(57)【要約】本発明で開示される主題は、解凍後の拡大および／または継代なしに下流の応用に直接使用することができる、解離された細胞のすぐに使用可能な凍結保存集団の組成物に関する。本発明で開示される主題は、そのような組成物を調製する方法、およびそのような組成物を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法も提供する。この主題は、実験で使用される品質管理された多能性幹細胞（ＰＳＣ）、および大型バッチを生成することによるバッチ間変動の排除を提供し、すぐに使用可能なアリコートとして凍結保存されるので異なる時間に異なる場所で繰り返し使用し得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
解離された細胞の凍結集団と凍結保存用培地とを含む組成物であって、前記凍結集団内の細胞の濃度が、少なくとも細胞約１００万個／ｍｌである、組成物。
【請求項２】
異種核酸がトランスフェクトされた細胞を含む組成物であって、解離された細胞の凍結集団および凍結保存用培地を解凍することにより得られる細胞にトランスフェクトすることにより調製され、前記凍結集団内の細胞の濃度が、少なくとも細胞約１００万個／ｍｌである、組成物。
【請求項３】
前記凍結集団内の細胞の濃度が、少なくとも細胞約５００万個／ｍｌである、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
前記凍結集団内の細胞の濃度が、少なくとも細胞約３０００万個／ｍｌである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記凍結集団内の細胞の濃度が、少なくとも細胞約５０００万個／ｍｌである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記哺乳動物細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記多能性幹細胞が、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）または胚性幹細胞（ＥＳＣ）である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
凍結細胞を含む組成物を調製する方法であって、
培養培地で培養された細胞の集団を解離させるステップ、
解離された細胞を凍結保存用培地に浮遊させるステップであって、細胞浮遊液を形成するステップ、および
前記細胞浮遊液を凍結させるステップであって凍結細胞の組成物を形成するステップ
を含み、
凍結細胞の前記組成物が、少なくとも細胞約１００万個／ｍｌの濃度を有する、方法。
【請求項１０】
トランスフェクト細胞を調製する方法であって、
（ｉ）凍結細胞を含む組成物を、
培養培地で培養された細胞の集団を解離させるステップと、
解離された細胞を凍結保存用培地に浮遊させるステップであって、細胞浮遊液を形成するステップと、
前記細胞浮遊液を凍結させるステップであって、凍結細胞の組成物を形成するステップと
を含む方法であって、凍結細胞の前記組成物が、少なくとも細胞約１００万個／ｍｌの濃度を有する、方法により、調製するステップ；および
（ｉｉ）組成物（ｉ）からの細胞に異種核酸をトランスフェクトするステップ
を含む方法。
【請求項１１】
前記細胞の集団を解離させるステップが、細胞の前記集団を有効量の細胞解離溶液に曝露することをさらに含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞解離溶液が、酵素不含細胞解離溶液および酵素含有溶液からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
酵素含有細胞解離溶液が、１つまたは複数の酵素を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記酵素が、コラゲナーゼ、プロテアーゼ、トリプシン、パパイン、ヒアルロニダーゼ、およびＤＮａｓｅからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記酵素不含細胞解離溶液が、１つまたは複数のキレート剤を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記キレート剤がＥＤＴＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記培養培地が、フィーダーフリー培地である、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物中の前記凍結細胞の濃度が、少なくとも細胞約５００万個／ｍｌである、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組成物中の前記凍結細胞の濃度が、少なくとも細胞約３０００万個／ｍｌである、請求項９〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項９〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記哺乳動物細胞が、ＰＳＣまたはＥＳＣである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＳＣがｉＰＳＣである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞を培養するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、
解離された細胞の集団と凍結保存用培地とを含む凍結細胞の組成物を解凍するステップ、および
前記細胞を下流の処置に付すステップ
を含み、前記細胞が、前記下流の処置の前に、指数関数的に拡大されない、方法。
【請求項２４】
前記凍結細胞の組成物が、少なくとも細胞約１００万個／ｍｌの濃度を有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記凍結細胞の組成物が、少なくとも細胞約５００万個／ｍｌの濃度を有する、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記凍結細胞の組成物が、少なくとも細胞約３０００万個／ｍｌの濃度を有する、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項２３〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物細胞が、ＰＳＣまたはＥＳＣである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＳＣがｉＰＳＣである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記下流の処置が、前記細胞を分化させるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法を含む、請求項２３〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、多数のドーパミン産生前駆細胞に分化する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ドーパミン産生前駆細胞が、検出可能なレベルのフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１アルファ（ＬＭＸ１Ａ）、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）またはこれらの組合せを発現する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｉＰＳＣが、神経変性疾患と診断された対象に由来する、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記解離された細胞の集団が、外来性核酸を発現し、その発現レベルが、凍結されたことのない細胞の集団による前記外来性核酸の発現レベルより高い、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記解離された細胞の集団の発現レベルが、前記凍結されたことのない細胞の集団の発現レベルより少なくとも約２倍高い、請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記解離された細胞の集団の発現レベルが、前記凍結されたことのない細胞の集団の発現レベルより少なくとも約５％高い、請求項３５または３６に記載の組成物。
【請求項３８】
凍結される細胞の集団に核酸を導入するステップをさらに含む、請求項９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記核酸が、トランスフェクションまたはヌクレオフェクションにより導入される、請求項３８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年４月２６日に出願された米国仮出願番号第６２／４９０，４３２号、２０１７年６月１３日に出願された米国仮出願番号第６２／５１８，８９１号、および２０１７年６月１３日に出願された米国仮出願番号第６２／５１９，００６号に基づく優先権を主張しており、これら出願の各々の内容は、それらの全体が参考として援用され、そしてこれら出願の各々への優先権が主張される。
【０００２】
１．序論
本発明で開示される主題は、解凍後の拡大および／または継代なしに下流の応用に直接使用することができる、すぐに使用可能な(ready-to-use)凍結保存細胞の組成物、ならびに前記組成物の調製方法、前駆組成物、および前記組成物中の細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、疾患モデリングおよび細胞置換療法に革命をもたらしている。ＰＳＣは、今では患者から（例えば、誘導ＰＳＣ、またはｉＰＳＣとして）日常的に作製され、疾患の原因となる疑いがある遺伝子変異を意のままに変更して、遺伝子型と表現型の関係を詳しく調査することができる。これらの技術は、ゲノムワイドな関連性と因果関係を橋わたししており、疾患関連コンテクストの提供に欠かせないステップであるＰＳＣ分化を誘導する能力の益々の高度化と併用されれば、疾患の発症機序に対するかつてない見識をもたらす。疾患モデリングに加えて、ＰＳＣを臨床的に意義のある細胞型に誘導して、細胞置換療法に無限の資源を提供することができる。両方のＰＳＣ応用は強力であるが、ｈＰＳＣの維持および分化についての多くの実際の態様には改善の余地がありうる。
【０００４】
疾患モデリング実験における１つの実際の複雑化要因は、ｈＰＳＣ株を維持し、同時に、それらの分化を誘導することである。ｉＰＳＣ疾患モデリング研究における「最優良事例」は、多くのｉＰＳＣ株の拡大と分化を並行して何度も行うことを必要とし、このプロセスは、本明細書では「連続継代」と定義される。異なる細胞株は、異なる速度で拡大することが多いので、ＰＳＣを同期することは、難題である。もう１つの複雑化要因は、各ＰＳＣ細胞株が、連続継代中にドリフトしうるため、分化不良が、病的状態または最適以下のＰＳＣ培養のどちらかを招くことがあることである。連続継代は、他の細胞株または微生物による夾雑のリスクを増大させ、実験の過程で遺伝子不安定性を促進することもある。複数のｉＰＳ株の連続継代および並行した分化に関連する仕事量は、人為的ミスの機会も増大させる。段階的アプローチは、拡大の仕事量と分化の仕事量を分け、実験を行う前に適正な品質管理を行う時間をもたらすことができるだろう。
【０００５】
連続継代は、細胞療法のよりいっそう大きな問題を生じさせることもありうる。多能性幹細胞は、ｃＧＭＰ条件下で貯蔵され、その後、細胞バンクの完全性および無菌性を検証する一連の高価な試験を受ける。検証後、預けられたＰＳＣは、解凍され、拡大された後、バンクを臨床的に意義のある細胞型に変換するための分化が開始される。解凍、拡大およびＰＳＣ継代は、主要変数および製造中の複雑性増加を生じさせる。このステップは、分化プロセスに入るＰＳＣのタイミング、収量および質を変化させることもある。
【０００６】
したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養用の細胞を調製する旧来の方法に関連する問題をなくすための、ならびに高品質で非常に一貫性のあるＰＳＣを生成するための、方法および組成物が、当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
３．発明の要旨
本発明で開示される主題は、解凍後の拡大および／または継代なしに下流の応用に直接使用することができる、すぐに使用可能な凍結保存細胞の組成物、そのような組成物の調製方法、前駆組成物、ならびに前記組成物中の細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養方法および他の使用方法に関する。
【０００８】
本発明で開示される主題は、実験で使用される品質管理された多能性幹細胞（ＰＳＣ）、および大型バッチを生成することによるバッチ間変動の排除を提供し、この大型バッチは、すぐに使用可能なアリコートとして凍結保存されるので異なる時間に異なる場所で繰り返し使用することができる。
【０００９】
開示される主題の一態様に従って、細胞の凍結集団と凍結保存用培地とを含む組成物が提供される。別の態様では、本開示は、異種核酸がトランスフェクトされた細胞を含む組成物であって、細胞の凍結集団および凍結保存用培地を解凍することにより得られる細胞にトランスフェクトすることにより調製される組成物を提供する。
【００１０】
ある特定の実施形態では、凍結細胞の集団は、細胞の解離された集団である。ある特定の実施形態では、凍結細胞の集団は、少なくとも細胞約５０万、１００万、５００万、１０００万、２０００万、３０００万、４０００万、５０００万、６０００万、７０００万、８０００万、９０００万、または１億個／ｍｌの濃度である。ある特定の実施形態では、凍結集団内の細胞の濃度は、少なくとも細胞約１００万個／ｍｌである。ある特定の実施形態では、凍結集団内の細胞の濃度は、少なくとも細胞約５００万個／ｍｌである。ある特定の実施形態では、凍結集団内の細胞の濃度は、少なくとも細胞約３０００万個／ｍｌである。ある特定の実施形態では、凍結集団内の細胞の濃度は、少なくとも細胞約５０００万個／ｍｌである。
【００１１】
ある特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）である。ある特定の実施形態では、多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であるか、または胚性幹細胞（ＥＳＣ）から調製される。
【００１２】
さらに、本発明で開示される主題は、凍結細胞を含む組成物を調製する方法であって、培養培地で培養された細胞の集団を解離させるステップ、解離された細胞を凍結保存用培地に浮遊させるステップであって、細胞浮遊液を形成するステップ、および細胞浮遊液を凍結させるステップであって、凍結細胞の組成物を形成するステップを含む方法を提供する。加えて、本開示は、トランスフェクト細胞を調製する方法であって、（ｉ）凍結細胞を含む組成物を、培養培地で培養された細胞の集団を解離させるステップと、解離された細胞を凍結保存用培地に浮遊させるステップであって、細胞浮遊液を形成するステップと、細胞浮遊液を凍結させるステップであって、凍結細胞の組成物を形成するステップとを含む方法により、調製するステップ；および（ｉｉ）組成物（ｉ）からの細胞に異種核酸をトランスフェクトするステップを含む、方法を提供する。
【００１３】
ある特定の実施形態では、凍結細胞の組成物は、少なくとも細胞約５０万、１００万、５００万、１０００万、２０００万、３０００万、４０００万、５０００万、６０００万、７０００万、８０００万、９０００万、または１億個／ｍｌの濃度を有する。
【００１４】
ある特定の実施形態では、細胞の集団を解離させるステップは、細胞の集団を有効量の細胞解離溶液に曝露することをさらに含む。ある特定の実施形態では、細胞解離溶液は、酵素不含細胞解離溶液および酵素含有溶液からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、酵素含有細胞解離溶液は、１つまたは複数の酵素を含む。ある特定の実施形態では、酵素は、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、コラゲナーゼ、プロテアーゼ、トリプシンおよび誘導体、パパイン、ヒアルロニダーゼ、ならびにＤＮａｓｅからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、酵素不含細胞解離溶液は、キレート剤を含む。ある特定の実施形態では、キレート剤は、ＥＤＴＡであるか、または基材と細胞の相互作用を除去するために使用される他のＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋不含薬剤である。ある特定の実施形態では、培養培地は、フィーダーフリー培地である。
【００１５】
開示される主題の別の態様に従って、本発明で開示される主題は、細胞を培養するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法であって、解離され凍結された細胞の集団と凍結保存用培地とを含む組成物を解凍するステップ、および細胞を下流の処置に付すステップを含み、細胞が、下流の処置の前に、基本的に拡大および／または継代されない、方法を提供する。ある特定の実施形態では、凍結細胞の組成物は、少なくとも細胞約５０万、１００万、５００万、１０００万、２０００万、３０００万、４０００万、５０００万、６０００万、７０００万、８０００万、９０００万、または１億個／ｍｌの濃度を有する。
【００１６】
ある特定の実施形態では、細胞の集団は、凍結後に拡大される。ある特定の実施形態では、細胞の集団は、集団内の細胞が最大１、２、３、４または５ラウンド、細胞分裂するように、一定の期間、拡大される。
【００１７】
ある特定の実施形態では、細胞の集団は、細胞が細胞分裂するように、一定の期間、拡大され、前記拡大は、指数関数的拡大ではない。ある特定の実施形態では、細胞の集団は、凍結後に継代される。ある特定の実施形態では、細胞の集団は、最大１、２、３、４または５回、継代される。ある特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、哺乳動物細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）である。ある特定の実施形態では、多能性幹細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であるか、または胚性幹細胞（ＥＳＣ）から調製される。
【００１８】
ある特定の実施形態では、下流の処置は、凍結保存細胞を分化させるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法を含む。ある特定の実施形態では、凍結保存細胞は、多数の体細胞、例えば、神経細胞またはそれらの前駆体に分化し、前記の分化した細胞は、前記細胞の、検出可能なレベルの、１つまたは複数のマーカーを発現する。ある特定の実施形態では、凍結保存細胞は、神経堤または神経堤由来細胞に分化する。ある特定の実施形態では、凍結保存細胞は、ドーパミン産生細胞、例えば中脳ドーパミン細胞、またはそれらの前駆体に分化する。ある特定の実施形態では、ドーパミン前駆細胞は、検出可能なレベルのフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１アルファ（ＬＭＸ１Ａ）および／またはチロシンヒドロキシラーゼ（tyrosine  hydroxylast）（ＴＨ）を発現する。
【００１９】
ある特定の実施形態では、ｉＰＳＣは、疾患または障害、例えば神経変性疾患、と診断された対象に由来する。ある特定の実施形態では、神経変性疾患は、パーキンソン病である。
