(57)【要約】  本願発明は、肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための組成物を提供する。具体的には、本願発明は、生物学的に活性なタンパク質およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む融合タンパク質；および肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するために有効である融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。本願発明の医薬組成物は、炎症性細胞および繊維芽細胞の増殖を阻害する効果を有し、したがって、肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための組成物として有効に使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効な成分として、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体タンパク質を含む融合タンパク質；および免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための医薬組成物であって、
ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、以下の変異（１）から（７）：
（１）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置９８から１０１でのアミノ酸の、ＥＩＲＰのアミノ酸配列（配列番号：６８）での置換；
（２）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０から１７４でのアミノ酸の、ＴＧＬＥＡＶのアミノ酸配列（配列番号：６９）での置換；
（３）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０から１７４でのアミノ酸の、ＴＧＬＥＡＮのアミノ酸配列（配列番号：７０）での置換；
（４）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０でのアミノ酸の、アミノ酸Ｎでの置換；
（５）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７４でのアミノ酸の、アミノ酸Ｎでの置換；
（６）上記（１）から（５）の１つ以上の変異と共に、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１８０でのアミノ酸の、アミノ酸Ｅでの置換；および
（７）野生型ＦＧＦ２１タンパク質の免疫原性を低下させるための１から１０アミノ酸の変異
からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、医薬組成物。
【請求項２】
融合タンパク質が、生物学的に活性なタンパク質、またはその変異体またはフラグメントをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
変異によって導入されるＦＧＦ２１変異体タンパク質のアミノ酸残基Ｎが、グリコシル化されている、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
生物学的に活性なタンパク質が、インスリン、Ｃ−ペプチド、レプチン、グルカゴン、ガストリン、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、アミリン、カルシトニン、コレシストキニン、ペプチドＹＹ、神経ペプチドＹ、骨形成タンパク質−６（ＢＭＰ−６）、骨形成タンパク質−９（ＢＭＰ−９）、オキシントモジュリン、オキシトシン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、イリシン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有タンパク質５（ＦＮＤＣ５）、アペリン、アディポネクチン、Ｃ１ｑおよび腫瘍壊死因子関連タンパク質（ＣＴＲＰファミリー）、レジスチン、ビスファチン、オメンチン、レチノール結合タンパク質−４（ＲＢＰ−４）、グリセンチン、アンジオポイエチン、インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）、エキセンディン−４および成長ホルモンからなる群から選択されるものである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
生物学的に活性なタンパク質が、ＧＬＰ−１、その変異体およびエキセンディン−４から選択されるものである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＧＬＰ−１の変異体が、配列番号：４３から４６のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有する、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
野生型ＦＧＦ２１タンパク質が、配列番号：１によって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ＦＧＦ２１変異体タンパク質が、配列番号：６から２３のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項９】
融合タンパク質が、リンカーをさらに含む、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
リンカーが、ＦＧＦ２１変異体タンパク質を免疫グロブリンのＦｃ領域に連結する、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
リンカーが、免疫グロブリンのＦｃ領域のＣ−末端およびＦＧＦ２１変異体タンパク質のＮ−末端に連結される、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
リンカーが、１０から３０アミノ酸残基からなるペプチドである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
リンカーが、配列番号：２から５のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
免疫グロブリンのＦｃ領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＤのＦｃ領域のいずれか、またはそれらの組合せを含むハイブリッドＦｃである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ハイブリッドＦｃが、ＩｇＧ４領域およびＩｇＤ領域を含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
融合タンパク質が、Ｎ−末端からＣ−末端へ以下の順において連結された、生物学的に活性なタンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
リンカーが、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質間にさらに連結される、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
リンカーが、免疫グロブリンのＦｃ領域のＣ−末端およびＦＧＦ２１変異体タンパク質のＮ−末端に連結される、請求項１７に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
融合タンパク質が、配列番号：３６、３７および３９から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つによって示される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
融合タンパク質が、配列番号：６５、６６および６７から選択されるアミノ酸配列のいずれか１つによって示される、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための、請求項１または２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２２】
肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための組成物を製造するための、請求項１または２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
請求項１または２に記載の医薬組成物を対象に投与する工程を含む、肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願発明は、肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための組成物に関する。具体的には、本願発明は、生物学的に活性なタンパク質およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む融合タンパク質；および肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するために有効である融合タンパク質を含む医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルス性または細菌性感染、アルコールまたは毒性物質、脂肪または重金属の過剰蓄積、異常な免疫応答などのような肝臓疾患には種々の原因がある。これらの原因は、ウイルス性肝炎、アルコール性肝臓疾患、非アルコール性脂肪肝疾患、中毒性肝炎、自己免疫性肝臓疾患などを含むことができる。また、いくつかの肝臓疾患は、慢性進行を介して肝硬変、肝線維症、および肝臓癌に進行する可能性がある。
【０００３】
急性ウイルス性肝炎または中毒性肝炎などの急性肝臓疾患は、重度の疲労、食欲不振、黄疸などを引き起こし、肝臓移植が行われないとき死亡に至る可能性がある急性肝不全に異常に進行する可能性がある。他方では、慢性ウイルス性肝炎および脂肪肝疾患のようにゆっくりと進行する慢性肝臓疾患はほとんど無症候性であり、患者は日常生活上有意な不都合を感じないかもしれないが、肝線維症が進行中であり、慢性肝臓疾患が気付かないうちに肝硬変および肝臓癌に進行する可能性がある。肝硬変の罹患率は、韓国の肝硬変罹患率統計によると２０１２年に、成人で０．５％および６５歳以上で約１．０％と推定される。これは医療機関での診断の病歴に基づいて調査されたアンケートの結果であるため、肝硬変の実際の罹患率はより高い可能性がある。韓国における肝硬変の最も一般的な原因はウイルス性肝炎であり、第２の最も一般的な原因はアルコール性肝臓疾患である。
【０００４】
肝障害が何らかの原因によって持続的に繰り返されるとき、症状の有無にかかわらず、肝硬変、線維症、および肝臓癌を発症する大きなリスクがある。肝硬変が発症したとき、処置しても硬化した肝臓を元の状態に戻すことは困難である。
【０００５】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、食物などによって刺激されるとき、腸管におけるＬ細胞によって分泌される３１アミノ酸からなるインクレチンホルモンである。その生物学的効果は、膵臓のβ細胞、脳などのような標的組織において発現されるＧタンパク質−共役受容体であるＧＬＰ−１受容体を介する細胞内シグナル伝達を介して生じる。血液に分泌されるＧＬＰ−１は、酵素ジペプチジルペプチダーゼ−４（ＤＰＰ−４）によるＮ−末端でのアミノ酸の開裂による活性の喪失によって引き起こされる２分未満の非常に短い半減期を有する。ＧＬＰ−１は血糖レベルに基づいて膵臓のβ細胞におけるインスリンの分泌を刺激するため、低血糖を誘発することなく血糖を低下させることに対して強い効果を有する。さらに、ＧＬＰ−１の投与は、種々の動物モデルおよびヒトにおいて体重減少をもたらし、これは食欲抑制に対する効果のために食物摂取の低減によって引き起こされることが知られている。ＧＬＰ−１は、膵臓のβ細胞において発現されるＧＬＰ−１受容体を介する糖脂質毒性によって引き起こされる細胞死を阻害することによって、β細胞の増殖を誘導し、β細胞の生存能力を増強させる。グルカゴンの過剰分泌は、血糖を増加させ、糖尿病における高血糖の原因の１つであることが知られている。加えて、ＧＬＰ−１が、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）タンパク質−特異的グルカゴンの分泌を阻害することによって、空腹時血糖上昇を阻害するように膵臓のα細胞に作用することが知られている。
【０００６】
エキセンディン−４は、臨床的に重要なＧＬＰ−１受容体アゴニストである。エキセンディン−４は、３９アミノ酸残基を有するポリペプチドであり、ドクトカゲ(Gila Monster lizard)の唾液腺において通常生産される。エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１と５２％のアミノ酸配列相同性を有し、哺乳動物においてＧＬＰ−１受容体と相互作用することが知られている（Thorens et al. (1993) Diabetes 42:1678-1682）。エキセンディン−４は、インビトロでインスリン−生産細胞によるインスリンの分泌を刺激することが示されており、インスリン−生産細胞によるインスリン放出の誘導は、等モル条件下でＧＬＰ−１よりも強い。エキセンディン−４は、インスリンの分泌を強く刺激して、ＧＬＰ−１よりも長い作用期間で齧歯動物およびヒトの両方において血糖レベルを減少させるが、エキセンディン−４は、ＧＬＰ−１を欠いている哺乳動物において、よく知られていないエピトープを有するため、抗原性を示す。
【０００７】
ＧＬＰ−１およびエキセンディン−４類似体（例えば、リラグルチドおよびエキセナチド）がヒトにおいてグルコースコントロールを改善する能力は、臨床的に確認されている。ＧＬＰ−１がアポトーシスの阻害および誘導される増殖を介してβ細胞量を増加させることが報告されている。さらに、ＧＬＰ−１が、満腹シグナルを増強しながら、胃酸分泌および胃内容排出を阻害する腸ホルモンとして作用し、それにより食欲を低減させることも報告されている。ＧＬＰ−１のかかる効果は、ＧＬＰ−１類似体が２型糖尿病を有する患者に投与されるときに観察される体重減少を説明することができる。加えて、ＧＬＰ−１は、齧歯動物において虚血後の心臓保護効果を示す。
【０００８】
様々な試みが、長時間作用型ＧＬＰ−１類似体を開発するためになされている。臨床的に確認される長時間作用型ＧＬＰ−１類似体は、デュラグルチド（ＷＯ  ２００５／０００８９２）およびアルビグルチド（ＷＯ  ２００３／０５９９３４）を含む。デュラグルチドはＦｃ−融合ＧＬＰ−１類似体であり、アルビグルチドはアルブミン−融合ＧＬＰ−１類似体であり、これら両方が週１回投与を可能にする薬物動態学プロフィールを有する。両方の薬物は、週１回投与で血糖を低下させること、および体重を低減させることについて優れた効果を有し、また、エキセナチドおよびリラグルチドと比較したとき、処置に関して非常に改善された利便性を提供する。
【０００９】
一方、肝臓で合成される線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、グルコースおよび脂質ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たすことが知られているホルモンである。ＦＧＦ２１は、ＦＧＦ２１特異的受容体、すなわち、ＦＧＦ受容体、およびβ−クロトー複合体の両方が発現される、肝臓、脂肪細胞、膵臓のβ細胞、脳の視床下部、および筋肉組織において薬理学的作用を示す。種々の糖尿病および代謝疾患の非ヒト霊長類およびマウスモデルにおいて、ＦＧＦ２１はインスリン非依存的に血糖レベルを低下させ、体重を低下させ、血中のトリグリセリドおよび低比重リポタンパク質（ＬＤＬ）濃度を低下させることができることが報告されている。加えて、ＦＧＦ２１がインスリン感受性改善効果も有することが知られており、したがって新規の抗−糖尿病または抗肥満治療剤の標的として高い可能性を有している（ＷＯ  ２００３／０１１２１３）。
【００１０】
したがって、ＦＧＦ２１に基づく新規の抗糖尿病薬を開発するために、いくつかのアミノ酸の置換、挿入、および欠失を介して野生型ＦＧＦ２１配列に基づくＦＧＦ２１変異体を構築することによってその生物学的活性およびインビボ安定性を改良する試みがなされている（ＷＯ２０１０／０６５４３９参照）。しかしながら、ＦＧＦ２１は非常に短い半減期を有するため、生物学的薬剤として直接的に使用されるとき、問題があることが証明されている（Kharitonenkov, A. et al., Journal of Clinical Investigation 115:1627-1635, 2005）。ＦＧＦ２１のインビボ半減期は、マウスにおいて１から２時間、およびサルにおいて２．５から３時間である。したがって、糖尿病に対する治療剤として現在の形態において使用されるＦＧＦ２１について、毎日の投与が必要とされる。
【００１１】
様々なアプローチは、ＦＧＦ２１組換えタンパク質のインビボ半減期を増加させることを試みることにおいて報告されている。そのような一例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、すなわち、ポリマー材料をＦＧＦ２１に結合させて、その分子量を増加させ、それにより、腎臓排出を阻害し、インビボ保持時間を増加させることである（ＷＯ２０１２／０６６０７５参照）。別のアプローチは、ヒトアルブミンに結合する脂肪酸と融合することによって半減期を改良することを試みている（ＷＯ２０１２／０１０５５３参照）。さらなる例は、ヒトＦＧＦ受容体単独にまたはβ−クロトーとの複合体のときに特異的に結合するアゴニスト抗体の産生を介する、野生型ＦＧＦ２１と同等の薬理学的活性を維持しながら半減期を増加させることを試みる（ＷＯ２０１２／１７０４３８参照）。別の例において、半減期は、ＩｇＧのＦｃ領域がＦＧＦ２１分子に結合する長時間作用型融合タンパク質を調製することによって改良された（ＷＯ２０１３／１８８１８１参照）。
【００１２】
長時間作用型薬物を作製するために種々の利用可能な技術の中で、Ｆｃ融合技術は、インビボ半減期を増加させながら、免疫応答または毒性の誘導のような他のアプローチで見られる欠点が少ないため広く使用される。長時間作用型治療薬としてのＦｃ−融合ＦＧＦ２１タンパク質の開発のために、以下の条件が満たされるべきである。
【００１３】
第一に、融合によって引き起こされるインビトロ活性の減少は最小限にされるべきである。ＦＧＦ２１のＮ−末端およびＣ−末端の両方がＦＧＦ２１の活性に関与している。この点において、ＦＧＦ２１融合タンパク質の活性は融合の位置に依存して大きく変化することが知られている。したがって、ＦＧＦ２１に変異が導入されているＦｃ−融合ＦＧＦ２１融合タンパク質の活性は、融合の存在／非存在または位置に依存して変化し得る。第二に、ヒトにおいて１週間に１回の間隔で投与を可能にする薬物動態学プロフィールは、融合によるインビボ半減期の増加によって実現されるべきである。第三に、免疫原性がバイオ医薬品の投与後にほとんどの患者で予期され得ることを考慮すると、融合リンカーまたは変異による免疫原性リスクは最小にされるべきである。第四に、融合の位置または変異の導入から生じる安定性の問題はないべきである。第五に、望ましくない免疫応答が融合免疫グロブリンのアイソタイプに依存して生じる可能性があるため、そのような応答を防ぐための解決策が必要である。
