(57)【要約】  本明細書では、抗原特異的エフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する多能性幹細胞から生成するための方法が提供される。さらに本明細書では、本明細書に提供されるエフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を投与することによる養子細胞療法のための方法が提供される。
2020517237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成する方法であって、
（ａ）多能性幹細胞（ＰＳＣ）を改変し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、それによりＣＡＲ−ＰＳＣを生成することと；
（ｂ）前記ＣＡＲ−ＰＳＣをＣＤ３４+造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化させる、又はフォワードプログラミングすることと；
（ｃ）前記ＣＤ３４+ＨＰＣをＴ細胞及び／又はＮＫ細胞にさらに分化させることと；
（ｄ）前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を拡大させることであって、拡大させることが、抗原特異的標的細胞と共培養し、それにより抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成することを含む、ことと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の前記ＰＳＣが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ｉＰＳＣが、Ｔ細胞からリプログラミングされる、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｂ）が、指向された分化誘導を実施することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
指向された分化誘導が、
（ａ）ブレビスタチン、ＧＳＫ−３阻害剤、ＦＧＦ２、及びＶＥＧＦの存在下で胚様体（ＥＢ）を生成することと；
（ｂ）中胚葉誘導を誘導させるため、前記ＥＢをＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２と接触させることと；
（ｃ）Ｆｌｔ−３リガンド、ＩＬ３、ＳＣＦ、及びＴＰＯの存在下で前記ＥＢを分化させ、それによりＨＰＣを生成することと、
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｃ）の分化させることが、ＢＭＰ４が本質的に不在である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｃ）の分化させることが、ＢＭＰ４が不在である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｃ）の分化させることが、ＩＬ−１１、ｃＡＭＰ、及び／又はＶＥＧＦの存在をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｃ）の分化させることが、ＩＬ−１１、ｃＡＭＰ、及びＶＥＧＦの存在をさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＧＳＫ−３阻害剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
指向された分化誘導が、
（ａ）個別化されたＰＳＣを、ブレビスタチン、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦの存在下、アミンでコーティングされた表面上で培養することと；
（ｂ）前記ＰＳＣをＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２と接触させることにより、分化を開始させることと；
（ｃ）前記ＰＳＣをＦｌｔ−３リガンド、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びヘパリンの存在下でさらに分化させ、それによりＨＰＣを生成することと、
を含み、前記方法がＥＢの形成を含まない、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＳＣが、本質的に導入遺伝子を含まない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＳＣがヒトである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、又はγδＴ細胞である、請求項１又は３に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）の前記ＰＳＣが、単一の誘導性プロモーターの制御下でＥＲＧ／ＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を発現するようにさらに改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、及びＨＯＸＡ４を発現するように、前記ＰＳＣを改変することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｂ）のプログラミングが、ＥＲＧ／ＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９の発現を、ＨＰＣを生成するのに十分な期間にわたり誘導することと、ステップ（ｃ）の前に発現の前記誘導を終了させることと、を含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
規定されたフィーダーフリー条件下で前記細胞を培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）が、ＣＤ３４及びＣＤ４３を発現する細胞について、抗原特異的Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化させる前に選択することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
選択することが、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を実施することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＤ３４及びＣＤ４３を発現する前記細胞が、前記全細胞集団の少なくとも３５パーセントを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ３４及びＣＤ４３を発現する前記細胞が、前記全細胞集団の少なくとも６５パーセントを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＨＰＣの少なくとも５パーセントが前記ＣＡＲを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＨＰＣの少なくとも１０パーセントが前記ＣＡＲを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＨＰＣの少なくとも１５パーセントが前記ＣＡＲを発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｃ）の分化させることが、前記ＨＰＣを、低酸素条件下、アスコルビン酸及びニコチンアミドの存在下、レトロネクチン及びノッチＤＬＬ−４でコーティングされた表面上で培養することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記培養物が、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯ、及びＩＬ７をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記培養物が、ＧＳＫ−３阻害剤、ＩＬ−２、及び／又はＩＬ−１２をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記培養物が、ＧＳＫ−３阻害剤、ＩＬ−２、及びＩＬ−１２をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
ステップ（ｄ）の拡大させることが、前記抗原特異的Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、及びＩＬ−１５の存在下で培養することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
ステップ（ｄ）の拡大させることが、前記抗原特異的Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１の存在下で培養することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ｄ）の拡大させることが、前記抗原特異的Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体、ＦＬＴ３リガンド、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及び／又はＩＬ−２１の存在下で培養することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
ステップ（ｄ）の拡大させることが、ＳＣＦ及びＴＰＯからなる群から選択される１つ又は２つの追加的な成分をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３４】
前記分化されたＣＤ３４+ＨＰＣの少なくとも１．５パーセントが、ＣＤ３+ＣＡＲ+Ｔ細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
前記分化されたＣＤ３４+ＨＰＣの少なくとも２パーセントが、ＣＤ３-ＣＡＲ+ＮＫ細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記拡大されたＣＤ３４+ＨＰＣの少なくとも２パーセントが、ＣＤ３+ＣＡＲ+Ｔ細胞である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
前記拡大されたＣＤ３４+ＨＰＣの少なくとも１０パーセントが、ＣＤ３-ＣＡＲ+ＮＫ細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＡＲ及び前記抗原特異的標的細胞が、前記同じ抗原に特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
前記抗原がＣＤ１９である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記抗原特異的標的細胞が腫瘍細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗原特異的標的細胞がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
前記抗原特異的標的細胞がＨＬＡクラスＩ陰性である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記抗原特異的エフェクターＴ細胞の少なくとも５パーセントが、標的細胞に対する細胞傷害性活性を示す、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記抗原特異的エフェクターＮＫ細胞の少なくとも４０パーセントが、標的細胞に対する細胞傷害性活性を示す、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＣＡＲが、前記ＰＳＣの前記ゲノムに組み込まれたＤＮＡによってコードされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＣＡＲが、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗原結合領域が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、又はｓｃＦｖである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＰＳＣがＨＬＡホモ接合性である、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＨＬＡホモ接合性ＰＳＣが、遺伝子座対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ又はＨＬＡ−ＤＱの１つ以上においてホモ接合性である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＨＬＡホモ接合性ＰＳＣが、前記遺伝子座対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ又はＨＬＡ−ＤＱの２つにおいてホモ接合性である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＨＬＡホモ接合性ＰＳＣが、ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂにおいてホモ接合性である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＨＬＡホモ接合性ＰＳＣが、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃにおいてホモ接合性である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成する方法であって、
（ａ）ＰＳＣを改変し、ＣＡＲを発現し、それによりＣＡＲ−ＰＳＣを生成することと；
（ｂ）前記ＣＡＲ−ＰＳＣをブレビスタチン、ＧＳＫ−３阻害剤、ＦＧＦ２、及びＶＥＧＦの存在下で培養し、それによりＥＢを生成することと；
（ｃ）中胚葉誘導を誘導するため、前記ＥＢをＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２と接触させることと；
（ｄ）ＥＢをＦｌｔ−３リガンド、ＩＬ３、ＳＣＦ、及びＴＰＯの存在下で分化させ、それによりＣＤ３４+ＨＰＣを生成することと；
（ｅ）前記ＣＤ３４+ＨＰＣをＴ細胞及び／又はＮＫ細胞にさらに分化させることと；
（ｆ）前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を拡大させることであって、拡大させることが、抗原特異的標的細胞と共培養し、それにより抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成することを含む、ことと
を含む、方法。
【請求項５５】
前記ＧＳＫ−３阻害剤がＣＨＩＲ９９０２１である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成する方法であって、
（ａ）ＰＳＣを改変し、ＣＡＲを発現し、それによりＣＡＲ−ＰＳＣを生成することと；
（ｂ）個別化されたＣＡＲ−ＰＳＣを、ブレビスタチン、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦの存在下、アミンでコーティングされた表面上で培養することと；
（ｃ）前記ＣＡＲ−ＰＳＣをＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２と接触させることにより、分化を開始させることと；
（ｄ）前記ＣＡＲ−ＰＳＣをＦｌｔ−３リガンド、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びヘパリンの存在下でさらに分化させ、それによりＨＰＣを生成することと；
（ｅ）前記ＨＰＣをＴ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化させることと；
（ｆ）前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を拡大させることであって、拡大させることが、抗原特異的標的細胞と共培養し、それにより抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成することを含む、ことと
を含み、前記方法がＥＢの形成を含まない、方法。
【請求項５７】
抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成する方法であって、
（ａ）ＰＳＣを改変し、ＣＡＲを発現し、それによりＣＡＲ−ＰＳＣを生成することと；
（ｂ）前記ＣＡＲ−ＰＳＣをＣＤ３４+ＨＰＣに分化させることと；
（ｃ）ＣＤ３４+ＣＤ４３+ＨＰＣについて選択することと；
（ｄ）前記ＣＤ３４+ＣＤ４３+ＨＰＣをＴ細胞及び／又はＮＫ細胞にさらに分化させることと；
（ｅ）前記Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を拡大させることであって、拡大させることが、抗原特異的標的細胞と共培養し、それにより抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成することを含む、ことと
を含む、方法。
【請求項５８】
請求項１〜５７のいずれか一項に従って生成された抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の集団。
【請求項５９】
請求項１〜５７のいずれか一項に従って生成された前記抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を含む医薬組成物。
【請求項６０】
対象におけるがんの治療を意図した、請求項１〜５７のいずれか一項に従って生成された前記抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を含む組成物。
【請求項６１】
対象におけるがんを治療する方法であって、請求項１〜５８のいずれか一項に従って生成された前記抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を前記対象に有効量で投与することを含む、方法。
【請求項６２】
前記がんが腫瘍抗原を発現し、且つ前記抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞が前記腫瘍抗原に特異的である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記対象がヒトである、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１７年４月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／４８６，８７５号明細書の優先権の利益を主張し、その内容全体はここで参照により援用される。
【背景技術】
【０００２】
１．分野
本発明は、一般に分子生物学の分野に関する。より詳細には、それは、抗原特異的免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞及びＮＫ細胞に関する方法及び組成物に関する。
【０００３】
２．関連技術の説明
がんと診断された患者にとって利用可能な診断及び治療オプションにおける技術的進歩にもかかわらず、依然として予後不良のままであることが多く、多くの患者が治癒不能である。免疫療法は、正常組織を損傷させることなく悪性腫瘍細胞を根絶する可能性とともに、様々な腫瘍を有すると診断された患者に対して強力であるが標的化された治療をもたらす可能性を秘めている。理論上、免疫系のＴ細胞は、腫瘍細胞に特異的なタンパク質パターンを認識する能力があり、種々のエフェクター機構を通じてのそれらの破壊を媒介することになる。養子Ｔ細胞療法は、患者自身のＴ細胞の腫瘍根絶能力を利用・増幅し、次にこれらのエフェクターを、それらが残留腫瘍を有効に除去しても健常組織を損傷しないような状態で患者に戻すという試みである。この手法は腫瘍免疫学の分野にとって新規性はないが、養子Ｔ細胞療法の臨床使用における多くの欠点により、がん治療におけるこの手法の十分な利用が損なわれる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現行の養子Ｔ細胞療法は、患者や腫瘍特異的Ｔ細胞の不足、例えば、体内にそれらが希少であること、それらがいくつかの腫瘍免疫系の回避機構を克服できないこと、及びそれらの寿命が短いことにより、制限を受ける。所望される抗原に対して反応性を示す、典型的には少数のＴ細胞を単離及び拡大することは困難である。したがって、免疫療法における有効利用を意図した治療的に十分且つ機能的な抗原特異的免疫細胞に対する需要は満たされていない。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
第１の実施形態では、本開示は、抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成する方法であって、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を改変し、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、それによりＣＡＲ−ＰＳＣを生成することと；ＣＡＲ−ＰＳＣをＣＤ３４+造血前駆細胞（ＨＰＣ）に分化させるか又はフォワードにリプログラミングすることと；ＣＤ３４+ＨＰＣをＴ細胞及び／又はＮＫ細胞にさらに分化させることと；Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を拡大させることと、を含む、方法を提供する。いくつかの態様では、拡大させることは、抗原特異的標的細胞と共培養し、それにより抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成することを含む。
【０００６】
特定の態様では、ＣＡＲを発現するように改変されたＰＳＣは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）又は胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。特定の態様では、ｉＰＳＣは、体細胞、例えばＴ細胞からリプログラミングされる。
【０００７】
いくつかの態様では、ＣＡＲ−ＰＳＣをＣＤ３４+ＨＰＣに分化させるステップは、指向された分化誘導（directed differentiation）を実施することを含む。特定の態様では、指向された分化誘導は、胚様体（ＥＢ）をブレビスタチン、ＧＳＫ−３阻害剤、ＦＧＦ２、及びＶＥＧＦの存在下で生成すること；中胚葉誘導を誘導するため、ＥＢをＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２と接触させることと；ＥＢをＦｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＳＣＦ、及びＴＰＯの存在下で分化させ、それによりＨＰＣを生成することと、を含む。いくつかの態様では、分化は、ＢＭＰ４が本質的に含まないか又は含まない培地中でなされる。他の態様では、分化は、ＢＭＰ４の存在下でなされる。特定の態様では、ＧＳＫ−３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。いくつかの態様では、分化は、ＩＬ−１１、ｃＡＭＰ、及び／又はＶＥＧＦの存在をさらに含む。
【０００８】
いくつかの態様では、指向された分化誘導は、ブレビスタチン、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦの存在下で、アミンでコーティングされた表面上で個別化されたＰＳＣを培養することと；ＰＳＣをＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２と接触させることにより分化を開始させることと；ＰＳＣをＦｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びヘパリンの存在下でさらに分化させ、それによりＨＰＣを生成することと、を含み、方法はＥＢの形成を含まない。
【０００９】
特定の態様では、方法は、方法全体の持続時間など、限定されたフィーダーフリー条件下で該細胞を培養することを含む。いくつかの態様では、ＰＳＣは、本質的には導入遺伝子を含まないか又は導入遺伝子を含まない。特定の態様では、ＰＳＣは、ヒトである。特定の態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、及び／又はγδＴ細胞である。
【００１０】
特定の態様では、ＣＡＲを発現するように改変されたＰＳＣは、ＥＲＧ／ＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９を、例えば単一の誘導性プロモーターの制御下で発現するようにさらに改変される。いくつかの態様では、方法は、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、及び／又はＨＯＸＡ４を発現するようにＰＳＣを改変することをさらに含む。したがって、いくつかの態様では、ＣＡＲ−ＰＳＣをＣＤ３４+ＨＰＣに分化させるステップは、ＥＲＧ／ＥＴＶ２、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９の発現を、ＨＰＣを生成するのに十分な期間にわたり誘導することと、ＨＰＣをＴ細胞及び／又はＮＫ細胞にさらに分化させる前に発現の誘導を終了させることと、を含む。
【００１１】
具体的な態様では、ＣＡＲ−ＰＳＣをＣＤ３４+ＨＰＣに分化させるステップは、抗原特異的Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化させる前に、ＣＤ３４及び／又はＣＤ４３を発現する細胞について選択することをさらに含む。特定の態様では、選択することは、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を実施することを含む。いくつかの態様では、ＣＤ３４及び／又はＣＤ４３を発現する細胞は、全細胞集団の少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、又はより高いパーセントを含む。いくつかの態様では、ＣＤ３４及び／又はＣＤ４３陽性細胞について選択するためにＭＡＣｓを実施するステップは実施されない。
【００１２】
特定の態様では、少なくとも２、３、４、５、１０、１５、２０、又はより高いパーセントのＨＰＣが、ＣＡＲを発現する。いくつかの態様では、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又はより高いパーセントのＨＰＣが、ＣＡＲを発現する。
【００１３】
いくつかの態様では、ＨＰＣをＴ細胞及び／又はＮＫ細胞に分化させることは、低酸素条件下、アスコルビン酸及びニコチンアミドの存在下で、ＨＰＣをレトロネクチン及びノッチＤＬＬ−４でコーティングされた表面上で培養することを含む。いくつかの態様では、培養物は、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３リガンド、ＴＰＯ、及びＩＬ−７をさらに含み、また任意選択的には、ＧＳＫ阻害剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）、ＩＬ−２、及び／又はＩＬ−１２を含む。特定の態様では、拡大するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体及びＩＬ−２の存在下で培養することをさらに含む。さらなる態様では、拡大するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を抗ＣＤ３抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、及びＩＬ−２１の存在下で培養することをさらに含む。いくつかの態様では、拡大するステップは、抗原特異的Ｔ細胞を、抗ＣＤ３抗体、ＦＬＴ３リガンド、ＩＬ−７、ＩＬ−２、及び／又はＩＬ−１５の存在下で培養することを含み、また任意選択的にはＳＣＦ、ＴＰＯ、及び／又はＩＬ−２１をさらに含む。特定の態様では、分化されたＣＤ３４+ＨＰＣの少なくとも１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はより高いパーセントが、ＣＤ３+ＣＡＲ+Ｔ細胞である。いくつかの態様では、分化されたＣＤ３４+ＨＰＣの少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、又はより高いパーセントが、ＣＤ３−ＣＡＲ＋ＮＫ細胞である。いくつかの態様では、拡大されたＣＤ３４+ＨＰＣの少なくとも２パーセントが、ＣＤ３+ＣＡＲ+Ｔ細胞である。特定の態様では、拡大されたＣＤ３４+ＨＰＣの少なくとも１０パーセントが、ＣＤ３-ＣＡＲ+ＮＫ細胞である。
【００１４】
特定の態様では、ＣＡＲ及び抗原特異的標的細胞は、同じ抗原に特異的である。ある具体的な態様では、抗原はＣＤ１９である。特定の態様では、抗原特異的標的細胞は、腫瘍細胞である。いくつかの態様では、抗原特異的標的細胞は、ヒトである。特定の態様では、抗原特異的標的細胞は、ＨＬＡクラスＩ陰性である。いくつかの態様では、抗原特異的エフェクターＴ細胞の少なくとも５、例えば、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、又はより高いパーセントが、標的細胞に対する細胞傷害性活性を呈する。特定の態様では、抗原特異的エフェクターＮＫ細胞の少なくとも１０、例えば、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、又はより高いパーセントが、標的細胞に対する細胞傷害性活性を呈する。
【００１５】
いくつかの態様では、ＣＡＲは、ＰＳＣのゲノムに組み込まれたＤＮＡによってコードされる。特定の態様では、ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。具体的な態様では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８を含む。いくつかの態様では、抗原結合領域は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、又はｓｃＦｖである。
【００１６】
特定の態様では、ＰＳＣは、ＨＬＡホモ接合性である。いくつかの態様では、ＨＬＡホモ接合性ＰＳＣは、対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ又はＨＬＡ−ＤＱ遺伝子座の１つ以上においてホモ接合性である。特定の態様では、ＨＬＡホモ接合性ＰＳＣは、対立遺伝子ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ又はＨＬＡ−ＤＱ遺伝子座の２つにおいてホモ接合性である。特定の態様では、ＨＬＡホモ接合性ＰＳＣは、ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂにおいてホモ接合性である。特定の態様では、ＨＬＡホモ接合性ＰＳＣは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃにおいてホモ接合性である。
【００１７】
別の実施形態は、抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成する方法であって、ＣＡＲを発現するようにＰＳＣを改変し、それによりＣＡＲ−ＰＳＣを生成することと；ＣＡＲ−ＰＳＣをブレビスタチン、ＧＳＫ−３阻害剤、ＦＧＦ２、及びＶＥＧＦの存在下で培養し、それによりＥＢを生成することと；中胚葉誘導を誘導するため、ＥＢをＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２と接触させることと；ＥＢをＦｌｔ−３リガンド、ＢＭＰ４、ＩＬ−３、ＳＣＦ、及びＴＰＯの存在下で分化させ、それによりＣＤ３４+ＨＰＣを生成することと；ＣＤ３４+ＨＰＣをＴ細胞及び／又はＮＫ細胞までさらに分化させることと；Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を拡大させることであって、拡大させることが、抗原特異的標的細胞と共培養し、それにより抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成することを含む、ことと、を含む、方法を提供する。特定の態様では、ＧＳＫ−３阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１である。
【００１８】
さらに別の実施形態では、抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成する方法であって、ＣＡＲを発現するようにＰＳＣを改変し、それによりＣＡＲ−ＰＳＣを生成することと；ブレビスタチン、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦの存在下で、アミンでコーティングされた表面上で個別化されたＣＡＲ−ＰＳＣを培養し、且つＣＡＲ−ＰＳＣをＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦ２と接触させることにより分化を開始させることと；ＣＡＲ−ＰＳＣをＦｌｔ−３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＳＣＦ、ＴＰＯ、及びヘパリンの存在下でさらに分化させ、それによりＣＤ３４+ＨＰＣを生成することと；ＣＤ３４+ＨＰＣをＴ細胞及び／又はＮＫ細胞まで分化させることと；Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を拡大させることであって、拡大させることが、抗原特異的標的細胞と共培養し、それにより抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成することを含む、ことと、を含む、方法が提供され、方法はＥＢの形成を含まない。
【００１９】
さらなる実施形態は、抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成する方法であって、ＣＡＲを発現するようにＰＳＣを改変し、それによりＣＡＲ−ＰＳＣを生成することと；ＣＡＲ−ＰＳＣをＣＤ３４+ＨＰＣに分化させることと；ＣＤ３４+ＣＤ４３+ＨＰＣについて選択することと；ＣＤ３４+ＣＤ４３+ＨＰＣをＴ細胞及び／又はＮＫ細胞までさらに分化させることと；Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞を拡大させることであって、拡大させることが、抗原特異的標的細胞と共培養し、それにより抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を生成することを含む、ことと、を含む、方法を提供する。
