(57)【要約】  この開示は、ウイルスを不活化する際に使用する方法に関する。N-メチルグルカミドでウイルスを不活化する方法は、タンパク質サブユニット、タンパク質（酵素、因子など）、組換えタンパク質、抗体、ワクチン、遺伝子治療製品などの生理活性薬物の精製プロセスに適用できる。この方法で使用される界面活性剤は、アミド結合によって結合された、親水性グルコース部分と疎水性脂肪酸尾部からなる複数のN-メチルグルカミド同族体に基づいている。さらに、これらの糖ベースの界面活性剤は本来非イオン性であり、薬物タンパク質、血漿生物学、非エンベロープウイルスワクチン、またはアデノ随伴ウイルス粒子を破壊しない。未同定のエンベロープウイルス汚染物質を含む対象の生物学的産物溶液を精製する方法であって、対象の生物学的産物溶液を標準溶液とインキュベートし、ステップ（a）の生物学的産物溶液に存在する潜在的なエンベロープウイルス汚染物質を不活化し、ステップ（b）の最終溶液に存在する不活化ウイルスを測定し、対象の別の生物学的産物溶液をN-メチルグルカミド溶液とインキュベートし、ステップ（d）の最終溶液に存在する不活化ウイルスを測定し、ステップ（c）の最終溶液の結果とステップ（e）の最終溶液の結果を比較することを含む、前記方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
未同定のエンベロープウイルス汚染物質を含む対象の生物学的産物溶液を精製する方法であって、
（ａ）対象の生物学的産物溶液を、Ｎ−メチルグルカミド溶液とともにインキュベートし、（ｂ）該生物学的産物溶液中に存在する潜在的なエンベロープウイルス汚染物質を不活化し、
（ｃ）該生物学的産物溶液を精製する
ことを含む、前記方法。
【請求項２】
前記エンベロープウイルスが、ＲＮＡまたはＤＮＡウイルス、一本鎖または二本鎖ウイルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記エンベロープウイルスが前記生物学的産物溶液に加えられている、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ウイルスが更にレトロウイルスを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルスが、レトロウイルス科、フラビウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ラブドウイルス科、ブニヤウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、アレナウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびポックスウイルス科から成る群から選択されるウイルス科の１以上に属する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記エンベロープウイルスが、異種指向性白血病ウイルス、偽狂犬病ウイルス、または牛ウイルス性下痢ウイルスを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｎ−メチルグルカミドが、アミド結合により非環式親水性グルコース糖部分に連結された炭素長がｎ（ｎ≧３）の脂肪酸疎水性鎖から構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｎ−メチルグルカミドが、Ｍｅｇａ  ８、Ｍｅｇａ  ９、Ｍｅｇａ  １０、Ｍｅｇａ  １１、およびＭｅｇａ  １２からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的産物が、組換えタンパク質、抗体、サイトカイン、血漿タンパク質、ワクチン溶液、核酸治療剤および遺伝子治療産物からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的産物が真核細胞から産生されたものであるである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記真核細胞が哺乳類細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物学的産物が原核細胞から産生されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
Ｎ−メチルグルカミド溶液の濃度が、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の０．５から１０．０倍の範囲内である、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
インキュベートする工程が低温で成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
インキュベートする工程が、１から３７℃の温度範囲で行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
エンベロープウイルス溶液中でエンベロープウイルスを不活化する方法であって、
（ａ）Ｎ−メチルグルカミド溶液をエンベロープウイルス溶液に加え、
（ｂ）該エンベロープウイルス溶液中のエンベロープウイルスを不活化する
ことを含む、前記方法。
【請求項１７】
前記エンベロープウイルスが前記生物学的産物溶液に加えられている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
未同定のエンベロープウイルス汚染物質を含む対象の生物学的産物溶液を精製する方法であって、
（ａ）対象の生物学的産物溶液を標準溶液とインキュベートし、
（ｂ）工程（ａ）の生物学的産物溶液中に存在する潜在的なエンベロープウイルス汚染物質を不活化し、
（ｃ）工程（ｂ）の最終溶液中に存在する不活化ウイルスを測定し、
（ｄ）別の対象の生物学的産物溶液をＮ−メチルグルカミンとインキュベートし、
（ｅ）工程（ｄ）の最終溶液中に存在する不活化ウイルスを測定し、
（ｆ）工程（ｃ）の最終溶液の結果と工程（ｅ）の最終溶液の結果を比較する
ことを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
生物学的医薬は、あらゆる種類の生物由来の原材料、すなわち細胞株、細胞培養液、組織または体液に関するプロセスから生成される分子である。生物由来の治療薬の製造は、安全性を保証するために多くの精製ステップを必要とする複雑なプロセスである。製造途中の各工程またはプロセスにおいて、微生物汚染の可能性があることを考慮することが特に重要である。組み換えタンパク質の生産の場合、生物学的医薬は、大概にして、目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含むプラスミドＤＮＡを有する遺伝子操作されたヒトまたは動物由来の細胞［例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞］またはハイブリドーマ細胞、例えばＮＳ０の培養および精製プロセスを実行する一連の単位操作によって行われる。ＣＨＯ細胞とＢＨＫ細胞が、内因性レトロウイルス様粒子（ＥＲＶＬＰ）をコードする染色体に組み込まれたプロウイルスエレメントを持っていることはよく知られている（非特許文献１および２）。全血または血漿由来の生物学的医薬製剤は、血液由来の病原体、即ち、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）ウイルスなどによる原料汚染の問題に直面している。また、製造中間体に偶発的な物質が導入される可能性があり、製造にさらなる課題が生じることとなる。これまでのところ、バイオリアクターによるウイルス汚染事件に関する多くの報告がある（非特許文献３および４）。特に、ウイルスの不活化および／または除去は、長年にわたって生物製剤業界を悩ませてきた。その理由には、ウイルスが由来するソースの多様性とその小さなサイズが含まれる。
【０００２】
ウイルスは、エンベロープグループと非エンベロープグループに分類される。内因性レトロウイルス様粒子は、エンベロープを有し、ＣＨＯおよびＢＨＫ細胞とそれらに関連する培養液中に認められ、それにより、さらなる精製ステップ、設備、機器、および環境の汚染のリスクを引き起こす。現在の方法では感染性は観察されていないが、内因性レトロウイルス様粒子は、患者や産業に潜在的なリスクをもたらす。これらすべての理由により、製造プロセスからこれらの汚染物質を迅速かつ効果的に不活化および／または除去することがますます重要になっている。
【０００３】
界面活性剤は、さまざまなアレイやアッセイにおいてウイルスを不活化するための重要なツールとして使用されている。１９８０年代以降、界面活性剤は（輸血や血漿由来の治療用製品などの血液成分を必要とする患者のための）血液サンプルのプールとサンプルを取り扱う実験室のスタッフの安全性を高めてきた。最近では、ウイルス汚染の潜在的なリスクがある生物学的製剤やワクチンの製造プロセスで界面活性剤が広く使用されている。生物学的製剤の製造において、エンベロープウイルスの不活化に使用される最もよく特徴付けられた非常に効果的な界面活性剤は、ポリソルベート（Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０）、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（別名Ｏｃｔｏｘｉｎｏｌ−１０）およびリン酸トリ−ｎ−ブチル（ＴｎＢＰ、溶媒としてポリソルベートまたはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と共にしばしば使用される）などの非イオン性界面活性剤である。ポリソルベートは室温条件で非常に効果的であるが、比較的高濃度では、低温で効果が低下する。したがって、これらの界面活性剤は、生物活性と分子構造の安定化に重要な低温条件を必要とする生物材料の製造に対して、最適な選択肢ではない可能性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｃｈａｎ、Ｓ．Ｙ．、１９９４、Ｗａｎｇ  Ｇ．ら  １９９９
【非特許文献２】Ｓｕｚｕｋｉ  Ａら  １９８２
【非特許文献３】Ｈｓｉｅｈ、Ｗ．Ｔ．ら  ２００８