【００１４】
免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のＦｃ領域をＦＧＦ２１分子に連結することによって長時間作用型融合タンパク質を開発する試みが既に報告されている（ＷＯ  ２０１３／１８８１８１参照）。Ｆｃが野生型ＦＧＦ２１のＮ−末端に融合しているが、野生型ＦＧＦ２１と比較してインビトロ活性に明確な差異はない１つのＦｃ−ＦＧＦ２１構造の場合、半減期はタンパク質のインビボ分解のために非常に短いことが知られている。この問題に取り組むために、タンパク質分解に抵抗するためにＦＧＦ２１の特定の部位位置にいくつかの変異を導入することによって、インビボ半減期を改良する試みがなされてきた。しかしながら、免疫原性リスクは、複数の変異の導入とともに増加する可能性がある。対照的に、ＦｃがＦＧＦ２１分子のＣ−末端に融合しているＦＧＦ２１−Ｆｃ構造の場合、Ｆｃ−ＦＧＦ２１構造と比較して、この部位での融合によって引き起こされる活性の有意な減少があることが知られている。
【００１５】
ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の組合せ投与は、体内の作用メカニズムおよび標的組織に依存して単一の投与と比較して相乗効果を有する可能性があり、潜在的に優れた抗−糖尿病有効性およびさらなる利点が期待される。ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の組合せ投与またはＧＬＰ−１／ＦＧＦ２１融合タンパク質の効果は、既に研究され、報告されている（ＷＯ  ２０１０／１４２６６５およびＷＯ  ２０１１／０２０３１９参照）。
【００１６】
様々な問題が、ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１を含む融合タンパク質を開発するために解決されなければならない。野生型ＧＬＰ−１および野生型ＦＧＦ２１が非常に短いインビボ半減期を有するため、たとえ治療薬として開発されたとしても、少なくとも１日に１回投与される必要がある。したがって、患者に対する利便性を改良するように長時間作用型融合タンパク質を開発するために、Ｆｃ融合のような長時間作用型技術が必要とされる。ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の２つの標的に対するデュアル機能薬において、変異の導入は、薬の活性およびインビボ安定性を維持することが重要であり、それぞれの変異によって引き起こされる活性、構造または安定性の変化と関連する問題に対処すべきである。ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１の２つの標的に対する薬効は、バランスがとれていなければならず、インビトロ活性、薬物動態学プロフィール、動物モデルにおける薬理学的有効性、およびヒトにおける有効性の臨床評価さえも考慮した薬物設計がこの目的のために必要とされる。融合タンパク質は、人体において存在し得ない構造を有しており、単一の標的に対する融合タンパク質と比較して構造的に複雑である。加えて、変異またはリンカー操作が２つの標的のバランスをとることが必要とされるため、凝集複合体を形成する可能性が高まり得、これを防ぐためにさらなるタンパク質操作が必要とされ得る。さらに、起こり得る免疫原性は、新規の変異配列または複合体構造のために増加し得、これは対処されるべきまたは回避されるべきである。
【００１７】
本願発明者らは、上記問題を解決するために努力を行い、結果として、肝炎、肝線維症、および肝硬変を処置することに対して有効な融合タンパク質を開発し、本願発明を完成させた。
【発明の概要】
【００１８】
技術的問題
本願発明の目的は、肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための医薬組成物を提供することである。
【００１９】
問題に対する解決手段
本願発明の１つの目的にしたがって、有効な成分として、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体タンパク質を含む融合タンパク質；および免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための医薬組成物であって、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、以下の変異（１）から（７）：
（１）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置９８から１０１でのアミノ酸の、ＥＩＲＰのアミノ酸配列（配列番号：６８）での置換；
（２）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０から１７４でのアミノ酸の、ＴＧＬＥＡＶのアミノ酸配列（配列番号：６９）での置換；
（３）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０から１７４でのアミノ酸の、ＴＧＬＥＡＮのアミノ酸配列（配列番号：７０）での置換；
（４）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０でのアミノ酸の、アミノ酸Ｎでの置換；
（５）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７４でのアミノ酸の、アミノ酸Ｎでの置換；
（６）上記（１）から（５）の１つ以上の変異と共に、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１８０でのアミノ酸の、アミノ酸Ｅでの置換；および
（７）野生型ＦＧＦ２１タンパク質の免疫原性を低下させるための１から１０アミノ酸の変異
からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、医薬組成物を提供する。
【００２０】
さらに、本願発明の別の目的にしたがって、有効な成分として、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体タンパク質を含む融合タンパク質；生物学的に活性なタンパク質、またはその変異体またはフラグメント；および免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための医薬組成物であって、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、以下の変異（１）から（７）：
（１）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置９８から１０１でのアミノ酸の、ＥＩＲＰのアミノ酸配列（配列番号：６８）での置換；
（２）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０から１７４でのアミノ酸の、ＴＧＬＥＡＶのアミノ酸配列（配列番号：６９）での置換；
（３）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０から１７４でのアミノ酸の、ＴＧＬＥＡＮのアミノ酸配列（配列番号：７０）での置換；
（４）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０でのアミノ酸の、アミノ酸Ｎでの置換；
（５）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７４でのアミノ酸の、アミノ酸Ｎでの置換；
（６）上記（１）から（５）の１つ以上の変異と共に、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１８０でのアミノ酸の、アミノ酸Ｅでの置換；および
（７）野生型ＦＧＦ２１タンパク質の免疫原性を低下させるための１から１０アミノ酸の変異
からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む、医薬組成物を提供する。
【００２１】
さらに、本願発明の別の目的にしたがって、肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための本願発明の医薬組成物の使用を提供する。
【００２２】
さらに、本願発明の別の目的にしたがって、肝炎、肝線維症および肝硬変を予防または処置するための組成物を製造するための本願発明の医薬組成物の使用を提供する。
【００２３】
さらに、本願発明の別の目的にしたがって、本願発明の融合タンパク質を対象に投与する工程を含む、肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための方法を提供する。
【００２４】
本願発明の有利な効果
有効な成分として、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体タンパク質を含む融合タンパク質；および免疫グロブリンのＦｃ領域を含む、肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための本願発明の医薬組成物は、炎症性細胞および繊維芽細胞の増殖を阻害する効果を有し、したがって肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための組成物として有効に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１Ａは、ヒトβ−クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、ＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む融合タンパク質（以下、「ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質」）としての、ＤＦＤ４、ＤＦＤ５、ＤＦＤ６、ＤＦＤ７、ＤＦＤ９、およびＤＦＤ１３のインビトロ活性を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は、変異の導入のために、活性において有意な減少を示さなかった。
【００２６】
【図１Ｂ】図１Ｂは、ヒトβ−クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を含む融合タンパク質としての、ＤＦＤ６、ＤＦＤ１３、ＤＦＤ１８、ＤＦＤ７２、ＤＦＤ７３およびＤＦＤ７４のインビトロ活性を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は、変異の導入のために、活性において有意な減少を示さなかった。
【００２７】
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヒトβ−クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を含む融合タンパク質としての、ＤＦＤ６およびＤＦＤ６（大腸菌）のインビトロ活性を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は、変異の導入のために、活性において有意な減少を示さなかった。
【００２８】
【図２Ａ】図２Ａは、ヒトβ−クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、ＦＧＦ２１のＮ−末端およびＦｃ領域を連結するリンカーが導入されたＦＧＦ２１変異体融合タンパク質としての、ＤＦＤ３およびＤＦＤ４のインビトロ活性を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は、わずかな違いがリンカー配列に依存して活性において示されたが、活性において有意な減少を示さなかった。
【００２９】
【図２Ｂ】図２Ｂは、ヒトβ−クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、ＦＧＦ２１のＮ−末端およびＦｃ領域を連結するリンカーが導入されたＦＧＦ２１変異体融合タンパク質としての、ＤＦＤ１およびＤＦＤ１３のインビトロ活性を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は、わずかな違いがリンカー配列に依存して活性において示されたが、活性において有意な減少を示さなかった。
【００３０】
【図３】図３は、ヒトβ−クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、ＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）、Ｆｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）およびＤＦＤ１のインビトロ活性を示すグラフである。ＤＦＤ１およびＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）は、同様の活性を有したが、Ｆｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）は、他のタンパク質よりも２倍高いインビトロ活性を有した。
【００３１】
【図４Ａ】図４Ａは、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質であるＤＦＤ４のサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果である。
【００３２】
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＥＩＲＰ変異が導入されたＦＧＦ２１変異体融合タンパク質であるＤＦＤ１３のサイズ排除クロマトグラフィー分析の結果である。
【００３３】
【図４Ｃ】図４Ｃは、融合タンパク質の安定性に対するＦＧＦ２１のＥＩＲＰ変異の効果を立証するためにサイズ排除クロマトグラフィーを使用してＤＦＤ４およびＤＦＤ１３の提案された含有量の高分子量凝集体（ＨＭＷ％）を比較するグラフである。ＤＦＤ１３が、ＤＦＤ４と比較して、最初の段階および２週間以上後の時点で、低い割合の高分子量凝集体（ＨＭＷ％）と関連したことを立証し、ＥＩＲＰ変異の導入がＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の安定性を改良し、それによりＨＭＷ％を有意に低下させることを示す。
【００３４】
【図５】図５は、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の皮下投与後９６時間にわたる血液中のそれぞれのタンパク質の濃度を示す。データは平均値および標準偏差として示される。
【００３５】
【図６Ａ】図６Ａは、投与の時点から１４日までの食餌性肥満マウスモデルにおいてＤＦＤ１８の単一の投与後にグラム単位にて表された体重の変化を示すグラフである。ＤＦＤ１８は、優れた体重減少効果を示した。データは平均値および平均の標準誤差として示される。
【００３６】
【図６Ｂ】図６Ｂは、投与の時点から１４日までの食餌性肥満マウスモデルにおいてＤＦＤ１８の単一の投与後に％単位にて表された体重の変化を示すグラフである。ＤＦＤ１８は、優れた体重減少効果を示した。データは平均値および平均の標準誤差として示される。
【００３７】
【図７】図７は、ヒトＧＬＰ−１受容体が過剰発現されるＣＨＯ細胞系を使用して、ＧＬＰ−１変異体およびＧＬＰ−１のＣ−末端をＦｃ領域に連結するヒンジに依存して、融合タンパク質のインビトロＧＬＰ−１活性を示すグラフである。一般的に、ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）配列を含む融合タンパク質（ＤＦＤ２３）は、他のＧＬＰ−１変異体配列を含む他の融合タンパク質よりも２から３倍低い活性を示した。ＧＬＰ−１活性において有意な差異は、ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）配列以外の変異体配列を含む融合タンパク質間で示さなかった。
【００３８】
【図８Ａ】図８Ａは、ＤＦＤ５９、ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４のＧＬＰ−１活性を示すグラフである。３つの融合タンパク質（ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４）およびＦＧＦ２１を含まないＦｃ−融合ＧＬＰ−１変異体のインビトロＧＬＰ−１活性を、ヒトＧＬＰ−１受容体が過剰発現されるＣＨＯ細胞系を使用して、測定した。３つの融合タンパク質は、同様のＥＣ５０値を示し、Ｆｃ−融合ＧＬＰ−１変異体（ＤＦＤ５９）は、融合タンパク質よりも約２倍高い活性を示した。
【００３９】
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２、およびＤＦＤ１１４のＦＧＦ２１活性を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体に依存する融合タンパク質のインビトロ活性を、ヒトβ−クロトーが過剰発現されるＨＥＫ２９３細胞系を使用して、測定した。ＦＧＦ２１部分のインビトロ活性が３つの融合タンパク質において同様であったことを立証した。
【００４０】
【図９Ａ】図９Ａは、融合タンパク質ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２、およびＤＦＤ１１４のＦＧＦ２１部分の、皮下投与後にわたる血清薬物濃度を示すグラフである。データは平均値および標準偏差として示される。
【００４１】
【図９Ｂ】図９Ｂは、融合タンパク質ＤＦＤ５９、ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２、およびＤＦＤ１１４のＧＬＰ−１部分の、皮下投与後にわたる血清薬物濃度を示すグラフである。データは平均値および標準偏差として示される。
【００４２】
【図１０Ａ】図１０Ａは、２週間、４日間の間隔で食餌性肥満マウスモデルにおいてＤＦＤ１１４、ＤＦＤ１１２、ＤＦＤ７４またはＤＦＤ７２の反復皮下投与後の血清トリグリセリド（ＴＧ）における変化を示すグラフである。融合タンパク質およびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の投与は、コントロールグループと比較して、血清脂質低下効果を示した。データは平均値および平均の標準誤差として示される。統計分析は、一元配置分散分析後のＤｕｎｎｅｔの多重比較検定によって行われた（＊＊＊：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ビヒクルコントロール）。
【００４３】
