(57)【要約】  本発明は、好ましくは遺伝子スイッチの制御下での、マトリックス金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）の、硬皮症の処置を必要とする患者への送達による、硬皮症の処置のための方法に関する。このように、ＭＭＰの発現を活性化又は不活化するリガンド活性化因子の使用は、遺伝子スイッチを制御する。別の実施形態において、本発明は、活性化リガンドを用いることにより活性化可能な遺伝子スイッチの制御下にある、ＭＭＰをコードするポリヌクレオチドで形質移入／形質導入された自己由来遺伝子改変細胞の、硬皮症の処置のための送達に関する。
2020517615.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
硬化性の症状を処置する方法であって、発現ベクター、又は発現ベクターを含む細胞の投与を含み、前記ベクター又は前記細胞は、非マトリックス金属タンパク質分解酵素（非−ＭＭＰ）シグナルペプチド、及びマトリックス金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）ポリペプチド、又はその、酵素的に活性なコラーゲン分解フラグメントを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、方法。
【請求項２】
前記細胞は最初に、硬皮症を患っている患者から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
単離された前記細胞は、エキソビボで培養される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、線維芽細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードする前記ポリヌクレオチドはさらに、遺伝子スイッチ発現系に作動可能に連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子発現スイッチ系は、活性化リガンドの存在下で活性化されてＭＭＰを発現し、前記活性化リガンドの不在下で不活化されてＭＭＰの発現を引き下げる、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ＭＭＰは、マトリックス金属タンパク質分解酵素１（ＭＭＰ−１）である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＭＭＰ−１は、ヒトＭＭＰ−１である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記発現ベクターは、ウイルスベクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルスベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択されるウイルスに由来する、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記活性化リガンドは、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘである、請求項６に記載の方法。
【請求項１３】
投与は、皮内注射による、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ｖｅｌｅｄｉｍｅｘは、形質移入された前記細胞の注射に従って、前記患者に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
細胞の投与の後、前記ｖｅｌｅｄｉｍｅｘは、少なくとも５日間送達される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記硬化性の症状は、硬皮症である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記硬皮症は、線状硬皮症、限局性強皮症、全身性限局性強皮症、汎硬化性限局性強皮症、及び混合限局性強皮症から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子スイッチ系に作動可能に連結された、非マトリックス金属タンパク質分解酵素（非−ＭＭＰ）シグナルペプチド、及びマトリックス金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）ポリペプチド、又はその、酵素的に活性なコラーゲン分解フラグメントを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクター。
【請求項１９】
前記遺伝子スイッチ系は、リガンド誘導転写因子に作動可能に連結された誘導プロモータを含む、請求項１８に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２０】
前記遺伝子スイッチ系は、活性化リガンドの存在下で活性化され、前記活性化リガンドの不在下で不活化される、請求項１９に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２１】
配列番号１の配列を含む、請求項１８に記載のレンチウイルスベクター。
【請求項２２】
配列番号１の配列を含むレンチウイルスベクター。
【請求項２３】
配列番号１の配列を含むベクターで形質導入又は形質移入された、硬皮症を患っている患者から得られた線維芽細胞を含む医薬組成物。
【請求項２４】
請求項２２に記載のベクターでインビトロ又はエクスビボ形質導入された細胞。
【請求項２５】
遺伝子スイッチ系に作動可能に連結された、非マトリックス金属タンパク質分解酵素（非−ＭＭＰ）シグナルペプチド、及びマトリックス金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）ポリペプチド、又はその、酵素的に活性なコラーゲン分解フラグメントを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、単離された遺伝子改変細胞又は遺伝子改変細胞の集団。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドは、細胞あたり１コピー超且つ６コピー未満の平均コピー数にて、前記細胞若しくは前記細胞の集団中に存在し、又は細胞ゲノム若しくは細胞ゲノムの集団中に統合されている、請求項２５に記載の遺伝子改変細胞又は遺伝子改変細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子データとして提出される配列表を含み、これは、その全体を参照により本明細書に組み込む。前記ＡＳＣＩＩコピーは、２０１８年４月２０日に作成され、“ＩＮＸ００３７２ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿２０１８０４２０．ｔｘｔ”と称し、サイズは１１，６９１バイト（ディスク上のサイズは１２，２８８バイト）である。
【０００２】
本発明は、マトリックス金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドの、硬化症状の処置を必要とする患者への送達による、硬化症状の処置のための方法及び組成物に関する。更なる実施形態において、本発明は、遺伝子スイッチ発現系の使用により条件的に発現される、ＭＭＰをベクター内にコードするポリヌクレオチドの、硬化症状を患う患者から単離された細胞への送達に関する。細胞は好ましくは、患者から単離されて、ＭＭＰをコードするポリヌクレオチドが形質移入されて、インビトロ又はエクスビボで培養されてから、患者に投与される。さらに、リガンド活性化因子が患者に投与されてＭＭＰの発現が活性化され、又は投与を止めてＭＭＰの発現が不活化される。別の実施形態において、本発明は、ＭＭＰ又はそのフラグメントを送達するのに用いられる構築体に関する。
【背景技術】
【０００３】
限局性硬皮症（ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ）は、永続的な機能障害及び外観不良（ｄｉｓｆｉｇｕｒｅｍｅｎｔ）を引き起こす虞がある皮膚硬化の自己免疫炎症性の硬化性障害である。用語「限局性強皮症（ｍｏｒｐｈｅａ）」は、限局性硬皮症と同義である。限局性硬皮症は、線状硬皮症、限局性強皮症（ｃｉｒｃｕｍｓｃｒｉｂｅｄ  ｍｏｒｐｈｅａ）、全身性限局性強皮症、汎硬化性限局性強皮症、及び混合限局性強皮症が挙げられるいくつかのサブタイプがある。限局性硬皮症は、血管又は内臓が関与しない、皮膚及び基礎をなす組織の稀な線維化障害であり、病変の深さ及びパターンによって分類されるいくつかのサブタイプを包含する。従来の分類体系（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）は、最近、専門家のコンセンサスによって変更されて、より臨床的に応用可能な分類が提供された。変更された分類体系は、「パドヴァ基準」（Ｌａｘｅｒ  ＆  Ｚｕｌｉａｎ，２００６）と呼ばれる。限局性硬皮症の基礎をなす病因は、おそらく多元的であり、遺伝的要因及び環境曝露が関与して、小血管の損傷、線維化促進サイトカインの放出、及びコラーゲンの合成と破壊とのバランスの破壊で頂点に達する。コラーゲンの生産過剰及び蓄積が、疾患の特徴である。限局性硬皮症の小児において最も共通するサブタイプである線状サブタイプ（Ｆｅｔｔ  ＆  Ｗｅｒｔｈ，２０１１）は、真皮、皮下組織、並びに時折、基礎をなす筋肉、腱、及び骨を巻き込む線状プラークによって特徴付けられる（Ｌａｘｅｒ  ＆  Ｚｕｌｉａｎ，２００６）。線状硬皮症は、通常、皮膚及び皮下組織、例えば、脂肪組織、筋肉、及び時折、皮膚病変下の骨に限られる。限局性硬皮症は、通常、自己限局性の疾病であり、皮膚肥厚の線状領域が、小児において、基礎をなす組織及び筋肉に及ぶ虞があり、これが、罹患した脚又は腕の成長を損なう虞がある。実際に、関係する最も共通する部位は脚であり、腕、前頭部、及び胴が続く。四肢の病変は、筋肉が挙げられる軟組織の萎縮、障害のある成長に起因する四肢長の相違、及び関節拘縮を引き起こす虞がある。関節の全体にわたる病変は、運動を害し、そして永続的となる場合がある。
【０００４】
限局性硬皮症の出現率及び有病率は、十分に記載されていない。限局性硬皮症の出現率は、１００，０００人あたりおおよそ０．４〜２．７と推定された（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）、（Ｆｅｔｔ  ＆  Ｗｅｒｔｈ，２０１１）、（Ｋｅｌｓｅｙ  ＆  Ｔｏｒｏｋ，２０１３）。汎発性硬皮症及び限局性硬皮症は、臨床的に区別可能な疾患である（Ｌｉｐｓｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。Ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ及びＮＩＨに従えば、硬皮症（汎発性の形態及び限局性の形態）の米国有病率は、おおよそ３００，０００人であり、当該個体の２／３（又はおおよそ２００，０００人）は、限局性硬皮症であると推定されている（ＧＡＲＤ，２０１２）（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，２０１５）。
【０００５】
現在入手可能な情報は、限局性硬皮症の処置について具体的に示される治癒的療法も治療法もないことを示している。現行の処置は、徴候及び病徴を制御して、疾患の拡散を遅らせることを目的としている。メトトレキサート、コルチコステロイド、及びミコフェノール酸モフェチルは、疾患プロセスの初期にある多くの患者に利益を提供するが、多くの場合、特に硬化した病変において、長期的効力をもたらすことができない。したがって、限局性硬皮症は、疾患の進行に関して２つの構成要素：１）活性（炎症性）相、及び２）損傷（硬化性）相があると考えることができる。メトトレキサート等の現行の処置は、活性相に対処する；しかしながら、現在まで、病変が損傷相に入ると、治療は有効でない。
【０００６】
限局性硬皮症の希少性を考えると、根拠に基づく治療的処置のごく少数の選択肢しか存在しない。一般に、処置の選択肢は、局所療法及び全身療法、並びに紫外線（ＵＶ）光線療法に分けることができる。
【０００７】
メトトレキサートが有効な処置であるという証拠を研究が提供しているが、症状を治癒させないにしても疾患活性の自然発生的な向上が起こるまで、症状を抑制するために、低い供与量が何年も投与されなければならない（Ｃｈｒｉｓｔｅｎ−Ｚａｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。安定化が、５．４年の平均疾患期間の後に得られる。患者は時折、長期間の、疾患休止に続く再活性化を経験する；患者の３１％は、１０年後の活動性疾患を報告した。ほとんどの患者は、美的後遺症（ａｅｓｔｈｅｔｉｃ  ｓｅｑｕｅｌａｅ）があり、３８％は、機能的制限がある。メトトレキサート及び全身性コルチコステロイドの組合せは、疾患の初期のステージにおいて有効であるが、長期にわたる活動性疾患を予防しないし、再発も長期的に予防しない（Ｐｉｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０００８】
ＵＶＡ１光線治療が有効であり得る；しかしながら、処置は、重荷となる場合があり（３０〜４０セッションについて、２〜３×／週）、そして処置後の再発率は、４６％である（Ｐｉｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。ほとんどの調査者は、ＵＶＡ１が限局性硬皮症について有効な処置であると同意している一方、投薬レジメン又は頻度及び総曝露についてのコンセンサスは不足している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、新しい、向上した治療法が、硬皮症の処置に必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、硬皮症の処置を必要とする患者への、好ましくは誘導遺伝子スイッチの制御下での、マトリックス金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）の送達による、硬皮症の処置方法に関する。そのような様式では、例えば、ＭＭＰの発現を活性化又は不活化するリガンド活性化因子の使用が、遺伝子スイッチを制御する（すなわち、遺伝子発現活性化リガンドの投与又は投与の停止をそれぞれ介する）。別の実施形態において、本発明は、活性化リガンドを用いることによる遺伝子スイッチ発現の制御下にある、ＭＭＰをコードするポリヌクレオチドで形質移入又は形質導入された自己由来遺伝子改変細胞の、硬皮症の処置のための送達に関する。
【００１１】
本発明の実施形態として、限定されないが、以下が挙げられる：
【００１２】
マトリックス金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）タンパク質又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質移入された細胞を、硬化性の症状の処置を必要とする患者に投与することを含む、硬化性の症状を処置する方法。硬皮症を患っている、形質移入の前の患者から単離された、形質移入された自己由来細胞の使用をさらに含む、硬化性の症状を処置する方法。エキソビボで培養された形質移入細胞の使用をさらに含む、硬化性の症状を処置する方法。線維芽細胞の使用をさらに含む、硬化性の症状を処置する方法。遺伝子スイッチ発現系に作動可能に連結された、ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドの使用及び発現をさらに含む、硬化性の症状を処置する方法。遺伝子スイッチ発現系は、活性化リガンドの存在下で活性化され（すなわち、誘導され、又は「オン」にされる）、そして活性化リガンドの不在下で不活化される（すなわち、引き下げられ、又は「オフ」にされる）、硬化性の症状を処置する方法。遺伝子スイッチ発現系が、リガンド誘導転写因子に作動可能に連結された誘導プロモータを含み、当該リガンド誘導転写因子は、活性化リガンドに結合した場合に活性化される、硬化性の症状を処置する方法。遺伝子スイッチ発現系は、同時活性化パートナーをさらに含む、硬化性の症状を処置する方法。発現ベクターは、ウイルスベクターである、硬化性の症状を処置する方法。ウイルスベクターは、レンチウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルスから選択されるウイルスに由来する、硬化性の症状を処置する方法。ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである、硬化性の症状を処置する方法。前記レンチウイルスベクターは、ＩＮＸＮ−２００５である、硬化性の症状を処置する方法。遺伝子発現系活性化リガンドは、非ステロイド化合物である、硬化性の症状を処置する方法。活性化リガンドは、非ステロイドジアシルヒドラジン化合物である、硬化性の症状を処置する方法。活性化リガンドは、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘである、硬化性の症状を処置する方法。細胞は、遺伝子スイッチ系に作動可能に連結されたＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターによって形質移入される、硬化性の症状を処置する方法。形質移入された細胞は、注射によって、硬化性の症状の処置を必要とする患者に投与される、硬化性の症状を処置する方法。投与は、皮内注射による、硬化性の症状を処置する方法。形質移入された細胞の注射の後、活性化リガンド、例えば、限定されないが、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘが、患者に投与される、硬化性の症状を処置する方法。活性化リガンド、例えば、限定されないが、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘの投与は、遺伝子スイッチを活性化して、患者において、ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドの発現を誘導する、硬化性の症状を処置する方法。形質移入された細胞の投与の後、活性化リガンド、例えば、限定されないが、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘが、少なくとも５日間送達される、硬化性の症状を処置する方法。形質移入された細胞の投与の後、活性化リガンド、例えば、限定されないが、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘが、毎日、又は他の、７日以上、１０日以上、１４日以上、２１日以上、２８日以上、３０日以上、６０日以上、９０日以上、若しくは最大１００日以上の間隔にて送達される、硬化性の症状を処置する方法。硬化性の症状は、限局性硬皮症である、硬化性の症状を処置する方法。限局性硬皮症は、線状硬皮症、限局性強皮症、全身性限局性強皮症、汎硬化性限局性強皮症、及び混合限局性強皮症から選択される、硬化性の症状を処置する方法。
