(57)【要約】対象の皮膚の水疱形成および／または剥離を処置および／または予防するための、グランザイムＢ阻害剤および薬学的に許容され得る担体を含む組成物を使用する方法が提供される。また、対象の水疱のできた、または剥離した皮膚の領域の治癒を改善するために組成物を使用するための方法も提供される。組成物は、経口投与、経鼻投与、局所投与、角層下投与、表皮内投与、表皮下投与のために；または注射による投与のために製剤化され得る。
2020510655.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）を有する化合物および薬学的に許容され得る担体を含む、皮膚の水疱形成および／または剥離を処置および／または予防するための組成物であって、ここで、式Ｉが、
【化１３】
2020510655.tif 000016
｛式中、
Ｒ１は、
（ａ）１，２，３−トリアゾリル、および
（ｂ）１，２，３，４−テトラゾリル
から選択されるヘテロアリール基であり；
ｎは、１または２であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルから選択され；
Ｒ３は、
（ａ）水素、
（ｂ）必要に応じてカルボン酸、カルボン酸塩、またはカルボン酸Ｃ１〜Ｃ８エステル基（−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ１〜Ｃ８）で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、必要に応じてアルキルヘテロアリール基、またはヘテロアリール基で置換されたアミドから選択され；
Ｚは、基
【化１４】
2020510655.tif 000017
（式中、
Ｙは、水素、複素環、−ＮＨ２、またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ４は、
（ｉ）Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、
（ｉｉ）必要に応じてＣ１〜Ｃ６アルキルで置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、
（ｉｖ）Ｃ６〜Ｃ１０アリール、
（ｖ）ヘテロシクリル、
（ｖｉ）Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、
（ｖｉｉ）アラルキル、および
（ｖｉｉｉ）ヘテロアルキルアリールから選択され；
Ｒ５は、ヘテロアリールまたは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１０であり、式中、Ｒ１０は、
（ｉ）必要に応じて、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロアリール、アミノ、またはカルボン酸で置換されたＣ１〜Ｃ１２アルキル、
（ｉｉ）必要に応じて、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはカルボン酸で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル、
（ｉｉｉ）必要に応じて、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、必要に応じて置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール、必要に応じて置換されたＣ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、アミノ、またはカルボン酸で置換された、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、
（ｉｖ）必要に応じて、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、必要に応じて置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール、必要に応じて置換されたＣ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、アミノ、またはカルボン酸で置換された、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、
（ｖ）ヘテロシクリル、
（ｖｉ）Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、
（ｖｉｉ）アラルキル、および
（ｖｉｉｉ）ヘテロアルキルアリールから選択される）から選択されるアシル基である｝、その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容され得る塩、ならびに薬学的に許容され得る担体を含む、組成物。
【請求項２】
前記化合物が、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、およびその立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容され得る塩からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記化合物が、４−（（（２Ｓ，３Ｓ）−１−（（２−（（Ｓ）−５−（（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）カルバモイル）−３−シクロヘキシル−２−オキソイミダゾリジン−１−イル）−２−オキソエチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸またはその薬学的に許容され得る塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
経口投与、経鼻投与、局所投与、角層下投与、表皮内投与、表皮下投与のために；または注射による投与のために製剤化された、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記局所製剤が、皮膚浸透促進剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記皮膚浸透促進剤がプロピレングリコールである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記局所製剤が増粘剤をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記増粘剤が架橋ポリアクリレートポリマーである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記局所製剤が、約４〜約７．４のｐＨを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記局所製剤が、約６．０のｐＨを有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記局所製剤が、約０．５〜約２０ｍｇ／ｍＬの式（Ｉ）の化合物を含むゲルの形態である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記局所製剤が、約１０ｍｇ／ｍＬの式（Ｉ）の化合物を含むゲルの形態である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
治療上有効な量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象の皮膚の水疱形成および／または剥離を処置および／または予防する方法。
【請求項１４】
前記組成物が、経口投与、経鼻投与、局所投与、角層下投与、表皮内投与、または表皮下投与のために製剤化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記組成物が、注射による投与のために製剤化される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
治療上有効な量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象の水疱のできた、かつ／または剥離した皮膚を治癒させる方法。
【請求項１７】
前記組成物が、経口投与、経鼻投与、局所投与、角層下投与、表皮内投与、または表皮下投与のために製剤化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物が、注射による投与（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒａｔｉｏｎ）のために製剤化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
治療上有効な量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象の皮膚の水疱形成および／または剥離を減少および／または予防するための方法。
【請求項２０】
前記組成物が、経口投与、経鼻投与、局所投与、角層下投与、表皮内投与、または表皮下投与のために製剤化される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、注射による投与のために製剤化される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
皮膚は２つの主要な層：表皮および表皮で構成されている。水疱は、真皮内または真皮下の流体の蓄積である。剥離とは、皮膚の上層（表皮）の損傷および損失をさす。皮膚の剥離および／または水疱形成は、皮膚を刺激または損傷する環境因子、例えば極端な温度（高温または低温）、感染、摩擦、太陽、風、熱、乾燥、過度の湿度、反復刺激、化学物質、アレルゲン、または薬物；ならびに自己免疫障害および遺伝障害を含む病的状態によって引き起こされ得る。
【０００２】
水疱形成は多くの皮膚科学的状態の特徴であり、さまざまな程度の重症度で現れ得るが、一般に、表皮の異なる層における細胞と細胞の接着の崩壊、または真皮からの表皮の脱離によって引き起こされるびらん、または皮膚表面からの液体で満たされた隆起を特徴とする。皮膚が流体／電解質の保持、体温調節、および感染からの保護を調節する際のバリアとして働く重大な役割に起因して、水疱形成の大きさおよび重症度によっては、そのような機能が損なわれ、潜在的に致死性である可能性がある（Ｗｏｎｇら，Ａｕｓｔｒａｌａｓ  Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４０：１３１−１３４，１９９９）。
【０００３】
病因に基づいて、これらの皮膚疾患は、通常、４つの主な群：ａ）抗体媒介性、ｂ）皮膚への有害な薬物反応、ｃ）先天性の状態、ならびにｄ）熱傷、摩擦、日光、虫刺され、感染、および化学兵器などの外部傷害に起因する水疱形成、に分類される。自己免疫性水疱性皮膚疾患に関して、自己抗体は、皮膚の構造または接着分子に対して産生され、特異的自己抗原の位置および水疱形成のレベルに基づいている；これらの疾患は、さらに表皮内水疱症と表皮下水疱症に分類される。天疱瘡（表皮内水疱形成）は、細胞間接着（棘融解）の喪失と、デスモグレイン、カドヘリンおよび／またはその他のデスモソームタンパク質などの上皮接着タンパク質に対して特異的な抗体の存在を特徴とする上皮間水疱形成を特徴とする。水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎および表皮水疱症などの表皮下水疱性皮膚疾患では、真皮表皮接合部（ＤＥＪ）の成分を標的とする自己抗体は、この基底膜の崩壊および結果としての表皮の脱離を引き起こす（Ｂａｕｍら，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．１３：４８２−４８９，２０１４）。
【０００４】
Ｐｅｅｌｉｎｇ  ｓｋｉｎ症候群（皮膚剥脱、家族性連続皮膚剥離、剥脱性魚鱗癬とも呼ばれる）とは、下層の表皮からの角質層（皮膚の最外層）の分離に起因する、痛みを伴わない連続的で自発的な皮膚の剥離（剥脱）を特徴とする、稀な遺伝性皮膚障害の群をさす。Ｐｅｅｌｉｎｇ  ｓｋｉｎ症候群は、水疱形成および／または紅斑（皮膚の発赤）および／またはそう痒症（そう痒）も示し得る。Ｐｅｅｌｉｎｇ  ｓｋｉｎ症候群の症状は、出生時に観察され得るか、または幼児期に現れ得る。２つの型のＰｅｅｌｉｎｇ  ｓｋｉｎ症候群が認識される：（１）外皮全体を含む全身型；および（２）四肢だけ、主に手と足を含む先端型（先端Ｐｅｅｌｉｎｇ  ｓｋｉｎ症候群）。先端型では、患者は通常、出生時または幼児期に水疱およびびらんを手と足に発症し、これは水疱性皮膚障害、単純性表皮水疱症を暗示する。
【０００５】
水疱性皮膚障害は、皮膚および／または粘膜の水疱およびびらんを伴う稀な皮膚疾患の群である。水疱性皮膚疾患の種類としては：（１）水疱性類天疱瘡、薬物誘発性天疱瘡、風土性天疱瘡、紅斑性天疱瘡、増殖性天疱瘡、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、粘膜類天疱瘡、表皮水疱症、線状ＩｇＡ病、水疱性ループス、疱疹状皮膚炎などの自己免疫性水疱症ならびに（２）例えば、単純性表皮水疱症、接合部型表皮水疱症、栄養障害型表皮水疱症、および後天性表皮水疱症をはじめとする表皮水疱症（ＥＢ）などの遺伝性水疱症が挙げられる。時々、皮膚は、化粧品、洗剤、溶剤、またはペルーバルサム、硫酸ニッケル、またはウルシオール（毒オーク、毒ウルシ、ツタウルシ）などのその他の化学物質と接触すると、水膨れができる。水疱はまた、虫刺され、抽出物または刺し傷によって引き起こされるアレルギー反応が原因でも生じる。化学兵器剤（すなわち、びらん剤）または発疱剤（vesicant）も、皮膚と接触する場所では大きな有痛性水疱を引き起こし得る（例えば、マスタードガス）。水疱形成は、カンタリジンなどの水泡を生じさせる物質（vesicant）を放出するいくつかの種類の甲虫との接触後にも起こり得る。そのような水疱形成は、水疱性甲虫皮膚炎またはパエデルス皮膚炎に関連している。
【０００６】
ＤＥＪは、表皮と真皮の間の特殊化された基底膜であり、皮膚の完全性および機能の重大な目的を果たす。ＤＥＪは、表皮の基底板と真皮の乳頭層の間に堅固な固定を提供する一方、これらの二層間の細胞および分子交換中に選択フィルターとして働く。さらに、ＤＥＪと表皮の基底板との相互作用は、基底ケラチノサイトの極性を決定し、それに付着した増殖細胞を維持しながら、娘細胞を上層に向かって遊走させる。
【０００７】
構造的に、ＤＥＪは４つの区域：１）基底表皮細胞膜、２）透明帯、３）緻密板および４）小線維帯（真皮乳頭層）に分割することができる。最初の層は、基底ケラチノサイト膜と、ヘミデスモソームと呼ばれるその特殊化された接合部構造によって表され、これは膜貫通タンパク質α６／β４およびα３／β１インテグリン、ならびにＸＶＩＩ型コラーゲンによってケラチノサイト細胞骨格を透明帯に接続する。透明帯では、これらのタンパク質は、ケラチン細胞骨格を、主にラミニン−５で構成される係留フィラメントに架橋する。これらの係留フィラメントは、次に、ナイドジェンおよびパールカンを通して、緻密板の主な成分であるＩＶ型コラーゲンと結合する。ＤＥＪの最後の結合部は、緻密板の要素と小線維帯のアンカリングフィブリルとの間の結合によって表される。Ｂｕｒｇｅｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．９：６５１−６５８，１９９７；Ａｕｍａｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．１８（１）：１９−２８，１９９９。
【０００８】
アンカリングフィブリルは、ＤＥＪの構造的完全性に役立つ非線維性コラーゲンである、ＶＩＩ型コラーゲンでほぼ独占的に構成されている。遺伝子ＣＯＬ７Ａ１にコードされるＶＩＩ型コラーゲンは、３つのα１鎖のホモ三量体であり、Ｃ末端非コラーゲン性ドメイン２（ＮＣ−２）およびＮ末端非コラーゲン性ドメイン１（ＮＣ−１）に隣接する１つの中央コラーゲン性ドメインで構成される。ＮＣ−１には、接着タンパク質と高い相同性を持ついくつかのサブドメイン：１つの軟骨マトリックスタンパク質様ドメイン（ＣＭＰ）、９つのフィブロネクチン様ドメイン（ＦＮＩＩＩ）、および１つのフォンウィルブランド因子Ａ様ドメイン（ｖＷＦＡ２）（Ｌｅｉｎｅｗｅｂｅｒら，Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ．５８５：１７４８−１７５２，２０１１）が含まれる。これらのドメインの中で、ＦＮＩＩＩ領域はいくつかのＥＣＭ成分との相互作用に極めて重要である。ＮＣ１領域の組換えバージョンを用いる研究により、ＦＮＩＩＩドメインと、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン−５およびフィブロネクチンとの強い結合親和性が明らかになった。Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４５１６−１４５２２，１９９７；Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：１７７−１８３，１９９９。ラミニン−５およびＩＶ型コラーゲンへのＦＮＩＩＩ結合を通じて真皮乳頭層の緻密板への固定を可能にするのはこの領域である。
【０００９】
真皮と表皮との間の最初の接着点としてのその役割のために、ＶＩＩ型コラーゲンの構造改変または機能障害は、結果として表皮脱離および水疱形成を伴うＤＥＪの崩壊をもたらす。ＶＩＩ型コラーゲンの変異またはＶＩＩ型コラーゲンに対する自己抗体の産生は、それぞれ栄養障害型表皮水疱症および後天性表皮水疱症の主な原因である。これらの状態は、広範な表皮脱離および水疱の形成を特徴とする。Ｈａｓ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｍｂｒ．７６：１１７−１７０，２０１５。
【００１０】
ＦＮＩＩＩ−２ドメインの残基Ｄ３９０の後のＶＩＩ型コラーゲンのグランザイムＢ（ＧｚｍＢ）媒介性切断も本明細書に示される。その上、特異的ＧｚｍＢ阻害剤である化合物Ａおよび化合物２０によるこの切断の阻害（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１２：２１９７−２２００，２００２）も本明細書において実証されている。これらの観察は、ＧｚｍＢを小線維帯／緻密板結合の崩壊と、従って表皮脱離と関連付ける。そのようなＧｚｍＢに媒介されるＤＥＪ崩壊は、自己免疫／遺伝障害の間だけでなく、熱傷、虫刺されおよび放射線の結果として皮膚の水疱性炎症事象の間にも生じ得る。
【００１１】
その上、主要なコラーゲンおよびラミニン結合タンパク質であるα６／β４インテグリンが、本明細書においてＧｚｍＢの基質として同定されている。このインテグリンの重要性の根拠は、動物モデルと、重度でしばしば致命的なヒトの水疱症の両方からもたらされる。ホモ接合性のβ４ヌルマウスは、出生直後に死亡し、表皮の広範な脱離を示す。このβ４欠乏により誘発されるＤＥＪの崩壊は、ケラチノサイトの基底表面でのヘミデスモソームの形成不全の結果であり、このインテグリンが接着剤の役割を厳密に果たさないが、ヘミデスモソームの構築にも重要であることを示唆する。（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１３：３６６−３６９，１９９６）。
【００１２】
ヒトにおいて、α６／β４が関与するインテグリン複合体の変異および欠損、ならびにα６／β４に対する自己抗体の産生は、広範な粘膜皮膚の水疱形成および皮膚外の関与を特徴とする潜在的に致死的な表現型を引き起こし得る。いくつかの研究により、幽門閉鎖を伴う接合部型表皮水疱症（ＪＥＢ−ＰＡ）、重症接合部型表皮水疱症（ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ  ｂｕｌｌｏｓａ  ｇｒａｖｉｓ）、および非致死性接合部型表皮水疱症に罹患している患者においてα６／β４インテグリンをコードする遺伝子における変異（Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：６６９−６７４，１９９７；Ｒｕｚｚｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２８２６−２８３１，１９９７；Ｖｉｄａｌら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：２２９−２３４，１９９５）またはサブユニットの１つのタンパク質レベルでの非存在（Ｎｉｅｓｓｅｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０９：１６９５−１７０６，１９９６）が同定されている。Ｐｈｉｌｌｉｐｓらは、これらの患者由来の皮膚切片においてβ４の特定のエピトープに対する１つの抗体はＤＥＪレベルで免疫反応性を示したが、異なるエピトープに対する別の抗体は示さなかったことを報告した。（Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２４：５７１−５７６，１９９４）。彼らは、まだ同定されていないプロテアーゼによるエピトープの原位置でのタンパク質切断が免疫反応性の喪失の原因であると推測した。
【００１３】
類天疱瘡は、脚、腕、腹部の皮膚発疹および水疱形成を特徴とする自己免疫障害のファミリーである。α６とβ４の両方のサブユニットに対する自己抗体は、口腔類天疱瘡および瘢痕性類天疱瘡を持つ患者において検出されている。（Ｓａｍｉら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：５３３−５４０，２００２；Ｌｅｖｅｒｋｕｓら，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４５：９９８−１００４，２００１）。α６／β４インテグリンおよびＶＩＩ型コラーゲンの変異は、水疱性皮膚疾患に関連している。そのような変異は、これらのタンパク質の構造を変え、それによりＤＥＪをＧｚｍＢ切断させやすくすることができ、かつ／またはこのタンパク質分解活性は、自己免疫状態を起こすまたは悪化させる能力のある自己抗原を生成するかもしれない。
【００１４】
水疱形成および剥離の処置の開発の進歩にもかかわらず、皮膚の剥離および／または水疱形成を予防する、かつ／または処置する際に使用するための、新しい処置および改善された製剤に対する必要性が存在する。本発明は、これらの必要性を満たし、さらに関連する利点を提供しようと努力するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｗｏｎｇら，Ａｕｓｔｒａｌａｓ  Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．４０：１３１−１３４，１９９９
【非特許文献２】Ｂａｕｍら，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．１３：４８２−４８９，２０１４
【非特許文献３】Ｂｕｒｇｅｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．９：６５１−６５８，１９９７
【非特許文献４】Ａｕｍａｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．１８（１）：１９−２８，１９９９
【非特許文献５】Ｌｅｉｎｅｗｅｂｅｒら，Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ．５８５：１７４８−１７５２，２０１１
【非特許文献６】Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４５１６−１４５２２，１９９７
【非特許文献７】Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：１７７−１８３，１９９９
【非特許文献８】Ｈａｓ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｍｂｒ．７６：１１７−１７０，２０１５
【非特許文献９】Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１２：２１９７−２２００，２００２
【非特許文献１０】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１３：３６６−３６９，１９９６