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、２週間、４日間の間隔で食餌性肥満マウスモデルにおいてＤＦＤ１１４、ＤＦＤ１１２、ＤＦＤ７４またはＤＦＤ７２の反復皮下投与後の血清総コレステロール（ＴＣ）における変化を示すグラフである。融合タンパク質およびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の投与は、コントロールグループと比較して、血清脂質低下効果を示した（＊＊＊：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ビヒクルコントロール）。
【００４４】
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、２週間、４日間の間隔で食餌性肥満マウスモデルにおいてＤＦＤ１１４、ＤＦＤ１１２、ＤＦＤ７４またはＤＦＤ７２の反復皮下投与後の肝臓におけるトリグリセリド（ＴＧ）における変化を示すグラフである。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の投与は、コントロールグループと比較して、肝臓における脂質低下効果を示した（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：  Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ビヒクルコントロール）。
【００４５】
【図１１】図１１は、２週間、４日間の間隔で食餌性肥満マウスモデルにおいてＤＦＤ１１４またはＤＦＤ１１２の反復皮下投与によって得られた肝臓の組織病理学的写真を示す。融合タンパク質の投与は、コントロールグループと比較して、肝臓脂肪症−低下効果を示した。
【００４６】
【図１２Ａ】図１２Ａは、４週間、２日間の間隔でメチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ）食餌誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２の反復皮下投与後のＡＬＴレベルにおける変化を示すグラフである。ＡＬＴレベルは、コントロールグループと比較して、融合タンパク質−処置グループにおいて用量依存的に減少し、ＡＬＴレベルは、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質−処置グループにおいても減少した。データは平均値および平均の標準誤差として示される。統計分析は、一元配置分散分析後のＤｕｎｎｅｔの多重比較検定によって行われた（＃＃＃：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＭＣＳコントロール、＊＊：Ｐ＜０．０１、＊＊＊：  Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＭＣＤコントロール）。
【００４７】
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、４週間、２日間の間隔でメチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ）食餌誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２の反復皮下投与後のＡＳＴレベルにおける変化を示すグラフである。ＡＳＴレベルは、コントロールグループと比較して、融合タンパク質−処置グループにおいて用量依存的に減少し、ＡＳＴレベルは、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質−処置グループにおいても減少した（＃＃＃：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＭＣＳコントロール、＊＊：Ｐ＜０．０１  ｖｓ．  ＭＣＤコントロール）。
【００４８】
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、４週間、２日間の間隔でメチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ）食餌誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２の反復皮下投与後の炎症レベルにおける変化を示すグラフである。炎症レベルは、コントロールグループと比較して、融合タンパク質−処置グループにおいて用量依存的に減少し、炎症レベルは、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質−処置グループにおいても減少した（＃＃＃：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＭＣＳコントロール、＊＊＊：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＭＣＤコントロール）。
【００４９】
【図１３Ａ】図１３Ａは、４週間、２日間の間隔でＭＣＤ食餌誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２の反復皮下投与後の肝臓における線維症関連指標であるアルファ平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）における変化を示すグラフである。α−ＳＭＡの発現は、メチオニンコリン標準（ＭＣＳ）コントロールグループと比較して、ＭＣＤコントロールグループにおいて増加した。他方では、融合タンパク質−処置グループおよびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質−処置グループにおけるα−ＳＭＡレベルは、コントロールグループと比較して、減少した。データは平均値および平均の標準誤差として示される。統計分析は、一元配置分散分析後のＤｕｎｎｅｔの多重比較検定によって行われた（＃＃＃：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＭＣＳコントロール、＊＊＊：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＭＣＤコントロール）。
【００５０】
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、４週間、２日間の間隔でＭＣＤ食餌誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２の反復皮下投与後の肝臓における線維症関連指標である形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）における変化を示すグラフである。ＴＧＦ−βの発現は、ＭＣＳコントロールグループと比較して、ＭＣＤコントロールグループにおいて増加した。他方では、融合タンパク質−処置グループおよびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質−処置グループにおけるＴＧＦ−βレベルは、コントロールグループと比較して、減少した（＃＃＃：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＭＣＳコントロール、＊＊＊：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＭＣＤコントロール）。
【００５１】
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、４週間、２日間の間隔でＭＣＤ食餌誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２の反復皮下投与後の肝臓における線維症関連指標であるＰｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色の結果を示すグラフである。コラーゲンの量は、ＭＣＳコントロールグループと比較して、ＭＣＤコントロールグループにおいて増加した。他方では、融合タンパク質−処置グループおよびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質−処置グループにおけるＰｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄレベルは、コントロールグループと比較して、減少した（＃＃＃：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＭＣＳコントロール、＊＊：Ｐ＜０．０１  ｖｓ．  ＭＣＤコントロール）。
【００５２】
【図１４】図１４は、肝臓の組織病理学的写真を示す。肝臓組織における脂肪は有意に低下した。
【００５３】
【図１５Ａ】図１５Ａは、８週間、２日間の間隔で食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の血液生化学的指標であるＡＬＴレベルにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清ＡＬＴ低下効果が、コントロールグループと比較して観察された。データは平均値および平均の標準誤差として示される。統計分析は、一元配置分散分析後のＤｕｎｎｅｔの多重比較検定によって行われた（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【００５４】
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、８週間、２日間の間隔で食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後のＡＳＴレベルにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清ＡＳＴ低下効果が、コントロールグループと比較して観察された（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【００５５】
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、８週間、２日間の間隔で食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後のＴＧにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清ＴＧ低下効果が、コントロールグループと比較して観察された（＊：Ｐ＜０．０５、＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【００５６】
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、８週間、２日間の間隔で食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後のＴＣレベルにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清ＴＣ低下効果が、コントロールグループと比較して観察された（＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。
【００５７】
【図１６Ａ】図１６Ａは、８週間、２日間の間隔で食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の肝臓における投与前および投与後間のＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）における変化を示すグラフを提供する。融合タンパク質が投与されたとき、投与後ＮＡＦＬＤ活性スコアは、投与前スコアと比較して減少した。
【００５８】
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、８週間、２日間の間隔で食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の肝臓における投与前および投与後間の肝臓線維症スコアにおける変化を示すグラフを提供する。融合タンパク質が投与されたとき、投与後肝臓線維症スコアは、投与前スコアと比較して減少した。
【００５９】
【図１７Ａ】図１７Ａは、８週間、２日間の間隔でチオアセトアミド（ＴＡＡ）−誘発性肝線維症ラットモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の血液生化学的指標であるＡＬＰレベルにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清ＡＬＰ低下効果が、ＴＡＡコントロールグループと比較して観察された。データは平均値および平均の標準誤差として示される。統計分析は、一元配置分散分析後のＤｕｎｎｅｔの多重比較検定によって行われた（＃＃＃：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  正常コントロール、＊＊：Ｐ＜０．０１  ｖｓ．  ＴＡＡコントロール）。
【００６０】
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、８週間、２日間の間隔でチオアセトアミド（ＴＡＡ）−誘発性肝線維症ラットモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の血液生化学的指標であるＧＧＴレベルにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清ＧＧＴ低下効果が、ＴＡＡコントロールグループと比較して観察された（＃＃＃：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  正常コントロール、＊：Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ＴＡＡコントロール）。
【００６１】
【図１７Ｃ】図１７Ｃは、８週間、２日間の間隔でチオアセトアミド（ＴＡＡ）−誘発性肝線維症ラットモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の血液生化学的指標であるＴ−ＢＩＬレベルにおける変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、血清Ｔ−ＢＩＬ低下効果が、コントロールグループと比較して観察された（＃＃：Ｐ＜０．０１  ｖｓ．  正常コントロール、＊：Ｐ＜０．０５  ｖｓ．  ＴＡＡコントロール）。
【００６２】
【図１７Ｄ】図１７Ｄは、８週間、２日間の間隔でチオアセトアミド（ＴＡＡ）−誘発性肝線維症ラットモデルにおいてＤＦＤ１１２の反復皮下投与後の肝臓における線維症領域における変化を示すグラフである。融合タンパク質が投与されたとき、線維症領域低下効果が、コントロールグループと比較して観察された（＃＃＃：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  正常コントロール、＊＊＊：Ｐ＜０．００１  ｖｓ．  ＴＡＡコントロール）。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
以下で、本願発明は詳細に説明される。
【００６４】
本願発明による肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための組成物において活性成分として含まれる融合タンパク質は、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体タンパク質；および免疫グロブリンのＦｃ領域を含み、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、以下の変異（１）から（７）：
（１）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置９８から１０１でのアミノ酸の、ＥＩＲＰのアミノ酸配列（配列番号：６８）での置換；
（２）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０から１７４でのアミノ酸の、ＴＧＬＥＡＶのアミノ酸配列（配列番号：６９）での置換；
（３）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０から１７４でのアミノ酸の、ＴＧＬＥＡＮのアミノ酸配列（配列番号：７０）での置換；
（４）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０でのアミノ酸の、アミノ酸Ｎでの置換；
（５）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７４でのアミノ酸の、アミノ酸Ｎでの置換；
（６）上記（１）から（５）の１つ以上の変異と共に、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１８０でのアミノ酸の、アミノ酸Ｅでの置換；および
（７）野生型ＦＧＦ２１タンパク質の免疫原性を低下させるための１から１０アミノ酸の変異
からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む。
【００６５】
融合タンパク質は、生物学的に活性なタンパク質、またはその変異体またはフラグメントをさらに含み得る。
【００６６】
具体的には、本願発明による肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための組成物において活性成分として含まれる融合タンパク質は、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体タンパク質；生物学的に活性なタンパク質、またはその変異体またはフラグメント；および免疫グロブリンのＦｃ領域を含み、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、以下の変異（１）から（７）：
（１）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置９８から１０１でのアミノ酸の、ＥＩＲＰのアミノ酸配列（配列番号：６８）での置換；
（２）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０から１７４でのアミノ酸の、ＴＧＬＥＡＶのアミノ酸配列（配列番号：６９）での置換；
（３）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０から１７４でのアミノ酸の、ＴＧＬＥＡＮのアミノ酸配列（配列番号：７０）での置換；
（４）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０でのアミノ酸の、アミノ酸Ｎでの置換；
（５）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７４でのアミノ酸の、アミノ酸Ｎでの置換；
（６）上記（１）から（５）の１つ以上の変異と共に、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１８０でのアミノ酸の、アミノ酸Ｅでの置換；および
