投与されることができる。具体的な有効量又は十分量は、処置される特定の病状、患者の身体的条件（例えば、患者の体重、年齢、又は性別）、治療を受けている被験体のタイプ、治療期間、併用療法の性質（存在する場合）、採用される特定の処方、化合物の構造又はその誘導体などの要因によって変化する。有効量は、例えば、有効成分の総質量（例えば、グラム、ミリグラム又はマイクログラム）、又は体重に対する活性成分の質量比、例えば、ミリグラム／キログラム（ｍｇ／ｋｇ）として表すことができる。
用語「適用」及び「投与」は、本明細書において互換的に使用され、本発明の分子構築物又は医薬組成物を、治療を必要とする被検体に適用することを意味する。
【００４２】
用語「被験体」及び「患者」は、本明細書では互換的に使用され、本発明の分子構築物、医薬組成物及び／又は方法によって治療可能な人類を含む動物を意味する。用語「被験体」又は「患者」は、１つの性別が特定されていない限り、オスとメスの両方の性別を指すことが意図される。従って、用語「被験体」又は「患者」は、本開示の治療方法から利益を得ることができる任意の哺乳動物を含む。「被験体」又は「患者」の例は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及びニワトリを含むがこれらに限定されない。例示的な実施形態において、患者はヒトである。用語「哺乳動物」は、ヒト、霊長類、家畜、及び、農場動物、例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ又は牛；動物園、スポーツ又はペット動物；及びマウス及びラットのようなげっ歯類を含む哺乳綱のすべてのメンバーを指す。用語「非ヒト哺乳動物」は、ヒト以外の哺乳綱のすべてのメンバーを指す。
本開示は、少なくとも、Ｔ-Ｅ医薬品の構築に基づいている。このようなＴ-Ｅ医薬品は、標的細胞、標的組織又は器官に、血液循環、リンパ系、及び他の細胞、組織又は器官よりも相対的に高い割合で送達できる。この場合に、医薬品の治療効果は増加する一方、副作用及び毒性の範囲、重症度は低下する。標的成分を含まない形態よりも低い用量でＴ−Ｅ分子の形態で治療エフェクターを投与することもできる。従って、より低い投薬量で治療エフェクターを投与しても、効力を失うことなく、副作用及び毒性を低下させることができる。
【００４３】
パートＩ：マルチアームリンカーの新規設計
Ｉ−（ｉ）：マルチアームリンカーの新規形態
本開示の第１態様は、（１）複数のリンクアミノ酸残基を含むコア、及び（２）それぞれ上記コアのリンクアミノ酸残基に結合された複数のリンクアームを含むマルチアームリンカーユニットに関する。本発明のコアは、そのＮ及び／又はＣ末端に結合された１つ又は２つの結合部分を有することを特徴とする。本開示の実施形態によれば、上記結合部分は、機能成分（例えば、標的化成分、治療エフェクター成分又は薬物動態学的特性を改善する成分）を上記コアに結合させて本発明のリンカーユニットの治療効果を改善するのに有用である。
【００４４】
上記コアは、３−１２０アミノ酸残基の長さを有するポリペプチドであり、少なくとも２つのリンクアミノ酸残基（それぞれ独立してリジン（Ｋ）、アスパラギン酸（Ｄ）及び／又はグルタミン酸（Ｅ）残基である）を含む。例えば、本発明のコアは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又はそれ以上のＫ、Ｄ及び／又はＥ残基を含み得る。好ましくは、本発明のコアは、２から２０のＫ残基、又は２から２０のＤ及び／若しくはＥ残基を含む。理解され得るように、上記リンクアミノ酸残基は、側鎖にアミン基又はカルボキシル基を有する非天然アミノ酸残基であり得る。実施形態によれば、任意の２つのリンクアミノ酸残基は、互いに隣接していてもよいが、スペーサーによって分離されていてもよい。
【００４５】
本開示の実施形態によれば、上記ペプチドコアは、少なくとも（即ち、１、２、３又はそれ以上）のスペーサーを含む。特定の実施形態において、１つのスペーサーは、ポリペプチドのＮ末端から始まる最初のリンクアミノ酸残基のＮ末端に結合される。以下の説明では、このようなスペーサーは、コアのＮ末端に配置されているため、Ｎ末端スペーサーと呼ばれることがある。追加又は代替として、１つのスペーサーは、ポリペプチドのＮ末端始まる最後のリンクアミノ酸残基のＣ末端に結合される。同様に、このようなスペーサーは、コアのＣ末端に配置されているため、以下にＣ末端スペーサーと呼ばれることもある。
【００４６】
一般的には、上記スペーサーは、（１）リンクアミノ酸残基以外の単一のアミノ酸残基、（２）リンクアミノ酸残基以外の２〜２０（即ち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０）のアミノ酸残基のペプチド、又は（３）２〜１２のＥＧ単位（即ち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２のＥＧ単位）を有するＰＥＧ化アミノ酸であり得る。具体的には、本発明のコアが複数のＫ残基を含む場合、上記スペーサーは、２〜１２のＥＧ単位を有するＰＥＧ化アミノ酸、又は１−１２の非Ｋアミノ酸残基を含み得る。ここで、上記非Ｋアミノ酸残基は、それぞれグリシン（Ｇ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、スレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、プロリン（Ｐ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）残基からなる群より選択される。好ましくは、上記非Ｋアミノ酸残基は、それぞれＧ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ及びＷ残基からなる群より選択される。より好ましくは、上記非Ｋアミノ酸残基は、それぞれＧ及び／又はＳ残基である。或いは、本発明のコアが複数のＤ／Ｅ残基を含む場合、スペーサーは、２〜１２のＥＧ単位を有するＰＥＧ化アミノ酸、又は１−１２の非Ｄ／Ｅアミノ酸残基を含み得る。ここで、上記非Ｄ／Ｅアミノ酸残基は、それぞれＫ、Ｇ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ及びＷ残基からなる群より選択される。好ましくは、上記非Ｄ／Ｅアミノ酸残基は、それぞれＧ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ及びＷ残基からなる群より選択される。より好ましくは、上記非Ｄ／Ｅアミノ酸残基は、それぞれＧ及び／又はＳ残基である。
【００４７】
理解され得るように、本発明のコアが複数のスペーサーを含む場合、各スペーサーは同じでも異なっていてもよい。即ち、スペーサーは、それぞれ同じ若しくは異なるアミノ酸配列及び／又はＥＧ単位を含み得る。本開示の実施形態によれば、本発明のコアは、３つのスペーサーを含み、そのうちの１つのスペーサーは、８つのＥＧ繰り返し単位を有するＰＥＧ化アミノ酸であり、他の２つのスペーサーは、それぞれ１つのＳ残基及び１つのＧ残基である。本開示の他の実施形態によれば、本発明のコアは、５つのスペーサーを含み、そのうちの１つのスペーサーは、４つのＧ残基及び２つのＳ残基から構成される一方、他の４つのスペーサーは、それぞれ１つのＧ及び１つのＳ残基から構成される。本開示のさらなる他の実施形態によれば、本発明のコアは、それぞれ４つのＥＧ繰り返し単位を有するＰＥＧ化アミノ酸である５つのスペーサーを含む。
【００４８】
本発明のリンカーユニットの調製において、アミン−反応基（例えば、スクシンイミジルエステル基、ＴＦＰエステル基又はカルボキシル基）又はカルボキシル−反応基（例えば、アミン基）を有するペプチド又はＰＥＧ鎖は、本発明のコアのリンクアミノ酸残基（即ち、Ｋ、Ｄ及び／又はＥ残基）に結合される。より具体的には、一方の末端にアミン−反応基を有し、他方の末端に官能基を有するペプチド又はＰＥＧ鎖は、ペプチド／ＰＥＧ鎖のアミン−反応基とＫ残基のアミン基との間でアミド結合を形成することにより本発明のコアのＫ残基に結合することができる。スクシンイミジルエステルは、ＮＨＳエステルであってもよい。或いは、一方の末端にカルボキシル−反応基を有し、他方の末端に官能基を有するペプチド又はＰＥＧ鎖は、ペプチド又はＰＥＧ鎖のアミン基とＤ残基又はＥ残基のカルボキシル基との間でアミド結合を形成することにより本発明のコアのＤ残基又はＥ残基のカルボキシル基に結合することができる。本開示において、リンクアミノ酸残基に結合されたペプチド又はＰＥＧ鎖は、リンクアームと呼ばれ、その遊離末端（即ち、コアのリンクアミノ酸残基に結合されていない末端）に官能基を有する。一般的には、上記官能基は、アミン、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ＴＢＤＭＳ、ＮＨＳ、マレイミド基、ビニルスルホン基、モノスルホン基、メチルスルホニルベンゾチアゾール基、ヨード基、ヨードアセトアミド基、アジド基、アルキン基、シクロオクチン基、テトラジン基及びシクロオクテン基からなる群より選択される。ここで、上記テトラジン基は、１，２，３，４−テトラジン、１，２，３，５−テトラジン、１，２，４，５−テトラジン又はそれらの誘導体である。上記シクロオクテン基は、ノルボルネン基又はトランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）基である。上記シクロオクチン基は、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）基、ジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ）基、ビシクロノニン（ＢＣＮ）基及びジベンゾアザシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ又はＤＢＣＯ）基からなる群より選択される。本開示の一実施形態によれば、上記テトラジン基は、６−メチル−テトラジンである。
【００４９】
本開示のいくつかの実施形態によれば、上記リンクアームは、リンクアミノ酸残基以外の２〜１２（即ち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２）のアミノ酸残基（それぞれは、天然又は非天然アミノ酸残基であってもよい）を含むペプチドである。特定の実施形態において、本発明のコアは、複数のＫ残基を含み、リンクアームは、２〜１２の非Ｋアミノ酸残基（即ち、独立してＧ、Ｅ、Ｄ、Ｓ、Ｒ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｐ、Ａ、Ｖ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｆ、Ｙ及びＷ残基からなる群より選択される上記アミノ酸残基）を含むペプチドである。一実施例によれば、本発明のコアは、複数のＫ残基を含み、リンクアームは、独立してＧ、Ｓ、Ｅ及びＲ残基からなる群より選択される５−１０のアミノ酸残基を含むペプチドである。或いは、上記リンクアームは、２〜２４（即ち、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３又は２４）のＥＧ繰り返し単位、好ましくは５〜１５個のＥＧの繰り返し単位、より好ましくは６〜１２個のＥＧの繰り返し単位を有するＰＥＧ鎖であり得る。理解され得るように、上記リンクアームのペプチド又はＰＥＧ鎖は、ほぼ同じ長さのポリマーで置換されてもよい。炭水化物又は他の親水性ビルディングブロックを含むポリマーは、リンクアームとして適用できる。
【００５０】
本開示の実施形態によれば、少なくとも１つの結合部分は、Ｎ末端スペーサーのα−アミン基及び／又はＣ末端スペーサーのカルボキシル基に結合される。結合部分は、アミノ酸残基であってはならない。アミノ酸残基は、アミン基及びカルボキシレート基の両方を含み、これらの基は、ペプチドコアとペプチド結合を形成する際に互いに干渉するためである。
【００５１】
具体的には、本発明のリンカーユニットの結合部分は、一方の末端にアミン−反応基（例えば、カルボキシル又は塩化カルボニル基）又はカルボキシル−反応基（例えば、アミン基又はヒドラジン基）を有し、他方の末端に結合基を有する。上記結合基は、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基及びシクロオクチン基からなる群より選択される（その例示的な例については上記を参照）。本開示のいくつかの実施形態によれば、１つのスペーサーは、Ｎ末端スペーサーである。これらの実施形態において、結合部分は、カルボキシル基を有するため、結合部分のカルボキシル基とＮ末端スペーサーのα−アミン基との間でアミド結合を形成することでＮ末端スペーサーのα−アミン基に結合することができる。本開示の特定の実施形態によれば、１つのスペーサーは、Ｃ末端スペーサーである。これらの実施形態において、結合部分は、アミン基を有するため、結合部分のアミン基とＣ末端スペーサーのカルボキシル基との間でアミド結合を形成することでＣ末端スペーサーのカルボキシル基に結合することができる。これらの場合において、コアがＮ末端スペーサー及びＣ末端スペーサーの両方を有するため、コアは、２つの結合部分を有し、そのうち、１つの結合部分がＮ末端スペーサーのα−アミン基に結合され、もう１つの結合部分がＣ末端スペーサーのカルボキシル基に結合される。これによって、コアに結合された結合部分は、その遊離末端（即ち、コアに結合されていない末端）に結合基を有する。
【００５２】
必要に応じて、結合部分は、カルボキシル基又はアミン基と結合基との間に配置された２〜１０（即ち、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）個のＥＧの繰り返し単位を有するＰＥＧ鎖をさらに含む。例えば、上記ＰＥＧ鎖は、４、６、７又は８個のＥＧの繰り返し単位を有し得る。
【００５３】
理解され得るように、上記コアに２つの結合部分が結合されている場合、その結合基は、同じでも異なっていてもよい。好ましくは、２つの結合基は異なる。好ましい実施例において、１つの結合基は、アジド基、アルキン基又はシクロオクチン基であり、もう１つの結合基は、テトラジン基又はシクロオクテン基である。
【００５４】
好ましくは、結合部分の結合基がアジド基、アルキン基又はシクロオクチン基である場合、リンクアームの官能基は、テトラジン基又はシクロオクテン基である一方、結合部分の結合基がテトラジン又はシクロオクテン基である場合、リンクアームの官能基は、アジド基、アルキン基又はシクロオクチン基である。上記リンカーユニットがそれぞれＮ末端及びＣ末端スペーサーに結合された２つの結合部分を有する場合、上記リンクアームの官能基は、好ましくはマレイミド基、ビニルスルホン基、モノスルホン基、ヨード基又はヨードアセトアミド基であり、２つの結合部分のうちの１つの結合基は、アジド基、アルキン基又はシクロオクチン基であり、もう１つの結合部分の結合基は、テトラジン基又はシクロオクテン基である。
【００５５】
図１Ａから１Ｅに示すように、コア１０ａ、１０ｂ、１０ｃ、１０ｄ及び１０ｅのいずれにも結合部分が結合されている。図１Ａから１Ｄでは、それぞれテトラジン基、ＴＣＯ基、アジド基、及びアルキン基を有する結合部分は、コア１０ａ、１０ｂ、１０ｃ及び１０ｄのＮ末端スペーサーのα−アミン基に結合される。図１Ｅは、保護基とするアセチル基がペプチドコア１０ｅのスペーサーのα−アミン基に結合される一方、ＤＢＣＯ基（結合基として）を有する結合部分がコア１０ｅのＣ末端スペーサーのカルボキシル基に結合される代替例を提供する。
【００５６】
本開示のいくつかの実施形態において、上記コアは、２つの結合基を含む。図１Ｆは、それぞれテトラジン基及びＤＢＣＯ基を有する結合部分がペプチドコア１０ｆのＮ末端スペーサーのα−アミン基及びＣ末端スペーサーのカルボキシル基に結合される例を示す。図１Ｇは、それぞれＴＣＯ基及びＤＢＣＯ基を有する結合部分がペプチドコア１０ｇのＮ末端スペーサーのα−アミン基及びＣ末端スペーサーのカルボキシル基に結合される他の例を提供する。別の例では、ペプチドコア１０ｈのＮ末端スペーサーのα−アミン基及びＣ末端スペーサーのカルボキシル基は、それぞれアルキン基を有する結合部分及びＤＢＣＯ基を有する結合部分に結合される。
【００５７】
スキーム１−３は、１つ又は２つの上記結合部分が結合したコアの合成例を提供する。
【００５８】
＜＜スキーム１：Ｎ末端にテトラジン基又はＴＣＯ基が結合されたコアの調製＞＞
2020510097.tif 000005
＜＜スキーム２：Ｃ末端にＤＢＣＯ基が結合されたコアの調製＞＞
2020510097.tif 000006
＜＜スキーム３：Ｎ末端及びＣ末端にそれぞれ結合部分が結合されたコアの調製＞＞
2020510097.tif 000007
ＰＥＧ化アミノ酸をスペーサーとして用いるペプチドコアの合成では、Ｇ残基及びＳ残基のような通常のアミノ酸を用いる場合よりもステップが少ない。さらに、様々な長さ（即ち、エチレングリコールの繰り返し単位の数）のＰＥＧ化アミノ酸を使用することにより、可溶性及びＫ残基の隣接するアミノ基間の間隔を柔軟に提供することができる。ＰＥＧ化アミノ酸に加えて、上記コアは、Ｄ型アミノ酸、ホモアミノ酸、Ｎ−メチルアミノ酸などの人工アミノ酸を含むように構築されてもよい。好ましくは、様々な長さのＰＥＧを有するＰＥＧ化アミノ酸は、上記コアの構築に用いられる。これは、アミノ酸分子に含まれるＰＥＧ部分は、配座的柔軟性及び結合基間の適切な間隔を提供し、水溶性を向上でき、一般に免疫原性が弱いためである。ＰＥＧ化アミノ酸含有コアの合成は、通常のポリペプチドの合成プロセスと類似している。
【００５９】
安定性の目的のために、上記コアのＮ末端は、結合部分と結合していない場合、アセチル基と結合していることが好ましい。
【００６０】
理解され得るように、上記コアに結合されたリンクアームの数は、主にコアに含まれるリンクアミノ酸残基（即ち、Ｋ、Ｄ及び／又はＥ残基）の数によって決定される。本発明のコアに少なくとも２つのリンクアミノ酸残基が含まれるため、本発明のリンカーユニットは、複数のリンクアームを含み得る。
【００６１】
図２Ａに示すように、リンカーユニット２０Ａは、隣接する２つのＫ残基及び第１のＫ残基のＮ末端に結合されたスペーサー２１０（即ち、「Ｎ末端スペーサー」）を有するコアを含む。カルボキシル基２３０及びシクロオクテン基２４０を有する結合部分は、結合部分のカルボキシル基２３０とスペーサー２１０のα−アミン基の間でアミド結合を形成することによりスペーサー２１０のα−アミン基に結合される。この例では、２つのリンクアーム２２０ａ、２２０ｂはそれぞれ独立してＫ残基に結合される。以下に述べるように、リンクアームの遊離末端（即ち、Ｋ残基に結合されていない末端）は、機能成分との結合に有用であり、コアのＮ末端にあるシクロオクテン基２４０は、追加の機能成分又は他のリンカーユニットとの結合を可能にする。
【００６２】
図２Ｂは、本発明のリンカーユニットの代替例を提供する。図２Ｂにおいて、リンカーユニット２０Ｂは、４つのＫ残基及びそれぞれ４つのＫ残基に結合された４つのリンクアーム２２０ａ−２２０ｄを含む。第１及び第２のＫ残基は、それらの間でアミド結合を形成することで結合され、第２、第３及び第４のＫ残基は、スペーサー２１０ｂ又は２０１ｃによって互いに分離される。カルボキシル基２３０及びアジド基２５０を有する結合部分は、結合部分のカルボキシル基２３０とＮ末端スペーサー２１０ａのα−アミン基との間でアミド結合を形成することによりＮ末端スペーサー２１０ａに結合される。前述のように、スペーサー２１０ａ−２１０ｃは、同じ又は異なるアミノ酸配列及び／又はＥＧ単位を含み得る。
【００６３】
図２Ｃは、それぞれスペーサー２１０ｂ−２１０ｅによって分離された５つのＫ残基、及びそれぞれ５つのＫ残基に結合された５つのリンクアーム２２０ａ−２２０ｅを含むリンカーユニット２０Ｃに関する。さらに、Ｎ末端及びＣ末端スペーサーとして機能する上記スペーサー２１０ａ、２１０ｆは、それぞれ最初のＫ残基のＮ末端及び最後のＫ残基のＣ末端に結合される。この例では、カルボキシル基２３０及びアルキン基２６０を有する結合部分は、結合部分のカルボキシル基２３０とスペーサー２１０ａのα−アミン基との間でアミド結合を形成することによりスペーサー２１０ａに結合される。
【００６４】
図２Ｄに示すように、リンカーユニット２０Ｄは、結合部分がコアのＮ末端の代わりにコアのＣ末端に結合される以外、リンカーユニット２０Ａ−２０Ｃと同様の構造を有する。図２Ｄに示すように、アミン基２３５及びシクロオクチン基２７０を有する結合部分は、結合部分のアミン基２３５とＣ末端スペーサー２１０ｃのカルボキシル基との間でアミド結合を形成することによりＣ末端スペーサー２１０ｃに結合される。