【非特許文献１１】Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．６：６６９−６７４，１９９７
【非特許文献１２】Ｒｕｚｚｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２８２６−２８３１，１９９７
【非特許文献１３】Ｖｉｄａｌら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１０：２２９−２３４，１９９５
【非特許文献１４】Ｎｉｅｓｓｅｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０９：１６９５−１７０６，１９９６
【非特許文献１５】Ｐｈｉｌｌｉｐｓら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２４：５７１−５７６，１９９４
【非特許文献１６】Ｓａｍｉら，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２９：５３３−５４０，２００２
【非特許文献１７】Ｌｅｖｅｒｋｕｓら，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４５：９９８−１００４，２００１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、水疱形成および皮膚の剥離の処置のための組成物および方法を提供する。組成物は、ＧｚｍＢ阻害剤および薬学的に（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｃｉｃａｌｌｙ）許容され得る担体を含む。
【００１７】
一態様では、本発明は、皮膚の剥離および／または水疱形成を予防するのに効果的なＧｚｍＢ阻害剤化合物を含む組成物を提供する。一実施形態では、本発明は、４（（（２Ｓ，３Ｓ）−１−（（２−（（Ｓ）−５−（（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）カルバモイル）−３−シクロヘキシル−２−オキソイミダゾリジン−１−イル）−２−オキソエチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸（化合物Ａの実施形態）またはその薬学的に許容され得る塩を薬学的に許容され得る担体と組み合わせて含む、皮膚の剥離および／または水疱形成のための製剤を提供する。
【００１８】
本発明の別の態様では、皮膚の剥離および／または水疱形成を処置するための方法が提供される。この方法では、ＧｚｍＢ阻害剤化合物またはその薬学的に許容され得る塩を薬学的に許容され得る担体と組み合わせて含む組成物が、それを必要とする対象に投与される。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、皮膚の剥離および／または水疱形成を予防するための方法を提供する。この方法では、ＧｚｍＢ阻害剤化合物またはその薬学的に許容され得る塩を薬学的に許容され得る担体と組み合わせて含む組成物が、損傷した皮膚に投与される。
【００２０】
本発明のさらなる態様では、本発明は、ＧｚｍＢ阻害剤の皮下または皮内送達のための方法を提供する。この方法では、ＧｚｍＢ阻害剤化合物またはその薬学的に許容され得る塩を薬学的に許容され得る担体と組み合わせて（ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｔｉｈ）含む組成物が、皮膚に投与される。
【００２１】
上記の方法では、組成物は、薬学的に許容され得る担体と組み合わせた、ＧｚｍＢ阻害剤またはその薬学的に許容され得る塩を含有するゲル剤または液剤として製剤化されることができる。ゲル剤は、経口投与または局所投与されることができ、液剤は局所にまたは注射によって投与されることができる。
【００２２】
さらに他の実施形態では、薬学的に許容され得る担体と組み合わせた、ＧａｍＢ阻害剤またはその薬学的に許容され得る塩は、静脈内、筋肉内、鼻腔内、経口、髄腔内（intrathecally）、または粘膜などに投与され得る。例えば、組成物は、錠剤、カプセル剤、ゲル剤または液剤の形態であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
前述の態様および本発明の付随する利点の多くは、添付の図面と併せて以下の詳細な記載を参照することによりそれがより良く理解されるので、より容易に十分に理解される。
【００２４】
【図１】図１は、新鮮なヒト皮膚へのＧｚｍＢ（２００ｎＭ）の添加およびＤＥＪの分離を示す。正常な皮膚とビヒクルで処置した皮膚が最初の２つのパネルに示されている。矢印は、ＧｚｍＢで処置した皮膚における真皮からの表皮の分離を示す。腹部の全層皮膚を待機的形成手術から得、切除直後に使用した。小さな断片（０．２×０．４ｍｍ）を直ちに１０％ホルマリンで固定し（天然皮膚）、一方でその他の断片を２００ｎＭ  ＧｚｍＢを含むまたは含まない３００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に入れた。次に、試料を３７℃の水浴中で２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、皮膚を１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、切片化し（５μｍ）、標準法を用いてヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【００２５】
【図２】図２は、新鮮なヒト皮膚へのＧｚｍＢ（１００ｎＭ）の添加およびＤＥＪの分離を示す。正常な皮膚とビヒクルで処置した皮膚が最初の２つのパネルに示されている。矢印は、真皮からの表皮の分離を示す。腹部の全層皮膚を待機的形成手術から得、すぐに使用した。小さな断片（０．２×０．４ｍｍ）を、ＧｚｍＢを含むまたは含まない３００μＬのＰＢＳに入れた。次に、試料を３７℃の水浴中で２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、皮膚を１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、切片化し（５μｍ）、標準法を用いてＨ＆Ｅで染色した。
【００２６】
【図３】図３は、ＧｚｍＢがＶＩＩ型コラーゲンを切断することを実証する。ＧｚｍＢ阻害剤（セルピンＡ３Ｎ、化合物２０、化合物Ａ）の添加は、ＧｚｍＢに媒介されるＶＩＩ型コラーゲン切断を防止した。フラグメントを示すバンドが標識されている。ＧｚｍＢ切断アッセイは４０μＬのＰＢＳ中で実施された。手短に言えば、ＶＩＩ型コラーゲン（５００ｎｇ）を、２００ｍＭのＧｚｍＢとともに３７℃で２４時間インキュベートした。阻害のために、ＧｚｍＢを、ＶＩＩ型コラーゲンの添加の前に化合物２０、セルピンＡ３Ｎおよび化合物Ａとともに３７℃で１時間インキュベートした。２４時間後、全ての試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、ＰＶＤＦ膜にブロットし、ＶＩＩ型コラーゲンに特異的な一次抗体（ウサギ抗ＶＩＩ型コラーゲン、Ａｂｃａｍ  ｐｌｃ）とともに４℃で一晩インキュベートし、その後二次標識抗ウサギ抗体とともに室温で１時間インキュベートした。
【００２７】
【図４】図４は、ＶＩＩ型コラーゲン構造の図解である。ＧｚｍＢは、ＦＮＩＩＩドメイン２の残基Ｄ３９０の後を切断する。ＦＮ様ドメインは、細胞外マトリックスとＶＩＩ型コラーゲンの相互作用を担う。ＧｚｍＢのＶＩＩ型コラーゲン内の切断部位は、Ｋｌｅｉｆｅｌｄらによって既に記載された方法を用いるＴＡＩＬＳ分析を用いて決定した（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：２８１−２８８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１６１１，２０１０）。手短に言えば、ＶＩＩ型コラーゲンを、２００ｎＭのＧｚｍＢとともに３７℃で２４時間インキュベートした。Ｎ末端を差別的に標識し、変性させ、ブロックした。次に、試料をトリプシンとともにインキュベートしてトリプシンペプチドを生成し、次にアミン反応性ポリマーＨＰＧ−ＡＬＤとともにインキュベートして標識ペプチドを負に富化し、ＧｚｍＢ切断部位を同定した。
【００２８】
【図５】図５は、ＶＩＩ型コラーゲンの免疫染色を示す。矢印は、ＶＩＩ型コラーゲン染色を示す。ＧｚｍＢ皮膚切断アッセイおよびパラフィン包埋を図１および２に記載されるように実施した。その後、５μｍ切片を脱パラフィンし、ＣａｒｅｎｚｙｍｅＩ：トリプシンキット（ＢｉｏＣａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して１５分間トリプシンによる酵素処理抗原回復（enzymatic  antigen  retrieval）に付した。次に、スライドをトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中１０％ヤギ血清で１時間ブロックし、その後ウサギ抗ＶＩＩ型コラーゲン抗体（Ａｂｃａｍ  ｐｌｃ）とともに４℃で一晩インキュベートした。次に、全てのスライドを二次ビオチン化抗体とともにインキュベートし、ＤＡＢ染色を製造業者の指示に従って実施した。
【００２９】
【図６】図６は、α６β４のＧｚｍＢ切断を示す。ＧｚｍＢ阻害剤（化合物２０、セルピンＡ３Ｎ、および化合物Ａ）を使用した。ＧｚｍＢ切断アッセイは４０μＬのＰＢＳ中で実施された。手短に言えば、α６β４（５００ｎｇ）を、２００ｎＭのＧｚｍＢとともに３７℃で２４時間インキュベートした。阻害のために、ＧｚｍＢを、α６β４インテグリンの添加の前に化合物２０、セルピンＡ３Ｎおよび化合物Ａとともに３７℃で１時間インキュベートした。２４時間後、全ての試料を１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、１．５時間の電気泳動によって分離した。次に、バンドをクーマシー染料による染色によって可視化した。
【００３０】
【図７】図７は、ＧｚｍＢが、ＴＪタンパク質、ＪＡＭ−Ａ、ＡＪタンパク質、Ｅ−カドヘリン、およびデスモソーム、Ｄｓｇ−１およびＤｓｇ−３を含む細胞−細胞接着タンパク質を切断することを実証する。各タンパク質を、切断フラグメントを同定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離される前にＧｚｍＢとともに２時間インキュベートした。５つ全てのタンパク質が、タンパク質単独またはＧｚｍＢ＋化合物２０阻害剤と比較して、ＧｚｍＢとともにインキュベートした場合に全タンパク質の減少および断片化の増加を示した。Ｅ−カドヘリンおよびＤｓｇ−１は、１００ｎＭ  ＧｚｍＢで総タンパク質のほぼ完全な喪失を示したが、ＪＡＭ−Ａ、ＺＯ−１、およびＤｓｇ−３は、ＧｚｍＢ処置後も総タンパク質がまだ検出可能であるため、切断が少ないことを示した。
【００３１】
【図８Ａ】図８Ａから８Ｃは、ＧｚｍＢ阻害剤である化合物Ａが水疱形成を予防する証拠を提供する。スティールロッド（ｓｔｅａｌ  ｒｏｄ）を６秒間１００℃に加熱することによりマウスを熱傷させて、水疱形成を誘発した。２つの独立した実験を行った。図８Ａでは、化合物Ａを３０日間毎日添加した。この図は、食塩水で処置した皮膚における水疱を形成している真皮からの表皮の分離を示す。水疱形成は、化合物Ａで処置した皮膚において防止される。図８Ｂでは、ＰＢＳ中の化合物Ａ（３．６ｍｇ／ｍＬ）を皮下注射によって毎日投与し、ゲル中の化合物Ａ（３．６ｍｇ／ｍＬ）を局所適用によって毎日投与した。両方の製剤中の化合物Ａは、食塩水だけの処置（皮下注射による毎日投与）と比較して水疱形成を減少させることが見出された。図８Ｃでは、局所適用によって毎日投与されたゲル中の化合物Ａ（３．６ｍｇ／ｍＬ）は、ゲル単独（局所適用による毎日投与）と比較して、水疱形成を減少させた。
【図８Ｂ−Ｃ】図８Ａから８Ｃは、ＧｚｍＢ阻害剤である化合物Ａが水疱形成を予防する証拠を提供する。スティールロッド（ｓｔｅａｌ  ｒｏｄ）を６秒間１００℃に加熱することによりマウスを熱傷させて、水疱形成を誘発した。２つの独立した実験を行った。図８Ａでは、化合物Ａを３０日間毎日添加した。この図は、食塩水で処置した皮膚における水疱を形成している真皮からの表皮の分離を示す。水疱形成は、化合物Ａで処置した皮膚において防止される。図８Ｂでは、ＰＢＳ中の化合物Ａ（３．６ｍｇ／ｍＬ）を皮下注射によって毎日投与し、ゲル中の化合物Ａ（３．６ｍｇ／ｍＬ）を局所適用によって毎日投与した。両方の製剤中の化合物Ａは、食塩水だけの処置（皮下注射による毎日投与）と比較して水疱形成を減少させることが見出された。図８Ｃでは、局所適用によって毎日投与されたゲル中の化合物Ａ（３．６ｍｇ／ｍＬ）は、ゲル単独（局所適用による毎日投与）と比較して、水疱形成を減少させた。
【００３２】
【図９】図９は、本発明の製剤および方法において有用な代表的な化合物（Ｐ１から出発するＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１）の調製のための代表的な合成経路の略図である。
【００３３】
【図１０】図１０は、本発明の製剤および方法において有用な代表的な化合物（Ｐ５から出発するＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１）の調製のためのもう一つの代表的な合成経路の略図である。
【００３４】
【図１１】図１１は、本発明の製剤および方法において有用な代表的な化合物（Ｐ１またはＰ５以外の成分から出発するＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１）の調製のためのさらなる代表的な合成経路の略図である。
【００３５】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、は、表皮下水疱性疾患のＤＥＪでＧｚｍＢレベルが上昇していることを実証する。図１２Ａは、上段に、健康な皮膚、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）、疱疹状皮膚炎（ＤＨ）、および後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）のＨ＆Ｅ染色の代表的な画像を表す。下段には、健康、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）、疱疹状皮膚炎（ＤＨ）、および後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）の生検のＧｚｍＢ免疫染色が示される。豊富なＧｚｍＢは、罹患した皮膚の特に表皮分離の範囲（灰色の矢頭）の真皮表皮接合部のレベルで観察される。点線は、表皮と真皮の分離を示す。スケールバーは、２００μｍを表す。図１２Ｂは、上段に、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）、疱疹状皮膚炎（ＤＨ）、および後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）のＨ＆Ｅ染色の代表的な画像を表す。下段には、同じ組織切片のＧｚｍＢ染色が提供される。研究した全ての条件で、ＧｚｍＢは好中球と共局在する（灰色の円）。スケールバーは、４０μｍを表す。
【００３６】
【図１３】図１３Ａから１３Ｃは、α６インテグリンがＧｚｍＢ基質であり、表皮下水疱形成が減少していることを実証する。図１３Ａは、阻害剤セルピンＡ３Ｎ（ＳＡ３Ｎ）および化合物２０（Ｃｏｍ２０）を含むおよび含まないα６インテグリン（α６ｉｎｔ）サブユニットのＧｚｍＢ媒介性切断の４〜２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロット分析を表す。黒色矢印は、切断フラグメントを示し、＊は、全長タンパク質を示す。２００ｎＭの濃度で、ＧｚｍＢは切断バンドを生成し、この切断はＧｚｍＢ阻害剤によって防止される。図１３Ｂは、α６インテグリンの細胞外ドメインの概略図を表す。ＧｚｍＢに媒介される切断部位は、βプロペラ領域のリガンド結合ドメイン内にあるＡＴＯＭ（灰色の矢印）によってプロテオミクス的に同定された。ＧｚｍＢ、グランザイムＢ；ＴＭ、膜貫通ヘリックス。図１３Ｃは、健康、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）、疱疹状皮膚炎（ＤＨ）、および後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）の生検のα６インテグリン免疫染色を実証する。灰色の矢頭は真皮表皮の接着の領域内のインタクトなα６インテグリンを示し、黒色の矢頭は染色が弱いかまたはないことを示す。点線は、表皮と真皮の分離を示す。スケールバーは、２００μｍを表す。
【００３７】
【図１４】図１４Ａから１４Ｃは、ＧｚｍＢによるβ４インテグリン切断、および健康な皮膚に対するおよび表皮下水疱形成における状態を実証する。図１４Ａは、阻害剤セルピンＡ３Ｎ（ＳＡ３Ｎ）および化合物２０（Ｃｏｍ２０）を含むおよび含まないβ４インテグリンサブユニット（β４ｉｎｔ）のＧｚｍＢ媒介性切断の４〜２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットを表す。黒色矢印は、切断フラグメントを示し、＊は、全長タンパク質を示す。２００ｎＭの濃度で、ＧｚｍＢは切断バンドを生成し、この切断は両方のＧｚｍＢ阻害剤によって防止される。図１４Ｂは、β４インテグリンの細胞外ドメインの概略図を表す。ＧｚｍＢに媒介される切断部位は、特異性決定ループのリガンド結合ドメイン内にあるＡＴＯＭ（灰色の矢印）によってプロテオミクス的に同定された。ＧｚｍＢ（グランザイムＢ）；ＰＳＩ（プレキシン−セマフォリン−インテグリン）；ＶＷＦＡ（フォンウィルブランド因子Ａ）；ＣＲＲ（システインに富む領域）；ＴＭ（膜貫通ヘリックス）；ＦＮＩＩＩ（フィブロネクチン様ＩＩＩドメイン）。図１４Ｃは、健康、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）、疱疹状皮膚炎（ＤＨ）、および後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）の生検のβ４インテグリン免疫染色を表す。灰色の矢頭は真皮表皮の接着の領域内のインタクトなβ４インテグリンを示し、黒色の矢頭は染色が弱いかまたはないことを示す。点線は、表皮と真皮との間の分離を示す。β４インテグリンは接着に重要であるようである。水疱性類天疱瘡試料では、右下隅の真皮の皮弁は表皮に付着しており、強いβ４染色を示す。この範囲は、かすかなβ４インテグリン染色を有する分離した表皮に隣接している。スケールバーは、２００μｍを表す。
【００３８】
【図１５】図１５Ａから１５Ｃは、正常な皮膚に対する表皮下水疱形成におけるＧｚｍＢに媒介されるＶＩＩ型コラーゲン切断および組織学的評価を表す。図１５Ａは、阻害剤セルピンＡ３Ｎ（ＳＡ３Ｎ）および化合物２０（Ｃｏｍ２０）を含むおよび含まないＶＩＩ型コラーゲン（ｃｏｌｌ  ＶＩＩ）のＧｚｍＢ媒介性切断の１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットを示す。黒色矢印は、切断フラグメントを示し、＊は、全長タンパク質を示す。ＧｚｍＢは切断バンドを生成し、この切断は、Ｃｏｍ２０の添加によって減少し、Ｓ３ＡＮによって消失する。図１５Ｂは、ＶＩＩ型コラーゲンの細胞外ドメインの概略図を示す。ＡＴＯＭ（灰色の矢印）によってプロテオミクス的に同定されたＧｚｍＢに媒介される切断部位は、他の真皮表皮接合部の成分、例えばラミニンおよびＩＶ型コラーゲン；Ｃｏｌｌ  ＶＩＩ、ＶＩＩ型コラーゲン；ＧｚｍＢ、グランザイムＢ；ＮＣ、非コラーゲン性領域；ＣＭＰ、軟骨マトリックスタンパク質；ＶＷＦＡ、フォンウィルブランド因子Ａ；ＦＮＩＩＩ、フィブロネクチン様ＩＩＩドメイン；ＶＷＦＡ２、フォンウィルブランド因子Ａ２；Ｐｉ、タンパク質阻害剤へのＶＩＩ型コラーゲンの接着を媒介するフォンウィルブランド因子ＡおよびフィブロネクチンＩＩＩ−２型ドメインに属する。図１５Ｃは、健康、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）、疱疹状皮膚炎（ＤＨ）、および後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）の生検のＶＩＩ型コラーゲンの免疫染色を示す。ＶＩＩ型コラーゲン裏層は、健康な皮膚においてインタクトである（灰色の矢頭）が、罹患した試料では免疫反応性が弱いかまたはないことが観察された（黒色矢頭）。点線は、表皮と真皮の分離を示す。スケールバーは、２００μｍを表す。
【００３９】
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、ＸＶＩＩ型コラーゲンがＧｚｍＢによって切断され、水疱形成皮膚生検の表皮分離の範囲に存在しないことを示す。図１６Ａは、阻害剤セルピンＡ３Ｎ（ＳＡ３Ｎ）および化合物２０（Ｃｏｍ２０）を含むおよび含まないＸＶＩＩ型コラーゲン（ｃｏｌｌ  ＸＶＩＩ）のＧｚｍＢ媒介性切断の８％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥウエスタンブロットを示す。黒色矢印は、切断フラグメントを示し、＊は、全長タンパク質を示す。ＧｚｍＢは切断バンドを生成し、この切断は、Ｃｏｍ２０またはＳ３ＡＮの添加によって消失する。図１６Ｂは、健康、水疱性類天疱瘡（ＢＰ）、疱疹状皮膚炎（ＤＨ）、および後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）の生検のＸＶＩＩ型コラーゲンの免疫染色を示す。ＸＶＩＩ型コラーゲン裏層は、健康な皮膚においてインタクトである（灰色の矢頭）が、罹患した試料では免疫反応性が弱いかまたはないことが観察された（黒色矢頭）。点線は、表皮と真皮の分離を示す。スケールバーは、２００μｍを表す。
【００４０】
【図１７】図１７は、ＧｚｍＢがＤＥＪ分離を誘発することを実証する。ＰＢＳ、２００ｎＭ  ＧｚｍＢ、または１００μＭの化合物２０（Ｃｏｍ２０）で事前に不活性化した２００ｎＭ  ＧｚｍＢ中、３７℃で１２時間インキュベートした健康な皮膚のＨ＆Ｅ染色。表皮と真皮の間の裂隙（黒色の矢頭）は、ＧｚｍＢで処置した試料で観察されたが、ＰＢＳ対照およびＧｚｍＢがＣｏｍ２０によって阻害された試料には存在しなかった。スケールバーは、２００μｍを表す。
【００４１】
【図１８Ａ−Ｂ】図１８Ａから１８Ｉは、様々な位置のα４インテグリンのグランザイムＢ切断部位から新Ｎ末端ペプチドを同定する注釈付きＭＳ／ＭＳスペクトルを提供する。図１８Ａは、Ａｓｐ１１０↓Ａｓｎ１０１の切断部位を実証し；図１８Ｂは、Ａｓｐ１６６↓Ｍｅｔ１６７の切断を実証し；図１８Ｃは、Ａｓｐ１９９↓Ｐｈｅ２００の切断部位を実証し；図１８Ｄは、Ａｓｐ３０２↓Ｓｅｒ３０３の切断部位を実証し；図１８Ｅは、Ａｓｐ３１１↓Ｇｌｕ３１２の切断部位を実証し；図１８Ｆは、Ａｓｐ３５８↓Ｖａｌ３５９の切断部位を実証し、図１８Ｇは、Ａｓｐ４８２↓Ａｒｇ４８３の切断部位を実証し；図１８Ｈは、Ａｓｐ４８８↓Ｖａｌ４８９の切断を実証し；図１８Ｉは、Ｇｌｕ８５６↓Ｇｌｎ８５７の切断部位を実証する。
【図１８Ｃ−Ｄ】図１８Ａから１８Ｉは、様々な位置のα４インテグリンのグランザイムＢ切断部位から新Ｎ末端ペプチドを同定する注釈付きＭＳ／ＭＳスペクトルを提供する。図１８Ａは、Ａｓｐ１１０↓Ａｓｎ１０１の切断部位を実証し；図１８Ｂは、Ａｓｐ１６６↓Ｍｅｔ１６７の切断を実証し；図１８Ｃは、Ａｓｐ１９９↓Ｐｈｅ２００の切断部位を実証し；図１８Ｄは、Ａｓｐ３０２↓Ｓｅｒ３０３の切断部位を実証し；図１８Ｅは、Ａｓｐ３１１↓Ｇｌｕ３１２の切断部位を実証し；図１８Ｆは、Ａｓｐ３５８↓Ｖａｌ３５９の切断部位を実証し、図１８Ｇは、Ａｓｐ４８２↓Ａｒｇ４８３の切断部位を実証し；図１８Ｈは、Ａｓｐ４８８↓Ｖａｌ４８９の切断を実証し；図１８Ｉは、Ｇｌｕ８５６↓Ｇｌｎ８５７の切断部位を実証する。
【図１８Ｅ−Ｆ】図１８Ａから１８Ｉは、様々な位置のα４インテグリンのグランザイムＢ切断部位から新Ｎ末端ペプチドを同定する注釈付きＭＳ／ＭＳスペクトルを提供する。図１８Ａは、Ａｓｐ１１０↓Ａｓｎ１０１の切断部位を実証し；図１８Ｂは、Ａｓｐ１６６↓Ｍｅｔ１６７の切断を実証し；図１８Ｃは、Ａｓｐ１９９↓Ｐｈｅ２００の切断部位を実証し；図１８Ｄは、Ａｓｐ３０２↓Ｓｅｒ３０３の切断部位を実証し；図１８Ｅは、Ａｓｐ３１１↓Ｇｌｕ３１２の切断部位を実証し；図１８Ｆは、Ａｓｐ３５８↓Ｖａｌ３５９の切断部位を実証し、図１８Ｇは、Ａｓｐ４８２↓Ａｒｇ４８３の切断部位を実証し；図１８Ｈは、Ａｓｐ４８８↓Ｖａｌ４８９の切断を実証し；図１８Ｉは、Ｇｌｕ８５６↓Ｇｌｎ８５７の切断部位を実証する。
