(57)【要約】  体重維持の支援及び／又は肥満の治療若しくは予防に使用するための、ＦＡＭ４６Ａの活性を低下させることができる作用物質。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
体重維持の支援及び／又は肥満の治療若しくは予防に使用するための、ＦＡＭ４６Ａの活性を低下させることができる作用物質。
【請求項２】
前記作用物質が、減量介入中又は減量介入後に、好ましくは減量介入中に対象に投与される、請求項１に記載の使用のための作用物質。
【請求項３】
前記作用物質が、対象のレプチンレベルを増大させる、請求項１又は２に記載の使用のための作用物質。
【請求項４】
前記作用物質が、対象のレプチンレベルを増大させる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための作用物質。
【請求項５】
前記作用物質が、対象のＦＡＭ４６Ａレベルを減少させる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための作用物質。
【請求項６】
前記作用物質が、表１に列挙される前記作用物質から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための作用物質。
【請求項７】
前記作用物質が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は小分子からなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための作用物質。
【請求項８】
対象の体重維持を支援すること、及び／又は肥満を治療又は予防することができる作用物質を同定する方法であって、
（ａ）  ＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む調製物を、候補となる作用物質と接触させる工程と、
（ｂ）  前記候補となる作用物質が、前記ＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出する工程と、を含む、方法。
【請求項９】
ＦＡＭ４６Ａの活性を低下させる作用物質を同定する方法であって、
（ａ）  ＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む調製物を、候補となる作用物質と接触させる工程と、
（ｂ）  前記候補となる作用物質が、前記ＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出する工程と、を含む、方法。
【請求項１０】
前記ＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む前記調製物が、前記ＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む細胞を含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、脂肪細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、ＦＡＭ４６Ａの発現を低下させる作用物質を同定するためのものである、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、前記候補となる作用物質が、前記細胞によって産生されたレプチンのレベルに影響を及ぼすかどうかを検出することを更に含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記候補となる作用物質が天然生成物である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＦＡＭ４６Ａの活性を調節することができる作用物質、並びに治療における、特に体重維持の支援及び肥満治療における、このような作用物質の使用に関する。本発明はまた、このような作用物質を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
肥満は、世界の多くの地域で蔓延している慢性的な代謝異常である。肥満は、重度の併存症例えば２型糖尿病、心臓血管疾患、脂質異常症、及び特定のタイプのがんに関する主要な危険因子である（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  ＯｒｇａｎＴｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ（２０００）８９４：ｉ−ｘｉｉ、１〜２５３）。
【０００３】
肥満とは、炭水化物、脂肪などからの過剰なエネルギー蓄積の結果として、個体が通常より重い状態を意味する。余分な体重は、典型的には、皮膚の下又は内臓の周囲に脂肪の形態で保持される。
【０００４】
経験的データは、初期体重の少なくとも１０％の減量が、肥満関連の併存症のリスクの大幅な低下をもたらすことを示唆している（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ（２０００）８９４：ｉ−ｘｉｉ、１〜２５３）。しかしながら、減量能力は、対象間で非常に多様である。
【０００５】
エネルギー摂取量がエネルギー消費量を超える場合に、肥満が生じる。したがって、肥満を改善するために、脂肪、炭水化物などからのエネルギー摂取量を減少させる方法、又はｉｎ  ｖｉｖｏ代謝を促進することによってエネルギー消費量を増加させる方法が望まれる。したがって、食習慣及び運動の改善は、肥満及び肥満関連疾患の予防及び改善のための有効な方法であると考えられる。例えば、低カロリー食（ＬＣＤ）による介入は減量に非常に有効であり得るものであり、この減量は概して肥満関連の併存症、特に２型糖尿病のリスクの改善を伴うと長い間認識されてきた（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ（２０００）８９４：ｉ−ｘｉｉ、１〜２５３）。
【０００６】
減量を促進するための多くの方法が知られているが、減量介入の期間が完了すると、対象は減少した体重が再増加するというリスクに直面する。このような逆行リスクは、体重減少に関連した全ての利益を減少させる、又は潜在的に完全に逆戻りさせる危険がある。
【０００７】
したがって、体重減量を促進する改善された方法だけでなく、体重維持を支援する（減量の再増加を防止又は減少させ、したがって減量介入後に達成されたものと同様のレベルでの体重の維持をサポートする）ための方法についても、大きな必要性が残されている。このような改善は、肥満に対するより完全な治療を提供し、したがって肥満関連疾患のリスクを減少させるであろう。
【０００８】
肥満は、正常体重を有する個体よりも、肥満対象においてより高いか又は低いかのいずれかである特定のタンパク質のレベルの差を含む、身体における多くの生理学的変化に関連する（Ｓｉｎｇｌａ，Ｂａｒｄｏｌｏｉ  ａｎｄ  Ｐａｒｋａｓｈ，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ（２０１０））。更に、これらのタンパク質の多くの血中レベルは、減量介入中に劇的に変化することが示されている（Ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔａｌ．Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ（２０１０））。このような一例は、満腹関連ホルモンであるタンパク質のレプチンであり、そのレベルは肥満対象において増大し、次いで減量介入中には減少する。
【０００９】
しかしながら、これらのタンパク質レベルの変化が肥満及び体重減少と因果関係があるかどうか、又はそれらがまさしく肥満状態及び減量介入を反映しているかどうかは、ほとんど知られていない。
【００１０】
タンパク質レベルの変化に関して可能性のある因果関係を調べる１つの方法は、これらのタンパク質のレベルが遺伝的に制御されるかどうか、即ち、異なるレベルのこれらのタンパク質に関連する遺伝子多様体が存在するかどうかを研究することである。このような関係を研究する分析は、遺伝子−タンパク質−量的形質研究と呼ばれる。現代の分子生物学技術を使用して、これらの研究は、非常に大規模に何十万もの遺伝子多様体を対象とし、数百〜数千のタンパク質レベルとの関連性を試験して、実施され得る。特定のタンパク質レベルに関連する遺伝子多様体（いわゆる一塩基多型、短いＳＮＰ）は、タンパク質量的形質遺伝子座（ｐＱＴＬ）と呼ばれる。
【００１１】
ｐＱＴＬは、レベルの変化を示し、かつｃｉｓ−ｐＱＴＬと呼ばれるタンパク質をコードする遺伝子に近接することができる、又は異なるゲノム領域（ｔｒａｎｓ−ｐＱＴＬ）と関連付けることができる。ｔｒａｎｓ−ｐＱＴＬは、目的のタンパク質のレベルを調節するよう作用するタンパク質に関係する遺伝子多様体であることが多い。したがって、ｐＱＴＬの研究により、例えば肥満及び体重減少などの目的の形質に関連するタンパク質の新規なレギュレータを同定することが可能となる。
【発明の概要】
【００１２】
本発明者らは、Ｄｉｏｇｅｎｅｓの研究から得られた減量介入データに対するタンパク質量的形質遺伝子座（ｐＱＴＬ）解析を実施した。この研究は、汎ヨーロッパのランダム化及び管理された食事介入研究であり、８つのヨーロッパセンターにおける肥満及び過体重家族における減量及び体重維持に対する食事タンパク質及び血糖指数の効果を詳細に調べている（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｒｅｖ．１１：７６〜９１）。簡潔には、Ｄｉｏｇｅｎｅｓの研究は、過体重／肥満の参加者を低カロリー食（ＬＣＤ）による減量段階（ＣＩＤ１）に供し、対象は、８週間のＭｏｄｉｆａｓｔＲ食（約８００ｋＣａｌ／日）、続いて６ヶ月間の体重維持段階（ＣＩＤ２）をフォローした。
【００１３】
本文脈において、ｐＱＴＬは、ＬＣＤによる減量段階中のタンパク質レベルの変動に関与するゲノム遺伝子座である。本発明者らは、体重減少と相関する発現の変化を示したタンパク質に関連するｐＱＴＬを具体的に分析した。
【００１４】
本発明者らは、体重減少と有意に関連した、ＬＣＤ段階中の血中のレプチンレベルの発現差異を観察し、レプチンが食欲抑制及び制御に関連している領域における理解と相関する所見を観察した。本発明者らはまた、分枝鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼＥ１  Ｂサブユニット（ＢＣＫＤＨＢ）遺伝子とＦＡＭ４６Ａ遺伝子との間の６番染色体の領域において血液中のレプチンレベルに関連するｐＱＴＬを観察した。
【００１５】
２つの遺伝子のうちのどちらがｐＱＴＬシグナルに関与し得るかを区別するために、本発明者らは、いずれかの遺伝子の遺伝子発現レベルに関連したｐＱＴＬ領域における遺伝子多様体を調査した。更なる調査では、本発明者らは、領域内の遺伝子多様体がＦＡＭ４６Ａのみの遺伝子発現レベルに関連していることを観察した。この観察は、この遺伝子／タンパク質がレプチンレベルと逆相関するレプチンｐＱＴＬ  ＦＡＭ４６Ａと機能的に関連している可能性が高いこと、すなわち、ＦＡＭ４６Ａレベルが低くなるほど、それに伴いレプチンレベルが高くなることを示す。
【００１６】
加えて、本発明者らは、ＦＡＭ４６Ａは、Ｄｉｏｇｅｎｅｓの研究からのデータにおいて、ＢＣＬ２関連ａｔｈａｎｏｇｅｎｅ  ６（ＢＡＧ６）と高度に相関していることを観察した。この所見を裏付けるものとして、体格指数（ＢＭＩ）は、皮下脂肪におけるＢＡＧ６スプライシングの最も強い決定因子であることが知られている。細胞性ストレス関連タンパク質ＢＡＧ６は、遺伝子及びタンパク質の調節、並びにアポトーシスにおいて役割を果たすことが知られている。特に、ＢＡＧ６は、２型糖尿病及びＤｉｏｇｅｎｅｓデータにおいてもレプチンと相関する更なる細胞性ストレス関連タンパク質であるＨＳＰ７０の細胞含有量についての中心的なレギュレータである。理論に束縛されるものではないが、ＦＡＭ４６Ａと細胞性ストレス関連タンパク質ＢＡＧ６及びＨＳＰ７０との間の相関関係は、ＦＡＭ４６Ａと、期間中に細胞が受けるストレスが増大する食事介入の成功との間の更なる関連を示す。
【００１７】
したがって、本発明者らは、ＦＡＭ４６Ａと体重制御及び食欲抑制との間の２つの独立した関連を確立し、特に食事介入期間中に、このように体重維持及び肥満治療を支援する新しい介入を提供する。
