(57)【要約】  本発明はビリルビン誘導体及び金属を含むビリルビン誘導体粒子、その用途及び製造方法に関するものである。本発明のビリルビン誘導体粒子は多様な金属と配位結合を形成するので、ＭＲ診断、ＣＴ診断、光−音響診断、ＰＥＴ診断または光学診断に使用することができる。本発明のビリルビン誘導体粒子はプラチナ系抗癌剤と結合、光／活性酸素刺激により分解されることによって、内部に封入した抗癌剤を外部に放出させることができ、抗炎症及び抗癌活性を示すので、診断と同時に治療用途にも使用可能なセラノスティックス概念の物質である。また、本発明のビリルビン誘導体粒子は活性酸素種との反応性があるので、活性酸素種の種類及び濃度を検出するための組成物、センサー、キット、造影剤または装置としても有用に使われることができる。【選択図】図１
2020523404.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビリルビン誘導体及び金属を含むビリルビン誘導体粒子。
【請求項２】
前記ビリルビン誘導体粒子は、前記ビリルビン誘導体と前記金属が配位結合を通じて構成されたことを特徴とする、請求項１に記載のビリルビン誘導体粒子。
【請求項３】
前記配位結合は前記ビリルビン誘導体のカルボキシル基、ラクタム基またはピロール環と前記金属との間に形成することを特徴とする、請求項１に記載のビリルビン誘導体粒子。
【請求項４】
前記金属はＣｕ、Ｇａ、Ｒｂ、Ｚｒ、Ｙ、Ｔｃ、Ｉｎ、Ｔｉ、Ｇｄ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｇｄ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｒ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｒａ及びランタン族金属からなる群より選択された金属のイオンまたは金属化合物であることを特徴とする、請求項１乃至３のうち、いずれか一項に記載のビリルビン誘導体粒子。
【請求項５】
前記金属は超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ：superparamagnetic iron oxide Nanoparticle）または金ナノ粒子であることを特徴とする、請求項１乃至３のうち、いずれか一項に記載のビリルビン誘導体粒子。
【請求項６】
前記金属はプラチナ（Ｐｔ）イオンまたはシスプラチン（cisplatin）、カルボプラチン（carboplatin）、オキサリプラチン（oxaliplatin）、ネダプラチン（nedaplatin）及びヘプタプラチン（heptaplatin）からなる群より選択されたプラチナ系抗癌剤であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のビリルビン誘導体粒子。
【請求項７】
前記金属は６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８２Ｒｂ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ及び２０１ＴＩからなる群より選択された放射性同位元素であることを特徴とする、請求項１乃至３のうち、いずれか一項に記載のビリルビン誘導体粒子。
【請求項８】
前記ビリルビン誘導体はビリルビンに親水性分子がコンジュゲーションされたことを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載のビリルビン誘導体粒子。
【請求項９】
前記親水性分子は、デキストラン（dextran）、カルボデキストラン（carbodextran）、ポリサカライド（polysaccharide）、サイクロデキストラン（cyclodextran）、プルロニック（pluronic）、セルロース（cellulose）、澱粉（starch）、グリコーゲン（glycogen）、カーボハイドレート（carbohydrate）、単糖類（monosaccharide）、二糖類（bisaccharide）及びオリゴ糖類（oligosaccharide）、ポリフォスファジェン（polyphosphagen）、ポリラクタイド（polylactide）、ポリラクチドーコーグリコリド（poly（lactic-co-glycolic acid））、ポリカプロラクトン（polycaprolactone）、ポリアンハイドライド（polyanhydride）、ポリマレイン酸（polymaleic acid）及びポリマレイン酸の誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート（polyalkylcyanoacrylate）、ポリヒドロキシブチレート（polyhydroxybutylate）、ポリカーボネート（polycarbonate）、ポリオルトエステル（polyorthoester）、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol）、ポリプロピレングリコール(polypropylene glycol)、ポリエチレンイミン（polyethylenimine）、ポリ−Ｌ−リシン（poly-L-lysine）、ポリグリコリド（polyglycolide）、ポリメチルメタクリレート（poly[methyl]met[h]acrylate）、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone）、ポリ（アクリレート）（poly［acrylate］）、ポリ（アクリルアミド）（poly［acrylamide］）、ポリ（ビニルエステル）（poly［vinylester］）、ポリ（ビニルアルコール）（poly［vinyl alcohol］）、ポリスチレン（polystyrene）、ポリオキサイド（polyoxide）、ポリエレクトロライト（polyelectrolyte）、ポリ（１−ニトロプロピレン）（poly［1-nitropropylene］）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（poly［N-vinyl pyrrolidone］）、ポリビニルアミン（poly［vinyl amine］）、ポリ（ベータ−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Poly［beta-hydroxyethylmethacrylate］）、ポリエチレンオキサイド（Polyethyleneoxide）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−プロピレンオキサイド（Poly［ethylene oxide-b-propyleneoxide］）、ポリリシン（Polylysine）及びペプチドからなる群より選択されたことを特徴とする、請求項８に記載のビリルビン誘導体粒子。
【請求項１０】
請求項１乃至９のいずれか一項に記載のビリルビン誘導体粒子を含む組成物。
【請求項１１】
前記組成物は、画像診断用造影剤組成物であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物は癌の治療用薬剤学的組成物であることを特徴とする、請求項１０に記載の組物。
【請求項１３】
前記組成物は、炎症性疾患の治療及び診断用薬剤学的組成物であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物は活性酸素種（reactive oxygen species、ＲＯＳ）検出用であることを特徴とする、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１５】
金属及びビリルビン誘導体を含むビリルビン誘導体粒子の製造方法であって、
（ａ）ビリルビンを親水性分子とコンジュゲーションしてビリルビン誘導体を製造するステップ；及び
（ｂ）前記ビリルビン誘導体と金属を配位結合して前記金属が封入されたビリルビン誘導体粒子を製造するステップ
を含む、製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は大韓民国科学技術情報通信部の支援下で課題番号２０１８Ｍ３Ａ９Ｂ５０２３５２７によりなされたものであって、前記課題の研究管理専門機関は韓国研究財団、研究事業名は“バイオ・医療技術開発事業”、研究課題名は“腫瘍微細環境標的及び感応型薬物伝達プラットフォーム技術開発”、主管機関は韓国科学技術院、研究期間は２０１８．０４．０１−２０２０．１２．３１である。
【０００２】
本特許出願は２０１７年５月１３日付で大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１７−００５９５９７号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は本明細書に参照として挿入される。
【０００３】
本発明はビリルビン誘導体及び金属を含む粒子、その用途及び製造方法に関するものである。
【０００４】
【背景技術】
【０００５】
有機金属錯体（metal-organic  coordination  complexes）で構成された自然的に発生するビルディングブロックは長い間科学的霊感の源泉となってきた。例えば、特定金属と有機リガンドの配位は金属蛋白質（metalloproteins）、光合成（Ｍｇ（ＩＩ）−ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ）、酸素輸送（Ｃｕ（ＩＩ）−ｈｅｍｅ）及び付着（Ｆｅ（ＩＩＩ）−ｐｈｅｎｏｌｉｃｓ）のような生物学的機能の遂行において決定的な役割をする。このような有機金属錯体はバイオ医学分野だけでなく、センサー、分離工程及び触媒作用を含んだ化学領域でも潜在能力を見せる。しかしながら、その適用範囲は毒性問題と製造工程にかかる所要時間のために非常に限られていた。
【０００６】
ビリルビン（Bilirubin）は私達の生体内でのヘム（ｈｅｍｅ）の最終代謝産物であって、自然的に発生する有機金属錯体である。本発明者らはビリルビンを金属−有機配位物質として使用しようとする本発明の戦略において胆汁排出経路で発生する病理学的現象である胆石形成からヒントを得た。胆石は異常な胆汁代謝によって胆汁酸が金属と結合して胆管に形成された結石（calculus）である。ビリルビンは胆汁酸として排泄されるが、胆石の中で黒色胆石（black pigmented gallstone）は前記胆汁酸でビリルビンと銅及び／又はビリルビンとカルシウムからなる複合体の最終産物として知られている。ビリルビンは内在的に不対電子または非結合電子対（unpaired electrons or nonbonding electron pair）を有する豊富な官能基を有しているので、外部リンカーなくても陽イオン、金属イオンと反応して有機金属錯体を作ることができる。しかしながら、ビリルビンは非常に疎水性を帯びるので、溶媒によく溶解されないので、これを化学的に用いることは容易ではなかった。
【０００７】
本発明者らは前記ビリルビンの疎水性による適用上の問題を解決し、多様な用途に適用するためにビリルビンと親水性高分子の複合体からなるビリルビンナノ粒子を開発し、大韓民国登録特許第１０−１６８１２９９号の登録を受けたことがあり、前記特許は本特許明細書に参照として挿入される。
【０００８】
本明細書の全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体として本明細書に参照として挿入されて、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【０００９】
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、ビリルビン誘導体及び金属を含むビリルビン誘導体粒子を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記ビリルビン誘導体粒子を含む画像診断用造影剤を提供することにある。
【００１２】
本発明の更に他の目的は、前記ビリルビン誘導体粒子を含む癌の治療及び診断用薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明の更に他の目的は、前記ビリルビン誘導体粒子を含む炎症性疾患の治療または診断用薬剤学的組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明の更に他の目的は、前記ビリルビン誘導体粒子の製造方法を提供することにある。
【００１５】
本発明の更に他の目的は、前記ビリルビン誘導体粒子を含む活性酸素種（reactive oxygen species、ＲＯＳ）検出用組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の更に他の目的は、前記ビリルビン誘導体粒子を含む活性酸素種（reactive oxygen species、ＲＯＳ）検出用センサー装置を提供することにある。
