(57)【要約】  本開示は、多重化された遺伝子改変動物、例えばブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）不活化ブタ、を生成する方法を提供する。本開示はまた、多重化された遺伝子改変動物の出生率を改善する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）要素が不活性化されているブタ細胞の生成及び利用に関する。いくつかの実施形態において、ＰＥＲＶを含まない又はＰＥＲＶが減少したブタ細胞をクローン化して、ブタ胚を生成する。いくつかの実施形態において、ＰＥＲＶを含まない又はＰＥＲＶが減少した胚を成体ブタに成長させ、そこから臓器及び／又は組織を抽出し、非ブタ動物、例えばヒトなど、への異種移植などの目的に使用することができる。【選択図】  図１６Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
胚から成長したブタであって、前記胚は、少なくとも７５％の不活性ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）要素を有するブタ細胞を含む、ブタ。
【請求項２】
前記細胞における前記ＰＥＲＶ要素の約１００％が不活性である、請求項１に記載のブタ。
【請求項３】
前記ＰＥＲＶ要素は、ＰＥＲＶ要素の活性の低下又は排除をもたらす１つ以上の突然変異又はエピジェネティック変化を含む、請求項１又は請求項２に記載のブタ。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか１項に記載のブタであって、ここで、前記ブタ細胞の前記ＰＥＲＶ要素は、ＰＥＲＶ複製及び／又はアセンブリに関与する遺伝子に特異的なゲノム改変剤を前記細胞に投与することを含む方法によって不活性化されており、ここで、前記作用物質は前記遺伝子の転写及び／又は翻訳を破壊する、ブタ。
【請求項５】
前記作用物質は、ヌクレアーゼもしくはニッカーゼ又は前記ヌクレアーゼもしくはニッカーゼをコードする核酸である、請求項４に記載のブタ。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼもしくはニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼもしくはニッカーゼである、請求項４に記載のブタ。
【請求項７】
前記作用物質が、：
ａ）ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ又は、
ｂ）ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをコードする核酸、
をさらに含む、請求項４〜６のいずれか一項に記載のブタ。
【請求項８】
前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、配列番号１〜３又は２６〜１８１のいずれか１つのヌクレオチド配列、そのいずれの株特異的遺伝的変異体、又はそのいずれの組み合わせを含む、請求項７に記載のブタ。
【請求項９】
前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、配列番号１〜３又は２６〜１１６のいずれか１つのヌクレオチド配列、そのいずれの株特異的遺伝的変異体、又はそのいずれの組み合わせを含む、請求項７に記載のブタ。
【請求項１０】
前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、配列番号３５、３６、４８、９９、１０１、１０２、１０６、１０８、１１１、１１３のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれらのいずれの組み合わせを含む、請求項７に記載のブタ。
【請求項１１】
請求項４〜７のいずれか１項に記載のブタであって、ここで、前記作用物質はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする核酸であり、ここで、前記細胞は、前記作用物質を安定に発現するように操作され、ここで前記作用薬剤は、少なくとも１つのガイドＲＮＡをさらに含み、且つ、ここで、少なくとも１つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜３又は２６〜１１６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、ブタ。
【請求項１２】
当該ブタは、妊娠後少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも５年、少なくとも１０年にわたって同じ又は実質的に同じレベルのＰＥＲＶ不活化を維持する、先行請求項のいずれか一項に記載のブタ。
【請求項１３】
先行請求項のいずれか一項に記載のブタから得られた臓器又は組織。
【請求項１４】
ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）不活化ブタを生成する方法であって、：
ｉ．核を有する核ドナー細胞を得ることであって、前記核ドナー細胞中のＰＥＲＶ要素の少なくとも７５％が不活性であること；
ｉｉ．核移植卵母細胞を生成するため、前記核ドナー細胞の前記核をレシピエント除核卵母細胞にトランスファーすること；
ｉｉｉ．前記核移植卵母細胞を活性化に付すこと；
ｉｖ．胚盤胞又は胚を生成するため、前記核移植卵母細胞を培養すること；
ｖ．前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること；及び
ｖｉ．前記胚盤胞又は胚から生きたＰＥＲＶ不活化ブタを生成すること；
を含む方法。
【請求項１５】
ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）不活化ブタを生成する方法であって、：
ｉ．胚盤胞又は胚を生成するため核ドナー細胞の核を使用することであって、前記核ドナー細胞におけるＰＥＲＶ要素の少なくとも７５％が不活性であること；及び
ｉｉ．ＰＥＲＶ不活化ブタを作成するため、前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること；
を含む方法。
【請求項１６】
核ドナー細胞が胎児細胞である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記核ドナー細胞は、キメラＰＥＲＶ不活化胎児から単離される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記キメラＰＥＲＶ不活化胎児は、約１０日間、約２０日間、約３０日間、又は約３ヶ月の妊娠である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記キメラＰＥＲＶ不活化胎児はゲノム改変剤を使用して生成される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ゲノム改変剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、デアミナーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼもしくはニッカーゼからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記核ドナー細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの３０未満、２０未満、１０未満、５未満、又は２未満の集団倍加を受ける、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記核ドナー細胞は、ブタから単離される、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記ブタが、１０週齢未満、８週齢未満、６週齢未満、５週齢未満、４週齢未満、３週齢未満、２週齢未満、又は１週齢未満である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記核ドナー細胞中のＰＥＲＶ要素の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％が不活性である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＥＲＶ不活化ブタが、妊娠後少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも５年、少なくとも１０年にわたって同じ又は実質的に同じレベルのＰＥＲＶ不活化を維持する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１つの野生型胚盤胞又は胚を前記サロゲートにトランスファーすることをさらに含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の方法によって生成された単離されたブタ細胞。
【請求項２８】
請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の方法により生成された細胞から得られた器官又は組織。
【請求項２９】
ｉ．胚盤胞又は胚を生成するため、核ドナー細胞由来の核を使用することであって、前記核ドナー細胞中のＰＥＲＶ要素の少なくとも７５％が不活性であること、及び
ｉｉ．少なくとも１つのＰＥＲＶ不活化ブタを生成するため、前記胚盤胞又は胚を少なくとも１つのサロゲートにトランスファーすること、
を含む、ＰＥＲＶ不活化ブタの出生率を改善する方法であって、：
ここで、流産率は、細胞内のＰＥＲＶ要素の２５％超が活性である細胞から生成された胎児の流産率と比較して、減少している、方法。
【請求項３０】
遺伝子組み換え動物を作成する方法であって、：
ｉ．胚盤胞又は胚を生成するため、核ドナー細胞由来の核を使用することであって、前記核ドナー細胞内の複数の核酸配列が改変されること、及び
ｉｉ．前記遺伝子組み換え動物を作成するため、前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること、
を含む方法。
【請求項３１】
前記核ドナー細胞が胎児細胞である、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記核ドナー細胞がキメラＰＥＲＶ不活化胎児から単離される、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記キメラＰＥＲＶ不活化胎児は、約１０日間、約２０日間、約３０日間、又は約３ヶ月の妊娠である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記キメラＰＥＲＶ不活化胎児が、ゲノム改変剤を使用して生成される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記キメラＰＥＲＶ不活化胎児が、接合体注射によって生成される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
前記ゲノム改変剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、デアミナーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼもしくはニッカーゼからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記核ドナー細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの３０未満、２０未満、１０未満、５未満、又は２未満の集団倍加を受ける、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３８】
ブタが、１０週齢未満、８週齢未満、６週齢未満、５週齢未満、４週齢未満、３週齢未満、２週齢未満、又は１週齢未満である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
前記核ドナー細胞中のＰＥＲＶ要素の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％が不活性である、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項４０】
前記核ドナー細胞中のＰＥＲＶ要素の１００％が不活性である、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＰＥＲＶ不活化ブタが、妊娠後少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも５年、少なくとも１０年にわたって同じ又は同様のレベルのＰＥＲＶ不活化を維持する、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＰＥＲＶ不活化ブタがＰＥＲＶを含まないブタである、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＰＥＲＶ不活化ブタが少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の不活性ＰＥＲＶ要素を有する、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１つの野生型胚盤胞又は胚を前記サロゲートにトランスファーすることをさらに含む、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項４５】
ｉ．胚盤胞又は胚を生成するために、遺伝子改変された核ドナー細胞由来の核を使用すること、及び
ｉｉ．少なくとも１つの生存可能な子孫を生成するため、前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること、
を含む、遺伝的に改変された胚盤胞又は胚の体細胞核移植（ＳＣＮＴ）による妊娠損失又は流産のリスクを予防又は軽減する方法であって、
ここで、妊娠損失又は流産の割合は、コントロールの妊娠損失又は流産の割合と比較して減少している、方法。
【請求項４６】
前記遺伝的に改変された核ドナー細胞は、複数の遺伝的改変を有する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記複数の遺伝子改変は、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、又は少なくとも約１００の遺伝子改変を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記複数の遺伝子改変は、単一の反復遺伝子配列に対するものである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記遺伝子改変の少なくとも一部が異なる遺伝子に対するものである、請求項４５記載の方法。
【請求項５０】
前記遺伝的に改変された核ドナー細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はニッカーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ又はニッカーゼ、デアミナーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼ又はニッカーゼからなる群から選択されるゲノム改変剤を用いて改変されている、請求項４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権主張
この出願は、２０１７年４月２０日に出願された米国仮出願番号６２／４８７，８９８、２０１７年６月３０日に出願された米国仮出願番号６２／５２７，７０２、及び２０１７年８月１０日に出願された米国仮出願番号６２／５４３，６１０の優先権を主張し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
開示の背景
移植のための人間の臓器と組織の不足は、満たされていない重大な医学的ニーズを表す。米国と欧州だけで、約２０万人の患者が臓器移植を待っているが、これらの患者のごく一部のみがドナー臓器を受け取っている（アメリカ合衆国保健福祉省、臓器調達及び移植ネットワーク−２０１７；欧州委員会、Ｊｏｕｒｎａｌｉｓｔ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  ｏｒｇａｎ  ｄｏｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｆａｃｔｓ＆Ｆｉｇｕｒｅｓ．、２０１６）。ドナー臓器の重大な不足を緩和するために、ヒト人工多能性幹細胞（human  induced  pluripotent  stem  cells,  ｈｉＰＳＣ）からのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの臓器の開発、脱細胞化臓器足場の再配置、３Ｄプリント臓器の構築、ヒト臓器を含むキメラ動物の作成、及び異種間移植の実施（すなわち、異種移植）交配の実行を包含する、いくつかの戦略が想定されている。特に、異種移植は臓器提供と移植不足に対する魅力的な解決策である。ブタの(porcine)臓器は、サイズと機能が人間の臓器に似ているため、異種移植に適したリソースと考えられている。さらに、指定された病原体のない条件下でブタ(pigs)を大量に飼育することが可能であり、商業生産に使用することができる（Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２．０，  ２０１６，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ３４：１）。
【０００３】
異種移植は、慢性臓器不全患者に移植臓器をほぼ無制限に供給する可能性がある。しかし、ブタの臓器の臨床的使用は、免疫学的な非互換性により及びブタの内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）要素の伝播（element  transmission）の潜在的なリスクによって妨げられている。ＰＥＲＶは、外因性レトロウイルス感染時に生殖系列染色体に最初に組み込まれたブタゲノムのプロウイルスである（Ｇｉｆｆｏｒｄ，  Ｒ．  ＆  Ｔｒｉｓｔｅｍ，  Ｍ．，  ２００３，  Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ  ２６，  ２９１−３１５）。ＰＥＲＶには３つの主要なサブタイプがある。：  ＰＥＲＶ  Ａ、ＰＥＲＶ  Ｂ、及びＰＥＲＶＣ。サブタイプＡ及びＢは遍在し、且つ、ブタ及びヒトに伝染するのに対し、Ｃは一部のブタ系統にのみ存在し、且つ、ブタ間で伝染することができる（Ｐａｔｉｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ，  ７５：２７７１−２７７５）。ＰＥＲＶは、定義上、他の種と共有されておらず、且つ通常、最近のレトロウイルス感染の結果である（Ｇｉｆｆｏｒｄ及びＴｒｉｓｔｅｍ）。
【０００４】
ほとんどのＰＥＲＶは時間の経過とともに変異が蓄積して不活性になるが、特定の無傷のＰＥＲＶはｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト細胞に感染することが示されている（Ｐａｔｉｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．，  ３：２８２−２８６；  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３５０：１１０１−１１０４）。これらの無傷のＰＥＲＶは、ブタからヒトへの異種移植において人獣共通感染の潜在的なリスクをもたらす（Ｄｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，  ２３：５３−５９；  Ｄｅｎｎｅｒ  Ｊ  ａｎｄ  Ｔｏｎｊｅｓ  Ｒ，  ２０１２，  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，  ２５：３１８−３４３）。他のレトロウイルスで報告されているように、ＰＥＲＶ統合からの突然変異誘発が腫瘍形成と免疫不全を引き起こす可能性があるため（Ｂｅｎｄｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ４５：１２５−１８１）、ＰＥＲＶは臨床的異種移植のコンテキストでの主要な安全性の懸念であると考えられている。これまで、いくつかのグループがＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（Ｄｕｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  ＦＡＳＥＢ  Ｊ，  ２９：ＬＢ７６１）又はＺｉｎｃ  Ｆｉｎｇｅｒ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｓｅｍａａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  １０）を使用してＰＥＲＶを不活性化しようとしたが、これらの試みは成功していない。
【０００５】
遺伝子組み換え動物は、ゲノムに意図的な改変を加えるように設計されており、他の用途の中でも科学的目的、家畜の改良、及び組換えタンパク質の生産などに数十年にわたって使用されてきた。転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、デアミナーゼ、及びクラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ベースのシステム、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９など、のクラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）ベースのシステムを包含する、遺伝子改変動物を生成するための多くの技術が開発されてきた。最近、これらの技術は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの多重ゲノム編集のために複数の核酸配列を標的にするために採用されている。しかしながら、遺伝子組み換え動物の生児出生及び/又は出生後の生存の成功率は、使用する技術、標的とするゲノム領域(複数可)、改変された動物の種を包含する、多数の要因に依存するが、その割合は遺伝的に改変されていない動物よりも低くなっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ヒトへの移植のための細胞、組織、及び／又は臓器の供給源としてＰＥＲＶを含まないブタを開発する、及び遺伝子組み換え動物、特に複数の遺伝子組み換えを持つように設計された動物の出生率及び/又は生存率を改善する技術が必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
開示の概要
いくつかの態様において、本開示は、胚から成長したブタ(swine)を提供し、ここで、前記胚は、少なくとも７５％の不活性ブタ(porcine)内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）要素を有するブタ細胞を含む。
【０００８】
いくつかの態様において、本開示は、ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）不活化ブタ（pig）を生成する方法であって、：
核を有する核ドナー細胞を得ることであって、前記核ドナー細胞中のＰＥＲＶ要素の少なくとも７５％が不活性であること；
核移植卵母細胞を生成するため、前記核ドナー細胞の前記核をレシピエント除核卵母細胞にトランスファーすること；
前記核移植卵母細胞を活性化すること；
胚盤胞又は胚を生成するため、前記核移植卵母細胞を培養すること；
前記胚盤胞又は胚をサロゲート（surrogate）にトランスファーすること；及び
前記胚盤胞又は胚から生きたＰＥＲＶ不活化ブタを生成すること；
を含む方法、を提供する。
【０００９】
いくつかの態様において、本開示は、ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）不活化ブタを生成する方法であって、：
胚盤胞又は胚を生成するため核ドナー細胞の核を使用することであって、前記核ドナー細胞におけるＰＥＲＶ要素の少なくとも７５％が不活性であること；及び
ＰＥＲＶ不活化ブタを作成するため、前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること；
を含む方法、を提供する。
【００１０】
いくつかの態様において、本開示は、
胚盤胞又は胚を生成するため、核ドナー細胞由来の核を使用することであって、前記核ドナー細胞中のＰＥＲＶ要素の少なくとも７５％が不活性であること、及び
少なくとも１つのＰＥＲＶ不活化ブタを生成するため、前記胚盤胞又は胚を少なくとも１つのサロゲートにトランスファーすること、
を含む、ＰＥＲＶ不活化ブタの出生率を改善する方法であって、ここで、流産率は、細胞内のＰＥＲＶ要素の２５％超が活性である細胞から生成された胎児の流産率と比較して、減少している、方法、
を提供する。
【００１１】
いくつかの態様において、本開示は、遺伝子組み換え動物を作成する方法であって、：
胚盤胞又は胚を生成するため、核ドナー細胞由来の核を使用することであって、前記核ドナー細胞内の複数の核酸配列が改変されること、及び
前記遺伝子組み換え動物を作成するため、前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること、
を含む方法、を提供する。
【００１２】
いくつかの態様において、本開示は、
胚盤胞又は胚を生成するために、遺伝子改変された核ドナー細胞由来の核を使用すること、及び
少なくとも１つの生存可能な子孫を生成するため、前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること、
を含む、遺伝的に改変された胚盤胞又は胚の体細胞核移植（ＳＣＮＴ）による妊娠損失又は流産のリスクを予防又は軽減する方法であって、
ここで、妊娠損失又は流産の割合は、コントロールの妊娠損失又は流産の割合と比較して減少している、方法、を提供する。
【００１３】
本明細書に開示及び記載されている実施形態のいずれかのブタから得られた臓器又は組織も提供される。本明細書に開示及び記載される方法のいずれかによって生成された単離ブタ細胞も提供される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、細胞内のＰＥＲＶ要素の約１００％が不活性である。いくつかの実施形態において、細胞内のＰＥＲＶ要素の１００％が不活性である。
【００１５】
いくつかの態様において、ＰＥＲＶ要素は、ＰＥＲＶ要素の活性の低下又は排除をもたらす１つ又は複数の突然変異又はエピジェネティックな変化を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ブタ細胞のＰＥＲＶ要素は、ＰＥＲＶ複製及び／又はアセンブリに関与する遺伝子に特異的なゲノム改変剤を細胞に投与することを含む方法によって不活性化されている。ここで、前記作用物質(the  agent)は前記遺伝子の転写及び／又は翻訳を破壊する。いくつかの実施形態において、前記作用物質は、ヌクレアーゼもしくはニッカーゼ又は前記ヌクレアーゼもしくはニッカーゼをコードする核酸であり、例えば、前記ヌクレアーゼもしくはニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼもしくはニッカーゼである。いくつかの実施形態において、前記作用物質が、：
