(57)【要約】  本発明は、以下のステップを含む、生物学的サンプル中の野生型（ＷＴ）ＢＲＡＦタンパク質とそのタンパク質変異体とのモル比を定めるための方法を開示している。ａ）グルタミン酸残基に対するＣ末端のペプチド結合、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基に対するＣ末端のペプチド結合を特異的に切断するセリンプロテイナーゼを用いることによって前記サンプルを消化して、プロテイナーゼによるペプチドの消化によってもたらされたペプチドフラグメントを含む組成物を得るステップであって、前記フラグメントの質量は前記野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質と１つの前記ＢＲＡＦタンパク質変異体とで異なる。ｂ）質量分析技術を用いて、野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質の消化からもたらされたペプチドフラグメントのモル量と、野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質の変異体の消化からもたらされたペプチドフラグメントのモル量とを定量的にアッセイするステップ。および、ｃ）定量的評価に基づいて、前記ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその前記変異体との少なくとも１つの特異的比率を算出するステップ。さらに、ＢＲＡＦ関連疾患のための所与の薬物処置に対する対象の感受性を推定するための方法。加えて、ＢＲＡＦ関連疾患を有する対象のための処置の方法。【選択図】図１
2020514684.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的サンプル中の野生型（ＷＴ）ＢＲＡＦタンパク質とそのタンパク質変異体とのモル比を定めるための方法であって、
ａ）グルタミン酸残基に対するＣ末端のペプチド結合、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基に対するＣ末端のペプチド結合を特異的に切断するセリンプロテイナーゼを用いることによって前記サンプルを消化して、前記プロテイナーゼによる前記ペプチドの消化によってもたらされたペプチドフラグメントを含む組成物を得るステップであって、前記フラグメントの質量は前記野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質とＢＲＡＦタンパク質変異体とで異なる、ステップと、
ｂ）質量分析技術を用いて、野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質の消化からもたらされたペプチドフラグメントのモル量と、前記野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質の変異体の消化からもたらされたペプチドフラグメントのモル量とを定量的にアッセイするステップと、
ｃ）前記定量的評価に基づいて、前記ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との少なくとも１つの特異的比率を算出するステップとを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ＢＲＡＦタンパク質変異体は、ＷＴ  ＢＲＡＦのアミノ酸位置６００に対応する位置において突然変異した変異体であり、前記ＷＴ  ＢＲＡＦにおいて前記位置はバリンによって占められている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＢＲＡＦタンパク質変異体はＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｒ、および／またはＶ６００Ｋである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記セリンプロテイナーゼはグルタミルエンドペプチダーゼ（Ｇｌｕ−Ｃ）である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記消化ステップは、前記サンプルを酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、および／またはリン酸緩衝剤で処理するステップを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルは腫瘍組織サンプルまたは体液である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプルは腫瘍組織であり、前記腫瘍組織は悪性メラノーマ、甲状腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳腫瘍癌、低悪性度神経膠腫、または卵巣癌腫瘍からの組織である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記定量的評価ステップにおいて用いられる野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質の消化によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号１および／または配列番号８によるポリペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記定量的評価ステップにおいて測定される前記野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質のタンパク質変異体の消化によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、および／または配列番号１０によるポリペプチドである、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記質量分析技術は、質量分析技術に整合する液体クロマトグラフィーである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
質量分析技術に整合する前記質量液体クロマトグラフィーはＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳである、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
ＢＲＡＦ関連疾患のための所与の薬物処置に対する対象の感受性を推定するための方法であって、
（ｉ）ＢＲＡＦ関連疾患である対象からのサンプルを提供し、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法によってＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比を定めるステップ、
（ｉｉ）前記ＢＲＡＦ関連疾患であり、かつ前記所与の薬物処置に感受性であることが既知である対象からの多数のサンプルから定められたＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比の基準値と、ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体とのモル特異的比とを比較するステップ、
（ｉｉｉ）前記比較に基づいて、所与の薬物処置に対する前記対象の感受性を定めるステップを含み、
前記サンプル中の前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの比率が、前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの前記比率の基準値よりも高いことで、所与の薬物処置に対する感受性の増加が示される、前記方法。
【請求項１３】
前記薬物処置は、たとえばベムラフェニブ、ダブラフェニブ、またはソラフェニブなどのキナーゼ阻害剤を用いた処置である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
所与の薬物処置に対する対象の感受性が処置前および処置後にモニタされ、ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比の動作前および動作後の変化は腫瘍組織の突然変異状態の変化を示す、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＢＲＡＦ関連疾患を有する対象に対する処置の方法であって、以下を提供するステップ、
（ｉ）ＢＲＡＦ関連疾患である対象からのサンプルを提供し、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法によってＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比を定めるステップと、
（ｉｉ）前記ＢＲＡＦ関連疾患であり、かつ前記所与の薬物処置に感受性であることが既知である対象からの多数のサンプルから定められたＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比の基準値と、ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体とのモル特異的比とを比較するステップと、
（ｉｉｉ）前記比較に基づいて、所与の薬物処置に対する前記対象の感受性を定めるステップであって、前記サンプル中の前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの比率が、前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの前記比率の基準値よりも高いことで、所与の薬物処置に対する感受性の増加が示される、ステップと、
（ｉｖ）もし患者が所与の薬物処置に対して感受性であることが見出されれば、処方されたかもしくは規定された１日用量（ＤＤＤ）の前記薬物処置の前記薬物を処方された処置期間投与するか、あるいは
もし前記患者が所与の薬物処置に対して感受性でないことが見出されれば、代わりにたとえば手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、および／または前記ＢＲＡＦ関連疾患に対して有益なその他の処置などの代替処置を開始するステップとを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に、医学的診断および標的療法の分野に関する。より具体的に、本発明は、質量分析の方法によってセリン／スレオニンプロテインキナーゼＢＲＡＦ配列の野生型および突然変異型のアミノ酸スペシエーションを決定するための特異的方法に関する。より具体的に、この方法は、たとえばアミノ酸位置６００などの点突然変異を有するＢＲＡＦ配列を分析する能力に関する。さらに本発明は、キナーゼ阻害剤によるメラノーマ患者の個別化処置に対する決定を行うための臨床的有用性を提供することに関する。
【背景技術】
【０００２】
今日の癌医療において増加し続ける要求から、研究団体に対して費用対効果を改善しながら臨床結果を改善できる新たな解決策を開発することが高度に予測および方向付けされていることが公知である。これらの課題に応答して、現代医療は患者にとってより効率が良くかつ有益であり、さらによりコストの少ないやり方で患者を処置するやり方を探求している。より安全で死亡率が低く、かつ効力が早く現れる薬物を期待している癌患者の要求に対処してそれを満たすために、規制指示の概要は我々研究団体にとって極めて重要である。
【０００３】
米国国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の一部である米国国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）ならびに地域の臨床医および科学者は、タンパク質バイオマーカーの発見および検証戦略を実行および提供することに大きな進歩を遂げてきた。これらの規制ガイドラインによって、健康、疾患、治療法への応答に対する高品質の標準化、感受性、特異的、定量的、かつ容易にアクセス可能なタンパク質、ペプチド、またはその他のバイオマーカーが規制当局（例、米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）；ＦＤＡ）の承認プロセスに提供される。
【０００４】
癌による死の約２２％の原因はタバコの使用によるものであることは、周知の事実である。別の１０％は、太り過ぎおよび肥満、貧しい食生活、ならびにしばしば身体運動の不足およびアルコールの過剰消費によるものである。その他の因子は、特定の感染症ならびに／または感染症および環境汚染物質への露出を含む。発展途上国における癌の２０％近くは、たとえばＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、およびヒトパピローマウイルスなどの感染症によるものである。これらの因子は、少なくとも部分的に、細胞の遺伝子およびタンパク質を変えることによって作用する。典型的に、癌が発達する前に多くのこうした遺伝子変化が必要とされる。統計上、癌の約５〜１０％は、人物の両親から遺伝した遺伝子の欠陥によるものである。
【０００５】
個別化医療は、個々の患者に合わせた医療処置モデルである。個別化医療においては、患者の遺伝的内容またはその他の分子もしくは細胞の分析の状況に基づいて、適切な処置を選択するためにしばしば最適な治療法が用いられる。遺伝情報を使用する薬理ゲノミクスは、個別化医療の特定の態様において主要な役割を演じており、この用語は、最初は遺伝学の状況において作られたが、それから広がってすべての種類の標的個人読み取り診断テストを包含するようになった。
【０００６】
各々すべての患者を個別にスクリーニングおよび測定することは、より正確な診断および個別化した活動計画を可能にするだろう。現代の遺伝子型判定は、個体のＤＮＡ配列の詳細な記述を提供する。次いで、想定できる疾患状態を説明し得る現存の遺伝子の変動を評価するために、彼らのゲノムを基準ゲノムと比較することができる。