（７）野生型ＦＧＦ２１タンパク質の免疫原性を低下させるための１から１０アミノ酸の変異
からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む。
【００６７】
野生型ＦＧＦ２１タンパク質は、グルコースおよび脂肪ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たすことが知られているホルモンであり、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ブタ、サルなど、好ましくはヒト由来であってよい。さらに好ましくは、野生型ＦＧＦ２１タンパク質は、配列番号：１によって示されるアミノ酸配列を有する野生型ヒトＦＧＦ２１タンパク質であり得る。
【００６８】
ＦＧＦ２１変異体タンパク質において含まれる変異は、好ましくは、ＥＩＲＰ、ＴＧＬＥＡＶ、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０ＮおよびＧ１７４Ｎの変異のいずれか１つ；ＴＧＬＥＡＶ、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０ＮおよびＧ１７４Ｎの変異のいずれか１つおよびＥＩＲＰの変異の組合せ；ＥＩＲＰ、ＴＧＬＥＡＶ、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０ＮおよびＧ１７４Ｎの変異のいずれか１つおよびＡ１８０Ｅの変異の組合せ；またはＴＧＬＥＡＶ、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０ＮおよびＧ１７４Ｎの変異のいずれか１つ、ＥＩＲＰの変異およびＡ１８０Ｅの変異の組合せであってよい。さらに、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、Ｎ−末端またはＣ−末端での１から１０アミノ酸が野生型ＦＧＦ２１タンパク質と比較して欠失されている配座を有してもよい。さらに好ましくは、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、配列番号：６から２３のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を含んでもよい。よりさらに好ましくは、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、配列番号：６から２３のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を含んでもよく、さらに、Ｎ−末端またはＣ−末端での１から１０アミノ酸が野生型ＦＧＦ２１タンパク質と比較して欠失されている配座を有してもよい。
【００６９】
融合タンパク質において、ＦＧＦ２１変異体タンパク質の変異によって導入されるアスパラギン（Ｎ）残基はグリコシル化されてもよい。
【００７０】
生物学的に活性なタンパク質は、インスリン、Ｃ−ペプチド、レプチン、グルカゴン、ガストリン、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、アミリン、カルシトニン、コレシストキニン、ペプチドＹＹ、神経ペプチドＹ、骨形成タンパク質−６（ＢＭＰ−６）、骨形成タンパク質−９（ＢＭＰ−９）、オキシントモジュリン、オキシトシン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、イリシン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有タンパク質５（ＦＮＤＣ５）、アペリン、アディポネクチン、Ｃ１ｑおよび腫瘍壊死因子関連タンパク質（ＣＴＲＰファミリー）、レジスチン、ビスファチン、オメンチン、レチノール結合タンパク質−４（ＲＢＰ−４）、グリセンチン、アンジオポイエチン、インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）、エキセンディン−４および成長ホルモンからなる群から選択される１つであってよい。好ましくは、生物学的に活性なタンパク質は、ＧＬＰ−１、その変異体およびエキセンディン−４から選択される１つであってよい。具体的には、融合タンパク質は、ＧＬＰ−１の効果およびＦＧＦ２１タンパク質の効果を同時に示すことができる。
【００７１】
本願明細書において使用される、用語「インスリン」は、膵臓のベータ細胞によって合成および分泌されるタンパク質を示し、血液中の一定のグルコースレベルを維持することにおいて役割を果たすホルモンである。インスリンは、血糖レベルが高いとき分泌され、血液中のグルコースをグリコーゲンの形態で保存される細胞に入るようにし、そして肝細胞においてグルコース生産を阻害する。それはまた、脂肪組織において脂肪酸へのグルコース酸化および転換を手助けする。筋肉において、それは、アミノ酸の吸収を促進し、タンパク質を合成する。エピネフリンおよびグルカゴンは、血糖レベルを増加させることによってインスリンのアンタゴニストとして作用する。
【００７２】
本願明細書において使用される、用語「Ｃ−ペプチド」は、プロインスリンのＡおよびＢ鎖を連結するペプチドを指す。Ｃ−ペプチドは、膵臓細胞の分泌顆粒によってインスリンと共に分泌されるが、血液中で破壊されないため、膵臓のインスリン分泌機能の指標として使用される。
【００７３】
本願明細書において使用される、用語「レプチン」は、一定レベルで脂肪組織によって分泌される体脂肪を維持するホルモンを指す。脂肪組織によって分泌されるレプチンは、脳に作用して、食欲を抑制し、体内の代謝を活性化し、それにより体重を低減させる。
【００７４】
本願明細書において使用される、用語「グルカゴン」は、膵臓によって合成および分泌されるタンパク質を指し、低下した血糖レベルに応答して分泌されるホルモンであり、血糖レベルを増加させる役割を果たす。グルカゴンは、ランゲルハンス島のα細胞によって分泌される２９アミノ酸残基からなる。
【００７５】
本願明細書において使用される、用語「ガストリン」は、胃の遠位端に分泌されるホルモンを指し、胃酸の分泌および膵液の生産を誘導し、胃、小腸、および大腸の動きを促進する。
【００７６】
本願明細書において使用される、用語「ガストリン阻害ポリペプチド」は、全ての胃液分泌を阻害する線状ポリペプチドを指す。
【００７７】
本願明細書において使用される、用語「アミリン」は、膵臓のベータ細胞によって合成および分泌されるホルモンを示し、インスリンのようなグルコース代謝を制御する。
【００７８】
本願明細書において使用される、用語「カルシトニン」は、血液中のカルシウムレベルを制御する甲状腺ホルモンを指す。カルシトニンは、甲状腺Ｃ細胞によって分泌される３２アミノ酸からなるポリペプチドである。
【００７９】
本願明細書において使用される、用語「コレシストキニン」は、十二指腸および空腸のＩ細胞によって生産される３３アミノ酸からなるホルモンを指す。コレシストキニンは、脾臓の収縮を加速しおよび膵臓酵素の分泌を促進する作用を示し、胃酸の分泌を阻害する。
【００８０】
本願明細書において使用される、用語「ペプチドＹＹ」は、ペプチドチロシンチロシンの略語であり、食物に応答して大腸および回腸の細胞によって分泌される３６アミノ酸からなるポリペプチドを指す。
【００８１】
本願明細書において使用される、用語「神経ペプチドＹ」は、カルボキシ末端がアミノ化されている３６アミノ酸からなる生物学的に活性なペプチドを指す。神経ペプチドＹは、脊椎動物の中枢および末梢神経系において広く分布され、交感神経系において血圧を制御し、脊椎動物の中枢神経系における内分泌または自律神経コントロール、摂食行動、記憶、および概日リズムに関与する。
【００８２】
本願明細書において使用される、ＢＭＰ−６とも呼ばれる用語「骨形成タンパク質６」は、骨形成に直接的に関与するタンパク質を指す。
【００８３】
本願明細書において使用される、ＢＭＰ−９とも呼ばれる用語「骨形成タンパク質９」は、骨形成に直接的に関与するタンパク質を指す。
【００８４】
本願明細書において使用される、用語「オキシトモジュリン」は、粘膜の壁細胞によって分泌される３７アミノ酸からなるポリペプチドを指す。オキシトモジュリンは、強い食欲抑制効果を有する。
【００８５】
本願明細書において使用される、用語「オキシトシン」は、９アミノ酸からなるホルモンを指し、分娩中の子宮収縮を促進し、授乳中の乳の分泌を手助けする。
【００８６】
本願明細書において使用される、用語「ＧＬＰ−１」は、食物などによって刺激される腸Ｌ細胞において分泌される３１アミノ酸からなるインクレチンホルモンを指す。例えば、ＧＬＰ−１タンパク質は、配列番号：４２のアミノ酸配列によって示されてもよい。
【００８７】
ＧＬＰ−１の変異体は、例えば、配列番号：４３から４６のいずれか１つのアミノ酸配列によって示されてもよい。
【００８８】
本願明細書において使用される、用語「イリシン」は、運動中に筋肉によって分泌され、白色脂肪細胞の褐色脂肪細胞への転換のような脂肪を分解するために血流を介して脂肪細胞に到達するホルモンを指す。イリシンは、１１２アミノ酸からなり、ＦＮＤＣ５と呼ばれる膜タンパク質の切断されたフラグメントである。
【００８９】
本願明細書において使用される、用語「ＦＮＤＣ５」は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有タンパク質５の略語であり、イリシンの前駆体物質を指す。
【００９０】
本願明細書において使用される、用語「アペリン」は、ＡＰＬＮ遺伝子によってコードされるペプチドを指す。アペリンは、脂肪組織によって合成および分泌され、インスリンと同じ機能を有する。
【００９１】
本願明細書において使用される、用語「アディポネクチン」は、脂肪細胞によって分泌されるタンパク質を指し、インスリン抵抗性を改良する。
【００９２】
本願明細書において使用される、用語「ＣＴＲＰファミリー」は、アジポカインファミリーの１つであり、グルコースおよび脂質代謝などを制御するように肝臓および筋肉組織に主に作用するＣ１ｑおよび腫瘍壊死因子−関連タンパク質を指す。
【００９３】
本願明細書において使用される、用語「レジスチン」は、脂肪細胞によって分泌される最近発見されたアジポカインを指し、１０８アミノ酸からなるタンパク質であり、脂肪分化中に増加される剤として知られ、脂肪細胞の分化を阻害することができる。
【００９４】
本願明細書において使用される、用語「ビスファチン」は、脂肪組織によって生産および分泌されるアジポカインの１つを指し、５２ｋＤａのタンパク質である。
【００９５】
本願明細書において使用される、用語「オメンチン」は、脂肪組織によって生産および分泌されるアジポカインの１つを指し、抗炎症性作用を有するタンパク質である。
【００９６】
本願明細書において使用される、用語「レチノール結合タンパク質−４」は、脂肪細胞によって分泌されるタンパク質を指し、インスリン抵抗性を改良するビタミンＡを有する。
【００９７】
本願明細書において使用される、用語「グリセリン(glycetin)」は、消化管中の主要なエンテログルカゴンを指し、位置３３−６６でのアミノ酸間のグルカゴンの全ての２９アミノ酸を含む６９アミノ酸からなる。
【００９８】
本願明細書において使用される、ＡＮＧとも呼ばれる用語「アンジオポイエチン」は、血管または血管内皮細胞の増殖中または体内での創傷治癒中に作用するタンパク質を指す。
【００９９】
本願明細書において使用される、ＩＬ−ＴＩＦとも呼ばれる用語「ＩＬ−２２」は、ＩＬ−２２遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。ＩＬ−２２は、上皮細胞の細菌抗原に応答して活性化されるナチュラルキラー細胞またはＴ細胞によって分泌される。
【０１００】
本願明細書において使用される、用語「Ｆｃ領域」、「Ｆｃフラグメント」または「Ｆｃ」は、免疫グロブリンの重鎖定常領域１（ＣＨ１）、重鎖定常領域２（ＣＨ２）および重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含むが、重鎖および軽鎖の可変領域および免疫グロブリンの軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含まないタンパク質を指す。さらに、本願明細書において使用される、用語「Ｆｃ領域変異体」は、Ｆｃ領域のアミノ酸の一部を置換することによって、または異なるタイプのＦｃ領域を組み合わせることによって調製されるものを指す。
【０１０１】
免疫グロブリンのＦｃ領域は、抗体を構成する完全なＦｃ領域、そのフラグメント、またはＦｃ領域変異体であってよい。さらに、Ｆｃ領域は、単量体または多量体の形態の分子を含み、重鎖定常領域のヒンジ領域をさらに含み得る。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジ領域での開裂を防止するように修飾されてもよい。さらに、Ｆｃのヒンジ配列は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を低下させるようにいくつかのアミノ酸配列において置換を有し得る。加えて、Ｆｃヒンジ配列のアミノ酸配列の一部は、Ｆａｂ領域の再配列を阻害するように置換されてもよい。ＦｃのＣ−末端でのリジン（Ｋ）は除去されてもよい。
【０１０２】
好ましくは、免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＤ  Ｆｃ領域のいずれか１つ；またはそれらの組合せであるハイブリッドＦｃであってよい。さらに、ハイブリッドＦｃは、ＩｇＧ４領域およびＩｇＤ領域を含んでよい。さらに、ハイブリッドＦｃ領域は、一部のＩｇＤ  Ｆｃのヒンジ配列およびＣＨ２、ならびにＩｇＧ４  ＦｃのＣＨ２およびＣＨ３配列を含んでもよい。
【０１０３】
加えて、本願発明のＦｃフラグメントは、野生型グリコシル化鎖、野生型よりも多いグリコシル化鎖、野生型よりも少ないグリコシル化鎖、または脱グリコシル化鎖の形態であってよい。グリコシル化鎖の増加、減少、または除去は、当分野で知られている慣用の方法、例えば化学的方法、酵素的方法、および微生物を使用する遺伝子操作する方法によって調製され得る。
【０１０４】
好ましくは、免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号：２４から２６、４７および４８から選択されるアミノ酸配列によって示され得る。
【０１０５】
融合タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端へ以下の順において連結された生物学的に活性なタンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含んでよい。さらに、融合タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端へ以下の順において連結されたＦＧＦ２１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域および生物学的に活性なタンパク質を含んでよい。好ましくは、融合タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端へ以下の順において連結された生物学的に活性なタンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含んでよい。
【０１０６】
さらに、融合タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端へ以下の順において連結されたＧＬＰ−１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含んでよい。さらに、融合タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端へ以下の順において連結されたＦＧＦ２１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＧＬＰ−１変異体タンパク質を含んでよい。好ましくは、融合タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端へ以下の順において連結されたＧＬＰ−１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含んでよい。
【０１０７】
さらに、融合タンパク質は、リンカーをさらに含み得る。
【０１０８】
融合タンパク質は、ＦＧＦ２１変異体タンパク質が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ−末端またはＣ−末端に直接的に連結される、またはＦＧＦ２１変異体タンパク質がリンカーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結される、形態であってよい。
【０１０９】
そのような場合、リンカーは、ＦｃフラグメントのＮ−末端、Ｃ−末端、または遊離基に連結されてよく、また、ＦＧＦ２１変異体タンパク質のＮ−末端、Ｃ−末端、または遊離基に連結されてよい。リンカーがペプチドリンカーであるとき、結合は任意の領域にて起こってよい。例えば、リンカーは、免疫グロブリンＦｃ領域のＣ−末端およびＦＧＦ２１変異体タンパク質のＮ−末端に連結され、免疫グロブリンＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質の融合タンパク質を形成してよい。
【０１１０】
さらに、本願発明の融合タンパク質は、生物学的に活性なタンパク質が融合タンパク質の免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ−末端に連結される形態であってよい。
【０１１１】
リンカーおよびＦｃが別々に発現され、次に連結されるとき、リンカーは当分野で知られている架橋剤であってよい。架橋剤の例は、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、４−アジドサリチル酸のようなＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルおよび３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）のようなジスクシンイミジルエステルを含むイミドエステル、およびビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンのような二機能性マレイミドを含んでよいが、これらに限定されない。
【０１１２】
さらに、リンカーはペプチドであってよい。好ましくは、リンカーは１０から３０アミノ酸残基からなるペプチドであってよい。
【０１１３】
さらに、アラニンはリンカーの末端にさらに付着され得る。好ましくは、リンカーは、配列番号：２から５のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。
【０１１４】
融合タンパク質は、１つ以上のＦＧＦ２１変異体タンパク質が互いに連結したＦＧＦ２１変異体タンパク質の二量体または多量体が、免疫グロブリンＦｃ領域に連結される形態であってよい。さらに、融合タンパク質は、免疫グロブリンＦｃ領域がそれに連結したＦＧＦ２１変異体タンパク質を有する、２つ以上の免疫グロブリンＦｃ領域が連結された二量体または多量体の形態であってよい。
