(57)【要約】  本発明は、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡと、該Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡの５’のプロセッシング配列と、該プロセッシング配列の５’の伸長配列とを含む核酸を提供する。本発明は、前記核酸と、担体と、随意的に、Ｃｐｆ１とを含む組成物も提供する。さらに、本発明は、標的真核細胞を遺伝的に改変する方法であって、前記細胞内の標的核酸を遺伝的に改変するために、前記核酸又は組成物と前記標的真核細胞を接触させることを含む方法を提供する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡと、該ｃｒＲＮＡの５’の伸長配列と、随意的に、前記ｃｒＲＮＡ及び伸長配列の間のプロセッシング配列とを含む核酸であって、前記プロセッシング配列はＣｐｆ１によって自己切断される配列である、核酸。
【請求項２】
プロセッシング配列を含み、該プロセッシング配列は、Ｃｐｆ１アレイの直接リピート配列の断片を含み、該直接リピート配列は、ｃｒＲＮＡ配列部分と、該ｃｒＲＮＡ配列部分の５’に位置するプロセッシング部分とを含み、前記断片は前記直接リピート配列のプロセッシング部分の少なくとも５個の連続したヌクレオチドを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記プロセッシング配列は前記直接リピート配列のプロセッシング部分の少なくともヌクレオチド１０個の断片を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項４】
前記プロセッシング配列は前記直接リピート配列のプロセッシング部分の全体を含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項５】
前記伸長配列は、前記プロセッシング配列又は前記ｃｒＲＮＡの配列を含まない、請求項１〜４のいずれかの核酸。
【請求項６】
前記伸長配列は少なくともヌクレオチド２個を含む、請求項１〜５のいずれかの核酸。
【請求項７】
前記伸長配列はヌクレオチド１０〜１００個を含む、請求項１〜６のいずれかの核酸。
【請求項８】
１個のＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡ配列だけを含む、請求項１〜７のいずれかの核酸。
【請求項９】
前記伸長配列の５’の第２のプロセッシング配列と、該第２のプロセッシング配列の５’の第２の伸長配列とをさらに含む、請求項１〜８のいずれかの核酸。
【請求項１０】
雑種形成又は共有結合で連結された供与体核酸をさらに含む、請求項１〜９のいずれかの核酸。
【請求項１１】
前記供与体核酸は前記プロセッシング配列の５’か、前記伸長配列の５’かに共有結合で連結される、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１２】
前記供与体核酸は、前記プロセッシング配列又は伸長配列にリンカー基によって連結される、請求項１１に記載の核酸。
【請求項１３】
前記供与体核酸は、前記伸長配列及び／又はプロセッシング配列に雑種形成される、請求項１０に記載の核酸。
【請求項１４】
前記Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡの３’にターゲッティング核酸をさらに含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の核酸。
【請求項１５】
前記伸長配列はヌクレオチド約６０個未満を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の核酸。
【請求項１６】
前記伸長配列はヌクレオチド約２０個未満を含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１７】
前記伸長配列はヌクレオチド約２〜２０個を含む、請求項１５に記載の核酸。
【請求項１８】
プロセッシング配列を含まない、請求項１〜１７のいずれかに記載の核酸。
【請求項１９】
前記伸長配列の５’に共有結合で連結した供与体核酸をさらに含む、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２０】
前記供与体核酸はリンカー基によって連結される、請求項１９に記載の核酸。
【請求項２１】
前記伸長配列に雑種形成した供与体核酸をさらに含む、請求項１８に記載の核酸。
【請求項２２】
前記Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡの３’にターゲッティング核酸をさらに含む、請求項１８〜２１のいずれかに記載の核酸。
【請求項２３】
前記伸長配列は自己雑種形成配列を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載の核酸。
【請求項２４】
前記伸長配列は、準安定ヘアピン構造、安定ヘアピン構造、シュードノット構造、Ｇ−４重体構造、バルジループ構造、インターナルループ構造、ブランチループ構造又はこれらの組み合わせを含む、請求項１〜２３のいずれかに記載の核酸。
【請求項２５】
前記伸長配列は繰り返すトリヌクレオチドモチーフを含む、請求項２４に記載の核酸。
【請求項２６】
前記繰り返すトリヌクレオチドモチーフは、ＣＡＡ、ＵＵＧ、ＡＡＧ、ＣＵＵ、ＣＣＵ、ＣＣＡ、ＵＡＡ、又はこれらの組み合わせである、請求項２５のいずれかに記載の核酸。
【請求項２７】
前記繰り返すトリヌクレオチドモチーフは、ＣＡＵ、ＣＵＡ、ＵＵＡ、ＡＵＧ、ＵＡＧ、又はこれらの組み合わせである、請求項２５のいずれかに記載の核酸。
【請求項２８】
前記繰り返すトリヌクレオチドモチーフは、ＣＧＡ、ＣＧＵ、ＣＧＧ、ＣＡＧ、ＣＵＧ、ＣＣＧ、又はこれらの組み合わせである、請求項２５のいずれかに記載の核酸。
【請求項２９】
前記繰り返すトリヌクレオチドモチーフは、ＣＮＧモチーフ又は、ＣＮＧモチーフの組み合わせであり、随意的には、ＣＧＡ又はＣＧＵである、請求項２５のいずれかに記載の核酸。
【請求項３０】
前記繰り返すトリヌクレオチドモチーフは、ＡＧＧ、ＵＧＧ、又はこれらの組み合わせである、請求項２５のいずれかに記載の核酸。
【請求項３１】
前記伸長配列は請求項２６〜３０のいずれかに記載の繰り返すトリヌクレオチドモチーフの組み合わせを含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の核酸。
【請求項３２】
前記伸長配列又はその部分はヌクレアーゼ分解に抵抗性がある、請求項１〜３１のいずれかに記載の核酸。
【請求項３３】
前記伸長配列は１個以上の改変ヌクレオチド間結合を含む、請求項１〜３２のいずれかに記載の核酸。
【請求項３４】
前記伸長配列の連続したヌクレオチド４個以上の領域か、前記伸長配列の全体かが改変ヌクレオチド間結合を有する、請求項３３に記載の核酸。
【請求項３５】
前記改変ヌクレオチド間結合は、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート、ホスホロアミダート、２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−メトキシエチル，２’−フルオロ，架橋核酸（ＢＮＡ）、又はホスホトリエステル修飾結合又はこれらの組み合わせを含む、請求項３３又は３４に記載の核酸。
【請求項３６】
前記伸長配列は、１個以上のゼノ核酸（ＸＮＡ）を含む、請求項１〜３５のいずれかに記載の核酸。
【請求項３７】
前記伸長配列の５’末端に付着したビオチン及び／又はアビジン若しくはストレプトアビジン分子をさらに含む、請求項１〜３６のいずれかに記載の核酸。
【請求項３８】
前記伸長配列の５’末端に付着したビオチン分子と、前記ビオチン分子にコンジュゲートされたアビジン又はストレプトアビジン分子と、随意的に、前記アビジン又はストレプトアビジンにコンジュゲートされたビオチン分子を含むターゲッティングコンストラクトとをさらに含む、請求項３７に記載の核酸。
【請求項３９】
前記ターゲッティングコンストラクトは、ビオチン分子が付着したペプチドである、請求項３８に記載の核酸。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれかに記載の核酸及び担体を含み、随意的に、Ｃｐｆ１タンパク質をさらに含む、組成物。
【請求項４１】
Ｃｐｆ１切断を促進する２価金属イオンを実質的に含まない、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
カチオン性脂質を含む、請求項４０又は４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記核酸はリポソームの中に存在する、請求項４０〜４２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４４】
前記核酸は、ポリマーナノ粒子に部分的又は完全に封入されているか、又は、金属又はポリマーナノ粒子に付着している、請求項４０〜４２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４５】
標的真核細胞を遺伝的に改変する方法であって、標的核酸を遺伝的に改変するために、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の核酸か、請求項４０〜４４のいずれかに記載の組成物に前記標的真核細胞を接触させることを含む、方法。
【請求項４６】
前記Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、前記標的細胞内の標的配列と雑種形成するターゲッティング配列を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記標的細胞は、哺乳類の細胞であり、随意的に、ヒト細胞である、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記核酸コンストラクトは細胞内に進入する際に切断され、それにより、前記Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡを前記核酸コンストラクトのその他のパーツから切り離す、請求項４５〜４７のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１７年１０月２日に出願された米国仮特許出願番号第６２／５６７，１２３号、２０１８年１月１２日に出願された米国仮特許出願番号第６２／６１７，１３８号及び２０１８年７月１２日に出願された米国仮特許出願番号第６２／６９７，３２７号（参照によりこれらの全体が本明細書に組込まれる）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、複数の細胞タイプ及び微生物におけるゲノム操作用の有効なツールであることが証明されている。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、標的核酸内に部位特異的２本鎖ＤＮＡ切断又は１本鎖ＤＮＡ切断を生成する。標的核酸の切断が細胞内で起こるとき、前記核酸の切断は非相同性末端結合（ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ  （ＮＨＥＪ））又は相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒｅｐａｉｒ  （ＨＤＲ））によって修復できる。
【０００３】
試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及び生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）の両方の細胞へのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ及びその遺伝子編集成分（例えばガイドＲＮＡ）の直接送達は、遺伝病を処置する治療戦略としてとてつもなく大きい可能性がある。しかし現在のところ、合理的な効率でこれらの成分を細胞内に直接送達することは困難である。
【０００４】
したがって、ゲノム操作を向上させるＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの細胞送達その他の特性を改善するための新規な組成物及び関連する方法を同定することには需要がある。本発明はかかる組成物及び関連する方法を提供する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、伸長配列を有するＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡを含む核酸である。１つの局面では、前記核酸は、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡと、該Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡの５’末端の伸長配列とを含み、該伸長配列はヌクレオチド約６０個未満を含む。別の局面では前記核酸は、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡと、該Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡの５’側のプロセッシング配列と、該プロセッシング配列の５’の伸長配列とを含む。前記核酸と、担体と、随意的に、Ｃｐｆ１タンパク質又は該タンパク質をコードするベクターとを含む組成物も提供される。
【０００６】
本発明は、標的真核細胞を遺伝的に改変するための方法も提供する。該方法は、前記標的真核細胞を上述のＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡを含む核酸と接触することを含む。
【０００７】
本発明のこれら及びその他の局面は以下のセクションでより詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａは、リポフェクタミン又はエレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）のいずれかを用いて未改変ｃｒＲＮＡとＣｐｆ１との複合体の送達を比較するグラフである。
【図１Ｂ】図１Ｂは、リポフェクタミンを介する送達と、（ヌクレオチド４１個の長さの）未改変ｃｒＲＮＡ及び伸長したｃｒＲＮＡとを含むＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡ複合体のＮＨＥＪ生成とを比較するグラフである。
【図１Ｃ】図１Ｃは、リポフェクタミンを介する送達と、（ヌクレオチド４１個の長さの）未改変ｃｒＲＮＡ及び伸長したｃｒＲＮＡとを含むＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡ複合体のＮＨＥＪ生成とを比較するグラフである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ヌクレオチド（ｎｔ）４１個の未改変ｃｒＲＮＡ及び伸長したｃｒＲＮＡｓの構造の模式図である。矢印はＣｐｆ１切断部位を表す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、図１Ｄに示すｃｒＲＮＡコンストラクトについてのＮＨＥＪ効率を示すグラフである。
【図１Ｆ】図１Ｆは、リポフェクタミンを用いるＣｐｆ１ＲＮＰと、蛍光色素で標識された異なる長さのｃｒＲＮＡｓとの細胞送達を表すグラフである。
【図２】図２は、エレクトロポレーションを介してＧＦＰ−ＨＥＫ細胞に送達された５’伸長ｃｒＲＮＡについてのＧＦＰノックダウンの関数としての遺伝子編集効率を表すグラフ（右パネル）と、前記ｃｒＲＮＡの模式図（左パネル）である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＡＩ９マウスでの生体内研究の模式図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、腓腹筋注射部位及び断層画像の模式図である。