【非特許文献４】Ｑｉｕ  Ｙ．ら、２０１３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（オクトキシノール、オクトキシノール−３、プレセプチン）は、ウイルスを不活化する上で定評のある効果的な界面活性剤である。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００とその誘導体は、極低温で非常に強力である。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００のオクチルフェノール成分は、エストロゲン受容体と相互作用して、曝露された動物の生殖へ影響をもたらすことが特徴である。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含むバイオプロセス廃棄物は、環境に直接排出されると、特に水生生物に悪影響を及ぼす。バイオプロセス廃棄物からのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の処理または回収は、非常に費用がかかり、面倒である。生理活性薬物を変更せずにウイルスを効果的に不活化する新しい環境にやさしい（または非環境毒性）界面活性剤の追求は、多くの生物医薬品業界にとって優先事項となっている。したがって、効果的で堅牢で環境に安全な界面活性剤を発見することは、バイオ医薬品産業にとって極めて優先されている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本方法の実施形態は、未同定のエンベロープウイルス汚染物質を有する対象の生物学的産物溶液を精製することを含み、対象の生物学的産物溶液をＮ−メチルグルカミド溶液とインキュベートし、生物学的産物溶液中に存在するあらゆる潜在的なエンベロープウイルス汚染物質を不活化すること、および、生物学的産物溶液を精製することを含む。
【０００７】
未同定のエンベロープウイルス汚染物質を含む対象の生物学的産物溶液を精製する方法であって、対象の生物学的産物溶液を標準溶液とインキュベートし、ステップ（ａ）の生物学的産物溶液に存在する潜在的なエンベロープウイルス汚染物質を不活化すること、ステップ（ｂ）の最終溶液中に存在するすべての潜在的なエンベロープウイルス汚染物質を不活化すること、対象の分離生物学的産物をＮ−メチルグルカミド溶液とインキュベートすること、ステップ（ｄ）の最終溶液中に存在する不活化されたウイルスを測定すること、および、ステップ（ｃ）とステップ（ｅ）の最終溶液の結果を比較することを含む方法。
【０００８】
当業者は、以下に記載される図面が例示目的のみであることを理解するであろう。図面は、本教示または特許請求の範囲を決して限定することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、エンベロープウイルスの界面活性剤破壊の理論的な一般メカニズムを示している。レトロウイルスなどのエンベロープウイルスは、二十面体型のヌクレオカプシドを有し、宿主細胞およびウイルスに由来するウイルスのエンベロープによって保護されている。各界面活性剤分子は親水性の頭と疎水性の尾を持つことにより、両親媒性の構造を有している。この２つの部分によって、各界面活性剤の固有の特性である臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が決定される。界面活性剤モノマーは、特定のＣＭＣ未満でウイルスエンベロープ内に挿入され、宿主へのウイルスの付着を妨害する場合と妨害しない場合がある。一方、ＣＭＣ以上の濃度では、より多くの界面活性剤モノマーがエンベロープに挿入されてエンベロープが破壊され、その結果、ウイルスが宿主細胞表面の受容体に結合できなくなる。
【図２】図２は、Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤の疎水性（非極性）および親水性（極性）領域を示す。
【図３】図３は、Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤ホモログの二次元（２Ｄ）および三次元（３Ｄ）構造を示す。各化合物は、同様に、非環式の親水性グルコース糖部分に結合したアミドによって結合された８〜１０個または１２個の炭素からなる疎水性脂肪酸鎖で構成されている。
【図４】図４は、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）をＣＭＣ  の０．５倍、１倍、２倍のＭｅｇａｘ  ８、Ｍｅｇａ  ９、Ｍｅｇａ  １０およびＭｅｇａ  １２と個別にインキュベートした場合、Ｘ−ＭｕＬＶが室温で３０分以内に完全に不活化されることを示している。
【図５】図５は、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）がＣＭＣの１倍および２倍の各界面活性剤（Ｍｅｇａ  ８、Ｍｅｇａ  ９、Ｍｅｇａ  １０、およびＭｅｇａ  １２）と別々にインキュベートされた場合、Ｘ−ＭｕＬＶが２．０  ℃で３０分以内に完全に不活化されることを示している。
【図６】図６は、組み換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）中２．０℃で３０分間インキュベートすると、０．３％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ  １０および０．３％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００によってＸ−ＭｕＬＶの完全な不活化が達成され、これら２つの界面活性剤が同等の潜在能力を有することを示している。
【図７】図７は、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）が、２．０℃で水またはＭｅｇａ  １０と２時間インキュベートした後でもその活性を維持することを示している。
【図８】図８は、Ｘ−ＭｕＬＶおよび漸増濃度のＭｅｇａ  １０とともに２．０℃で３０分間インキュベートされた組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の用量反応を示している。用量反応曲線は、この糖界面活性剤の濃度が増加するにつれて、Ｘ−ＭｕＬＶの力価が逆に、検出限界（ＬＯＤ）にまで減少しウイルスが検出されなかったことを示している。ｒＦＶＩＩＩ対照（Ｃｔｒｌ）の破線は、Ｘ−ＭｕＬＶのみとインキュベートしたｒＦＶＩＩＩの力価に対応している。
【図９】図９は、Ｘ−ＭｕＬＶおよび０．３％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ  １０と共に２．０℃で０、５、１５、３０、６０、および１２０分間インキュベートした組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の動力学を示している。Ｍｅｇａ  １０処理により、ウイルス力価の即時の低下（完全な不活化）が検出限界（ＬＯＤ）に達し、ウイルスは検出されなかった。これは、ｒＦＶＩＩＩのみおよび培地のみの対照とは対照的である。
【図１０】図１０は、０．０２％、０．１０％または０．２０％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ  １０を含むＸ−ＭｕＬＶの高力価ストックと共に２．０℃で０、５、３０、６０および１２０分間インキュベートした組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）の動力学を示している。ウイルスの不活化が観察されなかった０．０２％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ  １０、ｒＦＶＩＩＩおよび培地のみの対照サンプルとは対照的に、０．１０％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ  １０はウイルス力価の低下をもたらし、０．２０％（ｗ／ｖ）はウイルス力価の即時の低下（完全な不活化）を引き起こし、５分以内に検出限界（ＬＯＤ）に達した。
【図１１】図１１は、製造が異なるＭｅｇａ１０分子が、類似の再現可能な用量反応結果をもたらすことを示している。
【図１２】図１２は、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）でインキュベートしたときに、０．２および０．３（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ  １０で２．０℃、１５分以内にブタ偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が検出限界まで不活化されることを示している。
【図１３】図１３は、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）が、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）中で２．０℃で３０分インキュベートした場合、０．２、０．３、および０．４（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ  １０および１．０％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ  ９によって、検出限界まで完全に不活化されることを示している。
【図１４】図１４は、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）およびヒト血漿タンパク質溶液中で０．２、０．３、および０．４％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ  １０とともに２．０℃で３０分間インキュベートすると、Ｘ−ＭｕＬＶが検出限界まで完全に不活化されることを示している。両方のタンパク質溶液は、それぞれが３０  ｍｇ／ｍＬの最終濃度になるように調製された。
【図１５】図１５は、Ｍｅｇａ  １０（Ｍ１０）のみ、Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｔｗ２０）のみ、および０．０５％（ｗ／ｖ）、０．１０％（ｗ／ｖ）、または０．３０の濃度のＭｅｇａ  １０とＴｗ２０無し、または、０．０１％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）もしくは０．０６％（ｗ／ｖ）のＴｗ２０との混合物によるＸ−ＭｕＬＶの不活化を示している。０．３０％（ｗ／ｖ）０．３０％（ｗ／ｖ）Ｍ１０単独または０．３０％（ｗ／ｖ）Ｍ１０＋０．０６％（ｗ／ｖ）Ｔｗ２０混合物の濃度では、Ｘ−ＭｕＬＶは３０分以内に完全に不活化された。