【図１８Ｇ−Ｈ】図１８Ａから１８Ｉは、様々な位置のα４インテグリンのグランザイムＢ切断部位から新Ｎ末端ペプチドを同定する注釈付きＭＳ／ＭＳスペクトルを提供する。図１８Ａは、Ａｓｐ１１０↓Ａｓｎ１０１の切断部位を実証し；図１８Ｂは、Ａｓｐ１６６↓Ｍｅｔ１６７の切断を実証し；図１８Ｃは、Ａｓｐ１９９↓Ｐｈｅ２００の切断部位を実証し；図１８Ｄは、Ａｓｐ３０２↓Ｓｅｒ３０３の切断部位を実証し；図１８Ｅは、Ａｓｐ３１１↓Ｇｌｕ３１２の切断部位を実証し；図１８Ｆは、Ａｓｐ３５８↓Ｖａｌ３５９の切断部位を実証し、図１８Ｇは、Ａｓｐ４８２↓Ａｒｇ４８３の切断部位を実証し；図１８Ｈは、Ａｓｐ４８８↓Ｖａｌ４８９の切断を実証し；図１８Ｉは、Ｇｌｕ８５６↓Ｇｌｎ８５７の切断部位を実証する。
【図１８Ｉ】図１８Ａから１８Ｉは、様々な位置のα４インテグリンのグランザイムＢ切断部位から新Ｎ末端ペプチドを同定する注釈付きＭＳ／ＭＳスペクトルを提供する。図１８Ａは、Ａｓｐ１１０↓Ａｓｎ１０１の切断部位を実証し；図１８Ｂは、Ａｓｐ１６６↓Ｍｅｔ１６７の切断を実証し；図１８Ｃは、Ａｓｐ１９９↓Ｐｈｅ２００の切断部位を実証し；図１８Ｄは、Ａｓｐ３０２↓Ｓｅｒ３０３の切断部位を実証し；図１８Ｅは、Ａｓｐ３１１↓Ｇｌｕ３１２の切断部位を実証し；図１８Ｆは、Ａｓｐ３５８↓Ｖａｌ３５９の切断部位を実証し、図１８Ｇは、Ａｓｐ４８２↓Ａｒｇ４８３の切断部位を実証し；図１８Ｈは、Ａｓｐ４８８↓Ｖａｌ４８９の切断を実証し；図１８Ｉは、Ｇｌｕ８５６↓Ｇｌｎ８５７の切断部位を実証する。
【００４２】
【図１９Ａ−Ｂ】図１９Ａから１９Ｇは、様々な位置のβ４インテグリンのグランザイムＢ切断部位から新Ｎ末端ペプチドを同定する注釈付きＭＳ／ＭＳスペクトルを提供する。図１９Ａは、Ｇｌｕ２２３↓Ａｒｇ２２４の切断部位を実証し；図１９Ｂは、Ａｓｐ２３７↓Ａｌａ２３８の切断部位を実証し；図１９Ｃは、Ａｓｐ２７２↓Ｇｌｙ２７３の切断部位を実証し；図１９Ｄは、Ａｓｐ３５１↓Ｓｅｒ３５２の切断部位を実証し；図１９Ｅは、Ａｓｐ４４２↓Ｇｌｙ４４３の切断部位を実証し；図１９Ｆは、Ａｓｐ４４７↓Ａｌａ４４８の切断部位を実証し；図１９Ｇは、Ａｓｐ６１１↓Ａｌａ６１２の切断部位を実証する。
【図１９Ｃ−Ｄ】図１９Ａから１９Ｇは、様々な位置のβ４インテグリンのグランザイムＢ切断部位から新Ｎ末端ペプチドを同定する注釈付きＭＳ／ＭＳスペクトルを提供する。図１９Ａは、Ｇｌｕ２２３↓Ａｒｇ２２４の切断部位を実証し；図１９Ｂは、Ａｓｐ２３７↓Ａｌａ２３８の切断部位を実証し；図１９Ｃは、Ａｓｐ２７２↓Ｇｌｙ２７３の切断部位を実証し；図１９Ｄは、Ａｓｐ３５１↓Ｓｅｒ３５２の切断部位を実証し；図１９Ｅは、Ａｓｐ４４２↓Ｇｌｙ４４３の切断部位を実証し；図１９Ｆは、Ａｓｐ４４７↓Ａｌａ４４８の切断部位を実証し；図１９Ｇは、Ａｓｐ６１１↓Ａｌａ６１２の切断部位を実証する。
【図１９Ｅ−Ｆ】図１９Ａから１９Ｇは、様々な位置のβ４インテグリンのグランザイムＢ切断部位から新Ｎ末端ペプチドを同定する注釈付きＭＳ／ＭＳスペクトルを提供する。図１９Ａは、Ｇｌｕ２２３↓Ａｒｇ２２４の切断部位を実証し；図１９Ｂは、Ａｓｐ２３７↓Ａｌａ２３８の切断部位を実証し；図１９Ｃは、Ａｓｐ２７２↓Ｇｌｙ２７３の切断部位を実証し；図１９Ｄは、Ａｓｐ３５１↓Ｓｅｒ３５２の切断部位を実証し；図１９Ｅは、Ａｓｐ４４２↓Ｇｌｙ４４３の切断部位を実証し；図１９Ｆは、Ａｓｐ４４７↓Ａｌａ４４８の切断部位を実証し；図１９Ｇは、Ａｓｐ６１１↓Ａｌａ６１２の切断部位を実証する。
【図１９Ｇ】図１９Ａから１９Ｇは、様々な位置のβ４インテグリンのグランザイムＢ切断部位から新Ｎ末端ペプチドを同定する注釈付きＭＳ／ＭＳスペクトルを提供する。図１９Ａは、Ｇｌｕ２２３↓Ａｒｇ２２４の切断部位を実証し；図１９Ｂは、Ａｓｐ２３７↓Ａｌａ２３８の切断部位を実証し；図１９Ｃは、Ａｓｐ２７２↓Ｇｌｙ２７３の切断部位を実証し；図１９Ｄは、Ａｓｐ３５１↓Ｓｅｒ３５２の切断部位を実証し；図１９Ｅは、Ａｓｐ４４２↓Ｇｌｙ４４３の切断部位を実証し；図１９Ｆは、Ａｓｐ４４７↓Ａｌａ４４８の切断部位を実証し；図１９Ｇは、Ａｓｐ６１１↓Ａｌａ６１２の切断部位を実証する。
【００４３】
【図２０】図２０は、２００ｎＭグランザイムＢの添加を含まないおよび含むＩ型コラーゲンの７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥクーマシー染色を示す。黒色矢印は１３０ｋＤａで検出された全長タンパク質を示し、その他のバンドはＩ型コラーゲンスプライス変異体およびアイソフォームを表す。グランザイムＢの添加は、切断バンドの出現をもたらさない。Ｃｏｌｌ  Ｉ、Ｉ型コラーゲン（ＣｏｌｌＩ）；グランザイムＢ（ＧｚｍＢ）。
【００４４】
【図２１Ａ−Ｂ】図２１Ａから２１Ｄは、様々な位置のＶＩＩ型コラーゲンのグランザイムＢ切断部位から新Ｎ末端ペプチドを同定する注釈付きＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。図２１Ａは、Ａｓｐ１９３↓Ｐｈｅ１９４の切断部位を実証し、図２１Ｂは、Ｇｌｕ３３２↓Ｌｅｕ３３３の切断部位を実証し、図２１Ｃは、Ａｓｐ３９０↓Ｔｙｒ３９１の切断部位を実証し、図２１Ｄは、Ａｓｐ４１４↓Ａｌａ４１５の切断部位を実証する。
【図２１Ｃ−Ｄ】図２１Ａから２１Ｄは、様々な位置のＶＩＩ型コラーゲンのグランザイムＢ切断部位から新Ｎ末端ペプチドを同定する注釈付きＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。図２１Ａは、Ａｓｐ１９３↓Ｐｈｅ１９４の切断部位を実証し、図２１Ｂは、Ｇｌｕ３３２↓Ｌｅｕ３３３の切断部位を実証し、図２１Ｃは、Ａｓｐ３９０↓Ｔｙｒ３９１の切断部位を実証し、図２１Ｄは、Ａｓｐ４１４↓Ａｌａ４１５の切断部位を実証する。
【００４５】
【図２２Ａ】図２２Ａから２２Ｃは、化合物Ａが、α６β４インテグリン、ナイドジェン−２およびＶＩＩ型コラーゲンのグランザイムＢによる切断を防止することができることを示す。図２２Ａは、グランザイムＢ阻害剤化合物Ａを含むおよび含まないα６β４インテグリンのＧｚｍＢ媒介性切断のクーマシー染色を示す。組換えヒトインテグリンα６／β４、（α６  ａａ  ２４−８７８、β４  ａａ  ２８−７１０）を、２００ｎＭ精製ヒトＧｚｍＢ中、３７℃で２４時間インキュベートした。阻害研究のために、基質を反応物に添加する前に、ＧｚｍＢを１００μＭの化合物Ａの存在下、３７℃で１時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、タンパク質を変性させ、４％〜２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで（α６／β４について）分離した。切断は、標準的なクーマシー染色を使用して実証した（図２２Ａ）。図２２Ｂは、阻害剤化合物Ａを含むおよび含まないナイドジェン−２のＧｚｍＢ媒介性切断のウエスタンブロットを示す。黒色矢印は、切断フラグメントを示し、＊は、全長タンパク質を示す。２００ｎＭの濃度で、ＧｚｍＢは切断バンドを生成し、この切断は化合物Ａによって防止された。単離したナイドジェン−２（アミノ酸残基３１〜１３７５；５００ｎｇ）を２００ｎＭ精製ヒトＧｚｍＢ中、３７℃で２４時間インキュベートした。阻害研究のために、基質を反応物に添加する前に、ＧｚｍＢを１００μＭの化合物Ａの存在下、３７℃で１時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、ナイドジェン−２タンパク質を変性させ、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。切断を抗ナイドジェン−２抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出した。図２２Ｃは、阻害剤化合物Ａを含むおよび含まないＶＩＩ型コラーゲンのＧｚｍＢ媒介性切断のウエスタンブロットを示す。黒色矢印は、切断フラグメントを示し、＊は、全長タンパク質を示す。２００ｎＭの濃度で、ＧｚｍＢは切断バンドを生成し、この切断は１００μＭの化合物Ａによって防止される。単離したＶＩＩ型コラーゲン（アミノ酸残基１９９〜４８２；５００ｎｇ）を２００ｎＭ精製ヒトＧｚｍＢ中、３７℃で２４時間インキュベートした。阻害研究のために、基質を反応物に添加する前に、ＧｚｍＢを１００μＭの化合物Ａの存在下、３７℃で１時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、ＶＩＩ型コラーゲンタンパク質を変性させ、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。切断を抗ＶＩＩ型コラーゲン抗体（ＡＢＣＡＭ、オンタリオ州トロント）で検出した。
【図２２Ｂ】図２２Ａから２２Ｃは、化合物Ａが、α６β４インテグリン、ナイドジェン−２およびＶＩＩ型コラーゲンのグランザイムＢによる切断を防止することができることを示す。図２２Ａは、グランザイムＢ阻害剤化合物Ａを含むおよび含まないα６β４インテグリンのＧｚｍＢ媒介性切断のクーマシー染色を示す。組換えヒトインテグリンα６／β４、（α６  ａａ  ２４−８７８、β４  ａａ  ２８−７１０）を、２００ｎＭ精製ヒトＧｚｍＢ中、３７℃で２４時間インキュベートした。阻害研究のために、基質を反応物に添加する前に、ＧｚｍＢを１００μＭの化合物Ａの存在下、３７℃で１時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、タンパク質を変性させ、４％〜２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで（α６／β４について）分離した。切断は、標準的なクーマシー染色を使用して実証した（図２２Ａ）。図２２Ｂは、阻害剤化合物Ａを含むおよび含まないナイドジェン−２のＧｚｍＢ媒介性切断のウエスタンブロットを示す。黒色矢印は、切断フラグメントを示し、＊は、全長タンパク質を示す。２００ｎＭの濃度で、ＧｚｍＢは切断バンドを生成し、この切断は化合物Ａによって防止された。単離したナイドジェン−２（アミノ酸残基３１〜１３７５；５００ｎｇ）を２００ｎＭ精製ヒトＧｚｍＢ中、３７℃で２４時間インキュベートした。阻害研究のために、基質を反応物に添加する前に、ＧｚｍＢを１００μＭの化合物Ａの存在下、３７℃で１時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、ナイドジェン−２タンパク質を変性させ、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。切断を抗ナイドジェン−２抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出した。図２２Ｃは、阻害剤化合物Ａを含むおよび含まないＶＩＩ型コラーゲンのＧｚｍＢ媒介性切断のウエスタンブロットを示す。黒色矢印は、切断フラグメントを示し、＊は、全長タンパク質を示す。２００ｎＭの濃度で、ＧｚｍＢは切断バンドを生成し、この切断は１００μＭの化合物Ａによって防止される。単離したＶＩＩ型コラーゲン（アミノ酸残基１９９〜４８２；５００ｎｇ）を２００ｎＭ精製ヒトＧｚｍＢ中、３７℃で２４時間インキュベートした。阻害研究のために、基質を反応物に添加する前に、ＧｚｍＢを１００μＭの化合物Ａの存在下、３７℃で１時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、ＶＩＩ型コラーゲンタンパク質を変性させ、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。切断を抗ＶＩＩ型コラーゲン抗体（ＡＢＣＡＭ、オンタリオ州トロント）で検出した。
【図２２Ｃ】図２２Ａから２２Ｃは、化合物Ａが、α６β４インテグリン、ナイドジェン−２およびＶＩＩ型コラーゲンのグランザイムＢによる切断を防止することができることを示す。図２２Ａは、グランザイムＢ阻害剤化合物Ａを含むおよび含まないα６β４インテグリンのＧｚｍＢ媒介性切断のクーマシー染色を示す。組換えヒトインテグリンα６／β４、（α６  ａａ  ２４−８７８、β４  ａａ  ２８−７１０）を、２００ｎＭ精製ヒトＧｚｍＢ中、３７℃で２４時間インキュベートした。阻害研究のために、基質を反応物に添加する前に、ＧｚｍＢを１００μＭの化合物Ａの存在下、３７℃で１時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、タンパク質を変性させ、４％〜２０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで（α６／β４について）分離した。切断は、標準的なクーマシー染色を使用して実証した（図２２Ａ）。図２２Ｂは、阻害剤化合物Ａを含むおよび含まないナイドジェン−２のＧｚｍＢ媒介性切断のウエスタンブロットを示す。黒色矢印は、切断フラグメントを示し、＊は、全長タンパク質を示す。２００ｎＭの濃度で、ＧｚｍＢは切断バンドを生成し、この切断は化合物Ａによって防止された。単離したナイドジェン−２（アミノ酸残基３１〜１３７５；５００ｎｇ）を２００ｎＭ精製ヒトＧｚｍＢ中、３７℃で２４時間インキュベートした。阻害研究のために、基質を反応物に添加する前に、ＧｚｍＢを１００μＭの化合物Ａの存在下、３７℃で１時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、ナイドジェン−２タンパク質を変性させ、７．５％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。切断を抗ナイドジェン−２抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出した。図２２Ｃは、阻害剤化合物Ａを含むおよび含まないＶＩＩ型コラーゲンのＧｚｍＢ媒介性切断のウエスタンブロットを示す。黒色矢印は、切断フラグメントを示し、＊は、全長タンパク質を示す。２００ｎＭの濃度で、ＧｚｍＢは切断バンドを生成し、この切断は１００μＭの化合物Ａによって防止される。単離したＶＩＩ型コラーゲン（アミノ酸残基１９９〜４８２；５００ｎｇ）を２００ｎＭ精製ヒトＧｚｍＢ中、３７℃で２４時間インキュベートした。阻害研究のために、基質を反応物に添加する前に、ＧｚｍＢを１００μＭの化合物Ａの存在下、３７℃で１時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、ＶＩＩ型コラーゲンタンパク質を変性させ、１０％  ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。切断を抗ＶＩＩ型コラーゲン抗体（ＡＢＣＡＭ、オンタリオ州トロント）で検出した。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、皮膚の剥離および／または水疱形成の処置および／または予防のための組成物および方法を提供する。組成物は、ＧｚｍＢ阻害剤化合物を含む製剤を含み得る。本発明の方法において、組成物は、経口的に、局所的に、あるいは全身、皮下、皮内、または静脈内注射などによって投与される。
【００４７】
皮膚は２つの主要な層：表皮および真皮で構成されている。水疱は、真皮内または真皮下の流体の蓄積である。診断は、細胞間の破損の位置によって決まる（Ｃｌａｒｋｅら，Ｃｏｌｏｒ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｄｅｒｍａｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｐ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｌｔｓ．，Ｃｈ  ４，２０１４）。一般に、水疱は、３つの種類に分類することができる：１）角層下（非常に薄い蓋（ｒｏｏｆ）で、簡単に壊れる。例えば、膿痂疹、汗疹、ブドウ球菌性熱傷様皮膚症候群）；２）表皮内（すなわち表皮の内部、薄い蓋が破裂して露出した（denuded）表面を残す。例えば、天疱瘡、水痘、単純ヘルペス、急性湿疹）および３）表皮下（すなわち表皮の下、剛性の蓋（tense  roof）がインタクトなままである。例えば、水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、多形性紅斑ＳＪＳ／ＴＥＮ、摩擦水疱）。水疱形成は、摩擦、極端な温度、化学物質への曝露、ガスへの曝露、接触性皮膚炎、毒物、感染、押しつぶすこと／挟むこと、自己免疫および／または医学的状態によって引き起こされ得る。
【００４８】
剥離とは、皮膚の上層（表皮）の損傷および損失をさす。皮膚の剥離および／または水疱形成は、皮膚を刺激または損傷する環境因子、例えば極端な温度（高温または低温）、感染、摩擦、太陽、風、熱、乾燥、過度の湿度、反復刺激、化学物質、アレルゲン、または薬物；ならびに自己免疫障害および遺伝障害を含む病的状態によって引き起こされ得る。
【００４９】
病因に基づいて、これらの皮膚疾患は、通常、４つの主な群：ａ）抗体媒介性、ｂ）皮膚への有害な薬物反応、ｃ）先天性の状態、ならびにｄ）熱傷、摩擦、日光、虫刺され、感染、および化学兵器などの外部傷害に起因する水疱形成、に分類される。自己免疫性水疱性皮膚疾患に関して、自己抗体は、皮膚の構造または接着分子に対して産生され、特異的自己抗原の位置および水疱形成のレベルに基づく；これらの疾患は、さらに表皮内および表皮下水疱症に分類される。天疱瘡（表皮内水疱形成）は、細胞間接着（棘融解）の喪失と、デスモグレイン、カドヘリンおよび／またはその他のデスモソームタンパク質などの上皮接着タンパク質に対する抗体を特徴とする上皮間水疱形成を特徴とする。水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎および表皮水疱症などの表皮下水疱性皮膚疾患では、真皮表皮接合部（ＤＥＪ）の成分を標的とする自己抗体は、この基底膜の崩壊および結果としての表皮の脱離を引き起こす（Ｂａｕｍら，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ．Ｒｅｖ．１３：４８２−４８９，２０１４）。
【００５０】
上記のように、ｐｅｅｌｉｎｇ  ｓｋｉｎ症候群（脱落性皮膚、家族性連続皮膚剥離、剥脱性魚鱗癬とも呼ばれる）とは、下層の表皮からの角質層（皮膚の最外層）の分離に起因する、痛みを伴わない連続的で自発的な皮膚の剥離（剥脱）を特徴とする、稀な遺伝性皮膚障害の群をさす。Ｐｅｅｌｉｎｇ  ｓｋｉｎ症候群は、水疱形成および／または紅斑（皮膚の発赤）および／またはそう痒症（そう痒）も示すことがある。Ｐｅｅｌｉｎｇ  ｓｋｉｎ症候群の症状は、出生時に観察され得るか、または幼児期に現れることがある。２つの型のＰｅｅｌｉｎｇ  ｓｋｉｎ症候群が認識される：（１）外皮全体を含む全身型、および（２）四肢だけ、主に手と足を含む先端型（先端Ｐｅｅｌｉｎｇ  ｓｋｉｎ症候群）。先端型では、患者は通常、出生時または幼児期に水疱およびびらんを手と足に発症し、これは水疱性皮膚障害、単純性表皮水疱症を暗示する。
【００５１】
水疱性皮膚障害は、皮膚および／または粘膜の水疱およびびらんを伴う稀な皮膚疾患の群である。水疱性皮膚疾患の種類としては：（１）水疱性類天疱瘡、薬物誘発性天疱瘡、風土性天疱瘡、紅斑性天疱瘡、増殖性天疱瘡、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、腫瘍随伴性天疱瘡、粘膜類天疱瘡、表皮水疱症、線状ＩｇＡ病、水疱性ループス、疱疹状皮膚炎などの自己免疫性水疱症ならびに（２）例えば、単純性表皮水疱症、接合部型表皮水疱症、栄養障害型表皮水疱症、および後天性表皮水疱症をはじめとする表皮水疱症（ＥＢ）などの遺伝性水疱症が挙げられる。時々、皮膚は、化粧品、洗剤、溶剤、またはペルーバルサム、硫酸ニッケル、またはウルシオール（毒オーク、毒ウルシ、ツタウルシ）などのその他の化学物質と接触すると、水膨れができる。水疱はまた、虫刺され、抽出物または刺し傷によって引き起こされるアレルギー反応が原因でも生じる。化学兵器剤（すなわち、びらん剤）または発疱剤も、皮膚と接触する場所では大きな有痛性水疱を引き起こし得る（例えば、マスタードガス）。水疱形成は、カンタリジンなどのベルシカント（ｖｅｒｓｉｃａｎｔ）を放出するいくつかの種類の甲虫との接触後にも起こり得る。そのような水疱形成は、水疱性甲虫皮膚炎またはパエデルス皮膚炎に関連している。
【００５２】
真皮表皮接合部（ＤＥＪ）は、表皮と真皮の間の特殊化された基底膜であり、皮膚の完全性および機能の重大な目的を果たす。ＤＥＪは、表皮の基底板と真皮の乳頭層の間に堅固な固定を提供する一方、これらの二層間の細胞および分子交換中に選択フィルターとして働く。さらに、ＤＥＪと表皮の基底板との相互作用は、基底ケラチノサイトの極性を決定し、それに付着した増殖細胞を維持しながら、娘細胞を上層に向かって遊走させる。
【００５３】
構造的に、ＤＥＪは４つの区域：１）基底表皮細胞膜、２）透明帯、３）緻密板および４）小線維帯（真皮乳頭層）に分割することができる。最初の層は、基底ケラチノサイト膜と、ヘミデスモソームと呼ばれるその特殊化された接合部構造によって表され、これは膜貫通タンパク質α６／β４およびα３／β１インテグリン、ならびにＸＶＩＩ型コラーゲンを通してケラチノサイト細胞骨格を透明帯に接続する。透明帯では、これらのタンパク質は、ケラチン細胞骨格を、主にラミニン−５で構成される係留フィラメントに架橋する。これらの係留フィラメントは、次に、ナイドジェンおよびパールカンを通して、緻密板の主な成分であるＩＶ型コラーゲンと結合する。ＤＥＪの最後の結合部は、緻密板の要素と小線維帯のアンカリングフィブリルとの間の結合によって表される。Ｂｕｒｇｅｓｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．９：６５１−６５８，１９９７；Ａｕｍａｉｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｂｉｏｌ．１８（１）：１９−２８。
【００５４】
アンカリングフィブリルは、ＤＥＪの構造的完全性に役立つ非線維性コラーゲンである、ＶＩＩ型コラーゲンでほぼ独占的に構成されている。遺伝子ＣＯＬ７Ａ１にコードされるＶＩＩ型コラーゲンは、３つのα１鎖のホモ三量体であり、Ｃ末端非コラーゲン性ドメイン２（ＮＣ−２）およびＮ末端非コラーゲン性ドメイン１（ＮＣ−１）に隣接する１つの中央コラーゲン性ドメインで構成される（図４）。ＮＣ−１には、接着タンパク質と高い相同性を持ついくつかのサブドメイン：１つの軟骨マトリックスタンパク質様ドメイン（ＣＭＰ）、９つのフィブロネクチン様ドメイン（ＦＮＩＩＩ）、および１つのフォンウィルブランド因子Ａ様ドメイン（ｖＷＦＡ２）が含まれる。Ｌｅｉｎｅｗｅｂｅｒら，Ｆｅｂｓ  Ｌｅｔｔ．５８５：１７４８−１７５２，２０１１。これらのドメインの中で、ＦＮＩＩＩ領域はいくつかのＥＣＭ成分との相互作用に極めて重要である。ＮＣ１領域の組換えバージョンを用いる研究により、ＦＮＩＩＩドメインと、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン−５およびフィブロネクチンとの強い結合親和性が明らかになった。Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４５１６−１４５２２，１９９７；Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：１７７−１８３，１９９９。ラミニン−５およびＩＶ型コラーゲンへのＦＮＩＩＩ結合を通じて真皮乳頭層の緻密板への固定を可能にするのはこの領域である。
【００５５】
真皮と表皮との間の最初の接着点としてのその役割のために、ＶＩＩ型コラーゲンの任意の構造改変または機能障害は、結果として表皮脱離および水疱形成を伴うＤＥＪの崩壊をもたらす。ＶＩＩ型コラーゲンの変異またはＶＩＩ型コラーゲンに対する自己抗体の産生は、それぞれ栄養障害型表皮水疱症および後天性表皮水疱症の主な原因である。これらの状態は、広範な表皮脱離および水疱の形成を特徴とする。Ｈａｓ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｅｍｂｒ．７６：１１７−１７０，２０１５。
【００５６】
