(57)【要約】  悪性の固形および全身性腫瘍の治療、診断および予防において使用するための、安定なポリマー状の新規組換えタンパク質UK114が開示される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
悪性の固形および全身性新生物の治療、診断および予防における使用のためのポリマー状の組換えYjgF/YER057c/UK114 RIDタンパク質。
【請求項２】
ポリマー状タンパク質が、2〜15個の単量体単位を含む、請求項１に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項３】
タンパク質単量体単位が配列番号１の配列を有する、請求項１に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項４】
大腸菌により発現される、請求項１に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項５】
酸、酸化剤または架橋剤で処理することを特徴とする、請求項１に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項６】
ヤギ（Capra hircus）由来である、請求項１に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項７】
新生物の治療を受けている対象の免疫付与のための、アジュバント療法のための、および新規または再発性の悪性新生物の危険性がある対象のワクチン接種のための、請求項１に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項８】
新生物に罹患しているかまたは新生物の治療を受けている対象のモノクローナル抗体による受動免疫付与のための、アジュバント療法のための、および新規または再発性の悪性新生物の危険性がある対象の治療のための、請求項１記載の使用のためのタンパク質。
【請求項９】
腺癌の治療のための、請求項１に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項１０】
単量体または多量体形態である配列番号１の配列を有するタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、悪性の固形および全身性腫瘍の治療、診断および予防において使用するための安定なポリマー状の組換えYjgF/YER057c/UK114 RIDタンパク質（YjgF/YER057c/UK114）に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な原核生物および真核生物において高度に保存されているYjgF/YERO57c/UK114と呼ばれるタンパク質のファミリーは、そのタンパク質の構造的および機能的特徴を調査することに向けられた多くの研究の課題を提供している（Bartorelli et al., J. Tumor and Marker Oncology, 1994, 9, 37; Lambrecht JA et al., J.Biol. Chem., 2010, 285, 34401-34407; Lambrecht JA et al., J.Biol. Chem. 2012, 287, 3454-3461; Mistiniene E et al., Bioconjugate Chem. 2003, 14, 1243-1252; Dhawan L et al., Mol. Cell. Biol., 2012, 32, 3768-3775; Flynn JM et al., Mol. Microbiol., 2013, 89(4)751-759; Ernst DC et al., J. Bacteriology, 2014, 196 (18), 3335-3342; Niehaus TD et al., BMC Genomics, 2015, 16, 382）。UK114はYjgF/YER057c/UK114ファミリーに属する。前記ファミリーのメンバーの共通点は、それらの生物学的活性、特に2-アミノ-アクリレートのデアミナーゼ活性である（Lambrect et al., 2012を参照されたい）。この活性は、頭字語RIDを持つYjgF/YER057c/UK114ファミリーのすべてのメンバーを特徴づけている。
【０００３】
WO 9602567は、タンパク質UK114を含む過塩素酸可溶性ヤギ肝臓抽出物（UK101と呼ばれる）の抗腫瘍活性を記載している。このタンパク質は、「Ceciliani F. et al., FEBS Letters, 1996, 393, 147-150」に報告されているように、分子量が14.2kDaであり、137個のアミノ酸の配列を有する。
