(57)【要約】  宿主細胞におけるステビオールグリコシドの生成を改善するための組成物及び方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ又はそのカウレンオキシダーゼ変異体をコードする異種ヌクレオチド配列を含むように遺伝子組換えがなされる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、宿主細胞においてステビオールグリコシドを生成する能力がある経路のさらなる酵素をコードする１又は複数の異種ヌクレオチド配列をさらに含む。本明細書に記載の組成物及び方法は、限定はされないが、レバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭを含むステビオールグリコシドの異種生成における効率的経路を提供する。
2020533954.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼをコードする異種核酸を含む、１又は複数のステビオールグリコシドを生成する能力がある遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項２】
カウレンをカウレン酸に、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくは５５％を超える効率で変換する能力がある、請求項１に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項３】
前記カウレンオキシダーゼが、配列番号１の配列を有するアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項４】
前記カウレンオキシダーゼが、カウレン、カウレノール、及び／又はカウレナールのＣ１９位を酸化する能力がある、請求項１〜３のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項５】
前記カウレンオキシダーゼが、配列番号１５に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む異種核酸によってコードされる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項６】
前記カウレンオキシダーゼが、配列番号１５の配列を有する異種核酸によってコードされる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項７】
カウレンをカウレン酸に３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくは５５％を超える効率で変換する能力があり、且つ前記カウレンオキシダーゼが、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項８】
前記カウレンオキシダーゼは、配列番号１の機能ドメインに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する機能ドメインを有するポリペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項９】
カウレンをカウレン酸に、５５％を超える効率で変換する能力がある、請求項２６に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項１０】
カウレン酸を生成する能力がある、請求項１〜９のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項１１】
ステビオールを生成する能力がある、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項１２】
ＲｅｂＤを生成する能力がある、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項１３】
ＲｅｂＭを生成する能力がある、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項１４】
ＲｅｂＭ及びＲｅｂＭ２を、少なくとも１０：１、１００：１、又は１０００：１の比で生成する能力がある、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項１５】
前記遺伝子組換え宿主細胞が、ＲｅｂＭ２を検出不能なレベルで生成する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項１６】
前記遺伝子組換え宿主細胞が、ステビオールを作製するための経路の１又は複数の酵素をコードする１又は複数の異種核酸をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項１７】
前記遺伝子組換え宿主細胞が、ステビオールグリコシドを作製するための経路の１又は複数の酵素をコードする１又は複数の異種核酸をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項１８】
前記遺伝子組換え宿主細胞が、ＲｅｂＡを作製するための経路の１又は複数の酵素をコードする１又は複数の異種核酸をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項１９】
前記遺伝子組換え宿主細胞が、ＲｅｂＭを作製するための経路の１又は複数の酵素をコードする１又は複数の異種核酸をさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項２０】
前記遺伝子組換え宿主細胞が、ＲｅｂＥを作製するための経路の１又は複数の酵素をコードする１又は複数の異種核酸をさらに含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項２１】
前記経路の前記１又は複数の酵素が、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項２２】
前記経路の前記１又は複数の酵素が、コパリル二リン酸シンターゼを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項２３】
前記経路の前記１又は複数の酵素が、ｅｎｔ−カウレンシンターゼを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項２４】
前記経路の前記１又は複数の酵素が、カウレン酸ヒドロキシラーゼを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項２５】
前記経路の前記１又は複数の酵素が、チトクロムＰ４５０レダクターゼを含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項２６】
前記経路の前記１又は複数の酵素が、１又は複数のウリジン５’−二リン酸依存性糖転移酵素を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項２７】
前記経路の前記１又は複数の酵素が、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１、Ｓｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１、ＵＧＴ４００８７、ｓｒ．ＵＧＴ＿９２５２７７８、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８４０、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０、又はＯｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項２８】
前記経路の前記１又は複数の酵素が、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、ＵＧＴ９１Ｄ、又はＵＧＴ４００８７又はその変異体を含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項２９】
前記経路の前記１又は複数の酵素が、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、ｅｎｔ−カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸ヒドロキシラーゼ、チトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＵＧＴＡＤ、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、及びＵＧＴ９１Ｄを含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項３０】
前記経路の前記１又は複数の酵素が、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ、コパリル二リン酸シンターゼ、ｅｎｔ−カウレンシンターゼ、カウレンオキシダーゼ、カウレン酸ヒドロキシラーゼ、チトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＵＧＴ４００８７又はその変異体、ＵＧＴ７４Ｇ１、ＵＧＴ７６Ｇ１、ＵＧＴ８５Ｃ２、及びＵＧＴ９１Ｄを含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項３１】
前記ＵＧＴ４００８７が、配列番号１７、１８、又は３３に記載されている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項３２】
前記経路の前記１又は複数の酵素が、二官能性コパリル二リン酸シンターゼ及びカウレンシンターゼを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項３３】
前記経路の１又は複数の酵素をコードする前記１又は複数の異種核酸が、単一の転写制御因子の制御下にある、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項３４】
前記経路の１又は複数の酵素をコードする前記１又は複数の異種核酸が、複数の異種転写制御因子の制御下にある、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項３５】
前記細胞が、細菌細胞、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、及び植物細胞からなる群から選択される、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項３６】
前記細胞が、酵母細胞である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項３７】
前記酵母が、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)である、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞。
【請求項３８】
カウレン酸を生成するための方法であって、
（ａ）請求項１〜３７のいずれか一項に記載の遺伝子組換え出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)宿主細胞の集団を、ＲｅｂＤの作製に適した条件下の炭素源を有する培地中で培養することと；
（ｂ）前記カウレン酸化合物を前記培地から回収することと、
を含む、方法。
【請求項３９】
ＲｅｂＤを生成するための方法であって、
（ａ）請求項１〜３７のいずれか一項に記載の遺伝子組換え宿主細胞の集団を、ＲｅｂＤの作製に適した条件下の炭素源を有する培地中で培養することと；
（ｂ）前記ＲｅｂＤ化合物を前記培地から回収することと、
を含む、方法。
【請求項４０】
ＲｅｂＭを生成するための方法であって、
（ａ）請求項１〜３７のいずれか一項に記載の遺伝子組換え宿主細胞の集団を、ＲｅｂＭの作製に適した条件下の炭素源を有する培地中で培養することと；
（ｂ）前記ＲｅｂＭ化合物を前記培地から回収することと、
を含む、方法。
【請求項４１】
カウレン酸を生成するための方法であって、
（ａ）カウレンを、カウレン酸の形成に適した条件下で、カウレンをカウレン酸に変換する能力がある、前記請求項のいずれかに記載のカウレンオキシダーゼと接触させることと；
（ｂ）前記カウレン酸化合物を前記培地から回収することと、
を含む、方法。
【請求項４２】
発酵組成物であって、
（ａ）ｉ．カウレンをカウレン酸に変換する能力がある、前記請求項のいずれかに記載のカウレンオキシダーゼをコードする異種核酸
を含む遺伝子組換え宿主細胞；及び
（ｂ）前記遺伝子組換え宿主細胞から生成されるステビオールグリコシド
を含む発酵組成物。
【請求項４３】
前記ステビオールグリコシドが、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ及びＲｅＭを、少なくとも１：７：５０のＲｅｂＡ：ＲｅｂＤ：ＲｅｂＭの比で含む、請求項４２に記載の発酵組成物。
【請求項４４】
配列番号１に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性を有する、天然に存在しないカウレンオキシダーゼ。
【請求項４５】
インビボでカウレンをカウレン酸に３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、若しくは５５％を超える効率で変換する能力がある、天然に存在しないカウレンオキシダーゼ。
【請求項４６】
請求項４４又は４５に記載の天然に存在しないカウレンオキシダーゼをコードする天然に存在しない核酸。
【請求項４７】
ステビオールグリコシドを生成するための方法であって、
（ａ）請求項１〜３７のいずれか一項に記載の遺伝子組換え宿主細胞の集団をステビオールグリコシドの作製に適した条件下の炭素源を有する培地中で培養すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願に対する交互参照
[0001]  本願は、２０１７年８月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／５４４，７１８号、及び２０１７年８月１１日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４６６３７号の利益を主張し、それらの内容は、それら全体がここで参照により援用される。
【０００２】
２．発明の分野
[0002]  本開示は、特定のカウレンオキシダーゼ（ＫＯ）、それを含む組成物、それを含む宿主細胞、並びにレバウジオシドＤ及びレバウジオシドＭを含むレバウジオシドの生成のためのその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
３．背景
[0003]  天然源に由来する０カロリー甘味料は、高糖消費の不良な効果（例えば糖尿病及び肥満）を制限するため、所望される。レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）、ステビア属植物（Ｓ．レバウディアナ・ベルトニ(S. rebaudiana Bertoni)）によって生成される多数の甘味化合物の一つである。すべてのレバウジオシドの中で、ＲｅｂＭは、最高の効力を有し（スクロースよりも約２００〜３００倍甘い）、最もクリーンな味である。しかし、ＲｅｂＭは、専らステビア属植物により少量で生成され、全ステビオールグリコシド含量の小画分（＜１．０％）である。Ohta et al., 2010, J. Appl. Glycosci., 57, 199-209 (2010)。それ故、大量且つ高純度での生成を可能にする生物工学的経路を用いてＲｅｂＭを生成することが望ましい。
【０００４】
[0004]  バイオテクノロジーを用いて生成物を経済的に生成するため、原料から生成物への生物変換における各ステップは、高い変換効率（理想的には＞９０％）を有することが必要である。ＲｅｂＭを生成するための我々の酵母の改変においては、我々は、ｅｎｔ−カウレンからカウレン酸を取り込むＲｅｂＭまでの経路における早期の生合成ステップにおいて、明確な制限を同定した（図１Ａ及び１Ｂ）。
【０００５】
[0005]  ＫＯ酵素は、すべての植物中に見出され、通常は植物ホルモンのジベレリンを生成するように作用する。植物細胞内のジベレリンのレベルは、工業生産における酵母において生成されるＲｅｂＭのレベルよりも数桁低く、それ故、大部分のＫＯ酵素は、商業的生産においてＲｅｂＭを生成するのに要求される高フラックスを有することが期待されない。通常的には、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)由来のＫＯ酵素（Ｓｒ．ＫＯ）は、ＲｅｂＭを生成するように設計された酵母中でｅｎｔ−カウレンをカウレン酸に変換するため、用いられている。この植物がステビオールグリコシドを高レベルで生成することから、Ｓｒ．ＫＯ酵素が大部分の他のＫＯ酵素よりも高い変換率を有する、又はそれらよりも高いフラックスを処理するように進化しているはずであることが従来からの信念となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
[0006]  ＲｅｂＭまでの高い炭素フラックスを有する酵母株では、Ｓｒ．ＫＯが、カウレン酸への低い変換効率（２５．６％）を有することが見出され、また上流中間代謝産物（ｅｎｔ−カウレン、カウレノール及びカウレナール）が非常に高いレベルで形成された（図１Ｃ）。
【０００７】
[0007]  ＲｅｂＭを効率的に高純度で生成するため、カウレン酸を高効率で生成する能力がある改善された酵素が要求される。本明細書に提供される組成物及び方法は、この要求に対処するとともに、それに関連する利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
４．発明の概要
[0008]  カウレンのカウレン酸への改善された変換のための組成物及び方法が本明細書に提供される。これらの組成物及び方法は、一部には、特定のカウレンオキシダーゼ（ＫＯ）がカウレンをカウレン酸に著しく高い効率で変換する能力があるという驚くべき発見に基づく。新しいＫＯを有する株の性能における控えめな改善（例えば１０パーセント）であっても、潜在的には、ＲｅｂＭに対する市場の需要が５０００百万トン／年であると仮定すると、将来における生産コストにおいて、１，０００万ドル余り節約することが可能である。
【０００９】
[0009]  本明細書に記載の特定のＫＯはまた、残留カウレノール又はカウレナールをほとんど又は全く伴わずに、カウレン酸を生成する能力がある。そのように、特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物及び方法は、高収量のＲｅｂＭなどのステビオールグリコシドを有する組成物を得るための下流プロセシングのコストを低減しうる。
【００１０】
[0010]  一態様では、産業的に有用な化合物の生成において用いられる遺伝子組換え宿主細胞及び方法が本明細書に提供される。一態様では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼをコードする異種核酸を含む遺伝子組換え宿主細胞が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、ステビオール及び／又はステビオールグリコシドを生成する能力がある１又は複数の酵素経路をさらに含む。
【００１１】
[0011]  特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼの配列（例えば、配列番号１）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼをコードする異種核酸を含む遺伝子組換え宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、カウレンをカウレン酸に、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、若しくは９８％を超える効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、酵母細胞である。特定の実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)細胞である。
【００１２】
[0012]  別の態様では、異種ステビオールグリコシドを生成するための方法であって、本明細書に記載のようなステビオールグリコシドを生成する能力がある、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞の集団を、前記ステビオールグリコシド化合物の作製に適した条件下で炭素源を有する培地中で培養することと；前記ステビオールグリコシドを培地から回収することと、を含む、方法が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、異種ステビオールグリコシドは、ＲｅｂＤ及びＲｅｂＭからなる群から選択される。
【００１３】
[0013]  別の態様では、ＲｅｂＤを生成するための方法であって、本明細書に記載のようなＲｅｂＤを生成する能力がある、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞の集団を、前記ＲｅｂＤの作製に適した条件下で炭素源を有する培地中で培養することと；前記ＲｅｂＤを培地から回収することと、を含む、方法が本明細書に提供される。
【００１４】
[0014]  別の態様では、ＲｅｂＭを生成するための方法であって、本明細書に記載のようなＲｅｂＭを生成する能力がある、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞の集団を、前記ＲｅｂＭの作製に適した条件下で炭素源を有する培地中で培養することと；前記ＲｅｂＭを培地から回収することと、を含む、方法が本明細書に提供される。
【００１５】
[0015]  別の態様では、カウレン酸を生成するための方法であって、カウレンを、カウレンをカウレン酸に変換する能力がある本明細書に記載のカウレンオキシダーゼと、カウレン酸の形成に適した条件下で接触させることを含む、方法が本明細書に提供される。
【００１６】
[0016]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞である。いくつかの実施形態では、酵母は、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＲｅｂＤ又はＲｅｂＭを高効率で生成する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＲｅｂＤ又はＲｅｂＭを、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ酵素を含まない酵母細胞と比べて増量で生成する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
５．図面の簡単な説明
【図１Ａ】[0017]ファルネシルピロリン酸からステビオールへの変換の略図を提供する。
【図１Ｂ】[0018]ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）からＲｅｂＭへの変換の略図を提供する。
【図１Ｃ】[0019]ｅｎｔ−カウレン〜カウレノール〜カウレナール〜カウレン酸への変換の略図を提供する。
【図１Ｄ】[0020]メバロン酸経路の模式図を提供する。
【図２】[0021]ステビオールからＲｅｂＭへの例示的経路を提供する。
【図３Ａ】[0022]酵母におけるカウレン酸生成についてスクリーニングするため、個別のＫＯ酵素を挿入するために用いられる「ランディングパッド」設計の模式図を提供する。
【図３Ｂ】[0023]酵母におけるカウレン酸生成変換についてスクリーニングするためのＫＯ遺伝子構築物の模式図を提供する。
【図４】[0024]異なるカウレンオキシダーゼを用いてインビボで生成されたカウレン酸の相対的増加を図示するチャートを提供する。
【図５】[0025]ＲｅｂＭに対する高フラックスを有する酵母株においてインビボで生成されたカウレン酸の総量に対して正規化された、ｅｎｔ−カウレン、カウレノール、及びカウレナールの相対的レベルを図示する棒グラフを提供する。
【図６】[0026]Ｓｒ．ＫＯ又はＰｓ．ＫＯのいずれかを含有する高フラックスの株におけるＲｅｂＭ力価の相対的レベルを図示するチャートを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
６．実施形態の詳細な説明
６．１  用語法
[0027]  本明細書で用いられるとき、用語「異種」は、通常は天然に見出されないものを指す。用語「異種ヌクレオチド配列」は、通常は天然における所与の細胞内で見出されないヌクレオチド配列を指す。そのようなことから、異種ヌクレオチド配列は、（ａ）その宿主細胞に対して外来性である（即ち、細胞に対して「外因性」である）；（ｂ）宿主細胞内で天然に見出される（即ち「内因性」）が、細胞内で非天然量（即ち、宿主細胞内に天然に見出される量よりも多い量又は少ない量）で存在する；又は（ｃ）宿主細胞内で天然に見出されるが、その天然遺伝子座の外部に位置づけられることがある。用語「異種酵素」は、通常は天然における所与の細胞内で見出されない酵素を指す。用語は、（ａ）所与の細胞に対して外因性である（即ち、宿主細胞内で天然に存在しない又は宿主細胞内の所与の状況下で天然に存在しないヌクレオチド配列によってコードされる）酵素；及び（ｂ）宿主細胞内で天然に見出される（例えば、酵素は、細胞に対して内因性であるヌクレオチド配列によってコードされる）が、宿主細胞内で非天然量（例えば、天然に見出される量よりも多い量又は少ない量）で生成される酵素を包含する。
【００１９】
[0028]  他方、用語「天然」又は「内因性」は、分子に関連して本明細書で用いられるとき、特定の酵素及び核酸では、それらの由来元であるか又は天然に見出される生物内で、天然微生物における分子の発現のレベルに対してより低い、等しい、若しくはより高い可能性がある発現のレベルで独立的に発現される分子を示す。天然酵素又はポリヌクレオチドの発現が組換え微生物において修飾されてもよいことは理解される。
【００２０】
[0029]  本明細書で用いられるとき、用語「親細胞」は、修飾宿主細胞に改変される１又は複数の特定の遺伝子修飾、例えば、ステビオール経路の酵素の異種発現、ステビオールグリコシド経路の酵素の異種発現、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼの異種発現、コパリル二リン酸シンターゼの異種発現、カウレンシンターゼの異種発現、カウレンオキシダーゼ（例えば、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ）の異種発現、ステビオールシンターゼ（カウレン酸ヒドロキシラーゼ）の異種発現、チトクロムＰ４５０レダクターゼの異種発現、ＵＧＴ７４Ｇ１の異種発現、ＵＧＴ７６Ｇ１の異種発現、ＵＧＴ８５Ｃ２の異種発現、９１Ｄの異種発現、及びＵＧＴ４００８７若しくは変異体の異種発現からなる群から選択される１又は複数の修飾を含まないことを除いて、本明細書に開示される遺伝子組換え宿主細胞と同一の遺伝的バックグラウンドを有する細胞を指す。
【００２１】
[0030]  本明細書で用いられるとき、用語「天然に存在する」は、天然に見出されるものを指す。例えば、天然の供給源から単離されうる生物中に存在し、且つ研究室においてヒトにより意図的に修飾されていないカウレンオキシダーゼは、天然に存在するカウレンオキシダーゼである。逆に、本明細書で用いられるとき、用語「天然に存在しない」は、天然に見出されないものを指すが、ヒト介入によって作出されない。
【００２２】
[0031]  用語「媒体」は、培地及び／又は発酵培地を指す。
【００２３】
[0032]  用語「発酵組成物」は、遺伝子組換え宿主細胞及び遺伝子組換え宿主細胞によって生成される生成物又は代謝産物を含む組成物を指す。発酵組成物の例が、細胞、水相、及び遺伝子組換え宿主細胞から生成される化合物を含む、容器（例えば、フラスコ、プレート、又は発酵槽）の全内容物でありうる全細胞ブロスである。
【００２４】
[0033]  本明細書で用いられるとき、用語「生成」は、一般に、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞によって生成されるステビオール又はステビオールグリコシドの量を指す。いくつかの実施形態では、生成は、宿主細胞によるステビオール又はステビオールグリコシドの収量として表される。他の実施形態では、生成は、ステビオール又はステビオールグリコシドを生成する場合の宿主細胞の生産性として表される。
【００２５】
[0034]  本明細書で用いられるとき、用語「生産性」は、宿主細胞が培養される発酵ブロスの（体積基準の）量あたり、経時的に（時間あたり）生成されるステビオール又はステビオールグリコシドの（重量基準の）量として表される、宿主細胞によるステビオール又はステビオールグリコシドの生成を指す。
【００２６】
[0035]  本明細書で用いられるとき、用語「収量」は、重量基準の、宿主細胞によって消費される炭素源の量あたり生成されるステビオール又はステビオールグリコシドの量として表される、宿主細胞によるステビオール又はステビオールグリコシドの生成を指す。
【００２７】
[0036]  本明細書で用いられるとき、化合物（例えば、ＲｅｂＭ２、ステビオールグリコシド、又は他の化合物）の用語「検出不能なレベル」は、化合物を測定するための標準的技術によって測定及び／又は分析されるには低過ぎる化合物のレベルを意味する。例えば、用語は、実施例６に記載の分析法により検出可能でない化合物のレベルを含む。
