(57)【要約】  予め定義された配列を有する標的二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチドを合成する方法であって、ａ）アレイ装置内に、多様性のあるオリゴヌクレオチドライブラリメンバーを含むオリゴヌクレオチドライブラリを用意する工程であって、ライブラリメンバーはそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を有し、かつ別個のライブラリ封じ込め内で水溶液中に含有され、多様性は、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓオリゴ）、および少なくとも１つのオーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓオリゴ）を含み、そして少なくとも１０，０００対のマッチングオリゴヌクレオチドをカバーする、工程と、ｂ）第１の工程において、前記ライブラリ由来のマッチングオリゴヌクレオチドの少なくとも第１の対を、液体ハンドラーを用いて第１の反応封じ込め中に移し、マッチングオリゴヌクレオチドをアセンブルし、それによって少なくとも１つのオーバーハングを含む第１の反応産物を得る工程と、ｃ）第２の工程および更なる工程において、前記ライブラリ由来のマッチングオリゴヌクレオチドの少なくとも第２の対および更なる対を、液体ハンドラーを用いて第２の反応封じ込めおよび更なる反応封じ込め中にそれぞれ移し、マッチングオリゴヌクレオチドをアセンブルし、それによって少なくとも１つのオーバーハングを各々含む第２の反応産物および更なる反応産物をそれぞれ得る工程と、ｄ）前記第１、第２、および更なる反応産物を、予め決められたワークフローにおいてアセンブルし、それによってオーバーハングを有する前記標的ｄｓポリヌクレオチドを生成する工程であって、場合によってはその後、平滑末端を調製するための仕上げ工程が続く、工程とを含み、工程ｂ）およびｃ）において用いられるマッチングオリゴヌクレオチドの前記対、およびアセンブリワークフローは、前記標的ｄｓポリヌクレオチドを生成するアルゴリズムを用いて決定される、方法。【選択図】図１Ｂ
2020537546.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予め定義された配列を有する標的二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチドを合成する方法であって、
ａ）アレイ装置内に、多様性のあるオリゴヌクレオチドライブラリメンバーを含むオリゴヌクレオチドライブラリを用意する工程であって、前記ライブラリメンバーがそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を有し、かつ別個のライブラリ封じ込め内で水溶液中に含有され、多様性が、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓオリゴ）、および少なくとも１つのオーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓオリゴ）を含み、そして少なくとも１０，０００対のマッチングオリゴヌクレオチドをカバーする、工程と、
ｂ）第１の工程において、前記ライブラリ由来のマッチングオリゴヌクレオチドの少なくとも第１の対を、液体ハンドラーを用いて第１の反応封じ込め中に移し、前記マッチングオリゴヌクレオチドをアセンブルし、それによって少なくとも１つのオーバーハングを含む第１の反応産物を得る工程と、
ｃ）第２の工程および更なる工程において、前記ライブラリ由来のマッチングオリゴヌクレオチドの少なくとも第２の対および更なる対を、液体ハンドラーを用いて第２の反応封じ込めおよび更なる反応封じ込め中にそれぞれ移し、前記マッチングオリゴヌクレオチドをアセンブルし、それによって少なくとも１つのオーバーハングを各々含む第２の反応産物および更なる反応産物をそれぞれ得る工程と、
ｄ）前記第１、第２、および更なる反応産物を、予め決められたワークフローにおいてアセンブルし、それによってオーバーハングを有する前記標的ｄｓポリヌクレオチドを生成する工程であって、場合によってはその後、平滑末端を調製するための仕上げ工程が続く、工程と
を含み、
工程ｂ）およびｃ）において用いられるマッチングオリゴヌクレオチドの前記対、およびアセンブリワークフローが、前記標的ｄｓポリヌクレオチドを生成するアルゴリズムを用いて決定される、方法。
【請求項２】
一連の異なる標的ｄｓポリヌクレオチドが、同じオリゴヌクレオチドライブラリを用いて合成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異なる標的ｄｓポリヌクレオチドが、５０％未満、好ましくは３０％未満の配列同一性を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ｓｓオリゴが、６〜２６ｎｔの長さを有する、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ｄｓオリゴが、６〜２６ｂｐの長さを有し、そして前記オーバーハングが、各ｄｓオリゴの長さの半分以下である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記多様性が、リン酸化、メチル化、ビオチン化、またはフルオロフォアもしくはクエンチャへの結合のいずれか１つまたは複数によって修飾されるｓｓオリゴおよび／またはｄｓオリゴをカバーする、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的ｄｓポリヌクレオチドが、少なくとも４８ｂｐｓの長さを有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記アセンブリが、酵素反応および／または化学反応であるライゲーション反応による、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ライゲーション反応が、リガーゼ、好ましくはＴ３、Ｔ４、もしくはＴ７  ＤＮＡリガーゼ、またはポリメラーゼもしくはリボザイムを用いた酵素的ライゲーション反応である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記アセンブリが、マッチングオーバーハングを直接的にハイブリダイズすることによるものであり、または適切なｓｓオリゴリンカーを間接的にハイブリダイズすることによるものであり、ｓｓオリゴリンカーが、前記ライブラリから選択され、かつ移されて、前記第１、第２、または更なる反応産物のいずれかをアセンブルする、前記ライブラリ内に含有されるｓｓオリゴである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的ｄｓポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、鋳型と同一である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的ｄｓポリヌクレオチドが、特異的突然変異誘発、エンドヌクレアーゼ、またはエキソヌクレアーゼのいずれかによって、目的の配列（ＳＯＩ）を有する前記ポリヌクレオチドを得るようにさらに修飾される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的ｄｓポリヌクレオチドが、ｄｓ  ＤＮＡ、ｓｓ  ＤＮＡ、またはＲＮＡ分子のいずれか１つである、その誘導体を生成するようにさらに修飾され、好ましくは、修飾方法が、メチルトランスフェラーゼ、キナーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、多重自動化ゲノム工学（ＭＡＧＥ）、接合性アセンブリゲノム工学（ＣＡＧＥ）、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（Ａｇｏ）もしくはその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ハイブリダイジング分子、スルフリラーゼ、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、またはＴＮａｓｅのいずれかを使用する酵素的修飾のいずれか１つである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記別個のライブラリ封じ込めが、好ましくは使用頻度に従って、三次元のオーダーで空間的に配置され、前記三次元のオーダーが、少なくとも部分的に積み重ねられる少なくとも２つのライブラリ封じ込めを含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アレイ装置が、マイクロタイタープレート、マイクロ流体マイクロプレート、一セットのキャピラリ、マイクロアレイ、またはバイオチップのいずれか、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡバイオチップである、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記標的ｄｓポリヌクレオチドが、鋳型の配列またはＳＯＩとの同一性の程度を確認するために配列決定される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
多様性のあるライブラリメンバーを含むアレイ装置内に提供されるオリゴヌクレオチドライブラリであって、前記ライブラリメンバーが、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓオリゴ）、および少なくとも１つのオーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓオリゴ）であり、前記ライブラリメンバーがそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を有し、かつ別個のライブラリ封じ込め内で水溶液中に含有され、封じ込めが、三次元のオーダーで空間的に配置され、多様性が、少なくとも１０，０００対のマッチングオリゴヌクレオチドをカバーする、オリゴヌクレオチドライブラリ。
【請求項１８】
前記ライブラリ封じ込めが、好ましくは使用頻度に従って、三次元のオーダーで空間的に配置され、そして前記三次元のオーダーが、少なくとも部分的に積み重ねられる少なくとも２つのライブラリ封じ込めを含む、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチドライブラリ。
【請求項１９】
予め定義された配列を有する一連の異なる標的二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチドを合成するための、請求項１７または１８に記載のオリゴヌクレオチドライブラリの使用であって、前記異なる標的二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチドが、５０％未満、好ましくは３０％未満の配列同一性を有する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、オリゴヌクレオチドの多様なライブラリを用いて、予め定義された配列を有する二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチドを合成する新規の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチドの人工的な合成は、現在、必ずしも排他的であるわけではない２種類の方法によって達成される：
ポリヌクレオチドの合成方法の第１のクラスは、「化学合成」である。これは、ホスホラミダイト化学（ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、１９８１）を用いて、ヌクレオチドを逐次的に、順々に連結することによって、一本鎖ＤＮＡ（またはＲＮＡ）分子が構築されるプロセスである。この方法は、あらゆる複雑な、特定の予め決められた鋳型配列を有するＤＮＡ分子の構築を可能にする。化学的方法は、その安価な性質に起因して、一般に普及しており、容易に平行化可能であり、そして一部の実施において、チップ中でのＤＮＡまたはＲＮＡの高スループット生成を可能にする（ＬｅＰｒｏｕｓｔら、２０１０）。これらの方法の主な最大の不利点は、反応の収率が、合成されることとなる鋳型の長さによって劇的に低下し、分子のサイズを、典型的にはおよそ２００塩基対（ｂｐまたはｂｐｓ）に制限することである。
【０００３】
ＤＮＡ合成方法の第２のクラスは、「アセンブリ方法」である。これは、異なるサイズの、そして種々の配列のオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを、特定の方法で生化学的に連結して、所望の標的配列を有するより大きな分子を得ることからなる。これらのオリゴヌクレオチドの源は、多くの場合、化学合成物であるが、天然に存在するＤＮＡの酵素的消化の産物であってもよい。このアセンブリ方法は、多くの場合、「Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」の製品名で商品化されており、この用語は、大きなポリヌクレオチド鎖（１Ｋ〜５Ｋｂｐ）の合成についての換喩語であるが、遺伝子サイズ長とは限らない。より小さなポリヌクレオチドを標的配列中にアセンブルするためのいくつかのアプローチが、文献中に報告されている（Ｓｔｅｍｍｅｒら、１９９５；Ｓｍｉｔｈら、２００３；Ｅｎｇｌｅｒら、２００８；Ｇｉｂｓｏｎら、２００９；Ｈｏｒｓｐｏｏｌ  ２０１０）。
【０００４】
過去数年で、「Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」（Ｇｉｂｓｏｎら、２００９）は、いくつかの直鎖状ｄｓＤＮＡフラグメント（約３０ｂｐ〜最大数Ｋｂｐの範囲のサイズ）を連結するための、一般に普及する方法となった。当該方法は、ペアワイズ重複配列相同性を有する多くのｄｓＤＮＡフラグメントを連結することからなる。フラグメント間で、重複相同領域は、約１５〜８０ｂｐの間の範囲であってよい。オーバーハングは必須でない。なぜなら、当該方法の酵素的機構が、オーバーハングの生成に注意して、ギャップを埋めて、フラグメントを正確にライゲートするからである。この酵素的機構は、３つの酵素を利用する：Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、およびＴａｑ  ＤＮＡリガーゼであり、全て等温反応である。当該方法は、シンプルかつ応用自在であり、直鎖状の、そして環状のｄｓＤＮＡ産物の双方を生成することができる。この方法の不利な面は、自動化についての制限であり、これが、大規模な商用利用にとって不適なものとなっている。
【０００５】
何千もの塩基対のＤＮＡ分子を構築する共通のテーマは、最大数百ｎｔまたはｂｐの小さなフラグメントを化学的に合成してから、これらを、クローニング、ライゲーション、ＰＣＡ、またはＧｉｂｓｏｎアセンブリによって連結することである。
【０００６】
いくつかのアプローチは、できる限り化学合成を通して、考えられる遺伝的空間をカバーするオリゴヌクレオチドのライブラリ、または考えられる遺伝的空間の必要とされるサブセットを予め構築することを示唆する。
【０００７】
ＣｈａｒｉおよびＣｈｕｒｃｈは、合成されたオリゴヌクレオチド（２００塩基）を用いて短いＤＮＡフラグメントを生成して、酵母および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でのインビボ相同組換えを用いて、大きなＤＮＡセグメントにアセンブルすることを提唱する（ＣｈａｒｉおよびＣｈｕｒｃｈ、２０１７）。
【０００８】
ＷＯ２００９／１３８９５４Ａ２は、固相アセンブリによるより大きなポリヌクレオチドの合成方法を開示しており、より大きなポリヌクレオチドのアセンブリに必要とされる、定義されるサブユニットが、必要に応じて化学的に合成される。
【０００９】
Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（ＵＳ２０１６／０２１５３１６Ａ１）は、考えられる全てのヘキサマー（Ｎ＝４，０９６個のオリゴ）の空間を含むライブラリを用いることを提唱する。次に、６塩基対長のオリゴが、オリゴリンカーを用いてアセンブルされて、ポリヌクレオチドが形成される。オリゴヌクレオチドの連結および大規模なＤＮＡ合成に関するある種の制限が存在する。当該方法は、適切に設計されたライブラリ、および、例えば、クローニング、大容量の試薬の使用についてのマニュアルプロトコルを必要とするので、時間がかかる。すると、実質的なコストが合成の価格に加わり、標的配列長が増大するにつれ、ｂｐあたりの実質的なコストが増大する。
【００１０】
ＷＯ２００２／０８１４９０号は、ヒトゲノムデータベース等のデータベースで利用可能な情報に基づくコンピュータ誘導ポリヌクレオチドアセンブリによって、ゲノム配列情報の結果を利用するアプローチを開示する。具体的には、標的ポリヌクレオチドを生成する方法であって、標的ポリヌクレオチドは、コンピュータープログラムによって、一連の連続したオリゴヌクレオチドに構文解析され、前記標的ポリヌクレオチドは、デノボ合成されるオリゴヌクレオチドを、開始オリゴヌクレオチドに、単方向または双方向に逐次的に加えることによって生成される、方法を開示する。
【００１１】
また、ＷＯ２００４／０３３６１９号は、ゲノム配列情報の結果を、コンピュータ誘導ポリヌクレオチドアセンブリに利用するアプローチを開示する。
過去２、３年で、ＤＮＡを合成する技術におけるかなりの進展が見られたが、ＤＮＡの容量、スループット、および、特に長さに関して、制限がまだ厳しい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明の目的は、標的ｄｓポリヌクレオチドを合成する時間を短くすることを意図した、二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチドを合成する改良方法を提供することである。
目的は、本発明の主題によって解決される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明に従えば、予め定義された配列を有する標的ｄｓポリヌクレオチドを合成する方法であって、
ａ）アレイ装置内に、多様性のあるオリゴヌクレオチドライブラリメンバーを含むオリゴヌクレオチドライブラリを用意する工程であって、ライブラリメンバーはそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を有し、かつ別個のライブラリ封じ込め（ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）内で水溶液中に含有され、多様性は、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓオリゴ）、および少なくとも１つのオーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓオリゴ）を含み、そして少なくとも１０，０００対のマッチングオリゴヌクレオチドをカバーする、工程と、
ｂ）第１の工程において、前記ライブラリ由来のマッチングオリゴヌクレオチドの少なくとも第１の対を、液体ハンドラーを用いて第１の反応封じ込め中に移し、マッチングオリゴヌクレオチドをアセンブルし、それによって少なくとも１つのオーバーハングを含む第１の反応産物を得る工程と、
ｃ）第２の工程および更なる工程において、前記ライブラリ由来のマッチングオリゴヌクレオチドの少なくとも第２の対および更なる対を、液体ハンドラーを用いて第２の反応封じ込めおよび更なる反応封じ込め中にそれぞれ移し、マッチングオリゴヌクレオチドをアセンブルし、それによって少なくとも１つのオーバーハングを各々含む第２の反応産物および更なる反応産物をそれぞれ得る工程と、
ｄ）前記第１、第２、および更なる反応産物を、予め決められたワークフローにおいてアセンブルし、それによってオーバーハングを有する前記標的ｄｓポリヌクレオチドを生成する工程であって、場合によってはその後、平滑末端を調製するための仕上げ工程が続く、工程と
を含み、
マッチングオリゴヌクレオチドの前記対およびアセンブリワークフローは、前記標的ｄｓポリヌクレオチドを生成するアルゴリズムを用いて決定される、方法が提供される。
【００１４】
具体的には、一連の異なる標的ｄｓポリヌクレオチドは、同じオリゴヌクレオチドライブラリを用いて合成される。具体的には、前記異なる標的ｄｓポリヌクレオチドは、異なる配列を有しており、そして互いのフラグメントでない。
【００１５】
具体的には、前記異なる標的ｄｓポリヌクレオチドは、５０％未満、好ましくは３０％未満の配列同一性を有する。具体的には、前記異なる標的ｄｓポリヌクレオチドは、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、または２１％未満の配列同一性を有する。さらにより好ましくは、前記異なる標的ｄｓポリヌクレオチドは、互いに対して２０または１０％未満の配列同一性を有し、具体的には、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、９、８、７、６、または５％未満の配列同一性を有する。
【００１６】
具体的には、前記標的ｄｓポリヌクレオチドは、ＤＮＡ分子である。
具体的には、１つまたは複数の増幅工程が、例えばＰＣＲを実行することによって、好ましくは２５サイクル、実行される。具体的には、前記ＰＣＲは、ＨｉＦｉ熱安定ＤＮＡポリメラーゼ（ＰｈｕｓｉｏｎまたはＱ５）、およびアセンブルされるフラグメントのオーバーハングのそれぞれに相補的な２つのオリゴヌクレオチドを使用し、前記相補的なオリゴヌクレオチドは、ＴｙｐｅＩＩＳ制限酵素（ＢｆｕＡＩ）用の切断部位を含む。具体的には、増幅された産物は、ＴｙｐｅＩＩＳ制限酵素と接触させられ、これは、増幅されたフラグメント中に元のオーバーハングを導入する。具体的には、前記増幅工程は、第１、第２、第３の、または更なるアセンブリ工程のいずれか１つまたは複数の後に実行され、そこで第１、第２、第３の、または更なる反応産物がそれぞれ増幅される。具体的には、前記増幅工程は、標的ｄｓポリヌクレオチドのアセンブリの後に実行され、そこで標的ｄｓポリヌクレオチドが増幅される。
【００１７】
具体的には、予め決められたワークフロー（「アセンブリワークフロー」とも呼ばれる）は、階層的なものであり、これは、以下のように具体的に特徴付けられる：
階層的なワークフローとは、中間体として生成されるポリヌクレオチドの中間にアセンブルされたマッチング対の平行な、または別個の生成を意味するものとし、各中間体は、別個の反応コンパートメント内にアセンブルされており、中間体は、さらにアセンブルされて、標的ポリヌクレオチドまたはその一部が得られる。具体例に従えば、第１の工程において、オリゴヌクレオチドのマッチング対は、同時に、そして独立した反応コンパートメントにおいて組み合わされることによって、各コンパートメント内で、試薬オリゴヌクレオチドの組み合わされたサイズ、および試薬オリゴヌクレオチドと同じオーバーハング長を有するポリヌクレオチドが生成する。第２の工程および以降の工程において、このプロセスは、試薬としての以前の産物または他のオリゴヌクレオチドを用いることによって反復的に繰り返されることによって、各段（ｔｉｅｒ）において、同じオーバーハングサイズを維持する試薬ポリヌクレオチドの組み合わされたサイズのポリヌクレオチドが生成する。最後の前の工程が３つのコンパートメントを有する場合には、第１に、マッチング対を有するコンパートメントの２つのみを反応させてから、この産物と、最後のコンパートメントとの更なる反応工程が、標的ポリヌクレオチドを生成することとなる。代替的には、３つのコンパートメントが、合計で２つのマッチング対のみを形成することができるポリヌクレオチドを含有する場合には、３つのコンパートメントを組み合わせて、標的ポリヌクレオチドが生成される。
