(57)【要約】  Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産するための非天然微生物、非天然微生物の発酵によってＮ−アセチルノイラミン酸を生産するための方法、及び非天然微生物の発酵によって生産されたＮ−アセチルノイラミン酸を含有する栄養組成物が開示されている。
2020537530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｅｕ５Ａｃを生産することができる非天然微生物であって、前記非天然微生物が、少なくとも１つの異種酵素を含むシアル酸生合成経路を有し、微生物の天然のシアル酸異化経路が、機能しなくなっており、Ｎｅｕ５Ａｃの発酵生産の間に炭素源として使用されない糖類をインポートするための少なくとも１つのホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系が、機能しなくなっており、前記微生物が、外因性の炭素源を得るためにホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系を使用することなく、発酵ブロス中に存在する外因性の炭素源を単独の炭素源として利用し得る、非天然微生物。
【請求項２】
シアル酸生合成経路が、酵素グルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼ、グルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、及びＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼを含む、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項３】
シアル酸生合成経路の酵素の少なくとも１つが、異種酵素である、請求項１又は２に記載の非天然微生物。
【請求項４】
天然のシアル酸異化経路が、機能しなくなっている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項５】
シアル酸異化経路に関与する酵素をコードする遺伝子のうちの１つ以上の発現が損なわれているという点で、又はシアル酸異化経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列が変更されており、その結果、変更されたタンパク質コードヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、変更されていないヌクレオチド配列によってコードされている酵素の酵素活性を有さないという点で、シアル酸異化経路に関与する酵素をコードする遺伝子のうちの１つ以上が非天然微生物のゲノムから欠失している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項６】
Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェートエピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ及びシアル酸パーミアーゼをコードする遺伝子の群から選択される遺伝子のうちの１つ以上の発現が損なわれているという点で、又はこれらの遺伝子のうちの少なくとも１つのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列が変更されており、その結果、変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、変更されていないヌクレオチド配列によってコードされている酵素の酵素活性を有さないという点で、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェートエピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ及びシアル酸パーミアーゼをコードする遺伝子の群から選択される遺伝子のうちの１つ以上を欠失させるように遺伝子操作されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項７】
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼからなる群から選択される酵素のうちの１つ以上の活性が、無効とされている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項８】
酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ及び／若しくはＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼをコードする遺伝子の一方若しくは両方を欠失させることによって、これらの酵素の一方若しくは両方の発現を損なわせることによって、又は一方若しくは両方の遺伝子のタンパク質コード領域を突然変異させ、その結果、それぞれの変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、変更されていないヌクレオチド配列によってコードされている酵素の酵素活性を有さないようにすることによって、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ及び／又はＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼの活性を無効とするように遺伝子操作されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項９】
炭水化物をインポートするための、少なくとも１つのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）依存性の糖輸送ホスホトランスフェラーゼ系が、機能しなくなっている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項１０】
糖類／Ｈ＋シンポーター、好ましくは、スクロースプロトンシンポーター、ラクトースプロトンシンポーター及びグルコースプロトンシンポーターからなる群から選択される糖類／Ｈ＋シンポーターを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項１１】
好ましくはＰＥＰシンターゼの過剰発現に起因して、野生型微生物と比較して増強したＰＥＰ生合成を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項１２】
機能的ＰＥＰカルボキシラーゼ、機能的グルタメートシンターゼ、機能的ＷｚｘＣタンパク質、機能的ＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルホスフェートグルコース−１−ホスフェートトランスフェラーゼ、機能的β−ガラクトシドパーミアーゼ、機能的β−ガラクトシダーゼ、機能的ＹｊｈＣタンパク質、機能的フコースイソメラーゼ、機能的フクロキナーゼ及び機能的Ｎ−アセチルグルタミンアミノアシラーゼからなる群から選択される１つ以上を欠いている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項１３】
好ましくはグルタミンシンターゼの過剰発現に起因して、野生型微生物と比較して増強したグルタミン合成を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項１４】
Ｎｅｕ５Ａｃを生産するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の非天然微生物の使用。
【請求項１５】
Ｎｅｕ５Ａｃを生産し得る非天然微生物を使用する発酵によってＮｅｕ５Ａｃを生産するための方法であって、
ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の非天然微生物を提供するステップ、
ｂ）非天然微生物を、発酵ブロス中で、非天然微生物がＮｅｕ５Ａｃを生産することを許容する条件下で培養するステップ、及び
ｃ）任意選択的に、Ｎｅｕ５Ａｃを発酵ブロスから回収するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
発酵ブロスが、非天然微生物を生育させるための炭素源であって、好ましくは、グルコース、キシロース、スクロース、フルクトース、ラクトース、グリセロール、合成ガス及びこれらの組み合わせからなる群から選択される炭素源を含有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
栄養組成物を製造するための、請求項１５又は１６に記載の方法によって生産されたＮｅｕ５Ａｃの使用。
【請求項１８】
請求項１５又は１６に記載の方法によって生産されたＮｅｕ５Ａｃを含有する栄養組成物。
【請求項１９】
少なくとも１つのＨＭＯ、好ましくは少なくとも１つの中性のＨＭＯ及び／又は少なくとも１つのシアル化されたＨＭＯも含有する、請求項１８に記載の栄養組成物。
【請求項２０】
栄養組成物が、プロバイオティクス微生物も含有する、請求項１８又は１９に記載の栄養組成物。
【請求項２１】
医薬製剤、乳児用調製物及び栄養補助食品からなる群から選択される栄養組成物である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２２】
液体形態で、好ましくは濃縮物の形態若しくはすぐに飲むことができる形態で、又は固体形態で、好ましくは粉末、顆粒、フレーク若しくはペレットの形態で存在する、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって生産されたＮｅｕ５Ａｃを含有する乳児用調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産し得る非天然微生物、前記非天然微生物を使用する発酵によってＮ−アセチルノイラミン酸を生産するための方法、発酵によって生産されたＮ−アセチルノイラミン酸の使用及びこの様式で生産されたＮ−アセチルノイラミン酸を含有する生成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
シアル酸（Ｓｉａ）は、９つの炭素からなる骨格を有する負に荷電した単糖のファミリーである。これらのα−ケト酸の５０を超える形態が、自然界で発見されている。最も豊富なシアル酸は、Ｎ−アセチルノイラミン酸（ＮＡＮＡ、ＮｅｕＮＡｃ、Ｎｅｕ５Ａｃ）であると考えらえている。
【０００３】
シアル酸は、脊椎動物及び高等無脊椎動物の細胞表面上の糖複合体（糖タンパク質及び糖脂質）内に存在するグリカンの末端糖類として存在する。シアル酸は、エスケリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）Ｋ１、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ヘモフィルス・デュクレイ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ）、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、ナイセリア・ゴノレア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）及びストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）を含む病原性細菌のリポ多糖及び莢膜多糖の成分である。
【０００４】
シアル酸は、胚の神経系の発生、転移、免疫応答の調節及び細菌又はウイルスへの感染を含む多くの生理学的及び病態生理学的なプロセスにおいて重要な役割を果たす。シアル酸は、脳のガングリオシドの、並びに、細胞間相互作用、ニューロンの伸長、シナプス接続の修正及び記憶の形成を容易にする神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）を修飾するポリアシル酸鎖の、必須の成分である。子ブタにおいて、シアル酸に富んだ飼料は、脳のシアル酸のレベルを増大させ、２つの学習関連遺伝子の発現を増大させる。したがって、この飼料はまた、学習及び記憶を増強させる。
【０００５】
乳児、特に早産の乳児は、迅速な脳の成長のため及びこの発生段階で乳児の免疫系が発生するため、シアル酸を含む栄養を多く必要とする。シアル酸、特にＮ−アセチルノイラミン酸のレベルは、ヒトの母乳で高い（およそ０．５ｇ・Ｌ−１）。逆に、乳児用調製物には、少量又はごくわずかな量のＮ−アセチルノイラミン酸しか含有していない。
【０００６】
したがって、十分な質、及び乳児用調製物及び他の栄養組成物を補うために十分な量のシアル酸、特にＮｅｕ５Ａｃを提供することが必要である。これに関して、様々なアプローチが過去に公開されている。
【０００７】
文献ＥＰ１４８４４０６Ａ１は、Ｎｅｕ５Ａｃを生産する能力を有するがＮｅｕ５Ａｃを分解する能力は野生型株と比較して限定されているか、又は有さず、その結果、Ｎｅｕ５Ａｃが培養培地中に蓄積し、この培地から回収され得る、微生物を使用して、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産するためのプロセスを記載している。Ｎｅｕ５Ａｃの生産を可能にするために、この微生物は、強力なＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼ活性及び／又はＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ活性を有する。より具体的には、エスケリキア・コリ細胞にランダム突然変異生成を行い、グルコースを含有する培地で良好に生育したがＮ−アセチルノイラミン酸を含有する培地では生育が限られていたか、又はなかった細胞系が、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ及びＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードする発現プラスミドで形質転換された。培養期間の後、細胞は遠心分離によってペレット化され、−２０℃でいわゆる「ウェット細胞」として保管され、解凍の後に必要に応じて使用された。Ｎ−アセチルノイラミン酸の生産では、９０ｇ・Ｌ−１のＮ−アセチルグルコサミン、５０ｇ・Ｌ−１のグルコース、１０ｍＬ・Ｌ−１のキシレン、及び４ｇ・Ｌ−１の洗剤の存在によって透過処理された２００ｇ・Ｌ−１の前記ウェット細胞を含む反応混合物（３０ｍＬ）が提供された。インビトロでの反応が完了した後、Ｎｅｕ５Ａｃの形成がＨＰＬＣによって評価された。
【０００８】
文献ＷＯ９４／２９４７６Ａ１は、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＮＡＧ、ＧｌｃＮＡｃ）からＮ−アセチル−Ｄ−ノイラミン酸を調製するためのインビトロでの方法を開示している。調製において、ＮＡＧは、塩基触媒されたエピマー化によって、Ｎ−アセチル−Ｄ−マンノサミン（ＮＡＭ、ＭａｎＮＡｃ）に変換される。その後、ＮＡＭはピルビン酸と反応して、反応においてＮｅｕ５Ａｃ−アルドラーゼを触媒して、Ｎｅｕ５Ａｃを生じさせた。Ｎｅｕ５Ａｃ−アルドラーゼは、前記Ｎｅｕ５Ａｃ−アルドラーゼを発現する組換えエスケリキア・コリ細胞から調製された。アルドラーゼ酵素は、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ−Ｃ（登録商標）ビーズを前記組換えエスケリキア・コリ細胞の粗抽出物と混合することによって固定された。ＮＡＭからＮｅｕ５Ａｃへの変換は、前記固定された酵素ビーズをＮＡＭ及びピルビン酸の混合物に添加することによって開始された。反応の最後に、Ｎｅｕ５Ａｃが反応混合物から単離された。
【０００９】
これまでのプロセスに代わって、ＥＰ０５７８８２５Ａ１は、Ｎ−アセチルグルコサミン及びピルビン酸の混合物とＮ−アセチルノイラミン酸リアーゼとをアルカリ条件下で処理することによる、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産するためのインビトロでのプロセスを開示している。
【００１０】
米国特許第７，５７９，１７５号は、透過処理された微生物を利用してＮ−アセチルノイラミン酸を生産するためのプロセスを開示している。この方法は、（ｉ）Ｎ−アセチルノイラミン酸のアルドラーゼ活性若しくはＮ−アセチルノイラミン酸のシンターゼ活性を有する微生物の培養物又は培養物の処理物、（ｉｉ）ピルビン酸を生産し得る微生物の培養物若しくは培養物の処理物又はホスホエノールピルビン酸を生産し得る微生物の培養物若しくは培養物の処理物、（ｉｉｉ）Ｎ−アセチルマンノサミン及び（ｉｖ）ピルビン酸又はホスホエノールピルビン酸を形成するために必要なエネルギー源、を含有する混合物の調製を含む。混合物は、キレート剤又は界面活性剤を含む水性培地において調製され、水性培地におけるＮ−アセチルノイラミン酸の形成及び蓄積を可能とし、その後、水性培地からＮ−アセチルノイラミン酸を回収した。
【００１１】
前述のプロセスの問題点は、（ｉ）小規模の生産のみが可能であること、及び（ｉｉ）Ｎｅｕ５Ａｃに対して反応平衡を付与するために過剰なピルビン酸が必要であることである。さらに、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルマンノサミン及びホスホエノールピルビン酸は、これらの反応のための高価な基質である。
【００１２】
国際公開公報ＷＯ２００８／０４０７１７Ａ２は、培地における微生物の培養を含む、シアル酸を生産するための方法であって、前記微生物がシアル酸シンターゼ（ＮｅｕＢ）及びＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃエピメラーゼ（ＮｅｕＣ）をコードする異種遺伝子を有し、前記微生物がＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ（ＮｅｕＡ）をコードする遺伝子を欠いているか、又はＣＭＰ−Ｎｅｕ５Ａｃシンターゼ（ＮｅｕＡ）をコードする全ての遺伝子が不活化されているか、若しくは欠失しており、並びに、シアル酸アルドラーゼ（ＮａｎＡ）をコードする内在性遺伝子、シアル酸トランスポーター（ＮａｎＴ）をコードする内在性遺伝子、及び任意選択的にＭａｎＮＡｃキナーゼ（ＮａｎＫ）をコードする内在性遺伝子が欠失しているか、又は不活化されている、方法を開示している。Ｎｅｕ５Ａｃは、氷酢酸を使用する沈殿によって、培養物の上清（２リットル）から精製されている。
【００１３】
国際公開第ＷＯ２００８／０９７３６６Ａ２は、シアル酸を生産する、代謝を操作されたエスケリキア・コリ細胞に関する。前記細胞において、ｎａｎＴ（シアル酸トランスポーター）遺伝子及びｎａｎＡ（シアル酸アルドラーゼ）遺伝子が不活化されており、ナイセリア・メニンジティディスＢ群におけるシアル酸生合成を容易にするｎｅｕＣ遺伝子及びｎｅｕＢ遺伝子が導入されており、前記ｎａｎＴ−ｎａｎＡ−エスケリキア・コリ細胞において発現プラスミドを使用して過剰発現している。さらに、エスケリキア・コリのグルコサミンシンターゼ遺伝子（ｇｌｍＳ）は、ｎｅｕＢ及びｎｅｕＣと共過剰発現している。
【００１４】
国際公開第ＷＯ２０１２／０８３３２９Ａ１は、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ及びＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを構成的に発現するトリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）の真菌細胞においてＮｅｕ５Ａｃを生産するための方法及び作用物質を開示している。このようなトリコデルマ属細胞は、ＧｌｃＮＡｃの存在下で培養され、菌糸体が、Ｎｅｕ５Ａｃの存在について、ＨＰＬＣ−ＭＳによって分析された。
【００１５】
中国特許出願第ＣＮ１０６９２９４６１Ａは、グルコサミン−フルクトース−６−ホスフェートトランスアミナーゼ、グルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミンイソメラーゼ及びＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼをコードする遺伝子を発現するバチルス・サブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞を使用してＮ−アセチルノイラミン酸を生産するためのプロセスを開示している。この細胞はさらに、ホスホトランスフェラーゼ系ＥＩＩＣＢＡのグルコース特異的な成分をコードするｐｔｓＧ遺伝子が欠失している。０．６６ｇ・Ｌ−１というＮｅｕ５Ａｃの収量が、グルコース含有培地においてこれらの細胞を培養することによって得られた。