ＧｚｍＢは、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の顆粒に見出されるアポトーシス促進性のセリンプロテアーゼである。ＧｚｍＢは、ポア形成タンパク質であるパーフォリンとともに標的細胞に放出され、細胞質へのそのパーフォリン依存性内部移行およびその後のアポトーシス誘導をもたらす（例えば、Ｍｅｄｅｍａら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７：３４９２−３４９８，１９９７参照）。しかし、ＧｚｍＢは、その他の種類の免疫細胞（例えば、マスト細胞、マクロファージ、好中球、および樹状細胞）または非免疫細胞（ケラチノサイト、軟骨細胞）によって発現され分泌されることもでき、細胞外マトリックスリモデリング活性を有することが示されている（Ｈｉｅｂｅｒｔら，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１８（１２）：７３２−７４１）。本出願において、皮膚でのＧｚｍＢの蓄積は、水疱形成で生じるものと同様に、真皮からの表皮の分離を促進できることが示される。また、ＧｚｍＢが真皮表皮接合部（ＤＥＪ）の重要な接合部タンパク質を切断することも実証されている。
【００５７】
ＧｚｍＢの増加は多くの皮膚疾患で観察される。図１および２において、ＧｚｍＢのヒト皮膚への添加が真皮からの表皮の分離を誘発することが本明細書において示された。
【００５８】
本明細書に記載される驚くべき結果に基づいて、そして理論に縛られることなく、皮膚におけるＧｚｍＢの阻害は、上述の原因により剥離または水疱形成を起こす傾向のあり得る皮膚の剥離および／または水疱形成を予防することができると考えられる。
【００５９】
一態様では、本発明は、皮膚の剥離または水疱形成を予防および／または処置するための組成物を提供する。組成物は、ＧｚｍＢ阻害剤化合物またはその薬学的に許容され得る塩を薬学的に許容され得る担体、および必要に応じてその他の水疱および／または創傷治癒成分または化合物と組み合わせて含む製剤を含む。
【００６０】
本発明の実践において、本発明の組成物は、有意な完全な皮膚の浸透なく、角質層の浸透に有効な特定の製剤を含むことができることが有利に見出された。本発明の製剤は一般に治療薬の全身投与に望ましい特徴である経皮送達よりもＧｚｍＢ阻害剤化合物の皮内送達に有効である。本発明の組成物はまた、静脈内または経口投与用に製剤化されて、それぞれＳＪＳ／ＴＥＮまたは口腔天疱瘡などの特定の状態を処置することもできる。
【００６１】
ＧｚｍＢ阻害剤化合物
本発明の製剤および方法は、式（Ｉ）を有するＧｚｍＢ阻害剤化合物
【化１】
2020510655.tif 000003
｛式中、
Ｒ１は、
（ａ）１，２，３−トリアゾリル、および
（ｂ）１，２，３，４−テトラゾリル
から選択されるヘテロアリール基であり；
ｎは、１または２であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルから選択され；
Ｒ３は、
（ａ）水素、
（ｂ）必要に応じてカルボン酸、カルボン酸塩、またはカルボン酸Ｃ１〜Ｃ８エステル基（−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ１〜Ｃ８）で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、必要に応じてアルキルヘテロアリール基、またはヘテロアリール基で置換されたアミドから選択され；
Ｚは、基
【化２】
2020510655.tif 000004
（式中、
Ｙは、水素、複素環、−ＮＨ２、またはＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ４は、
（ｉ）Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、
（ｉｉ）必要に応じてＣ１〜Ｃ６アルキルで置換されたＣ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、
（ｉｖ）Ｃ６〜Ｃ１０アリール、
（ｖ）ヘテロシクリル、
（ｖｉ）Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、
（ｖｉｉ）アラルキル、および
（ｖｉｉｉ）ヘテロアルキルアリールから選択され；
Ｒ５は、ヘテロアリールまたは−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１０であり、
式中、Ｒ１０は、
（ｉ）必要に応じて、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロアリール、アミノ、またはカルボン酸で置換されたＣ１〜Ｃ１２アルキル、
（ｉｉ）必要に応じて、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはカルボン酸で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル、
（ｉｉｉ）必要に応じて、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、必要に応じて置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール、必要に応じて置換されたＣ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、アミノ、またはカルボン酸で置換された、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、
（ｉｖ）必要に応じて、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、必要に応じて置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール、必要に応じて置換されたＣ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、アミノ、またはカルボン酸で置換された、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、
（ｖ）ヘテロシクリル、
（ｖｉ）Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、
（ｖｉｉ）アラルキル、および
（ｖｉｉｉ）ヘテロアルキルアリールから選択される）から選択されるアシル基である｝、
その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容される塩
を使用する。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明の製剤および方法において有用な化合物は、式（Ｉ）を有する化合物、その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容され得る塩を含み、式中、
Ｒ１は、
（ａ）１，２，３−トリアゾリル、および
（ｂ）１，２，３，４−テトラゾリル
から選択されるヘテロアリール基であり；
ｎは、１であり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルから選択され；
Ｒ３は、
（ａ）水素、
（ｂ）必要に応じて、カルボン酸、カルボン酸塩、またはカルボン酸Ｃ１〜Ｃ８エステル基（−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２−、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣ１〜Ｃ８）で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、必要に応じて、アルキルヘテロアリール基、またはヘテロアリール基で置換されたアミドから選択され；
Ｚは、基
【化３】
2020510655.tif 000005
（式中、Ｒ４、Ｒ５、およびＹは上記の通りである）から選択されるアシル基である。
【００６３】
さらなる実施形態では、本発明の製剤および方法において有用な化合物は、式（Ｉ）を有する化合物、その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容され得る塩を含み、式中、
Ｒ１は、テトラゾールまたはトリアゾールであり；ｎは１であり；Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルから選択され；Ｒ３は、水素、カルボン酸またはカルボン酸基で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、必要に応じて、アルキルヘテロアリール基、またはヘテロアリール基で置換されたアミドで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキルから選択され；Ｚは、
【化４】
2020510655.tif 000006
であり；かつ
Ｒ１は、テトラゾールまたはトリアゾールであり；ｎは１であり；Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルから選択され；Ｒ３は、独立に、水素、またはカルボン酸またはカルボン酸基で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル、必要に応じてアルキルヘテロアリール基、またはヘテロアリール基で置換されたアミドであり；Ｚは、
【化５】
2020510655.tif 000007
（式中、
Ｒ４は、
（ｉ）Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、
（ｉｉ）Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、
（ｉｉｉ）Ｃ６〜Ｃ１０アリール、および
（ｉｖ）Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロアリールから選択され；
Ｒ５は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ１０であり、式中、Ｒ１０は、
（ｉ）必要に応じて、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロアリール、アミノ、またはカルボン酸で置換されたＣ１〜Ｃ１２アルキル、
（ｉｉ）必要に応じて、Ｃ１〜Ｃ６アルキルまたはカルボン酸で置換されたＣ１〜Ｃ１０ヘテロアルキル、
（ｉｉｉ）必要に応じて、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、必要に応じて置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール、必要に応じて置換されたＣ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、アミノ、またはカルボン酸で置換された、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、
（ｉｖ）必要に応じて、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、必要に応じて置換されたＣ６〜Ｃ１０アリール、必要に応じて置換されたＣ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、アミノ、またはカルボン酸で置換された、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、
（ｖ）Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロアリールから選択され；かつ
Ｙは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、または−ＮＨ２である）である。
【００６４】
もう一つの実施形態では、本発明の組成物および方法において有用な化合物は、式（ＩＩ）を有する化合物：
【化６】
2020510655.tif 000008
その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容され得る塩を含み、式中、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＲ１０は式（Ｉ）について上記の通りである。
【００６５】
特定の実施形態では、Ｒ１０は、カルボン酸またはカルボン酸基で置換されているＣ１〜Ｃ１２アルキルと定義される場合に、
ｎが２、３、４、５、または６である、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２Ｈであり；
必要に応じて、ここで、１または複数の単一のメチレン炭素が、フルオロ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１〜Ｃ３アルキル（例えば、メチル）、またはＣ６〜Ｃ１０アリール基で置換されており；
必要に応じて、ここで、１または複数の単一のメチレン炭素が、２つのフルオロ（例えば、ジフルオロ、パーフルオロ）またはＣ１〜Ｃ３アルキル（例えば、ｇｅｍ−ジメチル）基で置換されており；
必要に応じて、ここで、１または複数の単一のメチレン炭素が、それらが結合している炭素と一緒に、３、４、５、または６員の炭素環式環（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルなどのスピロ基）を形成する２つのアルキル基で置換されており；かつ
必要に応じて、ここで、不飽和炭素−炭素結合（例えば、−ＣＨ＝ＣＨ−などのアルケニル）からの隣接する炭素原子またはベンゼン環の形状（例えば、１，２−、１，３−、および１，４−フェニレン）がとられ
；あるいは
式中、Ｒ１０は、カルボン酸またはカルボン酸基で置換されているＣ３〜Ｃ６シクロアルキルと定義される場合に、
【化７】
2020510655.tif 000009
（式中、ｎは、１、２、３、または４である）であり、必要に応じて、ｎ＝３または４の場合、ここで、不飽和炭素−炭素結合からの隣接する炭素原子（例えば、シクロペンテニルまたはシクロヘキセニル）である。
【００６６】
特定の実施形態では、本発明の組成物および方法において有用な化合物は、式（ＩＩ）を有する化合物、その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容され得る塩を含み、式中、
Ｒ１は、テトラゾールまたはトリアゾールであり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルから選択され；
Ｒ３は、水素、必要に応じてカルボン酸、カルボン酸塩、またはカルボン酸エステル基で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル；または必要に応じて、必要に応じてアルキルヘテロアリール基で置換されていてよいアミドで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；かつ
Ｒ１０は、必要に応じて、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ１〜Ｃ１０ヘテロアリール、アミノ、またはカルボン酸で置換されたＣ１〜Ｃ１２アルキルである。
【００６７】
さらなる実施形態では、本発明の組成物および方法において有用な化合物は、式（ＩＩ）を有する化合物、その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容され得る塩を含み、式中、
Ｒ１は、テトラゾールまたはトリアゾールであり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルから選択され；
Ｒ３は、水素、必要に応じてカルボン酸、カルボン酸塩、またはカルボン酸エステル基で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ８アルキルまたはＣ３〜Ｃ６シクロアルキルであり；かつ
Ｒ１０は、
（ａ）Ｃ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）またはＣ１〜Ｃ１０ヘテロアリール（例えば、トリアゾリルまたはテトラゾリル）で置換されたＣ１〜Ｃ３アルキル；
（ｂ）ｎが２、３、４、５、または６である、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２Ｈ；
（ｃ）ｎが１、２、３、または４である、
【化８】
2020510655.tif 000010
から選択される。
【００６８】
一実施形態では、本発明の組成物および方法において有用な化合物は、式（ＩＩ）を有する化合物、その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容され得る塩を含み、式中、
Ｒ１は、テトラゾールであり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル（例えば、メチル）、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルキル（例えば、シクロヘキシル）から選択され；
Ｒ３は、水素あるいは必要に応じてカルボン酸、カルボン酸塩、またはカルボン酸塩エステル基で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル（例えば、カルボン酸、カルボン酸塩、またはカルボン酸エステル基で置換されたＣ２アルキル）であり；
Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ８アルキル（例えば、Ｃ４アルキル）であり；かつ
Ｒ１０は、ｎが２、３、４、５、または６である、−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２Ｈ（例えば、ｎが２である場合には−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ２Ｈ）である。
【００６９】
式（ＩＩ）の代表的な化合物には、Ｃ１〜Ｃ５が含まれる。
【００７０】
さらなる実施形態では、本発明の組成物および方法において有用な化合物は、式（ＩＩＩ）を有する化合物：
【化９】
2020510655.tif 000011
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、およびＹは、式（Ｉ）について上に定義される通りである）、その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容され得る塩を含む。
【００７１】
特定の実施形態では、本発明の組成物および方法において有用な化合物は、式（ＩＩＩ）を有する化合物、その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容され得る塩を含み、式中、
Ｒ１は、テトラゾールまたはトリアゾールであり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルから選択され；
Ｒ３は、水素；必要に応じてカルボン酸、カルボン酸塩、またはカルボン酸エステル基で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキル；または必要に応じて、必要に応じてアルキルヘテロアリール基で置換されていてよいアミドで置換されたＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ４は、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル、Ｃ６〜Ｃ１０アリール、Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、またはヘテロシクリルであり；かつ
Ｙは、水素、Ｃ１〜Ｃ４アルキル、または−ＮＨ２である。
【００７２】
さらなる実施形態では、本発明の組成物および方法において有用な化合物は、式（ＩＩＩ）を有する化合物、その立体異性体、互変異性体、または薬学的に許容され得る塩を含み、式中、
Ｒ１は、テトラゾールまたはトリアゾールであり；
Ｒ２は、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、およびＣ３〜Ｃ６シクロアルキルから選択され；
Ｒ３は、必要に応じてカルボン酸、カルボン酸塩、またはカルボン酸エステル基で置換されたＣ１〜Ｃ４アルキルであり；
Ｒ４は、
（ｉ）Ｃ１〜Ｃ８アルキル（例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル）、
（ｉｉ）Ｃ３〜Ｃ６シクロアルキル（すなわちシクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル）、
（ｉｉｉ）Ｃ６〜Ｃ１０アリール（例えば、フェニル）、
（ｉｖ）Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロアリール（例えば、チオフェニル）、および
（ｖ）ヘテロシクリル（例えば、モルホリニル）から選択され；かつ
Ｙは、水素である。
【００７３】
式（ＩＩＩ）の代表的な化合物には、Ｃ６が含まれる。
【００７４】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の化合物について、代表的な置換基Ｒ３には、以下が含まれる：
【化１０】
2020510655.tif 000012
【００７５】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の化合物について、代表的な置換基Ｒ４には、以下が含まれる：
【化１１】
2020510655.tif 000013
【００７６】
式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）の化合物について、代表的な置換基Ｒ５には、以下が含まれる：
【化１２】
2020510655.tif 000014
【００７７】
阻害剤化合物の各々は、不斉炭素中心を含み、立体異性体（すなわち、ジアステレオマーおよびエナンチオマーなどの光学異性体）を生じさせる。本発明がそのようなジアステレオマーならびにそれらのラセミ体および分割された鏡像異性的に純粋な形態を含むことは理解される。また、特定の構成において、特定の基の相対的な立体化学は、絶対立体化学が示されていない場合に「シス」または「トランス」として表されることがあることも理解される。
【００７８】
本明細書に記載の化合物のいくつかは、オレフィン二重結合を含み、特に明記されない限り、ＥおよびＺ幾何異性体の両方を含むことを意味する。
【００７９】
特定の化合物は、１または複数の互変異性型（例えば、ｐＨ環境に応じて酸性または塩基性型）で存在することがある。化合物がそれらの互変異性型（すなわち、互変異性体）を含むことは理解される。
【００８０】
化合物が塩基性である場合、塩は、無機酸および有機酸を含む薬学的に許容され得る無毒の酸から調製されてよい。そのような酸の例としては、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモ酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、およびｐ−トルエンスルホン酸が挙げられる。
【００８１】
特に明記しない限り以下の定義。
【００８２】
本明細書において使用される場合、「アルキル」という用語は、親アルカン、アルケン、またはアルキンの単一炭素原子から１つの水素原子を除去することによって得られる飽和または不飽和、分岐、直鎖または環状一価炭化水素基をさす。代表的なアルキル基としては、メチル；エタニル、エテニル、エチニルなどのエチル；プロパン−１−イル、プロパン−２−イル、シクロプロパン−１−イル、プロパ−１−エン−１−イル、プロパ−１−エン−２−イル、プロパ−２−エン−１−イル（アリル）、シクロプロパ−１−エン−１−イル；シクロプロパ−２−エン−１−イル、プロパ−１−イン−１−イル、およびプロパ−２−イン−１−イルなどのプロピル；ブタン−１−イル、ブタン−２−イル、２−メチル−プロパン−１−イル、２−メチル−プロパン−２−イル、シクロブタン−１−イル、ブタ−１−エン−１−イル、ブタ−１−エン−２−イル、２−メチル−プロパ−１−エン−１−イル、ブタ−２−エン−１−イル、ブタ−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブタ−１−エン−１−イル、シクロブタ−１−エン−３−イル、シクロブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１−イン−１−イル、ブタ−１−イン−３−イル、およびブタ−３−イン−１−イルなどのブチル；などが挙げられる。特定のレベルの飽和が意図される場合、「アルカニル」、「アルケニル」、および「アルキニル」という表現が使用される。アルキル基にはシクロアルキル基が含まれる。「シクロアルキル」という用語は、示された数の炭素原子を有する単環式、二環式、および三環式アルキル基をさす。代表的なシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘプチル、アダマンチル、シクロドデシルメチル、および２−エチル−１−ビシクロ［４．４．０］デシル基が挙げられる。アルキル基は、以下に記載されるように非置換であっても置換されていてもよい。
