(57)【要約】  真菌Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１株におけるインフルエンザウイルス表面タンパク質の組換え発現が提供される。組換えタンパク質は、インフルエンザワクチン組成物中で使用するためのものである。【選択図】図なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのＣ１調節配列に作動可能に連結されるインフルエンザウイルス表面タンパク質をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む、前記インフルエンザウイルス表面タンパク質を産生するために遺伝子改変されたＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１であって、前記インフルエンザウイルス表面タンパク質が、その外部ドメインおよび膜貫通ドメインを含みかつ前記Ｃ１中で膜結合タンパク質として発現される、Ｃ１。
【請求項２】
前記インフルエンザウイルス表面タンパク質が、ヘマグルチニン（ＨＡ）である、請求項１に記載のＣ１。
【請求項３】
前記発現構築物が、前記ＨＡをコードする前記核酸配列にインフレームで連結されるＣ１シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項２に記載のＣ１。
【請求項４】
前記ＨＡ亜型が、インフルエンザＡ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６、ならびにインフルエンザＢ亜型からなる群から選択される、請求項２に記載のＣ１。
【請求項５】
前記ＨＡ亜型が、インフルエンザＡ亜型Ｈ１、Ｈ２、およびＨ３、ならびにインフルエンザＢ亜型から選択されるヒトに感染する亜型である、請求項２に記載のＣ１。
【請求項６】
前記ＨＡが、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／０７（Ｈ３Ｎ２）（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７−様）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／２００６：Ｂ  Ｙａｍａｇａｔａ  ｌｉｎｅａｇｅ、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）、およびＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）からなる群から選択されるインフルエンザウイルス株に由来する、請求項２に記載のＣ１。
【請求項７】
前記少なくとも１つのＣ１調節配列が、Ｃ１プロモーターを含む、請求項１に記載のＣ１。
【請求項８】
前記Ｃ１プロモーターが、ｈｅｘ１（ウォロニンボディ）、ｃｂｈ１（セロビオヒドロラーゼ１）およびｃｈｉ１（キチナーゼ１）プロモーターからなる群から選択される、請求項７に記載のＣ１。
【請求項９】
前記Ｃ１プロモーターが、ｈｅｘ１プロモーターである、請求項７に記載のＣ１。
【請求項１０】
前記Ｃ１シグナルペプチドが、Ｇｌａ１（グルコアミラーゼ１、Ｃ１）、ＧｌａＡ（グルコアミラーゼＡ、アスペルギルス）およびＣｂｈ１（セロビオヒドロラーゼ１、Ｃ１）からなる群から選択されるタンパク質に由来するシグナルペプチドである、請求項３に記載のＣ１。
【請求項１１】
前記Ｃ１シグナルペプチドが、Ｃｂｈ１に由来する、請求項１０に記載のＣ１。
【請求項１２】
前記発現構築物が、ＨＡに融合されたＣｂｈ１シグナルペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されるｈｅｘ１プロモーターを含む、請求項１に記載のＣ１。
【請求項１３】
前記ＨＡが、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／２００６：Ｂ  Ｙａｍａｇａｔａ  ｌｉｎｅａｇｅ、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）、およびＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）からなる群から選択されるインフルエンザウイルス株に由来する、請求項１２に記載のＣ１。
【請求項１４】
前記インフルエンザウイルス表面タンパク質が、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）である、請求項１に記載のＣ１。
【請求項１５】
前記ＮＡ亜型が、インフルエンザＡ−Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８およびＮ９ならびにインフルエンザＢ亜型からなる群から選択される、請求項１４に記載のＣ１。
【請求項１６】
前記ＮＡ亜型が、インフルエンザＡ亜型Ｎ１およびＮ２ならびにインフルエンザＢ亜型から選択されるヒトに感染する亜型である、請求項１４に記載のＣ１。
【請求項１７】
前記発現構築物が、ＮＡをコードする核酸配列に作動可能に連結されるｈｅｘ１プロモーターを含む、請求項１４に記載のＣ１。
【請求項１８】
前記ＮＡが、前記インフルエンザウイルス株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）由来である、請求項１７に記載のＣ１。
【請求項１９】
前記Ｃ１株が、Ｗ１Ｌ＃１００Ｉ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１Δｃｈｉ１Δａｌｐ２Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１５３、ＵＶ１８−１００ｆ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１、Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１４７、Ｗ１Ｌ＃１００Ｉ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１Δｃｈｉ１Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１４９、およびＵＶ１８−１００ｆ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１Δｐｅｐ４Δａｌｐ２、Δｐｒｔ１Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１４３からなる群から選択される、請求項１に記載のＣ１。
【請求項２０】
インフルエンザウイルス表面タンパク質を産生するための方法であって、前記インフルエンザウイルス表面タンパク質を発現するのに好適な条件下で請求項１に記載のＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１を培養すること、および前記インフルエンザウイルス表面タンパク質を回収することを含む、方法。
【請求項２１】
前記インフルエンザウイルス表面タンパク質を回収することが、菌糸体からの抽出を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１中で膜結合インフルエンザウイルス表面タンパク質を発現するための発現構築物であって、インフルエンザウイルス表面タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結される少なくとも１つのＣ１調節配列を含み、前記インフルエンザウイルス表面タンパク質が、その外部ドメインおよび膜貫通ドメインを含む、発現構築物。
【請求項２３】
請求項１に記載の改変Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１によって産生される実質的に純粋な、組換えインフルエンザウイルス表面タンパク質であって、純度９５％以上に精製されならびに活性でかつ免疫原性であり、かつワクチンとして使用される場合に防御免疫応答を誘導する、インフルエンザウイルス表面タンパク質。
【請求項２４】
請求項１に記載の改変Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１に産生されるインフルエンザウイルス表面タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌類Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ中での組換えインフルエンザウイルス表面タンパク質の産生に関する。組換えタンパク質は、インフルエンザワクチン組成物中で使用するためのものである。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、マイナス一本鎖のセグメント化されたＲＮＡゲノムを有する脂質エンベロープウイルスである。ビリオンのエンベロープは、ヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼの２種類の表面糖タンパク質を含み、これらはウイルス感染に不可欠な役割を果たす。ヘマグルチニン（ＨＡ）は、ウイルスの宿主細胞への付着および膜融合によるウイルス侵入を媒介する。ノイラミニダーゼ（ＮＡ）は、新しい子孫の放出およびそれらの凝集の防止に重要な役割を果たす酵素である。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、それらの核タンパク質および基質タンパク質の違いに基づいて、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型に分類される。各型は、それらの表面に存在するＨＡとＮＡとの組み合わせに従って、亜型にさらに分類される。インフルエンザＡウイルスについては、ＨＡの１６の亜型およびＮＡの９の亜型が特定されており、そのうち３つのＨＡ亜型（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）および２つのＮＡ亜型（Ｎ１およびＮ２）がヒトにおいてよく発見される。インフルエンザＢウイルスについては、ＨＡの１つの亜型およびＮＡの１つの亜型のみが認識される。
【０００４】
インフルエンザウイルス株の命名法に関する世界保健機関のガイドラインは次のとおりである。まず、ウイルスの型（Ａ、Ｂ、またはＣ）、次に宿主（非ヒトの場合）、分離された場所、分離された番号、分離された年（スラッシュで区切られる）が指定される。インフルエンザＡでは、ＨＡおよびＮＡ亜型は括弧内に記載される。例えば、多くの場合インフルエンザワクチンに含まれる株は、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）である。
【０００５】
毎年インフルエンザシーズン前での高リスクの個人に対するワクチン接種は、インフルエンザの影響を減少させるための最も効果的な手段である。最も一般的なインフルエンザワクチンは、トリの受精卵を使用して産生した不活化ウイルス粒子で構成されている。各インフルエンザシーズンに先立って、特別委員会が、これから来るインフルエンザシーズンに襲来する可能性が最も高いウイルスを表すと考える３つのウイルス株を選択する。選択されたウイルスのサンプルは、所望の抗原特性を有する種ウイルス株として製造業者に提供される。種ウイルスは、ニワトリ受精卵に注射される。これらの卵は、インフルエンザウイルスが増殖する間にインキュベートされる。好適な期間の後に、卵を開き、卵白を採取する。このサンプルは、ウイルスを含む。ウイルスは、卵の材料から精製され、不活化される。次いで、個々のウイルス株を組み合わせて、一般的な三価インフルエンザワクチンを作製する。
【０００６】
卵でのワクチンの産生は、複数の欠点を伴う。まず、膨大な数の卵（１〜２個／用量）を必要とする。加えて、例えばインフルエンザシーズン中にワクチン組成を変更する必要がある場合、産生に時間を要し、高価であり、柔軟性に欠ける。また、卵内での産生は、結果的にウイルス収率の変動を生じ、卵タンパク質に対するアレルギー反応とも関連する。
【０００７】
卵の使用を避けるために、インフルエンザウイルスを産生する代替的方法が提案されている。これらの方法は、哺乳類細胞培養、例えばＭＤＣＫ細胞（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）またはＰＥＲＣ．６細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）内でウイルスを伝播させることによりウイルス粒子を産生することを含む。加えて、組換えヘマグルチニンおよび／またはノイラミニダーゼタンパク質の産生は、例えば、バキュロウイルス発現ベクター（Ｆｌｕｂｌｏｋ（登録商標）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．）を使用する昆虫細胞において、植物細胞（Ｍｅｄｉｃａｇｏ  Ｉｎｃ．）において、細菌系（ＶａｘＩｎｎａｔｅ）において、ならびにＮｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ（Ｉｎｔｒｅｘｏｎ／Ｎｅｕｇｅｎｅｓｉｓ）およびＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓなどの菌類において示唆されている（例えば、Ｍｕｒｕｇａｎら、２０１３年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８７：２０−２５を参照されたい）。しかし、これまでに記載された方法は比較的高価であり、かつ／またはそれらの収率は比較的低い。
【０００８】
米国特許第８，１６３，５３３号は、菌糸異核共存体を使用して多価組換えワクチンを迅速に産生するための方法および組成物について開示している。菌糸異核共存体は、病原性生物由来の抗原の多様体をコードする組換えＤＮＡ分子が導入されている２つ以上の親株の組み合わせから生成される。その結果得られるワクチンは、多価である。
【０００９】