【００１７】
本発明の更に他の目的は、前記ビリルビン誘導体粒子を用いて活性酸素種を検出する方法を提供することにある。
【００１８】
【００１９】
本発明の他の目的及び利点は下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面により、一層明確になる。
【００２０】
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明は下記１乃至１７の発明を提供する。
【００２２】
１．ビリルビン誘導体及び金属を含む、ビリルビン誘導体粒子。
【００２３】
２．前記ビリルビン誘導体粒子はビリルビン誘導体と前記金属が配位結合を通じて構成されたことを特徴とする、発明１のビリルビン誘導体粒子。
【００２４】
３．１において、前記配位結合はビリルビン誘導体のカルボキシル基、ラクタム基またはピロール環と前記金属との間に形成することを特徴とする、発明２のビリルビン誘導体粒子。
【００２５】
４．前記金属はＣｕ、Ｇａ、Ｒｂ、Ｚｒ、Ｙ、Ｔｃ、Ｉｎ、Ｔｉ、Ｇｄ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｇｄ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｒ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｒａ及びランタン族金属からなる群より選択された金属のイオンまたは金属化合物であることを特徴とする、発明１乃至３のビリルビン誘導体粒子。
【００２６】
５．前記金属は超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ：superparamagnetic iron oxide nanoparticle）または金ナノ粒子であることを特徴とする、発明１乃至３のいずれか１つのビリルビン誘導体粒子。
【００２７】
６．前記ビリルビン誘導体粒子は金属が中心部に位置し、前記ビリルビン誘導体が前記金属の周辺を囲む形態からなることを特徴とする、発明５のビリルビン誘導体粒子。
【００２８】
７．前記金属は単一金属粒子またはクラスター金属粒子の形態であることを特徴とする、発明６のビリルビン誘導体粒子。
【００２９】
８．前記金属はプラチナ（Ｐｔ）イオンまたはシスプラチン（cisplatin）、カルボプラチン（carboplatin）、オキサリプラチン（oxaliplatin）、ネダプラチン（nedaplatin）及びヘプタプラチン（heptaplatin）からなる群より選択されたプラチナ系抗癌剤であることを特徴とする、発明１乃至３のいずれか１つのビリルビン誘導体粒子。
【００３０】
９．前記金属は６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８２Ｒｂ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ及び２０１ＴＩからなる群より選択された放射性同位元素であることを特徴とする、発明１乃至３のいずれか１つのビリルビン誘導体粒子。
【００３１】
１０．前記ビリルビン誘導体はビリルビンに親水性分子がコンジュゲーションされたことを特徴とする、発明１乃至９のいずれか１つのビリルビン誘導体粒子。
【００３２】
１１．前記親水性分子はデキストラン（dextran）、カルボデキストラン（carbodextran）、ポリサカライド（polysaccharide）、サイクロデキストラン（cyclodextran）、プルロン（pluronic）、セルロース（cellulose）、澱粉（starch）、グリコーゲン（glycogen）、カーボハイドレート（carbohydrate）、単糖類（monosaccharide）、二糖類（bisaccharide）及びオリゴ糖類（oligosaccharide）、ポリフォスファジェン（polyphosphagen）、ポリラクタイド（polylactide）、ポリラクチドーコーグリコリド（poly（lactic-co-glycolic acid））、ポリカプロラクトン（polycaprolactone）、ポリアンハイドライド（polyanhydride）、ポリマレイン酸（polymaleic acid）及びポリマレイン酸の誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート（polyalkylcyanoacrylate）、ポリヒドロキシブチレート（polyhydroxybutylate）、ポリカーボネート（polycarbonate）、ポリオルトエステル（polyorthoester）、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol）、ポリプロピレングリコール（polypropylene glycol）、ポリエチレンイミン（polyethylenimine）、ポリ−Ｌ−リシン（poly-L-lysine）、ポリグリコリド（polyglycolide）、ポリメチルメタクリレート（poly[methyl]met[h]acrylate）、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone）、ポリ（アクリレート）（poly［acrylate］）、ポリ（アクリルアミド）（poly［acrylamide］）、ポリ（ビニルエステル）（poly［vinyl ester］）、ポリ（ビニルアルコール）（poly［vinyl alcohol］）、ポリスチレン（polystyrene） 、 ポリオキサイド（polyoxide）、ポリエレクトロライト（polyelectrolyte）、ポリ（１−ニトロプロピレン）（poly［1-nitropropylene］）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（poly［N-vinyl pyrrolidone］）、ポリビニルアミン（poly［vinyl amine］）、ポリ（ベータ−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Poly［beta-hydroxyethylmethacrylate］）、ポリエチレンオキサイド（Polyethyleneoxide）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−プロピレンオキサイド（Poly［ethylene oxide-b-propyleneoxide］）、ポリリシン（Polylysine）及びペプチドからなる群より選択されたことを特徴とする、発明１０のビリルビン誘導体粒子。
【００３３】
１２．前記親水性分子はポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）であることを特徴とする、発明１１のビリルビン誘導体粒子。
【００３４】
１３．前記ＰＥＧはメトキシＰＥＧ（methoxy polyethylene glycol）、ＰＥＧプロピオン酸のスクシンイミド（succinimide of PEG propionic acid）、ＰＥＧブタン酸のスクシンイミド（succinimide of PEG butanoic acid）、分岐型のＰＥＧ−ＨＮＳ（branched PEG-NHS）、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（PEG succinimidyl succinate）、カルボキシルメチル化ＰＥＧのスクシンイミド（succinimide of carboxymethylated PEG）、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカーボネート（benzotriazole carbonate of PEG）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル（PEG-glycidyl ether）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（PEG oxycarbonylimidazole）、ＰＥＧニトロフェニルカーボネート（PEG nitrophenyl carbonates）、ＰＥＧ−アルデヒド（PEG aldehyde）、ＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステル（PEG succinimidyl carboxymethyl ester）及びスクシンイミジルエステル（PEG succinimidyl ester）からなる群より選択されることを特徴とする、発明１２のビリルビン誘導体粒子。
【００３５】
１４．前記ＰＥＧの平均分子量は２００乃至２００００Ｄａであることを特徴とする、発明１２のビリルビン誘導体粒子。
【００３６】
１５．１乃至１４のいずれか１つのビリルビン誘導体粒子を含む組成物。
【００３７】
１６．前記組成物は画像診断用造影剤組成物であることを特徴とする、発明１５の組成物。
【００３８】
１７．前記画像診断用造影剤組成物は、磁気共鳴診断（ＭＲ）用、ＣＴ診断用、ＰＥＴ診断用または光学診断用であることを特徴とする発明１６の組成物。
【００３９】
１８．前記組成物は癌の治療用薬剤学的組成物であることを特徴とする発明１５の組成物。
【００４０】
１９．前記癌は、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、直膓癌及び子宮頚部癌からなる群より選択されたことを特徴とする発明１８の組成物。
【００４１】
２０．前記組成物は炎症性疾患の治療及び診断用薬剤学的組成物であることを特徴とする発明１５の組成物。
【００４２】
２１．次のステップを含む金属及びビリルビン誘導体を含むビリルビン誘導体粒子の製造方法：
【００４３】
（ａ）ビリルビンを親水性分子とコンジュゲーションしてビリルビン誘導体を製造するステップ；及び
【００４４】
（ｂ）前記ビリルビン誘導体と金属を配位結合して金属が封入されたビリルビン誘導体粒子を製造するステップ。
【００４５】
２２．前記（ｂ）ステップは次のステップを含むことを特徴とする、発明２１のビリルビン誘導体粒子の製造方法：
【００４６】
（ｂ−１）ビリルビン誘導体からなる粒子を製造するステップ；及び
【００４７】
（ｂ−２）ビリルビン誘導体からなる粒子に金属を封入するステップ。
【００４８】
２３．前記（ｂ）ステップはビリルビン誘導体からなる粒子が製造されると共に、金属が封入されることを特徴とする、発明２１のビリルビン誘導体粒子の製造方法。
【００４９】
２４．前記組成物は活性酸素種（reactive oxygen species、ＲＯＳ）検出用であることを特徴とする発明１５の組成物。
【００５０】
２５．前記組成物は造影剤組成物であることを特徴とする発明２４の組成物。
【００５１】
２６．前記活性酸素種はスーパーオキサイド（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（hydroxyl radical、ＯＨ）、一重項酸素（1O2 singlet oxygen）、有機ヒドロペルオキシド（ＲＯＯＨ）、アルコキシラジカル（ＲＯ・）、ペルオキシラジカル（ＲＯＯ・）またはオゾン（Ｏ３）及び二酸化窒素（ＮＯ２）からなる群より選択されることを特徴とする発明２４の組成物。
【００５２】
２７．発明１乃至１４のいずれか１つのビリルビン誘導体粒子を含む、活性酸素種（reactive oxygen species、ＲＯＳ）検出用センサー装置。
【００５３】
２８．次のステップを含む、活性酸素種検出方法：
【００５４】
（ａ）発明１乃至１３のいずれか１つのビリルビン誘導体粒子を含む懸濁液を活性酸素種を含む試料と接触させるステップ；及び
【００５５】
（ｂ）前記試料を接触する前後の懸濁液の変化を対照群と比較分析するステップ。
【００５６】
２９．前記（ｂ）ステップの懸濁液の変化はビリルビン誘導体粒子の沈殿有無、波長に従う吸光度、懸濁液の透明度、懸濁液内の金属イオンの濃度及びＭＲＩ画像シグナルの強度からなる群より選択されることを特徴とする発明２８の方法。
【００５７】
３０．発明１乃至１４のいずれか１つのビリルビン誘導体粒子を含む組成物を対象（subject）に投与するステップを含む画像診断方法。
【００５８】
３１．発明１乃至１４のいずれか１つのビリルビン誘導体粒子を含む組成物を対象（subject）に投与するステップを含む、癌の治療方法。
【００５９】
３２．発明１乃至１４のいずれか１つのビリルビン誘導体粒子を含む組成物を対象（subject）に投与するステップを含む、炎症性疾患の治療及び診断方法。
【００６０】
【００６１】
本発明の一態様によれば、本発明はビリルビン誘導体及び金属を含むビリルビン誘導体粒子を提供する。
【００６２】