【図１６】図１６は、Ｍｅｇａ  １０（Ｍ１０）のみ、リン酸トリ（ｎ−ブチル）（ＴｎＢＰ）のみ、および０．０５％（ｗ／ｖ）または  ０．３０％（ｗ／ｖ）の濃度のＭｅｇａ  １０とＴｎＢＰ混合物による、Ｘ−ＭｕＬＶの不活化を示す。０．３０％（ｗ／ｖ）Ｍ１０単独または０．３０％（ｗ／ｖ）Ｍ１０＋０．３０％（ｗ／ｖ）ＴｎＢＰ混合物の濃度では、Ｘ−ＭｕＬＶは３０分以内に完全に不活化された。興味深いことに、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｍ１０＋０．０５％（ｗ／ｖ）ＴｎＢＰにはウイルス力価の低下があり（完全な不活化ではない）、Ｍｅｇａ  １０とＴｎＢＰの間に相乗効果があることを示している。その他の界面活性剤処理では、ウイルス力価はｒＦＶＩＩＩ対照（界面活性剤なし）と同等であり、ウイルスの不活化は生じなかった。
【図１７】図１７は、５５０  ｍＭ  ＮａＣｌとの共存または不在における、０．０６％（ｗ／ｖ）、０．１０％（ｗ／ｖ）または０．２０％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ  １０あるいは０．３０％（ｗ／ｖ）、０．５１％（ｗ／ｖ）または０．７１％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ  ９によるＸ−ＭｕＬＶの不活化を示している。０．２０％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ  １０のみ、０．２０％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ  １０＋ＮａＣｌ、および５００ｍＭのＮａＣｌと共存または不在の０．７１％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ  ９の濃度で、Ｘ−ＭｕＬＶは有意に不活化された。０．１０％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ  １０＋５５０  ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５１％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ  ９＋５００  ｍＭ  ＮａＣｌにおいてウイルス力価が低下し、このことは、Ｍｅｇａ  １０またはＭｅｇａ  ９とＮａＣｌの間に相乗効果があることを示している。その他の界面活性剤処理では、ウイルス力価がｒＦＶＩＩＩ対照（界面活性剤なし）とＮａＣｌ対照（界面活性剤なし）と同等であり、ウイルスの不活化は生じなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
この開示は、ウイルス不活化に関連する方法および組成物を提供する。
【００１１】
定義
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用される。以下に記載されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている文書を含む他の文書におけるその単語の使用と矛盾する場合、以下に記載されている定義は、（この用語が最初に使用された文献などで）反対の意味が明確に意図されていない限り、この明細書とそれに関連するクレームを解釈する目的で常に支配する。
【００１２】
適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語には複数形も含まれ、逆もまた同様である。ここでの「ａ」の使用は、特に明記しない限り、または「１つ以上」の使用が明らかに不適切でない限り、「１つ以上」を意味する。「または」の使用は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は交換可能であり、限定的ではない。「など」、「たとえば」、「例」などの用語もまた、限定を意図したものではない。例えば、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語は、「含んでいるがそれに限定されない」ことを意味するものとする。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、提供される単位値の＋／−１０％を指す。
【００１４】
本明細書で使用する場合、「実質的に」という用語は、関心のある特徴または特性の全体またはおおよその程度を示す定性的状態を指す。生物学の当業者は、生物学的および化学的組成および材料の試験、製造、および保管に影響を与える多くの変動要素のために、また、生物学的および化学的組成および材料の試験、製造、および保管に使用される機器および機器に固有の誤差のために、生物学的および化学的現象は、絶対的な結果を達成または回避することは、仮にあったとしても、非常に稀であることを理解するであろう。したがって、「実質的に」という用語は、本明細書では、多くの生物学的および化学的現象に固有の潜在的な完全性の欠如を捉えるために使用される。
【００１５】
１９８０年代以降、献血者から集めた血液をプールしてウイルスを不活化するための必須手段として、界面活性剤が使用されてきた。このプロセスは、血液、血漿、または血漿由来の第ＶＩＩＩ因子（ｐｄＦＶＩＩＩ）などの血液／血漿由来の成分を受ける患者の安全にとって重要である。さらに、この浄化手段は、臨床検査室または血漿由来生物学的製剤（ＰＤＢＰ）の製造施設での血液の処理に直接関与する要員の安全性を改善する。最近では、この手法は、動物由来の材料を含む生物学的治療薬やワクチンの生物医薬品製造プロセスにも不可欠となっている。動物由来の材料（すなわち、哺乳動物細胞で生成された血液、血漿、組織、タンパク質）は、内因性ウイルスを運ぶか、または外来ウイルスで簡単に汚染される可能性がある。したがって、医薬品製造プロセスには、患者がウイルスのない治療を受けることを保証するための一連の効果的なウイルス不活化（すなわち、溶剤洗浄、低ｐＨ、および熱処理）と除去技術（すなわち、ウイルス濾過）が含まれる。これらのプロセスは、生物学的に誘導された治療製品またはワクチン製品の安全な一般利用に不可欠である。効率、堅牢性、そして最も重要なこれらの製品の全体的な安全性を向上させる新しい方法が非常に必要とされている。これらの要求を満たすために、環境に優しいＮ−メチルグルカミドをベースとする界面活性剤を使用する新しい方法が、この明細書において特徴付けられている。
【００１６】
界面活性剤は、親水性（極性）頭部基と疎水性（非極性）尾部基で構成される両親媒性分子である。この普遍的な構造により、界面活性剤と他の分子、特にタンパク質やエンベロープウイルスとの相互作用が水溶液中で可能になる。基礎科学と応用技術では、界面活性剤を可溶化剤または安定剤として使用して、生体分子の凝集を防止したり、細胞培養物や組織懸濁液から膜タンパク質を可溶化することが可能である。タンパク質の可溶化に使用する場合、次の特性により、特定の界面活性剤は他のものよりも望ましいものとなる：１）電荷のない界面活性剤（非イオン性界面活性剤）は、目的のタンパク質の構造と活性を維持するのに有用である、２）臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）が低い界面活性剤は、透析により界面活性剤を簡単に除去できる、３）透明な界面活性剤であり、したがって、タンパク質の吸光度の測定値には影響を与えない、４）純度の高い界面活性剤は、実験ごとのばらつきを減らす。同時に、タンパク質薬物を破壊せず、界面活性剤からの干渉なしにタンパク質濃度を検出し、界面活性剤が非常に純粋であり必ずウイルスが不活化されることを保証することが必要であることから、上記特性のほとんどは、ウイルス不活化の界面活性剤酵素を選択するうえで利用できる。
【００１７】
一般的に、エンベロープウイルスの不活化は、両親媒性構造と具体的な界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）に依存する。ＣＭＣは、界面活性剤モノマーが凝集してミセル構造を形成する濃度を意味する。水溶液では、より多くの界面活性剤モノマーが接触すると、親水性の頭部が隣接して、水溶液から疎水性の尾を保護し、最終的にミセル構造に組織化する。ＣＭＣは、特定の条件下で所定の界面活性剤のウイルス不活化が発生する濃度に関連している可能性がある。ウイルス不活化の理論的メカニズムは、モノマーが界面活性剤ＣＭＣ未満でウイルスエンベロープに挿入されことであり、これはウイルスに有害である可能性がある。濃度がＣＭＣ以上になるとすぐに、膜内に存在するこれらの界面活性剤モノマーがミセルを形成し、完全性を破壊したり、ウイルスのエンベロープを完全に取り除くことができる。ウイルスのエンベロープがないと、ウイルスは宿主細胞の原形質膜上の受容体に結合できず、複製と拡散を進めることができない。
【００１８】
これまでのところ、生物医薬品製造業界では、エンベロープウイルスを不活化するためにいくつかの界面活性剤が使用されている。汎用される非イオン性界面活性剤の１つであるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、タンパク質薬物を破壊することなくエンベロープウイルスを不活化するのに非常に効果的である。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、生物医薬品製造プロセスで使用された後、廃水処理プラントに廃棄されるか、水域環境に直接放出される（Ｍａｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ、１９９６、ＪＡＯＣＳ、７３：９２９−９３３）。残念ながら、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の副産物には、エストロゲン受容体基質を模倣し、動物の生殖システム、特に水生生物に悪影響を与える可能性のあるオクチルフェノールが含まれている。したがって、この界面活性剤は、多くの国において、環境に対して有毒な化学物質であるとみなされ、その使用が禁止されはじめている。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に匹敵する有効性を持つ、環境に安全な界面活性剤を見出すために、多くの生物医薬品業界が熱心に取り組んできた。たとえば、Ｂｉｏｇｅｎ、Ｉｎｃ．とＧｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｉｎｃ．は、それぞれラウリルジメチルアミンＮ−オキシド（ＬＤＡＯ）とアルキルグルコシドを調査している（Ｃｏｎｌｅｙら，２０１４，ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ＃Ｗ０２０１４０２５７７１Ａ２；  Ｃｏｎｌｅｙら，２０１６，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．刊行前のＥｐｕｂ、Ｆｉｓｈｅｒら，２０１６，米国特許＃２０１６０３３３０４６Ａ１）。これら企業は異なるクラスの新しい界面活性剤を区別することができたが、本発明の実施形態は、エンベロープウイルスの不活化において、完全に新規で非常に効果的なクラスの非イオン性界面活性剤、Ｎ−メチルグルカミド（脂肪酸糖としても知られる）を特定する。