国際公開第２０１４／１５１４８８号は、組換えヘマグルチニン配合物、特に組換えインフルエンザヘマグルチニン（ｒＨＡ）の安定性を改善し、かつその効力を維持する方法について開示している。特に、システイン残基を変異させることにより、または還元剤およびクエン酸ナトリウムを配合することにより、ｒＨＡ配合物の安定性が大いに改善され得ることが示された。
【００１０】
Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ株Ｃ１（以前はＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ株Ｃ１と命名されていた）は、１９９０年代初期に発見された糸状の好熱性真菌である。野生型Ｃ１は、自然にセルラーゼを高レベルで産生するため、商業的規模でこうした酵素を産生するのに魅力的であった。長年にわたり、Ｃ１中で追加の酵素および他の工業用タンパク質を産生するために、Ｃ１の発現系およびいくつかの改良された株が開発されている。例えば、野生型Ｃ１分離株と比較してより高いレベルでのセルラーゼ産生を特徴とする改良Ｃ１株が開発されており、「高セルラーゼ」または「ＨＣ」と称される。さらに、低レベルのセルラーゼを産生するＣ１株（「低セルラーゼ」または「ＬＣ」と称される）も開発されており、これは、より純粋な酵素の商業的産生を可能にする。
【００１１】
野生型Ｃ１は、ブダペスト条約に従って、１９９６年８月２９日に番号ＶＫＭ  Ｆ−３５００  Ｄで寄託された。ＨＣおよびＬＣ株も寄託されている。例えば、株ＵＶ１３−６は、寄託番号ＶＫＭ  Ｆ−３６３２  Ｄ、株ＮＧ７Ｃ−１９は、寄託番号ＶＫＭ  Ｆ−３６３３  Ｄ、株ＵＶ１８−２５は、寄託番号ＶＫＭ  Ｆ−３６３１  Ｄである。寄託された追加の改良Ｃ１株としては、（ｉ）ＨＣ株ＵＶ１８−１００ｆ（Δａｌｐ１Δｐｙｒ５）−寄託番号ＣＢＳ１４１１４７；（ｉｉ）ＨＣ株ＵＶ１８−１００ｆ（Δａｌｐ１Δｐｅｐ４Δａｌｐ２Δｐｙｒ５、Δｐｒｔ１）寄託番号ＣＢＳ１４１１４３；（ｉｉｉ）ＬＣ株Ｗ１Ｌ＃１００Ｉ（Δｃｈｉ１Δａｌｐ１Δａｌｐ２Δｐｙｒ５）−寄託番号ＣＢＳ１４１１５３；および（ｉｖ）ＬＣ株Ｗ１Ｌ＃１００Ｉ（Δｃｈｉ１Δａｌｐ１Δｐｙｒ５）−寄託番号ＣＢＳ１４１１４９が挙げられる。
【００１２】
米国特許第８，２６８，５８５号および米国特許第８，８７１，４９３号は、異種タンパク質またはポリペプチドを発現し、分泌するための糸状菌宿主の分野における形質転換系について開示している。また、経済的な様態で大量のポリペプチドまたはタンパク質を産生させるプロセスも開示されている。この系は、クリソスポリウム属、より具体的にはＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅの形質転換またはトランスフェクトされた真菌株およびその変異体または誘導体を含む。また、クリソスポリウムコーディング配列を含む形質転換体、ならびにクリソスポリウム遺伝子の発現調節配列も開示されている。
【００１３】
米国特許第９，１７５，２９６号は、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅの真菌宿主株について開示している。また、純度７５％以上の純粋なタンパク質の同種および／または異種の産生方法、人工タンパク質混合物の産生方法、および所望の酵素を機能的に発現する株の簡易スクリーニング方法も開示されている。米国特許第９，１７５，２９６号は、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅにおける遺伝子発現の転写制御に好適である単離されたプロモーター配列、およびＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅの真菌宿主株を単離するための方法をさらに開示しており、この方法では、プロテアーゼ分泌は、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ株ＵＶ１８〜２５のプロテアーゼ分泌の２０％未満である。 
【００１４】
費用効果が高く、かつ季節性インフルエンザワクチンの産生要件を満たす時間制約のある方法で、効果的な高収率の免疫原性タンパク質を提供する、インフルエンザワクチン組成物を産生するための改善された方法が必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明は、いくつかの態様によれば、インフルエンザウイルス表面タンパク質のヘマグルチニンおよびノイラミニダーゼを産生するために遺伝子改変されたＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ株Ｃ１を提供する。
【００１６】
本明細書に開示されるように、インフルエンザウイルス表面タンパク質は、それらの外部ドメインおよび膜貫通ドメインの両方を含む完全長の膜結合タンパク質として産生される。驚くべきことに、Ｃ１によって産生された完全長の膜結合型は機能的かつ免疫原性であるが、改変された分泌型は不活性であることがわかった。マウスモデルにおいて例示されるように、膜結合型は特に有効であり、比較的低濃度で免疫応答を誘発した。有利なことに、Ｃ１は、商業的規模の産生に適した高収率で膜結合型を産生できる。
【００１７】
したがって、本発明は、インフルエンザワクチン組成物中での使用のために、有効な免疫原性インフルエンザウイルスタンパク質を高収率で産生するための効率的なシステムを提供する。
【００１８】
一態様によれば、本発明は、少なくとも１つのＣ１調節配列に作動可能に連結されるインフルエンザウイルス表面タンパク質をコードする核酸配列を含む発現構築物を含む、インフルエンザウイルス表面タンパク質を産生するために遺伝子改変されたＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１を提供し、インフルエンザウイルス表面タンパク質は、その外部ドメインおよび膜貫通ドメインを含み、かつＣ１内で膜結合タンパク質として発現される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルス表面タンパク質はヘマグルチニン（ＨＡ）である。これらの実施形態によれば、発現構築物は、ＨＡをコードする核酸配列に、インフレームで連結されるＣ１シグナルペプチドをコードする核酸配列をさらに含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＨＡ亜型は、インフルエンザＡ−Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５およびＨ１６、ならびにインフルエンザＢ亜型からなる群から選択される。
【００２１】
いくつかの特定の実施形態では、ＨＡ亜型は、インフルエンザＡ亜型Ｈ１、Ｈ２およびＨ３、ならびにインフルエンザＢ亜型から選択されるヒトに感染する亜型である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＨＡは、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／０７（Ｈ３Ｎ２）（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７−様）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／２００６：Ｂ  Ｙａｍａｇａｔａ  ｌｉｎｅａｇｅ、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）、およびＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）からなる群から選択されるインフルエンザウイルス株に由来する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＣ１調節配列は、Ｃ１プロモーターを含む。いくつかの実施形態では、Ｃ１プロモーターは、ｈｅｘ１（ウォロニンボディ）、ｃｂｈ１（セロビオヒドロラーゼ１）およびｃｈｉ１（キチナーゼ１）プロモーターからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの特定の実施形態では、Ｃ１プロモーターは、ｈｅｘ１プロモーターである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、Ｃ１シグナルペプチドは、Ｃｂｈ１（セロビオヒドロラーゼ１、Ｃ１）、Ｇｌａ１（グルコアミラーゼ１、Ｃ１）およびＧｌａＡ（グルコアミラーゼＡ、アスペルギルス）からなる群から選択されるタンパク質由来のシグナルペプチドである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの特定の実施形態では、Ｃ１シグナルペプチドは、Ｃｂｈ１に由来する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、発現構築物は、ＨＡに融合されたＣｂｈ１シグナルペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されるｈｅｘ１プロモーターを含む。これらの実施形態によれば、ＨＡは、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／２００６：Ｂ  Ｙａｍａｇａｔａ  ｌｉｎｅａｇｅ、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）、およびＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）からなる群から選択されるインフルエンザウイルス株に由来する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルス表面タンパク質は、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＮＡ亜型は、インフルエンザＡ−Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８およびＮ９ならびにインフルエンザＢ亜型からなる群から選択される。
【００２８】
いくつかの特定の実施形態では、ＮＡ亜型は、インフルエンザＡ亜型Ｎ１およびＮ２、ならびにインフルエンザＢ亜型から選択されるヒトに感染する亜型である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００２９】
いくつかの実施形態では、発現構築物は、ＮＡをコードする核酸配列に作動可能に連結されるｈｅｘ１プロモーターを含む。これらの実施形態によれば、ＮＡは、インフルエンザウイルス株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）由来である。
【００３０】
いくつかの実施形態では、Ｃ１株は、以下からなる群から選択される：Ｗ１Ｌ＃１００Ｉ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１Δｃｈｉ１Δａｌｐ２Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１５３、ＵＶ１８−１００ｆ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１、Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１４７、Ｗ１Ｌ＃１００Ｉ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１Δｃｈｉ１Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１４９、およびＵＶ１８−１００ｆ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１Δｐｅｐ４Δａｌｐ２、Δｐｒｔ１Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１４３。いくつかの特定の実施形態では、Ｃ１株は、Ｗ１Ｌ＃１００Ｉ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１Δｃｈｉ１Δａｌｐ２Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１５３である。追加の特定の実施形態では、Ｃ１株は、ＵＶ１８−１００ｆ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１、Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１４７である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、Ｃ１株は、内因性プロテアーゼをコードする１つ以上の遺伝子を削除するために変異された株である。いくつかの実施形態では、Ｃ１株は、内因性キチナーゼをコードする遺伝子を削除するために変異された株である。
【００３２】
さらなる態様によれば、本発明は、インフルエンザウイルス表面タンパク質を産生するための方法を提供し、本方法は、インフルエンザウイルス表面タンパク質の発現に好適な条件下で、本発明の遺伝的改変されたＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１を培養すること、およびインフルエンザウイルス表面タンパク質を回収することを含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、インフルエンザウイルス表面タンパク質の回収は、菌糸体からの抽出を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、回収されたタンパク質の収率は少なくとも８０％である。特定の例示的な実施形態によれば、収率は８０％である。
【００３５】
別の態様によれば、本明細書では、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１中で膜結合インフルエンザウイルス表面タンパク質を発現するための発現構築物、インフルエンザウイルス表面タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結される少なくとも１つのＣ１調節配列を含む発現構築物が提供され、インフルエンザウイルス表面タンパク質は、その外部ドメインおよび膜貫通ドメインを含む。