【００６５】
図２Ｅは、リンカーユニット２０Ｅが４つのスペーサー２１０ａ−２１０ｄを含む代替例を提供する。この例では、Ｎ末端及びＣ末端スペーサーとして機能するスペーサー２１０及び２１０ｄは、それぞれ最初のＫ残基のＮ末端及び最後のＫ残基のＣ末端に結合される。スペーサー２１０ｂは、第３と第４のＫ残基の間に配置される。スペーサー２１０ｃは、第５と第６のＫ残基の間に配置される。アミン基２３５及びテトラジン基２８０を有する結合部分は、結合部分のアミン基２３５とスペーサー２１０ｄのカルボキシル基との間でアミド結合を形成することによりスペーサー２１０ｄに結合される。  
【００６６】
図２Ｆは、本開示の他の実施形態に係る２つの結合部分を含むリンカーユニット２０Ｆを提供する。本発明のコアは、７つのＫ残基を含む。Ｎ末端及びＣ末端スペーサーとして機能する２つのスペーサー２１０ａ、２１０ｆは、それぞれ上記コアのＮ末端及びＣ末端に配置される。シクロオクチン基２７０を有する結合部分は、スペーサー２１０ａのα−アミン基に結合され、シクロオクテン基２４０を有する結合部分は、スペーサー２１０ｆのカルボキシル基に結合される。以下に述べるように、リンカーユニット２０Ｆは、担体としてリンクアーム２２０ａ−２２０ｇ、シクロオクチン基２７０、及びシクロオクテン基２４０を介してそれぞれ３種類の官能基と結合することができる。
【００６７】
理解され得るように、上述したリンカーユニット２０Ａ−２０Ｆ又は後述のリンカーユニットのある特徴は、ここで開示される他のリンカーユニットと共通であるため、具体的な実施形態の文脈に矛盾しない限り、これらの特徴のいくつか又はすべては、以下の実施例においても適用される。しかし、簡潔のために、以下、これらの共通特徴を繰り返して説明しないこともある。
【００６８】
リンクアームの遊離末端に存在する官能基（即ち、アミン基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ＴＢＤＭＳ基、ＮＨＳ基、マレイミド基、ビニルスルホン基、モノスルホン基、メチルスルホニルベンゾチアゾール基、ヨード基、ヨードアセトアミド基、アジド、アルキン基、シクロオクチン基、テトラジン基、又はシクロオクテン基）によって、対応する官能基を有する機能成分（例えば、標的化成分、治療エフェクター成分、又は薬物動態学的特性を改善する成分）を設計することができ、これによって、機能成分は、以下の化学反応のいずれかを介してリンクアームの遊離末端に結合することができる。
（１）アミド結合の形成：この場合には、リンクアームは、その遊離末端にアミン基、カルボキシル基又はＮＨＳ基を有し、機能成分は、アミン基又はカルボキシル基を有する。
（２）エステル結合の形成：この場合には、リンクアームは、その遊離末端にヒドロキシル基又はＴＢＤＭＳ基を有し、機能成分は、ヒドロキシル−反応基（例えば、トシル−Ｏ基）を有する。
（３）チオール−マレイミド（又はビニルスルホン）反応：この場合には、リンクアームは、その遊離末端にマレイミド基、ビニルスルホン基、モノスルホン基又はメチルスルホニルベンゾチアゾール基を有し、機能成分は、チオール基を有する。
（４）ＳＮ２反応：この場合には、リンクアームは、その遊離末端にヨード基又はヨードアセトアミド基を有し、機能成分は、チオール基を有する。
（５）銅（Ｉ）触媒型アルキン−アジド環化付加反応（ＣｕＡＡＣ反応）：リンクアームの遊離末端及び機能成分のうちの一方は、アジド基又はピコリルアジド基を有し、他方は、アルキン基を有する。ＣｕＡＡＣ反応は、スキーム４、５に例示される。
（６）逆電子要請型ディールス・アルダー（ｉＥＤＤＡ）反応：リンクアームの遊離末端及び機能成分のうちの一方は、テトラジン基を有し、他方は、シクロオクテン基（例えば、ＴＣＯ基又はノルボルネン基）を有する。ｉＥＤＤＡ反応は、スキーム６、７に例示される。
（７）ひずみ促進型アジド−アルキンクリックケミストリー（ＳＰＡＡＣ）反応：リンクアームの遊離末端及び機能成分のうちの一方は、アジド基を有し、他方は、シクロオクチン基を有する。ＳＰＡＡＣ反応は、スキーム８に例示される。
【００６９】
ＣｕＡＡＣ反応により、１，５−二置換−１，２，３−トリアゾールが得られる。アルキンとアジドとの間の反応は、非常に選択的であり、天然の生体分子の中にアルキン基及びアジド基は存在しない。さらに、この反応は迅速かつｐＨ非感受性である。クリック反応を触媒するために、臭化第一銅又はヨウ化第一銅のような銅（Ｉ）を使用する代わりに、銅（ＩＩ）と、還元剤、例えば、アスコルビン酸ナトリウムとの混合物を使用して、反応混合物中のその場で銅（Ｉ）を生成することがより好ましい。或いは、第２成分は、銅フリー反応により、本発明のコアのＮ末端又はＣ末端に結合され得る。この銅フリー反応において、ペンタメチルシクロペンタジエニルルテニウムクロライド錯体を触媒として使用して、アジド−アルキンクリックケミストリーを触媒する。
【００７０】
＜＜スキーム４：アジド基とアルキン基との間で起きるＣｕＡＡＣ反応＞＞
2020510097.tif 000008
＜＜スキーム５：ピコリルアジド基とアルキン基との間で起きるＣｕＡＡＣ反応＞＞
2020510097.tif 000009
＜＜スキーム６：ＴＣＯ基とテトラジン基との間で起きるｉＥＤＤＡ反応＞＞
2020510097.tif 000010
＜＜スキーム７：ノルボルネン基とテトラジン基との間で起きるｉＥＤＤＡ反応＞＞
2020510097.tif 000011
＜＜スキーム８：アジド基とＤＢＣＯ基との間で起きるＳＰＡＡＣ反応＞＞
2020510097.tif 000012
説明の便宜上、リンクアームに結合された機能成分を第１成分と呼ぶ。理解され得るように、本発明のリンカーユニットが有する第１成分の数は、コアのリンクアミノ酸残基（即ち、Ｋ、Ｄ及び／又はＥ残基）の数（そのため、リンクアームの数）によって決定される。従って。当業者であれば、必要に応じて、例えば、所望の標的化又は治療効果を達成するために、リンカーユニットの第１成分の数を調整することができる。
【００７１】
２つの第１成分を有するリンカーユニット３０Ａの例は、図３Ａに示される。リンカーユニット３０Ａは、２つの第１成分３１０ａ、３１０ｂがリンクアーム２２０ａ、２２０ｂを介してそれぞれコアのＫ残基に結合される以外、図２Ａのリンカーユニット２０Ａと同様の構造を有する。図３Ｂは、リンカーユニット３０Ｂがそれぞれリンクアーム２２０ａ−２２０ｅを介して結合された５つの第１成分３１０ａ−３１０ｅを有する他の例を提供する。同様に、図３Ｃにおいて、リンクアーム３１０ａ−３１０ｃは、３つの第１成分３１０ａ−３１０ｃの結合を可能にする。
【００７２】
所望の効果（例えば、治療効果）を向上させるために、本発明のリンカーユニットは、上記第１成分に加えて、第２成分をさらに含み得る。例えば、第２成分は、標的化成分又はエフェクター成分であり得る。本開示の任意の実施形態において、第１成分は、エフェクター成分であり、第２成分は、第１成分と相加的若しくは相乗的、又は第１成分と独立して作用する別のエフェクター成分であり得る。必要に応じて、第１成分及び第２成分は、異なる特性を示す。例えば、第１成分は、標的化成分であり、第２成分は、エフェクター成分であり、その逆もまた然りである。或いは、第１成分は、エフェクター成分であり、第２成分は、リンカーユニットの溶解性、クリアランス、半減期、及び生物学的利用能等の薬物動態学的特性を改善させる成分である。特定の第１成分及び／又は第２成分の選択は、本発明のリンカーユニット（又はマルチアームリンカーユニット）が使用される用途に依存する。これらの機能成分の例は、本明細書のパートＩ−（ｉｉ）に後述する。
【００７３】
構造的には、第２成分は、コアのＮ末端又はＣ末端に結合された結合部分の結合基（即ち、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基又はシクロオクチン基）に結合される。必要に応じて、第２成分を短いＰＥＧ鎖（好ましくは２〜１２個のＥＧの繰り返し単位を有する）に結合した後、結合基に結合してもよい。
【００７４】
本開示のいくつかの実施形態によれば、コアの結合基は、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基又はシクロオクチン基である。従って、アジド−反応基（例えば、アルキン基又はＤＢＣＯ基）、アルキン−反応基（例えば、アジド基）、テトラジン−反応基（例えば、ノルボルネン基又はＴＣＯ基）、シクロオクテン−反応基（例えば、テトラジン基）又はシクロオクチン−反応基（例えば、アジド基）を有する第２成分は、適切なクリックケミストリー反応（例えば、ＣｕＡＡＣ反応、ｉＥＤＤＡ反応又はＳＰＡＡＣ反応）によりコアの結合基に結合することができる。
【００７５】
図４Ａを参照されたい。以下の特徴以外、図４Ａは、図２Ａと同様である。第一に、リンカーユニット４０Ａは、それぞれリンクアーム２２０ａ及び２２０ｂに結合された２つの第１成分４１０ａ、４１０ｂを有する。第二に、コアのＮ末端にシクロオクテン基２４０を有するため、シクロオクテン−反応基（例えば、テトラジン基２８０）を有する第２成分は、ｉＥＤＤＡ反応によりシクロオクテン基２４０に結合することができる。
【００７６】
図４Ｂは、代替例を提供する。この代替例には、リンカーユニット４０Ｂは、テトラジン基２８０ではなくアジド基２５０がコアのＣ末端にある以外、図２Ｅのリンカーユニット２０Ｅと同様の構造を有する。また、６つの第１成分４１０ａ−４１０ｆは、それぞれリンクアーム２２０ａ−２２０ｆに結合され、アルキン基２６０を有する第２成分は、ＣｕＡＡＣ反応によりアジド基２５０に結合される。
【００７７】
或いは、リンカーユニットは、それぞれそのＮ末端及びＣ末端にある２つの結合基を有してもよい。上記のように、第１結合基がアジド基、アルキン基又はシクロオクチン基である場合、第２結合基は、好ましくはテトラジン基又はシクロオクテン基である。したがって、２つの機能成分は、それぞれＳＰＡＡＣ及びｉＥＤＤＡ反応又はＣｕＡＡＣ及びｉＥＤＤＡ反応によりコアに結合され得る。例えば、シクロオクチン−反応基（例えば、アジド基）を有する第２成分は、ＳＰＡＡＣ反応により第１カップリング基に結合され、アルキン−反応基（例えば、アジド基）、テトラジン−反応基（例えば、ノルボルネン基又はＴＣＯ基）又はシクロオクテン−反応基（例えば、テトラジン基）を有する第３成分は、ＣｕＡＡＣ又はｉＥＤＤＡ反応により第２カップリング基に結合され得る。或いは、テトラジン−反応基（例えば、ノルボルネン基又はＴＣＯ基）又はシクロオクテン−反応基（例えば、テトラジン基）を有する第２成分は、ｉＥＤＤＡ反応により第１カップリング基に結合され、アジド−反応基（例えば、アルキン基又はＤＢＣＯ基）、アルキン−反応基（例えば、アジド基）又はシクロオクチン−反応基（例えば、アジド基）を有する第３成分は、ＣｕＡＡＣ又はＳＰＡＡＣ反応により第２カップリング基に結合され得る。
【００７８】
図４Ｃは、それぞれ第２成分及び第３成分に結合された２つの結合基を含む本発明のリンカーユニット４０Ｃの例を提供する。リンカーユニット４０Ｃは、第１成分４１０ａ−４１０ｇがそれぞれリンクアーム２２０ａ−２２０ｇに結合され、アジド基２５０を有する第２成分４２０がＳＰＡＡＣ反応によりシクロオクチン２７０に結合され、テトラジン２８０を有する第３成分４３０がｉＥＤＤＡ反応によりシクロオクテン２４０に結合される以外、図２Ｆのリンカーユニット２０Ｆと同様の構造を有する。
【００７９】
標的部位にあるエフェクター成分の放出を必要となる場合に、リンクアームに切断可能な結合を導入することができる。このような結合は、酸／アルカリ加水分解、還元／酸化、又は酵素によって切断される。リンクアームの形成に適用される切断可能なＰＥＧ鎖の一実施形態は、ＮＨＳ−ＰＥＧ２−２０−Ｓ−Ｓ−マレイミド（又はビニルスルホン）であり、ここで、Ｓ−Ｓはゆっくりと還元され得るジスルフィド結合であり、ＮＨＳ基はコアのアミン基と結合することにより、ＰＥＧ鎖がコアに結合される。リンクアームの遊離末端にあるマレイミド（又はビニルスルホン）基は、アジド基、アルキン基、テトラジン基、又は歪んだアルキン基で置換されてもよい。本開示のいくつかの実施形態によれば、リンクアームは、２−２０個のＥＧの繰り返し単位を有し、且つその遊離末端（即ち、コアに結合されていない末端）にジスルフィド結合を有するＰＥＧ鎖である。
【００８０】
スキーム９は、スルフヒドリル含有分子との結合に適したスルフヒドリル反応性化学基（例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基及びハロアセチル基）を提供する。
【００８１】
＜＜スキーム９：チオール特異的結合＞＞
2020510097.tif 000013
反応混合物のｐＨが６．５から７．５である場合、マレイミド基は、スルフヒドリルと特異的に反応する。チオ−スクシンイミド付加物わずかに可逆的であり、生理的状態では、マレイミドの除去がゆっくりと起こる。このようなレトロチオールマイケル反応を回避するために、温和な条件下（＞ｐＨ９．０）で塩基触媒によりチオスクシンイミド付加体の開環を行うことができ、生成物は化学的に安定である。
【００８２】
ビニルスルホン基は、遊離チオール基と選択的に反応することができる。このビニルスルホン基のマイケル付加反応は、温和な条件（ｐＨ７−８）下の目的分子のスルフヒドリル基の選択的修飾に適する。
【００８３】
ヨードアセチル基とスルフヒドリル基との直接ＳＮ２反応により、安定なチオエーテル結合が生成される。Ｒ基は、フヒドリル基を含むｓｃＦｖ、ペプチド、小分子薬物又はマルチアームリンカーユニットのペプチドコアである。
【００８４】
スキーム１０は、タンパク質成分をヒドロキシル基を有するコアに結合する方法を提供する。ＰＥＧリンカー（３）の形成は、化学量論量のＮａＨ及び触媒量のＮａＩの条件下でヒドロキシル含有コア（１）とトシレートリンクアーム（２）を直接エーテル化することにより実現することができる。ｓｃＦｖ（４）を含む目的のエーテル化コアは、ｓｃＦｖと中間体（３）をさらに１，４−付加することで得られる。Ｙ基は、Ｙ'基と反応可能なマレイミド基又はビニルスルホン基である。Ｙ'は、タンパク質成分のＳＨ基、又はペプチドのＳＨ基若しくはＮＨ２基である。
【００８５】
＜＜スキーム１０：タンパク質成分をヒドロキシル基を有するコアに結合する方法＞＞
2020510097.tif 000014
【００８６】
スキーム１１は、低分子化合物をヒドロキシル基を有するコアに結合する例を提供する。様々なクロスカップリング反応は、リンクアーム（５）及びＹ'修飾小分子薬物を出発原料として用いる薬物を有するトシレートリンクアーム（６）の形成に適用できる。所望の薬物を有するエーテル化コア（７）は、化学量論量のＮａＨ及び触媒量のＮａＩの条件下でヒドロキシ含有コア（１）と薬物（６）を有するトシレートリンクアームとをエーテル化することにより得られる。Ｙは、リンクアームの末端官能基であり、ＴＢＤＭＳ基、ヒドロキシル基、マレイミド基、ＮＨＳ基、ビニルスルホン基、アジド基、アルキン基、ＴＣＯ基、ＢＣＮ基、ＤＢＣＯ基及びテトラジン基からなる群より選択される。Ｙ'は、修飾された小分子薬物の末端官能基であり、カルボン酸基、スルフヒドリル基、アミン基、ＮＨＳ基、ビニルスルホン基、アジド基、アルキン基、ＴＣＯ基、ＢＣＮ基、ＤＢＣＯ基及びテトラジン基からなる群より選択される。Ｘは、カップリング反応後の２つの末端官能基ＹとＹの'間の架橋結合を表す。
【００８７】
＜＜スキーム１１：小分子成分をヒドロキシル基を有するコアに結合する方法＞＞
2020510097.tif 000015
【００８８】
スキーム１２は、スキーム１１で使用されるリンクアームＴｓＯ−ＰＥＧ６-ＯＴＢＤＭＳの調製例を提供する。ヘキサエチレングリコール（ＨＯ−ＰＥＧ６-ＯＨ）は市販品である。ＴｓＣｌ／ＮａＯＨで媒介されるヘキサエチレングリコールのモノスルホン酸塩形成により、トシレートリンクアーム（８）（ＴｓＯ−ＰＥＧ６-ＯＨ）を調製することができる。さらに、ＴＢＤＭＳＣｌ／イミダゾールで媒介されるトシレートリンクアーム（８）のシリルエーテル化により、所望のトシル及びＯＴＢＤＭＳ保護基を有するのリンクアーム（９）（ＴｓＯ−ＰＥＧ６-ＯＴＢＤＭＳ）が得られる。
【００８９】
＜＜スキーム１２：ヒドロキシル基と結合するためのリンクアームの調製＞＞
2020510097.tif 000016
【００９０】
スキーム１３は、スキーム１１で使用されるリンクアームＣｌ−ＰＥＧ６-ＯＴＢＤＭＳの調製の代替例を提供する。ＳＯＣｌ２で媒介されるヘキサエチレングリコールのモノクロロ化により、塩化エタノイル（１０）（Ｃｌ−ＰＥＧ６-ＯＨ）が得られる。さらに、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ／イミダゾールで媒介される塩化エタノイル（１０）のシリルエーテル化は、所望のリンクアーム（１１）（Ｃｌ−ＰＥＧ６-ＯＴＢＤＭＳ）が得られる。略語：ＴＢＡＦ（フッ化テトラブチルアンモニウム）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド）、Ｅｔ３Ｎ（トリエチルアミン）、ＴＢＤＭＳ（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、Ｔｓ（ｐ−トルエンスルホニル）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）。
【００９１】
＜＜スキーム１３：コアのヒドロキシル基と結合するための代替的なリンクアームの調製＞＞  
2020510097.tif 000017
【００９２】
＜＜スキーム１４は、タンパク質成分をカルボン酸基を有するコアに結合する方法を提供する。典型的なＤＣＣ／ＮＨＳ／Ｅｔ３Ｎ条件下でＣＯ２Ｈ含有コア（１２）とＯＨ基を有するリンクアーム（１３）とを直接エステル化することにより、対応するエステル化コア（１４）が得られる。次いで、エステル修飾コア（１４）とｓｃＦｖのサルファ又はアザマイケル付加により、所望のｓｃＦＶを有するエステル化コア（１５）が得られる。リンクアームの他端にＹ基を有する。Ｙ基は、Ｙ'基と反応可能なマレイミド基又はビニルスルホン基である。Ｙ'は、タンパク質成分のＳＨ基、又はペプチドのＳＨ基若しくはＮＨ２基である。
【００９３】
＜＜スキーム１４：タンパク質成分をカルボン酸基を有するコアと結合する方法＞＞
2020510097.tif 000018
【００９４】
スキーム１５は、小分子成分をカルボン酸（ＣＯ２Ｈ）基を有するコアと結合する方法を提供する。典型的なＤＣＣ／ＮＨＳ／Ｅｔ３Ｎの条件下でＣＯ２Ｈ含有コア（１２）とＯＨ基を有するリンクアーム（１６）を直接エステル化することにより対応するエステル修飾コア（１７）が得られる。次いで、適切な条件下でのエステル修飾コア（１７）と修飾された小分子薬物との結合により、所望の薬物を有するエステル修飾コア（１８）が得られる。Ｙは、リンクアームの末端官能基であり、ＯＴＢＤＭＳ基、ヒドロキシル基、マレイミド基、ＮＨＳ基、ビニルスルホン基、アジド基、アルキン基、ＴＣＯ基、ＢＣＮ基、ＤＢＣＯ基及びテトラジン基からなる群より選択される。Ｙ'は、修飾された小分子薬物の末端官能基であり、カルボン酸基、スルフヒドリル基、アミン基、ＮＨＳ基、ビニルスルホン基、アジド基、アルキン基、ＴＣＯ基、ＢＣＮ基、ＤＢＣＯ基及びテトラジン基からなる群より選択される。Ｘは、カップリング反応後の２つの末端官能基ＹとＹ'の間の結合を表す。
【００９５】
＜＜スキーム１５：小分子成分をカルボン酸基を有するコアと結合する方法＞＞
2020510097.tif 000019
【００９６】
スキーム１６は、スキーム１５で使用されるリンクアームＴｓＯ−ＰＥＧ６-ＯＨの調製例を提供する。この例では、ＴｓＣｌ／ＮａＯＨで媒介されるヘキサエチレングリコール（ＨＯ−ＰＥＧ６-ＯＨ）のモノスルホン酸塩形成により、トシレートリンクアーム（８）（ＴｓＯ−ＰＥＧ６-ＯＨ）が得られる。リンクアームＣｌ−ＰＥＧ６-ＯＴＢＤＭＳの調製の代替例は、スキーム１７に示される。この例では、ＳＯＣｌ２で媒介されるヘキサエチレングリコール（ＨＯ−ＰＥＧ６-ＯＨ）のモノクロロ化により、塩化エタノイル（１０）（Ｃｌ−ＰＥＧ６-ＯＨ）が得られる。略語：ＴＢＡＦ（フッ化テトラブチルアンモニウム）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ'−ジシクロヘキシルカルボジイミド）、Ｅｔ３Ｎ（トリエチルアミン）、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）、Ｔｓ（ｐ−トルエンスルホニル）、ＤＭＦ（ジメチルホルムアミド）。
【００９７】