【００１８】
したがって、一態様では、本発明は体重維持の支援及び／又は肥満の治療若しくは予防に使用するための、ＦＡＭ４６Ａ活性を低下させることができる作用物質を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、対象の食欲を抑制するのに使用するための、ＦＡＭ４６Ａ活性を低下させることができる作用物質を提供する。別の態様では、本発明は、満腹感を延長するのに使用するための、ＦＡＭ４６Ａ活性を低下させることができる作用物質を提供する。別の態様では、本発明は、対象による食物摂取を低減するのに使用するための、ＦＡＭ４６Ａ活性を低下させることができる作用物質を提供する。別の態様では、本発明は、対象における脂肪堆積を低減するのに使用するための、ＦＡＭ４６Ａ活性を低下させることができる作用物質を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、体重維持を支援するための、ＦＡＭ４６Ａ活性を低下させることができる作用物質の使用を提供する。別の態様では、本発明は、対象の食欲を抑制するための、ＦＡＭ４６Ａ活性を低下させることができる作用物質の使用を提供する。別の態様では、本発明は、満腹感を延長するための、ＦＡＭ４６Ａ活性を低下させることができる作用物質の使用を提供する。別の態様では、本発明は、対象による食物摂取を低減するための、ＦＡＭ４６Ａ活性を低下させることができる作用物質の使用を提供する。別の態様では、本発明は、対象における脂肪堆積を低減するための、ＦＡＭ４６Ａ活性を低下させることができる作用物質の使用を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、体重維持の支援を必要とする対象に本発明の作用物質を投与することを含む、体重維持を支援する方法を提供する。別の態様では、本発明は、食欲抑制を必要とする対象に本発明の作用物質を投与することを含む、対象の食欲を抑制する方法を提供する。別の態様では、本発明は、満腹感の延長を必要とする対象に本発明の作用物質を投与することを含む、満腹感を延長する方法を提供する。別の態様では、本発明は、食物摂取の低減を必要とする対象に本発明の作用物質を投与することを含む、対象による食物摂取を低減する方法を提供する。別の態様では、本発明は、脂肪堆積の低減を必要とする対象に本発明の作用物質を投与することを含む、対象の脂肪堆積を低減する方法を提供する。別の態様では、本発明は、肥満の治療又は予防を必要とする対象に本発明の作用物質を投与することを含む、肥満を治療又は予防する方法を提供する。
【００２２】
ＦＡＭ４６Ａの活性は、本発明の作用物質の非存在下での活性と比較して低下し得る。ＦＡＭ４６Ａの活性は、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％又は１００％低下し得る。
【００２３】
作用物質は、例えば、ＦＡＭ４６Ａアンタゴニスト若しくは阻害物質であってもよく、又は作用物質は、細胞中のＦＡＭ４６Ａのレベルを減少させてもよい。
【００２４】
一実施形態では、作用物質は、対象の食欲を抑制する。
【００２５】
一実施形態では、作用物質は満腹感を増大又は延長する。別の実施形態では、作用物質は、対象による食物摂取を低減する。別の実施形態では、作用物質は、対象における脂肪堆積を低減する。
【００２６】
一実施形態では、作用物質は、減量介入中又は減量介入後に対象に投与される。好ましい実施形態では、作用物質は、減量介入中に対象に投与される。減量介入は、例えば、食事療法（例えば、低カロリー食）及び／又は運動療法であり得る。
【００２７】
一実施形態では、作用物質は、対象のレプチンレベルを増大させる。レプチンのレベルは、本発明の作用物質の非存在下でのレベルと比較して増大し得る。レプチンのレベルは、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％、１００％又はそれ以上増大し得る。
【００２８】
一実施形態では、作用物質は、対象のＦＡＭ４６Ａのレベルを減少させる。本文脈において、「レベル」は、ＦＡＭ４６Ａの量を意味し、例えば、発現したタンパク質の量を分析することによって、及び／又は存在する対応するｍＲＮＡの量を分析することによって測定することができる。好ましくは、作用物質はＦＡＭ４６Ａの発現を低下させる。例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡは、ＦＡＭ４６Ａの発現を低下させ得る。
【００２９】
一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、ＦＡＭ４６Ａの発現を低下させ得る。
【００３０】
ＦＡＭ４６Ａのレベルは、本発明の作用物質の非存在下でのレベルと比較して減少し得る。ＦＡＭ４６Ａのレベルは、例えば、少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、５０％、７５％又は１００％減少し得る。
【００３１】
一実施形態では、作用物質は、表１に列挙される作用物質から選択される。
【００３２】
好ましい実施形態では、作用物質は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、又は小分子からなる群から選択される。ポリペプチドは、例えば、抗体であり得る。したがって、本発明の作用物質は、ＦＡＭ４６Ａ又はポリペプチド（例えば、抗体）を標的とするｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はアンチセンスＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの形態であり得る。ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターなどのベクターの形態であり得る。
【００３３】
本発明の作用物質は、本発明の方法によって同定される作用物質であり得る。
【００３４】
別の態様では、本発明は、対象の体重維持を支援すること、及び／又は肥満を治療若しくは予防することができる作用物質を同定する方法であって、
（ａ）ＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む調製物を、候補となる作用物質と接触させる工程と、
（ｂ）候補となる作用物質が、ＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出する工程と、を含む、方法を提供する。
【００３５】
ＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に対する影響は、候補となる作用物質の存在下及び非存在下（すなわち、対照実験）におけるＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性を比較することによって分析することができる。
【００３６】
別の態様では、本発明は、ＦＡＭ４６Ａの活性を低下させる作用物質を同定する方法であって、
（ａ）ＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む調製物を、候補となる作用物質と接触させる工程と、
（ｂ）候補となる作用物質が、ＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドの活性に影響を及ぼすかどうかを検出する工程と、を含む、方法を提供する。
【００３７】
本発明の方法は、対象の食欲を抑制すること、満腹感を増大又は延長すること、対象による食物摂取を低減すること、及び／又は対象の脂肪堆積を低減することができる作用物質を同定するための方法であり得る。
【００３８】
一実施形態では、ＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む調製物は、ＦＡＭ４６Ａポリペプチド又はポリヌクレオチドを含む細胞を含む。
【００３９】
好ましい実施形態では、細胞は、脂肪細胞である。
【００４０】
一実施形態では、方法は、ＦＡＭ４６Ａの発現を低下させる作用物質を同定するためのものである。
【００４１】
一実施形態では、方法は、候補となる作用物質が、細胞によって産生されたレプチンのレベルに影響を及ぼすかどうかを検出することを含む。
【００４２】
一実施形態では、方法は、ＦＡＭ４６Ａに結合する作用物質を決定し、続いてこれらの作用物質のいずれがレプチンレベルを調節できるかを決定することを含む。
【００４３】
一実施形態では、候補となる作用物質は天然生成物である。
【００４４】
別の態様では、本発明は、体重維持を支援し、対象の食欲を抑制し、満腹感を増大若しくは延長し、対象による食物摂取を低減し、対象における脂肪堆積を低減し、及び／又は肥満を治療若しくは予防する作用物質を同定する方法において、ＦＡＭ４６Ａ又はそれをコードするポリヌクレオチドの使用を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、体重維持を支援すること、対象における食欲を抑制すること、満腹感を増大若しくは延長すること、対象による食物摂取を低減すること、対象における脂肪堆積を低減すること、及び／又は肥満を治療若しくは予防することにおいて使用するための薬を製造するための、ＦＡＭ４６Ａの活性を低下させることができる作用物質の使用を提供する。
【００４６】
別の態様では、本発明は、ＦＡＭ４６Ａの発現を低下させる作用物質を同定する方法であって、
（ａ）細胞、好ましくは、ＦＡＭ４６Ａを発現する細胞を、候補となる作用物質と接触させる工程と、
（ｂ）候補となる作用物質がＦＡＭ４６Ａの発現を低下させるかどうかを検出する工程と、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】ＦＡＭ４６Ａ遺伝子とＢＣＫＤＨＢ遺伝子との間に位置するレプチン関連ｐＱＴＬ  ＳＮＰの遺伝子座特異的プロット。ＬｏｃｕｓＺｏｏｍツールによって生成した、ＬＣＤ中のレプチンタンパク質発現の変化に関連する、遠位遺伝子型を同定され、インピュテーションされたＳＮＰについての関連プロット。ＳＮＰのｐ値は、ｙ軸上のスケールで−ｌｏｇ１０変換後にプロットされ、色は、１０００ゲノムのＥＵＲデータセットに基づくその領域で最も関連のあるＳＮＰとのペアの連鎖不平衡（紫色のドット）を反映している。
【図２】脂肪細胞分化中のＦＡＭ４６Ａ、ＬＥＰ、ＰＰＡＲｇ、ＣＥＢＰａ、及びＡＤＩＰＯＱの発現。ＦＡＭ４６Ａ及びＬＥＰについての相対ｍＲＮＡ発現を、分化の０日目から４日ごとに、１５日目の完全成熟まで測定した。ｍＲＮＡ発現は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によって測定された。
【図３】ＳＧＢＳ脂肪細胞におけるレプチンタンパク質発現に対するＦＡＭ４６Ａ遺伝子サイレンシング効果。主原稿の図４Ａ及び図４Ｂに対応する個々のデータ点。ＳＧＢＳ細胞を陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮＥＧ）又はＦＡＭ４６Ａ特異的ｓｉＲＮＡ（ｓｉＦＡＭ４６Ａ）でトランスフェクトし、９日目に実験を行った。遺伝子発現レベルは、ＴＢＰ（ＴＡＴＡ結合タンパク質）発現に対して表される。結果は、ｎ＝９について平均＋／−ＳＤ（標準偏差）として与えられる。
【図４】ＳＧＢＳ脂肪細胞におけるＦＡＭ４６Ａの過剰発現。ＳＧＢＳ細胞を、０．５μｇの完全長ＦＡＭ４６Ａ  ｃＤＮＡで４８時間トランスフェクトして、ＦＡＭ４６Ａ発現を２０倍に増加させた。ＦＡＭ４６Ａ  ｍＲＮＡを、９日目にｑＲＴ／ＰＣＲによって評価した。遺伝子発現レベルは、ＴＢＰ（ＴＡＴＡ結合タンパク質）発現に対して表される。データは、スチューデントのｔ検定（ｐＢａｓａｌ＝３．０×１０−４、ｐＩｎｓｕｌｉｎ＝１．０×１０−４）を使用して計算された統計的有意性について平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１とともに示される。