【０００４】
様々な種から単離される天然タンパク質UK114および／またはそれと交差反応するタンパク質は、正常細胞の細胞質にしか存在しないが、種々の割合で悪性固形全身性腫瘍細胞の細胞膜にも存在する（Bartorelli A, et al., Int J Oncol. 1996 Mar;8(3):543-8.; Bussolati G, et al., Int J Oncol. 1997 Apr; 10(4):779-85）。腺癌では、それは腫瘍の80%を超えて発現している。組換え型でのタンパク質UK114の大腸菌発現が、WO 0063368において、および「Colombo I et al.(Biochim. Biophys. Acta, 1998, 1442, 49-59)およびBurman JD et al.,(BMC Structural Biology, 2007, 7, 30)」において記載されているが、二量体構造を報告したWO 0063368とは異なり、「Deriu D et al.,(Acta Cryst., 2003, D59, 1676-1678)」は、結晶形態のタンパク質UK114が三量体配置を有することを報告した。単量体構造を有するタンパク質UK114（Oka et al., 1995 J.Biol.Chem. 270: 30060-30067）は不安定な二量体または三量体形態で存在し得ることが文献から知られている。実験的には、クロマトグラフィーおよび質量分析によって示されるように、様々な物理化学的条件、特に様々なイオンおよびタンパク質変性濃度によって、二量体または三量体タンパク質UK114が単量体立体構造をとることがある。Mistinieneらの研究によれば、（大腸菌から得られる）組換えタンパク質UK114は、3MKClまたは3Mグアニジン塩酸塩によって誘導されるわずかな変性の条件下では、単量体形態で現れるが、0.1MNaCl溶液中では、それは三量体形態である。この結果のばらつきは、様々な不安定性の条件下で三量体が単量体に解離する傾向があるためである。
【０００５】
いずれにせよ、三量体と考えられる形態の免疫原性活性は記載されていないが、本出願人によって行われた研究は、異種の哺乳動物に注射されたときに単量体大腸菌から得られる組換えタンパク質が抗体反応を生じないことを示している。二量体および／または三量体として記載されている「Colombo I. et al.,( Biochim. Biophys. Acta, 1998, 1442, 49-59)」およびWO 0063368に開示されている組換えタンパク質は、実際に、還元性および非還元性の両方の条件下において迅速に単量体に解離し、したがって、抗体反応を誘導することはできない。
【０００６】
WO 0063368は、単一のアミノ酸において天然型とは異なる組換え型のUK114を記載している。請求の形態のタグが存在しないことは、WO 0063368の実施例に記載されているように、様々な精製工程を意味する。請求されるタンパク質は二量体型であると宣言されているが、ＳＤＳでは完全に単量体に解離するが、非還元条件下ではその９０％しか解離しない。「Colombo I. et al. in Biochimica et Biophysica Acta」に記載の形態は、N末端でのクローニングに由来する3つのさらなるアミノ酸（VPM）を提示しているが、これも単量体に解離する。異種哺乳動物に注射した場合、これらのタンパク質のいずれも細胞毒性免疫反応を引き起こさない。WO 0063368および「Colomboらの文献」は、このタンパク質が、抗UK101抽出抗体によって免疫学的に認識され、それは明らかのことであり、何故なら、単量体タンパク質は、ほとんどが、弱いIgG反応とは別に良好な免疫反応を誘導できないハプテン（分子量14.2kD）であるためであるが、その抗原決定基を標的とする抗体により認識され、何故なら、それは、ウエスタンブロットにおいて、担体（50kD糖タンパク質）も含む（分子UK114に加えて、大部分が単量体に解離する）抽出物UK101で免疫付与することにより生成される抗天然UK114（抽出）抗体に結合するからであることも記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
しかしながら、これらの組換えタンパク質が哺乳動物に注射されたとき、それらは細胞毒性免疫反応を引き起こさない。何故なら、それらは二量体および／または三量体であると考えられているが、それらは単量体に急速に変換され、ハプテンである、すなわち免疫原性単独ではないからである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
