(57)【要約】  本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドである新規のプロテイントランスダクションドメイン及びその用途を提供する。  本発明の配列番号１に記載されたペプチドをＰＴＤとして使用する場合、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡなどの生物学的分子（目的物質）を細胞内に容易に高収率で導入させることができる。
2020510645.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチド。
【請求項２】
前記配列番号１のアミノ酸配列は、配列番号２に記載された核酸配列で暗号化されたものである請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドは、プロテイントランスダクションドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ；ＰＴＤ）である請求項１に記載のペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドは、遺伝子伝達体である請求項１に記載のペプチド。
【請求項５】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合可能な物質が、配列番号１に記載されたアミノ酸配列に化学結合して形成された結合体。
【請求項６】
前記化学結合は、共有結合又は非共有結合である請求項５に記載の結合体。
【請求項７】
前記共有結合可能な物質は、ペプチド又はタンパク質である請求項６に記載の結合体。
【請求項８】
前記非共有結合は、イオン結合又は静電気的引力による結合又は疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）による結合である請求項６に記載の結合体。
【請求項９】
前記イオン結合又は静電気的引力によって結合可能な物質は、電荷を帯びている物質である請求項８に記載の結合体。
【請求項１０】
前記電荷を帯びている物質は、ＤＮＡ又はＲＮＡである請求項９に記載の結合体。
【請求項１１】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力によって結合可能な物質が、配列番号１に記載されたアミノ酸配列と混合されている複合体。
【請求項１２】
前記静電気的引力によって結合可能な物質は、電荷を帯びている物質である請求項１１に記載の複合体。
【請求項１３】
前記電荷を帯びている物質は、ＤＮＡ又はＲＮＡである請求項１２に記載の複合体。
【請求項１４】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合可能な物質が、配列番号１に記載されたアミノ酸配列に結合して形成された結合体又は配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力によって結合可能な物質が、配列番号１に記載されたアミノ酸配列と混合されている複合体を含む化粧料組成物。
【請求項１５】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合可能な物質が、配列番号１に記載されたアミノ酸配列に結合して形成された結合体又は配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力によって結合可能な物質が、配列番号１に記載されたアミノ酸配列と混合されている複合体を含む薬学組成物。
【請求項１６】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドを、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合可能な物質に結合させ、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合可能な物質を細胞内に導入させる、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合可能な物質を用いた哺乳動物の細胞内導入方法。
【請求項１７】
配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドを、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力によって結合可能な物質と混合させ、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力によって結合可能な物質を細胞内に導入させる、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力によって結合可能な物質を用いた哺乳動物の細胞内導入方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のプロテイントランスダクションドメイン及びその用途に関し、より詳細には、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドである、新規のプロテイントランスダクションドメイン（ＰＴＤ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）は、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡなどの伝達に有用なペプチドであり、５〜３０個のアミノ酸配列からなっている。ＰＴＤは、透過させようとする生物学的分子（目的物質）との融合が簡便であり、生物学的分子の構造又は機能に影響を与えず、安定的である点から、最近、化粧品、医薬品などにおいて脚光を浴びている。
ＰＴＤ系列のうち、ＨＩＶから由来したＴＡＴタンパク質の４８〜６０番アミノ酸配列は、細胞透過配列を持っていることが初めて知られ、様々な生物学的物質を細胞内に伝達することが可能になった。その後、細胞内透過過程の機転が明らかになり、陰電荷を帯びる細胞膜に付きやすい陽イオン系列の配列が多く製造され始めた。
現在まで知られたＰＴＤは３つに大別でき、（ｉ）両親媒性ペプチド（ｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎ、ＰＥＰ１、ＭＰＧ、ｐＶＥＣ、ＭＡＰ、ＣＡＤＹ）、（ｉｉ）陽イオンペプチド（ｐｏｌｙａｒｇｉｎｉｎｅ、ＴＡＴ、ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ、Ｐ２２Ｎ）、及び（ｉｉｉ）疎水性ペプチド（Ｋ−ＦＧＦ、Ｃ１０５Ｙ）である。両親媒性と陽イオンペプチドは比較的多く知られているが、疎水性ペプチドは、配列の人為的合成によって作られたものでないことから、現在まで知られたペプチドの数が非常に制限的である。
ＰＴＤは、生物学的分子が通過できない細胞透過ができるが、これは、細胞膜のグリコサミノグリカン（ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ；ＧＡＧ）を通って細胞内に入り込むことができ、その他、エンドサイトーシス経路を通じて取り込まれるかもしれない。
ＰＴＤと生物学的物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、核酸、小分子、タンパク質、細胞毒性薬物、イメージング剤など）との結合は、共有結合、イオン結合、静電気的引力などを含む様々な手段によって行うことができる。
既存の伝達体（例えば、リポソーム、ポリマーなど）と比較して、ＰＴＤの重要な長所は、治療目的や診断用に細胞内に生物学的分子を伝達しようとする際、毒性が低く、治療に対する免疫拒否反応が少ないことである。これによって、高濃度の処理方法による問題点を段階的な処理技法で改善することもできる。
それにもかかわらず、現在臨床で使用されるＰＴＤはごく稀であり、ウイルスから由来したＰＴＤの場合、免疫反応に影響を及ぼすなどの問題点があり、ウイルスから由来しない一方で伝達効率が高い伝達体の発掘が、当業界において至急要望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明では、目的物質の伝達効率が高い一方で、様々な副作用の発生が顕著に低減した新しいＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ）を開発し、提供しようとする。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。前記配列番号１のアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号２に記載された核酸配列で暗号化されているものとすることができる。また、前記ペプチドは、一例として、プロテイントランスダクションドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ；ＰＴＤ）とすることができる。また、前記ペプチドは、一例として、遺伝子伝達体とすることができる。