【図４Ａ】図４Ａは、エレクトロポレーションを用いて供与体ＤＮＡとともに送達された、異なる伸長配列を有するｃｒＲＮＡについてのＨＤＲ頻度のグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、エレクトロポレーションを用いるＮＨＥＪ効率を示す、供与体ＤＮＡとともに送達された異なる伸長配列を有するｃｒＲＮＡについてのＧＦＰ−細胞の百分率のグラフである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、エレクトロポレーションを用いるＮＨＥＪ効率を示す、供与体ＤＮＡとともに送達された異なる伸長配列を有するｃｒＲＮＡについてのＢＦＰ−細胞の百分率のグラフである。
【図４Ｄ】図４Ｄは、標的配列への相同性がない１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を伴って、あるいは、伴わないでエレクトロポレーションを用いて送達される、伸長ｃｒＲＮＡについてのＧＦＰ−細胞の百分率のグラフである。
【図４Ｅ】図４Ｅは、標的配列との相同性がない１００ヌクレオチドＲＮＡｓ及び９ヌクレオチドＲＮＡで伸長されたｃｒＲＮＡについてのエレクトロポレーションを用いる遺伝子編集をＧＦＰ−細胞の百分率として示すグラフである。
【図４Ｆ】図４Ｆは、エレクトロポレーションを用いて、４ヌクレオチドの伸長を伴う、及び、伴わないで、化学部分でさらに修飾されたｃｒＲＮＡについてのＧＦＰ−細胞の百分率のグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、ｃｒＲＮＡと供与体ＤＮＡとのコンジュゲーションの模式図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ｃｒＲＮＡと供与体ＤＮＡとのコンジュゲーションの模式図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、チオールでの還元後の、ｃｒＲＮＡ／ＤＮＡのコンジュゲーション体分子からの供与体ＤＮＡ及びｃｒＲＮＡの切り離しを示すゲル電気泳動分離の画像である。
【図６】図６は、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（すなわち、カチオン性ポリマー）を用いるトランスフェクション後に、ＨＤ−ＲＮＡにコンジュゲーションされたＣｐｆ１がＧＦＰ−ＨＥＫ細胞においてＮＨＥＪを誘導することを示すグラフである。
【図７】図７は、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（すなわち、カチオン性ポリマー）を用いるトランスフェクション後に、ＨＤ−ＲＮＡにコンジュゲーションされたＣｐｆ１がＧＦＰ−ＨＥＫ細胞においてＨＤＲを誘導することを示すグラフである。
【図８】図８は、Ｃｐｆ１タンパク質の配列を提供する。
【図９】図９は、Ｃｐｆ１プロセッシング配列の例を提供する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、供与体ＤＮＡにコンジュゲーションされたｃｒＲＮＡの模式図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、供与体ＤＮＡにコンジュゲーションされたｃｒＲＮＡに用いられる配列を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、初代Ａｉ９筋芽細胞におけるエレクトロポレーションを用いるさまざまなｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１での処理後のＲＦＰ＋細胞の百分率のグラフである。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、初代Ａｉ９筋芽細胞に１００ヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡとともにトランスフェクションされたＲＦＰ−細胞の百分率のグラフである。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子を標的とするｃｒＲＮＡについて９ヌクレオチドの伸長配列を伴うか、あるいは、伴わない、Ｃｐｆ１ＲＮＰで、エレクトロポレーションを用いてトランスフェクションされたＨｅｐＧ２細胞におけるＮＨＥＪ効率のグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ｃｒＲＮＡ伸長に用いることが可能なＲＮＡ構造を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、さまざまなＲＮＡ構造を提供するのに使用可能なトリヌクレオチドリピート配列を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ｃは、ｃｒＲＮＡの多量体を形成するために使用可能なキッシングループにおけるｃｒＲＮＡの雑種形成する伸長配列の交差を表す。
【図１１Ｄ】図１１Ｄは、３量体（パネル(i)）または８量体（パネル(ii)）を形成する、ｃｒＲＮＡの雑種形成する伸長配列の交差を表す。
【図１２】図１２は、ＢＦＰを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるさまざまなＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡｓの編集効率（％ＢＰＦ−）を示す。ＭＳは５’末端から最初のトリヌクレオチドの２’−ＯＭｅ３’ホスホロチオアート修飾であり、＋９ｄｕは５’末端から９番目のヌクレオチドの２’デオキシ修飾であり、＋９Ｓは５’末端から最初の９個のヌクレオチドのホスホロチオアート修飾である。ＢＦＰノックアウト効率はエレクトロポレーションの７日後にフロー・サイトメトリーで測定された。平均±Ｓ．Ｅ．、ｎ＝３。全ての伸長ｃｒＲＮＡｓはステューデントｔ検定によるｐ値が０．０５未満で、未改変ｃｒＲＮＡに対して統計的有意差を示した。
【図１３Ａ】図１３Ａは、未改変Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ及びＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡの模式図である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ及びＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡの活性の相対値をＧＦＰノックダウンの関数として示すグラフである。
【図１３Ｃ】図１３Ｃは、Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ及びＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡの活性の相対値をＧＦＰノックダウンの関数として示すグラフである。
【図１４】図１４は、ビオチン及びアビジンで修飾され、かつ、ビオチンを含む標的分子に連結された、伸長ｃｒＲＮＡの模式図である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、伸長配列を有するｃｒＲＮＡに施された化学修飾の模式図である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、血清中でのインキュベーション後に残存するｃｒＲＮＡ量を定量するグラフである。
【図１５Ｃ】図１５Ｃは、ヌクレオチド９個の伸長配列及び化学修飾を有するｃｒＲＮＡのリポフェクタミンを用いる送達後のＧＦＰ−細胞の百分率のグラフである。
【図１５Ｄ】図１５Ｄは、化学修飾を施された伸長ｃｒＲＮＡ及び未改変のｃｒＲＮＡをＣｐｆ１とともにエレクトロポレーションを用いて送達後のＧＦＰ−細胞の百分率を比較するグラフである。
【図１６】図１６は、未改変ｃｒＲＮＡ（ヌクレオチド４１個）、塩基対９個伸長したｃｒＲＮＡ（合計ヌクレオチド５０個）、又は、塩基対５９個伸長したｃｒＲＮＡ（合計ヌクレオチド１００個）を含むＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡ複合体のカチオン性ポリマーを介する送達及びＮＨＥＪ生成を比較するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明は、従来のＣｐｆ１のための改変ガイド核酸（以下、「ｃｒＲＮＡ」という。）と比較して特性が向上したｃｒＲＮＡを提供する。本明細書で用いるところのｃｒＲＮＡは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣｐｆ１と結合して、該ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの標的をＣｐｆ１で切断されるべき標的核酸内の特定の場所に定める、核酸配列（例えばＲＮＡ）を指す。Ｃｐｆ１はＶ型適応免疫に関与するクラスＩＩＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムのＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１は、機能するために、他のＣＲＩＳＰＲ酵素のようにｔｒａｃｒＲＮＡ分子を必要としないが、単一のｃｒＲＮＡだけは必要とする。Ｃｐｆ１は、その標的の５’上流に位置する「ＴＴＮ」ＰＡＭモチーフを好む。さらに、Ｃｐｆ１の切断部位は塩基約３〜５個が突出しており、「粘着末端」を作り出す（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６．  “Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｃｐｆ１  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ”  オンライン発行２０１６年６月６日）。塩基対３〜５個のオーバーハングを有するこれらの粘着末端は、ＮＨＥＪを介するライゲーションを促進し、かつ、適合する末端を有するＤＮＡ断片の遺伝子編集を改善する。
【００１０】
Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、いずれかの出所源から由来又は単離された、いずれかの生物種又はいずれかの人工合成又は天然の変異体又はオーソログからのものでも可能であることを当業者は理解するであろう。これは、前記Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡが、いずれかの細菌生物種由来のいずれかのＣｐｆ１ポリペプチド又はオーソログか、これらの人工合成変異体かを認識する（結合する）ｃｒＲＮＡの必要な要素（例えば、配列又は構造）を有することができるといえる。Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡ配列の例は図９に提供され、したがって例えば、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡの例は、配列番号２１〜３９のいずれかを含むものを含む）。人工合成変異体Ｃｐｆ１のＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡ配列の例は、Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ，Ｉｎｃ．（コロラド州、米国）によるＭＡＤ７  Ｃｐｆ１オーソログに対応するｃｒＲＮＡである。Ｃｐｆ１変異体の別の例は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｃｐｆ１  （ＡｓＣｐｆ１）のＨ８００Ａ、Ｋ８０９Ａ、Ｋ８６０Ａ、Ｆ８６４Ａ及びＲ７９０Ａ、又は異なるＣｐｆ１オーソログ（例えば、Ｈ８００Ａ突然変異又は対応する位置でのＨ→Ａ突然変異）の対応する位置での改変を導入することによるようなＲＮａｓｅ活性を低減除去するための改変されたＣｐｆ１である。
【００１１】
典型的にはｃｒＲＮＡは、標的ドメインと、該標的ドメインの５’に位置するステム−ループドメインとを含む。ｃｒＲＮＡの全長は、Ｃｐｆ１を標的核酸内の特定の場所にガイド可能であれば特に限定されない。ステム−ループドメインは一般的にはヌクレオチド（ｎｔ）約１９〜２２個の長さで、標的／ガイドドメインはヌクレオチド約１４〜２５個からいずれか（例えば、少なくともヌクレオチド約１４個、１５個、１６個、１７個又は１８個）である。Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡの全長は、一部の実施態様では、ヌクレオチド２０個から１００個まで、２０個から９０個まで、２０個から８０個まで、２０個から７０個まで、２０個から６０個まで、２０個から５５個まで、２０個から５０個まで、２０個から４５個まで、２０個から４０個まで、２０個から３５個まで、２０個から３０個まで、又は２０個から２５個までの長さである。
【００１２】
本開示の１つの局面は、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡと、該ｃｒＲＮＡの５’の伸長配列と、随意的に、プロセッシング配列とを含む核酸を提供し、該プロセッシング配列は、前記ｃｒＲＮＡ及び前記伸長配列の間か、前記伸長配列の内部か、前記伸長配列の５’かに位置してもかまわない。
【００１３】
伸長配列
本発明の核酸は、ｃｒＲＮＡの５’に位置する伸長配列を含む。伸長配列は、いずれかの組み合わせの核酸（すなわち、いずれかの配列）を含んでもかまわない。ある実施態様では、前記伸長配列は核酸分子の全陰電荷密度を増大させ、ｃｒＲＮＡを含む核酸の送達を改善する。
【００１４】
一部の実施態様では、伸長配列は細胞内に入ったら切断できる。いずれかの特定の理論又は作用機序に拘束されることは望まないが、Ｃｐｆ１は前記伸長配列を切断できる。しかし、ある種の用途では、前記伸長配列がＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡから切断されないコンストラクトを用いることが望ましい。例えば、前記伸長配列かその一部分又は一領域かが、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡにより切断に抵抗性（例えば、ヌクレアーゼ抵抗性）がある、１個又は２個以上のヌクレオチド間連結（改変「骨格」）を含むことができる。改変ヌクレオチド間連結の例は、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホナート、ホスホロアミダート、２’−Ｏ−メチル，２’−Ｏ−メトキシエチル，２’−フルオロ，架橋核酸（ＢＮＡ）、又はホスホトリエステル修飾結合と、これらの組み合わせとを含むが、これらに限定されない。前記伸長配列又はその一部は、ヌクレアーゼ抵抗性のゼノ核酸（ＸＮＡｓ）のような人工合成ヌクレオチドを含むこともできる。ＸＮＡｓは、ＤＮＡ又はＲＮＡのリボフラノース環が、１，５アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡｓ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡｓ）、及び２’４’−Ｃ−（Ｎ−メチルアミノメチレン）架橋核酸（ＢＮＡｓ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−メチレン−β−Ｄ−リボ核酸又はロックド核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ、ＬＮＡｓ）、ＡＮＡ（アラビノ核酸）、２’−フルオロ−アラビノ核酸（ＦＡＮＡｓ）及びα−Ｌ−スレオフラノシル核酸（ＴＮＡｓ）のような５又は６員修飾リボース分子によって置換された核酸である。さらにこれらのいずれかの組み合わせも使用可能である。
【００１５】
伸長配列の長さは、該伸長配列が全陰電荷密度を増大しないのであれば、特に限定されない。例えば、伸長配列は、少なくともヌクレオチド（ｎｔ）約２個、約１０００個まで（例えば、少なくとも２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個又は９００個、かつ、約１０００個まで）の長さであることが可能である。１つの局面では、前記伸長配列の長さは、約８０個未満、約６０個未満、約４０個未満（例えば、約３０個未満又は約２０個未満）のように、ヌクレオチド約１００個未満である。前述の長さの下限及び上限のいずれかは範囲として表現できる。より短い配列（例えば、ヌクレオチド約１５個未満又は約１０個未満）も使用できる。一部の実施態様では、前記伸長配列は、少なくともヌクレオチド約４個、少なくともヌクレオチド約６個、又は少なくともヌクレオチド約９個のように、少なくともヌクレオチド約２個を含む。上述のいずれかは範囲として表現できる。したがって例えば、前記伸長配列はヌクレオチド約２〜６０個（例えば、約２〜４０個、約２〜３０個、約２〜２０個、約２〜１５個又は約２〜１０個）、約４〜６０個（例えば、約４〜４０個、約４〜３０個、約４〜２０個、約４〜１５個又は約４〜１０個）、約６〜６０個（例えば、約６〜４０個、約６〜３０個、約６〜２０個、約６〜１５個又は約６〜１０個）、あるいは、約９〜６０個（例えば、約９〜４０個、約９〜３０個、約９〜２０個、約９〜１５個又は約９〜１０個）であることが可能である。