ａ）ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ又はｔｒａｃｒＲＮＡ又は、
ｂ）ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをコードする核酸、
をさらに含む。
【００１７】
いくつかの態様において、前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、配列番号１〜３又は２６〜１８１のいずれか１つのヌクレオチド配列、そのいずれの株特異的遺伝的変異体、又はそのいずれの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、配列番号１〜３又は２６〜１１６のいずれか１つのヌクレオチド配列、そのいずれの株特異的遺伝的変異体、又はそのいずれの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、配列番号３５、３６、４８、９９、１０１、１０２、１０６、１０８、１１１、１１３のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれらのいずれの組み合わせを含む。いくつかの態様において、前記作用物質はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする核酸であり、ここで、前記細胞は、前記作用物質を安定に発現するように操作され、ここで前記作用薬剤は、少なくとも１つのガイドＲＮＡをさらに含み、且つ、ここで、少なくとも１つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜３又は２６〜１１６のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ブタは、妊娠後(post−gestation)少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも５年、少なくとも１０年にわたって同じ又は実質的に同じレベルのＰＥＲＶ不活化を維持する。
【００１９】
いくつかの態様において、核ドナー細胞は、体細胞、胎児細胞、生殖細胞、幹細胞、又は及び人工多能性幹細胞（induced  pluripotent  stem  cell、ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態において、核ドナー細胞は胎児細胞である。いくつかの実施形態において、核ドナー細胞はキメラＰＥＲＶ不活化胎児から単離される。いくつかの態様において、前記キメラＰＥＲＶ不活化胎児は、妊娠約１０日、約２０日、約３０日、又は約３ヶ月である。
【００２０】
いくつかの態様において、前記キメラＰＥＲＶ不活化胎児は、ゲノム改変剤、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はニッカーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ又はニッカーゼ、デアミナーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼ又はニッカーゼ、を使用して生成される。
【００２１】
いくつかの態様において、前記核ドナー細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの３０未満、２０未満、１０未満、５未満、又は２未満の集団倍加(population  doublings)を受ける。いくつかの実施形態において、前記核ドナー細胞は、ブタから単離される。いくつかの実施形態において、前記ブタが、１０週齢未満、８週齢未満、６週齢未満、５週齢未満、４週齢未満、３週齢未満、２週齢未満、又は１週齢未満である場合、前記核ドナー細胞は前記ブタから単離される。いくつかの態様において、前記核ドナー細胞中の前記ＰＥＲＶ要素の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％は不活性である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、前記ＰＥＲＶ不活化ブタが、妊娠後少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも５年、少なくとも１０年にわたって同じ又は同様のレベルのＰＥＲＶ不活化を維持する。
【００２３】
いくつかの態様において、当該方法は、少なくとも１つの野生型胚盤胞又は胚を前記サロゲートにトランスファーすることをさらに含む。
【００２４】
いくつかの態様において、前記核ドナー細胞中の前記ＰＥＲＶ要素の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％が不活性である。いくつかの実施形態において、前記核ドナー細胞中の前記ＰＥＲＶ要素の１００％が不活性である。
【００２５】
いくつかの実施形態において、前記ＰＥＲＶ不活化ブタが、妊娠後少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも５年、少なくとも１０年にわたって同じ又は同様のレベルのＰＥＲＶ不活化を維持する。いくつかの実施形態において、前記ＰＥＲＶ不活化ブタがＰＥＲＶを含まないブタである。いくつかの実施形態において、前記ＰＥＲＶ不活化ブタは、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、又は少なくとも約９９％の不活性ＰＥＲＶ要素を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
図面の簡単な説明
【図１Ａ】図１Ａは、感染したヒト細胞のＰＥＲＶコピー数が時間とともに増加することを示している。ヒトＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ細胞は、同等数のブタＰＫ１５細胞と１週間、共培養した。前記ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ単一細胞は、ＧＦＰシグナルに基づいたフローサイトメトリーによって分離され、その後クローンに成長した。前記ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローンを分離し、且つ、７０、８７、１３２日間培養した。ＰＥＲＶ  ｐｏｌプライマーを使用したｄｄＰＣＲにより、ＰＥＲＶコピー数を分析した。ＰＫ１５細胞のいずれの接触なしのＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰをコントロールとして使用した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、高度に感染したｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローンのＰＥＲＶ挿入部位を示す。逆ＰＣＲにより検出された前記２２のＰＥＲＶ挿入部位のうち、１５が遺伝子内領域にマッピングされた。遺伝子内ヒットの一部がテストされた。１２個中７個がジャンクションＰＣＲにより検証され、且つ表示されている。３０ｂｐヒトゲノム配列が下線付きで示されている一方、ＰＥＲＶ  ＬＴＲは二重下線で示されている。ゲノム配列はＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒにアラインされ、且つ対応する遺伝子がリストされる。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヒトからヒトへのＰＥＲＶ伝達を調べるために使用される実験計画の簡略図を示す。ＧＦＰで標識されたヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ）に感染したＰＥＲＶを、非標識ＷＴ  ＨＥＫ２９３Ｔ（ＨＥＫ２９３Ｔ）と１４日間、共培養した。ＨＥＫ２９３Ｔクローンを共培養から分離し、且つ、ゲノムＤＮＡを抽出して、ＨＥＫ２９３Ｔクローンがｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ細胞由来のＰＥＲＶに感染しているかどうかを判定した。
【図１Ｄ】図１Ｄは、ヒトからヒトへのＰＥＲＶ伝達の検出を示す。ＨＥＫ２９３Ｔの個々のクローンは、フローサイトメトリーによるｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰとＨＥＫ２９３Ｔとの共培養から分離された単一細胞から増殖した。ＰＣＲゲル画像は、ランダムにテストされた４つのＨＥＫ２９３Ｔクローンのうち３つがＰＥＲＶ配列を含んでいたが（ＰＥＲＶ  ｐｏｌ、ｅｎｖ、及びｇａｇ）、ＧＦＰ又はブタゲノムＤＮＡの配列を含んでいなかったことを示す（ブタ固有のＧＧＴＡでテスト済み）。サンプルの順番は次のとおり。：  １）ＨＥＫ２９３Ｔクローン１；  ２）ＨＥＫ２９３Ｔクローン２；  ３）ＨＥＫ２９３Ｔクローン３；  ４）ＨＥＫ２９３Ｔクローン４；  ５）ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰコントロール；  ６）ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ；  ７）ＰＫ１５  ＷＴ；及び８）ネガティブコントロール。
【図１Ｅ】図１Ｅは、異なるｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローンが異なる感染力を持っていることを示す。ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰとＷＴ  ＨＥＫ２９３Ｔとの共培養からの感染したＨＥＫ２９３Ｔクローンの割合は、２０％から９７％まで変化した。割合は、培養中のｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローンのＰＥＲＶコピー数に対応する。４つの親ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローンのＰＥＲＶコピー数は、それぞれ、１５、２８、２７及び２８である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＰＥＲＶ挿入部位の染色体マッピングを示す。染色体上のＰＥＲＶ統合部位は、ハイブリダイゼーションキャプチャ及びロングリードＰａｃｂｉｏシーケンシングを使用して、ＷＴ  ＦＦＦ３細胞株で検出された。灰色のバーは染色体の足場(scaffolds)を表す。矢印（上向き）は、前方又はプラスの染色体鎖のＰＥＲＶを表す。矢印（下向き）は、リバースストランド又はマイナスストランドのＰＥＲＶを表す。
【図２Ｂ−Ｃ】図２Ｂは、高度に修飾されたＦＦＦ３クローンの生存率をグラフ化したものである。ＦＦＦ３中のＰＥＲＶをターゲットにした後、単一細胞をソートし、すぐに遺伝子型を決定した。単一細胞間でのＰＥＲＶターゲティング周波数のバイモーダル分布が観察された（上のパネル）。１００％ＰＥＲＶを含まないＦＦＦ３細胞は、直接遺伝子型決定された単一細胞の中に存在していた。ただし、このパターンは単一細胞の増殖後に変化した（下のパネル）。単一細胞クローンの中で、効率の低いもの（≦３９％、集団の平均ターゲティング効率は３７％であった）のみが得られ、且つ、ＰＥＲＶが１００％根絶されなかったいくつかのＦＦＦ３クローンの持続性が観察された（下のパネル）。  図２Ｃは、ＰＦＴα及びｂＦＧＦによる処理が高度に修飾されたＦＦＦ３クローンの成長を維持することを示す。ｐ５３の阻害剤と成長因子との併用により、高度に編集された細胞が救出される。ＦＦＦ３の集団は、遺伝子編集実験中にＰＦＴα及びｂＦＧＦで処理された。；次に、単一細胞を直接遺伝子型決定のため及びコロニー成長のためにソートし、その後遺伝子型決定を行った。単一細胞と拡大クローンの両方が、ＰＥＲＶターゲティング効率で同様の二峰性分布を示し、且つ高度に修飾されたクローンがこの条件下で生き残った。
【図２Ｄ−Ｅ】図２Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９処理後のＰＥＲＶｐｏｌ遺伝子座の１００％ＰＥＲＶを含まないクローンの１つのハプロタイプを示す。ＰＦＴα及びｂＦＧＦで処理されたＦＦＦ３集団から、いくつかの１００％ＰＥＲＶを含まないクローンが達成された。ｙ軸は、編集されたＰＥＲＶ遺伝子座を示す。ｘ軸は、ＰＥＲＶ遺伝子座内のインデルの相対位置を示す。ＰＥＲＶｐｏｌシーケンス内の整列されたインデルイベントは、赤で表される。紫色の色合いは、ＰＥＲＶの異なるハプロタイプを示す。  図２Ｅは、１００％のＰＥＲＶ改変クローンではＰＥＲＶ産生が排除されることを示す。細胞培養上清に存在するＰＥＲＶ粒子の逆転写酵素（ＲＴ）活性は、逆転写アッセイにより検出された。その結果、１００％ＰＥＲＶを含まないクローン上清ではＰＥＲＶ産生が見られなかったのに対し、ＷＴ  ＦＦＦ３細胞の上清では顕著なＲＴ活性が示された。サンプルの順序は左から右である。：  ２−ｌｏｇ  ＤＮＡラダー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）；ＲＴ＋（市販の逆転写酵素（ＲＴ）を使用）；ＲＴ−（ＲＴ酵素なし）；ＲＴ＋／ＦＦ  ＷＴ（市販のＲＴ酵素プラスＷＴ  ３ＦＦＦ溶解（３ＦＦＦ培地からのウイルスペレットの溶解）；１００％ＦＦＦ３（１００％ＰＥＲＶ不活化ＦＦＦ３クローン溶解）；ＷＴ  ＦＦ（ＷＴ  ３ＦＦＦ溶解）；ｎｅｇ（溶解なし又はＲＴ酵素、ＲＮＡテンプレートなし）。
【図３Ａ】図３Ａは、１００％ＰＥＲＶを含まないＰＦＦＦ３からクローン化されたブタ胚盤胞を示す。７日目ＰＥＲＶを含まないブタ胚盤胞は、ＳＯＸ２（内部細胞塊）、ＤＡＰＩ（核）、及びファロイジン（細胞境界）で染色された。レーザー走査共焦点顕微鏡を使用して、染色された胚盤胞を画像化した。
【図３Ｂ】図３Ｂは、１００％ＰＥＲＶを含まないＰＦＦＦ３からクローン化された胎児のＰＥＲＶターゲティング効率を示している。ｙ軸は、編集されたＰＥＲＶ遺伝子座を示す。ｘ軸は、ＰＥＲＶ遺伝子座内のインデルの相対位置を示す。ＰＥＲＶ  ｐｏｌシーケンス内の整列されたインデルイベントは、赤で表される。紫色の色合いは、異なるＰＥＲＶハプロタイプを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ｉＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰの選択されたクローンのＰＥＲＶコピー数を示している。ＷＴ  ＨＥＫ２９３Ｔ（非ＧＦＰ）細胞を、同等数のＰＥＲＶ感染ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ（ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ）クローン１０の細胞と２週間、共培養した。ＧＦＰネガティブ単一ヒト細胞は、ＧＦＰシグナルに基づいたフローサイトメトリーにより分離された。単一細胞コロニーが成長した後、ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローン１０  ＰＥＲＶコピー数を標準マーカーとして使用して、ＧＦＰネガティブクローンのＰＥＲＶ要素を検出及び定量するために、ｑＰＣＲを介してゲノムＤＮＡを増幅した（クローン１０のＰＥＲＶコピー数は、共培養実験の前にｄｄＰＣＲで検出された）。ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローン１０からＷＴ  ＨＥＫ２９３Ｔヒト細胞へのＰＥＲＶ伝達はＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子のｑＰＣＲによって検出され、且つ、異なるＷＴ  ＨＥＫ２９３ＴクローンはＰＥＲＶの異なるコピー数を示した。
【図４Ｂ】図４Ｂは、開いたクロマチン及び転写活性領域にＰＥＲＶが優先的に挿入されることを示す。遺伝子発現レベル、ＤＮａｓｅシグナル、及びＰＥＲＶ挿入部位周辺の領域と残りの接合部との間のＨ３Ｋ２７Ａｃシグナルを測定し、且つ比較した。ＰＥＲＶ挿入部位の転写、ＤＮａｓｅシグナル、及びＨ３Ｋ２７Ａｃレベルの増加が観察された。
【図５Ａ】図５Ａは、ＤＮＡ損傷効果のモジュレーターの効果を示すグラフである。ＦＦＦ３細胞をｂＦＧＦ、ＰＦＴａ、及びｂＦＧＦ＋ＰＦＴａで処理した。ｂＦＧＦとＰＦＴａの両方で処理しただけではＰＥＲＶ編集効率は向上しなかったが、ｂＦＧＦとＰＦＴａのカクテルで処理するとターゲティング頻度が大幅に向上し（ｐ値＝０．００１６）、ｂＦＧＦとＰＦＴａとの間に相乗効果があることが実証された。
【図５Ｂ】図５Ｂは、経時的なＦＦＦ３−＃５の集団に対するＰＦＴ−ａとｂＦＧＦとのカクテルによる処置の効果を示すグラフである（Ｄ＝日数）。結果は持続的な高いＰＥＲＶターゲティング効率を示した一方、前記カクテルで処理されなかったＦＦＦ３−＃４の集団はＰＥＲＶ編集効率の減少したパターンを示した。（ＡＮＯＶＡ、日（ｐ値＝０．２３）、ＰＦＴａ／ｂＦＧＦ処置（ｐ値＝０．００００２））。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＦＦＦ３細胞に対するｂｃｌ−２による７日間の処置の効果を示すグラフである。Ｂｃｌ−２の異なる投与量を用いた処置の間で有意差（ｐ値＝０．５６５）は検出されなかった。Ｂｃｌ−２の用量依存性細胞毒性も実験中に観察された。
【図６Ａ】図６Ａは、ＦＦＦ３集団におけるＰＥＲＶのターゲティング効率に対するラージＴ抗原(large  T  antigen)の効果を示すグラフである（ｐ値＝０．０５、ウィルコクソン検定（片側））。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＰＥＲＶ編集効率を分析するために使用されるソートされた単一細胞から成長したクローンに対するラージＴＴ抗原の効果を示す表である。ラージＴＴ抗原処理は、未処理のグループと比較して、ＰＥＲＶ−ｋｏクローンの比率がそれぞれ８０％及び９０％増加し、それぞれ３．７５倍及び５．０６倍になった。
【図７】図７は、１００％ＰＥＲＶを含まないＰＦＦＦ３の転写プロファイルを示す。ＲＮＡｓｅｑを使用して、ｐｏｌ遺伝子のＰＥＲＶの不活性化を分析した。ｙ軸はサイトを示す。Ｘ軸は、ＰＥＲＶ遺伝子座内のインデルの相対位置を示す。ＰＥＲＶ  ｐｏｌシーケンスの整列されたインデルイベントが赤色で表される。
【図８】図８は、ＦＦ３ＣＦのＰＥＲＶジャンクションを検出するために使用されるプライマーを示す。
【図９】図９は、ＰＥＲＶフリーＦＦＦ３で生まれた１匹の子豚のＰＥＲＶターゲティング効率を示している。ｙ軸は、編集されたＰＥＲＶ遺伝子座を示す。ｘ軸は、ＰＥＲＶ遺伝子座内のインデルの相対位置を示す。ＰＥＲＶｐｏｌシーケンス内の整列されたインデルイベントは、赤で表される。紫色の濃淡は、異なるＰＥＲＶのハプロタイプを示している。ブタの遺伝子型は、ＰＥＲＶの２５コピーすべてが機能的に変異していることを示した。
【図１０】図１０は、ＰＥＲＶフリーＦＦＦ３で生まれた９匹の子豚のＰＥＲＶターゲティング効率を示している。「＃１」子豚（左に６本のバー）と「＃２」子豚（右に３本のバー）は、２つの異なるＰＥＲＶフリーＦＦＦ３クローンを示す。
【図１１】図１１は、ブタＰＫ１５及びＰＫ１５と共培養されたヒトＨＥＫ２９３Ｔ（ｉＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ）のＰＥＲＶコピー数を示しています。  Ａ）  ＰＫ１５細胞株のＰＥＲＶ  ｅｎｖ  Ａ、Ｂ、Ｃのコピー数。ＰＫ１５細胞において、ＰＥＲＶ−Ａ及びＰＥＲＶ−Ｂは検出されたが、ＰＥＲＶ−Ｃは検出されなかった。ＰＥＲＶ−Ａのコピー数は、ＰＥＲＶ−Ｂの約２倍である。各２Ｄ増幅プロットにおいて、黒いドット（左下象限）は増幅なしの液滴を表し、緑（右下象限）はＧＡＰＤＨ（参照遺伝子）を含有する液滴を表し、青（左上象限）はサブタイプＡ、Ｂ又はCからのＰＥＲＶ  ｅｎｖを含有する液滴を表し、オレンジ（右上の象限）は、ＧＡＰＤＨ及びＰＥＲＶ  ｅｎｖを含有する液滴を表す。ＧＡＰＤＨと比較して測定したＰＥＲＶサブタイプＡ、Ｂ、及びＣのコピー数は、各プロットの下に表示される。  Ｂ）  ＰＫ１５はＰＥＲＶをＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰヒト細胞に伝達し、且つＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰのＰＥＲＶコピー数は時間とともに増加する。ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ細胞を同等数のＰＫ１５細胞と共培養した。ヒト細胞集団は、ＧＦＰ発現に基づいてソートする順次ラウンド(sequential  rounds)により分離された。精製したヒト細胞を３つの時点で収集した。そして、ヒト細胞内のＰＥＲＶ要素を検出及び定量するため、ゲノムＤＮＡを収集し且つｄｄＰＣＲにより増幅した。ブタＰＫ１５からヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのＰＥＲＶ伝達は、ＰＥＲＶ  ｅｎｖ遺伝子のｄｄＰＣＲによって検出された。ＰＥＲＶ−Ａ及びＰＥＲＶ−Ｂは、ＰＫ１５との接触の履歴があるＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検出されたが、ＰＥＲＶ−Ｃは検出されなかった。そしてＰＥＲＫコピー数はＨＥＫ２９３Ｔ細胞において経時的に増加した。
【図１２】図１２は、ＦＦＦ３におけるＰＥＲＶサブタイプコピー数の検証を示す。ＷＴブタ初代胎児線維芽細胞株（ＦＦＦ３）のＰＥＲＶコピー数は、ｐｏｌ及びｅｎｖ遺伝子の両方のｄｄＰＣＲによって検出された。ｐｏｌ遺伝子によって決定されるＰＥＲＶコピー数（２５）は、ｅｎｖ遺伝子によって検出されるもの（２４）と類似している。
【図１３】図１３は、ブタゲノム内のＰＥＲＶの位置を検出するプロセスを説明する概略図を示している。ＰＥＲＶの位置をマッピングするために、ＰＥＲＶ固有のハイブリダイゼーションキャプチャの後にＰａｃＢｉｏロングリードゲノムシーケンス（Ｎ５０＝２，４３９ｂｐ、以下で説明）を実行した。そしてゲノムの非反復領域においてＰＥＲＶの２１コピーをマッピングした。
【図１４】図１４は、ｐｏｌを標的とするｇＲＮＡの設計プロセスを説明する概略図を示す。
【図１５】図１５Ａは、ブタのクローニングに使用されたＰＥＲＶを含まないクローンの代表的な核型を示している。核型分析を使用して異なるクローンを分析した。５つは異常な核型を示し、３つは正常を示した。３つの異常な核型の例。注目すべきは、転座（色のペアで示される）又は挿入又は削除を伴うすべての染色体には、１つの場合（ｔ（１０，１２）の転座ペアの染色体１０、上のパネル）を除いてＰＥＲＶが含まれる。    図１５Ｂは、代表的な正常な核型を示している。このＰＥＲＶを含まないクローンは、完全に正常な核型を示している。
【図１６】図１６Ａは、ＰＥＲＶ−ＫＯ胎児の代表的な画像を示している。合計６頭の生きた胎児（２頭のＷＴ及び４頭のＰＥＲＶを含まない胎児）が３頭のサロゲート(sarrogate)繁殖用雌豚(sows)から達成された。この写真は、妊娠（pregnancy）５０日目に１頭のサロゲート繁殖用雌豚から達成された３つの生きたＰＥＲＶフリー胎児を示していた。    図１６Ｂは、胎児のゲノムＤＮＡにおけるＰＥＲＶの不活性化効率を示している。胎児ゲノムＤＮＡを使用して、ＰＥＲＶ不活化効率を測定した。由来するＰＥＲＶフリー細胞株と同様に、ＰＥＲＶ−ＫＯ胎児も〜１００％ＰＥＲＶ不活化効率を示した。これは、妊娠中にサロゲート繁殖用雌豚からの再感染が発生しなかったことを示唆している。
【図１７】図１７Ａは、ＰＥＲＶを含まないブタの画像を示している。この写真は、出生後２日目に最初に生まれたブタ（Ｌａｉｋａ）を示している。    図１７Ｂは、ブタのゲノムＤＮＡにおけるＰＥＲＶ不活性化を示している。ＰＥＲＶ−ＫＯブタは、ＰＥＲＶｐｏｌ遺伝子座のディープシーケンシングにより、さまざまな年齢で遺伝子型を特定した。調べたブタはすべて、ＰＥＲＶの不活化効率が１００％を示した。これは、サロゲート繁殖用雌豚からクローンブタへのＰＥＲＶの再感染は検出されないことを実証している。    図１７Ｃは、ｍＲＮＡレベルでのＰＥＲＶ不活性化を示している。全ｍＲＮＡ生成ｃＤＮＡを使用して、ＰＥＲＶ−ＫＯブタ転写物のＰＥＲＶ不活性化効率を検出した。すべてのブタは、ｍＲＮＡレベルで〜１００％のＰＥＲＶ根絶効率を示した。
【図１８】図１８は、３０ｄ  ＰＥＲＶを含まないブタに由来する単一細胞のＰＥＲＶ不活性化効率を示している。３０ｄ  Ｈ９ｐ０１  ＰＥＲＶフリー豚由来の細胞を単一細胞に分類した。そして、ＰＥＲＶｐｏｌ遺伝子断片を、単一細胞のゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用したディープシーケンスにより遺伝子型を特定した。すべての単一細胞は１００％のＰＥＲＶ不活性化を示した。
【図１９】図１９は、ＰＥＲＶを含まないブタ及びＷＴ  ＦＦＦ３線維芽細胞のＰＥＲＶコピー数を示しています。ＰＥＲＶを含まないブタのゲノムＤＮＡ及びＷＴ  ＦＦＦ３線維芽細胞を使用して、ｄｄＰＣＲによりＰＥＲＶコピー数を測定した。すべてのＰＥＲＶを含まないブタは、ＷＴ  ＦＦＦ３線維芽細胞と同様のＰＥＲＶコピー数を示した。
【図２０】図２０は、すべてのＰＥＲＶ非含有ブタの核型代表を示す。すべてのＰＥＲＶを含まないブタは、正常な核型を示した。
【図２１】図２１は、本明細書に記載の一実施形態に係る細胞株の構築ストラテジーの概略図を示す。
【図２２】図２２は、本明細書に記載の一実施形態による細胞品質管理戦略の概略図を示す。
【図２３】図２３は、本明細書に記載の一実施形態によるＳＣＮＴクローニング手順の概略図を示す。
【図２４】図２４は、本明細書に記載の一実施形態による、細胞生存条件を改善するための方法の概略図を示す。簡単に言えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養時間ウィンドウを短縮するために、単一細胞のクローニングプロセスはスキップされる。細胞成長時間を短縮するため、ＳＣＮＴのための単一細胞クローンの代わりに選択された細胞集団が使用される。そして、繁殖用雌豚自体が胎児の発育に最適な遺伝子改変を行った胚を選択する。
【図２５】図２５は、本明細書に記載の一実施形態による、細胞生存率条件を改善する方法の概略図を示す。簡単に言えば、細胞へのストレスを軽減するために、細胞の代わりにマイクロインジェクションによって接合体に対して修飾が行われる。
【図２６】図２６は、本明細書に記載の実施形態による、細胞生存条件を改善する方法の概略図を示す。簡単に説明すると、線維芽細胞は３０日目の胎児から分離され、ＳＣＮＴによる再クローン化に使用される。
【図２７】図２７は、ＰＥＲＶノックアウト（ＫＯ）効率がトランスフェクションで使用されるｇＲＮＡの数とともに増加することを示している。胎児線維芽細胞は、Ｙｕｋａｔａｎから５０〜６０ＰＥＲＶコピーで入手した。フラグメント分析からクロマトグラフィーデータが表示される。
【図２８】図２８は、不活化ＰＥＲＶｐｏｌがヒトＥＲＶｐｏｌの活性によって補完されないことを示すＰＣＲデータを示している。
【図２９】図２９は、代理母の選択が出産率(delivery  rate)、同腹仔数(liter  size)、生存率（survival  rate）、及び繁殖用雌豚あたりの予想ブタ数(expected  pigs  per  sow)に与える影響を実証している。
【図３０】図３０は、ブタ生産中に再クローン化ステップを含めることが、出産率、同腹仔数(liter  size)、生存率、及び繁殖用雌豚あたりの予想豚数に与える影響を実証している。
【図３１】図３１Ａは、ＷＴブタにおけるＰＥＲＶフラグメント分析のクロマトグラフィーデータを示している。    図３１Ｂは、ＰＥＲＶ  ＫＯ  ＹｏｒｋｓｈｉｒｅにおけるＰＥＲＶフラグメント分析のクロマトグラフィーデータを示している。データは、大部分が１００塩基対（ｂｐ）を超える、大規模な欠失のみを伴う１００％ＰＥＲＶ  ＫＯを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
