(57)【要約】  被験者由来の試料中の円錐角膜（ＫＣ）に関連する一塩基多型（ＳＮＰ）を検出するシステムおよび方法を説明する。
2020517296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者のＫＣを診断するかまたは予後を予測する方法であって、前記方法は、被験者由来の試料中の２つ以上の遺伝的変異体を検出することを含み、前記２つ以上の遺伝的変異体が図１に記載された群から選択され、そして前記２つ以上の遺伝的変異体の存在が前記被験者のＫＣの診断または予後を示す、方法。
【請求項２】
前記遺伝的変異体の検出が配列決定方法によって行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記２つ以上の遺伝的変異体が図２に記載された群から選択され、そして前記被験者がアフリカ系アメリカ人である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記２つ以上の遺伝的変異体が図３に記載された群から選択され、前記被験者が白色人種（Caucasian）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記２つ以上の遺伝的変異体が図４に記載された群から選択され、そして前記被験者がヒスパニック（Hispanic）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
前記２つ以上の遺伝的変異体が図５に記載された群から選択され、そして前記被験者が東アジア人である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記被験者由来の前記試料からヌクレオチド分子を増幅させることをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
検出が、前記被験者由来の前記試料もしくは前記試料のアンプリコンからのヌクレオチド分子中に２つ以上の遺伝的変異体を検出することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
被験者のＫＣが発症する危険性を予測する方法であって、前記方法は、被験者由来の試料中の２つ以上の遺伝的変異体を検出することを含み、前記２つ以上の遺伝的変異体が図１に記載された群から選択され、そして前記２つ以上の遺伝的変異体の存在が前記被験者のＫＣの発症の危険性を示す、方法。
【請求項１０】
前記２つ以上の遺伝的変異体が図２に記載された群から選択され、そして前記被験者がアフリカ系アメリカ人である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記２つ以上の遺伝的変異体が図３に記載された群から選択され、そして前記被験者が白色人種（Caucasian）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記２つ以上の遺伝的変異体が図４に記載された群から選択され、そして前記被験者がヒスパニック（Hispanic）である、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記２つ以上の遺伝的変異体が図５に記載された群から選択され、そして前記被験者が東アジア人である、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記被験者由来の前記試料からヌクレオチド分子を増幅させることをさらに含む、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
検出が、前記被験者由来の前記試料もしくは前記試料のアンプリコンからのヌクレオチド分子中に２つ以上の遺伝的変異体を検出することを含む、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
被験者のＫＣの治療のための治療計画を策定する方法であって、前記方法は、被験者由来の試料中の２つ以上の遺伝的変異体を検出することを含み、前記２つ以上の遺伝的変異体が図１に記載された群から選択され、そして前記２つ以上の遺伝的変異体の存在が前記被験者のＫＣ治療計画の必要性を示す、方法。
【請求項１７】
被験者のＫＣを治療する方法であって、前記方法は、被験者由来の試料中の２つ以上の遺伝的変異体を検出することを含み、前記２つ以上の遺伝的変異体が図１に記載された群から選択され、そして前記被験者のＫＣを治療する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、一般に疾患関連遺伝子の対立遺伝子の単離および検出のための方法に関する。具体的には、本願は、円錐角膜の診断および予後の予測に関連する対立遺伝子の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
円錐角膜（ＫＣ）は、陽性の家族歴を有する被験者のうち約６〜２３．５％に最もよく見られる角膜拡張性疾患である（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．、Ｈａｕｓｅｒ，Ｍ．Ａ．、Ａｆｓｈａｒｉ，Ｎ．Ａ．、Ａｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｒ．Ｒ．、Ｌｉｕ，Ｙ．らによる、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｓｙｓ  Ｓｅｘｕａｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２０１２年、Ｓ：６）。報告されたＫＣの有病率は、１００，０００人あたり８．８人〜５４．４人である。有病率のこの変動は、部分的には疾患の診断に用いられる様々な基準によるものである。（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．、Ｈａｕｓｅｒ，Ｍ．Ａ．、Ａｆｓｈａｒｉ，Ｎ．Ａ．、Ａｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｒ．Ｒ．、Ｌｉｕ，Ｙ．らによる、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｓｙｓ  Ｓｅｘｕａｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２０１２年、Ｓ：６、および、Ｎｏｗａｋ，Ｄ．、Ｇａｊｅｃｋａ，Ｍ．らによる、Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  Ａｆｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２０１１年、第１８巻第１号第２〜６頁）。多くの研究が、ＫＣの遺伝子的原因を定義しようと試みた文献内に見られる。これらの研究は、実験パラメータに応じて疾患の原因に関与すると考えられる多数の可能性のある遺伝的変異体もしくはＳＮＰを明らかにしてきた。
【０００３】
ＫＣは、中心角膜もしくは中心傍角膜が漸進的に菲薄化し、かつ急峻化することで不正乱視を引き起こす一般的な角膜疾患である。遺伝パターンは顕著でもなく予測可能でもないが、陽性の家族歴が報告されている。ＫＣの発生率は、多くの場合２０００人中に１人であると報告される。ＫＣは、ボウマン層の断片化、基質の菲薄化および上皮の積層、デスメ膜の皺襞もしくは破損、および可変的な量のびまん性角膜瘢痕化を含む、病理学的所見を示すことがある。
【０００４】
病理組織学的研究では、ボウマン層の破損もしくは完全な欠如、コラーゲンの崩壊、瘢痕化および菲薄化が示されている。これらの変化の原因は知られていないが、一部では、角膜においてコラーゲンの分解を引き起こす酵素の変化が疑われている。ＫＣの遺伝的素因が示唆されている一方で、特異遺伝子は特定されていない。ＫＣ症例の大半は両側性であるが、非対称であることが多い。影響の少ない眼は、強度の乱視または軽度の急峻化を示す場合がある。発症は一般的に青年期の初期であり、２０代半ば〜３０代に進行する。しかし、症状は人生のはるかに早い時期もしくは遅い時期に始まることがある。進行は個体ごとに様々である。視力を適切に矯正しない眼鏡では、頻繁に変更されることがよくある。他の一般的な進行は、ソフトコンタクトレンズから乱視用もしくは乱視矯正用コンタクトレンズを経て、硬質のガス透過性コンタクトレンズへと進行する。
【０００５】
今日まで、有効な予防方法は証明されていない。一部では、目を擦ったり圧迫したりすること（例えば、手を目に押し当てて寝ること）がＫＣの進行の原因となるおよび／またはＫＣの進行を引き起こす可能性があると考えられているため、被験者に目を擦らないように説明する必要がある。一部の被験者では、アレルゲンの回避が目の刺激を軽減し、したがって目の擦を軽減するのに役立つことがある。
【０００６】
現在、診断は細隙灯検査と、中心角膜もしくは下部角膜の菲薄化の観察とによって行うことができる。コンピュータ角膜形状解析法はまた、早期ＫＣの検出に有用であり、ＫＣの進行を追跡することが可能である。超音波厚さ測定を使用して、角膜の最薄領域を測定することもできる。コンピュータ角膜形状解析法を使用した新しいアルゴリズムが考案され、現在では、不完全型円錐角膜、潜在的もしくは疑いのある円錐角膜の検出が可能となっている。これらの装置は、屈折矯正手術を受ける予定の被験者を良好に検査することができる可能性があるが、依然として当技術分野では、良好に予後を予測し、かつ診断する方法が必要とされている。
【０００７】
本開示は、円錐角膜に関連する突然変異対立遺伝子の検出によってＫＣの予後を予測し、かつ診断する方法を提供することによって、この要求を満たしている。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、ＫＣに関連する１つ以上の対立遺伝子を検出する改善された方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本開示は、被験者のＫＣに関連する変異体を検出する方法を提供しており、この方法は、被験者由来の試料中の２つ以上の遺伝的変異体（例えば一塩基多型（ＳＮＰ）およびインデル）を検出することを含み、ここで、２つ以上の遺伝的変異体は図１に記載された遺伝的変異体からなる群から選択され、２つ以上の遺伝的変異体の存在は被験者のＫＣを示す。
【００１０】
いくつかの実施形態では、本開示は、被験者のＫＣを診断するかまたは予後を予測する方法を提供しており、この方法は、被験者由来の試料中の２つ以上の遺伝的変異体（例えば一塩基多型（ＳＮＰ）およびインデル）を検出することを含み、ここで、２つ以上の遺伝的変異体は図１に記載された遺伝的変異体からなる群から選択され、２つ以上の遺伝的変異体の存在は被験者のＫＣの診断または予後を示す。
【００１１】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は図２に記載された遺伝的変異体からなる群から選択される。追加の実施形態では、被験者はアフリカ系アメリカ人である。さらなる実施形態では、アフリカ系アメリカ人は、アフリカ系アメリカ人に特有の２つ以上の遺伝的変異体を検出することによって特定される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は図３に記載された遺伝的変異体からなる群から選択される。追加の実施形態では、被験者は白色人種（Caucasian；コーカサス人）である。さらなる実施形態では、白色人種（コーカサス人）は、白色人種（コーカサス人）に特有の２つ以上の遺伝的変異体を検出することによって特定される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は図４に記載された遺伝的変異体からなる群から選択される。追加の実施形態では、被験者はヒスパニックである。さらなる実施形態では、ヒスパニックは、ヒスパニックに特有の２つ以上の遺伝的変異体を検出することによって特定される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は図５に記載された遺伝的変異体からなる群から選択される。追加の実施形態では、被験者は東アジア人または韓国人である。さらなる実施形態では、東アジア人または韓国人は、東アジア人または韓国人に特有の２つ以上の遺伝的変異体を検出することによって特定される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は、本明細書（例えば図１〜図５）に記載された突然変異（例えば遺伝的変異体）の任意の組合せからなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記遺伝的変異体の検出は配列決定方法によって行われる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本開示は、被験者のＫＣに関連するかもしくは原因となる変異体を検出する方法を提供しており、この方法は、被験者由来の試料中の２つ以上の遺伝的変異体（例えば一塩基多型（ＳＮＰ）およびインデル）を検出することを含み、ここで、２つ以上の遺伝的変異体は図１に記載された遺伝的変異体からなる群から選択され、２つ以上の遺伝的変異体の存在は被験者のＫＣを示す。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本開示は、被験者のＫＣが発症する危険性を予測する方法を提供しており、この方法は、被験者由来の試料中の２つ以上の遺伝的変異体を検出することを含み、ここで、２つ以上の遺伝的変異体は図１に記載された遺伝的変異体からなる群から選択され、２つ以上の遺伝的変異体の存在は被験者のＫＣの発症の危険性を示す。
【００１９】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は図２に記載された遺伝的変異体からなる群から選択される。追加の実施形態では、被験者はアフリカ系アメリカ人である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は図３に記載された群から選択される。追加の実施形態では、被験者は白色人種（コーカサス人）である。
【００２１】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は図４に記載された遺伝的変異体からなる群から選択される。追加の実施形態では、被験者はヒスパニックである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は図５に記載のものからなる群から選択される。追加の実施形態では、被験者は東アジア人または韓国人である。
【００２３】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は、本明細書（例えば図１〜図５）に記載された突然変異（例えば遺伝的変異体）の任意の組合せからなる群から選択される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、前記遺伝的変異体の検出は配列決定方法によって行われる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、被験者のＫＣの治療のための治療計画を策定する方法を提供しており、この方法は、被験者由来の試料中の２つ以上の遺伝的変異体を検出することを含み、ここで、２つ以上の遺伝的変異体は図１に記載された遺伝的変異体からなる群から選択され、２つ以上の遺伝的変異体の存在は被験者のＫＣ治療計画の必要性を示す。
【００２６】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は図２に記載された遺伝的変異体からなる群から選択される。追加の実施形態では、被験者はアフリカ系アメリカ人である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は図３に記載された遺伝的変異体からなる群から選択される。追加の実施形態では、被験者は白色人種（コーカサス人）である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は図４に記載された遺伝的変異体からなる群から選択される。追加の実施形態では、被験者はヒスパニックである。
【００２９】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は図５に記載された遺伝的変異体からなる群から選択される。追加の実施形態では、被験者は東アジア人または韓国人である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体（例えばＳＮＰ）は、本明細書（例えば図１〜図５）に記載された突然変異（例えば遺伝的変異体）の任意の組合せからなる群から選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、前記遺伝的変異体の検出は配列決定方法によって行われる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本開示は、被験者の円錐角膜を治療する方法を提供しており、この方法は、被験者のＫＣを診断するかまたは予後を予測することと、ＫＣを治療することとを含む。さらなる実施形態では、治療方法は、眼鏡もしくはコンタクトレンズを着用することおよび／またはコラーゲン架橋結合もしくは角膜移植を実施することを含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】染色体、遺伝子記号、ｄｂＳＮＰ  ｉｄ、および民族性によって順序付けられた研究コホート内に見られる各変異の頻度を記載した表である。リストは、白色人種（コーカサス人）（Ｃ）、東アジア人（ＥＡ）、ヒスパニック（Ｈ）、アフリカ系アメリカ人（ＡＡ）および南アジア人（ＳＡ）の民族群間で一致する変異体に分類され、その後に各群に特有の変異体が続く。エクソーム全体にわたる２５９個の遺伝子内の合計１，１１７個の非同義的一塩基変異体（ＳＮＶ）および挿入／欠失（ＩＮＤＥＬ）が記載されている。エクソーム集約コンソーシアム（ＥｘＡＣ、ｅｘａｃ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／）から取得したＲｅｆＳｅｑ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）受託番号とともにマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）が提供される。1576482282863_01576482282863_1Ｎ＝各群の総対立遺伝子
【００３４】
【図２】円錐角膜を有するアフリカ系アメリカ人の被験者に特有の遺伝的変異体を記載した図である。
【００３５】
【図３】円錐角膜を有する白色人種（コーカサス人）の被験者に特有の遺伝的変異体を記載した図である。
【００３６】
【図４】円錐角膜を有するヒスパニックの被験者に特有の遺伝的変異体を記載した図である。
【００３７】
【図５】円錐角膜を有する東アジア人の被験者に特有の遺伝的変異体を記載した図である。
【００３８】
【図６】円錐角膜を有する全ての被験者に一致する遺伝的変異体を記載した図である。
【００３９】
【図７】白色人種（コーカサス人）群内で特定された角膜遺伝子からの希少変異体のオッズ比（ＯＲ）およびリスクスコアの割当を記載した表である。変異体は、角膜の構造および機能に関連する４８の遺伝子から得られ、かつ白色人種（コーカサス人）研究コホートにおける変異体に関するより大きなリストから抽出された。変異体は、１つ以上の症例試料中および０人の民族対応対照群中の存在に基づいて選択された。リスクスコアは、ベイズモデルにおいて保存優先度から調整されたＯＲと、赤色および黄色の円で示される７つのバイオインフォマティクスツールからのインシリコ予測とを組み込んだアルゴリズムから導き出された。
【００４０】
略語：Ａ＝アフリカ系アメリカ人、Ｃ＝白色人種（コーカサス人）、Ｈ＝ヒスパニック、および、ＥＡ＝東アジア人。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
疾患に関連する変異体の検出は、様々な病状を診断し、かつ予後を予測するためのますます重要な手法となっている。ＫＣに関して本開示は、変異対立遺伝子を検出し、かつ、ＫＣを有する被験者の診断においてもしくはＫＣを有する被験者を診断するために、およびＫＣを発症する個体の危険性を予測するためにこの情報を使用する方法を提供する。
【００４２】
本明細書中で使用される「発明」または「本発明」という用語は、本発明の特定の実施形態のいずれかに限定するものではなく、特許請求の範囲および明細書に記載したように、本発明の任意のおよび全ての実施形態に一般に適用される。
【００４３】
本明細書で使用される場合、文脈が特に明確に指示しない限りは、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」には複数の言及が含まれる。したがって、例えば「方法」への言及には、本開示を読めば当業者に明らかとなるであろう本明細書に記載された種類の１つ以上の方法および／または段階が含まれる。「および／または」の使用は，「ａ、ｂおよび／またはｃ」という用語が「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ａおよびｂ」、「ｂおよびｃ」、「ｃおよびａ」、および「ａ、ｂおよびｃ」を含むと理解されるように包括的に定義されることが理解されるべきである。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、例えば、ヌクレオチド配列の長さ、誤差の程度、寸法、組成物中の成分の量、濃度、体積、工程温度、工程時間、収量、流量、圧力、および、同様の値およびその範囲を変更することを意味しており、例えば、化合物、組成物、濃縮物を製造するため、もしくは製剤を使用するために用いられる一般的な測定手順および取扱い手順を通じて、これらの手順の不注意によるエラーを通じて、方法を実行するために使用される出発材料または原料の製造、供給源または純度の差異を通じて生じる可能性がある数量の変動などの考慮事項を指している。「約」という用語はまた、例えば、特定の初期濃度もしくは混合物を含む組成物、製剤、もしくは細胞培養物の老化により異なる量、および特定の初期濃度もしくは混合物を含む組成物もしくは製剤の混合もしくは加工により異なる量を包含する。「約」という用語によって変更されるかどうかに関わらず、本明細書に添付される特許請求の範囲はこれらの量と同等のものを含む。「約」という用語は、記載の基準値に類似した値の範囲をさらに指す場合がある。特定の実施形態では、「約」という用語は、記載の基準値の５０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１パーセント以下の範囲の値の範囲を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「多型」という用語およびその変形は、異なるゲノムもしくは個体の間またはそれらの中の２つ以上の選択的ゲノム配列もしくは対立遺伝子の発生を指す。用語「遺伝的突然変異」または「遺伝的変異」およびその変形は、多型を含む。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「一塩基多型」（「ＳＮＰ」）という用語およびその変形は、対立遺伝子間で変化する１つのヌクレオチドの部位を指す。一塩基多型（ＳＮＰ）は単一塩基の変化もしくは点突然変異であるが、変形例には、個体間の遺伝的変異の原因となるいわゆる「インデル」突然変異（１〜７５までのいくつかのヌクレオチドの挿入または欠失）も含まれる。全てのヒトの遺伝的変異の約９０％を構成するＳＮＰは、３０億塩基のヒトゲノムに沿って１００〜３００塩基ごとに発生する。しかし、ＳＮＰは、ウイルスなどの他の生物においてはるかに頻繁に発生する可能性がある。ＳＮＰは、ゲノムのコード領域もしくは非コード領域において発生する可能性がある。コード領域のＳＮＰは、タンパク質産物のアミノ酸配列を変更してもしなくてもよい。非コード領域のＳＮＰは、プロモーター部位もしくは加工部位を変更する可能性があり、遺伝子の転写および／または加工に影響を及ぼす可能性がある。個体が目的のゲノム領域に特定のＳＮＰを有するかどうかを知ることにより、様々な疾患の診断、予防および治療の用途を発展させるのに十分な情報を提供することができる。