【００２８】
[0037]  用語「カウレン」は、カウレンの任意の立体異性体を含む化合物カウレンを指す。特定の実施形態では、用語は、ｅｎｔ−カウレンのような当該技術分野で公知の鏡像異性体を指す。特定の実施形態では、用語は、以下の構造：
【化１】
2020533954.tif 000003
に記載の化合物を指す。
【００２９】
[0038]  用語「カウレノール」は、カウレノールの任意の立体異性体を含む化合物カウレノールを指す。特定の実施形態では、用語は、ｅｎｔ−カウレノールのような当該技術分野で公知の鏡像異性体を指す。特定の実施形態では、用語は、以下の構造：
【化２】
2020533954.tif 000004
に記載の化合物を指す。
【００３０】
[0039]  用語「カウレナール」は、カウレナールの任意の立体異性体を含む化合物カウレナールを指す。特定の実施形態では、用語は、ｅｎｔ−カウレナールのような当該技術分野で公知の鏡像異性体を指す。特定の実施形態では、用語は、以下の構造：
【化３】
2020533954.tif 000005
に記載の化合物を指す。
【００３１】
[0040]  用語「カウレン酸」は、カウレン酸の任意の立体異性体を含む化合物カウレン酸を指す。特定の実施形態では、用語は、ｅｎｔ−カウレン酸のような当該技術分野で公知の鏡像異性体を指す。特定の実施形態では、用語は、以下の構造：
【化４】
2020533954.tif 000006
に記載の化合物を指す。
【００３２】
[0041]  本明細書で用いられるとき、用語「ステビオールグリコシド」は、ステビオールのグリコシド、例えば限定はされないが、天然に存在するステビオールグリコシド、例えば、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、ステビオシド、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、合成ステビオールグリコシド、例えば、酵素的にグルコシル化されたステビオールグリコシド及びそれらの組み合わせを指す。
【００３３】
[0042]  本明細書で用いられるとき、用語「変異体」は、具体的に列挙される「参照」ポリペプチド（例えば野生型配列）と、アミノ酸挿入、欠失、突然変異、及び／又は置換の分だけ異なるポリペプチドを指すが、参照ポリペプチドに対して実質的に類似する活性を保持する。いくつかの実施形態では、変異体は、組換えＤＮＡ技術、例えば突然変異誘発により作出される。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、その参照ポリペプチドと、一方の塩基残基ともう一方との（即ち、ＡｒｇとＬｙｓとの）置換、一方の疎水性残基ともう一方との（即ち、ＬｅｕとＩｌｅとの）置換、又は一方の芳香族残基ともう一方との（即ち、ＰｈｅとＴｙｒとの）置換などの分だけ異なる。いくつかの実施形態では、変異体は、参照配列との実質的な構造的類似性をもたらす保存的置換が得られる場合の類似体を含む。かかる保存的置換の例として、限定はされないが、グルタミン酸のアスパラギン酸に対するものとその逆；グルタミンのアスパラギンに対するものとその逆；セリンのトレオニンに対するものとその逆；リジンのアルギニンに対するものとその逆；又はイソロイシン、バリン若しくはロイシンのいずれかの互いに対するものが挙げられる。
【００３４】
[0043]  本明細書で用いられるとき、用語「配列同一性」又は「パーセント同一性」は、２つ以上の核酸又はタンパク質配列との関連では、同じである、又は特定の百分率で同じであるアミノ酸残基若しくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列若しくは部分配列を指す。例えば、配列は、比較ウインドウにわたる最大対応について比較及び整列されるときの参照配列に対する特定領域、又は配列比較アルゴリズムを用いて若しくはマニュアルアライメント及び目視検査により測定されるときの指定領域にわたり、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、若しくはより高い同一性のパーセント同一性を有しうる。例えば、同一性のパーセントは、配列内での同一ヌクレオチド（又はアミノ酸残基）の数を、全ヌクレオチド（又はアミノ酸残基）の長さから任意のギャップの長さを引いたもので除した比を計算することにより決定される。
【００３５】
[0044]  便宜上、２つの配列間の同一性の程度は、当該技術分野で公知のコンピュータプログラム及び数学的アルゴリズムを用いて確認されうる。パーセント配列同一性を計算するかかるアルゴリズムは、一般に比較領域にわたる配列ギャップ及びミスマッチを説明する。Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ(Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res., 22: 4673-4680), ＡＬＩＧＮ (Myers et al., (1988) CABIOS, 4: 11-17), ＦＡＳＴＡ (Pearson et al., (1988) PNAS, 85:2444-2448; Pearson (1990), Methods Enzymol., 183: 63-98) 及びギャップＢＬＡＳＴ (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402)のように配列を比較し、整列するプログラムは、この目的にとって有用である。ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０ (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990)は、配列分析プログラムＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮ、及びＴＢＬＡＳＴＸに関連して用いるため、国立生体情報センター(National Center for Biological Information) (NCBI)を含むいくつかのソースから、またインターネット上で入手可能である。追加的情報は、NCBIウェブサイトで見出すことができる。
【００３６】
[0045]  特定の実施形態では、配列アライメント及びパーセント同一性の計算は、ＢＬＡＳＴプログラムを用い、その標準のデフォルトパラメータを用いて決定することができる。ヌクレオチド配列アライメント及び配列同一性の計算においては、ＢＬＡＳＴＮプログラムが、そのデフォルトパラメータ（ギャップオープニングペナルティ＝５、ギャップエクステンションペナルティ＝２、核酸マッチ(Nucleic match)＝２、核酸ミスマッチ(Nucleic mismatch)＝−３、期待値＝１０．０、ワードサイズ＝１１、クエリ範囲における最大マッチ＝０）とともに用いられる。ポリペプチド配列アライメント及び配列同一性の計算においては、ＢＬＡＳＴＰプログラムが、そのデフォルトパラメータ（アライメントマトリックス＝ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップコスト：イグジステンス(Existence)＝１１、エクステンション(Extension)＝１；コンポジショナルアジャストメント(Compositional adjustment)＝コンディショナルコンポジショナルスコア(Conditional compositional score)、マトリックスアジャストメント(matrix adjustment)；期待値＝１０．０；ワードサイズ＝６；クエリ範囲における最大マッチ＝０）とともに用いられる。或いは、以下のプログラム及びパラメータ：Clone Manager Suite、バージョン５のAlign Plusソフトウェア(Sci-Ed Software)；ＤＮＡ比較：グローバル比較、標準線形スコアリングマトリックス、ミスマッチペナルティ＝２、オープンギャップペナルティ＝４、エクステンドギャップペナルティ＝１．アミノ酸比較：グローバル比較、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスが用いられる。本明細書に記載の実施形態では、配列同一性は、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰプログラムを用い、それらのデフォルトパラメータを用いて計算される。本明細書に記載の実施形態では、２つ以上の配列の配列アライメントが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗを用いて、提案されたデフォルトパラメータ（デアライン(Dealign)インプット配列：なし；Ｍｂｅｄ−ｌｉｋｅクラスタリングガイドツリー：あり；Ｍｂｅｄ−ｌｉｋｅクラスタリングイタレーション：あり；組み合わされたイタレーションの数：デフォルト（０）；最大ガイドツリーイタレーション：デフォルト；最大ＨＭＭイタレーション：デフォルト；オーダー：インプット）を用いて実施される。
【００３７】
６．２  宿主細胞
[0046]  カウレンからカウレン酸（ＫＡ）を高効率で生成する能力がある宿主細胞が、本明細書に提供される。特定の実施形態では、宿主細胞は、出発物質としてのカウレンからカウレン酸を生成しうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、培地中の炭素源からカウレン酸を生成しうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、培地中の炭素源からカウレン酸を生成可能であり、カウレン酸からＲｅｂＡ又はＲｅｂＤをさらに生成しうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＲｅｂＤからレバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）をさらに生成しうる。
【００３８】
[0047]  特定の実施形態では、宿主細胞は、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼの酵素活性を含む。エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ酵素は、カウレンをカウレン酸に高効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ酵素は、カウレンをカウレン酸に３０％を超える効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ酵素は、カウレンをカウレン酸に３５％を超える効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ酵素は、カウレンをカウレン酸に４０％を超える効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ酵素は、カウレンをカウレン酸に９５％を超える効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ酵素は、カウレンをカウレン酸に５０％を超える効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ酵素は、カウレンをカウレン酸に５５％を超える効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ酵素は、カウレンをカウレン酸に約５８％の効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ酵素は、カウレンをカウレン酸に３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％を超える効率で変換する能力がある。
【００３９】
[0048]  特定の実施形態では、宿主細胞は、カウレンをカウレン酸に３０％を超える効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、宿主細胞は、カウレンをカウレン酸に３５％を超える効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、宿主細胞は、カウレンをカウレン酸に４０％を超える効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、宿主細胞は、カウレンをカウレン酸に４５％を超える効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、宿主細胞は、カウレンをカウレン酸に５０％を超える効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、宿主細胞は、カウレンをカウレン酸に５５％を超える効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、宿主細胞は、カウレンをカウレン酸に約５８％の効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、宿主細胞は、カウレンをカウレン酸に３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％を超える効率で変換する能力がある。
【００４０】
[0049]  変換効率は、当業者にとって明白な任意の技術により評価可能である。特定の実施形態では、変換効率は、カウレンを酵素又は宿主細胞とカウレン酸の形成に適した条件下で接触させることにより評価可能である。効率は、生成されるカウレン酸のモル量を、得られる組成物中のカウレン及びカウレン酸の総量と比較することにより評価可能である。効率はまた、カウレン酸及びカウレン酸の下流生成物の総量を、得られる組成物中のカウレン、カウレノール、カウレナール、カウレン酸、及びカウレン酸の下流生成物の総量と比較することにより評価可能である。例えば、図５中に示されるＰｓ．ＫＯを含む株の変換効率は、カウレン酸及び図２に示されるすべての下流化合物の総量を、得られる組成物中のカウレン、カウレノール、カウレナール、カウレン酸、及び図２に示されるすべての下流化合物（即ち、ステビオール、１グルコース＋ステビオール、２グルコース＋ステビオール、３グルコース＋ステビオール、４グルコース＋ステビオール、５グルコース＋ステビオール、及び６グルコース＋ステビオール）の総量と比較することにより評価された。
【００４１】
[0050]  特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して実質的に同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも９９％、若しくは６０％〜９９％の間の少なくともいずれかの百分率が同一であるアミノ酸配列を含むカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。
【００４２】
[0051]  特定の実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸配列を含み、且つカウレンをカウレン酸に変換する能力があるカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、本明細書に記載のアミノ酸配列を含み、且つカウレン、カウレノール、及びカウレナールの各々の１９位を酸化する能力があるカウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、カウレンをカウレン酸に３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、若しくは９７％を超える効率で変換する能力があり、且つ配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、カウレンオキシダーゼを含む宿主細胞が本明細書に提供される。
【００４３】
[0052]  特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を含むエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して実質的に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、少なくとも６０％、少なくとも９９％、若しくは６０％〜９９％の間のいずれかの百分率であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。
【００４４】
[0053]  特定の実施形態では、配列番号１の配列を有するエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼをコードする配列番号１４のヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。特定の実施形態では、配列番号１４のヌクレオチド配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む宿主細胞が本明細書に提供される。
【００４５】
[0054]  特定の実施形態では、宿主細胞は、上記のエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼポリペプチドの変異体を含む。特定の実施形態では、変異体は、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼポリペプチドと比べて、最大１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１のアミノ酸置換を含みうる。特定の実施形態では、変異体は、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼポリペプチドと比べて、最大１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１の保存的アミノ酸置換を含みうる。特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸のいずれかは、宿主細胞について、例えばコドン最適化により最適化されうる。
【００４６】
[0055]  本明細書に記載の実施形態では、２つのポリペプチドの対応するアミノ酸位置又は対応するループ位置を判定するため、任意の好適な方法を用いることができる。特定の実施形態では、カウレンオキシダーゼの配列及び参照配列の配列番号１は、Ｃｌｕｓｔａｌ（Ｗ）を用い、そのデフォルトパラメータを用いて整列されうる。他の実施形態では、カウレンオキシダーゼの配列及び参照配列の配列番号１は、ExPASyウェブサーバー経由で、又はプログラムDeepView (Swiss Pdb-Viewer)からアクセス可能である、タンパク質構造相同性のモデリングサーバーであるSWISS-MODELなどの構造的アライメントを用いて整列されうる。
【００４７】
[0056]  特定の実施形態では、カウレンは、図１Ｃに示される通りである。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ又はエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体は、Ｃ−１９でカウレンの酸化を触媒し、カウレノールを形成する能力がある。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ又はエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体は、Ｃ−１９でカウレノールの酸化を触媒し、カウレナールを形成する能力がある。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼは、Ｃ−１９でカウレナールの酸化を触媒し、カウレン酸を形成する能力がある。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ又はエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体は、Ｃ−１９でカウレンの酸化を触媒し、カウレノールを形成し、Ｃ−１９でカウレノールの酸化を触媒し、カウレナールを形成し、またＣ−１９でカウレナールの酸化を触媒し、カウレン酸を形成する能力がある。
【００４８】
[0057]  特定の実施形態では、ＲｅｂＤは、図２に示される通りである。特定の実施形態では、宿主細胞は、カウレン酸をステビオールに変換する能力がある１又は複数の酵素をさらに含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、ステビオールを１又は複数のステビオールグリコシドに変換する能力がある１又は複数の酵素をさらに含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換する能力がある１又は複数の酵素をさらに含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換する能力がある１又は複数の酵素をさらに含む。
【００４９】
[0058]  宿主細胞のエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ又は任意のエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体がカウレンを基質として受け取る一方で、カウレンの供給源は、当業者にとって好適と見なされる任意の供給源でありうる。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ又は任意のエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体は、カウレンと接触されうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、カウレンと接触されうる。特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ又はエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼの任意の変異体は、カウレン、カウレノール、及びカウレナールの１又は複数を含む組成物と接触されうる。特定の実施形態では、組成物は、カウレンを含む。特定の実施形態では、組成物は、カウレノールを含む。特定の実施形態では、組成物は、カウレナールを含む。特定の実施形態では、組成物は、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)葉から単離された天然生成物に由来する。特定の実施形態では、組成物は、微生物に由来する。特定の実施形態では、宿主細胞は、１又は複数の炭素源を含む組成物と接触されうる。
【００５０】
[0059]  特定の実施形態では、所望される反応を触媒するのに適した任意のエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体は、当該技術分野で公知の任意の好適な方法についてスクリーニング可能である。例えば、好適なエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体は、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体をコードする異種核酸を発現させ、基質の所望される位置（例えば、カウレン、カウレノール、及び／又はカウレナールのＣ−１９位）で酸化を触媒する能力があるエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼの機能的変異体を生成する細胞をスクリーニングすることにより、インビボでアッセイ可能である。例示的なスクリーニング方法は、下の実施例に記載される。別の例では、好適なエンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体は、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体をカウレン、カウレノール、及び／又はカウレナールなどの基質と接触させることにより、インビトロでスクリーニング可能である。この例では、カウレン酸、ステビオール、又はステビオールグリコシド、例えばＲｅｂＤの存在についてのアッセイは、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体が好適な酵素であるか否かを判定するための試験として使用可能である。反応は、ＬＣ−ＭＳ又は他の当該技術分野で公知の方法により分析可能である。例えば、国際公開第２０１３／０２２９８９号を参照のこと。
【００５１】
[0060]  特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体は、それがインビボでカウレンをカウレン酸に３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、若しくは９７％を超える効率で変換する能力がある場合、カウレンをカウレン酸に変換するのに適すると考えられる。
【００５２】
[0061]  特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体は、それがインビボでカウレンをカウレノールに３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、若しくは９７％を超える効率で変換する能力がある場合、カウレンをカウレノールに変換するのに適すると考えられる。
【００５３】
[0062]  特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体は、それがインビボでカウレノールをカウレナールに３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、若しくは９７％を超える効率で変換する能力がある場合、カウレノールをカウレナールに変換するのに適すると考えられる。
【００５４】
[0063]  特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体は、それがインビボでカウレナールをカウレン酸に３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、若しくは９７％を超える効率で変換する能力がある場合、カウレナールをカウレン酸に変換するのに適すると考えられる。
【００５５】
[0064]  特定の実施形態では、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ変異体は、変換効率がインビボで３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、若しくは９７％を超える場合、カウレンをカウレン酸に変換するのに適すると考えられ、ここで変換効率は、カウレン酸及び図２に示されるすべての下流化合物の総量を、得られる組成物中のカウレン、カウレノール、カウレナール、カウレン酸、及び図２に示されるすべての下流化合物の総量で除すること（×１００パーセント）により算出される。
【００５６】
[0065]  有利な実施形態では、宿主細胞は、カウレンを作る能力がある１又は複数の酵素経路であって、個別に又は一緒に利用される経路を含みうる。特定の実施形態では、宿主細胞は、ゲラニルゲラニル二リン酸をカウレンに変換する能力がある１又は複数の酵素を含む。有用な酵素及び酵素をコードする核酸は、当業者に公知である。特定の実施形態では、宿主細胞は、ゲラニルゲラニル二リン酸をカウレンに変換する能力がある１又は複数の酵素を含む。さらに有利な実施形態では、宿主細胞は、カウレン酸をステビオール及び／又はステビオールグリコシドに変換する能力がある１又は複数の酵素であって、個別に又は一緒に利用される経路を含みうる。有用な酵素及び酵素をコードする核酸は、当業者に公知である。特に有用な酵素及び核酸は、下記セクション中に記載され、例えば、米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号、米国特許出願公開第２０１４／０３５７５８８Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１８８号、国際公開第２０１６／０３８０９５Ａ２号、及び米国特許出願公開第２０１６／０１９８７４８Ａ１号にさらに記載される。
【００５７】
[0066]  さらなる実施形態では、宿主細胞は、炭素源からゲラニルゲラニル二リン酸を作る能力がある１又は複数の酵素をさらに含む。これらは、ＤＸＰ経路の酵素及びＭＥＶ経路の酵素を含む。有用な酵素及び酵素をコードする核酸は、当業者に公知である。各経路の例示的な酵素は、以下に記載され、例えば、米国特許出願公開第２０１６／０１７７３４１Ａ１号にさらに記載される。ＭＥＶ経路はまた、図１Ｄに示される。
【００５８】
[0067]  特定の実施形態では、追加的な酵素は、天然である。有利な実施形態では、追加的な酵素は、異種である。特定の実施形態では、２つの酵素は、１つのポリペプチドにおいて組み合わせ可能である。
【００５９】
６．３  天然に存在しないカウレンオキシダーゼポリペプチド及び核酸