【０００７】
「個別化医療」を用いた標的療法による正確な処置は、予防ケアの進歩を大きく助け得る。このことは、長年にわたって、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２遺伝子のそれぞれにおける特定の突然変異に対して女性を遺伝子型判定して、メラノーマ、乳癌、および／または卵巣癌の家族歴による傾向を調査したときに証明された。
【０００８】
ゲノム内に存在する突然変異によってマッピングされた多数の疾患症状の発生源の同一性によって、個体において容易に同定され得るものほど処置に成功する機会が増すことが示される。コンパニオン診断は、標的とする患者グループまたはサブグループに対して特異的な薬物の有効性および安全性をテストするために用いられる定義である。多くの場合に、コンパニオン診断アッセイは、治療処置の有効性を高めることに適応する。
【０００９】
今日、現代医療において、医師がしばしば自身の患者にとって最も有効な処置療法を見出すまで試行錯誤手順を用いることは共通している。よって、非常に複雑な疾患生物学における処置ガイダンスを助け得る新規の方法を伴う、個体を考慮した処置法の改善が有利であろう。
【００１０】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ：Ｍｉｔｏｇｅｎ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｋｉｎａｓｅ）シグナル伝達および対応する経路活性化は、細胞生育、分化、およびストレス応答において中心的役割を果たす。癌疾患において、ＭＡＰＫ経路活性は、多くの種類の癌発達に関与している。この経路は一般的に、膜結合受容体への細胞外成長因子の結合によって活性化され、次いでこの膜結合受容体が細胞内タンパク質を細胞膜に入れて、小さいグアノシン三リン酸結合タンパク質であるＲＡＳの活性化をもたらす。よって、ＲＡＳは、下流のシグナル伝達を刺激する活性化した立体構造をとる。その結果として、細胞内の広範囲の機能プロセスを制御するＥＲＫのリン酸化および活性化がもたらされることとなる。この経路は、ＢＲＡＦを含む特異的タンパク質の突然変異によっても活性化され得る。こうした活性化突然変異は、ＢＲＡＦの制御性のリン酸化を模倣し、野生型タンパク質に比べてキナーゼ活性を増すと考えられる。
【００１１】
悪性メラノーマは世界で６番目に多い癌であり、北部欧州諸国およびオーストラリアにおいて発病率が増加している。世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によると、世界中で毎年約１３２０００の新たなメラノーマの症例が診断されている。初期のメラノーマの症例の大部分は、外科的に治癒される。しかし、一部の原発腫瘍は再発して転移性となる。米国癌合同委員会（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｉｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ）（ＡＪＣＣ）の腫瘍の進行度分類は、腫瘍の厚さ、有糸分裂速度および潰瘍化、ならびに局所および遠隔の伝播に基づいている。悪性メラノーマは本質的に処置が困難であり、５年生存率が非常に低い（＜１５％）。
【００１２】
ＭＡＰＫシグナル伝達を恒常的に引き起こし、上流の刺激の必要性をバイパスするＢＲＡＦ突然変異は、悪性メラノーマにおいて高い発生率で起こる。したがって、薬物の影響によるＢＲＡＦＶ６００Ｅキナーゼ活性の細胞阻害は、ＭＥＫおよびＥＲＫリン酸化の減少をもたらすことになる。ヒトの癌において同定されたすべてのＢＲＡＦ突然変異の約９０％は、エクソン１５におけるＴ１７９９Ａトランスバージョンであり、その結果としてＶ６００Ｅアミノ酸置換およびＢＲＡＦキナーゼ活性化がもたらされる。腫瘍における高頻度の活性化突然変異および結果として起こるＭＡＰＫ経路の常習性から、ＢＲＡＦは魅力的な治療法の標的となり、ＢＲＡＦＶ６００Ｅおよびその他の活性化ＢＲＡＦ突然変異体のキナーゼ活性を阻害することによって、有効な治療法が提供され得る。
【００１３】
さまざまなレベルの選択性を有するＢＲＡＦ阻害剤が同定され、臨床的にテストされている。癌の広がりおよび疾患の初期段階は、特定の兆候および症状または診断テストによって検出され得る。次いでそれは典型的に、たとえばＸ線コンピュータ断層撮影（ＣＴ：ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ：ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ：ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ）、または質量分析イメージングなどのさまざまなタイプの医療用イメージングプラットフォームによってさらに調査され、生検の病理学診断によって確認される。女性の乳癌および男性の前立腺癌の処置において、診断の発達によって両方の疾患において最近１０年間の死亡率が有意に減少したことによって実証されるとおり、乳癌におけるスクリーニングの利益は、患者および我々の社会の両方にとって有益である。
【００１４】
男性における最も一般的な癌の種類は、肺癌、前立腺癌、結腸直腸癌、および胃癌である。女性において最も頻度の高い事象は、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、および子宮頸癌である。しかし、皮膚およびすべての種類の悪性メラノーマを含めると、これは症例の約４０％を占めるだろう。子供に関する癌の種類はさまざまであり、最も一般的なのは急性リンパ芽球性白血病および脳腫瘍である。しかしアフリカにおいては、最も一般的な癌疾患は、非ホジキンリンパ腫である。癌の財務費用は、２０１０年現在で一年当り１兆１６００億米ドルと推定されている。
【００１５】
ほとんどのメラノーマはＢＲＡＦ、ＮＦ１、ＲＡＳ、ＭＤＭ２（ＫＩＴ）遺伝子に変更を有しており、その結果としてＭＡＰＫおよびＲＡＳ経路の活性化がもたらされて、重要な細胞周期およびアポトーシス細胞機能を再プログラミングすることによって生存優位性が与えられる。臨床および病理学的特性は、メラノーマの同定された（ＢＲＡＦ、ＲＡＳ、ＮＦ１、三重野生型）ゲノムサブタイプを部分的に反映するが、臨床および遺伝学のどちらの観点からも、これらのグループはなおも異種性である。
【００１６】
たとえばキナーゼ阻害剤または免疫応答を調節する薬物などの、標的療法を可能にする新たに開発された薬物は、より有望である。２つの化合物ベムラフェニブおよびダブラフェニブ（キナーゼ阻害剤）は、転移性および切除不能のＢＲＡＦ突然変異（Ｖ６００Ｅ）メラノーマの処置に対して、ＦＤＡの承認を受けた。マイトジェン活性化細胞外シグナル制御キナーゼ（ＭＥＫ：ｍｉｔｏｇｅｎ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）阻害剤であるトラメチニブも、ＦＤＡに承認されている。しかし、これらのより新しい処置は、耐性の発達も受けてきた。最近、ＦＤＡは、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）とイピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４抗体）との組み合わせを、ＢＲＡＦ  Ｖ６００野生型およびＢＲＡＦ突然変異の切除不能転移性メラノーマの両方の患者の処置に対して承認した。
【００１７】
よって、標的キナーゼ阻害剤医療による悪性メラノーマ患者の専用処置を開始する前に、ＢＲＡＦ突然変異およびそれらの結果を個別に調査することが強く要求されている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
したがって、本発明は好ましくは、生物学的サンプル中の野生型（ＷＴ：ｗｉｌｄｔｙｐｅ）ＢＲＡＦタンパク質とそのタンパク質変異体とのモル比を定めるための方法を提供することによって、上に識別した当該技術分野における欠点および不利益の１つ以上を単独または任意の組み合わせで緩和、軽減、または除去することを求め、かつ少なくとも上述の問題を解決するものであり、この方法は以下のステップを含む。ａ）グルタミン酸残基に対するＣ末端のペプチド結合、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基に対するＣ末端のペプチド結合を特異的に切断するセリンプロテイナーゼを用いることによって前記サンプルを消化して、プロテイナーゼによるペプチドの消化によってもたらされたペプチドフラグメントを含む組成物を得るステップであって、前記フラグメントの質量は前記野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質とＢＲＡＦタンパク質変異体とで異なる。ｂ）質量分析技術を用いて、野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質の消化からもたらされたペプチドフラグメントのモル量と、野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質の変異体の消化からもたらされたペプチドフラグメントのモル量とを定量的にアッセイするステップ。および、ｃ）定量的評価に基づいて、前記ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との少なくとも１つの特異的比率を算出するステップ。
【００１９】
加えて、ＢＲＡＦ関連疾患に対する所与の薬物処置に対する対象の感受性を推定するための方法が提供され、この方法は以下のステップを含む。（ｉ）ＢＲＡＦ関連疾患である対象からのサンプルを提供し、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法によってＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比を定めるステップ。（ｉｉ）前記ＢＲＡＦ関連疾患であり、かつ前記所与の薬物処置に感受性であることが既知である対象からの多数のサンプルから定められたＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比の基準値と、ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体とのモル特異的比とを比較するステップ。（ｉｉｉ）前記比較に基づいて、所与の薬物処置に対する対象の感受性を定めるステップであって、前記サンプル中の前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの比率が、前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの比率の基準値よりも高いことで、所与の薬物処置に対する感受性の増加が示される。
【００２０】
さらに、ＢＲＡＦ関連疾患を有する対象に対する処置の方法が提供され、この方法は以下を提供するステップを含む。（ｉ）ＢＲＡＦ関連疾患である対象からのサンプルを提供し、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法によってＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比を定めるステップ。（ｉｉ）前記ＢＲＡＦ関連疾患であり、かつ前記所与の薬物処置に感受性であることが既知である対象からの多数のサンプルから定められたＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比の基準値と、ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体とのモル特異的比とを比較するステップ。（ｉｉｉ）前記比較に基づいて、所与の薬物処置に対する対象の感受性を定めるステップであって、前記サンプル中の前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの比率が、前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの比率の基準値よりも高いことで、所与の薬物処置に対する感受性の増加が示される。および、（ｉｖ）もし患者が所与の薬物処置に対して感受性であることが見出されれば、処方された処置期間にわたり処方されたかもしくは規定された１日用量（ＤＤＤ：ｄｅｆｉｎｅｄ  ｄａｉｌｙ  ｄｏｓｅ）の前記薬物処置の薬物を投与し、あるいはもし患者が所与の薬物処置に対して感受性でないことが見出されれば、代わりにたとえば手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、および／または前記ＢＲＡＦ関連疾患に対して有益なその他の処置などの代替処置を開始するステップ。
【００２１】
本発明が可能であるこれらおよびその他の態様、特徴、および利点は、以下の本発明の実施形態の説明から明らかとなり解明されるだろう。添付の図面が参照される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＢＲＡＦ（野生型および突然変異形）のＳＲＭに基づく定量の一般的な実験手順を示す図である。
【図２】新鮮凍結腫瘍サンプルからの腫瘍組織可溶化物における、ＢＲＡＦの野生型および４つの突然変異体のＧｌｕＣ生成ペプチドに対するＳＲＭシグネチャー前駆物質クロマトグラフィーピークを示す図である。ＷＴ、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｒ、およびＶ６００Ｋに対する滞留時間は、それぞれ１９．９、２３．２、１８．３、１５．９、および１５．８ｍｉｎである。
【図３Ａ】新鮮凍結腫瘍サンプルからの腫瘍組織可溶化物におけるペプチドのＳＲＭシグネチャーを定める特徴的遷移イオンを示す図である。ここには野生型の例が示される。
【図３Ｂ】新鮮凍結腫瘍サンプルからの腫瘍組織可溶化物におけるペプチドのＳＲＭシグネチャーを定める特徴的遷移イオンを示す図である。ここにはＶ６００Ｅの例が示される。