【図５】ＦＡＭ４６Ａの過剰発現により、インスリン及び非インスリン刺激レプチン放出の、それぞれ、有意な２８％及び２４％の減少（ｐ＝０．０３４及び０．０３８、片側ｔ検定、それぞれ基準状態及びインスリン刺激状態の両方について）がもたらされた。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「含む（comprising）」、「含む（comprises）」、及び「から構成される（comprised of）」は、「含む（including）」又は「含む（includes）」又は「含有する（containing）」又は「含有する（contains）」と同義であり、包括的又は非限定的であり、追加の、列挙されていない構成要素、要素、又は工程を除外しない。用語「含む（comprising）」、「含む（comprises）」、及び「から構成される（comprised of）」はまた、用語「からなる（consisting of）」を含む。
【００４９】
ＦＡＭ４６Ａ
ＦＡＭ４６Ａ（ＨＢＶ  Ｘトランス活性化遺伝子１１タンパク質；ＨＢＶ  ＸＡｇ−トランス活性化タンパク質１１；Ｃ６ｏｒｆ３７及びＸＴＰ１１としても知られる）は、胎盤組織、松果腺、及び下垂体において強く発現することが観察されている。ＦＡＭ４６Ａ遺伝子の第１エキソンは、特定の網膜疾患及び結腸がんと関連している縦列反復を様々な数で含む。
【００５０】
一実施形態では、ＦＡＭ４６ＡはヒトＦＡＭ４６Ａである。
【００５１】
ＦＡＭ４６Ａのアミノ酸配列の例は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０６０１０３．２で寄託された配列である。
【００５２】
ＦＡＭ４６Ａのアミノ酸配列の例は：
MAEGEGYFAMSEDELACSPYIPLGGDFGGGDFGGGDFGGGDFGGGGSFGGHCLDYCESPTAHCNVLNWEQVQRLDGILSETIPIHGRGNFPTLELQPSLIVKVVRRRLAEKRIGVRDVRLNGSAASHVLHQDSGLGYKDLDLIFCADLRGEGEFQTVKDVVLDCLLDFLPEGVNKEKITPLTLKEAYVQKMVKVCNDSDRWSLISLSNNSGKNVELKFVDSLRRQFEFSVDSFQIKLDSLLLFYECSENPMTETFHPTIIGESVYGDFQEAFDHLCNKIIATRNPEEIRGGGLLKYCNLLVRGFRPASDEIKTLQRYMCSRFFIDFSDIGEQQRKLESYLQNHFVGLEDRKYEYLMTLHGVVNESTVCLMGHERRQTLNLITMLAIRVLADQNVIPNVANVTCYYQPAPYVADANFSNYYIAQVQPVFTCQQQTYSTWLPCN（配列番号１）である。
【００５３】
ＦＡＭ４６Ａをコードするヌクレオチド配列の例は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０１７６３３．２で寄託された配列である。
【００５４】
ＦＡＭ４６Ａをコードするヌクレオチド配列の例は：
ATGGCGGAGGGTGAAGGGTACTTCGCCATGTCTGAGGACGAGCTGGCCTGCAGCCCCTACATCCCCCTAGGCGGCGACTTCGGCGGCGGCGACTTCGGCGGCGGCGACTTCGGCGGCGGCGACTTCGGCGGTGGCGGCAGCTTCGGTGGGCATTGCTTGGACTATTGCGAAAGCCCTACGGCGCACTGCAATGTGCTGAACTGGGAGCAAGTGCAGCGGCTGGACGGCATCCTGAGCGAGACCATTCCGATTCACGGGCGCGGCAACTTCCCCACGCTCGAGCTGCAGCCGAGCCTGATCGTGAAGGTGGTGCGGCGGCGCCTGGCCGAGAAGCGCATTGGCGTCCGCGACGTGCGCCTCAACGGCTCGGCAGCCAGCCATGTCCTGCACCAGGACAGCGGCCTGGGCTACAAGGACCTGGACCTCATCTTCTGCGCCGACCTGCGCGGGGAAGGGGAGTTTCAGACTGTGAAGGACGTCGTGCTGGACTGCCTGTTGGACTTCTTACCCGAGGGGGTGAACAAAGAGAAGATCACACCACTCACGCTCAAGGAAGCTTATGTGCAGAAAATGGTTAAAGTGTGCAATGACTCTGACCGATGGAGTCTTATATCCCTGTCAAACAACAGTGGCAAAAATGTGGAACTGAAATTTGTGGATTCCCTCCGGAGGCAGTTTGAATTCAGTGTAGATTCTTTTCAAATCAAATTAGACTCTCTTCTGCTCTTTTATGAATGTTCAGAGAACCCAATGACTGAGACATTTCACCCCACAATAATCGGGGAGAGCGTCTATGGCGATTTCCAGGAAGCCTTTGATCACCTTTGTAACAAGATCATTGCCACCAGGAACCCAGAGGAAATCCGAGGGGGAGGCCTGCTTAAGTACTGCAACCTCTTGGTGAGGGGCTTTAGGCCCGCCTCTGATGAAATCAAGACCCTTCAAAGGTATATGTGTTCCAGGTTTTTCATCGACTTCTCAGACATTGGAGAGCAGCAGAGAAAACTGGAGTCCTATTTGCAGAACCACTTTGTGGGATTGGAAGACCGCAAGTATGAGTATCTCATGACCCTTCATGGAGTGGTAAATGAGAGCACAGTGTGCCTGATGGGACATGAAAGAAGACAGACTTTAAACCTTATCACCATGCTGGCTATCCGGGTGTTAGCTGACCAAAATGTCATTCCTAATGTGGCTAATGTCACTTGCTATTACCAGCCAGCCCCCTATGTAGCAGATGCCAACTTTAGCAATTACTACATTGCACAGGTTCAGCCAGTATTCACGTGCCAGCAACAGACCTACTCCACTTGGCTACCCTGCAATTAA（配列番号２）である。
【００５５】
ＦＡＭ４６Ａのアミノ酸配列の更なる例は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＡＡＨ０７３５１．１で寄託された配列である。
【００５６】
ＦＡＭ４６Ａのアミノ酸配列の更なる例は：
MAEGEGYFAMSEDELACSPYIPLGGDFGGGDFGGGDFGGGDFGGGDFGGGGSFGGHCLDYCESPTAHCNVLNWEQVQRLDGILSETIPIHGRGNFPTLELQPSLIVKVVRRRLAEKRIGVRDVRLNGSAASHVLHQDSGLGYKDLDLIFCADLRGEGEFQTVKDVVLDCLLDFLPEGVNKEKITPLTLKEAYVQKMVKVCNDSDRWSLISLSNNSGKNVELKFVDSLRRQFEFSVDSFQIKLDSLLLFYECSENPMTETFHPTIIGESVYGDFQEAFDHLCNKIIATRNPEEIRGGGLLKYCNLLVRGFRPASDEIKTLQRYMCSRFFIDFSDIGEQQRKLESYLQNHFVGLEDRKYEYLMTLHGVVNESTVCLMGHERRQTLNLITMLAIRVLADQNVIPNVANVTCYYQPAPYVADANFSNYYIAQVQPVFTCQQQTYSTWLPCN（配列番号３）である。
【００５７】
ＦＡＭ４６Ａをコードするヌクレオチド配列の更なる例は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＢＣ００７３５１．２で寄託された配列である。
【００５８】
ＦＡＭ４６Ａをコードするヌクレオチド配列の更なる例は：
ATGGCGGAGGGTGAAGGGTACTTCGCCATGTCTGAGGACGAGCTGGCCTGCAGCCCCTACATCCCCCTAGGCGGCGACTTCGGCGGCGGCGACTTCGGCGGCGGCGACTTCGGCGGCGGCGACTTCGGCGGCGGCGACTTCGGCGGTGGCGGCAGCTTCGGTGGGCATTGCTTGGACTATTGCGAAAGCCCTACGGCGCACTGCAATGTGCTGAACTGGGAGCAAGTGCAGCGGCTGGACGGCATCCTGAGCGAGACCATTCCGATTCACGGGCGCGGCAACTTCCCCACGCTCGAGCTGCAGCCGAGCCTGATCGTGAAGGTGGTGCGGCGGCGCCTGGCCGAGAAGCGCATTGGCGTCCGCGACGTGCGCCTCAACGGCTCGGCAGCCAGCCATGTCCTGCACCAGGACAGCGGCCTGGGCTACAAGGACCTGGACCTCATCTTCTGCGCCGACCTGCGCGGGGAAGGGGAGTTTCAGACTGTGAAGGACGTCGTGCTGGACTGCCTGTTGGACTTCTTACCCGAGGGGGTGAACAAAGAGAAGATCACACCACTCACGCTCAAGGAAGCTTATGTGCAGAAAATGGTTAAAGTGTGCAATGACTCTGACCGATGGAGTCTTATATCCCTGTCAAACAACAGTGGCAAAAATGTGGAACTGAAATTTGTGGATTCCCTCCGGAGGCAGTTTGAATTCAGTGTAGATTCTTTTCAAATCAAATTAGACTCTCTTCTGCTCTTTTATGAATGTTCAGAGAACCCAATGACTGAGACATTTCACCCCACAATAATCGGGGAGAGCGTCTATGGCGATTTCCAGGAAGCCTTTGATCACCTTTGTAACAAGATCATTGCCACCAGGAACCCAGAGGAAATCCGAGGGGGAGGCCTGCTTAAGTACTGCAACCTCTTGGTGAGGGGCTTTAGGCCCGCCTCTGATGAAATCAAGACCCTTCAAAGGTATATGTGTTCCAGGTTTTTCATCGACTTCTCAGACATTGGAGAGCAGCAGAGAAAACTGGAGTCCTATTTGCAGAACCACTTTGTGGGATTGGAAGACCGCAAGTATGAGTATCTCATGACCCTTCATGGAGTGGTAAATGAGAGCACAGTGTGCCTGATGGGACATGAAAGAAGACAGACTTTAAACCTTATCACCATGCTGGCTATCCGGGTGTTAGCTGACCAAAATGTCATTCCTAATGTGGCTAATGTCACTTGCTATTACCAGCCAGCCCCCTATGTAGCAGATGCCAACTTTAGCAATTACTACATTGCACAGGTTCAGCCAGTATTCACGTGCCAGCAACAGACCTACTCCACTTGGCTACCCTGCAATTAA（配列番号４）である。
【００５９】
一実施形態では、ＦＡＭ４６Ａは、配列番号１又は３と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号１又は３によって表されるタンパク質の本来の機能を実質的に保持する。
【００６０】
一実施形態では、ＦＡＭ４６Ａをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２又は４と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み、好ましくは、ヌクレオチド配列によりコードされるタンパク質は、配列番号１又は３によって表されるタンパク質の本来の機能を実質的に保持する。
【００６１】
一実施形態では、ＦＡＭ４６Ａをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１又は３と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み、好ましくは、アミノ酸配列は、配列番号１又は３によって表されるタンパク質の本来の機能を実質的に保持する。
【００６２】
レプチン
レプチンは、空腹を防ぐことによるエネルギーバランスの調節に関与するホルモンである。レプチンは、脂肪細胞、加えて身体内の他の細胞によって合成される。
【００６３】
レプチンは、空腹を促進するホルモングレリンの作用と対向し、両ホルモンは、視床下部の弓状核の受容体を標的にして食欲を調節する。肥満対象においてレプチンに対する感度の低下が観察されると、その結果、満腹感を検出できなくなる。
【００６４】
一実施形態では、レプチンはヒトレプチンである。
【００６５】
レプチンのアミノ酸配列の例は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＰ＿０００２２１．１で寄託された配列である。