【００２０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞に、凍結保存前、または凍結保存して解凍した後、核酸がトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、核酸は、トランスフェクションまたはヌクレオフェクションにより導入される。ある特定の実施形態では、細胞は、凍結保存されたことのない細胞と比較して核酸の取込みおよび／または発現の増加を示す。ある特定の実施形態では、解離された細胞の集団の発現レベルは、凍結されたことのない細胞の集団の発現レベルより少なくとも約２倍高い。ある特定の実施形態では、解離された細胞の集団の発現レベルは、凍結されたことのない細胞の集団の発現レベルより少なくとも約５％高い。
【００２１】
したがって、様々な実施形態は、トランスフェクト細胞を産生する方法であって、解離され凍結された細胞の集団と凍結保存用培地とを含む組成物を解凍するステップ、および、次いで、目的の核酸を細胞にトランスフェクトするステップを含み、細胞が、トランスフェクションの前に、基本的に拡大されず、および／または基本的に継代されず、トランスフェクション効率が、トランスフェクション前に凍結保存されなかった対照細胞のトランスフェクション効率と比較して実質的に上昇され、および／またはトランスフェクトされた核酸の発現が、トランスフェクション前に凍結保存されなかった対照細胞におけるトランスフェクトされた核酸の発現と比較して実質的に増加される、方法を提供する。ある特定の実施形態では、上述の方法により調製されるトランスフェクト細胞の組成物であって、前記細胞が、トランスフェクトされた核酸、例えば異種核酸、を含有する、組成物が提供され、前記異種核酸は、挿入、欠失、置換または再構成により変更された配列を含む核酸配列であって、その少なくとも一部分がトランスフェクション前の細胞に見られないものである、核酸配列を含む。
４．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ−１Ｅ】図１Ａ〜１Ｌは、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理（ＣｒｙｏＰａｕｓｅｄ）細胞の生存率、バンク一貫性、およびＰＳＣマーカー発現を図示する。（１Ａ、１Ｆ）新鮮（対照）およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９細胞の解凍後の生存パーセント。生存率は、アクリジンオレンジ（生）およびヨウ化プロピジウム蛍光（死）蛍光（ＣＰについてはｎ＝１５、対照についてはｎ＝２８）を使用してＮｅｘｃｅｌｏｍ自動細胞計数器で測定した。（１Ｂ）１３の独立したＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＰＳＣ細胞バンクにおける、凍結前（赤色三角）および解凍後（黒丸）の細胞の生存率。（１Ｃ〜１Ｅ）フローサイトメトリーによる対照またはＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞における幹細胞マーカー発現（または自発的分化、ＳＳＥＡ−１）（１Ｃ）、平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値（１Ｄ、ｎ＝３）または免疫蛍光（１Ｅ、スケールバー＝１００μｍ）。（１Ｇ）対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の多能性を評定するためのＰｌｕｒｉＴｅｓｔアッセイ。対照（ｎ＝２）またはＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理（ｎ＝２）ＷＡ０９培養物を使用してＲＮＡを得た後、マイクロアレイにハイブリダイズした。ＰｌｕｒｉＴｅｓｔアルゴリズムを使用してアレイデータを処理した。各サンプルが、２つの関連パラメーター、多能性スコアおよび新規性スコア、としてプロットされている。４つのサンプルすべてが、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔの多能性評定に合格した。赤色クラウドは、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔに合格したサンプルの代表であり、その一方で、青色クラウドは、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔに不合格であったサンプルである。（１Ｈ）対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞のメチル化を評価するＭＡプロット。相補的ＣｐＧ部位（反対の鎖上の１塩基ずれた）についてのメチル化値を組み合わせて、ＣｐＧユニットのメチル化を得た。１０リードの最小閾値カバー度を使用してＣｐＧユニットをフィルタリングし、その結果、対照サンプルおよびＣｒｙｏＰａｕｓｅサンプルについてそれぞれ３，７１４，４１８および３，４０８，１５８のＣｐＧユニットを得た。両方のサンプルによりカバーされる３，１５５，４８２の共通ＣｐＧユニットのメチル化レベルの統計的分散を推定する、外れ値の影響を受けない変動性の堅牢な尺度である、中央絶対偏差（ＭＡＤ）により、メチル化レベルの一致を評価した。（１Ｉ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞には奇形腫を生じさせる能力がある。すべてのパネルについて、赤色矢印は、外胚葉を指し、緑色および青色アスタリスクは、中胚葉を示し、黒色矢印は、内胚葉を指す。（上）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９  ｈＥＳＣに由来する、ヘマトキシリン（hemotoxylin）およびエオシンで染色された奇形腫切片を示す、低倍率画像。スケールバー＝１ｍｍ。（中央）内胚葉（杯細胞、黒色矢印）および中胚葉（緑色アスタリスク）を含有する領域を示す高倍率画像、スケールバー＝２００μｍ。（下）外胚葉（黒色性神経外胚葉、赤色矢印）および中胚葉（脂肪細胞、青色アスタリスク）を示す高倍率画像、スケールバー＝２００μｍ。（１Ｊ）Ｏｐｅｒｅｔｔａハイコンテントイメージャーを用いてγＨ２ＡＸ発現により測定した対照およびＣｒｙｏＰａｕｓ���処理細胞におけるＤＮＡ損傷の定量（左）、ならびにアッセイの陽性対照としての、およびＤＮＡ損傷に対する脆弱性について試験するための、０．５μＭカンプトテシンでの１時間の処置後の定量（右、ｎ＝３；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。（１Ｋ）０．５μＭカンプトテシンで１時間処置したまたはしていない、対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞における、γＨ２ＡＸ発現の代表免疫蛍光。（１Ｌ）染色体分析を、２０の中期ＤＡＰＩバンドを用いて行い、これらのすべてを十分に核型分析した。対照（２０／２０）およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞（２０／２０）両方が、正常な４６、ＸＸ核型を有した。（１Ａ）、（１Ｃ）および（１Ｊ）では、少なくとも３回の独立した実験でウィルコクソンの符号付き順位検定を行い、対照とＣｒｙｏＰａｕｓｅの間に統計的差異（ｐ＞０．０５）は見られなかった。図５Ａも参照されたい。
【図１Ｆ】図１Ａ〜１Ｌは、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理（ＣｒｙｏＰａｕｓｅｄ）細胞の生存率、バンク一貫性、およびＰＳＣマーカー発現を図示する。（１Ａ、１Ｆ）新鮮（対照）およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９細胞の解凍後の生存パーセント。生存率は、アクリジンオレンジ（生）およびヨウ化プロピジウム蛍光（死）蛍光（ＣＰについてはｎ＝１５、対照についてはｎ＝２８）を使用してＮｅｘｃｅｌｏｍ自動細胞計数器で測定した。（１Ｂ）１３の独立したＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＰＳＣ細胞バンクにおける、凍結前（赤色三角）および解凍後（黒丸）の細胞の生存率。（１Ｃ〜１Ｅ）フローサイトメトリーによる対照またはＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞における幹細胞マーカー発現（または自発的分化、ＳＳＥＡ−１）（１Ｃ）、平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値（１Ｄ、ｎ＝３）または免疫蛍光（１Ｅ、スケールバー＝１００μｍ）。（１Ｇ）対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の多能性を評定するためのＰｌｕｒｉＴｅｓｔアッセイ。対照（ｎ＝２）またはＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理（ｎ＝２）ＷＡ０９培養物を使用してＲＮＡを得た後、マイクロアレイにハイブリダイズした。ＰｌｕｒｉＴｅｓｔアルゴリズムを使用してアレイデータを処理した。各サンプルが、２つの関連パラメーター、多能性スコアおよび新規性スコア、としてプロットされている。４つのサンプルすべてが、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔの多能性評定に合格した。赤色クラウドは、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔに合格したサンプルの代表であり、その一方で、青色クラウドは、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔに不合格であったサンプルである。（１Ｈ）対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞のメチル化を評価するＭＡプロット。相補的ＣｐＧ部位（反対の鎖上の１塩基ずれた）についてのメチル化値を組み合わせて、ＣｐＧユニットのメチル化を得た。１０リードの最小閾値カバー度を使用してＣｐＧユニットをフィルタリングし、その結果、対照サンプルおよびＣｒｙｏＰａｕｓｅサンプルについてそれぞれ３，７１４，４１８および３，４０８，１５８のＣｐＧユニットを得た。両方のサンプルによりカバーされる３，１５５，４８２の共通ＣｐＧユニットのメチル化レベルの統計的分散を推定する、外れ値の影響を受けない変動性の堅牢な尺度である、中央絶対偏差（ＭＡＤ）により、メチル化レベルの一致を評価した。（１Ｉ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞には奇形腫を生じさせる能力がある。すべてのパネルについて、赤色矢印は、外胚葉を指し、緑色および青色アスタリスクは、中胚葉を示し、黒色矢印は、内胚葉を指す。（上）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９  ｈＥＳＣに由来する、ヘマトキシリン（hemotoxylin）およびエオシンで染色された奇形腫切片を示す、低倍率画像。スケールバー＝１ｍｍ。（中央）内胚葉（杯細胞、黒色矢印）および中胚葉（緑色アスタリスク）を含有する領域を示す高倍率画像、スケールバー＝２００μｍ。（下）外胚葉（黒色性神経外胚葉、赤色矢印）および中胚葉（脂肪細胞、青色アスタリスク）を示す高倍率画像、スケールバー＝２００μｍ。（１Ｊ）Ｏｐｅｒｅｔｔａハイコンテントイメージャーを用いてγＨ２ＡＸ発現により測定した対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理���胞におけるＤＮＡ損傷の定量（左）、ならびにアッセイの陽性対照としての、およびＤＮＡ損傷に対する脆弱性について試験するための、０．５μＭカンプトテシンでの１時間の処置後の定量（右、ｎ＝３；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。（１Ｋ）０．５μＭカンプトテシンで１時間処置したまたはしていない、対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞における、γＨ２ＡＸ発現の代表免疫蛍光。（１Ｌ）染色体分析を、２０の中期ＤＡＰＩバンドを用いて行い、これらのすべてを十分に核型分析した。対照（２０／２０）およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞（２０／２０）両方が、正常な４６、ＸＸ核型を有した。（１Ａ）、（１Ｃ）および（１Ｊ）では、少なくとも３回の独立した実験でウィルコクソンの符号付き順位検定を行い、対照とＣｒｙｏＰａｕｓｅの間に統計的差異（ｐ＞０．０５）は見られなかった。図５Ａも参照されたい。
【図１Ｇ−１Ｈ】図１Ａ〜１Ｌは、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理（ＣｒｙｏＰａｕｓｅｄ）細胞の生存率、バンク一貫性、およびＰＳＣマーカー発現を図示する。（１Ａ、１Ｆ）新鮮（対照）およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９細胞の解凍後の生存パーセント。生存率は、アクリジンオレンジ（生）およびヨウ化プロピジウム蛍光（死）蛍光（ＣＰについてはｎ＝１５、対照についてはｎ＝２８）を使用してＮｅｘｃｅｌｏｍ自動細胞計数器で測定した。（１Ｂ）１３の独立したＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＰＳＣ細胞バンクにおける、凍結前（赤色三角）および解凍後（黒丸）の細胞の生存率。（１Ｃ〜１Ｅ）フローサイトメトリーによる対照またはＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞における幹細胞マーカー発現（または自発的分化、ＳＳＥＡ−１）（１Ｃ）、平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値（１Ｄ、ｎ＝３）または免疫蛍光（１Ｅ、スケールバー＝１００μｍ）。（１Ｇ）対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の多能性を評定するためのＰｌｕｒｉＴｅｓｔアッセイ。対照（ｎ＝２）またはＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理（ｎ＝２）ＷＡ０９培養物を使用してＲＮＡを得た後、マイクロアレイにハイブリダイズした。ＰｌｕｒｉＴｅｓｔアルゴリズムを使用してアレイデータを処理した。各サンプルが、２つの関連パラメーター、多能性スコアおよび新規性スコア、としてプロットされている。４つのサンプルすべてが、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔの多能性評定に合格した。赤色クラウドは、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔに合格したサンプルの代表であり、その一方で、青色クラウドは、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔに不合格であったサンプルである。（１Ｈ）対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞のメチル化を評価するＭＡプロット。相補的ＣｐＧ部位（反対の鎖上の１塩基ずれた）についてのメチル化値を組み合わせて、ＣｐＧユニットのメチル化を得た。１０リードの最小閾値カバー度を使用してＣｐＧユニットをフィルタリングし、その結果、対照サンプルおよびＣｒｙｏＰａｕｓｅサンプルについてそれぞれ３，７１４，４１８および３，４０８，１５８のＣｐＧユニットを得た。両方のサンプルによりカバーされる３，１５５，４８２の共通ＣｐＧユニットのメチル化レベルの統計的分散を推定する、外れ値の影響を受けない変動性の堅牢な尺度である、中央絶対偏差（ＭＡＤ）により、メチル化レベルの一致を評価した。（１Ｉ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞には奇形腫を生じさせる能力がある。すべてのパネルについて、赤色矢印は、外胚葉を指し、緑色および青色アスタリスクは、中胚葉を示し、黒色矢印は、内胚葉を指す。（上）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９  ｈＥＳＣに由来する、ヘマトキシリン（hemotoxylin）およびエオシンで染色された奇形腫切片を示す、低倍率画像。スケールバー＝１ｍｍ。（中央）内胚葉（杯細胞、黒色矢印）および中胚葉（緑色アスタリスク）を含有する領域を示す高倍率画像、スケールバー＝２００μｍ。（下）外胚葉（黒色性神経外胚葉、赤色矢印）および中胚葉（脂肪細胞、青色アスタリスク）を示す高倍率画像、スケールバー＝２００μｍ。（１Ｊ）Ｏｐｅｒｅｔｔａハイコンテントイメージャーを用いてγＨ２ＡＸ発現により測定した対照およびＣｒｙｏＰａｕｓ���処理細胞におけるＤＮＡ損傷の定量（左）、ならびにアッセイの陽性対照としての、およびＤＮＡ損傷に対する脆弱性について試験するための、０．５μＭカンプトテシンでの１時間の処置後の定量（右、ｎ＝３；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。（１Ｋ）０．５μＭカンプトテシンで１時間処置したまたはしていない、対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞における、γＨ２ＡＸ発現の代表免疫蛍光。（１Ｌ）染色体分析を、２０の中期ＤＡＰＩバンドを用いて行い、これらのすべてを十分に核型分析した。対照（２０／２０）およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞（２０／２０）両方が、正常な４６、ＸＸ核型を有した。（１Ａ）、（１Ｃ）および（１Ｊ）では、少なくとも３回の独立した実験でウィルコクソンの符号付き順位検定を行い、対照とＣｒｙｏＰａｕｓｅの間に統計的差異（ｐ＞０．０５）は見られなかった。図５Ａも参照されたい。