【００３６】
さらに別の態様によれば、本明細書では、本発明の改変Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１によって産生される実質的に純粋な組換えインフルエンザウイルス表面タンパク質が提供され、インフルエンザウイルス表面タンパク質は純度９５％以上に精製され、かつ活性および免疫原性があり、ワクチンとして使用されるときに防御免疫応答を誘導する。
【００３７】
本明細書でさらに提供されるのは、本発明の改変Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１が産生したインフルエンザウイルス表面タンパク質を含むインフルエンザワクチン組成物である。
【００３８】
本発明のこれらのおよびさらなる態様および特徴は、以下の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１Ａ】設計され、試験が行われた発現構築物を示す図である。ヘマグルチニン（ＨＡ）、第１のシリーズＰ＝プロモーター、ｓｓ＝シグナル配列、Ｔ＝ターミネーター。各構築物に含まれるＨＡ型は、太字でマークされている。
【図１Ｂ】設計され、試験が行われた発現構築物を示す図である。ヘマグルチニン（ＨＡ）、第１のシリーズＰ＝プロモーター、ｓｓ＝シグナル配列、Ｔ＝ターミネーター。各構築物に含まれるＨＡ型は、太字でマークされている。
【図２Ａ】設計され、試験が行われた発現構築物を示す図である。ヘマグルチニ（ＨＡ）、第２のシリーズＰ＝プロモーター、ｓｓ＝シグナル配列、Ｔ＝ターミネーター。各構築物に含まれるＨＡ型は、太字でマークされている。
【図２Ｂ】設計され、試験が行われた発現構築物を示す図である。ヘマグルチニ（ＨＡ）、第２のシリーズＰ＝プロモーター、ｓｓ＝シグナル配列、Ｔ＝ターミネーター。各構築物に含まれるＨＡ型は、太字でマークされている。
【図２Ｃ】構築物Ｐｈｅｘ１−ｓｓＣｂｈ−ＮＣ−ＴＭＤ−Ｔｃｂｈ１を含む発現ベクターの図である。
【図２Ｄ】形質転換に使用される断片の図である。
【図３】設計され、試験が行われた発現構築物を示す図である。ヘマグルチニン（ＨＡ）、第３のシリーズＰ＝プロモーター、ｓｓ＝シグナル配列、Ｔ＝ターミネーター。各構築物に含まれるＨＡ型は、太字でマークされている。
【図４】設計され、試験が行われた発現構築物、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）の図である。Ｐ＝プロモーター、ｓｓ＝シグナル配列、Ｔ＝ターミネーター。各構築物に含まれるＮＡは太字でマークされている。
【図５】略語リストを示す図である。
【図６】Ｃ１中で異種タンパク質を産生させるための例示的な発現ベクターを示す図である。
【図７】ＴＭＤ含有ＨＡの精製手順を示す図である。
【図８】ＨＡが細胞内に局在しているか、細胞壁に付着しているかを区別するための分画検査のフローチャートである。
【図９】ｒＨＡ−ＴＭＤの生化学的評価の図である。
【図１０Ａ】マウスへの注射後、２７日目（図１０Ａ）およびＤ４９（図１０Ｂ）にＣ１中で産生されたＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）に対して誘発された抗体応答である。
【図１０Ｂ】マウスへの注射後、２７日目（図１０Ａ）およびＤ４９（図１０Ｂ）にＣ１中で産生されたＡ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）に対して誘発された抗体応答である。
【図１１】攪拌槽発酵を使用するＣ１中のＨＡ産生のウエスタンブロット分析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本発明は、真菌Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ、特にＣ１株中でのインフルエンザウイルス表面タンパク質の組換え発現に関する。本発明は、いくつかの実施形態によれば、インフルエンザウイルス表面タンパク質を発現する遺伝子改変Ｃ１細胞、およびそれを使用してインフルエンザワクチン組成物を産生するための方法を提供する。
【００４１】
ここで、Ｃ１中で産生されるインフルエンザ抗原は、マウスにおいて、業界標準の抗原と同等であるかまたはそれ以上の免疫応答を生じることが開示される。
【００４２】
本明細書で使用される「Ｃ１」または「Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１」は、ブダペスト条約に基づいて寄託されたＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１株（以前はＣｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ株Ｃ１と以前に命名された、寄託番号ＶＫＭ  Ｆ−３５００  Ｄ、寄託日１９９６年８月２９日）を指す。これらの用語は、例えば、１つ以上の内因性遺伝子を削除するために変異された、遺伝子改変されたその亜株も包含する。例えば、Ｃ１株（亜株）は、内因性プロテアーゼをコードする１つ以上の遺伝子および／または内因性キチナーゼをコードする１つ以上の遺伝子を削除するように変異された株であり得る。例えば、本発明によって包含されるＣ１株としては、Ｗ１Ｌ＃１００Ｉ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１Δｃｈｉ１Δａｌｐ２Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１５３、ＵＶ１８−１００ｆ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１、Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１４７、Ｗ１Ｌ＃１００Ｉ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１Δｃｈｉ１Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１４９、およびＵＶ１８−１００ｆ（ｐｒｔ−Δａｌｐ１Δｐｅｐ４Δａｌｐ２、Δｐｒｔ１Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１４３が挙げられる。
【００４３】
近年の論文（Ｍａｒｉｎ−Ｆｅｌｉｘら、２０１５年、Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａ、３：６１９−６３）は、温度の上昇、培養中の性的形態、分生子の特性などのいくつかの基準に基づいて、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ属の分割を提唱したことに留意されたい。提唱された基準によれば、Ｃ１は、Ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ属ヘテロタリック／サーモフィラに属する。したがって、Ｍａｒｉｎ−Ｆｅｌｉｘの論文によれば、Ｃ１の更新名はＴｈｅｒｍｏｔｈｅｌｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ株Ｃ１である。
発現構築物
【００４４】
「発現構築物」、「ＤＮＡ構築物」または「発現カセット」という用語は、本明細書において同義的に使用され、目的タンパク質をコードする核酸配列を含み、かつ目的タンパク質が標的宿主細胞で発現されるように組み立てられる、人工的に組み立てられたかまたは単離された核酸分子を指す。発現構築物は、典型的には、目的タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結される適切な調節配列を含む。発現構築物は、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含み得る。
【００４５】
「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書において、別個の断片の形態でのまたはより大きい構築物の一成分としてのデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、およびそれらの修飾形態のポリマーを指すために使用される。核酸配列は、コード配列、すなわち、タンパク質などの、細胞中の最終産物をコードする配列であり得る。核酸配列は、例えばプロモーターなどの、調節配列であってもよい。
【００４６】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では、アミノ酸残基のポリマーを指すために使用される。「ペプチド」という用語は典型的には、２〜５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示し、「タンパク質」は５０個を超えるアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を示す。
【００４７】
参照配列に対して「相同」である配列（核酸配列およびアミノ酸配列など）は、本明細書では配列間の同一性パーセントを指し、同一性パーセントは、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。相同核酸配列は、コドン使用法および遺伝暗号の縮重に関連する変化形態を含む。
【００４８】
配列同一性は、当該分野で公知のとおり、ヌクレオチド／アミノ酸配列比較アルゴリズムを使用して決定され得る。
【００４９】
用語「調節配列」は、プロモーターおよびターミネーターなどの、コード配列の発現（転写）を制御するＤＮＡ配列を指す。
【００５０】
用語「プロモーター」は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで別のＤＮＡ配列の転写を制御するかまたは指示する調節ＤＮＡ配列に関する。通常、プロモーターは、転写される配列の５’領域に配置される（すなわち、先立って、上流に配置される）。プロモーターは、その全体において天然の供給源に由来するか、または自然界に見られる異なるプロモーターに由来する異なる要素で構成されるか、またはさらに合成ヌクレオチドセグメントを含み得る。プロモーターは、構成的（すなわち、プロモーター活性化は誘導剤によって調節されず、したがって転写速度は一定である）であるか、または誘導性（すなわち、プロモーター活性化は誘導剤によって調節される）であり得る。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は完全に定義されておらず、場合によっては完全に定義できないため、いくつかの変化形態のＤＮＡ配列は、同一のプロモーター活性を有し得る。
【００５１】
用語「ターミネーター」は、転写終結を調節する別の調節ＤＮＡ配列に関する。ターミネーター配列は、転写される核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。
【００５２】
用語「Ｃ１プロモーター」および「Ｃ１ターミネーター」は、Ｃ１中での使用に好適である、すなわちＣ１中で遺伝子発現を指示できるプロモーター配列およびターミネーター配列を示す。いくつかの実施形態によれば、Ｃ１プロモーター／ターミネーターは、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１の内因性遺伝子に由来する。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ１プロモーターは、ｈｅｘ１（ウォロニンボディ）プロモーターである。例示的なｈｅｘ１プロモーター配列は、配列番号１として示される。さらなる実施形態では、Ｃ１プロモーターは、ｃｈｉ１（キチナーゼ１）プロモーターである。例示的ｃｈｉ１プロモーター配列は、配列番号２として示される。
【００５３】
いくつかの実施形態によれば、Ｃ１プロモーター／ターミネーターは、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１に対して外因性の遺伝子に由来する。例えば、ｂｇｌプロモーターが使用され得る。
【００５４】
「作動可能に連結される」という用語は、選択された核酸配列が調節エレメント（プロモーターまたはターミネーター）に近接しており、調節エレメントが、選択された核酸配列の発現を調節できることを意味する。
【００５５】
「シグナルペプチド」または「シグナル配列」という用語は、本明細書では同義的に使用され、典型的には、タンパク質を宿主細胞中の分泌経路に導く、新たに合成されたポリペプチド鎖のＮ末端に存在する短いペプチド（通常５〜３０アミノ酸長）を指す。典型的には、シグナルペプチドは、その後除去される。「Ｃ１シグナルペプチド」は、Ｃ１との使用に好適である、すなわちＣ１で発現したタンパク質を指示してＣ１の分泌経路に向けることができるシグナルペプチドを示す。いくつかの実施形態によれば、Ｃ１シグナルペプチドは、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１の内因性遺伝子に由来する。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ１シグナルペプチドは、Ｇｌａ１（グルコアミラーゼ１、Ｃ１）由来のシグナルペプチドである。Ｇｌａ１シグナルペプチドをコードする例示的配列は、配列番号２３の１位〜２０位に示される。さらなる実施形態では、Ｃ１シグナルペプチドは、Ｃｂｈ１（セロビオヒドロラーゼ１、Ｃ１）由来のシグナルペプチドである。Ｃｂｈ１シグナルペプチドをコードする例示的配列は、配列番号３に示される。
【００５６】