【０１１５】
さらに、具体的には、融合タンパク質は、配列番号：３６から３９のいずれか１つのアミノ酸配列によって示されてもよい。さらに具体的には、それは、配列番号：３６、３７または３９のアミノ酸配列によって示されてもよい。
【０１１６】
さらに、融合タンパク質は、好ましくは配列番号：５８から６７のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。さらに好ましくは、融合タンパク質は、配列番号：６５、６６または６７によって示されるアミノ酸配列を有するペプチドであってよい。
【０１１７】
ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、野生型ＦＧＦ２１タンパク質の免疫原性を低下させるための１から１０アミノ酸の変異をさらに含み得る。免疫原性は、当分野で知られている慣用の方法によって予測され得る。例えば、タンパク質の起こり得る免疫原性は、例えば、ｉＴｏｐｅＴＭおよびＴＣＥＤＴＭ方法を使用することによってスクリーニングされ得る。
【０１１８】
さらに、免疫原性を最小限にするための変異は、当分野で知られている慣用の方法によって設計され得る。例えば、免疫原性が起こり得る免疫原性を評価するためにＥｐｉＳｃｒｅｅｎＴＭ分析を実施することによって観察されるとき、免疫原性を誘導するアミノ酸配列はＴ細胞エピトープマッピングを介して同定され得、最小限にされた免疫原性を有する変異体はコンピューター内予測を介して設計され得る。
【０１１９】
融合タンパク質は、肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するために使用することができる。
【０１２０】
具体的には、肝炎は、急性ウイルス肝炎、慢性肝炎、アルコール性肝炎、自己免疫性肝炎、劇症肝炎、または非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）であってよい。具体的には、肝硬変は、アルコール性肝硬変、または原発性胆汁性肝硬変であってよい。
【０１２１】
さらに、医薬組成物は、医薬担体をさらに含んでもよい。医薬担体は、患者に抗体を送達するために適当な非毒性材料である限り、あらゆる担体であってよい。例えば、蒸留水、アルコール、脂肪、ワックスおよび不活性な固体を担体として含めてよい。薬学的に許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）もまた医薬組成物に含めてよい。これらの製剤において、融合タンパク質の濃度は大きく異なり得る。
【０１２２】
具体的には、医薬組成物は、組成物のｐＨ、浸透圧、粘性、透明性、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解または放出速度、吸着、または透過性を変更、維持、または保存するための製剤材料を含んでよい。適当な製剤について、それは、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）、抗微生物剤、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）、緩衝剤（例えば、ホウ酸、重炭酸、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）、増量剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）、キレート化剤（例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ））、錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）、増量剤、単糖類、二糖類および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）、タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）、着色剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）、溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）、糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（例えば、プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート、例えば、ポリソルベート  ２０またはポリソルベート  ８０；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポール）、安定性向上剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）、成長向上剤（例えば、アルキル金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム；またはマンニトール、ソルビトール）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または医薬アジュバントをさらに含んでよいが、これらに限定されない。
【０１２３】
加えて、本願発明はまた、本願発明の医薬組成物を処置を必要とする対象に投与することを含む肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための方法を提供する。このような方法は、有効量の本願発明の融合タンパク質を急性ウイルス肝炎、慢性肝炎、アルコール性肝炎、自己免疫性肝炎、劇症肝炎、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のような肝炎の症状を有する哺乳動物に投与することを含んでよい。有効量の本願発明の融合タンパク質を肝硬変、例えば、アルコール性肝硬変、原発性胆汁性肝硬変、および肝線維症の症状を有する哺乳動物に投与することを含んでもよい。
【０１２４】
本願発明の医薬組成物は、任意の経路を介して投与されてよい。本願発明の組成物は、任意の適当な手段を介して、直接的に（例えば、局所的に、注射により組織領域に投与することにより、移植、または局所投与により）または全身的に（例えば、経口または非経口投与により）動物に提供されてもよい。本願発明の組成物は、静脈内、皮下、眼科的、腹腔内、筋肉内、経口、経直腸、眼窩内、脳内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、髄腔内、大槽内、嚢内、鼻腔内、またはエアロゾル投与を介して非経腸的に提供されるとき、組成物は、好ましくは水性であるか、または生物学的に適用できる体液懸濁液または溶液の一部を含んでよい。したがって、担体またはビヒクルは、生物学的に適用可能であるため、組成物に加えられてよく、および患者に送達されてよい。したがって、生物学的に適当な塩水は、一般的に、製剤のための体液のような担体として含まれてもよい。
【０１２５】
さらに、投与頻度は、使用される製剤における融合タンパク質の薬物動態パラメータに依存して変化し得る。一般的に、所望の効果をなし遂げるように投与用量が達成されるまで、医師は組成物を投与するだろう。したがって、組成物は、単位用量として、時間間隔で少なくとも２つの用量で（標的融合タンパク質の同じ量を含んでも含まなくてもよい）投与されてもよく、または移植デバイスまたはカテーテルを介して連続的な注射によって投与されてもよい。適当な投与用量の添加の正確さは、当業者によって日常的に行われてもよく、それらによって日常的に行われている研究の範囲に対応する。
【０１２６】
さらに、ヒトにおいて融合タンパク質の好ましい単位用量は、０．０１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、およびさらに好ましくは１μｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。これは最適な量であるが、単位用量は処置される疾患または副作用の存在／非存在に依存して変化し得る。それにもかかわらず、最適な投与用量は、慣用の実験を実施することにより決定されてもよい。融合タンパク質の投与は、周期的ボーラス注射、外部貯蔵器（例えば、静脈内バッグ）、または内部供給源からの連続的な静脈内、皮下、もしくは腹腔内投与（例えば、生体侵食性(bioerodable)インプラント）によって行われてよい。
【０１２７】
加えて、本願発明の融合タンパク質は、他の生物学的に活性な分子と共に対象レシピエントに投与され得る。融合タンパク質および他の分子、投与形態、および最適な用量の最適な組合せは、当分野でよく知られている慣用の実験によって決定され得る。
【０１２８】
本願発明は、有効な成分として、肝炎、肝線維症および肝硬変を予防または処置するための融合タンパク質を含む本願発明の医薬組成物の使用を提供する。
【０１２９】
本願発明は、有効な成分として、肝炎、肝線維症および肝硬変を予防または処置するための組成物を製造するための融合タンパク質を含む本願発明の医薬組成物の使用を提供する。
【０１３０】
さらに別の局面において、本願発明は、融合タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。単離された核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｍＲＮＡからなる群から選択されてよく、具体的には、それはＤＮＡであってよい。
【０１３１】
そのような場合、融合タンパク質をコードする単離された核酸分子は、コドン重複のために互いに異なる配列を有してよい。さらに、単離された核酸が融合タンパク質を生産することができる限り、所望の目的にしたがって、単離された核酸は適当に修飾されてよく、または、ヌクレオチドは単離された核酸のＮ−末端またはＣ−末端に加えられてよい。
【０１３２】
単離された核酸分子は、例えば、配列番号：７１から８０のいずれか１つによって示されるヌクレオチド配列を含んでよい。
【０１３３】
さらに別の局面において、本願発明は、単離された核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
【０１３４】
本願明細書において使用される、用語「発現ベクター」は、宿主細胞の形質転換のために適当である、および挿入された異種核酸配列の発現を指向または制御する、核酸配列を含むベクターを指す。発現ベクターは、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、およびそれらの類似体を含む。ウイルスベクターの例は、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスを含むが、これらに限定されない。
【０１３５】
本願明細書において使用される、用語「異種核酸配列の発現」または標的タンパク質の「発現」は、挿入されたＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写産物の翻訳、およびＦｃ融合タンパク質産物、抗体または抗体フラグメントの生産を指す。
【０１３６】
有効な発現ベクターは、ＲｃＣＭＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ）またはその変異体であってよい。有効な発現ベクターは、哺乳動物細胞において標的遺伝子の連続的な転写を促進するためのヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、および転写後ＲＮＡ安定性のレベルを増強するためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列を含み得る。本願発明の例示的な態様において、発現ベクターは、ＲｃＣＭＶの修飾されたベクターであるｐＡＤ１５である。
【０１３７】
さらに別の局面において、本願発明は、発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１３８】
本願明細書において使用される、用語「宿主細胞」は、組換え発現ベクターが導入され得る原核細胞または真核細胞を指す。本願明細書において使用される、用語「形質転換」、または「トランスフェクト」は、当分野で知られている種々の技術によって細胞への核酸（例えば、ベクター）の導入を指す。
【０１３９】
適当な宿主細胞は、本願発明のＤＮＡ配列で形質転換またはトランスフェクトされ得、および標的タンパク質の発現および／または分泌のために使用され得る。本願発明において使用されてもよい適当な宿主細胞の例は、不死ハイブリドーマ細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＡＰ細胞（ヒト羊水由来細胞）、およびＣＯＳ細胞を含む。
【０１４０】
発明のための様式
以下、本願発明の例示的な態様は、実施例を基準にして詳細に記載されている。しかしながら、本願発明によるこれらの実施例は、多くの異なる形態において修飾することができ、本願発明の範囲は、ここに記載の実施例に限定されると解釈されるべきでない。
【０１４１】
調製実施例１．ＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む融合タンパク質の調製および精製
【０１４２】
調製実施例１−１．ＦＧＦ２１変異体タンパク質の発現のための発現ベクターの調製
Ｆｃ−ＦＧＦ２１構造においてＦＧＦ２１の安定性、活性および薬物動態学プロフィールを改良するために、ＦＧＦ２１の変異試験を行った。
【０１４３】
具体的には、タンパク質変異体は、ＦＧＦ２１タンパク質の３次元構造分析に基づくタンパク質活性に有意に影響を及ぼすことが予期される、ＬＬＬＥ領域（配列番号．１のＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置９８から１０１でのアミノ酸）およびＧＰＳＱＧ領域（配列番号．１のＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０から１７４でのアミノ酸）、およびＡ１８０領域について設計した。
【０１４４】
ＦＧＦ２１タンパク質に導入される各変異の位置、配列情報、標的および予期される効果は、以下の表１に列挙される。表１において、Ｎは、グリコシル化アスパラギン（Ｎ）を示す。
【表１】
2020502053.tif 000003
【０１４５】
さらに、表１に記載されている変異を含むＦＧＦ２１変異体タンパク質は、以下の表２に列挙される。
【表２】
2020502053.tif 000004
【０１４６】
アミノ酸をコードするヌクレオチドは、Ｎ−末端からＣ−末端に順に、融合された担体、リンカー、およびＦＧＦ２１変異体タンパク質が発現されるように、発現ベクターに負荷された。各ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の材料コード、ＦＧＦ２１に導入される変異の配列、融合担体の配列およびリンカー配列は、以下の表３に列挙される。表３において、Ｎは、グリコシル化アスパラギン（Ｎ）を示す。
【表３】
2020502053.tif 000005
【０１４７】
ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を生産するために、ＦＧＦ２１変異体タンパク質の各々をコードするヌクレオチド配列を、各タンパク質のアミノ酸配列に基づいてＢｉｏｎｅｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｋｏｒｅａ）に相談することによって合成した。ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素配列を、ＦＧＦ２１変異体タンパク質の各々をコードするヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に加え、タンパク質翻訳のための開始コドンおよび細胞の外側に発現されるタンパク質を分泌することができるリーダー配列（ＭＤＡＭＬＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＨＡ）を５’末端で制限酵素配列の次に挿入した。終始コドンを、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の各々をコードするヌクレオチド配列の次に挿入した。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の各々をコードするヌクレオチド配列を、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩの２つの制限酵素を使用することによってｐＴｒａｎｓ−ｅｍｐｔｙ発現ベクターにクローニングした。ＣＭＶプロモーター、ｐＵＣ由来の複製起源、ＳＶ４０由来の複製起源およびアンピシリン−耐性遺伝子を含む単純な構造を有するｐＴｒａｎｓ−ｅｍｐｔｙ発現ベクターを、ＣＥＶＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０１４８】
一方、ＤＦＤ６（大腸菌発現）およびＦｃ−ＦＧＦ２１融合タンパク質ＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）の場合、各融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を、大腸菌発現のためのｐＥＴ３０ａ発現ベクターに挿入した。
【０１４９】
調製実施例１−２．ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の発現のためのプラスミドＤＮＡの構築
発現のために使用される大量のプラスミドＤＮＡを得るために、大腸菌を調製実施例１−１において構築された発現ベクターの各々で形質転換した。細胞壁が弱められた大腸菌細胞を、熱ショックを介して各発現ベクターで形質転換し、コロニーを得るために形質転換体をＬＢプレート上に置いた。このように得られたコロニーをＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間培養し、各発現ベクターを含む各大腸菌培養物を１００ｍＬの容量において得た。このように得られた大腸菌を培養培地を除去するために遠心し、次にＰ１、Ｐ２、Ｐ３溶液（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：１２９６３）を細胞壁を破壊するために加え、それによりタンパク質およびＤＮＡが分離されたＤＮＡ懸濁液を得た。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  精製カラムを使用することによってこのように得られたＤＮＡ懸濁液から精製した。溶出したプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動を介して同定し、濃度および純度をナノドロップデバイス（Ｔｈｅｒｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｌｉｔｅ）を使用することによって測定した。このように得られたＤＮＡを、発現のために使用した。
【０１５０】
調製実施例１−３．ＣＡＰ−Ｔ細胞における融合タンパク質の発現
