(57)【要約】本開示は、結晶状態及び／又は結晶化中の化合物の分析のための方法及びシステムに関する。二次元相関（２ＤＣＯＳ）及び共分布分析（２ＤＣＤＳ）分析プロットを生成及び分析できる。非同期プロットは、事象の順序を確立するのに役立つ。凝集に関連する自己ピークと相関する正のクロスピークを同定できる。自己ピークは、最も摂動された分子の領域をすばやく識別するために参照でき、これは、分子の結晶化状態の駆動力を示す。どの種類の官能基（例えば領域）が最も摂動されるか（正の、強い自己ピーク）を決定することができ、異なる自己ピークがどのように最大の強度変化を持つようになるかを観察することができる。結晶化の様々な段階の同期プロットにおける自己ピークのこれらの変化は、アモルファス状態から結晶状態までの過程の動態に関する情報を提供することができる。
2020523606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
結晶状態及び／又は結晶化中の化合物の特性を表すデータを処理するための方法であって：
適用された摂動に関する化合物のスペクトルデータを取得すること；
二次元相関（２ＤＣＯＳ）分析を適用して、化合物の同期相関プロットを生成すること；
同期相関プロットにおいて、化合物の凝集に関連する自己ピークと相関するクロスピークを特定すること；及び
クロスピークを使用して、化合物の結晶化の特性を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
結晶化の特性は、化合物の核生成から結晶形への転移に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
結晶化の特性を決定することは、結晶化の特性を、適用された摂動に関するスペクトル強度の分布存在の順序と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
結晶化の特性を決定することは、核生成事象の条件を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
結晶化の特性を決定することは、化合物とその環境との水素結合相互作用の減少を検出することにより、結晶化による脱水事象を評価することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
結晶化の特性を決定することは、化合物内の振動モードを決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記特定されたピーク強度は、強度の変化が観察される温度範囲を決定するために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記凝集プロセスの強度限界を画定し、各強度値と前記限界内の最大強度値との比によって定義される前記強度限界内の各強度値の小数値を決定することをさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
凝集プロセスにおいて存在する各ピークの前記限界によって画定されるように、初期及び最終の小数値を特定し、少なくとも前記初期及び最終の小数値に基づいて、凝集量を決定することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
結晶状態及び／又は結晶化中の化合物の特性を表すデータを処理するためのシステムであって：
適用された摂動に関する化合物のスペクトルデータを取得するように構成されたデータ取得モジュールと；
相関分析モジュールであって：
二次元相関（２ＤＣＯＳ）分析を適用して、化合物の同期相関プロットを生成し；
同期相関プロットにおいて、化合物の凝集に関連する自己ピークと相関するクロスピークを特定し；
クロスピークを使用して、化合物の結晶化の特性を決定するように構成された相関分析モジュールと
を含むシステム。
【請求項１１】
表示用の１つ以上のプロットを生成するための視覚モデルジェネレータをさらに含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
ヒューマンインターフェースを含むヒューマンインタラクションモジュールをさらに含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１３】
データ取得モジュールは、量子カスケードレーザ顕微鏡を含む、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１４】
結晶状態及び／又は結晶化中の化合物の特性を表すデータを処理するための方法であって：
適用された摂動に関する化合物のスペクトルデータを取得すること；
二次元共分布（２ＤＣＤＳ）分析を適用して、化合物の非同期共分布プロットを生成すること；
非同期共分布プロットにおいて、化合物の凝集に関連する自己ピークと相関するクロスピークを特定すること；及び
クロスピークを使用して、化合物の結晶化の特性を決定すること
を含む方法。
【請求項１５】
クロスピークを使用することは：
２つの波数ν１及びν２について、２つの波数に対応するクロスピークが正の値を有するか否かを決定し；
クロスピークが正の値を有する場合、ν１でのスペクトル強度の存在は、ν２でのスペクトル強度の存在が分布している間隔よりも低い適用された摂動の間隔内で分布していると決定することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
クロスピークを使用することは：
２つの波数ν１及びν２について、２つの波数に対応するクロスピークが負の値を有するか否かを決定し；
クロスピークが負の値を有する場合、ν２でのスペクトル強度の存在は、ν１でのスペクトル強度の存在が分布している間隔よりも低い適用された摂動の間隔内で分布していると決定することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
スペクトルデータはＦＴ−ＩＲスペクトルデータである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
非同期共分布プロットにおける非同期共分布強度は、２つのスペクトル信号の分布の差として表される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
適用される摂動は、時間、温度、濃度、又は圧力である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
二次元共分布（２ＤＣＤＳ）分析を適用して、化合物の同期共分布プロットを生成すること；
同期共分布プロットにおいて、化合物の凝集に関連する同期共分布ピークを特定すること；及び
同期共分布ピークを使用して、適用された摂動に関するスペクトル強度の分布パターンの重なりの程度を決定すること
をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
同期共分布ピークを使用することは、２つの波数ν１及びν２について、２つの波数に対応する同期共分布ピークが特定の範囲内にあるか否かを決定することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
二次元相関（２ＤＣＯＳ）分析を適用し、化合物の同期相関プロット及び非同期相関プロットを生成すること；
同期相関プロットにおいて、化合物の凝集に関連する自己ピークと相関する正のクロスピークを特定すること；及び
スペクトルデータの特定されたピーク強度を使用して、化合物の凝集量を決定すること
をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
化合物の凝集量を、適用された摂動に関してスペクトル強度の分布存在の順序と比較することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
スペクトルデータを取得することは、化合物を含むサンプルに対してＱＣＬ赤外分光法を実施することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
微粒子及び溶液の識別のために関心領域を認識することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
微粒子の集団分布を確認するために微粒子のサイズ及び数を決定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２７】
スペクトルデータを分析して、信号対雑音比を確認し、ベースライン補正を実行し、水蒸気含有量を決定し、及び／又はスペクトル領域内の信号強度を決定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
サンプルの摂動に基づいて共分散又は動的スペクトルデータを生成することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２９】
同期プロットで得られた互いに同位相のスペクトルデータにおける、ピーク強度を含む変化を相関させることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３０】
前記スペクトルデータにおいて変化する要素を決定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３１】
スペクトルデータにおける全体的な最大強度変化を決定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３２】
スペクトルデータにおける全体的な最小強度変化を決定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３３】
バンドにおける基になるスペクトルの寄与の最小数を決定し、カーブフィッティング分析を実行し、サンプルの二次構造組成を決定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３４】
スペクトルデータの解像度を向上させることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３５】
非同期プロットで得られた互いに逆位相のスペクトルデータにおけるピーク強度を含む変化を相関させることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３６】
化合物中のアミノ酸側鎖の脱アミノ化の存在及び／又は程度を決定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３７】
化合物のドメインの安定性を決定することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項３８】
結晶状態及び／又は結晶化中の化合物の特性を表すデータを処理するためのシステムであって：
適用された摂動に関する化合物のスペクトルデータを取得するように構成されたデータ取得モジュールと；
相関分析モジュールであって、
二次元共分布（２ＤＣＤＳ）分析を適用して、化合物の非同期共分布プロットを生成し；
非同期共分布プロットにおいて、化合物の凝集に関連する自己ピークと相関するクロスピークを特定し；
クロスピークを使用して、化合物の結晶化の特性を決定するように構成された相関分析モジュールと
を含むシステム。
【請求項３９】
表示用の１つ以上のプロットを生成するための視覚モデルジェネレータをさらに含む、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４０】
ヒューマンインターフェースを含むヒューマンインタラクションモジュールをさらに含む、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４１】
データ取得モジュールは、量子カスケードレーザ顕微鏡を含む、請求項３８に記載のシステム。
【請求項４２】
非結晶性生理学的状態の同じ化合物の同じ特性を表すデータを処理し、結晶状態又は結晶化中の化合物の特性を非結晶性生理学的状態の化合物の特性と比較することをさらに含む、請求項１〜９及び１４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１７年６月１２日に出願された米国仮出願第６２／５１８，３７６号の利益を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。上記ＡＳＣＩＩのコピーは２０１８年６月１１日に作成され、その名前は０９８２１０−００２４＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１６，２４１バイトである。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質凝集現象は、産業用バイオプロセス全体でよくあることである。タンパク質は、複雑な物理化学的特性のために、発現、分離、及び精製に費用がかかる。凝集は、タンパク質分解の主要な態様であり、免疫原性、患者における抗薬物抗体反応（ＡＤＡ）、及び効力の喪失につながる場合がある。タンパク質凝集体の検出及び測定は、バイオ医薬品業界及びその他の科学研究分野の主要な目的である。タンパク質凝集体の形成は、タンパク質治療薬（すなわち、生物学的製剤又はバイオシミラー）の生産に大きく影響し、生産収率を効果的に低下させる可能性があるため、産業用途で重要である。
【発明の概要】
【０００４】
本願の技術は、例えば、以下で説明される様々な態様に従って示されている。本願の技術の態様の様々な例を以下に説明する。これらは例として提供されており、本願の技術を限定するものではない。
【０００５】
タンパク質結晶学の分野では、タンパク質結晶検出の領域で未だ改善が必要とされている。結晶スクリーニングの自動化の努力がなされても、結晶スクリーンのモニタリングとその後の検出ボトルネックが観察された場合には欠点が存在する。現在、ＵＶの使用は、タンパク質がその配列にトリプトファン又はいくつかのチロシン残基を含む場合にのみ有用である。可視スペクトルが日常的に使用されているが、結晶が塩かタンパク質かを区別することはできない。第二高調波発生（ＳＨＧ）には多くの場合、結晶化条件に応じて偽陽性と偽陰性の両方がある。さらに、結晶化プロセス中にあるタンパク質の詳細な評価、その安定性、分子状態、又は同定を提供するものはない。
【０００６】
本願の技術の態様には、ＱＣＬ顕微鏡、スライドセルアクセサリ、及びカスタムスライドセルの使用が含まれ、タンパク質、タンパク質−標的、及び／又はタンパク質薬物複合体の結晶化過程を成功裏に評価するための画期的なアプローチを提供する。この方法は、様々な温度及び結晶化条件下でハイパースペクトル画像（ＨＳＩ）を取得することを伴い、溶液中のタンパク質を代表し、回折パターンの収集中に貴重なビーム時間の損失を伴う凝集体又は塩の結晶から識別される、安定したタンパク質結晶の選択に関する包括的な理解が得られる。この方法は、スライドセルアクセサリ、スライドセル、及び詳細な分子分析のための２Ｄ  ＩＲ及び共分散アルゴリズムを含む分析技術を使用することにより、サンプルのアレイをハイスループットで比較評価できる。
【０００７】
本願の技術の態様は、小分子、ポリマー、タンパク質、ペプチド及び／又はペプトイドを含む分子の結晶及び／又は結晶化を分析する方法を提供する。
本願の技術の態様によれば、結晶化を研究するために、タンパク質サンプルが分光分析され、スペクトルデータが分析される。この方法及び／又はその一部は、完全に自動化でき、結晶化のメカニズムの決定に使用できる。
【０００８】
ＱＣＬＭ及び２Ｄ  ＩＲ相関分光法の組合せにより、様々な温度条件下で溶液からの分子の核生成及び結晶化をモニタリングできる。その意味合いは、ガラス転移温度（Ｔｇ）及び生成される結晶の種類、ならびにその成長の間の関係を理解することを含む。この組合せは、溶液の視覚画像であるために強力であり、結晶、及び２Ｄ  ＩＲ相関分光法を使用したＱＣＬ  ＩＲスペクトルデータの分析を使用して、平衡状態の熱力学的事象を温度との関係で記述することができる。フェーズ図も生成できる。結晶化の動態は、ハイパースペクトル画像（ＨＳＩ）を介して事象をリアルタイムでモニタリングすることでモニタリングできる。結晶のサイズ及び二次元寸法は、低倍率（１視野：最大２．０ｍｍで３〜５μｍの画像ピクセルサイズ）又は高倍率（１視野：６５０μｍで１．４μｍの画像ピクセルサイズ）の対物レンズを使用してモニタリングできる。量子カスケードレーザは、１８００〜９００ｃｍ−１のスペクトル領域内で強化された信号対雑音比（ＳＮＲ）を提供する。また、温度制御されたアクセサリと一緒にカスタムスライドセルを使用して、同じ温度摂動条件下でサンプルのアレイを評価できる。本願の技術は、（１）沈殿剤を含む溶媒条件、及び（２）同じ結晶化条件下での異なる分子の比較研究を促進する。結晶化条件に水性媒体が含まれる場合、中赤外領域の指紋領域内のバンドを狭めることにより脱水の証拠を観察でき、それにより溶媒和及び脱水のさらなる理解が得られる。本願の技術は水性媒体に限定されず、溶媒の混合物及び分子（例えば小分子）の結晶化におけるそれらの効果を含む。分子（例えば、小分子）の結晶化過程は、溶媒及び対象の分子内の官能基の異なる振動モードをモニタリングすることで研究できる。最後に、分子相互作用も決定できるため、結晶内のこれらの分子の動態も提供する。
【０００９】