いくつかの実施形態によれば、Ｃ１シグナルペプチドは、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ  Ｃ１に対して外因性の遺伝子に由来する。例えば、いくつかの実施形態では、Ｃ１シグナルペプチドは、ＧｌａＡ（グルコアミラーゼＡ、アスペルギルス）に由来する。ＧｌａＡシグナルペプチドをコードする例示的配列は、配列番号２４の１位〜１８位に示される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「インフレーム」は、１つ以上の核酸配列を指す場合、これらの配列が、正しいリーディングフレームを保持するように連結されることを示す。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態による発現構築物は、インフレームで融合されるＣ１シグナルペプチドおよびインフルエンザウイルス表面タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結されるＣ１プロモーター配列およびＣ１ターミネーター配列を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、発現構築物は、インフルエンザウイルス表面タンパク質に融合されその分泌を促進する担体タンパク質をコードする核酸配列を含まない。
【００６０】
特定の発現構築物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限エンドヌクレアーゼ分解、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアセンブリ法、遺伝子合成法、またはそれらの組み合わせなどの従来の分子生物学的方法を含むさまざまな方法によって組み立てられ得る。
インフルエンザウイルス表面タンパク質
【００６１】
「ＨＡ」と略されるヘマグルチニンは、宿主細胞上のシアル酸含有受容体を介してウイルスの宿主細胞への付着を媒介するＩ型膜糖タンパク質である。ＨＡ分子は、ホモ三量体としてウイルス中に存在する。各単量体は一般に、ＨＡ１およびＨＡ２と呼ばれる２つのドメインを含み、ＨＡ２ドメインは、膜貫通領域（これがＨＡタンパク質をウイルス膜に接続する）、および小さい細胞質尾部を含む。単量体は、ＨＡ０と呼ばれる７５ｋＤａの前駆体タンパク質として合成され、ウイルスの表面で三量体タンパク質へと組み立てられる。シグナルペプチドは、ＨＡ０を指示して宿主細胞の分泌経路に向け、成熟タンパク質中には存在しない。活性であるためには、ＨＡ０前駆体は宿主の細胞プロテアーゼによって切断される必要がある。切断後に、ＨＡ１およびＨＡ２ドメインに対応する２つのサブユニットが生成され、ジスルフィド結合によって連結される（かつウイルスの表面に固定される）。
【００６２】
特に定義しない限り、本明細書で使用する「ヘマグルチニン」または「ＨＡ」という用語は、インフルエンザウイルスヘマグルチニン、特にウイルス粒子、膜貫通ドメイン、および細胞質尾部の外側に伸びる外部ドメインを含む完全長タンパク質を指す。この用語は、ＨＡ０非切断型および成熟ＨＡ１＋ＨＡ２型を含む。
【００６３】
本発明のＨＡの亜型は、インフルエンザＡ亜型Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、またはＨ１６であり得る。ＨＡ亜型は、インフルエンザＢ亜型でもある。特定の実施形態では、ＨＡ亜型は、ヒトに感染する亜型である。いくつかの実施形態では、ＨＡ亜型は、インフルエンザＡ亜型Ｈ１、Ｈ２およびＨ３から選択される。追加の特定の実施形態では、ＨＡ亜型はインフルエンザＢ亜型である。
【００６４】
「ＮＡ」と略されるノイラミニダーゼは、宿主細胞からの新しいウイルスの子孫の放出を媒介するＩＩ型膜結合酵素である。それはウイルス表面に、それぞれが一般に細胞質ドメイン、膜貫通ドメイン、ストークドメイン、および酵素活性部位を担持する球状ヘッドドメインを含む、４つの同一のモノマーの四量体として存在する。別に定義されない限り、本明細書で使用される「ノイラミニダーゼ」または「ＮＡ」という用語は、完全長タンパク質を指す。
【００６５】
本発明のＮＡの亜型は、インフルエンザＡ亜型Ｎ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８もしくはＮ９、またはインフルエンザＢ亜型であり得る。特定の実施形態では、ＮＡ亜型は、ヒトに感染する亜型である。いくつかの実施形態では、ＮＡ亜型は、インフルエンザＡ亜型Ｎ１およびＮ２から選択される。追加の特定の実施形態では、ＮＡ亜型は、インフルエンザＢ亜型である。
【００６６】
様々なインフルエンザウイルス株のＨＡおよびＮＡのヌクレオチド配列およびタンパク質配列は、例えば、国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のデータベースで公開されている。ＨＡおよびＮＡ遺伝子／タンパク質の例示的な配列としては、インフルエンザ株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｕｒｕｇｕａｙ／７１６／０７（Ｈ３Ｎ２）（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／１０／０７−様）、Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／２００６：Ｂ  Ｙａｍａｇａｔａ  ｌｉｎｅａｇｅ、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）、およびＡ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）由来のものが挙げられる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６７】
ＨＡおよびＮＡの遺伝的改変多様体はまた、「ユニバーサル」ＨＡおよびＮＡと示される多様体などの、本発明に従うＣ１に改変され得る。ユニバーサルＨＡおよびＮＡは、例えばＣａｒｔｅｒら、（２０１６年）Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｂｒｏａｄｌｙ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒ  Ｈ１Ｎ１  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．９０（９）．４７２０−３４に記載されているように、複数のインフルエンザ株に対する保護を刺激する交差反応性抗原である。
【００６８】
インフルエンザウイルス表面タンパク質は、それらの外部ドメインおよび膜貫通ドメインを含む膜結合タンパク質として、本発明に従ってクローン化され、発現される。本発明のクローン化されたＨＡ／ＮＡ遺伝子は典型的には、天然のシグナルペプチドをＣ１シグナルペプチドで置換することにより改変される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、ＨＡは、インフルエンザウイルス株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（「ＨＡ  Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ」）由来である。天然シグナルペプチドを含まず、膜貫通ドメインを有するＨＡ  Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａのアミノ酸配列は、配列番号４として示される。天然シグナルペプチドを含まず、膜貫通ドメインを有するＨＡ  Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５として示される。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ＨＡは、インフルエンザウイルス株Ａ／Ｔｅｘａｓ／５０／２０１２（Ｈ３Ｎ２）（「ＨＡ  Ｔｅｘａｓ」）由来である。天然シグナルペプチドを含まず、膜貫通ドメインを有するＨＡ  Ｔｅｘａｓのアミノ酸配列は、配列番号６として示される。天然シグナルペプチドを含まず、膜貫通ドメインを有するＨＡ  Ｔｅｘａｓをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７として示される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、ＨＡは、インフルエンザウイルス株Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／０８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）（「ＨＡ  Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ」）に由来する。天然シグナルペプチドを含まず、膜貫通ドメインを有するＨＡ  Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏのアミノ酸配列は、配列番号８として示される。天然シグナルペプチドを含まず、膜貫通ドメインを有するＨＡ  Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏをコードするヌクレオチド配列は、配列番号９として示される。
【００７２】
いくつかの実施形態では、ＨＡは、インフルエンザウイルス株Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／０４／２００６：Ｂ  Ｙａｍａｇａｔａ  ｌｉｎｅａｇｅ（「ＨＡ  Ｆｌｏｒｉｄａ」）に由来する。天然シグナルペプチドを含まず、膜貫通ドメインを有するＨＡ  Ｆｌｏｒｉｄａのアミノ酸配列は、配列番号１０として示される。天然シグナルペプチドを含まず、膜貫通ドメインを有するＨＡ  Ｆｌｏｒｉｄａをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１１として示される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、ＨＡは、インフルエンザウイルス株Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）（「ＨＡ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ」）由来である。天然のシグナルペプチドを含まず、膜貫通ドメインを有するＨＡ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａのアミノ酸配列は、配列番号１２として示される。天然シグナルペプチドを含まず、膜貫通ドメインを有するＨＡ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３として示される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ＮＡは、インフルエンザウイルス株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）（「ＮＡ  Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ」）由来である。ＮＡ  Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａの完全長のアミノ酸配列は、配列番号１４として示される。完全長のＮＡ  Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１５として示される。
【００７５】
Ｃ１中での発現の場合、クローン化されたＨＡ／ＮＡ遺伝子は好ましくは、Ｃ１の発現のために最適化されたコドンであり、これは、クローン化された遺伝子が、Ｃ１のコドン使用頻度を用いて、目的のインフルエンザウイルス表面タンパク質のアミノ酸配列に基づき設計されることを意味する。
【００７６】
特定の例示的な実施形態によれば、遺伝子は、Ｃ１プロモーターおよびＣ１ターミネーターの下でクローニングされる。
【００７７】
Ｃｈｈシグナル配列を有する、ｈｅｘ１プロモーターおよびｃｂｈ１ターミネーター下の膜貫通ドメインを有するＨＡ  Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａをコードする例示的な発現構築物は、配列番号１６として示される。ＨＡをコードする配列は、配列番号１６の２９２０位〜４５６３位に対応する。このセグメントは、異なるＨＡタンパク質またはＮＡタンパク質をコードする発現構築物を得るために、異なるＨＡタンパク質またはＮＡタンパク質をコードするヌクレオチド配列で置き換えられてもよい。
【００７８】
配列番号１６として示される発現構築物を含む例示的な発現ベクターは、配列番号１７として示され、図２Ｃに示される。
遺伝子操作Ｃ１
【００７９】
本発明によるインフルエンザウイルス表面タンパク質を産生させるために遺伝子操作されたＣ１細胞は、上記のように、インフルエンザウイルス表面タンパク質をコードする核酸を含む発現構築物をＣ１細胞、特にＣ１細胞の核に導入することにより生成される。特に、本発明による遺伝子改変は、発現構築物の宿主ゲノムへの組み込みを意味する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、Ｃ１は、単一のインフルエンザウイルスタンパク質を産生するために遺伝子操作される。他の実施形態では、Ｃ１は、複数の異なるインフルエンザウイルスタンパク質を産生するために遺伝子操作される。「複数」は、少なくとも２つを示す。
【００８１】
発現構築物のＣ１細胞への導入、すなわちＣ１の形質転換は、糸状菌を形質転換するための当技術分野で公知の方法により実施できる。例えば、形質転換は、当該技術分野で既知であり、以下の実施例セクションにも記載されるプロトプラスト形質転換法を用いて実施できる。 
【００８２】
形質転換された細胞の容易な選択を促進するために、選択マーカーをＣ１細胞中に形質転換しもよい。「選択マーカー」は、抗生物質耐性（耐性マーカー）、特定のリソースを利用する能力（利用／栄養要求性マーカー）、または、例えばスペクトル測定により検出できるレポータータンパク質の発現などの、非形質転換細胞に存在しない特定の型の表現型を付与する遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを示す。栄養要求性マーカーは典型的に、食品または医薬品業界での選択手段として好ましい。選択マーカーは、発現構築物と同時形質転換された別個のポリヌクレオチド上に、または発現構築物の同じポリヌクレオチド上にあり得る。