【図４】アミノ酸位置６００におけるＢＲＡＦ突然変異の１つ（Ｖ６００Ｅ）およびＭＥＫリン酸化の減少をもたらすＢＲＡＦＶ６００Ｅキナーゼ活性の細胞阻害を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
近年、癌の分野では、従来の疾患病理学において提示された癌の種類の遺伝的多様さに関して、多くのことが発見された。癌患者の中の腫瘍異種性の定義は、単一の腫瘍における遺伝的多様性である。他の展望の中でも特にこれらの発見は、一般的母集団に適用されて結果が良くなかった薬物が、特定の遺伝プロファイルを有するある割合の症例に対しては良好な結果を出し得ることを確認する可能性を高めるものである。
【００２４】
個別化医療によって、個体に対して処置をより特異的に合わせることができ、彼らのゲノム、ならびにその後の転写物および最終発現タンパク質に基づいて、彼らの身体がその薬物にどのように応答するか、およびその薬物が有効となるかどうかの洞察を与えることができる。遺伝子型判定は個別化医療に対する貴重なツールであり、これは個体のＤＮＡ配列を調べてそれを基準配列と比較することによって、個体の遺伝的構成（遺伝子型）の差異を定めるものである。遺伝子型判定は個体における遺伝子突然変異の存在を発見できるが、遺伝子発現は最もしばしば細胞のタンパク質レベルに対応しないことが公知である。さらに、突然変異および野生型タンパク質の両方を発現する複数の遺伝子が存在する可能性もある。
【００２５】
タンパク質配列決定によって行われる表現型判定は、定量的レベルで真の突然変異および野生型の状態を確認して、ＢＲＡＦの非突然変異および突然変異形の化学量論的測定を提供できる唯一のやり方である。
【００２６】
マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）シグナル伝達および対応する経路活性化は、細胞生育、分化、およびストレス応答において中心的役割を果たす。癌疾患において、ＭＡＰＫ経路活性は多くの種類の癌発達に関与している。この経路は一般的に、膜結合受容体への細胞外成長因子の結合によって活性化され、次いでこの膜結合受容体が細胞内タンパク質を細胞膜に入れて、小さいグアノシン三リン酸結合タンパク質であるＲＡＳの活性化をもたらす。よって、ＲＡＳは下流のシグナル伝達を刺激する活性化した立体構造をとる。その結果として、細胞内の広範囲の機能プロセスを制御するＥＲＫのリン酸化および活性化がもたらされることとなる。この経路は、ＢＲＡＦを含む特異的タンパク質の突然変異によっても活性化され得る。こうした活性化突然変異はＢＲＡＦの制御性のリン酸化を模倣し、野生型タンパク質に比べてキナーゼ活性を増すと考えられる。
【００２７】
ＭＡＰＫシグナル伝達を恒常的に引き起こして上流の刺激の必要性をバイパスするＢＲＡＦ突然変異は、悪性メラノーマにおいて高い発生率で起こる。したがって、薬物の影響によるＢＲＡＦＶ６００Ｅキナーゼ活性の細胞阻害は、ＭＥＫおよびＥＲＫリン酸化の減少をもたらすことになる。これらの翻訳後修飾の機能的効果の結果、初期Ｇ１細胞周期停止、続いて細胞死によって、細胞増殖の阻害がもたらされることになる。
【００２８】
これまでに、特定の癌において高頻度を有する４５を超える癌関連ＢＲＡＦ突然変異が同定されており、４０〜６０％は悪性メラノーマに関連付けられる。ヒトの癌において同定されたすべてのＢＲＡＦ突然変異の約９０％は、エクソン１５におけるＴ１７９９Ａトランスバージョンであり、その結果としてＶ６００Ｅアミノ酸置換およびＢＲＡＦキナーゼ活性化がもたらされる。メラノーマ癌と母斑（皮膚または粘膜の境界がはっきりした慢性的病変）との突然変異の変動は、８０％超であると報告されている。もっと低い範囲の発生率も報告されている。他の腫瘍における０〜１８％の範囲である（Ｎａｍｂａ  Ｈ，Ｎａｋａｓｈｉｍａ  Ｍ，Ｈａｙａｓｈｉ  Ｔ，Ｈａｙａｓｈｉｄａ  Ｎ，Ｍａｅｄａ  Ｓ，Ｒｏｇｏｕｎｏｖｉｔｃｈ  ＴＩ，Ｏｈｔｓｕｒｕ  Ａ，Ｓａｅｎｋｏ  ＶＡ，Ｋａｎｅｍａｔｓｕ  Ｔ，Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｓ（２００３年９月）．「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｔ  ｓｐｏｔ  ＢＲＡＦ  ｍｕｔａｔｉｏｎ，Ｖ５９９Ｅ，ｉｎ  ｐａｐｉｌｌａｒｙ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒｓ」．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８８（９）：４３９３−７．）。
【００２９】
患者の診断において、症例の９０％でヌクレオチド１７９９においてチミンがアデニンに置換されていることが見出された。これはアミノ酸シフトをもたらすことになる。すなわち、バリン（Ｖ）がグルタミン酸（Ｅ）に置換される。このアミノ酸シフトは、活性化セグメント内の６００位置にて起こることになり、過去に詳細に説明されている（Ｔａｎ  ＹＨ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｅｕ  ＫＷ，Ａｎｇ  ＰＷ，Ｌｉ  ＷＱ，Ｓａｌｔｏ−Ｔｅｌｌｅｚ  Ｍ，Ｉａｃｏｐｅｔｔａ  Ｂ，Ｓｏｏｎｇ  Ｒ（２００８年４月）．「Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ」．Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ．４０（３）：２９５−８．）。
【００３０】
腫瘍における高頻度の活性化突然変異および結果として起こるＭＡＰＫ経路の常習性から、ＢＲＡＦは魅力的な治療法の標的となり、ＢＲＡＦＶ６００Ｅおよびその他の活性化ＢＲＡＦ突然変異体のキナーゼ活性を阻害することによって、有効な治療法が提供され得る。
【００３１】
たとえばベムラフェニブなど、Ｖ６００Ｅ突然変異を有する癌を標的とするように設計された薬物が存在し、これはメラノーマ細胞株のプログラム細胞死を引き起こす。しかし、最近患者におけるベムラフェニブの第２相調査において報告されたその応答効率は、Ｖ６００−ＢＲＡＦの突然変異位置におけるＥ６００−ＢＲＡＦへの突然変異を有する転移性メラノーマの患者が、確証された独立に再調査された全体の奏効率５３％を示したという結果であった。無増悪生存期間の中央値は６．８ヵ月であり、全生存期間の中央値は１５．９ヵ月であった（Ｊ．Ａ．Ｓｏｓｍａｎ，Ｋ．Ｂ．Ｋｉｍ，Ｌ．Ｓｃｈｕｃｈｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ＢＲＡＦ  Ｖ６００−ｍｕｔａｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ」Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１２，３６６；８  ７０７−７１４）。
【００３２】
このことは、確証されたＥ６００−ＢＲＡＦ突然変異を有する症例においても、奏効率は患者の半分だけである（５３％）ことを示す。よって、この処置に応答しなかった残りの４７％にとっては、その処置が有効である可能性があるか否かの指示を得て、代わりに他の処置を用いるために時間を取ることは、有益であるだけでなくおそらくは生命にかかわることだったであろう。ベムラフェニブの場合、それはＢ−Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路におけるＢ−Ｒａｆ／ＭＥＫステップを妨げることによって機能する。実際に、プロテアソーム阻害剤に対する脆弱性は、持続的なＢＲＡＦシグナル伝達に依存する。したがって本発明者らは、Ｖ６００Ｅ  ＢＲＡＦの実際のタンパク質レベルと、野生型ＢＲＡＦに対するその比率とが、腫瘍に働きかける処置にとって極めて重要であるものと仮定する。よって、キナーゼ阻害剤による悪性メラノーマの処置を開始する前に、ＢＲＡＦタンパク質のＷＴ対突然変異体の異種性を調査することが強く求められている。特異的タンパク質分析が必須の重要性を有する理由は、キナーゼ阻害剤薬物がタンパク質の三次元構造の特異的領域（単数または複数）に向けて開発されるからである。多くの場合、薬物分子と標的タンパク質（ＢＲＡＦ）との親和性相互作用および結合定数は、この特異的結合にとって最適な所与のエネルギ閾値レベルを有し、このエネルギ閾値レベルは動作ウィンドウによって定められ、このことは癌薬物が正しい三次元構造に対して非常に特異的であることを意味する。ＢＲＡＦタンパク質構造に何らかの変化があると薬物が正しく結合しない可能性があり、結果として異種性ＢＲＡＦタンパク質環境において、薬物分子はＢＲＡＦタンパク質の特異的フラクションのみに正しく結合して阻害する可能性がある。
【００３３】
以下の説明は、野生型および／または突然変異体のＢＲＡＦタンパク質配列の状態を測定するための質量分析法に適用可能な本発明の実施形態に焦点を当てたものである。しかし、本発明はこの適用に限定されず、組織サンプルにおける分子特性および相互作用を測定する他の適用にも適用され得ることが認識されるだろう。突然変異形（単数または複数）のＢＲＡＦおよび非突然変異ＢＲＡＦ（野生型）の定量化が、この方法内で定められ、それによってＢＲＡＦタンパク質の形の定量的読み取りが提供される。
【００３４】
質量分析（Ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）は、非常に高感度で任意の所与の分子の内在特性であるその質量を測定するため、貴重な分析技術である。したがって、広範囲の分子タイプおよび広範囲のサンプルタイプ／生物学的材料を測定するために、ＭＳが用いられ得る。このイオン化プロセスにおいて、前駆イオンは加速によって活性化され、形成されたフラグメントイオンの一部がトラップ内で不安定であるような条件下の質量選択的リニアイオントラップに入る。遅延時間の後に、これまで不安定だったフラグメントの捕捉を可能にするようにイオントラップの安定性パラメータが変更される。その結果、変更された内部エネルギ分布を有する前駆イオンから生じた生成イオンスペクトルが得られる。前駆イオンがリニアイオントラップに入った後の多数のミリ秒にわたって、前駆物質内部エネルギ分布の進展を追跡することが可能である。時間遅延フラグメント化生成物イオンスペクトルは、典型的に逐次フラグメント化生成物の減少を示し、より容易に解釈されるスペクトルをもたらす。時間遅延フラグメント化にとって重要であるいくつかの重要な実験パラメータが識別されており、この技術は小さい前駆イオンおよび多重荷電分子の両方に対する適用を有する。
【００３５】
タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）は、現代の複雑な混合物の質量分析調査のほとんどの中心である。フラグメント化は、前駆イオンの標的ガスとの衝突による活性化を伴い、荷電および中性フラグメントを生成し得る。フラグメントイオンの性質およびその強度は、しばしば前駆イオンの構造を示し、よって未知の分析物の同定のために有用な情報をもたらすことができ、さらに異なるクラスの分析物に対する有用なスクリーニング技術を提供する。多重衝突による活性化は、活性化時間を延長し、かつ前駆イオンにより高いエネルギを蓄積させることを可能にする。衝突ガス圧力がより高いことは、衝突緩和率もより高いことを意味する。
【００３６】
エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ：Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）は、質量分析において最も一般的に用いられるイオン化技術であり、臨床検査室における複雑な生物学的サンプル中のバイオマーカーの定量的測定のためのますます重要な技術となってきている。従来のＥＳＩ−ＭＳは多段階プロセスであり、分析物は最初に質量分析計のイオン化ソースに導入され、そこで分析物は最初にイオン化されて正または負の電荷を取得する。次いで荷電イオンは質量分析計を通過し、イオンはその質量電荷比（ｍ／ｚ値）によって分類および分離される。分離されたイオンは、次いで検出器システムに通されて濃度を測定され、その結果がコンピュータシステムによって質量スペクトルと呼ばれるチャートに表示される。
【００３７】
質量スペクトル分析の前の分析物分画のために高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ：ｈｉｇｈ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）をＥＳＩ−ＭＳに結合するとき、ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳは、複雑な生物学的サンプルを分析するための非常に強力な技術となった。この機器は、たとえば薬物化合物および薬物分子代謝物などの分子種の空間分布を記録することになる。その後、好適な画像処理ソフトウェアを用いて質量分析計からデータをインポートして、サンプルの光学画像の視覚化および比較を可能にできる。
【００３８】
この発明において、本発明者らはサンプル、すなわち消化された新鮮凍結腫瘍、ホルマリン固定およびパラフィン包埋された腫瘍、ならびに生物流体（すなわち体液）を予備分画し、この予備分画には高ｐＨ勾配を有するＨＰＬＣまたは静電クロマトグラフィー分離を用い、その後にＳＲＭアッセイのＭＳ／ＭＳに整合する二次元のナノＨＰＬＣを行う。ＢＲＡＦペプチドの定量的アッセイが腫瘍のＢＲＡＦ状態をタンパク質レベルで明らかにし、野生型および突然変異ＢＲＡＦタンパク質の比率が得られる。野生型と突然変異体とのＢＲＡＦ比は、キナーゼ阻害剤による悪性メラノーマの処置への応答に重要な影響を有するだろう。この比率によって、この比率は誰がその処置の利益を得て応答するかを予測するツールの働きをするだろう。
【００３９】
