(57)【要約】約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇのＫＬＫ１ポリペプチド総投与量を有する１つ以上の組織カリクレイン−１（ＫＬＫ１）ポリペプチドの剤形が提供され、皮下剤形および静脈内剤形が含まれる。また、例えば、虚血性病態および出血性病態を治療するための、関連デバイスおよびその使用方法も提供される。【選択図】図２Ａ
2020510023.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
約０．５μｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇのＫＬＫ１ポリペプチド総投与量で製剤される１つ以上の組織カリクレイン（ＫＬＫ１）ポリペプチドを含む剤形。
【請求項２】
皮下または静脈内投与に適している、請求項１に記載の剤形。
【請求項３】
約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または１０μｇ／ｋｇのＫＬＫ１ポリペプチド総投与量を含む、請求項１または２に記載の剤形。
【請求項４】
約１．０μｇ／ｋｇ〜約５．０μｇ／ｋｇ、または約１．０μｇ／ｋｇ〜約４．０μｇ／ｋｇ、または約１．０μｇ／ｋｇ〜約３．０μｇ／ｋｇ、または約１．０μｇ／ｋｇ〜約２．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約５．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約４．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約３．０μｇ／ｋｇ、または約３．０μｇ／ｋｇ〜約５．０μｇ／ｋｇ、または約３．０μｇ／ｋｇ〜約４．０μｇ／ｋｇ、または約２．５μｇ／ｋｇ〜約３．５μｇ／ｋｇ、または約３μｇ／ｋｇの総ＫＬＫ１ポリペプチド皮下剤形を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の剤形。
【請求項５】
約０．５μｇ／ｋｇ〜約３．０μｇ／ｋｇ、または約０．５μｇ／ｋｇ〜約２．０μｇ／ｋｇ、または約０．５μｇ／ｋｇ〜約１．０μｇ／ｋｇ、または約０．５μｇ／ｋｇ〜約０．８μｇ／ｋｇ、または約０．５μｇ／ｋｇ〜約０．７５μｇ／ｋｇ、または約０．７５μｇ／ｋｇの総ＫＬＫ１ポリペプチド静脈内剤形を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の剤形。
【請求項６】
第１のＫＬＫ１ポリペプチドおよび第２のＫＬＫ１ポリペプチドを含み、
前記第１のＫＬＫ１ポリペプチドが、ポリペプチド当たり３つの異なる位置に結合した３つのグリカンを有し、前記第２のＫＬＫ１ポリペプチドが、ポリペプチド当たり２つの異なる位置に結合した２つのグリカンを有し、
前記第１のＫＬＫ１ポリペプチドおよび前記第２のＫＬＫ１ポリペプチドが、約４５：５５〜約５５：４５の比で前記剤形中に存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の剤形。
【請求項７】
前記グリカンのうちの１つ以上がＮ−結合グリカンである、請求項６に記載の剤形。
【請求項８】
前記グリカンのうちの１つ以上が、配列番号３または４によって定義される、ＫＬＫ１のアミノ酸残基７８、８４、または１４１に結合している、請求項６または７に記載の剤形。
【請求項９】
前記第１のＫＬＫ１ポリペプチドの前記３つのグリカンが、残基７８、８４、および１４１におけるＮ−結合グリカンである、請求項６〜８のいずれか一項に記載の剤形。
【請求項１０】
前記第２のＫＬＫ１ポリペプチドの前記２つのグリカンが、残基７８および８４におけるＮ−結合グリカンであるが、残基１４１においては結合しない、請求項６〜９のいずれか一項に記載の剤形。
【請求項１１】
前記第１のＫＬＫ１ポリペプチドおよび前記第２のＫＬＫ１ポリペプチドが約５０：５０の比で前記剤形中に存在する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の剤形。
【請求項１２】
前記剤形がＫＬＫ１ポリペプチドの三重グリコフォームおよびＫＬＫ１ポリペプチドの二重グリコフォームを含み、前記三重グリコフォームおよび前記二重グリコフォームが約４５：５５〜約５５：４５の比で前記剤形中に存在する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の剤形。
【請求項１３】
前記三重グリコフォームが、配列番号３または４によって定義されるＫＬＫ１のアミノ酸残基７８、８４、および１４１においてＮ−結合グリカンを含む、請求項１２に記載の剤形。
【請求項１４】
前記二重グリコフォームが、配列番号３または４によって定義される、ＫＬＫ１のアミノ酸残基７８および８４においてＮ−結合グリカンを含むが、ＫＬＫ１のアミノ酸残基１４１においては含まない、請求項１２または１３に記載の剤形。
【請求項１５】
前記三重グリコフォームおよび前記二重グリコフォームが、約５０：５０の比で前記剤形中に存在する、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の剤形。
【請求項１６】
前記１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドが、組換えＫＬＫポリペプチド、成熟ＫＬＫ１ポリペプチド、ヒトＫＬＫ１（ｈＫＬＫ１）ポリペプチド、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の剤形。
【請求項１７】
前記ｈＫＬＫ１ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基７８〜１４１もしくは配列番号２のアミノ酸残基７８〜１４１、またはそれらの活性フラグメント、または配列番号１のアミノ酸残基７８〜１４１もしくは配列番号２のアミノ酸残基７８〜１４１に対して少なくとも約９０、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の配列同一性を有する活性変異体を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる、請求項１６に記載の剤形。
【請求項１８】
前記ｈＫＬＫ１ポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸残基２５〜２６２もしくは配列番号２のアミノ酸残基２５〜２６２、またはそれらの活性フラグメント、または配列番号１のアミノ酸残基２５〜２６２もしくは配列番号２のアミノ酸残基２５〜２６２に対して少なくとも約９０、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の配列同一性を有する活性変異体を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる、請求項１６に記載の剤形。
【請求項１９】
前記ＫＬＫ１ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基２５〜２６２に対して少なくとも約９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＫＬＫ１ポリペプチドが、Ｅ１４５および／またはＡ１８８を含む、請求項１６に記載の剤形。
【請求項２０】
前記ＫＬＫ１ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸残基２５〜２６２に対して少なくとも約９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記ＫＬＫ１ポリペプチドが、Ｑ１４５および／またはＶ１８８を含む、請求項１６に記載の剤形。
【請求項２１】
薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、アジュバント、または担体を含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の剤形。
【請求項２２】
ＫＬＫ１の他のグリコシル化アイソフォーム（グリコフォーム）を実質的に含まない、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の剤形。
【請求項２３】
タンパク質１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満のエンドトキシンレベル、総タンパク質１ｍｇ当たり約１００ｎｇ未満の宿主細胞、総タンパク質１ｍｇ当たり約１０ｐｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを有し、かつ／または凝集物を実質的に含まない（約９５％超がＳＥＣ  ＨＰＬＣによって単一ピークとして現れる）、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の剤形。
【請求項２４】
アンジオテンシン受容体遮断薬、エダバロン、ファインレノン、およびバルドキサロンのうち１つ以上（それらの組み合わせを含む）から選択される第２の薬剤をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の剤形。
【請求項２５】
前記アンジオテンシン受容体遮断薬が、ロサルタン、アジシルサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、フィマサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、サプリサルタン、テルミサルタン、およびバルサルタンのうち１つ以上（それらの組み合わせを含む）から選択される、請求項２４に記載の剤形。
【請求項２６】
それを必要とする対象を治療する方法であって、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の剤形を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２７】
前記剤形を前記対象に皮下または静脈内投与することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
脳虚血（虚血性脳卒中）、心虚血（心筋虚血）、虚血性大腸炎、四肢虚血、および皮膚虚血のうちの１つ以上から任意選択的に選択される、前記対象における虚血性病態を治療するための、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
任意選択的に、脳内（脳の内部）出血性脳卒中およびくも膜下出血性脳卒中を含む出血性脳卒中である、前記対象における出血性病態を治療するための、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３０】
血管性認知症、糖尿病（任意選択的に２型糖尿病（Ｔ２Ｄ））、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、腎臓病（任意選択的に慢性腎臓病、糖尿病性腎臓病、または多発性嚢胞腎症）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびループス腎炎を含む関連病態、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、巣状分節性糸球体硬化症、ならびに本態性高血圧症のうち１つ以上から選択される疾患を治療するための、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記剤形を前記対象に皮下投与することを含み、前記剤形の皮下投与が、前記対象において前記１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドの治療上有効な血清レベルを達成し、任意選択的に、前記皮下投与後に約もしくは少なくとも約２、４、６、８、１０、１２、２４、２３、４８、６０、７２、８４、９６時間以上、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日以上の間、前記治療上有効な血清レベルを維持する、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記剤形を前記対象に静脈内投与することを含み、前記剤形の静脈内投与が、前記対象において前記１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドの治療上有効な血清レベルを、任意選択的に、前記静脈内投与後約０．５、１、２、３、もしくは４時間で、または約０．５、１、２、３、もしくは４時間未満で達成する、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記治療上有効な血清レベルが約１．０〜約５．０ｎｇ／ｍｌ、または約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０ｍｇ／ｍｌである、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記剤形の投与が、高用量剤形、任意選択的に少なくとも約１５μｇ／ｋｇ、または少なくとも約２０μｇ／ｋｇ、または少なくとも約５０μｇ／ｋｇ、または少なくとも約１００μｇ／ｋｇ、または少なくとも約４００μｇ／ｋｇ以上のＫＬＫ１ポリペプチド総投与量を有する高用量剤形と比較して、改善された薬物動態プロファイルまたは生物学的効果を達成する、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
