(57)【要約】  ある実施形態において、本開示は、細胞のゲノムにおいて、相同組換え修復（ＨＤＲ）の効率を上昇させるための方法であって：（ａ）細胞に、（ｉ）ヌクレアーゼ、および（ｉｉ）ゲノムに挿入されるべき修飾配列を含むドナー核酸を、導入すること、および、（ｂ）細胞を、３７℃から、より低温への温度シフトに供することを含み、ヌクレアーゼが、細胞において切断部位でゲノムを切断し、ドナー核酸が、上昇したＨＤＲ率によって、修飾配列によるゲノム配列の修復を導く方法を、提供する。
2020510443.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のゲノムにおいて、相同組換え修復（ＨＤＲ）の効率を上昇させるための方法であって：
（ａ）細胞に：（ｉ）ヌクレアーゼ；および（ｉｉ）ゲノムに挿入されるべき修飾配列を含むドナー核酸を、導入すること、および
（ｂ）細胞を、３７℃から、より低温への温度シフトに供すること
を含み、
ヌクレアーゼが、細胞において切断部位でゲノムを切断し、ドナー核酸が、上昇したＨＤＲ率によって、修飾配列によるゲノム配列の修復を導く、方法。
【請求項２】
該より低温が、２８℃〜３５℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該より低温が、３０℃〜３３℃の間である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞を、少なくとも２４時間、該より低温で増殖させる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
細胞が、哺乳類細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
細胞が、幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、または初代細胞から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ヌクレアーゼが、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼから選択されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼが、ｓｇＲＮＡと共に、ＤＮＡ形式またはＲＮＡ形式のいずれかで、細胞に導入される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ｓｇＲＮＡが、合成であり、かつ、化学的に修飾されている、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡが細胞に導入される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰが細胞に導入される、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡが細胞に導入される、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
ドナー核酸が、対称性のホモロジーアームを含有し、ヌクレアーゼにより切断されるゲノム内のＤＮＡ鎖と相補的である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
相同組換え修復（ＨＤＲ）率が、少なくとも１．５倍上昇している、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１に記載の方法により生産された細胞。
【請求項１７】
請求項１６に記載の細胞を含む、医薬組成物。
【請求項１８】
目的のたんぱく質を、それを必要とする対象に提供する方法であって：
（ａ）請求項１に記載の方法に従い、目的のたんぱく質をコードするドナー核酸を、細胞に導入すること；および
（ｂ）該細胞を対象に導入して、目的のたんぱく質を対象において発現させること、
を含む、方法。
【請求項１９】
細胞のゲノムにおいて、相同組換え修復（ＨＤＲ）の効率を上昇させるための方法であって：細胞に、（ｉ）ヌクレアーゼ、および（ｉｉ）対称性のホモロジーアームを含み、ヌクレアーゼにより切断されるゲノム内のＤＮＡ鎖と相補的であり、切断部位から１０塩基対を超えて離れてゲノムに挿入されるべき修飾配列を含むドナー核酸を、導入することを含み、ヌクレアーゼが、細胞において切断部位でゲノムを切断し、ドナー核酸が、上昇したＨＤＲ率によって、修飾配列によるゲノム配列の修復を導く、方法。
【請求項２０】
さらに、細胞を、３７℃から、より低温への温度シフトに供することを含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１６年１２月２０日に出願された、米国仮特許出願第６２／４３７，０４２号の利益を主張するものであり、該仮出願は、あらゆる目的のために、その全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
ゲノム配列のＤＮＡ標的切断についての様々な方法が、当業界で記載されている。これらの標的切断事象を用いて、標的突然変異誘発を誘導し、細胞ＤＮＡ配列の標的欠失を誘導し、所定の染色体遺伝子座での標的組換えを促進することができる。これらの方法は、しばしば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ、ＨＤＲ）などのエラー発生プロセスによる切断の修復が、遺伝子の不活性化または目的の外来性配列の挿入をもたらし得るように、標的ＤＮＡ配列中に２本鎖切断（ＤＳＢ）またはニックを誘導するための、操作された切断システムの使用を包含する。特異的切断をガイドするように操作されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と共にＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いて、操作されたＺｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）などの、特異的ヌクレアーゼを使用することによって切断が起こり得る。
【０００３】
ＨＤＲプロセスによる特異的標的位置でのゲノム修飾の効率は、細胞内では比較的低い。従って、細胞ゲノムにおいて、相同組換え修復（ＨＤＲ）の効率を上昇させるための方法が、依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本発明の概要
ある実施形態において、本発明は、細胞のゲノムにおいて、相同組換え修復（ＨＤＲ）の効率を上昇させるための方法であって：（ａ）細胞に、（ｉ）ヌクレアーゼ、および（ｉｉ）ゲノムに挿入されるべき修飾配列を含むドナー核酸を、導入すること、および、（ｂ）細胞を、３７℃から、より低温への温度シフトに供することを含み、ヌクレアーゼが、細胞において切断部位でゲノムを切断し、ドナー核酸が、上昇したＨＤＲ率によって、修飾配列によるゲノム配列の修復を導く方法を、提供する。例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）率は、少なくとも１．５倍上昇している。場合により、相同組換え修復（ＨＤＲ）率は、少なくとも２倍上昇している。
【０００５】
ある局面において、該より低温は、２８℃〜３２℃の間である。場合により、該より低温は、３０℃〜３３℃の間である。例えば、細胞を、少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間、例えば、１〜５日間（１日、２日、３日、４日、または５日間）、該より低温で増殖させる。場合により、細胞を、温度シフト後に３７℃で増殖させる。
【０００６】
ある局面において、細胞は、哺乳類細胞などの、真核細胞である。特定の実施形態において、細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの、幹細胞である。別の特定の実施形態において、細胞は、初代細胞である。
【０００７】
ある局面において、本発明で用いられるヌクレアーゼには、全てのＤＮＡ配列特異的エンドヌクレアーゼ、またはＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。場合により、ヌクレアーゼは、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼから選択されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。例えば、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。例示すると、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ＤＮＡ形式（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）で、または、ＲＮＡ形式（例えば、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰまたはｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡ）で、ｓｇＲＮＡと共に細胞に導入される。場合により、ｓｇＲＮＡは、合成であり、かつ、化学的に修飾されている。ある局面において、ドナー核酸は、対称性のホモロジーアームを含有する。場合により、ドナー核酸は、ヌクレアーゼによって切断されるゲノム内のＤＮＡ鎖と相補的である。
【０００８】
ある局面において、本発明で用いられるヌクレアーゼは、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。他のある局面において、本発明で用いられるヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。
【０００９】
ある実施形態において、本発明は、上記の方法により生産された単離細胞を提供する。
【００１０】
ある実施形態において、本発明は、上記の方法により生産された単離細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
ある実施形態において、本発明は、目的のたんぱく質を、それを必要とする対象に提供する方法であって：（ａ）目的のたんぱく質をコードするドナー核酸を、上記の方法に従い、細胞に導入すること；および（ｂ）該細胞を対象に導入して、目的のたんぱく質を対象において発現させること、を含む方法を、提供する。
【００１２】
ある実施形態において、本発明は、細胞のゲノムにおいて、相同組換え修復（ＨＤＲ）の効率を上昇させるための方法であって：細胞に、（ｉ）ヌクレアーゼ；および（ｉｉ）対称性のホモロジーアームを含み、ヌクレアーゼにより切断されるゲノム内のＤＮＡ鎖と相補的であり、切断部位から１０塩基対を超えて離れてゲノムに挿入されるべき修飾配列を含むドナー核酸を、導入することを含み、ヌクレアーゼが、細胞において切断部位でゲノムを切断し、ドナー核酸が、上昇したＨＤＲ率によって、修飾配列によるゲノム配列の修復を導く方法を、提供する。例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）率が、少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍上昇している。場合により、本方法はさらに、細胞を、３７℃から、より低温（例えば、２８℃〜３５℃の間、または３０℃〜３３℃の間）への温度シフトに供することを含む。例えば、細胞を、少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間、例えば、１〜５日間（１日、２日、３日、４日、または５日間）、該より低温で増殖させる。場合により、細胞を、温度シフト後に３７℃で増殖させる。ある局面において、細胞は、哺乳類細胞などの、真核細胞である。特定の実施形態において、細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの、幹細胞である。別の特定の実施形態において、細胞は、初代細胞である。ある局面において、本発明で用いられるヌクレアーゼは、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼから選択されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。例えば、ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。例示すると、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ＤＮＡ形式（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）で、または、ＲＮＡ形式（例えば、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰまたはｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡ）で、ｓｇＲＮＡと共に細胞に導入される。ある局面において、本発明で用いられるヌクレアーゼは、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。他のある局面において、本発明で用いられるヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１ａ〜図１ｂは、ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子座での遺伝子編集および変異検出のための、１本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナーデザイン、ｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲプローブおよびプライマーデザインを示している。（ａ）２つのガイドＲＮＡ（ＣＡＭＫ−ＣＲ１およびＣＡＭＫ−ＣＲ２）を、ＣＡＭＫ２Ｄ  Ｅｘｏｎ２を特異的に標的とするようにデザインし、ＣＡＭＫ−ＣＲ１およびＣＡＭＫ−ＣＲ２は１４ヌクレオチド重複しており、ＤＮＡを切断してＨＤＲにより同じ配列変更を導入するようにデザインした。（ｂ）２つのｓｓＯＤＮ  ＨＤＲドナー（Ｃ−ＣＲ２およびＣ−ＣＲ２−Ａｓｙｍ）を、キナーゼノックアウトＫ４３Ｒ変異（ＡＡＡからＡＧＧ）および４つのサイレント変異を、ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子座のＥｘｏｎ２に導入するように、デザインした。ｓｓＯＤＮドナーＣ−ＣＲ２は、（＋）鎖のＨＤＲドナーであり、目的の変異の両側にバランスの取れたホモロジーアームを持つ（それぞれ５’−７３ｎｔおよび３’−７２ｎｔ）。Ｃ−ＣＲ２−Ａｓｙｍは、（−）鎖のＨＤＲドナーであり、長さの異なるホモロジーアームを有し（それぞれ５’−９３ｎｔおよび３’−３６ｎｔ）、ガイドＲＮＡ非標的鎖に相補的である。後の再切断を防ぐために、ドナーオリゴＣ−ＣＲ２とＣ−ＣＲ２−Ａｓｙｍの両方が、ガイドＣＡＭＫ−ＣＲ１認識部位内に３つのサイレント変異を、かつＰＡＭ部位内に１つのサイレント変異を導入する。Ｃ−ＣＲ２およびＣ−ＣＲ２−Ａｓｙｍが、ガイドＣＡＭＫ−ＣＲ２認識部位内に、４つのサイレント変異を導入する。一対のプライマー、およびＶｉｃまたはＦａｍフルオロフォアをコンジュゲートした対立遺伝子特異的プローブもまた、未変更の野生型対立遺伝子および変異配列変換事象をそれぞれ検出するようにデザインした。適切な遺伝子座が確実に増幅されるように、フォワードプライマーは、ドナー配列内でアニールするようにデザインし、一方リバースプライマーは、ドナー配列の外側でアニールするようにデザインした。