【００８３】
形質転換後、例えば、選択された選択マーカーに従う選択培地でＣ１細胞を培養することにより、陽性形質転換体が選択される。
【００８４】
目的タンパク質の発現は、標準的な方法を用いて検出され得る。この検出は、例えば、様々なタイプの染色によりまたは免疫学的方法により、タンパク質自体を検出することによって、または、例えば赤血球凝集アッセイにより、その活性を検出することによって実施され得る。検出前に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの様々な手法を使用してタンパク質を分離できる。例示的な手順は、以下の実施例のセクションに記載される。
【００８５】
最良の産生物が選択され、発酵において適用されて、大量の望ましい遺伝子産物を産生する。
タンパク質の産生
【００８６】
タンパク質を産生するために遺伝子改変されたＣ１細胞は、インフルエンザウイルス表面タンパク質をコードする核酸の発現を可能にする条件下で培養される。振盪フラスコおよび撹拌タンク発酵の例示的な培養条件は、以下の実施例セクションで詳述する。
ワクチン組成
【００８７】
本発明によるワクチンまたは免疫原性組成物は、上記のように産生されたインフルエンザウイルス表面タンパク質および薬学的に許容される担体を含む。
【００８８】
「免疫原性」または「免疫原性の」という用語は、免疫応答を刺激または誘発する物質の能力に関する。免疫原性は、例えば、免疫学的に適格な生物に物質で負荷した後に、その物質に特異的な抗体の存在を決定することにより測定される。物質に特異的な抗体の存在およびそれらの量は、当技術分野で公知の方法により、例えばＥＬＩＳＡアッセイを使用して検出される。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、特定のインフルエンザシーズンについて、ＦＤＡによって推奨されているインフルエンザウイルスの３つの株に由来する精製ＨＡタンパク質を含む免疫剤形で配合される。機能性免疫は、インフルエンザヘマグルチニンに結合する抗体、インフルエンザウイルスの赤血球凝集能をブロックする抗体、またはインフルエンザウイルスを中和する抗体を定量化するアッセイを使用して測定できる。組換えＨＡワクチンによる防御免疫応答は、インフルエンザ感染の影響を受けやすい動物またはヒトのチャレンジ試験でも測定できる。
【００９０】
本発明のワクチンは、組換えＨＡおよび／またはＮＡタンパク質、ならびに任意によりアジュバントを含む。驚くべきことに、以下に例示するように、本発明に従ってＣ１中で産生された組換えＨＡタンパク質は、アジュバントを含まずに投与された場合でもマウスにおいて体液性応答を誘発することが見出された。
【００９１】
ワクチンは、筋肉内、鼻腔内、皮内、経口、腹腔内、皮下、または経皮投与モードを含む、多くの異なるモードのいずれか１つでの投与用に配合できる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、非経口投与用に配合される。いくつかの特定の実施形態では、ワクチンは、筋肉内投与用に配合される。他の特定の実施形態では、ワクチンは皮内投与用に配合される。
【００９３】
追加の特定の実施形態では、ワクチンは、粘膜送達、特に鼻腔内送達用に配合される。
【００９４】
ワクチン組成物は、安定剤、緩衝液、または防腐剤を含む、様々な賦形剤を含んでよい。
【００９５】
いくつかの実施形態によれば、本発明によるワクチン組成物はアジュバントを含まない。
【００９６】
いくつかの用途では、薬学的に許容されるアジュバントをワクチン配合物に含めることができる。アジュバントの選択は、ワクチンの投与モードによって一部には決定される。
【００９７】
鼻腔内アジュバントの非限定的な例としては、キトサン粉末、ＰＬＡおよびＰＬＧミクロスフェア、ＱＳ−２１、リン酸カルシウムナノ粒子（ＣＡＰ）およびｍＣＴＡ／ＬＴＢ（熱不安定性エンテロトキシンの五量体Ｂサブユニットを含む変異コレラ毒素Ｅ１１２Ｋ）が挙げられる。
【００９８】
他の投与モードのアジュバントの例としては、ゲル形態の無機アジュバント（水酸化アルミニウム／リン酸アルミニウム）、リン酸カルシウム、細菌アジュバント（モノホスホリルリピドＡおよびムラミルペプチドなど）、微粒子アジュバント（ＩＳＣＯＭＳ（「免疫刺激複合体」）、リポソーム、生分解性ミクロスフェアなど）、油エマルジョンおよび乳化剤をベースとしたアジュバント（例えば、ＩＦＡ（「不完全フロイントアジュバント」）、ＳＡＦ（「Ｓｙｎｔｅｘ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ」）、サポニン（ＱＳ−２１など）、スクアレン／スクアラン）、合成アジュバント（例えば、非イオン性ブロック共重合体、ムラミルペプチド類似体、合成リピドＡ、合成ポリヌクレオチドおよびポリカチオン性アジュバント）が挙げられる。
【００９９】
アジュバントは、アジュバント、宿主動物、免疫原によって異なり得るアジュバント量で利用される。典型的な量は、免疫ごとに約１マイクログラム〜約１ｍｇで変化し得る。当業者は、適切な濃度または量が容易に決定できることをわかっている。
【表１】
2020533966.tif 000002
2020533966.tif 000003
【０１００】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をより完全に例解するために提示される。しかし、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された原理の多くの変形および修正を容易に考案することができる。
実施例
実施例１−Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ（Ｃ１）中でのヘマグルチニン（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）の発現
【０１０１】
Ｃ１中での様々なインフルエンザウイルス株の組換えＨＡタンパク質の発現のために、いくつかの一連の発現構築物を設計した。この検査で試験を行ったＨＡタンパク質のリストは、以下の表１に詳述する。発現構築物は、図１〜図４に詳述する（図１〜３−ＨＡを有する構築物；図４−ＮＡを有する構築物Ｐ＝プロモーター、ｓｓ＝シグナル配列、Ｔ＝ターミネーター）。各構築物に含まれるＨＡ型またはＮＡは、太字でマークされている。構築物の様々なエレメントを記載するために使用される略語のリストを図５に示す。構築物の産生については、以下の「材料および方法」で詳述する。
【表２】
2020533966.tif 000004
【０１０２】
最初に、ＨＡを、細胞外培地へのＨＡの分泌を促進する担体として十分に分泌されたＡ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼＡ（ＧｌａＡ）に融合した、ｃｂｈ１（セロビオヒドロラーゼ１）またはｃｈｉ１（キチナーゼ１）プロモーター下で発現した。ＨＡ遺伝子を、ＧｌａＡの触媒ドメインをコードするｇｌａＡ遺伝子の一部に融合した。ＫＥＸ２切断部位（ＶＩＳＫＲ）を、ゴルジ体中で部位が切断された後に別のＨＡタンパク質が得られるようにｇｌａＡ遺伝子とＨＡ遺伝子の間に設計した。構築物は、検出および精製の目的でＣ末端ＦＬＡＧタグをさらに含んだ。発現構築物のこの最初のシリーズでは、ＨＡを、膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）および細胞質尾部を含まずに発現した。
【０１０３】
発現構築物の改変体では、他の２つのプロモーターと比較して初期に誘導される初期構成的プロモーターと考えられる、ｈｅｘ１（ヘキサゴナルペルオキシソーム、ウォロニンボディ）プロモーターを試験した。
【０１０４】
ＨＡ  Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａの場合、次のように追加の構築物多様体を作製した：
−ｃｂｈ１またはｃｈｉ１プロモーターを含み、ＧｌａＡ担体タンパク質を含まないが、ＥＲへの標的のためのｃｂｈ１シグナル配列を含む構築物。
−ｃｈｉ１プロモーターおよび担体タンパク質としてＧｌａ１（Ｃ１グルコアミラーゼ１）を含む構築物。
−担体タンパク質としてＥＧ２（エンドグルカナーゼ２）を含む構築物。
−ｈｅｘ１プロモーター、ＧｌａＡ担体タンパク質を含み、ＦＬＡＧタグを含まない構築物。
【０１０５】
構築物を発現するためのＣ１宿主株を、タンパク質分解安定性アッセイに基づいて選択した。簡潔に述べると、バキュロウイルス発現系（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｅｒｉｄｅｎ  ＵＳＡ）で産生されたＨＡを、いくつかの候補Ｃ１宿主株の発酵終了（ＥＯＦ）培地でのタンパク質分解安定性について試験した（以下の表２を参照）。より少ないＨＡ分解が、試験した他の株と比較してＤ２４０株（高セルラーゼ（ＨＣ）株）およびＤ３８９（低セルラーゼ（ＬＣ）株）の培養ろ液の存在下で観察された。Ｄ２４０およびＤ３８９をしたがって、組換えＨＡを産生するための宿主株として選択した。後の実験では、Ｄ３８２もＨＡの組換え発現について試験した。
【０１０６】
形質転換を、以下の「材料および方法」に記載のとおり実施した。
【０１０７】
形質転換後に、形質転換体を収集し、９６ウェルプレートで培養した。培地を、グルコアミラーゼ（該当する場合）およびヘマグルチニンの発現についてスクリーニングした。陽性形質転換体を振盪フラスコでさらに培養し、ＨＡの発現を、ブロッティング技術およびＨＡ活性アッセイを用いて評価した。結果を図１Ａ〜図１Ｂにまとめる。
【０１０８】
得られた形質転換体の分析は、ＦＬＡＧタグ配列が省略された場合に、組換えＨＡ＿ＮＣがＣ１中でより良く発現されたことを明らかにした。ＨＡ＿ＮＣに対するモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットで示されるように、このタグを含まない場合、振盪フラスコ培養の細胞外培地中にＨＡを含む高分子量種（１３０〜１６０ｋＤａ）が検出された。信号強度に基づき、これは、大規模発酵に外挿した場合、培地中約３０ｍｇ／Ｌを表し、１０ｇ／Ｌの総細胞外タンパク質レベルに達する。ＨＡ＿ＮＣの発現レベルは、ＨＣ株でよりもＬＣ株において高かった。さらに、高レベルのＨＡは細胞内でおよび／または細胞壁に関連して見出され、これは、培地で見られるものと少なくとも同程度であると推定される。
【０１０９】
最多の発現は、ｈｅｘ１プロモーターを有する構築物を含む形質転換体で得られた。
【０１１０】
第２のシリーズの発現構築物が設計され、ＨＡのネイティブな膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）またはＴ４バクテリオファージフィブリチンからの組換えＣ末端三量体化ドメイン（Ｔ４  ｆｏｌｄｏｎドメイン）の存在について試験した。Ｔ４  ｆｏｌｄｏｎドメインを、細胞外分泌時のＨＡの安定性を促進するために追加した。８つのＧｌｙ残基（「８ｘＧ」）のリンカーを、ＨＡとＴ４  ｆｏｌｄｏｎドメインの間にクローン化した。ＴＭＤを追加して、得られたＨＡの発現レベルおよび活性に対するその効果について試験した（ＴＭＤを含むＨＡ構築物は分泌されると予想されなかったが、細胞内で見つかるか、または細胞壁に関連付けられる）。さらに、ＨＡとＧｌａＡ担体の間に５つのＧｌｙ残基（「５ｘＧ」）のストレッチを含む改変ＫＥＸ２タンパク質分解部位を、こうした改変リンカーがより高いレベルの別個のＨＡタンパク質を得ることをもたらし得るかを調べるために試験した。このシリーズに使用したプロモーターは、前のシリーズでこのプロモーターを使用して得られたより強い発現に基づき、ｈｅｘ１であった。これらのシリーズの様々な構築物については、図２Ａ〜図２Ｂに詳述する。図２Ｃは、構築物Ｐｈｅｘ１−ｓｓＣｂｈ−ＮＣ−ＴＭＤ−Ｔｃｂｈ１を含む発現ベクターを例示する（発現ベクターの配列を配列番号１７として示す）。図２Ｄは、形質転換に使用される断片を例示する。
【０１１１】
第１のシリーズで見られたように、より良い発現は担体ＧｌａＡを含まずに達成された。担体が存在した場合、２つの部分の間に改変タンパク質分解部位を使用した場合であっても、Ｇｌａ−ＨＡ融合タンパク質のみが目で確認された。Ｃ末端Ｔ４−ｆｏｌｄｏｎドメインの存在は、細胞外で検出されるＨＡのレベルにプラスの効果を有したが、結果として生じるＨＡは不活性（赤血球凝集アッセイでマイナスの結果）のようであった。Ｔ４  ｆｏｌｄｏｎドメインに融合したＨＡの活性をさらに評価するために、構築物Ｐｈｅｘ１−ｓｓＣｂｈ−ＮＣ−８ｘＧ−Ｔ４  ｆｏｌｄｏｎ−Ｔｃｂｈ１から発現したＨＡを精製し、マウスでの免疫原性アッセイで試験した（以下の実施例２を参照されたい）。機能的免疫原性は観察されなかった。
【０１１２】
ＨＡの天然の膜貫通ドメインは、発現レベル（細胞内または細胞壁関連）にプラスの効果を有した。さらに、得られたタンパク質は、ＨＡ活性アッセイにおいて非常に活性が高かった。そのＴＭＤを有するＨＡの活性をさらに評価するために、構築物Ｐｈｅｘ１−ｓｓＣｂｈ−ＮＣ−ＴＭＤ−Ｔｃｂｈ１から発現したＨＡを精製し、マウスでの免疫原性アッセイで試験した（以下の実施例２を参照されたい）。機能的免疫原性が観察され、これは以下でより詳述するように、特に効果的であった。
【０１１３】
発現構築物の第３のシリーズを設計した。このシリーズでは、これまで試験を行わなかった型を含む、様々な型のＨＡを、ｃｂｈシグナル配列を含み、担体なし、かつＣ末端にＴ４  ｆｏｌｄｏｎドメインまたはＴＭＤを有してｈｅｘ１プロモーター下で発現した。このシリーズではＴ４  ｆｏｌｄｏｎドメインを、Ｇｌｙリンカーを含まずに、またはＨＡとＴ４  ｆｏｌｄｏｎドメインの間に改変リンカーを含んでクローン化した。さらに、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）の２つの多様体も試験した。シリーズの様々な構築物については、図３〜図４に詳述する。
【０１１４】