＜＜スキーム１６：カルボン酸基と結合するためのリンクアームの調製＞＞
2020510097.tif 000020
＜＜スキーム１７：カルボン酸基と結合するための代替的なリンクアームの調製＞＞
2020510097.tif 000021
スキーム１８は、リンクアームの調製、及びリンクアームをペプチドコアにおけるセリン残基のＯＨ基と結合する方法を示す。ＨＯ−ＰＥＧ１２−Ｃｌ（１９）の調製プロセスは、スキーム１７と同様である。ＨＯ−ＰＥＧ１２−ビニルスルホン（２０）の形成は、ＨＯ−ＰＥＧ１２−Ｃｌ（１９）とビニルスルホン酸ナトリウムとの反応により達成される。ＴｓＣｌ／Ｅｔ３Ｎで媒介されるＨＯ−ＰＥＧ１２−ビニルスルホン（２０）のモノスルホン酸塩形成により、トシレートリンクアーム（２１）（ＴｓＯ−ＰＥＧ１２−ビニルスルホン）が得られる。別の反応では、ペプチドコアＡｃ−ＺＳＺＳＺＳＣと短いリンカーマレイミド−ＰＥＧ３−ＤＢＣＯとを反応させることにより、クリック反応と結合するためのＤＢＣＯが導入される。次いで、修飾されたペプチドコア（２２）をトシレートリンクアーム（２１）（ＴｓＯ−ＰＥＧ１２−ビニルスルホン）とを化学量論量のＮａＨ及び触媒量のＮａＩの条件下で反応させることで、ＰＥＧリンカー修飾ペプチドコア（２３）が調製される。次いで、ＰＥＧリンカー修飾ペプチドコア（２３）とＳＨ含有ｓｃＦｖとのサルファマイケル付加により、所望のｓｃＦｖを有するＰＥＧリンカー修飾ペプチドコア（２４）が得られる。
【００９８】
＜＜スキーム１８：リンクアームをセリン残基を有するペプチドコアと結合する方法＞＞
2020510097.tif 000022
【００９９】
＜＜スキーム１９は、小分子成分をセリン残基を有するペプチドコアと結合する方法を示す。プロセスは、スキーム１７に記載のプロセスと同様である。この例では、リンクアームをペプチドコアのヒドロキシル基に結合する前に、小分子薬物をリンクアームに結合する。様々なクロスカップリング反応は、トシレートリンクアーム（５）とＹ'修飾小分子薬物との反応による薬物を有するトシレートリンクアーム（６）の形成に適用できる。所望の薬物を有するエフェクターリンカーユニット（２８）は、化学量論量のＮａＨ及び触媒量のＮａＩの条件下でセリン含有ペプチドコア（２２）と薬物を有するトシレートリンクアーム（６）とをエーテル化することにより得ることができる。Ｙは、リンクアームの末端官能基であり、ＯＴＢＤＭＳ基、ヒドロキシル基、マレイミド基、ＮＨＳ基、ビニルスルホン基、アジド基、アルキン基、ＴＣＯ基、ＢＣＮ基、ＤＢＣＯ基、及びテトラジン基からなる群より選択される。Ｙ'は、修飾された小分子薬物の末端官能基であり、カルボン酸基、スルフヒドリル基、アミン基、ＮＨＳ基、ビニルスルホン基、アジド基、アルキン基、ＴＣＯ基、ＢＣＮ基、ＤＢＣＯ基、及びテトラジン基からなる群より選択される。Ｘは、カップリング反応後の２つの末端官能基ＹとＹ'の間の結合を表す。
【０１００】
スキーム１９：小分子成分をセリン残基を有するペプチドコアのリンカーユニットと結合する方法＞＞
2020510097.tif 000023
【０１０１】
Ｉ−（ｉｉ）：マルチアームリンカーに適用される機能成分
リンカーユニット（又はマルチアームリンカー）が第２及び／又は第３成分を含まず、第１成分のみを含む場合、第１成分は、被験体に治療効果を発揮できるエフェクター成分である。一方、本発明のリンカーユニットが第１成分に加えて他の成分を含む場合、少なくとも１つの成分は、エフェクター成分であり、他の成分は、別のエフェクター成分、標的化成分、又はリンカーユニットの１つ以上の薬物動態学的特性（例えば、溶解性、クリアランス、半減期、及び生物学的利用能）を向上可能な成分であり得る。例えば、リンカーユニットは、２種類のエフェクター成分；１つのエフェクター成分及び１つの標的化成分又は１つの薬物動態学的特性改善成分；２種類の標的化成分及び１種類のエフェクター成分；２種類のエフェクター成分及び１種類の標的化成分；或いは１種類の標的化成分、１種類のエフェクター成分及び１種類のリンカーユニットの薬物動態学的特性を改善可能な成分を含み得る。
【０１０２】
びまん性腫瘍の治療を目的として、本発明のリンカーユニットの第１成分及び第２成分のうちの一方は、びまん性腫瘍に関連する、及び／又は、びまん性腫瘍上で過剰発現される細胞表面抗原に特異的な抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）であり、本発明のリンカーユニットの第１成分及び第２成分のうちの他方は、細胞毒性薬物、又は細胞表面抗原ＣＤ３若しくはＣＤ１６ａに特異的な抗体断片である。好ましくは、本発明のリンカーユニットの第１成分は、腫瘍関連抗原に特異的な抗体断片であり、本発明のリンカーユニットの第２成分は、細胞毒性薬物、又は細胞表面抗原ＣＤ３又はＣＤ１６ａに特異的な抗体断片である。本開示の実施形態によれば、びまん性腫瘍に関連する、及び／又は、びまん性腫瘍上で過剰発現される細胞表面抗原は、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ７２ａ、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８又はＣＤ３１９である。必要に応じて、細胞毒性薬物は、メルタンシン、オーリスタチン、メイタンシン、ドキソルビシン、カリケアマイシン、及びカンプトテシンからなる群より選択される。
【０１０３】
本発明のリンカーユニットによって治療可能なびまん性腫瘍は、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫又は骨髄腫であり得る。
【０１０４】
好ましい実施形態において、本発明のリンカーユニットは、Ｂリンパ球由来リンパ腫又は白血病の治療に用いられる。この場合に、第１成分は、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３７、ＣＤ７９ａ，又はＣＤ７９ｂに特異的な抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）であり、第２成分は、細胞毒性薬物、又はＣＤ３若しくはＣＤ１６ａに特異的な抗体断片（例えば、ｓｃＦｖ）である。
【０１０５】
別の好ましい実施形態において、本発明のリンカーユニットはＢリンパ球由来リンパ腫又は白血病の治療に用いられる。この場合に、第１成分は、ＣＤ７９ａに特異的な抗体断片であり、第２成分は、ＣＤ７９ｂに特異的な抗体断片であり、その逆もまた然りである。
【０１０６】
別の好ましい実施形態において、本発明のリンカーユニットによって治療可能な疾患は、形質細胞腫又は多発性骨髄腫である。この場合に、第１成分は、ＣＤ３８、ＣＤ７８、ＣＤ１３８又はＣＤ３１９に特異的な抗体断片であり、第２成分は、細胞毒性薬物又は、ＣＤ３若しくはＣＤ１６ａに特異的な抗体断片である。
【０１０７】
別の好ましい実施形態において、本発明のリンカーユニットは、Ｔ細胞由来リンパ腫又は白血病に効果を有する。この場合に、第１成分は、ＣＤ５、ＣＤ３０又はＣＤ４３に特異的な抗体断片であり、第２成分は、細胞毒性薬物、又はＣＤ３若しくはＣＤ１６ａに特異的な抗体断片である。
【０１０８】
好ましい実施形態において、本発明のリンカーユニットは、骨髄性白血病に用いられる。この場合に、第１成分は、ＣＤ３３又はＣＤ３４に特異的な抗体断片であり、第２成分は、細胞毒性薬物又は、ＣＤ３若しくはＣＤ１６ａに特異的な抗体断片である。
【０１０９】
固形腫瘍の治療については、本発明のリンカーユニットの第１成分は、ペプチドホルモン、成長因子又は腫瘍関連抗原に特異的な抗体断片であり、第２成分は、細胞毒性薬物、トール様受容体アゴニスト、放射性核種と複合体を形成したキレート剤、サイトカイン、又は成長因子、細胞表面抗原、ハプテン若くはサイトカインに特異的な抗体断片である。
【０１１０】
腫瘍関連抗原は、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒト上皮成長因子受容体３（ＨＥＲ３）、ヒト上皮成長因子受容体（ＨＥＲ４）、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ  １９−９）、糖鎖抗原１２５（ＣＡ  １２５）、ムチン１（ＭＵＣ  １）、ガングリオシドＧＤ２、ガングリオシドＧＤ３、ガングリオシドＧＭ２、フコシルＧＭ１、Ｎｅｕ５ＧｃＧＭ３、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、メソセリン、ムチン関連Ｔｎ、シアリルＴｎ、ルイスＹ、シアリルルイスＹ、ルイスＡ、ルイスｘ、ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、グロボＨ、及び段階特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）からなる群より選択される。
【０１１１】
ペプチドホルモンは、セクレチン、ガストリン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ガストリン放出ポリペプチド、グルカゴン様ポリペプチド１（ＧＬＰ−１）、ニューロメジン、オクトレオチド、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、性腺刺激ホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）及びソマトスタチンからなる群より選択される。
【０１１２】
成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、変異型ＥＧＦ、エピレグリン、ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）からなる群より選択される。一実施例では、第１標的化成分は、ＥＧＦ、変異型ＥＧＦ、ＨＢ−ＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ｂＦＧＦ又はＨＧＦである。他の実施例では、第１エフェクター成分は、ＥＧＦ、変異型ＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ｂＦＧＦ又はＨＧＦに特異的な抗体断片である。
【０１１３】
細胞表面抗原は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ３、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２８又はＣＤ１３４である。
【０１１４】
ハプテンは、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、トリニトロフェノール（ＴＮＰ）、ダンシル、ペニシリン、ｐ−アミノ安息香酸、又は配列番号２３のアミノ酸配列を有する短いペプチドである。
【０１１５】
サイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β又はＴＮＦ−αである。好ましくは、第２成分は、ＩＬ−２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αから選択されるサイトカインに特異的な非中和抗体断片である。
【０１１６】
理解され得るように、腫瘍細胞に対して細胞毒性効果を示す細胞毒性薬物は、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、及びメゲストロール）、ＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴススクリン及びロイプロリド）、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド及びビカルタミド）、光線力学療剤（例えば、バルトポルフィン、フタロシアニン、光増感剤Ｐｃ４、及びデメトキシ−ハイポクレアチンＡ）、窒素マスタード（例えば、シクロホスファミド、イフォスファミド、トロホスファミド、クロラムブシル、エストラムスチン、及びメルファラン）、ニトロソウレア（例えば、カルムスティーン及びロムスチン）、アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン及びトレオスルファン）、トリアゼン（例えば、ダカルバジン、テモゾロミド）、白金含有化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）、ビンカアルカロイド（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びヴィノレルビン）、タキソイド（例えば、パクリタキセル、ドセタキセル、及びタキソール）、エピポドフィリン（例えば、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシド、トポテカン、９−アミノカンプトテシン、カンプトイリノテカン、イリノテカン、クリスタノール、マイトマイシンＣ）、抗代謝薬物、ＤＨＦＲ阻害剤（例えば、メトトレキセート、ジクロロメトトレキサート、トリメトレキセート、エダトレキサート）、ＩＭＰデヒドロゲナーゼ阻害剤（例えば、ミコフェノール酸、チアゾフリン、リバビリン、及びＥＩＣＡＲ）、リボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤（例えば、ヒドロキシ尿素及びデフェロキサミン）、ウラシル類似体（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フロクスウリジン、ドキシフルリジン、ラットレトレックス、テガフール−ウラシル、カペシタビン）、シトシン類似体（例えば、シタラビン（ａｒａＣ）、シトシンアラビノシド、及びフルダラビン）、プリン類似体（例えば、メルカプトプリン及びチオグアニン）、ビタミンＤ３類似体（例えば、ＥＢ１０８９、ＣＢ１０９３、及びＫＨ１０６０）、イソプレニル化阻害剤（例えば、ロバスタチン）、ドーパミン作動性神経毒（例えば、１−メチル−４−フェニルピリジニウムイオン）、細胞周期阻害剤（例えば、スタウロスポリン）、アクチノマイシン（例えば、アクチノマイシンＤ、ダクチノマイシン）、ブレオマイシン（例えば、ブレオマイシンＡ２、ブレオマイシンＢ２、ペプロマイシン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ピラルビシン、ゾルビシン、ミトキサントロン）、ＭＤＲ阻害剤（例えば、ベラパミル）、Ｃａ２＋ＡＴＰアーゼ阻害剤（例えば、タプシガルギン）、イマチニブ、サリドマイド、レナリドマイド、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、アキシチニブ、ボスチニブ、セジラニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レスタウルチブ、ネラチニブ、ニロチニブ、セマキサニブ、スニチニブ、トセラニブ、バンデタニブ、バタラニブ、リツキシマブ、ニロチニブ、ソラフェニブ、エベロリムス、テムシロリムス、プロテアソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、及びリファフォロリムス）、オブリメルセン、ゲムシタビン、ミノマイシン、ロイコボリン、ペメトレキセド、シクロホスファミド、ダカルバジン、プロカルビジン、プレドニゾロン、デキサメタゾン、カンペタテシン、プリカマイシン、アスパラギナーゼ、アミノプテリン、メトプテリン、ポルフィロマイシン、メルファラン、ロイロシジン、ロイロシン、クロラムブシル、トラベクテイン、プロカルバジン、ディスコデルモライド、カルミノマイシン、アミノプテリン、又はヘキサメチルメラミンであり得る。本開示の具体的な実施形態によれば、細胞毒性薬物は、メルタンシン、オーリスタチン、メイタンシン、ドキソルビシン、カリケアマイシン、又はカンプトテシンである。
【０１１７】
トール様受容体アゴニストは、リポテイコ酸、グルカン、モトリモード、イミキモッド、レスキモッド、ガリコイモッド、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＤＯＮ）、リポ多糖（ＬＰＳ）、モノホスホリル脂質Ａ、又はザイモサンである。
【０１１８】
本発明の方法によって治療可能な固形腫瘍は、メラノーマ，食道がん、胃がん、、脳腫瘍、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膀胱がん、乳がん、膵臓がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、腎がん、肝細胞がん、卵巣がん、前立腺がん、甲状腺がん、精巣がん、又は頭頸部扁平上皮がんであり得る。
【０１１９】
Ｉ−（ｉｉｉ）：マルチアームリンカーの使用
本開示は、適切な本開示のリンカーユニットを用いて様々な疾患（例えば、びまん性腫瘍及び固形腫瘍）を治療する方法にも関する。一般的に、この方法は、上記治療を必要とする被験体に有効量の本開示の実施形態に係るリンカーユニットを投与するステップを含む。
【０１２０】
従来の治療用構築物と比較して、パートＩで説明した本発明のリンカーユニットは、いくつかの点で有利である。
（１）機能成分の数は、必要又は用途に応じて調整することができる。本発明のリンカーユニットは、適用要件（例えば、治療される疾患、本発明のリンカーユニットの投与経路、本発明のリンカーユニットが有する抗体の結合活性及び／又は親和性）に応じて、２つの成分（即ち、第１成分及び第２成分）又は３つの成分（即ち、第１成分、第２成分、及び第３成分）を含むことができる。例えば、本発明のリンカーユニットを組織／器官（例えば、目の治療）に直接送達する場合に、化標的成分としての第２成分を必要とせず、エフェクター成分だけで十分である。しかし、本発明のリンカーユニットを周辺的に（例えば、経口、経腸、鼻、局所、経粘膜、筋肉内、静脈内、又は腹腔内注射）送達する場合に、本発明のリンカーユニットは、本発明のリンカーユニットを病変部位（例えば、腫瘍又はがん細胞／組織）に標的化する標的化成分、及び病変部位で治療効果を発揮するエフェクター成分を同時に含む必要がある。本発明のリンカーユニットの標的化効果若しくは治療効果、又は安定性を向上させるために、本発明のリンカーユニットに、第３成分（例えば、第２標的化成分、第２エフェクター成分、又はＰＥＧ鎖）をさらに含むことができる。
【０１２１】
（２）第１成分は、バンドルの形で提供される。上記のように、第１成分の数は、コアに含まれるリンクアミノ酸残基の数によって変化する。コアにおけるリンクアミノ酸残基の数が２〜２０であるため、各リンカーユニットに少なくとも２つの第１成分を含み得る。このように、従来の治療用構築物又は方法のように単一分子（例えば、細胞毒性薬物及び抗体）を提供する代わりに、本発明のリンカーユニットは、一度により多くの機能成分（標的化成分又はエフェクター成分）を提供することができ、それによって、治療効果が大きく改善される。
【０１２２】
（３）リンカーユニットは、それに結合された結合基を介して機能成分又は他の分子構築物（以下のパートＩＩを参照）に効率的に結合され得る。本発明のコアは、商業的に合成することができる。或いは、本発明のコアは、スキーム４から９で提供される手順に従って容易に調製することができる。ここで、合成ポリペプチドのα−アミン基を保護するための保護基として機能するＮ末端９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）は、結合基（即ち、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基又はシクロオクチン基）によって置換されている。追加又は代替として、結合基は、ポリペプチドのカルボキシル基と反応してポリペプチドに結合されもよい。このように調製されたコアは、機能成分（例えば、本発明の第２成分及び／又は第３成分）及びコアを連結するコネクタとして機能する１つ又は２つの結合基を含む。
【０１２３】
パートＩＩ：ジョイント−リンカー分子構築物及びその使用