【００１４】
【図２】図２ａ〜図２ｃは、ｍｃ−ｉＰＳＣのＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子座でのＨＤＲを実行するための、１本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナーおよびｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡの、同時送達のための、最適化された方法を示している。ＥｄｉｔＰｒｏ（登録商標）ＲＮＡトランスフェクション試薬を用いて、ｓｇＲＮＡ  ＣＡＭＫ−ＣＲ１またはＣＡＭＫ−ＣＲ２、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびｓｓＯＤＮドナーＣ−ＣＲ２を、ｍｃ−ｉＰＳＣに同時トランスフェクトした。（ａ）トランスフェクト細胞由来の野生型対立遺伝子および変異対立遺伝子のパーセントを、野生型対立遺伝子特異的蛍光プローブ（ＶＩＣ）および変異対立遺伝子特異的蛍光プローブ（ＦＡＭ）を用いて、ｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって検出した。サンプル中の各ドロップレットの蛍光強度をドロップレット数に対してプロットする。ピンクの閾値ラインを超える蛍光強度を有するドロップレットを、標的対立遺伝子についてポジティブとして、カウントする。下図（緑）は野生型対立遺伝子のドロップレットを表し、上図（青）はＨＤＲが生じた対立遺伝子を表す。提示したデータは、最良の濃度１０ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮで、２つのｓｇＲＮＡを用いた、１回の代表的な実験によるものである。（ｂ）変異対立遺伝子頻度の定量。データは、４回の独立した実験からの平均±ＳＥＭとして提示した。ｓｇＲＮＡ  ＣＡＭＫ−ＣＲ２は、全対立遺伝子の１５％超で、一貫してＨＤＲをもたらした。（ｃ）ｄｄＰＣＲ実験に用いたのと同じｇＲＮＡおよびドナーを用いた、次世代シーケンシングによる目的のヌクレオチド変化の定量。各バーは、ドナーオリゴに含まれる、６つのヌクレオチド変化のうちの１つを表す。データは、完全な配列変換が、標的領域にわたって、かつ、ｄｄＰＣＲの結果と一致した頻度で起こったことを示している。ｄｄＰＣＲによって直接測定されない２つのＡからＧへの変化もまた、ＣＲＩＳＰＲ切断部位により近いＡからＧへの変化と比較してより低い頻度ではあるが、組み込まれていた。提示したデータは、４回の独立した実験からの、正確な各ゲノム座標における目的の塩基変化の平均パーセントである。
【００１５】
【図３】図３ａ〜図３ｂは、ＮＧＳによって決定される、ｍｃ−ｉＰＳＣのＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子座でのＨＤＲ効率に対する、「低温ショック」およびｓｓＯＤＮ  ＨＤＲドナーデザインの効果を示している。ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子座でのＨＤＲを達成するために、様々な量のｓｓＯＤＮ  Ｃ−ＣＲ２またはＣ−ＣＲ２−Ａｓｙｍを、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ  ＣＡＭＫ−ＣＲ１またはＣＡＭＫ−ＣＲ２と共に、ｍｃ−ｉＰＳＣに送達した。実験は、「材料および方法」に記載されているように、２４時間間隔での様々な温度で実施した：ＰＬ１：３７℃−３７℃−３７℃、ＰＬ２：３７℃−３２℃−３７℃、ＰＬ３：３７℃−３２℃−３２℃。（ａ）各処置（Ｃ−ＴＲ２またはＣ−ＴＲ２−Ａｓｙｍを伴うＣＡＭＫ−ＣＲ１、Ｃ−ＴＲ２またはＣ−ＴＲ２−Ａｓｙｍを伴うＣＡＭＫ−ＣＲ２）について、１０ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮ  ＨＤＲドナーを使用したＨＤＲ事象を、「材料および方法」に記載されているようにＮＧＳによって決定した。提示したデータは、ＨＤＲ事象の平均パーセント（Ｃ−ＣＲ２：３回の独立した実験からの８回の反復試験；Ｃ−ＣＲ２−Ａｓｙｍ：２回の独立した実験からの６回の反復試験）である。ＨＤＲのタイプを、目的の変異の領域の周辺の得られた配列に基づいて、３つのグループに分類した。完全ＨＤＲ：全ての目的の塩基変化が、再編集されたインデルを伴わず存在する。編集ＨＤＲ：１つ以上の目的の塩基変化が、再編集されたインデルの存在と共に、存在する。部分的ＨＤＲ：全部ではないがいくつかの目的の塩基変化が存在し、インデルを伴わない。データは、細胞を「低温ショックする」ことによってＨＤＲの増加が達成できること、および増加の大部分が「完全ＨＤＲ」カテゴリーであることを示している。各ｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮ処置についての、３つの温度条件間の、ＨＤＲ全体の効率の違いの有意性を、一元配置ＡＮＯＶＡにより解析した（全てのｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮ処置について一元配置ＡＮＯＶＡ  Ｐ＜０．０００１、フォローアップのダネット多重比較のＰ値は図に示している）。３０ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮおよびオリゴなしの処置由来のＨＤＲは、表４に示した。（ｂ）各処置（Ｃ−ＴＲ２またはＣ−ＴＲ２−Ａｓｙｍを伴うＣＡＭＫ−ＣＲ１、Ｃ−ＴＲ２またはＣ−ＴＲ２−Ａｓｙｍを伴うＣＡＭＫ−ＣＲ２）の完全ＨＤＲ事象をプロットして、２つのｓｓＯＤＮデザイン間の完全ＨＤＲ頻度を比較した。提示したデータは、完全ＨＤＲ事象±ＳＥＭの平均パーセントである（２回の独立した実験からの、６回の生物学的反復試験）。各処置グループにおける、２つのｓｓＯＤＮデザイン間の完全ＨＤＲ頻度の違いを、スチューデントＴ検定により評価して、Ｐ値を図に示している。全ての温度条件に渡って、（＋）鎖ｓｓＯＤＮ  Ｃ−ＣＲ２は、（−）鎖ｓｓＯＤＮ  Ｃ−ＣＲ２−Ａｓｙｍよりも、より多くの完全ＨＤＲを促進する。
【００１６】
【図４】図４ａ〜図４ｃは、ＴＧＦＢＲ１遺伝子座での、遺伝子編集のための、ガイドＲＮＡおよび１本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナーデザインを示す。（ａ）２つのガイドＲＮＡ  ＴＲ−ＣＲ２およびＴＲ−ＣＲ３を、ＴＧＦＢＲ１  Ｅｘｏｎ４を特異的に標的とし、異なる配列変更をＨＤＲにより導入するように、デザインした。ＴＲ−ＣＲ３は、ＴＲ−ＣＲ２の３９ヌクレオチド下流にある。（ｂ）２つのｓｓＯＤＮ  ＨＤＲドナー（Ｔ−ＣＲ２およびＴ−ＣＲ２−Ａｓｙｍ）を、ＨＤＲ変換された配列の再編集を防ぐために、ガイドＲＮＡ  ＴＲ−ＣＲ２標的部位の１２ｂｐ上流にサイレント変異を導入し、ガイドＲＮＡ認識配列内に３つのサイレント変異を導入するように、デザインした。Ｔ−ＣＲ２は、バランスの取れたホモロジーアームを、目的の変異の両側に有し（それぞれ、５’−７３ｎｔおよび３’−７４ｎｔ）、ガイドＲＮＡ標的切断鎖に相補的な（＋）鎖のＨＤＲドナーである。Ｔ−ＣＲ２−Ａｓｙｍは、長さの異なるホモロジーアームを有し（それぞれ、５’−９３ｎｔおよび３’−３６ｎｔ）、ガイドＲＮＡ非標的鎖に相補的な（−）鎖のＨＤＲドナーである。（ｃ）２つのｓｓＯＤＮドナー（Ｔ−ＣＲ３およびＴ−ＣＲ３−Ａｓｙｍ）を、ＨＤＲ変換された配列の再編集を防ぐために、ガイドＲＮＡ  ＴＲ−ＣＲ３標的部位の１２ｂｐ上流に、既知のＳＮＰを導入し、ガイドＲＮＡ認識配列内に２つのサイレント変異を、かつ、ＴＲ−ＣＲ３  ＰＡＭ部位内に１つのサイレント変異を有するように、デザインした。Ｔ−ＣＲ３は目的の変異の両側に、バランスの取れた長さのホモロジーアーム（それぞれ５’−７３ｎｔと３’−７２ｎｔ）を有し、ガイドＲＮＡ標的鎖に相補的な（＋）鎖のＨＤＲドナーである。Ｔ−ＣＲ３−Ａｓｙｍは目的の変異の両側に、バランスのとれていない長さのホモロジーアーム（それぞれ、５’−８６ｎｔおよび３’−３６ｎｔ）を有し、ガイドＲＮＡ非標的鎖に相補的な（−）鎖のＨＤＲドナーである。
【００１７】
【図５】図５ａ〜図５ｂは、ｍｃ−ｉＰＳＣのＴＧＦＢＲ１遺伝子座でのＨＤＲ効率に対する、「低温ショック」およびｓｓＯＤＮ  ＨＤＲドナーデザインの効果を示す。ｓｓＯＤＮ  ＨＤＲドナーおよびｓｇＲＮＡを、ＴＧＦＢＲ１遺伝子座でのＨＤＲを達成するために、Ｃａｓ９ｍＲＮＡと共に、ｍｃ−ｉＰＳＣ細胞に同時送達した。実験は、「材料および方法」に記載したように、２４時間間隔での様々な温度で実施した：ＰＬ１：３７℃−３７℃−３７℃、ＰＬ２：３７℃−３２℃−３７℃、ＰＬ３：３７℃−３２℃−３２℃、ＰＬ４：３２℃−３２℃−３２℃。（ａ）各処置（Ｔ−ＴＲ２またはＴ−ＴＲ２−Ａｓｙｍを伴うＴＲ−ＣＲ２、Ｔ−ＴＲ３またはＴ−ＴＲ３−Ａｓｙｍを伴うＴＲ−ＣＲ３）について、１０ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮ  ＨＤＲドナーを用いたＨＤＲ事象を、「材料および方法」に記載されているようにＮＧＳによって決定した。提示したデータは、ＨＤＲ事象の平均パーセンテージ（３回の独立した実験からの４回の反復試験）である。ＨＤＲのタイプを、目的の変異の領域の周辺の得られた配列に基づいて、３つのグループに分類した。完全ＨＤＲ：全ての目的の塩基変化が、再編集されたインデルを伴わず存在する。編集ＨＤＲ：１つ以上の目的の塩基変化が、再編集されたインデルの存在と共に、存在する。部分的ＨＤＲ：全部ではないがいくつかの目的の塩基変化が存在し、インデルを伴わない。各ｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮ処置についての、３つの温度条件間の、ＨＤＲ全体の効率の違いの有意性を、一元配置ＡＮＯＶＡにより解析した（一元配置ＡＮＯＶＡ  Ｐ＞０．０５、フォローアップのダネット多重比較のＰ値は図に示している）。３０ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮおよびオリゴなしの処置由来のＨＤＲは、表５に示した。（ｂ）各処置（Ｔ−ＴＲ２またはＴ−ＴＲ２−Ａｓｙｍを伴うＴＲ−ＣＲ２、Ｔ−ＴＲ３またはＴ−ＴＲ３−Ａｓｙｍを伴うＴＲ−ＣＲ３）についての、１０ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮ  ＨＤＲドナーを用いた完全ＨＤＲ事象をプロットして、２つのｓｓＯＤＮデザイン間の完全ＨＤＲ頻度を比較した。提示したデータは、完全ＨＤＲ事象±ＳＥＭの平均パーセントである（４回の反復試験を伴う、３回の独立した実験）。各処置グループにおける、２つのｓｓＯＤＮデザイン間の完全ＨＤＲ頻度の違いを、スチューデントＴ検定により評価して、Ｐ値を図に示している。全ての温度条件に渡って、（＋）ｓｓＯＤＮ鎖Ｔ−ＣＲ２およびＴ−ＣＲ３は、それぞれ、（−）ｓｓＯＤＮ鎖Ｔ−ＣＲ２−ＡｓｙｍおよびＴ−ＣＲ３−Ａｓｙｍよりも、より多くの完全ＨＤＲを促進する。
【００１８】
【図６】図６は、「低温ショック」が、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子座でのＨＤＲ効率を高めることを示す。ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子座でのＨＤＲを達成するために、ｍｃ−ｉＰＳＣと同じトランスフェクション条件を用いて、様々な量のｓｓＯＤＮ  Ｃ−ＣＲ２を、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ  ＣＡＭＫ−ＣＲ１またはＣＡＭＫ−ＣＲ２と共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に送達した。実験は、「材料および方法」に記載されているように、２４時間間隔での様々な温度で実施した：ＰＬ１：３７°Ｃ−３７°Ｃ−３７°Ｃ、ＰＬ２：３７°Ｃ−３２°Ｃ−３７°Ｃ、ＰＬ３：３７°Ｃ−３２°Ｃ−３２°Ｃ。（ａ）各処置についての、１０ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮ  ＨＤＲドナーを用いたＨＤＲ事象を、「材料および方法」に記載されているようにＮＧＳによって決定した。データは、３回の反復試験による、ＨＤＲ事象の平均パーセンテージとして提示した。ＨＤＲのタイプを、目的の変異の領域の周辺の得られた配列に基づいて、３つのグループに分類した。完全ＨＤＲ：全ての目的の塩基変化が起こり、インデルはない。編集ＨＤＲ：１つ以上の目的の塩基変化が起こるが、インデルがある。部分的ＨＤＲ：全部ではないがいくつかの目的の塩基変化が起こり、インデルはない。各ｇＲＮＡおよびｓｓＯＤＮ処置についての、３つの温度条件間の、ＨＤＲ全体の効率の違いの有意性を、一元配置ＡＮＯＶＡにより解析した。（一元配置ＡＮＯＶＡ：Ｃ−ＣＲ２を伴うＣＡＭＫ−ＣＲ１、Ｐ＝０．００４１；Ｃ−ＣＲ２を伴うＣＡＭＫ−ＣＲ２、Ｐ＝０．０４６９；フォローアップのダネット多重比較のＰ値は図に示している）。３０ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮおよびオリゴなしの処置由来のＨＤＲは、表７に示した。