【００１３】
硬化性の症状の処置を必要とする患者に、遺伝子スイッチに作動可能に連結した、マトリックス金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）タンパク質又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドで形質導入された自己由来細胞を、前記遺伝子スイッチを誘導する活性化リガンドと組み合わせて含む皮内注射を施すことを含む、硬化性の症状を処置する方法。遺伝子スイッチの活性化リガンドは、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘである、硬化性の症状を処置する方法。ｖｅｌｅｄｉｍｅｘは、患者に与えずにおかれて、遺伝子スイッチを不活化する、硬化性の症状を処置する方法。硬化性の症状は、限局性硬皮症である、硬化性の症状を処置する方法。限局性硬皮症は、線状硬皮症、限局性強皮症、全身性限局性強皮症、汎硬化性限局性強皮症、及び混合限局性強皮症から選択される、硬化性の症状を処置する方法。
【００１４】
遺伝子スイッチ系に作動可能に連結された、マトリックス金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含む、レンチウイルスベクター。
【００１５】
マトリックス金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターであって、遺伝子スイッチ系は、リガンド誘導転写因子に作動可能に連結された誘導プロモータを含み、当該リガンド誘導転写因子は、活性化リガンドに結合した場合に活性化される、レンチウイルスベクター。遺伝子スイッチ系は、活性化リガンドの存在下で活性化され、そして活性化リガンドの不在下で不活化される、レンチウイルスベクター。配列番号１の配列を含むレンチウイルスベクター。配列番号１で示されるヌクレオチド配列を含むＩＮＸＮ−２００５と称されるレンチウイルスベクターで形質導入された、硬皮症を患っている患者から得られた線維芽細胞を含む医薬組成物。ＩＮＸＮ−２００５と称されるレンチウイルスベクターで形質導入された、硬皮症を患っている患者から得られた線維芽細胞を含む医薬組成物。マトリックス金属タンパク質分解酵素（ＭＭＰ）又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むレンチウイルスベクターでインビトロ又はエクスビボ形質導入された細胞。配列番号１の配列を含むレンチウイルスベクターでインビトロ又はエクスビボ形質導入された細胞。機能的ＭＭＰ遺伝子を含んで、マトリックス金属タンパク質分解酵素−１を発現する、硬皮症を患っている患者由来の自己由来遺伝子改変線維芽細胞。
【００１６】
機能的ＭＭＰ遺伝子を含んで、マトリックス金属タンパク質分解酵素を発現する、硬化症疾患を患っている患者由来の自己由来遺伝子改変線維芽細胞。
【００１７】
添付の図面を参照することにより、以下の詳細な説明と共に考慮されれば、本発明のより十全な理解が得られるであろう。図面に示す実施形態は、本発明を例証することを意図するに過ぎず、例示した実施形態に本発明を制限するものとして解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】本発明で用いられ得る遺伝子スイッチ系を示す。
【図２】エクジソン受容体ベースのリガンド誘導遺伝子スイッチ、及びＭＭＰ１タンパク質をコードする遺伝子を含むレンチウイルスベクター（「ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１」）の構築体マップを示す。構築体の要素及び機能を、表１に示している。
【図３】本発明の範囲内のレンチウイルス形質導入プロセスの概略図を示す。
【図４】ｖｅｌｅｄｉｍｅｘあり、そしてなしの、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１の種々の希釈物での正常なヒト真皮線維芽細胞の形質導入、及びそのような形質導入の平均コピー数を示すグラフを表す。
【図５Ａ】硬皮症のブレオマイシンモデルにおいて、薄くされた真皮厚さ（図５Ａ）及び薄くされた皮下筋厚さ（図５Ｂ）を示すグラフ表示を表す。群１は、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１で形質導入したヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）（「ＨＤＦ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１」）を注射したブレオマイシンマウスモデルに相当し、ｍｏｃｋ賦形剤を経口投与している。群２は、ＨＤＦ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１細胞を注射し、且つｖｅｌｅｄｉｍｅｘを経口投与したブレオマイシンマウスモデルに相当する。群３は、非遺伝子改変ヒト真皮線維芽細胞（非−ＧＭ  ＨＤＦ）を注射したブレオマイシンマウスモデルに相当し、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘを経口投与している。群４は、生理食塩水（ブレオマイシンでない）を注射し、いかなるタイプの細胞も注射せず、且つｖｅｌｅｄｉｍｅｘを経口投与した対照マウスに相当する。誤差棒は、標準偏差を表す
【図５Ｂ】硬皮症のブレオマイシンモデルにおいて、薄くされた真皮厚さ（図５Ａ）及び薄くされた皮下筋厚さ（図５Ｂ）を示すグラフ表示を表す。群１は、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１で形質導入したヒト真皮線維芽細胞（ＨＤＦ）（「ＨＤＦ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１」）を注射したブレオマイシンマウスモデルに相当し、ｍｏｃｋ賦形剤を経口投与している。群２は、ＨＤＦ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１細胞を注射し、且つｖｅｌｅｄｉｍｅｘを経口投与したブレオマイシンマウスモデルに相当する。群３は、非遺伝子改変ヒト真皮線維芽細胞（非−ＧＭ  ＨＤＦ）を注射したブレオマイシンマウスモデルに相当し、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘを経口投与している。群４は、生理食塩水（ブレオマイシンでない）を注射し、いかなるタイプの細胞も注射せず、且つｖｅｌｅｄｉｍｅｘを経口投与した対照マウスに相当する。誤差棒は、標準偏差を表す
【図６】ＨＤＦ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１細胞を皮内注射したマウスにおけるＭＭＰ１の血清レベルのグラフを表す。血清を、研究２８、３３、及び３９日目（線維芽細胞の注射後（−）１［すなわち、採血前］、４、及び１０日目）に各マウスから収集した。血清を１：２に希釈して、ＭＭＰ１発現について、高感度ＭＭＰ１  ＥＬＩＳＡ（ＬＬＯＤ＝２２ｐｇ／ｍＬ）を用いてアッセイした。誤差棒は、標準偏差を表す。
【図７】群１〜４のそれぞれについてのマウス由来の、ヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）で染色した組織切片の代表的なインビボ薬理学画像を示す。
【図８】例示的な、意図した処置スケジュールの概要を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
別に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語並びにあらゆる略語は、本発明の技術分野の通常の技術者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似若しくは同等のあらゆる組成物、方法、キット及び情報連絡手段を用いて、本発明を実施することができるが、好ましい組成物、方法、キット及び情報連絡手段は本明細書に記載される。
【００２０】
本明細書で引用する全ての参照文献は、法律の及ぶ限り、参照により本明細書に組み込む。こうした参照文献についての論述は、その著者によってなされた主張を要約することを意図するに過ぎない。いずれかの参照文献（又はいずれかの参照文献の１部分）が、関連する先行技術であるという承認は一切していない。本出願人は、引用したあらゆる参照文献の正確さ及び適切性に異議を唱える権利を留保する。引用した参考文献中のいずれかに示されるあらゆる記述、結論、仮説、データ、又は他の情報が、本開示と矛盾する、又は本開示に相反する場合には、本開示が、引用した参考文献の矛盾する、又は相反する部分を無効にして、これに優先するものとする。
【００２１】
本発明をより分かりやすくするために、いくつかの用語を本明細書に定義する。更なる定義を詳細な説明の全体を通して記載する。
【００２２】
特許請求の範囲及び／又は明細書において用語「含む」と一緒に用いられるとき、「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」という語の使用は、「１つの」を意味し得るが、「１つ又は複数の」、「少なくとも１つの」、及び「１つ以上」の意味とも一致する。
【００２３】
本出願全体を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために使用される装置、方法に固有の誤差の変動、又は試験対象の間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。典型的には、この用語は、状況に応じて、約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％若しくは２０％又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％若しくは２０％未満の変動性を含むことを意味する。
【００２４】
特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、二者択一のみを指すことが明示されているか、又は二者択一が互いに排他的ではない限り、「及び／又は」を意味するために用いられるが、本開示は、二者択一のみ、並びに「及び／又は」を指す定義を支持する。
【００２５】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される通り、「含んでいる」（並びに「含む」及び「含む」などを含むあらゆる形態）、「有している」（並びに「有する」及び「有する」などを含むあらゆる形態）、「包含している」（並びに「包含する」及び「包含する」などを含むあらゆる形態）、又は「含有している」（並びに「含有する」及び「含有する」などを含むあらゆる形態）という語は、包括的であるか、又は制限がなく、したがって、追加的な、記載されていない要素若しくは方法ステップを除外しない。本明細書で論じるあらゆる実施形態は、本発明の任意の方法又は組成物に関して実施することができ、その逆も然りである。さらにまた、本発明の組成物を用いて、本発明の方法を達成することができる。
【００２６】
用語「核酸」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、及び「ポリヌクレオチド」は、互換的に用いられて、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかを、配列内に存在し得、且つ相補的な配列を有する第２の分子とのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションを妨げない合成ヌクレオチド類似体又は他の分子と共に指す。これらの分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。
【００２７】
核酸、核酸配列、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、共通祖先の核酸又は核酸配列に、天然に、又は人工的に由来する場合、「相同」である。タンパク質及び／又はタンパク質配列は、そのコードＤＮＡが、共通の祖先核酸又は核酸配列から、天然若しくは人工的に得られる場合、相同的である。相同的分子は、ホモログと呼ぶことができる。例えば、本明細書に記載するように、任意の天然に存在するタンパク質は、任意の利用可能な突然変異誘発方法によって修飾することができる。発現されると、この突然変異誘発核酸は、元の核酸によりコードされたタンパク質と相同的であるポリペプチドをコードする。相同性は、一般に、２つ以上の核酸若しくはタンパク質（又はそれらの配列）同士の配列同一性から推定される。相同性を確立する上で有用な配列同士の同一性の正確なパーセンテージは、該当する核酸及びタンパク質によって変動するが、相同性を確立するために、少なくとも２５％の配列同一性が通常使用される。さらに、相同性を確立するために、より高レベルの配列同一性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は９９％以上を用いることもできる。配列同一性パーセンテージを決定するための方法（例えば、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＮ）が、本明細書に記載され、一般に利用可能である。
【００２８】
ポリペプチドの２つの核酸配列又はアミノ酸配列に関して、用語「同一」又は「配列同一性」は、指定の比較ウィンドウにわたる最大一致についてアラインメントしたとき、２つの配列内で同じである残基を指す。本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０、通常、約５０〜約２００、より一般的には約１００〜約１５０の連続した位置のセグメントを指し、ここで、２つの配列を最適にアラインメントした後、１つの配列を同じ数の連続位置の参照配列と比較することができる。比較のための配列のアラインメント方法は、当技術分野で公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムにより；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のアラインメントアルゴリズムにより；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索方法により；これらのアルゴリズムのコンピュータ実装（限定されないが、Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  Ｃａｌｉｆ．，によるＰＣ／ＧｅｎｅプログラムのＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．のＧＡＰ，ＢＥＳＴＦＩＴ，ＢＬＡＳＴ，ＦＡＳＴＡ，ＴＦＡＳＴＡなど）により実施することができ；ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８８）Ｇｅｎｅ  ７３：２３７−２４４  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３；Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−１０８９０；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８：１５５−１６５；及びＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４：３０７−３３１によって十分に記載されている。また、アライメントは検査及びマニュアルアライメントによっても実施されることが多い。