１日に約１回または２回、２日毎に１回または２回、３日毎に１回または２回、４日毎に１回または２回、５日毎に１回または２回、６日毎に１回または２回、１週間毎に１回または２回の投与計画として、前記剤形を前記対象に投与することを含む、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
任意選択的に皮下投与により、３日毎に１日に約１回の投与計画として前記剤形を前記対象に投与することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
１つの静脈内剤形を前記対象に静脈内投与し、続いて、任意選択的に１日に約１回または２回、２日毎に１回または２回、３日毎に１回または２回、４日毎に１回または２回、５日毎に１回または２回、６日毎に１回または２回、１週間毎に１回または２回の投与計画として、１つ以上の皮下剤形を前記対象に皮下投与することを含む、請求項２６〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記静脈内投与が、前記対象において前記１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドの治療上有効な血清レベルを、前記静脈内投与後約０．５、１、２、３、もしくは４時間で、または約０．５、１、２、３、もしくは４時間未満で達成し、前記皮下投与が、前記皮下投与後に約もしくは少なくとも約２、４、６、８、１０、１２、２４、２３、４８、６０、７２、８４、９６時間以上、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日以上の間、前記治療上有効な血清レベルを維持する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
任意選択的に同一のまたは異なる剤形または組成物の一部として、アンジオテンシン受容体遮断薬、エダバロン、ファインレノン、およびバルドキサロンのうちの１つ以上（それらの組み合わせを含む）から選択される第２の薬剤を投与することを含む、請求項２６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記アンジオテンシン受容体遮断薬が、ロサルタン、アジルサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、フィマサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、サプリサルタン、テルミサルタン、およびバルサルタンのうちの１つ以上（それらの組み合わせを含む）から選択される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜２５のいずれか一項に記載の剤形を含むデバイスであって、前記剤形を皮下または静脈内に送達するのに適している、デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下で、２０１７年１０月３日に出願された米国仮特許出願第６２／５６７，４０６号、２０１７年６月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５１６，４６３号、および２０１７年３月９日に出願された米国仮特許出願第６２／４６９，３８５号に対する優先権を主張するものであり、これらの各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供されており、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むこのテキストファイル名は、ＤＩＡＭ＿０３７＿０３ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。本テキストファイルは９ＫＢであり、２０１８年３月９日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出されている。
【０００３】
背景
技術分野
本開示の実施形態は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇのＫＬＫ１ポリペプチド総投与量を有する、１つ以上の組織カリクレイン−１（ＫＬＫ１）ポリペプチドの剤形に関し、皮下および静脈内剤形が含まれる。また、例えば、虚血性病態および出血性病態を治療するための、関連デバイスおよびその使用方法も提供される。
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
組織カリクレインはすべて、トリプシンまたはキモトリプシンのそれと同様の基質特異性を有するプロテアーゼ活性を有する。ＫＬＫ１の最もよく特徴付けられている活性は、直接的にまたは間接的に、両ブラジキニン受容体（ＢＫ−Ｂ１、ＢＫ−Ｂ２）のサブタイプを活性化する、キニンと総称されるブラジキニン（ＢＫ）様ペプチドを生成するキニノーゲンのその酵素切断である。キニンによるＢＫ受容体の活性化は、体内の虚血に応答して多数の複雑な代謝経路を動かし、これには改善された血流（血管拡張による）、抗炎症反応、血管新生または血管形成による細胞修復、およびアポトーシスの減少が含まれ得る。
組織カリクレイン媒介性放出が、腎臓および心臓を含む種々の組織において血流を増加させ（例えば、Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２９：６５７−６６４，２００９を参照のこと）、このことはカリクレイン治療が特定の病態に対処する１つの様式である可能性が高いことを示すかなりの数の科学的研究がある。したがって、ＫＬＫ１は、患者における血流の再確立および炎症の軽減が脳機能、腎機能、心機能を含む臓器機能の維持に不可欠である広範囲の臨床シナリオを治療する可能性を有すると考えられている。しかし、ヒトにおいてＫＬＫ１の治療レベルを達成し維持する最適な剤形および投与経路を同定する必要性が依然としてある。本開示は、これらおよび他の必要性に対処する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ．２９：６５７−６６４，２００９
【発明の概要】
【０００６】
簡単な概要
本開示の実施形態は、組織カリクレイン−１（ＫＬＫ１）の製剤が逆用量曲線を有するという予想外の発見に関し、低用量製剤のある時点までの投与は、高用量製剤と比較して改善された薬物動態および／または活性プロファイルを示す。
【０００７】
したがって、特定の実施形態は、約１．０μｇ／ｋｇ〜約５．０μｇ／ｋｇまたは〜約１０．０μｇ／ｋｇのＫＬＫ１ポリペプチド総投与量で製剤される１つ以上の組織カリクレイン（ＫＬＫ１）ポリペプチドを含む剤形を含む。特定の実施形態において、剤形は皮下投与または静脈内投与に適している。
【０００８】
いくつかの実施形態において、剤形は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、または１０μｇ／ｋｇ（その間のすべての範囲を含む）のＫＬＫ１ポリペプチド総投与量を含む。
【０００９】
特定の剤形は、約１．０μｇ／ｋｇ〜約４．０μｇ／ｋｇ、または約１．０μｇ／ｋｇ〜約３．０μｇ／ｋｇ、または約１．０μｇ／ｋｇ〜約２．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約５．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約４．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約３．０μｇ／ｋｇ、または約３．０μｇ／ｋｇ〜約５．０μｇ／ｋｇ、または約３．０μｇ／ｋｇ〜約４．０μｇ／ｋｇ、または約２．５μｇ／ｋｇ〜約３．５μｇ／ｋｇ、または約３μｇ／ｋｇの総ＫＬＫ１ポリペプチド皮下投与剤形を含む。
【００１０】
特定の剤形は、約０．５μｇ／ｋｇ〜約３．０μｇ／ｋｇ、または約０．５μｇ／ｋｇ〜約２．０μｇ／ｋｇ、または約０．５μｇ／ｋｇ〜約１．０μｇ／ｋｇ、または約０．５μｇ／ｋｇ〜約０．８μｇ／ｋｇ、または約０．５μｇ／ｋｇ〜約０．７５μｇ／ｋｇ、または約０．７５μｇ／ｋｇの総ＫＬＫ１ポリペプチド静脈内剤形を含む。
【００１１】
一部の剤形は、ＫＬＫ１グリコフォームの混合物、例えば、第１のＫＬＫ１ポリペプチドおよび第２の組織ＫＬＫ１ポリペプチドを含み、
第１のＫＬＫ１ポリペプチドは、ポリペプチド当たり３つの異なる位置に結合した３つのグリカンを有し、第２のＫＬＫ１ポリペプチドは、ポリペプチド当たり２つの異なる位置に結合した２つのグリカンを有し、
第１のＫＬＫ１ポリペプチドおよび第２のＫＬＫ１ポリペプチドは、約４５：５５〜約５５：４５の比で剤形中に存在する。
【００１２】
いくつかの態様において、グリカンのうちの１つ以上はＮ−結合グリカンである。いくつかの態様において、グリカンのうちの１つ以上は、配列番号３または４によって定義されるようにＫＬＫ１のアミノ酸残基７８、８４、または１４１において結合している。いくつかの態様において、第１のＫＬＫ１ポリペプチドの３つのグリカンは、残基７８、８４、および１４１におけるＮ−結合グリカンである。いくつかの態様において、第２のＫＬＫ１ポリペプチドの２つのグリカンは、残基７８および８４におけるＮ−結合グリカンであるが、残基１４１においては結合しない。いくつかの態様において、第１のＫＬＫ１ポリペプチドおよび第２のＫＬＫ１ポリペプチドは、約５０：５０の比で剤形中に存在する。
【００１３】
一部の剤形は、ＫＬＫ１ポリペプチドの三重グリコフォームとＫＬＫ１ポリペプチドの二重グリコフォームとの混合物を含み、三重グリコフォームおよび二重グリコフォームは約４５：５５〜約５５：４５の比で剤形中に存在する。いくつかの態様において、三重グリコフォームは、配列番号３または４によって定義されるように、ＫＬＫ１のアミノ酸残基７８、８４、および１４１においてＮ−結合グリカンを含む。いくつかの態様において、二重グリコフォームは、配列番号３または４によって定義されるように、ＫＬＫ１のアミノ酸残基７８および８４においてＮ−結合グリカンを含むが、ＫＬＫ１のアミノ酸残基１４１においては含まない。いくつかの態様において、三重グリコフォームおよび二重グリコフォームは、約５０：５０の比で剤形中に存在する。
【００１４】
特定の実施形態において、１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドは、成熟ＫＬＫ１ポリペプチド、ヒトＫＬＫ１（ｈＫＬＫ１）ポリペプチド、または成熟ｈＫＬＫ１ポリペプチド（それらの任意の組み合わせを含む）（例えば、配列番号３または４およびその変異体）である。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ｈＫＬＫ１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基７８〜１４１もしくは配列番号２のアミノ酸残基７８〜１４１、またはそれらの活性フラグメント、または配列番号１のアミノ酸残基７８〜１４１もしくは配列番号２のアミノ酸残基７８〜１４１に対して少なくとも約９０、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の配列同一性を有する活性変異体を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ｈＫＬＫ１ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸残基２５〜２６２もしくは配列番号２のアミノ酸残基２５〜２６２、またはそれらの活性フラグメント、または配列番号１のアミノ酸残基２５〜２６２もしくは配列番号２のアミノ酸残基２５〜２６２に対して少なくとも約９０、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の配列同一性を有する活性変異体を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的になる。
【００１７】
いくつかの実施形態において、ＫＬＫ１ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基２５〜２６２に対して少なくとも約９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＫＬＫ１ポリペプチドはＥ１４５および／またはＡ１８８を含む。いくつかの実施形態において、ＫＬＫ１ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸残基２５〜２６２に対して少なくとも約９０、９５、９６、９７、９８、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、ＫＬＫ１ポリペプチドはＱ１４５および／またはＶ１８８を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、剤形は、薬学的に許容される希釈剤、アジュバント、または担体を含む。いくつかの態様において、剤形は、ＫＬＫ１の他のグリコシル化アイソフォーム（グリコフォーム）を実質的に含まない。