ヒト細胞系を、調製実施例１−２において得られた各プラスミドＤＮＡ型でトランスフェクトした。各プラスミドＤＮＡ型を、ＰＥＩ溶液（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．：１０１−１０Ｎ）を使用することによって、ＰＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養されていたＣＡＰ−Ｔ細胞（ＣＥＶＥＣ）に形質導入した。ＤＮＡおよびＰＥＩ溶液の混合溶液をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用することによって細胞懸濁液と混合し、３７℃で５時間培養し、ＰＥＭ培地を加えた。３７℃で５−７日間培養後、培養物を細胞を除去するために遠心し、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を含む上清を得た。
【０１５１】
調製実施例１−４．大腸菌におけるＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の発現および精製
大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）を、ＤＦＤ６（大腸菌）およびＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）融合タンパク質を発現する各プラスミドＤＮＡで形質転換した。各融合タンパク質を発現する形質転換された大腸菌を２０ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１５時間震盪しながら培養し、次に培養培地の一部を１００ｍｌのＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間震盪しながら培養した。培養完了後、培養物を大腸菌ペレットを得るために遠心し、次に細胞を高圧細胞破砕機を使用して破壊し、封入体を得た。
【０１５２】
得られた封入体を、洗浄および溶出、次にタンパク質リフォールディングプロセスにより精製した。具体的には、細菌タンパク質を除去するために、得られた封入体を、０．５％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファー溶液（ｐＨ  ８．０）で２−３回洗浄し、次に８Ｍ  ウレア、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１ｍＭ  ＤＴＴを含む８Ｍ  ウレアバッファーに再懸濁した。８Ｍ  ウレアバッファー中のタンパク質が完全に変性されるために、タンパク質リフォールディングプロセスを以下の通りに行った。
【０１５３】
第１に、２０ｍＭ  グリシン、ｐＨ９．０  バッファーで段階的に希釈することによって、８Ｍ  ウレアバッファーから尿素を除去した。２Ｍ  尿素から、硫酸銅（ＣｕＳＯ４）を８０μＭの濃度まで加え、タンパク質の安定な構造的フォールディングを誘導した。リフォールディングプロセスを完了したタンパク質をＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．４）に懸濁し、不純物を除去するために懸濁液を０．２２μｍフィルターで濾過し、次に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  アフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷した。カラムを１Ｘ  ＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．４）で洗浄し、次にタンパク質を１００ｍＭ  グリシンバッファー溶液（ｐＨ３．０）を使用して溶出し、ＤＦＤ６（大腸菌）融合タンパク質を調製した。
【０１５４】
ＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）融合タンパク質の場合、リフォールディングプロセスを完了したタンパク質を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  バッファー溶液（ｐＨ８．０）に懸濁し、不純物を除去するために懸濁液を０．２２μｍフィルターで濾過し、次に、陰イオン交換樹脂カラム（ＰＯＲＯＳ（登録商標）  ＨＱ  ５０μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に負荷した。カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  バッファー溶液（ｐＨ８．０）で洗浄し、次に、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  バッファー溶液（ｐＨ８．０）を濃度勾配に沿って投与し、ＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）融合タンパク質を溶出した。陰イオン交換樹脂によって得られたＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）融合タンパク質を、１Ｍの濃度まで硫酸アンモニウムと混合し、次に、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（Ｐｈｅｎｙｌ  ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。具体的には、カラムを１Ｍ  硫酸アンモニウムを含む５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  バッファー溶液（ｐＨ８．０）で洗浄し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  バッファー溶液（ｐＨ８．０）を濃度勾配に沿って投与し、溶出した画分を１０％  Ｔｒｉｓ−グリシン  ゲル電気泳動を通して分析した。ゲルを穏やかに振とうしながらクマシーブリリアントブルーＲで染色し、高い純度でＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を含む画分を回収し、次に、最終バッファー溶液（１Ｘ  ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を使用して４℃で一晩透析した。透析完了時に、得られたタンパク質貯蔵溶液を４℃で、３０，０００ＭＷカットオフ遠心フィルターを使用することによって３，０００ｒｐｍで濃縮した。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の濃度は、ＢＣＡ定量分析を介して測定した。
【０１５５】
調製実施例１−５．ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の精製
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  アフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１Ｘ  ＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．４）で平衡にした。調製実施例１−３において得られた各ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を含む培養上清を０．２μｍフィルターで濾過し、次に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  アフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷した。カラムを１Ｘ  ＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．４）で洗浄し、次に、１００ｍＭ  グリシンバッファー溶液（ｐＨ３．０）を使用してタンパク質を溶出した。アフィニティークロマトグラフィーによって得られた融合タンパク質を、陰イオン交換樹脂カラム（ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＱ  ５０μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して精製した。ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質をカラムから溶出する前に、陰イオン交換樹脂カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  バッファー溶液（ｐＨ８．０）で平衡にした。具体的には、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  バッファー溶液（ｐＨ８．０）でカラムを洗浄後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  バッファー溶液（ｐＨ８．０）を濃度勾配に沿って分配し、溶出した画分を分析した。各溶出した画分をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を使用して分析し、高い純度でＦＧＦ２１変異体融合タンパク質を含む画分を回収した。調製実施例１−４に記載されている方法にしたがって濃度および定量分析を行った。
【０１５６】
実験的実施例１．融合タンパク質のインビトロ活性
【０１５７】
実験的実施例１−１．タンパク質活性に対するＦＧＦ２１変異の効果
調製実施例１において調製された融合タンパク質ＤＦＤ４、ＤＦＤ５、ＤＦＤ６、ＤＦＤ６（大腸菌）、ＤＦＤ７、ＤＦＤ９、ＤＦＤ１３、ＤＦＤ１８、ＤＦＤ７２、ＤＦＤ７３およびＤＦＤ７４のインビトロ活性を測定した。
【０１５８】
具体的には、融合タンパク質のインビトロＦＧＦ２１活性を、ＦＧＦ２１の共受容体であるヒトβ−クロトーを過剰発現するように修飾されたＨＥＫ２９３細胞系（Ｙｕｈａｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｏｒｅａ）を使用して評価した。活性の評価のために、調製実施例１−４および１−５において調製された融合タンパク質を含む濃縮物を、３μＭの濃度で３倍連続希釈に付した。５時間、血清欠損状態において培養した後、ヒトβ−クロトーを過剰発現する細胞系を希釈された融合タンパク質で２０分間処理し、次に、室温で３０分間６０ｒｐｍで撹拌しながら細胞溶解バッファー（Ｃｉｓｂｉｏ／Ｃａｔ＃  ６４ＥＲＫＰＥＧ）を加えることによって溶解した。細胞溶解物溶液を細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）およびリン酸化ＥＲＫを検出することができる抗体（Ｃｉｓｂｉｏ／Ｃａｔ＃  ６４ＥＲＫＰＥＧ）と混合し、混合物を２時間室温で維持した。蛍光検出器（ＴＥＣＡＮ／ＧＥＮｉｏｓＰｒｏ）を使用して蛍光を検出した。融合タンパク質の活性をこれらのＥＣ５０値を比較することによって測定した。結果は図１Ａから１Ｃに示される。
【０１５９】
図１Ａから１Ｃに示されるとおり、変異配列を野生型ＦＧＦ２１タンパク質に導入することによって調製された融合タンパク質のインビトロ活性を阻害せず、各融合タンパク質の活性は互いに類似であったことが確認された。大腸菌において発現されたＤＦＤ６（大腸菌）サンプルおよび動物細胞において発現されたＤＦＤ６サンプルを介して、Ｎ−グリコシル化変異を野生型ＦＧＦ２１タンパク質に導入することによって調製された融合タンパク質のインビトロ活性を阻害しなかったことも確認された。
【０１６０】
実験的実施例１−２．タンパク質活性に対するリンカー配列の効果
調製実施例１において調製された融合タンパク質ＤＦＤ１、ＤＦＤ３、ＤＦＤ４およびＤＦＤ１３のインビトロ活性を測定した。
【０１６１】
具体的に、融合タンパク質のＦＧＦ２１活性を、実験的実施例１−１に記載されている方法にしたがって調製実施例１−５において調製された融合タンパク質を含む濃縮物を使用することによって測定した。結果は図２Ａおよび２Ｂに示される。
【０１６２】
図２Ａおよび２Ｂに示されるとおり、わずかな違いがリンカー配列に依存して活性において示されたが、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質は活性において有意な減少を示さなかったことが確認された。
【０１６３】
実験的実施例１−３．ＤＦＤ１、ＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）およびＦｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）についての実験結果
調製実施例１において調製された融合タンパク質ＤＦＤ１およびコントロールタンパク質ＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）およびＦｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）のインビトロ活性を測定した。
【０１６４】
具体的には、融合タンパク質のＦＧＦ２１活性を、調製実施例１−５において調製された融合タンパク質および実験的実施例１−１に記載されている方法にしたがうコントロールタンパク質を含む濃縮物を使用することによって測定した。結果は図３に示される。
【０１６５】
図３に示されるとおり、ＤＦＤ１およびＲＧＥ（Ａｍｇｅｎ）が類似のインビトロ活性を有するが、Ｆｃ−ＦＧＦ２１（Ｌｉｌｌｙ）は他のタンパク質よりも２倍高いインビトロ活性を有することが確認された。
【０１６６】
実験的実施例２．融合タンパク質の安定性の評価
実験的実施例２−１．安定性を評価するための実験的方法
サンプル調製の最初の段階でタンパク質凝集体の量を測定するために、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）方法を使用して高分子量凝集体（％ＨＭＷ）を定量した。結果は図４Ａから４Ｃに示される。
【０１６７】
具体的には、ＴｏｓｏＨａａｓモデルＴＳＫ−ＧＥＬ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラムを、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ方法のために使用した。１ｍＬ／分の流速でバッファー溶液（１Ｘ  ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を流すことによって、カラムを平衡にした。調製実施例１−５において調製されたＤＦＤ４およびＤＦＤ１３タンパク質貯蔵溶液を、４℃で３０，０００ＭＷ  カットオフ遠心フィルターを使用して３，０００ｒｐｍで２０ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の標的濃度に濃縮した。ＢＣＡ定量分析によるそれぞれのサンプルの濃度の測定後、２０ｍｇ／ｍＬの最終濃度にバッファー溶液（１Ｘ  ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）でサンプルを希釈した。ＤＦＤ４およびＤＦＤ１３の初期ＨＭＷ％を測定するために、２０ｍｇ／ｍｌのサンプルを、１Ｘ  ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．４で１ｍｇ／ｍｌの濃度に希釈した。次に、各１００μｌの希釈されたサンプルをＳＥＣ−ＨＰＬＣカラムに注射し、分析した。それぞれのサンプルの安定性評価のために、２週間５℃、２５℃および３７℃で保存しながら、４日目、８日目および１４日目にＳＥＣ−ＨＰＬＣ方法を使用してサンプルの％ＨＭＷを測定した。
【０１６８】
図４Ａから４Ｃに示されるとおり、ＤＦＤ１３が、ＤＦＤ４と比較して、最初の段階および最大２週の時点でより少ない量の高分子量凝集体（ＨＭＷ％）を有することが確認され、ＥＩＲＰ変異の導入がＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の安定性を改良し、それによりＨＭＷ％を有意に低下させたことを示した。
【０１６９】
実験的実施例２−２．安定性結果
安定性に対するＦＧＦ２１の元の配列ＬＬＬＥ（９８−１０１）に導入されたＥＩＲＰ変異の効果を調べるために、実験的実施例２−１に記載されている方法にしたがってＤＦＤ４（配列番号：２９）およびＤＦＤ１３（配列番号：３５）の安定性を測定した。ＤＦＤ４およびＤＦＤ１３の０時サンプル（最初の段階；０日）および４、８、および１４日保存サンプルに対する分析結果は、以下の表４において要約されている（表４にて、Ｎ．Ｄ．は「検出されない」を意味する）。
【０１７０】
【表４】
2020502053.tif 000006
【０１７１】
表４に示されるとおり、最初の段階（０日）での％ＨＭＷの量は、ＤＦＤ４について０．９１％、およびＤＦＤ１３について０．５６％であった。２週後、２５℃での保存条件下で、％ＨＭＷの量はＤＦＤ４について８．８３％に増加したが、ＤＦＤ１３において観察されなかった。ＤＦＤ１３は、ＤＦＤ４と比較して、最初の段階および２週でより小さい％ＨＭＷ率を有することが示された。ＥＩＲＰ変異が導入されたとき、ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質のＨＭＷ％率は非常に低減されたことが見いだされた。
【０１７２】
実験的実施例３：融合タンパク質の薬物動態学測定
実験的実施例３−１．薬物動態学測定の実験的方法
平均体重が薬物処置の１日前に類似であるように、Ｏｒｉｅｎｔ  ＢＩＯ  Ｃｏ．  （Ｋｏｒｅａ）から購入した６週齢オスＩＣＲマウスをグループ（血液回収時間あたりｎ＝３）に分類した。その後、試験物質をそれぞれ、１ｍｇ／ｋｇの単一皮下用量（ＲＧＥの場合にて２ｍｇ／ｋｇ）において投与した。次に、血液サンプルをそれぞれ、注射後１、４、８、１２、２４、４８、７２、および９６時間に回収した。血液中の無傷な全長ＦＧＦ２１タンパク質の濃度を、ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端およびＣ−末端に免疫反応を有するＩｎｔａｃｔ  ヒトＦＧＦ２１  ＥＬＩＳＡキット（Ｆ１２３１−Ｋ０１、Ｅａｇｌｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用して、測定した。マウスへの各融合タンパク質の皮下注射後に９６時間までに回収された血液中のサンプルの濃度を測定し、各物質の薬物動態パラメータを計算した。
【０１７３】
実験的実施例３−２．薬物動態学活性測定の結果
マウスにおいて融合タンパク質の皮下投与後の血液中のそれぞれのタンパク質の濃度  対  時間を示すグラフ（図５）に基づいて、薬物動態パラメータを計算した。データは以下の表５に示される。
【表５】
2020502053.tif 000007
【０１７４】
融合タンパク質の薬物動態学プロフィールを比較し、薬物の暴露レベルを示す曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて評価した。
【０１７５】
表５に示されるとおり、ＤＦＤ４をＤＦＤ１３と、およびＤＦＤ６をＤＦＤ７３と比較すると、ＥＩＲＰ配列の導入がＡＵＣ値において約１０から２０％の増加をもたらしたことが決定された。ＤＦＤ９をＤＦＤ４と比較すると、ＴＧＬＥＡＶの導入がＡＵＣ値において約６倍の増加をもたらした。