安定なポリマー状の組換えYjgF/YERO57c7/UK114 RIDタンパク質が異種動物に注射されると、それは悪性の固形および全身性腫瘍細胞上に発現される同一および／または交差反応抗原に対する強力で持続性の細胞毒性抗体反応を誘発することが発見された。
【発明の効果】
【０００９】
したがって、本発明によるタンパク質は、悪性の固形および全身性腫瘍の治療、診断および予防に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明で得られるタンパク質のポリマー、二量体および三量体形態に対応するウエスタンブロッティングのバンドを提示する図である。
【図２Ａ】タンパク質PRP14で免疫付与されたウサギ抗体RIC1でのブロッティングにより得られるウエスタンブロッティングを示す図である。
【図２Ｂ】タンパク質PRP14で免疫付与されたウサギ抗体RIC1でのブロッティングにより得られるウエスタンブロッティングを示す図である。
【図３】ウサギ抗体を用いたウエスタンブロッティングを示す図である。
【図４】過免疫抗PRP14ウサギ結成におけるIgM媒介細胞毒性を示す図である。
【図５】細胞膜上に存在する抗原との抗体結合を示す図である。
【図６】実施例１の三量体タンパク質を用いて免疫付与したウサギ血清中に存在するIgGおよびIgM抗体の結合を示すフローサイトメトリー分析（FACS）結果である。
【図７】異なる濃度（0.1〜5%）の種々の抗血清を用いて実施された試験の結果を示すである。
【図８】細胞毒性試験結果を示す図である。
【図９ａ】細胞毒性対細胞増殖抑制性結果を示す図である。
【図９ｂ】細胞毒性対細胞増殖抑制性結果を示す図である。
【図９ｃ】細胞毒性対細胞増殖抑制性結果を示す図である。
【図９ｄ】細胞毒性対細胞増殖抑制性結果を示す図である。
【図１０】マウス結腸腺癌（C26）を有するBalb/c）マウスのPRP14による処理結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
様々な種に存在するUK114の同一性の分析により、Homo sapiens（100%とする）との同一性が、Macaca mulattaの99.3%からHeterocephalus glaberの45.6%の範囲であることが示された。
【００１２】
86%未満および60%を超える同一性値は、抗体反応を刺激するのに充分に異種であるが腫瘍細胞膜上に発現される決定基を認識するポリクローナル抗体を産生することができる良好な同一性を有するので、本発明の目的に適している。表1は、前記UK114タンパク質の同一性パーセンテージをヒトUK114と比較して示す。様々な種に存在するUK114の同一性の分析は、Homo sapiens（100%とする）との同一性が、Macaca mulattaの99.3%からHeterocephalus glaberの45.6%の範囲であることを示した。
【００１３】
【表１−１】
2020502273.tif 000002
【００１４】
【表１−２】
2020502273.tif 000003
【００１５】
【表１−３】
2020502273.tif 000004
【００１６】
【表１−４】
2020502273.tif 000005
【００１７】
【表１−５】
2020502273.tif 000006
【００１８】
本発明による安定なポリマー状の組換えYjgF/YER057c/UK114 RIDタンパク質（以降、PRP14と呼ぶ）は、それぞれ137アミノ酸の配列を有する3つ以上の単量体単位を含み、したがって分子量が約42.6以上である。
【００１９】
その単量体単位の好ましい配列は、配列番号1の配列である。
GSHMSSLVRRIISTAKAPAAIGPYSQAVLVDRTIYISGQLGMDPASGQLVPGGVVEEAKQALTNIGEILKAAGCDFTNVVKATVLLADINDFSAVNDVYKQYFQSSFPARAAYQVAALPKGGRVEIEAIAVQGPLTTASL. 
【００２０】
Capra hircusに由来すると共に以下に記載するように大腸菌において適切なベクターにより発現された例としてここに示す配列は、前記配列よりも4個多いN末端アミノ酸により特徴付けられる。前述のさらなるアミノ酸はG-S-H-M（グリシン−セリン-ヒスチジン-メチオニン）である。N末端に前記4つのさらなるアミノ酸が存在するために、2つ以上の14.2kDA単量体単位のクラスターからなるポリマー形態は、天然型または先に記載の組換えYjgF/YERO57c7/UK114タンパク質の二量体型または三量体型よりも安定であることが分かった。事実、水溶液中の既知のタンパク質は、急速に単量体に解離する不安定な二量体または三量体の形態を生じさせるが、配列番号1の配列は、解離しない、すなわちそれらの免疫原性性能を維持しているポリマー形態（二量体および三量体）を生じさせる。