【００１６】
一部の実施態様では、前記伸長配列は、前記核酸コンストラクトにより大きな陰電荷密度を付与する以外の機能を有しない。この実施態様では例えば、前記伸長配列はランダム配列又はノンコーディング配列である。プロセッシング配列が用いられるときのように、場合によっては、前記配列はプロセッシング配列の切断の際に分解されて核酸コンストラクトから切り離されることが可能である。
【００１７】
他の実施態様では伸長配列は、核酸コンストラクトにより大きな陰電荷密度を付与することとは別であり、かつ、異なる機能を有する。前記伸長配列はいずれかの追加の機能を有することができる。例えば伸長配列は、供与体ＤＮＡのような別の核酸のための雑種形成ブイを提供することができる。また一部の実施態様では、伸長配列はアプタマーである、及び／又は細胞結合を促進することができる。しかし時として、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ以外のタンパク質とガイドＲＮＡとの結合を採用することは望ましくない。さらにアプタマー配列は嵩張ってコンパクトでないことがある複雑なフォールディングパターンを有することが典型的である。したがって他の実施態様では、伸長配列はアプタマー配列ではない。
【００１８】
一部の実施態様では、伸長配列は、編集されるべき標的細胞中での発現が望まれるタンパク質をコードする配列を含むことができる。例えば伸長配列は、前記核酸コンストラクトに使用されるｃｒＲＮＡと対になる（すなわち認識して誘導される）ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのようなＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードする配列を含むことができるかもしれない。伸長配列は、例えば、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼのｍＲＮＡの配列を含むことができる。
【００１９】
一部の実施態様では、伸長は構造化された伸長を提供するために自己フォールディング（自己雑種形成）をする。提供される構造のタイプに限定はない。前記伸長はランダムコイル構造を有することができるが、一部の実施態様では前記伸長は、同じヌクレオチド数のランダムコイル構造よりもよりコンパクトで、より高い総陰電荷密度を提供する構造を有する。前記伸長の全長を増大させることにより、分子の陰電荷は増大する。よりコンパクトな構造が用いられるとき、前記分子の総陰電荷密度はさらに増大する。コンパクトさ又は電荷密度は、ゲル電気泳動の泳動度に基づいて決定できる。より具体的には、ゲル電気泳動がヌクレオチドの個数が同じ２本の核酸について同一ゲル上で一緒に実施されるとき、泳動度がより高い（前記ゲル中でより遠くまで移動する）核酸がよりコンパクトな構造を有すると認められる。
【００２０】
他の実施態様では前記伸長配列は、少なくとも１個の準安定ヘアピン構造、安定ヘアピン構造、シュードノット構造、Ｇ４重体（ｑｕａｄｒａｐｌｅｘ）構造、バルジループ構造、インターナルループ構造、分枝ループ構造又はこれらの組み合わせを含む。これらのタイプのヌクレオチド構造は本発明の技術分野で知られており、図１１Ａに模式図で示される。図解は単に一般的な構造を図示することを目的とするに過ぎず、実際の分子構造の詳細な図解を意図するものでないことが理解されるべきである。例えばヘアピン構造は「バルジ」その他の構造のバリエーションを作出する散在非相補性領域を有することができること、及び、他の描写された構造が類似のバリエーションを含むことができることを当業者は認識する。所定のヌクレオチド配列の構造は入手可能なアルゴリズム（Ｒｅｎｓｓｅｌａｅｒ  Ｐｏｌｙｔｅｃｈｎｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ及びニューヨーク州立大学Ａｌｂａｎｙ校、Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅによって運営される「Ｔｈｅ  ｍｆｏｌｄ  Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ」、Ｍ．  Ｚｕｋｅｒ，  Ｄ．  Ｈ．  Ｍａｔｈｅｗｓ及びＤ．  Ｈ．  Ｔｕｒｎｅｒ．  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｉｎ ＲＮＡ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １１−４３，  Ｊ．  Ｂａｒｃｉｓｚｅｗｓｋｉ及びＢ．  Ｆ．  Ｃ．  Ｃｌａｒｋ，編，  ＮＡＴＯ  ＡＳＩ  Ｓｅｒｉｅｓ，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｄｏｒｄｒｅｃｈｔ，  ＮＬ，  （１９９９）も参照せよ）を用いて決定できる。
【００２１】
提供される構造のタイプは、リピートするトリヌクレオチドモチーフを用いて制御することができる（例えば図１１Ｂ）。リピートするトリヌクレオチドモチーフは、配列中に少なくとも２回（例えば、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、７回以上、８回以上又は１０回以上）リピートするトリヌクレオチドのモチーフである。したがって、前記伸長配列はリピートするトリヌクレオチドモチーフを含む。１つの実施態様では前記伸長配列は、ＣＡＡ、ＵＵＧ、ＡＡＧ、ＣＵＵ、ＣＣＵ、ＣＣＡ、ＵＡＡ又はこれらの組み合わせのリピートするトリヌクレオチドのモチーフを含み、該モチーフはランダムコイル配列を提供する。他の実施態様では前記伸長配列は、ＣＡＵ、ＣＵＡ、ＵＵＡ、ＡＵＧ、ＵＡＧ又はこれらの組み合わせのリピートするトリヌクレオチドのモチーフを含み、該モチーフは準安定ヘアピン構造を提供する。別の実施態様では前記伸長配列は、リピートするＣＮＧ（例えばＣＧＧ、ＣＡＧ、ＣＵＧ、ＣＣＧ）のトリヌクレオチドのモチーフ、リピートするＣＧＡ又はＣＧＵのトリヌクレオチドのモチーフ、又はこれらの組み合わせを含み、該モチーフは安定なヘアピン構造を提供する。別の実施態様では前記伸長配列は、ＡＧＧ、ＵＧＧ又はこれらの組み合わせのリピートするトリヌクレオチドのモチーフを含み、該モチーフは４重体（Ｇ−４重体）構造を提供する。さらに別の実施態様では前記伸長配列は、上述のトリヌクレオチドのモチーフの組み合わせと、これらによって作出される異なる構造の組み合わせとを含む。例えば前記伸長配列は、ランダムコイル構造を含む領域、準安定ヘアピン構造を含む領域、安定ヘアピン構造を含む領域、及び／又は、４重体を含む領域を有することができるかもしれない。したがって各領域は、示された構造と関連するリピートするトリヌクレオチドのモチーフを含むかもしれない。構造の非制限的な例は以下の表に提供される。
【００２２】
【表１】
2020537540.tif 000003
【００２３】
前記伸長配列は、ｃｒＲＮＡ多量体を作り出すために使用することもでき、したがって、別の実施態様では２個以上のｃｒＲＮＡ分子（例えば、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、又は８個以上のｃｒＲＮＡ分子）を含むｃｒＲＮＡ多量体であって、各ｃｒＲＮＡは本明細書に説明されるとおりの伸長配列を含み、前記多量体のｃｒＲＮＡ分子はそれらの伸長配列によって、例えば対合又は雑種形成を介して結合される、ｃｒＲＮＡ多量体が提供される。したがって１つの実施態様では、前記多量体の各ｃｒＲＮＡは、雑種形成を促進するために、前記多量体の別のｃｒＲＮＡの伸長配列の領域と十分に相補的な領域を含む、伸長配列を含む。前記相補的領域は、相互作用を促進するために適当ないずれかの長さ（例えば、ヌクレオチド４個以上、６個以上、８個以上、１０個以上、１５個以上等）であることができる。ｃｒＲＮＡは、例えば、多数のｃｒＲＮＡが特定の治療戦略のために望ましいときのように、多数のｃｒＲＮＡを同時に送達するために有用である。かかる使用の１つの例は、機能的な読み枠を回復するためにＤＮＡ断片が２本のｃｒＲＮＡｓによって切断される、エキソンスキッピングである（例えば、Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ  ＤＧ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５），  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｃａｕｓｅ  Ｄｕｃｈｅｎｎｅ  Ｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ６：６２４４）。エキソンスキッピングは、ターゲッティングのための核内でそれぞれが異なる部位（一方は５’部位で、他方は３’部位）を標的とする２本のｃｒＲＮＡｓを必要とする。理想的には、前記２本のｃｒＲＮＡｓの比は１：１であるべきだが、この比を維持することは困難である。多量体中で（例えば、それぞれが異なる標的配列を含む）ｃｒＲＮＡｓを対にすることにより、所望の比での送達が促進できる。
【００２４】
１つの実施態様では、構造化された伸長配列を有する２本以上のｃｒＲＮＡｓがＲＮＡ「キッシング」相互作用（別名ループ−ループ相互作用）に参加し、一方の構造化伸長配列（例えば、ヘアピンループ）の対合していないヌクレオチドが第２のｃｒＲＮＡ上の別の構造（例えば、別のヘアピンループ）の対合していないヌクレオチドと塩基対を形成するときに前記相互作用が起こる。このタイプの相互作用の例が図１１Ｃに図示される。キッシングループその他の構造は前記２個以上のｃｒＲＮＡ分子を多量体化する。この戦略が数個のｃｒＲＮＡ分子を連結するために応用できる。
【００２５】
各ｃｒＲＮＡ上の前記伸長中の相補配列の雑種形成は、多量体化を促進するために使用することもできる。例えば超分子ｃｒＲＮＡ構造は自己集合能力を有する伸長領域を介して構築できる。例えば、適切に配置された雑種形成領域を有する３本のＲＮＡ分子によって３量体が形成できる（例えば図１１Ｄ、パネル(i)、Ｓｈｕ  Ｄ，  Ｓｈｕ  Ｙ，  Ｈａｑｕｅ  Ｆ，  Ａｂｄｅｌｍａｗｌａ  Ｓ及びＧｕｏ  Ｐ  （２０１１）  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ  ｓｔａｂｌｅ  ＲＮＡ  ｔｈｒｅｅ−ｗａｙ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｓ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．  Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６（１０）：６５８−６６７．））。同様に、ＲＮＡ８量体が１６本のＲＮＡ分子を集合させることによって生成できた（図１１Ｄ、パネル(ii)、Ｙｕ  Ｊ，  Ｌｉｕ  Ｚ，  Ｊｉａｎｇ  Ｗ，  Ｗａｎｇ  Ｇ，及びＭａｏ  Ｃ  （２０１４）  Ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎ  ＲＮＡ  ｔｉｌｅ  ｔｈａｔ  ｓｅｌｆ−ａｓｓｅｍｂｌｅｓ  ｉｎｔｏ  ａ  ｈｏｍｏ−ｏｃｔａｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐｒｉｓｍ．  Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．  ６：５７２４））。
【００２６】
上述のタイプの伸長のいずれもプロセッシング配列とともに、又は、該配列なしで使用できる。一部の実施態様では前記核酸は、複数のプロセッシング配列及び伸長配列を含むことができる。例えば前記核酸は、第１の伸長配列の５’の第２のプロセッシング配列と、第２のプロセッシング配列の５’の第２の伸長配列とをさらに含むことができる。第２のプロセッシング及び伸長配列は第１のプロセッシング配列及び伸長配列と同じ（例えばリピート）にでき、あるいは、第２のプロセッシング配列及び第２の伸長配列のいずれか又は両方が第１のプロセッシング配列及び／又は伸長配列と異なることができる。前記核酸は、プロセッシン及び伸長配列のいずれかの数に特に限定されず、プロセッシング配列及び／又は伸長配列を２個、３個、４個、５個等有することができる。
【００２７】
前記核酸コンストラクトの５’末端（すなわち適用可能な５’末端のプロセッシング配列又は伸長配列）は所望のとおりさらに改変できる。例えば５’末端は、生体直交型又は「クリック」化学反応に参加する官能基のような、官能基で修飾できる。例えば前記核酸の５’末端はアジド、テトラジン、アルキン、歪みアルケン又は歪みアルキンで化学的に修飾できる。かかる修飾は、適切に対合した官能基を用いて所望の化学部分又は分子をコンストラクトに参加させるのを促進できる。
【００２８】
前記核酸の５’末端は、随意的には上記に説明した生体直交型又は「クリック」化学を介して生体機能分子を含むために修飾できる。前記生体機能分子は、前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼの送達又は活性の増強か、あるいは、特定の目的地（例えば特定のタンパク質、細胞レセプター、組織等を標的にする部分）を前記核酸の標的にすること、又は、前記コンストラクトの追跡を促進する（例えば、蛍光マーカー、放射標識その他のような、検出可能な標識）ことのような、何か別の所望の機能の提供かをするいずれかの分子とすることができる。生体機能分子の例は、例えば、エンドソーム分解性ポリマー、供与体ＤＮＡ分子、アミノ糖（例えばＮ−アセチルガラトサミン（ＧａｌＮＡｃ）又はトリ−ＧａｌＮＡｃ）ガイド及び／又はトレーサーＲＮＡ（例えば１本鎖ガイドＲＮＡ）と、その他のペプチド、核酸及びターゲッティングリガンド（例えば抗体、リガンド、細胞レセプター、アプタマー、ガラクトース、糖、低分子）とを含む。１つの実施態様では、前記ｃｒＲＮＡは、前記ｃｒＲＮＡ伸長にコンジュゲーションされたビオチン又はアビジン（若しくはストレプトアビジン）分子を含み、改変ｃｒＲＮＡがアビジン／ストレプトアビジン又はビオチンとコンジュゲーションした別の分子（例えばターゲッティング分子又はペプチド）に結合できるようにする（例えば図１４を参照せよ）。別の実施態様では、ｃｒＲＮＡ伸長は、リンカーによってのようないずれかの適切なやり方でアミノ糖に共有結合で連結できる。本明細書で用いるところの「アミノ糖」は、水酸基がアミン基（例えばガラクトサミン）及び／又は複雑な官能基（例えば、Ｎ−アセチルガラトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、トリ−Ｎ−アセチルガラトサミン（三分岐Ｎ−アセチルガラトサミン））の一部である窒素で置換されている糖分子である。前記アミノ糖は、随意的なスペーサー基を含むように修飾できる。アミノ糖の例は、Ｎ−アセチルガラトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、三価ＧａｌＮＡｃ、又は、三分岐Ｎ−アセチルガラトサミンを含む。アミノ糖基の例は、以下を含む。
【００２９】
【化１】
2020537540.tif 000004
【００３０】
ここで、前記リンカーはいずれかの周知のものとすることができ、それぞれは他と同じか又は異なるものとすることができる。一般的に、前記リンカーは、飽和又は不飽和の脂肪族又はヘテロ脂肪族（ｈｅｔｅｒｏａｌｉｐｈａｔｉｃ）鎖である。該脂肪族又はヘテロ脂肪族鎖は、典型的には１〜３０個のメンバー（例えば１〜３０個の炭素、窒素及び／又は酸素原子）を含み、１個以上の官能基（例えば、１個以上のケトン、エーテル、エステル、アミド、アルコール、アミン、ウレア、チオウレア、スルホキシド、スルホンアミド及び／又はジスルフィド基）で置換できる。一部の場合では、より短い脂肪族又はヘテロ脂肪族鎖が用いられる（例えば、前記鎖においてメンバーが、約１〜１５個、約１〜１０個、約１〜５個、約３〜１５個、約３〜１０個、約５〜１５個又は約５〜１０個）。他の場合には、より長い脂肪族又はヘテロ脂肪族鎖が用いられる（例えば、前記鎖においてメンバーが、約５〜３０個、約５〜２５個、約５〜２０個、約１０〜３０個、約１０〜２５個、約１０〜２０個、約１５〜３０個、約１５〜２５個又は約１５〜２０個）。スペーサー基の例は、飽和又は不飽和のアルキル、アルケニル及びポリエチレングリコール（例えばＰＥＧ１−１０又はＰＥＧ１−５）又はこれらの組み合わせを含む。図示のためのより具体的な例は以下のとおりである。