Ｃ１は、様々な型のＨＡを産生できた。ＨＡ型の各々の５０〜１００ｍｇ／リットルのタンパク質がＣ１株によって産生されることが実証された。１つ以上の場合で、約３００ｍｇ／リットルの発現レベルが達成された。
【０１１５】
第２のシリーズからわかるように、Ｃ末端Ｔ４−ｆｏｌｄｏｎドメインの存在は、細胞外で検出されたＨＡのレベルにプラスの効果を有したが、得られたＨＡは、ＨＡとＴ４  ｆｏｌｄｏｎの間にリンカーを含まないか、または改変リンカーを有していても、不活性（赤血球凝集アッセイでマイナスの結果）のようであった。ＨＡの天然の膜貫通ドメインは再び、発現レベル（細胞内または細胞壁関連）にプラスの効果を示した。さらに、得られたタンパク質は、ＨＡ活性アッセイにおいて非常に活性が高かった。Ａ型およびＢ型の両方のインフルエンザタンパク質は上手く発現され、生物学的に活性であることがわかった。
【０１１６】
ＮＡに関しては、Ｃ１中で十分に発現され、細胞外および細胞内の両方で検出され得ることがわかった。
材料および方法
ＨＡタンパク質標準
【０１１７】
ＨＡタンパク質標準を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、ＵＳＡ）から入手した。これらのタンパク質を、バキュロウイルス発現ベクター系を使用して昆虫細胞中で産生し、生物学的活性および三次構造を保持する条件下で、純度＞９０％に精製した。タンパク質標準を、製造業者が推奨するとおり４℃で保存した。さらに、Ａ／Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（ＮＣ）からの卵由来ＨＡのバッチを、国立生物学的標準および管理研究所（ＮＩＢＳＣ）から注文した。このサンプルをアリコートに分けて、製造業者の推奨に従って−２０℃で保存した。
Ｃ１株
【０１１８】
この検査で試験した候補Ｃ１産生宿主を表２に示す。
ＨＣは、Ｃ１高セルラーゼ株を指し、ＬＣはＣ１低セルラーゼ株を指す。Ｐｒｔ−はプロテアーゼ欠損、Δａｌｐ１は主要な分泌プロテアーゼの遺伝子破壊、Δａｌｐ２は高度に発現した液胞プロテアーゼの遺伝子破壊、およびΔｃｈｉ１はＣ１中での高度に発現した細胞外Ｃ１キチナーゼの遺伝子破壊を指す。すべての株はΔｐｙｒ５である。
【表３】
2020533966.tif 000005
発現ベクターの構築
【０１１９】
Ｃ１、ｐＰ−ｓｓｇｌａＡ−ｇｌａＡ−ＨＡ−ＦＬＡＧ−タグ中で異種タンパク質を産生するためにここで使用した発現ベクターを図６に示す。この発現ベクターは、十分に分泌されたＡ．ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼＡタンパク質を担体として利用し、細胞外培地中への異種タンパク質の分泌を促進する。ＨＡ遺伝子を、Ａ．ｎｉｇｅｒのグルコアミラーゼＡの触媒ドメインをコードするｇｌａＡ遺伝子の一部に融合した。ＦＬＡＧタグ配列を、Ｃ末端で融合し、検出および精製するために組み込んだ。ＦＬＡＧタグは、配列Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ、配列番号３２）を有する短い親水性８アミノ酸ペプチドである。
第１シリーズの構築物の生成
【０１２０】
ＨＣ形質転換実験には、次の基本的なクローニングベクターを使用した：
ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩで消化したｐＶＪ１（Ｐｃｂｈ１＿ｇｌａＡ＿ｋｅｘ２＿ＧｅｎｅＸ＿Ｔｃｂｈ１）。
ＥｃｏＲＶはｋｅｘ２部位に位置し、ＥｃｏＲＩはＧｅｎｅＸの停止コドン直後に位置する。
【０１２１】
このベクターを使用して、４３のよく発現された遺伝子に基づいてＣ１にコドン最適化した、以下の合成遺伝子断片を連結し、培地中に分泌した（すべての合成断片を、ｐＭＫまたはｐＭＳシャトルベクターでＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）によってサブクローン化した）：
−ＨＡ＿ＮＣ＿ＦＬＡＧ−タグｘＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ（１５７７ｂｐ）
−ＨＡ＿ＵＲ＿ＦＬＡＧ−タグｘＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ（１５８６ｂｐ）
−ＨＡ＿ＦＬ＿ＦＬＡＧ−ｔタグｘＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ（１６５５ｂｐ）
−ＨＡ＿ＮＣｘＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ（１５５３ｂｐ）
【０１２２】
ＬＣ形質転換実験には、以下の基本的なクローニングベクターを使用した：
ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩで消化したｐＶＪ６（Ｐｃｈｉ１＿ｇｌａＡ＿ｋｅｘ２＿目的遺伝子＿Ｔｃｂｈ１）。
ＥｃｏＲＶはｋｅｘ２部位に位置し、ＥｃｏＲＩは目的遺伝子の停止コドンの直後に位置する。
【０１２３】
このベクターを使用して、以下の合成遺伝子断片を連結した：
（すべての合成断片を、ｐＭＫまたはｐＭＳシャトルベクターにＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）によってサブクローン化した）。
−ＨＡ＿ＮＣ＿ＦＬＡＧ−タグｘ  ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ（１５７７ｂｐ）
−ＨＡ＿ＵＲ＿ＦＬＡＧ−タグｘ  ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ（１５８６ｂｐ）
−ＨＡ＿ＦＬ＿ＦＬＡＧ−タグｘ  ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ  １６５５ｂｐ）
−ＨＡ＿ＮＣ  ｘ  ＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ（１５５３ｂｐ）
【０１２４】
ＨＡ  Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａの場合、次のように追加の構築物多様体を作製した：
＊ｃｂｈ１プロモーターまたはｃｈｉ１プロモーターを有し、ＧｌａＡ担体タンパク質を含まないが、ＥＲへの標的化のためのｃｂｈ１シグナル配列を含むベクター。このベクターを、次のように生成した：
【０１２５】
クローニングベクターｐＣＢＨＰｒｏｍをＳａｃＩ−ＢｓｐＨＩで消化し、ｃｂｈ１プロモーターを含む１８１９ｂｐ断片を単離した。
【０１２６】
クローニングベクターｐＶＪ１をＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ｃｂｈ１ターミネーターおよびｐＵＣ骨格を含む３８９６ｂｐ断片を単離した。
【０１２７】
これらの２つの断片を、ｓｓｃｂｈ１−ＨＡ＿ＮＣ＿ＦＬＡＧタグを含むＰｃｉＩ―ＥｃｏＲＩ（１６１７ｂｐ）で消化した合成断片と三方向ライゲーションでライゲートした。
【０１２８】
クローニングベクターｐＰｃｈｉ１−リンカー−Ｔｃｂｈ１をＮｃｏＩ−ＢｓｐＨＩで消化し、ｃｂｈ１プロモーター−ｃｂｈ１ターミネーターおよびｐＵＣ骨格を含む５７５８ｂｐ断片を単離した。このベクターを、ｓｓｃｂｈ１−ＨＡ＿ＮＣ＿ＦＬＡＧタグを含むＰｃｉＩ−ＥｃｏＲＩ（１６１７ｂｐ）で消化された合成断片とのライゲーションにおいて使用した。
【０１２９】
＊ｃｈｉ１プロモーターおよび担体タンパク質としてＧｌａ１（Ｃ１相同体）を含むベクターを以下のように生成した：
【０１３０】
クローニングベクターｐＰｃｈｉ１−Ｇｌａ１−ＸｙｎＢをＢｓｒＧＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ｃｈｉ１プロモーター、Ｇｌａ１担体タンパク質の一部、およびｃｂｈ１ターミネーターを含む６６０９ｂｐ断片を単離した。
【０１３１】
クローニングベクターｐＰｃｈｉ１−Ｇｌａ１−ＸｙｎＢをＢｓｒＧＩ−ＭａｂＩで消化し、Ｇｌａ１担体タンパク質の一部を含む７８３ｂｐ断片を単離した。
【０１３２】
これら２つの断片を、Ｇａｂ１、ＫＥＸ２部位、およびＨＡ＿ＮＣ＿ＦＬＡＧタグの一部を含むＭａｂＩ−ＥｃｏＲＩ（１７２３ｂｐ）で分解した合成断片と三方向ライゲーションでライゲートした。
【０１３３】
＊担体タンパク質としてＥＧ２を含むベクターを次のように生成した：
【０１３４】
クローニングベクターｐＰｃｂｈ１＿ＥＧ２＿Ｔｃｂｈ１をＳａｃＩ−ＰｃｉＩで消化し、ｃｂｈ１プロモーターおよびＥＧ２担体タンパク質の一部を含む３０３１ｂｐ断片を単離した。
【０１３５】
クローニングベクターｐＶＪ１をＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ｃｂｈ１ターミネーターおよびｐＵＣ骨格を含む３８９６ｂｐ断片を単離した。
【０１３６】
これらの２つの断片を、ＥＧ２の一部、ＫＥＸ２部位、およびＨＡ＿ＮＣ＿ＦＬＡＧタグを含むＰｃｉＩ―ＥｃｏＲＩ（１６６９ｂｐ）で消化した合成断片と三方向ライゲーションでライゲートした。
【０１３７】
＊「初期構築物」プロモーターｈｅｘ１、ＧｌａＡ担体タンパク質、およびＨＡ＿ＮＣを含みＦＬＡＧタグを含まないベクターを、次のとおり生成した：
【０１３８】
クローニングベクターｐＴｃＶ１０１１をＳａｃＩ−ＥｃｏＲＶで消化し、ｈｅｘ１プロモーター、ＧｌａＡ担体タンパク質、およびＫＥＸ２部位の一部を含む１６４３ｂｐ断片を単離した。
【０１３９】
クローニングベクターｐＶＪ１をＳａｃＩ−ＥｃｏＲＩで消化し、ｃｂｈ１ターミネーターおよびｐＵＣ骨格を含む３８９６ｂｐ断片を単離した。
【０１４０】
これらの２つの断片を、ｓｓｃｂｈ１−ＨＡ＿ＮＣを含むＥｃｏＲＶ−ＥｃｏＲＩ（１５５３ｂｐ）で消化した合成断片と三方向ライゲーションでライゲートした。
【０１４１】
すべてのベクターをＸＬ１−ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）で生成した。すべてのベクターから、クローニング接合部を配列分析によって検証した。
第３シリーズの構築物の生成
【０１４２】
ＨＡまたはＮＡ発現カセットを、ＮｏｔＩを用いてそれらのベクターから切除した。ｐｙｒ５選択マーカーを、ＢｇｌＩＩを使用してそのベクター（ＤＮＬ３５）から切除した。両方の断片をプラスミド骨格から分離し、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＳＶ  ＧｅｌおよびＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ  ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてゲルから精製した。Ｃ１宿主Ｄ３８９およびＤ３８２を、単一のＨＡまたはＮＡ発現カセットおよびｐｙｒ５マーカーと同時形質転換した。
形質転換およびマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）培養
【０１４３】
発現ベクターをＮｏｔＩで分解して、外来ＤＮＡを含まない発現カセットを作製した。これらの発現カセットを、ｐｙｒ５欠損Ｃ１株中でｐｙｒ５マーカーと同時形質転換した。
【０１４４】
各株の９６個の形質転換体の精製ストリークを、ショ糖を含む最小培地プレート上で作製し、３５℃で４日間インキュベートした。純粋なコロニーを、ケイラーゼ培地を含む９６ウェルプレート（マザープレート）に移し、３５℃でインキュベートした。３日後に、３μｌ／ウェルの培養液を産生培地（（ＮＨ４）２ＳＯ４  ３５ｍＭ、ＮａＣｌ  ７ｍＭ、ＫＨ２ＰＯ４  ５５ｍＭ、グルコース０．５％、ＭｇＳＯ４  ２ｍＭ、微量元素溶液、カザミノ酸、０．１％ビオチン４μｇ／Ｌ、ペニシリン２０ｇ／Ｌ、ストレプトマイシン５０ｇ／Ｌ  １０ｍＭ、ｐＨを１０Ｍ  ＫＯＨで５．５に設定した）を含む新しい９６ウェルプレート（ドータープレート）に移し、プレートを７２〜９６時間インキュベートした。上清をその後、必要な標的発現または酵素活性についてアッセイした。いくつかの構築物では、使用したドータープレート培地は産生培地または適合接種源培地（ａＩＭ）のいずれかであり、成長温度は３５℃、３０℃、または３５℃に続く３０℃の組み合わせであり、ドータープレートを４８（ａＩＭ）時間および７２（ａＩＭ）時間インキュベートした。
【０１４５】
ＴＭＤ含有抗原の場合、各培養物（ウェル）１００μｌをドータープレートウェルから９６ウェルＰＣＲプレートのウェルに移した。これを４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離した。培養液を除去し、１００μＬの抽出バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１％ＳＤＳ、０．２％ＣＨＡＰＳ）をウェルごとに添加した。これをよく混合し、９６℃で５分間インキュベートした。続いて、プレートを４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清を新しい９６ウェルプレートに移した。この上清２０μＬを使用してＰＶＤＦ膜にスポットした。その後、スポットブロットをＢＳＡでブロックし、適切な抗体を使用してスクリーニングした。ＨＲＰ結合二次抗体基質ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｄｕｒａ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｄｕｒａｔｉｏｎ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（３４０７５；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、結合した抗体を可視化した。画像を、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃを使用して作成した。マイクロタイタープレートまたは振盪フラスコ由来の選択された形質転換体培養サンプルを、標準技術に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティング分析を使用してさらに調査した。ウエスタンブロットは、スポットブロットで行われたのと同様の方法で同じ抗体を使用してスクリーニングした。
