(57)【要約】  本開示は、細胞内への進入を促進するためにＧＬＡドメインを利用した、分子の細胞内送達法に関する。【選択図】  図１Ｅ
2020533404.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内ペイロード送達法であって、
ａ）γカルボキシグルタミン酸成分（ＧＬＡ成分）に連結されたペイロード、
を含む分子と細胞を接触させる工程を含み、
前記ＧＬＡ成分はＧＬＡドメインまたはその活性断片を含むが、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインは含まない、
前記方法。
【請求項２】
ＧＬＡドメインまたはその活性断片が、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧＬＡタンパク質、ＧＡＳ６、トランスサイレチン（Transthretin）、ペリオスチン、プロリンリッチＧＬＡ１、プロリンリッチＧＬＡ２、プロリンリッチＧＬＡ３、およびプロリンリッチＧＬＡ４から独立して選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＧＬＡドメインまたはその活性断片がプロテインＳ由来である、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記構築物が、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧＬＡタンパク質、ＧＡＳ６、トランスサイレチン（Transthretin）、ペリオスチン、プロリンリッチＧＬＡ１、プロリンリッチＧＬＡ２、プロリンリッチＧＬＡ３、およびプロリンリッチＧＬＡ４から選択されるＥＧＦドメインを含む、請求項１〜３のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記構築物がプロテインＳから選択されるＥＧＦドメインを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＧＬＡ成分が、配列番号６に示される配列またはＨｉｓタグを持たないその誘導体を含む、請求項１〜５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＧＬＡドメイン成分がクリングルドメインをさらに含む、第１項〜第６項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記クリングルドメインが、活性化転写因子２（ＡＴＦ）；第ＸＩＩ因子（Ｆ１２）；トロンビン（Ｆ２）；ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；肝細胞増殖因子アクチベーター（ＨＧＦＡＣ）；Ｋｒｅｍｅｎタンパク質１（ＫＲＥＭＥＮ１）；ＫＲＥＭＥＮ２；リポ蛋白（ａ）（ＬＰＡ）；ＬＰＡＬ２；マクロファージ活性化タンパク質（Macrophage-stimulating protein）（ＭＳＰまたはＭＳＴ１）；ホスホイノシチド３キナーゼ相互作用タンパク質１（Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1）（ＰＩＫ３ＩＰ１）；組織プラスミノーゲン活性化物質（Tissue plasminogen activator）（ＰＬＡＴ）；ウロキナーゼ（ＰＬＡＵ）；プラスミン（ＰＬＧ）；ＰＲＳＳ１２；膜貫通受容体型チロシンキナーゼＲＯＲ１（Tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1）（ＲＯＲ１）；および膜貫通受容体型チロシンキナーゼＲＯＲ２（Tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR2）（ＲＯＲ２）を含む群から選択されるタンパク質由来である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
インビトロで実施される、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞内送達がインビボの細胞に対するものであり、例えば前記ＧＬＡ成分とペイロードとを含む分子が患者に投与される、請求項１〜８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が非アポトーシス性である、請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞がアポトーシス性であり、例えば、がん細胞、病原体感染細胞（ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、または寄生虫感染細胞など）のような異常細胞である、請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が幹細胞であり、係る成体幹細胞は前駆細胞を含む、請求項１〜１２のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞が表面マーカーＣＤ３４を有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞ががん幹細胞である、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞が造血幹細胞（haemotopoietic stem cell）である、請求項１３〜１５のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記造血幹細胞（haemotopoietic stem cell）が非がん性である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＧＬＡ成分が前記ペイロードと複合体形成している、請求項１〜１７のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ペイロードが薬剤または生物学的治療薬を含み、例えば、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗寄生虫剤、抗がん剤、抗がん剤治療（化学療法剤など）を含む、請求項１〜１８のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペイロードが、毒素、高分子（例えば、合成高分子または天然高分子）、生物学的に活性なタンパク質（例えば酵素、他の抗体または抗体フラグメント）、薬剤（小分子（化学成分）、化学療法剤）、放射性核種（特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、例えば９９ｍＴｃ）、金属キレート化剤、ナノ粒子、およびレポーター基（蛍光標識もしくは発光標識、またはＮＭＲ分光法もしくはＥＳＲ分光法で検出できる化合物など）を含む、請求項１〜１９のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＧＬＡ成分とペイロードとを含む分子をがん患者に投与することを含む、請求項１〜３０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記がんが上皮がんであり、例えば、結腸直腸がん、精巣がん、肝臓がん、胆道がん、前立腺がん、膵がん、グリア芽腫、メラノーマ、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、胃がん、食道がん、甲状腺がん、腎がん、膀胱がん、脳がん、頭頚部がん、もしくは肺がんである、または、前記がんが血液のがんであり、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、および慢性骨髄増殖性疾患であり、例えばＡＭＬであり得る、請求項３１に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、または抗菌剤である、請求項１９〜３２のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤が抗ウイルス剤である、請求項３３〜３７のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗寄生虫剤が、抗マラリア剤（キニーネおよび関連物質、クロロキン（choloroquine）、アモジアキン、ピリメタミン、プログアニル、スルホンアミド類、メフロキン、アトバコン、プリマキン、アルテミシニン（aremisinin）およびその誘導体、ハロファントリン、ドキシサイクリン、クリンダマイシンなど）、スルファジアジン、チニダゾール、パロモマイシン（アメーバ症、ジアルジア症、レーシュマニア症、および条虫をはじめとする治療に用いられ得る）、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、請求項１９〜４０のうちのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ペイロードが前記細胞の内部で活性型に変換される、請求項１〜４２のうちのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、細胞内への進入を促進するためにＧＬＡドメインを利用した、分子の細胞内送達法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＧＬＡドメインは、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ（ＰｒＳ）、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧＬＡタンパク質、ＧＡＳ６、トランスサイレチン（Transthretin）、ペリオスチン、プロリンリッチＧＬＡ１、プロリンリッチＧＬＡ２、プロリンリッチＧＬＡ３、およびプロリンリッチＧＬＡ４などの多くのＧＬＡタンパク質に含まれている。
【０００３】
いわゆるＧＬＡタンパク質のＧＬＡドメインは、がん細胞や病原体感染細胞のような、アポトーシス細胞の表面上のホスファチジルセリン（ＰｔｄＳ、別名ＰＳ）と結合することができる。この触媒ドメインを除いた、ホスファチジルセリンと特異的に結合する分子が、国際公開第２０１４／１５１５３５号および同第２０１４／１５１６８３号（参照によって本明細書に援用される）で開示されている。
【０００４】
ＧＬＡドメイン（ビタミンＫ依存性カルボキシル化／γカルボキシグルタミン酸ドメイン）は、アミノ配列（amino sequence）中のグルタミン酸残基がビタミンＫ依存性翻訳後カルボキシル化によって修飾されてγカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）となった、タンパク質ドメインである。
【０００５】
前記ＧＬＡドメインは、２つのカルボン酸残基の間でカルシウムイオンのキレート化によってカルシウムイオンと結合する。これらの残基が、成熟型Ｇｌａタンパク質のＮ末端の端から始まり、保存された芳香族残基で終わる、領域の一部となる。この結果、保存されたＧｌａ−ｘ（３）−Ｇｌａ−ｘ−Ｃｙｓモチーフが、前記ドメインの中央に存在することとなり、これが、カルボキシラーゼによる基質認識に重要と考えられる。
【０００６】
アネキシンＶも、ホスファチジルセリンと結合し、細胞内に内部移行されると考えられている。これは、アネキシンＶの三量体構造が細胞膜を変形させて、新規の細胞侵入門を開けるためである。例えば、Kenis et al The Journal of Biological Chemistry Vol 279, No. 50, Issue of December 10, pp. 52623-52629, 2004を参照されたい。興味深いことに、アネキシンＶの単量体変異体は細胞内に侵入しない。しかし、驚くべきことに、本発明者らによって、ＧＬＡドメインを含む特定の構築物を用いることで、本開示の分子が単量体である場合であっても、迅速に分子を、比較的大型の分子であっても、細胞内に輸送できることが確認された。
【０００７】
本開示の分子はアネキシンＶと同様の結合をしない。本発明者らは、本ＧＬＡ成分がアネキシンＶと同じ結合特性を有していないことを示唆する証拠を有している。すなわち、ホスファチジルセリンのターゲティングには微妙な差異がある。
【０００８】
これは、既知および既存の薬剤およびエフェクター／レポーター分子をより効果的に送達することができ、例えば、有効性を増加させ、および／またはオフターゲットな作用を減少させることができるため、治療用途および／または診断用途に重要な意味を持つ。
【０００９】
さらに、治療薬は、細胞内でのみ活性化される「プロ」形態で提供される場合があり、これは、治療濃度域を増大させ、例えば、より大きな用量を送達することを可能にし、および／またはオフターゲット効果をさらに減少させ得る。
【００１０】
さらに、細胞内病原体、例えばウイルス、細菌（結核など）および寄生虫（プラスモディウムなど）を、以前に可能であったよりも効果的に標的にできる。細胞内病原体は、一度細胞内に入ると細胞の防御機構によって保護されるため、効果的な治療が従来から非常に困難であった。
【００１１】
さらに、本開示の方法は、細胞内標的を標識し、それにアクセスし、および／またはそれをモニターすることを可能にする。
【００１２】
さらに、がん細胞に「選択的」ながん治療の細胞内送達は、がん細胞に深刻なストレスを与え、例えばアポトーシスまたは壊死を介して細胞死を強制する可能性がある。がん細胞のストレスとなる物理的な内部攻撃に対してがん細胞が耐性を持つことは困難である。従って、本開示の技術は、がんの治療にプラスの影響を与える可能性がある。
【発明の概要】
【００１３】
以下、本開示を下記項目に要約する：
１ａ．
細胞内ペイロード送達法であって、
γカルボキシグルタミン酸成分（ＧＬＡ成分）に連結されたペイロードを含む分子と細胞を接触させる工程を含み、
前記ＧＬＡ成分はＧＬＡドメインまたはその活性断片を含むが、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインは含まない、
前記方法。
１ｂ．
γカルボキシグルタミン酸成分（ＧＬＡ成分）に連結されたペイロードを含む分子であって、
前記ＧＬＡ成分はＧＬＡドメインまたはその活性断片を含むが、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインは含まない、
細胞内治療および／または細胞内診断で使用される前記分子。
１ｃ．
γカルボキシグルタミン酸成分（ＧＬＡ成分）に連結されたペイロードを含む分子であって、
前記ＧＬＡ成分はＧＬＡドメインまたはその活性断片を含むが、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインは含まない、
細胞内治療用且つ／または細胞内診断用の医薬の製造で使用される前記分子。
２．
ＧＬＡドメインまたはその活性断片が、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧＬＡタンパク質、ＧＡＳ６、トランスサイレチン（Transthretin）、ペリオスチン、プロリンリッチＧＬＡ１、プロリンリッチＧＬＡ２、プロリンリッチＧＬＡ３、およびプロリンリッチＧＬＡ４から独立して選択される、第１ａ項、第１ｂ項、または第１ｃ項に記載の方法またはその用途の分子。
３．
ＧＬＡドメインまたはその活性断片が、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、およびＧＡＳ６、例えばプロテインＳ、から独立して選択され、特に配列番号１に示される配列を含む、第２項に記載の方法またはその用途の分子。
４．
前記ＧＬＡ成分がＥＧＦドメイン、例えばカルシウム結合ＥＧＦドメイン、をさらに含む、第１ａ項、第１ｂ項、または第１ｃ項〜第３項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
５．
前記ＥＧＦドメインが、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、オステオカルシン、マトリックスＧＬＡタンパク質、ＧＡＳ６、トランスサイレチン（Transthretin）、ペリオスチン、プロリンリッチＧＬＡ１、プロリンリッチＧＬＡ２、プロリンリッチＧＬＡ３、およびプロリンリッチＧＬＡ４から選択される、第４項に記載の方法またはその用途の分子。
６．
前記ＥＧＦドメインが、トロンビン、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子、プロテインＣ、プロテインＳ、プロテインＺ、およびＧＡＳ６、例えばプロテインＳ、から選択される、第５項に記載の方法またはその用途の分子。
７．
前記ＧＬＡ成分が、配列番号６に示される配列またはＨｉｓタグを持たないその誘導体、特に配列番号６、を含む、第１ａ項、第１ｂ項、または第１ｃ項〜第６項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
８．
前記ＧＬＡドメイン成分がクリングルドメインをさらに含む、第１ａ項、第１ｂ項、または第１ｃ項〜第７項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
９．
前記クリングルドメインが、活性化転写因子２（ＡＴＦ）；第ＸＩＩ因子（Ｆ１２）；トロンビン（Ｆ２）；ヒアルロナン結合タンパク質２（ＨＡＢＰ２）；肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）；肝細胞増殖因子アクチベーター（ＨＧＦＡＣ）；Ｋｒｅｍｅｎタンパク質１（ＫＲＥＭＥＮ１）；ＫＲＥＭＥＮ２；リポ蛋白（ａ）（ＬＰＡ）；ＬＰＡＬ２；マクロファージ活性化タンパク質（Macrophage-stimulating protein）（ＭＳＰまたはＭＳＴ１）；ホスホイノシチド３キナーゼ相互作用タンパク質１（Phosphoinositide-3-kinase-interacting protein 1）（ＰＩＫ３ＩＰ１）；組織プラスミノーゲン活性化物質（Tissue plasminogen activator）（ＰＬＡＴ）；ウロキナーゼ（ＰＬＡＵ）；プラスミン（ＰＬＧ）；ＰＲＳＳ１２；膜貫通受容体型チロシンキナーゼＲＯＲ１（Tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR1）（ＲＯＲ１）；および膜貫通受容体型チロシンキナーゼＲＯＲ２（Tyrosine-protein kinase transmembrane receptor ROR2）（ＲＯＲ２）を含む群から選択されるタンパク質由来である、第８項に記載の方法またはその用途の分子。
１０．
インビトロで実施される、第１ａ項、第１ｂ項、または第１ｃ項〜第９項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
１１．
前記細胞内送達がインビボの細胞に対するものであり、例えば前記ＧＬＡ成分とペイロードとを含む分子が患者に投与される、第１項〜第９項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
１２．
前記細胞が非アポトーシス性である、第１ａ項、第１ｂ項、第１ｃ項〜第１１項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
１３．
前記細胞がアポトーシス性であり、例えば、がん細胞、病原体感染細胞（ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、または寄生虫感染細胞など）のような異常細胞（diseases cell）である、第１ａ項、第１ｂ項、第１ｃ項〜第１１項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
１４．