【００３１】
【化２】
2020537540.tif 000005
【００３２】
前記リンカーとのコンジュゲーションの前に、前記アミノ糖は官能基（例えば、アジド、テトラジン、アルキン、歪みアルケン又は歪みアルキン）を含むことができ、該官能基は、前記ｃｒＲＮＡ伸長に（例えば５’末端で）付着した適切に対合した官能基へのコンジュゲーションを可能にする。したがって例えば、前記伸長ｃｒＲＮＡとコンジュゲーションの前の前記アミノ糖は以下を含むことができる。
【００３３】
【化３】
2020537540.tif 000006
【００３４】
ここで、Ａ２は、本明細書に説明されるアジド、テトラジン、アルキン、歪みアルケン又は歪みアルキンを含む。より具体的な例は以下のとおりである。
【００３５】
【化４】
2020537540.tif 000007
【００３６】
ここで、Ａ２は本明細書に説明されるアジド、テトラジン、アルキン、歪みアルケン又は歪みアルキン、例えば
【００３７】
【化５】
2020537540.tif 000008
を含む。
【００３８】
プロセッシング配列
一部の実施態様では、前記ｃｒＲＮＡはプロセッシング配列を含む。該プロセッシング配列は、ガイド／ターゲッティング配列の必要なしにＣｐｆ１により試験管内でも生体内でも自己切断される核酸配列である。いずれかの特定の理論又は作用機序に拘束されることを望むものではないが、前記プロセッシング配列は、存在するとき、細胞内に入る際に切断され、ｃｒＲＮＡがいずれかの伸長配列から切り離される。前記プロセッシング配列はｃｒＲＮＡと伸長配列との間に配置できる。この構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）では、前記プロセッシング配列の切断の際、前記ｃｒＲＮＡは本明細書に提供される核酸コンストラクトの伸長配列から切り離される。
【００３９】
また前記プロセッシング配列は、前記伸長配列の中に配置されるか、前記伸長配列の５’に位置するか、あるいは、伸長配列として機能することができるかもしれない。また複数のプロセッシング配列を用いることができるかもしれない。例えば第２のプロセッシング配列が、単独で、あるいは、追加のヌクレオチド配列と一緒に、伸長配列として機能することができるかもしれない。しかし前記伸長配列は、一般的には、前記プロセッシング配列が存在するときには該プロセッシング配列とは異なるであろう。さらに１つの実施態様では、前記伸長配列は、前記プロセッシング配列及び／又は他のいかなる全（完全な）ｃｒＲＮＡ配列を含まない。
【００４０】
一部の実施態様では、前記プロセッシング配列は前記ｃｒＲＮＡのすぐ５’に位置する（すなわち、前記ｃｒＲＮＡに直接結合する）。他の実施態様では、前記ｃｒＲＮＡ及びプロセッシング配列の間にスペーサー配列が存在することができる。前記スペーサー配列は、Ｃｐｆ１の前記プロセッシング配列切断、又は、切断後切り離されたｃｒＲＮＡの機能を妨げないことを条件として、いずれかの長さ（例えば、ヌクレオチド１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）にすることができる。
【００４１】
１つの実施態様では、前記プロセッシング配列は、Ｃｐｆ１アレイの直接リピート配列の断片を含む。Ｃｐｆ１アレイ（ときどきプレｃｒＲＮＡと称されることもある）は、直接リピート配列と、各直接リピートの間のスペーサー配列とを含む天然に存在するアレイである。前記アレイの直接リピート部分は、ｃｒＲＮＡ配列部分とプロセッシング配列部分との２つのパーツを含む。所定の直接リピート内では、前記プロセッシング部分は前記ｃｒＲＮＡ配列部分の５’、しばしば前記プロセッシング配列のすぐ５’に位置する。この実施態様によれば、本発明に提供される核酸のプロセッシング配列は、Ｃｐｆ１切断に十分に効果がある前記直接リピートのプロセッシング部分の少なくとも断片を含む。例えば前記プロセッシング配列は、前記直接リピート配列のプロセッシング部分（又は前記直接リピート配列のプロセッシング部分の全体）の少なくともヌクレオチド６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個又は１７個のような、前記直接リピート配列のプロセッシング部分の少なくともヌクレオチド５個の断片を含むことができ、その長さは前記直接リピートが由来した生物種に依存するであろう。一部の実施態様では前記プロセッシング配列は、前記直接リピート配列のプロセッシング部分全体を含む。前記直接リピートは、いかなる微生物のＣｐｆ１アレイ由来とすることができる。直接リピート配列及び直接リピート配列のプロセッシング部分の例は、図９に提供される。本発明の核酸のプロセッシング配列は、図９におけるプロセッシング配列のいずれかの断片又は配列全体（例えば配列番号２〜２０）を含むことができる。
【００４２】
供与体核酸
本明細書に提供される核酸コンストラクトは供与体核酸（供与体ポリヌクレオチドとも称される）をさらに含むことができる。供与体ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えばＣｐｆ１）によって誘導される切断部位に挿入される核酸である。前記供与体ポリヌクレオチドの核酸は、当業者に知られたいかなるタイプの核酸ともすることができる。例えば、前記核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、人工合成核酸又はこれらのいずれかの組み合わせとすることができる。１つの実施態様では、前記供与体ポリヌクレオチドの核酸はＤＮＡであり、本明細書では「供与体ＤＮＡ」としても知られる。
【００４３】
前記供与体ポリヌクレオチドは、典型的には１本鎖で、所望の配列を含む２本鎖ＤＮＡを作出するためのテンプレートとして機能する。前記供与体配列と、該供与体配列が十分な配列同一性を有する、切断部位に隣接するゲノム配列との間での相同組換えを支援するために、前記供与体ポリヌクレオチドは、切断部位に隣接して前記切断部位近傍のゲノム配列領域（例えば、塩基約５０個以内、塩基約３０個以内、塩基約１５個以内、又は、塩基約１０個以内、塩基約５個以内、又は前記切断部位にすぐ隣接して）に至るゲノム配列に対して十分な同一性（例えば８５％、９０％、９５％又は１００％の配列同一性）を含むであろう。供与体ポリヌクレオチド配列は、いかなる長さとすることもできるが、ＨＤＲを促進するために、切断部位の両側で配列同一性を有する十分な数のヌクレオチドを有しなければならない。供与体ポリヌクレオチドのこれらの領域は相同性アームとして知られる。前記相同性アームは同じか異なる数の塩基を有することができ、それぞれは、一般的には、少なくともヌクレオチド５個の長さ（例えば、ヌクレオチド１０個以上、１５個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、１５０個以上、又は２００個以上）である。前記供与体ポリヌクレオチドは、前記相同性アームに挟まれた、突然変異その他の関心のあるＤＮＡ配列を含む中央領域も含む。したがって前記供与体ポリヌクレオチドの全長は両方の相同性アームの長さの合計よりも大きい（例えば、ヌクレオチド約１５個以上、約２０個以上、５０個以上、１００個以上、１５０個以上又は２００個以上、２５０個以上、５００個以上、１０００個以上、５０００個以上）のが典型的である。
【００４４】
前記供与体ポリヌクレオチド配列は標的ゲノム配列と同一でないのが典型的である。むしろ、前記相同性アームがＨＤＲを支援するのに十分な配列同一性を有する限り、前記供与体ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列に関して１個以上の単塩基変化、挿入、欠失、逆転又は再編成を含んでもかまわない。前記供与体ポリヌクレオチド配列は、該供与体ポリヌクレオチドの挿入成功の検出を促進する配列をさらに含んでもかまわない。
【００４５】
前記供与体ポリヌクレオチドの末端は（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）当業者に知られた方法によって保護される場合がある。例えば１個以上のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖分子の３’末端に付加される、及び／又は、自己相補性オリゴヌクレオチドが一方又は両方の末端に連結される。外来ポリヌクレオチドを分解から保護する追加の方法は、末端アミノ基（単数又は複数）の付加、及び、例えばホスホロチオアート、ホスホロアミダート及びＯ−メチルリボース又はデオキシリボース残基のような改変ヌクレオチド間連結の使用を含むが、これらに限定されない。
【００４６】
一部の実施態様では、前記供与体ポリヌクレオチド（例えば供与体ＤＮＡ）は、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡの５’末端、前記プロセッシング配列の５’末端又は前記伸長配列の５’末端に共有結合で連結される。好ましい実施態様では、前記供与体ポリヌクレオチドは前記伸長配列の５’末端に連結される。一部の実施態様では、前記供与体ＤＮＡと前記核酸との間の連結は可逆性がある（例えば、ジスルフィド結合）。
【００４７】
一部の実施態様では、前記供与体ＤＮＡは核酸コンストラクトに共有結合で連結される。例えば、前記供与体ポリヌクレオチドは、前記プロセッシング配列に連結され、該プロセッシング配列の５’に位置する伸長配列として機能することができる。別の実施態様では、前記供与体ポリヌクレオチドは伸長配列の５’に連結できる。
【００４８】
前記核酸及び供与体ＤＮＡは、当業者に知られたいずれかの方法によって連結又はコンジュゲーションできる。一部の実施態様では、前記供与体ＤＮＡの３’末端と、前記核酸の５’末端とが、連結を促進するために修飾される。例えば、前記核酸の５’末端はチオピリジンで活性化できる一方で、前記供与体ＤＮＡはチオール終端化でき、これによって２本の分子の間でジスルフィド結合が形成できる。一部の実施態様では、前記核酸及び供与体ＤＮＡの両方に相補性がある架橋ＤＮＡが、反応を促進するために２本の分子と雑種形成して該２本の分子を近接させる。図５Ａ〜５Ｃは、前記核酸への供与体ＤＮＡのコンジュゲーションの合成の非限定的な例を提供する。
【００４９】
他の実施態様では、前記核酸及び供与体ＤＮＡは、生体直交型又は「クリック」化学反応に参加する官能基のような官能基を介してコンジュゲーションできる。例えば、前記核酸の５’末端は、アジド、テトラジン、アルキン、歪みアルケン又は歪みアルキンのような官能基で化学的に修飾でき、前記供与体ＤＮＡの３’末端は適切に対合した官能基で化学的に修飾できる。例えば、前記核酸がアジドを含む場合には、該アジドは、（銅で触媒される）アジド−アルキン付加環化を介して前記供与体ＤＮＡのアルキン基と反応するか、あるいは、（触媒不要の）アジド−歪みアルキン付加環化を介して前記供与体ＤＮＡの歪みアルキン基と反応するであろう。同様に、前記核酸がテトラジンを含む場合には、該テトラジンはテトラジン／アルケン付加環化を介して歪みアルケンと反応するであろう。同様に、反対の構成（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）が使用でき、例えば、前記核酸がアルキン、歪みアルキン又は歪みアルケンを含む場合には、同じ付加環化反応によって前記供与体ＤＮＡのアジド又はテトラジン基と反応するであろう。
【００５０】
一部の実施態様では、前記核酸及び供与体ＤＮＡはリンカーを介してコンジュゲーションされる。例えば、前記核酸及び供与体ＤＮＡは、刺激応答性リンカー（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ  ｌｉｎｋｅｒ）によってコンジュゲーションできる。本明細書で用いるところの「刺激応答性リンカー（ｓｅｌｆ−ｉｍｍｏｌａｔｉｖｅ  ｌｉｎｋｅｒ）」は、特定の条件下（例えば特定のｐＨ値）で加水分解して、前記核酸から前記供与体ＤＮＡを切り離すことを可能にするリンカーである。
【００５１】
前記核酸供与体ＤＮＡコンジュゲートのリンカーは、前記供与体ＤＮＡを前記核酸に共有結合で連結できる、当業者に知られたいずれかのリンカーを含む。前記リンカーは、どちらかの末端で前記供与体ＤＮＡ及び核酸に結合できる。しかし一部の実施態様では、前記リンカーは、前記核酸の５’末端（例えば、ｃｒＲＮＡ、プロセッシング配列又は伸長配列の５’末端）及び前記供与体ＤＮＡの３’末端に結合する。前記リンカーは、供与体ＤＮＡの前記核酸へのコンジュゲーションに関して本明細書で説明されるような、当業者に知られたいずれかの方法によって前記核酸及び供与体ＤＮＡに結合できる。
【００５２】
別の実施態様では、前記供与体ポリヌクレオチドは、前記伸長配列及び／又はプロセッシング配列に雑種形成できる。したがって前記伸長配列は、雑種形成を促進するために、前記供与体ポリヌクレオチドに十分な相補性がある配列を含むことができる。
【００５３】
供与体核酸が前記伸長配列と共有結合又は非共有結合で連結されるとき、標的遺伝子がＣｐｆ１によって編集されるときに前記供与体核酸が前記ｃｒＲＮＡと密接に関連するように、前記供与体核酸はＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡによって切断されない伸長配列又はその部分に連結されることが時には望ましい。場合によっては、かかるコンストラクトによって遺伝子編集の改善が達成できると信じられている。Ｃｐｆ１によって切断されない伸長配列は、例えば、上記に説明した１個以上の改変ヌクレオチド間連結又は人工合成ヌクレオチドを含む伸長配列を含む。
【００５４】
組成物及び担体
本発明は、本明細書に説明した核酸分子のいずれかと担体とを含む組成物も含む。核酸送達に適するいかなる担体でも使用可能である。一部の実施態様では、前記担体は、本明細書に説明した核酸のいずれかと相互作用して、該核酸の細胞内への進入を促進することができる分子を含むことができる。
【００５５】
一部の実施態様では、前記担体はカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は、アンカーを介して、２本のアルキル鎖を含むことが一般的な非極性疎水性ドメインに連結された、陽荷電極性頭部基を有する両親媒性分子である。一部の実施態様では、前記カチオン性脂質は前記核酸コンストラクトと、随意的に、Ｃｐｆ１タンパク質との周囲にリポソーム（例えば脂質小胞）を形成する。したがって関連する局面では、前記核酸コンストラクトと、随意的に、Ｃｐｆ１タンパク質とを含むリポソームが提供される。
【００５６】