本願の技術の態様によれば、本明細書に記載の方法は、単一成分としての、又は他のペプチド又は脂質混合物との二成分もしくは三成分混合物としての、膜タンパク質、親水性タンパク質、ペプチド及びペプトイドに適用できる。混合物の場合、成分の１つは、各成分の同時検出を容易にするために、任意選択で同位体標識されてもよい。
【００１０】
本願の技術の態様によれば、サンプル調製の柔軟性、自動化の可能性、及び医薬品タンパク質製剤への有用性が証明されたデータ分析が可能になる。
本願の技術の態様によれば、本明細書に記載の方法は、水性又は脂質性のいくつかの環境における任意の分子、例えば小分子、ポリマー、タンパク質、ペプチド又はペプトイド試料に適用することができる。本明細書に記載の方法は、結晶化を評価するために定性的及び／又は定量的に使用できる。データ分析が実施され、それによって結晶化のメカニズムが決定され、結晶の安定性及び／又はその他の特性が決定される。
【００１１】
本願の技術の一態様によれば、この方法は、結晶化又は結晶の分析のために、透過フーリエ変換赤外（「ＦＴ−ＩＲ」）分光法及び／又は減衰全反射（「ＡＴＲ」）分光法、量子カスケードレーザ顕微鏡法（「ＱＣＬ」）、二次元相関分光法（「２ＤＣＯＳ」）、及び／又は二次元共分散型分光法（「２ＤＣＤＳ」）に関与する。本願の技術の態様によれば、ＦＴ−ＩＲ分光計、ＦＴ−ＩＲ顕微鏡、ＱＣＬ分光計又はＱＣＬ顕微鏡などの任意の適切な方法及び機器を使用してスペクトルデータを取得することができる。本願の技術の態様では、ＱＣＬ顕微鏡を使用してスペクトルデータを取得することが好ましい。
【００１２】
例えば、２ＤＣＤＳは溶液の分布母集団を確立するために使用することができる。したがって、結晶化前、核生成中、及び成長期中の分子の記述を確立するためにこれを使用できる。いくつかの実施形態では、２つの並行サンプルを評価することができる。一方は結晶とすることができ、定義上は均一であり、他方は溶液中の分子の挙動とすることができる。分析は、上述した段階における分子の異なるサブセットに関連していてもよい。
【００１３】
必要に応じて、温度及び／又は別の摂動を含み得る適用された摂動の存在下で、結晶又は結晶化を調べることができる。水溶液の場合、適用される摂動には、沈殿剤、ｐＨ、塩、及び／又は緩衝液の種類が含まれ得る。有機溶媒の場合、適用される摂動には溶媒の極性が含まれ得る。これに加え又はこれに代えて、適用される摂動には時間が含まれ得る（付随する摂動の有無は問わない）。
【００１４】
同期プロット及び非同期プロットの両方が生成及び分析され得る。例えば、非同期プロットは、事象の順序を確立するのに役立つ。凝集に関連する自己ピークと相関する正のクロスピークを特定することができる。自己ピークは、最も摂動された分子の領域をすばやく識別するために参照することができ、これは、分子の結晶化状態の駆動力を示す。最初に、分子が溶液中にあるとき、それはアモルファス状態にあると言われる。どの種類の官能基（例えば領域）が最も摂動されるか（正の、強い自己ピーク）を決定することができ、異なる自己ピークがどのように最大の強度変化を持つようになるかを観察することができる。結晶化の様々な段階の同期プロットにおける自己ピークのこれらの変化は、アモルファス状態から結晶状態までの過程の動態に関する情報を提供することができる。
【００１５】
さらに、分子と溶媒との相互作用、又は、溶液が主に分子間として相互作用に移行することによる変化に関して、事象の詳細な順序を特徴付けることができる。この事象は分子再配列を引き起こすことが想定でき、その分子再配列はクロスピークを用いて特定できる。
【００１６】
バイオ医薬品業界の製剤は、治療用タンパク質を安定化させるのに効果的に使用されている。賦形剤は、これらの治療用タンパク質の安定化に大きな役割を果たしてきた。熱ストレッサー下の賦形剤の物理化学的特性は、過去に実施された。本願の技術は、温度により誘発されるトレハロースの結晶化により本明細書で実証されているように、化学イメージングと分子記述の組合せを含む。
【００１７】
ここで説明する例では、温度条件によって引き起こされるトレハロースの結晶化過程には、水溶液との水素結合相互作用の損失（脱水）が含まれるが、結晶内のトレハロース分子間の分子間水素結合は増加する。中赤外領域の指紋領域内でのピーク又はバンド狭化は、トレハロースの脱水によるスペクトル特性の大きな変化である。しかし、スクロースやアラビノースなどの他の炭水化物と比較すると、温度の上昇によって誘導される結晶化は起こらない。
【００１８】
リアルタイム画像取得とＱＣＬＭ及び２Ｄ  ＩＲ相関分光法の組合せにより、結晶化の現象をさらに理解するために使用できる包括的な証拠が提供される。
本願の技術は、有機分子の評価に限定されず、医薬品用途で賦形剤として一般的に使用される金属有機種及び生体分子を含むことができる。本願の技術の実施形態は、核生成事象を検出するために使用することができる。本願の技術の実施形態は、結晶成長をモニタリングするために使用することができる。本願の技術の実施形態は、サンプルとその環境との水素結合相互作用の減少を検出することにより、結晶化による脱水事象を評価するために使用することができる。本願の技術の実施形態は、２Ｄ  ＩＲ相関分光法を使用することにより、結晶内の分子柔軟性の領域を記述するサンプル内の振動モードを評価するために使用することができる。
【００１９】
本願の技術の追加の特徴及び利点は、以下の説明に記載されており、一部はその説明から明らかになるか、本願の技術の実践によって習得され得る。本願の技術の利点は、本明細書及び特許請求の範囲ならびに添付の図面で特に指摘された構造によって実現及び達成される。
【００２０】
前述の一般的な説明及び以下の詳細な説明はいずれも例示的かつ説明的なものであり、特許請求される本願の技術のさらなる説明を提供することを意図していることを理解されたい。
【００２１】
添付の図面は、本願の技術のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれてその一部を構成し、本願の技術の態様を示し、明細書とともに本願の技術の原理を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１Ａ、１Ｂ、及び１Ｃは、本願の技術のいくつかの態様に従ってタンパク質凝集を決定するために使用される直交分析技術の結果を示す。図１Ａは、サイズ排除クロマトグラフィー（「ＳＥＣ」）の結果を示す。図１Ｂは、示差走査熱量測定（「ＤＳＣ」）の結果を示している。図１Ｃは、動的光散乱（「ＤＬＳ」）の結果を示している。
【図２】本願の技術のいくつかの態様による方法の異なるフェーズを示すフローチャートを示す。
【図３】多段階分析の結果を示す。
【図４】本願の技術のいくつかの態様による例示的なコンピューティングシステムの図を示す。
【図５】本願の技術のいくつかの態様による例示的な方法の動作を示すフローチャートを示す。
【図６】本願の技術のいくつかの態様による例示的な方法の動作を示すフローチャートを示す。
【図７−１】多段階分析の結果を示す。
【図７−２】同上。
【図８Ａ】開発可能性評価のためのＡＤＣフラグメント候補アミノ酸配列の比較を示す。ＡＤＣフラグメント０（「ＡＤＣ０」；配列番号１）は、Ｎ末端に追加の７個のアミノ酸（ＡＰＥＬＬＧＧ；配列番号２）を含む全長フラグメントである。ＡＤＣフラグメント１（「ＡＤＣ１」；配列番号３）はＮ末端でトランケートされ、一番上のフラグメントと同様に１つのジスルフィド架橋を含む。ＡＤＣフラグメント２（「ＡＤＣ２」；配列番号４）は、ＡＤＣフラグメント１と比較すると２つの点突然変異（Ｌ５Ｃ／Ｋ９７Ｃ）を有するため、さらにジスルフィド架橋を追加してＡＤＣフラグメント２を安定化させる。
【図８Ｂ】ＡＤＣフラグメント内の、主にβシート、βターン及びヒンジならびに２つの短いヘリックスから構成されるリチャードソンリボンモデルを示す。Ｎ末端、Ｃ末端、２５位、６２位及び７１位の３つのＡｒｇ、２７位及び６１位の隣接するＰｒｏ残基、及びジスルフィド結合Ｃｙｓ３１及びＣｙｓ９１が示されている。これらの３つのアルギニン残基は、ＡＤＣの内部プローブとして機能する。
【図９】図９Ａ及び９Ｂは、凝集体のサイズ及び識別を示す。図９Ａは、ＡＤＣ０及びＡＤＣｌのＱＣＬ赤外スペクトルオーバーレイを示す。図９Ｂは、それぞれ２４℃及び２８℃のプロットを示す。ＡＤＣフラグメントはすべて完全にＨ→Ｄに交換された。さらに、２４℃でのアミドＩ’バンドの最大値は凝集したＡＤＣ１に一致し、２８℃での最大値はＤ２Ｏ溶液中のＡＤＣ１に一致する。
【図１０】共分布分析の結果を示す。凝集メカニズムは、タンパク質内のアルギニン残基と選択された逆平行βシート及びβターンに関与していた。したがって、この分析は、凝集を引き起こしているタンパク質の領域を提供する。
【図１１】図１１Ａは、ＱＣＬ顕微鏡画像を示し、図１１Ｂは、１５％スクロース中のＡＤＣフラグメント２の関連するＱＣＬスペクトルを示す。これは、賦形剤及びタンパク質候補の両方の存在及び量を確認するために使用できる。
【図１２】図１２Ａ、１２Ｂ、及び１２Ｃは、ｐＨ６．６のＨＥＰＥＳ中のＡＤＣ２について、賦形剤としてＮａＣｌ及び様々な量のスクロースの存在下、２６℃で得られた１４００〜１８００ｃｍ−１のスペクトル領域内のＱＣＬスペクトル結果を示す（図１２Ａ：１５％スクロース、図１２Ｂ：３０％スクロース、及び図１２Ｃ：６０％スクロース）。これらの結果は、定量分析を実施できる範囲を実証しており、この方法によらなければ取得が困難な重要な情報を提供している。所望の賦形剤条件下で、タンパク質の安定性及びコンフォメーションを確認することができ、また同時に、目的のタンパク質及びその賦形剤の溶液中の濃度の測定も可能である。さらに、これらの条件下ではＡＤＣ２の凝集種は観察されなかった。
【図１３】様々な条件下でＱＣＬ顕微鏡を使用した４３回の実験で実施された正規分布分析の結果を示す。ＱｂＤ実験設定は、様々な量のＮａＣｌ、スクロース、及び様々な比率の両方の賦形剤（すなわち、ＮａＣｌ及びスクロース）の存在下でのＡＤＣフラグメント２の評価を表す３２４スペクトルデータが分析されるようなものであった。
【図１４】２番目に最適なフィットモデル（ＡＩＣモデル）を使用したＡＤＣ２  ＱＣＬ顕微鏡スペクトルデータの予測プロファイルを含むＤＯＥ段階的モデルフィッティングの結果を示す。
【図１５】最適なフィットモデル（ＢＩＣモデル）を使用したＡＤＣ２  ＱＣＬ顕微鏡スペクトルデータの予測プロファイルを含むＤＯＥ段階的モデルフィッティングの結果を示す。結果は、室温に近い条件でＡＤＣ２に最適な賦形剤として１８．５％スクロースを示唆している。
【図１６】図１６Ａ及び１６Ｂは、２６〜２８℃の温度範囲内でのＨＥＰＥＳ及び１５％スクロースの存在下でのＡＤＣフラグメント２の２Ｄ  ＩＲ相関分析プロット（図１６Ａ：同期、図１６Ｂ：非同期）を示す。１７２０〜１５００ｃｍ−１のスペクトル領域で研究されたアミドＩ’及び側鎖バンド。同期プロット（図１６Ａ）ＡＤＣ２は、凝集種の存在なしに主にβシート及びβターンの二次構造を有することが観察された。
【図１７】タンパク質の安定化におけるスクロースの役割を確認するために使用されるｐＨ６．６及び温度２６℃の５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ及び１５％スクロース中のＡＤＣフラグメント２の事象の順序を示す。
【図１８】図１８Ａ及び１８Ｂは、２６〜２８℃の温度範囲におけるＨＥＰＥＳ及び賦形剤としての１５％スクロース中のＡＤＣ２の２Ｄ  ＩＲ共分布分析プロット（図１８Ａ：同期、図１８Ｂ：非同期）を示す。側鎖は、πヘリックス及びβターン（ヒンジループ）と共に、低温で摂動した。
【図１９】２Ｄ  ＩＲ相関分析から生成されたバンド帰属を使用したＤ２Ｏ中のＡＤＣフラグメント２の代表的なカーブフィット分析を示しており、タンパク質の８０．４＋／−１．１％がβ構造を含むと判断された（表２及び３も参照））。
【図２０】図２０Ａは、Ｈ２Ｏ中２４〜６０℃の温度範囲内で取得した１７５０〜１４００ｃｍ−１の中赤外スペクトル領域における５０ｍｇ／ｍＬのＮＩＳＴｍＡｂのアミドＩ、ＩＩ、及びＩＩＩバンドを示すオーバーレイスペクトルを示す。図２０Ｂ及び２０Ｃは、図１６Ａのサンプルの２Ｄ  ＩＲ相関分析プロット（図２０Ｂ：同期、図２０Ｃ：非同期）を示す。
【図２１】図２１Ａは、Ｈ２Ｏ中２４〜６０℃の温度範囲内で取得した１７５０〜１５００ｃｍ−１の中赤外スペクトル領域における５０ｍｇ／ｍＬのＮＩＳＴｍＡｂのアミドＩ及びＩＩバンドの両方を示すオーバーレイスペクトルを示す。図２１Ｂ及び２１Ｃは、図２１Ａのサンプルの２Ｄ  ＩＲ相関分析プロット（図２１Ｂ：同期、図２１Ｃ：非同期）を示す。
【図２２】２４〜６０℃の温度範囲内の熱ストレス下で、Ｈ２Ｏ中５０ｍｇ／ｍＬのＮＩＳＴｍＡｂの事象の順序を示している。
【図２３】２４〜６０℃の温度範囲内の熱ストレス下で、Ｈ２Ｏ中５０ｍｇ／ｍＬのＮＩＳＴｍＡｂの非同期２Ｄ  ＩＲ共分布分析プロットを示している。
【図２４−１】図２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃ、及び２４Ｄは、それぞれ図２１Ａ、２１Ｂ、２１Ｃ、及び２２のプロットの再現を示し、同期プロット２Ｄ  ＩＲ相関分析プロット（図２４Ｂ）の自己ピークを横切る破線の垂直線が追加されている。
【図２４−２】同上。
【図２５】図２５Ａは、Ｈ２Ｏ中２４〜６０℃の温度範囲内で取得した１７５０〜１５００ｃｍ−１の中赤外スペクトル領域における４０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡのアミドＩ及びＩＩバンドの両方を示すオーバーレイスペクトルを示す。図２５Ｂ及び２５Ｃは、図２５Ａのサンプルの２Ｄ  ＩＲ相関分析プロット（図２５Ｂ：同期、図２５Ｃ：非同期）を示す。
【図２６】熱ストレス（２４〜６０℃）下でのＨ２Ｏ中のＢＳＡ４０ｍｇ／ｍＬの事象の順序を示す。
【図２７】２４〜６０℃の温度範囲及び１７５０〜１３８０ｃｍ−１のスペクトル領域内の熱ストレス下でのＨ２Ｏ中のＢＳＡ４０ｍｇ／ｍＬの非同期２Ｄ  ＩＲ共分布分析プロットを示す。
【図２８−１】図２８Ａは、Ｈ２Ｏ中２４〜６０℃の温度範囲内で取得した１７５０〜１５００ｃｍ−１のスペクトル領域におけるＮＩＳＴｍＡｂ／ＢＳＡ（１：２、モル比）混合物のアミドＩ及びＩＩバンドの両方を示すオーバーレイスペクトルを示す。
【図２８−２】図２８Ｂ及び２８Ｃは、図２８Ａのサンプルの２Ｄ  ＩＲ相関分析プロット（図２８Ｂ：同期、図２８Ｃ：非同期）を示す。
【図２９】図２９Ａは、Ｈ２Ｏ中２４〜６０℃の温度範囲内で取得した１７５０〜１５００ｃｍ−１のスペクトル領域における６００ｍｇ／ｍＬのリゾチームのアミドＩ及びＩＩバンドの両方を示すオーバーレイスペクトルを示す。図２９Ｂ及び２９Ｃは、図２９Ａのサンプルの２Ｄ  ＩＲ相関分析プロット（図２９Ｂ：同期、図２９Ｃ：非同期）を示す。
【図３０】熱ストレス（２４〜６０℃）下でのＨ２Ｏ中の６００ｍｇ／ｍＬのリゾチームの事象の順序を示す。
【図３１】２４〜６０℃の温度範囲及び１７５０〜１５００ｃｍ−１のスペクトル領域内における熱ストレス下でのＨ２Ｏ中６００ｍｇ／ｍＬのリゾチームの非同期２Ｄ  ＩＲ共分布分析プロットを示す。
【図３２Ａ】トレハロースのモデルを示す。
【図３２−１】図３２Ｂ、３２Ｃ、３２Ｄ、及び３２Ｅは、ＱＣＬＭ低倍率画像を示し、図３２Ｆは、トレハロースの同期２Ｄ  ＩＲ相関分析プロットを示す。
【図３２−２】同上。
【図３２−３】同上。
【図３３−１】図３３Ａ、図３３Ｂ、図３３Ｄ及び図３３Ｅは、ＱＣＬＭ低倍率画像を示し、図３３Ｃ及び図３３Ｆは、トレハロースの核生成及び結晶成長事象の同期２Ｄ  ＩＲ相関分析プロットを示す。
【図３３−２】同上。
【図３３−３】同上。
【図３４Ａ】０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、０．５％ｗ／ｖ  ＰＥＧ５０００、０．８Ｍ酒石酸カリウムナトリウム四水和物の溶液のアリコート（１ｕＬ）について、３０〜３８℃の範囲内の２℃の温度間隔での温度上昇に伴うタンパク質複合体のハイパースペクトル画像のコレクションを示す。
【図３４Ｂ】図３４Ａのサンプルについて２℃の温度間隔で３０〜３８℃の範囲の温度範囲内で取得した１７５０〜１４８０ｃｍ−１のスペクトル領域のＱＣＬ  ＩＲスペクトルを重ねたチャートを示す。
【図３４Ｃ】図３４Ａのサンプルの２Ｄ  ＩＲ相関分析プロット（同期）を示す。
【図３４Ｄ】図３４Ａのサンプルの２Ｄ  ＩＲ相関分析プロット（非同期）を示す。
【図３４Ｅ】タンパク質−ペプチド複合体集団内αヘリックス（１６５５ｃｍ−１）、βシート（１６３７ｃｍ−１）凝集体（１６１１ｃｍ−１）、Ａｒｇ（１５７８．５ｃｍ−１）の熱ストレス下での結晶化中の主要な過程として凝集事象をまとめた非同期２Ｄ  ＩＲ共分布分析プロットを示す。
【図３５Ａ】０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１０％ｗ／ｖ  ＰＥＧ６０００、５％ｖ／ｖ  ２−メチル−２，４−ペンタンジオールの結晶形について、３０〜３８℃の範囲内の２℃の温度間隔での温度上昇に伴う純粋な組換えタンパク質のハイパースペクトル画像のコレクションを示す。
【図３５Ｂ】図３４Ａのサンプルの結晶形態について２℃の温度間隔で３０〜３８℃の範囲の温度範囲内で取得した１６９０〜１６００ｃｍ−１のスペクトル領域のＱＣＬ  ＩＲスペクトルを重ねたチャートを示す。
【図３５Ｃ】図３４Ａのサンプルの結晶形態についての２Ｄ  ＩＲ相関分析プロット（同期）を示す。
【図３５Ｄ】図３４Ａのサンプルの結晶形態についての２Ｄ  ＩＲ相関分析プロット（非同期）を示す。