前記細胞が幹細胞であり、そのような成体幹細胞としては前駆細胞が挙げられる、第１ａ項、第１ｂ項、または第１ｃ項〜第１３項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
１５．
前記幹細胞が表面マーカーＣＤ３４を有する、第１４項に記載の方法またはその用途の分子。
１６．
前記幹細胞ががん幹細胞である、第１４項または第１５項に記載の方法またはその用途の分子。
１７．
前記幹細胞が造血（haemotopoietic）幹細胞、例えば造血（haemotopoietic）がん幹細胞、である、第１４項〜第１６項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
１８．
前記造血幹細胞が非がん性である、第１７項に記載の方法またはその用途の分子。
１９．
前記ＧＬＡ成分がペイロードと複合体形成している、第１ａ項、第１ｂ項、または第１ｃ項〜第１８項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
２０．
前記ペイロードが、薬剤または生物学的治療薬、例えば、抗ウイルス剤、抗細菌剤、抗寄生虫剤、抗がん剤、抗がん剤治療または化学療法剤、ウイルスまたはウイルスベクター（腫瘍溶解性ウイルスなど）を含む、第１ａ項、第１ｂ項、または第１ｃ項〜第１９項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
２１．
前記ペイロードが、毒素、高分子（例えば、合成高分子または天然高分子）、生物学的に活性なタンパク質（例えば酵素、他の抗体または抗体フラグメント）、薬剤（小分子（化学成分））、化学療法剤、放射性核種（特に放射性ヨウ化物、放射性同位元素、例えば９９ｍＴｃ）、金属キレート化剤、ナノ粒子、およびレポーター基（蛍光標識もしくは発光標識、またはＮＭＲ分光法もしくはＥＳＲ分光法で検出できる化合物など）を含むから選択される、第１ａ項、第１ｂ項、または第１ｃ項〜第２０項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
２２．
前記毒素が、アウリスタチン（例えば、ＭＭＡＥ（モノメチルアウリスタチンＥ）、ＭＭＡＦ（モノメチルアウリスタチンＦ））、ピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）、ドキソルビシン、デュオカルマイシン、メイタンシノイド（例えば、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ３）、およびＮ２’−デアセチル−Ｎ２’（４−メチル−４−メルカプト−１−オキソペンチル）−メイタンシン（ＤＭ４））、カリケアマイシン（calocheamicin）、ドラスタチン、メイタンシン、α−アマニチン、緑膿菌外毒素（ＰＥ３８）、リシンＡ鎖、ジフテリア毒素、ヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質（ＰＡＰ）、サポリン、ゲロニン、およびツブリシンから選択される、第２１項に記載の方法またはその用途の分子。
２３．
前記化学療法剤が、テモゾロミド、エポシロン類、メルファラン、カルムスチン、ブスルファン、ロムスチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、ポリフェプロサン、イホスファミド、クロラムブシル、メクロレタミン、ブスルファン、シクロホスファミド、カルボプラチン、シスプラチン、チオテパ、カペシタビン、ストレプトゾシン、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミド、酢酸ロイプロリド、塩酸ドキソルビシン、硫酸ブレオマイシン、塩酸ダウノルビシン、ダクチノマイシン、リポソーム化クエン酸ダウノルビシン、リポソーム化塩酸ドキソルビシン、塩酸エピルビシン、塩酸イダルビシン、マイトマイシン、ドキソルビシン、バルルビシン、アナストロゾール、クエン酸トレミフェン、シタラビン、フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、インターフェロンα−２ｂ、プリカマイシン、メルカプトプリン、メトトレキサート、インターフェロンα−２ａ、酢酸メドロキシプロゲステロン、リン酸エストラムスチンナトリウム、エストラジオール、酢酸ロイプロリド、酢酸メゲストロール、酢酸オクトレオチド、ジエチルスチルベストロール（deithylstilbestrol）二リン酸、テストラクトン、酢酸ゴセレリン、リン酸エトポシド、硫酸ビンクリスチン、エトポシド、ビンブラスチン、エトポシド、硫酸ビンクリスチン、テニポシド、トラスツズマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、リツキシマブ、エキセメスタン、塩酸イリノテカン（irinotecan hydrocholride）、アスパラギナーゼ、塩酸ゲムシタビン、アルトレタミン、塩酸トポテカン、ヒドロキシ尿素、クラドリビン、ミトタン、塩酸プロカルバジン、酒石酸ビノレルビン、ペントスタチンナトリウム（pentrostatin sodium）、ミトキサントロン、ペガスパルガーゼ、デニロイキンジフチトクス（denileukin diftitix）、アリトレチノイン（altretinoin）、ポルフィマー、ベキサロテン、パクリタキセル、ドセタキセル、三酸化ヒ素、トレチノイン、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、第２０項または第２１項に記載の方法またはその用途の分子。
２４．
前記化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤（チミジル酸合成酵素阻害剤を含む）、タキサン、アントラサイクリン、微小管阻害剤（植物性アルカロイドを含む）、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、第２０項〜第２３項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
２５．
前記化学療法剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、カバジタキセル（carbazitaxel）、これらのうちいずれか１つの誘導体、および上記のいずれかの２つ以上の組み合わせから選択される、第２４項に記載の方法またはその用途の分子。
２６．
前記アルキル化剤が、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素、テトラジン、アジリジン、プラチナ製剤およびその誘導体、非古典的アルキル化剤、並びにこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、第２４項または第２５項に記載の方法またはその用途の分子。
２７．
前記プラチナ製剤が、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン、リポプラチン、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、第２６項に記載の方法またはその用途の分子。
２８．
前記アルキル化（alkylating）が、葉酸代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサートおよびペメトレキセド）、プリン類似体（例えば、チオプリン類、例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオプリン、フルダラビン（リン酸エステル形態を含む）、ペントスタチン、およびクラドリビン）、ピリミジン類似体（例えば、フルオロピリミジン、例えば、５−フルオロウラシル、およびそのプロドラッグ、例えばカペシタビン［Ｘｅｌｏｄａ（登録商標）］）、フロクスウリジン、ゲムシタビン、シタラビン、デシタビン、ラルチトレキセド（トムデックス）塩酸塩、クラドリビン、および６−アザウラシル、並びにこれらの２つ以上の組み合わせから選択される代謝拮抗剤である、第２４項〜第２７項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
２９．
前記アントラサイクリンが、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ダウノルビシン（リポソーム化）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシン（リポソーム化）、エピルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択され、特にドキソルビシンである、第２３項〜第２８項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
３０．
前記薬剤が、例えば、トポイソメラーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、およびこれらの  以上の組み合わせから選択される抗がん剤である、第２０項〜第２９項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
３１．
前記抗がん剤治療が、例えば、Ｙ−９０、Ｐ−３２、Ｉ−１３１、Ｉｎ−１１１、Ｓｒ−８９、Ｒｅ−１８６、Ｓｍ−１５３、Ｓｎ−１１７ｍ、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される放射性核種である、第２０項〜第３０項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
３２．
前記ＧＬＡ成分とペイロードとを含む分子をがん患者に投与することを含む、第１ａ項、第１ｂ項、または第１ｃ項〜第３１項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
３３．
前記がんが上皮がんであり、例えば、結腸直腸がん、精巣がん、肝臓がん、胆道がん、グリア芽腫、メラノーマ、前立腺がん、膵がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、子宮がん、胃がん、食道がん、甲状腺がん、腎がん、膀胱がん、脳がん、頭頚部がん、もしくは肺がんである、または、前記がんが血液のがんであり、例えば、白血病、リンパ腫、骨髄腫、および慢性骨髄増殖性疾患であり、例えばＡＭＬ、ＡＬＬ、ＣＭＬ、およびＣＬＬであり得る、第３２項に記載の方法またはその用途の分子。
３４．
前記薬剤が抗ウイルス剤、抗寄生虫剤、または抗菌剤である、第２０項〜第３３項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
３５．
抗菌剤が、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネム類、ポリミキシン、リファマイシン、リピアルマイシン、キノロン、スルホンアミド、マクロライド、リンコマイシン、テトラサイクリン、アミノグリコシド、環状リポペプチド（ダプトマイシンなど）、グリシルサイクリン類（チゲサイクリンなど）、オキサゾリジノン類（リネゾリドなど）、およびリピアルマイシン類（フィダキソマイシンなど）から選択される、第３４項に記載の方法またはその用途の分子。
３６．
アシネトバクター（多剤耐性アシネトバクターを含む）、カンジダ（フルコナゾール耐性カンジダを含む）；カンピロバクター（カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）、およびこれらのうちのいずれか１つの薬剤耐性型；クラミジア（Clamidia）；ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）；クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）；シトロバクター；腸内細菌科（カルバペネム耐性腸内細菌科および広域スペクトル腸内細菌科（extended spectrum Enterobacteriaceae）を含み、特に、エンテロバクター、大腸菌（Escherichia coli）、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ（非チフスサルモネラおよびチフス菌、並びにこれらのうちいずれか１つの薬剤耐性型）、セラチア、赤痢菌（この薬剤耐性型を含む）、ペスト菌（Yersinia persitis））、エンテロコッカス（バンコマイシン耐性エンテロコッカスを含む）；淋病（淋菌（Neisseria gonorrhoeae）を含む）；リステリア菌（Listeria moncytogenes）；ヒト型結核菌（これらの薬剤耐性型を含む）；シュードモナス（緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）を含み、特に、この多剤耐性型）；ブドウ球菌属（例えば、黄色ブドウ球菌（Staphylococcous Aureus）、特に、これらのうちいずれか１つのメチシリン耐性型）、連鎖球菌（肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumonia）（特に薬剤耐性肺炎連鎖球菌）に起因する、蜂巣炎、毛包炎、膿痂疹、せつ（boil）、および肺炎など）；梅毒；並びにビブリオから選択される細菌感染症に対して、前記ＧＬＡ成分とペイロードとを含む分子を患者に投与することを含む、第３４項または第３５項に記載の方法またはその用途の分子。
３７．
前記抗菌剤が、ピラジンアミド、エタンブトール、リファブチン、カナマイシン、アミカシン、カプレオマイシン、ストレプトマイシン（streptomoycin）、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン、パラアミノサリチル酸（para-aminosalicyclic）、シクロセリン、テリジドン、チオナミド、プロチオナミド、クロファジミン、リネゾリド、アモキシシリン／クラブラン酸（clavuanate）、チオアセタゾン、イミペネム／シラスタチン、高用量イソニアジド、クラリスロマイシン、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、第３４項〜第３６項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
３８．
前記ＧＬＡ成分とペイロードとを含む分子を、結核が耐性を有している患者を含む結核患者に投与することを含む、第３７項に記載の方法またはその用途の分子。
３９．
前記患者が潜伏結核患者を有する、第３８項に記載の方法またはその用途の分子。
４０．
前記患者が活動性結核患者を有する、第３９項に記載の方法またはその用途の分子。
４１．
前記ＴＢ患者が合併性、例えば寄生虫感染症および／またはウイルス感染症、を有する、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
４２．
前記抗菌剤がメトロニダゾールである、第３４項〜第４１項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
４３．
前記薬剤が抗ウイルス剤である、第２０項〜第４２項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
４４．
前記抗ウイルス剤が、下記群、アバカビル、アシクロビル、アシクロビル、アデホビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリゲン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビレルテット、シドホビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、侵入阻害剤、ファムシクロビル、ファビピラビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、ＩＩＩ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、Ｉ型インターフェロン、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロック、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネクサビル、ヌクレオシド類似体、オセルタミビル、ペグインターフェロンα−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害剤、ラルテグラビル、逆転写酵素阻害剤、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン（Pyramidine）、サキナビル、スタブジン、相乗増強剤（Synergistic enhancer）（抗レトロウイルス剤）、チャノキ油、テラプレビル、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、ジドブジン、およびこれらの組み合わせ、から選択される、第４２項に記載の方法またはその用途の分子。
４５．
前記ウイルス感染症が、呼吸器合胞体ウイルスまたはインフルエンザウイルス、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、およびＨ７Ｎ９など）、Ｂ型インフルエンザウイルスもしくはＣ型インフルエンザウイルス、またはインフルエンザウイルス、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、およびＨ７Ｎ９など）、Ｂ型インフルエンザウイルスもしくはＣ型インフルエンザウイルス、またはインフルエンザウイルス、例えば、Ａ型インフルエンザウイルス（Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ５Ｎ１、Ｈ７Ｎ７、Ｈ１Ｎ２、Ｈ９Ｎ２、Ｈ７Ｎ２、Ｈ７Ｎ３、Ｈ１０Ｎ７、およびＨ７Ｎ９など）、Ｂ型インフルエンザウイルスもしくはＣ型インフルエンザウイルスである、第４３項または第４４項に記載の方法またはその用途の分子。
４６．
前記抗寄生虫剤が、抗マラリア剤（キニーネおよび関連物質、クロロキン（choloroquine）、アモジアキン、ピリメタミン、プログアニル、スルホンアミド類、メフロキン、アトバコン、プリマキン、アルテミシニン（aremisinin）およびその誘導体、ハロファントリン、ドキシサイクリン、クリンダマイシンなど）、スルファジアジン、チニダゾール、パロモマイシン（アメーバ症、ジアルジア症、レーシュマニア症、および条虫をはじめとする治療に用いられ得る）、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される、第３４項〜第４５項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
４７．
前記ＧＬＡ成分とペイロードとを含む分子をマラリア患者に投与することを含む、第４６項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
４８．
前記ペイロードが前記細胞の内部で活性型に変換される、第１項〜第４７項のいずれか一項に記載の方法またはその用途の分子。
４９．
前記活性型への変換が酵素によって行われる、第４８項に記載の方法。
５０．
前記酵素が、カルボキシルエステラーゼ、アセチルコリンエステラーゼ（acetylecholinesterase）、パラオキソナーゼ（パラオキソナーゼ２など）、マトリクスメタロプロテアーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、βラクタマーゼ（例えば、ヒト型結核菌およびカンサシ菌によって産生されるもの）およびシトシンデアミナーゼ（cytosine deminase）から選択される、第４９項に記載の方法または分子。