【００２０】
別の実施形態では、上記の実施形態に従って生成される抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の集団が提供される。本明細書に記載の実施形態に従って生成される抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を含む医薬組成物もまた本明細書に提供される。さらに、対象におけるがんの治療のための実施形態に従って生成される抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を含む組成物が本明細書に提供される。がんの治療のための実施形態に従って生成される抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞の使用についても本明細書に提供される。
【００２１】
さらに別の実施形態では、対象におけるがんを治療する方法であって、本明細書に記載の実施形態に従って生成される抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞を有効量で対象に投与することを含む、方法が提供される。いくつかの態様では、がんは、腫瘍抗原を発現し、抗原特異的エフェクターＴ細胞及び／又はＮＫ細胞は、前記腫瘍抗原に特異的である。特定の態様では、対象はヒトである。
【００２２】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明白となる。しかし、詳細な説明及び具体例が、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、あくまで例示として示されることは理解されるべきである、というのは、本発明の精神及び範囲の範囲内での様々な変更及び修飾がこの詳細な説明から当業者にとって明白となるからである。
【００２３】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに明らかにするように含められる。本発明は、これらの図面の１つ以上を、本明細書に提示される具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することにより、より十分に理解されることがある。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１Ａ】（図１Ａ）フォワードプログラミング方法及び指向された分化誘導方法を含む、Ｔ細胞及びＮＫ細胞をＰＳＣから生成するための方法を表す模式図。（図１Ｂ）ｈＰＣＳのフィーダーフリー並びに無血清Ｔ及びＮＫ細胞分化を表す図。略称：ＣＨＩＲ−ＣＨＩＲ９９０２１  ＧＳＫ−３阻害剤；ＨＤＭ、無血清造血分化培地；ＴＣＤＭ、Ｔ細胞分化培地；ＴＣＥＭ、Ｔ細胞拡大培地；ＨＰＣ、造血前駆細胞；アスターリスク（*）マークは任意選択的な増強成分である。（図１Ｃ）指向された分化誘導又はフォワードプログラミングを通じてのＣＤ３４+ＣＤ４３+ＨＰＣのＰＳＣからの効率。（図１Ｄ）Ｔ／ＮＫ分化培養物のフローサイトメトリー分析。（図１Ｅ）分化全体を通じての異なる細胞集団の収量。（図１Ｆ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の表現型。（図１Ｇ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大。固定化された抗ＣＤ３抗体（ｉＣＤ３）は、ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大用である（棒グラフ）。拡大培養下で増殖するＴ細胞は、不規則な形状をしたリンパ芽球の特徴的形態を得る（写真）。ＣＤ５６及びＣＤ８は、２週のＴ細胞拡大の発現を得る（フローサイトメトリーのドットプロット）。
【図１Ｂ】（図１Ａ）フォワードプログラミング方法及び指向された分化誘導方法を含む、Ｔ細胞及びＮＫ細胞をＰＳＣから生成するための方法を表す模式図。（図１Ｂ）ｈＰＣＳのフィーダーフリー並びに無血清Ｔ及びＮＫ細胞分化を表す図。略称：ＣＨＩＲ−ＣＨＩＲ９９０２１  ＧＳＫ−３阻害剤；ＨＤＭ、無血清造血分化培地；ＴＣＤＭ、Ｔ細胞分化培地；ＴＣＥＭ、Ｔ細胞拡大培地；ＨＰＣ、造血前駆細胞；アスターリスク（*）マークは任意選択的な増強成分である。（図１Ｃ）指向された分化誘導又はフォワードプログラミングを通じてのＣＤ３４+ＣＤ４３+ＨＰＣのＰＳＣからの効率。（図１Ｄ）Ｔ／ＮＫ分化培養物のフローサイトメトリー分析。（図１Ｅ）分化全体を通じての異なる細胞集団の収量。（図１Ｆ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の表現型。（図１Ｇ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大。固定化された抗ＣＤ３抗体（ｉＣＤ３）は、ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大用である（棒グラフ）。拡大培養下で増殖するＴ細胞は、不規則な形状をしたリンパ芽球の特徴的形態を得る（写真）。ＣＤ５６及びＣＤ８は、２週のＴ細胞拡大の発現を得る（フローサイトメトリーのドットプロット）。
【図１Ｃ】（図１Ａ）フォワードプログラミング方法及び指向された分化誘導方法を含む、Ｔ細胞及びＮＫ細胞をＰＳＣから生成するための方法を表す模式図。（図１Ｂ）ｈＰＣＳのフィーダーフリー並びに無血清Ｔ及びＮＫ細胞分化を表す図。略称：ＣＨＩＲ−ＣＨＩＲ９９０２１  ＧＳＫ−３阻害剤；ＨＤＭ、無血清造血分化培地；ＴＣＤＭ、Ｔ細胞分化培地；ＴＣＥＭ、Ｔ細胞拡大培地；ＨＰＣ、造血前駆細胞；アスターリスク（*）マークは任意選択的な増強成分である。（図１Ｃ）指向された分化誘導又はフォワードプログラミングを通じてのＣＤ３４+ＣＤ４３+ＨＰＣのＰＳＣからの効率。（図１Ｄ）Ｔ／ＮＫ分化培養物のフローサイトメトリー分析。（図１Ｅ）分化全体を通じての異なる細胞集団の収量。（図１Ｆ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の表現型。（図１Ｇ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大。固定化された抗ＣＤ３抗体（ｉＣＤ３）は、ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大用である（棒グラフ）。拡大培養下で増殖するＴ細胞は、不規則な形状をしたリンパ芽球の特徴的形態を得る（写真）。ＣＤ５６及びＣＤ８は、２週のＴ細胞拡大の発現を得る（フローサイトメトリーのドットプロット）。
【図１Ｄ】（図１Ａ）フォワードプログラミング方法及び指向された分化誘導方法を含む、Ｔ細胞及びＮＫ細胞をＰＳＣから生成するための方法を表す模式図。（図１Ｂ）ｈＰＣＳのフィーダーフリー並びに無血清Ｔ及びＮＫ細胞分化を表す図。略称：ＣＨＩＲ−ＣＨＩＲ９９０２１  ＧＳＫ−３阻害剤；ＨＤＭ、無血清造血分化培地；ＴＣＤＭ、Ｔ細胞分化培地；ＴＣＥＭ、Ｔ細胞拡大培地；ＨＰＣ、造血前駆細胞；アスターリスク（*）マークは任意選択的な増強成分である。（図１Ｃ）指向された分化誘導又はフォワードプログラミングを通じてのＣＤ３４+ＣＤ４３+ＨＰＣのＰＳＣからの効率。（図１Ｄ）Ｔ／ＮＫ分化培養物のフローサイトメトリー分析。（図１Ｅ）分化全体を通じての異なる細胞集団の収量。（図１Ｆ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の表現型。（図１Ｇ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大。固定化された抗ＣＤ３抗体（ｉＣＤ３）は、ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大用である（棒グラフ）。拡大培養下で増殖するＴ細胞は、不規則な形状をしたリンパ芽球の特徴的形態を得る（写真）。ＣＤ５６及びＣＤ８は、２週のＴ細胞拡大の発現を得る（フローサイトメトリーのドットプロット）。
【図１Ｅ】（図１Ａ）フォワードプログラミング方法及び指向された分化誘導方法を含む、Ｔ細胞及びＮＫ細胞をＰＳＣから生成するための方法を表す模式図。（図１Ｂ）ｈＰＣＳのフィーダーフリー並びに無血清Ｔ及びＮＫ細胞分化を表す図。略称：ＣＨＩＲ−ＣＨＩＲ９９０２１  ＧＳＫ−３阻害剤；ＨＤＭ、無血清造血分化培地；ＴＣＤＭ、Ｔ細胞分化培地；ＴＣＥＭ、Ｔ細胞拡大培地；ＨＰＣ、造血前駆細胞；アスターリスク（*）マークは任意選択的な増強成分である。（図１Ｃ）指向された分化誘導又はフォワードプログラミングを通じてのＣＤ３４+ＣＤ４３+ＨＰＣのＰＳＣからの効率。（図１Ｄ）Ｔ／ＮＫ分化培養物のフローサイトメトリー分析。（図１Ｅ）分化全体を通じての異なる細胞集団の収量。（図１Ｆ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の表現型。（図１Ｇ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大。固定化された抗ＣＤ３抗体（ｉＣＤ３）は、ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大用である（棒グラフ）。拡大培養下で増殖するＴ細胞は、不規則な形状をしたリンパ芽球の特徴的形態を得る（写真）。ＣＤ５６及びＣＤ８は、２週のＴ細胞拡大の発現を得る（フローサイトメトリーのドットプロット）。
【図１Ｆ−１】（図１Ａ）フォワードプログラミング方法及び指向された分化誘導方法を含む、Ｔ細胞及びＮＫ細胞をＰＳＣから生成するための方法を表す模式図。（図１Ｂ）ｈＰＣＳのフィーダーフリー並びに無血清Ｔ及びＮＫ細胞分化を表す図。略称：ＣＨＩＲ−ＣＨＩＲ９９０２１  ＧＳＫ−３阻害剤；ＨＤＭ、無血清造血分化培地；ＴＣＤＭ、Ｔ細胞分化培地；ＴＣＥＭ、Ｔ細胞拡大培地；ＨＰＣ、造血前駆細胞；アスターリスク（*）マークは任意選択的な増強成分である。（図１Ｃ）指向された分化誘導又はフォワードプログラミングを通じてのＣＤ３４+ＣＤ４３+ＨＰＣのＰＳＣからの効率。（図１Ｄ）Ｔ／ＮＫ分化培養物のフローサイトメトリー分析。（図１Ｅ）分化全体を通じての異なる細胞集団の収量。（図１Ｆ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の表現型。（図１Ｇ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大。固定化された抗ＣＤ３抗体（ｉＣＤ３）は、ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大用である（棒グラフ）。拡大培養下で増殖するＴ細胞は、不規則な形状をしたリンパ芽球の特徴的形態を得る（写真）。ＣＤ５６及びＣＤ８は、２週のＴ細胞拡大の発現を得る（フローサイトメトリーのドットプロット）。
【図１Ｆ−２】（図１Ａ）フォワードプログラミング方法及び指向された分化誘導方法を含む、Ｔ細胞及びＮＫ細胞をＰＳＣから生成するための方法を表す模式図。（図１Ｂ）ｈＰＣＳのフィーダーフリー並びに無血清Ｔ及びＮＫ細胞分化を表す図。略称：ＣＨＩＲ−ＣＨＩＲ９９０２１  ＧＳＫ−３阻害剤；ＨＤＭ、無血清造血分化培地；ＴＣＤＭ、Ｔ細胞分化培地；ＴＣＥＭ、Ｔ細胞拡大培地；ＨＰＣ、造血前駆細胞；アスターリスク（*）マークは任意選択的な増強成分である。（図１Ｃ）指向された分化誘導又はフォワードプログラミングを通じてのＣＤ３４+ＣＤ４３+ＨＰＣのＰＳＣからの効率。（図１Ｄ）Ｔ／ＮＫ分化培養物のフローサイトメトリー分析。（図１Ｅ）分化全体を通じての異なる細胞集団の収量。（図１Ｆ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の表現型。（図１Ｇ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大。固定化された抗ＣＤ３抗体（ｉＣＤ３）は、ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大用である（棒グラフ）。拡大培養下で増殖するＴ細胞は、不規則な形状をしたリンパ芽球の特徴的形態を得る（写真）。ＣＤ５６及びＣＤ８は、２週のＴ細胞拡大の発現を得る（フローサイトメトリーのドットプロット）。
【図１Ｇ−１】（図１Ａ）フォワードプログラミング方法及び指向された分化誘導方法を含む、Ｔ細胞及びＮＫ細胞をＰＳＣから生成するための方法を表す模式図。（図１Ｂ）ｈＰＣＳのフィーダーフリー並びに無血清Ｔ及びＮＫ細胞分化を表す図。略称：ＣＨＩＲ−ＣＨＩＲ９９０２１  ＧＳＫ−３阻害剤；ＨＤＭ、無血清造血分化培地；ＴＣＤＭ、Ｔ細胞分化培地；ＴＣＥＭ、Ｔ細胞拡大培地；ＨＰＣ、造血前駆細胞；アスターリスク（*）マークは任意選択的な増強成分である。（図１Ｃ）指向された分化誘導又はフォワードプログラミングを通じてのＣＤ３４+ＣＤ４３+ＨＰＣのＰＳＣからの効率。（図１Ｄ）Ｔ／ＮＫ分化培養物のフローサイトメトリー分析。（図１Ｅ）分化全体を通じての異なる細胞集団の収量。（図１Ｆ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の表現型。（図１Ｇ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大。固定化された抗ＣＤ３抗体（ｉＣＤ３）は、ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大用である（棒グラフ）。拡大培養下で増殖するＴ細胞は、不規則な形状をしたリンパ芽球の特徴的形態を得る（写真）。ＣＤ５６及びＣＤ８は、２週のＴ細胞拡大の発現を得る（フローサイトメトリーのドットプロット）。
【図１Ｇ−２】（図１Ａ）フォワードプログラミング方法及び指向された分化誘導方法を含む、Ｔ細胞及びＮＫ細胞をＰＳＣから生成するための方法を表す模式図。（図１Ｂ）ｈＰＣＳのフィーダーフリー並びに無血清Ｔ及びＮＫ細胞分化を表す図。略称：ＣＨＩＲ−ＣＨＩＲ９９０２１  ＧＳＫ−３阻害剤；ＨＤＭ、無血清造血分化培地；ＴＣＤＭ、Ｔ細胞分化培地；ＴＣＥＭ、Ｔ細胞拡大培地；ＨＰＣ、造血前駆細胞；アスターリスク（*）マークは任意選択的な増強成分である。（図１Ｃ）指向された分化誘導又はフォワードプログラミングを通じてのＣＤ３４+ＣＤ４３+ＨＰＣのＰＳＣからの効率。（図１Ｄ）Ｔ／ＮＫ分化培養物のフローサイトメトリー分析。（図１Ｅ）分化全体を通じての異なる細胞集団の収量。（図１Ｆ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の表現型。（図１Ｇ）ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大。固定化された抗ＣＤ３抗体（ｉＣＤ３）は、ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大用である（棒グラフ）。拡大培養下で増殖するＴ細胞は、不規則な形状をしたリンパ芽球の特徴的形態を得る（写真）。ＣＤ５６及びＣＤ８は、２週のＴ細胞拡大の発現を得る（フローサイトメトリーのドットプロット）。
【００２５】
【図２−１】ＰＳＣ由来Ｔ／ＮＫ細胞におけるＣＡＲの発現。プロテインＬ染色を用いてのフローサイトメトリーにより評価された分化段階全体を通じてのＣＡＲの発現。ＣＤ３+Ｔ細胞は、λ鎖マウス抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂ（クローンＳＰ３４−２）と共染色された。Ｅ１１  ＰＳＣ及びＥ１１由来のＨＰＣ及びＴ細胞によるＣＡＲの発現が示される。
【図２−２】ＰＳＣ由来Ｔ／ＮＫ細胞におけるＣＡＲの発現。プロテインＬ染色を用いてのフローサイトメトリーにより評価された分化段階全体を通じてのＣＡＲの発現。ＣＤ３+Ｔ細胞は、λ鎖マウス抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂ（クローンＳＰ３４−２）と共染色された。Ｅ１１  ＰＳＣ及びＥ１１由来のＨＰＣ及びＴ細胞によるＣＡＲの発現が示される。
【００２６】
【図３Ａ−３Ｂ】ＰＳＣ由来Ｔ／ＮＫ細胞におけるインビトロ抗ＣＤ１９  ＣＡＲ媒介性細胞傷害性。（図３Ａ）ルシフェラーゼを発現するＣＤ１９+Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ標的細胞を用いてのインビトロ細胞傷害性アッセイ。（図３Ｂ）Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｓ３生細胞分析システム（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてのリアルタイム標的細胞計数によるＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞溶解能。
【００２７】
【図４】ＰＳＣ由来Ｔ／ＮＫ細胞におけるインビトロ抗ＣＤ１９  ＣＡＲ誘導性サイトカイン産生。
【００２８】
【図５Ａ−１】ＰＳＣ由来ＣＡＲ−Ｔ／ＮＫ細胞のインビボ腫瘍溶解能。（図５Ａ）インビボ生物発光イメージングによって監視されたマウスにおける腫瘍増殖。（図５Ｂ）ＰＳＣ由来Ｔ（１Ｃ）又はＮＫ（Ａ１６）細胞のいずれかで処置された異なるマウス群における生存曲線。
【図５Ａ−２】ＰＳＣ由来ＣＡＲ−Ｔ／ＮＫ細胞のインビボ腫瘍溶解能。（図５Ａ）インビボ生物発光イメージングによって監視されたマウスにおける腫瘍増殖。（図５Ｂ）ＰＳＣ由来Ｔ（１Ｃ）又はＮＫ（Ａ１６）細胞のいずれかで処置された異なるマウス群における生存曲線。
【図５Ｂ】ＰＳＣ由来ＣＡＲ−Ｔ／ＮＫ細胞のインビボ腫瘍溶解能。（図５Ａ）インビボ生物発光イメージングによって監視されたマウスにおける腫瘍増殖。（図５Ｂ）ＰＳＣ由来Ｔ（１Ｃ）又はＮＫ（Ａ１６）細胞のいずれかで処置された異なるマウス群における生存曲線。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
特定の実施形態では、本開示は、抗原受容体、例えば本明細書中でＣＡＲ−ＰＳＣと称されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されているヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）から抗原特異的免疫エフェクター細胞を生成するための高度に効率的な方法を提供する。現行の方法によって生成される免疫エフェクター細胞が、限定はされないが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びｉＮＫＴ細胞を含みうる。
【００３０】
ＰＳＣは、Ｔ細胞の開始集団を（例えば、レトロウイルス又はエピソーム法により）リプログラミングし、Ｔ細胞由来のｉＰＳＣ（ＴｉＰＳＣ）を生成することにより得てもよい。Ｔ細胞は、様々な供給源、例えば血液サンプルから単離されてもよい。Ｔ細胞の開始集団は、それらの特徴的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子再構成を保持してもよく、ＨＬＡホモ接合性細胞（即ちＭＨＣクラスＩ及びＩＩ遺伝子においてホモ接合性である）であってもよい。したがって、ｉＰＳＣは、本明細書中でＨＬＡスーパードナーと称されるＨＬＡホモ接合性対象から単離された細胞から生成されうる。
【００３１】
次に、ＣＡＲ−ＰＳＣは、ＣＤ３４+造血前駆細胞（ＨＰＣ）を生成するように分化又はプログラムされてもよい。これは、サイトカイン（例えば、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−３、及びヘパリン）の組み合わせを用いた指向された分化誘導を通じて達成されてもよい（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７８９９号明細書中に記載、その全体が参照により本明細書中に援用される）。代替的方法では、ＣＡＲ−ＰＳＣは、ＥＴＶ２／ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９（即ちＥＧＨ）をコードする発現構築物によるフォワードプログラミングを用いて、ＣＤ３４+ＨＰＣに分化されてもよい（例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７８９３号明細書中に記載、その全体が参照により本明細書中に援用される）。これらのＥＧＨ−ＰＳＣは、長期生着能（ｅｎｇｒａｆｔａｂｉｌｉｔｙ）のため、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、及び／又はＨＯＸＡ４を発現するようにさらに改変されてもよい。
【００３２】
最終的には、ＣＤ３４+ＣＡＲ−ＨＰＣは、ＣＤ３+Ｔ細胞又はＣＤ５６+ＣＤ３-ＮＫ細胞に分化されてもよい。リンパ系能力についてＨＰＣ分化中（例えば７〜１１日）の最適な時間枠は、ＣＤ３４及びＣＤ４３の発現によって同定された７〜１１日であってもよい。例えば、増強されたリンパ系能力を有するＨＰＣは、マーカーＣＤ１４４、ＣＤ３４、ＣＤ４５、及びＣＤ７の２つ以上について陽性である細胞の画分を選別することにより単離されてもよい。
【００３３】
Ｔ細胞分化のための例示的方法は、レトロネクチン及びＤＬＬ−４のフィーダーフリーマトリックスとしての使用を含む。Ｔ細胞分化は、効率及び成熟を増強するためのアスコルビン酸の使用により、並びに低酸素条件下で培養することにより、さらに増強されてもよい。
【００３４】
さらに、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞は、分化プロセス中に抗原特異的標的細胞（例えば腫瘍細胞）と共培養することにより増強されてもよい。この方法は、標的細胞に対するＴ細胞及びＮＫ細胞の細胞傷害性活性を増強することが見出され、それは具体的には、腫瘍増殖における減少及び腫瘍細胞が注射されたマウスの生存における増加により認められた。
【００３５】
したがって、本開示の方法は、インビボでの安定な移植、インビトロでの化合物のスクリーニング、及び血液学的疾患及び損傷の機構の解明などの広範囲の用途に、無数の抗原特異的免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞及びＮＫ細胞を提供することができる。
【００３６】
Ｉ．定義
本明細書で用いられるとき、「本質的に含まない」は、特定成分の観点で、組成物に意図的に配合されている、且つ／又はあくまで汚染物質として又は微量で存在するような特定成分がないことを意味するように本明細書で用いられる。したがって、組成物の任意の意図しない汚染に起因する特定成分の総量は、０．０５％を十分に下回り、好ましくは０．０１％未満である。標準的分析法を用いて特定成分が全く検出できないような組成物が最も好ましい。
【００３７】
本明細書で用いられるとき、「ａ」又は「ａｎ」は、１以上を意味してもよい。特許請求の範囲で用いられ、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と併用されるとき、用語「ａ」又は「ａｎ」は、１又は２以上を意味してもよい。
【００３８】
特許請求の範囲の中での用語「又は」の使用は、あくまで代替物を指すことが明示されない限り「及び／又は」を意味するように用いられる、或いはその代替物は、相互に排他的であるが、本開示は、あくまで代替物と「及び／又は」を指すような定義を支持する。本明細書で用いられるとき、「別の」は、少なくとも第２又はそれ以上を意味してもよい。
【００３９】
本願全体を通じて、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために利用されているデバイス、方法における固有の誤差の変動、又は試験対象の中に存在する変動を含むことを示すように用いられる。
【００４０】
用語「外因性」は、細胞又は生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチドに関連して用いられるとき、人工的又は天然手段により細胞又は生物に導入されているタンパク質、遺伝子、核酸、又はポリヌクレオチドを指し；又は細胞に関連して用いられるとき、該用語は、単離され、その後、人工的又は天然手段により他の細胞に又は生物に導入された細胞を指す。外因性核酸は、異なる生物又は細胞に由来してもよい、又はそれは、生物又は細胞内部に天然に存在する核酸の１つ以上の追加的なコピーであってもよい。外因性細胞は、異なる生物に由来してもよい、又はそれは同じ生物に由来してもよい。非限定例によると、外因性核酸は、天然細胞内に存在するような場合と異なる染色体位置に存在するものであり、又はそれ以外では、天然に見出される核酸配列と異なる核酸配列によって隣接される。
【００４１】
「発現構築物」又は「発現カセット」は、転写を誘導する能力がある核酸分子を意味する。発現構築物は、最低限、１つ以上の所望される細胞型、組織又は臓器における遺伝子発現を誘導する、１つ以上の転写調節エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー又はそれと機能的に等価な構造）を含む。追加的なエレメント、例えば転写終結シグナルも含められてもよい。
【００４２】
「ベクター」又は「構築物」（時として、遺伝子送達系又は遺伝子導入「媒体」と称される）は、インビトロ又はインビボのいずれかで宿主細胞に送達されるべきポリヌクレオチドを含む高分子又は分子の複合体を指す。
【００４３】
ベクターの一般的タイプである「プラスミド」は、染色体ＤＮＡを独立して複製する能力がある、染色体ＤＮＡとは別の染色体外ＤＮＡ分子である。特定の場合、それは環状であり、且つ二本鎖である。
【００４４】
「複製起点」（「ｏｒｉ」）又は「複製起点」は、細胞内のプラスミド中に存在するとき、プラスミド中、及び／又はＤＮＡ合成が開始する部位又はその近傍で連結された配列を維持する能力がある、例えばリンパ増殖性ヘルペスウイルス中のＤＮＡ配列である。例として、ＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス）におけるｏｒｉは、ＦＲ配列（３０ｂｐのリピートの２０の不完全なコピー）、好ましくはＤＳ配列を含むが、ＥＢＶ中の他の部位がＥＢＮＡ−１に結合し、例えばＲｅｐ*配列が複製起点としてＤＳを代替しうる（Ｋｉｒｓｈｍａｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９９８）。したがって、ＥＢＶの複製起点は、ＦＲ、ＤＳ又はＲｅｐ*配列又は任意の機能的に等価な配列を、核酸修飾又はそれらから得られる合成的組み合わせを通じて含む。例えば、本開示ではまた、Ｌｉｎｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８に詳述された通り、例えば個別のエレメントの挿入又は突然変異による、ＥＢＶの遺伝子操作された複製起点が用いられてもよい。
【００４５】
特定のタンパク質を「コードする」、「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「断片」又は「導入遺伝子」は、適切な制御配列の制御下に置かれるとき、インビトロ又はインビボで、転写される、また任意選択的には遺伝子産物、例えばポリペプチドに翻訳される核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡのいずれかの形態で存在してもよい。核酸分子は、ＤＮＡ形態で存在するとき、一本鎖（即ちセンス鎖）又は二本鎖であってもよい。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端での開始コドン及び３’（カルボキシ）末端での翻訳停止コドンにより決定される。遺伝子は、限定はされないが、原核生物又は真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、原核生物又は真核生物ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含みうる。転写終結配列は通常、遺伝子配列の３’側に位置することになる。
【００４６】
用語「調節エレメント」は、集合的に、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、複製起点、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、エンハンサー、スプライスジャンクションなどを指し、それらは集合的に、レシピエント細胞内のコード配列の複製、転写、転写後プロセシング、及び翻訳をもたらす。選択されたコード配列が適切な宿主細胞内で複製、転写、及び翻訳されうる限り、これらの調節エレメントのすべてが存在する必要はない。
【００４７】
用語「プロモーター」は、その通常の意味で、ＤＮＡ制御配列を含むヌクレオチド領域を指すように本明細書で用いられ、ここで該制御配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、コード配列下流（３’方向）の転写を開始する能力がある遺伝子に由来する。それは、核酸配列の特異的転写を開始させるため、調節タンパク質及び分子が結合してもよい遺伝要素、例えばＲＮＡポリメラーゼ及び他の転写因子を含有してもよい。語句「作動可能に位置づけられた」、「作動可能に連結された」、「制御下で」及び「転写調節下で」は、プロモーターが、核酸配列の転写開始及び／又は発現を制御するため、核酸配列に関連した正確な機能的位置及び／又は配向で存在することを意味する。
【００４８】
「エンハンサー」は、プロモーターに近接して位置づけられるとき、エンハンサードメインの不在下でのプロモーターから生じる転写活性と比べて増強された転写活性を付与する核酸配列を意味する。
【００４９】
「作動可能に連結された」又は「同時発現された」は、核酸分子に関して、２以上の核酸分子（例えば、転写対象の核酸分子、プロモーター、及びエンハンサーエレメント）が核酸分子の転写を可能にするような方法で接続されることを意味する。「作動可能に連結された」又は「同時発現された」は、ペプチド及び／又はポリペプチド分子に関して、２以上のペプチド及び／又はポリペプチド分子が、単一のポリペプチド鎖、即ち融合ポリペプチドであって、その融合体の各ペプチド及び／又はポリペプチド成分の少なくとも１つの特性を有するものをもたらすような方法で接続されることを意味する。融合ポリペプチドは、好ましくは、キメラ、即ち異種分子からなるものである。
【００５０】
「相同性」は、２つのポリヌクレオチド間又は２つのポリペプチド間の同一性のパーセントを指す。ある配列ともう１つの配列との間の対応は、当該技術分野で公知の技術により決定されうる。例えば、相同性は、配列情報を整列し、容易に利用可能なコンピュータプログラムを用いることによる、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較により決定されうる。或いは、相同性は、相同性領域間での安定な二本鎖の形成、次いで一本鎖に特異的なヌクレアーゼでの消化と、消化された断片のサイズ決定を容易にする条件下での、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより決定されうる。２つのＤＮＡ、又は２つのポリペプチドの配列は、上記方法を用いた判定として、ヌクレオチド、又はアミノ酸の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、また最も好ましくは少なくとも約９５％が各々、規定された分子の長さにわたり一致するとき、互いに「実質的に相同である」。
【００５１】
用語「細胞」は、本明細書では当該技術分野でその最も広い意味で用いられ、多細胞生物の組織の構成単位である生体を指し、細胞はそれを外部から隔てる膜構造に覆われ、自己複製能を有し、且つ遺伝子情報及びそれを発現するための機構を有する。本明細書で用いられる細胞は、天然に存在する細胞又は人工的に修飾された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子組換え細胞など）であってもよい。
【００５２】
用語「幹細胞」は、本明細書で、好適な条件下で多様な範囲の特殊化細胞型に分化する能力がある一方で、他の好適な条件下で自己再生し、本質的に未分化な多能性状態で残存する能力がある細胞を指す。用語「幹細胞」はまた、多能性細胞、複能性細胞、前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ）及び前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）を包含する。例示的なヒト幹細胞は、骨髄組織から得られる造血又は間葉系幹細胞、胚組織から得られる胚性幹細胞、又は胎児の生殖組織から得られる胚性生殖細胞から得られてもよい。例示的な多能性幹細胞はまた、多能性に関連した特定の転写因子の発現により、それらを多能性状態にリプログラミングすることにより体細胞から生成可能であり；これらの細胞は、「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ又はｉＰＳ細胞」と称される。
【００５３】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期における胚、例えば胚盤胞期の内部細胞塊から得られる、又は人工的手段（例えば核移植）により生成される未分化多能性細胞であり、胚細胞（例えば精子及び卵）を含む、胚又は成体において任意の分化細胞型を生じさせうる。
【００５４】
「人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ又はｉＰＳ細胞）」は、因子（本明細書でリプログラミング因子と称される）の組み合わせを発現する、又はその発現を誘導することによる体細胞のリプログラミングにより作製された細胞である。ｉＰＳ細胞は、胎児、出生後、新生児、若年、又は成人体細胞を用いて作製されうる。特定の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用可能な因子として、例えば、Ｏｃｔ４（時としてＯｃｔ３／４と称される）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８が挙げられる。いくつかの実施形態では、体細胞は、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするための、少なくとも２つのリプログラミング因子、少なくとも３つのリプログラミング因子、少なくとも４つのリプログラミング因子、少なくとも５つのリプログラミング因子、少なくとも６つのリプログラミング因子、又は少なくとも７つのリプログラミング因子を発現させることにより、リプログラミングされる。
【００５５】