【００１８】
具体的には、アセンブリワークフローは、自動化される。具体的には、自動化されたワークフローは、連続的に、または同時に、１つまたは複数のコンパートメントの完全な、または部分的な内容物を、空であっても空でなくてもよい他の予め指定されたコンパートメント中に移すことができるマイクロ流体ハンドラーを使用する。
【００１９】
具体的には、アセンブリワークフローは、配列依存的であり、これは、マッチング対がワークフローにおいてあらゆる工程にて組み合わされる場合に、標的ｄｓポリヌクレオチドのより大きな部分を、または最終的に標的ｄｓポリヌクレオチドを得られるような特定の順序が、鋳型の配列によって決定されることを意味する。具体的には、ワークフローは、鋳型の配列、または標的ｄｓポリヌクレオチドの配列に従って決定される。
【００２０】
具体的には、本明細書中に記載される方法によって、１，０００、５，０００、１０，０００、もしくは１００，０００塩基対（ｂｐ）に達する、またはそれすら上回る長さのポリヌクレオチドが、安価に、かつ高速で生成され得る。
【００２１】
本明細書中に記載される方法は、具体的に、以下の構成要素を含む：
Ａ）遺伝的配列空間の全体をカバーし、かつ液体ハンドラーまたはマイクロ流体工学装置によるアクセスが効率的であるように空間内にオリゴを組織するように設計され得るオリゴヌクレオチドの予め構築されたライブラリ。アクセスは、ライブラリの空間的組織化が、必須のオリゴヌクレオチドにアクセスするのに必要とされる時間を減らす場合には、効率的であると考えられる。具体的には、前記アクセスは、ライブラリの総ハンドリング時間を減らす、または短くする場合には、効率的であると考えられ、前記総ハンドリング時間は、標的ｄｓポリヌクレオチドの合成中に、ライブラリメンバーを取り扱うのに費やされる時間である。具体的には、前記アクセスはさらに、他の組織化と比較して、操作可能なコストを少なくし、またはオリゴヌクレオチドへの、特に空間的にランダムに配置されたオリゴヌクレオチドもしくは辞書学的順序のオリゴヌクレオチドへのアクセスと関連する必須の消耗品の量を少なくする場合には、効率的であると考えられる。具体的には、アクセスは、ライブラリの総ハンドリング時間が、ランダムに、または辞書学的に組織されたライブラリの総ハンドリング時間と比較して、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、または５０％短くされる場合には、効率的であると考えられる。
【００２２】
Ｂ）長いポリヌクレオチドをミスマッチなしで生成するための、アルゴリズムによって決定される、配列特異的階層的アセンブリワークフロー。
本明細書中に記載されるライブラリは、具体的に、一本鎖（ｓｓ）および二本鎖（ｄｓ）オリゴヌクレオチド（オリゴ）を含み、ライブラリメンバーとも呼ばれる。これらのライブラリメンバーは、予め構築されて、保存安定溶液中に提供され、そしてアレイ装置内の定義された位置に位置決めされる。ライブラリのオリゴは、合成されて、必要とされるまでアレイ装置内で保存される。
【００２３】
具体的には、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドモノマーの直鎖状ポリマーであり、デオキシアデノシンを表す「Ａ」、デオキシチミジンを表す「Ｔ」、デオキシグアノシンを表す「Ｇ」、およびデオキシシチジンを表す「Ｃ」を含み、あるいは従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）の他に、ヌクレオチド類似体、例えば、イノシンおよび２’−デオキシイノシン、ならびにそれらの誘導体（例えば、７’−デアザ−２’−デオキシイノシン、２’−デアザ−２’−デオキシイノシン）、アゾール−（例えば、ベンズイミダゾール、インドール、５−フルオロインドール）もしくはニトロアゾール類似体（例えば、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、５−ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンズイミダゾール）およびそれらの誘導体、非環式糖類似体（例えば、ヒポキサンチン−もしくはインダゾール誘導体、３−ニトロイミダゾール、またはイミダゾール−４，５−ジカルボキサミドに由来するもの）、ユニバーサル塩基類似体の５’−三リン酸（例えば、インドール誘導体に由来する）、イソカルボスチリルおよびその誘導体（例えば、メチルイソカルボスチリル、７−プロピニルイソカルボスチリル）、水素結合ユニバーサル塩基類似体（例えばピロロピリミジン）、ならびに他の化学修飾された塩基（例えば、ジアミノプリン、５−メチルシトシン、イソグアニン、５−メチル−イソシトシン、Ｋ−２’−デオキシリボース、Ｐ−２’−デオキシリボース）、または、例えば、異なる塩基対形成優先性を有することができ、そしてストリンジェンシー／蓋然性が類似する複数の天然の核酸塩基と対形成することができる他の修飾された塩基を含むことができる。モノマーは、ホスホジエステル結合によって、または、ある場合では、ペプチジル結合によって、またはホスホロチオエート結合によって、または他の種類のヌクレオチド結合いずれかによって、連結される。
【００２４】
具体的には、一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリメンバー（本明細書中で、単にｓｓオリゴと呼ぶ）は、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、イノシンもしくは５−メチルイソシトシン、または３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ピロリジン、４−ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、５−ニトロインダゾール、３−ニトロイミダゾール、５−アミノインドール、ベンズイミダゾール、５−フルオロインドール、インドール、メチルイソカルボスチリル、ピロロピリミジン７−プロピニルイソカルボスチリル、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノ−アデノシン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、０（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学的に、もしくは生物学的に修飾された塩基（メチル化された塩基が挙げられる）；インターカレートされた塩基；修飾糖（例えば、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）であり、あるいはこれらを含む。
【００２５】
具体的には、二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドライブラリメンバー（本明細書中で、単にｄｓオリゴと呼ぶ）は、天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシド類似体（例えば、イノシンもしくは５−メチルイソシトシン、または３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ピロリジン、４−ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、５−ニトロインダゾール、３−ニトロイミダゾール、５−アミノインドール、ベンズイミダゾール、５−フルオロインドール、インドール、メチルイソカルボスチリル、ピロロピリミジン７−プロピニルイソカルボスチリル、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノ−アデノシン、７−デアザ−アデノシン、７−デアザ−グアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、０（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学的に、もしくは生物学的に修飾された塩基（メチル化された塩基が挙げられる）；インターカレートされた塩基；修飾糖（例えば、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホラミダイト結合）であり、あるいはこれらを含み、そして、完全に、または部分的に相補的な一本鎖オリゴヌクレオチドをアニールすることによって形成される。
【００２６】
具体的には、オリゴヌクレオチドライブラリメンバーは、Ｈ−ホスホネート、ホスホジエステル、ホスホトリエステル、もしくはホスファイトトリエステル合成方法が挙げられる化学的ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）合成方法のいずれかによって、または超並列オリゴヌクレオチド合成方法のいずれか、例えばマイクロアレイもしくはマイクロ流体工学ベースのオリゴヌクレオチド合成（例えば、参考文献（Ｇａｏら、２００１）（ＬｅＰｒｏｕｓｔら、２０１０）（Ｂｏｎｄｅら、２０１４ａ）に記載されている）によって生成され得る。
【００２７】
具体的には、オリゴヌクレオチドライブラリメンバーは、ＤＮＡポリメラーゼタンパク質によるｓｓＤＮＡ合成、またはハイブリッドＲＮＡ−ｓｓＤＮＡ分子を生成する逆転写酵素タンパク質によるものが挙げられる酵素的ポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）合成方法のいずれかによって、生成され得る。具体的には、酵素的ポリヌクレオチド合成反応は、インビボまたはインビトロで起こり得る。
【００２８】
具体的には、オリゴヌクレオチドライブラリメンバーは、ポリヌクレオチド合成方法のいずれかによって、ヌクレオチド構築ブロックからオリゴヌクレオチド配列を合成することによって生成され、構築ブロックは、デオキシアデノシンを表す「Ａ」、デオキシチミジンを表す「Ｔ」、デオキシグアノシンを表す「Ｇ」、もしくはデオキシシチジンを表す「Ｃ」、あるいは他の天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン）、ヌクレオチド−類似体、例えば、イノシンおよび２’−デオキシイノシン、ならびにそれらの誘導体（例えば、７’−デアザ−２’−デオキシイノシン、２’−デアザ−２’−デオキシイノシン）、アゾール−（例えば、ベンズイミダゾール、インドール、５−フルオロインドール）もしくはニトロアゾール類似体（例えば、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、５−ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンズイミダゾール）およびそれらの誘導体、非環式糖類似体（例えば、ヒポキサンチン−もしくはインダゾール誘導体、３−ニトロイミダゾール、またはイミダゾール−４，５−ジカルボキサミドに由来するもの）、ユニバーサル塩基類似体の５’−三リン酸（例えば、インドール誘導体に由来する）、イソカルボスチリルおよびその誘導体（例えば、メチルイソカルボスチリル、７−プロピニルイソカルボスチリル）、水素結合ユニバーサル塩基類似体（例えばピロロピリミジン）、または他の化学修飾された塩基のいずれか（例えば、ジアミノプリン、５−メチルシトシン、イソグアニン、５−メチル−イソシトシン、Ｋ−２’−デオキシリボース、Ｐ−２’−デオキシリボース）で構成される。構築ブロックは、ホスホジエステル結合もしくはペプチジル結合によって、またはホスホロチオエート結合によって、またはヌクレオチド結合の他のタイプのいずれかによって、連結される。
【００２９】
本発明の特定の実施形態において、前記ｓｓオリゴは、６〜２６ヌクレオチド長を有する。好ましくは、ｓｓオリゴは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチド長を有する。好ましくは、ｓｓオリゴは、最大２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、または１６ヌクレオチド長を有する。更なる特定の実施形態において、前記ｓｓオリゴは、２６を超えるヌクレオチド長を有する。好ましくは、ｓｓオリゴは、１００、９０、８０、７０、６０、または５０未満のヌクレオチド長を有する。
【００３０】
具体的には、ｄｓオリゴライブラリメンバーは、少なくとも１つのオーバーハングを有する。オーバーハングは、具体的に、ｄｓオリゴまたはポリヌクレオチドの一部である、かつ／またはこれを伸長する１つまたは複数のヌクレオチドの反応性の（すなわち、別のｓｓオリゴまたはオーバーハングとハイブリダイズすることができる）ｓｓ末端ストレッチによって特徴付けられる。
【００３１】
ライブラリは、具体的に、１つのオーバーハングおよび平滑末端を有するｄｓオリゴを含む。平滑末端は、具体的に、ｄｓオリゴまたはポリヌクレオチドの一部である、１つまたは複数の塩基対のｄｓ末端のストレッチによって特徴付けられる。
【００３２】
具体的には、双方の末端上にオーバーハングを有し、平滑末端を有していないｄｓオリゴが、ライブラリ内に含まれてもよい。
具体的には、ｄｓオリゴは、６〜２６塩基対の長さを有し、そして前記オーバーハングは、対応するｄｓオリゴ長の半分以下である。具体的には、ｄｓオリゴは、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５塩基対の長さを有する。具体的には、ｄｓオリゴは、最大２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、または１６塩基対の長さを有する。具体的には、前記ｄｓオリゴが６塩基対の長さである場合には、オーバーハングは、３ヌクレオチド以下の長さである。具体的には、前記ｄｓオリゴが２４塩基対の長さである場合には、オーバーハングは、１２ヌクレオチド以下の長さである。特定の更なる実施形態において、前記ｄｓオリゴは、２６塩基対を超える長さを有する。好ましくは、ｄｓオリゴは、１００、９０、８０、７０、６０、または５０塩基対未満の長さを有する。
【００３３】
本明細書中に記載されるライブラリは、具体的に、物理的オリゴヌクレオチドによって構成され、そして標準化された条件において合成される。オリゴヌクレオチドは、精製され、修飾を含んでもよく、そして理想的には、直ぐ使用できるように、適切なバッファーおよび／または賦形剤中で標準的な濃度および容量にて維持される。
【００３４】
具体的には、以下のバッファーおよび／または賦形剤のいずれかが、オリゴを溶液中に維持するのに用いられてもよい：トリスバッファー、Ｔ．Ｅ．バッファー（トリス−ＥＤＴＡバッファー）、またはＮｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ。具体的には、ライブラリメンバーは、トリスバッファー中に維持されてもよく、前記トリスバッファーは、約１０ｍＭ（＋／−１ｍＭまたは２ｍＭ）の濃度にて提供される。具体的には、ライブラリメンバーは、Ｔ．Ｅ．バッファー中に維持されてもよい。具体的には、前記Ｔ．Ｅ．バッファーは、少なくとも、約１０ｍＭ（＋／−１ｍＭまたは２ｍＭ）の濃度のトリス、および０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１．０ｍＭのいずれか１つの濃度のＥＤＴＡで構成される。具体的には、Ｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒは、脱イオン化され、濾過され、かつオートクレーブ処理された水であり、そして非特異的エンドヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、およびＲＮａｓｅ活性の混入が本質的にない。
【００３５】
具体的には、全てのライブラリメンバーは、それぞれの場合で同じ、または異なるバッファーおよび／または賦形剤を用いて、区画に分けられたアレイ装置内に維持される。
本明細書中に記載されるライブラリは、何千ものオリゴを含んでもよい。具体的には、本明細書中に記載されるライブラリは、多様性のあるオリゴヌクレオチドライブラリメンバーを含み、ライブラリメンバーはそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を有し、多様性は、少なくとも１０，０００対のマッチングオリゴヌクレオチドをカバーする。具体的には、ライブラリは、少なくとも２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、または１００，０００対のマッチングオリゴヌクレオチドを含む。具体的には、ライブラリは、配列空間の全体をカバーするのに十分な、マッチングオリゴヌクレオチドの対を含有する。
【００３６】
本明細書中に記載されるマッチングオリゴヌクレオチドの対は、部分的に、または完全に相補的な配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドを指す。マッチングオリゴの前記対は、別個の封じ込め内でｓｓオリゴとしてライブラリ中に存在してもよいし、２つ以上の相補的なｓｓオリゴが、一封じ込め内に含有されてもよく、そこでアニールしてｄｓオリゴを形成してもよい。一対のマッチングｓｓオリゴのヌクレオチド配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドにおいて、マッチング対が、ｓｓオリゴ配列のハイブリダイゼーションによって新しいｄｓポリヌクレオチド分子を形成することができるように、相補的であってもよく、好ましくは、ｓｓオリゴは、部分的にハイブリダイズすることによって、オーバーハングを有するｄｓポリヌクレオチドが得られる。
【００３７】
ｓｓオリゴは、具体的に、２つまたは３つのハイブリダイゼーションパートナーからなるマッチング対の一部であってもよい。具体的には、ｓｓオリゴは、別のｓｓオリゴ、または相補的なオーバーハングを有するｄｓオリゴである第２のハイブリダイゼーションパートナーとハイブリダイズすることができる第１のハイブリダイゼーションパートナーとして用いられ得る。
【００３８】
具体的には、ｓｓオリゴは、２つの異なるｓｓおよび／もしくはｄｓオリゴと、または第２および第３のハイブリダイゼーションパートナーとして用いられる２つの異なるｄｓポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができる第１のハイブリダイゼーションパートナーとして用いられ得る。具体的には、第１のハイブリダイゼーションパートナーは、マッチングｓｓオリゴであり、ｓｓオリゴの第１の部分は、第２ハイブリダイゼーションパートナーにハイブリダイズすることとなり、そしてｓｓオリゴの第２の部分は、第３のハイブリダイゼーションパートナーにハイブリダイズすることとなり、これによって、３つのハイブリダイゼーションパートナーでギャップなしに構成される１つのｄｓポリヌクレオチドが得られる。
【００３９】
一対のマッチングｄｓオリゴは、具体的に、ｄｓオリゴの対応するオーバーハング内の相補的配列によって特徴付けられ、例えば、それぞれのオーバーハングは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチドにおいて、マッチング対が、オーバーハング配列のハイブリダイゼーションによって新しいｄｓポリヌクレオチド分子を形成することができるように、相補的である。
【００４０】
本明細書中に記載されるライブラリは、具体的に、多様性のある二本鎖オリゴヌクレオチドライブラリメンバーを含んでもよく、ｄｓオリゴライブラリメンバーはそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を有する。具体的には、前記多様性は、少なくとも１００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、４０，０００、６０，０００、８０，０００、１００，０００、１２０，０００、１４０，０００、１６０，０００、１８０，０００、または２００，０００個の異なるｄｓオリゴをカバーする。
【００４１】
本明細書中に記載されるライブラリは、具体的に、多様性のある一本鎖オリゴヌクレオチドライブラリメンバーを含んでもよく、ｓｓオリゴライブラリメンバーはそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を有する。具体的には、前記多様性は、少なくとも１００、５００、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、４０，０００、６０，０００、８０，０００、１００，０００、１２０，０００、１４０，０００、１６０，０００、１８０，０００、または２００，０００個の異なるｓｓオリゴをカバーする。具体的には、前記ｓｓオリゴは、具体的にはｄｓポリヌクレオチドのアセンブリにおいて、リンカーとして用いられてもよい。
【００４２】
具体的には、前記多様性は、異なるライブラリメンバーについて、少なくとも１つの塩基または塩基対が異なることを意味する。１つのライブラリメンバーは、実際に、同じ配列のｓｓオリゴヌクレオチドまたはｄｓオリゴヌクレオチドの複数コピーを包含してもよい。ライブラリメンバーのそのような複数コピーは、具体的に、たった１つのライブラリ封じ込め内に含有される。
【００４３】
本発明の特定の実施形態において、前記多様性は、リン酸化されるｓｓオリゴおよび／またはｄｓオリゴをカバーする。特定の実施形態は、リン酸化、メチル化、ビオチン化、またはフルオロフォアもしくはクエンチャへの結合のいずれか１つまたは複数によって修飾されるｓｓオリゴまたはｄｓオリゴを指す。したがって、本明細書中に記載されるライブラリは、非修飾ｓｓオリゴ、リン酸化されたｓｓオリゴ、メチル化されたｓｓオリゴ、ビオチン化されたｓｓオリゴ、リン酸化、ビオチン化、かつメチル化されたｓｓオリゴ、非修飾ｄｓオリゴ、リン酸化されたｄｓオリゴ、メチル化されたｄｓオリゴ、ビオチン化されたｄｓオリゴ、およびリン酸化、ビオチン化、かつメチル化されたｄｓオリゴのいずれか、または全てであり得るライブラリメンバーを含む。好ましくは、ライブラリメンバーは、５’リン酸化を含む。具体的には、本明細書中に記載されるライブラリはさらに、フルオロフォアまたはクエンチャを含むｓｓオリゴ、およびフルオロフォアまたはクエンチャを含むｄｓオリゴを含む。
【００４４】
本発明の特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドライブラリは、アレイ装置内に提供され、そしてライブラリメンバーは、別個のライブラリ封じ込め内で、各水溶液中に含有される。具体的には、前記アレイ装置は、マイクロタイタープレート、マイクロ流体マイクロプレート、一セットのキャピラリ、マイクロアレイ、またはバイオチップのいずれか、好ましくはＤＮＡおよび／またはＲＮＡバイオチップである。前記アレイ装置は、上述の封じ込めの１つのみ、全て、または任意の数を含んでもよい。
【００４５】
本発明の特定の更なる実施形態において、複数の異なるライブラリメンバーが、１つのみのライブラリ封じ込め内に含有されてもよい。具体的には、１つのライブラリ封じ込め内に含有される前記異なるライブラリメンバーは、互いにアニールすることができないような配列のｓｓオリゴである。具体的には、１つのライブラリ封じ込め内に含有される前記異なるライブラリメンバーは、その中に含有される他のｄｓオリゴにライゲートすることができないような配列のｄｓオリゴである。具体的には、１つのライブラリ封じ込め内に含有される前記異なるライブラリメンバーは、互いにアニールすることができないような配列のｓｓオリゴおよびｄｓオリゴである。
【００４６】