【００２１】
実際、安定なポリマー形態のみが、YjgF/YERO57c/UK114ファミリーのタンパク質に固有のRID機能活性に関与する3D立体配座をもたらす（Lambrecht JA et al., J.Biol. Chem. 2012, 287, 3454-3461; Mistiniene E et al., Bioconjugate Chem. 2003, 14, 1243-1252; Dhawan L et al., Mol. Cell. Biol., 2012, 32, 3768-3775; Flynn JM et al., Mol. Microbiol., 2013, 89(4)751-759; Ernst DC et al., J. Bacteriology, 2014, 196 (18), 3335-3342; Niehaus TD et al., BMC Genomics, 2015, 16, 382）。
【００２２】
本発明の好ましい態様によれば、ヒトにとって異種のタンパク質が、Ｎ末端にポリヒスチジンセグメントを有するタンパク質を発現する発現ベクターで形質転換された大腸菌細胞中で発現され、ニッケル樹脂上の単一クロマトグラフィー段階での効率的な精製が可能になる。
【００２３】
得られるタンパク質は、14.2kDa単量体単位の、ポリマー、二量体および三量体形態に対応するWBのバンドを提示する（図１）。
【００２４】
本発明に係るPRP14タンパク質の三量体形態は、抗原性および細胞毒性活性のみならずRID機能も有するタンパク質の正確な生理学的構造を構成している。これは、WO 0063368およびColomboらの文献に記載のUK114タンパク質とは異なり、および、トラック１が分子量の標準を示し、トラック２がColombo Iらの文献に記載の組換えタンパク質UK114を示し、トラック３が酵母中で発現される組換えタンパク質UK114を示し、トラック４がWO 0063368に記載の組換えタンパク質を示す図２Ａに示される、前記タンパク質PRP14で免疫付与されたウサギ抗体RIC1でのブロッティングにより得られるウエスタンブロッティングで見ることができるように全体が単量体形態に解離する酵母中で発現されるタンパク質UK114とは異なり、部分的にのみ二量体および単量体形態に解離し得る。
前記タンパク質の配列が以下の表2に報告されている。
【００２５】
【表２】
2020502273.tif 000007
【００２６】
図２Ｂは安定したポリマーPRP14との比較を示している。組換え技術によって製造されたWO 0063368に記載されたタンパク質の90%が、非還元条件下でさえも単量体に解離することが示されている。
【００２７】
上記のタンパク質を過塩素酸のような強酸で処理することにより、さらなるポリマー状のPRP14を得ることができることも見出された。過塩素酸は酸化作用も有し、配列番号1のポリマーの形成は過酸化水素のような酸化剤を使用することによって得ることもできる。
【００２８】
またグルタルアルデヒドなどの架橋剤を使用することによって、配列番号1の配列のポリマーの形成を得ることができることも観察されている。
【００２９】
前記条件下で、タンパク質はクラスター化し、本発明による形態の形成をもたらし、それらは高分子量を有し、したがってより免疫原性である（図３：トラック１は解離したタンパク質、トラック２は三量体のPRP14、トラック３はHClO4で処理したタンパク質PRP14）。
【００３０】
前記三量体およびポリマー形態は、IgM-コンピテント抗原決定基を発現する。さらに、タンパク質の酸処理は、特に細胞毒性の主な原因であるIgM反応に関して、抗原性能をさらに増強する抗原決定基の同定および／または修飾を可能にするが、そのタンパク質の一次構造に修飾を誘導したり四次構造を破壊したりすることはない。
【００３１】
このようにして得られたIgMは腫瘍細胞に対して細胞毒性であり、過免疫血清中でのそれらの存在は、通常の抗原に対する通常のIgM反応よりもずっと長く持続する。該ポリマーは、タンパク質の免疫学的性能の顕著な増大、従って免疫反応における相当する増加を生じ、これは細胞増殖抑制特性ではなく非常に顕著な細胞毒性を有し（天然UK114の場合、質量分析によって示されるように、その大部分が単量体形態に低下する）、これは、クラスG免疫グロブリンだけでなく、主にクラスM免疫グロブリンによるものであり、現在の免疫学的理論とは反対に、数か月間循環を維持する（図４）。
【００３２】
UK101および天然UK114とは異なり、本発明によるタンパク質はアジュバントまたは担体の助けを借りずに抗体反応を誘導するが、これは免疫反応をさらに強化するために使用することができる。