【００１９】
糖をベースとする界面活性剤は優れた物理的特性を持ち、生分解性が高く、毒性がないため、特に水生環境の安全性プロファイルに貢献する（Ｂｏｇｄａｎ，２００７，Ｓｔａｌｍａｎｓら，１９９３）。したがって、開示される実施形態は、生物活性薬物製造においてウイルスを不活化するための新しい方法として、糖ベースの界面活性剤であるＮ−メチルグルカミドの使用に焦点を合わせている。
【００２０】
Ｎ−メチルグルカミドは、親水性の高いグルコース部分と疎水性の脂肪酸鎖がアミド結合で結合した非イオン性界面活性剤である。これらの界面活性剤は、約９５％の再生可能炭素指数で高度に生分解性であることが知られており、特に水生生物に対して無毒であると考えられているため、環境に優しい（Ｓｔａｌｍａｎｓら，１９９３，ＳＯＦＷ，１１９：７９４−８０８）。高い安全性と優れた物理的特性により、これらの界面活性剤は、基礎的な科学技術での使用だけでなく、シャンプーや食器用洗剤への使用に対する関心も高まっている。同様に、これらの界面活性剤は、生物学的に誘導された医薬品のウイルス不活化の主要な候補となり得る。
【００２１】
組換えタンパク質の大部分は、遺伝子操作された哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯおよびＢＨＫ）の発酵によって生成される。これらの細胞は、感染力が確認されていないエンベロープウイルス粒子である内在性レトロウイルス様粒子（ＥＲＶＬＰ）を生成する、染色体に組み込まれたレトロウイルスプロウイルス遺伝子またはエレメントを持っていることが知られている。ＥＲＶＬＰの不活化を実証するために、Ｘ−ＭｕＬＶが内因性レトロウイルスの具体的なモデルとして使用され、現在、所与の精製ユニット操作による不活化または除去に曝されるサンプルに加えることによって製造精製プロセスを評価するための実験室ツールとして使用されている。したがって、開示された実施形態は、Ｎ−メチルグルカミドを使用して、Ｘ−ＭｕＬＶなどのエンベロープウイルスを不活化するこの新しい方法を使用する。Ｘ−ＭｕＬＶモデルに基づいて、ヘルペスウイルス、フラビウイルス、フィロウイルスなどを含む、他のすべてのエンベロープウイルスも、Ｎ−メチルグルカミドの不活化の影響を受けやすいと予想される。さらに、この新しい方法は、透析やカラムクロマトグラフィーなどの界面活性剤除去ステップを含む可能性がある、薬物精製プロセス全体の全てのステップに適用できる。
【００２２】
一般に、この新しいクラスの界面活性剤によるウイルスの不活化には、Ｎ−メチルグルカミドを含むタンパク質サンプル（例えば、組換え第ＶＩＩＩ因子、ヒトＩｇＧ抗体および血漿成分）に加えられたＸ−ＭｕＬＶの実験室株の試験、２−８℃でのサンプルのインキュベーション、および、それに続く、ウイルス感染を観察するための指標細胞株（例えばＰＧ−４、Ｖｅｒｏ、またはＥＢＴｒ細胞株）での反応管の実験が含まれる。Ｎ−メチルグルカミドをテストするための体系的なアプローチは、さまざまな条件下での最初のスクリーニングから始まり、その後に、タンパク質活性評価、用量反応試験、高力価と低力価のウイルス株を用いた動力学研究、複数のウイルスと生物学的アプリケーション、そして最後に一貫性を確保するための複数のメーカーの比較が続く。最初のスクリーニング条件は、２〜８°Ｃで１２０分以内にウイルスの不活化が可能であり、０．１〜０．３％（ｗ／ｖ）の範囲の不活化濃度であった、旧来のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００界面活性剤の履歴データに基づいていた。新しい界面活性剤が既知の強力な界面活性剤（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）と同等であることを確認するために、Ｎ−メチルグルカミドの最初のスクリーニングでは、低温と３０および１２０分のインキュベーションを選択した。評価された濃度は、新しい界面活性剤のそれぞれのＣＭＣに基づいて決定した。次に、エンベロープウイルスの不活化に最も効果的であったＮ−メチルグルカミド候補を、発色アッセイキットを使用して、ヒト第ＶＩＩＩ因子活性への影響について評価した。次に、Ｎ−メチルグルカミドを、個々の界面活性剤ごとに０．０１４〜０１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で増加する濃度のＮ−メチルグルカミドに対するそれぞれの用量反応について評価した。不活化がどれだけ迅速に生じるかを評価するために、力価の低いウイルス調製物と高力価ウイルス調製物の両方を使用して、Ｎ−メチルグルカミドを用いた動力学的研究を行った。プロセス全体をとおして得られたデータの信頼性を高めるために、複数の製品を同様の条件下で分析し、試験したＮ−メチルグルカミドの一貫性と信頼性を実証した。最後に、Ｎ−メチルグルカミドが他の血液または血漿関連マトリックスで有効性を維持しているかどうかを評価するために、ウイルス免疫の不活化を同様の条件下でヒト免疫グロブリンＧおよびヒト血漿で測定した。まとめると、この体系的なアプローチにより、開示された実施形態は、精製プロセスにおけるＮ−メチルグルカミドの適用性を実証することができた。
【００２３】
Ｎ−メチルグルカミドでウイルスを不活化するこの方法は、タンパク質サブユニット、タンパク質（酵素、因子など）、組換えタンパク質、または抗体などの生物活性薬物の精製プロセスに適用できる。この方法で使用される環境に安全な（または非生態毒性）界面活性剤は、アミド結合で結合された、親水性グルコース部分と疎水性脂肪酸尾部からなる複数のＮ−メチルグルカミド同族体をベースとする。Ｎ−メチルグルカミドにはオクチルフェノールなどの既知の有毒な中間体が存在しないため、生物製剤の製造に使用した場合、環境への懸念に関連するリスクが排除される。さらに、これらの糖ベースの界面活性剤は本来非イオン性であり、目的の薬物タンパク質を破壊しない。この方法は、Ｎ−メチルグルカミドと生物学的製剤とのインキュベーションにより、エンベロープウイルスの潜在的な汚染物質を不活化する。この方法によるウイルスの減少を評価するために、モデルエンベロープウイルス（異種栄養性白血病ウイルス、偽狂犬病ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルスなど）をタンパク質薬物サンプル（たとえば、天然タンパク質、組換えタンパク質、抗体）に加え、Ｎ−メチルグルカミドとインキュベートした。インキュベーション後、ＴＣＩＤ５０アッセイを実施して、ウイルス力価と、非処理対照とＮ−メチルグルカミド処理サンプル間のウイルス感染力価の差である対数減少係数（LRF）を決定した。さらに、Ｎ−メチルクルカミドによるエンベロープウイルスの不活化は、業界標準のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００に匹敵するものである。総合すると、これらの優れた特性により、Ｎ−メチルグルカミドは生物由来医薬品の精製プロセスにおける強力なツールとなる。
【実施例】
【００２４】
材料
例１−ウイルス株：
低力価および高力価の異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）株、ｐＮＦＳ  Ｔｈ−１株は、それぞれバイエル病原菌安全研究所（カリフォルニア州バークレー）またはＢｉｏｒｅｌｉａｎｃｅ  Ｉｎｃ．（メリーランド州ロックビル）によって内部で調製された。高力価のブタ偽狂犬病ウイルス（ＰＰＶ）株、Ａｕｊｅｓｚｋｙ株は、Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅ  Ｉｎｃ．（メリーランド州ロックビル）によって調製された。高力価のウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）株、ＮＡＤＬ株も、Ｂｉｏｒｅｌｉａｎｃｅ  Ｉｎｃ．（メリーランド州ロックビル）によって調製された。
【００２５】
例２−細胞株：
ネコＰＧ−４細胞（Ｓ＋Ｌ−）（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２０３２）、アフリカミドリザル腎臓Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８１）、および胚性ウシ気管ＥＢＴｒ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−４４）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から購入した。
【００２６】
例３−細胞培養培地とサプリメント：
ＰＧ−４、Ｖｅｒｏ、およびＥＴＢｒ細胞に使用した培地は、マッコイ５Ａ（Ｌｏｎｚａ、１２−６８８Ｆ、Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）およびＭｉｎｕｔｅｓｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ  Ｅａｇｌｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０−０１０−ＣＶ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）である。以下の増殖培地サプリメントを使用した：ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＳＨ３００７０．０３、ローガン、ユタ州）、１００ｘペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（コーニング、３０−００２−Ｃｌ、マナッサス、バージニア州）、および  ２００  ｍＭ  Ｌ−グルタミンターゼ（Ｌ−Ｇｌｕｔａｍｉｎｕｔｅｓｅ）（Ｌ−Ｇｌｕ）（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、１６８０１４９、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）。
【００２７】
例４−化学物質：