特定の実施形態において、前記別個のライブラリ封じ込めは、三次元のオーダーで空間的に配置され、個々のコンパートメントは、装置内に、ｘ軸、ｙ軸、およびｚ軸内の定義された座標にて位置決めされる。具体的には、前記三次元のオーダーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０個の、またはさらに積み重ねられたライブラリ封じ込めの少なくともいずれか１つを含む。これらは、少なくとも部分的に、または完全に積み重ねられる。好ましくは、ライブラリ封じ込めは、異なる状態（ｌａｙｓ）で配置され、異なる状態において、一方が他方の上に配置される。具体的には、状態は、三次元のオーダー内の予め定義された位置にて配置される。好ましくは、一状態内の前記ライブラリ封じ込めはそれぞれ、二次元のオーダーで、予め定義された位置にて空間的に配置される一連のライブラリメンバーを含む。
【００４７】
具体的には、三次元のオーダーは、合成時間を短くするように主に機能するパラメータによって、予め定義される。好ましくは、前記パラメータは、例えば、天然に存在する、または標的ｄｓポリヌクレオチドもしくはそのフラグメントに共通して用いられるＤＮＡ配列において、マッチング対を頻繁に形成するオリゴを、互いに近接させて配置する、使用頻度である。所定のあらゆる配列を構築するのに必要とされるオリゴの数の多さに起因して、ライブラリ内のオリゴのほとんどの空間的分布は、ライブラリをスキャンして、所望のオリゴを検索するのに必要とされる時間に起因する、時間および資源の無駄を招くであろう。しかしながら、オリゴの特定の分布を用いることによって、マッチングオリゴの対を反応封じ込め中に移すための自動装置の動作は、最小になる。例えば、オリゴは、第１のプレートが、オリゴヌクレオチドの最も共通するマッチング対を含有し、そして更なるプレートが、使用頻度が最も低いオリゴを最後のプレートが含有するまで、多いものから順に配置される、マイクロウェルプレート内に保存され得る。
【００４８】
本明細書中に記載される方法において、本明細書中に記載されるライブラリ由来のオリゴヌクレオチドは、液体ハンドラーを用いて、反応封じ込め中に移される。具体的には、前記液体ハンドラーは、微小滴ハンドラーであってもよい。具体的には、液体ハンドラーは、自動化される。液体ハンドラーを用いて、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、または５００ｎＬの少なくともいずれか１つの適切な容量が、例えば、ライブラリメンバー、例えば一本鎖オリゴヌクレオチド、一本鎖オリゴヌクレオチドのマッチング対、および二本鎖オリゴヌクレオチドの１０９、１０１０、１０１１、または１０１２コピーの少なくともいずれか１つが、１つの反応封じ込め中に配置されるように、移され得る。好ましくは、特定のオリゴの少なくとも約１０１１コピー（例えば６．０６×１０１１コピー）が、１つの反応封じ込め中に配置されて、別のオリゴと反応する。好ましくは、液体ハンドラーによってオリゴが移される容量は、１０〜１０００ｎＬの間である。より好ましくは、１０〜５００ｎＬの間、さらにより好ましくは５０〜２５０ｎＬの間である。
【００４９】
具体的には、反応封じ込めは、マイクロタイタープレート、マイクロ流体マイクロプレート、一セットのキャピラリ、マイクロアレイ、またはバイオチップのいずれか１つ、好ましくはＤＮＡおよび／またはＲＮＡバイオチップのコンパートメントユニット、例えばウェルである。具体的には、反応封じ込めは、ある核酸鎖が、相補鎖相互作用および水素結合によって第２の核酸鎖に結合して、二本鎖オリゴヌクレオチドを生成する環境を特徴とする。そのような条件として、核酸を含有する水溶液または有機溶液の化学成分（例えば、塩、キレート剤、ホルムアミド）およびその濃度、ならびに混合物の温度が挙げられる。他の周知の要因、例えばインキュベーション時間の長さまたは反応チャンバの寸法が、環境に寄与し得る。
【００５０】
本明細書中で提供される方法に従えば、オリゴヌクレオチドは、ライブラリから反応封じ込め中に移されてアセンブルされて、反応産物が得られる。具体的には、前記アセンブリは、ｓｓヌクレオチド配列をハイブリダイズするあらゆる方法、ならびに／または酵素反応および／もしくは化学反応であるライゲーション反応による。具体的には、前記ライゲーション反応は、リガーゼ、またはライゲーション反応ができるリボザイムを用いる酵素的ライゲーション反応である。好ましくは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、または操作された酵素が、ライゲーション反応に用いられる。好ましくは、以下のライゲーション反応が用いられる：Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（１ｍＭ  ＡＴＰが補充された１μＬあたり１０突出末端ユニットの濃度にて）（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌ、２０１４、第１章、プロトコル１７）。
【００５１】
具体的には、前記アセンブリは、マッチングオーバーハングを直接的にハイブリダイズすることによるものであり、または適切なｓｓオリゴリンカーを間接的にハイブリダイズすることによるものであり、ｓｓオリゴリンカーは、前記ライブラリから選択され、かつ移されて、前記第１、第２、または更なる反応産物のいずれかをアセンブルする、前記ライブラリ内に含有されるｓｓオリゴである。
【００５２】
オリゴヌクレオチドは、具体的に、定義されたワークフローに従ってアセンブルされる。ワークフローは、具体的に、標的ｄｓポリヌクレオチドを生成するアセンブリに用いられ得ないミスマッチまたは反応産物を回避するように設計される。部分的構築体が、代替の方法でアニールし得る場合には、暴走、すなわち制御不能な重合反応が起こるおそれがある。望ましくない構築体または暴走反応をもたらすこととなるマッチングオリゴヌクレオチドの対の組合せを回避するように、マッチングオリゴヌクレオチドの対は、アセンブリ工程、すなわち特定のワークフローの予め決められたシーケンス内でアセンブルされる。好ましくは、前記特定のワークフローは、直線的ではなく階層的であり、すなわち、所望でない反応産物を可能な限り回避して好都合に生成される標的ｄｓポリヌクレオチドの定義された非連続部分である中間体反応産物を提供してから、そのような中間体反応産物が、更なる中間体反応産物中に、または標的ｄｓポリヌクレオチド配列中にさらにアセンブルされるアルゴリズムに従う。
【００５３】
直線的ワークフローにおいて、ポリヌクレオチドは、リーディング鎖の３’末端から始まり、そして次のオリゴを加えて、リーディング鎖の３’末端を次のオリゴの５’末端に連結するように、直線的にアセンブルされる。例えば、オリゴＢはオリゴＡにライゲートされ、オリゴＣはオリゴＢにライゲートされ、オリゴＤはオリゴＣにライゲートされる等である。このアセンブリは、全てのオリゴを反応封じ込めに同時に加えることによって、同時に達成されてもよく、またはポリヌクレオチドは、オリゴＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄその他を反応封じ込めに連続して加えることによって、累進的に伸長される。
【００５４】
階層的ワークフローは、例えば、相補的な配列またはオーバーハングに起因して、オリゴＤがオリゴＣにライゲートするだけでなく、オリゴＡにもライゲートすることができる場合、必須であり得る。先に記載される直線的ワークフローは、所望のポリヌクレオチドＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄに加えて、所望でないポリヌクレオチドＡ−Ｄ−Ｂ−Ｃ−Ｄをもたらすこととなる。したがって、ポリヌクレオチドは好ましくは、階層的ワークフローでアセンブルされる。したがって、２つの別個の反応封じ込めにおいて、オリゴＡおよびＢ、そしてオリゴＣおよびＤがそれぞれライゲートされる。ライゲーション反応は、反応産物Ａ−ＢおよびＣ−Ｄを与えることとなり、これらは次に、第３の反応封じ込めに移され得、そこではライゲーションと同時に、所望のポリヌクレオチドＡ−Ｂ−Ｃ−Ｄが形成される。
【００５５】
具体的には、前記ワークフローは、アルゴリズムを用いて決定される。具体的には、前記アルゴリズムは、マッチングオリゴヌクレオチドの対およびｓｓオリゴリンカーを必要に応じて選択して、単なる配列仕切り（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ）によってではなく、標的ｄｓポリヌクレオチドを、ミスマッチまたは所望でない反応産物をできるだけ回避してアセンブルする最適またはほぼ最適な方法を決定することによって、アセンブリワークフローを決定する。マッチングオリゴヌクレオチドの対およびアセンブリワークフローは、所望でない（誤った）反応または反応産物、例えば、回文配列、暴走反応、および曖昧でない（ｕｎａｍｂｉｇｕｏｕｓ）アセンブリを回避するように、特定して選択される。誤った反応産物が正しい反応産物の他にある場合には、そのような誤った反応産物は、正しいものから、例えば以下のように、適切に分離される：あるサイズのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを検出するためにゲル電気泳動を用いて、所望の反応産物のサイズに相当するゲルのバンドを切り出して精製する。具体的には、正しい反応産物は、配列中へのタグまたはラベルの組込みによって検出され得る。具体的には、オリゴは、オリゴのオーバーハングとハイブリダイズすることができるビオチン化されたオリゴヌクレオチドアダプターを用いて捕捉されてもよく、前記アダプターは、基質に固定されており、そしてストレプトアビジンでコーティングされる。捕捉されなかった誤った産物は、洗浄によって除去されて、その後、正しい産物は、温度を上げることによってアダプターから解放される。具体的には、当該技術において周知である更なる分離方法が用いられてもよい。具体的には、そのような方法は、クロマトグラフィまたはアフィニティ分離方法を含んでもよい。
【００５６】
本発明の特定の実施形態において、前記標的ｄｓポリヌクレオチドは、少なくとも４８ヌクレオチドの長さを有する。具体的には、前記標的ｄｓポリヌクレオチドは、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００、１０，０００、１００，０００、２００，０００、または５００，０００ヌクレオチドの少なくともいずれか１つの長さを有する。
【００５７】
典型的には、鋳型は、標的ｄｓポリヌクレオチドを合成するモデルとして用いられる。具体的には、前記標的ｄｓポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、鋳型のヌクレオチド配列と同一である。
【００５８】
特定の実施形態において、目的の配列（ＳＯＩ）が、一本鎖鋳型として提供され、かつ／または２つの一本鎖鋳型配列に翻訳され、これに基づいて、標的ｄｓポリヌクレオチドが合成される。特定の実施形態において、第１の鋳型は、ＳＯＩの配列を含み、そして第２の鋳型は、ＳＯＩに対する逆相補体を含む。
【００５９】
本発明の更なる実施形態において、前記標的ｄｓポリヌクレオチドは、前記鋳型と同一である配列を有するプロキシｄｓポリヌクレオチドであり、プロキシｄｓポリヌクレオチドはさらに、標的ｄｓポリヌクレオチドの配列と異なる目的の配列（ＳＯＩ）を有するポリヌクレオチドを得るように修飾される。典型的には、プロキシｄｓポリヌクレオチドは、中間産物として生成され、そこから、ＳＯＩによって特徴付けられるｄｓポリヌクレオチドが、突然変異誘発の１つまたは複数の更なる工程によって生成され得る。
【００６０】
具体的には、前記鋳型（これに従えば、前記プロキシｄｓポリヌクレオチドが合成される）の配列は、前記ＳＯＩと同一でない。具体的には、前記鋳型の配列は、前記ＳＯＩと１００、９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、もしくは９１％未満のいずれか１つだけ同一であり、かつ／または９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％の少なくともいずれかだけ同一である。
【００６１】
本明細書中で提供される方法の特定の実施形態において、一方の鎖の、またはｄｓ鎖のそれぞれの配列の３’末端もしくは５’末端、または両末端の末端ヌクレオチドは、除去されてから、より短い配列に仕切られる。具体的には、コンピュータ処理的に除去される。それによって、ＳＯＩと異なる鋳型が生成される。具体的には、配列の３’末端の、または５’末端の末端ヌクレオチドの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５のいずれか１つが除去されて、鋳型が生成される。具体的には、前記ヌクレオチドは除去されて、オーバーハングが生じ、かつ／または標的ｄｓポリヌクレオチドの末端のそれぞれにて平滑末端を生成することによる合成の仕上げのために調製される。
【００６２】
具体的には、鋳型は、一本鎖または二本鎖配列で構成される。好ましくは、前記鋳型は、一本鎖である。具体的には、前記２つの一本鎖鋳型配列はアラインされて、二本鎖鋳型を生成する。具体的には、前記鋳型の配列は、より短い配列、オリゴヌクレオチドライブラリメンバーを含むサブ配列に仕切られ、そしてライブラリ内の前記ライブラリメンバーの位置に、デジタル的に注釈が付けられる。具体的には、サブ配列への仕切りは、階層的ワークフローによって、そしてライブラリ内に存在するライブラリメンバーによって決まる。
【００６３】
具体的には、標的ｄｓポリヌクレオチドは、両末端上に平滑末端を有する。
具体的には、本明細書中で提供される方法は、仕上げ工程を含む。
具体的には、前記仕上げ工程は、平滑末端を生成することを意図して、３’末端および５’末端からそれぞれ以前に除去されたものに相当する１つまたは複数のヌクレオチドを加えて、鋳型を調製するように機能する。具体的には、ライブラリ由来のオリゴが選択され、これは、３’末端および５’末端のヌクレオチドとそれぞれ相補的である。すなわち、ポリヌクレオチドの付着末端（ｓｔｉｃｋｙ  ｅｎｄ）と相補的である。具体的には、これらのオリゴは、最終産物を増幅して、そして残りのヌクレオチドを各鎖に加えて、平滑末端を有する完全な標的ポリヌクレオチドを合成するように調製されるＰＣＲ反応において、プライマーとして用いられる。
【００６４】
具体的には、前記仕上げ工程は、残りのオリゴ、酵素、および試薬を除去して、ＤＮＡ産物としての標的ｄｓポリヌクレオチドを、下流の用途のために準備ができたままにするための、標準的なキット、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓのＭｏｎａｒｃｈ  ＰＣＲ  ＆  ＤＮＡクリーンアップキット（製品番号Ｔ１０３０）を使用したＰＣＲ産物の精製工程を含む。
【００６５】
代替的には、標的ｄｓポリヌクレオチドの一方または双方の平滑末端は、平滑末端を有するマッチングｄｓオリゴを選択することによって、またはオーバーハングと相補的であるｓｓオリゴを選択することによって、そしてそれ以上オーバーハングを生じさせることなくハイブリダイズすることで平滑末端を生成することによって、生成され得る。
【００６６】
具体的には、標的ｄｓポリヌクレオチドの前記ヌクレオチド配列、ＳＯＩ、または鋳型は、天然起源または人工的な起源のものであり得る。
複雑なＳＯＩを有するｄｓポリヌクレオチドを生成するために、より単純な、故により迅速なアセンブリワークフローにおいて、ＳＯＩと１００％未満同一である標的配列を有するプロキシｄｓポリヌクレオチドが生成されてもよい。次に、本明細書中に記載されるアセンブリ方法によって生成される前記プロキシｄｓポリヌクレオチドは、ＳＯＩのヌクレオチド配列と１００％同一であるヌクレオチド配列を有するｄｓポリヌクレオチドを生成するようにさらに修飾されてもよい。具体的には、前記プロキシｄｓポリヌクレオチドは、特異的突然変異誘発、エンドヌクレアーゼ、またはエキソヌクレアーゼのいずれかによって、前記鋳型のヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を得るようにさらに修飾される。
【００６７】
本発明の特定の更なる実施形態において、標的ｄｓポリヌクレオチドは、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、またはＲＮＡ分子のいずれかである、その誘導体を生成するようにさらに修飾される。
【００６８】
具体的には、前記標的ｄｓポリヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発によって修飾されることによって、ヌクレオチドの挿入、欠失、または置換のいずれかである１つまたは複数の点突然変異を導入する。
【００６９】
具体的には、前記標的ｄｓポリヌクレオチドは、メチルトランスフェラーゼ、キナーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、λ−ｒｅｄ組換えを用いる多重自動化ゲノム工学（ＭＡＧＥ）、接合性（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｖｅ）アセンブリゲノム工学（ＣＡＧＥ）、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質ファミリー（Ａｇｏ）もしくはその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、チロシン／セリン部位特異的リコンビナーゼ（Ｔｙｒ／Ｓｅｒ  ＳＳＲ）、ハイブリダイジング分子、スルフリラーゼ、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、またはＴＮａｓｅのいずれか１つまたは複数を使用する酵素的修飾によって修飾される。
【００７０】
本発明の特定の実施形態において、前記標的ｄｓポリヌクレオチドは、鋳型またはＳＯＩの配列との同一性の程度を確認するために配列決定される。あらゆる適切な配列決定法が用いられてよく、例えば、ＳＮＰジェノタイピング法（ハイブリダイゼーションベースの方法（例えば、分子ビーコン、ＳＮＰマイクロアレイ、制限酵素断片長多型）が挙げられる）、ＰＣＲベースの方法（対立遺伝子特異的ＰＣＲ、プライマー伸長ヌクレアーゼ、５’−ヌクレアーゼ、またはＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、一本鎖高次構造多型、温度勾配ゲル電気泳動、変性高速液体クロマトグラフィ、アンプリコン全体の高解像度溶融（ＨＲＭ）、ＳＮＰｌｅｘ、およびサーベイヤヌクレアーゼアッセイが挙げられる）；配列決定ベースの突然変異分析（ＰＴＲのＰＣＲアンプリコン全体のキャピラリ配列決定または高スループット配列決定（アンプリコンシーケンシング）が挙げられる）のいずれか１つがある。そのような高スループット（ＨＴ）アンプリコン配列決定法として、ポロニーシーケンシング、パイロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ一分子シーケンシング、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＤＮＡシーケンシング、トンネル電流ＤＮＡシーケンシング、ハイブリダイゼーションによる配列決定、質量分析による配列決定、マイクロ流体サンガーシーケンシング、顕微鏡観察ベースの配列決定、ＲＮＡＰシーケンシングが挙げられるが、これらに制限されない。
【００７１】
本明細書中で提供される本発明に従えば、オリゴヌクレオチドライブラリは、アレイ装置内に提供され、多様性のあるライブラリメンバーを含み、ライブラリメンバーは、一本鎖オリゴヌクレオチド（ｓｓオリゴ）、および少なくとも１つのオーバーハングを有する二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓオリゴ）であり、ライブラリメンバーはそれぞれ、異なるヌクレオチド配列を有し、かつ別個のライブラリ封じ込め内で水溶液中に含有され、封じ込めは、三次元のオーダーで空間的に配置され、多様性は、少なくとも１０，０００対のマッチングオリゴヌクレオチドをカバーする。
【００７２】
具体的には、前記ライブラリ封じ込めは、好ましくは使用頻度に従って、三次元のオーダーで空間的に配置され、そして前記三次元のオーダーは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０個の、またはさらに積み重ねられたライブラリ封じ込めの少なくともいずれか１つを含む。これらは、少なくとも部分的に、または完全に積み重ねられる。
【００７３】
さらに、本発明は、予め定義された配列を有する一連の異なる標的二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチドを合成するための、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドライブラリの使用を提供し、前記異なる標的二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチドは、５０％未満、好ましくは３０％未満の配列同一性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１Ａは、ヒトミトコンドリア（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８１：Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ受託番号：Ｊ０１４１５）の超可変領域ＩＩの４つのハプロタイプに相当するライブラリ（１００ｂｐのフラグメントのみを示す）を構築するのに用いたソース配列の図である。図１Ｂは、ハプロタイプの考えられるあらゆる組合せ（各多型部位の完全なヘテロ接合を想定する）を構築するのに必要とされるオリゴの設計の足場の図である。双方の鎖を示す。Ｚ形状の各ブロックは、Ｎ、または４つの塩基Ａ、Ｔ、Ｇ、もしくはＣのいずれかが置かれるオリゴ対である。各オリゴに足場を組む各オリゴ配列の上の、そして下の数字は、オリゴの長さを示し、そして括弧内に、可変部位の考えられる全てのハプロタイプをカバーするようにライブラリ内に存在することとなるオリゴの数を示す。各ｓｓオリゴは、下線が引かれたものが、アニールされる対として保存されることとなる以外、ライブラリのコンパートメント内に個々に保存されることとなる。
【図２】図２Ａは、ＤＩＳＣＯＶＥＲと呼ばれるＳＯＩのヌクレオチド配列（配列番号１）の図である。図２Ｂは、ＳＯＩ  ＤＩＳＣＯＶＥＲを構成する１６オリゴのヌクレオチド配列の図である。図２Ｃは、構成オリゴのダイマー構造の図である。ここでは、Ｄ＋およびＤ−について示すが、同じ構造が、他の全てのダイマーに当てはまる。
【図３】図３は、ウェルプレート内のオリゴの位置の図である。図３Ａは、アニーリングの後に、列１および３の内容物を、列２および４にそれぞれ移す図である。図３Ｂは、第１のライゲーション反応のインキュベーションの後に、列２の内容物を列４に移す図である。図３Ｃは、第２のライゲーション反応のインキュベーションの後に、Ａ４の内容物をウェルＢ４に移して、第３および最後のライゲーション反応のためにインキュベートする図である。ウェルＢ４は、１２８ｂｐの標的ｄｓポリヌクレオチドを含有する。
【図４】図４は、実施例２に記載するプロセスの内容物を示すアクリルアミドゲル（１０％）の図である。レーン１：反応Ｄ＋Ｉ（図２ＢにおけるウェルＡ２）。レーン２：６４ｂｐのｄｓＤＮＡによる陰性対照（ライゲーションについて）。レーン３：６４ｂｐのｄｓＤＮＡによる陽性対照（ライゲーションについて）。レーン４および５：２つの希釈剤における反応ＤＩ＋ＳＣ（図２ＣにおけるウェルＡ４）。レーン６および７：標的ｄｓポリヌクレオチド。レーン８：５０ｂｐのラダー（ＮＥＢ）。