【図３５Ｅ】非同期２Ｄ  ＩＲ共分布分析プロットを示し、主にらせん領域（１６５５．０ｃｍ−１）内の以下の側鎖モードを含む結晶化中及び熱ストレス中の純粋な組換えタンパク質の代表的な分布集団をまとめたものである：Ｈｉｓ（１６０６．０ｃｍ−１）、Ａｒｇ（１５８１．３ｃｍ−１）、Ｇｌｕ−（１５４０．８ｃｍ−１）、Ｔｙｒ（１５１７．０ｃｍ−１）、Ｔｒｐ（１４６１ｃｍ−１）。
【図３５Ｆ】溶液中の図３４Ａのサンプルの非同期２Ｄ  ＩＲ相関分析プロットを示す。
【図３５Ｇ】図３４Ａのサンプルの結晶形態の非同期２Ｄ  ＩＲ相関分析プロットを示す。
【図３６】コンピューティングシステムの例示的な図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下の詳細な説明では、本願の技術の理解を提供するための具体的な詳細が説明されている。しかし、これらの具体的な詳細の一部を備えていなくても本願の技術を実施できることは、当業者には明らかであろう。他の例では、本願の技術を不明瞭にしないために、周知の構造及び技術は詳細に示されていない。
【００２４】
タンパク質は、アミノ酸が直線状に配列された大きな有機化合物であり、隣接するアミノ酸残基のカルボキシル基とアミノ基との間のペプチド結合によって連結されている。ほとんどのタンパク質は、独自の三次元構造に折りたたまれる（フォールディング）。タンパク質が自然にフォールディングされた形状は、その天然型として知られている。多くのタンパク質は、単に自身のアミノ酸の化学的性質を介して補助なしでフォールディングが可能であるが、他のタンパク質は、天然型にフォールディングされるために分子シャペロンの助けを必要とする。タンパク質の構造には４つの異なる側面がある。
【００２５】
・一次構造：アミノ酸配列。
・二次構造：水素結合によって安定化された規則的な繰り返し局所構造。二次構造は局所的であるため、同じタンパク質分子内に、異なる二次構造の多くの領域が存在することができる。
【００２６】
・三次構造：単一のタンパク質分子の全体的な形状。二次構造同士の間の空間的関係。
・四次構造：複数のタンパク質分子の相互作用から生じる形状又は構造。この状況では通常、タンパク質サブユニットと呼ばれ、より大きな集合体又はタンパク質複合体の一部として機能する。
【００２７】
タンパク質は完全な剛体分子ではない。これらのレベルの構造に加えて、タンパク質は生物学的機能を実行しながら、いくつかの関連する構造間でシフトする場合がある。これらの機能的再配置の状況において、これらの三次又は四次構造は通常「立体配座」と呼ばれ、それらの間の移行は立体配座変化と呼ばれる。
【００２８】
タンパク質凝集は、ミスフォールディングされた剛体タンパク質の集団化として特徴付けられ、産業用バイオプロセス全体においてよくある現象と考えられている。凝集はタンパク質分解の主要な態様であると考えられており、多くの場合、タンパク質の免疫原性及び生物活性の損失につながる。タンパク質凝集は、アルツハイマー病やパーキンソン病などの異常な疾患状態から、タンパク質医薬品の生産、安定性、送達に至るまで、幅広い生物医学的状況において非常に重要である。本質的にアモルファス又はフィブリル状であり得るタンパク質凝集は、２つの異なるメカニズムのいずれかで開始され得る：Ａ）部分的にフォールディングされた中間体が凝集の直接の前駆体となる自己凝集、及びＢ）１種のタンパク質の凝集が別のタンパク質によって媒介されるヘテロ凝集。
【００２９】
タンパク質凝集体の形成は、タンパク質ベースの薬物又は市販の酵素の生産に大きな影響を与え、生産収率を大幅に低下させる可能性があるため、産業用途で重要である。生物学的製剤及びバイオシミラー産業は、タンパク質治療薬を含む複雑な薬物の研究、開発、及び製造に関与している。研究開発の効率は望ましくないほど低くなる可能性があり、これはタンパク質治療薬の高い損耗率のために医薬品開発のコストを増加させる。タンパク質治療薬の開発コストは、後期段階の失敗により大きく影響を受ける。研究開発コストを削減する１つの方法は、研究開発期の早い段階でタンパク質治療薬候補の一連の評価を実施することである。研究開発期の初期に様々な製剤条件及びストレッサーで治療用タンパク質の特性評価を行うことにより、治療候補の予測プロファイルが生成され、タンパク質凝集のリスクが評価される。このアプローチは、開発性評価として定義されている。この評価は、さらなる開発のためのタンパク質治療薬候補の選択など、意思決定に重要な情報を提供することができる。タンパク質の凝集が起こると、タンパク質治療薬は一般的に効能が低下し、免疫応答を誘発する可能性がある。重症の場合、そのような免疫反応は致命的である。
【００３０】
混合物中の凝集体を測定するために、過去にいくつかの方法が提案されてきた。これらの従来の方法は、特定のタンパク質又はペプチド用に設計され、及び／又は外来プローブの追加を必要とするため、生体分子の類へ普遍的に適用できる一般化された方法ではない。プローブを使用したＵＶ−Ｖｉｓ分光法、内因性又は外因性プローブを使用した蛍光分光法など、いくつかの分光技術が使用されている。同様に、近紫外円偏光二色性（「ＣＤ」）が使用されているが、すぐ近くにある凝集体の検出に限定されており、核磁気共鳴（「ＮＭＲ」）はバンド広がりの出現によるタンパク質凝集を検出するために使用され得る。目的のタンパク質のモル吸光係数が十分に大きければ、沈殿分析を使用して、オリゴマー化の程度を特定することもできる。サイズ排除などのクロマトグラフィー技術でも、タンパク質凝集体の存在を検出できる。しかし、これらの技術は、外因性プローブ、大量のタンパク質の使用を必要とする場合があり、時間がかかり、凝集メカニズムの決定を可能にするものはない。
【００３１】
タンパク質の凝集の問題は複雑であり、多くの場合、いくつかの異なる化学的プロセス及び／又は計算論的プロセスを伴うことが多いが、これらを見分けることは難しい。凝集は、ストレスによって誘発される場合があり、撹拌、酸化、脱アミノ及び温度変化などの物理的又は化学的変化を伴う。ｐＨ、塩条件、タンパク質濃度、又は製剤条件のわずかな変化でさえ、タンパク質凝集を引き起こす可能性がある。この場合も、凝集は生産量の低下、タンパク質治療薬の有効性の損失、及び免疫原性リスクに関する安全性の懸念につながる。凝集を評価するために現在利用可能な技術は、サイズ、同一性、凝集のメカニズム及び程度、ならびに溶液中のタンパク質治療薬の安定性など、プロセスに関与するすべての要因には対処していない。凝集体又は微粒子のサイズに対処するためにいくつかの手法が開発されているが、それらは同一性は特定しない。他の手法では、凝集体のサイズと同一性を特定できるが、凝集の程度を決定することはできない。タンパク質に存在するアミノ酸側鎖は、タンパク質の安定性への貢献に重要である。しかし、側鎖で観察される弱い化学的相互作用とタンパク質の二次構造の安定性との関係を、通常のベンチ設備を使用してハイスループットプロセスで決定することはできない。
【００３２】
タンパク質治療薬の安定性も医薬品開発に重要であり、タンパク質の熱転移温度を単に特定するだけでは完全に特徴付けることはできない。タンパク質治療薬の安定性を理解し、対処するには、より高いレベルの理解が必要である。例えば、以下を理解することが有益となり得る：１）目的のタンパク質内のドメインの相対的安定性、２）アミノ酸側鎖がドメインの安定性にどのように寄与するか、３）アミノ酸側鎖が凝集メカニズムに関与しているか否か、及び４）賦形剤がタンパク質治療薬の特定のドメインの重要な領域内で（例えば、アミノ酸側鎖における）弱い相互作用を安定化できるか。タンパク質凝集のメカニズムを決定するために重要なパラメータの理解にはギャップがある。
【００３３】
現在、市場で利用可能な手法を直交的に使用する場合、利用可能な手法の感度の違いが懸念される。一般的に、このような技術は、タンパク質治療薬のサイズ、純度及び安定性の決定に焦点を当て、製剤中のタンパク質凝集体又は微粒子の有無を評価して、ロット間の一貫性を実現する。
【００３４】
タンパク質治療薬の開発可能性をより良く評価するために使用できる技術、及び製品の完全性、有効性及び安全性を維持、確保するために必要な比較可能性評価が求められている。このようなプロセスは、食品医薬品局（「ＦＤＡ」）医薬品評価センター（「ＣＤＥＲ」）部門及びその他の関連規制機関によって、製品の完全性、有効性、及び安全性を確保するのに十分であると認識される必要がある。
【００３５】
バイオ医薬品業界のタンパク質凝集問題の解決策は、（１）Ｒ＆Ｄコストの削減、（２）製品の収率の向上による供給と需要の確保、（３）撤退のリスクの低減、（４）ＦＤＡ承認率の向上（５）市場投入までの時間の短縮、そして（６）それらによる評価の向上につながるであろう。また、新しいタンパク質治療薬のパイプラインは、がんや慢性疾患、中でも慢性関節リウマチ、クローン病、神経変性障害などの治療に対応し、患者の生活の質を向上させる態勢を整えている。
【００３６】
本願の技術の態様は、単一の実験で、タンパク質治療薬又は他の化学物質のサイズ、同一性、メカニズム、及び凝集の程度ならびに安定性を決定するための迅速で正確かつ再現可能な技術を提供する。本願の技術の態様は、様々なタンパク質治療薬候補の比較可能性評価及びタンパク質治療薬候補の開発可能性評価に対応している。データは、創薬、パイロットスケール又は製造における研究開発、又は品質管理及び品質保証の目的で、タンパク質、ポリマー、有機材料、無機材料の分類及び化学的特性評価に使用することができる。また、タンパク質治療薬の保管及び送達中の安定性評価にも。
【００３７】
本明細書に記載の計算方法及びシステムは、既存のタンパク質分析よりも大幅に改善されている。本明細書に記載の計算方法及びシステムは、いくつかの機器の使用を必要とせずに効率的かつ有意義な分析を容易にする形式でデータを生成及び保存する。したがって、本明細書に記載の計算方法及びシステムは、候補薬物の評価のためのスペクトルデータ分析の効率を改善することができる。
【００３８】
本願の技術の態様には、タンパク質治療薬の凝集の程度及びメカニズムに向けた重要な情報を提供するための二次元相関分光法（「２ＤＣＯＳ」）及び二次元共分布分光法（「２ＤＣＤＳ」）の使用が含まれる。本明細書に記載の方法は、内因性プローブとしての側鎖モードの分析を含むことができ、タンパク質内の構造モチーフ又はドメインの安定性を確認する情報を提供する。本明細書に記載の方法は、クオリティ・バイ・デザイン（「ＱＢＤ」）に準拠した実験計画法（Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ（「ＤＯＥ」））アプローチを介したハイスループット開発可能性及び比較可能性評価（「ＨＴ−ＤＣＡ」）に有用であることが示されている。
【００３９】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載のシステム及び方法は、タンパク質−タンパク質相互作用（「ＰＰＩ」）又はタンパク質−高分子（タンパク質−脂質相互作用、タンパク質ＤＮＡ又はタンパク質−ＲＮＡ相互作用又はタンパク質薬物相互作用）を決定するためにも使用できる。また、本明細書に記載のシステム及び方法は、有機溶液、ポリマー、ゲル、ナノ構造、又は小さな液晶などの分析にも使用できる。
【００４０】
図１Ａは、サイズ排除クロマトグラフィー（「ＳＥＣ」）の結果を示す。図１Ｂは、示差走査熱量測定（「ＤＳＣ」）の結果を示す。図１Ｃは、動的光散乱（「ＤＬＳ」）の結果を示す。これらの手法により、凝集体のサイズ、同一性、及び程度を決定できるが、凝集のメカニズムを決定できるものはない。凝集のメカニズムを理解することは、免疫原性のリスクがほとんど又はまったくなく、意図したとおりに機能する可能性を保証するタンパク質医薬品を開発するための基本である。
【００４１】
いくつかの実施形態によれば、例えば図２に示されるように、バイオプロセスの様々な部分からのサンプル（含水でも凍結乾燥でもよい）をフーリエ変換赤外（ＡＴＲ又は透過）分光法（「ＦＴ−ＩＲ」）でモニタリングし、凝集体を調査するために２ＤＣＯＳを使用して分析する。ラマン分光法、量子カスケードレーザ吸収、シンクロトロン光源フーリエ変換赤外顕微鏡法、及び／又はそれらの組合せなど、他の種類の分析を用いてもよい。凝集体が見つかった場合、確立されたデータベースに対して結果を比較することを含み得る評価手順を開始でき、その結果、バイオプロセスで使用されるプロトコルを修正又は変更できる。ＦＴ−ＩＲ分光法により、限定された操作で、かつ外因性プローブを使用することなく、タンパク質凝集体の測定における高度な柔軟性及び速度が可能になる。例示的な方法には、２ＤＣＯＳと組み合わせたＦＴ−ＩＲ分光法が含まれ得る。これは、凝集体の存在の判定、凝集メカニズムの判定を可能にし、タンパク質のパイプライン製造プロセスの修正を可能にして、有望なタンパク質を再び生成する。別の例示的な方法には、２ＤＣＯＳと組み合わせた量子カスケードレーザ顕微鏡法が含まれ得る。これは、凝集体の存在の判定、凝集のメカニズムの判定を可能にし、タンパク質のパイプライン製造プロセスの修正を可能にして、有望なタンパク質を再び生成する。さらに、タンパク質の熱転移も決定でき、確立された有望なタンパク質と比較するために２ＤＣＯＳプロットが生成され、目的のタンパク質製品の品質管理、安定性、及び実現性が可能になる。さらに、サンプル調製とデータ分析の容易さにより、この方法を自動化することができる。
【００４２】
ＦＴ−ＩＲ分光法は、立体構造の変化及び凝集を検知できる。この手法により、タンパク質、ペプチド、ペプトイドの凝集の程度を定性的及び定量的に分析することができる。２ＤＣＯＳを使用すると、さらなる分析が可能になり、凝集プロセスに関するメカニズムの情報が提供される。この方法に、以下の手法のうちの１つ又は複数を組み込んでもよい：透過型ＦＴ−ＩＲ分光法、減衰全反射（「ＡＴＲ」）ＦＴ−ＩＲ分光法、２ＤＣＯＳ分析、及び／又は２ＤＣＤＳ分析。
【００４３】
透過型ＦＴ−ＩＲ顕微鏡法又はＱＣＬ顕微鏡法において、サンプル調製は適切なバッファー中で純粋なタンパク質、ペプチド又はペプトイドを使用することを含み得る。サンプルを凍結乾燥し、Ｄ２Ｏに再懸濁することができる。タンパク質溶液をスライドとカバーの間に塗布し、溶媒の蒸発を防ぐために密封してもよい。スライドはスライドホルダーにセットできる。同様の手順が、適切なバッファー（ＰＢＳ又はＨＥＰＥＳ）を使用した参照基準に使用される。スライドに密着させた温度プローブを使用して、サンプルの温度を記録する。時間経過に伴う温度勾配を使用でき、取得したスペクトルデータは熱電対インターフェースを介して自動的に受信される。スペクトル分析中に、アミドＩバンドの半値全幅（ＦＷＨＨ）を温度との関係で決定し、転移温度を確立することができる。
【００４４】
減衰全反射（ＡＴＲ）ＦＴ−ＩＲ分光法は、水素／重水素交換試験、滴定実験、及び再構成膜タンパク質の配向の決定に使用することができる。この方法では、凍結乾燥とサンプルをＤ２Ｏに再溶解することを繰り返すことで、タンパク質を完全に交換できる。完全に交換されたタンパク質サンプルと緩衝液は、独立して薄膜として広げることができ、緩衝液が参照とみなされる。通常、Ｄ２Ｏ中のタンパク質サンプルはＡＴＲ結晶上に広げ、乾燥空気パージを使用して乾燥させる。後続のスペクトルは、タンパク質サンプルと、存在する場合はタンパク質の凝集形態を表す。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、スペクトルデータは、上述の方法のうちの１つ又は複数などの、任意の適切な方法によって生成することができる。分析する分子は、必要に応じて、水やＤ２Ｏなどの溶質を含む溶液で提供できる。溶液中の分析される分子の濃度は、溶質（例えば水）やサンプルの他の成分からの信号に対して分子から強い信号を提供する範囲（すなわち、適切な信号対雑音比）であることが好ましく、これにより、ここで説明するように、さらなる分析を容易にすることができる。通常、望ましい信号対雑音比を提供するタンパク質又はペプチド分子の濃度は、タンパク質又はペプチドのサイズに関連し、それに比例する。好ましい濃度は、分析のための適切な信号対雑音比を提供する。例えば、本明細書でさらに説明するように、サンプルは、溶質（例えば、水又はＤ２Ｏ）又はサンプルの他の成分に起因するスペクトルを差し引くことを必要とせず、目的の分子のスペクトルの分析を容易にすることができる。例えば、約１５０ｋＤのＩｇＧ又は他のタンパク質の場合、サンプルは約５０ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬの濃度のタンパク質を含むことができる。タンパク質の量は、この範囲から目的のタンパク質のサイズに比例して変化させることができる。例えば、約６７ｋＤのＢＳＡは、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約７５ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液で分析できる。サンプルは、経路長を有するセル内に提供され得る。経路長は、Ｄ２Ｏではより長く（例えば３０〜５０μｍ、好ましくは約４０μｍ）、水ではより短く（例えば４〜１２μｍ）することができる。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば、スペクトル分析は、例えば図３に示すように、段階的に実行することができる。図３に示すプロセスは、図２に示す「２ＤＣＯＳ／２ＤＣＤＳ分析」段階の少なくとも一部として実行される段階を含むことができる。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、タンパク質サンプルは摂動され（熱的に、化学的に、圧力、又は音響により）、振動スペクトルの動的変動を誘発する。段階３１０では、生のスペクトルデータを収集及び／又は分析することができる。スペクトルデータは、一定の温度間隔で連続的に取得できる。いくつかの実施形態によれば、データはベースライン補正され得る。