【００２９】
１クラスの実施形態では、例えば、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＰ（又はＣＬＵＳＴＡＬ、若しくはいずれか他の利用可能なアライメントソフトウエア）により測定して、本明細書のポリペプチド（ＭＭＰのフラグメントなど、例えば、ＭＭＰ−１タンパク質）は、参照ポリペプチド、又はそのフラグメントと少なくとも７０％、一般的には少なくとも７５％、任意選択で少なくとも８０％、８５％、９０％、９８％若しくは９９％以上同一である。同様に、核酸は、出発核酸に関して表すこともでき、例えば、これらは、例えば、デフォルトパラメータを用いたＢＬＡＳＴＮ（若しくはＣＬＵＳＴＡＬ、又はいずれか他の利用可能なアライメントソフトウエア）により測定して、参照核酸又はそのフラグメントと少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％、９９％以上同一であってよい。１分子が、より大きな分子と特定のパーセンテージの配列同一性を有するというとき、これは、２つの分子を最適にアラインメントしたとき、小さい方の前記パーセンテージの残基が、２つの分子が最適にアライメントされる順序に従って、大きい方の分子に一致する残基が見出されることを意味する。
【００３０】
核酸又はアミノ酸配列に適用される用語「実質的に同一の」は、核酸又はアミノ酸配列が、標準パラメータを用いた前述のプログラム（好ましくは、ＢＬＡＳＴ）を用い、参照配列と比較して、少なくとも９０％の配列同一性若しくはそれ以上、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは９８％及び最も好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、１１の語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合には、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３の語長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、及びＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５（１９９２）参照）を使用する。配列同一性のパーセンテージは、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアライメントした配列を比較することによって決定され、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アライメントのための参照配列（付加又は欠失を含まない）と比較して、付加又は欠失（すなわちギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、両配列中に同一の核酸塩基又はアミノ酸残基が存在する位置の数を決定して、一致した位置の数を取得し、一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割った後、その商に１００を掛けることにより、配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出する。好ましくは、実質的な同一性は、長さが少なくとも約５０残基の配列の領域にわたって、より好ましくは、少なくとも約１００残基の領域にわたって存在し、最も好ましくは、配列は、少なくとも約１５０残基にわたり実質的に同一である。最も好ましい実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたって実質的に同一である。
【００３１】
本明細書に開示するタンパク質の「機能性変異体」は、例えば、少なくとも又は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０の保存的アミノ酸置換を含む参照タンパク質（ＭＭＰなど、例えば、ＭＭＰ−１）のアミノ酸配列を含んでもよい。フレーズ「保存的アミノ酸置換」又は「保存的突然変異」は、共通の特性を有する別のアミノ酸による１アミノ酸の置換を指す。個々のアミノ酸同士の共通の特性を決定する機能的方法は、同種（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）生物の対応するタンパク質同士のアミノ酸変化の標準化頻度を分析することである（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ  Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｒ．Ｈ．，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７９））。こうした分析に従って、１群内のアミノ酸が優先的に互いと交換し、したがって、タンパク質構造全体に対するその影響が互いに最も類似する、アミノ酸の群を定義することができる（Ｓｃｈｕｌｚ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ  Ｓｃｈｉｒｍｅｒ，Ｒ．Ｈ．前掲）。保存的突然変異の例として、前述の亜群内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、陽電荷が維持されるようにリシンによるアルギニン、及びその逆の置換；陰電荷が維持され得るようなグルタミン酸によるアスパラギン酸の、及びその逆の置換；遊離−ＯＨが維持され得るようにセリンによるトレオニンの置換；並びに遊離−ＮＨ２が維持され得るように、グルタミンによるアスパラギンの置換を含む。
【００３２】
あるいは、又は追加的に、機能性変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を含む参照タンパク質のアミノ酸配列を含んでもよい。「非保存的突然変異」は、異なる群同士のアミノ酸置換、例えば、リシンによるトリプトファン、又はフェニルアラニンによるセリンの置換などを含む。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能性変異体を妨害しないか、又はその生物活性を阻害しないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能性変異体の生物活性が参照配列と比較して増加するように、機能性変異体の生物活性を増強し得る。
【００３３】
ＭＭＰの「コラーゲン分解」フラグメントは、Ｉ型、ＩＩ型及び／又はＩＩＩ型のコラーゲンを切断又は分解することできるＭＭＰのフラグメントである。この機能は、細胞外マトリックス蓄積を妨げ、若しくは阻害するように機能し、且つ／又は抗線維形成作用を提供する。
【００３４】
「遺伝子スイッチ系」は、参照タンパク質、例えばＭＭＰ又はそのフラグメントの発現をオン／オフすることができる条件的遺伝子発現系を指す。本発明の遺伝子スイッチ系は、少なくとも１つの誘導プロモータ（これは、それに作動可能に連結されている治療タンパク質（例えば、ＭＭＰ−１）又はそのフラグメントの発現に関連する）、リガンド誘導転写因子、及びリガンド誘導転写因子のための同時活性化パートナーを含むポリヌクレオチド配列を含む系を指す。本発明の一態様において、「誘導プロモータ」は、ＭＭＰ又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されている。遺伝子スイッチ系は、「活性化リガンド」の使用を含み、これは、「リガンド誘導転写因子」と複合体形成された場合に、誘導プロモータをトリガして、治療タンパク質又はそのフラグメントの転写を開始する。したがって、本発明はさらに、患者においてＭＭＰ又はそのフラグメントの発現をトリガするための、リガンド誘導転写因子及び活性化リガンドを含む「活性化複合体」に関する。その場合、活性化複合体は、誘導プロモータをトリガするために、リガンド誘導転写因子を、活性化リガンドと複合体形成された同時活性化パートナーと共に含むこととなる。遺伝子スイッチ系は、活性化リガンドの存在下で「活性化」され、又は「オン」にされ、そして活性化リガンドの不在下で「不活化」され、又は「オフ」にされる。したがって、遺伝子スイッチは、必要に応じて、活性化リガンドの存在又は不在によってオン／オフされ得る。特定の実施形態において、本発明で利用される好ましい遺伝子スイッチ発現系は、エクジソン受容体ベースのリガンド誘導遺伝子スイッチであり、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５０９０号明細書（２００２年２月２０日出願）及び米国特許第８，７１５，９５９号明細書（２０１４年５月６日発行）、並びに／又は国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１２７０号明細書及び米国特許第９，４０２，９１９号明細書に記載されており、これらは参照によって本明細書に組み込まれる。
【００３５】
用語「患者」又は「被験者」は、ヒト及び動物をはじめとする哺乳動物を指す。
【００３６】
用語「処置する」又は「処置」は、病徴を軽減且つ／若しくは緩和すること、そして／又は硬化性の症状の再発及び／若しくは進行を予防することを指す。例えば、硬皮症の処置は、コラーゲンの分解、又は細胞外マトリックス若しくはコラーゲン形成の阻害若しくは予防に向けられ、これらは硬化性の症状において大きな役割を果たす。処置は、ＥＣＭ生成若しくはコラーゲン形成の拘束（ｂｉｎｄｉｎｇ）、ブロック、阻害、若しくは中和を、又は硬皮症に起因するＥＣＭ生成若しくはコラーゲン形成の引下げ、防止、若しくは阻害を含み得る。本明細書中に記載される方法及び組成物で処置され得る徴候として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：１）汎発性強皮症（ＳＳｃ）（具体的には、強指症及び内臓線維形成）；２）以下が挙げられる皮膚線維形成：ａ）限局皮膚ＳＳｃ（ＩＳＳｃ）及びｂ）びまん性皮膚ＳＳｃ（ｄＳＳｃ）；３）間質性肺疾患（ＩＬＤ）を伴う汎発性強皮症（ＳＳｃ−ＩＬＤ）；４）エディマタス・ファイブロスクレロティック・パニキュロパシ（セルライト）；５）癒着性関節包炎（五十肩）；６）レイノー現象（ＲＰ）；７）乾癬；８）肝臓線維形成（非アルコール性脂肪肝炎が挙げられる）；９）腎臓線維形成（巣状分節性糸球体硬化症が挙げられる）；１０）心筋線維症；１１）慢性関節リウマチ；１２）クローン病；１３）潰瘍性大腸炎；１４）骨髄線維症；１５）全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）；１６）骨格筋線維形成（急性的な損傷に従う、又は慢性神経変性筋疾患に起因する）；１７）外眼筋の先天性線維形成（ＣＦＥＯＭ１、ＣＦＥＯＭ２、ＣＦＥＯＭ３、及びＴｕｋｅｌ症候群）；１８）慢性移植片対宿主疾患；１９）肥厚性瘢痕；２０）特発性肺線維形成；２１）サーベル状切痕；２２）デュピュイトラン拘縮；２３）ペイロニー病；２４）肥厚性瘢痕；２５）硬皮症に関連する手の機能不全；２６）放射線線維形成症候群；並びに２７）他の硬化性の症状。
【００３７】
用語「自己由来細胞」は、同じ個体から由来する、又は一個体をドナー及びレシピエントの双方として関係させる細胞を指す。本発明に従えば、自己由来細胞は、最初に、硬皮症を患っている患者から収穫される。当該細胞は、本発明に従って遺伝子改変されてから、同じ患者に再導入により戻されて、硬化性の症状が処置される。
【００３８】
用語「形質移入」は、哺乳類細胞中への遺伝子の送達を指す。そのような遺伝的材料の挿入により、タンパク質の発現又は生成が、細胞自身の機構を用いて可能となる。本発明に従えば、形質移入はまた、細胞が、ウイルスベクターの使用を介して形質導入される、又はポリヌクレオチドの化学的又は電気的送達の使用を介して形質移入されることを指すこともできる。
【００３９】
用語「形質導入」は、形質移入によるのではなく、ウイルスベクター又はレトロウイルスベクターを用いた、ウイルス感染による遺伝子の送達を指す。
【００４０】
用語「アデノ随伴ウイルスベクター」は、パーボウイルス（Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）科のメンバーを指し、一本鎖直鎖状ＤＮＡゲノムを有する小さな非エンベロープ正二十面体ウイルスである。アデノ随伴ウイルスゲノムは、末端逆位反復（ＩＴＲ）を含有し、これは、形質導入される遺伝子の、宿主細胞ゲノム中への統合を可能にする。
【００４１】
用語「形質導入ベクター」は、感染性のウイルス又はウイルス様ベクター、例えば、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのベクター粒子（ＭＭＰ遺伝子又はそのコラーゲン分解ＭＭＰフラグメントをコードする遺伝子を含む発現／運搬プラスミドベクターによる、パッケージング細胞株の同時形質移入から形成される）、パッケージングベクター、及びエンベロープベクターを指す。形質導入ベクターは、形質移入の後に、プロデューサ細胞培養液の上清から収穫される。適切なパッケージング細胞株が当該技術において知られており、例えば、２９３Ｔ細胞株が挙げられる。
【００４２】
用語「導入遺伝子」は、細胞又はゲノム中に導入されるあらゆる異種遺伝子（すなわち、天然に存在しない、又は普通では存在しないあらゆる遺伝子）を指す。
【００４３】
用語「レンチウイルスベクター」は、主にレンチウイルスに由来するＬＴＲ外部の構造及び機能遺伝子エレメントを含有するベクターを指す。
【００４４】
本明細書中で用いられるマトリックス金属タンパク質分解酵素又は「ＭＭＰ」は、アダマライシン、セラリシン、及びアスタシンが挙げられるカルシウム依存性亜鉛含有エンドペプチターゼである。ＭＭＰは、メトジンシンスーパーファミリとして知られている、プロテアーゼのより大きなファミリに属する。コラゲナーゼＭＭＰは、三重螺旋形の線維性コラーゲンを、特徴的な３／４フラグメント及び１／４フラグメントに分解することができる。好ましくは、ＭＭＰとして、以下に限定されないが、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−４、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１３、及びＭＭＰ−１４が挙げられる。
【００４５】
まとめて、これらの酵素は、全ての種類の細胞外マトリックスタンパク質を分解することができるが、いくつかの生物活性分子を処理することもできる。これらは、細胞表面受容体の切断、アポトーシスリガンド（例えばＦＡＳリガンド）の放出、及びケモカイン／サイトカイン不活化に関与することが知られている。ＭＭＰはまた、細胞行動、例えば、細胞の増殖、移動（接着／分散）、分化、血管新生、アポトーシス、及び宿主防御において重要な役割を果たすと思われる。
【００４６】
特に、ＭＭＰ１は、線維性瘢痕組織における主要な構成タンパク質、天然の線維性コラーゲンＩ型及びＩＩＩ型を消化する一方、基底膜の構成要素であるコラーゲンＩＶ型を割く（ｓｐａｒｅ）。ＭＭＰ１はまた、ＥＣＭリモデリング及び細胞シグナル伝達において、細胞表面、マトリックス基質及び非マトリックス基質、例えばＩＧＦ結合タンパク質、Ｌ−セレクチン、並びにＴＮＦαに作用することによって、重要な役割を果たし得る（Ｐａｒｄｏ  ＆  Ｓｅｌｍａｎ，２００５）。ＭＭＰ１は、チモーゲン（その「プロ」形態）として発現され、段階的タンパク質分解開裂が活性化に必要とされる。プロドメイン内の保存されたシステインは、触媒部位内の亜鉛イオンへの結合により、ＭＭＰ１を不活性状態で維持するのに必要とされる（「システインスイッチ」として知られている）。具体的には、ＭＭＰ１は、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型のコラーゲンを、三重螺旋形のドメイン中の、Ｎ末端から約四分の三の分子長の一部位にて切断する。
【００４７】
本発明は、硬化性の症状を患っている患者への、ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドで形質移入又は形質導入された細胞の送達に関する。本発明の実施形態において、ＭＭＰ又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチドは、ウイルスベクターで送達される。好ましくは、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。別の実施形態において、ウイルスベクター、例えばレンチウイルスベクターは、遺伝子スイッチ系を含み、これは、活性化リガンドの存在下で、ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントの条件的発現を可能にする。遺伝子スイッチ系が用いられる場合、活性化リガンドが、ＭＭＰベクターの投与の前に、投与と同時に、又は投与の後に、投与される。活性化リガンドは、遺伝子スイッチを、したがってＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントの発現をオン又はオフにし得るのに十分なやり方で、患者に（持続期間にわたって）周期的に投与されてよく、又は与えずにおかれてよい。本発明の別の態様において、硬化性の症状の患者から収穫された細胞が、ＭＭＰ又はそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド配列及び当該ポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された遺伝子スイッチ系を含むレンチウイルスベクターで形質導入されて、形質導入された細胞は、培養されて、同じ硬化性の症状の患者に投与される。遺伝子スイッチ系が用いられる場合には、リガンド活性化因子は、遺伝子スイッチを活性化するために投与され、又は遺伝子スイッチを不活化するために与えずにおかれる。