本発明者らは人体で銅（Ｃｕ）と有機リガンドであるビリルビンとの間に形成された錯体である胆石からヒントを得て、ビリルビンの配位結合特性を多様な用途に活用できるナノ粒子を開発するために鋭意研究努力した。その結果、ビリルビンに親水性分子を導入して水溶性ビリルビン誘導体とこれらが自己組織化されて形成されたビリルビン誘導体粒子を製作し、これらの多様な金属に対するキレート効果及び画像診断用造影剤、炎症性疾患及び癌疾患の治療剤としての活用可能性を確認した。
【００６３】
本発明の一実施形態によれば、本発明のビリルビン誘導体粒子は前記金属との配位結合を通じて金属錯体（metal complex）を形成する。
【００６４】
本発明の前記金属錯体（metal complex）とは、１つまたはその以上の金属原子やイオンを中心として幾つの異なるイオン分子または原子団などが方向性を有して立体的に配位して１つの原子集団をなしていることをいう。ここで、中心になる金属原子またはイオンに配位しているイオン分子または原子団をリガンドと呼ぶ。本発明のビリルビン誘導体粒子でビリルビン誘導体はリガンドとなり、ビリルビン誘導体と結合する金属は中心金属イオンとなる。
【００６５】
本発明の一実施形態によれば、前記配位結合は金属イオンとビリルビン誘導体のカルボキシル基、ピロール環、あるいはラクタム基の間に形成される。
【００６６】
前記配位結合が形成できるビリルビン分子内の位置を表現すれば、以下の化学式１で点線の円で表示された部分である。
【００６７】
【化１】
2020523404.tif 000003
【００６８】
【００６９】
本発明の一実施形態によれば、配位結合を通じて本発明のビリルビン誘導体と結合されることによって含まれる金属は、Ｃｕ、Ｇａ、Ｒｂ、Ｚｒ、Ｙ、Ｔｃ、Ｉｎ、Ｔｉ、Ｇｄ、Ｍｎ、Ｆｅ、Ａｕ、Ｐｔ、Ｐｄ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｍｎ、Ｚｎ、Ｇｄ、Ｍｏ、Ｎｉ、Ｆｅ、Ｃｒ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｓｒ、Ｂａ、Ｒａ及びＥｕ、Ｔｂなどのランタン族金属からなる群より選択された金属のイオンまたは金属化合物でありうるが、これに限定されるのではない。
【００７０】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明のビリルビン誘導体はＳＰＩＯＮ（superparamagnetic iron oxide nanoparticle）及び金ナノ粒子（ＡｕＮＰ、gold nanoparticle）を含む多様な金属粒子と結合する。
【００７１】
下記の実施例で確認されたように、本発明のビリルビン誘導体は、ＳＰＩＯＮ（superparamagnetic iron oxide nanoparticle）と結合してナノ粒子を形成し（図６ａ乃至６ｃ）、前記ＳＰＩＯＮ結合ビリルビン誘導体粒子は既存の臨床的に使われるＴ２強調ＭＲ造影剤であるフェリデックス（Feridex）に比べて優れる緩和度（relaxivity）を示すところ、ＭＲＩ造影向上のための造影剤として有用に使われることができる（図７）。
【００７２】
また、本発明の一実施形態によれば、本発明のビリルビン誘導体粒子は活性酸素を消去することができる。下記の実施例で確認されたように、本発明のＳＰＩＯＮを含むビリルビン誘導体粒子は、活性酸素種（ＲＯＳ、reactive oxygen species）発生剤である次亜塩素酸塩（hypochlorite）処理に反応して凝集されるので（図８）、炎症組織の活性酸素を消去することによって炎症を治療することに使われることができる。
【００７３】
したがって、本発明の前記ビリルビン誘導体粒子は、炎症疾患治療用薬学的組成物にも有用に使われることができる。
【００７４】
また、本発明の前記ビリルビン誘導体粒子は、大韓民国登録特許第１０−１６８１２９９号に開示されたように、ビリルビン誘導体粒子自体の抗癌作用、血管新生抑制作用によって癌疾患または血管新生疾患治療用薬学的組成物にも有用に使われることができる。
【００７５】
本発明の一実施形態によれば、前記ビリルビン誘導体粒子は金属が中心部に位置し、前記ビリルビン誘導体が前記金属の周辺を囲む形態に形成される。
【００７６】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明の金属を含むビリルビン誘導体粒子は多数個の金属粒子がクラスター（cluster）を形成したクラスター金属粒子形態と、各々の金属粒子が単一に分布した単一金属粒子形態、２つの区別された粒子形態に製造できる。
【００７７】
下記の実施例で確認されたように、本発明者らは本発明のビリルビン誘導体粒子が前記２つの形態に製造できるか否かを確認するためにＰＥＧ−ビリルビンコーティング酸化鉄ナノ粒子を構成するために２つの方法を全て適用した。その結果、本発明者らはＴＥＭイメージでＰＥＧ−ビリルビンシェルを使用して２つの類型の粒子が成功的に製造されたことを確認した（図６ｃ）。
【００７８】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明のビリルビン誘導体粒子に含まれる前記金属は、シスプラチン（cisplatin）、カルボプラチン（carboplatin）、オキサリプラチン（oxaliplatin）、ネダプラチン（nedaplatin）及びヘプタプラチン（heptaplatin）からなる群より選択されたプラチナ系抗癌剤である。下記の実施例で確認されたように、本発明のビリルビン誘導体粒子はシスプラチンを効果的にローディングすることができた（図１５）。前記シスプラチンと本発明のビリルビン誘導体粒子との間の予想結合形態は図１６の通りである。
【００７９】
本発明の具体的な実施形態によれば、本発明の前記プラチナ系抗癌剤を含むビリルビン誘導体粒子は、光、活性酸素または酸性ｐＨ刺激によりローディングした抗癌剤を周囲に放出することができる（図１７ａ及び図１７ｂ）。
【００８０】
したがって、本発明のビリルビン誘導体粒子は前述したビリルビン誘導体自体の抗癌／血管新生抑制作用だけでなく、前記プラチナ系抗癌剤のローディング及び放出特性によって癌を治療するための有効性分に使われることができる。
【００８１】
本明細書で、用語、“ビリルビン誘導体”はビリルビンの親水性分子とコンジュゲーション（conjugation、結合）されて形成する親水性または両親媒性の化合物を意味する。本発明のビリルビン誘導体は、金属成分と配位結合を形成して本発明のビリルビン誘導体粒子を形成する。
【００８２】
本発明の一実施形態によれば、前記親水性分子はビリルビンのカルボキシル基にコンジュゲーションされて親水性または両親媒性ビリルビン誘導体を形成する（Amphiphiles: Molecular Assembly and Applications (ACS Symposium Series) 1st Edition by Ramanathan Nagarajan及びVarious Self-Assembly Behaviors of Amphiphilic Molecules in Ionic Liquids By Bin Dong and Yanan Gao, DOI:10.5772/59095参照）。前記ビリルビンのカルボキシル基は親水性分子のアミン基とアミンコンジュゲーション（ｅｘ．ＥＤＣ／ＮＨＳ反応）または親水性分子のヒドロキシ基とエステル化反応を通じてコンジュゲーションされる（Conjugated Chitosan as a Novel Platform for Oral Delivery of Paclitaxel, Lee et al., J. Med. Chem., 2008, 51 (20), p.6442-6449, DOI: 10.1021/jm800767c 参照）。親水性分子がコンジュゲーションされた形態のビリルビンは両親媒性性質を有するので、水溶性溶媒に溶解可能であるので、化学的に取扱うことに有用であるだけでなく、自発的に自己組織化されて粒子を形成するので、疎水性及び親水性製剤全てに対して適用可能である。本発明の実施例で、本発明者らは親水性化合物であるＰＥＧ（Poly Ethylene Glycol）を使用してカルボキシル酸塩にアミド結合を形成する単純な反応を通じて本発明に従うビリルビン誘導体としてＰＥＧ化ビリルビン（ＰＥＧ−ＢＲ、ＰＥＧ−ビリルビン、Pegylated bilirubin）を製造した。
【００８３】
本発明で使用可能な親水性分子には、例えば、デキストラン（dextran）、カルボデキストラン（carbodextran）、ポリサカライド（polysaccharide）、サイクロデキストラン（cyclodextran）、プルロニック（pluronic）、セルロース（cellulose）、澱粉（starch）、グリコーゲン（glycogen）、カーボハイドレート（carbohydrate）、単糖類（monosaccharide）、二糖類（bisaccharide）及びオリゴ糖類（oligosaccharide）、ポリフォスファジェン（polyphosphagen）、ポリラクタイド（polylactide）、ポリラクチドーコーグリコリド（poly（lactic-co-glycolic acid））、ポリカプロラクトン（polycaprolactone）、ポリアンハイドライド（polyanhydride）、ポリマレイン酸（polymaleic acid）及びポリマレイン酸の誘導体、ポリアルキルシアノアクリレート（polyalkylcyanoacrylate）、ポリヒドロキシブチレート（polyhydroxybutylate）、ポリカーボネート（polycarbonate）、ポリオルトエステル（polyorthoester）、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol）、ポリプロピレングリコール（polypropylene glycol）、ポリエチレンイミン（polyethylenimine）、ポリ−Ｌ−リシン（poly-L-lysine）、ポリグリコリド（polyglycolide）、ポリメチルメタクリレート（poly[methyl]met[h]acrylate）、ポリビニルピロリドン（polyvinylpyrrolidone）、ポリ（アクリレート）（poly［acrylate］）、ポリ（アクリルアミド）（poly［acrylamide］）、ポリ（ビニルエステル）（poly［vinylester］）、ポリ（ビニルアルコール）（poly［vinylalcohol］）、ポリスチレン（polystyrene）、ポリオキサイド（polyoxide）、ポリエレクトロライト（polyelectrolyte）、ポリ（１−ニトロプロピレン）（poly［1-nitropropylene］）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）（poly［N-vinyl pyrrolidone］）、ポリビニルアミン（poly［vinyl amine］）、ポリ（ベータ−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Poly［beta-hydroxyethylmethacrylate］）、ポリエチレンオキサイド（Polyethyleneoxide）、ポリ（エチレンオキシド−ｂ−プロピレンオキサイド（Poly［ethyleneoxide-b[-]propyleneoxide］）及びポリリシン（Polylysine）などを挙げることができる。
【００８４】
本発明の一実施形態によれば、前記親水性高分子はポリエチレングリコールまたはその誘導体である。前記ポリエチレングリコール誘導体は、例えば、メトキシＰＥＧ（methoxy polyethylene glycol）、ＰＥＧプロピオン酸のスクシンイミド（succinimide of PEG propionic acid）、ＰＥＧブタン酸のスクシンイミド（succinimide of PEG butanoic acid）、分岐型のＰＥＧ−ＨＮＳ（branched PEG-NHS）、ＰＥＧスクシンイミジルスクシネート（PEG succinimidyl succinate）、カルボキシルメチル化ＰＥＧのスクシンイミド（succinimide of carboxymethylated PEG）、ＰＥＧのベンゾトリアゾールカーボネート（benzotriazole carbonate of PEG）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル（PEG-glycidyl ether）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール（PEG oxycarbonylimidazole）、ＰＥＧニトロフェニルカーボネート（PEG nitrophenyl carbonates）、ＰＥＧ−アルデヒド（PEG aldehyde）、ＰＥＧスクシンイミジルカルボキシメチルエステル（PEG succinimidyl carboxymethyl ester）及びスクシンイミジルエステル（PEG succinimidyl ester）などを挙げることができる（PEGylated polymers for medicine: from conjugation to self-assembled systems, Jorlemon et al., Chem. Commun., 2010, 46, 1377-1393参照）。