【００３３】
好ましくは非経口的に、特に皮下または筋肉内に投与される本発明によるポリマー組換えタンパク質は、悪性腫瘍の治療、以前に腫瘍の治療を受けた患者における再発に対する予防免疫、アジュバント療法、および一般的に前記腫瘍の発症または再発の危険性のある個体のワクチン接種に特に有用である。
【００３４】
推奨される治療的または予防的使用のために、このタンパク質は、免疫反応をさらに強化するために、場合によりアジュバントと結合させて、滅菌水性担体中の溶液または懸濁液の形で、皮下または筋肉内投与されるであろう。
【００３５】
ポリマー状のタンパク質は、舌下または局所などの他の経路によっても投与することができる。治療的適用、予防的適用およびワクチン適用のための投与量は、投与あたり5〜40mgの範囲であり得る。典型的なワクチン接種プロトコールは、2週間毎に1回で、4回の投与を含む。最後の投与の20/30日後に、4倍高い追加投与が行われる。免疫療法は、抗体価および細胞毒性を評価するために実験室試験でモニターされる。抗体価の低下または、免疫寛容のリスクにつながる過剰免疫を防止するために、実験室試験でモニターした抗体価に応じて、間隔をあけて追加投与して、満足な臨床結果が達成される（腫瘍量の減少または消失）まで治療を続けることができる。
【００３６】
このポリマー組換えタンパク質は、免疫抑制患者および／または特定の免疫療法に反応しない患者の筋肉内または静脈内受動免疫療法および受動血清予防ために有用であるモノクローナル抗体（抗PRP14Mabs）を調製するために使用することもできる。
【００３７】
例えば、ヒトモノクローナル抗体は、ヒト-マウスミエローマK6H6/B5を、このタンパク質で前処理した患者由来のエプシュタイン・バールウイルスで形質転換したリンパ球と融合することによって得ることができる。IgGモノクローナル抗体を使用する受動免疫療法の一般的な慣例とは異なり、補体の存在下で腫瘍細胞に対して細胞毒性であるIgM分泌性クローンを使用することが好ましい。あるいは、両方のタイプのモノクローナル抗体（IgGおよびIgM）の混合物を使用することができる。
【００３８】
トランスジェニック動物において産生されたヒト化マウスIgMモノクローナル抗体またはヒトIgM分泌性モノクローナル抗体も使用することができる。
【００３９】
免疫細胞化学は、以下の表3に示されるように、ヒト腫瘍が、ポリマー過免疫抗タンパク質血清（83%）およびポリマー抗タンパク質Mab（93%）に対して80%を超える陽性を示すことを示した。
【００４０】
【表３】
2020502273.tif 000008
【００４１】
陽性は腺癌（悪性ヒト腫瘍の65%を占める腺起源の新生物）における百分率としてかなり明白であるが、同じ腫瘍のすべての細胞に等しく存在するわけではない。したがって、乳、膵臓、腎臓、肝臓および前立腺の腫瘍のようないくつかの腫瘍は強く陽性であるが、一方他の腫瘍では、それらの膜上の抗原を発現しない粘液細胞の存在により、強く陽性と陰性または低陽性の領域（肺、結腸）とが交互である。
【００４２】
全身性腫瘍、白血病、リンパ腫、骨髄腫および肉腫では、陽性率は60%である。本発明は、以下に示される実施例において詳細に説明される。
【実施例１】
【００４３】
安定した三量体形態の、大腸菌からの組換えタンパク質UK114の調製：PRP14
発現ベクターpET-15bを、大腸菌からの組換えタンパク質UK114の発現に使用する。ベクターpET-15bに先行するプラスミドからUK114をコードするヌクレオチド配列を転写するために、UK114の配列を、以下のプライマー対を用いて、PCRによって増幅する。
【００４４】
UK-Nde-FOR（配列番号２）:
5'AGCATATTCGACTGACATATGTCGTCTTTGGTCAGAAGGAT-3'
UK-Xho-REV（配列番号３）:
5'ATCGTCGGGCTCACTCGAGCTAGAGTGATGCTGTCGTGAGA-3'
【００４５】
PCRの産物を、制限酵素NdeIおよびXhoIで消化し、得られたフラグメントをゲルから溶出する。
【００４６】
UK114をコードするDNAの得られたフラグメントを、ポリヒスチジンタグおよびN末端に位置する特異的プロテアーゼにより認識される切断部位に融合したタンパク質配列を発現するベクター中でクローン化する。
【００４７】
pET15b-UK114と呼ばれる作製されたプラスミドを用いて大腸菌細胞（DH5）を形質転換する。
【００４８】
形質転換物をスクリーニングした。プラスミドpET15b-UK114のクローニングされたヌクレオチド配列は、ベクターに正しく融合されエラーがないことが証明された。
【００４９】