【００１４】
１つの実施形態では、前記ＧＬＡ成分は、細胞の表面に露出したホスファチジルセリンと結合し、その後内部移行する。
【００１５】
理論に束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、生物学的観点から全てのホスファチジルセリンが均等なものであるとは限らないと考えている。本発明者らは、ＴＭＥＭ１６Ｆ酵素によって曝されるホスファチジルセリンが、免疫抑制に関与しており、本開示の分子によって「見られる」ものである、と考えている。
【００１６】
１つの実施形態では、前記細胞はアポトーシス細胞（すなわち、病気の、傷害を受けた、異常な、且つ／または感染した細胞）である。
【００１７】
１つの実施形態では、前記ＧＬＡ成分は幹細胞、例えば非アポトーシス細胞、である。
【００１８】
すなわち、１つの実施形態では、本開示で開示される分子は細胞内の病原体の治療に利用される。
【００１９】
本開示はまた、ＧＬＡドメインまたはその活性断片を含むが、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインは含まない、細胞内標的化および送達（細胞内ペイロード送達を含む）のための、ＧＬＡ成分の使用を包含する。
【００２０】
前記触媒ドメインが存在しないと、前記分子が細胞に進入することが可能となると思われる。前記触媒ドメインが存在すると、細胞内への進入が阻止され、前記分子が治療目的および診断目的に有用なものになることを妨げる天然の生物学的メカニズムが刺激される。
【００２１】
本開示はまた、ＧＬＡドメインまたはその活性断片を含むが、ＧＬＡタンパク質由来の活性触媒ドメインは含まない、細胞内標的化および送達（細胞内ペイロード送達を含み、特に、ペイロードが治療用実体／分子を含む細胞内ペイロード送達）用の医薬の製造のための、ＧＬＡ成分の使用を包含する。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
細胞内送達とは、本明細書で使用される場合、ペイロードなどを細胞内部に運ぶことを指す。
【００２３】
ペイロードとは、本明細書で使用される場合、ＧＬＡドメインに連結された、特に細胞内送達を目的とした分子を指す。この連結は、溶媒曝露リジンに部分を固定するために例えばマレイミドの化学作用またはクリックケミストリーを用いる化学的結合を通じた連結であり得る。あるいは、この連結は融合であり、例えば、連結された成分がＧＬＡ成分を有する融合タンパク質として発現されるペプチド結合であり、例えば、これは蛍光タンパク質または抗体といった特定の検出可能な標識に好適であり得る。リンカーはＧＬＡ成分とペイロードとの間に使用され得る。
【００２４】
１つの実施形態では、１つのＧＬＡ成分につき、１、２、３、４、または５種のペイロードが連結される。
【００２５】
ＧＬＡ成分（本明細書ではγカルボキシグルタミン酸成分とも称する）とは、ＧＬＡタンパク質（プロテインＳなど）由来のＧＬＡドメインを含むが、触媒ドメインは含まない、ポリペプチドを指す。前記ポリペプチドはＥＧＦドメインおよび／クリングルドメインをさらに含む場合があり、例えば前記ＥＧＦドメインはプロテインＳ由来である。１つの実施形態では、前記ＧＬＡ成分は３０〜３００個のアミノ酸残基を含み、例えば、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、または３００個の残基を含む。１つの実施形態では、前記ＧＬＡ成分は４．５〜３０ｋＤａの範囲内である。１つの実施形態では、前記ＧＬＡ成分は配列番号１に示される配列を含む。１つの実施形態では、前記ＧＬＡ成分は、配列番号６に示される配列またはＨｉｓタグを持たないその誘導体を含み、特に配列番号６を含む。
【００２６】
ＧＬＡドメイン（ビタミンＫ依存性カルボキシル化／γカルボキシグルタミン酸ドメイン）とは、本明細書で使用される場合、アミノ配列（amino sequence）中のグルタミン酸残基がビタミンＫ依存性翻訳後カルボキシル化によって修飾されてγカルボキシグルタミン酸（Ｇｌａ）となった、タンパク質ドメインである。１つの実施形態では、本開示の分子中に使用されるＧＬＡドメインは、未修飾（野生型）のＧＬＡドメイン由来の３０〜４５個の連続残基を含む。１つの実施形態では、前記ＧＬＡドメインは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、または１５個のＧＬＡ残基を含む。
【００２７】
１つの実施形態では、前記ＧＬＡ成分の３０％以下がＧＬＡ残基である。
【００２８】
１つの実施形態では、前記ＧＬＡ成分は１〜５個のジスルフィド結合を含み、例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のジスルフィド結合を含む。
【００２９】
前記ＧＬＡドメインは、２つのカルボン酸残基の間でカルシウムイオンのキレート化によってカルシウムイオンと結合する。これらの残基が、成熟型Ｇｌａタンパク質のＮ末端の端から始まり、保存された芳香族残基で終わる、領域の一部となる。この結果、保存されたＧｌａ−ｘ（３）−Ｇｌａ−ｘ−Ｃｙｓモチーフが、前記ドメインの中央に存在することとなり、これが、カルボキシラーゼによる基質認識に重要と考えられる。
【００３０】
ＧＬＡドメインは、本明細書で使用される場合、未修飾ＧＬＡドメインのアミノ酸のうちの１〜１０％（１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％など）が置換および欠失を受けている場合があるタンパク質であって、ただし、適切なインビトロアッセイにおいて、修飾後のドメインはネイティブＧＬＡドメイン（未修飾ＧＬＡドメイン）のネイティブ状態の活性のうちの少なくとも７０％（７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％など）を保持している、前記タンパク質も包含する。１つの実施形態では、完全長の未修飾（野生型）ＧＬＡドメインが使用される。
【００３１】
ＥＧＦドメインは、本明細書で使用される場合、保存されたタンパク質ドメインを指すである。ＥＧＦドメインは、３０〜４０個程度のアミノ酸残基を含み、動物性タンパク質の大多数で見出されている。ＥＧＦ様ドメインの出現が最も多く見られるのは、膜結合型タンパク質の細胞外ドメイン、または分泌されることが知られているタンパク質である。ＥＧＦ様ドメインは６個のシステイン残基を含む。ＥＧＦ様ドメインの主要構造は、二本鎖βシートからループ、そして短いＣ末端二本鎖βシートへと続く構造である。これら２つのβシートは通常、大（Ｎ末端）シートおよび小（Ｃ末端）シートと表される。ＥＧＦ様ドメインはタンパク質中に多数の直列型コピーとして頻繁に現れ、これらのリピートは通例一緒に折り畳まれて、機能単位としての、一本鎖の直鎖状のソレノイド型ドメインブロックを形成する。１つの実施形態では、使用されるドメインは完全長の未修飾ドメインである。
【００３２】
ＥＧＦドメインは、本明細書で使用される場合、未修飾ＥＧＦドメインのアミノ酸のうちの１〜１０％（１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％など）が置換および欠失を受けている場合があるタンパク質であって、ただし、適切なインビトロアッセイにおいて、修飾後のドメインはネイティブＥＧＦドメイン（未修飾ＥＧＦドメイン）のネイティブ状態の活性のうちの少なくとも７０％（７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％など）を保持している、前記タンパク質も包含する。１つの実施形態では、前記たんぱく質は完全長の未修飾（野生型）ドメインである。
【００３３】
クリングルドメインとは、本明細書で使用される場合、３つのジスルフィド結合により安定化された大型ループへと折り畳まれる、自律的なタンパク質ドメインを指す。クリングルドメインは、多数の水素結合と小型の逆平行βシートとによって定義される高次構造を有する、三重ループ、３−ジスルフィド架橋構造、を特徴とする。クリングルドメインは血液凝固タンパク質およびフィブリン溶解性タンパク質の全体に見られ、また、ＭＥＲＯＰＳペプチダーゼファミリーＳ１Ａに属するセリンプロテアーゼである、プロトロンビンおよびウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子をはじめとするいくつかの血漿タンパク質中に種々のコピー数で見られる。
【００３４】
クリングルドメインは、本明細書で使用される場合、未修飾クリングルドメインのアミノ酸のうちの１〜１０％（１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％または１０％など）が置換および欠失を受けている場合があるタンパク質であって、ただし、適切なインビトロアッセイにおいて、修飾後のドメインはネイティブクリングルドメイン（未修飾クリングルドメイン）のネイティブ状態の活性のうちの少なくとも７０％（７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％など）を保持している、前記タンパク質も包含する。１つの実施形態では、前記たんぱく質は完全長の未修飾（野生型）ドメインである。
【００３５】
本明細書で使用されるタンパク質の活性断片は、未修飾タンパク質の全体に満たないもの（または関連ドメイン）であって、適切なインビトロアッセイにおいて、未修飾の完全長のドメインまたはタンパク質の活性の少なくとも５０％（６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％など）を保持するものである。
【００３６】
触媒ドメインとは、本明細書で使用される場合、例えば図１Ａに図示されるような、Ｃ末端方向のＥＧＦドメインの下流にある、ドメイン（または断片）である。
【００３７】
腫瘍溶解性ウイルスとは、本明細書で使用される場合、
がん細胞に優先的に感染してそれを殺滅する、または
そのがん細胞中で選択的に複製する（例えば、その複製がｐ５３などのがん細胞でアップレギュレートされている遺伝子に依存しているため）、
ウイルスを指す。
【００３８】
ウイルスベクターとは、本明細書で使用される場合、複製欠損性ウイルスを指し、通常は導入遺伝子をコードしているものを指す。１つの実施形態では、ウイルスベクターは導入遺伝子を含んでおり、例えば治療用導入遺伝子を含む。
【００３９】
すなわち、前記腫瘍溶解性ウイルスは、複製可能（例えば複製適格性または条件付き複製性）または複製欠損性であり得る。通常、前記腫瘍溶解性ウイルスは複製適格性または条件付き複製性となり、特に複製適格性である。感染されたがん細胞は、腫瘍崩壊によって破壊されるので、新たな感染性ウイルス粒子またはビリオンを放出し、残存する腫瘍の破壊を促す。腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞の直接的な破壊を引き起こすだけではなく、宿主の抗腫瘍免疫応答も刺激すると考えられている。１つの実施形態では、前記腫瘍溶解性ウイルスは導入遺伝子を含んでおり、例えば治療用導入遺伝子を含む。
【００４０】
１つの実施形態では、本開示の方法で使用されるウイルスまたはベクターは導入遺伝子を含み、例えば、前記導入遺伝子は、細胞内の欠陥遺伝物質の置換、細胞内での新たな機能もしくは増強された機能の提供、細胞の治療に対する感度増加、細胞内の機能の遮断、または治療用のタンパク質もしくはペプチドの発現のための、導入遺伝子である。
【００４１】
インビトロとは、本明細書で使用される場合、ヒトまたは動物の身体で実施されない、実験室での研究を指す。
【００４２】
インビボとは、本明細書で使用される場合、生体、特にヒトまたは動物における、研究／検査／処置を指す。
【００４３】
幹細胞とは、本明細書で使用される場合、分化が可能である未分化細胞を指し、胚性幹細胞および成体幹細胞が包含され、特に成体幹細胞であり、例えば、前駆細胞、および造血幹細胞（haemotopoietic stem cell）、筋原幹細胞、骨芽幹細胞（osteoprogenitor stem cell）、神経幹細胞、間葉系幹細胞が包含され、例えば、衛星細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、骨膜、膵臓前駆細胞、内皮前駆細胞、芽細胞、および栄養膜幹細胞などである。
【００４４】
１つの実施形態では、前記方法は哺乳類幹細胞、例えばヒト幹細胞、に関する。本明細書で説明される幹細胞は主にヒト幹細胞である。しかし、当業者は必要に応じて、他の哺乳類の、関連性のあるまたは対応する幹細胞集団を特定することができる。例えば、ＳＳＥＡ−１はマウス胚性幹細胞、ヒト生殖系列細胞および胚性癌腫細胞のマーカーであり；ＳＳＥＡ−３は霊長類胚性幹細胞、ヒト胚性生殖系列細胞、ヒト胚性幹細胞および胚性癌腫細胞のマーカーであり；ＳＳＥＡ−４は霊長類胚性幹細胞、ヒト胚性生殖細胞、ヒト幹細胞、胚性癌腫細胞のマーカーであり；ＣＤ３２４はヒトおよびマウスの胚性幹細胞、胚性がん細胞のマーカーであり；ＣＤ９０はヒトおよびマウスの胚性幹細胞、造血幹細胞、胚性癌腫細胞のマーカーであり；ＣＤ１１７はヒトおよびマウスの胚性幹細胞、造血幹・前駆細胞、神経堤由来メラニン細胞、始原生殖細胞、胚性癌腫細胞のマーカーであり；ＣＤ３２６はヒトおよびマウスの胚性幹細胞、胚性癌腫細胞のマーカーであり；ＣＤ９はヒトおよびマウスの胚性幹細胞（embryonic stems）のマーカーであり；ＣＤ２４はヒトおよびマウスの胚性幹細胞のマーカーであり；ＣＤ２９はヒトおよびマウスの胚性幹細胞のマーカーであり；ＣＤ５９はヒトおよびマウスの胚性幹細胞のマーカーであり；ＣＤ１３３はヒトおよびマウスの胚性幹細胞、胚性癌腫細胞、造血幹細胞のマーカーであり；ＣＤ３１はヒトおよびマウスの胚性幹細胞のマーカーであり；ＴＲＡ−１−６０はヒト胚性幹細胞、奇形癌（teracarcinoma）、胚性生殖細胞、胚性癌腫細胞のマーカーであり；ＴＲＡ−１−８１はヒト胚性幹細胞、奇形癌（teracarcinoma）、胚性生殖細胞、胚性癌腫細胞のマーカーであり；Ｆｒｉｚｚｌｅｄ５はヒトおよびマウスの胚性幹細胞のマーカーであり；幹細胞因子（ＳＣＦ）はヒトおよび  胚性幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性癌腫細胞のマーカーであり；Ｃｒｉｐｔｏはヒトおよびマウスの胚性幹細胞、心筋細胞および胚性癌腫細胞のマーカーである。
【００４５】
造血幹細胞（ＨＳＣ）または血球芽細胞は、造血発生のプロセスを通じて他の全ての血液細胞を生じる幹細胞である。造血幹細胞は中胚葉から派生し、大部分の骨の芯に含まれる赤色骨髄に局在している。
【００４６】
がん幹細胞とは、本明細書で使用される場合、正常幹細胞に関連する特徴、具体的には特定のがん試料中に存在する全ての細胞型を生じる能力、を持つ、腫瘍形成性細胞（すなわち、腫瘍または血液がんの中に見出されるがん細胞）を指す。例えば、Identification and Targeting of Cancer Stem Cells, BioessayS 2009 Oct; 31 (10) 1038-1049を参照されたい。がん幹細胞は、以下の３つの明確な特性によって定義される：ｉ）選択的に腫瘍を惹起し腫瘍性増殖を駆動する能力、ｉｉ）自己複製を通じてそれ自体のコピーを際限なく生成する能力、および、ｉｉｉ）分化を通じてより成熟した、幹細胞以外のがん性子孫を生じる能力。がん幹細胞は必ずしも健常幹細胞由来である必要はなく、分化細胞由来であってもよい。
【００４７】
ＣＤ３４は、造血前駆細胞抗原ＣＤ３４としても知られており、細胞間接着因子としての機能を有する。ＣＤ３４は、幹細胞集団（stem population）を濃縮するためのマーカーとして使用することができる。
【００４８】
分子とは、本明細書で使用される場合、最も広い意味で使用され、合成の化学分子を包含するが、たんぱく質、高分子（天然高分子または合成高分子）、標識などの巨大分子も包含する。
【００４９】
文脈上特に指示がない限り、タンパク質はポリペプチドを包含する。
【００５０】
ペイロードは、薬剤、毒素、高分子、生物学的に活性なタンパク質、放射性核種、金属キレート化剤、標識および／またはレポーター基を含み得る。
【００５１】
薬剤とは、本明細書で使用される場合、文脈上特に指示がない限り、低分子量の化学成分、例えば有機化学法によって合成された低分子量化学成分、特に治療用途、特にヒトでの治療用途、が承認または認可または認可途中の分子、を指すことが意図される。本明細書で使用される薬剤は、抗ウイルス性化合物、抗生物質、および抗がん剤治療を包含する。
【００５２】
抗ウイルス性化合物（抗ウイルス剤）とは、本明細書で使用される場合、具体的にはウイルス感染症の治療用の医薬クラスを指し、広域抗ウイルス剤だけでなく、特定のウイルスまたは特定のウイルス科に特異的な「狭」域抗ウイルス剤も包含する。
【００５３】
抗生物質とは、本明細書で使用される場合、細菌の増殖を阻害する、または細菌を破壊する医薬または薬剤を指す。文脈上特に指示がない限り、抗菌性物質と抗生物質は本明細書においては交換可能とする。
【００５４】
抗寄生虫剤とは、本明細書で使用される場合、寄生虫の増殖を阻害する、寄生虫を破壊する、または寄生虫を宿主から除去する、医薬または薬剤を指す。
【００５５】
抗がん剤治療は、抗がん剤、化学療法、放射線療法、がん免疫療法などを包含する広義語である。
【００５６】
抗がん剤とは、本明細書で使用される場合は通常、小分子がん治療を指す。
【００５７】
化学療法とは、本明細書においては、通常は細胞傷害性薬剤を指し、抗悪性腫瘍薬を包含する。
【００５８】
生物学的治療薬（別名、バイオ医薬品、生物製剤、または生物学的製剤）は、生物源に「由来」する治療用製品であり、例えば組換えタンパク質および組換え断片であり、抗体、抗体結合性フラグメント（antibody binding fragment）および多特異的抗体分子、並びにこれらの物質を組み合わせた複合体といった抗体分子を包含する。生物学的に活性なタンパク質は生物学的治療薬のサブグループであり、組換えタンパク質およびその活性断片（抗体分子を含む）を包含する。
【００５９】
抗体分子は、本明細書で使用される場合、完全長の重鎖および軽鎖を有する完全抗体またはその断片、並びに上記のいずれか１つを含む分子、例えば、Ｆａｂ、修飾Ｆａｂ、Ｆａｂ’、修飾Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆａｂ−Ｆｖ、Ｆａｂ−ｄｓＦｖ、シングルドメイン抗体（例えば、ＶＨまたはＶＬまたはＶＨＨ）、ｓｃＦｖ、二価抗体、三価抗体、または四価抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、並びに上記のいずれかのエピトープ結合性フラグメントを包含する（例えば、Holliger and Hudson, 2005, Nature Biotech. 23(9):1126-1136; Adair and Lawson, 2005, Drug Design Reviews - Online 2(3), 209-217を参照）。これらの抗体フラグメントを生成および製造するための方法は当該技術分野において周知である（例えば、Verma et al., 1998, Journal of Immunological Methods, 216, 165-181を参照）。本発明で使用される他の抗体フラグメントとしては、国際特許出願第２００５／００３１６９号、同第２００５／００３１７０号および同第２００５／００３１７１号に記載のＦａｂおよびＦａｂ’フラグメントが挙げられる。多価抗体は、複数の特異性（例えば二重特異性）を含んでもよいし、または単一特異性であってもよい（例えば、国際公開第９２／２２８５３号および同第０５／１１３６０５号）。この例では、２種類の独立した標的タンパク質を中和することが目的であるため、二重特異性抗体および多特異的抗体のバリアントが特に考慮される。
【００６０】
