(57)【要約】本発明は、治療用抗体がβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされている実施形態を包含する。したがって、本発明には、特に、１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされた治療用抗体を含む組成物が含まれる。本発明は、特に、そのようなβ−１，６−グルカンコンジュゲートを製造及び／または使用する方法をさらに含む。ある種の実施形態では、本発明のβ−１，６−グルカンコンジュゲートは、治療薬としてまたは治療方法において有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜１０個のグルコースモノマー単位からなる１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされている治療用抗体を含む、組成物。
【請求項２】
前記β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜７個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項３】
前記β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して５〜８個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
前記β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜６個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ８個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ７個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ６個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ５個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ４個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ３個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ２個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗体が２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされている、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗体が３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされている、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗体が、２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜７個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗体が、２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜６個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
前記抗体が、２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して５〜８個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
前記抗体が、２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜６個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記抗体が、２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ６個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗体が、２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ５個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
前記抗体が、２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ４個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗体が、２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ３個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
前記抗体が、２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ２個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗体が、３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して５〜８個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗体が、３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜６個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗体が、３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜６個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗体が、３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ８個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
前記抗体が、３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ７個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項２９】
前記抗体が、３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ６個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項３０】
前記抗体が、３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ５個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項３１】
前記抗体が、３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ４個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項３２】
前記抗体が、３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ３個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項３３】
前記抗体が、３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、前記β−１，６−グルカンオリゴマーがそれぞれ２個のグルコースモノマー単位からなる、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項３４】
前記抗体が、式ＩＩ：
【化６４】
2020510622.tif 000083
［式中、
Ｌｙｓはリジン残基であり；
ｂは１〜６であり；かつ
【化６５】
2020510622.tif 000084
は式Ｉの化合物：
【化６６】
2020510622.tif 000085
（式中、
ａは１〜９であり；
Ｌはリンカーであり；及び
「
【化６７】
2020510622.tif 000086
」は、２つの原子間の結合箇所を示す）である］
に記載のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされている、先行請求項のいずれかに記載の組成物。
【請求項３５】
【化６８】
2020510622.tif 000087
が式Ｉａの化合物：
【化６９】
2020510622.tif 000088
（式中、
ａ１は１〜９であり；及び
「
【化７０】
2020510622.tif 000089
」は、２つの原子間の結合箇所を示す）である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項３６】
前記抗体が、表Ｉに列挙される配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する可変ドメインを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３７】
前記抗体が、表Ｉに列挙される重鎖配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖可変ドメインを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記抗体が、表Ｉに列挙される重鎖配列と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記抗体が、表Ｉに列挙される軽鎖配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
前記抗体が、表Ｉに列挙される軽鎖配列と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記抗体が、セルグツズマブ；イブリツモマブチウキセタン；リツキシマブ；トシツモマブ；ゲムツズマブ；アレムツズマブ；パニツムマブ；デパツキシズマブ；シブロツズマブ；コドリツズマブ；トラスツズマブ；パトリツマブ；フィギツムマブ；ガニツマブ；カンツズマブ；ＡＢＸ−ＭＡ１；バビツキシマブ：Ｊ５９１；パリビズマブ；及びベバシズマブからなる群から選択される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記抗体が、セルグツズマブ抗体；イブリツモマブチウキセタン抗体；リツキシマブ抗体；トシツモマブ抗体；ゲムツズマブ抗体；アレムツズマブ抗体；パニツムマブ抗体；デパツキシズマブ抗体；シブロツズマブ抗体；コドリツズマブ抗体；トラスツズマブ抗体；パトリツマブ抗体；フィギツムマブ抗体；ガニツマブ抗体；カンツズマブ抗体；ＡＢＸ−ＭＡ１抗体；バビツキシマブ：Ｊ５９１抗体；パリビズマブ抗体；またはベバシズマブ抗体である、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
前記抗体が、標的への結合をその親の治療用抗体と競合する、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記β−１，６−グルカンオリゴマーが化学合成される、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４５】
前記組成物に含有されるグルカンの乾燥重量のうち少なくとも９０％がβ−１，６−グルカンである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記組成物に含有されるグルカンの乾燥重量のうち１０％未満がβ−１，３−グルカンである、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４７】
前記組成物がβ−１，３−グルカンを実質的に含まない、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
治療を必要とする対象における標的部分の過剰発現及び／または増幅に関連するがんを治療する方法であって、治療有効量の、先行請求項のいずれか１項に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４９】
前記標的が、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲＶＩＩＩ、ＦＡＰ、Ｇｌｙｃｉｐａｎ−３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ３、ＩＧＦ１Ｒ（インスリン様成長因子１受容体）、Ｍｕｃ１（ＣａｎＡｇ）、ＭＵＣ１８、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＲＳＶ（Ｆタンパク質のＡ抗原部位）、及びＶＥＧＦ−Ａからなる群から選択される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的が細胞表面標的である、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記がんが乳癌である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記がんが前立腺癌である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記がんが子宮内膜癌である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記がんが胃癌である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記がんが膀胱癌である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記がんが肺癌である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記肺癌が非小細胞肺癌である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記がんが卵巣癌である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記がんが唾液腺癌である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記がんが膵臓癌である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記がんが血液癌である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記がんが皮膚癌である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
治療用抗体は様々ながんの治療に使用されてきた。治療用抗体は多くのがんの治療に有効であるが、このような治療が効果的ではない患者が依然として多数存在する。したがって、患者での有効性及び／またはより広範ながん患者群にわたる有効性を改善した新たな形態の治療用抗体が必要とされている。
【０００２】
例えば、トラスツズマブは、乳癌及び胃癌の治療に使用されるＨＥＲ２阻害性モノクローナル抗体である。Ｋａｄｃｙｌａ（登録商標）（アドトラスツズマブエムタンシン）は、細胞毒性薬エムタンシン（ＤＭ１）に結合されたモノクローナル抗体トラスツズマブからなる抗体−薬物コンジュゲートであり、転移性乳癌の治療用に承認されている。ＨＥＲ−２の過剰発現（スコア２／３＋）及び増幅は、乳癌で最も頻繁に発生するが、膀胱癌、胃癌、子宮内膜癌、肺癌、及び卵巣癌（Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２００７）２０：１９２−１９８）、ならびに前立腺癌（Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ（２００１）１１６：２３４−２３９）といったがんを含む、１８種の他の腫瘍実体にも見られる。トラスツズマブ及びＫａｄｃｙｌａ（登録商標）は、すべてではないが一部の患者、及び／またはすべてではないが一部の病態における、この種類のがん治療に有効である。したがって、がん患者での有効性及び／またはより広範ながん患者群にわたる有効性が改善された新たな形態のトラスツズマブ抗体が必要とされている。
【０００３】
別の例として、セツキシマブは、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）及び大腸癌（例えば、ＫＲＡＳ野生型ＥＧＦＲを発現する大腸癌）の治療に使用される上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）阻害剤である。セツキシマブは、すべてではないが一部の患者、及び／またはすべてではないが一部の病態における、この種類のがん治療に有効である。したがって、患者での有効性及び／またはより広範ながん患者群にわたる有効性が改善された新たな形態のセツキシマブ抗体が必要とされている。
セルグツズマブ；イブリツモマブチウキセタン；リツキシマブ；トシツモマブ；ゲムツズマブ；アレムツズマブ；パニツムマブ；デパツキシズマブ；シブロツズマブ；コドリツズマブ；パトリツマブ；フィギツムマブ；ガニツマブ；カンツズマブ；ＡＢＸ−ＭＡ１；バビツキシマブ：Ｊ５９１；パリビズマブ；またはベバシズマブを含むがこれらに限定されない他の多くの抗体が、すべてではないが一部の患者、及び／またはすべてではないが一部の病態における、がん治療に有効である。したがって、患者での有効性及び／またはより広範ながん患者群にわたる有効性が改善された新たな形態の上記及び他の治療用抗体が必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２００７）２０：１９２−１９８
【非特許文献２】Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ（２００１）１１６：２３４−２３９
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、治療用抗体がβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされている実施形態を包含する。したがって、本発明には、特に、１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされた治療用抗体を含む組成物が含まれる。本発明は、特に、これらのβ−１，６−グルカンコンジュゲートを製造及び／または使用する方法をさらに含む。ある種の実施形態では、本発明のβ−１，６−グルカンコンジュゲートは、治療薬としてまたは治療方法において有用である。
【０００６】
ある種の実施形態では、本発明は、各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜１０個のグルコースモノマー単位からなる、１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマー（例えば、１〜５個、１〜４個、または１〜３個のβ−１，６−グルカンオリゴマー）にコンジュゲートされた治療用抗体を含む組成物を包含する。ある種の実施形態では、各β−１，６−グルカンオリゴマーは独立して２〜８個のグルコースモノマー単位からなるか、各β−１，６−グルカンオリゴマーは独立して２〜６個のグルコースモノマー単位からなるか、各β−１，６−グルカンオリゴマーは独立して４〜６個のグルコースモノマー単位からなるか、各β−１，６−グルカンオリゴマーは８個のグルコースモノマー単位からなるか、各β−１，６−グルカンオリゴマーは７個のグルコースモノマー単位からなるか、各β−１，６−グルカンオリゴマーは６個のグルコースモノマー単位からなるか、各β−１，６−グルカンオリゴマーは５個のグルコースモノマー単位からなるか、各β−１，６−グルカンオリゴマーは４個のグルコースモノマー単位からなるか、各β−１，６−グルカンオリゴマーは３個のグルコースモノマー単位からなるか、または各β−１，６−グルカンオリゴマーは２個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の実施形態では、治療用抗体は、２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマー、例えば３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされている。
【０００７】
ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して２〜１０個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して２〜８個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して２〜６個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して４〜６個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して８個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して７個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して６個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して５個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して４個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して３個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して２個のグルコースモノマー単位からなる。
【０００８】
ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して２〜１０個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して２〜８個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して２〜６個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して４〜６個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して８個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して７個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して６個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して５個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して４個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して３個のグルコースモノマー単位からなる。ある種の特定の実施形態では、治療用抗体は３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、β−１，６−グルカンオリゴマーはそれぞれ独立して２個のグルコースモノマー単位からなる。
【０００９】
本発明のある種の実施形態では、治療用抗体は式ＩＩ：
【化１】
2020510622.tif 000002
に記載のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされており、
式中、Ｌｙｓはリジン残基であり；ｂは１〜６、１〜５、１〜４、または１〜３であり；ならびに
【化２】
2020510622.tif 000003
は式Ｉ：
【化３】
2020510622.tif 000004
の化合物であり、
式中、ａは１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、または１〜３であり；Ｌはリンカーであり；及び「
【化４】
2020510622.tif 000005
」は２つの原子間の結合箇所を表す。
【００１０】
本発明のある種の実施形態では、
【化５】
2020510622.tif 000006
は式Ｉａ：
【化６】
2020510622.tif 000007
の化合物であり、
式中、ａ１は１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、または１〜３であり；及び「
【化７】
2020510622.tif 000008
」は２つの原子間の結合箇所を表す。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、セルグツズマブ；イブリツモマブチウキセタン；リツキシマブ；トシツモマブ；ゲムツズマブ；アレムツズマブ；セツキシマブ；パニツムマブ；デパツキシズマブ；シブロツズマブ；コドリツズマブ；トラスツズマブ；パトリツマブ；フィギツムマブ；ガニツマブ；カンツズマブ；ＡＢＸ−ＭＡ１；バビツキシマブ：Ｊ５９１；パリビズマブ；またはベバシズマブである。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、セルグツズマブ；イブリツモマブチウキセタン；リツキシマブ；トシツモマブ；ゲムツズマブ；アレムツズマブ；パニツムマブ；デパツキシズマブ；シブロツズマブ；コドリツズマブ；トラスツズマブ；パトリツマブ；フィギツムマブ；ガニツマブ；カンツズマブ；ＡＢＸ−ＭＡ１；バビツキシマブ：Ｊ５９１；パリビズマブ；またはベバシズマブである。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、セルグツズマブ；イブリツモマブチウキセタン；リツキシマブ；トシツモマブ；ゲムツズマブ；アレムツズマブ；パニツムマブ；デパツキシズマブ；シブロツズマブ；コドリツズマブ；パトリツマブ；フィギツムマブ；ガニツマブ；カンツズマブ；ＡＢＸ−ＭＡ１；バビツキシマブ：Ｊ５９１；パリビズマブ；またはベバシズマブである。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、本明細書で定義される、セルグツズマブ抗体；イブリツモマブチウキセタン抗体；リツキシマブ抗体；トシツモマブ抗体；ゲムツズマブ抗体；アレムツズマブ抗体；セツキシマブ抗体；パニツムマブ抗体；デパツキシズマブ抗体；シブロツズマブ抗体；コドリツズマブ抗体；トラスツズマブ抗体；パトリツマブ抗体；フィギツムマブ抗体；ガニツマブ抗体；カンツズマブ抗体；ＡＢＸ−ＭＡ１抗体；バビツキシマブ：Ｊ５９１抗体；パリビズマブ抗体；ベバシズマブ抗体である。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、本明細書で定義される、セルグツズマブ抗体；イブリツモマブチウキセタン抗体；リツキシマブ抗体；トシツモマブ抗体；ゲムツズマブ抗体；アレムツズマブ抗体；パニツムマブ抗体；デパツキシズマブ抗体；シブロツズマブ抗体；コドリツズマブ抗体；トラスツズマブ抗体；パトリツマブ抗体；フィギツムマブ抗体；ガニツマブ抗体；カンツズマブ抗体；ＡＢＸ−ＭＡ１抗体；バビツキシマブ：Ｊ５９１抗体；パリビズマブ抗体；ベバシズマブ抗体である。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、本明細書で定義される、セルグツズマブ抗体；イブリツモマブチウキセタン抗体；リツキシマブ抗体；トシツモマブ抗体；ゲムツズマブ抗体；アレムツズマブ抗体；パニツムマブ抗体；デパツキシズマブ抗体；シブロツズマブ抗体；コドリツズマブ抗体；パトリツマブ抗体；フィギツムマブ抗体；ガニツマブ抗体；カンツズマブ抗体；ＡＢＸ−ＭＡ１抗体；バビツキシマブ：Ｊ５９１抗体；パリビズマブ抗体；ベバシズマブ抗体である。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、表Ｉに列挙される配列と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、表Ｉに列挙される配列の一部と少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、表Ｉに列挙される配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する配列が含まれる可変ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、表Ｉに列挙される配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する配列が含まれる重鎖可変ドメインを含む。本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、表Ｉに列挙される配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する配列が含まれる軽鎖可変ドメインを含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、表Ｉに列挙される配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する配列が含まれるＣＤＲを含む。本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、表Ｉに列挙される配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する配列が含まれる重鎖ＣＤＲを含む。本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、表Ｉに列挙される配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する配列が含まれる軽鎖ＣＤＲを含む。本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、表Ｉに列挙される配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する配列が含まれる重鎖ＣＤＲを含む。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、表Ｉに列挙される配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する配列が含まれる定常領域を含む。本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、表Ｉに列挙される配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する配列が含まれる軽鎖定常領域を含む。本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、表Ｉに列挙される配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する配列が含まれる重鎖定常領域を含む。本発明のいくつかの実施形態では、治療用抗体は、表Ｉに列挙される配列の少なくとも一部と少なくとも８０％の同一性を有する配列が含まれるヒンジドメインを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、治療用抗体は、その標的への結合を親の治療用抗体と競合する。例えば、いくつかの実施形態では、セルグツズマブ抗体は、ＣＥＡＣＡＭ５などへの結合をセルグツズマブと競合する。
【００２２】
様々な実施形態において、β−１，６−グルカンオリゴマーは化学合成される。様々な実施形態において、組成物に含有されるグルカンの乾燥重量のうち少なくとも９０％はβ−１，６−グルカンである。様々な実施形態において、組成物に含有されるグルカンの乾燥重量のうち１０％未満はβ−１，３−グルカンである。様々な実施形態において、組成物はβ−１，３−グルカンを実質的に含まない。
【００２３】
本発明はさらに、本発明の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、腫瘍抗原（例えば、ＣＥＡＣＡＭ５など）の発現に関連するがんを治療する方法を提供する。例えば、いくつかの実施形態では、本方法は、各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜１０個のグルコースモノマー単位からなる、１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマー（例えば、１〜５個、１〜４個、または１〜３個のβ−１，６−グルカンオリゴマー）にコンジュゲートされた治療用抗体を含む、治療有効量の組成物を投与することを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、がんは乳癌である。いくつかの実施形態では、がんは卵巣癌である。いくつかの実施形態では、がんは膀胱癌である。いくつかの実施形態では、がんは唾液腺癌である。いくつかの実施形態では、がんは子宮内膜癌である。いくつかの実施形態では、がんは膵臓癌である。いくつかの実施形態では、がんは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。いくつかの実施形態では、がんは前立腺癌である。いくつかの実施形態では、がんは転移性である。
【００２５】
定義