【００８３】
「アルカニル」とは、飽和分岐、直鎖、または環状アルキル基をさす。代表的なアルカニル基としては、メタニル；エタニル；プロパン−１−イル、プロパン−２−イル（イソプロピル）、およびシクロプロパン−１−イルなどのプロパニル；ブタン−１−イル、ブタン−２−イル（ｓｅｃ−ブチル）、２−メチル−プロパン−１−イル（イソブチル）、２−メチル−プロパン−２−イル（ｔ−ブチル）、およびシクロブタン−１−イルなどのブタニル；などが挙げられる。アルカニル基は、置換されていても非置換であってもよい。代表的なアルカニル基置換基としては、
−Ｒ１４、−ＯＲ１４、−ＳＲ１４、−ＮＲ１４（Ｒ１５）、
−Ｘ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１４、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１４、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ１４、
−Ｃ（＝ＮＲ１４）Ｒ１４、−Ｃ（＝ＮＲ１４）ＯＲ１４、−Ｃ（＝ＮＲ１４）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−Ｃ（＝ＮＲ１４）ＳＲ１４、
−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ１４、−Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ１４、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ１４、
−ＮＲ１４Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−ＮＲ１４（＝ＮＲ１４）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−ＮＲ１４Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、
−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１４、−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＲ１４、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ１４（Ｒ１５）、
−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１４、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ１４、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＳＲ１４、
−ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＲ１４、−ＯＳ（＝Ｏ）２ＮＲ１４（Ｒ１５）、および
−ＯＰ（＝Ｏ）２（ＯＲ１４）が挙げられ、
式中、各Ｘは独立にハロゲンであり；Ｒ１４およびＲ１５は独立に水素、本明細書において定義されるＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、アリールアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルである。
【００８４】
特定の実施形態では、単一の炭素原子上の２個の水素原子は、＝Ｏ、＝ＮＲ１２、または＝Ｓで置き換えることができる。
【００８５】
「アルケニル」とは、親アルケンの単一の炭素原子から１つの水素原子を除去することによって得られる少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和分枝、直鎖、環状アルキル基、またはそれらの組み合わせをさす。この基は、１または複数の二重結合に対してシスまたはトランス立体構造のいずれかであり得る。代表的なアルケニル基としては、エテニル；プロパ−１−エン−１−イル、プロパ−１−エン−２−イル、プロパ−２−エン−１−イル（アリル）、プロパ−２−エン−２−イル、およびシクロプロパ−１−エン−１−イル；シクロプロパ−２−エン−１−イルなどのプロペニル；ブタ−１−エン−１−イル、ブタ−１−エン−２−イル、２−メチル−プロパ−１−エン−１−イル、ブタ−２−エン−１−イル、ブタ−２−エン−１−イル、ブタ−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル、シクロブタ−１−エン−１−イル、シクロブタ−１−エン−３−イル、およびシクロブタ−１，３−ジエン−１−イルなどのブテニル；などが挙げられる。アルケニル基は、置換されていても非置換であってもよい。代表的なアルケニル基置換基としては、
−Ｒ１４、
−Ｘ、−ＣＸ３、−ＣＮ，
−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１４、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１４、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ１４、
−Ｃ（＝ＮＲ１４）Ｒ１４、−Ｃ（＝ＮＲ１４）ＯＲ１４、−Ｃ（＝ＮＲ１４）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−Ｃ（＝ＮＲ１４）ＳＲ１４、
−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ１４、−Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ１４、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ１４が挙げられ、
式中、各Ｘは独立にハロゲンであり；Ｒ１４およびＲ１５は独立に水素、本明細書において定義されるＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、アリールアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルである。
【００８６】
「アルキニル」とは、親アルキンの単一の炭素原子から１つの水素原子を除去することによって得られる少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する不飽和分枝、直鎖または環状アルキル基をさす。代表的なアルキニル基としては、エチニル；プロパ−１−イン−１−イルおよびプロパ−２−イン−１−イルなどのプロピニル；ブタ−１−イン−１−イル、ブタ−１−イン−３−イル、およびブタ−３−イン−１−イルなどのブチニル；などが挙げられる。アルキニル基は、置換されていても非置換であってもよい。代表的なアルキニル基置換基としては、アルケニル基について上記で説明されるものが挙げられる。
【００８７】
「ハロアルキル」という用語は、ハロゲン原子で置き換えられた１または複数の水素原子を有する上記で定義されるアルキル基をさす。代表的なハロアルキル基としては、クロロメチル、フルオロメチル、およびトリフルオロメチル基などのハロメチル基；ならびにクロロエチル、フルオロエチル、およびパーフルオロエチル基などのハロエチル基が挙げられる。
【００８８】
「ヘテロアルキル」という用語は、示された数の炭素原子を有し、１または複数の炭素原子が、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択されるヘテロ原子で置き換えられているアルキル基をさす。特定のレベルの飽和が意図される場合、「ヘテロアルカニル」、「ヘテロアルケニル」、および「ヘテロアルキニル」という表現が使用される。代表的なヘテロアルキル基としては、エーテル、アミン、およびチオエーテル基が挙げられる。ヘテロアルキル基にはヘテロシクリル基が含まれる。「ヘテロシクリル」という用語は、Ｏ、Ｓ、およびＮから選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する５員〜１０員の非芳香単環式または二環式環をさす。代表的なヘテロシクリル基としては、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロプラニル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｕｒａｎｙｌ）、およびモルホリニル基が挙げられる。ヘテロアルキル基は、置換されていても非置換であってもよい。代表的なヘテロアルキル置換基としては、
−Ｒ１４、−ＯＲ１４、−ＳＲ１４、−ＮＲ１４（Ｒ１５）、
−Ｘ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１４、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１４、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ１４、
−Ｃ（＝ＮＲ１４）Ｒ１４、−Ｃ（＝ＮＲ１４）ＯＲ１４、−Ｃ（＝ＮＲ１４）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−Ｃ（＝ＮＲ１４）ＳＲ１４、
−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ１４、−Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ１４、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ１４、
−ＮＲ１４Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−ＮＲ１４（＝ＮＲ１４）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−ＮＲ１４Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、
−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１４、−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＲ１４、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ１４（Ｒ１５）、
−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１４、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ１４、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＳＲ１４、
−ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＲ１４、−ＯＳ（＝Ｏ）２ＮＲ１４（Ｒ１５）、および
−ＯＰ（＝Ｏ）２（ＯＲ１４）が挙げられ、
式中、各Ｘは独立にハロゲンであり；Ｒ１４およびＲ１５は独立に水素、本明細書において定義されるＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、アリールアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルである。
【００８９】
特定の実施形態では、単一の炭素原子上の２個の水素原子は、＝Ｏ、＝ＮＲ１２、または＝Ｓで置き換えることができる。
【００９０】
「アルコキシ」という用語は、酸素原子と結合した本明細書に記載されるアルキル基をさす。代表的なＣ１〜Ｃ３アルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、およびイソプロポキシ基が挙げられる。
【００９１】
「アルキルアミノ」という用語は、窒素原子と結合した本明細書に記載されるアルキル基をさす。「アルキルアミノ」という用語は、モノアルキルアミノ基およびジアルキルアミノ基を含む。代表的なＣ１〜Ｃ６アルキルアミノ基としては、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、メチルエチルアミノ、ジエチルアミノ、プロピルアミノ、およびイソプロピルアミノ基が挙げられる。
【００９２】
「アルキルチオ」という用語は、硫黄原子と結合した本明細書に記載されるアルキル基をさす。代表的なＣ１〜Ｃ６アルキルチオ基としては、メチルチオ、プロピルチオ、およびイソプロピルチオ基が挙げられる。
【００９３】
「アリール」という用語は、親芳香環系の単一の炭素原子から１つの水素原子を除去することによって得られる一価芳香族炭化水素基をさす。適したアリール基としては、アセアントリレン、アセナフチレン、アセフェナントリレン、アントラセン、アズレン、ベンゼン、クリセン、コロネン、フルオランテン、フルオレン、ヘキサセン、ヘキサフェン、ヘキサレン、ａｓ−インダセン、ｓ−インダセン、インダン、インデン、ナフタレン、オクタセン、オクタフェン、オクタレン、オバレン、ペンタ−２，４−ジエン、ペンタセン、ペンタレン、ペンタフェン、ペリレン、フェナレン、フェナントレン、ピセン、プレイアデン、ピレン、ピラントレン、ルビセン、トリフェニレン、トリナフタレンなどから得られる基が挙げられる。特定の実施形態では、アリール基は、Ｃ５〜Ｃ１４アリール基である。その他の実施形態では、アリール基は、Ｃ５〜Ｃ１０アリール基である。指定された炭素原子の数とは、芳香環系中の炭素原子の数をさす。代表的なアリール基は、フェニル、ナフチル、およびシクロペンタジエニルである。アリール基は、置換されていても非置換であってもよい。代表的なアリール基置換基としては、
−Ｒ１４、−ＯＲ１４、−ＳＲ１４、−ＮＲ１４（Ｒ１５）、
−Ｘ、−ＣＸ３、−ＣＮ、−ＮＯ２、
−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ１４、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ１４、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−Ｃ（＝Ｏ）ＳＲ１４、
−Ｃ（＝ＮＲ１４）Ｒ１４、−Ｃ（＝ＮＲ１４）ＯＲ１４、−Ｃ（＝ＮＲ１４）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−Ｃ（＝ＮＲ１４）ＳＲ１４、
−Ｃ（＝Ｓ）Ｒ１４、−Ｃ（＝Ｓ）ＯＲ１４、−Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−Ｃ（＝Ｓ）ＳＲ１４、
−ＮＲ１４Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−ＮＲ１４（＝ＮＲ１５）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−ＮＲ１４Ｃ（＝Ｓ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、
−Ｓ（＝Ｏ）２Ｒ１４、−Ｓ（＝Ｏ）２ＯＲ１４、−Ｓ（＝Ｏ）２ＮＲ１４（Ｒ１５）、
−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ１４、−ＯＣ（＝Ｏ）ＯＲ１４、−ＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ１４（Ｒ１５）、−ＯＣ（＝Ｏ）ＳＲ１４、
−ＯＳ（＝Ｏ）２ＯＲ１４、−ＯＳ（＝Ｏ）２ＮＲ１４（Ｒ１５）、および
−ＯＰ（＝Ｏ）２（ＯＲ１４）が挙げられ、
式中、各Ｘは独立にハロゲンであり；Ｒ１４およびＲ１５は独立に水素、本明細書において定義されるＣ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、アリールアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロアリール、およびヘテロアリールアルキルである。
【００９４】
「アラルキル」という用語は、アルキル基の水素原子の１つの代わりに使用される、本明細書に定義されるように必要に応じて置換されたアリール基を有する本明細書に定義されるアルキル基をさす。適したアラルキル基としては、ベンジル、２−フェニルエタン−１−イル、２−フェニルエテン−１−イル、ナフチルメチル、２−ナフチルエタン−１−イル、２−ナフチルエテン−１−イル、ナフトベンジル、２−ナフトフェニルエタン−１−イルなどが挙げられる。特定のアルキル部分が意図されている場合、アラルカニル、アラルケニル、およびアラルキニルの用語が使用される。特定の実施形態では、アラルキル基は、Ｃ６〜Ｃ２０アラルキル基である（例えば、アラルキル基のアルカニル、アルケニル、またはアルキニル部分はＣ１〜Ｃ６基であり、アリール部分はＣ５〜Ｃ１４基である）。その他の実施形態では、アラルキル基はＣ６〜Ｃ１３アラルキル基である（例えば、アラルキル基のアルカニル、アルケニル、またはアルキニル部分はＣ１〜Ｃ３基であり、アリール部分はＣ５〜Ｃ１０アリール基である）。特定の実施形態では、アラルキル基はベンジル基である。
【００９５】
「ヘテロアリール」という用語は、単環式環または縮合環（すなわち、隣接する原子対を共有する環）であってよい、親ヘテロ芳香環系の単一の原子から１つの水素原子を除去することによって得られる一価複素芳香族基をさす。「複素芳香族」基は、Ｏ、Ｓ、およびＮから選択される１〜４個のヘテロ原子を含有する５員〜１４員の芳香族単環式または二環式環である。代表的な５員または６員の芳香族単環式環基としては、ピリジン、ピリミジン、ピリダジン、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、およびイソオキサゾールが挙げられる。代表的な９員または１０員芳香族二環式環基としては、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、インドール、ピラノピロール、ベンゾピラン、キオノリン（ｑｕｉｏｎｏｌｉｎｅ）、ベンゾシクロヘキシル、およびナフチリジンが挙げられる。適したヘテロアリール基としては、アクリジン、アルシンドール、カルバゾール、β−カルボリン、クロマン、クロメン、シンノリン、フラン、イミダゾール、インダゾール、インドール、インドリン、インドリジン、イソベンゾフラン、イソクロメン、イソインドール、イソインドリン、イソキノリン、イソチアゾール、イソオキサゾール、ナフチリジン、オキサジアゾール、オキサゾール、ペリミジン、フェナントリジン、フェナントロリン、フェナジン、フタラジン、プテリジン、プリン、ピラン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、ピロリジン、キナゾリン、キノリン、キノリジン、キノキサリン、テトラゾール、チアジアゾール、チアゾール、チオフェン、トリアゾール、キサンテンなどから得られる基が挙げられる。特定の実施形態では、ヘテロアリール基は５〜１４員のヘテロアリール基である。その他の実施形態では、ヘテロアリール基は５〜１０員のヘテロアリール基である。好ましいヘテロアリール基は、チオフェン、ピロール、ベンゾチオフェン、ベンゾフラン、インドール、ピリジン、キノリン、イミダゾール、オキサゾール、およびピラジンから得られるものである。ヘテロアリール基は、置換されていても非置換であってもよい。代表的なヘテロアリール基置換基としては、アリール基について上記で説明されるものが挙げられる。
【００９６】
「ヘテロアリールアルキル」という用語は、アルキル基の水素原子の１つの代わりに使用される、本明細書に定義されるように必要に応じて置換されたヘテロアリール基を有する本明細書に定義されるアルキル基をさす。特定のアルキル部分が意図されている場合、ヘテロアリールアルカニル、へテロアリールアルケニル、またはへテロアリールアルキニルという用語が使用される。特定の実施形態では、ヘテロアリールアルキル基は、６〜２０員のヘテロアリールアルキルである（例えば、ヘテロアリールアルキルのアルカニル、アルケニルまたはアルキニル部分は、Ｃ１〜Ｃ６基であり、ヘテロアリール部分は５〜１４員のヘテロアリール基である）。その他の実施形態では、ヘテロアリールアルキル基は、６〜１３員のヘテロアリールアルキルである（例えば、アルカニル、アルケニルまたはアルキニル部分はＣ１〜Ｃ３基であり、ヘテロアリール部分は５〜１０員のヘテロアリール基である）。
【００９７】
「アシル」基という用語は、−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒ’基をさし、Ｒ’は、本明細書に定義されるように、必要に応じて置換されたアルキル、必要に応じて置換されたアリール、および必要に応じて置換されたヘテロアリールから選択される。
【００９８】
「ハロゲン」または「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨード基をさす。
【００９９】
「置換された」という用語は、１または複数の水素原子が各々独立に１または複数の同じまたは異なる置換基で置き換えられている基をさす。
【０１００】
「薬学的に許容され得る塩」という用語は、無機塩基および有機塩基を含む薬学的に許容され得る塩基から調製される塩をさす。無機塩基から得られる代表的な塩としては、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、第二マンガン、第一マンガン、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、および亜鉛塩が挙げられる。薬学的に許容され得る有機塩基から得られる代表的な塩としては、第一級、第二級および第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂、例えばアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、およびトリメタミンの塩が挙げられる。
【０１０１】
代表的な化合物および関連する中間体は、市販の出発物質または従来の合成方法論によって調製される出発物質から調製した。代表的な化合物は、下に記載され、図８〜１０に示される方法Ａ〜Ｃに従って調製した。本発明の化合物の調製において有用な特定の中間体（Ｉ−１〜Ｉ−４）の調製は、国際公開第２０１７／１３２７７１号に記載されている（参照によりその全体が本明細書に援用される）。
【０１０２】
図９〜１１は、代表的な本発明の化合物Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１の調製のための代表的な合成経路の略図を提示する。本発明書において使用される場合、「Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１」とは、５つの成分：Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、およびＰ５から調製される本発明の化合物をさす。本発明の化合物の調製において有用な成分の保護されたバージョンは、例えば、「ＰＧ−Ｐ２」、「ＰＧ−Ｐ２−Ｐ１」、「ＰＧ−Ｐ３」、および「ＰＧ−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１」と名付けられる。ここで「ＰＧ」は、例えば、Ｐ１とＰ２またはＰ３とＰ１−Ｐ２のカップリングを可能にし、最終的に除去されて、例えば、Ｐ１−Ｐ２またはＰ１−Ｐ２−Ｐ３をもたらす保護基をさす。
【０１０３】