【００４８】
通常、本明細書中で呼ぶ「ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメント」は、（ｉ）ＭＭＰ；（ｉｉ）ＭＭＰの機能的変異体；（ｉｉｉ）ＭＭＰと実質的に同一のタンパク質；（ｉｖ）ＭＭＰのコラーゲン分解フラグメント；又は（ｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）若しくは（ｉｖ）の生物学的に活性なフラグメントである。
【００４９】
本発明に従えば、ＭＭＰ１をコードするベクターのヌクレオチド配列は、配列番号１のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％、又は１００％同一のヌクレオチド配列を含む。配列番号１において、ＭＭＰ１  ｃＤＮＡの配列は、天然のＭＭＰ１シグナルペプチドが、ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）（配列番号２）のシグナルペプチド配列で置換された、ヒトプロＭＭＰ１のコンセンサス配列に由来し、線維芽細胞からのＭＭＰ１のより効率的な分泌をもたらした。ｃＤＮＡ（１４１０ｂｐ）を生じさせて、初期分析のために、標準的な発現プラスミド中にクローニングした。特に、ＰＥＤＦシグナルペプチドの代わりに、他のシグナルペプチド配列が用いられてもよい。次に、当該ベクター用のＭＭＰ１  ｃＤＮＡを、潜在的スプライス部位を除去するように改変して、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ（活性化リガンド）を用いたＭＭＰ１発現制御用の、誘導遺伝子スイッチ発現カセット（すなわち、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチ）に隣接するｐＦＵＧＷ  ＳＩＮ−ＬＶ骨格（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（１０）：８１５０−８１５７（１９９８年１０月）及び国際公開第２０１７１６１１８０Ａ１号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２２８００号明細書）参照）中にクローニングして、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１ベクター（ＩＮＸＮ−２００５とも呼ばれる）が生じた。
【００５０】
ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１ベクターによって発現されるＭＭＰ１のアミノ酸配列は、配列番号３の配列を有し、この中で、配列番号４の配列は、ヒトＰＥＤＦシグナルペプチドに相当し、この中で、配列番号５の配列は、プレプロＭＭＰ１配列に相当し、これは、活性化と同時に切断されて、配列番号６のアミノ酸配列を含む成熟（酵素的に活性な）ＭＭＰ１タンパク質を形成する。図２は、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１のグラフィック表示を提供する。
【００５１】
なお、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１ベクターは、ベクター「ＩＮＸＮ−２００５」としても知られている。ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１ベクターと実質的に同一且つ／又は相同のベクターが、本発明によって想定される。ＩＮＸＮ−２００５ベクターは、遺伝子スイッチ系を含むレンチウイルスベクター（ＬＶ）を利用する。ＬＶは、複製不全の、水胞性口炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）シュードタイプ化、自己不活化（第３世代）レンチウイルス（ＳＩＮ−ＬＶ）である。特に、ＩＮＸＮ−２００５（ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１）は、レンチウイルスプラットフォームを、エクジソン受容体ベースのリガンド誘導遺伝子スイッチ発現系（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５０９０号明細書及び米国特許第８，７１５，９５９号明細書、並びに／又は国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１２７０号明細書及び米国特許第９，４０２，９１９号明細書中に記載される）と組み合わせて利用して、ＭＭＰ−１タンパク質を条件的に発現する。レンチウイルス骨格は、ウイルス中にパッケージングされることとなる組換えＬＶゲノムの転写に必要とされる最小の必須要素を含有する。ＬＶ骨格内にコードされるのは、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘリガンド誘導遺伝子スイッチが制御するＭＭＰ１の発現に必要とされる要素である。一部の実施形態において、本発明の形質導入レンチウイルスベクターを構築する出発物質は、レンチウイルス発現プラスミドベクター、ｐＳＭＰＵＷ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及びｐＦＵＧＷ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）から選択される。
【００５２】
ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１の要素及びその機能が、以下の表１において一覧にされている。
【００５３】
【表１−１】
2020517615.tif 000003
【００５４】
【表１−２】
2020517615.tif 000004
【００５５】
本発明の実施形態は、リガンド及び遺伝子スイッチ系を用いることにより、患者におけるＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントの発現を制御する能力を備える。遺伝子スイッチ系は、活性化リガンドの追加又は除去により治療タンパク質の遺伝子発現を調節するあらゆる系であってよい。遺伝子スイッチ系の構成要素は、少なくとも１つの誘導プロモータ（それに作動可能に関連する治療タンパク質の発現に関係する）、リガンド誘導転写因子、リガンド誘導転写因子のための同時活性化パートナー、及び活性化リガンドを含む。誘導プロモータは、ＭＭＰ遺伝子の発現を駆動するのに適したあらゆるプロモータであってよい。
【００５６】
リガンド誘導転写因子は、特定の（小分子）活性化リガンドとの相互作用によって遺伝子発現を調節するものであり、その対応する活性化リガンドの存在下又は不在下で制御されることとなる既知のあらゆる転写因子が挙げられる。一例として、リガンド誘導転写因子は、そのそれぞれのリガンド（例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソン、ビタミンＤ、並びにそれらの類似体及び模擬物）によって活性化される核内受容体スーパーファミリ、及びテトラサイクリンによって活性化されるテトラサイクリン制御トランス活性化因子（ｔＴＡ）のメンバーを含む。本発明の一態様において、遺伝子スイッチは、核内受容体ファミリ、例えばエクジソン受容体（ＥｃＲ）ファミリ及びｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ（ＵＳＰ）核内受容体タンパク質ファミリの少なくとも２つのメンバー由来のポリペプチド配列を含むヘテロ二量体タンパク質複合体を含む、エクジソン受容体（ＥｃＲ）ベースの遺伝子スイッチである。
【００５７】
活性化リガンドは、リガンド誘導転写因子と複合体を形成した後に、遺伝子スイッチをトリガしてＭＭＰの発現を刺激する、特異的リガンドである。このリガンドとして、例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、テトラサイクリン、ビタミンＤ、エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ、９−シス−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、Ｎ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン、オキサジアゾリン、ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン；Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン；Ｎ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン；アミドケトン；３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパギド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−サルファート（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−サルファート、ファルネソール（ｆａｍｅｓｏｌ）、胆汁酸、１，１−ビスホスホナートエステル、幼若ホルモンＩＩＩ等が挙げられ得る。本発明に有用なジアシルヒドラジンリガンドの例として、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、ＲＧ−１１５９３２（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、及びＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）が挙げられる。活性化リガンドは、当業者によって理解されるように、場合によっては、遺伝子スイッチをトリガするために必要とされる複合体を形成するのに、他の同時活性化パートナー又はリガンドを必要としてよい。
【００５８】
そのような系の例として、限定されないが、米国特許第６，２５８，６０３号明細書、米国特許第７，０４５，３１５号明細書、米国特許出願公開第２００６／００１４７１１号明細書、米国特許出願公開第２００７／０１６１０８６号明細書、及び国際公開第０１／７０８１６号パンフレットに記載される系が挙げられる。本発明の一態様において、遺伝子スイッチは、ＥｃＲベースの遺伝子スイッチである。そのような系の例として、限定されないが：国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００１／００９０５０号明細書（国際公開第２００１／０７０８１６号パンフレット）；米国特許第７，０９１，０３８号明細書；米国特許第７，７７６，５８７号明細書；米国特許第７，８０７，４１７号明細書；米国特許第８，２０２，７１８号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００１／０３０６０８号明細書（国際公開第２００２／０２９０７５号パンフレット）；米国特許第８，１０５，８２５号明細書；米国特許第８，１６８，４２６号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５２３５号明細書（国際公開第２００２／０６６６１３号パンフレット）；米国特許出願第１０／４６８，２００号明細書（米国特許出願公開第２０１２０１６７２３９号明細書）；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５７０６号明細書（国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレット）；米国特許第７，５３１，３２６号明細書；米国特許第８，２３６，５５６号明細書；米国特許第８，５９８，４０９号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５０９０号明細書（国際公開第２００２／０６６６１２号パンフレット）；米国特許出願第１０／４６８，１９３号明細書（米国特許出願公開第２００６０１００４１６号明細書）；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５２３４号明細書（国際公開第２００３／０２７２６６号パンフレット）；米国特許第７，６０１，５０８号明細書；米国特許第７，８２９，６７６号明細書；米国特許第７，９１９，２６９号明細書；米国特許第８，０３０，０６７号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５７０８号明細書（国際公開第２００２／０６６６１５号パンフレット）；米国特許出願第１０／４６８，１９２号明細書（米国特許出願公開第２０１１０２１２５２８号明細書）；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５０２６号明細書（国際公開第２００３／０２７２８９号パンフレット）；米国特許第７，５６３，８７９号明細書；米国特許第８，０２１，８７８号明細書；米国特許第８，４９７，０９３号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１５０８９号明細書（国際公開第２００５／１０８６１７号パンフレット）；米国特許第７，９３５，５１０号明細書；米国特許第８，０７６，４５４号明細書；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１２７０号明細書（国際公開第２００９／０４５３７０号パンフレット）；米国特許出願第１２／２４１，０１８号明細書（米国特許出願公開第２００９０１３６４６５号明細書）；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１５６３号明細書（国際公開第２００９／０４８５６０号パンフレット）；米国特許出願第１２／２４７，７３８号明細書（米国特許出願公開第２００９０１２３４４１号明細書）；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００９／００５５１０号明細書（国際公開第２０１０／０４２１８９号パンフレット）；米国特許出願第１３／１２３，１２９号明細書（米国特許出願公開第２０１１０２６８７６６号明細書）；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０２９６８２号明細書（国際公開第２０１１／１１９７７３号パンフレット）；米国特許出願第１３／６３６，４７３号明細書（米国特許出願公開第２０１３０１９５８００号明細書）；国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１２／０２７５１５号明細書（国際公開第２０１２／１２２０２５号パンフレット）；及び米国特許第９，４０２，９１９号明細書（これらはそれぞれ、その全体が参照によって組み込まれる）に記載される系が挙げられる。
【００５９】
本発明の別の態様において、遺伝子スイッチは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）の、ＦＫＢＰラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）とのヘテロ二量体化に基づいてよく、そしてラパマイシン又はその非免疫抑制類似体により調節される。そのような系の例として、以下に限定されないが、ＡＲＧＥＮＴ転写技術（ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）、並びに米国特許第６，０１５，７０９号明細書、米国特許第６，１１７，６８０号明細書、米国特許第６，４７９，６５３号明細書、米国特許第６，１８７，７５７号明細書、及び米国特許第６，６４９，５９５号明細書に記載される系が挙げられる。
【００６０】
本発明の別の態様において、本発明の遺伝子発現カセットは、ｃｕｍａｔｅスイッチ系を組み込んでもよく、これは、ｃｕｍａｔｅオペレータ配列に高い親和性で結合するＣｙｍＲリプレッサにより機能する（例えば、ＳＰＡＲＱ  ｃｕｍａｔｅスイッチ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．））。抑制は、ｃｕｍａｔｅ（ＣｙｍＲに結合する非毒性小分子）の添加により緩和される。この系は、誘導性がダイナミックであり、精巧に調整され得、可逆的且つ誘導可能である。
【００６１】