セリンプロテアーゼのトリプシンは、ＭＳ（／ＭＳ）分析を非常に受けやすいペプチドを生成するため、タンパク質消化に最も一般的に用いられる。タンパク質は、消化の際に酵素的に切断されて限られた数のより短いフラグメントになり、これらのフラグメントはペプチドと呼ばれ、それらの特徴的な質量およびパターンによってタンパク質の同定が可能になる。しかし、さらなる研究から、得られた比率は細胞中のＷＴ  Ｖ６００および突然変異Ｖ６００ＢＲＡＦペプチドの真の比率を模倣していないことが見出された。実際には、腫瘍細胞中に見出される他のタンパク質が、消化のためにトリプシンを用いて野生型のＢＲＡＦから得られるフラグメントと同じ配列を有するフラグメントを生じていたため、ＷＴと突然変異Ｖ６００ＢＲＡＦとの正しくない比率をもたらしており、このことは誤った処置判断をもたらす可能性があった。一般的に用いられる酵素トリプシンは、野生型の形のＢＲＡＦに対する一意のペプチドを生成しない。たとえば、生成される配列ＩＧＤＦＧＬＡＴＶＫ（配列番号１１）は、２つの他のタンパク質ＡＲＡＦ（スイス（Ｓｗｉｚｚ）プロットＰ１０３９８）およびＲＡＦ１（スイス（Ｓｗｉｚｚ）プロットＰ０４０４９）にも見出される。ＢＲＡＦタンパク質基準配列は、スイス（Ｓｗｉｚｚ）プロットＰ１５０５６に見出される。
【００４０】
本発明においては、グルタミン酸およびアスパラギン酸のＣ末端を高特異的に切断するセリンプロテイナーゼ、ここではセリンプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃを用いると、ＢＲＡＦの野生型および突然変異体の両方に対する一意のペプチドが生成されることが見出された。エンドプロテイナーゼＧｌｕＣは、グルタミン酸残基に対するＣ末端のペプチド結合を選択的に切断する。エンドプロテイナーゼＧｌｕＣはアスパラギン酸残基も切断するが、グルタミン酸残基よりも１００〜３００倍遅い速度であるため、グルタミン酸特異的エンドプロテアーゼと呼ばれる。
【００４１】
本発明の一実施形態において、生物学的サンプル中の野生型（ＷＴ）ＢＲＡＦタンパク質とそのタンパク質変異体とのモル比を定めるための方法は、以下のステップを含む。（ａ）グルタミン酸残基に対するＣ末端のペプチド結合、またはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸残基に対するＣ末端のペプチド結合を特異的に切断するセリンプロテイナーゼを用いることによって前記サンプルを消化するステップ。これはプロテイナーゼによるペプチドの消化によってもたらされたペプチドフラグメントを含む組成物を得るためのステップであり、前記フラグメントの質量は前記野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質とＢＲＡＦタンパク質変異体とで異なる。その後（ｂ）質量分析技術を用いて、野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質の消化からもたらされたペプチドフラグメントのモル量と、野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質の変異体の消化からもたらされたペプチドフラグメントのモル量とを定量的にアッセイするステップ。（ｃ）定量的評価に基づいて、前記ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との少なくとも１つの特異的比率を算出するステップ。
【００４２】
一実施形態において、ＢＲＡＦタンパク質変異体は、ＷＴ  ＢＲＡＦのアミノ酸位置６００に対応する位置において突然変異した変異体であり、ＷＴ  ＢＲＡＦにおいて前記位置はバリンに占められている。１つのさらなる実施形態において、ＢＲＡＦタンパク質変異体は、ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｒ、および／またはＶ６００Ｋである。
【００４３】
一実施形態において、セリンプロテイナーゼは、グルタミルエンドペプチダーゼ（Ｇｌｕ−Ｃ）、たとえばセリンエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（ＥＣ３．４．２１．１９）など、たとえばペプチダーゼファミリーＳ１Ｂに属するセリンエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃなど、たとえば黄色ブドウ球菌のＧｌｕＣなど、たとえば黄色ブドウ球菌Ｖ８のＧｌｕＣなど、たとえば黄色ブドウ球菌Ｖ８の配列決定グレードＧｌｕＣ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）などである。黄色ブドウ球菌株Ｖ８のエンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃは、２９．０２ｋＤａの平均分子量を有する。
【００４４】
微小環境および触媒特異性を制御する必要があり、それらはアッセイの緩衝条件によって定められることが見出された。グルタミン酸特異的セリンプロテイナーゼの特異性は、使用される緩衝剤およびｐＨ、ならびに可能な切断部位の周囲の構造に依存する。酢酸アンモニウム（ｐＨ約４）または重炭酸アンモニウム（ｐＨ約８）において、ＧｌｕＣセリンプロテイナーゼは、グルタミル結合を優先的に切断する。本発明者らは、重炭酸アンモニウムの使用によってＢＲＡＦに対する一意のペプチドが生じることを見出し、それらのペプチドはその後のアッセイにおいて一意のＭＳ／ＭＳフラグメントをもたらした。
SEQ ID 1: DLTVKIGDFGLATVKSRWSGSHQFE (WT),
SEQ ID 2: DLTVKIGDFGLATE (V600E),
SEQ ID 3: DLTVKIGDFGLATKKSRWSGSHQFE (V600K),
SEQ ID 4: DLTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE (V600R) and
SEQ ID 5: DLTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)
【００４５】
同様に本発明者らは、リン酸緩衝剤（ｐＨ約８）を用いることによってＧｌｕＣセリンプロテイナーゼがグルタミルおよびアスパルチル結合の両方を特異的に切断するようになることも見出し、よって本発明者らは、以下のＢＲＡＦタンパク質配列による突然変異したより小さいペプチド
SEQ ID 6: FGLATE (V600E),
SEQ ID 7: GLATD (V600D),
を、幾分長い特異的ＢＲＡＦ
SEQ ID 8: FGLATVKSRWSGSHQFE (WT),
SEQ ID 9: FGLATKKSRWSGSHQFE (V600K), and
SEQ ID 10: FGLATRKSRWSGSHQFE (V600R).
ペプチド配列に加えて生成することができた。
【００４６】
一実施形態において、消化ステップは、前記サンプルを酢酸アンモニウム、重炭酸アンモニウム、および／またはリン酸緩衝剤で処理するステップを含む。
【００４７】
一実施形態において、消化ステップは、前記サンプルをｐＨ（２５℃）３．６〜５．６、たとえば３．８〜４．６など、たとえば約４などの酢酸アンモニウムで処理するステップを含む。
【００４８】
一実施形態において、消化ステップは、前記サンプルをｐＨ（２５℃）８．０〜１１．３、たとえば８．２〜９．５など、たとえば約８．５などの重炭酸アンモニウムで処理するステップを含む。
【００４９】
一実施形態において、消化ステップは、前記サンプルをｐＨ（２５℃）５．７〜８、たとえば７．０〜８．０など、たとえば約７．６などのリン酸緩衝剤で処理するステップを含む。
【００５０】
一実施形態において、定量的評価ステップにおいて用いられる野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質の消化によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号１および／または配列番号８によるポリペプチドである。
【００５１】
一実施形態において、定量的評価ステップにおいて用いられる野生型（ＷＴ）ＢＲＡＦタンパク質のタンパク質変異体の消化によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、および／または配列番号１０によるポリペプチドである。
【００５２】
一実施形態において、定量的評価ステップにおいて用いられる野生型（ＷＴ）ＢＲＡＦタンパク質のＶ６００Ｅ  ＢＲＡＦタンパク質変異体の消化によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号２および／または配列番号６によるポリペプチドである。
【００５３】
一実施形態において、定量的評価ステップにおいて用いられる野生型（ＷＴ）ＢＲＡＦタンパク質のＶ６００Ｋ  ＢＲＡＦタンパク質変異体の消化によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号３および／または配列番号９によるポリペプチドである。
【００５４】
一実施形態において、定量的評価ステップにおいて用いられる野生型（ＷＴ）ＢＲＡＦタンパク質のＶ６００Ｒ  ＢＲＡＦタンパク質変異体の消化によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号４および／または配列番号１０によるポリペプチドである。
【００５５】
一実施形態において、定量的評価ステップにおいて用いられる野生型（ＷＴ）ＢＲＡＦタンパク質のＶ６００Ｄ  ＢＲＡＦタンパク質変異体の消化によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号５および／または配列番号７によるポリペプチドである。
【００５６】
よって、ＷＴ（Ｖ６００）ならびに突然変異体（Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｒ、およびＶ６００Ｋ）を有するＢＲＡＦの配列に由来する特異的ペプチドが提供される。ペプチド配列および各ペプチドに対するフラグメント化イオンは、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いた選択的反応モニタリングアッセイ（ＳＲＭ：Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｓｓａｙ）に用いられる。一実施形態において、質量分析技術はＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳである。
【００５７】
プロテアーゼは常に１００％完全なタンパク質の切断を起こすものではないため、消化の際のこうした代替的切断が他の可能なペプチドフラグメントをもたらすことがある。しかし、分析のために質量分析法を用いるとこのことを説明できる。なぜなら、代替的切断によってもたらされるペプチドも尚一意であり、よってＷＴおよび／またはその突然変異体の検出および定量化を可能にするからである。代替的ペプチドのいくつかは、他の変異体よりも頻繁に観察され、かつ／または出現することになる。代替的切断は主に以下のフラグメントをもたらすことが見出された。
SEQ ID 11: LTVKIGDFGLATVKSRWSGSHQFE (WT)
SEQ ID 12: DFGLATVKSRWSGSHQFE (WT)
SEQ ID 13: DLTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)
SEQ ID 14: DFGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)
SEQ ID 15: FGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)
SEQ ID 16: LTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)
SEQ ID 17: DLTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)
SEQ ID 18: LTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)
SEQ ID 19: DFGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)
SEQ ID 20: FGLATEKSRWSGSHQFE (V600E)
SEQ ID 21: LTVKIGDFGLATE (V600E)
SEQ ID 22: DFGLATE (V600E)
SEQ ID 23: DFGLATKKSRWSGSHQFE (V600K)
SEQ ID 24: FGLATKKSRWSGSHQFE (V600K)
SEQ ID 25: LTVKIGDFGLATKKSRWSGSHQFE (V600K)
SEQ ID 26: DLTVKIGDFGLATKSRWSGSHQFE (V600K)
SEQ ID 27: LTVKIGDFGLATKKSRWSGSHQFE (V600K)
SEQ ID 28: DFGLATKKSRWSGSHQFE (V600K)
SEQ ID 29: DFGLATRKSRWSGSHQFE (V600R)
SEQ ID 30: FGLATRKSRWSGSHQFE (V600R)
SEQ ID 31: LTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE (V600R)
SEQ ID 32: DLTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE (V600R)
SEQ ID 33: LTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE (V600R)
SEQ ID 34: DFGLATRKSRWSGSHQFE (V600R)
SEQ ID 35: DFGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)
SEQ ID 36: FGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)
SEQ ID 37: LTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)