他の態様において、本開示は、それぞれの結合部分を介して互いに結合された２つ以上のリンカーユニットを含む分子構築物、及びこの分子構築物の使用に関する。本開示の一実施形態によれば、分子構築物は、第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットを含む。一般には、第１リンカーユニット又は第２リンカーユニットは、それぞれ本開示の他の態様及び実施形態に関連して上述した構造を有する。具体的には、第１リンカーユニットは、第１コア及び第１コアに結合された２つ以上のリンクアーム（以下、第１リンクアーム）を含む。第２リンカーユニットは、第２コア及び第２コアに結合された２つ以上のリンクアーム（以下、第２リンクアーム）を含む。本開示のパートＩに記載のように、本発明のコアは、そのＮ末端及び／又はＣ末端に直接結合された少なくとも１つの結合部分を有することを特徴とする。本開示の特定の実施形態によれば、第１コア及び第２コアのそれぞれは、それらと結合した結合部分を有する。説明の便宜上、第１コアに結合した結合部分は、第１部分と呼ばれ、第２コアに結合された結合部分は、第２部分と呼ばれる。第１成分は、第１リンクアームに結合され、第２成分は、第２リンクアームに結合される。そして、第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、第１結合部分と第２結合部分との間で起きるｉＥＤＤＡ、ＳＰＡＡＣ又はＣｕＡＡＣ反応により互いに結合される。第１成分及び第２成分は、異なる機能を有し、小分子又はペプチド及びタンパク質であり得る。例えば、第１成分及び第２成分は、異なる２つの抗原に特異的な抗体断片、例えば、ｓｖＦｖ、ｓｄＡｂ、Ｆａｂ若くはＦ（ａｂ）'２、又は抗体ミメティックであり得る。
【０１２４】
より具体的には、第１結合部分及び第２結合部分は、それぞれその一方の末端に結合基を有し、他方の末端にアミン基又はカルボキシル基を有する。この結合基は、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基及びシクロオクチン基からなる群より選択される。従って、結合部分は、カルボキシル基を介してＮ末端スペーサーのα−アミン基に結合され得る。或いは、結合部分は、アミン基を介してＣ末端スペーサーのカルボキシル基に結合され得る。このように、コアの結合部分は、その遊離末端に結合基を有する。
【０１２５】
必要に応じて、結合部分は、結合基と連結基との間に、２〜１０個のＥＧの繰り返し単位を有するＰＥＧ鎖をさらに含む。例えば、ＰＥＧ鎖は、４、６、７又は８個のＥＧの繰り返し単位を含み得る。
【０１２６】
さらに必要に応じて、第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットのうちの一方は、第３結合部分をさらに含む。第３結合部分は、第３成分（例えば、抗体断片又は長鎖ＰＥＧ）又は第３リンカーユニットと結合するために使用され得る。この例では、第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、クリック反応により結合される。さらに、結合された第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットの第３結合部分は、異なるクリック反応により第３成分又はリンカーユニットに結合される。
【０１２７】
ＩＩ−（ｉ）：ジョイント−リンカー分子構築物の構造
本開示のいくつかの実施形態によれば、分子構築物は、２つのリンカーユニットを含み、リンカーユニットは、ＣｕＡＡＣ、ＳＰＡＡＣ又はｉＥＤＤＡ反応により互いに結合される。いくつかの実施形態において、１つのリンカーユニットは、標的化成分として機能する複数の第１成分に結合され、もう１つのリンカーユニットは、エフェクター成分として機能する複数の第２成分に結合される。
【０１２８】
図５Ａから５Ｃは、それぞれ２つのリンカーユニット間の結合を示す。
図５Ａは、ＣｕＡＡＣ反応により互いに結合された２つのリンカーユニット５０Ａ及び５５Ａを含む分子構築物を示す。第１リンカーユニット５０Ａは、第１コア５１０、第１コア５１０に結合されたリンクアーム５２０（即ち、第１リンクアーム）、及びリンクアーム５２０に結合された機能成分５３０（即ち、第１成分）を含む。ここで、第１コア５１０のＮ末端又はＣ末端スペーサーは、アジド基５１５が結合された結合部分を有する。同様に、第２リンカーユニット５５Ａは、第２コア５５０、第２コア５５０に結合されたリンクアーム５６０（即ち、第２リンクアーム）、及びリンクアーム５６０に結合された機能成分５７０（即ち、第２成分）を含む。ここで、第２コア５５０のＮ末端又はＣ末端スペーサーは、アルキン基５１６が結合された結合部分を有する。従って、リンカーユニット５０Ａ及び５５Ａは、アジド基５１５とアルキン基５１６との間で起きるＣｕＡＡＣ反応により互いに結合され得る。図５Ａにおける符号５４１は、ＣｕＡＡＣ反応により形成された化学結合を表す。
【０１２９】
図５Ｂは、本発明の分子構築物の他の例を提供する。この例において、第１コア５１１のＮ末端又はＣ末端スペーサーは、シクロオクチン基５１７が結合された結合部分を有し、第２コア５５１のＮ末端又はＣ末端スペーサーは、アジド基５１５が結合された結合部分を有する。さらに、リンカーユニット５０Ｂ及び５５Ｂは、シクロオクチン基５１７とアジド基５１５との間で起きるＳＰＡＡＣ反応により互いに結合され得る。図５Ｂにおける符号５４２は、ＳＰＡＡＣ反応により形成された化学結合を表す。
【０１３０】
或いは、第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットはｉＥＤＤＡ反応により互いに結合され得る。図５Ｃに示すように、リンカーユニット５０Ｃ及び５５Ｃは、コア５１２及び５５２がそれぞれテトラジン基５１８が結合された結合部分及びシクロオクテン基５１４が結合された結合部分を有する以外、それぞれリンカーユニット５０Ａ／５０Ｂ及び５５Ａ／５５Ｂと同様の構造を有する。リンカーユニット５０Ｃ及び５５Ｃは、テトラジン基５１８とシクロオクテン基５１４との間で起きるｉＥＤＤＡ反応により結合され得る。図５Ｃにおける符号５４３は、ｉＥＤＤＡ反応により形成された化学結合を表す。
【０１３１】
好ましくは、第１リンクアーム及び第２リンクアームのうちの少なくとも１つがＣｕＡＡＣ又はＳＰＡＡＣ反応により機能成分に結合される場合、第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、ｉＥＤＤＡ反応により互いに結合される。或いは、第１リンクアーム及び第２リンクアームの少なくとも１つがｉＥＤＤＡ反応により機能成分に結合される場合、第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、ＣｕＡＡＣ又はＳＰＡＡＣ反応により互いに結合される。
【０１３２】
他の治療用構築物に比べて、本発明の分子構築物は、少なくとも以下の３点で有利である。
（１）特定の数及び／又は種類の標的化／エフェクター成分を有するリンカーユニットは、独立して調製し、次いで適切なクリックケミストリー反応（例えば、ｉＥＤＤＡ、ＣｕＡＡＣ又はＳＰＡＡＣ反応）により一緒に結合されることができる。
（２）標的化成分及び／又はエフェクター成分の数及び種類は、適用要求（例えば、治療される疾患、結合活性、標的成分及び／又はエフェクター成分の親和性）に応じて変化し得る。標的化成分とエフェクター成分の組合せは、具体的な需要及び／又は用途に応じて調整することができる。本発明の各標的化成分及びエフェクター成分は、治療される特定の症状、患者の身体状態、及び／又は治療される疾患の種類などの要因によって変化し得る。当業者は、最良の治療効果を達成するために、最も適切な標的化成分と最も適切なエフェクター成分とを組み合わせることができる。本開示の実施形態によれば、標的化成分は、成長因子、ペプチドホルモン、サイトカイン、又は抗体断片であり得る。エフェクター成分は、免疫調節物質、放射性核種と複合体を形成したキレート剤、細胞毒性薬物、サイトカイン、可溶性受容体、又は抗体であり得る。
（３）他のカップリング反応と比較して、ｉＥＤＤＡ反応又はＳＰＡＡＣ反応は、任意の２つのリンカーユニットを結合する点でより効率的である。
【０１３３】
図６は、独立して構築可能な６つのリンカーユニットライブラリーを示す。この実施形態において、ライブラリー１−６は、それぞれ機能成分に結合された複数のリンカーユニット６０Ａ、６０Ｂ、６０Ｃ、６５Ａ、６５Ｂ及び６５Ｃを含む。リンカーユニット６０Ａ、６０Ｂ及び６０Ｃは、構造が類似しており、それぞれ１つのコア６１０及び特定の数のリンクアーム６２０を含み、コア６１０のＮ末端又はＣ末端がアジド基６１５を有する結合部分に結合される。例えば、リンカーユニット６０Ａは、３つのリンクアーム６２０を含むことで、３つの標的化成分６３０ａは、それぞれ３つのリンクアーム６２０に結合され得る。同様に、４つの標的化成分６３０ｂ及び５つの標的化成分６３０ｃは、それぞれリンカーユニット６０Ｂ及び６０Ｃに結合され得る。標的化成分６３０ａ、６３０ｂ及び６３０ｃは、同じでも異なっていてもよい。リンカーユニット６５Ａ、６５Ｂ及び６５Ｃは、それぞれ１つのコア６５０及び特定の数のリンクアーム６６０を含み、コア６５０のＮ末端又はＣ末端がシクロオクチン基６１７を有する結合部分に結合される。図に示すように、２つのエフェクター成分６７０ａ、３つのエフェクター成分６７０ｂ、及び６つのエフェクター成分６７０ｃは、それぞれリンカーユニット６５Ａ、６５Ｂ及び６５Ｃに結合され得る。エフェクター成分６７０ａ、６７０ｂ及び６７０ｃは、同じでも異なっていてもよい。ライブラリー１−６は、独立して調製され得る。当業者であれば、ライブラリー１、２及び３から第１リンカーユニットを選択し、ライブラリー４、５及び６から第２リンカーユニットを選択し、アジド基６１５とシクロオクチン基６１７との間で起きるｉＥＤＤＡ反応により第１リンカーユニットと第２リンカーユニットを結合することにより、特定の数の標的化成分及びエフェクター成分を有する分子構築物を調製することができる。
【０１３４】
理解され得るように、分子構築物は、３つのリンカーユニットを含み得る。第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、ｉＥＤＤＡ反応により互いに結合され、第３リンカーユニットは、ＣｕＡＡＣ反応により第１リンカーユニット又は第２リンカーユニットに結合される。或いは、第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、ｉＥＤＤＡ反応により互いに結合され、第３リンカーユニットは、ＳＰＡＡＣ反応により第１リンカーユニット又は第２リンカーユニットに結合される。いくつかの実施形態において、第１、第２及び第３リンカーユニットは、それぞれ複数の第１、第２及び第３成分を有する。ここで、第１、第２及び第３成分は、同じでも異なっていてもよい。
【０１３５】
図７に示すように、リンカーユニット７０Ａ、７０Ｂ及び７０Ｃは、ｉＥＤＤＡ及びＳＰＡＡＣ反応により互いに結合される。構造的には、リンカーユニット７０Ａ、７０Ｂ、７０Ｃは、それぞれコア（７１０ａ、７１０ｂ、７１０ｃ）、コア（７１０ａ、７１０ｂ、７１０ｃ）に結合されたリンクアーム（７２０ａ、７２０ｂ、７２０ｃ）、及びリンクアーム（７２０ａ、７２０ｂ、７２０ｃ）に結合された機能成分（７３０ａ、７３０ｂ、７３０ｃ）を含む。結合の目的のために、リンカーユニット７０ＡのＮ末端又はＣ末端は、テトラジン基が結合された結合部分を有し、リンカーユニット７０ＢのＮ末端及びＣ末端は、それぞれシクロオクテン基が結合された結合部分及びアジド基が結合された結合部分を有し、リンカーユニット７０ＣのＮ末端又はＣ末端は、シクロオクチン基が結合された結合部分を有する。これによって、リンカーユニット７０Ａ及び７０Ｂは、テトラジン基とシクロオクテン基との間で起きるｉＥＤＤＡ反応により結合される。図７における符号７５０は、ｉＥＤＤＡ反応により形成された化学結合を表す。一方、リンカーユニット７０Ｂ及び７０Ｃは、アジド基とシクロオクチン基との間で起きるＳＰＡＡＣ反応により結合される。図７における符号７６０は、ＳＰＡＡＣ反応により形成された化学結合を表す。
【０１３６】
理解され得るように、リンカーユニット７０Ａ、７０Ｂ及び７０Ｃに結合された機能成分７３０ａ、７３０ｂ、７３０ｃのそれぞれの数は、意図する用途に応じて同じでも異なっていてもよい。図６に示すライブラリーの概念に基づいて、異なる数及び／又は種類の機能成分を有するリンカーユニットは、異なるライブラリーとして独立して調製することができる。当業者は、分子構築物の用途に応じてライブラリーから所望のリンカーユニットを選択して組み合わせることができる。
【０１３７】
必要に応じて、本発明の分子構築物は、第１コア又は第２コアに結合される比較的長いＰＥＧ鎖を含むことができる。それにより、本発明の分子構築物が細網内皮系からさらに分離されることができ、被験体に投与された後により長い半減期を得る。ＰＥＧ鎖によりタンパク質を修飾することで、その薬物動態学的特性を改善させ、及び／又は、免疫原性を低下させる場合に、長さが２０，０００−５０，０００ダルトンのＰＥＧが好ましい。従って、本発明の好ましい実施形態において、比較的短いリンクアームを用いて標的化成分とエフェクター成分を結合し、本発明の分子構築物のインビボ半減期を増加させる目的で、２０，０００〜５０，０００ダルトンのＰＥＧ鎖をリンカーユニットのいずれかに結合する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、複数の抗体断片を標的化成分及び／又はエフェクター成分として用いて本発明の分子構築物を構築する。抗体断片を含む分子構築物に基づく標的化成分／エフェクター成分医薬品は、個々の抗体断片よりも長いインビボ半減期を有すべきである。いくつかの臨床用途、において、薬物を頻繁に投与しないように、医薬品のはるかに長い半減期が望まれている。これらの例では、重量が２０，０００〜５０，０００ダルトンのＰＥＧ鎖をリンクアームとして用いて、標的化成分又はエフェクター成分としての抗体断片と結合することができる。これらの長さのＰＥＧは、多数の治療用タンパク質を改変してそれらの半減期を増加させることに使用されている。
【０１３９】
ポリペプチドをコアとして採用することにより、本発明の分子構築物に多様性を提供することができる。該分子構築物では、１つの構築物に複数のコピー又は種類の標的化／エフェクター成分が存在し得る。それにより、薬物送達の特異性の増強、及び標的部位に対する効力が達成される。複数のリンカーユニットを含む分子構築物を用いることにより、多数の構成が採用されることができる。例えば、３つのｓｃＦｖを標的化成分として有する第１リンカーユニット、及び５つの治療薬分子を有する第２リンカーユニット；３つのｓｃＦｖを標的化成分として有する第１リンカーユニット、及び３つのｓｃＦｖをエフェクター成分として有する第２リンカーユニット；２つの第１ｓｃＦｖ（第１標的化成分として機能する）を有する第１リンカーユニット、２つの第２ｓｃＦｖ（第２標的化成分として機能する）を有する第２リンカーユニット、及び５つの治療薬分子を有する第３リンカーユニット；２つのｂｉ−ｓｃＦｖを標的化成分として有する第１リンカーユニット、及び２つのｓｃＦｖをエフェクター成分として有する第２リンカーユニット；又は３つのｓｃＦｖを標的化成分として有する第１リンカーユニット、２つのｓｃＦｖをエフェクター成分として有する第２リンカーユニット、薬物動態学的特性の向上の目的で２０，０００−５０，０００ダルトンの長いＰＥＧを導入したリンクアームである。
【０１４０】
本発明のいくつかの実施形態において、リンクアームとしての二機能性ＰＥＧを用いて、標的化成分又はエフェクター成分としての抗体の抗原結合断片をポリペプチドコアにあるアミン基に結合する。各ＰＥＧは、１つの末端にＮＨＳ基、もう１つの末端にマレイミド基及び／又はビニルスルホン基を有することができる。ＮＨＳ基は、ポリペプチドコアにあるアミン基と結合可能であり、マレイミド基又はビニルスルホン基は、抗体断片（例えば、抗体のｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ又はＦａｂ断片）のＣ残基スルフヒドリル基に結合可能である。ｓｃＦｖ及びｂｉ−ｓｃＦｖは、Ｃ末端に末端Ｃ残基を有するポリペプチドリンカーを含むように設計される。Ｆａｂは、ＩｇＧ全体にペプシン切断を行うことにより得ることができ、遊離のスルフヒドリル基は、穏やかな還元反応により鎖間ジスルフィド結合に由来する。
【０１４１】
標的化成分及びエフェクター成分は、それぞれｓｃＦｖであり、且つ６００ダルトン（１２単位のＥＧ）のリンクアームを使用する場合に、合計６つのｓｃＦｖを有する分子構築物は、分子量が約１７０，０００ダルトンである。７つのｓｃＦｖを有する分子構築物は、分子量が約２００，０００ダルトンである。８つのｓｃＦｖを有する分子構築物は、分子量が約２３０，０００ダルトンである。本発明の分子構築物のほとんどは、分子量が２００，０００ダルトン未満である一方、いくつかの分子構築物は、分子量が２００，０００−２５０，０００ダルトンである。
【０１４２】
４つの異なるセットのｓｃＦｖが１つの分子構築物に含まれる場合に、結合された一本鎖、ｓｃＦｖ１−ｓｃＦｖ２（例えば、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３に特異的なもの）等の二重特異性ｓｃＦｖ（ｂｉ−ｓｃＦｖ）を含む１つのリンカーユニット、及びそれぞれｓｃＦｖ（即ち、それぞれｓｃＦｖ３及びｓｃＦｖ４）を含む他の２つのリンカーユニットを有することが好ましい。二重特異性ｓｃＦｖ１−ｓｃＦｖ２の構築に２つの方法がある。「タンデム」構成において、ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＬ２−ＶＨ２又はＶＨ１−ＶＬ１−ＶＨ２−ＶＬ２が配置され、「ダイアボディ」構成において、ＶＬ２−ＶＬ１−ＶＨ１−ＶＨ２又はＶＨ２−ＶＨ１−ＶＬ１−ＶＬ２が配置される。ＧＧＧＧＳ（配列番号：２４）繰り返し単位又は他の配列を有する適切なリンカーは、免疫グロブリンドメインの間に配置される。
【０１４３】
発明者の経験では、マレイミド及びアジド基を含むペプチド又はＰＥＧリンカーは、マレイミド基とアジド基との間の自動結合反応により、長期間保存すると重合することがある。そのため、新しくかつ独立して各リンカーユニットを調製し、さらに、遅延なく標的化成分又はエフェクター成分をリンカーユニットに結合し、クリック反応によりリンカーユニットを結合するように処理することが好ましい。別の好ましい実施形態は、標的化成分及びエフェクター成分を両方ともアルキン基を介してリンカーユニットに結合し、１つのリンカーユニットにおけるアルキン基を、両端にアジド基を有する短いホモ二機能性リンカーを用いてアジド基に変更することである。そして、リンカーユニット（１つはアルキン基を有し、もう１つはアジド基を有する）をクリック反応により結合する。別の実施形態において、リンクアームの遊離末端にある官能基は、通常の生理学的ｐＨで安定した共有結合を形成できるビニルスルホンである。
【０１４４】
本発明の好ましいリンクアームはＰＥＧである。リンクアームの長さはいくつかの考慮事項にとって重要である。リンクアームの長さは、可撓性がある結合ｓｃＦｖ又は他の種類の機能成分が、立体的制約なしに標的細胞表面上の標的抗原部位に到達することを可能にするのに十分な長さであって、リンクアーム及びそれらのｓｃＦｖ断片若しくは機能成分の分子内及び分子間の絡み合いを引き起こすに至らない長さ、又は組織浸透を防げるために分子構築物全体のサイズを不必要に増加させるに至らない長さである。リンクアームが長すぎると、圧縮されたクラスタがアポトーシス又は他の細胞効果のための信号伝達プロセスを開始するために必要とされる場合に、抗原分子を引っ張って圧縮されたクラスタを形成することができない。標的抗原とその結合剤との異なる種類の組み合わせに対するリンクアームの最適長さは、過度の実験をすることなく当業者によって決定され得る。本発明のいくつかの分子構築物においては、ＮＨＳ−（ＰＥＧ）１２−マレイミド（又はビニルスルホン）（約５００ダルトン）のリンクアームが好ましい。完全に伸張した（ＰＥＧ）１２の長さは４０−５０オングストロームである。
【０１４５】
適用可能なリンクアーム及びカップリングアームは、ＰＥＧ鎖に制限されない。グリシン、セリン及び他のアミノ酸親水性残基を含むペプチド、及び多糖類、並びに、ＮＨＳ及びマレイミド（又はビニルスルホン）基を含むように修飾された他の生体適合性線状ポリマーを使用することができる。
【０１４６】
特定の治療用途では、本開示の分子構築物におけるエフェクター成分がリンクアームから放出され、標的部位の細胞（標的化成分又は周囲細胞によって結合された細胞を含む）に到達して薬理学的効果を引き起こすことができることが望ましい。この場合に、切断可能な結合がリンクアームに導入されている。加水分解、酸暴露、還元、及び酵素により切断されやすい切断可能な結合が、開発されている。例えば、炎症組織に存在するマトリックスメタロプロテイナーゼに敏感なペプチドセグメントは、治療用構築物の構築に使用されている。様々な細胞のエンドソーム又はリポソームに存在するカテプシンＢ又はＣに敏感なペプチドセグメントも、抗体薬物複合体のリンカーで設計されている。本発明の一実施形態において、マレイミド基又はビニルスルホン基に隣接するＳ−Ｓ結合を有するＰＥＧリンカー、即ちＮＨＳ−ＰＥＧ２−１２−Ｓ−Ｓ−マレイミド（又はビニルスルホン）を使用する。ここで、Ｓ−Ｓジスルフィド結合であり、緩徐に還元することができる。