開示の詳細な説明
本開示は、無傷のＰＥＲＶが低減された１つ以上の遺伝子改変ブタ細胞、又はこれらの細胞を生成する方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のブタ細胞は、無傷のＰＥＲＶ、又はこれらの細胞を生成する方法を全く有していない。いくつかの実施形態において、ＰＥＲＶ減少又はＰＥＲＶを含まないブタ細胞をクローン化してブタ胚を生成することができる。これは順番に成体のブタに成長することができる。そこから臓器及び/又は組織が抽出され、ヒトへの異種移植などの目的に使用できる。
【００２８】
Ｉ．定義
本明細書及び特許請求の範囲を通して数値に関連して使用される「約(about)」及び「およそ(approximately)」という用語は、当業者によく知られており、許容可能な精度の間隔を示す。
【００２９】
本明細書に開示される数値範囲は、範囲を定義する数字を含む。
【００３０】
用語「ａ」及び「ａｎ」は、用語が使用される文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、複数の指示対象を包含する。用語「ａ」（又は「ａｎ」）、ならびに用語「１つ又は複数」及び「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用することができる。さらに、本明細書で使用される「及び／又は」は、２つ以上の特定の特徴又は構成要素のそれぞれの他方の有無にかかわらず特定の開示と解釈されるべきである。したがって、本明細書の「Ａ及び／又はＢ」などの語句で使用される「及び／又は」という用語は、「Ａ及びＢ」、「Ａ又はＢ」、「Ａ」（単独）、及び「Ｂ」（単独）を包含するものとする。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などのフレーズで使用される「及び／又は」という用語は、以下の態様：  Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；Ｃ（単独）；を包含することを意図している。
【００３１】
本明細書を通して、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅ」又はその変形「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」又は「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」は、指定された整数又は整数のグループの包含を意味するが、いずれの他の整数又は整数のグループの除外を意味しないと理解される。本明細書で使用される場合、用語「含む」も狭い用語の使用を包含する「からなる」及び「から本質的になります。」
【００３２】
「ｐｉｇ」、「ｓｗｉｎｅ」及び「ｐｏｒｃｉｎｅ」という用語は、本明細書において交換可能に使用され、飼育ブタの様々な品種、イノシシ（Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ）種、を指す。
【００３３】
用語「生物学的に活性な」がタンパク質又はポリペプチドの断片又は誘導体を指すために使用される場合、断片又は誘導体は、参照完全長タンパク質又はポリペプチドの少なくとも１つの測定可能及び／又は検出可能な生物学的活性を保持することを意味する。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９タンパク質の生物学的に活性な断片又は誘導体は、ガイドＲＮＡに結合できる、ガイドＲＮＡと複合体を形成したときに標的ＤＮＡ配列に結合できる、及び／又は１つ以上のＤＮＡ鎖を切断できる可能性がある。
【００３４】
用語「ｔｅａｔｍｅｎｔ」、「ｔｒｅａｔｉｎｇ」、「ａｌｌｅｖｉａｔｉｏｎ」などは、疾患、傷害又は障害の文脈で使用される場合、一般に、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を得ることを意味するために使用される。また、治療中の症状の１つ以上の症状の重症度を改善、緩和、及び／又は軽減することを指すために使用される場合がある。効果は、疾患、状態、又はその症状の発症又は再発を完全に又は部分的に遅延させるという点で予防的であり得、及び／又は疾患又は状態の及び／又は疾患又は状態に起因する副作用の、部分的又は完全な治癒という点で治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」は、哺乳動物、特にヒト、の疾患又は状態のあらゆる治療を包含し、且つ、以下：
（ａ）疾患又は状態の素因があるかもしれないが、まだそれを有すると診断されていない対象において、疾患又は状態が発生するのを防ぐこと；
（ｂ）疾患又は状態を阻害すること（例えば、その発症を阻止すること）；又は
（ｃ）疾患又は状態を緩和すること（例えば、疾患又は状態の退縮を引き起こし、１つ又は複数の症状を改善すること）；
を包含する。
【００３５】
ＩＩ．ブタの細胞、組織、臓器
いくつかの態様において、細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、哺乳動物細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記哺乳動物細胞は、非ヒト哺乳動物細胞、例えば、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、又はネコである。いくつかの実施形態において、細胞はブタ細胞である。
【００３６】
いくつかの実施形態において、本開示は、無傷のＰＥＲＶが減少した１つ以上のブタ細胞を提供する。いくつかの実施形態において、ブタ細胞は、ブタ細胞に存在する無傷のＰＥＲＶが不活性化されるように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、ブタ細胞は、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満、５未満、３未満、２未満、１又はゼロコピーの無傷のＰＥＲＶ、を持つ。いくつかの実施形態において、ブタ細胞は、１０未満、５未満、３未満、２未満、１又はゼロコピーの無傷のＰＥＲＶ、を持つ。いくつかの実施形態において、ブタ細胞は、無傷のＰＥＲＶのゼロコピーを有する。いくつかの実施形態において、ブタ細胞は、約６０コピー〜約１コピー、約５０コピー〜約１コピー、約４０コピー〜約１コピー、約３０コピー〜約１コピー、約２０コピー〜約５コピー、約１５コピーから約１０コピー、又は約５コピーから約１コピーの無傷のＰＥＲＶを持つ。いくつかの実施形態において、細胞中のＰＥＲＶＳのうち少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％は不活性である。いくつかの実施形態において、細胞中のＰＥＲＶＳのうち約３０％〜１００％、約３５％〜１００％、約４０％〜１００％、約４５％〜１００％、約５０％〜１００％、約５５％〜１００％、約６０％〜１００％、約６５％〜１００％、約７０％〜１００％、約７５％〜１００％、約８０％〜１００％、約８５％〜１００％、約９０％〜１００％、約９５％〜１００％、約９６％〜１００％、約９７％〜１００％、約９８％〜１００％、又は約９９％〜１００％は、不活性である。いくつかの実施形態において、細胞内のＰＥＲＶの１００％が不活性である。
【００３７】
いくつかの態様において、細胞は初代細胞、例えばブタ初代細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は体細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は出生後細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は成体細胞（例えば、成体耳線維芽細胞）である。いくつかの実施形態において、細胞は胎児／胚細胞（例えば、胚割球）である。いくつかの実施形態において、細胞は生殖系列細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は卵母細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、初代細胞株からの細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、上皮細胞、筋肉細胞、線維芽細胞、内皮細胞、肝細胞、顆粒膜細胞、脂肪細胞である。特定の実施形態において、細胞は線維芽細胞である。いくつかの実施形態において、線維芽細胞は、胎児線維芽細胞、例えば女性胎児線維芽細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はがん細胞である。いくつかの実施形態において、細胞はがん細胞ではない。いくつかの実施形態において、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏにある。いくつかの実施形態において、細胞は生体内にある（ｉｎ  ｖｉｖｏ）。いくつかの実施形態において、細胞は単一細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は細胞コロニーのメンバーである。
【００３８】
いくつかの実施形態において、細胞はブタ細胞である。ブタ細胞の非限定的な例は、以下のブタ品種：
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ，  Ａｋｓａｉ  Ｂｌａｃｋ  Ｐｉｅｄ，  Ａｎｇｅｌｎ  Ｓａｄｄｌｅｂａｃｋ，  Ａｐｐａｌａｃｈｉａｎ  Ｅｎｇｌｉｓｈ，  Ａｒａｐａｗａ  Ｉｓｌａｎｄ，  Ａｕｃｋｌａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，  Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ，  Ｂａｂｉ  Ｋａｍｐｕｎｇ，  Ｂａ  Ｘｕｙｅｎ，  Ｂａｎｔｕ，  Ｂａｓｑｕｅ，  Ｂａｚｎａ，  Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｂｌａｃｋ，  Ｂｅｌａｒｕｓ  Ｂｌａｃｋ  Ｐｉｅｄ，  Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ，  Ｂｅｎｇａｌｉ  Ｂｒｏｗｎ  Ｓｈａｎｎａｊ，  Ｂｅｎｔｈｅｉｍ  Ｂｌａｃｋ  Ｐｉｅｄ，  Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ，  Ｂｉｓａｒｏ，  Ｂａｎｇｕｒ，  Ｂｌａｃｋ  Ｓｌａｖｏｎｉａｎ，  Ｂｌａｃｋ  Ｃａｎａｒｉａｎ，  Ｂｒｅｉｔｏｖｏ，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｌａｎｄｒａｃｅ，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｌｏｐ，  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｓａｄｄｌｅｂａｃｋ，  Ｂｕｌｇａｒｉａｎ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｃａｍｂｒｏｕｇｈ，  Ｃａｎｔｏｎｅｓｅ，  Ｃｅｌｔｉｃ，  Ｃｈａｔｏ  Ｍｕｒｃｉａｎｏ，  Ｃｈｅｓｔｅｒ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｃｈｉａｎｇｍａｉ  Ｂｌａｃｋｐｉｇ，  Ｃｈｏｃｔａｗ  Ｈｏｇ，  Ｃｒｅｏｌｅ，  Ｃｚｅｃｈ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｄａｎｉｓｈ  Ｌａｎｄｒａｃｅ，  Ｄａｎｉｓｈ  Ｐｒｏｔｅｓｔ，  Ｄｅｒｍａｎｔｓｉ  Ｐｉｅｄ，  Ｌｉ  Ｙａｎ，  Ｄｕｒｏｃ，  Ｄｕｔｃｈ  Ｌａｎｄｒａｃｅ，  Ｅａｓｔ  Ｌａｎｄｒａｃｅ，  Ｅａｓｔ  Ｂａｌｋａｎ，  Ｅｓｓｅｘ，  Ｅｓｔｏｎｉａｎ  Ｂａｃｏｎ，  Ｆｅｎｇｊｉｎｇ，  Ｆｉｎｎｉｓｈ  Ｌａｎｄｒａｃｅ，  Ｆｏｒｅｓｔ  Ｍｏｕｎｔａｉｎ，  Ｆｒｅｎｃｈ  Ｌａｎｄｒａｃｅ，  Ｇａｓｃｏｎ，  Ｇｅｒｍａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ，  Ｇｌｏｕｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ  Ｏｌｄ  Ｓｐｏｔｓ，  Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ  ｍｉｎｉｐｉｇ，  Ｇｒｉｃｅ，  Ｇｕｉｎｅａ  Ｈｏｇ，  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ，  Ｈａｎｔｅ，  Ｈｅｒｅｆｏｒｄ，  Ｈｅｚｕｏ，  Ｈｏｇａｎ  Ｈｏｇ，  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ  Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｇ，  Ｉｂｅｒｉａｎ，  Ｉｔａｌｉａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ，  Ｊａｐａｎｅｓｅ  Ｌａｎｄｒａｃｅ，  Ｊｅｊｕ  Ｂｌａｃｋ，  Ｊｉｎｈｕａ，  Ｋａｋｈｅｔｉａｎ，  Ｋｅｌｅ，  Ｋｅｍｅｒｏｖｏ，  Ｋｏｒｅａｎ  Ｎａｔｉｖｅ，  Ｋｒｓｋｏｐｏｌｊｅ，  Ｋｕｎｅｋｕｎｅ，  Ｌａｍｃｏｍｂｅ，  Ｌａｒｇｅ  Ｂｌａｃｋ，  Ｌａｒｇｅ  Ｂｌａｃｋ−Ｗｈｉｔｅ，  Ｌａｒｇｅ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｌａｔｖｉａｎ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｌｅｉｃｏｍａ，  Ｌｉｔｈｕａｎｉａｎ  Ｎａｔｉｖｅ，  Ｌｉｔｈｕａｎｉａｎ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｌｉｎｃｏｌｎｓｈｉｒｅ  Ｃｕｒｌｙ−Ｃｏａｔｅｄ，  Ｌｉｖｎｙ，  Ｍａｌｈａｄｏ  ｄｅ  Ａｌｃｏｂａｃａ，  Ｍａｎｇａｌｉｔｓａ，  Ｍｅｉｓｈａｎ，  Ｍｉｄｄｌｅ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｍｉｎｚｈｕ，  Ｍｉｎｏｋａｗａ  Ｂｕｔａ，  Ｍｏｎｇ  Ｃａｉ，  Ｍｏｒａ  Ｒｏｍａｇｎｏｌａ，  Ｍｏｕｒａ，  Ｍｕｋｏｔａ，  Ｍｕｌｅｆｏｏｔ，  Ｍｕｒｏｍ，  Ｍｙｒｈｏｒｏｄ，  Ｎｅｒｏ  ｄｅｉ  Ｎｅｂｒｏｄｉ，  Ｎｅｉｊｉａｎｇ，  Ｎｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ，  Ｎｉｎｇｘｉａｎｇ，  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｕｃａｓｉａｎ，  Ｎｏｒｔｈ  Ｓｉｂｅｒｉａｎ，  Ｎｏｒ���ｅｇｉａｎ  Ｌａｎｄｒａｃｅ，  Ｎｏｒｗｅｇｉａｎ  Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ，  Ｏｓｓａｂａｗ  Ｉｓｌａｎｄ，  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｓａｎｄｙ  ａｎｄ  Ｂｌａｃｋ，  Ｐａｋｃｈｏｎｇ  ５，  Ｐｈｉｌｉｐｐｉｎｅ  Ｎａｔｉｖｅ，  Ｐｉｅｔｒａｉｎ，  Ｐｏｌａｎｄ  Ｃｈｉｎａ，  Ｒｅｄ  Ｗａｔｔｌｅ，  Ｓａｄｄｌｅｂａｃｋ，  Ｓｅｍｉｒｅｃｈｅｎｓｋ，  Ｓｉｂｅｒｉａｎ  Ｂｌａｃｋ  Ｐｉｅｄ，  Ｓｍａｌｌ  Ｂｌａｃｋ，  Ｓｍａｌｌ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｓｐｏｔｓ，  Ｓｕｒａｂａｙａ  Ｂａｂｉ，  Ｓｗａｂｉａｎ−Ｈａｌｌ，  Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｌａｎｄｒａｃｅ，  Ｓｗａｌｌｏｗ  Ｂｅｌｉｅｄ  Ｍａｎｇａｌｉｔｚａ，  Ｔａｉｈｕ  ｐｉｇ，  Ｔａｍｗｏｒｔｈ，  Ｔｈｕｏｃ  Ｎｈｉｅｕ，  Ｔｉｂｅｔａｎ，  Ｔｏｋｙｏ−Ｘ，  Ｔｓｉｖｉｌｓｋ，  Ｔｕｒｏｐｏｌｊｅ，  Ｕｋｒａｉｎｉａｎ  Ｓｐｏｔｔｅｄ  Ｓｔｅｐｐｅ，  Ｕｋｒａｉｎｉａｎ  Ｗｈｉｔｅ  Ｓｔｅｐｐｅ，  Ｕｒｚｈｕｍ，  Ｖｉｅｔｎａｍｅｓｅ  Ｐｏｔｂｅｌｌｙ，  Ｗｅｌｓｈ，  Ｗｅｓｓｅｘ  Ｓａｄｄｌｅｂａｃｋ，  Ｗｅｓｔ  Ｆｒｅｎｃｈ  Ｗｈｉｔｅ，  Ｗｉｎｄｓｎｙｅｒ，  Ｗｕｚｈｉｓｈａｎｍ，  Ｙａｎａｎ，  Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ  ａｎｄ  Ｙｏｒｋｓｈｉｒｅ  Ｂｌｕｅ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ、
のうちのいずれかに由来する又は誘導される細胞である。
【００３９】
いくつかの実施形態において、細胞（例えばドナー核細胞）はキメラ／モザイク胎児から単離される。本明細書で使用される「キメラ」及び「モザイク」という用語は、交換可能に使用され、単一の受精卵から発生した１つの胎児において異なる遺伝子型を持つ細胞集団を２つ以上有する１つの胎児を指す。いくつかの実施形態において、キメラ胎児は、妊娠(gestation)約５日、約１０日、約１５日、約２０日、約２５日、約３０日、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月以上である。いくつかの実施形態において、キメラ胎児は、妊娠(gestation)約５日未満、約１０日未満、約１５日未満、約２０日未満、約２５日未満、約３０日未満、約２ヶ月未満、約３ヶ月未満、約４ヶ月未満、約５ヶ月未満、約６ヶ月未満、約７ヶ月未満、約８ヶ月未満、又は約９ヶ月未満である。
【００４０】
いくつかの態様において、キメラ胎児は、ゲノム改変剤、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、デアミナーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、を使用して生成される。いくつかの実施形態において、キメラ胎児は直接接合体注射により生成される。
【００４１】
いくつかの実施形態において、核ドナー細胞は、１０週齢未満、８週齢未満、７週齢未満、６週齢未満、５週齢未満、４週齢未満、３週齢未満、２週齢未満、又は１週齢未満である動物から単離される。
【００４２】
いくつかの実施形態において、核ドナー細胞、例えば、キメラ胎児から単離された細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで一定期間、増殖される(expanded)。いくつかの実施形態において、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１０未満、約５未満、又は約２未満の集団倍加で増殖する。いくつかの実施形態において、細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、又は約３０以下の集団倍加で増殖する。
【００４３】
いくつかの実施形態において、遺伝子修飾の前又は後に、細胞は、細胞の健康及び／又は生存を改善する１つ又は複数の因子の存在下で培養される。いくつかの実施形態において、因子は、ＢＥＰＰ一塩酸塩、ピフィスリン−α、Ｒ１８トリフルオロ酢酸、線維芽細胞成長因子（ｆｇｆ）、ラージＴ抗原、ＢＣＬ、又はそれらのいずれの組み合わせである。いくつかの実施形態において、因子（複数可）はＲＮＡ依存性プロテインキナーゼアポトーシスを誘導し、ｐ５３媒介アポトーシスを阻害し、１４−３−３タンパク質を阻害し、増殖を促進し、不死化を促進し、抗アポトーシス性、又はそれらのいずれの組み合わせである。
【００４４】
いくつかの実施形態において、因子は細胞周期チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施形態において、因子は抗アポトーシス因子である。いくつかの実施形態において、因子はｂｃｌ−２である。いくつかの実施形態において、因子は、以下：  ｃ−Ｍｙｃ、Ｂａｘ、ｐ５３、ｔＢｉｄ、及びＢＣＬ、のうちいずれか１つの阻害剤である。当業者は、抗アポトーシスチェックポイント阻害剤又は抗アポトーシス因子として使用できるさまざまな小分子及びそれらの小分子の可能な誘導体を知っている。いくつかの実施形態において、因子はＳＶ４０抗原である。
【００４５】
いくつかの実施形態において、因子はｐ５３阻害剤である。いくつかの実施形態において、因子はピフィスリン分子又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、因子はピフィスリンアルファ及び／又はピフィスリンベータである。ピフィスリン（ＰＦＴ）−αは、ｐ５３依存性の転写活性化とアポトーシスを可逆的に阻害することが実証されており、ＰＦＴ−μは、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−２へのｐ５３結合親和性を低下させることにより、ミトコンドリアへのｐ５３の結合を阻害することが実証されている。いくつかの実施形態において、ｐ５３阻害剤は、環化ＰＦＴ−α  ｐ５３不活性化剤、例えば環式ピフィスリン−α臭化水素酸塩など、である。いくつかの実施形態において、ｐ５３阻害剤は、細胞内のｐ５３発現を低減又は排除する核酸である。いくつかの態様において、核酸はアンチセンス及び／又はＲＮＡｉ分子である。いくつかの態様において、ｐ５３阻害剤は、ドミナントネガティブｐ５３タンパク質、又はドミナントネガティブｐ５３阻害剤をコードする核酸である。いくつかの実施形態において、ｐ５３阻害剤は、ピフィスリン−α、ピフィスリン−ベータ、ピフィスリン−α臭化水素酸塩、ピフィスリン−ミュー（ｍｕ）、エリプチシン、９−ヒドロキシエリプチシン、ニュートリン−３、ロスコビチン、及びＳＪ  １７２５５０からなる群から選択される。
【００４６】
いくつかの態様において、因子は成長因子である。いくつかの実施形態において、成長因子はブタ起源のものである。いくつかの実施形態において、成長因子は、遺伝子改変された細胞型に有用な成長因子である。例えば、遺伝子改変細胞が線維芽細胞又は線維芽細胞系統の細胞である場合、いくつかの実施形態において、成長因子は線維芽細胞成長因子である。いくつかの実施形態において、線維芽細胞成長因子は、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）又は線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）である。いくつかの実施形態において、線維芽細胞成長因子は塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）である。いくつかの実施形態において、成長因子は、表皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、及びケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）からなる群から選択される。
【００４７】
いくつかの実施形態において、細胞にはｐ５３阻害剤と成長因子の両方が投与される。特定の実施形態において、細胞にｂＦＧＦとピフィスリン−アルファの両方が投与される。
【００４８】
いくつかの態様において、本開示の細胞は、約１〜２０％の酸素（Ｏ２）、約１〜２０％の二酸化炭素（ＣＯ２）、約５０〜９０％のＮ２、又はいずれのそれらの組み合わせの条件で培養される。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、低酸素条件下で（例えば、１０％未満のＯ２の存在下で）培養される。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は約３７℃で培養される。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、約５％Ｏ２、５％ＣＯ２及び９０％Ｎ２で培養することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、少なくとも一定期間、トライガス(tri−gas)インキュベーターで培養される。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される場合の本開示の細胞は、細胞が約８０％、約７０％、約６０％、約５０％、約４０％、約３０％、約２０％、約１０％、又はより少ない培養密度、未満である(below)場合に分割及び／又は凍結される。いくつかの実施形態において、細胞が約５０％の集密度未満である場合、細胞は分割及び／又は凍結される。
【００５０】
ＩＩＩ．遺伝子改変
本開示は、遺伝的に改変された細胞及びそれに由来する動物を生成する方法を提供する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、複数の内因性核酸配列は、遺伝子改変細胞及びそれに由来する動物を生成するため、不活性化、外因性核酸の挿入、内因性核酸のサブトラクション、又はそれらのいずれの組み合わせにより修飾される。
【００５２】
いくつかの実施形態において、細胞（例えば、核ドナー細胞）中の複数の核酸配列が改変される。いくつかの実施形態において、少なくとも約２、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、又はそれ以上の核酸配列が改変されてる。いくつかの実施形態において、前記複数の遺伝子改変は、単一の反復遺伝子配列に対するものである。他の実施形態において、前記遺伝的改変の少なくとも一部は異なる遺伝子に対するものである。
【００５３】