振盪フラスコ培養条件
【０１４６】
振盪フラスコ培養実験を、５０ｍｌの培地を含む３００ｍｌフラスコで実施した。ＬＣおよびＨＣを、窒素源としてアンモニウムおよび０．５％グルコースを含む上記の産生培地で標準的に培養した。両方の株を、１％グルコースに加えて、窒素源として硝酸塩、０．１％カザミノ酸（ＣＭの場合）、０．５％ＹＥ（ＣＭの場合）（およびビタミン）を含む最小培地（ＭＭ）および完全培地（ＣＭ）でも試験した。培養を、２５０ｒｐｍ（１インチ／軌道）および３５℃で実施した。
スポットブロット分析
【０１４７】
得られた形質転換体のほとんどを、スポットブロット分析によってスクリーニングした。マイクロタイタープレート培養後に、プレートを遠心分離により回収し、上清を新しい９６ウェルプレートに移した。ＬＣ株については２５μｌの上清を使用し、ＨＣ株については１２．５μｌを使用した。サンプルを９６℃で５分間変性させ、氷上で冷却し、ＰＶＤＦ膜に移した。スポットブロットを、ｍＡｂ  αＧｌａＡまたはｍＡｂ  αＨＡ＿ＮＣで染色した（ＡｂＣａｍ  ａｂ６６１８９）。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタン分析
【０１４８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングを、標準手順に従って実施した。アルカリホスファターゼを用いるウエスタンブロットの開発を、基質としてＮＢＴおよびＢＣＩＰを使用して実施した。西洋ワサビペルオキシダーゼによるウエスタンブロットの開発を、供給業者によるＥＣＬ検出試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：Ｎｏｖｅｘ（商標登録）ＥＣＬ  ＃ＷＰ２０００５）を用いて実施した。開発されたウエスタンブロットの除去には、次のプロトコルを使用した（ＡｂＣａｍによる軽度の除去手順）。
【０１４９】
新しいストリッピングバッファーを調製し（１Ｌ：グリシン１５ｇ、ＳＤＳ  １ｇ、Ｔｗｅｅｎ２０  １０ｍｌ、ｐＨ２．２に調整）、膜をＲＴにて１０分間ストリッピングバッファー中でインキュベートした（振盪）。バッファーを廃棄し、手順を新しいストリッピングバッファーで繰り返した。次に、膜をＰＢＳで２回、ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した。
２Ｄゲル電気泳動
【０１５０】
２Ｄ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、サンプルを、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  ０．５ｍｌ  １０Ｋ遠心フィルターを使用して１０〜２０倍濃縮し、サンプルをその後、ＢｉｏＲａｄ  ｍｉｃｒｏ  Ｂｉｏｓｐｉｎ  ６クロマトグラフィーカラムを使用して脱塩し、タンパク質濃度を、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定した。タンパク質サンプルを、供給業者に従ってＢｉｏＲａｄ  ＲｅａｄｙＰｒｅｐ  ２Ｄクリーンアップキットを使用して精製した。精製後、タンパク質ペレット（約２００μｇ）を次のものを含む２００μｌ２−Ｄ再水和バッファー１（ＢｉｏＲａｄ）で再水和した：７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、４％ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  ＤＴＴ、０．２％Ｂｉｏ−Ｌｙｔｅ  ３／１０両性電解質（２０％）、および０．００２％ブロモフェノールブルー。再水和したタンパク質サンプルをＢｉｏＲａｄ  Ｒｅａｄｙ  Ｓｔｒｉｐ  ＩＰＧストリップ（１１ｃｍ  ｐＨ４〜７）に添加し、ＲＴで一晩インキュベートした。ＩＰＧストリップを完全に再水和させた後、供給業者（ＢｉｏＲａｄ）に従ってストリップに焦点を合わせた。２Ｄを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ４〜１５％勾配ゲル（ＢｉｏＲａｄ）で実行した。ゲルをクーマシーブリリアントブルー染色に使用するか、タンパク質をＰＶＤＦに転写した。
赤血球凝集アッセイ
【０１５１】
通常、インフルエンザウイルス粒子はその表面に、細胞上のシアル酸受容体に結合するＨＡを有する。ウイルスは、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）（赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ））に結合し、格子の形成を引き起こす。この特性は、赤血球凝集と呼ばれる。機能的ＨＡが赤血球を含むサンプル中に存在する場合、格子が形成され、それは血管の底に赤血球が沈殿する代わりに、「溶液中にとどまっている」ように見える。
【０１５２】
培地中へのＨＡ分泌の迅速な検出のために、培養液を、Ｖ底９６ウェルプレートで連続希釈（１ｘＰＢＳ中（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋非含有）最終量５０μｌ）された（ろ過済みの）真菌培養上清を等量（５０μｌ）の洗浄済みの０．５％ニワトリ赤血球を含む１ｘＰＢＳ中（Ｃａ２＋およびＭｇ２＋非含有）に加えることにより、赤血球凝集素活性について試験した。次いで、プレートを室温で１時間インキュベートした。サンプルを既知量の精製ＨＡ標準（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．またはＮＩＢＳＣ）と比較した。
ＥＧ２活性アッセイ
【０１５３】
ＥＧ２活性を、製造業者の指示に従って、アゾ−ＣＭＣａｓｅアッセイ（ＭｅｇａＺｙｍｅ）により測定した。
ＢＣＡアッセイ
【０１５４】
タンパク質含有量を、製造業者の指示に従って、ＢＣＡアッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）により定量化した。
分泌されたＨＡの精製
【０１５５】
振盪フラスコ培養後に、発酵ブロスを遠心分離し、上清を収集した。上清のサンプル３５ｍｌを、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａフィルター（カットオフ１０ｋＤａ）を使用して、総容量３００μｌ（＞１００ｘ濃縮）に濃縮した。カラムに添加する前に、サンプルを遠心分離（１４０００ｒｐｍで１分）によりきれいにした。ゲルろ過をＰＢＳ中で行い、１００μｌのサンプルを２４ｍｌ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００カラムに添加した。サンプルを１ｍｌ／分の流速で処理し、０．５ｍｌの画分を収集した（ＡＫＴＡＥｘｐｌｏｒｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ  １）。画分を、ＨＡ＿ＮＣに対するモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロットで分析した。
ＴＭＤ含有ＨＡの精製
【０１５６】
ＴＭＤ含有ＨＡを、抽出バッファーを使用して菌糸体断片から抽出し、その後ＡＥＸ−Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓを使用して精製した。精製手順については、図７を参照されたい。
脱グリコシル化実験
【０１５７】
細胞外画分および細胞内画分の両方を脱グリコシル化実験で使用した。ＥｎｄｏＨ（Ｅｎｄｏ−β−Ｎａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ；Ｒｏｃｈｅ  １１  ０８８  ７２６  ００１）脱グリコシル化を、供給業者推奨の条件下で実施した。したがって、反応を、以下を含むバッファー中で、３７℃で一晩行った：２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ  ｐＨ５．５、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、０．１Ｍ  β−メルカプトエタノールおよび０．０２％ＳＤＳ。１０ｍＵ  ＥｎｄｏＨを加える前に、タンパク質サンプルを１０分間９６℃で変性させた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングで分析し、ＨＡ＿ＮＣに対するｍＡｂ（ＡｂＣａｍ  ａｂ６６１８９）で染色した。ＰＮＧａｓｅＦ（ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（Ｅｌｉｚａｂｅｔｈｋｉｎｇｉａ  ｍｉｒｉｃｏｌａ）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｇ５１６６）脱グリコシル化を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００が最終濃度０．１％に添加される以外、ＥｎｄｏＨ脱グリコシル化と同様の条件下で行った。タンパク質サンプルの変性後に、５ＵのＰＮＧａｓｅＦを添加し、サンプルを３７℃で一晩インキュベートした。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロッティングで分析し、ＨＡ＿ＮＣに対するｍＡｂ（ＡｂＣａｍ  ａｂ６６１８９）で染色した。
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＫＥＸ２処理
【０１５８】
細胞外および細胞内の両方の画分を、ＫＥＸ２処理実験で使用した。サンプルを、ネイティブおよび変性の両方の形式で試験した。Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＫＥＸ２プロテアーゼタンパク質を、Ｈｉｇｈ−５昆虫細胞（ＡｂＣａｍ；ａｂ９６５５４）で産生した。ＫＥＸ２タンパク質の切断を、以下の条件下で実行した：画分を５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、ｐＨ＝７．５、５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．５ｍＭ  ＰＭＳＦおよび０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００でインキュベートした。タンパク質サンプルを、ネイティブまたは変性した形態で、８０ｍＵ  ＫＥＸ２と３７℃で４時間インキュベートした。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法で分析し、ＨＡ＿ＮＣに対するｍＡｂ（ＡｂＣａｍ  ａｂ６６１８９）およびＧｌａＡに対するモノクローナル抗体で染色した。
トリプシン消化
【０１５９】
部分的トリプシン消化を、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ＝５．５バッファー中でＲＴで実施した。細胞外サンプルをアッセイバッファーおよびトリプシンと混合した［ＴＰＣＫトリプシン（Ｐｉｅｒｃｅ）；ストック溶液は５０ｍｇ／ｍｌであり（アリコートは−７０℃で保存される）、標準溶液は５０ｎｇ／μｌである］。サンプルを、ｔ＝０、ｔ＝２’、ｔ＝５’、ｔ＝１０’、ｔ＝１５’、ｔ＝２０’、ｔ＝３０’、ｔ＝４５’、およびｔ＝６０’で採取した。消化物を、６ｘＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーを加えることにより停止させ、９６℃で５分間変性させた。サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット法で分析し、ＨＡ＿ＮＣに対するｍＡｂ（ＡｂＣａｍ  ａｂ６６１８９）、およびＧｌａＡに対するモノクローナル抗体で染色した。
菌糸体抽出物
【０１６０】
細胞内に局在するＨＡと細胞壁に付着しているＨＡを区別するために使用される分画検査を、図８に模式的に示すように実施した。簡潔に述べると、振盪フラスコ培養物からの細胞外培地（Ｅｘ）を収集し（測定量）、菌糸体を収集した。菌糸体を新鮮な冷産生培地で洗浄し、重量を量り、ＳＤＳを含むまたは含まない洗浄バッファーで等しい部分に分割した。この洗浄ステップをＲＴで１時間実施し、洗浄媒体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。粉砕した菌糸体を、元の振とうフラスコ培養と同じｇ／体積比の抽出バッファーに再懸濁し、回転プラットフォーム上で１０分間、ＲＴでチューブ中に放置し、その後、チューブを１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。残りのペレットを同量の抽出バッファーに再懸濁し、膜を可溶化するためにＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を加えた。上清を遠心分離により除去した後、最終細胞ペレットをＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファーに再懸濁した。
真菌プロトプラストの調製
【０１６１】
Ｃ１  ＬＣ培養物を、上記のように完全培地中で２日間成長させた。プロトプラストを生成し、精製した。追加の洗浄ステップを、細胞壁の破片がプロトプラストに混入するリスクを減らすために実行した。
実施例２−Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ（Ｃ１）中で産生されたＨＡの免疫原性
【０１６２】
動物試験を、Ｃ１中で産生された膜貫通ドメインを保有するＡ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）インフルエンザ株（ｒＨＡ−ＴＭＤ）の完全長組換えヘマグルチニンタンパク質の免疫原性を試験するために実施した。ｒＨＡ−ＴＭＤの生化学的評価を図９に示し、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ネイティブＰＡＧＥ、ＴＥＭネガティブ染色を使用するオリゴマー状態の分析を示す。ＴＥＭ画像の倍率は、ｘ２９０００である。スケールバー＝２００ｎｍ。白い矢印は、約４０ｎｍのオリゴマーを指す。白い円は、約１５ｎｍのオリゴマーを示している。