【００１６】
Ｚｈｕ，Ｄ．ら（Ｚｈｕ，Ｄ．ら（２０１７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：２２７〜２３４）は、ＰＥＰ合成関連遺伝子であるｐｃｋ及びｐｐｓＡをエスケリキア・コリにおいて過剰発現させるために多くのコピー数の共発現ベクターを使用することが、Ｎｅｕ５Ａｃの生産を増強させることを報告している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】欧州特許公開第１４８４４０６号明細書
【特許文献２】国際公開第９４／２９４７６号
【特許文献３】欧州特許公開第０５７８８２５号明細書
【特許文献４】米国特許第７５７９１７５号明細書
【特許文献５】国際公開第２００８／０４０７１７号
【特許文献６】国際公開第２００８／０９７３６６号
【特許文献７】国際公開第２０１２／０８３３２９号
【特許文献８】中国特許出願第１０６９２９４６１号明細書
【非特許文献】
【００１８】
【非特許文献１】Ｚｈｕ，Ｄ．ら（２０１７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．３９：２２７〜２３４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
したがって、産業規模で、そして安価な炭素源を単独の炭素源として使用して、シアル酸をより効率的に生産し得る微生物を提供することが目的であった。
【００２０】
この目的は、少なくとも１つの異種酵素を含むシアル酸合成経路を有し、天然のシアル酸異化経路が機能しなくなっており、Ｎｅｕ５Ａｃ生合成のためのホスホエノールピルビン酸の利用可能性に関して改善されており、そして前記外因性の炭素源を得るためにホスホエノールピルビン酸：ホスホトランスフェラーゼ系を使用することなく、発酵ブロス中に存在する単一の安価な外因性の炭素源を利用し得る、非天然微生物を提供することによって、達成される。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（発明の要旨）
第１の態様において、Ｎｅｕ５Ａｃを生産するための非天然微生物であって、該非天然微生物が、少なくとも１つの異種酵素を含むシアル酸合成経路を有し、天然のシアル酸異化経路が、機能しなくなっており、Ｎｅｕ５Ａｃの発酵生産の間に炭素源として使用されない糖類をインポートするための少なくとも１つのホスホトランスフェラーゼ系が機能しなくなっており、そして、前記非天然微生物が、前記外因性の炭素源を得るためにホスホトランスフェラーゼ系を使用することなく、発酵ブロス中に存在する外因性の炭素源を利用し得る、非天然微生物が提供される。
【００２２】
第２の態様において、Ｎｅｕ５Ａｃを生産するための、第１の態様に従った非天然微生物の使用が提供される。
【００２３】
第３の態様において、第１の態様に従った非天然微生物を使用する発酵による、Ｎｅｕ５Ａｃを生産するための方法が提供される。
【００２４】
第４の態様において、第２の態様に従った方法によって生産されるＮｅｕ５Ａｃが提供される。
【００２５】
第５の態様において、栄養組成物を製造するための、第４の態様に従ったＮｅｕ５Ａｃの使用が提供される。
【００２６】
第６の態様において、第３の態様の方法によって生産されたＮｅｕ５Ａｃを含む栄養組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】Ｎｅｕ５Ａｃを生産するための代謝経路を示す略図である。
【図２】Ｎｅｕ５Ａｃを生産するためのさらなる及び／又は代替的な代謝経路を示す略図である。
【図３】異なる非天然のエスケリキア・コリ株によるＮｅｕ５Ａｃの生産のレベルを示す棒グラフである。
【図４】異なる非天然のエスケリキア・コリ株によるＮｅｕ５Ａｃの生産のレベルを示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
第１の態様によると、Ｎｅｕ５Ａｃを生産し得る非天然微生物が提供される。前記非天然微生物は、シアル酸を生産するために十分な様式で異種ヌクレオチド配列から発現される少なくとも１つの異種酵素を含むシアル酸生合成経路を有する。前記微生物の天然のシアル酸異化経路は、機能しなくなっている。少なくとも１つのホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系もまた、機能しなくなっている。非天然微生物は、前記炭素源を得るためにホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系を必要とすることなく、外部から供給された炭素源を単独の炭素源として利用することができる。
【００２９】
本明細書において使用される用語「非天然微生物」は、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を導入するように遺伝子操作されている及び／又は微生物において天然に生じるヌクレオチド配列が修飾されている、すなわち、変更されている、置換されている、挿入されているか、又は欠失しているという点で遺伝子操作されている、微生物を指す。
【００３０】
本明細書において使用される用語「異種の」は、ある宿主生物において、天然に有さない化合物、ポリペプチド、タンパク質、酵素又はヌクレオチド配列がある場合、これらの化合物、ポリペプチド、タンパク質、酵素、（核酸分子の一部としての）ヌクレオチド配列を指す。「異種ヌクレオチド配列」は、遺伝子又は遺伝子断片であり得る。用語「異種発現」は、ある宿主生物において、天然に有さない遺伝子又は遺伝子断片がある場合、これらの異種の遺伝子又は遺伝子断片の発現を指す。異種遺伝子の発現は、宿主生物における異種のポリペプチド、タンパク質又は酵素の存在をもたらす。
【００３１】
非天然微生物は、Ｎｅｕ５Ａｃを生産することができる。本明細書において使用される用語「生産すること」は、微生物発酵によるＮｅｕ５Ａｃの生産を指す。「微生物発酵」は、所望の生成物、例えばＮｅｕ５Ａｃが、栄養を含有する発酵ブロス中で微生物を培養することによって生産され、その結果、微生物が化合物を他の化合物に変換し得る、一般的には大規模な、産業プロセスとして理解される。用語「大規模」及び「産業的」は、生産が、１００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、５０００Ｌ、１０，０００Ｌ、５０，０００Ｌ、１００，０００Ｌ又はさらには２００，０００Ｌを超える発酵ブロスの容積における微生物発酵によって生じ得ることを指す。
【００３２】
本明細書において使用される用語「生産し得る」又は「生産することができる」は、培地又は培養液において及び微生物がＮｅｕ５Ａｃを合成することを許容する条件下で微生物が培養される場合の、微生物がＮｅｕ５Ａｃを生産する能力を指す。
【００３３】
シアル酸生合成経路
非天然微生物は、Ｎｅｕ５Ａｃを生産するための微生物である。したがって、前記非天然微生物は、Ｎｅｕ５Ａｃを生産することができる。非天然微生物は、シアル酸生合成経路を有するように遺伝子操作されている微生物である。
【００３４】
一実施形態において、非天然微生物のシアル酸生合成経路は、グルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼ、グルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、及びハロ酸デヒドロゲナーゼ（ＨＡＤ）様スーパーファミリーの糖ホスファターゼからなる群から選択される少なくとも１つの異種酵素を含む。好ましくは、非天然微生物は、前記酵素をコードする遺伝子の１つ以上を含有するように遺伝子操作されている微生物である。前記酵素をコードする１つ以上の遺伝子を既に有しており、Ｎｅｕ５Ａｃを生産するために十分な様式で前記遺伝子を発現する宿主微生物が、シアル酸生合成経路を完了するように遺伝子操作されている必要はないが、それでも、前記遺伝子のうちの１つ以上の発現レベルを改変するように遺伝子操作され得、グルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼ、グルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、及び／又はＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼの量を増大させ、ひいては非天然微生物におけるＮｅｕ５Ａｃ生合成の速度を増大させることが理解される。
【００３５】
酵素グルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．６．１．１６）は、グルタミンを使用するフルクトース６−ホスフェートからグルコサミン−６−ホスフェートへの変換を触媒する。この酵素反応は、典型的には、ヘキソサミン生合成経路における第１のステップであると考えられている。グルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼの別名は、Ｄ−フルクトース−６−ホスフェートアミドトランスフェラーゼ、ＧＦＡＴ、グルコサミン−６−ホスフェートシンターゼ、ヘキソースリン酸アミノトランスフェラーゼ及びＬ−グルタミン−Ｄ−フルクトース−６−ホスフェートアミドトランスフェラーゼである。
【００３６】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、グルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼ（ＧｌｍＳ）、好ましくは、異種のグルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノ−トランスフェラーゼ、さらに好ましくは、エスケリキア・コリに由来するグルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼ又はエスケリキア・コリのＧｌｍＳの機能的変異体を有する。最も好ましくは、機能的変異体は、野生型酵素よりも有意に低減した、グルコサミン−６−ホスフェート阻害に対する感度を示す、エスケリキア・コリのＧｌｍＳのバージョン、例えば、突然変異体ｇｌｍＳ遺伝子（ｇｌｍＳ＊５４又はｇｌｍＳ＊）（配列番号６を参照されたい。）によってコードされている、エスケリキア・コリのＧｌｍＳのバージョンである。
【００３７】
酵素に関して本明細書において使用される用語「機能的変異体」は、活性を失っておらず、指定された酵素のアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％の同一性を有する、指定された酵素のポリペプチド変異体を指す。このことは、これらのポリペプチドが由来する元であるゲノム配列データにおいてある程度の多様性があるという可能性、また、これらのポリペプチド内に存在するアミノ酸の一部が酵素の触媒活性に著しく影響することなく置換され得るという可能性を考慮している。
【００３８】
用語「機能的変異体」としてはまた、触媒活性を著しく失っていない、酵素のトランケート型変異体に相当する、指定された酵素のポリペプチド変異体が含まれる。したがって、トランケート型変異体のアミノ酸配列は、１つ、２つ又は一続きの３つ以上の連続的なアミノ酸が不在であるという点で、指定された酵素のアミノ酸配列と異なり得る。トランケーションは、指定された酵素のアミノ末端（Ｎ末端）に、カルボキシル末端（Ｃ末端）に及び／又はアミノ酸配列内にあり得る。
【００３９】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、グルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、グルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列である。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、グルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、エスケリキア・コリのグルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼ又はこれらの機能的変異体をコードする。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、グルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列若しくはこれらの機能的変異体を含む核酸分子を含有するように、及び／又はグルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼ若しくはこれらの機能的変異体を含むように、遺伝子操作されている。
【００４０】
エスケリキア・コリのグルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１７１６９、配列番号１１）は、エスケリキア・コリのｇｌｍＳ遺伝子（配列番号１０）によってコードされている。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、エスケリキア・コリのＧｌｍＳコードするヌクレオチド配列又はこれらの機能的変異体を含み発現する、好ましくはＧｌｍＳ＊をコードするヌクレオチド配列（配列番号１２及び配列番号１３）を含み発現する核酸分子を含有する。
【００４１】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、エスケリキア・コリのＧｌｍＳ又はエスケリキア・コリのＧｌｍＳの機能的変異体の１つをコードするヌクレオチド配列は、エスケリキア・コリのｇｌｍＳと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００４２】
酵素グルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｇｎａ１、ＥＣ  ２．３．１．４）は、アセチル−ＣｏＡを使用して、グルコサミン−６−ホスフェートをＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートに変換する。この酵素反応は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における、アルファ−Ｄ−グルコサミン６−ホスフェートからＮ−アセチル−アルファ−Ｄ−グルコサミン１−ホスフェートを合成するサブ経路の最初のステップであると考えられている。Ｇｎａ１はまた、ホスホグルコサミンアセチラーゼ又はホスホグルコサミントランスアセチラーゼとしても知られている。
【００４３】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、グルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（Ｇｎａ１）、好ましくは、異種のグルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼ、さらに好ましくは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）に由来するグルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ４３５７７、配列番号１５）又はサッカロミセス・セレビシエのＧｎａ１の機能的変異体を含む。
【００４４】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、グルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、グルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列である。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、グルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、サッカロミセス・セレビシエのグルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼ又はこれらの機能的断片をコードする。しかし、グルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼ、これらの推定アミノ酸配列及びこれらのグルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、様々な異なる種から知られており、また、適切なグルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼとして使用され得る。
【００４５】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、グルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチル−トランスフェラーゼ若しくはこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するように、及び／又はグルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼ若しくはこれらの機能的変異体を含むように、遺伝子操作されている。
【００４６】
サッカロミセス・セレビシエのグルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ４３５７７、配列番号１５）は、サッカロミセス・セレビシエのｇｎａ１遺伝子（配列番号１４）によってコードされている。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、サッカロミセス・セレビシエのＧｎａ１又はこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列、好ましくは、サッカロミセス・セレビシエのＧｎａ１をコードするヌクレオチド配列（配列番号１４）を含み、発現する核酸分子を含む。
【００４７】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、サッカロミセス・セレビシエのＧｎａ１又はサッカロミセス・セレビシエのＧｎａ１の機能的変異体の１つをコードするヌクレオチド配列は、サッカロミセス・セレビシエのｇｎａ１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００４８】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃ６Ｐ）からＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）への変換を触媒する、ＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼを発現する。ＨＡＤ様スーパーファミリーは、細菌酵素であるハロ酸デヒドロゲナーゼにちなんで名付けられており、ホスファターゼを含む。ＧｌｃＮＡｃ６ＰからＧｌｃＮＡｃへの変換を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの適切なホスファターゼは、フルクトース−１−ホスフェートホスファターゼ（ＹｑａＢ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ７７４７５）及びアルファ−Ｄ−グルコース１−ホスフェートホスファターゼ（ＹｉｈＸ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ０Ａ８Ｙ３）からなる群から選択され得る。エスケリキア・コリのＹｑａＢ酵素及びエスケリキア・コリのＹｉｈＸ酵素は、ＧｌｃＮＡｃ６Ｐに対しても作用すると考えられている（Ｌｅｅ，Ｓ．Ｗ．及びＯｈ，Ｍ．Ｋ．（２０１５）、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ２８：１４３〜１５０）。一実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ−６−ホスフェートからＧｌｃＮＡｃへの変換を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼは、非天然微生物における異種酵素である。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ６ＰからＧｌｃＮＡｃへの変換を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼは、エスケリキア・コリのＹｑａＢ、エスケリキア・コリのＹｉｈＸ及びこれらの機能的変異体からなる群から選択される。