【００４８】
いくつかの実施形態によれば、スペクトルデータを使用して、タンパク質、ペプチド又はペプトイドの凝集形態の存在を判定することができる。これのために、最初のスペクトルが後続のスペクトルから差し引かれて、動的スペクトルが生成される。段階３２０では、後続のすべてのスペクトルから最初のスペクトル（２４℃）を差し引くことにより、共分散（差）スペクトルを生成できる。その結果、共分散（差）スペクトルには正と負のピークが含まれる、これは互いに同位相（ｉｎ  ｐｈａｓｅ）及び逆位相（ｏｕｔ−ｏｆ−ｐｈａｓｅ）とも呼ばれる。
【００４９】
特筆すべきこととして、本明細書に記載のプロセスは、スペクトルデータから水又は他の参照基準（例えば溶質）を手動で差し引く必要がない。このような手動の差引きは、タンパク質スペクトル分析でしばしば発生する非常に主観的なステップである。これに代えて、本明細書に記載のプロセスは、目的のサンプルの摂動に基づいて差スペクトルデータセットを生成する。その出力は、その後さらなる分析に使用できる。後続のすべてのスペクトルから、水バンドが重なった最初のスペクトルをアミドＩバンドとともに差し引くことにより、水のスペクトル成分が自動的に差し引かれる。
【００５０】
段階３３０では、２Ｄ  ＩＲ相関技術を適用して、同期プロット（段階３４０）及び非同期プロット（段階３５０）を生成することができる。例えば、スペクトルデータを高速フーリエ変換（「ＦＦＴ」）して複素行列を生成し、ここから相互相関積を介して強度行列を取得し、同期及び非同期プロットを生成することができる。これらのプロットを生成する技術については、本明細書でさらに詳しく説明する。
【００５１】
同期プロットは、摂動中に発生する強度の変化を表す。このプロットの対角線上には、スペクトル全体で変化したピーク又はバンド（自己ピークとして知られている）がある。対角線から外れているのはクロスピークであり、自己ピーク間の相関、つまり観察された二次構造変化間の関係を示す。同期プロットを使用して、同位相ピーク強度の変化又はシフトを関連付けることができる。
【００５２】
同期相関スペクトルでは、対角位置の自己ピークは、スペクトル信号の摂動による動的変動の範囲を表す。クロスピークは、２つの異なる波数でのスペクトル信号の同時変化を表し、強度変動の結合又は関連する起源を示唆する。クロスピークの符号が正の場合、対応する波数における強度は一緒に増加又は減少している。符号が負の場合、一方は増加し、他方は減少する。
【００５３】
非同期プロットには、事象の順序、つまりはタンパク質の凝集メカニズムを決定するために使用されるクロスピークのみが含まれる。非同期プロットを使用して、逆位相ピーク強度の変化又はシフトを関連付けることができる。
【００５４】
非同期相関スペクトルでは、信号変動の一部のフーリエ周波数成分について強度が逆位相で互いに変動する場合にのみ、クロスピークが発生する。波数ν２での強度変化が波数ν１の前に発生する場合、クロスピークの符号は正である。波数ν２での強度変化が波数ν１の後に発生する場合、クロスピークの符号は負である。同期プロットに変換された同じ非同期クロスピーク位置が負の領域（Φ（ν１，ν２）＜０）に入る場合、上記の符号規則は逆になる。
【００５５】
２Ｄ  ＩＲ相関は、二次元でピークを広げることにより、アミドＩやＩＩバンドなどの幅広いバンドの基になるピークのスペクトル分解能を高める。これらのプロットは本質的に対称であり、考察の目的で、分析のために上の三角形を参照する。同期プロット（３４０で示す）は、（ａ）対角線上の正のピークである自己ピーク、及び（ｂ）非対角ピークである正又は負のいずれかであり得るクロスピーク、の２種類のピークを含む。非同期プロット（３５０で示す）は、専ら逆位相ピークに関連するクロスピークで構成されている。結果として、このプロットはスペクトル分解能の向上を示している。分子事象の順序を確立するために、次の規則を適用できる：
Ｉ．非同期クロスピークν２が正の場合、ν２はν１の前に摂動される（ν２→ν１）。
【００５６】
ＩＩ．非同期クロスピークν２が負の場合、ν２はν１の後に摂動される（ν２←ν１）。
ＩＩＩ．同期クロスピーク（非対角ピーク、図３には示されていない）が正の場合、事象の順序は専ら非同期プロット（規則Ｉ及びＩＩ）を使用して確立される。
【００５７】
ＩＶ．同期プロットに負のクロスピークが含まれ、対応する非同期クロスピークが正の場合、順序は逆転される。
Ｖ．同期プロットに負のクロスピークが含まれ、対応する非同期クロスピークが負の場合、順序は維持される。
【００５８】
事象の順序は、ν２軸で観測される各ピークに対して確立できる。各事象の順序をまとめた表を提供することができる。段階３６０では、各事象の順序をまとめた表を使用して、事象プロットの順序が生成される。各ステップ（事象）の上部にはクロスピークν２の分光情報が存在し、各ステップの下部には、対応するピークの帰属又は各事象の生化学的情報が、それらが温度に応じて摂動される順序で存在する。ここに例を示す。
【００５９】
二次元相関分光法（「２ＤＣＯＳ」）分析を使用して、アミドＩバンドなどの複雑なバンドを分解することができる。２ＤＣＯＳ分析の例は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，２６８，６２８号に記載されている。当業者は、２ＤＣＯＳ分析での使用に適したアルゴリズムについて説明しているＩｓａｏ  Ｎｏｄａ、“Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｏ−ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｅｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．１０６９、ｐｐ．５１−５４に注目されたい。
【００６０】
２ＤＣＯＳの開発の概要は次のとおりである。個々にサンプリングされたスペクトルＡ（ｖｊ，ｔｋ）のセットは、観測されるスペクトル強度の変化を誘発する外部摂動の影響下で測定される系について取得できる。スペクトル変数ｖｊ（ｊ＝１，２，…，ｎ）は、例えば波数、周波数、散乱角などであり、他方の変数ｔｋ（ｋ＝１，２，…，ｍ）は、適用される摂動の効果、例えば、時間、温度、電位を表す。明示的に定義されたｔ１とｔｍとの間の観測間隔中に得られた連続的にサンプリングされたスペクトルデータセットのみが２ＤＣＯＳ分析に使用される。簡潔にするため、ここでは波数及び時間を用いて２つの変数を指定するが、他の物理変数の使用も有効であることが理解される。
【００６１】
２Ｄ相関分光法で使用される動的スペクトルは、
【００６２】
【数１】
2020523606.tif 000003
【００６３】
として明示的に定義され、ここで、
【００６４】
【数２】
2020523606.tif 000004
【００６５】
は系の基準状態のスペクトルである。基準状態の先験的な知識がない場合、基準スペクトルはｔ１とｔｍとの間の観測間隔にわたる時間平均スペクトルとして設定することもできる。
【００６６】
【数３】
2020523606.tif 000005
【００６７】
基準スペクトルのこの特定の選択により、観測間隔内の動的スペクトルの部分は、本質的に平均中心スペクトルと同等になる。同期及び非同期２Ｄ相関スペクトルΦ（ν１，ν２）及びΨ（ν１，ν２）は、
【００６８】
【数４】
2020523606.tif 000006
【００６９】
で与えられる。
項Ｎｉｊは、いわゆるＨｉｌｂｅｒｔ−Ｎｏｄａ変換行列の要素であり、
【００７０】
【数５】
2020523606.tif 000007
【００７１】
で与えられる。
同期スペクトルΦ（ν１，ν２）は、摂動変数ｔｋに沿って２つの異なる波数ν１及びν２で観測されたスペクトル強度の統合された、又は同時の変化を表す。同期相関強度の符号は、上記２つの波数で測定されたスペクトル強度がほぼ同じ方向に増加又は減少する場合、正になる。これに対し、一方が増加し、他方が減少している場合、Φ（ν１，ν２）の符号は負になる。
【００７２】
非同期スペクトルΨ（ν１，ν２）は、スペクトル強度の逆位相又は連続的な変化を表す。Ψ（ν１，ν２）＝０の場合、２つの波数ν１及びν２でのスペクトル強度の変動は完全に同期している。Φ（ν１，ν２）及びΨ（ν１，ν２）の符号が同じ場合、ν１で観測される全体的なスペクトル強度の変動は、主にν２での変動よりも前に発生する。符号が異なる場合、順序は逆になる。最後に、Φ（ν１，ν２）＝０の場合、強度変動の順序は決定できない。２Ｄ相関スペクトルは、スペクトル強度変動の連続的な順序のみを提供し、スペクトル信号の原因となる種の分布存在の順序は提供しないことを、重要点として強調しておく。
【００７３】
再び図３を参照すると、段階３７０において、共分布相関プロットは、溶液中のタンパク質集団分布の摂動領域（閾値８０％）を提供する。
二次元共分布分光法（「２ＤＣＤＳ」）分析を使用して、溶液中のタンパク質分子の集団と、これらのタンパク質の異なる集団がどのように挙動するかを分析することができる。当業者は、２ＤＣＤＳ分析での使用に適したアルゴリズムについて説明しているＩｓａｏ  Ｎｏｄａ、“Ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｃｏ−ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ｔｏ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｏｒｄｅｒ  ｏｆ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｅｓ”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｖｏｌ．１０６９、ｐｐ．５４−５６に注目されたい。
【００７４】
時間平均スペクトル
【００７５】
【数６】
2020523606.tif 000008
【００７６】
と共に、ｔ１≦ｔｋ≦ｔｍの観測間隔中に得られたｍ時間依存的スペクトルＡ（ｖｊ，ｔｋ）のセットは式（２）で与えられ、特性（時間）インデックスは
【００７７】
【数７】
2020523606.tif 000009
【００７８】
として定義される。
ここで使用される動的スペクトル
【００７９】
【数８】
2020523606.tif 000010
【００８０】
は、式（１）で定義されたものと同じである。波数ｖｊで観測されたスペクトル強度の分布の対応する特性時間は、
【００８１】
【数９】
2020523606.tif 000011
【００８２】
で与えられる。
繰り返しになるが、ここで使用される時間は、適用される摂動の代表的な変数の一般的な記載であるため、温度、濃度、圧力など、実験条件に応じて選択される他の任意の適切な物理変数に置き換えることができると理解される。特性時間
【００８３】
【数１０】
2020523606.tif 000012
【００８４】
は、ｔ１とｔｍとの間の観測間隔で区切られた時間軸に沿ったスペクトル強度Ａ（ｖｊ，ｔｋ）の分布密度の最初のモーメント（時間軸の原点、つまりｔ＝０）である。これは、時間にわたって分布する観測されたスペクトル強度の重心の位置に対応する。
【００８５】
２つの異なる波数ν１及びν２で測定されたスペクトル強度の時間分布の特性時間
【００８６】
【数１１】
2020523606.tif 000013
【００８７】
が与えられると、同期及び非同期の共分布スペクトルは
【００８８】
【数１２】
2020523606.tif 000014
【００８９】
として定義され、ここで、Ｔ（ν１，ν２）は
【００９０】
【数１３】
2020523606.tif 000015
【００９１】
で与えられる総結合差異である。
同期共分布強度Γ（ν１，ν２）は、時間軸に沿った２つの別個のスペクトル強度の分布の共存又は重複の測定値である。対照的に、非同期共分布強度Δ（ν１，ν２）は、２つのスペクトル信号の分布の差の測定値である。「共分布」という用語は、２つの異なる分布の比較を示し、この測定基準は２つの変動の比較に基づく「相関」の概念とは区別される。
【００９２】
式６、７、及び９を組み合わせることにより、非同期共分布スペクトルの式は
【００９３】
【数１４】
2020523606.tif 000016
【００９４】
で与えられる。
【００９５】
【数１５】
2020523606.tif 000017
【００９６】
の条件に当たった場合、Δ（ν１，ν２）の値はゼロに設定される。これは、いずれかの波数におけるスペクトル強度信号の欠如を示す。同期共分布スペクトルは、
【００９７】
【数１６】
2020523606.tif 000018
【００９８】
の関係から得られる。
非同期共分布スペクトルでは、正の符号を持つクロスピーク、すなわちΔ（ν１，ν２）＝０の場合、ν１でのスペクトル強度の存在は、ν２の場合比較して、時間軸に沿って主に初期段階で分布する。一方、Δ（ν１，ν２）＜０の場合、順序は逆転される。Δ（ν１，ν２）≒０の場合、時間経過にわたって２つの波数で観測されたスペクトル強度の平均分布は類似している。同期共分布のピークの符号は常に正であり、これは、分布パターンの重なりの程度の明らかな定性的測定を超えて、同期スペクトルの情報内容をいくらか制限する。
【００９９】
２ＤＣＤＳは、タンパク質の凝集メカニズムの要素、又は調査中の過程を加重方式で提供することができる。２ＤＣＤＳを使用して、摂動（例えば、時間、温度、濃度、圧力など）変数軸に沿って種の分布した存在のシーケンスを直接提供することができる。この手法は、中間種の存在を直接同定する際に２ＤＣＯＳ分析を強化する補完的なツールとして使用できる。いくつかの実施形態によれば、観測間隔中に摂動依存スペクトルが連続的に得られる。２Ｄ相関スペクトル（同期スペクトル及び非同期スペクトル）は、スペクトルの変動から導き出される。同期共分布強度は、摂動軸に沿った２つの別々のスペクトル強度の分布の共存又は重複として測定される。非同期共分布強度は、２つのスペクトル信号の分布の差として測定される。正の符号を持つクロスピーク、つまりΔ（ν１，ν２）＞０の場合、ν１でのスペクトル強度の存在は、ν２の場合と比較して時間軸に沿ってより早い段階で主に分布している。一方、Δ（ν１，ν２）＜０の場合、順序は逆転される。Δ（ν１，ν２）≒０の場合、時間経過にわたって２つの波数で観測されたスペクトル強度の平均分布は類似している。
【０１００】
２ＤＣＯＳ分析の間の差は、摂動プロセス及びそのサンプルへの影響による経路の平均的な記述を提供し、２ＤＣＤＳ分析は、摂動プロセス中の分子（タンパク質）の集団の重み付け要素を提供する。２ＤＣＯＳ及び２ＤＣＤＳの結果は、摂動のためにスペクトルデータにおいて変化している要素の直接かつ簡略化された記述である。
【０１０１】
いくつかの実施形態によれば、例えば図４に示されるように、データ分析を実行するためのシステムは、本明細書に記載の方法の機能を実行するために示されているコンポーネントを少なくとも含むことができる。取得したデータは、分析のために、プロセッサを含む１つ又は複数の演算器に提供され得る。データの分析を実行又は管理するモジュールを提供することができる。そのようなモジュールには、相関分析モジュール、視覚モデル生成モジュール、及び／又はヒューマンインタラクションモジュールが含まれ得る。モジュールは相互に通信してもよい。いくつかの実施形態では、モジュールはソフトウェアに実装されてもよい（例えば、サブルーチン及びコード）。例えば、モジュールはメモリ及び／又はデータストレージに保存され、プロセッサによって実行され得る。いくつかの態様では、モジュールの一部又はすべてをハードウェアに実装できる（例えば、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）、コントローラ、ステートマシン、ゲーテッドロジック、ディスクリートハードウェアコンポーネント、又はその他の適切なデバイス）、ファームウェア、ソフトウェア、及び／又はそれらの組合せ。本願の技術の様々な態様によるこれらのモジュールのさらなる特徴及び機能は、本開示でさらに説明される。
【０１０２】
いくつかの実施形態によれば、例えば図５に示されるように、取得したデータを確認及び準備する方法を実行することができる。データの種類が特定され、確認される。確認に基づき、データを変換及び／又は保存するか、又はユーザにエラーを表示して拒否することができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態によれば、例えば図６に示されるように、取得したデータを分析する方法を実行することができる。データの種類は、閾値に対する適切な信号対雑音比について確認される。確認に基づいて、データは分析に供されるか、分析前に平滑化フィルタに供してもよい。
【０１０４】
いくつかの実施形態によれば、例えば図６に示されるように、データは、ベースライン相関の適用、ピークの特定、データウィンドウの計算、相関の計算、共分布の計算、及び／又は摂動相関の計算を含む操作で分析することができる。
【０１０５】