さらに別の実施態様では、前記担体はカチオン性ポリマーを含む，本発明の組成物のカチオン性ポリマーの例は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ（アルギニン）、ポリ（リジン）、ポリ（ヒスチジン）、ポリ［２−｛（２−アミノエチル）アミノ｝−エチル−アスパラアミド］（ｐＡｓｐ（ＤＥＴ））、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）とポリ（アルギニン）のブロック共重合体，ＰＥＧとポリ（リジン）のブロック共重合体、ＰＥＧとポリ｛Ｎ−［Ｎ−（２−アミノエチル）−２−アミノエチル］アスパラアミド｝のブロック共重合体（ＰＥＧ−ＰＡｓｐ［ＤＥＴ］、（｛２，２−ビス［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル］−１，３−ジオキサン−５−イル｝メチル）ジメチルアミン、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン、（３ａＲ，５ｒ，６ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン、（３ａＲ，５Ｒ，７ａＳ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヘキサヒドロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン、（３ａＳ，５Ｒ，７ａＲ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−アミン、（３ａＲ，５Ｒ，７ａＲ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヘキサヒドロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン、（２−｛２，２−ビス［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル］−１）ジオキソール−５−アミン、（２−｛２，２−ビス［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキサン−４−イル｝エチル）ジメチルアミン、（３ａＲ，６ａＳ）−５−メチル−２−（（６Ｚ，９Ｚ）−オクタデカ−６，９−ジエン−１−イル）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピロール、（３ａＳ，７ａＲ）−５−メチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヘキサヒドロ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｃ］ピリジン，（３ａＲ，８ａＳ）−６−メチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヘキサヒドロ−３ａＨ−［１，３］ジオキソロ［４，５−ｄ］アゼピン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル２−（ジメチルアミノ）アセテート、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル３−（ジメチルアミノ）プロパノエート，６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタノエート］、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル５−（ジメチルアミノ）ペンタノエート、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル６−（ジメチルアミノ）ヘキサノエート、（３−｛２，２−ビス［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル］−１，３−ジオキサン−４−イル｝プロピル）ジメチルアミン、１−（（３ａＲ，５ｒ，６ａＳ）−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルメタナミン，１−（（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラヒドロ−３ａＨ−シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソラン−５−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルメタナミン、８−メチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキサ−８−アザスピロ［４，５］デカン、２−（２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−４−イル）−Ｎ−メチル−Ｎ−（ピリジン−３−イルメチル）エタナミン、１，３−ビス（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル−２−［２−（ジメチルアミノ）エチル］プロパンジオエート、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（（３ａＲ，５Ｒ，７ａＳ）−２−（（８Ｚ，１１Ｚ）−オクタデカ−８，１１−ジエン−１−イル）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヘキサヒドロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）メタナミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−（（３ａＲ，５Ｓ，７ａＳ）−２−（（８Ｚ，１１Ｚ）−オクタデカ−８，１１−ジエン−１−イル）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヘキサヒドロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−イル）メタナミン、（１ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）シクロペンタンアミン、（１ｓ，３Ｒ，４Ｓ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ）シクロペンタンアミン、２−（４，５−ジ（（８Ｚ，１１Ｚ）−ヘプタデカ−８，１１−ジエン−１−イル）−２−メチル−１，３−ジオキソラン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルエタノールアミン、２，３−ジ（（８Ｚ，１１Ｚ）−ヘプタデカ−８，１１−ジエン−１−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１，４−ジオキサスピロ［４，５］デカン−８−アミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジエチルアミノ）ブタノエート、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−［ビス（プロパン−２−イル）アミノ］ブタノエート，Ｎ−（４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ）ブタノイル）−（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−アミン、（２−｛２，２−ビス［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル］−１，３−ジオキサン−５−イル｝エチル）ジメチルアミン、（４−｛２，２−ビス［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル｝−１，３−ジオキサン−５−イル｝ブチル）ジメチルアミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル（２−（ジメチルアミノ）エチル）カルバメート、２−（ジメチルアミノ）エチル（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルカルバメート、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル）−３−（エチルアミノ）プロパノエート、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル）−４−（プロパン−２−イルアミノ）ブタノエート、Ｎ１，Ｎ１，Ｎ２−トリメチル−Ｎ２−（（（１１Ｚ，１４Ｚ）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）イコサ−１１，１４−ジエン−１−イル）エタン−１，２−ジアミン、３−（ジメチルアミノ）−Ｎ−（（１１Ｚ，１４Ｚ）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）イコサ−１１，１４−ジエン−１−イル）プロパンアミド、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（メチルアミノ）ブタノエート、ジメチル（｛４−［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］−３−｛［（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イルオキシ］メチル｝ブチル｝｝アミン、２，３−ジ（（（８Ｚ，１１Ｚ）−ヘプタデカ−８，１１−ジエン−１−イル）−８−メチル−１，４−ジオキサ−８−アザスピロ［４，５］デカン、３−（ジメチルアミノ）プロピル（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イルカルバメート、２−（ジメチルアミノ）エチル（（１１Ｚ，１４Ｚ）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）イコサ−１１，１４−ジエン−１−イル）カルバメート、１−（（３ａＲ，４Ｒ，６ａＲ）−６−メトキシ−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルメタナミン、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−［エチル（メチル）アミノ］ブタノエート、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−アミノブタノエート、３−（ジメチルアミノ）プロピル（（１１Ｚ，１４Ｚ）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）イコサ−１１，１４−ジエン−１−イル）カルバメート、１−（（３ａＲ，４Ｒ，６ＡＳ）−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）テトラヒドロフロ［３，４−ｄ］［１，３］ジオキソール−４−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルメタナミン、（３ａＲ，５Ｒ，７ａＲ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，２−ジ（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヘキサヒドロベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン、（１１Ｚ，１４Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）イコサ−１１，１４−ジエン−１−アミン、（３ＡＳ，４Ｓ，５Ｒ，７Ｒ，７ａＲ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−２−（（７Ｚ，１０Ｚ）−オクタデカ−７，１０−ジエン−１−イル）−２−（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ヘキサヒドロ−４，７−メタノベンゾ［ｄ］［１，３］ジオキソール−５−アミン、Ｎ，Ｎ−ジメチル−３，４−ビス（（９Ｚ，１２Ｚ）−オクタデカ−９，１２−ジエン−１−イル）ブタン−１−アミン、及び３−（４，５−ジ（（８Ｚ，１１Ｚ）−ヘプタデカ−８，１１−ジエン−１−イル）−１，３−ジオキソラン−２−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチルプロパン−１−アミンを含む。上記ポリマーのいずれかの組み合わせも使用できる。
【００５７】
他の実施態様では、前記担体はポリマーナノ粒子を含む。例えば本発明の組成物は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０号明細書に説明されるナノ粒子として投与できるが、前記明細書の全開示内容は引用によって明示的に取り込まれる。
【００５８】
Ｃｐｆ１ポリペプチド又はそれをコードする核酸
上記のリポソームの実施態様を含む一部の実施態様では、前記組成物はＣｐｆ１ポリペプチド又は該ポリペプチドをコードする核酸も含む。いずれのＣＰｆ１ポリペプチドも本発明の組成物に使用できるが、選択されたＣｐｆ１は、標的核酸の切断、及び／又は、適用できる場合には、前記核酸コンストラクトのプロセッシング配列の切断のために前記組成物中の核酸コンストラクトのｃｒＲＮＡと協動するように、適切に選択されるべきである。前記組成物のＣｐｆ１は、天然に存在するＣｐｆ１か、変異体又は突然変異体のＣｐｆ１ポリペプチドかとすることができる。一部の実施態様では、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは酵素活性を有する、例えば、ガイドＲＮＡに結合するとき、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは標的核酸を切断する。一部の実施態様では、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、野生型Ｃｐｆ１ポリペプチドと比較して（例えば、図８（配列番号１）に示すアミノ酸配列を含むＣｐｆ１ポリペプチドと比較して）酵素活性の低減を示すが、ＤＮＡ結合活性を保持する。Ｃｐｆ１の酵素活性を変化させる突然変異は本発明の技術分野で知られている。
【００５９】
例えばＣｐｆ１は、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ属又はＬａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ属又は図９に同定されるいずれかの属又は種の細菌由来とすることができる。Ｃｐｆ１タンパク質の例は図８に提供される。一部の実施態様では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図８に示すアミノ酸配列に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％又は１００％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施態様では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図８に示すアミノ酸配列のうち、アミノ酸１００個から２００個まで、２００個から４００個まで、４００個から６００個まで、６００個から８００個まで、８００個から１０００個まで、１０００個から１１００個まで、１１００個から１２００個まで、又は１２００個から１３００個までの、連続する範囲に対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６０】
一部の実施態様では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図８に示すアミノ酸配列のＣｐｆ１ポリペプチドのＲｕｖＣＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％又は１００％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施態様では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図８に示すアミノ酸配列のＣｐｆ１ポリペプチドのＲｕｖＣＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％または１００％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施態様では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図８に示すアミノ酸配列のＣｐｆ１ポリペプチドのＲｕｖＣＩＩＩドメインに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６１】
一部の実施態様では、Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ＦｎＣｐｆ１、Ｌｂ３Ｃｐｆ１、ＢｐＣｐｆ１、ＰｅＣｐｆ１、ＳｓＣｐｆ１、ＡｓＣｐｆ１、Ｌｂ２Ｃｐｆ１、ＣＭｔＣｐｆ１、ＥｅＣｐｆ１、ＭｂＣｐｆ１、ＬｉＣｐｆ１、ＬｂＣｐｆ１、ＰｃＣｐｆ１、ＰｄＣｐｆ１、又はＰｍＣＰｆ１か、これらに対して、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＣｐｆ１ポリペプチドかである。
【００６２】