【００４９】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ＧｌｃＮＡｃ６ＰからＧｌｃＮＡｃへの変換を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ６ＰからＧｌｃＮＡｃへの変換を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列である。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ６ＰからＧｌｃＮＡｃへの変換を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列は、エスケリキア・コリのフルクトース−１−ホスフェートホスファターゼ又はエスケリキア・コリのアルファ−Ｄ−グルコース１−ホスフェートホスファターゼ又はこれらの２つ酵素のうちの１つの機能的断片をコードする。
【００５０】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ＧｌｃＮＡｃ６ＰからＧｌｃＮＡｃへの変換を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼ若しくは前記ＨＡＤホスファターゼの機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するように、及び／又は、ＧｌｃＮＡｃ６ＰからＧｌｃＮＡｃへの変換を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼ若しくはこれらの機能的変異体を含むように、遺伝子操作されている。
【００５１】
ＧｌｃＮＡｃ６ＰからＧｌｃＮＡｃへの変換を触媒するＨＡＤ様スーパーファミリーの適切な糖ホスファターゼをコードするヌクレオチド配列は、エスケリキア・コリのＹｑａＢ、エスケリキア・コリのＹｉｈＸ及びこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列の群から選択され得る。
【００５２】
エスケリキア・コリのＹｑａＢ（配列番号１７）及びエスケリキア・コリのＹｉｈＸ（配列番号１９）は、エスケリキア・コリの遺伝子ｙｑａＢ（配列番号１６）及びｙｉｈＸ（配列番号１８）によってそれぞれコードされている。したがって、さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、エスケリキア・コリのＹｑａＢ、エスケリキア・コリのＹｉｈＸ又はこれらの２つ酵素のうちの１つの機能的断片をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する。
【００５３】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、エスケリキア・コリのＹｑａＢ又はこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列は、エスケリキア・コリのｙｑａＢと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００５４】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、エスケリキア・コリのＹｉｈＸ又はこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列は、エスケリキア・コリのｙｉｈＸと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００５５】
Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ（ＥＣ  ５．１．３．８）は、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）からＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）への変換を触媒する酵素である。この酵素は、炭水化物及びこれらの誘導体に作用するラセマーゼである。この酵素クラスの組織名は、Ｎ−アシル−Ｄ−グルコサミン２−エピメラーゼである。この酵素は、アミノ−糖代謝及びヌクレオチド−糖代謝に関与する。
【００５６】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、好ましくは、異種のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼを有する。
【００５７】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼは、アナベナ・バリアビリス（Ａｎａｂｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、アカリオクロリス属種（Ａｃａｒｙｏｃｈｌｏｒｉｓ  ｓｐ．）、ノストック属種（Ｎｏｓｔｏｃ  ｓｐ．）、ノストック・プンクチフォルメ（Ｎｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ）、バクテロイデス・オバータス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ）若しくはシネコシスティス属種（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．）に由来する、又はこれらの機能的変異体である。バクテロイデス・オバータス（Ｂ．ｏｖａｔｕｓ）ＡＴＣＣ  ８４８３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ７ＬＶＧ６、配列番号２１）のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼは、遺伝子ＢＡＣＯＶＡ＿０１８１６（配列番号２０）によってコードされている。シネコシスティス属種（株ＰＣＣ  ６８０３）のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ７４１２４、配列番号２３）はまた、レニン結合タンパク質としても知られており、ｓｌｒ１９７５遺伝子（配列番号２２）によってコードされている。
【００５８】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ又はこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、アナベナ・バリアビリス、アカリオクロリス属種、ノストック属種、ノストック・プンクチフォルメ、バクテロイデス・オバータス又はシネコシスティス属種のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ及びこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列である。
【００５９】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ若しくはこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有するように、及び／又は、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ若しくはこれらの機能的変異体を含むように、遺伝子操作されている。
【００６０】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼの機能的変異体の１つをコードするヌクレオチド配列は、シネコシスティス属種のｓｌｒ１９７５遺伝子と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００６１】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ＧｌｃＮＡｃ−６−ホスフェートエピメラーゼ活性及びＭａｎＮＡｃ−６−ホスフェートホスファターゼ活性を有する。
【００６２】
ＧｌｃＮＡｃ−６−ホスファターゼエピメラーゼは、ＧｌｃＮＡｃ−６−ホスフェートをＭａｎＮＡｃ−６−ホスフェートに変換するが、ＭａｎＮＡｃ−６−ホスフェートホスファターゼは、ＭａｎＮＡｃ−６−ホスフェートを脱リン酸化して、ＭａｎＮＡｃを生じさせる。図２に示すように、ＧｌｃＮＡｃ−６−ホスフェートエピメラーゼ活性及びＭａｎＮＡｃ−６−ホスフェートホスファターゼ活性を有することによって、ＧｌｃＮＡｃ−６−ホスフェートをＭａｎＮＡｃに変換するためのＮｅｕ５Ａｃの生産における、さらなるか、又は代替的な手段が提供される。
【００６３】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ＧｌｃＮＡｃ−６−ホスフェートエピメラーゼ又はこれらの機能的変異体をコードする遺伝子を有するように遺伝子操作されている。好ましくは、非天然微生物は、ＧｌｃＮＡｃ−６−ホスフェートエピメラーゼをコードするヌクレオチド配列を含み、発現する核酸分子を含有するように、遺伝子操作されている。
【００６４】
好ましくは、ＧｌｃＮＡｃ−６−ホスフェートエピメラーゼは、エンテロバクター・クロアカ亜種クロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｃｌｏａｃａｅ）（配列番号２５）又はこれらの機能的変異体に由来する。エンテロバクター・クロアカ亜種クロアカ（Ｅ．ｃｌｏａｃａｅ  ｓｕｂｓｐ．ｃｌｏａｃａｅ）のＧｌｃＮＡｃ−６−ホスフェートエピメラーゼをコードするヌクレオチド配列は、エンテロバクター・クロアカ亜種クロアカＡＴＣＣ  １３０４７（配列番号２４）のｎａｎＥ遺伝子のタンパク質コード領域である。
【００６５】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、ＧｌｃＮＡｃ−６−ホスフェートエピメラーゼの機能的変異体の１つをコードするヌクレオチド配列は、エンテロバクター・クロアカ亜種クロアカのｎａｎＥ遺伝子と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００６６】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ＭａｎＮＡｃ−６−ホスフェートホスファターゼ又はこれらの機能的変異体をコードする遺伝子を有するように遺伝子操作されている。
【００６７】
Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（ＥＣ  ２．５．１．５６）は、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）を使用するＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）からＮｅｕ５Ａｃへの変換を触媒する酵素である。Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ（ＮｅｕＢ）は、ｎｅｕＢ遺伝子によってコードされている。
【００６８】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ又はこれらの機能的変異体、好ましくは、異種のＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼを含む。さらなる実施形態において、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼは、カンピロバクター・ジェジュニ（配列番号２９）、ストレプトコッカス・アガラクチア、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）、メタノブレウィバクテル・ルミナチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｒｕｍｉｎａｔｉｕｍ）、アセトバクテリウム・ウーディー（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ）、デスルホバキュラ・トルオリカ（Ｄｅｓｕｌｆｏｂａｃｕｌａ  ｔｏｌｕｏｌｉｃａ）、エスケリキア・コリ、プレボテラ・ニグレセンス（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ  ｎｉｇｅｓｃｅｎｓ）、ハロラブダス・チアマテア（Ｈａｌｏｒｈａｂｄｕｓ  ｔｉａｍａｔｅａ）、デスルホチヌム・ホスフィトキシダンス（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｉｇｎｕｍ  ｐｈｏｓｐｈｉｔｏｘｉｄａｎｓ）又はカンジダツス・スカリンデュア属種（Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ  Ｓｃａｌｉｎｄｕａ  ｓｐ．）、イディオマリナ・ロイヒエンシス（Ｉｄｏｍａｒｉｎａ  ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）又はナイセリア・メニンジティディスに由来する。
【００６９】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ又はこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列は、異種ヌクレオチド配列である。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼをコードするヌクレオチド配列は、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ）のＮｅｕＢ（配列番号２８）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）のＮｅｕＢ、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカス（Ｂ．ｐｒｏｔｅｏｃｌａｓｔｉｃｕｓ）のＮｅｕＢ、メタノブレウィバクテル・ルミナチウム（Ｍ．ｒｕｍｉｎａｔｉｕｍ）のＮｅｕＢ、アセトバクテリウム・ウーディー（Ａ．ｗｏｏｄｉｉ）のＮｅｕＢ、デスルホバキュラ・トルオリカ（Ｄ．ｔｏｌｕｏｌｉｃａ）のＮｅｕＢ、エスケリキア・コリのＮｅｕＢ、プレボテラ・ニグレセンス（Ｐ．ｎｉｇｅｓｃｅｎｓ）のＮｅｕＢ、ハロラブダス・チアマテア（Ｈ．ｔｉａｍａｔｅａ）のＮｅｕＢ、デスルホチヌム・ホスフィトキシダンス（Ｄ．ｐｈｏｓｐｈｉｔｏｘｉｄａｎｓ）のＮｅｕＢ、カンジダツス・スカリンデュア属種（Ｃａ．ｓｃａｌｉｎｄｕａ  ｓｐ．）のＮｅｕＢ、イディオマリナ・ロイヒエンシス（Ｉ．ｌｏｉｈｉｅｎｓｉｓ）のＮｅｕＢ、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）のＮｅｕＢ、ナイセリア・メニンジティディス（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）のＮｅｕＢ及びこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される。
【００７０】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ又はＮ−アセチルノイラミン酸シンターゼの機能的変異体の１つをコードするヌクレオチド配列は、カンピロバクター・ジェジュニのＮｅｕＢ、ストレプトコッカス・アガラクチアのＮｅｕＢ、ブチリビブリオ・プロテオクラスチカスのＮｅｕＢ、メタノブレウィバクテル・ルミナチウムのＮｅｕＢ、アセトバクテリウム・ウーディーのＮｅｕＢ、デスルホバキュラ・トルオリカのＮｅｕＢ、エスケリキア・コリのＮｅｕＢ、プレボテラ・ニグレセンスのＮｅｕＢ、ハロラブダス・チアマテアのＮｅｕＢ、デスルホチヌム・ホスフィトキシダンスのＮｅｕＢ、カンジダツス・スカリンデュア属種のＮｅｕＢ、イディオマリナ・ロイヒエンシスのＮｅｕＢ、フソバクテリウム・ヌクレアタムのＮｅｕＢ、ナイセリア・メニンジティディスのＮｅｕＢをコードするヌクレオチド配列の１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００７１】
シアル酸異化経路
Ｎｅｕ５Ａｃを生産するための非天然微生物は、Ｎｅｕ５Ａｃを利用することができない。さらなる実施形態において、非天然微生物は、それがシアル酸を利用しないように遺伝子操作されている。このことによって、非天然微生物によって合成されたＮｅｕ５Ａｃは、天然の異化経路において分解されず、また、リポ多糖に及び／又はポリアシル酸に組み込まれることもない。逆に、非天然微生物はＮｅｕ５Ａｃを分泌することができ、これは、培養培地又は発酵ブロスに合成されている。
【００７２】
非天然微生物は、Ｎｅｕ５Ａｃを生産することができる。Ｎｅｕ５Ａｃを生産することができるようになるために、天然のシアル酸異化経路は機能しなくなっている。微生物におけるシアル酸異化経路の破壊は、その微生物によって合成された全てのシアル酸がさらに代謝されることを防止し、ひいては、非天然微生物によって生産され得るシアル酸の収量を増大させる。
【００７３】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、天然のシアル酸異化経路は、微生物を遺伝子操作することによって機能しなくなっている。
【００７４】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、天然のシアル酸異化経路は、シアル酸の異化作用に必要な酵素をコードする遺伝子の１つ以上を欠失させるか、又は他の方法で突然変異生成させることによって、破壊されている。したがって、シアル酸の異化作用に必要な酵素は、もはや生産されないか、又は正常な微生物、例えば野生型微生物よりもかなり低いレベルで生産される。例えば、シアル酸の異化作用に必要な酵素をコードする１つ以上の遺伝子は、ゲノムから欠失され得、その結果、対応する酵素は全く生産されない。あるいは、遺伝子発現を制御する調節配列は、この遺伝子が転写も翻訳もされ得ないように、置き換えられ得るか、又は突然変異され得る。転写又は翻訳のこの機能障害としては、転写又は翻訳の永続的な機能障害、並びに転写又は翻訳の一時的な機能障害が含まれる。すなわち、それぞれの遺伝子の転写又は翻訳は、転写又は翻訳を誘発又は抑制することによって調節され得る。したがって、それぞれの遺伝子の発現は、好ましくは、それぞれの遺伝子の発現を誘発する化合物（インデューサー）を培養培地に添加することによって、微生物を培養する間の任意の所望の時点で誘発され得る。別の実施形態において、それぞれの遺伝子の発現は、好ましくは、それぞれの遺伝子の発現を抑制する化合物（リプレッサー）を培養培地に添加することによってか、又はインデューサーとして作用するいずれかの化合物を培養培地から枯渇させることによって、微生物を培養する間の任意の所望の時点で抑制され得る。異なるアプローチにおいて、シアル酸の異化作用に必要な酵素をコードするヌクレオチド配列は、酵素の活性が無効にされるような手段で変更され得る。このことは、ヌクレオチド配列を改変して、元のヌクレオチド配列中のセンスコドン（アミノ酸を特定する）を停止コドンで置き換え、その結果、シアル酸代謝に必要な酵素の活性を欠いた、トランケートされたポリペプチドが生じることによってか、又は、シアル酸の異化作用に必要な酵素の非機能的変異体を生産する異なるアミノ酸を特定する別のコドンでセンスコドンを置き換えることによって、達成され得る。
【００７５】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物におけるシアル酸の異化作用を無効にするため、破壊又は改変の標的となる遺伝子は、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェートエピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ及びシアル酸パーミアーゼからなる群から選択される１つ以上の酵素をコードする。