【図５】図５Ａは、部分的なＳＯＩおよびその逆相補体（位置６５〜１００；これ以外では図１Ａ内）の図である。イタリック、太字、および通常のフォントの要素は、異なるダイマーを示す。下線を引いた部分は、回避される必要がある自己相補的なオーバーハングを強調する。上部の配列は配列番号１８；下部の配列は配列番号１９である。図５Ｂは、プロキシｄｓポリヌクレオチド（位置６５〜１００）を生成するための鋳型の部分配列の図である。黒色の背景の塩基対は、変更された部位を示し、これは目下、ダイマーを非自己相補性にする（得られる修飾されたオリゴは、実施例２のＯ−およびＶ＋と合致する）。上部の配列は配列番号２０；下部の配列は配列番号２１である。図５Ｃは、プロキシｄｓポリヌクレオチドを修飾して、ＳＯＩを有するｄｓポリヌクレオチドを生成するのに用いた突然変異導入プライマーの図である。下線を引いた文字は、突然変異が導入された塩基を示す。上部の配列は配列番号２２；下部の配列は配列番号２３である。
【図６】図６は、オリゴの配置の図であり、オリゴを、アニーリングおよび階層的合成用に調製するために、実施例１のライブラリから、９６ウェルプレート上に移した。
【図７】図７は、階層的合成プロセスの結果を示すアガロースゲル電気泳動（２％）の図である。最上部のバンドは、６０８産物を含有するものである。左のレーンは、５０ｂｐのラダーである。
【図８−１】図８は、実施例４の配列の図である。
【図８−２】図８は、実施例４の配列の図である。
【図８−３】図８は、実施例４の配列の図である。
【図８−４】図８は、実施例４の配列の図である。
【発明を実施するための形態】
【００７５】
明細書の全体を通じて用いられる特定の用語は、以下の意味を有する。
本明細書中で用いられる用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、１つまたは複数に、すなわち少なくとも１つを指すように本明細書中で用いられる。
【００７６】
用語「目的の配列」または「ＳＯＩ」は、本明細書中で提供される方法によって生成されることとなるｄｓポリヌクレオチドの所望のヌクレオチドまたは塩基対配列を指す。
用語「標的二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチド」は、予め定義された配列を有するポリヌクレオチドを指し、これは、本明細書中で提供される合成方法によって生成される。具体的には、前記標的二本鎖ポリヌクレオチドは、ＳＯＩと同一である、かつ／またはＳＯＩに相当する配列によって特徴付けられる。標的ｄｓポリヌクレオチド配列が、ＳＯＩと１００％未満同一である配列を有する場合には、標的ｄｓポリヌクレオチドは、ＳＯＩと同一である、かつ／またはＳＯＩに相当する配列を有するｄｓポリヌクレオチドを生成するようにさらに修飾することができるプロキシｄｓポリヌクレオチドとして理解される。
【００７７】
用語「プロキシ二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチド」は、配列が、ＳＯＩのヌクレオチド配列と１００％未満、少なくとも９０％、好ましくは９５％同一である標的二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチドを指す。ＳＯＩと同一である、かつ／またはＳＯＩに相当する配列を有するｄｓポリヌクレオチドであって、その配列が、曖昧でないアセンブリ反応または暴走反応を起こしがちである場合があるので、合成するのが困難であるｄｓポリヌクレオチドを生成するために、プロキシ二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチドが、最初に合成されてもよい。プロキシ二本鎖ポリヌクレオチドの配列は、回文配列、暴走反応、および曖昧でないアセンブリを回避し、かつ／または階層的アセンブリを促進するように設計される。具体的には、配列は、コンピュータ処理的に設計されてもよい。次に、合成されたプロキシｄｓポリヌクレオチドは、ＳＯＩのヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有するｄｓポリヌクレオチドを生成するように、さらに修飾されてもよい。具体的には、前記プロキシｄｓポリヌクレオチドは、特異的突然変異誘発、エンドヌクレアーゼもしくはエキソヌクレアーゼ、および／または酵素的修飾（メチルトランスフェラーゼ、キナーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、λ−ｒｅｄ組換えを用いる多重自動化ゲノム工学（ＭＡＧＥ）、接合性アセンブリゲノム工学（ＣＡＧＥ）、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質（Ａｇｏ）もしくはその誘導体、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、チロシン／セリン部位特異的リコンビナーゼ（Ｔｙｒ／Ｓｅｒ  ＳＳＲ）、ハイブリダイジング分子、スルフリラーゼ、リコンビナーゼ、ヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、またはＴＮａｓｅのいずれかを使用する）のいずれかによって、ＳＯＩと同一である、かつ／またはＳＯＩに相当する配列を有するｄｓポリヌクレオチドを得るようにさらに修飾される。
【００７８】
用語「鋳型」は、ある種の配列またはポリヌクレオチド配列によって特徴付けられるポリヌクレオチドを指し、当該配列は、標的ｄｓポリヌクレオチドを合成かつ生成するのに用いることができる。鋳型が、本明細書中で提供される合成方法に用いられる場合には、そのように生成される標的ｄｓポリヌクレオチドは、鋳型と１００％同一である配列を有する。
【００７９】
具体的には、前記鋳型は、一本鎖または二本鎖である。そのような鋳型は、天然のヌクレオチド配列であっても、人工的な、コンピュータ処理的に設計された、所望の産物を含むヌクレオチド配列であってもよい。そのような鋳型は、ＳＯＩと同一であってもよいし、ＳＯＩと１００％未満、好ましくは９５％未満、しかし少なくとも８０％同一であってもよい。
【００８０】
好ましくは、前記鋳型は、コンピュータ処理的に生成され、そして標的ｄｓポリヌクレオチドのリーディング鎖、および標的ポリヌクレオチドのリバース相補体の配列をそれぞれ含む。典型的には、本明細書中に記載される合成方法において２つの鋳型が用いられ、一鋳型が、標的ｄｓポリヌクレオチドの各鎖用である。鋳型配列をコンピュータ処理的に設計する場合、アセンブリに用いられる実験戦略との適合性が選ばれる。
【００８１】
用語「一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド」（「ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチド」または単純に「ｓｓオリゴヌクレオチド」もしくは「ｓｓオリゴ」とも呼ばれる）は、ヌクレオチドモノマーの直鎖状ポリマーであるオリゴヌクレオチドを指すものとする。オリゴヌクレオチドを形成するモノマーは、モノマー対モノマー相互作用の規則的なパターン、例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の塩基対形成、塩基スタッキング、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型またはリバースＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対形成、ゆらぎ塩基対形成等によって、天然のポリヌクレオチドに特異的に結合することができる。本明細書中に記載されるｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、典型的に、６〜２６の間のサイズの範囲が、より長くてもよい。本明細書中に記載されるｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、６〜２２０の間のヌクレオチド、例えば２７〜２００の間のヌクレオチドのサイズに及んでもよい。オリゴヌクレオチドが、文字の配列（大文字または小文字）、例えば「ＡＴＧＣ」によって表される場合はいつでも、ヌクレオチドは左から右に５’→３’の順であること、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを表し、「Ｔ」はデオキシチミジンを表し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表し、そして「Ｃ」はデオキシシチジンを表すことが理解されよう。従来のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）の他に、修飾されたヌクレオチド、例えば、Ｋ−２’−デオキシリボース、Ｐ−２’−デオキシリボース、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシキサントシン、または核酸塩基類似体を有するヌクレオチドが用いられてもよく、例えば、イノシンもしくは５−メチルイソシトシン、または３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ピロリジン、４−ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、５−ニトロインダゾール、３−ニトロイミダゾール、５−アミノインドール、ベンズイミダゾール、５−フルオロインドール、インドール、メチルイソカルボスチリル、ピロロピリミジン７−プロピニルイソカルボスチリルがある。専門用語および原子ナンバリング規則は、ＳｔｒａｃｈａｎおよびＲｅａｄ、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９）に開示されるものに従う。通常、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルによって、またはペプチジル結合によって、またはホスホロチオエート結合によって連結される４つの天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡについてデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはＲＮＡについてそれらのリボース対応物）を含む。しかしながら、非天然のヌクレオチド類似体を含んでもよい（例えば、修飾塩基、糖、またはヌクレオシド間結合が挙げられる）。
【００８２】
一部の実施形態において、一本鎖オリゴヌクレオチドのプールが、化学合成方法を用いて、例えば、モノマー−ホスホラミダイト、ダイマー−ホスホラミダイト（Ｎｅｕｎｅｒ，Ｃｏｒｔｅｓｅ，およびＭｏｎａｃｉ  １９９８）、もしくはトリマー−ホスホラミダイト（ＳｏｎｄｅｋおよびＳｈｏｒｔｌｅ  １９９２）、モノマー−ホスホラミダイトの混合物、ダイマー−ホスホラミダイトの混合物、トリマー−ホスホラミダイトの混合物、またはそれらの組合せからオリゴヌクレオチド配列を合成することによって、生成される。
【００８３】
一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、天然に存在する源から生成かつ精製され、または、例えばＦａｒｚａｄｆａｒｄら（２０１４）に記載される、種々の周知の酵素的方法のいずれかを用いて、インビボ突然変異誘発を経験した細胞内でインビボ合成される。具体的には、ｓｏｆｔランダム化されたオリゴヌクレオチドのプールを合成する酵素として、以下に限定されないが、合成中にミスマッチヌクレオチドを高い頻度で組み込む低フィデリティＤＮＡポリメラーゼタンパク質または低フィデリティ逆転写酵素タンパク質が挙げられる。代替的には、ミスマッチヌクレオチドが、当業者にとって周知である化学物質の存在に起因して、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素によって、より高い頻度でオリゴ中に組み込まれる。
【００８４】
用語「塩基対」または「ｂｐ」（単数または複数の略語として用いられる）もしくは「ｂｐｓ」（複数）は、ＤＮＡまたはＲＮＡの分子の相補鎖を連結するヌクレオチドの対、および水素結合によってピリミジンに連結したプリンからなるヌクレオチドの対のいずれかを指す。対は、ＤＮＡにおいてアデニンおよびチミン、ＲＮＡにおいてアデニンおよびウラシル、そしてＤＮＡおよびＲＮＡの双方においてグアニンおよびシトシンである。
【００８５】
用語「マッチングオリゴヌクレオチドの対」は、２つ以上の相補的なオリゴヌクレオチドを指す。「相補的な」は、２つの一本鎖核酸の類似の領域、または１つまたは複数のｄｓ核酸のオーバーハング部分のヌクレオチド配列が、ストリンジェントなアニーリング条件（そのようなアニーリングは、「ハイブリダイゼーション」とも呼ばれる）または増幅条件の下で、安定した二本鎖水素結合領域において、一本鎖領域を一緒にアニールさせることができるヌクレオチド塩基組成物を有することを意味する。１つの一本鎖領域のヌクレオチドの連続した配列が、一連の「標準」水素結合塩基対を、他の一本鎖領域のヌクレオチドの類似した配列と、ＡがＵまたはＴと対形成され、そしてＣがＧと対形成されるように形成することができる場合、ヌクレオチド配列は、１００％相補的である。従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）の他に、類似体、例えば、イノシンおよび２’−デオキシイノシン、ならびにそれらの誘導体（例えば、７’−デアザ−２’−デオキシイノシン、２’−デアザ−２’−デオキシイノシン）、アゾール−（例えば、ベンズイミダゾール、インドール、５−フルオロインドール）またはニトロアゾール類似体（例えば、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、５−ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンズイミダゾール）およびそれらの誘導体、非環式糖類似体（例えば、ヒポキサンチン−もしくはインダゾール誘導体、３−ニトロイミダゾール、またはイミダゾール−４，５−ジカルボキサミドに由来するもの）、ユニバーサル塩基類似体の５’−三リン酸（例えば、インドール誘導体に由来する）、イソカルボスチリルおよび他の疎水性類似体、ならびにその誘導体（例えば、メチルイソカルボスチリル、７−プロピニルイソカルボスチリル）のいずれか、水素結合ユニバーサル塩基類似体（例えばピロロピリミジン）、ならびに他の化学修飾された塩基（例えば、ジアミノプリン、５−メチルシトシン、イソグアニン、５−メチル−イソシトシン、Ｋ−２’−デオキシリボース、Ｐ−２’−デオキシリボース）が、異なる塩基対形成優先性を有することができ、そしてストリンジェンシー／蓋然性が類似する複数の天然の核酸塩基と対形成することができる。ある場合では、モノマーは、ホスホジエステルによって、またはペプチジル結合によって、またはホスホロチオエート結合によって、連結される。
【００８６】
用語「二本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド」（「ｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチド」または単純に「ｄｓオリゴヌクレオチド」もしくは「ｄｓオリゴ」とも呼ばれる）は、ヌクレオチドダイマーの直鎖状ポリマーであるオリゴヌクレオチドを指すものとする。オリゴヌクレオチドを形成するダイマーは、モノマー対モノマー相互作用の規則的なパターン、例えば、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ型の塩基対形成、塩基スタッキング、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型またはリバースＨｏｏｇｓｔｅｅｎ型の塩基対形成、ゆらぎ塩基対形成等によって結合した、２つの相補的なヌクレオチドである。本明細書中に記載されるｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、典型的に、６〜２６の間の塩基対（ｂｐ）のサイズの範囲が、より長くてもよい。本明細書中に記載されるｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチドは、６〜２００の間の塩基対、例えば２７〜２００の間の塩基対のサイズに及んでもよい。オリゴヌクレオチドが、文字の配列（大文字または小文字）、例えば「ＡＴＧＣ」によって表される場合はいつでも、ヌクレオチドは左から右に５’→３’の順であること、そして「Ａ」はデオキシアデノシンを表し、「Ｔ」はデオキシチミジンを表し、「Ｇ」はデオキシグアノシンを表し、そして「Ｃ」はデオキシシチジンを表すことが理解されよう。従来のヌクレオチド（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ）の他に、修飾されたヌクレオチド、例えば、Ｋ−２’−デオキシリボース、Ｐ−２’−デオキシリボース、２’−デオキシイノシン、２’−デオキシキサントシン、または核酸塩基類似体を有するヌクレオチドが用いられてもよく、例えば、イノシンもしくは５−メチルイソシトシン、または３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、ピロリジン、４−ニトロイミダゾール、４−ニトロピラゾール、４−ニトロベンズイミダゾール、４−アミノベンズイミダゾール、５−ニトロインダゾール、３−ニトロイミダゾール、５−アミノインドール、ベンズイミダゾール、５−フルオロインドール、インドール、メチルイソカルボスチリル、ピロロピリミジン７−プロピニルイソカルボスチリルがある。専門用語および原子ナンバリング規則は、ＳｔｒａｃｈａｎおよびＲｅａｄ、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９）に開示されるものに従う。通常、オリゴヌクレオチドは、ホスホジエステルによって、またはペプチジル結合によって、またはホスホロチオエート結合によって連結される４つの天然ヌクレオシド（例えば、ＤＮＡについてデオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、またはＲＮＡについてそれらのリボース対応物）を含む。しかしながら、非天然のヌクレオチド類似体を含んでもよい（例えば、修飾塩基、糖、またはヌクレオシド間結合が挙げられる）。
【００８７】
二本鎖分子の最も単純なＤＮＡ末端は、平滑末端と呼ばれる。平滑末端分子において、双方の鎖は、塩基対で終結する。非平滑末端は、種々のオーバーハングによって生じる。本明細書中で用いられる用語「オーバーハング」は、ｄｓオリゴまたはポリヌクレオチド分子の一方または双方の末端にて対になってないヌクレオチドのストレッチを指す。この対になってないヌクレオチドは、どちらの鎖にあってもよく、３’または５’のオーバーハングを生じさせる。オーバーハングの最も単純なケースは、単一のヌクレオチドである。オーバーハングは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヌクレオチドのいずれか１つ、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヌクレオチドの少なくともいずれか１つを含んでもよいし、それからなってもよい。オーバーハングは、典型的に、ｄｓオリゴ長の半分以下である。例えば、前記ｄｓオリゴが６ヌクレオチド長である場合、オーバーハングは、３ヌクレオチド長以下であり、これは、オーバーハングが１または２ヌクレオチド長であり得ることを意味する。別の例に従えば、前記ｄｓオリゴが２４ヌクレオチド長である場合には、オーバーハングは、１２ヌクレオチド長以下であり、これは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１ヌクレオチド長であり得ることを意味する。
【００８８】
本明細書中で用いられる用語「ライブラリ」は、核酸フラグメント（例えばオリゴヌクレオチドライブラリ）であり、かつ少なくとも１０，０００対のマッチングオリゴヌクレオチドを含むライブラリメンバーのコレクションを指すものとする。ライブラリメンバーは、一本鎖オリゴヌクレオチドであっても二本鎖オリゴヌクレオチドであってもよい。ライブラリメンバーは、共通の特徴（例えば、ゲノム配列によって与えられる）を共有するが、少なくとも１つの塩基対、ヌクレオチド、突然変異、および／または表現型が異なる。ライブラリは典型的に、共通の特徴を有するものの他に、多様であるライブラリメンバーを含有する。ライブラリの特定の一タイプは、ランダムな突然変異誘発によって生成された、オリゴヌクレオチドのランダム化された突然変異体のライブラリである。別の具体例は、合理的に設計された（または合成）ライブラリ、例えば、特異的に操作されたＤＮＡフラグメントまたはオリゴヌクレオチドを含むライブラリであろう。本明細書中に記載されるライブラリは、様々な長さおよび異なる配列のオリゴヌクレオチドで適切に構成されたライブラリメンバーを含み、オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡの特定の領域と対応してもよいし、遺伝的空間全体にまたがってもよい。例示的には、ライブラリは、ヒト染色体ゲノムまたはミトコンドリアゲノムの天然に存在するあらゆる全てのポリヌクレオチドをできる限り合成するのに必須の多様性のあるオリゴを含んでもよい。更なる例において、前記多様性は、ヒト以外の真核生物種、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒツジ、植物、菌類、または酵母の天然に存在するあらゆる全てのポリヌクレオチドをカバーしてもよい。さらに別の例において、前記多様性は、原核生物、例えば古細菌または細菌の天然に存在するあらゆる全てのポリヌクレオチドをカバーしてもよい。
【００８９】
本明細書中で提供されるライブラリは具体的に、一本鎖オリゴヌクレオチドである少なくとも１０，０００対のマッチングオリゴヌクレオチドを含み、それらは具体的には、部分的に、または完全に相補的な配列を含む、様々な長さのｓｓオリゴである。マッチングオリゴの前記対は、別個の封じ込め内でｓｓオリゴとしてライブラリ中に存在してもよいし、２つ以上の相補的なｓｓオリゴが、アニールしてｄｓオリゴを形成してもよい一封じ込め内に含有されてもよい。一対のマッチングｓｓオリゴのヌクレオチド配列は、少なくとも１、２、または３ヌクレオチド、好ましくは少なくとも４ヌクレオチド以上において、マッチング対が、ｓｓオリゴ配列のハイブリダイゼーションによって新しいｄｓポリヌクレオチド分子を形成することができるように、相補的であってもよく、好ましくは、ｓｓオリゴは、部分的にハイブリダイズすることによって、オーバーハングを有するｄｓポリヌクレオチドが得られる。
【００９０】
ライブラリは、好ましくは、人工的に、もしくは化学的に合成されたオリゴヌクレオチド、または当該技術において周知の適切な方法によって合成された化学修飾（例えば、ペプチジル核酸またはホスホロチオエート結合を含む）オリゴヌクレオチドを含む。ライブラリ中に含まれるオリゴヌクレオチドは、天然に存在するＤＮＡの酵素的消化によって生成することもできる。本明細書中に記載される前記オリゴヌクレオチドライブラリのメンバーは、具体的に、異なる配列、突然変異、または核酸塩基もしくはヌクレオチドの変更、例えば、１つまたは複数の以降のヌクレオチドの置換、挿入、または欠失によって特徴付けられる。典型的には、ライブラリメンバーは、少なくとも１つまたは複数の点突然変異で異なる。具体的には、一部の実施形態において、変異は、特定の位置での、全ての考えられる、天然に存在する核酸塩基残基をカバーする。突然変異体が親オリゴヌクレオチドの突然変異誘発によって生成される場合には、親オリゴヌクレオチドの種々の配列変異が生成される。