【００１９】
【図７】図７ａ〜図７ｃは、「低温ショック」後の、ｍｃ−ｉＰＳＣの多能性マーカーの発現を示している。Ｍｃ−ｉＰＳＣを、「補足の方法」に記載したように、２４時間間隔での様々な温度で増殖させた。ＰＬ１：３７℃−３７℃−３７℃、ＰＬ２：３７℃−３２℃−３７℃、ＰＬ３：３７℃−３２℃−３２℃。その後、細胞を、「補足の方法」に記載したように、多能性特異的抗体で染色した：（ａ）ＳＳＥＡ３（緑）、（ｂ）Ｎａｎｏｇ（緑）および（ｃ）ＯＣＴ４（緑）。細胞はまた、Ｈｏｅｃｈｓｔで共染色して、核を標識した（青）。
【００２０】
【図８】図８は、ＮＧＳによって決定されるように、「低温ショック」が、ｍｃ−ｉＰＳＣのＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子座でのＨＤＲ効率を高めることを示す。３０ｐｍｏｌのｓｓＯＤＮ  Ｃ−ＣＲ２を、ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子座でのＨＤＲを達成するために、Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびｓｇＲＮＡ  ＣＡＭＫ−ＣＲ１またはＣＡＭＫ−ＣＲ２と共に、ｍｃ−ｉＰＳＣに送達した。実験は、「材料および方法」に記載されているように、２４時間間隔での様々な温度で実施した：ＰＬ１：３７℃−３７℃−３７℃、ＰＬ２：３７℃−３２℃−３７℃、ＰＬ３：３７℃−３２℃−３２℃、ＰＬ４：３２℃−３０℃−３７℃、ＰＬ５：３７℃−３０℃−３０℃、ＰＬ６：３７℃−２８℃−３７℃、ＰＬ７：３７℃−２８℃−２８℃。（ａ）各処置についてのＨＤＲ事象を、「材料および方法」に記載されているようにＮＧＳによって決定した。提示したデータは、２回の反復試験によるＨＤＲ事象の平均パーセントである。ＨＤＲのタイプを、目的の変異の領域の周辺の得られた配列に基づいて、３つのグループに分類した。完全ＨＤＲ：全ての目的の塩基変化が、再編集されたインデルを伴わず存在する。編集ＨＤＲ：１つ以上の目的の塩基変化が、再編集されたインデルの存在と共に、存在する。部分的ＨＤＲ：全部ではないがいくつかの目的の塩基変化が存在し、インデルを伴わない。オリゴなしの処置における、編集ＨＤＲおよび部分的ＨＤＲ配列のパーセンテージの低さは、次世代シーケンシングに関するバックグラウンドエラー率を表す。オリゴなしの処置においては、完全ＨＤＲは検出されなかった。データは、細胞を「低温ショックする」ことによってＨＤＲの増加が達成できること、および増加の大部分が「完全ＨＤＲ」カテゴリーにあることを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
発明の詳細な説明
ある局面において、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を用いるなどにより、細胞のゲノムにおいて、相同組換え修復（ＨＤＲ）の効率を上昇させるための方法に関する。実施例に記載されているように、出願人らは、トランスフェクション後に、より低温で、細胞を「低温ショックする」ことによって、細胞（例えば、ＰＳＣおよびＨＥＫ２９３細胞）において、低いＨＤＲ率（１〜２０％）が、２〜１０倍高められることを実証した。本方法はまた、ＣＲＩＳＰＲ切断部位からより遠位にあるヌクレオチドがあまり効率的に組み込まれない、部分配列変換（「部分ＨＤＲ」）とは対照的に、ドナー配列にわたって完全な配列変換を生じた遺伝子座、すなわち「完全ＨＤＲ」の割合を増加させる。また、実施例において、１本鎖ＤＮＡオリゴドナーの構造がＨＤＲの忠実度に大きく影響し得、ＣＲＩＳＰＲ切断部位に関して対称性であり、標的鎖に相補的であるオリゴが、非対称性の非標的鎖相補的オリゴと比較して、「完全ＨＤＲ」を導く上でより効率的であることが示された。
【００２２】
ある実施形態において、本発明は、細胞のゲノムにおいて、相同組換え修復（ＨＤＲ）の効率を上昇させるための方法であって：（ａ）細胞に、（ｉ）ヌクレアーゼ、および（ｉｉ）ゲノムに挿入されるべき修飾配列を含むドナー核酸を、導入すること、および、（ｂ）細胞を、３７℃から、より低温への温度シフトに供することを含み、ヌクレアーゼが、細胞において切断部位でゲノムを切断し、ドナー核酸が、上昇したＨＤＲ率によって、修飾配列によるゲノム配列の修復を導く方法を、提供する。例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）率は、少なくとも１．５倍上昇している。場合により、相同組換え修復（ＨＤＲ）率は、少なくとも２倍上昇している。
【００２３】
ある局面において、該より低温は、２８℃〜３２℃の間である。場合により、該より低温は、３０℃〜３３℃の間である。例えば、細胞を、少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間、例えば、１〜５日間（１日、２日、３日、４日、または５日間）、該より低温で増殖させる。場合により、細胞を、温度シフト後に３７℃で増殖させる。
【００２４】
ある局面において、細胞は、哺乳類細胞などの、真核細胞である。特定の実施形態において、細胞は、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの、幹細胞である。別の特定の実施形態において、細胞は、初代細胞である。別の特定の実施形態において、細胞は植物細胞である。
【００２５】
ある局面において、本発明で用いられるヌクレアーゼには、全てのＤＮＡ配列特異的エンドヌクレアーゼ、またはＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼが含まれる。場合により、ヌクレアーゼは、ＣａｓヌクレアーゼまたはＣｐｆ１ヌクレアーゼから選択されるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。例えば、ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼである。例示すると、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、ＤＮＡ形式（例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼおよびｓｇＲＮＡをコードするＤＮＡ）で、または、ＲＮＡ形式（例えば、ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＰまたはｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡ）で、ｓｇＲＮＡと共に細胞に導入される。場合により、ｓｇＲＮＡは、合成であり、かつ、化学的に修飾されている。ある局面において、ドナー核酸は、対称性のホモロジーアームを含有する。場合により、ドナー核酸は、ヌクレアーゼによって切断されるゲノム内のＤＮＡ鎖と相補的である。
【００２６】
ある局面において、本発明で用いられるヌクレアーゼは、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。他のある局面において、本発明で用いられるヌクレアーゼは、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。
【００２７】
ある実施形態において、本発明は、上記の方法により生産された単離細胞を提供する。
【００２８】
ある実施形態において、本発明は、上記の方法により生産された単離細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００２９】
ある実施形態において、本発明は、目的のたんぱく質を、それを必要とする対象に提供する方法であって：（ａ）目的のたんぱく質をコードするドナー核酸を、上記の方法に従い、細胞に導入すること；および（ｂ）該細胞を対象に導入して、目的のたんぱく質を対象において発現させること、を含む方法を、提供する。
【００３０】
ある実施形態において、本発明は、細胞のゲノムにおいて、相同組換え修復（ＨＤＲ）の効率を上昇させるための方法であって：細胞に（ｉ）ヌクレアーゼ；および（ｉｉ）対称性のホモロジーアームを含み、ヌクレアーゼにより切断されるゲノム内のＤＮＡ鎖と相補的であり、切断部位から１０塩基対を超えて離れてゲノムに挿入されるべき修飾配列を含むドナー核酸を、導入することを含み、ヌクレアーゼが、細胞において切断部位でゲノムを切断し、ドナー核酸が、上昇したＨＤＲ率によって、修飾配列によるゲノム配列の修復を導く方法を、提供する。例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）率が、少なくとも１．５倍、または少なくとも２倍上昇している。場合により、本方法はさらに、細胞を、３７℃から、より低温（例えば、２８℃〜３５℃の間、または３０℃〜３３℃の間）への温度シフトに供することを含む。例えば、細胞を、少なくとも２４時間、または少なくとも４８時間、例えば、１〜５日間（１日、２日、３日、４日、または５日間）、該より低温で増殖させる。
【００３１】
Ｉ．定義
本開示を、より容易に理解し得るように、特定の用語を最初に定義する。本出願で使用されている際は、本明細書で他に明示的に提供されている場合を除いて、以下の用語のそれぞれは、以下に記載の意味を有するものとする。さらなる定義を、本出願を通して記載する。
【００３２】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に用いられ、直鎖状または環状の、および１本鎖または２本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。
【００３３】
用語「ポリヌクレオチド」「ペプチド」および「たんぱく質」は、互換的に用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。
【００３４】
「ＺｎフィンガーＤＮＡ結合たんぱく質」（または結合ドメイン）は、たんぱく質、またはより大きいたんぱく質内のドメインで、亜鉛イオンの配位により構造が安定化する結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１つ以上のＺｎフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡに結合する。ＺｎフィンガーＤＮＡ結合たんぱく質という用語は、しばしば、Ｚｎフィンガーたんぱく質またはＺＦＰとして、略される。
【００３５】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１つ以上のＴＡＬＥリピートドメイン／ユニットを含むポリペプチドである。リピートドメインは、ＴＡＬＥの、同族のＤＮＡ配列への結合に関与している。単一の「リピートユニット」（「リピート」とも呼ばれる）は、典型的には３３〜３５アミノ酸長であり、天然のＴＡＬＥたんぱく質内の他のＴＡＬＥリピート配列に、少なくともいくらかの配列相同性を示す。
【００３６】
用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム」または「Ｃａｓ９システム」という用語は、多くのＤＮＡ修復経路のうちの１つによって標的核酸を変更することができるシステムを指す。ある実施形態において、本明細書で記載されるＣａｓ９システムは、ＨＤＲ経路を介した標的核酸の修復を促進する。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９システムは、ｇＲＮＡ分子およびＣａｓ９分子を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９システムはさらに、第２のｇＲＮＡ分子を含む。
【００３７】
本明細書で用いられる「Ｃａｓ９分子」または「Ｃａｓ９ヌクレアーゼ」は、Ｃａｓ９ポリペプチド、またはＣａｓ９ポリペプチドをコードする核酸を指す。「Ｃａｓ９ポリペプチド」は、ｇＲＮＡ分子と相互作用することができ、ｇＲＮＡ分子と協調して、標的ドメインを含む部位に局在化することができ、ある実施形態においてはＰＡＭ配列に局在化することができる、ポリペプチドである。Ｃａｓ９分子は、天然のＣａｓ９分子、操作、変更、または修飾されたＣａｓ９分子と、参照ＣＡｓ９配列、例えば天然のＣａｓ９分子から、例えば少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるＣａｓ９ポリペプチドとの両方を含む。本文脈で用いられる「変更、操作、または修飾された」という用語は、単に参照または天然のＣａｓ配列からの違いを指すだけであり、特定のプロセスまたは由来の制限を課すものではない。Ｃａｓ９分子は、ヌクレアーゼ（２本鎖核酸の両方の鎖を切断する酵素）またはニッカーゼ（２本鎖核酸の一方の鎖を切断する酵素）であってよい。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、「ｇＲＮＡ分子」または「ｇＲＮＡ」は、Ｃａｓ９分子を標的核酸に標的化させることができる、ガイドＲＮＡを指す。一実施形態において、「ｇＲＮＡ分子」という用語は、ガイドリボ核酸を指す。別の実施形態において、「ｇＲＮＡ分子」という用語は、ｇＲＮＡをコードする核酸を指す。一実施形態において、ｇＲＮＡ分子は非天然である。一実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、合成ｇＲＮＡ分子である。別の実施形態において、ｇＲＮＡ分子は、化学的に修飾されている。
【００３９】