【００７６】
Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．６０）は、Ｎ−アセチルマンノサミンをリン酸化してＮ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェートを生じさせる酵素である。Ｎ−アセチル−マンノサミンキナーゼは、ｎａｎＫ遺伝子によってコードされている。エスケリキア・コリのｎａｎＫのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号３０によって表されている。
【００７７】
Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェートエピメラーゼは、Ｎ−アセチル−マンノサミン−６−ホスフェート（ＭａｎＮＡｃ−６−Ｐ）をＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）に変換する酵素である。この酵素反応は、Ｎ−アセチルノイラミネートからＤ−フルクトース６−ホスフェートを合成するサブ経路の１つのステップである。Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェートエピメラーゼは、ｎａｎＥ遺伝子によってコードされている。エスケリキア・コリのｎａｎＥのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号３２によって表されている。
【００７８】
Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼは、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼとも呼ばれているが、Ｎ−アセチルノイラミン酸の可逆のアルドール切断を触媒して、ピルビン酸及びＮ−アセチルマンノサミン（ＭａｎＮＡｃ）を形成する。Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼは、ｎａｎＡ遺伝子によってコードされている。エスケリキア・コリのｎａｎＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号３４によって表されている。
【００７９】
シアル酸パーミアーゼは、細胞膜を通してのシアル酸のプロトン依存性の輸送を触媒する。シアル酸パーミアーゼは、Ｎ−アセチルノイラミン酸を輸送し得る。シアル酸パーミアーゼの変異体はまた、関連するシアル酸Ｎ−グリコリルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ｇｃ）及び３−ケト−３−デオキシ−Ｄ−グリセロ−Ｄ−ガラクトノノン酸（ＫＤＮ）を輸送し得る。シアル酸パーミアーゼは、インビトロで双方向性のトランスポーターとして機能することが知られてはいるが、インビボでの細胞外Ｎｅｕ５Ａｃの細胞インポートの原因となっている。シアル酸パーミアーゼは、ｎａｎＴ遺伝子によってコードされている。エスケリキア・コリのｎａｎＴのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号３６によって表されている。ｎａｎＴの破壊は、非天然微生物によって生産され、培養培地に分泌された、Ｎｅｕ５Ａｃの再インポートを防ぐ。
【００８０】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェートエピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ及びシアル酸パーミアーゼからなる群から選択される酵素のうちの少なくとも１つの活性が、野生型微生物と比較して低減しているか、又は無効になっている。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、微生物は、これらの酵素のうちの少なくとも１つの活性が低減するように又は無効となるように、遺伝子操作されている。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェートエピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ及びシアル酸パーミアーゼをコードする遺伝子の１つ以上を完全に欠失させるように、これらの遺伝子のうちの１つ以上の発現を損なわせるように、又は遺伝子のタンパク質コード領域に突然変異を導入し、その結果、変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、変更されていないヌクレオチド配列によってコードされている酵素の酵素活性を有さないようにすることによって、対応する酵素のうちの１つ以上の活性を無効とするように、遺伝子操作されている。
【００８１】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ及びＮ−アセチル−グルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼの少なくとも１つによって提供される酵素活性を有さない。
【００８２】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物において、酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼの少なくとも１つは機能しなくなっている。
【００８３】
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ（ＥＣ  ３．５．１．２５）は、アミノ−糖−ヌクレオチドの生合成における最初のステップに関与する酵素である。これは、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェート（ＧｌｃＮＡｃ−６−Ｐ）のＮ−アセチル基の加水分解を触媒して、グルコサミン６−ホスフェート及び酢酸塩を生じさせる。Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼは、ｎａｇＡ遺伝子によってコードされている。エスケリキア・コリのｎａｇＡのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号３８によって表されている。
【００８４】
グルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼ（ＥＣ  ３．５．９９．６）は、グルコサミン６−ホスフェート（ＧｌｃＮ６Ｐ）の可逆の異性化−脱アミノ化を触媒して、フルクトース６−ホスフェート（Ｆｒｕ６Ｐ）を形成する。グルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼは、ｎａｇＢ遺伝子によってコードされている。エスケリキア・コリのｎａｇＢのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号４０によって表されている。
【００８５】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ及び／又はグルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼが機能しなくなるように遺伝子操作されている。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ及びグルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼをコードする遺伝子の１つ以上を完全に欠失させるように、これらの遺伝子のうちの１つ以上の発現を損なわせるように、又はこれらの遺伝子のうちの少なくとも１つのタンパク質コード領域に突然変異を導入し、その結果、変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、変更されていないヌクレオチド配列によってコードされている酵素の酵素活性を有さないようにすることによって、対応する酵素のうちの１つ以上の活性を無効とするように、遺伝子操作されている。
【００８６】
ホスホトランスフェラーゼ炭水化物輸送系
シアル酸の細胞内での生産には、ホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）が必要である。ＰＥＰは、糖分解及び糖新生に関与するので、非常に重要な代謝中間体である。Ｎｅｕ５Ａｃの生産を向上させるために、非天然微生物は、シアル酸生合成のためのＰＥＰのより良い供給をもたらすように、遺伝子操作されている。この目的を達成するために、非天然微生物は、少なくとも１つのＰＥＰ依存性の糖輸送ホスホトランスフェラーゼ系（ＰＴＳ）が機能しなくなっているという点で、遺伝子操作されており、すなわち、対応する遺伝子が欠失若しくは破壊されているか、又は遺伝子の発現が損なわれている。
【００８７】
破壊に適した、ＰＥＰ依存性の糖輸送ホスホトランスフェラーゼ系は、ｎａｇＥ遺伝子によってコードされている、タンパク質−Ｎｐｉ−ホスホ−Ｌ−ヒスチジン：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンＮｐｉ−ホスホトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．７．１．１９３）としても知られているＧｌｃＮＡｃパーミアーゼである。ＮａｇＥ（酵素ＩＩとしても知られている）は、ＰＥＰ依存性の糖輸送ホスホトランスフェラーゼ系の成分である。この系は、その基質をペリプラズム又は細胞外空間から細胞質に同時に輸送し、それをリン酸化する。ｎａｇＥの欠失若しくは破壊又はその発現の機能障害は、ＰＥＰを消費してのＧｌｃＮＡｃのインポートを防ぐため、有益であり、さもなければ、シアル酸の生産に利用可能なＰＥＰの量が減少する。したがって、ｎａｇＥの欠失若しくは破壊又はその発現の機能障害は、Ｎｅｕ５Ａｃを生産するために非天然微生物によって利用され得るＰＥＰの細胞内プールを増大させ、それによって、シアル酸を生産し得るが無傷で機能的なｎａｇＥ遺伝子を有する非天然微生物と比較して、非天然微生物におけるＮｅｕ５Ａｃの収量が増大する。エスケリキア・コリのｎａｇＥのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号４２によって表されている。
【００８８】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、タンパク質−Ｎｐｉ−ホスホ−Ｌ−ヒスチジン：Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンＮｐｉ−ホスホトランスフェラーゼ活性を無効とするように遺伝子操作されている。
【００８９】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ｎａｇＥ遺伝子を完全に欠失させるように、その発現を損なわせるように、又はｎａｇＥ遺伝子のタンパク質コード領域に突然変異を導入し、その結果、変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、変更されていないヌクレオチド配列によってコードされている酵素の酵素活性を有さないようにすることによって、ＮａｇＥ酵素の活性を無効とするように、遺伝子操作されている。
【００９０】
破壊に適した、炭水化物をインポートするための、別の又はさらなる、ＰＥＰ依存性の糖輸送ホスホトランスフェラーゼ系は、マンノースパーミアーゼである。
【００９１】
Ｅｎｚｙｍｅ  ＩＩＭａｎ複合体（マンノースＰＴＳパーミアーゼ、タンパク質−Ｎｐｉ−ホスホヒスチジン−Ｄ−マンノースホスホトランスフェラーゼ）であるＭａｎＸＹＺは、外因性のヘキソース（マンノース、グルコース、グルコサミン、フルクトース、２−デオキシグルコース、マンノサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンなど）をインポートし、ホスフェートエステルを細胞質内に放出する。この酵素はまた、ＰＥＰ依存性の糖輸送ホスホトランスフェラーゼ系の成分でもある。ＭａｎＸＹＺは、３つのポリペプチド鎖の中に４つのドメインを有し、ＭａｎＸ＝ＩＩＡＢＭａｎ、ＭａｎＹ＝ＩＩＣＭａｎ及びＭａｎＺ＝ＩＩＤＭａｎである。これらは、ほとんどの他のＰＴＳパーミアーゼに相同ではない分離群であるマンノースＰＴＳパーミアーゼファミリーのメンバーである。エスケリキア・コリのｍａｎＸ、ｍａｎＹ及びｍａｎＺのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号４４、配列番号４６及び配列番号４８によってそれぞれ表されている。
【００９２】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、タンパク質−Ｎｐｉ−ホスホ−Ｌ−ヒスチジン：マンノースＮｐｉ−ホスホトランスフェラーゼ活性を無効にするように遺伝子操作されている。
【００９３】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ＭａｎＸ、ＭａｎＹ及びＭａｎＺをコードする遺伝子の１つ以上を完全に欠失させるように、これらの遺伝子のうちの１つ以上の発現を損なわせるように、又は遺伝子のタンパク質コード領域に突然変異を導入し、その結果、変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、変更されていないヌクレオチド配列によってコードされている酵素の酵素活性を有さないようにすることによって、対応する酵素のうちの１つ以上の活性を無効とするように、遺伝子操作されている。
【００９４】
破壊に適した、別の又はさらなる、ＰＥＰ依存性の糖輸送ホスホトランスフェラーゼ系は、グルコーストランスポーターである。
【００９５】
グルコース特異的なＰＴＳトランスポーター（ＰｔｓＧ／Ｃｒｒ）は、外因性のグルコースを取り込み、ホスフェートエステルを細胞質内に放出する。酵素ＩＩＧｌｃ複合体は、２つのドメインを単一のポリペプチド鎖内にＩＩＣ−ＩＩＢのドメイン順で有し（ＰｔｓＧ）、さらなるポリペプチド鎖であるＣｒｒタンパク質又はＩＩＡＧｌｃタンパク質と共に機能する。
【００９６】
ｐｔｓＧ及び／若しくはｃｒｒの欠失若しくは破壊又はその発現の機能障害は、ＰＥＰを消費してグルコースのインポートを防ぐため、有益であり、さもなければ、シアル酸の生産に利用可能なＰＥＰの量が減少する。したがって、ｐｔｓＧ遺伝子の欠失若しくは破壊及び／又はその発現の機能障害は、Ｎｅｕ５Ａｃを生産するために非天然微生物によって利用され得るＰＥＰの細胞内プールを増大させ、それによって、シアル酸を生産し得るが、無傷で機能的なｐｔｓＧ遺伝子及び／又はｃｒｒ遺伝子を有する非天然微生物と比較して、Ｎｅｕ５Ａｃを生産し得る非天然微生物におけるＮｅｕ５Ａｃの収量が増大する。
【００９７】
エスケリキア・コリのｐｔｓＧ及びｃｒｒのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列は、配列番号５０及び配列番号５２によってそれぞれ表されている。
【００９８】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ＰｔｓＧ／Ｃｒｒ活性を無効とするように遺伝子操作されている。
【００９９】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ｐｔｓＧ遺伝子及び／若しくはｃｒｒ遺伝子を完全に欠失させるように、ｐｔｓＧ遺伝子及び／若しくはｃｒｒの発現を損なわせるように、又はｐｔｓＧ遺伝子及び／若しくはｃｒｒ遺伝子のタンパク質コード領域に突然変異を導入し、その結果、変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、変更されていないヌクレオチド配列によってコードされている酵素の酵素活性を有さないようにすることによって、ＰｔｓＧ／Ｃｒｒの活性を無効とするように、遺伝子操作されている。
【０１００】
炭素源の獲得
非天然微生物は、生育、増殖及びＮｅｕ５Ａｃの生産のために炭素源を必要とする。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、例えばグルコース又はスクロースなどの安価な単独の炭素源で生育し得る。前記単独の炭素源は、非天然微生物におけるシアル酸生合成のための遊離体を提供する。したがって、Ｎｅｕ５Ａｃを生産するために、非天然微生物を、ＭａｎＮＡｃ、ＧｌｃＮＡｃ又はグルコサミン（ＧｌｃＮ）の存在下で培養する必要はない。さらに、非天然微生物は、単独の炭素源をインポートするために、ＰＥＰ依存性の糖輸送ホスホトランスフェラーゼ系を要さず、したがって、単独の炭素源を得るためにＰＥＰを利用する必要がない。
【０１０１】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、単独の炭素源としてスクロースを利用するように遺伝子操作されている。
【０１０２】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、機能的なスクロース利用系を有する。前記機能的なスクロース利用系は、外部から供給されたスクロースの細胞インポート及びその加水分解を可能にし、その結果、得られた単糖のグルコース及びフルクトースが、非天然微生物の代謝によって、及び所望のＮｅｕ５Ａｃ生産のために、代謝利用され得るようになる。
【０１０３】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、機能的なスクロース利用系を有するように遺伝子修飾されている。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物のスクロース利用系は、スクロースプロトンシンポート輸送系、フルクトキナーゼ、インベルターゼ及びスクロースオペロンリプレッサーを含む。
【０１０４】
適切なスクロースプロトンシンポート輸送系は、ｃｓｃＢ遺伝子によってコードされているＣｓｃＢ、例えば、エスケリキア・コリのｃｓｃＢ遺伝子（配列番号５４）によってコードされているエスケリキア・コリのＣｓｃＢ（配列番号５５）である。
【０１０５】
適切なフルクトキナーゼ（ＥＣ  ２．７．１．４）は、ｃｓｃＫ遺伝子によってコードされているＣｓｃＫ、例えば、エスケリキア・コリのｃｓｃＫ遺伝子（配列番号５６）によってコードされているエスケリキア・コリのＣｓｃＫ（配列番号５７）である。
【０１０６】
ベータ−Ｄ−フルクトフラノシドにおける末端の非還元性のベータ−Ｄ−フルクトフラノシド残基を加水分解する適切なインベルターゼ（ＥＣ  ３．２．１．２６）は、ＣｓｃＡ、例えば、エスケリキア・コリのｃｓｃＡ遺伝子（配列番号５８）によってコードされているエスケリキア・コリのｃｓｃＡ（配列番号５９）である。
【０１０７】
適切なスクロースオペロンリプレッサーは、ｃｓｃＲ遺伝子によってコードされているＣｓｃＲ、例えば、エスケリキア・コリ（配列番号６０）のｃｓｃＲ遺伝子によってコードされているエスケリキア・コリのＣｓｃＲ（配列番号６１）である。
【０１０８】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、スクロースプロトンシンポート輸送系、フルクトキナーゼ、インベルターゼ及びスクロースオペロンリプレッサー又はこれらのタンパク質のうちのいずれか１つの機能的変異体を有するように遺伝子操作されている。
【０１０９】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、スクロースプロトンシンポート輸送系、フルクトキナーゼ、インベルターゼ及びスクロースオペロンリプレッサーの発現のための、前記スクロースプロトンシンポート輸送系、フルクトキナーゼ、インベルターゼ及びスクロースオペロンリプレッサーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を有するように遺伝子操作されている。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、遺伝子ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡ、好ましくはエスケリキア・コリの遺伝子ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＲを発現するように遺伝子操作されている。