「造血前駆細胞（ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」又は「造血前駆細胞（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ）」は、造血系列に関与するが、さらなる造血分化の能力があり、造血幹細胞、多能性造血幹細胞、共通骨髄前駆細胞、巨核球前駆細胞、赤血球前駆細胞、及びリンパ球系前駆細胞を含む細胞を指す。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄系列（単球及びマクロファージ、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球、及びマスト細胞）、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、及びリンパ球系列（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含むあらゆる血球型を生じさせる多能性幹細胞である（例えば、Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｎｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５を参照）。「マルチリンフォイドプロジェニター（ｍｕｌｔｉｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）」（ＭＬＰ）は、あらゆるリンパ球系列（Ｂ、Ｔ、及びＮＫ細胞）を生じさせるが、その他の（骨髄）能力を有していても有してしなくてもよく、且つＣＤ４５ＲＡ+／ＣＤ１０＋／ＣＤ７-である、任意の前駆細胞を説明するために定義される（Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。任意のＢ、Ｔ、及びＮＫ前駆細胞は、ＭＬＰと称されうる。「共通骨髄前駆細胞」（ＣＭＰ）は、顆粒球、単球、巨核球及び赤血球を生じうるＣＤ４５+／ＣＤ３１+／ＣＤ４３+／ＣＤ３４-細胞の発現によって規定される共通の骨髄前駆細胞を指す。造血前駆細胞は、ＣＤ３４を発現することがある。造血前駆細胞は、ＣＤ１３３を同時発現することがあり、ＣＤ３８の発現について陰性であってもよい。造血前駆細胞は、ＣＤ３４+／ＣＤ４５＋造血前駆細胞及びＣＤ３４+／ＣＤ４５+／ＣＤ４３+造血前駆細胞を含む。ＣＤ３４+／ＣＤ４３+／ＣＤ４５+造血前駆細胞は、骨髄前駆細胞を高度に富化することがある。造血細胞はまた、未分化造血細胞の様々なサブセット：ＣＤ３４-／ＣＤ１３３+／ＣＤ３８-（未分化造血前駆細胞）、ＣＤ４３（＋）ＣＤ２３５ａ（＋）ＣＤ４１ａ（＋／−）（赤血球−巨核球系細胞）、ｌｉｎ（−）ＣＤ３４（＋）ＣＤ４３（＋）ＣＤ４５（−）（多能性）、及びｌｉｎ（−）ＣＤ３４（＋）ＣＤ４３（＋）ＣＤ４５（＋）（骨髄偏向）細胞、ＣＤ１３３+／ＡＬＤＨ+（アルデヒドデヒドロゲナーゼ）を含む。これらの未分化造血細胞型又は造血前駆細胞はいずれも、本明細書に記載のようなｉＰＳ細胞に変換されることがあると予想される。いくつかの態様では、該細胞は、肥満細胞、ランゲルハンス細胞、破骨細胞、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ＣＩＫＴ細胞、又はＴ細胞、ＮＫ細胞、及びＢ細胞の他のサブタイプを含んでもよい。
【００５６】
本明細書で用いられるとき、用語「免疫細胞」は、限定はされないが、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｔ／ＮＫ細胞、樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、好中球、赤血球、単球、好塩基球、好中球、マスト細胞、好酸球、及びそれらの任意の組み合わせを含む、免疫系の細胞を指す。
【００５７】
Ｔ細胞の「アクチベーター」又はＴ細胞を活性化することになる条件は、Ｔ細胞を活性化する刺激を指し、抗原提示細胞上又は他の表面上に提示されることがある抗原；特異性と無関係に多数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体に結合するポリクローナルアクチベーターを含み、且つコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ−Ａ）やフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などのレクチン、及びＴＣＲ又はＣＤ３タンパク質上の不変フレームワークエピトープに特異的に結合する抗体などの作用物質；並びに相当数のＴ細胞を刺激するスーパー抗原を含み、且つ例えばブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃａｌ）エンテロトキシンなどのエンテロトキシンを含む。
【００５８】
用語「Ｔリンパ球」及び「Ｔ細胞」は、交換可能に用いられ、１つ以上のＭＨＣ分子又は１つ以上の非古典的ＭＨＣ分子と共に抗原提示細胞の表面又はマトリックスに提示されたときに抗原を認識する能力があるＴＣＲを発現する細胞を指す。
【００５９】
用語「Ｔ細胞」は、当該技術分野で定義されるようなＴリンパ球を指し、胸腺細胞、未熟Ｔリンパ球、成熟Ｔリンパ球、休止Ｔリンパ球、又は活性化Ｔリンパ球を含むことが意図される。Ｔ細胞は、ＣＤ４+Ｔ細胞、ＣＤ８+Ｔ細胞、ＣＤ４+ＣＤ８+Ｔ細胞、又はＣＤ４-ＣＤ８-細胞でありうる。Ｔ細胞はまた、Ｔヘルパー細胞、例えば、Ｔヘルパー１（ＴＨ１）細胞、又はＴヘルパー２（ＴＨ２）細胞、又はＴＨ１７細胞、並びに細胞傷害性Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、又はγδＴ細胞でありうる（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｗｙｎｎ，２００５、Ｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。少なくとも１つのマーカー、例えばＣＤ４だけ互いに異なるＴ細胞は、本明細書中でＴ細胞の「サブセット」と称される。
【００６０】
「ＣＤ４+Ｔ細胞」とは、表面上にＣＤ４を発現して細胞媒介性免疫応答に関与するＴ細胞のサブセットを指す。それらは刺激後の分泌特性によって特徴づけられ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２、ＩＬ−４及びＩＬ−１０などのサイトカインの分泌を含んでもよい。「ＣＤ４」は、Ｔリンパ球上の分化抗原として最初に定義されたものだけでなく、単球／マクロファージを含む他の細胞上に見出される５５ｋＤ糖タンパク質である。ＣＤ４抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、会合認識エレメントとしてＭＨＣ（主要組織適合複合体）クラスＩＩ制限免疫応答に関与する。Ｔリンパ球については、ヘルパー／インデューサーサブセットが定義される。
【００６１】
「ＣＤ８+Ｔ細胞」は、表面上にＣＤ８を発現し、ＭＨＣクラスＩ制限であり、且つ細胞傷害性Ｔ細胞として機能するＴ細胞のサブセットを指す。「ＣＤ８」分子は、胸腺細胞上並びに細胞傷害性Ｔリンパ球上及びサプレッサーＴリンパ球上に見出される分化抗原である。ＣＤ８抗原は、免疫グロブリンスーパー遺伝子ファミリーのメンバーであり、主要組織適合複合体クラスＩ制限相互作用における会合認識エレメントである。
【００６２】
「多能性幹細胞」は、１つ以上の組織若しくは臓器、又は好ましくは３つの胚葉：内胚葉（胃内壁、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、泌尿生殖器）、若しくは外胚葉（表皮組織及び神経系）のいずれかを構成するすべての細胞に分化する潜在能力を有する幹細胞を指す。
【００６３】
本明細書で用いられるとき、用語「体細胞」は、卵子や精子などの生殖細胞以外の任意の細胞であり、そのＤＮＡを次世代に直接的に伝達しないものを指す。典型的には、体細胞は、限られた多能性を有するか又は多能性を全く有しない。本明細書で用いられる体細胞は、天然に存在するか又は遺伝子改変されることがある。
【００６４】
「プログラミング」は、細胞により生成可能な後代の型を改変するプロセスである。例えば、プログラミングを用いずに同じ条件下で形成できている型と比べて、少なくとも１つの新しい細胞型の後代を培養下又はインビボのいずれかで形成可能になるように改変されているとき、細胞はプログラムされている。このことは、かかる後代をプログラミング前に本質的に全く形成できない場合、十分な増殖後、新しい細胞型の表現型特性を有する後代が測定可能な割合で観測されることを意味し、代替的には、新しい細胞型の特性を有する割合は、プログラミング前よりも多く測定されうる。このプロセスは、分化、脱分化、及び分化転換を含む。
【００６５】
「分化」は、大して特殊化されていない細胞がより特殊化された細胞型になるプロセスである。「脱分化」とは、部分的又は最終的に分化された細胞がより初期の発生段階、例えば多能性又は複能性の段階に戻る細胞プロセスである。「分化転換」は、ある分化された細胞型を他の分化された細胞型に変換するプロセスである。典型的には、プログラミングによる分化転換は、細胞が中間的多能性段階を経由することなく行われる。即ち、細胞は、ある分化された細胞型から他の分化された細胞型に直接的にプログラムされる。特定の条件下では、新しい細胞型の特性を有する後代の割合は、優先度が高い順に少なくとも約１％、５％、２５％、又はそれ以上であってもよい。
【００６６】
「リプログラミング」は、リプログラミングを用いずに同じ条件下で有すると思われるよりも少なくとも１つの新しい細胞型の後代を形成する測定可能に向上した能力を培養下又はインビボのいずれかで細胞に付与するプロセスである。より具体的には、リプログラミングは、多能性の潜在能力を体細胞に付与するプロセスである。このことは、かかる後代をリプログラミング前に本質的に全く生成できない場合、十分な増殖後、新しい細胞型の表現型特性を有する後代が測定可能な割合になることを意味し、さもなければ、新しい細胞型の特性を有する割合は、リプログラミング前よりも多く測定されうる。特定の条件下では、新しい細胞型の特性を有する後代の割合は、優先度が高い順に少なくとも約１％、５％、２５％、又はそれ以上であってもよい。
【００６７】
用語「フォワードプログラミング」は、１つ以上の特定の系列決定遺伝子又は遺伝子産物を複能性細胞又は多能性細胞に提供することにより多能性を全く有していない分化された体細胞とは対照的な複能性細胞又は多能性細胞をプログラムすることを指す。例えば、フォワードプログラミングは、造血前駆細胞若しくは他の前駆細胞、又は造血細胞若しくは他の分化された体細胞になるように、ＥＳＣ又はｉＰＳＣをプログラムするプロセスを示してもよい。
【００６８】
本明細書で用いられるとき、用語「対象」又は「それを必要とする対象」は、哺乳動物、好ましくは、細胞又は組織の移植を必要とする任意の年齢の男性又は女性のヒトを指す。典型的には、対象（本明細書ではレシピエントとも称される）は、細胞又は組織の移植による治療に適合しうる障害又は病理学的若しくは望ましくない病態、状態、若しくは症候群又は物理的、形態学的、若しくは生理学的な異常が原因で細胞又は組織の移植を必要とする。
【００６９】
本明細書で用いられるとき、遺伝子の「破壊」は、破壊の不在下における遺伝子産物の発現レベルと比べて、細胞において対象の遺伝子によりコードされる１つ以上の遺伝子産物の発現が排除又は低減されることを意味する。例示的な遺伝子産物として、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡ及びタンパク質産物が挙げられる。破壊は、いくつかの場合には一過性また可逆的であり、他の場合には永久的である。破壊は、いくつかの場合には、機能性又は全長のタンパク質又はｍＲＮＡの破壊であり、切断型又は非機能性産物が生成されることがあるという事実は関係しない。本明細書のいくつかの実施形態では、遺伝子の活性又は機能は、発現とは対照的に破壊される。遺伝子破壊は、人工的方法により、即ち、化合物、分子、複合体、若しくは組成物の添加若しくは導入により、且つ／又は例えばＤＮＡレベルで遺伝子の核酸の破壊若しくは遺伝子との会合により、一般に誘導される。遺伝子破壊の例示的方法として、遺伝子サイレンシング、ノックダウン、ノックアウト、及び／又は遺伝子破壊技術、例えば遺伝子編集が挙げられる。例として、アンチセンス技術、例えば、一般に発現の一過的低減をもたらすＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、及び／又はリボザイム、並びに標的遺伝子の不活性化又は破壊をもたらす遺伝子編集技術、例えば、破壊及び／又は相同組換えの誘導によるものが挙げられる。例として、挿入、突然変異、及び欠失が挙げられる。破壊は、典型的には、遺伝子によりコードされる正常産物又は「野生型」産物の発現の抑制及び／又は完全欠如をもたらす。かかる遺伝子破壊の例として、全遺伝子の欠失を含めて、遺伝子又は遺伝子の一部の挿入、フレームシフト突然変異及びミスセンス突然変異、欠失、ノックイン、並びにノックアウトが挙げられる。かかる破壊は、コード領域、例えば１つ以上のエクソンで行うことが可能であり、結果として、停止コドンの挿入などにより全長産物、機能性産物、又はいずれかの産物を生成できなくなる。かかる破壊はまた、遺伝子の転写を阻止するように、プロモーター又はエンハンサー又は転写の活性化に影響を及ぼす他の領域における破壊により行ってもよい。遺伝子破壊は、相同組換えによる標的遺伝子の不活性化を含む、遺伝子ターゲッティングを含む。
【００７０】
「ノッチリガンド」は、造血幹細胞などのいくつかの異なる哺乳動物細胞の膜に存在するノッチ受容体ポリペプチドに結合可能なタンパク質である。ヒト細胞において同定されているノッチ受容体として、Ｎｏｔｃｈ−１、Ｎｏｔｃｈ−２、Ｎｏｔｃｈ−３、及びＮｏｔｃｈ−４が挙げられる。ノッチリガンドは、典型的には、アミノ末端に２０〜２２のアミノ酸を含むＤＳＬドメイン（Ｄ−Ｄｅｌｔａ、Ｓ−Ｓｅｒｒａｔｅ、及びＬ−Ｌａｇ２）及び細胞外表面上に３〜８の間のＥＧＦ様リピートを有する（Ｆｕｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｕｒｉｅ，１９８８、Ｋｎｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７、Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。
【００７１】
「スーパードナー」は、特定のＭＨＣクラスＩ及びＩＩ遺伝子がホモ接合性である個体として本明細書で言及される。これらのホモ接合性個体は、スーパードナーとして機能しうるとともに、その細胞は、その細胞を含む組織及び他の物質を含めて、ハプロタイプがホモ接合性又はヘテロ接合性のいずれの個体に移植可能である。スーパードナーは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰ又はＨＬＡ−ＤＱ遺伝子座／遺伝子座対立遺伝子が各々、ホモ接合性でありうる。
【００７２】
用語「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」は、本明細書で用いられるとき、例えば、人工Ｔ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、又はキメラ免疫受容体を指し、特定の免疫エフェクター細胞に人工的な特異性を移植する改変された受容体を包含してもよい。ＣＡＲは、例えば養子細胞療法における使用を意図して、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与し、それにより多数の特異的Ｔ細胞の作製を可能にするように用いられてもよい。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、例えば細胞の腫瘍関連抗原に対する特異性を誘導する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメイン、膜貫通ドメイン、及び腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。特定の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン及びエンドドメインに融合された、モノクローナル抗体由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体を含む。他のＣＡＲ設計の特異性は、受容体のリガンド（例えばペプチド）又はパターン認識受容体、例えばデクチンに由来してもよい。特定の場合、抗原認識ドメインのスペーシングは、活性化誘導細胞死を低減するように修飾されうる。特定の場合、ＣＡＲは、追加的な同時刺激シグナル伝達のためのドメイン、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０、及び／又はＯＸ４０を含む。場合によっては、同時刺激分子、イメージング用（例えば陽電子放射断層撮影用）レポーター遺伝子、プロドラッグ、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカイン、及びサイトカイン受容体の添加時、Ｔ細胞を条件的に除去する遺伝子産物を含む分子が、ＣＡＲと同時発現されうる。
【００７３】
用語「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」は、１つ以上の抗原を、免疫系の特異的なエフェクター細胞によって認識可能なペプチド−ＭＨＣ複合体の形態で提示し、それによりその抗原又は提示されている抗原に対して有効な細胞性免疫応答を誘導することが可能な細胞のクラスを指す。ＡＰＣは、インタクトな全細胞、例えば、マクロファージ、Ｂ細胞、内皮細胞、活性化Ｔ細胞、及び樹状細胞；又は天然に存在するか若しくは合成の、β２ミクログロブリンと複合化された精製されたＭＨＣクラスＩ分子などの他の分子でありうる。多くの細胞型がＴ細胞認識のため、その細胞表面上に抗原を提示する能力があってもよい一方で、樹状細胞のみは、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答においてナイーブＴ細胞を活性化するのに効率的な量で抗原を提示する能力を有する。
【００７４】
ＩＩ．多能性幹細胞
特定の実施形態では、多能性幹細胞は、抗原受容体、例えばＣＡＲを発現するように改変される。多能性幹細胞は、限定はされないが、人工多能性幹細胞及び胚性幹細胞を含む幹細胞であってもよい。特定の態様では、本明細書で用いられる多能性幹細胞は、本開示の造血前駆細胞を含む、インビトロで長期増殖の能力がある一方で、身体のあらゆる細胞型に分化する潜在能力を保持する、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【００７５】
Ａ．胚性幹細胞
特定の態様では、ＥＳＣとしての多能性幹細胞。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し、高いインビトロ分化能を有する。ＥＳ細胞は、発生中の胚の外部栄養外胚葉層を除去し、次いで非増殖細胞の支持細胞層上で内部細胞塊を培養することにより単離されうる。再播種された細胞は、増殖し続け、除去、解離、さらなる再播種、及び増殖放置が可能であるＥＳ細胞の新しいコロニーを生成することができる。未分化ＥＳ細胞を「継代培養する」このプロセスは、数回反復することで、未分化ＥＳ細胞を含有する細胞株を生成可能である（米国特許第５，８４３，７８０号明細書；米国特許第６，２００，８０６号明細書；米国特許第７，０２９，９１３号明細書）。ＥＳ細胞は、増殖する一方でその多能性を維持するような潜在能力を有する。例えば、ＥＳ細胞は、細胞に関する、また細胞分化を制御する遺伝子に関する研究において有用である。遺伝子操作及び選択と組み合わせてのＥＳ細胞の多能性は、トランスジェニック、キメラ、及びノックアウトマウスの作製を通じたインビボでの遺伝子分析試験において用いることができる。
【００７６】
マウスＥＳ細胞を作製するための方法は周知である。一方法では、マウス１２９株からの着床前胚盤胞がマウス抗血清で処理され、栄養外胚葉が除去され、内部細胞塊が、ウシ胎仔血清を含有する培地中の化学的に不活化されたマウス胚性線維芽細胞の支持細胞層上で培養される。発生する未分化ＥＳ細胞のコロニーは、ウシ胎仔血清の存在下、マウス胚性線維芽細胞支持細胞層上で継代され、ＥＳ細胞の集団が作製される。いくつかの方法では、マウスＥＳ細胞は、サイトカイン白血病阻害因子（ＬＩＦ）を血清含有培地に添加することにより、支持細胞層の不在下で増殖されうる。他の方法では、マウスＥＳ細胞は、骨形成タンパク質及びＬＩＦの存在下で、無血清培地中で増殖されうる。
【００７７】
ヒトＥＳ細胞は、前述の方法（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８年；Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）により胚細胞を生成するため、精子及び卵細胞の融合、核移植、単為生殖、又はクロマチンのリプログラミングとそれに続くリプログラミングされたクロマチンの原形質膜内への取り込みによって生成される接合体又は胚盤胞段階の哺乳動物胚から作製又は誘導されうる。一方法では、ヒト胚盤胞が抗ヒト血清に曝露され、栄養外胚葉細胞が溶解され、マウス胚性線維芽細胞の支持細胞層上で培養されている内部細胞塊から除去される。さらに、内部細胞塊に由来する細胞の凝集塊が、化学的又は機械的に解離され、再播種され、未分化形態を有するコロニーが、マイクロピペットにより選択され、解離され、再播種される。いくつかの方法では、ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子の存在下、線維芽細胞の支持細胞層上でＥＳ細胞を培養することにより、血清を伴わずに増殖可能である。他の方法では、ヒトＥＳ細胞は、塩基性線維芽細胞増殖因子を含有する「条件づけ」培地の存在下、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はラミニンなどのタンパク質マトリックス上で該細胞を培養することにより、支持細胞層を伴わずに増殖可能である（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【００７８】
ＥＳ細胞はまた、前述の方法により、アカゲザル及びマーモセットを含む他の生物から（Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，１９９８；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５年；Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｄｏｒｉｃｏ，２０００；米国特許第５，８４３，７８０号明細書）、さらには樹立されたマウス及びヒト細胞株から誘導されてもよい。例えば、樹立されたヒトＥＳ細胞株は、ＭＡＯＩ、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、ＨＩ、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４及びＡＣＴ３０を含む。さらなる例として、樹立されているマウスＥＳ細胞株は、マウス株１２９胚の内部細胞塊から樹立されたＣＧＲ８細胞株を含み、ＣＧＲ８細胞の培養物は、支持細胞層を伴わずにＬＩＦの存在下で増殖可能である。
【００７９】
ＥＳ幹細胞は、転写因子Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、段階特異的な胚性抗原ＳＳＥＡ−１、段階特異的な胚性抗原ＳＳＥＡ−３、段階特異的な胚性抗原ＳＳＥＡ−４、転写因子ＮＡＮＯＧ、腫瘍拒絶抗原１−６０（ＴＲＡ−１−６０）、腫瘍拒絶抗原１−８１（ＴＲＡ−１−８１）、ＳＯＸ２、又はＲＥＸ１を含むタンパク質マーカーによって検出可能である。
【００８０】
Ｂ．人工多能性幹細胞
他の態様では、本明細書で用いられる多能性幹細胞は、一般にｉＰＳ細胞又はｉＰＳＣと略記される、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。多能性の誘導は当初、２００６年にマウス細胞を用いて（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００６）、また２００７年にヒト細胞を用いて（Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．２００７）、多能性に関連した転写因子の導入を介した体細胞のリプログラミングにより達成された。ｉＰＳＣの使用により、ＥＳ細胞の大規模臨床使用に関連した倫理的且つ実用的問題の大部分が回避され、またｉＰＳＣ由来の自家移植片を有する患者は、移植片拒絶を阻止するための生涯にわたる免疫抑制治療を必要としなくてもよい。
【００８１】
胚細胞を例外として、ｉＰＳＣにおける開始点として任意の細胞を用いることができる。例えば、細胞型であれば、ケラチノサイト、線維芽細胞、造血細胞、間葉細胞、肝細胞、又は胃細胞を挙げることができる。Ｔ細胞もまた、リプログラミング用の体細胞の供給源として用いてもよい（米国特許第８，７４１，６４８号明細書）。細胞分化の度合い又は細胞が収集される動物の年齢について制限はなく；本明細書に開示される方法では、未分化前駆細胞（体性幹細胞を含む）及び最終分化成熟細胞であっても、体細胞の供給源として用いることができる。
【００８２】
体細胞は、当業者に公知の方法を用いて、ｉＰＳＣを生成するようにリプログラミング可能である。当業者は、人工多能性幹細胞を容易に作製することができ、例えば、公開された米国特許出願公開第２００９０２４６８７５号明細書、公開された米国特許出願公開第２０１０／０２１００１４号明細書；公開された米国特許出願公開第２０１２０２７６６３６号明細書；米国特許第８，０５８，０６５号明細書；米国特許第８，１２９，１８７号明細書；米国特許第８，２６８，６２０号明細書；ＰＣＴ公開の国際公開第２００７／０６９６６６Ａ１号パンフレット、及び米国特許第８，２６８，６２０号明細書（参照により本明細書中に援用される）を参照のこと。一般に、核リプログラミング因子は、体細胞から多能性幹細胞を生成するため、用いられる。いくつかの実施形態では、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８の少なくとも３つ、又は少なくとも４つが利用される。他の実施形態では、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ及びＫｌｆ４が利用される。
【００８３】
これらの核リプログラミング物質のマウス及びヒトｃＤＮＡ配列は、国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレット及び米国特許第８，１８３，０３８号明細書（参照により本明細書中に援用される）に記載のＮＣＢＩ受入番号に関連して利用可能である。１つ以上のリプログラミング物質、又はこれらのリプログラミング物質をコードする核酸を導入するための方法は、当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第８，２６８，６２０号明細書、米国特許第８，６９１，５７４号明細書、米国特許第８，７４１，６４８号明細書、米国特許第８，５４６，１４０号明細書や、公開された米国特許第８，９００，８７１号明細書及び米国特許第８，０７１，３６９号明細書（いずれも参照により本明細書中に援用される）に開示されている。
【００８４】
ｉＰＳＣは、一旦得られると、多能性を維持するのに十分な培地中で培養されうる。ｉＰＳＣは、米国特許第７，４４２，５４８号明細書及び米国特許出願公開第２００３／０２１１６０３号明細書に記載の通り、多能性幹細胞、より詳細には胚性幹細胞を培養するために開発された様々な培地及び技術とともに用いられてもよい。マウス細胞の場合、培養は、分化抑制因子としての白血病阻害因子（ＬＩＦ）の通常の培地への添加とともに実施される。ヒト細胞の場合、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）がＬＩＦの代わりに添加されることが望ましい。当業者に公知と思われる、ｉＰＳＣを培養及び維持するための他の方法が、本方法とともに用いられてもよい。
【００８５】
特定の実施形態では、未決定の条件が用いられてもよく；例えば、多能性細胞は、幹細胞を未分化状態で維持するため、線維芽細胞支持細胞上又は線維芽細胞支持細胞に曝露されている培地上で培養されてもよい。いくつかの実施形態では、該細胞は、支持細胞としての、細胞分裂を完了させるために放射線又は抗生物質で処理されたマウス胚性線維芽細胞の共存下で培養される。或いは、多能性細胞は、規定されたフィーダー非依存性培養系、例えばＴＥＳＲ（商標）培地（Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ａ；Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６ｂ）又はＥ８（商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（商標）培地（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）を用いて、本質的に未分化な状態で培養及び維持されてもよい。
【００８６】
プラスミドは、例えば、調節された高コピー数を達成することや細菌におけるプラスミドの不安定性の潜在的要因を回避すること、またヒト細胞を含む哺乳動物細胞における使用に適合するプラスミド選択のための手段を提供すること、といったいくつかの目標を考慮して設計されている。ヒト細胞における使用に対するプラスミドの二重の要件については、特別な関心が払われている。第１に、プラスミドは大量のＤＮＡが生成及び精製可能であるように、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）における維持及び発酵に適する。第２に、プラスミドは、ヒト患者及び動物における使用において安全且つ好適である。第１の要件では、細菌発酵中、比較的容易に選択され、安定に維持されうる、高コピー数のプラスミドが求められる。第２の要件では、選択可能マーカーや他のコード配列などの要素を重視することが求められる。いくつかの実施形態では、マーカーをコードするプラスミドは、（１）高コピー数の複製起点、（２）選択可能マーカー、例えば限定はされないが、カナマイシン抗生物質選択用のｎｅｏ遺伝子、（３）チロシナーゼエンハンサーを含む転写終結配列、及び（４）様々な核酸カセットの組み込みのためのマルチクローニング部位；及び（５）チロシナーゼプロモーターに作動可能に連結されたマーカーをコードする核酸配列、から構成される。タンパク質をコードする核酸を誘導するための、当該技術分野で公知のプラスミドベクターが極めて多く存在する。これらは、限定はされないが、米国特許第６，１０３，４７０号明細書；米国特許第７，５９８，３６４号明細書；米国特許第７，９８９，４２５号明細書；及び米国特許第６，４１６，９９８号明細書（参照により本明細書中に援用される）に開示されたベクターを含む。
【００８７】
エピソーム遺伝子送達系は、プラスミド、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）に基づくエピソームベクター（米国特許第８，５４６，１４０号明細書）、酵母に基づくベクター、アデノウイルスに基づくベクター、サルウイルス４０（ＳＶ４０）に基づくエピソームベクター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）に基づくベクター、又はレンチウイルスベクターでありうる。ウイルス遺伝子送達系は、ＲＮＡに基づくウイルスベクター又はＤＮＡに基づくウイルスベクターでありうる。
【００８８】
１．ｉＰＳＣを生成するための細胞
本開示の特定の実施形態は、ｉＰＳＣにリプログラミングされる体細胞（例えば、血球又は皮膚細胞）の開始集団に関する。血球の集団は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、混合集団を含有する全血又はその画分、脾臓細胞、骨髄細胞、腫瘍浸潤リンパ球、白血球除去によって得られた細胞、生検組織、及びリンパ節、例えば腫瘍からのリンパ節流入を含みうる。好適なドナーは、免疫ドナー、非免疫（ナイーブ）ドナー、処置又は未処置ドナーを含む。「処置」ドナーは、１つ以上の生物学的修飾因子に曝露されているものである。「未処置」ドナーは、１つ以上の生物学的修飾因子に曝露されていない。
【００８９】
いくつかの態様では、血球の集団はＴ細胞を含む。Ｔ細胞は、Ｔ細胞の精製された集団でありうる、又は代替的には、Ｔ細胞は、異なるタイプの細胞、例えばＢ細胞及び／又は他の末梢血液細胞を有する集団内に存在しうる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞のサブセット、例えばＣＤ４+Ｔ細胞の精製された集団でありうる、又はそれらは、Ｔ細胞の異なるサブセットを含むＴ細胞の集団でありうる。別の実施形態では、Ｔ細胞は、長期間にわたり培養下で維持されているＴ細胞クローンである。Ｔ細胞クローンは、様々な程度、形質転換されうる。具体的な実施形態では、Ｔ細胞は、培養下で無制限に増殖するＴ細胞クローンである。
【００９０】
いくつかの態様では、Ｔ細胞は、初代Ｔ細胞である。用語「初代Ｔ細胞」は、長期間にわたり培養下で維持されているＴ細胞に対して、個体から得られるＴ細胞を含むことが意図される。したがって、初代Ｔ細胞は、特に、対象から得られる末梢血Ｔ細胞である。初代Ｔ細胞の集団は、多くはＴ細胞の１つのサブセットから構成されうる。或いは、初代Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の異なるサブセットから構成されうる。
【００９１】
Ｔ細胞は、健常者からの、又は代替的にはある病態に罹患した個体からの、以前に貯蔵された血液サンプルでありうる。該病態は、感染性疾患、例えば、ウイルス感染、細菌感染若しくは任意の他の微生物による感染に起因する病態、又は高増殖性疾患、例えばメラノーマのようながんでありうる。具体的な実施形態では、Ｔ細胞は、ヒト免疫不全ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ）（ＨＩＶ）に感染した個体から得られる。さらに別の実施形態では、Ｔ細胞は、自己免疫性疾患若しくはＴ細胞病理を患うか又はそれに罹りやすい対象から得られる。Ｔ細胞は、ヒト起源、マウス起源又は任意の他の哺乳動物種でありうる。
【００９２】
Ｔ細胞を含む細胞の集団を得る方法は、当該技術分野で周知である。例えば、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、当該技術分野で公知の方法に記載のように入手可能である。かかる方法の例が、実施例に示され、Ｋｉｍら（１９９２）；Ｂｉｓｗａｓら（１９９０）；Ｂｉｓｗａｓら（１９９１）によって考察されている。
【００９３】