本発明の別の態様において、本発明の遺伝子発現カセットは、リボスイッチを組み込んでもよく、これは、エフェクタに結合して、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質の生成の変化を生じさせる、メッセンジャＲＮＡ分子の調節セグメントである。リボスイッチを含有するｍＲＮＡは、そのエフェクタ分子の濃度に応じて、それ自体の活性の調節に直接関与する。エフェクタは、プリン／ピリミジン、アミノ酸、ビタミン、又は他の小分子補因子に由来する代謝物質であり得る。これらのエフェクタは、ｒｉｂｏｓｗｉｔｃｈセンサ又はアプタマ用のリガンドとして作用する。Ｂｒｅａｋｅｒ，ＲＲ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．（２０１１）４３（６）：８６７−７９。
【００６２】
本発明の別の態様において、本発明の遺伝子発現カセットは、ビオチンベースの遺伝子スイッチ系を組み込んでもよく、この中で、細菌リプレッサタンパク質ＴｅｔＲが、ストレプトアビジンに融合し、これが、ＶＰ１６に融合した合成ビオチン化シグナルと相互作用して、遺伝子発現を活性化する。合成ペプチドのビオチン化は、細菌ビオチンリガーゼＢｉｒＡによって調節されることで、リガンド応答性を可能にする。Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０４，２６４３−２６４８；Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１１（２）：１１７−１２４。
【００６３】
本発明の使用に適した更なる遺伝子スイッチ系が、当該技術において知られており、以下に限定されないが、Ａｕｓｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１２），３１（３）：１５５−１６８（参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されるものが挙げられる。
【００６４】
活性化リガンドは、リガンド誘導転写因子と複合体を形成して、遺伝子スイッチをトリガして、ＭＭＰの発現を刺激する、特異的なリガンドである。このリガンドは、例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、テトラサイクリン、ビタミンＤ、エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡ、９−シス−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、Ｎ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン、例えば、米国特許第６，０１３，８３６号明細書；米国特許第５，１１７，０５７号明細書；米国特許第５，５３０，０２８号明細書；及び米国特許第５，３７８，７２６号明細書、並びに米国特許出願公開第２００５／０２０９２８３号明細書及び米国特許出願公開第２００６／００２０１４６号明細書に開示されるもの；米国特許出願公開第２００４／０１７１６５１号明細書に記載されるオキサジアゾリン；ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、例えば欧州特許出願公開第４６１，８０９号明細書に開示されるもの；Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン、例えば米国特許第５，２２５，４４３号明細書に開示されるもの；Ｎ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン、例えば欧州特許出願公開第２３４，９９４号明細書に開示されるもの；Ｎ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン、例えば米国特許第４，９８５，４６１号明細書に記載されるもの；アミドケトン、例えば米国特許出願公開第２００４／００４９０３７号明細書に記載されるもの；（これらはそれぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる）、並びに、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパギド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−サルファート（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−サルファート、ファルネソール（ｆｒａｍｅｓｏｌ）、胆汁酸、１，１−ビスホスホナートエステル、幼若ホルモンＩＩＩ等が挙げられる他の類似の材料が挙げられ得る。本発明に有用なジアシルヒドラジンリガンドの例として、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、ＲＧ−１１５９３２（３，５−ジメチル−安息香酸（Ｒ）−Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、及びＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）が挙げられる。例えば、米国特許出願第１２／１５５，１１１号明細書及び国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００６７５７号明細書（これらは双方とも、その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）参照。
【００６５】
活性化リガンドは、当業者によって理解されるように、場合によっては、遺伝子スイッチをトリガするために必要とされる複合体を形成するのに、他の同時活性化パートナー又はリガンドを必要としてよい。
【００６６】
本発明の誘導プロモータは、治療遺伝子の発現を駆動することができるあらゆるプロモータであってよく、その活性化は、リガンド誘導転写因子とリガンド活性化因子（そして、場合によっては、同時活性化パートナー）間で形成される活性化複合体の形成によってトリガされる。発現に適したプロモータとして、例えば、ＣＭＶ最初期プロモータ、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモータ、ヒートショックプロモータ、初期及び後期のＳＶ４０プロモータ、レトロウイルス由来のＬＴＲ、並びにメタロチオネイン−Ｉプロモータが挙げられる。原核生物細胞若しくは真核生物細胞、又はそれらのウイルス中での遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモータが用いられてもよい。
【００６７】
本発明にとって好ましい遺伝子スイッチ系は、エクジソン受容体ベースのリガンド誘導遺伝子スイッチであり、これは、小分子活性化リガンド、例えば、限定されないが、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘの制御下で、導入遺伝子発現の調節を可能にする。エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチは、３つの基礎成分：（１）誘導プロモータ；（２）リガンド誘導転写因子及び同時活性化パートナー；並びに（３）活性化リガンド（ＡＬ）（例えば、限定されないが、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ）を含有する。リガンドの不在下では、遺伝子スイッチタンパク質複合体は、「オフ」シグナルを提供して、遺伝子転写を制限する。それに対して、リガンドの存在下では、複合体は、標的遺伝子（ＧＯＩ）発現のための用量依存的「オン」シグナルを提供する。エクジソン受容体ベースで調節される導入遺伝子発現の制御の概略図が、図１に示されている。
【００６８】
エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチの一例で挙げられるのが、２つの融合タンパク質：Ｇａｌ４／ＥｃＲ及びＶＰ１６／ＲＸＲである。これらの融合タンパク質（Ｇａｌ４−ＥｃＲ及びＶＰ１６−ＲＸＲ）の双方のコーディング配列は、複製不全レンチウイルスベクター中に挿入されて、形質導入後に、宿主細胞内で発現され得ることが記載されている。エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチ融合タンパク質の例がさらに、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００２／００５０９０号明細書、米国特許第８，７１５，９５９号明細書、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１１２７０号明細書、米国特許第９，４０２，９１９号明細書、及び国際公開第２００９／０４５３７０パンフレット（参照によって本明細書に組み込まれる）内に記載されている。
【００６９】
エクジソン受容体ベースのものが用いられる場合、本発明に従う方法はまた、小分子活性化リガンド、例えば、限定されないが、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘの投与を含んでもよい。ｖｅｌｅｄｉｍｅｘは、活性化リガンドのジアシルヒドラジン化学クラス（ＤＡＨ）内の化合物である。ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ（そのＵＳＡＮ名）は、以下の化学名を有し：３，５−ジメチル−安息香酸（Ｒ）−Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド；又はＮ−［（１Ｒ）−１−（１，１−ジメチルエチル）ブチル］−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシベンゾイル）−３，５−ジメチルベンゾヒドラジド；そしてＩＮＸＮ−１００１及びＲＧ−１１５９３２としても識別される。ｖｅｌｅｄｉｍｅｘは、式Ｉの構造式を有する：
【化１】
2020517615.tif 000005
【００７０】
このリガンドは、遺伝子治療及び細胞治療における導入遺伝子発現のタイミング及びレベルの制御についての安全性の増強を可能にする。本発明において、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘは、Ｇａｌ４−ＥｃＲリガンド結合融合タンパク質に結合することによって作用する。当該タンパク質は、同時活性化パートナー融合タンパク質（例えば、ＶＰ１６／キメラＲｘＲ／ＵＳＰ）と共に、治療遺伝子転写（ＭＭＰ１）のｍＲＮＡ発現を活性化して、ＭＭＰ１タンパク質の合成及び生成に導く（Ｐａｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）（Ｋａｒｚｅｎｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【００７１】
本発明の別の態様において、細胞は、硬化性の症状を患っている患者から単離又は収穫されて、ＭＭＰタンパク質又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドで形質移入又は形質導入される。その後、形質移入又は形質導入された細胞は、エキソビボで培養されてから、細胞が元々収穫された患者に投与される。ＭＭＰ１タンパク質をコードするポリヌクレオチド発現カセットが遺伝子スイッチを含むならば、硬化性の症状の患者はまた、遺伝子スイッチを活性化するために、活性化リガンドが投与されてもよい。
【００７２】
別の実施形態において、導入遺伝子発現は、送達の方法、例えば、硬化性の病変内への注射によって、所望の作用部位に実質的に制限され得る。これにより、リガンド活性化と組み合わせて、エフェクタの発現を、治療作用がある患部組織内に実質的に制限することで、全身曝露を最小にするので、安全性の懸念を引き下げることができる。
【００７３】
細胞が、硬化性の症状の患者から、既知の方法を介して抽出されて、培養されて、ＭＭＰタンパク質若しくはそのコラーゲン分解フラグメント、又はコラゲナーゼ活性を有する別のタンパク質（例えば、コラーゲン内のペプチド結合を壊す酵素）をコードするポリヌクレオチドでの形質移入又は形質導入（好ましくは、ウイルスベクターの使用によりなされる）が可能となる。遺伝子治療での送達に適したあらゆるウイルスベクターが用いられてよい。本発明において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、又はレンチウイルスベクターである。好ましくは、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００７４】
本発明の形質導入ベクターを構築するために用いられるレンチウイルスベクターは、トランスフェクション又は感染により、パッケージング細胞株に導入される。パッケージング細胞株は、ベクターゲノムを含有する形質導入ベクター粒子を産生する。パッケージング細胞株に対するパッケージングベクター、トランスファーベクター、及びエンベロープベクターの同時トランスフェクションの後、培地から組換えウイルスを回収して、当業者により使用される標準的な方法により滴定する。ゆえに、パッケージング構築体は、場合によっては優性選択マーカー、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、ＤＨＦＲ、グルタミン合成酵素、又はＡＤＡが一緒の、リン酸カルシウム形質移入、リポフェクション、又はエレクトロポレーションに続く、適切な薬物の存在下での選択及びクローンの単離によって、ヒト細胞株中に導入され得る。選択マーカー遺伝子は、構築物中のパッケージング遺伝子と物理的に連結させることができる。
【００７５】
パッケージング機能が、好適なパッケージング細胞により発現されるように構築された安定な細胞株は公知である。例えば、パッケージング細胞について記載する米国特許第５，６８６，２７９号明細書；及びＯｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）を参照されたい。レンチウイルスベクターが中に組み込まれたパッケージング細胞は、プロデューサ細胞を形成する。したがって、プロデューサ細胞は、目的の治療遺伝子を担持するパッケージングされた感染ウイルス粒子を産生又は放出することができる細胞若しくは細胞株である。好適なレンチウイルスベクターパッケージング細胞株の例として、２９３細胞がある。
【００７６】
組み込まれたトランスジーンのコピー数は、いずれか公知の方法を用いて評価することができる。例えば、定量ＰＣＲ、多重連結依存性プローブ増幅、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、マイクロアレイによるコピー数スクリーニング、及び通常の核型分析によって、コピー数を決定してもよい。各細胞に組み込まれたトランスジーンのコピー数は、製造中に細胞に投与するウイルス用量によってモジュレートしてもよい。ＭＭＰ含有ベクターで形質導入された硬化症状の採取細胞における細胞当たりの組込みトランスジーンコピー数は、用量依存的である。
【００７７】
一実施形態において、細胞内のＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり、正確に、約、少なくとも以下の値であり、又は以下の値を超えない：０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、又は５。
【００７８】
一実施形態において、細胞ゲノム中に統合されるＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり、正確に、約、少なくとも以下の値であり、又は以下の値を超えない：０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、又は５。
【００７９】
特定の実施形態において、細胞内のＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり１コピー超である。
【００８０】
特定の実施形態において、細胞内のＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり５コピー未満である。
【００８１】
特定の実施形態において、細胞内のＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり１コピー超且つ５コピー未満である。
【００８２】
特定の実施形態において、細胞内のＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり約１〜５コピーである。
【００８３】
特定の実施形態において、細胞内のＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり約２〜５コピーである。
【００８４】
特定の実施形態において、細胞内のＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり約３〜５コピーである。
【００８５】
特定の実施形態において、細胞内のＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり約４〜５コピーである。
【００８６】