抗体およびその結合性フラグメント、特にドメイン抗体、ＶＨＨ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｄｓ−ｓｃＦｖおよびｄｓＦｖなどの低分子量抗体フラグメントが、本発明の技術を用いて細胞内に送達され得る。
【００６１】
１つの実施形態では、前記抗体またはその結合性フラグメントはチェックポイント阻害剤であり、例えば抗ＰＤ−１阻害剤または抗ＰＤ−Ｌ１阻害剤である。
【００６２】
１つの実施形態では、前記抗体分子はヒト抗体またはヒト化抗体である。
【００６３】
毒素は有毒物質であり、特に天然源由来のものであり、特にタンパク質である。カリチアマイシンなど、多くの毒素ががん治療に使用されている。さらに、化学療法剤は毒性がある（すなわち毒素）と見なされる場合がある。そのため、毒素の定義は本明細書における他の定義と重複している。しかし、ヘビ毒のような神経毒は毒素ではあるが、化学療法剤ではない。しかし、当業者はこれらの技術的定義に精通しており、本開示との関連  意味を理解することができる。
【００６４】
診断薬とは、本明細書で使用される場合、診断するための、または疾病状態をモニターもしくは理解するための、分析またはイメージングに使用される薬剤である。診断薬は通常、何らかの方法で可視化、測定、またはモニターできる標識などのレポーター分子を含む。モニターは直接的であっても間接的であってもよい。
【００６５】
１つの実施形態では、本開示の分子は細胞内標的、例えば核、を標識することができる。
【００６６】
本開示での使用に好適な放射性核種としては、タリウム−２０１、テクネチウム−９９ｍ、ヨウ素−１２３、ヨウ素１３１、ヨウ素−１２５、フッ素−１８、および酸素−１５が挙げられる。
【００６７】
１つの実施形態では、ＲＡＳまたはＲＡＳシグナル経路内のタンパク質と相互作用し阻害する抗体がペイロードに使用される。ＲＡＳ遺伝子はＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＫＲＡＳを含む多重遺伝子族を構成する。ＲＡＳタンパク質は、細胞内の重要なシグナル伝達のハブとして機能する低分子量グアノシンヌクレオチド結合型ＧＴＰアーゼである。ＲＡＳ／ＭＡＰＫ経路は、その体細胞調節不全ががんの主因の１つであることから、腫瘍形成に関連して広範囲に研究されている。ＲＡＳはおよそ２０％の悪性腫瘍で体細胞変異している（Bos JL, Cancer Res. 49: 4682-4689, 1989）。この特定の場合では、例えば、前記ＧＬＡ成分はＲＡＳ細胞内抗体に融合されることが企図され（Cetin M et al., J Mol Biol. 429:562-573, 2017に記載）、すなわち前記構築物は組換えタンパク質法によって発現され得る。
【００６８】
異常細胞とは、本明細書で使用される場合、正常な健常細胞と差異がある、特に１または複数のマーカーの変異またはアップレギュレーションがある、例えば、状態もしくは疾患の素因または状態もしくは疾患の発生に関連付けられる異常；前がん細胞、がん、鎌状赤血球貧血などの状態または疾患と関連付けられる異常がある、細胞を指す。
【００６９】
アポトーシスとは、本明細書で使用される場合、正常且つ制御下の役割として生物の成長を引き起こす細胞死経路である。アポトーシスによる細胞死は、壊死などの細胞死機構ほど周辺組織にダメージを与えない。
【００７０】
壊死とは、本明細書で使用される場合、疾患または傷害による細胞死である。壊死によって、周辺組織にサイトカインおよび因子が放出され、これが周辺細胞にダメージを与え得る。壊疽は壊死による細胞死の一例である。
【００７１】
化学療法剤
文脈上特に指示がない限り、化学療法剤および化学療法または細胞傷害性物質は本明細書では同義的に使用される。
【００７２】
化学療法は、本明細書で使用される場合、悪性細胞および悪性組織にとって「選択的に」有害な特定の抗悪性腫瘍性化学物質または薬剤を指すことが意図されており、例えば、アルキル化剤、チミジル酸合成酵素阻害剤を含む代謝拮抗剤、アントラサイクリン系薬剤、植物性アルカロイドを含む微小管阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤および他の抗腫瘍剤である。これらの薬剤の多くは重篤な副作用を当然有しているので、この文脈中の選択的は大まかに使用されている。
【００７３】
好ましい用量は、治療されるがんの性質に基づいて実施者が選択してよい。
【００７４】
本開示の方法で使用され得るアルキル化剤の例としては、ナイトロジェンマスタード、ニトロソ尿素類、テトラジン類、アジリジン類、プラチン類および誘導体、ならびに非古典的アルキル化剤といったアルキル化剤が挙げられる。
【００７５】
白金含有化学療法剤（プラチン類とも称される）の例としては、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチン、ピコプラチン、ネダプラチン、トリプラチン（triplatin）およびリポプラチン（lipoplatin）（シスプラチンのリポソーム体）、特にシスプラチン、カルボプラチンおよびオキサリプラチンが挙げられる。
【００７６】
シスプラチンの用量はがんの種類に応じて約２０〜約２７０ｍｇ／ｍ２の範囲を取る。用量は約７０〜約１００ｍｇ／ｍ２の範囲内となる場合が多い。
【００７７】
ナイトロジェンマスタードとしては、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミドおよびブスルファンが挙げられる。
【００７８】
ニトロソ尿素類としては、Ｎ−ニトロソ−Ｎ−メチル尿素（ＭＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）およびセムスチン（ＭｅＣＣＮＵ）、フォテムスチンおよびストレプトゾトシンが挙げられる。テトラジン類としては、ダカルバジン、ミトゾロミドおよびテモゾロミドが挙げられる。
【００７９】
アジリジン類としては、チオテパ、マイトマイシンおよびジアジクオン（ＡＺＱ）が挙げられる。
【００８０】
本開示の方法で使用され得る代謝拮抗剤の例としては、葉酸代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサートおよびペメトレキセド）、プリン類似体（例えば、チオプリン類、例えば、アザチオプリン、メルカプトプリン、チオプリン、フルダラビン（リン酸塩形態も含む）、ペントスタチンおよびクラドリビン）、ピリミジン類似体（例えば、フルオロピリミジン、例えば、５−フルオロウラシルおよびそのプロドラッグ、例えばカペシタビン［ゼローダ（登録商標）］）、フロクスウリジン、ゲムシタビン、シタラビン、デシタビン、ラルチトレキセド（トムデックス）塩酸塩、クラドリビン並びに６−アザウラシルが挙げられる。
【００８１】
本開示の方法で使用され得るアントラサイクリン系薬剤の例としては、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ダウノルビシン（リポソーム体）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、ドキソルビシン（リポソーム体）、エピルビシン、イダルビシン、バルルビシン（現在では膀胱がんの治療にのみ使用されている）およびミトキサントロン、アントラサイクリン類似体、特にドキソルビシン、が挙げられる。
【００８２】
本開示の方法で使用され得る微小管阻害剤の例としては、ビンカアルカロイド類およびタキサン類が挙げられる。
【００８３】
ビンカアルカロイド類としては、完全天然化学薬品、例えばビンクリスチンおよびビンブラスチン、さらに、半合成ビンカアルカロイド類、例えばビノレルビン、ビンデシン、およびビンフルニン、が挙げられる。
【００８４】
タキサン類としては、パクリタキセル、ドセタキセル、アブラキサン、カバジタキセルおよびその誘導体が挙げられる。本明細書で使用されるタキサン類の誘導体としては、タキソールのようなタキサン類の改質剤（reformulation）が挙げられ、例えばミセル製剤中のものがあり、誘導体としてはまた、合成化学を用いてタキサンである出発物質が改変された化学的誘導体も挙げられる。
【００８５】
本開示の方法で使用され得るトポイソメラーゼ阻害剤としては、Ｉ型トポイソメラーゼ阻害剤、ＩＩ型トポイソメラーゼ阻害剤およびＩＩ型トポイソメラーゼ毒が挙げられる。Ｉ型阻害剤としては、トポテカン、イリノテカン、インドテカン（indotecan）およびインジミテカン（indimitecan）が挙げられる。ＩＩ型阻害剤としては、ゲニステインおよび以下の構造を有するＩＣＲＦ１９３が挙げられる。
【００８６】
ＩＩ型毒としては、アムサクリン、エトポシド、リン酸エトポシド、テニポシドおよびドキソルビシン並びにフルオロキノロン系抗生物質が挙げられる。
【００８７】
１つの実施形態では、化学療法剤はＰＡＲＰ阻害剤である。
【００８８】
本開示でペイロードとして使用するのに好適なウイルス
１つの実施形態では、本開示で使用されるウイルスはエンベロープウイルスであり、例えば、ヘルペスウイルス（単純ヘルペス１型など）、ポックスウイルス（ワクシニアウイルス（vaccina virus）など）、ヘパドナウイルス、フラビウイルス、トガウイルス、コロナウイルス、Ｄ型肝炎、オルソミクソウイルス、パラミクソウイルス（麻疹ウイルスまたはニューカッスル病ウイルスなど）、ラブドウイルス、ブニアウイルス、フィロウイルス、およびラブドウイルス科（水疱性口内炎ウイルスインディアナ株（ＶＳＶ）など）から選択されるエンベロープウイルスである。
【００８９】
１つの実施形態では、本開示で使用されるウイルスは非エンベロープウイルスであり、例えば、アデノウイルス科（アデノウイルスなど）、パピローマウイルス科（papilomaviridae）、ピコルナウイルス科（コクサッキーウイルスまたはセネカバレーウイルス（例えば、セネカウイルス属）など）、レオウイルスから選択される非エンベロープウイルスである。
【００９０】
１つの実施形態では、前記ウイルスはアデノウイルスであり、例えば、Ｂ群ウイルス（特に、Ａｄ３、Ａｄ７、Ａｄ１１、Ａｄ１４、Ａｄ１６、Ａｄ２１、Ａｄ３４、Ａｄ３５、Ａｄ５１、またはこれらのキメラ（chimeria）、例えばＥｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ）、Ｃ群ウイルス（特に、Ａｄ１、Ａｄ２、Ａｄ５、Ａｄ６、またはこれらのキメラ（chimeria））、Ｄ群ウイルス（特に、Ａｄ８、Ａｄ１０、Ａｄ１３、Ａｄ１５、Ａｄ１７、Ａｄ１９、Ａｄ２０、Ａｄ２２、Ａｄ３０、Ａｄ３２、Ａｄ３３、Ａｄ３６、Ａｄ３７、Ａｄ３８、Ａｄ３９、Ａｄ４２、Ａｄ４３、Ａｄ４４、Ａｄ４５、Ａ４６、Ａｄ４７、Ａｄ４８、Ａｄ４９、Ａｄ５０、またはこれらのキメラ（chimeria））、Ｅ群ウイルス（特に、Ａｄ４）、Ｆ群ウイルス（特に、Ａｄ４０、Ａｄ４１、またはこれらのキメラ（chimeria））、並びにＢ群、Ｃ群、Ｄ群、Ｅ群またはＦ群ウイルスの２つ以上のキメラ（chimeria）などから選択されるヒトアデノウイルスである。
【００９１】
ウイルスの大多数が、標的細胞の認識および取り込みと関連した、十分な報告がなされているタンパク質を有している。腫瘍溶解性ウイルスへの、再指示するための、またはより選択的な腫瘍ターゲティングを可能にするための、指向性の変更は、Verheije and Rottier, Adv. Virology 2012: 798526, 2012におけるレビューに記載されている方法を用いて導入され得る。
【００９２】
未改変ウイルスのターゲティングに関与していない更なるウイルス性細胞表面タンパク質に、遺伝子工学的に、標的化用モチーフを持たせることができる（例えば、Ａｄビリオンマイナーコートタンパク質ＩＸ  Salisch et al., PLoS One 12: e0174728, 2017）。
【００９３】
エンベロープウイルスはウイルスカプシドを被覆する外膜（エンベロープ）を有する。エンベロープは通例、宿主細胞膜の部位に由来するが（リン脂質およびタンパク質）、いくつかのウイルスタンパク質も含む。エンベロープ表面上の糖タンパク質は、宿主膜上の受容体部位を特定し結合する働きをする。ウイルスエンベロープはその後、宿主の膜と融合し、カプシドおよびウイルスゲノムを宿主に侵入・感染させる。
【００９４】
様々な腫瘍溶解性ウイルスが国際公開大２０１４／１３８３４号（参照によって本明細書に援用される）で開示されている。
【００９５】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、４種の重要な糖タンパク質、ｇＤ、ｇＨ／ｇＬ、ｇＢ、を利用して細胞に侵入するが、これらは、ｇＤがその受容体、ｎｅｃｔｉｎ１およびＨＶＥＭ、のうちの１つに結合することでカスケード様式で活性化される。リガンドおよびｓｃＦｖをｇＣおよび／またはｇＤタンパク質またはｇＨに挿入することにより、ＨＳＶの再ターゲティングが達成されている（Campadelli-Fiume, G et al.、Med Virol 21: 213-226, 2011, Gatta, V PLoS Pathog 11: e1004907, 2015におけるレビュー(Rev)）。腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス１型ベクターが臨床用に開発された。これらのウイルスは、複製適格性であり、ウイルス複製、神経病原性、および免疫回避能に影響する遺伝子に変異を有しており、例えば、ＮＶ１０２０（Ｒ７０２０）、ｄｌｓｐｔｋ、ｄ１８．３６ｔｋ、ｈｒＲ３、Ｒ３６１６、１７１６などの第一世代ウイルス、Ｇ２０７（ＭＧＨ−１）、３６１６ＵＢ、ＳＵＰ、ＮＶ１０２３などの第二世代ウイルス、Ｇ４７Δなどの第三世代ウイルス、Ｇ９２Ａ、ｄ１２．ＣＡＬＰ、Ｍｙｂ３４．５などの転写発現ベクター、ｒＲＰ４５０などの導入遺伝子発現ベクター、およびタリモジーン・ラハーパレプベック（Talimogene laherparepvec）（Ｔ−Ｖｅｃ）などの他のウイルスが挙げられる。ＨＳＶ−１ベクターは、例えば神経膠腫、メラノーマ、乳がん、前立腺がん、結腸がん、卵巣がん、および膵がんを含む、広範な固形腫瘍の治療に有用であると考えられている。ＨＳＶ−１ウイルスは、広範な細胞型および細胞種に感染し、生来の細胞溶解性であり、その複製生活環により宿主細胞の破壊をもたらし、十分に特徴付けられた巨大ゲノム（１５２Ｋ）を有するが、治療用遺伝子を挿入するための最大３０，０００のスペースを与える多くの非必須遺伝子を含有している。通常、ＨＳＶウイルスは安全性の理由から、チミジンキナーゼ遺伝子は変異されない。タリモジーン・ラハーパレプベックは腫瘍溶解性ヘルペスウイルスであり、メラノーマ治療における使用が承認されている。他のヘルペスベースのウイルス（herpes bases virus）としては以下が挙げられる：Ｇ２０７、ＳＥＰＲＥＨＶＩＲ（ＨＳＶ−１７１６）（ウイルツ・バイオロジクス社（Virttu Biologics）製）、ＨＳＶ−１  Ｒ３６１６変異株、ＨＳＶ−１  １７１６変異株、ＮＶ１０２０（Ｒ７０２０）、Ｒ３６１６変異株（ＲＬ１欠失）、ＫＭ１００変異株（ＵＬ４８遺伝子（トランス活性化因子テグメントタンパク質ｐＵＬ４８［ＶＰ１６］をコードする）およびＲＬ２遺伝子に挿入を有する）、Ｇ９２Ａ、Ｍｙｂ３４．５変異株およびｒＱＮｅｓｔｉｎ３４．５変異株。
【００９６】
ポックスウイルス：改変ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）のようなワクシニアウイルスが使用でき（Galmiche MC et al., J Gen Virol 78: 3019-3027, 1997）、ＭＶＡは腫瘍関連抗原ＭＵＣ−１に対するｓｃＦｖが挿入されたｐ１４融合分子で置換できる（Paul, S et al., Viral Immunol 20: 664-671, 2007）。また、レビュー、Liang L et al., Viruses 6: 3787-3808, 2014、Hsiao JC et al., J Virol 73: 8750-8761, 1999、レビュー、Chen TL and Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008、およびKinoshita T et al., J Biochem 144: 287-294, 2008も参照されたい。ジェネレックス社製（Jennerex）のＪＸ−５９４は、チミジンキナーゼ欠失ワクシニアウイルス＋ＧＭ−ＣＳＦである。ＧＬ−ＯＮＣ１は、前臨床マウスモデルにおいて広範な固形腫瘍の退縮および消失を引き起こす弱毒化ワクシニアウイルス（リステリア菌株）である。
【００９７】
パラミクソウイルス（麻疹ウイルスまたはニューカッスル病ウイルスなど）、
【００９８】
麻疹ウイルス（ＭｅＶ）は、パラミクソウイルス科の麻疹ウイルス属の一本鎖マイナス鎖エンベロープ（非分節）ＲＮＡウイルスである。麻疹ウイルスは２つのエンベロープ糖タンパク質、赤血球凝集素（Ｈ）付着タンパク質および融合（Ｆ）タンパク質、を有する。付着、侵入、およびその後の細胞間融合は、２つの麻疹受容体、ＣＤ４６、およびシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）を介して起こる。例えば、レビュー、Msaouel P et al., Methods Mol Biol 797: 141-162, 2012、Robinson S. and Galanis, E. Expert Opin Biol Ther. 17: 353-363, 2017、Aref S et al., Viruses 8. Pii:E294, 2016);(レビュー、Chen TL and Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008およびKinoshita T et al., J Biochem 144: 287-294, 2008)、および(Russell SJ and Peng KW, Curr Topic Microbiol. Immunol 330: 213-241, 2009、Robinson S and Galanis, E Expert Opin Biol. Ther 17: 353-363, 2017, Aref S et al., Viruses 8. Pii: E294, 2016)を参照されたい。ヒト甲状腺ナトリウム・ヨウ素共輸送体をコードする麻疹ウイルス、すなわちＭＶ−ＮＩＳは、麻疹ウイルスの弱毒化腫瘍溶解性Ｅｄｍｏｎｓｔｏｎ（Ｅｄ）株である。放射性ヨウ素イメージングはＮＩＳの遺伝子発現をモニターするための新規の手法を提供する。
【００９９】
ニューカッスル病ウイルスが使用されてもよい。
【０１００】
アデノウイルス科：アデノウイルスは、腫瘍溶解性薬剤として使用されている、最も広く研究されているウイルスの１つである。様々なペプチドおよびタンパク質が、ビリオン関連ウイルスタンパク質に組み込まれることで、アデノウイルスの未改変状態の指向性が変化された（レビュー、Verheije MH and Rottier PJM Adv Virol 2012: 798526, 2012）。しかし、これらは全て、核内でのウイルスの構築に依存しており、これが大きな課題となっている。
【０１０１】
他の無エンベロープウイルスとしては、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、およびレオウイルスが挙げられる。例えば、レビュー、Altan-Bonnet, N, Curr Opin Microbiol 32: 77-81, 2016、およびChen YH et al., Cell 160: 619-630, 2015、レビュー、Chen TL and Roffler S, Med Res. Rev. 28: 885-928, 2008、およびKinoshita T et al., J Biochem 144: 287-294, 2008、およびレビュー、Verheije MH and Rottier PJM Adv Virol 2012: 798526, 2012を参照されたい。