いくつかの実施形態において、本開示は、無傷のウイルス要素（例えば、ＰＥＲＶ）が減少した１つ又は複数の細胞を提供する。いくつかの実施形態において、核ドナー細胞は、細胞内に存在する無傷のウイルス要素が不活性化されるように遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、細胞は、無傷のウイルス要素のコピーを６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、２５未満、２０未満、１５未満、１０未満、５未満、３未満、２未満、１つ又は０有する。いくつかの実施形態において、ブタ細胞は、無傷のウイルス要素のコピーを１０個未満、５個未満、３個未満、２個未満、１個又はゼロ有する。いくつかの実施形態において、ブタ細胞は無傷のウイルス要素コピーをゼロ個有する。いくつかの実施形態において、細胞は、無傷のウイルス要素を、約６０コピー〜約１コピー、約５０コピー〜約１コピー、約４０コピー〜約１コピー、約３０コピー〜約１コピー、約２０コピー〜約５コピー、約１５コピー〜約１０コピー、又は約５コピーから約１コピー、有する。いくつかの実施形態において、前記細胞内の前記ウイルス要素の少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％は不活性である。いくつかの実施形態において、前記細胞内の前記ウイルス要素の約３０％〜１００％、約３５％〜１００％、約４０％〜１００％、約４５％〜１００％、約５０％〜１００％、約５５％〜１００％、約６０％〜１００％、約６５％〜１００％、約７０％〜１００％、約７５％〜１００％、約８０％〜１００％、約８５％〜１００％、約９０％〜１００％、約９５％〜１００％、約９６％〜１００％、約９７％〜１００％、約９８％〜１００％、又は約９９％〜１００％は不活性である。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本開示の細胞、組織、器官又は動物（例えばブタ）は、感染性ウイルスを欠く（又はその活性化株を欠くように操作されている）。いくつかの実施形態において、細胞は内因性レトロウイルスを欠いている。いくつかの実施形態において、本開示の細胞は、ヘルペスウイルス、ブタリンパ栄養性ヘルペスウイルス（ＰＬＨＶ）、ブタサイトメガロウイルス（ＰＣＭＶ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ブタサーコウイルス（ＰＣＶ）、Ｅ型肝炎ウイルス（ＨＥＶ）、狂犬病ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、パルボウイルス、ブタ水疱病ウイルス、ブタポリオウイルス、赤血球凝集性脳心筋炎ウイルス、ブタインフルエンザＡ型、アデノウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ネコ白血病ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、ネズミ白血病ウイルス、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ウマ伝染性貧血、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）など、のうちいずれか１つ以上を欠く（又はそれらの活性化株を欠くように操作されている）。いくつかの実施形態において、本開示の細胞、組織、器官又はブタは、ＰＥＲＶを欠いている（又はＰＥＲＶの活性化株を欠くように操作されている）。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本開示の細胞、組織、器官又は動物（例えばブタ）は、１つ又は複数の不活性化変異を含む。いくつかの実施形態において、細胞、組織、器官又は動物は、核酸配列（例えば、遺伝子又はレトロウイルス要素、例えばＰＥＲＶ要素など）の活性の低下又は排除をもたらす１つ又は複数の突然変異又は後成的変化を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸配列（例えば、ＰＥＲＶ要素）は、細胞、組織、器官又は動物に存在する核酸（複数可）を遺伝的に改変することにより不活性化される。いくつかの実施形態において、１つ以上の核酸配列（例えば、ＰＥＲＶ要素）の不活性化は、アッセイにより確認される。いくつかの実施形態において、アッセイは、感染性アッセイ、逆転写酵素ＰＣＲアッセイ、ＲＮＡ−ｓｅｑ、リアルタイムＰＣＲ、又はジャンクションＰＣＲマッピングアッセイである。
【００５６】
細胞、組織、器官又は動物は、当業者に知られているいずれの方法に従って遺伝的に改変することができる。いくつかの実施形態において、細胞内の核酸（複数可）は、細胞内の１つ又は複数の核酸配列（例えば、遺伝子又はレトロウイルス要素）が不活性化されるように遺伝子改変される。いくつかの実施形態において、核酸配列は、当技術分野で公知の及び／又は本明細書に開示される遺伝子改変システムのいずれかを使用して遺伝子改変される。いくつかの実施形態において、遺伝子改変システムは、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、及び／又はＣＲＩＳＰＲベースのシステムである。いくつかの実施形態において、遺伝子改変システムはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムである。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞内の１つ又は複数の核酸配列が不活性化されるように遺伝子改変され、そして、細胞（又は細胞からクローン化／誘導された組織又は臓器）がヒトに移植された場合、免疫応答を誘導するであろう１つ又は複数の遺伝子の発現が減少するように、細胞はさらに遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞内の１つ又は複数の核酸配列が不活性化されるように遺伝子改変され、そして、細胞（又は細胞からクローン化／誘導された組織又は臓器）がヒトに移植された場合、免疫応答を抑制するであろう１つ又は複数の遺伝子の発現を増加させるように、細胞はさらに遺伝子改変される。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞内の１つ又は複数の核酸配列が不活性化されるように遺伝子改変され、そして、細胞（又は細胞からクローン化／誘導された組織又は臓器）がヒトに移植された場合、細胞が免疫応答を誘導するであろう１つ又は複数の遺伝子の発現を低下させるように、細胞はさらに遺伝的に改変され、そして、細胞（又は細胞からクローン化／誘導された組織又は臓器）がヒトに移植された場合、細胞が免疫応答を抑制するでろう１つ又は複数の遺伝子の発現を増加させるように、細胞はさらに遺伝子改変される。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本開示は、遺伝的に改変された細胞からクローン化された胚盤胞又は胚を提供する。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された核酸（複数可）は、遺伝子改変された細胞から抽出され、異なる細胞にクローン化される。例えば、体細胞核移植では、遺伝子組み換え細胞からの遺伝子組み換え核酸が除核卵母細胞に導入される。いくつかの実施形態において、卵母細胞は、極体の近くの部分的な透明帯切開によって除核され、及び次いで、切開領域で細胞質を押し出すことができる。いくつかの実施形態において、卵母細胞は、細胞質のすべて又は実質的にすべてが無傷で得られる。いくつかの実施形態において、卵母細胞は、卵丘細胞の複数の層についてスクリーニングされる。いくつかの実施形態において、鋭利な傾斜先端を備えた注入ピペットを使用して、減数分裂２で停止した除核卵母細胞に遺伝子改変細胞を注入する。減数分裂−２で停止した卵母細胞は「卵」と呼ばれることが多い。いくつかの実施形態において、卵母細胞の融合及び活性化により胚が生成される。そのような胚は、本明細書では「遺伝子改変胚」と呼ばれることがある。いくつかの実施形態において、遺伝子改変胚は、レシピエント雌ブタの卵管に移される。
【００５８】
遺伝的に改変された胚盤胞又は胚は、本明細書に開示されるいずれの実施形態に従って生成され得る。一実施形態において、ブタ胎児線維芽細胞を取得することができ、ネオントランスフェクション試薬を使用してトランスフェクトすることができる。ＦＡＣＳ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでソート及び拡張された所望の修飾を有する単一細胞、遺伝子型決定された細胞及び／又は陽性クローンについて検証されたＰＣＲを介したノックアウト遺伝子の選択及び／又はノックイン遺伝子の抗体結合選択に対抗するために使用できる。その後、細胞輸送と体細胞クローン、又はそれらのいずれの組み合わせが続く。いくつかの実施形態において、遺伝子改変は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞の代わりにマイクロインジェクションを使用して接合体で行われる。接合体への直接注射は、細胞へのストレスが少ないと考えられる。接合体の改変が行われると、胚が移植されてモザイク動物が得られ、ＳＣＮＴクローニングに使用されるモザイク胎児から細胞が分離される。
【００５９】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるいずれの実施形態に従って生成される細胞、胚盤胞、胚などは、品質管理について試験される。品質管理の非限定的な例には、遺伝子ターゲティング効率を検出するＭｉｓｅｑ及びＳａｎｇｅｒシーケンス、オフターゲットを検出するＥｘｏｍｅシーケンス及び／又は全ゲノムシーケンス、染色体異常を検出する核型分析、ターゲット遺伝子発現を検出するＲＴ−ｑＰＣＲ、遺伝子発現パターン全体の正常性を検出するＲＮＡｓｅｑ、ノックアウト遺伝子の抗体結合カウンター選択（例えば、ビーズ濃縮による）、ノックイン遺伝子に対する特異的遺伝子抗体結合選択（例えば、フローサイトメトリーによるソーティング）；特定の遺伝子抗体結合、ヒト血清抗体結合、補体細胞傷害性、又は標的遺伝子の生理学的機能を検出するナチュラルキラー（ＮＫ）細胞アッセイ、遺伝子編集が胚発生に影響するかどうかを確認するための胚盤胞発生率、及びそれらの組み合わせ、のうちいずれかを包含する。
【００６０】
ＩＶ．  サロゲート及び／又は体細胞核移植
いくつかの実施形態において、遺伝的に改変された胚盤胞又は胚は、サロゲート（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ）、例えば前記サロゲートの卵管、に移される。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された胚盤胞又は胚は、活性化の約２０〜２４時間後にサロゲートの卵管に移される。いくつかの実施形態において、１つより多い胚盤胞又は胚がサロゲートに移される。いくつかの実施形態において、約１から約６００の間、約５０から約５００の間、約１００から約４００の間、又は約２００から約３００の間の胚盤胞又は胚が移入される。いくつかの実施形態において、移植の前に、例えば、卵割及び胚盤胞比を確認するなど、胚の品質管理を確認する。いくつかの実施形態において、サンプル細胞に由来する胚又は胚盤胞は、複数のサロゲート、例えば約５〜２０サロゲート／細胞株に移される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの野生型胚盤胞又は胚は、遺伝的に修飾された胚盤胞又は胚と同時に、又は実質的に同時にサロゲートに移される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの野生型胚盤胞又は胚は、遺伝子改変された胚盤胞又は胚がサロゲートに移される前又は後にサロゲートに移される。いくつかの実施形態において、サロゲートは、遺伝的に改変された胚盤胞又は胚の移植の約２０〜２１日後に妊娠がチェックされる。
【００６１】
いくつかの実施形態において、胚盤胞又は胚を移植する前に、特定の特性についてサロゲートをスクリーニングする。サロゲート特性の非限定的な例は、生理学的段階、年齢、受胎能、母性行動、授乳能力及び飼育能力、流産頻度、疾患、又はそれらのいずれの組み合わせを包含する。いくつかの実施形態において、サロゲートは、以前の同腹子数(litter  size)、適切な年齢、複数の出生歴を有する、及び／又は適切な生理学的段階を持つかについて選択される。いくつかの実施形態において、胚盤胞又は胚移植は春又は秋に行われる。いくつかの実施形態において、胚盤胞又は胚移植は夏及び／又は冬には行われない。
【００６２】
いくつかの実施形態において、大きなサロゲートは選択である。より大きなサロゲートは、より小さなサロゲートと比較して、出産率、同腹仔数、生存率、及び雌豚あたりの期待されるブタ数を包含する結果測定のいずれか１つ、又はそれらの組み合わせによって測定されるブタの生産を改善できると考えられる。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＳＣＮＴの第１ラウンドは、胎児を生成するためにサロゲートに移される胚を生成するために実行され、その後、細胞は胎児から単離される。単離された細胞は、ＳＣＮＴの第２ラウンドに使用され、遺伝子組み換え動物を生成するためにサロゲートに移される。いくつかの実施形態において、ＳＣＮＴの第２ラウンドで使用される胎児は、妊娠約１０日、約２０日、約３０日、約４０日、約５０日、約６０日、約７０日、約８０日、約９０日、約１００日、又は約１００日に屠殺される。いくつかの実施形態において、ＳＣＮＴの第２ラウンドで使用される胎児は、妊娠約５０日未満、約４０日未満、約３０日未満、約２０日未満、又は約１０日未満である。
【００６４】
いくつかの実施形態において、遺伝的に改変された胚盤胞又は胚は、出生後の遺伝的に改変された動物（例えば、ブタ）に成長する。いくつかの実施形態において、出生後の遺伝子改変動物は、新生児の遺伝子改変動物である。いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、幼若な遺伝子改変動物である。いくつかの実施形態において、遺伝子組み換え動物は、成体の遺伝子改変動物（例えば、５〜６ヶ月より古い）である。いくつかの実施形態において、遺伝子組み換え動物は、雌の遺伝子組み換え動物である。いくつかの実施形態において、動物は雄の遺伝子改変動物である。いくつかの実施形態において、遺伝子組み換え動物は非遺伝子組み換え動物と交配される。いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、別の遺伝子改変動物と交配される。いくつかの実施形態において、遺伝的に改変された動物は、活性レトロウイルス（例えば、ＰＥＲＶなど）が減少しているか又はまったくない別の遺伝子組み換え動物と交配される。いくつかの実施形態において、遺伝的に改変された動物は、ヒトに移植された場合、第２の遺伝子組み換え動物の細胞、組織又は臓器が免疫応答を誘発する可能性が低くなるように、遺伝子組み換えされた第２の遺伝子組み換え動物と交配される。
【００６５】
Ｖ．  遺伝子組み換え動物
本開示は、
胚盤胞又は胚を生成するために、遺伝子改変された核ドナー細胞由来の核を使用すること、及び
少なくとも１つの生存可能な子孫を生成するため、前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること、
を含む、遺伝的に改変された胚盤胞又は胚の体細胞核移植（ＳＣＮＴ）による妊娠損失又は流産のリスクを予防又は軽減する方法をも提供する。ここで、妊娠損失又は流産の割合は、コントロールの妊娠損失又は流産の割合と比較して減少している。
【００６６】
いくつかの実施形態において、妊娠喪失又は流産の割合は、コントロールの遺伝的に改変された胚盤胞又は胚の妊娠喪失又は流産の割合と比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又はそれ以上減少する。
【００６７】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、妊娠後少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも５年、少なくとも１０年にわたって同じ又は同様のレベルの遺伝子改変を維持する。
【００６８】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変動物は、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも７ヶ月、少なくとも８か月、少なくとも９か月、少なくとも１０か月、少なくとも１１か月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも３年、少なくとも４年、少なくとも５年、少なくとも６年、少なくとも７年、少なくとも８年、少なくとも９年、少なくとも１０年、又はそれ以上生存している。
【００６９】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変ブタはＰＥＲＶ不活化遺伝子改変ブタであり、且つ、妊娠後少なくとも１か月、少なくとも６か月、少なくとも１年、少なくとも５年、少なくとも１０年の間、同じ又は同様のレベルのＰＥＲＶ不活性化を維持する。いくつかの実施形態において、遺伝的に改変されたブタは、非ＰＥＲＶ不活化サロゲートからの出産(delivery)後、又は他の非ＰＥＲＶ不活化ブタと共に施設／空間にいた後でも、ＰＥＲＶ不活化遺伝子改変ブタのままである。
【００７０】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の出生後の遺伝子改変動物（例えば、ブタ）のいずれかから得られた細胞、組織又は器官を提供する。いくつかの実施形態において、細胞、組織又は器官は、肝臓、肺、心臓、脳、膵臓、筋肉、血液、骨、精巣及び卵巣からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、臓器は肝臓、肺や心臓である。いくつかの実施形態において、出生後の遺伝子改変動物由来の細胞は、膵島、肺上皮細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、肝細胞、非実質肝細胞、胆嚢上皮細胞、胆嚢内皮細胞、胆管上皮細胞、胆管内皮細胞、肝血管上皮細胞、肝血管内皮細胞、類洞細胞、脈絡叢細胞、線維芽細胞、セルトリ細胞、神経細胞、幹細胞、及び副腎クロム親和性細胞、からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、遺伝子改変された器官、組織又は細胞は、それらの自然環境から分離されている（すなわち、それらが成長している動物から分離されている）。いくつかの実施形態において、自然環境からの分離とは、自然環境からの物理的な分離、例えば、遺伝子組み換えドナー動物からの除去、及び遺伝子組み換え臓器、組織、又は細胞と直接接触している隣接細胞との関係の変化、を意味する（例えば、解離による）。
【００７１】
ＩＩＩ．  ＰＥＲＶ減少又はＰＥＲＶを含まないブタ細胞の生成方法
本開示は、本明細書に開示されるＰＥＲＶが低減されたＰＥＲＶを含まないブタ細胞のいずれかを生成する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、ＰＥＲＶ複製及び／又はアセンブリに関与する遺伝子に特異的なゲノム改変剤を前記細胞に投与することを含む、本明細書に開示されるブタ細胞のいずれかにおけるＰＥＲＶ要素を不活性化する方法を提供し、ここで、前記作用物質(agent)は前記遺伝子の転写及び/又は翻訳を破壊する。いくつかの実施形態において、前記作用物質は前記遺伝子の開始コドンを標的とし、前記遺伝子の転写を阻害する。いくつかの実施形態において、前記作用剤は前記遺伝子のエキソンを標的とし、前記作用剤は前記遺伝子においてフレームシフト変異を誘発する。いくつかの実施形態において、前記作用物質は、前記遺伝子に不活性化変異を導入する。いくつかの実施形態において、前記作用剤は前記遺伝子の転写を抑制する。
【００７２】
当業者は、細胞がＰＥＲＶを含まないかどうかを判定するための多数のアッセイを知っている。１つの方法は、ＰＥＲＶが減少した又はＰＥＲＶを含まないと考えられる遺伝子改変細胞にヒト細胞を曝露し、前記ヒト細胞のＰＥＲＶ感染をモニタリングすること、すなわち感染性アッセイ、である。例えば、実施例１及び２を参照。遺伝子組み換え細胞のＰＥＲＶ活性をモニタリングする他の方法は、例えばＲＮＡｓｅｑ、逆転写酵素ＰＣＲ、マイクロアレイ、及び／又はＰＥＲＶ関連遺伝子（例えばｇａｇ、ｐｏｌ及び／又はｅｎｖ）の発現及び／又は染色体の完全性をモニタリングするジャンクションＰＣＲ反応、を包含する。
【００７３】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される前記作用剤のいずれかはポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のヌクレアーゼ及び／又はニッカーゼ及び／又はＲＮＡ又はＤＮＡ分子のうち１つ又は複数をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチド剤は、１つ以上のＰＥＲＶブタ細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１つ以上の細胞によりポリヌクレオチドが一時的に発現されるような方法で、１つ以上のＰＥＲＶブタ細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、１つ以上の細胞によってポリヌクレオチドが安定的に発現されるように、１つ以上のＰＥＲＶブタ細胞に導入される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ブタ細胞ゲノムに安定して組み込まれるような方法で導入される。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは１つ又は複数のトランスポゾン要素とともに導入される。いくつかの実施形態において、トランスポゾン要素は、トランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、トランスポゾン要素は、ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポザーゼをコードするポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態において、転位性要素は誘導性である。いくつかの実施形態において、転位要素はドキシサイクリン誘導性である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは選択可能マーカーをさらに含む。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーはピューロマイシン耐性マーカーである。いくつかの実施形態において、選択可能なマーカーは蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）である。
【００７４】
いくつかの実施形態において、作用物質は、細胞内のＰＥＲＶ  ＤＮＡを標的とするために使用されるヌクレアーゼ又はニッカーゼである。いくつかの実施形態において、作用物質は、ＰＥＲＶの発現を特異的に標的とし、抑制する。いくつかの実施形態において、作用物質は転写抑制因子ドメインを含む。いくつかの実施形態において、転写抑制因子ドメインはクリュッペル会合ボックス（ＫＲＡＢ）である。
【００７５】
いくつかの実施形態において、作用物質はいずれのプログラム可能なヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、作用物質は天然のホーミングメガヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、作用物質は、ＴＡＬＥＮベースの作用物質、ＺＦＮベースの作用物質、もしくはＣＲＩＳＰＲベースの作用物質、又はそれらの、いずれの生物学的に活性な断片、融合体、誘導体もしくは組み合わせである。いくつかの実施形態において、作用物質はデアミナーゼ又はデアミナーゼをコードする核酸である。いくつかの実施形態において、細胞は、ＴＡＬＥＮベースの作用物質、ＺＦＮベースの作用物質、及び／又はＣＲＩＳＰＲベースの作用物質を安定に及び／又は一時的に発現するように設計される。
【００７６】
Ａ．  ＴＡＬＥＮベースの作用物質
いくつかの実施形態において、作用物質(agent)はＴＡＬＥＮベースの作用物質である。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮベースの作用物質は、１つ以上のＴＡＬＥＮポリペプチド／タンパク質又はその生物学的に活性なフラグメントもしくは誘導体、又は１つ以上のＴＡＬＥＮポリペプチドもしくはそのフラグメントもしくは誘導体をコードする１つ以上の核酸である。転写アクチベーター様（ＴＡＬ）エフェクター配列は、反復可変２残基（ｒｅａｐｅａｔ  ｖａｒｉａｂｌｅ−ｄｉｒｅｓｉｄｕｅｓ)（ＲＶＤ）の配列を組み立てることにより、特異的にＤＮＡ標的に結合するように組み立てることができる。ＴＡＬエフェクターとヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の融合タンパク質は、細胞に特定の遺伝的改変を行うために使用できる細胞ＤＮＡの標的二本鎖切断を行うことができる。いくつかの実施形態において、作用物質は、ＰＥＲＶ細胞内の１つ以上のＰＥＲＶ  ＤＮＡ配列を標的とするＴＡＬＥＮポリペプチド／タンパク質又はそのフラグメント又は誘導体である。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮの反復可変２残基（ＲＶＤ）部分は、ＰＥＲＶ細胞内の１つ以上のＰＥＲＶ  ＤＮＡ配列を標的とするように設計されている。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮベースの作用物質は、１つ以上のＴＡＬＥＮタンパク質をコードする核酸である。いくつかの実施形態において、核酸はプラスミド内にある。いくつかの実施形態において、核酸はｍＲＮＡである。
【００７７】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮタンパク質は細胞内で発現され、１つ又は複数のＰＥＲＶ遺伝子において部位特異的二本鎖ＤＮＡ切断を誘導する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮタンパク質はドナー配列を導入し、ここで、前記ドナー配列は部分的又は完全にＰＥＲＶ遺伝子を置換し、それによりＰＥＲＶ遺伝子をサイレンシング又は不活性化する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮは左ＴＡＬＥＮであり、且つ、左ＴＡＬＥＮと協同してＰＥＲＶ遺伝子の二本鎖を切断する右ＴＡＬＥＮをさらに含む。別の実施形態において、ＴＡＬＥＮ及び／又は核酸供ドナー配列をコードする核酸は、ベクター又はプラスミドの一部である。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮはスペーサーを包含する（例えば、スペーサー配列は長さが１２〜３０ヌクレオチドである）。
【００７８】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮタンパク質は、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン及び／又は修飾ＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインは、ＰＥＲＶ遺伝子内の領域に結合する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮは、Ｎ末端からＣ末端まで、：
（ｉ）長さが約５０から約２００アミノ酸の第１のセグメント；
（ｉｉ）ＰＥＲＶヌクレオチド配列への配列特異的結合を提供するＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメイン；
（ｉｉｉ）約２０〜１００アミノ酸長の第２セグメント；
（ｉｖ）修飾ＦｏｋＩヌクレアーゼ触媒ドメイン；
を含む。
【００７９】
特定の核酸に結合するようにＴＡＬＥＮを操作する方法は、Ｃｅｒｍａｋ，  ｅｔ  ａｌ，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １−１  １  （２０１１）に記載されている。米国公開出願第２０１１／０１４５９４０号は、ＴＡＬエフェクター及びそれらを使用してＤＮＡを修飾する方法を開示している。Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：  １４３  （２０１１）は、ＴＡＬ切断変異体をＦｏｋ  Ｉヌクレアーゼの触媒ドメインにリンクすることによる、部位特異的ヌクレアーゼアーキテクチャ用のＴＡＬＥＮの生成について説明している。ＴＡＬＥＮ結合ドメインの一般的な設計原則は、例えば、ＷＯ２０１１／０７２２４６に記載されている。これらの文書の各々は、その全体が本書に組み込まれる。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮベースの作用物質はＰＥＲＶのヌクレオチド配列を標的とする。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮベースの作用物質は、ＰＥＲＶの１より多い株にわたって保存されているヌクレオチド配列を標的とする。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮベースの作用物質は、ＰＥＲＶｐｏｌ、ｅｎｖ、及び／又はｇａｇ遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮベースの作用物質はＰＥＲＶｐｏｌ遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮベースの作用物質は、ＰＥＲＶｐｏｌ遺伝子の触媒コアをコードする配列を標的とする。