特定の実施形態において、細胞内のＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり約５コピーである。
【００８７】
特定の実施形態において、細胞ゲノム中に統合されるＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり１コピー超である。
【００８８】
特定の実施形態において、細胞ゲノム中に統合されるＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり５コピー未満である。
【００８９】
特定の実施形態において、細胞ゲノム中に統合されるＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり１コピー超且つ５コピー未満である。
【００９０】
特定の実施形態において、細胞ゲノム中に統合されるＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり約１〜５コピーである。
【００９１】
特定の実施形態において、細胞ゲノム中に統合されるＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり約２〜５コピーである。
【００９２】
特定の実施形態において、細胞ゲノム中に統合されるＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり約３〜５コピーである。
【００９３】
特定の実施形態において、細胞ゲノム中に統合されるＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり約４〜５コピーである。
【００９４】
特定の実施形態において、細胞ゲノム中に統合されるＭＭＰ又は他のコラーゲン分解導入遺伝子の数は、１細胞あたり約５コピーである。
【００９５】
本発明の別の実施形態において、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰベクターは、硬化性の症状の患者の生検から収穫されたヒト真皮細胞、例えば線維芽細胞を形質導入するのに用いられてよい。形質導入されたヒト真皮細胞（ＨＤＦ）は、エキソビボで培養されてから、同じ患者中に再導入される。このように、ＭＭＰ遺伝子を有するように遺伝子改変された自己由来細胞の生成は、段階的になされてもよい。ステージ１は、生検、酵素的消化、初期細胞の増殖、及び生検細胞株のクライオ凍結を包含し得る。ステージ２は、凍結した細胞株の解凍、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ形質導入用の細胞の増殖、追加の細胞増殖、細胞収穫、及びクライオ凍結から始めて、形質導入された細胞を生成し、これがその後、患者中に投与により戻される。好ましくは、硬化性の症状の患者の生検から収穫された細胞は、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰで形質導入されて、形質導入された細胞は、同じ硬化性の症状の患者中に投与により戻される。一実施形態において、形質導入された細胞は、「ＦＣＸ−０１３」原薬と呼ばれる。図３は、ＦＣＸ−０１３原薬の生成についての、本発明の範囲内の高レベルプロセスフロー図を示す。
【００９６】
本発明に従って、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘを用いたＦＣＸ−０１３の皮内投与は、ＭＭＰレベルを局所的に増大させて、硬化性の領域内に存在する過剰なコラーゲンを分解することとなる。機械形質導入の分野における研究は、組織の剛性の引下げが、ＭＭＰ及び抗線維形成剤、例えばプロスタグランジンの生成を、フィードフォワードループにおいて増大させることによって抗線維形成環境を促進することによって、継続中の線維形成に影響を与え得ることを示唆している（Ｃａｒｖｅｒ  ＆  Ｇｏｌｄｓｍｉｔｈ，２０１３）。
【００９７】
遺伝的スイッチが、リガンド活性化因子としてのｖｅｌｅｄｉｍｅｘの使用を必要とする場合、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘを含む組成物は、適切なあらゆる濃度に調合され得る。ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ製剤は、種々の強度でカプセル化されてもよく、例えば、経口投与用に５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、又は１００ｍｇの強度が挙げられる。一部の実施形態において、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ製剤は、経口投与用に、カプセルあたり５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、又は５０ｍｇのｖｅｌｅｄｉｍｅｘにてカプセル化されて用いられる。ｖｅｌｅｄｉｍｅｘは、少なくとも１週、２週、３週、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、又は６ヵ月の間、毎日投与されてもよい。一部の実施形態において、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘは、１日１回、５ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、又は３０ｍｇの量で投与される。別の好ましい実施形態において、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘは、１日１回、４０ｍｇの量で投与される。ｖｅｌｅｄｉｍｅｘの供与量が、毎日２回、毎日１回、２日に１回、３日に１回、又は他の、少なくとも７日、１０日、１４日、２１日、２８日、３０日、６０日、９０日、若しくはそれ以上の定期的な間隔にて投与されてもよい。
【００９８】
ｖｅｌｅｄｉｍｅｘは、２つの融合タンパク質間でヘテロ二量体化を安定化させて、活性のある転写因子を形成することによって作用する。この活性のある転写因子は、リガンド誘導遺伝子発現系の制御下に配置された標的導入遺伝子の発現を誘導する（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）、（Ｌａｐｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）、（Ｐａｌｌｉ，２００３）、（Ｓｈｅａ  ＆  Ｔｚｅｒｔｚｉｎｉｓ，２０１０）、（Ｗｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）、（Ｋａｔａｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【００９９】
遺伝子スイッチが遺伝子発現系中に組み込まれている特定の実施形態において、活性化リガンド（例えば、限定されないが、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ）の存在又は不在はそれぞれ、ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントの発現をオン又はオフにするように作用することができる。例えば、参照タンパク質の発現用の長期カイネティクスを判定するインビトロ研究がマウスにおいて行われ、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘの投与が経時的に変更された。ｖｅｌｅｄｉｍｅｘがリガンド活性化因子である参照遺伝子スイッチに作動可能に関連するタンパク質についてのオン／オフグループ期間は、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘの存在又は不在に直接関連することが示された。特に、表３並びに図５及び図６は、例えば、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１で形質導入された自己由来細胞の投与と組み合わせたｖｅｌｅｄｉｍｅｘの存在又は不在が、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチに作動可能に関連するＭＭＰ−１タンパク質の制御される発現と直接相関することを直接的に示している。当業者が知っており、且つ理解するように、「オフ」発現は、ゼロ（０）の検出可能な遺伝子発現を必ずしも意味するわけではない。その代わりとして、「オフ」発現は、遺伝子発現が、「オン」又はリガンドで活性化された遺伝子発現状態と比較して、実質的に引き下げられたことを意味する。
【０１００】
本発明は、過剰なコラーゲンを伴う硬化性の症状及び疾患の処置及び／又は予防に関する。そのような症状及び疾患として、限局性強皮症が挙げられ、線状硬皮症、限局性強皮症、全身性限局性強皮症、汎硬化性限局性強皮症、及び混合限局性強皮症、並びに１）汎発性強皮症（ＳＳｃ）（具体的には、強指症及び内臓線維形成）；２）以下が挙げられる皮膚線維形成：ａ）限局皮膚ＳＳｃ（ＩＳＳｃ）及びｂ）びまん性皮膚ＳＳｃ（ｄＳＳｃ）；３）間質性肺疾患（ＩＬＤ）を伴う汎発性強皮症（ＳＳｃ−ＩＬＤ）；４）エディマタス・ファイブロスクレロティック・パニキュロパシ（セルライト）；５）癒着性関節包炎（五十肩）；６）レイノー現象（ＲＰ）；７）乾癬；８）肝臓線維形成（非アルコール性脂肪肝炎が挙げられる）；９）腎臓線維形成（巣状分節性糸球体硬化症が挙げられる）；１０）心筋線維症；１１）慢性関節リウマチ；１２）クローン病；１３）潰瘍性大腸炎；１４）骨髄線維症；１５）全身エリテマトーデス（ＳＬＥ）；１６）骨格筋線維形成（急性的な損傷に従う、又は慢性神経変性筋疾患に起因する）；１７）外眼筋の先天性線維形成（ＣＦＥＯＭ１、ＣＦＥＯＭ２、ＣＦＥＯＭ３、及びＴｕｋｅｌ症候群）；１８）慢性移植片対宿主疾患；１９）肥厚性瘢痕；２０）特発性肺線維形成；２１）サーベル状切痕；２２）デュピュイトラン拘縮；２３）ペイロニー病；２４）肥厚性瘢痕；２５）硬皮症に関連する手の機能不全；２６）放射線線維形成症候群；並びに２７）他の硬化性の症状が挙げられる。
【０１０１】
ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、投与のために、患者の皮膚に遺伝子を直接送達するのに適した既知の方法によって送達される。ポリヌクレオチドは、注射によって、局所的に、又は移植可能な装置によって、送達されてもよい。各投与は、罹患組織の鮮創の後であってよい。
【０１０２】
一実施形態において、投与は：１）病変内に直接塗布（注射又は局所塗布）する；２）線維芽細胞をコラーゲンマトリックス内に埋め込む；３）線維芽細胞をヒドロゲル又はメッシュ内に埋め込む；４）線維芽細胞をポリマーカプセル内にカプセル化する；５）線維芽細胞を肝臓中に動脈内注射する；そして６）全身に局所投与することによる。
【０１０３】
一実施形態において、ポリヌクレオチドは、注射によって送達される。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ウイルスベクターを介して、遺伝子スイッチと組み合わせて送達される。別の実施形態において、ポリヌクレオチドは、収穫された自己由来細胞に送達されて（これは、ＭＭＰをコードするポリヌクレオチドをコードするウイルスベクターによる形質導入である）、形質導入された細胞が、患者に投与される。一実施形態において、ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントのポリヌクレオチドを含むベクターが、単回投与される。別の実施形態において、ベクターは、処置中に１〜２回、１〜３回、１〜４回、又は１〜５回、投与される。別の実施形態において、ＭＭＰ遺伝子（又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードする）を含む自己由来の形質導入された細胞が、処置中に１〜２回、１〜３回、１〜４回、又は１〜５回、投与される。
【０１０４】
ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドは、細胞を形質導入して、ＭＭＰタンパク質又はそのコラーゲン分解フラグメントを発現するのに十分な量で送達される。本発明の一態様において、ＩＮＸＮ−２００５ベクター又はＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰベクターは、硬化性の症状の患者の生検から収穫された細胞中に送達されて、形質導入された細胞が、硬化性の症状の患者に投与される。ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントのポリヌクレオチドを含むベクターの供与量は、Ｉ、ＩＩ、及び／若しくはＩＩＩ型コラーゲンの引下げ、又は抗線維形成作用により示されるコラーゲン分解作用を誘導するのに効果的なＭＭＰ遺伝子産物を発現するように細胞を形質導入するのに十分である。例えば、ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解若しくは抗線維形成フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むベクターの供与量は、所望の効果に達するのに有効な、適切なあらゆる量であってよい。これ以外にも、有効量は、線維形成作用、ＥＣＭ蓄積作用若しくはコラーゲン形成作用を引き下げ、阻害し、若しくは予防するのに必要な量、又は硬化性の症状を和らげ、若しくは阻害するのに必要とされる量であってよい。例えば、硬化性の症状の患者は、エクジソン受容体ベースの遺伝子発現系を含み、且つＭＭＰ導入遺伝子、例えばＩＮＸＮ−２００５を、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘと組み合わせて含むベクターで処置された患者について、処置前の硬化性の症状と比較して、又はｖｅｌｅｄｉｍｅｘなしでＩＮＸＮ−２００５で処置された患者若しくは処置なしの患者と比較して、ＥＣＭ蓄積が、１０、２０、３０、３５、４０、４５、５０、又は５５％引き下げられることが見出され得る。好ましくは、コラーゲン分解作用は、エクジソン受容体ベースの遺伝子発現系を含み、且つＭＭＰ導入遺伝子、例えばＩＮＸＮ−２００５を、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘと組み合わせて含むベクターで処置された患者について、コラーゲン形成又はＥＣＭ蓄積が、少なくとも５０％又は少なくとも５５％引き下げられる。これ以外にも、硬化症疾患の処置からもたらされるコラーゲン分解作用は、エクジソン受容体ベースの遺伝子発現系及びＭＭＰ−１導入遺伝子、例えばＩＮＸＮ−２００５を、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘと組み合わせて含む自己由来細胞で処置された患者について、処置前の硬化性の症状と比較して、又はｖｅｌｅｄｉｍｅｘなしでＩＮＸＮ−２００５で処置した患者若しくは処置なしの患者と比較して、コラーゲンＩ、ＩＩ、及び／若しくはＩＩＩ型、又はコラーゲン形成が、１０、２０、３０、３５、４０、４５、５０、又は５５％引き下げられることが見出され得る。好ましくは、コラーゲン分解作用は、エクジソン受容体ベースの遺伝子発現系を含み、且つＭＭＰ導入遺伝子、例えばＩＮＸＮ−２００５を、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘと組み合わせて含む自己由来細胞で処置された患者について、コラーゲン形成を少なくとも５０、又は少なくとも５５％引き下げる。一部の態様において、硬化性の症状の処置又はコラーゲン形成の低下は、コラーゲンＩ型、コラーゲンＩＩＩ型、及び／又はＴＧＦβの濃度の低下と相関する。本発明の別の態様において、コラーゲン形成の阻害は、ＩＦＮ−ガンマの増大によ���て表される。
【０１０５】
ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドが、遺伝子スイッチ系により条件的に発現される場合、リガンド活性化因子は、ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドの投与の前に、投与と同時に、且つ／又は投与の後に、患者に投与される。リガンド活性化因子は、遺伝子スイッチを活性化するのに適したあらゆる方法で投与されてよく、注射によるもの、局所的なもの、移植可能な装置によるもの、又は全身的なもの、例えば経口的なもの、静脈内へのもの、皮下若しくは筋肉内注射、非経口注射、真皮送達、又は経鼻送達が挙げられる。好ましくは、リガンド活性化因子は、経口投与される。リガンド活性化因子は、適切なあらゆる医薬キャリア中に存在してもよいし、持続的放出系用に設計された医薬組成物で送達されてもよい。ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドの投与のタイミングは、好ましくは、リガンド活性化因子の投与前である。本発明の一部の態様において、リガンド活性化因子は、ＭＭＰ若しくはそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドの注射の、又はＭＭＰ若しくはそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドで形質移入若しくは形質導入された細胞の注射の１、２、３、４、又は５日後に投与されてもよい。リガンド活性化因子はさらに、引き続いて、又は断続的に、毎日、毎週、又は毎月投与されて、ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントの発現を活性化してもよい。本発明の一態様において、リガンド活性化因子は、遺伝子スイッチ系に作動可能に連結されたＭＭＰ若しくはそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチド、又はそのようなポリヌクレオチドを含む形質導入された細胞の投与後の少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、又は少なくとも１００日までの間、毎日投与される。ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントの発現が止められることが所望される場合、リガンド活性化因子は今後は患者に投与されず、遺伝子スイッチが効果的にオフになる。好ましくは、リガンド活性化因子は、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘである。ＭＭＰ又はそのコラーゲン分解フラグメントの発現は、リガンド活性化因子が引き続いて投与されるならば、患者の寿命にわたって起こり得ると考えられる。