【００６６】
レプチンのアミノ酸配列の例は：
MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC（配列番号５）である。
【００６７】
レプチンをコードするヌクレオチド配列の例は、ＮＣＢＩアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０００２３０．２で寄託された配列である。
【００６８】
レプチンをコードするヌクレオチド配列の例は：
ATGCATTGGGGAACCCTGTGCGGATTCTTGTGGCTTTGGCCCTATCTTTTCTATGTCCAAGCTGTGCCCATCCAAAAAGTCCAAGATGACACCAAAACCCTCATCAAGACAATTGTCACCAGGATCAATGACATTTCACACACGCAGTCAGTCTCCTCCAAACAGAAAGTCACCGGTTTGGACTTCATTCCTGGGCTCCACCCCATCCTGACCTTATCCAAGATGGACCAGACACTGGCAGTCTACCAACAGATCCTCACCAGTATGCCTTCCAGAAACGTGATCCAAATATCCAACGACCTGGAGAACCTCCGGGATCTTCTTCACGTGCTGGCCTTCTCTAAGAGCTGCCACTTGCCCTGGGCCAGTGGCCTGGAGACCTTGGACAGCCTGGGGGGTGTCCTGGAAGCTTCAGGCTACTCCACAGAGGTGGTGGCCCTGAGCAGGCTGCAGGGGTCTCTGCAGGACATGCTGTGGCAGCTGGACCTCAGCCCTGGGTGCTGA（配列番号６）である。
【００６９】
レプチンアミノ酸配列は、分泌シグナル配列を含み得る。このようなシグナル配列は、分泌プロセス中に切断され得るため、タンパク質は、シグナル配列を欠く成熟形態で天然に存在し得る。当業者は、適切な生命情報科学的及び分子生物学的技術を使用して、このようなシグナル配列を容易に決定することができる。例えば、配列番号５の残基１〜２１は、シグナル配列として作用し得る。
【００７０】
減量及び体重維持
本明細書で使用される場合、用語「減量」は、体重（例えば、キログラム）、体格指数（ｋｇ／ｍ２）、ウェスト・ヒップ比（例えば、センチメートル）、体脂肪量（例えば、キログラム）、腰周囲（例えば、センチメートル）、又は腹囲（例えば、センチメートル）などのパラメータの減少を意味し得る。
【００７１】
減量は、介入（例えば、食事療法及び／又は運動療法）の開始時のパラメータの値から介入の終了時の上述のパラメータのうちの１つ以上の値を差し引くことによって計算され得る。
【００７２】
減量度は、上述の体重の表現型パラメータ（例えば、対象の体重（例えば、キログラム）又は体格指数（ｋ／ｇｍ２）における変化率）のうちの１つの変化率として表現され得る。例えば、対象は、その初期体重の少なくとも１０％、その初期体重の少なくとも８％、又はその初期体重の少なくとも５％を減じ得る。単に一例として、対象は、その初期体重の５〜１０％を減少させ得る。
【００７３】
一実施形態では、初期体重の少なくとも１０％の減量は、肥満関連の併存症のリスクの大幅な低下をもたらす。
【００７４】
本明細書で使用される場合、用語「体重維持」は、体重（例えば、キログラム）、体格指数（ｋｇ／ｍ２）、ウェスト・ヒップ比（例えば、センチメートル）、体脂肪量（例えば、キログラム）、腰周囲（例えば、センチメートル）、又は腹囲（例えば、センチメートル）などのパラメータにおける維持を意味し得る。体重維持は、例えば、介入（例えば、食事療法及び／又は運動療法）後に減量体重を維持することを意味し得る。
【００７５】
体重維持度は、ある期間にわたって上述のパラメータのうちの１つ以上の変化を測定することによって計算され得る。期間は、例えば、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０週であり得る。
【００７６】
本発明の作用物質によって支援される体重維持は、例えば、ある期間にわたって上述のパラメータのうちの１つ以上において、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％未満の変化（例えば、増加）をもたらし得る。
【００７７】
体重維持度は、減量達成後の期間中の再増加した体重として表すことができ、例えば、減量達成中の減量のパーセンテージとして表すことができる。
【００７８】
本発明の作用物質によって支援される体重維持は、作用物質の投与後の対象の食欲の抑制によってもたらされ得る。したがって、対象は、本発明の作用物質の非存在下での食欲と比較して、食欲が低減され得る。
【００７９】
本発明の作用物質によって支援される体重維持は、作用物質の投与後の対象の食欲の制御によってもたらされ得る。したがって、対象は、その食欲に対する制御を維持することができ、したがって、例えば減量介入の期間後に、その体重を維持することができる。
【００８０】
特に、本発明の作用物質は、減量介入（例えば、食事又は運動療法）の期間中及び／又は後に、食欲抑制又は制御により体重維持を支援し得る。
【００８１】
一態様では、本発明は、例えば減量期間後に、健康な身体組成を維持するための、本発明の作用物質の非治療的使用を提供する。
【００８２】
肥満
本明細書で使用する場合、用語「過体重」は、成人のヒトに関して、体格指数（ＢＭＩ）が２５〜３０であるものとして定義される。
【００８３】
本明細書で使用する場合、用語「体格指数」は、体重のｋｇ値を身長のメートル値の二乗で除算した比率を意味する。
【００８４】
本明細書で使用する場合、用語「肥満」は、動物、特にヒト及び他の哺乳類の脂肪組織に蓄えられた自然エネルギーが、一定の健康状態又は死亡率の増加に関係する点まで増加した状態を意味する。本明細書で使用する場合、用語「肥満の」は、成人のヒトに関して、３０を超えるＢＭＩを有するものとして定義される。
【００８５】
本明細書で使用する場合、用語「正常体重」は、成人のヒトに関して、１８．５〜２５のＢＭＩを有するものとして定義されるが、本明細書で使用する場合、用語「低体重」は、１８．５未満のＢＭＩとして定義され得る。
【００８６】
肥満は、世界中の多くの地域で流行の域に達している慢性的な代謝疾患であり、２型糖尿病、循環器疾患、脂質代謝異常、及びある種のがんなどといった深刻な併存症の主要なリスク因子である（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎ．Ｔｅｃｈ．Ｒｅｐ．Ｓｅｒ（２０００）８９４：ｉ−ｘｉｉ、１〜２５３）。
【００８７】
本明細書で使用する場合、用語「肥満関連疾患」は、肥満個体が発症するリスクが高い任意の状態を意味する。肥満関連疾患としては、糖尿病（例えば、２型糖尿病）、脳卒中、高コレステロール、心血管疾患、インスリン抵抗性、冠動脈心疾患、メタボリックシンドローム、高血圧及び脂肪肝が挙げられる。
【００８８】
スクリーニング方法
本発明は、ＦＡＭ４６Ａの活性を低下させることが可能な作用物質を提供し、加えて、このような作用物質を同定するための方法を提供する。
【００８９】
本発明の作用物質は、定性的又は定量的結果のいずれかを提供する方法によって同定され得る。更に、このような方法を使用して、特性評価に加え本発明の作用物質を同定することができる。
【００９０】
候補となる作用物質は、対象となる可能性のある任意の作用物質、例えばペプチド、ポリペプチド（例えば抗体）、核酸、又は小分子であり得る。好ましくは、候補となる作用物質は、治療目的に関し可能性がある化合物又は混合物である。好ましくは、候補となる作用物質は、哺乳動物、特にヒトにとって低毒性のものである。いくつかの実施形態では、候補となる作用物質は、植物又は動物抽出物などの天然化合物又は化合物の混合物を含む栄養剤及び／又は食品成分を含み得る。
【００９１】
候補となる作用物質は、作用物質のライブラリ、例えば、コンビナトリアル化学により作製されるライブラリ又はファージディスプレイライブラリの一部を形成し得る。一実施形態では、候補となる作用物質は、植物生理活性分子のライブラリの一部を形成する。
【００９２】
ＦＡＭ４６Ａ活性
タンパク質、例えば酵素の活性を低下させるための候補となる作用物質の能力は、ＩＣ５０値で表すことができる。ＩＣ５０は、タンパク質の活性を５０％低下（例えば、酵素活性を５０％低下）させるのに必要とされる作用物質の濃度である。ＩＣ５０値の計算は、当該技術分野において周知である。
【００９３】
好ましくは、本発明の作用物質は、ＦＡＭ４６Ａの阻害について、１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満、例えば１μＭ未満、１００ｎＭ未満、又は１０ｎＭ未満のＩＣ５０値を有する。
【００９４】
ＦＡＭ４６Ａ活性を測定するための技術は、細胞から単離されたＦＡＭ４６Ａに適用することができる。組換え技術を用いて、ＦＡＭ４６Ａを発現させてもよい。好ましくは、ＦＡＭ４６Ａは精製されている。
【００９５】
一実施形態では、ＦＡＭ４６Ａ活性は、レプチンレベルの調節を決定することによって測定される。
【００９６】
ＦＡＭ４６Ａの結合
本発明はまた、ＦＡＭ４６Ａに結合することができ、あるいは、又はそれに加えて、このような結合を特徴とする作用物質を同定する方法も提供する。例えば、方法は、絶対若しくは相対結合親和性、並びに／又は結合のエンタルピー及びエントロピーの測定を可能にし得る。結合親和性は、平衡解離（Ｋｄ）定数又は会合（Ｋａ）定数で表すことができる。
【００９７】
候補となる作用物質とタンパク質との間の結合を同定するための、多くのアッセイ法が当該技術分野において既知である。使用されるアッセイ法は、好ましくは、候補となる作用物質の自動化及び／又はハイスループットスクリーニングに適したものである。アッセイは、マイクロタイタープレート、マイクロビーズ、樹脂、又は同様のものなどの使い捨て固体支持体上で実施され得る。
【００９８】
例えば、固体支持体、例えば、マイクロビーズ、樹脂、マイクロタイタープレート、又はアレイ上に標的ＦＡＭ４６Ａを固定できる。次いで、候補となる作用物質を固定化された標的タンパク質と接触させてもよい。任意に、洗浄手順を適用して、弱結合剤又は非特異的結合剤を除去してもよい。次いで、標的タンパク質に結合する任意の作用物質を検出し、同定することができる。結合剤の検出を容易にするために、候補となる作用物質は、容易に検出可能なマーカーで標識され得る。マーカーは、例えば、放射性標識、酵素標識、抗体標識、蛍光標識、粒子（例えば、ラテックス又は金）標識、又は同様のものを含み得る。
【００９９】
あるいは、上記の手順を逆転させてもよく、候補となる作用物質を固定してもよく、標的ＦＡＭ４６Ａを上記固定化剤と接触させてもよい。任意に、洗浄手順を適用して、弱く結合した標的タンパク質又は非特異的に結合した標的タンパク質を除去してもよい。次いで、ＦＡＭ４６Ａが結合する任意の作用物質を検出し、同定することができる。結合の検出を容易にするために、ＦＡＭ４６Ａは、上記のように容易に検出可能なマーカーで標識されてもよい。
【０１００】
上記のアッセイに加えて、他の好適なアッセイ法が当該技術分野において既知である。このような手法の例としては、放射アッセイ、蛍光アッセイ、ＥＬＩＳＡ、蛍光偏光、蛍光異方性、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などが挙げられる。これらのアッセイは、ＦＡＭ４６Ａに結合する作用物質を同定するために適用され得る。実際、これらの手法の多くを自動化するためのプラットフォームは、ハイスループットスクリーニングを容易にするために当該技術分野において広く知られている。
【０１０１】
２つ以上のアッセイ法を使用して候補となる作用物質のＦＡＭ４６Ａに対する結合について詳細な理解を提供することができる。例えば、定性的結合情報を提供するアッセイは、本方法における第１ステップとして使用することができ、続いて、定量的結合データ及び／又は標的タンパク質の活性に対する効果についてのデータを提供するために、異なる技術を使用して更なるアッセイを行うことができる。
【０１０２】
競合結合試験を実施するために、上記のアッセイ法を適用してもよい。例えば、これらの手法は、候補となる作用物質の存在下で、タンパク質の基質又は補因子への結合を分析するのに同様に好適である。したがって、タンパク質とその基質又は補因子との間の結合を調節し、これによりタンパク質の活性に影響を及ぼす作用物質をスクリーニング及び同定するために、上記手法を使用することが可能である。