配列番号４のヌクレオチド配列（UK114の開始コドンは下線が引かれ太字にされている）:
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGTCGTCTTTGGTCAGAAGGATAATCAGCACGGCGAAAGCCCCCGCGGCCATTGGTCCCTACAGTCAGGCTGTGTTAGTCGACAGGACCATTTACATTTCAGGACAGCTAGGTATGGACCCTGCAAGTGGACAGCTTGTGCCAGGAGGGGTGGTAGAAGAGGCTAAACAGGCTCTTACAAACATAGGTGAAATTCTGAAAGCAGCAGGCTGTGACTTCACGAATGTGGTAAAAGCAACGGTTTTGCTGGCTGACATAAATGACTTCAGTGCTGTCAATGATGTCTACAAACAATATTTCCAGAGTAGTTTTCCGGCGAGAGCTGCTTACCAGGTTGCTGCTTTGCCCAAAGGAGGCCGTGTTGAGATCGAAGCAATAGCTGTGCAAGGACCTCTCACGACAGCATCACTCTAA
【００５０】
融合タンパク質His-tag-UK114の配列番号５のアミノ酸配列を以下に示す（His?タグからトロンビン切断部位までのセグメントに下線を引いて太字で示す）。
MGSSHHHHHHSSGLVPRGSHMSSLVRRIISTAKAPAAIGPYSQAVLVDRTIYISGQLGMDPASGQLVPGGVVEEAKQALTNIGEILKAAGCDFTNVVKATVLLADINDFSAVNDVYKQYFQSSFPARAAYQVAALPKGGRVEIEAIAVQGPLTTASL
【００５１】
トロンビン処理後のアミノ酸配列を以下に示す（配列番号1）。
GSHMSSLVRRIISTAKAPAAIGPYSQAVLVDRTIYISGQLGMDPASGQLVPGGVVEEAKQALTNIGEILKAAGCDFTNVVKATVLLADINDFSAVNDVYKQYFQSSFPARAAYQVAALPKGGRVEIEAIAVQGPLTTASL
【００５２】
タンパク質UK114を発現させるために、プラスミドを株DH5αから発現株（RosettaDE3）に転写する。
【００５３】
形質転換細胞を適切な培地（LB+抗生物質）中で増殖させ、タンパク質の発現をIPTGを用いて37℃で4時間誘導する。この誘導時間および37℃の温度は安定な三量体タンパク質UK114（PRP14）にとって理想的である。
【００５４】
SDSを含有するポリアクリルアミドゲル上での電気泳動（SDS-PAGE）、およびクーマシーブルーによるタンパク質の染色を行って、タンパク質の発現を確認する。
【００５５】
UK114-Hisを、一次抗ポリ-His抗体を用いてウエスタンブロッティングにより分析する。
【００５６】
試験したクローンは組換えタンパク質UK114を高レベルで発現する。タンパク質は細胞抽出物の可溶性画分中に存在する。
【００５７】
タンパク質は、ニッケル樹脂に対するポリヒスチジンタグの親和性を利用することによって精製することができる。37℃での誘導の4時間後に集められた細胞から得られた可溶性画分を、樹脂と共にインキュベートして、組換えタンパク質のHistagを、樹脂と結合したニッケルに結合させる。次に、フロースルー（樹脂に結合していないもの全て）を集め、種々の洗浄の後、タンパク質を、ニッケルへの結合に関してヒスチジンと競合する高濃度のイミダゾールで溶出する。
【００５８】
かなりのタンパク質濃度で溶出液をプールすることにより得られたサンプルを、50mM NaH2PO4,300mM NaCl,pH7.5中で透析する。
【００５９】
次に、サンプルを、タンパク質配列とHistag配列の間のN末端の切断部位を特異的に認識するセリンプロテアーゼであるトロンビンと共にインキュベートして、タグを除去させる。
【００６０】
消化したサンプルの一部を用いてSUPERDEX75カラムで分析的ゲルろ過を行い、既知の分子量標準を利用することによって、組換えタンパク質UK114の分子量を得ることができる（MW=42.6KDa）。精製されたタンパク質は、単量体の分子量と比較すると、コードPRP14で示される安定した三量体である。
【００６１】
ウエスタンブロッティング分析（図１）によって示されるように、これらの還元条件下で、タンパク質は解離せずに、安定して単量体、二量体および三量体のままである。それ故、このタンパク質は良好な免疫原活性を示す。
【実施例２】
【００６２】
二量体組換えタンパク質を2M過塩素酸、過酸化水素およびグルタルアルデヒドにより処理することによるポリマーの製造
A）2M過塩素酸による処理