いくつかの態様では、血球の開始集団は、造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む。ＨＳＣは通常、骨髄中に存在するが、血液中に押し出される可能性があり、それは末梢血中の多数のＨＳＣを収集するため、臨床的に用いられる動員というプロセスである。選択される１つの動員物質が、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。末梢血中を循環するＣＤ３４+造血幹細胞又は前駆細胞は、アフェレーシス技術により、非擾乱状態下、又はＧ−ＣＳＦのような造血増殖因子の外部投与後の動員後のいずれかに収集されうる。動員後に収集された幹細胞又は前駆細胞の数は、非擾乱状態下でアフェレーシス後に得られる数よりも多い。いくつかの態様では、細胞集団の供給源は、造血幹細胞又は前駆細胞を濃縮する必要がないことから、外来的に適用される因子により動員されていない細胞を有する対象である。
【００９４】
細胞の集団から造血前駆細胞を得る方法もまた、当該技術分野で周知である。造血前駆細胞は、様々なサイトカイン、例えば、ｈＳＣＦ、ｈＦＬＴ３、及び／若しくはＩＬ−３（Ａｋｋｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）を用いて拡大されてもよい、又はＣＤ３４+細胞は、ＭＡＣＳ又はＦＡＣＳを用いて濃縮されてもよい。上記の通り、ＣＤ３４+細胞を濃縮するため、ネガティブ選択技術もまた、用いてもよい。
【００９５】
本明細書に記載の方法における使用を意図した細胞の集団は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、齧歯類細胞（例えば、マウス又はラット）、ウシ細胞、ヒツジ細胞、ブタ細胞、ウマ細胞、ヒツジ細胞、イヌ細胞、及びネコ細胞又はそれらの混合物であってもよい。非ヒト霊長類細胞は、アカゲザル細胞を含む。該細胞は、動物、例えばヒト患者から得てもよい、又は細胞株から得てもよい。該細胞が動物から得られる場合、それらは、例えば非分離細胞（即ち混合集団）のようなものとして用いられてもよい；それらは、まず例えば形質転換により培養下で樹立されていてもよい；又はそれらは、予備的な精製方法が施されていてもよい。例えば、細胞集団は、細胞表面マーカーの発現に基づくポジティブ若しくはネガティブ選択により操作されてもよい；インビトロ若しくはインビボで１つ以上の抗原で刺激されてもよい；インビトロ若しくはインビボで１つ以上の生物学的修飾因子で処置されてもよい；又はこれらのいずれか若しくはすべての組み合わせであってもよい。例示的実施形態では、細胞集団に、非Ｔ細胞及び／又は特定のＴ細胞サブセットの枯渇についてのネガティブ選択が施される。ネガティブ選択は、ＣＤ１９、及びＣＤ２０などのＢ細胞マーカー；単球マーカーＣＤ１４；ＮＫ細胞マーカーＣＤ５６を含む、種々の分子の細胞表面発現に基づいて実施されうる。代替的には、細胞集団に、非ＣＤ３４+造血細胞及び／又は特定の造血細胞サブセットの枯渇についてのネガティブ選択が施されてもよい。ネガティブ選択は、（例えば巨核球系統の細胞に対する）種々の分子、例えば、抗体のカクテル（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＣＤ２３５ａ、及びＣＤ４１）の細胞表面発現に基づいて実施可能であり、例えばＭＡＣＳ又はカラム分離による他の細胞型の分離用に用いられてもよい
【００９６】
細胞サンプルを対象から得て、次に所望される細胞型のため、それを濃縮することも可能である。例えば、ＰＢＭＣ及び／又はＣＤ３４+造血細胞は、本明細書に記載のように血液から単離可能である。ＰＢＭＣからＴ細胞を濃縮するため、カウンターフロー遠心分離（水簸）が使用可能である。細胞はまた、種々の技術、例えば所望される細胞型の細胞表面上のエピトープに結合する抗体による単離及び／又は活性化、例えば、該細胞を活性化し、次いで同じビーズによるカラム分離を可能にする抗体コンュゲートビーズを用いるいくつかのＴ細胞単離キットを用いて、他の細胞から単離されうる。使用可能な別の方法は、特定の細胞型を、受容体会合により該細胞を活性化することなく選択的に濃縮するため、細胞表面マーカーに対する抗体を用いるネガティブ選択を含む。
【００９７】
骨髄細胞は、腸骨稜、大腿骨、脛骨、脊椎、肋骨又は他の髄空間から得てもよい。骨髄は、患者から採取され、様々な分離及び洗浄手順を通じて単離されてもよい。骨髄細胞を単離するための公知の手順は、以下のステップ：ａ）３つの画分中の骨髄懸濁液の遠心分離及び中間画分、又はバフィーコートの回収；ｂ）ステップ（ａ）からのバフィーコート画分が、分離流体、一般にはＦｉｃｏｌｌ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＡＢの商標）でもう１回遠心分離され、また骨髄細胞を含有する中間画分が収集される；並びにｃ）再注入可能な（ｒｅ−ｔｒａｎｓｆｕｓａｂｌｅ）骨髄細胞の回収のための、ステップ（ｂ）からの収集された画分の洗浄、を含む。
【００９８】
Ｔ細胞中に濃縮された細胞の集団の使用が所望される場合、細胞のかかる集団は、白血球除去及び連続流細胞分離装置を用いる機械的アフェレーシスにより、細胞の混合集団から入手可能である。例えば、Ｔ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（商標）勾配上の分離、Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配上の分離、又は水簸を含む任意の公知の方法により、バフィーコートから単離されうる。
【００９９】
特定の態様では、Ｔ細胞は、Ｔ細胞活性化におけるシグナルカスケードを誘導するためにＴ細胞受容体に結合する作用剤によって活性化される。例えば、ＣＤ３抗体が用いられてもよい。リプログラミングを意図してＴ細胞を有意な数の増殖状態に拡大するため、サイトカイン、例えばＩＬ−２もまた用いてもよい。特定の態様では、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８の双方が、同時刺激が関与する場合のＴ細胞活性化として用いられてもよい。代替的態様では、例えばプレートに結合された抗ＣＤ３などの抗ＣＤ３の架橋が適用されてもよい。可溶性抗ＣＤ３がＰＢＭＣ中のＴ細胞を活性化するために用いられる場合、可溶性抗ＣＤ３抗体がＰＢＭＣ中のＡＰＣに結合することがあり、次に該抗体をＴ細胞に提示する。可溶性抗ＣＤ３抗体単独が精製されたＴ細胞の集団内で用いられる場合、上述した理由のため、アネルギーが生じることになる。特定の実施形態は、Ｔ細胞を抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）及びＩＬ２の存在下で培養することを含み、それは高価で扱いにくいビーズ又はプレートに結合した抗体を用いる必要がないことから有利且つ便利であり；ＯＫＴ３及びＩＬ２の添加後であれば、ＰＢＭＣの細胞環境はＴ細胞の活性化に役立つことになる。次に、Ｔ細胞は、優先的拡大に起因し、ＰＢＭＣ培養下で他の細胞型を混雑させる。
【０１００】
特定の態様では、血球の開始集団は、例えばリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）からのリンパ芽球様細胞を含む。ＬＣＬの作製は、当該技術分野で公知であり、例えばＢ細胞のエプスタイン・バーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）による感染を介する（Ｆｒｉｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。
【０１０１】
２．体細胞のリプログラミング
いくつかの実施形態では、細胞（例えばＴ細胞）の開始集団が、例えば米国特許出願公開第２０１４／０３１５３０４号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載の方法により、ｉＰＳＣにリプログラミングされる。本開示の特定の態様では、リプログラミング因子が、１つ以上のベクター、例えば組み込みベクター又はエピソームベクターに含まれる発現カセットから発現される。さらなる態様では、リプログラミングタンパク質は、タンパク質形質導入によれば、体細胞に直接的に導入可能である。
【０１０２】
当業者は、標準の組換え技術を通じてベクターを構築することを十分に理解するであろう（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１年及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６年を参照、いずれも参照により本明細書中に援用される）。ベクターとして、限定はされないが、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルス、及び植物ウイルス）、及び人工染色体（例えばＹＡＣｓ）、例えばレトロウイルスベクター（例えば、モロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来）、レンチウイルスベクター（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来）、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター（その複製可能型、複製欠損型及び無活力（ｇｕｔｌｅｓｓ）型を含む）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、サルウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳腺腫瘍ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクターが挙げられる。
【０１０３】
ａ．ウイルスベクター
本開示の特定の態様では、ウイルスベクターが提供されてもよい。組換えウイルスベクターの作製においては、非必須遺伝子が、典型的には異種（又は非天然）タンパク質における遺伝子又はコード配列で置換される。ウイルスベクターは、核酸、おそらくはタンパク質を細胞に導入するためにウイルス配列を利用する発現構築物の一種である。特定のウイルスが、細胞に感染する、又は受容体媒介エンドサイトーシスを介して細胞に侵入する、そして宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定且つ効率的に発現させる能力は、それらを外来核酸の細胞（例えば哺乳動物細胞）への導入における魅力的な候補にしている。本開示の特定の態様の核酸を送達するために用いられてもよいウイルスベクターの非限定例は、下記の通りである。
【０１０４】
レトロウイルスは、その遺伝子を宿主ゲノムに組み込み、大量の外来遺伝子材料を導入し、広範囲の種及び細胞型に感染し、且つ特定の細胞株中にパッケージングされるその能力故に、遺伝子送達ベクターとして見込みがある（Ｍｉｌｌｅｒ，１９９２）。
【０１０５】
レトロウイルスベクターを構築するため、核酸が特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入され、複製欠損のウイルスが生成される。ビリオンを作製するため、ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖ遺伝子を有する（が、ＬＴＲ及びパッケージング成分を有しない）パッケージング細胞株が構築される（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。ｃＤＮＡを有する組換えプラスミドが、レトロウイルスＬＴＲ及びパッケージング配列と一緒に、（例えばリン酸カルシウム沈殿により）特定の細胞株に導入されるとき、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物のウイルス粒子へのパッケージングを可能にし、次に培地中に分泌される（Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ，１９８８；Ｔｅｍｉｎ，１９８６；Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３）。次に、組換えレトロウイルスを含有する培地は収集され、任意選択的には濃縮され、遺伝子導入用に用いられる。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞型に感染することができる。しかし、組込み及び安定な発現には、宿主細胞の分裂が要求される（Ｐａｓｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７５）。
【０１０６】
レンチウイルスは、共通のレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、制御性又は構造的機能を伴う他の遺伝子を有する複合レトロウイルスである。レンチウイルスベクターは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｂｌｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；米国特許第６，０１３，５１６号明細書及び米国特許第５，９９４，１３６号明細書を参照）。
【０１０７】
組換えレンチウイルスベクターは、非分裂細胞に感染する能力があり、生体内及び生体外遺伝子導入と核酸配列の発現の双方に使用可能である。例えば、非分裂細胞に感染する能力がある組換えレンチウイルス（ここで好適な宿主細胞には、パッケージング機能を保有する２つ以上のベクター、即ち、ｇａｇ、ｐｏｌ及びｅｎｖ、並びにｒｅｖ及びｔａｔがトランスフェクトされる）は、米国特許第５，９９４，１３６号明細書（参照により本明細書中に援用される）に記載されている。
【０１０８】
ｂ．エピソームベクター
本開示の特定の態様では、プラスミド又はリポソームに基づく染色体外（即ちエピソーム）ベクターの使用もまた提供されてもよい。かかるエピソームベクターは、例えば、ｏｒｉＰに基づくベクター、及び／又はＥＢＮＡ−１の誘導体をコードするベクターを含んでもよい。これらのベクターは、ＤＮＡの大きい断片の細胞への導入及び染色体外での維持、細胞周期あたり１回の複製、娘細胞への効率的分配を可能にし、且つ実質的に免疫応答を全く誘発しなくてもよい。
【０１０９】
特に、ｏｒｉＰに基づく発現ベクターの複製に必要とされる唯一のウイルスタンパク質であるＥＢＮＡ−１は、その抗原のＭＨＣクラスＩ分子上への提示に要求されるプロセシングをバイパスするための効率的機構を発現していることから、細胞性免疫応答を誘発しない（Ｌｅｖｉｔｓｋａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。さらに、ＥＢＮＡ−１は、トランスに作用し、クローン化遺伝子の発現を増強し、いくつかの細胞株においてクローン化遺伝子の発現を最大で１００倍誘導しうる（Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８年；Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。最終的には、かかるｏｒｉＰに基づく発現ベクターの作製は安価である。
【０１１０】
他の染色体外ベクターは、他のリンパ増殖性ヘルペスウイルスに基づくベクターを含む。リンパ増殖性ヘルペスウイルスは、リンパ芽球（例えばヒトＢリンパ芽球）において複製するヘルペスウイルスであり、その自然生活環の一部としてプラスミドになる。単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、「リンパ増殖性」ヘルペスウイルスでない。例示的なリンパ増殖性ヘルペスウイルスとして、限定はされないが、ＥＢＶ、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓｅｓ）（ＫＳＨＶ）；ヘルペスウイルス・サイミリ（Ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｓａｉｍｉｒｉ）（ＨＳ）及びマレック病ウイルス（Ｍａｒｅｋ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）（ＭＤＶ）が挙げられる。エピソームベースベクターの他の供給源もまた検討され、例えば、酵母ＡＲＳ、アデノウイルス、ＳＶ４０、又はＢＰＶが挙げられる。
【０１１１】
当業者は、標準の組換え技術を通じてベクターを構築することを十分に理解するであろう（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４を参照、いずれも参照により本明細書中に援用される）。
【０１１２】
ベクターはまた、遺伝子送達及び／又は遺伝子発現をさらに調節する、又はそれ以外では標的化細胞に有利な特性をもたらす、他の成分又は機能性を含みうる。かかる他の成分として、例えば、細胞に対する結合又は標的化に影響を及ぼす成分（細胞型又は組織に特異的な結合を媒介する成分を含む）；細胞によるベクターの核酸の取り込みに影響を及ぼす成分；取り込み後の細胞内でのポリヌクレオチドの局在化に影響を及ぼす成分（核局在化を媒介する作用物質など）；及びポリヌクレオチドの発現に影響を及ぼす成分が挙げられる。
【０１１３】
かかる成分はまた、マーカー、例えば、取り込み済みであり且つベクターによって送達された核酸を発現中である細胞について検出又は選択するために使用可能な検出可能マーカー及び／又は選択マーカーを含んでもよい。かかる成分は、（結合及び取り込みを媒介する成分又は機能性を有する特定のウイルスベクターの使用などの）ベクターの天然特性として提供されうる、又はベクターは、かかる機能性を提供するように修飾されうる。多種多様なかかるベクターは、当該技術分野で公知であり、一般に利用可能である。ベクターが宿主細胞内で維持されるとき、ベクターは、自律的構造として有糸分裂中の細胞により安定に複製されうる、宿主細胞のゲノム中に組み込まれうる、又は宿主細胞の核又は細胞質において維持されうる、のいずれかである。
【０１１４】
ｃ．トランスポゾンに基づく系
特定の態様では、プログラミング因子の送達では、トランスポゾン−トランスポザーゼシステムを用いることができる。例えば、トランスポゾン−トランスポザーゼシステムは、周知のＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｆｒｏｇ  Ｐｒｉｎｃｅトランスポゾン−トランスポザーゼシステム（後者の説明として、例えば欧州特許第１５０７８６５号明細書を参照）、又はＴＴＡＡに特異的なトランスポゾンＰｉｇｇｙＢａｃシステムでありうる。
【０１１５】
トランスポゾンは、転位と称されるプロセスである、単細胞のゲノム内部の異なる位置に移動することができるＤＮＡの配列である。該プロセスでは、それらは突然変異を引き起こし、ゲノムにおけるＤＮＡの量を変化させうる。トランスポゾンはまた、以前はジャンピング遺伝子と称されたが、移動性遺伝要素の例である。
【０１１６】
種々の移動性遺伝要素が存在し、且つそれらはそれらの転位機構に基づいて分類されうる。クラスＩの移動性遺伝要素、又はレトロトランスポゾンは、最初にＲＮＡに転写され、次いで逆転写酵素によりＤＮＡに逆転写され、次いでゲノム内の別の位置に挿入されることにより、自らを複製する。クラスＩＩ移動性遺伝要素は、ゲノム内部でそれらを「カットアンドペーストする」ため、トランスポザーゼを用いて、ある位置から別の位置に直接的に移動する。
【０１１７】
特定の実施形態では、本開示で提供される構築物（例えば、多系統構築物）では、ＰｉｇｇｙＢａｃ発現系が用いられる。ＰｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）ＤＮＡトランスポゾンは、「カットアンドペースト」機構を介して結集し、それにより、トランスポゾン自体によってコードされるトランスポザーゼ酵素（ＰＢトランスポザーゼ）は、ゲノム内部の他の部位でトランスポゾンを切断し、再び組み込む。ＰＢトランスポザーゼは、トランスポゾンに隣接するＰＢインバーテッド末端リピート（ＩＴＲ）を特異的に認識し；これらの配列に結合し、トランスポゾンの切除を触媒する。次に、ＰＢは、比較的ランダムな様式で、ゲノム全体を通じてＴＴＡＡ部位で組み込む。ジーントラップ突然変異（即ちトランスジェニック動物の作製に適応した）の作出においては、トランスポザーゼは、１つのプラスミド上にトランスに供され、ドナートランスポゾン、トランスポザーゼに対する結合部位によって隣接されるジーントラップ（ＩＴＲ）を含む組換えトランスポゾンを有するプラスミドが同時トランスフェクトされる。トランスポザーゼは、トランスポゾンのプラスミドからの切除とその後のゲノムへの組込みを触媒することになる。コード領域内部の組込みは、ジーントラップ発現に必要な要素を捕捉することになる。ＰＢは、いくつかの理想的な特性を有する：（１）それは遺伝子内部で優先的に挿入する（挿入の５０〜６７％がヒット遺伝子）（２）それは局所的ホッピングを全く示さない（広範なゲノムカバー率（ｇｅｎｏｍｅ  ｃｏｖｅｒａｇｅ））（３）それはトランスポザーゼのレベル上昇が転位減少を引き起こすような過剰生成阻害に対する感受性がない（４）それは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙと異なり、ドナー部位から明確に切断し、「フットプリント」を全く残さない。
【０１１８】
ｄ．調節エレメント
本開示において有用なリプログラミングベクターに含まれる発現カセットは、好ましくは、タンパク質コード配列、介在配列を含むスプライスシグナル、及び転写終結／ポリアデニル化配列に作動可能に連結された真核生物転写プロモーターを（５’→３’方向に）有する。
【０１１９】
（ｉ）プロモーター／エンハンサー
本明細書に提供される発現構築物は、プログラミング遺伝子の発現を駆動するためのプロモーターを含む。プロモーターは、一般にＲＮＡ合成用の開始部位を位置づけるように機能する配列を含む。この最良の公知例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスが欠けているいくつかのプロモーター、例えば、哺乳動物の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子用のプロモーターや、ＳＶ４０後期遺伝子用のプロモーターなどでは、開始部位に重なる別々のエレメントが、自ら開始場所を固定することに役立つ。追加的なプロモーターエレメントが、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流領域に位置するが、同様にいくつかのプロモーターが開始部位の下流に機能的エレメントを有することが示されている。コード配列をプロモーター「の制御下に」導くため、転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端が、選択されたプロモーターの「下流」（即ち、その３’側）に位置づけられる。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードＲＮＡの発現を促進する。
【０１２０】
プロモーターエレメント間のスペーシングは柔軟であることが多いことから、プロモーター機能は、エレメントが相互に対して反転又は移動するとき、保存される。ｔｋプロモーターでは、プロモーターエレメント間のスペーシングは、活性が低下し始める前に５０ｂｐの間隔に増加されうる。プロモーターに依存し、各エレメントは、転写を活性化するのに協調的又は独立的のいずれかで機能しうると思われる。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性制御配列を指す、「エンハンサー」と併用されてもされなくてもよい。
【０１２１】
プロモーターは、核酸配列に天然に会合されるものであってもよく、コードセグメント及び／又はエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって得られてもよい。かかるプロモーターは、「内因性」と称することができる。同様に、エンハンサーは、核酸配列に天然に会合されるものであり、その配列の下流又は上流のいずれかに位置してもよい。或いは、コード核酸セグメントを、通常はその天然環境下で核酸配列に会合されないプロモーターを指す、組換え又は異種プロモーターの制御下に位置づけることにより、特定の利点が得られることになる。組換え又は異種エンハンサーもまた、通常はその天然環境下で核酸配列に会合されないエンハンサーを指す。かかるプロモーター又はエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーター又はエンハンサー、及び任意の他のウイルス、又は原核生物若しくは真核細胞から単離されるプロモーター又はエンハンサー、及び「天然に存在する」ことがない、即ち異なる転写調節領域の異なるエレメント、及び／若しくは発現を改変する突然変異を有するプロモーター又はエンハンサーを含んでもよい。例えば、組換えＤＮＡ構成物において最も汎用されるプロモーターは、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース及びトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステムを含む。プロモーター及びエンハンサーの核酸配列を合成的に生成することに加えて、配列は、本明細書に開示される組成物と関連させて、ＰＣＲ（商標）を含む、組換えクローニング及び／又は核酸増幅技術を用いて生成されてもよい（米国特許第４，６８３，２０２号明細書及び米国特許第５，９２８，９０６号明細書を参照、各々は参照により本明細書中に援用される）。さらに、ミトコンドリア、クロロプラストなどの非核細胞小器官内部の配列の転写及び／又は発現を誘導する制御配列も同様に利用可能であることは検討される。
【０１２２】
天然に、発現用に選択される、細胞小器官、細胞型、組織、臓器、又は生物におけるＤＮＡセグメントの発現を有効に誘導するプロモーター及び／又はエンハンサーを用いることは重要となる。分子生物学の当業者は一般に、タンパク質発現用のプロモーター、エンハンサー、及び細胞型の組み合わせの使用について理解している（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９、参照により本明細書中に援用される）。用いられるプロモーターは、組換えタンパク質及び／又はペプチドの大規模生成において有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベルの発現を誘導するのに適した条件下で、構成的、組織特異的、誘導可能、且つ／又は有用であってもよい。プロモーターは、異種であっても又は内因性であってもよい。
【０１２３】
加えて、発現を誘導するには、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢによる）も利用可能である。Ｔ３、Ｔ７又はＳＰ６細胞質発現系の使用は、もう一つの考えられる実施形態である。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが、送達複合体の一部、又は追加的な遺伝子発現構築物のいずれかとして提供される場合、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支持しうる。
【０１２４】
プロモーターの非限定例として、初期又は後期ウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０初期又は後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター；真核細胞プロモーター、例えば、βアクチンプロモーター（Ｎｇ，１９８９；Ｑｕｉｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、ＧＡＤＰＨプロモーター（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｅｒｃｏｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）、メタロチオネインプロモーター（Ｋａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９年；Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）；及び連鎖状応答エレメントプロモーター、例えば、環状ＡＭＰ応答エレメントプロモーター（ｃｒｅ）、血清応答エレメントプロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）及び最小ＴＡＴＡボックス近傍の応答エレメントプロモーター（ｔｒｅ）が挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモーター配列（例えば、ジェンバンク受入番号Ｘ０５２４４、ヌクレオチド２８３−３４１に掲載のヒト成長ホルモン最小プロモーター）又はマウス乳腺腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＡＴＣＣ４５００７から入手可能）を用いることも可能である。
【０１２５】
組織特異的な導入遺伝子発現、特にプログラミングから誘導される造血細胞及び造血細胞の前駆体におけるレポーター遺伝子発現については、誘導された造血細胞及び前駆体を同定するための方法として望ましいことがある。特異性及び活性の双方を増強するため、シス作用性調節エレメントの使用が検討されている。例えば、造血細胞に特異的なプロモーターが用いられてもよい。多数のかかる造血細胞に特異的なプロモーターは、当該技術分野で公知であり、表１に提示される造血遺伝子のプロモーターが挙げられる。
【０１２６】
特定の態様では、本開示の方法はまた、エンハンサー配列、即ち、プロモーターの活性を増強し、且つシスに作用する潜在性を有し、たとえ（標的プロモーターから最大で数キロベース離れた）比較的長い距離にわたってもその配向性と無関係である、核酸配列に関する。しかし、エンハンサー機能は、それが所与のプロモーターの近隣で機能することもあることから、必ずしもかかる長い距離に制限されるとは限らない。
【０１２７】
多数の造血細胞プロモーター及びエンハンサー配列が同定されており、本方法において有用なことがある。例えば、米国特許第５，５５６，９５４号明細書；米国特許出願公開第２００２００５５１４４号明細書；米国特許出願公開第２００９０１４８４２５号明細書を参照のこと。
【０１２８】
（ｉｉ）開始シグナル及び関連した発現
コード配列の効率的翻訳のため、特定の開始シグナルもまた、本開示で提供される発現構築物において用いられてもよい。これらのシグナルは、ＡＴＧ開始コドン又は隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが、提供される必要があるかもしれない。当業者であれば、このことを決定し、必要なシグナルを提供することが容易にできるであろう。全インサートの翻訳を保証するため、開始コドンが所望されるコード配列のリーディングフレームと「インフレームで」なければならないことは周知である。外因性翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然又は合成のいずれかでありうる。発現の効率は、適切な転写エンハンサーエレメントの封入により増強されてもよい。
【０１２９】
特定の実施形態では、多重遺伝子、即ちポリシストロニックメッセージを作出するため、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）エレメントが用いられる。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化キャップ依存性翻訳のリボソーム走査モデルをバイパスし、内部部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２メンバー（ポリオ及び脳心筋炎）からのＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、並びに哺乳動物メッセージからのＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，１９９１）については記載がある。ＩＲＥＳエレメントは、異種オープンリーディングフレームに連結されうる。複数のオープンリーディングフレームが一緒に転写され、各々がＩＲＥＳによって分離されることで、ポリシストロニックメッセージを作出しうる。ＩＲＥＳエレメントのおかげで、各オープンリーディングフレームは、効率的翻訳のため、リボソームにアクセス可能である。複数の遺伝子は、単一のメッセージを転写するため、単一のプロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現されうる（米国特許第５，９２５，５６５号明細書及び米国特許第５，９３５，８１９号明細書を参照、各々は参照により本明細書中に援用される）。
【０１３０】
加えて、本開示に提供される構築物においてプログラミング遺伝子の連結又は同時発現をもたらすのであれば、特定の２Ａ配列要素が使用可能である。例えば、オープンリーディングフレームを連結し、単一のシストロンを形成することにより遺伝子を同時発現するのであれば、切断配列が使用可能である。例示的な切断配列が、Ｆ２Ａ（口蹄疫ウイルス２Ａ）又は「２Ａ様」配列（例えば、ゾセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス２Ａ；Ｔ２Ａ）である。特定の実施形態では、多系統構築物における遺伝子の発現を連結するため、Ｆ２Ａ切断ペプチドが用いられる。
【０１３１】
ｅ．複製起点
宿主細胞内でベクターを増殖させるため、それは、１つ以上の複製起点部位（「ｏｒｉ」と称されることが多い）、例えば、上記のようなＥＢＶのｏｒｉＰに対応する核酸配列、又はプログラミングの際に類似の若しくは増強された機能を伴う遺伝子操作されたｏｒｉＰに対応する核酸配列（複製が開始される特定の核酸配列である）を含有してもよい。或いは、上記のような他の染色体外複製ウイルスの複製起点又は自己複製配列（ＡＲＳ）が利用可能である。
【０１３２】
ｆ．選択及びスクリーニング可能マーカー
特定の実施形態では、核酸構築物を含有する細胞が、マーカーを発現ベクター内に含めることにより、インビトロ又はインビボで同定されてもよい。かかるマーカーであれば、細胞に同定可能な変化を与え、発現ベクターを含有する細胞の容易な同定が可能になる。一般に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を与えるものである。ポジティブ選択マーカーは、該マーカーの存在がその選択を可能にするようなものである一方、ネガティブ選択マーカーは、その存在がその選択を阻止するようなものである。ポジティブ選択マーカーの例が、薬剤耐性マーカーである。
【０１３３】