【０１７６】
加えて、ＦＧＦ２１のＣ−末端でインビボでタンパク質分解されることが知られているＦＧＦ２１のＣ−末端部分でのＮ−グリコシル化を介する持続性を改善する目的のために、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０Ｎ、およびＧ１７４Ｎ変異体を設計した。コントロール物質のそれぞれにわたるＮ−グリコシル化によるＡＵＣの増加を立証した。実際に、Ｎ−グリコシル化によるＡＵＣ改善効果を立証するために、グリコシル化なしで大腸菌において生産される物質であるＤＦＤ６（大腸菌）と比較した。ここで、ヒト細胞系において生産されたＤＦＤ６が大腸菌によって生産されたＤＦＤ６よりも３倍またはそれ以上であるＡＵＣレベルを示したことが見いだされ、薬物動態学プロフィールがグリコシル化によって改良されたことを示した。
【０１７７】
Ａｍｇｅｎ  Ｃｏ．の特許（ＷＯ  ２００９／１４９１７１）に記載されている変異であるＡ１８０Ｅを、ＤＦＤ１３およびＤＦＤ７３のようなＴＧＬＥＡＶまたはＧ１７０Ｎが導入された変異体に導入し、ＤＦＤ１８およびＤＦＤ７４を得た。ここで、約２から３倍のさらなるＡＵＣ増加が見いだされた。
【０１７８】
上記結果を要約すると、種々の変異体およびそれらの組合せの導入は、野生型ＦＧＦ２１融合タンパク質ＤＦＤ９と比較して薬物動態パラメータにおける改善をもたらした。最も高いＡＵＣ値を示す融合タンパク質はＥＩＲＰ、Ｇ１７０ＮおよびＡ１８０Ｅが導入されたＤＦＤ７４であり、ＤＦＤ９よりも約４５倍高いＡＵＣを示した。また、ＲＧＥの投与用量、すなわち２ｍｇ／ｋｇを考慮すると、ＤＦＤ７４がＡｍｇｅｎのＲＧＥよりもより良い薬物暴露を示すことが見いだされた。変異配列による全体の薬物動態学改善効果は、表６において要約されている。
【表６】
2020502053.tif 000008
【０１７９】
実験的実施例４．食餌性肥満マウスにおける融合タンパク質の活性
実験的実施例４−１．食餌性肥満マウスにおける活性を評価するための実験的方法
ＦＧＦ２１変異体融合タンパク質であるＤＦＤ１８の体重低減効果を、食餌誘発性ｏｂｅｓｅマウスにおいて評価した。食餌性肥満モデルについて、Ｃ５７ＢＬ／６ＪマウスをＣｅｎｔｒａｌ  Ｌａｂ．  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｃ．から購入し、８から１２週間６０ｋｃａｌ％脂肪を含む高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔ）を与えた。薬物処置の１日前（０日）に類似の平均値の体重を有するように、マウスをグループ（ｎ＝８／グループ）に分類し、次に、３０ｎｍｏｌ／ｋｇのサンプルを１回皮下に投与した。次に、３０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量での単回皮下投与を行い、次に、溶媒としてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と比較しての体重における変化の観察を行った。
【０１８０】
実験的実施例４−２．食餌性肥満マウスにおけるタンパク質活性
３０ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ１８の単一の投与後の食餌性肥満マウスモデルにおける時間とともにの体重における変化について、体重低減効果が投与後１０日目まで続き、最大体重低減（約１８％）が投与後１１日目であり、これが１４日目まで維持されたことが確認された（図６Ａおよび６Ｂ）。
【０１８１】
調製実施例２．融合タンパク質の調製および精製
調製実施例２−１．融合タンパク質の発現のための発現ベクターの調製
インビトロ活性、薬物動態学プロフィールおよび薬理学的有効性についてのＧＬＰ−１変異体タンパク質の配列およびそれに融合されるＦｃヒンジの配列の効果を同定するために、Ｆｃ−融合ＧＬＰ−１変異体タンパク質に関する種々の配列を設計した。ＧＬＰ−１変異体タンパク質の配列は以下の表７に列挙される。
【表７】
2020502053.tif 000009
【０１８２】
さらに、Ｆｃ−融合ＧＬＰ−１変異体の配列は表８に列挙される。
【表８】
2020502053.tif 000010
【０１８３】
表８において、ＨｙＦｃ５は配列番号：４７を言及し、ＨｙＦｃ４０は配列番号：４８を言及する。インビトロ活性、薬物動態学プロフィールおよび薬理学的有効性についてのＧＬＰ−１変異体タンパク質およびＦＧＦ２１変異体タンパク質の配列、ＧＬＰ−１変異体に融合されるＦｃヒンジの配列、ＦＧＦ２１変異体タンパク質およびＦｃ間を連結しているリンカーの配列の効果を調べるために、融合タンパク質に関する種々の配列を設計した。ＧＬＰ−１変異体タンパク質およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む融合タンパク質の配列は以下の表９に列挙される。各融合タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端へ以下の順において連結されたＧＬＰ−１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域、リンカーおよびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む。
【表９】
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【０１８４】
具体的には、融合タンパク質の各々をコードするヌクレオチド配列を、各タンパク質のアミノ酸配列に基づいてＢｉｏｎｅｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｋｏｒｅａ）に相談した後に合成した。ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素配列を、融合タンパク質の各々をコードするヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に加え、タンパク質翻訳のための開始コドンおよび細胞の外側に発現されるタンパク質を分泌することができるリーダー配列（ＭＤＡＭＬＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＨＡ）を５’末端で制限酵素配列の次に挿入した。終始コドンを、融合タンパク質の各々をコードするヌクレオチド配列の次に挿入した。融合タンパク質の各々をコードするヌクレオチド配列を、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩの２つの制限酵素を使用することによってｐＴｒａｎｓ−ｅｍｐｔｙ発現ベクターにクローニングした。ＣＭＶプロモーター、ｐＵＣ由来の複製起源、ＳＶ４０由来の複製起源およびアンピシリン−耐性遺伝子を含む単純な構造を有するｐＴｒａｎｓ−ｅｍｐｔｙ発現ベクターを、ＣＥＶＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【０１８５】
調製実施例２−２．Ｆｃ−融合ＧＬＰ−１変異体および融合タンパク質の発現のためのプラスミドＤＮＡの構築
発現のために使用される大量のプラスミドＤＮＡを得るために、大腸菌を調製実施例２−１において構築された発現ベクターの各々で形質転換した。熱ショックを介して弱められた細胞壁を有する大腸菌細胞を、各発現ベクターで形質転換し、コロニーを得るために形質転換体をＬＢプレート上に置いた。このように得られたコロニーをＬＢ培地に植菌し、３７℃で１６時間培養し、各発現ベクターを含む各大腸菌培養物を１００ｍＬの容量において得た。その後に得られた大腸菌を培養培地を除去するために遠心し、次にＰ１、Ｐ２、Ｐ３溶液（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：１２９６３）を細胞壁を破壊するために加え、それによりタンパク質およびＤＮＡが分離されたＤＮＡ懸濁液を得た。プラスミドＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ  精製カラムを使用することによってこのように得られたＤＮＡ懸濁液から精製した。溶出したプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって同定し、濃度および純度をナノドロップデバイス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｌｉｔｅ）を使用して測定した。このように得られたＤＮＡを、発現のために使用した。
【０１８６】
調製実施例２−３．ＣＡＰ−Ｔ細胞におけるＦｃ−融合ＧＬＰ−１変異体および融合タンパク質の発現
ヒト細胞系を、調製実施例２−２において得られた各プラスミドＤＮＡで形質転換した。各プラスミドＤＮＡ型を、ＰＥＩ溶液（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．：１０１−１０Ｎ）を使用することによって、ＰＥＭ培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において培養されていたＣＡＰ−Ｔ細胞（ＣＥＶＥＣ）に形質導入した。ＤＮＡおよびＰＥＩ溶液の混合溶液をＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞懸濁液と混合し、３７℃で５時間培養し、ＰＥＭ培地を加えた。３７℃で５−７日間培養後、培養物を細胞を除去するために遠心し、それぞれのタンパク質を含む上清を得た。
【０１８７】
調製実施例２−４．Ｆｃ−融合ＧＬＰ−１変異体および融合タンパク質の精製
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  アフィニティークロマトグラフィーカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を１Ｘ  ＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．４）で平衡にした。調製実施例２−３において得られた各Ｆｃ−融合ＧＬＰ−１変異体および融合タンパク質を含む培養上清を０．２μｍフィルターで濾過し、次に、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  アフィニティークロマトグラフィーカラムに負荷した。カラムを１Ｘ  ＰＢＳバッファー溶液（ｐＨ７．４）で洗浄し、次に、１００ｍＭ  グリシンバッファー溶液（ｐＨ３．０）を使用してタンパク質を溶出した。アフィニティークロマトグラフィーによって得られたタンパク質を、陰イオン交換樹脂カラム（ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＱ  ５０μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して精製した。アフィニティークロマトグラフィーから溶出したタンパク質を負荷する前に、陰イオン交換樹脂カラムを５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  バッファー溶液（ｐＨ８．０）で平衡にした。
【０１８８】
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  バッファー溶液（ｐＨ８．０）でカラムを洗浄後、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  バッファー溶液（ｐＨ８．０）を濃度勾配に沿って分配し、溶出した画分を分析した。各溶出した画分をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を使用するによって分析し、高い純度でＦｃ−融合ＧＬＰ−１変異体および融合タンパク質を含む画分を回収し、最終バッファー溶液（１Ｘ  ＰＢＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）を使用して４℃で一晩透析した。透析完了時に、得られたタンパク質貯蔵溶液を４℃で、３０，０００ＭＷカットオフ遠心フィルターを使用して３，０００ｒｐｍで濃縮した。それぞれのタンパク質の濃度は、ＢＣＡ定量分析を介して測定した。
【０１８９】
実験的実施例５．融合タンパク質のインビトロ活性
実験的実施例５−１．ＤＦＤ２３、ＤＦＤ２４、ＤＦＤ２５、ＤＦＤ２６、ＤＦＤ２７、ＤＦＤ２８およびＤＦＤ２９の活性
融合タンパク質ＤＦＤ２３、ＤＦＤ２４、ＤＦＤ２５、ＤＦＤ２６、ＤＦＤ２７、ＤＦＤ２８およびＤＦＤ２９のインビトロＧＬＰ−１活性を測定した。具体的には、ヒトＧＬＰ−１受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞系（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ、ＨＴＳ１６３Ｃ２）を購入し、融合タンパク質のＧＬＰ−１活性を評価するために使用した。活性の評価のために、融合タンパク質を含むサンプル（調製実施例２−４において調製されたタンパク質貯蔵溶液；以下「サンプル」）を、２５ｎＭの濃度で４倍連続希釈に付した。ヒトＧＬＰ−１受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞系を３０分間処理した後、生産された細胞内ｃＡＭＰを測定した（Ｃｉｓｂｉｏ、６２ＡＭ４ＰＥＢ）。それぞれのタンパク質の活性をＥＣ５０値を比較することによって評価した。
【０１９０】
図７に示されるとおり、ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）配列を含む融合タンパク質は、他のＧＬＰ−１変異体配列を含む融合タンパク質よりも約２〜３倍低い活性を示した。ＧＬＰ−１（Ａ２Ｇ）配列を除く変異配列を含む融合タンパク質間でＧＬＰ−１活性において有意な差異は観察されなかった。
【０１９１】
実験的実施例５−２．ＤＦＤ５９、ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４の活性
調製実施例２において調製された融合タンパク質ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４およびＤＦＤ５９（Ｆｃ−融合ＧＬＰ−１変異体）のインビトロＧＬＰ−１活性を測定した。具体的には、ヒトＧＬＰ−１受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞系（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ、ＨＴＳ１６３Ｃ２）を購入し、融合タンパク質のＧＬＰ−１活性を評価するために使用した。活性の評価のために、融合タンパク質のそれぞれを含むサンプルを、２５ｎＭの濃度で４倍連続希釈に付した。ヒトＧＬＰ−１受容体を過剰発現するＣＨＯ細胞系を３０分間処理した後、生産された細胞内ｃＡＭＰを測定した（Ｃｉｓｂｉｏ、６２ＡＭ４ＰＥＢ）。
【０１９２】
図８Ａおよび８Ｂに示されるとおり、それぞれのタンパク質の活性をＥＣ５０値を比較することによって評価した。３つの融合タンパク質は類似のＥＣ５０値を示し、ＤＦＤ５９（ＦＧＦ２１変異体を含まない）は融合タンパク質よりも約２倍高い活性を示した。
【０１９３】
次に、ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４におけるＦＧＦ２１部分のインビトロ活性を測定した。具体的には、融合タンパク質におけるＦＧＦ２１部分のインビトロ活性を、ヒトβ−クロトー（ＦＧＦ２１の共受容体）を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞系を使用して評価した。活性の評価のために、融合タンパク質の各々を含むサンプルを、３μＭの濃度で３倍連続希釈に付した。５時間、血清欠損状態において培養された後、ヒトβ−クロトーを過剰発現するＨＥＫ２９３細胞系を２０分間処理し、室温で３０分間６０ｒｐｍで撹拌しながら細胞溶解バッファー（Ｃｉｓｂｉｏ／Ｃａｔ＃  ６４ＥＲＫＰＥＧ）を加えることによって細胞を溶解した。細胞溶解物溶液をＥＲＫおよびリン酸化ＥＲＫを検出することができる抗体と混合し、混合物を２時間室温で維持した。蛍光検出器（ＴＥＣＡＮ／ＧＥＮｉｏｓＰｒｏ）を使用して蛍光を検出した。活性をこれらのＥＣ５０値を比較することによって測定した。
【０１９４】
図８Ａおよび８Ｂに示されるとおり、融合タンパク質ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４のＦＧＦ２１部分のインビトロ活性は類似であることが確認された。
【０１９５】
実験的実施例６．融合タンパク質の薬物動態学評価
実験的実施例６−１．薬物動態学評価のための実験的方法
平均体重が薬物処置の１日前に類似であるように、Ｏｒｉｅｎｔ  ＢＩＯ  （Ｋｏｒｅａ）から購入した６週齢オスＩＣＲマウスをグループ（血液回収時間あたりｎ＝３）に分類し、それぞれのサンプルを１ｍｇ／ｋｇの容量において１回皮下に投与した。血液サンプルをそれぞれ、注射後１、４、８、１２、２４、４８、７２、９６、１４４、１９２および２４０時間に回収した。血液中の各融合タンパク質の濃度を、ＦＧＦ２１部分およびＧＬＰ−１−Ｆｃ部分に基づいて別々に測定した。血液中の融合タンパク質の無傷な全長ＦＧＦ２１部分の濃度を、ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端およびＣ−末端に免疫反応を有するＩｎｔａｃｔ  ヒトＦＧＦ２１  ＥＬＩＳＡキット（Ｆ１２３１−Ｋ０１、Ｅａｇｌｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用して、測定した。さらに、血液中の融合タンパク質の活性なＧＬＰ−１−Ｆｃ部分の濃度を、ＥＬＩＳＡ分析を介して決定されるとき、ＧＬＰ−１およびＦｃのＮ−末端に免疫反応を有する抗体を使用して、測定した。マウスへのそれぞれのタンパク質の単回皮下注射後に２４０時間までに回収された血液サンプル中のそれぞれのタンパク質のＦＧＦ２１およびＧＬＰ−１−Ｆｃ部分の濃度を測定し、それぞれのタンパク質の薬物動態パラメータを計算した。
【０１９６】
実験的実施例６−２．薬物動態学活性結果
マウスにおいてそれぞれのタンパク質の単回皮下投与後の時間とともに血液中の各活性な物質の濃度に基づいて（図９Ａおよび９Ｂ）、融合タンパク質のＦＧＦ２１およびＧＬＰ−１−Ｆｃ部分に対する薬物動態パラメータを計算した。データは以下の表１０に示される。
【表１０】
2020502053.tif 000012
【０１９７】
各融合タンパク質の薬物動態学プロフィールを比較し、薬物の暴露レベルを示す曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいて評価した。
【０１９８】
表１０に示されるとおり、ＦＧＦ２１部分の薬物動態パラメータについて、ＤＦＤ１１４は薬物暴露（ＡＵＣ）および半減期の最も高い程度を示し、ＤＦＤ１１２が次に高いＡＵＣ値を示し、次にＤＦＤ６９が示した。ＤＦＤ１１４は、ＤＦＤ６９と比較して、ＡＵＣ値において約２倍以上高いことを示した。ＧＬＰ−１−Ｆｃ部分の薬物動態学について、同じＧＬＰ−１変異体配列を含む４つのタンパク質（ＤＦＤ５９、ＤＦＤ６９、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ１１４）は類似のＡＵＣ値を示した。