データ操作には、微粒子及び溶液の識別のための関心領域（ＲＯＩ）の自動認識が含まれる。微粒子のサイズ及び数が、微粒子の集団分布を確認するために決定され得る。データ操作を実行して、Ｓ／Ｎ比の決定、ベースライン補正、水蒸気量の決定などへの適合性を確保し、調査するスペクトル領域内の対象要素の信号強度を決定することができる。統計分析のためのデータ出力は、とりわけ実験計画法（Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）アプローチを使用して簡素化できる。対象要素の強度及びスペクトル位置は、カンマ区切りファイル（＊．ｃｓｖ）として出力できる。共分散、又は動的スペクトルデータセットを、目的のサンプルの摂動に基づいて生成でき、その出力をさらなる分析に使用できる。例えば、データ出力を、比較可能性評価のために、摂動の種類、賦形剤、タンパク質治療薬、タンパク質濃度、温度、取得日、及び／又は生物分析技術に由来する他の生物分析結果との統合を容易にする形式で提供できる。このアプローチにより、同様の条件下で実施されたすべての実験で統計分析の実施が可能になる。さらに重要なことは、ＤＯＥ分析の結果は、最終報告ができる状態の、意思決定を可能にする独立した文書になり得ることである。
【０１０６】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に記載の方法及びシステムは、相関関数を共分散又は動的スペクトルデータに適用して２つのプロット（同期及び非同期）を生成でき、このアルゴリズムは２Ｄ  ＩＲ相関分光法と呼ばれる。互いに同位相であるスペクトルデータの変化（例えばピーク強度）は、同期プロットで得られるように相関させることができる。スペクトルデータにおいて変化する要素を特定できる。スペクトルデータの全体的な最大強度変化を決定できる。スペクトルデータの全体的な最小強度変化を決定できる。タンパク質やペプチドのアミドバンドなどの幅広いバンドにおける基になるスペクトルの寄与の最小数は、カーブフィッティング分析のために決定でき、これにより、二次構造の組成を決定できる。調査中のスペクトル領域の、特にスペクトル内の広帯域の分解能を高めることができる。
【０１０７】
互いに逆位相のスペクトルデータの変化（例えばピーク強度）は、非同期プロットで得られるように相関させることができる。非同期プロットは、タンパク質の挙動を分子レベルで詳細に記述する事象の順序も含む。プロットの詳細な評価を実行して、事象の順序を特定できる。これに代えて、又はこれと組み合わせて、このプロセスは自動化できる。共分散又は動的スペクトルデータに結合分散関数を適用して、事象の順序を決定するために直接解釈できる統合された非同期プロットを生成できる。あるいは、この方法を使用して、複雑な記述であるタンパク質の分子挙動の記述に関する上記の解釈を検証することができる。カーブフィッティングルーチンの追加情報、カーブフィッティングルーチンの番号位置と強度情報の入力は、分析されたサンプル中のタンパク質の二次構造組成及びタンパク質凝集種の範囲を生成する自動化プロセスともなり得る。２Ｄ  ＩＲ相関プロットからの強度情報は、脱アミノなどの酸化生成物の定量測定に使用できる。例えば、脱アミノは、側顎に基づいて検出できる。このような分析は、候補薬物の選択又はタンパク質設計段階で使用できる。機械学習アプローチを、相関させて解決する必要がある属性の複雑さに対する長期的なソリューションとして実装できる。
【０１０８】
いくつかの実施形態によれば、例えば図７に示されるように、取得したデータの分析を段階的に実行して、タンパク質凝集研究に関して統計的に有効で非常に有益な包括的なソリューションを提供できる。いくつかの実施形態によれば、図７に示されるプロセスは、図３に示されるプロセスの応用を表すことができる。ＱＣＬ赤外線顕微鏡検査の結果（図７の左上）が、Ｈ→Ｄ（水素→重水素）に交換された完全長ＩｇＧ（１５０ＫＤａ）について、低温５℃（最大値が大きい）及び高温９０℃（最大値が小さい）での初期及び最終ＱＣＬスペクトルで、１７００〜１５００ｃｍ−１のスペクトル領域において示されている。アミドＩ’（１７００〜１６００ｃｍ−１、主にペプチド結合カルボニル伸縮モードによる）バンドと側鎖（表１で定義された１６００〜１５００ｃｍ−１）バンドの違いが観察される。
【０１０９】
【表１】
2020523606.tif 000019
【０１１０】
後続のすべてのスペクトルから低温での初期スペクトルを差し引くことにより、温度上昇によるスペクトルの変化が明らかになり（タンパク質の挙動の変化が明らかになる）、これは共分散スペクトルデータと呼ばれるが、通常は差スペクトルとも呼ばれる。次に、これらのスペクトル変化に相互相関関数を適用して、観測されたピーク間の関係を決定する。同期プロットと非同期プロットの２つのプロットが生成され、これらはタンパク質サンプルの摂動により観察された結果のピーク間の相関を提供する。これらのプロットは、豊富な分子情報と、タンパク質の挙動を説明する分子事象の順序を提供する。自己ピーク（対角線上のピーク）を含む同期プロット（図７の左下）が、凝集ピークとともに示されている。この図は、タンパク質の最大の強度変化を表しており、強度変化の小さい２つの追加の自己ピークが見られる。これらのピーク間の関係は、正又は負のいずれかであるクロスピーク（非対角ピーク）の観察に基づいて決定され、対角線上に見られる異なる自己ピーク間の関係（つまり、初期スペクトルの減算による強度の変化）を提供する。この仮説の例では、観察された関係は、タンパク質のらせん二次構造を伴う凝集事象をもたらす。これは、このらせんモチーフに見られるチロシン残基の存在によっても検証され、タンパク質の凝集プロセスの内部プローブとして機能する。したがって、チロシンのピークは、凝集しているタンパク質の領域を画定する。２ＤＣＯＳ分析は、ＳＥＣ、ＤＳＣ、ＤＬＳなどの他の直交技術ではこれまで利用できなかった貴重な詳細な分子情報を提供する。ＱＣＬから得られた結果は非常に再現性が高く、統計を使用して厳密にテストされている。ＱＣＬ赤外スペクトル領域は非常に選択的かつ高感度であるため、タンパク質の立体構造の変化と２０のアミノ酸側鎖振動モードのうちの６つを同時に調べることができる（表１を参照）。
【０１１１】
実施例１
３つの抗体薬物コンジュゲート断片について、開発可能性及び比較可能性の評価を実施した（図８Ａ〜Ｂ）。分析には合計４７回の実験が含まれた。ＱＣＬ顕微鏡を使用して４３のＤＯＥ条件の画像取得を実行し、そのうち１６はｐＨ６．６及びＴ＝２４〜３０℃のＨＥＰＥＳ緩衝液中のＡＤＣ０、ＡＤＣ１及びＡＤＣ２と呼ばれる３つのＡＤＣフラグメントの比較を含んでいた。ＡＤＣ２は調査した条件下では凝集しなかったのに対し、ＡＤＣ１はいくらかの凝集種を有していたが、２８℃に加熱すると、凝集体は溶液に戻ることが確認された（図９Ａ〜Ｂ）。さらに、ＡＤＣ０候補には凝集種が存在していたが、温度が上昇すると、凝集種の存在が増加した。これらの凝集種はＡＤＣ０であると判断された。同様の結果が、２ＤＣＤＳ分析を使用してＡＤＣ１について見出された（図１０）。
【０１１２】
また、凝集体を含まないＡＤＣ２のスペクトル分析を、様々な賦形剤（スクロース及びＮａＣｌ）の存在下で、室温付近、Ｔ＝２４〜２６℃で行った（図１１Ａ〜Ｂ）。ＱＣＬ画像（図１１Ａ）内に枠で示された異なる関心領域（ＲＯＩ）を選択し、分光学的にオフラインで分析（図１１Ｂ）することにより、分析の再現性を決定するための値を付加した。スクロース賦形剤は、１４２０〜１５２０ｃｍ−１で示されている。また、アミドＩ’及び側鎖バンド（１５２０〜１７００ｃｍ−１）も示されているため、この手法の高い感度及び選択性が証明されている。さらなる証拠は、図１２Ａ〜Ｃに示されている。分析的に、賦形剤とタンパク質治療薬の両方を直接検出する能力は、各製剤中の賦形剤の存在の確認を可能にするため、バイオ製薬業界にとって非常に価値がある。ＨＴ−ＤＣＡプラットフォームは、統計分析に必要な精度と再現性の両方、及びサンプル内の成分の非常に価値のある分子情報を提供する。
【０１１３】
様々な条件下でＱＣＬ顕微鏡（ＱＣＬ）を使用した４３の実験について、５１６のスペクトル及び正規分布分析の完全実施要因計画を実行した。ＱｂＤ実験設定は、様々な量のＮａＣｌ、スクロース、及び様々な比率の両方の賦形剤（すなわち、ＮａＣｌ及びスクロース）の存在下でのＡＤＣ２の評価を表す３２４のスペクトルデータを分析するようにした。サンプルサイズは、標準偏差に応じてｎ＝８〜１２に決定した。ＡＤＣ２で開発可能性及び比較可能性の評価を続け、以下は２６℃及び２８℃での１５、３０、６０％のスクロースで得られた結果の概要である。様々な濃度（３２５、３５０及び４００ｍＭ）のＮａＣｌ、ならびに賦形剤としてのスクロースとＮａＣｌの様々な比率について、同様の結果が得られた。典型的には、得られた結果は０．８より大きいｐ値で収束した（図１３）。分布分析に続いて、段階的全モデルフィットを使用したＤＯＥ統計評価を行い、ＡＩＣ及びＢＩＣモデル（図１４、１５）において、ＡＤＣ２の最良の賦形剤は１８．５％スクロースであるという同じ結果に達して終了した。
【０１１４】
ＨＴ−ＤＣＡプラットフォームのＱＣＬスペクトル分析能力は、タンパク質治療薬の分子分析と安定性のさらなる判定を提供する。この種の分析は非常に有益であり、タンパク質治療薬候補の最適な設計を可能にする。２ＤＣＯＳ分析及び２ＤＣＤＳ分析の２種類の相関分析を実行し、溶液中のタンパク質治療薬の挙動に関する情報を提供した。
【０１１５】
２Ｄ  ＩＲ相関プロットの概念分析を、タンパク質の赤外スペクトルに適用した。アミドＩ’及び側鎖バンドは幅広く、ペプチド結合内のカルボニル伸縮のように立体配座に影響されやすいか、側鎖振動モードであるかといった、隣接環境及び弱い相互作用に関する情報に富んだ多くの潜在的な寄与を含む。この情報を抽出するために、後続のすべてのスペクトルから参照スペクトルを差し引くことにより、共分散スペクトルが生成される。例えば、タンパク質の熱変性の研究（温度摂動）では、低温での初期スペクトルが減算に使用される。生成される共分散スペクトルには、温度上昇による強度の変化が含まれる。その後、相関関数がデータセットに適用され、共分散スペクトルで観測された強度の変化を、解像度が向上した２つの独立したグラフの形で関連付ける。これらのプロットは、非常に重なり合ったバンドを分解し、タンパク質の最も柔軟な領域を確立し、タンパク質の凝集メカニズムを解読し、タンパク質−標的相互作用を確立することができる。２Ｄ  ＩＲ相関プロットは、同期及び非同期プロットと呼ばれる。これらのプロットは本質的に対称であり、解釈のために、各プロットの上半分が参照される。同期プロットには、自己ピークとして知られる対角線上の正のピークがある。自己ピークには、スペクトルデータセット全体で観測される強度の全体的な変化が含まれる。変化の大きさを特定し、摂動によりタンパク質の領域が持つ可能性のある柔軟性又は感受性を決定するために使用できる。これらのピークの位置及び数は、アミドＩ’及び側鎖バンドの基になるスペクトルの寄与を決定するために使用される（表２を参照）。
【０１１６】
【表２】
2020523606.tif 000020
【０１１７】
同期プロットには、クロスピークとして知られる非対角ピークもある。これらのクロスピークは、自己ピークの関係を決定する。同期プロットで観察されるクロスピークは、互いに同位相の強度の変化によるものである。強度が漸進的に変化する、又はその逆の２つのピークを考慮することができ、これら２つの自己ピークは、相互関係を表す付随するクロスピークを持つ（図１６Ａ〜Ｂ）。
【０１１８】
非同期プロットは対角線上のピークは含まないが、スペクトル分解能を向上させる。得られるクロスピークは、共分散スペクトルの強度が互いに逆位相で変化したピークによるものであり、結果として詳細な情報を提供する。それらの中には、熱摂動による分子事象の順序がある。非同期プロットのクロスピークは正又は負のいずれかであり、上記順序を決定することができる。一般に、クロスピークの符号が両方のプロットで正の場合、非同期プロットで定義された順序は保持される。したがって、正のクロスピークは、ν２よりも前にν１が生じることを意味する。この解釈は、同期プロットの同じクロスピークも正である場合にのみ真（ｔｒｕｅ）と指定される。しかし、クロスピークの符号が両方のプロットで異なる場合、順序は逆転する。
【０１１９】
これを図１６Ａ〜Ｂのプロットに適用する。非同期プロットのクロスピークは（１６５２，１６３２）で正であることがわかる。１６５２ｃｍ−１（ν１）のピークは、１６３２ｃｍ−１（ν２）の前に摂動される。分子解釈では、タンパク質中の逆平行βシートの前にπヘリックスが摂動していると考えられる（表２）。同様に、βターン（ヒンジループ、１６７０．３ｃｍ−１）は逆平行βシートの前に摂動される。さらに、これらのプロットを使用して、スクロースが溶液中のＡＤＣ２をどのように安定化するかを決定した。側鎖とスクロースとの間の水素結合により、βターン（ヒンジループ）が安定化され、したがってβシートも安定化された。さらに重要なことに、目的のタンパク質断片中に生じた分子変化が図１７に示されている。
【０１２０】
温度摂動は室温付近に限定されていたが、分析により、側鎖及びその水性環境及び賦形剤（スクロース）の間のＨ結合相互作用を決定することができた。また、これらの相互作用によりＡＤＣ２の二次構造が安定した。
【０１２１】
２ＤＣＤＳ分析は、タンパク質溶液の動態及び温度範囲内の立体配座動態の分布の評価に役立つことが判明し、今回の場合、ＨＥＰＥＳバッファー中及び１５％スクロースの存在下のＡＤＣ２の温度範囲はわずか２６〜２８℃であった（図１８Ａ〜Ｂ）。非同期共分布プロットの解釈は、２Ｄ  ＩＲ相関と比較すると簡単である。プロット間のクロスピーク記号の比較は必要ない。正のクロスピークの場合、ν１はν２の前に生じると判断できる。さらに、負のクロスピークの場合、ν２はν１の前に生じると判断できる。
【０１２２】
このタンパク質では凝集は観察されなかった。非同期プロット（図１８Ｂ）を参照すると、溶液中のこのタンパク質では、ヒンジループとも呼ばれるβターン（１６６０ｃｍ−１）及び負に帯電したアスパラギン酸（１５５３ｃｍ−１）、及びグルタミン酸（１５４３ｃｍ−１）残基の間に相互依存性が観察される。この結果は、ＡＤＣ２のβターンモチーフ内の位置と一致している。２ＤＣＯＳ分析及び２ＤＣＤＳ分析により、ＡＤＣ２及び分子レベルでのＡＤＣ２に対するスクロースの安定化効果の完全な説明が可能になった（図１６Ａ〜１８Ｂ）。要約すると、ＡＤＣ２の主な安定化機能は、アルギニンと近くのアスパラギン酸残基の間で観察される塩橋相互作用によるヒンジループの機能であった。塩橋相互作用の破壊は、部位特異的突然変異誘発によって導入された２番目のジスルフィド架橋によって防止された。賦形剤としてスクロースを含む製剤条件により、さらなる安定化が達成された。具体的には、１５％スクロースも、これらの同じ残基とのＨ結合による安定化をもたらした。
【０１２３】
【表３】
2020523606.tif 000021
【０１２４】
図１９は、表３に示される結果に対応するプロットを示す。
実施例２
アメリカ国立標準技術研究所の標準物質８６７１（ＲＭ８６７１）ロット番号１４ＨＢ−Ｄ−００２、ヒト化ＩｇＧ１κモノクローナル抗体（ＮＩＳＴｍＡｂ）をＨ２Ｏ中に含むサンプルを、本明細書に記載の方法による分析のために調査した。ＱＣＬ顕微鏡を使用してデータを取得するために、サンプルをＣａＦ２スライドのセルに加えた。適用された摂動は、温度間隔が４℃の２４〜６０℃の範囲内の温度であった。ＱＣＬ  ＩＲスペクトルデータを、４ｃｍ−１で４×の倍率の対物レンズを使用して取得し、データは０．５ｃｍ−１ごとに符号化し、ベースライン補正した。
【０１２５】
ＮＩＳＴｍＡｂ標準はＩｇＧ１κタンパク質である。抗体の重鎖（配列番号５）及び軽鎖（配列番号６）のアミノ酸配列を以下に示す。
【０１２６】
【化１】
2020523606.tif 000022
【０１２７】
サンプルのアミノ酸側鎖の帰属は、表４及び５に記載されている。
【０１２８】
【表４】
2020523606.tif 000023
【０１２９】
【表５】
2020523606.tif 000024
【０１３０】
図２０Ａに示されるように、１７５０〜１４００ｃｍ−１の中赤外スペクトル領域における５０ｍｇ／ｍＬでのＮＩＳＴｍＡｂのＱＣＬスペクトルは、Ｈ２Ｏ中２４〜６０℃の温度範囲内で取得された。図２０Ａは、アミドＩ、ＩＩ及びＩＩＩバンドを示す重なり合ったスペクトルを示す。スペクトルデータに基づいて、同期（図２０Ｂ）及び非同期（図２０Ｃ）２Ｄ  ＩＲ相関分析プロットを生成した。アミドＩＩ及びＩＩＩバンドではなく、アミドＩバンドで重複するＨ２Ｏ吸収が観察され、分析のために十分なタンパク質濃度が達成されたことを示唆している。本開示の実施形態によれば、適用される方法は、Ｈ２Ｏの主観的な操作又はユーザによる基準減算の必要性を排除する。
【０１３１】
図２１Ａに示されるように、１７５０〜１５００ｃｍ−１の中赤外スペクトル領域における５０ｍｇ／ｍＬでのＮＩＳＴｍＡｂのＱＣＬスペクトルは、Ｈ２Ｏ中２４〜６０℃の温度範囲内で取得された。図２１Ａは、アミドＩＩ及びＩＩＩバンドの両方を示す重なり合ったスペクトルを示す。スペクトルデータに基づき同期（図２１Ｂ）及び非同期（図２１Ｃ）プロット。アミドＩ及びＩＩバンドの間の相関が確立される。非同期プロットを使用すると、解像度が向上する。
【０１３２】
Ｈ２Ｏ中の５０ｍｇ／ｍＬでのＮＩＳＴｍＡｂのピーク帰属を表６に示す。
【０１３３】
【表６】
2020523606.tif 000025
【０１３４】