本明細書で使用される場合、「抗体」とは、免疫グロブリン分子の可変領域、最適化領域、または選択領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して標的を認識し、それに特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で使用される場合、用語「抗体」には、インタクトポリクローナル抗体、インタクトモノクローナル抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’２、Ｆａｂ２、Ｆａｂ３、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、Ｆｅｂ、ｓｃＦｖ、ＳＭＩＰ、抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、マキシボディ、ｔａｎｄａｂ、ＤＶＤ、ＢｉＴｅ、ＴａｎｄＡｂなど、またはそれらの任意の組み合わせなど）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）変異体、少なくとも２つのインタクト抗体から作製される二重特異性抗体などの多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原決定部分を含む融合タンパク質、及び望ましい生物活性を抗体が示す限り、抗原認識部位を含む他のあらゆる修飾免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる重鎖定常領域ドメインの同一性に基づいた、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭという５つの主要なクラスの免疫グロブリン、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）のいずれでもあり得る。クラスの異なる免疫グロブリンは、異なった周知のサブユニット構造及び３次元構成を有する。抗体は、裸であっても、またはグルカン、毒素、放射性同位体などの他の分子にコンジュゲートされていてもよい。本明細書で使用される場合、抗体は、例えば「インタクト抗体」でも「抗体断片」でもあり得る。本明細書で使用される場合、「抗体」には、当技術分野で公知であり得るような種々の代替的形態、例えばラクダ抗体がさらに包含される。本明細書で使用される場合、抗体またはインタクト抗体は、ジスルフィド結合によって相互結合された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖、及び２つの軽（Ｌ）鎖を含んでいる免疫グロブリン分子であり得る。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変（ＶＬ）領域及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨ及びＶＬ領域はさらに、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存的である領域が挿入された、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分することができる。他のインタクト抗体、例えばインタクトなラクダ抗体が当技術分野において公知である。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「抗体断片」とは、免疫グロブリンタンパク質の全部または一部に由来するか、またはそれらと有意な同一性を有する部分、例えば抗体の抗原結合領域または可変領域などを少なくとも含む分子を意味する。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；トリアボディ；テトラボディ；直鎖抗体；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体に含まれる含ＣＤＲ部分が挙げられる。当業者であれば、用語「抗体断片」は、いかなる特定の生成様式も意味せず、またそれらに限定されないことを理解されよう。抗体断片は、インタクト抗体の切断、化学合成、組換え作製などを含むがこれらに限定されない任意の適切な方法論の使用を通じて作製することができる。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語グルカンとは、大部分または全体がグルコースモノマー単位からなる任意のポリマー分子またはオリゴマー分子を意味する。グルカンは遊離分子でも、または抗体などの１つ以上の他の分子とコンジュゲートされている分子でもあり得る。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「コンジュゲート」とは、１つ以上のグルカンに共有結合している抗体を指す。用語「グルカンコンジュゲート」または「グルカン結合」ならびにそれらの文法上の等価表現は、１つ以上のグルカンに共有結合している抗体分子を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「同一性」とは、参照核酸またはアミノ酸配列と１つ以上の他の核酸またはアミノ酸配列との間の全体的な関連性を指す。同一性はパーセンテージで表すことができる。同一性パーセントを計算するための方法は、当技術分野において公知である。同一性の計算には、配列の長さが同じかまたは類似することを必要としない。同一性パーセントの計算は、最適な比較を目的として２つの配列をアライメントすることにより実施することができる（例えば、最適なアライメントになるように第１及び第２の核酸配列の一方または両方にギャップを導入すること、ならびに比較のために同一でない配列を無視することができる）。その後、対応するヌクレオチド位置のヌクレオチドを比較することができる。第１の配列内のある位置を第２の配列内の対応する位置と同じヌクレオチドが占めている場合、配列はその位置に関して同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、各配列が共有する同一位置の数の関数であり、通常は、例えば、各配列を最適なアライメントにするために導入される任意のギャップの数及び／または長さを考慮する。配列の比較及び２つの配列間の同一性パーセントの決定は、ＢＬＡＳＴ（登録商標）などの数学的アルゴリズムを使用して完了することができる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「リンカー」とは、異なる要素を互いに接続する多要素の作用物質のその部分を指す。リンカーは、任意の供給源及び／または任意の手順、例えば当技術分野で公知の任意の供給源及び／または任意の手順により誘導または合成することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは治療用抗体（例えば、表Ｉから選択されるもの）とβ−１，６−グルカンオリゴマーとを結合させる。いくつかの実施形態では、リンカーは、剛直な３次元構造をとらない傾向があり、むしろ結合される要素間に柔軟性を与えることを特徴とする。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「治療」（また「治療する」または「治療すること」）とは、特定の疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の症状または特徴を部分的または完全に緩和する、改善する、軽減する、抑制する、その開始を遅延する、その重症度を抑制する、及び／またはそれらの発生率を減少させる治療用分子（例えばコンジュゲート）の任意の投与を指す。そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／または病態の徴候を示さない対象、及び／または疾患、障害、及び／または病態の初期徴候のみを示す対象の治療であり得る。あるいはまたは加えて、そのような治療は、関連する疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の確立された徴候を示す対象の治療であり得る。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」とは、投与されると、所望する効果が生じる量を意味する。いくつかの実施形態では、この用語は、治療投与レジメンに従って、疾患、障害、及び／または病態に罹患しているかまたは罹患しやすい集団に投与したときに、疾患、障害、及び／または病態を治療するのに十分である量を指す。いくつかの実施形態では、治療有効量は、疾患、障害、及び／または病態の１つ以上の症状の発生率及び／または重症度を抑制し、及び／またはその開始を遅延させるものである。当業者であれば、用語「治療有効量」には、実際に特定の対象で治療の成功がなされることを必要としないことを理解されよう。むしろ、治療有効量とは、そのような治療を必要とする対象に投与されたときに有意な数の対象において特定の望ましい薬理学的反応をもたらす量であり得る。いくつかの実施形態では、治療有効量が表す意味は、１つ以上の特定の組織（例えば、疾患、障害、または病態に侵された組織）または体液（例えば、血液、唾液、血清、汗、涙、尿など）において測定された量を指すものであり得る。当業者であれば、いくつかの実施形態では、治療有効量の特定のコンジュゲートを単回用量で製剤化及び／または投与できることを理解されよう。いくつかの実施形態では、治療有効量の特定のコンジュゲートを、例えば、投与レジメンの一部として、複数回用量で製剤化及び／または投与することができる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、一般に上記の式Ｉに記載されるもの、及び本明細書に開示されるクラス、サブクラス、及び種ごとにさらに例示されるものを含む、化合物（例えば、β−１，６−グルカンオリゴマー及び任意のリンカー）を包含する。本明細書で各変動要素に記載された好ましい部分集合は、構造部分集合のいずれかにも同様に使用できるものと理解されたい。本明細書で使用される場合、以下の定義は、特に記載のない限り、このような化合物に適用されるものとする。
【００３４】
本明細書に記載されるように、本発明において使用される化合物は、上に一般的に例示されるような、または本発明の特定のクラス、サブクラス、及び種ごとに例示されるような、１つ以上の置換基で場合により置換されていてもよい。「場合により置換される」という語句は、「置換または非置換」という語句と同義に使用されるものと理解されたい。一般に、用語「置換される」とは、用語「場合により」が先行するか否かにかかわらず、その置換の結果、安定なまたは化学的に実現可能な化合物をもたらすという条件で、指定部分の水素ラジカルが特定の置換基のラジカルで置換されることを意味する。指定された原子に関連して使用されるとき、用語「置換可能な」とは、その原子に結合したものが水素ラジカルであり、水素原子を好適な置換基のラジカルで置換できることを意味する。特に記載のない限り、「場合により置換される」基は、その基の各置換可能な位置に置換基を有していてもよく、また任意の所与の構造において特定の基から選択される複数の置換基で複数の位置を置換できる場合に、置換基が位置ごとに同じであっても異なっていてもよい。本発明で想定される置換基の組み合わせは、好ましくは、安定なまたは化学的に実現可能な化合物の形成をもたらすものである。
【００３５】
安定な化合物または化学的に実現可能な化合物とは、湿気または他の化学反応条件の不在下で、少なくとも１週間、約−８０℃〜約＋４０℃の温度に維持されたときに化学構造が実質的に変化しないものであるか、または患者への治療的投与または予防的投与に有用であるに足る十分な長い期間にわたってその完全性を維持する化合物である。いくつかの実施形態では、安定な化合物または化学的に実現可能な化合物とは、約−８０℃〜約＋２５℃の温度に維持されたときに化学構造が実質的に変化しないものである。いくつかの実施形態では、安定な化合物または化学的に実現可能な化合物とは、約−８０℃〜約＋４℃の温度に維持されたときに化学構造が実質的に変化しないものである。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「１つ以上の置換基」という語句は、上記の安定な及び化学的に実現可能な条件が満たされているという条件で、１つの置換基から、利用可能な結合部位の数に基づいて可能な最大数の置換基までに相当する、いくつかの置換基を指す。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「脂肪族」または「脂肪族基」とは、完全に飽和しているかまたは１つ以上の不飽和単位を含む、場合により置換される直鎖または分枝鎖のＣ１−１２炭化水素を意味する。例えば、好適な脂肪族基として、場合により置換される直鎖または分枝鎖のアルキル基、アルケニル基、及びアルキニル基が挙げられる。特に指定のない限り、様々な実施形態において、脂肪族基は、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３、または１〜２個の炭素原子を有する。
【００３８】
用語「アルキル」は、単独でまたはより大きな部分の一部として使用され、１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４、１〜３、または１〜２個の炭素原子を有する飽和の、場合により置換される直鎖または分枝鎖の炭化水素基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｉ−ブチル、ｓ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、ネオペンチル、３，３−ジメチルプロピル、ヘキシル、２−メチルペンチル、ヘプチルなどを指す。
【００３９】
用語「アルケニル」は、単独でまたはより大きな部分の一部として使用され、少なくとも１つの二重結合を有し、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、または２〜３個の炭素原子を有する、場合により置換される直鎖または分枝鎖の炭化水素基を指す。例示的なアルケニル基としては、ビニル、プロパ−１−エニル、プロパ−２−エニル、アレニル、２−メチルプロパ−２−エニル、３−メチルブタ−２−エニル、ブタジエニルなどが挙げられる。
【００４０】
用語「アルキニル」は、単独でまたはより大きな部分の一部として使用され、少なくとも１つの三重結合を有し、２〜１２、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜４、または２〜３個の炭素原子を有する、場合により置換される直鎖または分枝鎖の炭化水素基を指す。例示的なアルキニル基として、ＣＨ３−Ｃ≡Ｃ−、Ｈ−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−、ＣＨ３−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−、Ｈ−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２ＣＨ２−、Ｈ−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−、Ｈ−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ２が挙げられる。
【００４１】
用語「アルキレン」は、二価のアルキル基を指す。「アルキレン鎖」は、ポリメチレン基、例えば−（ＣＨ２）ｎ−（式中、ｎは正の整数、例えば、１〜６、１〜４、１〜３、１〜２、または２〜３）である。場合により置換されるアルキレン鎖は、１つ以上のメチレン水素原子が場合により置換基で置換されるポリメチレン基である。好適な置換基には、置換された脂肪族基について以下に記載されるものを含み、また本明細書に記載されるものを含む。アルキレン基の２つの置換基が一緒になって環系を形成してもよいことが理解されるであろう。ある種の実施形態では、２つの置換基は一緒になって３〜７員環を形成することができる。各置換基は、同じ原子にあっても、異なる原子にあってもよい。
【００４２】
用語「アルケニレン」は、二価のアルケニル基を指す。置換されたアルケニレン鎖は、１つ以上の水素原子が置換基で置換されている、少なくとも１つの二重結合を含むポリメチレン基である。好適な置換基は、置換された脂肪族基について以下に記載されるものを含む。
【００４３】
用語「アルキニレン」は、二価のアルキニル基を指す。置換されたアルキニレン鎖は、１つ以上の水素原子が置換基で置換されている、少なくとも１つの三重結合を含むポリメチレン基である。好適な置換基は、置換された脂肪族基について以下に記載されるものを含む。
【００４４】
用語「アリール」及び「アラ−」は、単独でまたはより大きな部分、例えば「アラルキル」、「アラルコキシ」、または「アリールオキシアルキル」の一部として使用され、１〜３個の芳香環を含んでいる、場合により置換されるＣ６−１４芳香族炭化水素部分を指す。例えば、アリール基は、Ｃ６−１０アリール基（例えば、フェニル及びナフチル）である。アリール基には、限定されないが、場合により置換されるフェニル、ナフチル、アントラセニル、及びフェナントレニルを含む。本明細書で使用される場合、用語「アリール」及び「アラ−」にはまた、アリール環が１つ以上の脂環式環と縮合されて、場合により置換される環構造を形成する基も含む（例えば、２，３−ジヒドロインデニル；１，２，３，４−テトラヒドロナフタレニル；１，２−ジヒドロナフタレニル；２，３−ジヒドロナフタレニル；８，１０−ジヒドロアントラセニル、フルオレニルなど）。
【００４５】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアルキル」は、１つ以上の官能基で場合により置換されており、炭素原子の代わりに、１つ以上の酸素原子、硫黄原子、窒素原子、リン原子、またはケイ素原子を含んでいる、本明細書に定義される直鎖、分枝鎖、及び環状のアルキル基を指す。類似する規則は、「ヘテロアルケニル」、「ヘテロアルキニル」などの他の一般用語にも適用される。さらに、本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」、「ヘテロアルキニル」などは、置換基及び非置換基の両方を包含する。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロ環」、「ヘテロシクリル」、「複素環ラジカル」、及び「複素環」は同義に使用され、飽和または部分不飽和のいずれかであり、炭素原子に加えて、１つ以上、例えば１〜４個の上で定義されたようなヘテロ原子を有する、安定な３〜８員単環または７〜１０員二環のヘテロ環部分を指す。ヘテロ環の環原子に関して使用される場合、用語「窒素」は置換された窒素を含む。例として、酸素、硫黄、または窒素から選択される０〜３個のヘテロ原子を有する飽和または部分不飽和の環において、窒素は（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピロリルにおける）Ｎ、（ピロリジニルにおける）ＮＨ、または（Ｎ−置換ピロリジニルにおける）ＮＲ＋であり得る。
【００４７】
複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子でそのペンダント基に結合されて安定な構造をもたらすことができ、また環原子のいずれかが場合により置換されていてもよい。そのような飽和または部分不飽和の複素環ラジカルの例としては、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピペリジニル、デカヒドロキノリニル、オキサゾリジニル、ピペラジニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ジアゼピニル、オキサゼピニル、チアゼピニル、モルホリニル、及びチアモルホリニルが挙げられるが、これらに限定されない。ヘテロシクリル基は、単環式、二環式、三環式、または多環式、好ましくは単環式、二環式または三環式、より好ましくは単環式または二環式であり得る。用語「ヘテロシクリルアルキル」とは、ヘテロシクリルで置換されているアルキル基を指し、アルキル及びヘテロシクリル部分は独立して場合により置換される。さらに、複素環には、複素環が１つ以上のアリール環と縮合されている基も含む。
【００４８】
用語「ヘテロアリール」及び「ヘテロアラ−」は、単独でまたはより大きな部分、例えば「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアラルコキシ」の一部として使用され、５〜１４個の環原子、好ましくは５、６、９、または１０個の環原子を有する基；一連の環で共有される６、１０、または１４個のπ電子を有する基；及び炭素原子に加えて、１〜５個のヘテロ原子を有する基を指す。ヘテロアリール基は、単環式、二環式、三環式、または多環式、例えば、単環式、二環式、または三環式（例えば、単環式または二環式）であり得る。用語「ヘテロ原子」とは、窒素、酸素、または硫黄を指し、窒素または硫黄の何らかの酸化形態及び塩基性窒素の何らかの四級化形態を含む。例えば、ヘテロアリールの窒素原子は塩基性窒素原子であってよく、また場合により対応するＮ−オキシドに酸化されていてもよい。ヘテロアリールがヒドロキシ基で置換されている場合、ヘテロアリールにはその対応する互変異性体も含まれる。本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリール」及び「ヘテロアラ−」にはまた、芳香族複素環が１つ以上のアリール環、脂環式環、またはヘテロ脂環式環と縮合されている基も含む。ヘテロアリール基の非限定的な例としては、チエニル、フラニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアゾリル、イソチアゾリル、チアジアゾリル、ピリジル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、インドリジニル、プリニル、ナフチリジニル、プテリジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、ジベンゾフラニル、インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、キノリル、イソキノリル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、４Ｈ−キノリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、及びピリド［２，３−ｂ］−１，４−オキサジン−３（４Ｈ）−オンが挙げられる。用語「ヘテロアリール」は、用語「ヘテロアリール環」、「ヘテロアリール基」、または「ヘテロ芳香族」と同義に使用されてもよく、そのいずれの用語も場合により置換されている環を含む。用語「ヘテロアラルキル」とは、ヘテロアリールで置換されているアルキル基を指し、アルキル及びヘテロアリール部分は独立して場合により置換されている。
【００４９】
アリール（アラルキル、アラルコキシ、アリールオキシアルキルなどを含む）またはヘテロアリール（ヘテロアラルキル及びヘテロアリールアルコキシなどを含む）基は、１つ以上の置換基を含んでいてもよく、したがって「場合により置換され」ていてもよい。上記及び本明細書で定義した置換基に加えて、アリール基またはヘテロアリール基の不飽和炭素原子の好適な置換基はまた、−ハロ、−ＮＯ２、−ＣＮ、−Ｒ＋、−Ｃ（Ｒ＋）＝Ｃ（Ｒ＋）２、−Ｃ≡Ｃ−Ｒ＋、−ＯＲ＋、−ＳＲ°、−Ｓ（Ｏ）Ｒ°、−ＳＯ２Ｒ°、−ＳＯ３Ｒ＋、−ＳＯ２Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｎ（Ｒ＋）２、−ＮＲ＋Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−ＮＲ＋Ｃ（Ｓ）Ｒ＋、−ＮＲ＋Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ＋）２、−ＮＲ＋Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｎ（Ｒ＋）Ｃ（＝ＮＲ＋）−Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｎ（Ｒ＋）Ｃ（＝ＮＲ＋）−Ｒ°、−ＮＲ＋ＣＯ２Ｒ＋、−ＮＲ＋ＳＯ２Ｒ°、−ＮＲ＋ＳＯ２Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−Ｏ−ＣＯ２Ｒ＋、−ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−Ｃ（Ｓ）Ｒ°、−ＣＯ２Ｒ＋、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ＋）−ＯＲ＋、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ＋）Ｃ（＝ＮＲ＋）−Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｎ（Ｒ＋）Ｃ（＝ＮＲ＋）−Ｎ（Ｒ＋）−Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−Ｃ（＝ＮＲ＋）−Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｃ（＝ＮＲ＋）−ＯＲ＋、−Ｎ（Ｒ＋）−Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｃ（＝ＮＲ＋）−Ｎ（Ｒ＋）−ＯＲ＋、−Ｃ（Ｒ°）＝Ｎ−ＯＲ＋、−Ｐ（Ｏ）（Ｒ＋）２、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ＋）２、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）−ＯＲ＋、及び−Ｐ（Ｏ）（ＮＲ＋）−Ｎ（Ｒ＋）２を含み、また一般にそれらから選択され、ここで、Ｒ＋は独立して水素もしくは場合により置換される脂肪族基、アリール基、ヘテロアリール基、脂環式基、もしくはヘテロシクリル基であるか、または２つの独立して存在するＲ＋が、その介在原子（複数可）とともに、場合により置換される５〜７員のアリール環、ヘテロアリール環、脂環式環、またはヘテロシクリル環を形成する。各Ｒ°は、場合により置換される脂肪族基、アリール基、ヘテロアリール基、脂環式基、またはヘテロシクリル基である。
【００５０】
脂肪族基もしくはヘテロ脂肪族基、または非芳香族炭素環もしくは複素環は、１つ以上の置換基を含んでいてもよく、したがって「場合により置換され」ていてもよい。上記及び本明細書で特に定義されない限り、脂肪族基もしくはヘテロ脂肪族基、または非芳香族炭素環もしくは複素環の飽和炭素に対する好適な置換基は、アリール基またはヘテロアリール基の不飽和炭素について上に列挙したものから選択され、加えて、＝Ｏ、＝Ｓ、＝Ｃ（Ｒ＊）２、＝Ｎ−Ｎ（Ｒ＊）２、＝Ｎ−ＯＲ＊、＝Ｎ−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ＊、＝Ｎ−ＮＨＣＯ２Ｒ°＝Ｎ−ＮＨＳＯ２Ｒ°、または＝Ｎ−Ｒ＊を含み、式中、Ｒ°は上に定義された通りであり、各Ｒ＊は独立して、水素または場合により置換されるＣ１−６脂肪族基から選択される。
【００５１】
上記及び本明細書で定義した置換基に加えて、非芳香族複素環の窒素に対する任意の置換基はまた、−Ｒ＋、−Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ＋、−Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ＋、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ＋、−Ｓ（Ｏ）２Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ＋）２、−Ｃ（＝ＮＨ）−Ｎ（Ｒ＋）２、または−Ｎ（Ｒ＋）Ｓ（Ｏ）２Ｒ＋（式中、各Ｒ＋は、上に定義された通り）を含み、また一般にそれらから選択される。ヘテロアリール環または非芳香族複素環の環窒素原子はまた、酸化されて、対応するＮ−ヒドロキシまたはＮ−オキシド化合物を形成し得る。酸化された環窒素原子を有するそのようなヘテロアリールの非限定的な例は、Ｎ−オキシドピリジルである。
【００５２】
上で詳述したように、いくつかの実施形態では、２つの独立して存在するＲ＋（または本明細書及び特許請求の範囲で同様に定義される任意の他の変動要素）が、その介在原子（複数可）とともに、３〜１３員脂環式、窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する３〜１２員ヘテロシクリル、６〜１０員アリール、または窒素、酸素、もしくは硫黄から独立して選択される１〜５個のヘテロ原子を有する５〜１０員ヘテロアリールから選択される単環または二環を形成する。
【００５３】
２つの独立して存在するＲ＋（または本明細書及び特許請求の範囲で同様に定義される任意の他の変動要素）が、その介在原子（複数可）と一緒になる場合に形成される例示的な環として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ａ）同じ原子に結合した２つの独立したＲ＋（または本明細書または特許請求の範囲で同様に定義される任意の他の変動要素）が、その原子とともに形成する環。例えばＮ（Ｒ＋）２であり、ここで、存在するＲ＋はいずれも窒素原子とともにピペリジン−１−イル、ピペラジン−１−イル、またはモルホリン−４−イル基を形成する；及びｂ）異なる原子に結合した２つの独立したＲ＋（または本明細書または特許請求の範囲で同様に定義される任意の他の変動要素）が、これら両方の原子とともに形成する環。例えば、フェニル基が２つの存在する
【化８】
2020510622.tif 000009
で置換されている場合、これらの２つの存在するＲ＋は、それらが結合する酸素原子とともに含酸素縮合６員環
【化９】
2020510622.tif 000010
を形成する。２つの独立して存在するＲ＋（または本明細書及び特許請求の範囲で同様に定義される任意の他の変動要素）は、その介在原子（複数可）とともに他の様々な環（例えばスピロ環及び架橋環）を形成することができ、上に詳述した例は限定を意図しないものと理解されたい。
【００５４】
特に記載のない限り、本明細書で示される構造はまた、その構造のすべての異性体（例えば、エナンチオマー、ジアステレオマー、及び幾何学的（または立体配座））型、例えば、各不斉中心のＲ及びＳ配置、（Ｚ）及び（Ｅ）二重結合異性体、ならびに（Ｚ）及び（Ｅ）立体配座異性体を含むことを意図する。したがって、本発明の化合物の単一の立体化学異性体、ならびにエナンチオマー、ジアステレオマー、及び幾何学的（または立体配座）混合物は、本発明の範囲内である。特に記載のない限り、本発明の化合物のすべての互変異性型が本発明の範囲内である。加えて、特に記載のない限り、本明細書で示される構造はまた、１つ以上の同位体濃縮原子の存在のみが異なる化合物を含むことを意図する。例えば、水素の代わりに重水素もしくは三重水素が存在する、または炭素の代わりに１３Ｃもしくは１４Ｃ濃縮炭素が存在する本構造を有する化合物は本発明の範囲内である。そのような化合物は、非限定的な例として、生物学的アッセイにおける分析ツールまたはプローブとして有用である。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】トラスツズマブ、ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（５量体）、及びＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）のＨＥＲ２結合能を試験するＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図２】トラスツズマブ、ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（５量体）、及びＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）でのヒト抗β−１，６−グルカンの存在を検出するＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図３】トラスツズマブ抵抗性ヒト細胞株ＪＩＭＴ−１を移植したヌードマウスモデルにおける、トラスツズマブ、ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（５量体）、ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）、及びＫａｄｃｙｌａ（登録商標）（Ｔ−ＤＭ１）の有効性試験の腫瘍サイズ平均の結果を示す。
【図４】トラスツズマブ抵抗性ヒト細胞株ＪＩＭＴ−１を移植したヌードマウスモデルにおける、トラスツズマブ、ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（５量体）、ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）、及びＫａｄｃｙｌａ（登録商標）（Ｔ−ＤＭ１）の有効性試験の腫瘍サイズ中央値の結果を示す。
【図５】トラスツズマブ及びＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）による処置後３７日目のトラスツズマブ抵抗性ヒト細胞株ＪＩＭＴ−１を移植したヌードマウスモデルにおける、腫瘍の腫瘍サイズ平均を示す。
【図６】トラスツズマブ及びＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）による処置後５１日目のトラスツズマブ抵抗性ヒト細胞株ＪＩＭＴ−１を移植したヌードマウスモデルにおける、腫瘍の腫瘍サイズ平均を示す。
【図７】β−１，６−グルカンのコンジュゲーションがセツキシマブのＥＧＦ受容体への結合に影響を及ぼさないことを示すグラフである。
【図８】β−１，６−グルカンのコンジュゲーションがセツキシマブのＥＧＦ受容体への結合に影響を及ぼさないことを示すグラフである。
【図９】β−１，６−グルカンのコンジュゲーションがセツキシマブのＥＧＦ受容体への結合に影響を及ぼさないことを示すグラフである。
【図１０】β−１，６−グルカンのコンジュゲーションがセツキシマブのＡＤＣＣに影響を及ぼさないことを示すグラフである。
【図１１】β−１，６−グルカンのコンジュゲーションがセツキシマブのＡＤＣＣに影響を及ぼさないことを示すグラフである。
【図１２】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブへの抗β−１，６−グルカンＩｇＧ２の結合の評価を示すチャートである。
【図１３】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブへの抗β−１，６−グルカンＩｇＧ２の結合の評価を示すチャートである。
【図１４】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブへの抗β−１，６−グルカンＩｇＧ２の結合の評価を示す２枚１組のグラフである。
【図１５】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブへの抗β−１，６−グルカンＩｇＧ２の結合の評価を示す３枚１組のグラフである。
【図１６】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブによる好中球活性化を示す７枚１組の画像である。好中球の活性化は、すべてのβ−１，６−グルカンサイズで観察した。
【図１７】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブによる好中球浸潤を示す６枚１組の画像である。
【図１８】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブへの抗β−１，６−グルカンＩｇＧ２の結合の評価を示すチャートである。
【図１９】β−１，６−グルカンのコンジュゲーションがセツキシマブのＥＧＦＲへの結合に影響を及ぼさないことを示す５枚１組のグラフである。
【図２０】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブへの抗β−１，６−グルカンＩｇＧ２の結合の評価を示す５枚１組のグラフである。
【図２１】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブへの抗β−１，６−グルカンＩｇＧ２の結合の評価を示す４枚１組のグラフである。
【図２２】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブへの抗β−１，６−グルカンＩｇＧ２の結合の評価を示すグラフである。
【図２３】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブへの抗β−１，６−グルカンＩｇＧ２の結合の評価を示すチャートである。
【図２４】β−１，６−グルカンのコンジュゲーションが、ＥＧＦ受容体への抗体の結合及びβ−１，６−グルカンへの抗β−１，６−グルカンＩｇＧ２の結合に与える効果を示す２枚１組のグラフである。図１８のグラフ１は、コンジュゲーションが、ＥＧＦ受容体に結合する抗体に与える効果を示す。図１８のグラフ２は、コンジュゲーションが、β−１，６−グルカンへの抗β−１，６−グルカンＩｇＧ２の結合に与える効果を示す。
【図２５】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがヒト血清中で安定であることを示す２枚１組のグラフである。図１９の左のグラフは、ヒト血清での抗体検出を示す。図１９の右のグラフは、ヒト血清でのβ−１，６−グルカンの検出を示す。
【図２６】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがマウス血清中で安定であることを示す２枚１組のグラフである。図２０の左のグラフはマウス血清での抗体検出を示す。図２０の右のグラフは、マウス血清でのβ−１，６−グルカンの検出を示す。
【図２７】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがヒト血清中で安定であることを示す２枚１組のグラフである。図２１の左のグラフは、ヒト血清での抗体検出を示す。図２１の右のグラフは、ヒト血清でのβ−１，６−グルカンの検出を示す。
【図２８】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブが熱不活性化ヒト血清中で安定であることを示す２枚１組のグラフである。図２２の左のグラフは、熱不活性化ヒト血清での抗体検出を示す。図２２の右のグラフは、熱不活性化ヒト血清でのβ−１，６−グルカンの検出を示す。
【図２９】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがマウス血清中で安定であることを示す２枚１組のグラフである。図２３の左のグラフはマウス血清での抗体検出を示す。図２３の右のグラフは、マウス血清でのβ−１，６−グルカンの検出を示す。
【図３０】薬物動態試験で試験したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性（抗β−１，６−グルカンＩｇＧ２結合）の評価を示すチャートである。
【図３１】腫瘍がないときのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの薬物動態学的な抗体安定性を示すグラフである。グラフは、β−１，６−グルカンの５量体とのコンジュゲーションがセツキシマブのＰＫに影響を及ぼさないことを示す。
【図３２】腫瘍がないときのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの薬物動態学的な抗体安定性を示すグラフである。グラフは、β−１，６−グルカンの５量体とのコンジュゲーションがセツキシマブのＰＫに影響を及ぼさないことを示す。
【図３３】腫瘍がないときのβ−１，６−グルカン検出の薬物動態分析を示すグラフである。
【図３４】腫瘍がないときのβ−１，６−グルカン検出の薬物動態分析を示すグラフである。
【図３５】腫瘍がないときのβ−１，６−グルカン検出の薬物動態分析を示すグラフである。
【図３６】腫瘍がないときのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ安定性の薬物動態分析を示すグラフである。β−１，６−グルカンの５量体を負荷したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブは、最大２．４の負荷でのＰＫを基準として安定であった。
【図３７】腫瘍がないときのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ安定性の薬物動態分析を示すグラフである。
【図３８】腫瘍がないときのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ安定性の薬物動態分析を示すグラフである。
【図３９】腫瘍がないときのβ−１，６−グルカン検出の薬物動態分析を示すグラフである。
【図４０】腫瘍がないときのβ−１，６−グルカン検出の薬物動態分析を示すグラフである。
【図４１】腫瘍がないときのβ−１，６−グルカン検出の薬物動態分析を示すグラフである。
【図４２】腫瘍のある動物におけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの薬物動態を示す２枚１組のグラフである。左のグラフは、腫瘍のある動物におけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの抗体検出を示す。右のグラフは、腫瘍のある動物におけるβ−１，６−グルカンの検出を示す。