【０１１０】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、ＣｓｃＢ、ＣｓｃＫ、ＣｓｃＡ又はＣｓｃＲの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列は、エスケリキア・コリのｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡ又はｃｓｃＲとそれぞれ少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１１１】
Ｎｅｕ５Ａｃを生産し得、機能的なスクロース利用系を有している、非天然微生物は、微生物の代謝及びＮｅｕ５Ａｃ生合成のために、単独の炭素源としてのスクロースの存在下で培養され得る。スクロースは安価な糖であり、発酵によるＮｅｕ５Ａｃの生産のための単独の炭素源としてのその利用は、ＧｌｃＮＡｃなどの他のシアル酸前駆体よりもコストが効率的である。
【０１１２】
別の適切な糖類利用系は、非天然微生物が、ｌａｃオペロンのｌａｃＹ遺伝子によってコードされているＬａｃＹであるＰＥＰ依存性の糖輸送ホスホトランスフェラーゼ系を伴わずに単独の炭素源上で生育することを可能にする。ＬａｃＹは、同一方向のプロトン勾配を使用して細胞膜を通してラクトースをインポートするβ−ガラクトシドパーミアーゼである。細胞内のラクトースは、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）によって加水分解され得、細胞内でグルコース及びガラクトースを生じさせる。ｌａｃＺ遺伝子もまた、ｌａｃオペロンの一部である。
【０１１３】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、β−ガラクトシドパーミアーゼ及びβ−ガラクトシダーゼを発現する。
【０１１４】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、β−ガラクトシドパーミアーゼ、好ましくはエスケリキア・コリのラクトースパーミアーゼＬａｃＹ（配列番号６３）又はこれらの機能的変異体、及びβ−ガラクトシダーゼ、好ましくはエスケリキア・コリのＬａｃＺ（配列番号６５）又はこれらの機能的変異体を発現するように遺伝子操作されている。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、β−ガラクトシドパーミアーゼをコードするヌクレオチド配列、好ましくは、エスケリキア・コリのＬａｃＹ（配列番号６２）若しくはこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列、及び／又はβ−ガラクトシダーゼをコードするヌクレオチド配列、好ましくは、エスケリキア・コリのＬａｃＺ（配列番号６４）若しくはこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を有するように遺伝子操作されている。
【０１１５】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、エスケリキア・コリのＬａｃＹ又はこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列は、エスケリキア・コリのｌａｃＹと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１１６】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、エスケリキア・コリのＬａｃＺ又はこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列は、エスケリキア・コリのｌａｃＺと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１１７】
Ｎｅｕ５Ａｃを生産し得る、また機能的β−ガラクトシドパーミアーゼ及び機能的β−ガラクトシダーゼを発現する、非天然微生物は、単独の炭素源としてのラクトースでの前記非天然微生物の培養を可能にする。
【０１１８】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、グルコース／Ｈ＋−シンポーターを発現する。好ましくは、非天然微生物は、前記非天然微生物においてグルコース／Ｈ＋−シンポーターをコードし、前記非天然微生物におけるその発現を可能にするヌクレオチド配列を含む核酸分子を有するように、遺伝子操作されている。
【０１１９】
適切なグルコース／Ｈ＋−シンポーターは、スタフィロコッカス・エピデルミス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）のグルコース／Ｈ＋−シンポーター（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ａ０Ｕ５ＱＤＭ９、配列番号６７）、ラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）のグルコース／Ｈ＋−シンポーター（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ａ０Ｃ１ＰＵ７５、配列番号６９）及びこれらの機能的変異体からなる群から選択される。
【０１２０】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、スタフィロコッカス・エピデルミス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ）のグルコース／Ｈ＋−シンポーター又はラクトバチルス・ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）のグルコース／Ｈ＋−シンポーターをコードする核酸分子を有するように遺伝子操作されている。好ましくは、非天然微生物は、配列番号６６、配列番号６８、及び、配列番号６６又は配列番号６８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む核酸分子を有する。
【０１２１】
Ｎｅｕ５Ａｃを生産し得る、また、スタフィロコッカス・エピデルミスのグルコース／Ｈ＋−シンポーター又はラクトバチルス・ブレビスのグルコース／Ｈ＋−シンポーターのいずれかを発現し得る、非天然微生物は、外部から供給されたグルコースを得るためにＰＥＰを要することなく、単独の炭素源としてのグルコースの存在下で培養され得る。
【０１２２】
さらなる遺伝子修飾
Ｎｅｕ５Ａｃを生産し得る非天然微生物は、任意選択的に、さらなる特徴を含み得、これらのさらなる特徴を有するように遺伝子操作されていてよい。これらのさらなる特徴は、非天然微生物の生産性を向上させて、Ｎｅｕ５Ａｃの収量をより高くすると考えられる。
【０１２３】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、野生型の微生物よりも多くのＰＥＰを合成する。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、増強したＰＥＰ生合成経路を有するように遺伝子操作されている。好ましくは、非天然微生物は、例えば、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ遺伝子をコードするｐｐｓＡ遺伝子が過剰発現しているという点で、及び／又は、非天然微生物が、ホスホエノールピルビン酸シンターゼ若しくはこれらの機能的変異体の発現を可能にするヌクレオチド配列の少なくとも１つのさらなるコピーを含有するという点で、増大したホスホエノールピルビン酸シンターゼ活性を有するように遺伝子操作されている。ｐｐｓＡの過剰発現は細胞内のＰＥＰ合成を増強させ、その結果、シアル酸の生産のために、より多くのＰＥＰが利用可能である。例えば、適切なホスホエノールピルビン酸シンターゼは、エスケリキア・コリのＰｐｓＡ（配列番号７１）である。
【０１２４】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、エスケリキア・コリのＰｐｓＡ又はこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含有する。エスケリキア・コリのＰｐｓＡ又はこれらの機能的変異体をコードする前記ヌクレオチド配列は、エスケリキア・コリのｐｐｓＡ遺伝子（配列番号７０）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０１２５】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼを過剰発現するように遺伝子操作されている。適切なホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼは、エスケリキア・コリのＰｃｋ（配列番号７３）である。
【０１２６】
酵素ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＥＣ  ４．１．１．４９）は、ｐｃｋ遺伝子によってコードされ、以下の反応：オキサロ酢酸＋ＡＴＰ→ホスホエノールピルビン酸＋ＡＤＰ＋ＣＯ２を触媒する。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼは、糖新生に関与する。
【０１２７】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼを過剰発現するように、及び／又は、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ若しくはこれらの機能的変異体の発現を可能にする少なくとも１つのさらなるヌクレオチド配列を含有するように、遺伝子操作されている。ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼの過剰発現は、ＰＥＰの細胞内レベルを増大させ、その結果、より多くのＰＥＰが、シアル酸の生産に利用可能である。
【０１２８】
ホスホエノールピルビン酸キナーゼ又はこれらの機能的変異体をコードするさらなるヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７２、又はエスケリキア・コリのｐｃｋ遺伝子（配列番号７２）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０１２９】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、機能的なホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ＥＣ  ４．１．１．３１）を有さない。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、トリカルボン酸サイクルの４つの炭素からなるジカルボン酸源であるオキサロ酢酸を形成する。ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、ｐｐｃ遺伝子によってコードされている。エスケリキア・コリにおいて、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（配列番号２７）は、ｐｅｐＣ遺伝子（配列番号２６）によってコードされている。
【０１３０】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を無効とするように遺伝子操作されている。
【０１３１】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ｐｐｃ遺伝子若しくはｐｅｐＣ遺伝子を欠失させるように、その発現を損なわせるように、又はｐｐｃ／ｐｅｐＣ遺伝子のタンパク質コード領域に突然変異を導入し、その結果、変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を有さないようにすることによって、ＰＥＰカルボキシラーゼ活性を無効とするように、遺伝子操作されている。
【０１３２】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ピルビン酸キナーゼ活性が弱まるか、又は無効となるように遺伝子操作されている。
【０１３３】
酵素ピルビン酸キナーゼは、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）及びＰＥＰからアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を生成する。ＡＤＰ及びＰＥＰからのＡＴＰの生成は、糖分解における最後のステップであり、このステップは、生理学的条件下で不可逆的である。エスケリキア・コリを含む多くのエンテロバクター科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）は、エスケリキア・コリにおいて３７％同一な、ピルビン酸キナーゼの２つのアイソフォーム、ＰｙｋＡ（配列番号７５）及びＰｙｋＦ（配列番号７７）を有する。
【０１３４】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ピルビン酸キナーゼをコードする１つ以上の遺伝子、好ましくはｐｙｋＡ遺伝子（配列番号７４）及び／若しくはｐｙｋＦ遺伝子（配列番号７６）を欠失させるように、ピルビン酸キナーゼをコードするこれらの遺伝子のうちの１つ以上の発現を損なわせるように、又はピルビン酸キナーゼをコードするこれらの遺伝子のうちの１つ以上のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列に１つ以上の突然変異を導入し、その結果、変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、ピルビン酸キナーゼ活性を有さないようにすることによって、少なくとも１つのピルビン酸キナーゼの活性を無効とするように、遺伝子操作されている。
【０１３５】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、野生型と比較して、より多くのグルタミンを合成する。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、増強したグルタミン生合成経路を有するように遺伝子操作されている。
【０１３６】
グルタミンシンターゼ（ＧｌｎＡ）は、以下の反応：ＡＴＰ＋Ｌ−グルタメート＋ＮＨ３＝ＡＤＰ＋ホスフェート＋Ｌ−グルタミンによって、グルタメートをグルタミンに変換する。エスケリキア・コリにおいて、グルタミンシンターゼ（配列番号７９）は、ｇｌｎＡ遺伝子（配列番号７８）によってコードされている。
【０１３７】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、グルタミンシンターゼを過剰発現するように、及び／又はグルタミンシンターゼ若しくはこれらの機能的変異体の発現を可能にする少なくとも１つのさらなるヌクレオチド配列を含有するように、遺伝子操作されている。グルタミンシンターゼの過剰発現は、グルタミンの細胞内レベルを増大させ、その後、フルクトース−６−ホスフェート（Ｆｒｃ−６Ｐ）からグルコサミン−６−ホスフェート（ＧｌｃＮ−６Ｐ）への細胞内での変換を向上させる。好ましくは、グルタミンシンターゼ又はこれらの機能的変異体をコードするさらなるヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列は、配列番号７８、又はエスケリキア・コリのｇｌｎＡ遺伝子（配列番号７８）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０１３８】
エスケリキア・コリにおける代謝のモデリングによって、グルタミン合成の増強が、Ｎｅｕ５Ａｃの生産を加速させることが確認されている。さらに、グルタミン合成を増強させるように遺伝子操作されていない、Ｎｅｕ５Ａｃを生産するエスケリキア・コリ株（＃ＮＡＮＡ１）における、トランスクリプトーム分析は、グルタミンシンターゼが、Ｎｅｕ５Ａｃを生産することができない関連するエスケリキア・コリ株と比較して高いレベルで発現されたことを明らかにした。
【０１３９】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、機能的グルタメートシンターゼを有していないか、又は野生型微生物と比較してグルタメートシンターゼ活性が低い。エスケリキア・コリのグルタメートシンターゼは、２つのサブユニット、ＧｌｔＢ（配列番号８１）及びＧｌｔＤ（配列番号８３）からなり、グルタミンを消費してグルタメートを合成する。ＧｌｔＢはｇｌｔＢ遺伝子（配列番号８０）によってコードされ、ＧｌｔＤはｇｌｔＤ遺伝子（配列番号８２）によってコードされている。
【０１４０】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ｇｌｔＢ遺伝子及び／若しくはｇｌｔＤ遺伝子を欠失させるように、これらの遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を損なわせるように、又はｇｌｔＢ遺伝子及び／若しくはｇｌｔＤ遺伝子のタンパク質コード領域に１つ以上の突然変異を導入し、その結果、変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、グルタメートシンターゼの非機能的な変異体を生じさせるようにすることによって、グルタメートシンターゼ活性を低減させるか、若しくは無効とするように、遺伝子操作されている。
【０１４１】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、グルタミナーゼ活性を有さない。
【０１４２】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、グルタミナーゼ遺伝子ａｓｎＢ、ｙｂａＳ及びｙｎｅＨの少なくとも１つを欠失させるように、これらの遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を損なわせるように、又はａｓｎＢ、ｙｂａＳ及び／若しくはｙｎｅＨのタンパク質コード領域に１つ以上の突然変異を導入し、その結果、変更されたヌクレオチド配列の１つによってコードされているポリペプチドは、グルタミナーゼ活性を有さないようにすることによって、グルタミナーゼ活性を無効とするように、遺伝子操作されている。
【０１４３】
ＡｓｎＢは、アスパラギンシンターゼであり、グルタミンを使用して、アスパルテートからアスパラギンへのＡＴＰ依存性の変換を触媒する。エスケリキア・コリのアスパラギンシンターゼＡｓｎＢ（配列番号８５）は、エスケリキア・コリのａｓｎＢ遺伝子（配列番号８４）によってコードされている。
【０１４４】
ＧｌｓＡ１又はＧｌｓ１としても知られているＹｂａＳは、グルタミナーゼ１であり、これは、Ｌ−グルタミンに対して高度に選択的なグルタミナーゼである。ＹｂａＳは、Ｌ−グルタミンをＬ−グルタメートに変換する。エスケリキア・コリのグルタミナーゼＹｂａＳ（配列番号８７）は、エスケリキア・コリのｙｂａＳ遺伝子（配列番号８６）によってコードされている。
【０１４５】
ＧｌｓＡ２、ＧｌｓＢ又はグルタミナーゼ２としても知られているＹｎｅＨは、以下の反応：Ｌ−グルタミン＋Ｈ２Ｏ＝Ｌ−グルタメート＋ＮＨ３を触媒する。エスケリキア・コリのグルタミナーゼＹｎｅＨ（配列番号８９）は、エスケリキア・コリのｙｎｅＨ遺伝子（配列番号８８）によってコードされている。
【０１４６】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、野生型微生物と比較して増大したグルタメートデヒドロゲナーゼ活性を有する。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、グルタメートデヒドロゲナーゼを過剰発現するように遺伝子操作されており、及び／又はグルタメートデヒドロゲナーゼ若しくはこれらの機能的変異体の発現を可能にする少なくとも１つのさらなるヌクレオチド配列を含有する。
【０１４７】
グルタメートデヒドロゲナーゼは、グルタメートをα−ケトグルタレートに変換する。グルタメートデヒドロゲナーゼの過剰発現は、α−ケトグルタレートの形成を増大させ、その後、グルタミン酸シンターゼによって、例えば、エスケリキア・コリのｇｌｔＤによってコードされているグルタミン酸シンターゼ又はこれらの機能的変異体によって、グルタメートに変換され得る。その場合、グルタメートは、グルタミンシンターゼ（ＧｌｎＡ）又はこれらの機能的変異体によって、グルタミンに変換され得る。