【０１０３】
好ましくは、本発明の作用物質は、高い親和性で結合するであろう。例えば、本発明の作用物質は、１００μＭ未満、より好ましくは１０μＭ未満、例えば１μＭ未満、１００ｎＭ未満、又は１０ｎＭ未満のＫｄでＦＡＭ４６Ａに結合する。
【０１０４】
結合親和性は、当該技術分野において既知の標準的な手法、例えば、表面プラズモン共鳴、ＥＬＩＳＡなど（例えば上記のような）を使用して測定することができ、解離（Ｋｄ）定数又は会合（Ｋａ）定数のいずれかで定量化することができる。
【０１０５】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ構造誘導スクリーニングなどのバイオインフォマティクスに基づくアプローチもまた、本発明の作用物質を同定するために使用され得る。
【０１０６】
ＦＡＭ４６Ａレベル
本発明は、ＦＡＭ４６Ａレベルを減少させるための作用物質を提供する。ＦＡＭ４６Ａのレベルは、細胞又は生物におけるタンパク質の発現レベルと同等であり得る。タンパク質レベルは、例えば、タンパク質をコードするｍＲＮＡのレベルの分析によって、直接又は間接的に分析され得る。
【０１０７】
ＦＡＭ４６Ａの発現を分析するための方法は、タンパク質のレベルに対する、候補となる作用物質の効果をスクリーニングするために、本発明で使用され得る。
【０１０８】
タンパク質の発現レベルを決定するための多くの手法が当該技術分野において既知である。これらの手法を適用して、ＦＡＭ４６Ａの発現レベルに対する、候補となる作用物質の効果を試験してもよい。使用される手法は、好ましくは、候補となる作用物質の自動化及び／又はハイスループットスクリーニングに適したものである。
【０１０９】
例えば、レポーター部分に操作可能に連結されたＦＡＭ４６Ａをコードするポリヌクレオチドを保有する細胞を使用して、スクリーニングを実施してもよい。レポーター部分は、内在的なＦＡＭ４６Ａコード遺伝子に操作可能に連結されてもよい。あるいは、レポーター部分に操作可能に連結されたＦＡＭ４６Ａの外来性コピーを細胞に挿入してもよい。この実施形態では、天然のＦＡＭ４６Ａ発現について欠損するように細胞を遺伝子操作することができる。好適なレポーター部分としては、蛍光標識、例えば、緑、黄、チェリー、シアン、又はオレンジ蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質が挙げられる。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、用語「操作可能に連結された」は、記載される構成要素が、意図された様式での機能を可能にする関係にあることを意味する。
【０１１１】
このような細胞は、候補となる作用物質と接触させることができ、ＦＡＭ４６Ａの発現レベルは、細胞におけるレポーター部分の発現レベルを分析することによって監視され得る。蛍光レポーター部分は、当該技術分野において既知の多くの手法、例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及び蛍光顕微鏡法によって分析することができる。ＦＡＭ４６Ａの発現レベルは、候補となる作用物質との接触前後で比較することができる。あるいは、ＦＡＭ４６Ａの発現レベルは、候補となる作用物質と接触した細胞と対照細胞との間で比較され得る。
【０１１２】
タンパク質、例えばＦＡＭ４６Ａの発現を分析するために、他の方法を使用してもよい。タンパク質発現は、直接分析され得る。例えば、発現は、クマシー染色又は銀染色による可視化を伴うＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析などの方法を使用して定量的に分析することができる。あるいは、発現は、タンパク質生成物に結合する抗体プローブによるウエスタンブロット法又は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いて、定量的に分析することができる。上記のように、レポーター部分で標識されたＦＡＭ４６Ａもまた、これらの方法で使用することができる。あるいは、タンパク質発現は、例えば、細胞内で転写されるタンパク質に対応するｍＲＮＡの量を研究することによって間接的に分析されてもよい。これは、定量的逆転写ＰＣＲ及びノーザンブロットなどの方法を使用して達成することができる。
【０１１３】
同様の手法を、レプチンタンパク質発現の分析に使用することができる。
【０１１４】
作用物質
本発明は、ＦＡＭ４６Ａの活性を低下させることが可能な作用物質を提供し、加えて、このような作用物質を同定するための方法を提供する。
【０１１５】
本発明の作用物質は、例えば、ペプチド、ポリペプチド（例えば抗体）、核酸（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びアンチセンスＲＮＡ）又は小分子であり得る。好ましくは、作用物質は、哺乳動物、特にヒトにとって低毒性である。いくつかの実施形態では、作用物質は、植物又は動物抽出物などの天然化合物又は化合物の混合物を含む栄養剤及び／又は食品成分を含んでもよい。
【０１１６】
ＦＡＭ４６Ａの活性に影響を及ぼす例示的な作用物質としては、表１に記載の作用物質が挙げられる。
【表１】
2020510611.tif 000002
【０１１７】
一実施形態では、作用物質はアセトアミノフェンである。一実施形態では、作用物質はクロフィブラートである。一実施形態では、作用物質はクプリゾンである。一実施形態では、作用物質はシタラビンである。一実施形態では、作用物質は、ジブチルフタレートである。一実施形態では、作用物質は、ジエチルマレエートである。一実施形態では、作用物質は、ジエチルニトロサミンである。一実施形態では、作用物質は、ジウロンである。一実施形態では、作用物質は、エンチノスタットである。一実施形態では、作用物質は、フィプロニルである。一実施形態では、作用物質は、過酸化水素である。一実施形態では、作用物質は、レフルノミドである。一実施形態では、作用物質は、ネファゾドンである。一実施形態では、作用物質は、ピリニクス酸である。一実施形態では、作用物質は、トレチノインである。一実施形態では、作用物質は、トリコスタチンＡである。一実施形態では、作用物質は、バルプロ酸である。一実施形態では、作用物質は、ビンクロゾリンである。
【０１１８】
一実施形態では、作用物質は、一般に安全であるとみなされる（ＧＲＡＳ）。
【０１１９】
一実施形態では、作用物質は、経口投与される場合、５０％以上の生物学的利用能を有する。
【０１２０】
本発明による使用のための作用物質は、例えば、塩又はエステル、特に薬剤として許容される塩又はエステルとして存在し得る。
【０１２１】
ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡ
ＦＡＭ４６Ａの発現は、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）を用いて調節することができる。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって介在される転写後遺伝子サイレンシングは、外来遺伝子の発現を制御するための、保存された細胞防御機構である。トランスポゾン又はウイルスなどの因子のランダムな組み込みは、相同一本鎖ｍＲＮＡ又はウイルスゲノムＲＮＡの配列特異的な分解を活性化するｄｓＲＮＡの発現を引き起こすと考えられる。サイレンシング効果は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られている（Ｒａｌｐｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１：４２９〜４３３）。ＲＮＡｉの機序は、長いｄｓＲＮＡを約２１〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）のＲＮＡ二本鎖にプロセシングすることを含む。これらの産物は、ｍＲＮＡの分解の配列特異的メディエータである、低干渉又はサイレンシングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。分化した哺乳類細胞において、３０ｂｐより長いｄｓＲＮＡは、タンパク質合成の停止及び非特異的ｍＲＮＡ分解をもたらすインターフェロン応答を活性化することが見出されている（Ｓｔａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６７：２２７〜６４）。しかしながら、この応答は、２１ｎｔのｓｉＲＮＡ二本鎖を使用することによって回避することができ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：６８７７〜８８；Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：８３４〜８）、培養哺乳動物細胞での遺伝子機能分析を可能にする。
【０１２２】
ｓｈＲＮＡは、小さなループ配列によって隔てられた短い逆位反復ＲＮＡからなる。これらは、細胞機構によって１９〜２２ｎｔ  ｓｉＲＮＡに迅速にプロセシングされ、それによって標的遺伝子発現が抑制される。
【０１２３】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、それらの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に結合することにより、標的ｍＲＮＡの翻訳を効果的に減少させることができる小さな（長さ２２〜２５ヌクレオチドの）ノンコーディングＲＮＡである。マイクロＲＮＡは、生物において天然に産生される小さなＲＮＡの非常に大きな群であり、そのうちの少なくともいくつかは標的遺伝子の発現を調節する。マイクロＲＮＡ系統群の基礎構成要素は、ｌｅｔ−７及びｌｉｎ−４である。ｌｅｔ−７遺伝子は、虫の成長の間、内在的なタンパク質コード遺伝子の発現を調節する、小さな高度に保存されたＲＮＡ種をコードする。活性のあるＲＮＡ種は、まず約７０ｎｔの前駆体として転写され、この前駆体は、約２１ｎｔの成熟型へと転写後にプロセシングされる。ｌｅｔ−７及びｌｉｎ−４はいずれも、Ｄｉｃｅｒ酵素によってそれらの成熟型にプロセシングされるヘアピンＲＮＡ前駆体として転写される。
【０１２４】
アンチセンスの概念は、細胞内でメッセンジャーＲＮＡに、短くて、場合によっては修飾されたＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子を選択的に結合させ、かかるメッセンジャーＲＮＡにコードされるタンパク質の合成を防止するというものである。
【０１２５】
標的タンパク質の発現を調節するためのｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ及びアンチセンスＤＮＡ／ＲＮＡの設計方法、並びにこれらの作用物質を対象となる細胞に送達する方法は、当該技術分野において周知である。更に、例えば組織特異的プロモータを使用することによって、生物中の特定の細胞型におけるタンパク質の発現を特異的に調節する（例えば、低下させる）ための方法が、当該技術分野において周知である。
【０１２６】
抗体
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、選択された標的に結合することができる完全な抗体又は抗体断片を意味し、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）及びＦ（ａｂ’）２、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体、キメラ抗体、ＣＤＲグラフト化抗体及びヒト化抗体を含む改変抗体、並びにファージディスプレイ又は代替技術を用いて産生される人工的に選択された抗体が挙げられる。
【０１２７】
加えて、本発明ではまた、典型的な抗体の代替物、例えば、「アビボディ」、「アビマー」、「アンチカリン」、「ナノボディ」、及び「ＤＡＲＰｉｎ」も使用され得る。
【０１２８】
抗体の製造方法は、当業者に既知である。あるいは、抗体は、民間の供給元に由来するものでもよい。
【０１２９】