【００８５】
本発明の具体的な実施形態によれば、前記ポリエチレングリコールの平均分子量は２００乃至２００００Ｄａである。
【００８６】
本発明で使用可能な親水性分子の更に他の例には、２つ以上（例えば、２−５０個）のアミノ酸からなるペプチドなどがある。前記アミノ酸には天然型アミノ酸だけでなく、非天然アミノ酸も含まれる。親水性アミノ酸には、グルタミン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アスパラギン、アルギニン、セリンなどがあり、疎水性アミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、メチオニン、バリン、アラニンなどがある。非コード化された親水性アミノ酸は、例えば、Ｃｉｔ及びｈＣｙｓなどがある。当業者はこのような情報とペプチド合成技術に基づいて親水性のペプチドを容易に合成してビリルビンナノ粒子の製造に使用することができる。
【００８７】
前記親水性分子の範囲には、前述した化合物だけでなく、これらの誘導体も含まれる。より具体的に、前記親水性分子はアミン基またはヒドロキシル基を有するか、またはアミン基またはヒドロキシル基を有するように変形されたものでありうる。この場合、本発明のビリルビンのカルボキシル基が前記親水性分子のアミングループとアミド結合を通じて、またはヒドロキシル基とエステル化反応を通じて非常に容易にコンジュゲーションできることは、本発明と関連した当業者に自明である。
【００８８】
【００８９】
本発明の他の一態様によれば、本発明は前記金属を含むビリルビン誘導体粒子を含む画像診断用造影剤を提供する。
【００９０】
本発明の一実施形態によれば、前記画像診断用造影剤は磁気共鳴（ＭＲ、magnetic resonance）診断用、コンピュータ断層撮影（ＣＴ、computed tomography）診断用、ＰＥＴ（positron emission tomography）診断用または光学診断用に使われることができる。
【００９１】
本発明の前記光学診断用途は光−音響診断及び蛍光イメージを用いた診断方法（用途）を含む。前記光−音響診断はビリルビン誘導体にシスプラチン金属を結合させることによって本発明の実施例を通じて検証したことがあり、前記蛍光イメージはＥｕ（ＩＩＩ）及びＴｂ（ＩＩＩ）などのランタン族（lanthanide）金属が有する蛍光特性を用いるものであって、前記金属にビリルビン誘導体を結合させることによって、ランタン族金属が有する蛍光波長帯あるいはその強さなどを調節してランタン族金属が放出する蛍光を検出することによって画像化が可能である。
【００９２】
具体的に、本発明のビリルビン誘導体粒子は外部リンカーの使用無しで多様な金属イオンをビリルビン誘導体内に導入して核医学イメージング（６４Ｃｕ、６８Ｇａ、８２Ｒｂ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、２０１ＴＩ）、ＭＲイメージング（Ｇｄ、Ｍｎ、Ｆｅ）及びＣＴイメージング（Ａｕ）に適用することができる。特に、従来の磁気共鳴画像またはコンピュータ断層撮影で使われる造影剤は外部リンカーと金属を複合体に提供してリガンドを操作したが、本発明のビリルビン誘導体は別途のリンカーがなくても速く効果的に前記金属と結合可能である。
【００９３】
本発明の更に他の一態様によれば、本発明は前記金属を含むビリルビン誘導体粒子を含む癌の治療及び診断用薬剤学的組成物を提供する。
【００９４】
本発明の一実施形態によれば、前記癌は、胃癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、肝癌、気管支癌、鼻咽頭癌、喉頭癌、膵臓癌、膀胱癌、結腸癌、直膓癌及び子宮頚部癌でありうるが、これに限定されるのではない。
【００９５】
本発明のビリルビン誘導体粒子は、抗−血管新生活性を示して癌の予防及び治療に用いることができる。具体的に、前述したシスプラチンなどのプラチナ系抗癌剤をローディングするビリルビン誘導体粒子が体内に投与される場合、ＥＰＲ効果により腫瘍組織で蓄積され、この際、外部から腫瘍組織に光を照射すれば、ビリルビンからなる疎水性層が親水性の光異性質体を含む親水性層に変換され、これによってナノ粒子が瓦解（崩壊）されることによってナノ粒子に含まれていた抗癌薬物が腫瘍組織に放出されて癌の治療が可能である。同時に、ナノ粒子から分解されたモノマーがアルブミンと結合するようになって腫瘍組織から蛍光が放出され、これを用いて腫瘍組織のイメージングが可能である。
【００９６】
下記の実施例で確認されたように、本発明の前記ビリルビン誘導体は、６４Ｃｕ、ＳＰＩＯＮ（Superparamagnetic iron oxide nanoparticle）、金ナノ粒子（ＧＮＰ、Gold Nanoparticle）及びＮｉ、Ｍｎ、Ｇｄ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｆｅなどの金属イオン、そしてプラチナ系抗癌剤と錯体を効果的に形成するので、多様な金属のキレート化が可能であり、多様な用途への適用が可能である（図５ａ及び５ｂ）。
【００９７】
一方、本発明のビリルビン誘導体粒子は腫瘍組織に選択的に蓄積され、外部から特定波長の光照射時、高熱を発生させる光熱効果を起こすので、癌疾患の治療に使われることができる。
【００９８】
下記の実施例のように、本発明者らはシスプラチン−ビリルビン誘導体粒子を腫瘍異種移植モデルのマウスで生体内の光−音響イメージングに初めて適用した結果、静脈内注射後、徐々に光−音響信号が増加し（図１８）、８０８ｎｍの光に露出後、５分以内に腫瘍の表面温度が５５〜６０℃まで急激に上昇することを確認することによって、本発明のビリルビン誘導体粒子は、光−音響イメージング（photo-acoustic imaging）だけでなく、光熱治療（photo-thermal therapy、ＰＴＴ）にも活用可能であることを確認した（図１９）。
【００９９】
【０１００】
本発明の更に他の一態様によれば、本発明は前記金属を含むビリルビン誘導体粒子を含む炎症性疾患の治療及び診断用薬剤学的組成物を提供する。
【０１０１】
本発明のビリルビン誘導体粒子は炎症性疾患の診断及び治療のためのＲＯＳ感受性物質として活用できる。具体的に、非経口的に体内に投与されたビリルビン誘導体粒子は、ＥＰＲ効果により炎症部位をターゲッティングすることができる。
【０１０２】
また、ビリルビン誘導体粒子は炎症部位で異常な水準の活性酸素を消去することによって、抗炎活性を示すことができるので、炎症の治療が可能である。
【０１０３】
本発明が適用可能な炎症性疾患は、例えば、炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease）、アトピー皮膚炎、浮腫、皮膚炎、アレルギー、喘息、結膜炎、歯周炎、鼻炎、中耳炎、粥状硬化症、咽喉炎、扁桃炎、肺炎、胃潰瘍、胃炎、クローン病、大腸炎、痔疾、痛風、強直性脊椎炎、リウマチ熱、ループス、線維筋痛症（fibromyalgia）、乾癬性関節炎、骨関節炎、関節リウマチ、肩関節周囲炎、腱炎、腱鞘炎、筋肉炎、肝炎、膀胱炎、腎臓炎、シェーグレン症候群（sjogren's syndrome）及び多発性硬化症などを挙げることができるが、これに限定されるのではない。
【０１０４】
本発明の一実施形態によれば、本発明のビリルビン誘導体粒子は、金属イオンと配位結合することができる。金属イオンと配位結合した本発明のビリルビン誘導体粒子は、次亜塩素酸などの活性酸素種と反応すれば、粒子が崩壊しながら金属イオンを放出する。本発明の具体的な実施形態によれば、マンガンイオン（Ｍｎ２＋）と配位結合したビリルビン誘導体粒子は、次亜塩素酸などの活性酸素種と反応してマンガンイオンを放出する。したがって、ビリルビン誘導体に配位されている時と放出された時のマンガンイオンの磁気共鳴画像でのT１値が変わるようになってＭＲＩ画像の明暗の差が出るが、これを通じて活性酸素種の検出が可能である。
【０１０５】
本発明の組成物が薬剤学的組成物の場合、薬剤学的に許容される担体が含まれる。前記薬剤学的に許容される担体は、製剤時に通常的に用いられるものであって、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるのではない。本発明の薬剤学的組成物は、前記成分の以外に、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などを追加で含むことができる。
【０１０６】
本発明の薬剤学的組成物は非経口投与が可能であり、例えば静脈内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、皮下投与または局部投与できる。また、その他にも経口投与、直腸投与、吸入投与、経鼻投与などが可能である。
【０１０７】
本発明の薬剤学的組成物の適合した投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性、疾病症状の程度、飲食、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因により多様であり、普通に熟練した医者は目的とする治療に効果的な投与量を容易に決定及び処方することができる。
【０１０８】
本発明の薬剤学的組成物は本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者が容易に実施することができる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化されることによって単位容量形態に製造されるか、または多容量容器内に内入させて製造できる。この際、剤形は油性または水性媒質の中の溶液、懸濁液または乳化液形態でありえ、分散剤または安定化剤を追加的に含むことができる。
【０１０９】
本発明の更に他の一態様によれば、本発明は次のステップを含む金属及びビリルビン誘導体を含むビリルビン誘導体粒子の製造方法を提供する：
【０１１０】
（ａ）ビリルビンを親水性分子とコンジュゲーションしてビリルビン誘導体を製造するステップ；及び
【０１１１】
（ｂ）前記ビリルビン誘導体と金属を配位結合して金属が封入されたビリルビン誘導体粒子を製造するステップ。
【０１１２】
本発明の一実施形態によれば、前記（ｂ）ステップは次のステップを含むことができる：
【０１１３】
（ｂ−１）ビリルビン誘導体からなる粒子を製造するステップ；
【０１１４】
（ｂ−２）ビリルビン誘導体からなる粒子に金属を封入するステップ；
【０１１５】
本発明の他の一実施形態によれば、前記（ｂ）ステップはビリルビン誘導体からなる粒子が製造されると共に、金属が封入できる。
【０１１６】
前記本発明のビリルビン誘導体と金属を含む粒子の製造方法をステップ別に詳細に説明する。
【０１１７】
（ａ）ビリルビンを親水性分子とコンジュゲーションしてビリルビン誘導体を製造するステップ
【０１１８】
ビリルビンを親水性分子とコンジュゲーションして親水性乃至は両親媒性のビリルビンを製造する。具体的には、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide）(EDC)またはＥＤＣ／ＮＨＳを用いてビリルビンのカルボキシル基を活性化させ、アミン基（−ＮＨ２）を有する親水性分子とアミド結合を通じてのコンジュゲーションを誘導する。前記ビリルビンとコンジュゲーションされる親水性分子は前述した親水性分子としてアミン基を有するか、またはアミン基を有するように変形されたものである。
【０１１９】
また、前記ビリルビンのカルボキシル基は親水性分子のヒドロキシル基とエステル化（esterification）反応を通じてコンジュゲーションされる。
【０１２０】
本発明の一実施形態によれば、ビリルビンを有機溶媒（例えば、ジメチルスルホキシド、ＤＭＳＯ）に溶かして、ビリルビンに存在するカルボキシル基を活性化させて所望の反応を誘導するためにＥＤＣを添加し、常温で約１０分間反応させる。その後、末端にアミン基を有する親水性分子（例えば、ポリエチレングリコール）を添加し、一定時間反応させて親水性分子がコンジュゲーションされたビリルビン誘導体を合成する。最後に、カルボキシル基とアミン基との間の反応により生成されたアミドボンドを有する最終ビリルビン誘導体をシリカカラムを通じて副産物から純粋に分離及び抽出する。
【０１２１】
【０１２２】
（ｂ）前記ビリルビン誘導体と金属を配位結合して金属が封入されたビリルビン誘導体粒子を製造するステップ
【０１２３】
本ステップは、前記（ａ）ステップで抽出した両親媒性ビリルビン誘導体（例えば、ＰＥＧ化されたビリルビン）を多様な金属粒子または金属イオンと配位結合を誘導して実際的に利用可能なナノ粒子形態に作るステップである。下記の具体的な製造方法は例示的なものであり、本発明の範囲はこれに限定されるのではない。
【０１２４】
【０１２５】
（ｂ−１）前記ビリルビン誘導体でビリルビンナノ粒子を製造するステップ
【０１２６】