本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合し得る物質が、配列番号１に記載されたアミノ酸配列に化学結合して形成された結合体を提供する。前記化学結合は、好ましくは、共有結合又は非共有結合とすることができる。前記共有結合し得る物質は、一例として、ペプチド又はタンパク質でよい。また、前記非共有結合は、一例として、イオン結合又は静電気的引力による結合又は疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）による結合とすることができる。前記イオン結合又は静電気的引力で結合し得る物質は、一例として、電荷を帯びている物質でよく、該電荷を帯びている物質は、一例として、ＤＮＡ又はＲＮＡでよい。
本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し得る物質が、配列番号１に記載されたアミノ酸配列と混合されている複合体を提供する。前記静電気的引力で結合し得る物質は、一例として、電荷を帯びている物質でよく、該電荷を帯びている物質は、一例として、ＤＮＡ又はＲＮＡでよい。
本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合し得る物質が配列番号１に記載されたアミノ酸配列に結合して形成された結合体又は配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し得る物質が配列番号１に記載されたアミノ酸配列と混合されている複合体を含む化粧料組成物を提供する。
本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合し得る物質が配列番号１に記載されたアミノ酸配列に結合して形成された結合体又は配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し得る物質が配列番号１に記載されたアミノ酸配列と混合されている複合体を含む薬学組成物を提供する。
本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドを、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合し得る物質に結合させ、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合し得る物質を細胞内に導入させることを特徴とする、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合し得る物質を用いた哺乳動物の細胞内導入方法を提供する。
本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドを、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し得る物質と混合させ、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し得る物質を細胞内に導入させることを特徴とする、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し得る物質を用いた哺乳動物の細胞内導入方法を提供する。
【発明の効果】
【０００５】
本発明の配列番号１に記載されたペプチドをＰＴＤとして用いる場合、タンパク質、ペプチド、ＤＮＡなどの生物学的分子（目的物質）を細胞内に容易に且つ高収率で導入させることができるという長所がある。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】一般的なＧＦＰ発現ベクターのマップである。
【図２】ＴＡＴ−ＧＦＰ発現ベクターのマップである。
【図３】ＰＥＰ１−ＧＦＰ発現ベクターのマップである。
【図４】ＳＴｅＰ−ＧＦＰ発現ベクターのマップである。
【図５】ＧＦＰ組換えタンパク質の発現結果である。
【図６】ＧＦＰ組換えタンパク質の精製結果である。
【図７】ＧＦＰタンパク質の細胞透過力の比較結果である。
【図８】ＧＦＰタンパク質の皮膚透過力の比較結果である。
【図９】ＰＥＰ１−ＥＧＦ発現ベクターのマップである。
【図１０】ＳＴｅＰ−ＥＧＦ発現ベクターのマップである。
【図１１】ＥＧＦ組換えタンパク質（ＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦ）の発現結果である。
【図１２】ＥＧＦ組換えタンパク質（ＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦ）の精製結果である。
【図１３】ＥＧＦ組換えタンパク質の細胞増殖効能結果（ＥＧＦ、ＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦ）である。
【図１４】ＥＧＦタンパク質の皮膚透過力の比較結果である。
【図１５】細胞透過性ペプチドの細胞毒性の確認結果である。
【図１６】細胞透過性ペプチド−ＦＩＴＣ混合物の‘細胞’透過力の比較結果である。
【図１７】細胞透過性ペプチド−ＦＩＴＣ混合物の‘皮膚’透過力の比較結果である。
【図１８】細胞透過性ペプチドとＦＩＴＣ−ＤＤＢＤ混合物の‘細胞’透過力の比較結果である。
【図１９】細胞透過性ペプチドとＦＧＦ２混合物の‘皮膚’透過力の比較結果である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
本明細書全体を通じて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体として本明細書に参照として組み込まれ、本発明の属する技術分野におけるレベル及び本発明の内容をより明確に説明する。
本発明者らは、目的物質を細胞内に伝達し得るより効率的なペプチド及びこれを用いた薬物伝達体（ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）を開発するために努力した結果、配列番号１に記載された細胞透過ペプチドを開発した。
配列番号１に記載されたペプチドは両親媒性の特性を帯び、目的物質の細胞内伝達に効率的に適用できることを確認し、本発明を完成するに至った。
このような結果から、本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドを提供する。前記配列番号１のアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号２に記載された核酸配列で暗号化されるものである。また、必要によって、本アミノ酸配列のＮ−末端又はＣ−末端に、必要な具現化のためのペプチドを結合させてもよい。
【０００８】
本発明の配列番号１に記載されたペプチドは、プロテイントランスダクションドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ；ＰＴＤ）又は遺伝子伝達体として使用することができる。
本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合し得る物質が、配列番号１に記載されたアミノ酸配列に化学結合して形成された結合体を提供する。
‘化学結合’とは、一切の化学的結合を全て含む概念であり、一例として、共有結合又は非共有結合が挙げられる。共有結合は、一例として、本発明の配列番号１に記載されたアミノ酸配列のＮ−末端又はＣ−末端へのペプチド結合によって目的物質（細胞又は皮膚内への導入対象物質）になり得ることを意味する。目的物質は、細胞内で特定目的、例えば皮膚美容的効能を発揮するペプチド又はタンパク質でよく、医薬的効能を発揮するペプチド又はタンパク質であってもよい。ペプチドの例には、ジ酢酸ジペプチドジアミノブチロイルベンジルアミド（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｏｙｌ  Ｂｅｎｚｙｌａｍｉｄｅ  Ｄｉａｃｅｔａｔｅ）（商品名：ＳＹＮ−ＡＫＥ）、アセチルヘキサペプチド−８（商品名：Ａｒｇｉｒｅｌｉｎｅ）などを挙げることができる。タンパク質の例には、ＥＧＦ（Ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ１（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−１）、ＦＧＦ２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２）、ＳＯＤ１（Ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ  ｄｉｓｍｕｔａｓｅ−１）、ＣＡＴ（Ｃａｔａｌａｓｅ）、ＦＫ５０６ｂｐ（ＦＫ５０６−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、ＢｏｎＴ／Ａ軽鎖（Ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｔｙｐｅ  Ａ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ）などを挙げることができる。