[0068]  別の態様では、参照配列（例えば配列番号１）と比べてのアミノ酸残基の修飾を含むが、カウレンをカウレン酸に、カウレンをカウレノールに、カウレノールをカウレナールに、及び／又はカウレナールをカウレン酸に変換するためのカウレンオキシダーゼとしての活性をさらに保持する、天然に存在しないカウレンオキシダーゼ変異体が本明細書に提供される。特定の実施形態では、天然に存在しないカウレンオキシダーゼ変異体は、最大２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、若しくは１のアミノ酸置換、欠失、付加、及び／又は挿入を、特定のアミノ酸位置又は参照配列（例えば配列番号１）と比べた位置に含みうる。特定の実施形態では、天然に存在しないカウレンオキシダーゼ変異体は、本明細書に記載のカウレンオキシダーゼ変異体のいずれかを含む。
【００６０】
[0069]  別の態様では、参照配列（例えば配列番号１５）と比べての核酸残基の修飾を含むが、タンパク質に翻訳されるとき、タンパク質は、カウレンをカウレン酸に、カウレンをカウレノールに、カウレノールをカウレナールに、及び／又はカウレナールをカウレン酸に変換するためのカウレンオキシダーゼとしての活性を保持する、天然に存在しないカウレンオキシダーゼ変異体が本明細書に提供される。特定の実施形態では、天然に存在しないカウレンオキシダーゼ変異体は、本明細書に記載のカウレンオキシダーゼ変異体のいずれかをコードしうる。
【００６１】
６．４  細胞株
[0070]  本明細書に提供される組成物及び方法にとって有用な宿主細胞は、古細菌、原核細胞、又は真核細胞を含む。
【００６２】
[0071]  好適な原核宿主は、限定はされないが、種々のグラム陽性、グラム陰性、又はグラム不定細菌のいずれかを含む。例として、限定はされないが、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アリシクロバチルス(Alicyclobacillus)属、アナベナ(Anabaena)属、アナシスティス(Anacystis)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属、アゾバクター(Azobacter)属、バチルス(Bacillus)属、ブレビバクテリウム(Brevibacterium)属、クロマチウム(Chromatium)属、クロストリジウム(Clostridium)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、エンテロバクター(Enterobacter)属、エルウィニア(Erwinia)属、エシェリキア(Escherichia)属、ラクトバチルス(Lactobacillus)属、ラクトコッカス(Lactococcus)属、メソリゾビウム(Mesorhizobium)属、メチロバクテリウム(Methylobacterium)属、ミクロバクテリウム(Microbacterium)属、フォルミディウム(Phormidium)属、シュードモナス(Pseudomonas)属、ロドバクター(Rhodobacter)属、ロドシュードモナス(Rhodopseudomonas)属、ロドスピリラム(Rhodospirillum)属、ロドコッカス(Rhodococcus)属、サルモネラ(Salmonella)属、セネデスムス(Scenedesmus)属、セラチア(Serratia)属、シゲラ(Shigella)属、スタフロコッカス(Staphlococcus)属、ストレプロマイセス(Strepromyces)属、シネココッカス(Synnecoccus)属、及びザイモモナス(Zymomonas)属に属する細胞が挙げられる。原核生物株の例として、限定はされないが、枯草菌(Bacillus subtilis)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefacines)、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(Brevibacterium ammoniagenes)、ブレビバクテリウム・インマリオフィラム(Brevibacterium immariophilum)、クロストリジウム・ベイエリンキイ(Clostridium beigerinckii)、エンテロバクター・サカザキ(Enterobacter sakazakii)、大腸菌(Escherichia coli）、ラクトコッカス・ラクティス(Lactococcus lactis)、メソリゾビウムロティ(Mesorhizobium loti)、緑膿菌(Pseudomonas aeruginosa)、シュードモナス・メバロニイ(Pseudomonas mevalonii)、シュードモナス・プディカ(Pseudomonas pudica)、ロドバクター・カプスラータ(Rhodobacter capsulatus)、ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)、ロドスピリラム・ラブラム(Rhodospirillum rubrum)、サルモネラ菌(Salmonella enterica)、チフス菌(Salmonella typhi)、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)、志賀赤痢菌(Shigella dysenteriae)、シゲラ・フレックスネリ(Shigella flexneri)、ソンネ菌(Shigella sonnei)、及び黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)が挙げられる。特定の実施形態では、宿主細胞は、大腸菌(Escherichia coli)細胞である。
【００６３】
[0072]  好適な古細菌宿主は、限定はされないが、アエロピルム(Aeropyrum)属、アーケオグロブス(Archaeoglobus)属、ハロバクテリウム(Halobacterium)属、メタノコッカス(Methanococcus)属、メタノバクテリウム(Methanobacterium)属、パイロコッカス(Pyrococcus)属、スルホロブス(Sulfolobus)属、及びサーモプラズマ(Thermoplasma)属に属する細胞を含む。古細菌株の例として、限定はされないが、アーケオグロブス・フルギダス(Archaeoglobus fulgidus)、ハロバクテリウム種(Halobacterium sp.)、メタノコックス・ヤンナスキイ(Methanococcus jannaschii)、メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム(Methanobacterium thermoautotrophicum)、サーモプラズマ・アシドフィラム(Thermoplasma acidophilum)、サーモプラズマ・ボルカニウム(Thermoplasma volcanium)、パイロコッカス・ホリコシイ(Pyrococcus horikoshii)、パイロコッカス・アビシ(Pyrococcus abyssi)、及びアエロパイラム・ペルニクス(Aeropyrum pernix)が挙げられる。
【００６４】
[0073]  好適な真核生物宿主は、限定はされないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞、及び植物細胞を含む。いくつかの実施形態では、本方法において有用な酵母は、微生物保管所（例えば、IFO、ATCCなど）に寄託されている酵母を含み、特に、アシクロコニジウム(Aciculoconidium)属、アムブロシオジマ(Ambrosiozyma)属、アルスロアスカス(Arthroascus)属、アルキシオジマ(Arxiozyma)属、アシュビア(Ashbya)属、バブジェビア(Babjevia)属、ベンシングトニア(Bensingtonia)属、ボトリオアスカス(Botryoascus)属、ボツリオザイマ(Botryozyma)属、ブレタノマイセス(Brettanomyces)属、ブレラ(Bullera)属、ブレロマイセス(Bulleromyces)属、カンジダ(Candida)属、シテロマイセス(Citeromyces)属、クラビスポラ(Clavispora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、シストフィロバシディウム(Cystofilobasidium)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、デッカラ(Dekkara)属、ディポダスコプシス(Dipodascopsis)属、ディポダスカス(Dipodascus)属、エニエラ(Eeniella)属、エンドマイコプセラ(Endomycopsella)属、エレマスカス(Eremascus)属、エレモテシウム(Eremothecium)属、エリスロバシディウム(Erythrobasidium)属、フェロマイセス(Fellomyces)属、フィロバシディウム(Filobasidium)属、ガラクトミセス(Galactomyces)属、ゲオトリクム(Geotrichum)属、ガイラーモンデラ(Guilliermondella)属、ハンセニアスポラ(Hanseniaspora)属、ハンゼヌラ(Hansenula)属、ハセガワエア(Hasegawaea)属、ホルターマニア(Holtermannia)属、ホルモアスカス(Hormoascus)属、ハイフォピキア(Hyphopichia)属、イッサトチェンキア(Issatchenkia)属、クロエケラ(Kloeckera)属、クロエケラスポラ(Kloeckeraspora)属、クルイベロマイセス(Kluyveromyces)属、コンドア(Kondoa)属、クライシア(Kuraishia)属、クルツマノマイセス(Kurtzmanomyces)属、ロイコスポリジウム(Leucosporidium)属、リポマイセス(Lipomyces)属、ロッデロマイセス(Lodderomyces)属、マラセジア(Malassezia)属、メチニコビア(Metschnikowia)属、ムラキア(Mrakia)属、ミキソザイマ(Myxozyma)属、ナドソニア(Nadsonia)属、ナカザワエワ(Nakazawaea)属、ネマトスポラ(Nematospora)属、オガタエア(Ogataea)属、オースポリディウム(Oosporidium)属、パキソレン(Pachysolen)属、ファチコスポラ(Phachytichospora)属、ファフィア(Phaffia)属、ピキア(Pichia)属、ロドスポリジウム(Rhodosporidium)属、ロドトルラ(Rhodotorula)属、サッカロマイセス(Saccharomyces)属、サッカロマイコーデス(Saccharomycodes)属、サッカロマイコプシス(Saccharomycopsis)属、サイトエラ(Saitoella)属、サカグチア(Sakaguchia)属、サターノスポラ(Saturnospora)属、シゾブラストスポリオン(Schizoblastosporion)属、シゾサッカロミセス(Schizosaccharomyces)属、シュワンニオマイセス(Schwanniomyces)属、スポリジオボルス(Sporidiobolus)属、スポロボロマイセス(Sporobolomyces)属、スポロパキデルミア(Sporopachydermia)属、ステファノアスカス(Stephanoascus)属、ステリグマトマイセス(Sterigmatomyces)属、ステリグマトスポリジウム(Sterigmatosporidium)属、シンビオタフリナ(Symbiotaphrina)属、シンポディオマイセス(Sympodiomyces)属、シンポディオマイコプシス(Sympodiomycopsis)属、トルラスポラ(Torulaspora)属、トリコスポリエラ(Trichosporiella)属、トリコスポロン(Trichosporon)属、トリゴノプシス(Trigonopsis)属、ツチヤエア(Tsuchiyaea)属、ウデニオマイセス(Udeniomyces)属、ワルトマイセス(Waltomyces)属、ヴィッカーハミア(Wickerhamia)属、ヴィッケルハミエラ(Wickerhamiella)属、ウィリオプシス(Williopsis)属、ヤマダザイマ(Yamadazyma)属、ヤロウイ���(Yarrowia)属、ジゴアスカス(Zygoascus)属、チゴサッカロミセス(Zygosaccharomyces)属、ザイゴウィリオプシス(Zygowilliopsis)属、及びザイゴザイマ(Zygozyma)属に属する。
【００６５】
[0074]  いくつかの実施形態では、宿主微生物は、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、デッケラ・ブルクセレンシス(Dekkera bruxellensis)、クリベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)（以前は、サッカロマイセス・ラクティス(Saccharomyces lactis)と称された）、クルベロマイセス・マルキシアヌス(Kluveromyces marxianus)、アルクスラ・アデニニボランス(Arxula adeninivorans)、又はハンセヌラ・ポリモルファ(Hansenula polymorpha)（現在、ピキア・アングスタ(Pichia angusta)として公知）である。いくつかの実施形態では、宿主微生物は、カンジダ(Candida)属、例えば、カンジダ・リポリチカ(Candida lipolytica)、カンジダ・ギリエルモンディ(Candida guilliermondii)、カンジダ・クルセイ(Candida krusei)、カンジダ・シュードトロピカリス(Candida pseudotropicalis)、又はトルラ酵母(Candida utilis)の株である。
【００６６】
[0075]  特定の実施形態では、宿主微生物は、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)である。いくつかの実施形態では、宿主は、パン酵母、ＣＢＳ７９５９、ＣＢＳ７９６０、ＣＢＳ７９６１、ＣＢＳ７９６２、ＣＢＳ７９６３、ＣＢＳ７９６４、ＩＺ−１９０４、ＴＡ、ＢＧ−１、ＣＲ−１、ＳＡ−１、Ｍ−２６、Ｙ−９０４、ＰＥ−２、ＰＥ−５、ＶＲ−１、ＢＲ−１、ＢＲ−２、ＭＥ−２、ＶＲ−２、ＭＡ−３、ＭＡ−４、ＣＡＴ−１、ＣＢ−１、ＮＲ−１、ＢＴ−１、及びＡＬ−１からなる群から選択される出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の株である。いくつかの実施形態では、宿主微生物は、ＰＥ−２、ＣＡＴ−１、ＶＲ−１、ＢＧ−１、ＣＲ−１、及びＳＡ−１からなる群から選択される出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の株である。特定の実施形態では、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の株は、ＰＥ−２である。別の特定の実施形態では、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の株は、ＣＡＴ−１である。別の特定の実施形態では、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)の株は、ＢＧ−１である。
【００６７】
[0076]  いくつかの実施形態では、宿主微生物は、工業的発酵に適した微生物である。特定の実施形態では、微生物は、工業的発酵環境の認められたストレス条件である、高い溶媒濃度、高温、拡大された基質利用、栄養制限、糖及び塩に起因する浸透圧ストレス、酸性度、亜硫酸及び細菌汚染、又はそれらの組み合わせの下で生存するように条件づけられる。
【００６８】
６．５  ステビオール及びステビオールグリコシドの生合成経路
[0077]  いくつかの実施形態では、ステビオール生合成経路及び／又はステビオールグリコシド生合成経路は、経路の１又は複数の酵素をコードするポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドを発現するように細胞を改変することにより、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞内で活性化される。図１Ｂは、例示的なステビオール生合成経路を図示する。図２は、ゲラニルゲラニルピロリン酸から開始して様々なステビオールグリコシドに至る、例示的なステビオールグリコシド生合成経路を図示する。
【００６９】
[0078]  したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞は、ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞は、コパリル二リン酸シンターゼ又はｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ；ｅｎｔ−コパリルピロリン酸シンターゼ又はＣＰＳとも称される）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞は、カウレンシンターゼ（ＫＳ；ｅｎｔ−カウレンシンターゼとも称される）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞は、本明細書に記載のようなカウレンオキシダーゼ活性（ＫＯ；ｅｎｔ−カウレン１９−オキシダーゼとも称される）を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞は、ステビオールシンターゼ（ｅｎｔ−カウレン酸１３−ヒドロキシラーゼ又はＫＡＨとも称される）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞は、チトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。
【００７０】
[0079]  いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞は、ＵＧＴ７４Ｇ１活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞は、ＵＧＴ７６Ｇ１活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞は、ＵＧＴ８５Ｃ２活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞は、ＵＧＴ９１Ｄ活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞は、ＵＤＰ糖転移酵素活性を有するポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む。
【００７１】
[0080]  特定の実施形態では、宿主細胞は、変異体を含む。特定の実施形態では、変異体は、関連ポリペプチドと比べて、最大１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１のアミノ酸置換を含みうる。特定の実施形態では、変異体は、参照ポリペプチドと比べて、最大１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１の保存的アミノ酸置換を含みうる。特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸のいずれかは、宿主細胞について、例えばコドン最適化により最適化されうる。
【００７２】
[0081]  ステビオール生合成経路及び／又はステビオールグリコシド生合成経路の例示的な核酸及び酵素は、以下に記載される。
【００７３】
６．５．１  ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＧＧＰＰＳ）
[0082]  ゲラニルゲラニル二リン酸シンターゼ（ＥＣ２．５．１．２９）は、ファルネシルピロリン酸のゲラニルゲラニル二リン酸への変換を触媒する。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)（受入番号ＡＢＤ９２９２６）、ギベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)（受入番号ＣＡＡ７５５６８）、ムス・ムスクルス(Mus musculus)（受入番号ＡＡＨ６９９１３）、タラシオシラ・シュードナナ(Thalassiosira pseudonana)（受入番号ＸＰ＿００２２８８３３９）、ストレプトマイセス・クラブリゲルス(Streptomyces clavuligerus)（受入番号ＺＰ＿０５００４５７０）、スルホロブス・アシドカルダリウス(Sulfulobus acidocaldarius)（受入番号ＢＡＡ４３２００）、シネココッカス種(Synechococcus sp.)（受入番号ＡＢＣ９８５９６）、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)（受入番号ＮＰ＿１９５３９９）、ブラケスレア・トリスポーラ(Blakeslea trispora)（受入番号ＡＦＣ９２７９８．１）及び米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号の場合が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのＧＧＰＰＳ核酸の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのＧＧＰＰＳ酵素の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
【００７４】
６．５．２  コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）
[0083]  コパリル二リン酸シンターゼ（ＥＣ５．５．１．１３）は、ファルネシルピロリン酸のゲラニルゲラニル二リン酸への変換を触媒する。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)（受入番号ＡＡＢ８７０９１）、ストレプトマイセス・クラブリゲルス(Streptomyces clavuligerus)（受入番号ＥＤＹ５１６６７）、ダイズ根粒菌(Bradyrhizobium japonicum)（受入番号ＡＡＣ２８８９５．１）、トウモロコシ(Zea mays)（受入番号ＡＹ５６２４９０）、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)（受入番号ＮＭ＿１１６５１２）、アジアイネ(Oryza sativa)（受入番号Ｑ５ＭＱ８５．１）及び米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号の場合が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのＣＤＰＳ核酸の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのＣＤＰＳ酵素の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、９５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
【００７５】
６．５．３  カウレンシンターゼ（ＫＳ）
[0084]  カウレンシンターゼ（ＥＣ４．２．３．１９）は、コパリル二リン酸のカウレン及び二リン酸への変換を触媒する。酵素の実例として、ダイズ根粒菌(Bradyrhizobium japonicum)（受入番号ＡＡＣ２８８９５．１）、ファエオスファエリア種(Phaeosphaeria sp.)（受入番号Ｏ１３２８４）、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)（受入番号Ｑ９ＳＡＫ２）、ピセア・グラウカ(Picea glauca)（受入番号ＡＤＢ５５７１１．１）及び米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号の場合が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのＫＳ核酸の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのＫＳ酵素の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
【００７６】
６．５．４  二官能性コパリル二リン酸シンターゼ（ＣＤＰＳ）及びカウレンシンターゼ（ＫＳ）
[0085]  ＣＤＰＳ−ＫＳ二官能性酵素（ＥＣ５．５．１．１３及びＥＣ４．２．３．１９）も使用可能である。酵素の実例として、モモ枝折病菌(Phomopsis amygdali)（受入番号ＢＡＧ３０９６２）、ヒメツリガネゴケ(Physcomitrella patens)（受入番号ＢＡＦ６１１３５）、ギベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)（受入番号Ｑ９ＵＶＹ５．１）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号、米国特許出願公開第２０１４／０３５７５８８Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１８８号、及び国際公開第２０１６／０３８０９５Ａ２号の場合が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのＣＤＰＳ−ＫＳ核酸の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのＣＤＰＳ−ＫＳ酵素の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
【００７７】
６．５．５  Ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（ＫＯ）
[0086]  Ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼ（ＥＣ１．１４．１３．７８；カウレンオキシダーゼとも称される）が本明細書に記載される。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのカウレンオキシダーゼ核酸の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのカウレンオキシダーゼ酵素の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
【００７８】
６．５．６  ステビオールシンターゼ（ＫＡＨ）
[0087]  ステビオールシンターゼ、又はカウレン酸ヒドロキシラーゼ（ＫＡＨ）、（ＥＣ１．１４．１３）は、カウレン酸のステビオールへの変換を触媒する。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)（受入番号ＡＣＤ９３７２２）、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)（配列番号１０）、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)（受入番号ＮＰ＿１９７８７２）、ヨーロッパブドウ(Vitis vinifera)（受入番号ＸＰ＿００２２８２０９１）、タルウマゴヤシ(Medicago trunculata)（受入番号ＡＢＣ５９０７６）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号、米国特許出願公開第２０１４／０３５７５８８Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１８８号、及び国際公開第２０１６／０３８０９５Ａ２号の場合が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのＫＡＨ核酸の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのＫＡＨ酵素の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
【００７９】
６．５．７  チトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＣＰＲ）
[0088]  チトクロムＰ４５０レダクターゼ（ＥＣ１．６．２．４）は、上記ＫＯ及び／又はＫＡＨの活性を補助又は促進する能力がある。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)（受入番号ＡＢＢ８８８３９）、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)（受入番号ＮＰ＿１９４１８３）、ギベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)（受入番号ＣＡＥ０９０５５）、クソニンジン(Artemisia annua)（受入番号ＡＢＣ４７９４６．１）、並びに米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号、米国特許出願公開第２０１４／０３５７５８８Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１５９１８８号、及び国際公開第２０１６／０３８０９５Ａ２号の場合が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのＣＰＲ核酸の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのＣＰＲ酵素の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
【００８０】
６．５．８  ＵＤＰ糖転移酵素７４Ｇ１（ＵＧＴ７４Ｇ１）