【００８１】
Ｂ．  ＺＦＮベースの作用物質
いくつかの実施形態において、作用物質はジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）ベースの作用物質である。いくつかの実施形態において、ＺＦＮベースの作用物質は、１つ以上のＺＦＮポリペプチド又はその生物学的に活性なフラグメントもしくは誘導体、又は１つ以上のＺＦＮポリペプチドもしくはそのフラグメントもしくは誘導体をコードする１つ以上の核酸である。ＺＦＮは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼに融合することにより生成される人工的な制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、特定の所望のＤＮＡ配列を標的とするように設計でき、且つ、これによりジンクフィンガーヌクレアーゼは複雑なゲノム内のユニークな配列を標的とすることができる。個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、通常３〜６個の個々のジンクフィンガーリピートを含有し、それぞれ９〜１８塩基対（ｂｐ）を認識できる。ジンクフィンガードメインが３塩基対のＤＮＡ配列を完全に認識して３フィンガーアレイを生成する場合、そのアレイは９塩基対の標的部位を認識することができる。いくつかの実施形態において、６本以上の個々の亜鉛フィンガーを備えた亜鉛フィンガーアレイを生成するために、１フィンガー又は２フィンガーモジュールが利用される。個々のジンクフィンガーの特異性は重複する可能性があり、且つ周囲のジンクフィンガーとＤＮＡのコンテキストに依存する可能性があるため、ＺＦＮは特定のＰＥＲＶをターゲットにするのに役立たない場合がある。
【００８２】
所望の配列を標的とすることができるジンクフィンガーアレイを生成するために、多くの選択方法が開発されてきた。いくつかの実施形態において、初期選択の努力はファージディスプレイを利用して、部分的にランダム化されたジンクフィンガーアレイの大きなプールから所与のＤＮＡ標的に結合するタンパク質を選択する。いくつかの実施形態において、酵母ワンハイブリッドシステム、細菌ワンハイブリッド及びツーハイブリッドシステム（例えば、「ＯＰＥＮ」システム）、及び哺乳動物細胞を使用して、所与のＤＮＡに結合するタンパク質を選択することができる。特に、ＯＰＥＮシステムは、所与のトリプレットを結合するために選択された個々のジンクフィンガーの事前に選択されたプールを組み合わせ、次いで、２回目の選択を使用して、目的の９ｂｐシーケンスを結合できる３フィンガーアレイを取得する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、ＰＥＲＶ遺伝子配列を編集するプロセスは、ゲノム中のＰＥＲＶ配列を認識し、且つＰＥＲＶ遺伝子配列中の部位を切断することができるジンクフィンガーヌクレアーゼをコードする少なくとも１つの核酸を細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、プロセスは、切断部位のいずれかの側と実質的な配列同一性を共有する上流配列及び下流配列に隣接する組み込み配列を含む少なくとも１つのドナーポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、プロセスは、切断部位でゲノムＰＥＲＶ配列の一部と実質的に同一であり、且つ少なくとも１つのヌクレオチド変化をさらに含む配列を含む少なくとも１つの交換ポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼがゲノムＰＥＲＶ配列に二本鎖切断を導入するように、細胞を培養してジンクフィンガーヌクレアーゼの発現を可能にする。いくつかの実施形態において、二本鎖切断は、非相同末端結合修復プロセスにより修復され、それにより、サイレンシング又は不活性化変異が染色体配列に導入される。いくつかの実施形態において、二本鎖切断は相同性指向修復プロセスにより修復され、それにより、ドナーポリヌクレオチドの配列がゲノムＰＥＲＶ配列に組み込まれるか、又は交換ポリヌクレオチドの配列が染色体配列の一部と交換される。
【００８４】
いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼはＰＥＲＶのヌクレオチド配列を標的とする。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＰＥＲＶの１つより多い株にわたって保存されているヌクレオチド配列を標的とする。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＰＥＲＶ  ｐｏｌ、ｅｎｖ、及び／又はｇａｇ遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼはＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態において、ジンクフィンガーヌクレアーゼは、ＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子の触媒コアをコードする配列を標的とする。
【００８５】
Ｃ．  ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質
いくつかの実施形態において、作用物質はＣＲＩＳＰＲベースの作用物質である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づく作用物質は、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質は、ＣＲＩＳＰＲ会合（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現に関与するか、又はその活性を指示する１つ以上のポリヌクレオチドであり、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性部分ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（「内在性ＣＲＩＳＰＲシステムのコンテキストで「直接反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡで処理された部分的直接反復を含包含する」、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムのコンテキストでは「スペーサー」とも呼ばれる）、及び／又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列及び転写物、を包含するがこれらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲタンパク質及び１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、１つ以上のｇＲＮＡは、ＰＥＲＶポリヌクレオチド配列と同族であり、且つプロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）に結合することができる配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰＡＭは配列ＮＧＧ又はＮＮＧＲＲＴを包含する。
【００８６】
いくつかの実施形態において、作用物質は、ＰＥＲＶ細胞中の１つ又は複数のＰＥＲＶ  ＤＮＡ配列を標的とするＣＲＩＳＰＲベースのポリペプチド又はその断片もしくは誘導体である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づく作用物質は、ＰＥＲＶ  ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する要素によって特徴付けられる。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲに基づく作用物質は、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又はその生物学的に活性な断片もしくは誘導体、又は１つ以上のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド又はその断片もしくは誘導体をコードする１つ以上の核酸である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又はその誘導体は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｉ型システムに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又はその誘導体は、ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ型システムに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又はその誘導体は、ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩＩ型システムに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又はその誘導体は、ＣＲＩＳＰＲ  ＩＶ型システムに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又はその誘導体は、ＣＲＩＳＰＲ  Ｖ型システムに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又はその誘導体は、ＣＲＩＳＰＲ  ＶＩ型システムに由来する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又はその誘導体は、ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩＡ型、ＩＩＢ型又はＩＩＣ型システムからのものである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又はその誘導体は、ＣＲＩＳＰＲ  ＩＩＣ型システムに由来する。いくつかの実施形態において、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼはＣａｓ９又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ又はその誘導体は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えばＣｐｆ１、又はその誘導体である。いくつかの実施形態において、部位特異的修飾ポリペプチドは、タイプＩＩＩ−Ｂ  Ｃｍｒ複合体、例えば、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ、Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ、又はＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するタイプＩＩＩ−Ｂ  Ｃｍｒ複合体、である。例えば、Ｈａｌｅ，  Ｃ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ２０１４，  ２８：２４３２−２４４３，及びＭａｋａｒｏｖａ  Ｋ．Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  ２０１５，  １３，  １−１５を参照。
【００８７】
特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質は、ＩＩ型ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを利用する。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質は、ＩＩ型ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及び追加のポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、追加のポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ（「ｔｒａｃｒメイトＲＮＡ」とも呼ばれる）及び／又は合成単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）である。例えば、Ｊｉｎｅｋ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３３７，  ８１６−８２１を参照。
【００８８】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質は、二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠くＣａｓタンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＤＮＡの一本鎖のみを切断することができる、すなわち、Ｃａｓタンパク質は「ニッカーゼ」である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質はＤＮＡのどちらの鎖も切断できない。いくつかの実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ニッカーゼであるように、又はＤＮＡのいずれかの鎖を切断する能力を欠くように変異されたＣａｓ９タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質はＤ１０Ａ及び／又はＨ８４０Ａ突然変異を有する。いくつかの実施形態において、作用物質は、Ｄ１０Ａ及び／又はＨ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。例えば、Ｃｏｎｇ  Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３３９，  ８１９−  ８２３；  Ｊｉｎｅｋ，  Ｍ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３３７，  ８１６−８２１；  Ｇａｓｉｕｎａｓ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ  Ｓ  Ａ，  １０９，  Ｅ２５７９−２５８６；及びＭａｌｉ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３３９，  ８２３−８２６；を参照。これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８９】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質はｇＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡはＰＥＲＶのヌクレオチド配列を標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、ＰＥＲＶの１つより多い株にわたって保存されているヌクレオチド配列を標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡはＰＥＲＶ  ｐｏｌ、ｅｎｖ、及び／又はｇａｇ遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡはＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子を標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡはＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子の触媒コアをコードする配列を標的とする。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡはＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子の非触媒コア領域を標的とする。いくつかの実施形態において、ＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子の非触媒コア領域は、ＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子の触媒コア領域の上流にある。
【００９０】
いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１〜３又は２６〜１１６のうちいずれか１つのヌクレオチド配列、その断片、又はその株特異的な遺伝的変異体を含む。特定の実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１〜３のうちいずれか１つのヌクレオチド配列、断片、又はその株特異的な遺伝的変異体を含む。いくつかの実施形態において、ｇＲＮＡは、配列番号１〜３もしくは２６〜１８１断片（例えば、プロトスペーサー）のうちいずれか１つのヌクレオチド配列、組み合わせ、又はそのいずれの株特異的な遺伝的変異体を含む。ゲノム上のガイドＲＮＡ切断部位が２０ｂｐプロトスペーサーから構成され、典型的にはその後に３ｐｂＰＡＭ配列（ＮＧＧ、ここで、Ｎは任意のヌクレオチドであり得る）が続くこと、及び２０ｂｐプロトスペーサーがＣａｓ９とペアリングしてゲノム切断を行うガイドＲＮＡとして使用されることは、当業者によりよく理解されるだろう。プロトスペーサーの最初の１〜３ｂｐのトランケーション（例えば、トランケートされたｇＲＮＡ（「ｔｒｕ−ｇＲＮＡ」））が同様の切断効果を達成できることも確立されている。例えば、Ｆｕ  Ｙ．，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２（３），  ２７９−２８４を参照。ｔｒｕ−ｇＲＮＡの場合、ｇＲＮＡの最後の１７〜１９ｂｐが同一で、最初の１〜３ｂｐがトランケートされている場合、ゲノム標的配列は同一と見なされる。いくつかの実施形態において、作用物質は少なくとも３つのガイドＲＮＡを含み、ここで３つのガイドＲＮＡ配列は配列番号１〜３のヌクレオチド配列を含む。他の実施形態において、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、配列番号３５、３６、４８、９９、１０１、１０２、１０６、１０８、１１１、１１３のうちいずれか１つのヌクレオチド配列、フラグメント（例えば、プロトスペーサー）、いずれの株特異的遺伝的変異体又はそのいずれの組み合わせ、を含む。
【００９１】
作用物質は、少なくとも２つのガイドＲＮＡ、少なくとも３つのガイドＲＮＡ、少なくとも４つのガイドＲＮＡ、少なくとも５つのガイドＲＮＡ、少なくとも６つのガイドＲＮＡ、少なくとも７つのガイドＲＮＡ、少なくとも８つのガイドＲＮＡ、少なくとも９個のガイドＲＮＡ、少なくとも１０個のガイドＲＮＡ、少なくとも１１個のガイドＲＮＡ、少なくとも１２個のガイドＲＮＡ、少なくとも１３個のガイドＲＮＡ、少なくとも１４個のガイドＲＮＡ、少なくとも１５個のガイドＲＮＡ、少なくとも６０個のガイドＲＮＡ、少なくとも１７個のガイドＲＮＡ、少なくとも１８個のガイドＲＮＡ、少なくとも１９個のガイドＲＮＡ、少なくとも約２０個のガイドＲＮＡ、少なくとも約３０個のガイドＲＮＡ、少なくとも約４０個のガイドＲＮＡ、少なくとも約５０個のガイドＲＮＡ、少なくとも約６０個のガイドＲＮＡ、少なくとも約７０個のガイドＲＮＡ、少なくとも約８０個のガイドＲＮＡ、少なくとも約９０個のガイドＲＮＡ、少なくとも約１００個のガイドＲＮＡ、又はそれ以上、を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、作用物質は少なくとも２つのガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのガイドＲＮＡを使用すると、細胞内のＰＥＲＶの、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％が不活性になる。いくつかの実施形態において、少なくとも２つのガイドＲＮＡを使用すると、細胞集団中の細胞の少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％は、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％不活性化されたＰＥＲＶである。ガイドＲＮＡの非限定的な組み合わせは、例えば、以下の表にリストされた組み合わせを包含する。
【表１】
2020517301.tif 000003
【００９３】
いくつかの実施形態において、作用物質は少なくとも３つのガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも３つのガイドＲＮＡを使用すると、細胞内のＰＥＲＶの、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％が不活性になる。いくつかの実施形態において、少なくとも３つのガイドＲＮＡを使用すると、細胞集団中の細胞の少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％は、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％不活性化されたＰＥＲＶである。ガイドＲＮＡの非限定的な組み合わせは、例えば、以下の表にリストされた組み合わせを包含する。
【表２】
2020517301.tif 000004
【００９４】
いくつかの実施形態において、作用物質は少なくとも４つのガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも４つのガイドＲＮＡを使用すると、細胞内のＰＥＲＶの、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％が不活性になる。いくつかの実施形態において、少なくとも４つのガイドＲＮＡを使用すると、細胞集団中の細胞の少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％は、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％不活性化されたＰＥＲＶである。ガイドＲＮＡの非限定的な組み合わせは、例えば、以下の表にリストされた組み合わせを包含する。
【表３】
2020517301.tif 000005
【００９５】
いくつかの実施形態において、作用物質は少なくとも５つのガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも５つのガイドＲＮＡを使用すると、細胞内のＰＥＲＶの、少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％が不活性になる。いくつかの実施形態において、少なくとも５つのガイドＲＮＡを使用すると、細胞集団中の細胞の少なくとも約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％は、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％又は１００％不活性化されたＰＥＲＶである。ガイドＲＮＡの非限定的な組み合わせは、例えば、以下の表にリストされた組み合わせを包含する。
【表４】
2020517301.tif 000006
【００９６】
いくつかの実施形態において、ＰＥＲＶ  ＫＯにおける少なくとも２つのガイドＲＮＡ（例えば２〜１０のガイドＲＮＡ）を使用すると、ＰＥＲＶ  ｐｏｌ配列に欠失が生じる。いくつかの実施形態において、欠失は、１ｂｐよりも大きく、２ｂｐよりも大きく、３ｂｐよりも大きく、４ｂｐよりも大きく、５ｂｐよりも大きく、６ｂｐよりも大きく、７ｂｐよりも大きく、８ｂｐよりも大きく、９ｂｐよりも大きく、約１０ｂｐよりも大きく、約１５ｂｐよりも大きく、約２０ｂｐよりも大きく、約２５ｂｐよりも大きく、約３０ｂｐよりも大きく、約３５ｂｐよりも大きく、約４０ｂｐよりも大きく、約４５ｂｐよりも大きく、約５０ｂｐよりも大きく、約５５ｂｐよりも大きく、約６０ｂｐよりも大きく、約６５ｂｐよりも大きく、約７０ｂｐよりも大きく、約７５ｂｐよりも大きく、約８０ｂｐよりも大きく、約８５ｂｐよりも大きく、約９０ｂｐよりも大きく、約９５ｂｐよりも大きく、約１００ｂｐよりも大きく、約１２５ｂｐよりも大きく、約１３０ｂｐよりも大きく、約１３５ｂｐよりも大きく、約１４０ｂｐよりも大きく、約１４５ｂｐよりも大きく、約１５０ｂｐよりも大きく、約２００ｂｐよりも大きい。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質の１つの又は複数の要素は、内因性のＣＲＩＳＰＲシステムを含む特定の生物、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ，  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ，  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ，  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ又はＴｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ、に由来する。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質は、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲベースのポリペプチド／タンパク質及びＣＲＩＳＰＲベースのポリヌクレオチドのうちいずれかの組み合わせである。例えば、いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質は、Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質は、ＣＡＳエンドヌクレアーゼ、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びＴＲＡＣＲ−ｍａｔｅ配列を含む。いくつかの実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列は、同じ分子内にあるように設計されている。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質は、前述のいずれかをコードする１つ以上のポリヌクレオチドである。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムＲＮＡなどのキメラＲＮＡである。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓシステムのＲＮＡ配列又は、システム又は複合体の機能的発現を減少又は排除するため、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の成分の発現のための核酸分子にハイブリダイズすることができる少なくとも１つの第２のガイド配列を有する。これにより、システム又は複合体は自己不活性化することができる。そして、第２のガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現のために核酸分子にハイブリダイズすることができ得る。