【図４３】腫瘍のある動物におけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの薬物動態を示す２枚１組のグラフである。左のグラフは、腫瘍のある動物におけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの抗体検出を示す。右のグラフは、腫瘍のある動物におけるβ−１，６−グルカンの検出を示す。
【図４４】腫瘍がないとき、または腫瘍のあるマウスでのβ−１，６−グルカン検出の薬物動態分析を示す２枚１組のグラフである。左のグラフは、腫瘍のあるマウスにおけるβ−１，６−グルカン検出の薬物動態分析を示す。左のグラフは、腫瘍がないときのβ−１，６−グルカン検出の薬物動態分析を示す。
【図４５】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの薬物動態分析を示す２枚１組のグラフである。左のグラフは、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの抗体検出を示す。右のグラフは、β−１，６−グルカンの検出を示す。
【図４６】週２回の処置によるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ蓄積の薬物動態分析を示す２枚１組のグラフである。左のグラフは、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの抗体検出を示す。右のグラフは、β−１，６−グルカンの検出を示す。週２回の処置で蓄積は観察されなかった。
【図４７】腫瘍のある動物におけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの薬物動態分析を示す２枚１組のグラフである。左のグラフは抗体の安定性を示す。右のグラフは、β−１，６−グルカンの検出を示す。
【図４８】腫瘍がないとき、または腫瘍のあるマウスでのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ安定性の薬物動態分析を示す２枚１組のグラフである。左のグラフは、腫瘍のあるマウスにおける抗体の安定性を示す。左のグラフは、腫瘍がないときの抗体の安定性を示す。
【図４９】腫瘍がないとき、または腫瘍のあるマウスでのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの薬物動態分析を示す２枚１組のグラフである。左のグラフは、腫瘍のあるマウスにおけるβ−１，６−グルカンの検出を示す。右のグラフは、腫瘍がないときのβ−１，６−グルカンの検出を示す。
【図５０】ＤＢＣＯまたは直接コンジュゲーション化学物質を有するｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを比較する薬物動態分析を示す２枚１組のグラフである。左のグラフは抗体の安定性を示す。右のグラフは、β−１，６−グルカンの検出を示す。
【図５１】ＢＲＡＦ変異型大腸腫瘍モデルにおけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの有効性を示すグラフである。
【図５２】ＢＲＡＦ変異型大腸腫瘍モデルにおけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの有効性を示すグラフである。
【図５３】ＢＲＡＦ変異型大腸腫瘍モデルにおけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの有効性を示すグラフである。
【図５４】ＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍モデルにおけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの有効性を示すグラフである。
【図５５】ＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍モデルにおけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの有効性を示すグラフである。
【図５６】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍の増殖を阻害することを示すグラフである。
【図５７】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍の増殖を阻害することを示すグラフである。
【図５８】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍の増殖を阻害することを示すグラフである。
【図５９】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍の増殖を阻害することを示すグラフである。
【図６０】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍の増殖を阻害することを示すグラフである。
【図６１】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍の増殖を阻害することを示すグラフである。
【図６２】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍の増殖を阻害することを示すグラフである（平均）。
【図６３】ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍の増殖を阻害することを示すグラフである（中央値）。
【図６４】ＫＲＡＳ変異型大腸癌異種移植モデルにおいてｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブが生存を延長させることを示すグラフである。
【図６５】腫瘍の退縮または停滞が直接コンジュゲートｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブで観察され、免疫記憶と相関することを示す６枚１組のグラフである。個々のグラフは個々のマウスを表す。
【図６６】４量体ＤＢＣＯのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブコンジュゲートでは、腫瘍の退縮または停滞が見られないことを示す５枚１組のグラフである。個々のグラフは個々のマウスを表す。
【図６７】停滞へのＴ細胞の関与に関する証拠を示すグラフである。
【図６８】ＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍の増殖を示すグラフである。
【図６９】ＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍の増殖を示すグラフである。
【図７０】ＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍の増殖を示すグラフである。
【図７１】ＫＲＡＳ変異型大腸腫瘍の増殖を示すグラフである。
【図７２】腫瘍増殖の平均を示すグラフである。
【図７３】腫瘍増殖の中央値を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
発明の詳細
本発明は、治療用抗体がβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされている実施形態を包含する。したがって、本発明には、特に、１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされた治療用抗体を含む組成物が含まれる。本発明は、特に、これらのβ−１，６−グルカンコンジュゲートを製造及び／または使用する方法をさらに含む。ある種の実施形態では、本発明のβ−１，６−グルカンコンジュゲートは、治療薬としてまたは治療方法において有用である。
【００５７】
治療用抗体
モノクローナル抗体は様々ながんの治療に有用である。抗体には、細胞表面部分を標的とするものがある。抗体には、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含むものがある。表Ｉに列挙される重鎖配列及び軽鎖配列は当技術分野で公知である。さらに、可変ドメイン、定常ドメイン、ＣＤＲ、及びＦＷなど、重鎖及び軽鎖ドメイン内の種々のドメインが当技術分野で公知である。表Ｉには、そこに列挙される配列の出典をいくつか記載している。出典の内容はすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【表１−１】
2020510622.tif 000011
【表１−２】
2020510622.tif 000012
【表１−３】
2020510622.tif 000013
【表１−４】
2020510622.tif 000014
【表１−５】
2020510622.tif 000015
【表１−６】
2020510622.tif 000016
【表１−７】
2020510622.tif 000017
【表１−８】
2020510622.tif 000018
【表１−９】
2020510622.tif 000019
【表１−１０】
2020510622.tif 000020
【表１−１１】
2020510622.tif 000021
【００５８】
本明細書で使用される場合、用語「治療用抗体」は、治療用抗体（例えば、表Ｉに記載されるもの）、及び治療用抗体と同じ標的を認識して、それに特異的に結合し、かつ、表Ｉに列挙する治療用抗体の対応する配列に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有する重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを有する、任意の抗体または抗体断片を包含する。場合によっては、治療用抗体は、２つのそのような可変ドメイン、３つのそのような可変ドメイン、４つのそのような可変ドメイン、２つのそのような重鎖可変ドメイン、２つのそのような軽鎖可変ドメイン、及び／または２つのそのような重鎖可変ドメインと２つのそのような軽鎖可変ドメインを含む。場合によっては、治療用抗体は、治療薬の対応する配列（例えば、表Ｉに列挙する配列の１つ以上、もしくは配列の一部）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有する重鎖または軽鎖を含む。場合によっては、治療用抗体は、２つのそのような鎖、３つのそのような鎖、４つのそのような鎖、２つのそのような重鎖、２つのそのような軽鎖、及び／または２つのそのような重鎖と２つのそのような軽鎖を含む。したがって、治療用抗体は、例えば、インタクト抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、またはＦｖなど）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、または二重特異性抗体などの多重特異性抗体であり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、治療用抗体は表Ｉに列挙される重鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、治療用抗体は表Ｉに列挙される重鎖配列の一部を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される重鎖配列は重鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される重鎖配列は重鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される重鎖配列は重鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される重鎖配列は重鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される重鎖配列は重鎖ＦＷ１を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される重鎖配列は重鎖ＦＷ２を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される重鎖配列は重鎖ＦＷ３を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される重鎖配列は重鎖ＦＷ４を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される重鎖配列は重鎖ＣＨ１定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される重鎖配列は重鎖ＣＨ２定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される重鎖配列は重鎖ＣＨ３定常ドメインを含む。
【００６０】
いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される軽鎖配列は軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、治療用抗体は表Ｉに列挙される軽鎖配列の一部を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される軽鎖配列は軽鎖ＣＤＲ１を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される軽鎖配列は軽鎖ＣＤＲ２を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される軽鎖配列は軽鎖ＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される軽鎖配列は軽鎖ＦＷ１を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される軽鎖配列は軽鎖ＦＷ２を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される軽鎖配列は軽鎖ＦＷ３を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される軽鎖配列は軽鎖ＦＷ４を含む。いくつかの実施形態では、表Ｉに列挙される軽鎖配列は軽鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、治療用抗体はカッパ軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、治療用抗体はラムダ軽鎖を含む。
【００６１】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される重鎖配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖を含む。
【００６２】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される軽鎖配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖を含む。
【００６３】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される重鎖配列に含まれる重鎖可変ドメインに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの重鎖可変ドメインを含んでいる重鎖を含む。
【００６４】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される軽鎖配列に含まれる軽鎖可変ドメインに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの軽鎖可変ドメインを含んでいる軽鎖を含む。
【００６５】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される重鎖配列に含まれるＣＤＲ配列の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、治療用抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる重鎖を含む。ある特定の例では、治療用抗体は２つのそのような重鎖を含む。
【００６６】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される同じ重鎖配列に含まれる２つのＣＤＲ配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、治療用抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる重鎖を含む。ある特定の例では、治療用抗体は２つのそのような重鎖を含む。
【００６７】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される同じ重鎖配列に含まれる３つのＣＤＲ配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、治療用抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる重鎖を含む。ある特定の例では、治療用抗体は２つのそのような重鎖を含む。
【００６８】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される軽鎖配列に含まれる配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、治療用抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、治療用抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【００６９】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される軽鎖配列に含まれるＣＤＲ配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、治療用抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、治療用抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【００７０】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される同じ軽鎖配列に含まれる２つのＣＤＲ配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、治療用抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、治療用抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【００７１】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される同じ軽鎖配列に含まれる３つのＣＤＲ配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性または同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、治療用抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、治療用抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【００７２】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される重鎖配列に含まれるＦＷドメインの配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つのＦＷドメインを含んでいる重鎖を含む。
【００７３】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される軽鎖配列に含まれるＦＷドメインの配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つのＦＷドメインを含んでいる軽鎖を含む。
【００７４】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される重鎖の１つ以上の定常ドメインまたはヒンジドメインの配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの定常ドメインまたはヒンジドメインを含んでいる重鎖を含む。
【００７５】
本発明の様々な例において、治療用抗体は、表Ｉに列挙される軽鎖配列に含まれる定常ドメインの配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの定常ドメインを含んでいる軽鎖を含む。
【００７６】
本明細書に記載の様々な抗体または抗体断片は、表Ｉに列挙されるいずれかの配列または配列の一部に対応する配列内に、１つ以上のアミノ酸変異、例えば１つ以上のアミノ酸置換が組み込まれている。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、当技術分野で公知であるような保存的置換であり得る。本明細書に記載の様々な重鎖及び軽鎖を利用して、抗体、例えば２つの重鎖及び軽鎖を含むモノクローナル抗体を作製することができる。
【００７７】
「治療用抗体」のこの定義は、本明細書に記載される特定の治療用抗体に等しく適用されるものと理解されるべきである。例えば、「セルグツズマブ抗体」は、セルグツズマブと、表Ｉに示されるセルグツズマブの配列に基づいて、「治療用抗体」の定義下で上記した種類の抗体及び抗体断片のいずれにも相当する。これは、「イブリツモマブチウキセタン抗体」；「リツキシマブ抗体」；「トシツモマブ抗体」；「ゲムツズマブ抗体」；「アレムツズマブ抗体」；「セツキシマブ抗体」；「パニツムマブ抗体」；「デパツキシズマブ抗体」；「シブロツズマブ抗体」；「コドリツズマブ抗体」；「トラスツズマブ抗体」；「パトリツマブ抗体」；「フィギツムマブ抗体」；「ガニツマブ抗体」；「カンツズマブ抗体」；「ＡＢＸ−ＭＡ１抗体」；「バビツキシマブ抗体」；「Ｊ５９１抗体」；「パリビズマブ抗体」；「ベバシズマブ抗体」の定義についても同様に適用される。以下に、「セツキシマブ抗体」及び「トラスツズマブ抗体」について、この定義をより詳細に説明する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、セツキシマブ抗体のコンジュゲートを含まない。いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、トラスツズマブ抗体のコンジュゲートを含まない。いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、セツキシマブ抗体のコンジュゲートまたはトラスツズマブ抗体のコンジュゲートを含まない。
【００７９】
セツキシマブ及びセツキシマブ抗体
セツキシマブは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするＩｇＧ１マウス−ヒトキメラモノクロナール抗体である。セツキシマブは、転移性大腸癌、転移性非小細胞肺癌、及び頭頸部癌の治療に使用される。
【００８０】
セツキシマブは、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む。セツキシマブの重鎖配列及び軽鎖配列は当技術分野で公知である。例えば、セツキシマブ重鎖または軽鎖は、（１）Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ７：３０１−１１，２００５；（２）Ｄｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．；８０：１７３７−４５，２００８；（３）当技術分野で認められたＩＭＧＴデータベース、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝７９０６からオンラインで入手可能な配列；及び／または（４）Ａｙｏｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ５（５）：６９９−７１０，２０１３（補足資料を含む）のいずれかに開示される、セツキシマブ重鎖配列またはセツキシマブ軽鎖配列を有し得る。上記文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。表ＩＩに、これらの出典から得た、ある特定のセツキシマブ配列を示す。なお、配列番号２は、ＩＭＧＴデータベース（上記）からのセツキシマブカッパ軽鎖配列であり、配列番号３は、Ａｙｏｕｂ  ｅｔ  ａｌ．（上記）からの別のセツキシマブカッパ軽鎖である。配列番号２４及び配列番号２５はそれぞれ、配列番号２及び配列番号３の定常ドメインである。
【表２−１】
2020510622.tif 000022
【表２−２】
2020510622.tif 000023
【表２−３】
2020510622.tif 000024
【表２−４】
2020510622.tif 000025
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「セツキシマブ抗体」は、セツキシマブ、及びＥＧＦＲを認識して、それに特異的に結合し、かつ、セツキシマブの対応する配列（すなわち、配列番号４または配列番号５）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有する重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを少なくとも有する任意の抗体または抗体断片を包含する。場合によっては、セツキシマブ抗体は、２つのそのような可変ドメイン、３つのそのような可変ドメイン、４つのそのような可変ドメイン、２つのそのような重鎖可変ドメイン、２つのそのような軽鎖可変ドメイン、及び／または２つのそのような重鎖可変ドメインと２つのそのような軽鎖可変ドメインを含む。場合によっては、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの対応する配列（すなわち、配列番号１〜３のうち１つ以上）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有する重鎖または軽鎖を含む。場合によっては、セツキシマブ抗体は、２つのそのような鎖、３つのそのような鎖、４つのそのような鎖、２つのそのような重鎖、２つのそのような軽鎖、及び／または２つのそのような重鎖と２つのそのような軽鎖を含む。したがって、セツキシマブ抗体は、例えば、インタクト抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、またはＦｖなど）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、または二重特異性抗体などの多重特異性抗体であり得る。
【００８２】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号１の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖を含む。
【００８３】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号２または配列番号３の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖を含む。
【００８４】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号４の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの重鎖可変ドメインを含んでいる重鎖を含む。
【００８５】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号５の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの軽鎖可変ドメインを含んでいる軽鎖を含む。
【００８６】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号６、配列番号７、または配列番号８の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる重鎖を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は２つのそのような重鎖を含む。
【００８７】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号６及び配列番号７のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる重鎖を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は２つのそのような重鎖を含む。
【００８８】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号６及び配列番号８のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる重鎖を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は２つのそのような重鎖を含む。
【００８９】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号７及び配列番号８のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる重鎖を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は２つのそのような重鎖を含む。
【００９０】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる重鎖を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は２つのそのような重鎖を含む。
【００９１】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号９、配列番号１０、または配列番号１１の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【００９２】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号９及び配列番号１０のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【００９３】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号９及び配列番号１１のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【００９４】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号１０及び配列番号１１のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【００９５】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性または同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、セツキシマブ抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【００９６】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、または配列番号１５の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つのＦＷドメインを含んでいる重鎖を含む。
【００９７】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つのＦＷドメインを含んでいる軽鎖を含む。
【００９８】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、または配列番号２３のうち１つ以上の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの定常ドメインまたはヒンジドメインを含んでいる重鎖を含む。
【００９９】
本発明の様々な例において、セツキシマブ抗体は、配列番号２４または配列番号２５の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの定常ドメインを含んでいる軽鎖を含む。
【０１００】
本明細書に記載の様々なセツキシマブ抗体または抗体断片は、配列番号１〜２５のいずれかに対応する配列内に、１つ以上のアミノ酸変異、例えば１つ以上のアミノ酸置換が組み込まれている。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、当技術分野で公知であるような保存的置換であり得る。本明細書に記載の様々な重鎖及び軽鎖を利用して、セツキシマブ抗体、例えば２つの重鎖及び軽鎖を含むモノクローナル抗体を作製することができる。
【０１０１】
トラスツズマブ及びトラスツズマブ抗体
トラスツズマブは、ＨＥＲ２を標的とするＩｇＧ１マウス−ヒトキメラモノクロナール抗体である。トラスツズマブは、乳癌及び胃癌の治療に適応する。トラスツズマブは、２本の重鎖及び２本の軽鎖を含む。トラスツズマブの重鎖配列及び軽鎖配列は当技術分野で公知である。例えば、トラスツズマブ重鎖または軽鎖は、（１）特許（例えば、米国特許第５，８２１，３３７号；同第７，８７９，３２５号；同第８，９３７，１５９号；米国特許公開第２００６／０２７５３０５号；ＥＰ特許公開第ＥＰ２５４０７４５Ａ９号）に記載される配列変異体；及び／または（２）当技術分野で認められたＩＭＧＴデータベースの配列（ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝７６３７＆Ｐａｒｔ＝Ｃｈａｉｎ＆Ｃｈａｉｎ＝７６３７Ｈからオンラインで入手可能）のいずれかに開示される、トラスツズマブ重鎖配列またはトラスツズマブ軽鎖配列を有し得る。これらすべての内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。表１に、これらの出典から得た、ある特定のトラスツズマブ配列を示す。
【表３−１】
2020510622.tif 000026
【表３−２】
2020510622.tif 000027
【表３−３】
2020510622.tif 000028
【０１０２】
本明細書で使用される場合、用語「トラスツズマブ抗体」は、トラスツズマブ、及びＨＥＲ２を認識して、それに特異的に結合し、かつ、トラスツズマブの対応する配列（例えば、配列番号２８または配列番号２９）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有する重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインを少なくとも有する任意の抗体または抗体断片を包含する。場合によっては、トラスツズマブ抗体は、２つのそのような可変ドメイン、３つのそのような可変ドメイン、４つのそのような可変ドメイン、２つのそのような重鎖可変ドメイン、２つのそのような軽鎖可変ドメイン、及び／または２つのそのような重鎖可変ドメインと２つのそのような軽鎖可変ドメインを含む。場合によっては、トラスツズマブ抗体は、トラスツズマブの対応する配列（例えば、配列番号２６または配列番号２７のうち１つ以上）に対して、少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有する重鎖または軽鎖を含む。場合によっては、トラスツズマブ抗体は、２つのそのような鎖、３つのそのような鎖、４つのそのような鎖、２つのそのような重鎖、２つのそのような軽鎖、及び／または２つのそのような重鎖と２つのそのような軽鎖を含む。したがって、トラスツズマブ抗体は、例えば、インタクト抗体、抗体断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、またはＦｖなど）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、または二重特異性抗体などの多重特異性抗体であり得る。
【０１０３】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号２６の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する重鎖を含む。
【０１０４】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号２７の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖を含む。
【０１０５】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号２８の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの重鎖可変ドメインを含んでいる重鎖を含む。
【０１０６】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号２９の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの軽鎖可変ドメインを含んでいる軽鎖を含む。