【００１９】
いくつかの態様において、剤形は、タンパク質約１ＥＵ／ｍｇ未満のエンドトキシンレベル、総タンパク質約１００ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞、総タンパク質約１０ｐｇ／ｍｇ未満の宿主細胞ＤＮＡを有し、および／または実質的に凝集物を含まない（約９５％超がＳＥＣ  ＨＰＬＣによって単一ピークとして現れる）。
【００２０】
いくつかの態様において、投与量は、第２の薬剤、例えば、アンジオテンシン受容体遮断薬、エダバロン、ファインレノン、およびバルドキサロンのうちの１つ以上（それらの組み合わせを含む）から選択される薬剤を含む。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン受容体遮断薬は、ロサルタン、アジルサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、フィマサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、サプリサルタン、テルミサルタン、およびバルサルタンのうちの１つ以上（それらの組み合わせを含む）から選択される。
【００２１】
また、それを必要とする対象を治療する方法であって、本明細書に記載の剤形を対象に投与することを含む、方法も含まれる。いくつかの実施形態は、剤形を対象に皮下または静脈内投与することを含む。特定の方法は、脳虚血（虚血性脳卒中）、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、心虚血（心筋虚血）、虚血性大腸炎、四肢虚血、および皮膚虚血のうちの１つ以上から任意選択的に選択される、対象における虚血性病態を治療することに関する。特定の方法は、血管性認知症の治療に関する。いくつかの方法は、対象における出血病態、任意選択的に脳内（脳の内部）出血性脳卒中およびくも膜下出血性脳卒中を含む出血性脳卒中の治療に関する。いくつかの方法は糖尿病、例えば２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の治療に関する。特定の実施形態は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の治療に関する。いくつかの実施形態は、腎臓病、例えば、慢性腎臓病、糖尿病性腎臓病、または多発性嚢胞腎症の治療に関する。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびループス腎炎などの関連病態または合併症、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、巣状分節性糸球体硬化症、ならびに本態性高血圧症を治療する方法も含まれる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、剤形を皮下投与することが、対象において１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドの治療上有効な血清レベルを達成し、場合によっては、皮下投与後に約もしくは少なくとも約２、４、６、８、１０、１２、２４、２３、４８、６０、７２、８４、９６時間以上、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日以上の間、対象において１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドの治療上有効な血清レベルを維持する。いくつかの実施形態において、剤形の対象への静脈内投与が、対象において１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドの治療上有効な血清レベルを、任意選択的に、静脈内投与後に約０．５、１、２、３、もしくは４時間で、または約０．５、１、２、３、もしくは４時間未満で達成する。いくつかの実施形態において、治療上有効な血清レベルは、約１．０〜約５．０ｎｇ／ｍｌ、または約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０ｍｇ／ｍｌ（その間のすべての範囲を含む）、例えば、１．０〜約５．０ｎｇ／ｍｌ、または約１．０〜約４．０ｎｇ／ｍｌ、または約１．０〜約３．０ｎｇ／ｍｌ、または約１．０〜約２．０ｎｇ／ｍｌ、または約２．０〜約５．０ｎｇ／ｍｌｇ、または約２．０〜約４．０ｎｇ／ｍｌ、または約２．０〜約３．０ｎｇ／ｍｌ、または約３．０〜約５．０ｎｇ／ｍｌ、または約３．０〜約４．０ｎｇ／ｍｌである。
【００２３】
いくつかの実施形態において、剤形の投与は、高用量剤形、例えば、少なくとも約１５μｇ／ｋｇ、または少なくとも約２０μｇ／ｋｇ、または少なくとも約５０μｇ／ｋｇ、または少なくとも約１００μｇ／ｋｇ、または少なくとも約４００μｇ／ｋｇ以上のＫＬＫ１ポリペプチド総投与量を有する高用量剤形と比較して、改善された薬物動態プロファイルまたは生物学的効果を達成する。いくつかの実施形態では、改善された薬物動態プロファイルは、例えば、皮下投与後に約もしくは少なくとも約２、４、６、８、１０、１２、２４、２３、４８、６０、７２、８４、９６時間以上、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日以上で測定される、単回皮下投与後の血清半減期の増加を含む。
【００２４】
特定の実施形態は、１日に約１回または２回、２日毎に１回または２回、３日毎に１回または２回、４日毎に１回または２回、５日毎に１回または２回、６日毎に１回または２回、１週間毎に１回または２回の投与計画として、剤形を対象に投与することを含む。特定の実施形態は、例えば、皮下投与により、３日毎に１日に約１回の投与計画として剤形を対象に投与することを含む。
【００２５】
特定の実施形態は、１つの静脈内剤形を対象に静脈内投与し、続いて、例えば、１日に約１回または２回、２日毎に１回または２回、３日毎に１回または２回、４日毎に１回または２回、５日毎に１回または２回、６日毎に１回または２回、１週間毎に１回または２回の投与計画として、１つ以上の皮下剤形を対象に皮下投与することを含む。いくつかの実施形態において、静脈内投与が、対象において１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドの治療上有効な血清レベルを、静脈内投与後、約０．５、１、２、３、もしくは４時間で、または約０．５、１、２、３、もしくは４時間未満で達成し、皮下投与が、皮下投与後に約もしくは少なくとも約２、４、６、８、１０、１２、２４、２３、４８、６０、７２、８４、９６時間以上、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日以上の間、治療上有効な血清レベルを維持する。
【００２６】
特定の方法は、アンジオテンシン受容体遮断薬、エダバロン、ファインレノン、およびバルドキサロンのうちの１つ以上（それらの組み合わせを含む）から選択される第２の薬剤を、例えば、同一の剤形の一部としてまたは異なる剤形もしくは組成物の一部として投与することを含む。いくつかの実施形態において、アンジオテンシン受容体遮断薬は、ロサルタン、アジルサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、フィマサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、サプリサルタン、テルミサルタン、およびバルサルタンのうちの１つ以上（それらの組み合わせを含む）から選択される。
【００２７】
本明細書に記載の剤形を含むデバイスも含まれ、それは皮下投与に適合されているか、または適している。いくつかの態様において、デバイスは注射器である。いくつかの態様において、注射器は、注射器に取り付けられた皮下注射針アセンブリを含む。いくつかの態様において、注射器は、針アセンブリの周りに保護カバーを含む。いくつかの態様において、注射器は、長さが約１／２インチから約５／８インチである針を有し、約２５〜約３１のゲージを有する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）治療のためのヒトにおけるＫＬＫ１（ＤＭ１９９）第Ｉ／ＩＩ相予備試験の結果を示す。患者（ｎ＝３７）に２８日間、プラセボまたは２つの用量（１５μｇ／ｋｇの高用量、または３μｇ／ｋｇの低用量）のうちの１つのＫＬＫ１を３日毎に投与し、空腹時血糖（ＦＢＧ）レベルを測定した。高用量（１５μｇ／ｋｇ）は有意な効果を示さなかったが、低用量（３μｇ／ｋｇ）はベースラインと比較してＦＢＧレベルに対して統計的に有意な（ｐ＜０．０５）効果を示した。したがって、低用量３μｇ／ｋｇは、高用量１５μｇ／ｋｇと比較して予想外の改善をもたらす。
【図２Ａ】健康なヒト対象において、成熟ヒトＫＬＫ１グリコフォームの低用量製剤（３μｇ／ｋｇ、ｎ＝１２）の皮下投与が、低用量製剤（０．７５μｇ／ｋｇ、ｎ＝１２）の静脈内投与と比較しても、有意な血清半減期の延長をもたらすことを示す。
【図２Ｂ】健康なヒト対象において、成熟ヒトＫＬＫ１グリコフォームの低用量製剤（３μｇ／ｋｇ、ｎ＝１２）の皮下投与が、低用量製剤（０．７５μｇ／ｋｇ、ｎ＝１２）の静脈内投与と比較しても、有意な血清半減期の延長をもたらすことを示す。
【図３】３μｇ／ｋｇのＫＬＫ１（ＤＭ１９９）投与量が、約３〜５ｎｇ／ｍｌの所望のまたは治療上有効な血清／血漿濃度でかなり安定した薬物濃度を維持した臨床試験の結果を示す。対照的に、１５／２５μｇ／ｋｇの投与量が多いと、投与量間の変動が大きくなり、血漿レベルが比例して高くなる。
【図４Ａ】２型糖尿病患者において行われたＫＬＫ１投与試験の結果を示す。図４Ａは要約を示し、図４Ｂおよび４Ｄはプラセボ群の結果を示し、図４Ｃは（ＫＬＫ１）ＤＭ１９９群の結果を示す。数値はインスリン抵抗性（ＨＯＭＡ２−ＩＲ）の派生尺度であり、数値が大きいほどインスリン抵抗性が高く、病気が重くなることを表す。
【図４Ｂ】２型糖尿病患者において行われたＫＬＫ１投与試験の結果を示す。図４Ａは要約を示し、図４Ｂおよび４Ｄはプラセボ群の結果を示し、図４Ｃは（ＫＬＫ１）ＤＭ１９９群の結果を示す。数値はインスリン抵抗性（ＨＯＭＡ２−ＩＲ）の派生尺度であり、数値が大きいほどインスリン抵抗性が高く、病気が重くなることを表す。
【図４Ｃ】２型糖尿病患者において行われたＫＬＫ１投与試験の結果を示す。図４Ａは要約を示し、図４Ｂおよび４Ｄはプラセボ群の結果を示し、図４Ｃは（ＫＬＫ１）ＤＭ１９９群の結果を示す。数値はインスリン抵抗性（ＨＯＭＡ２−ＩＲ）の派生尺度であり、数値が大きいほどインスリン抵抗性が高く、病気が重くなることを表す。
【図４Ｄ】２型糖尿病患者において行われたＫＬＫ１投与試験の結果を示す。図４Ａは要約を示し、図４Ｂおよび４Ｄはプラセボ群の結果を示し、図４Ｃは（ＫＬＫ１）ＤＭ１９９群の結果を示す。数値はインスリン抵抗性（ＨＯＭＡ２−ＩＲ）の派生尺度であり、数値が大きいほどインスリン抵抗性が高く、病気が重くなることを表す。
【図５Ａ】は、腎機能（クレアチニン、血中尿素）の測定に関する２型糖尿病患者（１群当たりｎ＝１２〜１３人）の２８日間の複数回投与試験の結果を示す。この結果は、低投与量（３μｇ／ｋｇ）が腎機能の測定の改善に対して高投与量（１５μｇ／ｋｇ）よりも有意に高い効果をもたらした。
【図５Ｂ】は、腎機能（クレアチニン、血中尿素）の測定に関する２型糖尿病患者（１群当たりｎ＝１２〜１３人）の２８日間の複数回投与試験の結果を示す。この結果は、低投与量（３μｇ／ｋｇ）が腎機能の測定の改善に対して高投与量（１５μｇ／ｋｇ）よりも有意に高い効果をもたらした。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
定義
別途定義されない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明の属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に説明されるものと類似のまたは等価の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができ、好ましい方法および材料を説明する。本発明の目的のために、以下の用語を下記に定義する。
【００３０】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書では、冠詞の文法的対象の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」とは、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００３１】
「約」とは、基準の量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さに対して、３０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１％だけ変化する量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量、または長さを意味する。
【００３２】