【０１００】
いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲベースの作用物質のいずれかを使用する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に開示されるＣＲＩＳＰＲベースの作用物質のいずれかを利用することにより、ＰＥＲＶポリヌクレオチド配列を改変するための効果的な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、様々な組織及び器官からの異なるタイプの細胞におけるＰＥＲＶポリヌクレオチド配列の改変すること（例えば、削除、不活性化）を包含する、多種多様な有用性を有する。そのようなものとして、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、そのようなものとして、例えば遺伝子又はゲノム編集において広範な用途を有する。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、本開示は、
それぞれ少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲタンパク質及び１つ又は複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする１つ又は複数のベクターの量を提供すること、及び
１つ又は複数のベクターを哺乳動物に投与すること、
を含む、ゲノム編集のｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提供する。
ここで、１つ又は複数のベクターのｉｎ  ｖｉｖｏ発現は、ＣＲＩＳＰＲタンパク質のｇＲＮＡと同種のＰＥＲＶ遺伝子座への結合、及び哺乳動物の細胞集団におけるｉｎ  ｖｉｖｏでの二本鎖切断（ＤＳＢ）の生成を包含し、
ここで、ＤＳＢのｉｎ  ｖｉｖｏ相同組換え（ＨＲ）は、哺乳動物の細胞集団のゲノムの編集をもたらす。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲタンパク質はｃａｓ９であり、そして、１つ以上のｇＲＮＡは、プロトスペーサー隣接モチーフ（「ＰＡＭ」）に結合することができる配列を含む。いくつかの実施形態において、ＨＲは、ＰＥＲＶ遺伝子座で発現されるタンパク質のミスセンス又はナンセンスを導入する非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を包含する。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質は、ＰＥＲＶ発現を調節する部分をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲベースの作用物質は、転写抑制因子ドメインを含む融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、転写抑制因子ドメインはクリュッペル会合ボックス（ＫＲＡＢ）である。
【０１０３】
Ｄ．  遺伝子組み換え細胞の健康／生存の改善
いくつかの態様において、本明細書に記載の遺伝子改変ブタ細胞のいずれかの健康及び／又は生存は、遺伝子改変プロセスの結果として損なわれる（例えば、多重ＤＮＡ損傷効果）。これらの状況では、遺伝子組み換え細胞の健康及び／又は生存を改善する１つ又は複数の因子で遺伝子組み換え細胞（複数可）を処置することが有利な場合がある。
【０１０４】
いくつかの態様において、１つ又は複数の遺伝子改変細胞には、ｐ５３阻害剤と成長因子の両方が投与される。特定の実施形態において、遺伝的に改変された１つ又は複数の細胞に、ｂＦＧＦ及びピフィスリン−アルファの両方が投与される。
【０１０５】
ＩＶ．  治療方法
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される遺伝子改変ブタ細胞、組織又は臓器のいずれかを使用して、非ブタ対象を処置することができる。いくつかの実施形態において、本開示は、本明細書に記載の遺伝子改変細胞、組織又は器官のいずれかを、それを必要とする非ブタ対象に移植する方法を提供する。いくつかの実施形態において、非ブタ対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は非ヒト霊長類である。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法のいずれかにおいて使用するための遺伝子改変臓器は、遺伝子組み換えブタの、心臓、肺、脳、肝臓、大脳基底核、脳幹髄質、中脳、脳橋、小脳、大脳皮質、視床下部、目、下垂体、甲状腺、副甲状腺、食道、胸腺、副腎、虫垂、膀胱、胆嚢、小腸、大腸、小腸、腎臓、膵臓、脾臓、胃、皮膚、前立腺、精巣、卵巣、及び／又は子宮から選択することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法のいずれかで使用するための遺伝子改変組織は、遺伝子改変ブタの、軟骨（例えば、食道軟骨、膝の軟骨、耳の軟骨、鼻の軟骨）、平滑筋や心臓（心臓弁など）などの筋肉（これらに限定されない）、腱、靭帯、骨（例えば、骨髄）、角膜、中耳及び静脈、から選択することができる。いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法のいずれかで使用するための遺伝子改変細胞は、血球、皮膚卵胞、毛包、及び／又は幹細胞を包含する。臓器又は組織のいずれの部分（例えば、角膜などの目の部分）にも本発明の組成物を投与することができる。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、本開示は、臓器、組織又は細胞機能の損傷、欠損又は欠如をもたらす疾患、障害又は損傷を有する対象を治療することを提供する。いくつかの実施形態において、対象は、対象の１つ又は複数の細胞、組織又は臓器の損傷をもたらす傷害又は外傷を受けている（例えば、自動車事故）。いくつかの実施形態において、対象は火又は酸熱傷を受けている。いくつかの実施形態において、対象は、臓器、組織又は細胞機能の損傷、欠損又は欠如をもたらす疾患又は障害を有する。いくつかの実施形態において、対象は自己免疫疾患に罹患している。いくつかの実施形態において、疾患は、心臓疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）、拡張型心筋症、重度の冠動脈疾患、瘢痕化した心臓組織、心臓の先天異常、Ｉ型又はＩＩ型糖尿病、肝炎、嚢胞性線維症、肝硬変、腎不全、ループス、強皮症、ＩｇＡ腎症、多発性嚢胞腎疾患、心筋梗塞、肺気腫、慢性気管支炎、閉塞性細気管支炎、肺高血圧症、先天性横隔膜ヘルニア、先天性サーファクタントタンパク質Ｂ欠乏症、及び先天性嚢胞性肺気腫、原発性胆汁性胆管炎、硬化性胆管炎、胆道閉鎖症、アルコール依存症、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、及び／又はアルファ−１アンチトリプシン欠乏症、からなる群から選択される。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、本開示の遺伝子改変細胞、組織及び／又は臓器のいずれかは、遺伝子改変ドナーブタから分離され、且つ、非ブタ対象宿主に投与される。この文脈で使用される「投与すること」又は「投与」には、導入すること、適用すること、注入すること、移植すること(implanting)、移植すること(grafting)、縫合すること、及び移植すること(transplanting)が含まれるが、これらに限定されない。本開示によれば、遺伝的に改変された細胞、組織及び／又は臓器は、所望の部位で本発明の臓器、組織、細胞又は組成物の局在化をもたらす方法又は経路によって投与され得る。本発明の臓器、組織、細胞又は組成物は、細胞の少なくとも一部が生存可能なままである対象の所望の位置への細胞の送達をもたらすいずれの適切な経路によって対象に投与することができる。いくつかの実施形態において、細胞の、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％（別々に投与されるか、又は組織もしくは臓器の一部として投与されるか）は、対象への投与後も生存可能なままである。本発明の臓器、組織、細胞又は組成物を投与する方法は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態において、細胞、組織及び／又は臓器は宿主に移植される(transplanted)。いくつかの実施形態において、細胞、組織及び／又は臓器は宿主に注入される。いくつかの実施形態において、細胞、組織及び／又は臓器は、宿主の表面（例えば、骨又は皮膚）に移植される(grafted)。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細胞（複数可）、組織（複数可）又は臓器（複数可）を、遺伝子改変された細胞（複数可）、組織（複数可）又は臓器（複数可）が投与される宿主の免疫系から保護することが必要である。例えば、いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細胞（複数可）、組織（複数可）又は臓器（複数可）は、遺伝子改変された細胞（複数可）、組織（複数可）又は臓器（複数可）を宿主からの免疫応答から保護するために、マトリックス又はコーティング（例えば、ゼラチン）とともに投与される。いくつかの実施形態において、マトリックス又はコーティングは生分解性マトリックス又はコーティングである。いくつかの実施形態において、マトリックス又はコーティングは天然のものである。他の実施形態において、マトリックス又はコーティングは合成である。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、遺伝子改変された細胞（複数可）、組織（複数可）又は臓器（複数可）は、免疫抑制化合物とともに投与される。いくつかの実施形態において、免疫抑制化合物は、小分子、ペプチド、抗体、及び／又は核酸（例えば、アンチセンス又はｓｉＲＮＡ分子）である。いくつかの実施形態において、免疫抑制化合物は小分子である。いくつかの実施形態において、小分子は、ステロイド、ｍＴＯＲ阻害剤、カルシニューリン阻害剤、抗増殖剤又はＩＭＤＨ阻害剤である。いくつかの実施形態において、小分子は、コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、ブデソニド、プレドニゾロン）、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）、ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、シロリムス、エベロリムス）、ＩＭＤＨ阻害剤（アザチオプリン、レフルノミド、ミコフェノレーート）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、アントラサイクリン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ミトラマイシン）及びメトトレキサート、又はその塩もしくは誘導体からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、免疫抑制化合物は、ＣＴＬＡ４、抗ｂ７抗体、アバタセプト、アダリムマブ、アナキンラ、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、イキセキズマブ、ナタリズマブ、リツキシマブ、セキヌマブ、トシリズマブ、トシリズマブ、ウステキヌマブ、ベドリズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、及びムルモナブからなる群から選択されるポリペプチドである。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、対象に投与される遺伝子改変された細胞（複数可）、組織（複数可）、又は臓器（複数可）は、それらが対象において免疫応答を誘導する可能性が低いようにさらに遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、遺伝的に改変された細胞（複数可）、組織（複数可）、又は臓器（複数可）は、機能的免疫刺激分子を発現しないようにさらに遺伝的に改変されている。
【実施例】
【０１１２】
実施例
本開示は現在一般的に説明されている。以下の実施例を参照することにより、これらが本開示の特定の態様及び実施形態の例示の目的のためにのみ包含されること、及び本開示を限定することを意図しないもことが、より容易に理解されるであろう。例えば、本明細書で開示される特定の構築物及び実験設計は、適切な機能を検証するための例示的なツール及び方法を表す。したがって、開示された特定の構築物及び実験計画のいずれも、本開示の範囲内で置き換えることができることは容易に明らかであろう。
【０１１３】
実施例１．  ＰＥＲＶはヒト細胞において感染、複製、増殖する
臨床医は、ブタのドナー臓器又は組織に存在するＰＥＲＶがヒト宿主の細胞に感染する可能性があることを恐れていた。ＰＥＲＶが感染後にヒト細胞で活性を維持し、且つ増殖したかどうかを判断するために、ＰＥＲＶコピー数を、集団とＰＥＲＶ感染ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ細胞（ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ）のクローンの両方で４か月以上監視した。ＰＥＲＶコピー数は、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）によって決定されるように、時間とともに増加した（図１Ａ）。ＰＥＲＶには、ＰＥＲＶ−Ａ、ＰＥＲＶ−Ｂ、及びＰＥＲＶ−Ｃの３つの主要なサブタイプがある。サブタイプＡ及びＢは遍在し、且つブタからヒトに感染可能であることが報告されているのに対し、サブタイプＣは一部のブタ系統にのみ存在し、且つブタ間でのみ伝播することができる（Ｐａｔｉｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ７５，  ２７７１−５）。以前の報告と一致して、ＰＥＲＶ−Ａ及びＰＥＲＶ−Ｂが感染したヒト細胞で検出され（データは示さず）、それらがヒト指向性であることを確認した。ただし、ＰＥＲＶ−ＣはＰＫ１５又はｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ細胞のいずれでも検出されなかった（データは示さず）。ＰＥＲＶがヒトゲノムに組み込まれるか、感染したヒト細胞でエピソームのままであるかを判断するために、感染したクローンｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ細胞で接合部捕捉配列決定を実施した。新規ＰＥＲＶ接合部がヒトゲノムで検出された。これらＰＥＲＶ接合は遺伝子内領域で過剰出現している（２２の検出接合のうち１５）（図１Ｂ）。さらに、ＰＥＲＶ挿入部位は、ランダムに選択されたゲノム位置よりも著しく高い転写レベル、ＤＮａｓｅ感度、及びＨ３Ｋ２７アセチル化を有しており（図４Ｂ）、ＰＥＲＶが転写活性領域に組み込まれる傾向があることを示唆している。
【０１１４】
ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローンのＰＥＲＶのコピー数の増加が、細胞内ＰＥＲＶ複製によるものか、ヒト細胞間の細胞間ＰＥＲＶ伝達によるものかを判断するため、クローンｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ細胞をＷＴ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と２週間、共培養した。続いて、共培養したＷＴクローンのＰＥＲＶ要素をＰＣＲで評価した（図１Ｃ及び１Ｄ）。ＰＥＲＶ  ｐｏｌ、ｅｎｖ、及びｇａｇ遺伝子の存在は、ブタ細胞との接触歴のないＷＴ  ＨＥＫ２９３細胞で検出された。感染したＷＴ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の割合は１８％から９７％まで変化し、共培養における親ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローンの低ＰＥＲＶコピー数及び高ＰＥＲＶコピー数にそれぞれ対応する低割合及び高割合を持つ（図１Ｅ）。これらの結果は、感染したヒト細胞がＰＥＲＶを新鮮なヒト細胞集団に伝達できることを示す。したがって、異種移植のコンテキストでヒト宿主へのＰＥＲＶ伝播のリスクがあり、ＰＥＲＶを含まないブタを生産することによりこのリスクを排除する必要性を確認している。
【０１１５】
実施例２．  ＰＥＲＶを含まないブタの初代細胞
ＰＥＲＶを含まないブタの生成には、ＰＥＲＶ活性を欠く初代ブタ細胞の産生が含まれ、これはブタ胚を産生するために体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を介してクローン化することができる。ブタ胎児線維芽細胞株（ＦＦＦ３）を選択して、ＰＥＲＶを含まない初代ブタ細胞を作成するように改変した。まず、ＦＦＦ３ゲノムに存在するＰＥＲＶのマッピングと特性評価を行った。機能的ＰＥＲＶのコピー数は、逆転写酵素（ｐｏｌ）遺伝子のｄｄＰＣＲによって決定されたように、約２５と推定された（データは示さず）。推定されたＰＥＲＶコピー数は、ＰＥＲＶ−Ａ  ｅｎｖ遺伝子の１０コピー、ＰＥＲＶ−Ｂ  ｅｎｖ遺伝子の１４コピー、及びゲノムで同定されたＰＥＲＶ−Ｃ  ｅｎｖ遺伝子の０コピーの合計に近いものであった（データは示さず）。全ゲノムシーケンスを使用して、トランケートされたＰＥＲＶ−Ｂのコピーが１つ検出された。このトランケートされたＰＥＲＶ−Ｂは、以前はｄｄＰＣＲでは検出できなかった（データは示さず）。
【０１１６】
ＰａｃＢｉｏのロングリードゲノムシーケンス（Ｎ５０＝２，４３９ｂｐ）は、ＰＥＲＶ特異的ハイブリダイゼーションキャプチャ後に実行された。結果は、ＰＥＲＶの２１コピーをゲノムの非反復領域にマッピングした（図２Ａ）。２つの追加コピーが反復領域にマップされ、且つ２つは現在のブタゲノムアセンブリにマップできまなかった（１１％  ｇａｐｓ，  Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｂｕｉｌｄ  １０．２）（Ｇｒｏｅｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４９１：３９３−８）。これらのＰＥＲＶを不活性化の標的とするために、それぞれ配列番号１〜３の配列を有するＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子の触媒コアに特異的な３つのＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を設計した。ＦＲＩＳ細胞の集団をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９と３つのｇＲＮＡで１２日間処理した後、ＰＥＲＶ  ｐｏｌ遺伝子座の３７％が不活性化変異を獲得していた。興味深いことに、結果は単一細胞間のターゲティング効率のバイモーダル分布を示した。約３４％（２３のうち８）の単一細胞は高い編集効率を有し（＞９０％）、６０％（２３のうち１４）の単一細胞は低い編集効率を有した（＜２０％）。これはおそらく、反復配列ターゲティングの遺伝子変換の結果である（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ８０：３５０）。驚くべきことに、集団において高度に修飾された細胞が存在するにもかかわらず、上記の手順では、高効率の単一細胞ＦＦＦ３クローンは得られなかった（図２Ｂ）。
【０１１７】
ＦＦＦ３ゲノム中の複数の部位でのＣａｓ９による同時ＤＮＡ切断がＤＮＡ損傷によって誘発される老化又はアポトーシスを引き起こすことができるかどうかを判断するために、老化及び／又はアポトーシス経路の阻害を調べて、ＦＦＦ３集団のターゲティング効率を高めることができるかどうか、且つ高度に修飾されたクローンの生存率を高めることができるかどうかを判断した。遺伝子改変中にｐ５３阻害剤、ピフィスリンアルファ（ＰＦＴα）、及び成長因子ｂＦＧＦを含有するカクテルを適用すると、得られたＦＦＦ３集団の平均ターゲティング効率が大幅に向上した（図５Ａ（ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．００００２）、図５Ｂ）。さらに、ｐ５３及びＲｂ経路の両方の阻害剤であるＳＶ４０ラージＴ抗原を一時的に過剰発現させると、平均ターゲティング効率が向上した（図６Ａ、片側ウィルコクソン検定、ｐ＝０．０５）。それどころか、アポトーシス阻害剤であるＢｃｌ−２の過剰発現は、平均的なターゲティング効率を増加させなかった（図５Ｃ、ＡＮＯＶＡ、ｐ＝０．５６５）。ＰＦＴα及びｂＦＧＦカクテルは、効率が高く、細胞毒性が低く、制御が容易なために使用された。この最適化されたカクテルを使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９で処理された集団から１００％ＰＥＲＶ不活化ＦＦＦ３細胞が単離された（図２Ｃ、２Ｄ）。
【０１１８】
１００％ＰＥＲＶ不活化ＦＦＦ３クローンでＲＮＡ−ｓｅｑ（図７）を実施した。その結果、すべてのｐｏｌ転写物が変異していたことが確認された。さらに、ＰＥＲＶ  ｐｏｌのゲノムワイドな破壊の影響と、ＦＦＦ３からのＰＥＲＶのｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産におけるその役割を調べた。１００％ＰＥＲＶ−不活化ＦＦＦ３の細胞培養上清では、ＰＥＲＶの逆転写酵素（ＲＴ）活性は検出されなかった（図２Ｅ）。さらに、強力なＲＴ活性がＷＴ  ＦＦＦ３で観察され、改変細胞がＰＥＲＶ粒子をほとんど又はまったく生成しなかったことを示唆している。
【０１１９】
１００％ＰＥＲＶ不活性化細胞におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のオフターゲット効果を調べるために、核型分析を実施した。核型分析の結果は、正常な染色体構造を示した（データは示さず）。より高い解像度で染色体の完全性を調べるために、接合部ＰＣＲ反応を行って、ＰＥＲＶ−ＰＥＲＶ欠失で失われるであろう片側のすべてのＰＥＲＶゲノム接合部の完全性をチェックした。テストしたすべてのジャンクションは無傷のままであり、これはこれらの領域でＰＥＲＶ−ＰＥＲＶの欠失が検出されなかったことを示している。ジャンクションＰＣＲ反応で使用されるプライマーを図８に示す。したがって、１００％ＰＥＲＶで不活性化されたＦＦＦ３では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によって引き起こされるオフターゲット効果又はオンターゲットゲノム損傷の検出はなかった。
【０１２０】
実施例３．  ＰＥＲＶを含まない胚
ＰＥＲＶ活性が１００％根絶されたＦＦＦ３細胞が得られた後、ＳＣＮＴを使用してＰＥＲＶを含まない胚が作製された。手作りのブタのクローニング（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００７，  Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，  ６８：１１０４−１０）を使用して、５０−７８％の効率のブタ胚が成功裡にクローニングされた。これらの胚は培養で７日間成長し、そして胚盤胞段階に達した。正常な胚盤胞構造が観察された。さらに、７日目に内部細胞塊（ＳＯＸ２＋）の多能性が検証された（図３Ａ）。
【０１２１】
ＰＥＲＶを含まないＦＦＦ３細胞株を使用して、体細胞核移植を介してブタクローニングの追加のラウンドを実施し、代理母に移植した（移植胚２５０個）。胚移植後４９日目に、胎児は帝王切開によって１頭の繁殖用雌豚から採取された。４頭の生きた胎児が繁殖用雌豚から隔離された。ＰＥＲＶの不活性化レベルとＰＥＲＶのコピー数は、ｄｄＰＣＲによってチェックされた。結果は、ＰＥＲＶを含まない細胞株から産生された胎児にＰＥＲＶの再感染はないことを示した（図３Ｂ）。胎児は、元のＰＥＲＶを含まない細胞株と同じＰＥＲＶ不活性化効率（１００％、図３Ｂ）とＰＥＲＶコピー数（データは示さず）を示した。ＰＥＲＶを含まない胎児に由来する細胞株を使用して、ブタのクローニングの第２のラウンドが実施された。
【０１２２】
実施例４．  ＰＥＲＶを含まない子豚
【０１２３】
ＰＥＲＶ活性が１００％撲滅されたＦＦＦ３からのＳＣＮＴによって生成されたＰＥＲＶを含まない胚を代理母に移植した（２５０胚移植／繁殖用雌豚）。胎児ゲノムＤＮＡを使用して、ＰＥＲＶ不活化効率を測定した。元のＰＥＲＶを含まない細胞株と同様に、ＰＥＲＶ−ＫＯ胎児も〜１００％ＰＥＲＶ不活化効率を示した。これは、妊娠中にサロゲート繁殖用雌豚からの再感染が発生しなかったことを示唆している（図．１６Ａ及び１６Ｂ）。驚くべきことに、複数の遺伝子編集を行った場合でも、３か月、３週間、３日後に子豚は完全にＰＥＲＶなしで生まれた（図９及び１０）。１６頭のＰＥＲＶを含まない子豚が生産され、それらのうち３頭が帝王切開から生まれ、それらのうち１３頭が自然分娩から生まれ、且つ１３頭のうち２頭が自然分娩の難産で死亡した。すべての子豚と死んだ子豚のさまざまな組織からのｍＲＮＡからＤＮＡを単離し、帝王切開と自然分娩から生まれた子豚の両方についてＰＥＲＶの再感染をディープシーケンスで確認した。結果は、すべての子豚がゲノムＤＮＡとｍＲＮＡレベルの両方で１００％のＰＥＲＶ根絶を示したことを、示した。また、ＷＴを有する施設内に維持された子豚はいかなる再感染を示さなかった（図１７）。すべてのＰＥＲＶを含まないブタはＷＴ  ＦＦＦ３細胞と同様のＰＥＲＶコピー数（図１９）及び正常な核型（図２０）を示した。
【０１２４】
まとめると、このデータはブタ細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＥＲＶを初代ヒト細胞に伝達することを明確に確立している。この研究からの注目すべき観察は、ＰＥＲＶに感染したヒト細胞は、ブタ細胞との接触歴のない新鮮なヒト細胞にＰＥＲＶをロバストに通過させることであった。したがって、異種移植のヒト試験の前に、ＰＥＲＶ感染のリスクを排除する必要があるかもしれないと考えられている。これらの研究は、クローン化可能な一次ブタ線維芽細胞におけるＰＥＲＶ活性の完全な根絶を実証している。さらに、改変された線維芽細胞を用いたＰＥＲＶ不活化ブタ胚、胎児及び子豚の生産、及びサロゲート繁殖用雌豚による再感染の欠如も実証されている。ＰＥＲＶを含まないブタがあるアクティブな内在性レトロウイルスを欠いている最初の哺乳類であり、宿主に関連するこれらの要素の生物学的機能への洞察を与えることができた。最も重要なことは、ＰＥＲＶを含まないブタは、ブタからヒトへの異種移植のための臓器及び組織の安全な供給源として役立つ可能性があることである。移植のための臓器の深刻な不足は、臓器不全の医学的治療にとって重大な課題であるため、これは非常に重要で待望の生物医学的進歩であろう。
【０１２５】
方法
ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９  ｇＲＮＡ設計
ＲライブラリＤＥＣＩＰＨＥＲを使用して、配列番号１〜３のアミノ酸配列を有する特定のｇＲＮＡを設計した。