【０００９】
本発明の結合体において、前記非共有結合は、一例として、イオン結合又は静電気的引力による結合又は疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）でよい。イオン結合又は静電気的引力又は疎水性相互作用によって、複数の生物学的物質（例えば、ｓｉＲＮＡ、核酸、小分子、タンパク質、細胞毒性薬物、イメージング剤など）が本発明の配列番号１に記載されたペプチドに結合し、細胞又は皮膚内へ導入され得る。前記イオン結合又は静電気的引力で結合し得る物質は、一例として、電荷を帯びている物質でよいが、一例としてＤＮＡ又はＲＮＡでよい。
【００１０】
本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し得る物質と配列番号１に記載されたアミノ酸配列とが混合されている複合体を提供する。本発明によれば、人為的な化学結合を誘導せず、混合させるだけでも、本発明の配列番号１に記載されたペプチドと疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し得る目的物質が本発明の配列番号１に記載されたペプチドと疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し、細胞内又は皮膚内に導入され得ることが確認された。前記静電気的引力で結合し得る物質は、一例として、電荷を帯びている物質でよく、前記電荷を帯びている物質は、一例として、ＤＮＡ又はＲＮＡでよい。
本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合し得る物質が配列番号１に記載されたアミノ酸配列に結合して形成された結合体又は配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し得る物質と配列番号１に記載されたアミノ酸配列とが混合されている複合体を含む化粧料組成物を提供する。下記の本発明の実験から、本発明の結合体又は複合体で製造される場合、皮膚侵入効果に優れることが確認された。
【００１１】
本発明の化粧料組成物は特定の形態（剤形）に限定されず、いずれの剤形を含んでもよいが、一例として、化粧水、ジェル、水溶性リキッド、クリーム、エッセンス、水中油（Ｏ／Ｗ）型及び油中水（Ｗ／Ｏ）型のエマルジョン、軟膏からなる基礎化粧料剤形、水中油型及び油中水型メーキャップベース、ファウンデーション、スキンカバー、リップスティック、リップグロス、ペースパウダー、ツーウェイケーキ、アイシャドー、シックカラー及びアイブローペンシル類からなる色調化粧料剤形の中から選ばれるいずれか一つでよい。
また、本発明の化粧料組成物は、化粧分野における通常の補助剤、例えば、親水性又は親油性ゲル化剤、親水性又は親油性活性剤、保存剤、抗酸化剤、溶媒、芳香剤、充填剤、遮断剤、顔料、吸臭剤及び染料を含有することができる。
本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合し得る物質が配列番号１に記載されたアミノ酸配列に結合して形成された結合体又は配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し得る物質と配列番号１に記載されたアミノ酸配列とが混合されている複合体を含む薬学組成物を提供する。
【００１２】
本発明の薬学組成物は、特定の剤形に限定されず、いずれの剤形をも含み、具体的な剤形の例には、硬膏剤（ＰＬＡＳＴＥＲＳ）、顆粒剤（ＧＲＡＮＵＬＥＳ）、ローション剤（ＬＯＴＩＯＮＳ）、リニメント剤（ＬＩＮＩＭＥＮＴＳ）、リモナーデ剤（ＬＥＭＯＮＡＤＥＳ）、芳香水剤（ＡＲＯＭＡＴＩＣ  ＷＡＴＥＲＳ）、散剤（ＰＯＷＤＥＲＳ）、シロップ剤（ＳＹＲＵＰＳ）、眼軟膏剤（ＯＰＨＴＨＡＬＭＩＣ  ＯＩＮＴＭＥＮＴＳ）、液剤（ＬＩＱＵＩＤＳ  ＡＮＤ  ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ）、エアロゾル剤（ＡＥＲＯＳＯＬＳ）、エキス剤（ＥＸＴＲＡＣＴＳ）、エリキシル剤（ＥＬＩＸＩＲＳ）、軟膏剤（ＯＩＮＴＭＥＮＴＳ）、流動エキス剤（ＦＬＵＩＤＥＸＴＲＡＣＴＳ）、乳剤（ＥＭＵＬＳＩＯＮＳ）、懸濁剤（ＳＵＳＰＥＮＳＩＯＮＳ）、煎剤（ＤＥＣＯＣＴＩＯＮＳ）、浸剤（ＩＮＦＵＳＩＯＮＳ）、点眼剤（ＯＰＨＴＨＡＬＭＩＣ  ＳＯＬＵＴＩＯＮＳ）、錠剤（ＴＡＢＬＥＴＳ）、坐剤（ＳＵＰＰＯＳＩＴＯＲＩＥＳ）、注射剤（ＩＮＪＥＣＴＩＯＮＳ）、酒精剤（ＳＰＩＲＩＴＳ）、カタプラズマ剤（ＣＡＴＡＰＬＡＳＭＡ）、カプセル剤（ＣＡＰＳＵＬＥＳ）、クリーム剤（ＣＲＥＡＭＳ）、トローチ剤（ＴＲＯＣＨＥＳ）、チンキ剤（ＴＩＮＣＴＵＲＥＳ）、ペースト剤（ＰＡＳＴＥＳ）、丸剤（ＰＩＬＬＳ）、軟質又は硬質ゼラチンカプセルの中から選ばれるいずれか一つでよい。
【００１３】
また、本発明の薬学組成物は、好ましくは、薬剤学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤をさらに含むことができる。使用可能な担体、賦形剤又は希釈剤には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、澱粉、アカシアガム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油があり、これらの中から選ばれる一つ以上を使用することができる。
本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドを、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合し得る物質に結合させ、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合し得る物質を細胞内に導入させることを特徴とする、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドと化学結合し得る物質を用いた哺乳動物の細胞内導入方法を提供する。
【００１４】
また、本発明は、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドを、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し得る物質と混合させ、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し得る物質を細胞内に導入させることを特徴とする、配列番号１に記載されたアミノ酸配列を有するペプチドに疎水性相互作用又は静電気的引力で結合し得る物質を用いた哺乳動物の細胞内導入方法を提供する。
【００１５】
本発明の方法により、細胞内に導入させようとする目的物質を容易に高収率で細胞内に導入させることができる。このとき、本発明の配列番号１にアミノ酸配列を有するペプチドを使用する以外は、目的物質の細胞内導入のために必要な技術は、当業界の公知技術を利用することができる。
以上のように、本発明は、配列番号１に記載された２７個のアミノ酸配列で構成されたペプチドを用いて、細胞透過が可能であり、タンパク質及び遺伝子を伝達できることを提示する。また、伝達物質の位置によってその効率が変わるので、本発明は、ＰＴＤを用いた物質伝達に効果的な方法を提示する基礎的な資料にもなり得るだろう。また、本発明の配列番号１に記載されたペプチドは、単純な混合でも物質を伝達できる長所があり、伝達体として有用であろう。
以上、本発明の内容の特定部分を詳細に記述したところ、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的技術は単なる一具現例であり、それらによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付する請求項とその同等物によって定義されるといえよう。
【００１６】