[0089]  ＵＧＴ７４Ｇ１は、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして、またウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド１９−ＣＯＯＨトランスフェラーゼとして機能する能力がある。図２に示される通り、ＵＧＴ７４Ｇ１は、ステビオールを１９−グリコシドに変換する能力がある。ＵＧＴ７４Ｇ１はまた、ステビオールモノシドをルブソシドに変換する能力がある。ＵＧＴ７４Ｇ１はまた、ステビオールビオシドをステビオシドに変換する能力があってもよい。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)の場合（例えば、Richman et al., 2005, Plant J. 41: 56-67、並びに米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１号及び国際公開第２０１６／０３８０９５Ａ２号及び受入番号ＡＡＲ０６９２０．１の場合）が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのＵＧＴ７４Ｇ１核酸の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのＵＧＴ７４Ｇ１酵素の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
【００８１】
６．５．９  ＵＤＰ糖転移酵素７６Ｇ１（ＵＧＴ７６Ｇ１）
[0090]  ＵＧＴ７６Ｇ１は、グルコース部分をアクセプター分子ステビオール１，２グリコシドのＣ−１３−Ｏ−グルコースのＣ−３’に移す能力がある。したがって、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１３−Ｏ−１，２グルコシドＣ−３’グルコシルトランスフェラーゼ及びウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１９−Ｏ−グルコース、１３−Ｏ−１，２ビオシドＣ−３’グルコシルトランスフェラーゼとして機能する能力がある。図２に示される通り、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ステビオールビオシドをＲｅｂＢに変換する能力がある。ＵＧＴ７６Ｇ１はまた、ステビオシドをＲｅｂＡに変換する能力がある。ＵＧＴ７６Ｇ１はまた、ＲｅｂＤをＲｅｂＭに変換する能力がある。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)の場合（例えば、Richman et al., 2005, Plant J. 41: 56-67、並びに米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号及び国際公開第２０１６／０３８０９５Ａ２号及び受入番号ＡＡＲ０６９１２．１の場合）が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのＵＧＴ７６Ｇ１核酸の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのＵＧＴ７６Ｇ１酵素の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
【００８２】
６．５．１０  ＵＤＰ糖転移酵素８５Ｃ２（ＵＧＴ８５Ｃ２）
[0091]  ＵＧＴ８５Ｃ２は、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール１３−ＯＨトランスフェラーゼ、及びウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１９−Ｏ−グルコシド１３−ＯＨトランスフェラーゼとして機能する能力がある。したがって、図２に示される通り、ＵＧＴ８５Ｃ２は、ステビオールをステビオールモノシドに変換する能力があり、１９−グリコシドをルブソシドに変換する能力もある。酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)の場合（例えば、Richman et al., 2005, Plant J. 41: 56-67、並びに米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号及び国際公開第２０１６／０３８０９５Ａ２号及び受入番号ＡＡＲ０６９１６．１の場合）が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのＵＧＴ８５Ｃ２核酸の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのＵＧＴ８５Ｃ２酵素の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
【００８３】
６．５．１１  ＵＤＰ糖転移酵素９１Ｄ（ＵＧＴ９１Ｄ）
[0092]  ＵＧＴ９１Ｄは、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ステビオール−１３−Ｏ−グルコシドトランスフェラーゼとして機能し、グルコース部分をアクセプター分子ステビオール−１３−Ｏ−グルコシド（ステビオールモノシド）の１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に移し、ステビオシドを生成する能力がある。ＵＧＴ９１Ｄはまた、図２に示される通り、ウリジン５’−ジホスホグルコシル：ルブソシドトランスフェラーゼとして機能し、グルコース部分をアクセプター分子ルブソシドの１３−Ｏ−グルコースのＣ−２’に移し、ステビオシドをもたらす能力がある。ＵＧＴ９１Ｄは、ＵＧＴ９１Ｄ２、ＵＧＴ９１Ｄ２ｅ、又はＵＧＴ９１Ｄ−ｌｉｋｅ３とも称される。ＵＧＴ９１Ｄ酵素の実例として、ステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)の場合（例えば、受入番号ＡＣＥ８７８５５．１、米国特許出願公開第２０１４／０３２９２８１Ａ１号、国際公開第２０１６／０３８０９５Ａ２号、及び配列番号７を有するＵＧＴ配列の場合）が挙げられる。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、これらのＵＧＴ９１Ｄ核酸の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのＵＧＴ９１Ｄ酵素の少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。
【００８４】
６．５．１２  ＲｅｂＡをＲｅｂＤ（ＵＧＴＡＤ）に変換する能力があるウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ
[0093]  ウリジン二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴＡＤ）は、図２に示される通り、グルコース部分をＲｅｂＡの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’位に移し、ＲｅｂＤを生成する能力がある。ＵＧＴＡＤはまた、グルコース部分をステビオシドの１９−Ｏ−グルコースのＣ−２’位に移し、ＲｅｂＥを生成する能力がある。ＵＧＴの有用例として、アジアイネ(Oryza sativa)由来のＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１（Houghton-Larsen et al.、国際公開第２０１３／０２２９８９Ａ２号においてＥＵＧＴ１１とも称される；ＸＰ＿０１５６２９１４１．１）及びトマト(Solanum lycopersicum)由来のＳｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１（Markosyan et al.、国際公開第２０１４／１９３８８８Ａ１号においてＵＧＴＳＬ２とも称される；ＸＰ＿００４２５０４８５．１）が挙げられる。さらに有用なＵＧＴとして、ＵＧＴ４００８７（ＸＰ＿００４９８２０５９．１）、ｓｒ．ＵＧＴ＿９２５２７７８（配列番号１６）、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８４０（ＸＰ＿００３５６０６６９．１）、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１（ＢＡＪ９４０５５．１）、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０（ＸＰ＿０１０２３０８７１．１）、及びＯｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ１＿ｌｉｋｅ（ＸＰ＿００６６５０４５５．１）が挙げられる。任意のＵＧＴ又はＵＧＴ変異体は、本明細書に記載の組成物及び方法において使用可能である。これらの酵素をコードする核酸は、本明細書に提供される細胞及び方法において有用である。特定の実施形態では、ＵＧＴの少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有する核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、これらのＵＧＴの少なくとも１つに対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸を用いる細胞及び方法が本明細書に提供される。特定の実施形態では、本明細書に記載のＵＧＴ変異体をコードする核酸が本明細書に提供される。
【００８５】
[0094]  特定の実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、ＵＧＴ４００８７の配列（例えば、配列番号１７又は配列番号１８）に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素をコードする異種核酸を含む。特定の実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに９０％、９５％、９６％、若しくは９７％よりも大きい効率で変換する能力がある。特定の実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、糖アクセプタードメインを含むＵＤＰ糖転移酵素を含み、ここで糖アクセプタードメインのアミノ酸配列は、配列番号１７又は配列番号１８の糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の配列同一性を有する。特定の実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、ループ１アミノ酸配列、ループ１変異体アミノ酸配列、ループ２アミノ酸配列、ループ２変異体アミノ酸配列、ループ３＿１アミノ酸配列、ループ３＿１変異体アミノ酸配列、ループ３＿２アミノ酸配列、ループ３＿２変異体アミノ酸配列、ループ４＿１アミノ酸配列、ループ４＿１変異体アミノ酸配列、ループ４＿２アミノ酸配列、又はそれらのいずれかの組み合わせを含むＵＤＰ糖転移酵素を含む。特定の実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、配列番号１７又は配列番号１８の糖アクセプタードメインに対して少なくとも６１％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素を含み、配列番号１７又は配列番号１８のループ４＿１アミノ酸配列をさらに含む。
【００８６】
[0095]  本明細書で用いられるとき、用語「ループ１変異体」アミノ酸配列は、配列番号１７又は１８の参照ループ１アミノ酸配列（又は配列番号２８の配列を有するＵＧＴ４００８７の修飾ループ１配列）と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のアミノ酸挿入、欠失、突然変異、及び／又は置換だけ異なるが、配列番号１７又は１８のループ１アミノ酸配列位置に対応する位置に各々挿入された、ループ１変異体アミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素が、ＲｅｂＡのＲｅｂＤへの変換及び／又はステビオシドのＲｅｂＥへの変換を触媒することを可能にするアミノ酸配列を指す。
【００８７】
[0096]  本明細書で用いられるとき、用語「ループ２変異体」アミノ酸配列は、配列番号１７又は１８の参照ループ２アミノ酸配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のアミノ酸挿入、欠失、突然変異、及び／又は置換だけ異なるが、配列番号１７又は１８のループ２アミノ酸配列位置に対応する位置に各々挿入された、ループ２変異体アミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素が、ＲｅｂＡのＲｅｂＤへの変換及び／又はステビオシドのＲｅｂＥへの変換を触媒することを可能にするアミノ酸配列を指す。
【００８８】
[0097]  本明細書で用いられるとき、用語「ループ３＿１変異体」アミノ酸配列は、配列番号１７又は１８の参照ループ３＿１アミノ酸配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のアミノ酸挿入、欠失、突然変異、及び／又は置換だけ異なるが、配列番号１７又は１８のループ３＿１アミノ酸配列位置に対応する位置に挿入された、ループ３＿１変異体アミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素が、ＲｅｂＡのＲｅｂＤへの変換及び／又はステビオシドのＲｅｂＥへの変換を触媒することを可能にするアミノ酸配列を指す。本明細書で用いられるとき、用語「ループ３＿２変異体」アミノ酸配列は、配列番号１７又は１８の参照ループ３＿２アミノ酸配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０のアミノ酸挿入、欠失、突然変異、及び／又は置換だけ異なるが、配列番号１７又は１８のループ３＿２アミノ酸配列位置に対応する位置に各々挿入された、ループ３＿２変異体アミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素が、ＲｅｂＡのＲｅｂＤへの変換及び／又はステビオシドのＲｅｂＥへの変換を触媒することを可能にするアミノ酸配列を指す。特定の実施形態では、ループ３＿２変異体アミノ酸配列は、参照ループ３＿２アミノ酸配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは最大３０のアミノ酸挿入、欠失、突然変異、及び／又は置換だけ異なる。
【００８９】
[0098]  本明細書で用いられるとき、用語「ループ４＿１変異体」アミノ酸配列は、配列番号１７又は１８の参照ループ４＿１アミノ酸配列と、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、若しくは最大３０のアミノ酸挿入、欠失、突然変異、及び／又は置換だけ異なるが、配列番号１７又は１８のループ４＿１アミノ酸位置に対応する位置に挿入された、ループ４＿１変異体配列を含むＵＤＰ糖転移酵素が、ＲｅｂＡのＲｅｂＤへの変換及び／又はステビオシドのＲｅｂＥへの変換を触媒することを可能にするアミノ酸配列を指す。
【００９０】
[0099]  特定の実施形態では、宿主細胞は、ＵＧＴ４００８７の機能ドメインを含み、ここでＵＧＴ４００８７は、配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を含むＵＧＴ４００８７のＮ末端糖アクセプタードメインを含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のアミノ酸配列を含むＵＧＴ４００８７のＣ末端糖ドナードメインを含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、ＵＧＴ４００８７の糖アクセプタードメインは、（配列番号１７のアミノ酸１〜２１５位に対応する）配列番号１８のアミノ酸の約１〜２１４位を含む。特定の実施形態では、ＵＧＴ４００８７の糖ドナードメインは、（配列番号１７のアミノ酸２１６〜４３６位に対応する）配列番号１８のアミノ酸の約２１５〜４３５位を含む。特定の実施形態では、ＵＧＴ４００８７の糖アクセプタードメインは、配列番号１７のアミノ酸の約１〜２１５位を含む。特定の実施形態では、ＵＧＴ４００８７の糖ドナードメインは、配列番号１７の２１６〜４３６のおよそのアミノ酸位置を含む。特定の実施形態では、ＵＧＴ４００８７の糖アクセプタードメイン及び糖ドナードメインは各々、配列番号１８に関して、１〜２１４又は２１５又は４３５よりも狭い範囲のアミノ酸残基を含む。特定の実施形態では、ＵＧＴ４００８７の糖アクセプタードメイン及び糖ドナードメインは各々、配列番号１７に関して、１〜２１５又は２１６〜４３６よりも狭い範囲のアミノ酸残基を含む。
【００９１】
[00100]  特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して実質的に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、少なくとも９９％、若しくは６０％〜９９％の間のいずれかの百分率が同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む宿主細胞が本明細書に提供される。
【００９２】
[00101]  特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列を含むＵＧＴ４００８７をコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して実質的に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００９３】
[00102]  特定の実施形態では、ＵＧＴ４００８７と別のＵＤＰ糖転移酵素との三次元モデル構造が比較及び分析されたとき、それらはＮ末端糖アクセプタードメインで有意な立体構造的差異を有する４つのループ（即ち、ループ１、ループ２、ループ３、及びループ４）を示した。２つのＵＧＴ間での対応するループ配列の交換からの実験的結果は、ＵＧＴ４００８７のループ１、ループ２、ループ３＿１、ループ３＿２、及びループ４＿１が、それら各々の、ＲｅｂＡからＲｅｂＤに変換する能力がある他のＵＤＰ糖転移酵素からの対応するループ配列と置換可能であることを示した。これらの実施形態では、ループ３の２バージョン（即ち、ループ３＿１及びループ３＿２）及びループ＿４の２バージョン（即ち、ループ４＿１及びループ４＿２）は、２つの可能なループ長に相当するように設計された。
【００９４】
[00103]  したがって、特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素をコードする異種核酸を含む。特定の実施形態では、ＵＤＰ糖転移酵素は、ＵＧＴ４００８７（即ち、配列番号１７又は１８）のループ１アミノ酸配列を、配列番号１７又は１８のループ１位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置に各々、さらに含む。特定の実施形態では、配列番号１７又は１８のループ１アミノ酸配列は、配列番号３０のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ループ１アミノ酸配列は、配列番号２８の配列を有する。特定の実施形態では、ＵＤＰ糖転移酵素は、ループ１変異体アミノ酸配列を、配列番号１７又は１８のループ１位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置に各々、さらに含む。ループ１変異体アミノ酸配列は、配列番号１７若しくは１８の参照ループ１アミノ酸配列又は配列番号２８を有するループ１アミノ酸配列と異なるが、ループ１アミノ酸変異体を含むＵＤＰ糖転移酵素が、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換し、及び／又はステビオシドをＲｅｂＥに変換するためのその活性を保持することを可能にするアミノ酸配列を指す。
【００９５】
[00104]  特定の実施形態では、ＵＤＰ糖転移酵素は、ＵＧＴ４００８７（即ち、配列番号１７又は１８）のループ２アミノ酸配列を、配列番号１７又は１８のループ２位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置に各々、さらに含む。特定の実施形態では、配列番号１７又は１８のループ２アミノ酸配列は、配列番号２４のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＵＤＰ糖転移酵素は、ループ２変異体アミノ酸配列を、配列番号１７又は１８のループ２位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置に各々、さらに含む。ループ２変異体アミノ酸配列は、配列番号１７若しくは１８の参照ループ２アミノ酸配列と異なるが、ループ２アミノ酸変異体を含むＵＤＰ糖転移酵素が、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換し、及び／又はステビオシドをＲｅｂＥに変換するためのその活性を保持することを可能にするアミノ酸配列を指す。
【００９６】
[00105]  特定の実施形態では、ＵＤＰ糖転移酵素は、ＵＧＴ４００８７（即ち、配列番号１７又は１８）のループ３＿１アミノ酸配列を、配列番号１７又は１８のループ３＿１位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置に各々、さらに含む。特定の実施形態では、配列番号１７又は１８のループ３＿１アミノ酸配列は、配列番号２５のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＵＤＰ糖転移酵素は、ループ３＿１変異体アミノ酸配列を、配列番号１７又は１８のループ３＿１位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置に各々、さらに含む。ループ３＿１変異体アミノ酸配列は、配列番号１７若しくは１８の参照ループ３＿１アミノ酸配列と異なるが、ループ３＿１アミノ酸変異体を含むＵＤＰ糖転移酵素が、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換し、及び／又はステビオシドをＲｅｂＥに変換するためのその活性を保持することを可能にするアミノ酸配列を指す。
【００９７】
[00106]  特定の実施形態では、ＵＤＰ糖転移酵素は、ＵＧＴ４００８７（即ち、配列番号１７又は１８）のループ３＿２アミノ酸配列を、配列番号１７又は１８のループ３＿２位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置に各々、さらに含む。特定の実施形態では、配列番号１７又は１８のループ３＿２アミノ酸配列は、配列番号２６のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＵＤＰ糖転移酵素は、ループ３＿２変異体アミノ酸配列を、配列番号１７又は１８のループ３＿２位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置に各々、さらに含む。ループ３＿２変異体アミノ酸配列は、配列番号１７若しくは１８の参照ループ３＿２アミノ酸配列と異なるが、ループ３＿２アミノ酸変異体を含むＵＤＰ糖転移酵素が、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換し、及び／又はステビオシドをＲｅｂＥに変換するためのその活性を保持することを可能にするアミノ酸配列を指す。
【００９８】
[00107]  特定の実施形態では、ＵＤＰ糖転移酵素は、ＵＧＴ４００８７（即ち、配列番号１７又は１８）のループ４＿１アミノ酸配列を、配列番号１７又は１８のループ４＿１位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置に各々、さらに含む。特定の実施形態では、配列番号１７又は１８のループ４＿１アミノ酸配列は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、ＵＤＰ糖転移酵素は、ループ４＿１変異体アミノ酸配列を、配列番号１７又は１８のループ４＿１位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置に各々、さらに含む。ループ４＿１変異体アミノ酸配列は、配列番号１７若しくは１８の参照ループ４＿１アミノ酸配列と異なるが、ループ４＿１アミノ酸変異体を含むＵＤＰ糖転移酵素が、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換し、及び／又はステビオシドをＲｅｂＥに変換するためのその活性を保持することを可能にするアミノ酸配列を指す。
【００９９】
[00108]  特定の実施形態では、ＵＤＰ糖転移酵素は、ＵＧＴ４００８７（即ち、配列番号１７又は１８）のループ４＿２アミノ酸配列を、配列番号１７又は１８のループ４＿２位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置に各々、さらに含む。配列番号１７又は１８のループ４＿２アミノ酸配列は、配列番号２８のアミノ酸配列を有する。
【０１００】
[00109]  特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素、又はそのＵＤＰ糖転移酵素をコードする異種核酸を含み、且つ以下：
（ａ）配列番号１７若しくは１８のループ１アミノ酸配列、配列番号３０のアミノ酸配列、又は配列番号１７若しくは１８のループ１位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置各々でのループ１変異体アミノ酸配列；
（ｂ）配列番号１７若しくは１８のループ２アミノ酸配列、又は配列番号１７若しくは１８のループ２位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置各々でのループ２変異体アミノ酸配列；
（ｃ）配列番号１７若しくは１８のループ３＿１アミノ酸配列、又は配列番号１７若しくは１８のループ３＿１位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置各々でのループ３＿１変異体アミノ酸配列；
（ｄ）配列番号１７若しくは１８のループ３＿２アミノ酸配列、又は配列番号１７若しくは１８のループ３＿２位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置各々でのループ３＿２変異体アミノ酸配列；
（ｅ）配列番号１７若しくは１８のループ４＿１アミノ酸配列、又は配列番号１７若しくは１８のループ４＿１位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置各々でのループ４＿１変異体アミノ酸配列；及び
（ｆ）配列番号１７若しくは１８のループ４＿２位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素の位置各々での配列番号１７若しくは１８のループ４＿２アミノ酸配列、
のいずれかの組み合わせをさらに含む。
【０１０１】
[00110]  特定の実施形態では、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換する能力があるＵＤＰ糖転移酵素の三次元モデル構造が比較及び分析されたとき、ＵＧＴ４００８７のループ４＿１が、別のＵＤＰ糖転移酵素の対応するループ４＿１位置に組み込まれる（且つその天然ループ４＿１アミノ酸配列を置換する）とき、ＵＤＰ糖転移酵素変異体の、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換するその能力の観点での優れた活性をもたらすことが発見された。実施例１２を参照のこと。これらの結果は、ＲｅｂＡをＲｅｂＤに変換するため、いずれかの好適なＵＤＰ糖転移酵素のループ４＿１アミノ酸配列が配列番号１７又は１８のループ４＿１アミノ酸配列と置換されうることを示す。
【０１０２】
[00111]  したがって、特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも６１％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％同一であるアミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素を含み、且つＵＧＴ４００８７（即ち、配列番号１７又は１８）のループ４＿１アミノ酸配列（即ち、配列番号２７）をさらに含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも６１％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％同一であるアミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素をコードする異種核酸を含み、且つ配列番号１７又は１８のループ４＿１アミノ酸配列（例えば配列番号２７）をさらに含む。特定の実施形態では、配列番号１７又は１８に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％であるアミノ酸配列を含むいずれかの好適なＵＤＰ糖転移酵素は、配列番号１７又は１８からのループ４＿１アミノ酸配列をその対応するループ４＿１位置で組み込む（その天然ループ４＿１アミノ酸配列を置換する）のに使用可能である。例えば、Ｏｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ＿ｌｉｋｅ、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１、Ｓｌ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１、Ｓｒ．ＵＧＴ＿ｇ２５２７７８、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８４０、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０、又はＳｉ９１Ｄｌｉｋｅは、配列番号１７又は１８からのループ４＿１アミノ酸配列をその対応するループ４＿１位置に組み込むための基盤として使用可能である。特定の実施形態では、ＵＤＰ糖転移酵素は、配列番号３３のアミノ酸配列を含む。