具体的に、親水性分子がコンジュゲーションされた両親媒性ビリルビン誘導体をクロロホルムまたはジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に溶解させ、これを窒素ガス条件下に乾燥させて脂質膜層を作る。その後、製作されたビリルビン誘導体の脂質膜層を水溶液で水和させれば、自己組織化されたビリルビンナノ粒子を収得することができる。
【０１２７】
【０１２８】
（ｂ−２）前記ビリルビン誘導体からなる粒子に金属粒子または金属イオンを封入するステップ
【０１２９】
前記（ｂ−１）ステップで得られたビリルビンナノ粒子水溶液に多様な金属粒子または金属イオン水溶液を混ぜて反応させれば、キレーター（chelator）あるいはリンカー（linker）など、他の添加物無しでも所望の金属がビリルビン誘導体に封入されるか、あるいは錯体を形成するようになる。反応しない金属イオンなどはサイズ排除カラムあるいは透析を通じて除去して最終的に所望の反応物を得ることができる。
【０１３０】
本発明のビリルビン誘導体粒子に金属を封入するステップ（ｂ−２）は、前記ビリルビン誘導体でビリルビンナノ粒子を製造するステップ（ｂ−１）と同時になされることができる。
【０１３１】
即ち、ビリルビン誘導体の脂質膜層を水溶液に水和させてビリルビンナノ粒子を製造（ステップｂ−１）した後に金属イオン水溶液を混合して反応（ステップｂ−２）させず、ビリルビン誘導体の脂質膜層に直ちに金属イオン水溶液を混合しながら水和させれば、ステップ（ｂ−１）−（ｂ−２）を順次に遂行することと同様に、ビリルビン誘導体粒子に金属イオンが封入される。しかしながら、ステップ（ｂ−１）−（ｂ−２）を順次に遂行してビリルビンナノ粒子水溶液を作った後、金属イオン水溶液を混ぜて錯体を作る方が金属イオンの封入効率の面で優れる。
【０１３２】
金属ナノ粒子（例えば、鉄ナノ粒子及び金ナノ粒子など）にビリルビン誘導体をコーティングする方法は金属イオンを封入する方法と少し異なる過程を経る。
【０１３３】
本発明の他の実施形態によれば、本発明のビリルビン誘導体は金属イオンを単一層にコーティングした粒子を形成することができる。
【０１３４】
具体的に、鉄ナノ粒子にビリルビン誘導体を単一層にコーティングする方法は、前記ステップ（ｂ）過程で得られたビリルビンナノ粒子水溶液に鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）が溶解されているヘキサン（hexane）溶液を入れるようになれば、水層と有機溶媒層の境界部が形成され、その境界部にソニケーターを用いて人為的な圧力を加えて一定時間２つ層を混ぜてくれれば、リガンド交換（ligand exchange）方法により鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）に元来コーティングされていたオレイン酸（oleic acid）層が落ちて、その代わりにビリルビン誘導体（例えば、ＰＥＧ化されたビリルビン）のカルボキシル基が鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）のコア部分とキレート化反応を通じて金属ナノ粒子をコーティングするようになる。
【０１３５】
本発明の他の実施形態によれば、本発明のビリルビン誘導体は金属粒子クラスターをコーティングした粒子を形成することができる。
【０１３６】
具体的に、有機溶媒（例えば、クロロホルム）に溶かしたビリルビン誘導体（例えば、ＰＥＧ化ビリルビン）とメタノールに溶かしたＳＰＩＯＮ粒子を共に混ぜた後、窒素ガス条件下で前記有機溶媒を乾燥させれば、脂質膜層が生成される。生成された脂質膜層を水和させれば、クラスター形態のＳＰＩＯＮナノ粒子が生成される。
【０１３７】
純粋なＳＰＩＯＮナノ粒子は前記各々の過程を経た後に磁石を用いた磁気分離方法により最終的な反応物を分離することができる。
【０１３８】
本発明の更に他の実施形態に、金ナノ粒子にビリルビン誘導体をコーティングする方法は、前記（ａ）ステップで収得したビリルビン誘導体を有機溶媒でない水に溶かした後、金ナノ粒子が溶けている水溶液と直ちに一定時間反応させて得ることができ、ＳＰＩＯＮと類似な原理により元来の金ナノ粒子をコーティングしていたクエン酸（citrate）に代えてビリルビン誘導体がナノ粒子コア部分を囲みながらコーティングするようになる。
【０１３９】
【０１４０】
本発明の他の一態様によれば、本発明は前述した本発明のビリルビン誘導体粒子を含む活性酸素種（reactive oxygen species、ＲＯＳ）検出用組成物を提供する。
【０１４１】
本明細書で活性酸素種とは、普通に存在する基底状態の三重項酸素（３Ｏ２）より反応性が大きく、活性が豊富な酸素種をいう。
【０１４２】
本発明の一実施形態によれば、前記活性酸素種はスーパーオキサイド（Ｏ２−）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）、ヒドロキシラジカル（hydroxyl radical、(・ＯＨ）、一重項酸素（1O2 singlet oxygen）を含む。また、前記活性酸素種は有機ヒドロペルオキシド（ＲＯＯＨ）、アルコキシラジカル（ＲＯ・）、ペルオキシラジカル（ＲＯＯ・）またはオゾン（Ｏ３）及び二酸化窒素（ＮＯ２）を含む。
【０１４３】
本発明の他の一態様によれば、本発明は前述した本発明のビリルビン誘導体粒子を含む活性酸素種（reactive oxygen species、ＲＯＳ）検出用センサー装置を提供する。
【０１４４】
本発明の具体的な実施形態によれば、前記検出用センサー装置は特別に制限されず、後述するように本発明のビリルビン誘導体粒子と活性酸素種の接触による物理−化学的変化が感知できる当業界で使われる如何なる装置でも可能である。
【０１４５】
【０１４６】
本発明の更に他の一態様によれば、本発明は次のステップを含む活性酸素種検出方法を提供する：
【０１４７】
（ａ）本発明のビリルビン誘導体粒子を含む懸濁液を活性酸素種を含む試料と接触させるステップ；
【０１４８】
（ｂ）前記試料を接触する前後の懸濁液の変化を対照群と比較分析するステップ。
【０１４９】
【０１５０】
本発明の前記活性酸素種検出方法をステップ別に説明する。
【０１５１】
（ａ）本発明のビリルビン誘導体粒子を含む懸濁液を活性酸素種を含む試料と接触させるステップ
【０１５２】
前記ステップは本発明のビリルビン誘導体粒子を含む懸濁液（suspension）と活性酸素種を検出しようとする試料と接触させて懸濁液の中のビリルビン誘導体粒子と活性酸素種を反応させるステップである。本発明のビリルビン誘導体は活性酸素種と反応性がある。したがって、前記懸濁液の中のビリルビン誘導体が試料の内部の活性酸素種と接触すれば、活性酸素との反応により金属粒子のシェル（shell）を成していたビリルビン誘導体が金属粒子から分離される。これによって疎水性を有する金属粒子が互いに合って凝集物（aggregate）または沈殿物（precipitate）を形成する。
【０１５３】
本明細書で試料はヒトまたは動物の尿、唾液、血液（血漿、血清、血球）、組織（肝、膵臓、皮膚などの病変部の組織）を含むが、これに限定されるのではない。また、前記試料は活性酸素種を発生させる化合物を含む溶液など、その他の物質を含む。
【０１５４】
（ｂ）前記試料を接触する前後の懸濁液の変化を対照群と比較分析するステップ
【０１５５】
前記ステップはビリルビン誘導体が試料内の活性酸素種との反応により表れる懸濁液の変化を対照群と比較分析するステップである。前記対照群は活性酸素種の種類及び濃度別にｉ）予め測定されるか、またはｉｉ）前記ステップ（ａ）と同時に測定される活性酸素種の種類及び濃度に従う懸濁液の変化を意味する。
【０１５６】
本発明の一実施形態によれば、前記（ｂ）ステップの懸濁液の変化はビリルビン誘導体粒子の沈殿有無、波長に従う吸光度、懸濁液の透明度、懸濁液内の金属イオンの濃度及びＭＲ画像シグナルの強度を含むが、必ずこれに限定されるのではない。
【０１５７】
本発明の前記方法は前述した本発明のビリルビン誘導体粒子、これを含む組成物または装置を共通的に用いるので、この両者に共通した内容は本明細書の過度な複雑性を避けるために、その記載を省略する。
【０１５８】
本発明の一態様によれば、本発明はビリルビン誘導体粒子を含む組成物を対象（subject）に投与するステップを含む画像診断方法を提供する。
【０１５９】
本発明の他の一態様によれば、本発明はビリルビン誘導体粒子を含む組成物を対象（subject）に投与するステップを含む癌の治療方法を提供する。
【０１６０】
本発明の更に他の一態様によれば、本発明はビリルビン誘導体粒子を含む組成物を対象（subject）に投与するステップを含む炎症性疾患の治療及び診断方法を提供する。
【０１６１】
本明細書で使われた用語、“投与”または“投与する”は、本発明の組成物の治療的または診断的有効量を前記組成物を必要とする対象（個体）に直接的に投与することによって対象の体内で同一な量が形成されるようにすることをいう。
【０１６２】
組成物の“治療的有効量”は組成物を投与しようとする対象に治療的または予防的効果を提供することに充分の組成物の含有量を意味し、これに“予防的有効量”を含む意味である。組成物の“診断的有効量”は組成物を投与しようとする対象に診断効果を提供することに充分の組成物の含有量を意味する。
【０１６３】
本明細書で使われた用語、“対象”は制限無しでヒト、マウス、ラット、モルモット、犬、猫、馬、牛、豚、猿、チンパンジー、ヒヒ（baboon）または赤毛猿を含む。具体的には、本発明の対象はヒトである。
【０１６４】
本発明の画像診断方法、癌の治療方法及び炎症性疾患の治療及び診断方法は、本発明の一態様であるビリルビン誘導体粒子を含む各用途の組成物を投与するステップを含む方法であるので、これらの間に重複する内容に対しては本明細書の記載の過度な複雑性を避けるために省略する。
【０１６５】
【発明の効果】
【０１６６】
本発明の特徴及び利点を要約すれば、次の通りである：
【０１６７】
（ｉ）本発明は金属を含む親水性ビリルビン誘導体粒子、その用途及び製造方法を提供する。
【０１６８】
（ｉｉ）本発明のビリルビン誘導体粒子は多様な金属と配位結合を形成するので、ＭＲ診断、ＣＴ診断、光−音響診断、ＰＥＴ診断または光学診断に使用することができる。
【０１６９】
（ｉｉｉ）本発明のビリルビン誘導体粒子は前記診断用途だけでなく、ビリルビン自体の抗酸化活性、抗癌活性によって抗炎症活性及び抗癌活性を示すので、炎症性疾患や癌疾患を治療する治療用途にも同時に使用することができるセラノスティックス（theranostics）の概念である。
【０１７０】
（ｉｖ）本発明のビリルビン誘導体粒子は、光または活性酸素刺激により分解されることによって、内部に封入した薬物を外部に放出させることができる。
【０１７１】
また、本発明のビリルビン誘導体粒子は活性酸素種との反応性があるので、活性酸素種の種類及び濃度を検出するための組成物、センサー、キット、造影剤または装置として使われることができる。
【０１７２】
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１】本発明のビリルビン誘導体粒子を用いた応用方法の例を示す。
【０１７４】
【図２】本発明のビリルビン誘導体粒子の製造過程及びＰＥＴイメージングに使用するための放射性同位元素６４Ｃｕを用いたプロセスを示した図である。
【０１７５】
【図３】放射性標識効率を最適化するための反応条件を確認するためにｐＨ及び温度に従う効率を示した図である。
【０１７６】
【図４】６４Ｃｕ−ビリルビン粒子を静脈内注射後、１、３及び６時間後のＰＣ−３腫瘍（黄色矢印）保有マウスの代表的なｍｉｃｒｏ−ＰＥＴイメージを示した図である（axial image、上段；coronal image、下段）。
【０１７７】
【図５ａ】ＰＥＧ−ビリルビンと金属イオンの反応時、比色計測定を示したものであって、特定金属イオンとの反応前（上段）と反応後（下段）のビリルビン粒子の懸濁液写真である。
【０１７８】
【図５ｂ】ＰＥＧ−ビリルビンと金属イオンの反応時、比色計測定を示したものであって、特定金属イオンとの反応前後のビリルビン粒子の懸濁液に対するＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを示した図である。
【０１７９】
【図６ａ】ＰＥＧ−ビリルビンを用いた鉄酸化物基盤ＭＲプローブの製作を示した図であって、１）左側の脂質膜（lipid film）方法はクラスターを形成した酸化鉄が中心に位置し、ＰＥＧ−ビリルビン層がその周辺を囲む形態の、本発明の金属が封入されたビリルビン誘導体粒子を生成し、２）右側の超音波処理（sonication）方法はＰＥＧ−ビリルビン層でコーティングされた単一酸化鉄ナノ粒子を生成する。
【０１８０】
【図６ｂ】ＰＥＧ−ビリルビンと超常磁性酸化鉄の配位結合原理を示す図である。
【０１８１】
【図６ｃ】ＰＥＧ−ビリルビンシェル（shell）を有するクラスターを成している酸化鉄ナノ粒子（左側）及び単一分布した酸化鉄ナノ粒子（右側）を示す代表的なＴＥＭイメージを示した図である。
【０１８２】