一部の実施態様では、前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、図８に示すアミノ酸配列の９１７位に対応するアミノ酸残基にアミノ酸置換（例えばＤ→Ａ置換）を含む、及び／又は、図８に示すアミノ酸配列の１００６位に対応するアミノ酸残基にアミノ酸置換（例えばＥ→Ａ置換）を含む、及び／又は、図８に示すアミノ酸配列の１２５５位に対応するアミノ酸残基にアミノ酸置換（例えばＤ→Ａ置換）を含む。
【００６３】
前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  Ｃｐｆ１  （ＡｓＣｐｆ１）のＨ８００Ａ、Ｋ８０９Ａ、Ｋ８６０Ａ、Ｆ８６４Ａ、又はＲ７９０Ａか、異なるＣｐｆ１オーソログの対応する位置かでの改変を含むＣｐｆ１のような、ＲＮａｓｅ不活性化Ｃｐｆ１とすることができる。突然変異Ｃｐｆ１タンパク質の例は、Ｚｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｇｅｎｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１  Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  ｃｒＲＮＡ  Ａｒｒａｙ，”  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０１７，  ３５  （１），  ３１−３４に開示されるものを含む。前記Ｃｐｆ１ポリペプチドは、ｄＣｐｆ１塩基エディター（例えば、Ｃｐｆ１−シトシンデアミナーゼ融合タンパク質）とすることができる。例は、例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３６  ３２４−３２７  （２０１８）及びＭａｈｆｏｕｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，  ４７５（１１），  １９５５−１９６４  （２０１８）に開示されたタンパク質を含む。人工合成変異体Ｃｐｆ１の例は、Ｉｎｓｃｒｉｐｔａ，  Ｉｎｃ．  （米国、コロラド州）によるＭＡＤ７  Ｃｐｆ１オーソログである。Ｃｐｆ１タンパク質の追加の例は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５２６９０号明細書に開示された、キメラタンパク質又は突然変異タンパク質を含む、これらのＣｐｆ１タンパク質のいずれかを含むが、前記明細書の全開示内容は引用によって明示的に取り込まれる。
【００６４】
他の核酸
前記組成物は、前記ｃｒＲＮＡに加えて他の核酸をさらに含む。例えば、前記組成物は本明細書に説明される供与体ポリヌクレオチドを含むことができる。代替的に、又は、追加的に、前記組成物は、供与体ポリヌクレオチドではない１種類以上の追加の核酸（例えば、編集されるべき標的配列又は編集されるべき細胞の内在性核酸配列と有意な配列同一性がない核酸（例えば、相同組換えを可能にするには不十分な配列同一性のレベル）を含むことができる。これらの追加の核酸は、１本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡ分子（又は、随意的に人工合成核酸残基を有する、ＲＮＡ及びＤＮＡの両方を含むハイブリッド分子）のようなＲＮＡ又はＤＮＡとすることができる。前記追加の核酸は、ヌクレオチド少なくとも５個の長さ（例えば、１０個以上、１５個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、１５０個以上、２００個以上）のように、いずれかの長さとすることができる。一部の実施態様では、前記核酸は、ヌクレオチド５００個以上、１０００個以上、又は、５０００個以上を含むかもしれない。）しかし、たいていの場合は、前記核酸は、ヌクレオチド約１０００個以下、又は、５００個以下（例えば２００個以下）のように、約５０００個以下を含むであろう。
【００６５】
前記組成物は、関心のある特定のタンパク質、例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１ポリペプチド）をコードする核酸をさらに含む。前記ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、本発明の他の局面に関して本明細書に説明されるいずれかとすることができる。
【００６６】
２価金属イオン
一部の実施態様では、送達前に前記プロセッシング配列の時期尚早な切断を低減又は防止するために、使用される特定のＣＰｆ１タンパク質を活性化する２価金属イオン（例えばマグネシウム）を前記組成物は実質的又は完全に含まない。濃度がＣｐｆ１の自己プロセッシング酵素活性を可能にしないとき（ｗｈａｔ）、前記組成物は実質的にマグネシウムを含まないと考えられる。一部の実施態様では、前記組成物は約２０ｍＭ以下のＮａＣｌを含み、前記Ｃｐｆ１タンパク質を活性化するマグネシウムその他の２価イオンを実質的又は完全に含まない。
【００６７】
真核細胞を遺伝的に改変する方法
本発明は、標的真核細胞を遺伝的に改変する方法も提供し、該方法は、標的核酸を遺伝的に改変するために（ｔｏ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｙ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、前記標的真核細胞を本明細書に説明するいずれかの核酸又は組成物（例えば、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡと、該ｃｒＲＮＡの５’の伸長配列と、随意的に、前記ｃｒＲＮＡ及び前記伸長配列の間のプロセッシング配列とを含む核酸）と接触させることを含む。一部の実施態様では、前記核酸のＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、前記標的細胞内の標的配列と雑種形成するターゲッティング配列（例えば、ステム−ループドメインの３’）を含む。一部の実施態様では、前記Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡはプロセッシング配列を含み、該プロセッシング配列は前記細胞内に進入する際に切断され、それにより、前記Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡを前記プロセッシング配列及び前記伸長配列から切り離す。他の実施態様では、前記Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡはプロセッシング配列を含まない。
【００６８】
標的核酸は、前記ｃｒＲＮＡのターゲッティング配列が結合してＣｐｆ１による切断を誘導するポリヌクレオチド（例えばＲＮＡ、ＤＮＡ）である。標的核酸は、前記ｃｒＲＮＡが雑種形成して、今度は、前記エンドヌクレアーゼを前記標的核酸にガイドする、「標的部位」又は「標的配列」を含む。
【００６９】
「標的真核細胞」は、本発明の技術分野で知られたいずれかの真核細胞でかまわず、生体内及び試験管内の両方の細胞を含む。ある実施態様では、前記標的細胞は哺乳類細胞である。
【００７０】
いずれの投与経路も前記組成物を前記哺乳類に送達するために使用できる。実際、前記組成物を投与するために２つ以上の経路が使用できるが、特定の経路が別の経路よりも迅速で効果的な反応を提供できる。試験管内又は生体外（ｅｘ  ｖｉｖｏ）で細胞に投与されるとき、前記核酸又は組成物はいずれかの適切な方法によって前記細胞に接触させることができる。例えば前記核酸は、リポソーム内に入れる、カチオン性ポリマーにより封入される、及び／又は、エレクトロポレーションにより導入されることができる。哺乳類又はヒトのような被験体に投与されるとき、前記組成物はさまざまな経路のいずれかによって投与できる。例えば、組成物の投与量を、体腔に適用又は注入し、（例えば、経皮パッチを介して）皮膚を通じて吸収し、吸引し、摂取し、組織に局所的に適用し、又は、例えば静脈内、腹腔内、経口、皮内、皮下又は動脈内投与を介して非経口的に投与することもできる。
【００７１】
前記組成物は、スポンジ、生体適合性メッシュワーク、機械式リザーバー又は機械式インプラントのような徐放又は持続性放出を可能にするデバイス内又はデバイス上で投与できる。例えば、ポリマー組成物で構成される機械式リザーバー又はインプラント又はデバイスのようなインプラント（例えば米国特許第５，４４３，５０５号を参照せよ）、デバイス（例えば米国特許第４，８６３，４５７号を参照せよ）は、前記組成物の投与に特に有用である。前記組成物は、例えばゲルフォーム、ヒアルロン酸、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ビス−２−ヒドロキシエチル−テレフタラート（ＢＨＥＴ）のようなポリホスホエステル、及び／又はポリ乳酸−グリコール酸を含む持続放出製剤（例えば米国特許第５，３７８，４７５号を参照せよ）の剤形でも投与できる。
【実施例】
【００７２】
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、もちろん、本発明の範囲をいかなるやり方でも限定するものと解釈すべきではない。以下の表２は、これらの実験に用いた核酸配列を提供する。
【００７３】
【表２−１】
2020537540.tif 000009
【００７４】
【表２−２】
2020537540.tif 000010
【００７５】
実施例１
本実施例は、未改変Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡがＣａｓ９  ｓｇＲＮＡより低い遺伝子編集効率を提供する傾向があることを示す。
【００７６】
ＳｐＣａｓ９及びＡｓＣｐｆ１は、両方ともガイドＲＮＡの伸長なしで、緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターシステムを用いて比較された。ＡｓＣｐｆ１及びＳｐＣａｓ９を直接比較するために、両方のヌクレアーゼで認識できるＧＦＰ遺伝子内の適合プロトスペーサーＤＮＡ配列が選択された。システムは図１３Ａに示される。エレクトロポレーション及びカチオン性脂質の両方を用いて、ドキシサイクリン誘導性プロモーターの制御下でＧＦＰ遺伝子を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＧＦＰ−ＨＥＫ）内にＲＮＰ複合体が導入された。編集活性は、ＮＨＥＪを介するインデル（ｉｎｄｅｌ）突然変異を通じてＧＦＰが破壊されるので、ＧＦＰ陰性細胞の集団を計測することによって測定された。エレクトロポレーション細胞及びリポフェクタミン処理細胞の両方で、ＡｓＣｐｆ１のＲＮＰはＳｐＣａｓ９よりも低い遺伝子編集を示した（図１３Ｂ及び１３Ｃ）。ＡｓＣｐｆ１のＲＮＰをエレクトロポレーションした細胞はＧＦＰ陰性が３１％であったが、ＳｐＣａｓ９のＲＮＰをエレクトロポレーションした細胞はＧＦＰ陰性が４１％であった（図１３Ｂ）。リポフェクタミン及びＲＮＡｉＭａｘ送達システムを用いると、ＡｓＣｐｆ１処理細胞はＧＦＰ陰性が約８％であったが、ＳｐＣａｓ９処理細胞はＧＦＰ陰性が約３０％であった（図１３Ｃ）。
【００７７】
実施例２
本実施例は、ＣＰｆ１  ｃｒＲＮＡと、該ＣＰｆ１  ｃｒＲＮＡの５’のプロセッシング配列と、該プロセッシング配列の５’の伸長配列（ｃｒＲＮＡを可逆的に過剰に荷電する）とを含む核酸が、試験管内でカチオン性脂質によるＣｐｆ１の送達を増強する。
【００７８】
リポフェクタミン及びポリカチオンのようなカチオン性材料は、細胞及び生きている動物への核酸の最も慣用される送達ビークルである。したがって、カチオン性脂質リポフェクタミンがＣｐｆ１／ｃｒＲＮＡ複合体を緑蛍光タンパク質発現ＨＥＫ細胞（ＧＦＰ−ＨＥＫ）にトランスフェクションする効率が解析された。簡潔には、インデル形成を介してＧＦＰ遺伝子をノックダウンするように設計されたｃｒＲＮＡがＣｐｆ１と複合体を形成させ、細胞内にエレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）するか、リポフェクタミンでトランスフェクションするかのいずれかを行った。その後遺伝子編集効率が、フロー・サイトメトリーを介してＧＦＰノックアウト細胞の数を計測することにより測定し、ＧＦＰをもはや発現しない細胞は細胞がＣｐｆ１／ｃｒＲＮＡ複合体でトランスフェクションされたことを示す。
【００７９】
これらの実験からの結果は、リポフェクタミンが未改変のＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡ複合体を効率的にトランスフェクションすることができないことを示す（図１Ａ）。具体的には、リポフェクタミン及びＣｐｆ１／ｃｒＲＮＡ複合体で処理された細胞はＮＨＥＪ効率が８％しかなかったのに対し、Ｃｐｆ１／ｃｒＲＮＡ複合体でエレクトロポレーションされた細胞はＮＨＥＪ効率が４０％あり、送達の制限がリポフェクタミンを用いるＮＨＥＪ効率が低い主な理由であったことを示す。
【００８０】
配列伸長の効果を調べるために、長さがヌクレオチド４１個のｃｒＲＮＡが、ヌクレオチド９個伸長される（ｃｒＲＮＡ＋９）か、ヌクレオチド５９個伸長された（ｃｒＲＮＡ＋５９）。前記伸長は、自己切断して活性型ｃｒＲＮＡになる自己プロセッシング配列を含んでいた。未改変ｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ＋９及びｃｒＲＮＡ＋５９がそれぞれ個別にＣｐｆ１と複合体を形成させ、リポフェクタミンを用いてＧＦＰ−ＨＥＫ細胞にトランスフェクションされた。５’末端伸長の起こりうるプロセッシングを予防するために、ＲＮＰは低塩濃度条件で形成された。トランスフェクション効率の指標であるＮＨＥＪレベルは、ＧＦＰ陰性細胞の百分率を計測することにより測定された。図１Ｂに示すとおり、自己プロセッシング配列を用いるｃｒＲＮＡの伸長は、カチオンビークルを用いるトランスフェクション効率を有意に増強する。伸長しないｃｒＲＮＡをリポフェクタミンを介して処理した細胞は、ＧＦＰ陰性が８％を示したが、塩基９個伸長したｃｒＲＮＡで処理した細胞はＧＦＰ−が１８％で、塩基５９個伸長したｃｒＲＮＡで処理した細胞は３７％で、対照の未改変ｃｒＲＮＡよりほぼ４倍増大していた。さらに、ｃｒＲＮＡ＋９、ｃｒＲＮＡ＋１５及びｃｒＲＮＡ＋２５がリポフェクタミンを用いてテストされ、遺伝子編集効率の長さ依存性の増大を示した（図１Ｃ）。
【００８１】
この増強に具体的な５’伸長配列の必要性があるかどうかを確かめるために、３種類の異なるヌクレオチド５９個の５’伸長が比較された。ヌクレオチド５９個が伸長した元々の第１のｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋５９）は上記に説明され、１個のＡｓＣｐｆ１  プレ−ｃｒＲＮＡを含み、塩基５９個が伸長した第２のｃＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋５９−Ｄ２）は４個のＡｓＣｐｆ１  プレ−ｃｒＲＮＡ部位をタンデムに含み、塩基５９個が伸長した第３のｃＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋５９−Ｄ３）はヒトゲノムのいかなる配列とも相同性がないスクランブルされたＤＮＡ配列が先に配置されるＦｎＣｐｆ１  プレ−ｃｒＲＮＡを含む（図１Ｄ）。これらのｃｒＲＮＡｓは上の段落と同様にリポフェクタミン２０００を用いて送達された。３種類の５’伸長の全てが等価な編集活性を示した。ｃｒＲＮＡ＋５９細胞はＧＦＰ陰性が３２％、ｃｒＲＮＡ＋５９＿Ｄ２細胞はＧＦＰ陰性が３０％で、ｒＲＮＡ＋５９＿Ｄ３細胞はＧＦＰ陰性が２７％であった（図１Ｅ）。これは、エレクトロポレーションした細胞でヌクレオチド９個伸長したｃｒＲＮＡｓについての過去の知見と同様に、５’伸長増強について厳密な配列要求性がないことを示唆する。さらに、前記ｃｒＲＮＡについて陰荷電密度を増大させること、それにより、前記ＡｓＣｐｆ１  ＲＮＰ複合体についても陰荷電密度を増大させることは、カチオン性脂質による細胞へのＡｓＣｐｆ１の送達を増強できるという上記仮説を裏付ける証拠をこれらの結果は提供する。
【００８２】
前記伸長したｃｒＲＮＡｓがＣｐｆ１の内在的なヌクレアーゼ活性を増強したかどうかを決定するために、試験管内ＤＮＡ切断アッセイで前記伸長したｃｒＲＮＡｓがテストされた。野生型ｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ＋９及びｃｒＲＮＡ＋５９について１５分間及び６０分間のインキュベーション時間での活性の違いは前記３種類のｃｒＲＮＡｓの間で観察されなかった。インキュベーション時間がたった５分間のときには、ｃｒＲＮＡ＋５９は野生型ｃｒＲＮＡよりもＤＮＡ切断が遅かった。