【０１０７】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号３０、配列番号３１、または配列番号３２の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる重鎖を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は２つのそのような重鎖を含む。
【０１０８】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号３０及び配列番号３１のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる重鎖を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は２つのそのような重鎖を含む。
【０１０９】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号３０及び配列番号３２のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる重鎖を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は２つのそのような重鎖を含む。
【０１１０】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号３１及び配列番号３２のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる重鎖を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は２つのそのような重鎖を含む。
【０１１１】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる重鎖を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は２つのそのような重鎖を含む。
【０１１２】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号３３、配列番号３４、または配列番号３５の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【０１１３】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号３３及び配列番号３４のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【０１１４】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号３３及び配列番号３５のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【０１１５】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号３４及び配列番号３５のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【０１１６】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号３３、配列番号３４、及び配列番号３５のそれぞれに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性または同一性を有するＣＤＲ配列を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は、そのようなＣＤＲ配列を含んでいる軽鎖を含む。ある特定の例では、トラスツズマブ抗体は２つのそのような軽鎖を含む。
【０１１７】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、または配列番号３９の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つのＦＷドメインを含んでいる重鎖を含む。
【０１１８】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、または配列番号４３の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つのＦＷドメインを含んでいる軽鎖を含む。
【０１１９】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、または配列番号４７のうち１つ以上の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの定常ドメインまたはヒンジドメインを含んでいる重鎖を含む。
【０１２０】
本発明の様々な例において、トラスツズマブ抗体は、配列番号４８の配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の同一性を有する少なくとも１つの定常ドメインを含んでいる軽鎖を含む。
【０１２１】
本明細書に記載の様々な抗体または抗体断片は、配列番号２５〜４８のいずれかに対応する配列内に、１つ以上のアミノ酸変異、例えば１つ以上のアミノ酸置換が組み込まれている。いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換は、当技術分野で公知であるような保存的置換であり得る。本明細書に記載の様々な重鎖及び軽鎖を利用して、抗体、例えば２つの重鎖及び軽鎖を含むモノクローナル抗体を作製することができる。
【０１２２】
β−１，６−グルカンオリゴマー
本発明のβ−１，６−グルカンオリゴマーは、任意の供給源及び／または任意の手順、例えば当技術分野で公知の任意の供給源及び／または任意の手順により誘導または合成することができる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、β−１，６−グルカンオリゴマーは、地衣類に由来し、一実施形態では、イワタケ属（例えば、Ｕ．ｐｕｓｔｕｌａｔａ、及びＵ．ｈｉｒｓｕｔｅ、Ｕ．ａｎｇｕｌａｔａ、Ｕ．ｃａｒｏｌｉｎｉａｎａ、またはＵ．ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）に由来する。いくつかの実施形態では、β−１，６−グルカンは、真菌に由来し、一実施形態では、カンジダ属に由来（例えば、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓに由来）する。グルカンの由来元となり得る他の生物として、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｍ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｄｉｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｂｏｔｒｙｏｓｐｈａｅｒｉａ  ｒｈｏｄｉｎａ、Ｌａｓｉｏｄｉｐｌｏｄｉａ  ｔｈｅｏｂｒｏｍａｅ、及びＰｙｔｈｉｕｍｎ  ｉｎｓｉｄｉｏｓｕｍが挙げられる。純粋なβ−グルカンは市販されており、例えば、プスツランは、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ及びＥｌｉｃｉｔｙｌから入手可能な、Ｕｍｂｉｌｉｃａｒｉａ  ｐａｐｕｌｌｏｓａから精製されたβ−１，６−グルカンである。β−グルカンはまた、例えば、Ｔｏｋｕｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３１６：１６１−１７２，１９９９に記載されるような様々な方法で真菌細胞壁から精製することができ、その生成物から、当技術分野で公知である方法によってβ−１，６−グルカン部分を濃縮することができる。いくつかの実施形態では、β−１，６−グルカンを生物から単離した後、化学修飾または酵素修飾して、例えば溶解度を増加させることができる。実際には、全長の天然グルカンは不溶性であり、メガダルトン範囲の分子量を有する。いくつかの実施形態では、本発明は、可溶性β−１，６−グルカンオリゴマーを使用する。いくつかの実施形態では、可溶化は、長い不溶性グルカンを断片化することによって達成することができる。これは、例えば、加水分解により、またはいくつかの実施形態では、グルカナーゼによる消化（例えば、β−１，３グルカナーゼによる消化、またはβ−１，６グルカナーゼによる制限消化）によってなし得る。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、β−１，６−グルカンオリゴマーは、当技術分野で公知であるように化学合成される。例示的な実施形態では、β−１，６−グルカンオリゴマーは、グリコシル化反応によって結合されたグルコースモノマー、ゲンチオビオースダイマー、またはアミグダリンから合成される。β−１，６−グルカンオリゴマーの長さは、使用する「構成単位」の数を選択することによって制御される。例示的な実施形態では、３つの異なる「構成単位」を以下から選択することができる。
【化１０】
2020510622.tif 000029
【０１２５】
例示的な実施形態では、グルコースモノマーまたは構成単位はシュミット反応条件を経て結合される。例示的なシュミット反応条件には、グルカンモノマーの遊離ヒドロキシル基をその対応するトリクロロアセトイミダートに変換させ、続いて、ＢＦ３・ＯＥｔ２またはＴＭＳＯＴｆの存在下で、別のグルコースモノマーの遊離ヒドロキシル基と反応させることが含まれるが、これに限定されない。
【０１２６】
別の例示的な実施形態では、グルコースモノマーの遊離ヒドロキシル基は選択的に保護される。別の例示的な実施形態では、遊離ヒドロキシル基は、塩化ベンゾイルまたはテキシルジメチルシリルクロリドとの反応によって保護される。
【０１２７】
別の態様では、本発明は、構造式Ｖ：
【化１１】
2020510622.tif 000030
（式中、
Ｒ１は、水素またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ２は、水素またはヒドロキシル保護基であり；
Ｒ３は、水素、ヒドロキシル保護基、
【化１２】
2020510622.tif 000031
であり；かつ
ａ２は０〜８である）
で表され、ある特定のβ−１，６−グルカンオリゴマーまたはオリゴマー前駆体の化学合成に使用できる、ある特定の中間体化合物を包含する。
【０１２８】
ヒドロキシル保護基は、当技術分野で周知されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９に詳細に記載されるものを含む。好適なヒドロキシル保護基の例として、エステル、カーボネート、スルホネートアリルエーテル、エーテル、シリルエーテル、アルキルエーテル、アリールアルキルエーテル、及びアルコキシアルキルエーテルがさらに挙げられるが、これらに限定されない。好適なエステルの例には、ギ酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、ペンタン酸エステル、クロトン酸エステル、及び安息香酸エステルが含まれる。好適なエステルの具体例として、ギ酸エステル、ギ酸ベンゾイル、クロロ酢酸エステル、トリフルオロ酢酸エステル、メトキシ酢酸エステル、トリフェニルメトキシ酢酸エステル、ｐ−クロロフェノキシ酢酸エステル、３−フェニルプロピオン酸エステル、４−オキソペンタン酸エステル、４，４−（エチレンジチオ）ペンタン酸エステル、（トリメチル酢酸）ピバル酸エステル、クロトン酸エステル、４−メトキシ−クロトン酸エステル、安息香酸エステル、ｐ−安息香酸ベンジル、２，４，６−トリメチル安息香酸エステルが挙げられる。好適な炭酸エステルの例としては、炭酸９−フルオレニルメチル、炭酸９−フルオレニルエチル、炭酸２，２，２−トリクロロエチル、炭酸２−（トリメチルシリル）エチル、炭酸２−（フェニルスルホニル）エチル、炭酸２−（フェニルスルホニル）ビニル、炭酸２−（フェニルスルホニル）アリル、及び炭酸ｐ−ニトロベンジルが挙げられる。好適なシリルエーテルの例としては、トリメチルシリルエーテル、トリエチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル、トリイソプロピルシリルエーテル、ジメチルヘキシルシリルエーテル、及び他のトリアルキルシリルエーテルが挙げられる。好適なアルキルエーテルの例として、メチルエーテル、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジルエーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、トリチルエーテル、ｔ−ブチルエーテル、及びアリルエーテル、またはそれらの誘導体が挙げられる。アルコキシアルキルエーテルとしては、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、（２−メトキシエトキシ）メチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、ベータ−（トリメチルシリル）エトキシメチルエーテル、及びテトラヒドロピラン−２−イルエーテルなどのアセタールが挙げられる。好適なアリールアルキルエーテルの例としては、ベンジルエーテル、ｐ−メトキシベンジル（ＭＰＭ）エーテル、３，４−ジメトキシベンジルエーテル、Ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ハロベンジルエーテル、２，６−ジクロロベンジルエーテル、ｐ−シアノベンジルエーテル、２−及び４−ピコリルエーテルが挙げられる。本明細書で使用されるいずれの化学用語も、化学分野で一般的に使用される通常の意味を有することを意図するものと理解されるべきである。
【０１２９】
したがって、例示的な実施形態では、Ｒ１は水素である。別の実施形態では、Ｒ１はヒドロキシル保護基である。別の実施形態では、Ｒ１はヒドロキシル保護基であり、そのヒドロキシル保護基はジメチルヘキシルシリル（「ＴｈｅｘＤＭＳ」）である。別の実施形態では、Ｒ１はヒドロキシル保護基であり、そのヒドロキシル保護基はギ酸ベンゾイル（「Ｂｚ」）である。別の実施形態では、Ｒ２は水素である。別の実施形態では、Ｒ２はヒドロキシル保護基である。別の実施形態では、Ｒ２はヒドロキシル保護基であり、そのヒドロキシル保護基はギ酸ベンゾイルである。
【０１３０】
別の実施形態では、Ｒ３は水素である。別の実施形態では、Ｒ３は
【化１３】
2020510622.tif 000032
である。別の実施形態では、Ｒ３は
【化１４】
2020510622.tif 000033
である。別の実施形態では、Ｒ２はヒドロキシル保護基である。別の実施形態では、Ｒ３はヒドロキシル保護基であり、そのヒドロキシル保護基はギ酸ベンゾイルである。別の実施形態では、Ｒ３はヒドロキシル保護基であり、そのヒドロキシル保護基はアリルエーテルである。
【０１３１】
別の実施形態では、ａ２は、０、１、２、３、４、５、６、７、または８である。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、構造に出現し、結合の位置で官能基を構造に結合する
【化１５】
2020510622.tif 000034
は、一般に、例えば（Ｒ）−及び（Ｓ）−立体化学を含む、可能な異性体の混合物またはそのいずれかを示す。例えば、
【化１６】
2020510622.tif 000035
は、以下のいずれかまたは両方を含むことを意味する。
【化１７】
2020510622.tif 000036
【０１３３】
本明細書で使用される場合、結合を横切って出現する
【化１８】
2020510622.tif 000037
は、２つの原子間の結合箇所を示す。例えば、
【化１９】
2020510622.tif 000038
は、上記のグルコース環が、それが置換基である、図示されていない構造に結合していることを意味する。
【０１３４】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のβ−１−６グルカンオリゴマーは、低分子量のβ−１−６グルカンオリゴマー、例えば１０個以下（例えば、９、８、７、６、５、４、３、または２個）のグルコースモノマー単位が含まれるβ−１−６グルカンオリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、低分子量のβ−１，６−グルカンオリゴマー、例えば１０個以下（例えば、９、８、７、６、５、４、３、または２個）のグルコースモノマー単位を含んでいるβ−１−６グルカンオリゴマーを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなるβ−１，６−グルカンオリゴマーを含む。ある種の実施形態では、本発明の組成物に含有される少なくとも８０重量％、９０重量％、９５重量％、９８重量％、９９重量％、または１００重量％のβ−１，６−グルカンオリゴマーは、低分子量のβ−１，６−グルカンオリゴマー、例えば１０個以下（例えば、９、８、７、６、５、４、３、または２個）のグルコースモノマー単位を含んでいるβ−１，６−グルカンオリゴマーである。ある種の実施形態では、「重量」は「乾燥重量」を指す。
【０１３５】
ある種の実施形態では、本発明の組成物に含有される少なくとも８０重量％、９０重量％、９５重量％、９８重量％、９９重量％、または１００重量％のグルカンが、β−１，６グルカンである。ある種の実施形態では、「重量」は「乾燥重量」を指す。ある種の実施形態では、本発明の組成物に含有される２０重量％、１０重量％、５重量％、２重量％、または１重量％未満のグルカンが、β−１，３グルカンである。ある種の実施形態では、「重量」は「乾燥重量」を指す。
【０１３６】
コンジュゲート
本明細書に開示される治療用抗体を、１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートすることができる。本出願は、特に、治療用抗体にコンジュゲートされるβ−１，６−グルカンオリゴマーの長さ、治療用抗体にコンジュゲートされるβ−１，６−グルカンオリゴマーの負荷量（例えば、各抗体にコンジュゲートされるβ−１，６−グルカンオリゴマーの数）、及びβ−１，６−グルカンオリゴマーを治療用抗体と結合するコンジュゲーションの種類に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療用抗体を、リンカーを介して１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートすることができる。
【０１３７】
グルカンの長さ
いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、２〜１０個のグルコースモノマー単位（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のグルコースモノマー単位）で構成されるβ−１，６−グルカンオリゴマーを含む。特定の実施形態では、本発明のコンジュゲートは、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、４〜８、５〜８、５〜７、５〜６、６〜７、または７〜８個のグルコースモノマー単位からなるβ−１，６−グルカンオリゴマーを含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、式Ｉ：
【化２０】
2020510622.tif 000039
に示されるように、リンカーＬを介して治療用抗体に共有結合したβ−１，６−グルカンオリゴマーを含み、
式中、ａは、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、または１〜３であり、Ｌはリンカーであり、及び「
【化２１】
2020510622.tif 000040
」は２つの原子（例えば、リンカーの原子及び治療用抗体の原子）の結合箇所を表す。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、リンカーＬは、式Ｉａ：
【化２２】
2020510622.tif 000041
に示されるような開環グルコースモノマーであり得、
式中、ａ１は１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、または１〜３であり、及び「
【化２３】
2020510622.tif 000042
」は２つの原子間の結合箇所を表す。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、用語「コンジュゲート」及びその文法上の形態は、示された分子間の何らかの会合を指す。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションは共有結合性である。他の実施形態では、コンジュゲーションは非共有結合性である。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションは直接的である。他の実施形態では、コンジュゲーションはリンカー分子を介する。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションは、当技術分野において公知であり、本明細書に記載されているような任意の手段によるものである。例えば、コンジュゲーションは、それぞれの分子間、またはリンカー部分とそれぞれの分子との間のアミド形成、ウレタン結合、イミン結合、またはジスルフィド結合によるものであり得る。リンカー分子の化学骨格に関しては、制限がないものと理解されるべきである。いくつかの実施形態では、化学骨格は、生体適合性、非免疫原性、及び／または水溶性であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、本明細書に記載されるような結合を促進する活性化学基をさらに含む、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含んでもよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、リンカーＬは、アルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、−Ｎ３（アジジル）、−Ｃ（Ｏ）Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリールで場合により置換されるアルキル、アルキレニル、アルキニル、アリール、ヘテロアルキル、ヘテロシクリル、またはヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、リンカーＬは、ポリエステル、ポリイミン、ポリ酸、タンパク質、またはペプチドである。他の実施形態では、リンカー分子は、アルキレン、アルケニレン、アルキニレン、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニレン、またはヘテロアルキニレン部分を含む。
【０１４２】
したがって、いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造式：
【化２４】
2020510622.tif 000043
から形成されるか、またはそれから誘導され、
式中、ａは上に定義されており、Ｒ１はＨ、アルキル、アリール、またはヘテロアリールであり；Ｒ２は、アジジルで場合により置換されるアルキル、Ｒ３で場合により置換されるアルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、またはヘテロアリールであり；Ｒ３は、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｈ、アリール−Ｃ（Ｏ）Ｈ、アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、またはアリール−Ｃ（Ｏ）ＯＨで場合により置換されるヘテロアリールである。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造式：
【化２５】
2020510622.tif 000044
を含むことができ、
式中、ａ及びＲ１は上で定義されている。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造式：
【化２６】
2020510622.tif 000045
を含むことができ、
式中、ａは上で定義されており、Ｒ４は、Ｒ５で場合により置換されるアルキル、−Ｃ（Ｏ）−アルキル、−Ｃ（Ｏ）−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリールであり；Ｒ５は、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｈ、アリール−Ｃ（Ｏ）Ｈ、アルキル−Ｃ（Ｏ）ＯＨ、またはアリール−Ｃ（Ｏ）ＯＨで場合により置換されるヘテロアリールである。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造式：
【化２７】
2020510622.tif 000046
を含むことができ、
式中、ａは上で定義されている。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造式：
【化２８】
2020510622.tif 000047
から形成されるか、またはそれから誘導され、
式中、ａ及びＲ１は上で定義されている。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造式：
【化２９】
2020510622.tif 000048
から形成されるか、またはそれから誘導され、
式中、ａ及びＲ１は上で定義されている。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造式：
【化３０】
2020510622.tif 000049
から形成されるか、またはそれから誘導され、
式中、ａ及びＲ１は上で定義されている。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造式：
【化３１】
2020510622.tif 000050
から形成されるか、またはそれから誘導され、
式中、ａは上で定義されている。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造式：
【化３２】
2020510622.tif 000051
から形成されるか、またはそれから誘導され、
式中、ａは上で定義されている。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造式：
【化３３】
2020510622.tif 000052
から形成されるか、またはそれから誘導され、
式中、ａは上で定義されている。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造式：
【化３４】
2020510622.tif 000053
から形成されるか、またはそれから誘導され、
式中、ａは上で定義されている。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、コンジュゲートは、以下の構造式：
【化３５】
2020510622.tif 000054
から形成されるか、またはそれから誘導され、
式中、ａは上で定義されている。
【０１５４】
コンジュゲートにいくつかのβ−１，６−グルカンオリゴマーが含まれる場合、またはコンジュゲートの集団を含む組成物について考察する場合、上述の値及び範囲は、コンジュゲートされたβ−１，６−グルカンオリゴマーに存在するグルコースモノマー単位の実際の数を指す場合もあれば、平均数を指す場合もあるものと理解されるべきである。β−１，６−グルカンオリゴマーの長さ（グルコースモノマー単位の数に基づいて定義）は、例えば、単一のβ−１，６−グルカンオリゴマー、またはそれぞれ同じ長さを有するβ−１，６−グルカンオリゴマーの集団を指す場合、整数であり得る。β−１，６−グルカンオリゴマーの集団の長さを指す場合にも、β−１，６−グルカンオリゴマーの長さは整数であり得るが、その場合、整数の長さは、集団中の少なくとも９０％のβ−１，６−グルカンオリゴマー（例えば、集団中の少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のβ−１，６−グルカンオリゴマー）の実際の長さを表す。β−１，６−グルカンオリゴマーの長さは、集団が２つ以上の異なる長さを有するβ−１，６−グルカンオリゴマーの混合物を含む場合、端数で表される場合がある。端数は、集団中のβ−１，６−グルカンオリゴマーの平均長さの仮定値、予想値、概算値、または測定値を示す場合がある。したがって、２つの整数間の値として表される長さは、その間にある任意の整数の端数を包含する。
【０１５５】
β−１，６−グルカンオリゴマー中のモノマーグルコース単位の数を決定する様々な方法が、当技術分野で公知である。様々な例において、β−１，６−グルカンオリゴマー中のモノマーグルコース単位の数は、治療用抗体とのコンジュゲーション前に得るかまたは決定する。例えば、場合によっては、β−１，６−グルカンオリゴマーまたはβ−１，６−グルカンオリゴマー前駆体は、特定の既知の長さを有するように合成される。実施例２８にゲンチオペントースの合成を記載している。実施例２９に２−アジドエチルゲンチオテトロースの合成を記載している。実施例３０に２−アジドエチルゲンチオヘキソースの合成を記載している。本明細書に記載の上記及び他の構成単位を使用して、公知の合成方法（例えば本明細書に記載のもの）に従って、長さが異なるβ−１，６−グルカンオリゴマー及び他のβ−１，６−グルカンオリゴマー前駆体を作製できることが理解されよう。ある特定の例では、特定の数（または範囲）のモノマーグルコース単位を有するβ−１，６−グルカンオリゴマーが、オリゴマーの集団、例えばプスツラン由来のオリゴマーの集団から、例えばプスツランの分解または修飾などにより単離される。様々な例において、それぞれ特定の数のモノマーグルコース単位を有するβ−１，６−グルカンオリゴマーの集団を提供し、オリゴマーあたりのモノマーグルコース単位の数をクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフ）及び／または質量分析法（例えばＭＡＬＤＩ）によって決定する。様々な例において、様々な数のモノマーグルコース単位を有するオリゴマーを含むβ−１，６−グルカンオリゴマーの集団を提供し、オリゴマーあたりのモノマーグルコース単位の数をクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフ）及び／または質量分析法（例えばＭＡＬＤＩ）によって決定する。様々な例において、特定の数のモノマーグルコース単位を有する１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーを選択または単離する。様々な例において、β−１，６−グルカンオリゴマー中のモノマーグルコース単位の数は、例えば質量分析法（例えばＭＡＬＤＩ）によって、治療用抗体とのコンジュゲーション後に得るかまたは決定する。
【０１５６】
グルカン負荷量
いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートに存在する治療用抗体分子を、１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートすることができる。ある種の実施形態では、１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマー（例えば、１〜５個、１〜４個、または１〜３個のβ−１，６−グルカンオリゴマー、例えば、１、２、３、４、５、または６個のβ−１，６−グルカンオリゴマー）にコンジュゲートされている。ある種の実施形態では、２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされている。ある種の実施形態では、２または３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされている。ある種の実施形態では、３または４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされている。ある種の実施形態では、３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートされている。２つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーが同じ治療用抗体分子にコンジュゲートされている場合、その２つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーの長さは、同じであっても異なっていてもよいものと理解されるべきである。いくつかの実施形態では、２つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーは同じ長さを有する。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、式ＩＩまたは式ＩＩａの「グルカン負荷量」または変数「ｂ」という用語は、各治療用抗体分子にコンジュゲートされている個々のβ−１，６−グルカンオリゴマーの実際の数または平均数を指す。グルカン負荷量は、例えば、単一のコンジュゲートまたはそれぞれが同じ負荷量を有するコンジュゲートの集団の負荷量を指す場合、整数であり得る。コンジュゲートの集団の負荷量を指す場合にも、グルカン負荷量は整数であり得るが、その場合、整数の負荷量は、集団中の少なくとも９０％のコンジュゲート（例えば、集団中の少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の分子）に見出される実際の負荷量を表す。集団が負荷量の異なる２つ以上のコンジュゲートの混合物を含む場合、グルカン負荷量は端数で表される場合がある。端数は、集団中のコンジュゲートの平均負荷量の仮定値、予想値、概算値、または測定値を示す場合がある。したがって、２つの整数間の値として表されるグルカン負荷量は、その間にある任意の整数の端数を包含する。
【０１５８】
β−１，６−グルカンオリゴマーの負荷量を決定する様々な方法が、当技術分野で公知である。様々な例において、コンジュゲートは特定の負荷量を有するように合成される。様々な例において、コンジュゲート、またはそれぞれ特定の負荷量を有するコンジュゲートの集団を提供し、負荷量をクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフ）及び／または質量分析法（例えばＭＡＬＤＩ）及び／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定する。様々な例において、様々な負荷量を有するコンジュゲートの集団を提供し、負荷量をクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフ）及び／または質量分析法（例えばＭＡＬＤＩ）及び／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定する。様々な例において、特定の負荷量を有するコンジュゲートを選択または単離する。
【０１５９】
コンジュゲーション
本発明の様々な実施形態において、１つ以上の上述のβ−１，６−グルカンオリゴマーが治療用抗体に、本明細書に記載されるようにコンジュゲートされている。特定の実施形態では、１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーがリンカーを介してコンジュゲートされている。いくつかの実施形態では、１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーは、それぞれ独立して、例えばリジン残基を介して治療用抗体にコンジュゲートされている。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、式ＩＩ：
【化３６】
2020510622.tif 000055
のものであり
式中：
Ｌｙｓはリジン残基であり；
ｂは１〜６、１〜５、１〜４、または１〜３であり；かつ
【化３７】
2020510622.tif 000056
は式Ｉまたは式Ｉａの化合物である。
【０１６１】
式ＩＩは、式Ｉまたは式Ｉａの化合物と治療用抗体とのコンジュゲートの模式図を表している。それによれば、ｂが１であり、
【化３８】
2020510622.tif 000057
が式Ｉａの化合物であるとき、式ＩＩのコンジュゲートは、以下：
【化３９】
2020510622.tif 000058
（式中、「Ｌｙｓ」はリジン残基の脂肪族鎖及び末端アミン部分を示す）のように図示することができる。
【０１６２】
加えて、上記構造は、複数例の式Ｉまたは式Ｉａの化合物がコンジュゲートの一部であり得ることを表すことを意図する。例えば、上記式ＩＩにおいてｂが２であるとき、コンジュゲートは以下の模式図：
【化４０】
2020510622.tif 000059
によって表され、式ＩＩにおいてｂが３であるとき、コンジュゲートは以下の模式図：
【化４１】
2020510622.tif 000060
によって表される。
【０１６３】
例示的なコンジュゲート
治療用抗体を、１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートすることができる。本出願は、特に、治療用抗体にコンジュゲートされるβ−１，６−グルカンオリゴマーの長さ、治療用抗体にコンジュゲートされるβ−１，６−グルカンオリゴマーの負荷量（例えば、各抗体にコンジュゲートされるβ−１，６−グルカンオリゴマーの数）、及びβ−１，６−グルカンオリゴマーを治療用抗体と結合するコンジュゲーションの種類に関する。いくつかの実施形態では、治療用抗体を、リンカーを介して１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートすることができる。
【０１６４】
本発明のいくつかの例示的な実施形態では、コンジュゲートが以下の特徴を有し得る（または組成物が、以下の特徴を有するコンジュゲートを含み得る）：