本明細書全体を通して、文脈上他の解釈を要する場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、述べられる工程もしくは要素または工程または要素の群を包含するが、任意の他の工程もしくは要素または工程もしくは要素の群は排除することを暗示することが理解されよう。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、「からなる」という語句に続くものは何でも含み、かつそれらに限定されることを意味する。ゆえに、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句は、列挙される要素を必要とするか、または必須であること、かつ他の要素が何ら存在してはならないことを示す。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、この語句の後に列挙された要素を含むことを意味し、列挙された要素の開示で特定された活性または作用を妨害または貢献しない他の要素に限定される。ゆえに、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という語句は、列挙された要素が必要または必須であることを示すが、他の要素は任意であり、列挙された要素の活性または作用に実質的に影響するかどうかによって存在する場合と存在しない場合がある。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、天然および非天然のアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体および模倣物の両方を意味することを意図する。天然に存在するアミノ酸には、タンパク質生合成中に利用される２０（Ｌ）−アミノ酸、ならびに４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、ホモシステイン、シトルリン、およびオルニチンなどが含まれる。非天然アミノ酸には、例えば、（Ｄ）−アミノ酸、ノルロイシン、ノルバリン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、エチオニンなどが含まれ、これらは当業者に既知である。アミノ酸類似体は、天然および非天然アミノ酸の修飾形態を含む。そのような修飾には、例えば、アミノ酸上の化学基および部分の置換もしくは置換、またはアミノ酸の誘導体化によるものが含まれ得る。アミノ酸模倣物には、例えば、参照アミノ酸に特徴的な電荷および電荷間隔などの機能的に類似した特性を示す有機構造が含まれる。例えば、アルギニンを模倣する有機構造（ＡｒｇまたはＲ）は、同様の分子空間に位置し、天然に存在するＡｒｇアミノ酸の側鎖のｅ−アミノ基と同程度の可動性を有する正電荷部分を有するだろう。模倣物はまた、アミノ酸またはアミノ酸官能基の最適な間隔および電荷相互作用を維持するための制約された構造を含む。当業者は、どの構造が機能的に等価なアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣物を構成するかを知っており、または決定することができる。
【００３４】
「エンドトキシンを含まない」または「実質的にエンドトキシンを含まない」という用語は、一般に、最大で微量（例えば、対象に対して臨床的に有害な生理学的影響を及ぼさない量）のエンドトキシン、好ましくは検出不可能な量のエンドトキシンを含む剤形、組成物、溶媒、デバイス、および／または血管に関する。エンドトキシンは、特定の細菌、通常はグラム陰性菌に関連する毒素だが、エンドトキシンはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどのグラム陽性菌に見られ得る。最も一般的なエンドトキシンは、様々なグラム陰性菌の外膜に見られるリポ多糖（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖（ＬＯＳ）であり、これらの細菌が病気を引き起こす能力の中心的な病原性の特徴を表す。ヒトにおける少量のエンドトキシンは、他の生理的副作用の中でも、発熱、血圧低下、ならびに炎症および凝固の活性化を生じさせ得る。
【００３５】
したがって、医薬品の製造では、少量であってもヒトに副作用を与え得るので、薬物および／または薬物容器からエンドトキシンのほとんどまたはすべての痕跡を除去することが多くの場合は望ましい。通常、ほとんどのエンドトキシンを分解するには３００℃を超える温度が必要であるため、この目的のためには発熱物質除去オーブンを使用できる。例えば、注射器またはバイアルなどの一次包装材料に基づくと、２５０℃のガラス温度と３０分の保持時間の組み合わせは、エンドトキシンレベルの３ｌｏｇの減少を達成するのに十分である。エンドトキシンを除去する他の方法が企図され、例えば、本明細書に記載され、当技術分野で既知のクロマトグラフィーおよびろ過方法が含まれる。また、エンドトキシンが本発明の組成物中に存在する危険性を排除しないにしても減少させるために、哺乳動物細胞のような真核細胞中でＫＬＫ１ポリペプチドを産生し、真核細胞から単離する方法も含まれる。好ましいのは、ＫＬＫ１ポリペプチドを産生し、化学的に定義された無血清培地で増殖した組換え細胞からそれらを単離する方法である。
【００３６】
エンドトキシンは、当技術分野で既知の通例の技術を使用して検出され得る。例えば、カブトガニの血液を利用するリムルス変形細胞溶解物アッセイは、エンドトキシンの存在を検出するための非常に感度の高いアッセイである。この試験では、この反応を増幅する強力な酵素カスケードにより、非常に低レベルのＬＰＳがリムルス溶解物の検出可能な凝固を引き起こし得る。エンドトキシンは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）でも定量化できる。実質的にエンドトキシンを含まないために、エンドトキシンのレベルは、タンパク質１ｍｇ当たりまたは１ｍｌ当たり約０．００１、０．００５、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０８、０．０９、０．１、０．５、１．０、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ＥＵ未満であり得る。通常、１ｎｇのリポ多糖（ＬＰＳ）は約１〜１０ＥＵに相当する。
【００３７】
剤形のＫＬＫ１ポリペプチドなどの薬剤の「半減期」は、生物の血清もしくは組織への投与時のそのような活性と比較して、または他の定義された時点と比較して、薬剤がその薬理学的、生理学的、または他の活性の半分を失うのにかかる時間を指し得る。「半減期」とはまた、薬剤のレベルが、生物の血清もしくは組織に投与される時点のそのような量または濃度に対して、または他の定義された時点に対して、生物の血清または組織に投与される開始量の半分だけ減少するのにかかる時間を指し得る。半減期は、血清および／または任意の１つ以上の選択された組織で測定できる。
【００３８】
「調節する」および「変更する」という用語は、通常、対照に対して統計的に有意なまたは生理学的に有意な量もしくは程度の「増加」、「増強」または「刺激」、ならびに「減少」または「低減」を含む。「増加した」、「刺激された」、または「強化された」量は、典型的に「統計的に有意な」量であり、対照組成物、試料、または試験対象によって生み出される量またはレベルの１．１、１．２、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍またはそれを超える倍率（例えば、５００、１０００倍）（１を超えるすべての整数かつそれらの間の小数点、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８等）である増加を含み得る。「減少」または「減少」量は、通常「統計的に有意な」量であり、生じた対照組成物、試料または試験対象の量またはレベルにおける、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは１００％の減少を含み得る。１つの非限定的な例として、比較は、高投与量剤形のＫＬＫ１の投与に対する低投与量剤形（例えば、１〜１０μｇ／ｋｇ）のＫＬＫ１の投与によって生じる薬物動態学的パラメーター／プロフィールまたは生物学的／治療的応答の量もしくはレベル間でされ得る。比較および「統計的に有意な」量の他の例は、本明細書に記載される。
【００３９】
「ポリペプチド」、「タンパク質」および「ペプチド」という用語は、互換的に使用され、特定の長さに限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。「酵素」という用語は、ポリペプチドまたはタンパク質触媒を含む。この用語には、ミリストイル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、およびシグナル配列の追加または欠失などの修飾が含まれる。「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、１つ以上のアミノ酸鎖を意味し、各鎖がペプチド結合により共有結合したアミノ酸を含み、上記ポリペプチドまたはタンパク質が非共有結合および／または天然タンパク質、すなわち、天然に存在する特異的非組換え細胞、または遺伝子操作された細胞または組換え細胞により産生されたタンパク質の配列を有するペプチド結合により一緒に共有結合した複数の鎖を含むことができ、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、または天然配列の１つまたは複数のアミノ酸の欠失、付加、および／または置換を有する分子を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドは、通常は細胞では見られない異種ポリヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列の組み合わせでできている、１つ以上の組換えＤＮＡ分子を含む組換え細胞によって産生される「組換え」ポリペプチドである。
【００４０】
「参照配列」という用語は、一般に、別の配列が比較されている核酸コード配列またはアミノ酸配列を指す。本明細書に記載のすべてのポリペプチド配列およびポリヌクレオチド配列は、名前によって記載されるものならびに表および配列表に記載されるものを含む参照配列として含まれる。
【００４１】
結果は、偶然に発生する可能性が低い場合、通常「統計的に有意」と呼ばれる。試験または結果の有意水準は、従来、偶然にイベントが発生する可能性が低いことを受け入れるのに必要な証拠の量に関連する。特定の場合、統計的有意性は、帰無仮説が実際に真である場合に帰無仮説を拒否する判定を行う確率として定義され得る（第一種過誤、または「偽陽性判定」として知られる決定）。多くの場合、この決定はｐ値を使用して行われる。ｐ値が有意水準より低い場合、帰無仮説は拒絶される。ｐ値が小さいほど、結果は大きくなる。ベイズ因子は統計的有意性を決定するために利用することもできる（Ｇｏｏｄｍａｎ，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１３０：１００５−１３，１９９９を参照）。
【００４２】
「溶解度」という用語は、液体溶媒に溶解して均一な溶液を形成する、本明細書で提供されるＫＬＫ１ポリペプチドの特性を指す。溶解度は通常、溶媒の単位体積当たりの溶質の質量（溶媒１ｋｇ当たりの溶質ｇ、ｄＬ（１００ｍＬ）当たりのｇ、ｍｇ／ｍｌなど）、モル濃度、モル濃度、モル比率、または濃度の他の同様の記述のいずれかによる濃度として表現される。溶媒量当たりの溶解できる溶質の最大平衡量は、温度、圧力、ｐＨ、および溶媒の性質などの特定の条件下でのその溶媒への溶質の溶解度である。特定の実施形態において、溶解度は、生理学的ｐＨまたは他のｐＨ、例えば、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ７．４、ｐＨ８．０またはｐＨ９．０で測定される。特定の実施形態において、溶解度は、水中またはＰＢＳもしくはＮａＣｌなどの生理的緩衝液（ＮａＰの有無にかかわらず）中で測定される。特定の実施形態では、溶解度は、比較的低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．０）および比較的高い塩（例えば、５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭ  ＮａＰ）で測定される。特定の実施形態において、溶解度は、血液または血清などの生体液（溶媒）で測定される。特定の実施形態において、温度は、ほぼ室温（例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、または約２５℃）またはほぼ体温（３７℃）であり得る。特定の実施形態では、ＫＬＫ１ポリペプチドは、室温または３７℃で、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、または少なくとも約６０ｍｇ／ｍｌの溶解度を有する。
【００４３】
「実質的に」または「本質的に」は、ほぼ全体にまたは完全に、例えば、ある所与の量の９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上を意味する。
【００４４】