【０１９９】
実験的実施例７．食餌性肥満マウスにおける非アルコール性脂肪性肝炎に対する融合タンパク質活性の評価
実験的実施例７−１．食餌性肥満マウスにおける非アルコール性脂肪性肝炎に対する活性の評価方法
融合タンパク質ＤＦＤ１１４およびＤＦＤ１１２、およびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質ＤＦＤ７４およびＤＦＤ７２の脂肪性肝炎および脂質の改善効果を、食餌性肥満マウスモデルにおいて評価した。
【０２００】
食餌性肥満を誘導するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに約３７週間６０ｋｃａｌ％脂肪を含む高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔ）を与え、脂肪性肝炎を有する肥満マウスモデルを作製した。平均体重が薬物処置の１日前に類似であるように、マウスをグループ（ｎ＝６／グループ）に分類した。その後、ＤＦＤ１１４、ＤＦＤ１１２、ＤＦＤ７４およびＤＦＤ７２を、２週間４日間隔で３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で３回投与した。
【０２０１】
コントロールグループは、同じ方法によって、試験薬物の調製のために使用される溶媒（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）で皮下に投与された。最後の投与の４日後、動物を一晩絶食させ、血液を下大静脈から回収し、肝臓組織を吸入麻酔および開腹後に摘出した。血液生化学的試験を回収された血液サンプルから単離された血清サンプルで行い、固定された肝臓組織をトリミング、脱水、パラフィン包埋、スライシングなどを介して検体として調製した。そして、調製された検体をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色し、組織病理学的変化を光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＥＣＬＩＰＳＥ  Ｅ６００）を使用して観察した。
【０２０２】
実験的実施例７−２．食餌性肥満マウスにおける非アルコール性脂肪性肝炎に対する活性評価結果
融合タンパク質およびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の脂肪性肝炎および脂質改善効果を評価するために、ＤＦＤ１１４、ＤＦＤ１１２、ＤＦＤ７４およびＤＦＤ７２を、食餌性肥満マウスモデルにおいて２週間４日間隔で３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で繰り返し投与した。次に、血清および肝臓組織における脂質変化を分析し、組織病理学的変化を観察した。
【０２０３】
図１０Ａから１０Ｃに示されるとおり、血清中のトリグリセリド（ＴＧ）および総コレステロール（ＴＣ）を、融合タンパク質ＤＦＤ１１４およびＤＦＤ１１２、およびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質ＤＦＤ７４およびＤＦＤ７２の反復皮下投与後に測定した。結果として、ビヒクルコントロールグループと比較して、血清トリグリセリドおよび総コレステロールレベルは減少し、肝臓組織におけるトリグリセリドレベルもまた減少した。
【０２０４】
図１１に示されるとおり、融合タンパク質ＤＦＤ１１４およびＤＦＤ１１２の反復皮下投与後に行われた組織病理学的実験は、肝臓組織における脂質がビヒクルコントロールグループと比較して有意に減少したことを示した。
【０２０５】
実験的実施例８．ＭＣＤ誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスにおける融合タンパク質の活性評価
実験的実施例８−１．ＭＣＤ誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスにおける活性評価方法
非アルコール性脂肪性肝炎モデルにおいて融合タンパク質およびＦＧＦ２１変異体融合タンパク質の炎症および線維症低下効果を評価するために、ＭＣＤモデルにおけるＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２の効果を評価した。
【０２０６】
メチオニンコリン欠乏（ＭＣＤ）食餌誘発性非アルコール性肝臓疾患動物モデルは、非アルコール性脂肪性肝炎の評価のために広範に使用されるモデルの１つである。肝臓線維症を有する脂肪性肝炎は、ベータ−酸化および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）合成において重要な役割を果たすメチオニンおよびコリンを欠いている規定食を給餌することによって誘発された。このことは、ヒト脂肪性肝炎病理学的モデルと類似であることが知られている。脂肪性肝炎モデルを誘導するために、ＭＣＤ規定食およびメチオニンコリン標準（ＭＣＳ）規定食を、Ｃ５７ＢＬ／６に１０日間ＭＣＤ規定食、次に４日間ＭＣＳ規定食で給餌することによって１７週間交互に自由に提供した。
【０２０７】
動物を、試験物質の投与前に計量し、各グループの平均体重が可能な限り均等に分配されるようにグループにランダム的に割り当てた。１０匹のマウスを各グループに割り当てた後、３、１０および３０ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ１１２および１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ７２を４週間２日間隔で皮下に投与した。ＭＳＣコントロールグループおよびＭＣＤ規定食コントロールグループにおいて、マウスは、同じ方法によって４週間２日間隔で、試験物質の調製のために使用される溶媒（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）で皮下に投与された。
【０２０８】
４週間試験物質の反復投与、マウスを一晩絶食させ、血液を下大静脈から回収し、肝臓組織を吸入麻酔および開腹後に摘出した。血液生化学的試験を回収された血液サンプルから単離された血清サンプルで行い、固定された肝臓組織を一般的な組織処理プロセスを介して検体として調製した。次に、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）および免疫組織化学的染色を行い、組織病理学的変化を光学顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＢＸ５３）を使用して観察した。
【０２０９】
実験的実施例８−２．ＭＣＤ誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスにおける活性評価結果
３、１０および３０ｎｍｏｌ／ｋｇの融合タンパク質ＤＦＤ１１２および１０ｎｍｏｌ／ｋｇのＦＧＦ２１変異体融合タンパク質ＤＦＤ７２を４週間２日間隔でＭＣＤ誘発性非アルコール性脂肪性肝炎マウスに繰り返し投与した。次に、血液生化学的試験および組織病理学的試験を行い、非アルコール性脂肪性肝炎に対する効果を評価した。
【０２１０】
図１２Ａから１２Ｃに示されるとおり、非アルコール性脂肪性肝炎が誘導されたＭＣＤコントロールグループは、正常食で食餌されたＭＣＳコントロールグループと比較して、肝臓損傷指標として有意に高いアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）を示した（ｐ＜０．００１）。血清ＡＳＴおよびＡＬＴレベルは、ＭＣＤコントロールグループと比較して、ＤＦＤ１１２を投与されたグループにおいて用量依存的に減少した。加えて、ＭＣＤコントロールグループは、組織病理学的試験にてＭＣＳコントロールグループと比較して、有意に高い炎症レベルを示した（ｐ＜０．０１）。ＤＦＤ１１２が投与されたとき、炎症レベルはＭＣＤコントロールグループと比較して、用量依存的に減少した。
【０２１１】
図１３Ａから１３Ｃおよび図１４に示されるとおり、肝臓線維症に対する融合タンパク質の効果を評価するために、肝臓線維症指標として肝臓組織におけるアルファ−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）および形質転換増殖因子−ベータ（ＴＧＦ−β）を、免疫組織化学的染色を使用して染色し、画像分析によって定量した。α−ＳＭＡおよびＴＧＦ−βの発現は、ＭＣＳコントロールグループと比較して、ＭＣＤコントロールグループにおいて増加した（ｐ＜０．００１）。ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２が投与されたとき、α−ＳＭＡおよびＴＧＦ−βの発現はＭＣＤコントロールグループと比較して減少した。加えて、肝臓組織におけるコラーゲンを、Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色を使用して染色し、画像分析によって定量した。結果として、ＭＣＤコントロールグループにおいてコラーゲンの量はＭＣＳコントロールグループよりも高く、そして、ＤＦＤ１１２およびＤＦＤ７２が投与されたとき、ＭＣＤコントロールグループと比較して肝臓組織におけるコラーゲンの減少傾向が観察された（ｐ＜０．００１）。
【０２１２】
実験的実施例９．食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスにおける融合タンパク質の活性評価
実験的実施例９−１．食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスにおける融合タンパク質の活性評価のための方法
非アルコール性脂肪性肝炎モデルにおいて融合タンパク質の炎症および線維症低下効果を評価するために、ＤＦＤ１１２の効果を食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスモデルにおいて評価した。
【０２１３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスに約３０週間、４０％脂肪、４０％炭水化物および２％コレステロールを含む高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｄｉｅｔ）を給餌することによって、肥満および非アルコール性脂肪性肝炎を有するマウスモデルを調製した。肝臓組織の組織病理学的試験を薬物処置の約３週前に行い、ＡＬＴおよびＡＳＴレベルおよび体重を投与前に測定した。非アルコール性脂肪性肝炎誘導程度および体重が均等に分配されるように、実験動物を選択し、グループに分類された。１２匹のマウスを各グループに割り当て、ＤＦＤ１１２を３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量で８週間２日間隔で皮下に繰り返し投与した。コントロールグループにおいて、試験物質を調製するために使用される溶媒（ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ＤＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）を同じ方法によって注射した。
【０２１４】
最後の投与後、マウスを一晩絶食させ、血液を下大静脈から回収し、肝臓組織を吸入麻酔および開腹後に摘出した。血液生化学的試験を回収された血液サンプルから単離された血清サンプルで行った。固定された肝臓組織を検体として調製し、調製された検体をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）またはＰｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄで染色し、組織病理学的変化を観察した。
【０２１５】
実験的実施例９−２．食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスにおける融合タンパク質の活性評価結果
３または１０ｎｍｏｌ／ｋｇの用量でのＤＦＤ１１２を８週間２日間隔で食餌性肥満および非アルコール性脂肪性肝炎マウスに繰り返し投与した。次に、血液生化学的および組織病理学的試験を行い、非アルコール性脂肪性肝炎に対する効果を評価した。
【０２１６】
図１５Ａから１５Ｄに示されるとおり、肝臓損傷指標としての血清ＡＬＴおよびＡＳＴレベルは、ＤＦＤ１１２で投与されたグループにおいて正常レベルに減少した（ｐ＜０．００１）。血清トリグリセリド（ＴＧ）および総コレステロール（ＴＣ）レベルもまた、ビヒクルコントロールグループと比較して有意に減少した（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．００１）。
【０２１７】
図１６Ａから１６Ｂに示されるとおり、投与前および投与後からの組織病理学的試験結果は、非アルコール性脂肪性肝炎グレードを分類するための指標としての投与後のＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）が、８週の反復投与で、投与前スコアと比較して、ビヒクルコントロールグループにおいて増加または維持したことを示した。他方では、ＮＡＦＬＤ活性スコアは、投与前スコアと比較して、ＤＦＤ１１２投与グループにおける全対象において有意に減少した。加えて、線維症程度評価時に、線維症の程度は、投与前の程度と比較して、コントロールグループにおいて維持または悪化したが、ＤＦＤ１１２投与グループにおいて有意な改善効果が観察された（ｐ＜０．０５）。
【０２１８】
実験的実施例１０．ＴＡＡ−誘発性肝線維症ラットにおける融合タンパク質活性の評価
実験的実施例１０−１．ＴＡＡ−誘発性肝線維症ラットにおける融合タンパク質活性の評価方法
融合タンパク質の肝線維症−低下効果を評価するために、肝線維症が飲料水によって誘導されたラットモデルにおいてＤＦＤ１１２の効果を評価した。
【０２１９】
約１４週間Ｗｉｓｔａｒラットにチオアセトアミド（ＴＡＡ）を含む飲料水を提供することによって肝線維症モデル調製した。動物を、試験物質の投与前に計量し、各グループの平均体重が可能な限り均等に分配されるようにグループにランダム的に割り当てた。８匹のラットを各グループに割り当てた後、３０ｎｍｏｌ／ｋｇのＤＦＤ１１２を８週間２日間隔で皮下に繰り返し投与した。ＴＡＡ飲料水を投与の終了まで連続的に提供した。正常コントロールグループは試験の開始から投与の終了まで標準飲料水で食餌し、ＴＡＡコントロールグループは試験の開始から投与の終了までＴＡＡ飲料水で食餌した。
【０２２０】
投与の終了後、マウスを一晩絶食させ、血液を下大静脈から回収し、肝臓組織を吸入麻酔および開腹後に摘出した。血液生化学的試験を回収された血液サンプルから単離された血清サンプルで行い、固定された肝臓組織を検体として調製し、Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄで染色し、肝実質の線維症の程度を比較するために組織病理学的変化を観察した。
【０２２１】
実験的実施例１０−２．ＴＡＡ−誘発性肝線維症ラットにおける融合タンパク質活性の評価のための方法
３０ｎｍｏｌ／ｋｇの融合タンパク質ＤＦＤ１１２を８週間２日間隔でＴＡＡ−誘発性肝線維症ラットに繰り返し投与し、血液生化学的試験および組織病理学的試験によって肝線維症に対する効果を評価した。
【０２２２】
図１７ａから１７ｄに示されるとおり、肝線維症が誘導されたＴＡＡコントロールグループは、標準飲料水が提供されたコントロールグループと比較して、肝臓損傷指標としての、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）および総ビリルビン（Ｔ−ｂｉｌ）の有意に高いレベルを示した（ｐ＜０．０１またはｐ＜０．００１）。
【０２２３】
ＡＬＴ、ＧＧＴおよびＴ−Ｂｉｌレベルが、ＴＡＡコントロールグループと比較して、ＤＦＤ１１２投与で有意に減少したことが観察された。組織病理学的試験は、Ｐｉｃｒｏｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色で陽性に染色された肝線維症領域の割合が、正常コントロールグループと比較して、ＴＡＡコントロールグループにおいて有意に増加したことを示した。加えて、肝線維症領域の割合が、ＴＡＡコントロールグループと比較して、ＤＦＤ１１２投与で有意に減少したことが観察された（ｐ＜０．００１）。
【図１Ａ】
2020502053.tif 000013
【図１Ｂ】
2020502053.tif 000014
【図１Ｃ】
2020502053.tif 000015
【図２Ａ】
2020502053.tif 000016
【図２Ｂ】
2020502053.tif 000017
【図３】
2020502053.tif 000018
【図４Ａ】
2020502053.tif 000019
【図４Ｂ】
2020502053.tif 000020
【図４Ｃ】
2020502053.tif 000021
【図５】
2020502053.tif 000022
【図６Ａ】
2020502053.tif 000023
【図６Ｂ】
2020502053.tif 000024
【図７】
2020502053.tif 000025
【図８Ａ】
2020502053.tif 000026
【図８Ｂ】
2020502053.tif 000027
【図９Ａ】
2020502053.tif 000028
【図９Ｂ】
2020502053.tif 000029
【図１０Ａ】
2020502053.tif 000030
【図１０Ｂ】
2020502053.tif 000031
【図１０Ｃ】
2020502053.tif 000032
【図１１】
2020502053.tif 000033
【図１２Ａ】
2020502053.tif 000034
【図１２Ｂ】
2020502053.tif 000035
【図１２Ｃ】
2020502053.tif 000036
【図１３Ａ】
2020502053.tif 000037
【図１３Ｂ】
2020502053.tif 000038
【図１３Ｃ】
2020502053.tif 000039
【図１４】
2020502053.tif 000040
【図１５Ａ】
2020502053.tif 000041
【図１５Ｂ】
2020502053.tif 000042
【図１５Ｃ】
2020502053.tif 000043
【図１５Ｄ】
2020502053.tif 000044
【図１６Ａ】
2020502053.tif 000045
【図１６Ｂ】
2020502053.tif 000046
【図１７Ａ】
2020502053.tif 000047
【図１７Ｂ】
2020502053.tif 000048
【図１７Ｃ】
2020502053.tif 000049
【図１７Ｄ】
2020502053.tif 000050
【配列表】
2020502053000001.app
【国際調査報告】
2020502053.tif 000051
2020502053.tif 000052
2020502053.tif 000053
2020502053.tif 000054
2020502053.tif 000055