【００９１】
本明細書中に記載されるライブラリの多様性はさらに、リン酸化された、メチル化された、ビオチン化された、またはフルオロフォアもしくはクエンチャに連結されたライブラリメンバーを含んでもよい。本明細書中に記載されるように、ライブラリメンバーは、１つまたは複数の追加のホスホリル基を含んでもよい。
【００９２】
ライブラリメンバーのメチル化、ＤＮＡ分子への、好ましくはシステインまたはアデニンへのメチル基の付加は、当該技術において周知の適切なＤＮＡメチル化方法に従って実行される。
【００９３】
本明細書中で用いられるビオチン化は、１つまたは複数のビオチン分子を、核酸、例えばｓｓオリゴまたはｄｓオリゴに共有結合させる方法を指す。本明細書中に記載されるライブラリメンバーは、当該技術において周知の適切な方法によってビオチン化されてもよく、これは好ましくは、化学的ビオチン化方法である。オリゴヌクレオチドは、ビオチンホスホラミダイトを用いる、当該技術において周知のホスホラミダイト方法によって、オリゴヌクレオチド合成の過程で容易にビオチン化することができる。
【００９４】
本明細書中に記載されるライブラリのメンバーは、当該技術において周知の適切な化学的方法および酵素的方法によって、フルオロフォアにコンジュゲートされてもよい。核酸の蛍光標識化に用いられる例示的な方法は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＡＲＥＳ  ＤＮＡ標識化キット（これは、蛍光色素によるＤＮＡの酵素的標識化のためのツーステップ方法を使用する）を用いる、蛍光色素によるＤＮＡの酵素的標識化方法を使用してもよい。更なる例示的な方法は、例えばＵＬＹＳＩＳ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔを用いる、標識化されたヌクレオチドの酵素的組込みなしに核酸を標識化する化学的方法を使用してもよい。更なる例示的な方法は、アミン末端オリゴヌクレオチドの化学的標識化を使用して、単独で標識化された蛍光オリゴヌクレオチドコンジュゲートを、例えばＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｍｉｎｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔを用いて、調製してもよい。更なる例示的な方法は、ＤＮＡアレイ／マイクロアレイおよび他のハイブリダイゼーション技術を使用してもよい。
【００９５】
ライブラリメンバーは、１つまたは複数のクエンチャ、例えば、フルオロフォアから励起エネルギーを吸収する物質に、当該技術において周知の適切な方法によって結合されてもよい。クエンチャの例として、以下に限定されないが、ダブシル（ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸）、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ、Ｑｘｌ  ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ、Ｉｏｗａ  ｂｌａｃｋ  ＦＱ、Ｉｏｗａ  ｂｌａｃｋ  ＲＱ、およびＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１が挙げられる。
【００９６】
本明細書中で用いられる用語「点突然変異」または核酸塩基変更は、例えば、単一の核酸塩基またはアミノ酸を導入もしくは交換し、またはギャップを導入することによって、特定の位置にて核酸またはアミノ酸配列を変更する突然変異事象を指すものとする。点突然変異または核酸塩基変更は、配列における１つまたは複数の単一の、隣接する、または連続した核酸塩基またはアミノ酸残基の変化を伴ってもよい。限られた多様性をカバーする突然変異体のレパートリーを含むライブラリでは、配列内の点突然変異の頻度は、突然変異体が、親（または基準）配列に対して少なくとも特定の配列同一性を、例えば８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の少なくともいずれかで共有するように、制限される。
【００９７】
本明細書中に記載されるヌクレオチド配列に関する「パーセント（％）ヌクレオチド配列同一性」は、配列をアラインして、必要に応じてギャップを導入して、最大パーセント配列同一性を達成した後に、特定のヌクレオチド配列内のヌクレオチドと同一である、候補配列内のヌクレオチドのパーセンテージとして定義される（あらゆる保存的置換を配列同一性の一部とみなさない）。当業者であれば、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができ、比較されることとなる配列の全長にわたる最大アラインメントを達成するのに必要とされるあらゆるアルゴリズムが挙げられる。
【００９８】
本明細書中で用いられる用語「多様性」は、本明細書中で提供されるライブラリを特徴付ける汎用性の程度を指す。具体的には、前記多様性は、異なる長さおよび異なる配列の一本鎖オリゴおよび二本鎖オリゴを含む。例えば、ライブラリは、８核酸塩基長のｓｓオリゴ（本明細書中でオクタマーと呼ばれる）の考えられる全ての配列変異を含んでもよく、これらは、８核酸塩基長の６５，５３６個の異なるｓｓオリゴであり、そして加えて、長さの異なる他のｓｓオリゴまたはｄｓオリゴを含んでもよく、これらは、標的配列内に共通して含まれるので、所定のあらゆる配列を構築するのに、より頻繁に必要とされる。共通して使用される一本鎖オリゴまたは二本鎖オリゴを、ライブラリの多様性に含めることは、合成コストを引き下げて、時間効率を増大させる。
【００９９】
具体的には、前記多様性は、ゲノム全体、例えばヒトゲノムをカバーしてもよい。具体的には、前記多様性は、遺伝的空間の全体をカバーしてもよい。具体的には、前記多様性は、複数の方法で複数回、ゲノムまたは遺伝的空間の全体をカバーしてもよい。例えば、考えられる全てのヘキサマー、ヘプタマー、および／またはオクタマーの配列組合せを包含することによる。例えば、前記ライブラリはまた、全ての、または選択された、９マーおよび１０マー、または最大２６マーまでのいずれかを包含してもよい。
【０１００】
具体例に従えば、本明細書中に記載されるオリゴヌクレオチドのプール内の多様性は、以下のように特徴付けられる：多様性は、オリゴヌクレオチド配列内の突然変異の数によって決定されてもよい。例えば、１６ヌクレオチド長の一本鎖オリゴヌクレオチドにおいて、考えられる単一ヌクレオチド変化の理論上の数は、１６×３＝４８である（天然に存在する４つのＤＮＡ、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣヌクレオチドによる）。オリゴヌクレオチドあたりの天然に存在する４つのＤＮＡ、Ａ、Ｔ、Ｇ、またはＣヌクレオチドによる２つの単一ヌクレオチド変化（二重突然変異体）について、考えられる配列の数は、６，４０８である。オリゴヌクレオチドあたり３つの単一ヌクレオチド変化（三重突然変異体）について、当該数は、５６３，９０４である。四重突然変異について、当該数は、３６，７９４，７３６である。これらの数は、オリゴヌクレオチド配列内に非天然の核酸塩基を組み込むことによって、さらに増大し得る。
【０１０１】
ライブラリ内のオリゴヌクレオチドの配列決定ベースのスクリーニングのための例示的な方法は、以下がある：ＳＮＰジェノタイピング法（ハイブリダイゼーションベースの方法（例えば、分子ビーコン、ＳＮＰマイクロアレイ、制限酵素断片長多型）が挙げられる）、ＰＣＲベースの方法（対立遺伝子特異的ＰＣＲ、プライマー伸長ヌクレアーゼ、５’−ヌクレアーゼ、またはＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ、一本鎖高次構造多型、温度勾配ゲル電気泳動、変性高速液体クロマトグラフィ、アンプリコン全体の高解像度溶融（ＨＲＭ）、ＳＮＰｌｅｘ、およびサーベイヤヌクレアーゼアッセイが挙げられる）；配列決定ベースの突然変異分析（ＰＴＲのＰＣＲアンプリコン全体のキャピラリ配列決定または高スループット配列決定（アンプリコンシーケンシング）が挙げられる）。そのような高スループット（ＨＴ）アンプリコン配列決定法として、ポロニーシーケンシング、パイロシーケンシング、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（Ｓｏｌｅｘａ）シーケンシング、ＳＯＬｉＤシーケンシング、半導体シーケンシング、ＤＮＡナノボールシーケンシング、Ｈｅｌｉｓｃｏｐｅ一分子シーケンシング、一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シーケンシング、Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＤＮＡシーケンシング、トンネル電流ＤＮＡシーケンシング、ハイブリダイゼーションによる配列決定、質量分析による配列決定、マイクロ流体サンガーシーケンシング、顕微鏡観察ベースの配列決定、ＲＮＡＰシーケンシングが挙げられるが、これらに制限されない。
【０１０２】
各ライブラリメンバーは、ライブラリ内のライブラリメンバーの選択、またはライブラリ内のライブラリメンバーの同定を促進するために、選択可能なマーカー、ＤＮＡ配列タグ、またはバーコードによって個々に特徴付けられてマークされてもよい。代替的には、遺伝的突然変異は、適切な判定方法、例えば、高スループット配列決定、キャピラリ配列決定によって直接決定されてもよいし、予め定義された配列とハイブリダイズする特異的プローブを使用して、対応するオリゴヌクレオチドを選ぶことによって決定されてもよい。
【０１０３】
別個のコンテナ内にライブラリメンバーを位置決めして、コンテナ内にオリゴヌクレオチドのライブラリを得ることが所望されてもよい。特定の実施形態に従えば、ライブラリは、アレイ、例えばＤＮＡバイオチップ内に提供され、当該アレイは、固体キャリア上に一連のスポットを含む。
【０１０４】
本明細書中で用いられる用語「突然変異誘発」は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの配列を変更するプロセスを指す。具体的には、部位特異的突然変異誘発は、知られているヌクレオチド配列内に、特定の突然変異を生じさせる方法を指す。この突然変異は、特異的な、標的化された変化であり、ヌクレオチドの単一または複数の挿入、欠失、または置換を含んでもよい。この作業は、制限酵素、具体的にはエンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼによって実行されてもよい。エンドヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの中央でホスホジエステル結合を切断するが、エキソヌクレアーゼは、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの５’末端または３’末端にてホスホジエステル結合を切断する。
【０１０５】
本明細書中で用いられる用語「アルゴリズム」は、実行されることとなるアクションの、自己完結型の（ｓｅｌｆ−ｃｏｎｔａｉｎｅｄ）シーケンスを指す。アルゴリズムは、空間および時間の有限量内で、そして、機能を算出するための明確に定義された形式言語で表すことができる、有効な方法である。初期状態および初期入力から始めて、命令は、実行される場合に、有限数の、明確に定義された連続する状態を通って進んで、最終的に「出力」を生成して、最後の終了状態にて終了するコンピュータ操作を記述する。ある状態から次の状態への転換は、必然的に決定的である。
【０１０６】
用語「ワークフロー」または「アセンブリワークフロー」は、最適な数のオリゴサブセット、およびアセンブリの、標的ｄｓポリヌクレオチドへのシーケンスを指す。本明細書中で提供される方法において、鋳型の配列は、オリゴのサブセットに相当するサブ配列に分割され、特定のヌクレオチド合成問題、例えば、回文配列、暴走反応、および曖昧でないアセンブリを回避してもよい。特に、より短いオリゴヌクレオチドへのそのような分割は、アセンブリプロセスを短くするのに、そして所望でない反応産物を分離する必要を回避するのに、非常に効率的であり得る。具体的には、オリゴのサブセットのライゲーションは、中間体反応産物（中間体とも呼ばれる）を産出し、そして中間体反応産物のアセンブリは、最終的に標的ｄｓポリヌクレオチドを産出する。好ましくは、上で列挙したものに対する追加の基準が、オリゴのサブセットを選択するのに用いられてもよい。そのような追加の基準として、あらゆる単回のライゲーション反応に使用されるオリゴのサブセットのサイズの最小化（例えば、ミスマッチライゲーションを回避するため）、オリゴヌクレオチド前駆体のサブセットのメンバーのアニーリング温度の差の最小化、異なる二本鎖サブユニットのオーバーハングのアニーリング温度の差の最小化、フレームシフトアダプターまたは一本鎖オリゴリンカーを使用するかどうか、そしてサブセットを形成する、異なるオリゴのハイブリッド形成部分間のクロスハイブリダイゼーションの程度を最小にするかどうかが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０７】
サブセット内のオリゴの数は、変化してもよい。好ましくは、サブセットのサイズは、１〜１００、または２〜１００の範囲内に、より好ましくは１〜５０、または２〜５０の範囲内に、さらに好ましくは１〜１０、または２〜１０の範囲内にある。
【０１０８】
クロスハイブリダイゼーションの程度が最小限にされたサブセットにおいて、セットのサブユニット、およびセットの他のあらゆるサブユニットの相補体からなる二重鎖または三重鎖は、少なくとも１つのミスマッチを含有する。言い換えると、そのようなサブセットのオリゴの配列は、サブセットの他の全てのオリゴの配列と、少なくとも１ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２オリゴヌクレオチド異なる。特定の実施形態において利用可能なオリゴヌクレオチドタグの数は、タグあたりのサブユニットの数によって、そしてサブユニットの長さによって決まる。
【０１０９】
組み合わされたオーバーハングに相補的な配列を有する一本鎖オリゴリンカーが、標的ポリヌクレオチド内の隣接するオリゴを連結する。リンカーは、例えば６塩基を含んでもよく、これは、２つの隣接するオリゴヌクレオチドをそれぞれ、（それぞれ、一方は３’末端上で、そして他方は５’末端上で）３塩基長のオーバーハングに連結する。
【０１１０】
本発明の特定の一実施形態において、アセンブリワークフローを決定するプロセスは、アルゴリズムによって実行される。鋳型の配列の候補分割が、本明細書中で提供される方法に従って、サブセットの最適な数およびアセンブリ配列を見出すために体系的に調査されて、合成のために分割される。最初に、鋳型配列全体が、単一のサブセットとしてとられ、その後、先で一覧にされるサブセット基準を満たす仕切りが見出されるまで、候補オリゴの数を、サイズを引き下げる中で増大させながら、サブセットがどんどん小さくなって形成される。
【０１１１】
用語「アセンブリ」または「アセンブルする」は、一本鎖および／または二本鎖オリゴを連結かつ／またはハイブリダイズすることによる、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの形成を指す。具体的には、前記アセンブリは、ｓｓヌクレオチド配列をハイブリダイズするあらゆる方法、ならびに／または酵素反応および／もしくは化学反応であるライゲーション反応による。好ましくは、前記アセンブリは、インビトロライゲーション方法による。
【０１１２】
標的ｄｓポリヌクレオチドのアセンブリは、マッチングｓｓオリゴ、ｄｓオリゴのオーバーハングを直接的にハイブリダイズすることによっても、１つまたは複数の適切なｓｓオリゴリンカーを間接的にハイブリダイズすることによってもよく、ｓｓオリゴリンカーは、ライブラリ内に含有され、そしてライブラリから選択されて移されて、前記第１の、第２の、または更なる反応産物のいずれかをアセンブルする。
【０１１３】
直接的アセンブリについて、オリゴヌクレオチド配列は、一本鎖オリゴ部分または重複部分（すなわち、重複する部分またはオーバーハング）によって、重複部分が連続配列内に一度だけ含まれるように、互いに結合される。２つのオリゴヌクレオチド配列を重複部分でアラインすると、連続配列が形成され、その長さは、一緒にとられた双方の個々のオリゴヌクレオチドの長さマイナス重複部分の長さである。結果的に、アラインされたオリゴヌクレオチドのそれぞれのセグメントを含む連続配列が得られる。
【０１１４】
間接的アセンブリについて、ｓｓオリゴをアラインして、これらを、一本鎖リンカーを介して結合すると直ぐに、標的ｄｓポリヌクレオチド、または前記第１、第２、もしくは更なる反応産物のいずれかが形成される。例えば、２つのオリゴヌクレオチド（それぞれ、例えば１０塩基長）が、例えば６塩基長のｓｓオリゴリンカーによって、第１のオリゴヌクレオチドの３’末端の３塩基が、ｓｓリンカーの５’末端の３塩基とアラインするように、そして第２のオリゴヌクレオチドの５’末端の３塩基が、ｓｓリンカーの３’末端の３塩基とアラインするように、結合されてもよい。
【０１１５】
用語「第１の、第２の、または更なる反応産物」は、１つまたは複数の反応封じ込め内で実行されるライゲーション反応の産物を指す。第１の工程において、マッチングオリゴヌクレオチドの少なくとも第１の対は、ライブラリから、第１の反応封じ込め中に、液体ハンドラーを用いて移されて、マッチングオリゴヌクレオチドは、ライゲーション反応においてアセンブルされることによって、第１の反応産物を形成する。具体的には、前記第１の、第２の、そして更なる反応産物はそれぞれ、少なくとも１つのオーバーハングを含む。マッチングオリゴヌクレオチドが、前記反応産物のオーバーハングとハイブリダイズする第１の部分を含む場合には、そしてさらに、新しい反応産物の別のオーバーハングを生じさせる第２の部分を含む場合には、反応産物のそのようなオーバーハングにより、オーバーハングの方向への、別のマッチングオリゴヌクレオチドとの更なるアセンブリは、例えば、オーバーハングを有する新しい反応産物を生成し得る。代替的には、マッチングオリゴヌクレオチドが、オーバーハングの全長にわたってオーバーハングとハイブリダイズして、例えば、オーバーハングの全ヌクレオチドをカバーする部分からのみなる場合には、平滑末端が生じ得る。
【０１１６】
具体的なケースでは、一方の末端または双方の末端上に平滑末端を有するｄｓ標的二本鎖（ｄｓ）ポリヌクレオチドが生成される。そのような平滑末端は、好ましくは、あらゆる末端オーバーハングを、マッチングｓｓオリゴおよび／またはｄｓオリゴ（そのようなオーバーハングの全長とハイブリダイズする）とハイブリダイズすることによって、新しいオーバーハングを生じさせることなく生成されるので、平滑末端を生成する。
【０１１７】
前記第１の工程において、１つまたは複数の対のマッチングオリゴヌクレオチド、および１つまたは複数のｓｓオリゴリンカーは、前記第１の反応封じ込め中に、液体ハンドラーを用いて移され、そしてマッチングオリゴヌクレオチドをアセンブルし、それによって第１の反応産物が得られる。好ましくは、前記第１の反応封じ込め中に移される、マッチング対の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５のいずれか１つ、好ましくは４、さらに好ましくは１、２、または３であり、そして移されるｓｓオリゴリンカーの数は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５のいずれか、好ましくは４、さらに好ましくは１、２、または３である。
【０１１８】
第２の工程および更なる工程において、少なくとも第２の対および更なる対のマッチングオリゴヌクレオチドは、ライブラリから、第２の反応封じ込めおよび更なる反応封じ込め中にそれぞれ、液体ハンドラーを用いて移され、そしてマッチングオリゴヌクレオチドをアセンブルし、それによって第２の反応産物および更なる反応産物がそれぞれ得られる。前記第２の工程において、１つまたは複数の対のマッチングオリゴヌクレオチド、および１つまたは複数のｓｓオリゴリンカーが、前記第２の反応封じ込め中に移される。好ましくは、前記第２の工程に移される、マッチング対の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５のいずれか、好ましくは４、より好ましくは１、２、または３であり、そして移されるｓｓオリゴリンカーの数は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５のいずれか、好ましくは４、より好ましくは１、２、または３である。前記更なる工程において、１つまたは複数の対のマッチングオリゴヌクレオチド、および１つまたは複数のｓｓオリゴリンカーが、前記更なる反応封じ込め中に移される。好ましくは、前記更なる工程に移される、マッチング対の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５のいずれか、好ましくは４、より好ましくは１、２、または３であり、そして移されるｓｓオリゴリンカーの数は、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５のいずれか、好ましくは４、より好ましくは１、２、または３である。
【０１１９】
工程および対応する反応産物の数は、制限されない。大きな標的ｄｓポリヌクレオチドを合成するために、工程において、一連の反応産物が、標的ポリヌクレオチドへのアセンブリのために生成される必要がある場合があり、例えば、少なくとも５、１０、２０、５０、１００、５００、１，０００、５，０００個、またはそれ以上が必須であるかもしれない。
【０１２０】
本明細書中で用いられる用語「ハイブリダイズする」、「ハイブリダイゼーション」、「ハイブリダイジング」、「アニール」、および「アニーリング」は、通常、１つまたは複数のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。水素結合は、Ｗａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対形成、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合によって、または他のあらゆる配列特異的様式で起こってもよい。複合体は、二重鎖構造を形成する２本の鎖、多重鎖複合体を形成する３本以上の鎖、単一の自己ハイブリダイジング鎖、またはこれらのあらゆる組合せを含んでもよい。ハイブリダイゼーション反応は、より広いプロセスにおける工程、例えばＰＣＲの開始、またはリボザイムによるポリヌクレオチドの酵素的切断を構成してもよい。
【０１２１】
本明細書中で用いられる用語「ライゲーション」は、２つの核酸配列が互いに、分子間化学結合（例えば水素結合）によりアニールして、適切な条件下で二重鎖を形成するプロセスを意味することが意図される。
【０１２２】
本明細書中で反応産物とも呼ばれるライゲーション産物は、二本鎖核酸および一本鎖核酸の双方から形成することができる。二本鎖核酸は、「付着末端」ライゲーションまたは「平滑末端」ライゲーションによってライゲートすることができる。付着末端ライゲーションにおいて、末端オーバーハングを含むスタガード末端が、ライゲーションパートナーにハイブリダイズすることができる。平滑末端ライゲーションにおいて、末端のオーバーハングは存在せず、ライゲーションの成功は、５’末端と３’末端の一過性の結合次第である。平滑末端ライゲーションは、一般に、付着末端ライゲーションよりも効率的でなく、種々の最適化、例えば、濃度、インキュベーション時間、および温度の調整が、効率を向上させるように施されてもよい。また、一本鎖ポリヌクレオチドがライゲートされてもよい。
【０１２３】