【０１４７】
本開示のいくつかの実施形態によれば、上記の実施形態で説明した標的化成分は、成長因子、ペプチドホルモン、サイトカイン、及び抗体断片からなる群から選択され、エフェクター成分は、トール様受容体アゴニストなどの免疫調節物質、放射性核種と複合体を形成したキレート剤、治療薬、サイトカイン、可溶性受容体、又は抗体若しくは抗体断片である。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、抗体断片は、抗原結合断片（Ｆａｂ）、可変断片（Ｆｖ）、一本鎖可変領域断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、又は二重特異性一本鎖可変領域断片（ｂｉ−ｓｃＦｖ）の形態である。一実施形態によれば、ｂｉ−ｓｃＦｖは、二重特異性タンデムｓｃＦｖ又は二重特異性ダイアボディｓｃＦｖである。
【０１４９】
分子構築物の拡散能力を保持するために、２５０，０００ダルトン未満の分子サイズが好ましい。したがって、ｓｃＦｖは、ほとんどの実施形態にとって好ましい。ＤＮＡレベルでは、グリシン及びセリンを主要残基として有する１０−２５個のアミノ酸残基のペプチドリンカーを介して、いずれかの順序（ＶＬ−ＶＨ又はＶＨ−ＶＬ）でＶＬ及びＶＨが単一のポリペプチドとして結合されるように、遺伝子が構築される。Ｃ末端には、グリシン残基、セリン残基、及びＣ末端残基を有する短いペプチド延伸部が設計されている。上記ペプチド延伸部は、ペプチド延伸部及びＣ末端残基を延伸状態に維持可能な他の親水性及び荷電アミノ酸残基（例えば、Ｈ、Ｋ、Ｒ、Ｎ及びＱ残基）を含んでもよい。これによって、Ｃ残基のＳＨ基は、マルチアームリンカーユニットのリンクアームと自由に結合され得る。組換えｓｃＦｖ及びｂｉ−ｓｃＦｖは、大腸菌及びシュードモナス・プチダなどの細菌、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母、又はＣＨＯ及びＨＥＫ２９３細胞株などの哺乳類細胞で調製することができる。
【０１５０】
本発明者らは、ＨＥＫ２９３及びＣＨＯの細胞株において、インビトロシステム及び動物モデルにおける実験のために、数多くのＩｇＧ抗体、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ及び種々の抗体断片、Ｆｃに基づくタンパク質、並びに他の組換え抗体が調製された。本発明者らは、ヒト臨床試験用の抗体を調製するための細胞株についても開発している。ＨＥＫ２９３一過性発現系は、研究室で複数の１〜２Ｌのフラスコを用いて１ｇまでのＩｇＧ又は抗体断片を調製することに便利に使用することができる。本発明の分子構築物に使用される抗体断片は、一般に、炭水化物修飾を有さず、且つ、炭水化物修飾は、ｓｃＦｖの、その抗原性標的に対する結合活性には必要とされない。さらに、抗体断片には、１つのジスルフィド結合及び１つの末端Ｃしか存在しない。従って、小規模細菌発現系がｓｃＦｖ調製の代替手段として開発されている。大腸菌を用いて細胞内封入体、ペリプラズム及び／又は分泌型でｓｃＦｖを回収するための発現系が用いられている。ｓｃＦｖは、ほとんどの場合に、ほとんどのκ軽鎖のＶＨと相互作用するプロテインＬを有するアフィニティーカラムで精製することができ、又は他の場合に、イオン交換カラムで精製することができる。
【０１５１】
ジョイント−リンカープラットフォームに基づく本発明の例は、主にｓｃＦｖ及びＦａｂを標的化成分及び／又はエフェクター成分を使用する。しかし、特異的結合分子は、ｓｄＡｂ又は他の抗体断片に基づく結合分子の大きなライブラリーから選別されることもできる。免疫グロブリンドメインに基づいていないが、選択された標的分子に特異的結合親和性を有する抗体に似ている結合分子のライブラリーは、（１）標的分子と結合するために選択されたオリゴヌクレオチド又は短いペプチドであるアプタマー；（２）ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来する小さな結合タンパク質であるフィノマー；（３）シスタチンのシステインタンパク質阻害剤ファミリーに由来の結合タンパク質であるアフィマー；及び（４）天然のアンキリンタンパク質に由来する構造を有する遺伝子組み換えタンパク質であって、これらのタンパク質の３、４又は５個の繰り返しモチーフからなるダルピン（設計されたアンキリンリピートタンパク質）を含む。これらの抗体模倣物の分子量が約１０Ｋ〜２０Ｋダルトンである。
【０１５２】
ＩＩ−（ｉｉ）：ジョイント−リンカー分子構築物との併用に適した機能成分
上記のように、本発明のジョイント−リンカーは、少なくとも２つのリンカーユニットを含む。第１リンカーユニットは、１つ以上の標的化成分を有し、第２リンカーユニットは、１つ以上のエフェクター成分又は薬物動態学的特性改善成分を有し、その逆もまた然りである。当業者であれば、本明細書のパートＩ−（ｉｉ）に記載の第１成分及び第２成分に基づいて、適切な機能成分を標的化成分、エフェクター成分及び／又は薬物動態学的特性改善成分として選択することにより、所望の効果が得られる。
ＩＩ−（ｉｉｉ）：ジョイント−リンカー分子構築物の使用
本開示は、適切なジョイント−リンカー分子構築物を用いて様々な疾患を治療する方法にも関する。一般的には、この方法は、上記治療を必要とする被験体に有効量の本開示の実施形態に係るジョイント−リンカー分子構築物を投与するステップを含む。
【０１５３】
理解され得るように、本開示の他の態様又は実施形態に記載の機能成分の例は、本分子構築物にも適用可能である。簡潔のために、これらの例についての説明はここで省略する。
【０１５４】
しかし、説明のために、ここで、様々なタイプの肺がんの治療における本発明の分子構築物の使用を説明する。様々なタイプの肺がんの患者を治療するには、以下のエフェクター成分を有する本発明のリンカーユニット又は分子構築物を投与することができる。
（１）細胞毒性薬物−メルタンシン。モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、レナリドマイド、ポマリドマイド、エリブリン、ツブリシンＡ、ツブリシンＢ、ドキソルビシン、カリケアマイシン及びカンプトテシン；
（２）免疫賦活剤−トール様受容体アゴニスト、モノホスホリル脂質Ａ；又は
（３）免疫チェックポイント阻害剤：ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１に特異的な抗体、抗体断片又は抗体ミメティック
【０１５５】
以下の実験例は、本発明の特定の態様を解明し、本発明を実施する際に当業者を支援するために提供される。これらの実施例は、決して本発明の範囲を限定するものと考えられるべきではない。さらに詳述することなく、当業者は、本明細書の説明に基づいて、本発明を最大限に利用できると考えられる。
【実験例】
【０１５６】
実施例１：ペプチドコアとしてのペプチド１〜４の直接合成
マルチアームリンカーユニットを構築するための中心コアとして適用可能な結合基含有ペプチドを４つ設計した。標準固相法により結合基含有ペプチド１〜４（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅＣｏ．，Ｌｔｄ．；Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）を直接合成し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（島津Ｎｅｘｅｒａ−ｉ  ＬＣ−２０４０Ｃ  ３Ｄ  ＨＰＬＣシステム；カラム：クロマシル１００−５Ｃ１８カラム（２５０ｍｍＸ４．６ｍｍ；５μｍ）；移動相：アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：５％〜２０％；１５分間、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：２５℃）により、９５％純度に精製した。
【０１５７】
ペプチド１（純度：９５．５２％）は、配列番号１（ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＫＧＳＧＳＫＧＳＫ）のペプチド配列を有し、そのＮ末端及びＣ末端がいずれも化学的に修飾された。具体的には、配列番号１のＮ末端は、４−ペンチン酸のアミド化により修飾され、Ｃ末端は、メチルアルコールによりエステル化された。ペプチド２（純度：９７．０５％）は、配列番号２（ＧＧＳＧＧＳＫＧＳＫＧＳＫＧＳＫＧＳＫ）のペプチド配列を有し、そのＮ末端及びＣ末端がそれぞれ２−アジド酢酸及びメチルアルコールにより修飾された。ペプチド３（純度：９８．７１％）を調製するために、配列番号３（ＧＳＳＧＳＳＫＧＳＧＫＧＳＧＫＧＳＧＫＧＳＧＫ）のペプチドのをＮ末端３−ブチン酸でアミド化し、アミド樹脂によりＣ末端に第一級アミドを形成した。同様に、ペプチド４（純度：９５．９５％）の場合、配列番号４（ＧＳＳＧＳＳＧＳＳＧＳＫＧＳＧＳＫＧＳＧＳＫ）のペプチドのＮ末端をエキソ−５−ノルボルネンカルボン酸によりアミド化し、そのＣ末端もアミド化により修飾した。
【０１５８】
合成したペプチドをそれぞれエレクトロスプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ−ＭＳ）（ＡＰＩ  １５０  ＥＸ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により分析した。
【０１５９】
以下に示すように、本発明のペプチド１（配列番号１）は、分子量（ｍ．ｗ．）が１５３２．５８ダルトンである。
【０１６０】
2020510097.tif 000024
以下に示すように、本発明のペプチド２（配列番号２）は、分子量（ｍ．ｗ．）が１７３４．８４ダルトンである。
【０１６１】
2020510097.tif 000025
以下に示すように、本発明のペプチド３（配列番号３）は、分子量（ｍ．ｗ．）が２００４．９７７ダルトンである。
【０１６２】
2020510097.tif 000026
以下に示すように、本発明のペプチド４（配列番号４）は、分子量（ｍ．ｗ．）が１９３５．９８ダルトンである。
【０１６３】
2020510097.tif 000027
ノルボルネン含有ペプチド４の精製サンプルを逆相分析ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍＸ４．６ｍｍ；５μｍ）；移動相：アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：０％〜１００％；３０分間以上、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：２５℃）により分析し、２１０ｎｍ（ＯＤ２１０）での紫外線（ＵＶ）吸光度を測定した。図８Ａは、本発明のノルボルネン含有ペプチド４の逆相分析ＨＰＬＣプロファイルを示す。同図には、保持時間が１４．１７分間のノルボルネン含有ペプチド４のピーク（矢印＃２；矢尻＃１は、溶出溶媒のピークである）が示される。図８Ｂは、ペプチド４の質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果を示す。特に指定がない限り、全ての質量分析は、中央研究院分子生物学研究所のマスコア施設（ＩＭＢ）（台湾、台北）で行った。測定は、ブルカー・オートフレックスＩＩＩ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計（ブルカー・ダルトニクス、ブレーメン、ドイツ）で行った。
【０１６４】
実施例２：ペプチドコアとしてのＰＥＧ化ペプチド５の直接合成
標準固相法により以下に示すペプチド５（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＷｕＸｉ  ＡｐｐＴｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）を直接合成した。ペプチド５のＰＥＧ化ペプチドは、配列番号５（−Ｘａａ４−Ｋ−Ｘａａ４−Ｋ−Ｘａａ４−Ｋ−Ｘａａ４−Ｋ−Ｘａａ４−Ｋ）の配列を有し、そのＮ末端がアジド酢酸により修飾され、そのＣ末端がメチルアルコールにより修飾された。本発明者らはペプチドを設計し、その調製をＳｈａｎｇｈａｉ  ＷｕＸｉ  ＡｐｐＴｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）に委託した。
【０１６５】
（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｎｅｘｅｒａ−ｉ  １２００  ＨＰＬＣ−ＢＥシステムを用いて逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ  Ｃ１８、１５０ｍｍＸ４．６ｍｍ、５μｍ；移動相：アセトニトリル及び０．１％のトリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：１０％〜４０％；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ（２０分間以上）；カラム温度：２５℃）によりアジド含有ＰＥＧ化ペプチド５を９７．５８％純度に精製した。図９Ａは、アジド含有ＰＥＧ化ペプチド５の逆相分析ＨＰＬＣプロファイルを示す。同図には、保持時間が７．９４１分間のアジド含有ＰＥＧ化ペプチド５のピークが示される。
【０１６６】
2020510097.tif 000028
ＥＳＩ−ＭＳによりコアとしてのアジド含有ＰＥＧ化ペプチド５を確定した。図９Ｂは、本発明のＰＥＧ化ペプチド５がアジド基を有する１つのカップリングアームを含むペプチドコアであることを示す。ＥＳＩ−ＭＳの結果は、本発明の分子構築物のｍ．ｗ．が９９６．６ダルトンであることを示した。
【０１６７】
実施例３：ペプチドコアとしてのペプチド６〜１０の直接合成
マルチアームリンカーユニットを構築するための中心コアとして適用可能な結合基含有ペプチドを５つ設計した。標準固相法によりペプチド６〜１０を直接合成した。（ペプチド６〜１０：ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅＣｏ．，Ｌｔｄ．製；ペプチド７〜９：ＮｉｎｇＢｏ  ＫａｒｅＢａｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，Ｎｉｎｇｂｏ，Ｃｈｉｎａ製）。
【０１６８】
ペプチド６（以下に示す）も配列番号２（ＧＧＳＧＧＳＫＧＳＫＧＳＫＧＳＫＧＳＫ）のアミノ酸配列を有し、そのＮ末端がアジド−Ｘａａ５−酸により修飾され、そのＣ末端がＣ末端アミド化により修飾された。中心コアとして、ペプチド６は、ＧＳの配列を有するスペーサーによって分離された５つのＫ残基を有し、Ｎ末端にあるアジド基は、対応する反応基を有する成分又は他のリンカーユニットとクリック反応することができる。
【０１６９】
2020510097.tif 000029
ペプチド６の精製サンプルを逆相分析ＨＰＬＣ（カラム：クロマシル１００−５Ｃ１８カラム（２５０ｍｍＸ４．６ｍｍ；５μｍ）、移動相：アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：１５％〜３０％；１２分間、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：３５℃）により分析した。
【０１７０】
合成したペプチド６をＥＳＩ−ＭＳにより測定した。ＥＳＩ−ＭＳの結果は、本発明の分子構築物の分子量が１９５４．１５ダルトンであることを示した。
【０１７１】
以下に示すように、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳＫＧＳＧＳＫＧＳＫ（配列番号１）の配列を有するペプチド７のＮ末端をジベンゾシクロオクチン−酸（ＤＢＣＯ−酸）により修飾し、Ｃ末端をアミド樹脂により修飾した。ペプチド７は、中心コアとして機能し、そのＮ末端に成分又はリンカーユニットとクリック反応するための１つのＤＢＣＯ基を有する。
【０１７２】
2020510097.tif 000030
ＤＢＣＯ含有ペプチド７の精製サンプルを逆相分析ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍＸ４．６ｍｍ；５μｍ）；移動相：アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：０％〜７３％；３０分間以上、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：２５℃）により分析し、３００ｎｍでのＵＶ吸光度を測定した。図１０Ａは、ＤＢＣＯ含有ペプチド７の逆相分析ＨＰＬＣプロファイルをし、保持時間：１９．１６６分間にピークを有する。
【０１７３】
合成したＤＢＣＯ含有ペプチド７をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより測定した。図１０Ｂは、ＤＢＣＯ含有ペプチド７の分子量が１７３４．７３ダルトンであることを示した。
【０１７４】
以下に示すように、ＳＫＳＫＳＫ（配列番号６）の配列を有するペプチド８のＮ末端は、アジド−Ｘａａ６−酸により修飾され、Ｃ末端がアミド樹脂によりアミド化された。ペプチド８（以下に示す）は、同じスペーサー配列（即ち、単一のＳ残基）によって分離された３つのＫ残基を含む。このアジド含有ペプチド８のｍ．ｗ．は１０２４．１７ダルトンである。
【０１７５】
2020510097.tif 000031
以下に示すように、ペプチド９は、ＫＫＫの配列（即ち、Ｋ残基の間にスペーサーがない）を有し、そのＮ末端がプロパルギル−Ｘａａ６酸により修飾され、そのＣ末端がＣ末端第一級アミド化により修飾された。図１１Ａにおけるデータは、アルキン−ペプチド９のｍ．ｗ．が７３２．４５４ダルトンであることを示す。
【０１７６】
2020510097.tif 000032
以下に示すように、ペプチド１０（ＫＳＫＧＫ；配列番号７）のＮ末端は酢酸により修飾され、そのＣ末端はアミン−Ｘａａ８−アジドにより修飾された。中心コアとして、ペプチド１０は、Ｎ末端にあるアミノ基をブロックする１つのアセチル基、及び又はリンカーユニットとクリック反応するためのＣ末端にある１つのアジド基を有する。ペプチド１０は、３つのＫ残基を含み、第１のＫ残基と第２のＫ残基の間のスペーサーがＳであり、第２のＫ残基と第３のＫ残基の間のスペーサーがＧである。図１１Ｂは、ペプチド１０の分子量が１００９ダルトンであることを示す。
【０１７７】
2020510097.tif 000033
実施例４：マルチアームリンカーユニットを構築するためのペプチドコアとしての二重結合基含有ペプチド１１（配列番号８）の直接合成
以下に示すように、ペプチド１１は、ＧＧＳＧＧＳＫＧＳＳＧＫＧＧＳＧＧＳ（配列番号８）のアミノ酸配列を有し、そのＮ末端がエキソ−５−ノルボルネンカルボン酸により修飾され、そのＣ末端が３−アジド−プロピルアミンにより修飾された。中心リンカーユニットを構築するための中心コアとして機能するペプチド１１（以下に示す）は、Ｎ末端にクリック反応により成分又はリンカーユニットと結合するためのエキソ−５−ノルボルネニル基を有し、Ｃ末端にクリック反応により他の成分又はリンカーユニットと結合するためのアジド基を有する。二重結合基含有ペプチド１１は、ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄによって調製された。
【０１７８】
2020510097.tif 000034
実施例５：コレシストキニンオクタペプチド（ＣＣＫ８）セグメント（配列番号９）の合成
ＣＣＫ８含有ペプチドは、ＣＧＧＧＧＳＤＹＭＧＷＭＤＦ（配列番号９）の配列を有し、そのＮ末端が酢酸により修飾され、そのＣ末端がアミド樹脂によりアミド化された。ＣＣＫ８含有ペプチドは、ＣＣＫの８−アミノ酸残基及び６つのアミノ酸残基（ＣＧＧＧＧＳ；配列番号１０）の連続したＮ末端延長部から構成され、これにより、そのＮ末端は、システイン残基である。Ｎ末端システイン残基は、本開示に係るリンカーユニットのＰＥＧ−マレイミドリンクアームと結合するためのＳＨ基を提供する。このペプチドは、ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏ．，Ｌｔｄによって調製された。
【０１７９】