【０１０３】
[00112]  特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して実質的に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【０１０４】
[00113]  特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列を含むＵＧＴ４００８７をコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して実質的に同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも６０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも６５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０１０５】
[00114]  したがって、特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％同一であるアミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素を含む。特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＣ末端糖ドナードメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、若しくは９５％同一であるアミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素をコードする異種核酸を含む。特定の実施形態では、ＵＤＰ糖転移酵素は、他のＵＤＰ糖転移酵素からのＣ末端糖ドナードメインをさらに含む。好適なＣ末端糖ドナードメインを有する他のＵＤＰ糖転移酵素の例として、Ｏｂ＿ＵＧＴ９１Ｂ＿ｌｉｋｅ、Ｈｖ＿ＵＧＴ＿Ｖ１、ＳＩ＿ＵＧＴ＿１０１２４９８８１、Ｓｒ．ＵＧＴ＿ｇ２５２７７８、Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８４０、Ｂｄ＿ＵＧＴ１０８５０、又はＳｉ９１Ｄｌｉｋｅが挙げられる。
【０１０６】
[00115]  特定の実施形態では、Ｎ末端糖アクセプタードメイン内の特定のアミノ酸残基が、非機能的な推定上のＵＤＰ糖転移酵素の活性のあるＵＤＰ糖転移酵素への触媒活性を回復しうることが発見された。したがって、宿主細胞は、配列番号１７又は１８のＮ末端糖アクセプタードメインのアミノ酸配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素を含み、且つ以下のアミノ酸残基：
（ａ）配列番号１８のアミノ酸位置１１に対応するＵＤＰ糖転移酵素のアミノ酸位置でのバリン；
（ｂ）配列番号１８のアミノ酸位置１２に対応するＵＤＰ糖転移酵素のアミノ酸位置でのイソロイシン；
（ｃ）配列番号１８のアミノ酸位置５５に対応するＵＤＰ糖転移酵素のアミノ酸位置でのプロリン；
（ｄ）配列番号１８のアミノ酸位置９０に対応するＵＤＰ糖転移酵素のアミノ酸位置でのグルタミン酸；
（ｅ）配列番号１８のアミノ酸位置２０３に対応するＵＤＰ糖転移酵素のアミノ酸位置でのセリン；
（ｆ）配列番号１８のアミノ酸位置２２３に対応するＵＤＰ糖転移酵素のアミノ酸位置でのグルタミン酸；又は
（ｇ）配列番号１８のアミノ酸位置４１３に対応するＵＤＰ糖転移酵素のアミノ酸位置でのバリン、
の１又は複数をさらに含み、ここで配列番号１８のアミノ酸位置に対応するＵＤＰ糖転移酵素のアミノ酸位置は、配列アライメントによって決定される。
【０１０７】
[00116]  特定の実施形態では、宿主細胞は、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＵＤＰ糖転移酵素を含む。
【０１０８】
[00117]  特定の実施形態では、宿主細胞は、上記のＵＧＴ４００８７ポリペプチドの変異体を含む。特定の実施形態では、変異体は、ＵＧＴ４００８７ポリペプチドと比べて、最大１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１のアミノ酸置換を含みうる。特定の実施形態では、変異体は、ＵＧＴ４００８７ポリペプチドと比べて、最大１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１の保存的アミノ酸置換を含みうる。特定の実施形態では、本明細書に記載の核酸のいずれかは、宿主細胞について、例えばコドン最適化により最適化されうる。有用な核酸は、配列番号３５及び３６を含む。
【０１０９】
６．６  ＭＥＶ経路ＦＰＰ及び／又はＧＧＰＰの生成
[00118]  いくつかの実施形態では、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞は、ＦＰＰ及び／又はＧＧＰＰの形成にとって有用なＭＥＶ経路の１又は複数の異種酵素を含む。図１Ｄを参照のこと。いくつかの実施形態では、ＭＥＶ経路の１又は複数の酵素は、アセトアセチルＣｏＡを形成するため、アセチルＣｏＡをマロニルＣｏＡと縮合する酵素を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＶ経路の１又は複数の酵素は、アセトアセチルＣｏＡを形成するため、アセチルＣｏＡの２分子を縮合する酵素を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＶ経路の１又は複数の酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡを形成するため、アセトアセチルＣｏＡをアセチルＣｏＡと縮合する酵素を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＶ経路の１又は複数の酵素は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＶ経路の１又は複数の酵素は、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸にリン酸化する酵素を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＶ経路の１又は複数の酵素は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素を含む。いくつかの実施形態では、ＭＥＶ経路の１又は複数の酵素は、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素を含む。
【０１１０】
[00119]  いくつかの実施形態では、ＭＥＶ経路の１又は複数の酵素は、アセチルＣｏＡチオラーゼ、アセトアセチルＣｏＡシンテターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ及びメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アセトアセチルＣｏＡの形成を触媒する能力があるＭＥＶ経路の酵素に関しては、遺伝子組換え宿主細胞は、アセチルＣｏＡの２分子を縮合し、アセトアセチルＣｏＡ、例えばアセチルＣｏＡチオラーゼを形成する酵素；又はアセチルＣｏＡをマロニルＣｏＡと縮合し、アセトアセチルＣｏＡ、例えばアセトアセチルＣｏＡシンターゼを形成する酵素のいずれかを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、アセチルＣｏＡの２分子を縮合し、アセトアセチルＣｏＡ、例えばアセチルＣｏＡチオラーゼを形成する酵素；及びアセチルＣｏＡをマロニルＣｏＡと縮合し、アセトアセチルＣｏＡ、例えばアセトアセチルＣｏＡシンターゼを形成する酵素の双方を含む。
【０１１１】
[00120]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の２つ以上の酵素をコードする１又は複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の２つの酵素をコードする１又は複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換しうる酵素及びメバロン酸をメバロン酸５−リン酸に変換しうる酵素をコードする１又は複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の３つの酵素をコードする１又は複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の４つの酵素をコードする１又は複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の５つの酵素をコードする１又は複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の６つの酵素をコードする１又は複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の７つの酵素をコードする１又は複数の異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路の酵素のすべてをコードする複数の異種核酸を含む。
【０１１２】
[00121]  いくつかの実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）をジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換しうる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、ＩＰＰ及び／又はＤＭＡＰＰ分子を縮合し、ポリプレニル化合物を形成しうる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、ＩＰＰ又はポリプレニルを修飾し、ＦＰＰなどのイソプレノイド化合物を形成しうる酵素をコードする異種核酸をさらに含む。
【０１１３】
６．６．１  アセチルＣｏＡのアセトアセチルＣｏＡへの変換
[00122]  いくつかの実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、アセチル−コエンザイムＡの２分子を縮合し、アセトアセチルＣｏＡを形成しうる酵素、例えばアセチルＣｏＡチオラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、（ＮＣ＿０００９１３領域：２３２４１３１．２３２５３１５；大腸菌（Escherichia coli））、（Ｄ４９３６２；パラコッカス・デニトリフィカンス(Paracoccus denitrificans)）、及び（Ｌ２０４２８；出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)）が挙げられる。
【０１１４】
[00123]  アセチルＣｏＡチオラーゼは、アセチルＣｏＡの２分子の可逆的縮合を触媒し、アセトアセチルＣｏＡを生成するが、この反応は熱力学的に好ましくなく、アセトアセチルＣｏＡ合成にわたり、アセトアセチルＣｏＡチオリシスが好ましい。アセトアセチルＣｏＡシンターゼ（ＡＡＣＳ）（或いはアセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシルトランスフェラーゼと称される；ＥＣ２．３．１．１９４）は、アセチルＣｏＡをマロニルＣｏＡと縮合し、アセトアセチルＣｏＡを形成する。アセチルＣｏＡチオラーゼと対照的に、ＡＡＣＳによって触媒されるアセトアセチルＣｏＡ合成は、それに伴うマロニルＣｏＡの脱炭酸に起因し、本質的にエネルギー的に好ましい反応(energy-favored reaction)である。さらに、ＡＡＣＳは、アセトアセチルＣｏＡに対してチオリシス活性を示さず、それ故、反応は不可逆的である。
【０１１５】
[00124]  アセチルＣｏＡチオラーゼ及び異種ＡＤＡ及び／又はホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）を含む宿主細胞では、アセトアセチルＣｏＡチオリシスを支持する、アセチルＣｏＡチオラーゼによって触媒される可逆反応は、大規模なアセチルＣｏＡプールを生じることがある。ＡＤＡの可逆的活性を考慮すると、このアセチルＣｏＡプールは、次第にアセチルＣｏＡをアセトアルデヒドに変換する可逆反応の方にＡＤＡを駆動し、それにより、アセチルＣｏＡの生成に向けて、ＡＤＡによってもたらされる利点が減少することがある。同様に、ＰＴＡの活性は可逆的であり、それ故、大規模なアセチルＣｏＡプールが、アセチルＣｏＡをアセチルリン酸に変換する可逆反応の方にＰＴＡを駆動することがある。したがって、いくつかの実施形態では、アセチルＣｏＡに対する強力な引力をもたらし、ＡＤＡ及びＰＴＡの正反応を駆動するため、本明細書に提供される遺伝子組換え宿主細胞のＭＥＶ経路は、アセトアセチルＣｏＡシンターゼを利用し、アセトアセチルＣｏＡをアセチルＣｏＡ及びマロニルＣｏＡから形成する。
【０１１６】
[00125]  いくつかの実施形態では、ＡＡＣＳは、ストレプトマイセス種(Streptomyces sp.)株ＣＬ１９０に由来する（Okamura et al., Proc Natl Acad Sci USA 107(25):11265-70 (2010)）。ストレプトマイセス種(Streptomyces sp.)株ＣＬ１９０の代表的なＡＡＣＳヌクレオチド配列は、受入番号ＡＢ５４０１３１．１を含む。ストレプトマイセス種(Streptomyces sp.)株ＣＬ１９０の代表的なＡＡＣＳタンパク質配列は、受入番号Ｄ７ＵＲＶ０、ＢＡＪ１００４８を含む。本明細書に提供される組成物及び方法にとって有用な他のアセトアセチルＣｏＡシンターゼとして、限定はされないが、ストレプトマイセス種(Streptomyces sp.)（ＡＢ１８３７５０；ＫＯ−３９８８ＢＡＤ８６８０６）；Ｓ．アヌラツス(S. anulatus)株９６６３（ＦＮ１７８４９８；ＣＡＸ４８６６２）；ストレプトマイセス種(Streptomyces sp.)ＫＯ−３９８８（ＡＢ２１２６２４；ＢＡＥ７８９８３）；アクチノプラネス種(Actinoplanes sp.)Ａ４０６４４（ＡＢ１１３５６８；ＢＡＤ０７３８１）；ストレプトマイセス種(Streptomyces sp.)Ｃ（ＮＺ＿ＡＣＥＷ０１００００６４０；ＺＰ＿０５５１１７０２）；ノカルジオプシス・ダッソンビエイ(Nocardiopsis dassonvillei)ＤＳＭ４３１１１（ＮＺ＿ＡＢＵＩ０１００００２３；ＺＰ＿０４３３５２８８）；マイコバクテリウム・ウルセランス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｕｌｃｅｒａｎｓ）Ａｇｙ９９（ＮＣ＿００８６１１；ＹＰ＿９０７１５２）；マイコバクテリウム・マリナム(Mycobacterium marinum)Ｍ（ＮＣ＿０１０６１２；ＹＰ＿００１８５１５０２）；ストレプトマイセス種(Streptomyces sp.)Ｍｇ１（ＮＺ＿ＤＳ５７０５０１；ＺＰ＿０５００２６２６）；ストレプトマイセス種(Streptomyces sp.)ＡＡ４（ＮＺ＿ＡＣＥＶ０１００００３７；ＺＰ＿０５４７８９９２）；Ｓ．ロゼオスポラス(S. roseosporus)ＮＲＲＬ１５９９８（ＮＺ＿ＡＢＹＢ０１０００２９５；ＺＰ＿０４６９６７６３）；ストレプトマイセス種(Streptomyces sp.)ＡＣＴＥ（ＮＺ＿ＡＤＦＤ０１００００３０；ＺＰ＿０６２７５８３４）；Ｓ．ビリドクロモゲネス(S. viridochromogenes)ＤＳＭ４０７３６（ＮＺ＿ＡＣＥＺ０１００００３１；ＺＰ＿０５５２９６９１）；フランキア種(Frankia sp.)ＣｃＩ３（ＮＣ＿００７７７７；ＹＰ＿４８０１０１）；ノカルジア・ブラジリエンシス(Nocardia brasiliensis)（ＮＣ＿０１８６８１；ＹＰ＿００６８１２４４０．１）；及びオーストウィッキア・ケロネ(Austwickia chelonae)（ＮＺ＿ＢＡＧＺ０１０００００５；ＺＰ＿１０９５０４９３．１）が挙げられる。さらなる好適なアセトアセチルＣｏＡシンターゼとして、米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号及び米国特許出願公開第２０１１／０２８１３１５号（それらの内容は、それら全体が参照により援用される）に記載のものが挙げられる。
【０１１７】
[00126]  本明細書に提供される組成物及び方法においても有用なアセトアセチルＣｏＡシンターゼは、本明細書に記載のアセトアセチルＣｏＡシンターゼのいずれかの「誘導体」であると言われる分子を含む。かかる「誘導体」は、（１）本明細書に記載のアセトアセチルＣｏＡシンターゼのいずれかと実質的相同性を共有する；及び（２）アセチルＣｏＡとマロニルＣｏＡとの不可逆的縮合を触媒し、アセトアセチルＣｏＡを形成する能力がある、という特徴を有する。アセトアセチルＣｏＡシンターゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が、アセトアセチルＣｏＡシンターゼの場合と同様、少なくとも８０％、またより好ましくは少なくとも９０％、また最も好ましくは少なくとも９５％である場合、アセトアセチルＣｏＡシンターゼと「実質的相同性」を共有すると言われる。
【０１１８】
６．６．２  アセトアセチルＣｏＡのＨＭＧ−ＣｏＡへの変換
[00127]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、アセトアセチルＣｏＡをアセチルＣｏＡのもう一つの分子と縮合し、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリルＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）を形成しうる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、（ＮＣ＿００１１４５．相補体１９０６１．２０５３６；出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)）、（Ｘ９６６１７；出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)）、（Ｘ８３８８２；シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)）、（ＡＢ０３７９０７；キタサトスポラ・グリセオラ(Kitasatospora griseola)）、（ＢＴ００７３０２；ヒト(Homo sapiens)）、及び（ＮＣ＿００２７５８、遺伝子座タグＳＡＶ２５４６、ＧｅｎｅＩＤ１１２２５７１；黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)）が挙げられる。
【０１１９】
６．６．３  ＨＭＧ−ＣｏＡのメバロン酸への変換
[00128]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換しうる酵素、例えばＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨを用いるヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ−ＣｏＡレダクターゼである。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．３４；ＥＣ１．１．１．８８）は、（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡの（Ｒ）−メバロン酸の還元的脱アシル化を触媒し、且つクラスＩ及びクラスＩＩ  ＨＭＧｒｓの２つのクラスに分類されうる。クラスＩは、真核生物及び大部分の古細菌からの酵素を含み、またクラスＩＩは、特定の原核生物及び古細菌のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む。配列における分岐に加えて、２クラスの酵素はまた、それらの補助因子特異性に関して異なる。ＮＡＤＰＨを排他的に利用するクラスＩ酵素と異なり、クラスＩＩのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＰＨとＮＡＤＨとの間を識別する能力が変化する。例えば、Hedl et al., Journal of Bacteriology 186 (7): 1927-1932 (2004)を参照のこと。クラスＩＩのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを選択するための補助因子特異性は、以下に提供される。
【０１２０】
【表１】
2020533954.tif 000007
【０１２１】
[00129]  本明細書に提供される組成物及び方法にとって有用なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨを補助因子として利用することができるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、例えばＰ．メバロニイ(P. mevalonii)、Ａ．フルギドゥス(A. fulgidus)又は黄色ブドウ球菌(S. aureus)に由来するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼを含む。特定の実施形態では、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、専らＮＡＤＨを補助因子として用いる能力があり、例えば、Ｐ．メバロニイ(P. mevalonii)、Ｓ．ポメロイ(S. pomeroyi)又はＤ．アシドボランス(D. acidovorans)に由来するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが挙げられる。
【０１２２】
[00130]  いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、シュードモナス・メバロニイ(Pseudomonas mevalonii)に由来する。ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ（ＥＣ１．１．１．８８）をコードするシュードモナス・メバロニイ(Pseudomonas mevalonii)の野生型ｍｖａＡ遺伝子の配列については前述されている。Beach and Rodwell, J. Bacteriol. 171:2994-3001 (1989)を参照のこと。シュードモナス・メバロニイ(Pseudomonas mevalonii)の代表的なｍｖａＡヌクレオチド配列は、受入番号Ｍ２４０１５を含む。シュードモナス・メバロニイ(Pseudomonas mevalonii)の代表的なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列は、受入番号ＡＡＡ２５８３７、Ｐ１３７０２、ＭＶＡＡ＿ＰＳＥＭＶを含む。
【０１２３】
[00131]  いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、シリシバクター・ポメロイ(Silicibacter pomeroyi)に由来する。シリシバクター・ポメロイ(Silicibacter pomeroyi)の代表的なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列は、受入番号ＮＣ＿００６５６９．１を含む。シリシバクター・ポメロイ(Silicibacter pomeroyi)の代表的なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列は、受入番号ＹＰ＿１６４９９４を含む。
【０１２４】
[00132]  いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、デルフチア・アシドボランス(Delftia acidovorans)に由来する。デルフチア・アシドボランス(Delftia acidovorans)の代表的なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼヌクレオチド配列は、ＮＣ＿０１０００２ＲＥＧＩＯＮ：相補体（３１９９８０．．３２１２６９）を含む。デルフチア・アシドボランス(Delftia acidovorans)の代表的なＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼタンパク質配列は、受入番号ＹＰ＿００１５６１３１８を含む。
【０１２５】
[00133]  いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ジャガイモ(Solanum tuberosum)に由来する(Crane et al., J. Plant Physiol. 159:1301-1307 (2002))。
【０１２６】
[00134]  本明細書に提供される組成物及び方法においても有用なＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、本明細書に記載のＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのいずれかの「誘導体」と言われる分子を含み、例えば、Ｐ．メバロニイ(P. mevalonii)、Ｓ．ポメロイ(S. pomeroyi)及びＤ．アシドボランス(D. acidovorans)に由来する。かかる「誘導体」は、（１）本明細書に記載のＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼのいずれかと実質的相同性を共有する；及び（２）（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡの（Ｒ）−メバロン酸への還元的脱アシル化を触媒する一方で、優先的には補助因子としてＮＡＤＨを用いる能力がある、という特徴を有する。ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの誘導体は、誘導体のアミノ酸配列が、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの場合と同様、少なくとも８０％、またより好ましくは少なくとも９０％、また最も好ましくは少なくとも９５％である場合、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼと「実質的相同性」を共有すると言われる。
【０１２７】
[00135]  本明細書で用いられるとき、語句「ＮＡＤＨを用いる」は、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが、例えばＮＡＤＨに対する比活性がＮＡＤＰＨに対する比活性よりも高いことを示すことにより、補助因子としてＮＡＤＰＨよりもＮＡＤＨについて選択的であることを意味する。いくつかの実施形態では、補助因子としてのＮＡＤＨについての選択性は、ｋｃａｔ（ＮＡＤＨ）／ｋｃａｔ（ＮＡＤＰＨ）比として表される。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５の、又は２５よりも大きいｋｃａｔ（ＮＡＤＨ）／ｋｃａｔ（ＮＡＤＰＨ）比を有する。いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＤＨを排他的に用いる。例えば、ＮＡＤＨを排他的に用いる、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、インビトロで唯一の補助因子として供されるＮＡＤＨによりいくつかの活性を呈し、またＮＡＤＰＨが唯一の補助因子として供されるとき、検出可能な活性を呈しない。当該技術分野で公知の、補助因子特異性を決定するためのいずれかの方法を用いて、補助因子としてＮＡＤＨに対する優先度を有するＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、例えば、Kim et al., Protein Science 9:1226-1234 (2000)；及びWilding et al., J. Bacteriol. 182(18):5147-52(2000)（それらの内容は、それら全体がここで参照により援用される）によって記載のものを同定することができる。
【０１２８】