実施例1に従って得られたタンパク質溶液（3mg/ml）5mlを、4℃で2M過塩素酸5mlと混合する。酢酸ナトリウムを添加してpHを4.1に調整し、得られた溶液を4℃で一晩インキュベートする。沈殿物を10,000rpmで1時間の遠心分離により除去する。
【００６３】
1000Daのカットオフを有する透析チューブを使用して、溶液をPBSに対して4℃で撹拌しながら透析し、0.2ミクロンのフィルターを通して濾過する。これらの条件下、実施例１の三量体タンパク質での免疫付与により得られたウサギ抗体を用いたウエスタンブロッティングによって示されるように（図３）、共有結合を有し（したがって、解離しない）、同じ抗原決定基を有し、約70kDまでのより高い分子量を有する、同じタンパク質の異なるポリマーが形成される。図３において、トラック１は、WO 0063368に記載されている組換えタンパク質を指し、トラック２は実施例１のタンパク質PRP14を指し、トラック3は過塩素酸で処理した後に得られたポリマー形態を指す。
【００６４】
B）過酸化水素による処理
実施例１に従って得られたタンパク質溶液（3mg/ml）5mlを、室温で30%過酸化水素5mlと混合する。得られた溶液を室温で2時間インキュベートする。
【００６５】
1000Daのカットオフを有する透析チューブを使用して、溶液をPBSに対して4℃で撹拌しながら透析し、0.2ミクロンのフィルターを通して濾過する。前記条件下で、共有結合を有しており、その理由で解離することはできない、同じタンパク質の異なるポリマーが形成される。得られたポリマーは、過塩素酸を用いて得られるものに対応する分子量を有する。
【００６６】
C）グルタルアルデヒドによる処理
実施例１に従って得られたタンパク質溶液（3mg/ml）5mlを、4℃で、リン酸緩衝液（pH7.2,0.1M）中の0.01Mグルタルアルデヒド溶液1mlと混合する。得られる溶液を4℃で一晩インキュベートする。沈殿物を10,000rpmで1時間の遠心分離により除去する。
【００６７】
1000Daのカットオフを有する透析チューブを使用して、溶液をPBSに対して4℃で撹拌しながら透析し、0.2ミクロンのフィルターを通して濾過する。前記条件下で、共有結合を有し、よって解離することができず、同じ抗原決定基を有し、約70kDまでのより高い分子量を有する、同じタンパク質の異なるポリマーが形成される。得られるポリマーは、過塩素酸または過酸化水素を用いて得られるものに対応する分子量を有する。
【実施例３】
【００６８】
腫瘍細胞への抗タンパク質PRP14抗体のインビトロ結合
細胞膜上に存在する抗原への結合および、種々のヒト腫瘍細胞株（KATO 3°, HT29, TSA, MCF7, JURKAT）上での補体媒介細胞毒性活性および非腫瘍細胞株（NCTC, MCF10, HUVEC）上での細胞毒性の不存在を、哺乳動物において産生された過免疫抗PRP14血清、および対応するMabを用いて示した。
【００６９】
A）標的としてヒト腫瘍細胞HT29を用いるFACS分析
固定されておらず透過処理されていない細胞を、実施例1のタンパク質（PRP14）を用いて免疫付与することによって得られたウサギRIC1抗体を用いて試験した。
【００７０】
フローサイトメトリー分析（FACS）は、細胞膜上に存在する抗原との抗体結合を示しており（図５）、１は対照血清、２は実施例１の抗タンパク質血清であり、実施例１の三量体タンパク質を用いて免疫付与したウサギ血清中に存在するIgGおよびIgM抗体の結合である（PRP14、図６）。
【００７１】
IgM抗体は主に細胞毒性作用に関与している。
【００７２】
B）標的としてのインキュベーションウエルに接着しているHT29細胞を用いるELISAアッセイ。乾燥および固定しているが、透過処理していない細胞
図７は、得られた異なる濃度（0.1〜5%）の種々の抗血清を用いて実施された試験の結果を示す。実施例１のタンパク質（PRP14）で免疫付与することによって得られたウサギ抗体；過塩素酸で処理することによって得られるポリマータンパク質（PRP a）で免疫付与することによって得られるウサギ抗体を使用。対照は、免疫前ウサギ血清である。
【００７３】
C）MTTアッセイを用いる細胞毒性活性試験。ポリマータンパク質UK114+補体を用いて免疫付与したウサギ抗血清を用いて試験したHT29細胞
細胞毒性試験を図８に報告する。1）対照：免疫前ウサギ血清；2）抗天然UK114mAb（International Journal of Oncology 8: 543-548,1996）；3）ポリマータンパク質PRP14を用いて免疫付与して得られたウサギ抗体；4）過塩素酸処理したポリマータンパク質PRP14を用いて免疫付与して得られたウサギ抗体；5）H2O2で処理したポリマータンパク質PRP14を用いて免疫付与して得られたウサギ抗体。
【実施例４】