通常、薬剤選択マーカーの組み入れは、形質転換体のクローニング及び同定に役立ち、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシン及びヒスチジノールに対する耐性を付与する遺伝子は、有用な選択マーカーである。条件の実行に基づく形質転換体の識別を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色分析を基本とするＧＦＰなどのスクリーニング可能マーカーを含むマーカーの他のタイプについても検討される。或いは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などのネガティブ選択マーカーとしてスクリーニング可能な酵素が利用されてもよい。当業者であれば、おそらくはＦＡＣＳ分析と併せて、免疫学的マーカーを利用する仕方についても理解するであろう。用いられるマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現可能である限り、重要であると考えられない。選択及びスクリーニング可能マーカーのさらなる例は、当業者に周知である。
【０１３４】
本開示による、核酸、例えばＤＮＡ又はＲＮＡの、造血前駆細胞にプログラムされるべき多能性幹細胞への導入では、本明細書に記載の通り、又は当業者に公知と思われる通り、細胞の形質転換のための核酸送達に適した任意の方法を用いてもよい。かかる方法として、限定はされないが、例えば、生体外トランスフェクションによる（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ，１９８９）、注射（米国特許第５，９９４，６２４号明細書、米国特許第５，９８１，２７４号明細書、米国特許第５，９４５，１００号明細書、米国特許第５，７８０，４４８号明細書、米国特許第５，７３６，５２４号明細書、米国特許第５，７０２，９３２号明細書、米国特許第５，６５６，６１０号明細書、米国特許第５，５８９，４６６号明細書及び米国特許第５，５８０，８５９号明細書、各々は参照により本明細書中に援用される）、例えばマイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５；米国特許第５，７８９，２１５号明細書、参照により本明細書中に援用される）による；エレクトロポレーションによる（米国特許第５，３８４，２５３号明細書、参照により本明細書中に援用される；Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６；Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）；リン酸カルシウム沈殿による（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７３；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０）；ＤＥＡＥ−デキストラン、次いでポリエチレングリコールを用いることによる（Ｇｏｐａｌ，１９８５）；直接音波負荷による（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）；リポソーム媒介トランスフェクション（Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，１９８２；Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９；Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０；Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）及び受容体媒介トランスフェクション（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８８）による；微粒子銃による（ＰＣＴ出願の国際公開第９４／０９６９９号パンフレット及び国際公開第９５／０６１２８号パンフレット；米国特許第５，６１０，０４２号明細書；米国特許第５，３２２，７８３号明細書、米国特許第５，５６３，０５５号明細書、米国特許第５，５５０，３１８号明細書、米国特許第５，５３８，８７７号明細書及び米国特許第５，５３８，８８０号明細書、各々は参照により本明細書中に援用される）；シリコンカーバイド繊維を用いた撹拌による（Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；米国特許第５，３０２，５２３号明細書及び米国特許第５，４６４，７６５号明細書、各々は参照により本明細書中に援用される）；アグロバクテリウム媒介形質転換による（米国特許第５，５９１，６１６号明細書及び米国特許第５，５６３，０５５号明細書、各々は参照により本明細書中に援用される）；乾燥／阻害媒介ＤＮＡ取り込みによる（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５）ＤＮＡの直接送達、及びかかる方法の任意の組み合わせが挙げられる。これらなどの技術の適用を通じて、細胞小器官、細胞、���織又は生物は、安定に又は一過性に形質転換されてもよい。
【０１３５】
Ｃ．ＭＨＣハプロタイプマッチング
主要組織適合複合体（ＭＨＣ）は、同種臓器移植片の免疫拒絶の主因である。３つの主要なＭＨＣクラスＩハプロタイプ（Ａ、Ｂ、及びＣ）と３つの主要なＭＨＣクラスＩＩハプロタイプ（ＤＲ、ＤＰ、及びＤＱ）とが存在する。ＨＬＡ遺伝子座は、高度に多形性であり、染色体６上の４Ｍｂにわたり分布される。領域内部のＨＬＡ遺伝子をハプロタイプ化する能力は、この領域が自己免疫及び感染症に関連し、ドナーとレシピエントとの間のＨＬＡハプロタイプの適合性が移植の臨床成績に影響しうることから、臨床的に重要である。ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡは、細胞内部からペプチドを提示し、且つＭＨＣクラスＩＩに対応するＨＬＡは、細胞の外部からＴリンパ球に抗原を提示する。移植片と宿主との間でのＭＨＣハプロタイプの不適合性は、移植片に対する免疫応答を惹起し、その拒絶をもたらす。したがって、患者は、拒絶を予防するため、免疫抑制剤で治療されうる。ＨＬＡ適合幹細胞株は、免疫拒絶のリスクを克服することがある。
【０１３６】
移植におけるＨＬＡの重要性を理由に、好ましいドナー−レシピエント対を同定するため、ＨＬＡ遺伝子座が通常は血清学及びＰＣＲにより分類される。ＨＬＡクラスＩ及びＩＩ抗原の血清学的検出は、精製されたＴ又はＢリンパ球を伴う補体媒介性リンパ球毒性試験を用いて達成されうる。この手順は、主にＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂ遺伝子座と適合するように用いられる。分子に基づく組織タイピングは、時として血清学的検査よりも正確でありうる。ＰＣＲ産物が一連のオリゴヌクレオチドプローブに対して試験される、ＳＳＯＰ（配列特異的オリゴヌクレオチドプローブ）法などの低分解能分子法は、ＨＬＡ抗原を同定するために用いることができ、これらの方法は現在、クラスＩＩ−ＨＬＡタイピング用に用いられる最も一般的な方法である。ＰＣＲ増幅用に対立遺伝子特異的プライマーを用いる、ＳＳＰ（配列特異的プライマー）法などの高分解能技術は、特異的なＭＨＣ対立遺伝子を同定しうる。
【０１３７】
ドナーとレシピエントとの間のＭＨＣ適合性は、ドナー細胞がＨＬＡホモ接合性である、即ち各抗原提示タンパク質における同一の対立遺伝子を有する場合、有意に増加する。大部分の個体は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩ遺伝子に対してヘテロ接合性であるが、特定の個体は、これらの遺伝子においてホモ接合性である。これらのホモ接合性個体は、スーパードナーとして役立つことができ、それら細胞から作製された移植片は、そのハプロタイプにおいてホモ接合性又はヘテロ接合性のいずれかであるすべての個体に移植されうる。さらに、ホモ接合性ドナー細胞が、ある集団内に高頻度で見出されるハプロタイプを有する場合、これらの細胞は、多数の個体に対する移植療法における用途を有してもよい。
【０１３８】
したがって、いくつかの実施形態では、本方法のＰＳＣは、治療されるべき対象、又は該患者の場合と同じ若しくは実質的に同じＨＬＡタイプを有する別の対象の体細胞から生成されうる。ある場合、ドナーの主要なＨＬＡ（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ及びＨＬＡ−ＤＲの３つの主要な遺伝子座）は、レシピエントの主要なＨＬＡと同一である。場合によっては、体細胞ドナーはスーパードナーであってもよく；したがって、ＨＰＣや、それに続く免疫細胞、例えばＴ細胞を生成するため、ＭＨＣホモ接合性スーパードナー由来のＰＳＣが用いられてもよい。したがって、スーパードナーに由来する免疫エフェクター細胞は、そのハプロタイプにおいてホモ接合性又はヘテロ接合性のいずれかである対象に移植されてもよい。例えば、免疫細胞は、ＨＬＡ−Ａ及びＨＬＡ−Ｂなどの２つのＨＬＡ対立遺伝子にホモ接合性でありうる。そのようなものとして、スーパードナーから得られる免疫細胞は、本明細書に開示される方法において用いられ、潜在的には多数の有望なレシピエントに「マッチする」可能性がある免疫細胞が作製可能である。
【０１３９】
Ｄ．遺伝子操作された抗原受容体
ＰＳＣは、改変されたＴＣＲ又はＣＡＲなどの抗原受容体を発現するように遺伝子操作されうる。例えば、ＰＳＣ（例えば自家又は同種）は、がん抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲ又はＣＡＲを発現するように修飾される。
【０１４０】
修飾の好適な方法は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ａｕｓｕｂｅｌ，上記を参照のこと。例えば、該細胞は、がん抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲを発現するため、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１９：４９６−５１０（２００８）及びＪｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １１４：５３５−４６（２００９）に記載の形質導入技術を用いて、形質導入されてもよい。
【０１４１】
完全長ＴＣＲα及びβ（又はγ及びδ）鎖をコードするＲＮＡのエレクトロポレーションは、レトロウイルス性に形質導入された、内因性のＴＣＲ鎖の対合によって引き起こされる自己反応性で長期的問題を克服するための選択肢として用いることができる。たとえかかる代替的な対合が一過性トランスフェクション法において生じるとしても、作製される見込みのある自己反応性Ｔ細胞は、導入されたＴＣＲα及びβ鎖が専ら一過性に発現されることから、後になってこの自己反応性を失うことになる。導入されたＴＣＲα及びβ鎖の発現が減少するとき、正常な自己Ｔ細胞のみが残される。これは、完全長ＴＣＲ鎖が、導入されたＴＣＲ鎖を決して失うことがなく、患者において常在する自己反応性を引き起こす、安定なレトロウイルス形質導入により導入されるような状況ではない。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、該細胞は、１つ以上の抗原受容体をコードする、遺伝子工学により導入される１つ以上の核酸、及びかかる核酸の遺伝子操作産物を含む。いくつかの実施形態では、該核酸は、異種である、即ち通常は細胞内又は細胞から得られるサンプル中に存在せず、例えば改変されている細胞及び／又はかかる細胞の由来元である生物において通常は見出されない、別の生物又は細胞から得られるものなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、該核酸は、天然に存在せず、天然に見出されない核酸（例えばキメラ）が挙げられる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、該ＣＡＲは、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを有する。いくつかの実施形態では、該抗原は、細胞の表面上に発現されるタンパク質である。いくつかの実施形態では、該ＣＡＲはＴＣＲ様ＣＡＲであり、且つ該抗原は、プロセシングされたペプチド抗原、例えば、ＴＣＲのように、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子との関連で、細胞表面上で認識される、細胞内タンパク質のペプチド抗原である。
【０１４４】
例示的な抗原受容体、例えばＣＡＲ及び組換えＴＣＲ、並びに該受容体を改変し、細胞に導入するための方法は、例えば、国際特許出願公開番号としての国際公開第２０００１４２５７号パンフレット、国際公開第２０１３１２６７２６号パンフレット、国際公開第２０１２／１２９５１４号パンフレット、国際公開第２０１４０３１６８７号パンフレット、国際公開第２０１３／１６６３２１号パンフレット、国際公開第２０１３／０７１１５４号パンフレット、国際公開第２０１３／１２３０６１号パンフレット、米国特許出願公開番号としての米国特許第２００２１３１９６０号明細書、米国特許第２０１３２８７７４８号明細書、米国特許第２０１３０１４９３３７号明細書、米国特許第６，４５１，９９５号明細書、米国特許第７，４４６，１９０号明細書、米国特許第８，２５２，５９２号明細書、米国特許第８，３３９，６４５号明細書、米国特許第８，３９８，２８２号明細書、米国特許第７，４４６，１７９号明細書、米国特許第６，４１０，３１９号明細書、米国特許第７，０７０，９９５号明細書、米国特許第７，２６５，２０９号明細書、米国特許第７，３５４，７６２号明細書、米国特許第７，４４６，１９１号明細書、米国特許第８，３２４，３５３号明細書、及び米国特許第８，４７９，１１８号明細書、並びに欧州特許出願番号としての欧州特許第２５３７４１６号明細書、並びに／又はＳａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１３  Ａｐｒｉｌ；３（４）：３８８−３９８；Ｄａｖｉｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（４）：ｅ６１３３８；Ｔｕｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２０１２  Ｏｃｔｏｂｅｒ；２４（５）：６３３−３９；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ，２０１２  Ｍａｒｃｈ  １８（２）：１６０−７５に記載のものを含む。いくつかの態様では、遺伝子操作された抗原受容体は、米国特許第７，４４６，１９０号明細書に記載のようなＣＡＲ、及び国際特許出願公開番号としての国際公開第２０１４０５５６６８Ａｌ号パンフレットに記載のものを含む。
【０１４５】
１．キメラ抗原受容体
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ａ）細胞内シグナル伝達ドメイン、ｂ）膜貫通ドメイン、及びｃ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインを含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、改変された抗原受容体は、ＣＡＲ、例えば、活性化若しくは刺激性ＣＡＲ、同時刺激性ＣＡＲ（国際公開第２０１４／０５５６６８号パンフレットを参照）、及び／又は阻害性ＣＡＲ（ｉＣＡＲ，Ｆｅｄｏｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３を参照）を含む。ＣＡＲは、一般に、いくつかの態様ではリンカー及び／又は膜貫通ドメインを介して、１つ以上の細胞内シグナル伝達成分に連結された細胞外抗原（又はリガンド）結合ドメインを含む。かかる分子は、典型的には、天然抗原受容体を通じてシグナルを、同時刺激受容体と組み合わせたかかる受容体を通じてシグナルを、及び／又は同時刺激受容体単独を通じてシグナルを模倣又は近似する。
【０１４７】
本開示の特定の実施形態は、抗原特異的ＣＡＲポリペプチド、例えば、細胞内シグナル伝達ドメイン、膜貫通ドメイン、及び１つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインを含む、免疫原性（ｈＣＡＲ）を低減するためにヒト化されているＣＡＲをコードする核酸を含む核酸の使用に関する。特定の実施形態では、該ＣＡＲは、１つ以上の抗原間で共有された空間を含むエピトープを認識してもよい。特定の実施形態では、該結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、及び／又はその抗原結合断片を含みうる。別の実施形態では、その特異性は、受容体に結合するペプチド（例えばサイトカイン）から誘導される。
【０１４８】
ヒトＣＡＲ核酸がヒト患者用の細胞免疫療法を増強するために用いられるヒト遺伝子であってもよいことが検討されている。具体的な実施形態では、本発明は、完全長ＣＡＲｃＤＮＡ又はコード領域を含む。抗原結合領域又はドメインは、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のＶＨ及びＶＬ鎖の断片、例えば米国特許第７，１０９，３０４号明細書（参照により本明細書中に援用される）に記載のものを含みうる。該断片はまた、ヒト抗原特異的抗体のいくつもの異なる抗原結合ドメインでありうる。より具体的な実施形態では、該断片は、ヒト細胞における発現のためのヒトコドン使用用に最適化された配列によってコードされる抗原特異的ｓｃＦｖである。
【０１４９】
該配列の場合、多量体、例えば二重特異性抗体又は多量体でありうる。多量体は、軽鎖及び重鎖の可変部分の二重特異性抗体への交差対合（ｃｒｏｓｓ  ｐａｉｒｉｎｇ）により形成される可能性が最も高い。該構築物のヒンジ部分は、完全に欠失されているから、最初のシステインが維持されているまで、セリンではなくプロリンの置換まで、最大で最初のシステインまで切断されているまで、複数の代替物を有しうる。Ｆｃ部分は欠失されうる。安定で且つ／又は二量体化する任意のタンパク質は、この目的を果たしうる。ヒト免疫グロブリンから、Ｆｃドメインの１つに限り、例えばＣＨ２又はＣＨ３ドメインのいずれかであれば使用可能である。さらに、二量体化を改善するために修飾されているヒト免疫グロブリンのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３領域であれば使用可能である。さらに、免疫グロブリンのヒンジ部に限れば使用可能である。さらに、ＣＤ８αの一部であれば使用可能である。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ核酸は、他の同時刺激受容体、例えば膜貫通ドメイン及び修飾されたＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。他の同時刺激受容体として、限定はされないが、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、及び４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の１つ以上が挙げられる。ＣＤ３ζによって開始される一次シグナルに加えて、ヒトＣＡＲに挿入されたヒト同時刺激受容体によって提供される追加的なシグナルは、ＮＫ細胞の完全な活性化にとって重要であり、インビボでの持続性及び養子免疫療法の治療的成功を改善することに役立ちうる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、特定の抗原（又はマーカー若しくはリガンド）、例えば養子療法により標的にされるべき特定の細胞型において発現される抗原、例えばがんマーカー、及び／又は減衰応答を誘導することが意図された抗原、例えば正常若しくは非罹患細胞型上に発現される抗原に対する特異性を用いて構築される。したがって、ＣＡＲは、典型的には、その細胞外部分に、１つ以上の抗原結合分子、例えば、１つ以上の抗原結合断片、ドメイン、若しくは部分、又は１つ以上の抗体可変ドメイン、及び／又は抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合部分又は抗体分子の一部、例えばモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重（ＶＨ）鎖及び可変軽（ＶＬ）鎖由来の一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。
【０１５２】
キメラ抗原受容体の特定の実施形態では、（抗原結合領域を含む細胞外ドメインと称されてもよい）受容体の抗原特異的部分は、腫瘍関連抗原又は病原体に特異的な抗原結合ドメインを含む。抗原は、パターン認識受容体、例えばデクチン１によって認識される炭水化物抗原を含む。腫瘍関連抗原は、それが腫瘍細胞の細胞表面上に発現される限り、任意の種類であってもよい。腫瘍関連抗原の例示的実施形態として、ＣＤ１９、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、突然変異ｐ５３、突然変異ｒａｓなどが挙げられる。
【０１５３】
キメラ受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ源、ｃＤＮＡ源から入手されうる、又は（例えばＰＣＲを介して）合成されうる、又はそれらの組み合わせでありうる。ゲノムＤＮＡのサイズ及びイントロンの数に依存して、イントロンがｍＲＮＡを安定化することが見出されることから、ｃＤＮＡ又はその組み合わせを用いることが望ましいことがある。加えて、ｍＲＮＡを安定化するため、内因性又は外因性非コード領域を用いることがさらに有利なことがある。
【０１５４】
キメラ構築物がネイキッドＤＮＡとして又は好適なベクター内で免疫細胞に導入可能であることが検討される。ネイキッドＤＮＡを用いてエレクトロポレーションにより細胞を安定にトランスフェクトする方法は、当該技術分野で公知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号明細書を参照のこと。ネイキッドＤＮＡは、一般に発現にとって適切な配向性でプラスミド発現ベクター内に含有されるキメラ受容体をコードするＤＮＡを指す。
【０１５５】
或いは、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又はレンチウイルスベクター）は、キメラ構築物を免疫細胞に導入するため、使用可能である。本開示の方法に従う使用に適したベクターは、免疫細胞において非複製性である。細胞において維持されるウイルスのコピー数が細胞の生存度を維持するのに十分に低い場合には、ウイルスに基づく多数のベクターが知られており、例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶ、又はＢＰＶに基づくベクターなどが挙げられる。
【０１５６】
いくつかの態様では、抗原特異的結合、又は認識成分は、１つ以上の膜貫通及び細胞内シグナル伝達ドメインに連結される。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、天然にＣＡＲにおけるドメインの１つに会合される膜貫通ドメインが用いられる。場合によっては、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するため、かかるドメインの同じ又は異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避するようなアミノ酸置換により選択又は修飾される。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、天然又は合成供給源のいずれかに由来する。供給源が天然である場合、ドメインは、いくつかの態様では任意の膜結合又は膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体のα、β又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ζ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２Ｄ、及びＤＡＰ分子に由来する（即ち、それらの少なくとも膜貫通領域を含む）ものを含む。或いは、膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態では合成である。いくつかの態様では、合成膜貫通ドメインは、主にロイシン及びバリンなどの疎水性残基を含む。いくつかの態様では、フェニルアラニン、トリプトファン及びバリンの三つ組が、合成膜貫通ドメインの各末端に見出されることになる。
【０１５８】
特定の実施形態では、免疫細胞、例えばＮＫ細胞を遺伝的に修飾するための本明細書に開示されるプラットフォーム技術は、（ｉ）エレクトロポレーション装置（例えばｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ）を用いる非ウイルス遺伝子導入、（ｉｉ）エンドドメイン（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３ζ、又は他の組み合わせ）を通じてシグナル伝達するＣＡＲ、（ｉｉｉ）抗原認識ドメインを細胞表面に接続する可変長の細胞外ドメインを有するＣＡＲ、及び場合によっては、（ｉｖ）ＣＡＲ+免疫細胞を強力且つ数値的に拡大することができる、Ｋ５６２由来の人工的抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１５９】
２．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
いくつかの実施形態では、遺伝子操作された抗原受容体は、組換えＴＣＲ及び／又は天然に存在するＴ細胞からクローン化されたＴＣＲを含む。「Ｔ細胞受容体」又は「ＴＣＲ」は、可変ａ及びβ鎖（各々、ＴＣＲα及びＴＣＲβとしても公知）又は可変γ及びδ鎖（各々、ＴＣＲγ及びＴＣＲδとしても公知）を有し、且つＭＨＣ受容体に結合された抗原ペプチドに特異的に結合する能力がある分子を指す。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、αβ形態である。
【０１６０】
典型的には、αβ及びγδ形態で存在するＴＣＲは、一般に構造的に類似するが、それらを発現するＴ細胞は、明らかな解剖学的位置又は機能を有してもよい。ＴＣＲは、細胞の表面上に又は可溶性形態で見出されうる。一般に、ＴＣＲは、一般に主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子に結合された抗原を認識することに関与する場合、Ｔ細胞（又はＴリンパ球）の表面上に見出される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメイン及び／又は短い細胞質側末端を有しうる（例えば、Ｊａｎｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ，３rd  Ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ．４３３，１９９７を参照）。例えば、いくつかの態様では、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメイン、１つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、及びＣ末端に短い細胞質側末端を有しうる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、シグナル伝達を媒介することに関与したＣＤ３複合体の不変タンパク質に関連する。特に指定のない限り、用語「ＴＣＲ」は、その機能的ＴＣＲ断片を包含するように理解されるべきである。該用語はまた、αβ形態又はγδ形態でのＴＣＲを含む、インタクトなＴＣＲ又は完全長ＴＣＲを包含する。
【０１６１】
したがって、本明細書における目的として、ＴＣＲに対する参照には、任意のＴＣＲ又は機能断片、例えば、ＭＨＣ分子において結合された特異的抗原ペプチド、即ちＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するＴＣＲの抗原結合部分が含まれる。交換可能に使用可能なＴＣＲの「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」は、ＴＣＲの構造ドメインの一部を有するが、完全なＴＣＲが結合する対象の抗原（例えばＭＨＣ−ペプチド複合体）に結合する分子を指す。場合によっては、抗原結合部分は、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するのに十分である、ＴＣＲの可変ドメイン、例えばＴＣＲの可変ａ鎖及び可変β鎖（一般には各鎖が３つの相補性決定領域を有する場合など）を有する。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖の可変ドメインは、ループ、又は相補性決定領域（ＣＤＲ）（免疫グロブリンに類似する）を形成するように会合し、ＴＣＲ分子の結合部位を形成することにより抗原認識を付与し、ペプチド特異性を決定することで、ペプチド特異性を決定する。典型的には、免疫グロブリンのように、ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲｓ）によって分離される（例えば、Ｊｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３を参照）。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、プロセシングされた抗原を認識することに関与する主要なＣＤＲであるが、α鎖のＣＤＲ１もまた、抗原ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されている一方で、β鎖のＣＤＲ１は、該ペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられる。いくつかの実施形態では、β鎖の可変領域は、さらなる超可変（ＨＶ４）領域を有しうる。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖は、定常ドメインを有する。例えば、免疫グロブリンのように、ＴＣＲ鎖の細胞外部分（例えば、ａ鎖、β鎖）は、２つの免疫グロブリンドメイン、Ｎ末端に可変ドメイン（例えば、Ｖa又はＶｐ；典型的にはＫａｂａｔ付番（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ  Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，１９９１，５th  ｅｄ．）に基づくアミノ酸１〜１１６）と、細胞膜に隣接した１つの定常ドメイン（例えば、ａ鎖定常ドメイン又はＣa、典型的にはＫａｂａｔに基づくアミノ酸１１７〜２５９、β鎖定常ドメイン又はＣp、典型的にはＫａｂａｔに基づくアミノ酸１１７〜２９５）とを有しうる。例えば、場合によっては、２つの鎖によって形成されたＴＣＲの細胞外部分は、２つの膜から近位の定常ドメインと、ＣＤＲを有する２つの膜から遠位の可変ドメインを有する。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、２つの鎖間を連結させる、短い接続配列を有する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲが定常ドメインにおいて２つのジスルフィド結合を有するように、α及びβ鎖の各々において追加的なシステイン残基を有してもよい。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖は、膜貫通ドメインを有しうる。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、正に荷電される。場合によっては、ＴＣＲ鎖は、細胞質側末端を有する。場合によっては、該構造は、ＴＣＲがＣＤ３のような他の分子と会合することを可能にする。例えば、膜貫通領域を伴う定常ドメインを有するＴＣＲは、細胞膜内のタンパク質に固定され、ＣＤ３シグナル伝達装置又は複合体の不変サブユニットと会合しうる。
【０１６５】
一般に、ＣＤ３は、哺乳類における３つの異なる鎖（γ、δ、及びε）及びζ鎖を有しうる多タンパク質複合体である。例えば、哺乳類では、該複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖、及びＣＤ３ζ鎖のホモ二量体を有しうる。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及びＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを有する免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連した細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及びＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は、負に荷電され、それはこれらの鎖の正荷電Ｔ細胞受容体鎖との会合を可能にするという特徴である。ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、及びＣＤ３ε鎖の細胞内末端が各々、免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ又はＩＴＡＭとして公知の単一の保存モチーフを有する一方で、各ＣＤ３ζ鎖は３つを有する。一般に、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に関与する。これらのアクセサリー分子は、負に荷電した膜貫通領域を有し、ＴＣＲから該細胞にシグナルを増殖する役割を担う。ＣＤ３鎖及びζ鎖は、ＴＣＲと一緒に、Ｔ細胞受容体複合体として公知のものを形成する。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは２つの鎖α及びβ（又は任意選択的にはγ及びδ）のヘテロ二量体であってもよく、又は一本鎖ＴＣＲ構築物であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、例えば１又は複数のジスルフィド結合によって連結された２本の別々の鎖（α鎖及びβ鎖又はγ鎖及びδ鎖）を有するヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、標的抗原（例えばがん抗原）に対するＴＣＲが同定され、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲをコードする核酸は、例えば公的に利用可能なＴＣＲ  ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅により、種々の供給源から得ることができる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、生物学的供給源から、例えば細胞から、例えばＴ細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマ又は他の公的に利用可能な供給源から得られる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、インビボで単離された細胞から得ることができる。いくつかの実施形態では、高親和性Ｔ細胞クローンは、患者から単離され、ＴＣＲが単離されうる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマ又はクローンでありうる。いくつかの実施形態では、標的抗原に対するＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、又はＨＬＡ）で改変されたトランスジェニックマウスにおいて作製されている。いくつかの実施形態では、標的抗原に対するＴＣＲを単離するため、ファージディスプレイが用いられる。いくつかの実施形態では、ＴＣＲ又はその抗原結合部分は、ＴＣＲの配列に関する知識から合成的に作製されうる。