【図７】ＰＥＧ−ビリルビンでコーティングされたＳＰＩＯＮの特徴を示すものであって、水溶液上でＰＥＧ−ビリルビンでコーティングされたＳＰＩＯＮのＴ２強調ＭＲファントムイメージと鉄濃度の関数としてのＴ２緩和速度を示した図である。
【０１８３】
【図８】ＰＥＧ−ビリルビンでコーティングされたＳＰＩＯＮの特徴を示すものであって、ＲＯＳ刺激前後のＰＥＧ−ビリルビンでコーティングされたＳＰＩＯＮのＴＥＭイメージを示した図である。
【０１８４】
【図９ａ】ＰＥＧ−ビリルビンでコーティングされたＳＰＩＯＮの特徴を示すものであって、ＰＥＧ−ビリルビンでコーティングされたＳＰＩＯＮのＲＯＳ濃度に従うＲＯＳ−反応性を順次的なＭＲファントムイメージで示した図である。
【０１８５】
【図９ｂ】ＰＥＧ−ビリルビンでコーティングされたＳＰＩＯＮの特徴を示すものであって、ＰＥＧ−ビリルビンでコーティングされたＳＰＩＯＮのＲＯＳ濃度に従うＴ２緩和値変化グラフである。
【０１８６】
【図１０】Ｎｏｘ２遺伝子の大食細胞内の発現程度をＲＴ＿ｑＰＣＲで測定して示した図である。
【０１８７】
【図１１ａ】ＲＯＳ生成条件下でＰＥＧ−ＤＳＰＥコーティングＳＰＩＯＮとＰＥＧ−ＢＲ  ＳＰＩＯＮ処理グループとの間の大食細胞食作用の程度を光学顕微鏡で観察した結果を示した図である。
【０１８８】
【図１１ｂ】マウスの腹腔から採取した大食細胞を対象とするＰＥＧ−ＤＳＰＥコーティングＳＰＩＯＮとＰＥＧ−ＢＲ  ＳＰＩＯＮ処理グループとの間の大食細胞食作用の程度をＭＲＩファントム実験で比較して示した図である。
【０１８９】
【図１２】ＰＥＧ−ＢＲがコーティングされた金ナノ粒子を活性酸素種と反応時、ＰＥＧ−ＢＲコーティングが剥けて、金ナノ粒子同士凝集しながら近赤外線（NIR）領域で強力な光熱効果（photothermal effect）が発生することを示す図である。
【０１９０】
【図１３】ＰＥＧ−ＢＲがコーティングされた金ナノ粒子を用いたマウスのＣＴ画像結果を示した図である。
【０１９１】
【図１４】シスプラチンがローディングされたビリルビン粒子の陰で染色された（negatively stained）ＴＥＭイメージを示した図である。
【０１９２】
【図１５】シスプラチンキレート化を示したものであって、一般ビリルビン粒子（ＢＲＮＰ）及びシスプラチンと反応させたビリルビン粒子（BRNP+シスプラチン）の懸濁液写真（左側）及びＵＶ／Ｖｉｓスペクトルを示した図である。
【０１９３】
【図１６】ＰＥＧ−ビリルビン粒子とシスプラチンの推定反応メカニズムを示した図である。
【０１９４】
【図１７ａ】シスプラチンが封入されたＰＥＧ−ビリルビン粒子でいろいろな条件（ｐＨ、ＲＯＳ）及び時間に従うシスプラチン放出様相を示した図である。
【図１７ｂ】シスプラチンが封入されたＰＥＧ−ビリルビン粒子でいろいろな条件（ｐＨ、ＲＯＳ）及び時間に従うシスプラチン放出様相を示した図である。
【０１９５】
【図１８】ヌードマウスの異種移植腫瘍に注射後、時間に従うイン・ビボ光音響イメージ（photoacoustic image）及びこれに相応する腫瘍でピクセル値の半−定量分析（semi-quantitative analysis）を示した図である。
【０１９６】
【図１９】８００ｍＷ／ｃｍ２の出力強度で近赤外線（ＮＩＲ）レーザーに露出した腫瘍異種移植マウスの互いに異なる時間間隔での赤外線熱画像イメージを示した図である。
【０１９７】
【図２０】ヌードマウスの異種移植腫瘍にシスプラチンが封入されたＰＥＧ−ビリルビン粒子を注射した後、光を用いて光熱治療を進行し、期間別に観察した結果を示した図である。
【図２１】ヌードマウスの異種移植腫瘍にシスプラチンが封入されたＰＥＧ−ビリルビン粒子を注射した後、光を用いて光熱治療を進行し、期間別に観察した結果を示した図である。
【０１９８】
【図２２】本発明のＰＥＧ化されたビリルビンがコーティングされた鉄ナノ粒子水溶液の活性酸素種の濃度に従う変化を示した図である。
【０１９９】
【図２３】本発明のＰＥＧ化されたビリルビンがコーティングされた鉄ナノ粒子水溶液の活性酸素種としてＮａＯＣｌの濃度に従う変化を示した図である。
【０２００】
【図２４】本発明のＰＥＧ化されたビリルビンがコーティングされた鉄ナノ粒子水溶液の活性酸素種として２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩(2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride)（AAPH）の濃度に従う変化を示した図である。
【０２０１】
【図２５】本発明のＰＥＧ化されたビリルビンがコーティングされた鉄ナノ粒子水溶液の活性酸素種として過酸化水素水の濃度に従う変化を示した図である。
【０２０２】
【図２６】本発明のＰＥＧ化されたビリルビンがコーティングされた金ナノ粒子（ＰＥＧ−ＢＲ  ＧＮＰ）の水溶液を各種類の活性酸素種（Ｈ２Ｏ２、ＮａＯＣｌ、ＡＡＰＨ）と反応させる前後の溶液の肉眼上の変化を示した図である。
【０２０３】
【図２７】本発明のＰＥＧ化されたビリルビンがコーティングされた金ナノ粒子（PEG-bilirubin gold nanoparticle）の水溶液を各種類の活性酸素種（Ｈ２Ｏ２、ＮａＯＣｌ、ＡＡＰＨ）と反応させる前後の溶液の吸光度変化を示した図である。
【０２０４】
【図２８】本発明のＰＥＧ化されたビリルビンに対する対照群としてＰＥＧ−ｔｈｉｏｌがコーティングされた金ナノ粒子（PEG-thiol gold nanoparticle）の水溶液を各種類の活性酸素種（Ｈ２Ｏ２、ＮａＯＣｌ、ＡＡＰＨ）と反応させる前後の溶液の吸光度変化を示した図である。
【０２０５】
【図２９】マンガンイオン（Ｍｎ２＋）が配位結合して作ったビリルビン誘導体粒子の模式図を示した図である。
【０２０６】
【図３０】ＭＲＩイメージングに使用するための常磁性元素であるマンガンイオン（Ｍｎ２＋）が配位結合したビリルビン誘導体ナノ粒子の製造過程を示した図である。ＰＥＧ−ビリルビンでナノ粒子を作った後、マンガンイオンを混ぜてマンガンイオンが配位結合した粒子を作る。
【０２０７】
【図３１】本発明のビリルビン誘導体及び金属を含む粒子が活性酸素を検出または診断することができることを示す模式図である。具体的に、本発明のマンガンイオンが配位結合したビリルビン誘導体と活性酸素が反応した時、疎水性であるビリルビンは親水性であるビリベルジンに変わるか、またはビリルビンのフラグメント（fragments）に分解されながら結合が弱くなってナノ粒子が瓦解する。これによって、配位結合していたマンガンイオンが落ちながらＭＲＩ画像イメージ向上になる。
【０２０８】
【図３２】本発明のマンガンイオンが配位結合したビリルビン誘導体粒子が活性酸素刺激によりマンガンイオンを放出する様相を示した図である。
【０２０９】
【図３３】マンガンイオンが配位結合したビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）ナノ粒子に活性酸素生成物質として次亜塩素酸（hypochlorite）を処理する前後のＴＥＭイメージを示した図である。
【０２１０】
【図３４】マンガンが配位結合したビリルビンナノ粒子に活性酸素（次亜塩素酸塩）処理前後のＭＲＩ  Ｔ１強調画像を示した図である。
【０２１１】
【発明を実施するための形態】
【０２１２】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨に従って本発明の範囲がこれら実施例により制限されないということは当業界で通常の知識を有する者において自明である。
【０２１３】
【０２１４】
実施例
【０２１５】
【０２１６】
実施例１：本発明のビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）粒子の製造
【０２１７】
１−１．ビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）の製造
【０２１８】
本発明者らはビリルビンの錯体形成効果を用いた、ビリルビンと金属を含むビリルビン誘導体を製造するための前ステップであって、ビリルビンに親水性分子としてポリエチレングリコールをコンジュゲーションしたビリルビン誘導体を製造した。
【０２１９】
まずビリルビンをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶かし、ビリルビンに存在するカルボキシル基を活性化させて所望の反応を誘導するために１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide)（ＥＤＣ）を適当量添加して常温で約１０分間反応させた。次に、末端にアミン基を有するポリエチレングリコールを添加し、一定時間反応させてビリルビンのカルボキシル基と、ポリエチレングリコールのアミン基がアミド結合によりコンジュゲーションされたビリルビン誘導体を合成した。最後に、前記製造された最終ビリルビン誘導体をシリカカラムを通じて副産物から純粋に分離及び抽出した。
【０２２０】
１−２．ビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）粒子の製造
【０２２１】
前記実施例１−１で製造したポリエチレングリコールがコンジュゲーションされた両親媒性のビリルビン誘導体をクロロホルムまたはジメチルスルホキシドなどの有機溶媒に溶解させ、これを窒素ガス条件下に乾燥させて脂質膜層を製造した。製作されたビリルビン誘導体の脂質膜層を水溶液で水和させて水溶液上に溶解されている自己組織化されたビリルビン粒子を製造した。
【０２２２】
【０２２３】
実施例２：本発明の金属（金属イオン）を含むビリルビン誘導体粒子の製造１
【０２２４】
２−１．放射線同位元素である６４Ｃｕイオンを含むビリルビン誘導体粒子の製造及びイン・ビボＰＥＴ画像化
【０２２５】
本発明のビリルビン誘導体粒子の金属イオンの封入効果を確認するために、次のような実験を遂行した。前記実施例１で製造したビリルビン誘導体粒子水溶液に別途の添加物無しでＰＥＴ画像診断に使われる少量の放射性同位元素６４ＣｕＣｌ２水溶液を混合した。すると、反応が非常に激烈で速く起こって約３０分位の反応時間だけで６４Ｃｕイオンがローディングされた（図２）。
【０２２６】
また、本発明のビリルビン誘導体粒子がどれくらい多い活性があるかを確認するためにサイズ排除カラムを用いてビリルビンに内包されていない遊離の６４Ｃｕを除去した後、放射線線量計で定量化した。一方、６４Ｃｕキレート化のうち、他のｐＨと温度条件下で、反応方法は生理学的環境（３７℃、ｐＨ７．４）とほぼ同一に最適化された（図３）。
【０２２７】
前記６４Ｃｕイオンと本発明のビリルビン誘導体との配位結合はビリルビンのピロール基、ラクタム基、カルボキシル基と形成されることができ、これを例示的に化学式で表現すれば、以下の化学式２の通りである。
【０２２８】
【化２】
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【０２２９】
【０２３０】
また、前記実施例１で製造したビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）粒子に６４Ｃｕイオンを配位結合させたビリルビン誘導体粒子を腫瘍を有するラットに注入し、ＰＥＴ画像でイン・ビボ性能を予備的に確認した。確認結果、６４Ｃｕ−ビリルビン粒子は時間依存的に腫瘍を明確に視角化し、注射後、１時間、３時間及び６時間で表れた最も高い腫瘍の吸収率（tumor uptake）は約２．１５、２．８１及び３．７５％注射投与量（ＩＤ）／ｇであった（図４）。
【０２３１】
【０２３２】
２−２．多様な金属（Ｎｉ、Ｍｎ、Ｇｄ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｆｅ）イオンを含むビリルビン誘導体粒子の製造
【０２３３】
本発明のビリルビン誘導体粒子の多様な金属イオンに対する封入効果（キレート効果）を確認するために６種の金属（Ｎｉ、Ｍｎ、Ｇｄ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｆｅ）イオンの間の錯体形成可能性を確認した。実験方法は前記２−１のように実施例１で製造したビリルビン粒子水溶液に前記各金属イオンを含む水溶液を入れて混合した。一定の反応時間が経た後、全ての金属、特に遷移金属はＭｇとＣａの色相変化と比較する時、分別が可能な程度の色相変化（Ｎｉ＝Ｆｅ＞Ｇｄ＝Ｍｎ）を示した（図５ａ）。また、吸光度パターンは一般的な粒子溶液と比較して、各金属で、マグネシウムとカルシウムグループでも多様な変化を示した（図５ｂ）。
【０２３４】
前記結果のように、ビリルビン粒子溶液の色相が特定金属イオンと配位結合を成した後、元来の黄色から変化されるか、または特定吸光度パターンが変位または変更されれば、以前の生体医学応用分野を超えた新たなＰＥＧ化ビリルビンの適用可能性を見せるものでありうる。したがって、本発明のビリルビン誘導体粒子の多様な金属に対する有機金属錯体形成能力は、金属イオン感知システムを含んだ多様な応用が可能であることを確認することができる。
【０２３５】
【０２３６】
【０２３７】