臭化ヘキサジメトリン（ポリブレン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ９２６８−５ｇ、ミズーリ州セントルイス）を使用して、ＰＧ−４細胞におけるＸ−ＭｕＬＶ感染の効率を高め、マッコイ５Ａ培地に最終濃度３  μｇ／ｍｌで添加した。この試験で特性検討される非イオン性界面活性剤は、オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ  ８）（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＤＧ０１７、ミズーリ州セントルイスまたはＳｉｇｍａもしくはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ  ９）（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＤＧ０１９、ミズーリ州セントルイスまたはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ  １０）（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＤＧ０２１、ミズーリ州セントルイスまたはＳｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州セントルイス）、ドデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ  １２）（Ｂａｃｈｅｍ、Ｐ−１１７５．０００１、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）、およびＰ−ｔｅｒｔ−オクチノフェノキシ）ポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、１０８６４３２５００、  ビレリカ、ＭＡ）である。
【００２８】
生物学的溶液：
各ウイルス不活化アッセイは、組換えヒト第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）（全長野生型、バイエル社内準備）、ヒトＩｇＧまたは血漿タンパク質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、  ＭＯ）のいずれかを含む生物学的産物溶液の存在下に実施した。
【００２９】
方法
【００３０】
実施例１  界面活性剤の準備
界面活性剤Ｍｅｇａ  ８、Ｍｅｇａ  ９、Ｍｅｇａ  １０、Ｍｅｇａ  １２は、５％重量／体積（ｗ／ｖ）ストック溶液の目標濃度で調製した。各界面活性剤は、製造元から粉末として入手し、適切に計量し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水に溶解した。界面活性剤が室温で完全に溶解しなかった場合、溶液を≦３７℃の水浴（Ｍｅｇａ  １０およびＭｅｇａ  １２）で約１０〜１５分間加熱した。当初、５％Ｍｅｇａ  １２が≦３７℃で溶液に溶解しなかったため、≦６０℃の水浴に入れた。その結果、３０分後に溶解した。Ｍｅｇａ  １２の臨界ミセル濃度は０．０１３％であったため、少なくとも１０倍ストック溶液がウイルス不活化での使用に便利であると思われた。したがって、新しいストック溶液を０．１５％の濃度でＭｉｌｌｉ−Ｑ水を用いて調製した。この条件では、≦６０℃の水浴に入れた場合（約１５分）、混合物をより早く溶液にすることができた。界面活性剤は２−８℃で暗容器に保存した。
【００３１】
実施例２  Ｍｅｇａ  ８、Ｍｅｇａ  ９、Ｍｅｇａ  １０、およびＭｅｇａ  １２ウイルス不活化スクリーニング
組換え第ＶＩＩＩ因子（ｒＦＶＩＩＩ）治療薬の一般的な製造条件下で、異種指向性マウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）、ブタ仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）、またはウシウイルス性下痢症ウイルス（ＢＶＤＶ）を効果的かつ確実に不活化する能力について、Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤（Ｍｅｇａ  ８、Ｍｅｇａ  ９、Ｍｅｇａ  １０、Ｍｅｇａ  １２）を評価した。各界面活性剤について試験された濃度は、それぞれ臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の０．５倍、１倍、または２倍を基準とした。各界面活性剤は、界面活性剤を含まないｒＦＶＩＩＩタンパク質とインキュベートし、１：１１の比率でＸ−ＭｕＬＶの高力価ストックを加えて、２．０±１．０°Ｃで３０分間インキュベートした。ｒＦＶＩＩＩのみを含む陽性対照サンプルを加え、２．０±１．０℃で０および３０分間インキュベートした。各インキュベーション時間後、４０  μＬの各不活化サンプルまたは対照を取り出し、４．０  ｍＬの基本培地（即ち、Ｘ−ＭｕＬＶ用の３  μｇ／ｍＬのポリブレンが補充されたマッコイ５Ａ培地（ＭＰ）またはＥＭＥＭ）を含む１５  ｍＬチューブに移した。この１：１０１の希釈係数クエンチにより、指標細胞株に対する毒性の影響を超えて界面活性剤を希釈できると同時に、ウイルスがＴＣＩＤ５０アッセイの実行に必要な範囲内で希釈されることになる。簡単に説明すると、ウイルスの感染性を評価するためのＴＣＩＤ５０アッセイは、クエンチしたサンプルをＭＰまたはＥＭＥＭで、１１回希釈レベルまで、１：３．２倍で連続希釈することにより実施した。１日前に９６穴細胞培養プレートに３，０００細胞／ウェルで播種された指標細胞の単層を、８連で、クエンチされ連続希釈されたサンプルまたは基本培地の希釈１００  μＬでインキュベートした。３７℃で１．５〜２．５時間のインキュベーション後、４％ＦＢＳ、２％Ｐ／Ｓ、および２％Ｌ−Ｇｌｕを補充した基本培地（ＰＲＶまたはＢＶＤＶ用のマッコイ５ＡまたはＥＭＥＭ）からなる１００  μＬのアッセイ培地をプレートの各ウェルに加えた。その後、細胞を３７℃で最大６〜７日間インキュベートし、光学顕微鏡下でウイルス感染を示す細胞変性効果（ＣＰＥ）の形成を観察した。
【００３２】
実施例３  ヒト第ＶＩＩＩ因子活性を評価するための発色アッセイ
Ｍｅｇａ  １０は、ｒＦＶＩＩＩマトリックス中に０．３％（ｗ／ｖ）の濃度で調製し（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏで調製された５．０％（ｗ／ｖ）ストック溶液から）、２．０±１．０℃で１２０分間インキュベートした。Ｍｉｌｌｉ−Ｑ  Ｈ２Ｏのみを添加したｒＦＶＩＩＩマトリックスの希釈液対照も準備し、同じ条件下でインキュベートした。インキュベーション後、界面活性剤と希釈液対照を発色アッセイ（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ  ＣＯＡＴＥＳＴ  ＳＰ４  ＦＶＩＩＩキット、カタログ：８２４０９４６３）ＦＶＩＩＩ標準および対照とともに１ｘアッセイバッファーで適切なレベルに希釈した。３０  μＬの各界面活性剤、対照、および標準液を３連で９６ウェルプレートにロードした。発色アッセイ試薬を製造元のプロトコルにしたがって追加し、３７．０℃、５．０％ＣＯ２で８分間インキュベートした。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダーを用いて４０５および４９２  ｎｍでアッセイプレートの吸光度を測定した。データはＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５を使用して分析した。
【００３３】
実施例４  Ｔｒｉｔｏｎを含まないｒＦＶＩＩＩマトリックスの用量応答
ｒＦＶＩＩＩとインキュベートし、Ｘ−ＭｕＬＶを加えたＭｅｇａ  １０界面活性剤の最低有効濃度を評価するために、界面活性剤の用量反応試験を実施した。各界面活性剤の０．５％（ｗ／ｖ）サンプルを組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）マトリックス中で調製し、ｒＦＶＩＩＩマトリックスで１：２連続希釈して、０．０１４〜０．５％（ｗ／ｖ）範囲の各界面活性剤の６サンプルを調製した。さらに、ｒＦＶＩＩＩマトリックスのみを含む陽性対照サンプルを加えた。各界面活性剤サンプルと対照に、１：１１の比率で低力価のＸ−ＭｕＬＶを添加し、２．０±１．０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、１００  μＬの各不活化サンプルと対照を取り出し、３  μｇ／ｍＬポリブレンを補充した３．０  ｍＬのマッコイ５Ａ培地（ＭＰ）を含む１５  ｍＬチューブに移した。この１：３１希釈係数クエンチにより、指標細胞株（ＰＧ−４）に対する毒性の影響を超えて界面活性剤を希釈でき、またＸ−ＭｕＬＶをＴＣＩＤ５０アッセイの実行に必要な範囲内で希釈できることとなった。簡単に説明すると、Ｘ−ＭｕＬＶ感染を評価するためのＴＣＩＤ５０アッセイは、クエンチしたサンプルをＭＰで、１１回希釈レベルまで、１：３．２倍で連続希釈することにより実施した。１日前に９６穴細胞培養プレートに３，０００細胞／ウェルで播種されたＰＧ−４細胞の単層を、８連で、クエンチされたサンプルまたはＭＰの希釈１００μＬでインキュベートした。３７℃で１．５〜２．５時間のインキュベーション後、４％ＦＢＳ、２％Ｐ／Ｓ、および２％Ｌ−Ｇｌｕを補充したマッコイ５Ａからなる１００  μＬのアッセイ培地を用いて細胞を覆った。その後、細胞を３７℃で最大６〜７日間インキュベートし、光学顕微鏡下でＸ−ＭｕＬＶ感染を示す細胞変性効果（ＣＰＥ）の形成を観察した。
【００３４】
実施例４  ウイルス不活化動力学
ｒＦＶＩＩＩとインキュベートし、Ｘ−ＭｕＬＶを加えたＭｅｇａ  １０界面活性剤の不活化率を評価するために、ウイルス不活化動態研究を実施した。Ｍｅｇａ  １０の０．０２％、０．１０％、０．２０％、および０．３０％（ｗ／ｖ）サンプルは、Ｔｒｉｔｏｎを含まない組み換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）マトリックスで調製した。さらに、ｒＦＶＩＩＩマトリックスのみを含む陽性対照サンプルまたは培地のみの対照を加えた。各界面活性剤サンプルと対照に、１：１１の比率で低力価と高力価のＸ−ＭｕＬＶストックを添加し、２．０±１．０℃で０、５、１５、３０、６０、１２０分間インキュベートした。各インキュベーション後、１００または４０  μＬの各不活化サンプルと対照を取り出し、３  μｇ／ｍＬのポリブレンを補充した３．０  ｍＬまたは４．０  ｍＬのマッコイ５Ａ培地（ＭＰ）を含む１５  ｍＬチューブに移した。この１：３１（低力価Ｘ−ＭｕＬＶ）または１：１０１（高力価Ｘ−ＭｕＬＶ）の希釈係数クエンチにより、指標細胞株（ＰＧ−４）に対する毒性の影響を超えて界面活性剤を希釈でき、さらにＸ−ＭｕＬＶがＴＣＩＤ５０アッセイの実行に必要な範囲内で希釈されるようになる。簡単に説明すると、Ｘ−ＭｕＬＶの感染性を評価するためのＴＣＩＤ５０アッセイは、クエンチした各サンプルをＭＰで、１１回希釈レベルまで、１：３．２倍で連続希釈することにより実施した。１日前にウェルあたり３，０００セルで播種されたＰＧ−４細胞の単層に、８連でクエンチされたサンプルまたはＭＰの希釈あたり１００  μＬを接種した。３７℃、５％ＣＯ２で１．５〜２．５時間のインキュベーション後、４％ＦＢＳ、２％Ｐ／Ｓ、および２％Ｌ−Ｇｌｕを補充したマッコイ５Ａ培地からなる１００  μＬのアッセイ培地を使用して、細胞を覆った。次に、細胞を３７℃、５％ＣＯ２で最大６〜７日間インキュベートし、光学顕微鏡で観察して、Ｘ−ＭｕＬＶ感染を示す細胞変性効果（ＣＰＥ）の形成を観察した。