２４〜６０℃の温度範囲内の熱ストレス下でのＨ２Ｏ中５０ｍｇ／ｍＬのＮＩＳＴｍＡｂの事象の順序を図２２に示す。１６３５．５ｃｍ−１には、１６９２ｃｍ−１βターンの摂動により逆平行βシートが帰属し、両方の振動モードが最も安定している。また、１６１８ｃｍ−１には、この研究に基づいて６０℃で熱誘導されたタンパク質凝集が帰属した。１６５２ｃｍ−１にはαヘリックスが帰属し得る。
【０１３５】
Ｈ２Ｏ中５０ｍｇ／ｍＬのＮＩＳＴｍＡｂの事象の順序を表７に示す。
【０１３６】
【表７】
2020523606.tif 000026
【０１３７】
図２３は、２４〜６０℃の温度範囲内の熱ストレス下でのＨ２Ｏ中５０ｍｇ／ｍＬのＮＩＳＴｍＡｂの非同期２Ｄ  ＩＲ共分布分析プロットを示す。２４〜６０℃の温度範囲及びスペクトル領域１７６０〜１３８０ｃｍ−１でのＮＩＳＴｍＡｂ（５０ｍｇ／ｍＬ）内の熱ストレス。このプロットは、溶液中のタンパク質の集団で最も一般的な応答を提供する。したがって、５０ｍｇ／ｍＬのＮＩＳＴｍＡｂの場合、その熱ストレスは、おそらく塩橋相互作用を介して、Ａｒｇとともにグルタミン酸の摂動に関連していた。Ｈｉｓ残基にＨ結合したグルタミン酸、及びこれらの残基はαヘリックス及びβシート内に位置する。
【０１３８】
図２４Ａ〜Ｄは、（Ａ）重ね合わせた生のスペクトルデータ、２Ｄ  ＩＲ相関：（Ｂ）同期及び（Ｃ）非同期プロット、及び（Ｄ）共分布非同期プロットの間の関係を提供する自動分析の例を示す。同期プロット内の自己ピーク（図２４Ｂに示す対角線上の正のピーク）絶対強度値に基づく自動分析中に、破線の垂直線が提供される。
【０１３９】
実施例３
Ｈ２Ｏ中にウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）を含むサンプルを、本明細書に記載の方法による分析のために調査した。ＱＣＬ顕微鏡を使用してデータを取得するために、サンプルをＣａＦ２スライドのセルに加えた。適用された摂動は、温度間隔が４℃の２４〜６０℃の範囲内の温度であった。ＱＣＬスペクトルデータを、４ｃｍ−１で４×の倍率の対物レンズを使用して取得し、データは０．５ｃｍ−１ごとに符号化し、ベースライン補正した。
【０１４０】
以下は、分析したＢＳＡのアミノ酸配列である。
ＤＴＨＫＳＥＩＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＨＦＫＧＬＶＬＩＡＦＳＱＹＬＱＱＣＰＦＤＥＨＶＫＬＶＮＥＬＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＨＡＧＣＥＫＳＬＨＴＬＦＧＤＥＬＣＫＶＡＳＬＲＥＴＹＧＤＭＡＤＣＣＥＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＳＨＫＤＤＳＰＤＬＰＫＬＫＰＤＰＮＴＬＣＤＥＦＫＡＤＥＫＫＦＷＧＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＹＹＡＮＫＹＮＧＶＦＱＥＣＣＱＡＥＤＫＧＡＣＬＬＰＫＩＥＴＭＲＥＫＶＬＴＳＳＡＲＱＲＬＲＣＡＳＩＱＫＦＧＥＲＡＬＫＡＷＳＶＡＲＬＳＱＫＦＰＫＡＥＦＶＥＶＴＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＫＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＤＮＱＤＴＩＳＳＫＬＫＥＣＣＤＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＫＤＡＩＰＥＮＬＰＰＬＴＡＤＦＡＥＤＫＤＶＣＫＮＹＱＥＡＫＤＡＦＬＧＳＦＬＹＥＹＳＲＲＨＰＥＹＡＶＳＶＬＬＲＬＡＫＥＹＥＡＴＬＥＥＣＣＡＫＤＤＰＨＡＣＹＳＴＶＦＤＫＬＫＨＬＶＤＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＤＱＦＥＫＬＧＥＹＧＦＱＮＡＬＩＶＲＹＴＲＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＳＬＧＫＶＧＴＲＣＣＴＫＰＥＳＥＲＭＰＣＴＥＤＹＬＳＬＩＬＮＲＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＥＫＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＴＰＤＥＴＹＶＰＫＡＦＤＥＫＬＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＰＤＴＥＫＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＬＫＨＫＰＫＡＴＥＥＱＬＫＴＶＭＥＮＦＶＡＦＶＤＫＣＣＡＡＤＤＫＥＡＣＦＡＶＥＧＰＫＬＶＶＳＴＱＴＡＬＡ（配列番号７）
サンプルのアミノ酸側鎖の帰属を表８に示す。
【０１４１】
【表８】
2020523606.tif 000027
【０１４２】
図２５Ａに示されるように、１７５０〜１５００ｃｍ−１の中赤外スペクトル領域における４０ｍｇ／ｍＬでのＢＳＡのＱＣＬスペクトルは、Ｈ２Ｏ中２４〜６０℃の温度範囲内で取得された。図２５Ａは、アミドＩ及びＩＩバンドを示す重なり合ったスペクトルを示す。スペクトルデータに基づき、同期（図２５Ｂ）及び非同期（図２５Ｃ）２Ｄ  ＩＲ相関分析プロットを生成した。アミドＩ及びＩＩバンドの間の相関が確立される。非同期プロットを使用すると、解像度が向上する。また、同期プロット内の最高強度の自己ピークは、この球状タンパク質のヘリカル摂動によるものである。さらに、凝集は観察されなかった。
【０１４３】
４０ｍｇ／ｍＬでのＢＳＡのピーク帰属を表９に示す。
【０１４４】
【表９】
2020523606.tif 000028
【０１４５】
２４〜６０℃の温度範囲内の熱ストレス下での４０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの事象の順序を図２６に示す。４０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの事象の順序を表１０にも示す。
【０１４６】
【表１０】
2020523606.tif 000029
【０１４７】
リジン（１５３０．０及び１５２５．５ｃｍ−１）との塩橋相互作用に関与するらせん領域（１６５３．９ｃｍ−１）内に位置するアスパラギン酸（１５６７ｃｍ−１）及びグルタミン酸（１５８４ｃｍ−１）が最初に摂動され、続いてβシート（１６２９．６ｃｍ−１）、次に逆平行βシート（１６２９．６ｃｍ−１）βターン（１６９８ｃｍ−１）内のチロシン（１５１８ｃｍ−１）及びヒスチジン（１６０６．５ｃｍ−１）が摂動される。最後に、高温では、βターン（１６８４．０ｃｍ−１）付近に位置するアルギニンとグルタミン酸（１５６０ｃｍ−１）及びアスパラギン酸（１５７６．４ｃｍ−１）を含む塩橋相互作用が摂動する。
【０１４８】
図２７は、２４〜６０℃の温度範囲及び１７５０〜１３８０ｃｍ−１のスペクトル領域内の熱ストレス下でのＨ２Ｏ中のＢＳＡ４０ｍｇ／ｍＬの非同期２Ｄ  ＩＲ共分布分析プロットを示す。ＢＳＡ４０ｍｇ／ｍＬの場合、その熱ストレスは、βターン及びらせん領域内のグルタミン酸の摂動に関連していた。
【０１４９】
実施例４
Ｈ２Ｏ中にＮＩＳＴｍＡｂ及びＢＳＡの混合物を含むサンプルを、本明細書に記載の方法による分析のために調査した。ＱＣＬ顕微鏡を使用してデータを取得するために、サンプルをＣａＦ２スライドのセルに加えた。適用された摂動は、温度間隔が４℃の２４〜６０℃の範囲内の温度であった。ＱＣＬスペクトルデータを、４ｃｍ−１で４×の倍率の対物レンズを使用して取得し、データは０．５ｃｍ−１ごとに符号化し、ベースライン補正した。
【０１５０】
図２８Ａに示されるように、１７５０〜１５００ｃｍ−１のスペクトル領域におけるＮＩＳＴｍＡｂ／ＢＳＡ（１：２、モル比）混合物のＱＣＬスペクトルは、Ｈ２Ｏ中２４〜６０℃の温度範囲内で取得された。図２８Ａは、アミドＩ及びＩＩバンドを示す重なり合ったスペクトルを示す。スペクトルデータに基づき、同期（図２８Ｂ）及び非同期（図２８Ｃ）２Ｄ  ＩＲ相関分析プロットを生成した。全体的に、同期プロットの輪郭は、ＮＩＳＴｍＡｂ及びＢＳＡの純粋な成分の両方で区別可能な特徴を示した。
【０１５１】
ＮＩＳＴｍＡｂ／ＢＳＡのピーク帰属を表１１に示す。
【０１５２】
【表１１】
2020523606.tif 000030
【０１５３】
実施例５
Ｈ２Ｏ中にリゾチームを含むサンプルを、本明細書に記載の方法による分析のために調査した。Ｈ２Ｏ中のサンプルについては、７μｍの経路長を有するカスタムＣａＦ２スライドセルを使用した。適用された摂動は、温度間隔が４℃の２４〜６０℃の範囲内の温度であった。ＱＣＬ  ＩＲスペクトルデータを、４ｃｍ−１で４×の倍率の対物レンズを使用して取得し、データは０．５ｃｍ−１ごとに符号化し、ベースライン補正した。
【０１５４】
以下は、分析したリゾチームのアミノ酸配列である。
ＫＶＦＧＲＣＥＬＡＡＡＭＫＲＨＧＬＤＮＹＲＧＹＳＬＧＮＷＶＣＡＡＫＦＥＳＮＦＮＴＱＡＴＮＲＮＴＤＧＳＴＤＹＧＩＬＱＩＮＳＲＷＷＣＮＤＧＲＴＰＧＳＲＮＬＣＮＩＰＣＳＡＬＬＳＳＤＩＴＡＳＶＮＣＡＫＫＩＶＳＤＧＮＧＭＮＡＷＶＡＷＲＮＲＣＫＧＴＤＶＱＡＷＩＲＧＣＲＬ（配列番号８）
サンプルのアミノ酸側鎖の帰属を表１２に示す。
【０１５５】
【表１２】
2020523606.tif 000031
【０１５６】
図２９Ａに示されるように、１７５０〜１５００ｃｍ−１のスペクトル領域における６００ｍｇ／ｍＬでのリゾチームのＱＣＬスペクトルは、Ｈ２Ｏ中２４〜６０℃の温度範囲内で取得された。図２９Ａは、アミドＩ及びＩＩバンドを示す重なり合ったスペクトルを示す。スペクトルデータに基づき、同期（図２９Ｂ）及び非同期（図２９Ｃ）２Ｄ  ＩＲ相関分析プロットを生成した。熱ストレスにより、タンパク質のらせん領域とβターンとの間の相関が確立できる。また、グルタミン酸、アスパラギン酸及びアルギニン、リジン、ヒスチジン残基間の弱い相互作用は、同期プロット及び非同期プロットの両方で観察される相関関係によって確立されるように、リゾチームの安定性にとって重要である。このタンパク質では凝集は観察されなかった。
【０１５７】
６００ｍｇ／ｍＬでのリゾチームのピーク帰属を表１３に示す。
【０１５８】
【表１３】
2020523606.tif 000032
【０１５９】
２４〜６０℃の温度範囲内の熱ストレス下での６００ｍｇ／ｍＬのリゾチームの事象の順序を図３０に示す。４０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡの事象の順序を表１４にも示す。
【０１６０】
【表１４】
2020523606.tif 000033
【０１６１】
チロシン（１５１４．６ｃｍ−１）及びリジン（１５２６．９ｃｍ−１）が最初に摂動され、その後アルギニン（１６２８．７ｃｍ−１）、次にβシート（１６３７．２ｃｍ−１）、次にβシート内のグルタミン酸（１５３６．８ｃｍ−１）に続いてらせん領域（１６４７．０ｃｍ−１）及びβターン（１６９８．０ｃｍ−１及び１６８３．８ｃｍ−１）内のグルタミン酸（１５５６ｃｍ−１）、その後にグルタミン酸（１５４７．８ｃｍ−１）ヒンジループ（１６６０．５ｃｍ−１）次にアスパラギン酸（１５６６．１，１６７２．３ｃｍ−１）、及びおそらくＮ末端近くに位置するＨ結合相互作用によってアスパラギン酸と相互作用する単一のヒスチジン（１５９６．６ｃｍ−１）、そして最後に、いずれも（１６６６．６ｃｍ−１）に帰属するＡｒｇ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ。凝集は観察されなかった。
【０１６２】
図３１は、２４〜６０℃の温度範囲及び１７５０〜１５００ｃｍ−１のスペクトル範囲内の熱ストレス下でのＨ２Ｏ中６００ｍｇ／ｍＬのリゾチームの非同期２Ｄ  ＩＲ共分布分析プロットを示す。リゾチーム（６００ｍｇ／ｍＬ）の場合、その熱ストレスは、ヒンジループ内に位置するチロシンと、βターン及びらせん領域の近くに位置するリジン及びグルタミン酸の摂動に関連していた。
【０１６３】
実施例６
高純度の市販トレハロース二水和物を水性媒体中の６０％（ｗ／ｖ）溶液として含むサンプルを、本明細書に記載の方法による分析のために研究した。ＱＣＬ顕微鏡を使用してデータを取得するために、サンプルをＣａＦ２スライドのセルに加えた。適用された摂動は、４℃の温度間隔の２４〜６０℃の範囲内の温度であり、平衡時間を５分間とした。画像化は低倍率対物レンズを用い、視野２ｍｍ、ピクセルサイズ４．３μｍで行った。
【０１６４】
図３２Ａ〜３２Ｆに示すように、６０％トレハロース溶液の低倍率画像を、ガラス転移温度未満の様々な温度で取得した。スペクトルデータに基づき、同期２Ｄ  ＩＲ相関分析プロットを生成した（図３２Ｅ）。典型的な幅広いピークは、トレハロース二糖に由来するものとして観察される。
【０１６５】
図３３Ａは、核生成及び初期結晶形態の分析を示す。図３３Ａ及び３３Ｂに示すように、ガラス転移温度付近の様々な温度で、６０％トレハロース溶液の低倍率画像を取得した。スペクトルデータに基づいて、同期２Ｄ  ＩＲ相関分析プロットを生成した（図３３Ｃ）。主な変化は、トレハロースの核生成から結晶形への転移による対角線上の正の自己ピークで観察される。図３３Ｂ（図３３Ｄ〜３３Ｆ）は、主に１４００〜１２００ｃｍ−１スペクトル領域内のピーク狭まり効果及びＣＨ２シザリングなどの振動モード内のより大きな摂動によって観察される結晶成長の分析及び脱水の証拠を示す。同期プロット内の自己ピークから観察されるように、１４５０ｃｍ−１での振動が最大の変化を示した。
【０１６６】
実施例７
０．１ＭトリスｐＨ８．５、０．５％ｗ／ｖＰＥＧ５０００、０．８Ｍ酒石酸ナトリウムカリウム四水和物を含むサンプルを、本明細書に記載の方法による分析のために研究した。ＱＣＬ顕微鏡を使用してデータを取得するために、サンプルをＣａＦ２スライドのセルに加えた。適用された摂動は、２℃の温度間隔の３０〜３８℃の範囲内の温度であり、平衡時間を４分間とした。
【０１６７】
図３４Ａは、蒸気拡散結晶化中の実際のハンギングドロップスクリーンのアリコート（１μＬ）の３０〜３８℃の温度範囲内及び２℃の温度間隔のハイパースペクトル画像の収集を示す。画像は、タンパク質複合体又は混合物の１７５０〜１４８０ｃｍ−１の中赤外スペクトル領域で４分間の温度平衡期間後に取得した。０．１ＭトリスｐＨ８．５、０．５％ｗ／ｖＰＥＧ５０００、０．８Ｍ酒石酸カリウムナトリウム四水和物の結晶化条件における凝集体及び微結晶が示されている。関心領域（ＲＯＩ）が強調表示され、温度に関連してモニタリングされ、他ではアモルファス結晶と考えられるものの成長を示す。
【０１６８】
図３４Ｂは、ＱＣＬ  ＩＲスペクトルを重ねたチャートを示す。ＱＣＬ  ＩＲによる関心対象の視覚化及び検査の有効性が示されており、温度上昇に伴って強度が低下することが観察される幅広いアミドＩバンドの存在により、それがタンパク質であることが確認される。
【０１６９】
次いで、ＱＣＬ  ＩＲスペクトルは、図３４Ｃ（同期）及び図３４Ｄ（非同期）に示される２Ｄ  ＩＲ相関分析にかけられ、温度に関連して成長するＨＳＩ  ＲＯＩ内の対象は、同期プロットにおける１６２０ｃｍ−１の顕著な自己ピークにより、実際にタンパク質凝集体であることが明らかにされ、結果としてプローブや色素を使用せずにタンパク質のタンパク質結晶化プロセスを評価するための前例のない洞察を提供する。フロースルーチャネル設計のマイクロチップとは対照的に、分析に使用されるスライドにはフロースルーチャネルが含まれていないため、目詰まりの可能性がない。
【０１７０】
タンパク質−ペプチド複合体の結晶化のアリコートをそのまま分析した。さらに、タンパク質もペプチドも同位体で標識しなかった。熱ストレス下で取得したＨＳＩは、温度上昇（Ｔ＝３０〜３８℃）に伴って凝集体が成長する証拠を提供したが、さらに２ＤＣＯＳ分析の価値は、凝集プロセスに関与する分子成分の特定である。タンパク質又はペプチドにしかない重要なバンドの帰属を行った。Ｈ２Ｏで観察される骨格振動モードは、βターン（１６９２．３ｃｍ−１）、ヒンジループ（１６６４．３ｃｍ−１）、αヘリックス（１６５７．０ｃｍ−１）、βシート（１６３７．５ｃｍ−１）、及び凝集体（１６１１．０ｃｍ−１）に帰属した。さらに、内部プローブとして機能する、又は摂動を受ける弱い相互作用の情報を提供する側鎖モードは、Ａｒｇ（１５８３．７ｃｍ−１）、Ａｓｐ−（１５７８．５ｃｍ−１）、及びＧｌｕ−（１５４７．０ｃｍ−１）に帰属した。１７０８ｃｍ−１のＰｈｅ側鎖モードはタンパク質にしかなく、Ｈｉｓ（１６００．３ｃｍ−１）はペプチドにしかない。
【０１７１】
３０〜３８℃の温度範囲内の熱ストレス下での、図３４Ａ〜３４Ｅのタンパク質−ペプチド複合体の結晶化に関する事象の順序を表１５に示す。
【０１７２】
【表１５】
2020523606.tif 000034
【０１７３】
タンパク質は、凝集プロセスに関連する短いβシートセグメント（１６３７ｃｍ−１）を含むが、ヒスチジン（Ｈｉｓ）側鎖モード（１６００ｃｍ−１）はペプチドにしかなく、これもこのプロセスに関与している。具体的には、ペプチドは、ペプチドの中央に位置する３つのタンデムＨｉｓ残基を持ち、ペプチドの内部プローブとして機能する。本明細書に記載の規則に従う２ＤＣＯＳ非同期及び同期プロットの分析は、以下のような事象の分子順序をもたらし、図３５Ｃに関して表１５にも要約されている：塩橋相互作用に関連するＧｌｕ−（１５４７．０ｃｍ−１）、Ａｓｐ−（１５７８．５ｃｍ−１）及びＡｒｇ（１５８３．７ｃｍ−１）を含む弱い相互作用が最初に摂動され、続いてαヘリックス（１６５７．０ｃｍ−１）、次に凝集プロセス（１６１１．０ｃｍ−１）に関与するβシート（１６３７．５ｃｍ−１）、続いてペプチド内のＨｉｓ残基（１６００．３ｃｍ−１）の摂動。これは、ペプチドが凝集プロセスにも関与していることを示唆している。続いて、ヒンジループ（１６６４．３ｃｍ−１）、次にβターン（１６９２．３ｃｍ−１）、最後にβ−内のタンパク質のみに見られるＰｈｅ残基（１７０８ｃｍ−１）が続く。