［実施例１．細胞及び皮膚透過性ＧＦＰタンパク質発現ベクターの作製］
巨大分子タンパク質又はペプチドを細胞及び皮膚内に伝達しやすくするために、細胞及び皮膚透過能を有するペプチドと伝達しようとするタンパク質（ｃａｒｇｏ）とを融合して組換えタンパク質発現ベクターを製造した。
本実施例では、このような融合タンパク質がどれくらい細胞及び皮膚に伝達され得るのかの伝達能力を容易に分析するために、伝達しようとする目的タンパク質（ｃａｒｇｏ）として、緑色蛍光タンパク質（Ｇｒｅｅｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ：以下、“ＧＦＰ”と略称する。）を選択した。
既存によく知られたＰＴＤであるＴＡＴ又はＰＥＰ１をＧＦＰに融合し、本発明で新規に開発されたＳＴｅＰ（配列番号１）と細胞及び皮膚内伝達能力を比較した。
【００１７】
（１）ｐＧＦＰベクターの作製
ＧＦＰの塩基配列に該当するＤＮＡ切片をプラスミドｐＥＴ１５ｂのＸｈｏＩ、ＢａｍＨＩ座にサブクローンし、ＧＦＰタンパク質を発現させるｐＧＦＰを製造した。ｐＧＦＰ発現ベクターには細胞及び皮膚透過能を有するペプチドが融合されておらず、ＧＦＰは約２９ｋＤａの親水性高分子タンパク質であるから、このベクターで発現したＧＦＰは細胞及び皮膚に伝達し得る能力がないといえる。したがって、細胞及び皮膚透過性比較のための対照群として作製した。
ＧＦＰの塩基配列に該当するＤＮＡ切片をプラスミドｐＥＧＦＰ−Ｃ２（クローンテック）を用いてＰｆｕ  ＤＮＡ重合酵素で重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）させ、ＧＦＰの完全な配列を増幅した。正方向開始体（ｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）は、５’−ＣＴＣＧＡＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＧＣＴＧ−３’であり、逆方向開始体（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）の配列は、５’−ＧＧＡＴＣＣＴＴＡＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣ  ＡＴＧＣＣＧＡＧ−３’である。ＰＣＲ産物はＸｈｏ  Ｉ−Ｂａｍ  ＨＩで切られ、ｐＥＴ１５ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ座にサブクローンされ、一般的なＧＦＰタンパク質を発現させるｐＧＦＰを製造した。図１は、一般的なＧＦＰ発現ベクターのマップである。
【００１８】
（２）ｐＴＡＴ−ＧＦＰベクターの作製
ＨＩＶ−１  ＴＡＴと融合されたＧＦＰを発現させるｐＴＡＴ−ＧＦＰは、次の方法で作製した。まず、２本のオリゴヌクレオチドが製造され、ＨＩＶ−１  ＴＡＴの９個のアミノ酸をコードする二本鎖オリゴヌクレオチドとして合成された。ＨＩＶ−１  ＴＡＴの９個アミノ酸をコードする配列は、上鎖５’−ＴＡＧＧＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＡＧＡＣ−３’と下鎖５’−ＴＣＧＡＧＴＣＴＴＣＧＴＣＧＣＴＧＴＣＴＣＣＧＣＴＴＣＴＴＣＣ−３’である。二本鎖オリゴヌクレオチドは直接にｐＧＦＰのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩにサブクローンされ、ＴＡＴ−ＧＦＰタンパク質を発現させるｐＴＡＴ−ＧＦＰを作製した。図２は、ＴＡＴ−ＧＦＰ発現ベクターのマップである。
【００１９】
（３）ｐＰＥＰ１−ＧＦＰベクターの作製
ＰＥＰ１が融合されたＧＦＰを発現させるｐＰＥＰ１−ＧＦＰは、次の方法で作製した。まず、２本のオリゴヌクレオチドの上鎖５’−ＴＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＧＡＡＴＧＧＡＧＣＣＡＧＣＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧＴＡＡＡＧＴＧＣ−３’と下鎖５’−ＴＣＧＡＧＣＡＣＴＴＴＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＧＡＧＡＣＣＡＴＴＣＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣ−３’が合成され、ＰＥＰ１ペプチドをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを作った。
二本鎖オリゴヌクレオチドは直接にｐＧＦＰのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩにサブクローンされ、ＰＥＰ１−ＧＦＰタンパク質を発現させるｐＰＥＰ１−ＧＦＰを作製した。図３は、ＰＥＰ１−ＧＦＰ発現ベクターのマップである。
【００２０】
（４）ｐＳＴｅＰ−ＧＦＰベクターの作製
本発明のＳＴｅＰが融合されたＧＦＰを発現させるｐＳＴｅＰ−ＧＦＰは、次の方法で作製した。まず、２本のオリゴヌクレオチドの上鎖５’−ＴＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＧＡＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＧＴＡＴＧＧＣＣＧＴＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣ−３’と下鎖５’−ＴＣＧＡＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＡＴＡＣＧＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＴＴＣＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣ−３’が合成され、ＳＴｅＰペプチドをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを作った。二本鎖オリゴヌクレオチドは直接にｐＧＦＰのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩにサブクローンされ、ＳＴｅＰ−ＧＦＰタンパク質を発現させるｐＳＴｅＰ−ＧＦＰを作製した。図４は、ＳＴｅＰ−ＧＦＰ発現ベクターのマップである。
【００２１】
［実施例２．ＧＦＰ組換えタンパク質の発現］
本実施例では、上記の実施例で作製された組換えベクターから該当のタンパク質を発現しようとした。４種類の発現ベクターをそれぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｒｏｓｅｔｔａ−ｇａｍｉ２（ＤＥ３）細胞内に形質転換させた。形質転換されたバクテリア細胞は、アンピシリンが含まれた１，０００ｍｌのＬＢ培地を用いてＯＤ６００値が０．６になるまで３７℃で培養し、２２℃で０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを導入して２４時間追加培養し、ＧＦＰタンパク質の発現を誘導した。
それぞれのＧＦＰタンパク質の発現有無の確認は、ＩＰＴＧの添加による目的タンパク質の誘導発現前と後の培養細胞を収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動をした後、クマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）でタンパク質を染色して観察した。
その結果、図５から確認されるように、ＧＦＰは２９．３５ｋＤａ、ＴＡＴ−ＧＦＰは３０．５４ｋＤａ、ＰＥＰ１−ＧＦＰは３２．１８ｋＤａ、ＳＴｅＰ−ＧＦＰは３２．９５ｋＤａの大きさを有するタンパク質が発現することが確認できた。図５は、ＧＦＰ組換えタンパク質の発現結果である。
【００２２】
［実施例３．ＧＦＰ組換えタンパク質の精製］
本実施例では、上記の実施例でそれぞれ発現したタンパク質に対して細胞破砕工程の実施後、Ｈｉｓタグ親和カラムを用いてＧＦＰタンパク質だけを純粋分離精製しようとした。４種のＧＦＰタンパク質の精製方法は、下記のように同じ方法を用いて精製した。
ｐＥＴ１５−ＧＦＰ、ｐＴＡＴ−ＧＦＰ、ｐＰＥＰ１−ＧＦＰ、ｐＳＴｅＰ−ＧＦＰ形質転換細胞を１Ｘ  Ｎａｔｉｖｅ緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）において超音波機を用いて破壊した後、これを遠心分離して凝集体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）と細胞質（上清液）とに分離した。