合成したＣＣＫ８含有ペプチドをＥＳＩ−ＭＳにより測定した。質量分析ＥＳＩ（図１２Ａ）により生成物を分析し、データは、（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋−ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ６５Ｈ８６Ｎ１６Ｏ２１Ｓ３  １５２３．６７；ｆｏｕｎｄ  １５２３．５４１８を示す。ＭＳスペクトルにおいて、［Ｍ＋Ｈ＋１］＋、［Ｍ＋Ｈ＋２］＋、［Ｍ＋Ｈ＋３］＋及び［Ｍ＋Ｈ＋４］＋に対応する１５２４．５４４８、１５２５．５４５８、１５２６．５４５８及び１５２７．５４５８に４つの同位体ピークが観察された。
【０１８０】
実施例６：ＣＣＫ８含有ペプチドとＭａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳの結合
ＣＣＫ８含有ペプチドのチオール基をヘテロ二官能性架橋剤であるＭａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳとを反応させた。ペプチドを１０ｍＭの最終濃度で１００％ＤＭＳＯに溶解し、ヘテロ二官能性架橋剤であるＭａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳを２５０ｍＭの最終濃度で１００％ＤＭＳＯに溶解した。Ｍａｌ−ＰＥＧ６−ＮＨＳ架橋剤を１０ｍＭの最終濃度（１０ｍＭのペプチド溶液に対してモルで１倍過剰）で溶解したペプチド溶液に加えた。反応混合物を室温で一晩インキュベートした。
【０１８１】
ＣＣＫ８−ＰＥＧ６−ＮＨＳを逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍＸ１０ｍｍ；５μｍ）；移動相：アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：３０％〜１００％；３０分間以上、流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：２５℃）により精製した。ＤＭ１−ＰＥＧ６−ＮＨＳの逆相ＨＰＬＣの溶出プロファイルは、２５４ｎｍでのＵＶ吸光度の測定することにより監視された。
【０１８２】
合成したＣＣＫ８−ＰＥＧ６−ＮＨＳ（以下に示す）を質量分析ＥＳＩ（図１２Ｂ）により分析した。データは、（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋２Ｈ］２＋−ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ９１Ｈ１２５Ｎ１９Ｏ３４Ｓ３  ２１２５．２８；ｆｏｕｎｄ  ２１２３．７９を示す。ＭＳスペクトルにおいて、［Ｍ＋２Ｈ＋１］２＋、［Ｍ＋２Ｈ＋２］２＋、［Ｍ＋２Ｈ＋３］２＋、［Ｍ＋２Ｈ＋４］２＋及び［Ｍ＋２Ｈ＋５］２＋に対応する１０６３．３９８、１０６３．８９７８、１０６４．４００３、１０６４．９０２２及び１０６５．４０６１にも同位体ピークが観察された。
【０１８３】
実施例７：メルタンシン（ＤＭ１）とＭａｌ−ＰＥＧ６−ＣＯ２Ｈの結合
ＤＭ１は、ＡＬＢ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ，Ｃｈｉｎａから購入された。ＳＨ基を有するＤＭ１とヘテロ二官能性架橋剤との結合、及び生成物の精製は、上記の実施例と同様であった。
【０１８４】
簡単に言えば、ＤＭ１分子のチオール基をヘテロ二官能性架橋剤であるＭａｌ−ＰＥＧ６−ＣＯ２Ｈと反応させた。ＤＭ１を１０ｍＭの最終濃度で１００％ＤＭＳＯに溶解し、Ｍａｌ−ＰＥＧ６−ＣＯ２Ｈを２５０ｍＭの最終濃度（１０ｍＭのＤＭ１溶液に対してモルで１倍過剰）で１００％ＤＭＳＯに溶解した。Ｍａｌ−ＰＥＧ６−ＣＯ２Ｈ架橋剤を１０ｍＭの最終濃度で溶解したＤＭ１溶液に加えた。反応混合物を室温で一晩インキュベートした。
【０１８５】
2020510097.tif 000035
ＤＭ１−ＰＥＧ６−ＣＯ２Ｈを逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍＸ１０ｍｍ；５μｍ）；移動相：アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：３０％〜１００％；３０分間以上、流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：２５℃）により精製した。２５４ｎｍでのＵＶ吸光度を測定することにより監視されたＤＭ１−ＰＥＧ６−ＣＯ２Ｈの逆相ＨＰＬＣの溶出プロファイルは、ＤＭ１−ＰＥＧ６−ＣＯ２Ｈの溶出ピークが１１．５分間の保持時間を有することを示した。このように合成したＤＭ１−ＰＥＧ６−ＣＯ２Ｈ（上に示した）の質量分析の結果は、この分子構築物のｍ．ｗ．が１２４２．４２９ダルトンであることを示した。
【０１８６】
実施例８：ペプチドコアとしてのペプチド７及びリンクアームとしてのＴＦＰ−ＰＥＧ１２−Ｍａｌ又はＮＨＳ−ＰＥＧ６−Ｍａｌを有するＤＢＣＯ含有リンカーユニットの合成
この実施例において、ＰＥＧ１２−マレイミドの３つのリンクアームをペプチドコアＤＢＣＯ−ペプチド７に結合した。架橋剤であるＴＦＰ−ＰＥＧ１２−マレイミド［α−マレインイミド−ω−（２．３．５．６−テトラフルオロフェニル−プロピオンアミド）−ドデカエチレングリコール］エステルは、ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎ  Ｉｎｃ（Ｐｌａｉｎ  Ｃｉｔｙ，ＵＳＡ）から購入された。結合プロセスは、製造業者の説明に従って実行された。Ｋ残基を有するペプチドを１０ｍＭの最終濃度で１００％ＤＭＳＯに溶解した。ＴＦＰ−ＰＥＧ１２−マレイミド架橋剤を６０ｍＭの最終濃度（１０ｍＭのペプチド溶液に対してモルで６倍過剰）で溶解したペプチドに加えた。触媒である有機塩基ＤＡＢＣＯ（１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタン）（５当量）を反応混合物に加えた。反応混合物を室温で１８時間以上インキュベートした。
【０１８７】
以下に示すように、このように合成したマレイミド−ＰＥＧ１２結合ＤＢＣＯ−ペプチド７は、ＤＢＣＯ基を有する１つのカップリングアーム及びマレイミド基を有する３つのＰＥＧリンクアームを含む。図１３Ａは、質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果を示す。この結果は、本発明の分子構築物のｍ．ｗ．が３９７８ダルトンであることを示した。
【０１８８】
2020510097.tif 000036
ＰＥＧ６−マレイミドの３つのリンクアームをペプチドコアＤＢＣＯ−ペプチド７に結合した。架橋剤であるＮＨＳ−ＰＥＧ６−マレイミド（スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミド−プロピオンアミド）−ヘキサエチレングリコール］）エステルは、Ｃｏｎｊｕ−ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃから購入された。結合プロセスは、製造業者の説明に従って実行された。Ｋ残基を有するペプチドを１０ｍＭの最終濃度で１００％ＤＭＳＯに溶解した。ＮＨＳ−ＰＥＧ６−マレイミド架橋剤を６０ｍＭの最終濃度（１０ｍＭのペプチド溶液に対してモルで６倍過剰）で溶解したペプチドに加えた。触媒である有機塩基ＤＡＢＣＯ（５当量）を反応混合物に加えた。反応混合物を室温で１８時間以上インキュベートした。
【０１８９】
このように合成したマレイミド−ＰＥＧ６結合アジド−ペプチド７は、ＤＢＣＯ基を有する１つのカップリングアーム及びマレイミド基を有する３つのＰＥＧリンクアームを含む。結果は、分子量が３１８６．６８７ダルトンであることを示す（図１３Ｂ）。
【０１９０】
実施例９：ＮＨＳ−ＰＥＧ６−Ｍａｌをアジド含有ペプチド８のＮＨ２基と結合することによるマルチアームリンカーユニットの合成
上述した実施例に記載のプロトコルに従って架橋剤の合成を実行した。このように合成したＰＥＧ６−マレイミド結合アジド−ペプチド８をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより測定した。
【０１９１】
以下に示すように、このように合成したマレイミド−ＰＥＧ６結合アジド−ペプチド８は、アジド基を有する１つのカップリングアーム及びマレイミド基を有する３つのＰＥＧリンクアームを含む。図１４は、質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果を示す。この結果は、本発明の分子構築物のｍ．ｗ．が１０２４．６２７ダルトンであること示した。
【０１９２】
2020510097.tif 000037
実施例１０：ＮＨＳ−ＰＥＧ６−Ｍａｌをアルキン含有ペプチド９のＮＨ２基と結合することによるマルチアームリンカーユニットの合成
上述した実施例に記載のプロトコルに従って架橋剤の合成を実行した。このように合成したＰＥＧ６−マレイミド結合アルキン−ペプチド９をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより測定した。
【０１９３】
以下に示すように、このように合成したマレイミド−ＰＥＧ６結合アルキン−ペプチド９は、アルキン基を有する１つのカップリングアーム及びマレイミド基を有する３つのＰＥＧリンクアームを含む。図１５は、質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果を示す。この結果は、本発明の分子構築物のｍ．ｗ．が２１９４．１３ダルトンであること示した。
【０１９４】
2020510097.tif 000038
実施例１１：ペプチドコアとしてのペプチド１２（配列番号１１）及びリンクアームとしてのＲＳＧＳＳＧ（配列番号１２）を有するノルボルネン含有リンカーユニットの直接合成
ペプチドコアとしてのペプチド１２及びリンクアームとしてのペプチドＲＳＧＳＳＧ（配列番号１２）を有するノルボルネン含有リンカーユニットを標準Ｆｍｏｃ化学法による人工合成により合成した。以下に示すように、リンクアームのＮ末端をフェニルマレイミド基により修飾した。本発明者らは、リンカーユニットを設計し、フェニルマレイミド修飾リンクアームを有するノルボルネン含有リンカーユニットの調製をＯＮＴＯＲＥＳ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｃｈｉｎａ）に委託した。
【０１９５】
2020510097.tif 000039
フェニルマレイミド修飾リンクアームを有するノルボルネン含有リンカーユニットの精製サンプルを逆相分析ＨＰＬＣ（カラム：Ｃ１８カラム（２５０ｍｍＸ４．６ｍｍ；５μｍ）；移動相：アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：２７％〜４７％；２０分間以上、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：３０℃）により分析した。
質量分析法ＥＳＩ−ＭＳによりフェニルマレイミド修飾リンクアームを有するノルボルネン含有リンカーユニットを同定した。
【０１９６】
フェニルマレイミド修飾リンクアームを有する本発明のノルボルネン含有リンカーユニットは、ノルボルネン基を有する１つのカップリングアーム及びそれぞれの遊離末端にフェニルマレイミド修飾を有する３つのリンクアームを含むペプチドコアに基づくリンカーユニットである。このように合成したリンカーユニットの質量分析法の結果は、９６６に強い分子イオンを示し、［Ｍ＋３Ｈ］３＋に対応し、リンカーユニットの実際の分子量が２８９５ダルトンであることを示した。
【０１９７】
実施例１２：ペプチドコアとしてのペプチド１３（配列番号１）及びリンクアームとしてのＲＳＧＳＳＧ（配列番号１２）を有するアルキン含有リンカーユニットの直接合成
ペプチドコアとしてのペプチド１３及びリンクアームとしてのＲＳＧＳＳＧ（配列番号１２）を有するアルキン含有リンカーユニットを標準Ｆｍｏｃ化学法による人工合成により直接合成した。以下に示すように、ペプチド１３のＮ末端及びＣ末端は、それぞれ４−ペンチン酸によりアミド化され、メチルアルコールによりエステル化された。リンクアームのＮ末端は、３−マレイミドプロピオン酸により修飾された。本発明者らは、リンカーユニットを設計し、マレイミド修飾リンクアームを有するアルキン含有リンカーユニットの調製をＳｈａｎｇｈａｉ  ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅＣｏ．，Ｌｔｄ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）に委託した。
【０１９８】
マレイミド修飾リンクアームを有するアルキン含有リンカーユニットの精製サンプルを逆相分析ＨＰＬＣ（カラム：クロマシル１００−５  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍＸ４．６ｍｍ；５μｍ）；移動相：アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：５％〜４８％；１５分間以上、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：３５℃）により分析した。図１６は、マレイミド修飾リンクアームを有するアルキン含有リンカーユニットの逆相ＨＰＬＣプロファイルであり、矢尻がピークを示す。
【０１９９】
質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによりマレイミド修飾リンクアームを有するアルキン含有リンカーユニットを同定した。
【０２００】
マレイミド修飾リンクアームを有する本発明のアルキン含有リンカーユニットは、アルキン基を有するカップリングアーム及びそれぞれの遊離末端にマレイミド修飾を有する３つのリンクアームを含むペプチドコアに基づくリンカーユニットである。図１７は、質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果を示す。この結果は、本発明の分子構築物のｍ．ｗ．が３５８３．７０１ダルトンであることを示した。
【０２０１】
2020510097.tif 000040
実施例１３：ペプチドコアとしてのペプチド１４（配列番号１３）及びリンクアームとしてのＳＧＳＳＧＳＳＧ（配列番号１４）を有するメチルテトラジン含有リンカーユニットの直接合成
ペプチドコアとしてのペプチド１４及びリンクアームとしてのＳＧＳＳＧＳＳＧ（配列番号１４）を有するメチルテトラジン含有リンカーユニットを標準Ｆｍｏｃ化学法による人工合成により直接合成した。以下に示すように、リンクアームのＮ末端は、３−マレイミドプロピオン酸により修飾された。本発明者らは、リンカーユニットを設計し、マレイミド修飾リンクアームを有するメチルテトラジン含有リンカーユニットの調製をＳｈａｎｇｈａｉ  ＷｕＸｉ  ＡｐｐＴｅｃｈ  Ｃｏ．，Ｌｔｄに委託した。
【０２０２】
マレイミド修飾リンクアームを有するメチルテトラジン含有リンカーユニットの精製サンプルを逆相分析ＨＰＬＣ（カラム：Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ  ５ｕ  Ｃ１８カラム、１５０ｍｍＸ４．６ｍｍ、４μｍ；移動相：アセトニトリル及び０．１％のトリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：１０％〜４０％；流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ（２０分間以上）；カラム温度：３０℃）により分析した。
【０２０３】
2020510097.tif 000041
質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによりマレイミド修飾リンクアームを有するメチルテトラジン含有リンカーユニットを同定した。
【０２０４】
本発明のマレイミド修飾リンクアームを有するメチルテトラジン含有リンカーユニットは、メチルテトラジン基を有する１つのカップリングアーム及びそれぞれの遊離末端にマレイミド修飾を有する３つのリンクアームを含むペプチドコアに基づくリンカーユニットである。質量分析法ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果は、本発明の分子構築物のｍ．ｗ．が１０３８ダルトンであることを示した。
【０２０５】
実施例１４：ＮＨＳ−ＰＥＧ６−ＣＣＫ８とＤＢＣＯ含有ペプチド７のＮＨ２基との結合
この実施例では、３つのＰＥＧ６−ＣＣＫ８をペプチドコアＤＢＣＯ含有ペプチド７に結合した。ＮＨＳ−ＰＥＧ６−ＣＣＫ８は、上述した実施例で調製された。
【０２０６】
結合プロセスは、製造業者の説明に従って実行された。Ｋ残基を有するペプチドを１ｍＭの最終濃度で１００％ＤＭＳＯに溶解した。上述した実施例で調製されたＮＨＳ−ＰＥＧ６−ＣＣＫ８を６ｍＭの最終濃度（１ｍＭのペプチド溶液に対してモルで６倍過剰）で溶解したペプチドに加えた。触媒である有機塩基ＤＡＢＣＯ（５０当量）を反応混合物に加えた。反応混合物を室温で１８時間以上インキュベートした。ＣＣＫ８−ＰＥＧ６結合ＤＢＣＯ−ペプチド７を逆相ＨＰＬＣカラム：Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  ＳＰＨＥＲ−３００  Ｃ１８カラム（２５０ｍＭＸ３０ｍｍ；３００オングストローム；５μｍ）；移動相：アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：０％〜７３％；２８分間以上、流速：２７．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：２５℃）により精製した。
【０２０７】
以下に示すように、このように合成したＣＣＫ８−ＰＥＧ６結合ＤＢＣＯ−ペプチド７は、ＤＢＣＯ基を有する１つのカップリングアーム及びＣＣＫ８ペプチドを有する３つのＰＥＧリンクアームを含む。データは、（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋−  ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ３３４Ｈ４７０Ｎ７７Ｏ１１９Ｓ９  ７７５１．０５７４；ｆｏｕｎｄ  ７７５１．０５３３を示す。ＭＳスペクトルにおいて、それぞれ［Ｍ＋Ｈ＋１］＋、［Ｍ＋Ｈ＋２］＋、［Ｍ＋Ｈ＋３］＋、［Ｍ＋Ｈ＋４］＋、［Ｍ＋Ｈ＋５］＋、［Ｍ＋Ｈ＋６］＋、［Ｍ＋Ｈ＋７］＋、［Ｍ＋Ｈ＋８］＋及び［Ｍ＋Ｈ＋９］＋に対応する７７５２．０７１４、７７５３．０７５９、７７５４．０８１８、７７５５．０８２０、７７５６．０８４９、７７５７．０３５３、７７５８．０６４７、７７５９．０８４４及び７７６０．０６３６にも９つの同位体ピークが観察された（図１８）。
【０２０８】
2020510097.tif 000042
実施例１５：ＣＯ２Ｈ−ＰＥＧ６−ＤＭ１とアジド含有ペプチド２のＮＨ２基との結合
このように合成したアジド含有ペプチド２（ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅＩｎｃ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）を１０ｍＭの最終濃度で１００％ＤＭＳＯに溶解した。ＣＯ２Ｈ−ＰＥＧ６−ＤＭ１は、上述した実施例で調製された。
【０２０９】
アジド含有ペプチド２及び有機塩基ＤＭＡＰを１／１５のモル比で１００％ＣＨ２Ｃｌ２に混合した。ＣＯ２Ｈ−ＰＥＧ６−ＤＭ１をアジド含有ペプチド２と結合する前に、エチル（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を１／２（ＣＯ２Ｈ−ＰＥＧ６−ＤＭ１：ＥＤＣ）のモル比でＣＯ２Ｈ−ＰＥＧ６−ＤＭ１の１００％ＣＨ２Ｃｌ２溶液に加え、インキュベートしてＣＯ２Ｈ−ＰＥＧ６−ＤＭ１分子のＣＯ２Ｈ基を活性化させた。次いで、ＥＤＣ活性化ＣＯ２Ｈ−ＰＥＧ６−ＤＭ１を最終モル比１／６（アジド含有ペプチド２：ＣＯ２Ｈ−ＰＥＧ６−ＤＭ１）でアジド含有ペプチド２の１００％  ＣＨ２Ｃｌ２溶液に加えた。反応混合物をさらに室温で一晩インキュベートした。
【０２１０】
アジド含有ペプチド２を逆相ＨＰＬＣ（カラム：Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍＸ１０ｍｍ；５μｍ）；移動相：アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：０％〜１００％；３０分間以上、流速：３．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：２５℃）により精製した。