【０１６３】
先行する免疫原性検査を、Ｃ１中で産生された同じウイルス株からの分泌型ｒＨＡを用いて実施した。このｒＨＡの膜貫通ドメインは、切断されており、それはネイティブＨＡ中には見られない追加のドメイン（８−ＧｌｙドメインおよびＴ４  ｆｏｌｄｏｎドメイン）を含む。ｒＨＡ−８Ｇｌｙ−Ｔ４構築物は、機能的な抗体応答を誘導しなかった。次に、膜貫通ドメインを有する構築物（ｒＨＡ−ＴＭＤ）がより良好な免疫原性を誘導できることが提唱された。
【０１６４】
この目的のために、８匹のＢａｌｂ／Ｃ  ＢｙＪマウスの８つの群に、Ｃ１中で産生されたｒＨＡ−ＴＭＤの、１〜３０μｇの範囲で３倍の漸増用量を４週間おきに２回筋肉内（ＩＭ）注射した。陰性対照として、５匹のマウスを同じ免疫スケジュールに従ってＰＢＳにより免疫した。血液サンプルを、赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイによる抗体応答分析のために２７日目および４９日目に収集した。
【０１６５】
以下により詳細に説明するように、これらの結果は、早くも、Ｃ１中で調製された完全長ｒＨＡをマウスへ単回注射後に、続く２回目の注射後にさらに増強された、特異的な機能的抗体応答が誘導されたことを示した。
材料および方法
試験対象組成物
【０１６６】
表３に、この検査で試験した組成物を示す。ブラッドフォード技術によって定量化したタンパク質含有量を、注射用量の調製に使用した。いずれの組成物も、使用するまで５℃±３℃で保存した。
【表４】
2020533966.tif 000006
動物情報
【０１６７】
動物種：マウス
状態：ＳＰＦ
株：Ｂａｌｂ／ｃ  ＢｙＪマウス
供給業者：Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ
年齢：Ｄ０で９週齢
性別：雌
体重：２０〜２２ｇ
着色による個体の識別
ケアおよび保守：毎日
ハウジング
場所：動物４匹／すべての群用のケージ／Ｌ２バイオセーフティ要件に準拠する空気調整された建物内のケージ
動物／ケージの数：４
食餌：粒状食品（Ｍ２０、ＳＤＳ、ＤＩＥＴＥＸ  Ｆｒａｎｃｅ、Ｓｔ  Ｇｒａｔｉｅｎ、Ｆｒａｎｃｅ）
水：水道水、自由に、自動給水システムを介する
検疫：Ｎ／Ａ
順応：本検査に割り当てられたマウスを、免疫付与の前に５日間、設計されたハウジングに順応させた。
群の定義
群の定義を表４に要約する。
【表５】
2020533966.tif 000007
検査スケジュール
検査スケジュールを、表５に詳述する。
【表６】
2020533966.tif 000008
臨床モニタリング
【０１６８】
動物を、免疫付与後の平日（月曜日から金曜日）に毎日観察し、−１日目および２７日目に体重測定した。
生物学的サンプリング
【０１６９】
血液サンプルを、Ｄ２７に眼窩後洞（ＲＯＳ）または顎下静脈からイソフルラン麻酔下で採取し、すべての動物からＤ４９に放血後に頸動脈切片により採取した。Ｄ４９に、麻酔を、腹腔内経路により２００μＬの量で投与されるイマルゲネ（ケタミン１．６ｍｇ）およびロンパン（キシラジン０．３２ｍｇ）により行った。
【０１７０】
体液性応答アッセイでは、Ｄ２７に血液２００μＬを、凝固活性化剤および血清分離剤（ＢＤ  Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ  ｒｅｆ３６５９５１）を含むバイアル中に収集した。３７℃で２時間後、血液を１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、血清を分析まで−２０℃で保存した。
【０１７１】
Ｄ４９：１ｍＬの血液を、凝固活性化剤および血清分離剤（ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ  ＳＳＴ  ＩＩ  Ａｄｖａｎｃｅ  ｒｅｆ  ３６７９５７）を含むバイアル中に収集した。５℃で２日後、血液を２０分間２０００ｇで遠心分離し、血清を分析まで−２０℃で保存した。
赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイ
【０１７２】
このアッセイは、インフルエンザウイルスの赤血球を凝集させる能力に基づく。ＨＡに対する機能的抗体を含む血清は、赤血球凝集活性を阻害する。このアッセイでは、機能的な抗ＨＡ抗体の濃度の特徴を明らかにするために、インフルエンザで免疫した動物の血清をインフルエンザウイルスで滴定する。
試薬：
−９６ウェルＶ底プレート（ＮＵＮＣ）
−ＲＤＥ（受容体破壊酵素）：１０ｍＵ／ｍＬのコレラ菌ＩＩＩ型由来ノイラミニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）
−Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋非含有ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）
−ＴＰＣＫトリプシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）
−ニワトリ赤血球（「ｃＲＢＣ」）：血清処理用にはＰＢＳ中で１０％、ＨＩアッセイ用にはＰＢＳ中で０．５％（Ｓａｎｏｆｉ  Ｐａｓｔｅｕｒ）
−インフルエンザ株Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９、透明尿膜腔液１９００赤血球凝集単位（ＨＡＵ）／５０μＬ
【０１７３】
滴定を以下のとおり実施する：ウイルス懸濁液をキャリブレートし４ＨＡＵ／５０μＬの濃度を得るために、ウイルスの連続希釈（２倍）をＰＢＳ中で行った。次に、キャリブレートしたウイルス（５０μＬ）を、１／１０から開始して５０μＬの血清連続希釈液（２倍）を含むＰＢＳ中でＶ字型９６ウェルプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、ニワトリ赤血球（ＰＢＳ中０．５％）（５０μＬ）を各ウェルに加え、室温で１時間後に赤血球凝集（赤い点）または赤血球凝集（ピンクのネットワーク）の阻害を視覚的に読み取った。
【０１７４】
ＨＡに対する血清非特異的阻害剤を除去するために、ＨＩアッセイの前に各血清を、受容体破壊酵素（ＲＤＥ）、ニワトリ赤血球、およびＴＰＣＫトリプシンで処理した。簡単に述べると、１０ｍＵ／ｍＬのＲＤＥを各血清に加えた（血清１容量に対してＲＤＥ  ５容量）。次に、混合物を＋３７℃で１８時間インキュベートした後、＋５６℃で１時間不活性化した。冷却するために、混合物「血清−ＲＤＥ」を３０分〜４時間の間４℃に置いた。「血清−ＲＤＥ」混合物を次に、ＰＢＳ中の１０％ｃＲＢＣに３０分間室温で吸収させ（血清１容量に対してｃＲＢＣ５容量）、その後、＋５℃、７００ｇで１０分間遠心分離した。上清を回収し、トリプシン処理を、１０容量のＲＤＥ−ＲＢＣ−熱不活化血清（希釈血清１：１０）を１容量の０．４％トリプシン（生理食塩水中のｗ／ｖ）と＋５６℃で３０分間混合することにより、行った。その後、ＨＩを実施し、最終的な血清希釈を１：１０で検討した。
【０１７５】
ウイルス懸濁液をキャリブレートし４ＨＡＵ／５０μＬの濃度を得るために、ウイルスの連続希釈（２倍）をＰＢＳ中で行った。次に、キャリブレートしたウイルス（５０μＬ）を、１／１０から開始して５０μＬの血清連続希釈液（２倍）を含むＰＢＳ中でＶ字型９６ウェルプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。次いで、ニワトリ赤血球（ＰＢＳ中０．５％）（５０μＬ）を各ウェルに加え、室温で１時間後に赤血球凝集（赤点）または赤血球凝集（ピンクネットワーク）の阻害を視覚的に読み取った。
【０１７６】
ＨＩ力価は、赤血球凝集を完全に阻害した血清の最後の希釈の逆数である。統計分析を行うために、初期希釈の半分（１／１０）に相当する５の値を、陰性と判定されたすべての血清に任意に付与した。
【０１７７】
各血清とも、非特異的凝集素が存在しないように制御した（各血清、およびウイルス非含有ｃＲＢＣの４段階希釈）。ｃＲＢＣ（ｃＲＢＣおよびＰＢＳのみ）の制御、および４ＨＡＵのウイルス標準希釈液の存在の制御を各プレートで実施した。
観察および逸脱
【０１７８】
顎下静脈からの採血の翌日であるＤ２８に、群Ａのマウスは、おそらくこの介入から回復しなかったため病気であると見出され、安楽死させた。
結果
臨床モニタリング
【０１７９】
平均体重の増加がＤ１〜Ｄ２７のすべての群で観察された。
体液性応答
【０１８０】
Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９（Ｈ１Ｎ１）に対して誘発された抗体反応を、Ｄ２７およびＤ４９にＨＩアッセイによりすべての動物から収集された個々の血清で測定した。これらの結果を、図１０Ａ〜図１０Ｂに示す。
【０１８１】
ｒＨＡの最初の注射後、統計分析を除外して、Ｃ１−ｒＨＡの２つの最小用量でＨＩ応答はないかまたは低かった。それでも、これらの結果は、Ｃ１−ｒＨＡが実際に抗体応答を誘発したことを強く示唆した。
【０１８２】
追加注射後に、応答がさらに増強した。有意な用量依存的ＨＩ効果がＣ１−ｒＨＡによって誘発され、平均ＨＩ力価は、１μｇおよび３０μｇの用量でそれぞれ１０８〜８３０の範囲であった。
【０１８３】
Ｃ１中で産生された完全長組換えＨＡは、マウスにおいていずれの負の臨床徴候も誘発しなかったことに留意されたい。
【０１８４】
Ｃ１は、５日間の発酵で１ｇ／ＬのレベルのＨＡおよび他の抗原を容易に産生できる。なぜなら：
【０１８５】
季節性インフルエンザワクチンの場合−分配される総容量＝１４６Ｍ／年
【０１８６】
各０．５ｍＬの用量は、以下を含むように配合される：各株に１５μｇのＨＡ。
【０１８７】
したがって、３ｘ１０００Ｌ規模の発酵運転は、２，１７５ｇのインフルエンザに対する年間の世界規模のＨＡ／株のニーズを満たすことができる。
実施例３−ＨＡの撹拌タンク発酵
【０１８８】
実験を、バッチおよびフェドバッチ技術を備えた撹拌タンク発酵槽にて、大規模での上記のｒＨＡ−ＴＭＤの産生レベルを測定するために行った。この目的のために、ＭｉｎｉｆｏｒｓＴＭ  ３Ｌバイオリアクターを使用して、ｒＨＡ−ＴＭＤを発現するＣ１株Ｄ３８９を培養した。
【０１８９】
表６に、５０時間にわたって行った最初の一連の実験の発酵条件をまとめる。「バッチ」−発酵開始時での指定された炭水化物の濃度。「フェドバッチ」−炭水化物中の供給物質の濃度。発酵を、ｐＨ７．５、開始容量１．５リットルで実施した。
【表７】
2020533966.tif 000009
【０１９０】
発酵後に、菌糸体を収集し、ＨＡを抽出した。
【０１９１】
菌糸体濃度を評価するために、菌糸体の乾燥重量を測定した。簡潔に述べると、任意の特定の量の発酵ブロスを収集し、数回洗浄して、培地ならびに発酵中間体および分泌タンパク質などの培地成分を除去した。得られた材料を次に、９０℃で２４時間乾燥させ、重量を測定した。すべての発酵サンプルは、ほぼ同じ菌糸体濃度を含むことがわかった。
【０１９２】
ＨＡの定量化を、抽出されたＨＡについて得られたウエスタンブロットシグナルを既知量のＨＡ標準と比較することにより行った（図１３）。
【０１９３】
最適バッチの産生レベルは、約３７５ｍｇ／ｌであると計算され、これは１７０ｍｇ／ｌ／日である。
【０１９４】
表７は、９８〜１３７時間実施した２セットの実験の発酵条件およびその結果のＨＡ産生レベルをまとめたものである。この表は、発酵終了（ＥＯＦ）の結果を示す。
【表８】
2020533966.tif 000010
【０１９５】
特定の実施形態の前述の説明は、現在の知識を適用することにより、過度の実験なく、および一般的な概念から逸脱することなく、こうした特定の実施形態を様々な用途に容易に変更および／または適合させることができるように、本発明の一般的な性質を完全に明らかにする。したがって、こうした適応および改変は、開示された実施形態の等価物の意味および範囲内で理解されるものとし、意図される。本明細書で使用される語法または用語は説明するためのものであり、限定することを目的にするものではないことを理解されたい。開示される様々な化学構造および機能を実行するための手段、材料、およびステップは、本発明から逸脱することなく、様々な代替的形態をとり得る。
【図１Ａ】
2020533966.tif 000011
【図１Ｂ】
2020533966.tif 000012
【図２Ａ】
2020533966.tif 000013
【図２Ｂ】
2020533966.tif 000014
【図２Ｃ】
2020533966.tif 000015
【図２Ｄ】
2020533966.tif 000016
【図３】
2020533966.tif 000017
【図４】
2020533966.tif 000018
【図５】
2020533966.tif 000019
【図６】
2020533966.tif 000020
【図７】
2020533966.tif 000021
【図８】
2020533966.tif 000022
【図９】
2020533966.tif 000023
【図１０Ａ】
2020533966.tif 000024
【図１０Ｂ】
2020533966.tif 000025
【図１１】
2020533966.tif 000026
【配列表】
2020533966000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月18日(2020.5.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020533966000001.app
【国際調査報告】
2020533966.tif 000027
2020533966.tif 000028
2020533966.tif 000029
2020533966.tif 000030
2020533966.tif 000031
2020533966.tif 000032
2020533966.tif 000033
2020533966.tif 000034
2020533966.tif 000035