【０１６７】
３．抗原提示細胞
マクロファージ、Ｂリンパ球、及び樹状細胞を含むＡＰＣは、特定のＭＨＣ分子のそれらの発現により分化される。ＡＰＣは、抗原を内部移行させ、それらの外部細胞膜上のＭＨＣ分子と一緒に、その抗原の一部を再発現する。ＭＨＣは、複数の遺伝子座を有する大きい遺伝子複合体である。ＭＨＣ遺伝子座は、クラスＩ及びクラスＩＩ  ＭＨＣと称される、ＭＨＣ膜分子の２つの主要クラスをコードする。Ｔヘルパーリンパ球は、一般にＭＨＣクラスＩＩ分子に関連する抗原を認識し、且つＴ細胞傷害性リンパ球は、ＭＨＣクラスＩ分子に関連する抗原を認識する。ＭＨＣは、ヒトではＨＬＡ複合体と称され、マウスではＨ−２複合体と称される。
【０１６８】
場合によっては、ａＡＰＣが、実施形態の治療組成物及び細胞療法生成物を調製するのに有用である。抗原提示系の調製及び使用に関する一般的ガイダンスについては、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、米国特許第６，３５５，４７９号明細書、米国特許第６，３６２，００１号明細書及び米国特許第６，７９０，６６２号明細書を参照のこと。
【０１６９】
ａＡＰＣ系は、少なくとも１つの外因性補助分子を含んでもよい。補助分子の任意の好適な数及び組み合わせが利用されてもよい。補助分子は、同時刺激分子及び接着分子などの補助分子から選択されてもよい。例示的な同時刺激分子として、ＣＤ８６、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、４１ＢＢリガンド、及びＩＬ−２１が挙げられる。接着分子は、セレクチンなどの炭水化物結合糖タンパク質、インテグリンなどの膜貫通結合糖タンパク質、カドヘリンなどのカルシウム依存性タンパク質、及び１回膜貫通型免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質、例えば細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）（例えば、細胞対細胞又は細胞対マトリックス接触を促進する）を含んでもよい。例示的な接着分子として、ＬＦＡ−３及びＩＣＡＭ、例えばＩＣＡＭ−１が挙げられる。例示的な補助分子、例えば同時刺激分子及び接着分子の選択、クローニング、調製、及び発現にとって有用な技術、方法、及び試薬が、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号明細書、米国特許第６，３５５，４７９号明細書、及び米国特許第６，３６２，００１号明細書に例示されている。
【０１７０】
４．抗原
遺伝子操作された抗原受容体によって標的にされる抗原の中に、養子細胞療法により標的にされるべき疾患、状態、又は細胞型との関連で発現されるものが挙げられる。疾患及び状態の中で、増殖性、腫瘍性、及び悪性疾患及び障害、例えばがん及び腫瘍、例えば、血液がん、免疫系のがん、例えばリンパ腫、白血病、及び／若しくは骨髄腫、例えばＢ．Ｔ．及び骨髄性白血病、リンパ腫、及び多発性骨髄腫が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗原は、疾患又は状態の細胞上、例えば腫瘍又は病原性細胞上で、正常又は非標的化細胞若しくは組織と比べて、選択的に発現又は過剰発現される。他の実施形態では、抗原は、正常細胞上で発現され、且つ／又は改変細胞上で発現される。
【０１７１】
任意の好適な抗原は、本方法において用途が見出されてもよい。例示的な抗原として、限定はされないが、感染病原体からの抗原分子、オート／自己抗原、腫瘍／がん関連抗原、及び腫瘍ネオ抗原が挙げられる（Ｌｉｎｎｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０１７２】
腫瘍関連抗原は、前立腺がん、乳がん、結腸直腸がん、肺がん、膵がん、腎がん、中皮腫、卵巣がん、又はメラノーマがんに由来してもよい。例示的な腫瘍関連抗原又は腫瘍細胞由来抗原として、ＭＡＧＥ１、３、及びＭＡＧＥ４（又は他のＭＡＧＥ抗原）；ＰＲＡＭＥ；ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ−ＥＳＯ−１としても公知）；ＳＡＧＥ；及びＨＡＧＥ又はＧＡＧＥが挙げられる。腫瘍抗原のこれらの非限定例は、メラノーマ、肺がん、肉腫、及び膀胱がんなどの広範囲の腫瘍タイプにおいて発現される。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号明細書を参照のこと。前立腺がん腫瘍関連抗原は、例えば、前立腺特異膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸性ホスフェート（ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ）、ＮＫＸ３．１、及び前立腺の６回膜貫通上皮抗原（ＳＴＥＡＰ）を含む。
【０１７３】
他の腫瘍関連抗原として、Ｐｌｕ−１、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、Ｃｒｉｐｔｏ及びＣｒｉｐｔｉｎが挙げられる。加えて、腫瘍抗原は、自己ペプチドホルモン、例えば、多くのがんの治療に有用な、短い１０アミノ酸長ペプチドである、全長ゴナドトロピンホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）、であってもよい。
【０１７４】
腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原の発現、例えばＨＥＲ−２／ｎｅｕの発現によって特徴づけられるがんに由来する腫瘍抗原を含む。目的の腫瘍関連抗原は、系列特異的腫瘍抗原、例えばメラニン細胞−メラノーマ系列抗原ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼ及びチロシナーゼ関連タンパク質を含む。例示的な腫瘍関連抗原として、限定はされないが、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ−Ｍｙｃ、細胞質セリン／トレオニンキナーゼ（例えば、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−Ｒａｆ、及びＣ−Ｒａｆ、サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＲＴ−１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、−１０、ＧＡＧＥ−１、−２、−８、ＧＡＧＥ−３、−４、−５、−６、−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＴＲＫ受容体、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、インターフェロン制御因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１（ＴＡＣＳＴＤ１）、ＴＡＣＳＴＤ２、受容体チロシンキナーゼ（例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（特にＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮増殖因子受容体（ＶＥＧＦＲ））、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、ｓｒｃ−ファミリー、ｓｙｋ−ＺＡＰ７０ファミリー）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、転写のシグナルトランスデューサー及びアクチベーターＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴＳ、及びＳＴＡＴＥ、低酸素症誘導因子（例えば、ＨＩＦ−１及びＨＩＦ−２）、核内因子−κＢ（ＮＦ−Ｂ）、ノッチ受容体（例えば、Ｎｏｔｃｈ１〜４）、ｃ−Ｍｅｔ、ラパマイシンの哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）、ＷＮＴ、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、及びそれらの調節サブユニット、ＰＭＳＡ、ＰＲ−３、ＭＤＭ２、メソセリン、腎細胞がん−５Ｔ４、ＳＭ２２−α、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）及びＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても公知）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫の転座限界点、ＥｐｈＡ２、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、ｍｅｓｏｔｈｅｌｉａｎ、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧｓＳ、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ｆｏｓ関連抗原１、ＣＢＸ２、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＳＵＮＣ１、ＬＲＲＮ１及びイディオタイプの任意の１つ以上に由来する、又はそれらを含む腫瘍抗原が挙げられる。
【０１７５】
抗原は、正常細胞と比べて腫瘍細胞内で突然変異した遺伝子又は腫瘍細胞内で異なるレベルで転写された遺伝子に由来するエピトープ領域又はエピトープペプチドを含んでもよく、例えば、テロメラーゼ酵素、サバイビン、メソセリン、突然変異ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再配列、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、突然変異型又は野生型ｐ５３、チトクロムＰ４５０  １Ｂ１、及び異常に発現されたイントロン配列、例えばＮ−アセチルグルコサミン転移酵素Ｖ；骨髄腫及びＢ細胞リンパ腫における特有のイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン再配列；腫瘍ウイルスプロセスに由来するエピトープ領域又はエピトープペプチドを含む腫瘍抗原、例えばヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６及びＥ７；エプスタイン・バーウイルスタンパク質ＬＭＰ２；腫瘍選択的発現を伴う非突然変異がん胎児性タンパク質、例えばがん胎児性抗原及びαフェトプロテインが挙げられる。
【０１７６】
他の実施形態では、抗原は、病原性微生物又は日和見病原性微生物（本明細書で感染症微生物とも称される）、例えば、ウイルス、真菌、寄生虫、及び細菌から得られる、又はそれに由来する。特定の実施形態では、かかる微生物に由来する抗原は、完全長タンパク質を含む。
【０１７７】
ＩＩＩ．免疫エフェクター細胞
Ａ．造血前駆細胞
抗原受容体、例えばＣＡＲを発現するように改変された本開示のＰＳＣは、当該技術分野で公知の方法により、ＨＰＣに分化されてもよい。一方法では、ＣＡＲ−ＰＳＣは、指向された分化誘導を通じてＣＤ３４+ＨＰＣに分化される。もう一つの方法では、ＣＡＲ−ＰＳＣは、フォワードプログラミングを通じてＣＤ３４+ＨＰＣに分化される。
【０１７８】
１．指向された分化誘導
本開示の特定の実施形態は、ＣＡＲ−ＰＳＣのＨＰＣへの分化に関する。ＣＡＲ−ＰＳＣは、例えば米国特許第８，３７２，６４２号明細書（参照により本明細書中に援用される）に記載される当該技術分野で公知の方法によりＨＰＣに分化されうる。一方法では、造血分化を促進するため、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、及びＧＭ−ＣＳＦの組み合わせが用いられてもよい。特定の実施形態では、細胞培養物の、分化用のＰＳＣを調製するための第１の培地、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びＦＧＦを含む第２の培地、次いでＦｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＩＬ−３、及びＩＬ−６を含む第３の培地中の培養物への逐次的曝露により、多能性細胞がＨＰＣ及び造血細胞に分化されうる。第２の限定培地はまた、ヘパリンを含みうる。さらに、ＢＭＰ４及びＶＥＧＦを含有する培地へのＦＧＦ−２（５０ｎｇ／ｍｌ）の封入は、多能性細胞からの造血前駆細胞の生成の効率を増強しうる。さらに、第１の限定培地へのグリコーゲンシンターゼキナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１、ＢＩＯ、及びＳＢ−２１６７６３）の封入は、ＨＰＣの生成をさらに増強しうる。
【０１７９】
一般に、多能性細胞の造血前駆細胞への分化は、定義された条件又は定義されていない条件を用いて実施されてもよい。定義された条件が、得られる細胞がヒト対象への投与が意図される場合の実施形態では一般に好ましいことは理解されるであろう。造血幹細胞は、定義された条件下で（例えばＴｅＳＲ培地を用いて）多能性幹細胞から誘導されてもよく、また造血細胞は、多能性細胞由来の胚様体から作製されてもよい。他の実施形態では、多能性細胞は、ＯＰ９細胞又はマウス胚性線維芽細胞上で共培養され、次いで分化されてもよい。
【０１８０】
多能性細胞は、分化プロセスの一部として胚様体又は凝集体を形成することが可能であってもよい。分化を誘導するための「胚様体」（ＥＢ）、又は増殖細胞群の形成は、一般にはヒト多能性幹細胞のＥＢへのインビトロ凝集を含み、ヒト多能性幹細胞の内胚葉、外胚葉、及び中胚葉起源を表す複数の組織型への自発的及びランダム分化を可能にする。したがって、三次元のＥＢは、いくつかの造血細胞及び内皮細胞画分を生成するため、使用可能である。
【０１８１】
ＥＢは、以下のプロトコルを用いて形成されてもよい。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングされたプレート上でのフィーダーフリーでの増殖に適応した未分化ｉＰＳＣは、室温で約８〜１０分間の０．５ＭＥＤＴＡ処理を用いた培養密度で収集されてもよい。ＥＤＴＡは、インキュベーション後に吸引され、ＥＢは、ＲＯＣＫ阻害剤又はブレビスタチンを含有するＳＦＤ培地中の該細胞を収集することにより形成されてもよい。該培地は翌日、異なるサイトカイン製剤を含有するＥＢ１分化培地に変更されてもよい。該細胞は、凝集体形成を促進するため、２５〜５０万個の細胞／ｍｌの密度で蒔かれる。
【０１８２】
凝集体形成を促進するため、該細胞は、７５％ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ＲＡ添加物を有しない０．０５％Ｎ２及びＢ−２７が添加された２５％ハム改変Ｆ１２（Ｃｅｌｌｇｒｏ）、２００ｍＭの１−グルタミン、０．０５ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸−２−リン酸マグネシウム塩（Ａｓｃ２−Ｐ）（ＷＡＫＯ）、及び４．５×１０-4のＭＴＧからなる無血清分化（ＳＦＤ）培地中での一晩インキュベーションのため、低吸着プレートに移されてもよい。翌日、細胞は、各ウェルから収集され、遠心分離されてもよい。次に、該細胞は、分化から最初の４日間、約５０ｎｇ／ｍｌの骨形成因子（ＢＭＰ４）、約５０ｎｇ／ｍｌの血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、及び５０ｎｇ／ｍｌのｚｂ  ＦＧＦが添加されたＳＦＤ基礎培地からなる「ＥＢ分化培地」に再懸濁されてもよい。該細胞は、４８時間ごとに半分供給される。分化から５日目、培地は、５０ｎｇ／ｍｌの幹細胞因子（ＳＣＦ）、約５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）、５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−６（ＩＬ−６）、５０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−３（ＩＬ−３）、５０ｎｇ／ｍｌのトロンボポエチン（ＴＰＯ）が添加されたＳＦＤ培地からなる第２の培地と交換される。該細胞は、新しい分化培地が４８時間ごとに半分供給される。培地変更は、分化培養物を３００ｇで５分間沈降させ、分化培養物から体積の半分を吸引し、それに新しい培地を補充することにより実施される。特定の実施形態では、ＥＢ分化培地は、概ねＢＭＰ４（例えば約５０ｎｇ／ｍｌ）、ＶＥＧＦ（例えば約５０ｎｇ／ｍｌ）、また任意選択的にはＦＧＦ−２（例えば約２５〜７５ｎｇ／ｍｌ又は約５０ｎｇ／ｍｌ）を含んでもよい。上清は、吸引され、新しい分化培地と交換されてもよい。或いは、該細胞は、新しい培地に２日ごとに半分供給されてもよい。該細胞は、分化プロセス中の異なる時点で収集されてもよい。
【０１８３】
ＨＰＣは、限定培地を用いて多能性幹細胞から培養されてもよい。限定培地を用いての多能性細胞の造血ＣＤ３４+幹細胞への分化のための方法は、例えば、米国特許出願第１２／７１５，１３６号明細書（その全体が参照により援用される）に記載されている。これらの方法は、本開示で用いられてもよいことが期待される。
【０１８４】
例えば、造血ＣＤ３４+分化を誘導するため、限定培地が用いられてもよい。限定培地は、増殖因子ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３及び／又はＧＭＣＳＦを含有してもよい。多能性細胞は、ＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、また任意選択的にはＦＧＦ−２を含む第１の限定培地中で培養され、次いで、（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、及びＧＭＣＳＦ）又は（Ｆｌｔ３リガンド、ＩＬ−３、ＩＬ−６、及びＴＰＯ）のいずれかを含む第２の培地中で培養されてもよい。第１及び第２の培地はまた、ＳＣＦ、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＧＦ−２、及び／又はＴＰＯの１つ以上を含んでもよい。実質的な低酸素条件（例えば２０％未満のＯ2）が、造血又は内皮分化をさらに促進してもよい。
【０１８５】
細胞は、機械的又は酵素的手段を介して（例えばトリプシン又はＴｒｙｐＬＥ（商標）を用いて）実質的に個別化されてもよい。ＲＯＣＫ阻害剤（例えばＨ１１５２又はＹ−２７６３２）も、該培地中に含まれてもよい。これらの手法は、例えばロボティックオートメーションを用いて自動化されてよいことが期待される。
【０１８６】
特定の実施形態では、多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進するため、実質的な低酸素条件が用いられてもよい。当業者によって理解されるであろうが、約２０．８％未満の大気酸素含量は低酸素性と考えられることになる。培養下でのヒト細胞は、外気と比べて低下した酸素含量を有する大気条件下で増殖しうる。この相対的低酸素は、培地に曝露された大気酸素を低減することにより、達成されてもよい。胚細胞は、典型的には、一般に二酸化炭素が環境レベルで大気酸素が約１％〜約６％の間での低下した酸素条件下で、インビボで発生する。理論によって拘束されることを望まないが、低酸素条件が特定の胚発生条件の態様を再現することがあると期待される。下の例に示されるように、特定の実施形態では、多能性細胞、例えばｉＰＳＣ又はｈＥＳＣの、より分化した細胞型、例えばＨＰＣへのさらなる分化を促進するため、低酸素条件を用いることができる。
【０１８７】
多能性細胞の造血前駆細胞への分化を促進するため、以下の低酸素条件が用いられてもよい。特定の実施形態では、造血前駆細胞への分化を促進するため、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、未満約１５％、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、未満約１０％、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約５％、約４％、約３％、約２％、又は約１％の大気酸素含量が用いられてもよい。特定の実施形態では、低酸素大気は、約５％の酸素ガスを含む。
【０１８８】
任意の所与の造血前駆細胞の拡大において特定の培地が用いられることに無関係に、用いられる培地は、好ましくは、少なくとも１つのサイトカインが約０．１ｎｇ／ｍＬ〜約５００ｎｇｍＬ、より通常的には１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬの濃度で添加される。好適なサイトカインとして、限定はされないが、ｃ−キットリガンド（ＫＬ）（造血幹細胞因子（ＳｔＩ）、マスト細胞増殖因子（ＭＧＦ）、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）とも称される）、ＩＬ−６、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１１  ＭＩＰ−１α、ＬＩＦ、ｃ−ｍｐｌリガンド／ＴＰＯ、及びｆｌｋ２／ｆｌｋ３リガンド（Ｆｌｔ２Ｌ又はＦｌｔ３Ｌ）が挙げられる。特に、培養物は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及びＴＰＯの少なくとも１つを含むことになる。より詳細には、培養物は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３Ｌ及びＴＰＯを含むことになる。
【０１８９】
一実施形態では、サイトカインは、培地に含有され、培地灌流により補充される。或いは、バイオリアクターシステムを用いるとき、サイトカインは、別々の入口を通じて、濃縮溶液として、培地灌流なしに、別々に添加されてもよい。サイトカインが灌流なしに添加されるとき、それらは典型的には、バイオリアクター内の容積の１／１０〜１／１００に等しい量で１０倍〜１００倍溶液として添加され、新しいサイトカインは約２〜４日ごとに添加されることになる。さらに、新しい濃縮されたサイトカインはまた、灌流培地中のサイトカインに、さらに別々に添加されうる。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、ＨＰＣは、破壊されたメチル−ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）を示し、骨髄分化又はリンパ系分化を促進するための条件下で培養される。いくつかの態様では、ＨＰＣは、メチル化ＤＮＡへの結合性を本質的に有しない非機能的ＭｅＣＰ２を発現する。特定の態様では、ＨＰＣは、ＭｅＣＰ２  ＤＮＡ結合活性をもたらすのに十分なレベルでＭｅＣＰ２を発現しない。特定の態様では、ＭｅＣＰ２は、ＭｅＣＰ２遺伝子における切断又は突然変異の理由で非機能的である。いくつかの態様では、破壊されたＭｅＣＰ２を示すＨＰＣを得ることは、ＨＰＣをｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ又はＭｅＣＰ２の小分子阻害剤と接触させることを含む。
【０１９１】
（ｉ）例示的な三次元分化法
ＨＰＣへのＰＳＣ分化のための例示的方法は、フィーダーフリー条件下、例えば、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（Ｅ８）培地中、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はビトロネクチンでコーティングされたプレート上での維持を含む。凝集体は、５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ−３阻害剤）、及びブレビスタチン（ミオシンＩＩ阻害剤）（例えば２〜１０μＭ、例えば１０μＭ）が添加されたＥｓｓｅｎｔｉａｌ  ３（Ｅ３）培地（例えば、Ｅ８培地の８中３の成分のみを含有する：ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地、アスコルビン酸（例えば１００〜５００μＭ）、２−リン酸マグネシウム及び亜セレン酸ナトリウム）中、特にサブコンフルエント、０．５〜１百万細胞／ｍｌの密度で例えば８０％未満のコンフルエンスでのＰＳＣから作られる。凝集体形成、及びその後のステップは、連続撹拌下、超低付着（ＵＬＡ）フラスコ内での２４時間の培養中、実施される。
【０１９２】
形成された細胞凝集体（即ちＥＢ）は、サイトカイン（２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５０ｍｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２）を誘導する造血中胚葉が添加された無血清分化培地（例えば、５０％ＩＭＤＭ、５０％Ｈａｍｓ  Ｆ１２培地、１００μｇ／ｍｌのポリビニルアルコール、１００μｇ／ｍｌの組換えヒト血清アルブミン、１×非必須アミノ酸添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１×既知組成の脂質添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１２５μＭのアスコルビン酸２−リン酸マグネシウム、０．２５μＭのリノール酸、微量元素添加物Ａ（０．３×）、Ｂ（０．２×）及びＣ（０．１×）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、５ｍＭの塩化ナトリウム、１００μＭのモノチオグリセロール、２０μＭのエタノールアミン、１００ｎｇ／ｍｌのヘパリン、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１）にさらに移される。培養は、２日目の完全培地変更を伴い、例えば４日間継続される。
【０１９３】
造血ＣＤ３４+前駆細胞の分化及び拡大を支持するため、細胞凝集体が、造血支持サイトカイン、例えば、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、２０ｍｇ／ｍｌのＴＰＯ、１０ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３Ｌ、２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３、及び２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４が添加された無血清分化培地（上記）にさらに移される。培養は、２日目の完全培地変更を伴い、例えば４日間継続される。
【０１９４】
培養物は、分化プロセス後、例えば９日後、収集される。単一の細胞懸濁液が、例えばアクターゼ中に、分化細胞凝集体の消化を通じて得られる。次に、例えばＭＡＣＳによって単離された単離ＣＤ３４+細胞がＴ／ＮＫ分化培養物に蒔かれる、又は単離後１時間以内の後の使用のため、凍結保存される。
【０１９５】
（ｉｉ）例示的な二次元分化法
代替的な例示的方法では、ＰＳＣは、ＨＰＣの生成用の二次元分化プロトコルを受ける。まず、ＰＳＣが、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（Ｅ８）培地中、例えばＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）又はビトロネクチンでコーティングされて、フィーダーフリー条件下で、例えば５〜１０継代にわたり、低酸素条件に気候順応される。ＰＳＣは、個別化され、５ｕＭのブレビスタチン（例えば２〜１０μＭ、例えば１０μＭ）が添加された無血清限定（ＳＦＤ）培地の存在下、２５０００／ｃｍ2の密度で、ＰｕｒｅＣｏａｔアミンでコーティングされた６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）上に蒔かれる。ＳＦＤ基礎培地は、７５％ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２２００−０６９）（グルタミン及び２５ｍＭヘペス＋Ｐ／Ｓを有する）、２５％Ｈａｍｓ  Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  １０−０８０−ＣＶ）、０．５％Ｎ２添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １７５０２−０４８）、レチノイン酸を有しない１％Ｂ２７添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２５８７−０１０）、０．０５％ＢＳＡ、５０ｕｇ／ｍｌのアスコルビン酸、及び４．５×１０−４Ｍのモノチオグリセロールで、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ−４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦが添加されたものを含有してもよい。
【０１９６】
造血分化の誘導は、１日目、例えば、７５％ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２２００−０６９）（グルタミン及び２５ｍＭヘペス＋Ｐ／Ｓを有する）、２５％Ｈａｍｓ  Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  １０−０８０−ＣＶ）、０．５％Ｎ２添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １７５０２−０４８）、レチノイン酸を有しない１％Ｂ２７添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２５８７−０１０）、０．０５％ＢＳＡ、５０ｕｇ／ｍｌのアスコルビン酸、及び４．５×１０−４Ｍのモノチオグリセロールで、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦが添加されたものを含有するＳＦＤ基礎培地中で培養することにより開始される。２日目、培地は吸引され、細胞は、さらに４８時間、新しいＥＢ１培地（例えば、７５％ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２２００−０６９）（グルタミン及び２５ｍＭヘペス＋Ｐ／Ｓを有する）、２５％Ｈａｍｓ  Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  １０−０８０−ＣＶ）、０．５％Ｎ２添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １７５０２−０４８）、レチノイン酸を有しない１％Ｂ２７添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２５８７−０１０）、０．０５％ＢＳＡ、５０ｕｇ／ｍｌのアスコルビン酸、及び４．５×１０−４Ｍのモノチオグリセロールで、５０ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、ＶＥＧＦ、及びｂＦＧＦが添加されたものを含有するＳＦＤ基礎培地）に配置された。
【０１９７】
５〜１０日目、培地は吸引され、細胞は、次の４８時間、ＥＢ２培地に配置された。ＥＢ２培地は、７５％ＩＭＤＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２２００−０６９）（グルタミン及び２５ｍＭヘペス＋Ｐ／Ｓを有する）、２５％Ｈａｍｓ  Ｆ１２（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ  １０−０８０−ＣＶ）、０．５％Ｎ２添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １７５０２−０４８）、レチノイン酸を有しない１％Ｂ２７添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １２５８７−０１０）、０．０５％ＢＳＡ、５０ｕｇ／ｍｌのアスコルビン酸、及び４．５×１０−４Ｍのモノチオグリセロールで、５０ｎｇ／ｍｌのＦｌｔ−３リガンド、ＩＬ３、ＩＬ６、ＳＣＦ、及びＴＰＯ（各々、５０ｎｇ／ｍｌ及び５０００Ｕ／ｍｌのヘパリン）が添加されたものを含有する新しいＳＦＤ基礎培地を含んでもよい。該細胞は、分化の７、８、９、１０日目にＴｒｙｐＬＥを用いて収集され、ＨＰＣマーカー及びリンパ系前駆細胞の存在について染色される。
【０１９８】
２．フォワードプログラミング
本開示の特定の実施形態は、造血細胞の分化／機能にとって重要なプログラミング遺伝子の組み合わせの発現を介したＣＡＲ−ＰＳＣのフォワードプログラミングにより、ＨＰＣを提供する。一方法では、ＰＳＣは、例えば国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７８９３号明細書（その全体が参照により本明細書中に援用される）に記載の、ＥＴＳ遺伝子（例えば、ＥＴＣ２又はＥＲＧ）、造血発生遺伝子（例えば、ＧＡＴＡ２）、及びホメオボックス遺伝子（例えば、ＨＯＸＡ９）などの少なくとも３つの造血前駆体プログラミング遺伝子を発現するように修飾される。特定の態様では、ＥＴＶ２／ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９遺伝子は、１つのベクター、例えば誘導性ＰｉｇｇｙＢａｃベクターにより、ＣＡＲ−ＰＳＣにトランスフェクトされた双方向Ｔｉｇｈｔプロモーターを用いて、同時発現される。
【０１９９】
さらに、ＥＧＨ−ＣＡＲ−ＰＳＣは、長期生着能のための追加的な遺伝子を発現するようにさらに修飾されてもよい。例示的な遺伝子として、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、ＨＯＸＡ４、ＺＮＦ４１４、ＫＬＦ４、ＺＮＦ１３１、ＢＣＬ２、ＥＴＶ６、ＺＮＦ３５０、及び／又はＲＢＡＫが挙げられる。例えば、ＰＳＣは、ＨＭＧＡ２、ＭＹＣＮ、ＮＲ４Ａ２、ＳＯＸ１７、ＴＦＥＣ、ＭＥＩＳ１、及びＨＯＸＡ４を発現するための１つ以上のベクターがトランスフェクトされてもよい。