【０１４８】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、グルタメートデヒドロゲナーゼ又はこれらの機能的変異体の発現を可能にするさらなるヌクレオチド配列としては、エスケリキア・コリのグルタメートデヒドロゲナーゼＧｄｈＡ（配列番号９１）のタンパク質コード領域が含まれる。グルタメートデヒドロゲナーゼ又はこれらの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号９０、又はエスケリキア・コリのｇｄｈＡ遺伝子（配列番号９０）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、若しくは少なくとも９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列であり得る。
【０１４９】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、リポ多糖（ＬＰＳ）及び／又はコラン酸を合成することができない。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ＬＰＳ及び／又はコラン酸の合成を無効とするように遺伝子操作されている。
【０１５０】
一実施形態において、非天然微生物は、ｗｚｘＣ遺伝子を欠失させるように、ｗｚｘＣ遺伝子の発現を損なわせるように、又は遺伝子のタンパク質コード領域に１つ以上の突然変異を導入することによって、ＷｚｘＣ酵素の活性を無効とするように、遺伝子操作されており、前記変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドは、ＷｚｘＣの酵素活性を有さない。ＷｚｘＣは、ＬＰＳ生合成に必要であり、推定上のエクスポートタンパク質をコードする。エスケリキア・コリのｗｚｘＣのヌクレオチド配列は配列番号９２よって表されており、推定アミノ酸配列は配列番号９３によって表されている。
【０１５１】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルホスフェートグルコース−１−ホスフェートトランスフェラーゼ活性を有さない。
【０１５２】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、好ましくは、ｗｃａＪ遺伝子若しくはこれらの機能的変異体を欠失させることによって、ｗｃａＪ遺伝子若しくはこれらの機能的変異体の発現を損なわせることによってか、又はタンパク質コード領域に突然変異を導入し、その結果、変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、ＷｃａＪの酵素活性を有さないようにすることによってＷｃａＪ酵素の活性を無効にすることによって、ＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルホスフェートグルコース−１−ホスフェートトランスフェラーゼ活性を無効とするように遺伝子操作されている。ＷｃａＪは、ＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルホスフェートグルコース−１−ホスフェートトランスフェラーゼをコードする。前記ＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルホスフェートグルコース−１−ホスフェートトランスフェラーゼは、コラン酸生合成における第１の酵素である。エスケリキア・コリのｗｃａＪのヌクレオチド配列は配列番号９４によって表されており、推定アミノ酸配列は配列番号９５によって表されている。
【０１５３】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、非天然微生物がラクトースとは別の単独の炭素源で、例えば、単独の炭素源としてのスクロース又はグルコースで培養され得る場合、機能的β−ガラクトシドパーミアーゼ（ＬａｃＹ）及び／又は機能的β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）を含み得ない。
【０１５４】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、β−ガラクトシドパーミアーゼ遺伝子（ｌａｃＹ）及び／又はβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｌａｃＺ）が欠失しているという点で、β−ガラクトシドパーミアーゼ遺伝子及び／若しくはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子の発現が損なわれているという点で、又はβ−ガラクトシドパーミアーゼ遺伝子及び／若しくはβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列が変更されており、その結果、前記変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドは、β−ガラクトシドパーミアーゼ及び／又はβ−ガラクトシダーゼの酵素活性を有さないという点で、遺伝子操作されている。
【０１５５】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、機能的ＹｊｈＣを有さない。ＹｊｈＣは、ｙｊｈＣ遺伝子又はこれらの機能的変異体によってコードされている酸化還元酵素である。
【０１５６】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、好ましくはｙｊｈＣ遺伝子を欠失させることによって、ｙｊｈＣ遺伝子の発現を損なわせることによってか、又はｙｊｈＣ遺伝子のタンパク質コード領域に１つ以上の突然変異を導入し、その結果、変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、ＹｊｈＣの酸化還元酵素活性を有さないようにすることによって、ＹｊｈＣの酸化還元酵素活性を無効とするように遺伝子操作されている。
【０１５７】
エスケリキア・コリのｙｊｈＣのヌクレオチド配列は配列番号９６によって表されており、推定アミノ酸配列は配列番号９７によって表されている。
【０１５８】
その場合、さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、以下の酵素活性の１つ以上：フコースイソメラーゼ、フクロキナーゼ及びＮ−アセチルグルタミンアミノアシラーゼを有さない。一実施形態において、非天然微生物は、これらの酵素活性のうちの１つ以上の活性を無効とするように遺伝子操作されている。
【０１５９】
フコースイソメラーゼは、アルドースＬ−フコースを対応するケトースＬ−フクロースに変換する。フコースイソメラーゼは、Ｌ−フコースからＬ−ラクトアルデヒド及びグリセロンホスフェートを合成するサブ経路における第１の酵素である。エスケリキア・コリのフコースイソメラーゼＦｕｃＩ（配列番号９９）は、エスケリキア・コリのｆｕｃＩ遺伝子（配列番号９８）によってコードされている。
【０１６０】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、好ましくはｆｕｃＩ遺伝子を欠失させることによって、ｆｕｃＩ遺伝子の発現を損なわせることによって、又はｆｕｃＩ遺伝子のタンパク質コード領域を修飾し、その結果、前記変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、フコースイソメラーゼ活性を有さないようにすることによって、フコースイソメラーゼ活性を無効とするように遺伝子操作されている。
【０１６１】
フクロキナーゼは、フコースのリン酸化を触媒する。フクロキナーゼは、Ｌ−フコースからＬ−ラクトアルデヒド及びグリセロンホスフェートを合成するサブ経路における第２の酵素である。エスケリキア・コリのフクロキナーゼＦｕｃＫ（配列番号１０１）は、エスケリキア・コリのｆｕｃＫ遺伝子（配列番号１００）によってコードされている。エスケリキア・コリのフクロキナーゼはまた、より低い効率で、Ｄ−リブロース、Ｄ−キシルロース及びＤ−フルクトースをリン酸化することができる。
【０１６２】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、好ましくはｆｕｃＫ遺伝子を欠失させることによってか、又はｆｕｃＫ遺伝子の発現を損なわせることによってか、又はｆｕｃＫ遺伝子のタンパク質コード領域に突然変異を導入し、その結果、前記変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、フコースイソメラーゼ活性を有さないようにすることによって、フコースイソメラーゼ活性を無効とするように遺伝子操作されている。
【０１６３】
Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼは、以下の反応：Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン６−ホスフェート＋Ｈ２Ｏ→Ｄ−ガラクトサミン６−ホスフェート＋酢酸塩を触媒する。Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼは、ａｇａＡ遺伝子によってコードされている。エスケリキア・コリの株Ｃ及び株ＥＣ３１３２とは対照的に、Ｋ−１２株はＮ−アセチルガラクトサミン及びＤ−ガラクトサミンでは生育することができず、それは、これらが欠失を有し、ひいては、これらの化合物に特異的に活性なＰＴＳ系を欠いているためである。したがって、Ｋ−１２株において、ＡｇａＡは、これらの化合物の分解に関与しない。エスケリキア・コリのＡｇａＡ（配列番号１０３）は、エスケリキア・コリのａｇａＡ遺伝子（配列番号１０２）によってコードされている。
【０１６４】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、好ましくはａｇａＡ遺伝子を欠失させることによって、ａｇａＡ遺伝子の発現を損なわせることによってか、又はａｇａＡ遺伝子のタンパク質コード領域に突然変異を導入し、その結果、前記変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ活性を有さないようにすることによって、Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ活性を無効とするように遺伝子操作されている。
【０１６５】
非天然微生物は、酵母、真菌及び細菌からなる群から選択される。好ましくは、非天然微生物は、例えば、連邦医薬品局（ＦＤＡ）によって断言されているか、又は適格な専門家によって独立に判定されている、一般に安全と認められる生物（ＧＲＡＳ）、さらに好ましくは、原核性微生物、最も好ましくは、細菌性微生物である。Ｎｅｕ５Ａｃの生産に適した細菌は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スポロラクトバチルス属（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ミクロモノスポラ属（Ｍｉｃｒｏｍｏｍｏｓｐｏｒａ）、マイクロコッカス属（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）から選択され得る。適切な細菌種としては、バチルス・サブティリス、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアグランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、シトロバクター・フロインディイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・サーモフィルス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、エスケリキア・コリ、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス・ヘルベティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブルッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・イエンセニ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、パントエア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトボルム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、プロプリオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）及びキサントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）が含まれる。
【０１６６】
第２の態様によると、Ｎｅｕ５Ａｃを生産するために、本明細書において先に記載された非天然微生物の使用が提供される。非天然微生物は、産業規模でＮｅｕ５Ａｃを生産することができる。本明細書において使用されるＮｅｕ５Ａｃの生産に関する用語「することができる」及び「し得る」は、前記非天然微生物がＮｅｕ５Ａｃを生産することを許容する条件下で培養される場合、非天然微生物の、Ｎｅｕ５Ａｃを合成し、前記Ｎｅｕ５Ａｃを発酵ブロス中に分泌する能力を指す。この能力には、前記非天然微生物が、高い細胞密度まで増殖する能力及び、大容量で、例えば、１０００Ｌを超える容積で、好ましくは１００００Ｌを超える容積で、さらに好ましくは８００００Ｌを超える容積で、最も好ましくは２０万Ｌを超える容積で培養される能力が含まれる。
【０１６７】
第３の態様によると、微生物発酵によってＮｅｕ５Ａｃを生産するための方法が提供される。この方法は、
−  Ｎｅｕ５Ａｃを生産することができる非天然微生物、好ましくは、本明細書において先に記載された非天然微生物を提供するステップ、
−  前記非天然微生物を、発酵ブロス中で、前記微生物によるＮｅｕ５Ａｃの生産を許容する条件下で培養するステップ、及び任意選択的に、
−  Ｎｅｕ５Ａｃを発酵ブロスから回収するステップ
を含む。
【０１６８】
発酵ブロスは、非天然微生物のための少なくとも１つの炭素源を含有する。この炭素源は、好ましくは、グルコース、キシロース、フルクトース、スクロース、ラクトース、グリセロール、合成ガス及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。
【０１６９】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、非天然微生物は、ピルビン酸、グルコサミン、Ｎ−アセチルグルコサミンからなる群から選択される１つ以上の不存在下で、及び／又はこれらを添加せずに、発酵ブロス中で培養される。
【０１７０】
この方法は、発酵ブロス中でのその培養の間に非天然微生物によって生産されたＮｅｕ５Ａｃを回収する任意選択的なステップを含む。Ｎｅｕ５Ａｃは、非天然微生物が発酵ブロスから除去された後に、例えば遠心分離によって、発酵ブロスから回収され得る。その後、Ｎｅｕ５Ａｃはさらに、こうして澄明化された発酵ブロスから、精密濾過、限外濾過、ダイアフィルトレーション、疑似移動床式クロマトグラフィー、電気透析、逆浸透、ゲル濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィーなどの適切な技術によって精製され得る。
【０１７１】
この方法は、微生物発酵によるＮｅｕ５Ａｃの大規模な及び経済的に維持可能な生産に適している。
【０１７２】
第４の態様によると、本明細書において記載される微生物発酵によって生産されたＮｅｕ５Ａｃが提供される。
【０１７３】
第５の態様によると、栄養組成物を製造するための、本明細書において記載されるように生産されたＮｅｕ５Ａｃの使用が提供される。
【０１７４】
第６の態様によると、第３の態様の方法によって生産されたＮｅｕ５Ａｃを含有する栄養組成物が提供される。
【０１７５】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、栄養組成物は、少なくとも１つのヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、好ましくは少なくとも１つの中性ＨＭＯ及び／又は少なくとも１つの酸性ＨＭＯをさらに含有する。
【０１７６】
中性ＨＭＯは、２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）及びラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ（ＬＮＰＦＩ）からなる群から選択され得る。
【０１７７】
１つの酸性ＨＭＯは、シアル化されたＨＭＯからなる群から選択され得、好ましくは、３’−シアリルラクトース（３−ＳＬ）、６’−シアリルラクトース（６−ＳＬ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースａ（ＬＳＴ−ａ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｂ（ＬＳＴ−ｂ）、シアリルラクト−Ｎ−テトラオースｃ（ＬＳＴ−ｃ）及びジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース（ＤＳＬＮＴ）からなる群から選択され得る。
【０１７８】
さらなる実施形態において、栄養組成物は、医薬製剤、乳児用調製物及び栄養補助食品からなる群から選択される。
【０１７９】
栄養組成物は、液体形態で、又は限定はしないが、粉末、顆粒、フレーク及びペレットを含む固体形態で存在し得る。
【０１８０】
さらなる及び／又は代替的な実施形態において、栄養組成物はまた、微生物、好ましくはプロバイオティクス微生物を含む。乳児用食品の適用では、好ましい微生物は、健康なヒトのマイクロバイオームに由来するか、又はこの中で見られ得る。好ましくは、微生物は、ビフィドバクテリウム属、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属、ストレプトコッカス属、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、リューコノストック属（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ベイロネラ属（Ｖｅｉｌｏｎｅｌｌａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バクテリオイデス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｉｄｅｓ）、プレボテラ属（Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ）、エスケリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）又はサッカロミケス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）から選択されるが、他の属も適切であり得る。さらなる及び／又は代替的な実施形態において、微生物は、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｒｅｖｅ）、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ラクティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌａｃｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・サリバリウス、ラクトコッカス・ラクティス、ラクトバチルス・パラカセイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ブルガリカス、ラクトバチルス・ヘルベティクス、ラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）、リューコノストック・メセンテロイデス（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ  ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、エスケリキア・コリ、エンテロコッカス・フェシウム及びストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（ＶＳＬ＃３）からなる群から選択される。