SEQ ID 38: DLTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)
SEQ ID 39: LTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)
SEQ ID 40: DFGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)
SEQ ID 41: FGLATDKSRWSGSHQFE (V600D)
SEQ ID 42: DLTVKIGDFGLATD (V600D)
SEQ ID 43: LTVKIGDFGLATD (V600D)
SEQ ID 44: DFGLATD (V600D)
SEQ ID 45: FGLATD (V600D)
【００５８】
１つのさらなる実施形態において、野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質の消化の際の代替的切断によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、定量的評価ステップに用いられる。野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質の消化の際のこうした代替的切断によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号１１および／または配列番号１２によるポリペプチドであってもよい。
【００５９】
１つのさらなる実施形態において、野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質のタンパク質変異体の消化の際の代替的切断によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、定量的評価ステップに用いられる。野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質のタンパク質変異体の消化の際のこうした代替的切断によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、および／または配列番号４５によるポリペプチドであってもよい。
【００６０】
１つのさらなる実施形態において、野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質のＶ６００Ｅタンパク質変異体の消化の際の代替的切断によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、定量的評価ステップに用いられる。野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質のＶ６００Ｅタンパク質変異体の消化の際のこうした代替的切断によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、および／または配列番号２２によるポリペプチドであってもよい。
【００６１】
１つのさらなる実施形態において、野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質のＶ６００Ｋタンパク質変異体の消化の際の代替的切断によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、定量的評価ステップに用いられる。野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質のＶ６００Ｋタンパク質変異体の消化の際のこうした代替的切断によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、および／または配列番号２８によるポリペプチドであってもよい。
【００６２】
１つのさらなる実施形態において、野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質のＶ６００Ｒタンパク質変異体の消化の際の代替的切断によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、定量的評価ステップに用いられる。野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質のＶ６００Ｒタンパク質変異体の消化の際のこうした代替的切断によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、および／または配列番号３４によるポリペプチドであってもよい。
【００６３】
１つのさらなる実施形態において、野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質のＶ６００Ｄタンパク質変異体の消化の際の代替的切断によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、定量的評価ステップに用いられる。野生型（ＷＴ）Ｂ−ｒａｆタンパク質のＶ６００Ｄタンパク質変異体の消化の際のこうした代替的切断によってもたらされるポリペプチドフラグメントは、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、および／または配列番号４５によるポリペプチドであってもよい。
【００６４】
一実施形態において、前記比率は、１つの単一ＢＲＡＦ野生型と１つの単一ＢＲＡＦタンパク質変異体との間のものである。１つの代替的実施形態において、前記比率は、１つの単一ＢＲＡＦ野生型と少なくとも２つのＢＲＡＦタンパク質変異体、たとえば２、３、４、または５つのＢＲＡＦタンパク質変異体との間のものである。
【００６５】
しかし、提供される方法を用いて、もっと多くのペプチドが導出され得る。ＢＲＡＦタンパク質のペプチドの定量的分析は、以下の材料および方法に記載されている。このＳＲＭアッセイは、たとえば消化された新鮮凍結腫瘍、ホルマリン固定およびパラフィン包埋された腫瘍、ならびに生物流体（すなわち体液）などの生物学的サンプルから得られるタンパク質調製物中のＢＲＡＦタンパク質のＷＴまたは突然変異ペプチドの相対レベルまたは絶対レベルを定量化するために用いられ得る。腫瘍組織は、悪性メラノーマ、甲状腺癌、結腸直腸癌、肺癌、低悪性度神経膠腫、または卵巣癌腫瘍からのものであり得る。生物流体は、血漿（ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ヘパリン）、血清、全血、バフィーコート、血小板、尿、および唾液であり得る。
【００６６】
よって本発明の一実施形態において、サンプルは腫瘍組織サンプルまたは体液である。１つのさらなる実施形態において、サンプルは腫瘍組織であり、この腫瘍組織は、好ましくは悪性メラノーマ、甲状腺癌、結腸直腸癌、肺癌、低悪性度神経膠腫、または卵巣癌腫瘍からの組織である。１つのさらなる実施形態において、サンプルは体液であり、好ましくはこの体液は血漿（ＥＤＴＡ、クエン酸塩、ヘパリン）、血清、全血、バフィーコート、および血小板である。
【００６７】
感受性および特異性の改善のために、ＢＲＡＦおよびその突然変異タンパク質の形に対する新規の抗体を提供する新たな抗体ライブラリの生成および産生のための基礎として、現行のペプチドを用いることもできる。
【００６８】
ＳＲＭアッセイの結果は、生物学的サンプル（例、癌組織）中のＢＲＡＦタンパク質の突然変異およびＷＴ変異体の正確な定量的レベル、ならびに生物学的サンプル内のＷＴ対突然変異の異種性の程度のために用いられ得る。生物学的サンプル内のＢＲＡＦペプチドの異種性に関する情報は、医師またはその他の医療専門家が患者に対する適切な治療法をより正確に定めることを可能にできる。こうしたＳＲＭアッセイは、どの患者がキナーゼ阻害剤に応答する可能性が最も高いかを予測できる。たとえばベムラフェニブなどのキナーゼ阻害剤は、６００アミノ酸位置に特異的に作用および結合するように開発されており、その結合特性は、野生型ではなく突然変異した６００位置に対して最適化されている。このことは、図４に示されるアミノ酸位置６００のＢＲＡＦ突然変異によって例示されている。
【００６９】
本発明の一実施形態において、質量分析技術は、質量分析技術に整合する液体クロマトグラフィーである。１つのさらなる実施形態において、質量分析技術に整合する質量液体クロマトグラフィーは、ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＭＳである。
【００７０】
一実施形態において、ＢＲＡＦ関連疾患のための所与の薬物処置に対する対象の感受性は、ＢＲＡＦ関連疾患である対象からのサンプルを提供するステップによって推定される。ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比が定められる。前記ＢＲＡＦ関連疾患であり、かつ前記所与の薬物処置に感受性であることが既知である対象からの多数のサンプルから定められたＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比の基準値と、ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体とのモル特異的比とが比較される。前記比較に基づいて、所与の薬物処置に対する対象の感受性を定め、前記サンプル中の前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの比率が、前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの比率の基準値よりも高いことで、所与の薬物処置に対する感受性の増加が示される。
【００７１】
１つのさらなる実施形態において、薬物処置とは、たとえばベムラフェニブまたはソラフェニブなどのキナーゼ阻害剤を用いた処置のことである。
【００７２】
メラノーマ患者に対する処置後の診断の要求もまだまだ満たされておらず、ここで突然変異状態およびタンパク質レベルでのＷＴに対する比率の結果を定める方法は、患者の状態の有効性を提供できる患者の読み取りテストである。これは、患者が異種性突然変異プロファイルを有する細胞を含む腫瘍を有し、その処置が腫瘍細胞の一部のみを特異的に標的として腫瘍全体の収縮をもたらすような場合には重要であり得るが、薬物処置に応答しないより小さい腫瘍を残している。
【００７３】
よって一実施形態において、所与の薬物処置に対する対象の感受性が処置前および処置後にモニタされ、ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比の変化が定められて、腫瘍組織の突然変異状態の変化を示す。よって、特異的モル比の変化は、その処置が所与の処置に感受性である腫瘍細胞の根絶に成功したことを示すものかもしれない。しかし、残った他の腫瘍細胞を根絶するためにフォローアップ処置が必要なことがある。よって本発明の方法は、初期の腫瘍細胞に対するＢＲＡＦ処置への感受性を探索するため、および残りの腫瘍細胞の後処置のための両方に用いられてもよい。
【００７４】
加えてこの方法は、腫瘍組織内にＢＲＡＦ６００ＶからＥへの突然変異を除くその他の突然変異が存在し得るときの、ＷＴ  ＢＲＡＦに対する比率決定に関する。こうして、この方法および革新内で測定された比率に関するアッセイ読み取りが、ホモ接合性ＷＴ対突然変異ＢＲＡＦの患者、およびヘテロ接合性ＷＴ対突然変異ＢＲＡＦの患者も示す。このとき、患者の材料から単離されたＤＮＡにおいてＶからＥ−ＢＲＡＦが検出されるときに、ＶからＥ−ＢＲＡＦ突然変異に対して選択的である阻害剤に対して、分子テストによる診断が用いられる。これは、現在の標準的な診療であり、典型的には患者から生検材料が単離され、それがホルマリンで固定されてパラフィンに包埋される。このテストはこの設定に対する特定的なものであり、ＦＤＡに承認されている。これらのＶからＥ−ＢＲＡＦ突然変異のアッセイ内での接合状態は、ルーチン的に評価されない。よって１つのさらなる実施形態において、ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比は、ホモ接合性ＷＴ対突然変異ＢＲＡＦの患者、およびヘテロ接合性ＷＴ対突然変異ＢＲＡＦの患者も示す。
【００７５】
ベムラフェニブは、ヘテロ接合性または野生型ＢＲＡＦではなく、ホモ接合性ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ突然変異を有するメラノーマ細胞において、ＩＦＮによってＭＨＣ分子の誘導を増強できることが示されている。ＭＨＣ分子は、腫瘍細胞とリンパ球との相互作用のために重要であり、ベムラフェニブによるＭＨＣ発現の増強は、腫瘍細胞の免疫認識を促進し得る。免疫系関連遺伝子の発現に対するベムラフェニブのこの効果は、メラノーマ患者においてルーチン的に確立されていないＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅの接合状態に依存するものかもしれない（Ｓａｐｋｏｔａ  Ｂ，Ｈｉｌｌ  ＣＥ，Ｐｏｌｌａｃｋ  ＢＰ．Ｖｅｍｕｒａｆｅｎｉｂ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ＭＨＣ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＢＲＡＦ（Ｖ６００Ｅ）ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２０１３；２：ｅ２２８９０）。メラノーマにおけるホモ接合性のＶからＥ−ＢＲＡＦ突然変異のパーセンテージは不明確だが、遺伝子レベルで頻繁に起こる。従来の配列決定手順によって評価されたＶからＥ−ＢＲＡＦ突然変異を有するメラノーマ患者のおよそ５０％がホモ接合性であることが公知である（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎ  ＪＣ，Ｓｚｎｏｌ  Ｍ，Ｐａｖｌｉｃｋ  ＡＣ，Ａｒｉｙａｎ  Ｓ，Ｃｈｅｎｇ  Ｅ，Ｂａｃｃｈｉｏｃｃｈｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖ６００Ｋ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｍｏｎｇ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＢＲＡＦ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＢＲＡＦ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ＰＬＸ４０３２．Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１０；８：６７）。加えて、ＶからＥ−ＢＲＡＦの接合状態は時間とともにヘテロ接合性からホモ接合性に変化でき、このことは異なる解剖学的位置からの異時性メラノーマ転移において示された。メラノーマが一旦転移段階に達すると、その後のメラノーマ転移における突然変異状態は変化しないようであった。ＶからＥ−ＢＲＡＦは、初期（良性母斑にも存在する）突然変異事象において安定したものとして出現した（Ｓｉｇａｌｏｔｔｉ  Ｌ，Ｆｒａｔｔａ  Ｅ，Ｐａｒｉｓｉ  Ｇ，Ｃｏｒａｌ  Ｓ，Ｍａｉｏ  Ｍ．Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ＢＲＡＦ  Ｖ６００Ｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ：ｎｅｗ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｕｃｃｅｓｓ？  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１１；１０５：３２７−８）。