２つの相補的な配列間、または十分に相補的な配列間のライゲーション効率は、用いられる操作条件、特にストリンジェンシーによって決まる。ストリンジェンシーは、相同性の程度を示すことが理解され得る；ストリンジェンシーが高いほど、配列間の相同性パーセントは高い。ストリンジェンシーは、特に、２つの核の配列の塩基組成によって、かつ／または２つの核の配列間のミスマッチの程度によって、定義されてもよい。条件、例えば塩濃度および温度を変えることによって、所定の核酸配列は、その正確な相補体とのみ（高いストリンジェンシー）、または幾分関連したあらゆる配列と（低いストリンジェンシー）ライゲートすることが許容され得る。温度を上昇させ、または塩濃度を引き下げることで、ライゲーション反応の選択性は高まる傾向があり得る。
【０１２４】
ライゲーション反応は、酵素、具体的にはＤＮＡリガーゼ酵素によって実行される。ＤＮＡリガーゼは、ヌクレオチド同士を常時結合する、電子対を共有するホスホジエステル結合の形成を触媒する。また、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼは、ｄｓＤＮＡ鋳型が存在しない場合には、概して遅い反応ではあるが、ｓｓＤＮＡをライゲートすることができる。ライゲーション反応に用いることができる酵素の非限定的な例は、ＡＴＰ依存二本鎖ポリヌクレオチドリガーゼ、ＮＡＤ＋依存ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼ、および一本鎖ポリヌクレオチドリガーゼである。リガーゼの非限定的な例として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）ＤＮＡリガーゼ、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＤＮＡリガーゼ、サーマス・スコトダクトゥス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｓｃｏｔｏｄｕｃｔｕｓ）ＤＮＡリガーゼ（ＩおよびＩＩ）、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．）、ＶａｎＣ−型リガーゼ、９°Ｎ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔｓｐ  ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、Ｓｓｏ７−Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−Ｔ７  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ｓｓｏ７−  ＡｍｐリガーゼＤＮＡリガーゼ、および熱安定リガーゼがある。リガーゼ酵素は、野生型、突然変異アイソフォーム、および遺伝子操作された変異体であってもよい。ライゲーション反応は、バッファー構成要素、小分子ライゲーションエンハンサー、および他の反応構成要素を含有してもよい。
【０１２５】
好ましくは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼが、ライゲーション反応に用いられる。本明細書中で提供される方法において、ライゲーション反応は、副反応を阻止し、かつミスマッチを最小にする高フィデリティ条件の下で実行される。
【０１２６】
中間体反応産物中への、または標的ポリヌクレオチド中へのアセンブリは、適切なライゲーションバッファー溶液を用いて実行されてもよい。ライゲーションバッファー溶液は、例えば、典型的にはヌクレアーゼフリーの環境において、選択されるリガーゼが活性であることを確実にするｐＨ（典型的には、約７〜９の間のｐＨである）の水溶液である。好ましくは、ｐＨは、約５ｍＭ〜５０ｍＭの間の濃度のトリス−ＨＣｌによって維持される。ライゲーションバッファー溶液は、１つまたは複数のヌクレアーゼインヒビタ、通常カルシウムイオンキレーター、例えばＥＤＴＡを含んでよい。典型的には、ＥＤＴＡは、約０．１〜１０ｍＭの間の濃度にて含まれる。ライゲーションバッファー溶液は、いかなる補因子でも含むが、選択されたリガーゼについて活性であることが必要とされる。通常、典型的には塩化物塩として提供される、約０．２ｍＭ〜２０ｍＭの間の濃度の二価マグネシウムイオンである。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼについて、ＡＴＰが補因子として必要とされる。リガーゼバッファー溶液はまた、還元剤、例えばジチオスレイトール（ＤＴＴ）またはジチオエリトリトール（ＤＴＥ）を、典型的には約０．１ｍＭ〜約１０ｍＭの間の濃度にて含んでもよい。場合によっては、リガーゼバッファーは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの非特異的結合を減らす薬剤を含有してもよい。例示的な薬剤として、サケ精子ＤＮＡ、ニシン精子ＤＮＡ、血清アルブミン、およびデンハルト溶液が挙げられる。好ましくは、第１および第２のオリゴヌクレオチドが、標的配列の連続した相補的領域の塩基と完全にマッチした二重鎖を形成する場合には、ライゲーション条件は、ライゲーションが起こることとなるように調整される。しかしながら、一部の実施形態における第１のオリゴヌクレオチドの５’末端および第２のオリゴヌクレオチドの３’末端上の非対形成ヌクレオチドが、検出の一助となり、または平滑末端ライゲーションを減らすのを可能にすることが有利であり得ると理解される。ライゲーション反応における重要なパラメータとして、温度、塩濃度、変性剤、例えばホルムアミドの有無および濃度、第１および第２のオリゴヌクレオチドの濃度、ならびに使用されるリガーゼのタイプが挙げられる。反応用のハイブリダイゼーション条件を選択する方法が、当業者に知られている。
【０１２７】
好ましくは、ライゲーションは、完全にマッチするオリゴヌクレオチドのみがハイブリダイズすることを確実にするストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の下で起こる。典型的には、ストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションが起こる温度を調整する一方、ある一定の値、例えば１００ｍＭ  ＮａＣｌまたは相当量にて塩濃度を保持することによって、制御される。他の要因、例えば、第１および第２のオリゴヌクレオチドの特定の配列、第１および第２のオリゴヌクレオチドの長さ、ならびに選択されるリガーゼの熱不安定性も関連し得る。好ましくは、ライゲーション反応は、ライゲーションバッファー内で、ハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの融解温度に近い温度にて実行される。より好ましくは、ライゲーション反応は、ライゲーションバッファー溶液内で、ハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの融解温度の１０℃以内の温度にて実行される。最も好ましくは、ライゲーション反応は、ライゲーションバッファー溶液内で、ハイブリダイズされるオリゴヌクレオチドの融解温度の０〜５℃未満の範囲における温度にて実行される。
【０１２８】
ライゲーションは、１つまたは複数の増幅反応の後に続いてもよい。一部の実施形態において、ライゲーション産物または標的ポリヌクレオチドは、増幅前に単離または富化される。単離は、アフィニティ精製およびゲル電気泳動が挙げられる種々の適切な精製方法によって達成することができる。例えば、ライゲーション産物または標的ポリヌクレオチドは、支持体上に固定された選択的結合剤の、捕捉プローブに付着したタグへの結合によって、単離することができる。次に、支持体は、捕捉プローブ、および捕捉プローブにハイブリダイズされたあらゆるポリヌクレオチドを、サンプル反応容量の他の内容物から分離または単離するのに用いることができる。次に、単離されたポリヌクレオチドは、増幅、および更なるサンプル調製工程に用いることができる。一部の実施形態において、捕捉プローブは、環状の標的ポリヌクレオチドの増幅の前に、分解され、または選択的に除去される。反応産物または標的ポリヌクレオチドの増幅は、当業者に知られている種々の適切な増幅方法によって達成することができる。
【０１２９】
用語「誘導体」は、元のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと異なるが、その必須の特性を保持するオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを指す。誘導体は、例えば、化学的手段および／または酵素的手段によって、１つもしくは複数の点突然変異を導入するように、または異種部分もしくはタグに結合するように、一本鎖ＤＮＡまたは相補的ＲＮＡ分子を操作するために、ｄｓポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）を出発物質として用いて生成されてもよい。
【０１３０】
通常、誘導体は、全体的に密接に類似しており、そして多くの領域において、元のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと同一である。実際に、特定のあらゆる核酸分子またはポリペプチドが、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるかは、従来通り、知られているコンピュータープログラムを用いて判定することができる。クエリ配列（本発明の配列）と対象配列との間の最良の全体的マッチを決定する好ましい方法（グローバル配列アラインメントとも呼ばれる）は、Ｂｒｕｔｌａｇら（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｌｏｓｃｉ．（１９９０）６：２３７〜２４５）のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定することができる。配列アラインメントにおいて、クエリ配列および対象配列は双方とも、ＤＮＡ配列である。ＲＮＡ配列は、ＵをＴに変換することによって比較することができる。前記グローバル配列アラインメントの結果は、同一性パーセントである。内部欠失のためではなく、５’欠失または３’欠失のため、対象配列がクエリ配列よりも短い場合には、結果にマニュアル補正がなされなければならない。これは、同一性パーセントを算出する場合、ＦＡＳＴＤＢプログラムが対象配列の５’トランケーションおよび３’トランケーションを説明しないからである。例えば、同一性パーセントを求めるために、９０塩基の対象配列が、１００塩基のクエリ配列に対してアラインされる。欠失は、対象配列の５’末端に存在するので、ＦＡＳＴＤＢアラインメントは、５’末端の最初の１０塩基のマッチした／アラインメントを示さない。１０の減じられた塩基は、配列の１０％を表す（５’末端および３’末端の塩基の数は、クエリ配列内のマッチしない／塩基の総数である）ので、１０％が、ＦＡＳＴＤＢプログラムによって算出された同一性パーセントスコアから減算される。残りの９０塩基が完全にマッチする場合には、最終パーセント同一性は９０％になる。別の例において、９０塩基の対象配列が、１００塩基のクエリ配列と比較される。このとき、欠失は内部欠失であるので、対象配列の５’または３’上に、クエリとマッチしない／アラインされない塩基はない。この場合、ＦＡＳＴＤＢによって算出される同一性パーセントは、マニュアルで補正されない。ここでも、クエリ配列とマッチしない／アラインされない対象配列の５’および３’塩基のみが、マニュアルで補正される。
【０１３１】
本発明のライブラリは、配列空間全体をカバーするのに必須の何千ものオリゴを含んでもよい。オリゴヌクレオチドライブラリメンバーはそれぞれ、コンパートメント内に物理的に配置されてもよい。全てのコンパートメントは、好都合には、装置の１つまたは複数の部品の内部に提供されてもよい。これらは合わせて「アレイ装置」として提供される。そのようなアレイ装置は、マイクロタイタープレート、マイクロ流体マイクロプレート、一セットのキャピラリ、マイクロアレイ、またはバイオチップのいずれか１つまたは複数であってもよく、好ましくはＤＮＡまたはＲＮＡバイオチップである。オリゴは、好都合には、自動化された手段によって、例えば、ロボット工学的に、または、例えば自動化された液体ハンドラーを用いる、専用の流体を介して、そのようなコンパートメントから、本明細書中で反応コンパートメントと呼ばれる他のコンパートメント中に、すなわちある容器から別の容器に移されてもよい。ポリヌクレオチドの時間効率的なアセンブリを促進するために、オリゴヌクレオチドライブラリメンバーの使用頻度に相当する、反応および対応する容器の階層構造が使用されてもよい。新しい容器への移動は、オリゴの１つもしくは複数の分子を対応する位置から選ぶ、装置の物理的動作、またはマイクロ流体工学による気圧／水圧堆積を包含する。所定のあらゆる配列を理論的に構築するのに必要とされるオリゴの数の多さに起因して、ライブラリ内のライブラリメンバーのほとんどの空間的分布は、ライブラリのスキャニングおよび液体ハンドラーの長い移動時間に起因する、時間および資源の無駄を招くであろう。しかしながら、ライブラリメンバーの特定の分布を用いることによって、標的配列に従えば、動作が最小であることが確実にされ得る。一例が、マイクロウェルプレート中に保存することであり、そこでは、第１のプレートが、オリゴの最も共通する対組合せを、多いものから順に、使用頻度が最も低いライブラリメンバーを含有する最後のマイクロウェルプレートまで、含む。
【０１３２】
具体的には、前記別個のライブラリ封じ込めは、二次元のオーダーで空間的に配置され、個々のコンパートメントは、装置内に、ｘ軸およびｙ軸内の定義された座標にて位置決めされる。オーダーは、具体的に、合成時間を短くするように主に機能するパラメータによって予め定義される。好ましくは、前記パラメータは、例えば、天然に存在する、または標的ｄｓポリヌクレオチドもしくはそのフラグメントに共通して用いられるＤＮＡ配列において、マッチング対を頻繁に形成するオリゴを、互いに近接させて配置する、使用頻度である。より好ましくは、前記別個のライブラリ封じ込めは、三次元のオーダーで空間的に配置され、個々のコンパートメントは、装置内に、ｘ軸、ｙ軸、およびｚ軸内の定義された座標にて位置決めされる。オーダーは、具体的に、天然に存在するＤＮＡ配列において、マッチング対を頻繁に形成するオリゴを、互いに近接させて配置する、使用頻度によって決定される。具体的には、ライブラリメンバーの空間的配置は、以下のパラメータのいずれか１つ、または多数によって決まり得る：オリゴヌクレオチドの使用頻度、天然のＤＮＡ配列におけるオリゴヌクレオチドの出現頻度、一セットの設計されたＤＮＡ配列におけるオリゴヌクレオチドの出現頻度、マイクロ流体装置によるハンドリング時間またはアクセス時間の最小化、マイクロ流体装置による操作可能なコストの、または消耗品量の最小化。
【０１３３】
具体例において、前記別個のライブラリ封じ込めは、積み重ねられたプレートとして配置され、場合によってはバーコードで標識化され、そして自動化された微小滴ハンドラーによってアクセス可能な、マイクロウェルプレートである。ライブラリメンバーは、好都合には、前記積み重ねられたマイクロウェルプレート内に保存されてもよく、オーダーおよび積重ねは、使用頻度の低下に従う。
【０１３４】
本明細書中で用いられる用語「液体ハンドラー」、「自動化されたハンドラー」、または「微小滴ハンドラー」は、液体取扱い、好ましくは自動化された液体取扱いの方法に用いられるあらゆる装置、好ましくはセンサー一体化ロボットシステムに用いられる装置を指す。少量の分配が、生命科学において次第に普通に見られるようになるにつれて、気密シールによる精度レベルが高いマイクロシリンジが出現した。一部のマニュアルホルダーまたは電子ホルダーが、分配される容量の精度を確実にするようにピストン置換を正確に制御するように設計される。シリンジの他に、ピペットが、液体取扱い用の、別の一般に普及しているツールである。分配される容量は、マイクロリットルレベルであってもサブマイクロリットルレベルであってもよい。マルチチャンネルピペットは、一度のマルチルートピペッティングに推奨される。市場には、固定容量ピペットおよび調整可能容量ピペットの双方が出ている。前者は、より正確かつ精密であるが、後者は、用途の範囲がより大きい。なぜなら、オペレータが、必要に応じて異なる容量を選択することができるからである。また、高スループットは、生命科学研究において極めて重要になった。代表的な応用の１つが、マイクロアレイプリンティングである。この技術は、バイオサンプルスポットのアレイをそれぞれナノリットルスケールにて生じさせて、多数の実験の分析を、ほんの少量のサンプルで同時に可能にする。何千ものバイオサンプルをスポッティングするプロセスは、ハンドヘルド分配ツールではほとんど不可能な作業であり、ロボットの液体取扱いを重要な態様にする。
【０１３５】
ロボットワークステーションは、マニュアルの液体取扱いに勝る複数の利点を有する。というのも、ロボットは、疲労せずに働き、スループットを増大させ、一貫して実行し、そして正確さおよび精度を確実にすることができるからである。プラットフォームが組込み型であり、かつ多機能であることの要件に従えば、液体取扱い作業が、機能のほんの一部である、より複雑なシステムが存在する。液体取扱いの包括的なアーキテクチャが、以下のように構築されてもよい。第１に、制御センターは、ロボットワークステーションの分配部と洗浄ステーションとの間を移動するロボットを制御する。洗浄ステーションは、分配ヘッドを、その寿命を長くするために、そしてサンプルの安全性を確実にするためにクリーニングするのに用いられる。液体サンプルは、分配ヘッドから放出されて、更なるプロセシング用の基質上に置かれる。センサーは、フィードバック制御が制御センターによって実行され得るように分配部の状態を監視するために、組み込まれる。センサーは、全てのワークステーションに必ずしも設置されるわけではないが、より良好な性能をもたらすためのフィードバックループを構築するために、益々用いられる。
【０１３６】
用語「キャピラリ」は、ガラスキャピラリ、マイクロ流体キャピラリ、および自律マイクロ流体キャピラリシステムのいずれかを指す。キャピラリマイクロ流体工学は、多くの異なる分野において重要なツールである。それらの軸対称流、および有機溶媒に耐える能力に起因して、それらのリトグラフ的に製造されたポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）対応物と比較した場合、ガラスキャピラリ装置は、マイクロ流体用途についての利点を有する。特に、環状のチューブが、正方形の外流チャンネル中に挿入される。これは、これらの装置のアラインメントおよびセンタリングを大いに単純化する。これらの装置は、１０〜数百μｍのサイズの範囲の小さな小滴および大きな小滴を生成することができる。
【０１３７】
用語「マイクロタイタープレート」は、ウェルプレート、マルチウェルプレート、またはマイクロウェルプレートのいずれかを指す。これらのプレートは、共通して、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルを有する、２：３の矩形のミックスで製造されるが、他のキャビティ配置も利用可能である。ずっと稀であるが、利用可能な他のサイズのいくつかは、６ウェル、２４ウェル、３４５６ウェル、および９６００ウェルである。マイクロプレートのウェルは典型的に、数十ナノリットル〜数ミリリットルの間の液体を保持する。
【０１３８】
用語「マイクロアレイ」は、通常、ＤＮＡまたはタンパク質の、多数の分子またはフラグメントが規則的なパターンで付着している支持材料（例えばガラスまたはプラスチックのスライド）を指す。より具体的には、定義された位置において何千もの小さなスポットがプリントされている顕微鏡スライドを指し、前記スポットは、ＤＮＡまたはＲＮＡに結合することができる。そのようなスライドは、多くの場合、バイオチップ、ＤＮＡチップ、ＲＮＡチップ、または遺伝子チップとも呼ばれる。そのようなマイクロアレイは、共有結合または非共有結合でＤＮＡまたはＲＮＡに結合することができるので、オリゴが、予め定義された位置、すなわちスポットに保存されるアレイ装置として機能することができる。
【０１３９】
「マイクロ流体装置」は、生物学的アッセイおよび化学的アッセイを行う多数の利点を提供する微小滴の形態での離散的な流体パケットの操作を可能にする。これらのうち、利点は、アッセイに必要とされる試薬の容量、必要とされるサンプルのサイズ、および装置自体のサイズの大きな引下げである。そのような技術はまた、加熱、拡散、および対流混合等のプロセスが起こる容量を減らすことによって、生物学的アッセイおよび化学的アッセイの速度を高める。小滴が生成されると、注意深く設計された小滴は、多数の小滴の多重化を可能にして、大規模な複雑な生物学的アッセイおよび化学的アッセイを可能にする。
【０１４０】
用語「マイクロ流体マイクロプレート」は、マイクロ流体技術と、標準的な、ＳＢＳで構成された９６ウェルマイクロプレートアーキテクチャとの、マイクロ流体マイクロプレート技術の形態での組合せを指す。マイクロ流体マイクロプレートが、必須のワークフローの改良、サンプルおよび試薬の保存、反応動態の向上、ならびに、多重分析物ローディングによってアッセイの感度を向上させる能力を可能にする（Ｋａｉら、２０１２）。
【０１４１】
本明細書中で用いられる用語「メチルトランスフェラーゼ」は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ、タンパク質メチルトランスフェラーゼ、およびヒストンメチルトランスフェラーゼのいずれかを指すことができる。メチルトランスフェラーゼはさらに、クラスＩメチルトランスフェラーゼ（全て、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に結合するＲｏｓｓｍａｎ  ｆｏｌｄを含有する）、クラスＩＩメチルトランスフェラーゼ（ＳＥＴドメインを含有し、ＳＥＴドメインヒストンメチルトランスフェラーゼによって例示される）、およびクラスＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（膜結合している）に細分割することができる。
【０１４２】
用語「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」は、当業者に周知の遺伝子編集方法、およびその変形を指す。そのような変形として、以下に限定されないが、シチジンデアミナーゼへのヌクレアーゼ−デッドＣａｓ９（ｄＣａｓ９）の融合が挙げられ、これは、シチジンの、ウラシルへの部位特異的変換、およびＣａｓ９タンパク質への突然変異を可能にして、一本鎖ＤＮＡ切断（ニック）しか生じさせないＣａｓ９タンパク質のバージョンを生成する。
【０１４３】
用語「多重自動化ゲノム工学」または「ＭＡＧＥ」は、通常、複数の核酸配列を、１つまたは複数の細胞中に、細胞培養体の全体が、ゲノムまたは標的領域への一セットの変化を包含する状態に近づくように導入することを含む技術を指す。当該方法は、対立遺伝子の特定の一配置を生成するのに用いられてもよいし、場合によっては、追加のランダムな、または設計されていない変化を含む、設計された対立遺伝子のコンビナトリアル探査に用いられてもよい。
【０１４４】
ｓｓＤＮＡ−結合タンパク質媒介組換え、相同組換え、およびＭＡＧＥベースの方法は典型的に、複数のオリゴヌクレオチドを細胞中に導入することを含み、オリゴヌクレオチドを含むトランスフォーメーション培地またはトランスフェクション培地を用いて、細胞をトランスフォームまたはトランスフェクトする工程と、トランスフォーメーション培地またはトランスフェクション培地を増殖培地と置き換える工程と、増殖培地中で細胞をインキュベートする工程と、必要であれば、または所望される場合には、複数の核酸突然変異が、目的のヌクレオチド配列中に導入されるまで、工程を繰り返す工程とを含む。突然変異誘発のサイクル数を増やすと、通常、導入される突然変異の多様性が増大する。