【０１７４】
図３４Ｅに示されるように、選択されたタンパク質−ペプチド複合体の結晶化スクリーンも２ＤＣＤＳによって分析し、溶液中のタンパク質−ペプチド複合体集団の挙動を決定した。分析は、凝集事象（１６１１ｃｍ−１）に関連するタンパク質−ペプチド複合体の大部分が、βシート（１６３７．５ｃｍ−１）を含むことを支持している。また、αヘリックス（１６５７．０ｃｍ−１）成分とＡｒｇ（１５８３．７ｃｍ−１）側鎖モードとの関係は、凝集プロセス中の熱ストレスによって摂動されることが示されている。
【０１７５】
実施例８
純粋な組換えタンパク質をハンギングドロップ結晶化に供し、目的のハンギングドロップのスクリーニングアリコートを取り出して、ＨＳＩ取得のためにＱＣＬＭ上に組み立てて配置したカスタムスライドセル内の予め決められたウェルに配置した。ＨＳＩデータは、図３５Ａに示されるように、０．６１ＮＡ、４．６ｕｍピクセル解像度の低倍率対物レンズを使用して、２ｍｍ×２ｍｍの視野（ＦＯＶ）、３０〜３８℃の温度範囲、２℃の温度間隔で収集した。
【０１７６】
微結晶が観察され、さらなる検査のために関心領域が選択された。この場合も、結晶スクリーニングトレイから移されたアリコートは、３０〜３８℃の温度範囲内で２℃の増分間隔で熱ストレスを受けた。ＨＳＩデータは、４分間の温度平衡後に収集された。暗い部分は、熱的にストレスを受けるタンパク質の微結晶である。
【０１７７】
図３５Ｂは、ＱＣＬ  ＩＲスペクトルを重ねたチャートを示す。図３５Ｂは、アミドＩバンド１６９０〜１６００ｃｍ−１の強度の減少から観察されるように、部分的に展開したアミドＩ及びＩＩバンドのＱＣＬ  ＩＲオーバーレイである。ＱＣＬ  ＩＲスペクトルは向上したＳＮＲを示し、０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１０％ｗ／ｖＰＥＧ６０００、５％ｖ／ｖ  ２−メチル−２，４−ペンタンジオールの結晶化溶液でこのような微結晶の検査を可能にする。図３５Ｃ（同期）及び図３５Ｄ（非同期）に示された、結果として得られる２Ｄ  ＩＲ相関プロットは、熱ストレス中の溶液中のタンパク質と著しく類似しており、微結晶ではあるが、その挙動は溶液中の挙動に匹敵することを示唆している。
【０１７８】
結晶化中の純粋な組換えタンパク質のアリコートを、結晶化スクリーニング溶液中でそのまま分析した。熱ストレス下で取得したＨＳＩは、温度範囲内（Ｔ＝３０〜３８℃）で熱ストレスを受けた微結晶の証拠を提供したが、さらに２ＤＣＯＳ分析の価値は、タンパク質性の結晶の特定及び結晶化したタンパク質が溶液中のタンパク質と同様に振る舞うことの特定である（本明細書でさらに議論する）。バンドの帰属を以下のように決定した：Ｈ２Ｏ中の骨格振動モード関連は：βターン（１６８７．０ｃｍ−１）、３１０ヘリックス（１６７５．０ｃｍ−１）、αヘリックス（１６５５．０ｃｍ−１）、βシート（１６３７．５ｃｍ−１）に帰属した。さらに、内部プローブとして機能する側鎖モードは：パラ置換芳香族側鎖モードのＰｈｅ（１７２５．５及び１７０９．５ｃｍ−１）、Ｈｉｓ（１６０６．０ｃｍ−１）、Ａｒｇ（１５８１．３ｃｍ−１）、Ａｓｐ−（１５５６．０ｃｍ−１）、Ｇｌｕ−（１５４０．８ｃｍ−１）、Ｔｙｒ（１５１７．０ｃｍ−１）、及びＴｒｐ（１４６１．０ｃｍ−１）に帰属した。
【０１７９】
３０〜３８℃の温度範囲内の熱ストレス下での、図３５Ａ〜３５Ｅのタンパク質−ペプチド複合体の結晶化に関する事象の順序を表１６に示す。
【０１８０】
【表１６】
2020523606.tif 000035
【０１８１】
この分析は、ここで説明されている規則に従う２ＤＣＯＳ非同期及び非同期プロットに基づいている：熱摂動は、Ｎ末端内に位置するＴｒｐ残基（１４６１．０ｃｍ−１）から始まり、続いてβシート（１６３７．５ｃｍ−１）、その後、Ｃ末端付近に位置するＨｉｓ残基（１６０６．０ｃｍ−１）、その後、Ａｒｇ残基（１５８１．３ｃｍ−１）、続いてらせん領域αヘリックス（１６５５．０ｃｍ−１）及び３１０ヘリックス（１６７５．０ｃｍ−１）、その後、βターン（１６８７．０ｃｍ−１）、続いて側鎖モードＡｓｐ−（１５５６．０ｃｍ−１）、パラ置換芳香族側鎖モードのＰｈｅ（１７２５．５及び１７０９．５ｃｍ−１）、Ｇｌｕ−（１５４０．８ｃｍ−１）、そして最後にＴｙｒ（１５１７．０ｃｍ−１）。
【０１８２】
図３５Ｅに示すように、結晶化中の純粋な組換えタンパク質を２ＤＣＤＳで分析し、温度範囲Ｔ＝３０〜３８℃での溶液中のタンパク質微結晶集団の挙動を決定した。Ｔｙｒ残基（１５１７ｃｍ−１）に帰属されたクロスピークの強度変化に示されるように、熱ストレッサーにより、タンパク質の中央部分がより大きく摂動した。また、溶液中のタンパク質の大部分で摂動されたのは、そのαヘリックスセグメント（１６５５．０ｃｍ−１）、Ｃ末端付近に位置する単一のＨｉｓ残基（１６０６．０ｃｍ−１）、及びＮ末端内に位置するＴｒｐ（１４６１．０ｃｍ−１）であった。最後に、Ａｒｇ（１５８１．３ｃｍ−１）、Ａｓｐ−（１５５６．０ｃｍ−１）、及びＧｌｕ−（１５４０．８ｃｍ−１）など、塩橋相互作用におそらく関与している側鎖モードも摂動された。
【０１８３】
図３５Ｆ及び３５Ｇに示されるように、（１）溶液中（図３５Ｆ；Ｔ＝２４〜６０℃）及び（２）結晶化（図３５Ｇ；Ｔ＝３０〜３８℃）についての熱ストレス時の純粋な組換えタンパク質の２ＤＣＯＳ非同期プロットは、同様のクロスピークパターンを持つことが示されており、タンパク質の挙動が類似していることが示唆される。この観察結果は、強度とピーク位置の同様の変化によるものである。溶液の条件及び温度範囲が異なるにもかかわらず、タンパク質は同様の挙動を示しており、微結晶内のタンパク質が溶液中のタンパク質を代表することを示唆している。
【０１８４】
図３６は、（例えば図４の）コンピューティングデバイスを実装できる例示的なコンピュータシステムを示すブロック図である。特定の実施形態では、コンピュータシステム１９００は、専用サーバ内にあるか、別のエンティティに統合されるか、又は複数のエンティティに分散されたハードウェア又はソフトウェアとハードウェアとの組合せを用いて実装され得る。
【０１８５】
コンピュータシステム１９００は、バス１９０８又は情報を通信するための他の通信メカニズム、及び情報を処理するためにバス１９０８に結合されたプロセッサ１９０２を含む。例として、コンピュータシステム１９００には、１つ又は複数のプロセッサ１９０２を実装してもよい。プロセッサ１９０２は、汎用マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）、コントローラ、ステートマシン、ゲーテッドロジック、ディスクリートハードウェアコンポーネント、及び／又は情報の計算や他の操作を実行できるその他の適切なエンティティであり得る。
【０１８６】
コンピュータシステム１９００は、ハードウェアに加えて、当該コンピュータプログラムの実行環境を作成するコード、例えば、プロセッサファームウェア、プロトコルスタック、データベース管理システム、オペレーティングシステム、又は、同梱のメモリ１９０４に格納されたこれらの１つ以上の組合せを構成するコードを含むことができる。メモリ１９０４は、例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、フラッシュメモリ、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、プログラマブル読み出し専用メモリ（ＰＲＯＭ）、消去可能ＰＲＯＭ（ＥＰＲＯＭ）、レジスタ、ハードディスク、リムーバブルディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、及び／又は、プロセッサ１９０２によって実行される情報及び命令を格納するためのバス１９０８に結合された他の任意の適切なストレージデバイスである。プロセッサ１９０２及びメモリ１９０４は、専用ロジック回路によって補足されるか、又はそれに組み込まれてもよい。
【０１８７】
命令は、メモリ１９０４に格納され、１つ以上のコンピュータプログラム製品に、すなわち、コンピュータシステム１９００により実行するため、又はその動作を制御するためにコンピュータ可読媒体にエンコードされたコンピュータプログラム命令の１つ以上のモジュールに実装されてもよい。実装は、当業者に周知の任意の方法によって、例えば、限定するものではないが、データ指向言語（例えば、ＳＱＬ、ｄＢａｓｅ）、システム言語（例えば、Ｃ、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、Ｃ＋＋、アセンブリ）、アーキテクチャ言語（例えば、Ｊａｖａ、．ＮＥＴ）、及び／又はアプリケーション言語（例えば、ＰＨＰ、Ｒｕｂｙ、Ｐｅｒｌ、Ｐｙｔｈｏｎ）などのコンピュータ言語でなされてもよい。命令は、配列言語、アスペクト指向言語、アセンブリ言語、オーサリング言語、コマンドラインインターフェース言語、コンパイル言語、並行言語、中括弧言語、データフロー言語、データ構造化言語、宣言型言語、難解言語、拡張言語、第４世代言語、機能言語、インタラクティブモード言語、インタープリター言語、反復言語、リストベース言語、リトル言語、ロジックベース言語、機械言語、マクロ言語、メタプログラミング言語、マルチパラダイム言語、数値解析、英語ベース以外の言語、オブジェクト指向クラスベース言語、オブジェクト指向プロトタイプベース言語、オフサイドルール言語、手続き型言語、リフレクティブ言語、ルールベース言語、スクリプト言語、スタックベース言語、同期言語、構文処理言語、視覚言語、ｗｉｒｔｈ言語、及び／又はｘｍｌベース言語などのコンピュータ言語で実装されてもよい。メモリ１９０４はまた、プロセッサ１９０２によって実行される命令の実行中に一時変数又は他の中間情報を格納するために使用されてもよい。
【０１８８】
本明細書で説明されるコンピュータプログラムは、ファイルシステム内のファイルに必ずしも対応するわけではない。プログラムは、他のプログラム又はデータを保持するファイルの一部（例えば、マークアップ言語ドキュメントに保存されている１つ以上のスクリプト）に、当該プログラム専用の単一ファイルに、又は複数の調整ファイル（例えば、１つ以上のモジュール、サブプログラム、又はコードの一部を格納するファイル）に格納することができる。コンピュータプログラムを展開して、１つのコンピュータで、又は１つのサイトにあるか、複数のサイトに分散され、通信ネットワークで相互接続されている複数のコンピュータで実行することができる。本明細書で説明するプロセス及びロジックフローは、１つ以上のコンピュータプログラムを実行する１つ以上のプログラマブルプロセッサで実行でき、入力データを操作して出力を生成することで機能を実行する。
【０１８９】
コンピュータシステム１９００は、情報及び命令を記憶するためにバス１９０８に結合された磁気ディスク又は光ディスクなどのデータ記憶装置１９０６をさらに含む。コンピュータシステム１９００は、入力／出力モジュール１９１０を介して様々なデバイス（例えば、デバイス１９１４及び１９１６）に結合され得る。入力／出力モジュール１９１０は、任意の入力／出力モジュールであり得る。例示的な入力／出力モジュール１９１０は、データポート（例えば、ＵＳＢポート）、オーディオポート、及び／又はビデオポートを含む。いくつかの実施形態では、入力／出力モジュール１９１０は通信モジュールを含む。例示的な通信モジュールには、イーサネット（登録商標）カード、モデム、ルータなどのネットワークインターフェースカードが含まれる。特定の態様では、入力／出力モジュール１９１０は、入力デバイス１９１４及び／又は出力デバイス１９１６などの複数のデバイスに接続するように構成される。例示的な入力デバイス１９１４は、キーボード及び／又はポインティングデバイス（例えば、マウス又はトラックボール）を含み、それにより、ユーザはコンピュータシステム１９００に入力を提供することができる。触覚入力デバイス、視覚入力デバイス、音声入力デバイス、及び／又は脳コンピュータインターフェースデバイスなど、他の種類の入力デバイス１９１４を使用して、ユーザとの対話を提供することもできる。例えば、ユーザに提供されるフィードバックは、あらゆる形態の感覚フィードバック（視覚フィードバック、聴覚フィードバック、及び／又は触覚フィードバック）にすることができ、ユーザからの入力は、音響、音声、触覚、及び／又は脳波入力を含む任意の形態で受け取ることができる。例示的な出力デバイス１９１６は、ユーザに情報を表示するための陰極線管（ＣＲＴ）又は液晶ディスプレイ（ＬＣＤ）モニタなどのディスプレイデバイスを含む。
【０１９０】
特定の実施形態によれば、クライアントデバイス及び／又はサーバには、プロセッサ１９０２がメモリ１９０４に含まれる１つ以上の命令の１つ以上のシーケンスを実行することに応答して、コンピュータシステム１９００を使用して実装することができる。そのような命令は、データ記憶装置１９０６などの別の機械可読媒体からメモリ１９０４に読み込まれてもよい。メモリ１９０４に含まれる命令のシーケンスの実行により、プロセッサ１９０２は、本明細書に記載のプロセスステップを実行する。メモリ１９０４に含まれる命令のシーケンスを実行するために、マルチプロセッシング構成の１つ又は複数のプロセッサを使用することもできる。いくつかの実施形態において、本開示の様々な態様を実装するために、ソフトウェア命令の代わりに、又はソフトウェア命令と組み合わせて、ハードウェアに組み込まれた回路要素を使用することができる。したがって、本開示の態様は、ハードウェア回路要素とソフトウェアの特定の組合せに限定されない。
【０１９１】
本明細書に記載の本願の様々な態様は、バックエンドコンポーネント（例えばデータサーバ）を含むコンピューティングシステム、又はミドルウェアコンポーネント（例えばアプリケーションサーバ）を含むコンピューティングシステム、又はフロントエンドコンポーネント（例えば、ユーザが本明細書に記載の主題の実装とやり取りできるようなグラフィカルユーザインターフェース及び／又はウェブブラウザを備えたクライアントコンピュータ）を含むコンピューティングシステム、あるいは１つ以上のこのようなバックエンド、ミドルウェア、又はフロントエンドコンポーネントの任意の組合せで実装できる。システム１９００のコンポーネントは、デジタルデータ通信の任意の形態又は媒体（例えば、通信ネットワーク）により相互接続することができる。通信ネットワークの例には、ローカルエリアネットワーク及びワイドエリアネットワークが含まれる。
【０１９２】
本明細書で使用する「機械可読記憶媒体」又は「コンピュータ可読媒体」という用語は、実行のためにプロセッサ１９０２に命令を提供することに関与する任意の媒体を指す。そのような媒体は、不揮発性媒体、揮発性媒体、及び伝送媒体を含むがこれらに限定されない多くの形態を取り得る。不揮発性媒体には、例えば、データ記憶装置１９０６などの光ディスク又は磁気ディスクが含まれる。揮発性媒体には、メモリ１９０４などの動的メモリが含まれる。伝送媒体には、バス１９０８を構成するワイヤを含む、同軸ケーブル、銅線、及び光ファイバーが含まれる。機械可読媒体の一般的な形式には、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、その他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、その他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴のパターンを有する他の物理的媒体、ＲＡＭ、ＰＲＯＭ、ＥＰＲＯＭ、フラッシュＥＰＲＯＭ、その他のメモリチップ又はカートリッジ、又はコンピュータが読み取れるその他の媒体が含まれる。機械可読記憶媒体は、機械可読記憶デバイス、機械可読記憶基板、メモリデバイス、機械可読伝播信号をもたらす物質の組成、又はそれらの１つ以上の組合せであり得る。
【０１９３】
本明細書で使用する場合、「プロセッサ」は１つ以上のプロセッサを含むことができ、「モジュール」は１つ以上のモジュールを含むことができる。
本願の技術の一態様では、機械可読媒体は、命令がエンコード又は格納されたコンピュータ可読媒体であり、命令と、命令の機能を実現させるシステムの残りの部分との間の構造的及び機能的関係を定義する演算要素である。命令は、例えば、システム又はシステムのプロセッサによって実行可能である。命令は、例えば、コードを含むコンピュータプログラムである。機械可読媒体は、１つ又は複数の媒体を含み得る。
【０１９４】
本明細書で使用する「モジュール」という用語は、ハードウェア又はファームウェアで具現化されるロジック、又は、例えばＣ＋＋などのプログラミング言語で書かれた、入口点及び出口点を有し得るソフトウェア命令の集合を指す。ソフトウェアモジュールは、コンパイルされて実行可能プログラムにリンクされるか、ダイナミックリンクライブラリにインストールされるか、ＢＡＳＩＣなどの解釈言語で記述される。ソフトウェアモジュールは、他のモジュール又はそれ自体から呼び出すことができ、かつ／又は検出された事象又は中断に応答して呼び出すことができることが理解されよう。ソフトウェア命令は、ＥＰＲＯＭやＥＥＰＲＯＭなどのファームウェアに埋め込まれていてもよい。さらに、ハードウェアモジュールは、ゲート及びフリップフロップなどの接続された論理ユニットで構成されてもよく、かつ／又はプログラマブルゲートアレイ又はプロセッサなどのプログラマブルユニットで構成されてもよい。本明細書に記載のモジュールは、ソフトウェアモジュールとして実装されることが好ましいが、ハードウェア又はファームウェアで表されてもよい。