ポリクローナル抗体が所望される場合、選択された哺乳動物（例えば、マウス、ウサギ、ヤギ、又はウマ）は免疫され得る。既知の手順に従って、免疫動物から血清を回収し、処理してもよい。血清が他の抗原に対するポリクローナル抗体を含有する場合、ポリクローナル抗体は、免疫親和性クロマトグラフィによって精製され得る。ポリクローナル抗血清を製造及びプロセシングするための手法は、当該技術分野において既知である。
【０１３０】
本発明で使用される抗原（例えば、タンパク質）に対するモノクローナル抗体は、当業者によって容易に産生され得る。ハイブリドーマによりモノクローナル抗体を作製するための一般的な方法は周知である。不死化抗体産生細胞株は、細胞融合によって、また、腫瘍形成性のＤＮＡによるＢリンパ球の直接形質転換、又はエプスタインバーウイルスによるトランスフェクションなどの他の手法によって作製することができる。抗原に対して産生されるモノクローナル抗体の集団は、様々な特性、例えば、アイソタイプ及びエピトープ親和性についてスクリーニングすることができる。
【０１３１】
代替的な手法は、例えば、ファージがそのコートの表面上に、多種多様な相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するｓｃＦｖ断片を発現する、ファージディスプレイのライブラリをスクリーニングすることを含む。この手法は、当該技術分野において周知である。
【０１３２】
抗原に対するモノクローナル及びポリクローナルいずれの抗体も、診断において特に有用であり、中和抗体は、受動性免疫療法において有用である。モノクローナル抗体は、特に、抗イディオタイプ抗体を産生するために使用され得る。抗イディオタイプ抗体は、それに対する防御が所望される感染因子である抗原の「インターナルイメージ（intenal image）」を有する免疫グロブリンである。
【０１３３】
抗イディオタイプ抗体を産生するための手法は、当該技術分野において既知である。これらの抗イディオタイプ抗体はまた、抗原の免疫病原性領域の解明に加えて、治療に有用であり得る。
【０１３４】
ポリペプチド及びポリヌクレオチドの細胞への導入
本発明で使用するための作用物質は、例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチドであり得る。ポリヌクレオチド及びポリペプチドはまた、本発明の方法又はスクリーニングアッセイの一部として細胞内へ導入することが必要な場合がある。
【０１３５】
本発明がポリペプチドを使用する場合、細胞に直接ポリペプチドが投与され得る（例えば、ポリペプチド自体が投与され得る）か、又は対象とする細胞におけるポリペプチドの発現を可能にする条件下で、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを細胞に導入することによって、ポリペプチドが投与され得る。ポリヌクレオチドは、ベクターを使用して細胞に導入され得る。
【０１３６】
ベクターは、ある環境から別の環境への対象物の移動を可能にする又は容易にするツールである。本発明によれば、及び一例として、組換え核酸法で使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（例えば、異種ｃＤＮＡセグメントなどの異種ＤＮＡセグメント）などの対象物を標的細胞に移動させることができる。ベクターは、細胞内で異種核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を維持するか、核酸断片を含むベクターの複製を促進するか、又は核酸断片によってコードされるタンパク質の発現を促進する目的を果たし得る。ベクターは、非ウイルス又はウイルスであってもよい。組換え核酸法で使用されるベクターの例としては、プラスミド、染色体、人工染色体及びウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、例えば、ネイキッド（ｎａｋｅｄ）核酸（例えば、ＤＮＡ）であってもよい。最も単純な形態では、ベクター自体は、目的のヌクレオチドであってもよい。
【０１３７】
本発明で使用されるベクターは、例えば、プラスミド又はウイルスベクターであり得、ポリヌクレオチドの発現のためのプロモータ、及び任意にプロモータのレギュレータを含み得る。
【０１３８】
本発明で使用されるポリヌクレオチドを含むベクターは、形質導入及びトランスフェクションなど、当該技術分野において既知の様々な手法を使用して細胞に導入することができる。例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、バキュロウイルス、及び単純ヘルペスウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターを用いた感染；核酸の直接注入、並びに遺伝子銃による形質転換など、この目的に好適ないくつかの手法が、当該技術分野で既知である。非ウイルス送達系としては、ＤＮＡトランスフェクション法が挙げられるが、これに限定されない。トランスフェクションは、非ウイルスベクターを使用して標的細胞に遺伝子を送達するプロセスを含む。
【０１３９】
ポリペプチド又はポリヌクレオチドの移動は、物理的又は化学的に細胞膜を透過させ得る当該技術分野において既知の方法のいずれかによって実施され得る。ポリペプチドを細胞に移動させるために、細胞膜透過ペプチドも使用され得る。
【０１４０】
加えて、本発明は、遺伝子ターゲティングプロトコル、例えば、ＤＮＡ修飾剤の送達を用いてもよい。
【０１４１】
ベクターは、発現ベクターであり得る。本明細書に記載される発現ベクターは、転写可能な配列を含有する核酸領域を含む。したがって、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及びｒＲＮＡをコードする配列が、この定義に含まれる。
【０１４２】
発現ベクターは、好ましくは、宿主細胞によるコーディング配列の発現をもたらすことが可能な制御配列に操作可能に連結された、本発明で使用するためのポリヌクレオチドを含む。コーディング配列に「操作可能に連結される」調節配列は、制御配列に適した条件下でコーディング配列の発現が達成されるように連結される。例えば、制御配列によって指示される転写レベルについて転写調節因子への応答性をより高める更なる転写調節因子を添加することによって、制御配列が修飾されてもよい。
【０１４３】
ポリヌクレオチド
【０１４４】
本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。これらは、一本鎖又は二本鎖であり得る。数多くの異なるポリヌクレオチドは、遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードすることができることが、当業者には理解されるであろう。加えて、本発明のポリペプチドが発現される任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映するように、常法を用いて、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を与えないヌクレオチドの置換をすることが、当業者に可能であることが理解されるべきである。
【０１４５】
ポリヌクレオチドは、当該技術分野において利用可能な任意の方法によって修飾され得る。このような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性又は寿命を向上させるために実施され得る。
【０１４６】
ＤＮＡポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、組換えにより、合成により、又は当業者に利用可能な任意の手段によって産生され得る。これらはまた、標準的な技術によってクローン化され得る。
【０１４７】
より長いポリヌクレオチドは、一般的に、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）クローニング技術を用いて、組換え手段を使用して産生される。これは、クローン化しようとする標的配列に隣接する一対のプライマー（例えば、約１５〜３０ヌクレオチド）を作製することと、プライマーをｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ、例えば、動物又はヒト細胞から得られるｍＲＮＡ又はｃＤＮＡと接触させることと、所望の領域の増幅をもたらす条件下でポリメラーゼ連鎖反応を実施することと、（例えば、アガロースゲルで反応混合物を精製することによって）増幅された断片を単離することと、増幅されたＤＮＡを回収することと、を含む。プライマーは、増幅されたＤＮＡを好適なベクターにクローン化することができるように、好適な制限酵素認識部位を含有するように設計することができる。
【０１４８】
タンパク質
本明細書で使用する場合、用語「タンパク質」は、単鎖ポリペプチド分子、加えて個々の構成ポリペプチドが共有結合又は非共有結合手段によって連結される複数のポリペプチド（multiple-polypeptide）の複合体を含む。本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、モノマーがアミノ酸であり、ペプチド結合又はジスルフィド結合を介してともに連結したポリマーを意味する。
【０１４９】
多様体、誘導体、類似物、相同体、及び断片
本明細書で言及される特定のタンパク質及びヌクレオチドに加えて、本発明は、多様体、誘導体、類似物、相同体、及びこれらの断片を包含する。
【０１５０】
本発明の文脈において、任意の所与の配列の変異体は、対象とするポリペプチド又はポリヌクレオチドが、その内在的な機能のうちの少なくとも１つを保持するような方法で、特定配列の残基（アミノ酸残基又は核酸残基のいずれか）が修飾された配列である。変異体配列は、天然ポリペプチド又はポリヌクレオチド中に存在する少なくとも１つの残基の付加、欠失、置換、修飾、交換、及び／又は変異によって得ることができる。
【０１５１】
本明細書で使用する場合、本発明のタンパク質又はポリペプチドに関し、用語「誘導体」は、得られたタンパク質又はポリペプチドがその内在的な機能のうちの少なくとも１つを保持するのであれば、配列から又は配列への１つ（又は１つ以上の）アミノ酸残基の任意の置換、変異、修飾、置き換え、欠失及び／又は付加を含む。
【０１５２】
本明細書で使用する場合、ポリペプチド又はポリヌクレオチドに関し、用語「類似物」は、任意の模倣物質を、すなわち、模倣するポリペプチド又はポリヌクレオチドの内在的な機能のうちの少なくとも１つを有する化学化合物を含む。
【０１５３】
典型的には、修飾配列が必要な活性又は能力を保持するのであれば、アミノ酸置換は、例えば、１、２、又は３〜１０、又は２０個の置換が行われてもよい。アミノ酸置換は、非天然に生じる類似物の使用を含み得る。
【０１５４】
本発明で使用されるタンパク質は、サイレントな変化をもたらし、結果として機能的に等価なタンパク質が得られる、アミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換も含み得る。内在的な機能が保有されるという条件で、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性における類似性をもとに、計画的なアミノ酸置換がなされ得る。例えば、負に帯電したアミノ酸としてはアスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられ、正に帯電したアミノ酸としてはリジン及びアルギニンが挙げられ、並びに帯電しておらず同様の親水性値をもつ極性頭部を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、及びチロシンが挙げられる。
【０１５５】
保存的置換は、例えば、下表によりなされ得る。第２欄の同じブロックにおけるアミノ酸、及び好ましくは第３欄の同じ行内にあるアミノ酸は、互いに置換され得る。
【表２】
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【０１５６】
本明細書で使用する場合、用語「相同体」は、野生型アミノ酸配列又は野生型ヌクレオチド配列と特定の相同性を有する対象物を意味する。用語「相同性」は、「同一性」と同一視可能である。
【０１５７】