４種のＧＦＰタンパク質にはいずれもＨｉｓ６タグがされているので、このような特性を用いて細胞破砕後に援心分離によって分離されたそれぞれの上清液を、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ親和カラム（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）で精製した。
カラムの平衡及びＧＦＰタンパク質の結合は、１Ｘ  Ｎａｔｉｖｅ緩衝液を使用し、洗浄（Ｗａｓｈｉｎｇ）と溶出（Ｅｌｕｔｉｏｎ）は、１Ｘ  Ｎａｔｉｖｅ緩衝液に濃度別イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を製造して使用した。純粋分離精製されたＧＦＰタンパク質は、安定化バッファ（５０ｍｍ  ＮａＰＯ４、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｐＨ７．５）を用いて透析を実施した。ここで得られた最終産物をそれぞれ、ＧＦＰ、Ｔａｔ−ＧＦＰ、ＰＥＰ１−ＧＦＰ、ＳＴｅＰ−ＧＦＰと命名した。図６は、ＧＦＰ組換えタンパク質の精製結果である。
【００２３】
［実施例４．細胞及び皮膚透過性ＧＦＰタンパク質の細胞透過分析］
本実施例では、上記の実施例で精製された４種のＧＦＰタンパク質の細胞透過能力を比較するために、ＨａＣａＴ（ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）細胞においてＧＦＰ緑色蛍光を用いた細胞内透過を観察した。
ＨａＣａＴ（ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ）細胞は、培養用スライドで２４時間培養した。その後、培養培地を除去した後、ＨＢＳＳで３回洗浄後、ＧＦＰ及び細胞透過性ＧＦＰタンパク質（ＰＥＰ１−ＧＦＰ、ＴＡＴ−ＧＦＰ、ＳＴｅＰ−ＧＦＰ）を細胞に処理した。細胞に処理時、それぞれのタンパク質の濃度が１０ｍＭになるようにストック（ｓｔｏｃｋ）を作り、培地に１／１０に希釈して最終１０μＭになるように処理した後、２時間培養した。２時間後、培地を除去し、ＰＢＳを用いて細胞を洗浄した後、冷却メタノールを用いて１０分間−２０℃で細胞を固定した。細胞は、ＰＢＳで十分に洗浄した後、ＰＢＳに１／５０００で希釈された核染色試薬（ＤＡＰＩ）を入れ、光が遮断された状態で１０分間染色させた。ＰＢＳで十分に洗浄し、マウント（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）した後、共焦点スキャニングレーザー顕微鏡を用いて分析した。
その結果、ＳＴｅＰ−ＧＦＰタンパク質処理グループの細胞内緑色蛍光が最も明るく見えることから、ＳＴｅＰが細胞内透過効果を大きく向上させたことがわかる。図７は、ＧＦＰタンパク質の細胞透過力の比較結果である。
【００２４】
［実施例５．細胞及び皮膚透過性ＧＦＰタンパク質の皮膚透過分析］
細胞だけでなく皮膚でもＳＴｅＰによってＧＦＰタンパク質の透過が向上するかどうかを調べるために、フランツセル（Ｆｒａｎｚ  ｃｅｌｌ、直径９ｍｍ）を使用した。
セルの上段と下段との間にブタ皮膚（０．７ｍｍ厚、Ｍｅｄｉｋｉｎｅｔｉｃｓ）を装着し、その上段に５０μＭ  ＧＦＰタンパク質を３００μｌ処理した。２４時間後、ブタ皮膚を取り出し、ＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、クライオモルド（ｃｒｙｏ  ｍｏｌｄ）にＯＣＴエンベディングマトリックス（ＯＣＴ  ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ、Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）を処理し、組織を−７０℃で凍結した。凍結組織は、クライオトーム（ｃｒｙｏｔｏｍｅ、ＨＭ５２０，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて−２０℃で７μｍの厚さでクロスセクション（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｃｔｉｏｎ）し、切片スライドを作製した。皮膚細胞の核を染色するために、スライドガラス（ｓｌｉｄｅ  ｇｌａｓｓ）に固定させた組織切片は、ＰＢＳに１／５０００で希釈された核染色試薬（ＤＡＰＩ）を入れ、光が遮断された状態で１０分間染色した後、ＰＢＳで３回洗浄した。マウントした後、共焦点スキャニングレーザー顕微鏡を用いて分析した。
実験の結果、ＧＦＰはブタ皮膚組織内に全く伝達されないのに対し、本発明のＳＴｅＰ−ＧＦＰは皮膚内に効率的に伝達され得ることが確認できた。図８は、ＧＦＰタンパク質の皮膚透過力の比較結果である。図８において、‘ＬＵＴ  Ｉｍａｇｅ’は、ＬＵＴ（Ｌｏｏｋ  Ｕｐ  Ｔａｂｌｅ）を用いて明暗対比を向上させたイメージである。
【００２５】
［実施例６．細胞及び皮膚透過性ＥＧＦタンパク質発現ベクターの作製］
ＳＴｅＰによる細胞及び皮膚透過能を容易に観察するためにＧＦＰタンパク質を用いたが、ＳＴｅＰの効果がＧＦＰに限らないことを説明するために、他の実施例として、上皮細胞成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）にＳＴｅＰを融合して組換えタンパク質発現ベクターを製造した。
上皮細胞成長因子は、上皮細胞の細胞分裂を促進するホルモンで、５３個のアミノ酸残基を持つペプチドであり、分子量は６，２００ダルトンである。上皮細胞成長因子は、生理的な作用において必須の役割を担う３個のジスフィルド結合（ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄｓ：Ｃｙｓ６−Ｃｙｓ２０、Ｃｙｓ１４−Ｃｙｓ３１、Ｃｙｓ３３−Ｃｙｓ４２）を持つポリペプチドタンパク質である。
上皮細胞成長因子は、体内で上皮細胞の増殖、そして傷が発生した時にそれを治癒する作用を持つ因子と知られている。上皮細胞成長因子は、上皮細胞と間葉（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ）細胞を含む各種細胞に対して、有糸分裂の促進、細胞成長の促進及び胃酸分泌の抑制などの活性があり、皮膚又は角膜の創傷治療剤又は胃潰瘍治療剤として使用できることが知られている。
ＰＥＰ１とＳＴｅＰをそれぞれＥＧＦに融合し、新規開発されたＳＴｅＰと細胞増殖効能及び皮膚内伝達能力を比較した。
【００２６】
（１）ｐＰＥＰ１−ＥＧＦベクターの作製
皮膚透過性ヒト上皮細胞成長因子（ｈｕｍａｎ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ；ｒｈＥＧＦ）を製造するためにヒト上皮細胞成長因子融合タンパク質発現ベクターを製造した。
ヒト上皮細胞成長因子とＰＥＰ１（ＫＥＴＷＷＥＴＷＷＴＥＷＳＱＰＫＫＫＲＫＶ）ペプチドの融合タンパク質発現のためのタンパク質発現ベクターが製造された。ヒト上皮細胞成長因子は、ｃＤＮＡ配列に基づいて２つの開始体が合成された。正方向開始体５’−ＡＣＡＣＴＣＧＡＧＡＡＴＡＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＡＴＧＴＣ−３’はＸｈｏＩ制限酵素切断部位を有し、逆方向開始体５’−ＴＧＴＧＧＡＴＣＣＴＴＡＧＣＧＣＡＧＴＴＣＣ−３’は、ＢａｍＨＩ制限酵素切断部位を有する。重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）が行われ、重合酵素連鎖反応生成物をＴＡ−クローニングベクターに連結した。その後、ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで切断し、切断されたオリゴヌクレオチドを溶出させた（Ｉｎｖｉｔｅｋ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎ）。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）を用いて、前記切断されたオリゴヌクレオチドをｐＥＴ１５ｂベクターに連結し、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５細胞に形質転換させた。形質転換されたバクテリアからｐＥＧＦベクターを精製した。