【０１０２】
多数のアデノウイルスが存在し、例えば、Ａｄ５−ｙＣＤ／ｍｕｔＴＫＳＲ３９ｒｅｐ−ｈＩＬ１２（例えば、前立腺がんの治療の治療用）、オンコス・セラピュティックス社（Oncos Therapeutics）製のＣＧＴＧ−１０２（Ａｄ５／３−Ｄ２４−ＧＭＣＳＦ）（例えば軟部肉腫の治療用）、Ｏｎｃｏｒｉｎｅ（Ｈ１０１）、ＣＧ００７０、Ｅｎａｄｅｎｏｔｕｃｉｒｅｖ（ＥｎＡｄ）（国際公開第２００５／１１８８２５号）、ＯｖＡｄ１およびＯｖＡｄ２（国際公開第２００８／０８０００３号で開示）、ＯＮＣＯＳ−１０２（例えば切除不能な悪性胸膜中皮腫用）、並びにＤＮＸ−２４０１（例えば、神経膠腫用）がある。
【０１０３】
Ｃａｖａｔａｋは、悪性黒色腫の治療に有用な野生型コクサッキーウイルスＡ２１の製剤の商品名である。セネカバレーウイルス（ＮＴＸ−０１０）および（ＳＶＶ−００１）は、例えば小細胞肺がんおよび神経芽細胞腫用である。
【０１０４】
レオウイルス：Ｒｅｏｌｙｓｉｎ（登録商標）（ペラレオレプ（pelareorep）；野生型レオウイルス；血清型３株Ｄｅａｒｉｎｇ；オンコライティクス・バイオテック社（Oncolytics Biotech））は、例えば、種々のがんおよび細胞増殖性疾患の治療用である。
【０１０５】
水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）：ＶＳＶは腫瘍溶解性薬剤として研究されている別のエンベロープウイルスである。例えば、Betancourt D et al., J Virol 89: 11786-11800, 2015、およびレビュー、Hastie E and Grdzelishvili VZ J Gen Virol 93: 2529-2545, 2012を参照されたい。
【０１０６】
ウイルスにコードされるタンパク質
１つの実施形態では、本開示の方法で使用されるウイルスまたはベクターは導入遺伝子を含み、例えば、前記導入遺伝子は、細胞内の欠陥遺伝物質の置換、細胞内での新たな機能もしくは増強された機能の提供、細胞の治療に対する感度増加、細胞内の機能の遮断、または治療用のタンパク質もしくはペプチドの発現のための、導入遺伝子である。
【０１０７】
１つの実施形態では、本開示に係るペイロードとして使用されるウイルスは、例えば、ＲＮＡｉ配列、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（例えば、抗体分子もしくはその結合性フラグメント、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節剤、蛍光タグ、または酵素）から独立して選択される作用剤をコードする、１または複数の導入遺伝子を含む。
【０１０８】
この作用剤としては、限定はされないが、前臨床で有望であることが示されていたが、効率的且つ経済的な送達手段を欠いていた、独特なフォーマット、例えばペプチド、細胞内抗体、および代替足場（alternative scaffold）（レビュー、Boldicke T, Protein Sci 26: 925-945, 2017、Marschall and Dubel, Comput Struct Biotechnol J 14: 304-308, 2016、Miersch and Sidhu F1000Res 5.pii.F1000 Faculty Rev. 1947, 2016、Peptides, Tsomaia Eur J Med Chem 94:459-470, 2015、Marschall ALJ et al, Mabs 7: 1010-1035, 2015、AlDeghaither D et al., J Clin Pharmacol. 55: S4-S20, 2015）、並びに、腫瘍細胞、腫瘍幹細胞、腫瘍関連内皮、および腫瘍関連間質に対して治療効果を有する作用剤が挙げられる。特に興味深いのは、例えば治療薬、バイオマーカーおよび／または診断薬として、多機能性を発揮し得る分子である。単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子は、臨床において承認されたプロドラッグ（ガンシクロビル（ＧＣＶ））を有する、確立されたプロドラッグ変換酵素である（例えば、Holder et al., Cancer Res. 53: 3475-3485, 1993, Touraine RL et al., Gene Therapy 5: 1705-1711, 1998を参照）。
【０１０９】
さらに、前記チミジンキナーゼタンパク質の発現は、治療中のウイルス療法の活性のイメージングおよび追跡に利用することもできる。陽電子断層撮影法および単一光子放射型コンピュータ断層撮影法は共に、がんの検出およびモニタリング並びにがん治療にルーチン的に使用されている方法であり、共に、適切なチミジンキナーゼ基質が投与された場合にチミジンキナーゼタンパク質の発現を検出する実用的な手段である（Wang JQ et al., Bioorg Med Chem 13: 549-556, 2005、Tjuvajev JG et al, J Nucl Med 43: 1072-1083, 2002）。あるいは、ＮＩＳ遺伝子が用いられる場合があり、ＴＫに酷似した、腫瘍溶解性ウイルス内の、診断目的および治療目的の作用剤として利用されている（Miller A and Russell S Expert Opin Biol Ther 16: 15-32, 2016、Ravera S et al., Annu Rev Physiol 79: 261-289, 2017、Portulano et al., Endocr Rev. 35: 106-149, 2014）。
【０１１０】
１つの実施形態では、ＲＡＳまたはＲＡＳシグナル経路内のタンパク質と相互作用しそれを阻害する抗体が、例えばＧＬＡ成分との融合タンパク質として、本開示のウイルスにコードされる。ＲＡＳ遺伝子はＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、およびＫＲＡＳを含む多重遺伝子族を構成する。例えば、Bos JL, Cancer Res. 49: 4682-4689, 1989;およびCetin M et al.,  J Mol Biol. 429:562-573, 2017を参照されたい。
【０１１１】
標識
１つの実施形態では、前期ペイロードは蛍光ラベル、化学発光標識、放射性標識、酵素、色素またはリガンドを含む。
【０１１２】
本開示における標識は、アッセイを用いて検出できるあらゆる部分と定義される。レポーター分子の非限定例としては、酵素、放射標識、ハプテン、蛍光ラベル、リン光性分子、化学発光性分子、発色団、光親和性分子、着色粒子またはビオチンなどのリガンドが挙げられる。標識は、本明細書で使用される場合、タグ、例えばＨｉｓタグ、Ｆｌａｇタグなど、も包含する。標識はビオチンを包含し、ビオチンはアビジンの基質となる。
【０１１３】
標識は複合または融合によりＧＬＡ成分に連結され得る。標識はペイロード単独であってもよいし、治療用ペイロードのように別の独立体が追加されてもよい。
【０１１４】
標識複合体は診断薬としての使用に好適である。診断薬は通常、インビトロ診断に用いられるクラスと、「指向性イメージング（directed imaging）」として一般に知られているインビボ診断プロトコルに用いられるクラスとの、２つのクラスに分類される。多くの適切なイメージング剤が当該技術分野において公知であり、それらをペプチドおよびポリペプチドに結合するための方法も同様である（例えば、米国特許第５，０２１，２３６号；同第４，９３８，９４８号；および同第４，４７２，５０９号を参照）。使用されるイメージング部分は、常磁性イオン、放射性同位元素、蛍光色素、ＮＭＲで検出可能な物質、およびＸ線造影剤とすることができる。
【０１１５】
常磁性イオンの場合、例として、クロム（ＩＩＩ）イオン、マンガン（ＩＩ）イオン、鉄（ＩＩＩ）イオン、鉄（ＩＩ）イオン、コバルト（ＩＩ）イオン、ニッケル（ＩＩ）イオン、銅（ＩＩ）イオン、ネオジム（ＩＩＩ）イオン、サマリウム（ＩＩＩ）イオン、イッテルビウム（ＩＩＩ）イオン、ガドリニウム（ＩＩＩ）イオン、バナジウム（ＩＩ）イオン、テルビウム（ＩＩＩ）イオン、ジスプロシウム（ＩＩＩ）イオン、ホルミウム（ＩＩＩ）イオン、および／またはエルビウム（ＩＩＩ）イオンなどのイオンを挙げることができ、ガドリニウムが特に好ましい。Ｘ線造影のような他の状況で有用なイオンとしては、ランタン（ＩＩＩ）イオン、金（ＩＩＩ）イオン、鉛（ＩＩ）イオン、そして特にビスマス（ＩＩＩ）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１１６】
治療用途および／または診断用途の放射性同位元素の場合では、アスタチン２１１、１４炭素、５１クロム、３６塩素、５７コバルト、５８コバルト、銅６７、１５２Ｅｕ、ガリウム６７、３水素、ヨウ素１２３、ヨウ素１２５、ヨウ素１３１、インジウム１１１、５９鉄、３２リン、レニウム１８６、レニウム１８８、７５セレン、３５硫黄、テクネチウム（technicium）９９ｍおよび／またはイットリウム９０を挙げることができる。１２５Ｉは特定の実施形態での使用するのに好適であり、テクネチウム（technicium）９９ｍおよび／またはインジウム１１１はそれらのエネルギーの低さと長期検出への適合性から特に好適である。放射標識されたペプチドおよびポリペプチドは、当該技術分野において周知の技術に従って作製され得る。例えば、ペプチドおよびポリペプチドは、ヨウ化ナトリウムおよび／またはヨウ化カリウム、並びに、次亜塩素酸ナトリウムなどの化学的酸化剤、またはラクトペルオキシダーゼなどの酵素的酸化剤との接触により、ヨウ素化することが可能である。ペプチドは、配位子交換法により、例えば、第一スズ溶液で過テクネチウム酸を還元し、還元したテクネチウムをセファデックスカラム上にキレート化し、このカラムにペプチドをアプライすることにより、テクネチウム９９ｍ標識され得る。あるいは、例えば、過テクネチウム酸、ＳＮＣｌ２などの還元剤、フタル酸ナトリウム−カリウム溶液などの緩衝溶液、およびペプチドをインキュベートすることによる、直接標識法が使用され得る。金属イオンとして存在する放射性同位元素をペプチドに結合するためにしばしば使用される介在官能基は、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。
【０１１７】
ペイロードとして使用するのに好適な蛍光ラベルとしては、Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、ＡＭＣＡ、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ−ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ−Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ−ＴＲＸ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃｙ３、Ｃｙ５，６−ＦＡＭ、フルオレセインイソチオシアネート、ＨＥＸ、６−ＪＯＥ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５００、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ＲＥＧ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ、Ｒｅｎｏｇｒａｐｈｉｎ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、テトラメチルローダミン、および／またはＴｅｘａｓ  Ｒｅｄが挙げられる。
【０１１８】
別のタイプのペイロードとして、インビトロでの使用に好適なペイロードがあり、その場合、ペプチドは、発色基質との接触により有色産物を生成する二次結合リガンドおよび／または酵素（酵素タグ）に連結される。好適な酵素の例としては、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、（セイヨウワサビ）ハイドロゲンペルオキシダーゼ、またはグルコースオキシダーゼが挙げられる。好適な二次結合リガンドは、ビオチンと、アビジンおよびストレプトアビジン化合物である。このような標識の使用は当業者に周知であり、例えば、米国特許第３，８１７，８３７号、同第３，８５０，７５２号、同第３，９３９，３５０号、同第３，９９６，３４５号、同第４，２７７，４３７号、同第４，２７５，１４９号、および同第４，３６６，２４１号に記載されている。
【０１１９】
ペプチドをその「複合体化パートナー」に連結するための他の結合法も当該技術分野において公知である。いくつかの結合法は、抗体に結合された、例えば、ジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）；エチレントリアミン五酢酸；Ｎ−クロロ−ｐ−トルエンスルホンアミド；および／またはテトラクロロ−３α−６α−ジフェニルグリコウリル−３などの有機キレート化剤を含む、金属キレート錯体の使用を含む（米国特許第４，４７２，５０９号および同第４，９３８，９４８号）。ペプチドまたはポリペプチドは、グルタルアルデヒドまたは過ヨウ素酸塩などのカップリング剤の存在下で酵素と反応させてもよい。フルオレセインマーカーとの複合体は、例えば、これらのカップリング剤の存在下で、または、イソチオシアン酸塩との反応によって作製される。
【０１２０】
１つの実施形態では、前記標識は幹細胞の核を染色または標識することができる。
【０１２１】
併用療法
１つの実施形態では、前記ＧＬＡ成分は第二の治療法、例えば抗がん剤治療、と組み合わせて使用される。これは、前記ＧＬＡ成分とは別々に投与される治療法である（すなわち、ＧＬＡ成分とは連結されない）。
【０１２２】
１つの実施形態では、使用される化学療法剤の組合せは、例えば、プラチン、および５−ＦＵまたはそのプロドラッグ、例えばシスプラチンまたはオキサプラチン（oxaplatin）、およびカペシタビンまたはゲムシタビン、例えばＦＯＬＦＯＸ、である。
【０１２３】
１つの実施形態では、前記化学療法は化学療法薬剤の併用を含み、特に細胞障害性化学療法剤の併用を含む。
【０１２４】
１つの実施形態では、前記化学療法の併用は、プラチン（シスプラチンなど）およびフルオロウラシルまたはカペシタビンを含む。
【０１２５】
１つの実施形態では、前記化学療法の併用は、カペシタビンおよびオキサリプラチン（ゼロックス（Xelox））である。
【０１２６】
１つの実施形態では、前記化学療法は、フォリン酸および５−ＦＵの併用であり、所望によりオキサリプラチンを組み合わせてもよい。
【０１２７】
１つの実施形態では、化学療法は、所望によりオキサリプラチン（ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ）を組み合わせた、フォリン酸、５−ＦＵおよびイリノテカン（ＦＯＬＦＩＲＩ）の併用である。投与計画は以下から成る：イリノテカン（１８０ｍｇ／ｍ２、９０分間かけてＩＶ）、同時にフォリン酸（４００ｍｇ／ｍ２［または２×２５０ｍｇ／ｍ２］、１２０分間かけてＩＶ）；その後、フルオロウラシル（４００〜５００ｍｇ／ｍ２、ＩＶボーラス）、次にフルオロウラシル（２４００〜３０００ｍｇ／ｍ２、４６時間かけて点滴静注）。通例、このサイクルを２週間毎に繰り返す。上記の投与量はサイクル毎に変更してもよい。
【０１２８】
１つの実施形態では、前記化学療法の併用は、微小管阻害剤を使用し、例えば、硫酸ビンクリスチン、エポシロンＡ、Ｎ−［２−［（４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−３−ピリジニル］−４−メトキシベンゼンスルホンアミド（ＡＢＴ−７５１）、タキソール由来化学療法剤、例えばパクリタキセル、アブラキサン、もしくはドセタキセル、またはこれらの組合せを使用する。
【０１２９】
１つの実施形態では、前記併用はｍＴｏｒ阻害剤を使用する。ｍＴｏｒ阻害剤の例としては、エベロリムス（ＲＡＤ００１）、ＷＹＥ−３５４、ＫＵ−００６３７９４、パパマイシン（papamycin）（シロリムス）、テムシロリムス、デフォロリムス（ＭＫ−８６６９）、ＡＺＤ８０５５およびＢＥＺ２３５（ＮＶＰ−ＢＥＺ２３５）が挙げられる。
【０１３０】
１つの実施形態では、前記併用はＭＥＫ阻害剤を使用する。ＭＥＫ阻害剤の例としては、ＡＳ７０３０２６、ＣＩ−１０４０（ＰＤ１８４３５２）、ＡＺＤ６２４４（セルメチニブ）、ＰＤ３１８０８８、ＰＤ０３２５９０１、ＡＺＤ８３３０、ＰＤ９８０５９、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ、ＢＩＸ０２１８９またはＢＩＸ０２１８８が挙げられる。
【０１３１】
１つの実施形態では、前記併用はＡＫＴ阻害剤を使用する。ＡＫＴ阻害剤の例としては、ＭＫ−２２０６およびＡＴ７８６７が挙げられる。
【０１３２】
１つの実施形態では、前期併用はオーロラキナーゼ阻害剤を使用する。オーロラキナーゼ阻害剤の例としては、オーロラＡ阻害剤Ｉ、ＶＸ−６８０、ＡＺＤ１１５２−ＨＱＰＡ（バラセルチブ（Barasertib））、ＳＮＳ−３１４メシル酸塩、ＰＨＡ−６８０６３２、ＺＭ−４４７４３９、ＣＣＴ１２９２０２およびヘスペラジン（Hesperadin）が挙げられる。
【０１３３】
１つの実施形態では、前記併用はｐ３８阻害剤を使用し、例えば、Ｎ−［４−（｛４−［３−（３−ｔｅｒｔ−ブチル−１−ｐ−トリル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）ウレイド］ナフタレン−１−イルオキシ｝メチル）ピリジン−２−イル］−２−メトキシアセトアミドなどの、国際公開第２０１０／０３８０８６号で開示されたｐ３８阻害剤を使用する。
【０１３４】
１つの実施形態では、前記併用はＢｃｌ−２阻害剤を使用する。Ｂｃｌ−２阻害剤の例としては、メシル酸オバトクラックス、ＡＢＴ−７３７、ＡＢＴ−２６３（ナビトクラックス）およびＴＷ−３７が挙げられる。
【０１３５】
１つの実施形態では、前記化学療法の併用は、カペシタビン（ゼローダ）、リン酸フルダラビン、フルダラビン（フルダラ（fludara））、デシタビン、ラルチトレキセド（トムデックス）、塩酸ゲムシタビンおよびクラドリビンなどの代謝拮抗物質を含む。
【０１３６】
１つの実施形態では、前記併用は、免疫応答および／または腫瘍血管新生（tumour vasculation）の制御を支援し得るガンシクロビルを含む。
【０１３７】
１つの実施形態では、前記化学療法はＰＡＲＰ阻害剤を含む。
【０１３８】
１つの実施形態では、前記併用療法は、特異的なＤＨＯＤＨ酵素活性阻害によるがん代謝の阻害剤を含む。
【０１３９】
１つの実施形態では、本明細書における前記方法で使用される１または複数の治療法は、低用量の抗がん剤を用いた継続的または高頻度の治療であり、他の治療法と同時に与えられる場合が多い、メトロノミック療法である。
【０１４０】
１つの実施形態では、例えば２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回の、複数サイクルの治療（化学療法など）の使用が提供される。
【０１４１】
１つの実施形態では、前記化学療法は２８日サイクルで使用される。
【０１４２】