【図１Ｉ−１Ｌ】図１Ａ〜１Ｌは、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理（ＣｒｙｏＰａｕｓｅｄ）細胞の生存率、バンク一貫性、およびＰＳＣマーカー発現を図示する。（１Ａ、１Ｆ）新鮮（対照）およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９細胞の解凍後の生存パーセント。生存率は、アクリジンオレンジ（生）およびヨウ化プロピジウム蛍光（死）蛍光（ＣＰについてはｎ＝１５、対照についてはｎ＝２８）を使用してＮｅｘｃｅｌｏｍ自動細胞計数器で測定した。（１Ｂ）１３の独立したＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＰＳＣ細胞バンクにおける、凍結前（赤色三角）および解凍後（黒丸）の細胞の生存率。（１Ｃ〜１Ｅ）フローサイトメトリーによる対照またはＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞における幹細胞マーカー発現（または自発的分化、ＳＳＥＡ−１）（１Ｃ）、平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値（１Ｄ、ｎ＝３）または免疫蛍光（１Ｅ、スケールバー＝１００μｍ）。（１Ｇ）対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の多能性を評定するためのＰｌｕｒｉＴｅｓｔアッセイ。対照（ｎ＝２）またはＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理（ｎ＝２）ＷＡ０９培養物を使用してＲＮＡを得た後、マイクロアレイにハイブリダイズした。ＰｌｕｒｉＴｅｓｔアルゴリズムを使用してアレイデータを処理した。各サンプルが、２つの関連パラメーター、多能性スコアおよび新規性スコア、としてプロットされている。４つのサンプルすべてが、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔの多能性評定に合格した。赤色クラウドは、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔに合格したサンプルの代表であり、その一方で、青色クラウドは、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔに不合格であったサンプルである。（１Ｈ）対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞のメチル化を評価するＭＡプロット。相補的ＣｐＧ部位（反対の鎖上の１塩基ずれた）についてのメチル化値を組み合わせて、ＣｐＧユニットのメチル化を得た。１０リードの最小閾値カバー度を使用してＣｐＧユニットをフィルタリングし、その結果、対照サンプルおよびＣｒｙｏＰａｕｓｅサンプルについてそれぞれ３，７１４，４１８および３，４０８，１５８のＣｐＧユニットを得た。両方のサンプルによりカバーされる３，１５５，４８２の共通ＣｐＧユニットのメチル化レベルの統計的分散を推定する、外れ値の影響を受けない変動性の堅牢な尺度である、中央絶対偏差（ＭＡＤ）により、メチル化レベルの一致を評価した。（１Ｉ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞には奇形腫を生じさせる能力がある。すべてのパネルについて、赤色矢印は、外胚葉を指し、緑色および青色アスタリスクは、中胚葉を示し、黒色矢印は、内胚葉を指す。（上）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９  ｈＥＳＣに由来する、ヘマトキシリン（hemotoxylin）およびエオシンで染色された奇形腫切片を示す、低倍率画像。スケールバー＝１ｍｍ。（中央）内胚葉（杯細胞、黒色矢印）および中胚葉（緑色アスタリスク）を含有する領域を示す高倍率画像、スケールバー＝２００μｍ。（下）外胚葉（黒色性神経外胚葉、赤色矢印）および中胚葉（脂肪細胞、青色アスタリスク）を示す高倍率画像、スケールバー＝２００μｍ。（１Ｊ）Ｏｐｅｒｅｔｔａハイコンテントイメージャーを用いてγＨ２ＡＸ発現により測定した対照およびＣｒｙｏＰａｕｓ���処理細胞におけるＤＮＡ損傷の定量（左）、ならびにアッセイの陽性対照としての、およびＤＮＡ損傷に対する脆弱性について試験するための、０．５μＭカンプトテシンでの１時間の処置後の定量（右、ｎ＝３；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。（１Ｋ）０．５μＭカンプトテシンで１時間処置したまたはしていない、対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞における、γＨ２ＡＸ発現の代表免疫蛍光。（１Ｌ）染色体分析を、２０の中期ＤＡＰＩバンドを用いて行い、これらのすべてを十分に核型分析した。対照（２０／２０）およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞（２０／２０）両方が、正常な４６、ＸＸ核型を有した。（１Ａ）、（１Ｃ）および（１Ｊ）では、少なくとも３回の独立した実験でウィルコクソンの符号付き順位検定を行い、対照とＣｒｙｏＰａｕｓｅの間に統計的差異（ｐ＞０．０５）は見られなかった。図５Ａも参照されたい。
【図２Ａ−２Ｊ】図２Ａ〜２Ｍは、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の分化誘導の動態および程度を図示する。（２Ａおよび２Ｌ）神経誘導中にフローサイトメトリーにより定量されたＯＣＴ４およびＰＡＸ６発現（ｎ＝５；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。（２Ｂ〜２Ｃ）神経誘導の０、３、６および９日後の代表フローサイトメトリー（２Ｂ）および免疫蛍光（２Ｃ）。（２Ｄ）中内胚葉誘導中にフローサイトメトリーにより定量されたＯＣＴ４およびブラキウリ発現（ｎ＝３；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。中内胚葉誘導の０、１、２および４日後の代表フローサイトメトリー（２Ｅ、２Ｋ）および免疫蛍光（２Ｆ）。（２Ｇ）細胞１００万、５００万、１０００万、２０００万および３０００万個／ｍＬで凍結された場合の解凍後のＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の生存率。アクリジンオレンジ（生）およびヨウ化プロピジウム（死）蛍光を用いて自動細胞計数器で生存細胞のパーセントを決定した（ｎ＝３；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。（２Ｈ、２Ｍ）Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙで拡大された対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞においてフローサイトメトリーにより測定された幹細胞マーカー発現（または自発的分化、ＳＳＥＡ−１）（ｎ＝３；２Ｈには平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値、２Ｍには代表例）。（２Ｉ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の中脳ドーパミンニューロン分化の２１日後のＦＯＸＡ２（赤色）およびＴＨ（緑色）発現。スケールバー＝１００μｍ。（２Ｊ）対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９  ｈＥＳＣならびに中脳ドーパミンニューロンの遺伝子発現。サンプルをＷＡ０９  ｈＥＳ対照細胞に正規化し、発現の倍率変化を色分けした。対照ｈＥＳと比較して高い発現レベルが赤色で示され、低いレベルが青色で示されている。（２Ａ）、（２Ｄ）、（２Ｇ）および（２Ｈ）では、少なくとも３回の独立した実験でウィルコクソンの符号付き順位検定を行い、対照とＣｒｙｏＰａｕｓｅの間に統計的差異（ｐ＞０．０５）は見られなかった。
【図２Ｋ−２Ｌ】図２Ａ〜２Ｍは、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の分化誘導の動態および程度を図示する。（２Ａおよび２Ｌ）神経誘導中にフローサイトメトリーにより定量されたＯＣＴ４およびＰＡＸ６発現（ｎ＝５；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。（２Ｂ〜２Ｃ）神経誘導の０、３、６および９日後の代表フローサイトメトリー（２Ｂ）および免疫蛍光（２Ｃ）。（２Ｄ）中内胚葉誘導中にフローサイトメトリーにより定量されたＯＣＴ４およびブラキウリ発現（ｎ＝３；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。中内胚葉誘導の０、１、２および４日後の代表フローサイトメトリー（２Ｅ、２Ｋ）および免疫蛍光（２Ｆ）。（２Ｇ）細胞１００万、５００万、１０００万、２０００万および３０００万個／ｍＬで凍結された場合の解凍後のＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の生存率。アクリジンオレンジ（生）およびヨウ化プロピジウム（死）蛍光を用いて自動細胞計数器で生存細胞のパーセントを決定した（ｎ＝３；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。（２Ｈ、２Ｍ）Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙで拡大された対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞においてフローサイトメトリーにより測定された幹細胞マーカー発現（または自発的分化、ＳＳＥＡ−１）（ｎ＝３；２Ｈには平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値、２Ｍには代表例）。（２Ｉ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の中脳ドーパミンニューロン分化の２１日後のＦＯＸＡ２（赤色）およびＴＨ（緑色）発現。スケールバー＝１００μｍ。（２Ｊ）対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９  ｈＥＳＣならびに中脳ドーパミンニューロンの遺伝子発現。サンプルをＷＡ０９  ｈＥＳ対照細胞に正規化し、発現の倍率変化を色分けした。対照ｈＥＳと比較して高い発現レベルが赤色で示され、低いレベルが青色で示されている。（２Ａ）、（２Ｄ）、（２Ｇ）および（２Ｈ）では、少なくとも３回の独立した実験でウィルコクソンの符号付き順位検定を行い、対照とＣｒｙｏＰａｕｓｅの間に統計的差異（ｐ＞０．０５）は見られなかった。
【図２Ｍ】図２Ａ〜２Ｍは、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の分化誘導の動態および程度を図示する。（２Ａおよび２Ｌ）神経誘導中にフローサイトメトリーにより定量されたＯＣＴ４およびＰＡＸ６発現（ｎ＝５；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。（２Ｂ〜２Ｃ）神経誘導の０、３、６および９日後の代表フローサイトメトリー（２Ｂ）および免疫蛍光（２Ｃ）。（２Ｄ）中内胚葉誘導中にフローサイトメトリーにより定量されたＯＣＴ４およびブラキウリ発現（ｎ＝３；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。中内胚葉誘導の０、１、２および４日後の代表フローサイトメトリー（２Ｅ、２Ｋ）および免疫蛍光（２Ｆ）。（２Ｇ）細胞１００万、５００万、１０００万、２０００万および３０００万個／ｍＬで凍結された場合の解凍後のＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の生存率。アクリジンオレンジ（生）およびヨウ化プロピジウム（死）蛍光を用いて自動細胞計数器で生存細胞のパーセントを決定した（ｎ＝３；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。（２Ｈ、２Ｍ）Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙで拡大された対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞においてフローサイトメトリーにより測定された幹細胞マーカー発現（または自発的分化、ＳＳＥＡ−１）（ｎ＝３；２Ｈには平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値、２Ｍには代表例）。（２Ｉ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の中脳ドーパミンニューロン分化の２１日後のＦＯＸＡ２（赤色）およびＴＨ（緑色）発現。スケールバー＝１００μｍ。（２Ｊ）対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９  ｈＥＳＣならびに中脳ドーパミンニューロンの遺伝子発現。サンプルをＷＡ０９  ｈＥＳ対照細胞に正規化し、発現の倍率変化を色分けした。対照ｈＥＳと比較して高い発現レベルが赤色で示され、低いレベルが青色で示されている。（２Ａ）、（２Ｄ）、（２Ｇ）および（２Ｈ）では、少なくとも３回の独立した実験でウィルコクソンの符号付き順位検定を行い、対照とＣｒｙｏＰａｕｓｅの間に統計的差異（ｐ＞０．０５）は見られなかった。
【図３Ａ−３Ｅ】図３Ａ〜３Ｅは、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の遺伝子改変。Ａ〜Ｂ）ＧＦＰプラスミドでのヌクレオフェクションの２４時間後の対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞におけるＧＦＰ発現の代表免疫蛍光（Ａ）およびフローサイトメトリー（Ｂ）。（Ｃ）ＧＦＰプラスミドでのヌクレオフェクションの２４時間後に対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞においてフローサイトメトリーにより定量されたＧＦＰ発現（ｎ＝３；平均±ＳＤとして示されている独立した生物学的反復実験についての値）。（Ｄ）ＥｍＧＦＰを含有するセンダイウイルスベクターでの形質導入後のＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞におけるＧＦＰ発現の代表免疫蛍光。最初の形質導入からの個々のサブクローンを少なくも１０継代にわたってＧＦＰ＋コロニーとして維持することができた。（Ｅ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０１  ｉＣＲＩＳＰＲ細胞におけるＨＰＲＴガイドＲＮＡを用いるゲノム切断検出キットの使用後の切断産物のアガロースゲル分析。＋または−は、検出酵素あり（＋）およびなし（−）を示す。（１）陽性対照；（２）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理前にＣａｓ９を誘導したがガイドＲＮＡを用いなかったｉＣＲＩＳＰＲ細胞；（３）Ｃａｓ９誘導を用いずＨＰＲＴガイドＲＮＡを用いたｉＣＲＩＳＰＲ細胞；（４）Ｃａｓ９誘導およびＨＰＲＴガイドＲＮＡを用いたｉＣＲＩＳＰＲ細胞；（５）Ｃａｓ９誘導およびＨＰＲＴガイドＲＮＡを用いた（ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理していない）ｉＣＲＩＳＰＲ細胞。（Ｃ）では、３回の独立した実験でウィルコクソンの符号付き順位検定を行い、対照とＣｒｙｏＰａｕｓｅの間に統計的差異（ｐ＞０．０５）は見られなかった。
【図４Ａ−４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の遺伝子改変を図示する。対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞へのＧＦＰプラスミドのヌクレオフェクションの２４および４８時間後のフローサイトメトリー（４Ａ）または蛍光顕微鏡観察（４Ｂ）によるＧＦＰ発現。（４Ｃ）酵素あり（レーン１）およびなし（レーン２）での、ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ陽性対照。酵素あり（レーン３）およびなし（レーン４）で、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理前に細胞にＤｏｘ添加、しかしヌクレオフェクション中にガイドＲＮＡなし。酵素あり（レーン５）およびなし（レーン６）で、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理前に細胞へのＤｏｘ添加なし、しかしヌクレオフェクション中にＨＰＲＴガイドＲＮＡを施した。酵素あり（レーン７）およびなし（レーン８）での、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理前にＤｏｘを、解凍後にＨＰＲＴガイドＲＮＡを施した細胞。酵素あり（レーン９）およびなし（レーン１０）での、ＤｏｘおよびＨＰＲＴガイドＲＮＡを施した（しかし決して凍結させなかった）新鮮対照細胞。
【図５Ａ−５Ｆ】図５Ａ〜５Ｆは、凍結保存条件に変更を加えたＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の生存率を図示する。図１に関連する。生存率は、アクリジンオレンジ（生）およびヨウ化プロピジウム（死）蛍光を使用して自動細胞計数器で測定した。（５Ａ）ＷＡ０９、９６０．１Ｂ、１５３．３Ａ、およびＷＡ０１  ｉＣＲＩＳＰＲ細胞株におけるＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理および対照細胞の生存パーセント。（５Ｂ）ＦｒｅＳＲ−ＳまたはＰＳＣ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｖａｔｉｏｎ  Ｋｉｔでの速度制御フリーザーまたは従来の凍結のどちらかを使用するＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９細胞の解凍後生存率。（５Ｃ）速度制御フリーザーまたは従来の凍結（方法を参照されたい）のどちらかを使用するＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９細胞の解凍後生存率。（５Ｄ）フィーダーフリー（Ｇｅｌｔｒｅｘ（商標））条件またはフィーダーベースの条件のどちらかで成長したＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９細胞の解凍後生存率。「ＣＲＦ」は、速度制御フリーザーの使用を示し、その一方で、「−８０」は、液体窒素タンクに移す前に２４時間、−８０℃の細胞凍結容器内でのバイアルの保管を示す。ＤＭＳＯは、１０％ＤＭＳＯの凍結保存用培地としての使用を示す。速度制御フリーザーまたは従来の凍結のどちらかを使用して、細胞をＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理した。（５Ｅ）１年より長きにわたり凍結された対照またはＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞におけるフローサイトメトリーによる幹細胞マーカー発現（または自発的分化、ＳＳＥＡ−１）。（５Ｆ）対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９  ｈＥＳＣを使用する奇形腫成長速度。
【図６】図６は、凍結保存細胞の調製および使用に関する従来の方法およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ方法の略図である。