【０２００】
好ましくは、ＥＴＶ２／ＧＡＴ２／ＨＯＸＡ９遺伝子は、ＰＳＣを造血前駆細胞にフォワードプログラムするのに十分な期間に限って発現される。したがって、造血前駆体プログラミング遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下でありうる。したがって、造血前駆体プログラミング遺伝子の発現は、多系統造血前駆細胞にフォワードプログラムするのに十分な期間、ＰＳＣにおいて誘導されうる。その期間は、約１日〜約２０日、例えば、約３、４、５、６、７、８、９、又は１０日でありうる。或いは、造血前駆体プログラミング遺伝子は、エピソームベクターによりＰＳＣに導入されうる。したがって、造血前駆体プログラミング遺伝子の場合、ＰＳＣにおいて一過性に発現されうる。
【０２０１】
Ｂ．リンパ系細胞分化
次に、ＨＰＣは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びＴ／ＮＫ細胞を含むリンパ系細胞にさらに分化されうる。いくつかの態様では、分化中のＨＰＣは、リンパ系細胞への分化のため、７〜１２日目、例えば８〜１１日目、単離される。この段階でのＨＰＣは、ＣＤ３４及びＣＤ４３の発現により同定されてもよい。さらに、リンパ系能力を有するＨＰＣは、ＣＤ１４４、ＤＬＬ４、ＣＤ７及びＣＤ２３５を、１１日目に低下する低いレベルで発現しうるが、これらのマーカーの発現の特定の閾値レベルが、細胞をＤＬＬ４の存在下でリンパ系分化に向けて予備刺激するのに必要であることを意味する。
【０２０２】
いくつかの態様では、分化プロセスの７〜１１日目、例えば、７日目、８日目、９日目、１０日目又は１１日目に単離したＨＰＣは、Ｔ及びＮＫ細胞などのリンパ系細胞に分化されうる。いくつかの態様では、リンパ系前駆細胞における起源のタイミングは、ＨＰＣ分化中の血液内皮前駆細胞の減少及び赤血球前駆細胞の出現に一致する。特定の態様では、９日目のＨＰＣは、Ｔ細胞生成時の効率上昇を有してもよい。リンパ系分化の能力があるＨＰＣは、特定マーカーの発現により、単離及び／又は同定されうる。例えば、ＣＤ３４及び／又はＣＤ４３の表面発現、特にＣＤ３４及びＣＤ４３の双方の発現を伴う細胞は、リンパ系分化について、例えばＭＡＣＳ選別により選択されてもよい。
【０２０３】
リンパ系前駆細胞を検出するための追加的なマーカーとして、ＤＬＬ４、ＣＤ１４４、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ４３lo、ＣＤ４５lo/-、ＣＤ２３５、ＣＤ７、Ｆｌｋ−１、ＡＰＮＬＲが挙げられる。特定の態様では、ＣＤ３４／ＣＤ７、ＣＤ２３５／ＣＤ７、ＤＬＬ４／ＣＤ３４、ＤＬＬ４／ＣＤ３１、ＤＬＬ４／ＣＤ１４４、又はＣＤ３４／ＣＤ４３lo二重陽性集団の存在が、リンパ系前駆細胞を同定するため、用いられる。ＨＰＣ上でのＣＤ１４４の発現は、ＣＤ３１、ＣＤ３４及びＤＬＬ４と共染色される。ＨＰＣ上でのＣＤ７の発現では、ＣＤ２３５、ＣＤ３４及びＣＤ４３との共染色がなされる。それ故、ＣＤ１４４及びＣＤ７を同時発現するＨＰＣは、リンパ系能力により、膜結合ノッチリガンド（ＤＬＬ４）を血液内皮マーカーと共に発現する前駆体が捕捉され、インビトロで最終的な造血発生の系列を生成する能力があるリンパ系前駆細胞を出現させるための表現型シグネチャーが作出されることを示す。特定の態様では、ＨＰＣは、ＣＤ３１、ＣＤ３４、ＣＤ１４４、ＣＤ４３、ＣＤ４５、ＣＤ６、ＣＤ３３５、Ｆｌｋ−１、及びＤＬＬ４を含む表面マーカーの選別により、増強されたリンパ系能力を有する細胞にさらに選別されてもよい。いくつかの態様では、ＨＰＣのＣＤ１１４／ＣＤ３４、ＣＤ１４４／ＣＤ４５、ＣＤ１４４／ＣＤ７、及びＣＤ１４４／ＣＤ３４／ＣＤ４５／ＣＤ７の陽性画分は、リンパ系細胞に分化される。特定の態様では、ＨＰＣのＣＤ１４４／ＣＤ７陽性画分は、リンパ系細胞に分化される。
【０２０４】
ＨＰＣは、リンパ系分化のための規定されたフィーダーフリー条件下で培養されてもよい。培地は、１つ以上のマトリックス成分、例えば、レトロネクチン、フィブロネクチン又はＲＧＤペプチドを含有してもよい。いずれの理論にも拘束されたくないが、マトリックス成分は、胚性幹細胞の増殖用の固体支持体を提供することがある。特定の実施形態では、マトリックス成分は、培養表面に適用され、細胞を培地に播種する前に、培地と接触されてもよい。例えば、細胞は、細胞を凝集塊に機械的に分離するか又は細胞を個別化し、且つ造血前駆細胞に分化誘導する前、フィブロネクチン又はＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）でコーティングされたプレート上の限定培地（例えばＴｅＳＲ培地）中で培養されてもよい。
【０２０５】
様々なマトリックス成分が、多能性細胞を培養するため、用いられてもよく、例えば、コラーゲン（例えば、コラーゲンＩＶ）、ラミニン、ビトロネクチン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、ゼラチン、ポリリジン、トロンボスポンジン（例えば、ＴＳＰ−１、−２、−３、−４及び／又は−５）、及び／又はＰＲＯＮＥＣＴＩＮ−Ｆ（商標）が挙げられる。特定の実施形態では、ＴｅＳＲを用いて予め培養された細胞でのＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、コラーゲンＩＶ、又はラミニンのみの使用は、細胞生存度に対して生じうる有害作用が理由で回避されてもよいが、これらの組成物は、有利には他のマトリックス成分と併用されてもよい。これらマトリックス成分の組み合わせは、細胞増殖及び細胞生存度を促進するためのさらなる利益をもたらすことがある。特定の実施形態では、細胞を例えば造血分化前に培養するため、上記マトリックス成分の１、２、３、４、５、６、又はそれ以上が用いられてもよい。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、リンパ系分化を増強するため、アスコルビン酸が用いられてもよい。限定培地は、約１０μＭ〜約１ｍＭ、例えば１００〜５００μＭ、例えば約５０μＭ〜約１００μＭ、例えば約９５μＭのアスコルビン酸が添加されてもよい。アスコルビン酸は、様々なアスコルビン酸塩、例えばリン酸アスコルビン酸マグネシウムから選択されてもよい。いくつかの実施形態では、リンパ系分化を増強するため、ニコチンアミド（例えばニコチン酸）が、例えば約０．１ｍＭ〜約５ｍＭの濃度で用いられてもよい。
【０２０７】
いくつかの態様では、ＨＰＣは、対象におけるノッチリガンドの生成を増強する物質を投与することによってノッチリガンドの内因性活性を改変することにより、リンパ系細胞、例えばＴ細胞に分化される。方法はまた、ノッチリガンド並びにＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３及びＩＬ−３からなる群から選択される１つ以上のサイトカインを有効量で含む培地中で該細胞を培養することを含む。いくつかの特定の実施形態では、該培地は、ＩＬ−６をさらに含みうる。いくつかの実施形態では、ノッチリガンドは、δ４ノッチリガンド（ＤＬＬ４）、例えばＤＬＬ４：Ｆｃキメラである。
【０２０８】
Ｔ細胞系列の細胞の分化及び増殖を促進及び維持するノッチリガンドが選択される。ノッチリガンドは、起源がヒトであってもよい、又は齧歯類、イヌ、ネコ、ブタ、ヒツジ、雌ウシ、ヤギ、及び霊長類などの哺乳動物種を含む他種に由来してもよい。ノッチリガンドの特定例として、デルタファミリーが挙げられる。デルタファミリーは、δ−１（ジェンバンク受入番号ＡＦ００３５２２、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、δ−３（ジェンバンク受入番号ＡＦ０８４５７６、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））、δ様１（ジェンバンク受入番号ＮＭ＿００５６１８及びＮＰ＿００５６０９、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）；ジェンバンク受入番号Ｘ８０９０３、Ｉ４８３２４、ハツカネズミ（Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ））、δ様３（ジェンバンク受入番号ＮＭ＿０５３６６６、Ｎ＿４４６１１８、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ））、δ−４（ジェンバンク受入番号ＡＦ２７３４５４、ＢＡＢ１８５８０、ハツカネズミ（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）；ジェンバンク受入番号ＡＦ２７９３０５、ＡＡＦ８１９１２、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ））、及びδ様４（ジェンバンク受入番号Ｑ９ＮＲ６１、ＡＡＦ７６４２７、ＡＦ２５３４６８、ＮＭ＿０１９０７４、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）；ジェンバンク受入番号ＮＭ＿０１９４５４、ハツカネズミ（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ））を含む。ノッチリガンドは、市販されている、又は組換えＤＮＡ技術により生成され、様々な程度に精製されうる。
【０２０９】
方法は、上記の培養下で分化されたＮＫ細胞を生成するのに十分な持続時間にわたりＨＰＣ細胞を維持するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、分化されたＮＫ細胞は、Ｔ細胞を伴う培養下で出現するが、ＮＫ細胞は、６週間後、増殖を停止することがある。一般に、ＮＫ細胞の数における増加及び／又はそれらの分化状態についての判定は、当業者に公知の通常の方法を用いて評価される。例えば、該培養細胞は、ＮＫ細胞の発現について、該細胞を抗ＣＤ５６及び抗ＣＤ３抗体で染色することにより、フローサイトメトリーによって監視されてもよい。抗ＣＤ３抗体、例えばＯＫＴ３は、０．５〜２μｇの濃度で存在してもよい。ＣＤ５６+／ＣＤ３-である細胞であれば、分化されたＮＫ細胞を示すことになる。
【０２１０】
特定の態様では、ＣＤ３+Ｔ細胞又はＣＤ５６+ＣＤ３-ＮＫ細胞へのリンパ系分化は、レトロネクチン及びＤＬＬ４でコーティングされたプレート上での二次元低酸素培養により実施される。特定の態様では、非組織培養処理プレートは、ＨＰＣのリンパ系分化における使用を意図して、ＤＬＬ４：Ｆｃキメラタンパク質及びＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（フィブロネクチン断片ＣＨ−２９６；宝酒造株式会社、日本）でコーティングされてもよい。該分化は、Ｔ／ＮＫ細胞分化の第１の期間、それに続くＴ又はＮＫ細胞拡大の第２の期間を含んでもよい。分化の第１の期間は約１週間〜約２週間であってもよく、また拡大の第２の期間もまた約１週間〜約２週間であってもよい。したがって、リンパ系分化及び拡大の全期間は、約２〜４週間であってもよい。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、リンパ系分化プロセスは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の細胞傷害性活性を増強するため、抗原特異的標的細胞、例えば抗原特異的腫瘍細胞との共培養を含んでもよい。特定の態様では、リンパ系分化の拡大期間は、抗原特異的標的細胞との共培養を含んでもよい。例えば、ＣＤ１９-ＣＡＲ−Ｔ細胞又はＮＫ細胞は、拡大期間中、例えば１〜３週間、特に２週間、ＣＤ１９+腫瘍細胞（例えば、ＣＤ１９+Ｄａｕｄｉ細胞）と共培養されてもよい。いくつかの態様では、拡大期間は、拡大を改善するため、サイトカイン、例えばＩＬ２、ＩＬ１５、及び／又はＩＬ２１、特にＩＬ２の添加をさらに含んでもよい。該サイトカインの濃度は、例えば１０〜５０μＭに最適化されてもよい。
【０２１２】
Ｃ．細胞培養
特定の実施形態では、ＨＰＣの骨髄又はリンパ系への分化を促進するため、実質的な低酸素条件が用いられてもよい。特定の実施形態では、造血前駆細胞への分化を促進するため、約２０％未満、約１９％未満、約１８％未満、約１７％未満、約１６％未満、約１５％未満、約１４％未満、約１３％未満、約１２％未満、約１１％未満、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約５％、約４％、約３％、約２％、又は約１％の大気酸素含量が用いられてもよい。特定の実施形態では、低酸素大気は、約５％の酸素ガスを含む。
【０２１３】
本明細書に記載の通り、ＨＰＣの骨髄及びリンパ系への分化を促進するため、有利には１つ以上の限定培地が用いられてもよく；特に、血清及びマウス支持細胞層などの動物産物の除去により、細胞の動物産物への曝露に伴うリスクが低減され、ヒト対象により安全に投与可能と思われる細胞の作製が可能になる。伝統的な幹細胞の培養発現が、幹細胞を種々の細胞型に分化させるための血清産物及びマウス支持細胞層に依存していることから、これらの伝統的方法は、分化が実施可能な規模を制限し、生物学的可変性及び潜在的汚染を増加させ、且つ通常であれば有用性が明らかであるかもしれないトランスレーショナル療法（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）におけるＥＳ細胞の使用を妨害している。
【０２１４】
一般に、本開示の細胞は、細胞増殖を持続可能な栄養素に富んだ緩衝液である培地中で培養される。本明細書に記載の方法に従う、多能性幹細胞の単離、拡大並びに造血前駆細胞及び造血細胞への分化に適した培地として、限定はされないが、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１５、ＲＰＭＩ１６４０、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、及びＯｐｔｉ−ＭＥＭ  ＳＦＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。合成培地は、ヒト血清アルブミン、ヒトＥｘＣｙｔｅリポタンパク質、トランスフェリン、インスリン、ビタミン、必須及び非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、グルタミン及びマイトジェンが添加された、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（Ｇｉｂｃｏ）などの最小必須培地を含むだけでなく、好適である。本明細書で用いられるとき、マイトジェンは、細胞の分裂を刺激する作用剤を指す。作用剤は、化学物質でありえ、通常は細胞が細胞分裂を開始することを促進し、有糸分裂を誘発するタンパク質の一部の形態でありうる。一実施形態では、米国特許出願第０８／４６４，５９９号明細書及び国際公開第９６／３９４８７号パンフレットに記載の場合などの無血清培地、及び米国特許第５，４８６，３５９号明細書に記載のような「完全培地」が、本明細書に記載の方法での使用を意図して検討される。いくつかの実施形態では、該培地は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ヒト自家血清、ヒトＡＢ血清又は血小板リッチ血漿（ヘパリン（２Ｕ／ｍｌ）が添加される）が添加される。
【０２１５】
免疫細胞は、多能性幹細胞又は造血前駆細胞を、該細胞の骨髄又はリンパ系への分化を促進するのに十分な因子の細胞内レベルを増加させる条件下の培地中で培養することにより作製されうる。該培地はまた、増殖因子の様々な種類のような１つ以上の造血細胞分化及び成熟化剤を含有してもよい。これらの作用剤は、細胞のより成熟した表現型への関与の誘導を補助する（又は成熟細胞の生存を優先的に促進する）、又はこれの効果のいずれの組み合わせも有することがある。分化剤及び成熟化剤は、造血細胞系列の細胞の増殖を促進する能力がある可溶性増殖因子（ペプチドホルモン、サイトカイン、リガンド−受容体複合体、及び他の化合物）を含んでもよい。かかる作用剤の非限定例として、限定はされないが、造血又は内皮増殖因子、例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＦＬＴ−３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−９（ＩＬ−９）、又は顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、又はそのアイソフォーム若しくは変異体が挙げられる。
【０２１６】
ＩＶ．抗原特異的免疫細胞の使用
特定の態様の方法及び組成物によって提供される抗原特異的免疫エフェクター細胞は、種々の用途において使用可能である。これらは、限定はされないが、ほんの数例を挙げれば、インビボでの細胞の移植又は注入；細胞傷害性化合物、発がん物質、突然変異原の増殖／制御因子、医薬化合物などのインビトロでのスクリーニング；血液学的疾患及び損傷の機構の解明；作用剤及び／又は増殖因子が機能する機構の研究；患者におけるがんの診断及び監視；遺伝子治療；並びに生物活性生成物の生成を含む。
【０２１７】
Ａ．試験化合物のスクリーニング
本開示の免疫細胞は、本明細書に提供されるリンパ系細胞の特徴に影響を及ぼす因子（溶媒、小分子薬、ペプチド、及びポリヌクレオチドなど）又は環境条件（培養条件又は操作など）をスクリーニングため、使用可能である。
【０２１８】
本開示の特定のスクリーニング用途は、薬剤研究における医薬化合物の試験に関する。読者は、一般には、標準教科書のＩｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９７、及び米国特許第５，０３０，０１５号明細書を参照する。特定の態様では、骨髄及びリンパ系細胞は、短期間培養下、造血細胞及び前駆体で以前に実施されている通り、標準的薬剤スクリーニング及び毒性アッセイにおける試験用細胞の役割を担う。候補医薬化合物の活性の評価は、一般に、特定の態様に提供される造血細胞又は前駆体を候補化合物と組み合わせること、形態における任意の変化、マーカー表現型、又は（不活性化合物で処置された１又は複数の未処置細胞と比べての）該化合物に起因し得る細胞の代謝活性を判定すること、次に該化合物の効果を観察された変化と相関させることを含む。該スクリーニングは、該化合物が造血細胞又は前駆体に対する薬理学的効果を有するように設計される、又は他の効果を有するように設計された化合物が造血細胞又は前駆体に対して意図されない効果を有してもよい、のいずれかの理由で実施されてもよい。２以上の薬剤は、考えられる薬剤−薬剤相互作用効果を検出するため、（同時的又は経時的のいずれかにしても該細胞と組み合わせることにより）組み合わせて試験されうる。
【０２１９】
Ｂ．養子細胞療法
いくつかの実施形態では、本開示は、免疫療法のための方法であって、本開示の免疫細胞を有効量で投与することを含む、方法を提供する。一実施形態では、内科疾患又は障害は、免疫応答を誘発する免疫細胞集団の導入により治療される。本開示の特定の実施形態では、がん又は感染は、免疫応答を誘発する免疫細胞集団の導入により治療される。本明細書では、個体におけるがんの進行を治療する、又は遅延させるための方法であって、を含む、抗原特異的細胞療法剤を有効量で個体に投与することを含む、方法が提供される。本方法は、免疫異常、固形がん、血液がん、及びウイルス感染の治療に適用されてもよい。
【０２２０】
本治療方法が有用である場合の腫瘍は、任意の悪性細胞タイプ、例えば固形腫瘍又は血液腫瘍に見出されるものを含む。例示的な固形腫瘍として、限定はされないが、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭、首、卵巣、腎臓、喉頭、肉腫、肺、膀胱、メラノーマ、前立腺、及び乳房からなる群から選択される臓器の腫瘍を挙げることができる。例示的な血液腫瘍として、骨髄の腫瘍、Ｔ又はＢ細胞悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽細胞腫、骨髄腫などが挙げられる。本明細書に提供される方法を用いて治療されてもよいがんのさらなる例として、限定はされないが、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺の腺がん、及び肺の扁平上皮がんを含む）、腹膜のがん、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）又は胃（ｓｔｏｍａｃｈ）がん（胃腸がん及び胃腸間質がんを含む）、膵がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝がん、膀胱がん、乳がん、大腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜又は子宮がん、唾液腺がん、腎（ｋｉｄｎｅｙ）又は腎（ｒｅｎａｌ）がん、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、様々なタイプの頭頚部がん、及びメラノーマが挙げられる。
【０２２１】
がんは、詳細には、限定はされないが、以下の組織学的タイプ：悪性新生物；がん腫；未分化がん腫；巨細胞がん及び紡錘細胞がん；小細胞がん；乳頭がん；扁平上皮がん；リンパ上皮がん；基底細胞がん；毛母がん；移行上皮がん；乳頭状移行上皮がん；腺がん；悪性ガストリン産生腫瘍；胆管がん；肝細胞がん；肝細胞がん及び胆管がんの合併；索状腺がん；腺様嚢胞がん；腺腫性ポリープにおける腺がん；腺がん、家族性結腸ポリポーシス；固形がん；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞腺がん；乳頭状腺がん；色素嫌性がん；好酸性がん；好酸性腺がん；好塩基性がん；明細胞腺がん；顆粒細胞がん；濾胞腺がん；乳頭腺がん及び濾胞腺がん；非被包性硬化性がん；副腎皮質がん；類内膜がん；皮膚付属器がん；アポクリン腺がん；皮脂腺がん；耳垢腺がん；粘膜表皮がん；嚢胞腺がん；乳頭嚢胞腺がん；乳頭漿液性嚢胞腺がん；粘液性嚢胞腺がん；粘液性腺がん；印環細胞がん；浸潤性導管がん；髄様がん；小葉がん；炎症性がん；乳房のパジェット病；腺房細胞がん；腺扁平上皮がん；扁平上皮化生を伴う腺がん；悪性胸腺腫；悪性の卵巣間質腫；悪性莢膜細胞腫；悪性顆粒膜細胞腫；悪性アンドロブラストーマ；セルトリ細胞腫；悪性ライディッヒ細胞腫；悪性脂質細胞腫瘍；悪性傍神経節腫；悪性乳房外傍神経節腫；褐色細胞腫；血管球血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；悪性黒子由来黒色腫；末端黒子型黒色腫；結節性黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；がん肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胎児性がん；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛がん；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管外皮腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉性軟骨肉腫；骨巨細胞腫；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル芽細胞歯牙肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル芽細胞線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽腫；乏突起細胞腫；乏突起膠芽細胞腫；原始神経外胚葉性；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；小リンパ球性悪性リンパ腫；びまん性大細胞悪性リンパ腫；濾胞性悪性リンパ腫；菌状息肉腫；他の特定された非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；低グレード／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中間グレード／濾胞性ＮＨＬ；中間グレードびまん性ＮＨＬ；高グレード免疫芽球性ＮＨＬ；高グレードリンパ芽球性ＮＨＬ；高グレード小非切断細胞ＮＨＬ；バルキー病ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞性白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞性白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；ヘアリー細胞白血病；慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）；並びに慢性骨髄芽球性白血病であってもよい。
【０２２２】
治療用途として本明細書に提供される細胞の適合性を判定するため、該細胞はまず、好適な動物モデルにおいて試験されうる。１つのレベルで、細胞は、インビボで生存し、それらの表現型を維持するそれらの能力について評価される。本明細書に提供される細胞は、免疫不全動物（例えばＮＯＧマウス、又は化学的に若しくは放射線照射により免疫不全にされた動物）のさらなら観察が許容される部位、例えば腎臓カプセルの下、脾臓内、肝小葉内、又は骨髄内に投与される。組織は、数日から数週又はそれ以上の期間後、収集され、赤血球などの開始細胞型がさらに存在するか否かについて評価される。これは、投与された細胞に検出可能な標識（例えば緑色蛍光タンパク質、又はβ−ガラクトシダーゼ）を提供することにより；又は投与されたヒト細胞に特異的な構成的マーカーを測定することにより、実施されうる。本明細書に提供される細胞が齧歯類モデルにおいて試験中である時、投与された細胞の存在及び表現型は、ヒト特異抗体を用いる免疫組織化学又はＥＬＩＳＡにより、又はヒトポリヌクレオチド配列に特異的であるような増幅を引き起こすプライマー及びハイブリダイゼーション条件を用いるＲＴ−ＰＣＲ分析により、評価可能である。ｍＲＮＡ又はタンパク質レベルでの遺伝子発現を評価するのに適したマーカーが、本開示における他の箇所に提供される。
【０２２３】
本開示の方法によって提供される免疫細胞は、様々な動物モデルにおいて、血液学的障害及び損傷を治療するそれらの能力について試験されてもよい。例えば、鎌状赤血球貧血マウスモデル又はＴ／Ｂ細胞欠損Ｒａｇ−２ノックアウトマウスが、本明細書に開示される骨髄及びリンパ系細胞を試験するための特に有用な動物モデルであってもよい。
【０２２４】
動物モデルにおける望ましい機能特性又は有効性を示す、本開示の特定の態様に提供される免疫細胞はまた、それを必要とするヒト対象への直接投与に適してもよい。止血を目的として、該細胞は、循環に対して十分な接近性を有する任意の部位に投与されうる。造血細胞又はその前駆体はまた、損傷又は疾患の部位に送達されてもよい。
【０２２５】
本開示の特定の態様に提供される細胞は、それを必要とする任意の対象の治療に使用可能である。かかる治療に適することがあるヒト状態は、様々な貧血及び異常ヘモグロビン症、並びに造血細胞数の減少によって特徴づけられる疾患（例えば、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、好中球減少症、無顆粒球症、グランツマン血小板無力症、血小板減少症、及び後天性免疫不全症候群など）を含む。ヒト治療においては、用量は、一般に、対象の体重、苦痛の性質及び重症度、並びに投与された細胞の複製能について調節して、約１０9〜１０12個の細胞、典型的には約５×１０9〜５×１０10個の細胞である。治療方法及び適切な用量を決定するための究極的責任は、監督臨床医（ｍａｎａｇｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃｉａｎ）とともにある。
【０２２６】
治療有効量の免疫細胞は、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、若しくは関節内注射、又は注入を含むいくつかの経路により投与されうる。
【０２２７】
養子細胞療法における使用を意図した治療有効量の免疫細胞は、治療中の対象において所望される効果を達成する量である。例えば、これは、進行を阻害する、若しくは自己免疫若しくは同種免疫疾患の退行を引き起こすのに必要である、又は自己免疫性疾患、例えば疼痛及び炎症によって引き起こされる症状を軽減する能力がある免疫細胞の量でありうる。それは、炎症、例えば、疼痛、浮腫及び体温上昇に関連する症状を軽減するのに必要な量でありうる。それはまた、移植された臓器の拒絶を低減又は予防するのに必要な量でありうる。
【０２２８】
免疫細胞集団は、疾患に合致する治療計画、例えば、病態を寛解するための１日〜数日にわたる単回若しくは数回用量、又は疾患の進行を阻害し、疾患の再発を予防するための延長期間にわたる定期的用量で投与されうる。製剤中に用いられるべき正確な用量はまた、投与経路や、疾患又は障害の重症度に依存することになり、また施術者の判断及び各患者の環境に応じて決定されるべきである。免疫細胞の治療有効量は、治療中の対象、苦痛の重症度及びタイプ、並びに投与の様式に依存することになる。いくつかの実施形態では、ヒト対象の治療において使用可能な用量は、少なくとも３．８×１０4から、少なくとも３．８×１０5、少なくとも３．８×１０6、少なくとも３．８×１０7、少なくとも３．８×１０8、少なくとも３．８×１０9、又は少なくとも３．８×１０10の免疫細胞／ｍ2の範囲である。特定の実施形態では、ヒト対象の治療において用いられる用量は、約３．８×１０9〜約３．８×１０10の免疫細胞／ｍ2の範囲である。さらなる実施形態では、免疫細胞の治療有効量は、約５×１０6細胞／ｋｇ体重〜約７．５×１０8細胞／ｋｇ体重、例えば約２×１０7細胞〜約５×１０8細胞／ｋｇ体重、又は約５×１０7細胞〜約２×１０8細胞／ｋｇ体重で変動しうる。免疫細胞の正確な量は、対象の年齢、体重、性別、及び生理学的状態に基づいて当業者により容易に測定される。有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験システムから得られる用量反応曲線から外挿されうる。
【０２２９】
免疫細胞は、免疫介在性障害の治療用の１以上の他の治療薬と組み合わせて投与されてもよい。併用療法剤は、限定はされないが、１つ以上の抗微生物剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤及び抗真菌剤）、抗腫瘍剤（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、パクリタキセル、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン、又はビンクリスチン）、免疫枯渇剤（ｉｍｍｕｎｅ−ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン、又はビンクリスチン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、又はグルココルチコイド、例えばデキサメタゾン若しくはプレドニゾン）、抗炎症剤（例えば、グルココルチコイド、例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾン若しくはプレドニゾン、又は非ステロイド性抗炎症剤、例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェン若しくはナプロキセンナトリウム）、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１０又はトランスフォーミング増殖因子β）、ホルモン（例えば、エストロゲン）、又はワクチンを含みうる。さらに、限定はされないが、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン及びタクロリムス）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えばラパマイシン）；ミコフェノール酸モフェチル、（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＩＶＩＧ、又はＢ細胞を認識する）抗体；化学療法剤（例えば、メトトレキサート、トレオスルファン、ブスルファン）；放射線照射；又はケモカイン、インターロイキン若しくはそれらの阻害剤（例えば、ＢＡＦＦ、ＩＬ−２、抗ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＪＡＫキナーゼ阻害剤）を含む免疫抑制剤又は免疫寛容誘発剤（ｔｏｌｅｒｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）が投与可能である。かかる追加的な医薬品は、所望される効果に応じて、免疫細胞の投与の前、間、又は後に投与可能である。細胞及び薬剤のこの投与は、同じ経路により、又は異なる経路により、また同じ部位又は異なる部位のいずれかに可能である。
【０２３０】
Ｃ．医薬組成物
さらに、本明細書では、免疫細胞（例えばＴ細胞又はＮＫ細胞）及び薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物及び製剤が提供される。投与は、自家又は非自家でありうる。例えば、Ｔ細胞及び／又はＮＫ細胞並びにそれらを含む組成物は、１つの対象から入手され、且つ同じ対象又は異なる適合する対象に投与されうる。本開示の免疫細胞は、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射、又は非経口投与を含む局所注射を介して投与されうる。本開示の治療組成物を投与するとき、それは一般に、単位用量の注射剤型（例えば、溶液、懸濁液、乳濁液）で配合されることになる。
【０２３１】
本明細書に記載のような医薬組成物及び製剤は、所望される純度を有する活性成分（抗体又はポリペプチドなど）を、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、１つ以上の任意選択的な薬学的に許容できる担体と混合することにより調製されうる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２２nd  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２）。薬学的に許容できる担体は、一般に、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、限定はされないが、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジル；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及び他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、又はデキストリン；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤、を含む。本明細書中の例示的な薬学的に許容できる担体は、間質薬物分散剤、例えば可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えばヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標），Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）をさらに含む。特定の例示的なｒＨｕＰＨ２０を含むｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許出願公開第２００５／０２６０１８６号明細書及び米国特許出願公開第２００６／０１０４９６８号明細書に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなど、１つ以上の追加的なグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【実施例】