【０２１１】
図１９は、５つのＤＭ１分子が結合されたアジド含有ペプチド２の逆相ＨＰＬＣ溶出プロファイルを示し、保持時間：１７．８分間にピークを有する。図２０は、このように合成した５つのＤＭ１分子が結合されたアジド含有ペプチド２（以下に示す）の質量分析を示し、この分子構築物のｍ．ｗ．が７８５６．２ダルトンであることを示した。
【０２１２】
2020510097.tif 000043
実施例１６：ペプチドコアとしてのアジド含有ペプチド１５（配列番号１５）及びＣＣＫ８ペプチドを有する標的化成分リンクアームとしてのＥＧＧＧＧＳＤＹＭＧＷＭＤＦ（配列番号１６）を含むＣＣＫ８含有標的化バンドルの直接合成
この実施例では、ＣＣＫ８含有標的化バンドルを合成した。標的化バンドル（以下に示すように）は、アジド含有ペプチド１５（ペプチドコアとして）及びＥＧＧＧＧＳＤＹＭＧＷＭＤＦ（配列番号１６）の配列を有する４分岐アームを含む。上記分岐アームは、リンクアーム配列（ＥＧＧＧＧＳ；配列番号１７）及びＣＣＫオクタペプチド（ＤＹＭＧＷＭＤＦ；配列番号１８）から構成され、その遊離末端に第一級アミド修飾を有する。ＣＣＫ８含有標的化バンドルは、標準Ｆｍｏｃ化学法による人工合成により合成された。本発明者らは、ＣＣＫ８−標的化バンドルを設計し、リンカーユニットの調製をＳｈａｎｇｈａｉ  ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅＣｏ．，Ｌｔｄ．（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）に委託した。
【０２１３】
2020510097.tif 000044
ＣＣＫ８含有標的化バンドルの精製サンプルを逆相分析ＨＰＬＣ（カラム：クロマシル１００−５  Ｃ１８カラム（２５０ｍｍＸ４．６ｍｍ；５μｍ）；移動相：アセトニトリル及び０．１％トリフルオロ酢酸；アセトニトリルの線形勾配：３５％〜８４％；１５分間以上、流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ；カラム温度：３５℃）により分析した。図２１の逆相ＨＰＬＣプロファイルは、ＣＣＫ８−標的化バンドルの溶出ピークが８．９８８分間の保持時間を有することを示し、２５４ｎｍでＵＶ吸光度を測定した。ＣＣＫ８含有標的化バンドルの純度は９５．２５％である。
【０２１４】
質量分析法ＥＳＩ−ＴＯＦによりＣＣＫ８含有標的化バンドルを同定した。図２２は、質量分析法ＥＳＩ−ＴＯＦの結果を示す。この結果は、本発明の分子構築物のｍ．ｗ．が１６０８．６９４４ダルトンであることを示した（（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ（ｚ＝５）：［Ｍ＋５Ｈ］５＋）。
【０２１５】
実施例１７：Ｅｘｐｉ２９３Ｆ過剰発現システムによるヒトＣＤ３に特異的なｓｃＦｖの調製
変異テプリズマブのｓｃＦｖを調製するために、ヒト化抗体のＶＨ及びＶＬのＤＮＡ配列をコドン最適化なしで使用した。ＶＨ−ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１９）−ＶＬ−（ＧＧＧＧＳ）２（配列番号２０）−ＣをコードするＤＮＡ配列を合成した。変異テプリズマブ抗体分子は、ＶＨのＣＤＲ３にシステイン残基を有するため、上記のＳＨ−マレイミド結合を防げる。そのため、本発明者らは、システイン残基をセリン残基に置換する変異テプリズマブを調製した。本発明の実験で調製したヒトＣＤ３に特異的なｓｃＦｖのアミノ酸配列は、配列番号２１に示される。
【０２１６】
哺乳動物発現システムを用いて組換えタンパク質を調製するために、Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞株に基づく過剰発現システムを用いた。該システムは、Ｅｘｐｉ２９３ＦＴＭ細胞株、カチオン性脂質系ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３試薬、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３トランスフェクションエンハンサー１、２、及び発現システムの一部である培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＵＳＡ）を含むＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３トランスフェクションキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＵＳＡ）を使用した。
【０２１７】
遺伝子をコードする配列をｐｃＤＮＡ３発現カセットに入れた。Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞を２．０×１０６  生存細胞／ｍｌの密度でＥｘｐｉ２９３Ｆ発現培地に接種した後、トランスフェクションの際に細胞が活発な分裂の状態にあることを確保するために、１８〜２４時間維持した後トランスフェクションした。トランスフェクションの際に、７．５×１０８個の細胞を入れた２５５ｍｌの培地を２Ｌのエルレンマイヤーシェーカーフラスコに入れた後、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３トランスフェクション試薬でトランスフェクションした。トランスフェクション後、オービタルシェーカー（１２５ｒｐｍ）においてトランスフェクションされた細胞を３７°Ｃで１６〜１８時間インキュベートし、次いで、そこにＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ２９３トランスフェクションエンハンサー１及びエンハンサー２を加えた後、引き続き、５又は６日インキュベートした。培養上清液を回収し、プロテインＬアフィニティークロマトグラフィーにより培地における発現されたｓｃＦｖ組換えタンパク質を精製した。
【０２１８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析は、ｓｃＦｖのｍ．ｗ．が２７６４３ダルトンであることを示した。ＣＤ３に特異的な変異テプリズマブｓｃＦｖの純度を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシー染色によって分析した。図２３Ａは、変異テプリズマブの精製ｓｃＦｖのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【０２１９】
実施例１８：  Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株上のヒトＣＤ３に対する変異テプリズマブｓｃＦｖの結合能力の染色分析
Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株によりＣＤ３を発現するヒトＴリンパ球に対する変異テプリズマブの結合能力を検討した。Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株上のヒトＣＤ３分子に対する変異テプリズマブの結合能力を分析した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、細胞表面にＴ細胞受容体（ＴｃＲ）／ＣＤ３複合体を発現するヒトＴリンパ球細胞の不死化細胞である。
【０２２０】
２ｘ１０６個のＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞をＰＢＳ（１％ＦＢＳ及び０．１％アジ化ナトリウムを含む）における０．１又は１μｇ／ｍｌのｓｃＦｖと共に氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、ＢＳ／ＦＢＳで１：２００に希釈したＦＩＴＣ結合プロテインＬ（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｎｅｗａｒｋ，ＵＳＡ）と共に暗所で４℃で３０分間インキュベートした。プロテインＬ−ＦＩＴＣ及びＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウスＩｇＧ．Ｆｃ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）を二次抗体として用いた。二次抗体のみの染色を陰性対照として用いた。ＯＫＴ３（ヒトＣＤ３に特異的なマウスモノクローナル抗体）を陽性対照として用いた。細胞の染色をＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。ヒストグラムのｘ軸は蛍光強度である。図２３Ｂは、変異テプリズマブがＴ細胞に結合したことを示す。
【０２２１】
実施例１９：ＣＤ３に特異的なＤＢＣＯ−ｓｃＦｖの調製
上記の実施例と同様に、配列番号１２をコードするＤＮＡ配列を合成し、発現した。ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖのＶＬ及びＶＨの配列は、変異テプリズマブのＶＬ及びＶＨの配列である。Ｍａｌ−ＰＥＧ５−ＤＢＣＯ（Ｃｏｎｊｕ−ｐｒｏｂｅ，Ｉｎｃ．）との結合において、変異テプリズマブの精製ｓｃＦｖのＣ末端にあるシステイン残基を、モル比１：１（［ＴＣＥＰ］：［ｓｃＦｖ］）でトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）と共に室温で３時間静かに振とうすることにより還元した。ＮＡＰ−１０  Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５カラムを用いて、還元型抗ＣＤ３ｓｃＦｖを含む緩衝液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール及び５ｍＭ  ＥＤＴＡ）に置換した。還元反応及び緩衝液交換の後、室温でＭａｌ−ＰＥＧ５−ＤＢＣＯとｓｃＦｖとを１：１のモル比で一晩を反応させることにより結合を行った。余分な架橋剤を脱塩カラムで除去し、ＤＢＣＯ結合ｓｃＦｖ生成物を分析した。
【０２２２】
質量分析ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦの結果は、ＤＢＣＯ結合ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖのサンプルのｍ．ｗ．が２８１４８ダルトンであることを示した。複数のＤＢＣＯ結合ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖの純度（データは示されていない）を、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシー染色によって分析した。図２３Ｃは、ＤＢＣＯ結合ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖ及び抗ＣＤ３ｓｃＦｖのフローサイトメトリー分析の結果を示す（陽性対照）。結果は、非結合ｓｃＦｖと同様に、本発明のＤＢＣＯ結合ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖもＴ細胞に結合することを証明した。
【０２２３】
実施例２０：ＣＣＫ型Ｂ受容体発現腫瘍細胞株に対するＣＣＫ８ペプチド分子の結合能力の染色分析
Ｐａｎｃ−１腫瘍細胞株上のヒトＣＣＫ８型Ｂ受容体分子に対するＣＣＫ８ペプチド分子の結合能力を分析した。Ｐａｎｃ−１は、５６歳の白人からの膵臓十二指腸切除標本から抽出された膵臓がん細胞に由来する。この細胞株の悪性度は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで検証された。
染色前に、Ｃｙｓ含有ＣＣＫ８ペプチドをマレイミド−ＦＩＴＣと結合して、ＦＩＴＣ標識ＣＣＫ８ペプチドをＦＩＴＣを有する検出ＣＣＫ８分子として調製した。次いで、２ｘ１０６個のＰａｎｃ−１細胞をＰＢＳ（１％ＦＢＳ及び１％アジ化ナトリウムを含む）における１５０μｇ／ｍｌのＣＣＫ８−ＦＩＴＣ分子の反応混合物と共に暗所で３０分間インキュベートした。マレイミド−ＦＩＴＣのみの染色を陰性対照として用いた。細胞の染色をＦＡＣＳ（ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により分析した。ヒストグラムのｘ軸は蛍光強度である。図２４において、暗い領域は、Ｐａｎｃ−１細胞の蛍光分布の背景を表し、破線は、マレイミド−ＦＩＴＣで染色されたＰａｎｃ−１細胞の蛍光分布であり、暗線は、ＣＣＫ８−ＦＩＴＣで染色されたＰａｎｃ−１細胞の蛍光分布である。染色分析の結果は、ＦＩＴＣ標識ＣＣＫ８ペプチド分子がＰａｎｃ−１細胞に結合したことを示す。
【０２２４】
実施例２１：４アームＣＣＫ８含有標的化バンドル及び１つのエフェクター成分としてのＣＤ３に特異的なｓｃＦｖを有する分子構築物の調製
この実施例において、上記の実施例のＣＣＫ８含有標的化リンカーユニットとＤＢＣＯ−ＣＤ３に特異的なｓｃＦｖのエフェクター成分とをＳＰＡＡＣ反応により結合した。上記のように、標的化リンカーユニットは、配列番号１６の配列及び１つの遊離アジド基を有する分岐アームを含む。
【０２２５】
ＳＰＡＡＣ反応のプロセスを製造業者（Ｃｏｎｊｕ−Ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃ．）の説明に従って実行された。簡単に言えば、１１３μｌの標的化リンカーユニット（１２．４ｍｇ／ｍｌ）を１：１のモル比（［アジド］：［ＤＢＣＯ］）でエフェクター成分を含む溶液に加えた。反応混合物を室温で３時間インキュベートした。
【０２２６】
生成物は、以下に示すように、ＣＣＫ８を含む４つのアーム及び１つのエフェクター成分としてのＣＤ３に特異的なｓｃＦｖを有する単一のリンカーユニット分子構築物である。結合後の反応混合物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果は、本発明の分子構築物のサイズが予想サイズと同じであることを示した。
【０２２７】
2020510097.tif 000045
実施例２２：３つのＣＣＫ８ペプチド分子を有する標的化リンカーユニット及び５つのＤＭ１分子を有するエフェクターリンカーユニットから構成されるジョイント−リンカー分子構築物の調製
ＳＰＡＡＣ反応のプロセスは、上記の実施例と同様に行われた。
【０２２８】
この実施例において、３つのＣＣＫペプチド分子及び１つの遊離ＤＢＣＯ基を有する標的化リンカーユニットと、５つのＤＭ１分子及び１つの遊離アジド基を有するエフェクターリンカーユニット（薬物バンドル）とを上記実施例に記載のＳＰＡＡＣ反応により結合した。以下に示すように、得られたジョイント−リンカー分子構築物は、３つのＣＣＫ８ペプチド、及び５つのＤＭ１分子を有する１つの薬物バンドルを含む。データは、（ＥＳＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ：［Ｍ＋Ｈ］＋−ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ  ｆｏｒ  Ｃ６８６Ｈ９９３Ｎ１２９Ｏ２４６Ｓ１４Ｃｌ５Ｎａ１  １５６３２．０７；ｆｏｕｎｄ  １５６３０．６１８６を示した。ＭＳスペクトルにおいて、６つの同位体ピークは、［Ｍ＋Ｈ＋１］＋、［Ｍ＋Ｈ＋２］＋、［Ｍ＋Ｈ＋３］＋、［Ｍ＋Ｈ＋４］＋、［Ｍ＋Ｈ＋５］＋及び［Ｍ＋Ｈ＋６］＋に対応する１５６３１．６６９９、１５６３２．６８７７、１５６３３．５７１２、１５６３４．４５０７、１５６３５．５３０２及び１５６３７．６９３３にも観察された（図２５）。
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【０２２９】
実施例２３：ＭＡＬＴＩ−ＴＯＦ質量分析によるグルタチオンの存在下での合成したＤＢＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミド結合ペプチド１６（配列番号２２）とメチルテトラジン−ＰＥＧ４−マレイミド結合ペプチド１６（配列番号２２）とのチオール交換付加物の分析
反応混合物のｐＨが６．５から７．５である場合、マレイミド基は、スルフヒドリル含有分子と特異的に反応することができる。チオールのマレイミドへのマイケル付加は、チオール−マレイミド付加物を形成するためのさまざまな生体結合に一般的に使用されている。しかし、チオール−マレイミド付加物は、生理学的条件下でチオール交換により破壊的に切断される可能性がある。いわゆるレトロチオール−マイケル反応は、チオール−マレイミド付加物の分解をもたらし、付加物の安定性を低下させる可能性がある。
【０２３０】
この実施例において、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析により、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミド結合ペプチド１６及びメチルテトラジン−ＰＥＧ４−マレイミド結合ペプチド１６について、水溶液におけるチオール含有グルタチオン分子の存在下での合成したカップリング基を有するチオール−マレイミドペプチドコアのチオール−マレイミド交換を検討した。ＤＢＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミド結合ペプチド１６を以下のように調製した。ペプチド１６を標準固相法により合成した（本発明者らは、ペプチド１６の調製をＳｈａｎｇｈａｉ  ＣｈｉｎａＰｅｐｔｉｄｅＣｏ．，Ｌｔｄに委託した）。ペプチド１６（アセチル−ＣＧＧＳＧＧＳＧＧＳＫＧＳＧＳＫＧＳＫ；配列番号２２）は、９５％の純度を有し、ペプチド１６のＮ末端がアセチル基により修飾された。ヘテロ二官能性架橋剤であるＤＢＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミドは、Ｃｏｎｊｕ−ｐｒｏｂｅ  Ｉｎｃから購入された。上記実施例と同様に、架橋剤であるＤＢＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミドとペプチド１６とをチオール−マレイミド反応により結合した。このように合成したＤＢＣＯ−ペプチド１６のｍ．ｗ．は２２２７であるダルトンである（以下に示す）。
【０２３１】
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次いで、このように合成したＤＢＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミドペプチド１６をグルタチオンと１：１０（［ペプチド］：［グルタチオン］）で１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０；１００ｍＭのＮａＣｌを含む）において３７ｏＣで２４、４８、及び７２時間インキュベートした。得られた反応混合物をさらにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。結果は、７２時間のチオール−マレイミド交換によるインキュベーション後のＤＢＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミドグルタチオン付加物（以下に示す）は、分子量が９４０．３８５ダルトンであることを示す（図２６Ａ）。
【０２３２】
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ＤＢＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミド結合ペプチド１６の調製での説明と同様に、メチルテトラジン−ＰＥＧ４−マレイミド結合ペプチド１６を調製し、分析した。このように合成したメチルテトラジン−ＰＥＧ４−マレイミドペプチド１６のｍ．ｗ．は２１１１．２ダルトンである（以下に示す）。
【０２３３】
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このように合成したグルタチオンを有するメチルテトラジン−ＰＥＧ４−マレイミドペプチド１６の反応は、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ３−マレイミドペプチド１６とグルタチオンとの反応の条件と同じである。得られた反応混合物をさらにＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより分析した。質量分析の結果は、７２時間のインキュベーション後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによりメチルテトラジン−ＰＥＧ４−マレイミドグルタチオン付加物（以下に示す）が観察され（図２６Ｂ）、付加物の分子量が８２６．３９７ダルトンである。