【００４７】
「プライマー」という用語およびその変形は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてＤＮＡ合成の開始点として作用するオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは通常、長さが約１０〜約３５ヌクレオチドであり、標的配列に相補的な領域にハイブリダイズする。
【００４８】
「プローブ」という用語およびその変形（例えば、検出プローブ）は、ＰＣＲ反応において標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す。標的配列は、解析対象の核酸の領域を指し、目的の多型部位を含む。
【００４９】
ハイブリダイゼーションは、プローブセット内のプローブが修飾されて新しくより大きな分子実体（例えばプローブ産物）を形成するように生じる。本明細書のプローブは、ストリンジェントな条件下で目的の核酸領域にハイブリダイズしてもよい。本明細書で使用される場合、「ストリンジェンシー」という用語は、温度、イオン強度、および有機溶媒などの他の化合物の存在の条件に関して使用され、その条件下で核酸のハイブリダイゼーションが行われる。「ストリンジェンシー」は、一般的にＴｍより約２０℃〜２５℃低い範囲の約Ｔｍ℃で生じる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションを使用して、同一のポリヌクレオチド配列を単離して検出してもよいし、または、類似するかまたは関連するポリヌクレオチド配列を単離して検出してもよい。「ストリンジェントな条件」下では、ヌクレオチド配列は、その全体または一部において、その正確な相補体および近縁の配列にハイブリダイズする。低ストリンジェンシー条件は、約１００〜約１０００ヌクレオチド長のプローブが採用される場合、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌのＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、ｐＨはＮａＯＨで７．４に調整）、０．１％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬（５０×デンハルトは５００ｍｌあたり、５ｇのＦｉｃｏｌｌ（Ｔｙｐｅ  ４００）、５ｇのＢＳＡを含む）、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中で６８℃での結合もしくはハイブリダイゼーション、その後の室温で２．０＋ＳＳＰＥ、０．１％のＳＤＳを含む溶液中の洗浄と同等の条件を含む。多くの同等の条件を採用して低ストリンジェンシー条件を含んでもよいことは、当技術分野でよく知られており、ハイブリダイゼーション溶液の成分だけでなく、プローブの長さおよび性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、および標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成、溶液中に存在するかまたは固定化されているかなど）、ならびに、塩および他の成分の濃度（例えば、ホルミアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの存在または非存在）などの因子を変更して、上記の条件とは異なるが同等の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件を生成してもよい。さらに、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションを促進する条件（例えば、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄段階の温度を上昇させること、ハイブリダイゼーション溶液中でホルムアミドを使用することなど）は、当技術分野でよく知られている。核酸ハイブリダイゼーションに関して使用される場合、高ストリンジェンシー条件は、約１００〜約１０００ヌクレオチド長のプローブが採用される場合の、５＋ＳＳＰＥ、１％のＳＤＳ、５×デンハルト試薬、および１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中で６８℃での結合もしくはハイブリダイゼーション、その後の６８℃で０．１＋ＳＳＰＥおよび０．１％のＳＤＳを含む溶液中の洗浄と同等の条件を含む。
【００５０】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関係する当業者が一般に理解する用語と同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似するかまたは同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または検査に使用することができるが、本明細書では、方法および材料の様々な実施形態を具体的に説明する。
【００５１】
上記で説明したように、ＫＣは最も一般的な角膜拡張性疾患であり、患者の約６〜２３．５％が陽性の家族歴を有している。（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．、Ｈａｕｓｅｒ，Ｍ．Ａ．、Ａｆｓｈａｒｉ，Ｎ．Ａ．、Ａｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｒ．Ｒ．、Ｌｉｕ，Ｙ．らによる、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｓｙｓ  Ｓｅｘｕａｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２０１２年、Ｓ：６。）報告されたＫＣの有病率は、１００，０００人あたり８．８人〜５４．４人である。有病率のこの変動は、部分的には疾患の診断に用いられる様々な基準によるものである。（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．、Ｈａｕｓｅｒ，Ｍ．Ａ．、Ａｆｓｈａｒｉ，Ｎ．Ａ．、Ａｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｒ．Ｒ．、Ｌｉｕ，Ｙ．らによる、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｓｙｓ  Ｓｅｘｕａｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２０１２年、Ｓ：６、および、Ｎｏｗａｋ，Ｄ．、Ｇａｊｅｃｋａ，Ｍ．らによる、Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  Ａｆｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２０１１年、第１８巻第１号第２〜６頁）多くの研究が、ＫＣの遺伝子的原因を定義しようと試みた文献内に見られる。これらの研究は、実験パラメータに応じて疾患の原因に関与すると考えられる多数の可能性のある遺伝的変異体もしくはＳＮＰを明らかにしてきた。
【００５２】
一般的に、これまでに実施された研究は、主にマイクロサテライト遺伝子型決定およびマイクロチップ技術（ＳＮＰアレイ）を利用して、ゲノム内の関心領域を調査する。これに対して、本明細書に記載された研究では、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術を利用して、疾患の原因に関与する遺伝的変異体を特定し、かつ検証した。この研究には、全エクソームシークエンシング（ＷＥＳ）方法（ＡＣＥ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（商標）、Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州メンローパーク）が含まれ、この方法では、ヒトエクソームを構成する約２２，０００個の遺伝子が捕捉されかつ配列決定され、インデルを含む単一点突然変異もしくは変異体が特定された。
【００５３】
ヒトゲノム内には、ＫＣの表現型プロファイルに関与する遺伝子突然変異を含む様々な遺伝子座が存在することが認識されている。文献に記載されているこれら遺伝子座の中には、染色体１５ｑ２．３２および１５ｑ２２．３３−ｑ２４．２、１３ｑ３２、１６ｑ２２．３−ｑ２３．１、３ｐ１４−ｑ１３、５ｑ１４．３−ｑ２１．１、５ｑ２１．２および５ｑ３２−ｑ３３、１ｐ３６．２３−３６．２１および８ｑ１３．１−ｑ２１．１１、９ｑ３４、１４ｑ１１．２および１４ｑ２４．３にマップされた領域が存在する（例えば、Ｂｉｓｃｅｇｌｉａ  Ｌ、Ｄｅ  Ｂｏｎｉｓ  Ｐ、Ｐｉｚｚｉｃｏｌｉ  Ｃらによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００９年、第５０巻第１０８１〜１０８６頁、Ｈｕｇｈｅｓ  ＡＥ、Ｄａｓｈ  ＤＰ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＡＪ、Ｆｒａｚｅｒ  ＤＧ、Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ  Ｇらによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００３年、第４４巻第５０６３〜５０６６頁、Ｇａｊｅｃｋａ  Ｍ、Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａ  Ｕ、Ｗｉｎｔｅｒｓ  Ｄらによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００９年、第５０巻第１５３１〜１５３９頁、Ｃｚｕｇａｌａ，Ｍ．、Ｋａｒｏｌａｋ，Ｊ．Ａ．、Ｎｏｗａｋ，Ｄ．Ａ．らによる、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１２年、第２０巻第３８９〜３９７頁、Ｔｙｙｎｉｓｍａａ  Ｈ、Ｓｉｓｔｏｎｅｎ  Ｐ、Ｔｕｕｐａｎｅｎ  Ｓらによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００２年、第４３巻第３１６０〜３１６４頁、Ｂｒａｎｃａｔｉ  Ｆ、Ｖａｌｅｎｔｅ  ＥＭ、Ｓａｒｋｏｚｙ  Ａらによる、Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ２００４年、第４１巻第１８８〜１９２頁、Ｔａｎｇ  ＹＧ、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＹＳ、Ｔａｙｌｏｒ  ＫＤらによる、Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｄ  ２００５年、第７巻第３９７〜４０５頁、Ｂｕｒｄｏｎ  ＫＰ、Ｃｏｓｔｅｒ  ＤＪ、Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ  ＪＣらによる、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２００８年、第１２４巻第３７９〜３８６頁、Ｌｉ，Ｘ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．、Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｇ．、Ｐｉｃｏｒｎｅｌｌ，Ｙ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｄ．、Ｈｕ，Ｍ．、Ｙａｎｇ，Ｈ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００６年、第４７巻第３７９１〜３７９５頁、および、Ｌｉｓｋｏｖａ  Ｐ、Ｈｙｓｉ  ＰＧ、Ｗａｓｅｅｍ  Ｎ、Ｅｂｅｎｅｚｅｒ  ＮＤ、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ  ＳＳ、Ｔｕｆｔ  ＳＪらによる、Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２０１０年、第１２８巻第１１９１−１１９５頁を参照。）
【００５４】
上記で説明したように、これらの研究は主にマイクロサテライト遺伝子型決定をアレイチップ技術と組み合わせて利用して、ゲノム内の関心領域を調査する。
【００５５】
上述の研究に加えて、視覚系ホメオボックス遺伝子１（ＶＳＸ１）における突然変異は、ＫＣと診断された患者におけるこの遺伝子の標的検査を通じて特定されてきた。これまでにＶＳＸ１遺伝子に関して実施された研究は病原体を明確に特定しておらず、実際、多くの文献が矛盾する結果を提示している。例えば、Ｂｉｓｃｅｇｌｉａ，Ｌ．、Ｃｉａｓｃｈｅｔｔｉ，Ｍ．、Ｄｅ  Ｂｏｎｉｓ，Ｐ．、Ｃａｍｐｏ，Ｐ．Ａ．、Ｐｉｚｚｉｃｏｌｉ，Ｃ．、Ｓｃａｌａ，Ｃ．、Ｇｒｉｆａ，Ｍ．、Ｃｉａｖａｒｅｌｌａ，Ｐ．、Ｄｅｌｌｅ  Ｎｏｃｉ，Ｎ．、Ｖａｉｒａ，Ｆ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００５年、第４６巻第３９〜４５頁、Ｈｅｏｎ，Ｅ．、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａ．、Ｋｏｐｐ，Ｋ．Ｋ．、Ｒｏｏｔｍａｎ，Ｄ．、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ａ．Ｌ．、Ｂｉｌｌｉｎｇｓｌｅｙ，Ｇ．、Ｐｒｉｓｔｏｎ，Ｍ．、Ｄｏｒｖａｌ，Ｋ．Ｍ．、Ｃｈｏｗ，Ｒ．Ｌ．、ＭｃＩｎｎｅｓ，Ｒ．Ｒ．らによる、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２００２年、第１１巻第９号第１０２９〜１０３６頁、Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｇ．、Ｐｉｃｏｒｎｅｌｌ，Ｙ．、Ｓｕ，Ｘ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｙａｎｇ，Ｈ．およびＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．らによる、Ｃｏｒｎｅａ  ２００８年、第２７巻第１８９〜１９２頁、Ａｌｄａｖｅ，Ａ．Ｊ．、Ｙｅｌｌｏｒｅ，Ｖ．Ｓ．、Ｓａｌｅｍ，Ａ．Ｋ．、Ｙｏｏ，Ｇ．Ｌ．、Ｒａｙｎｅｒ，Ｓ．Ａ．、Ｙａｎｇ，Ｈ．、Ｔａｎｇ，Ｇ．Ｙ．、Ｐｉｃｏｎｅｌｌ，Ｙ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００６年、第４７巻第７号第２８２０〜２頁、Ｔａｎｗａｒ，Ｍ．、Ｋｕｍａｒ，Ｍ．、Ｎａｙａｋ，Ｂ．、Ｐａｔｈａｋ，Ｄ．、Ｓｈａｒｍａ，Ｎ．、Ｔｉｔｉｙａｌ，Ｊ．Ｓ．およびＤａｄａ，Ｒ．らによる、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２０１０年、第１６巻第２３９５〜２４０１頁、Ｍｏｋ，Ｌ．Ｗ．、Ｂａｅｋ，Ｓ．Ｊ．、Ｊｏｏ，Ｃ．Ｋ．らによる、Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２００８年、第５３巻第８４２〜８４９頁、Ｊｅｏｕｎｇ，Ｊ．Ｗ．、Ｋｉｍ，Ｍ．Ｋ．、Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｓ．、Ｋｉｍ，Ｓ．Ｙ．、Ｋｏ，Ｈ．Ｓ．、Ｗｏｎ  Ｒｙａｎｇ  Ｗｅｅ，Ｗ．Ｒ．、Ｊｉｎ  Ｈａｋ  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．らによる、Ｃｏｒｎｅａ  ２０１２年、第３１巻第７号第７４６〜７５０頁、Ｄｅｈｋｏｒｄｉ，Ｆ．Ａ．、Ｒａｓｈｋｉ，Ａ．、Ｂａｇｈｅｒｉ，Ｎ．、Ｃｈａｌｅｓｈｔｏｒｉ，Ｍ．Ｈ．、Ｍｅｍａｒｚａｄｅｈ，Ｅ．、Ｓａｌｅｈｉ，Ａ．、Ｇｈａｔｒｅｈ，Ｈ．、Ｚａｎｄｉ，Ｆ．、Ｙａｚｄａｎｐａｎａｈｉ，Ｎ．、Ｔａｂａｔａｂａｉｅｆａｒ，Ｍ．Ａ．、Ｃｈａｌｅｓｈｔｏｒｉ，Ｍ．Ｈらによる、Ｍｅｔｈｏｄ、Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ  ２０１３年、第５７巻第６４６〜６５１頁、Ｓａｅｅ−Ｒａｄ，Ｓ．、Ｈａｓｈｅｍｉ，Ｈ．、Ｍｉｒａｆｔａｂ，Ｍ．、Ｎｏｏｒｉ−Ｄａｌｏｉｉ，Ｍ．Ｒ．、Ｃｈａｌｅｓｈｔｏｒｉ，Ｍ．Ｈ．、Ｒａｏｏｆｉａｎ，Ｒ．、Ｊａｆａｒｉ，Ｆ．、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｗ．、Ｆａｋｈｒａｉｅ，Ｇ．、Ｒｅｚｖａｎ，Ｆ．、Ｈｅｉｄａｒｉ，Ｍ．らによる、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２０１１年、第１７巻第３１２８〜３１３６頁、Ｗａｎｇ，Ｙ．、Ｊｉ���，Ｔ．、Ｘ．Ｚｈａｎｇ，Ｘ．、Ｗｅｉ，Ｗ．、Ｃｕｉ，Ｙ．、Ｇｅｎｇ，Ｔ．、Ｌｉｕ，Ｑ．、Ｇａｏ，Ｊ．、Ｌｉｕ，Ｍ．、Ｃｈｅｎ，Ｃ．、Ｚｈａｎｇ，Ｃ．、Ｚｈｕ，Ｘ．らによる、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１３年、第３４巻第３号第１６０〜１６６頁、Ｄａｓｈ，Ｄ．Ｐ．、Ｓ  Ｇｅｏｒｇｅ，Ｓ．、Ｏ’Ｐｒｅｙ，Ｄ．、Ｂｕｒｎｓ，Ｄ．、Ｎａｂｉｌｉ，Ｓ．、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｕ．、Ｈｕｇｈｅｓ，Ａ．Ｅ．、Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ，Ｇ．、Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．、Ｆｒａｚｅｒ，Ｄ．、Ｈｅｏｎ，Ｅ．、Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｃ．Ｅ．らによる、Ｅｙｅ  ２０１０年、第２４巻第６号第１０８５〜１０９２頁を参照されたい。
【００５６】
ＫＣの病因におけるＶＳＸ１遺伝子の可能な役割について多くの調査が行われているが、これは解析の対象となる唯一の遺伝子ではない。
【００５７】
文献内で調査された遺伝子の中で最も顕著なのは、コラーゲンの構造に関連する様々な遺伝子である。コラーゲンはヒトの角膜の主要なタンパク質成分であり、様々なコラーゲンタンパク質をコードするコラーゲン遺伝子にはいくつかの種類がある。ここで興味深いのは、ＣＯＬ４Ａ３およびＣＯＬ４Ａ４（Ｓｔａｂｕｃ−Ｓｉｌｉｈ，Ｍ．、Ｒａｖｎｉｋ−Ｇｌａｖａｃ，Ｍ．、Ｇｌａｖａｃ，Ｄ．、Ｈａｗｌｉｎａ，Ｍ．、Ｓｔｒａｚｉｓａｒ  Ｍ．らによる、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２００９年、第１５巻第２８４８〜２８６０頁、Ｓｔａｂｕｃ−Ｓｉｌｉｈ，Ｍ．、Ｓｔｒａｚｉｓａｒ，Ｍ．、Ｒａｖｎｉｋ  Ｇｌａｖａｃ，Ｍ．、Ｈａｗｌｉｎａ、Ｇｌａｖａｃ，Ｄ．らによる、Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍａｔｏｖｅｎ  ＡＰＡ  ２０１０年、第１９巻第２号第３〜１０頁、Ｖｉｔａｒｔ，Ｖ．、Ｂｅｎｃｉｃ，Ｇ．、Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃ．、Ｈｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｈｕｆｆｍａｎ  Ｊ．、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．、Ｂｕｃａｎ，Ｋ．、Ｎａｖａｒｒｏ，Ｐ．、Ｇｕｎｊａｃａ，Ｇ．、Ｍａｒｉｎ，Ｊ．、Ｚｇａｇａ，Ｌ．、Ｋｏｌｃｉｃ，Ｉ．、Ｐｏｌａｓｅｋ，Ｏ．、Ｋｉｒｉｎ，Ｍ．、Ｈａｓｔｉｅ，Ｎ．Ｄ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．、Ｒｕｄａｎ，Ｉ．、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｈ．、Ｖａｔａｖｕｋ，Ｚ．、Ｆｌｅｃｋ，Ｂ．、Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．らによる、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１０年、第１９巻第２１号第４３０４〜４３１１頁）が２ｑ３６．３にマップされ（Ｖｉｔａｒｔ，Ｖ．、Ｂｅｎｃｉｃ，Ｇ．、Ｈａｙｗａｒｄ，Ｃ．、Ｈｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｓ．、Ｈｕｆｆｍａｎ  Ｊ．、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．、Ｂｕｃａｎ，Ｋ．、Ｎａｖａｒｒｏ，Ｐ．、Ｇｕｎｊａｃａ，Ｇ．、Ｍａｒｉｎ，Ｊ．、Ｚｇａｇａ，Ｌ．、Ｋｏｌｃｉｃ，Ｉ．、Ｐｏｌａｓｅｋ，Ｏ．、Ｋｉｒｉｎ，Ｍ．、Ｈａｓｔｉｅ，Ｎ．Ｄ．、Ｗｉｌｓｏｎ，Ｊ．Ｆ．、Ｒｕｄａｎ，Ｉ．、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｈ．、Ｖａｔａｖｕｋ，Ｚ．、Ｆｌｅｃｋ，Ｂ．、Ｗｒｉｇｈｔ，Ａ．らによる、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１０年、第１９巻第２１号第４３０４〜４３１１頁）、ＣＯＬ４Ａ１およびＣＯＬ４Ａ２が１３ｑ３２遺伝子座にマップされることである（Ｇａｊｅｃｋａ  Ｍ、Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａ  Ｕ、Ｗｉｎｔｅｒｓ  Ｄらによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００９年、第５０巻第１５３１〜１５３９頁、Ｃｚｕｇａｌａ，Ｍ．、Ｋａｒｏｌａｋ，Ｊ．Ａ．、Ｎｏｗａｋ，Ｄ．Ａ．らによる、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１２年、第２０巻第３８９〜３９７頁、Ｋａｒｏｌａｋ，Ｊ．Ａ．、Ｋｕｌｉｎｓｋａ，Ｋ．、Ｎｏｗａｋ，Ｄ．Ｍ．、Ｐｉｔａｒｑｕｅ，Ｊ．Ａ．、Ｍｏｌｉｎａｒｉ，Ａ．、Ｒｙｄｚａｎｉｃｚ，Ｍ．、Ｂｅｊｊａｎｉ，Ｂ．Ａ．、Ｇａｊｅｃｋａ，Ｍ．らによる、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２０１１年、第１７巻第８２７〜８４３頁）。ＣＯＬ４Ａ３およびＣＯＬ４Ａ４遺伝子に関連して、２００９年に発表された研究においてＳｔａｂｕｃ−Ｓｉｌｉｈらは、有意なｐ値を有するいくつかのＳＮＰを特定した。１０４人の血縁関係のない診断患者と１５７人の健康な献血者とを含むこの研究では、ＣＯＬ４Ａ４遺伝子中の対立遺伝��３９７９に位置する多型Ｍ１３２７Ｖのｐ値が＜０．０００１であり、点突然変異は、症例に対して２０８個の総対立遺伝子のうち１３４個であり、対照群に対して３１４個の対立遺伝子のうち１３２個であった（Ｓｔａｂｕｃ−Ｓｉｌｉｈ，Ｍ．、Ｒａｖｎｉｋ−Ｇｌａｖａｃ，Ｍ．、Ｇｌａｖａｃ，Ｄ．、Ｈａｗｌｉｎａ，Ｍ．、Ｓｔｒａｚｉｓａｒ  Ｍ．らによる、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２００９年、第１５巻第２８４８〜２８６０頁）。そうは言うものの、２０１０年に発行されたその後の論文において、Ｓｔａｂｕｃ−Ｓｉｌｉｈらは、ＣＯＬ４Ａ３およびＣＯＬ４Ａ４がＫＣの病因に有意な役割を果たすことを考慮していない（Ｓｔａｂｕｃ−Ｓｉｌｉｈ，Ｍ．、Ｓｔｒａｚｉｓａｒ，Ｍ．、Ｒａｖｎｉｋ  Ｇｌａｖａｃ，Ｍ．、Ｈａｗｌｉｎａ、Ｇｌａｖａｃ，Ｄ．らによる、Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍａｔｏｖｅｎ  ＡＰＡ  ２０１０年、第１９巻第２号第３〜１０頁）。
【００５８】