上鎖５’−ＧＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＧＡＡＴＧＧＴＣＴＣＡＧＣＣＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＧＴＡＡＡＧＴＧＣＣＴＣＧＡＧＴＡＴＡＴ−３’と下鎖（ｂｏｔｔｏｍ  ｓｔｒａｎｄ）５’−ＡＴＡＴＡＣＴＣＧＡＧＧＣＡＣＴＴＴＡＣＧＴＴＴＴＴＴＴＴＴＣＧＧＣＴＧＡＧＡＣＣＡＴＴＣＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＡＴＡＴＧＧＡＡＴＴＣＣＣＣ−３’を合成し、これをアニール（ａｎｎｅａｌ）してＰｅｐ−１ペプチドをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを作った。二本鎖オリゴヌクレオチドは直接にｐＥＧＦのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩにサブクローンされ、ＰＥＰ１−ＥＧＦタンパク質を発現させるｐＰＥＰ１−ＥＧＦを作製した。図９は、ＰＥＰ１−ＥＧＦ発現ベクターのマップである。
【００２７】
（２）ｐＳＴｅＰ−ＥＧＦベクターの作製
ＳＴｅＰが融合されたＥＧＦを発現させるｐＳＴｅＰ−ＥＧＦは、次の方法で作製した。まず、２本のオリゴヌクレオチドの上鎖５’−ＴＡＴＧＡＡＡＧＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＧＡＡＴＧＧＴＣＣＣＡＧＣＣＧＴＡＴＧＧＣＣＧＴＡＡＡＡＡＡＣＧＴＣＧＴＣＡＧＣＧＴＣＧＴＣＧＴＣ−３’と下鎖５’−ＴＣＧＡＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＣＴＧＡＣＧＡＣＧＴＴＴＴＴＴＡＣＧＧＣＣＡＴＡＣＧＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＴＴＣＧＧＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＣＣＣＡＣＣＡＧＧＴＴＴＣＴＴＴＣＣ−３’が合成され、ＳＴｅＰペプチドをコードする二本鎖オリゴヌクレオチドを作った。二本鎖オリゴヌクレオチドは直接にｐＥＧＦのＮｄｅＩ−ＸｈｏＩにサブクローンされ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦタンパク質を発現させるｐＳＴｅＰ−ＥＧＦを作製した。図１０は、ＳＴｅＰ−ＥＧＦ発現ベクターのマップである。
【００２８】
［実施例７．ＥＧＦ組換えタンパク質の発現（ＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦ）］
本実施例では、上記の実施例で作製された組換えベクターから該当のタンパク質を発現しようとした。細胞及び皮膚透過性ＥＧＦ（ＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦ）との効能及び効果の比較を目的に、市販されている一般ＥＧＦを使用し、本実施例ではベクターの作製から発現、精製は、実施しなかった。市販されている一般ＥＧＦは、約６ｋＤａのタンパク質であり、細胞及び皮膚に伝達し得る能力がない。
２種類の発現ベクターをそれぞれＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞内に形質転換させた。形質転換されたバクテリア細胞は、アンピシリンが含まれた１，０００ｍｌのＬＢ培地を用いてＯＤ６００値が０．６になるまで３７℃で培養し、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧを導入して８時間３７℃で追加培養し、ＰＥＰ１−ＥＧＦ及びＳＴｅＰ−ＥＧＦタンパク質の発現を誘導した。
それぞれのＥＧＦタンパク質の発現有無の確認は、ＩＰＴＧの添加による目的タンパク質の誘導発現前と後の培養細胞を収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動をした後、クマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ｂｌｕｅ）でタンパク質を染色して観察した。
その結果、図１１から確認されるように、ＰＥＰ１−ＥＧＦは１１．９ｋＤａ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦは１２．４ｋＤａの大きさを有するタンパク質が発現することが確認できた。図１１は、ＥＧＦ組換えタンパク質（ＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦ）の発現結果である。
【００２９】
［実施例８．ＥＧＦ組換えタンパク質の純粋分離精製（ＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦ）］
本実施例では、上記の実施例でそれぞれ発現したタンパク質に対して細胞破砕工程の実施後、Ｈｉｓタグ親和カラムを用いて、目的とするＰＥＰ１−ＥＧＦ及びＳＴｅＰ−ＥＧＦタンパク質だけを純粋分離精製した。２種のＥＧＦタンパク質の精製方法は、下記のように同じ方法を用いて精製した。
ｐＰＥＰ１−ＥＧＦ、ｐＳＴｅＰ−ＥＧＦ形質転換細胞を細胞培養及び発現によって回収された菌体を５０ｍＭトリス緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ８．０）において超音波機を用いて破壊した後、これを遠心分離して凝集体（ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ  ｂｏｄｙ）と細胞質（上清液）とに分離した。
２種のＥＧＦタンパク質は凝集体形態で発現し、細胞破砕後に援心分離によって目的タンパク質の大部分が凝集体に含まれている。したがって、目的タンパク質の純粋分離精製のために８Ｍウレア緩衝液を用いて可溶化（ｓｏｌｕｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）させなければならない。
また、２種のＥＧＦタンパク質にはいずれもＨｉｓ６タグがされているので、このような特性を用いて、可溶化されたそれぞれのＥＧＦ試料をＮｉ２＋−ＮＴＡ親和カラム（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）で精製することができる。
細胞破砕後に援心分離によって回収されたそれぞれの凝集体は、８Ｍウレアが含まれている５０ｍＭトリス緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８Ｍ  ｕｒｅａ、ｐＨ８．０）によって可溶化させ、遠心分離して、可溶化されない不純物とそれぞれのＥＧＦタンパク質が含まれた上清液とに分離した。
それぞれのＥＧＦタンパク質を含有する上清液は、Ｎｉ２＋−ＮＴＡ親和カラム（Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ＵＳＡ）で精製を実施した。カラムの平衡及びＥＧＦタンパク質の結合は、５０ｍＭトリス緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８Ｍ  ｕｒｅａ、ｐＨ８．０）を使用し、洗浄と溶出は、カラムの平衡及び結合緩衝液に濃度別イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を製造して使用した。純粋分離精製されたタンパク質はそれぞれ、ＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦと命名した。
【００３０】
［実施例９．ＥＧＦ組換えタンパク質のリフォールディング及びＨＰＬＣ精製（ＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦ）］
純粋分離精製された２種のタンパク質は、活性を有するようリフォールディング工程を追加実施した。２種のＥＧＦタンパク質のリフォールディング方法は、下記のように同じ方法を用いてリフォールディングした。
純粋分離精製されたそれぞれのタンパク質は、リフォールディング還元緩衝液（５０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、１ｍＭ  Ｌ−Ｃｙｓｔｅｉｎｅ、ｐＨ９．６）を用いて撹拌器で１０倍希釈し、２５℃で１時間さらに反応させた。次いで、リフォールディング酸化のためにＬ−シスチン（Ｌ−Ｃｙｓｔｉｎｅ）を最終５ｍＭになるように添加し、撹拌器を用いて４℃で１５時間反応させた。反応が完了したリフォールディング溶液は、遠心分離によって、リフォールディング過程中に発生した沈殿物を除去し、得られたリフォールディング上清液は、濃縮後にＨＰＬＣ精製を実施した。
リフォールディング後、濃縮されたそれぞれのＥＧＦタンパク質を６Ｍ  ＨＣｌを用いて酸性化（ｐＨ２．７〜ｐＨ３．０）した後、０．２μｍフィルターでろ過して試料を準備し、ＭＰＬＣを用いて１次精製をした。