本明細書で使用される「治療」または「治療する」は、疾患または病理学的状態の症状または病理に対するいかなる望ましい効果を含み、治療されている疾患または病態の１つ以上の測定可能マーカーにおける最小限の変化または低減さえも含み得る。「治療」または「治療する」は、疾患もしくは病態、またはその関連症状の完全な根絶もしくは治癒を必ずしも示すものではない。この治療を受ける対象は、それを必要とする対象である。臨床改善の例示的なマーカーは、当業者には明らかであろう。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「治療上有効な量」、「治療用量」、「予防上有効な量」、または「診断上有効な量」という用語は、投与後に所望の生物学的反応を引き出すのに必要な薬剤（例えば、ＫＬＫ１ポリペプチドまたはその剤形）の量である。
【００４６】
本明細書で使用する「対象」には、ＫＬＫ１ポリペプチドまたはその剤形で治療することができる症状を示す、または症状を示すリスクがある動物が含まれる。適切な対象（患者）としては、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、家畜、および飼育動物またはペット（ネコやイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類、好ましくはヒト患者が含まれる。
【００４７】
「単離された」とは、本来の状態で通常付随する成分を実質的または本質的に含まない物質を意味する。例えば、本明細書で使用される「単離されたペプチド」または「単離されたポリペプチド」などは、その天然の細胞環境由来、かつ細胞の他の成分との会合由来のペプチドまたはポリペプチド分子のインビトロ単離および／または精製を含み、すなわち、宿主細胞タンパク質または核酸などのインビボ物質とは有意に関連していない。
【００４８】
「野生型」もしくは「参照」配列または「野生型」もしくは「参照」タンパク質／ポリペプチドの配列は、変異の導入により変異体ポリペプチドが誘導された参照配列であり得る。一般に、所与のタンパク質の「野生型」アミノ酸配列は、本来最も一般的な配列である。同様に、「野生型」遺伝子配列は、最も一般的に天然に見出されるその遺伝子のポリヌクレオチド配列である。突然変異は、自然のプロセスまたは人為的な手段のいずれかを介して、「野生型」遺伝子（すなわちそれがコードするタンパク質）に導入され得る。
【００４９】
本明細書の各実施形態は、特に明記しない限り、他のすべての実施形態に適用されるものとする。
【００５０】
剤形
本開示の実施形態は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約５μｇ／ｋｇまたは約１０．０μｇ／ｋｇのＫＬＫ１ポリペプチド総投与量で製剤される１つ以上の組織カリクレイン（ＫＬＫ１）ポリペプチドを含む剤形に関する。場合によっては、剤形は、対象、例えばヒト対象への皮下または静脈内投与に適している（または適合されている）。
【００５１】
特定の剤形は、約０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、０．９５、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９．０、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、もしくは１０μｇ／ｋｇ（その間のすべての範囲を含む）のＫＬＫ１ポリペプチド総投与量を含むか、それらからなるか、本質的にそれらからなるか、またはそれらで構成される。
【００５２】
例えば、特定の剤形は、約０．１μｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約９．０μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約８．０μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約７．０μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約６．０μｇ／ｋｇ、約０．１μｇ／ｋｇ〜約５．０μｇ／ｋｇ、または約０．１μｇ／ｋｇ〜約４．０μｇ／ｋｇ、または約０．１μｇ／ｋｇ〜約３．０μｇ／ｋｇ、または約０．１μｇ／ｋｇ〜約２．０μｇ／ｋｇ、または約０．０１μｇ／ｋｇ〜約１．０μｇ／ｋｇ、または約０．５μｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ〜約９．０μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ〜約８．０μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ〜約７．０μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ〜約６．０μｇ／ｋｇ、約０．５μｇ／ｋｇ〜約５．０μｇ／ｋｇ、または約０．５μｇ／ｋｇ〜約４．０μｇ／ｋｇ、または約０．５μｇ／ｋｇ〜約３．０μｇ／ｋｇ、または約０．５μｇ／ｋｇ〜約２．０μｇ／ｋｇ、または約０．５μｇ／ｋｇ〜約１．０μｇ／ｋｇ、または約１．０μｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇ、約１．０μｇ／ｋｇ〜約９．０μｇ／ｋｇ、約１．０μｇ／ｋｇ〜約８．０μｇ／ｋｇ、約１．０μｇ／ｋｇ〜約７．０μｇ／ｋｇ、約１．０μｇ／ｋｇ〜約６．０μｇ／ｋｇ、約１．０μｇ／ｋｇ〜約５．０μｇ／ｋｇ、または約１．０μｇ／ｋｇ〜約４．０μｇ／ｋｇ、または約１．０μｇ／ｋｇ〜約３．０μｇ／ｋｇ、または約１．０μｇ／ｋｇ〜約２．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約９．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約８．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約７．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約６．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約５．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約４．０μｇ／ｋｇ、または約２．０μｇ／ｋｇ〜約３．０μｇ／ｋｇ、または約３．０μｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇ、または約３．０μｇ／ｋｇ〜約９．０μｇ／ｋｇ、または約３．０μｇ／ｋｇ〜約８．０μｇ／ｋｇ、または約３．０μｇ／ｋｇ〜約７．０μｇ／ｋｇ、または約３．０μｇ／ｋｇ〜約６．０μｇ／ｋｇ、または約３．０μｇ／ｋｇ〜約５．０μｇ／ｋｇ、または約３．０μｇ／ｋｇ〜約４．０μｇ／ｋｇ、または約４．０μｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇ、または約４．０μｇ／ｋｇ〜約９．０μｇ／ｋｇ、または約４．０μｇ／ｋｇ〜約８．０μｇ／ｋｇ、または約４．０μｇ／ｋｇ〜約７．０μｇ／ｋｇ、または約４．０μｇ／ｋｇ〜約６．０μｇ／ｋｇ、または約４．０μｇ／ｋｇ〜約５．０μｇ／ｋｇ、または約５．０μｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇ、または約５．０μｇ／ｋｇ〜約９．０μｇ／ｋｇ、または約５．０μｇ／ｋｇ〜約８．０μｇ／ｋｇ、または約５．０μｇ／ｋｇ〜約７．０μｇ／ｋｇ、または約５．０μｇ／ｋｇ〜約６．０μｇ／ｋｇ、または約６．０μｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇ、または約６．０μｇ／ｋｇ〜約９．０μｇ／ｋｇ、または約６．０μｇ／ｋｇ〜約８．０μｇ／ｋｇ、または約６．０μｇ／ｋｇ〜約７．０μｇ／ｋｇ、または約７．０μｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇ、または約７．０μｇ／ｋｇ〜約９．０μｇ／ｋｇ、または約７．０μｇ／ｋｇ〜約８．０μｇ／ｋｇ、または約８．０��ｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇ、または約８．０μｇ／ｋｇ〜約９．０μｇ／ｋｇ、または約９．０μｇ／ｋｇ〜約１０．０μｇ／ｋｇのＫＬＫ１ポリペプチド総投与量を含むか、それらからなるか、本質的にそれらからなるか、またはそれらで構成される。特定の剤形は、約２．５μｇ／ｋｇ〜約３．５μｇ／ｋｇ、または約３μｇ／ｋｇのＫＬＫポリペプチド総投与量を有し、静脈内投与に適した剤形が含まれる。特定の剤形は、約０．５μｇ／ｋｇ〜約１．０μｇ／ｋｇ、または約０．７５μｇ／ｋｇのＫＬＫポリペプチド総投与量を有し、静脈内投与に適した剤形が含まれる。
【００５３】
組織カリクレイン−１（ＫＬＫ１）ポリペプチド。上述のように、特定の剤形は１つ以上の組織カリクレイン−１またはＫＬＫ１ポリペプチドを含む。組織カリクレインは、少なくとも１５の別個の異なるタンパク質を含むセリンプロテアーゼの遺伝子スーパーファミリーのメンバーである（組織カリクレイン１〜１５と命名）（Ｙｏｕｓｅｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｒｅｖ；２２：１８４−２０４）。組織カリクレイン−１はトリプシン様セリンプロテアーゼである。ヒトおよび動物の組織において、組織カリクレイン−１はキニノーゲンをリジル−ブラジキニン（別名カリジン）に切断し、デカペプチドキニンはブラジキニンのそれと同様の生理学的効果を有する。ブラジキニンは、血管を拡張させ、それにより血圧を低下させるペプチドである。カリジンはブラジキニンと同一であり、追加のリジン残基がＮ末端に追加され、ブラジキニン受容体を介してシグナルを送る。
【００５４】
ＫＬＫ１遺伝子は、長さが２６２個のアミノ酸残基であり、「プレ」配列（残基１〜１８）および「プロ」配列（残基１９〜２４）を含む単一のプレプロ酵素をコードし、トリプシン様酵素により活性化される。ヒトＫＬＫ１の「成熟」および「活性」形態は、分子量２６ｋＤａ、理論ｐＩ値４．６の約２３８個のアミノ酸残基（残基２５−２６２）の糖タンパク質である。トリプシン消化および熱不活性化の両方に対するタンパク質の高い安定性を担うと考えられているＫＬＫ１の三次構造において、ＫＬＫ１は５つのジスルフィド結合を有する。
【００５５】
組織カリクレイン−１のアミノ酸配列は、ヒト（配列番号１および配列番号２）、マウス（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ３９３４９．１、１９９４年２月１日を参照）、イエネコ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００３９９７５２７．１、２０１２年１１月６日を参照）、ゴリラ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００４０６１３０５．１、２０１２年１２月３日を参照）、ウシ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＩ５１５５９．１、２００７年８月２日を参照）、イヌ（例えば、ＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１００３２６２．１、２０１３年２月２２日を参照）、ラット（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＡＥ５１９０６．１、２００６年４月２５日を参照）、オリーブヒヒ（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿００３９１６０２２．１、２０１２年９月４日を参照）である。ＫＬＫ１は、低分子量のキニノーゲンから血管作動性ペプチドであるＬｙｓブラジキニンを放出するその能力において種間で機能的に保存されている。本発明の組織カリクレイン−１ポリペプチドは、ＫＬＫ１の既知のアミノ酸配列のいずれか、またはその断片もしくは変異体を有し得る。
【００５６】
特定の実施形態では、ＫＬＫ１ポリペプチドは「成熟」ＫＬＫ１ポリペプチドである。特定の実施形態において、ＫＬＫ１ポリペプチドは、ヒトＫＬＫ１ポリペプチド、任意選択的に成熟ヒトＫＬＫ１ポリペプチドである。特定の実施形態では、ＫＬＫ１ポリペプチドは、組換えヒトポリペプチド、例えば、任意選択的に成熟形態の組換えヒトＫＬＫ１ポリペプチドである。組換えヒトＫＬＫ１（ｒｈＫＬＫ１）は、尿中ＫＬＫ１（例：ヒト尿から単離されたヒトＫＬＫ１）など、他のＫＬＫ１供給源に比べて特定の利点を提供でき、同種のｒｈＫＬＫ１調製物、より簡単な許認可への調節、および細胞培養条件に基づいたアミノ酸配列またはグリコシル化パターンを変える選択肢が含まれる。
【００５７】
ヒト組織カリクレイン−１（ｈＫＬＫ１）ポリペプチドの例示的なアミノ酸配列を、以下の表Ｋ１に提供する。
【表Ｋ１】
2020510023.tif 000003
【００５８】
特定の実施形態では、ＫＬＫ１ポリペプチドは、配列番号１〜３もしくは配列番号４、または配列番号１もしくは配列番号２の残基１〜２６２、残基１９〜２６２、もしくは残基２５〜２６２（その断片および変異体を含む）を含むか、それらからなるか、またはそれらから本質的なる。配列番号１および２のアミノ酸１〜１８はシグナルペプチドを表し、アミノ酸１９〜２４はプロペプチド配列を表し、アミノ酸２５〜２６２は成熟ペプチドを表す。したがって、プレプロタンパク質は、推定１７アミノ酸シグナルペプチド、７アミノ酸プロ酵素断片、および２３８アミノ酸の成熟ＫＬＫ１タンパク質を含む。