同様に、Ｋａｒｏｌａｋらは、エクアドル人家系内のＣＯＬ４Ａ１遺伝子およびＣＯＬ４Ａ２遺伝子に関する調査結果を立証しており、この研究には、１家系から２３人、他のエクアドル人家系から罹患者２５人、エクアドル人の対照被験者６４人が含まれていた（Ｋａｒｏｌａｋ，Ｊ．Ａ．、Ｋｕｌｉｎｓｋａ，Ｋ．、Ｎｏｗａｋ，Ｄ．Ｍ．、Ｐｉｔａｒｑｕｅ，Ｊ．Ａ．、Ｍｏｌｉｎａｒｉ，Ａ．、Ｒｙｄｚａｎｉｃｚ，Ｍ．、Ｂｅｊｊａｎｉ，Ｂ．Ａ．、Ｇａｊｅｃｋａ，Ｍ．らによる、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２０１１年、第１７巻第８２７〜８４３頁）。この研究では、重要なＣＯＬ４Ａ１およびＣＯＬ４Ａ２遺伝子内のいくつかの突然変異が特定された。例えば、ＣＯＬ４Ａ１遺伝子の４００２対立遺伝子に見られる多型Ｇｌｎ１３３４Ｈｉｓは、２３人（ｐ＝０．０５６）が検査された家系の健康な人よりも患者においてより頻繁に観察された。しかし、ｃに差はなかった。４００２Ａ＞Ｃの対立遺伝子は、残りのＫＣ家系から解析された罹患者とエクアドル人の対照被験者（ｐ＝０．１７）との間に分布していた。
【００５９】
上述の研究（Ｋａｒｏｌａｋ，Ｊ．Ａ．、Ｋｕｌｉｎｓｋａ，Ｋ．、Ｎｏｗａｋ，Ｄ．Ｍ．、Ｐｉｔａｒｑｕｅ，Ｊ．Ａ．、Ｍｏｌｉｎａｒｉ，Ａ．、Ｒｙｄｚａｎｉｃｚ，Ｍ．、Ｂｅｊｊａｎｉ，Ｂ．Ａ．、Ｇａｊｅｃｋａ，Ｍ．らによる、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２０１１年、第１７巻第８２７〜８４３頁）に関連して、Ｃｚｕｇａｌａらは、同じエクアドル人の家族群に関する研究を実施し、ＣＯＬ４Ａ１およびＣＯＬ４Ａ２以外の８つの候補遺伝子を明らかにした（Ｃｚｕｇａｌａ，Ｍ．、Ｋａｒｏｌａｋ，Ｊ．Ａ．、Ｎｏｗａｋ，Ｄ．Ａ．らによる、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１２年、第２０巻第３８９〜３９７頁）。これらの遺伝子は、ＭＢＮＬ１、ＩＰＯ５、ＦＡＲＰ１、ＲＮＦ１１３Ｂ、ＳＴＫ２４、ＤＯＣＫ９、ＺＩＣ５およびＺＩＣ２である。これらの８個の遺伝子内で９２個の配列変異体が特定された。この研究において参照される９２個の変異体のうち少なくとも４個は、ＫＣ表現型との統計的相関を示している。これらの遺伝子およびその関連するＳＮＰは１３ｑ３２遺伝子座に位置するが、この研究およびＣＯＬ４Ａ１およびＣＯＬ４Ａ２遺伝子を対象に実施された研究の両方の別の重要な側面は、結果が主にエクアドルの一家系の遺伝子解析から得られることである（Ｃｚｕｇａｌａ，Ｍ．、Ｋａｒｏｌａｋ，Ｊ．Ａ．、Ｎｏｗａｋ，Ｄ．Ａ．らによる、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１２年、第２０巻第３８９〜３９７頁）。
【００６０】
本明細書で参照される症例研究は、コラーゲン遺伝子の役割および角膜内でコラーゲン遺伝子が果たす役割をさらに解明し、ヒトゲノム内の重要なホットスポットであり得るゲノム上の位置である１３ｑ３２遺伝子座の役割を調査するために実施された（Ｇａｊｅｃｋａ  Ｍ、Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａ  Ｕ、Ｗｉｎｔｅｒｓ  Ｄらによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００９年、第５０巻第１５３１〜１５３９頁、および、Ｃｚｕｇａｌａ，Ｍ．、Ｋａｒｏｌａｋ，Ｊ．Ａ．、Ｎｏｗａｋ，Ｄ．Ａ．らによる、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１２年、第２０巻第３８９〜３９７頁）。ＫＣ患者において無秩序であることが知られているＣＯＬ４Ａ３およびＣＯＬ４Ａ４遺伝子は、染色体異常にさらされていることが多く、コラーゲン型ＩおよびＩＩＩの減少の原因ともなりかねず、これは、この疾患においてしばしば検出される特徴である（Ｃｒｉｔｃｈｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｗ．、Ｃａｌａｎｄｒａ，Ａ．Ｊ．、Ｎｅｓｂｕｒｎ，Ａ．Ｂ．、Ｋｅｎｎｅｙ，Ｍ．Ｃ．らによる、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  １９８８年、第４６巻第９５３〜６３頁、Ｋｅｎｎｅｙ，Ｍ．Ｃ．、Ｎｅｓｂｕｒｎ，Ａ．Ｂ、Ｂｕｒｇｅｓｏｎ，Ｒ．Ｅ．、Ｂｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．、Ｌｊｕｂｉｍｏｖ  Ａ．Ｖ．らによる、Ｃｏｒｎｅａ  １９９７年、第１６巻第３４５〜５１頁、Ｍｅｅｋ，Ｋ．Ｍ．、Ｔｕｆｔ，Ｓ．Ｊ．、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．、Ｇｉｌｌ  Ｐ．Ｓ．、Ｈａｙｅｓ，Ｓ．、Ｎｅｗｔｏｎ，Ｒ．Ｈ．、Ｂｒｏｎ，Ａ．Ｊ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００５年、第４６巻第１９４８〜５６頁、Ｂｏｃｈｅｒｔ，Ａ．、Ｂｅｒｌａｕ，Ｊ．、Ｋｏｃｚａｎ，Ｄ．、Ｓｅｉｔｚ，Ｂ．、Ｔｈｉｅｓｓｅｎ，Ｈ．Ｊ．、Ｇｕｔｈｏｆｆ，Ｒ．Ｆ．らによる、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｅ  ２００３年、第１００巻第５４５〜９頁、Ｓｔａｃｈｓ，Ｏ．、Ｂｏｃｈｅｒ，Ａ．、Ｇｅｒｂｅｒ，Ｔ．、Ｋｏｃｚａｎ，Ｄ．、Ｔｈｉｅｓｓｅｎ，Ｈ．Ｊ．、Ｇｕｔｈｏｆｆ，Ｒ．Ｆ．らによる、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｅ  ２００４年、第１０１巻第３８４〜９頁、Ｐｅｔｔｅｎａｔｉ，Ｍ．Ｊ、Ｓｗｅａｔｔ，Ａ．Ｊ．、Ｌａｎｔｚ，Ｐ．、Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｊ．、Ｒａｏ，Ｐ．Ｎ．、Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｍ．らによる、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９９７年、第１０１巻第２６〜９頁）。
【００６１】
家族性ＫＣとして標識されたＫＣのサブセットを定義する遺伝的連鎖の探索により、主に家系に応じて異なるＳＮＰ候補が特定される。例えば、遺伝子ＶＳＸ１は、いくつかの例外的な家族研究に基づく一次候補であると考えられた（Ｂｉｓｃｅｇｌｉａ，Ｌ．、Ｃｉａｓｃｈｅｔｔｉ，Ｍ．、Ｄｅ  Ｂｏｎｉｓ，Ｐ．、Ｃａｍｐｏ，Ｐ．Ａ．、Ｐｉｚｚｉｃｏｌｉ，Ｃ．、Ｓｃａｌａ，Ｃ．、Ｇｒｉｆａ，Ｍ．、Ｃｉａｖａｒｅｌｌａ，Ｐ．、Ｄｅｌｌｅ  Ｎｏｃｉ，Ｎ．、Ｖａｉｒａ，Ｆ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００５年、第４６巻第３９〜４５頁、Ｈｅｏｎ，Ｅ．、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａ．、Ｋｏｐｐ，Ｋ．Ｋ．、Ｒｏｏｔｍａｎ，Ｄ．、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ａ．Ｌ．、Ｂｉｌｌｉｎｇｓｌｅｙ，Ｇ．、Ｐｒｉｓｔｏｎ，Ｍ．、Ｄｏｒｖａｌ，Ｋ．Ｍ．、Ｃｈｏｗ，Ｒ．Ｌ．、ＭｃＩｎｎｅｓ，Ｒ．Ｒ．らによる、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２００２年、第１１巻第９号第１０２９〜１０３６頁）が、民族および地理的位置が異なる血縁関係のない個体を含むこの遺伝子を対象とした非家族に基づいた研究もまた実施されている。これらの研究は、ＶＳＸ１の役割をより良好に定義する遺伝子内の特異的ＳＮＰを特定しようとするものである（Ａｌｄａｖｅ，Ａ．Ｊ．、Ｙｅｌｌｏｒｅ，Ｖ．Ｓ．、Ｓａｌｅｍ，Ａ．Ｋ．、Ｙｏｏ，Ｇ．Ｌ．、Ｒａｙｎｅｒ，Ｓ．Ａ．、Ｙａｎｇ，Ｈ．、Ｔａｎｇ，Ｇ．Ｙ．、Ｐｉｃｏｎｅｌｌ，Ｙ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００６年、第４７巻第７号第２８２０〜２頁、Ｔａｎｗａｒ，Ｍ．、Ｋｕｍａｒ，Ｍ．、Ｎａｙａｋ，Ｂ．、Ｐａｔｈａｋ，Ｄ．、Ｓｈａｒｍａ，Ｎ．、Ｔｉｔｉｙａｌ，Ｊ．Ｓ．およびＤａｄａ，Ｒ．らによる、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２０１０年、第１６巻第２３９５〜２４０１頁、Ｍｏｋ，Ｌ．Ｗ．、Ｂａｅｋ，Ｓ．Ｊ．、Ｊｏｏ，Ｃ．Ｋ．らによる、Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２００８年、第５３巻第８４２〜８４９頁、Ｊｅｏｕｎｇ，Ｊ．Ｗ．、Ｋｉｍ，Ｍ．Ｋ．、Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｓ．、Ｋｉｍ，Ｓ．Ｙ．、Ｋｏ，Ｈ．Ｓ．、Ｗｏｎ  Ｒｙａｎｇ  Ｗｅｅ，Ｗ．Ｒ．、Ｊｉｎ  Ｈａｋ  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．らによる、Ｃｏｒｎｅａ  ２０１２年、第３１巻第７号第７４６〜７５０頁、Ｄｅｈｋｏｒｄｉ，Ｆ．Ａ．、Ｒａｓｈｋｉ，Ａ．、Ｂａｇｈｅｒｉ，Ｎ．、Ｃｈａｌｅｓｈｔｏｒｉ，Ｍ．Ｈ．、Ｍｅｍａｒｚａｄｅｈ，Ｅ．、Ｓａｌｅｈｉ，Ａ．、Ｇｈａｔｒｅｈ，Ｈ．、Ｚａｎｄｉ，Ｆ．、Ｙａｚｄａｎｐａｎａｈｉ，Ｎ．、Ｔａｂａｔａｂａｉｅｆａｒ，Ｍ．Ａ．、Ｃｈａｌｅｓｈｔｏｒｉ，Ｍ．Ｈらによる、Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ  ２０１３年、第５７巻第６４６〜６５１頁、Ｗａｎｇ，Ｙ．、Ｊｉｎ，Ｔ．、Ｘ．Ｚｈａｎｇ，Ｘ．、Ｗｅｉ，Ｗ．、Ｃｕｉ，Ｙ．、Ｇｅｎｇ，Ｔ．、Ｌｉｕ，Ｑ．、Ｇａｏ，Ｊ．、Ｌｉｕ，Ｍ．、Ｃｈｅｎ，Ｃ．、Ｚｈａｎｇ，Ｃ．、Ｚｈｕ，Ｘ．らによる、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１３年、第３４巻第３号第１６０〜１６６頁、Ｄａｓｈ，Ｄ．Ｐ．、Ｓ  Ｇｅｏｒｇｅ，Ｓ．、Ｏ’Ｐｒｅｙ，Ｄ．、Ｂｕｒｎｓ，Ｄ．、Ｎａｂｉｌｉ，Ｓ．、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｕ．、Ｈ���ｇｈｅｓ，Ａ．Ｅ．、Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ，Ｇ．、Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｊ．、Ｆｒａｚｅｒ，Ｄ．、Ｈｅｏｎ，Ｅ．、Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｃ．Ｅ．らによる、Ｅｙｅ  ２０１０年、第２４巻第６号第１０８５〜１０９２頁）。一般に、これらの研究による出版物は決定的ではなく、実際には、ＶＳＸ１遺伝子内に見られる特定の非同義的候補ＳＮＰの病因的役割には異議が唱えられている（Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｇ．、Ｐｉｃｏｒｎｅｌｌ，Ｙ．、Ｓｕ，Ｘ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｙａｎｇ，Ｈ．およびＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．らによる、Ｃｏｒｎｅａ  ２００８年、第２７巻第１８９〜１９２頁、Ａｌｄａｖｅ，Ａ．Ｊ．、Ｙｅｌｌｏｒｅ，Ｖ．Ｓ．、Ｓａｌｅｍ，Ａ．Ｋ．、Ｙｏｏ，Ｇ．Ｌ．、Ｒａｙｎｅｒ，Ｓ．Ａ．、Ｙａｎｇ，Ｈ．、Ｔａｎｇ，Ｇ．Ｙ．、Ｐｉｃｏｎｅｌｌ，Ｙ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００６年、第４７巻第７号第２８２０〜２頁、Ｔａｎｗａｒ，Ｍ．、Ｋｕｍａｒ，Ｍ．、Ｎａｙａｋ，Ｂ．、Ｐａｔｈａｋ，Ｄ．、Ｓｈａｒｍａ，Ｎ．、Ｔｉｔｉｙａｌ，Ｊ．Ｓ．およびＤａｄａ，Ｒ．らによる、ＶＳＸ１  ｇｅｎｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２０１０年、第１６巻第２３９５〜２４０１頁）。
【００６２】
家族関係のないＫＣは、開業医が見る疾患の最も一般的な形態である（Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．による、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｎ  Ａｍ．２００３年、第１６巻第４号第６０７〜６２０頁）。そうは言うものの、ＫＣの未検出形態のために、家族集積性が過少報告されている可能性がある。角膜形状解析法などの診断技術の最近の進歩は、疾患の他の形態が実際に遺伝するかどうかを十分に理解するのに役立つ場合がある。
【００６３】
ＶＳＸ１遺伝子を含む上述の研究（Ｂｉｓｃｅｇｌｉａ，Ｌ．、Ｃｉａｓｃｈｅｔｔｉ，Ｍ．、Ｄｅ  Ｂｏｎｉｓ，Ｐ．、Ｃａｍｐｏ，Ｐ．Ａ．、Ｐｉｚｚｉｃｏｌｉ，Ｃ．、Ｓｃａｌａ，Ｃ．、Ｇｒｉｆａ，Ｍ．、Ｃｉａｖａｒｅｌｌａ，Ｐ．、Ｄｅｌｌｅ  Ｎｏｃｉ，Ｎ．、Ｖａｉｒａ，Ｆ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００５年、第４６巻第３９〜４５頁、Ｈｅｏｎ，Ｅ．、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ，Ａ．、Ｋｏｐｐ，Ｋ．Ｋ．、Ｒｏｏｔｍａｎ，Ｄ．、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ａ．Ｌ．、Ｂｉｌｌｉｎｇｓｌｅｙ，Ｇ．、Ｐｒｉｓｔｏｎ，Ｍ．、Ｄｏｒｖａｌ，Ｋ．Ｍ．、Ｃｈｏｗ，Ｒ．Ｌ．、ＭｃＩｎｎｅｓ，Ｒ．Ｒ．らによる、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２００２年、第１１巻第９号第１０２９〜１０３６頁、Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｇ．、Ｐｉｃｏｒｎｅｌｌ，Ｙ．、Ｓｕ，Ｘ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｙａｎｇ，Ｈ．およびＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．らによる、Ｃｏｒｎｅａ  ２００８年、第２７巻第１８９〜１９２頁、Ａｌｄａｖｅ，Ａ．Ｊ．、Ｙｅｌｌｏｒｅ，Ｖ．Ｓ．、Ｓａｌｅｍ，Ａ．Ｋ．、Ｙｏｏ，Ｇ．Ｌ．、Ｒａｙｎｅｒ，Ｓ．Ａ．、Ｙａｎｇ，Ｈ．、Ｔａｎｇ，Ｇ．Ｙ．、Ｐｉｃｏｎｅｌｌ，Ｙ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００６年、第４７巻第７号第２８２０〜２頁、Ｔａｎｗａｒ，Ｍ．、Ｋｕｍａｒ，Ｍ．、Ｎａｙａｋ，Ｂ．、Ｐａｔｈａｋ，Ｄ．、Ｓｈａｒｍａ，Ｎ．、Ｔｉｔｉｙａｌ，Ｊ．Ｓ．およびＤａｄａ，Ｒ．らによる、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２０１０年、第１６巻第２３９５〜２４０１頁、Ｍｏｋ，Ｌ．Ｗ．、Ｂａｅｋ，Ｓ．Ｊ．、Ｊｏｏ，Ｃ．Ｋ．らによる、Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２００８年、第５３巻第８４２〜８４９頁、Ｊｅｏｕｎｇ，Ｊ．Ｗ．、Ｋｉｍ，Ｍ．Ｋ．、Ｐａｒｋ，Ｓ．Ｓ．、Ｋｉｍ，Ｓ．Ｙ．、Ｋｏ，Ｈ．Ｓ．、Ｗｏｎ  Ｒｙａｎｇ  Ｗｅｅ，Ｗ．Ｒ．、Ｊｉｎ  Ｈａｋ  Ｌｅｅ，Ｊ．Ｈ．らによる、ＶＳＸ１  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ：Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｋｏｒｅａｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ、Ｃｏｒｎｅａ  ２０１２年、第３１巻第７号第７４６〜７５０頁、Ｄｅｈｋｏｒｄｉ，Ｆ．Ａ．、Ｒａｓｈｋｉ，Ａ．、Ｂａｇｈｅｒｉ，Ｎ．、Ｃｈａｌｅｓｈｔｏｒｉ，Ｍ．Ｈ．、Ｍｅｍａｒｚａｄｅｈ，Ｅ．、Ｓａｌｅｈｉ，Ａ．、Ｇｈａｔｒｅｈ，Ｈ．、Ｚａｎｄｉ，Ｆ．、Ｙａｚｄａｎｐａｎａｈｉ，Ｎ．、Ｔａｂａｔａｂａｉｅｆａｒ，Ｍ．Ａ．、Ｃｈａｌｅｓｈｔｏｒｉ，Ｍ．Ｈらによる、Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌｏｇｉｃａ  ２０１３年、第５７巻第６４６〜６５１頁、Ｓａｅｅ−Ｒａｄ，Ｓ．、Ｈａｓｈｅｍｉ，Ｈ．、Ｍｉｒａｆｔａｂ，Ｍ．、Ｎｏｏｒｉ−Ｄａｌｏｉｉ，Ｍ．Ｒ．、Ｃｈａｌｅｓｈｔｏｒｉ，Ｍ．Ｈ．、Ｒａｏｏｆｉａｎ，Ｒ．、Ｊａｆａｒｉ，Ｆ．、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｗ．、Ｆａｋｈｒａｉｅ，Ｇ．、Ｒｅｚｖａｎ，Ｆ．、Ｈｅｉｄａｒｉ，Ｍ．らによる、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２０１１年、第１７巻第３１２８〜３１３６頁、Ｗａｎｇ，Ｙ．、Ｊｉｎ，Ｔ．、Ｘ．Ｚｈａｎｇ，Ｘ．、Ｗｅｉ，Ｗ．、Ｃｕｉ，Ｙ．、Ｇｅｎｇ，Ｔ．、Ｌｉｕ，Ｑ．、Ｇａｏ，Ｊ．、Ｌｉｕ，Ｍ．、Ｃｈｅｎ，Ｃ．、Ｚｈａｎｇ，��．、Ｚｈｕ，Ｘ．らによる、Ｃｏｍｍｏｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｋｅｒａｔｏｃｏｎｕｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈａｎ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０１３年、第３４巻第３号第１６０〜１６６頁）および様々なＣＯＬ遺伝子（Ｓｔａｂｕｃ−Ｓｉｌｉｈ，Ｍ．、Ｒａｖｎｉｋ−Ｇｌａｖａｃ，Ｍ．、Ｇｌａｖａｃ，Ｄ．、Ｈａｗｌｉｎａ，Ｍ．、Ｓｔｒａｚｉｓａｒ  Ｍ．らによる、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２００９年、第１５巻第２８４８〜２８６０頁、Ｓｔａｂｕｃ−Ｓｉｌｉｈ，Ｍ．、Ｓｔｒａｚｉｓａｒ，Ｍ．、Ｒａｖｎｉｋ  Ｇｌａｖａｃ，Ｍ．、Ｈａｗｌｉｎａ、Ｇｌａｖａｃ，Ｄ．らによる、Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍａｔｏｖｅｎ  ＡＰＡ  ２０１０年、第１９巻第２号第３〜１０頁、Ｋａｒｏｌａｋ，Ｊ．Ａ．、Ｋｕｌｉｎｓｋａ，Ｋ．、Ｎｏｗａｋ，Ｄ．Ｍ．、Ｐｉｔａｒｑｕｅ，Ｊ．Ａ．、Ｍｏｌｉｎａｒｉ，Ａ．、Ｒｙｄｚａｎｉｃｚ，Ｍ．、Ｂｅｊｊａｎｉ，Ｂ．Ａ．、Ｇａｊｅｃｋａ，Ｍ．らによる、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２０１１年、第１７巻第８２７〜８４３頁、Ｃｒｉｔｃｈｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｗ．、Ｃａｌａｎｄｒａ，Ａ．Ｊ．、Ｎｅｓｂｕｒｎ，Ａ．Ｂ．、Ｋｅｎｎｅｙ，Ｍ．Ｃ．らによる、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ  １９８８年、第４６巻第９５３〜６３頁、Ｋｅｎｎｅｙ，Ｍ．Ｃ．、Ｎｅｓｂｕｒｎ，Ａ．Ｂ、Ｂｕｒｇｅｓｏｎ，Ｒ．Ｅ．、Ｂｕｔｋｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．、Ｌｊｕｂｉｍｏｖ  Ａ．Ｖ．らによる、Ｃｏｒｎｅａ  １９９７年、第１６巻第３４５〜５１頁、Ｍｅｅｋ，Ｋ．Ｍ．、Ｔｕｆｔ，Ｓ．Ｊ．、Ｈｕａｎｇ，Ｙ．、Ｇｉｌｌ  Ｐ．Ｓ．、Ｈａｙｅｓ，Ｓ．、Ｎｅｗｔｏｎ，Ｒ．Ｈ．、Ｂｒｏｎ，Ａ．Ｊ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００５年、第４６巻第１９４８〜５６頁、Ｂｏｃｈｅｒｔ，Ａ．、Ｂｅｒｌａｕ，Ｊ．、Ｋｏｃｚａｎ，Ｄ．、Ｓｅｉｔｚ，Ｂ．、Ｔｈｉｅｓｓｅｎ，Ｈ．Ｊ．、Ｇｕｔｈｏｆｆ，Ｒ．Ｆ．らによる、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｅ  ２００３年、第１００巻第５４５〜９頁、Ｓｔａｃｈｓ，Ｏ．、Ｂｏｃｈｅｒ，Ａ．、Ｇｅｒｂｅｒ，Ｔ．、Ｋｏｃｚａｎ，Ｄ．、Ｔｈｉｅｓｓｅｎ，Ｈ．Ｊ．、Ｇｕｔｈｏｆｆ，Ｒ．Ｆ．らによる、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｅ  ２００４年、第１０１巻第３８４〜９頁、Ｐｅｔｔｅｎａｔｉ，Ｍ．Ｊ、Ｓｗｅａｔｔ，Ａ．Ｊ．、Ｌａｎｔｚ，Ｐ．、Ｓｔａｎｔｏｎ，Ｃ．Ａ．、Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｊ．、Ｒａｏ，Ｐ．Ｎ．、Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｍ．らによる、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  １９９７年、第１０１巻第２６〜９頁、Ｌｉ，Ｘ．、Ｂｙｋｈｏｖｓｋａｙａ，Ｙ．、Ｃａｉａｄｏ  Ｃａｎｅｄｏ，Ａ．Ｌ．、Ｈａｒｉｔｕｎｉａｎｓ，Ｔ．、Ｓｉｓｃｏｖｉｃｋ，Ｄ．、Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｊ．Ａｌｄａｖｅ，Ａ．Ｊ．、Ｓｚｃｚｏｔｋａ−Ｆｌｙｎｎ，Ｌ．、Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｓ．Ｋ．、Ｒｏｔｔｅｒ，Ｊ．Ｉ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｄ．、Ｙａｒｏｎ  Ｓ．Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２０１３年、第５４巻第２６９６〜２７０４頁）は、遺伝子内の突然変異が疾患の表現型に関与している可能性があるほんの数��である。これらの研究は、主に目的の１個または２個の遺伝子の構造および機能に焦点を当てており、その際、疾患の原因に関与する可能性のあるゲノム内の他の遺伝子突然変異の可能性を見落としている。文献の多くは、ＫＣは遺伝的に複雑な疾患であると明記しており（Ｂｉｓｃｅｇｌｉａ  Ｌ、Ｄｅ  Ｂｏｎｉｓ  Ｐ、Ｐｉｚｚｉｃｏｌｉ  Ｃらによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００９年、第５０巻第１０８１〜１０８６頁、Ｔａｎｇ  ＹＧ、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ＹＳ、Ｔａｙｌｏｒ  ＫＤらによる、Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｄ  ２００５年、第７巻第３９７〜４０５頁、Ｌｉ，Ｘ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．、Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｇ．、Ｐｉｃｏｒｎｅｌｌ，Ｙ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｄ．、Ｈｕ，Ｍ．、Ｙａｎｇ，Ｈ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００６年、第４７巻第３７９１〜３７９５頁、Ｌｉｓｋｏｖａ  Ｐ、Ｈｙｓｉ  ＰＧ、Ｗａｓｅｅｍ  Ｎ、Ｅｂｅｎｅｚｅｒ  ＮＤらによる、Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２０１０年、第１２８巻第１１９１−１１９５頁、Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｊ．、Ｈａｕｓｅｒ，Ｍ．Ａ．、Ａｆｓｈａｒｉ，Ｎ．Ａ．、Ａｌｌｉｎｇｈａｍ，Ｒ．Ｒ．、Ｌｉｕ，Ｙ．らによる、Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｓｙｓ  Ｓｅｘｕａｌ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２０１２年、Ｓ：６、Ｎｏｗａｋ，Ｄ．