「鋳型核酸」、「ドナー核酸」または「ドナーポリヌクレオチド」は、ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９分子）と組み合わせて用いて、標的位置の構造を変更することができる、核酸配列を指す。一つの実施形態において、鋳型核酸は、鋳型核酸のいくつかまたは全ての配列を有するように、典型的には切断部位またはその近傍で、修飾される。一つの実施形態において、鋳型核酸は１本鎖である。代替の実施形態において、鋳型核酸は２本鎖である。一つの実施形態において、鋳型核酸はＤＮＡであり、例えば、２本鎖ＤＮＡである。代替の実施形態において、鋳型核酸は１本鎖ＤＮＡである。一つの実施形態において、鋳型核酸はＲＮＡであり、例えば２本鎖ＲＮＡまたは１本鎖ＲＮＡである。一実施形態において、鋳型核酸は外来性核酸配列である。別の実施形態において、鋳型核酸配列は、内在性核酸配列、例えば、内在性相同領域である。一実施形態において、鋳型核酸は、核酸配列のプラス鎖に対応する、１本鎖オリゴヌクレオチドである。別の実施形態において、鋳型核酸は、核酸配列のマイナス鎖に対応する、１本鎖オリゴヌクレオチドである。
【００４０】
「相同組換え修復」または「ＨＤＲ」は、相同核酸（例えば、内在性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外来性核酸、例えば、鋳型核酸）を用いて、細胞内でＤＮＡ損傷を修復するプロセスを指す。古典的ＨＤＲは、典型的には、２本鎖切断で重大な切除があった場合に作用し、ＤＮＡの少なくとも１つの１本鎖部分を形成する。正常細胞では、ＨＤＲは典型的には、切断の認識、切断の安定化、切除、１本鎖ＤＮＡの安定化、ＤＮＡ交差中間体の形成、交差中間体の分解、および連結などの一連のステップを包含する。
【００４１】
「非相同末端結合」または「ＮＨＥＪ」は、古典的ＮＨＥＪ（ｃＮＨＥＪ）、代替的ＮＨＥＪ（ａｌｔＮＨＥＪ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、１本鎖アニーリング（ＳＳＡ）、および合成依存的マイクロホモロジー媒介末端結合（ＳＤ−ＭＭＥＪ）を含む、ライゲーション媒介修復および／または非鋳型媒介修復を指す。
【００４２】
「組換え」は、２つのポリヌクレオチド間の遺伝子情報の交換プロセスを指し、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）および相同組換えによるドナー捕捉を含むが、これらに限定されない。「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復メカニズムを介して、細胞における２本鎖切断の修復中におこる、当該交換の特殊形態を指す。本プロセスは、ヌクレオチド配列相同性を必要とし、「標的」分子の鋳型修復に「ドナー」分子を使用して、ドナーから標的への遺伝子情報の移行をもたらす。この移行は、破壊された標的とドナーとの間に形成するヘテロ２本鎖ＤＮＡのミスマッチ修正、および／または標的の一部となるであろう遺伝子情報を再合成するためにドナーが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、および／または関連するプロセスを包含し得る。この特殊なＨＲはしばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全部が、標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の変更をもたらす。
【００４３】
本開示の方法において、本明細書で記載されるヌクレアーゼは、標的配列（例えば、細胞クロマチン）において、所定の認識部位で２本鎖切断を作成し、切断領域のヌクレオチド配列に相同性を有する「ドナー」ポリヌクレオチドを、細胞に導入することができる。２本鎖切断の存在は、ドナーポリヌクレオチドによるゲノム配列の修復を促進することが示されている。ドナーポリヌクレオチドは、物理的に組み込まれ得るか、あるいは、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えを介した切断の修復用の鋳型として用いられ、ドナーにおけるように、ヌクレオチド配列の全部または一部が、細胞クロマチンに導入される。したがって、細胞クロマチンにおける第一の配列は、変更することができ、ある実施形態においては、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列に変換させることができる（本明細書では、「修飾配列」と呼ばれる）。したがって、「置換する」または「置換」という用語の使用は、あるヌクレオチド配列の別の配列による置換を表すと理解され得、必ずしもあるポリヌクレオチドの別のヌクレオチドによる物理的または化学的置換を必要としない
【００４４】
ＩＩ．ヌクレアーゼ
本発明の方法は、鋳型核酸（導入遺伝子）が、標的化様式でゲノム配列の修復を導くように、細胞のゲノムの切断のためにヌクレアーゼを利用する。ある実施形態において、ヌクレアーゼは天然である。他の実施形態において、ヌクレアーゼは非天然であり、例えば、天然の野生型ヌクレアーゼの、操作または修飾されたバージョンである。
【００４５】
ヌクレアーゼには、Ｃａｓたんぱく質、ＤＮＡ配列特異的エンドヌクレアーゼ、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１）、制限エンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ホーミングエンドヌクレアーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ、およびＺｎフィンガーヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例示的ヌクレアーゼには、タイプＩ、タイプＩＩ、タイプＩＩＩ、タイプＩＶ、およびタイプＶエンドヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。例えば、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ、またはＣｐｆ１ヌクレアーゼ）である。いくつかの特定の実施形態において、ヌクレアーゼはＣａｓ９であり、例えば、細菌（例えば、化膿性連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、またはストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ））からクローニングされた、またはこれら細菌由来の、Ｃａｓ９である。
【００４６】
ある実施形態において、ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムである。該システムのＲＮＡ要素をコードするＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔｓ）遺伝子座、およびたんぱく質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）遺伝子座（Jansen et al., 2002. Mol. Microbiol. 43: 1565-1575; Makarova et al., 2002. Nucleic Acids Res. 30: 482-496; Makarova et al., 2006. Biol. Direct 1: 7; Haft et al., 2005. PLoS Comput. Biol. 1:e60）が、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムの遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と、ＣＲＩＳＰＲ媒介核酸切断の特異性をプログラミングすることができる非コードＲＮＡエレメントとの組み合わせを含有する。
【００４７】
タイプＩＩＣＲＩＳＰＲは、最もよく特徴付けをされているシステムの１つであり、４つの連続した工程で標的ＤＮＡ２本鎖切断を実行する。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズして、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの、それぞれのスペーサーを含む成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと、標的認識のためのさらなる要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間のワトソン・クリック塩基対形成を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡへ向かわせる。第４に、Ｃａｓ９は標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に２本鎖切断を作成する。
【００４８】
ある実施形態において、Ｃａｓたんぱく質は、天然のＣａｓたんぱく質の「機能性誘導体」である。天然配列ポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列ポリペプチドと共通する定性的生物学的特徴を有する化合物である。「機能性誘導体」には、対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物活性を有するという条件で、天然配列のフラグメントおよび天然配列ポリペプチドの誘導体およびそのフラグメントを含まれるが、これらに限定されない。本明細書で企図される生物活性は、機能性誘導体が、ＤＮＡ基質をフラグメントに加水分解する能力である。「誘導体」という用語は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、共有結合的修飾の両方、およびそれらの融合体を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはそのフラグメントの好適な誘導体には、Ｃａｓたんぱく質またはそのフラグメントの、変異体、融合体、共有結合的修飾が含まれるが、これらに限定されない。Ｃａｓたんぱく質またはそのフラグメントを含む、Ｃａｓたんぱく質、および、Ｃａｓたんぱく質またはそのフラグメントの誘導体は、細胞から入手可能であるか、または化学的に合成され得るか、またはこれら２つの手順の組み合わせにより得ることができる。細胞は、天然にＣａｓたんぱく質を生産する細胞であるか、天然にＣａｓたんぱく質を産生し、より高い発現レベルで内在性Ｃａｓたんぱく質を生産するように、または外来性導入核酸（該核酸は、内在性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする）からＣａｓたんぱく質を産生するように、遺伝子操作された細胞であり得る。場合によっては、細胞は天然にＣａｓたんぱく質を生産せず、Ｃａｓたんぱく質を生産するように遺伝的操作されている。
【００４９】
他の実施形態において、ヌクレアーゼは、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮは、異種のＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインを含む。これらの分子は、周知のゲノム編集ツールである。例えば、Gai, et al., Trends Biotechnol. 2013 Jul; 31(7): 397−405を参照されたい。
【００５０】
ＩＩＩ．宿主細胞
ゲノム修飾における任意の宿主細胞を、本発明において用いることができる。細胞タイプは、例えば初代細胞などの、細胞株または天然の（例えば、単離された）細胞であり得る。
【００５１】
例示すると、好適な細胞には、真核生物（例えば、動物、植物、哺乳動物）細胞および／細胞株が含まれる。これらの細胞または細胞株の、非限定的な例には、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）、およびｐｅｒＣ６細胞が含まれる。ある実施形態において、細胞株は、ＣＨＯ、ＭＤＣＫまたはＨＥＫ２９３細胞株である。好適な細胞にはまた、例として、胚性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、および間葉系幹細胞などの幹細胞が含まれる。
【００５２】
ＩＶ．送達方法
ヌクレアーゼ、これらのヌクレアーゼをコードする核酸、鋳型核酸、および該たんぱく質および／該核酸を含む組成物が、任意の好適な手段により、任意の細胞タイプに、インビボまたはエクスビボで、送達され得る。
【００５３】
本明細書に記載されるヌクレアーゼおよび／またはドナーコンストラクトはまた、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＰＳＲ／Ｃａｓシステムの１つ以上をコードする配列を含有するベクターを用いて、送達され得る。プラスミドベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、およびアデノ随伴ウイルスベクターなどを含むが、これらに限定されない、任意のベクターシステムが、用いられ得る。米国特許第６，５３４，２６１号；６，６０７，８８２号；６，８２４，９７８号；６，９３３，１１３号；６，９７９，５３９号；７，０１３，２１９号；および７，１６３，８２４号（これらの全体が、参照により本明細書に組み込まれる）もまた、参照されたい。さらに、これらのベクターのいずれも、処置に必要な配列を１つ以上含み得ることは、明らかであろう。従って、１つ以上のヌクレアーゼおよびドナーコンストラクトが細胞に導入される場合、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同じベクター上または異なるベクター上に、保有され得る。複数のベクターが用いられる場合、各ベクターは、１つまたは複数のヌクレアーゼ、および／またはドナーコンストラクトをコードする配列を、含み得る。
【００５４】
従来のウイルス性または非ウイルス性遺伝子導入方法が、ヌクレアーゼおよびドナーコンストラクトをコードする核酸を、細胞（例えば、哺乳類細胞）および標的組織に導入するために、用いられ得る。非ウイルス性ベクター送達システムには、ＤＮＡまたはＲＮＡプラスミド、ＤＮＡ  ＭＣ、ネイキッド核酸、およびリポソームまたはポロクサマーなどの送達媒体と複合体を形成した核酸が、含まれる。ウイルス性ベクター送達システムには、細胞への送達後に、エピソームゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。
【００５５】