【０１０６】
リガンド活性化因子は、遺伝子スイッチを所望の期間活性化するのに十分な量で送達される。例えば、活性化リガンド（例えば、限定されないが、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ）が毎日投与される場合、供与量は、１０〜１００ｍｇ、２５〜７５ｍｇ、３０〜５０ｍｇ、又は４０〜５０ｍｇの強度で投与されてもよい。当業者であれば、送達系に基づいてリガンド活性化因子の供与量を、そして遺伝子スイッチを活性化する有効性の所望の期間を調整することができるであろう。
【０１０７】
本開示の医薬組成物は、適切な薬学的に許容可能なあらゆるキャリアを含んでもよい。適切なキャリアとして、以下に限定されないが、水、デキストロース、グリセロール、生理食塩水、エタノール、及びそれらの組合せが挙げられる。キャリアは、更なる剤、例えば、湿潤剤若しくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、又は製剤の有効性を増強するアジュバントを含有し得る。局所用のキャリアとして、石油、イソプロピルパルミタート、ポリエチレングリコール、エタノール（９５％）、水中ポリオキシエチレンモノラウラート（５％）、又は水中ラウリル硫酸ナトリウム（５％）が挙げられる。他の材料、例えば、抗酸化剤、湿潤剤、粘性安定化剤、及び類似の剤が、必要に応じて加えられてもよい。
【０１０８】
本開示の医薬組成物は、以下を含んでもよいし、以下と同時（同時、処理前、又は処理後）投与されてもよい：１）ボツリヌス毒素（例えばボトックス）；２）抗ＩＬ６バイオロジック（例えばトシリズマブ）；３）抗ＣＤ２０バイオロジック（例えばリツキシマブ）；４）選択的同時刺激調節因子（例えばアバタセプト）；５）可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激因子；血管拡張薬及び抗線維形成剤として作用する（例えばＢＡＹ６３−２５２１）；６）ベータグリカンペプチド；ＴＧＦ−ベータシグナル伝達を阻害する（例えばＰ１４４クリーム）；７）ＣＢ２受容体活性化因子；免疫応答を阻害する；８）抗ＢＬｙＳバイオロジック；Ｂ細胞の生存／分化を抑止する（例えばベリムマブ）；９）ＰＰＡＲ活性化因子、抗線維形成（例えばＩＶＡ−３３７）；１０）ピリドン誘導体（例えばピルフェニドン）；１１）凝固因子ＸＩＩＩ；１２）クロストリジウムコラゲナーゼ；１３）サリドマイド誘導体−抗血管新生及び免疫調節物質（例えばＣＣ−４０４７）；１４）ベータ−カテニン／ＣＢＰ調節因子；抗線維形成剤（例えばＣ−８２）；１５）ＩＬ１−ＴＲＡＰ（例えばＩＬ１−ＴＲＡＰ）；１６）オンコスタチンＭ  ｍＡｂ；抗線維形成／免疫調節物質（例えばＧＳＫ−２３３０８１１）；１７）重水素含有ピルフェニドン（例えばＳＤ−５６０）；１８）ｍｉＲ−２９類似体（例えばＭＲＧ−２０１）；並びに１９）脂肪由来新生細胞（例えばＥＣＣＣＳ−５０）。
【０１０９】
硬化性の症状の処置に適した医薬処置のキット又は系もまた、本発明の範囲内である。本発明の医薬処置の系又はキットは、遺伝子スイッチ系に連結される、ＭＭＰタンパク質又はそのコラーゲン分解フラグメントをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを、そして別個に、遺伝子スイッチ系を活性化するのに用いられる活性化リガンドを含む注射可能な組成物を含んでよい。
【実施例】
【０１１０】
実施例１
ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１レンチウイルスの構築及び特性評価
ＭＭＰ１遺伝子を、培養線維芽細胞に、組換えレンチウイルスベクター（ＬＶ）、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１を用いて導入した。ＬＶは、複製不全の、水胞性口炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）シュードタイプ化、自己不活化（第３世代）レンチウイルス（ＳＩＮ−ＬＶ）である。ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１は、配列番号１に相当するヌクレオチド配列を有し、アミノ酸配列は、配列番号３の配列を有する。
【０１１１】
ヒトＭＭＰ１遺伝子のソース
ＭＭＰ１  ｃＤＮＡの配列（配列番号１）は、線維芽細胞からのＭＭＰ１のより効率的な分泌を実現するために、天然のＭＭＰ１シグナルペプチドが、ヒト色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）（配列番号２）のシグナルペプチド配列で置換されている、ヒトプロＭＭＰ１のコンセンサス配列に由来した。初期の分析のために、ｃＤＮＡ（１４１０ｂｐ）を生成して、標準的な発現プラスミド中にクローニングした。次に、ＭＭＰ１  ｃＤＮＡを改変して、潜在的スプライス部位を除去して、活性化リガンド、例えば、限定されないが、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘを用いたＭＭＰ１発現制御のために、エクジソン受容体ベースの発現カセットに隣接するｐＦＵＧＷ  ＳＩＮ−ＬＶ骨格中にクローニングして、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１ベクターを生成した。図２は、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１のグラフ表示を示す。
【０１１２】
実施例２：ＦＣＸ−０１３及びｖｅｌｅｄｉｍｅｘのバックグラウンド
２．１  インビトロ研究
ＭＭＰ１のｖｅｌｅｄｉｍｅｘ誘発発現を、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１での形質導入によって遺伝子改変した一次線維芽細胞内で評価した。正常な一次ヒト真皮線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を、研究グレードＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１株の種々の希釈物で形質導入した。形質導入後２継代の後に、形質導入したＮＨＤＦ（ＨＤＦ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１）を、２４ウェルプレート中に播種して、１００ｎＭ  ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ又は０．１％ＤＭＳＯ（ビヒクル）で処置した。ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１で形質導入していないＮＨＤＦ（「ｍｏｃｋ」）も研究に含めた。細胞上清を、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ又はＤＭＳＯの添加の７２時間後に収集して、ＭＭＰ１発現レベルについて、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＤｕｏＳｅｔ）によって分析した。また、細胞を収集して、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１構築体に特異的なプライマー及びプローブを用いたｑＰＣＲによって、統合したＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１のコピー数（細胞あたりの平均）について分析した。３つの形質導入研究の結果を、以下の表２で、そして図４で視覚的に詳述する。ＭＭＰ１発現の高いレベルが、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘの存在下で見られた。非誘導レベルは、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１希釈物がより高い（ＭＯＴがより低い）ｍｏｃｋ形質導入レベルと類似した。平均統合コピー数は、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１用量と比肩し、５．７コピー／細胞もの高いコピー数が達成された。
【０１１３】
【表２】
2020517615.tif 000006
【０１１４】
２．２  インビボ研究
限局性硬皮症の疾患表現型を完全に再現する齧歯類モデルは、現在入手可能でない。さらに、近い齧歯類モデルは、免疫能力があり、遺伝子修飾ヒト細胞の評価を妨げる。ＦＣＸ−０１３が潜在的有効性を有するかを扱うために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを利用してブレオマイシン誘発硬皮症モデルを選択して、ＧＭ線維芽細胞によって発現されたＭＭＰ１が、真皮線維形成を食い止めることができるかを評価した。１：１６の用量で形質導入したＨＤＦ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１細胞（平均５．７の統合コピー／細胞）（上述の表２の形質導入＃３）、及びｍｏｃｋ形質導入細胞（非ＧＭ）を、さらに（形質導入後６継代にまで）増殖させて、インビボ研究に用いるのに十分な細胞数を得てから、低温保存した。それぞれのバイアルを解凍して、培養して、ＥＬＩＳＡによって、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ（＋ＡＬ）又は０．１％ＤＭＳＯ（ＡＬなし）の存在下で、誘導ＭＭＰ１発現について再確認した。結果を、以下の表３に示す。
【０１１５】
【表３】
2020517615.tif 000007
【０１１６】
以下の表４のインビボ研究設計において詳述するように、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ブレオマイシン（又は生理食塩水；群４）の真皮注射を、１日おきに４週間受けさせた。最後のブレオマイシン処置の翌日に、マウスに、ＨＤＦ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１細胞（群１及び２）、非修飾細胞（群３）、又は細胞なし（注射なし、群４）を、ブレオマイシン注射と同じ位置中に注射した。細胞注射と同じ日に開始して、マウスは、連続１０日間の経口強制飼養によって、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ（群２、３、及び４）又は賦形剤（ｃａｐｒｙｏｌ９０／トリアセチン；群１）を受けた。細胞の注射後１０日目に、注射部位の生検を行って、組織構造について保存した。組織切片を、Ｈ＆Ｅで染色して、画像化して、真皮厚さを、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて測定した（マウスあたり５スライド、スライドあたり５画像；１０×倍率、１ピクセル＝０．８６８６μｍコンバージョン）。各群の各マウスについてランダムに選択した画像を、図７に示す。また、血清を、研究２８、３３、及び３９日目（線維芽細胞の注射後−１｛採血前｝、４、及び１０日目）に各マウスから収集して、循環ＭＭＰ１についてアッセイした（図６）。
【０１１７】
【表４】
2020517615.tif 000008
【０１１８】
図５に示すグラフは、ＨＤＦ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１細胞の皮内注射によるブレオマイシン誘発病変の処置が、真皮層（図５Ａ）及び皮下筋層（図５Ｂ）の厚さを薄くすることを示している。さらに、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘの経口送達によるＭＭＰ１発現の誘導は、非ブレオマイシン（生理食塩水）処置した皮膚と類似のレベルにまで、真皮の厚さを薄くし（図５Ａ）、そしてさらに、皮下筋層の厚さを薄くした（図５Ｂ）。データは、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ活性化なしでインビトロで測定した低いレベルのＭＭＰ１発現（おそらく、統合されたＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１コピー数が高いことに起因する人為現象である）ですら、真皮及び皮下筋の厚さに影響を及ぼしたことを示唆している。
【０１１９】
ＭＭＰ１は、この研究において、用いた細胞によって、全身的に検出するのに十分高いレベルにてインビボ発現された（図６）。高いレベルのＭＭＰ１が、ベクタープラスｖｅｌｅｄｉｍｅｘで処置した動物の血清中で検出されるが、ＭＭＰ１は、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘなしでベクターで処置した動物の血清中で、検出可能でない。このことは、低いレベルのＭＭＰ１が、真皮の厚さを薄くするのに十分であり得ることを示唆している。
【０１２０】
実施例３：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける研究
この実施例は、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのブレオマイシン誘発（ＢＬＭ誘発）疾患モデルを用いた研究を記載する。図８は、処置スケジュールの概要を示す。
【０１２１】
表は、研究群の説明を記載する。
【０１２２】
この研究の設計は、以下を示した実験データ（データ示さず）を前提とする：
【０１２３】
ＦＣＸ−０１３プラスｖｅｌｅｄｉｍｅｘを投与したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおいて、ＭＭＰ１発現（タンパク質及びｍＲＮＡ）は、ＦＣＸ−０１３の注射後２４時間〜３日目で最大であり、２８日目までに検出不能となった。
【０１２４】
タンパク質発現は、ＢＬＭ未処置動物と比較して、ＢＬＭ処置動物においてより高かった。
【０１２５】
観察された全身毒性は、ブレオマイシン処置に由来した。
【０１２６】
明確な毒性は、２×１０６個のＦＣＸ−０１３細胞と関連しなかった。
【０１２７】
ＤＮＡコピー数及びＭＭＰ１発現の迅速な下降が、ＦＣＸ−０１３の注射後１０日目までにあった。
【０１２８】
コピー数の目標は、好ましくは、十分なＭＭＰ１発現を確実にするために、細胞あたり１コピー超であるべきであり、そして、硬皮症等の障害を処置する際の安全性及び有効性のために、細胞あたり約５コピー以下であるべきである。
【０１２９】
この実施例の研究の目的は、毒性、ベクターの生体内分布、ベクターの持続性、及び皮内に注射されたＦＣＸ−０１３細胞のＭＭＰ１発現を評価すること、並びにＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスのＢＬＭ誘発硬皮症モデルの正常な、そして硬化性の皮膚における作用を観察することである。
【０１３０】
本研究を、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを利用して、ブレオマイシン誘発硬皮症モデルにおいて行う。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに、ブレオマイシン又は生理食塩水の真皮注射を、１日（Ｄ又はｄ）おきに４週間受けさせる（研究の１日目（Ｄ１）は、ＢＬＭによる処置の開始を表す）。最後のブレオマイシン処置の翌日に、マウスに、ＦＣＸ−０１３細胞、非修飾細胞、又は細胞なしを、ブレオマイシン注射と同じ位置中に注射する。細胞注射と同じ日に開始して、マウスに、連続３０日間の経口強制飼養によって、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ又は賦形剤を受けさせる。一部の群において、１４日の回復期がある。最終回の評価は、ビヒクル、ＦＣＸ−０１３細胞、又は非−ＧＭ−ＨＤＦ細胞の注射の３、１０、３０（そして回復群において４５）日後に行う。血清を、細胞注射の３及び１０日後に各マウスから収集して、循環ＭＭＰ１についてアッセイする。具体的には、血清を、マウス（１０日目に犠牲にする）から（細胞の注射後）３日目に収集し、そして血清を、マウス（３０日目に犠牲にする）から（細胞の注射後）１０日目に収集する。