、Ｇａｊｅｃｋａ，Ｍ．らによる、Ｍｉｄｄｌｅ  Ｅａｓｔ  Ａｆｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２０１１年、第１８巻第１号第２〜６頁、Ｂｕｒｄｏｎ，Ｋ．Ｐ．およびＶｉｎｃｅｎｔ，Ａ．Ｌ．らによる、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｔｏｍ  ２０１３年、第９６巻第１４６〜１５４頁）、複数の遺伝子内の複数の突然変異を暗示している。ＨＧＦおよびＬＯＸ遺伝子は、ＫＣと診断された患者において有意であると特定されたＳＮＰを含む（Ｂｕｒｄｏｎ，Ｋ．Ｐ．、Ｍａｃｇｒｅｇｏｒ，Ｓ．、Ｂｙｋｈｏｖｓｋａｙａ，Ｙ．、Ｊａｖａｄｉｙａｎ，Ｓ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｌａｕｒｉｅ，Ｋ．Ｊ．、Ｍｕｓｚｙｎｓｋａ，Ｄ．、Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｒ．、Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｊ．、Ｈａｒｉｔｕｎｉａｎｓ，Ｔ．、Ｈｅｎｄｅｒｓ，Ａ．Ｋ．、Ｄａｓｈ，Ｄ．、Ｓｉｓｃｏｖｉｃｋ，Ｄ．、Ａｎａｎｄ，Ｓ．、Ａｌｄａｖｅ，Ａ．、Ｃｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．、Ｓｚｃｚｏｔｋａ−Ｆｌｙｎｎ，Ｌ．、Ｍｉｌｌｓ，Ｒ．Ａ．、Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｓ．Ｋ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｄ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｔ．、Ｇｒａｎｔ  Ｗ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｇ．Ｗ．、Ｒｏｔｔｅｒ，Ｊ．Ｉ．、Ｈｅｗｉｔｔ，Ａ．Ｗ．、Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．、Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｃ．、Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｅ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２０１１年、第５２巻第１１号第８５１４〜８５１９頁、Ｓａｈｅｂｊａｄａ，Ｓ．、Ｓｃｈａｃｈｅ，Ｍ．、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ａ．Ｊ．、Ｓｎｉｂｓｏｎ，Ｇ．、Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｍ．、Ｂａｉｒｄ，Ｐ．Ｎ．らによる、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１４年、第９巻第１号、Ｄｕｄａｋｏｖａ，Ｌ．、Ｐａｌｏｓ，Ｍ．、Ｊｉｒｓｏｖａ，Ｋ．、Ｓｔｒａｎｅｃｋｙ，Ｖ．、Ｋｒｅｐｅｌｏｖａ，Ａ．、Ｈｙｓｉ  Ｐ．Ｇ．、Ｌｉｓｋｏｖａ，Ｐ．らによる、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１５年、Ｂｙｋｈｏｖｓｋａｙａ，Ｙ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｅｐｉｆａｎｔｓｅｖａ，Ｉ．、Ｈａｒｉｔｕｎｉａｎｓ，Ｔ．、Ｓｉｓｃｏｖｉｃｋ，Ｄ．、Ａｌｄａｖｅ，Ａ．、Ｓｚｃｚｏｔｋａ−Ｆｌｙｎｎ，Ｌ．、Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｓ．Ｋ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｄ．、Ｒｏｔｔｅｒ，Ｊ．Ｉ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２０１２年、第５３巻第７号第４１５２〜４１５７頁、Ｈａｏ  ＸＤ１、Ｃｈｅｎ  Ｐ、Ｃｈｅｎ  ＺＬ、Ｌｉ  ＳＸ、Ｗａｎｇ  Ｙ．らによる、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１５年、第３６巻第２号第１３２〜１３６頁）。
【００６４】
ＨＧＦ遺伝子は、３つの細胞層全てによって角膜において発現することが知られている（Ｗｉｌｓｏｎ  ＳＥ、Ｗａｌｋｅｒ  ＪＷ、Ｃｈｗａｎｇ  ＥＬ、Ｈｅ  ＹＧらによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．１９９３年、第３４巻第８号第２５４４〜２５６１頁）。タンパク質は涙腺においても産生され、角膜の角化細胞におけるＨＧＦ発現は角膜損傷に反応して亢進し、上皮創傷の治癒過程への関与が示唆される（Ｂｕｒｄｏｎ，Ｋ．Ｐ．、Ｍａｃｇｒｅｇｏｒ，Ｓ．、Ｂｙｋｈｏｖｓｋａｙａ，Ｙ．、Ｊａｖａｄｉｙａｎ，Ｓ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｌａｕｒｉｅ，Ｋ．Ｊ．、Ｍｕｓｚｙｎｓｋａ，Ｄ．、Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｒ．、Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｊ．、Ｈａｒｉｔｕｎｉａｎｓ，Ｔ．、Ｈｅｎｄｅｒｓ，Ａ．Ｋ．、Ｄａｓｈ，Ｄ．、Ｓｉｓｃｏｖｉｃｋ，Ｄ．、Ａｎａｎｄ，Ｓ．、Ａｌｄａｖｅ，Ａ．、Ｃｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．、Ｓｚｃｚｏｔｋａ−Ｆｌｙｎｎ，Ｌ．、Ｍｉｌｌｓ，Ｒ．Ａ．、Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｓ．Ｋ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｄ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｔ．、Ｇｒａｎｔ  Ｗ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｇ．Ｗ．、Ｒｏｔｔｅｒ，Ｊ．Ｉ．、Ｈｅｗｉｔｔ，Ａ．Ｗ．、Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．、Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｃ．、Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｅ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２０１１年、第５２巻第１１号第８５１４〜８５１９頁、Ｌｉ  Ｑ、Ｗｅｎｇ  Ｊ、Ｍｏｈａｎ  ＲＲらによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．１９９６年、第３７巻第５号第７２７〜７３９頁）。さらに、ＨＧＦ遺伝子に関連する特定のＳＮＰは、遠視および近視と相関があり（Ｙａｎｏｖｉｔｃｈ，Ｔ．、Ｌｉ，Ｙ．Ｊ．、Ｍｅｔｌａｐａｌｌｙ，Ｒ．、Ａｂｂｏｔｔ，Ｄ．、Ｔｒａｎ  Ｖｉｅｔ，Ｋ．Ｎ．、Ｙｏｕｎｇ，Ｔ．Ｌ．らによる、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２００９年、第１５巻第１０２８〜１０３５頁、Ｖｅｅｒａｐｐａｎ，Ｓ．、Ｐｅｒｔｉｌｅ，Ｋ．Ｋ．、Ｉｓｌａｍ，Ａ．Ｆ．、Ｓｃｈａｃｈｅ，Ｍ．、Ｃｈｅｎ，Ｃ．Ｙ．、Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｐ．、Ｄｉｒａｎｉ，Ｍ．、Ｂａｉｒｄ，Ｐ．Ｎ．らによる、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ２０１０年、第１１７巻第２号第２３９〜２４５頁）、原発閉塞隅角緑内障（ＰＡＣＧ）と相関がある（Ａｗａｄａｌｌａ，Ｍ．Ｓ．、Ｔｈａｐａ，Ｓ．Ｓ．、Ｂｕｒｄｏｎ，Ｋ．Ｐ．、Ｈｅｗｉｔｔ，Ａ．Ｗ．、Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｅ．、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  ２０１１；  １７：２２４８−２２５４）。
【００６５】
これらの様々な眼の状態に関連していることが判明したＳＮＰのサブセットは、ＫＣ患者のゲノムにも見られた（Ｂｕｒｄｏｎ，Ｋ．Ｐ．、Ｍａｃｇｒｅｇｏｒ，Ｓ．、Ｂｙｋｈｏｖｓｋａｙａ，Ｙ．、Ｊａｖａｄｉｙａｎ，Ｓ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｌａｕｒｉｅ，Ｋ．Ｊ．、Ｍｕｓｚｙｎｓｋａ，Ｄ．、Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｒ．、Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｊ．、Ｈａｒｉｔｕｎｉａｎｓ，Ｔ．、Ｈｅｎｄｅｒｓ，Ａ．Ｋ．、Ｄａｓｈ，Ｄ．、Ｓｉｓｃｏｖｉｃｋ，Ｄ．、Ａｎａｎｄ，Ｓ．、Ａｌｄａｖｅ，Ａ．、Ｃｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．、Ｓｚｃｚｏｔｋａ−Ｆｌｙｎｎ，Ｌ．、Ｍｉｌｌｓ，Ｒ．Ａ．、Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｓ．Ｋ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｄ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｔ．、Ｇｒａｎｔ  Ｗ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｇ．Ｗ．、Ｒｏｔｔｅｒ，Ｊ．Ｉ．、Ｈｅｗｉｔｔ，Ａ．Ｗ．、Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．、Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｃ．、Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｅ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２０１１年、第５２巻第１１号第８５１４〜８５１９頁）。
【００６６】
眼におけるＨＧＦタンパク質の役割に関して、Ｂｕｒｄｏｎらは、「眼の屈折力は、角膜の形状によって少なくとも部分的に決定され、角膜の形状はＫＣにおいて大きく変化しているため、これらの複雑な眼の状態の遺伝子決定基間の重複を示唆している」と述べている（Ｂｕｒｄｏｎ，Ｋ．Ｐ．、Ｍａｃｇｒｅｇｏｒ，Ｓ．、Ｂｙｋｈｏｖｓｋａｙａ，Ｙ．、Ｊａｖａｄｉｙａｎ，Ｓ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｌａｕｒｉｅ，Ｋ．Ｊ．、Ｍｕｓｚｙｎｓｋａ，Ｄ．、Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｒ．、Ｌｅｃｈｎｅｒ，Ｊ．、Ｈａｒｉｔｕｎｉａｎｓ，Ｔ．、Ｈｅｎｄｅｒｓ，Ａ．Ｋ．、Ｄａｓｈ，Ｄ．、Ｓｉｓｃｏｖｉｃｋ，Ｄ．、Ａｎａｎｄ，Ｓ．、Ａｌｄａｖｅ，Ａ．、Ｃｏｓｔｅｒ，Ｄ．Ｊ．、Ｓｚｃｚｏｔｋａ−Ｆｌｙｎｎ，Ｌ．、Ｍｉｌｌｓ，Ｒ．Ａ．、Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｓ．Ｋ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｄ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｔ．、Ｇｒａｎｔ  Ｗ．Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，Ｇ．Ｗ．、Ｒｏｔｔｅｒ，Ｊ．Ｉ．、Ｈｅｗｉｔｔ，Ａ．Ｗ．、Ｓｈａｒｍａ，Ｓ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．、Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｃ．、Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｅ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２０１１年、第５２巻第１１号第８５１４〜８５１９頁、）。ＨＧＦ遺伝子がＫＣに関連していることを検証する文献内で公開された、少なくとも２つの研究が存在する（Ｓａｈｅｂｊａｄａ，Ｓ．、Ｓｃｈａｃｈｅ，Ｍ．、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ａ．Ｊ．、Ｓｎｉｂｓｏｎ，Ｇ．、Ｄａｎｉｅｌｌ，Ｍ．、Ｂａｉｒｄ，Ｐ．Ｎ．らによる、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ２０１４年、第９巻第１号、Ｄｕｄａｋｏｖａ，Ｌ．、Ｐａｌｏｓ，Ｍ．、Ｊｉｒｓｏｖａ，Ｋ．、Ｓｔｒａｎｅｃｋｙ，Ｖ．、Ｋｒｅｐｅｌｏｖａ，Ａ．、Ｈｙｓｉ  Ｐ．Ｇ．、Ｌｉｓｋｏｖａ，Ｐ．らによる、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１５年）。
【００６７】
ＬＯＸは、角膜を含む様々な組織においてコラーゲンとエラスチンとの架橋を開始する酵素をコードする（Ｈａｍａｌａｉｎｅｎ，Ｅ．Ｒ、Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．、Ｓｈｅｅｒ，Ｄ．、Ｔａｓｋｉｎｅｎ，Ｋ．、Ｐｉｈｌａｊａｎｅｍｉ，Ｔ．、Ｋｉｖｉｒｉｋｋｏ，Ｋ．Ｉ．らによる、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１９９１年、第１１巻第５０８〜５１６頁）。Ｌｉらは、ＬＯＸ遺伝子が位置する５ｑ２３．２遺伝子座を含むいくつかの遺伝子座をＫＣにマップする全ゲノム連鎖解析を実行した（Ｌｉ，Ｘ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．、Ｔａｎｇ，Ｙ．Ｇ．、Ｐｉｃｏｒｎｅｌｌ，Ｙ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｄ．、Ｈｕ，Ｍ．、Ｙａｎｇ，Ｈ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００６年、第４７巻第３７９１〜３７９５頁）。さらに、マイクロアレイ上のＫＣ上皮を解析した研究では、ＬＯＸの発現レベルが亢進することが判明した（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｋ．、Ｂｉｒｋｅｎｋａｍｐ−Ｄｅｍｔｒｏｄｅｒ，Ｋ．、Ｅｈｌｅｒｓ，Ｎ．、Ｏｒｎｔｏｆｔ，Ｔ．Ｆ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２００３年、第４４巻第２４６６〜２４７６頁）。Ｂｙｋｈｏｖｓｋａｙａらは、ＫＣおよび対照群とＫＣ家系とを持つ患者の２つの独立した集団に関する研究において、ＫＣに関連するこの遺伝子内に少なくとも４つのＳＮＰを発見した（Ｂｙｋｈｏｖｓｋａｙａ，Ｙ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｅｐｉｆａｎｔｓｅｖａ，Ｉ．、Ｈａｒｉｔｕｎｉａｎｓ，Ｔ．、Ｓｉｓｃｏｖｉｃｋ，Ｄ．、Ａｌｄａｖｅ，Ａ．、Ｓｚｃｚｏｔｋａ−Ｆｌｙｎｎ，Ｌ．、Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｓ．Ｋ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｄ．、Ｒｏｔｔｅｒ，Ｊ．Ｉ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２０１２年、第５３巻第７号第４１５２〜４１５７頁）。この研究は、ｒｓ２９５６５４０  ＳＮＰがヨーロッパ系の母集団におけるＫＣに関連していることが判明した群において再現され（Ｄｕｄａｋｏｖａ，Ｌ．、Ｐａｌｏｓ，Ｍ．、Ｊｉｒｓｏｖａ，Ｋ．、Ｓｔｒａｎｅｃｋｙ，Ｖ．、Ｋｒｅｐｅｌｏｖａ，Ａ．、Ｈｙｓｉ  Ｐ．Ｇ．、Ｌｉｓｋｏｖａ，Ｐ．らによる、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１５年）、さらに、漢民族の母集団に対して実施された研究において（Ｈａｏ  ＸＤ１、Ｃｈｅｎ  Ｐ、Ｃｈｅｎ  ＺＬ、Ｌｉ  ＳＸ、Ｗａｎｇ  Ｙ．、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｇｅｎｅｔ  ２０１５年、第３６巻第２号第１３２〜１３６頁）再現された。
【００６８】
リボフラビン／紫外線Ａ波誘発角膜コラーゲン架橋結合（ＣＸＬ）は、ＫＣ患者の一般的な治療形態になっているので（Ａｓｈｗｉｎ，Ｐ．Ｔ．、ＭｃＤｏｎｎｅｌｌ，Ｐ．Ｊ．らによる、Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋａｇｅ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｆｕｔｕｒｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．、Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１０年、第９４巻第９６５〜９７０頁）、角膜においてコラーゲン架橋結合を引き起こす分子経路をコードするＬＯＸなどの遺伝子に関心が集まっている。ＫＣ患者内のＬＯＸ遺伝子の遺伝子型を知ることは、ＣＸＬ治療の結果に意味を持ち、洞察力を提供すると考えられている（Ｂｙｋｈｏｖｓｋａｙａ，Ｙ．、Ｌｉ，Ｘ．、Ｅｐｉｆａｎｔｓｅｖａ，Ｉ．、Ｈａｒｉｔｕｎｉａｎｓ，Ｔ．、Ｓｉｓｃｏｖｉｃｋ，Ｄ．、Ａｌｄａｖｅ，Ａ．、Ｓｚｃｚｏｔｋａ−Ｆｌｙｎｎ，Ｌ．、Ｉｙｅｎｇａｒ，Ｓ．Ｋ．、Ｔａｙｌｏｒ，Ｋ．Ｄ．、Ｒｏｔｔｅｒ，Ｊ．Ｉ．、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ，Ｙ．Ｓ．らによる、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２０１２年、第５３巻第７号第４１５２〜４１５７頁）。
【００６９】
一態様では、本開示は、ゲノム試料を単離して一塩基多型検出を特定し、かつ検証する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ゲノム試料は、単離細胞、全血、血清、血漿、尿、唾液、汗、排泄物および涙からなる群から選択されてもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ゲノム試料は血漿もしくは血清であり、この方法は、被験者の血液試料から血漿もしくは血清を単離することをさらに含む。
【００７１】
いくつかの実施形態では、方法は、被験者からの細胞の試料を提供することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、被験者の細胞表面を、細胞を基質上に可逆的に固定化することが可能な基質と接触させることによって収集される。
【００７２】
開示された方法は、様々な試料から得られた様々な細胞型に適用可能である。いくつかの実施形態では、開示された方法で使用するための細胞型には、上皮細胞、内皮細胞、結合組織細胞、骨格筋細胞、内分泌細胞、心臓細胞、尿細胞、メラニン細胞、角化細胞、血液細胞、白血球、軟膜、有毛細胞（例えば、毛根細胞を含む）および／または唾液細胞が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、細胞は上皮細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、被膜下血管周囲細胞（上皮型１）、淡細胞（上皮型２）、中間細胞（上皮型３）、暗細胞（上皮型４）、未分化細胞（上皮型５）、大髄質細胞（上皮型６）である。いくつかの実施形態では、細胞は口腔上皮細胞（例えば、口腔スワブを使用して収集された上皮細胞）である。いくつかの実施形態では、開示された方法において使用される細胞の試料には、上記で特定された細胞型の任意の組み合わせが含まれる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、方法は、被験者からの細胞の試料を提供することを含む。いくつかの実施形態では、提供される細胞は口腔上皮細胞である。
【００７４】
細胞試料は、被験者の細胞の基質への可逆的結合を可能にする任意の様々な方法によって収集される。いくつかの実施形態では、細胞を基質に可逆的に結合するために、基質は、被験者の細胞を含む試料との物理的相互作用に使用される。いくつかの実施形態では、細胞を基質に可逆的に結合するために、基質は、被験者の身体との物理的相互作用に直接使用される。いくつかの実施形態では、試料は口腔細胞の試料であり、口腔細胞の試料は、被験者の口腔膜（例えば、頬の内側）を、膜から除去される細胞を可逆的に固定化することが可能な基質と接触させることによって収集される。このような実施形態では、スワブは、人の歯を磨くのと同等の力（例えば、軽い力もしくは圧力）で被験者の頬の内側に擦り付けられる。被験者の細胞を基質に可逆的に結合させることを可能にする任意の方法が、開示された方法での使用のために想定される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、試料は、非侵襲的な方法で有利に収集される。そのため、試料の収集は、あらゆる場所でほとんど誰によっても達成される。例えばいくつかの実施形態では、試料は、診療所、被験者の自宅、また医療処置が施されているかまたは施される予定の施設で収集される。いくつかの実施形態では、被験者、被験者の医師、看護師、医師の助手または他の臨床職員が試料を収集する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、基質は、細胞が可逆的に結合された様々な材料のいずれかで作られている。例示的な基質には、レーヨン、綿、シリカ、エラストマー、セラック、アンバー、天然もしくは合成のゴム、セルロース、ベークライト、ナイロン、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、または他の材料もしくはそれらの組合せで作られたものが含まれる。いくつかの実施形態では、基質は、レーヨンチップまたは綿チップを有するスワブである。
【００７７】
いくつかの実施形態では、試料を含む基質は１回以上凍結融解され（例えば、凍結された後、試料を含む基質が融解し、本方法に従って使用されて再凍結され）るか、または本方法において使用される。
【００７８】
別の態様では、様々な溶菌液が記載されており、当業者に知られている。核酸を試料から単離するために、これらの周知の溶菌液のいずれかを本方法とともに採用することができる。例示的な溶菌液には、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（登録商標）および他の製造業者によって販売されるものなどの市販のもの、ならびに研究環境における熟練者によって生成することができるものが含まれる。溶菌緩衝液もまた十分に説明され、様々な溶菌緩衝液は、開示された方法で用途を見出すことができ、この方法は例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（全３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０１２年）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３年〜２０１３年）に開示されており、これらは両方とも、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