核酸の非ウイルス性送達の方法には、エレクトロポレーション、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤増強取り込みが、含まれる。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００システム（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を用いた、ソノポレーション（Ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）もまた、核酸の送達に用いることができる。
【００５６】
さらなる例示的な核酸送達システムには、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ，  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ（例えば、米国特許第６，００８，３３６号参照）により提供されるシステムが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；４，９４６，７８７号；および４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。効率的な、ポリヌクレオチドの受容体認識リポフェクションに好適なカチオン性および中性脂質ポリヌクレオチドには、Ｆｅｉｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号、国際公開第９１／１６０２４号のものが含まれる。
【００５７】
脂質：核酸複合体（免疫脂質複合体（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ  ｃｏｍｐｌｅｘ）などの、標的リポソームを含む）の調製は、当業者に周知されている（例えば、Crystal, Science 270:404-410 (1995); Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995); Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994); Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994); Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995); Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)；米国特許第４，１８６，１８３号、４，２１７，３４４号、４，２３５，８７１号、４，２６１，９７５号、４，４８５，０５４号、４，５０１，７２８号、４，７７４，０８５号、４，８３７，０２８号、および４，９４６，７８７号参照）。
【００５８】
操作されたＺＦＰ、ＴＡＬＥおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムをコードする核酸の送達のための、ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための、高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターは患者に直接投与することができ（インビボ）、あるいは、ウイルスベクターはインビトロで細胞を処置するために使用することができ、修飾された細胞が患者に投与される（エクスビボ）。
【００５９】
ヌクレアーゼおよび／またはドナーコンストラクトを含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソームなど）はまた、インビボでの細胞の形質導入のために、生物に直接投与することができる。あるいは、ネイキッドＤＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所適用およびエレクトロポレーションを含むがこれらに限定されない、血液または組織細胞との最終的な接触に分子を導入するために通常使用される経路の、いずれかによるものである。これらの核酸を投与するのに好適な方法は、利用可能であり、かつ、当業者には周知であり、また、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路を使用することができるが、ある特定の経路はしばしば、もう一つの経路よりもより即時型で、かつより効果的な反応を提供することができる。
【００６０】
ヌクレアーゼコード配列およびドナーコンストラクトは、同じまたは異なるシステムを用いて送達され得ることは、明らかであろう。例えば、ヌクレアーゼおよびドナーは、同じＤＮＡ  ＭＣによって運搬され得る。あるいは、ドナーポリヌクレオチドはＭＣにより運搬され得、一方で１つ以上のヌクレアーゼは標準的プラスミドまたはＡＡＣベクターにより、運搬され得る。さらに、異なるベクターは、同じまたは異なる経路により投与され得る（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）。ベクターは、同時に、または任意の連続した順番で、送達され得る。
【００６１】
本明細書に開示される方法を用いた遺伝子操作の効果は、例えば、目的の組織から単離されたＲＮＡ（例、ｍＲＮＡ）のノーザンブロットによって、観察することができる。典型的には、ｍＲＮＡが存在するか、またはｍＲＮＡの量が増加している場合、対応する導入遺伝子が発現されていると仮定することができる。遺伝子および／またはコードされたポリペプチドの活性を測定する他の方法を、用いることができる。使用される基質および反応生成物または副生成物の増加または減少を検出する方法に応じて、異なる種類の酵素アッセイを、用いることができる。さらに、発現されるポリペプチドのレベルは、免疫化学的に、すなわち、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ、および当業者に周知の他の抗体ベースのアッセイ、例えば、電気泳動検出アッセイ（染色法またはウェスタンブロッティングのいずれかによる）などによって、測定することができる。
【００６２】
Ｖ．温度シフト
本発明は、ヌクレアーゼおよび／またはドナー核酸の導入後に、宿主細胞を低温ショックの期間に供することを包含する。細胞は、トランスフェクション後数分以内に、３７℃からより低温に移行させる（低温ショック）か、またはより低温に移行させる前に短期間（たとえば１日）３７℃で維持させてよい。
【００６３】
細胞を低温ショックさせる期間は、数時間から数日の範囲であり得る。ある実施形態において、細胞を、１日〜４日間、低温ショックさせる。低温ショックの期間はまた、ヌクレアーゼが導入される細胞タイプに応じて異なるであろうことは、明らかであろう。
【００６４】
さらに、細胞が低温ショックを受ける温度は、細胞分裂を減少させる任意の温度であるが、ヌクレアーゼが発現および／または活性化する温度である。好適な温度は、宿主細胞タイプに応じて異なるであろう。哺乳類細胞について、低温ショック温度は、３５°Ｃ、３４°Ｃ、３３°Ｃ、３２℃、３１°Ｃ、３０℃、２９°Ｃ、２８℃、２７°Ｃ、２６°Ｃ、２５°Ｃ、および、さらに低い温度が含まれるが、これらに限定されない。さらに、温度は、細胞が分裂していないか、または減少した速度で分裂している程度に、十分に低いままであれば、低温ショックの期間中に変動し得る。
【００６５】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これはさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願を通して引用された全ての図および全ての参考文献、特許および公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【００６６】
実施例１
低温ショックは、誘導多能性幹細胞の遺伝子編集に関して、相同組換え修復の頻度を増加させる
序論
Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｓｐａｃｅｄ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔｓ（ＣＲＩＳＰＲ）技術の最も有望な用途の１つは、ヒト疾病の遺伝的モデルの作成におけるその使用である。ＣＲＩＳＰＲ技術は、疾病表現型を研究するために正常な個体から単離された誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に使用でき、または推定上の疾病を引き起こす変異を野生型に戻すために疾病患者に由来するＩＰＳＣに使用できる。Ｚｎフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）と比較した、ＣＲＩＳＰＲアプローチの相対的頑強さは、ゲノムワイド関連研究により生まれた経験的データや他の非コード変異と同様に、たんぱく質をコードする変異に対しての試験を利用可能にした（３、４）。多くの成功にもかかわらず、ｉＰＳＣにおける遺伝子編集は、外来性ドナーＤＮＡがＣＲＩＳＰＲ誘導２本鎖切断を修復するために使用されるプロセスである相同組換え修復（ＨＤＲ）が、形質転換された癌細胞株より効率が低いという事実に見舞われている（５−８）。
【００６７】
低いＨＤＲ率を克服するために、研究者らは、ＣＲＩＳＰＲプラスミド上および／またはドナーＤＮＡ上に抗生物質耐性遺伝子を含むこと（９）などのいくつかの戦略を採用した。これらの戦略は、効果的ではあるが、外来ＤＮＡのゲノムへの望ましくない挿入を残したままである。Ｃｒｅ／ｌｏｘシステムや痕跡を残さない（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ−ｆｒｅｅ）ＰｉｇｇｙＢＡＣトランスポゾンなどの、選択マーカーの切除を可能にする技術と、ポジティブ選択マーカーとを組み合わせることは、顕著な改善を示すが、クローン選択が２段階プロセスになるために予定表（ｔｉｍｅｌｉｎｅ）を伸ばす（２、１０）。１本鎖オリゴＤＮＡヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）ドナー分子を使用する方法は、ランダムな組み込みおよび望ましくない「痕跡（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ）」に関してより大きな２本鎖ＤＮＡ分子が存在するという問題を回避するが、やはり比較的低い頻度で成功する修復および２本鎖切断部位周辺の配列変換を受けやすい（７、１１）。Ｍｉｙａｏｋａらは、希少なクローンの単離が困難であることを克服するために、ｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ、クローンのプール、および同胞選択を使用して、非常に希少なクローンを濃縮する戦略を考案した（１２）。ＨＤＲ率を上昇させるためのさらなる戦略は、細胞周期の進行の既知の化学的インヒビターで、細胞周期の同調（ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎ）を誘導することによって、Ｃａｓ９ＲＮＰ複合体のヌクレアーゼへの送達のタイミングをとることを含む（１３）。ここでは、同調させたＨＥＫ２９３細胞で最大３８％のＨＤＲの顕著な増加を達成することができるが、ヒト初代線維芽細胞またはＨ９ヒト胚性幹細胞では、同調の効果は最小限であった。ｓｓＯＤＮ構造および組成物の仕様もＨＤＲ率に影響を及ぼすことが示されている。Lin et al.は、少なくとも６０ヌクレオチドのホモロジーアームを有するオリゴが最も効果的であるが、鎖相補性は要因ではないことを見出した。Richardson et al.による、ドナーオリゴの構造が、いかにして、ＨＥＫ２９３細胞のＨＤＲに影響を及ぼすかについての、より詳細な研究は、Ｃａｓ９ＲＮＰ−ｄｓＤＮＡ複合体のインビトロ結合から得られた洞察を用いた。彼らは、ＧＦＰレポーターアッセイを使用して、ＰＡＭ部位に関してより短く、（＋）鎖に対して相補的（すなわち、非標的鎖）である非対称性ドナーオリゴが、ＨＤＲを促進することにおいて、対称性ドナーオリゴよりも効果的であることを示した（１４）。Paquet et al.によるｉＰＳＣのＨＤＲを最適化する研究は、目的の変異の効率的な挿入は、標的鎖に相補的なオリゴ（−）で達成できること、および目的の変異の組込みの頻度は、ＣＲＩＳＰＲ切断部位からの距離依存的であることを示した。ＨＤＲの忠実度はまた、オリゴにサイレント塩基変化を導入して、ＣＲＩＳＰＲ認識配列を破壊することにより、上昇させることができた（１５）。
【００６８】
本発明者らは、ｉＰＳＣの遺伝子編集ステップを体系的に評価して、送達、ＣＲＩＳＰＲ様式、およびドナーオリゴデザインの最良の組み合わせを決定した。次いで、ＨＤＲを実行する細胞の能力に対する、中程度の「低温ショック」の効果を試験した。本発明者らにより最適化された方法は、Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡ、標的鎖に相補的な対称ドナーオリゴ（−）、および再編集を防ぐためのサイレント変化と組み合わせた、大きなＲＮＡ分子を送達するためにデザインした脂質の新規の組み合わせにより、所望の遺伝子の変更を１０−３０％の効率でゲノムに導入することができる。３２℃の、短い「低温ショック」にさらに細胞をさらすと、３７℃で低い効率の修復が観察される場合には、完全ＨＤＲの量が２〜１０倍増加し得る。
【００６９】
方法および材料
１）細胞株および細胞培養
ヒトｍｃ−ｉＰＳ細胞を、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＣ３０１Ａ−１）から入手し、毎日培地交換しながらｍＴｅＳＲ培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および５０ユニット／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）被覆プレート上で維持した（Ludwig, T. E., et al. (2006). “Feeder-independent culture of human embryonic stem cells.” Nat Methods 3(8): 637-646）。継代培養のために、細胞をＰＢＳで洗浄し、３７℃で５分間Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理した。細胞を、ｍＴｅＳＲ培地で再懸濁し、８０ｇで５分間遠心分離し、細胞ペレットを１０μＭ  ＲＯＣＫ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｙ−２７６３２（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を添加したｍＴｅＳＲ培地に再播種した。