【０１８１】
Ｎｅｕ５Ａｃと生きた生物との組み合わせに加えて、Ｎｅｕ５Ａｃはまた、プロバイオティクスの分野で時々使用される死滅した培養物（例えば、チンダル化された細菌）と組み合わせて使用され得る。このような死滅した培養物は、免疫系の短期の刺激を生じさせるタンパク質、ペプチド、オリゴ糖、細胞壁断片及び天然の生成物を提供し得る。
【０１８２】
栄養組成物におけるＮｅｕ５Ａｃとプロバイオティクス微生物との組み合わせは、消化管において適切なマイクロバイオームを確立するか、又は再確立するために特に有利であり、これに関連する健康上の利益が促進される。
【０１８３】
さらに有利なものとしては、シアル酸と、イヌリンを含むガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）及び／又はフルクトオリゴ糖（ＦＯＳ）などの確立されたプレバイオティクスとの組み合わせである。
【０１８４】
本発明は、特定の実施形態に関して、また図面を参照して記載されるが、本発明はこれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。さらに、詳細な説明及び特許請求の範囲における、第１の、第２のなどという用語は、類似の要素の間を区別するために使用され、時間的な、空間的な、ランクにおけるか、又はあらゆる他の様式における順序の記載を必ずしも必要としているわけではない。このように使用されている用語は適切な状況下で交換可能であること、及び本明細書において記載される発明の実施形態が本明細書において記載又は説明される以外の順序で操作され得ることを理解されたい。
【０１８５】
特許請求の範囲において使用される用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）は、そのあとに列挙される手段に制限されるものと解釈されるべきではないことに留意されたい。この用語は、他の要素又はステップを排除しない。したがって、この用語は、言及された特徴、整数、ステップ又は構成要素が述べられた通りに存在することを特定していると解釈されるが、１つ以上の他の特徴、整数、ステップ、若しくは構成要素又はこれらの群の存在又は追加を排除するものではない。したがって、「手段Ａ及びＢを含むデバイス」という表現の範囲は、構成要素Ａ及びＢのみからなるデバイスに限定されてはならない。この表現は、本発明に関して、デバイスの唯一の関連する構成要素がＡ及びＢであることを意味する。
【０１８６】
本明細書の全体を通して、「実施形態」への参照は、実施形態に関連して記載されている特定の、構造又は特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書の全体を通しての様々な箇所における、「一実施形態において（ｉｎ  ｏｎｅ  ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」又は「一実施形態において（ｉｎ  ａｎ  ｅｍｂｏｄｉｅｎｔ）」という表現の存在は、必ずしもこれらの全てが同一の実施形態を参照しているわけではなく、しかし、多くの及び／又は異なる実施形態を参照し得る。さらに、本開示から当業者に明らかであろうが、特定の特徴、構造又は特性は、１つ以上の実施形態において、あらゆる適切な様式で組み合わされ得る。
【０１８７】
同様に、本発明の代表的な実施形態の記載において、本発明の様々な特徴は、時として、本開示を合理化し、様々な発明性のある態様のうちの１つ以上の理解を容易にすることを目的として、単一の実施形態、図面又はその説明にまとめてグループ化されることを理解されたい。しかし、この開示方法は、特許請求の範囲に記載の発明が、各請求項において明示的に言及されているものよりも多くの特徴を要するという意図を反映するものと解釈されるべきではない。むしろ、以下の特許請求の範囲が反映するように、発明性のある態様は、単一の前述の開示された実施形態の特徴の全てにあるわけではない。したがって、詳細な説明に従った特許請求の範囲は、ここで、この詳細な説明に明示的に組み込まれ、各請求項は、本発明の別個の実施形態として、それのみで有効である。
【０１８８】
さらに、本明細書において記載される一部の実施形態は、他の実施形態に含まれる一部の特徴を含むが、他の実施形態に含まれる他の特徴は含まず、当業者に理解されるように、異なる実施形態の特徴の組み合わせは、本発明の範囲内にあり、異なる実施形態を形成する。例えば、以下の特許請求の範囲において、特許請求の範囲に記載の実施形態のいずれも、任意の組み合わせで使用され得る。
【０１８９】
さらに、実施形態の一部は、コンピュータシステムのプロセッサによってか、又は機能を実行する他の手段によって実装され得る方法として、又は方法の要素の組み合わせとして、本明細書において記載されている。したがって、このような方法又は方法の要素を実行するための必要な指示を備えたプロセッサは、この方法又は方法の要素を実行するための手段を形成する。さらに、設備の実施形態の、本明細書において記載される要素は、本発明を実施する目的で要素によって行われる機能を実行するための手段の例である。
【０１９０】
本明細書において提供される詳細な説明及び図面において、多くの具体的な詳細が示されている。しかし、本発明の実施形態がこれらの具体的な詳細を伴わずに実施され得ることが理解される。他の場合において、記載を簡潔にするため及び理解を容易にするために、周知の方法、構造及び技術は、詳細に示されていない。
【０１９１】
本発明をここで、本発明のいくつかの実施形態を詳細に記載することによって記載する。本発明の他の実施形態が、本発明の真の趣旨又は技術的教示から逸脱することなく、当業者の知識に従って構成され得ることは明らかであり、本発明は、添付の特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。
【実施例】
【０１９２】
［実施例１］  Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産するエスケリキア・コリのＢＬ２１（ＤＥ３）株の代謝操作
代謝操作は、特異的な内在性遺伝子の突然変異生成及び欠失、並びに異種遺伝子のゲノム組み込みによって行われた。遺伝子ｌａｃＺ及びａｒａＡを、Ｅｌｌｉｓら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：６７４２〜６７４６（２００１））によって記載されているミスマッチ−オリゴヌクレオチドを使用する突然変異生成によって不活化した。
【０１９３】
ゲノムの欠失は、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：６６４０〜６６４５（２０００））の方法に従って生じさせた。Ｎ−アセチルグルコサミンの分解を防ぐために、以下の遺伝子をエスケリキア・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）のゲノムから欠失させた：Ｎ−アセチルグルコサミン特異的ＰＴＳ酵素ＩＩ（ｎａｇＥ）、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ（ｎａｇＡ）及びグルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼ（ｎａｇＢ）。Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ｎａｎＫ）、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェートエピメラーゼ（ｎａｎＥ）、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ（ｎａｎＡ）及びシアル酸パーミアーゼ（ｎａｎＴ）をコードする、Ｎ−アセチルノイラミン酸の異化作用の遺伝子クラスターの全体もまた欠失させた。グルコサミンのインポートを容易にするホスホエノールピルビン酸依存性ホスホトランスフェラーゼ系をコードする遺伝子ｍａｎＸ、ｍａｎＹ及びｍａｎＺもまた欠失させた。ｗｚｘＣ−ｗｃａＪ遺伝子もまた欠失させた。ｗｃａＪ遺伝子は、コラン酸合成における最初のステップを触媒するＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルホスフェートグルコース−１−ホスフェートトランスフェラーゼをコードする（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９９６、１７８：４８８５〜４８９３）。さらに、Ｌ−フコースイソメラーゼ、Ｌ−フクロースキナーゼ及びＮ−アセチルガラクトサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼをそれぞれコードする遺伝子ｆｕｃＩ及びｆｕｃＫ及びａｇａＡを欠失させた。
【０１９４】
異種遺伝子のゲノム組み込みは、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポザーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ＵＳＡ）又はマリナートランスポザーゼＨｉｍａｒ１の高活性なＣ９突然変異体（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１９９９、ＵＳＡ  ９６：１１４２８〜１１４３３）を使用する転位によって行われた。ＥＺ−Ｔｎ５トランスポソームを生産するために、目的の遺伝子を、ＦＲＴ部位が隣接する抗生物質耐性マーカー（あるいは、この耐性マーカー遺伝子は、ｌｏｘ６６−ｌｏｘ７１部位によって隣接されていた）とともに増幅した。得られたＰＣＲ産物は、両端に、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼのための１９ｂｐのモザイク末端認識部位を有していた。Ｈｉｍａｒ１トランスポザーゼを使用する組み込みのために、目的の発現構築物（オペロン）を、抗生物質耐性マーカーが隣接するＦＲＴ部位／ｌｏｘ６６−ｌｏｘ７１部位と共に同様にクローニングし、アラビノース誘導性プロモーターＰａｒａＢの制御下で、マリナートランスポザーゼＨｉｍａｒ１の高活性なＣ９突然変異体をコードするｐＥｃｏｍａｒベクターに移した。全ての遺伝子は、エスケリキア・コリにおける発現のためにコドン最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｒｐ．によって合成して調製された。
【０１９５】
発現断片＜Ｐｔｅｔ−ｌａｃＹ−ＦＲＴ−ａａｄＡ−ＦＲＴ＞（配列番号１）を、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼを使用して組み込んだ。エスケリキア・コリＫ１２  ＴＧ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＮ７２５８３）のラクトースインポーターＬａｃＹの遺伝子の組み込みが成功した後、耐性遺伝子を、プラスミドｐＣＰ２０上でコードされているＦＬＰレコンビナーゼによって、ストレプトマイシン耐性クローンから取り除いた（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．２０００、ＵＳＡ  ９７：６６４０〜６６４５）。株が単独の炭素源としてのスクロースで生育することを可能にするスクロースパーミアーゼ、フルクトキナーゼ、スクロース加水分解酵素及び転写リプレッサーの遺伝子（それぞれ遺伝子ｃｓｃＢ、ｃｓｃＫ、ｃｓｃＡ及びｃｓｃＲ）を含むエスケリキア・コリＷ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＣＰ００２１８５．１）のｃｓｃ遺伝子クラスター（配列番号２）もまた、ゲノムに挿入した。このクラスターを、プラスミドｐＥｃｏｍａｒ−ｃｓｃＡＢＫＲを使用する転位によって、エスケリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムに組み込んだ。
【０１９６】
得られた株を、Ｎｅｕ５Ａｃを生産するために、以下の発現カセット：＜Ｐｔｅｔ−ｓｌｒ１９７５−ｇｎａ１−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞（配列番号３）、＜Ｐｔｅｔ−ｎｅｕＢ−ｌｏｘ６６−ｋａｎＲ−ｌｏｘ７１＞（配列番号４）＜Ｐｔｅｔ−ｓｌｒ１９７５−Ｐｔ５−ｎｅｕＢ−ＦＲＴ−ｄｈｆｒ−ＦＲＴ＞（配列番号５）、＜Ｐｔｅｔ−ｇｌｍＳ＊−ｇｎａ１−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞（配列番号６）及び＜Ｐｔｅｔ−ｐｐｓＡ−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞（配列番号７）のゲノム組み込みによって、さらに修飾した。配列番号５のｄｈｆｒ発現カセットを除いて、全ての耐性マーカー遺伝子を、プラスミドｐＫＤ−Ｃｒｅ（配列番号８）を導入し、その後、１００μｇ・ｍＬ−１のアンピシリン及び１００ｍＭのＬ−アラビノースを含有する２ＹＴ寒天プレート上で、３０℃で選択することによって、段階的な様式でゲノムから除去した（次のラウンドの遺伝子組み込みの前に）。その後、耐性クローンをアンピシリンとゲノム組み込みに使用した選択的抗生物質を欠く２ＹＴ寒天プレートに移した。プレートを４２℃でインキュベートして、プラスミドの細胞を治癒させた。アンピシリン及び選択的抗生物質に対して感受性であったクローンが、さらなる実験及び修飾に使用された。
【０１９７】
遺伝子ｓｌｒ１９７５（ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＡＬ３５７２０）は、シネコシスティス属種ＰＣＣ６８０３のＮ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼをコードする。遺伝子ｇｎａ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿１１６６３７）は、サッカロミセス・セレビシエのグルコサミン−６−ホスフェートアセチルトランスフェラーゼをコードする。遺伝子ｎｅｕＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦ３０５５７１）は、カンピロバクター・ジェジュニのシアル酸シンターゼをコードする。遺伝子ｇｌｍＳ＊は、エスケリキア・コリのＬ−グルタミン：Ｄ−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼ遺伝子の突然変異型である（Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．２００５、５月、７（３）：２０１〜１４）。遺伝子ｐｐｓＡ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＣＴ４３５２７）は、エスケリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）のホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする。
【０１９８】
＜Ｐｔｅｔ−ｓｌｒ１９７５−ｇｎａ１−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞を生成するために、遺伝子ｓｌｒ１９７５及びｇｎａ１を、構成的プロモーターＰｔｅｔの後ろにあるオペロンとしてサブクローニングし、ゲンタマイシン耐性遺伝子（ｌｏｘ６６／ｌｏｘ７１部位が隣接している）に融合し、そして平滑末端でのライゲーションによってｐＥｃｏｍａｒベクターに挿入した。得られた発現カセットを、アラビノース誘導性プロモーターＰａｒａＢの制御下で、ベクターｐＥｃｏｍａｒ−ｓｌｒ１９５−ｇｎａ１−ａａｃＣ１、及びマリナートランスポザーゼＨｉｍａｒ１の高活性なＣ９突然変異体を使用して、ゲノムに組み込んだ。
【０１９９】
＜Ｐｔｅｔ−ｎｅｕＢ−ｌｏｘ６６−ｋａｎＲ−ｌｏｘ７１＞を生成するために、ｎｅｕＢを、構成的プロモーターＰｔｅｔの後ろでクローニングし、カナマイシン耐性遺伝子（ｌｏｘ６６／ｌｏｘ７１部位が隣接している）に融合した。得られた発現カセットを、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼを使用してゲノムに組み込んだ。＜Ｐｔｅｔ−ｓｌｒ１９７５−Ｐｔ５−ｎｅｕＢ−ＦＲＴ−ｄｈｆｒ−ＦＲＴ＞を生成するために、遺伝子ｓｌｒ１９７５及びｎｅｕＢを、構成的プロモーターＰｔｅｔ及びＰｔ５の後ろでそれぞれ別個にサブクローニングし、トリメトプリム耐性遺伝子（ＦＲＴ部位が隣接している）に融合した。得られた発現カセットを、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼを使用することによってゲノムに組み込んだ。
【０２００】
発現カセット＜Ｐｔｅｔ−ｇｌｍＳ＊−ｇｎａ１−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞を、ｇｌｍＳ＊及びｇｎａ１を構成的プロモーターＰｔｅｔの後ろにあるオペロンとしてクローニングすることによって生成した。この構築物を、ゲンタマイシン耐性遺伝子（ｌｏｘ６６／ｌｏｘ７１部位が隣接している）にさらに融合した。得られた発現カセットを、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼを使用することによってゲノムに組み込んだ。
【０２０１】
＜Ｐｔｅｔ−ｐｐｓＡ−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞を生成するために、ｐｐｓＡ遺伝子を構成的プロモーターＰｔｅｔの後ろでクローニングし、ゲンタマイシン耐性遺伝子（ｌｏｘ６６／ｌｏｘ７１部位が隣接している）に融合した。得られた発現カセットを、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼを使用することによってゲノムに組み込んだ。
【０２０２】
総合すると、累積したゲノム修飾は、Ｎｅｕ５Ａｃを生産する株であるエスケリキア・コリ＃ＮＡＮＡ１を生じさせた。
【０２０３】
［実施例２］  フェドバッチ発酵の間のＮ−アセチルノイラミン酸の生産
エスケリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株＃ＮＡＮＡ１を、１ｍＬ・Ｌ−１の微量元素溶液（５４．４ｇ・Ｌ−１のクエン酸鉄アンモニウム、９．８ｇ・Ｌ−１のＭｎＣｌ２×４・Ｈ２Ｏ、１．６ｇ・Ｌ−１のＣｏＣｌ２×６・Ｈ２Ｏ、１ｇ・Ｌ−１のＣｕＣｌ２×２・Ｈ２Ｏ、１．９ｇ・Ｌ−１のＨ３ＢＯ３、９ｇ・Ｌ−１のＺｎＳＯ４×７・Ｈ２Ｏ、１．１ｇ・Ｌ−１のＮａ２ＭｏＯ４×２・Ｈ２Ｏ、１．５ｇ・Ｌ−１のＮａ２ＳｅＯ３、１．５ｇ・Ｌ−１のＮｉＳＯ４×６・Ｈ２Ｏ）を補った、７ｇ・Ｌ−１のＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、７ｇ・Ｌ−１のＫ２ＨＰＯ４、２ｇ・Ｌ−１のＫＯＨ、０．３ｇ・Ｌ−１のクエン酸、２ｇ・Ｌ−１のＭｇＳＯ４×７・Ｈ２Ｏ、５ｇ・Ｌ−１のＮＨ４Ｃｌ２及び０．０１５ｇ・Ｌ−１のＣａＣｌ２×６・Ｈ２Ｏを含有し、炭素源としての２％（ｍ／ｖ）スクロースと、抗生物質ゼオシン（１０μｇ・ｍＬ−１）とを含有する、１０００ｍＬの無機塩培地で開始して、３０℃で、３Ｌの発酵槽（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ、Ｅｄｉｓｏｎ、ＵＳＡ）内で培養した。培養は、同一のスクロース含有培地において生育させたプレ培養物からの２．５％（ｖ／ｖ）接種材料で開始された。バッチ相の終わりは、溶解酸素レベルの上昇によって特徴付けされた。スクロースフィードを、バッチ相を離れた直後に適用した。５０％（ｍ／ｖ）のスクロースフィードに、２ｇ・Ｌ−１のＭｇＳＯ４×７・Ｈ２Ｏ、０．０１５ｇ・Ｌ−１のＣａＣｌ２×６・Ｈ２Ｏ及び１ｍＬ・Ｌ−１の微量元素溶液を補った。開始容積を参照して、９．０〜１１．０ｍＬ・Ｌ−１のフィード速度を適用した。通気を３Ｌ・分−１で維持した。溶解酸素を、撹拌速度を制御することによって、２０〜３０％の飽和で維持した。ｐＨを、２５％アンモニア溶液を添加することによって７．０で維持した。
【０２０４】