本文脈において、相同配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、又は９７％、又は９９％同一であり得るアミノ酸配列を含むものとみなされる。典型的には、相同体は、対象とするアミノ酸配列と同じ活性部位等を含み得る。相同性は、類似性（すなわち、類似する化学的特性／機能を有するアミノ酸残基）の観点で考慮することもできるが、本発明の文脈では、相同性を配列同一性の観点で表現することが好ましい。
【０１５８】
本文脈において、相同配列は、対象配列と少なくとも５０％、５５％、６５％、７５％、８５％又は９０％同一、好ましくは少なくとも９５％、又は９７％、又は９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含むものとみなされる。相同性は、類似性の観点で考慮することもできるが、本発明の文脈では、相同性を配列同一性の観点で表現することが好ましい。
【０１５９】
好ましくは、本明細書に記載の配列番号のうちのいずれか１つに対しある程度の同一性（％）を有する配列についての言及は、参照する配列番号の全長に対し記載の同一性（％）を有する配列を指すものである。
【０１６０】
相同性比較は、目で行うこともでき、又はより一般的には、容易に利用できる配列比較プログラムを使用して実施できる。これらの市販のコンピュータプログラムにより、２つ以上の配列間の相同性（％）又は同一性（％）を計算することができる。
【０１６１】
相同性パーセントは、連続的な配列にわたって計算することができる。すなわち、一方の配列を他方の配列とアラインメントし、一方の配列中の各々のアミノ酸又はヌクレオチドを他方の配列中の対応するアミノ酸又はヌクレオチドと一度に１残基ずつ直接比較する。これは、「ギャップなし」アラインメントと呼ばれている。典型的には、こうしたギャップなしアラインメントは、比較的短い残基数に対してのみ行われる。
【０１６２】
これは、非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、アミノ酸又はヌクレオチド配列の１つの挿入又は欠失以外は同一の配列のペアにおいて、後続する残基又はコドンがアラインメントから外れる場合があることを考慮していないため、グローバルアラインメントを実施する場合に、相同性パーセントが大きく減少する可能性がある。そのため、殆どの配列比較法は、全体的な相同性スコアに過度にペナルティを適用することなく、考えられる挿入及び欠失を考慮に入れた最適アラインメントを生成するように設計されている。これは、局所相同性を最大にするように、配列アラインメント中に「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１６３】
しかしながら、これらのより複雑な方法は、同数の同一のアミノ酸又はヌクレオチドに対して、２つの比較配列間の関係性がより高いことを反映している可能な限り少ないギャップを有する配列アラインメントが、多数のギャップを有する配列アラインメントよりも高いスコアを達成するように、アラインメント中に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てている。典型的に、ギャップの存在には比較的高いコストを課し、ギャップ中の後続するそれぞれの残基には小さなペナルティを課す、「アフィンギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。当然のことながら、高いギャップペナルティが、ギャップのより少ない最適化アラインメントを生成する。殆どのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティを変更することができる。しかしながら、配列比較のためにこのようなソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を用いるのが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを用いる場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは、ギャップについては−１２であり、各伸長については−４である。
【０１６４】
したがって、最大相同性（％）の算出には、まず、ギャップペナルティを考慮した最適アラインメントの生成が必要である。このようなアラインメントを実施するのに好適なコンピュータプログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージである（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２：３８７）。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同書１８章参照）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３〜４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳ式の比較ツールが挙げられるが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡとは２つともオフライン及びオンライン検索が利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同書７−５８〜７−６０頁参照）。しかしながら、いくつかの用途については、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用するのが好ましい。ＢＬＡＳＴ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと称する別のツールもまた、タンパク質とヌクレオチド配列との比較に使用できる（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７４（２）：２４７〜５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７７（１）：１８７〜８参照）。
【０１６５】
最終的な相同性（％）を同一性の点から測定することができるが、アラインメントプロセスそのものは、典型的には、イエスかノーかのペア比較に基づいていない。むしろ、化学的類似性又は進化距離に基づいて、各々のペアワイズ比較にスコアを割り当てる、スケール化類似性スコア行列が通常使用される。一般的に使用されるこのような行列の例は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（ＢＬＡＳＴ式プログラムのデフォルト行列）である。ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、通常、パブリックデフォルト値か、又は提供される場合はカスタムシンボル比較表かのいずれかを使用する（更なる詳細についてはユーザマニュアル参照）。いくつかの用途については、ＧＣＧパッケージ用のパブリックデフォルト値を用いるか、他のソフトウェアの場合、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルト行列を使用するのが好ましい。
【０１６６】
ソフトウェアにより最適アラインメントが生成されたら、相同性（％）、好ましくは配列同一性（％）を算出することができる。典型的に、ソフトウェアは、配列比較の一部としてこれを行い、数値による結果を生成する。
【０１６７】
「断片」はまた、多様体であり、その用語は、典型的には、機能的に又は例えばアッセイにおいてのいずれかで対象となるポリペプチド又はポリヌクレオチドの選択された領域を意味する。したがって、「断片」は、完全長のポリペプチド又はポリヌクレオチドの一部分であるアミノ酸配列又は核酸配列を指す。
【０１６８】
このような多様体は、部位特異的変異導入などの標準的な組換えＤＮＡ法を用い調製され得る。挿入がなされる場合、挿入部位のいずれかの側の天然に生じる配列に相当する５’及び３’隣接領域と合わせて挿入部位をコードしている、合成ＤＮＡが作製され得る。隣接領域は、適切な酵素（複数可）により配列が切断されて、合成ＤＮＡが切断部分にライゲートされ得るよう、天然に生じる配列中の部位に相当する簡便な制限部位を含有し得る。次に、このＤＮＡを本発明により発現させて、コードされているタンパク質を作製する。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作について当該技術分野で既知の数多くの標準法について単に例示するものであり、その他の既知の手法も使用され得る。
【０１６９】
コドン最適化
本発明で使用されるポリヌクレオチドは、コドンの最適化がなされ得る。コドン最適化は、国際公開第１９９９／４１３９７号及び同第２００１／７９５１８号に既に記載されている。異なる細胞は、特定のコドンの使用で相違がある。このコドンバイアスは、その細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量におけるバイアスに対応している。対応するｔＲＮＡの相対的存在量と一致するように調整されるように、配列中のコドンを変更することにより、発現を増加させることが可能である。同様に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型で稀であることがわかっているコドンを意図的に選択することによって発現を低下させることが可能である。このように、追加的な転写度合いの制御が可能である。哺乳動物の細胞のコドン使用表は、他の多様な生物と同様に当業者に知られている。
【０１７０】
処置方法
治療についての本明細書の全基準は、治癒的、緩和的、予防的治療を含む。哺乳類、特にヒトの治療が好ましい。ヒト及び動物治療の両方が、本発明の範囲内である。
【０１７１】
投与
本発明で使用される作用物質は単独で投与され得るが、特にヒトの治療法において、それらは一般的には医薬担体、賦形剤又は希釈剤との混合物で投与されるであろう。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、作用物質は栄養剤、食品添加物、又は食品成分であり、したがって好適な食品組成物に配合され得る。そのため、作用物質は、例えば食料品、飲料、栄養補助食品、機能性食品、栄養配合物又はペットフード製品の形態で投与され得る。
【０１７３】
投与量
当業者は、本発明の作用物質について、過度の実験を行うことなしに、対象への投与のための適切な投与量を容易に決定することができる。典型的には、医師が個々の患者に最も好適な実際の投与量を決定し、その投与量は、用いる特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用期間、齢、体重、健康状態、性別、食事、投与の方法及び時期、排泄率、併用する薬剤、特定の状態についての重症度、並びに個々に受けている治療を含む様々な要因によるであろう。当然ではあるが、より高い又はより低い投与量範囲が優れている個別の場合があり得、そのような場合は本発明の範囲内にある。
【０１７４】
対象
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒト又は非ヒト動物のいずれかを意味する。
【０１７５】
非ヒト動物の例としては、脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、イヌ、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、又はモルモット）、ブタ及びネコなどの哺乳類が挙げられる。非ヒト動物は、コンパニオンアニマルであってもよい。
【０１７６】
好ましくは、対象は、ヒトである。
【０１７７】
当業者は、開示される本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示される本発明の全ての特徴を組み合わせることができることを理解するであろう。
【０１７８】
本発明の好ましい特徴及び実施形態を、これより非限定的な例によって記述する。
【０１７９】