【００７０】
２）ＣＲＩＳＰＲおよびＣａｓ９試薬
ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、Ｄｏｅｎｃｈのアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｐｏｒｔａｌｓ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｐｐ／ｐｕｂｌｉｃ／）およびＺｈａｎｇ研究室のＣＲＩＳＰＲデザインツール（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ．ｍｉｔ．ｅｄｕ）を用いて、デザインした。ガイド配列は、プラスミドｐＸ４５８（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）にサブクローニングするか、またはＩＶＴｓｇＲＮＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）として合成した。ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）Ｐｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手し、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ（５ｍｅＣ、Ψ）は、ＴｒｉＬｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから得た。修復鋳型（Ｕｌｔｒａｍｅｒ、ＩＤＴ）は、オリゴヌクレオチドの中央に標的変異を有し、変異の両側に相同なゲノムフランキング配列を有する１本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）としてデザインした（Miyaoka, Chan et al. 2014, Richardson, Ray et al. 2016）。いくつかのｓｓＯＤＮデザインではまた、ガイドＲＮＡ結合配列およびＰＡＭ部位に、サイレント変異を導入した。ＰＣＲプライマーはプライマー３を用いてデザインし、プライマーはＳｉｇｍａから購入した。プライマー、プローブ、およびオリゴヌクレオチドドナーの配列については、表１を参照されたい。
【表１−１】
2020510443.tif 000003
【表１−２】
2020510443.tif 000004
【００７１】
３）トランスフェクション
ｍｃ−ｉＰＳＣでのＣａｓ９ｍＲＮＡおよびＩＶＴｇＲＮＡの脂質ベーストランスフェクションについては、手順は、ＩＶＴｇＲＮＡおよびＣａｓ９たんぱく質トランスフェクションに少し修正を加えた手順と、同様であった（追加の方法参照）。具体的には、４８０ｎｇのＩＶＴｇＲＮＡおよび２μｇのＣａｓ９ｍＲＮＡを、最初に、５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地で混合し、続いて、２．５μｌのｍＲＮＡ−ＩｎＳｔｅｍまたはＥｄｉｔ−Ｐｒｏ（登録商標）（ＭＴＩ−ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）を添加した。相同組換え修復実験については、脂質添加の前に、様々な量のｓｓＯＤＮを該複合体に添加した。トランスフェクション効率をモニターするために、１００ｎｇのＧＦＰｍＲＮＡもまた、各混合物に添加した。プレートを、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて、３７℃で４８時間インキュベートし、その後細胞を、ゲノムＤＮＡ抽出のために回収した。
【００７２】
４）ゲノムＤＮＡ抽出および編集した領域のＰＣＲ増幅
トランスフェクト細胞からのゲノム抽出のために、各ウェルからの培地を吸引し、細胞を３７℃で１０分間、２５０μｌのＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理した。７５０μｌのｍＴｅＳＲ培地を、各ウェルに添加し、細胞懸濁液を１．５ｍｌエッペンドルフチューブに移して、１０００ｇで５分間回転させた。ゲノムＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出し、１００ｎｇのゲノムＤＮＡを、Ｑ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）および標的特異的プライマー（表１）を用いたＰＣＲに使用した。具体的には、ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子座のＰＣＲ増幅を、プライマーＣａｍｋ２Ｄ−ＦおよびＣａｍｋ２Ｄ−Ｒを用いて行った。ＴＧＦＢＲ１遺伝子座のＰＣＲ増幅は、プライマーＴＧＦβＲ１−ＦおよびＴＧＦβＲ１−Ｒを用いて行った。サーモサイクラーの条件は、９８℃３０秒を１サイクル、９８℃１０秒、６３℃３０秒、７２℃１分を３１サイクル、および７２℃１分を１サイクルに設定した。ＰＣＲ反応は、最終的には４℃に保った。
【００７３】
５）次世代シーケンシングおよび解析
ＰＣＲアンプリコンを、２段階クリーンアップで高分子量（ＨＭＷ）ゲノムＤＮＡおよび残存プライマーを除去することにより、ライブラリー調製のために洗浄した。ＨＭＷ ＤＮＡを、０．６ｖ／ｖ比のＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を添加することによって除去し、透明な上清を新しいプレートに移した。移した上清に０．２ｖ／ｖのＡｍｐｕｒｅＸＰビーズを添加することによってプライマーを除去し、透明になるまで再び磁石上に置き、次いで上清を廃棄した。ビーズを８０％ＥｔＯＨで２回洗浄し、風乾し、２０μｌの水に再懸濁してＤＮＡを溶出した。生成物をＴａｐｓｔａｔｉｏｎ  ＨＳＤ５０００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりサイズについてモニターし、Ｑｕｂｉｔ  ＨＳ  ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて定量した。洗浄したＰＣＲ生成物を、製造元の標準試薬量の半分の使用量に従うように修正したＮｅｘｔｅｒａＸＴキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に使用した。サンプルには、Ｉｌｌｕｍｉｎａの標準インデックスキットを使用して、最大３８４のｉ５／ｉ７のユニークな組み合わせで、一意的にインデックスを付けた。増幅を、加熱蓋をして、７２℃で３分、９８℃で１分、その後９８℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分を１２〜１４サイクル行った後、７２℃で５分の最終伸長を行い、４℃まで冷却した。ライブラリーを、上記と同じＡｍｐｕｒｅＸＰビーズプロトコールに従ってサイズ選択し、１５μｌの水中に溶出した。生成物を、Ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎ  ＨＳＤ１０００（Ａｇｉｌｅｎｔ）で泳動し、ＡＢＩ用のＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ定量キット（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてｑＰＣＲによって定量した。ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ用のＫＡＰＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、ＴＥｐＨ８．０中でそれぞれ４ｎＭに正規化し、適切な比率の容量でプールした。標準的なＩｌｌｕｍｉｎａプロトコールに従って、ライブラリーを変性させ、１２ｐＭに希釈し、１％ｖ／ｖのＰｈｉＸコントロールを添加した。実行パラメーターは、１５０ｂｐペアエンド、デュアルインデックス８ｂｐにそれぞれ設定し、ＭｉＳｅｑ３００ｖ２試薬キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用した。サンプルは、ＭｉＳｅｑ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｖ２．６またはｂｃｌ２ｆａｓｔｑ  ｖ２．１７を使用して逆多重化した（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）。リードの重複排除後のガイド部位での対象範囲は、クローンサンプルでは約３００倍、多様な非クローン集団の評価では最低３０００倍に設定した。
【００７４】
ＮＳＤデータ解析は、自社開発のパイプラインを用いて実行した。手短に言うと、ＰＲＩＮＳＥＱを使用して、ペアエンドリードに対して品質フィルタリングを実行した。フィルタリングしたリードを、次いで、ＢＷＡで参照ゲノムに対してアライメントし、次に、インデルの検出を向上させるために、ＡＢＲＡ（ａｓｓｅｍｂｌｙ−ｂａｓｅｄ  ｒｅａｌｉｇｎｅｒ）を用いてリアライメントした。品質保証のために、アンプリコンのカバレッジ深度を調べ、挿入及び欠失頻度についてアンプリコン領域全体を調査した。ＣＲＩＳＰＲ部位のインデル頻度を計算するために、ターゲットウィンドウとしてｓｇＲＮＡ配列（１８−２０塩基）を使用し、このウィンドウに及ぶ野生型およびインデルリードの数を数えた。さらに、インデルリードは、本ウィンドウ内に、少なくとも１つの挿入または欠失塩基を有する必要があり、一方、野生型リードは、点突然変異は考慮せずに、本ウィンドウ内にインデルを有さない。インデルの全体的な割合の他に、インデルの破壊性（ｄｉｓｒｕｐｔｉｖｅｎｅｓｓ）を評価するために、インフレームのインデルの割合を計算した（Mose, L. E., et al. (2014). “ABRA: improved coding indel detection via assembly-based realignment.” Bioinformatics 30(19): 2813-2815）。インデル長ヒストグラムおよび他の全てのチャートは、Ｒを用いてプロットした。ｓｇＲＮＡガイド領域およびそのフランキング領域における、点突然変異の頻度もまた調べた。相同組換え修復（ＨＤＲ）プロジェクトでは、ＨＤＲ効率を評価するために、オリゴタイプを分類した。
【００７５】
６）ＣＡＭＫ２Ｄ野生型配列および変異配列を検出するためのｄｄＰＣＲアッセイ
製造元の指示に従い、ＱＸ２００（登録商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲＳｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ）を用いた。ＣＡＭＫ２Ｄ野生型配列および変異配列を検出するためのｄｄＰＣＲアッセイは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓを使用してデザインし、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）に注文した。ｄｄＰＣＲ反応物は、以下のように、標準的なプロトコールを用いて組み立てた。プローブ用ｄｄＰＣＲスーパーミックス（ｄＵＴＰなし）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）を、１６０ｎｇのサンプルゲノムＤＮＡ、１μｌの２０×ＦＡＭアッセイおよび１μｌの２０×ＶＩＣアッセイ（１×ＣＡＭＫ２Ｄ−ｄｄＰＣＲプライマーＦおよびＣＡＭＫ２Ｄ−ｄｄＰＣＲプライマーＲ各９００ｎＭ、１ｘプローブ各２５０ｎＭ）、５ユニットの制限酵素ＢａｍＨＩ−ＨＦ（登録商標）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、ＭＡ）、および最終反応容量２０μｌにするための水と、組み合わせた。ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒを用いて、反応液を約２０，０００個の１ナノリットルのドロップレットに変換し、このスーパーミックスの製造業者の推奨に従って、サーマルサイクリング用の９６ウェルプレートに移した。サーマルサイクリング後、ドロップレットをＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒで読み取り、蛍光振幅に基づき、ポジティブとネガティブに割り当てた。プライマーおよびプローブ配列は、表１に列挙している。
【００７６】
７）トランスフェクト細胞における「低温ショック」実験
トランスフェクションの１日前に、ｍｃ−ＩＰＳＣをトランスフェクションのセクションに記載されているように２４ウェルプレートに播種し、４つのグループ（Ｐ１−Ｐ４）に分けた。グループＰ１〜Ｐ３は３７℃で保ち、Ｐ４は３２℃で２４時間インキュベートした。細胞を、その後、記載したように、「Ｅｄｉｔ−Ｐｒｏ」を用いて、ＩＶＴｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびｓｓＯＤＮでトランスフェクトした。トランスフェクション後に、グループＰ１は、回収するまで３７℃で保ち、一方、残りのグループは、トランスフェクションの２４時間後に３７℃に戻したグループＰ３を除いて、回収するまで３２℃に移した。細胞を、記載したように、４８時間後にゲノムＤＮＡの単離のために回収し、インデル形成およびＨＤＲを、ｄｄＰＣＲまたはＮＧＳのいずれかにより測定した。
【００７７】
８）追加のトランスフェクション方法