移動相としては、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｖ／ｖ）を入れた水とアセトニトリル（ＡＣＮ）を使用し、カラムはＣ１８  ４０ｇカートリッジ（ｃａｒｔｒｉｄｇｅ）を使用した。アセトニトリル（ＡＣＮ）濃度を順次に増加させる勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）方法で、ＵＶ検出機を用いて精製し、ＨＰＬＣを用いて分析した結果、ＰＥＰ１−ＥＧＦ及びＳＴｅＰ−ＥＧＦに該当するピーク（ｐｅａｋ）に対する純度が５０〜８０％であるものを集め、回転蒸発器（Ｒｏｔａｒｙ  ｅｖａｐｏｒａｔｏｒ）で濃縮した。
また、９５％以上の高純度ＰＥＰ−ＥＧＦ及びＳＴｅＰ−ＥＧＦタンパク質を得るために、２次でＨＰＬＣを用いて追加精製した。ＨＰＬＣは、移動相として、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）（ｖ／ｖ）を入れた水とアセトニトリル（ＡＣＮ）を使用し、カラムは、Ｃ１８  ５０×２５０ｍｍを使用した。アセトニトリル（ＡＣＮ）濃度を順次に増加させる勾配方法でＵＶ検出機を用いて純度が９５％以上のものを取得し、濃縮後、安定化バッファ（５０ｍｍ  Ｎａ２ＣＯ３、１０％  Ｇｌｙｃｅｒｏｌ、ｐＨ９．６）を用いて透析を実施した。図１２は、ＥＧＦ組換えタンパク質（ＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦ）の精製結果である。
【００３１】
［実施例１０．ＥＧＦ組換えタンパク質の細胞増殖活性度測定（ＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦ）］
ＥＧＦ、ＰＥＰ１−ＥＧＦ及びＳＴｅＰ−ＥＧＦによる細胞増殖効果を測定するためにマウス線維芽細胞（Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３ｃｌｏｎｅ  Ａ３１ｃｅｌｌｓ）に対して、それぞれの精製されたタンパク質を濃度別に処理し、細胞の成長率を測定した。マウス線維芽細胞は、生長培地に２４時間培養し、無血清培地で２０時間飢餓状態（Ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ）にした後、それぞれの組換えタンパク質を濃度別に処理して２４時間培養する方法で進行した。詳細な方法としては、１０％ＢＣＳが入っているＤＭＥＭ培地（生長培地）１００μｌずつ、９６ウェルプレートにＢａｌｂ／ｃ  ３Ｔ３  ｃｌｏｎｅ  Ａ３１細胞を１０４個／ウェルに入れ、２４時間培養後、０％ＢＣＳ培地（無血清培地）に移して２０時間程度飢餓状態にした。その後、ＥＧＦ、ＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦタンパク質を最大で９０ｎｇ／ｍｌ濃度から始めて３倍ずつ希釈して準備し、各ウェルに入れて２４時間処理した。
最終測定方法は、ＷＳＴアッセイ（Ｔａｋａｒａ，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）製品を使用し、その方法は、製品使用説明書に基づいて行った。ＥＤ５０（５０％  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）濃度を表す吸光度のタンパク質処理濃度を１ユニットと定めて定量した。
その結果、精製されたＥＧＦ、ＰＥＰ１−ＥＧＦ及びＳＴｅＰ−ＥＧＦ対して、６Ｘ１０６ユニット／ｍＭ以上の細胞増殖活性度を示すことを確認した。特に、ＥＧＦに比べてＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦが細胞増殖活性に優れたが、これは、ＰＴＤとの融合状態にも拘わらず、細胞中のＥＧＦ受容体との結合には問題がないことが分かる。図１３は、ＥＧＦ組換えタンパク質の細胞増殖効能結果（ＥＧＦ、ＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦ）である。
【表１】
2020510645.tif 000003
【００３２】
［実施例１１．細胞及び皮膚透過性ＥＧＦタンパク質の皮膚透過分析］
組織染色を用いたＳＴｅＰ−ＥＧＦの皮膚透過性分析のために、ブタ皮膚（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｓｋｉｎ）を用いたフランツセル（Ｆｒａｎｚ  ｃｅｌｌ）に同一量（４２ｕＭ）のＮｏｒｍａｌ  ＥＧＦとＰＥＰ１−ＥＧＦ、ＳＴｅＰ−ＥＧＦを処理した。２４時間後、フランツセル（Ｆｒａｎｚ  ｃｅｌｌ）の間にあるブタ皮膚を取り出して蒸留水に洗浄した後、組織染色過程を進行した。ドナー細胞（Ｄｏｎｏｒ  ｃｅｌｌ）に露出されたブタ皮膚部位を切断し、１０％緩衝ホルマリン（ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｆｏｒｍａｌｉｎ）において固定させた後、パラフィンブロック（ｐａｒａｆｆｉｎ  ｂｌｏｃｋ）を製造し、マイクロトーム（Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて７μｍで組織を区分（ｓｅｃｔｉｏｎ）した。その後、スライド上に組織を固定（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）した後、パラフィンを除去し、水和過程の後、組織切片を３０分間ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）した。ブロッキングが終わった組織に抗ＥＧＦ抗体（Ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ，ｇｒｅｅｎ）を処理し、４℃で１８時間反応させた。翌日、ＰＢＳＴで洗浄後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ２次抗体を常温で２時間処理し、ＰＢＳＴで再び洗浄した。その後、対照染色のためにＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（ｂｌｕｅ）で常温で１０分間反応した後、蛍光培地（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｅｄｉｕｍ）に封入して蛍光顕微鏡で観察した。
実験の結果、ＥＧＦは角質層でのみ観察され、ＰＥＰ１−ＥＧＦは上皮層まで観察された。本発明のＳＴｅＰ−ＥＧＦはＰＥＰ１−ＥＧＦに比べても、皮膚内への効率的な伝達が可能であることが確認できた。図１４は、ＥＧＦタンパク質の皮膚透過力の比較結果である。
【００３３】
［実施例１２．ペプチド合成］
本発明者らは、細胞透過性ペプチドと目標物質間の非共有結合によって細胞透過能が向上することを確認するために、細胞透過性ペプチドを合成した。非共有結合によって細胞透過能を向上させると既に知られているＰＥＰ１ペプチドと新規の細胞透過性ペプチドＳＴｅＰをそれぞれ合成した。ペプチドメーカーに依頼して、液相・固相法によって、ペプチドを合成した。その配列は、下記表２のとおりだった。
【表２】
2020510645.tif 000004
【００３４】
［実施例１３．細胞透過性ペプチドの細胞毒性の確認］
本発明のペプチドが生体内高分子伝達時に無害に使用されるかどうかを確認するために細胞毒性を確認した。
１０％ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地で培養されたＨａＣａＴ細胞を２．５×１０４ずつ９６ウェルプレートに分注し、２４時間培養後にＨＢＳＳで２回洗浄した。細胞透過性ペプチドであるＰＥＰ１とＳＴｅＰをそれぞれ５０μＭ、１００μＭ、２００μＭの濃度でＤ．Ｗに溶かした後、最終濃度が２．５μＭ、５μＭ、１０μＭとなるように培地に希釈して細胞に処理し、２４時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで反応させた。培養後、上清液を除去し、ＷＳＴ溶液を培地に１：９の比率で希釈して細胞に処理した。３時間培養後、４５０ｎｍで吸光値を測定し、ペプチド非処理群の細胞と処理群の細胞を比較して細胞生存率を計算した。
その結果、図１５に示しているように、ＰＥＰ１、ＳＴｅＰ両方とも１０μＭの濃度でも細胞毒性が表れないことを確認した。図１５は、細胞透過性ペプチドの細胞毒性確認結果である。
【００３５】
［実施例１４．細胞透過性ペプチド−ＦＩＴＣ混合物の細胞透過分析］
本実施例では、細胞透過性ペプチドが目標物質と非共有結合状態で細胞内に伝達する能力を容易に分析するために、緑色蛍光タンパク質（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ：以下、“ＦＩＴＣ”と略称する。）を目的物質として選択した。