細胞溶菌は、核酸を細胞内から回収するために一般に行われる方法である。多くの場合、細胞は溶菌液、一般に界面活性剤を含むアルカリ溶液、または溶菌酵素の溶液と接触する。このような溶菌液は、一般的には塩、界面活性剤および緩衝剤、ならびに当業者が理解して使用する他の薬剤を含む。完全溶菌および／または部分的溶菌の後、核酸は溶菌液から回収される。
【００８０】
いくつかの実施形態では、細胞は、ｐＨが約ｐＨ４〜約１０、約５〜約９、約６〜約８または約７〜約９の範囲である水性緩衝液に再懸濁される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、緩衝塩濃度は、約１０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約８０ｍＭである。
【００８２】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）またはエチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）などのキレート剤をさらに含む。
【００８３】
いくつかの実施形態では、溶菌液は、蔗糖、およびマルチトール、ソルビトール、キシリトール、エリスリトールおよび／またはイソマルトなどの糖アルコールを含むがこれらに限定されないポリオールなどの細胞からの核酸放出に役立つ他の化合物をさらに含む。いくつかの実施形態では、ポリオールは、約２％〜約１５％ｗ／ｗ、約５％〜約１５％ｗ／ｗまたは約５％〜約１０％ｗ／ｗの範囲にある。
【００８４】
いくつかの実施形態では、溶菌液は、例えば限定ではないが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＳＤＳ、ＣＴＡＢ、Ｘ−１１４、ＣＨＡＰＳ、ＤＯＣおよび／またはＮＰ−４０などの界面活性剤をさらに含む。いくつかの実施形態では、このような界面活性剤は、約１％〜約５％ｗ／ｗ、約１％〜約４％ｗ／ｗまたは約１％〜約３％ｗ／ｗの範囲にある。
【００８５】
実施形態では、溶菌液は、例えば限定ではないが、尿素、ドデシル硫酸ナトリウムおよび／またはチオ尿素などのカオトロープをさらに含む。いくつかの実施形態では、カオトロープは、約０．５Ｍ〜８Ｍ、約１Ｍ〜約６Ｍ、約２Ｍ〜約６Ｍまたは約１Ｍ〜３Ｍの範囲の濃度で使用される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、溶菌液は１つ以上の追加の溶菌試薬をさらに含み、このような溶菌試薬は当技術分野でよく知られている。いくつかの実施形態では、このような溶菌試薬には、例えば限定ではないがリゾチームなどの細胞壁溶菌酵素が含まれる。いくつかの実施形態では、溶菌試薬は、０．５％のドデシル硫酸ナトリウムを含む０．１水酸化ナトリウム水溶液などのアルカリ性洗剤溶液を含む。
【００８７】
いくつかの実施形態では、溶菌液は、蔗糖液などの糖水溶液およびＥＤＴＡなどのキレート剤、例えばＳＴＥＴ緩衝液をさらに含む。特定の実施形態では、溶菌試薬は、細胞懸濁液を所望の濃度の２倍の溶菌液（例えば０．２水酸化ナトリウム、１．０％ドデシル硫酸ナトリウム）の等量と混合することにより調製される。
【００８８】
いくつかの実施形態では、所望の程度の溶菌が達成された後、溶菌液および溶菌細胞を含む混合物を中和または消光試薬と接触させて、溶菌試薬が所望の産物に悪影響を及ぼさないように条件を調整する。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約５〜約９、約６〜約８、約５〜約７、約６〜約７、または約６．５〜７．５のｐＨに調整されて、例えば核酸を含むがこれに限定されない細胞含有物の分解を最小限に抑え、および／または防止する。いくつかの実施形態では、溶菌試薬がアルカリ溶液を含む場合、中和試薬は酸性緩衝液、例えばアルカリ金属酢酸塩／酢酸緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、溶菌試薬の温度および組成などの溶菌条件は、例えば核酸を含むがこれに限定されない、所望の産物の分解を最小限に抑えながら溶菌が実質的に完了するように選択される。
【００８９】
上述の任意の組み合わせは、当業者が採用することができ、他の既知の日常的な方法と組み合わせることもでき、このような組み合わせは本発明によって想定される。
【００９０】
別の態様では、例えばゲノムＤＮＡを含むがこれに限定されない核酸は、後続の解析を実施する前に溶菌緩衝液から単離される。いくつかの実施形態では、例えば限定ではないが、リアルタイムＰＣＲ解析などの追加の解析を実施する前に、核酸は溶菌緩衝液から単離される。少量の核酸の単離に有用な様々な方法のいずれかが、開示された方法の様々な実施形態によって使用される。これらには、沈殿、ゲルろ過、密度勾配および固相結合が含まれるが、これらに限定されない。このような方法は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（全３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０１２年）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３年〜２０１３年）にも記載されており、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
核酸沈殿は、当業者に知られている単離のための周知の方法である。様々な固相結合法もまた当該技術分野で知られており、ビーズ（例えばシリカ、磁性体）、カラム、膜の形態、または当該技術分野で知られている任意の他の様々な物理的形態における固相を利用する固相結合法を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、開示された方法において使用される固相は、核酸を可逆的に結合する。このような固相の例には、いわゆる「混合床」固相が含まれ、少なくとも２つの異なる固相の混合物であり、それぞれが異なる溶液条件下での核酸に対する能力と、異なる条件下での核酸放出能および／または放出能力を有し、例えば、米国特許出願第２００２／０００１８１２号に記載されており、その全体は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。開示された方法による核酸に対する固相の親和性は、溶質を基質に結合するために一般的に使用される多くの手段のいずれか１つによるものとすることができる。このような手段の例には、イオン性相互作用（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィ）および疎水性相互作用（例えば、逆相クロマトグラフィ）、ｐＨ値の差および変化、塩の差および変化（例えば、濃度変化、カオトロピック塩／カオトロピック剤の使用）が含まれるが、これらに限定されない。ｐＨに基づいた例示的な固相には、これには限定されないがＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ  ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ  Ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  Ｂｕｃｃａｌ  Ｋｉｔ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｂｅａｄｓで使用されるものが含まれ、これは、低ｐＨ（＜６．５）で核酸と結合し、高ｐＨ（＞８．５）で核酸を放出し、モノ−アミノ−Ｎ−アミノエチル（ＭＡＮＡＥ）は７．５よりも低いｐＨで核酸と結合し、８よりも大きいｐＨで核酸を放出する。イオン交換を基にした例示的な基質には、ＰＨＡＲＭＡＣＩＡ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）製のＤＥＡ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）およびＤＥＡＥ−ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）、Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（ミシガン州ミッドランド）製のＤＯＷＥＸ（登録商標）Ｉ、Ｒｏｈｍ＆Ｈａａｓ（ペンシルベニア州フィラデルフィア）製のＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）、Ｄｕｏｌｉｔｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎ．（オハイオ州クリーブランド）製のＤＵＯＬＩＴＥ（登録商標）、ＤＩＡＬＯＮ  ＴＩおよびＤＩＡＬＯＮ  ＴＩＩが含まれるが、これらに限定されない。
【００９２】
単独で、もしくは他の方法と組み合わせて使用するために任意の個別の方法が考えられ、このような有用な組合せは、当業者によく知られ、かつ理解されている。
【００９３】
別の態様では、開示された方法は、ゲノム解析を含む様々な核酸解析用のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）などの核酸を単離するために使用される。いくつかの実施形態では、このような解析には、欠失、挿入、転換および転位を含むがこれらに限定されない様々な遺伝的突然変異の検出が含まれる。いくつかの実施形態では、突然変異は一塩基多型（ＳＮＰ）である。
【００９４】
例えば限定ではないがゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）などの単離された核酸を解析するための様々な方法は、当技術分野で知られており、核酸配列決定方法（次世代シークエンシング方法を含む）、ＰＣＲ法（リアルタイムＰＣＲ解析、マイクロアレイ解析、ハイブリダイゼーション解析を含む）ならびに、核酸組成物が解析されかつ当業者に知られている様々な他の方法を含む、当技術分野で知られている任意の他の核酸配列解析方法を含む。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（全３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０１２年）およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３年〜２０１３年）を参照されたい。
【００９５】
一態様では、本明細書に記載されたＳＮＰを配列決定によって検出してもよい。例えば、ハイスループットシークエンシングもしくは次世代シークエンシング（ＮＧＳ）は、遺伝子内の突然変異を検出するための魅力的な選択肢を示している。配列内容を全て間接的に推測するＰＣＲ、マイクロアレイ、高分解能融解および質量分析法とは異なり、ＮＧＳは各塩基の同一性および遺伝子内に含まれる順序を直接確認する。市場で最新のプラットフォームは１０，０００倍以上のエクソン領域を被覆する能力を有しており、つまり、配列内の各塩基位置の内容は数千回測定される。この高度な被覆率により、共通配列が非常に正確になり、不均一試料中の希少変異体の検出が可能になる。例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織から抽出された試料では、多くの場合、関心のある突然変異が存在する頻度は１％しかない。この試料が１０，０００Ｘの被覆率で配列決定される場合、試料の１％しか含まない希少対立遺伝子であっても、１００回繰り返し一意に測定される。したがって、ＮＧＳは非常に高感度で信頼性の高い正確な結果を提供するので、ＦＦＰＥおよび他の混合試料の臨床診断検査に最適である。
【００９６】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術と呼ばれることが多い配列決定技術の例には、合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）、大規模並列シグネチャシークエンシング（ＭＰＳＳ）、ポロニーシークエンシング、パイロシークエンシング、可逆的色素停止剤シークエンシング、ＳＯＬｉＤシークエンシング、イオン半導体シークエンシング、ＤＮＡナノボールシークエンシング、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅ一分子シークエンシング、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シークエンシング、一分子リアルタイム（ＲＮＡＰ）シークエンシングおよびナノポアＤＮＡシークエンシングが含まれるが、これらに限定されない。
【００９７】
ＭＰＳＳは、アダプタ連結およびその後のアダプタ解読、４ヌクレオチド単位での配列の読取りの複雑な手法を使用するビーズを基にした方法であり、この方法により、配列特異的な偏りまたは特定の配列の損失の影響を受けやすくなった。
【００９８】
ポロニーシークエンシングは、インビトロ対タグライブラリをエマルションＰＣＲ、自動化顕微鏡および連結に基づいた配列決定化学と組み合わせて、大腸菌ゲノムを９９．９９９９％を超える精度で、かつサンガーシークエンシングの約１／１０のコストで配列決定した。
【００９９】
パイロシークエンシングの並列化版であるこの方法は、油剤の水滴中のＤＮＡを増幅させ（エマルションＰＣＲ）、各液滴は、単一のプライマー塗布ビーズに付着してクローンコロニーを形成する単一のＤＮＡテンプレートを含む。配列決定機器は、各々が単一のビーズおよび配列決定用酵素を含む多数のピコリットル容量のウェルを含む。パイロシークエンシングでは、ルシフェラーゼを使用して、新生ＤＮＡに添加された個々のヌクレオチドを検出するための光を生成し、組み合わされたデータを使用して配列の読取りを発生させる。この技術は、一方の端でサンガーシークエンシングと比較し、かつ他方の端でＳｏｌｅｘａおよびＳＯＬｉＤと比較して中間の読取り長および塩基あたりの価格を提供する。
【０１００】
ＳＢＳは、可逆的な色素停止剤に基づいた配列決定技術である。ＤＮＡ分子は最初にフローセル上のプライマーに付着して増幅され、これにより、局所的なクローンコロニーが形成される。４種類の可逆的停止塩基（ＲＴ塩基）が添加され、組み込まれていないヌクレオチドは洗い流される。パイロシークエンシングとは異なり、ＤＮＡは一度に１ヌクレオチドしか伸長することができない。カメラは蛍光標識ヌクレオチドの画像を撮影し、次いで、色素は末端の３’ブロッカーとともにＤＮＡから化学的に除去され、次のサイクルが可能になる。
【０１０１】
ＳＯＬｉＤ技術は、連結による配列決定を採用している。ここで、固定長の全ての可能なオリゴヌクレオチドのプールは、配列決定された位置に従って標識される。
【０１０２】
オリゴヌクレオチドはアニールされかつ連結され、配列を一致させるためのＤＮＡリガーゼによる優先的連結により、その位置のヌクレオチドを知らせる信号が得られる。配列決定の前に、ＤＮＡはエマルションＰＣＲによって増幅される。結果として生じたビーズはそれぞれ同じＤＮＡ分子のコピーのみを含み、スライドガラスに置かれる。結果、イルミナシークエンシングに匹敵する量および長さの配列が得られる。
【０１０３】
イオン半導体シークエンシングは、標準の配列決定化学を使用することに基づいているが、新規の半導体に基づいた検出システムを使用している。この配列決定方法は、他の配列決定システムで使用される光学的方法とは対照的に、ＤＮＡの重合中に放出される水素イオンの検出に基づいている。配列決定されるテンプレートＤＮＡ鎖を含むマイクロウェルは、１種類のヌクレオチドであふれている。導入されたヌクレオチドが主要なテンプレートヌクレオチドに相補的である場合、成長中の相補鎖に組み込まれる。これにより、水素イオンが放出され、反応が生じたことを示す超感受性イオンセンサがトリガされる。ホモポリマーの繰り返しがテンプレート配列に存在する場合、複数のヌクレオチドは単一のサイクルに組み込まれる。これにより、対応する数の水素が放出され、かつ比例的に電子信号が増加する。
【０１０４】
ＤＮＡナノボールシークエンシングは、生物の全ゲノム配列を決定するために使用されるハイスループットシークエンシング技術の一種である。この方法は、ローリングサークル複製を使用してゲノムＤＮＡの小断片をＤＮＡナノボールに増幅させる。次いで、連結による非鎖状シークエンシングを使用してヌクレオチド配列を決定する。このＤＮＡ配列決定の方法により、多数のＤＮＡナノボールをランごとに配列決定することができる。
【０１０５】
Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの一分子シークエンシングでは、フローセル表面に付着したｐｏｌｙＡテールアダプタが添加されたＤＮＡ断片を使用する。次の段階は伸長に基づく配列決定を含んでおり、蛍光標識ヌクレオチド（サンガー法と同様に一度に１つのヌクレオチド型）でフローセルを循環洗浄する。読取りは、Ｈｅｌｉｏｓｃｏｐｅシーケンサによって実施される。
【０１０６】
一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シークエンシングは、ＳＢＳ方法に基づいている。ＤＮＡは、ウェルの底部に位置する捕捉ツールを含むウェル状の小型容器であるゼロモード導波路（ＺＭＷ）で合成される。配列決定は、（ＺＭＷの底部に付着した）未修飾のポリメラーゼと、溶液中を自由に流れる蛍光標識ヌクレオチドとを使用して実施される。ウェルは、ウェルの底部で発生する蛍光のみが検出されるように構築されている。蛍光標識はＤＮＡ鎖への取込み時にヌクレオチドから分離され、未修飾のＤＮＡ鎖が残る。
【０１０７】
ポリスチレンビーズに付着したＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）に基づく一分子リアルタイムシークエンシングでは、配列決定されたＤＮＡの遠位端は別のビーズに付着し、両方のビーズが光学トラップに配置される。転写中のＲＮＡＰの動きにより、ビーズがより接近して相対距離が変化し、単一のヌクレオチド分解能で記録することができる。配列は、（サンガース法と同様に）４つのヌクレオチド型のそれぞれの濃度を低下させた４つの読取りに基づいて推定される。
【０１０８】
ナノポアシークエンシングは、シクロデキストリンと共有結合したアルファ溶血素ポアを通過するヌクレオチドで発生する電気信号の読出しに基づいている。ナノポアを通過するＤＮＡは、イオン電流を変化させる。この変化は、ＤＮＡ配列の形状、大きさおよび長さに依存する。ヌクレオチドの各型は、ナノポアを通るイオンの流れを異なる期間にわたって遮断する。
【０１０９】
ＶｉｓｉＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓでは、特別に設計されたＤＮＡポリメラーゼを使用している。このポリメラーゼはセンサとして機能し、その活性中心にドナー蛍光色素が組み込まれている。このドナー色素は、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）によって作用し、異なる標識ヌクレオチドの蛍光を誘導する。この手法により、ポリメラーゼがヌクレオチドを配列に組み込む速度（１秒あたり数百回）で読取りを実施することが可能になる。ヌクレオチド蛍光色素は、ＤＮＡ鎖への組込み後に放出される。
【０１１０】
質量分析法を使用して、連鎖停止反応で生成されたＤＮＡ断片間の質量差を決定してもよい。
【０１１１】
ＳＢＳ技術は、既存のパイロシークエンシングに基づいたＮＧＳプラットフォームの制限を克服することが可能である。
【０１１２】
このような技術は、読取りのための複合酵素カスケードに依存しており、ホモポリマー領域におけるヌクレオチド数の正確な決定には信頼性がなく、個々のヌクレオチドを成長中のＤＮＡ鎖全体に行き渡らせるのに過度な時間が必要である。ＳＢＳ  ＮＧＳプラットフォームは、直接配列決定法を使用して、非常に高精度で、急速で、かつ低コストな配列決定方法を作り出す。
【０１１３】
１つの例示的なＳＢＳシークエンシングは、テンプレートＤＮＡの断片化、増幅、ＤＮＡ配列決定プライマーのアニーリング、および、例えばスポットの高密度アレイとしてガラスチップに最終的に固定することによって初期化される。ＤＮＡ断片のアレイは、４つの可能なヌクレオチド全てを識別することができる蛍光色素に結合した切断可能な化学部分を含む修飾ヌクレオチドで各断片を伸長することによって配列決定される。アレイを高解像度電子カメラ（Ｍｅａｓｕｒｅ）によって連続的にスキャンして、伸長したＤＮＡ断片に新たに組み込まれた各塩基（Ａ、Ｃ、ＧまたはＴ）の蛍光強度を決定する。各修飾塩基の組込み後、アレイは切断化学反応にさらされて、蛍光色素および末端キャップが破壊され、追加の塩基を添加することが可能になる。この工程は、断片が完全に配列決定されるか、または読取り長が最大になるまで繰り返される。
【０１１４】
別の態様では、リアルタイムＰＣＲは、例えばＳＮＰを含むがこれに限定されない遺伝子突然変異の検出において使用される。いくつかの実施形態では、特異遺伝子候補中のＳＮＰの検出は、繋留消光部分を使用することによる蛍光分子の分子内消光の使用に基づいて、リアルタイムＰＣＲを使用して実施される。したがって、例示的な実施形態によれば、リアルタイムＰＣＲ法には分子ビーコン技術の使用も含まれる。分子ビーコン技術は、目的のＤＮＡ標的に結合することによって蛍光が復元される内部消光蛍光色素分子を含むヘアピン状分子を利用する（例えば、Ｋｒａｍｅｒ，Ｒ．らによる、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、第１４巻、第３０３〜３０８頁、１９９６年を参照）。いくつかの実施形態では、蓄積しているＰＣＲ産物に対する分子ビーコンプローブの増強された結合を使用して、ゲノムＤＮＡに存在するＳＮＰを特異的に検出する。
【０１１５】
リアルタイムＰＣＲアッセイの設計については、多くの場合アンプリコンと呼ばれる、２つのプライマーによって挟まれた後に増幅されるＤＮＡ断片を含むいくつかの部分が調整され、２つのプライマーおよび１つまたは複数の検出プローブが使用されるべきである。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、被験者由来の試料中のＳＮＰ部位は、本明細書に記載された増幅方法もしくは当技術分野で知られている任意の他の増幅方法によって増幅されてもよい。試料中の核酸は、普遍的な増幅方法（例えば、全ゲノム増幅および全ゲノムＰＣＲ）を使用して、ＳＮＰ部位を本明細書に記載されたプローブと接触させる前に増幅されてもよいし、されなくてもよい。
【０１１７】
リアルタイムＰＣＲは、配列特異的な様式でゲノムの対立遺伝子と結合する短いポリヌクレオチド（「検出プローブ」と称する）に結合した蛍光色素の視覚的な発光に依存しているか、または定量ＰＣＲもしくはｑＰＣＲと呼ばれる二本鎖ＤＮＡに挿入される蛍光分子に依存している。単一のヌクレオチドごとに異なるリアルタイムＰＣＲプローブは、異なる波長で蛍光を発するプローブの結合および検出により、リアルタイムＰＣＲアッセイにおいて区別することができる。リアルタイムＰＣＲは、検出用途（診断用途）、定量化用途、および遺伝子型決定用途における使用が見出されている。
【０１１８】