[00136]  いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、ＮＡＰＤＨよりもＮＡＤＨについて選択的であるように、例えば補助因子結合ポケットの部位特異的変異誘発を通じて改変される。ＮＡＤＨの選択性を改変するための方法は、Watanabe  et al., Microbiology 153:3044-3054 (2007)に記載されており、またＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの補助因子特異性を決定するための方法は、Kim et al., Protein Sci. 9:1226-1234 (2000)に記載されており、それらの内容は、それら全体がここで参照により援用される。
【０１２９】
[00137]  いくつかの実施形態では、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼは、天然にメバロン酸分解経路を含む宿主種、例えばメバロン酸をその唯一の炭素源として異化する宿主種に由来する。これらの実施形態の中で、通常は内在化された（Ｒ）−メバロン酸のその天然宿主細胞内の（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡへの酸化的アシル化を触媒する、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼが、メバロン酸生合成経路を含む遺伝子組換え宿主細胞内での、可逆反応、即ち（Ｓ）−ＨＭＧ−ＣｏＡの（Ｒ）−メバロン酸への還元的脱アシル化を触媒するため、利用される。唯一の炭素源としてのメバロン酸で増殖可能な原核生物については、Anderson et al., J. Bacteriol, 171(12):6468-6472 (1989); Beach et al., J. Bacteriol. 171:2994-3001 (1989); Bensch et al., J. Biol. Chem. 245:3755-3762; Fimongnari et al., Biochemistry 4:2086-2090 (1965); Siddiqi et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 8:110-113 (1962); Siddiqi et al., J. Bacteriol. 93:207-214 (1967);及びTakatsuji et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.110:187-193 (1983)（それらの内容は、それら全体がここで参照により援用される）により記載されている。
【０１３０】
[00138]  本明細書に提供される組成物及び方法のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＮＡＤＨを用いるＨＭＧｒとＮＡＤＰＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの双方を含む。ＮＡＤＰＨを用いるＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、（ＮＭ＿２０６５４８；キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)）、（ＮＣ＿００２７５８、遺伝子座タグＳＡＶ２５４５、ＧｅｎｅＩＤ１１２２５７０；黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)）、（ＡＢ０１５６２７；ストレプトマイセス種(Streptomyces sp.)ＫＯ３９８８）、（ＡＸ１２８２１３、切断されたＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼをコードする配列を提供する；出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)）、及び（ＮＣ＿００１１４５：相補体（１１５７３４．１１８８９８；出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)）が挙げられる。
【０１３１】
６．６．４  メバロン酸のメバロン酸−５−リン酸への変換
[00139]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸に変換しうる酵素、例えばメバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、（Ｌ７７６８８；シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)）、及び（Ｘ５５８７５；出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)）が挙げられる。
【０１３２】
６．６．５  メバロン酸−５−リン酸のメバロン酸−５−ピロリン酸への変換
[00140]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換しうる酵素、例えばホスホメバロン酸キナーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、（ＡＦ４２９３８５；パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)）、（ＮＭ＿００６５５６；ヒト(Homo sapiens)）、及び（ＮＣ＿００１１４５．相補体７１２３１５．７１３６７０；出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)）が挙げられる。
【０１３３】
６．６．６  メバロン酸−５−ピロリン酸のＩＰＰへの変換
[00141]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニル二リン酸（ＩＰＰ）に変換しうる酵素、例えばメバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、（Ｘ９７５５７；出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)）、（ＡＦ２９００９５；フェシウム菌(Enterococcus faecium)）、及び（Ｕ４９２６０；ヒト(Homo sapiens)）が挙げられる。
【０１３４】
６．６．７  ＩＰＰのＤＭＡＰＰへの変換
[00142]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＭＥＶ経路を介して生成されたＩＰＰをジメチルアリルピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）に変換しうる酵素、例えばＩＰＰイソメラーゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、（ＮＣ＿０００９１３、３０３１０８７．３０３１６３５；大腸菌（Escherichia coli））、及び（ＡＦ０８２３２６；ヘマトコッカス藻(Haematococcus pluvialis)）が挙げられる。
【０１３５】
６．６．８  ポリプレニルシンターゼ
[00143]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＩＰＰ及び／又はＤＭＡＰＰ分子を縮合し、６つ以上の炭素を含有するポリプレニル化合物を形成しうるポリプレニルシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。
【０１３６】
[00144]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＩＰＰの１分子をＤＭＡＰＰの１分子と縮合し、ゲラニルピロリン酸（「ＧＰＰ」）の１分子を形成しうる酵素、例えばＧＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、（ＡＦ５１３１１１；アメリカオオモミ(Abies grandis)）、（ＡＦ５１３１１２；アメリカオオモミ(Abies grandis)）、（ＡＦ５１３１１３；アメリカオオモミ(Abies grandis)）、（ＡＹ５３４６８６；キンギョソウ（Antirrhinum majus））、（ＡＹ５３４６８７；キンギョソウ(Antirrhinum majus)）、（Ｙ１７３７６；シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)）、（ＡＥ０１６８７７、遺伝子座ＡＰ１１０９２；セレウス菌(Bacillus cereus)；ＡＴＣＣ１４５７９）、（ＡＪ２４３７３９；スイートオレンジ(Citrus sinensis)）、（ＡＹ５３４７４５；クラルキア・ブレウェリ(Clarkia breweri)）、（ＡＹ９５３５０８；イプス・ピニ(Ips pini)）、（ＤＱ２８６９３０；トマト(Lycopersicon esculentum)）、（ＡＦ１８２８２８；ペパーミント(Mentha x piperita)）、（ＡＦ１８２８２７；ペパーミント(Mentha x piperita)）、（ＭＰＩ２４９４５３；ペパーミント(Mentha x piperita)）、（ＰＺＥ４３１６９７、遺伝子座ＣＡＤ２４４２５；パラコッカス・ゼアキサンチニファシエンス(Paracoccus zeaxanthinifaciens)）、（ＡＹ８６６４９８；ピクロリザ・クロア(Picrorhiza kurrooa)）、（ＡＹ３５１８６２；ヨーロッパブドウ(Vitis vinifera)）、及び（ＡＦ２０３８８１、遺伝子座ＡＡＦ１２８４３；ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)）が挙げられる。
【０１３７】
[00145]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＩＰＰの２分子をＤＭＡＰＰの１分子と縮合するか又はＩＰＰの分子をＧＰＰの分子に付加し、ファルネシルピロリン酸（「ＦＰＰ」）の分子を形成しうる酵素、例えばＦＰＰシンターゼをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、（ＡＴＵ８０６０５；シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)）、（ＡＴＨＦＰＳ２Ｒ；シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)）、（ＡＡＵ３６３７６；クソニンジン(Artemisia annua)）、（ＡＦ４６１０５０；ウシ(Bos taurus)）、（Ｄ００６９４；大腸菌（Escherichia coli）Ｋ−１２）、（ＡＥ００９９５１、遺伝子座ＡＡＬ９５５２３；フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ヌクレアタム(Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum)ＡＴＣＣ２５５８６）、（ＧＦＦＰＰＳＧＥＮ；ギベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)）、（ＣＰ０００００９、遺伝子座ＡＡＷ６００３４；グルコノバクター・オキシダンス(Gluconobacter oxydans)６２１Ｈ）、（ＡＦ０１９８９２；ヒマワリ(Helianthus annuus)）、（ＨＵＭＦＡＰＳ；ヒト(Homo sapiens)）、（ＫＬＰＦＰＳＱＣＲ；クリベロマイセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)）、（ＬＡＵ１５７７７；シロバナハウチワマメ(Lupinus albus)）、（ＬＡＵ２０７７１；シロバナハウチワマメ(Lupinus albus)）、（ＡＦ３０９５０８；ムス・ムスクルス(Mus musculus)）、（ＮＣＦＰＰＳＧＥＮ；アカパンカビ(Neurospora crassa)）、（ＰＡＦＰＳ１；グアユールゴムノキ(Parthenium argentatum)）、（ＰＡＦＰＳ２；グアユールゴムノキ(Parthenium argentatum)）、（ＲＡＴＦＡＰＳ；ラット(Rattus norvegicus)）、（ＹＳＣＦＰＰ；出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)）、（Ｄ８９１０４；分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)）、（ＣＰ０００００３、遺伝子座ＡＡＴ８７３８６；化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)）、（ＣＰ００００１７、遺伝子座ＡＡＺ５１８４９；化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)）、（ＮＣ＿００８０２２、遺伝子座ＹＰ＿５９８８５６；化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)ＭＧＡＳ１０２７０）、（ＮＣ＿００８０２３、遺伝子座ＹＰ＿６００８４５；化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)ＭＧＡＳ２０９６）、（ＮＣ＿００８０２４、遺伝子座ＹＰ＿６０２８３２；化膿レンサ球菌(Streptococcus pyogenes)ＭＧＡＳ１０７５０）、（ＭＺＥＦＰＳ；トウモロコシ(Zea mays)）、（ＡＥ０００６５７、遺伝子座ＡＡＣ０６９１３；超好熱性真正細菌(Aquifex aeolicus)ＶＦ５）、（ＮＭ＿２０２８３６；シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)）、（Ｄ８４４３２、遺伝子座ＢＡＡ１２５７５；枯草菌(Bacillus subtilis)）、（Ｕ１２６７８、遺伝子座ＡＡＣ２８８９４；ダイズ根粒菌(Bradyrhizobium japonicum)ＵＳＤＡ１１０）、（ＢＡＣＦＤＰＳ；ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)）、（ＮＣ＿００２９４０、遺伝子座ＮＰ＿８７３７５４；軟性下疳菌(Haemophilus ducreyi)３５０００ＨＰ）、（Ｌ４２０２３、遺伝子座ＡＡＣ２３０８７；インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae)ＲｄＫＷ２０）、（Ｊ０５２６２；ヒト(Homo sapiens)）、（ＹＰ＿３９５２９４；ラクトバチルス・サケイ亜種サケイ(Lactobacillus sakei subsp. sakei)２３Ｋ）、（ＮＣ＿００５８２３、遺伝子座ＹＰ＿０００２７３；レプトスピラ・インテロガンス血清型コペンハー���ンｓｔｒ．（Leptospira interrogans serovar Copenhageni str.）Ｆｉｏｃｒｕｚ  Ｌ１−１３０）、（ＡＢ００３１８７；ルテウス菌(Micrococcus luteus)）、（ＮＣ＿００２９４６、遺伝子座ＹＰ＿２０８７６８；淋菌(Neisseria gonorrhoeae)ＦＡ１０９０）、（Ｕ０００９０、遺伝子座ＡＡＢ９１７５２；根粒菌(Rhizobium sp.)ＮＧＲ２３４）、（Ｊ０５０９１；出芽酵母(Saccharomyces cerevisae)）、（ＣＰ００００３１、遺伝子座ＡＡＶ９３５６８；シリシバクター・ポメロイ(Silicibacter pomeroyi)ＤＳＳ−３）、（ＡＥ００８４８１、遺伝子座ＡＡＫ９９８９０；肺炎球菌(Streptococcus pneumoniae)Ｒ６）、及び（ＮＣ＿００４５５６、遺伝子座ＮＰ７７９７０６；ピアス病菌(Xylella fastidiosa)Ｔｅｍｅｃｕｌａ１）が挙げられる。
【０１３８】
[00146]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＩＰＰとＤＭＡＰＰ又はＩＰＰとＦＰＰを組み合わせることで、ゲラニルゲラニルピロリン酸（「ＧＧＰＰ」）を形成しうる酵素をコードする異種ヌクレオチド配列をさらに含む。かかる酵素をコードするヌクレオチド配列の実例として、限定はされないが、（ＡＴＨＧＥＲＰＹＲＳ；シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)）、（ＢＴ００５３２８；シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)）、（ＮＭ＿１１９８４５；シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)）、（ＮＺ＿ＡＡＪＭ０１０００３８０、遺伝子座ＺＰ＿００７４３０５２；バチルス・チューリンゲンシス・セロバー・イスラエレンシス(Bacillus thuringiensis serovar israelensis)、ＡＴＣＣ３５６４６  ｓｑ１５６３）、（ＣＲＧＧＰＰＳ；ニチニチソウ(Catharanthus roseus)）、（ＮＺ＿ＡＡＢＦ０２００００７４、遺伝子座ＺＰ＿００１４４５０９；フソバクテリウム・ヌクレアタム亜種ビンセンティ(Fusobacterium nucleatum subsp. vincentii)、ＡＴＣＣ４９２５６）、（ＧＦＧＧＰＰＳＧＮ；ギベレラ・フジクロイ(Gibberella fujikuroi)）、（ＡＹ３７１３２１；イチョウ(Ginkgo biloba)）、（ＡＢ０５５４９６；パラゴムノキ(Hevea brasiliensis)）、（ＡＢ０１７９７１；ヒト(Homo sapiens)）、（ＭＣＩ２７６１２９；ムコール・シルシネロイデス・エフ・ルシタニコス(Mucor circinelloides f. lusitanicus)）、（ＡＢ０１６０４４；ムス・ムスクルス(Mus musculus)）、（ＡＡＢＸ０１０００２９８、遺伝子座ＮＣＵ０１４２７；アカパンカビ(Neurospora crassa)）、（ＮＣＵ２０９４０；アカパンカビ(Neurospora crassa)）、（ＮＺ＿ＡＡＫＬ０１０００００８、遺伝子座ＺＰ＿００９４３５６６；青枯病菌(Ralstonia solanacearum)ＵＷ５５１）、（ＡＢ１１８２３８；ラット(Rattus norvegicus)）、（ＳＣＵ３１６３２；出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)）、（ＡＢ０１６０９５；シネココッカス・エロンガタス(Synechococcus elongates)）、（ＳＡＧＧＰＳ；シナピス・アルバ(Sinapis alba)）、（ＳＳＯＧＤＳ；スルホロブス・アシドカルダリウス(Sulfolobus acidocaldarius)）、（ＮＣ＿００７７５９、遺伝子座ＹＰ＿４６１８３２；シントロファス・アシディトロフィクス(Syntrophus aciditrophicus)ＳＢ）、（ＮＣ＿００６８４０、遺伝子座ＹＰ＿２０４０９５；ビブリオ・フィシェリ(Vibrio fischeri)ＥＳ１１４）、（ＮＭ＿１１２３１５；シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)）、（ＥＲＷＣＲＴＥ；パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)）、（Ｄ９００８７、遺伝子座ＢＡＡ１４１２４；パントエア・アナナティス(Pantoea ananatis)）、（Ｘ５２２９１、遺伝子座ＣＡＡ３６５３８；ロドバクター・カプスラタス(Rhodobacter capsulatus)）、（ＡＦ１９５１２２、遺伝子座ＡＡＦ２４２９４；ロドバクター・スフェロイデス(Rhodobacter sphaeroides)）、及び（ＮＣ＿００４３５０、遺伝子座ＮＰ＿７２１０１５；ストレプトコッカス・ミュータンス(Streptococcus mutans)ＵＡ１５９）が挙げられる。
【０１３９】
[00147]  メバロン酸経路の酵素の例が上に示される一方、特定の実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞、組成物及び方法においてＤＭＡＰＰ及びＩＰＰを生成するための代替的又は追加的経路として、ＤＸＰ経路の酵素が使用可能である。ＤＸＰ経路の酵素及び酵素をコードする核酸は、当該技術分野で周知であり、特徴づけられている（国際公開第２０１２／１３５５９１Ａ２号）。
【０１４０】
６．７  ステビオールグリコシドを生成する方法
[00148]  別の態様では、ステビオールグリコシドを生成するための方法であって、
（ａ）炭素源を有する培地中でのステビオールグリコシドを生成する能力がある本明細書に記載の遺伝子組換え宿主細胞のいずれかの集団をステビオールグリコシド化合物の作製に適した条件下で培養するステップと；（ｂ）前記ステビオールグリコシド化合物を培地から回収するステップと、を含む、方法が本明細書に提供される。
【０１４１】
[00149]  いくつかの実施形態では、遺伝子組換え宿主細胞は、遺伝子組換え宿主細胞の１又は複数の修飾を含まない親細胞、又は１又は複数の修飾のサブセットのみを含む親細胞と比べて増量のステビオールグリコシドを生成するが、それ以外では遺伝的に同一である。いくつかの実施形態では、増量は、例えば、収量、生成、生産性において、ｇ／Ｌ細胞培養物、ｍｇ／ｇ乾燥細胞重量で、細胞培養物の単位体積あたりを基準に、単位乾燥細胞重量あたりを基準に、単位時間あたりで細胞培養物の単位体積あたりを基準に、又は単位時間あたりで単位乾燥細胞重量あたりを基準に測定されるとき、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％であるか、又は１００％を超える。
【０１４２】
[00150]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、発酵培地１リットルあたり約１０グラムを超える、上昇レベルのステビオールグリコシドを生成する。いくつかのかかる実施形態では、ステビオールグリコシドは、細胞培養物１リットルあたり約１０〜約５０グラム、約１５グラム超、約２０グラム超、約２５グラム超、又は約３０グラム超の量で生成される。
【０１４３】
[00151]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、約５０ｍｇ超／ｇ乾燥細胞重量の上昇レベルのステビオールグリコシドを生成する。いくつかのかかる実施形態では、ステビオールグリコシドは、約５０〜約１５００ｍｇ、約１００ｍｇ超、約１５０ｍｇ超、約２００ｍｇ超、約２５０ｍｇ超、約５００ｍｇ超、約７５０ｍｇ超、又は約１０００ｍｇ超／ｇ乾燥細胞重量の量で生成される。
【０１４４】
[00152]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、細胞培養物の単位体積あたりを基準に、親細胞によって生成されるステビオールグリコシドのレベルよりも、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１，０００倍、又はそれ以上高い、上昇レベルのステビオールグリコシドを生成する。
【０１４５】
[00153]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単位乾燥細胞重量あたりを基準に、親細胞によって生成されるステビオールグリコシドのレベルより、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１，０００倍、又はそれ以上高い、上昇レベルのステビオールグリコシドを生成する。
【０１４６】
[00154]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単位時間あたりで細胞培養物の単位体積あたりを基準に、親細胞によって生成されるステビオールグリコシドのレベルより、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１，０００倍、又はそれ以上高い、上昇レベルのステビオールグリコシドを生成する。
【０１４７】
[00155]  いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単位時間あたりで単位乾燥細胞重量あたりを基準に、親細胞によって生成されるステビオールグリコシドのレベルより、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、又は少なくとも約１，０００倍、又はそれ以上高い、上昇レベルのステビオールグリコシドを生成する。
【０１４８】
[00156]  ほとんどの実施形態では、宿主細胞による上昇レベルのステビオールグリコシドの生成は、誘導化合物により誘導可能である。かかる宿主細胞は、誘導化合物の不在下で容易に操作可能である。次に、誘導化合物が添加され、宿主細胞による上昇レベルのステビオールグリコシドの生成が誘導される。他の実施形態では、宿主細胞による上昇レベルのステビオールグリコシドの生成は、培養条件、例えば増殖温度、培地成分などを変更することにより誘導可能である。
【０１４９】
６．８  培地及び条件
[00157]  微生物培養物の維持及び増殖のための材料及び方法は、微生物学又は発酵科学の当業者にとって周知である（例えば、Bailey et al., Biochemical Engineering Fundamentals, second edition, McGraw Hill, New York, 1986を参照）。適切な培地、ｐＨ、温度、及び好気性、微好気性、又は嫌気性条件に対する要件に対して、宿主細胞、発酵、及びプロセスの具体的要件に応じて検討がなされる必要がある。
【０１５０】
[00158]  本明細書に提供されるステビオールグリコシドを生成する方法は、限定はされないが、細胞培養プレート、フラスコ、又は発酵槽を含む好適な容器内の好適な培地（例えば、パントテン酸補充の存在下又は不在下）中で実施されてもよい。さらに、方法は、微生物産物の工業生産を支持するため、当該技術分野で公知の発酵のいずれかの規模で実施されうる。撹拌タンク発酵槽、エアリフト発酵槽、バブル発酵槽、又はそれらのいずれかの組み合わせを含む任意の好適な発酵槽が用いられてもよい。宿主細胞として出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)を用いる特定の実施形態では、Kosaric, et al, in Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Sixth Edition, Volume 12, pages 398-473, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KDaA, Weinheim, Germanyで詳述の通り、株は発酵槽内で増殖されうる。
【０１５１】
[00159]  いくつかの実施形態では、培地は、ステビオールグリコシドを生成する能力がある遺伝子組換え微生物が存続しうる、即ち増殖及び生存度を維持しうるような任意の培地である。いくつかの実施形態では、培地は、同化可能な炭素源、窒素源及びリン酸源を含む水性培地である。かかる培地はまた、適切な塩、ミネラル、金属及び他の栄養素を含みうる。いくつかの実施形態では、炭素源及び必須細胞栄養素の各々は、発酵培地に増加的又は継続的に添加され、また必要とされる各栄養素は、例えば炭素源をバイオマスに変換する細胞の代謝又は呼吸機能に基づく所定の細胞増殖曲線に従い、増殖細胞による効率的同化にとって必要とされる本質的に最小レベルで維持される。
【０１５２】
[00160]  微生物を培養するための好適な条件及び好適な培地は、当該技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、好適な培地は、例えば、インデューサー（例えば、遺伝子産物をコードする１又は複数のヌクレオチド配列が誘導性プロモーターの制御下にあるとき）、リプレッサー（例えば、遺伝子産物をコードする１又は複数のヌクレオチド配列が抑制可能なプロモーターの制御下にあるとき）、又は選択剤（例えば、遺伝子修飾を含む微生物について選択するための抗生物質）などの１又は複数の追加的な作用物質が添加される。
【０１５３】
[00161]  いくつかの実施形態では、炭素源は、単糖（単糖類）、二糖、多糖、非発酵性炭素源、又はそれらの１又は複数の組み合わせである。好適な単糖の非限定例として、グルコース、ガラクトース、マンノース、フルクトース、キシロース、リボース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な二糖の非限定例として、スクロース、ラクトース、麦芽糖、トレハロース、セロビオース、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な多糖の非限定例として、デンプン、グリコゲン、セルロース、キチン、及びそれらの組み合わせが挙げられる。好適な非発酵性炭素源の非限定例として、酢酸塩及びグリセロールが挙げられる。
【０１５４】
[00162]  培地中の炭素源、例えばグルコースの濃度は、細胞増殖を促進しても、使用微生物の増殖を抑制するほどに高い必要がない。典型的には、培養は、検出不能なレベル（検出限界は約＜０．１ｇ／ｌである）であるが、増殖及びバイオマスの所望されるレベルを達成するためのレベルで添加されている炭素源、例えばグルコースを用いて実施される。他の実施形態では、培地中の炭素源、例えばグルコースの濃度は、約１ｇ／Ｌより大きい、好ましくは約２ｇ／Ｌより大きい、またより好ましくは約５ｇ／Ｌより大きい。さらに、培地中の炭素源、例えばグルコースの濃度は、典型的には約１００ｇ／Ｌより少ない、好ましくは約５０ｇ／Ｌより少ない、またより好ましくは約２０ｇ／Ｌより少ない。培養成分濃度に関しては、初期及び／又は進行中の両成分濃度を指すことは注目されるべきである。場合によっては、培養中、培地において炭素源を枯渇させておくことが望ましいことがある。