【００３５】
実施例５  他のタンパク質の存在下でのＮ−メチルグルカミド界面活性剤によるウイルス不活化
ヒト血漿、血漿由来生物製剤またはヒト抗体の一般的な製造条件下でＸ−ＭｕＬＶ、ＰＲＶまたはＢＶＤＶを効果的かつ確実に不活化する能力について、Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤（Ｍｅｇａ  ８、Ｍｅｇａ  ９、Ｍｅｇａ  １０、Ｍｅｇａ  １２）を評価した。各界面活性剤について試験された濃度は、それぞれ臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の０．５倍、１倍、または２倍に基づいて決定された。各界面活性剤を、界面活性剤および複数の濃度の遊離タンパク質（高タンパク質勾配）とともにインキュベートし、１：１１の比率でＸ−ＭｕＬＶの高力価ストックを添加し、２．０±１．０℃で３０分間インキュベートした。それぞれのタンパク質のみを含む陽性対照サンプルを加え、２．０±１．０℃で０および３０分間インキュベートした。各インキュベーション時間後、４０  μＬの各不活化サンプルまたは対照を取り出し、４．０  ｍＬの基本培地（即ち、Ｘ−ＭｕＬＶ用の３  μｇ／ｍＬのポリブレンが補充されたマッコイ５Ａ培地（ＭＰ）またはＰＶＲもしくはＢＶＤＶ用のＥＭＥＭ）を含む１５  ｍＬチューブに移した。この１：１０１の希釈係数クエンチにより、指標細胞株に対する毒性の影響を超えて界面活性剤を希釈でき、ウイルスがＴＣＩＤ５０アッセイの実行に必要な範囲内で希釈されることになる。簡単に説明すると、ウイルスの感染性を評価するためのＴＣＩＤ５０アッセイは、クエンチした各サンプルを基本培地（ＭＰまたはＥＭＥＭ）で、１１回希釈レベルまで、１：３．２倍で連続希釈した。１日前にウェルあたり３，０００細胞で播種された指標細胞の単層に、８連で、クエンチされたサンプルまたは基本培地の希釈１００  μＬでインキュベートした。３７℃で１．５〜２．５時間のインキュベーション後、４％ＦＢＳ、２％Ｐ／Ｓ、および２％Ｌ−Ｇｌｕを補充した基本培地（マッコイ５ＡまたはＥＭＥＭ）からなる１００  μＬのアッセイ培地を使用して細胞を覆った。次に、細胞を３７℃で最大６〜７日間インキュベートし、光学顕微鏡下でウイルス感染を示す細胞変性効果（ＣＰＥ）の形成を観察した。
【００３６】
アッセイ例
【００３７】
実施例１：Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤：特性、調製、および評価
この試験では、４つのメチルグルカミドをベースとする界面活性剤オクタノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ  ８）、ノナオイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ  ９）、デカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ  １０）、およびドデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ  １２））を分析した（表１）。これらの界面活性剤はすべて市販のＮ−メチルグルカミドで、複数のロットを複数の販売業者（Ｇ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｉｇｍａ、またはＢａｃｈｅｍ）から粉末状で購入した。
【００３８】
図１は、界面活性剤がどのようにしてウイルスのエンベロープを破壊することができるかについての理論的なメカニズムを示している。一般に、それぞれの界面活性剤の臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を下回ると、界面活性剤のモノマーがウイルスのエンベロープ内に挿入され、ウイルスが細胞（宿主）に付着するのを阻止したり排除することが可能となる。ＣＭＣを超える濃度では、より多くのモノマーがウイルスエンベロープに挿入され、ウイルスエンベロープが完全に破壊される。モノマーは、それ自体で、または、剥離されたエンベロープ由来のミセルとウイルスタンパク質の混合物で、ミセルを形成できる。この明細書内の下記の例で説明するように、ＣＭＣは有効濃度の指標となるようである（実施例３）。ＣＭＣ以上の濃度では、この研究で試験したメチルグルカミド界面活性剤のそれぞれでウイルスの不活化が生じた。
【００３９】
Ｎ−メチルグルカミドは、アミド結合によって連結された非環式親水性グルコース極性頭部基および（８〜１０個、または１２個の炭素からなる）疎水性脂肪酸鎖尾部を含む（図２）。表１に示されるように、Ｎ−メチルグルカミド類は同様に構成され、分子量の増加に比例して対応する炭素鎖長のみが異なる。他の研究によれば、脂肪酸鎖の炭素が増加すると、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）は逆に減少する。
【表１】
2020533987.tif 000003
【００４０】
図３は、この研究で使用したＮ−メチルグルカミドの２次元（２Ｄ）および３次元（３Ｄ）構造を示している。２次元構造と３次元構造はどちらも、炭素、水素、酸素、窒素の分子の同様の配置を示している（Ｊｅｆｆｅｒｙ  ａｎｄ  Ｍａｌｕｓｙｎｋｓａ  ，１９８８，  Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．，  Ｂ４５：４４７−４５２）。興味深いことに、Ｍｅｇａ  ８と他のＮ−メチルグルカミドとの間の分子パッキングは、頭から頭の二層パッキング（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｐａｃｋｉｎｇ）を形成する可能性があるが、その他のものは、頭から尾の単層パッキング（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ  ｂｉｌａｙｅｒ  ｐａｃｋｉｎｇ）でパッキング形成する可能性がある（Ｊｅｆｆｅｒｙ  ａｎｄ  Ｍａｌｕｓｙｎｋｓａ、１９８８、Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ。、Ｂ４５：４４７−４５２）。このパッキングの違いは、炭素鎖が増加するにつれて、効力の増加に寄与する可能性がある。
【００４１】
表２は、方法の項でも詳述されている界面活性剤粉末の製造元と自社調製を示している。調製した５％（重量／容量、ｗ／ｖ）の界面活性剤のうち、Ｍｅｇａ  ８とＭｅｇａ  ９は室温で水に容易に溶解した。Ｍｅｇａ  １０は３７℃の水浴で温める必要があり、溶液を１５分以内に可溶化した。しかし、Ｍｅｇａ  １２は３７℃の水浴で水に溶解できず、６０℃の水浴で少なくとも５分間で徐々に溶解した。Ｔ同様の事象は他者によっても観察されており、疎水性を高める脂肪鎖の長さの増加と関係があり、溶解性、特に水への溶解の可能性を低下させる可能性がある（Ｇａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ。、Ｂｕｒｃｚｙｋ、２００７）。そのため、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で新たに０．１５％ストックを準備したが、これはＣＭＣの少なくとも１０倍である。６０℃の水浴に入れると、この新しい調剤は１５分以内に溶解することができた。
【表２】
2020533987.tif 000004
【００４２】
実施例２：ウイルス−背景と特徴
レトロウイルス科、フラビウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フィロウイルス科、ラブドウイルス科、ブニヤウイルス科、オルソミクソウイルス科、パラミクソウイルス科、アレナウイルス科、ヘパドナウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびポックスウイルス科など、多数のエンベロープＲＮＡおよびＤＮＡウイルスが存在する。これらの科に属する血液感染性ウイルスの多くは、生物学的に活性な医薬品の製造に使用される動物由来の製品を汚染する可能性がある。したがって、多くの製薬会社は、マウス白血病ウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（ＢＶＤＶ）、偽狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）などのモデルウイルスを使用して、さまざまな精製方法でウイルスの除去を実証している（表３）。Ｘ−ＭｕＬＶは、タンパク質製剤を発現させるための宿主細胞株（ＣＨＯまたはＢＨＫ細胞など）における内因性レトロウイルス様粒子のモデルウイルスとして一般的に使用される。Ｘ−ＭｕＬＶは、主要な血液感染性病原体ＨＩＶなど、レトロウイルスを含む他のエンベロープウイルスのモデルでもある。ＢＶＤＶはフラビウイルスのモデルであり、（最近の世界的な発生に関与する）ジカウイルスやＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのウイルスの代替となり得る。ＰＲＶはヘパドナウイルスのモデルであり、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）の代替となり得ることができるが、ＨＢＶは最も一般的な血液媒介性病原体の１つである。理論的には、これらのエンベロープウイルスはすべて、Ｎ−メチルグルカミドによる界面活性剤不活化の影響を受けやすい。
【００４３】
【表３】
2020533987.tif 000005
【００４４】
Ｎ−メチルグルカミドウイルス不活化の典型的な条件は、Ｘ−ＭｕＬＶの低および高力価ストックを使用して評価されている（表４）。Ｘ−ＭｕＬＶの低力価のストックを用量反応研究および速度論研究に使用した。Ｘ−ＭｕＬＶの高力価ストックを、速度論研究と、対数減少係数（ＬＲＦ）で表されるウイルス不活化の高容量の決定に使用した。表４に含まれるその他のウイルスは、ＢＶＤＶとＰＲＶの高力価ウイルス株である。これらは、Ｎ−メチルグルカミド界面活性剤の不活化の影響を受けやすいはずである。