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜１０個のグルコースモノマー単位からなる１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜１０個のグルコースモノマー単位からなる１〜５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜１０個のグルコースモノマー単位からなる１〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜１０個のグルコースモノマー単位からなる１〜３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜１０個のグルコースモノマー単位からなる２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜１０個のグルコースモノマー単位からなる２．５〜３．５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；または
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜１０個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜８個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して３〜７個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜６個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して５個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して６個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して７個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して８個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている。
【０１６５】
本発明のいくつかの例示的な実施形態では、コンジュゲートが以下の特徴を有し得る（または組成物が、以下の特徴を有するコンジュゲートを含み得る）：
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜６個のグルコースモノマー単位からなる１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜６個のグルコースモノマー単位からなる１〜５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜６個のグルコースモノマー単位からなる２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜６個のグルコースモノマー単位からなる２．５〜３．５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；または
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２〜６個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている。
【０１６６】
本発明のいくつかの例示的な実施形態では、コンジュゲートが以下の特徴を有し得る（または組成物が、以下の特徴を有するコンジュゲートを含み得る）：
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜８個のグルコースモノマー単位からなる１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜８個のグルコースモノマー単位からなる１〜５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜８個のグルコースモノマー単位からなる２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜８個のグルコースモノマー単位からなる２．５〜３．５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；または
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜８個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている。
【０１６７】
本発明のいくつかの例示的な実施形態では、コンジュゲートが以下の特徴を有し得る（または組成物が、以下の特徴を有するコンジュゲートを含み得る）：
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜６個のグルコースモノマー単位からなる１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜６個のグルコースモノマー単位からなる１〜５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜６個のグルコースモノマー単位からなる２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜６個のグルコースモノマー単位からなる２．５〜３．５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；または
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４〜６個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている。
【０１６８】
本発明のいくつかの例示的な実施形態では、コンジュゲートが以下の特徴を有し得る（または組成物が、以下の特徴を有するコンジュゲートを含み得る）：
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４．５〜５．５個のグルコースモノマー単位からなる１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４．５〜６．５個のグルコースモノマー単位からなる１〜５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４．５〜５．５個のグルコースモノマー単位からなる２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４．５〜５．５個のグルコースモノマー単位からなる２．５〜３．５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；または
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４．５〜５．５個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている。
【０１６９】
本発明のいくつかの例示的な実施形態では、コンジュゲートが以下の特徴を有し得る（または組成物が、以下の特徴を有するコンジュゲートを含み得る）：
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して８個のグルコースモノマー単位からなる１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して８個のグルコースモノマー単位からなる１〜５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して８個のグルコースモノマー単位からなる２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して８個のグルコースモノマー単位からなる２．５〜３．５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；または
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して８個のグルコースモノマー単位からなる、３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている。
【０１７０】
本発明のいくつかの例示的な実施形態では、コンジュゲートが以下の特徴を有し得る（または組成物が、以下の特徴を有するコンジュゲートを含み得る）：
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して７個のグルコースモノマー単位からなる１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して７個のグルコースモノマー単位からなる１〜５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して７個のグルコースモノマー単位からなる２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して７個のグルコースモノマー単位からなる２．５〜３．５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；または
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して７個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている。
【０１７１】
本発明のいくつかの例示的な実施形態では、コンジュゲートが以下の特徴を有し得る（または組成物が、以下の特徴を有するコンジュゲートを含み得る）：
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して６個のグルコースモノマー単位からなる１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して６個のグルコースモノマー単位からなる１〜５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して６個のグルコースモノマー単位からなる２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して６個のグルコースモノマー単位からなる２．５〜３．５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；または
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して６個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている。
【０１７２】
本発明のいくつかの例示的な実施形態では、コンジュゲートが以下の特徴を有し得る（または組成物が、以下の特徴を有するコンジュゲートを含み得る）：
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して５個のグルコースモノマー単位からなる１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して５個のグルコースモノマー単位からなる１〜５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して５個のグルコースモノマー単位からなる２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して５個のグルコースモノマー単位からなる２．５〜３．５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；または
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して５個のグルコースモノマー単位からなる３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている。
【０１７３】
本発明のいくつかの例示的な実施形態では、コンジュゲートが以下の特徴を有し得る（または組成物が、以下の特徴を有するコンジュゲートを含み得る）：
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４個のグルコースモノマー単位からなる１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４個のグルコースモノマー単位からなる１〜５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４個のグルコースモノマー単位からなる４〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４個のグルコースモノマー単位からなる５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４個のグルコースモノマー単位からなる２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；または
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して４個のグルコースモノマー単位からなる２〜３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている。
【０１７４】
本発明のいくつかの例示的な実施形態では、コンジュゲートが以下の特徴を有し得る（または組成物が、以下の特徴を有するコンジュゲートを含み得る）：
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して３個のグルコースモノマー単位からなる１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して３個のグルコースモノマー単位からなる１〜５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して３個のグルコースモノマー単位からなる４〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して３個のグルコースモノマー単位からなる５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して３個のグルコースモノマー単位からなる２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；または
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して３個のグルコースモノマー単位からなる２〜３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている。
【０１７５】
本発明のいくつかの例示的な実施形態では、コンジュゲートが以下の特徴を有し得る（または組成物が、以下の特徴を有するコンジュゲートを含み得る）：
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２個のグルコースモノマー単位からなる１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２個のグルコースモノマー単位からなる１〜５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２個のグルコースモノマー単位からなる４〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２個のグルコースモノマー単位からなる５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２個のグルコースモノマー単位からなる２〜４個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている；または
各β−１，６−グルカンオリゴマーが独立して２個のグルコースモノマー単位からなる２〜３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに治療用抗体がコンジュゲートされている。
【０１７６】
本発明のいくつかの例示的な実施形態では、コンジュゲートは、式ＩＩａ：
【化４２】
2020510622.tif 000061
によって表すことができ、式中、ａ１は１〜９であり；ｂは１〜６である。他の実施形態では、ａ１は、１、２、３、４、５、６、７、８、または９である。他の実施形態では、ｂは、１、２、３、４、５、または６である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は１〜９であり；ｂは２〜４である。
【０１７７】
別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は１〜９であり；ｂは３である。
【０１７８】
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は１〜３であり；ｂは１〜６である。他の実施形態では、ａは、１、２、または３である。他の実施形態では、ｂは、１、２、３、４、５、または６である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は１〜３であり；ｂは２〜４である。
【０１７９】
別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は１〜３であり；ｂは３である。
【０１８０】
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は２〜４であり；ｂは１〜６である。他の実施形態では、ａ１は、２、３、または４である。他の実施形態では、ｂは、１、２、３、４、５、または６である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は２〜４であり；ｂは２〜４である。
【０１８１】
別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は２〜４であり；ｂは３である。
【０１８２】
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は３であり；ｂは１〜６である。他の実施形態では、ｂは、１、２、３、４、５、６である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は３であり；ｂは２〜４である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は３であり；ｂは３である。
【０１８３】
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は４であり；ｂは１〜６である。他の実施形態では、ｂは、１、２、３、４、５、６である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は４であり；ｂは２〜４または４〜６である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は４であり；ｂは３である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は４であり；ｂは５である。
【０１８４】
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は５であり；ｂは１〜６である。他の実施形態では、ｂは、１、２、３、４、５、６である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は５であり；ｂは２〜４または４〜６である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は５であり；ｂは３である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は５であり；ｂは５である。
【０１８５】
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は６であり；ｂは１〜６である。他の実施形態では、ｂは、１、２、３、４、５、６である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は６であり；ｂは２〜４または４〜６である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は６であり；ｂは３である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は６であり；ｂは５である。
【０１８６】
別の実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は７であり；ｂは１〜６である。他の実施形態では、ｂは、１、２、３、４、５、６である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は７であり；ｂは２〜４または４〜６である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は７であり；ｂは３である。別の例示的な実施形態では、コンジュゲートは式ＩＩａによって表すことができ、式中、ａ１は７であり；ｂは５である。
【０１８７】
コンジュゲートの特性
本明細書に記載の様々な実施形態のいずれにおいても、本発明の治療用抗体コンジュゲートはその標的への結合が可能であり得る。いくつかの実施形態では、標的は、がんまたは腫瘍細胞によって増幅及び／または過剰発現する。いくつかの実施形態では、本発明の治療用抗体コンジュゲートは、その標的への結合を親抗体と競合する。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションにより、補体（Ｃ３）沈着が増強される。Ｃ３沈着は、Ｃ３のアルファ鎖またはベータ鎖に対するモノクローナル抗体を用いたウエスタン分析またはＦＡＣＳ分析を含む任意の公知の方法によってアッセイすることができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションにより、抗β−１，６−グルカン抗体による結合が増強される。抗β−１，６−グルカン抗体による結合は、抗ヒトＩｇＧ２抗体を用いたＥＬＩＳＡ分析を含む任意の公知の方法によってアッセイすることができる。これら様々な実施形態における増強は、非コンジュゲート等価物と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、またはそれ以上であり得る。
【０１８８】
使用及び投与
以下の使用及び方法は、本明細書に記載のいずれのコンジュゲートにも適用される。本発明の治療用抗体コンジュゲートは、例えばがんの治療、例えば標的抗原（例えばタンパク質または他の部分）の増幅及び／または過剰発現を伴うがんの治療に使用することができる。本発明のコンジュゲートは、例えばがんの治療に使用することができる。いくつかの実施形態では、がんは乳癌である。いくつかの実施形態では、がんは卵巣癌である。いくつかの実施形態では、がんは膀胱癌である。いくつかの実施形態では、がんは唾液腺癌である。いくつかの実施形態では、がんは子宮内膜癌である。いくつかの実施形態では、がんは膵臓癌である。いくつかの実施形態では、がんは前立腺癌である。いくつかの実施形態では、がんは非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）である。いくつかの実施形態では、がんは血液癌である。いくつかの実施形態では、がんは皮膚癌である。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、がんは転移性である。様々な実施形態において、本明細書に記載の治療用抗体コンジュゲートの投与によって治療されるがんまたは腫瘍は、再発性または治療抵抗性のがんまたは腫瘍（例えば、非コンジュゲート治療用抗体による治療に抵抗性であるがんまたは腫瘍）である。そのような治療は、例えば、そのようながんに罹患しているか、罹患が疑われるか、または罹患していると診断された対象におけるものであり得る。様々な実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートは、がんまたは腫瘍に罹患しているか、罹患が疑われるか、または罹患していると診断された対象に投与すると、細胞増殖抑制性、細胞傷害性となるか、またはがんもしくは腫瘍の増殖を緩徐化、遅延化、または阻害する。様々な実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートは、がんまたは腫瘍に罹患しているか、罹患が疑われるか、または罹患していると診断された対象に投与すると、対象の生存期間を延長するか、または生存の可能性を高める。様々な実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートは、がんまたは腫瘍に罹患しているか、罹患が疑われるか、または罹患していると診断された対象に投与すると、がんまたは腫瘍の退縮または停滞を誘発させる。様々な実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートは、がんまたは腫瘍に罹患しているか、罹患が疑われるか、または罹患していると診断された対象に投与すると、がんまたは腫瘍の再発を阻害するのに有効な免疫反応を誘発させる。様々な実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートは、例えば標的とするがんまたは腫瘍に好中球を動員する。様々な実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートは、例えば標的とするがんまたは腫瘍の好中球浸潤を引き起こすかまたは促進する。様々な実施形態において、がんまたは腫瘍に罹患しているか、罹患が疑われるか、または罹患していると診断された対象に、本明細書に記載のコンジュゲートを投与しても、有害作用、例えばサイトカインストームまたは敗血症を誘発しない。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートは、その非コンジュゲート等価物（例えば、治療用抗体）と比較して、腫瘍をもつ対象において増強された治療反応を生じさせる。例えば、いくつかの実施形態では、コンジュゲーションは、腫瘍細胞に対する食作用及び／または細胞傷害性応答を増強するか、またはいくつかの実施形態では、腫瘍細胞の補体介在性の溶解を増強する。いくつかの実施形態では、これらの応答に好中球及び／またはマクロファージが介在する。食作用及び／または溶解は、タイムラプス顕微鏡または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を含む任意の公知の方法によって評価することができる。これら様々な実施形態における増強は、非コンジュゲート等価物と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、またはそれ以上であり得る。
【０１９１】
様々な実施形態において、本明細書に記載のコンジュゲートを医薬組成物に組み込むことができる。そのような医薬組成物は、例えばがんまたは腫瘍の治療、例えば本明細書に記載のがんまたは腫瘍の治療に有用であり得る。本発明の医薬組成物は、当業者に公知の方法（例えば、その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｌｌｏｙｄ  Ａｌｌｅｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ａｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０１２に記載される方法）によって製剤化することができる。
【０１９２】
医薬組成物は、治療有効量の本明細書に記載のコンジュゲートを含むことができる。そのような有効量は、部分的には、投与される組成物の効果、または複数の薬剤が使用される場合には、コンジュゲートと１つ以上の追加の活性薬との組み合わせ効果に基づいて当業者が容易に決定することができる。本明細書に記載のコンジュゲートの治療有効量はまた、個体の病状、年齢、性別、及び体重、ならびに組成物（及び１つ以上の追加の活性薬）が所望する反応、例えば、少なくとも１つの病態パラメーターの改善、例えば、疾患または障害の少なくとも１つの症状の改善を個体に誘発する能力などの要因に応じて異なる可能性がある。対象に投与される用量に影響を与える他の要因には、例えば、疾患または障害の種類または重症度が含まれる。他の要因には、例えば、対象が同時期にまたは以前に罹患している他の医学的障害、対象の健康状態全般、対象の遺伝的素因、食事、投与時間、排泄頻度などが含まれ得る。本明細書に記載の組成物のいずれかに適したヒト用量を、例えば、第Ｉ相用量漸増試験でさらに評価することができる。
【０１９３】
投与経路は、非経口投与、例えば注射による投与であり得る。医薬組成物は、水または別の薬学的に許容される液体の滅菌溶液または滅菌懸濁液を含む注射用製剤の形態で非経口投与することができる。例えば、医薬組成物は、治療用分子を滅菌水及び生理食塩水などの薬学的に許容されるビヒクルまたは媒体、及び他の好適な賦形剤と適切に組み合わせた後、一般に認められた薬務に必要な単位剤形で混合することによって製剤化することができる。医薬組成物に含まれるコンジュゲートの量は、指定された範囲内の適切な用量が供給されるような量である。製剤化した注射剤を好適なアンプルに封入することができる。
【実施例】
【０１９４】
本明細書に記載の実施例は、特に、種々のｍＡｂＸｃｉｔｅコンジュゲート（１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーに結合された治療用抗体）の作製に使用するための、プスツランからのグルカンの精製、種々のｍＡｂＸｃｉｔｅ−コンジュゲートの生成及び特性決定、合成β−１，６−グルカンの製造方法、及び治療用抗体を１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーにコンジュゲートするための好適な結合化学を実証する。
【０１９５】
ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅコンジュゲートまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−トラスツズマブコンジュゲート（１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーにトラスツズマブを結合）の、異なる長さ（例えば、トラスツズマブ分子あたり約３個のβ−１，６−グルカンオリゴマーに４〜６個のグルコースモノマー単位）のβ−１，６−グルカンオリゴマーとのコンジュゲーションの効果に関する試験もまた本明細書に記載する。β−１，６−グルカンオリゴマーとコンジュゲートされたときのＨＥＲ２へのトラスツズマブの結合を試験したところ、コンジュゲートされていないトラスツズマブと同様であることが見出された。本発明の実施例に記載される結果のなかには、ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅコンジュゲートで処置されたトラスツズマブ抵抗性腫瘍異種移植マウスモデルにおける前臨床での成功結果が含まれている。
【０１９６】
ＥＧＦＲ−ｍＡｂＸｃｉｔｅコンジュゲートまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブコンジュゲート（１つ以上のβ−１，６−グルカンオリゴマーにセツキシマブを結合）の、異なる長さ（例えば４〜９個のグルコースモノマー単位）、及び異なる負荷量（例えばセツキシマブ分子あたり平均１〜６個のβ−１，６−グルカンオリゴマー）のβ−１，６−グルカンオリゴマーとのコンジュゲーションの効果に関する試験もまた本明細書に記載する。β−１，６−グルカンオリゴマーとコンジュゲートされたときのＥＧＦＲへのセツキシマブの結合に加え、その抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を試験したところ、コンジュゲートされていないセツキシマブと同様であることが見出された。本発明の実施例に記載の結果のうち、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブコンジュゲートは好中球を動員することがライブイメージング技術及び組織学によって確認された。本明細書に記載の結果にはまた、ＢＲＡＦ及びＫＲＡＳ変異を有する腫瘍異種移植マウスモデルにおける前臨床での成功結果が含まれている。
【０１９７】
本発明は、２つの異なる治療用抗体（トラスツズマブ及びセツキシマブ）を使用して得られたこれらの結果、例えば特定の長さのβ−１，６−グルカンオリゴマー及び特定の負荷量のβ−１，６−グルカンオリゴマーを使用した場合に観察される改善が、本明細書に記載のものを含む他の治療用抗体に一般化できるという認識を包含する。
【０１９８】
ある種の本発明の実施例において、β−１，６−グルカンコンジュゲートの試験に有用なモデルとしてマウスを選択した。その理由は、この哺乳動物が低力価の内因性抗β−１，６−グルカンしか有さないためである。その結果、抗β−１，６−グルカン抗体のレベルを、ＩＶＩＧの投与によって制御することができた。
【０１９９】
以下の実施例で使用されるように、グルカンは「＃量体」と呼ばれる場合があり、ここでの「＃」はトラスツズマブまたはセツキシマブとのコンジュゲーション前に存在していたグルコースモノマー単位の数である。例えば、限定するものではないが、コンジュゲーション前に３つのグルコースモノマー単位を含むグルカンを、「３量体」または「３ｍｅｒ」として識別し、４つのグルコースモノマー単位を含むグルカンを、「４量体」または「４ｍｅｒ」として識別し、５つのグルコースモノマー単位を含むグルカンを、「５量体」または「５ｍｅｒ」などとして識別することができる。グルカンが還元的アミノ化（直接コンジュゲーション）を介してコンジュゲートされる場合、グルコースモノマー単位のうちの１つが開環して、残りのグルコースモノマー単位とトラスツズマブまたはセツキシマブとの間に「リンカー」を形成する。したがって、「３量体」を用いた直接コンジュゲーションによって調製されたコンジュゲートを指す場合、以下の構造：
【化４３】
2020510622.tif 000062
を含むと考えられ、例えばＮＨＳ  ＤＢＣＯのような非グルコース系のリンカーが、例えば、「４量体」とともに使用される場合、得られるコンジュゲートは以下の構造：
【化４４】
2020510622.tif 000063
を含むと考えられる。
【０２００】
各実施例において例示的な実施形態が詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲に定義されるような本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換、及び改変が各実施形態になされ得るものと理解されるべきである。
【０２０１】
実施例１：プスツランからのオリゴマーの精製
プスツランの分解
プスツラン（Ｅｌｉｃｉｔｙｌ−Ｏｌｉｇｏｔｅｃｈ）を１００ｍｇ／ｍｌで濃塩酸に懸濁させた。得られたスラリーを室温で１．２５時間激しく撹拌する間に、混合物の粘度は著しく低下した。次いで、微細な黒色スラリーを、７容量のｎ−プロパノールを入れたビーカーに移すと、黄褐色の固体が沈殿した。１５分間激しく撹拌した後、混合物を数本のチューブに移し、遠心分離（３６００×ｇ、５分間）により不溶性固体を液体から分離した。上清をデカントして、薄茶色のペレットを残した。ペレットをエタノール及びｎ−プロパノールで順次洗浄し、微量の低級糖（単糖類及び二糖類）を除去した。各チューブに水を添加し、引き続き混合物を室温で一晩撹拌した。これらの撹拌混合物の遠心分離（３６００×ｇ、１５分間）により、暗褐色のペレット及び透明で淡色の上清を得た。上清をプールして凍結し、凍結乾燥させ、出発物質のプスツランを基準として１５質量％の回収率で、β−１，６−グルカンのラダーを黄褐色の粉末として得た。ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  ＨＩＬＩＣ  Ａｍｉｄｅ  ＯＢＤ分取カラムによる混合物のＬＣ−ＭＳ分析によって決定したところ、得られたオリゴ糖のサイズは３ｍｅｒ〜１４ｍｅｒまでの範囲であり、それより大きいオリゴ糖（１４超）はＬＣでは存在するがＭＳの検出限界外であった（ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ  ＨＩＬＩＣ  ＯＢＤ分取カラム、１３０Å、５μｍ、１９ｍｍ×２５０ｍｍ、及びＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ  ＨＩＬＩＣ分析カラム、３．５μｍ、３ｍｍ×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓから入手、使用前に製造業者による記載の通りに予備洗浄；０．１％ギ酸を含む９５〜４０％アセトニトリル／水、５０℃、０．７５ｍＬ／分で１５分間）。加えて、ＥＬＳＤ分析によって決定したところ、物質の大部分を３ｍｅｒ〜８ｍｅｒが占めていた。
【０２０２】
Ｐ２によるオリゴ糖ラダーのバルクサイズ分画
ＸＫ５０カラム（Ｂｉｏｒａｄから入手したＰ２極細樹脂。製造業者による記載の通りに前処理し、２つのＸＫ５０  １００ｃｍ長カラムの充填に利用した）を、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００アイソクラティックポンプに並列に接続した。ポンプの下流に外部圧力計を設置し、カラム圧力をモニターした。分離はすべて、０．１Ｍ酢酸を利用して流速３．５ｍｌ／分で実施した。オリゴ糖ラダーを水に溶解して総容量を最大１２ｍＬにし、１３ｍｌのループを備える手動注入器を通してカラムに注入した。約５００分間かけて分離を行い、最初の２４０分は分流して廃棄した。残りのフローを６ｍＬ画分ずつ合計２８８画分採取した。画分をＭＡＬＤＩ／ＴＯＦによって分析し、異なったサイズのβ−１，６−グルカンを含有する画分をまとめてプールして凍結し、凍結乾燥させた。