【０１５５】
[00163]  好適な培地中で使用可能である同化可能な窒素の供給源として、限定はされないが、単純な窒素源、有機窒素源及び複合窒素源が挙げられる。かかる窒素源は、無水アンモニア、アンモニウム塩、並びに動物、野菜及び／又は微生物起源の物質を含む。好適な窒素源として、限定はされないが、タンパク質加水分解物、微生物バイオマス加水分解物、ペプトン、酵母抽出物、硫酸アンモニウム、尿素、及びアミノ酸が挙げられる。典型的には、培地中の窒素源の濃度は、約０．１ｇ／Ｌより大きい、好ましくは約０．２５ｇ／Ｌより大きい、またより好ましくは約１．０ｇ／Ｌより大きい。しかし、窒素源の培地への特定濃度を超えての添加は、微生物の増殖にとって有利でない。結果として、培地中の窒素源の濃度は、約２０ｇ／Ｌより小さい、好ましくは約１０ｇ／Ｌより小さい、またより好ましくは約５ｇ／Ｌより小さい。さらに、場合によっては、培養中、培地において窒素源を枯渇させておくことが望ましいことがある。
【０１５６】
[00164]  有効な培地は、無機塩類、ビタミン、微量金属又は増殖プロモーターなどの他の化合物を含有しうる。かかる他の化合物はまた、有効な培地中の炭素源、窒素源又はミネラル源の中に存在しうる、又は専ら培地に添加されうる。
【０１５７】
[00165]  培地はまた、好適なリン酸源を含有しうる。かかるリン酸源は、無機及び有機双方のリン酸源を含む。好ましいリン酸源として、限定はされないが、一塩基性又は二塩基性のリン酸ナトリウム及びリン酸カリウム、リン酸アンモニウム並びにそれらの混合物などのリン酸塩が挙げられる。典型的には、培地中のリン酸塩の濃度は、約１．０ｇ／Ｌより大きい、好ましくは約２．０ｇ／Ｌより大きい、またより好ましくは約５．０ｇ／Ｌより大きい。しかし、リン酸塩の培地への特定濃度を超えての添加は、微生物の増殖にとって有利でない。したがって、培地中のリン酸塩の濃度は、典型的には約２０ｇ／Ｌより少ない、好ましくは約１５ｇ／Ｌより少ない、またより好ましくは約１０ｇ／Ｌより少ない。
【０１５８】
[00166]  好適な培地はまた、マグネシウムの供給源を、好ましくは生理学的に許容できる塩、例えば硫酸マグネシウム七水和物の形態で含みうるが、類似量のマグネシウムに寄与する濃度の他のマグネシウム源が使用可能である。典型的には、培地中のマグネシウムの濃度は、約０．５ｇ／Ｌより大きい、好ましくは約１．０ｇ／Ｌより大きい、またより好ましくは約２．０ｇ／Ｌより大きい。しかし、マグネシウムの培地への特定濃度を超えての添加は、微生物の増殖にとって有利でない。したがって、培地中のマグネシウムの濃度は、典型的には約１０ｇ／Ｌより少ない、好ましくは約５ｇ／Ｌより少ない、またより好ましくは約３ｇ／Ｌより少ない。さらに、場合によっては、培養中、培地においてマグネシウム源を枯渇させておくことが望ましいことがある。
【０１５９】
[00167]  いくつかの実施形態では、培地はまた、生物学的に許容できるキレート剤、例えばクエン酸三ナトリウムの二水和物を含みうる。かかる例では、培地中のキレート剤の濃度は、約０．２ｇ／Ｌより大きい、好ましくは約０．５ｇ／Ｌより大きい、またより好ましくは約１ｇ／Ｌより大きい。しかし、キレート剤の培地への特定濃度を超えての添加は、微生物の増殖にとって有利でない。したがって、培地中のキレート剤の濃度は、典型的には約１０ｇ／Ｌより少ない、好ましくは約５ｇ／Ｌより少ない、またより好ましくは約２ｇ／Ｌより少ない。
【０１６０】
[00168]  培地はまた、最初に、培地の所望されるｐＨを維持するための生物学的に許容できる酸又は塩基を含みうる。生物学的に許容できる酸として、限定はされないが、塩酸、硫酸、硝酸、リン酸及びそれらの混合物が挙げられる。生物学的に許容できる塩基として、限定はされないが、水酸化アンモニウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム及びそれらの混合物が挙げられる。いくつかの実施形態では、使用塩基は、水酸化アンモニウムである。
【０１６１】
[00169]  培地はまた、生物学的に許容できるカルシウム源、例えば限定はされないが、塩化カルシウムを含みうる。典型的には、培地中のカルシウム源、例えば塩化カルシウム二水和物の濃度は、約５ｍｇ／Ｌ〜約２０００ｍｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約２０ｍｇ／Ｌ〜約１０００ｍｇ／Ｌの範囲内、またより好ましくは約５０ｍｇ／Ｌ〜約５００ｍｇ／Ｌの範囲内である。
【０１６２】
[00170]  培地はまた、塩化ナトリウムを含みうる。典型的には、培地中の塩化ナトリウムの濃度は、約０．１ｇ／Ｌ〜約５ｇ／Ｌの範囲内、好ましくは約１ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌの範囲内、またより好ましくは約２ｇ／Ｌ〜約４ｇ／Ｌの範囲内である。
【０１６３】
[00171]  いくつかの実施形態では、培地はまた、微量金属を含みうる。かかる微量金属は、便宜上、培地の残りとは別に調製可能である保存液としての培地に添加されうる。典型的には、培地に添加されるかかる微量金属溶液の量は、約１ｍＬ／Ｌより多い、好ましくは約５ｍＬ／Ｌより多い、またより好ましくは約１０ｍＬ／Ｌより多い。しかし、微量金属の培地への特定濃度を超えての添加は、微生物の増殖にとって有利でない。したがって、培地に添加されるかかる微量金属溶液の量は、典型的には約１００ｍＬ／Ｌより少ない、好ましくは約５０ｍＬ／Ｌより少ない、またより好ましくは約３０ｍＬ／Ｌより少ない。微量金属を保存液に添加することに加えて、個別成分が別々に添加可能であり、各々が微量金属溶液の上記範囲によって指定される成分の量に依存せずに対応する範囲内にありうることは注目されるべきである。
【０１６４】
[00172]  培地は、他のビタミン、例えば、パントテン酸、ビオチン、カルシウム、パントテン酸、イノシトール、ピリドキシン−ＨＣｌ、及びチアミン−ＨＣｌを含みうる。かかるビタミンは、便宜上、培地の残りとは別に調製可能である保存液としての培地に添加されうる。しかし、ビタミンの培地への特定濃度を超えての添加は、微生物の増殖にとって有利でない。
【０１６５】
[00173]  本明細書に記載の発酵方法は、限定はされないが、バッチ、フェドバッチ、細胞リサイクル、連続式及び半連続式を含む、通常の培養方法で実施されうる。いくつかの実施形態では、発酵は、フェドバッチモードで実施される。かかる場合、培地の成分の一部が培養中に、例えばパントテン酸が発酵の生成段階中に枯渇される。いくつかの実施形態では、例えば生成段階の開始時に、培養物に比較的高濃度のかかる成分が添加されてもよく、それにより、添加が必要になるまでの期間、増殖及び／又はステビオールグリコシドの生成が支持される。培養全体を通じて、これら成分は、好ましい範囲で、培養によりレベルが激減すると添加を行うことにより、維持される。培地中の成分のレベルは、例えば、培地を定期的にサンプリングし、濃度についてアッセイすることにより、監視されうる。或いは、一旦標準的な培養手順が開発されると、培養全体を通じて、特定の時点での既知のレベルに対応する時間間隔で添加がなされうる。当業者によって理解されるであろうが、栄養素の消費の速度は、培養中、培地の細胞密度が増加するにつれて増加する。さらに、外来微生物の培地への導入を回避するため、当該技術分野で公知の通り、無菌添加方法を用いて添加が実施される。さらに、培養中、少量の抗発泡剤が添加されてもよい。
【０１６６】
[00174]  培地の温度は、遺伝子組換え細胞の増殖及び／又はステビオールグリコシドの生成に適した任意の温度でありうる。例えば、培地への接種材料の接種前、培地は、約２０℃〜約４５℃の範囲内の温度、好ましくは約２５℃〜約４０℃の範囲内の温度、またより好ましくは約２８℃〜約３２℃の範囲内の温度に導かれ、且つそこで維持されうる。
【０１６７】
[00175]  培地のｐＨは、酸又は塩基の培地への添加により制御されうる。かかる場合、ｐＨを制御するためにアンモニアが用いられるとき、それは便宜上、培地における窒素源としても役立つ。好ましくは、ｐＨは、約３．０〜約８．０、より好ましくは約３．５〜約７．０、また最も好ましくは約４．０〜約６．５で維持される。
【０１６８】
[00176]  いくつかの実施形態では、培養中、培地の炭素源濃度、例えばグルコース濃度が監視される。培地のグルコース濃度は、上清、例えば培地の無細胞成分中のグルコース濃度を監視するために使用可能である、公知の技術を用いて、例えばグルコースオキシダーゼ酵素試験又は高圧液体クロマトグラフィーを用いて監視されうる。上述の通り、炭素源濃度は、細胞増殖阻害が生じるレベル未満で保持されるべきである。炭素源としてのグルコースにおいて、かかる濃度は生物間で変動してもよいが、細胞増殖阻害は、約６０ｇ／Ｌより大きいグルコース濃度で生じ、試験により容易に測定可能である。したがって、グルコースが炭素源として用いられるとき、グルコースは、好ましくは発酵槽に供され、検出限界未満で維持される。或いは、培地中のグルコース濃度は、約１ｇ／Ｌ〜約１００ｇ／Ｌの範囲内、より好ましくは約２ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの範囲内、またさらにより好ましくは約５ｇ／Ｌ〜約２０ｇ／Ｌの範囲内で維持される。炭素源濃度は、例えば実質的に純粋なグルコース溶液の添加により、所望されるレベル内で維持されうるが、培地の炭素源濃度を一定分量の元の培地の添加により維持することが許容可能であり、且つ好ましいことがある。一定分量の元の培地の使用は、培地中の他の栄養素（例えば、窒素源及びリン酸源）の濃度が同時に維持可能であることから、望ましいことがある。同様に、微量金属濃度は、一定分量の微量金属溶液の添加により、培地中で維持されうる。
【０１６９】
[00177]  他の好適な発酵培地及び方法は、例えば国際公開第２０１６／１９６３２１号に記載されている。
【０１７０】
６．９  発酵組成物
[00178]  別の態様では、本明細書に記載の遺伝子組換え宿主細胞及び遺伝子組換え宿主細胞から生成されるステビオールグリコシドを含む発酵組成物が本明細書に提供される。発酵組成物は、培地をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、発酵組成物は、遺伝子組換え宿主細胞を含み、またＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、及びＲｅｂＭをさらに含む。特定の実施形態では、本明細書に提供される発酵組成物は、遺伝子組換え宿主細胞から生成されるステビオールグリコシドの主成分としてＲｅｂＭを含む。特定の実施形態では、発酵組成物は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、及びＲｅｂＭを少なくとも１：７：５０の比で含む。特定の実施形態では、発酵組成物は、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、及びＲｅｂＭを少なくとも１：７：５０〜１：１００：１０００の比で含む。特定の実施形態では、発酵組成物は、少なくとも１：７：５０〜１：２００：２０００の比で含む。特定の実施形態では、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、及びＲｅｂＭの比は、遺伝子組換え宿主細胞及び培地に関連したステビオールグリコシドの全含量に基づく。特定の実施形態では、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、及びＲｅｂＭの比は、培地中のステビオールグリコシドの全含量に基づく。特定の実施形態では、ＲｅｂＡ、ＲｅｂＤ、及びＲｅｂＭの比は、遺伝子組換え宿主細胞と会合したステビオールグリコシドの全含量に基づく。
【０１７１】
[00179]  特定の実施形態では、本明細書に提供される発酵組成物は、ＲｅｂＭ２を検出不能なレベルで含有する。特定の実施形態では、本明細書に提供される発酵組成物は、天然に存在しないステビオールグリコシドを検出不能なレベルで含有する。特定の実施形態では、本明細書に提供される発酵組成物は、ＧＣクロマトグラフィーにかけられるとき、ＲｅｂＡピークとＲｅｂＢとの間に「ステビオール＋２グルコース」ピークを検出可能なレベルで生成しない。
【０１７２】
６．１０  ステビオールグリコシドの回収
[00180]  一旦ステビオールグリコシドが宿主細胞により生成されると、後の使用のため、それは当該技術分野で公知の任意の好適な分離及び精製方法を用いて回収又は単離されてもよい。いくつかの実施形態では、ステビオールグリコシドを含む有機相が、遠心分離により発酵から分離される。他の実施形態では、ステビオールグリコシドを含む有機相は、発酵から自発的に分離する。他の実施形態では、ステビオールグリコシドを含む有機相は、抗乳化剤及び／又は核形成剤を発酵反応に添加することにより、発酵から分離される。抗乳化剤の実例として、凝集剤及び凝固剤が挙げられる。核形成剤の実例として、ステビオールグリコシド自体や、ドデカン、ミリスチン酸イソプロピル、及びオレイン酸メチルなどの有機溶媒の液滴が挙げられる。
【０１７３】
[00181]  これらの細胞内で生成されるステビオールグリコシドは、培養上清中に存在し、及び／又は宿主細胞と会合してもよい。ステビオールグリコシドが宿主細胞と会合する場合の実施形態では、ステビオールグリコシドの回収は、細胞を透過性にするか又は溶解する方法を含んでもよい。代替的に又は同時に、培地中のステビオールグリコシドは、限定はされないが、クロマトグラフィー、抽出、溶媒抽出、膜分離、電気透析、逆浸透、蒸留、化学誘導体化及び結晶化を含む回収プロセスを用いて回収されうる。
【０１７４】
[00182]  いくつかの実施形態では、ステビオールグリコシドは、有機相中に存在することがある他の生成物から分離される。いくつかの実施形態では、分離は、吸着、蒸留、気体−液体抽出（ストリッピング）、液体−液体抽出（溶媒抽出）、真空抽出、蒸発、限外濾過、及び標準的なクロマトグラフィー技術を用いてなされる。他の好適な発酵培地及び方法は、例えば米国特許出願公開第２０１６／０１８５８１３号に記載されている。
【０１７５】
６．１１  遺伝子組換え細胞を作製する方法
[00183]  さらに、上記修飾の１又は複数、例えば、エンドウ(Pisum sativum)カウレンオキシダーゼ、及び／又は例えばステビオールグリコシド化合物における生合成経路酵素をコードする１又は複数の異種核酸を含むように遺伝子操作された宿主細胞を作製するための方法が本明細書に提供される。宿主細胞内での異種酵素の発現は、酵素をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、宿主細胞内での発現を可能にする調節エレメントの制御下で、宿主細胞内に導入することにより達成されうる。いくつかの実施形態では、核酸は、染色体外プラスミドである。他の実施形態では、核酸は、ヌクレオチド配列を宿主細胞の染色体に組み込みことが可能な染色体組込みベクターである。
【０１７６】
[00184]  これらタンパク質をコードする核酸は、限定されない当業者に公知の任意の方法により宿主細胞に導入されうる（例えば、Hinnen et al. (1978) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1292-3; Cregg et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:3376-3385; Goeddel et al.  eds, 1990, Methods in Enzymology, vol. 185, Academic Press, Inc. , CA; Krieger, 1990, Gene Transfer and Expression -- A Laboratory Manual, Stockton Press, NY; Sambrook et al. , 1989, Molecular Cloning -- A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY; and Ausubel et al. , eds. , Current Edition, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NYを参照）。例示的技術として、限定はされないが、スフェロプラスティング、エレクトロポレーション、ＰＥＧ１０００媒介形質転換、及び酢酸リチウム若しくは塩化リチウム媒介形質転換が挙げられる。
【０１７７】
[00185]  宿主細胞内での酵素のコピー数は、酵素をコードする遺伝子の転写を修飾することにより変更されることがある。これは、例えば酵素をコードするヌクレオチド配列のコピー数を変更することにより（例えば、ヌクレオチド配列を含むより高い若しくはより低いコピー数の発現ベクターを用いることにより、又はヌクレオチド配列の追加的コピーを宿主細胞のゲノムに導入することにより、又は宿主細胞のゲノム中のヌクレオチド配列を欠失させる若しくは破壊することにより）、オペロンのポリシストロニックｍＲＮＡ上のコード配列の順序を変化させる、又はオペロンを崩壊させて、各々がそれ自身の調節エレメントを有する個別遺伝子にすることより、又はヌクレオチド配列が作動可能に連結される対象のプロモーター若しくはオペレーターの長さを増加させることにより、達成されうる。代替的に又追加的に、宿主細胞内の酵素のコピー数は、酵素をコードするｍＲＮＡの翻訳のレベルを変更することにより変更されてもよい。これは、例えば、ｍＲＮＡの安定性を修飾する、リボソーム結合部位の配列を修飾する、リボソーム結合部位と酵素コード配列の開始コドンとの間の距離若しくは配列を変更する、酵素コード領域の開始コドンの５’側「の上流に」位置する若しくはそれに隣接する全シストロン間領域を修飾する、ヘアピン及び特定化された配列を用いてｍＲＮＡ転写物の３’末端を安定化する、酵素のコドン使用を変更する、酵素の生合成に用いられる希少コドンｔＲＮＡの発現を変更する、及び／又は例えば酵素の安定性をそのコード配列の突然変異によって増強することにより、達成可能である。
【０１７８】
[00186]  宿主細胞内の酵素の活性は、例えば限定はされないが、宿主細胞内での溶解度の増加若しくは減少を呈する酵素の修飾形態を発現させる、酵素の活性の阻害をもたらすドメインが欠如した酵素の改変形態を発現させる、基質に対してより高い若しくはより低いＫｃａｔ又はより低い若しくはより高いＫｍを有する酵素の改変形態を発現させる、又は経路内の別の分子によるフィードバック若しくはフィードフォワード調節により多かれ少なかれ影響を受ける酵素の改変形態を発現させるようないくつかの方法において改変されうる。
【０１７９】
[00187]  いくつかの実施形態では、宿主細胞を遺伝的に修飾するために用いられる核酸は、形質転換宿主細胞の選択において、また外来ＤＮＡを維持するため、宿主細胞に対して選択圧をかけることにおいて有用な１又は複数の選択可能マーカーを含む。
【０１８０】
[00188]  いくつかの実施形態では、選択可能マーカーは、抗生物質耐性マーカーである。抗生物質耐性マーカーの実例として、限定はされないが、ＢＬＡ、ＮＡＴ１、ＰＡＴ、ＡＵＲ１−Ｃ、ＰＤＲ４、ＳＭＲ１、ＣＡＴ、マウスｄｈｆｒ、ＨＰＨ、ＤＳＤＡ、ＫＡＮＲ、及びＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物が挙げられる。大腸菌(E. coli)由来のＢＬＡ遺伝子産物は、βラクタム抗生物質（例えば、狭スペクトルセファロスポリン、セファマイシン、及びカルバペネム（エルタペネム）、セファマンドール、及びセフォペラゾン）とテモシリンを除くすべての抗グラム陰性細菌ペニシリンに耐性を付与し；Ｓ．ノウルセイ(S. noursei)由来のＮＡＴ１遺伝子産物は、ノウルセオトリシンに耐性を付与し；Ｓ．ビリドクロモゲネス(S. viridochromogenes)Ｔｕ９４由来のＰＡＴ遺伝子産物は、バイアロフォス(bialophos)に耐性を付与し；出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)由来のＡＵＲ１−Ｃ遺伝子産物は、オーレオバシジン(Auerobasidin)Ａ（ＡｂＡ）に耐性を付与し；ＰＤＲ４遺伝子産物は、セルレニンに耐性を付与し；ＳＭＲ１遺伝子産物は、スルホメツロンメチルに耐性を付与し；Ｔｎ９トランスポゾン由来のＣＡＴ遺伝子産物は、クロラムフェニコールに耐性を付与し；マウスｄｈｆｒ遺伝子産物は、メトトレキサートに耐性を付与し；クレブシエラ・ニューモニエ(Klebsiella pneumonia)のＨＰＨ遺伝子産物は、ハイグロマイシンＢに耐性を付与し；大腸菌(E. coli)のＤＳＤＡ遺伝子産物は、唯一の窒素源としてＤ−セリンを有するプレート上で細胞が増殖することを可能にし；Ｔｎ９０３トランスポゾンのＫＡＮＲ遺伝子は、Ｇ４１８に耐性を付与し；またストレプトアロテイクス・ヒンダスタヌス(Streptoalloteichus hindustanus)由来のＳＨ  ＢＬＥ遺伝子産物は、ゼオシン（ブレオマイシン）に耐性を付与する。いくつかの実施形態では、抗生物質耐性マーカーは、本明細書に開示される遺伝子組換え宿主細胞が単離された後、欠失される。
【０１８１】
[00189]  いくつかの実施形態では、選択可能マーカーは、遺伝子組換え微生物において要求性（例えば栄養要求性）を救出する。かかる実施形態では、親微生物は、アミノ酸又はヌクレオチド生合成経路内で機能する１又は複数の遺伝子産物中に機能的破壊を含み、しかも非機能的な場合、親細胞を１又は複数の栄養素の添加を伴わない培地中で増殖できなくする。かかる遺伝子産物として、限定はされないが、酵母中のＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ１、ＬＹＳ２、ＭＥＴ１５、ＴＲＰ１、ＡＤＥ２、及びＵＲＡ３遺伝子産物が挙げられる。次に、栄養要求性表現型は、親細胞を、破壊された遺伝子産物の機能的コピーをコードする発現ベクター又は染色体組み込み構築物で形質変換することにより救出可能であり、作製された遺伝子組換え宿主細胞は、親細胞の栄養要求性表現型の欠損に基づいて選択可能である。選択可能マーカーとしてのＵＲＡ３、ＴＲＰ１、及びＬＹＳ２遺伝子の利用は、ポジティブ及びネガティブ選択の双方が可能であることから、著明な利点を有する。ポジティブ選択は、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、及びＬＹＳ２突然変異の栄養要求性相補性により実施される一方で、ネガティブ選択は、原栄養菌株の増殖を阻止するが、ＵＲＡ３、ＴＲＰ１、及びＬＹＳ２突然変異体各々の増殖を可能にする特異的阻害剤、即ち、５−フルオロ−オロト酸（ＦＯＡ）、５−フルオロアントラニル酸、及びアミノアジピン酸（ａＡＡ）の各々に基づく。他の実施形態では、選択可能マーカーは、公知の選択方法により同定可能な他の非致死的欠損又は表現型を救出する。
【０１８２】
[00190]  本開示の方法、組成物及び生物において有用な特異的な遺伝子及びタンパク質が本明細書に記載されるが、かかる遺伝子に対する絶対的同一性が必要でないことは理解されるであろう。例えば、ポリペプチド又は酵素をコードする配列を含む特定の遺伝子又はポリヌクレオチドにおける改変が実施され、活性についてスクリーニングされうる。典型的には、かかる改変は、保存的突然変異及びサイレント突然変異を含む。かかる修飾又は突然変異されたポリヌクレオチド及びポリペプチドは、当該技術分野で公知の方法を用いて、機能的酵素の発現についてスクリーニングされうる。
【０１８３】
[00191]  遺伝暗号の固有の縮重に起因し、かかる酵素をコードするポリヌクレオチドをクローン化及び発現するため、実質的に同じか又は機能的に等価なポリペプチドをコードする他のポリヌクレオチドもまた使用可能である。
【０１８４】
[00192]  当業者によって理解されるであろうが、特定の宿主内で、コード配列を修飾し、その発現を増強することは有利でありうる。遺伝暗号は、６４の可能なコドンにより冗長であるが、大部分の生物は、典型的にはこれらコドンのサブセットを用いる。ある種において最も多く利用されるコドンは、最適コドンと称され、大して頻繁には利用されないコドンは、希少又は低使用コドンとして分類される。宿主の好ましいコドン使用を反映させるため、時として「コドン最適化」又は「種コドンバイアスの制御」と称されるプロセスにおいて、コドンは置換可能である。他の宿主細胞におけるコドン最適化は、コドン使用表を用いて容易に判定されうる、又は市販のソフトウェア、例えばIntegrated DNA Technologies製のCodonOp (www.idtdna.com/CodonOptfrom)を用いて実施されうる。
【０１８５】
[00193]  特定の原核生物又は真核生物宿主によって好まれるコドンを有する最適化されたコード配列（Murray et al., 1989, Nucl Acids Res. 17: 477-508）が調製されることで、例えば、翻訳の速度を増加させることができる、又は望ましい特性、例えば非最適化配列から生成された転写物と比べると延長された半減期を有する組換えＲＮＡ転写物を作製することができる。宿主の好ましさを反映させるため、翻訳停止コドンについても修飾されうる。例えば、出芽酵母(S. cerevisiae)及び哺乳類における典型的な停止コドンは各々、ＵＡＡ及びＵＧＡである。単子葉植物における典型的な停止コドンはＵＧＡである一方、昆虫及び大腸菌(E. coli)は、一般に停止コドンとしてＵＡＡを用いる(Dalphin et al., 1996, Nucl Acids Res. 24: 216-8)。
【０１８６】
[00194]  当業者は、遺伝暗号の縮重性に起因し、ヌクレオチド配列が異なる種々のＤＮＡ分子が、本開示の所与の酵素をコードするように使用可能であることを理解するであろう。上記の生合成酵素をコードする天然ＤＮＡ配列は、あくまで本開示の実施形態を例示するために本明細書で参照され、本開示は、本開示の方法において利用される酵素のポリペプチド及びタンパク質のアミノ酸配列をコードする任意の配列のＤＮＡ分子を含む。同様の様式で、ポリペプチドは、典型的には、所望される活性の欠損又は有意な欠損を伴わずに、そのアミノ酸配列内に１又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び挿入を許容しうる。本開示は、修飾又は変異ポリペプチドが参照ポリペプチドの酵素的同化又は異化活性を有する限り、本明細書に記載の特定のタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有するようなポリペプチドを含む。さらに、本明細書に示されるＤＮＡ配列によってコードされるアミノ酸配列は、あくまで本開示の実施形態を例示する。
【０１８７】
[00195]  さらに、本明細書に提供される組成物及び方法にとって有用な酵素の相同体は、本開示によって包含される。いくつかの実施形態では、２つのタンパク質（又はタンパク質の領域）は、アミノ酸配列が、少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性を有するとき、実質的に相同である。２つのアミノ酸配列、又は２つの核酸配列のパーセント同一性を判定するため、配列は、最適な比較を目的として整列される（例えば、最適な整列化のため、第１及び第２のアミノ酸又は核酸配列の一方又は両方にギャップが導入可能であり、非相同性配列は比較を目的として無視されうる）。一実施形態では、比較を目的として整列された参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、典型的には少なくとも４０％、より典型的には少なくとも５０％、さらにより典型的には少なくとも６０％、またさらにより典型的には少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、アミノ酸残基又はヌクレオチドは、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチドで比較される。第１の配列における位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドによって占められるとき、分子はその位置で同一である（本明細書で用いられるとき、アミノ酸又は核酸の「同一性」は、アミノ酸又は核酸の「相同性」に等しい）。２つの配列間のパーセント同一性は、２つの配列の最適な整列化を意図して導入される必要がある、ギャップの数、及び各ギャップの長さを考慮に入れて、配列によって共有される同一位置の数の関数である。
【０１８８】
[00196]  「相同性」がタンパク質又はペプチドに関連して用いられるとき、同一でない残基位置が保存的アミノ酸置換により異なることが多いことが理解される。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似的化学特性（例えば、電荷又は疎水性）を伴う側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されたものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に改変することがない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、パーセント配列同一性又は相同性の程度は、置換の保存的性質について訂正するように上方に調節されてもよい。この調節を設けるための手段は、当業者に周知である（例えば、Pearson W. R., 1994, Methods in Mol Biol 25: 365-89を参照）。
【０１８９】
[00197]  以下の６群：１）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）は各々、互いに対して保存的置換であるアミノ酸を有する。
【０１９０】