【図７】図７は、従来のＰＳＣ培養と比較したＣｒｙｏＰａｕｓｅ方法の異なる略図である。（上）従来の（対照）ワークフローは、凍結保存からコロニーを回復させ、長期間にわたってそれらを拡大させて、目的の細胞型への分化誘導などの特定の応用のために培養物の一部分を定期的に使用する。徐々に、ＰＳＣは、遺伝子変化、夾雑、または自発的分化量の変化を獲得する可能性があり、これらのいずれもが結果に影響を及ぼしうる。（下）ＣｒｙｏＰａｕｓｅは、可能な最小継代数でＰＳＣの大型プールを拡大させる。次いで、大型バッチを解離させて単一細胞浮遊液にした後、凍結保存する。この凍結プロセスは、ＰＳＣの産生をそれらの使用から分離し、その結果、各バンクの適正な品質管理および特徴付けを行うための時間が確保される。このプロセスはまた、複数の実験での同一の細胞の使用を可能にし、世界中のどこにでも出荷できるようにし、したがって、他の研究所が、ＰＳＣの全く同じ出発集団を用いて独立した実験を開始することができる。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｃは、新鮮非凍結対照ＷＡ０９細胞と比較して、遺伝子改変されたＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９ヒト胚性幹細胞の集団により発現された構築物の発現レベル分布を図示する。（８Ａ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理され、解凍され次第、３．４ｋｂ  ＧＦＰプラスミドがヌクレオフェクトされたＷＡ０９幹細胞の集団（青色グラフ、ａ）、ＧＦＰベクターがヌクレオフェクトされた新鮮非凍結対照ＷＡ０９細胞の集団（赤色グラフ、ｂ）、およびヌクレオフェクトされていないＷＡ０９細胞の集団（緑色グラフ、ｃ）における、フローサイトメトリーにより測定されたＧＦＰ発現レベルの分布。（８Ｂ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理され、解凍され次第、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する９．３ｋｂ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９プラスミドがヌクレオフェクトされたＷＡ０９幹細胞の集団、およびｍＣｈｅｒｒｙ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９プラスミドがヌクレオフェクトされた新鮮非凍結対照ＷＡ０９細胞の集団における、フローサイトメトリーで測定されたｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルの分布。細胞に、２．５μｇ、５μｇ、７．５μｇ、１０μｇまたは１２．５μｇのプラスミドをヌクレオフェクトした。（８Ｃ）２．５μｇ、５μｇ、７．５μｇ、１０μｇおよび１２．５μｇのプラスミドのヌクレオフェクション後のｍＣｈｅｒｒｙを発現するＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞および新鮮非凍結対照細胞のパーセント。ＣｒｙｏＰａｕｓｅおよび新鮮非凍結条件下で２．５μｇのプラスミドを用いて、第２のヌクレオフェクション溶液であるＨＳＣ２も試験し、ｍＣｈｅｒｒｙ発現について分析した。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｃは、新鮮非凍結対照ＷＡ０９細胞と比較して、遺伝子改変されたＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９ヒト胚性幹細胞の集団により発現された構築物の発現レベル分布を図示する。（８Ａ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理され、解凍され次第、３．４ｋｂ  ＧＦＰプラスミドがヌクレオフェクトされたＷＡ０９幹細胞の集団（青色グラフ、ａ）、ＧＦＰベクターがヌクレオフェクトされた新鮮非凍結対照ＷＡ０９細胞の集団（赤色グラフ、ｂ）、およびヌクレオフェクトされていないＷＡ０９細胞の集団（緑色グラフ、ｃ）における、フローサイトメトリーにより測定されたＧＦＰ発現レベルの分布。（８Ｂ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理され、解凍され次第、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する９．３ｋｂ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９プラスミドがヌクレオフェクトされたＷＡ０９幹細胞の集団、およびｍＣｈｅｒｒｙ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９プラスミドがヌクレオフェクトされた新鮮非凍結対照ＷＡ０９細胞の集団における、フローサイトメトリーで測定されたｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルの分布。細胞に、２．５μｇ、５μｇ、７．５μｇ、１０μｇまたは１２．５μｇのプラスミドをヌクレオフェクトした。（８Ｃ）２．５μｇ、５μｇ、７．５μｇ、１０μｇおよび１２．５μｇのプラスミドのヌクレオフェクション後のｍＣｈｅｒｒｙを発現するＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞および新鮮非凍結対照細胞のパーセント。ＣｒｙｏＰａｕｓｅおよび新鮮非凍結条件下で２．５μｇのプラスミドを用いて、第２のヌクレオフェクション溶液であるＨＳＣ２も試験し、ｍＣｈｅｒｒｙ発現について分析した。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｃは、新鮮非凍結対照ＷＡ０９細胞と比較して、遺伝子改変されたＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９ヒト胚性幹細胞の集団により発現された構築物の発現レベル分布を図示する。（８Ａ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理され、解凍され次第、３．４ｋｂ  ＧＦＰプラスミドがヌクレオフェクトされたＷＡ０９幹細胞の集団（青色グラフ、ａ）、ＧＦＰベクターがヌクレオフェクトされた新鮮非凍結対照ＷＡ０９細胞の集団（赤色グラフ、ｂ）、およびヌクレオフェクトされていないＷＡ０９細胞の集団（緑色グラフ、ｃ）における、フローサイトメトリーにより測定されたＧＦＰ発現レベルの分布。（８Ｂ）ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理され、解凍され次第、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する９．３ｋｂ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９プラスミドがヌクレオフェクトされたＷＡ０９幹細胞の集団、およびｍＣｈｅｒｒｙ  ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９プラスミドがヌクレオフェクトされた新鮮非凍結対照ＷＡ０９細胞の集団における、フローサイトメトリーで測定されたｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルの分布。細胞に、２．５μｇ、５μｇ、７．５μｇ、１０μｇまたは１２．５μｇのプラスミドをヌクレオフェクトした。（８Ｃ）２．５μｇ、５μｇ、７．５μｇ、１０μｇおよび１２．５μｇのプラスミドのヌクレオフェクション後のｍＣｈｅｒｒｙを発現するＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞および新鮮非凍結対照細胞のパーセント。ＣｒｙｏＰａｕｓｅおよび新鮮非凍結条件下で２．５μｇのプラスミドを用いて、第２のヌクレオフェクション溶液であるＨＳＣ２も試験し、ｍＣｈｅｒｒｙ発現について分析した。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
５．発明の詳細な説明
本発明で開示される主題は、解凍後の拡大および／または継代なしに下流の応用に直接使用することができ、したがって、連続継代に関連する複数の問題、例えば夾雑および細胞の質の非一貫性、をなくす、すぐに使用可能な凍結保存細胞の組成物に関する。本発明で開示される主題は、そのような組成物の調製方法、前駆組成物、ならびに下流の応用、例えば、細胞分化、細胞療法および疾患モデリングに前記組成物中の細胞を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法にも関する。
【００２４】
開示を明確にするために、限定としてではなく、この詳細な説明は、以下のサブセクションに分割される：
５．１．定義；
５．２．すぐに使用可能な凍結保存細胞の組成物；
５．３．すぐに使用可能な凍結保存細胞の調製方法；および
５．４．すぐに使用可能な凍結保存細胞の使用方法。
【００２５】
５．１  定義
本明細書において使用される用語は、本発明に関する文脈の中で、および各用語が使用される特定の文脈において、当技術分野におけるそれらの通常の意味を一般に有する。本発明の組成物および方法ならびにそれらの製造および使用方法を説明する追加のガイダンスを実施者に提供するために、ある特定の用語が下でまたは本明細書の他の箇所で論じられる。
【００２６】
用語「約」または「おおよそ」は、当業者によって決定される特定の値について許容される誤差範囲内を意味し、この許容される誤差範囲は、値が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの制約にある程度依存することになる。例えば、「約」は、当技術分野での実務に従って、３または３超の標準偏差内を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、例えば、最大１０％、最大５％または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生体系または生物学的プロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、例えば、５倍以内、または２倍以内を意味し得る。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「アリコート」は、溶液、例えば細胞浮遊溶液、の総量の一部分を意味する。「細胞のアリコート」は、細胞浮遊液から分割され、別の容器で保管される、細胞浮遊液の総量の一部分を意味する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「細胞培養」は、研究または医療処置のための人工培地におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「接着細胞培養」は、細胞を、組織培養フラスコまたはプレートの底に接着した状態で細胞培養培地において成長させる、細胞培養方法を指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「培養培地」は、ペトリプレート、マルチウェルプレートおよびこれらに類するものなどの培養用の器の中の細胞を覆う液体であって、細胞に栄養を与えて細胞を支持するための栄養素を含有する液体を指す。培養培地は、細胞の所望の変化を生じさせるために添加される増殖因子も含むことがある。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「細胞浮遊液」は、単一細胞または小さい細胞凝集体が容器の壁に接着せずに液体培地中に浮遊している溶液を指す。「単一細胞浮遊液」は、単一細胞が液体培地中に浮遊している細胞浮遊液を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「凍結保存する」または「凍結保存」は、細胞が極低温への冷却により保存されるプロセスである。
【００３３】
本明細書で使用される場合、用語「凍結保存法用培地」は、凍結保存細胞と混合され、保管される、液体を指す。凍結保存法用培地は、氷形成に起因する凍結傷害から細胞を保護するために使用される物質の有効量を含有することもある。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語「拡大」または「拡大させる（する）」は、細胞数の増加を指す。
【００３５】
本明細書で使用される場合、用語「継代」は、培養用の器から培養培地を除去し、培養用の器の中で培養された細胞を新たな培養培地に移すプロセスを指す。継代プロセスは、培養細胞のさらなる拡大を可能にする。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、人工環境を指し、かつ人工環境で起こるプロセスまたは反応を指す。ペトリ皿、コニカルチューブおよび細胞培養がｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境の実例だが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書で使用される場合、用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、天然の環境（例えば、動物または細胞）を指し、かつ、天然の環境で起こるプロセスまたは反応、例えば、胚の発生、細胞分化、神経管形成などを指す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「分化」は、特定されていない細胞、例えば、多能性幹細胞、例えば胚性幹細胞（ＥＳＣ）および／または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が、心臓、肝臓、ニューロンもしくは筋肉細胞などの、特定の細胞またはその前駆体の特色を獲得するプロセスを指す。分化は、細胞と細胞外の物理的および化学的条件との相互作用により、例えば、遺伝子発現を直接または間接的に調節する細胞表面に埋め込まれたタンパク質が関与するシグナル伝達経路によって、制御される。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「細胞の集団」または「細胞集団」は、細胞の群を指す。非限定的な例では、細胞集団は、少なくとも約１０万個、少なくとも約５０万個、少なくとも約１００万個、少なくとも約２００万個、少なくとも約３００万個、少なくとも約４００万個、少なくとも約５００万個、少なくとも約１０００万個、少なくとも約２０００万個、少なくとも約３０００万個、少なくとも約４０００万個、少なくとも約５０００万個、少なくとも約６０００万個、少なくとも約７０００万個、少なくとも約８０００万個、少なくとも約９０００万個、少なくとも約１億個の細胞、少なくとも約２億個の細胞、少なくとも約５億個の細胞、少なくとも約１０億個の細胞、少なくとも約１５億個の細胞、少なくとも約２０億個の細胞、少なくとも約２５億個の細胞、少なくとも約３０億個の細胞、またはこれらの間の値を含むことができる。集団は、１つの細胞型を含む純粋な集団であることもある。あるいは、集団は、１つより多くの細胞型、例えば、混合細胞集団を含むこともある。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「幹細胞」は、培養で無期限に分裂し、特定の細胞を生じさせる能力を有する細胞を指す。ヒト幹細胞は、ヒトからのものである幹細胞を指す。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「胚性幹細胞」は、着床前期の胚に由来し、培養で長期間にわたって分化せずに分裂することができ、３種の一次胚葉の細胞および組織に発達することが公知である、原始（未分化）細胞を指す。ヒト胚性幹細胞は、ヒトからのものである胚性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、用語「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」は、培養で長期間にわたって分化せずに分裂することができ、３種の一次胚葉の細胞および組織に発達することが公知である、胚盤胞期までのおよび胚盤胞期を含む早期ヒト胚に由来する多能性幹細胞の種類を指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「多能性」は、内胚葉、中胚葉および外胚葉を含む生物の３種の発生学的胚葉に発達する能力を指す。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「誘導多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」は、体細胞、例えば、ＣＩ  ４、Ｃ７２およびこれらに類するものへの、ある特定の胚性遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４導入遺伝子）の導入により形成される（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、TakahashiおよびYamanaka、Cell、１２６巻、６６３〜６７６頁（２００６年）を参照されたい）、胚性幹細胞と類似している、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の種類を指す。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「多能性幹細胞株」または「ＰＳＣ株」は、最長数日、数カ月〜数年にわたって分化せずに増殖することを可能にするｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で培養された多能性幹細胞の集団を指す。
【００４５】
有効量は、所望の効果を生じさせる量である。
【００４６】
本明細書で使用される場合、細胞に関しての用語「分化を誘導すること」は、デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）を非デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）に変化させることを指す。したがって、「幹細胞において分化を誘導すること」は、幹細胞とは異なる特徴、例えば遺伝子型（例えば、マイクロアレイなどの遺伝子分析により判定される遺伝子発現の変化）および／または表現型（例えば、ＴＵＪＩ、ＤＣＸ、ＴＢＲ１、ＲＥＥＬＩＮおよびＦＯＸＧ１などの、タンパク質の発現の変化）を有する子孫細胞に分裂するように、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）を誘導することを指す。「個体」または「対象」は、本明細書では、脊椎動物、例えば、ヒトまたは非ヒト動物、例えば哺乳動物である。哺乳動物には、ヒト、霊長類、家畜、競技用動物、げっ歯類およびペットが含まれるが、これらに限定されない。非ヒト動物対象の非限定的な例としては、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモット；ウサギ；イヌ；ネコ；ヒツジ；ブタ；ヤギ；ウシ；ウマ；ならびに非ヒト霊長類、例えば類人猿およびサルが挙げられる。
【００４７】
本明細書で使用される場合、用語「疾患」は、細胞、組織もしくは器官の正常機能を損なわせる、またはそれらの正常機能に干渉する、任意の状態または障害を指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「処置すること」または「処置」は、処置を受ける個体もしくは細胞の疾患経過を変えようとする臨床的介入を指し、予防のために行われることもあり、または臨床病理検査の過程で行われることもある。処置の治療的効果としては、限定ではないが、疾患の発生または再発の防止、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的病理学的帰結の減少、転移の防止、疾患進行速度の低下、病的状態の改善または緩和、および寛解または予後改善が挙げられる。疾患または障害の進行を防止することにより、処置は、罹患したもしくは診断された対象または障害を有することが疑われる対象において障害に起因する悪化を防止することができるが、処置は、障害のリスクがあるまたは障害を有することが疑われる対象において障害または障害の症状の発生を防止することもできる。
【００４９】
５．２  すぐに使用可能な凍結保存細胞の組成物
本発明で開示される主題は、解離された細胞の凍結集団と凍結保存用培地とを含む組成物を提供する。細胞の凍結集団は、すぐに使用可能であり、細胞を解凍後の拡大および／または継代なしに、またはほとんどなしに、下流の応用に使用することができる。
【００５０】
ある特定の実施形態では、解離された細胞の集団は、集団内の各細胞が、解離されていない細胞の集団と比較して他の細胞への接着レベルの低下を示すような、単一細胞浮遊液を含む。ある特定の実施形態では、解離された細胞の集団は、解離されていない細胞の集団と比較して低下したレベルまたは量の細胞凝集体を含む。ある特定の実施形態では、解離された細胞の集団は、解離されていない細胞の集団と比較してサイズが小さい細胞凝集体を含む。
【００５１】
ある特定の実施形態では、解離された細胞の集団は、集団内の各細胞が集団内の他の細胞と接着していない、したがって、集団が細胞凝集体を含まない、単一細胞浮遊液を含む。