【０１４５】
ＭＡＧＥは特に、高度に効率的なラムダファージｒｅｄ組換え系（λ  Ｒｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用し、これは、細胞のゲノムが、促進された指向性進化の形態を介して所望の機能を実行するように再プログラムされるプロセスである。λ  Ｒｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍは、β遺伝子、γ遺伝子、およびエキソ遺伝子を含み、それらの産物はそれぞれ、Ｂｅｔａ、Ｇａｍ、およびＥｘｏと呼ばれる。Ｇａｍは、宿主ＲｅｃＢ、Ｃ、Ｄエキソヌクレアーゼ活性およびＳｂｃＣ、Ｄヌクレアーゼ活性を阻害するので、外因的に加えられる直鎖状ＤＮＡは、分解しない。Ｅｘｏタンパク質は、各鎖の末端に結合する一方、他の鎖を５’方向から３’方向に分解させるｄｓＤＮＡ依存エキソヌクレアーゼである。Ｂｅｔａは、得られるｓｓＤＮＡオーバーハングに結合して、これを最終的に、相補的な染色体ＤＮＡ標的と対形成させる。λ  Ｒｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）属、シトロバクター（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）属、および赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）属の種における特定遺伝子の不活化に、そしてこれらの染色体中に小さな生物学的タグまたは単一の遺伝子を導入するのに広く利用されてきた。
【０１４６】
用語「接合性アセンブリゲノム工学」または「ＣＡＧＥ」は、複数の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株由来の互いに異なる遺伝子型を、単一のキメラゲノム中に階層的に組み合わせるためのコンジュゲーションを用いる、正確なゲノムアセンブリ方法を指す。ＣＡＧＥは、インビトロ操作によって制約が課されることなく、株間での特定のゲノム領域の大規模な移入を可能にする。コンジュゲーション機構を有するドナー株、およびドナーからＤＮＡを受け取るレシピエント株を確立することによって、株はペアワイズにアセンブルされる。株の対内で、ドナーゲノムおよびレシピエントゲノムにおける移入マーカーおよび選択マーカーのコンジュガル起源（ｃｏｎｊｕｇａｌ  ｏｒｉｇｉｎ）の標的配置は、所望のドナー−レシピエントキメラゲノムの移入および選択の制御を可能にする。設計によって、選択マーカーは、ゲノムアンカーポイントとして作用し、そして階層的ゲノム移入の以降のラウンドにおいて、リサイクルされる。
【０１４７】
「Ａｇｏ」は、一本鎖ＤＮＡガイドが、プラスミドＤＮＡ標的のＡｇｏベース切断を提供することができる、ＤＮＡベースのＤＮＡ干渉をもたらすことが示されてきたＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質を指す。重要な利点は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９とは異なり、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）の要件がないことである。
【０１４８】
ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）は、２５〜４０ｂｐのサイズの範囲のＤＮＡ標的部位を、ＤＮＡ結合ドメインにより配列特異的に認識して、相対するＤＮＡ鎖上のＦｏｋＩヌクレアーゼドメインの作用により、スタガード二本鎖切断を生じさせる。
【０１４９】
「メガヌクレアーゼ」（ホーミングエンドヌクレアーゼとしても知られている）は、１４〜４０ｂｐの間の特定のＤＮＡ配列を認識して直ぐに、ＤＳＢを切断して誘導する。メガヌクレアーゼの効率は、適度に高く、そして標的部位毎に、単一のカスタム生体ポリマーしか必要としない。
【０１５０】
「チロシン／セリン部位特異的リコンビナーゼ」または「Ｔｙｒ／Ｓｅｒ  ＳＳＲ」は、典型的には３０〜４０ｂｐ長の間の標的配列を認識し、哺乳類ゲノムにおける相同組換え修復（ＨＤＲ）を可能にする最古のゲノム工学ツールの１つであった。手短に言うと、標的部位は、３つの部分を含み、短いＤＮＡ配列の側面に、２つの逆方向反復が位置し、そして組換えが、一対の標的部位間で起こり得、標的部位間のＤＮＡ配列は、欠失、反転、または置き換えられ得る。特に、Ｔｙｒ  ＳＳＲは、二本鎖切断を生じさせることのない鎖交換の機構を利用するが、Ｓｅｒ  ＳＳＲは、二本鎖切断を生じさせる。しかし、より単純なデザイナー二本鎖ヌクレアーゼとは異なり、ＳＳＲは、一致した切断（ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ）、および存在するドナーＤＮＡとの再ライゲーションを必要とする。
【０１５１】
前述の説明は、以下の実施例を参照してより完全に理解されるであろう。しかしながら、そのような実施例は、単に本発明の１つまたは複数の実施形態を実践する方法の代表であり、発明の範囲を制限するものとして読まれるべきでない。
【実施例】
【０１５２】
以下の実施例において、オリゴのライブラリを生成する方法、それを取り扱う方法、ならびにその含有量および特性を確認する方法を記載する。さらに、本明細書中で提供する方法に従ってポリヌクレオチドを合成する方法を記載する。
【０１５３】
実施例１
ライブラリの生成
１．１  遺伝的情報の空間構造の決定
Ａ．第１に、ライブラリ内に含まれるべきオリゴヌクレオチドの全ての配列を列挙する必要がある。これらの配列を、全ての潜在的に所望される標的をカバーする配列の入力セットから、予めコンピュータで求める。この情報は、例えば、可能である組合せ（例えば、全てのヘプタマー、全てのオクタマーなど）のサブセット、制限酵素のセットによるゲノムの消化の予測される転帰、または他のあらゆるコンピュータ操作基準といった、基準の多様性に由来し得る。
【０１５４】
本実施例において、１６５６９塩基対を有するヒトミトコンドリアゲノム（Ｇｅｎｅ  Ｂａｎｋ受託番号Ｊ０１４１５；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、１９８１）を、ライブラリの基礎として機能させた。理想的には、全ての報告される配列は、以下および図１に記載するのと同じ方法で処理することとした。
【０１５５】
基準ゲノム配列を、８〜２６ｂｐ長の間のオリゴヌクレオチドダイマーに仕切った。同様に、逆相補体をコンピュータで求めて、８〜２６ｎｔ長の間のオリゴヌクレオチドに仕切った。これは、４ｎｔのオーバーハングを有するｄｓ構造体を形成することができる、総計２，０７０個のオリゴをもたらした（図１参照）。次に、配列を、最初に１、次に２、そして３、最大１５ヌクレオチドまでシフトすることによって、同じプロセスを繰り返し実行した。結果として、ライブラリ内に２０７０×１６＝３３，１２０個のオリゴができた。
【０１５６】
このデータベースにおいて、４ｂｐ重複するものしかカウントしない場合には、少なくとも１６５４４個のマッチング対が存在する。一般的に言えば、バリアント配列は、類似の方法で処理されるべきであり、これは、多重度を非線形的に増大させる。例えば、１６個の多型部位しか含有しない約１００ｂｐのウィンドウが、４００個超のオリゴを、そしてほぼ２０，０００個のマッチング対を加える（図１）。組み合わせ理論は、より可変的な部位を考慮する場合、オリゴライブラリが、その設計において考慮される配列変異体の数により、非多項式形態でポピュレートされることを包含する。
【０１５７】
オリゴのいくつかを、ハプロタイプの全体にわたって保存して、対形成された要素として、ライブラリ内に割り当てた（図１Ｂ）。可変部位に（変異性の程度に応じて）またがるオリゴを、ｓｓＤＮＡ要素として独立して維持した。
【０１５８】
Ｂ．ライブラリの二次元配置を、好ましい基準に従ってライブラリメンバーをソートすることによって決定した。ここでは、１６マーを、第１に配列シフトによって、そして第２に、配列内の第１の出現の順序に従って、そしてコンジュゲート対を交互に入れ替えることによって、ソートした。所定の位置について代わりのオリゴが生じると、それらのオリゴを、出現頻度に従ってサブソートした。全ての入力配列の全体にわたって保存されるオリゴを、同じ位置において、それらのコンジュゲート対により割り当てた。
【０１５９】
オリゴの個々の使用、そしてまたそのマッチング対の相対的使用の双方を反映する代わりの基準は、辞書学的に、長さ、マッチング対の隣接関係、頻度、または他のあらゆる、任意であるが知られている方法であり得る。
【０１６０】
Ｃ．次に、第１の配列を、実際のオリゴを配置することとなる１５３６マイクロウェルプレート内の位置に相当する二次元アレイに割り当てた。
Ｄ．１５３５個の残りのウェルが全て、工程Ｂのソーティング優先性を反映する順序でオリゴによって占められるまで、以降のオリゴを加えた。
【０１６１】
Ｅ．次に、工程Ｃを、全ての３３，１２０個以上のオリゴがマイクロウェルプレート内に分配されるまで、次の１５３６個のオリゴ等で繰り返した。
Ｆ．情報を、各オリゴの位置の経過を追うために、デジタル的に保存した。後の工程にて、これを２つの目的に供した：第１に、オリゴへのより簡単なアクセスのためのルックアップ・テーブルとして機能させた。第２に、利用可能な容量の経過を追うための、全てのオリゴの使用およびアクセス頻度の監視を可能にさせた。
１．２．ライブラリの合成
配列を適切に構築してから、各オリゴの実際の合成を実行した。物理的に、ヒトミトコンドリアゲノムを構築するのに用いたライブラリは、ポリプロピレン（ポリプロピレンが好ましい。しかしながら、表面へのＤＮＡ吸収を最小にするあらゆる材料を用いることができる）製の、２７枚の１５３６マイクロウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  １５３６ウェルプレート、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ製品番号ＣＬＳ３７２６−５０ＥＡ）からなる。簡単なアクセスのために、そして内容物のブックキーピングのために、各プレートを明白にラベル付けかつ／またはバーコード化した。
【０１６２】
生成した各オリゴを、上で決定したように、予め定義したプレート内に位置決めした。本実施例では、オリゴを５’末端にてリン酸化した。他の応用では、３’、５’、または両端にて、他の修飾、例えばジホスフェートもしくはトリホスフェート、ビオチン、ＴＥＧ、もしくはチオール修飾因子による処理、またはメチル化その他を必要としてもよい。オリゴを、１マイクロウェルあたりの１オリゴあたり、１０μＬの容量の水溶液（ヌクレアーゼフリーのｄｄＨ２０またはＴＲＩＳ１０ｍＭ  ｐＨ８．０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に、２００μＭの濃度にて維持した（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２０１４）。
【０１６３】
ライブラリの実際の生成を、分子生物学の標準的な方法で実行することができ、これは、ヌクレアーゼで、天然に存在するＤＮＡを消化して、オリゴ合成装置その他で化学的に構築してから、ＨＰＬＣ、キャピラリ電気泳動、または他の技術で分離かつ精製することによる。オリゴヌクレオチドの合成および修飾は標準的であるので、多くのサービスから外部調達することもできる。本実施例に従えば、デオキシヌクレオシドホスホラミダイトの化学反応を反復的に実行して、モノヌクレオチドを固相付着ポリヌクレオチドに共有結合させる自動ＤＮＡ合成装置を用いて、ライブラリを生成した（ＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｔｕｔｈｅｒｓ、１９８１）
ライブラリを、短期間使用しない場合−２０℃で、または長期間保存する場合−８０℃で保存した。
１．３  ライブラリの使用法
Ａ．プレートを３℃で少なくとも６０分間置くことによってライブラリを解凍し、氷上で、または３〜５℃の間の温度のより冷たいプレート上で維持した。
【０１６４】
Ｂ．各マイクロウェルプレートを、オービタルミキサー内で２５００ｒｐｍにて３０秒間ボルテックスして、遠心分離機内で９００ｒｐｍにて１分間スピンダウンした。
Ｃ．低容量の微小滴ハンドラー（ＴＰＰ  Ｌａｂ  Ｔｅｃｈ  Ｍｏｓｑｕｉｔｏ  Ｘ１）を用いて、１００ｎＬ（推奨範囲：５０〜２５０ｎＬ）を、１．８μＬの溶液または溶液小滴（推奨範囲は１〜５μＬである）を含有したフレッシュな３８４マイクロウェルプレート（他の容量、例えば９６もしくは１５３６、または表面を用いることもできる）に移し、そこでオリゴを組み合わせ、かつ／またはさらに反応させた。
【０１６５】
Ｄ．デジタルデータベースにおいて、各マイクロウェルの使用容量に、使用法の更なるラウンドに必要とされる全てのオリゴが常に十分であることを確実にするように、注釈を付けた。なお、一部の液体ハンドラーは、アクセスした各ウェル内の使用した容量および残りの容量の正確かつリアルタイムな測定を実現する。この機能は、より正確な追跡の一助となり得る。
【０１６６】
Ｅ．ライブラリを使用したら、−８０℃の保存に戻した。
１．４  ライブラリの特性の決定
本発明のライブラリを定義する主な特性は、ｉ）オリゴヌクレオチドの定義された長さ、ｉｉ）一本鎖および／または少なくとも１つのオーバーハングを有する二本鎖、ならびにｉｉｉ）一定数のオリゴである。本実施例で用いられるライブラリの主な特性は、ｉ）８〜２６ｎｔの範囲のオリゴヌクレオチドの長さ、ｉｉ）一本鎖または少なくとも１つのオーバーハングを有する二本鎖のオリゴの存在、およびｉｉｉ）少なくとも３３，１２０個のオリゴがライブラリ内に含まれることであった。
【０１６７】
品質管理の目的で、これらの特性が保持するものを確認することができることが所望される。
Ｉ．オリゴヌクレオチドの長さの確認
微小滴ハンドラーを用いて、各マイクロウェルの５〜１０ｎＬのアリコートをとって、共通の溶液中にプールした。代替的には、ランダムなアリコートをとって、１０個の異なるプール溶液中に、各オリゴが１つのプール内にのみあるようにプールした。プールをボルテックスによって混合した。プールした溶液あたりの数μＬの小アリコートを、キャピラリ電気泳動（Ｋｅｍｐ、１９９８）により泳動した。代替的には、サンプルを、２５％アクリルアミドゲル上で分析して、ｓｓＤＮＡの６〜２４ｂｐの範囲の標準ラダーと比較することができる。
ＩＩ．ライブラリ内に存在するオリゴヌクレオチドの構造の確認
変性させたが、それ以外は非処理の所定のオリゴのサンプルを、エキソヌクレアーゼ、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エキソヌクレアーゼＩで処理したサンプルと比較して、ｓｓオリゴ、ｄｓオリゴ、およびｓｓオーバーハングを有するｄｓオリゴを区別した（例えばＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉ、製品番号ＥＮ０５８１）。この酵素は、ｓｓＤＮＡをモノヌクレオチドおよびジヌクレオチドに消化するが、ｄｓＤＮＡを無傷のままにする（ＬｅｈｍａｎおよびＮｕｓｓｂａｕｍ、１９６４）。したがって、非処理のサンプルおよび処理したサンプルは、キャピラリ電気泳動により調査した場合、以下の結果の１つを与えた：
−  非処理のサンプルは、６〜２６ｎｔの範囲内で単一のバンドを示し、そして処理したサンプルは、バンドを示さなかった。これは、元のサンプルが、ｓｓＤＮＡからなることを意味した。
【０１６８】
−  非処理のサンプルは、６〜２６ｎｔの範囲内で単一のバンドを示し、そして処理したサンプルは、同じバンドを示した。これは、元のサンプルが、ｄｓＤＮＡ（オーバーハングなし）からなることを意味した。
【０１６９】
−  非処理のサンプルは、双方が６〜２６ｎｔの範囲内にある２つの異なるバンドを示し、そして処理したサンプルは、長さが、非処理のサンプルの最も小さなバンドと合致する単一のバンドを示した。これは、元のサンプルが、１つのオーバーハングを有するＤＮＡのダイマーからなることを意味した。オーバーハングの長さは、非処理のサンプルの２つのバンドのサイズの差異であり、そしてｄｓ部分の長さは、処理したサンプル上で示されるものである。
【０１７０】
−  非処理のサンプルは、６〜２６ｎｔの範囲内にある単一のバンドを示し、そして処理したサンプルは、長さが、非処理のサンプルのものよりも小さい単一のバンドを示した。これは、元のサンプルが、等しいサイズの２つのオーバーハングを有するＤＮＡのダイマーからなることを意味した。オーバーハングの長さは、処理したサンプルおよび非処理のサンプルのサイズの差異であり、そしてｄｓ部分の長さは、処理したサンプルのバンドによって示されるものである。
【０１７１】
−  非処理のサンプルは、双方が６〜２６ｎｔの範囲内にある２つのバンドを示し、そして処理したサンプルは、長さが、非処理のサンプルの双方よりも小さい単一のバンドを示した。これは、元のサンプルが、異なるサイズの２つのオーバーハングを有したＤＮＡのダイマーからなることを意味する。オーバーハングの長さを、処理したサンプルによって与えられるサイズに対する、各バンドのサイズの差異によって判定する。ｄｓ部分の長さは、処理したサンプル上で示されるものである。
【０１７２】
他の分析技術、例えばＨＰＬＣもまた、そのスペクトルにおいて、非処理のサンプルの組成を明らかにすることができ、これは、ＤＮＡの単一の、または２つの種の存在を直接示し、ライブラリの１ウェル内のオリゴヌクレオチドの性質の直接的な証拠を提供する。また、円二色性を用いて、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡを、そしてオーバーハングを有するｄｓＤＮＡすら識別することができる。
ＩＩＩ．オリゴヌクレオチドの数およびマッチング対の数の確認
各マイクロウェルの内容物の５０〜１００ｎＬのサンプルを、共通の溶液中にプールして、９５℃で３分間の加熱によってアニールさせ、そして少なくとも室温に、または１６℃にまで冷却させた。Ｍｇ＋、ＡＴＰ等の必須の補因子を含む、ライゲーションに必須の対応するバッファーを加えた。反応を触媒するのに十分なリガーゼ（例えばＴ４リガーゼ、ＮＥＢ、製品番号Ｍ０２０２）を加えた（反応溶液１μＬあたり１Ｕ）。反応混合液を、室温にて１時間、または１６℃で一晩、インキュベートした。
【０１７３】
仮説によって、マッチング対が十分である場合には、リガーゼは、マッチング対を共有結合させて、ランダムな配列を有する広範な長さのＤＮＡ分子が得られることとなる。長さの分布を、ＴＡＥ中アガロース２〜４％による電気泳動を用いて分析した。適切なラダー（別個のレーン上；５０または１００ｂｐを推奨）と一緒に泳動したサンプルは、バンドが分離せずに、サンプルレーンに沿ったＤＮＡのスメアを示した。およそ１００〜２００ｂｐの狭い範囲を、ラダーによるガイドでのゲルの切断によって単離した（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２０１４；第５章）。ゲル抽出のための標準的なプロトコルの後、切り出したアガロースブロックからＤＮＡを単離した（例えば、ＺｙｍｏｃｌｅａｎゲルＤＮＡ回収キット、Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、製品番号Ｄ４００１Ｔ）。精製の後、サンプルをディープシーケンシングして、プール内の異なる配列を決定した（Ｂｅｎｔｌｅｙら、２００８）。
【０１７４】
以下の分析を実行して、オリゴの、そしてマッチング対の数を推定した。反応のための出発物質が、６〜２６ｎｔの間のＤＮＡからなる場合には、そして配列が高度に反復的でない場合には、平均して、少なくとも２×Ｎ×１００／２６オリゴ（Ｎは、報告された配列の数である）、最大２×Ｎ×２００／６オリゴ、およびほぼ同じ数のマッチング対が存在すると結論することができる。更なるバイオインフォマティック分析を用いて、以下のようにオリゴの配列を抽出した。配列の１つの最初の６ｎｔをとって、完全な配列プール内のこのパターンについての調査およびマッチを実行して、出現数に注釈を付けた。これを、７ｎｔについて、その後８ｎｔその他について、２６ｎｔまで繰り返した。統計学的Ｔ検定を用いることによって、どの数が、ランダムな出現と有意に異なるかを決定した。この特徴的なパターンを、推定上のオリゴのリスト内に保存して、その出現を全て、データベースから除外した。この手順を、さらに仕切ることができず、そしてパターンのリストに今回加える、６〜２６ｎｔの間のＤＮＡサブ配列しか残らなくなるまで、残りの配列で繰り返した。同定されたオリゴの数を、Ｍと呼んだ。これらのオリゴは、少なくとも１つの他のオリゴにリンクしたので、相対する鎖内のそれらの部分的相補体と共に、連続オリゴは、マッチング対の一部であることを意味した。それゆえに、同定したオリゴの数と少なくとも同程度のマッチング対が存在したが、末端のものは除いた。例えば、Ｍ−Ｎマッチング対のオーダーで存在した。統計学的分析およびブートストラッピングシミュレーションを実行して、同定した数が、少なくとも３３，１２０個のオリゴのより大きなセットのサブサンプルであることを予想し得るかを判定した。
【０１７５】
実施例２
１２８ｂｐの標的ＤＮＡ分子の合成
本実施例では、本明細書中で提案する方法によって１２８ｂｐの配列を合成する方法を実証した。図２Ａは、目的の配列を示しており、これを、ＤＩＳＣＯＶＥＲと呼び、１６ｎｔの８ｄｓオリゴを、各鎖上の４ｎｔオーバーハング（図２Ｃ参照）および８つの相補的部位で形成した、１６のマッチング対（図２Ｂ）から構築した。各ｄｓオリゴを、文字Ｄ、Ｉ、Ｓ、Ｃ、Ｏ、Ｖ、Ｅ、Ｒ、ならびにそれらの構成するリーディング鎖およびラギング鎖によって、それぞれ上付き文字＋および−によって表す。オリゴは、実施例１で生成したライブラリの一部であった。これは、以下の特性を有する：全てのオリゴを、５’末端にてリン酸化し、ヌクレアーゼフリーのｄｄＨ２０中に２００μＭの濃度にて提供し、使用したオリゴは一本鎖であり、純粋であった。
Ａ．アニーリング溶液の調製
反応チューブ内で、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ（５０ｍＭ）、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、ＤＴＴ（１０ｍＭ）、およびＡＴＰ（１ｍＭ）を有する２５２μＬのｄｄＨ２０を調製した。ｐＨを７．５に設定した。いくつかの市販のバッファー、例えばＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓのＬｉｇａｓｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ、製品番号Ｂ０２０２Ｓを、Ｈ２０中に混合するために用意して、リガーゼ活性に必須のＡＴＰを確実に含有させた。溶液を、ボルテックスによって十分に混合した。この溶液ミックスの２８μＬを、４×２アレイの８マイクロウェル中に分配した。各オリゴの１μＬを、プレートの予め定義したマイクロウェルに移して、ピペッティングによって十分に混合した：
Ｄ＋およびＤ−をウェルＡ１に
Ｉ＋およびＩ−をウェルＡ２に
Ｓ＋およびＳ−をウェルＡ３に
Ｃ＋およびＣ−をウェルＡ４に
Ｏ＋およびＯ−をウェルＢ１に
Ｖ＋およびＶ−をウェルＢ２に
Ｅ＋およびＥ−をウェルＢ３に
Ｒ＋およびＲ−をウェルＢ４に
Ｂ．アニーリング。
【０１７６】
プレートをシールして、サーモサイクラー内にて９５℃で５分間インキュベートして、ｓｓオリゴのマッチング対をアニールさせることができた。その後、温度を毎分１℃ずつ低くするランプ機能により、温度を１６℃にまで低くした。終了したら、二本鎖オリゴを１６℃に維持した。