実施例３：本発明の金属（金属ナノ粒子）を含むビリルビン誘導体粒子の製造２
【０２３８】
３−１．単一超常磁性酸化鉄ナノ粒子（superparamagnetic iron oxide nanoparticle 、ＳＰＩＯＮ）を含むビリルビン誘導体粒子の製造
【０２３９】
超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯＮ）に本発明のビリルビン誘導体をコーティングするために、前記実施例１で製造したビリルビンナノ粒子水溶液に酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）が溶解されているヘキサン（hexane）溶液を添加して水層とヘキサン層が分れて境界部を形成した。その境界部にソニケーターを用いて人為的な圧力を加えて一定時間２つ層を混ぜることによって、酸化鉄ナノ粒子の表面にビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）がコーティングされた形態の粒子を製造した（図６ａ）。前記反応の原理はリガンド交換（ligand exchange）原理であって、鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）に元来コーティングされていたオレイン酸（oleicacid）層が落ちて、その代わりに前記ビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）のカルボキシル基が鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯＮ）のコア部分とキレート化反応を通じて金属ナノ粒子をコーティングするものである（図６ｂ）。
【０２４０】
【０２４１】
３−２．クラスター化された形態の超常磁性酸化鉄ナノ粒子（superparamagnetic iron oxide nanoparticle、ＳＰＩＯＮ）を含むビリルビン誘導体粒子の製造
【０２４２】
金属粒子クラスターをビリルビン誘導体でコーティングした形態の粒子を製造するために、前記実施例３−１のようにビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）が溶解された水溶液に有機溶媒に溶解された金属粒子を添加する代わり、有機溶媒（例えば、クロロホルム）に溶かしたビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）にメタノールに溶かしたＳＰＩＯＮ粒子を混合した。その後、窒素ガス条件下で前記有機溶媒を乾燥させて脂質膜層を生成した。最後に、生成された脂質膜層を水和させてクラスター形態のＳＰＩＯＮナノ粒子を製造した。純粋なＳＰＩＯＮナノ粒子は前記過程を経た後に磁石に分離し、これを通じて製造されたクラスター形態のＳＰＩＯＮナノ粒子を最終的な反応物に分離した。
【０２４３】
本発明者らはＴＥＭイメージでＰＥＧ−ビリルビンシェルを使用して前記実施例３−１及び３−２の２つ類型の粒子が成功的に製造されたことを確認した（図６ｃ）。
【０２４４】
【０２４５】
３−３．金ナノ粒子を含むビリルビン誘導体粒子の製造
【０２４６】
金ナノ粒子にビリルビン誘導体をコーティングするために、前記実施例１−１で製造したビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）を有機溶媒でない水に溶かした後、金ナノ粒子が溶解されている水溶液と直ちに一定時間反応させて製造した。反応原理は、前記実施例３−１でのＳＰＩＯＮコーティングと類似の原理で、金ナノ粒子をコーティングしていたクエン酸（citrate）層に代えてビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）がナノ粒子コア部分を囲みながらコーティングするようになる。
【０２４７】
【０２４８】
【０２４９】
実施例４：本発明の金属（金属ナノ粒子）を含むビリルビン誘導体粒子のＲＯＳ反応性
【０２５０】
４−１．ＳＰＩＯＮを含むビリルビン誘導体粒子のＭＲＩファントム研究（MRI phantom study）
【０２５１】
本発明者らは単一分布粒子の形態にＰＥＧ−ビリルビンによりコーティングされたＳＰＩＯＮの特性を研究するためにＭＲＩファントム研究（phantom study）を進行した。
【０２５２】
まず本発明のビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ビリルビン）コーティングＳＰＩＯＮと、臨床的に承認されたＴ２強調ＭＲ剤（T2-weighted MR agent）であるフェリデックス（Feridex）のファントム画像を比較した結果、本発明のビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ビリルビン）コーティングＳＰＩＯＮがフェリデックスより優れる緩和度（relaxivity）値を示した（図７）。
【０２５３】
また、本発明のビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ビリルビン）コーティングＳＰＩＯＮをＲＯＳ発生剤である次亜塩素酸塩（hypochlorite）で処理すると、ビリルビン固有のＲＯＳに対する反応性（ROS-responsiveness）により、ＴＥＭ画像でＰＥＧ−ビリルビンでコーティングされたＳＰＩＯＮの凝集が観察された（図８）。また、予想の通り、Ｔ２  ＭＲファントム研究でもＰＥＧ−ビリルビンにより維持される親水性損失によって、ＲＯＳ濃度に比例するＴ２信号の漸進的な減少によるＲＯＳ−反応性が間接的に立証された（図９ａ及び図９ｂ）。このようなＳＰＩＯＮ凝集反応はＳＰＩＯＮのサイズを漸進的に増加させることができるので、今後magnetic hyperthermiaという治療効果の潜在的な対象になることができる。
【０２５４】
【０２５５】
４−２．ＳＰＩＯＮを含むビリルビン誘導体粒子のＲＯＳ反応性に対するイン・ビトロ及びイン・ビボ試験
【０２５６】
ＰＥＧ−ビリルビンがコーティングされた鉄ナノ粒子がイン・ビトロ及びイン・ビボでＲＯＳに反応して作動及び凝集するか否かを確認するために、炎症条件で活性酸素及び大食作用を通じて外部病源体（pathogen）を貪食するとよく知られた１次大食細胞及び大食細胞株を用いて以下のような実験を進行した。
【０２５７】
まず、人為的な炎症条件を作るためにＬＰＳ（lipopolysaccharide）を大食細胞あるいは腹腔に処理した後、それと同時にＰＥＧ−ビリルビンでコーティングされたＳＰＩＯＮと対照群に用いられたＰＥＧ−ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(PEG-distearoylphospha tidylethanolamine)（PEG-DSPE）がコーティングされたＳＰＩＯＮ粒子を各々処理して、その貪食様相を光学顕微鏡及びＭＲファントム画像を用いて観察した。
【０２５８】
各条件でＲＯＳが同一な量に生成されるかを調べるために体内でＲＯＳ発生源として知られたＮｏｘ２遺伝子の大食細胞内の発現程度をＲＴ＿ｑＰＣＲを通じて測定した。その結果、ＰＥＧ−ＤＳＰＥとＰＥＧ−ＢＲ  ＳＰＩＯＮグループ間の前記Ｎｏｘ２遺伝子の発現程度がほとんど類似すると表れて、正常条件よりは増加した類似な量のＲＯＳが生成されることを確認した（図１０）。
【０２５９】
また、同等な量のＲＯＳ生成条件で各々のＰＥＧ−ＤＳＰＥコーティングＳＰＩＯＮとＰＥＧ−ＢＲ  ＳＰＩＯＮ処理グループ間の貪食程度を光学顕微鏡を通じて観察した。観察結果、ＰＥＧ−ＢＲコーティングＳＰＩＯＮ処理群で対照群であるＰＥＧ−ＤＳＰＥコーティングＳＰＩＯＮ処理群に比べてより高い貪食程度を示した（図１１ａ、貪食程度の増加により、一層濃い色として観察される）。腹腔から大食細胞を採取して得たＭＲＩ細胞ファントム研究でも同一な様相を示した（図１１ｂ）。
【０２６０】
前記の結果は、ＬＰＳ処理によりストレスが増加した大食細胞で生成された活性酸素に反応してＰＥＧ−ＢＲコーティングＳＰＩＯＮでＰＥＧ−ＢＲコーティングが剥けることによって、ＳＰＩＯＮコアが凝集してそれによって貪食が増加したか、または貪食された後に活性酸素により反応して細胞内でも互いに凝集が起こって前記のような結果が生じたことと考えられる。それに反して、対照群であるＰＥＧ−ＤＳＰＥコーティングＳＰＩＯＮは活性酸素と何の反応もしないので、相対的に完全な形態のＰＥＧ−ＤＳＰＥコーティングＳＰＩＯＮナノ粒子、その自体の活性が観察されたことと考えられる。
【０２６１】
【０２６２】
４−３．金ナノ粒子を含むビリルビン誘導体粒子のＣＴファントム研究及びＲＯＳ反応性に対するイン・ビトロ及びイン・ビボ試験
【０２６３】
金ナノ粒子（Gold nanoparticle）は前臨床（preclinical）領域でＣＴ造影剤に広く研究されている。ＳＰＩＯＮのように、クエン酸によりコーティングされた金ナノ粒子表面は配位結合によりＰＥＧ化されたビリルビン（ＰＥＧ−ＢＲ）に代替できる。本発明で、金ナノ粒子へのＰＥＧ化ビリルビンの成功的結合は、ＴＥＭイメージとＣＴファントムイメージを通じて確認し、キレート化後、ＵＶ−Ｖｉｓ波長変化及びビリルビンによりコーティングされた金ナノ粒子の反応性酸素種−反応性（ROS-responsiveness）を対照群であるＰＥＧ化チオール（pegylated thiol）によりコーティングされた金ナノ粒子と比較して観察することによって確認した。
【０２６４】
また、ＰＥＧ−ＢＲがコーティングされた金ナノ粒子は活性酸素と反応時、ＰＥＧ−ＢＲコーティングが剥けて、これによってリガンドを消失した金ナノ粒子同士凝集し、これによって金ナノ粒子が近赤外線領域（NIR region）で強力な光熱効果（photothermal effect）を有するようになる吸光度変化を有するようになる（図１２）。これは、ＰＥＧ−ＢＲがコーティングされた金ナノ粒子基盤の造影剤は今後にＣＴを用いた診断だけでなく、腫瘍で活性酸素に反応して光熱効果による治療も図ることができるツールとして利用できる可能性を示す。
【０２６５】
また、ｉｎ  ｖｉｖｏ上でＰＥＧ化ビリルビンがコーティングされた金ナノ粒子のＣＴ画像をマウスで確認して見た結果、長時間の間安定的に循環（long circulation）しながら血管造影が可能であることを確認し、それと共に肝及び脾臓など、主要臓器の画像化においても優れる結果を示した（図１３）。
【０２６６】
【０２６７】
実施例５：本発明の金属（プラチナ系抗癌剤）を含むビリルビン誘導体粒子の製造３
【０２６８】
本発明のビリルビン誘導体粒子の金属と錯体を形成するキレート効果及び腫瘍に対する治療効能を立証するために腫瘍に対して使われる最も代表的な金属薬物であるシスプラチンをローディングしたナノ粒子を製造した（図１４）。シスプラチンは白金金属骨格を有しており、ナノ運搬体と共に使用されてきた。
【０２６９】
ＰＥＧ化ビリルビン（ＰＥＧ−ＢＲ）粒子とシスプラチンの加水分解生成物を反応させた結果、溶液の中で前例ない色変化が表れると共に、シスプラチンがローディングされることを確認した（図１５）。前記ＰＥＧ化ビリルビンとシスプラチンの結合原理を示す模式図を図１６に示した。
【０２７０】
また、シスプラチンが封入されたビリルビンナノ粒子でいろいろな条件（ｐＨ、ＲＯＳ）及び時間に従うシスプラチン放出実験を進行した結果、シスプラチンはＲＯＳに反応して最も高い放出率を示し、その次に細胞内のライソソームの環境と類似すると知られた酸性条件（ｐＨ５．５）で高い放出率を示し、生理的なｐＨでは最も低い放出率を示した（図１７ａ及び図１７ｂ）。
【０２７１】
前記結果から本発明の金属を含むビリルビン誘導体粒子は安定的にシスプラチンというプラチナ系薬剤を封入し、周辺微細環境に選択的に封入した薬剤が放出できることを間接的に確認することができる。
【０２７２】
【０２７３】
【０２７４】
実施例６：本発明の金属（プラチナ系抗癌剤）を含むビリルビン誘導体粒子の光−音響及び光熱活性
【０２７５】
減少したSoret bandピークを犠牲させれば、赤外線領域（IR region）（赤色偏移）での吸光度の上昇は８０８ｎｍの光で顕著な光熱活性を誘発する。ビリルビンナノ粒子その自体に顕著なＩＲ光感受性が存在するので、元来の一般的なＩＲ光源では光熱活性を引き出すことができなかった。このような変化と新しく獲得した光子特性は“プラチナブルース”理論により説明できる。この理論によれば、シスプラチンの加水分解生成物をアミドリガンドと反応させた時に得ることができる。
【０２７６】
ＰＥＧ化されたビリルビンをシスプラチンと配位結合させた本発明のナノ粒子は近赤外線領域（NIR region）で新しく獲得した吸光度によって、本発明者らはこのような金属−錯体を光−音響イメージ（photo-acoustic image）と光熱治療（photo-thermal therapy、ＰＴＴ）に使用した。光−音響イメージと光熱治療は特定波長の光で同一な原理を共有する。
【０２７７】