ｍｃ−ｉＰＳＣにおけるＤＮＡの脂質ベーストランスフェクションのために、細胞を、トランスフェクションの１日前に、１ウェルあたり１×１０ ５でＭａｄｒｉｇａｌ被覆２４ウェルプレートに播種した。トランスフェクション当日に、１μｇのｐＸ４５８−ＣＲＩＳＰＲ  ＤＮＡを５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地で希釈し、続いて２μｌのＤＮＡ−Ｉｎ（登録商標）Ｓｔｅｍトランスフェクション試薬（ＭＴＩ−ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）を添加した。相同組換え修復実験のために、脂質添加の前に、様々な量のｓｓＯＤＮを混合物に添加した。サンプルを、ゆるやかに混合し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、混合物全体を細胞に一滴ずつ添加した。プレートを、５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で４８時間インキュベートし、細胞をゲノムＤＮＡ抽出のために回収した。
【００７８】
ｍｃ−ｉＰＳＣにおけるＩＶＴｇＲＮＡおよびＣａｓ９ヌクレアーゼの脂質ベーストランスフェクションについては、手順は、ＤＮＡトランスフェクションに少しの修正を加えた手順と同様であった（Liang, X., et al. (2015). “Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection.” J Biotechnol 208: 44-53）。具体的には、４８０ｎｇのＩＶＴｇＲＮＡおよび２μｇのＣａｓ９ヌクレアーゼを、５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ培地で最初に混合し、室温で１０分保持して安定なＲＮＰ複合体を形成し、その後、２．５μｌのｍＲＮＡ−ＩｎＳｔｅｍまたはＥｄｉｔ−Ｐｒｏ（ＭＴＩ−ＧｌｏｂａｌＳｔｅｍ）を添加した。相同組換え修復実験のために、脂質添加の前に、様々な量のｓｓＯＤＮを混合物に添加した。１００ｎｇのＧＦＰｍＲＮＡもまた、各混合物に添加して、トランスフェクション効率をモニターした。プレートを、５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で４８時間インキュベートし、細胞をゲノムＤＮＡ抽出のために回収した。
【００７９】
ｓｓＯＤＮの有無にかかわらずｐＸ４５８  ＣＲＩＳＰＲプラスミドのヌクレオフェクションのために、ｍｃ−ｉＰＳＣを最初に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ被覆１０ｍｍディッシュ中で、６０〜７０％コンフルエントに達するまで培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、全ての細胞が解離するまで、３ｍｌのＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、３７℃で５〜８分間処理した。細胞を、ＴｅＳＲ培地で再懸濁して、計数した。次に、細胞を１５ｍｌチューブに移し、８０ｇで５分間遠心した。上清を除去した後、細胞を、１×１０７／ｍｌで、Ｐ３またはＰ４ヌクレオフェクション溶液（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に再懸濁した。２０μｌの細胞懸濁液をチューブに移し、１μｇのｐＸ４５８−ＣＲＩＳＰＲを、各チューブに添加した。相同組換え修復実験については、様々な量のｓｓＯＤＮもまた、混合物に添加した。次いで、懸濁液を、泡が発生しないよう注意しながら、８ウェルストリップ（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の各ウェルに移し、Ａｍａｘａ（登録商標）４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、プログラムＣＭ−１１３またはＣＥ−１１８により、エレクトロポレーションした。ヌクレオフェクトした細胞を、各ウェルにおいて、１０μＭのＲＯＣＫ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｙ−２７６３２と共に、５００μｌの予熱したｍＴＥＳＲ培地を含むＭａｔｒｉｇｅｌ被覆２４ウェルプレートの個々のウェルに、直接プレーティングした。プレートを、５％ＣＯ２のインキュベーターにおいて、３７℃で４８時間インキュベートし、その後細胞を、ゲノムＤＮＡ抽出のために回収した。
【００８０】
ｍｃ−ｉＰＳＣにおけるＩＶＴｇＲＮＡおよびＣａｓ９たんぱく質のヌクレオフェクションについては、手順は、ＤＮＡヌクレオフェクションに少しの修正を加えた手順と同様であった。具体的には、４８０ｎｇのＩＶＴｇＲＮＡおよび２μｇのＣａｓ９たんぱく質を、ＯｐｔｉＭＥＭ培地で最初に混合し、最終容量５μｌとし、室温で１０分保持して安定なＲＮＰ複合体を形成した。相同組換え修復実験のために、様々な量のｓｓＯＤＮもまた、混合物に添加した。該複合体を、その後、Ｐ３またはＰ４ヌクレオフェクション溶液中の、２０μｌの細胞懸濁液に移し、上述のように、Ａｍａｘａ（登録商標）４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ  Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、プログラムＣＭ−１１３またはＣＥ−１１８を用いて、エレクトロポレーションした。
【００８１】
結果
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ＲＮＡ様式および脂質送達を用いた、ｉＰＳＣにおける効率的なＨＤＲ。
ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子内でＨＤＲを生成するための最良の条件を見出すために、遺伝子編集プロトコールのいくつかの局面を評価した。最初に、どのＣＲＩＳＰＲ様式（例えば、オールインワンプラスミドＤＮＡ、ｓｇＲＮＡとＣａｓ９ｍＲＮＡ、またはｓｇＲＮＡインビトロ転写（ＩＶＴ）／Ｃａｓ９リボヌクレオたんぱく質）および送達方法（例えば、ヌクレオフェクション、または大型のＤＮＡおよびＲＮＡ分子の送達の増強のために製剤化された脂質）が、ＰＣＲアンプリコン次世代シーケンシング（ＮＧＳ）によって検出されたように、ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子内の２つの特定の位置（図１ａ）で最大数の２本鎖切断を生じたかを、決定した。各様式および送達方法の、最良のＮＨＥＪ誘導インデル率を、表２に提示している。最適なインデル形成を決定するために使用した条件の完全なマトリックスを、ＨＤＲを促進するための、様式と送達の最良の組み合わせを決定するために再試験し、これらもまた表２に提示している。ＣＲＩＳＰＲ認識配列を破壊するようにデザインされた４つの塩基変化の組込みと、同じオリゴ上にＣＡＭＫ２Ｄのキナーゼをノックアウトしたバージョンを作り出すようにデザインされた特定の変異の組込みを測定するために、多重ｄｄＰＣＲアッセイを使用した（図１ｂ）。非ＨＤＲ野生型対立遺伝子を特異的に検出する異なるプローブを用いて、野生型の編集されていない配列の量を決定した（図１ｂ）。ドナーオリゴデザインは、ホモロジーアームの長さに関して対称性であり、ＣＲＩＳＰＲ切断部位は、目的のキナーゼノックアウト変異に、できるだけ近い位置であった。ドナー配列はまた、非標的ＣＲＩＳＰＲ切断鎖（＋）と相同であった。オリゴにより導入された４つのサイレント変異は、ガイドＣＡＭＫ−ＣＲ２のＣＲＩＳＰＲ認識配列を４つの位置で変更し、ガイドＣＡＭＫ−ＣＲ１においては、ＰＡＭ配列を変異させ、３つの配列変化を導入した。アッセイは、異なるＤＮＡ配列の両方の合成フラグメントを用いて、ＨＤＲドナーオリゴ配列についてヘテロ接合性およびホモ接合性であることが知られているＨＥＫ２９３細胞で以前に作製されたクローンにおいて、検証した（データ不掲載）。比較した全ての条件についての最良のＨＤＲ率を表２に提示し、最良の組み合わせについてのデータを図２ａに提示している。ＩＶＴ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡおよびＥｄｉｔＰｒｏ（登録商標）脂質については、ＣＡＭＫ−ＣＲ１に対しては全対立遺伝子の９％がドナーオリゴ配列を組み込んでいたこと、およびＣＡＭＫ−ＣＲ２に対しては対立遺伝子の１９％がドナーオリゴ配列を組み込んでいたことを確認した（図２ｂ）。ｄｄＰＣＲの結果を確認するために、ｉＰＳＣのトランスフェクト集団由来のＰＣＲアンプリコンに対してＮＧＳを実施した（図２ｃ）。ＣＡＭＫ−ＣＲ１およびＣＡＭＫ−ＣＲ２の両方を伴うＩＶＴ ｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ｍＲＮＡについて、遺伝子座へのＨＤＲの成功を示すであろう目的の塩基変化は、正確なゲノム座標で、かつ、ｄｄＰＣＲによって決定されるものと厳密に一致する頻度で観察され、ｄｄＰＣＲアッセイによって直接測定されなかった２つのグアニン置換を含んでいた。これら２つの置換は、ｓｇＲＮＡアニーリングを破壊するよ���にデザインされたサイレント変異よりも、ＣＲＩＳＰＲ切断部位に対してより遠位であり、より低い頻度で観察された。
【表２】
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【００８２】
ＩＩ．「低温ショック」は、ＨＤＲ率を増加させる。
３２℃で増殖および維持されたＴ抗原温度感受性不死化細胞株は、３７℃で増殖させた同様の細胞株よりも、より効率的にＨＤＲが生じたという以前の観察に基づいて（データ不掲載）、ｍｃ−ｉＰＳ細胞株を、様々な間隔の３２℃にさらした場合に、ＨＤＲの効率に影響を与えるかどうかを試験した。実験のデザイン、および、得られた、各温度でのｄｄＰＣＲによって測定されたＨＤＲが生じた対立遺伝子全体の百分率を、表３に提示する。ＨＤＲのベースラインとして３７℃での通常の培養条件を使用すると（グループＰＬ１）、１０ｐｍｏｌおよび３０ｐｍｏｌの濃度において、それぞれ、ガイドＣＡＭＫ−ＣＲ１については７．５０％および５．０％、ガイドＣＡＭＫ−ＣＲ２については１６．１６％および８．８６％のＨＤＲ頻度が観察された。細胞をトランスフェクション直後に３２℃に移し、その状態で２４時間保持し、さらに２４時間３７℃に移動した場合に（グループＰＬ２）、ＨＤＲにおいて１．８〜２．３倍の統計的に有意な増加を観察した。この効果は、より低いＨＤＲ効率がベースラインで観察された３０ｐｍｏｌ濃度で、より顕著であった。トランスフェクション後に４８時間、細胞を３２℃にさらすと（グループＰＬ３）また、ＨＤＲについて統計的に有意な効果があり、ＨＤＲが２．０〜３．６倍増加し、さらにＨＤＲがベースラインでより低かった条件では、この効果はより顕著であった。
【表３】
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【００８３】
ＩＩＩ．「低温ショック」および代替１本鎖オリゴヌクレオチドドナーデザインは、ＨＤＲの効率に影響を及ぼす。
最近のデータは、的確なドナーオリゴデザインは、ドナーオリゴＨＤＲの効率に、劇的な影響を及ぼし得ることを、示唆している。より具体的には、ＣＲＩＳＰＲ切断部位に関して非対称的な長さであり（切断部位に近い側の方が短い）、かつ非標的鎖（Ｃａｓ９によって最初に切断されない鎖）と相補的な配列を有するオリゴは、ＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子座を編集するために採用したデザイン、すなわちＣＲＩＳＰＲ切断部位を囲んで対称性であり、かつ標的鎖に相補的であるオリゴよりも、より効率的なＨＤＲのプロモーターである（１４）。２つのデザインを直接比較し、さらにＨＤＲに対する低温ショックの効果をテストするために、対称性の標的鎖オリゴドナーで観察されたＨＤＲの量を、同じ配列変更を導入するようにデザインした、非対称性の非標的鎖オリゴドナーで観察されたＨＤＲの量と比較する、遺伝子編集実験を計画した（図１ｂ）。アンプリコンベースＮＧＳによりＨＤＲの量を決定し、得られた配列データを、いくつかの方法で解析した：
１）該遺伝子座でのＨＤＲ全体の量、すなわち、目的の変化の全部または一部が存在するかどうかに関わらない、オリゴ組換え修復（ｏｌｉｇｏ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ）の量；
２）目的の６つすべての塩基変化が完全であるオリゴ組換え修復である「完全ＨＤＲ」を表したＨＤＲのパーセンテージ（完全オリゴ％）；
３）変換された配列にインデルが再導入されたために一度修復されたが、再編集されたと推定されるＨＤＲのパーセンテージ（編集オリゴ％）；および
４）配列に２つのより遠位の配列変化（目的のＣＡＭＫ２キナーゼノックアウト変異）がみられないように、部分的オリゴ組換え修復が生じた、ＨＤＲパーセンテージ（部分的オリゴ％）（図３ａおよび表４）。
【００８４】
ｄｄＰＣＲによって最初に観察されたように、ガイドＣＡＭＫ−ＣＲ２は、ベースライン条件で、すなわち、細胞が３７℃でトランスフェクトされ維持される条件で、ガイドＣＡＭＫ−ＣＲ１よりも、全ＨＤＲはより低いが、ＨＤＲ全体を促進する上でより効率的であった（図２ｂおよび図３ａ）。全ての温度条件およびオリゴ濃度にわたるＨＤＲ全体の量は、ガイドＣＡＭＫ−ＣＲ１と同等であった。概して、統計的に有意なＨＤＲ全体の増加が、温度、ガイドおよびオリゴデザインのすべての比較にわたって観察された（図３ａおよび表４）。ガイドＣＡＭＫ−ＣＲ１については、両方のオリゴについてＨＤＲ全体の量が、３つの温度条件にわたって、本質的に同じであり、両方のオリゴデザインについてＰＬ３温度条件下で、約２．９倍のＨＤＲ全体の増加が観察された（図３ａ）。ＣＡＭＫ−ＣＲ２については、対称性のオリゴＣ−ＣＲ２に対するＨＤＲ全体の倍数の増加は約２．４倍であったが、反応の大きさはある種のＨＤＲが生じた対立遺伝子の４０％であった（図３ａ）。非対称性デザインＣ−ＣＲ２については、ＰＬ１とＰＬ３との間で３．５倍のＨＤＲの増加が観察されたが、反応の大きさは、対称性のガイドで観察されたものの約半分であった（図３ａ）。しかしながら、「低温ショック」の結果として観察された「完全」ＨＤＲの量のみを考慮すると、用いたオリゴのタイプは、特にガイドＣＡＭＫ−ＣＲ２に対して劇的な効果を有し、最初の２つのデザインの間でのＨＤＲ全体の違いはより大きく、対称性のオリゴデザインが６つすべてのヌクレオチド変化の変換を導く点で優れていた（図３ｂおよび表４）。ガイドＣＡＭＫ−ＣＲ１については、ＨＤＲ全体の量は、全ての温度条件にわたって、両方のオリゴタイプについて同様であり、「完全」ＨＤＲの量はまた、対称性のオリゴについてより多かったが、その差はＰＬ３条件下においてのみ統計的に有意であった（図３ｂおよび表４）。