本開示のＧＬＡ成分は以下の感染症の１または複数の治療に適用することができる：アシネトバクター感染症（アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii））、放線菌症（イスラエル放線菌（Actinomyces israelii）、アクチノマイセス・ゲレンセリアエ（Actinomyces gerencseriae）およびプロピオニバクテリウム・プロピオニクス（Propionibacterium propionicus））、アフリカ睡眠病、別名アフリカトリパノソーマ症（ブルセイトリパノソーマ（Trypanosoma brucei））エイズ（後天性免疫不全症候群）（ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス））、アメーバ症（赤痢アメーバ（Entamoeba histolytica））、アナプラズマ症（アナプラズマ属菌種）、広東住血線虫症（アンギオストロンギルス）、アニサキス症（アニサキス）、炭疽（炭疽菌（Bacillus anthracis））、溶血性アルカノバクテリア（Arcanobacterium haemolyticum）感染症（溶血性アルカノバクテリア（Arcanobacterium haemolyticum））、アルゼンチン出血熱（フニンウイルス）、回虫症（回虫（Ascaris lumbricoides））、アスペルギルス症（アスペルギルス属菌種）、アストロウイルス感染症（アストロウイルス科）、バベシア症（バベシア属菌種）、セレウス菌感染症（セレウス菌（Bacillus cereus））、細菌性肺炎（複合細菌）、細菌性膣炎（細菌性膣炎微生物叢）、バクテロイデス感染症（バクテロイデス）、バランチジウム症（大腸バランチジウム（Balantidium coli））、バルトネラ症（バルトネラ）、バイリスアスカリス感染症（バイリスアスカリス）、ＢＫウイルス感染症（ＢＫウイルス）、黒色砂毛症（ピエドライア・ホルタ（Piedraia hortae））、ブラストシスチス感染症（Blastocystosis）（ブラストシスチス）、ブラストミセス症（ブラストミセス・デルマティティディス（Blastomyces dermatitidis））、ボリビア出血熱（マチュポウイルス）、ボツリヌス中毒および乳児ボツリヌス症（ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）；注：ボツリヌス中毒はボツリヌス菌（Clostridium botulinum）による感染症ではなく、ボツリヌス毒素の摂取により引き起こされる）、ブラジル出血熱（サビアウイルス）、ブルセラ症（ブルセラ）、腺ペスト（腸内細菌科）、バークホルデリア感染症（バークホルデリア）、ブルーリ潰瘍（マイコバクテリウム・ウルセランス（Mycobacterium ulcerans））、カリシウイルス感染症（カリシウイルス科（ノロウイルスおよびサポウイルス））、カンピロバクター症（カンピロバクター）、カンジダ症、別名鵞口瘡（カンジダ）、毛細虫症（フィリピン毛頭虫（Capillaria philippinensis）による腸疾患、肝毛頭虫（Capillaria hepatica）による肝疾患、および肺毛頭虫（Capillaria aerophila）による肺疾患）、カリオン病（バルトネラ・バシリホルミス（Bartonella bacilliformis））、ネコ引っ掻き病（ヘンセラ菌（Bartonella henselae））、蜂巣炎（通常、Ａ群レンサ球菌およびブドウ球菌）、シャーガス病、別名アメリカトリパノソーマ症（クルーズトリパノソーマ）、軟性下疳（軟性下疳菌（Haemophilus ducreyi））、ニワトリ痘（水痘帯状疱疹ウイルス）、チクングンヤ熱（アルファウイルス）、クラミジア（トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis））、肺炎クラミジア（Chlamydophila pneumoniae）感染症、別名ＴＷＡＲ（肺炎クラミジア（Chlamydophila pneumoniae））、コレラ（コレラ菌（Vibrio cholerae））、黒色分芽菌症（フォンセセア・ペドロソイ（Fonsecaea pedrosoi））、ツボカビ症（バトラコキトリウム・デンドロバチディス（Batrachochytrium dendrabatidis））、肝吸虫症（肝吸虫（Clonorchis sinensis））、クロストリジウム・ディフィシル大腸炎（クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile））、コクシジオイデス症（コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）およびコクシジオイデス・ポサダシ（Coccidioides posadasii））、コロラドダニ熱（コロラドダニ熱ウイルス）、感冒／急性ウイルス性鼻咽頭炎／急性コリーザ（通常、ライノウイルスおよびコロナウイルス）、クリミア‐コンゴ出血熱（クリミア‐コンゴ出血熱ウイルス）、クリプトコッカス症（クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans））、クリプトスポリジウム症（クリプトスポリジウム）、皮膚幼虫移行症（通常、ブラジル鉤虫（Ancylostoma braziliense）および多数の他の寄生虫）、シクロスポラ症（シクロスポラ・カエタネンシス（Cyclospora cayetanensis））、嚢虫症（有鉤条虫（Taenia solium））、サイトメガロウイルス感染症（サイトメガロウイルス）、デング熱（ＤＥＮ−１、ＤＥＮ−２、ＤＥＮ−３およびＤＥＮ−４などのデングウイルス）、二核アメーバ症（二核アメーバ（Dientamoeba fragilis））、ジフテリア（ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae））、裂頭条虫症（裂頭条虫）、メジナ虫症（メジナ虫（Dracunculus medinensis））、エボラ出血熱（エボラウイルス）、エキノコックス症（エキノコックス）、エーリキア症（エーリキア）、腸内細菌科（カルバペネム耐性腸内細菌科）、蟯虫症（蟯虫（Enterobius vermicularis））、エンテロコッカス感染症（エンテロコッカス）、腸内ウイルス（腸内ウイルス）、発疹チフス（Rickettsia prowazekii）、伝染性紅斑（パルボウイルスＢ１９）、突発性発疹（ヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ−６）およびヒトヘルペスウイルス７（ＨＨＶ−７））、肝蛭症（Fasciolasis）（肝蛭（Fasciola hepatica）および巨大肝蛭（Fasciola gigantica））、肥大吸虫症（ブスキ肥大吸虫（Fasciolopsis buski））、フィラリア症（フィラリア上科）、ウェルシュ菌（Clostridium perfringens）による食中毒（ウェルシュ菌（Clostridium perfringens））、自由生活アメーバ感染症（種々の病原体）、フソバクテリウム感染（フソバクテリウム）、ガス壊疽（通常、ウェルシュ菌などのクロストリジウム）、ジオトリクム症（ジオトリクム・カンジダム（Geotrichum candidum））、ジアルジア症（ランブル鞭毛虫（Giardia lamblia））、鼻疽（鼻疽菌（Burkholderia mallei））、顎口虫症（有棘顎口虫（Gnathostoma spinigerum）および剛棘顎口虫（Gnathostoma hispidum））、淋病（淋菌（Neisseria gonorrhoeae））、鼡径部肉芽腫（クレブシエラ・グラヌロマティス（Klebsiella granulomatis））、Ａ群連鎖球菌感染症（化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes））、Ｂ群連鎖球菌感染症（ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae））、インフルエンザ菌感染症（インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae））、手足口病（腸内ウイルス、主にコクサッキーＡ群ウイルスおよびエンテロウイルス７１（ＥＶ７１））、ハンタウイルス肺症候群（シンノンブレウイルス）、ハートランドウイルス病（ハートランドウイルス）、ピロリ菌感染症（ピロリ菌（Helicobacter pylori））、溶血性尿毒症症候群（大腸菌（Escherichia coli）、例えばＯ１５７：Ｈ７、Ｏ１１１および��１０４：Ｈ４）、腎症候性出血熱（ブニヤウイルス科）、Ａ型肝炎（Ａ型肝炎ウイルス）、Ｂ型肝炎（Ｂ型肝炎ウイルス）、Ｃ型肝炎（Ｃ型肝炎ウイルス）、Ｄ型肝炎（Ｄ型肝炎ウイルス）、Ｅ型肝炎（Ｅ型肝炎ウイルス）、単純ヘルペス（単純ヘルペスウイルス１型および２型（ＨＳＶ−１およびＨＳＶ−２）、ヒストプラズマ症（ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum））、鉤虫感染症（ズビニ鉤虫（Ancylostoma duodenale）およびアメリカ鉤虫（Necator americanus））、ヒトボカウイルス感染症（ヒトボカウイルス）、ヒトエールリヒア・エウィンギ症（Human ewingii ehrlichiosis）（エールリヒア・エウィンギ（Ehrlichia ewingii））、ヒト顆粒球性アナプラズマ症（アナプラズマ・ファゴサイトフィルム（Anaplasma phagocytophilum））、ヒトメタニューモウイルス感染症（ヒトメタニューモウイルス）、ヒト単球エールリヒア症（エールリヒア・シャフェンシス（Ehrlichia chaffeensis））、ヒトパピローマウイルス感染症（ヒトパピローマウイルス）、ヒトパラインフルエンザウイルス感染症（ヒトパラインフルエンザウイルス）、膜様条虫症（小型条虫（Hymenolepis nana）および縮小条虫（Hymenolepis diminuta））、エプスタイン・バーウイルス伝染性単核球症（エプスタイン・バーウイルス）、インフルエンザ（オルトミクソウイルス科）、イソスポーラ症（戦争イソスポーラ（Isospora belli））、川崎病、角膜炎（種々の病原体）、キンゲラ・キンゲ感染症（キンゲラ・キンゲ（Kingella kingae））、ラッサ熱（ラッサ熱ウイルス）、レジオネラ症、別名在郷軍人病（在郷軍人病菌（Legionella pneumophila））、レジオネラ症、別名ポンティアック熱（在郷軍人病菌（Legionella pneumophila））、レーシュマニア症（リーシュマニア）、ハンセン病（らい菌（Mycobacterium leprae）およびマイコバクテリウム・レプロマトシス（Mycobacterium lepromatosis））、レプトスピラ症（レプトスピラ）、リステリア症（リステリア菌（Listeria monocytogenes））、ライム病ボレノア（ライム病菌（Borrelia burgdorferi）、ボレリア・ガリニ（Borrelia garinii）、およびボレリア・アフゼリ（Borrelia afzelii））、リンパ系フィラリア症（バンクロフト糸状虫（Wuchereria bancrofti）およびマレー糸状虫（Brugia malayi））、リンパ球性脈絡髄膜炎（リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス）、マラリア（プラスモジウム）、マールブルグ出血熱（マールブルグウイルス）、麻疹（麻疹ウイルス）、中東呼吸器症候群（中東呼吸器症候群コロナウイルス）、類鼻疽（類鼻疽菌（Burkholderia pseudomallei））、髄膜炎（多種）、髄膜炎菌性疾患（髄膜炎菌（Neisseria meningitidis））、横川吸虫症（通常、横川吸虫（Metagonimus yokagawai））、微胞子虫症（微胞子虫門）、伝染性軟属腫（伝染性軟属腫ウイルス）、サル痘（サル痘ウイルス）、流行性耳下腺炎（流行性耳下腺炎ウイルス）、発疹熱（発疹熱リケッチア（Rickettsia typhi））、マイコプラズマ肺炎（肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae））、菌腫（放線菌腫）および真菌腫）、ハエ幼虫症（寄生性双翅目ハエ幼虫）、新生児結膜炎（最も一般的には、トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis）および淋菌（Neisseria gonorrhoeae））、ノロウイルス感染症（ノロウイルス）、ノカルジア症（ノカルジア、例えばノカルジア・アステロイデス（N. asteroides））、オンコセルカ症（回旋糸状虫（Onchocerca volvulus））、オピストルキス症（タイ肝吸虫（Opisthorchis viverrini）およびネコ肝吸虫（Opisthorchis felineus））、パラコクシジオイデス症（南アメリカ分芽菌（Paracoccidioides brasiliensis））、肺吸虫症（肺吸虫、例えばウエステルマン肺吸虫（Paragonimus westermani））、パスツレラ症（パスツレラ）、骨盤腹膜炎（種々の病原体）、百日咳（百日咳菌（Bordetella pertussis））、ペスト（ペスト菌（Yersinia pestis））、肺炎球菌感染症（肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae））、ニューモシスチス肺炎（ニューモシスチス・イロベチ（Pneumocystis jirovecii））、肺炎（種々の病原体）、灰白髄炎（ポリオウイルス）、プレボテラ感染症（プレボテラ）、原発性アメーバ性髄膜脳炎（通常、フォーラーネグレリア（Naegleria fowleri））、進行性多巣性白質脳症（ＪＣウイルス）、オウム病（オウム病クラミジア（Chlamydophila psittaci））、Ｑ熱（Ｑ熱コクシエラ（Coxiella burnetii））、狂犬病（狂犬病ウイルス）、回帰熱（ボレリア、例えばボレリア・ヘルムシ（B. hermsii）および回帰熱ボレリア（B. recurrentis））、呼吸器合胞体ウイルス感染症（呼吸器合胞体ウイルス）、リノスポリジウム症（リノスポリジウム・セーベリ（Rhinosporidium seeberi））、ライノウイルス感染症（ライノウイルス）、リケッチア感染症（リケッチア属菌種）、リケッチア痘症（痘瘡リケッチア（Rickettsia akari））、リフトバレー熱（リフトバレー熱ウイルス）、ロッキー山紅斑熱（Rickettsia rickettsii）、ロタウイルス感染症（ロタウイルス）、風疹（風疹ウイルス）、サルモネラ症（サルモネラ）、重症急性呼吸器症候群（ＳＡ
ＲＳコロナウイルス）、住血吸虫症（住血吸虫）、敗血症（種々の病原体）、細菌性赤痢（赤痢菌）、帯状疱疹（水痘帯状疱疹ウイルス）、天然痘（大痘瘡または小痘瘡）、スポロトリコーシス（スポロトリックス・シェンキイ（Sporothrix schenckii））、ブドウ球菌性食中毒（ブドウ球菌属）、ブドウ球菌感染症（ブドウ球菌）、糞線虫症（糞線虫（Strongyloides stercoralis））、亜急性硬化性全脳炎（麻疹ウイルス）、梅毒（梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum））、条虫症（条虫）、テタヌス（破傷風菌（Clostridium tetani））、須毛白癬（通常、白癬菌）、頭部白癬（トリコフィトン・トンズランス（Trichophyton tonsurans））、体部白癬（通常、白癬菌）、股部白癬（通常、有毛表皮糸状菌（Epidermophyton floccosum）、紅色白癬菌（Trichophyton rubrum）、および毛瘡白癬菌（Trichophyton mentagrophytes））、手白癬（Tinea manum）（紅色白癬菌（Trichophyton rubrum））、黒癬（通常、ホルタエア・ウェルネキイ（Hortaea werneckii））、足白癬（通常、白癬菌）、爪白癬（通常、白癬菌）、癜風（マラセジア）、トキソカラ症（イヌ回虫（Toxocara canis）またはネコ回虫（Toxocara cati））、トラコーマ（トラコーマクラミジア（Chlamydia trachomatis））、トキソプラズマ症（トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii））、旋毛虫症（旋毛虫（Trichinella spiralis））、トリコモナス症（腟トリコモナス（Trichomonas vaginalis））、鞭虫症（鞭虫（Trichuris trichiura））、結核（通常、ヒト型結核菌）、野兎病（野兎病菌（Francisella tularensis））、腸チフス（チフス菌（Salmonella enterica subsp. enterica, serovar typhi））、発疹チフス（リケッチア）、ウレアプラズマ・ウレアリチカム感染症（ウレアプラズマ・ウレアリチカム（Ureaplasma urealyticum））、渓谷熱（コクシジオイデス・イミチス（Coccidioides immitis）またはコクシジオイデス・ポサダシ（Coccidioides posadasii））、ベネズエラウマ脳炎（ベネズエラウマ脳炎ウイルス）、ベネズエラ出血熱（グアナリトウイルス）、ビブリオ・バルニフィカス感染症（ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus））、腸炎ビブリオ腸炎（腸炎ビブリオ（Vibrio parahaemolyticus））、ウイルス性肺炎（種々のウイルス）、西ナイル熱（西ナイルウイルス）、白色砂毛症（トリコスポロン・ベイゲリ（Trichosporon beigelii））、仮性結核菌感染症（仮性結核菌（Yersinia pseudotuberculosis））、エルシニア症（エンテロコリチカ菌（Yersinia enterocolitica））、黄熱（黄熱病ウイルス）、並びに接合菌症（接合菌類）。
【０１４３】
細胞内病原体
病原体が細胞内部に一度入り込むと、細胞環境によるある程度の保護がその病原体にかかり得るため、細胞内病原体は治療が最も困難なものであり得る。
【０１４４】
病原体は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物などであり得る。本開示の分子は細胞内病原体、特に本明細書で開示される細胞内病原体、の治療に特に有用である。
【０１４５】
有名な細胞内細菌としては、ヘンセラ菌（Bartonella henselae）、野兎病菌（Francisella tularensis）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、チフス菌（Salmonell typhi）、ブルセラ属、レジオネラ属、マイコバクテリウム属（ヒト型結核菌など）、ノカルジア属、ロドコッカス・エクイ（Rhodococcus equi）、エルシニア属、髄膜炎菌（Neisseria meninggitidis）が挙げられる。
【０１４６】
本開示の方法で使用するのに好適な細胞内病原体の治療に使用される１または複数の抗生剤は、エリスロマイシン、ドキシサイクリン、アジスロマイシン、リファンピン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、ドキシサイクリン、シプロフロキサシン、アンピシリン、トリメトプリムスルファメトキサゾール、クロラムフェニコール、ＴＭＰ−ＳＭＺ（トリメトプリムスルファメトキサゾール）、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン類、グリシルサイクリン類、エタンブトール、リファブチン、イミペネム、セフォタキシム、アミカシン、バンコマイシン、ミノサイクリン、ペニシリンＧ、アンピシリン、フルオロキノロン、アズトレオナム、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される。
【０１４７】
ヒト型結核菌は治療が困難であることで有名である。１つの独立した態様において、本開示は、１または複数のＴＢ薬がペイロードとして本明細書に記載のＧＬＡ成分と複合体形成された、潜伏結核および／または活動性結核の治療用の分子を提供する。