リアルタイムＰＣＲを実施するための関連するいくつかの方法は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ（米国特許第５，２１０，０１５号明細書および米国特許第５，４８７，９７２号明細書、ならびにＬｅｅらによる、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２１巻第３７６１〜６頁、１９９３年）、分子ビーコンプローブ（米国特許第５，９２５，５１７号明細書および米国特許第６，１０３，４７６号明細書、ならびにＴｙａｇｉおよびＫｒａｍｅｒによる、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１４巻第３０３〜８頁、１９９６年）、自己プローブ型アンプリコン（ｓｃｏｒｐｉｏｎｓ）（米国特許第６，３２６，１４５号明細書、およびＷｈｉｔｃｏｍｂｅらによる、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、第１７巻第８０４〜７頁、１９９９年）、Ａｍｐｌｉｓｅｎｓｏｒ（ＣｈｅｎらによるＡｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、第６４巻第４２１０〜６頁、１９９８年）、Ａｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（米国特許第６，１１７，６３５号明細書、およびＮａｚａｒｅｎｋｏらによる、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２５巻第２５１６〜２１頁、１９９７年）、置換ハイブリダイゼーションプローブ（Ｌｉらによる、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第３０巻、Ｅ５、２００２年）、ＤｚｙＮＡ−ＰＣＲ（Ｔｏｄｄらによる、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．、第４６巻第６２５〜３０頁、２０００年）、蛍光制限酵素検出（Ｃａｉｒｎｓらによる、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、第３１８巻第６８４〜９０頁、２００４年）、および近接ハイブリダイゼーションプローブ（米国特許第６，１７４，６７０号明細書、およびＷｉｔｔｗｅｒらによる、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２２巻第１３０〜１頁、第１３４〜８頁、１９９７年）に依存するアッセイを含むものが、当該技術分野において開示されている。
【０１１９】
多くの適切な遺伝子型決定手順の１つは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）対立遺伝子識別アッセイである。このアッセイのいくつかの例では、プローブの５’末端に蛍光レポーター色素で標識され、プローブの３’末端で消光色素によって標識されたオリゴヌクレオチドプローブが利用される。消光剤が無傷のプローブに近接していることにより、レポーター用の蛍光性が低く維持される。ＰＣＲ反応の間、ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性によりプローブが切断され、色素と消光剤とが分離される。これにより、レポーターの蛍光性が増加する。ＰＣＲ産物の蓄積は、レポーター色素の蛍光性の増加を監視することによって直接検出される。ＤＮＡポリメラーゼの５’ヌクレアーゼ活性は、プローブが標的にハイブリダイズし、かつＰＣＲの間に増幅される場合にのみ、レポーターと消光剤との間でプローブを切断する。プローブは、特定のＳＮＰ対立遺伝子が存在する場合にのみ標的ＳＮＰ位置にまたがり、かつ核酸分子にハイブリダイズするように設計されている。
【０１２０】
リアルタイムＰＣＲ法には、様々な段階もしくはサイクルが増幅方法の一部として含まれる。これらのサイクルには、二本鎖核酸を変性させること、フォワードプライマー、リバースプライマーおよび検出プローブを標的ゲノムＤＮＡ配列にアニーリングすること、および、アニールされたフォワードプライマーおよびリバースプライマーから第二鎖ＤＮＡを合成（すなわち、複製）することが含まれる。この３段階の工程は、本明細書ではサイクルと呼ばれる。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０サイクルが採用される。いくつかの実施形態では、約１０〜約６０サイクル、約２０〜約５０または約３０〜約４０サイクルが採用される。いくつかの実施形態では、４０サイクルが採用される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、二本鎖核酸の変性段階は、約８０℃〜１００℃、約８５℃〜約９９℃、約９０℃〜約９５℃の温度で、約１秒〜約５秒、約２秒〜約５秒、または約３秒〜約４秒の間に生じる。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸の変性段階は、９５℃の温度で約３秒間生じる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、フォワードプライマー、リバースプライマーおよび検出プローブを標的ゲノムＤＮＡ配列にアニーリングする段階は、約４０℃〜約８０℃、約５０℃〜約７０℃、約５５℃〜約６５℃で、約１５秒〜約４５秒、約２０秒〜約４０秒、約２５秒〜約３５秒の間に生じる。いくつかの実施形態では、フォワードプライマー、リバースプライマーおよび検出プローブを標的ゲノムＤＮＡ配列にアニーリングする段階は、約６０℃で約３０秒間生じる。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、アニールされたフォワードプライマーおよびリバースプライマーから第二鎖ＤＮＡを合成（すなわち、複製）することは、約４０℃〜約８０℃、約５０℃〜約７０℃、約５５℃〜約６５℃で、約１５秒〜約４５秒、約２０秒〜約４０秒、約２５秒〜約３５秒の間に生じる。いくつかの実施形態では、フォワードプライマー、リバースプライマーおよび検出プローブを標的ゲノムＤＮＡ配列にアニーリングする段階は、約６０℃で約３０秒間生じる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された本方法に従って調製した約１μＬ、約２μＬ、約３μＬ、約４μＬまたは約５μＬのゲノムＤＮＡ試料が、わずか約０．０５μＬ、約０．１０μＬ、約０．１５μＬ、約０．２０μＬ、約０．２５μＬまたは約０．２５μＬの３０Ｘ、３５Ｘ、４０Ｘ、４５Ｘ、５０Ｘまたは１００ＸリアルタイムＰＣＲアッセイミックスおよび蒸留水と混合されて、ＰＣＲマスターミックスを形成することが判明した。いくつかの実施形態では、ＰＣＲマスターミックスは、最終体積が約５μＬ、約６μＬ、約７μＬ、約８μＬ、約９μＬ、約０μＬ、約１１μＬ、約１２μＬ、約１３μＬ、約１４μＬ、約１５μＬ、約１６μＬ、約１７μＬ、約１８μＬ、約１９μＬ、もしくは約２０μＬ、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、上記のように調製された２μＬのゲノムＤＮＡ試料は、ＰＣＲマスターミックスを形成するために、わずか約０．１５μＬの４０ＸリアルタイムＰＣＲアッセイミックスおよび２．８５μＬの蒸留水と混合されることが見出された。
【０１２６】
例示的な反応が本明細書に記載されているが、当業者は、プローブ設計に基づいて温度および時間を変更する方法を理解するであろう。さらに、本方法は、上述の時間および温度の任意の組み合わせを想定している。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、プライマーは実験環境において試験され、かつ設計される。いくつかの実施形態では、プライマーはインシリコ方法に基づいてコンピュータによって設計される。プライマー配列は、増幅されるアンプリコンもしくは標的核酸配列の配列に基づいている。通常、長いアンプリコンと比較して、短いアンプリコンはより効率的に複製し、かつより効率的な増幅をもたらす。
【０１２８】
プライマーの設計において、当業者は、二次構造の考慮事項（ＧＣ含量の増加は、二次構造の増加の原因となり得る）と同様に設計されるプライマーのＧＣ含量およびＡＴ含量に基づいて、融解温度（Ｔｍ：プライマー標的二重鎖の半分が解離して一本鎖になり、二重鎖の安定性の指標となる温度であり、Ｔｍの増加は安定性の増大を示す）を考慮する必要があることを理解するであろう。Ｔｍ’は、当技術分野で知られている様々な方法を使用して計算され、当業者はこのような様々なＴｍの計算方法を容易に理解するであろうし、このような方法は、例えばこれには限定されないが、ｐｒｏｍｅｇａ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｓｅｒｖ／ｔｏｏｌｓ／ｂｉｏｍａｔｈ／ｃａｌｃ１１．ｈｔｍのワールドワイドウェブで利用可能なＴｍ計算機などのオンラインツールで利用可能なものが含まれる。プライマーの特異性は、Ｔａｑポリメラーゼにより伸長する部分である３’末端配列と組み合わせた完全な配列によって定義される。いくつかの実施形態では、３’末端は、誤った増幅産物の偽プライミングおよび生成を軽減するのに役立つように、標的配列内の他のいずれにも見られない少なくとも５〜７個の特異なヌクレオチドを有していなければならない。通常、フォワードプライマーおよびリバースプライマーは、標的と同様の効率で結合する。いくつかの例では、例えばＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴなどのツール（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖのワールドワイドウェブ上にある）を採用して、アラインメントを実施し、かつプライマー設計に役立てる。
【０１２９】
当業者は、標的核酸配列のプライマー設計に関する基礎を十分に承知しており、このような方法に対して広範な教示を持つ様々な参照マニュアルおよびテキストには、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（全３巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０１２年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００３〜２０１３年）、Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｆｒｏｍ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｔｏ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ（Ｉａｎ  Ｍ．ＭａｃＫａｙによる、Ｃａｌｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、２００７年）、ｐｒｉｍｅｒｄｉｇｉｔａｌ．ｃｏｍ／ｔｏｏｌｓ／ＰｒｉｍｅｒＡｎａｌｙｓｅｒ．ｈｔｍｌのワールドワイドウェブ上で使用可能なプライマーアナライザＪａｖａツール、および、Ｋａｌｅｎｄａｒ  Ｒらによる（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第９８巻第２号第１３７〜１４４頁（２０１１年））があり、その全体は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
プライマー設計の追加の側面は、プライマーの複雑性または言語的配列の複雑性である（Ｋａｌｅｎｄａｒ  Ｒら（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、第９８巻第２号第１３７〜１４４頁（２０１１年））を参照）。言語的配列の複雑性が大きいプライマー（例えばヌクレオチドの配列および組成）は、通常はより効率的である。いくつかの実施形態では、言語的配列の複雑性の計算方法は、単純反復配列、不完全直接反復配列もしくは逆方向反復配列、ポリプリンおよびポリピリミジン三本鎖ｃＤＮＡ構造、および四本鎖構造（例えば、Ｇ四重鎖）を含む低複雑領域の検出用の比較配列間の保存領域を探索するために使用される。いくつかの実施形態では、言語的複雑性（ＬＣ）の測定は、アルファベットキャパシティＬ−グラム法を使用して（Ａ．Ｇａｂｒｉｅｌｉａｎ、Ａ．Ｂｏｌｓｈｏｙらによる、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ＆Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２３巻第２６３〜２７４頁（１９９９年）、および、Ｙ．Ｌ．Ｏｒｌｏｖ、Ｖ．Ｎ．Ｐｏｔａｐｏｖらによる、Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ：ａｎ  ｉｎｔｅｒｎｅｔ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第３２巻第Ｗ６２８〜Ｗ６３３頁（２００４年）参照）、全長配列に沿って実施され、この配列の長さの期待値合計（Ｅ）で除算された配列内の１〜Ｌの大きさの単語の観察範囲（ｘｉ）の合計として計算される。いくつかのＧリッチ（およびＣリッチ）な核酸配列は、Ｇカルテットのスタックを含む四本鎖ＤＮＡ構造に折り畳まれる（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｘ．ｏｒｇのワールドワイドウェブ参照）。いくつかの例では、これらの四重鎖は、２個もしくは４個のＤＮＡ分子の分子間結合、２つのＧ塩基を含む配列の二量化によって、またはグアニンの４ブロックを含む一本鎖の分子間折り畳みにより形成され（Ｐ．Ｓ．Ｈｏによる、ＰＮＡＳ、第９１巻第９５４９〜９５５３頁（１９９４年）、Ｉ．Ａ．Ｉｌ’ｉｃｈｅｖａ、Ｖ．Ｌ．Ｆｌｏｒｅｎｔ’ｅｖらによる、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第２６巻第５１２〜５３１頁（１９９２年）、Ｄ．Ｓｅｎ、Ｗ．Ｇｉｌｂｅｒｔらによる、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、第２１１巻第１９１〜１９９頁（１９９２）、Ｐ．Ａ．Ｒａｃｈｗａｌ、Ｋ．Ｒ．Ｆｏｘらによる、Ｍｅｔｈｏｄｓ、第４３巻第２９１〜３０１頁（２００７年）、Ｓ．Ｂｕｒｇｅ、Ｇ．Ｎ．Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ、Ｐ．Ｈａｚｅｌ、Ａ．Ｋ．Ｔｏｄｄ、Ｋ．Ｎｅｉｄｌｅらによる、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第３４巻第５４０２〜５４１５頁（２００６年）、Ａ．Ｇｕｅｄｉｎ、Ｊ．Ｇｒｏｓ、Ｐ．Ａｌｂｅｒｔｉ、Ｊ．Ｍｅｒｇｎｙらによる、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第３８巻第７８５８〜７８６８頁（２０１０年）、Ｏ．Ｓｔｅｇｌｅ、Ｌ．Ｐａｙｅｔ、Ｊ．Ｌ．Ｍｅｒｇｎｙ、Ｄ．Ｊ．ＭａｃＫａｙ、Ｊ．Ｈ．Ｌｅｏｎらによる、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、第２５巻第ｉ３７４〜ｉ３８２頁（２００９年）を参照）、いくつかの例では、これらの四重鎖は、言語的複雑性がＬＣ＝３２％  ｆｏｒ（ＴＴＡＧＧＧ）４と低いために、プライマー設計から除外される。
【０１３１】
これらの方法は、ＣＧ含量および融解温度に関する、ＧＣスキュー（Ｇ−Ｃ）／（Ｇ＋Ｃ）、ＡＴスキュー（Ａ−Ｔ）／（Ａ＋Ｔ）、ＣＧ−ＡＴスキュー（Ｓ−Ｗ）／（Ｓ＋Ｗ）、またはプリン−ピリミジン（Ｒ−Ｙ）／（Ｒ＋Ｙ）スキューを有する配列におけるパターン解析用の様々なバイオインフォマティクスツールを含み、言語的配列の複雑性プロファイルを決定するためのツールを提供する。例えば、ｎが正の整数であるｎ塩基のスライディングウィンドウにおけるＧＣスキューは、ウィンドウ内の全配列についてＧがグアニンの総数であり、かつＣがシトシンの総数である式（Ｇ−Ｃ）／（Ｇ＋Ｃ）に従って、１塩基の手順で計算される（Ｙ．Ｂｅｎｉｔａらによる、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第３１巻第ｅ９９頁（２００３年））。正のＧＣスキュー値がＧ塩基の過剰を示す一方で、負のＧＣスキュー値は、Ｃ塩基の過剰を示した。同様に、配列において他のスキューが計算される。他の方法と同様に、このような方法が採用されて、いくつかの実施形態においてプライマーの複雑性を決定する。
【０１３２】
非限定的な例示的実施形態によれば、リアルタイムＰＣＲは、エキソヌクレアーゼプライマー（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ）を使用して実施される。このような実施形態では、プライマーは、Ｔａｑなどの熱安定性ポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性を利用して、増幅反応に存在する二重標識プローブを切断する（例えば、Ｗｉｔｔｗｅｒ，Ｃ．らによる、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、第２２巻第１３０〜１３８頁、１９９７年を参照）。ＰＣＲ産物に相補的である一方で、このアッセイで使用されるプライマープローブはＰＣＲプライマーとは異なり、蛍光可能な分子と蛍光を消光することが可能な分子との両方で二重標識されている。プローブが無傷の場合、ＤＮＡプローブ内の蛍光信号の分子内消光は信号をほとんどもたらさない。蛍光分子が増幅中にＴａｑのエキソヌクレアーゼ活性によって遊離すると、消光が大幅に減少して蛍光信号が増加することになる。蛍光プローブの非限定的な例には、６−カルボキシ−フルオレセイン部分などが含まれる。例示的な消光剤には、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ１部分などが含まれる。
【０１３３】
様々なＰＣＲプライマーは、開示された方法で用途を見出すことができる。例示的なプライマーには、本明細書に記載されたものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３４】
様々な検出プローブは、開示された方法で用途を見出すことができ、遺伝子型決定および／または定量化に使用される。当業者が一般に採用する検出プローブには、加水分解プローブ（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ、５’ヌクレアーゼプローブまたは二重標識プローブとしても知られている）、ハイブリダイゼーションプローブ、およびＳｃｏｒｐｉｏｎプライマー（１個の分子内でプライマーと検出プローブとを組み合わせたもの）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、検出プローブは様々な修飾を含む。いくつかの実施形態では、検出プローブには、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド修飾、ホスホロチオエート骨格修飾、ホスホロジチオエート骨格修飾、ホスホルアミデート骨格修飾、メチルホスホネート骨格修飾、３’末端リン酸修飾および／または３’アルキル置換などの修飾された核酸残基が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、検出プローブは、修飾のために標的配列に対する親和性が増大している。このような検出プローブには、化学修飾を含む検出プローブだけでなく、長さが増加した検出プローブも含まれる。このような修飾には、２’−フルオロ（２’−デオキシ−２’−フルオロ−ヌクレオシド）修飾、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＺＮＡ（ｚｉｐ核酸）、モルホリノ、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、ポリカチオン共役体、および２’−ピレン修飾が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、検出プローブは、２’フルオロ修飾（別名、２’−デオキシ−２’−フルオロ−ヌクレオシド）、ＬＮＡ（ロックド核酸）、ＰＮＡ（ペプチド核酸）、ＺＮＡ（ｚｉｐ核酸）、モルホリノ、メチルホスホネート、ホスホルアミデート、および／またはポリカチオン共役体を含む１つ以上の修飾を含む。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、検出プローブは、本明細書に記載されたものなどの検出可能な部分、および当業者に知られている任意の検出可能な部分を含む。このような検出可能な部分には、例えば蛍光標識および化学発光標識が含まれるが、これらに限定されない。このような検出可能な部分の例はまた、ＦＲＥＴ対の群を含むことができる。いくつかの実施形態では、検出プローブは検出可能な物質を含む。
【０１３８】
蛍光標識の例としては、ＡＭＣＡ、ＤＥＡＣ（７−ジエチルアミノクマリン−３−カルボン酸）、７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン−３、７−ヒドロキシクマリン−３、ＭＣＡ（７−メトキシクマリン−４−酢酸）、７−メトキシクマリン−３、ＡＭＦ（４’−（アミノメチル）フルオレセイン）、５−ＤＴＡＦ（５−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン）、６−ＤＴＡＦ（６−（４，６−ジクロロトリアジニル）アミノフルオレセイン）、６−ＦＡＭ（６−カルボキシフルオレセイン、ａｋａ  ＦＡＭ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＦＡＭ（商標）を含む）、ＴＡＱＭＡＮ  ＶＩＣ（登録商標）、５（６）−ＦＡＭカダベリン、５−ＦＡＭカダベリン、５（６）−ＦＡＭエチレンジアミン、５−ＦＡＭエチレンジアミン、５−ＦＩＴＣ（ＦＩＴＣ異性体Ｉ、フルオレセイン−５−イソチオシアネート）、５−ＦＩＴＣカダベリン、フルオレセイン−５−マレイミド、５−ＩＡＦ（５−ヨードアセトアミドフルオレセイン）、６−ＪＯＥ（６−カルボキシ−４’，５’−ジクロロ−２’，７’−ジメトキシフルオレセイン）、５−ＣＲ１１０−（５−カルボキシローダミン１１０）、６−ＣＲ１１０−（６−カルボキシローダミン１１０）、５−ＣＲ６Ｇ（５−カルボキシローダミン６Ｇ）、６−ＣＲ６Ｇ（６−カルボキシローダミン６Ｇ）、５（６）−カルボキシローダミン６Ｇカダベリン、５（６）−カルボキシローダミン６Ｇエチレンジアミン、５−ＲＯＸ（５−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、６−ＲＯＸ（６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン）、５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）、６−ＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）、５−ＴＡＭＲＡカダベリン、６−ＴＡＭＲＡカダベリン、５−ＴＡＭＲＡエチレンジアミン、６−ＴＡＭＲＡエチレンジアミン、５−ＴＭＲ  Ｃ６マレイミド、６−ＴＭＲ  Ｃ６マレイミド、ＴＲ  Ｃ２マレイミド、ＴＲカダベリン、５−ＴＲＩＴＣ、Ｇ異性体（テトラメチルローダミン−５−イソチオシアネート）、６−ＴＲＩＴＣ、Ｒ異性体（テトラメチルローダミン−６−イソチオシアネート）、ダンシルカダベリン（５−ジメチルアミノナフタレン−１−（Ｎ−（５−アミノペンチル））スルホンアミド）、ＥＤＡＮＳ  Ｃ２マレイミド；フルオレスカミン、ＮＢＤ、およびピロメテンならびにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１３９】
化学発光標識の例には、サザンブロットおよびウェスタンブロットプロトコル（例えば全体が参照として本明細書に組み込まれる、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌらによる、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）（２００１年）参照）とともに使用される標識が含まれるが、これらに限定されない。例としては、−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３”−ホスホリルオキシ）フェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）、アクリジニウムエステル、およびアダマンチル安定化１，２−ジオキセタンならびにそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