【０１９５】
モジュールは、より少ない数のモジュールに統合できると考えられる。１つのモジュールを複数のモジュールに分離することもできる。説明されたモジュールは、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、又はそれらの任意の組合せとして実装されてもよい。さらに、説明されたモジュールは、有線又は無線ネットワーク、又はインターネットを介して接続された様々な場所に存在してもよい。
【０１９６】
一般に、プロセッサには、例として、コンピュータ、プログラムロジック、又は本明細書で説明するように動作するデータ及び命令を表す他の基板構成が含まれ得ることが理解されよう。他の実施形態では、プロセッサには、コントローラ回路、プロセッサ回路、プロセッサ、汎用シングルチップ又はマルチチップマイクロプロセッサ、デジタルシグナルプロセッサ、埋め込みマイクロプロセッサ、マイクロコントローラなどが含まれ得る。
【０１９７】
さらに、一実施形態では、プログラムロジックは、１つ又は複数のコンポーネントとして有利に実装できることが理解されよう。コンポーネントは、有利には１つ以上のプロセッサで実行するように構成され得る。コンポーネントには、限定するものではないが、ソフトウェア又はハードウェアコンポーネント、ソフトウェアモジュールなどのモジュール、オブジェクト指向ソフトウェアコンポーネント、クラスコンポーネント及びタスクコンポーネント、プロセスメソッド、関数、属性、プロシージャ、サブルーチン、プログラムコードのセグメント、ドライバ、ファームウェア、マイクロコード、回路要素、データ、データベース、データ構造、表、配列、及び変数が含まれる。
【０１９８】
本明細書に開示の実施形態には以下が含まれる：
Ａ．結晶状態及び／又は結晶化中の化合物の特性を表すデータを処理するための方法であって：適用された摂動に関する化合物のスペクトルデータを取得すること；二次元相関（２ＤＣＯＳ）分析を適用して、化合物の同期相関プロットを生成すること；同期相関プロットにおいて、化合物の凝集に関連する自己ピークと相関するクロスピークを特定すること；及びクロスピークを使用して、化合物の結晶化の特性を決定することを含む方法。
【０１９９】
Ｂ．結晶状態及び／又は結晶化中の化合物の特性を表すデータを処理するためのシステムであって：適用された摂動に関する化合物のスペクトルデータを取得するように構成されたデータ取得モジュールと；二次元相関（２ＤＣＯＳ）分析を適用して、化合物の同期相関プロットを生成し；同期相関プロットにおいて、化合物の凝集に関連する自己ピークと相関するクロスピークを特定し；クロスピークを使用して、化合物の結晶化の特性を決定するように構成された相関分析モジュールとを含むシステム。
【０２００】
Ｃ．非一時的なコンピュータ読み取り可能媒体であって、１つ又は複数のコンピュータで実行されると、その１つ又は複数のコンピュータに：結晶状態及び／又は結晶化中の化合物の、適用された摂動に関するスペクトルデータを取得すること；二次元相関（２ＤＣＯＳ）分析を適用して、化合物の同期相関プロットを生成すること；同期相関プロットにおいて、化合物の凝集に関連する自己ピークと相関するクロスピークを特定すること；及びクロスピークを使用して、化合物の結晶化の特性を決定することを実行させる命令を含む非一時的なコンピュータ読み取り可能媒体。
【０２０１】
Ｄ．結晶状態及び／又は結晶化中の化合物の特性を表すデータを処理するための方法であって：適用された摂動に関する化合物のスペクトルデータを取得すること；二次元共分布（２ＤＣＤＳ）分析を適用して、化合物の非同期共分布プロットを生成すること；非同期共分布プロットにおいて、化合物の凝集に関連する自己ピークと相関するクロスピークを特定すること；及びクロスピークを使用して、化合物の結晶化の特性を決定することを含む方法。
【０２０２】
Ｅ．結晶状態及び／又は結晶化中の化合物の特性を表すデータを処理するためのシステムであって：適用された摂動に関する化合物のスペクトルデータを取得するように構成されたデータ取得モジュールと；二次元共分布（２ＤＣＤＳ）分析を適用して、化合物の非同期共分布プロットを生成し；非同期共分布プロットにおいて、化合物の凝集に関連する自己ピークと相関するクロスピークを特定し；クロスピークを使用して、化合物の結晶化の特性を決定するように構成された相関分析モジュールとを含むシステム。
【０２０３】
Ｆ．非一時的なコンピュータ読み取り可能媒体であって、１つ又は複数のコンピュータで実行されると、その１つ又は複数のコンピュータに：結晶状態及び／又は結晶化中の化合物の、適用された摂動に関するスペクトルデータを取得すること；二次元共分布（２ＤＣＤＳ）分析を適用して、化合物の非同期共分布プロットを生成すること；非同期共分布プロットにおいて、化合物の凝集に関連する自己ピークと相関するクロスピークを特定すること；及びクロスピークを使用して、化合物の結晶化の特性を決定することを実行させる命令を含む非一時的なコンピュータ読み取り可能媒体。
【０２０４】
実施形態Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、及びＦのそれぞれは、以下の追加の要素のうちの１つ又は複数を任意の組合せで有することができる。
要素１：前記特定されたピーク強度は、強度の変化が観察される温度範囲を決定するために使用される。
【０２０５】
要素２：前記凝集プロセスの強度限界を画定し、各強度値と前記限界内の最大強度値との比によって定義される前記強度限界内の各強度値の小数値を決定する。
要素３：凝集プロセスにおいて存在する各ピークの前記限界によって画定されるように、初期及び最終の小数値を特定し、少なくとも前記初期及び最終の小数値に基づいて、凝集量を決定する。
【０２０６】
要素４：結晶化の特性は、化合物の核生成から結晶形への転移に基づく。
要素５：結晶化の特性を決定することは、結晶化の特性を、適用された摂動に対するスペクトル強度の分布存在の順序と比較することを含む。
【０２０７】
要素６：結晶化の特性を決定することは、核生成事象の条件を決定することを含む。
要素７：結晶化の特性を決定することは、化合物とその環境との水素結合相互作用の減少を検出することにより、結晶化による脱水事象を評価することを含む。
【０２０８】
要素８：結晶化の特性を決定することは、化合物内の振動モードを決定することを含む。
要素９：クロスピークを使用することは：２つの波数ｖ１及びｖ２について、２つの波数に対応するクロスピークが正の値を有するか否かを決定し；クロスピークが正の値を有する場合、ｖ１でのスペクトル強度の存在は、ｖ２でのスペクトル強度の存在が分布している間隔よりも低い適用された摂動の間隔内で分布していると決定することを含む。
【０２０９】
要素１０：クロスピークを使用することは：２つの波数ｖ１及びｖ２について、２つの波数に対応するクロスピークが負の値を有するか否かを決定し；クロスピークが負の値を有する場合、ｖ２でのスペクトル強度の存在は、ｖ１でのスペクトル強度の存在が分布している間隔よりも低い適用された摂動の間隔内で分布していると決定することを含む。
【０２１０】
要素１１：スペクトルデータはＦＴ−ＩＲスペクトルデータである。
要素１２：非同期共分布プロットにおける非同期共分布強度は、２つのスペクトル信号の分布の差として表される。
【０２１１】
要素１３：適用される摂動は、時間、温度、濃度、又は圧力である。
要素１４：二次元共分布（２ＤＣＤＳ）分析を適用して、化合物の同期共分布プロットを生成する。
【０２１２】
要素１５：同期共分布プロットにおいて、化合物の凝集に関連する同期共分布ピークを特定する。
要素１６：同期共分布ピークを使用して、適用された摂動に関するスペクトル強度の分布パターンの重なりの程度を決定する。
【０２１３】
要素１７：同期共分布ピークを使用することは、２つの波数ｖ１及びｖ２について、２つの波数に対応する同期共分布ピークが特定の範囲内にあるか否かを決定することを含む。
【０２１４】
要素１８：二次元相関（２ＤＣＯＳ）分析を適用し、化合物の同期相関プロット及び非同期相関プロットを生成する。
要素１９：同期相関プロットにおいて、化合物の凝集に関連する自己ピークと相関する正のクロスピークを特定する。
【０２１５】
要素２０：スペクトルデータの特定されたピーク強度を使用して、化合物の凝集量を決定する。
要素２１：化合物の凝集量を、適用された摂動に関してスペクトル強度の分布存在の順序と比較する。
【０２１６】
要素２２：スペクトルデータを取得することは、化合物を含むサンプルに対してＱＣＬ赤外分光法を実施することを含む。
要素２３：微粒子及び溶液の識別のために関心領域を認識する。
【０２１７】
要素２４：微粒子の集団分布を確認するために微粒子のサイズ及び数を決定する。
要素２５：スペクトルデータを分析して、信号対雑音比を確認し、ベースライン補正を実行し、水蒸気含有量を決定し、及び／又はスペクトル領域内の信号強度を決定する。
【０２１８】
要素２６：サンプルの摂動に基づいて共分散又は動的スペクトルデータを生成する。
要素２７：同期プロットで得られた互いに同位相のスペクトルデータにおける、ピーク強度を含む変化を相関させる。
【０２１９】
要素２８：スペクトルデータにおいて変化する要素を決定する。
要素２９：スペクトルデータにおける全体的な最大強度変化を決定する。
要素３０：スペクトルデータにおける全体的な最小強度変化を決定する。
【０２２０】
要素３１：バンドにおける基になるスペクトルの寄与の最小数を決定し、カーブフィッティング分析を実行し、サンプルの二次構造組成を決定する。
要素３２：スペクトルデータの解像度を向上させる。
【０２２１】
要素３３：非同期プロットで得られた互いに逆位相のスペクトルデータにおけるピーク強度を含む変化を相関させる。
要素３４：化合物中のアミノ酸側鎖の脱アミノ化の存在及び／又は程度を決定する。
【０２２２】
要素３５：化合物のドメインの安定性を決定する。
要素３６：表示用の１つ以上のプロットを生成するための視覚モデルジェネレータ。
要素３７：ヒューマンインターフェースを含むヒューマンインタラクションモジュールである。
【０２２３】
要素３８：データ取得モジュールは、量子カスケードレーザ顕微鏡を含む。
上述の説明は、当業者が本明細書に記載の様々な構成を実施できるようにするために提供されている。本願の技術は、様々な図及び構成を参照して特に説明されているが、これらは例示のみを目的としており、本願の技術の範囲を限定するものとして解釈されるべきではないことを理解されたい。
【０２２４】
本願の技術を実装する方法は他にもたくさんある。本明細書に記載の様々な機能及び要素は、本願の技術の範囲から逸脱することなく、示したものとは異なるように区分され得る。これらの構成に対する様々な変更は、当業者には容易に明らかであり、本明細書で定義される一般的な原理は、他の構成に適用され得る。したがって、本願の技術の範囲から逸脱することなく、当業者によって本願の技術に対して多くの変更及び改良を行うことができる。
【０２２５】
開示されたプロセスにおけるステップの特定の順序又は階層は、例示的なアプローチの実例であることが理解される。設計上の希望に応じて、プロセス内のステップの特定の順序又は階層を再構成してもよいことが理解される。一部のステップは同時に実行できる。添付の方法クレームは、見本の順序で様々なステップの要素を提示し、提示された特定の順序又は階層に限定されることを意図していない。
【０２２６】
本明細書で使用する、一連の項目に先行し、任意の項目を隔てる「及び」又は「又は」の用語を伴う「〜の少なくとも１つ」という句は、そのリストの各メンバー（すなわち各項目）ではなく、リスト全体を修飾する。「〜の少なくとも１つ」という句は、リストされた各項目の少なくとも１つを選択する必要はない。むしろ、この句は、項目のいずれか１つを少なくとも１つ、及び／又は、項目の任意の組合せを少なくとも１つ、及び／又は各項目の少なくとも１つを意味することがある。例として、「Ａ、Ｂ、及びＣの少なくとも１つ」又は「Ａ、Ｂ、又はＣの少なくとも１つ」という句は、それぞれＡのみ、Ｂのみ、又はＣのみ；Ａ、Ｂ、及びＣの任意の組合せ；及び／又はＡ、Ｂ、Ｃのそれぞれの少なくとも１つを指す。
【０２２７】
本開示で使用される「上」、「下」、「前」、「後」などの用語は、通常の重力の基準枠ではなく、任意の基準枠を参照するものと理解されるべきである。したがって、上面、下面、前面、及び後面は、重力の基準枠において上向き、下向き、斜め方向、又は水平方向に延びていてもよい。
【０２２８】
さらに、「含む」、「有する」などの用語が明細書又は特許請求の範囲で使用される限り、そのような用語は、「含む」という用語が請求項の移行語として採用された場合に解釈される「含む」と同様の態様で包括的であることを意図している。
【０２２９】
「例示的」という語は、本明細書では「例、実例、又は例示として役立つ」ことを意味するために使用される。本明細書で「例示的」として説明される実施形態は、必ずしも他の実施形態よりも好ましい又は有利であると解釈される必要はない。
【０２３０】
単数形の要素への言及は、特に明記しない限り「ただ１つのみ」を意味するものではなく、「１つ以上」を意味することを意図している。男性の代名詞（例：彼の）には、女性及び中性の性別（例：彼女の及びその）が含まれ、逆も同様である。「いくつか」という用語は、１つ以上を指す。下線及び／又は斜体の見出し及び小見出しは、便宜のためだけに使用され、本願の技術を制限せず、本願の技術の説明の解釈に関して参照されない。当業者に知られている、又は後に当業者に知られるようになる本開示を通して説明される様々な構成の要素に対するすべての構造的及び機能的等価物は、参照により本明細書に明示的に組み込まれ、本願の技術に含まれることが意図される。さらに、本明細書で開示されるものは公衆に献呈されることを意図していない（そのような開示が上記の説明で明示的に記載されているか否かを問わない）。
【０２３１】
本願の技術の特定の態様及び実施形態を説明したが、これらは例としてのみ提示されており、本願の技術の範囲を限定することを意図するものではない。実際、本明細書で説明される新規の方法及びシステムは、その趣旨から逸脱することなく、他の様々な形態で具現化され得る。添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物は、本願の技術の範囲及び趣旨に含まれるような形態又は変更を網羅することを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３２−３】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
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【図３３−３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３４Ｅ】
2020523606.tif 000082
【図３５Ａ】
2020523606.tif 000083
【図３５Ｂ】
2020523606.tif 000084
【図３５Ｃ】
2020523606.tif 000085
【図３５Ｄ】
2020523606.tif 000086
【図３５Ｅ】
2020523606.tif 000087
【図３５Ｆ】
2020523606.tif 000088
【図３５Ｇ】
2020523606.tif 000089
【図３６】
2020523606.tif 000090
【配列表】
2020523606000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月21日(2020.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
【表１】
2020523606.tif 000091
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
【表２】
2020523606.tif 000092
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２３】
【表３】
2020523606.tif 000093
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
【化１】
2020523606.tif 000094
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２８】
【表４】
2020523606.tif 000095
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
【表５】
2020523606.tif 000096
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４１】
【表８】
2020523606.tif 000097
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
【表１２】
2020523606.tif 000098
【国際調査報告】
2020523606.tif 000099
2020523606.tif 000100
2020523606.tif 000101