【０２３４】
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実施例２４：Ｐａｎｃ−１腫瘍細胞株に対する４つのＣＣＫ８ペプチド分子を有する標的化リンカーユニット及び１つの抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ分子を有するエフェクター部分から構成される分子構築物のＴ細胞媒介細胞毒性分析
ヒト末梢血Ｔ細胞をＴ細胞の供給源として用いた。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）遠心分離により、健常ドナーからのバフィーコート（台湾血液サービス財団）から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、９０％ＦＢＳ／１０％ＤＭＳＯで凍結保存しておいた。ヒトＰａｎ  Ｔ細胞分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて、非Ｔ細胞の枯渇（陰性選択）により、ＰＢＭＣからヒトＴ細胞を調製した。Ｔ細胞を１０μ／ｍｌの組換えヒトＩＬ−２（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ，Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＵＳＡ）の存在下で培養した。抗ＤＮＰ  ＡＮ０２  ｍＡｂをアイソタイプ一致対照として用いた。
【０２３５】
５，０００個のＰａｎｃ−１標的細胞のアリコート（１００μｌ完全ＲＰＭＩ培地における）に、４つのＣＣＫ８ペプチドを有する標的化部分及び１つの抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ分子を有するエフェクター部分から構成される分子構築物、又は４つのＣＣＫ８ペプチドを有する標的化部分のみを含む分子構築物（陰性対照）と共に、７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で３０分間培養した後、ヒトＴ細胞と異なるＥ：Ｔ比（２０：１、１０：１又は５：１）で混合した。インキュベーションの２４時間後、ａＣｅｌｌａ−Ｔｏｘ  ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）を用いて、製造業者の説明に従って、発光法により細胞毒性を分析した。プレートルミノメーター（マルチ検出マイクロプレートリーダー、ＤＰｈａｒｍａ、Ｏｓａｋａ、Ｊａｐａｎ）で細胞プレートを読み取った。
【０２３６】
Ｐａｎｃ−１腫瘍細胞を用いて、４つのＣＣＫ８ペプチドを有する標的化部分及び１つの抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ分子を有するエフェクター部分から構成される分子構築物の、ＣＣＫ８型Ｂ受容体発現腫瘍細胞に対するＴ細胞媒介細胞溶解を調べた。上記実施例と同様に、４つのＣＣＫ８ペプチドを有する標的化部分及び１つの抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ分子を有するエフェクター部分から構成される分子構築物を調製した。
【０２３７】
細胞毒性効果の分析において、ドナー由来の単離されたヒトＴリンパ球を選択して、Ｔ細胞媒介細胞毒性を調べた。Ｐａｎｃ−１細胞を４つのＣＣＫ８ペプチドを有する標的化部分及び１つの抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ分子を有するエフェクター部分から構成される分子構築物（１０μｇ／ｍＬ）と共に３７℃で１時間インキュベートした後、ヒトＴリンパ球と異なるＥ：Ｔ比（２０：１、１０：１又は５：１）で混合し、２４時間インキュベートした。４つのＣＣＫ８ペプチドを有する標的化部分の単独（エフェクター部分がない）及び１つの抗ＣＤ３  ｓｃＦｖを有するエフェクター部分の単独（標的化部分がない）を陰性対照として用いた。ａＣｅｌｌａ−Ｔｏｘ  ｋｉｔにより細胞溶解を分析した。
【０２３８】
実施例２５：Ｐａｎｃ−１腫瘍細胞株に対する３つのＣＣＫ８ペプチド分子を有する標的化リンカーユニット及び５つのＤＭ１分子を有するエフェクターリンカーユニットから構成されるジョイント−リンカー分子構築物の細胞毒性分析
上記実施例と同様に、３つのＣＣＫ８ペプチド分子を有する標的化リンカーユニット及び５つのＤＭ１分子を有するエフェクターリンカーユニットから構成されるジョイント−リンカー分子構築物を調製した。
【０２３９】
Ｐａｎｃ−１細胞（２ｘ１０４／ウェル）を、ＤＭＥＭ培地（１０％のウシ胎仔血清含有）を含有する９６ウェルプレートのウェルに接種した。１８時間後、異なる濃度（１μＭから１０倍希釈）の、３つのＣＣＫ−８ペプチド（薬物バンドルがない）を有するリンカーユニット、５つのＤＭ１分子（薬物バンドルがない）を有するリンカーユニット、及び標的化部分としての３つのＣＣＫ−８ペプチドと、エフェクター部分としての５つのＤＭ１分子とを有する分子構築物で細胞を処理した。６時間インキュベート後、培養培地を新しい培地に交換し、細胞をさらに４８時間インキュベートした。ａｌａｍａｒＢｌｕｅ細胞生存度試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、製造者の説明に従って細胞の生存率を測定した。
【０２４０】
図２７は、３つの治療群のＰａｎｃ−１細胞の生存率の結果を示す。３つのＣＣＫ−８ペプチドの標的化リンカーユニット及び５つのＤＭ１分子の薬物バンドルを有する分子構築物は、約３５％のＰａｎｃ−１細胞の細胞溶解を引き起こした。
【０２４１】
実施形態の上記の説明が単なる例として与えられており、当業者によって様々な変更がなされ得ることが理解されるだろう。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度具体的に、又は１又は複数の個々の実施形態を参照して、上述されているが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を行うことができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
2020510097.tif 000057
【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
2020510097.tif 000059
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
2020510097.tif 000090
【図１７】
2020510097.tif 000091
【図１８】
2020510097.tif 000092
【図１９】
2020510097.tif 000093
【図２０】
2020510097.tif 000094
【図２１】
2020510097.tif 000095
【図２２】
2020510097.tif 000096
【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年11月12日(2019.11.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
コアと、２〜２０個のリンクアームを含むリンカーユニットであって、
前記コアは、複数のリジン（Ｋ）残基、１つ以上のスペーサー及び第１結合部分を含み、
任意の２つの前記Ｋ残基は、互いに隣接するか、又は１つのスペーサーによって分離され、
各前記スペーサーは、それぞれ独立して（１）１つ以上の非Ｋアミノ酸残基、又は（２）２〜１２個のエチレングリコール（ＥＧ）の繰り返し単位を有するＰＥＧ化アミノ酸を含み、
少なくとも１つの前記スペーサーは、Ｎ末端から始まる最初のＫ残基のＮ末端、又はＮ末端から始まる最後のＫ残基のＣ末端に結合され、
前記第１結合部分は、カルボキシル基又はアミン基、及び結合基を含み、前記結合基がアジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基及びシクロオクチン基からなる群より選択される基であり、
前記スペーサーが前記最初のＫ残基のＮ末端に結合される場合、前記第１結合部分は、カルボキシル基を含み、前記スペーサーのα−アミン基とアミド結合を形成することで前記スペーサーに結合され、或いは、
前記スペーサーが前記最後のＫ残基のＣ末端に結合される場合、前記第１結合部分は、アミン基を有し、前記スペーサーのカルボキシル基とアミド結合を形成することで前記スペーサーに結合され、
複数のリンクアームにおいて、
各前記リンクアームは、２〜１２個の非Ｋアミノ酸残基を含むペプチド、又は２〜２４個のＥＧの繰り返し単位を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖であり、
各前記リンクアームは、その一方の末端に反応基を有し、その他方の末端に官能基を有し、前記リンクアームの反応基と前記コアのＫ残基前記のアミン基との間でアミド結合を形成することで前記コアのＫ残基に結合され、
前記官能基は、アミン基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル（ＮＨＳ）基、マレイミド基、ビニルスルホン基、モノスルホン基、メチルスルホニルベンゾチアゾール基、ヨード基、ヨードアセトアミド基、アジド基、アルキン基、シクロオクチン基、テトラジン基、及びシクロオクテン基からなる群より選択され、ただし、前記官能基は、テトラジン基又はシクロオクテン基である場合、前記結合がアジド基、アルキン基又はシクロオクチン基であり、、前記官能基は、アジド基、アルキン基又はシクロオクチン基である場合、前記結合基がテトラジン基又はシクロオクテン基である、リンカーユニット。
【請求項２】
前記スペーサーは、１つ以上のグリシン（Ｇ）及び／又はセリン（Ｓ）残基を含み、
前記反応基は、スクシンイミジルエステル（ＳＥ）基、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル基又はカルボキシル基である、請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項３】
前記コアは、それぞれ前記最初のＫ残基のＮ末端及び前記最後のＫ残基のＣ末端に結合された２つのスペーサーを含み、
前記コアは、第２結合部分をさらに含み、前記第２結合部分は、カルボキシル基又はアミン基、及び結合基を有し、前記結合基は、アジド基、アルキン基、テトラジン基、シクロオクテン基及びシクロオクチン基からなる群より選択され、
前記第１結合部分及び第２結合部分のうちの一方は、前記最初のＫ残基のＮ末端に結合された前記スペーサーのＮ末端に結合され、
前記第１結合部分及び第２結合部分のうちの他方は、前記最後のＫ残基のＣ末端に結合された前記スペーサーのＣ末端に結合される、請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項４】
前記官能基は、マレイミド基、ビニルスルホン基、モノスルホン基、ヨード基又はヨードアセトアミド基であり、
前記第１結合部分及び第２結合部分のうちの一方の結合基は、アジド基、アルキン基又はシクロオクチン基であり、
前記第１結合部分及び第２結合部分のうちの他方の結合基は、テトラジン基又はシクロオクテン基である、請求項６に記載のリンカーユニット。
【請求項５】
前記リンクアームの前記ペプチドは、それぞれ独立してＧ、Ｓ、グルタミン酸（Ｅ）残基、及びアルギニン（Ｒ）残基からなる群より選択される５〜１０個のアミノ酸残基を含む、請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項６】
前記シクロオクテン基は、ノルボルネン基又はトランス−シクロオクテン（ＴＣＯ）基であり、
前記シクロオクチン基は、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）基、ジフルオロシクロオクチン（ＤＩＦＯ）基、ビシクロノニン（ＢＣＮ）基又はジベンゾアザシクロオクチン（ＤＩＢＡＣ）基であり、或いは
前記テトラジン基は、１，２，３，４−テトラジン基、１，２，３，５−テトラジン基、１，２，４，５−テトラジン基、又はその誘導体である、請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項７】
前記コアは、複数の第１成分をさらに含み、
複数の前記第１成分は、それぞれ複数の前記リンクアームとの間でアミド結合又はエステル結合を形成すること、或いはチオール−マレイミド反応、ＳＮ２反応、銅触媒型アジド−アルキン環状付加（ＣｕＡＡＣ）反応、ひずみ促進型アジド−アルキンクリックケミストリー（ＳＰＡＡＣ）反応又は逆電子要請型ディールス・アルダー（ｉＥＤＤＡ）反応により複数の前記リンクアームに結合される、請求項１に記載のリンカーユニット。
【請求項８】
前記コアは、ＣｕＡＡＣ反応、ＳＰＡＡＣ反応又はｉＥＤＤＡ反応により前記結合基に結合される第２成分をさらに含む、請求項７に記載のリンカーユニット。
【請求項９】
各前記第１成分は、第１細胞表面抗原に特異的な第１抗体断片であり、前記第１細胞表面抗原は、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ７２ａ、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８及びＣＤ３１９からなる群より選択され、
前記第２成分は、細胞毒性薬物又は第２細胞表面抗原に特異的な第２抗体断片であり、前記第２細胞表面抗原は、ＣＤ３又はＣＤ１６ａである、請求項８に記載のリンカーユニット。
【請求項１０】
各前記第１成分は、ペプチドホルモン、第１成長因子又は腫瘍関連抗原に特異的な第１抗体断片であり、
前記第２成分は、細胞毒性薬物、トール様受容体アゴニスト、放射性核種と複合体を形成したキレート剤、サイトカイン、又は第２成長因子、細胞表面抗原、ハプテン若しくはサイトカインに特異的な第２抗体断片であり
前記第１成長因子は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、変異型ＥＧＦ、エピレグリン、ヘパリン結合上皮成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ−Ａ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及び肝細胞成長因子（ＨＧＦ）からなる群より選択され、
前記第２成長因子は、ＥＧＦ、変異型ＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ｂＦＧＦ、及びＨＧＦからなる群より選択され、
前記ペプチドホルモンは、セクレチン、コレシストキニン（ＣＣＫ）、ソマトスタチン、オクトレオチド、及び甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）からなる群より選択され、
前記腫瘍関連抗原は、上皮成長因子受容体（ＨＥＲ１）、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、糖鎖抗原１９−９（ＣＡ  １９−９）、ＣＡ  １２５、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ムチン１（ＭＵＣ  １）、ガングリオシドＧＤ２、黒色腫関連抗原（ＭＡＧＥ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、メソセリン、ムチン関連Ｔｎ、シアリルＴｎ、グロボＨ、段階特異的胚抗原−４（ＳＳＥＡ−４）、及び上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）からなる群より選択され、
前記細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、細胞毒性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死１（ＰＤ−１）、プログラム細胞死１リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）からなる群より選択される、請求項８に記載のリンカーユニット。
【請求項１１】
前記コアは、複数の第１成分、第２成分及び第３成分をさらに含み、
複数の前記第１成分は、それぞれ複数の前記リンクアームとの間でアミド結合又はエステル結合を形成すること、或いはチオール−マレイミド反応又はＳＮ２反応により複数の前記リンクアームに結合され、
前記第２成分及び第３成分は、それぞれ前記第１結合部分及び第２結合部分の結合基に結合され、
前記第２成分及び第３成分のうちの一方は、ｉＥＤＤＡ反応により１つの結合基に結合され、前記第２成分及び第３成分のうちの他方は、ＳＰＡＡＣ又はＣｕＡＡＣ反応により他の結合基に結合される、請求項４に記載のリンカーユニット。
【請求項１２】
請求項１から７のいずれか１項に記載の第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットを含む分子構築物であって、
前記第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットは、前記第１リンカーユニットと第２リンカーユニットの結合基の間で起きるＣｕＡＡＣ反応、ＳＰＡＡＣ反応又はｉＥＤＤＡ反応により結合される、分子構築物。
【請求項１３】
複数の第１成分及び複数の第２成分をさらに含み、前記複数の第１成分及び複数の第２成分は、それぞれ前記第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットの複数のリンクアームとの間でアミド結合又はエステル結合を形成すること、或いはチオール−マレイミド反応、ＳＮ２反応、ＣｕＡＡＣ反応、ＳＰＡＡＣ反応又はｉＥＤＤＡ反応により前記第１リンカーユニット及び第２リンカーユニットの複数のリンクアームに結合される、請求項１２に記載の分子構築物。
【請求項１４】
各前記第１成分は、第１細胞表面抗原に特異的な第１抗体断片であり、前記第１細胞表面抗原は、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４３、ＣＤ７２ａ、ＣＤ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、及びＣＤ３１９からなる群より選択され、
各前記第２成分は、細胞毒性薬物又は第２細胞表面抗原に特異的な第２抗体断片であり、前記第２細胞表面抗原は、ＣＤ３又はＣＤ１６ａである、請求項１３に記載の分子構築物。
【請求項１５】
各前記第１成分は、ペプチドホルモン、第１成長因子又は腫瘍関連抗原に特異的な第１抗体断片であり、
各前記第２成分は、細胞毒性薬物、トール様受容体アゴニスト、放射性核種と複合体を形成したキレート剤、サイトカイン、又は第２成長因子、細胞表面抗原、ハプテン若しくはサイトカインに特異的な第２抗体断片であり、
前記第１成長因子は、ＥＧＦ、変異型ＥＧＦ、エピレグリン、ＨＢ−ＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦからなる群より選択され、
前記第２成長因子は、ＥＧＦ、変異型ＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ｂＦＧＦ及びＨＧＦからなる群より選択され、
前記ペプチドホルモンは、セクレチン、ＣＣＫ、ソマトスタチン、オクトレオチド及びＴＳＨからなる群より選択され、
前記腫瘍関連抗原は、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＣＡ  １９−９、ＣＡ  １２５ＣＥＡ、ＭＵＣ  １、ガングリオシドＧＤ２、ＭＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、メソセリン、ムチン関連Ｔｎ、シアリルＴｎ、グロボＨ、ＳＳＥＡ−４及びＥｐＣＡＭからなる群より選択され、
前記細胞表面抗原は、ＣＤ３、ＣＤ１６ａ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１からなる群より選択される、請求項１３に記載の分子構築物。
【国際調査報告】
2020510097.tif 000105
2020510097.tif 000106