【００４５】
【表４】
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【００４６】
実施例３：Ｎ−メチルグルカミド誘導体のスクリーニング
Ｘ−ＭｕＬＶの高力価ストックを不活化する能力について、Ｎ−メチルグルカミド誘導体を試験した。各界面活性剤（Ｍｅｇａ  ８、Ｍｅｇａ  ９、Ｍｅｇａ  １０、またはＭｅｇａ  １２）をＣＭＣの０．５倍、１倍、および２倍で試験した。タンパク質薬剤（組換え第ＶＩＩＩ因子、ｒＦＶＩＩＩ、抗体または血漿）と混合し、エンベロープウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ、ＰＲＶ、またはＢＶＤＶ）を加え、室温または２．０±１．０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、反応を停止し、適切な指標細胞（ＰＧ−４、Ｖｅｒｏ、またはＥＢＴｒ細胞）を使用してＴＣＩＤ５０力価アッセイを行った。ＴＣＩＤ５０は、次の２つの疑問、即ち、試験したウェルのいずれかに観察可能なウイルス感染はあるか？、もしあるなら、試験されたサンプル中のウイルスの量（力価）はどれくらいか？との疑問に対する回答を提供する。予想通り、２℃あるいは室温（２５℃）での３０分間のインキュベーション後、Ｘ−ＭｕＬＶを加えたｒＦＶＩＩＩ対照の測定力価は、平均してそれぞれ６．４０と６．４５  Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬであった（図４および図５）。各温度条件について、Ｎ−メチルグルカミド（Ｍｅｇａ  ８、９、１０、１２）とその濃度をテストすると、Ｎ−メチルグルカミドの濃度が１ｘ  ＣＭＣ以上の場合、検出限界（ＬＯＤ）までＸ−ＭｕＬＶが不活化されたが、このことは、１０４．３倍以上の完全なウイルス感染性の不活化、即ち、４．３以上の対数減少係数（ＬＲＦ）を示している（図４および図５、表５および表６）。検出限界（ＬＯＤ）が２．０３  Ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ以下であることに注意することが重要である。これは、ウイルスが観察されない場合の力価でもある。Ｍｅｇａ  ９およびＭｅｇａ  １０は０．５ｘ  ＣＭＣの濃度では、Ｘ−ＭｕＬＶを２５℃で完全に不活化したが、２℃では部分的に不活化した。０．５ｘ  ＣＭＣのＭｅｇａ  ８およびＭｅｇａ  １２は、２５℃または２℃で処理を行った場合、有意な不活化はなかった（図４および図５）。Ｎ−メチルグルカミドによるＸ−ＭｕＬＶの不活化はＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と同じくらい効果的であるが、アッセイ指標細胞に対する毒性は低かった（図６）。０．３％（ｗ／ｖ）では、両方の界面活性剤がＸ−ＭｕＬＶを完全に不活化した。Ｍｅｇａ  １０は、２．０３  ＴＣＩＤ５０／ｍＬの検出限界（ＬＯＤ）以下を示したが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００は、２．５４  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ以下のＬＯＤを示した（図６）。要約すると、これらの結果は、これらの環境にやさしい界面活性剤がウイルス不活化に効果的で強力であることを示している。
【００４７】
【表５】
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【表６】
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【００４８】
実施例４：ｒＦＶＩＩＩに対するＮ−メチルグルカミドの効果
Ｎ−メチルグルカミド類のスクリーニングにより、低濃度（〜０．２％）での高い有効性と溶解性により、Ｍｅｇａ  １０がＮ−メチルグルカミド類のトップ候補に決定された。Ｍｅｇａ  １０がタンパク質の薬物活性に悪影響を及ぼさないことを保証するために、発色アッセイキットを使用して、ｒＦＶＩＩＩ調製物の活性を測定した。このアッセイの原理には、血液凝固メカニズムの特定のステップが含まれ、第Ｘ因子が第Ｘａ因子に変換されて、発色基質の加水分解が行われる。この反応は第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）の活性に依存し、測定可能な色の強度に直接相関する。ｒＦＶＩＩＩ調製物のサンプルを０．３％（重量／体積、ｗ／ｖ）のＭｅｇａ  １０または０．３％（体積／体積、ｖ／ｖ）の水と２．０±１．０℃で２時間インキュベートし、発色アッセイキットを使用してｒＦＶＩＩＩの活性を測定した。水対照およびＭｅｇａ１０処理サンプルの平均活性（ＩＵ／ｍＬ）は、それぞれ５７．１９および５２．２６  ＩＵ／ｍＬで同等であった（図７）。これらの結果は、Ｍｅｇａ  １０との２時間のインキュベーション（これは、３０分のウイルス不活化をはるかに超える時点である）後でさえ、ｒＦＶＩＩＩ活性が維持されていることを示している。この結果は、Ｍｅｇａ  １０がエンベロープウイルスの不活化に効果的であるだけでなく、タンパク質薬剤の活性に影響がないことを示している。
【００４９】
実施例５：用量反応
Ｍｅｇａ  １０の最低効果濃度を決定するために、用量反応試験を行った。０．０１４〜０．５％（重量／容量、ｗ／ｖ）の範囲で濃度を上げ、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）とインキュベートし、Ｘ−ＭｕＬＶ（低力価）を２．０±１．０℃で３０分間加えた。ｒＦＶＩＩＩのみの対照も同じ条件下でインキュベートした。インキュベーション後、すべての反応を停止し、サンプルを採取してＴＣＩＤ５０アッセイで段階希釈した。Ｍｅｇａ  １０反応では、０．０１４〜０．０６％（ｗ／ｖ）の濃度でウイルス力価は対照と同等であり、Ｍｅｇａ  １０がこれらの低濃度ではエンベロープウイルスを不活化できなかったことを示している（図８）。Ｍｅｇａ  １０濃度を約０．１１％に上げると、たちまち、ウイルス力価は約２．６２  Ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬに顕著に減少した。Ｍｅｇａ１０の約０．２３％で、ウイルス力価はウイルス感染が観察されないレベルまで顕著に減少した（図７および表７）。０．２３％（ｗ／ｖ）では、Ｍｅｇａ  １０の検出限界（ＬＯＤ）は１．５２未満のＬｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬであり、したがって、Ｍｅｇａ  １０のＬＲＦは２．０±１．０℃で３０分間で３．９６以上であった（表７）。要約すると、Ｘ−ＭｕＬＶを迅速かつ完全に不活化する最低濃度は、Ｍｅｇａ  １０で約０．２３％である。
【００５０】
【表７】
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【００５１】
実施例６：動力学試験
力価の低いウイルス調製物と力価の高いウイルス調製物の両方を使用して動力学試験を行い、Ｍｅｇａ  １０がＸ−ＭｕＬＶをどれだけ迅速かつ広範囲に不活化できるかを決定した。動力学試験は、複数の濃度（０．０２％、０．１０％、０．２０％、および０．３０％（ｗ  ／  ｖ））、タイムポイント（０、５、１５、３０、６０、および１２０分）、および低力価と高力価のＸ−ＭｕＬＶ株において実施した。新たに高力価Ｘ−ＭｕＬＶ株を試験することにより、より高いアッセイ感度が得られ、これはより高いＬＲＦに反映されている。０．３％のＭｅｇａ  １０を組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）調製物とインキュベートし、低力価Ｘ−ＭｕＬＶウイルスを２．０±１．０℃で０、５、１５、３０、６０、および１２０分間加えた。次に、反応サンプルを反応停止し、ＴＣＩＤ５０アッセイのためにサンプルを採取した。Ｍｅｇａ  １０の結果は、Ｘ−ＭｕＬＶを界面活性剤含有サンプルと混合した直後にウイルスが不活化されたことを示している（ｔ〜０）（図９）。アッセイされたどの時点でもウイルス感染性は検出されず、≦１．５２Ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬの検出限界に達し、ＬＲＦが３．８０以上である完全な不活化が再度示された。
【００５２】
【表８】
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【００５３】
高力価のＸ−ＭｕＬＶストックと複数のＭｅｇａ  １０濃度で同様の実験を繰り返すと、０分（ｔ〜０）（０．２０％Ｍｅｇａ  １０）でウイルスの部分的な不活化が観察され、５分（０．２０％Ｍｅｇａ  １０）で完全に不活化された（図１０）。特に、Ｍｅｇａ  １０の０．２０％では、インキュベーションの５〜１２０分で生ウイルスは観察されず、２．０３以下Ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬの検出限界であり、ウイルス感染性減少が１０４．８０倍以上に達した（表９）。この例は、Ｍｅｇａ  １０が低濃度で、０〜５分の範囲内のクイックアクションをもって、非常に効果的であることを示している。
【００５４】
【表９】
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【００５５】
実施例７：Ｍｅｇａ  １０のロット間比較
複数の販売元と製造ロットにわたってＭｅｇａ  １０の一貫性を確保するために、Ｇ−ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅとＳｉｇｍａの界面活性剤製品を比較した用量反応試験を行った。各販売元について、サンプルは複数の濃度（０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４％ｗ／ｖ）で調製し、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）とインキュベートし、Ｘ−ＭｕＬＶ（高力価）を３０分間、２．０±１．０℃で添加した。ｒＦＶＩＩＩのみの対照も同じ条件下でインキュベートした。インキュベーション後、すべての反応を停止し、ＴＣＩＤ５０アッセイで力価測定した。Ｇ−ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅまたはＳｉｇｍａが作製したＭｅｇａ  １０サンプルそれぞれについて、ウイルス力価はそれぞれの濃度レベルで互いに一致した（図１１）。このＸ−ＭｕＬＶ不活化プロファイルは、両方の供給源からのＭｅｇａ  １０製品が同等であることを示している。０．２−０．４％Ｍｅｇａ  １０の各製品で処理されたサンプルは、２．０３以下のＬｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬと４．４５以上のＬＲＦの完全な不活化を示した。要約すると、異なる供給源からのＭｅｇａ  １０は、相互に、および以前のデータと一貫した結果をもたらした。