【００５２】
凍結された細胞を凍結保存用培地中で、高濃度で保管することができ、したがって、組成物の単一アリコートは、解凍後の拡大なしに、またはほとんどなしに、下流の応用に十分な数の細胞を提供することができる。例えば、限定によるものではないが、アリコート中の細胞の濃度は、細胞１００万個／ｍｌより高い、または細胞５００万個／ｍｌより高い、または細胞１０００万個／ｍｌより高い、または細胞２０００万個／ｍｌより高いこともある。
【００５３】
ある特定の実施形態では、組成物の単一アリコートは、解凍後の拡大なしに下流の応用に十分な数の細胞を提供する。
【００５４】
ある特定の実施形態では、組成物の単一アリコートは、解凍後の継代なしに下流の応用に十分な数の細胞を提供する。
【００５５】
ある特定の実施形態では、組成物の単一アリコートは、解凍後の拡大および継代なしに下流の応用に十分な数の細胞を提供する。
【００５６】
ある特定の実施形態では、組成物の単一アリコートは、下流の応用に十分な数の細胞を提供するか、または解凍後、細胞の集団は、集団内の細胞が、限られた量の細胞分裂、例えば、最大０．５ラウンド、最大１ラウンド、最大２ラウンド、最大３ラウンド、最大４ラウンド、または最大５ラウンド細胞分裂するように、一定の期間、拡大される（０．５ラウンドの細胞分裂は、細胞集団の倍加時間の半分である期間にわたって培養することを意味する）。
【００５７】
ある特定の実施形態では、細胞の集団は、解凍後、集団内の細胞が細胞分裂するように、一定の期間、拡大され、前記拡大は、指数関数的拡大ではない。
【００５８】
ある特定の実施形態では、細胞の集団は、解凍後継代される。ある特定の実施形態では、細胞の集団は、最大１回、最大２回、最大３回、最大４回、または最大５回、継代される。
【００５９】
ある特定の実施形態では、凍結保存用培地中の細胞の濃度は、少なくとも細胞約１０万個／ｍｌ、少なくとも細胞約５０万個／ｍｌ、少なくとも細胞約１００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約１０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約１５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約２０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約２５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約３０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約３５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約４０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約４５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞５０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約５５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約６０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約６５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約７０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約７５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約８０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約８５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約９０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約９５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約１億個／ｍｌ、少なくとも細胞約１億５０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約２億個／ｍｌ、少なくとも細胞約２億５０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約３億個／ｍｌ、少なくとも細胞約３億５０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約４億個／ｍｌ、少なくとも細胞約４億５０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約５億個／ｍｌである。
【００６０】
ある特定の実施形態では、組成物の単一アリコートは、少なくとも約１ｍｌ、少なくとも約２ｍｌ、少なくとも約３ｍｌ、少なくとも約４ｍｌ、少なくとも約５ｍｌ、少なくとも約６ｍｌ、少なくとも約７ｍｌ、少なくとも約８ｍｌ、少なくとも約９ｍｌ、少なくとも約１０ｍｌ、少なくとも約１５ｍｌ、少なくとも約２０ｍｌ、少なくとも約２５ｍｌ、少なくとも約３０ｍｌ、少なくとも約３５ｍｌ、少なくとも約４０ｍｌ、少なくとも約４５ｍｌ、少なくとも約５０ｍｌ、少なくとも約５５ｍｌ、少なくとも約６０ｍｌ、少なくとも約６５ｍｌ、少なくとも約７０ｍｌ、少なくとも約７５ｍｌ、少なくとも約８０ｍｌ、少なくとも約８５ｍｌ、少なくとも約９０ｍｌ、少なくとも約９５ｍｌ、少なくとも約１００ｍｌ、少なくとも約１５０ｍｌ、少なくとも約２００ｍｌ、少なくとも約２５０ｍｌ、少なくとも約３００ｍｌ、少なくとも約３５０ｍｌ、少なくとも約４００ｍｌ、少なくとも約４５０ｍｌ、少なくとも約５００ｍｌ、少なくとも約１０００ｍｌの体積を有する。
【００６１】
ある特定の実施形態では、細胞は、幹細胞、例えば、多能性幹細胞（例えば、ヒト多能性幹細胞）である。ヒト幹細胞の非限定的な例としては、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト単為生殖性幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、または細胞系列特異的分化が可能な任意の他の細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト多能性幹細胞株である。ヒト多能性幹細胞株の非限定的な例としては、ＷＡ０９（Ｈ９）、９６０．１Ｂ、１５．３Ａ、およびＷＡ０１  ｉＣＲＩＳＰＲ細胞株が挙げられる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、非ヒト幹細胞である。非ヒト幹細胞  非ヒト霊長類幹細胞、げっ歯類幹細胞、イヌ幹細胞、ネコ幹細胞の非限定的な例。ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、誘導多能性幹細胞である。
【００６２】
接着細胞培養で成長することができるいずれの種類の細胞も、本発明で開示される主題に適している。そのような細胞の非限定的な例としては、動物細胞、昆虫細胞および植物細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、ＣＯＳ細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、ＨＥＫ細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、ＨｅＬａ細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、網膜細胞である。
【００６３】
当技術分野において公知の任意の種類の凍結保存用培地を、本発明で開示される主題とともに使用することができる。凍結保存用培地は、基質、例えば、氷形成に起因する凍結傷害から細胞を保護することができる凍結保存剤を含有することができる。凍結保存剤の非限定的な例としては、グリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコールおよびグリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ならびにトレハロース（trehalos）が挙げられる。凍結保存用培地の非限定的な例としては、ＦｒｅＳＲ（商標）−Ｓ、ＰＳＣ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｔｅｍ−ＣｅｌｌＢａｎｋｅｒ  ＧＭＰ、１０％ＤＭＳＯを含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｅ  Ｍｅｄｉａ（Ｂｉｏｌｉｆｅ）、およびＣｒｙｏＳｔｅｍ凍結保存用培地（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、凍結保存用培地は、ＦｒｅＳＲ（商標）−Ｓである。
【００６４】
細胞と凍結保存用培地とを含む組成物をアリコートにし、凍結保存に適している当技術分野において公知の任意の種類の保管容器または保管用の器で保管することができる。凍結保存容器の非限定的な例としては、例えば、ガラス製バイアル（例えば、これに限定されないが、フリントガラス製バイアル）、アンプル、プラスチック製可撓性容器、例えば、これらに限定されないが、ＰＶＣ（ポリ塩化ビニル）製容器、ＣＺ樹脂製容器、ポリプロピレン製容器および注射器、ならびにガラス製注射器などの、バイアル、プラスチックバッグ、チューブおよびボックスが挙げられる。
【００６５】
５．３  すぐに使用可能な凍結保存細胞の調製方法
本発明で開示される主題は、解離され凍結された細胞の集団を含む組成物を調製する方法を提供する。組成物を、解凍後の拡大および／または継代なしに、またはほとんどなしに、下流の応用に直接使用することができる。
【００６６】
ある特定の非限定的実施形態では、解離され凍結された細胞の集団を調製する方法は、培養培地で培養された細胞の集団を解離させるステップ、解離された細胞を凍結保存用培地に浮遊させて細胞浮遊液を形成するステップ、および細胞浮遊液を凍結させて凍結細胞の組成物を形成するステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞は、凍結の前に拡大される。
【００６７】
ある特定の実施形態では、細胞の少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０または９５％は、解凍後に生存可能である。
【００６８】
ある特定の実施形態では、解離され凍結された細胞の組成物は、少なくとも細胞約１０万個／ｍｌ、少なくとも細胞約５０万個／ｍｌ、少なくとも細胞約１００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約１０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約１５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約２０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約２５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約３０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約３５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約４０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約４５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞５０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約５５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約６０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約６５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約７０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約７５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約８０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約８５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約９０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約９５００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約１億個／ｍｌ、少なくとも細胞約１億５０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約２億個／ｍｌ、少なくとも細胞約２億５０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約３億個／ｍｌ、少なくとも細胞約３億５０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約４億個／ｍｌ、少なくとも細胞約４億５０００万個／ｍｌ、少なくとも細胞約５億個／ｍｌの濃度を有する。
【００６９】
ある特定の実施形態では、組成物の単一アリコートは、少なくとも約１ｍｌ、少なくとも約２ｍｌ、少なくとも約３ｍｌ、少なくとも約４ｍｌ、少なくとも約５ｍｌ、少なくとも約６ｍｌ、少なくとも約７ｍｌ、少なくとも約８ｍｌ、少なくとも約９ｍｌ、少なくとも約１０ｍｌ、少なくとも約１５ｍｌ、少なくとも約２０ｍｌ、少なくとも約２５ｍｌ、少なくとも約３０ｍｌ、少なくとも約３５ｍｌ、少なくとも約４０ｍｌ、少なくとも約４５ｍｌ、少なくとも約５０ｍｌ、少なくとも約５５ｍｌ、少なくとも約６０ｍｌ、少なくとも約６５ｍｌ、少なくとも約７０ｍｌ、少なくとも約７５ｍｌ、少なくとも約８０ｍｌ、少なくとも約８５ｍｌ、少なくとも約９０ｍｌ、少なくとも約９５ｍｌ、少なくとも約１００ｍｌ、少なくとも約１５０ｍｌ、少なくとも約２００ｍｌ、少なくとも約２５０ｍｌ、少なくとも約３００ｍｌ、少なくとも約３５０ｍｌ、少なくとも約４００ｍｌ、少なくとも約４５０ｍｌ、少なくとも約５００ｍｌ、少なくとも約１０００ｍｌの体積を有する。
【００７０】
ある特定の実施形態では、細胞は、解離される前に培養培地で培養される。細胞を培養するのに適している任意の種類の培養培地を、本発明で開示される主題とともに使用することができる。ある特定の実施形態では、培養培地は、フィーダーフリー培養培地である。ある特定の実施形態では、培養培地は、フィーダー培地である。ある特定の実施形態では、培地は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地である。
【００７１】
培養培地で培養された細胞は、細胞解離溶液を使用して、培養プレートまたはフラスコなどの培養面から解離される。解離は、単一細胞浮遊液を形成するための、細胞の互いの分離を補助することもできる。細胞接着から細胞を解離させるのに適している当技術分野において公知の任意の種類の薬剤または溶液を、本発明で開示される主題とともに、細胞解離溶液として使用することができる。細胞解離溶液は、タンパク質分解および／またはコラーゲン分解機能を有する酵素を含有することができる。そのような酵素の非限定的な例としては、Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、コラゲナーゼ、プロテアーゼ、トリプシンおよび誘導体、パパインが挙げられる。細胞解離溶液は、ヒアルロニダーゼおよびＤＮａｓｅなどの、他の酵素も含有することができる。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸の分解を触媒することができる酵素のファミリーである。ＤＮａｓｅは、解離培地に漏出する核酸を消化することができる酵素のファミリーである。そのような酵素含有溶液の非限定的な例としては、トリプシン緩衝液、トリプシン−ＥＤＴＡ緩衝液、Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｄｅｔａｃｈｉｎ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）、およびＡｃｃｕｍａｘが挙げられる。細胞解離溶液は、酵素不含であることもある。ある特定の実施形態では、酵素不含細胞解離溶液は、溶液中の遊離カルシウムおよびマグネシウムイオンをキレートし、これにより細胞を解離させるために、キレート剤を含有することができる。キレート剤の非限定的な例は、ＥＤＴＡであるか、または基材と細胞の相互作用を除去するために使用される他のＣａ＋＋／Ｍｇ＋＋不含薬剤、１，１−ビス（ジフェニルホスフィノ）エチレンである。そのような酵素不含溶液の非限定的な例としては、Ｇｅｎｔｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＧＣＤＲ、ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；細胞解離緩衝液、酵素不含、ハンクス平衡塩類溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）；および細胞解離緩衝液、酵素不含、ＰＢＳ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）；またはＥＤＴＡが挙げられる。ある特定の実施形態では、細胞は、Ａｃｃｕｔａｓｅを使用して解離される。
【００７２】
ある特定の実施形態では、細胞の解離集団は、洗浄され、その後、凍結保存用培地に浮遊される。細胞の解離集団を、細胞の洗浄に適している当技術分野において公知の任意の溶液で、洗浄することができる。ある特定の実施形態では、細胞の解離集団は、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地で洗浄される。
【００７３】
細胞浮遊液をアリコートにし、凍結保存に適している当技術分野において公知の任意の種類の保管容器で保管することができる。凍結保存容器および凍結保存用の器の非限定的な例は、上記である。
【００７４】
細胞を凍結保存するために細胞浮遊液を凍結させるのに適している当技術分野において公知の任意の凍結方法、例えば、速度制御フリーザープログラムを、本発明で開示される主題とともに使用することができる。
【００７５】
ある特定の実施形態では、凍結方法は、以下のプログラムを用いてプログラムされた速度制御フリーザーの使用を含む：
ステップ１：４℃で待機；
ステップ２：−４℃に１．２℃／分（サンプル）；
ステップ３：−４０℃に２５℃／分（チャンバー）；
ステップ４：−１２℃に１０℃／分（チャンバー）；
ステップ５：−４０℃に１．０℃／分（チャンバー）；
ステップ６：−９０℃に１０℃／分（チャンバー）；そして
ステップ７：−９０℃で待機。
【００７６】
ある特定の実施形態では、速度制御フリーザーが−９０℃に達した後、細胞の凍結アリコートを液体窒素タンクに移すことができる。
【００７７】
ある特定の実施形態では、凍結方法は、従来の緩速冷却方法である。
【００７８】
５．４  すぐに使用可能な凍結保存細胞の使用方法