【００８３】
ＲＮＰとしてよりもプラスミドによって送達される場合にＣｐｆ１における遺伝子編集活性の増強があるかどうかを決定するために、５’伸長ｃｒＲＮＡｓが研究された。Ｃｐｆ１プラスミドがｃｒＲＮＡｓのエレクトロポレーションの２４時間前にトランスフェクションされ、遺伝子編集活性が決定された。Ｃｐｆ１がプラスミドから産生されたときに遺伝子編集効率の改善は観察されなかった。
【００８４】
さらに、エレクトロポレーションかリポフェクタミンかを介する送達後の細胞内への取り込みを伸長したｃｒＲＮＡｓが増強したかどうかを決定するために、前記ｃｒＲＮＡｓは蛍光色素で標識された。Ｃｐｆ１  ＲＮＰｓのエレクトロポレーションは、９０％を超える細胞が色素−ｃｒＲＮＡについて陽性であるという結果になり、ｃｒＲＮＡの長さに関係なく、効率の高い送達を示した。リポフェクタミンを用いるＣｐｆ１  ＲＮＰの送達効率は、ｃｒＲＮＡの長さに依存し、野生型ｃｒＲＮＡよりも伸長したｃｒＲＮＡｓはＨＥＫ２９３Ｔ細胞内により効率的に送達された（図１Ｆ）。
【００８５】
結果は、本明細書に提供される伸長ｃｒＲＮＡは送達及び遺伝子編集の効率を増強することを示す。
【００８６】
実施例３
本実施例は、Ｃｐｆ１の活性がエレクトロポレーションを用いるＨＥＫ細胞における５’末端伸長で増強されることを証明する。
【００８７】
ヌクレオチド４個、９個、１５個、２５個及び５９個の５’末端伸長を有するＧＦＰをターゲッティングするｃｒＲＮＡが、ＡｓＣｐｆ１とのＲＮＰ複合体としてエレクトロポレーションによってＧＦＰ−ＨＥＫ細胞内に導入された。前記ヌクレオチド４個ないし２５個の伸長のための配列はスクランブルされ、ヌクレオチド５９個の伸長は、ヒトゲノム配列との相同性がないスクランブルされたＲＮＡ配列が先に配置されたＡｓＣｐｆ１プレ−ｃｒＲＮＡからなるものであった。
【００８８】
前記ヌクレオチド４個ないし２５個の５’伸長を有するｃｒＲＮＡｓは全て、伸長のないｃｒＲＮＡよりも劇的に増大した遺伝子編集を示した。伸長のないｃＲＮＡでエレクトロポレーションされた細胞はＧＦＰ陰性が３０％（ｃｒＲＮＡ）、ヌクレオチド４個ないし２５個伸長したｃｒＲＮＡでエレクトロポレーションされた細胞はＧＦＰ陰性が５５ないし６０％で、ヌクレオチド５９個伸長したｃｒＲＮＡでエレクトロポレーションされた細胞はＧＦＰ陰性が３７％であった（図２）。前記ヌクレオチド４個及び２５個の５’伸長ｃｒＲＮＡｓについての遺伝子編集レベルはＳｐＣａｓ  ９ＲＮＰでエレクトロポレーションされた細胞の遺伝子編集レベルに匹敵する。
【００８９】
結果は、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡの５’伸長は遺伝子編集効率を増大させることを確認する。
【００９０】
実施例４
本実施例は、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡ及び伸長配列５’を含む核酸が、カチオン性脂質による生体内でのＣｐｆ１の送達と、細胞内でのＣＰｆ１活性とを増強することを証明する。
【００９１】
２’Ｏ−メチル修飾、ホスホロチオアート連結及びデオキシヌクレオチドリボース基という３種類の異なる化学的修飾が伸長を有するｃｒＲＮＡｓについて調査された（図１５Ａ）。ヌクレオチド４個のうち最初の３個が２’−Ｏ−メチルヌクレオチド及び３’ホスホロチオアート連結で伸長され（ＭＳ）、ヌクレオチド９個の５’伸長ｃｒＲＮＡの９位にデオキシヌクレオチド（９ｄＵ）、ヌクレオチド９個の５’伸長ｃｒＲＮＡのヌクレオチド９個全てに３’ホスホロチオアート連結し、さらに９位にデオキシヌクレオチド（９ｓ）。
【００９２】
伸長及び化学的修飾を有するｃｒＲＮＡｓを含むＣｐｆ１  ＲＮＰがＧＦＰ−ＨＥＫ細胞にエレクトロポレーションされ、遺伝子編集活性がフロー・サイトメトリーによって測定された。化学的修飾を有する伸長ｃｒＲＮＡは未改変伸長ｃｒＲＮＡと同様の活性があった（ＧＦＰ陰性細胞４６＆に対し４１％）（図１５Ｄ）。
【００９３】
また、これらのｃｒＲＮＡｓは青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞株（ＢＦＰ−ＨＥＫ）を用いて調べられた。結果は図１２に提供される。
【００９４】
この実験からの結果は、ＡｓＣｐｆ１の遺伝子編集効率、及び、前記ｃｒＲＮＡの５’末端の化学修飾への許容範囲を５’伸長が増大させることを示す。さらに、前記ｃｒＲＮＡの５’末端が伸長する場合には、前記ｃｒＲＮＡの５’化学修飾は前記活性を損なうことなく可能である。
【００９５】
化学的に修飾されたｃｒＲＮＡｓを用いる極めて重要な利益は、血清ヌクレアーゼによる加水分解に対してより安定であることである。したがって、５’化学的修飾ｃｒＲＮＡの血清安定性が調査された。
【００９６】
５’化学的修飾ｃｒＲＮＡｓは希釈されたウシ胎仔血清中でインキュベーションされ、その分解がゲル電気泳動を介して解析された。図１５Ｂは、血清中での１５分間のインキュベーション後に残存するｃｒＲＮＡの定量を提供する。結果は、修飾されないｃｒＲＮＡｓは血清中で速やかに分解するが、ホスホロチオアート骨格を含むｃｒＲＮＡ＋９Ｓは血清中での加水分解に著しく安定であることを示す。
【００９７】
５’修飾ｃｒＲＮＡｓは、細胞内及び血清中のヌクレアーゼからｃｒＲＮＡを保護する能力のため、Ｃｐｆ１  ＲＮＰをトランスフェクションするリポフェクタミンの能力を増強できるかどうか決定するためにも研究された。ｃｒＲＮＡ＋９Ｓを有するＣｐｆ１は、ｃｒＲＮＡ＋９よりも４０％も細胞内で遺伝子を編集する効率が高く、５’ｃｒＲＮＡ伸長によって可能になった５’ｃｒＲＮＡ化学修飾は遺伝子編集において多数の用途があるだろうということを示唆する（図１５Ｃ）。
【００９８】
Ｃｐｆ１  ＲＮＰの結晶構造が最近解明され、ＡｓＣｐｆ１タンパク質がｃｒＲＮＡのホスホジエステル骨格と多数の相互作用を形成することが証明されている。したがって、伸長のないｃｒＲＮＡの５’化学修飾は、ｃｒＲＮＡ及びＣｐｆ１の間の重要な相互作用を破壊して、ＡｓＣｐｆ１の遺伝子編集活性の破壊をもたらす可能性が高い。
【００９９】
対照的に、５’伸長を有するｃｒＲＮＡは、ＡｓＣｐｆ１タンパク質と相互作用するヌクレオチドは修飾されないため、化学修飾を許容できるようにみえる。これらの結果は、前記ｃｒＲＮＡの５’末端に化学的修飾を導入するための方法論を提供するが、該化学的修飾は生体外及び生体内での治療用途のために送達を潜在的に増強できる。かかるコンストラクトは、ターゲッティングリガンド、エンドソーム脱出部分その他の機能的分子のような他の分子が、前記伸長ｃｒＲＮＡとコンジュゲーションされて前記Ｃｐｆ１分子と協動することも可能にする。例えば、ビオチン又はアビジン（又はストレプトアビジン）がｃｒＲＮＡ伸長にコンジュゲーションされて、必要に応じてストレプトアビジン又はビオチンとコンジュゲーションした他の分子（例えばターゲッティング分子）と修飾されたｃｒＲＮＡが結合することを可能にする（例えば図１４）。さらに前記ｃｒＲＮＡは、前記伸長を経てＣｐｆ１ｍＲＮＡとコンジュゲーションでき、Ｃｐｆ１を前記ｍＲＮＡの翻訳により送達することを可能にする。前記Ｃｐｆ１のｍＲＮＡが翻訳されて細胞質中でＣｐｆ１タンパク質を産生するとき、Ｃｐｆ１タンパク質はコンストラクトのｃｒＲＮＡのパートを認識し、随意的に、連結するＲＮＡ配列をプロセッシングして、Ｃｐｆ１ｍＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを分離するであろう。
【０１００】
実施例５
伸長配列を有するｃｒＲＮＡはカチオン性ポリマーがＣｐｆ１をトランスフェクションする能力を増強することができるかどうか決定するためにも実験は行われた。特に、実施例２で使用されたさまざまな長さのｃｒＲＮＡ（伸長なし、ヌクレオチド９個の伸長及びヌクレオチド５９個の伸長を有するｃｒＲＮＡ）がＣｐｆ１と複合体を形成して、カチオン性ポリマーＰＡｓｐ（ＤＥＴ）と混合してＧＦＰ−ＨＥＫ細胞に添加された。製剤のＮＨＥＪ効率はフロー・サイトメトリーを介してＧＦＰ陰性細胞の頻度を計測することによって決定された。
【０１０１】
図１６に示すとおり、塩基５９個の５’伸長はＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を介するＡｓＣｐｆ１  ＲＮＰの細胞への送達を２倍増強した。伸長のないｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）はＧＦＰ陰性が８％、ヌクレオチド９個伸長したｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋９）はＧＦＰ陰性が１０％、ヌクレオチド５９個伸長したｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋５９）はＧＦＰ陰性が１８％であった。これらの結果は、前記伸長配列は、カチオン性ポリマーを用いる細胞へのｃｒＲＮＡの送達を改善できることを証明する。
【０１０２】
実施例６
本実施例は、伸長ｃｒＲＮＡが生体内でのＣｐｆ１送達を増強することを証明する。
【０１０３】
伸長ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋５９）が、カチオン性脂質を介する生体内でのＣｐｆ１送達を増強できるかどうか決定するために実験が行われた。実験の概略は図３Ａに提供される。
【０１０４】
研究はＡｉ９マウスで過去に確認されたスペーサーを用いて実行された。リポフェクタミン又はＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を、ＡｓＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体又はＡｓＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ＋５９複合体のいずれかと組み合わせた１回の筋内注射をＡｉ９マウスに施した。前記注射の２週間後に、ｔｄＴｏｍａｔｏ（赤色蛍光）が腓腹筋（図３Ｂの筋肉図）の１０μｍ切片で撮像された。伸長なし及び伸長ありのｃｒＲＮＡｓについて収集した画像の比較により、伸長ありのｃｒＲＮＡはＡｓＣｐｆ１  ＲＮＰを生体内で送達するＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の能力を劇的に増強したことを示した。さらに、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）と複合体を形成した伸長ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋５９）のＲＮＰは、注射部位から数ミリメートル離れた場所と、腓腹筋全体とでｔｄＴｏｍａｔｏの発現を誘導した。前記筋肉内でのｔｄＴｏｍａｔｏ発現の高レンジは、筋繊維のユニークな多核性のためである可能性がある。これは、ｔｄＴｏｍａｔｏを前記筋繊維の全長にわたって発現させて、数ミリメートルの長さにわたって観察可能にできるかもしれない。
【０１０５】
ヌクレオチド５９個の伸長ｃｒＲＮＡが生体内でのＡｓＣｐｆ１  ＲＮＰの送達と、さらには、編集効率を増強できる能力は、動物研究用ツールとして、及び、ヒト疾患、特に遺伝性筋ジストロフィー症を処置するための潜在的な治療薬としてのＣｐｆ１の価値を高める。
【０１０６】
実施例７
５．１  伸長ｃｒＲＮＡはＨＤＲ及びＮＨＥＪの発生率を増大させる
５’伸長が、ＮＨＥＪレベルとともにＨＤＲ発生率を増大できるかどうか調べるために、さまざまな伸長を含むｃｒＲＮＡを含むＡｓＣｐｆ１  ＲＮＰが、１本鎖オリゴヌクレオチド供与体（ｓｓＯＤＮ）と一緒にＧＦＰ−ＨＥＫ細胞に導入された。ＨＤＲ発生率は制限酵素消化アッセイを用いて定量化される一方、ＮＨＥＪレベルはＧＦＰ陰性細胞の集団を計測することにより決定された（最初のセクションと同様）。ヌクレオチド４個及び９個伸長したｃｒＲＮＡの両方について２倍のＤＨＲの改善が観察された（図４Ａにおいて、ｃｒＲＮＡ＋４についてのＨＤＲ頻度は１７％、ｃｒＲＮＡ＋９についてのＨＤＲ頻度は１８％に対し、未改変ｃｒＲＮＡについては９％）。塩基５９個の伸長についてはＨＤＲのより小さい増大が観察された（図４Ａにおいて、ｃｒＲＮＡについてＨＤＲ発生率１３％）。
【０１０７】
興味深いことに、ＨＤＲについて用いたｓｓＯＤＮは、ＡｓＣｐｆ１のＮＨＥＪ効率も劇的に増大させた。ｓｓＯＤＮはＧＦＰ陰性細胞の百分率を、伸長なしのｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）については３０％から４６％に、塩基４個伸長したｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋４）について５５％から９５％に、塩基９個伸長したｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋９）について５８％から９３％に、塩基５９個伸長したｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋５９）について３７％から５８％に増大させた（図４Ｂ）。外部から添加されたＤＮＡがＡｓＣｐｆ１  ＲＮＰを介する編集を増強したという知見は、ＢＦＰレポーターシステムにおいてさらに確認された。ヒトゲノムとの相同性が全くない１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）がＡｓＣｐｆ１  ＲＮＰとともにＢＦＰ−ＨＥＫ細胞内にエレクトロポレーションされた。同様にｓｓＤＮＡの添加は、伸長なし及び伸長ありのｃｒＲＮＡｓの両方についてＡｓＣｐｆ１の編集活性を２倍増加させた。ＢＦＰ陰性集団は、伸長なしのｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）については３１％から５０％に、塩基４個伸長したｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋４）について５９％から９１％に、塩基９個伸長したｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ＋９）について６０％から９５％に増大させた（図４Ｃ）。遺伝子編集を増強するために外部から添加されたＤＮＡはＣｐｆ１  ＲＮＰの標的部位に対する相同性がなければならないかどうかを決定するために追加実験が行われた。前記標的配列との相同性が全くない１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）とともにＡｓＣｐｆ１  ＲＮＰが細胞にエレクトロポレーションされ、遺伝子編集効率が計測された。同様に、相同性のないｓｓＤＮＡの追加もＡｓＣｐｆ１の編集活性を両方の伸長ｃｒＲＮＡについて約９０％に増大させた（図４Ｄ）。結果は、ｓｓＤＮＡがＡｓＣｐｆ１を用いて編集を増大できることを証明する。さらに、５’末端伸長を用いる活性増強は、外部のｓｓＤＮＡと相乗的で、これらが誘導した遺伝子編集はトータルで１００％に近かった。エレクトロポレーションの代わりにリポフェクタミンが送達方法として用いられる場合には、ｓｓＤＮＡの追加はＣｐｆ１遺伝子編集効率を増強しないことが観察された。
【０１０８】
ｓｓＲＮＡはゲノムにインテグレートできないのでより安全に使用できるため、ＤＮＡよりもＲＮＡを遺伝子編集に用いることが好ましいことがときどきある。ＤＮＡよりもｓｓＲＮＡの効果をテストするために、ＧＦＰ−ＨＥＫ細胞がＣｐｆ１  ＲＮＰ及び２本の異なるｓｓＲＮＡｓ（ヌクレオチド９個及び１００個）とともにエレクトロポレーションされ、得られた遺伝子編集レベルが決定された。少し配列のばらつきがある２本のヌクレオチド１００個のｓｓＲＮＡｓは、両方ともＣｐｆ１の遺伝子編集効率を劇的に増大させ、２倍の改善が得られたが、ヌクレオチド９個のｓｓＲＮＡは１０％の遺伝子編集効率の増強を誘導した（図４Ｅ）。
【０１０９】
これらの結果は、１本鎖核酸がＣｐｆ１編集活性を細胞内で増大させるために使用可能であることを証明する。
【０１１０】
５．２  単一分子の伸長ｃｒＲＮＡ及び供与体ＤＮＡ
本実施例の第２部は、供与体ＤＮＡと単一分子に組み合わされた伸長ｃｒＲＮＡがＨＤＲを増強できることを証明する。
【０１１１】