【表４−１】
2020510443.tif 000007
【表４−２】
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【表４−３】
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【表４−４】
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【００８５】
これらの所見を別の遺伝子座に拡張するため、および「低温ショック」とオリゴデザインのＨＤＲにおける効果をさらにテストするために、ＴＧＦＲＢ１遺伝子座にサイレント変化とＳＮＰを挿入する遺伝子編集実験をデザインした。テストした２つのガイドの位置は図４ａに示し、４つのドナーオリゴの配列、目的の配列変更の位置、およびそれらのガイド位置との関係を、図４ｂおよび図４ｃに示す。ガイドＴＲ−ＣＲ２は、目的のＡからＣへの配列変化の３’側におよそ３１ｂｐの位置で切断を導くように、デザインした（図４ｂ）。対称性および非対称性ドナーオリゴは両方とも、該遺伝子座でのガイド認識および再編集を妨げるようにデザインされた、３つのさらなる配列変化も含有していた。ホモロジーアームの長さもまた、図４ｂに列挙している。ガイドＴＲ−ＣＲ３は、目的のＣからＴへの配列変化の３’側におよそ３０ｂｐの位置で切断させるように、デザインした（図４ｃ）。ＴＲ−ＣＲ２およびそのｓｓＯＤＮと同様に、変換された遺伝子座の再編集を防ぐために、３つのさらなるサイレント配列変更も含んだ。ホモロジーアームの長さを、ガイドＴＲ−ＣＲ２に用いられるｓｓＯＤＮに、できるだけ近いように、デザインした（図４ｃ）。
【００８６】
ＩＶＴｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＡ脂質形式を使用すると、両方のＣＲＩＳＰＲはｍｃ−ｉＰＳＣ株におけるインデルの生成において効率的であり、修復オリゴが存在しない場合、ＮＧＳによって決定されるように、インデルを有する対立遺伝子のパーセントは、ＴＲ−ＣＲ２については９２％、ＴＲ−ＣＲ３については６４％であった。両方の修復オリゴが存在する場合、ガイドＴＲ−ＣＲ２は、３７℃の条件ＰＬ１において、対称性オリゴＴ−ＣＲ２については６０％、非対称性デザインについては４２％の、非常に効率的なＨＤＲ全体率を導いた（図５ａおよび表５）。ガイドＴＲ−ＣＲ３については、対称性および非対称性のデザインそれぞれについて、３７℃で、４１％および３４％のＨＤＲ全体パーセンテージが観察された（図５ａおよび表５）。
【００８７】
ＣＡＭＫ２Ｄで観察されたように、３２℃で、２４時間（グループＰＬ２）または４８時間（グループＰＬ３）のいずれかで、細胞を培養すると、ＨＤＲの増加をもたらした；しかしながら、その効果は、３７℃で開始した場合の比較的高いＨＤＲ率を考えると、概して最小であり、大抵の場合、統計的有意性には達しなかった（図５ａおよび表５）。しかしながら、「低温ショック」効果は、３７℃での「完全ＨＤＲ」の量が対称性オリゴよりも少なかった非対称性オリゴで、より顕著であった。ここでは、ガイドＴＲ−ＣＲ２および非対称性ドナーＴ−ＣＲ２については、３７℃で観察されたＨＤＲ全体の量（ＰＬ１）を、細胞を３２℃で４８時間培養したときに観察された量（ＰＬ３）と比較した場合に、統計的有意性が達成され、ガイドＴＲ−ＣＲ３および非対称性ガイドＴ−ＣＲ３については、ＰＬ２およびＰＬ３条件の両方で、統計的有意性が達成された（図５ａおよび表５）。しかしながら、「低温ショック」およびベースライン条件の結果として観察された、「完全」ＨＤＲの量のみを考慮すると、用いたオリゴのタイプは劇的な効果を有していた（図５ｂおよび表５）。１つ（ＴＲ−ＣＲ２／ＰＬ３）を除くすべての比較において、対称性のドナーオリゴは、「完全」ＨＤＲ修復を導くことにおいて、それらに対応する非対称性ドナーオリゴよりも、統計的に有意に優れていた（図５ｂおよび表５）。
【表５−１】
2020510443.tif 000011
【表５−２】
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【表５−３】
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【表５−４】
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【００８８】
ＩＶ.ベースＨＤＲ率がより低いほど、「低温ショック」はより効果的である。
研究中の特定のｍｃ−ｉＰＳＣ株以外の細胞タイプにおいて「低温ショック」が効果的であるかどうかを調べるために、表３のデータを導出するのに用いたのと同一のＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子編集実験をＨＥＫ２９３細胞において繰り返し、ｄｄＰＣＲを用いてＨＤＲレベルを決定し（表６）、ＮＧＳによって具体的なＨＤＲカテゴリーを決定した（図６および表７）。両方のＣＡＭＫ２ＤｓｇＲＮＡおよび２つのドナーオリゴ濃度についての、ベースラインのＨＤＲ全体のレベルは、３７℃で約１％であった（表６、表７および図６）。これらの結果は、プラスミドベースのオールインワンＣＲＩＳＰＲ様式（データ不掲載）と、独立した実験においてｉＰＳＣに使用されたＩＶＴｓｇＲＮＡ／Ｃａｓ９ＲＮＡ様式の両方を使用して得た。これは、ＨＥＫ２９３細胞株を同じ相対的効率でトランスフェクトしたにもかかわらず、１０ｐｍｏｌ濃度のＣＡＭＫ−ＣＲ１およびＣＲ２について、ＨＤＲ全体レベルがそれぞれ１０％および２０％を超えたｍｃ−ｉＰＳＣ株において観察されたものとは対照的である（図３ａおよびデータ不掲載）。遺伝子座および細胞タイプが遺伝子編集のレベルを決定することができる程度は、他者によって記載されている（８）。しかしながら、３７℃で観察された低いＨＤＲ率にもかかわらず、２４時間（ＰＬ２）および４８時間（ＰＬ３）の両方の条件下での「低温ショック」は、最良のｓｇＲＮＡであるＣＡＭＫ−ＣＲ２について、ｄｄＰＣＲによって決定されるように、２４時間および４８時間の条件の両方において、ＨＤＲ全体で、統計的に有意な６．９倍の増加をもたらした（表６）。両方のガイドおよび全ての条件が、「低温ショック」に応答して、ＨＤＲ全体で、統計的に有意な増加をもたらした（図６および表７）。
【００８９】
アンプリコンベースＮＧＳおよび解析により、ガイドＣＡＭＫ−ＣＲ２についてのＰＬ１対ＰＬ３の比較を除いて、「低温ショック」が両方のガイドについて、統計的に有意なＨＤＲ全体の増加をもたらしたことを、確認した。概して、「完全」ＨＤＲの増加は、両方のガイドおよびすべての条件について、５〜２０倍を超えた（図６および表７）。
【表６】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【表７−３】
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【００９０】
Ｖ．「低温ショック」は、多能性マーカーの発現に影響を及ぼさない
低温期間にｍｃ−ＩＰＳＣをさらすことが、様々な細胞系譜への分化能に影響を及ぼし得るかどうかを試験するために、該プロセスがＨＤＲ率に影響を及ぼしたかどうかを決定するために用いたのと同じ「低温ショック」プロトコールを行い、その発現が多能性の指標であるたんぱく質抗原を認識する抗体で、細胞を染色した。これらの研究の結果は、マーカーＳＳＥＡ３、ＮａｎｏｇおよびＯＣＴ４の発現が、細胞を、２４時間または４８時間のいずれにおいても、３２℃の温度条件にさらした結果、変化しないことを証明している（図７ａ―ｃ）。
【００９１】
ＶＩ．「低温ショック」は、様々な温度条件において、ＨＤＲ率を上昇させるのに効果的である。
細胞を３２℃より低い温度条件にさらすことの効果を試験するために、我々は、前述の細胞培養プロトコールを繰り返し、２４時間と４８時間の両方について、３０℃、２８℃、並びに３２℃のいずれかに、ｍｃ−ＩＰＳＣをさらした。
【００９２】
得られたＰＣＲアンプリコンを、ｄｄＰＣＲおよびＮＧＳの両方で、解析した（表８、表９、および図８）。一般に、ＨＤＲ全体の増加（表９および図８）と「完全」ＨＤＲの増加（図８）は、テストした３つの温度間で同等であり、これらのデータはＨＤＲの増加が３２℃の温度条件に依存しないことを示している。
【表８】
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【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【００９３】
考察
ＣＲＩＳＰＲベースのゲノム工学方法論の急速な発展は、この技術から最大の利益を得るために不可知論的（ａｇｎｏｓｔｉｃ）かつ体系的な評価プロセスを必要とする。ここに、ｍｃ−ｉＰＳ株において、ＨＤＲを促進するうえで非常に効果的な、最適化されたＣＲＩＳＰＲ様式／送達の組み合わせを報告する。次に、この方法を用いて、より低温へさらすことがＨＤＲ効率を高めることができるかどうかを評価し、２４時間または４８時間、３２℃すなわち「低温ショック」にさらすことが、ＨＤＲ率を２倍以上高めることができることを見出した。ＤＮＡ修復酵素の化学的阻害により修復プロセスを非相同末端結合からＨＤＲへと「追いやる」こと（１６）、および他のインヒビターによりＧ２／Ｍ境界で細胞をブロックおよび同調させること（１３）を含んで、ＨＤＲ率を上昇させる方法を見出すためにかなりの努力が払われていることを考えると、我々の方法は、特に遺伝子編集が治療の場で適用されている場合には、より広い応用を有し得る、より「生理学的な」アプローチを提供する。
【００９４】
興味深いことに、「低温ショック」効果は、より低いＨＤＲ率（対立遺伝子の１〜２０％）が観察される場合に、より劇的であり、ベースのＨＤＲ率が３０％以上を超えて増加するにつれて減少する。これは、少なくともこのアプローチにより、変更することができる対立遺伝子の数についての理論的限界を示唆している。「低温ショック」がＨＤＲを増加させる正確なメカニズムは、現在研究中である。Ｚｎフィンガーヌクレアーゼがインデル形成を増加させるのと同様のメカニズムが、有望であり得る（１７）。ＣＡＭＫ２ＤガイドＣＡＭＫ−ＣＲ１およびＴＧＦＢＲ１ガイドＴＲ−ＣＲ２で観察されたように、非常に効率的なＣＲＩＳＰＲを用いた場合のインデル形成に対する「低温ショック」の効果は、最小限であることが観察された。逆に、ＨＥＫ２９３細胞のＣＡＭＫ２Ｄ遺伝子座で観察されたように、切断効率およびインデル形成がより低い場合、切断効率およびインデル形成の増加はより顕著である。インデル形成の増加は、明らかにより高いＨＤＲ率に寄与し得るが、「低温ショック」で観察されたすべての上昇を説明するわけではなく、また「完全ＨＤＲ」が低温条件下で好まれる理由を説明するわけでもない。ＨＤＲ率の上昇に寄与し得る可能性のあるメカニズムは、３２℃で細胞を増殖させることが細胞周期に影響を及ぼし、より多くの細胞がＧ２／Ｍに蓄積することである；しかし、これまでの我々の初期の所見では、この仮説を裏付ける細胞周期効果は何ら示されていない（データ不掲載）。３つ目の、そしてより寄与している可能性の高い要因は、低温が組換え中間体を安定させるように作用する熱力学的効果を有することである。メカニズムを詳細に理解するために、研究が現在進められている。潜在的懸念の一つは、「低温ショック」が多能性に悪影響を及ぼす可能性があることである。多能性の３つの標準的マーカー、Ｏｃｔ４、ＳＳＥＡ３、Ｎａｎｏｇ（１８、１９）を見た予備的分析は、これが問題ではないことを示唆しているが、Ｎａｎｏｇ発現のいくらかの喪失は低温に長期間さらされることで起こるのかもしれない（図７）。「低温ショック」が効果的であって、細胞株や応用を超えて一般化可能であることを保証するためには、明らかにより多くの研究が必要である。
【００９５】
我々はまた、ＨＤＲを促進するために使用されるドナーオリゴの構造が、生じるＨＤＲの全体の頻度と種類の両方に大きな影響を与える可能性があることも示す。試験した２つの遺伝子座おいて、対称性の標的鎖および非対称性の非標的鎖の両方のオリゴデザインが、高レベルにＨＤＲ全体をもたらすことができたが、特に「低温ショック」の条件下では、対称性の標的鎖オリゴが、非対称性の非標的鎖オリゴよりも効率的に、「完全ＨＤＲ」をもたらした。これらのデータは、Richardson et al.のデータ（１４）と一致していないが、我々のデータは、ドナーオリゴが同じ鎖に対してデザインされているPaquet et alのデータ（１５）と一致している。
【００９６】
要約すると、我々は、ＨＤＲプロセスによって、定方向の（ｄｉｒｅｃｔｅｄ）ゲノム配列変更が効率的に生じた細胞集団を得るために、ヌクレオフェクションまたは選択の使用を必要としない、ｉＰＳＣにおいて遺伝子編集を行うためのプロトコールを開発した。我々はまた、ＨＤＲが、より低温に、単純に、短時間、生理学的にさらされることを導入することによって、効果的に増加され得ることを示したが、これは多くのゲノム工学応用にわたって広く有用であろう。
【００９７】
参考文献
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
2020510443.tif 000027
【図３−２】
2020510443.tif 000028
【図４】
2020510443.tif 000029
【図５−１】
2020510443.tif 000030
【図５−２】
2020510443.tif 000031
【図６】
2020510443.tif 000032
【図７−１】
2020510443.tif 000033
【図７−２】
2020510443.tif 000034
【図７−３】
2020510443.tif 000035
【図８】
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【配列表】
2020510443000001.app
【国際調査報告】
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2020510443.tif 000038
2020510443.tif 000039
2020510443.tif 000040
2020510443.tif 000041
2020510443.tif 000042