プローブの標識は、当技術分野で知られている。標識プローブは、増幅中に増幅された領域内でハイブリダイズするために使用される。プローブは、増幅用プライマーとして作用するのを回避するように修飾されている。検出プローブは２つの蛍光色素で標識され、１つは他の色素の蛍光を消光することができる。一方の色素はプローブの５’末端に結合され、他方は内部部位に結合され、これにより、プローブが非ハイブリダイズ状態にある場合に消光が生じる。
【０１４１】
通常、リアルタイムＰＣＲプローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に関与する一対の色素（レポーター色素およびアクセプター色素）で構成されており、それによってアクセプター色素はレポーター色素の発光を消光する。一般に、蛍光標識したプローブはアンプリコン定量化の特異性を増大させる。
【０１４２】
開示された方法のいくつかの実施形態において使用されるリアルタイムＰＣＲには、本開示を考慮して当業者によって決定されるように、１つ以上のハイブリダイゼーションプローブ（すなわち、検出プローブ）の使用も含まれる。非限定的な例として、このようなハイブリダイゼーションプローブには、記載の方法において提供されたものの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。ＨＥＸチャネルおよび／またはＦＡＭチャネルプローブなどの例示的なプローブは、当業者により理解されている。
【０１４３】
例示的な実施形態によれば、検出プローブおよびプライマーは、例えばプライマー設計ソフトウェアを使用するインシリコ解析、ならびに国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）に寄託された遺伝子およびゲノムの利用可能なヌクレオチドデータベースに対する相互参照を使用して都合よく選択される。いくつかの実施形態では、プライマーおよび／またはプローブの選択にいくつかの追加のガイドラインを使用してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、プライマーおよびプローブは、互いに近接しているが重複しないように選択される。いくつかの実施形態では、プライマーは、同じ（もしくは近い）ＴＭ（例えば、約５８℃〜約６０℃）を有してもよい。いくつかの実施形態では、プローブのＴＭは、プライマーのＴＭのために選択されたものよりも約１０℃高い。いくつかの実施形態では、プローブおよびプライマーの長さは、約１７〜３９個の塩基対などであるように選択される。これらおよび他のガイドラインは、適切なプライマーおよび／またはプローブを選択する際に、いくつかの例において当業者により使用される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されたＳＮＰは、上述の検出プローブを使用する融解曲線分析によって検出されてもよい。例えば、目的のＳＮＰを含む領域にハイブリダイズした短いオリゴヌクレオチドプローブの融解曲線を分析してもよい。これらの反応では２つのプローブが使用され、それぞれが問題のＳＮＰの特定の対立遺伝子に相補的である。完全に一致したプローブは、不一致のプローブと比較してより安定しており、かつ融解温度が高い。したがって、ＳＮＰ遺伝子型は、一致したオリゴヌクレオチドプローブもしくは不一致のオリゴヌクレオチドプローブのアニーリングおよび融解によって生成される特徴的な融解曲線に応じて推測される。
【０１４５】
一態様では、本明細書に記載された方法は、少なくとも１つの検出プローブを試料もしくはそのアンプリコンからのヌクレオチド分子にハイブリダイズし、かつ少なくとも１つの検出プローブを検出することによって本明細書に記載の２つ以上のＳＮＰを検出することを含んでもよい。
【０１４６】
別の態様では、診断検査を利用して、様々な突然変異のいずれかを検出することによって１つ以上の遺伝子状態を決定する。いくつかの実施形態では、診断検査は、特定の条件が、例えば物理的症状、徴候および／または症状、ならびに家族歴情報に基づいて疑われる場合に、診断を確定するために使用される。いくつかの実施形態では、診断検査の結果は、医療分野の当業者が任意の患者に対する適切な治療計画を決定するのに役立ち、個々の患者に合わせたより効果的な治療計画を可能にする。いくつかの実施形態では、治療計画には、当業者によって決定されるような、様々な薬剤治療、外科的治療、ライフスタイルの変更、またはそれらの組合せのいずれかが含まれる。
【０１４７】
開示された方法により得られた核酸は、欠失、挿入、転換および転位などの突然変異を検出するための検査を含む様々な診断検査に有用である。いくつかの実施形態では、このような診断は、将来的に発現する疾患の２つのコピーを必要とする疾患について１つの遺伝子コピーを保有する非罹患者を特定するのに有用であり、情報が治療計画、着床前遺伝子診断、出生前診断検査、新生児検診、（遺伝的系譜目的の）家系ＤＮＡ検査、ＫＣを予測するかまたは診断するための発症前検査の発展に用途を見出すことができる疾患について、１つの遺伝子コピーを保有する非罹患者を特定する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、新生児を検査することができる。いくつかの実施形態では、新生児検診には、遺伝性疾患を特定するために出生直後に採用される任意の遺伝子検査が含まれる。いくつかの実施形態では、新生児検診は遺伝性疾患の特定に用途が見出され、これにより、治療計画が人生の早い時期に決定される。このような検査には、フェニルケトン尿症と先天性甲状腺機能低下症について乳児を検査することが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、遺伝子突然変異の単一のコピーを保有する人々を特定するために、保因者検査が採用される。場合によっては、２つのコピーが存在する場合に突然変異が遺伝性疾患を引き起こす可能性がある。場合によっては、遺伝性疾患を引き起こすには１つのコピーで十分である。場合によっては、アベリノ型の突然変異の存在などの２つのコピーの存在は特定の治療計画には禁忌とされており、適切な治療計画を確実に実施するために、外科的処置を行う前の事前検査が特定の被験者について追求される。いくつかの実施形態では、このような情報はまた、個体が生殖を熟考するのに有用であり、個体が情報に基づいた決定をするのに役立ち、医療分野の当業者が個々の被験者および被験者の血縁者に重要なアドバイスを提供するのに役立つ。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、予測検査および／または発症前検査を使用して、様々な疾患に関連する遺伝子突然変異を検出する。場合によっては、これらの検査は、遺伝性疾患のある家族を持っているが、検査時に疾患の特徴を示さない可能性のある人々に役立つ。いくつかの実施形態では、予測型検査は、例えば人が、特定の種類のがんを含むがこれに限定されない遺伝的根拠を含む疾患を発症する機会を増加させる突然変異を特定する。いくつかの実施形態では、発症前検査は、任意の身体的な徴候もしくは症状が現れる前に、人が遺伝性疾患を発症するかどうかを決定するのに有用である。予測型および発症前型の検査の結果は、人が特異的疾患を発症する危険性に関する情報を提供し、被験者および被験者の血縁者にとって適切な治療計画に関する意思決定を行うのに役立つ。予測検査はまた、いくつかの実施形態では、例えば治療的表層角膜切除術（ＰＴＫ）および／またはレーザ屈折矯正角膜切除術（ＰＲＫ）などであるがそれらに限定されない、レーシック（ＬＡＳＩＫ）手術および／または他の屈折矯正手術の実施には禁忌とされるアベリノ型の突然変異の存在など、特定の治療計画には禁忌とされる突然変異を検出するために採用される。例えば、アベリノ型の突然変異を示す被験者は、レーシック（ＬＡＳＩＫ）手術または他の屈曲矯正手術を受けるべきではない。同様に、場合によっては、ＫＣ突然変異を有する被験者は、レーシック（ＬＡＳＩＫ）手術または他の屈曲矯正手術を受けるべきではない。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、診断検査には、薬物応答に対する遺伝的変異の影響を決定する遺伝子検査を含む薬理ゲノミクスも含まれる。このような薬理ゲノミクス解析からの情報は、適切な治療計画の決定および策定に用途が見出される。医療分野の当業者は、適切な治療計画を設計する際に遺伝的変異の存在および／または非存在に関する情報を使用する。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、本開示の方法を使用して遺伝子プロファイルが決定される疾患には、ＫＣが含まれる。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本方法は、個体の遺伝子プロファイルを決定する際に使用されるゲノムＤＮＡを提供することによって、個々の患者に合わせた薬物治療計画の策定に用途が見出される。いくつかの実施形態では、このような遺伝子プロファイル情報は、治療計画を決定し、および／または策定するために当業者によって使用される。いくつかの実施形態では、記載された方法によって単離された核酸において特定された様々な遺伝的変異および突然変異の存在および／または非存在は、個々の患者に合わせた薬物治療の計画もしくは予定の一部として当業者によって使用される。例えば、いくつかの実施形態では、開示された方法を使用して得られた情報は、特定の疾患の診断を決定するため、および／または治療計画を決定するためにデータベースまたは他の確立された情報と比較される。場合によっては、特定の被験者における遺伝的突然変異の存在および／または非存在に関する情報は、提案された治療計画に関する決定を下すためにデータベースまたは他の標準的な情報源と比較される。場合によっては、遺伝的突然変異の存在は特定の治療計画を追求することを示している。場合によっては、遺伝的突然変異の非存在は、特定の治療計画を追求しないことを示している。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、特定の遺伝的突然変異の存在および／または非存在に関する情報は、治療機関による治療の治療効果を決定し、かつ治療機関による治療のための治療計画を調整するために使用される。いくつかの実施形態では、遺伝的突然変異の存在および／または非存在に関する情報は、治療計画を追求するかどうかを決定するために採用される。いくつかの実施形態では、遺伝的突然変異の存在および／または非存在に関する情報は、治療計画を継続するかどうかを決定するために採用される。いくつかの実施形態では、遺伝的突然変異の存在および／または非存在は、治療計画を中止するかどうかを決定するために採用される。他の実施形態では、遺伝的突然変異の存在および／または非存在は、治療計画を変更するかどうかを決定するために採用される。いくつかの実施形態では、遺伝的突然変異の存在および／または非存在は、治療計画の一部として投与されている治療の投薬量を増加させるかまたは減少させるかを決定するために使用される。他の実施形態では、遺伝的突然変異の存在および／または非存在は、治療計画の一部として投与されている治療の投薬頻度を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施形態では、遺伝的突然変異の存在および／または非存在は、１日あたり、１週間あたりの投薬回数、１日あたりの治療回数を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施形態では、遺伝的突然変異の存在および／または非存在は、治療の投薬量を変更するかどうかを決定するために使用される。いくつかの実施形態では、遺伝的突然変異の存在および／または非存在は、治療計画の開始前および／または治療計画の開始後に決定される。いくつかの実施形態では、遺伝的突然変異の存在および／または非存在は、遺伝的突然変異の存在および／または非存在に関する所定の標準的な情報と比較されて決定される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、複数の遺伝的突然変異の存在および／または非存在の複合体は、開示された方法を使用して生成され、このような複合体には、複数の遺伝的突然変異の存在および／または非存在に関する情報の任意の集合が含まれる。いくつかの実施形態では、例えば図１〜図５の遺伝的突然変異を含む、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、２０以上、３０以上または４０以上の遺伝的突然変異の有無が検査され、複合体の生成に使用される。いくつかの実施形態における例示的な情報には、核酸またはタンパク質の情報、または核酸および／またはタンパク質の遺伝的突然変異の両方に関する情報の組合せが含まれる。一般に、複合体には、遺伝的突然変異の存在および／または非存在に関する情報が含まれる。いくつかの実施形態では、これらの複合体は、治療計画を追求するか、維持するかまたは中止するために、所定の標準的な情報との比較に使用される。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ＫＣは、例えば本明細書に記載された２つ以上の遺伝的変異体の検出を通じて予測されおよび／または検出され、例えば、図１に記載されたものから選択された少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０、１００、１５０、２００または２５０個の変異体を含むが、これらに限定されない。
【０１５７】
本開示はまた、鑑別診断に役立つ方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＫＣは、本明細書に記載された２つ以上の遺伝的変異体の検出を通じて、エキシマレーザ治療後のペルーシド角膜辺縁変性、球状角膜、コンタクトレンズ誘発角膜変形、および／または角膜拡張症と区別され、例えば、図１に記載されたものから選択された少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０、１００、１５０、２００または２５０個の変異体を含むが、これらに限定されない。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は、図２に記載された群から選択された少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０、１００、１５０、２００または２５０個の遺伝的変異体であり、被験者はアフリカ系アメリカ人である。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は、図３に記載された群から選択された少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０、１００、１５０、２００または２５０個の遺伝的変異体であり、被験者は白色人種（コーカサス人）である。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は、図４に記載された群から選択された少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０、１００、１５０、２００または２５０個の遺伝的変異体であり、被験者はヒスパニックである。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体は、図５に記載された群から選択された少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、５０、１００、１５０、２００または２５０個の遺伝的変異体であり、被験者は東アジア人である。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体の検出は、ＫＣを診断するため、またはＫＣを発症する危険性を予測するために身体検査と組み合わされる。このような身体検査は、角膜曲率、角膜乱視、および角膜厚を評価するための補助検査だけでなく、目の検査も含むことができる。いくつかの実施形態では、被験者の最良の潜在的視力が評価される。目の検査の構成要素は、病歴（例えば、眼鏡の処方の変更、視力低下、目を擦った期間、医学的問題、アレルギー、および／または睡眠パターンなどを含む）、被験者の精神的状態および身体的状態に関連する側面の評価、距離を置いた場所での、および適切な場合に近距離および遠距離での現在の矯正（記録された現在の矯正力）を伴う視力、（指示がある場合は屈折矯正された）眼鏡および／またはハードコンタクトレンズもしくはガス透過性コンタクトレンズによる、最良の矯正視力の測定、ピンホール視力の測定、外部検査（まぶた、まつ毛、涙器、眼窩）、眼位および眼球運動性の検査、瞳孔機能の評価、眼圧の測定（ＩＯＰ）、前部の細隙灯生体顕微鏡検査、拡張検査（例えば、水晶体、黄斑、周辺網膜、視神経、および硝子体の拡張検査などを含む）、および角膜曲率測定／コンピュータ角膜形状解析／コンピュータ断層撮影／超音波厚さ測定を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、２つ以上の遺伝的変異体の検出は、ＫＣを診断するため、またはＫＣを発症する危険性を予測するために、ＫＣ発症の１つ以上の症状もしくは徴候と組み合わされる。いくつかの実施形態では、徴候はＫＣの初期徴候である。いくつかの実施形態では、ＫＣの初期徴候には、強度の乱視もしくは進行性の乱視を伴う非対称屈折異常、強度の乱視および不正性（１８０度まで増加しない軸）を示す角膜曲率測定値、眼底検査または網膜検影法での赤色反射のシザリング、Ｋ読取りおよびコンピュータ角膜形状解析での、下部急峻化、傾斜した軸、または上昇した角膜曲率測定値、特に下角膜における角膜菲薄化（最大の角膜菲薄化は、最大急峻化部位もしくは最大隆起部位に対応する）、ペンライトが側頭部側から照射されている場合のＲｉｚｚｕｔｉの徴候または鼻側角膜の円錐反射、フライシャーリング、コーンの基部周囲の上皮内に存在することが多い鉄堆積物が含まれるが、これらに限定されない。鉄堆積物の色は茶色であり、コバルトブルーのフィルタ、またはフォークト線条、基質中の微細でほぼ上下平行な線条によって最良に視覚化される（これらは通常、眼球に対する強い圧力によって消失し、この圧力がなくなると再び出現する）。いくつかの実施形態では、徴候はＫＣの後期徴候である。いくつかの実施形態では、ＫＣの後期徴候には、マンソン徴候（下方視におけるまぶたの突出）、表面の瘢痕化、ボウマン膜の破損、急性水腫（デスメ膜の破損により房水がストーマに流入し、深刻な角膜肥厚、視力低下および疼痛の原因となる状態）、（角膜曲率を変更し、不正乱視を低減することによって、場合によっては逆説的に視力を改善することがある）急性水腫の解消後の間質瘢痕が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、ＫＣを発症する危険性の増大に関連する２つ以上の遺伝的変異体の検出を使用して、ＫＣを有すると疑われるか、将来的にＫＣを発症すると予測される個体の治療計画の決定に役立てることができる。
【０１６５】
ＫＣ治療計画には、視力の提供および視野の維持を目的とした様々な治療計画が含まれる。軽度の場合は、眼鏡または乱視用ソフトコンタクトレンズを使用することができる。不正な角膜乱視をなくすためには、ほとんどの場合、硬質のガス透過性コンタクトレンズが必要である。ハードコンタクトレンズまたはガス透過性コンタクトレンズを着用することができる被験者の大半は、視力が劇的に改善されている。ＫＣで見られる不正で急峻な角膜に良好に適合するように特殊なコンタクトレンズが開発されており、これらには、ＲｏｓｅＫ（商標）、（角膜形状解析および／または波面測定に基づく）特注設計のコンタクトレンズ、半強膜コンタクトレンズ、ピギーバックレンズの使用（ソフトレンズおよびハードレンズを同時に使用）、および強膜レンズが含まれる（これらに限定されない）。（例えば、中央の瘢痕により）コンタクトレンズに対して不耐性になるか、または許容範囲の視力を持たない被験者には、外科的代替手段を行う。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載された２つ以上の遺伝的変異体の検出を使用して、ＫＣを発症する危険性があると疑われる個体の適切な治療を早期に開始することができる。いくつかの実施形態では、治療は、角膜形状の変化を停止させることに向けられている。いくつかの実施形態では、疾患発症を初期段階で特定する（すなわち、早期疾患発症を特定する）ために、ＫＣを発症する危険性の増大を予測する２つ以上の遺伝的変異体の検出により、角膜の早期および／またはより頻繁な監視が可能になる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、治療には、角膜水腫の症状がある被験者に対する薬物療法が含まれ、疼痛および腫脹の急性期管理が含まれる。被験者には通常、毛様体筋麻痺剤、塩化ナトリウム（Ｍｕｒｏ）５％軟膏が投与され、圧迫用眼帯が提供される場合がある。圧迫用眼帯を取り外した後であっても、被験者は、水腫の症状が解消するまで、数週間から数か月間、塩化ナトリウム点眼薬または軟膏を継続する必要がある。被験者は、激しく目を擦ることや眼の外傷を避けるように勧告される。
【０１６８】
別の態様では、本明細書に記載された２つ以上のＳＮＰの検出を使用して、ＫＣを発症する危険性があると疑われる個体の早期もしくは定期的な監視を開始することができる。いくつかの実施形態では、被験者を６ヶ月から１年ごとを基本として追跡して、角膜の菲薄化および急峻化の進行、ならびに結果として生じる視力の変化を監視し、かつコンタクトレンズの適合および手入れを再評価することができる。いくつかの実施形態では、水腫を発症した被験者は症状が解消するまでより頻繁に見られる。
【０１６９】
別の態様では、本明細書に記載された２つ以上の遺伝的変異体の検出を使用して、被験者のＫＣを診断することができる。いくつかの実施形態では、診断後、治療計画には外科的介入が含まれる。最初の治療計画は、被験者が角膜瘢痕化を示さない場合のコンタクトレンズ適合など、より侵襲性の低い手順に焦点が当てられている。しかし、被験者が不耐性になるか、またはこれ以上コンタクトレンズの恩恵を受けなくなると、手術が次の選択肢となる。外科的選択肢は、ＩＮＴＡＣＳ（すなわち、ＩＣＲＳもしくは角膜リングとしても知られる移植）、前部層状角膜移植、または全層角膜移植を含むことができるが、これらに限定されない。治療はＦＤＡ非承認の治療を含むことができ、角膜を強化して、場合によっては形状の進行性の変化を防ぐための角膜のＵＶ／リボフラビンコラーゲン架橋結合の使用を含むがこれに限定されず、この治療はエキシマレーザ治療、伝導性角膜移植、および／またはＩＮＴＡＣＳと組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、外科医は有水晶体眼内レンズ（ＩＯＬ）を使用して、強度の近視および一部の乱視に対処することもできる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、外科的介入には、コンタクトレンズ不耐性の被験者における軽度から中程度のＫＣの治療にも承認されている角膜内リングセグメント（ＩＮＴＡＣＳ、Ａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから市販）が含まれる。これらの場合、被験者は透明な中心角膜と、セグメントが挿入された約７ｍｍの光学部で４５０ミクロンを超える角膜厚とを有している必要がある。ＩＮＴＡＣＳの利点は、角膜組織の除去、および眼内切開を必要とせず、中心角膜に触れないことである。ほとんどの被験者は、術後に最高の視力を得るために眼鏡および／またはコンタクトレンズを必要とするが、角膜が平らになり、手術後のレンズが使いやすくなる。いくつかの例では、ＩＮＴＡＣＳを除去し、その後に他の外科的選択肢を検討することができる。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、外科的介入は、ＫＣを治療するための選択肢として再浮上した前部層状角膜移植を含む。前部層状角膜移植は、被験者の内皮を無傷の状態にしたまま、中心の前部角膜の置換を含む。利点は、内皮移植片拒絶反応の危険性が排除されること、および、内皮およびデスメ膜ならびに一部の基質が無傷の状態で残るため、切開における眼球の外傷性裂傷の危険性が少なく、視力機能回復が速いことである。デスメ層および内皮に触れずに前部基質を除去するための、深層層状角膜移植（ＤＡＬＫ）およびビッグバブル（ｂｉｇ  ｂｕｂｂｌｅ）角膜移植（ＢＢＫ）を含むいくつかの技法がある。しかし、この手順は全層角膜移植との対話を必要とするため技術的に困難な可能性があり、術後に界面の混濁が最高矯正視力（ＢＣＶＡ）の低下を引き起こす可能性があり、乱視が全層角膜移植と対比して前部角膜移植で良好に治療されたかどうかは明らかではない。全層角膜移植は成功率が高く、安全性および有効性について長い実績がある標準的な外科的治療である。この手順の危険性には、感染および角膜拒絶反応、ならびに創縁における外傷性裂傷の危険性が含まれる。全層角膜移植（ＰＫ）後の多くの被験者には、不正乱視が残っているため、ハードコンタクトレンズもしくはガス透過性コンタクトレンズを必要とする場合がある。任意の種類の屈曲矯正手術は、転帰の予測不可能性、および増強し不安定な不正乱視を引き起こす危険性のため、円錐角膜患者において禁忌と見なされる。