【００７６】
よって一実施形態において、対象のＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比におけるＢＲＡＦタンパク質変異体が時間とともに増加することは、ヘテロ接合性およびホモ接合性突然変異の変化または蓄積を示すものであってもよく、これは疾患の性質の根拠となる。
【００７７】
記載される本発明の方法を用いると、医師はＢＲＡＦ関連疾患である個体に対する標的処置に対してより良好な処置決定を行うことができるだろう。よって一実施形態において、ＢＲＡＦ関連疾患を有する対象に対する処置の方法は、ＢＲＡＦ関連疾患である対象からのサンプルを提供するステップを含む。ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比が定められる。前記ＢＲＡＦ関連疾患であり、かつ前記所与の薬物処置に感受性であることが既知である対象からの多数のサンプルから定められたＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比の基準値と、ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体とのモル特異的比とが比較される。前記比較に基づいて、所与の薬物処置に対する対象の感受性を定め、前記サンプル中の前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの比率が、前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの比率の基準値よりも高いことで、所与の薬物処置に対する感受性の増加が示される。もし患者が所与の薬物処置に対して感受性であることが見出されれば、処方されたかまたは規定された１日用量（ＤＤＤ）の前記薬物処置の薬物を投与する。ベムラフェニブについて、こうした処方された用量は、５００〜２０００ｍｇ、たとえば９６０ｍｇなどを経口で１日２回であってもよい。ダブラフェニブについて、こうした処方された用量は、５０〜３００、たとえば１５０ｍｇなどを１日２回であってもよい。ソラフェニブについて、こうした処方された用量は、２００〜８００、たとえば４００ｍｇなどを１日２回であってもよい。処置の持続時間は通常、有効性に到達するか、または許容できない毒性が起こるまでである。もし患者が所与の薬物処置に対して感受性でないことが見出されれば、これは、たとえば手術、放射線療法、化学療法、免疫療法、および前記ＢＲＡＦ関連疾患に対して有益なその他の処置などの他の処置を代わりに用いなければならないことを示す。
【００７８】
１つの代替的実施形態において、ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質と、その少なくとも２つのタンパク質変異体との特異的モル比が定められる。前記ＢＲＡＦ関連疾患であり、かつ前記所与の薬物処置に感受性であることが既知である対象からの多数のサンプルから定められたＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその少なくとも２つの変異体との特異的モル比の基準値と、前記ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質と前記その少なくとも２つの変異体とのモル特異的比とが比較される。前記比較に基づいて、所与の薬物処置に対する対象の感受性を定め、前記サンプル中の前記少なくとも２つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの比率が、前記少なくとも２つのＢＲＡＦタンパク質変異体に対するＷＴ  ＢＲＡＦの比率の基準値よりも高いことで、所与の薬物処置に対する感受性の増加が示される。
【００７９】
患者が所与の薬物処置に対して感受性であることが見出されるとき、前記薬物の投与は併用処置の形であってもよい。こうした併用処置は、たとえばダブラフェニブとトラメチニブとの組み合わせなどの併用療法を含んでもよい。加えてこうした併用処置は、患者が感受性であることが見出された薬物の投与と、たとえば手術、放射線療法、化学療法、および免疫療法などの他の処置との組み合わせであってもよい。よって一実施形態において、処置は併用処置の形である。１つのさらなる実施形態において、こうした併用処置は２つの薬物を用いた併用療法の形であるか、または１つの薬物とたとえば手術、放射線療法、化学療法、および免疫療法などの１つの他の処置形との併用療法の形である。
【００８０】
加えて、ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とそのタンパク質変異体とのモル特異的比は低、中間、および高と分類されてもよく、ここで低は１０超：１の比を含み、中間は１０：１から１：１０、高は１：１０超を含む。よって一実施形態において、ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とそのタンパク質変異体とのモル特異的比は低、中間、および高と分類され、ここで低は１０超：１の比を含み、中間は１０：１から１：１０、高は１：１０超を含む。
【００８１】
腫瘍ＢＲＡＦ変異体が顕著に優位を占めている場合、処置はより効果的であることが予期される。腫瘍ＢＲＡＦ野生型が顕著に優位を占めている場合、処置はより効果が低いことが予期される。一実施形態において、ＢＲＡＦ関連疾患を有する対象に対する処置の方法は、ＢＲＡＦ関連疾患である対象からのサンプルを提供するステップを含む。ＷＴ  ＢＲＡＦタンパク質とその変異体との特異的モル比が定められる。一実施形態において、前記サンプルにおけるＷＴ  ＢＲＡＦ対前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体の比が低い（１０超：１）ことは、所与の薬物処置に対する低い感受性を示す。一実施形態において、前記サンプルにおけるＷＴ  ＢＲＡＦ対前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体の比が中間（１０：１から１：１０）であることは、所与の薬物処置に対する少なくとも部分的な感受性を示す。加えてこのことは、ＷＴ  ＢＲＡＦを有するものとＷＴ  ＢＲＡＦを有さないものとの両方の細胞集団を有する異種性腫瘍を示してもよい。一実施形態において、前記サンプルにおけるＷＴ  ＢＲＡＦ対前記少なくとも１つのＢＲＡＦタンパク質変異体の比が高い（１：１０超）ことは、所与の薬物処置に対する高い感受性を示す。もし患者が所与の薬物処置に対して感受性であることが見出されれば、処方されたかまたは規定された１日用量（ＤＤＤ）の前記薬物処置の薬物を投与する。
【００８２】
材料および方法
以下の実施例はさらなる実施例であり、決して本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本発明は添付の請求項のみによって限定される。
【００８３】
ヒト組織のサンプル調製
−２０Ｃにて実行するクリオスタットを用いて、腫瘍からの凍結組織サンプルを１０×１０μｍの厚さの切片にスライスした。２００μｌの５０ｍＭ重炭酸アンモニウムおよび６Ｍ尿素の中で切片を溶解した。ホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍組織を、ミクロトームを用いて切片にするか、またはパラフィン包埋ブロックからコアを切り取った。Ｅｎ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＴＭ  ＦＬＥＸ  ｔａｒｇｅｔ  ｒｅｔｒｉｖａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（高ｐＨ）（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク（Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて、切片またはコアを脱パラフィンし、９８Ｃにて１０分間加熱した。サンプルを、４Ｃにて１４０００×ｇで１０分間遠心分離した。表面に浮遊するパラフィンを除去し、回収溶液（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を吸引した。このステップを１回繰り返した。このサンプルに、３００μＬの５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中の６Ｍ塩化グアニジンを加えた。サンプルをＢｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ２５０（出力４、１０％デューティサイクル）で２分間超音波処理した後、１００００ｇにて５分間遠心分離した。
【００８４】
サンプル中のタンパク質の量は、ＢＣＡ法（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によって定めた。固定量（１５０μｇ）のタンパク質を１０ｍＭ  ＤＴＴで還元し（３７℃にて１ｈ）、４０ｍＭヨードアセトアミドを用いてアルキル化し（３０ｍｉｎ、室温にて暗さを保った）、その後５０ｍＭ重炭酸アンモニウム緩衝剤（ｐＨ７．６）による緩衝剤交換を行った。次いでサンプルを１：２０ｗ／ｗ（酵素：タンパク質）の比率の配列決定グレードＧｌｕＣ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって、３７℃にて一晩消化した。３０μＬの１％ギ酸を加えることによって、消化を停止した。遠心蒸発器を用いてサンプルを乾燥し、１５０μＬの１％ギ酸に再懸濁し、１００００ｇにて５分間遠心分離した。さらなる使用のときまで、上清を−８０℃にて保存した。
【００８５】
ペプチド
Ｒｅａｄ  Ｇｌｅａｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＡＢ（Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎ）によって、９５％より高純度のペプチドの供給を受けた。
【００８６】
遷移リストの生成
Ｓｋｙｌｉｎｅ  ｖ３．１．０ソフトウェア（ＭａｃＣｏｓｓ  Ｌａｂ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）にて遷移リストを作成した。最初に、２＋、３＋、および４＋荷電状態における各ペプチドに対して、多い数の遷移、基準に適合するすべての可能なｙイオンシリーズ（ｍ／ｚ＞前駆物質−２から最終イオン−２、前駆物質ｍ／ｚ排除ウィンドウ：２０Ｔｈ）を選択した。
【００８７】
ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅトリプル四重極ＭＳを用いたＳＲＭアッセイの開発
ＴＳＱ  Ｖａｎｔａｇｅトリプル四重極質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いたナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、ペプチド混合物を分析した。ＴＳＱは、Ｅａｓｙ  ｎ−ＬＣＩＩポンプ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を備えていた。サンプルを、プレカラムＡｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ１００Ｃ８（５×０．３ｍｍ、５μｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に注入し、オンライン脱塩および濃縮の後に、Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ１００Ｃ８（１５０μｍ×０．０７５ｍｍ、３μｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）においてペプチドを分離した。０．１％ギ酸を含有する１０〜３５％アセトニトリルからの３５ｍｉｎ直線勾配において分離を行った。流速は３００ｎＬ／ｍｉｎであった。ＭＳ分析は正イオンモードで行い、スプレー電圧およびデクラスタリング電位はそれぞれ１７５０Ｖおよび０に設定した。トランスファーキャピラリ温度を２７０℃に設定し、Ｓレンズの振幅は１４３であった。単位分解能（０．７ＦＷＨＭ）にて動作するＱ１およびＱ３においてＳＲＭ遷移を取得し、Ｑ２における衝突ガス圧力を１．２ｍＴｏｒｒに設定した。サイクル時間は３．０ｓであった。Ｓｋｙｌｉｎｅのデータのマニュアル検査によって前駆物質当りの遷移を選択し、最終アッセイに対してスケジュールした遷移リストを作成した。ヒトＭＭ組織消化物にペプチド混合物を加えることによって、選択した遷移を実際のマトリックスにおいてテストした。