【０２３２】
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するため、含められる。以下の実施例中に開示される技術が、本発明の実施において十分に機能するような発明者によって発見された技術を表し、ひいてはその実施のための好ましい方法を構成すると考えることができることは、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施形態において多くの変更を設けられることを理解するだけでなく、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく同様又は類似の結果を得る必要がある。
【０２３３】
実施例１−抗ＣＤ１９  ＣＡＲを発現するＰＳＣ由来Ｔ／ＮＫ細胞の誘導
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する多能性幹細胞を作製するため、２つの別々の方法を用いた。一方法では、導入遺伝子を含まないＰＳＣを、レトロウイルスベクターを用いて１Ｃ細胞を生成し（米国特許出願公開第２０１６０２５７９３９号明細書；その全体が参照により本明細書中に援用される）又はエピソームベクターを用いてＥ１１細胞を生成することで、Ｔ細胞から誘導した。第２の方法では、ＰＳＣに造血プログラミング遺伝子（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ  ｇｅｎｅｓ）ＥＴＶ２／ＥＲＧ、ＧＡＴＡ２、及びＨＯＸＡ９をコードするＰｉｇｇｙＢａｃ発現ベクターをトランスフェクトし（Ｈ１  ＥＳＣをＤＯＸ誘導性ＥＴＶ２−ＧＡＴＡ２−ＨＯＸＡ９（ＥＧＨ）造血プログラミング遺伝子の導入により改変し）、Ａ１６細胞を生成した。次に、両方法からのＰＳＣを遺伝子組換えし、ＦＭＣ６３  ｍＡｂ由来のヒトＣＤ１９に結合するｓｃＦｖドメイン、ＣＤ２８同時刺激ドメイン及びＣＤ３ζシグナル伝達ドメインからなる第２世代の抗ヒトＣＤ１９キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を構成的に発現した。
【０２３４】
非修飾及びＣＡＲ修飾ＰＳＣを、サイトカイン分化誘導（１Ｃ、Ｅ１１）又はＥＧＨ誘導プログラミング（Ａ１６）を通じて、ＣＤ３４+Ｔ／ＮＫ前駆細胞に分化させた（図１Ａ〜Ｂ）。単離したＣＤ３４+前駆細胞を、リン酸アスコルビン酸マグネシウム（０．２５ｍＭ）、ニコチンアミド（２ｍＭ）及びサイトカイン（ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ７、ＩＬ２）を添加したＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中、ＤＬＬ４／レトロネクチンでコーティングしたプレート上での４週の低酸素培養物を用いて、ＣＤ３+Ｔ（１Ｃ、Ｅ１１）及びＣＤ３-ＣＤ５６+ＮＫ（Ａ１６）細胞にさらに分化させた。並行して、Ｔ／ＮＫ培養物に、マイトマイシンＣで処理したＤａｕｄｉ細胞（β２ミクログロブリン欠損ＨＬＡクラスＩ陰性ＣＤ１９+Ｂリンパ芽球様細胞株）を、抗原（ＣＤ１９）に特異的なＣＡＲ活性化の供給源として、分化の最後２週の間に添加した。作製したＴ／ＮＫ細胞を次のように名づけた：１Ｃ又はＥ１１由来Ｔ細胞−Ｔ、ＣＡＲ−Ｔ、ＣＡＲ−Ｔ／Ａｇ（Ｄａｕｄｉ共培養）；Ａ１６由来ＮＫ細胞−ＮＫ、ＣＡＲ−ＮＫ、ＣＡＲ−ＮＫ／Ａｇ（Ｄａｕｄｉ共培養）。
【０２３５】
分化段階全体を通じたＣＡＲの発現を、プロテインＬ染色を用いてフローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ３+Ｔ細胞を、λ鎖マウス抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂ（クローンＳＰ３４−２）と共染色した。Ｔ／ＮＫ細胞への分化後、ＣＡＲの発現が有意に抑制されたが、ＣＡＲ陽性Ｔ及びＮＫ細胞は、ＣＡＲに特異的な抗原との活性化培養（Ａｇ；ＣＤ１９+Ｄａｕｄｉ細胞と共培養）後、選択的に拡大可能であった。
【０２３６】
ＰＳＣ由来Ｔ（１Ｃ）及びＮＫ（Ａ１６）細胞の細胞傷害性機能を、ルシフェラーゼを発現するＣＤ１９+Ｄａｕｄｉ及びＲａｊｉ標的細胞を用いるインビトロ細胞傷害性アッセイにより評価した。標的を１：１の比でのＴ／ＮＫエフェクターとともに２４時間インキュベートし、ルシフェラーゼ活性を、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）により、培養ライセート中で定量化した。式：（１−（ＥＴ／Ｔ））×１００（式中、ＥＴ−エフェクター＋標的培養物、Ｔ−標的のみ）により、パーセント細胞傷害性を算出した。
【０２３７】
非修飾Ｔ／ＮＫ細胞が何らかの検出可能な活性が欠如していた一方で、両方のＣＡＲを発現するＴ（１Ｃ）及びＮＫ（Ａ１６）細胞は、ＣＤ１９+標的に対する細胞傷害性を示した。ＣＡＲ依存性細胞傷害性活性は、ＣＤ１９+標的（Ｄａｕｄｉ）細胞との２週のＴ／ＮＫ共培養（ＣＡＲ／Ａｇ変異体）後、有意に増強された（図３Ａ）。
【０２３８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞溶解能を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｓ３生細胞分析システム（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いるリアルタイム標的細胞計数により確認した。ＧＦＰを発現するＣＤ１９+Ｒａｊｉ標的細胞を、非修飾及びＣＡＲトランスフェクトＰＳＣ（Ｅ１１  ＴｉＰＳＣ）由来Ｔ細胞とともに１：１比でインキュベートした。ＧＦＰ+Ｒａｊｉ細胞のタイムラプスイメージング及び計数を、９時間にわたり実施した。生存可能（ＧＦＰ＋）Ｒａｊｉ細胞の有意な減少が、ＣＡＲ−Ｔ細胞のみとの培養下で検出された（図３Ｂ）。
【０２３９】
２週のＴ／ＮＫ分化とそれに続くＰＳＣ（Ｅ１１  ＴｉＰＳＣ）由来ＣＤ３４+ＨＰＣからの１週の抗ＣＤ３誘導Ｔ細胞の拡大培養により作製したＣＡＲ−Ｔ細胞を、ヒトＣＤ１９抗原をトランスフェクトしたマウスＰ８１５マスト細胞腫細胞（ＣＤ１９+Ｐ８１５）及び非トランスフェクトＰ８１５とともに２４時間インキュベートし、ＣＡＲ誘導性及び構成的サイトカイン産生を各々評価した。ＬＥＧＥＮＤｐｌｅｘフローサイトメトリー多重サイトカインアッセイ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を用いて、培養上清中のサイトカインを測定した（図４）。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ２、ＩＬ１３及びＧＭ−ＣＳＦの特異的なＣＡＲ誘導性産生を示した。ＰＳＣ由来ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性特性についても、構成的なグランザイムＢ分泌により示された。
【０２４０】
インビボでＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性を試験するため、８週齢ＮＳＧマウスに、５×１０4のルシフェラーゼを発現するＲａｊｉ細胞を腹膜内（ｉｐ）注射した。翌日（１日目）、Ｔ（１Ｃ由来）及びＮＫ（Ａ１６由来）細胞を、１０7／マウスの用量で注射した（ｉｐ）。３日目及び５日目、Ｔ／ＮＫ注射を反復した。Ｔ／ＮＫ注射の間（１〜５日目）、すべてのマウスに、ＩＬ２及びＩＬ１５サイトカインの組み合わせを（双方とも５００ｎｇ／マウスで）追加注射した（ｉｐ）。マウスにおける腫瘍増殖を、２週ごとにインビボ生物発光イメージングにより監視した（図５Ａ）。１５０ｍｇ／ｋｇのＩｎＶｉｖｏ−Ｇｌｏルシフェリン（Ｐｒｏｍｅｇａ）を注射した（ｉｐ）麻酔マウスを、ルシフェリン注射後１５分以内に、Ｐｅａｒｌ  Ｔｒｉｌｏｇｙインビボイメージャー（ＬｉＣｏｒ）を用いて分析した。ＰＳＣ由来Ｔ（１Ｃ）又はＮＫ（Ａ１６）細胞のいずれかで処置した異なるマウス群における生存曲線を図５Ｂに示す。
【０２４１】
２週目に検出された腫瘍は有意に抑制され、平均マウス生存は、ＣＡＲを発現するＰＳＣ由来Ｔ又はＮＫ細胞を用いた１回の処置期間（２日間隔で３回注射）で約２倍延長された。インビボでの腫瘍溶解能は、ＣＡＲを発現するＰＳＣ由来Ｔ又はＮＫ細胞のインビトロでの抗原陽性腫瘍細胞との先行的な共培養により、有意に改善されうる。
【０２４２】
実施例２−指向された分化誘導の方法
ＣＤ３４+リンパ造血前駆細胞へのＰＣＳ分化：実施例１のＴ細胞由来ＰＳＣ（レトロウイルス及びエピソームリプログラミングの各々により末梢血Ｔ細胞から誘導された１Ｃ及びＥ１１  ＴｉＰＳＣ）は、凝集体懸濁培養を通じて、ＣＤ３４+造血前駆細胞に分化した。ＰＳＣは、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（Ｅ８）培地中、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）又はビトロネクチンでコーティングされた６ウェルプレート上、フィーダーフリー条件下で維持した。２μＭのＣＨＩＲ９９０２１（ＧＳＫ−３阻害剤）及び５μＭのブレビスタチン（ミオシン−ＩＩ阻害剤）を添加したＥ８培地中、５０万細胞／ｍｌの密度でのサブコンフルエントなＰＳＣ（＜８０％のコンフルエンス）から凝集体が作られた。（あらゆるその後の培養ステップを含む）１５〜２０ｒｐｍで、ロッカープラットフォーム上、連続撹拌下、超低付着（ＵＬＡ）フラスコ内での６時間培養中、凝集体の形成を実施した。
【０２４３】
細胞凝集体形成を伴う培養物を、６及び２４時間後、２μＭのＣＨＩＲ９９０２１、５０ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２を等しい培地容量の添加により添加した無血清造血分化培地（ＨＤＭ：５０％ＩＭＤＭ、５０％Ｈａｍｓ  Ｆ１２培地、１００μｇ／ｍｌのポリビニルアルコール、１００μｇ／ｍｌの組換えヒト血清アルブミン、１×非必須アミノ酸添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１×既知組成脂質添加物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１２５μＭのアスコルビン酸２−リン酸マグネシウム、０．２５μＭのリノール酸、微量元素添加物Ａ（０．３×）、Ｂ（０．２×）及びＣ（０．１×）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、５ｍＭの塩化ナトリウム、１００μＭのモノチオグリセロール、２０μＭのエタノールアミン、１００ｎｇ／ｍｌのヘパリン、及び１０ｎｇ／ｍｌのＩＧＦ１）に徐々に移した。２日目、細胞凝集体が１５分間の沈降により沈殿し、培地を吸引し、造血中胚葉誘導性サイトカイン（２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、５０ｍｇ／ｍｌのＶＥＧＦ及び５０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２）を添加したＨＤＭに培養物を移した。完全培地を毎日変更しながら、培養を３日間継続した。
【０２４４】
造血ＣＤ３４+前駆細胞の分化及び拡大を支持するため、細胞凝集体を、造血支持サイトカイン（５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、５０ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ、２０ｎｇ／ｍｌのＦＬＴ３Ｌ及び２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−３）を添加したＨＤＭにさらに移した。完全培地を毎日変更しながら、培養を３〜５日間継続した。造血移行プロセスを改善するため、以下の増強成分：ＩＬ１１（５〜２０ｎｇ／ｍｌ）、８Ｂｒ−ｃＡＭＰ（１００〜３００μＭ）、及び／又はＶＥＧＦ（２０〜５０ｎｇ／ｍｌ）が添加可能である。
【０２４５】
浮遊する個別の細胞又は小集団として懸濁液中で同定されたＨＰＣを、２＋３＋３〜５日の分化プロセス（全体で８〜１０日）後、収集した。ＨＰＣを、７０μｍ及び３０μｍのセルストレーナー（Ｃｏｒｎｉｎｇ）による全分化培養物の濾過により単離した。遠心分離により濾液から収集したＨＰＣを、ＨＤＭで１回洗浄し、ＴＣＤＭ（Ｔ細胞分化培地）に再懸濁した。Ｔ／ＮＫの能力を有するＨＰＣを濃縮するため、ＣＤ３４+ＨＰＣ画分の単離は、製造業者からの推奨に従い、直接ＣＤ３４ミクロビーズ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いる磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）により実施可能である。ＨＰＣをＴ／ＮＫ分化培養物に蒔くか、又は後の使用のため、単離から１時間以内に凍結保存した。
【０２４６】
Ｔ／ＮＫ分化培養物：Ｔ／ＮＫ分化のため、非組織培養処理したプラスチックプレートを、ノッチリガンドｈＤＬＬ４−Ｆｃキメラタンパク質及びレトロネクチンのＰＢＳで希釈したもの（各々、０．５μｇ／ｃｍ2）でコーティングした。細胞プレーティング前、コーティング溶液を吸引し、プレートを、ＰＢＳで１回洗浄し、ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＧｌｕｔａＭａｘ（１／１００）、リン酸アスコルビン酸マグネシウム（２５０μＭ）、ニコチンアミド（２ｍＭ）、並びにサイトカインＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ及びＩＬ７（各々、５０ｎｇ／ｍｌ）からなる０．２５ｍｌ／ｃｍ2のＴ細胞分化培地（ＴＣＤＭ）を充填した。ＰＳＣ由来ＨＰＣを５０００細胞／ｃｍ2の密度で蒔き、低酸素（５％Ｏ2）ＣＯ2インキュベーター内で２週間培養し、３日目に等しいＴＣＤＭ培養容量を添加し、半分の培養容量を翌々日ごとに交換した。穏やかな再懸濁と、非接着性細胞の収集と、それに続くＰＢＳ−ＥＤＴＡ（０．５ｍＭ）による５〜１０分処理による緩く付着した細胞の収集とにより、全分化細胞を収集した。分化プロセスを継続し、Ｔ／ＮＫ細胞の収量を改善するため、Ｔ細胞分化培養は、Ｔ／ＮＫ細胞の所望される収量が達成されるまで、収集した細胞を新規に調製したＤＬＬ４／レトロネクチンプレートに１００００細胞／ｃｍ2の密度で再び蒔くことにより反復可能である。Ｔ／ＮＫ分化の効率もまた、以下の増強成分：ＣＨＩＲ９９０２１（１〜３μＭ）、ＩＬ２（２〜１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ１２（１０〜５０ｎｇ／ｍｌ）のＴＣＤＭへの添加により改善することができる。
【０２４７】
Ｔ細胞拡大培養物：Ｔ細胞拡大のため、非組織培養処理プレートを、抗ＣＤ３  ｍＡｂ（クローンＯＫＴ３）、ｈＤＬＬ４−Ｆｃ及びレトロネクチンをＰＢＳで希釈したもの（各々、０．５μｇ／ｃｍ2）でコーティングした。細胞プレーティング前、コーティング溶液を吸引し、プレートを、ＰＢＳで１回洗浄し、ＳｔｅｍＳｐａｎ  ＳＦＥＭ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｇｌｕｔａｍａｘ（１／１００）、リン酸アスコルビン酸マグネシウム（２５０μＭ）、ニコチンアミド（２ｍＭ）、並びにサイトカインＳＣＦ、ＴＰＯ、ＦＬＴ３Ｌ、ＩＬ７（各々、５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ２、ＩＬ１５（各々、１０ｎｇ／ｍｌ）からなる０．２５ｍｌ／ｃｍ2のＴ細胞拡大培地（ＴＣＥＭ）で充填した。拡大を改善するため、ＩＬ２１（５〜２０ｎｇ／ｍｌ）も添加することができた。Ｔ／ＮＫ分化培養物から収集した細胞を、１００００細胞／ｃｍ2の密度で蒔き、低酸素（５％Ｏ2）ＣＯ2インキュベーター内で最大２週間培養し、３日目に等しいＴＣＥＭ培養容量を添加し、半分の培養容量を翌々日ごとに交換した。拡大したＴ細胞を、穏やかな再懸濁と非接着性細胞の収集により収集した。
【０２４８】
実施例３−指向された分化誘導方法の特徴づけ
まずＰＳＣを、懸濁細胞凝集体の培養下、８〜１０日間、ＷＮＴ誘導性の分化プライミング、中胚葉誘導及びＨＰＣ分化の連続ステップを通じて、ＣＤ３４+ＨＰＣに分化させた（図１Ｂ）。ＨＰＣ画分を濾過により単離した。ＣＤ３４+ＨＰＣのＭＡＣｓ選別は、実施しなかったが、任意選択的には直接ＣＤ３４常磁性ビーズ（Ｍｙｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて実施してもよい。次に、ＨＰＣを、Ｔ／ＮＫ分化のため、２〜４週間、ヒトＤＬＬ４−Ｆｃ+レトロネクチンでコーティングしたプレートに移した。Ｔ細胞は、抗ＣＤ３  ｍＡｂ（ＯＫＴ３クローン）でコーティングしたプレート上での培養下で１〜２週間、さらに拡大することができた。
【０２４９】
ＰＳＣ（１Ｃ  ＴｉＰＳＣ）由来ＣＤ３４+細胞は、Ｔ／ＮＫ分化条件下で２週後、低ＦＳＣ／ＳＳＣパラメータで規定される典型的なリンパ系細胞集団を発現した（図１Ｄ、左側のドットプロット）。このリンパ系集団は、大部分のＣＤ３+Ｔ及びＣＤ５６+ＣＤ３-ＮＫ細胞を含有した（図１Ｄ、中間のドットプロット）。Ｔ細胞集団は、ＣＤ４+及びＣＤ８+の単一及び二重陽性細胞、並びに有意な割合の二重陰性細胞を含んだ（図１Ｄ、右側のドットプロット）。
【０２５０】
各個別の細胞型の収量を、細胞誘導の各段階での絶対細胞数のインプットに対するアウトプットの比として算出した。例えば、１．５ＣＤ３４+ＨＰＣの収量は、平均で１．５（アウトプット）ＣＤ３４+ＨＰＣが１（インプット）ＰＳＣから誘導可能であることを示す。したがって、１０２Ｔ細胞の収量は、１０２（アウトプット）Ｔ細胞が１（インプット）ＣＤ３４+ＨＰＣから誘導可能であることを示す（図１Ｅ）。
【０２５１】
ＰＳＣ（１Ｃ  ＴｉＰＳＣ）由来Ｔ細胞（ＣＤ３+）は、４週間かけて分化及び拡大し、α／βＴＣＲ（γ／δでない、又は不変Ｖα２４  ＮＫＴ  ＴＣＲ）並びに典型的なＴ細胞マーカーＣＤ５、ＣＤ２７、及びＣＤ７を発現した（図１Ｆ）。それらはまた、細胞傷害性Ｔ／ＮＫ関連（ＣＤ１６１、ＣＤ９４）マーカー及び活性化（ＣＤ６９）マーカーを発現した。
【０２５２】
固定化された抗ＣＤ３抗体（ｉＣＤ３）は、ＰＳＣ由来Ｔ細胞の拡大を達成するため、最低限必要であり、十分であった（図１Ｇ、棒グラフ）。ＣＤ３及びＣＤ２８  ｍＡｂ（ｓＣＤ３、ｓＣＤ２８）での可溶性刺激は、単独又は組み合わせ（ｓＣＤ３+ｓＣＤ２８）のいずれか、又はｉＣＤ３に添加するとき（ｉＣＤ３+ｓＣＤ２８）、有効でなかった。拡大培養下で増殖するＴ細胞は、不規則な形状のリンパ芽球の特徴的形態を得た（図１Ｇ、写真）。比較的異質なインプット細胞集団と対照的に、２週間のＴ細胞拡大から収集した細胞は、本質的に純粋なＣＤ３+Ｔ細胞であり、それはまた、ＣＤ５６を発現し、ＣＤ８の発現を得た（図１Ｇ、フローサイトメトリーのドットプロット）。したがって、この指向された分化誘導方法は、Ｔ細胞を効率的に生成した。
＊＊＊
【０２５３】
本明細書に開示及び主張される方法のすべては、本開示に照らして過度の実験を行うことなく作成し、実施することができる。本発明の組成物及び方法が好ましい実施形態に関して記載されている一方、バリエーションが、方法に、また本明細書に記載の方法のステップ又は一連のステップにおいて、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく適用されてもよいことは当業者に明らかになるであろう。より詳細には、化学的に且つ生理的に関連がある特定の薬剤が本明細書に記載の薬剤と置き換えられてもよい一方で、同じ又は類似の結果が得られることになることは明らかになるであろう。当業者にとって明白なすべてのかかる類似の代替及び修飾は、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の精神、範囲、及び概念の範囲内に含まれると思われる。
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示されるものを補足する例示的な手順又はその他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書中に具体的に援用される。
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Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ８：４２４−４２９，２０１１．
Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．７：３７４５，１９８８．
Ｄｏｕｌａｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．１０：１２０−３６，２０１２．
Ｅｒｃｏｌａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３：１５３３５−１５３４１，１９８８．
Ｅｖａｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｄｅｖｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ−Ｒａｖｅｎ，ＮＹ，１０５４−１０８７，１９９７．
Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：８４６３−８４６７，１９８７．
Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７６：３３４８−３３５２，１９７９．
Ｆｒｉｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  Ｖｉｒｕｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｐａｒｔ  ＩＩＩ，１２５−１２７，２００１
Ｆｕｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｕｒｉｅ，Ｃｅｌｌ  ５３：５０５−５１８，１９８８．
Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２：４５６−４６７，１９７３．
国際公開番号、国際公開第２００７／０６９６６６号パンフレット
国際公開番号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７８９３号明細書
国際公開番号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０５７８９９号明細書
国際公開番号、国際公開第９４／０９６９９号パンフレット
国際公開番号、国際公開第９５／０６１２８号パンフレット
国際公開番号、国際公開第９６／３９４８７号パンフレット
Ｊｏｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：９１３８，１９９０．
Ｋａｅｐｐｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ９：４１５−４１８，１９９０．
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Ｋａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ，３６：３７１−３７９，１９８９．
Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６６：３３６１−３３６４，１９９１．
Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：３８７９−３８８２，１９９２．
Ｋｎｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．７６１−７６６，１９８７．
Ｌａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，７：３３８−３４３，２００６．
Ｌａｎｇｌｅ−Ｒｏｕａｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２（７）：６１８１−６１８５，１９９８．
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Ｌｕｄｗｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３（８）：６３７−４６，２００６ａ．
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Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３３：１５３−１５９，１９８３．
Ｎａｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４（４９１０）：１３４２−１３４４，１９８９．
Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７２（５２５９）：２６３−２６７，１９９６．Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５（９）：８７１−８７５，
Ｎｇ，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１７：６０１−６１５，１９８９．
Ｎｉｃｏｌａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，５４：６１４−６２７，１９７９．
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Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，７２１：１８５−１９０，１９８２．
Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１４９：１５７−１７６，１９８７．
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Ｐａｓｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６７：２４２−２４８，１９７５．
特許公開番号、欧州特許１５０７８６５号明細書
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Ｐｏｔｒｙｋｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，１９９（２）：１６９−１７７，１９８５．
Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：７１６１−７１６５，１９８４．
Ｑｕｉｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４：９５３９−９５４５，１９８９．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２２nd  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１２．
Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：３９９−４０４，２０００．
Ｒｉｃｈａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，３７：２６３−２７２，１９８４．
Ｒｉｐｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１０：６８９−６９５，１９９０．
Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９９７．
Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８９１−１８９７，１９８７．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１：８６１−８７２，２００７．
Ｔｅｍｉｎ，Ｉｎ：Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ，Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ（Ｅｄ．），ＮＹ，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，１４９−１８８，１９８６．
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３８：１３３−１６５，１９９８．
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ａｎｄ  Ｏｄｏｒｉｃｏ，Ｊ．Ｔｒｅｎｄｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：５３−５７，２０００．
Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅ．ＵＳＡ，９２：７８４４−７８４８，１９９５．
Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６：７１６−７１８，１９８６．
米国特許出願第０８／４６４，５９９号明細書
米国特許出願第１２／７１５，１３６号明細書
米国特許出願第６１／０８８，０５４号明細書
米国特許第４，６８３，２０２号明細書
米国特許第５，０３０，０１５号明細書
米国特許第５，３０２，５２３号明細書
米国特許第５，３２２，７８３号明細書
米国特許第５，３８４，２５３号明細書
米国特許第５，４６４，７６５号明細書
米国特許第５，４８６，３５９号明細書
米国特許第５，５３８，８７７号明細書
米国特許第５，５３８，８８０号明細書
米国特許第５，５５０，３１８号明細書
米国特許第５，５５６，９５４号明細書
米国特許第５，５６３，０５５号明細書
米国特許第５，５８０，８５９号明細書
米国特許第５，５８９，４６６号明細書
米国特許第５，５９１，６１６号明細書
米国特許第５，６１０，０４２号明細書
米国特許第５，６５６，６１０号明細書
米国特許第５，７０２，９３２号明細書
米国特許第５，７３６，５２４号明細書
米国特許第５，７８０，４４８号明細書
米国特許第５，７８９，２１５号明細書
米国特許第５，８４３，７８０号明細書
米国特許第５，８４３，７８０号明細書
米国特許第５，９２８，９０６号明細書
米国特許第５，９４５，１００号明細書
米国特許第５，９８１，２７４号明細書
米国特許第５，９９４，１３６号明細書
米国特許第５，９９４，６２４号明細書
米国特許第６，０１３，５１６号明細書
米国特許第６，２００，８０６号明細書
米国特許第６，２２５，０４２号明細書
米国特許第６，３５５，４７９号明細書
米国特許第６，３６２，００１号明細書
米国特許第６，５４４，５１８号明細書
米国特許第６，７９０，６６２号明細書
米国特許第７，０２９，９１３号明細書
米国特許第８，０５８，０６５号明細書
米国特許第８，１２９，１８７号明細書
米国特許第８，２６８，６２０号明細書
米国特許第８，２６８，６２０号明細書
米国特許第８，３７２，６４２号明細書
米国特許第８，７４１，６４８号明細書
米国特許出願公開第２００２００５５１４４号明細書
米国特許出願公開第２００５０２６０１８６号明細書
米国特許出願公開第２００６０１０４９６８号明細書
米国特許出願公開第２００９０１４８４２５号明細書
米国特許出願公開第２００９０２４６８７５号明細書
米国特許出願公開第２０１０／０２１００１４号明細書
米国特許出願公開第２０１２０２７６６３６号明細書
米国特許出願公開第２０１４／０３１５３０４号明細書
米国特許出願公開第２０１６０２５７９３９号明細書
Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９：９１−１０５，２００９．
Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１３４４−１３４６，１９８９．
Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１０：８７−９４，１９８０．
Ｗｙｎｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６：１０６９−１０７０，２００５．
Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９：９７１−９７４，２００１．
Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１３１（５）：８６１−７２，２００７．
【図１Ａ】
2020517237.tif 000003
【図１Ｂ】
2020517237.tif 000004
【図１Ｃ】
2020517237.tif 000005
【図１Ｄ】
2020517237.tif 000006
【図１Ｅ】
2020517237.tif 000007
【図１Ｆ−１】
2020517237.tif 000008
【図１Ｆ−２】
2020517237.tif 000009
【図１Ｇ−１】
2020517237.tif 000010
【図１Ｇ−２】
2020517237.tif 000011
【図２−１】
2020517237.tif 000012
【図２−２】
2020517237.tif 000013
【図３Ａ−３Ｂ】
2020517237.tif 000014
【図４】
2020517237.tif 000015
【図５Ａ−１】
2020517237.tif 000016
【図５Ａ−２】
2020517237.tif 000017
【図５Ｂ】
2020517237.tif 000018
【国際調査報告】
2020517237.tif 000019
2020517237.tif 000020
2020517237.tif 000021
2020517237.tif 000022