図９は、Ｐ５から出発する代表的な本発明の化合物Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１の調製のためのもう一つの代表的な合成経路の略図である。この経路では、化合物Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１は、脱保護ステップおよびその他の化学修飾によって適切に分離された、連続的なカップリングステップによって、Ｐ５で始まる段階的な方法で調製される。図９に示されるように、Ｐ５をＰＧ−Ｐ４と結合させてＰ５−Ｐ４−ＰＧを得、これを次に脱保護してＰ５−Ｐ４を得、いつでも次の成分であるＰ３−ＰＧとのカップリングする状態になっている。このプロセスは、ＰＧ−Ｐ２とＰ５−Ｐ４−Ｐ３およびＰＧ−Ｐ１とＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２とのその後のカップリングによって継続されて、最終的にＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１が得られる。
【０１０４】
図１０は、Ｐ１から出発する代表的な本発明の化合物Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１の調製のための代表的な合成経路の略図である。この経路では、化合物Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１は、脱保護ステップおよびその他の化学修飾によって適切に分離された、連続的なカップリングステップによって、Ｐ１で始まる段階的な方法で調製される。図１０に示されるように、Ｐ１をＰＧ−Ｐ２と結合させてＰＧ−Ｐ２−Ｐ１を得、これを次に脱保護してＰ２−Ｐ１を得、いつでも次の成分であるＰＧ−Ｐ３とのカップリングする状態になっている。このプロセスは、ＰＧ−Ｐ４とＰ３−Ｐ２−Ｐ１およびＰＧ−Ｐ５とＰ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１とのその後のカップリングによって継続されて、最終的にＰ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１が得られる。
【０１０５】
図１１は、Ｐ１またはＰ５以外の成分から出発する本発明の代表的な化合物Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１の調製のためのさらなる代表的な合成経路の略図である。この経路では、化合物Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１は、脱保護ステップおよびその他の化学修飾によって適切に分離された、連続的なカップリングステップによって、Ｐ２で始まる段階的な方法で調製される。図１１に示されるように、Ｐ５−Ｐ４−Ｐ３−Ｐ２−Ｐ１への複数の経路がある。下に列挙される実施例Ｃ１〜Ｃ６は、この方法によって調製された。
【０１０６】
代表的な化合物の調製およびそれらの特徴は、国際公開第２０１７／１３２７７１号の実施例Ｃ１〜Ｃ６に記載されている（参照によりその全体が本明細書に援用される）。代表的な化合物の構造を表１に示す。
【０１０７】
【表１】
2020510655.tif 000015
【０１０８】
表１の同定された化合物は、ＧｚｍＢ阻害活性を示した。特定の実施形態では、選択化合物は、ＩＣ５０＜５０，０００ｎＭを示した。その他の実施形態では、選択化合物は、ＩＣ５０＜１０，０００ｎＭを示した。さらなる実施形態では、選択化合物は、ＩＣ５０＜１，０００ｎＭを示した。なおさらなる実施形態では、選択化合物は、ＩＣ５０＜１００ｎＭを示した。特定の実施形態では、選択化合物は、１０ｎＭ〜１００ｎＭ、好ましくは１ｎＭ〜１０ｎＭ、より好ましくは０．１ｎＭ〜１ｎＭ、さらにより好ましくは０．０１ｎＭ〜０．１ｎＭのＩＣ５０を示した。
【０１０９】
どの化合物も、５０μＭの濃度で評価されたカスパーゼのいずれも有意に阻害する能力を実証しなかった。特定の実施形態では、化合物は、５０μＭで５０％未満の阻害を示した。その他の実施形態では、化合物は、５０μＭで５０％よりも大きい阻害を示したが、２５μＭで１０％未満の阻害を示した。これらの結果は、選択化合物が、カスパーゼを有意に阻害することなく、ＧｚｍＢを選択的に阻害することを実証する。
【０１１０】
組成物
上記のように、本発明の組成物は、本明細書に記載されるＧｚｍＢ阻害剤を含む。これらの組成物において有用な代表的なＧｚｍＢ阻害剤化合物は、４−（（（２Ｓ，３Ｓ）−１−（（２−（（Ｓ）−５−（（（２Ｈ−テトラゾール−５−イル）メチル）カルバモイル）−３−シクロヘキシル−２−オキソイミダゾリジン−１−イル）−２−オキソエチル）アミノ）−３−メチル−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−４−オキソブタン酸（本明細書中では、化合物Ａと呼ぶ）、およびその薬学的に許容され得る塩である。
【０１１１】
特定の実施形態では、ＧｚｍＢ阻害剤（例えば、化合物Ａ、化合物２０またはセルピンＡ３Ｎなど）は、製剤の約０．２５〜約２５．０ｍｇ／ｍＬの量で製剤中に存在する。特定の実施形態では、ＧｚｍＢ阻害剤は、製剤の約３．０〜約１５ｍｇ／ｍＬの量で存在する。その他の実施形態では、ＧｚｍＢ阻害剤は、製剤の約１０．０〜約１５．０ｍｇ／ｍＬの量で存在する。一実施形態では、ＧｚｍＢ阻害剤は、製剤の約１０．０ｍｇ／ｍＬで存在する。
【０１１２】
本発明の製剤のｐＨは、例えば、トリエタノールアミンなどの塩基で調整することにより、望みに応じて容易に変動させることができる。特定の実施形態では、製剤のｐＨは、約４．０〜約７．４である。その他の実施形態では、製剤のｐＨは、約４．０〜約６．５である。その他の実施形態では、皮膚への局所適用のためなどには、製剤のｐＨは、約６．０である。
【０１１３】
特定の実施形態では、本発明の製剤は、有機成分も含む水性製剤である。水性製剤は、緩衝されていて、約４〜約７の範囲（約４〜５、４〜７、および５〜７を含む）のｐＨを有する。特定の実施形態では、ｐＨは約４．０〜約６．５である。その他の実施形態では、ｐＨは約６．０である。適した緩衝液としては、局所投与されるかまたは注射によって投与される製薬用および化粧用組成物に有用なものが挙げられる。代表的な緩衝液としては、酢酸塩およびリン酸緩衝液が挙げられる。
【０１１４】
製剤のｐＨが上昇するとＧｚｍＢ阻害剤の皮膚透過性が低下することは、以前に決定されている。
【０１１５】
ＧｚｍＢ阻害剤化合物に加えて、本発明の製剤は、１または複数の浸透促進剤を含むことができる。適した浸透促進剤としては、プロピレングリコール（ＰＧ）、尿素、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ジメチル  イソソルビド（ＤＭＩ）、トランスクトール（Ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、Ｎ−メチル−２−ピロリドン（ＭＮＰ）などを挙げることができる。浸透促進剤の量は、所望の製剤特性を達成するために含み得る。
【０１１６】
代表的な浸透促進剤は、プロピレングリコール（ＰＧ）である。製剤中に存在するプロピレングリコールの量は、製剤の総重量に基づいて約５〜８０重量％の範囲であり得る。特定の実施形態では、プロピレングリコールは、製剤の総重量に基づいて約１５〜約２５重量％の量で存在する。その他の実施形態では、プロピレングリコールは、製剤の総重量に基づいて約２０重量％の量で存在する。特定の局所適用には、プロピレングリコールは、約８０％  ｗ／ｗまでの量で使用され得る。
【０１１７】
プロピレングリコール以外の適したポリオールを製剤に使用することができることは理解される。プロピレングリコールまたはその他の適したポリオールは、ヒドロゲル製剤を提供し、ゲルの急速な乾燥を防止する。その他のポリオール、例えばグリセリンと比較して、プロピレングリコールは、浸透促進剤であり、より優れた溶媒または共溶媒であるという利点を提供する。
【０１１８】
本発明の代表的な製剤は、ＧｚｍＢ阻害剤（０．５〜１５ｍｇ／ｍＬ）、浸透促進剤（プロピレングリコール、１５〜２５重量％）、およびｐＨ５の水性酢酸緩衝液を含む。
【０１１９】
特定の実施形態では、製剤は１または複数の増粘剤またはゲル化剤をさらに含む。適した増粘剤としては、カーボポール、カルボマー、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、デンプン、植物ガム、糖などが挙げられる。
【０１２０】
代表的な増粘剤としては、架橋ポリアクリレートポリマー、例えばペンタエリトリトールのエーテルで架橋されたポリアクリレートポリマー（例えば、カーボポール（登録商標）９４０または９８０）を挙げることができる。増粘剤は、一般に、製剤の総重量に基づいて約０．１〜約５．０重量％（例えば、製剤の総重量に基づいて０．５重量％）の量で製剤中に存在する。カーボポール（登録商標）９４０または９８０を使用する場合、約０．５％  ｗ／ｗ未満を含有する製剤はゲルというよりもローションであり、約５未満のｐＨでは、製剤は粘性がない。
【０１２１】
ｐＨ感受性であるカーボポール（登録商標）９４０または９８０を含む製剤に関して、製剤をゲルとして得るためのｐＨは約５および約６である。製剤の最終ｐＨは、適した塩基を薬学的に許容され得る塩基（例えば、水酸化ナトリウム、トリエチルアミン、またはトリエタノールアミンなど）として使用することにより、所望のｐＨ範囲を達成するように調整され得る。特定の実施形態では、製剤のｐＨは、トリエタノールアミンで調整される。
【０１２２】
高い濃度の増粘剤（例えば、カーボポール（登録商標）９４０または９８０）を用いて、ゲル製剤中のＧｚｍＢ阻害剤のより高い濃度が達成されることが観察されている。特定の実施形態では、増粘剤（例えば、カーボポール（登録商標）９４０または９８０）濃度は、製剤（例えば約１０ｍｇ／ｍＬのＧｚｍＢ阻害剤を含むゲル製剤）の約０．５〜２重量％である。例えば、２０ｍｇ／ｍＬのＧｚｍＢ阻害剤を含むゲル製剤に関して、増粘剤（例えば、カーボポール（登録商標）９４０または９８０）濃度は製剤の約５重量％までである。
【０１２３】
本発明の代表的な製剤としては、ＧｚｍＢ阻害剤（０．５〜１５ｍｇ／ｍＬ）、浸透促進剤（プロピレングリコール、１５〜２５重量％）、増粘剤（カーボポール（登録商標）９４０または９８０、０．５〜５重量％）、およびｐＨ５の水性酢酸緩衝液（トリエタネラミン（ｔｒｉｅｔｈａｎｅｌａｍｉｎｅ）でｐＨ６．０に滴定（ｔｉｔｕａｔｅｄ））が挙げられる。
【０１２４】
特定の実施形態では、製剤は、１または複数の保存料をさらに含むことができる。適した保存料としては、安息香酸、ＥＤＴＡ、塩化ベンザルコニウム、パラベンなどが挙げられる。
【０１２５】
代表的なパラベンとしては、メチルパラベンおよびプロピルパラベン（例えば、製剤の総重量に基づいて約０．２重量％のメチルパラベンおよび約０．０２重量％のプロピルパラベン）が挙げられる。
【０１２６】
一実施形態では、局所投与用の製剤は、トリエチルアミンで最終製剤ｐＨを５〜６に調整した、プロピレングリコール（２０％  ｗ／ｗ）、カーボポール（登録商標）９４０または９８０（０．５％  ｗ／ｖ）、メチルパラベン（０．２％  ｗ／ｗ）、プロピルパラベン（０．０２％  ｗ／ｗ）および酢酸緩衝液ｐＨ５（ＱＳ）を含有するビヒクル中に０．３５％  ｗ／ｖの濃度でＧｚｍＢ阻害剤（例えば、化合物Ａ、化合物２０またはセルピンＡ３ｎ）を含むゲルである。
【０１２７】
もう一つの実施形態では、局所投与用の製剤は、トリエタノールアミンで最終製剤ｐＨを６に調整した、プロピレングリコール（２０％  ｗ／ｗ）、カーボポール（登録商標）９４０または９８０（０．５〜２．０％  ｗ／ｖ）、メチルパラベン（０．２％  ｗ／ｗ）、プロピルパラベン（０．０２％  ｗ／ｗ）および酢酸緩衝液ｐＨ５（ＱＳ）を含有するビヒクル中に１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＧｚｍＢ阻害剤（例えば、化合物Ａ、化合物２０またはセルピンＡ３ｎ）を含むゲルである。
【０１２８】
一実施形態では、製剤は、薬学的に許容され得る注射ビヒクル（例えば、ＰＢＳ）中に０．２５〜２５ｍｇ／ｍＬの濃度のＧｚｍＢ阻害剤を含む注射用製剤である。
【０１２９】
本発明の製剤は、調製物の投与様式に許容され得る１または複数の担体をさらに含むことができ、その投与様式は局所投与、洗浄（lavage）、表皮投与、表皮下投与、表皮内投与、真皮投与、真皮下投与、経皮投与、皮下投与、角層下投与、注射によるもの、または選択された処置に適した任意のその他の様式である。局所投与には、体外表面（例えば、皮膚）ならびに体内表面（例えば、粘膜）への投与が含まれる。適した担体は、そのような投与様式で用いる当技術分野で公知の担体である。
【０１３０】
適した組成物は、当技術分野で公知の手段によって製剤化されることができ、それらの投与様式および用量は、当業者によって決定されることができる。例えば、ＧｚｍＢ阻害剤、例えば、化合物Ａなどは、滅菌水または食塩水あるいは非水溶性可溶性化合物の投与に使用される薬学的に許容され得るビヒクルに溶解することができる。化合物を投与するために局所的に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）または局部的に（ｌｏｃａｌｌｙ）使用することができる、軟膏剤、ペースト剤、ゲル剤、ハイドロゲル剤、フォーム剤、クリーム剤、散剤、ローション剤、オイル剤、半固体剤、石鹸剤、薬用石鹸剤、シャンプー剤、薬用シャンプー剤、スプレー剤、フィルム剤、または液剤をはじめとする多くの適した製剤が公知である。
【０１３１】
その他の実施形態では、適した組成物は、顆粒剤、散剤、錠剤、コーティング錠、（マイクロ）カプセル剤、坐剤、シロップ剤、乳剤、懸濁剤、または組成物の長期放出（protracted  release）を伴う調製物を含む医薬組成物であり得、その中には、製剤用賦形剤および添加剤および／または助剤、例えば崩壊剤、結合剤、コーティング剤、膨張剤、滑沢剤、香味料、甘味料または可溶化剤が習慣的に使用される。医薬組成物は、様々な薬物送達システムでの使用に適している。薬物送達のための方法の簡単な概説には、Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９，１５２７−１５３３（１９９０）およびＬａｎｇｅｒおよびＴｉｒｒｅｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４２８，４８７−４９２（２００４）を参照されたい。その上、本明細書に記載される組成物は、デポー製剤、徐放（time-release）、遅延放出または持続放出送達システムとして製剤化され得る。
【０１３２】
投与様式は、経口投与、舌下投与、鼻腔内投与、気管内投与、吸入、眼投与、上記のような局所投与、経皮投与、皮内投与、表皮内投与、表皮下投与、皮下投与、角層下投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、胸骨内、投与、または経粘膜投与を介する、を含む任意の医学的に許容され得る様式であり得る。その上、投与様式は、体外デバイスおよび／または組織貫通電磁デバイスを介するものであってよい。
【０１３３】
選択された特定の様式は、選択された特定の化合物、所望の結果、処置される特定の状態および治療有効性に必要とされる投与量に依存する。本明細書に記載される方法は、一般的に言えば、医学的に許容され得る任意の投与様式、例えば、臨床的に許容され得ない有害作用を引き起こすことなく有効なレベルの応答変化を生成する任意の様式を使用して実行され得る。
【０１３４】
組成物は、障害および投与様式に応じて、異なる容器、ビヒクルまたは製剤で提供され得る。例えば、経口適用には、組成物は舌下錠、ガム、洗口液、練り歯磨き、キャンディー、ゲル、フィルムなどとして投与され得；局所適用には、ローション、軟膏、ゲル、クリーム、スプレー、ティッシュ、スワブ、ワイプなどとして投与され得る。
【０１３５】
組成物は、注射によって、例えば、静脈内、皮下、角層下、筋肉内、腹腔内、胸骨内、表皮内、または表皮下経路を介するボーラス注射または持続注入によって投与され得る。注射用製剤は、単位剤形で、例えば、アンプルまたは複数用量容器で、保存料を添加して提示され得る。組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液または乳濁液などの形態をとることができ、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの調合剤（formulatory  agent）を含むことができる。経口投与には、組成物は、組成物を当技術分野で周知の薬学的に許容され得る担体と組み合わせることにより、例えば舌下錠、液体製剤、または経口ゲルとして容易に製剤化され得る。
【０１３６】
吸入による投与には、組成物は、適切な推進剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素またはその他の適切なガスを使用して、加圧パックまたはネブライザーからエアロゾルスプレー提示の形で便利に送達され得る。加圧エアロゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することにより決定され得る。吸入器または注入器で使用するための、例えばゼラチンのカプセルおよびカートリッジは、組成物の粉末混合物および適切な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンを含むように製剤化され得る。治療薬を吸入するための医療デバイスは、当技術分野で公知である。一部の実施形態では、医療デバイスは吸入器である。その他の実施形態では、医療デバイスは定量吸入器である。
【０１３７】
調製および医薬製剤について当業者に公知の多くの技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ｂｙ  Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｇｅｎｎａｒｏ，２０ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，（２０００）に記載されている。
【０１３８】
製剤は、賦形剤、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール、植物由来の油、または水素化ナフタレンをさらに含み得る。賦形剤は、生体適合性であり得、例えば、生分解性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマー、またはポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマーを含み得る。
【０１３９】
本発明の製剤または本明細書に開示される特定の方法で使用するための製剤は、適切に１または複数のその他の治療薬と組み合わせて投与され得る。本明細書に記載される本発明の特定の実施形態による、または本明細書に開示される特定の方法での使用のための、ＧｚｍＢ阻害剤およびその医薬組成物、例えば、化合物Ａなどは、埋込物（implant）または創傷被覆材などの医療デバイスまたはアプライアンスによって投与され得る。また、そのような化合物または組成物を含有および放出することを意図する埋込物が考案され得る。一例は、一定期間にわたって化合物を放出するように適合させたポリマー材料で作られた埋込物であろう。
【０１４０】
特定の実施形態では、本発明の製剤は、記載される成分を「含み」、その他の成分を含むことができる。その他の実施形態では、本発明の製剤は記載される成分「から本質的になり」、製剤の特性に実質的に影響を及ぼさないその他の成分を含むことがある。その他の実施形態では、本発明の製剤は、記載される成分「からなり」、その他の成分を含まない。
【０１４１】
その他の態様では、本発明は、ＧｚｍＢ阻害剤の角層下、表皮内、表皮下、皮下、および／または全身送達によって、水疱または皮膚剥離の症状を処置および／または寛解し、水疱のできたおよび／または剥離した皮膚を治癒し、あるいは皮膚の水疱形成および／または剥離、皮膚の水疱形成および／または剥離を低減または予防するための方法を提供する。
【０１４２】
特定の実施形態では、方法は、治療上有効な量のＧｚｍＢ阻害剤またはＧｚｍＢ阻害剤を含む製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む。代表的な投与経路としては、一般に、局所投与、経口投与、および注射による投与が挙げられる。より具体的な投与経路は本明細書に列挙される。
【０１４３】
「治療上有効な量」とは、所望の治療結果、例えば皮膚の水疱形成および／または剥離の減少、皮膚の水疱形成および／または剥離の減少、またはＧｚｍＢ活性のレベルの低下を達成するために必要な投与量および期間で有効な量をさす。化合物の治療上有効な量は、対象の病状、年齢、性別、および体重、ならびに対象の所望の応答を誘発する化合物の能力などの要因によって異なり得る。投与計画は、最適な治療応答を得るように調整することができる。治療上有効な量はまた、ＧｚｍＢ阻害剤の任意の毒性作用または有害作用を治療上有益な効果が上回る量である。
【０１４４】
投与量の値は、軽減される状態の重症度によって異なり得ることに留意されたい。任意の特定の対象について、具体的な投与計画は、個々の必要性および組成物の投与を施行または監督する人の専門的判断に従って、経時的に調整することができる。本明細書に記載される投与量範囲は単なる例であって、医師によって選択され得る投与量範囲を制限するものではない。組成物中の活性化合物の量は、対象の病状、年齢、性別、および体重などの要因によって異なり得る。投与計画は、最適な治療応答を得るように調整することができる。例えば、単一のボーラスを投与することができ、数回に分割した用量を経時的に投与することができ、または治療状況の緊急性によって示されるように、用量を比例的に減少または増加させることができる。
【０１４５】
この方法では、ＧｚｍＢ阻害剤の投与は、局部（ｌｏｃａｌ）投与（例えば、部位への投与）、皮下投与、皮内投与、角層下投与、表皮内投与、表皮下投与、および／または部位（例えば、水疱および／または剥離皮膚の範囲）への局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与であり得る。さらに、ＧｚｍＢ阻害剤は、例えば、経口的に、腹腔内に（ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｉｅａｌｌｙ）、または静脈内により全身投与され得る。
【０１４６】
「対象」または「患者」という用語は、哺乳類生物を含むことが意図される。対象または患者の例としては、ヒトおよび非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、およびトランスジェニック非ヒト動物が挙げられる。本発明の具体的な実施形態では、対象はヒトである。
【０１４７】
「投与する」という用語は、ＧｚｍＢ阻害剤またはＧｚｍＢ阻害剤を含む医薬組成物を、対象の系へ、または対象内または対象上の特定の領域へ送達する任意の方法を含む。
【０１４８】
本明細書において使用される場合、「適用する」という用語は、化合物の拡散、被覆（少なくとも一部分）、または層化を含むＧｚｍＢ阻害剤の投与をさす。
【０１４９】
本明細書において使用される場合、「処置する」または「処置」という用語は、検出可能であろうと検出不能であろうと、１または複数の症状の軽減または寛解、障害の程度の減少、障害の安定した（すなわち悪化していない）状態、障害の寛解または緩和を含むがこれらに限定されない、有益または望ましい結果をさす。「処置」はまた、処置されない場合に予想される生存時間と比較して、生存時間を延長することも意味し得る。
【０１５０】
以下の実施例は、本発明を限定するのではなく、例示する目的で提供される。
【実施例】
【０１５１】
一般的な方法
代表的な本発明の化合物は、国際公開第２０１７／１３２７７１号（参照によりその全体が本明細書に援用される）の図８〜２０に記載され説明される方法Ａ〜Ｃに従って調製された。化合物の調製のための完全な方法は、国際公開第２０１７／１３２７７１号に見出される。
【０１５２】
以下の一般的な方法および合成中間体の調製、試薬レベルおよび相対量または試薬／中間体が、合成する特定の化合物に合わせて、期待される結果に有意な変化を与えることなく、最大５０％まで上下に変更され得ることは理解される。
【０１５３】
実施例１
ＧｚｍＢによる表皮の真皮からの分離