【００８８】
ＱＥｘａｃｔｉｖｅ  ＭＳを用いたＳＲＭアッセイの開発
ＱＥｘａｃｔｉｖｅ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を用いたナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって、ペプチド混合物を分析した。ＱＥｘａｃｔｉｖｅは、Ｅａｓｙ  ｎ−ＬＣ１０００ポンプ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を備えていた。サンプルをプレカラムＡｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ１００Ｃ８（５×０．３ｍｍ、５μｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）に注入し、オンライン脱塩および濃縮の後に、Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ１００Ｃ８（１５０μｍ×０．０７５ｍｍ、３μｍ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）においてペプチドを分離した。０．１％ギ酸を含有する５〜４０％アセトニトリルからの６０ｍｉｎ直線勾配において分離を行った。流速は３００ｎＬ／ｍｉｎであった。Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計において、ｍ／ｚ４００〜１６００の範囲で分解能７０，０００（ｍ／ｚ２００）によって全ＭＳ走査を取得した。標的値は１．００Ｅ＋０６であった。この方法はＢＲＡＦペプチドに対する包含リストを含んでおり、荷電状態２以上を有する１５の最も強いピークを３０％の標準化衝突エネルギを有するＨＣＤ衝突セルにおいてフラグメント化し、ｍ／ｚ２００における分解能１７，５００を有するＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計においてタンデム質量スペクトルを取得した。標的値は１．００Ｅ＋０５であった。イオン選択閾値は３．３０Ｅ＋０５カウントであり、最大許容イオン蓄積時間は全ＭＳ走査に対して１００ｍｓであり、タンデム質量スペクトルに対して６０ｍｓであった。Ｓｋｙｌｉｎｅのデータのマニュアル検査によって前駆物質当りの遷移を選択し、最終アッセイに対してスケジュールした遷移リストを作成した。ヒトＭＭ組織消化物にペプチド混合物を加えることによって、選択した遷移を実際のマトリックスにおいてテストした。
【００８９】
結果
よってＶ６００ＷＴ、Ｖ６００Ｅ、Ｖ６００Ｄ、Ｖ６００Ｒ、およびＶ６００Ｋに対する１０の一意のペプチドフラグメントを見出し、その一部を図２に示しており、ここには新鮮凍結腫瘍サンプルからの腫瘍組織可溶化物における、ＢＲＡＦの野生型および４つの突然変異体のＧｌｕＣ生成ペプチドに対するＳＲＭシグネチャー前駆物質クロマトグラフィーピークを示す。ペプチドに対する対応するＳＲＭシグネチャーを得て、これを図３においてＡ）野生型およびＢ）Ｖ６００Ｅについて示している。表１は、これらのペプチド（配列番号１から配列番号５）のＳＲＭ／ＭＲＭシグネチャークロマトグラフィーピークに対する特徴をさらにまとめたものである。
【００９０】
単一アミノ酸の突然変異誘発は、患者における疾患状態および疾患の進行度分類に機能的に影響を与えることになる可能性のあるタンパク質配列の組み合わせを与える。このことをアミノ酸位置６００におけるＢＲＡＦ突然変異によって例示し、図４に示す。
【００９１】
以下は、ＢＲＡＦペプチドに対するＧｌｕＣペプチド配列および選択したＳＲＭ遷移のリストを含む。
SEQ ID NO: 1: DLTVKIGDFGLATVKSRWSGSHQFE
モノアイソトピック質量：２７７９．１０
前駆物質ｍ／ｚ：１３８９．７１４（荷電状態：２）
遷移ｍ／ｚ：1548.7554 (y13), 1447.7077 (y12), 1348.6393 (y11), 1220.5443 (y10), 1133.5123 (y9), 977.4112 (y8), 791.3319 (y7), 704.2998 (y6), 647.2784 (y5), 560.2463 (y4), 423.1874 (y3), 1332.2006 (y24), 1275.6586 (y23), 1225.1348 (y22), 1175.6006 (y21), 1111.5531 (y20), 1055.0111 (y19), 1026.5003 (y18), 968.9868 (y17), 895.4526 (y16), 866.9419 (y15), 810.3999 (y14), 774.8813 (y13), 724.3575 (y12), 674.8233 (y11), 610.7758 (y10), 567.2598 (y9), 489.2092 (y8), 396.1696 (y7), 352.6536 (y6), 324.1428 (y5)。
【００９２】
前駆物質ｍ／ｚ：９２６．８１１８（荷電状態：３）
遷移ｍ／ｚ：1548.7554 (y13), 1447.7077 (y12), 1348.6393 (y11), 1220.5443 (y10), 1133.5123 (y9), 977.4112 (y8), 791.3319 (y7), 704.2998 (y6), 647.2784 (y5), 560.2463 (y4), 423.1874 (y3), 1332.2006 (y24), 1275.6586 (y23), 1225.1348 (y22), 1175.6006 (y21), 1111.5531 (y20), 1055.0111 (y19), 1026.5003 (y18), 968.9868 (y17), 895.4526 (y16), 866.9419 (y15), 810.3999 (y14), 774.8813 (y13), 724.3575 (y12), 674.8233 (y11), 610.7758 (y10), 567.2598 (y9), 489.2092 (y8), 396.1696 (y7), 352.6536 (y6), 324.1428 (y5), 888.4695 (y24), 850.7748 (y23), 817.0923 (y22), 784.0695 (y21), 741.3711 (y20), 703.6765 (y19), 684.6693 (y18), 646.3270 (y17), 597.3042 (y16), 578.2970 (y15), 540.6023 (y14), 516.9233 (y13), 483.2407 (y12), 450.2179 (y11), 407.5196 (y10), 378.5089 (y9), 326.4752 (y8)。
【００９３】
前駆物質ｍ／ｚ：６９５．３６０７（荷電状態：４）
遷移ｍ／ｚ：1548.7554 (y13), 1447.7077 (y12), 1348.6393 (y11), 1220.5443 (y10), 1133.5123 (y9), 977.4112 (y8), 791.3319 (y7), 704.2998 (y6), 647.2784 (y5), 560.2463 (y4), 423.1874 (y3), 1332.2006 (y24), 1275.6586 (y23), 1225.1348 (y22), 1175.6006 (y21), 1111.5531 (y20), 1055.0111 (y19), 1026.5003 (y18), 968.9868 (y17), 895.4526 (y16), 866.9419 (y15), 810.3999 (y14), 774.8813 (y13), 724.3575 (y12), 674.8233 (y11), 610.7758 (y10), 567.2598 (y9), 489.2092 (y8), 396.1696 (y7), 352.6536 (y6), 324.1428 (y5), 888.4695 (y24), 850.7748 (y23), 817.0923 (y22), 784.0695 (y21), 741.3711 (y20), 703.6765 (y19), 684.6693 (y18), 646.3270 (y17), 597.3042 (y16), 578.2970 (y15), 540.6023 (y14), 516.9233 (y13), 483.2407 (y12), 450.2179 (y11), 407.5196 (y10), 378.5089 (y9), 326.4752 (y8)。
【００９４】
SEQ ID NO: 2: DLTVKIGDFGLATDKSRWSGSHQFE
モノアイソトピック質量：２７９５．０６
前駆物質ｍ／ｚ：１３９７．６９３（荷電状態：２）
遷移ｍ／ｚ：1564.7139 (y13), 1463.6662 (y12), 1348.6393 (y11), 1220.5443 (y10), 1133.5123 (y9), 977.4112 (y8), 791.3319 (y7), 704.2998 (y6), 647.2784 (y5), 560.2463 (y4), 423.1874 (y3), 1340.1799 (y24), 1283.6379 (y23), 1233.1140 (y22), 1183.5798 (y21), 1119.5323 (y20), 1062.9903 (y19), 1034.4796 (y18), 976.9661 (y17), 903.4319 (y16), 874.9212 (y15), 818.3791 (y14), 782.8606 (y13), 732.3367 (y12), 674.8233 (y11), 610.7758 (y10), 567.2598 (y9), 489.2092 (y8), 396.1696 (y7), 352.6536 (y6), 324.1428 (y5)。
【００９５】
前駆物質ｍ／ｚ：９３２．１３１３（荷電状態：３）
遷移ｍ／ｚ：1564.7139 (y13), 1463.6662 (y12), 1348.6393 (y11), 1220.5443 (y10), 1133.5123 (y9), 977.4112 (y8), 791.3319 (y7), 704.2998 (y6), 647.2784 (y5), 560.2463 (y4), 423.1874 (y3), 1340.1799 (y24), 1283.6379 (y23), 1233.1140 (y22), 1183.5798 (y21), 1119.5323 (y20), 1062.9903 (y19), 1034.4796 (y18), 976.9661 (y17), 903.4319 (y16), 874.9212 (y15), 818.3791 (y14), 782.8606 (y13), 732.3367 (y12), 674.8233 (y11), 610.7758 (y10), 567.2598 (y9), 489.2092 (y8), 396.1696 (y7), 352.6536 (y6), 324.1428 (y5), 893.7890 (y24), 856.0943 (y23), 822.4118 (y22), 789.3890 (y21), 746.6907 (y20), 708.9960 (y19), 689.9888 (y18), 651.6465 (y17), 602.6237 (y16), 583.6165 (y15), 545.9219 (y14), 522.2428 (y13), 488.5603 (y12), 450.2179 (y11), 407.5196 (y10), 378.5089 (y9), 326.4752 (y8)。
【００９６】
前駆物質ｍ／ｚ：６９９．３５０３（荷電状態：４）
遷移ｍ／ｚ：1564.7139 (y13), 1463.6662 (y12), 1348.6393 (y11), 1220.5443 (y10), 1133.5123 (y9), 977.4112 (y8), 791.3319 (y7), 704.2998 (y6), 647.2784 (y5), 560.2463 (y4), 423.1874 (y3), 1340.1799 (y24), 1283.6379 (y23), 1233.1140 (y22), 1183.5798 (y21), 1119.5323 (y20), 1062.9903 (y19), 1034.4796 (y18), 976.9661 (y17), 903.4319 (y16), 874.9212 (y15), 818.3791 (y14), 782.8606 (y13), 732.3367 (y12), 674.8233 (y11), 610.7758 (y10), 567.2598 (y9), 489.2092 (y8), 396.1696 (y7), 352.6536 (y6), 324.1428 (y5), 893.7890 (y24), 856.0943 (y23), 822.4118 (y22), 789.3890 (y21), 746.6907 (y20), 708.9960 (y19), 689.9888 (y18), 651.6465 (y17), 602.6237 (y16), 583.6165 (y15), 545.9219 (y14), 522.2428 (y13), 488.5603 (y12), 450.2179 (y11), 407.5196 (y10), 378.5089 (y9), 326.4752 (y8)。
【００９７】
SEQ ID NO: 3: DLTVKIGDFGLATRKSRWSGSHQFE
モノアイソトピック質量：２８３６．１６
前駆物質ｍ／ｚ：１４１８．２３（荷電状態：２）