Ｃ．ライゲーション溶液の調製
ライゲーション溶液を、以下の順序で、１３．３μＬのヌクレアーゼフリーのｄｄＨ２０、２μＬのリガーゼバッファー、および４μＬのＡＴＰを、１ｍＭの最終濃度に、氷上での混合によって調製した。ライゲーション溶液をボルテックスによって十分に混合して、スピンダウンした。０．７μＬのＴ４リガーゼ（ＮＥＢ、製品番号Ｍ０２０２）を加えて、最終溶液の１μＬあたり総計１ユニットとし、穏やかなピペッティングによって十分に混合した。必要とされるまで、溶液を氷上で維持した。２．５μＬのライゲーション溶液を、Ｂのｄｓオリゴを含有する８マイクロウェルの各々に移して、ピペッティングによって混合した。その後、プレートを、ここでもシールした。
Ｄ．ライゲーションラウンド
第１ラウンドのライゲーションのために、以下のウェルを以下のようにマージした：Ｄ＋Ｉ、Ｓ＋Ｃ、Ｏ＋Ｖ、Ｅ＋Ｒ。これを、一方のウェルの内容物を他方のウェル中に移すことによって達成した（双方のウェルの内容物を、新しいウェル中に移すことも可能である）。最も左の内容物を最も右に移すスキームを用いた（図３Ａ）。ライゲーション反応混合液を、１６℃で少なくとも１時間、インキュベートした。ウェルＤＩ＋ＳＣおよびＯＶ＋ＥＲをマージすることによって（図３Ｂ）、このプロセスを繰り返し、そしてここでも、それぞれを１時間インキュベートした。最終のライゲーションラウンドについて、ウェルＤＩＳＣ＋ＯＶＥＲをマージして、もう１時間インキュベートした（図３Ｃ）。１２８ｂｐの産物を含有する最終容量は、１４０μＬであった。
Ｅ．精製
アガロースゲル２％（５μＬのＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ  ＤＮＡ  ｓｔａｉｎを供給した５０ｍＬ  ＴＡＥ中１ｍｇアガロース）を、１１ウェルのコームを入れて調製した。４．５μＬの５０ｂｐラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製品番号Ｎ３２３６またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製品番号１０４１６０１４）を、第１のレーンに加えて、工程Ｄで得た１４０μＬの溶液を、残りのウェルの全体にわたって分配した。ゲルを、８５Ｖ、２００ｍＡ、および１２ワットにて５０分間泳動した。電気泳動が完了した後、ゲルをＵＶトランスイルミネータ上に置いて、１２８ｂｐのフラグメントに相当するゲルのバンドを切り出した。これらのバンドの精製を、前記目的用の市販のキットで（例えば、Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ、先の実施例を参照）、またはこの目的のためのあらゆる標準的なプロトコルに従って、実行することができる。
Ｆ．増幅
産物の量をさらに増大させるために、工程Ｄで得た産物を、ＰＣＲによって増幅させた（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２０１４；第８章）。出発の１６ｎｔのＤ−およびＲ＋を、前記増幅用のプライマーとして用いた。増幅後、構築体を、酵素およびプライマーから解放して、２つのアリコートに分離して、更なる使用のための１つを標識化して−２０℃で保存し、そして他の１つを、構築体を配列確認するのに用いた。
【０１７７】
図４は、このプロセスの中間の工程および最終結果を示すアクリルアミドゲルを示す。レーン６および７において、上部のバンドは、１２８ｂｐ標的ｄｓポリヌクレオチドに相当する。この構築体を単離して（２％アガロースゲルから；不図示）、精製して、増幅させて、双方の鎖をサンガーシーケンシングした。得られた配列は、標的と、そしてその逆相補体と同一であった。
【０１７８】
実施例３
複雑な配列またはＲＮＡ合成用の標的ＤＮＡ配列の後処理
３．１  プロキシｄｓポリヌクレオチドの設計
本実施例において、ｄｓポリヌクレオチドを合成した。そのワークフローは、通常、曖昧な工程を含むであろう。例えば自己相補的なオリゴダイマーがある（例えば図５Ａ）。そのような自己相補的なダイマーを、不必要な暴走反応を回避するためにワークフローから除く必要があるので、鋳型配列は、自己相補的な要素を、異なる塩基で置き換えることによって、得られるアセンブリワークフローが曖昧とならないように、創出した。この鋳型に従って、プロキシｄｓポリヌクレオチドを合成した。
【０１７９】
図５Ａにおいて、目的の配列を示す。下線を引いた部分は、自己相補および自己重合ができる配列の部分を示す。これらの配列を回避するために、３つのオリゴにまたがる２つの塩基対修飾を含む鋳型配列（図５Ｂ）を設計した。
【０１８０】
プロキシｄｓポリヌクレオチドを、実施例２において実証したように、本明細書中で提示する方法で合成した。プロキシ配列を、実施例２のオリゴＯ−およびＶ＋と合致するように選択し、結果的に、その合成は、先に記載したように正確に進んだ。
【０１８１】
プロキシｄｓポリヌクレオチドが合成されると、目的の配列と同一である配列を有するｄｓポリヌクレオチドを、以下のように生成した。特異的突然変異誘発の原理を用いた。これは、ＰＣＲ増幅と同時に、合成されるプロキシｄｓポリヌクレオチド内の除外される標的配列の部分を、元の標的配列で置き換えるものである。
【０１８２】
合成が完了して、１２８ｂｐのプロキシｄｓポリヌクレオチドを精製した後に、ＰＣＲ反応を調製した。この反応混合液において、３’末端プライマーだけでなく一対の「突然変異導入プライマー」（ＡｔｔＢ）を含めた。この突然変異導入プライマーは、突然変異が導入される要素（本実施例では、３つの塩基）の両側に、プロキシ配列と完全に重複する１０ヌクレオチドを有した。これらの規定により、この実施例では、反応条件および試薬を標準化する市販のキット（Ｔａｑ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、製品番号Ｅ５０００Ｓ）を用いることによって、標準的なＰＣＲを実行して、ＳＯＩと同一である配列を有するｄｓポリヌクレオチドを回収した（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２０１４；第１３章）。
３．２  ＲＮＡの生成
また、所定の標的配列を有するＲＮＡ分子を、プロキシｄｓポリヌクレオチドを用いて生成する必要がある。これを、２つの工程で行った。第１に、目的のＲＮＡ配列の逆相補配列（すなわちＤＮＡ配列）を、コンピュータで求める必要があった。ＤＮＡ配列は、合成することとなる配列である。第２に、特定のプロモータ配列を、鋳型ＤＮＡ配列中に組み込んで、ＤＮＡ依存酵素によって認識可能であるようにした。これは後に、ＤＮＡをＲＮＡに転写することとなる（Ｒｉｏ、２０１１）。本実施例では、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼＩ系を用いた。必須の工程は、以下の通りである：
Ａ．ＤＮＡ鋳型の設計。目的の所定のＲＮＡ配列について、そのＤＮＡ逆相補体を、逆相補体の５’末端にＴ７  ＲＮＡ  ｐｏｌプロモータ配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ（配列番号２４）を含むように、コンピュータで求めた。
【０１８３】
Ｂ．プロキシｄｓポリヌクレオチドの合成。プロキシｄｓＤＮＡポリヌクレオチドを、実施例２（実施例１および実施例３．１も参照）に記載したように、工程３．２．ＡのＤＮＡ鋳型に従って合成した。プロキシＤＮＡの合成後、その末端を修飾して、平滑末端を生成した。ｓｓオーバーハングを、各ｄＮＴＰの３３μＭの存在下で、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ポリメラーゼＩ  Ｌａｒｇｅ  ＫｌｅｎｏｗフラグメントのＤＮＡの１μｇあたり１ユニットとの２５℃で１５分間のインキュベーションによって平滑末端化して、ＥＴＤＡ  １０ｍＭを加えて、７５℃で２０分間加熱することによって、不活化した（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、製品番号Ｍ０２１０から得た；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、２０１４；第１２章）。次に、プロキシｄｓポリヌクレオチドを精製して、増幅させて、再度精製した：１μｇ  ＤＮＡの最小量が、以下に記載するＲＮＡ合成反応に必要とされる。
【０１８４】
Ｃ．ＲＮＡの転写、後処理、および精製。ＲＮＡ転写のための標準的なプロトコルを続けた（例えば、他にいくつかあるうちの、ＨｉＳｃｒｉｂｅ  Ｔ７  ＡＲＣＡ  ｍＲＮＡ  Ｋｉｔ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、製品番号Ｅ２０６０）。これは、プロキシＤＮＡからのＲＮＡの合成を含んだ。プロキシＤＮＡからのＲＮＡの合成のために、以下のプロトコルを用いた：
１〜３μｇのＤＮＡを、２μＬの２×ｒＮＴＰ  Ｍｉｘ、２μＬのＴ７  ＲＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｍｉｘ、および１８ｕＬのＮｕｃｌｅａｓｅ  Ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒで構成される溶液中に溶解させてから、３７℃で３０分間インキュベートすることによって、ＲＮＡ分子を生成した。２μＬのＤＮａｓｅを加えて、３７℃で１５分インキュベートすることによって、反応を止めて、鋳型ＤＮＡを消化してから、得られたＲＮＡを、先の実施例において記載したように、スピンカラムを用いて精製した。
【０１８５】
実施例４
６０８ｂｐの標的ＤＮＡ分子の合成
本実施例では、６０８ｂｐの標的ｄｓポリヌクレオチドを、本明細書中で提供する方法を用いて合成する方法を実証した（ＳＯＩは、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ「Ｒｉｂｂｏｎ＿ｔｅｓｔ＿６０８」、配列番号２６である）。オリゴは、実施例１において生成したライブラリの一部であった。オリゴは、実施例２と同じ特性を有した。
【０１８６】
オリゴを、反応プレート内で非対称的に調製して、第４のライゲーションにて異なるサイズの部分構築体を得た。６０８ｂｐの配列は、１２８ｂｐの１つの反応産物および１６０ｂｐの３つの反応産物を得る４ラウンドのライゲーションを完了することによって達成され、これを次に、精製して、２ラウンドの更なるライゲーションに曝すことによって、６０８ｂｐの標的ｄｓポリヌクレオチドの各鎖を得ることとなる。
４．１  アニーリング溶液の調製
７７２μＬのｄｄＨ２０および９２μＬのＴ４リガーゼバッファーによって構成される、８６４μＬのアニーリング溶液のマスターミックスを調製した。この溶液ミックスの２１．６μＬを、３８マイクロウェル中に分配した。０．７μＬの各オリゴ（１５０μＭ中）を、プレートの予め定義したマイクロウェルに移して、ピペッティングによって混合した。
【０１８７】
部分的に相補的なｓｓオリゴは、実施例１のライブラリに由来し、そして図６に示すように、９６ウェルプレート上の特定のウェル内に入れた。簡単にするために、オリゴを、アニーリングのために入れたプレート上の位置に従って命名した。実施例２のように、リーディング鎖およびラギング鎖を、＋および−の上付き文字によってそれぞれ表す；ＦＡＳＴＡフォーマットでの配列番号２７〜１０２の配列参照。なお、行Ｅ〜Ｇ、列２〜７のウェルは、意図して空きのままにした。
４．２  アニーリング
実施例２のようにアニーリングを行った。
４．３  ライゲーション溶液の調製
ライゲーション溶液を、実施例２と同様に調製したが、量を、３８反応ウェルに十分である８０μＬに調整した。すなわち：７．２μＬのヌクレアーゼフリーｄｄＨ２Ｏ、８μＬのリガーゼバッファー、４０μＬのＡＴＰ、そしてボルテックスミキシングの後、２４．８μＬのＴ４リガーゼを、ピペッティングによって混合。
【０１８８】
得られた溶液の２μＬを、Ｂにおける３８反応ウェルの各々にディスペンサで移して、ライゲーション用に調製してから、マルチチャンネルピペットを用いて穏やかに混合した。
４．４  最初の４つのライゲーションラウンド
第１のライゲーションラウンドについて、完全な内容物を、列（１〜７）の行ＡおよびＣ内のウェルから行ＢおよびＤのウェル中にそれぞれ、そしてウェルＥ１およびＧ１からウェルＦ１およびＨ１中にそれぞれ移した。マルチチャンネルピペットで移してから、穏やかに混合した。このスキームは、実施例２と同等である：最も左の内容物は、最も右のウェルに移す。プレートをシールして、反応混合液をサーモサイクラー内にて１６℃で少なくとも１時間インキュベートした。なお、行２〜７のウェルＥ〜Ｇは空きのままである。
【０１８９】
第２のライゲーションラウンドについて、プレートを開けて、完全な内容物を、列（１〜７）の行Ｂ内のウェルから行Ｄのウェル中に、そしてウェルＦ１からウェルＨ１中にピペッティングによって移して、混合した。プレートをここでもシールして、１６℃で少なくとも１時間インキュベートした。
【０１９０】
第３のライゲーションラウンドについて、プレートを開けて、完全な内容物を、列１〜７の行Ｄ内のウェルから行Ｈのウェル中にピペッティングによって移してから、混合した。プレートをここでもシールして、１６℃で少なくとも１時間インキュベートした。
【０１９１】
第４のライゲーションラウンドについて、プレートを開けて、完全な内容物を、ウェルＨ２、Ｈ４、およびＨ６から、ウェルＨ３、Ｈ５、およびＨ７中にそれぞれピペッティングによって移してから、混合した。なお、ウェルＨ１はそのままにした。プレートをここでもシールして、１６℃で少なくとも１時間インキュベートした。
４．５  中間精製
７レーンのコームと共に、実施例２のＥ部のように、３つのアガロースゲルを調製して、５０ｂｐのラダーを含めた。Ｄ部由来のウェルＨ１内の内容物を、ゲルの６レーン中に分配した（各レーン上に３３μＬ）。内容物Ｈ３、Ｈ５、およびＨ７を、他の２つのゲルのそれぞれ３つのレーン中に分配した（各レーン上に４１μＬ）。ゲルを、実施例２のＥ部において示されるように泳動してから、必要に応じてバンドを切り出した（ゲル１のレーン２〜４について１２８ｂｐ、そしてゲル１およびゲル２の残りのレーンについて８０ｂｐ）。実施例２のＥ部において記載されるように精製を実行して、同じ合成等価体を含有する同じ精製カラムサンプル内にプールした。４つのサンプルをそれぞれ、１０μＬのｄｄＨ２０で（Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ精製キット内で示されるように）溶出して、溶出効率を向上させるために３５℃で温めた。内容物を、ＰＣＲ反応チューブのストライプに移して、Ｓ１からＳ４まで標識した。
【０１９２】
Ｓ１から、そしてＳ４から０．５μＬのサンプルをとって、０．５μＬのｄｄＨ２Ｏ中に希釈した。これらのサンプルを用いて、２６０ｎｍでの分光測光法（ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってＤＮＡ濃度を推定して、それぞれ１．５２μｇ／μＬおよび１．９８μｇ／μＬとした。サンプルＳ２およびＳ３が、類似のモル濃度範囲にあるとみなした。
４．６  ライゲーション溶液の調製
サンプルを、氷内に置いた。サンプルＳ１およびＳ４に、（Ｅ部において測定のためにとった０．５μＬを補うために）０．５μＬのｄｄＨ２０を加えた。各サンプルに１．１４μＬのリガーゼバッファーを加えることによって、ライゲーション反応を調製した。０．３μＬのＴ４リガーゼを、Ｓ１およびＳ３に加えた。溶液を、ピペッティングによって混合した。
４．７  ライゲーションの最後の２つのラウンド
第５のライゲーション反応について、完全な内容物を、ピペッティングによって、チューブ１および３からチューブ２および４中にそれぞれ移してから、混合した。チューブを閉じた。反応物を、サーモサイクラー内にて１６℃で８０分間インキュベートした。
【０１９３】
最後のライゲーション反応ラウンドについて、完全な内容物を、ピペッティングによってチューブ２からチューブ４中に移してから、混合した。チューブを閉じた。反応を、サーモサイクラー内にて１６℃で８０分間インキュベートした。これで、階層的な合成プロセスを完了した。
４．８  最終精製
８レーンのコームを用いた２％アガロースゲルから、精製を実行した。第１のレーンは、実施例２のＥ部のように、５０ｂｐのラダーを含有した。完全なサンプルを、ＳＤＳなしの１０μＬの紫色のローディングダイと混合して、単一のレーン中に分配した。ゲルを、１００Ｖ、２００ｍＡ、１２ワットにて４５分間泳動した。図７は、得られたゲルを示す。６０８ｂｐの予想されるサイズに相当する上部のバンドを切り出して、実施例２のＥ部におけるように、Ｚｙｍｏゲル抽出キットで、３５℃に温めた２０μＬのｄｄＨ２０水を用いて精製した。このサンプル内の０．５μＬを用いて、溶液が１０ｎｇ／μＬを含有すると分光測光法で推定された。
４．９  配列決定
溶液を、２つのサンプルに分けた。一方は約１０μＬ、そしてもう一方は９．５μＬであった。それぞれの溶液に、プライマー（プライマー１およびプライマー２）を加えて、サンガー法によって配列決定した。配列決定により、信頼性が高い中心領域は、標的ｄｓポリヌクレオチドの、ＳＯＩとの完全な配列同一性が確認される。
【０１９４】
実施例５
１０，０００ｂｐのＤＮＡ分子の合成
本実施例において、１０，０００ｂｐの目的の配列からなるｄｓポリヌクレオチドの構築を、実施例１のライブラリ設計に基づいて、４つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓダイマーを形成する２６ｂｐのオリゴを用いて実証する。
５．１．配列プロセシング
Ａ．目的の配列のリーディング鎖の逆相補体をコンピュータで求めて、双方の配列（リーディング鎖および逆相補体）において、３’末端の最後の４ヌクレオチドを除去する。これにより、２つの一本鎖鋳型配列（一方はＳＯＩのリーディング鎖に相当し、他方はＳＯＩの逆相補体に相当する）マイナス３’末端の４ヌクレオチドが得られる。
【０１９５】
Ｂ．双方のｓｓ鋳型の配列をアラインして、二本鎖鋳型配列が得られ、これを次に、より短い配列（オリゴサブセットまたはサブ配列と呼ぶ）に仕切る。これらは、ライブラリ内に含有されるオリゴ内に存在する。ライブラリ内のそれらの位置に、デジタル的に注釈を付ける。
【０１９６】
Ｃ．工程Ｂにおいて決定したサブ配列の曖昧でないアセンブリを可能にするワークフローを決定する。
５．２．反応
以下の全ての工程を、特に明記しない限り、１６℃で実行し、そして全ての溶液を調製して、氷上で維持する。
【０１９７】
Ａ．７００μＬの２×リガーゼバッファーのｄｄＨ２０溶液を調製して、１．８μＬのこのマスター混合溶液を、３８４マイクロウェルプレートの各ウェル内に分配する。
Ｂ．ＳＯＩのリーディング鎖マイナス３’末端の４ヌクレオチドであるｓｓ鋳型配列の、４．１、工程Ｂにおいて決定したサブ配列に相当するオリゴヌクレオチドライブラリメンバーのそれぞれの０．１μＬを、標的配列内での出現の順にライブラリから抽出して、３４８マイクロウェルプレートのマイクロウェル内に、ウェルＡ１、Ｂ１、...、Ｐ１から始めて分配して、その後、全てのオリゴがウェル中に分配されるまで、以降の列Ａ２、Ｂ２その他に進める。
【０１９８】
Ｃ．ＳＯＩの逆相補体マイナス３’末端の４ヌクレオチドであるｓｓ鋳型配列の、４．１、工程Ｂにおいて決定したサブ配列に相当するオリゴヌクレオチドライブラリメンバーのそれぞれの０．１μＬを、逆配列の順に抽出して、工程Ｂのマイクロウェルプレートに、ここでもウェルＡ１から始めて、全てのオリゴがウェルに中に分配されるまで分配する。この時点では、各マイクロウェルは、相補的な２２ｂｐおよび４ヌクレオチドで構成されるオーバーハングを有する２つのオリゴを含有する。まとめると、ウェルは現在、オリゴヌクレオチドライブラリメンバーのマッチング対を含有するはずである。
【０１９９】
Ｄ．マイクロウェルプレートをシールして、サーモサイクラー内で９５℃にてアニールを開始して、毎分１℃のランプ速度にて１６℃に引き下げる。
Ｅ．ｄｄＨ２０中に１μＬあたり２０結合ユニットの濃度にてＴ４リガーゼを含む、８００μＬのマスターミックスライゲーション反応溶液を調製して、この溶液の２μＬを、プレートの３８４ウェルの各々に分配する。
【０２００】
Ｆ．プレートを、遠心分離機内で１０００ｇパルスでスピンダウンする。
Ｇ．溶液を含有する行を、以下の式を用いて列挙する：２ｔ−１ｋ（式中、ｔは段数であり、ｔ＝１，２，３，４であり；ｋは、充填したウェルを有する行のインデックスであり、ｒ＝ｋ＝１、...、１６／２ｔ−１である）。このように、第１の段において、全ての行が列挙され、第２の段において半分のみ等である。
【０２０１】
Ｈ．奇数のインデックスの各行のウェルの内容物を、マルチチャンネルマイクロピペットまたは液体ハンドラーを用いて、偶数のインデックスの最も右の列のウェルに移す。
Ｉ．内容物を移した直後に、溶液をマイクロピペットまたはハンドラーで直接ピペッティングすることによって、穏やかに混合する。
【０２０２】
Ｊ．反応物を６０分間インキュベートして、ライゲーション反応を完了させる。
Ｋ．マイクロウェルプレートの最後の行（Ｐ）のみを充填して、残りの充填されたウェルが総計２４になるまで、工程Ｇ〜Ｊをさらに４回繰り返す。
【０２０３】
Ｌ．２４ウェル（４８μＬを含有する）の各々の内容物を、２４本の反応チューブに移して、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓのＭｏｎａｒｃｈ  ＰＣＲ  ＆  ＤＮＡクリーンアップキット（製品番号Ｔ１０３０）に従うカラム内での精製用に調製して、１００ｂｐよりも長い中間体反応産物のみを含有する６μＬの精製溶液が得られた。
【０２０４】
Ｍ．精製溶液を、８連のＰＣＲチューブの３本のフレッシュなストリップに移して、８行×３列に配置する。
Ｎ．工程Ｅにおける１７．５μＬの溶液をとり、そして７．５μＬのリガーゼバッファー（１０×）を、７×の最終濃度になるように加えて、この溶液の１μＬを、各チューブに分配した。
【０２０５】
Ｏ．工程Ｈ〜Ｊと同じように反応をさらに３回進めて、充填した３本のチューブ（最後の行の各列に１つずつ）が得られる。
Ｐ．列１の内容物を列２に移して、列３をそのままにする。
【０２０６】
Ｑ．反応物を１時間インキュベートする。
Ｒ．列２の内容物を、列３に移す。
Ｓ．反応物を１時間インキュベートする。
【０２０７】
Ｔ．０．８％アガロースゲルを調製して、サンプルを、１０ｋｂｐラダーと一緒にロードする。ゲルを、１００Ｖにて４５分間泳動する。
Ｕ．１０Ｋｂｐに相当するバンドを、ゲルブロックから抽出して、標準的なプロトコルおよびキット（Ｚｙｍｏ  ｃｌｅａｎを、本実施例で推奨する。実施例１も参照）を用いて精製する。
５．３．仕上げおよび増幅
Ａ．ライブラリ由来の２つの２６ｂｐ長のオリゴを選択し、これらは、ＳＯＩの３’末端の最後の２６ヌクレオチドと相補的である。すなわち、ポイント４．１の工程Ａにおいて欠失した４ヌクレオチドも含む。これらの２つのオリゴを、最終産物を増幅するように、そして残りの４ｂｐを各鎖に加えて、平滑末端を有する１０，０００ｂｐの配列を完成させるように準備されるＰＣＲ反応において、プライマーとして用いる。
【０２０８】
Ｂ．ポイント４．２の工程Ｌにおけるように、ＰＣＲ産物を標準的なキットで精製して、残りのオリゴ、酵素、および試薬を除去して、最終ＤＮＡ産物、すなわち、ＳＯＩに同一である配列を有するｄｓポリヌクレオチドを、下流の用途のために準備ができたままにする。
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【図１】
2020537546.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【配列表】
2020537546000001.app
【国際調査報告】
2020537546.tif 000014
2020537546.tif 000015