本発明の実施は、特に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、微生物学、及び免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は文献で説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３  ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｒｏｅ，Ｂ．，Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｈｎ，Ａ．（１９９６）ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  ＭｃＧｅｅ，Ｊ．Ｏ’Ｄ．（１９９０）Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、並びに、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．及びＤａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。これらの一般的なテキストの各々は、本明細書に参照により組み込まれる。
【０１８０】
本研究は、Ｄｉｏｇｅｎｅｓ減量介入データに対して実施されるタンパク質量的形質遺伝子座（ｐＱＴＬ）及び発現量的形質遺伝子座（ｅＱＴＬ）分析に関する。このＤｉｏｇｅｎｅｓの研究は、汎ヨーロッパの、ランダム化し、制御した食事介入研究であり、８つのヨーロッパセンターにおいて、肥満及び過体重家族における減量及び体重維持に対する食事タンパク質及び血糖指数の効果を詳しく調べている（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｒｅｖ．１１：７６〜９１）。簡潔には、Ｄｉｏｇｅｎｅｓの研究は、スクリーニングした参加者を低カロリー食（ＬＣＤ）段階（ＣＩＤ１）に供し、過体重／肥満の対象は、８週間のＭｏｄｉｆａｓｔＲ食（約８００ｋＣａｌ／日）、続いて体重維持期（ＣＩＤ２）をフォローした。
【０１８１】
これを、イルミナチップ上で遺伝子型を同定された共通の多様体と、体格指数（ＢＭＩ）変化に関連するタンパク質に焦点を合わせる間のタンパク質発現変化との間の関連性を試験した第１の研究とする。
【実施例】
【０１８２】
実施例１
レプチンタンパク質発現に対するｐＱＴＬ効果
ベースライン及びＬＣＤ中の両方でＢＭＩに関連する４２個のタンパク質の中でも、レプチンのみがＬＣＤ中に有意なｐＱＴＬシグナルを示した。６番染色体上の遺伝子間領域の２つの緊密に連結されたＳＮＰは、レプチンタンパク質の発現変化に関連していた（図１）。周囲遺伝子は、分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の異化に関与するＢＣＫＤＨＢと、ＦＡＭ４６Ａ、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路に関与するＳＭＡＤシグナル伝達経路関連タンパク質と、を含む。これらの研究からの脂肪細胞発現データを使用して、本発明者らは、ｅＱＴＬ分析を実施した。ＦＡＭ４６Ａ遺伝子発現のみが、ｐＱＴＬ領域におけるＳＮＰと関連を示した。ｐＱＴＬ遺伝子座の周囲５Ｍｂ以内の他の遺伝子は、それらのデータ中のＦＡＭ４６Ａシグナルよりも高いｅＱＴＬ関連シグナルを示さなかった。ＦＡＭ４６Ａの生物学的役割は、大部分が不明である。そのタンパク質は、遺伝子調節、アポトーシス、タンパク質合成及び分解の調節に関与するＢＡＧ６タンパク質と相互作用する。近年、皮下脂肪におけるＢＡＧ６スプライシングは、ＢＭＩによって高度に決定されることが示されている。ＢＡＧ６はまた、ストレス応答にも関与している。ヒートショックタンパク質ＨＳＰ７０とＢＡＧ６との間に相互関係があることは、ＢＡＧ６が、ＨＳＰ７０の細胞含有量の中心的なレギュレータであり得ることを示唆しており、ひいては、２型糖尿病及びそれらのデータにおいて、レプチンと明確に関連していることを示唆している（年齢、性別、ＬＣＤ介入中のセンター及びＢＭＩ変化について調整された多変量回帰からのｐ＝３．４×１０−４）。ＦＡＭ４６Ａの調節領域内のｐＱＴＬ関連シグナルもまた、ＨＳＰ７０について観察された（データは示されていない）。交絡補因子としてレプチン発現の変化を調節することは、ｐＱＴＬ結果に影響を与えなかった（データ非掲載）。換言すれば、ＦＡＭ４６Ａ調節領域におけるＨＳＰ７０  ｐＱＴＬシグナルは、レプチン−レベルに依存しなかった。
【０１８３】
実施例２
ＦＡＭ４６Ａとレプチンとの関係
脂肪細胞成熟中のＦＡＭ４６Ａとレプチンとの相互関係も明らかである。脂肪前駆細胞ではＦＡＭ４６Ａの発現は高く、かつ成熟中に低下し、７日目には最低になる。この低下は、レプチンの状況と一致する（図２）。ＱＴＬ結果の遺伝的特性評価を完了するために、ｐＱＴＬ及びｅＱＴＬ  ＳＮＰの指向性を評価した。本発明者らは、最初に、ＬＣＤ中のレプチン変化に有意に関連する２つのｐＱＴＬ  ＳＮＰに焦点をあてた。ＳＮＰ  ｒｓ９３４４０３１は、レプチンタンパク質レベルの変化と明確に関連付けられ（ｐ＝１．４８×１０−７）、ＦＡＭ４６Ａ遺伝子発現変化と否定的に関連した（ｐ＝４．９×１０−３）。第２のｐＱＴＬ  ＳＮＰ  ｒｓ４８１７７７についても同じ傾向が見出されたが、遺伝子発現は、ｅＱＴＬ試験及びｐＱＴＬ試験間のサンプルサイズの差のために、名目上の有意性に到達しなかった（ｐ＝０．１２）。拡大解析では、全ての遺伝子型が同定されかつインピュテーションされたＳＮＰについて、６番染色体上の８１．３〜８１．８Ｍｂに位置するＦＡＭ４６Ａのプロモータ領域内で、ｐＱＴＬシグナルを抽出した（図１）。この領域における１，８３３個のＳＮＰのうち、９４個は、補正されていない５％の名目上の有意性のあるレベルを仮定して、それぞれ、レプチン及びＦＡＭ４６ＡのｐＱＴＬ及びｅＱＴＬとして同定された。全てのＱＴＬ  ＳＮＰは、レプチンタンパク質とＦＡＭ４６Ａ遺伝子発現との間に反対の関連性を示し、レプチン上のＦＡＭ４６Ａの調節的な役割と一致した。
【０１８４】
実施例３
ＦＡＭ４６Ａのノックダウン
ＦＡＭ４６Ａ遺伝子のサイレンシングは、エレクトロポレーションによるＲＮＡ干渉によって達成された。簡潔には、分化の７日目に、ヒト脂肪細胞ＳＧＢＳ細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで分離し、計数した。Ｓｉｌｅｎｃｅｒ  Ｓｅｌｅｃｔ陰性対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＮｅｇ）又はヒトＦＡＭ４６Ａを標的とする遺伝子特異的ｓｉＲＮＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）を、以下のパラメータ：１，１００Ｖ、２０ｍｓ、１パルスを使用するＮｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて、４００，０００個の細胞当たり２５ｎＭの濃度で脂肪細胞に送達した。トランスフェクション後、細胞を同じ培地で４８時間インキュベートした。
【０１８５】
ｓｉＲＮＡによるトランスフェクションにより、基準状態及びインスリン刺激状態において、それぞれ、ＦＡＭ４６Ａ遺伝子発現の７０％及び７４％の低下がもたらされた。ＦＡＭ４６Ａタンパク質は、基準状態及びインスリン誘導状態において、それぞれ、３１％及び７３％低下した（図３）。
【０１８６】
ＦＡＭ４６Ａノックダウンは、レプチン遺伝子発現に影響を及ぼさず、脂肪細胞分化ＰＰＡＲγ及びＣＥＢＰαのマーカーに何の影響も視られなかった（データ非掲載）。
【０１８７】
逆に、ＦＡＭ４６Ａノックダウンは、脂肪細胞からのインスリン刺激レプチン分泌の非常に有意な４９％の増加をもたらした（レプチン増加について、ｐ＝０．０００２、片側ｔ検定）。事前のインスリン刺激を伴わない条件下では、ノックダウンは、レプチン分泌のわずか１９％の増加を示した（データ非掲載）。ＦＡＭ４６Ａのノックダウンの効果がレプチンに特異的であるかどうかを評価するために、アディポネクチンの分泌を試験した。アディポネクチンの分泌は、ノックダウンによる影響を受けなかった（データ非掲載）。
【０１８８】
実施例４
ＦＡＭ４６Ａの過剰発現
ＦＡＭ４６Ａ遺伝子の過剰発現は、エレクトロポレーションによるｃＤＮＡトランスフェクションによって達成された。簡潔には、分化の７日目に、ＳＧＢＳ細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで剥離し、計数した。ｐＣＭＶ６空ベクター（対照）又はＦＡＭ４６Ａ（ＮＭ＿０１７６３３）完全ヒトｃＤＮＡ  ＯＲＦクローン（ＯｒｉＧｅｎｅ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ  ２０８５０，ＵＳＡ）を、以下のパラメータ：１，１００Ｖ、２０ｍｓ、１パルスを使用しＮｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を用いて、４００，０００個の細胞当たり０．５μｇの濃度で脂肪細胞に送達した。トランスフェクション後、細胞を同じ培地で４８時間インキュベートした。
【０１８９】
ＳＧＢＳ細胞のトランスフェクションは、ＦＡＭ４６Ａ発現の２１倍の増加をもたらした（図４）。ＦＡＭ４６Ａの過剰発現により、インスリン及び非インスリン刺激レプチン放出の、有意なそれぞれ２８％及び２４％の減少（それぞれ基準状態及びインスリン刺激状態の両方についてｐ＝０．０３４及び０．０３８、片側ｔ検定）がもたらされた（図５）。過剰発現は、ＰＰＡＲγ又はＣＥＢＰα遺伝子発現に影響を及ぼさなかった（データ非掲載）。アディポネクチン放出は、基準状態に加えてインスリン刺激状態の両方において、ＦＡＭ４６Ａ過剰発現による影響を受けなかった（データは示されていない）。
【０１９０】
ＦＡＭ４６Ａ、レプチン及びＰＰＡＲγについての遺伝子発現を測定するために、９日目にＲｎｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＳＧＢＳ脂肪細胞から全ＲＮＡを単離した。ＮａｎｏＤｒｏｐを用いて量及び品質を評価した後、製造者の指示に従って、高容量ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して、０．５μｇの全ＲＮＡを逆転写した。
【０１９１】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ装置（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いたＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎキットＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  １５３６  ＤＮＡ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒキットを使用して、ｍＲＮＡの発現レベルを決定した。Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈウェブサイトを使用して、オリゴ配列を設計した。ヒトプライマーは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅから入手した。ＦＡＭ４６Ａ、レプチン、ＣＥＢＰα、及びＰＰＡＲγ  ｍＲＮＡレベルをＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ）に対して正規化した。プライマーは下表に列挙されたように使用した。
【表３】
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【０１９２】
上記明細書で言及した全ての出版物は、本明細書に参照により組み込まれる。本発明に開示される作用物質、使用及び方法の様々な修正及び変更は、本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく、当業者には明白であろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して開示されているが、特許請求される本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者には自明の、開示した、本発明を実施するためのモードの種々の改変は以下の特許請求の範囲の範囲内であることを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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