【０１２６】
細胞培養
ブタＰＫ１５及びヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）高グルコースで維持された。すべての細胞を３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで維持した。
【０１２７】
ブタ胎児線維芽細胞ＦＦＦ３は、１５％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び１％ＨＥＰＥＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を補充したピルビン酸ナトリウムを含むダルベッコ改良法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）高グルコースで維持された。全ての細胞は、３８℃、及び５％ＣＯ２、９０％Ｎ２、及び５％Ｏ２で加湿トライガス(tri−gas)インキュベーター中で維持した。
【０１２８】
ＰｉｇｇｙＢａｃ−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡｓの構築と細胞株の確立
Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ８０：３５０によって以前に記載された手順と同様に、Ｕ６−ｇＲＮＡ１−Ｕ６−ｇＲＮＡ２（Ｇｅｎｅｗｉｚ）をコードするＤＮＡフラグメントが合成され、そして以前に構築されたＰｉｇｇｙＢａｃ−ｃａｓ９プラスミドに組み込まれた。ＰｉｇｇｙＢａｃ−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡｓインテグレーションでＦＦＦ３細胞株を確立するために、市販キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の指示に従ってＮｅｏｎトランスフェクションシステムを使用して、５×１０５個のＦＦＦ３細胞に１６μｇＰｉｇｇｙＢａｃ−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡｓプラスミド及び４μｇＳｕｐｅｒ  ＰｉｇｇｙＢａｃ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅプラスミド（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をトランスフェクトした。統合された構築物を運ぶ細胞を選択するために、２μｇ／ｍＬピューロマイシンをトランスフェクトされた細胞に適用した。ピューロマイシンを野生型ＦＦＦ３細胞に適用したネガティブコントロールに基づいて、ピューロマイシンの選択が４日で完了したと判断された。ＦＦＦ３−ＰｉｇｇｙＢａｃ細胞株は、以後２μｇ／ｍＬピューロマイシンで維持し、２μｇ／ｍＬドキシサイクリンを適用して、ドキシサイクリン誘導性ＦＦＦ３−ＰｉｇｇｙＢａｃ細胞株のＣａｓ９発現を誘導した。
【０１２９】
ＦＦＦ３細胞株でのＣａｓ９一貫した発現を避けるため、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００試薬を使用した３μｇ  ＰｉｇｇｙＢａｃ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ−Ｏｎｌｙ  Ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅベクターで５×１０５個の細胞をトランスフェクトすることにより、ＦＦＦ３ゲノムからのＰｉｇｇｙＢａｃ−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡｓ切除を実施した。次に、ＰｉｇｇｙＢａｃ−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡｓを切除したＦＦＦ３細胞を、クローンの成長と遺伝子型決定のために９６ウェルプレートに単一細胞ソートした。
【０１３０】
単一細胞クローンの遺伝子型解析
最初に、ピューロマイシン選択とそれに続くＰｉｇｇｙＢａｃ切除をＦＦＦ３  ＰｉｇｇｙＢａｃ−Ｃａｓ９／２ｇＲＮＡ細胞株で実施した。次に、細胞を単一細胞ソートして、直接ジェノタイピング用の９６ウェルＰＣＲプレートとコロニー成長用の９６ウェル細胞培養プレートの両方に分けた。
【０１３１】
クローン増殖なしで単一ＦＦ細胞の遺伝子型を決定するために、以前に報告された単一細胞遺伝子型決定プロトコルに従って、ソートされた単一細胞からのＰＥＲＶ遺伝子座を直接増幅した。簡単に説明すると、単一細胞を９６ウェルＰＣＲプレートにソートした。各ウェルは５  μＬの溶解混合液を有し、これは、０．５μＬの１０Ｘ  ＫＡＰＡエクスプレス抽出バッファー（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．１  μＬの１Ｕ／μＬ  ＫＡＰＡ  Ｅｘｐｒｅｓｓ抽出酵素、及び４．６μｌの水を含有した。溶解反応物を７５℃で１５分間インキュベートし、その後反応物を９５℃で５分間不活性化した。その後、すべての反応液を、１ｘ  ＫＡＰＡ  ２Ｇ  ｆａｓｔ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、０．２μＭ  ＰＥＲＶ  Ｉｌｌｕｍｉｎａプライマー（方法表２）を含有する２０μＬ  ＰＣＲ反応液に添加した。反応物を９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃、２０秒、５９℃、２０秒及び７２℃、１０秒の２５サイクルが続いた。Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンスアダプターを追加するために、１ｘＫＡＰＡ  ２Ｇ  ｆａｓｔ（ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）とＩｌｌｕｍｉｎａシーケンスアダプターを含む０．３  μＭプライマーとを含有するＰＣＲミックス２０μＬに反応産物３μＬを加えた。反応物を９５℃で３分間インキュベートした後、９５℃、１０秒、５９℃、２０秒及び７２℃、１０秒の１０サイクルが続いた。ＥＸ  ２％ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でＰＣＲ産物をチェックし、続いてゲルから３００−４００ｂｐの産物を回収した。次に、これらの産物をほぼ同じ量で混合し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）、ＭｉＳｅｑ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で配列決定した。ディープシーケンスデータを分析し、ＣＲＩＳＰＲ−ＧＡを使用したＰＥＲＶ編集効率を決定した（Ｄｅｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｖｉｒｕｓｅｓ，  ８：２１５）。
【０１３２】
ＰＥＲＶｐｏｌ遺伝子型解析で使用されるプライマー
Ｉｌｌｕｍｉｎａ＿ＰＥＲＶ＿ｐｏｌフォワード：
５’−ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＧＡＣＴＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＴＴＣＡＡ−３’  （配列番号４）
Ｉｌｌｕｍｉｎａ＿ＰＥＲＶ＿ｐｏｌリバース：
５’−ＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＣＴＣＴＣＣＴＧＣＡＡＡＴＣＴＧＧＧＣＣ−３’  （配列番号５）
【０１３３】
ＧＦＰ−ＨＥＫ２９３ＴへのＰＫ１５  ＷＴ及びＷＴ  ＨＥＫ２９３ＴへのＧＦＰ−ＨＥＫ２９３ＴのＰＥＲＶ感染性試験
１）ＰＫ１５  ＷＴのＧＦＰ−ＨＥＫ２９３ＴへのＰＥＲＶ感染性試験
手順は、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ８０：３５０によって以前に説明された手順と同様である。簡単に説明すると、１ｘ１０５個のＬｅｎｔｉ−ＧＦＰ−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と１ｘ１０５個のＰＫ１５  ＷＴ細胞とを１０ｃｍディッシュで共培養し、１週間増殖させた。高純度ＧＦＰ陽性ＧＦＰ−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を得るために、フローサイトメトリーを介して連続的な細胞ソートを実施した。ＧＦＰ−ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をバルクとしてソートし、１２５日間培養した。異なる時点（ｄ７６、ｄ８０、及びｄ１２５）で細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ｄｄＰＣＲを介して経時的にＰＥＲＶコピー数が増加したかどうかを検出した。バルク細胞からの単一細胞ソートは異なる時点で行われた。単一細胞がクローンに成長した後、いくつかのクローンのＰＥＲＶ感染を最初にＰＣＲで調べ、次にｄｄＰＣＲを介してＰＥＲＶ感染クローンのＰＥＲＶコピー数を定量化した。
【０１３４】
２）ＧＦＰ−ＨＥＫ２９３ＴからＷＴ  ＨＥＫ２９３ＴへのＰＥＲＶ感染性試験
ＰＥＲＶは、ヒト細胞にヒトから伝播することができるかどうかを試験するために、ＰＥＲＶ感染ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ（Ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰ）クローンの１×１０５細胞を、ＷＴ  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の１×１０５細胞と、２週間共培養した後、ＧＦＰ陰性の単一細胞をフローサイトメトリーでソートした。単一細胞がクローンに成長した後、ＰＣＲによるＰＥＲＶ感染を調べて、さまざまなｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローンの感染率を検出した。特に、ｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローン１０と共培養されたＧＦＰネガティブクローンのＰＥＲＶコピー数は、標準マーカーとしてｉ−ＨＥＫ２９３Ｔ−ＧＦＰクローン１０のｄｄＰＣＲで検出されたコピー数を使用して、ｑＰＣＲによって定量化された。
【０１３５】
逆転写酵素（ＲＴ）アッセイ
ＲＴアッセイは、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ８０：３５０によって以前に記載されたプロトコルと同じである。簡単に言えば、ＦＦＦ３野生型細胞及び１００％改変ＦＦＦ３クローンのＲＴ活性をテストするために、５ｘ１０５個の細胞を１０ｃｍペトリ皿に播種し、細胞が８０％培養密度に達した後に上清を回収した。培地を最初に４００ｇで４分間遠心分離して細胞とデブリを取り除き、０．４５μＭ  Ｍｉｌｌｅｘ−ＨＶシリンジフィルター（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）でろ過した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｕｎｉｔ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して、ろ過した上清を４０００ｇで１０分間濃縮した。次に、濃縮された上清を５０，０００ｒｐｍで６０分間、超遠心分離した。上清を注意深く除去し、ウイルスペレットを完全に再懸濁し、２０μＬの１０％ＮＰ４０で３７°で６０分間溶解した。ＲＴ反応は、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して実施した。反応の総容量は２０μＬで、これは、１ｘＲＴバッファー、０．５ｍＭ  ｄＮＴＰ、０．５μＭインフルエンザリバースプライマー（５‘  ＣＴＧＣＡＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＴＡＴＧ  ３’）（配列番号６）、１００ユニットのＲｎａｓｅＯＵＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１００単位のＳｕｐｅｒＲｎａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、５μＬのサンプル溶解、及び４０ｎｇのＩＤＴ合成インフルエンザＲＮＡテンプレート（これは、５‘及び３’末端の両方でＲｎａｓｅ耐性であった）を含有した。ＲＮＡ鋳型配列は、
５’  ｒＡ＊ｒＡ＊ｒＣ＊ｒＡ＊ｒＵ＊ｒＧｒＧｒＡｒＡｒＣｒＣｒＵｒＵｒＵｒＧｒＧｒＣｒＣｒＣｒＵｒＧｒＵｒＵｒＣｒＡｒＵｒＵｒＵｒＵｒＡｒＧｒＡｒＡｒＡｒＵｒ  ＣｒＡｒＡｒＧｒＵｒＣｒＡｒＡｒＧｒＡｒＵｒＡｒＣｒＧｒＣｒＡｒＧｒＡｒＡｒＧｒＡｒＧｒＵｒＡｒＧｒＡｒＣｒＡｒＵｒＡｒＡｒＡｒＣｒＣｒＣｒＵｒＧｒＧ  ｒＵｒＣｒＡｒＵｒＧｒＣｒＡｒＧｒＡｒＣｒＣｒＵ＊ｒＣ＊ｒＡ＊ｒＧ＊ｒＵ＊ｒＧ  ３’  （＊  ホスホジエステル結合）（配列番号７）
であった。ＲＴ反応が完了した後、ＲＴ産物を、インフルエンザフォワード（５’  ＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＴＴＣＡＴＴＴ  ３’）（配列番号８）及びインフルエンザリバースプライマー（上記の配列）を使用したＰＣＲによって調べた。アンプリコンの予想サイズは７２ｂｐであった。
【０１３６】
ＰＥＲＶコピー数の定量化
Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ８０：３５０で前述したように、Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ（登録商標）（ｄｄＰＣＲ（登録商標））を使用して、製造元の指示（ＢｉｏＲａｄ）に従ってＰＥＲＶのコピー数を定量化した。簡単に言えば、培養細胞からゲノムＤＮＡを抽出し（ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）、５０ｎｇのゲノムＤＮＡをＭｓｅＩ（１０Ｕ）で３７℃で３時間消化し、その後６５℃で１０分間の不活性化が続いた。それからｄｄＰＣＲ反応が準備された。反応混合物は、１ｘｄｄＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  ｍｉｘ、１μＬの１８μＭターゲットプライマー及び５μＭターゲットプローブ（ＶＩＣ）、１μＬの１８μＭリファレンスプライマー及び５μＭリファレンスプローブ（ＦＡＭ）、５ｎｇの消化ＤＮＡ、及び総容量２０μＬまでの水を含有する。プライマーの配列とプローブ情報は、拡張データ表１に記載されている。
【０１３７】
ＱＸ１００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒで液滴を生成した後、液滴を慎重に９６ウェルＰＣＲプレートに移し、そしてＢｉｏｒａｄ  ＰＣＲマシンを使用して次のように熱サイクリングに進んだ。：  酵素活性化のために９５℃１０分間、その後、変性のために９４℃３０秒間、アニーリング／伸長のために６０℃１分間（傾斜率  ２℃／秒）、酵素の失活のために９８℃１０分間、の４０サイクル。
【０１３８】
サーマルサイクリングの後、９６ウェルプレートをＢｉｏｒａｄ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒに配置し、ＱｕｎａｔａＳｏｆｔ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して実験計画を立て、実験を読み取った。プログラムが終了したら、製造元の指示（ＢｉｏＲａｄ）に従ってゲーティングにより結果を分析した。
方法表１−ｄｄＰＣＲアッセイで使用されるプライマー
【表５】
2020517301.tif 000007
【０１３９】
ターゲティング効率の計算
Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（６）で以前に説明されたように、ＰＥＲＶ不活性化の効率を推定するために、カスタムパイプラインが構築された。簡単に説明すると、ｐｏｌ遺伝子は増幅され、ＰＥ２５０又はＰＥ３００を使用したＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇによってシーケンスされた。まず、ＰＥＡＲ（１５）を使用した２つの重複する読み取りを結合し、ＢＬＡＴを使用して参照領域にマッピングした。マッピング後、読み取りはハプロタイプとインデルタイプの特定の組み合わせを含有するセットにグループ化された。マッピングされた読み取りの総数の０．５％未満の表現を持つ読み取りセットは破棄された。最後に、Ｇｕｅｅｌｌｅｔ  ａｌ（１６）で説明されているように、さまざまな挿入と削除を呼び出すためにマッピング出力が解析された。
【０１４０】
ＰＥＲＶ−ヒト接合部キャプチャ
高度に感染したｉ−ＨＥＫ２９３−ＧＦＰクローンのＰＥＲＶ挿入部位は、標準の逆ＰＣＲプロトコルによって決定された。これらのクローンのゲノムＤＮＡは、Ｓａｕ３ＡＩ消化によって断片化され、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を使用した低ＤＮＡ濃度でセルフライゲーションされた。次に、ＰＥＲＶ−ヒト接合部を含む断片を、以下に示すＰＥＲＶ  ＬＴＲ上のプライマーを使用したＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ産物は、ＰＣＲ  Ｂｌｕｎｔ  ＴＯＰＯキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用したサブクローンであり、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングされた。ＰＥＲＶ  ＬＴＲのすぐ隣の配列は、ＵＳＣＳ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒを使用してヒトゲノムにアラインメントされた。ヒト遺伝子におけるヒットの一部は、ジャンクションＰＣＲ及びサンガーシーケンスを使用して検証された。
配列番号２４−ＰＥＲＶ＿ＬＴＲ＿Ｆ：ＡＴＧＣＣＣＣＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡ
配列番号２５−ＰＥＲＶ＿ＬＴＲ＿Ｒ：ＧＧＴＴＡＧＧＴＴＧＣＡＴＴＴＴＣＡＴＣＣＴＴ
【０１４１】
ＳＣＮＴブタ胚を生産するためのハンドメイドクローニング
特に記載のない限り、すべての化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。ハンドメイドクローニング（ＨＭＣ）は、Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔｈｅｒｉｏｇｅｎｏｌｏｇｙ，６８：１１０４−１０に記載されている手順に基づいている。手短に言えば、ブタの卵巣は屠殺場から得られ、卵丘細胞卵母細胞複合体（ＣＯＣ）は大きな卵胞から集められた。次に、ブタ卵母細胞のｉｎ−ｖｉｔｒｏ成熟を、重炭酸緩衝Ｍ１９９培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）４００μＬを含有する４ウェルディッシュ（Ｎｕｎｃ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で実施した。１０％ブタ卵胞液、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０ＩＵ／ｍＬ妊娠馬血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）及び５ＩＵ／ｍＬヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）を、鉱油下で補充し、３８．５℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２及び９０％Ｎ２の加湿空気中で４２〜４３時間インキュベートした。成熟後、ＣＯＣの卵丘細胞を、１ｍｇ／ｍＬヒアルロニダーゼを含有するＨＥＰＥＳ緩衝Ｍ１９９でのピペッティングを繰り返すことにより除去し、Ｔ２（２％ＦＢＳを含むＨＥＰＥＳ緩衝Ｍ１９９）液滴で卵母細胞を洗浄することが続いた。この時点から、すべての操作は３９℃に調整された加熱ステージで実行された。溶液の液滴（２０ｕＬ／液滴）は、６０ｍｍペトリ皿の蓋（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で作成し、鉱油で覆った。卵母細胞の移入は、細かく引き絞り、火で磨かれたガラスピペットを使用して行われた。卵母細胞をプロナーゼ液滴（３．３ｍｇ／ｍＬ）に配置し、卵母細胞の形状が変化するまで約１分間消化した後、Ｔ２及びＴ２０（２０％ＦＢＳを含むＨＥＰＥＳで緩衝化されたＭ１９９）液滴での連続洗浄が続き、洗浄中に卵母細胞の透明帯が除去された。次に、透明帯のない卵母細胞を、２．５ｕｇ／ｍＬのサイトカラシンＢ（ＣＢ）を含有するＴ２０液滴に並べた。卵母細胞の除核は極体位置によって指示され、Ｕｌｔｒａ  Ｓｈａｒｐ  Ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ  Ｂｌａｄｅｓ（Ｓｈｅａｒｅｒ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ＬＬＣ、Ｐｕｌｌｍａｎ、ＷＡ）を使用して実体顕微鏡で手動で実行して卵母細胞の細胞質の１／３を除去し、そして、除核された卵母細胞は、融合の次のステップのためにＴ２液滴に置かれた。卵母細胞と体細胞との融合を行うため、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎを使用して１００％ＰＥＲＶ−ＫＯＦＦＦ３線維芽細胞を剥離し、Ｔ１０（１０％ＦＢＳを含むＨＥＰＥＳバッファーＭ１９９）で中和し、濾過して分離した単一細胞を取得した。一方、融合用の溶液の小滴は３５ｍｍペトリ皿の蓋（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で調製し、細胞質体(cytoplasts)と呼ばれる除核卵母細胞と１〜５μＬの体細胞とを異なるＴ１０小滴に置いた。細胞質体を、０．４ｍｇ／ｍＬの植物性血球凝集素（ＰＨＡ−Ｐ）に２〜３秒間（ｓ）、個別に移し、Ｔ１０液滴の底に落ち着いた単一の細胞にすばやく落とした。付着後、細胞質体と細胞とのペアをピックアップし、０．３Ｍマンニトールと５μｍポリ（ビニ���アルコール）（ＰＶＡ）とを含有するブタ融合培地（ｐＦＭ）液滴で平衡化され、次いで５００μＬｐＦＭ溶液で覆われた融合チャンバに移した。融合チャンバには、直径０．５ｍｍ、間隔０．８ｍｍの平行な白金線が含まれていた。
【０１４２】
２Ｖの交流（ＡＣ）を使用して（ＣＥＬＬＦＵＳＩＯＮ：ＢＬＳ  ＣＦ−１５０／ＢＳＰ、ＢＬＳ  Ｌｔｄ．、ハンガリー）、ワイヤから最も遠い体細胞で負極ワイヤにペアを取り付け、その後、９μｓの間、１００Ｖの単一の直流（ＤＣ）パルスで、融合させた。次に、ペアを慎重に取り出し、Ｔ１０で１時間インキュベートして、体細胞を細胞質体に完全に融合させた。そして、細胞質体と体細胞とのより多くの融合のために同じ手順が繰り返された。
【０１４３】
次に、上記の融合ペアを別の未融合細胞質体と融合させた。同様に、融合していない細胞質体を、０．３Ｍマンニトール、５μｍＰＶＡ、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４及び０．５ｍＭ  ＣａＣｌ２を含有する５００μＬのウシ融合培地（ｂＦＭ）で覆われた融合チャンバに移した。同じＡＣ２Ｖを使用して、未融合の細胞質体を負極ワイヤに取り付け、その後、融合ペアを細胞質体の反対側に配置し、そのペアは負極ワイヤから最も遠い状態にした。８０μｓの間、４３Ｖ  ＤＣの単一パルスを適用して、細胞質体ペアトリプレットを融合させた。次に、トリプレットすなわち構築された胚をＴ１０液滴に約１０分間置き、細胞質体の完全な融合を可能にした。化学活性化は２回目の融合の後に行われた。構築した胚を、５μｇ／ｍｌ  ＣＢ及び１０μｇ／ｍＬシクロヘキシミド（ＣＸ）を補充し、鉱油で覆った４００μＬ  ＰＺＭ３溶液で４時間インキュベートした（Ｇｕｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，３０：２９６８−２９７０）。その後、胚をＰＺＭ３で洗浄し、４ウェル皿の底に凝集針ＤＮ−０９  ／Ｂ（ＢＬＳ  Ｌｔｄ．、ハンガリー）で作られた小さなＵ底穴を含むウェル（ＷＯＷ）システムのウェルに移した。ＷＯＷシステムで構築された胚を、次いで、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、及び９０％Ｎ２を含む加湿トライガス（ｔｒｉｇａｓ）インキュベーター中で、７日間３８．５℃で、インキュベートして、胚盤胞の形態を可能にし、そして、再構築された胚発生率あたりの胚盤胞が評価された。
【０１４４】
免疫染色
７日目のブタ胚盤胞を固定し、製造業者の指示に従って多能性幹細胞４マーカー免疫細胞化学キット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａ２４８８１）を使用して染色した。ただし、キットによって提供される抗体は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ａ−２１４４６）と結合したヤギ抗ブタ抗ＳＯＸ２（ｓｃ−１７３２０）及びウサギ抗ヤギＩｇＧ二次抗体で置換された。ＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）  Ｌｉｖｅ  ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（登録商標）試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｒ３７６０５）及びファロイジン（Ａ２２２８２）は、イメージングの５分前に適用された。胚染色で使用される抗体の最終濃度は、抗ＳＯＸ２で１：１００、ウサギ抗ヤギＩｇＧで１：２００、ファロイジンで１：４０、ＮｕｃＢｌｕｅで１：１００である。
【０１４５】
共焦点顕微鏡
胚盤胞を、マイクロディッシュ３５ｍｍ（Ｉｂｉｄｉ  ８０４０６）におけるマイクロインサート４ウェルのウェルに移し、１０倍の水対物レンズを備えたＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５共焦点レーザー走査顕微鏡を使用して撮像した。ＩｍａｒｉｓとＦｉｊｉソフトウェアを組み合わせて使用し、画像をトリミング、セグメント化、コントラスト強調した。
【０１４６】
実施例５．  ＳＣＮＴに望ましい遺伝子型を持つ単一細胞クローン
ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９遺伝子編集後、細胞集団を９６ウェルプレートに単一細胞ソートし、４．５ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、１１０ｍｇ／Ｌ  ピルビン酸ナトリウム、ＧｌｕｔａＭａｘを補充したＤＭＥＭ、並びに５ｎｇ／ｍＬ塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）（１３２５６０２９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び１０ｎｇ／ｍＬ環状ピフィスリン−α臭化水素酸塩（ｃＰＦＴ−α）（Ｐ４２３６、Ｓｉｇｍａ）、Ｐ５３阻害剤、において〜１４日間、増殖させた。次に、単一細胞クローンからゲノムＤＮＡを分離し、ジェノタイピングを実施した。次に、所望のクローンを拡大し、上記の培養条件で培養した。この戦略では、目的の遺伝子型のクローンが生成されるが、細胞の倍加時間が多すぎるため、細胞の生存率は最適以下である可能性がある。ただし、培地にｂＦＧＦとｃＰＦＴ−αを加えると、細胞の生存率が大幅に向上する。