大多数の遺伝病は、ノックアウトの代わりに遺伝子修正を必要とし、したがって、ＨＤＲを介して遺伝子突然変異を修正できるＣｐｆ１にもとづく治療薬の開発に大きな関心がある。供与体ＤＮＡ及びＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡの両方を効率的に封入するナノ粒子を生成する課題を解決するために、ｃｒＲＮＡ及び供与体ＤＮＡが可逆的なジスルフィド結合を介して単一分子に組み合わせることができるかどうかを決定する実験が行われた。１つの課題は、過去に報告されたとおり、ｃｒＲＮＡの５’末端は化学修飾に極めて敏感なことである。したがって、ｃｒＲＮＡの伸長自己プロセッシング配列の５’末端での化学的修飾がテストされた。
【０１１２】
ｃｒＲＮＡを５’末端に４個の追加のヌクレオチドで伸長し、化学的修飾（すなわち５’ＤＢＣＯ、５’チオール又は５’アジド）が前記ヌクレオチドの末端に付加された。ヌクレオチド４個伸長したｃｒＲＮＡｓの活性が５’末端での化学的修飾あり及びなしでテストされた。簡潔には、インデル形成を介してＧＦＰ遺伝子をノックダウンするために設計された、５’修飾され、過剰に荷電したｃｒＲＮＡがＣｐｆ１と複合体を形成して、細胞内にエレクトロポレーション（ヌクレオフェクション）された。その後、フロー・サイトメトリーを介してＧＦＰノックアウト細胞の数を計測することによって遺伝子編集効率が決定されたが、ここでＧＦＰをもはや発現しない細胞は、該細胞がＣｐｆ１／ｃｒＲＮＡ複合体でトランスフェクションされたことを示す。
【０１１３】
図４Ｆは、ｃｒＲＮＡ複合体の全てが薬４０％のＧＦＰノックアウトを示し、これは修飾なしの対照ｃｒＲＮＡと同様のレベルだったので、化学的修飾又はヌクレオチド伸長のいずれもＣｐｆ１−ｃｒＲＮＡ活性に影響がなかったことを示す。
【０１１４】
活性を失うことなくｃｒＲＮＡの５’末端での化学を付加できるので、チオール末端を有する供与体ＤＮＡと反応させるためにｃｒＲＮＡの５’末端はチオピリジンで活性化された（図５Ａ〜５Ｃ）。２個の巨大分子の間の反応は速度が遅い。したがって、前記ｃｒＲＮＡ及び供与体ＤＮＡの両方に相補的な架橋ＤＮＡを用いる方法が使われた。ｃｒＲＮＡ及び供与体ＤＮＡの間のコンジュゲーション収率を増強するために、前記架橋が雑種形成して２個の巨大分子を近接させて反応を促進する。前記コンジュゲーション収率は４０％以下で産物はゲル抽出により精製された。前記コンジュゲートは「相同性ＤＮＡ−ｃｒＲＮＡ」（ＨＤ−ＲＮＡ）と命名された。ＨＤ−ＲＮＡはジスルフィド結合を含み、該結合は細胞質中で還元されるはずである。ＨＤ−ＲＮＡのチオールを介する切断はＨＤ−ＲＮＡをＤＴＴ中で６時間インキュベーションし、その分子量をゲル電気泳動を通じて解析することによって決定された。図５Ｃにおけるゲルの比較から、ＤＴＴがＨＤ−ＲＮＡを還元して、供与体ＤＮＡ及びｃｒＲＮＡを再生することを示す。
【０１１５】
Ｃｐｆ１と複合体を形成したＨＤ−ＲＮＡはＧＦＰ−ＨＥＫ細胞にエレクトロポレーションされ、ＨＤＲ及びＮＨＥＪのレベルが、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ及び供与体ＤＮＡを別々にエレクトロポレーションした細胞と比較された。Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ及び供与体ＤＮＡをエレクトロポレーションした細胞と比較したＨＤ−ＲＮＡでエレクトロポレーションされた細胞から類似のレベルのＮＨＥＪ及びＨＤＲが観察され、ジスルフィド結合を介するｃｒＲＮＡの供与体ＤＮＡとのコンジュゲーションは、ｃｒＲＮＡ又は供与体ＤＮＡのいずれの機能にも影響を与えなかったことを証明した。
【０１１６】
カチオン性脂質（すなわちリポフェクタミン）又はカチオン性ポリマー（すなわちＰＡｓｐ（ＤＥＴ））とともにトランスフェクション後にＨＤ−ＲＮＡがＣＰｆ１のＨＤＲ効率を増強するかどうかを決定するために実験が行われた。これらの実験のために、Ｃｐｆと複合体を形成したＨＤ−ＲＮＡが、リポフェクタミン又はＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いてＧＦＰ−ＨＥＫ細胞にトランスフェクションされ、ＨＤＲ及びＮＨＥＪのレベルが比較された。ＮＨＥＪはＧＦＰ陰性細胞の頻度を計測することによって決定され、ＢＦＰ遺伝子のターゲッティング領域のＰＣＲアンプリコンを用いるＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイを実行することによって確認された。ＨＤＲ効率は、細胞のＤＮＡを単離し、前記供与体ＤＮＡに埋め込まれた制限酵素部位の存在を解析することによって決定された。結果は図６及び７に提供される。
【０１１７】
図６及び７は、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いる送達後、Ｃｐｆ１のＮＨＥＪ及びＨＤＲ効率の両方をＨＤ−ＲＮＡが増強したことを証明する。具体的には、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いて送達されたＨＤ−ＲＮＡ／Ｃｐｆ１複合体で処理された細胞の６０％以下でＨＤＲが検出されたが、これはＰＡｓｐ（ＤＥＴ）で複合体化されたＣｐｆ１／ｃｒＲＮＡ及び供与体ＤＮＡで処理された細胞のＨＤＲ発生率よりも著しく高い。さらに、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いて送達されたＨＤ−ＲＮＡ／Ｃｐｆ１複合体で観察された６０％のＤＨＲ発生率は、Ｃｐｆ１／ｃｒＲＮＡ複合体のエレクトロポレーションで観察されたＨＤＲ発生率よりも高く、供与体ＤＮＡをＣｐｆ１切断部位の近傍に配置することはＨＤＲを補助するかもしれないことを示唆する。
【０１１８】
これらの結果は、伸長ｃｒＲＮＡはＨＤＲを増強できることを証明する。
【０１１９】
実施例９
本実施例は、異なる細胞タイプにおける伸長ｃｒＲＮＡの使用と、遺伝疾患を処置する方法の有用性を証明する。
【０１２０】
ＨＤ−ＲＮＡは、カチオン性脂質を用いる送達後、Ｃｐｆ１が細胞内でＨＤＲを生成する能力を増強できるため、多数の潜在的な用途がある。デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）はＨＤ−ＲＮＡの最初の医学用途としてテストされた。ＤＭＤは早発型致死性疾患で、ジストロフィン遺伝子の突然変異により発生し、最もありふれた先天性ミオパシーであり、ＤＭＤ患者の約３０％は、ＨＤＲにもとづく治療薬で潜在的には処置できるかもしれない単一塩基突然変異又は小さな欠失を有する。
【０１２１】
したがって、ジストロフィン遺伝子を標的とするように設計されたＨＤ−ＲＮＡが、ＨＤＲを介するｍｄｘマウスから得られた筋芽細胞におけるジストロフィンの突然変異を修正する能力についてテストされた。ジストロフィン遺伝子を切断でき、ジストロフィン遺伝子に存在するＣからＴへの突然変異を修正でき、供与体ＤＮＡも含むようにＨＤ−ＲＮＡが設計された（図１０Ａ及びＢ）。Ｃｐｆ１／ＨＤ−ＲＮＡ＋リポフェクタミンで処置されたｍｄｘ筋芽細胞におけるＨＤＲ発生率が決定され、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ、供与体ＤＮＡ及びリポフェクタミンで処置されたｍｄｘ筋芽細胞に対して比較された。ＨＤ−ＲＮＡと複合体を形成したＣｐｆ１は、ＣＰｆ１  ＲＮＰ及び供与体ＤＮＡで処置された細胞よりもｍｄｘ筋芽細胞におけるＨＤＲ生成がより効率的であることがわかった。例えば、ＨＤ−ＲＮＡで処理された細胞は５〜１０％のＨＤＲ発生率を有するが、対照細胞はたった１％のＨＤＲ発生率しかなかった。
【０１２２】
別の実験では、ｔｄＴｏｍａｔｏｒレポーターの上流の３重のポリ（Ａ）シグナルに連結した３つの読み枠全てに終止コドンを含むトランスジェニックマウス系統である、Ａｉ９マウスから単離された初代筋芽細胞が、５’伸長あり及び伸長なしのｃｒＲＮＡｓと複合体化したＡｓＣｐｆ１  ＲＮＰとともにエレクトロポレーションされた。Ａｉ９マウスはトランスジェニックマウス系統で、該マウスは、３重ポリ（Ａ）シグナルに連結した３つの読み枠全てに終止コドンを有するｔｄＴｏｍａｔｏｒレポーターを含む。ＡｓＣｐｆ１スペーサーは、ゲノム欠失を通じて前記終止配列の除去をもたらす複数の切断をＤＮＡに導入するように設計された。遺伝子編集の成功は、ｔｄＴｏｍａｔｏ（赤色蛍光タンパク質、ＲＦＰ）の発現によって示され、これは蛍光顕微鏡を通じて可視化でき、フロー・サイトメトリーを用いて定量化できる。伸長があるｃｒＲＮＡｓは伸長のないｃｒＲＮＡより４０〜５０％遺伝子編集を増大させる。伸長のないｃｒＲＮＡで処理された筋芽細胞はＲＧＰ陽性が１２％であったが、ヌクレオチド２個伸長したｃｒＲＮＡで処理された筋芽細胞はＲＦＰ陽性が１５％で、ヌクレオチド９個伸長したｃｒＲＮＡで処理された筋芽細胞はＲＦＰ陽性が１８％で、ヌクレオチド５９個伸長したｃｒＲＮＡで処理された筋芽細胞はＲＦＰ陽性が１６％であった（図１０Ｃ）。さらに遺伝子編集効率が標的ＤＮＡの初代筋芽細胞との配列相同性がないｓｓＤＮＡｓｓＲＮＡ（ヌクレオチド１００個）とともにｃｒＲＮＡを用いてテストされた。ｓｓＤＮＡ及びｓｓＲＮＡの両方とも、遺伝子編集効率を増強した（図１０Ｄ）。
【０１２３】
全体として、初代筋芽細胞における標的配列の欠失は、伸長ｃｒＲＮＡｓの遺伝子編集の増強は、遺伝学的な標的及び細胞タイプを超えて広範に適用可能であることを示唆する。これらの結果は、ＨＤ−ＲＮＡが遺伝病の治療薬として使用可能であることを証明する。
【０１２４】
実施例１０
以下の実施例は、５’ｃｒＲＮＡ伸長の遺伝子編集効果は、遺伝学的な標的及び細胞タイプを超えて広範に適用可能であることを証明する。これらのｃｒＲＮＡは、該ｃｒＲＮＡがＣｐｆ１  ＲＮＰが内在性遺伝子を編集する能力を増強できるかどうかを知るために、Ｓｅｒｐｉｎａ１をたたき台として用いてテストされた。
【０１２５】
ｃｒＲＮＡ又はｃｒＲＮＡ＋９のいずれかとともにＳｅｐｉｎａ１遺伝子を標的とするＣｐｆ１がＨｅｐＧ２細胞にエレクトロポレーションを用いてトランスフェクションされた。Ｓｅｒｐｉｎａ１遺伝子の突然変異はアルファ１−アンチ−トリプシン欠損症を起こし、治療的遺伝子編集の標的となるからである。ＮＨＥＪ効率を定量化するために、ＨｅｐＧ２細胞由来のゲノムＤＮＡについてドロップレットデジタルＰＣＲが実施された。
【０１２６】
図１０Ｅに示すとおり、ｃｒＲＮＡ＋９を有するＣｐｆ１  ＲＮＰは野生型ｃｒＲＮＡと比較してＮＨＥＪ効率が増強された。これらの結果は、５’ｃｒＲＮＡ伸長の遺伝子編集効果は遺伝学的な標的を超えて広範に適用可能であることをさらに示す。
【０１２７】
本明細書に引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、引用により取り込まれるために各文献が個別にかつ特定して示され、本明細書にその全体が示されたのと同じ程度に、引用によって取り込まれる。
【０１２８】
用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び「少なくとも１つ」及び類似の指示対象の本発明を説明するコンテキスト（特に以下の特許請求の範囲のコンテキストにおける）における使用は、本明細書に特段示されるか、又は文脈によって明確に矛盾しないかぎり、単数形及び複数形の両方をカバーするように解釈されるべきである。１つ以上の事項のリストが続く用語「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ」という用語の利用（例えば、「ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｏｆ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ」）は、本明細書に特段示されるか、又は文脈によって明らかに矛盾しないかぎり、リストされた事項（Ａ又はＢ）から選択される１つの事項を意味すると解釈されるべきである。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」及び「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」は、特段の注記がないかぎり、開放端的な用語として解釈されるべきである（すなわち、「含むが、限定されない」ことを意味する）。本明細書における数値範囲の列挙は、本明細書で特段示されないかぎり、該範囲内に属するそれぞれ別の数値を個別に引用する簡略的な方法として機能することを単に意図するに過ぎず、それぞれ別の数値は、本明細書で個別に列挙されたように明細書に取り込まれる。本明細書に説明される全ての方法は、本明細書で特段示されるか、文脈によって明らかに矛盾しないかぎり、いずれかの適当な順序で実施できる。本明細書に提供されるいずれか及び全ての実施例の使用、又は、例示的な文言（例えば、「ｓｕｃｈ  ａｓ」）は、単により良く発明を説明することを意図するものであって、特段特許請求の範囲に記載されないかぎり、発明の範囲に制限を課すものではない。明細書における文言は、特許請求の範囲に記載されない要素が発明の実施に必須であることを示すと解釈すべきではない。
【０１２９】
本発明の好ましい実施態様は、本発明を実施するために発明者に知られたベストモードを含めて本明細書に説明される。これらの好ましい実施態様の変形は以上の説明を読んだ当業者には自明になるかもしれない。発明者は当業者がかかる変形を適宜用いることを予想し、発明者は本明細書に特に説明した以外にも本発明が実施されることを意図する。したがって、本発明は適用可能な法律によって許されるとおり、本明細書に添付する特許請求の範囲に列挙される主題の全ての改変及び均等物を含む。さらに、本明細書で特段示されるか、文脈によって明らかに矛盾しないかぎり、全ての可能な変形における上記の要素のいずれかの組み合わせは本発明に包含される。
【図１Ａ】
2020537540.tif 000011
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2020537540.tif 000013
【図１Ｄ】
2020537540.tif 000014
【図１Ｅ】
2020537540.tif 000015
【図１Ｆ】
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【図２】
2020537540.tif 000017
【図３Ａ】
2020537540.tif 000018
【図３Ｂ】
2020537540.tif 000019
【図４Ａ】
2020537540.tif 000020
【図４Ｂ】
2020537540.tif 000021
【図４Ｃ】
2020537540.tif 000022
【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2020537540.tif 000027
【図５Ｃ】
2020537540.tif 000028
【図６】
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【図７】
2020537540.tif 000030
【図８】
2020537540.tif 000031
【図９】
2020537540.tif 000032
【図１０Ａ】
2020537540.tif 000033
【図１０Ｂ】
2020537540.tif 000034
【図１０Ｃ】
2020537540.tif 000035
【図１０Ｄ】
2020537540.tif 000036
【図１０Ｅ】
2020537540.tif 000037
【図１１Ａ】
2020537540.tif 000038
【図１１Ｂ】
2020537540.tif 000039
【図１１Ｃ】
2020537540.tif 000040
【図１１Ｄ】
2020537540.tif 000041
【図１２】
2020537540.tif 000042
【図１３Ａ】
2020537540.tif 000043
【図１３Ｂ】
2020537540.tif 000044
【図１３Ｃ】
2020537540.tif 000045
【図１４】
2020537540.tif 000046
【図１５Ａ】
2020537540.tif 000047
【図１５Ｂ】
2020537540.tif 000048
【図１５Ｃ】
2020537540.tif 000049
【図１５Ｄ】
2020537540.tif 000050
【図１６】
2020537540.tif 000051
【配列表】
2020537540000001.app
【国際調査報告】
2020537540.tif 000052
2020537540.tif 000053
2020537540.tif 000054