【０１４８】
本開示の分子は、マイコバクテリウムが位置している細胞内部に送達することによって、現在の医薬の有効性を大きく増加させることができ得る。
【０１４９】
ＴＢの治療は、ＴＢが潜在か活動性か、患者が成人か、小児か、妊婦か、ＨＩＶ陽性か、上記の組み合わせであるかを含む、いくつかの要因に依存している。以下の詳細は、本発明の全ての態様、例えば、どのような分子を調製し、患者を治療するためにそれらをどのように使用するか、に関する。
【０１５０】
ＨＩＶ患者および２〜１１歳の小児における潜在性結核の治療は、６〜９か月間、１日１回のイソニアジドである。妊婦患者は１日１回ではなく週２回治療され得る。
【０１５１】
すなわち、１つの実施形態では、本開示の分子において、前記ＧＬＡ成分はイソニアジドまたはその均等物を含むペイロードに連結されている。
【０１５２】
複雑化する要因のない１２歳齢以上の患者における潜在性ＴＢの治療は、３か月間、週１回のイソニアジドおよびリファペンチンの投与であり得る。あるいは、リファンピンは４か月間、１日１回投与され得る。
【０１５３】
すなわち、１つの実施形態では、前記ペイロードはリファペンチンをさらに含む。
【０１５４】
あるいは、本明細書に記載のＧＬＡドメインがリファペンチンを含むペイロードに連結された分子が提供され得る。本開示の分子の組み合わせも治療用に提供され得る。
【０１５５】
活動性結核の第一選択治療は、イソニアジド、リファンピン、エタンブトール、ピラジンアミド、およびこれらの２つ以上の組み合わせから選択される場合が多い。
【０１５６】
すなわち、リファンピンを含むペイロードに連結された本明細書に記載のＧＬＡ成分を含む、本開示の分子が提供される。
【０１５７】
また、エタンブトールを含むペイロードに連結された本明細書に記載のＧＬＡ成分を含む、本開示の分子が提供される。
【０１５８】
別の実施形態では、ピラジンアミドを含むペイロードに連結された本明細書に記載のＧＬＡ成分を含む、本開示の分子が提供される。
【０１５９】
ＴＢの治療に使用されるペイロードは、例えば以下などの、２種以上、例えば３種の薬剤または４種の薬剤を含み得ることが、明示的に企図される：イソニアジドとリファマイシン、イソニアジドとピラキシナミド、イソニアジドとエタンブトール、リファマイシンとピラキシナミド、リファマイシンとエタンブトール、ピラキシナミドとエタンブトール、イソニアジドとリファマイシンとピラキシナミド、イソニアジドとリファマイシンとエタンブトール、および、イソニアジドとリファマイシンとピラキシナミドとエタンブトール。
【０１６０】
ウイルス病原体としては、インフルエンザ、ヒト免疫不全ウイルス、デングウイルス、西ナイルウイルス、天然痘ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、韓国型出血熱ウイルス、ニワトリ痘、水痘帯状疱疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス１型または２型、エプスタイン・バーウイルス、マールブルグウイルス、ハンタウイルス、黄熱病ウイルス、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎またはＥ型肝炎、エボラウイルス、ヒトパピローマウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、狂犬病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ロタウイルス、ＨＩＶ（ＨＴＬＶ−１およびＨＴＬＶ−２など）が挙げられる。
【０１６１】
抗ウイルス剤は以下のうちの１または複数から独立して選択され得るＧＬＡ成分に連結され得る：アバカビル、アシクロビル、アシクロビル、アデホビル、アマンタジン、アンプレナビル、アンプリゲン、アルビドール、アタザナビル、アトリプラ、ボセプレビレルテット、シドホビル、コンビビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エドクスジン、エファビレンツ、エムトリシタビン、エンフビルチド、エンテカビル、侵入阻害剤、ファムシクロビル、ホミビルセン、ホスアンプレナビル、ホスカルネット、ホスホネット、ガンシクロビル、イバシタビン、イムノビル、イドクスウリジン、イミキモド、インジナビル、イノシン、インテグラーゼ阻害剤、ＩＩＩ型インターフェロン、ＩＩ型インターフェロン、Ｉ型インターフェロン、インターフェロン、ラミブジン、ロピナビル、ロビリド、マラビロック、モロキシジン、メチサゾン、ネルフィナビル、ネビラピン、ネクサビル、ヌクレオシド類似体、オセルタミビル、ペグインターフェロンα−２ａ、ペンシクロビル、ペラミビル、プレコナリル、ポドフィロトキシン、プロテアーゼ阻害剤、ラルテグラビル、逆転写酵素阻害剤、リバビリン、リマンタジン、リトナビル、ピラミジン（Pyramidine）、サキナビル、スタブジン、相乗増強剤（Synergistic enhancer）（抗レトロウイルス剤）、チャノキ油、テラプレビル、テノホビル、テノホビルジソプロキシル、チプラナビル、トリフルリジン、トリジビル、トロマンタジン、ツルバダ、バラシクロビル、バルガンシクロビル、ビクリビロック、ビダラビン、ビラミジン、ザルシタビン、ザナミビル、およびジドブジン。
【０１６２】
抗ウイルス剤が、例えば有効性を増大させるために、組み合わせて使用され得ることは、当該技術分野において周知である。
【０１６３】
すなわち、１つの実施形態では、本発明の分子は、原生動物疾患、例えばマラリア、アフリカ睡眠病など、を治療するためのペイロードを含んで提供される。
【０１６４】
有名な寄生原生動物としては、プラスモディウムタイプの寄生虫が挙げられ、例えばマラリアである。マラリアの治療に使用される薬物としては、例えば、キニーネおよび関連物質、クロロキン（choloroquine）、アモジアキン、ピリメタミン、プログアニル、スルホンアミド類、メフロキン、アトバコン、プリマキン、アルテミシニン（aremisinin）およびその誘導体、ハロファントリン、ドキシサイクリン、クリンダマイシン、スルファジアジン、並びにこれらの２つ以上の組み合わせなどがある。
【０１６５】
すなわち、実施形態において、本明細書に記載のＧＬＡ成分が１または複数の抗マラリア薬を含むペイロードに連結されている、本開示の分子が提供される。
【０１６６】
１つの実施形態では、本開示の分子は、賦形剤、希釈剤および／または担体を含む医薬組成物に含まれた状態で提供される。１つの実施形態では、前記組成物は非経口製剤としての組成物である。
【０１６７】
非経口製剤とは、胃腸管を通じて送達されないように設計された製剤を意味する。通例、非経口送達経路には注射、移植、または注入が含まれる。
【０１６８】
１つの実施形態では、前記非経口製剤は注射剤の形態である。注射には、静脈内注射、皮下注射、頭蓋内注射、くも膜下腔内注射、腫瘍内注射、または筋肉内注射が含まれる。注射とは、本明細書で用いられる場合、注射器を介した身体内への液体の挿入を意味する。
【０１６９】
１つの実施形態では、前記非経口製剤は点滴の形態をとる。
【０１７０】
注入とは、本明細書で用いられる場合、点滴、注入ポンプ、シリンジポンプ、または均等デバイスによる、より低速の液体の投与を意味する。１つの実施形態では、注入は、１．５分間〜１２０分間の範囲の期間に亘って、例えば、およそ、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、６５分、７０分、６５分、８０分、８５分、９０分、９５分、１００分、１０５分、１１０分、または１１５分間に亘って投与される。
【０１７１】
１つの実施形態では、前記製剤は静脈内（ＩＶ）投与用である。この経路は、大部分の臓器および組織に迅速にアクセス可能であるため特に有効であり、また、転移の治療、例えば確立した転移の治療に特に有用であり、とりわけ、肝臓および肺などの高度に血管が発達した領域に位置する転移の治療に有用である。
【０１７２】
治療用製剤は通例、製造および貯蔵の条件下で無菌且つ安定となる。前記組成物は、液剤、マイクロエマルジョン、リポソーム、またはヒトへの投与に好適な他の非経口製剤として製剤化することができ、注射器またはバイアルなどの充填済みデバイスとして、特に単回投与として、製剤化できる。
【０１７３】
前述の通り、前記製剤は通常、薬剤的に許容できる希釈剤または担体を含むことになり、例えば、ウイルスと適合性があり、且つウイルスがその中で必要な期間安定である、無毒の等張担体を含む。
【０１７４】
前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、およびその適切な混合物、を含有する溶媒または分散媒とすることができる。適切な流動性は、分散剤または界面活性剤、例えばレシチンまたは非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０またはポリソルベート４０、の使用などによって維持することができる。分散液中で、必要な粒径の維持を、界面活性剤の存在によって補助してもよい。等張剤の例としては、組成物中の、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムが挙げられる。
【０１７５】
１つの実施形態では、本開示のＧＬＡ成分と、当該ＧＬＡ成分に連結されたまたは連結されていないペイロードと、を含むパーツからなるキットが提供される。
【０１７６】
本明細書の文脈での「含む」は、「包含する」を意味することが意図されている。技術的に適切であれば、本発明の実施形態は組み合わせてもよい。各実施形態は特定の特徴／要素を含むものとして本明細書に記載されている。本開示は、前記特徴／要素を含む、またはそれらから本質的になる、別の実施形態も包含する。
【０１７７】
特許および出願などの技術参考文献は参照によって本明細書に援用される。
【０１７８】
技術背景は本明細書の技術開示の一部であり、そこでの議論は、当該分野および本技術の適用で遭遇した技術的問題の議論も含んでおり、先行技術の議論に限定されないので、補正の基礎として使用される場合がある。
【０１７９】
本明細書で具体的かつ明示的に記載されたあらゆる実施形態は、単独で、または１もしくは複数の別の実施形態と組み合わせて、権利放棄の根拠を形成する場合がある。
【０１８０】
以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらの実施例は単なる例示であり、本発明の範囲を限定するものとは決して解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１８１】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１ＤはＧＬＡタンパク質構造の種々の表現を示している。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図１Ｄ】同上。
【図１Ｅ】図１Ｅは本開示本開示のＧＬＡ成分の実施形態を示している。
【図２】図２Ａは過酸化物処理によりアポトーシス誘導された乳がん細胞株のプロテインＳ（ＰｒＳ）およびアネキシンの染色を示している。過酸化物処理され、ＦＩＴＣ−ＰｒＳで染色されたヒトＭＤＡ−２３１細胞。  図２ＢはＡと同様に染色された未処理ＭＤＡ−２３１細胞。  図２Ｃはアネキシン染色された処理後ＭＤＡ−２３１細胞。  図２Ｄは過酸化物処理され、ＰｒＳで染色されたヒトＭＣＦ−７細胞。  図２ＥはＤと同様に染色されたマウスＭＥＴ−１細胞。  図２ＦはＤと同様に染色されたマウス４Ｔ１細胞。
【図３】図３Ａは重なっているが、別々の、ＰｒＳとアネキシンの細胞局在を示している。過酸化物で処理され、Ｃｙ５  ＰｒＳ（赤）およびＦＩＴＣ  アネキシン（緑）で染色された、マウス４Ｔ１細胞。明るい矢印、共局在シグナル；赤い矢印、ＰｒＳでは染色されたがアネキシンでは染色されなかった細胞；緑色の矢印、アネキシンで比較的明るく染色され、ＰｒＳではより暗く染色された細胞染色であって、結合パターンの違いを示している（挿入図はＰｒＳ染色とアネキシン染色を別々に示している）。  図３ＢはＦＩＴＣ  ＰｒＳおよびＣｙ５  アネキシンで染色された処理後の４Ｔ１細胞。緑色の矢印、ＰｒＳでは染色されたがアネキシンでは染色されなかった細胞染色。  図３Ｃは１，０００倍過剰な冷アネキシンとプレインキュベートされた、処理後の４Ｔ１細胞のＣｙ５  アネキシン染色。
【図４】図４はＰｒＳおよびアネキシンによるアポトーシスＣＯＳ−１細胞の染色を示している。細胞を、記載の通りにｔ−ＢＨＰで処理し、ＦＩＴＣ  アネキシン（左）およびＣｙ５  ＰｒＳ（右）で染色した。矢印はアポトーシス小体と推定される細胞下構造を示している。
【図５】図５はＰｒＳおよびアネキシンによる細胞外小胞の染色の差異を示している。細胞外小胞を４Ｔ１細胞から用意し、ＦＩＴＣ  ＰｒＳ（緑）およびＣｙ５  アネキシン（赤）で染色した。矢印は、アネキシンのみ（赤色矢印）、ＰｒＳのみ（緑色矢印）および両方のタンパク質（明るい矢印）で染まっている小胞を示している。
【図６】図６ＡはＰｒＳおよびアネキシンの細胞内局在を示している。アポトーシス４Ｔ１細胞をＦＩＴＣ  ＰｒＳ（緑色矢印）およびＣｙ５アネキシン（赤色矢印）で染色した；明るい矢印は共局在である。  図６Ｃは予想アポトーシス小体。
【図７】図７ＡはＰｒＳの５分間以内の内部移行を示している。アポトーシス４Ｔ１細胞をＦＩＴＣ  ＰｒＳ（緑）およびＣｙ５  アネキシン（赤）で染色し、これらのタンパク質を添加した１０分以内にイメージングした。マージ画像。  図７Ｂはヘキスト核染色のみ。
【図８】図８はマウスの４Ｔ１腫瘍のＢＬＩ画像を示している。
【図９】図９は放射性標識したＰｒＳおよびアネキシンを用いた、４Ｔ１腫瘍に対するドキソルビシンの作用のＳＰＥＣＴイメージング。４Ｔ１乳がん腫瘍を有するマウスを、９９ｍＴｃ  ＰｒＳ（ＡおよびＢ）、またはアネキシン（ＣおよびＤ）を用いて、ドキソルビシンの前（ＡおよびＣ）およびドキソルビシンの２４時間後（ＢおよびＤ）にイメージングした。
【図１０】図１０はシクロヘキサミド処置マウスのＳＰＥＣＴイメージングを示している。処置前（ＡおよびＣ）および処置の２４時間後（ＢおよびＤ）の５匹／パネルのマウスが示されている。マウスのイメージングを、９９ｍＴｃ  ＰｒＳ（ＡおよびＢ）、またはアネキシン（ＣおよびＤ）のいずれかを用いて行い、矢印は肝臓シグナルの増加を示している。
【図１１】図１１はＣｙ５  ＰｒＳの感染脾臓への局在を示している。ＣＤ１マウスを生物発光性リステリアに感染させ、感染後２日目にイメージングした。このマウスには屠殺の３０分前にＣｙ５  ＰｒＳを注射し、その脾臓を摘出し、凍結した。軽微に感染したマウス（Ａ）および未感染の対照マウス（Ｃ）が示されている。Ｃｙ５チャネルにおける、各マウスの感染脾臓（Ｂ）および未感染脾臓（Ｄ）の切片が、位相差画像とマージされて示されている。
【図１２】図１２はドキソルビシンで処理された腫瘍へのＣｙ５  ＰｒＳの局在を示している。４Ｔ１乳がん腫瘍を移植したマウスを、ドキソルビシンで処置するか（右パネル）、または左は未処置（左パネル）とした。２４時間後、マウスにＣｙ５  ＰｒＳを静脈内注射し、３０分後に屠殺した。腫瘍を摘出し、凍結し、蛍光顕微鏡法用に切片化した。４匹の異なるマウスのマージ後のＣｙ５／位相差画像が示されている。
【図１３】図１３はＴＳＣの分化を示している。ＴＳＣを増殖因子の存在下（左）または非存在下（右）で培養した。右パネルの矢印は分化に特徴的な巨細胞を示している。
【図１４】図１４は栄養膜幹細胞および分化後のトロホブラストのＰｒＳ染色を示している。栄養膜幹細胞（左）は増殖因子の中止によりトロホブラスト巨細胞（右）に分化した。これらの細胞をＣｙ５  ＰｒＳで染色し、イメージングした。
【図１５】図１５はＭＳＣの分化を示している。ＭＳＣに、脂肪細胞（上段パネル）または骨芽細胞（下段パネル）へと分化させるための、本明細書に記載の通りの処理を行った。それぞれの場合で分化細胞は予想通りの形態を示した。
【図１６】図１６はＰｒＳ（緑）、アネキシン（赤）、およびヘキスト（青）で染色されたＭＳＣを示している。細胞は染色混合物の添加の１０分以内にイメージングした。
【図１７】図１７はＰｒＳ（緑、最も明るい領域）、アネキシン（赤、細胞膜の周りの明るい領域）、およびヘキスト（青）で染色されたＴＳＣを示している。細胞は染色混合物の添加の５分以内にイメージングした。
【図１８】図１８はＴＳＣ小胞の染色の差異を示している。ＴＳＣを図１７と同様に染色した。このグループの細胞は、アネキシン（赤）で染まるがＰｒＳ（緑）では染まらない大型の小胞を分泌している。
【図１９】図１９はＣ１７．２神経前駆細胞のＰｒＳ染色を示している。細胞をＰｒＳ−ＦＩＴＣで染色し、標準的（共焦点以外の）顕微鏡法でイメージングした。
【図２０】図２０は４ＣにおけるＴＳＣへのＰｒＳの内部移行を示している。ＦＩＴＣ  ＰｒＳ（緑）およびＣｙ５  アネキシン（赤）を４ＣでＴＳＣに添加し、共焦点顕微鏡でイメージングした。
【図２１】図２１はマウス骨髄由来のリネージネガティブな（lineage-negative）、ＳＣＡ−１／ｃ−ｋｉｔ染色細胞を示している。細胞は分析のこの時点ではＰＩ（ヨウ化プロピジウム；死細胞の検出用）でもＰｒＳでも染色されなかった。造血系が染色されていないこと（左パネル）と、ｃ−ｋｉｔおよびＳＣＡ１が染色されていること（右パネル）は、緑（最も明るい領域）で示される、ＨＳＣ集団を定義している。
【図２２】図２２は長期のＨＳＣのＰｒＳ染色。ＨＳＣを図１と同様に単離し、ＦＩＴＣ  ＰｒＳで染色した。Ｃｙ７を用いてＳＬＡＭパターンを求めた（Ｘ軸）。
【図２３】図２３は短期のＨＳＣのＰｒＳ染色。ＨＳＣを図１と同様に単離し、ＦＩＴＣ  ＰｒＳで染色した。Ｃｙ７を用いてＳＬＡＭパターンを求めた（Ｘ軸）。
【図２４】図２４は長期のＨＳＣにおけるＰｒＳの内部移行を示している。ＨＳＣを記載の通りに準備し、ＰｒＳ染色し、共焦点顕微鏡で観察した。緑（最も明るい領域）、ＦＩＴＣ  ＰｒＳ；青、ヘキスト核染色；赤、ＰＩ。なお、ＰＩ染色が核から除かれた場合、その細胞が生きていることを示している。
【図２５】図２５は核内ＰＩを示す死んだＨＳＣの例を示している。
【図２６】図２６はＧＬＡを介した取り込みは細胞にとって無毒である。
【実施例】
【０１８２】
本明細書は付属の配列表の配列１〜６も包含する。
【０１８３】
本プロジェクトにより、ＳＰＥＣＴ（単光子コンピュータ断層撮影法）用のインビボイメージング剤としての標識された組み換えＰｒＳの試験が開始された。驚くべきことに、前記分子はアポトーシス細胞に迅速に内部移行することが分かった。この予期せぬ発見から、この現象をさらに研究することとなり、そこで、ＰｒＳも、いくつかの種類の非アポトーシス性の幹細胞サブセットに内部移行されることが分かった。
【０１８４】
ＰｒＳは配列番号６に示されるプロテインＳ  ＧＬＡドメインおよびプロテインＳ  ＥＧＦドメインである。
【０１８５】
方法