腫瘍異種移植モデルのマウスで生体内の光−音響イメージングに適用時、本発明のビリルビン誘導体は静脈内注射後、徐々に光−音響信号が増加することを確認した（図１８）。したがって、同一な条件で光熱治療可能性を確認し、８０８ｎｍの光に露出後、５分以内に腫瘍の表面温度が５５〜６０℃まで急激に上昇することを確認した（図１９）。結果的に、実際の光を用いて光熱治療を進行したグループで時間に従って有意な腫瘍ボリューム減少効果が観察された（図２０及び図２１）。
【０２７８】
【０２７９】
実施例７：本発明の金属を含むビリルビン誘導体粒子の活性酸素種に対する反応性
【０２８０】
実施例７−１．鉄ナノ粒子を含むビリルビン誘導体粒子の活性酸素種に対する反応性確認（肉眼上の色相変化）
【０２８１】
本発明のビリルビン誘導体粒子の活性酸素種に対する反応性及び変化を確認するために活性酸素種の濃度に従う本発明のＰＥＧ化されたビリルビンがコーティングされた鉄ナノ粒子の変化を確認した。
【０２８２】
まずＰＥＧ化されたビリルビンがコーティングされた鉄ナノ粒子を含む懸濁液を前述した実施例のような方法により製造した後、懸濁液にＮａＯＣｌ（１００、１０、１、０．１、０ｍＭ）とＡＡＰＨ＊（１００、１０、１、０．１、０ｍＭ）、過酸化水素水（１００ｍＭ）を濃度別に添加し、その結果を肉眼と光学顕微鏡で観察した。［＊２，２’−アゾビス（２−アミジノプロパン）二塩酸塩（*2,2'-Azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (AAPH)）］また、陰性対照群としてＰＥＧ化されたＤＳＰＥ**がコーティングされた鉄ナノ粒子を使用した。［**1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphor ethanolamine(DSPE)］
【０２８３】
結果は、図２２乃至２５で示した。
【０２８４】
図２２に示したように、ＮａＯＣｌ  １００ｍＭ濃度では高濃度の活性酸素によって鉄ナノ粒子をコーティングしていたＰＥＧ化されたビリルビンが全て脱落して残っている疎水性の鉄ナノ粒子同士互いに凝集して沈んでしまう。これによって、右側２つチューブで見える鉄ナノ粒子水溶液の固有なコーヒー色も消失して透明な水色を示した。一方、中間濃度である１ｍＭを処理した中間チューブグループはごく少量だけ凝集しており（赤色矢印）、右側の対照群グループ（０ｍＭ）に比べて鉄ナノ粒子の弱い凝集によって、より深まったコーヒー色を示した。
【０２８５】
また、図２３乃至２５に示したように、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）>>ＡＡＰＨ>>>>>過酸化水素水の順序に活性酸素との反応性が異なることを各々確認することができた。また、陰性対照群で使用したＰＥＧ化された１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（1,2-Distearoyl-sn- glycero-3-phosphoethanolamine）(DSPE)がコーティングされた鉄ナノ粒子は３種類の活性酸素と何の反応もしないことを確認した。したがって、本発明の活性酸素とＰＥＧ化されたビリルビンがコーティングされた鉄ナノ粒子の反応は非常に特異的であることを確認することができる。
【０２８６】
【０２８７】
実施例７−２．金ナノ粒子を含むビリルビン誘導体粒子の活性酸素種に対する反応性確認（吸光度変化）
【０２８８】
本発明のビリルビン誘導体粒子の活性酸素種に対する反応性を定量的に確認するためにビリルビン誘導体粒子と活性酸素種を反応させる前後の吸光度を測定した。具体的に、ＰＥＧ化されたビリルビンがコーティングされた金ナノ粒子を各種類の活性酸素種と反応させる前後の溶液の変化を肉眼及び吸光度を測定して確認した。
【０２８９】
結果は、図２６乃至２８に示した。
【０２９０】
ＡＡＰＨの場合、ＰＥＧ化されたビリルビンがコーティングされた金ナノ粒子のみ特異的に反応し、陰性対照群に使用したＰＥＧ化されたチオール（ＰＥＧ−ＳＨ）がコーティングされた金ナノ粒子は反応しなかった。また、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）の場合、ＰＥＧ化されたビリルビンがコーティングされた金ナノ粒子とＰＥＧ化されたｔｈｉｏｌ（ＰＥＧ−ＳＨ）がコーティングされた金ナノ粒子全て反応することと見えて、本発明のビリルビン誘導体粒子が特異的に活性酸素種（ＡＡＰＨ）にさらに高い反応性を示すことを確認した。
【０２９１】
前記結果から本発明のビリルビン誘導体粒子は活性酸素種の種類及び濃度を鑑別することに有用に使用できることが分かる。
【０２９２】
【０２９３】
実施例８：本発明のマンガンイオン配位結合ビリルビン誘導体粒子の活性酸素種に対する反応性
【０２９４】
実施例８−１．マンガンイオン配位結合ビリルビン誘導体粒子の製造
【０２９５】
本発明の金属を含むビリルビン誘導体粒子の活性酸素種に対する反応性及び変化を追加的に確認するためにマンガンイオン（Ｍｎ２＋）を配位結合してビリルビン誘導体粒子を製造した。マンガンイオンが配位結合したビリルビン誘導体ナノ粒子の模式図と製造方法は図２９及び図３０に示した。具体的に、５）前記実施例１で製造したビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）粒子水溶液を強く混ぜながらＰＥＧ−ＢＲ：ＭｎＣｌ２のモル割合が１：１になるようにＭｎＣｌ２水溶液をシリンジポンプ（syrynge pump）を用いて点滴した。以後、３７℃で４８時間の間反応させた。６）反応が終わった後、透析バック（Float A-Lyzer、MW cutoff：２０Ｋ）を用いてビリルビンナノ粒子と結合できなかったマンガンイオンを除去し、７）Amicon  １０Ｋを用いて濃縮することによってマンガンイオンが配位結合したビリルビン誘導体ナノ粒子を製造した。８）製造されたビリルビン誘導体ナノ粒子に結合したマンガンイオンの量を測定するためにＩＣＰ−ＯＥＳ（Agilent ICP−OES 5110）を使用した。その結果、本発明のマンガンイオンが配位結合したビリルビン誘導体ナノ粒子はマンガンイオンが２２．６７±２．２０ｍｇ／ｋｇ（ＰＥＧ−ＢＲ  １ｍＭ基準）結合されたことを確認した。
【０２９６】
【０２９７】
実施例８−２．マンガンイオン配位結合ビリルビン誘導体粒子の活性酸素種に対する反応性確認（イオン濃度、ＴＥＭイメージ及びＭＲ画像）
【０２９８】
前記実施例８−１で製造した本発明のマンガンイオン配位結合ビリルビン誘導体粒子の活性酸素との反応を確認するために、マンガンイオン配位結合ビリルビン誘導体粒子に次亜塩素酸を投入し、時間に従うマンガンイオンの放出量及びＭＲＩ  Ｔ１強調画像を得た。図３１は、本発明のマンガンイオンが配位結合したビリルビン誘導体と活性酸素が反応した時、疎水性であるビリルビンが親水性であるビリベルジンに変わりながら結合が弱くなってナノ粒子が瓦解され、これによって配位結合していたマンガンイオンが落ちながら活性酸素をＭＲＩを用いてイメージングできることを説明する。
【０２９９】
具体的に、マンガンイオンが配位結合したビリルビンナノ粒子１ｍＬを透析バック（Float A-Lyzer、MW cutoff：２０Ｋ）に入れて、９９ｍＬの蒸溜水にＮａＯＣｌ １ｍＭを入れた後、室温で振ってくれて配位結合状態から落ちるマンガンイオンの透析を進行した。定まった時間（０、１、２、３、６、１２、２４、４８及び７２ｈｒ）で透析バックの内側で５０μｌを採取し、各分画に含まれたマンガンの量をＩＣＰ−ＭＳ（Agilent ICP−MS 7700S）を通じて確認した。
【０３００】
結果は図３２に示した。図３２に示したように、本発明のマンガンイオンが配位結合したビリルビン誘導体粒子は活性酸素刺激によりマンガンイオンを放出した。
【０３０１】
【０３０２】
また、本発明者らは本発明のマンガンイオンが配位結合したビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）ナノ粒子の次亜塩素酸（hypochlorite）処理前後の形態学的変化を透過電子顕微鏡で観察した。結果は図３３に示した。図３３に示したように、活性酸素（次亜塩素酸）刺激前にはマンガンイオンが配位結合したビリルビン誘導体粒子が１個所に集まって小さな球形態を帯びていたが、刺激後にはマンガンイオンとビリルビンの結合が変わりながら集まっておらず、分散された様子を確認することができた。
【０３０３】
また、本発明者らは本発明のマンガンイオンが配位結合したビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）ナノ粒子の次亜塩素酸（hypochlorite）処理前後のＭＲ画像シグナルの強度変化を測定した。測定装備は１７−ｃｍボアサイズの３−Ｔｅｓｌａ  ＭＲＳ  ３０００スキャナー（w/ a birdcage rat head coil, MR Solutions, Surrey, United Kingdom）を使用し、水平方向（Horizontal）Ｔ１強調画像の測定パラメータは次の通りであった：
【０３０４】
Time of repetition (TR)/echo time (TE); 550 ms/11 ms, flip angle; 90°, field of view (FOV); 45 mm × 45 mm, slice thickness; 1.5 mm, matrix number; 256 × 128.
【０３０５】
結果は表１及び図３４に示した。
【０３０６】
【表１】
2020523404.tif 000005
【０３０７】
前記表１及び図３４に示したように、本発明のマンガンイオンが配位結合したビリルビン誘導体（ＰＥＧ−ＢＲ）ナノ粒子は、活性酸素（次亜塩素酸）処理後、ＭＲＩ  Ｔ１強調画像の明るさが向上することを確認することができた。したがって、前記結果から本発明のビリルビン誘導体粒子は活性酸素、またはこれを伴う炎症部位の検出用組成物として有用に使用できることを確認した。
【０３０８】
【０３０９】
以上、本発明の特定の部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者に当たってこのような具体的な技術は単に好ましい実施形態であり、ここに本発明の範囲が制限されるのでないことは明白である。
【０３１０】
【０３１１】
【０３１２】
【図１】
2020523404.tif 000006
【図２】
2020523404.tif 000007
【図３】
2020523404.tif 000008
【図４】
2020523404.tif 000009
【図５ａ】
2020523404.tif 000010
【図５ｂ】
2020523404.tif 000011
【図６ａ】
2020523404.tif 000012
【図６ｂ】
2020523404.tif 000013
【図６ｃ】
2020523404.tif 000014
【図７】
2020523404.tif 000015
【図８】
2020523404.tif 000016
【図９ａ】
2020523404.tif 000017
【図９ｂ】
2020523404.tif 000018
【図１０】
2020523404.tif 000019
【図１１ａ】
2020523404.tif 000020
【図１１ｂ】
2020523404.tif 000021
【図１２】
2020523404.tif 000022
【図１３】
2020523404.tif 000023
【図１４】
2020523404.tif 000024
【図１５】
2020523404.tif 000025
【図１６】
2020523404.tif 000026
【図１７ａ】
2020523404.tif 000027
【図１７ｂ】
2020523404.tif 000028
【図１８】
2020523404.tif 000029
【図１９】
2020523404.tif 000030
【図２０】
2020523404.tif 000031
【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
2020523404.tif 000034
【図２４】
2020523404.tif 000035
【図２５】
2020523404.tif 000036
【図２６】
2020523404.tif 000037
【図２７】
2020523404.tif 000038
【図２８】
2020523404.tif 000039
【図２９】
2020523404.tif 000040
【図３０】
2020523404.tif 000041
【図３１】
2020523404.tif 000042
【図３２】
2020523404.tif 000043
【図３３】
2020523404.tif 000044
【図３４】
2020523404.tif 000045
【国際調査報告】
2020523404.tif 000046
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2020523404.tif 000048
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