本発明で開示される主題は、解離され凍結された細胞の集団と凍結保存用培地とを含む組成物を培養する、または別様に使用する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法も提供する。ある特定の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの方法は、組成物を下流の処置に付すステップを含み、細胞は、下流の処置の前に拡大および／または継代されない。
【００７９】
ある特定の実施形態では、解離され凍結された細胞の集団を含む組成物は、下流の処置に適切な数の細胞を含有する。例えば、組成物の単一アリコートは、下流の処置に十分な数の細胞を含むことができる。
【００８０】
ある特定の実施形態では、組成物の単一アリコートは、下流の応用に十分な数の細胞を提供し、解凍後に細胞の集団は、集団内の細胞が細胞分裂、例えば、少なくとも１、２、３、４または５ラウンド細胞分裂するように、一定の期間、拡大される。ある特定の非限定的実施形態では、細胞の集団は、使用前に、最大２回の細胞分裂に十分な期間、または最大５回の細胞分裂に十分な期間、培養で（必要に応じて、細胞培養培地を加えて）維持される。
【００８１】
ある特定の非限定的実施形態では、細胞の集団は、使用前に、例えば細胞の集団が解凍された後、最長約１、５、１０、１５、２０、２５または３０時間の期間、培養で（必要に応じて、細胞培養培地を加えて）維持される。
【００８２】
ある特定の非限定的実施形態では、細胞の集団は、使用前に、例えば細胞の集団が解凍された後、最長約２４時間の期間、培養で（必要に応じて、細胞培養培地を加えて）維持される。
【００８３】
ある特定の実施形態では、細胞の集団は、解凍後、集団内の細胞が細胞分裂するように、一定の期間、拡大され、前記拡大は、指数関数的拡大ではない。
【００８４】
ある特定の実施形態では、細胞の集団は、解凍後継代される。ある特定の実施形態では、細胞の集団は、最大１、２、３、４または５回、継代される。
【００８５】
ある特定の実施形態では、解離され凍結された細胞の集団は、ヒトｉＰＳＣまたはヒトＥＳＣを含む。ある特定の実施形態では、下流の処置は、細胞の集団を多数の体性細胞、例えば、ニューロンまたはその前駆体に分化させる方法を含む。ある特定の実施形態では、前記の分化させた細胞は、治療に使用するための治療用組成物、例えば医薬組成物に含まれることがある。ある特定の実施形態では、分化させた細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで疾患モデリングに使用することができる。例えば、多能性幹細胞を分化させる方法は、国際公開番号ＷＯ／２０１０／０９６４９６、ＷＯ／２０１１／１４９７６２、ＷＯ／２０１３／０６７３６２、ＷＯ／２０１６／１９６６６、ＷＯ／２０１４／１７６６０６、ＷＯ／２０１５／０７７６４８、ならびに国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ１６／０６８４３０（２０１６年１２月２２日に出願された）、ＰＣＴ／ＵＳ１７／０１６７２３（２０１７年２月６日に出願された）およびＰＣＴ／ＵＳ１７／０１５４８０（２０１７年１月２７日に出願された）において開示されており、これらの各々の内容は、それら全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み入れられる。
【００８６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞の集団は、多数のドーパミン細胞、例えば中脳ドーパミン細胞、またはそれらの前駆体に分化する。ある特定の実施形態では、ドーパミン前駆細胞は、検出可能なレベルのフォークヘッドボックスタンパク質Ａ２（ＦＯＸＡ２）、ＬＩＭホメオボックス転写因子１アルファ（ＬＭＸ１Ａ）および／またはチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現する。ある特定の実施形態では、解離され凍結された細胞の集団は、神経変性疾患、例えばパーキンソン病、を有すると診断されたまたは有するリスクがある対象に由来するｉＰＳＣを含む。
【００８７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞に外来性核酸がトランスフェクトされ、例えば、本明細書に記載される細胞は、ヌクレオフェクション方法、エレクトロポレーション方法、液体／リポソームベースの方法、リン酸カルシウムにより誘導される方法、または外来性遺伝物質を哺乳動物細胞に移す他の方法に付される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞は、凍結されたことのない対照細胞と比較して、トランスフェクション後の核酸取込みおよび／または核酸の発現レベル上昇を示す。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞による発現レベル上昇は、非凍結対照細胞による発現レベルより少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０または２５倍高い。
【００８８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される細胞による発現レベル上昇は、非凍結対照細胞による発現レベルより少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０または７５％高い。
【００８９】
ある特定の実施形態では、発現レベル上昇は、核酸を発現する集団内の細胞の量を指す。
【００９０】
ある特定の実施形態では、発現レベル上昇は、１つもしくは複数の細胞によりまたは細胞の集団により発現されるｍＲＮＡまたはタンパク質の強度または量を指す。
【００９１】
ある特定の実施形態では、凍結保存前に、細胞に核酸がトランスフェクトされる。
【００９２】
ある特定の実施形態では、凍結保存後、例えば解凍後に、細胞に核酸がトランスフェクトされる。ある特定の実施形態では、凍結保存後、解凍の少なくとも約０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４時間後に、細胞にトランスフェクトされる。
【００９３】
ある特定の実施形態では、核酸は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集に使用される核酸分子、例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸、ＣＰＦ１タンパク質をコードする核酸、および／または所定の標的のガイドＲＮＡをコードする核酸を含む（例えば、Congら、Science、２月１５日；３３９巻（６１２１号）：８１９〜２３頁（２０１３年）；Hsuら、Cell.２０１４年６月５日；１５７巻（６号）：１２６２〜７８頁；Ranら、Nature  Protocols、１１月；８巻（１１号）：２２８１〜３０８頁．（２０１３年）；Gilbertら、Cell、２０１３年７月１８日；１５４巻（２号）：４４２〜５１頁；Staahlら、Nat  Biotechnol.２０１７年５月；３５巻（５号）：４３１〜４３４頁；およびMaliら、Science.２０１３年２月１５日；３３９巻（６１２１号）：８２３〜６頁を参照されたく、これらの各々の内容は、それら全体が参照により組み入れられる）。
【００９４】
ある特定の実施形態では、トランスフェクト細胞の組成物が提供される。ある特定の実施形態では、上記方法の１つまたは複数を実施するための材料を含むキットが提供される。そのようなキットは、例えば、凍結保存細胞、およびＣＲＩＳＰ遺伝子編集のための分子をコードする核酸、またはプロモーター配列を含む発現カセットなどを含みうる。
【実施例】
【００９５】
６．実施例
本発明で開示される主題は、以下の実施例を参照することによってより良く理解されるであろう。この実施例は、本発明で開示される主題の例示として提供するものであり、限定として提供するものではない。
【００９６】
（実施例１）
解凍後に継代なしに使用するための、解離され凍結保存された多能性幹細胞
概要
ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）は、細胞置換療法および疾患モデリングのための無限の細胞源を提供する。それらには並外れた活力（enormous  power）があるにもかかわらず、技術的態様が再現性を妨げてきた。ここに記載するのは、ほぼすべてのＰＳＣ実験についての主要変数（ＰＳＣ出発物質の質および量）を排除する、ＰＳＣワークフローの単純な改良である。ほとんどの研究所は、ＰＳＣを連続的に継代し、拡大後に少量を使用するが、これらの実験の「ジャストインタイム」性は、品質管理が使用前にめったに行われないことを意味する。品質管理の欠如は、ＰＳＣの質、無菌性および遺伝的完全性を損なわせることがありえ、これは、得られる結果の交絡因子を生じさせる。ＣｒｙｏＰａｕｓｅと呼ばれる、ここで開示する方法（図７）は、ＰＳＣの培養物を解離させて単一細胞にし、これらのＰＳＣを、解凍して直ちに分化などの実験に使用することができる使い捨て凍結保存バイアルとして、貯蔵する。
【００９７】
ここで、ＣｒｙｏＰａｕｓｅを使用して凍結保存した細胞を、旧来の方法で培養した細胞と対照して試験した。短期生存率または多能性に差がないことをここに示す。さらに、ＣｒｙｏＰａｕｓｅは、中胚葉および神経分化の分化効率の損失を示さなかった。解凍後生存率は、常に９０％より高く、解凍後の幹細胞マーカー発現に有意差がないことが判明した。ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞を解凍し、拡大なしに、直接、分化させることまたは遺伝子改変することができることが判明した。最新のデータは、再現性を増大させ、分化前に異なるＰＳＣ株を同期させるのに役立ち、細胞療法および疾患モデリング応用のためのＰＳＣの拡大中の遺伝子不安定性および夾雑の可能性をなくすことになる、ＰＳＣの簡単な新規使用方法を、あらゆる研究所に提供する。
【００９８】
ＣｒｙｏＰａｕｓｅは、品質管理された同じＰＳＣから複数の実験を繰り返すことを可能にし、細胞療法応用と疾患モデリング応用の両方のためのＰＳＣの拡大中の遺伝子不安定性および夾雑の可能性をなくす。加えて、ＣｒｙｏＰａｕｓｅは、同一の出発ＰＳＣ集団から異なる時点で複数の分化または遺伝子改変実験を行うことを可能にする。ＣｒｙｏＰａｕｓｅは、地理的に離れている研究所が同一の出発ＰＳＣ集団を用いて実験することを可能にする。一貫性に加えて、高い自発的分化、夾雑または遺伝的完全性レベルが実験を損なわせた可能性を低下させるために、各バンクを使用前に予備検証することができる。いずれの研究所も、ＣｒｙｏＰａｕｓｅを実装して、疾患モデリング応用と細胞療法応用の両方において再現性を増大させることができる。
【００９９】
結果
最新の研究は、播種効率のわずかな低下が観察されたが、生存率、多能性および分化能に差がないことを示す。ＣｒｙｏＰａｕｓｅを規模拡大させることができる。例えば、４段セルファクトリーから２億８０００万の細胞バンクを構築することができる。本実施例は、解凍後生存率を有意に低下させることなく１バイアル当たり細胞３０００万個ほど高い濃度で細胞を凍結させた。
【０１００】
ＣｒｙｏＰａｕｓｅ条件の開発
解凍後の拡大をなくして幹細胞実験の再現性を向上させることができるかどうかを判定した。回復および拡大の迂回には、解凍後の高い生存率が現実的であることが求められる可能性が高い。Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地（Ｅ８；Chenら、２０１１年）でのＷＡ０９（Ｈ９）フィーダーフリー培養を使用する臨床パラダイムを使用した。ＷＡ０９細胞をＡｃｃｕｔａｓｅで処置して単一細胞浮遊液を生成した後、洗浄し、単分散ヒト多能性幹細胞凍結保存用に設計された市販の培地であるＦｒｅＳＲ（商標）−Ｓに再浮遊させた。標準プログラムを使用して速度制御フリーザーで細胞を凍結保存した後、「すぐに使用可能な」アリコートとして液体窒素中で長期保管した（材料および方法を参照されたい）。最初の実験は、驚くほど高い解凍後生存率を実証した。解凍後生存率への、細胞株の影響、凍結保存用培地の影響、および速度制御フリーザーの寄与の影響を詳しく調査し、Ｅ８培地でのフィーダーフリー培養を使用したとき、これらの変数のいずれかに対しても明らかな依存性がないことが判明した。異なるＰＳＣ株（図５Ａ）、異なる凍結保存用培地（図５Ｂ）および従来の緩速冷却（図５Ｃ）には、効率のはっきりした差はなかった。主な要因は、初期培養条件であるようだった。旧来のフィーダーベースの方法を使用して拡大させたＷＡ０９細胞のほうが、生存率が低かったが、この生存率低下がＦｒｅＳＲ（商標）−Ｓでは軽減されたからである（図５Ｄ）。
【０１０１】
実験のバランスをとるために、ベースライン条件は、別段の断り書きがない限り、速度制御フリーザーでのＦｒｅＳＲ（商標）−ＳにおけるＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理したＷＡ０９であった。この条件は、アクリジンオレンジ／ヨウ化プロピジウム（ＡＯＰＩ）を使用して、偏りのない自動細胞計数器で測定したとき、凍結させなかった対照ＷＡ０９細胞よりほんの数パーセントしか低くない解凍後生存率を常に生じさせた（図１Ａおよび１Ｆ）。複数のバンクを生成して、解凍後生存率がインプット培養物の生存率ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理によってのみ制限されることが分かった（図１Ｂ）。今までに試験した最長時点である最長１年の液体窒素中での保管について、生存率の損失も、多能性の損失も、観察されなかった（図５Ｅ）。並外れた解凍後生存率にもかかわらず、２４時間の培養後の播種効率の低下があり（データを示さない）、そのため、播種効率のこの差を相殺するために、より多くのＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞（新鮮対照での細胞２００，０００個／ｃｍ２に対してＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞での細胞４００，０００個／ｃｍ２）を播種した。
【０１０２】
ＣｒｙｏＰａｕｓｅ細胞の検証
ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の健常性を評定するために、分化が正常に誘導されたであろう播種の翌日に、ＰＳＣマーカーを検査した。フローサイトメトリーで測定することができたＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞と新鮮対照細胞の間の多能性幹細胞マーカーＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２およびＮＡＮＯＧに明らかな差はなかった（図１Ｃおよび１Ｄ）。自発的分化マーカーＳＳＥＡ１の増加もなかった（図１Ｃおよび１Ｄ）。免疫蛍光分析によってフロー結果を独立して確認し、２集団間に識別可能な差はなかった（図１Ｅ）。
【０１０３】
ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＰＳＣの多能性の特色についてのより包括的な検査を行うために、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔを使用して、対照培養物とＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理培養物を比較した（Mullerら、２０１１年；Williamsら、２０１１年；Mullerら、２０１２年）。ＰｌｕｒｉＴｅｓｔは、全ゲノム転写プロファイルに基づくものであり、未分化幹細胞培養物の多能性についての信頼できる評定を可能にする。簡単に言うと、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔは、多数の多能性関連転写物の発現を「多能性スコア」を用いて分析し、「新規性スコア」と称される第２の指標を用いて、遺伝的におよびエピジェネティック的に正常なヒト多能性幹細胞において典型的に観察される全般的転写パターンとの被験サンプルの適合性について試験する。ＰｌｕｒｉＴｅｓｔを用いて、対照とＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９サンプルの両方が、経験的に定義された多能性および新規性スコア閾値に合格し、新規性１クラス分類器モデルへの適合を示すことが判明し、これは、両方のサンプル群が、十分に特徴付けられたｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣ細胞株で観察されるものと非常に類似した遺伝子発現パターンを示すことを示す（図１Ｇ）。ＣｒｙｏＰａｕｓｅ細胞のエピジェネティックな景観も縮小表示バイサルファイト（bisulfide）シークエンシング（ＲＲＢＳ）によって調査し、対照細胞とＣｒｙｏＰａｕｓｅ細胞間に共通ＣｐＧユニットのメチル化レベルの強い一致を見いだした（図１Ｈ；ＭＡＤ＝０．１２２）。これは、技術的反復実験間で観察された一致したメチル化レベル（Kacmarczykら、２０１６年）に匹敵する。
【０１０４】
多能性のもう１つの尺度は、奇形腫の生成である。対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ培養物は、大体同じサイズおよび動態で奇形腫を生成した（図５Ｆ）。ＣｒｙｏＰａｕｓｅ奇形腫のヘマトキシリンおよびエオシン染色切片は、３種の胚葉すべての派生物を示した（図１Ｉ：内胚葉［黒色矢印］、中胚葉［緑色および青色アスタリスク］および外胚葉［赤色矢印］）。まとめると、これらのデータは、解凍後に直接ＣｒｙｏＰａｕｓｅ細胞を使用して肝要な多能性マーカーの発現に差がないことを、フローサイトメトリー、ＰｌｕｒｉＴｅｓｔ、ＣｐＧメチル化および奇形腫形成により実証する。
【０１０５】
ゲノムに二本鎖ＤＮＡ破断がある細胞の割合を評定するために、ハイコンテント顕微鏡を用いて核ｇＨ２ＡＸの定量的免疫蛍光検査を行った（図１Ｊおよび１Ｋ；概説についてはRedonら、２００２年を参照されたい）。ｇＨ２ＡＸを発現する細胞のパーセンテージに統計的差異はなかった。このアッセイを検証し、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ細胞のほうがＤＮＡ傷害剤に対して感受性が高かったかどうかを確かめるために、細胞傷害性キノロンアルカロイドであるカンプトテシンを添加した。カンプトテシンへの曝露後にγＨ２ＡＸを発現する細胞のパーセンテージに統計的差異はなかった。最後に、本発明者らは、解凍後のＣｒｙｏＰａｕｓｅ細胞に関する核型を分析して、全般的な遺伝子異常について試験した。正常な核型が対照（２０／２０分裂中期スプレッド）およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ培養物（２０／２０分裂中期スプレッド；図１Ｌ）に見られた。
【０１０６】
分化誘導および細胞療法
ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞と対照細胞の間にほとんど差がないこと見いだすことができたため、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化能を評定した。対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞を二重ＳＭＡＤ阻害に曝露して、ＷＡ０９  ｈＥＳＣを神経運命に誘導した（Chambersら、２００９年）。ＯＣＴ４およびＰＡＸ６を経時的に測定して、神経分化の効率および動態を評定した。神経誘導のタイミングにも程度にも差がなかった（図２Ａ〜２Ｃ、および２Ｋ）。中内胚葉運命に誘導されたＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞もまた、分化の程度および動態に関して区別不能であった（図２Ｄ〜２Ｆ、および２Ｌ）。これらの細胞の両方の運命は、相対的に未熟であり、したがって、作製がより容易であるため、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞からの中脳ドーパミンニューロンの作製を試みた（Barkerら、２０１５年）。ＷＡ０９  ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞は、臨床的に適合する「標準操作手順」から、ＦＯＸＡ２／ＴＨ二重陽性の有糸分裂後中脳ドーパミンニューロンを効率的に生成し、対照細胞に由来するニューロンと同様の遺伝子発現プロファイルを示す（図２Ｉおよび２Ｊ）。