この実施例では、本発明者らは、ＧｚｍＢによる処置の後、全層皮膚において表皮が真皮から分離することを実証する。腹部の全層皮膚を待機的形成手術から得、切除および輸送の直後に使用した。皮膚の小さな断片（０．２×０．４ｍｍ）を直ちに１０％ホルマリンで固定し（天然皮膚）、一方でその他の断片を２００ｎＭ  ＧｚｍＢを含むまたは含まない３００μＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に入れた。次に、皮膚試料を３７℃の水浴中で２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、皮膚を１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、切片化し（５μｍ）、標準法を用いてヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。図１は、新鮮なヒト皮膚へのＧｚｍＢ（２００ｎＭ）の添加がＤＥＪの分離を導くことを示す。正常な皮膚と、ビヒクルで処置した皮膚が最初の２つのパネルに示されている。矢印は、ＧｚｍＢで処置した皮膚における真皮からの表皮の分離を示す。
【０１５４】
もう一つの実験では、全層皮膚の小さな断片（０．２×０．４ｍｍ）を、ＧｚｍＢを含むまたは含まない３００μＬのＰＢＳに入れた。次に、試料を３７℃の水浴中で２４時間インキュベートした。インキュベーションの後、皮膚を１０％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、切片化し（５μＭ）、標準法を用いてＨ＆Ｅで染色した。図２は、新鮮なヒト皮膚へのＧｚｍＢ（１００ｎＭ）の添加およびＤＥＪの分離を示す。正常な皮膚とビヒクルで処置した皮膚が最初の２つのパネルに示されている。矢印は、ＧｚｍＢで処置した皮膚における真皮からの表皮の分離を示す。
【０１５５】
実施例２
ＶＩＩ型コラーゲンによるＧｚｍＢ切断およびＧｚｍＢ阻害剤を使用する阻害
ＧｚｍＢ切断アッセイは４０μＬのＰＢＳ中で実施された。手短に言えば、ＶＩＩ型コラーゲン（５００ｎｇ）を、２００ｍＭのＧｚｍＢとともに３７℃で２４時間インキュベートした。阻害のために、ＧｚｍＢを、ＶＩＩ型コラーゲンの添加の前に化合物２０、セルピンＡ３Ｎおよび化合物Ａとともに３７℃で１時間インキュベートした。２４時間後、全ての試料を１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥに負荷し、ＰＶＤＦ膜にブロットし、ＶＩＩ型コラーゲンに特異的な一次抗体（ウサギ抗ＶＩＩ型コラーゲン、Ａｂｃａｍ  ｐｌｃ）とともに４℃で一晩インキュベートし、その後二次標識抗ウサギ抗体とともに室温で１時間インキュベートした。図３は、ＧｚｍＢがＶＩＩ型コラーゲンを切断すること、およびＧｚｍＢ阻害剤（ＳＡ３Ｎ、化合物２０、化合物Ａ）の添加がＧｚｍＢに媒介されるＶＩＩ型コラーゲンの切断を防止することを示す。
【０１５６】
ＧｚｍＢについてＶＩＩ型コラーゲン内の切断部位は、Ｋｌｅｉｆｅｌｄらによって既に記載された方法を用いるＴＡＩＬＳ分析を用いて決定した（ｄｅｔｅｒｍｅｄ）（Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２８：２８１−２８８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１６１１，２０１０）。手短に言えば、ＶＩＩ型コラーゲンを、２００ｎＭのＧｚｍＢとともに３７℃で２４時間インキュベートした。Ｎ末端を差別的に標識し、変性させ、ブロックした。次に、試料をトリプシンとともにインキュベートしてトリプシンペプチドを生成し、次にアミン反応性ポリマーＨＰＧ−ＡＬＤとともにインキュベートして標識ペプチドを負に富化し、ＧｚｍＢ切断部位を同定した。
【０１５７】
実施例３
全層皮膚のＤＥＪでのＶＩＩ型コラーゲンの同定
ＧｚｍＢ皮膚切断アッセイおよびパラフィン包埋を図１および２に記載されるように実施した。その後、５μｍ切片を脱パラフィンし、ＣａｒｅｎｚｙｍｅＩ：トリプシンキット（ＢｉｏＣａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ）を使用して１５分間トリプシンによる酵素処理抗原回復に付した。次に、スライドをトリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）中１０％ヤギ血清で１時間ブロックし、その後ウサギ抗ＶＩＩ型コラーゲン抗体（Ａｂｃａｍ  ｐｌｃ）とともに４℃で一晩インキュベートした。次に、全てのスライドを二次ビオチン化抗体とともにインキュベートし、ＤＡＢ染色を製造業者の指示に従って実施した。図５は、ＶＩＩ型コラーゲンの免疫染色を示す。矢印は、ＶＩＩ型コラーゲン染色を示す。
【０１５８】
実施例４
α６β４のＧｚｍＢ切断およびＧｚｍＢ阻害剤を使用する阻害
この実施例では、ＧｚｍＢが、細胞外マトリックスの固定に関与する重要なタンパク質であるインテグリンα６β４を切断することができることが実証された。その上、α６β４インテグリンタンパク質への変化が、水疱形成および皮膚の剥離が観察される皮膚状態で観察される。
【０１５９】
ＧｚｍＢ切断アッセイは４０μＬのＰＢＳ中で実施された。手短に言えば、α６β４（５００ｎｇ）を、２００ｎＭのＧｚｍＢとともに３７℃で２４時間インキュベートした。阻害のために、ＧｚｍＢを、α６β４インテグリンの添加の前に化合物２０、セルピンＡ３Ｎおよび化合物Ａとともに３７℃で１時間インキュベートした。２４時間後、全ての試料を１０％ポリアクリルアミドゲルに負荷し、１．５時間の電気泳動によって分離した。次に、バンドをクーマシー染料による染色によって可視化した。（図６）。
【０１６０】
実施例５
この実施例では、細胞間接合タンパク質ＺＯ−１、ＪＡＭ−Ａ、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄ）、およびデスモソーム、Ｄｓｇ−１およびＤｓｇ−３の生化学的切断アッセイを行った。
【０１６１】
基質を、切断フラグメントを同定するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離される前にＧｚｍＢとともに２時間インキュベートした。タンパク質をＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルに流し、ウエスタンブロッティング（ＪＡＭ−Ａ、Ｅ−ｃａｄ）またはクーマシー染色（ＺＯ−１、Ｄｓｇ−１、Ｄｓｇ−３）によって分析した。５つ全てのタンパク質が、タンパク質単独またはＧｚｍＢ＋化合物２０（Ｃ２０）阻害剤と比較して、ＧｚｍＢとともにインキュベートした場合に全タンパク質の減少および断片化の増加を示した（図７）。Ｅ−カドヘリンおよびＤｓｇ−１は、１００ｎＭ  ＧｚｍＢで総タンパク質のほぼ完全な喪失を示したが、ＪＡＭ−Ａ、ＺＯ−１、およびＤｓｇ−３は、ＧｚｍＢ処置後も総タンパク質を検出可能であるため、切断が少ないことを示した。
【０１６２】
実施例６
ＧｚｍＢ阻害剤の投与後の水疱形成の阻害
この実施例では、糖尿病マウスモデルを使用して、一般に皮膚の水疱形成を引き起こす事象の施行前またはその事象の後、但し水疱形成の前に、皮膚をＧｚｍＢ阻害剤で前処置することによって水疱形成が防止され得ることを示した。この実施例では、スティールロッド（ｓｔｅａｌ  ｒｏｄ）を６秒間１００℃に加熱することによりマウスを熱傷させて、水疱形成を誘発した。
【０１６３】
２つの別々の実験を行った。実験１は３０日間の３アーム試験であった。アーム１は、マウスを毎日ＰＢＳ中の化合物Ａ（３．６ｍｇ／ｍＬ）で皮下注射によって処置することからなった。アーム２では、化合物Ａ（３．６ｍｇ／ｍＬ）は、マウスに毎日ゲルの状態で局所適用によって投与された。アーム３では、マウスは毎日皮下注射により食塩水を対照として投与された。
【０１６４】
実験２は２５日間の２アーム試験であった。アーム１は、局所適用によってゲル中の化合物Ａ（３．６ｍｇ／ｍＬ）を毎日投与することからなった。アーム２は、対照としてビヒクルゲルを局所適用によって毎日投与することからなった。
【０１６５】
図８Ａは、食塩水で処置した皮膚における水疱を形成している真皮からの表皮の分離を示す。水疱形成は、化合物Ａで処置した皮膚において防止される。図８Ｂは、ＰＢＳ中の化合物Ａ（３．６ｍｇ／ｍＬ）およびゲル中の化合物Ａ（３．６ｍｇ／ｍＬ）が、食塩水だけの処置と比較して水疱形成を減少させることが見出されたことを実証する。図８Ｃは、ゲル中の化合物Ａが、ゲルを単独で使用した場合と比較して水疱形成を減少させたことを示す。そのため、図８Ａから８Ｃは、ＧｚｍＢ阻害剤（化合物Ａ）が水疱形成を防止できる証拠を提供する。
【０１６６】
ＧｚｍＢ阻害剤製剤
化合物Ａを含むＧｚｍＢ阻害剤組成物は、ゲルの体積に基づいて３．６ｍｇ／ｍＬの化合物Ａでゲルとして製剤化された。
【０１６７】
ベースビヒクルを作製するための手順
ベースビヒクルは、酢酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５）中に２０％プロピレングリコール（ＰＧ）、０．２％メチルパラベン、０．０２％プロピルパラベンを含んでいた。ベースビヒクルは、２０％のＰＧと酢酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５）を混合することによって調製された。過剰量のメチルパラベンおよびプロピルパラベン（０．２％メチルパラベン／０．０２％プロピルパラベン）を溶液に添加し、室温で一晩（＞８時間）撹拌した。溶液のｐＨを１Ｍ  ＨＣｌでｐＨ５に調整した。最終混合物を０．４５μＭフィルターによって濾過した。
【０１６８】
ゲル製剤を作製するための手順：
前臨床実験室規模（非滅菌）には、化合物Ａをビヒクル（２０％ＰＧ、０．２％メチルパラベン、０．０２％プロピルパラベン、酢酸緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ５）、上記の通り調製）に添加し、１時間超音波処理することによって１３ｍｇ／ｍＬの製剤を調製した。１％カーボポール９４０ＮＦを製剤に添加し、カーボポールを完全に水和させるために混合物を室温で２４時間撹拌した。２４時間後、ｐＨをトリエタノールアミンでｐＨ６．０±０．２に調整した。最終製剤は、無色の透明なゲルである。製剤は、物理的かつ化学的に安定しており、ＵＰＬＣ−ＵＶによる９０％を超える化合物Ａの回収は、冷蔵保管条件（２〜８℃）で最大１か月である。
【０１６９】
製剤は滅菌することができる。例えば、水和したカーボポール混合物はオートクレーブプロセスによって滅菌することができ、化合物Ａ溶液は０．２２μｍろ過によって濾過することができ、組み合わせプロセスは滅菌環境で実行することができる。
【０１７０】
実施例７
罹患した皮膚の免疫組織化学および組織検査
水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、および後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）に罹患した患者由来のパラフィン包埋皮膚試料を、視覚化のための３，３’−ジアミノベンジジン、ならびにα６（ＡＢＣＡＭ）およびβ４（ＡＢＣＡＭ）インテグリン、およびＮｏｖａｒｅｄ（登録商標）によって視覚化したＸＶＩＩ型コラーゲン（ドイツ、フライブルクの大学医療センターフライブルクのＣｌａｕｓ−Ｗｅｒｎｅｒ  Ｆｒａｎｚｋｅ博士のご厚意により提供されたもの）を使用する、ＧｚｍＢ（ＡＢＣＡＭ、オンタリオ州トロント、カナダ）およびＶＩＩ型コラーゲン（ＡＢＣＡＭ、カナダオンタリオ州トロント）の免疫組織化学分析のために切片化した（５μｍ）。待機的腹成術を受けている患者から得た健康な皮膚を対照として使用した。細胞浸潤物および組織構造を観察するために、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色も確立された方法を使用して実施された。ＧｚｍＢ産生免疫細胞は、Ｈ＆Ｅスライドを脱染色し、ＧｚｍＢについて同じ切片をプローブすることによって検出された。Ａｐｅｒｉｏ  ＣＳ２スライドスキャナ（ライカ、オンタリオ州コンコード）を使用して全てのスライドをスキャンした。
【０１７１】
異なる天疱瘡サブタイプの患者のヒト皮膚水疱の生体外切片も検査して、ＧｚｍＢが病変内または病変周囲の表皮に存在するかどうかを確認した。ホルマリンで固定し、パラフィンで包埋した天疱瘡の水疱組織を、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色およびＧｚｍＢに対する免疫染色によって分析した。健康な皮膚と比較して、びまん性のＧｚｍＢ染色が表皮内にあり、棘融解の部位が疱疹状天疱瘡、落葉状天疱瘡、および増殖性天疱瘡において認められる。ＧｚｍＢのレベルの最大の増加は、特にＩｇＡ天疱瘡、ヘイリー・ヘイリー病、および限局性口腔尋常性天疱瘡（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｏｒａｌ  ｐｅｍｐｈｉｇｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）において、水疱および水疱液内に見られた。尋常性天疱瘡および腫瘍随伴性天疱瘡はしかし、より低いレベルのＧｚｍＢを示したが、依然として真皮内にＧｚｍＢ蓄積の証拠があった。
【０１７２】
ＤＥＪタンパク質切断アッセイ
組換えヒトインテグリンα６／β４（α６  ａ．ａ．２４〜８７８、β４  ａ．ａ．２８〜７１０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）、ＶＩＩ型コラーゲン（１９９〜４８２  ａ．ａ．、ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ、カリフォルニア州サンディエゴ）、ＸＶＩＩ型コラーゲン（ａ．ａ．４９０〜１４９７、Ｃｌａｕｓ−Ｗｅｒｎｅｒ  Ｆｒａｎｚｋｅ博士のご厚意により提供されたもの）、およびＩ型コラーゲン（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、コロラド州リトルトン）を、２００ｎＭの精製ヒトＧｚｍＢ（ＥｍｅｒａｌｄＢｉｏ、ワシントン州ベインブリッジアイランド）中、３７℃で２４時間インキュベートした。阻害研究のために、基質を反応物に添加する前に、ＧｚｍＢを６００ｎｍのセルピンＡ３Ｎ（カナダ、アルバータ州エドモントンのアルバータ大学のＣｈｒｉｓ  Ｒ．Ｂｌｅａｃｋｌｅｙ博士のご厚意により提供されたもの）または１００μＭの小分子阻害剤化合物２０（ブリティッシュコロンビア州バンクーバーのＣｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔの厚意による）の存在下、３７℃で１時間インキュベートした。２４時間のインキュベーションの後、タンパク質を変性させ、４〜２０％（インテグリンα６／β４について）、１０％（ＶＩＩ型コラーゲンについて）、８〜１０％（ＸＶＩＩ型コラーゲンについて）、または７．５％（Ｉ型コラーゲンについて）のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分離した。切断を、抗ヒトインテグリンα６サブユニット（ＡＢＣＡＭ）、抗ヒトインテグリンβ４サブユニット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）、抗ＶＩＩ型コラーゲン（ＡＢＣＡＭ）、および抗ヒトＸＶＩＩ型コラーゲン（Ｃｌａｕｓ−Ｗｅｒｎｅｒ  Ｆｒａｎｚｋｅ博士のご厚意により提供されたもの）を使用するウエスタンブロットによって検出し、Ｌｉ−Ｃｏｒ  Ｏｄｉｓｓｅｙ（登録商標）ＦＣ（Ｌｉ−Ｃｏｒ、ネブラスカ州リンカーン）を使用して画像化した。クーマシー染色を、製造業者の指示に従ってＩ型コラーゲン切断の評価に使用した。
【０１７３】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
ＧｚｍＢ切断部位は、前述のようにＡＴＯＭＳによって同定された（Ｄｏｕｃｅｔ  ａｎｄ  Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．５０１：２７５−２９３，２０１１；  Ｄｏｕｃｅｔ  ａｎｄ  Ｏｖｅｒａｌｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １０：Ｍ１１０．００３５３３，２０１１）。手短に言えば、ＧｚｍＢ消化または対照基質を変性させ、システインをジチオトレイトールで還元し、ヨードアセトアミドでアルキル化した。アセトン沈殿の前に、第一級アミン基をホルムアルデヒドおよびシアノ水素化ホウ素ナトリウムでジメチル化した。ペレットを１μｇ／ｍＬ  ＭＳグレードトリプシンを含む消化緩衝液に再溶解し（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）、ＳｔａｇｅＴｉｐｓ（商標）を使用して脱塩した（Ｒａｐｐｓｉｌｂｅｒら，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２：１８９６−１９０６，２００７）。試料をＲｅｐｒｏＳｉｌＰｕｒ（商標）１２０  Ｃ１８−ＡＱ  １．９μｍ粒子（Ｄｒ．  Ｍａｉｓｃｈ）カラムのＩｍｐａｃｔＩＩ（商標）Ｑ−ＴＯＦ（Ｂｒｕｋｅｒ、マサチューセッツ州ビレリカ）で分析し、データに依存する上位１８ピークの前駆体選択の前に、ｅａｓｙ−ｎ  ＬＣ（商標）システム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって送達された水中アセトニトリル（０．１％  ｖ／ｖギ酸）の勾配によって分離した。ＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ  ４．３（Ｂｒｕｋｅｒ）を使用してスペクトルを抽出し、酵素特異性として半特異的ＡｒｇＣを、固定修飾としてカルバミドメチル化（Ｃ）およびジメチル化（Ｋ）を、さらに可変修飾として脱アミド化（Ｎ、Ｑ）、ジメチル化（Ｎ−ｔｅｒｍ）、ピログルタム化（pyroglutamation）（Ｑ）および酸化（Ｍ）を使用してＵｎｉｐｒｏｔヒトプロテオームデータベース（２０１６年０２月２４日ダウンロード；７０，４７２配列）に対して検索した。可能性のあるＧｚｍＢ切断部位を、ペプチド期待値＜０．０１で同定された、同定された配列のＮ末端の酸性残基を持つ、半特異的なＮ末端ジメチル化ペプチドとして定義した。
【０１７４】
皮膚切断アッセイ
待機的形成手術を受けている患者から得た新鮮な健康なヒト皮膚を研究所に輸送し、ほぼ１ｍｍ×４ｍｍのストリップに切断した。脂肪組織層を除去して、真皮および表皮のストリップを得た。次に、皮膚ストリップを３００μＬのＰＢＳか、２００ｎＭのＧｚｍＢか、あるいは、１００μＭの化合物２０とともに３７℃で１時間のインキュベーションによって前もって不活性化した２００ｎＭのＧｚｍＢ中、３７℃で１２時間インキュベートした。インキュベーションの後、試料を１０％緩衝ホルマリン中で一晩固定し、パラフィン包埋し、確立した法を用いてＨ＆Ｅ染色のために切片化した。ＧｚｍＢは組織の奥深くまで浸透しない可能性があるので、試料の最外切片を染色に使用した。
【０１７５】
結果
ＧｚｍＢは水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、およびＥＢＡにおいてＤＥＪのレベルで蓄積する。
水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、およびＥＢＡからの患者皮膚試料の免疫組織化学は、ＧｚｍＢがＤＥＪで蓄積することを示した。具体的には、水疱性類天疱瘡のＨ＆Ｅ染色により、主に好酸球および好中球からなる、高密度の炎症性浸潤を伴う表皮下水疱形成が明らかとなった（図１２Ａおよび１２Ｂ）。強いＧｚｍＢ染色は、大部分の好中球においてＤＥＪのレベルで観察されたが、好酸球では、水疱内および脱離した表皮層直下の両方で観察されなかった（図１２Ｂ）。疱疹状皮膚炎は、真皮乳頭の先端にある、主に好中球といくつかの好酸球からなる、特徴的な表皮下裂隙および乳頭膿瘍を特徴とした（図１２Ａおよび１２Ｂ）。これらの乳頭膿瘍はＧｚｍＢについて重度に染色され、その分泌における好中球およびリンパ球の関与を示唆した（１２Ｂ）。ＧｚｍＢの存在はＤＥＪに隣接する上部真皮乳頭層で主に観察されたが、表皮層に包埋された陽性細胞も検出することができた。ＥＢＡの皮膚は、分離された表皮と真皮の間の間質腔に、主に好中球とリンパ球で構成される豊富な免疫浸潤物を伴う表皮脱離を示した（図１２Ａおよび１２Ｂ）。ＢＰおよびＤＨにおいて観察されたのと同様に、ＧｚｍＢは主に好中球に見出された（図１１Ｂ）。
【０１７６】
ＧｚｍＢはα６およびβ４インテグリンをインビトロでその機能に極めて重要なドメインで切断する
罹患した皮膚のＤＥＪのレベルでＧｚｍＢの存在が確認されると、本発明者らはＧｚｍＢがＤＥＪ機能に重大な基底膜の重要な成分であるα６／β４インテグリン、ＶＩＩ型コラーゲン、およびＸＶＩＩ型コラーゲンの切断を媒介すると仮定した。α６とβ４の両方のインテグリンサブユニットはＧｚｍＢによって切断された（図１３Ａおよび図１４Ａ）；全長α６インテグリンは１５０ｋＤａで検出され、約２０、２５、および３７ｋＤａのフラグメントを有するが、全長β４（１００ｋＤａ）の切断は、約６５ｋＤａの明らかなフラグメントおよび５０ｋＤａのより弱いバンドを生じた。これらのＤＥＪ成分の切断が実際にＧｚｍＢによって媒介されたことを確かめるために、ＧｚｍＢ特異的競合阻害剤である化合物２０、および不可逆的セリンプロテアーゼ阻害剤であるセルピンＡ３Ｎを切断アッセイに含めた。両方の阻害剤は、それぞれ１００μＭおよび６００ｎＭでα６およびβ４インテグリンサブユニットの切断を防止した（図１３Ａおよび図１４Ａ）。さらに、ＡＴＯＭＳによる質量分析を用いて、これらのタンパク質の切断部位を同定し、ＧｚｍＢに媒介されたα６およびβ４インテグリンの切断がＤＥＪ機能を損なうことがあり得るかどうかを評価した。本発明者らはα６およびβ４インテグリンの細胞外ドメインに焦点を当てた。このタンパク質領域はＧｚｍＢにさらされる可能性が高いためである。α６インテグリンは、細胞外β−プロペラドメイン内のＦＧ  ＧＡＰリピート２、３、４、５、および７のＡｓｐ１００、Ａｓｐ１６６、Ａｓｐ１９９、Ａｓｐ３０２、Ａｓｐ３１１、Ａｓｐ３５８、Ａｓｐ４８２、およびＡｓｐ４８８でＧｚｍＢによって切断され（図１３Ｂおよび図１８Ａ〜Ｉ）、Ｇｌｕ８５６での切断部位も検出された。β４インテグリンサブユニットの切断は、Ｇｌｕ２２３、Ａｓｐ２３７およびＡｓｐ２７２のフォンウィルブランド因子Ａドメイン内、ならびにＡｓｐ６１１のシステインリッチ領域１内、およびＡｓｐ３５１、Ａｓｐ４４２およびＡｓｐ４４７のこれらの２つのドメイン間のリンカー領域内にあった（図１３Ｂおよび図１９Ａ〜Ｇ）。
【０１７７】
ＧｚｍＢはリガンド結合領域でＶＩＩ型コラーゲンを切断する
ウエスタンブロットを用いて、ＧｚｍＢによるＶＩＩ型コラーゲンドメインａ．ａ１９９〜４８２の切断を評価した。このフラグメントは、非コラーゲン性領域１（ＮＣ１）の一部であり、これはＶＩＩ型コラーゲンとＥＣＭのその他のタンパク質との相互作用にとって極めて重要である（Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４５１６−１４５２２，１９９７；Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：１７７−１８３，１９９９）。未処理のＶＩＩ型コラーゲンフラグメントは約３０ｋＤａで検出され、ＧｚｍＢによるその切断により、約２０および２５ｋＤａのバンドが生じた（図１５Ｂ）。他方、ヒト身体で最も一般的なコラーゲンであるＩ型コラーゲンは、ＧｚｍＢで切断されなかった（図２０）。セルピンＡ３ＮによるＶＩＩ型コラーゲン切断の阻害により、約２０と２５ｋＤａの両方バンドの出現が防止されたが、化合物２０の阻害は不完全であったので、切断バンドは約２５ｋＤａでまだ検出できた（図１５Ｂ）。切断の位置に関して言えば、本発明者らが試験したＶＩＩ型コラーゲンのＮＣ１フラグメントは、ＧｚｍＢによってＡｓｐ１９３のフォンウィルブランド因子Ａドメイン、Ｇｌｕ３３２およびＡｓｐ３９０のフィブロネクチン様ドメインＩＩＩ−２、およびＡｓｐ４１４のフィブロネクチン様ドメインＩＩＩ−３内で切断された（図１５Ｂおよび図２１Ａ〜２１Ｃ）。
【０１７８】
ＸＶＩＩ型コラーゲンは、ＧｚｍＢ切断のための基質である