【０２０３】
ＨＩＬＩＣ及びＣ１８／Ｃ１８ＡＱクロマトグラフィーによるオリゴ糖の最終精製
Ｐ２精製からの乾燥試料を最少量の水に溶解し、さらにＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ  ＨＩＬＩＣ  ＯＢＤ分取カラムで分離した（ＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ  ＨＩＬＩＣ  ＯＢＤ分取カラム、１３０Å、５μｍ、１９ｍｍ×２５０ｍｍ、及びＸＢｒｉｄｇｅ  ＢＥＨ  Ａｍｉｄｅ  ＨＩＬＩＣ分析カラム、３．５μｍ、３ｍｍ×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓから入手、使用前に製造業者による記載の通りに予備洗浄；１３０Å、５μｍ、１９ｍｍ×２５０ｍｍ、０．１％ギ酸を含む９５〜４０％アセトニトリル／水、２５ｍＬ／分で３０分間）。ＬＣ／ＭＳによって決定される異なったサイズのオリゴ糖を含有する精製画分を凍結し、凍結乾燥させた。完全に乾燥させた後、０．１％ギ酸を含有する最少量の水にオリゴ糖を再溶解し、順列に接続したＣ１８  ＡＱ及びＣ１８カラム（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ  ＩＳＣＯから入手し、使用前に製造業者の推奨に従って予備洗浄したＣ１８及びＣ１８ＡＱカートリッジ；１０倍ｗｔ／ｗｔベッドサイズ）に通し、生成物を０．１％ギ酸を含む水（１０カラム容量）で溶出した。フロースルーを凍結し、凍結乾燥させて白色粉末とした。
【０２０４】
実施例２：β−１，６−グルカンオリゴマーのトラスツズマブへのコンジュゲーション
還元的アミノ化によるβ−１，６−グルカンオリゴマーのトラスツズマブへのコンジュゲーション
実施例１に記載のようにプスツランから得たβ−１，６−グルカンオリゴマーを、還元的アミノ化によってトラスツズマブにコンジュゲートした。β−１，６−グルカンオリゴマーは式Ｖ：
【化４５】
2020510622.tif 000064
のものであり、式中、ａは３〜５である。トラスツズマブをＴＦＦ（５０ｋＤａ膜）によって保存溶液から０．２Ｍホウ酸Ｎａ、ｐＨ８．０へ緩衝液交換し、トラスツズマブを濃縮させた（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）。β−１，６−オリゴマーを、エンドトキシンフリーの０．１Ｍ水溶液として調製した。エンドトキシンフリー水中の０．３Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウム、及び１０：９０のＰＥＧ２０００：エンドトキシンフリー水の溶液に、ｐＨが約８．０になるまで０．１Ｍホウ酸ナトリウムを添加した。トラスツズマブの濃度が５ｍｇ／ｍＬになるまでトラスツズマブを添加した。２３０倍モル過剰のβ−１，６−オリゴマー溶液を２１℃で添加し、反応物を２３時間撹拌した。１００倍モル比のリジンをオリゴ糖に添加することによってコンジュゲーションを停止させた。反応停止溶液は、０．１Ｍホウ酸Ｎａ、ｐＨ８．０中、１Ｍリジンであった。
【０２０５】
コンジュゲーション後、反応混合物を、５０ｋＤａのＴＦＦ膜を用いて、４６．７％トレハロース脱水物、０．７４％Ｌ−ヒスチジン、及び１．１５％Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物に、１倍から１０倍に希釈した。最終のトラスツズマブ−オリゴ糖コンジュゲートを１ｍｇ／ｍｌに調整した。保存緩衝液は、４℃の、４６．７％トレハロース脱水物、０．７４％Ｌ−ヒスチジン、１．１５％Ｌ−ヒスチジン塩酸塩一水和物、及び０．０１％のポリソルベート２０であった。コンジュゲートされていないオリゴ糖は、オリゴ糖−トラスツズマブコンジュゲートの濃度の０．１％未満であった。平均ＭＷ２０００のＰＥＧは、オリゴ糖−トラスツズマブコンジュゲートの濃度の０．１％未満であった。
【０２０６】
分析方法：
ａ）ＳＥＣ分離
ａ．未修飾トラスツズマブ
ｂ．オリゴ糖−トラスツズマブコンジュゲート
ｃ．ＳＥＣ分離は、ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００、４ｍｍ、２５０Åシリカ、４．６ｍｍ内径×３０ｃｍを利用。移動相０．４ＭのＮａＣｌＯ４、０．０５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２を使用、λ＝２８０ｎｍでのＵＶ検出を利用
ｂ）ＭＡＬＤＩによる負荷量の推定（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＭＡＬＤＩ／Ｑ−ＴＯＦ  ４８００または同等の機器）。注：オリゴ糖は親水性のため、ＨＩＣにより個々の負荷を決定することはできない。
ａ．リニア高質量ポジティブモードでＢＳＡ（ＭＷ  ６６３４１）を検量線標準（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）として使用
ｂ．シナピン酸（Ｓｉｇｍａ）をマトリックスとして利用
ｃ．ネイティブのトラスツズマブを対照として使用
ｄ．トラスツズマブコンジュゲートの平均ｍ／ｚを未修飾のトラスツズマブの平均ｍ／ｚから減算し、推定負荷量を求め、単位負荷量の質量で除算して、コンジュゲートの負荷量を決定する。データの平均標準偏差は、０．２〜０．３負荷量単位である
ｃ）ＨＡＢＡ（Ｓｉｇｍａ）をマトリックスとして使用した、ＭＡＬＤＩによるオリゴ糖のｍ／ｚ測定（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ４８００または同等の機器）。
ｄ）ＸＢｒｉｄｇｅ  ３ｍｍ×１０ｃｍ、３．５μｍ粒径（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してＬＣ−ＭＳによりオリゴ糖のｍ／ｚを測定。移動相Ａ：水／０．１％ギ酸、Ｂ：１００％アセトニトリル／０．１％ギ酸を使用。質量分析にＺＱ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用する。
【０２０７】
実施例３：ＥＬＩＳＡによるＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅの結合有効性
本実施例は、実施例２に記載するように調製したＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅコンジュゲートのＨＥＲ２への結合能試験について記載する。ＥＬＩＳＡプレートのウェルをＨＥＲ２抗原でコーティングした。ＰＢＳ対照、トラスツズマブ、ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（５量体）、及びＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）をウェルに加え、インキュベートした。ウェルを洗浄し、標識した抗ヒトＩｇＧ抗体をウェルに添加した。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、検出試薬を塗布して、プレートを読み取った。図１に示すように、ＰＢＳ対照のシグナルは陰性であり、トラスツズマブ、ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（５量体）、及びＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）の結合が検出された。
【０２０８】
実施例４：ＥＬＩＳＡによるＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅの検出
本実施例は、実施例２に記載するように調製したＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅコンジュゲートを検出するための選択的ＥＬＩＳＡについて記載する。ＥＬＩＳＡプレートのウェルをＨＥＲ２抗原でコーティングした。ＰＢＳ対照、トラスツズマブ、ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（５量体）、及びＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）をウェルに加え、インキュベートした。ウェルを洗浄し、ヒト抗β−１，６−グルカンポリクローナル抗体をウェルに添加した。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、標識した抗ヒトＩｇＧ２抗体をウェルに添加した。インキュベーション後、ウェルを洗浄し、検出試薬を塗布して、プレートを読み取った。図２に示すように、ＰＢＳ対照及びトラスツズマブのシグナルは陰性であり、ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（５量体）、及びＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）は検出された。
【０２０９】
実施例５：ヌードマウスにおけるＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（５量体）及び（６量体）の有効性試験
本実施例では、実施例２に記載するように調製したＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅコンジュゲートの有効性を、トラスツズマブ抵抗性ヒト細胞株ＪＩＭＴ−１を移植したヌードマウスモデルにおいて試験した。本試験は、還元的アミノ化（直接）化学反応、抗体あたり約３オリゴマーの負荷量である５量体または６量体オリゴマーをコンジュゲーションに利用したＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅに関するものであった。
【０２１０】
本実施例では、７週齢の雌ヌードマウスに２．５×１０６個のＪＩＭＴ−１細胞を移植した。腫瘍の大きさが１５０〜１８２ｍｍ３に達したら、マウスを５つの試験処置群に無作為に割り付けた。その結果、各群の平均腫瘍体積は約１６０ｍｍ３であった。各抗体の投与前に、プールしたヒト抗体（ＩＶＩＧ）約５００ｍｇ／ｋｇ（０．１ｍＬ）をすべてのマウスに腹腔内（ＩＰ）注射した。ＩＶＩＧ投与の２時間後、ＩＰ注射により以下の処置のうちの１つを各群に施した：ＰＢＳ対照；１５ｍｇ／ｋｇのトラスツズマブ；１５ｍｇ／ｋｇのＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（５量体）；１５ｍｇ／ｋｇのＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）；またはＫａｄｃｙｌａ（登録商標）（Ｔ−ＤＭＩ）。
【０２１１】
本試験を通して、週２回腫瘍をモニターし、外カリパスを用いて腫瘍増殖率を測定した。処置初日の前後に腫瘍を測定した。体重も週２回収集した。最大腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したときにマウスを安楽死させた。腫瘍が潰瘍化した場合、腫瘍が歩行を妨げた場合、または身体状態の悪化があった場合にも、マウスを安楽死させた。元の体重からの減少が１５％を超えた場合にも、マウスを安楽死させた。
【０２１２】
本実験から収集したデータの分析を実施した。腫瘍体積は、以下の式に基づいて計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝｛長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２｝／２。図３は、腫瘍の大きさを平均値で表した結果を示す。図４は、腫瘍の大きさを中央値で表した結果を示す。
【０２１３】
ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）は、ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（５量体）よりも、試験期間にわたる腫瘍の大きさの平均値及び中央値の減少に有効であることが観察された。図５及び６に示すように、ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）は、それぞれ処置後３７日目及び５１日目の時点でトラスツズマブよりも有効であることが示された。
【０２１４】
実施例６：ヌードマウスにおけるＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（５量体）、（６量体）、及び（７量体）の有効性試験
本実施例では、実施例２に記載するように調製したＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅコンジュゲートの有効性を、トラスツズマブ抵抗性ヒト細胞株ＪＩＭＴ−１を移植したヌードマウスモデルにおいて試験する。本試験は、還元的アミノ化（直接）化学反応、抗体あたり約３オリゴマーの負荷量である５量体、６量体、または７量体オリゴマーをコンジュゲーションに利用したＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅに関するものである。
【０２１５】
本実施例では、７〜９週齢の雌ヌードマウスに２．５×１０６個のＪＩＭＴ−１細胞を移植する。腫瘍の大きさが約１５０〜１８０ｍｍ３に達したら、マウスを５つの試験処置群に無作為に割り付ける。各抗体の投与前に、プールしたヒト抗体（ＩＶＩＧ）約５００ｍｇ／ｋｇ（０．１ｍＬ）をすべてのマウスに腹腔内（ＩＰ）注射する。ＩＶＩＧ投与の２時間後、ＩＰ注射により以下の処置のうちの１つを各群に施す：ＰＢＳ対照；トラスツズマブ；ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（５量体）；ＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（６量体）；またはＨＥＲ２−ｍＡｂＸｃｉｔｅ（７量体）。
【０２１６】
本試験を通して、週２回腫瘍をモニターし、外カリパスを用いて腫瘍増殖率を測定する。処置初日の前後に腫瘍を測定する。体重も週２回収集する。最大腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したときにマウスを安楽死させる。腫瘍が潰瘍化する場合、腫瘍が歩行を妨げる場合、または身体状態の悪化がある場合にも、マウスを安楽死させる。元の体重からの減少が１５％を超えた場合にも、マウスを安楽死させる。本実験から収集したデータの分析を実施する。腫瘍体積は、以下の式に基づいて計算する：ＴＶ（ｍｍ３）＝｛長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２｝／２。
【０２１７】
実施例７：β−１，６−グルカンオリゴマーのセツキシマブへのコンジュゲーション
戦略１：ＮＨＳ−ＤＢＣＯによるβ−１，６−グルカンオリゴマーのセツキシマブへのコンジュゲーション
式ＩＶの化合物：
【化４６】
2020510622.tif 000065
をセツキシマブ（ＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．２）にコンジュゲートした。それには、ＰＢＳ（ｐＨ７．２、３％ＤＭＳＯ含有）の反応溶液に１２倍過剰の上記化合物の合成物を添加し、反応物を２１℃で３０分間撹拌した。ＮＨＳ−ＤＢＣＯ−オリゴ糖に対して１００倍比のリジンを添加することによって反応を停止させた。次に、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて５０ｋＤａのＴＦＦ膜で混合物を緩衝液交換した。最終のセツキシマブ−オリゴ糖コンジュゲートを１ｍｇ／ｍｌに調整した。保存緩衝液は４℃、ｐＨ７．２のＰＢＳである。コンジュゲートされないオリゴ糖は、オリゴ糖−セツキシマブコンジュゲートの濃度の０．１％未満である。
【０２１８】
戦略２：還元的アミノ化によるβ−１，６−グルカンオリゴマーのセツキシマブへのコンジュゲーション
別法として、還元的アミノ化によりβ−１，６−グルカンオリゴマーをセツキシマブにコンジュゲートした。β−１，６−グルカンオリゴマーは式Ｖ：
【化４７】
2020510622.tif 000066
のものであり、式中、ａは０〜８である。セツキシマブをＴＦＦ（５０ｋＤａ膜）によって保存溶液から０．２Ｍホウ酸Ｎａ、ｐＨ８．０へ緩衝液交換し、セツキシマブを濃縮させた（１０〜２０ｍｇ／ｍｌ）。β−１，６−オリゴマーを、エンドトキシンフリーの０．１Ｍ水溶液として調製した。
【０２１９】
エンドトキシンフリー水中の０．３Ｍシアノ水素化ホウ素ナトリウム、及び１０：９０のＰＥＧ２０００：エンドトキシンフリー水の溶液に、ｐＨが約８．０になるまで０．１Ｍホウ酸ナトリウムを添加した。セツキシマブの濃度が５ｍｇ／ｍＬになるまでセツキシマブを添加した。２３０倍モル過剰のβ−１，６−オリゴマー溶液を２１℃で添加し、反応物を２３時間撹拌した。１００倍モル比のリジンをオリゴ糖に添加することによってコンジュゲーションを停止させる。反応停止溶液は、０．１Ｍホウ酸Ｎａ、ｐＨ８．０中、１Ｍリジンである。
【０２２０】
コンジュゲーション後、反応混合物をＰＢＳ（ｐＨ７．２）で１倍から１０倍に希釈し、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）を用いて５０ｋＤａのＴＦＦ膜で緩衝液交換した。最終のセツキシマブ−オリゴ糖コンジュゲートを１ｍｇ／ｍｌに調整した。保存緩衝液は４℃、ｐＨ７．２のＰＢＳであった。コンジュゲートされないオリゴ糖は、オリゴ糖−セツキシマブコンジュゲートの濃度の０．１％未満であった。平均ＭＷ２０００のＰＥＧは、オリゴ糖−セツキシマブコンジュゲートの濃度の０．１％未満であった。
【０２２１】
分析方法：
ｅ）ＳＥＣ分離
ｄ．未修飾セツキシマブ
ｅ．オリゴ糖−セツキシマブコンジュゲート
ｆ．ＳＥＣ分離は、ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＳＷ３０００、４ｍｍ、２５０Åシリカ、４．６ｍｍ内径×３０ｃｍを利用。移動相０．４ＭのＮａＣｌＯ４、０．０５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．２を使用、λ＝２８０ｎｍでのＵＶ検出を利用
ｆ）ＭＡＬＤＩによる負荷推定（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＭＡＬＤＩ／Ｑ−ＴＯＦ  ４８００または同等の機器）。注：オリゴ糖は親水性のため、ＨＩＣにより個々の負荷を決定することはできない。
ｅ．リニア高質量ポジティブモードでＢＳＡ（ＭＷ  ６６３４１）を検量線標準（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）として使用
ｆ．シナピン酸（Ｓｉｇｍａ）をマトリックスとして利用
ｇ．ネイティブのセツキシマブを対照として使用
ｈ．セツキシマブコンジュゲートの平均ｍ／ｚを未修飾のセツキシマブの平均ｍ／ｚから減算し、推定負荷量を求め、単位負荷量の質量で除算して、コンジュゲートの負荷量を決定する。データの平均標準偏差は０．２〜０．３負荷量単位である
ｇ）ＨＡＢＡ（Ｓｉｇｍａ）をマトリックスとして使用した、ＭＡＬＤＩによるオリゴ糖のｍ／ｚ測定（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ４８００または同等の機器）。
ｈ）ＸＢｒｉｄｇｅ  ３ｍｍ×１０ｃｍ、３．５μｍ粒径（Ｗａｔｅｒｓ）を使用してＬＣ−ＭＳによりオリゴ糖のｍ／ｚを測定。移動相Ａ：水／０．１％ギ酸、Ｂ：１００％アセトニトリル／０．１％ギ酸を使用。質量分析にＺＱ（Ｗａｔｅｒｓ）を使用する。
【０２２２】
実施例８：セツキシマブのグルカンとのコンジュゲーションはＥＧＦＲへの結合を変化させない
コンジュゲーションがセツキシマブのＥＧＦＲへの結合に影響を与えるかどうかに関する試験を行った。これらの実験は、対照としてセツキシマブ及びリツキシマブを使用して行った。ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体及びマウス抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣを用いて試料を検出した。ブロッキング及び染色緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２＋２％ＢＳＡ）及び洗浄緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）も利用した。
【０２２３】
２×１０５個のＡ４３１（上皮細胞、類表皮癌）細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ中にて室温で１時間ブロックした後、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ、セツキシマブ、またはリツキシマブ（陰性対照）と、染色緩衝液中にて室温で１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し（３回）、検出抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ）を１：１００希釈で添加した。さらに３回洗浄した後、細胞を遠心沈降させ、ＰＢＳに再懸濁して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＦＡＣＳにより分析した。細胞をＦＡＣＳ（ＦＩＴＣに対するＦＬ１）によって分析した。
【０２２４】
β−１，６−グルカンのコンジュゲーションは、セツキシマブのＥＧＦＲへの結合を妨害しなかった。ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのＥＧＦＲへの結合は、非特異的対照（「抗体なし」）であるリツキシマブ、セツキシマブ、及びｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ（６量体、７量体、または８量体のβ−１，６−グルカンオリゴマー）を用い、抗体あたり１〜５個のβ−１，６−グルカンオリゴマーの範囲の負荷について（図７、８、及び９）、ＦＡＣＳにより評価した。結果は、どのコンジュゲートまたは負荷量（具体的には、１もしくは２負荷量の８量体のβ−１，６−グルカンオリゴマー、または３〜５負荷量の５量体のβ−１，６−グルカンオリゴマー）も、セツキシマブ対照と比較した場合に、ＥＧＦＲへの結合が損なわれなかったことを示している。直接コンジュゲーションに関連した本明細書で考察する本実施例及び他の実施例では、β−１，６−グルカンオリゴマーをプスツランから精製した。実施例１に記載したように、プスツランを処理してβ−１，６−グルカンのラダーを得て、それから、例えば分画及び精製により、所望の長さを有するオリゴマーを調製した。
【０２２５】
実施例９：セツキシマブのグルカンとのコンジュゲーションはＡＤＣＣを変化させない。
本発明者らはまた、グルカンとのコンジュゲーションがセツキシマブの抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響を及ぼすかどうかを調べた。本アッセイでの測定値は、ＮＦＡＴ応答要素によって駆動されるホタルルシフェラーゼの発現による発光シグナルであった。
【０２２６】
これらの実験も、対照としてセツキシマブ及びリツキシマブを使用して行った。標的細胞としてＡＤＣＣ  Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒヒト及び上皮癌細胞株Ａ４３１を使用して、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブに対するＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ応答を試験した。実験はＡＤＣＣ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して実施した。簡潔には、標的細胞（Ａ４３１）を完全培地にウェルあたり５，０００細胞の密度で播種し、一晩置いた。バイオアッセイ日に、抗体（セツキシマブ、セツキシマブ−ｍＡｂＸｃｉｔｅ、及び対照であるリツキシマブ）を段階希釈した。細胞培地を注意深く除去した後、様々な濃度のコンジュゲート及び抗体を細胞に添加し、続いてＡＤＣＣ  Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞を添加した。Ｅ：Ｔ比は１５：１であった。３７℃で６時間誘導した後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を添加し、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ照度計を使用して発光を測定した（図１０及び１１）。
【０２２７】
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（登録商標）ソフトウェアを使用して、データを４ＰＬ曲線にフィッティングした。セツキシマブ／Ａ４３１標的細胞を用いた応答のＥＣ５０は約２０ｎｇ／ｍｌであった。この結果は、ＡＤＣＣ  Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｅｆｆｅｃｔｏｒ細胞及びＡ４３１標的細胞を使用したＡＤＣＣレポーターバイオアッセイにおいて、β−１，６−グルカンコンジュゲーションがセツキシマブ対照と比較してセツキシマブのＡＤＣＣ（２．５、３、または４負荷量の５量体オリゴマーを有するｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ）を変化させなかったことを実証している。
【０２２８】
実施例１０：ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブコンジュゲートでのβ−１，６−グルカンオリゴマーの長さ及び負荷量
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗体活性を評価するために、２つの主要効力アッセイを開発した。
【０２２９】
１つ目の当該アッセイでは、抗β−１，６−グルカンのＥＬＩＳＡを使用して抗体活性を評価した。このＥＬＩＳＡでは、組換えＥＧＦＲペプチドをＥＬＩＳＡプレートに吸着させた。セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの結合に続いて、β−１，６−オリゴマーを抗β−１，６−グルカン抗体によって検出した。このアッセイの結果は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより評価された平均オリゴマー負荷量と良好に相関する。
【０２３０】
２つ目の当該アッセイでは、抗β−１，６−グルカンのＦＡＣＳを使用して抗体活性を評価した。このアッセイでは、抗体をＥＧＦＲペプチドではなく生細胞に添加した。β−１，６−オリゴマーを抗β−１，６−グルカン抗体によって検出した。このアッセイの結果もまた、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦにより評価された平均オリゴマー負荷量と良好に相関する。
【０２３１】
ＥＬＩＳＡアッセイ
本試験は、抗β−１，６−グルカン抗体のｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブへの結合を評価するために実施した。本実験では、β−１，６−グルカンオリゴマーの長さがｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ活性に与える影響を評価するため、オリゴマーの負荷量は２または６であり、オリゴマーの長さは４量体〜９量体であり、グルカンのセツキシマブとの結合はＤＢＣＯまたは直接のいずれかであった。セツキシマブを対照として使用した。ブロッキング及び染色緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．２＋２％ＢＳＡ）及びＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液（ＰＨ７．２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）も利用した。ＥＬＩＳＡは、１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して実施した。
【０２３２】
組換えＥＧＦＲペプチド（Ｒ＆Ｄ製のｒｈＥＧＦＲ／Ｆｃキメラペプチド）をＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ）に４℃で一晩吸着させた。３回洗浄した後、非特異的結合部位を室温で１時間ブロックした。次いで、セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを加え、室温で１時間、プレートシェーカー上でインキュベーションを行い、続いてさらに３回洗浄した。β−１，６−グルカンオリゴマーの検出を可能にするために、抗β−１，６−グルカン抗体（ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体）をプレートに添加し（３ｕｇ／ウェル）、室温で４５分間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１：５０００希釈の抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ）と室温で４５分間インキュベートした。十分に洗浄を行い（５回）、１００ｕＬのＴＭＢ基質を用いて視覚化を行った。
【０２３３】
ＯＤ６２０ｎｍでプレートを直に読み取った。また読み取りは１時間にわたり毎分行った。示されたデータは３つの複製ウェルの平均＋／−標準偏差である（図１２及び１３）。ＤＢＣＯ（Ａ）及び直接（Ｂ）コンジュゲートへの結合をＥＬＩＳＡによって評価した。試験したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのコンジュゲートはすべて、本アッセイにおいて活性であった。飽和に達した場合、オリゴマーの長さ（最大７〜８量体）が増加すると活性の増加が観察された。
【０２３４】
ＦＡＣＳアッセイ
本試験は、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブが生細胞上のＥＧＦＲに結合したときに、すべての長さのβ−１，６−グルカンオリゴマーが抗β−１，６−グルカン抗体によって認識されるかどうかを確認するために行った。セツキシマブを対照とし、コンジュゲートのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを使用してデータを取得した。本実験では、β−１，６−グルカンオリゴマーの負荷量は１〜６であり、オリゴマーの長さは４量体〜９量体の範囲であり、グルカンのセツキシマブとの結合はＤＢＣＯであった。
【０２３５】
２×１０５個のＡ４３１（上皮細胞、類表皮癌）細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ（ＰＢＳ  ｐＨ７．２＋２％ＢＳＡ）中にて室温で１時間ブロックした後、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ、及びセツキシマブまたはリツキシマブ（陰性対照）と、染色緩衝液中にて室温で１時間インキュベートした。３回洗浄した後（ＰＢＳ、ｐＨ７．２）、細胞を、精製した抗β−１，６−グルカン抗体（ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体）と室温で１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し（３回）、検出抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ２−ＰＥ）を１：１００希釈で添加した。さらに３回洗浄した後、細胞を遠心沈降させ、ＰＢＳに再懸濁して、ＦＡＣＳにより分析した。細胞は、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＦＡＣＳ（ＦＬ２）によって分析した。ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの結合は、非特異的対照（「抗体なし」）であるリツキシマブ、セツキシマブ、及びｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ（４量体〜９量体）を用いて、ＦＡＣＳにより評価した。結果を図１４及び１５に示す。Ａ４３１細胞上のＥＧＦＲへの結合及び抗β−１，６−グルカン抗体の沈着について本セクションで分析したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブはすべて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで機能的であった。
【０２３６】
実施例１１：ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの好中球浸潤
本実施例の試験は、ヌードマウスにおける薬力学（ＰＤ）を評価するために行った。具体的には、長さの異なるオリゴマーとのコンジュゲーションが好中球浸潤に与える効果を、ルミノールアッセイを用いたライブイメージング及び抗好中球抗体を用いた組織学という２種類のアプローチを用いて評価した。
【０２３７】
ライブイメージングアッセイ
本アッセイでは、ルミノールをミエロペルオキシダーゼ（好中球特異的酵素であり、活性化された好中球のマーカーである）と反応させ、得られる生物発光をＩＶＩＳイメージャーで検出する。これらの実験には、ＤＢＣＯ化学反応、４量体〜８量体オリゴマー長、及び抗体あたり２オリゴマーの負荷量を用いたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを含めた。セツキシマブ及びプスツラン（サイズ未定義のコンジュゲートされていないβ−１，６−グルカン）を対照として使用した。
【０２３８】
２×１０６個のＡ４３１（上皮細胞、類表皮癌）細胞をマウスにＳＣ移植した。本発明者らがイメージングに理想的であることを見出した３００〜４００ｍｍ３に腫瘍体積が達した時点で、ＩＶＩＧをマウスに投与し、その２時間後にｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ、セツキシマブ、またはビヒクル対照を投与した。処置開始から５時間後、マウスをイソフルラン吸入により麻酔し、ルミノールを投与し（２００ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）、７〜１５分以内にＩＶＩＳ  １００生物発光イメージングシステム（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で撮像した。
【０２３９】
定量化のため、ＩＶＩＳソフトウェアによって光子束の合計を計算し、バックグラウンドを減算した。処置の前日にすべてのマウスを撮像して、ベースラインを評価した。撮像後、腫瘍及び血液を採取した。腫瘍を組織検査に送った（イメージングとの相関性を求めるため）。ＰＢＳ及びセツキシマブを陰性対照として、及び（ＩＴ注射した）プスツランを陽性対照として用い、好中球の活性化をライブイメージングによって評価した。腫瘍上の輝点は陽性細胞を示す。
【０２４０】
試験したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ構築物（４量体〜８量体オリゴマーを有する）はすべて、本アッセイにおいて好中球活性化をもたらした。図１６を参照のこと。
【０２４１】
組織学アッセイ
本試験は、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ処置時の腫瘍における好中球浸潤を評価するために行った。グルカンのコンジュゲーションには直接化学反応を用いた。抗体あたり３オリゴマーの負荷量である５量体オリゴマーを使用した。
【０２４２】
本アッセイでは、セツキシマブ及びプスツラン（サイズ未定義のコンジュゲートされていないβ−１，６−グルカン）を対照として、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを試験した。２×１０６個のＡ４３１（上皮細胞、類表皮癌）細胞をマウスにＳＣ移植した。腫瘍の体積が３００〜４００ｍｍ３に達した時点でマウスにＩＶＩＧを投与し、その２時間後にｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ、セツキシマブ、またはビヒクル対照を投与した。処置開始から５時間後、腫瘍を収集して組織検査に送り、好中球浸潤を評価した。腫瘍はホルマリンで固定し、パラフィンブロックに包埋して、好中球特異的検出抗体（抗好中球（Ｌｙ６Ｇ）抗体（Ａｂｃａｍ  Ｎｏ．２５５７））で染色した。好中球浸潤を、免疫組織化学染色（濃い染色は陽性細胞を示す）によって評価した。上記のライブイメージング試験と相関して、組織学によっても、試験したすべてのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ（４量体〜８量体のオリゴマーを有する）で処置されたときに好中球浸潤が観察された。図１７を参照のこと。
【０２４３】
実施例１２：様々なオリゴマー負荷量を有するｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブと抗β−１，６−グルカン抗体またはＥＧＦＲとの結合
ＥＬＩＳＡアッセイ