遷移ｍ／ｚ：1504.7404 (y12), 1348.6393 (y11), 1220.5443 (y10), 1133.5123 (y9), 977.4112 (y8), 791.3319 (y7), 704.2998 (y6), 647.2784 (y5), 560.2463 (y4), 423.1874 (y3), 1360.7170 (y24), 1304.1750 (y23), 1253.6511 (y22), 1204.1169 (y21), 1140.0694 (y20), 1083.5274 (y19), 1055.0167 (y18), 997.5032 (y17), 923.9690 (y16), 895.4583 (y15), 838.9162 (y14), 803.3977 (y13), 752.8738 (y12), 674.8233 (y11), 610.7758 (y10), 567.2598 (y9), 489.2092 (y8), 396.1696 (y7), 352.6536 (y6), 324.1428 (y5)。
【００９８】
前駆物質ｍ／ｚ：９４５．８２２７（荷電状態：３）
遷移ｍ／ｚ：1504.7404 (y12), 1348.6393 (y11), 1220.5443 (y10), 1133.5123 (y9), 977.4112 (y8), 791.3319 (y7), 704.2998 (y6), 647.2784 (y5), 560.2463 (y4), 423.1874 (y3), 1360.7170 (y24), 1304.1750 (y23), 1253.6511 (y22), 1204.1169 (y21), 1140.0694 (y20), 1083.5274 (y19), 1055.0167 (y18), 997.5032 (y17), 923.9690 (y16), 895.4583 (y15), 838.9162 (y14), 803.3977 (y13), 752.8738 (y12), 674.8233 (y11), 610.7758 (y10), 567.2598 (y9), 489.2092 (y8), 396.1696 (y7), 352.6536 (y6), 324.1428 (y5), 907.4804 (y24), 869.7857 (y23), 836.1032 (y22), 803.0804 (y21), 760.3820 (y20), 722.6874 (y19), 703.6802 (y18), 665.3379 (y17), 616.3151 (y16), 597.3079 (y15), 559.6132 (y14), 535.9342 (y13), 502.2516 (y12), 450.2179 (y11), 407.5196 (y10), 378.5089 (y9), 326.4752 (y8)。
【００９９】
前駆物質ｍ／ｚ：７０９．６１８９（荷電状態：４）
遷移ｍ／ｚ：1504.7404 (y12), 1348.6393 (y11), 1220.5443 (y10), 1133.5123 (y9), 977.4112 (y8), 791.3319 (y7), 704.2998 (y6), 647.2784 (y5), 560.2463 (y4), 423.1874 (y3), 1360.7170 (y24), 1304.1750 (y23), 1253.6511 (y22), 1204.1169 (y21), 1140.0694 (y20), 1083.5274 (y19), 1055.0167 (y18), 997.5032 (y17), 923.9690 (y16), 895.4583 (y15), 838.9162 (y14), 803.3977 (y13), 752.8738 (y12), 674.8233 (y11), 610.7758 (y10), 567.2598 (y9), 489.2092 (y8), 396.1696 (y7), 352.6536 (y6), 324.1428 (y5), 907.4804 (y24), 869.7857 (y23), 836.1032 (y22), 803.0804 (y21), 760.3820 (y20), 722.6874 (y19), 703.6802 (y18), 665.3379 (y17), 616.3151 (y16), 597.3079 (y15), 559.6132 (y14), 535.9342 (y13), 502.2516 (y12), 450.2179 (y11), 407.5196 (y10), 378.5089 (y9), 326.4752 (y8)。
【０１００】
SEQ ID NO: 4: DLTVKIGDFGLATKKSRWSGSHQFE
モノアイソトピック質量：２８０８．１５
前駆物質ｍ／ｚ：１４０４．２２７（荷電状態：２）
遷移ｍ／ｚ：1577.7819 (y13), 1476.7342 (y12), 1348.6393 (y11), 1220.5443 (y10), 1133.5123 (y9), 977.4112 (y8), 791.3319 (y7), 704.2998 (y6), 647.2784 (y5), 560.2463 (y4), 423.1874 (y3), 1346.7139 (y24), 1290.1719 (y23), 1239.6480 (y22), 1190.1138 (y21), 1126.0664 (y20), 1069.5243 (y19), 1041.0136 (y18), 983.5001 (y17), 909.9659 (y16), 881.4552 (y15), 824.9132 (y14), 789.3946 (y13), 738.8708 (y12), 674.8233 (y11), 610.7758 (y10), 567.2598 (y9), 489.2092 (y8), 396.1696 (y7), 352.6536 (y6), 324.1428 (y5)。
【０１０１】
前駆物質ｍ／ｚ：９３６．４８７４（荷電状態：３）
遷移ｍ／ｚ：1577.7819 (y13), 1476.7342 (y12), 1348.6393 (y11), 1220.5443 (y10), 1133.5123 (y9), 977.4112 (y8), 791.3319 (y7), 704.2998 (y6), 647.2784 (y5), 560.2463 (y4), 423.1874 (y3), 1346.7139 (y24), 1290.1719 (y23), 1239.6480 (y22), 1190.1138 (y21), 1126.0664 (y20), 1069.5243 (y19), 1041.0136 (y18), 983.5001 (y17), 909.9659 (y16), 881.4552 (y15), 824.9132 (y14), 789.3946 (y13), 738.8708 (y12), 674.8233 (y11), 610.7758 (y10), 567.2598 (y9), 489.2092 (y8), 396.1696 (y7), 352.6536 (y6), 324.1428 (y5), 898.1450 (y24), 860.4504 (y23), 826.7678 (y22), 793.7450 (y21), 751.0467 (y20), 713.3520 (y19), 694.3448 (y18), 656.0025 (y17), 606.9797 (y16), 587.9725 (y15), 550.2779 (y14), 526.5988 (y13), 492.9163 (y12), 450.2179 (y11), 407.5196 (y10), 378.5089 (y9), 326.4752 (y8)。
【０１０２】
前駆物質ｍ／ｚ：７０２．６１７３（荷電状態：４）
遷移ｍ／ｚ：1577.7819 (y13), 1476.7342 (y12), 1348.6393 (y11), 1220.5443 (y10), 1133.5123 (y9), 977.4112 (y8), 791.3319 (y7), 704.2998 (y6), 647.2784 (y5), 560.2463 (y4), 423.1874 (y3), 1346.7139 (y24), 1290.1719 (y23), 1239.6480 (y22), 1190.1138 (y21), 1126.0664 (y20), 1069.5243 (y19), 1041.0136 (y18), 983.5001 (y17), 909.9659 (y16), 881.4552 (y15), 824.9132 (y14), 789.3946 (y13), 738.8708 (y12), 674.8233 (y11), 610.7758 (y10), 567.2598 (y9), 489.2092 (y8), 396.1696 (y7), 352.6536 (y6), 324.1428 (y5), 898.1450 (y24), 860.4504 (y23), 826.7678 (y22), 793.7450 (y21), 751.0467 (y20), 713.3520 (y19), 694.3448 (y18), 656.0025 (y17), 606.9797 (y16), 587.9725 (y15), 550.2779 (y14), 526.5988 (y13), 492.9163 (y12), 450.2179 (y11), 407.5196 (y10), 378.5089 (y9), 326.4752 (y8)。
【０１０３】
SEQ ID NO: 5: DLTVKIGDFGLATE
モノアイソトピック質量：１４７８．６６
前駆物質ｍ／ｚ：７３９．８９０５（荷電状態：２）
遷移ｍ／ｚ：1363.7468 (y13), 1250.6627 (y12), 1149.6150 (y11), 1050.5466 (y10), 922.4516 (y9), 809.3676 (y8), 752.3461 (y7), 637.3192 (y6), 490.2508 (y5), 433.2293 (y4), 320.1452 (y3), 682.3770 (y13), 625.8350 (y12), 575.3111 (y11), 525.7769 (y10), 461.7295 (y9), 405.1874 (y8), 376.6767 (y7), 319.1632 (y6)。
【０１０４】
前駆物質ｍ／ｚ：４９３．５９６１（荷電状態：３）
遷移ｍ／ｚ：1363.7468 (y13), 1250.6627 (y12), 1149.6150 (y11), 1050.5466 (y10), 922.4516 (y9), 809.3676 (y8), 752.3461 (y7), 637.3192 (y6), 490.2508 (y5), 433.2293 (y4), 320.1452 (y3), 682.3770 (y13), 625.8350 (y12), 575.3111 (y11), 525.7769 (y10), 461.7295 (y9), 405.1874 (y8), 376.6767 (y7), 319.1632 (y6), 455.2538 (y13), 417.5591 (y12), 383.8765 (y11), 350.8537 (y10), 308.1554 (y9)。
【０１０５】
前駆物質ｍ／ｚ：３７０．４４８９（荷電状態：４）
遷移ｍ／ｚ：1363.7468 (y13), 1250.6627 (y12), 1149.6150 (y11), 1050.5466 (y10), 922.4516 (y9), 809.3676 (y8), 752.3461 (y7), 637.3192 (y6), 490.2508 (y5), 433.2293 (y4), 320.1452 (y3), 682.3770 (y13), 625.8350 (y12), 575.3111 (y11), 525.7769 (y10), 461.7295 (y9), 405.1874 (y8), 376.6767 (y7), 319.1632 (y6), 455.2538 (y13), 417.5591 (y12), 383.8765 (y11), 350.8537 (y10), 308.1554 (y9)。
【０１０６】
上記において、特定の実施形態（単数または複数）を参照しながら本発明を説明したが、本発明が本明細書に示される特定の形に限定されることは意図していない。本発明は添付の特許請求の範囲のみによって限定され、たとえば上述と異なるものなど、上記の特定のもの以外の実施形態もこれらの添付の特許請求の範囲内で同等に可能である。
【０１０７】
特許請求の範囲における「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ／ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、他の構成要素またはステップの存在を除外するものではない。さらに、個別に列挙されていても、複数の手段、構成要素、または方法ステップがたとえば単一のユニットまたはプロセッサなどによって実現されてもよい。加えて、異なる請求項に個別の特徴が含まれることがあるが、これらはおそらくは有利に組み合わされてもよく、異なる請求項に含まれることは特徴の組み合わせが実行可能かつ／または有利ではないことを意味するものではない。加えて、単数形の参照は複数形を除外するものではない。「ａ」、「ａｎ」、「第１の」、「第２の」などの用語は、複数形を排除するものではない。請求項における参照符号は単に明確化する例として提供されたものであり、決して特許請求の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【図１】
2020514684.tif 000003
【図２】
2020514684.tif 000004
【図３Ａ】
2020514684.tif 000005
【図３Ｂ】
2020514684.tif 000006
【図４】
2020514684.tif 000007
【配列表】
2020514684000001.app
【国際調査報告】
2020514684.tif 000008
2020514684.tif 000009
2020514684.tif 000010