【００５９】
配列番号１および配列番号２（または配列番号３および配列番号４）の比較は、２つのｈＫＬＫ１アミノ酸配列間の２つのアミノ酸の差を示す。種内の２つの個体間の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、２６２のアミノ酸残基１４５でのＥからＱへの置換と、２６２の位置１８８でのＡからＶへの置換を説明する。配列番号１は、位置１４５にＥ（グルタミン酸）および位置１８８にＡ（アラニン）を有し、配列番号２は、位置１４５にＱ（グルタミン）および位置１８８にＶ（バリン）を有する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ１ポリペプチドは、１４５位にＥ、１４５位にＱ、１８８位にＡ、１８８位にＡ、１４５位にＥおよび１８８位にＡ、１４５位にＱおよび１８８位にＶ、１４５位にＱおよび１８８位にＡ、または、１４５位にＥおよび１８８位にＶを有する。
【００６０】
上述のように、特定の実施形態は、参照ＫＬＫ１ポリペプチドの活性変異体および断片を含む。出発または参照ポリペプチドの「変異体」は、出発または参照ポリペプチドのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するポリペプチドである。そのような変異体には、例えば、目的のポリペプチドのアミノ酸配列内の残基の欠失、挿入、および／または置換が含まれる。これに関連して、変異体アミノ酸は、出発または参照ポリペプチド配列の対応する位置のアミノ酸とは異なるアミノ酸を指す。欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせを行って、最終変異体または変異体構築物に到達できるが、ただし、最終構築物が所望の機能特性を保有していることが条件である。アミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数または位置の変化など、ポリペプチドの翻訳後プロセスを変化させ得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＫＬＫポリペプチドは、例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列（例えば、配列番号１〜４）などの参照配列に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％のアミノ酸同一性を有する。
【００６２】
いくつかの態様では、ＫＬＫ１ポリペプチドは、配列番号１もしくは３、または例えば配列番号１の残基２５〜２６２または残基７８〜１４１などの配列番号１もしくは３の断片に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％のアミノ酸同一性を有する。このようなＫＬＫ１ポリペプチドは、アミノ酸残基１４５においてＥもしくはＱ、および／または１８８位においてＡもしくはＶを有し得る。
【００６３】
いくつかの態様では、ＫＬＫ１ポリペプチドは、配列番号２もしくは４、または例えば配列番号２の残基２５〜２６２または残基７８〜１４１などの配列番号２もしくは４の断片に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９８．５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％のアミノ酸同一性を有する。このようなＫＬＫ１ポリペプチドは、アミノ酸残基１４５においてＥもしくはＱ、および／または１８８位においてＡもしくはＶを有し得る。
【００６４】
ポリペプチドに関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列をアラインしてギャップを導入した後、参照配列のアミノ酸残基と同一である候補配列のアミノ酸残基の割合として定義され、必要であれば、最大配列同一性パーセントを達成し、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当業者の範囲内である様々な方法で達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。ＡＬＩＧＮ−２プログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａで公開されている。
【００６５】
本明細書の目的のために、所与のアミノ酸配列Ａのアミノ酸配列同一性％、または所与のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％、（所与のアミノ酸配列Ａは、所与のアミノ酸配列Ｂへの、とともに、に対する特定のアミノ酸配列同一性有するかつ含むと言い換えることもできる）は、次のように計算できる。Ｘ／Ｙの１００倍、式中、Ｘは、ＡおよびＢのそのプログラムのアラインメントにおけるプログラムの配列アライメントプログラムによって同一の一致としてスコア付けされたアミノ酸残基の数であり、ＹはＢのアミノ酸残基の総数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡのアミノ酸配列同一性％は、Ａに対するＢのアミノ酸配列同一性％と等しくない。
【００６６】
変異体はまた、例えば精製を促進し、代謝半減期を改善し、またはポリペプチドの同定を容易にするために、参照ＫＬＫ１ポリペプチドに付加される異種配列または化学修飾を含み得る。例には、Ｈｉｓタグ、Ｆｃ領域、および／またはＰＥＧ化配列およびＰＥＧなどの親和性タグが含まれる。
【００６７】
「断片」という用語には、ＫＬＫ１ポリペプチドの活性を保持するＫＬＫ１ポリペプチド（またはその変異体）のより小さな部分が含まれる。断片は、例えば、長さが約２０〜約５０、約２０〜約１００、約２０〜約１５０、約２０〜約２００、または約２０〜約２５０アミノ酸の範囲のサイズのＫＬＫ１ポリペプチド断片を含む。他の実施形態において、ＫＬＫ１ポリペプチド断片は、サイズが約５０〜約１００、約５０〜約１５０、約５０〜約２００、約５０〜約２５０アミノ酸長の範囲である。他の実施形態において、ＫＬＫ１ポリペプチド断片は、サイズが約１００〜約１５０、約１００〜約２００、約１００〜約２５０、約１５０〜約１７５、約１５０〜約２００、または約１５０〜約２５０アミノ酸長の範囲である。他の例示的な実施形態では、ＫＬＫ１ポリペプチド断片は、サイズが約２００〜約２５０アミノ酸長の範囲である。特定の実施形態は、約、最大約、または少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０以上（例えば、連続）のアミノ酸残基の全長ＫＬＫ１のポリペプチド断片を含む。いくつかの実施形態では、断片は、プレプロタンパク質配列の残基２５〜２６２または残基７８〜１４１を有し得る。いくつかの実施形態では、断片は、上述のように、配列番号１または配列番号２のそのようないかなる断片サイズであり得る。
【００６８】
場合によっては、ＫＬＫ１ポリペプチドの断片および変異体は、低分子量キニノーゲンから血管作動性ペプチドであるＬｙｓ−ブラジキニンを放出する酵素能力を保持する。いくつかの実施形態では、活性変異体または断片は、キニノーゲンなどの高分子量前駆体からカリジンを放出する、または比色定量もしくは蛍光定量断片を放出する、Ｄ−ｖａｌ−ｌｅｕ−ａｒｇ−７アミド−４−トリフルオロメチルクマリンなどのキニノーゲンと同様の基質を切断するＫＬＫ１ポリペプチドのセリンプロテアーゼ活性を保持する。ＫＬＫ１ポリペプチドのプロテアーゼ活性は、低分子量キニノーゲンの切断、またはｌｙｓ−ブラジキニンの生成のいずれかを測定することにより、酵素活性アッセイで測定できる。１つのアッセイ形式では、標識基質がＫＬＫ１グリコフォームと反応し、標識断片の放出が検出される。ＫＬＫ１の活性測定に適したこのような蛍光発生基質の一例は、Ｄ−ｖａｌ−ｌｅｕ−ａｒｇ−７アミド−４−トリフルオロメチルクマリン（Ｄ−ＶＬＲ−ＡＦＣ、ＦＷ５９７．６）（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ＃Ｖ２８８８またはＡｎａ  Ｓｐｅｃ  Ｉｎｃ  Ｃａｔ＃２４１３７）である。Ｄ−ＶＬＲ−ＡＦＣが加水分解されると、反応で生成される遊離ＡＦＣは、蛍光検出（励起４００ｎｍ、発光５０５ｎｍ）または３８０ｎｍでの分光光度検出（吸光係数＝１２，６００、ｐＨ７．２）で定量化できる。他の方法および基質はまた、ＫＬＫ１タンパク質分解活性を測定するために使用してもよい。
【００６９】
グリコフォームおよびその混合物。特定の実施形態において、剤形は、１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドグリコフォームの混合物を含み、規定比率の二重および三重グリコシル化ＫＬＫ１ポリペプチドを含む剤形が含まれる（その全体が参照により組み込まれる米国出願第１４／６７７，１２２号を参照のこと）。
【００７０】
ヒトカリクレインは、例えば、配列番号３または４に示す成熟アミノ酸配列ならびに推定されるＯ−結合グリコシル化部位に対して、残基７８、８４、および１４１において３つの潜在的なＡｓｎ結合（Ｎ結合）グリコシル化部位を有する。しかし、Ｏ結合グリコシル化は、天然のＫＬＫ１では検出されない。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、３つすべての位置（位置７８、８４、および１４１）でグリコシル化されたＫＬＫ１ポリペプチドは高分子量バンドとして検出され、本明細書ではＫＬＫ１の高分子量三重グリコシル化グリコフォーム（または「高グリコフォーム」または「三重グリコフォーム」ＫＬＫ１）と呼ばれる。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、３つの利用可能な位置のうち２つ（位置７８および８４）のみにおいてグリコシル化されたＫＬＫ１ポリペプチドは、低分子量バンドとして検出され、ＫＬＫ１の低分子量二重グリコシル化グリコフォーム（または「低グリコフォーム」または「二重グリコフォーム」ＫＬＫ１）と呼ばれる。
【００７１】
したがって、特定の剤形は、例えば、第１のＫＬＫ１ポリペプチドおよび第２のＫＬＫ１ポリペプチドを含む、定義された比でのＫＬＫ１グリコフォームの混合物を含み、第１のＫＬＫ１ポリペプチドは、ポリペプチドのグリコシル化に利用可能な３つの異なる位置に結合した３つのグリカンを有し、第２のＫＬＫ１ポリペプチドは、ポリペプチドのグリコシル化に利用可能な３つの異なる位置のうちの２つのみに結合した２つのグリカンを有する。特定の実施形態において、第１および第２のＫＬＫ１ポリペプチドは、例えば、約４６：５４、約４７：５３、約４８：５２、約４９：５１、約５１：４９、約５２：４８、約５３：４７、および約５４：４６（その間のすべての整数と小数点を含む）を含む約４５：５５〜約５５：４５の比で剤形中に存在する。特定の実施形態において、第１および第２のＫＬＫ１ポリペプチドは、約５０：５０の比で剤形中に存在する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＫＬＫ１ポリペプチドの比は約６０：４０ではない。いくつかの実施形態では、第１および第２のＫＬＫ１ポリペプチドの比は約４０：６０ではない。特定の実施形態において、剤形は、ＫＬＫ１の他のグリコシル化アイソフォーム（グリコフォーム）を含まないか、または実質的に含まない。
【００７２】
一部の剤形は、ＫＬＫ１ポリペプチドの三重グリコフォームおよびＫＬＫ１ポリペプチドの二重グリコフォームを含み、三重グリコフォームおよび二重グリコフォームは、例えば、約４６：５４、約４７：５３、約４８：５２、約４９：５１、約５１：４９、約５２：４８、約５３：４７、および約５４：４６を含む約４５：５５〜約５５：４５の比で剤形中に存在する。いくつかの実施形態において、三重グリコフォームおよび二重グリコフォームは、約５０：５０の比で剤形中に存在する。いくつかの実施形態では、三重グリコフォームおよび二重グリコフォームの比は約６０：４０ではない。いくつかの実施形態では、三重グリコフォームおよび二重グリコフォームの比は約４０：６０ではない。特定の実施形態において、剤形は、ＫＬＫ１の他のグリコシル化アイソフォーム（グリコフォーム）を含まないか、または実質的に含まない。
【００７３】
ＫＬＫ１の二重および三重グリコシル化アイソフォームの比は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、レクチンアフィニティークロマトグラフィー、およびレクチンアフィニティー電気泳動を含んでもよい高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの様々な方法で検出および定量化することができる。ＫＬＫ１グリコフォーム混合物の調製および特徴付けは、米国特許出願第１４／６７７，１２２号に記載されており、その全体が参照により組み込まれている。
【００７４】
追加の薬剤。特定の実施形態において、剤形は、もう１つの追加の治療薬、例えば第２の治療薬を含む。いくつかの実施形態において、追加の薬剤は、アンジオテンシン受容体遮断薬、エダバロン、ファインレノン、およびバルドキサロンのうちの１つ以上（それらの組み合わせを含む）から選択される。アンジオテンシン受容体遮断薬の例としては、ロサルタン、アジルサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、フィマサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、サプリサルタン、テルミサルタン、およびバルサルタン（それらの組み合わせを含む）が挙げられる。