【００５６】
実施例８：Ｎ−メチルグルカミドによる組換えＦＶＩＩＩ中のその他エンベロープウイルス（ＢＶＤＶおよびＰＲＶ）の不活化
さらに、Ｎ−メチルグルカミドによる強力かつ即効性のＸ−ＭｕＬＶ不活化が、他のエンベロープウイルスにおいても同様に機能するか否かを判断するために、組換えＦＶＩＩＩ（ｒＦＶＩＩＩ）溶液中で、Ｍｅｇａ  ９およびＭｅｇａ  １０がＢＶＤＶおよびＰＲＶを不活化する能力を評価した。
【００５７】
Ｍｅｇａ  ９およびＭｅｇａ  １０によるＢＶＤＶの不活化は、用量反応試験によって測定した。０．５、０．８、および１．０％（ｗ  ／  ｖ）のＭｅｇａ  ９と、０．２、０．３、および０．４％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ  １０を含むｒＦＶＩＩＩのサンプルに、ＢＶＤＶストックを１：１１で添加し、２．０±１．０℃で３０分インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを反応停止し、ＥＢＴＲ指標細胞を使用してＴＣＩＤ５０アッセイを行い力価決定した。結果は、Ｍｅｇａ  ９が１．０％の濃度でのみＢＶＤＶを検出限界（≦２．０３Ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）まで不活化できることを示した。Ｍｅｇａ  １０は、０．２、０．３、および０．４％（ｗ／ｖ）でＢＶＤＶを完全に不活化することができた。どちらの界面活性剤も、ＢＤＶＤの感染力を１/１０５．１４倍以下に低下させることができた。
【００５８】
ＰＲＶを、０．２または０．３％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ  １０を含むｒＦＶＩＩＩ調製物に添加（１：１１）し、２．０±１．０℃で０、５、１５、３０、および６０分の時点でアッセイした。インキュベーション後、サンプルの反応を停止し、Ｖｅｒｏ指標細胞を使用したＴＣＩＤ５０アッセイで力価測定した。その結果、０．２％と０．３％のＭｅｇａ  １０が即座にウイルス感染性を１／１０４．５以下に低下させることができ、１５分で検出限界（≦２．０３Ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）に達して、両濃度のＭｅｇａ  １０によって1/１０５．１０以下の感染性低下が示された（図１２）。
【００５９】
要約すると、Ｍｅｇａ  １０は、０．２％で１５分以内にＰＲＶを不活化し、０．２％で混合直後にＢＶＤＶを不活化することができ、１/１０５．１４倍以下にＢＶＤＶ感染は減少を示した。Ｍｅｇａ  ９は１．０％（ｗ  ／  ｖ）で、処置後３０分以内にＢＶＤＶをＬＯＤに達するまで不活化することが可能であった。  Ｍｅｇａ  １０とＭｅｇａ  ９はどちらもＢＶＤＶをＬＯＤに達するまで不活化することができ、ＢＶＤＶの感染力が1/１０５．１４以下に減少したことを示している。ＢＶＤＶのＭｅｇａ  １０による不活化はＭｅｇａ  ９よりもはるかに速く、低濃度によるものである。これらの結果は、Ｎ−メチルグルカミドがウイルスの科や種に関係なくエンベロープウイルスを効果的に不活化できることを示している（図１３）。
【００６０】
メチルグルカミドを他の化合物と共に試験して、ウイルス不活化に対する潜在的な相乗効果を調べた。メチルグルカミドを、Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｔｗ２０）界面活性剤、リン酸トリ（ｎ−ブチル）（ＴｎＢＰ）溶媒、または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）塩と共に、または無しで、混合し、Ｘ−ＭｕＬＶとインキュベートした。次に、各サンプルまたは対照の力価を、前述のＴＣＩＤ５０アッセイを使用して測定した。各実験（図１５、１６、１７）において、対照は界面活性剤を含むことなくＸ−ＭｕＬＶを添加されたｒＦＶＩＩＩから構成され、測定された力価は約６．５  ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌの予想範囲内であった。０．０５％（ｗ／ｖ）、０．１０％（ｗ／ｖ）、または０．３０％（ｗ／ｖ）の濃度のＭｅｇａ  １０を、一般的に使用される０．０１％（ｗ／ｖ）、０．０２％（ｗ／ｖ）、または０．０６％（ｗ／ｖ）のＴｗ２０界面活性剤と混合し、その際のウイルス力価は、Ｍｅｇａ  １０単独と同等であった（図１５）。したがって、Ｍｅｇａ  １０＋Ｔｗ２０はウイルスの不活化をさらに促進するものではなかった。０．０５％（ｗ／ｖ）または０．３０％（ｗ／ｖ）の濃度Ｍｅｇａ  １０を、一般的に使用される０．０５％（ｗ／ｖ）または０．３０％（ｗ／ｖ）のＴｎＢＰ溶媒と（それぞれ）混合したが、０．０５％Ｍｅｇａ  １０のみの場合に比較して、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ  １０＋０．０５％（ｗ／ｖ）ＴｎＢＰを使用した場合には、ウイルス力価がわずかに低下した（図１６）。したがって、Ｍｅｇａ  １０＋ＴｎＢＰは、ウイルスの不活化をわずかに増強した。最後に、０．１０％（ｗ／ｖ）濃度のＭｅｇａ  １０または０．５１％（ｗ／ｖ）濃度のＭｅｇａ  ９を５００  ｍＭ  ＮａＣｌと混合した場合には、０．１０％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ  １０単独または０．５１％（ｗ／ｖ）Ｍｅｇａ  ９単独に比較して、ウイルス力価を低下させた（図１７）。したがって、Ｍｅｇａ  １０もしくはＭｅｇａ  ９＋ＮａＣｌはウイルスの不活化を促進した。まとめると、結果は、メチルグルカミドとＴｎＢＰまたはＮａＣｌの間で相乗効果が観察され、メチルグルカミドのウイルス不活化効率を高めるために使用できることを示している。
【００６１】
実施例９：Ｎ−メチルグルカミドによるヒト抗体溶液およびヒト血漿中のエンベロープウイルス（Ｘ−ＭｕＬＶ）の不活化
この時点で、Ｍｅｇａ  １０は、組換えＦＶＩＩＩタンパク質マトリックス中の複数のエンベロープウイルスの強力な不活化因子であることが示されている。Ｍｅｇａ  １０が他の血漿関連タンパク質マトリックスで有効かどうかを評価するために、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）および血漿溶液でＸ−ＭｕＬＶ不活化を行った。各タンパク質マトリックスサンプルは、０．２、０．３、および０．４％（ｗ／ｖ）のＭｅｇａ  １０を含む３０  ｍｇ／ｍＬで調製し、Ｘ−ＭｕＬＶストック（１：１１）を添加し、２．０±１．０℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、サンプルを反応停止し、ＰＧ−４指標細胞を使用したＴＣＩＤ５０アッセイにおいて連続希釈した。結果は、ヒトＩｇＧとヒトの血漿サンプルの両方で、Ｍｅｇａ  １０がＸ−ＭｕＬＶを検出限界（≦２．０３Ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）まで不活化し、ＩｇＧにおける1/１０４．４６以下へのＸ−ＭｕＬＶ感染力低下とヒト血漿溶液における1/１０３．５０以下へのＸ−ＭｕＬＶ感染力低下を示した（図１４）。上記２つのタンパク質マトリックスに対するウイルス感染力低下の値の違いは、ＩｇＧ陽性対照と比較して、ヒト血漿サンプルの陽性対照ウイルス力価が低かったためである。この不一致の考えられる原因は、実験を実行する前に血漿が熱で不活化されていないことに起因する、非特異的な補体媒介ウイルス不活化である。要約すると、Ｍｅｇａ  １０は、ｒＦＶＩＩＩタンパク質溶液と同様に、複数の血液関連タンパク質マトリックスでＸ−ＭｕＬＶを効果的かつ迅速に不活化することができ、Ｎ−メチルグルカミドによるウイルス不活化は、生物学的製剤の種類、発生源、濃度に影響されないことを示している。
【００６２】
Ｎ−メチルグルカミドでウイルスを不活化するこの方法は、タンパク質サブユニット、タンパク質（酵素、因子など）、組換えタンパク質、もしくは抗体またはヒト血液／血漿由来の医薬などの生物活性薬物の精製プロセスに適用できる。この方法で使用される環境的に安全な界面活性剤は、アミド結合で結合された親水性のグルコース部分と疎水性の脂肪酸尾部で構成されている、糖をベースとした複数のＮ−メチルグルカミド同族体群である。Ｎ−メチルグルカミドにはオクチルフェノールのような有毒中間体の存在が知られていないため、環境への懸念に関連するリスクが排除される。さらに、これらの糖ベースの界面活性剤は本来非イオン性であり、非イオン性界面活性剤は目的の薬物タンパク質を破壊しないことが示されている。本来、Ｎ−メチルグルカミドは非エンベロープウイルスや核酸調製物に影響を与えない。この方法は、潜在的なエンベロープウイルス汚染物質を不活化するために、Ｎ−メチルグルカミドとタンパク質製剤とのインキュベーション工程を含む。この方法によるウイルスの減少を評価するために、複数のモデルエンベロープウイルス（たとえば、異種向性白血病ウイルス、偽狂犬病ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス）をタンパク質薬物サンプル（たとえば、天然タンパク質、組換えタンパク質、抗体、ヒト血漿）に個別に添加し、Ｎ−メチルグルカミドとインキュベートした。インキュベーション後、ウイルス感染力価を測定するためにＴＣＩＤ５０アッセイを実施した。さらに、Ｎ−メチルグルカミドによるエンベロープウイルスの不活化は、数多くの文献があるウイルス不活化界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の不活化に匹敵する。総合すると、これらの優れた特性により、Ｎ−メチルグルカミドは生物由来医薬品の精製プロセスにおける強力なツールとなる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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2020533987.tif 000030
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