【０１４７】
実施例６．  ＳＣＮＴのためのバルク細胞改変
遺伝子編集後、抗体結合又はビーズ選択により改変細胞が濃縮され、濃縮された細胞集団が単一細胞ソート手順を経ることなくＳＣＮＴに直接使用された。図２４。この戦略は、細胞培養時間を短縮し、細胞が古くなりすぎて一般に生存率が低下することを回避する。
【０１４８】
実施例７：  ｉｎ  ｖｉｖｏ改変
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子編集の場合、細胞損傷は、特にマルチプレックス編集では、細胞培養及びトランスフェクションの手順中に回避するのが難しい場合がある。、したがって、モザイク胎児を達成するために、ブタ接合体へのＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９の送達のためのｉｎ  ｖｉｖｏマイクロインジェクション法が開発された。図２５。３０日齢の胎児を採取し、細胞を抽出した。次に、単一細胞をソートし、単一細胞クローンとして遺伝子型を特定した。目的のクローンが拡張され、ＳＣＮＴに使用された。この戦略により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション手順が回避され、細胞は十分な生存率を保持した。図３０に示すように、再クローン化は同腹仔数を大幅に増加させ、有意な増加ではないものの、生存率の増加も示した。
【０１４９】
実施例８：  卵母細胞の収集及びｉｎ−ｖｉｔｒｏ成熟（ＩＶＭ）
卵丘卵母細胞複合体（ＣＯＣ）を単離するためには、性的に成熟した若雌ブタ又は繁殖用雌ブタからの卵巣が使用された。卵母細胞収集及びＩＶＭ培養は、Ｒ．  Ｔｏｍｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｒｅｐｒｏｄ．  Ｄｅｖ．  ５５，  １２１−７  （２００９）に記載されるように行った。卵丘細胞の複数の層（少なくとも３層）で囲まれた卵母細胞を飽和湿度の５％ＣＯ２、５％Ｏ２及び９０％Ｎ２雰囲気中で３８．５℃でＩＶＭ培地中で約４２−４４時間、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ成熟させるために採取した。
【０１５０】
実施例９：  体細胞核移植（ＳＣＮＴ）
Ｈ．  Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．８、ｅ５７７２８（２０１３）によって以前に記述されたように、ＳＣＮＴを実施した。０．１％（ｗ／ｖ）ヒアルロニダーゼで処理することにより、培養ＣＯＣから卵丘細胞を除去した。卵母細胞と隣接する細胞質に含まれる最初の極体は、ＴＬＨ−ＰＶＡの傾斜ピペットを使用して穏やかな吸引により除核された。ＧＴＫＯ／ｈＣＤ５５／ｈＣＤ５９陽性線維芽細胞株由来のドナー細胞を、除核卵母細胞の囲卵腔に挿入した。再構築した胚を、融合培地（０．２５Ｍ  Ｄ−ソルビンアルコール、０．０５ｍＭ  Ｍｇ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、２０ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ及び０．５ｍＭのＨＥＰＥＳ［酸を含まない］）でＥｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（ＬＦ２０１、ＮＥＰＡ  ＧＥＮＥ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．、日本）を使用して、２００Ｖ／ｍｍの単一直流パルスで２０μｓの間、融合した。次に、胚をＰＺＭ−３で０．５〜１時間培養し、０．２５Ｍ  Ｄ−ソルビンアルコール、０．０１ｍＭ  Ｃａ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２、０．０５ｍＭ  Ｍｇ（Ｃ２Ｈ３Ｏ２）２及び０．１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを含有する活性化培地で１００ｍｓの間、１５０Ｖ／ｍｍの単一パルスで活性化した。胚を、５％ＣＯ２、５％Ｏ２、９０％Ｎ２の加湿雰囲気で３８．５°Ｃ、２時間、５μｇ／ｍＬサイトカラシンＢを補充したＰＺＭ−３で平衡化し（ＡＰＭ−３０Ｄ、ＡＳＴＥＣ、日本）、次に、胚移植まで上記と同じ培養条件でＰＺＭ−３培地で培養した。
【０１５１】
実施例１０：  胚移植
胚移植では、代理母として少なくとも１つの出産歴と良好な同腹仔数の繁殖用雌ブタが選択された。ＳＣＮＴ胚は、レシピエントの卵管に外科的に移植された。妊娠は、超音波スキャナー（ＨＳ−１０１  Ｖ、Ｈｏｎｄａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．、Ｙａｍａｚｕｋａ、日本）を使用して、外科的移植の約２３日後に確認された。サロゲートの選択はブタのクローンの結果にとって重要であると判断された。例えば、小さなサロゲート（例えば、Ｄｉａｎｎａｎ）と比較して代理母（例えば、Ｓａｎｙｕａｎ）が大きいほど、出産率、同腹仔数、生存率、及び繁殖用雌豚１頭あたりの予想豚数の結果測定値が向上する。図２９。
【０１５２】
実施例１１：  胎児とブタの分析
サロゲート繁殖用雌豚から胎児及びＰＥＲＶを含まない細胞からクローン化されたブタへのＰＥＲＶの再感染があったかどうかをテストするために、ＷＴ及びＰＥＲＶノックアウト胎児を帝王切開（ｃ−ｓｅｃｔｉｏｎ）により代理母豚から収集した。ゲノムＤＮＡ及び総ＲＮＡは、異なる時点でクローンブタの異なる組織から単離された。その後、ＰＥＲＶ遺伝子型のゲノムＤＮＡとＲＮＡの両方をディープシーケンスでチェックした。ＰＥＲＶノックアウトの胎児とブタは、ゲノムと組織の転写産物の両方で〜１００％のＰＥＲＶ不活化効率を示した。ＰＥＲＶのコピー数は、それらがクローン化された細胞株に類似していることが確認された。ＰＥＲＶの再感染は、これらの方法によって生成された胎児又はブタのいずれでも観察されなかった。
【０１５３】
実施例１２：  使用されたガイドＲＮＡの数の増加に伴うＫＯ効率の増加
異なる数のガイドＲＮＡがＰＥＲＶノックアウト（ＫＯ）の効率に与える影響を調べるために、２、３、及び４つのガイドＲＮＡの組み合わせを使用して実験を実施した。簡単に言えば、ＰＥＲＶ  ＫＯは、約５０〜６０個のＰＥＲＶコピーを含有するＹｕｃａｔａｎミニブタの胎児線維芽細胞で行われた。ＰＥＲＶ  ＫＯ効率は、バルクのフラグメント分析及びクロマトグラフィーにより決定された結果を使用して測定した。ＫＯ効率はｇＲＮＡの数が増えると増加することが観察され。図２７。２つのガイドＲＮＡを使用すると、ＰＥＲＶ  ｐｏｌ配列に欠失がある集団の細胞の１２．５２％が得られ、３つのガイドＲＮＡを使用すると、ＰＥＲＶ  ｐｏｌ配列に欠失がある集団の細胞の２２．１９％が得られた。４つのガイドＲＮＡを使用した場合、ＫＯ効率は５２．４７％に増加した。重要なことに、少なくとも４つのガイドＲＮＡを使用した場合、かなりの数の細胞で１００ｂｐを超える欠失が観察された。図２７、右下パネル。小さなインデルとは異なり、２つより多いガイドＲＮＡを使用して生成される大きな欠失は、ＰＥＲＶｐｏｌの触媒ドメインを完全に除去するため、自然突然変異によって元に戻すことはできないと、と考えられている。
【０１５４】
自発的変異の回避に加えて、ＰＥＲＶ  ｐｏｌの不活性化はヒトＥＲＶｐｏｌの活性によって補完できないことが実証された。図２８。簡単に説明すると、ＰＫ１５  ＷＴ細胞（「ＰＫ１５−ＷＴ＋ｍＣｈｅｒｒｙ」）、ＰＥＲＶ  ＫＯ細胞（「ＰＫ１５−＃１５）」、及び組換えヒトＥＲＶｐｏｌを発現するＰＥＲＶ  ＫＯ細胞（「ＰＫ１５−＃１５＋組換えＥＲＶ  Ｐｏｌ」）を、ヒト２９３−ＧＦＰ細胞で共培養した。２週間後、２９３−ＧＦＰ細胞は指定された数でＦＡＣＳ分離された。そして、ｐｏｌ及びｅｎｖレベルで測定されるＰＥＲＶ感染はＰＣＲを使用して決定された。ＧＧＴＡをネガティブコントロールとして使用して、ＰＫ１５で汚染された２９３−ＧＦＰ細胞の代わりに、ｐｏｌ／ｅｎｖ発現がＰＥＲＶ感染に起因することを示した。図２８に示すように、ＰＫ１５−ＷＴ細胞はｐｏｌとｅｎｖの両方を発現したが、組換えヒトＥＲＶｐｏｌを発現するＰＥＲＶ  ＫＯもＰＥＲＶ  ＫＯもｐｏｌ又はｅｎｖの発現を示さなかった。このデータは、ＰＥＲＶ不活化されたブタ臓器のＰＥＲＶは、ヒトＥＲＶに曝露しても再活性化されないことを示している。
【０１５５】
Ｐａｒａ  Ａ。胚から成長したブタであって、ここで、前記胚は、少なくとも７５％の不活性ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）要素を有するブタ細胞を含む。
【０１５６】
Ｐａｒａ  Ｂ。Ｐａｒａ  Ａのブタであって、ここで、ブタ細胞はブタ雌胎児線維芽細胞（ＰＦＦＦ３）細胞である。
【０１５７】
Ｐａｒａ  Ｃ。Ｐａｒａ  Ａ又はＰａｒａ  Ｂのブタであって、ここで、細胞内のＰＥＲＶ要素の約１００％が不活性である。
【０１５８】
Ｐａｒａ  Ｄ。Ｐａｒａ  Ａ〜Ｃのいずれか１つのブタであって、ここで、前記ＰＥＲＶ要素は、ＰＥＲＶ要素の活性の低下又は排除をもたらす１つ又は複数の突然変異又は後成的変化を含む。
【０１５９】
Ｐａｒａ  Ｅ。Ｐａｒａ  Ａ〜Ｄのいずれかの１つのブタであって、ここで、前記ブタ細胞の前記ＰＥＲＶ要素は、ＰＥＲＶ複製及び／又はアセンブリに関与する遺伝子に特異的なゲノム改変剤を前記細胞に投与することを含む方法によって不活性化されており、ここで、前記作用物質は、前記遺伝子の転写及び／又は翻訳を破壊する。
【０１６０】
Ｐａｒａ  Ｆ。Ｐａｒａ  Ｅのブタであって、ここで、前記作用物質は、ヌクレアーゼ又はニッカーゼ、又はヌクレアーゼもしくはニッカーゼをコードする核酸である。
【０１６１】
Ｐａｒａ  Ｇ。Ｐａｒａ  Ｆのブタであって、ここで、前記ヌクレアーゼ又はニッカーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はニッカーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ又はニッカーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼ又はニッカーゼからなる群から選択される。
【０１６２】
Ｐａｒａ  Ｈ。Ｐａｒａ  Ｇのブタであって、ここで、前記ヌクレアーゼ又はニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼ又はニッカーゼである。
【０１６３】
Ｐａｒａ  Ｉ。Ｐａｒａ  Ｈのブタであって、ここで、前記ＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼ又はニッカーゼは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はニッカーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ又はニッカーゼ、又はそれらの生物学的に活性なフラグメントもしくは誘導体である。
【０１６４】
Ｐａｒａ  Ｊ。Ｐａｒａ  Ｅ〜Ｉのいずれか１つのいずれかのブタであって、ここで、前記作用物質は、ａ）ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡもしくはｔｒａｃｒＲＮＡ、又はｂ）ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをコードする核酸、をさらに含む。
【０１６５】
Ｐａｒａ  Ｋ。Ｐａｒａ  Ｊのブタであって、ここで、前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、配列番号１〜３もしくは２６〜１８１のいずれか１つのヌクレオチド配列、そのいずれの株特異的遺伝的変異体、又はそのいずれの組み合わせを含む。
【０１６６】
Ｐａｒａ  Ｌ。Ｐａｒａ  Ｊのブタであって、ここで、前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、配列番号１〜３もしくは２６〜１１６のいずれか１つのヌクレオチド配列、その株特異的遺伝子変異体、又はそのいずれの組み合わせを含む。
【０１６７】
Ｐａｒａ  Ｍ。Ｐａｒａ  Ｊのブタであって、ここで、前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡは、配列番号３５、３６、４８、９９、１０１、１０２、１０６、１０８、１１１、１１３のいずれか１つのヌクレオチド配列、又はそれらのいずれの組み合わせを含む。
【０１６８】
Ｐａｒａ  Ｎ。ＰＡＲＡ  Ｅ〜Ｊのいずれか１つのブタであって、ここで、前記作用物質は、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼ又はニッカーゼをコードする核酸であり、ここで、前記細胞は、前記作用物質を安定に発現するように操作され、ここで、前記作用物質は、少なくとも１つのガイドＲＮＡをさらに含み、及びここで、少なくとも１つのガイドＲＮＡ配列は、配列番号１〜３又は２６〜１１６のいずれか１つの前記ヌクレオチド配列を含む。
【０１６９】
Ｐａｒａ  Ｏ。Ｐａｒａ  Ｎのブタであって、ここで、前記作用物質は少なくとも３つのガイドＲＮＡを含み、ここで、前記３つのガイドＲＮＡ配列は配列番号１〜３の前記ヌクレオチド配列を含む。
【０１７０】
Ｐａｒａ  Ｐ。Ｐａｒａ  Ａ〜Ｏのいずれか１つのブタであって、ここで、当該ブタは、妊娠後少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも５年、少なくとも１０年にわたって同じ又は実質的に同じレベルのＰＥＲＶ不活性化を維持する。
【０１７１】
Ｐａｒａ  Ｑ。Ｐａｒａ  Ａ〜Ｐのいずれか１つのブタから得られた臓器又は組織。
【０１７２】
Ｐａｒａ  Ｒ。Ｐａｒａ  Ｑの臓器又は組織を対象に移植する方法であって、前記対象に前記臓器を移植するステップを含む。
【０１７３】
Ｐａｒａ  Ｓ。Ｐａｒａ  Ｒの方法であって、ここで前記対象はヒトである。
【０１７４】
Ｐａｒａ  Ｔ。Ｐａｒａ  Ｒの方法であって、ここで、前記対象は非ヒト霊長類である。
【０１７５】
Ｐａｒａ  Ｕ。ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）不活化ブタを生成する方法であって、当該方法は、
核を有する核ドナー細胞を得ることであって、前記核ドナー細胞中のＰＥＲＶ要素の少なくとも７５％が不活性であること；
核移植卵母細胞を生成するため、前記核ドナー細胞の前記核をレシピエント除核卵母細胞にトランスファーすること；
前記核移植卵母細胞を活性化に付すこと；
胚盤胞又は胚を生成するため、前記核移植卵母細胞を培養すること；
前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること；及び
前記胚盤胞又は胚から生きたＰＥＲＶ不活化ブタを生成すること；
を含む。
【０１７６】
Ｐａｒａ  Ｖ。ブタ内因性レトロウイルス（ＰＥＲＶ）不活化ブタを生成する方法であって、当該方法は、：
胚盤胞又は胚を生成するため核ドナー細胞の核を使用することであって、前記核ドナー細胞におけるＰＥＲＶ要素の少なくとも７５％が不活性であること；及び
ＰＥＲＶ不活化ブタを作成するため、前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること；
を含む。
【０１７７】
Ｐａｒａ  Ｗ。Ｐａｒａ  Ｕ又はＰａｒａ  Ｖの方法であって、ここで、前記核ドナー細胞が胎児細胞である。
【０１７８】
Ｐａｒａ  Ｘ。Ｐａｒａ  Ｕ又はＰａｒａ  Ｖの方法であって、ここで、前記核ドナー細胞がキメラＰＥＲＶ不活化胎児から単離される。
【０１７９】
Ｐａｒａ  Ｙ。  Ｐａｒａ  Ｘの方法であって、前記キメラＰＥＲＶ不活化胎児が妊娠約１０日、約２０日、約３０日、又は約３ヶ月である。
【０１８０】
Ｐａｒａ  Ｚ。Ｐａｒａ  Ｘの方法であって、前記キメラＰＥＲＶ不活化胎児は、ゲノム改変剤を使用して生成される。
【０１８１】
Ｐａｒａ  ＡＡ。Ｐａｒａ  Ｚの方法であって、前記キメラＰＥＲＶ不活化胎児は接合体注射により生成される。
【０１８２】
Ｐａｒａ  ＡＢ。Ｐａｒａ  Ｚの方法であって、ここで、前記ゲノム改変剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はニッカーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ又はニッカーゼ、デアミナーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼ又はニッカーゼからなる群から選択される。
【０１８３】
Ｐａｒａ  ＡＣ。Ｐａｒａ  Ｕ又はＰａｒａ  Ｖの方法であって、前記核ドナー細胞がたｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖される。
【０１８４】
Ｐａｒａ  ＡＤ。Ｐａｒａ  ＡＣの方法であって、前記核ドナー細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで３０未満、２０未満、１０未満、５未満、又は２未満の集団倍加を受ける。
【０１８５】
Ｐａｒａ  ＡＥ。Ｐａｒａ  Ｕ又はＰａｒａ  Ｖの方法であって、前記核ドナー細胞が体細胞である。
【０１８６】
Ｐａｒａ  ＡＦ。Ｐａｒａ  Ｕ又はＰａｒａ  Ｖの方法であって、前記核ドナー細胞が、胎児筋細胞、線維芽細胞、内皮細胞、肝臓細胞からなる群から選択される。
【０１８７】
Ｐａｒａ  ＡＧ。Ｐａｒａ  Ｕ又はＰａｒａ  Ｖの方法であって、前記核ドナー細胞がブタから単離される。
【０１８８】
Ｐａｒａ  ＡＨ。Ｐａｒａ  ＡＧの方法であって、前記ブタが１０週齢未満、８週齢未満、６週齢未満、５週齢未満、４週齢未満、３週齢未満、２週齢未満、又は１週齢未満である。
【０１８９】
Ｐａｒａ  ＡＩ。Ｐａｒａ  Ｕ又はＰａｒａ  Ｖの方法であって、前記核ドナー細胞中のＰＥＲＶ要素の少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％が不活性である。
【０１９０】
Ｐａｒａ  ＡＪ。Ｐａｒａ  Ｕ又はＰａｒａ  Ｖの方法であって、前記核ドナー細胞中の前記ＰＥＲＶ要素の１００％が不活性である。
【０１９１】
Ｐａｒａ  ＡＫ。Ｐａｒａ  Ｕ又はＰａｒａ  Ｖの方法であって、前記ＰＥＲＶ不活化ブタは、妊娠後少なくとも１ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも５年、少なくとも１０年にわたって同じ又は同様のレベルのＰＥＲＶ不活化を維持する。
【０１９２】
Ｐａｒａ  ＡＬ。Ｐａｒａ  Ｕ又はＰａｒａ  Ｖの方法であって、前記ＰＥＲＶ不活化ブタはＰＥＲＶを含まないブタである。
【０１９３】
Ｐａｒａ  ＡＭ。Ｐａｒａ  Ｕ又はＰａｒａ  Ｖの方法であって、前記ＰＥＲＶ不活化ブタは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の不活性なＰＥＲＶ要素を有する。
【０１９４】
Ｐａｒａ  ＡＮ。Ｐａｒａ  Ｕ又はＰａｒａ  Ｖの方法であって、デアセチラーゼ阻害剤をさらに含む。
【０１９５】
Ｐａｒａ  ＡＯ。Ｐａｒａ  Ｕ又はＰａｒａ  Ｖの方法であって、少なくとも１つの野生型胚盤胞又は胚を前記サロゲートにトランスファーすることをさらに含む。
【０１９６】
Ｐａｒａ  ＡＰ。Ｐａｒａ  Ｕ〜ＡＯのいずれか１つの方法で生成された分離ブタ細胞。
【０１９７】
Ｐａｒａ  ＡＱ。Ｐａｒａｓ  Ｕ〜ＡＯのいずれか１つの方法で生成された細胞から得られた臓器又は組織。
【０１９８】
Ｐａｒａ  ＡＲ。ＰＥＲＶ不活化ブタの出生率を改善する方法であって、当該方法は：
胚盤胞又は胚を生成するため、核ドナー細胞由来の核を使用することであって、前記核ドナー細胞中のＰＥＲＶ要素の少なくとも７５％が不活性であること、及び
少なくとも１つのＰＥＲＶ不活化ブタを生成するため、前記胚盤胞又は胚を少なくとも１つのサロゲートにトランスファーすること、
をみ、ここで、流産率は、細胞内のＰＥＲＶ要素の２５％超が活性である細胞から生成された胎児の流産率と比較して、減少している。
【０１９９】
Ｐａｒａ  ＡＳ。遺伝子組み換え動物を作成する方法であって、：
胚盤胞又は胚を生成するため、核ドナー細胞由来の核を使用することであって、前記核ドナー細胞内の複数の核酸配列が改変されること、及び
前記遺伝子組み換え動物を作成するため、前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること、
を含む。
【０２００】
Ｐａｒａ  ＡＴ。ＰａｒａＡＲ又はＡＳの方法であって、前記核ドナー細胞が胎児細胞である。
【０２０１】
Ｐａｒａ  ＡＵ。Ｐａｒａ  ＡＲ又はＡＳの方法であって、前記核ドナー細胞がキメラ胎児から単離される。
【０２０２】
Ｐａｒａ  ＡＶ。Ｐａｒａ  ＡＲ又はＡＳの方法であって、前記キメラ胎児は、約１０日間、約２０日間、約３０日間、又は約３ヶ月の妊娠である。
【０２０３】
Ｐａｒａ  ＡＷ。Ｐａｒａ  ＡＶの方法であって、前記キメラ胎児が、ゲノム改変剤を使用して生成される。
【０２０４】
Ｐａｒａ  ＡＸ。Ｐａｒａ  ＡＵの方法であって、前記キメラ胎児が、接合体注射によって生成される、請求項３２に記載の方法。
【０２０５】
Ｐａｒａ  ＡＹ。Ｐａｒａ  ＡＱの方法であって、前記ゲノム改変剤は、ジンクフィンガーヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼもしくはニッカーゼ、デアミナーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼもしくはニッカーゼからなる群から選択される。
【０２０６】
Ｐａｒａ  ＡＺ。Ｐａｒａ  ＡＲ又はＡＳの方法であって、前記核ドナー細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖する。
【０２０７】
Ｐａｒａ  ＢＡ。Ｐａｒａ  ＡＺの方法であって、前記核ドナー細胞は、
の３０未満、２０未満、１０未満、５未満、又は２未満の集団倍加を受ける。
【０２０８】
Ｐａｒａ  ＢＢ。Ｐａｒａ  ＡＲ又はＡＳの方法であって、前記核ドナー細胞は体細胞である。
【０２０９】
Ｐａｒａ  ＢＣ。Ｐａｒａ  ＡＲ又はＡＳの方法であって、前記核ドナー細胞が胎児筋細胞、線維芽細胞、内皮細胞、肝細胞からなる群から選択される。
【０２１０】
Ｐａｒａ  ＢＤ。Ｐａｒａ  ＡＲ又はＡＳの方法であって、前記核ドナー細胞が、１０週齢未満、８週齢未満、６週齢未満、５週齢未満、４週齢未満、３週齢未満、２週齢未満、又は１週齢未満である動物から単離されている。
【０２１１】
Ｐａｒａ  ＢＥ。Ｐａｒａ  ＡＲ又はＡＳの方法であって、前記複数の核酸配列が不活性化、外因性核酸の挿入、内因性核酸の減算、又はそれらのいずれの組み合わせによって改変されている。
【０２１２】
Ｐａｒａ  ＢＦ。Ｐａｒａ  ＡＲ又はＡＳの方法であって、前記少なくとも約２、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、又はそれ以上の核酸配列が改変されている。
【０２１３】
Ｐａｒａ  ＢＧ。遺伝的に改変された胚盤胞又は胚の体細胞核移植（ＳＣＮＴ）による妊娠損失又は流産のリスクを予防又は軽減する方法であって、当該方法は、：
胚盤胞又は胚を生成するために、遺伝子改変された核ドナー細胞由来の核を使用すること、及び
少なくとも１つの生存可能な子孫を生成するため、前記胚盤胞又は胚をサロゲートにトランスファーすること、
を含み、ここで、妊娠損失又は流産の割合は、コントロールの妊娠損失又は流産の割合と比較して減少している。
【０２１４】
Ｐａｒａ  ＢＨ。Ｐａｒａ  ＢＧの方法であって、前記遺伝的に改変された核ドナー細胞は、複数の遺伝的改変を有する。
【０２１５】
Ｐａｒａ  ＢＩ。Ｐａｒａ  ＢＨの方法であって、前記複数の遺伝子改変は、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約３０、少なくとも約４０、少なくとも約５０、少なくとも約６０、少なくとも約７０、少なくとも約８０、少なくとも約９０、又は少なくとも約１００の遺伝子改変を含む。
【０２１６】
Ｐａｒａ  ＢＪ。Ｐａｒａ  ＢＧの方法であって、前記複数の遺伝子改変は、単一の反復遺伝子配列に対するものである。
【０２１７】
Ｐａｒａ  ＢＫ。Ｐａｒａ  ＢＧの方法であって、前記遺伝子改変の少なくとも一部が異なる遺伝子に対するものである。
【０２１８】
Ｐａｒａ  ＢＬ。Ｐａｒａ  ＢＧの方法であって、前記遺伝的に改変された核ドナー細胞は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ又はニッカーゼ、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ又はニッカーゼ、デアミナーゼ、及びＣＲＩＳＰＲ会合ヌクレアーゼ又はニッカーゼからなる群から選択されるゲノム改変剤を用いて改変されている。
【０２１９】
参照による組み込み
本明細書で言及されるすべての刊行物及び特許は、個々の刊行物又は特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、参照によりその全体が組み込まれる。
【０２２０】
本開示の特定の実施形態が議論されてきたが、上記の明細書は例示であって制限的なものではありません。本明細書及び以下の特許請求の範囲を検討することにより、開示の多くの変形が当業者に明らかになるであろう。本開示の全範囲は、特許請求の範囲、均等物の全範囲、及び明細書、ならびにそのような変形を参照することにより決定されるべきである。
【配列表フリーテキスト】
【０２２１】
【図１Ａ】
2020517301.tif 000008
【図１Ｂ】
2020517301.tif 000009
【図１Ｃ】
2020517301.tif 000010
【図１Ｄａｎｄ１Ｅ】
2020517301.tif 000011
【図２Ａ】
2020517301.tif 000012
【図２Ｂａｎｄ２Ｃ】
2020517301.tif 000013
【図２Ｄａｎｄ２Ｅ】
2020517301.tif 000014
【図３Ａ】
2020517301.tif 000015
【図３Ｂ】
2020517301.tif 000016
【図４Ａ】
2020517301.tif 000017
【図４Ｂ】
2020517301.tif 000018
【図５Ａ】
2020517301.tif 000019
【図５Ｂ】
2020517301.tif 000020
【図５Ｃ】
2020517301.tif 000021
【図６Ａ】
2020517301.tif 000022
【図６Ｂ】
2020517301.tif 000023
【図７】
2020517301.tif 000024
【図８】
2020517301.tif 000025
【図９】
2020517301.tif 000026
【図１０】
2020517301.tif 000027
【図１１Ａ】
2020517301.tif 000028
【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2020517301.tif 000032
【図１５Ａａｎｄ１５Ｂ】
2020517301.tif 000033
【図１６Ａａｎｄ１６Ｂ】
2020517301.tif 000034
【図１７Ａ．１７Ｂａｎｄ１７Ｃ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａａｎｄ３１Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020517301.tif 000051