【００７５】
純度。いくつかの実施形態では、剤形の「純度」は、例えば、宿主細胞タンパク質、宿主細胞ＤＮＡ、エンドトキシンの量（例えば、総量、相対量、割合）、および／またはＳＥＣ  ＨＰＬＣによる単一ピーク純度の割合によって特徴付けられる。場合によっては、剤形の純度は、他の成分、例えば、前述のいずれか１つ以上と比較したＫＬＫ１ポリペプチドの量（例えば、割合）によって特徴付けられる。
【００７６】
いくつかの実施形態では、剤形の純度は、宿主細胞タンパク質のレベルまたは量に対して、またはそれによって特徴付けられる。組換え発現に使用される宿主細胞は、細菌および酵母から哺乳類または昆虫種に由来する細胞株にまで及び得る。細胞は、数百から数千の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）および最終製品を汚染する可能性のある他の生体分子を含む。ＨＣＰは、目的のタンパク質とともに分泌されるか、偶発的な細胞溶解により放出されることができ、目的のタンパク質を汚染し得る。２種類の免疫学的方法がＨＣＰ分析に適用され得る。ウェスタンブロッティング（ＷＢ）およびイムノアッセイ（ＩＡ）、これには、ＥＬＩＳＡおよびサンドイッチイムノアッセイなどの技術、または放射性、発光性、または蛍光性のレポートラベルを使用した同様の方法が含まれる。本発明の組成物は、総タンパク質１ｍｇ当たり約５００ｎｇ未満、約４００ｎｇ未満、約３００ｎｇ未満、約２００ｎｇ未満、約１００ｎｇ未満、または約５０ｎｇ未満の宿主細胞タンパク質を含み得る。
【００７７】
場合によっては、純度は、宿主細胞ＤＮＡのレベルまたは量に関連して、またはレベルまたは量によって特徴付けられる。残留宿主細胞ＤＮＡの検出は、宿主細胞ゲノム内の配列用の様々なプライマーを用いたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実施することができる。残留宿主細胞ＤＮＡは、一般的に特定の閾値レベルを下回っていると報告されるが、ｒＰＣＲ法で定量化することもできる。本発明の組成物は、総タンパク質１ｍｇ当たり約１００ｐｇ未満、約９０ｐｇ未満、約８０ｐｇ未満、約７０ｐｇ未満、約６０ｐｇ未満、約５０ｐｇ未満、約４０ｐｇ未満、約３０ｐｇ未満、約２０ｐｇ未満、または約１０ｐｇ／ｍｇ未満の宿主細胞デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を含み得る。
【００７８】
特定の実施形態において、純度は、エンドトキシンの量またはレベルに関連して、またはエンドトキシンの量またはレベルによって特徴付けられる。本明細書で述べたように、エンドトキシンは非常に強力で熱安定性があり、滅菌膜フィルターを通過し、細菌が存在する場所または存在した場所のすべてに存在する。エンドトキシンユニット（ＥＵ）は、ＵＳＰ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄの生物活性の単位である。
【００７９】
細菌性エンドトキシンテスト（ＢＥＴ）は、カブトガニ（リムルスポリフェムスまたはタキプレウストライデンタトゥス）のアメーバ細胞溶解物（白血球）を使用して、グラム陰性細菌由来のエンドトキシンを検出または定量化する試験である。ＦＤＡ承認済みのリムルスアメーバ細胞溶解（ＬＡＬ）試薬は、すべてのＵＳＰエンドトキシン試験に使用される。この試験には、少なくとも３つの方法がある：ゲル形成に基づくゲル凝固技術である方法Ａ、内因性基質の切断後の濁度の発生に基づく比濁法である方法Ｂ、合成ペプチド−色素原複合体の切断後の発色に基づく発色法である方法Ｃ。
【００８０】
少なくとも２種類のエンドトキシン試験がＵＳＰ＜８５＞ＢＥＴに記載されている。測光試験には、分光光度計、エンドトキシン固有のソフトウェア、および印刷機能が必要である。最も単純な測光システムは、乾燥した、事前にキャリブレーションされた試薬を含む使い捨てＬＡＬカートリッジを採用したハンドヘルドユニットであり、液体試薬または標準液は必要ない。ＦＤＡ承認済みユニットは、Ｅｎｄｏｓａｆｅ（登録商標）−ＰＴＳ（商標）の名称で販売される。デバイスは、少量サンプルの、滅菌チューブ内で希釈されたＣＳＰの２５μＬアリコートを分析し、結果をプリントアウトするのに約１５分かかる。対照的に、ゲル凝固法では、乾熱ブロック、キャリブレーションされたピペットと温度計、ボルテックスミキサー、凍結乾燥ＬＡＬ試薬、試薬を水和するためのＬＡＬ試薬水（ＬＲＷ）、および発熱物質除去ガラス器具が必要である。この凝固試験では、希釈された試料および液体試薬は、試料および陽性対照の調製に約１時間、ヒートブロックでの１時間のインキュベーションを必要とし、結果は手動で記録される。したがって、自動化システムの簡潔さと速度は、薬学設定に理想的に適している。
【００８１】
場合によっては、剤形の純度は凝集の程度によって特徴付けられる。例えば、ＫＬＫ１の凝集の程度は、サイズに基づいて粒子を分離するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって測定することができる。これは、精製タンパク質の三次構造および四次構造を決定するために一般に受け入れられている方法である。ＳＥＣは、主にタンパク質またはポリマーなどの大きな分子の分析に使用される。ＳＥＣは、これらの小さな分子を粒子の細孔に閉じ込めることで機能する。より大きな分子は、大きすぎて細孔に入ることができないため、単純に細孔を通過する。したがって、大きな分子は小さな分子よりも速くカラムを流れ、つまり、分子が小さいほど保持時間が長くなる。特定の組成物はまた、凝集体を実質的に含まない（約９５％超がＳＥＣ  ＨＰＬＣによって単一ピークとして現れる）。特定の実施形態は、ＳＥＣ  ＨＰＬＣによって単一ピークとして現れる約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％を超える凝集体を含まない。
【００８２】
特定の実施形態において、剤形中のＫＬＫ１ポリペプチドの「純度」が具体的に定義される。例えば、特定の剤形は、剤形の他の成分と比較して、少なくとも約８０、少なくとも約８５、少なくとも約９０、少なくとも約９１、少なくとも約９２、少なくとも約９３、少なくとも約９４、少なくとも約９５、少なくとも約９６、少なくとも約９７、少なくとも約９８、少なくとも約９９、または１００％（その間のすべての小数を含む）純度である１つ以上のｈＫＬＫ１ポリペプチドを含む。純度は、例えば、化合物を分離、同定、および定量するために生化学および分析化学で頻繁に使用されるカラムクロマトグラフィーの周知の形態である高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって、制限なく測定できる。
【００８３】
特定の実施形態において、剤形は、以下の純度の判定：タンパク質１ｍｇ当たり約１ＥＵ未満のエンドトキシン、タンパク質１ｍｇ当たり約１００ｎｇ未満の宿主細胞タンパク質、タンパク質１ｍｇ当たり約１０ｐｇ未満の宿主細胞ＤＮＡ、および／またはＳＥＣ  ＨＰＬＣによる約９５％超の単一ピーク純度のうちの１つ以上を有する。
【００８４】
場合によっては、剤形は、例えば、安定性を最適化し等張性を得るために、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、アジュバント、または担体を用いて製剤される。特定の態様において、剤形のｐＨは、生理学的ｐＨまたは約ｐＨ７．４であり、約ｐＨ６．５、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．５、またはそれらの任意の範囲が含まれる。いくつかの実施形態では、剤形は、生理学的に許容される担体と組み合わせたＫＬＫ１ポリペプチドを含む。このような担体には、使用される用量および濃度でそれらに曝露される細胞または哺乳動物に無毒である、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤が挙げられる。製剤化の方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎに開示されている。Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，Ｅｄｉｔｉｏｎ２１（２００５）。
【００８５】
「生理学的に許容される」または「薬学的に許容される」という語句は、ヒトに投与されたときに有意なアレルギー反応または同様の都合の悪い反応を生じない分子実体および組成物を指す。典型的には、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして、注射剤として調製される。注射前の液体の溶液または懸濁液に適した固体形態も調製できる。調製物を乳化することもできる。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、等張剤、および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。従来の任意の媒体および薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物中でのその使用を企図している。
【００８７】
本明細書に記載の剤形は、様々な技術により投与されるために製剤化することができ、例えば、皮下および静脈内投与を含む。特定の実施形態は、皮下注射による投与を含む。場合によっては、皮下注射（ＳＣ、ＳＱ、ｓｕｂ−ｃｕ、ｓｕｂ−Ｑ、またはＳＱを含むサブカット（ｓｕｂｃｕｔ）と略される）を、真皮と総称される、真皮および表皮の直下の皮膚層である皮下組織にボーラスとして投与される。人がＳＣを最も簡単に注射できる体の例示的な場所には、特定の側面である臍の周りの領域（約２インチの円）を除く腰のすぐ上と下の上腕の外側領域、腰骨のすぐ後ろの臀部の上部、および大腿部の上部から約４インチ下から膝の約４インチ上までの、外側に向かう途中の大腿部の前面、が含まれるが、これらに限定されない。これらの領域は、人のサイズによって異なる。また、注射部位を変えることで、脂肪萎縮症と呼ばれるしこりまたは小さなへこみが皮膚に形成されるのを防ぐ。
【００８８】
皮下注射は通常、皮膚の下の脂肪組織に行われ、特定の場合によっては、より小さく短い針を使用できる。特定の例では、約２５〜約３１のゲージを備えた、長さが約１／２インチ〜約５／８インチである針は、薬剤を皮下投与するのに十分である。当業者には理解されるように、これらは一般的な推奨事項であり、ＳＣ注射は他のサイズの針で投与することができる。いくつかの実施形態では、筋肉への注射を防ぐために組織をつまむこと、および／または皮膚に対して約４５度の角度で針を挿入することによって、ＳＣ投与が行われる。
【００８９】
また、本明細書に記載の有効量の剤形を対象に投与することを含む、それを必要とする対象を治療する方法も含まれる。例えば、特定の実施形態は、特に、虚血性病態、血管性認知症、出血性病態、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、糖尿病、または腎臓病を治療する方法を含む。
【００９０】
したがって、いくつかの実施形態において、対象は虚血性病態を有する。非限定的な例には、脳虚血（虚血性脳卒中）、一過性虚血発作（ＴＩＡ）、心虚血（心筋虚血）、虚血性大腸炎、四肢虚血、および皮膚虚血が含まれる。いくつかの実施形態において、対象は血管性認知症を有する。いくつかの実施形態において、対象は、出血性病態、例えば、脳内（脳の内部）出血性脳卒中およびくも膜下出血性脳卒中を含む出血性脳卒中を有する。いくつかの実施形態において、対象は、糖尿病、例えば、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を有する。特定の実施形態において、対象は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を有する。いくつかの実施形態において、対象は、腎臓病、例えば、慢性腎臓病、糖尿病性腎臓病、または多発性嚢胞腎症を有する。いくつかの実施形態において、対象は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、またはループス腎炎などの関連病態もしくは合併症を有する。特定の実施形態において、対象は、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、巣状分節性糸球体硬化症、または本態性高血圧症を有する。これらのおよび関連する医学的病態は、当技術分野の通例の技術に従って診断することができる。
【００９１】
特定の場合によっては、剤形の投与は、対象において１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドの治療上有効な血清レベルを達成する。場合によっては、剤形の投与は、投与後約もしくは少なくとも約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０時間で、１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドの治療上有効な血清レベルを達成する。場合によっては、剤形は静脈内または皮下投与される。場合によっては、治療上有効な血清レベルは、約もしくは少なくとも約１．０〜約もしくは少なくとも約５．０ｎｇ／ｍｌ、または約もしくは少なくとも約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０ｍｇ／ｍｌ（その間のすべての範囲を含む）である。