【０１３１】
研究処置群を、以下に示す。
【０１３２】
【表５−（ａ）】
2020517615.tif 000009
【０１３３】
【表５−（ｂ）】
2020517615.tif 000010
【０１３４】
ブレオマイシン試薬の皮内投与経路、用量、及びレジメンを、真皮硬化モデルを誘導するように選択する。ｖｅｌｅｄｉｍｅｘの経口投与経路、用量、及びレジメンを選択する。なぜなら、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘが経口的に与えられ、そして最大用量が、臨床的に与えられ得る用量を包含するからである。被験物質の皮内投与経路を選択する。なぜならこれが、ヒト投与経路となり得るからである。
【０１３５】
以前の研究において、細胞あたり５．７±０．６９の平均コピーを有するＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１修飾ＨＤＦによる処置は、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘの存在下で、１５７１±５４ｎｇ／ｍＬ  ＭＭＰ１タンパク質をインビトロで発現し、そしてブレオマイシンで処置したＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの真皮及び皮下筋の双方の厚さを有意に薄くした。さらに、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘの不在下で、真皮及び皮下筋の厚さを、中程度に、しかし有意に薄くした。インビトロで、この５．７コピー数の細胞は、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘの不在下で１９．９±１．２ｎｇ／ｍＬ  ＭＭＰ１タンパク質を発現した。これは、異なる研究で用いたより低い０．８３コピー数の細胞について、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘの存在下でインビトロで発現されたＭＭＰ１のレベルと類似する。インビトロ形質導入研究からのＭＭＰ１発現レベルに基づいて、コピー率とＭＭＰ１発現との間に線形相関があり得る。加えて、ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１の約１コピー／細胞は、マウスにおいて識別可能な毒性を示さないが、真皮の厚さ及び真皮線維形成の双方を引き下げる有効性の有意な低下を示すことが観察された。したがって、群の細胞の総数が３つに異なる（３×１０５、１×１０６、３×１０６）約５コピー／細胞のコピー数標的を、本研究で試験することとする用量として選択する。
【０１３６】
手順、観察、及び測定
生存度チェック
頻度：１日２回、朝に１回、そして午後に１回、研究を通してなされる。
臨床観察
頻度：順応期間の間に少なくとも１回、投薬日の用量投与前に少なくとも１回、そしてその後毎日１回。
服用後
頻度：臨床観察値を、用量投与後１〜２時間、そして１日の終わりに記録する。服用後観察のタイミングは、延長してもよい。臨床観察値を、服用後期間の残りについて、毎日記録する。
体重
頻度：順応期間の間、少なくとも毎週。用量投与の日、そして服用後期間の間、少なくとも週に２回（予定した安楽死の日を含む）。
臨床病理
血液学的検査
頻度：細胞の注射後３、１０、及び３０日目。
【０１３７】
ＰＣＲ用の組織の収集及び保存
ＰＣＲ組織収集テーブルにおいて同定した組織の代表的なサンプルを、無菌的技術を用いた細胞特異的定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）分析のために収集する。腹部を切開し、そして血液を、血液学的評価のために大静脈から収集する。組織の小切片（可能な場合、病変／腫瘤の全体を含む）を、臓器から切り出して、組織切片の重量を記録する。サンプルを、秤量後直ちに、ドライアイス／アルコール浴で急速凍結して、分析のための出荷まで維持（＜−６０℃）するようにセットしたフリーザ内に配置するまで、ドライアイスを含有するクーラー内に配置する。
【０１３８】
ベクター／ｍＲＮＡ  ｑＰＣＲ
組織及び主要な臓器の注射部位及び選択リストを、ベクター及びＭＭＰ１特異的ｍＲＮＡについて、ｑＰＣＲによって評価する。
【０１３９】
実施例４：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける研究−ＦＣＸ−０１３を介したＭＭＰ１の発現
ＦＣＸ−０１３細胞の生体内分布及びＭＭＰ−１の発現カイネティクスを、非肥満性糖尿病患者／重症複合型免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスにおいて評価した。ＦＣＸ−０１３プラスｖｅｌｅｄｉｍｅｘの生体内分布及び発現を、条件付きの（ｑｕａｌｉｆｉｅｄ）定量的ＰＣＲアッセイを用いた、ＬＶ構築体ＤＮＡ及びＭＭＰ−１特異的ｍＲＮＡの発現の評価によって判定した。ＭＭＰ−１タンパク質を、市販のキットを用いて定量化した。ＭＭＰ−１の生体内分布及び発現を、ＦＣＸ−０１３細胞の皮内注射の後に評価した。雄及び雌の免疫欠損ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの背中の上の２つの部位中に、細胞を皮内注射（１×１０６細胞／部位）してから、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ（４８ｍｇ／ｋｇ）を、ＦＣＸ−０１３注射後の最大２８日間、毎日経口で与えた。
【０１４０】
統合されたＩＮＸＮ−２００５（ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ１）コピー数（ＦＣＸ−０１３細胞を表す）及び構築体特異的ＭＭＰ−１  ｍＲＮＡ発現レベルを測定する定量的ＰＣＲ法を用いて、発現レベルを評価した。ＤＮＡコピー数についての検出下限及び定量化はそれぞれ、１００ｎｇの総ＤＮＡあたり５及び１２．５コピーである。
【０１４１】
ＭＭＰ−１タンパク質の定量化を、市販のキット（ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）のＨｕｍａｎ  ＭＭＰ  ３−Ｐｌｅｘ  Ｕｌｔｒａ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｋｉｔ）で行った；メーカーの推奨に従って調製した血清サンプル溶解液及び皮膚溶解液（１１〜１０００００ｐｇ／ｍＬのダイナミックレンジ）中でのＭＭＰ−１定量化に用いた。
【０１４２】
投薬溶液中の、そして投薬懸濁液中のｖｅｌｅｄｉｍｅｘの判定を、紫外線（ＵＶ）検出による高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）によって証明した。方法を、アッセイ期間中の特異性、線形性、精度、正確さ、及び安定性について証明した。
【０１４３】
この研究は、ＦＣＸ−０１３プラス経口ｖｅｌｅｄｉｍｅｘで処置したマウスにおけるＭＭＰ−１発現の開始、ピーク、及びプラトーを同定して、ＧＬＰ毒物学主研究にとって最適な収集時点を報ずることであった。提唱した臨床研究での使用が意図されるＦＣＸ−０１３製造方法を用いて生じた細胞を、雄及び雌の免疫欠損ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの背中の上の２つの部位中に皮内注射した（１００万細胞／部位）。これらの細胞の特性を、表３に示す。次に、マウスに、経口によるｖｅｌｅｄｉｍｅｘ（４８ｍｇ／ｋｇ；群１）又は賦形剤（Ｃａｐｒｙｏｌ９０／トリアセチン；群２）を、ＦＣＸ−０１３注射の後最大２８日間、毎日受けさせた。６時間、２４時間、並びに３、７、１０、１４、２１、及び２８日目に、各群内のマウスのサブセットを、評価のために安楽死させた。皮膚生検を収集して、ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡによるＭＭＰ−１タンパク質定量化用に、又はｑＰＣＲ及びＲＴ−ｑＰＣＲによるそれぞれＩＮＸＮ−２００５  ＤＮＡ及びｍＲＮＡ測定用に処理した。血清もまた収集して、ＭＳＤ  ＥＬＩＳＡによって、あらゆる全身性ＭＭＰ−１タンパク質（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ＭＭＰ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ）の存在について試験した。処置群及び終了時点を、表４に要約する。
【０１４４】
【表６】
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【０１４５】
皮膚生検において、ＩＮＸＮ−２００５コピー数（ＦＣＸ−０１３細胞を表す）は、２４時間以内に下降し始めるが、注射後２８日目でもまだ検出可能であり、雄と雌との間に、そしてｖｅｌｅｄｉｍｅｘ処置動物と賦形剤処置動物との間に有意な差異はない（データ示さず）。ＭＭＰ−１  ｍＲＮＡ発現を、各サンプルのハウスキーピング遺伝子標準化Ｃｔ値の比率として算出し、そしてｖｅｌｅｄｉｍｅｘ処置なしの注射後２８日目の時点についてのＣｔ値の平均に標準化した。結果を、図２に、２８日目（ｖｅｌｅｄｉｍｅｘなし；ＡＬ）の時点のフォールドオーバーとして表す。ＤＮＡ発現と同様に、ｍＲＮＡ発現は、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ活性化リガンドで経口的に処置したマウスにおいて、早く（ＦＣＸ−０１３の注射後３日目に）ピークに達し、そして注射後１０日目の後に、最小限度に検出可能であった。
【０１４６】
考察：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける皮内ＦＣＸ−０１３の投与及びｖｅｌｅｄｉｍｅｘによる毎日の経口投薬は、皮膚において、２４時間〜３日の間にピークに達するＭＭＰ−１  ｍＲＮＡ及びタンパク質の発現をもたらした。ＭＭＰ−１発現レベルは、注射後１０日目の後に、未検出であった。経時的な発現レベルの下降は、ＦＣＸ−０１３細胞数を表すＩＮＸＮ−２００５  ＤＮＡコピー数のロスと一貫していた。これは、注射後２８日目でもまだ測定可能であった。また、ｖｅｌｅｄｉｍｅｘによる他の標的タンパク質の発現の制御を評価する非臨床的研究は、標的タンパク質の最大の発現が、おおよそ２５０ｎｇ／ｍＬの組織内でのｖｅｌｅｄｉｍｅｘのレベルとなる用量でのｖｅｌｅｄｉｍｅｘの経口投与の後に達成され得ることを示唆している。
【０１４７】
略語及び頭字語
（略語又は頭字語−定義）
ＢＬＭ−ブレオマイシン
Ｃｍａｘ−最大観察濃度
ＣＹＰ−シトクロム
ＤＭＳＯ−ジメチルスルホキシド
ＥＣＭ−細胞外マトリックス
ＥｃＲ−エクジソン受容体
ＦＣＸ−０１３−条件的（調節された）エクジソン受容体ベースの遺伝子発現系の制御下で、ヒトマトリックス金属タンパク質分解酵素１（ＭＭＰ−１）を発現且つ分泌する、遺伝子改変されたヒト真皮線維芽細胞
ＦＸＲ−ファルネソイドＸ受容体
Ｇａｌ４−ＥｃＲ−酵母Ｇａｌ４転写因子のＤＮＡ結合ドメインと融合したトウヒノシントメハマキ（Ｃｈｏｒｉｓｔｏｎｅｕｒａ  ｆｕｍｉｆｅｒａｎａ）由来の突然変異を起こしたＥｃＲのＤＥＦドメインを含む
ＧＭ−遺伝子改変された
ＧＭ−ＨＤＦ−遺伝子改変されたヒト真皮線維芽細胞
ＩＮＸＮ−１００１−Ｖｅｌｅｄｉｍｅｘ活性化リガンド
ＩＮＸＮ−２００５−ＭＭＰ−１遺伝子構築体（ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ−１としても知られている）を含有するレンチウイルスベクター
ＩＰ−腹腔内
ＩＶ−静脈内
ＬＶ−レンチウイルス
ＬＶ−ＲＴＳ−ＭＭＰ−１−ＭＭＰ−１遺伝子構築体（ＩＮＸＮ−２００５としても知られている）を含有するレンチウイルスベクター
ＬＴＲ−長末端反復
ＭＭＰ−１−マトリックス金属タンパク質分解酵素１
ＭＴＤ−最大耐性用量
ＮＡ−入手不可能である
ＮＯＤ／ＳＣＩＤ−非肥満性糖尿病患者／重症複合型免疫不全（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）
ＲＡＲ−レチノイン酸受容体
ＲＸＲ−レチノイドＸ受容体
ＳＤ−Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ
ＵＳＡＮ−合衆国承認名称
ＵＳＰ−Ｕｌｔｒａｓｐｉｒａｃｌｅ
ＶＰ１６−ＲＸＲ−コーディング配列は、ＨＳＶ−１のＶＰ１６タンパク質の転写活性化ドメインと融合したキメラ（すなわち、ヒト配列及びイナゴ配列）ＲＸＲのＥＦドメインからなる。
【０１４８】
参考文献
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Ｔａｋｅｄａ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ，”Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，ｖｏｌ．１０３，ｎｏ．３，ｐｐ．３５９−６３，１９９４．
Ｗｅｉｓｓ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ＨＮ１０  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｅｓ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ−ｌｉｋｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，”Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒ，ｐｐ．１−１２，２００９．
Ｙａｍａｍｏｔｏ，“Ｔｈｅ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｍｏｄｅｌ：ｗｈａｔ  ｈａｖｅ  ｗｅ  ｌｅａｒｎｅｄ  ｆｏｒ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ？”  Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ．２００６  Ｆｅｂ；２９７（８）：３３３−４４．Ｅｐｕｂ  ２００６  Ｊａｎ  １０．
Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｓｋｉｎ．Ｉ：Ｌｏｃａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｓｋｉｎ  ｍｉｍｉｃｋｉｎｇ  ｓｃｌｅｒｏｄｅｒｍａ．”  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１９９９  Ａｐｒ；１１２（４）：４５６−６２．
Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｃ  ｓｋｉｎ．ＩＶ：ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｒｍａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｂｙ  ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ  ｉｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ．”  Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２００１  Ｏｃｔ；１１７（４）：９９９−１００１．
Ｙａｍａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．”  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．２０１０  Ｊａｎ；３７（１）：２６−４１．
Ｚｈｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，“ＵＶＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｕｌｔｒａｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｈａｉｒｌｅｓｓ  ｍｏｕｓｅ  ｓｋｉｎ：ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｔｏ  ＵＶＢ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄａｍａｇｅ，”Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ，ｖｏｌ．１００，ｎｏ．２，ｐｐ．１９４−９，１９９３．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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