ヘミデスモソームの重要な成分として、ＸＶＩＩ型コラーゲンは表皮接着に関与する細胞内および細胞外構造要素の架橋に重大な役割を果たす（Ｆｒａｎｚｋｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４００５−４００８，２００５）。ＸＶＩＩ型コラーゲンＮＣ１６外部ドメイン（ａ．ａ４９０〜１４９７）のＧｚｍＢによる処置は、この領域の切断をもたらし、約１００ｋＤａの切断バンドの出現をもたらした（全長タンパク質約１３０ｋＤａ）。化合物２０とセルピンＡ３Ｎの両方とのＧｚｍＢのプレインキュベーションは、ＮＣ１６切断を防止した（図１６Ａ）。ＡＴＯＭＳは、１または２μｇのタンパク質を使用してＸＶＩＩ型コラーゲンで試みられた。ＧｚｍＢ消化および未消化形態のＸＶＩＩ型コラーゲンを、それぞれ、重い（１３ＣＤ２Ｏホルムアルデヒド）および軽い（１２ＣＨ２Ｏホルムアルデヒド）ジメチル化タグによって比較した。
【０１７９】
ＤＥＪのα６／β４インテグリン、ＶＩＩ型コラーゲン、およびＸＶＩＩ型コラーゲン裏層は、罹患した皮膚で破壊される
α６およびβ４インテグリンサブユニットとＶＩＩ型コラーゲンの両方がＧｚｍＢの基質であることを示すウエスタンブロットおよびＡＴＯＭＳ分析に続いて、本発明者らは、水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、およびＥＢＡ皮膚試料でのそれらの完全性を評価しようとした。正常な皮膚におけるα６インテグリンの染色は、主に真皮の血管周囲に、ＤＥＪの連続線として局在した。罹患皮膚試料を調査すると、α６インテグリン局在化のパターンは全ての条件で類似していて、切片全体にわたって散在した染色を示した。これはタンパク質の断片化を示している可能性があった（図１３Ｃ）。ＤＥＪでは、表皮脱離の範囲と表皮がまだ真皮に付着している部分の両方で、染色が存在しないか、弱いか、または無秩序であった（図１３Ｃ）。インテグリンβ４に関して、健康な皮膚において、ならびに水疱性類天疱瘡および疱疹状皮膚炎では表皮が真皮に固定されている範囲で、強く十分に局在した染色がＤＥＪを描写した（図１４Ｃ）。しかし、研究した全ての条件で表皮分離の範囲で、インテグリンβ４染色は全く存在しないかまたは微かであった（図１４Ｃ）。
【０１８０】
Ｍｏｏｎｅｙら（Ｊ．Ｃｕｔａｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１８：４１７−４２２，１９９１）は以前に、円板状エリトマトーデスを有する患者のＤＥＪの断片化されたＶＩＩ型コラーゲンを示した。正常な皮膚は、表皮と真皮の間の界面を覆うＶＩＩ型コラーゲンについての連続した強い染色を示したが（図１５Ｃ）、水疱性類天疱瘡および疱疹状皮膚炎では、ＶＩＩ型コラーゲン染色は弱いかまたは存在しなかった。両方の疾患の弱い染色は、水疱または乳頭膿瘍の真皮側に局在しており、ＮＣ１のＶＩＩ型コラーゲンの切断により、ＤＥＪの小線維帯がその上の緻密板から分離したことと一致していた（図１５Ｃ）。疱疹状皮膚炎では、ＶＩＩ型コラーゲン染色は独特のパターンを提示し、短い染色切片は表皮に対して平行ではなく、表皮に対して垂直であった。ＥＢＡ試料のＶＩＩ型コラーゲン染色は、断続的なパターンを示し、ＤＥＪセグメントは弱い染色を強い染色を有する範囲と交互に提示した（図１５Ｃ）。
【０１８１】
最後に、全ての条件についてＸＶＩＩ型コラーゲン染色パターンは、その他の基質に対して観察されたパターンと類似していた。健康な皮膚では明らかな連続した染色のラインが検出されたが、罹患した皮膚ではＤＥＪの完全性が低下した範囲で弱い染色が観察され、表皮が脱離した皮膚の部分ではほとんど見られなかった（図１６Ｂ）。
【０１８２】
ＧｚｍＢとのインキュベーションは、健康なヒト皮膚において表皮分離をもたらし、化合物２０によって阻害される
ＧｚｍＢは、水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、およびＥＢＡのＤＥＪで豊富であり、重要な接合部のタンパク質を切断する能力があるので、新しく単離されたヒト皮膚でのＧｚｍＢタンパク質分解のＤＥＪ完全性への直接的な影響を評価した。表皮および真皮を含む健康な皮膚の約１ｍｍ×４ｍｍのストリップをＧｚｍＢの２００ｎＭ溶液に浸漬し、３７℃で１２時間インキュベートした。インキュベーションすると、Ｈ＆Ｅ染色により、ＧｚｍＢ処置試料の表皮と真皮の間に、ＰＢＳ対照にはほとんど存在しない裂隙の出現が明らかになった（図１７）。ＧｚｍＢ特異的阻害剤である化合物２０によるＧｚｍＢの不活性化は、ＤＥＪ裂隙の形成を防止し、ＰＢＳ対照と同様の組織形態を明らかにした（図１７）。
【０１８３】
考察
現在、細胞外ＧｚｍＢが、ＥＣＭ切断による調節不全および／または慢性炎症ならびに組織修復障害に関連する状態において、病原性の、パーフォリン非依存性の役割を果たすことは、文献で広く認知されている（Ｂｏｉｖｉｎら，ＰｌｏＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ３３１６３，２０１２；Ｈｉｅｂｅｒｔら，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．２０：１４０４−１４１４，２０１３；Ｐａｒｋｉｎｓｏｎら，Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  １４：６７−７７，２０１４；Ｓｈｅｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１８６：８７−２００，２０１６）。本研究では、ウエスタンブロットおよびＡＴＯＭＳを使用して、ＤＥＪの重要な成分であるα６／β４インテグリンおよびＶＩＩ型コラーゲンが、アンカリング機能のために重要な領域でＧｚｍＢによって切断されることが初めて示された。また、水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎およびＥＢＡの罹患ヒト皮膚生検において、表皮下水疱が、新しく発見されたＧｚｍＢ基質であるα６／β４インテグリン、ＶＩＩ型コラーゲン、およびＸＶＩＩ型コラーゲンの分解を伴うＤＥＪでのＧｚｍＢレベルの上昇を示すことも実証された。ＧｚｍＢ活性の病理学的関連性を裏付けながら、本発明者らは、生理的に適切な濃度のＧｚｍＢに曝露した健康なヒトの皮膚の真皮からの表皮の部分的脱離を報告し、この分離がＧｚｍＢ特異的阻害剤によって防止され得ることを示した。これらのデータは、異なる自己免疫表皮下水疱形成の病因における、ＧｚｍＢの一般的な細胞外の役割を示唆する。
【０１８４】
α６／β４インテグリンの重要性の根拠は、動物モデル（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｎｅｕｔら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１３：３６６−３６９，１９９６）と、重度でしばしば致命的なヒトの水疱症の両方からもたらされる。α６／β４が関与するインテグリン複合体の変異および欠損、ならびに抗α６／β４インテグリン自己抗体の産生（Ｌｅｖｅｒｋｕｓら，Ｂｒ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４５：９９８−１００４，２００１；Ｋｉｓｓら，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５１：１０４−１１０，２００５）は、広範な粘膜皮膚の水疱形成を特徴とする致死的な表現型に寄与する。いくつかの研究で、表皮水疱症の多くのサブタイプにおける、α６／β４インテグリンをコードする遺伝子における変異（Ｒｕｚｚｉら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２８２６−２８３１，１９９７；Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６３：１３７６  １３８７，１９９８；Ｊｏｎｋｍａｎら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１９：１２７５−１２８１，２００２）またはそのサブユニットの１つのタンパク質レベルでの非存在（Ｎｉｅｓｓｅｎら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１０９（Ｐｔ  ７）１６９５−１７０６，１９９６）が同定された。特に、Ｐｈｉｌｌｉｐｓらは、まだ同定されていないプロテアーゼによるエピトープの原位置でのタンパク質分解切断は、接合部型表皮水疱症の患者においてβ４サブユニットの免疫反応性の喪失の原因となりうることを推測した（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら，Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２４：５７１−５７６，１９９４）。この研究で、本発明者らは、ＧｚｍＢが、それらのリガンド結合細胞外ドメインのいくつかの部位でα６とβ４の両方のインテグリンサブユニットを切断し（ＴｕｃｋｗｅｌｌおよびＨｕｍｐｈｒｉｅｓ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４００：２９７−３０３，１９９７；ＯｘｖｉｇおよびＳｐｒｉｎｇｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ，Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４８７０−４８７５，１９９８；Ｔｓｕｒｕｔａら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３８７０７  ３８７１４，２００３；Ｐａｗａｒら，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．３１３：１０８０−１０８９，２００７）、この分子の接着特性を損なう可能性があることを示す。致死性接合部型表皮水疱症に記載されるミスセンス変異およびアミノ酸欠失の大部分がその細胞外ドメインに位置していた（Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎら，ＡＪＰＡ  １５２：９３５−９４１，１９９８；Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎら，ＡＪＰＡ  １５２：１５７−１６６，１９９８；Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６３：１３７６−１３８７，１９９８；Ｎａｋａｎｏら，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．４９：６１８−６２６，２００１）が、非致死型に関連するミスセンスまたはスプライス変異は、細胞質部分に頻繁に位置していた（Ｋａｍｂｈａｍら，Ａｍ．Ｊ．Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓ．３６：１９０−１９６，２０００；Ｎａｋａｎｏら，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．４９：６１８−６２６，２００１；Ｋｏｓｔｅｒら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１６（Ｐｔ  １）：３８７  ３９９，２００３）ので、これらの細胞外領域の重要性は、インテグリンβ４について特に明白である。興味深いことに、ナカノら��、致死変異が高度に保存された領域内にある場合の、インテグリンβ４の重要なリガンド結合部位を消失させるおそれのある致死変異ｐ．Ｄ１３１Ｙ／ｐ．Ｇ２７３Ｄを同定した（Ｎａｋａｎｏら，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．４９：６１８−６２６，２００１）。本発明者らが同定したＧｚｍＢ切断部位の１つはＡｓｐ２７２にあるため、このことは、α６／β４インテグリンのＧｚｍＢ媒介性切断が同様にこの分子の接着特性に深刻な影響を与えることがあり得ることを実証する。
【０１８５】
真皮乳頭層の主成分として、ＤＥＪの完全性の基本であるもう１つのタンパク質は、ＶＩＩ型コラーゲンである。ＶＩＩ型コラーゲンドメインの中で、フィブロネクチン様領域は、いくつかのＥＣＭ成分との相互作用に極めて重要である。ＮＣ１領域の組換えバージョンを用いる研究により、フィブロネクチン様ドメインと、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン３３２およびフィブロネクチンとの強い結合親和性が明らかになった（Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１４５１６−１４５２２，１９９７；Ｃｈｅｎら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１１２：１７７−１８３，１９９９）、これは真皮乳頭層の緻密板との固定を可能にする。ＶＩＩ型コラーゲンの変異またはこの領域に対する自己抗体の産生は、ＤＥＪの深刻な崩壊をもたらし、栄養障害型表皮水疱症およびＥＢＡをそれぞれ引き起こす（Ｄａｎｇ  ａｎｄ  Ｍｕｒｒｅｌｌ，Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１７：５５３−５６８，２００８；ＫｉｍおよびＫｉｍ，Ｊ．Ｅｕｒ．Ａｃａｄ．Ｓｅｒｍａｔｏｌ．Ｖｅｎｅｒｅｏｌ．２７：１２０４−１２１３，２０１３）。これらの状態は、広範な表皮脱離および水疱の形成を特徴とする。フォンウィルブランド因子Ａドメインだけでなくフィブロネクチン様ＩＩＩ−２ドメインのＶＩＩ型コラーゲンのＧｚｍＢ媒介性切断、およびＧｚｍＢ阻害剤であるセルピンＡ３Ｎおよび化合物２０によるこの切断の阻害が本明細書に示されている（Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙら，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２：２１９７  ２２００、２００２）。さらに、ヘミデスモソームのもう１つの重要な成分である、ＸＶＩＩ型コラーゲンのＧｚｍＢ媒介性切断も観察され、そのα６／β４インテグリンとの相互作用は、基底ケラチノサイトを透明帯に固定するタンパク質複合体の構築に必要である（Ｋｏｓｔｅｒら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１６（Ｐｔ２）：３８７−３９９、２００３）。総合すると、これらの観察は、ＧｚｍＢがα６／β４インテグリンおよびＸＶＩＩ型コラーゲンの切断によって基底ケラチノサイト／透明帯の接続を破壊し、およびＶＩＩ型コラーゲンの切断により緻密板／小線維帯の接着を破壊することができることを示す。
【０１８６】
ＤＥＪでのＧｚｍＢの蓄積は、例えば、ＳＪＳ／ＴＥＮおよび汎発性水疱性固定薬疹をはじめとする多くの界面の皮膚疾患に観察される（Ｃｈｏら，Ｊ．Ａｍ．Ａｃａｄ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．７０：５３９−５４８，２０１４）。しかし、いずれもこのプロテアーゼの細胞外の役割を考慮していない。むしろ、ＧｚｍＢは、ＣＤ８＋Ｔ細胞−およびＮＫ媒介性のケラチノサイトおよびメラノサイトの死にパーフォリン依存的に寄与することが提案された。本発明者らの結果は、この仮説が水疱形成におけるＧｚｍＢの病理学的役割を説明しないことを示す。正常な皮膚にはほとんど存在しないが、豊富なＧｚｍＢが、以前の研究と一致して、自己免疫性表皮下水疱形成状態の水疱性類天疱瘡および疱疹状皮膚炎においてＤＥＪで観察され（Ｈｕｓｓｅｉｎら  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．６０：６２−７１，２００７；Ａｂｒｅｕ  Ｖｅｌｅｚら，Ｏｕｒ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｏｎｌｉｎｅ  ４：６２７−６３０、２０１３）、ＥＢＡのＤＥＪでのこのプロテアーゼの蓄積が初めて示された。抗ＤＥＪ自己抗体誘発性の表皮下水疱形成が浸潤性の炎症細胞によって分泌されるプロテアーゼによって媒介されることは、長い間仮定されてきた（Ｊｏｒｄｏｎら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．８５（Ｓｕｐｐｌ）：７２ｓ−７８ｓ，１９８５）。実際に、自己抗体に媒介される免疫細胞のＤＥＪへの動員は、それがプロテイナーゼの局所的および集中的な脱顆粒を指示するため、真皮表皮分離の必須条件である（ＳｉｔａｒｕおよびＺｉｌｌｉｋｅｎｓ、Ｅｘｐ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１４：８６１−８７５、２００５）。このメカニズムを確認して、水疱性類天疱瘡（Ｍｉｈａｉら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．１１：１１１７−１１２８，２００７）、ＥＢＡ（Ｓｉｔａｒｕら，ＡＪＰＡ  １６１：３０１  ３１１、２００２）、および妊娠性類天疱瘡（Ｈｅｒｒｅｒｏ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ｅｔ  ａｌ．．  Ｅｕｒ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：１０３９−１０４８，２００６）の患者の血清に含まれる自己抗体は、ＤＥＪへの白血球の動員を促進し、その分離をもたらす。ＧｚｍＢは、自己免疫状態におけるこのＤＥＪ分離の重要な要因となり得る。それは、本明細書において今回同定されているＤＥＪ基質がこれらの疾患で水疱形成が起こっている範囲の近くで分解されるためである。
【０１８７】
細胞外ＧｚｍＢの自己免疫疾患における病理学的役割は、重要な基質の物理的崩壊に限定されないかもしれない。増大する証拠は、抗原性のＧｚｍＢ生成ペプチドフラグメントが、いくつかの自己免疫疾患の伝播を維持するフィードフォワードループの一部であることを示唆している（Ｄａｒｒａｈ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｆｆｅｒ．１７：６２４−６３２，２０１０に概説）。研究は、ＧｚｍＢが特定の自己免疫状態での自己抗原生成に役立つことを示唆する（Ｎａｇａｒａｊｕら，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．４４：２３７６−２３８６，２００１；Ｎｉｌａｎｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４：４０２５−４０３２、２０１０；Ｄａｒｒａｈら，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．１６：３５５−３６５，２０１７）。本開示では、ＧｚｍＢは、α６／β４インテグリン、ＸＶＩＩ型コラーゲン、およびＶＩＩ型コラーゲンを、それぞれ、特定の類天疱瘡疾患、水疱性類天疱瘡、およびＥＢＡの患者の血清に存在する自己抗体によって認識されるエピトープ領域で切断することが実証されている。口腔類天疱瘡では、同定された自己エピトープの１つは、α６インテグリンのペプチドａ．ａ．２９２〜３０５によって表される（Ｒａｓｈｉｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：１９６８−１９７７，２００６）。インビトロで、本発明者らは、ＧｚｍＢが残基Ａｓｐ１９９およびＡｓｐ３０２でα６インテグリンを切断すること、従ってＧｚｍＢが潜在的にこの抗原性フラグメントを生体内で生成し、持続される免疫応答のサイクルおよび抗原フラグメントのさらなる生成を確立することができることを示した。
【０１８８】
上記のように、ＸＶＩＩ型コラーゲンのＮＣ１６領域のＧｚｍＢ媒介性切断も観察された。ＸＶＩＩ型コラーゲン自己抗体の産生は、水疱性類天疱瘡を引き起こす（Ｚｉｍｉｎａら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２８：２７３６−２７３９、２００８；Ｎｉｓｈｉｅ，Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．７３：１７９−１８６，２０１４）が、このタンパク質のＮＣ１６外部ドメインの変異は、接合部型表皮水疱症の特定の形態と関連している（ＭｃＧｒａｔｈら，ＡＪＰＡ  １４８：１７８７−１７９６，１９９６；Ｓｃｈｕｍａｎｎら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．６０：１３４４−１３５３，１９９７）。ＸＶＩＩ型コラーゲンのＮＣ１６領域の特異的ＧｚｍＢ切断部位は、ＡＴＯＭＳによって同定されなかったが、このドメインは水疱性類天疱瘡の免疫優性領域であり、その組換え型は、この状態に罹患した患者の約８５％で特異的自己抗体を検出するために使用される（Ｇｉｕｄｉｃｅら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：５７４２−５７５０，１９９３；Ｍｕｒａｋａｍｉら，Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．１３：１１２−１１７，１９９６）。
【０１８９】
最後に、いくつかのグループが、ＥＢＡにおいて、ＴおよびＢ細胞がＶＩＩ型コラーゲンのＮＣ１ドメインの同一領域を標的とすることを実証している（Ｊｏｎｅｓら，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１０４：２３１−２３５，１９９５；Ｍｕｌｌｅｒら，Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３５：９９−１０７、２０１０）。特に、Ｌａｐｉｅｒｅらは、ＶＩＩ型コラーゲンの異なるフラグメントを１９人のＥＢＡ患者由来の血清とともにインキュベートし、１６の血清がフィブロネクチン様ＩＩＩドメイン１〜４で構成される融合タンパク質と強く反応したことを観察した（Ｌａｐｉｅｒｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１８３１−１８３９，１９９３）。ＶＩＩ型コラーゲンのＮＣ１ドメインはまた、Ｆｃ依存性好中球の活性化および真皮表皮分離の誘導を媒介する（Ｓｉｔａｒｕら，ＡＪＰＡ  １６１：３０１−３１１，２００２）。
【０１９０】
要約すると、本研究は、ＧｚｍＢ細胞外タンパク質分解が、自己免疫性水疱形成皮膚状態のＤＥＪ障害による角層下、表皮内、および表皮下の水疱形成に直接寄与することを初めて示す。ＧｚｍＢの阻害は、自己免疫性水疱形成を含む角層下、表皮内および表皮下の水疱形成の処置および予防のための新規な治療アプローチを表す。
【０１９１】
本発明の好ましい実施形態が示され説明されてきたが、本発明の精神および範囲を逸脱することなく様々な変更がそれになされ得ることが理解される。
排他的所有権または特権が主張される本発明の実施形態は以下のように定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ−Ｃ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１８Ｃ−Ｄ】
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【図１８Ｅ−Ｆ】
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【図１８Ｇ−Ｈ】
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【図１８Ｉ】
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【図１９Ａ−Ｂ】
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【図１９Ｃ−Ｄ】
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【図１９Ｅ−Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図２０】
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【図２１Ａ−Ｂ】
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【図２１Ｃ−Ｄ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【国際調査報告】
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