抗β−１，６−グルカン抗体のｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブへの結合を、対照としてセツキシマブを使用し、ＥＬＩＳＡを用いて評価した。本試験に利用したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのコンジュゲーションには、抗体あたり１〜３オリゴマーの負荷量の６量体オリゴマーを使用したクリックケミストリー（ＤＢＣＯ）を利用した。
【０２４４】
ＥＬＩＳＡは、１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して実施した。ヒト組換えＥＧＦＲペプチド（ｒｈＥＧＦＲ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ製ペプチド））をＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ）に４℃で一晩吸着させた。２、３回洗浄した後、非特異的結合部位をＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液（ブロッキング及び染色緩衝液：ＰＢＳ  ｐＨ７．２＋２％ＢＳＡ）中にて室温で１時間ブロックした。次いで、セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを加え、室温で１時間、プレートシェーカー上に置き、続いてさらに３回洗浄した。β−１，６−グルカンオリゴマーの検出を可能にするために、抗β−１，６−グルカン抗体（ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体）をプレートに添加し（３ｕｇ／ウェル）、室温で４５分間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液（ｐＨ７．２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ））、１：５０００希釈の抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ）と室温で４５分間インキュベートした。十分に洗浄を行い（５回）、１００ｕＬのＴＭＢ基質を用いて視覚化を行った。ＯＤ６２０ｎｍでプレートを直に読み取った（１時間にわたり毎分）。図１８に示す結果は３つの複製ウェルの平均＋／−標準偏差である。結合はＥＬＩＳＡで評価した。様々な負荷量でコンジュゲートされたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブはすべて、本アッセイにおいて活性であり、活性は負荷量が増加するにつれて増加した。
【０２４５】
ＦＡＣＳアッセイ
ＦＡＣＳ試験を実施して、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがＥＧＦＲ結合及び抗β−１，６−グルカンのＩｇＧ２沈着に与える効果を評価した。本試験に利用したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのコンジュゲーションには、抗体あたり１〜６オリゴマーの負荷量の４量体〜９量体オリゴマーを使用したクリックケミストリー（ＤＢＣＯ）を利用した。セツキシマブを対照として使用した。検出する抗体には、ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体及びマウス抗ヒトＩｇＧ２−ＰＥまたはマウス抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣが含まれていた。
【０２４６】
２×１０５個のＡ４３１（上皮細胞、類表皮癌）細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ中にて室温で１時間ブロックした後、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ、セツキシマブ、またはリツキシマブ（陰性対照）と、染色緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．２＋２％ＢＳＡ）中にて室温で１時間インキュベートした。次いで細胞を洗浄し（３回；ＰＢＳ  ｐＨ７．２）、検出抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ２−ＰＥまたはマウス抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ）を１：１００希釈で添加した。さらに３回洗浄した後、細胞を遠心沈降させ、ＰＢＳに再懸濁して、ＦＡＣＳにより分析した。ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内でＦＡＣＳ（ＰＥに対するＦＬ２、またはＦＩＴＣに対するＦＬ１）によって細胞を分析した。
【０２４７】
ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの結合は、対照（「抗体なし」）である緩衝液、セツキシマブ、及びｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ（１〜６の範囲の負荷量）を用いて、ＦＡＣＳにより評価した。セツキシマブと様々な負荷量のオリゴマーとのコンジュゲーションは、セツキシマブのＥＧＦＲへの結合に影響を及ぼさなかった。さらに、抗β−１，６−グルカン抗体の沈着は、低負荷量または高負荷量いずれのオリゴマーでも損なわれなかった。これらのアッセイでは、最小負荷量１が抗β−１、６−グルカンＩｇＧ２によって検出された。図１９、２０、２１、及び２２を参照のこと。
【０２４８】
実施例１３：様々なオリゴマー負荷量を有するｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブと抗β−１，６−グルカン抗体またはＥＧＦＲとの結合
ＥＬＩＳＡアッセイ
本試験では、直接還元的アミノ化化学反応、５量体オリゴマー、及び抗体あたり１〜５オリゴマーの負荷量によりコンジュゲーションを実施したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを利用した。抗β−１，６−グルカンのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブへの結合をＥＬＩＳＡを用いてアッセイした。セツキシマブを対照として使用した。ＥＬＩＳＡは、１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して実施した。検出する抗体には、ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体及びマウス抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰが含まれていた。
【０２４９】
ヒト組換えＥＧＦＲペプチド（ｒｈＥＧＦＲ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ製ペプチド））をＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ）に４℃で一晩吸着させた。２、３回洗浄した後、非特異的結合部位をＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．２＋２％ＢＳＡ）中にて室温で１時間ブロックした。次いで、セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを加え、室温で１時間、プレートシェーカー上に置き、続いてさらに３回洗浄した（ｐＨ７．２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）。β−１，６−グルカンオリゴマーの検出を可能にするために、抗β−１，６−グルカン抗体をプレートに添加し（３ｕｇ／ウェル）、室温で４５分間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１：５０００希釈の抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ抗体と室温で４５分間インキュベートした。十分に洗浄を行い（５回）、１００ｕＬのＴＭＢ基質を用いて視覚化を行った。ＯＤ６２０ｎｍでプレートを直に読み取った（１時間、毎分）。示されたデータは３つの複製ウェルの平均＋／−標準偏差である。クリックケミストリー（ＤＢＣＯ）で観察されたものと同様に、還元的アミノ化を用いて作製されたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブコンジュゲートはすべて、本アッセイにおいて活性であり、活性はオリゴマーの負荷量が増加するにつれて増加した。図２３及び２４を参照のこと。
【０２５０】
ＦＡＣＳアッセイ
これらの試験は、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブがＥＧＦＲ結合及び抗β−１，６−グルカンのＩｇＧ２沈着に与える効果を評価するために実施した。本試験では、直接還元的アミノ化化学反応、５量体オリゴマー、及び抗体あたり３〜５オリゴマーの負荷量によりコンジュゲーションを実施したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを利用した。セツキシマブを対照として使用した。検出する抗体には、ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体及びマウス抗ヒトＩｇＧ２−ＰＥまたはマウス抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣが含まれていた。
【０２５１】
４×１０５個のＡ４３１（上皮細胞、類表皮癌）細胞をＰＢＳ−ＢＳＡ中にて室温で１時間ブロックした後、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ、セツキシマブ、またはリツキシマブ（陰性対照）と、染色緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．２＋２％ＢＳＡ）中にて室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し（３回；ＰＢＳ  ｐＨ７．２）、染色緩衝液に再懸濁し、細胞の半分はＥＧＦＲへの結合について分析し、もう半分は抗β−１，６−グルカン抗体の沈着について分析した。検出抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ２−ＰＥまたはマウス抗ヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣ）を１：１００希釈で細胞に添加し、室温で４５分間インキュベートした。さらに３回洗浄した後、細胞を遠心沈降させ、ＰＢＳに再懸濁して、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してＦＡＣＳにより分析した。ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの結合は、緩衝液対照（「抗体なし」）、セツキシマブ、及びｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ（様々な負荷量）を用いて、ＦＡＣＳ（ＦＩＴＣに対するＦＬ１；ＰＥに対するＦＬ２）により評価した（図２４）。この結果は、様々なオリゴマー負荷量でのセツキシマブのコンジュゲーションが、セツキシマブのＥＧＦＲへの結合に影響を及ぼさないことを実証している。さらに、抗β−１，６−グルカンＩｇＧ２抗体の結合は、低負荷量または高負荷量いずれのオリゴマーでも損なわれなかった。検出は負荷量４及び５では類似しており、負荷量３を有するコンジュゲートではわずかに弱かった。
【０２５２】
実施例１４：血清中のｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ安定性
本実施例では、対照としてセツキシマブを使用して、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブでの安定性分析を実施した。本試験に利用したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのコンジュゲーションには、ＤＢＣＯまたは直接化学反応、４量体〜５量体のオリゴマー、及び抗体あたり３オリゴマーの負荷量を利用した。ＥＬＩＳＡは、１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）検出キットを使用して実施した。検出する抗体には、ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体、マウス抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ、及びヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰが含まれていた。ブロッキング及び染色緩衝液（ＰＢＳ中のカゼイン（Ｐｉｅｒｃｅ））及びＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液（ＰＨ７．２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）も利用した。
【０２５３】
ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブまたはセツキシマブ対照を、マウスにおける投与量５ｍｇ／ｋｇに相当する濃度（５０μｇ／ｍＬ）で血清（ヒトまたはマウス血清）に添加し、３７℃で１、２、３、４、５、１４、４８、７２、または９６時間インキュベートした。次いで、抗体（ＩｇＧ濃度）及びβ−１，６−グルカンオリゴマーの存在をＥＬＩＳＡによって決定した。
【０２５４】
組換えＥＧＦＲ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ製のｈＥＧＦＲペプチド）でコーティングした９６ウェルプレート中で血清をインキュベートした。抗体を検出する際の希釈は１：５００であり、セツキシマブにコンジュゲートしたβ−１，６−グルカンを検出する際の希釈は１：１０であった。総ヒト抗体結合（セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ）を、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）を用いて検出した。ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって顕色した。
【０２５５】
セツキシマブにコンジュゲートされたβ−１，６−グルカンオリゴマーを特異的に検出するために、アフィニティー精製したヒト抗β−１，６−グルカン抗体（ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体）を使用した（ウェルあたり３μｇ、室温で１時間）。検出は、抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ）を用いて実施した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ））を添加し、発光をＥｎｖｉｓｉｏｎルミノメーターを使用して測定した。６２０ｎｍのＯＤを１時間にわたり、毎分読み取った。２つの複製からの結果を平均し、標準偏差を決定した。抗体レベルを、セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブに対する時間の関数としてプロットした。血清中の各抗体の半減期は、半減するまでに要した時間で決定した。セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブは、３７℃の血清中で最大４日間安定であった。β−１，６−グルカンオリゴマーもまた検出され、これはβ−１，６−グルカンオリゴマーが抗体とコンジュゲートされたときに安定であることを示唆した。図２５〜２９を参照のこと。
【０２５６】
実施例１５：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びマウスでのＰＫの評価
β−１，６−グルカンの好中球認識はオプソニン的であり、試験されたすべてのヒト血清に存在する内因性ＩｇＧ、ならびに補体系のタンパク質を必要とする。セツキシマブに結合している小さいサイズのβ−１，６−グルカンオリゴマーは、非コンジュゲート型では短すぎて、これらの内因性ＩｇＧ及び循環中の補体タンパク質に結合することができない。だが、セツキシマブとコンジュゲートした場合、結合活性により、プレートアッセイまたは細胞上の高密度のＥＧＦＲのいずれでも内因性抗体によって容易に認識される。以下の試験は、オリゴマーの長さ及び負荷量がＰＫに与える影響を調べるために実施した。
【０２５７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物動態（ＰＫ）
本試験では、抗体あたり１、２、及び２．５オリゴマーの負荷量での直接化学反応を使用して、５量体〜８量体のオリゴマーをコンジュゲートしたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを利用した。セツキシマブを対照として使用した。検出する抗体には、ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体及びマウス抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰが含まれていた。ＥＬＩＳＡは、１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して実施した。
【０２５８】
ヒト組換えＥＧＦＲペプチド（ｒｈＥＧＦＲ／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ製ペプチド））をＥＬＩＳＡプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ）に４℃で一晩吸着させた。２、３回洗浄した後、非特異的結合部位をＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液（ＰＢＳ  ｐＨ７．２＋２％ＢＳＡ）中にて室温で１時間ブロックした。次いで、セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを加え、室温で１時間、プレートシェーカー上に置き、続いてさらに３回洗浄した（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液（ＰＨ７．２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ））。β−１，６−グルカンオリゴマーの検出を可能にするために、抗β−１，６−グルカン抗体をプレートに添加し（３ｕｇ／ウェル）、室温で４５分間インキュベートした。ウェルを３回洗浄し、１：５０００希釈の抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ抗体と室温で４５分間インキュベートした。十分に洗浄を行い（５回）、１００ｕＬのＴＭＢ基質を用いて視覚化を行った。ＯＤ６２０ｎｍでプレートを直に読み取った。
【０２５９】
６２０ｎｍのＯＤを１時間にわたり、毎分読み取った。示されたデータは３つの複製ウェルの平均＋／−標準偏差である。試験された直接コンジュゲートはすべて、このｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて活性であったため、そのＰＫ特性について試験した。図３０を参照のこと。このグラフはまた、抗体あたり１及び２．５オリゴマーの負荷量で観察されたものを表す。
【０２６０】
腫瘍のないヌードマウスにおけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの薬物動態（ＰＫ）
本試験では、抗体あたり異なる負荷量のオリゴマーでの直接化学反応を使用して、５量体〜８量体のオリゴマーをコンジュゲートしたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを利用した。セツキシマブを対照として使用した。実験にはさらに、ブロッキング及び染色緩衝液：ＰＢＳ中のカゼイン（Ｐｉｅｒｃｅ）ならびにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液（ＰＨ７．２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）を利用した。ＥＬＩＳＡは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して実施した。
【０２６１】
コンジュゲートの半減期に影響を及ぼす可能性があるため、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのコンジュゲートのＰＫを、抗β−１，６−グルカン抗体（ＩＶＩＧ）の存在下で、腫瘍のないヌードマウスにおいて決定した。これらの実験では、７週齢の雌ヌードマウスに抗β−１，６−グルカン抗体（ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体）をＩＰ注射し、２時間後に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブまたはセツキシマブを注射した（１群３匹）。全抗体及びコンジュゲート抗体の循環レベルを評価するために、注射後の様々な時点（１時間〜９６時間）で末梢血採血によって採血した。抗凝固処理したチューブ（ＥＤＴＡ処理したチューブ）を使用して血漿を採取し、−７０℃で保存した。次いで、抗体（ＩｇＧ濃度）及びβ−１，６−グルカンオリゴマーの存在をＥＬＩＳＡによって決定した。
【０２６２】
組換えＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ製のペプチド））でコーティングした９６ウェルプレート中で、血漿またはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ対照（標準として）をインキュベートした。抗体を検出する際の希釈は１：５００であり、セツキシマブにコンジュゲートしたβ−１，６−グルカンオリゴマーを検出する際の希釈は１：１０であった。
【０２６３】
総ヒト抗体結合（セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ）を、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰ）を用いて検出した。セツキシマブに結合されたβ−１，６−グルカンオリゴマーを特異的に検出するために、アフィニティー精製したヒト抗β−１，６−グルカン抗体を使用した（ウェルあたり３μｇ、室温で１時間）。検出は、抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ）を用いて実施した。ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって顕色した。６２０ｎｍのＯＤを１時間にわたり、毎分読み取った。各時点における３匹のマウスからの結果を平均し、標準誤差を決定した。図３１〜３５を参照のこと。抗体レベルを、セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブに対する時間の関数としてプロットした。各抗体の半減期は、半減するまでに要した時間で決定した。５量体オリゴマーとコンジュゲートされたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの半減期は、セツキシマブの半減期と同様であった。しかしながら、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのクリアランスは、低負荷量レベルであっても抗体にコンジュゲートされたオリゴマーが長くなると増加した。この結果は、より短いオリゴマーを有するｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのコンジュゲートが、ｉｎ  ｖｉｖｏである種の利点を有する場合があることを示唆する。より長いオリゴマー（５〜８量体）も検出されており、セツキシマブとコンジュゲートしたとき安定であった。
【０２６４】
実施例１６：腫瘍のないヌードマウスにおける、様々な負荷量でのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの薬物動態（ＰＫ）
本試験では、抗体あたり異なる負荷量のオリゴマーでの直接化学反応を使用して、５量体〜８量体のオリゴマーをコンジュゲートしたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを利用した。セツキシマブを対照として使用した。本実験には、ブロッキング及び染色緩衝液：ＰＢＳ中のカゼイン（Ｐｉｅｒｃｅ）ならびにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液（ＰＨ７．２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）を含んでいた。
【０２６５】
本実験例では、７週齢の雌ヌードマウスに抗β−１，６−グルカン抗体（ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体）をＩＰ注射し、２時間後に５ｍｇ／ｋｇのｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブまたはセツキシマブを注射した（１群３匹）。全抗体及びコンジュゲート抗体の循環レベルを評価するために、注射後の様々な時点（１時間〜９６時間）で末梢血採血によって採血した。抗凝固処理したチューブ（ＥＤＴＡ処理したチューブ）を使用して血漿を採取し、−７０℃で保存した。次いで、抗体（ＩｇＧ濃度）及びβ−１，６−グルカンオリゴマーの存在をＥＬＩＳＡ（１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ））によって決定した。
【０２６６】
組換えＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ製のペプチド））でコーティングした９６ウェルプレート中で、血漿またはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ対照（標準として）をインキュベートした。抗体を検出する際の希釈は１：５００であり、セツキシマブにコンジュゲートしたβ−１，６−グルカンを検出する際の希釈は１：１０であった。
【０２６７】
総ヒト抗体結合（セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ）を、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰ）を用いて検出した。セツキシマブに結合されたβ−１，６−グルカンオリゴマーを特異的に検出するために、アフィニティー精製したヒト抗β−１，６−グルカン抗体を使用した（ウェルあたり３μｇ、室温で１時間）。検出は、抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ）を用いて実施した。ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ））によって顕色した。６２０ｎｍのＯＤを１時間にわたり、毎分読み取った。各時点における３匹のマウスからの結果を平均し、標準誤差を決定した。抗体レベルを、セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブに対する時間の関数としてプロットした。各抗体の半減期は、半減するまでに要した時間で決定した。図３６〜４１を参照のこと。異なる負荷量の５量体とコンジュゲートされたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのＰＫプロファイルは、セツキシマブのＰＫプロファイルと同様であった。しかしながら、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのクリアランスは、低負荷量レベルであっても抗体にコンジュゲートされたオリゴマーが長くなると増加した。セツキシマブとコンジュゲートしたとき、β−グルカン（５〜８量体）は安定であった。ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのコンジュゲートは約３の負荷量で安定であった。オリゴマーもまた、約３の負荷量で安定であった。
【０２６８】
実施例１７：腫瘍のあるマウスにおけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの薬物動態（ＰＫ）
多くの治療用モノクローナル抗体の血漿クリアランスが、腫瘍のあるマウスでは、腫瘍のないマウスと比較して大幅に増強されることが多くの研究により示されており、これは標的介在性の排除経路の存在を示唆している。本発明のコンジュゲートの標的介在性の分解を評価するために、本発明者らは、ＥＧＦＲを発現するＨＣＴ−１１６ヒト大腸癌異種移植を有するマウスにおいても、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの血漿沈着を評価した。
【０２６９】
本試験では、抗体あたり３及び４オリゴマーの負荷量での直接化学反応を使用して、５量体オリゴマーをコンジュゲートしたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを利用した。セツキシマブを対照として使用した。本試験にはさらに、ブロッキング及び染色緩衝液：ＰＢＳ中のカゼイン（Ｐｉｅｒｃｅ）ならびにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液（ＰＨ７．２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）を含んでいた。ＥＬＩＳＡは、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いた１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）検出キットを使用して実施した。ＨＣＴ−１１６（ＫＲＡＳ変異型大腸癌）細胞を使用した。
【０２７０】
本実験では、７週齢の雌ヌードマウスに２．５×１０６個のＨＣＴ−１１６細胞をＳＣ移植した。腫瘍が１２０ｍｍ３を超える体積に達したとき、マウスを無作為に群（３マウス／群）に分け、ＩＶＩＧ（ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体を起源とする）で処置し、その２時間後にビヒクル対照、セツキシマブ、またはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを投与した（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）。ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの血漿薬物動態を処置後の様々な時点（１〜９６時間）で試験した。
【０２７１】
組換えＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ製のペプチド））でコーティングした９６ウェルプレート中で、血漿またはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ対照（標準として）をインキュベートした。抗体を検出する際の希釈は１：５００であり、セツキシマブにコンジュゲートしたβ−１，６−グルカンオリゴマーを検出する際の希釈は１：１０であった。総ヒト抗体結合（セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ）を、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰ）を用いて検出した。セツキシマブに結合されたβ−１，６−グルカンオリゴマーを特異的に検出するために、アフィニティー精製したヒト抗β−１，６−グルカン抗体を使用した（ウェルあたり３μｇ、室温で１時間）。検出は、抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ）を用いて実施した。ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ）によって顕色した。
【０２７２】
本実験から収集したデータの分析を実施した。腫瘍体積は、以下の式、ＴＶ（ｍｍ３）＝｛長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２｝／２に基づいて計算した。ＥＬＩＳＡ分析のため、６２０ｎｍのＯＤを１時間にわたり、毎分読み取った。各時点における３匹のマウスからの結果を平均し、標準誤差を決定した。図４２〜４４を参照のこと。抗体レベルを、セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブに対する時間の関数としてプロットした。各抗体の半減期は、半減するまでに要した時間で決定した。図４４は、腫瘍のないマウスと腫瘍のあるマウスにおけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのＰＫの比較を示す。抗体の安定性及びβ−１，６−グルカンの検出はＥＬＩＳＡによって評価した。図４５は、腫瘍のあるマウスにおける、３または４負荷量のβ−１，６オリゴマーとコンジュゲートされたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの比較を示す。抗体の安定性及びβ−１，６−グルカンの検出はＥＬＩＳＡによって評価した。抗体あたり４オリゴマーの負荷量よりも、３オリゴマーの負荷量で５量体オリゴマーと直接コンジュゲートされたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのＰＫの方が安定であった。腫瘍のある動物におけるＰＫがオリゴマーの負荷量が大きいほど低いことは、腫瘍依存性の分解により説明することができる。
【０２７３】
実施例１８：腫瘍のあるマウスにおけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの蓄積
本実施例の試験は、経時的に抗体蓄積をもたらさない投与レジメンを特定するために行った。
【０２７４】
本実施例では、抗体あたり３オリゴマーの負荷量での直接化学反応を使用して、５量体オリゴマーをコンジュゲートしたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを利用した。セツキシマブを対照として使用した。ブロッキング及び染色緩衝液（ＰＢＳ中のカゼイン（Ｐｉｅｒｃｅ））ならびにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液（ｐＨ７．２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）も利用した。ＥＬＩＳＡは、１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）検出キットを使用して実施した。
【０２７５】
本実施例では、７週齢の雌ヌードマウスに２．５×１０６個のＨＣＴ−１１６（ＫＲＡＳ変異型大腸癌）細胞をＳＣ移植した。腫瘍の体積が１２０ｍｍ３に達したとき、マウスを無作為に群（３マウス／群）に分け、ＩＶＩＧ（ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体を起源とする）で処置し、その２時間後にビヒクル対照、セツキシマブ、またはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを投与した。投与量は半減期によって決定し、週２回投与した（５ｍｇ／ｋｇ）。マウスに３回投与し、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの血漿を採取して、処置後のコンジュゲートの蓄積を試験した。
【０２７６】
組換えＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ製のペプチド））でコーティングした９６ウェルプレート中で、血漿またはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ対照（標準として）をインキュベートした。抗体を検出する際の希釈は１：５００であり、セツキシマブにコンジュゲートしたβ−１，６−グルカンオリゴマーを検出する際の希釈は１：１０であった。
【０２７７】
総ヒト抗体結合（セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ）を、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰ）を用いて検出した。セツキシマブに結合されたβ−１，６−グルカンオリゴマーを特異的に検出するために、アフィニティー精製したヒト抗β−１，６−グルカン抗体を使用した（ウェルあたり３μｇ、室温で１時間）。検出は、抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ）を用いて実施した。ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｋｉｔ（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ））によって顕色した。ＥＬＩＳＡ分析のため、６２０ｎｍのＯＤを１時間にわたり、毎分読み取った。
【０２７８】