【０１７２】
さらに、円錐角膜の治療には、コラーゲン架橋結合および角膜移植が含まれる。コラーゲン架橋結合は、特殊なレーザおよび点眼薬を使用して、角膜を構成するコラーゲン繊維の「架橋結合」もしくは強化を促進する新しい治療法である。この治療は、角膜を平らにするかまたは強化し、さらなる突出を防止する。他の治療法で良好な視力が得られなくなった場合は、角膜移植を推奨される場合がある。角膜移植では、罹患角膜を眼から除去し、健康な提供角膜に置き換える。
【０１７３】
一態様では、本開示は、被験者の円錐角膜を治療する方法を提供しており、この方法は、被験者のＫＣを診断するかまたは予後を予測することと、ＫＣを治療することとを含む。さらなる実施形態では、治療は、眼鏡またはコンタクトレンズの着用、毛様体筋麻痺剤の投与、角膜内リングセグメントの適用、前部層状角膜移植の実施、および／またはコラーゲン架橋結合または角膜移植の実施を含んでもよい。
【０１７４】
別の態様では、本開示は、ＫＣを診断し、予後を予測し、および／または治療するための診断キットを提供する。上述の試薬のいずれかまたは全てを診断キットにパッケージ化してもよい。このようなキットには、本明細書に記載されたプライマー、プローブ、緩衝液および／または他の試薬のいずれかおよび／または全てが任意の組合せで含まれる。いくつかの実施形態では、キットは、図１に記載されたものから選択された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５個の変異体の検出用試薬を含むが、これらに限定されない。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、試薬は凍結乾燥粉末としてキットに含められる。いくつかの実施形態では、試薬は、再構成のための指示書とともに凍結乾燥粉末としてキットに含められる。いくつかの実施形態では、試薬は液体としてキットに含められる。いくつかの実施形態では、試薬は、プラスチックおよび／またはガラスのバイアルもしくは他の適切な容器に含められる。いくつかの実施形態では、プライマーおよびプローブは全て、キット内の個々の容器に含められる。いくつかの実施形態では、プライマーは１つの容器に一緒に包装され、プローブは別の容器に一緒に包装される。いくつかの実施形態では、プライマーおよびプローブは単一の容器に一緒に包装される。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、キットには、対照ｇＤＮＡおよび／またはＤＮＡ試料がさらに含まれる。いくつかの実施形態では、対照ＤＮＡ試料は正常である（例えば、ＫＣを有していない被験者からのもの）。いくつかの実施形態では、対照ＤＮＡ試料は、図１に記載された群から選択された変異体のいずれかを含む、検出対象の突然変異に対応する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、対照ＤＮＡ試料の濃度は、５ｎｇ／μＬ、１０ｎｇ／μＬ、２０ｎｇ／μＬ、３０ｎｇ／μＬ、４０ｎｇ／μＬ、５０ｎｇ／μＬ、６０ｎｇ／μＬ、７０ｎｇ／μＬ、８０ｎｇ／μＬ、９０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬ、１１０ｎｇ／μＬ、１２０ｎｇ／μＬ、１３０ｎｇ／μＬ、１４０ｎｇ／μＬ、１５０ｎｇ／μＬ、１６０ｎｇ／μＬ、１７０ｎｇ／μＬ、１８０ｎｇ／μＬ、１９０ｎｇ／μＬまたは２００ｎｇ／μＬである。いくつかの実施形態では、対照ＤＮＡ試料の濃度は、５０ｎｇ／μＬ、１００ｎｇ／μＬ、１５０ｎｇ／μＬまたは２００ｎｇ／μＬである。いくつかの実施形態では、対照ＤＮＡ試料の濃度は１００ｎｇ／μＬである。いくつかの実施形態では、対照ＤＮＡ試料は同じ濃度を有する。いくつかの実施形態では、対照ＤＮＡ試料は異なる濃度を有する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液、例えばＧＴＸｐｒｅｓｓ  ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）試薬混合物、または任意の同等の緩衝液をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、本明細書に記載された任意の緩衝液を含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、キットは、（例えばＭ１３ベクターを含む）ベクターなどのクローニングで使用するための試薬をさらに含むことができる。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、キットには、ＤＮＡの精製に使用するための試薬がさらに含まれる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、キットには、被験者の角膜ジストロフィーの検出用キットを使用するための指示書がさらに含まれる。いくつかの実施形態では、これらの指示書には、本明細書に記載されたプロトコルの様々な態様が含まれる。
【０１８２】
予備研究
研究コホートは、２１９の症例および６０の対照群で構成されていた。白色人種（コーカサス人）群は、７０人の症例および３３の家族症例の合計１０４の症例に加えて３８の対照群で構成され、東アジア人のコホートは、７０人の症例および５つの家族症例の合計７５の症例に加えて２０の対照群で構成され、ヒスパニック群は、１３人の症例および５つの家族症例の合計１８の症例に加えて１つの対照群で構成され、アフリカ系アメリカ人群は、１５人の症例および３つの家族症例の合計１８の症例で構成され、南アジア人群は、３人の症例および２つの家族症例の合計５つの症例および１つの対照群で構成されている（図１〜図６）。
【０１８３】
試料および対照群は、米国、カナダ、チェコ共和国、ギリシャ、ブラジル、北アイルランド、韓国およびメキシコの診療所から収集された。対照群は、眼疾患の個体歴も家族歴もない個体から収集された。各診療所は、ＣＬＥＫの研究とＫＣおよび拡張性疾患に関する世界的に一致した研究とに基づいて、ＫＣを診断するための基準を利用した。要約すると、全ての被験者が総合的な眼科検査を受け、ＫＣの診断は、プラチドディスクに基づく反射による角膜形状解析、角膜断層撮影および細隙灯検査の臨床所見に基づいたものであった。角膜の形状解析値および厚さ測定値は、角膜曲率測定値（Ｋ）、急峻値Ｋ、最大値Ｋを意味しており、最薄の角膜厚および中心角膜厚を、Ｏｃｕｌｙｚｅｒ  ＩＩ（Ａｌｃｏｎ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ、米国テキサス州フォートワース）またはＰｅｎｔａｃａｍ（登録商標）ＨＲ（ＯＣＵＬＵＳ  Ｏｐｔｉｋｇｅｒａｔｅ  ＧｍｂＨ、ドイツ国ヴェツラー）などのシャインプルーフカメラシステムを利用して測定した。一部の場所では、Ｓｃｈｗｉｎｄ  Ｓｉｒｉｕｓ（Ｓｃｈｗｉｎｄ  Ｅｙｅ−Ｔｅｃｈ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、ドイツ国クラインオストハイム）も高次収差（ＨＯＡ）の診断に利用された。家族歴が知られている場合は、試料収集時に患者によって開示された。
【０１８４】
試料の収集は、ｉＳＷＡＢ収集キット（Ｍａｗｉ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、米国カリフォルニア州ヘイワード）を使用して実施された。要するに、収集キットには、４本の口腔スワブと、専用の１．５ｍＬエッペンドルフチューブに未公開の防腐剤を含有している１ｍＬの溶液とが含まれていた。患者は、４本のスワブの各々で内側の口腔を擦って十分な上皮組織を収集して、ゲノムＤＮＡについて０．５〜３．０μｇのＤＮＡ収量を確保した。各スワブは、各口腔スワブから収集した細胞を擦り落とすように設計されたエッペンドルフチューブ内に置かれた。収集された上皮細胞を含むチューブは、使用の準備ができるまで４℃で保存された。
【０１８５】
ＱＩＡＧＥＮ  Ｉｎｃ．（ドイツ国ヒルデン）のＱＩＡａｍｐ（登録商標）ＤＮＡ血液小型キットを使用して、ゲノムＤＮＡ抽出が実施された。全血に推奨されるＤＮＡ抽出プロトコルが全ての試料に利用され、ＤＮＡは、キットに提供された１５０μｌの溶出緩衝液中でスピンカラムから溶出された。３．４ｎｇ／μｌの濃度は、ＷＥＳライブラリーの調製に必要な最小値である少なくとも０．５μｇを生成するための最小許容ＤＮＡ濃度であった。
【０１８６】
ＡＣＥ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（商標）（Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州メンローパーク）は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００でＰｅｒｓｏｎａｌｉｓが行った全ての全エクソームシークエンシング（ＷＥＳ）の実施に利用された。全エクソームＡＣＥ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（商標）は、８，０００個を超える遺伝子の調節領域を含むエクソーム外の領域に対する被覆率を増加させる。結果として得られる配列データはＰｅｒｓｏｎａｌｉｓによって処理され、バリアントコール形式（ＶＣＦ）ファイルは全ての症例および対照群について生成された。各ＶＣＦファイルは、ヒトエクソームを構成する約２２，０００個の遺伝子内に見られる約１５０，０００個の変異体で構成されていた。
【０１８７】
ＶＣＦはＢＣＦｔｏｏｌｓバージョン１．３．１を使用して処理されて、インデルを左寄せにし、かつ正規化し、複数対立遺伝子部位を複数のコールに分割し、基準塩基が既知の基準（１０００人ゲノム、フェーズ１および３、ＧＲＣｈ３７基準）と一致することを確認した。次いで、ＶＣＦｔｏｏｌｓバージョン０．１．１５を使用して、全ての基準塩基のコールおよびｃｈｒ１−２２ＸＹの外のコンティグにおいてコールされた変異体をパージした。次いで、ＢＣＦｔｏｏｌｓバージョン１．３．１を使用して、全ての試料を単一の変異体「データベース」に統合し、そこから、各民族群の試料を部分群へ抽出した。次いで、各部分群がＰＬＩＮＫ形式に変換され、各変異体の対立遺伝子数は、ＰＬＩＮＫ  ｖ１．９０ｂ３．３８を使用して症例および対照群について集計された。次いで、ＰＬＩＮＫ結果ファイルは特注のＢＡＳＨスクリプトを使用して変更され、その後、全ての変異体にはＡＮＮＯＶＡＲを使用して注釈を付けられた。
【０１８８】
変異体には、各変異体の周囲の領域の保存レベルを決定するために、３つの異なるスコアリングシステムを使用して注釈が付けられた。これらはＧＥＲＰ＋＋であり、スコアは−１２．３〜６．１７であり、６．１７が最も保存されており、ＰｈｙｌｏＰは脊椎動物および哺乳類の両方を含む４０＋のゲノムアラインメントに基づいてスコアを計算し、ＳｉＰｈｙは２９のゲノムアラインメント（哺乳類）を利用して、値が大きいほど保存性が高いことを示す対数オッズ比を生成する。追加の選別は、エクソーム集約コンソーシアム（ＥｘＡＣ、ｈｔｔｐ：／／ｅｘａｃ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／）で文書化されている血縁関係のない６０，７０６人のデータを含む、０．０５以下のマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）もしくはＮＡに基づいている。ＥｘＡｃ亜母集団はサンプルの民族群と次のように一致し、ＥｘＡｃ  ＡＦＲ（アフリカ／アフリカ系アメリカ人）はアフリカ系アメリカ人であり、ＥｘＡｃ  ＮＦＥ（フィンランド人以外のヨーロッパ人）は白色人種（コーカサス人）であり、ＥｘＡｃ  ＥＡＳ（東アジア人）は東アジア人であり、ＥｘＡｃ  ＡＭＲ（ヒスパニック（混合アメリカ人）はヒスパニックであった。
【０１８９】
損傷の結果として疾患に関連する可能性が最も高い変異体を選択するために、以下の基準が適用され、ミスセンス、ＳＴＯＰの生成／欠失、ナンセンス、またはフレームシフト／非フレームシフトインデルに分類された変異体に焦点が当てられた。これらの変異体は、Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙを使用した遺伝子セット濃縮解析を通じて、角膜もしくはＫＣ、キーとなる項目に関連する遺伝子内の変異体にさらに選別された。機能注釈チャートツールは、既定のカテゴリに加えて「ＧＡＤ＿Ｄｉｓｅａｓｅ」および「ＧＡＤ＿Ｄｉｓｅａｓｅ＿Ｃｌａｓｓ」とともに使用され、全ての豊富な項目のリストは、遺伝子カウント１およびＥＡＳＥ  １．０で導出された。最後に、各変異体の病理は、ＳＩＦＴ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ  ２  ＨＤＩＶ、ＰｏｌｙＰｈｅｎ  ２  Ｈｖａｒ、ＬＲＴ、ＭｕｔａｔｉｏｎＴａｓｔｅｒ、ＭｕｔａｔｉｏｎＡｓｓｅｓｓｏｒおよびＦＡＴＨＭＭの７つの公開された方法によるインシリコ予測で評価された。各ツールは、エクソンＤＮＡ配列におけるミスセンスの変化のために転写されたアミノ酸配列および翻訳されたタンパク質に対する可能性のある影響を判断することを目的としており、予測に到達した際に各々が異なる測定基準を考慮する。各ツールによる予測を満たしている場合、例えばこの予測が、ＳＩＦＴで有害、ＰｏｌｙＰｈｅｎ  ２  ＨＤＩＶでほぼ確実に損傷／恐らく損傷、ＰｏｌｙＰｈｅｎ  ２  ＨＶａｒでほぼ確実に損傷／恐らく損傷、ＬＲＴで有害、ＭｕｔａｔｉｏｎＴａｓｔｅｒで必然的病原、病原、ＭｕｔａｔｉｏｎＡｓｓｅｓｓｏｒで高、ＦＡＴＨＭＭで損傷であれば、変異体は病原性が１００％であるとして分類される。良性および／または一般的として分類された変異体は、疾患プロファイルに関連する場合にのみ考慮され、ＥｘＡＣに文書化されているものよりも高いＭＡＦレベルで症例試料内に存在する。この研究では、一般的な変異体は、ＥｘＡＣ内のＭＡＦが１％を超えると定義されており、つまり、ＭＡＦ（ＥｘＡＣ＿Ａｌｌ）＞０．０１である。
【０１９０】
各試料の民族性のプロファイリングには、染色体ごとに染色体上で利用可能な、公開されている１０００人ゲノムのフェーズ３のＶＣＦデータ（Ｔｈｅ  １０００  Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ、２０１５年）（ｎ＝２，５０４）が使用された。研究コホート内の試料は、これらのデータと比較された。１０００人ゲノムの染色体ＶＣＦは、ＫＣ試料ごとに正規化された。その後、全ての進行中の解析はＰＬＩＮＫ  ｖ１．９０ｂ３．３８を使用して行われた。
【０１９１】
正規化されたＶＣＦはＰＬＩＮＫ形式に変換され、その後、１０００人のゲノムおよび円錐角膜試料にわたるｄｂＳＮＰ  ｒｓ番号に基づいて一致する変異体のみが保持された。変異体は、以下のパラメータに基づいて、１０００人の各ゲノム染色体および円錐角膜データセットから削除され、ＭＡＦ＞０．２の変異体のみを保持し、以下のパラメータに基づいて連鎖不平衡下にない変異体のみを保持する。パラメータは、ウィンドウサイズが５０であり、段階サイズ（変異体カウント）が５であり、分散拡大係数（ＶＩＦ）の閾値は１．５である。マルチ対立遺伝子変異体はさらに除去された。次いで、１０００人ゲノムの染色体およびＫＣデータセットの全てが単一のプロジェクトに統合された。次いで、主成分解析（ＰＣＡ）が実施された。試料の固有値は、Ｒバージョン３．２．５（２０１６−０４−１４）を使用して最初の３つの主成分についてプロットされた。１０００人のゲノムは、それぞれの超母集団、つまりアフリカ／アフリカ系アメリカ人、ヒスパニック（混合アメリカ人）、東アジア人、ヨーロッパ人および南アジア人に分類された。
【０１９２】
診療所が提供する臨床記録に民族性が記載されていないＫＣ試料の民族性を予測するために、単純な多項ロジスティック回帰モデルが、上述の通り選別された１０００人ゲノムデータを使用して構築された。このモデルでは、１０００人ゲノムの超母集団が転帰であり、最初の２０の主成分が予測因子であった。超母集団を予測する最良の主成分は、前方後方段階的重回帰分析およびベイズ情報量基準（ＢＩＣ）を使用して選択された。このモデルは、受信者動作特性（ＲＯＣ）解析により、０．９８７（９５％ＣＩ：０．９８２−０．９９２）の曲線下面積（ＡＵＣ）を達成した。次いで、このモデルを使用して、１０００人ゲノムおよびＫＣ試料全ての民族性が予測され、それぞれの予測値がプロットされた。１つを除く全ての症例では、ＫＣ試料の予測された民族性は、試料の出荷元に基づいて想定される民族性と一致した。全てのモデリングはＲを使用して実施された。
【０１９３】
相対リスク（ＲＲ）スコアは、角膜の構造および機能に直接関連する遺伝子内に見られる変異体のサブセットの疾患予測に定量値を割り当てる目的で作成された。（図７）リスクスコアの計算では、次の段階が使用された。ベイズのロジスティック回帰モデルは、症例／対照群の状態を転帰として、かつ下流分析のために選択された変異体を予測因子として使用して最初に構築された。ＰｈｙｌｏＰ保存スコアは、モデルの予測因子として使用される各変異体の対数オッズ比に関して提供され、平均優先度は、解析されるそれぞれの民族部分群においてコールされる全ての変異体の平均ＰｈｙｌｏＰスコアを意味している。したがってこのモデルは、保存性が高いほどＯＲが増加し、保存性が低いほどＯＲが減少するように、症例および対照群全体の相対対立遺伝子の集計を、さらには変異体が特定された領域の保存（「保存ＯＲ」）を考慮する各変異体のオッズ比（ＯＲ）を生成する。次いで、リスクスコアは、前述の定義された基準による損傷結果を予測するインシリコツールの数を乗算することによって、保存ＯＲから直接計算された。インデルのリスクスコアは、現在のインシリコツールではこれらの予測を提供することができないため、それぞれの保存ＯＲとして残された。説明した円錐角膜の多様性は、マクファデンのＲ２によって定義されている。
【０１９４】
ＷＥＳデータの不均一性および民族部分群の確立：研究コホートは、白色人種（コーカサス人）、東アジア人、ヒスパニック、アフリカ系アメリカ人、南アジア人の５つの民族群で構成されていた。この研究の民族的多様性を考慮し、かつ民族群間でのＫＣの発生率と有病率の既知の変動の観点から、民族性が研究群の遺伝子プロファイルに影響を与える態様を決定した。ＰＣＡバイプロットを使用して、ＫＣコホート全体を１０００人ゲノムのフェーズ３のＶＣＦデータに対してグラフ化し、試料コホートを、自然に発生する母集団の変異体パターンに基づいて部分群に分離した。
【０１９５】
遺伝的変異体は、各民族群内で様々な頻度で全エクソームにわたって特定された。症候性眼疾患および非症候性眼疾患の両方に関連することが知られている２５９個の遺伝子に位置する合計１，１１７個の変異体が、研究コホート内で特定された（図１）。変異体は、タンパク質機能を変化させると予測されるミスセンス一塩基多型（ＳＮＰ）およびコード挿入ならびにコード欠失（インデル）として、本明細書では定義されている。良性として分類された変異体は、エクソーム集約コンソーシアム（ＥｘＡＣ）で文書化されている変異体よりもマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）が高い症例試料内に存在する場合に含まれていた。
【０１９６】
遺伝子または遺伝子が位置する遺伝子座は、疾患に関連するものとして特定された。例えば、結果は、ｒｓ３８１２９５４などのＺＮＦ４６９遺伝子内の一般的な変異体がＫＣの病因に関与していることを裏付けている。この変異体は、全ての症例試料内に１８．３％（表３）、白色人種（コーカサス人）コホート内に２５．５％、東アジア人コホート内に１８．１％の割合で存在していた。これらの種類の変異体の多くは、民族間で一致した。
【０１９７】
一般的な変異体であるＶＳＸ１遺伝子内のｒｓ６１３８４８２は、２０．８％のＭＡＦで研究コホートに存在していた。これは、白色人種（コーカサス人）、ヒスパニック、アフリカ系アメリカ人の３つの民族群で見られ、３３．３％、つまり１０２例中３４例の白色人種（コーカサス人）群において最も多く見られた。個々のゲノム内の任意の変異体の存在を考慮する場合、変異体がヘテロ接合型またはホモ接合型のいずれに見られたかに関わらず、遺伝子型も考慮に入れる必要がある。
【０１９８】
希少変異体および病理を予測するためのリスクスコアリング方法の提供：ほとんどの変異体は特定の個体、すなわち一個人だけの変異体に見られ、その結果、ＧＷＡＳおよび一般的な変異体に典型的に適用される従来の統計的方法論では、データが提示した異種モデルに有意性は示されなかった。このような広範囲の遺伝子に関する調査結果の範囲を考慮して、角膜の構造および機能に関連する遺伝子の綿密な解析が行われた。ＫＣはその表現型が角膜に影響を与える疾患であるため、角膜の遺伝子内の変異体の危険因子の定量化は、いくつかの実施形態において臨床環境での診断手段として使用される。
【０１９９】
変異体群の有意性を評価するために、選択された変異体の病理を予測するように機能する危険因子を割り当てる方法が作成された。この解析では、角膜の構造および機能に関連する４８個の遺伝子（図７）内の合計１９９個の変異体が示されている。
【０２００】
図７は、各変異体のゲノム上の領域の保存に調整されたＯＲを記載している。この変異体のセットのＲＯＣに基づく感度およびＡＵＣは、白色人種（コーカサス人）群（１０３の症例試料）について、パネルが変異体を９５％の時間で正常に特定したことを示している。
【０２０１】
遺伝子検査：さらに、この作業は、家族歴のために危険にさらされている可能性があるか、または屈折矯正手術の候補者である発症前の個体の遺伝子検査を立証する。症状が現れる前にＫＣを発症する危険性を理解することは、適切な診断および治療を保証するのに役立ち、かつこの疾患がもたらす身体的不快感および視力喪失の心的外傷を軽減するのに役立つ。定量的リスクスコアを使用して、角膜の構造および機能に関連する遺伝子内の希少変異体の病理を評価することができる。このモデルは、他の希少変異体および一般的な変異体を含むように拡張することができる。研究コホートの数は限られていたため、変異体は、このツールの実証に使用するために保守的に選択され、リスクスコアが取得元の試料セットに関連していることを強調する必要があった。
【０２０２】
【表１】
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【０２０３】
角膜の構造および機能に関連する希少変異体は、研究コホート内に見られる変異体に関するより大きなリストから抽出された。変異体は、１つ以上の症例試料中および０人の民族対応対照群中の存在に基づいて選択された。変異体の平均数は、アフリカ系アメリカ人のコホートを除いて、１症例あたり２〜５変異体の範囲であった（表１）。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、患者のゲノム内の３個以上の変異体に基づく高次のリスクプロットがＫＣの予測因子として使用される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【国際調査報告】
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