【０１０７】
製造者は、ＦｒｅＳＲ（商標）−Ｓで凍結保存するとき、細胞１００万個／ｍＬの細胞密度を指定している。この密度は、より小規模の実験には妥当であるが、１実験当たり数十億個の細胞を必要とする細胞療法などの、多くの細胞数を必要とする応用には制約になる。それ故、凍結保存中に細胞密度を増加させることが、生存率または播種効率に悪影響を及ぼすかどうかを試験した。試験した最高密度である３０００万個／ｍＬの密度までは細胞を凍結させたときに生存率（図２Ｇ）にも播種効率（データを示さない）にも明らかな差は認められなかった。高密度調製は、製造前に数十億個のインプットＰＳＣを通常は必要とするほとんどの治療応用に、合理的なワークフローを提供するはずである。
【０１０８】
ＣｒｙｏＰａｕｓｅの強みは、大型の、特徴付けられた、すぐに使用可能な細胞バンクの生成である。この戦略には多くの利点があるが、不利な点は、凍結保存および品質管理の前に、すべてのＰＳＣ拡大をすべて一度に行う必要がある点である。拡大の規模を大きくするための努力の一環として、自動で閉じた系になるように容易に構成することができる、すべての層を一度に容易に供給することを可能にする、結合されたフラスコである、「セルファクトリー」を使用した。４層フラスコサイズ（２５２８ｃｍ２、またはおおよそ４４×６ウェルプレート）を使用してＰＳＣを拡大させ、これらは、１ファクトリー（ｎ＝３）当たり細胞約２億５０００万個の平均収量を有した。そのような「ファクトリー」での成長の複雑化要因は、層状のフラスコを直接顕微鏡で観察することができないので、拡大中に形態をモニターすることが困難であることである。ＣｒｙｏＰａｕｓｅバンクが正確に拡大されたことを検証するために、ＰＳＣマーカーを試験し、ファクトリーで拡大された細胞は、同等のマーカー発現を有すること（図２Ｈおよび２Ｍ）および分化することができること（データを示さない）を見いだした。
【０１０９】
遺伝子改変
ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞は、通常は解凍の２４時間後に挙動するため、細胞を解凍直後に遺伝子操作することができるかどうかを調査した。解凍直後のＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９細胞のヌクレオフェクション効率を新鮮対照細胞と比較した。ＧＦＰプラスミドでのヌクレオフェクションの２４時間後、蛍光顕微鏡検査は、両方の条件でＧＦＰ＋細胞を明示し、フローサイトメトリー定量は、＞８５％がＧＦＰを発現したことを明示した（図３Ａ〜３Ｃおよび４Ａ〜４Ｂ）。直ちに解凍したＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞は、形質導入の２４時間後に蛍光顕微鏡検査により示される通り、ＥｍＧＦＰを発現するセンダイウイルスベクターによる形質導入にも成功することができた（図３Ｄ）。ＣＰ由来のセンダイ形質導入サブクローンを、少なくとも１５継代（試験した最長）にわたって増殖させることができた。
【０１１０】
ヌクレオフェクション成功は、解凍し次第のゲノム改変がうまくいくことを示唆した。標的ゲノム改変を試験するために、ＡＡＶＳ１遺伝子座に組み込まれた誘導性Ｃａｓ９を含有するＰＳＣである、ｉＣＲＩＳＰＲシステム（Gonzalezら、２０１４年）を使用した。ＷＡ０１（Ｈ１）ｉＣＲＩＳＰＲ細胞を拡大させ、次いで、ドキシサイクリンで処置した２４時間後にＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理した：これは、凍結前にＣａｓ９を予め発現するＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞を生成した。解凍した時点で、ＨＰＲＴガイドＲＮＡをこれらの細胞にヌクレオフェクトし、その後、ゲノム分析を行った。発現されたＣａｓ９を伴うＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理されたｉＣＲＩＳＰＲ細胞を解凍し、解凍直後にそれらの細胞にＨＰＲＴガイドＲＮＡをヌクレオフェクトした。ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ｉＣＲＩＳＰＲ  ＷＡ０１（Ｈ１）細胞と対照ｉＣＲＩＳＰＲ  ＷＡ０１（Ｈ１）細胞の間にＨＰＲＴ標的化突然変異効率の明らかな差はなかった（図３Ｅおよび４Ｃ）。
【０１１１】
考察
新規方法（ＣｒｙｏＰａｕｓｅ）は、ほとんどの多能性幹細胞ベースの応用にとって非常に重要な変数（分化またはゲノム改変前の多能性細胞の性質）を、排除すると言える。凍結保存ｈＰＳＣは、使用前に回復、拡大および継代を必要とすることは、一般に認知されている。本実験は、解離させたヒト多能性幹細胞を、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理しなかった対応する「新鮮」細胞と比較して、解凍後生存率をほとんど損なうことなく、播種効率のわずかな低下で、単一細胞浮遊液として凍結保存することができることを実証した。最新のデータは、このパラダイム変化を可能にする技術的駆動因子が、多数の凍結保存パラダイム（LiuおよびChen、２０１４年）を使用してＥ８で拡大させた細胞に関して回復向上が観察された、培養システムであることを示す。
【０１１２】
ＣｒｙｏＰａｕｓｅは、従来のＰＳＣ培養と比較して多数の利点を提供する。ＣｒｙｏＰａｕｓｅは、いつでも分化できる状態になっている細胞の大型バンクを、規定された状態に固定すること、したがって、再現性を向上させることが可能である。継続的監視ではなく、夾雑（細胞株、マイコプラズマ、細菌）、遺伝子不安定性、複数のｉＰＳ株の同期、および培養の純度を測定することなどの、品質試験によって、バンク全体を検証することができる。
【０１１３】
疾患モデリング研究は、非常に多くの健常および罹病個体に由来する複数のｉＰＳＣクローンを用いて、最良に行われる。従来の並行培養方法は、実験のための新鮮出発物質の継続的な供給源を提供するために複数の細胞株の維持を分化誘導と並行して行う必要があるので、沢山の人手を要し、多大な時間を必要とする。異なる速度で拡大するｉＰＳ株は、分化および並行した継代の同期した開始を複雑にし、通常は、結果として、ある時点で準備が整う培養の数を最大にし、残部は過小または過剰拡大されることが多いということを妥協することになる。連続培養は、細胞株の相互夾雑のリスク、実験中の微生物の偶発的導入、または拡大培養中にゲノム異常を獲得する細胞の使用も増加させる。ＣｒｙｏＰａｕｓｅは、ＰＳＣ拡大の作業を分化実験から切り離す。ＣｒｙｏＰａｕｓｅは、ＰＳＣの同一プールからの反復分化を可能にし、したがって、ＰＳＣ調製の変動性を完全になくす。ＰＳＣマーカーステータス、遺伝的完全性、無菌性、および細胞株認証などの、十分な一連の品質管理基準により、使用前に各バンクを検証することができる。ほとんどの研究所は、現在のところ、使用中に、または恐らく、連続的な継代を開始する前にも、「抜き取り検査」を行う。「ジャストインタイム」ＰＳＣワークフローの変数は、ほぼすべてのＰＳＣ応用の堅牢性および再現性をほぼ確実に低下させる。それは、ＰＳＣ拡大速度の不確実性のため、分化をいつ開始することができるのかを分かりにくくするので、不便でもありうる。
【０１１４】
ＣｒｙｏＰａｕｓｅの利点は、細胞治療薬の製造については、よりいっそう重大でありうる。典型的な細胞療法ワークフローでは、ｈＰＳＣは、拡大され、ＧＭＰ施設に貯蔵された後、細胞バンクを検証するための高価で多大な時間がかかる試験を受ける。このＰＳＣバンクの治療に有用な細胞型への変換には、通常は、治療用細胞型への分化を開始させる前に、凍結保存状態からの回復および限定数の細胞継代が必要である。これは、ＰＳＣが最適以下の状態である細胞バンクの分化を開始させる可能性を生じさせ、したがって、再現性および製品収量を低下させる恐れがある。製造実行は、時間および金銭面でとてつもなく高価でありえ、患者の有害事象の原因となる恐れもありうるだろう。製造の再現性もまた、ヒトに使用するための細胞製品を評定する際に規制当局が検査する重要な特質の１つである。ＰＳＣ拡大のタイミング、収量および品質を、細胞療法についての変数として、ＣｒｙｏＰａｕｓｅをそのような応用について検証することができる場合には、完全に排除することができる。臨床的に適合するＳＯＰを使用してＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９細胞を中脳ドーパミンニューロンに誘導することができることを、ここに示す。
【０１１５】
一部の細胞置換療法におけるＰＳＣ派生物の使用についての１つの大きな複雑化要因は、細胞のＨＬＡステータスを患者に適合させることである。自家ｉＰＳＣは、患者適合細胞を生じさせ、免疫不適合を回避する、１つの戦略である。しかし、自家戦略に伴う実際的および潜在的安全性複雑化要因がかなりある。このことが、それらを臨床使用の前に注意深く品質管理することができ、その上、さらに、同種異系移植のために特定の患者にＨＬＡを厳密に一致させることができるように、多数のＰＳＣ株を貯蔵するための、複数の大規模な取り組みを招いた。このシナリオでのＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理の使用は、多くの異なるＰＳＣを臨床的に有用な細胞に変換するために使用される手順を単純化することができるだろう。
【０１１６】
方法および材料
ヒト多能性幹細胞維持
ＷＡ０９（Ｈ９）および９６０．１Ｂ  ｉＰＳＣ株を、ＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃１１３３００３２）で１：５０希釈したＧｅｌｔｒｅｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ１４１３２０２）上のＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）（Ｅ８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ１５１７００１）培地で、最初に維持し、短時間（３分）の０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃２５３０００５４）処置、その後、剥離（コロニー構造を維持するために）、そして新たなＥ８培地での２回の洗浄を使用して、３〜４日ごとにクラスターとして継代させた。細胞を、２４時間、１０μＭ  Ｙ−２７６３２で再度播種した。３０〜５５継代の間の細胞を使用し、異常な核型は見られなかった。
【０１１７】
図５Ｄは、使用したロット（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＳｔｅｍＣｅｌｌ，Ｉｎｃ）に依存して細胞１０，５００個／ｃｍ２の密度で播種してＭＥＦ上で維持したＷＡ０９細胞を使用した。ＰＳＣに、その週の間、毎日、ｈＰＳＣ培地［ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％ノックアウト血清代替物（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃１０８２８０２８）、３．５ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃２５０３００８１）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ  ＮＥＡＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃１１１４００５０）、５５μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃２１９８５０２３）、および６ｎｇ／ｍＬの塩基性ｒｈＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃２３３−ＦＢ）で構成されたもの］を供給した。金曜日には、月曜日の供給まで培養物を静的状態で維持できるようにするために、ＦＧＦ２を徐放するＳｔｅｍＢｅａｄｓ（ＳｔｅｍＣｕｌｔｕｒｅｓ，Ｉｎｃ．、ＳＢ５００）を補給した培地を細胞に供給することが多かった。ｈＰＳＣのフィーダーベースの培養についての作業プロトコールは、http://stemcells.mskcc.orgで入手することができる。
【０１１８】
ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞の産生
ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞バンクを生成するために、Ｅ８培地で成長させたＰＳＣを３７℃インキュベーターにおいて３０分間、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃ＡＴ−１０４）で解離させた。細胞を２容量（細胞：Ａｃｃｕｔａｓｅに対して）のＥ８で洗浄し、遠心分離して細胞をペレットにした（２００×ｇ、室温、５分間）。上清を吸引し、すすぎを繰り返した。最後に、細胞をＦｒｅＳＲ−Ｓ（商標）（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃０５８５９）に別段の指示がない限り細胞１０００万個／ｍＬで再浮遊させた。ＦｒｅＳＲ−Ｓ：細胞混合物を予冷したクライオチューブに添加し、その後、次のプログラムを使用して速度制御フリーザーで凍結させた：
ステップ１：４℃で待機；ステップ２：−４℃に１．２℃／分（サンプル）；ステップ３：−４０℃に２５℃／分（チャンバー）；ステップ４：−１２℃に１０℃／分（チャンバー）；ステップ５：−４０℃に１．０℃／分（チャンバー）；ステップ６：−９０℃に１０℃／分（チャンバー）；ステップ７：−９０℃で待機。速度制御フリーザーが−９０℃に達したら迅速にクライオチューブを液体窒素タンクに移した。
【０１１９】
図５Ｂおよび５Ｃで使用した他の凍結保存用培地は、ＰＳＣ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ２６４４６０１）、Ｓｔｅｍ−ＣｅｌｌＢａｎｋｅｒ  ＧＭＰ（ＡＭＳＢＩＯ、＃１１８９０）、およびＥ８培地中の１０％ＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、＃２６５０）である。図５Ｃで使用した従来の凍結は、−８０℃の細胞凍結容器内でバイアルを２４時間保管した後、液体窒素タンクに移すことと定義する。
【０１２０】
幹細胞マーカーのフローサイトメトリーおよび免疫蛍光分析
Ｈｕｍａｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５６０４６１）およびＨｕｍａｎ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５６０５８９）を製造業者のプロトコール通りに使用して、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩで幹細胞マーカーを定量した。免疫蛍光染色のために、次の一次抗体を使用した：ＮＡＮＯＧ（１：２００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５６０４８２）；ＯＣＴ４（１：２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃ｓｃ−９０８１）；ＳＯＸ２（１：１００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＡＦ２０１８）。適切なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ結合二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を１：４００で使用した。
【０１２１】
ＰｌｕｒｉＴｅｓｔアッセイ
ＰｌｕｒｉＴｅｓｔは、全ゲノムトランスクリプトームマイクロアレイデータ分析に基づく。簡単に言うと、以前に記載された手順（Mullerら、２０１１年；Williamsら、２０１１年；Mullerら、２０１２年）と同じ手順を利用した。Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ単離キットを製造業者（Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）の説明書に従って使用して、培養条件（対照およびＣｒｙｏＰａｕｓｅ、１サンプル当たり細胞１×１０６個）ごとに２回の生物学的反復実験からＲＮＡを単離した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨＴ１２ｖ４マイクロアレイを製造業者の説明書に従ってハイブリダイズした（Mullerら、２０１１年；Williamsら、２０１１年；Mullerら、２０１２年）。得られた生データをＲ／Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｌｕｍｉ−ｐａｃｋａｇｅ（Duら、２００８年；Linら、２００８年；Mullerら、２０１１年）で処理した。スキャナー技術の変化およびＩｌｌｕｍｉｎａによるハイブリダイゼーションプロトコールの改良のため、近年のＰｌｕｒｉＴｅｓｔの結果に、より低い多能性およびより高い新規性スコアを示す傾向があることは、認知されている（Ｂｅｒｎｈａｒｄ  Ｓｃｈｕｌｄｔ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｓｃｈｌｅｓｗｉｇ−Ｈｏｌｓｔｅｉｎ、Ｋｉｅｌ、Ｇｅｒｍａｎｙ、私信）。この技術的偏りを考慮したとしても、両方（対照サンプルおよびＣｒｙｏＰａｕｓｅサンプル）は、両方の生物学的反復実験で経験的多能性およびより高い新規性スコア閾値に合格する。
【０１２２】
縮小表示バイサルファイトシークエンシング
シークエンシングライブラリー作製のために、１μｇの高品質ゲノムＤＮＡを、ＮＥＸＴＦｌｅｘ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏｏ、＃５１１９−０１）で、製造業者の説明書に従って使用した。非メチル化ラムダＤＮＡを１％で加えて、バイサルファイト（bisulfate）転化レベルを評定した。１２サイクルのＰＣＲを行った。サンプルをＨｉｓｅｑ  ２５００  Ｒａｐｉｄ  ｍｏｄｅ  Ｐａｉｒｅｄ  Ｅｎｄ  １２５にかけ、サンプルごとに平均１億４０００万リードを生成した。
【０１２３】
ＲＲＢＳ  ＤＮＡメチル化分析
ＦＡＳＴＱファイルをｂｃｌ２ｆａｓｔｑ（Ｖ２．１７）により生成し、Ｉｌｌｕｍｉｎａのｃｈａｓｔｉｔｙ  ｆｉｌｔｅｒに基づいてパスフィルターリードについてフィルタリングした。シークエンシングアダプターを、ＦＬＥＸＢＡＲ（Ｖ２．４）（Dodtら、２０１２年）、参照ヒトゲノムｈｇ１９とのＢｉｓｍａｒｋ（Ｖ０．１４．４）（Kruegerら、２０１１年）およびＢｏｗｔｉｅ２（Ｖ２．２．５）（Langmeadら、２０１２年）を使用するゲノムアラインメント、によりトリミングし、塩基ごとのＣｐＧメチル化指標をカスタムＰＥＲＬスクリプト（Garrett-Bakelmannら、２０１５年）で計算した。
【０１２４】
γＨ２ＡＸ定量的免疫蛍光検査