本実験から収集したデータの分析を実施した。腫瘍体積は、以下の式に基づいて計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝｛長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２｝／２。各時点における３匹のマウスからの結果を平均し、標準誤差を決定した。図４６を参照のこと。抗体レベルを、セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブに対する時間の関数としてプロットした。各抗体の半減期は、半減するまでに要した時間で決定した。週２回の投与レジメンは、ＰＫによって決定した半減期に基づくと、抗体またはオリゴマーいずれの蓄積ももたらさない。この治療スケジュールを、マウス異種移植片モデルでのｍＡｂＸｉｔｅ−セツキシマブの有効性を評価する以降の実施例に使用した。
【０２７９】
実施例１９：腫瘍のないマウス及び腫瘍のあるマウスにおけるｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの薬物動態の安定性
抗体の安定性及びβ−１，６−グルカンの検出はＥＬＩＳＡによって評価した。本試験に利用したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのコンジュゲーションには、クリックケミストリー（ＤＢＣＯ）、４量体オリゴマー、及び抗体あたり３オリゴマーの負荷量を利用した。セツキシマブを対照として使用した。ブロッキング及び染色緩衝液：ＰＢＳ中のカゼイン（Ｐｉｅｒｃｅ）ならびにＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ緩衝液（ＰＨ７．２、０．０５％Ｔｗｅｅｎ）も利用した。ＥＬＩＳＡは、１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）検出キットを使用して実施した。
【０２８０】
本実施例では、７週齢の雌ヌードマウスに２．５×１０６個のＨＣＴ−１１６（ＫＲＡＳ変異型大腸癌）細胞をＳＣ移植した。腫瘍が１２０ｍｍ３を超える体積に達したとき、マウスを無作為に群（３マウス／群）に分け、ＩＶＩＧ（ヒト抗β−１，６−グルカンのポリクローナル抗体を起源とする）で処置し、その２時間後にビヒクル対照、セツキシマブ、またはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを投与した（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）。ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの血漿薬物動態を処置後の様々な時点（１〜９６時間）で試験した。
【０２８１】
組換えＥＧＦＲ（ｈＥＧＦＲ（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ製のペプチド））でコーティングした９６ウェルプレート中で、血漿またはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ対照（標準として）をインキュベートした。抗体を検出する際の希釈は１：５００であり、セツキシマブにコンジュゲートしたβ−１，６−グルカンオリゴマーを検出する際の希釈は１：１０であった。
【０２８２】
総ヒト抗体結合（セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ）を、ＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）−ＨＲＰ）を用いて検出した。セツキシマブに結合されたβ−１，６−グルカンオリゴマーを特異的に検出するために、アフィニティー精製したヒト抗β−１，６−グルカン抗体を使用した（ウェルあたり３μｇ、室温で１時間）。検出は、抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ抗体（マウス抗ヒトＩｇＧ２（Ｆｃ）−ＨＲＰ）を用いて実施した。ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して顕色した。ＥＬＩＳＡ分析のため、６２０ｎｍのＯＤを１時間にわたり、毎分読み取った。
【０２８３】
本実験から収集したデータの分析を実施した。腫瘍体積は、以下の式に基づいて計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝｛長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２｝／２。各時点における３匹のマウスからの結果を平均し、標準誤差を決定した。図４７〜５０を参照のこと。抗体レベルを、セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブに対する時間の関数としてプロットした。各抗体の半減期は、半減するまでに要した時間で決定した。直接コンジュゲートしたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブでの観察結果と対照的に、このｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのＰＫプロファイルは、腫瘍のあるマウスにおいて大幅に減少した。抗体は比較的安定したままであったが、β−１，６−グルカンオリゴマーは、小さいオリゴマー（４量体）及び負荷量３でも安定ではなかった。
【０２８４】
実施例２０：ＢＲＡＦ大腸癌細胞（ＣＲＣ）を有するヌードマウスにおける有効性試験
本試験に利用したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのグルカンのコンジュゲーションには、クリックケミストリー（ＤＢＣＯ）、４量体及び６量体のオリゴマー、ならびに抗体あたり３及び４オリゴマーの負荷量を利用した。
【０２８５】
本実施例では、７週齢の雌ヌードマウスの背側領域に１×１０６個のＨＴ−２９細胞（ヒトＢＲＡＦ変異型大腸腺癌細胞株）を移植した。腫瘍が約１１８〜３８３ｍｍ３に達したら、マウスを４つの試験処置群（ｎ＝５）に無作為に割り付けた。その結果、各群の平均腫瘍体積は同様であった（平均＝２５５．８±０．８ｍｍ３）。各抗体の投与前に、プールしたヒト抗体（ＩＶＩＧ）５００ｍｇ／ｋｇ（約０．１ｍＬ）をすべてのマウスに腹腔内（ＩＰ）注射する。ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ、セツキシマブ（５ｍｇ／ｋｇ）、及び対照を、ＩＶＩＧ投与から最低２時間後にＩＰ注射により投与した。本試験を通して、週２回腫瘍をモニターし、外カリパスを用いて腫瘍増殖率を測定した。処置初日の前後に腫瘍を測定した。体重も週２回収集した。最大腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したときにマウスを安楽死させた。腫瘍が潰瘍化した場合、腫瘍が歩行を妨げた場合、または身体状態の悪化があった場合にも、マウスを安楽死させた。元の体重からの減少が１５％を超えた場合にも、マウスを安楽死させた。動物は二酸化炭素（ＣＯ２）吸入により安楽死させた。
【０２８６】
本実験から収集したデータの分析を実施した。腫瘍体積は、以下の式に基づいて計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝｛長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２｝／２。結果を図５１〜５３に示す。４量体のＤＢＣＯ結合オリゴマーを用いたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブによる処置は、ＨＴ−２９腫瘍の増殖を遅延させた。ボーダーライン活性は、６量体のＤＢＣＯ結合オリゴマーで見られた。その実験設定では、セツキシマブも腫瘍増殖を遅延させていることに留意すべきである。
【０２８７】
実施例２１：ＫＲＡＳ大腸癌細胞（ＣＲＣ）をもつヌードマウスにおける有効性試験
本実施例では、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの有効性を、ＫＲＡＳ  ＣＲＣで処置したヌードマウスにおいて試験した。本試験に利用したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのグルカンのコンジュゲーションには、クリックケミストリー（ＤＢＣＯ）または直接化学反応、４量体〜６量体のオリゴマー、及び抗体あたり３オリゴマーの負荷量を利用した。
【０２８８】
本実施例では、７週齢の雌ヌードマウスに２．５×１０６個のＨＣＴ−１１６細胞（ＨＣＴ−１１６は、ヒトＫＲＡＳ変異型大腸癌細胞株である）をＳＣ移植した。腫瘍の体積が６７±１．３ｍｍ３の範囲内であるとき、マウスを無作為に群（１０マウス／群）に分け、ＩＶＩＧ（抗β−１，６−グルカン抗体を起源とする）で処置し、その２時間後にビヒクル対照、セツキシマブ、またはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを投与した。投与量は半減期によって決定し、週２回投与した（５ｍｇ／ｋｇ）。腫瘍体積は、週２回のキャリパー測定により評価した。体重は週２回モニターした。腫瘍の体積が２０００ｍｍ３に達した後、または体重が１５％超減少した場合にマウスを安楽死させた。
【０２８９】
本実験から収集したデータの分析を実施した。腫瘍体積は、以下の式に基づいて計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝｛長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２｝／２。結果を図５４及び５５に示す。４量体のＤＢＣＯ結合オリゴマーを用いたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブによる処置は、ＨＣＴ−１１６腫瘍の増殖を遅延させる。しかしながら、その実験では６量体のＤＢＣＯ結合オリゴマーは腫瘍増殖に効果を及ぼさなかった。これらの結果は、ＨＴ−２９異種移植片モデルで得られた結果を裏付けるとともに、より短いオリゴマーが、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブコンジュゲートのより良好なＰＫプロファイルによって説明できるような特定の利点を有し得ることを示唆している。増殖の阻害は、この実験において、４量体のＤＢＣＯ結合オリゴマーを有するｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブでも、５量体の直接コンジュゲートを有するｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブでも同様であった。
【０２９０】
実施例２２：ＫＲＡＳ  ＣＲＣをもつヌードマウスにおける有効性試験
本実施例では、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの有効性を、ＫＲＡＳ  ＣＲＣをもつヌードマウスにおいて試験した。本試験に利用したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのコンジュゲーションには、還元的アミノ化（直接）化学反応、５量体オリゴマー、及び抗体あたり３オリゴマーの負荷量を利用した。
【０２９１】
本実施例では、７週齢の雌ヌードマウスに２．５×１０６個のＨＣＴ−１１６細胞（ＨＣＴ−１１６は、ヒトＫＲＡＳ変異型大腸癌細胞株である）を移植した。腫瘍が約４６〜７９ｍｍ３に達したら、マウスを４つの試験処置群（ｎ＝９）に無作為に割り付けた。その結果、各群の平均腫瘍体積は同様であった（平均＝５７±３．５ｍｍ３）。各抗体の投与前に、プールしたヒト抗体（ＩＶＩＧ）５００ｍｇ／ｋｇ（約０．１ｍＬ）をすべてのマウスに腹腔内（ＩＰ）注射する。ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ、セツキシマブ（５ｍｇ／ｋｇ）、及び対照を、ＩＶＩＧ投与から最低２時間後にＩＰ注射により投与した。本試験を通して、週２回腫瘍をモニターし、外カリパスを用いて腫瘍増殖率を測定した。処置初日の前後に腫瘍を測定した。体重も週２回収集した。最大腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したときにマウスを安楽死させた。腫瘍が潰瘍化した場合、腫瘍が歩行を妨げた場合、または身体状態の悪化があった場合にも、マウスを安楽死させた。元の体重からの減少が１５％を超えた場合にも、マウスを安楽死させた。
【０２９２】
本実験から収集したデータの分析を実施した。腫瘍体積は、以下の式に基づいて計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝｛長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２｝／２。結果を図５６及び５７に示す。５量体の直接コンジュゲートを用いたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブによる処置は、平均で、かつ中央値を見ても腫瘍増殖遅延の向上を示した。
【０２９３】
実施例２３：ＫＲＡＳ  ＣＲＣをもつヌードマウスにおける用量反応
本実施例では、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの用量反応を試験した。本試験に利用したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのコンジュゲーションには、還元的アミノ化（直接）化学反応、５量体オリゴマー、及び抗体あたり約３オリゴマーの負荷量を利用した。
【０２９４】
本実施例では、７週齢の雌ヌードマウスに２．５×１０６個のＨＣＴ−１１６細胞（ＨＣＴ−１１６は、ヒトＫＲＡＳ変異型大腸癌細胞株である）をＳＣ移植した。腫瘍の体積が５１〜８０ｍｍ３の範囲内であるとき、マウスを無作為に群（９マウス／群）に分け、ＩＶＩＧ（抗β−１，６−グルカン抗体を起源とする）で処置し、その２時間後にビヒクル対照、セツキシマブ、またはｍＡｂＸｃｉｔｅ  ＥＧＦＲを投与した。投与量は半減期によって決定し、週２回投与した。様々な用量：各抗体について５、１０、１５ｍｇ／ｋｇを評価した。腫瘍体積は、週２回のキャリパー測定により評価した。体重は週２回モニターした。腫瘍の体積が２０００ｍｍ３に達した後、または体重が１５％超減少した場合にマウスを安楽死させた。
【０２９５】
本実験から収集したデータの分析を実施した。腫瘍体積は、以下の式に基づいて計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝｛長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２｝／２。結果を図５８〜６１に示す。
【０２９６】
実施例２４：ＫＲＡＳ  ＣＲＣをもつヌードマウスにおける用量反応
本実施例では、５量体の直接コンジュゲートを用いたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブによる処置は、用量依存的な腫瘍増殖遅延を示した。本試験に利用したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのコンジュゲーションには、還元的アミノ化（直接）化学反応、５量体オリゴマー、及び抗体あたり約３オリゴマーの負荷量を利用した。本試験では、ＫＲＡＳ  ＣＲＣをもつヌードマウスを繰り返して利用した。
【０２９７】
本実施例では、７週齢の雌ヌードマウスに３×１０６個のＨＣＴ−１１６細胞（ＨＣＴ−１１６は、ヒトＫＲＡＳ変異型大腸癌細胞株である）を移植した。腫瘍が約６５〜８９ｍｍ３に達したら、マウスを４つの試験処置群（ｎ＝７）に無作為に割り付けた。その結果、各群の平均腫瘍体積は同様であった（平均＝７４±１．２ｍｍ３）。各抗体の投与前に、プールしたヒト抗体（ＩＶＩＧ）５００ｍｇ／ｋｇ（約０．１ｍＬ）をすべてのマウスに腹腔内（ＩＰ）注射する。ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ、セツキシマブ（５ｍｇ／ｋｇ）、及び対照を、ＩＶＩＧ投与から最低２時間後にＩＰ注射により投与した。本試験を通して、週２回腫瘍をモニターし、外カリパスを用いて腫瘍増殖率を測定した。処置初日の前後に腫瘍を測定した。体重も週２回収集した。最大腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したときにマウスを安楽死させた。腫瘍が潰瘍化した場合、腫瘍が歩行を妨げた場合、または身体状態の悪化があった場合にも、マウスを安楽死させた。元の体重からの減少が１５％を超えた場合にも、マウスを安楽死させた。
【０２９８】
本実験から収集したデータの分析を実施した。腫瘍体積は、以下の式に基づいて計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝｛長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２｝／２。腫瘍増殖阻害（ＴＧＩ）は、以下の式に基づいて計算した：ＴＧＩ％＝（ｘ日目のＴＶビヒクル−初日のＴＶビヒクル）−（ｘ日目のＴＶ処置−初日のＴＶ処置）×１００／（ｘ日目のＴＶビヒクル−初日のＴＶビヒクル）。ＴＧＩが５０％を超えると有意とみなされる。腫瘍体積の結果（図６２及び６３を参照）及び生存曲線（図６４を参照）を示す。５量体の直接コンジュゲートを用いたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブによる処置は、平均で、かつ中央値を見ても腫瘍増殖遅延の向上を示した。セツキシマブまたはｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのいずれかを投与されたこれらのＨＣＴ−１１６腫瘍のあるマウスにおける本有効性試験は、セツキシマブで処置されたマウスと比較して、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを投与されたマウスの方が長く生存することを示した。このデータは、ＥＧＦＲ陽性腫瘍に特異的に送達されたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブが、セツキシマブによってＫＲＡＳ変異体の状態を問わず腫瘍増殖を抑制でき、大腸癌における個別化臨床治療戦略の機会を与え得ることを示唆している。
【０２９９】
実施例２５：ＫＲＡＳ  ＣＲＣをもつヌードマウスにおける腫瘍再負荷アッセイ
ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ（５量体の直接コンジュゲーション）を投与された、ＨＣＴ−１１６腫瘍のあるマウスにおける有効性試験は、セツキシマブで処置されたマウスよりもｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブを投与されたマウスの方が長く生存することを示した。この生存は、腫瘍の退縮または停滞のいずれかをマウスが示すことと関連していた。
【０３００】
獲得免疫記憶応答の生成は腫瘍の再発及び転移を予防するために不可欠であるため、本発明者らは、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブが有効な抗腫瘍免疫記憶を誘導できるかどうかも検討することにした。それを行うために、腫瘍再負荷アッセイを使用した。その理由は、確立された記憶応答についてだけではなく、宿主免疫系が全身がんの再発を制御する能力についての確固とした測定値でもあるからである。ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ処置を中断して、ＨＣＴ−１１６細胞をマウスに再負荷した。
【０３０１】
処置中断の１７日後に、２．５×１０６個のＨＴＣ−１１６細胞をヌードマウスに皮下（ＳＣ）再移植した。腫瘍体積は、週２回のキャリパー測定により評価した。体重は週２回モニターした。腫瘍の体積が２０００ｍｍ３に達した後、または体重が１５％超減少した場合にマウスを安楽死させた。
【０３０２】
腫瘍体積は、以下の式に基づいて計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝｛長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２｝／２。結果を図６５及び６６に示す。各図は、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブが腫瘍増殖を阻害し、ＨＣＴ−１１６による再負荷からマウスを保護することを示している。原発腫瘍と二次腫瘍が示されている。５ｍｇ／ｋｇのセツキシマブ（図６５及び６６）、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ（図６５の５量体の直接コンジュゲート）、または他の構築物（図６６）で処置された個々のマウスについての増殖曲線を示す。
【０３０３】
ヌードマウスに存在するＴ細胞が低レベルであるにもかかわらず、負荷量３で５量体に直接コンジュゲートされたセツキシマブが、幾匹かのマウスにおいて持続的効果をもたらすことを示した。具体的には、本発明者らは、腫瘍の退縮または停滞のいずれかを示すマウスで、がん細胞による再負荷時に二次腫瘍が増殖していないことを実証した。これは、好中球が記憶を付与する反応を開始することを示唆している。この効果は、セツキシマブ、またはクリックＤＢＣＯリンカーを利用してコンジュゲートされたｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブで最初に処置したマウスには観察されなかった。
【０３０４】
実施例２６：ＢＲＡＦ  ＣＲＣをもつヌードマウスにおけるＴ細胞の枯渇
ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブが有効性及び抗腫瘍免疫記憶を示すことから、本発明者らは、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの直接コンジュゲートの全体的な抗腫瘍効果が細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）に依存するかどうかを検討することにした。ＣＤ８＋Ｔリンパ球は、多くの腫瘍の増殖制御に関与する主要な細胞集団である。しかしながら、ＣＴＬがｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの治療効果に不可欠であるかどうかを検討するために、ＣＤ８及びＣＤ４の両方を枯渇する抗体を投与した。
【０３０５】
ＣＤ８＋ＣＤ４＋枯渇抗体を３匹のマウスに投与した。そのうち２匹は完全に腫瘍が退縮し、１匹は処置中断期間及び再負荷後の４０日間にわたって引き続き腫瘍の停滞を示した。ＣＤ８及びＣＤ４枯渇抗体は、実験期間にわたり週２回投与した。腫瘍体積は、週２回のキャリパー測定により評価した。体重は週２回モニターした。腫瘍の体積が２０００ｍｍ３に達した後、または体重が１５％超減少した場合にマウスを安楽死させた。
【０３０６】
腫瘍体積は、以下の式に基づいて計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝｛長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２｝／２。腫瘍が退縮した２匹のマウスは枯渇による影響を受けなかった。しかしながら、増殖が鈍化したマウスは枯渇後に腫瘍が指数関数的に増殖した。結果を図６７に示す。結果は、ＣＤ８＋ＣＤ４＋細胞の枯渇が、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの治療効果を著しく損なったことを示しており、これは、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ直接コンジュゲートの抗腫瘍効果が確かに獲得免疫Ｔ細胞に依存していること、自然免疫系の好中球の活性化が、獲得免疫系のＴ細胞の活性化へと進行することを示唆している。
【０３０７】
実施例２７：ＫＲＡＳ  ＣＲＣをもつヌードマウスにおける有効性試験
本実施例では、ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブの有効性を、ＫＲＡＳ  ＣＲＣをもつヌードマウスにおいて試験した。本試験に利用したｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブのコンジュゲーションには、還元的アミノ化（直接）化学反応、４量体または６量体のオリゴマー、及び抗体あたり２．３、２．５、または５オリゴマーの負荷量を利用した。
【０３０８】
本実施例では、７週齢の雌ヌードマウスに２．５×１０６個のＨＣＴ−１１６細胞（ＨＣＴ−１１６は、ヒトＫＲＡＳ変異型大腸癌細胞株である）を移植した。腫瘍が約４６〜７９ｍｍ３に達したら、マウスを４つの試験処置群に無作為に割り付けた。その結果、各群の平均腫瘍体積は同様であった。各抗体の投与前に、プールしたヒト抗体（ＩＶＩＧ）５００ｍｇ／ｋｇ（約０．１ｍＬ）をすべてのマウスに腹腔内（ＩＰ）注射する。ｍＡｂＸｃｉｔｅ−セツキシマブ、セツキシマブ（５ｍｇ／ｋｇ）、及び対照を、ＩＶＩＧ投与から最低２時間後にＩＰ注射により投与した。本試験を通して、週２回腫瘍をモニターし、外カリパスを用いて腫瘍増殖率を測定した。処置初日の前後に腫瘍を測定した。体重も週２回収集した。最大腫瘍体積が２０００ｍｍ３に達したときにマウスを安楽死させた。腫瘍が潰瘍化した場合、腫瘍が歩行を妨げた場合、または身体状態の悪化があった場合にも、マウスを安楽死させた。元の体重からの減少が１５％を超えた場合にも、マウスを安楽死させた。
【０３０９】
本実験から収集したデータの分析を実施した。腫瘍体積は、以下の式に基づいて計算した：ＴＶ（ｍｍ３）＝｛長さ（ｍｍ）×幅（ｍｍ）２｝／２。結果を図６８〜７３に示す。
【０３１０】
実施例２８：ゲンチオペントースの合成
プスツランからのオリゴマー精製に加え、合成方法によって好適なグルカンを調製することができる。例えば、ゲンチオペントースを以下の方法で調製することができる。
【０３１１】
以下の例示的な糖の合成は、３つの「構成単位」（構成単位１、構成単位２、及び構成単位３）の調製から開始する。２つの「構成単位」（構成単位１及び構成単位２）は、Ｄ−アミグダリンから調製される保護されたダイマーである。構成単位３はグルコースから調製される。
【０３１２】
スキーム１は、構成単位１の合成を示している。
【化４８】
2020510622.tif 000067
【０３１３】
化合物１（Ｄ−アミグダリン；Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ及びＢｏｓｃｈｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから市販されている）をピリジン及びＤＭＡＰの存在下で塩化ベンゾイルと反応させてベンゾイルエステル２を得た（収率８１％）。ベンゾイルエステル２をトルエンとアセトンの３：２混合物に溶解し、Ｈ２の存在下で、５０％湿潤した触媒量の炭素担持Ｐｄ（ＯＨ）２に曝露することによって還元し、オリゴ糖３（９３％）を得た（「構成単位１」）。２工程全体の収率は７５％であった。
【０３１４】
スキーム２は、構成単位２の合成を示している。
【化４９】
2020510622.tif 000068
【０３１５】
最初に化合物１を、イミダゾール及びＤＭＦの存在下でジメチルテキシルシリルクロリド（ＴｈｅｘＤＭＳ−Ｃｌ）と反応させて６−ヒドロキシル部分を選択的に保護し、化合物４ａを得た（収率８２％）。次に、化合物４ａをピリジン及びＤＭＡＰの存在下で塩化ベンゾイルと反応させてベンゾイルエステル４を得た（収率８１％）。何らかの特定の理論に束縛されるものではないが、ＴｈｅｘＤＭＳの使用は、グリコシル化時にジメチル−ｔｅｒｔ−ブチルシリル部分が容易に切断されるため有利であると考えられる。次に、ベンゾイルエステル４をトルエン／アセトン混合物（３：２比）に溶解し、Ｈ２の存在下で、５０％湿潤した触媒量の炭素担持Ｐｄ（ＯＨ）２に曝露することによって還元し、オリゴ糖５（９３％）を得た（「構成単位２」）。工程全体の収率は６１％であった。
【０３１６】
スキーム３は、構成単位３の合成を示している。
【化５０】
2020510622.tif 000069
【０３１７】
最初に化合物６（ＶＷＲから市販されているグルコース）を塩化アセチルの存在下でアリルアルコールと反応させ、化合物６ａを得た。化合物６ａをピリジンの存在下で加熱しながらトリチルクロリドと反応させて、化合物６ｂを得ることにより、化合物６ａの６−ヒドロキシル位置を保護した。化合物６ｂをピリジン及びＤＭＡＰの存在下で塩化ベンゾイルと反応させて、ベンゾイルエステル６ｃを得ることにより、化合物６ｂの残りのヒドロキシル部分を保護した。化合物６ｃを、メタノールとジクロロメタンの混合物中にて０℃で三フッ化ホウ素エーテラートと反応させ、化合物７（「構成要素３」）を得た。構成単位３の合成は全収率４２％で行われた。
【０３１８】
スキーム４は、ゲンチオトリオースの合成を示している。
【化５１】
2020510622.tif 000070
【０３１９】
化合物５をジクロロメタン中の触媒ＤＢＵの存在下でＣｌ３ＣＣＮと反応させ、トリクロロイミデート８を得た。化合物８を塩基不活性化シリカのプラグに再度通過させてベースライン物質を除去し、それ以上何も操作せずに先に進んだ。化合物８を化合物７（構成単位３）とシュミットグリコシル化条件下で反応させ（成分を−４０℃で触媒トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネートと反応させる）、化合物９（ゲンチオトリオース）を得た。この２工程全体の収率は７０％であった。
【０３２０】
スキーム５は、ゲンチオペントース１２を形成するグリコシル化を示している。
【化５２】
2020510622.tif 000071
【０３２１】
ゲンチオトリオース９を０℃でメタノール中の三フッ化ホウ素エーテラートで処理した後、室温に温めて化合物１０を得た。化合物３（構成単位１）をジクロロメタン中の触媒ＤＢＵの存在下でＣｌ３ＣＣＮと反応させ、トリクロロイミデート１１を得た。トリクロロイミデート１１と化合物１０をシュミットグリコシル化条件下で反応させ、完全に保護されたゲンチオペントース１２を得た。この工程全体の収率は６０％であった。
【０３２２】
スキーム６は、ゲンチオペントース１２の脱保護を示している。
【化５３】
2020510622.tif 000072
【０３２３】
ゲンチオペントース１２をメタノールとジオキサンの混合物中で触媒量の塩化パラジウムと接触させてアリル部分を除去した。得られた生成物を、メタノールとＴＨＦの混合物中で生成物を触媒量のナトリウムメトキシドと反応させることにより全体的に脱保護し、ゲンチオペントース１３を得た。１０段階の直線工程（全１６工程）の全収率は１４％であった。
【０３２４】
実施例２９：２−アジドエチルゲンチオテトロースの合成
スキーム７は、実施例７に記載されるように調製される、構成単位２へのアジド部分の組み込みを示している。
【化５４】
2020510622.tif 000073
【０３２５】
化合物５（構成単位２）をジクロロメタン存在下の触媒量のＤＢＵの存在下でＣｌ３ＣＣＮと反応させ、トリクロロイミデート８を得た。トリクロロイミデート８をシュミットグリコシル化条件下で反応させ、化合物１４を得た。化合物１４を全収率７０％で合成した。
【０３２６】
スキーム８は、２−アジドエチルゲンチオテトロースの合成を示している。
【化５５】
2020510622.tif 000074
【０３２７】
メタノール中の三フッ化ホウ素エーテラート錯体の処理によって化合物１４を脱保護し、化合物１５を得た。化合物３（構成単位１）をトリクロロアセトニトリル及び触媒ＤＢＵで処理して化合物１１を得た。次に、化合物１４及び化合物１１にシュミットグリコシル化条件を施し、ゲンチオテトロース生成物１６を得た。この一連の全収率は６０％であった。
【０３２８】
実施例３０：２−アジドエチルゲンチオヘキソースの合成
本実施例は、グルカン合成のためのさらなる方法を提供する。スキーム９は、ゲンチオトリオース１７の合成を示している。
【化５６】
2020510622.tif 000075
【０３２９】
化合物３（構成単位１）をジクロロメタン中の触媒ＤＢＵの存在下でＣｌ３ＣＣＮと反応させ、トリクロロイミデート１１を得た。トリクロロイミデート１１をシュミットグリコシル化条件下で化合物７（構成単位３）と反応させてゲンチオトリオース１７を得た（全収率７２％）。
【０３３０】
スキーム１０は、ゲンチオトリオース９への２−アジドエチル部分の組み込みを示している。
【化５７】
2020510622.tif 000076
【０３３１】
８０℃で酢酸中の触媒量のパラジウム（０）テトラキストリフェニルホスフィンに曝露し、化合物１８を得ることにより、ゲンチオトリオース９を脱保護した。メタノール中の塩化パラジウムを利用した結果、アリル部分の還元に加えて、シリル部分が失われた。遊離ヒドロキシル部分がトリクロロイミデート１９として官能化された後に、典型的なルイス酸条件下で２−アジドエタノールのグリコシル化を生じさせ、生成物２０を得た。この一連の工程で、全収率５６％の２−アジドエチルゲンチオトリオースを得た。
【０３３２】
スキーム１１ａ〜ｃは、２−アジドエチルゲンチオヘキソース２４の合成を示している。
【化５８】
2020510622.tif 000077
【０３３３】
スキーム１１ａに示すように、化合物２０をメタノール中の三フッ化ホウ素エーテラート錯体と反応させて、化合物２１を得た（収率７５％）。
【化５９】
2020510622.tif 000078
【０３３４】
スキーム１１ｂに示すように、化合物１７をメタノールとジオキサンの混合物中で、塩化パラジウム（ＩＩ）で還元して、化合物２２を得た（収率９２％）。化合物２２をジクロロメタン中の触媒ＤＢＵの存在下でＣｌ３ＣＣＮと反応させ、トリクロロイミデート２３（収率８６％）を得た。
【化６０】
2020510622.tif 000079
【０３３５】
スキーム１１ｃに示すように、化合物２１及び２３をシュミットグリコシル化条件下にし、目的生成物２４を得た（収率８３％）。全合成過程で、収率６２％で化合物２４が得られた。
【０３３６】
実施例３１：コンジュゲート前駆体の合成
いくつかの実施形態では、糖オリゴマーはさらに、オリゴマーを抗体にコンジュゲートするのに有用な官能基に結合されたリンカー部分を含むことができる。したがって、以下の合成例は、糖オリゴマー（例えば、実施例１のようにプスツランから単離されるか、または実施例７〜９で上述のように調製された糖オリゴマー）の使用方法、及び抗体へのオリゴマーのコンジュゲーションを補助するための官能基の付加方法を示している。この化合物はまだ抗体とコンジュゲートされていないため、本明細書ではこれを「コンジュゲート前駆体」と呼ぶ。以下に、上記の抗体とコンジュゲートするのに適した３つの例示的な前駆体を示す。
【０３３７】
コンジュゲート前駆体Ｂ
コンジュゲート前駆体Ｂの合成は、スキーム１２に従って調製することができる：
【化６１】
2020510622.tif 000080
【０３３８】
Ｂ−１をＮａＢＨ３（ＣＮ）及び酢酸ナトリウムの存在下で４−（アミノメチル）安息香酸と接触させた。反応が完了するまで、反応物を５０℃で撹拌した。次に、生成物を０℃でホルムアルデヒド、ＮａＢＨ３（ＣＮ）、及び酢酸ナトリウムで処理した。反応物を撹拌し、室温に温めて生成物Ｂ−２を得た。
【０３３９】
Ｂ−２をＤＭＦに溶解した。ＴＳＤＵをこの溶液に添加し、続いてＤＩＰＥＡに添加した。反応が完了するまで溶液を撹拌して、コンジュゲート前駆体Ｂを得た。
【０３４０】
コンジュゲート前駆体Ｃ
コンジュゲート前駆体Ｃの合成は、スキーム１３に従って調製することができる：
【化６２】
2020510622.tif 000081
【０３４１】
Ｃ−１をＤＭＳＯに溶解し、５０℃でプロパ−２−イン−１−オール及びＣｕＩと接触させた。反応が完了するまで反応物を撹拌して、Ｃ−２を得た。Ｃ−２をデスマーチン試薬の存在下でＤＣＭに溶解してＣ−３を得た。Ｃ−３をメタノールとＴＨＦの溶液に溶解し、ナトリウムメトキシドと接触させてコンジュゲート前駆体Ｃを得た。
【０３４２】
コンジュゲート前駆体Ｄ
コンジュゲート前駆体Ｄの合成は、スキーム１４に従って調製することができる：
【化６３】
2020510622.tif 000082
【０３４３】
Ｄ−１をＮａＢＨ３（ＣＮ）及び酢酸ナトリウムの存在下で２−アジドエタン１−アミンと接触させた。反応が完了するまで、反応物を５０℃で撹拌した。次に、生成物を０℃でホルムアルデヒド、ＮａＢＨ３（ＣＮ）、及び酢酸ナトリウムで処理した。反応物を撹拌し、室温に温めて生成物Ｄ−２を得た。
【０３４４】
Ｄ−２をＤＭＳＯに溶解し、５０℃でペンタ−４−イナール及びＣｕＩと接触させた。反応が完了するまで溶液を撹拌して、コンジュゲート前駆体Ｄを得た。
【０３４５】
他の実施形態
本発明のいくつかの実施形態を本明細書に記載しているが、本開示及び実施例を改変して、本発明の他の方法及び組成物を提供することができる。したがって、本発明の範囲は、例として示された特定の実施形態に加えて、添付の特許請求の範囲によって定義されるようなものであることが理解されよう。本明細書で引用された参考文献はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2020510622.tif 000100
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
2020510622.tif 000133
【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
2020510622.tif 000139
【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【国際調査報告】
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