【００９２】
場合によっては、剤形の投与は、対象において１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドの治療上有効な血清レベルを達成し維持する。例えば、いくつかの実施形態において、剤形の投与は、１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドの治療上有効な血清レベルを、約もしくは少なくとも約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０時間で達成し、対象において、投与後、約もしくは少なくとも約０．５、１、２、４、６、８、１０、１２、２４、２３、４８、６０、７２、８４、９６時間以上、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日以上の間、１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドの治療上有効な血清レベルを維持する。場合によっては、治療上有効な血清レベルは、約もしくは少なくとも約１．０〜約もしくは少なくとも約５．０ｎｇ／ｍｌ、または約もしくは少なくとも約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０ｍｇ／ｍｌ（その間のすべての範囲を含む）である。
【００９３】
場合によっては、剤形の投与は、より高用量ＫＬＫ１ポリペプチド剤形と比較して改善された薬物動態プロファイルまたは生物学的（例えば治療的）効果を達成またはもたらす。例えば、場合によっては、剤形の皮下投与は、少なくとも約１５μｇ／ｋｇ、または少なくとも約２０μｇ／ｋｇ、または少なくとも約５０μｇ／ｋｇ、または少なくとも約１００μｇ／ｋｇ、または少なくとも約４００μｇ／ｋｇ以上のＫＬＫ１ポリペプチド総投与量を有する剤形と比較して改善された薬物動態プロファイルまたは生物学的（例えば、治療的）効果を達成する。場合によっては、改善された薬物動態プロファイルは、皮下投与（例えば、単回皮下投与）後、例えば、約または少なくとも約２、４、６、８、１０、１２、２４、２３、４８、６０、７２、８４、９６時間以上、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日以上で測定される単回皮下投与後または静脈内投与後の血清半減期の増加を含む。
【００９４】
特定の実施形態は、１つ以上のＫＬＫ１剤形をある期間にわたって規定された間隔で投与する投与計画を含む。例えば、特定の投与計画には、ＫＬＫ１剤形を１日１回または２回、２日毎に１回または２回（例えば、１日おきに１回）、３日毎に１回または２回（例えば、初回または初期投与後に３日毎に１回）、４日毎に１回または２回、５日毎に１回または２回、６日毎に１回または２回、１週間毎に１回または２回、隔週に１回または２回投与することを含む。特定の投与計画は、３日毎に１日１回ＫＬＫ１剤形を投与することを含み（例えば、初回または初期投与後３日毎に１日１回）、剤形は皮下投与されることを含む。
【００９５】
特定の実施形態は、少なくとも１つの静脈内剤形を対象に静脈内投与し、続いて１つ以上の皮下剤形を対象に、例えば、１日に約１回または２回、２日毎に１回または２回、３日毎に１回または２回、４日毎に１回または２回、５日毎に１回または２回、６日毎に１回または２回、１週間毎に１回または２回の投与計画として皮下投与することを含む。特定の実施形態において、静脈内投与または剤形は、対象において１つ以上のＫＬＫ１ポリペプチドの治療上有効な血清レベルを、静脈内投与後、約０．５、１、２、３、もしくは４時間で、または約０．５、１、２、３、もしくは４時間未満で達成し、皮下投与または剤形は、皮下投与後に約もしくは少なくとも約２、４、６、８、１０、１２、２４、２３、４８、６０、７２、８４、９６時間以上、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、もしくは１４日以上の間、治療上有効な血清レベルを維持する。
【００９６】
投与量のいくらかの変動は、治療される対象の病態に応じて必然的に発生する。いずれにしても、投与の責任者が個々の対象に適切な用量を決定する。さらに、ヒトへの投与の場合、調製物は無菌性、発熱性、およびＦＤＡによって必要とされる一般的な安全性および純度の基準を満たすべきである。場合によっては、本明細書に記載されるように、調製物は実質的にエンドトキシン不含または発熱物質不含である。業界向けＦＤＡガイダンスによると、成人の健常ボランティアの治療薬の初期臨床試験における最大安全開始用量の推定（２００５年７月）、付録Ｄ：動物用量をヒト等価用量に変換する。ヒト等価用量はラット用量の１／７であり、ヒト等価用量はマウス用量の１／１２である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の剤形は、１つ以上の追加の治療薬または治療手法とともに投与される。いくつかの態様では、剤形の投与は、他の治療手法単独の投与と比較した場合、他の治療手法の低用量の有効性を可能にし、他の手法の高用量の投与で観察される毒性を軽減する。本明細書に記載の剤形の投与の前、後、および／または同時（例えば、一緒に）に１つ以上の追加の治療薬を投与することができる。剤形および追加の治療薬は、別々に、または同じ混合物もしくはカクテルの一部として投与することができる。本明細書で使用される場合、追加の治療薬には、例えば、病態（例えば、虚血性または出血性病態）の治療のための使用が当業者に知られている薬剤が含まれる。追加の薬剤の例としては、アンジオテンシン受容体遮断薬、エダバロン、ファインレノン、およびバルドキサロン（それらの組み合わせを含む）が挙げられる。アンジオテンシン受容体遮断薬の特定の実施例としては、ロサルタン、アジルサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、フィマサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、サプリサルタン、テルミサルタン、およびバルサルタン（それらの組み合わせを含む）が挙げられる。
【００９８】
デバイス。また、皮下または静脈内送達に適したデバイスを含む、本明細書に記載の剤形を含むデバイスも含まれる。いくつかの実施形態において、デバイスは注射器である。いくつかの実施形態では、注射器は皮下注射針アセンブリに取り付けられ、任意選択的に注射針アセンブリの周りに保護カバーを備える。いくつかの実施形態では、針は、長さが約１／２インチ〜約５／８インチであってよく、約２５〜約３１のゲージを有する。したがって、特定の実施形態は、本明細書に記載の剤形を含む、皮下投与に適した針アセンブリに取り付けられたまたは取り付け可能なデバイスを含む。例えば、特定のデバイスは、任意選択的にバイアルまたは注射器が皮下注射針アセンブリに取り付け可能または取り付けられている場合、バイアルまたは注射器を含む。また、ゴム製キャップを有するバイアルも含まれ、皮下投与の剤形を取り出すために針／シリンジをゴム製キャップを介してバイアルに挿入することができる。
【００９９】
特定の態様において、デバイスは皮下注射針に取り付け可能または取り付けられた注射器であり、針または針アセンブリの周りに１つ以上の取り外し可能かつ／または永久的な保護カバーとともに包装されている。例えば、（投与中に取り外される）第１の取り外し可能な保護カバーは、投与前に使用者または他の人を針から保護することができ、第２の保護カバーは、投与後、デバイスを安全に廃棄するために定位置に入れること（すなわちスナップ留め）ができる。
【０１００】
本発明を以下の実施例によって説明する。特定の例、物質、量、および手順は、本明細書に記載のとおり本発明の範囲および主旨に従って広く解釈されることを理解されたい。
【実施例】
【０１０１】
実施例１
ヒトにおける低用量ＫＬＫ１製剤の薬物動態
低用量ＫＬＫ１製剤の薬物動態をヒトで評価した。製剤は、米国特許出願第１４／６７７，１２２号（参照により組み込まれる）に記載のとおり調製された、成熟ヒトＫＬＫ１の二重および三重グリコシル化アイソフォームの混合物で構成される。
【０１０２】
単回用量比較試験は、３０分間のＩＶ注入と単回皮下注射後のＫＬＫ１製剤の安全性、忍容性、薬物動態を確立するように設計した。ＩＶ投与量は０．７５μｇ／ｋｇであり、皮下投与量は３μｇ／ｋｇであった。試験群は、それぞれ６人の女性と６人の男性の１２人のボランティアで構成された。
【０１０３】
静脈内投与量は、リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ＝７．２）に溶解した１０４．４ｍｇ／ｍｌ製剤として臨床部位に供給した。投与に必要なＫＬＫ１ポリペプチドの量を、各試験ボランティアの体重および用量レベルに基づいて計算した。皮下投与量は、リン酸緩衝生理食塩水中の２６．１ｍｇ／ｍｌ溶液として提供した。投与前に、この投与量を生理食塩水で２．６１ｍｇ／ｍｌに希釈し、試験参加者の体重に応じて注入量を調整した。
【０１０４】
血漿中のＫＬＫ１濃度は、ＫＬＫ１特異的抗体を用いたＥＬＩＳＡによって測定した。この方法は、ヒトの臨床試験で使用するために開発され検証されている。
【０１０５】
図２Ａ〜２Ｂに示すように、健康なヒト対象において、成熟ヒトＫＬＫ１グリコフォームの低用量製剤（３μｇ／ｋｇ、ｎ＝１２）の皮下投与がＫＬＫ１の有効な血漿レベルを達成するだけでなく、低用量製剤（０．７５μｇ／ｋｇ、ｎ＝１２）の静脈内投与と比較しても、有意な血清半減期の延長をもたらすことを示す。成熟ヒトＫＬＫ１グリコフォームの低用量製剤の静脈内投与により、ＫＬＫ１の有効な血漿レベルが急速に達成された。図２Ａは、投与後８０時間の血清レベルを示し、図２Ｂは投与後４時間の血清レベルを示す。
【０１０６】
健常ボランティアにおける２つのＫＬＫ１皮下投与の戦略（３μｇ／ｋｇ、および１５／２５μｇ／ｋｇ）の薬物動態（ＰＫ）プロファイルも、第Ｉ相臨床試験で評価した。結果を図３に示す。ポイントは、１群当たり６人の参加者から得た平均値を表す。矢印は投与の時間を表す。最新の特許からの目標用量とみなされる３μｇ／ｋｇ用量は、約３〜５ｎｇ／ｍｌの望ましいまたは治療上有効な血清／血漿濃度でかなり安定した薬物レベルを維持した。対照的に、高投与量は、投与量間の変動が大きくなり、比例してより高いレベルを引き起こした。
【０１０７】
ＫＬＫ１の投与量試験を２型糖尿病患者で実施した。結果を図４Ａ〜４Ｄに示す。ポイントは、投与３時間後のインスリン抵抗性のＨＯＭＡ２−ＩＲ測定を使用して、投与の２時間後に行われた食事耐性試験の結果である。数値はインスリン抵抗性の派生尺度であり、数値が大きいほどインスリン抵抗性が高く、病気の可能性が高くなる。図４Ｄはプラセボ群の結果を示し、図４Ｃは薬物群（ＤＭ１９９）の結果を示す。１日目の試験をベースラインとして実行した後、翌日から指定された用量レベルの単回投与を行った。インスリン抵抗性は、高用量を試験した８日目の結果と比較して低用量を試験した５日目に改善し（図４Ｃ）、低用量がより効果的であることを示唆した。
【０１０８】
２型糖尿病患者（１群当たりｎ＝１２〜１３人）の２８日間の複数回投与試験も実施した。結果を図５Ａ〜５Ｂに示す。バーは、血清クレアチニンおよび尿素濃度のベースラインからの平均±ＳＥＭ変化を表す。これらは腎機能の典型的な尺度であり、正常値を超えると腎機能障害を示す。この結果は、低用量（３μｇ／ｋｇ）が腎機能の測定の改善に対して高用量よりも有意に高い効果をもたらしたことを示す。Ｐ値は、３μｇ／ｋｇ群とプラセボとの間の比較に基づく。
【０１０９】
上述の発明は、理解を明確にする目的で、例示および実施例によりある程度詳細に説明されたが、本発明の教示に鑑み、添付の特許請求の範囲の主旨または範囲から逸脱することなく、それらに対して特定の変更および修正が可能であることは当業者には容易に明らかであろう。
【０１１０】
すべての特許、特許出願、および刊行物の完全な開示、および本明細書で引用される電子的に入手可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑでのヌクレオチド配列の提出、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢでのアミノ酸配列の提出、およびＧｅｎＢａｎｋおよびＲｅｆＳｅｑの注釈付きコード領域からの翻訳を含む）は参照により組み込まれる。上述の詳細な説明および実施例は、理解を明確にするためだけに提供される。それから不必要な制限が理解されるべきではない。本発明は、示され説明された正確な詳細に限定されるものではなく、当業者に明らかな変更は、特許請求の範囲によって定義される本発明内に含まれる。
【図１】
2020510023.tif 000004
【図２Ａ】
2020510023.tif 000005
【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2020510023.tif 000011
【図５Ａ】
2020510023.tif 000012
【図５Ｂ】
2020510023.tif 000013
【配列表】
2020510023000001.app
【国際調査報告】
2020510023.tif 000014
2020510023.tif 000015