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ、島津製作所）を使用して、培養上清中のＮｅｕ５Ａｃを検出した。機器は、λ＝２１０ｎｍのＵＶ−ＶＩＳ検出器（ＳＰＤ−１０ＡＶＰ、島津製作所）と、適切なガードカートリッジを有するＲｅｚｅｘ  ＲＯＡ−有機酸Ｈ＋分析カラム（３００×７．８ｍｍ）とを含んでいた。５ｍＭのＨ２ＳＯ４での、５０℃でのイソクラティック溶出を、０．５ｍｌ・分−１の流量で行った。培養上清を遠心分離し、滅菌ろ過し、９５℃で５分間加熱した。最終的な遠心分離の後、５μＬの試料をカラムにアプライした。Ｎ−アセチルノイラミン酸の濃度を、市販されている標準（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ、Ｃｏｍｐｔｏｎ、ＵＫ）を使用して、標準曲線から計算した。８８時間インキュベーションした後、培養上清における最終的なＮｅｕ５Ａｃ力価は、６８．６ｇ・Ｌ−１であった。
【０２０５】
［実施例３］  エスケリキア・コリ株＃ＮＡＮＡ１における単一ノックアウト突然変異体の生成及び培養によって、向上したＮｅｕ５Ａｃ生産能力が明らかになる
エスケリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株＃ＮＡＮＡ１をさらに修飾して、遺伝子ｇｌｔＢ、ｙｊｈＣ及びｐｐＣが除去されたか、又は破壊された欠失突然変異体を生じさせた。株＃ＮＡＮＡ１、＃ＮＡＮＡ１ΔｇｌｔＢ、＃ＮＡＮＡ１ΔｙｊｈＣ及び＃ＮＡＮＡ１Δｐｐｃを、９６ウェルプレート内で培養した。したがって、株の単一コロニーを、寒天プレートから、２００μＬの実施例２において記載された最少培地を含有するマイクロタイタープレートに移し、≒２０時間にわたり３０℃で、強く振とうしながらインキュベートした。その後、５０μＬの培養液を、ウェル当たり４００μＬの最少培地を含有するディープウェル９６ウェルプレート（２．０ｍＬ）に移した。
【０２０６】
さらに４８時間インキュベーションした後、培養を停止し、上清中のＮ−アセチルノイラミン酸の量を、ＬＣトリプル四重極ＭＳ検出系を使用する多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードにおける質量分析によって判定した。前駆イオンが四重極１において選択及び分析され、フラグメンテーションが、衝突気体としてアルゴンを使用する衝突セルにおいて生じ、フラグメントイオンが四重極３において選択される。培養上清をＬＣ／ＭＳグレードの水で１：１００に希釈した後に、１μｌのＮ−アセチルノイラミン酸試料をＨＰＬＣ器械に注入した。試料を、ＸＢｒｉｄｇｅ  Ａｍｉｄｅガードカートリッジ（３．５μｍ、２．１×１０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）を備えたＸＢｒｉｄｇｅ  Ａｍｉｄｅ  ＨＰＬＣカラム（３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ）（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）上で、５０℃で、４００μｌ・分−１の流量の１０ｍＭの酢酸アンモニウムを伴うアセトニトリル：Ｈ２Ｏ中で、分離した。各分離は、２４０秒間継続した。Ｎ−アセチルノイラミン酸を、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）陽イオン化モードのＭＲＭによって分析した。質量分析計を単位導出で作動させた。Ｎ−アセチルノイラミン酸は、ｍ／ｚ  ３０９．２［Ｍ＋Ｈ］のイオンを形成する。Ｎ−アセチルノイラミン酸の前駆イオンは、衝突セル内で、フラグメントイオンｍ／ｚ  ２９２．２０、ｍ／ｚ  ２７４．１５及びｍ／ｚ  １２１．１５にさらにフラグメンテーションされた。衝突エネルギー、Ｑ１  Ｐｒｅ  Ｂｉａｓ及びＱ３  Ｐｒｅ  Ｂｉａｓを各分析物について個別に最適化した。定量方法は、市販されている標準（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ、Ｃｏｍｐｔｏｎ、ＵＫ）を使用して確立された。
【０２０７】
図３は、培養された株の相対的なＮｅｕ５Ａｃ収量を示す。親株と比較して、株＃ＮＡＮＡ１についての値は１００％に設定され、単一ノックアウト突然変異体は、２０％〜２５％多くのＮ−アセチルノイラミン酸を生産した。
【０２０８】
［実施例４］  発酵ブロスからのＮｅｕ５Ａｃの精製
発酵が終了した後、バイオマスを、限外濾過によって、その後、モジュールフィルター（０．０５μｍのカットオフ）（ＣＵＴ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｅｒｋｒａｔｈ、ドイツ）及びクロスフローフィルター（１５０ｋＤａのカットオフ）（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）を連続的に使用することによって、発酵培地から分離した。１９ｇ・Ｌ−１を超えるシアル酸を含有する、およそ１ｍ３の無細胞発酵培地が得られた。
【０２０９】
次いで、無細胞液体をイオン交換クロマトグラフィーによって脱イオン化した。最初に、陽イオン性の汚染物質を、２００Ｌの容積の強力な陽イオン交換器で（Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ  ２５６８（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、ドイツ）、Ｈ＋の形態で除去した。ＮａＯＨを使用して、約１．５のｐＨを有する得られた溶液を、７．０に中和した．第２のステップにおいて、陰イオン及び望ましくない着色物質を、強力な陰イオン交換器Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ  ６３６８  Ａ（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、Ｃｏｌｏｇｎｅ、ドイツ）を使用して、塩化物の形態で溶液から除去した。イオン交換器は、２００Ｌのベッドボリュームを有していた。クロスフローフィルター（１５０ｋＤａのカットオフ）（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ  ＧｍｂＨ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ドイツ）での第２の濾過ステップを使用して、溶液を酸性化することによって生じた沈殿物を除去した。糖を濃縮するために、溶液を、Ｄｏｗ  Ｆｉｌｍｔｅｃ（登録商標）ＮＦ２７０−４０４０（ＩＮＡＱＵＡ  Ｖｅｒｔｒｉｅｂｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ、Ｍｏｎｃｈｅｎｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）で、約１／４の容積までナノろ過した。次いで、濃縮されたＮｅｕ５Ａｃ溶液を、ロータリーエバポレーターで約４００ｇＬ−１以上の濃度までさらに濃縮した。生成物の特異的結晶化は、１０倍過剰な５℃の氷酢酸で１２〜６０時間にわたり行われた。固体画分をろ過し、エタノールで洗浄し、そして４０℃で乾燥させた。乾燥して結晶化した生成物をさらに精製した。したがって、乾燥生成物を１ｋｇ当たり２ＬのＨ２Ｏに溶解し、活性炭（ＣＡＳ−Ｎｏ：７４４０−４４−０、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ  ＆  ＣＫＧ、Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ、ドイツ）で処理した。活性炭から分離された後の澄明化した溶液を、それが固体化するまで５０℃で蒸発させることによって濃縮した。固体材料を９９％エタノールと混合し、４℃で少なくとも１６時間にわたりインキュベートした。その後、固体画分をろ過し、４０℃で乾燥させた。Ｒｅｚｅｘ  ＲＯＡ−有機酸Ｈ＋カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ａｓｃｈａｆｆｅｎｂｕｒｇ、ドイツ）を使用するＨＰＬＣによって判定されたクロマトグラムの曲線下面積によると９５％を超える純度を有する白色の生成物であるクリスタリンが得られた。
【０２１０】
［実施例５］  Ｎ−アセチルノイラミン酸の生産のための代替経路
実施例１において記載されたエスケリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株（ΔｌａｃＺ、ΔａｒａＡ、ΔｎａｇＡＢＥ、ΔｎａｎＡＴＥＫ、ΔｍａｎＸＹＺ、ΔｗｃａＪ、ΔｆｕｃＩＫ、ΔａｇａＡ、ｌａｃＹ＋、ｃｓｃＡＢＫＲ＋）を、発現カセット＜Ｐｔｅｔ−ｇｌｍＳ＊−ｇｎａ１−ｌｏｘ６６−ａａｃＣ１−ｌｏｘ７１＞を組み込むことによってさらに修飾し、Ｎ−アセチルグルコサミンを合成できる株（株Ａ）を生じさせた。株Ａを、Ｎ−アセチルノイラミン酸を生産するための株を生成するように修飾した。この目的を達成するために、発現構築物＜Ｐｔｅｔ−ｓｌｒ１９７５−Ｐｔ５−ｎｅｕＢ−ＦＲＴ−ｄｈｆｒ−ＦＲＴ＞（配列番号５）又は＜Ｐｔｅｔ−ＥｃｎａｎＥ−Ｐｔ５−ｎｅｕＢ−ＦＲＴ−ｄｈｆｒ−ＦＲＴ＞（配列番号９）を株Ａのゲノムに個別に組み込み、それぞれ株Ｂ及びＣを得た。ＥｃｎａｎＥ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＹＰ＿００３６１４５９２）は、エンテロバクター・クロアカ亜種クロアカＡＴＣＣ  １３０４７のＮ−アシルグルコサミン−６−ホスフェート２−エピメラーゼをコードする。全ての発現カセットを、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポザーゼを使用してゲノムに組み込んだ。
【０２１１】
これらの株の単一コロニーを、寒天プレートから、２００μＬの実施例２において記載された最少培地を含有するマイクロタイタープレートに移し、≒２０時間にわたり３０℃で、強く振とうしながら培養した。その後、５０μＬの培養液を、ウェル当たり４００μＬの最少培地を含有するディープウェル９６ウェルプレート（２．０ｍＬ）に移した。さらに４８時間インキュベーションした後、培養を停止し、上清中のＮ−アセチルノイラミン酸レベルを、質量分析によって判定した。
【０２１２】
Ｎｅｕ５Ａｃの生産は、株Ｂ及びＣの培養上清において検出可能であるにすぎなかった。図４において、培養された株の相対的なＮｅｕ５Ａｃ生産が示されている。比較において、株ＢのＮｅｕ５Ａｃ生産の値は１００％と設定された。株Ｃは、株Ｂと比較して約７．５％のＮｅｕ５Ａｃを生産した。
【０２１３】
［実施例６］  Ｎｅｕ５Ａｃを含有する乳児用調製物の組成
【０２１４】
【表１】
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【図１】
2020537530.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月17日(2020.6.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎｅｕ５Ａｃを生産することができる非天然微生物であって、前記非天然微生物が、少なくとも１つの異種酵素を含むシアル酸生合成経路を有し、微生物の天然のシアル酸異化経路が、機能しなくなっており、Ｎｅｕ５Ａｃの発酵生産の間に炭素源として使用されない糖類をインポートするための少なくとも１つのホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系が、機能しなくなっており、前記微生物が、外因性の炭素源を得るためにホスホエノールピルビン酸：糖ホスホトランスフェラーゼ系を使用することなく、発酵ブロス中に存在する外因性の炭素源を単独の炭素源として利用し得る、非天然微生物。
【請求項２】
シアル酸生合成経路が、酵素グルタミン−フルクトース−６−ホスフェートアミノトランスフェラーゼ、グルコサミン−６−ホスフェートＮ−アセチルトランスフェラーゼ、Ｎ−アセチルグルコサミン２−エピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸シンターゼ、及びＨＡＤ様スーパーファミリーの糖ホスファターゼを含む、請求項１に記載の非天然微生物。
【請求項３】
シアル酸生合成経路の酵素の少なくとも１つが、異種酵素である、請求項１又は２に記載の非天然微生物。
【請求項４】
天然のシアル酸異化経路が、機能しなくなっている、請求項１〜３のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項５】
シアル酸異化経路に関与する酵素をコードする遺伝子のうちの１つ以上の発現が損なわれているという点で、又はシアル酸異化経路に関与する酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子のタンパク質コード領域のヌクレオチド配列が変更されており、その結果、変更されたタンパク質コードヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、変更されていないヌクレオチド配列によってコードされている酵素の酵素活性を有さないという点で、シアル酸異化経路に関与する酵素をコードする遺伝子のうちの１つ以上が非天然微生物のゲノムから欠失している、請求項１〜４のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項６】
Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェートエピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ及びシアル酸パーミアーゼをコードする遺伝子の群から選択される遺伝子のうちの１つ以上の発現が損なわれているという点で、又はこれらの遺伝子のうちの少なくとも１つのタンパク質コード領域のヌクレオチド配列が変更されており、その結果、変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、変更されていないヌクレオチド配列によってコードされている酵素の酵素活性を有さないという点で、Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ、Ｎ−アセチルマンノサミン−６−ホスフェートエピメラーゼ、Ｎ−アセチルノイラミン酸アルドラーゼ及びシアル酸パーミアーゼをコードする遺伝子の群から選択される遺伝子のうちの１つ以上を欠失させるように遺伝子操作されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項７】
Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ及びＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼからなる群から選択される酵素のうちの１つ以上の活性が、無効とされている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項８】
酵素Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ及び／若しくはＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼをコードする遺伝子の一方若しくは両方を欠失させることによって、これらの酵素の一方若しくは両方の発現を損なわせることによって、又は一方若しくは両方の遺伝子のタンパク質コード領域を突然変異させ、その結果、それぞれの変更されたヌクレオチド配列によってコードされているポリペプチドが、変更されていないヌクレオチド配列によってコードされている酵素の酵素活性を有さないようにすることによって、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアセチラーゼ及び／又はＮ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェートデアミナーゼの活性を無効とするように遺伝子操作されている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項９】
炭水化物をインポートするための、少なくとも１つのホスホエノールピルビン酸（ＰＥＰ）依存性の糖輸送ホスホトランスフェラーゼ系が、機能しなくなっている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項１０】
糖類／Ｈ＋シンポーター、好ましくは、スクロースプロトンシンポーター、ラクトースプロトンシンポーター及びグルコースプロトンシンポーターからなる群から選択される糖類／Ｈ＋シンポーターを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項１１】
好ましくはＰＥＰシンターゼの過剰発現に起因して、野生型微生物と比較して増強したＰＥＰ生合成を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項１２】
機能的ＰＥＰカルボキシラーゼ、機能的グルタメートシンターゼ、機能的ＷｚｘＣタンパク質、機能的ＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルホスフェートグルコース−１−ホスフェートトランスフェラーゼ、機能的β−ガラクトシドパーミアーゼ、機能的β−ガラクトシダーゼ、機能的ＹｊｈＣタンパク質、機能的フコースイソメラーゼ、機能的フクロキナーゼ及び機能的Ｎ−アセチルグルタミンアミノアシラーゼからなる群から選択される１つ以上を欠いている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項１３】
好ましくはグルタミンシンターゼの過剰発現に起因して、野生型微生物と比較して増強したグルタミン合成を有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の非天然微生物。
【請求項１４】
Ｎｅｕ５Ａｃを生産するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の非天然微生物の使用。
【請求項１５】
Ｎｅｕ５Ａｃを生産し得る非天然微生物を使用する発酵によってＮｅｕ５Ａｃを生産するための方法であって、
ａ）請求項１〜１３のいずれか一項に記載の非天然微生物を提供するステップ、
ｂ）非天然微生物を、発酵ブロス中で、非天然微生物がＮｅｕ５Ａｃを生産することを許容する条件下で培養するステップ、及び
ｃ）任意選択的に、Ｎｅｕ５Ａｃを発酵ブロスから回収するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
発酵ブロスが、非天然微生物を生育させるための炭素源であって、好ましくは、グルコース、キシロース、スクロース、フルクトース、ラクトース、グリセロール、合成ガス及びこれらの組み合わせからなる群から選択される炭素源を含有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
栄養組成物を製造するための、請求項１５又は１６に記載の方法によって生産されたＮｅｕ５Ａｃの使用。
【請求項１８】
請求項１５又は１６に記載の方法によって生産されたＮｅｕ５Ａｃを含有する栄養組成物。
【請求項１９】
少なくとも１つのＨＭＯ、好ましくは少なくとも１つの中性のＨＭＯ及び／又は少なくとも１つのシアル化されたＨＭＯも含有する、請求項１８に記載の栄養組成物。
【請求項２０】
栄養組成物が、プロバイオティクス微生物も含有する、請求項１８又は１９に記載の栄養組成物。
【請求項２１】
医薬製剤、乳児用調製物及び栄養補助食品からなる群から選択される栄養組成物である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２２】
液体形態で、好ましくは濃縮物の形態若しくはすぐに飲むことができる形態で、又は固体形態で、好ましくは粉末、顆粒、フレーク若しくはペレットの形態で存在する、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の栄養組成物。
【請求項２３】
請求項１５又は１６に記載の方法によって生産されたＮｅｕ５Ａｃを含有する乳児用調製物。
【国際調査報告】
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