【００７４】
細胞毒性対細胞増殖抑制性
ATPライトは細胞毒性と細胞増殖抑制性効果を区別しない細胞生存率測定試験である。
【００７５】
アネキシンV＋ヨウ化プロピジウム試験を用いて、抗PRP14については、ATPライト試験を用いて検出された新生物細胞の78%生存率損失のうち60%が細胞毒性効果（アポトーシス）によるもので、60%が細胞増殖抑制性効果によるものであるが、UK101/UK114に対する天然抗体については、生存率のほとんど全ての損失が、細胞毒性効果ではなく細胞増殖抑制性効果によるものであることが分かった（図９）。
【実施例５】
【００７６】
マウス結腸腺癌（C26）を有するBalb/c）マウスのPRP14による処理
C26は非常に攻撃的なマウス腫瘍であり、急速に増殖して、20日でBalb/cマウス（体重18/20グラム）の生命に不適合な寸法に達する。
【００７７】
腫瘍移植の4日後（新生物塊が既に認められている場合）、処理マウスには、4、11および18日目に10マイクログラムのポリマータンパク質PRP14を投与し、一方、対照動物には、食塩水またはWO 0063368に記載の組換えタンパク質UK114を投与した。試験はルシフェラーゼ法で行った。図１０に示されるように、ポリマータンパク質PRP14によるBALB/cマウスの処理は、皮下に移植されたC26癌の増殖および腫瘍質量の有意な（>50%）減少をもたらした。対照動物またはWO 0063368に記載されている組換えタンパク質UK114で処理したマウスにおいては、有意な減少はなかった。
【実施例６】
【００７８】
活性化HER2ラット遺伝子を有するBALB/cマウスにおける乳癌発症の抑制
これは、文献（Calogero et al., Breast Cancer Research 2007, 9:21）に詳しく記載されている実験モデルであり、HER2 neu遺伝子を過剰発現する雌性BALB/cマウスに乳癌が現れるものである。癌の発症は、十分に確立された固定時間に現れ、このモデルを用いて経時的にモニターすることができる。
【００７９】
20匹の動物を使用し、乳癌の外観を経時的にモニターした。このモデルは、これらの動物では、異型性過形成が、生後2週目に乳管および小葉に自発的に発症するという知見に基づいている。10週目に上皮細胞が管を閉塞し膨張させ、その場で癌腫の外観を呈する。数週間が経過するにつれて、前記新生物発生前病変は侵襲性癌腫に変換される。実験の終わりまでに、33週間で、触知可能な侵襲性癌が全部で10個の乳腺に出現した。
【００８０】
浸潤性癌の出現の予防または遅延におけるタンパク質PRP14を用いた予防的免疫付与の効果を評価するために、ポリマータンパク質+フロイントアジュバントを、10匹の動物（試験用動物）に誕生8週目から投与した。その後、皮下追加免疫剤を4週間ごとに投与した。同数の動物（対照）を食塩水で処理した。
【００８１】
発生率および腫瘍出現曲線と出現した複数の腫瘍の数との間の相違を、試験および対照動物において評価した。
【００８２】
試験動物と対照動物との間で前記パラメーターの有意な減少が観察された。PRP14で処理した動物の10%のみが腫瘍移植体を提示し、該移植体の寸法および数はより小さかった。
【００８３】
したがって、結果は、活性化HER2遺伝子の分裂促進活性によって乳腺上皮細胞に誘導される癌性形質転換および侵襲性癌の形成を抑制および／または防止するためのポリマータンパク質による抗腫瘍ワクチン接種の性能を確認している。
【実施例７】
【００８４】
ヒト腫瘍HT29を有するヌードマウスにおける受動的血清予防
HT29ヒト結腸腺癌細胞をヌードマウスに移植して、過免疫哺乳動物血清（タンパク質PRP14で免疫）および前記タンパク質で免疫する前の同じ哺乳動物からの血清を用いて、ヒト腫瘍を有するヌードマウスへの抗腫瘍免疫の伝達を示した。
【００８５】
タンパク質PRP14で免疫した哺乳動物の過免疫血清は、ヌードマウスへのヒト腫瘍の移植をかなり減少させることが示された。免疫前対照血清を注射した対照の100%と比べると、20%の腫瘍しか（過免疫哺乳動物血清で）免疫予防を行った動物に根付いておらず、移植潜在率および生存率がかなり増加していた。
【００８６】
処理動物では、いずれにせよ移植された腫瘍の成長時間は、対照のそれよりも3倍短く、生存率は、対照におけるよりも少なくとも2倍高かった（表４）。
【００８７】
【表４】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図９ｄ】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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