Ｇｅｌｔｒｅｘ被覆皿の上の１０μＭ  Ｙ−２７６３２を含むＥ８培地に単一ＰＳＣを細胞１００，０００個／ｃｍ２で播種した。２４時間後、細胞をＥ８中０．５μＭカンプトテシン（Ｓｉｇｍａ、＃Ｃ９９１１）で１時間、３７℃で処置した。次いで、細胞をホスホヒストンＨ２Ａ．Ｘ（１：３００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、＃０５−６３６）に対して染色し、適切なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ結合二次抗体を１：４００で使用した。画像を獲得し、ｅＨａｒｍｏｎｙソフトウェアを使用してＰｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｏｐｅｒｅｔｔａで分析した。
【０１２５】
神経誘導
Chambersら、２００９年の派生物を使用した。神経誘導前に、Ｇｅｌｔｒｅｘ被覆皿の上の１０μＭ  Ｙ−２７６３２を含むＥ８培地（１：３０）に単一ＰＳＣを細胞２００，０００個（新鮮対照）または４００，０００個／ｃｍ２（ＣｒｙｏＰａｕｓｅ）で播種した。２４時間後、培地を除去し、１００ｎＭ  ＬＤＮ１８９１９３および１０μＭ  ＳＢ４３１５４２（ＬＳＢ）を含むＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（商標）（Ｅ６）培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃Ａ１５１６４０１）を添加した。細胞に３日間、Ｅ６培地＋ＬＳＢを供給した後、３回の供給の間に段階的にＮ２培地（下記参照）に移行し、２日ごとに新たな培地と交換した。神経変換効率をＯＣＴ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５６０１８６）およびＰＡＸ６（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５６２２４９）についてのフロー分析により定量した。ＯＣＴ４およびＰＡＸ６（１：２００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５６１４６２）対する抗体を使用して、培養物を染色もした。Kriksら、２０１１年の改良版を使用して、中脳ドーパミンニューロンを作製した。簡単に言うと、上記の通りＧｅｌｔｒｅｘ上で成長させたＷＡ０９細胞を、ＳＨＨおよびＷＮＴシグナルでの二重ＳＭＡＤ阻害に付した後、最終的に回収した。回収後、Kriksら、２０１１年（準備中の原稿）の中で見つけられる同じ増殖因子および小分子を含有する中脳ドーパミン支持培地を添加した。チロシンヒドロキシラーゼ（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃Ｐ２１９６２）およびＦＯＸＡ２（１：２００、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＡＦ２４００）に対する抗体を使用して、培養物を染色した。適切なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ結合二次抗体を１：４００で使用した。
０日目：Ｅ６  ＋  １００ｎＭ  ＬＤＮ１８９１９３および１０μＭ  ＳＢ４３１５４２
１日目：Ｅ６  ＋  １００ｎＭ  ＬＤＮ１８９１９３および１０μＭ  ＳＢ４３１５４２
２日目：Ｅ６  ＋  １００ｎＭ  ＬＤＮ１８９１９３および１０μＭ  ＳＢ４３１５４２
４日目：３：１  Ｅ６対Ｎ２  ＋  １００ｎＭ  ＬＤＮ１８９１９３および１０μＭ  ＳＢ４３１５４２
６日目：１：１  Ｅ６対Ｎ２  ＋  １００ｎＭ  ＬＤＮ１８９１９３および１０μＭ  ＳＢ４３１５４２
８日目：１：３  Ｅ６対Ｎ２  ＋  １００ｎＭ  ＬＤＮ１８９１９３および１０μＭ  ＳＢ４３１５４２
１０日目：Ｎ２  ＋  １００ｎＭ  ＬＤＮ１８９１９３および１０μＭ  ＳＢ４３１５４２
【０１２６】
Ｎ２培地は、１ｇの重炭酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｓ５７６１）と、０．７８ｇのグルコース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｇ７０２１）と、０．５ｍＬの２−メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃２１９８５０２３）とを含む５００ｍＬのＤＭＥＭ／Ｆ１２を含有する。培地を滅菌濾過（２２μｍ）した後、５ｍＬのＮ２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｂ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃０７１５６）および０．０２ｎＭプロゲステロン（１００％エタノールに溶解された１ｍＭストックからの１０μＬ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｐ８７８３）を添加した。
【０１２７】
中内胚葉誘導
単一ＰＳＣを上記の通り播種した。２４時間後、培地を除去し、５μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  ＃０４−０００４−１０）を含むＥ６培地を添加して、中内胚葉を生じさせた（Lamら、２０１４年）。５μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１を含むＥ６を、最長４日間、２４時間ごとに交換した。変換効率をＯＣＴ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、＃５６０１８６）およびブラキウリ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＩＣ２０８５Ａ）についてのフロー分析により定量した。ＯＣＴ４およびブラキウリに対する抗体（１：４０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＡＦ２０８５）を使用して培養物を染色し、適切なＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ結合二次抗体を１：４００で使用した。
【０１２８】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅセット（Ｑｉａｇｅｎ、＃７９２５４）およびＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃７４１０６）を使用して、ＲＮＡを細胞ペレットから単離した。ＲＴ２  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、＃３３０４０４）およびＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ＰＣＲマシンを使用して、ＲＮＡサンプルの逆転写およびｃＤＮＡ合成を行った。ＲＴ２  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｑｉａｇｅｎ、＃３３０５０３）を使用して、ｑＰＣＲ分析用のｃＤＮＡサンプルを調製した。次のＱｉａｇｅｎプライマーを含有するカスタムＲＴ２  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  ＰＣＲ  Ａｒｒａｙにサンプルをかけた：ＯＴＸ２（ＰＰＨ１６１５１）、ＦＯＸＡ２（ＰＰＨ００９７６）、ＣＯＲＩＮ（ＰＰＨ５８０２９）、ＳＨＨ（ＰＰＨ０２４０５）、ＬＭＸ１Ａ（ＰＰＨ２２２１９）、ＬＭＸ１Ｂ（ＰＰＨ１２２４０）、ＥＮ１（ＰＰＨ００９８６）、ＮＲ４Ａ２（ＰＰＨ０２０８２）、ＮＥＵＲＯＧ２（ＰＰＨ１１５６４）、ＡＳＣＬ１（ＰＰＨ０７０９０）、ＴＨ（ＰＰＨ０２０６２）、ＣＨＲＮＢ３（ＰＰＨ０１８９１）、ＤＤＣ（ＰＰＨ１９３７４）、ＣＣＫ（ＰＰＨ２２２７２）、ＤＲＤ２（ＰＰＨ０１８７６）、ＰＩＴＸ３（ＰＰＨ１２３８０）、ＳＬＣ１８Ａ（ＰＰＨ０１４３７）、ＫＣＮＪ６（ＰＰＨ０１４１５）、ＳＬＣ１７Ａ６（ＰＰＨ１４８８８）、ＰＯＵ４Ｆ１（ＰＰＨ１４４８５）、ＮＫＸ６−１（ＰＰＨ１７３４０）、ＳＩＭ１（ＰＰＨ１１０１１）、ＮＫＸ２−１（ＰＰＨ００２４６）、ＦＥＶ（ＰＰＨ０２０３３）、ＮＫＸ２−２（ＰＰＨ０１５７４）、ＧＢＸ２（ＰＰＨ１３９００）、ＤＢＨ（ＰＰＨ０２０６６）、ＩＳＬ１（ＰＰＨ０２４６１）、ＦＯＸＧ１（ＰＰＨ０１９７３）、ＨＯＸＢ２（ＰＰＨ０５８０４）、ＤＬＸ２（ＰＰＨ０１９４３）、ＧＡＴＡ３（ＰＰＨ０２１４３）、ＰＨＯＸ２Ａ（ＰＰＨ１５６３０）、ＰＨＯＸ２Ｂ（ＰＰＨ１０３６１）、ＰＡＸ６（ＰＰＨ０２５９８）、ＦＡＢＰ７（ＰＰＨ０２４３８）、ＭＡＰ２（ＰＰＨ０２４１９）、ＰＯＵ５Ｆ１（ＰＰＨ０２３９４）、ＰＲＲ１６（ＰＰＨ１３０５７）、ＫＲＴ１９（ＰＰＨ０１００４）、ＭＫＩ６７（ＰＰＨ０１０２４）、ＴＯＰ２Ａ（ＰＰＨ０１５２０）、ＧＦＡＰ（ＰＰＨ０２４０８）、ＡＣＴＢ（ＰＰＨ０００７３）、ＴＢＰ（ＰＰＨ０１０９１）、ＨＧＤＣ（ＰＰＨ６５８３５）、ＲＴＣ（ＰＰＸ６３３４０）およびＰＰＣ（ＰＰＸ６３３３９）。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｃ１０００  Ｔｏｕｃｈ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＣＦＸ９６  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、＃１８５５１９５）を使用して、分析を行った。
【０１２９】
奇形腫
ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）をｉｎ  ｖｉｖｏ研究に使用し、ＭＳＫＣＣ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ＣｏｍｍｉｔｔｅｅおよびＲｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒにより承認されたガイドラインに従ってケアした。８週齢雌マウスの側腹部に、３００万個のＨ９細胞を、１：２でＨＥＰＥＳ緩衝ＨＢＳＳに混合したＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とともに皮下注射した。マウスを罹患／死亡の兆候について毎日観察し、体重を少なくとも週に２回評定した。ノギスを使用して週に２回、腫瘍を測定し、長さ×幅２×０．５２という式を使用して体積を計算した。研究の最後に、腫瘍を１０％ホルマリンで固定し、処理し、パラフィンに包埋し、切片を作製し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。顕微鏡スライドを病理医が再調査した。
【０１３０】
セルファクトリーの使用
ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理の前に、Ｎｕｎｃ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｆａｃｔｏｒｙ（商標）Ｓｙｓｔｅｍ、４トレイ層（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃１４０００４）を使用して、大型バンクを拡大させた。継代後の最初の２日間、細胞に５００ｍＬのＥ８培地を供給し、３日目に６００ｍＬを供給した。単一細胞浮遊液を生成するために、１４０ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅを３０分間、３７℃で添加し、次いで、トレイを１００ｍＬの培地で洗浄した。
【０１３１】
ヌクレオフェクション／ｉＣＲＩＳＰＲ
ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞にヌクレオフェクトするために、Ａｍａｘａ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）Ｋｉｔ  Ｖ（Ｌｏｎｚａ、＃ＶＣＡ−１００３）を使用した。ＷＡ０９  ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞を解凍し、洗浄した。１００μＬのＳｏｌｕｔｉｏｎ  Ｖを２２．２μＬのＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １と混合し、５００万個のＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞を１００μＬのこの混合物に添加した。１０μｌのＧＦＰ対照プラスミドを反応物に添加した後、プログラムＢ−０１６（Ｌｏｎｚａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）２ｂデバイス）を用いてヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクト細胞を、上記の通りＧｅｌｔｒｅｘ上の１０μＭ  Ｙ−２７６３２を含むＥ８に添加した。生細胞を図３Ａおよび４Ｂのために撮像し、Ａｃｃｕｔａｓｅでの培養物の処置、洗浄、および０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳへの再浮遊の後、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩＩで蛍光を測定することにより、蛍光を発する細胞の数を判定した。フローデータをＦｌｏｗＪｏで分析し、免疫蛍光画像をＡｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐで補正した。
【０１３２】
ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ｉＣＲＩＳＰＲ遺伝子改変を行うために、ＷＡ０１（Ｈ１）ｉＣＲＩＳＰＲ細胞を上記の通り拡大させた後、２４時間のＤｏｘ処置を行って、Ｃａｓ９を誘導した（Gonzalezら、２０１４年）。Ｃａｓ９誘導細胞を回収し、上記の通り洗浄し、その後、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理した。ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞を解凍し、洗浄した後、ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）から購入した２００ｎｇのＨＰＲＴガイドＲＮＡを用いてヌクレオフェクションを行った。ガイド配列は、ＣＡＴＴＴＣＴＣＡＧＴＣＣＴＡＡＡＣＡである。
【０１３３】
センダイ形質導入
ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９細胞を解凍し、洗浄し、１０μＭ  Ｙ−２７６３２を補給したＥ８培地に再浮遊させ、ＥｍＧＦＰを発現するセンダイウイルスベクター（ＣｙｔｏＴｕｎｅ（商標）ＥｍＧＦＰ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ａ１６５１９）を感染多重度５で添加した。形質導入ＣＰ細胞をＥ８に再度播種して拡大させた。形質導入細胞を少なくとも１５継代にわたって拡大させることができた。
【０１３４】
参考文献
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【０１３５】
（実施例２）
解離され凍結保存された多能性幹細胞は、非凍結保存細胞より高レベルで外来性核酸を発現する。
ＷＡ０９ヒト胚性幹細胞を凍結保存し、解凍し、解凍後直ちにそれらの細胞に、実施例１により説明したように３．４ｋｂ  ＧＦＰプラスミドをヌクレオフェクトした。凍結保存しなかった新鮮非凍結対照ＷＡ０９細胞に同様にヌクレオフェクトし、ヌクレオフェクションの２４時間後にフローサイトメトリーを使用してＧＦＰ発現を分析した。非トランスフェクトＷＡ０９細胞も陰性対照として使用した。図８Ａにより示される通り、ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理細胞は、異なる小分子ＤＮＡ取込みパターンを示した：全体としては、小プラスミドからＧＦＰを発現した細胞は若干少なかったが、より明るく発現した。これは、ＣｒｙｏＰａｕｓｅによって大量のＤＮＡを取り込む細胞の能力がより高くなることを示唆する。細胞の全プール内のより小さい構築物に関するより低いパーセンテージが、ＤＮＡ力価測定の結果でありうる：すなわち、大量のプラスミドを取り込む細胞は、より少ないＤＮＡを通常は取り込むであろう集団内の細胞のためのものをほとんど残さない。
【０１３６】
ＷＡ０９  ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理および新鮮非凍結細胞に、ｍＣｈｅｒｒｙを発現する、より大きい９．３ｋｂ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラスミドもヌクレオフェクトした。細胞に２．５μｇ、５μｇ、７．５μｇ、１０μｇまたは１２．５μｇのプラスミドをヌクレオフェクトした。ＣｒｙｏＰａｕｓｅおよび新鮮非凍結条件下で２．５μｇのプラスミドを用いて、第２のヌクレオフェクション溶液であるＨＳＣ２も試験した。図８Ｂおよび８Ｃにより示される通り、ＨＳＣ緩衝液ＣｒｙｏＰａｕｓｅ処理ＷＡ０９細胞は、すべての濃度で、新鮮非凍結細胞と比較して高い発現レベルを示した。
【０１３７】
本発明で開示される主題およびその利点を詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲によって定義される通りの本発明の趣旨および精神から逸脱することなく、ここに様々な変化、置換および変更を加えることができることは、理解されるはずである。さらに、本願の範囲は、本明細書に記載するプロセス、機械、製造（物）、物の組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図したものではない。本発明で開示される主題の開示から当業者には容易に理解されるであろうが、本明細書に記載する対応する実施形態と実質的に同じ機能を果たすまたは実質的に同じ結果を達成する、現在存在するまたは後に開発されるプロセス、機械、製造（物）、物の組成物、手段、方法またはステップを、本発明で開示される主題に従って用いることができる。したがって、添付の特許請求の範囲は、それらの範囲内にそのようなプロセス、機械、製造（物）、物の組成物、手段、方法またはステップを含むことを意図したものである。
【０１３８】
特許、特許出願、公表文献、製品説明およびプロトコールを本願の至る所に引用しており、それらの開示は、それら全体が参照によりあらゆる目的で本明細書に組み入れられる。
【図１Ａ−１Ｅ】
2020517281.tif 000003
【図１Ｆ】
2020517281.tif 000004
【図１Ｇ−１Ｈ】
2020517281.tif 000005
【図１Ｉ−１Ｌ】
2020517281.tif 000006
【図２Ａ−２Ｊ】
2020517281.tif 000007
【図２Ｋ−２Ｌ】
2020517281.tif 000008
【図２Ｍ】
2020517281.tif 000009
【図３Ａ−３Ｅ】
2020517281.tif 000010
【図４Ａ−４Ｃ】
2020517281.tif 000011
【図５Ａ−５Ｆ】
2020517281.tif 000012
【図６】
2020517281.tif 000013
【図７】
2020517281.tif 000014
【図８Ａ】
2020517281.tif 000015
【図８Ｂ】
2020517281.tif 000016
【図８Ｃ】
2020517281.tif 000017
【国際調査報告】
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2020517281.tif 000019
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