[00198]  パーセント配列同一性とも称される、ポリペプチドにおける配列相同性は、典型的には配列分析ソフトウェアを用いて計測される。分子配列を異なる生物からの多数の配列を有するデータベースと比較する典型的な使用アルゴリズムは、コンピュータプログラムＢＬＡＳＴである。多数の異なる生物からの配列を有するデータベースを探索するとき、アミノ酸配列を比較することは典型的である。
【０１９１】
[00199]  さらに、前述の酵素をコードする遺伝子のいずれか（又は本明細書に記載の任意のその他（又はその発現を制御若しくは調節する調節エレメントのいずれか））は、当業者にとって公知である遺伝子／タンパク質工学技術、例えば定向進化又は合理的突然変異誘発により最適化されてもよい。かかる作用により、当業者は、酵素を酵母における発現及び活性について最適化することが可能になる。
【０１９２】
[00200]  さらに、これらの酵素をコードする遺伝子は、他の真菌及び細菌種から同定可能であり、この経路の調節を意図して発現されうる。限定はされないが、サッカロマイセス属菌（Saccharomyces spp.）、例えば、出芽酵母(S. cerevisiae)及びＳ．ウバルム(S. uvarum)、クルイベロマイセス属菌(Kluyveromyces spp.)、例えば、Ｋ．サーモトレランス(K. thermotolerans)、Ｋ．ラクティス(K. lactis)、及びＫ．マルシアヌス(K. marxianus)、ピチア属菌(Pichia spp.)、ハンゼヌラ属菌(Hansenula spp.)、例えば、Ｈ．ポリモルファ(H. polymorpha)、カンジダ属菌(Candida spp.)、トリコスポロン属菌(Trichosporon spp.)、ヤマダジマ属菌(Yamadazyma spp.)、例えば、Y.属菌スティピティス(Y.spp.stipitis)、トルラスポラ・プレトリエンシス(Torulaspora pretoriensis)、イサチェンキア・オリエンタリス(Issatchenkia orientalis)、シゾサッカロミセス属菌(Schizosaccharomyces spp.)、例えば、分裂酵母(S. pombe)、クリプトコッカス属菌(Cryptococcus spp.)、アスペルギルス属菌(Aspergillus spp.)、ニューロスポラ属菌(Neurospora spp.)、又はウスチラゴ属菌(Ustilago spp.)を含む種々の生物は、これらの酵素の供給源として役立ちうる。嫌気性真菌からの遺伝子の供給源として、限定はされないが、ピロミセス属菌(Piromyces spp.)、オルピノミセス属菌(Orpinomyces spp.)、又はネオカリマスティクス属菌(Neocallimastix spp.)が挙げられる。有用な原核生物酵素の供給源として、限定はされないが、大腸菌（Escherichia coli）、ザイモモナス・モビリス(Zymomonas mobilis)、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)、バチルス属菌(Bacillus spp.)、クロストリジウム属菌(Clostridium spp.)、コリネバクテリウム属菌(Corynebacterium spp.)、シュードモナス属菌(Pseudomonas spp.)、ラクトコッカス属菌(Lactococcus spp.)、エンテロバクター属菌(Enterobacter spp.)、及びサルモネラ属菌(Salmonella spp.)が挙げられる。
【０１９３】
[00201]  追加的な相同性遺伝子及び相同性酵素を同定するため、当業者に公知の技術が好適であることがある。一般に、類似遺伝子及び／又は類似酵素は、機能分析により同定可能であり、機能的類似性を有することになる。類似遺伝子及び類似酵素を同定するため、当業者に公知の技術が好適であることがある。例えば、相同的又は類似的なＵＤＰ糖転移酵素、ＰＴＡ、又は任意の生合成経路の遺伝子、タンパク質、若しくは酵素を同定するため、技術として、限定はされないが、目的の遺伝子／酵素の公表された配列に基づくプライマーを用いるＰＣＲにより、又は目的の遺伝子の中の保存された領域を増幅するように設計された縮重プライマーを用いる縮重ＰＣＲにより遺伝子をクローン化することを含んでもよい。さらに、当業者は、機能的相同性又は類似性を有する相同的若しくは類似的な遺伝子、タンパク質、又は酵素を同定するための技術を用いることができる。技術としては、酵素の触媒活性について、（例えば、本明細書又はKiritani, K., Branched-Chain Amino Acids Methods Enzymology, 1970に記載のような）前記活性に対するインビトロ酵素アッセイを通じて、細胞又は細胞培養物を試験し、次いで前記活性を有する酵素を精製により単離し、エドマン分解、類似の核酸配列に対するＰＣＲプライマーの設計、前記ＤＮＡ配列のＰＣＲによる増幅、及び前記核酸配列のクローニングなどの技術を通じて酵素のタンパク質配列を決定することを含む。相同若しくは類似遺伝子及び／又は相同若しくは類似酵素、類似遺伝子及び／又は類似酵素若しくはタンパク質を同定するため、技術としては、候補遺伝子若しくは酵素に関するデータと、BRENDA、KEGG、若しくはMetaCYCなどのデータベースとの比較も含む。候補遺伝子若しくは酵素は、本明細書中の教示内容に従い、上記データベース内で同定されてもよい。
【実施例】
【０１９４】
７．実施例
実施例１：ファルネシルピロリン酸（ＦＰＰ）及びイソプレノイドファルネセンに対する高フラックスが可能な基本酵母株の作製
[00202]  ファルネセン生成株を、野生型出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)株（ＣＥＮ．ＰＫ２）から、ＧＡＬ１又はＧＡＬ１０プロモーターの制御下でメバロン酸経路（図１Ｄ）の遺伝子を発現することにより作出した。この株は、出芽酵母(S. cerevisiae)からの、アセチルＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ、メバロン酸キナーゼ、ホスホメバロン酸キナーゼ、メバロン酸ピロリン酸デカルボキシラーゼ、及びＩＰＰ：ＤＭＡＰＰイソメラーゼの染色体組み込みメバロン酸経路遺伝子を含んだ。本明細書に記載のすべての遺伝子を、公的に利用可能な又は他の好適なアルゴリズムを用いてコドン最適化した。さらに、株は、やはりＧＡＬ１又はＧＡＬ１０プロモーターのいずれかの制御下で、アルテミシニン・アニュア(Artemisinin annua)由来のファルネセンシンターゼの６コピーを含有した。株はまた、ＧＡＬ８０遺伝子及びＧＡＬ４ｏｃプロモーター下でのＧＡＬ４の追加的コピーの欠失を有し、ここで出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)のＧＡＬ４遺伝子のコード配列は、その天然プロモーターの「オペラティブコンスティテューティブ(operative constitutive)」バージョン（ＰＧＡＬ４ｏｃ；例えば、Griggs & Johnston (1991) PNAS 88(19):8597-8601を参照）の調節的制御下にある。最後に、スクアレンシンターゼをコードするＥＲＧ９遺伝子が、天然プロモーターを酵母遺伝子ＭＥＴ３のプロモーターと置換することにより下方制御される(Westfall et al PNAS 2012)。
【０１９５】
実施例２．レバウジオシドＡ（ＲｅｂＡ）に対する高フラックスが可能な基本酵母株の作製
[00203]  図１Ｂは、ＦＰＰからステビオールにかけての例示的な生合成経路を示す。図２は、ステビオールからグリコシドＲｅｂＭにかけての例示的な生合成経路を示す。上記のファルネセン基本株をＣ−２０イソプレノイドカウレンに対する高フラックスを有するように変換するため、ゲラニルゲラニルピロリン酸シンターゼ（ＧＧＰＰｓ）の６コピー、その後、コパリル二リン酸シンターゼ及びカウレンシンターゼ各々の４コピーをゲノムに組み込んだ。表１は、ＦＰＰをＲｅｂＡに変換するために用いたすべての遺伝子及びプロモーターを列挙する。このポイントで、ファルネセンシンターゼの６コピーを株から除去した。一旦新しい株がｅｎｔ−カウレンを作製することが確認されると、ｅｎｔ−カウレンをＲｅｂＡに変換するための残存する遺伝子をゲノムに挿入した。２コピーを有したＳｒ．ＫＡＨ酵素以外、各遺伝子に単一コピーを組み込んだ（表１）。表１に記載のすべての遺伝子を含有する株は、主にＲｅｂＡを生成した。酵素ＵＧＴ９１Ｄ＿ｌｉｋｅ３は、ＲｅｂＡをレバウジオシドＤ（ＲｅｂＤ）に変換するのにやや低い活性を有する。我々は、９１Ｄ＿ｌｉｋｅ３の単一コピーが、株中のＲｅｂＡの約（３％）を上記の酵母株中のＲｅｂＤにインビボで変換できることを評価した（図３及び表２）。次に、ＵＧＴ７６Ｇ１は、ＲｅｂＤを最終生成物レバウジオシドＭ（ＲｅｂＭ）に変換しうる。
【０１９６】
実施例３．カウレンをカウレン酸により高い効率で変換するカウレンオキシダーゼ（ＫＯ）酵素のスクリーニング
[00204]  ＲｅｂＭに対する高フラックスを伴う株を作製するため、実施例２に記載の株を、ＧＡＬ１プロモーター下、（実施例８、並びに本明細書中の付録として貼付されるＰＣＴ出願ＡＭ−７４００ＰＣＴ中の表及び図に記載の通り）遺伝子ＵＧＴ４００８７の単一コピーで形質転換した。この株は、主にＲｅｂＭを生成する。異なるＫＯ対立遺伝子をカウレンのカウレン酸へのインビボでの変換についてスクリーニングするため、このＲｅｂＭ株中のステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)ＫＯ遺伝子を除去し、専らＧＡＬ１プロモーター及びターミネーターを、プロモーターとターミネーターとの間のＦ−ＣｐｈＩ制限配列とともに有するランディングパッドと置換した（図３）。このスクリーニング株は、ここで任意のＫＯ酵素が欠如し、専らｅｎｔ−カウレンを作る。
【０１９７】
[00205]  文献から得られる１３のＫＯ酵素（表１）を、出芽酵母(S. cerevisiae)における最適な発現についてコドン最適化し、ＰＧＡＬ１に対して相同な６０ｂｐの配列及び図３Ａ中に記載のランディングパッド中のＦ−ＣｐｈＩ配列に隣接する酵母ターミネーターを用いて合成した。合成した各ＫＯ遺伝子を、単一コピーとともに、上記の酵母株においてｅｎｔ−カウレンをカウレン酸にインビボで変換する能力について個別に試験した。酵母を、ＫＯドナーＤＮＡ及びランディングパッド中のＤＮＡを切断するためのエンドヌクレアーゼＦ−ＣｐｈＩを含有するプラスミドを用いて形質転換した。各形質変換における特異的なＫＯ遺伝子に対して内側のリバースプライマー及びＧＡＬ１プロモーターの末端部のユニバーサルフォワードプライマーを用いるコロニーＰＣＲにより、正確な組込みを検証した。図３Ｂは、正確なＦ−ＣｐｈＩ切断及びＫＯ  ＤＮＡとの相同組換え後の最終遺伝子構築物を示す。
【０１９８】
【表２】
2020533954.tif 000008
【０１９９】
[00206]  図４は、ＫＯスクリーンの結果を示す。植物エンドウ(Pisum sativum)（エンドウ）由来の１つのＫＯ酵素（Ｐｓ．ＫＯ）は、この株バックグラウンド中のステビア・レバウディアナ(Stevia rebaudiana)全体からのＫＯ酵素（Ｓｒ．ＫＯ）と比べて、ｅｎｔ−カウレンをカウレン酸に変換するのに増強された（約３．５倍改善された）能力を有することが見出された。酵母細胞内での発現に用いられるエンドウ(Pisum sativum)ＫＯ酵素のコドン最適化された核酸配列を配列番号１５で示す。
【０２００】
実施例４．ｅｎｔ−カウレンからカウレン酸への改善された変換を有する高フラックスＲｅｂＭ株の作製
[00207]  次に、ＲｅｂＭに対して非常に高いフラックスを有する株において、Ｐｓ．ＫＯの活性をＳｒ．ＫＯに対して試験した。ＫＯ酵素は、通常、大部分の植物において、植物ホルモンのジベレリンを生成するように作用する。植物細胞内のジベレリンのレベルは、工業生産における酵母において生成されるＲｅｂＭのレベルよりも数桁低く、それ故、ＫＯ酵素は、商業的生産においてＲｅｂＭを生成するのに要求される高フラックスを有することが期待されない。表３は、ＫＯ酵素を最初にスクリーニングするのに用いた株（即ち、ＫＯ「基本株」）よりも高いＲｅｂＭフラックスを有する株中に含まれるすべての遺伝子及びプロモーターを列挙する。表３中のすべての遺伝子を酵母ゲノムに挿入した。ＫＯ酵素は、その後の３回の酸化を通じてｅｎｔ−カウレンを用い、カウレン酸を生成する。反応物及び中間体の順序は、以下の通りである。第１の酸化により、ｅｎｔ−カウレンがカウレノール（Ｋ−ＯＬ）になり、第２の酸化により、カウレノールがカウレナール（Ｋ−ＡＬ）になり、そして第３の酸化により、カウレナールがカウレン酸（−ａｃｉｄ）になる（図１Ｃ）。ｅｎｔ−カウレンからＲｅｂＭにかけて最大フラックスを達成するには、ＫＯ酵素は、Ｋ−ａｃｉｄにかけてｅｎｔ−カウレンを完全に酸化する必要がある。不完全な変換は、炭素を消費し、全ＲｅｂＭ力価を低減し、そして潜在的に有毒な中間体化合物を生成することになる。図５中のデータは、ＲｅｂＭにかけての高い炭素フラックスを有する株中で、Ｓｒ．ＫＯ対立遺伝子が上流中間体のｅｎｔ−カウレン、カウレノール（Ｋ−ＯＬ）、カウレナール（Ｋ−ＡＬ）を有意な量で蓄積させる一方で、Ｐｓ．ＫＯ酵素がこれら中間体の有意に低下した蓄積を示すことを示す。
【０２０１】
[00208]  図６は、カウレン酸がＰｓ．ＫＯによりＳｒ．ＫＯと比べてより多量に生成されることに起因し、Ｐｓ．ＫＯが細胞内で作製されるＲｅｂＭの量を増加させることを示す。高フラックスＲｅｂＭ株においては、Ｐｓ．ＫＯを有する株中でのＲｅｂＭ力価が、Ｓｒ．ＫＯを有する同一株と比べて１６％増加する。このより高いＲｅｂＭ力価は、Ｐｓ．ＫＯ株においてより多くのカウレン酸が生成されることに起因する。
【０２０２】
実施例５．酵母培養・条件
[00209]  想定されるカウレンオキシダーゼ遺伝子を含有することが確認された酵母コロニーを、２０ｇ／Ｌのスクロース及び３７．５ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを有するバードシード培地（ＢＳＭ、van Hoek et al., Biotechnology and Bioengineering 68(5), 2000, pp. 517-523により最初に記載された）を含む９６ウェルマイクロタイタープレートに採取した。細胞を、３０℃、高性能マイクロタイタープレートインキュベーター内で、１０００ＲＰＭ及び８０％湿度で振盪しながら３日間、培養物が炭素消耗に至るまで培養した。増殖飽和した培養物を、飽和培養物から１４．４μＬを採取し、新しい培地３６０μＬに希釈することにより、４０ｇ／Ｌのスクロース及び１５０ｇ／Ｌの硫酸アンモニウムを有するＢＳＭを含む新しいプレートに継代した。生成培地中の細胞を、３０℃、高性能マイクロタイタープレート振盪器内で、１０００ＲＰＭ及び８０％湿度で、抽出及び分析前にさらに３日間培養した。完了時、全細胞ブロスを１００％エタノール３６０μＬで希釈し、ホイルシールで密封し、１２５０ｒｐｍで３０分間振盪し、レバウジオシドを抽出する。４９０μＬの５０：５０のエタノール：水を新しい１．１ｍＬのアッセイプレートに添加し、１０ｕＬの培養物／エタノール混合物をアッセイプレートに添加する。混合物を遠心分離し、任意の固体をペレット化し、溶液４００μＬを新しい１．１ｍＬのプレートに移し、ＬＣ−ＭＳによってアッセイする。
【０２０３】
実施例６．分析法
ステビオール及びステビオールグリコシドの質量分析計による検出：
[00210]  試料を、以下の勾配を用いて、Sigma Ascentis Express Peptide ES-C18（５ｃｍ、２．１ｍｍ、２．７μｍ；パート番号５３３０１−Ｕ）を用いるＬＣ−ＭＳ質量分析計（AB QTrap 4000）により分析する。
【０２０４】
【表３】
2020533954.tif 000009
【０２０５】
[00211]  質量分析計は、負イオン多重反応モニタリングモードで作動させた。各レバウジオシド異性体を、確証的な標準から判定した保持時間、及びＭＲＭ移行により同定した。
【０２０６】
【表４】
2020533954.tif 000010
【０２０７】
カウレンの定量化
[00212]  培養ブロス中でのｅｎｔ−カウレンの力価を、制限されたサーマルマスオーブン及び炎光イオン化検出器を備えたガスクロマトグラフを用いて測定する。ブロスサンプルを、同比率のブロス及びメタノールを用いて抽出し、密封容器内で３０分間振盪し、細胞からｅｎｔ−カウレンを回収する。次に、ブロス：メタノール溶液の一定分量２４０ｕＬを酢酸エチル１ｍＬで希釈し、密封し、さらに３０分間振盪し、ｅｎｔ−カウレンを有機相に抽出する。有機相を、アッセイの線形範囲内に収まるように適宜希釈し、サンプルバイアルにアリコートする。サンプルを、線形範囲内に収まるように適切な分割比で注射する。（１）初期温度１５０℃、０分間、（２）２５℃／分の温度上昇により温度を２３０℃に、（３）１８００℃／分の温度上昇により温度を３２０℃にして１分間保持、という温度勾配を用いて、一定圧力モードでキャリアガスとして水素を用いる、Agilent DB-1MS LTM IIカラムでサンプル分離を行う。確証的なｅｎｔ−カウレン標準を用いる外部較正を用いて、ｅｎｔ−カウレン量を判定する。
【０２０８】
カウレン酸、カウレノール、及びカウレナールの定量化：
[00213]  培養ブロス中でのカウレン酸、カウレノール、及びカウレナールの力価を、可変波長検出器を備えた高圧液体クロマトグラフを用いて測定する。ブロスサンプル（１００μＬ）をエタノール３００μＬに希釈し、密封容器内で３０分間振盪する。水２００μＬをブロス：エタノール混合物に添加し、混合し、遠心分離する。（細胞ペレットを回避している）得られた溶液の一定分量をサンプルバイアルに移し、ＨＰＬＣを用いて分析する。以下の溶媒：
・移動相Ａ：水中０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）
・移動相Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸（ｖ／ｖ）
を用いて、以下の溶媒勾配を用いて、Aglient Eclipse Plus C18 USP L1（４．６ｍｍ×５０ｍｍ×１．８μｍ）でサンプル分離を行う。分析物を、２００ｎｍでのＵＶ吸光度を用いて検出し、ステビオール標準に対する相対的応答因子を伴う外部較正を用いて定量化する。
【０２０９】
【表５】
2020533954.tif 000011
【０２１０】
図６中に示されるデータにおいて用いられるレバウジオシドＭの定量化方法
[00214]  ブロス中でのレバウジオシドＭの力価を、三連四重極型質量分析計を備えた高圧液体クロマトグラフを用いて測定する。ブロスサンプルを、５０：５０のエタノール：水で２００倍〜８００倍の間に希釈したエッペンドルフチューブにアリコートし、２０分間混合し、遠心分離し、細胞及びデブリをペレット化し、上清の一定分量をサンプルバイアルに移し、分析にかける。サンプルは、分析物がＭＲＭ移行のシグナル強度に基づいて定量化される場合のフローインジェクションモードで流す。移動相は、１．１ｍＬ／分の流速で、４０％水＋０．１％ギ酸及び６０％アセトニトリル＋０．１％ギ酸である。レバウジオシドＭの濃度は、その応答の内部標準（レバウジオシドＮ）の場合への正規化により判定する。
【０２１１】
【表６】
2020533954.tif 000012
【０２１２】
【表７】
2020533954.tif 000013
【０２１３】
[00215]  本明細書中に引用されるすべての出版物、特許及び特許出願は、あたかも各個別の出版物又は特許出願が参照により援用されることが具体的且つ個別に示されたように、参照により本明細書中に援用される。前述の発明が、理解を明確にする目的で図面及び実施例によりある程度詳述されているが、本発明の教示内容に照らして、特定の変更及び修飾が、それらに対して、貼付の特許請求の範囲の精神又は範囲から逸脱することなく設けられてよいことは、当業者に容易に理解されるであろう。
【０２１４】
配列表
配列番号１
【化５】
2020533954.tif 000014
配列番号２
【化６】
2020533954.tif 000015
配列番号３
【化７】
2020533954.tif 000016
配列番号４
【化８】
2020533954.tif 000017
配列番号５
【化９】
2020533954.tif 000018
配列番号６
【化１０】
2020533954.tif 000019
配列番号７
【化１１】
2020533954.tif 000020
配列番号８
【化１２】
2020533954.tif 000021
配列番号９
【化１３】
2020533954.tif 000022
配列番号１０
【化１４】
2020533954.tif 000023
配列番号１１
【化１５】
2020533954.tif 000024
配列番号１２
【化１６】
2020533954.tif 000025
配列番号１３
【化１７】
2020533954.tif 000026
配列番号１４  ＡＹ２４５４４２．１  ｅｎｔ−カウレンオキシダーゼｍＲＮＡ［エンドウ(Pisum sativum)］
【化１８】
2020533954.tif 000027
配列番号１５
【化１９】
2020533954.tif 000028
配列番号１６（ｓｒ．ＵＧＴ＿ｇ２５２７７８）
【化２０】
2020533954.tif 000029
配列番号１７（ＵＧＴ４００８７バージョン１）
【化２１】
2020533954.tif 000030
配列番号１８（ＵＧＴ４００８７バージョン２）
【化２２】
2020533954.tif 000031
配列番号１９（Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１からのループ２）
ＥＧＬＰＤＧＡＥＳＴＮＤＶＰＨＤＲＰＤＭＶ
配列番号２０（Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１からのループ３＿１）
ＳＥＦＬＧＴＡＣＡＤ
配列番号２１（Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１からのループ３＿２）
ＳＥＦＬＧＴＡＣＡＤＷＶＩＶＤＶＦＨＨ
配列番号２２（Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１からのループ４＿１）
ＡＤＲＲＬＥＲＡＥＴＥＳＰＡＡＡＧＱＧＲＰＡＡＡＰＴＦＥＶＡＲＭＫＬＩＲＴＫＧＳＳＧＭ
配列番号２３（Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１からのループ４＿２）
ＭＭＬＬＧＳＡＨＭＩＡＳＩＡＤＲＲＬＥＲＡＥＴＥＳＰＡＡＡＧＱＧＲＰＡＡＡＰＴＦＥＶＡＲＭＫＬＩＲＴＫＧＳＳＧＭ
配列番号２４（ＵＧＴ４００８７からのループ２）
ＤＧＬＰＤＧＡＥＡＴＳＤＩＰＰＧＫＴ
配列番号２５（ＵＧＴ４００８７からのループ３＿１）
ＡＡＦＬＤＡＡＣＡＤＧＳＴＮＫＶＤ
配列番号２６（ＵＧＴ４００８７からのループ３＿２）
ＡＡＦＬＤＡＡＣＡＤＧＳＴＮＫＶＤＷＬＦＬＤＮＦＱＹ
配列番号２７（ＵＧＴ４００８７からのループ４＿１）
ＧＶＰＲＶＥＰＰＶＤＧＳＴＡ
配列番号２８（ＵＧＴ４００８７からのループ４＿２）
ＬＮＬＴＦＡＡＳＴＳＡＥＹＧＶＰＲＶＥＰＰＶＤＧＳＴＡ
配列番号２９（ＵＧＴ４００８７＿ループ１中に存在するＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１からの修飾ループ１）
ＴＰＲＮＩＳＲＬＰＰＶＰＰＡＬＡＰ
配列番号３０（Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１＿ループ１中に存在するＵＧＴ４００８７からの修飾ループ１）
ＴＰＲＮＩＳＲＬＲＰＶＲＰＡＬＡＰ
配列番号３１（配列番号８を有するＯｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１からのループ１）
ＴＰＲＮＩＳＲＬＰＰＶＲＰＡＬＡＰ
配列番号３２（配列番号１１を有するＵＧＴ４００８７からのループ１）
ＴＰＲＮＩＳＲＬＲＰＶＰＰＡＬＡＰ
配列番号３３（ＵＧＴ４００８７／Ｓｉ９１Ｄｌｉｋｅキメラ）
【化２３】
2020533954.tif 000032
配列番号３４（Ｏｓ＿ＵＧＴ＿９１Ｃ１＿ループ４＿１）
【化２４】
2020533954.tif 000033
配列番号３５（配列番号１７を有するＵＧＴ４００８７の非最適化核酸配列）
【化２５】
2020533954.tif 000034
配列番号３６（ＵＧＴ４００８７−１のコドン最適化核酸配列）
【化２６】
2020533954.tif 000035
【図１Ｄ】
2020533954.tif 000036
【図２】
2020533954.tif 000037
【図３】
2020533954.tif 000038
【図４】
2020533954.tif 000039
【図５】
2020533954.tif 000040
【図６】
2020533954.tif 000041
【配列表】
2020533954000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月31日(2020.3.31)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１７】
５．図面の簡単な説明
【図１Ａ】[0017]ファルネシルピロリン酸からステビオールへの変換の略図を提供する。
【図１Ｂ】[0018]ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）からＲｅｂＭへの変換の略図を提供する。
【図１Ｃ】[0019]ｅｎｔ−カウレン〜カウレノール〜カウレナール〜カウレン酸への変換の略図を提供する。
【図１Ｄ】[0020]メバロン酸経路の模式図を提供する。
【図２−１】[0021]ステビオールからＲｅｂＭへの例示的経路を提供する。
【図２−２】[0021]ステビオールからＲｅｂＭへの例示的経路を提供する。
【図２−３】[0021]ステビオールからＲｅｂＭへの例示的経路を提供する。
【図３Ａ】[0022]酵母におけるカウレン酸生成についてスクリーニングするため、個別のＫＯ酵素を挿入するために用いられる「ランディングパッド」設計の模式図を提供する。
【図３Ｂ】[0023]酵母におけるカウレン酸生成変換についてスクリーニングするためのＫＯ遺伝子構築物の模式図を提供する。
【図４】[0024]異なるカウレンオキシダーゼを用いてインビボで生成されたカウレン酸の相対的増加を図示するチャートを提供する。
【図５】[0025]ＲｅｂＭに対する高フラックスを有する酵母株においてインビボで生成されたカウレン酸の総量に対して正規化された、ｅｎｔ−カウレン、カウレノール、及びカウレナールの相対的レベルを図示する棒グラフを提供する。
【図６】[0026]Ｓｒ．ＫＯ又はＰｓ．ＫＯのいずれかを含有する高フラックスの株におけるＲｅｂＭ力価の相対的レベルを図示するチャートを提供する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ａ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１Ａ】
2020533954.tif 000042
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｂ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１Ｂ】
2020533954.tif 000043
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｃ
【補正方法】追加
【補正の内容】
【図１Ｃ】
2020533954.tif 000044
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１Ｄ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１Ｄ】
2020533954.tif 000045
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２−１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２−１】
2020533954.tif 000046
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２−２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２−２】
2020533954.tif 000047
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２−３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２−３】
2020533954.tif 000048
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2020533954.tif 000049
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2020533954.tif 000050
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図５】
2020533954.tif 000051
【手続補正１２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図６】
2020533954.tif 000052
【国際調査報告】
2020533954.tif 000053
2020533954.tif 000054
2020533954.tif 000055