ＦＩＴＣと細胞透過性ペプチド（ＰＥＰ１、ＳＴｅＰ）をホウ砂緩衝液（ｂｏｒａｘ  ｂｕｆｆｅｒ）（ｐＨ８．０）に溶かして準備した。混合は、ＦＩＴＣと細胞透過性ペプチド（ＰＥＰ１、ＳＴｅＰ）を１：０、１：１、１：２のモル比で混合して３７℃で３０分間反応させ、最終５μＭの細胞透過性ペプチド−ＦＩＴＣ混合物を細胞に処理した。細胞に混合物を処理した後、１時間３０分間培養し、混合物と同じ量の培地を追加して３０分さらに培養した。３０分後に培地を除去し、ＰＢＳで細胞を洗浄した後、冷却メタノールを用いて１０分間−２０℃で細胞を固定した。細胞はＰＢＳで十分に洗浄し、ＰＢＳに１／５０００で希釈された核染色試薬（ＤＡＰＩ）を入れ、光が遮断された状態で１０分間染色させた。ＰＢＳで十分に洗浄し、マウントした後、共焦点スキャニングレーザー顕微鏡を用いて分析した。
その結果、ＳＴｅＰ−ＦＩＴＣ混合物を処理したグループにおいて緑色蛍光が最も明るく、１：１に比べて１：２モル比においてより明るかった。すなわち、ＰＥＰ１に比べてＳＴｅＰがＦＩＴＣの細胞内透過力をより向上させたことが分かる。図１６は、細胞透過性ペプチド−ＦＩＴＣ混合物の細胞透過力の比較結果である。
【００３６】
［実施例１５：細胞透過性ペプチド−ＦＩＴＣ混合物の皮膚透過分析］
細胞だけでなく皮膚でもＳＴｅＰとの非共有結合状態でＦＩＴＣの透過が向上するか否かを確認するために、フランツセル（Ｆｒａｎｚ  ｃｅｌｌ、直径９ｍｍ）を使用した。
ＦＩＴＣと細胞透過性ペプチド（ＰＥＰ１、ＳＴｅＰ）をホウ砂緩衝液（ｐＨ８．０）に溶かして準備した。混合は、ＦＩＴＣと細胞透過性ペプチド（ＰＥＰ１、ＳＴｅＰ）を１：０、１：２のモル比で混ぜて３７℃で３０分間反応させ、最終１００μＭの細胞透過性ペプチド−ＦＩＴＣ混合物をフランツセルの上段に２００μｌ処理した。２４時間後、ブタ皮膚を取り出してＰＢＳで３回洗浄した。洗浄後、クライオモルド（ｃｒｙｏ  ｍｏｌｄ）にＯＣＴエンベディングマトリックス（ＯＣＴ  ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ、Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｈ  Ｌｔｄ．，ＵＫ）を処理し、組織を−７０℃で凍結した。凍結組織はクライオトーム（ｃｒｙｏｔｏｍｅ，ＨＭ５２０，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて−２０℃で７μｍの厚さでクロス−セクションし、切片スライドを作製した。皮膚細胞の核を染色するために、スライドガラスに固定させた組織切片は、ＰＢＳに１／５０００で希釈された核染色試薬（ＤＡＰＩ）を入れ、光が遮断された状態で１０分間染色した後、ＰＢＳで３回洗浄した。マウントした後、共焦点スキャニングレーザー顕微鏡を用いて分析した。
その結果、ＦＩＴＣはブタ皮膚角質層に止まるのに対し、本発明のＳＴｅＰ−ＦＩＴＣ混合物は皮膚内に効率的に伝達可能であることが確認できた。図１７は、細胞透過性ペプチド−ＦＩＴＣ混合物の皮膚透過力の比較結果である。
【００３７】
［実施例１６．細胞透過性ペプチド−（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｏｙｌ  Ｂｅｎｚｙｌａｍｉｄｅ）混合物の細胞透過分析］
本実施例では、皮膚生理活性を持つペプチドを用いた皮膚透過によって生理活性が増大することを確認し、本発明がシワ改善効能を持つ化粧品原料として使用可能であることを立証しようとした。
皮膚生理活性を有するペプチドとして、筋肉収縮に対する信号を防止してシワ改善に役立つと知られた、ＤＤＢＤ（Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  Ｄｉａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｏｙｌ  Ｂｅｎｚｙｌａｍｉｄｅ、商標名：ＳＹＮ−ＡＫＥ）を使用した。ＤＤＢＤは、ワグレリン（Ｗａｇｌｅｒｉｎ）１というヘビ毒を摸倣して合成されたペプチドである。
ＤＤＢＤの細胞伝達能力を容易に分析するために、ＦＩＴＣを連結したＦＩＴＣ融合ＤＤＢＤ（ＦＩＴＣ−ＤＤＢＤ）を合成した。ＳＴｅＰと非共有結合状態でＤＤＢＤの細胞内透過が向上するかを調べるために、ＢＡＬＢ／３Ｔ３（ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）細胞においてＦＩＴＣ緑色蛍光を用いたＤＤＢＤの細胞内透過を観察した。
ＢＡＬＢ／３Ｔ３細胞は、培養用スライドで２４時間培養した。その後、培養培地（ＤＭＥＭ＋１０％ＢＣＳ、１％ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）を除去した後、ＨＢＳＳで３回洗浄後、ＳＴｅＰとＦＩＴＣ−ＤＤＢＤを混ぜた混合物を処理した。混合は、ＦＩＴＣ−ＤＤＢＤとＳＴｅＰを１：５のモール比で混ぜて室温で１０分間反応させ、最終１０ｕＭのＦＩＴＣ−ＤＤＢＤを細胞に処理した。６０分後に培地を除去し、ＨＢＳＳを用いて細胞を洗浄した後、冷却メタノールを用いて１０分間−２０℃で細胞を固定した。細胞は、ＰＢＳで十分に洗浄した後、ＰＢＳに１／５０００で希釈された核染色試薬（ＤＡＰＩ）を入れ、光が遮断された状態で１０分間染色させた。ＰＢＳで十分に洗浄し、マウントした後、共焦点スキャニングレーザー顕微鏡を用いて分析した。
その結果、ＦＩＴＣ−ＤＤＢＤだけを処理したグループに比べて、ＳＴｅＰを混合してＦＩＴＣ−ＤＤＢＤを入れた時、細胞内透過がより向上することが確認できた。図１８は、細胞透過性ペプチドとＦＩＴＣ−ＤＤＢＤ混合物の‘細胞’透過力の比較結果である。
【００３８】
［実施例１７．細胞透過性ペプチド−ＦＧＦ２混合物の皮膚透過分析］
ＤＤＢＤのように小さい分子量のペプチドだけでなく、分子量が大きいタンパク質を用いても皮膚透過による生理活性が増大することを確認するために、ＦＧＦ２（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−２、塩基性線維芽細胞成長因子）を使用した。ＦＧＦ２は、皮膚を構成する角質形成細胞と線維芽細胞を刺激して、皮膚を再生させ、健康な皮膚状態に回復させると知られているが、高分子親水性物質であるため、皮膚内透過が難しい。
組織染色を用いたＦＧＦ２の皮膚透過性分析のために、ブタ皮膚（Ｐｏｒｃｉｎｅ  ｓｋｉｎ）を用いたフランツセル（Ｆｒａｎｚ  ｃｅｌｌ）に同一量（５００μｇ）のＦＧＦ２、ＰＥＰ１−ＦＧＦ２、及びＳＴｅＰとＦＧＦ２との混合物を処理した。２４時間後にフランツセル（Ｆｒａｎｚ  ｃｅｌｌ）の間にあるブタ皮膚を取り出して蒸留水で洗浄した後、組織染色過程を進行した。ドナー細胞（Ｄｏｎｏｒ  ｃｅｌｌ）に露出されたブタ皮膚部位を切断して１０％緩衝ホルマリン（ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｆｏｒｍａｌｉｎ）で固定させた後、パラフィンブロック（ｐａｒａｆｆｉｎ  ｂｌｏｃｋ）を製造し、マイクロトーム（Ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ）を用いて７μｍに組織を区分（ｓｅｃｔｉｏｎ）した。その後、スライド上に組織を固定（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）した後、パラフィンを除去し、水和過程後に組織切片を３０分間ブロッキングした。ブロッキングが終わった組織に抗ＦＧＦ２抗体（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，ｇｒｅｅｎ）を処理し、４℃で１８時間反応させた。翌日、ＰＢＳＴで洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ２次抗体を常温で２時間処理し、ＰＢＳＴで再び洗浄した。その後、組織切片は、ＰＢＳに１／５０００で希釈された核染色試薬（ＤＡＰＩ）を入れ、光が遮断された状態で１０分間染色した後、ＰＢＳで３回洗浄した。マウントした後、共焦点スキャニングレーザー顕微鏡を用いて分析した。
その結果、ＦＧＦ２はブタ皮膚組織内に全く伝達されないのに対し、ＰＥＰ１−ＦＧＦ２はブタ皮膚組織の皮膚内に効率的に伝達されることを確認した。ＳＴｅＰとＦＧＦ２は単純混合物であるにも拘わらず、ＰＥＰ１−ＦＧＦ２を超える皮膚伝達能力を持つことが確認できた。図１９は、細胞透過性ペプチドとＦＧＦ２との混合物の‘皮膚’透過力の比較結果である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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