蛍光のために、Ｃｙ５およびＦＩＴＣの複合体化を、それぞれＡｍｅｒｓｈａｍ（ＧＥヘルスケア社）およびＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（インビトロジェン社）標識化キットを製造業者の説明書に従って用いて達成した。両キットは未結合のフルオロフォアを除去するためのカラムを提供している。まず、アポトーシス細胞への結合の特異性を調べるために、１ｍｌ中０．７７ｍｇのＰｒＳ（第２画分）および１ｍｌ中０．７７ｍｇのアネキシンをＦＩＴＣで標識した。共局在および競合の研究のために、１ｍｌ中０．６８ｍｇのＰｒＳ（第３画分）および０．６８ｍｇのアネキシンをＣｙ５で標識した。共焦点顕微鏡法のために、第二の積荷（second shipment）からの０．７６ｍｇのＰｒＳをＦＩＴＣで標識し、以前に標識したＣｙ５結合型アネキシンを用いた。なお、正確な標識効率は測定されておらず、標識化キットの製造業者の説明書によれば、カラムからの回収率は８５％と推定されていた。従って、いずれの場合においても、２つのタンパク質の相対的な染色強度は、これらの偶発性を反映している可能性がある。細胞は最初３０分間染色したが、後に、５分未満で十分であることが確認された。アポトーシス細胞特異性についてＰｒＳを試験するために、まず、４種の乳がん細胞株、ヒトＭＤＡ−２３１およびヒトＭＣＦ７、並びにマウス４Ｔ１およびマウスＭＥＴ−１、を使用した。その後、サル腎細胞のＣＯＳ−１も使用した。アポトーシスは過酸化水素またはｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド（ｔ−ＢＨＰ）で誘導した。細胞を２４ウェルプレートに６×１０４細胞／ウェルで播種するか、またはＥｐｐｅｎｄｏｒｆチャンバースライドに１×１０４細胞／ウェルで播種し、翌日、３０分〜２時間の時点において２ｍＭのＨ２Ｏ２またはｔ−ＢＨＰを用いてアポトーシスを誘導した。誘導後、ウェルをＡｎｎｅｘｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＡＢ；サンタクルーズ・バイオテクノロジー社）で洗浄し、標識タンパク質で染色した。過去の経験および文献から、５．５μｇ／ｍｌのアネキシンタンパク質を染色に用いた。この量は、提供されたゲル画像に基づいてアネキシンの分子量を３６ｋＤ、組み換えＰｒＳの分子量を３０ｋＤと仮定して、ＰｒＳと等モルの添加量となるよう調整した。細胞は１５分間染色した。核酸の可視化のためにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素を用いた。次に、ウェルをＡＢで洗浄し、ＥＶＯＳ蛍光顕微鏡で生細胞のまま観察した。共焦点顕微鏡法のために、スタンフォード細胞科学イメージング施設（Stanford Cell Sciences Imaging Facility）のライカ社製ＳＰ８顕微鏡を利用した。次に、ウェルをＡＢで洗浄し、ライカ社製ｓｐ８顕微鏡で観察した。核の可視化のためにＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素を用いた。毒性試験のために、ＰｒＳを栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）に添加し、ネクセロム社製Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒを用いて、トリパンブルーにより生存率を試験した。
【０１８６】
腫瘍を検出する能力について標識タンパク質を試験するために、５×１０４個の４Ｔ１−ｌｕｃ細胞を５匹／群の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの、左腋窩脂肪パッドに移植した。マウスは、移植の１週間後から開始して、腫瘍成長をモニターするために、毎日インビボ生物発光イメージング（ＢＬＩ）でイメージングした。次に、マウスを移植後１１日目に１３ｍｇ／ｋｇ体重の腹腔内（ＩＰ）ドキソルビシンで処置し、翌日にＢＬＩを行った。腫瘍を有する対照マウスはドキソルビシンによる処置を行わなかった。処置の４８時間後、静脈内トレーサー注射（１．３ｇ／ｋｇのウレタンでＩＰ麻酔）の１時間後に、シングルヘッドＡ−ＳＰＥＣＴガンマカメラ（ガンマ・メディカ社（Gamma Medica））を用いてマウスをイメージングした（１ｍｍピンホールコリメータ、１２８工程で１２８×１２８イメージングマトリックス、１５秒／工程、２．７ｃｍ  ＲＯＲ；ＦＯＶ＝胸郭上部／頸部）。各タンパク質の注射量は１６０μｌ（８００μＣｉ）であった。その後、動物を屠殺し、体内分配を実施した。シクロヘキサミド処置実験は、５匹／群の若齢（７週齢）雄Ｓｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒマウスを麻酔（１．３ｇ／ｋｇのウレタンＩＰ）し、５０ｍｇ／ｋｇのシクロヘキシミドを静脈内注射した。シクロヘリキシミド注射の１時間４５分後に、トレーサーを注入した（ＰｒＳ＝１８０μｌ／１．２ｍＣｉ／投与；アネキシンＶ＝１７０μｌ／１．０５ｍＣｉ／投与）。トレーサー注射の４５分後、マウスを、Ａ−ＳＰＥＣＴガンマカメラ上のシングルヘッド平行孔コリメータ（１２８×１２８マトリックス）を用いて、１０分間の静止全身画像を撮像した。
【０１８７】
生きた動物の感染によるアポトーシス部位への蛍光ＰｒＳの特異的局在を調べるために、ＣＤ１マウスに生物発光性リステリア菌（Listeria monocytogenes）を静脈内注射した。この病原性微生物は脾臓を含む多くの臓器に感染し、単球や顆粒球の広範なアポトーシスを引き起こす。感染後の特定の時期において、脾臓は細菌複製の主要な場所であるため、脾臓における細菌由来ＢＬＩシグナルは、アポトーシス用のプローブの局在と相関させることができる。マウスを感染させ、毎日撮像した。脾臓シグナルが明確になったら（８週齢ＣＤ１雌マウスにおいて２×１０５コロニー形成単位の細菌の感染後２日目）、３００ｍｇ／ｋｇ体重のＣｙ５  ＰｒＳをマウスに注射し、３０分後に動物を屠殺し、脾臓を摘出し、ＯＣＴで凍結し、蛍光顕微鏡法用に切片化した。未感染の対照マウスを使用した。
【０１８８】
フローサイトメトリーは、アーヴィング・ワイズマン研究室のＣｈａｒｌｅｓ  Ｃｈａｎによって実施された。上記のように作製された、新たに標識したＦＩＴＣ  ＰｒＳを使用した。マウス造血幹細胞（ＨＳＣ）はこの研究室でルーチンで純化されている。細胞は、ｃ−Ｋｉｔ＋、リネージネガティブな細胞を染色することにより、正常なマウス骨髄から単離した。細胞をさらに特徴付けるために、ＳＬＡＭマーカー染色も実施した。これらのマーカーは自己複製および分化を行う細胞を染色するが、非染色のＨＳＣは分化のみが可能である。結果に示されているように、その後のＦＩＴＣ  ＰｒＳによる染色で、ＳＬＡＭ染色細胞の陽性率が明らかとなった。その後、ＦＩＴＣについて細胞をソーティングし、核の可視化のためにＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２を使用して共焦点顕微鏡で調べた。
【０１８９】
結果
細胞培養におけるアポトーシス状況下でＰｒＳ結合特異性を評価するために、いくつかのヒトおよびマウス乳がん細胞株を用いた。上記のように過酸化物でアポトーシスを誘導し、ＦＩＴＣ  ＰｒＳ結合を評価した。これらの実験の例を図２に示す。未処理細胞は図２のパネルＢに示されるような最小限の結合を示した。過酸化物の濃度およびインキュベーション時間は、濃度が高く且つ／またはインキュベーション時間が長くなるほど細胞が剥離し、染色および顕微鏡法が不可能となるため、一部の細胞のみが影響を受けるように選択した。さらに、多くの影響を受けていない細胞の存在は、各視野内の内部陰性対照の役割を果たした。ＦＩＴＣ−アネキシンは、ＰｒＳと同様のアポトーシス特異性を示し、内部陽性対照として機能した。次に、この２つのタンパク質の共局在および競合的結合について試験した。共局在化については、ＦＩＴＣ標識したＰｒＳおよびアネキシン、並びにＣｙ５標識したＰｒＳおよびアネキシンの両方を作製した。４Ｔ１細胞を過酸化物で処理し、Ｃｙ５標識したＰｒＳおよびアネキシン、並びにＦＩＴＣ標識したＰｒＳおよびアネキシンで染色することで、両方のフルオロフォアの組み合わせを用いた。次に、ＥＶＯＳ蛍光顕微鏡で細胞を可視化した。結果を図３に示す。試験した条件下では、明るく染まっている細胞全てが、両方のタンパク質による染色を示した。しかし、Ｃｙ５を使用したかＦＩＴＣを使用したかにかかわらず、ＰｒＳは、弱いながらも、アネキシンが染色しなかったいくつかの細胞を染色したようであった（図３）。各タンパク質による異なる細胞の相対的な染色強度は、２つのプローブの間で異なることがあった。すなわち、アネキシンが２つの細胞を同じ強度で染色し、ＰｒＳが染色しないこともあれば、その逆もあった（図３Ａ、緑色の矢印および挿入図）。このように、両プローブは概して同じ細胞を染色しても、微妙な違いを示すように思われた。競合アッセイでは、漸増する過剰量の未標識アネキシンをアポトーシス４Ｔ１細胞と共に１５分間プレインキュベートした後、細胞をＣｙ５  ＰｒＳで染色した。驚くべきことに、これらのタンパク質は露出したＰＳという同じ標的分子に結合すると考えられているが、ＰｒＳの染色は、試験された最多過剰量である１，０００倍の過剰アネキシンによってさえも遮断されなかった（図３Ｃ）。アネキシンとＰｒＳの共染色は、多くの細胞型で確認された。この２つのタンパク質は概して各細胞型で同じ細胞を染色したが、他の差異が明らかになった。特に、細胞よりも小さな物体の中には、染色に違いがあるものがあった（図４）。これらの物体は、過酸化物処理後に存在数が増加し、アポトーシス体、すなわちアポトーシス細胞が断片化する際に生じた膜結合型細胞断片と解釈された。図４に示すように、これらの物体の一部は両方のタンパク質で染まったが、ＰｒＳはこれらの実体を染色したが、アネキシンは染色しなかった。この観察は予想外のものであった。細胞内実体の染色の差異をさらに調べるために、標準的な遠心分離プロトコルを用いて、４Ｔ１マウス腫瘍細胞から細胞外小胞（ＥＶ）を調製した。この２つのタンパク質は、これらの小胞の染色にも差異があり（図５）、この結果は、生物学的��よび治療的な意味合いを持つ可能性がある。
【０１９０】
ＥＶ、具体的にはエキソソーム、微小小胞体（ＭＶ）、アポトーシス小体（ＡＢ）は、生体分子の細胞間移動を介した細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たしていると推定されている。これらの種類のＥＶの生合成は異なっており、エンドソーム（エキソソーム）もしくは原形質膜（ＭＶ）のいずれかに由来するか、またはプログラム細胞死の産物（ＡＢ）である。全ての哺乳類細胞はＥＶを分泌すると考えられている。各種ＥＶは、隣接する細胞と離れた細胞の両方にカーゴ（cargo）分子を移動させることで、腫瘍の発生や進行に関与するような細胞の行動に影響を与え得る。実際、ＥＶは、増殖シグナルの維持、増殖抑制の回避、細胞死への抵抗、エネルギー代謝の再プログラミング、ゲノム不安定性の獲得、および腫瘍微小環境の発達といった、がんのほぼすべての特徴に関与している可能性がある。また、ＥＶは血管新生の誘導、浸潤の制御、前転移ニッチの惹起、炎症の持続、および免疫監視機構の回避とも関連付けられている。免疫細胞もＥＶを介して連絡していると思われ、ＥＶを腫瘍細胞、感染組織、創傷からのシグナルとして認識し得る。ＥＶのバイオロジーとがんの特徴へのその貢献をより深く理解することは、がんの診断と治療の新たな可能性に繋がる。この分野の発展には、さらなるＥＶ表面マーカーの開発が不可欠であり、ＰｒＳはそのような決定因子になり得る。
【０１９１】
蛍光顕微鏡法によるこれらの研究に続いて、ＰｒＳおよびアネキシンによる染色の細胞内局在を共焦点顕微鏡で評価した。マウス４Ｔ１細胞（Ｌｕｃ−ＧＦＰレポーター欠損）を、８分割チャンバースライド上に１×１０４細胞／チャンバで播種し、翌日に２ｍＭ  Ｈ２Ｏ２またはｔ−ＢＨＰ（２時間曝露）でアポトーシスを誘導した。その後、細胞を洗浄し、ＰｒＳおよびアネキシンで１５分間染色した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２色素を用いて核酸を染色した。全ての場合において、最も明るく染まった細胞は両方のプローブで染色されていた。しかし、多くの細胞で、細胞質に標識ＰｒＳが見られたが、標識アネキシンは見られなかった（図６）。アネキシンは内部移行され、少数の細胞の小胞内にあると思われるが、表面局在化したＰｒＳと、内部移行したアネキシンは同一細胞内で一緒には観察されなかった。この２つのタンパク質は共にＰＳと結合すると推定されているため、これらの結果は予想外の結果であった。ＰｒＳの内部移行をさらに研究するために、タイムコース実験を実施した。アポトーシス４Ｔ１細胞を、Ｃｙ５  アネキシンおよびＦＩＴＣ  ＰｒＳで５分間染色し、プローブの添加から５分以内に観察した。ＰｒＳは、これらの細胞の細胞質に直ちに観察され、５分以内の内部移行が示された（図７）。また、タイムコース画像により、ＰｒＳとアネキシンが、初期の時点では同じ細胞を必ずしも等しくは染色しないことが示された。図７の細胞は異なる段階のアポトーシス中と思われ、左側の細胞は見かけ上インタクトな核膜に囲まれた凝集していない核を示しており、右の細胞は、アポトーシスプロセスの後半に起こる染色体凝縮の特徴となる場合が多い強い染色を示している。このような染色パターンは、ＰｒＳがアネキシンよりもアポトーシスのより早期に結合することを示している可能性がある。この時点では単なる推測ではあるが、このような選好性は、これまでに確認されたこれらのタンパク質間の違いの多くを説明するだろう。例えば、図３Ａおよび図３Ｂのように、一部の細胞がＰｒＳによっては染色されるが、アネキシンでは染色されないのは、アポトーシスのプロセスの早期にＰｒＳが結合しているからである可能性がある。生きた動物におけるＰｒＳの局在を調べるために、いくつかの実験を実施した。これらの研究では、アポトーシスを誘導することが知られているドキソルビシンで処理した腫瘍へのＰｒＳの局在化に加え、ｉｎ  ｖｉｖｏでの化学的および感染によるアポトーシス誘導を用いた。ＨＹＮＩＣ標識したＰｒＳおよびアネキシンを用いたＳＰＥＣＴイメージングを、４Ｔ１ｌｕｃ乳腺腫瘍を与え、ドキソルビシンで処置した動物で実施した。４Ｔ１腫瘍はルシフェラーゼで標識されているため、インビボ生物発光画像法（ＢＬＩ）を用いることで４Ｔ１腫瘍をマウスでイメージングすることができる。この実験から得られた画像の１つを図８に示す。この方法は、腫瘍の移植を評価し、個々の動物における進行を経時的に追跡することに用いることができる。次に、９９ｍＴｃ標識したＰｒＳおよびアネキシンを、ドキソルビシンおよび対照で処理した動物のＳＰＥＣＴイメージングに使用した。結果の一例を図９に示す。２匹の動物の頭部および胸郭の画像は��唾液腺におけるＰｒＳプローブの非特異的な蓄積を示しており、このプローブを用いた場合のＳ／Ｎ比の低さを示している。したがって、示されているＰｒＳ画像の表示の閾値を下げて、バックグラウンドをより多く取り除いた結果、より明るい着色画像が得られた。Ｓ／Ｎ比の低さは、１ｍｇのタンパク質のみのＨＹＮＩＣ標識が最適以下であること、また、ＨＹＮＩＣ：タンパク質標識比の対照試験を実施できないことに起因すると考えられる。
【０１９２】
また、肝臓でアポトーシスを誘導するシクロヘキサミドで処置したマウスのＳＰＥＣＴイメージングを実施した（図１０）。図１０では、５匹のマウスの全身画像が各パネルに示されている。多くの放射性標識プローブと同様に、バックグラウンドが腎臓に見られる。マウスをシクロヘキサミドで処置した場合、肝臓におけるアネキシンＳＰＥＣＴシグナルが増加した。ここでも、ＰｒＳはアネキシンと比較して低いシグナルを示した。アネキシンはシクロヘキサミド処置マウスのアポトーシスを起こした肝臓を検出することができたが、ＰｒＳは処置による肝臓におけるシグナル増加をごくわずかに示しただけであった。ＳＰＥＣＴイメージングとは独立してアポトーシス組織および処置腫瘍へのＰｒＳの局在化を調べるため、またＨＹＮＩＣ標識の付随する合併症を調べるために、アポトーシス応答を誘導する細菌に感染したマウスおよび腫瘍担持マウスにＣｙ５  ＰｒＳを注射した。感染には、ルシフェラーゼで標識され、ＢＬＩについてよく特徴付けられた病原性微生物であるリステリア菌（Listeria monocytogenes）を使用した。脾臓からの特徴的なＢＬＩシグナルは、良好な共局在研究を可能にする。ＣＤ１マウスを上記と同様に感染させ、感染後２日目にＢＬＩでイメージングした。その後、マウスにＣｙ５  ＰｒＳを注射し、３０分後に屠殺し、切片作製と蛍光顕微鏡法のために脾臓を摘出した（図１１）。全ての場合において、感染マウスからの脾臓切片は、対照よりもはるかに大きなＣｙ５蛍光シグナルを示した。図１１において、図示されている感染マウスは光子数が少なかったが、このことは、この動物では感染がまだそれほど進行していないことを示している。多くのマウスはこの日に脾臓からこの１０倍のシグナル強度を示した。しかし、Ｃｙ５チャネルの蛍光は、図示されている未感染対照と比較しても、非常に強いものであった。顆粒球およびマクロファージがこのような動物におけるアネキシンシグナルの主な供給源であることが示されている（これらの細胞は、組織の破壊を制限するためにアポトーシスをプログラムされている）ことから、この結果は、感染に対し進行中の自然免疫応答を反映している可能性がある。
【０１９３】
次に、ドキソルビシンで処置した４Ｔ１腫瘍への蛍光ＰｒＳの局在性を試験した。腫瘍を移植したマウスを、上述と同様にドキソルビシンで処置し、Ｃｙ５  ＰｒＳを静脈内注射し、３０分後に屠殺し、切片作製および蛍光顕微鏡法のために腫瘍を摘出した。結果を図１２に示す。強い染色領域が処置動物で観察されたのに対し、未処置の腫瘍切片からはそれよりも控えめなシグナルが観察された。いくつかの未処置腫瘍は、バックグラウンドよりもシグナルが高い小領域を示したが、未処置切片のいずれにおいても、処置腫瘍と同様の強度のシグナルは観察されなかった。
【０１９４】
幹細胞は、分化細胞とは表現型が異なり、免疫応答の誘導を避けるために非アポトーシス的にＰＳを発現することがある。栄養膜幹細胞（ＴＳＣ）は、培養下でいくつかの種類のトロホブラストに分化する。ＴＳＣは、マウス子宮擦過標本から、線維芽細胞増殖因子、アクチビン、およびヘパリンの存在下での増殖により作製される。これらの因子を培地から除去すると、ＴＳＣは自然に巨大細胞に分化する（図１３）。ＴＳＣはＰｒＳで染まったが、培養下でこれらの細胞から派生した分化後トロホブラストは染まらなかった（図１４）。また、ＰｒＳがアポトーシス誘導なしで幹細胞に内部移行されることも確認した。この結果は、アポトーシスが誘導された癌化細胞株での観察結果を裏付けるものである。アポトーシスが誘導されない場合、腫瘍細胞で観察された染色は最小限のものであった。幹細胞内への内部移行を調べるために、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）とＴＳＣを使用した。ＭＳＣはマウス骨髄から用意した。マウスから骨髄をフラッシュし、成長因子の非存在下で６日間培養した。このインキュベーションの間、ＭＳＣおよび造血幹細胞（ＨＳＣ）は複製するが、一方、線維芽細胞は接着するが、数世代を超えては増殖しない。６日後には、単層が見えるようになる。トリプシン処理により継代すると、接着したＭＳＣは保持されるが、浮遊状態で増殖するＨＳＣは失われる。線維芽細胞は、増殖因子がないために持続性がなく、保持もされない。従って、この単純な手順によって、ほぼ均質なＭＳＣの集団が得られる。これらの細胞の同一性を確認するために、培養物をデキサメタゾンとグリセロールリン酸（骨芽細胞への分化を誘導する）またはデキサメタゾンとインドメタシン（脂肪細胞への分化を誘導する）で別々に処理した。結果を図１５に示す。上記の処理に応答して、分化後の細胞は、それぞれの細胞の外観を示した。脂肪細胞は大きな脂肪小胞を含み、骨芽細胞は特有の細胞内コラーゲンとミネラル化を伴って黒色を呈した。
【０１９５】
細胞内染色パターンを評価するために、未分化ＭＳＣをＰｒＳおよびアネキシン、並びにＨｏｅｃｈｓｔ核染色試薬で染色し、共焦点顕微鏡で観察した。観察の結果を図１６に示す。ＰｒＳは急速に内部移行した。ＭＳＣの場合、約２０個に１個の割合でＰｒＳで染まり、以前のデータと一致したが、染色の正確な割合は求めなかった。ＭＳＣの形態は不均一であり、これらの細胞は培地中に大量の物質を分泌し、その一部がチャンバースライドの表面に接着して、画像の一部にバックグラウンドを生じる。それでもなお、データは、表面にアネキシンを添加した５分以内の、ＰｒＳの内部移行を明確に示している。また、ＴＳＣをＭＳＣで行ったように染色およびイメージングした。観察により、これらの細胞への内部移行が同様に確認され、この内部移行も、タンパク質添加の５分以内に生じている。結果を図１７に示す。ＴＳＣは、形態学的に非常に可変的であり、図から分かるように、分化がない場合には多核であることがある。ＭＳＣと同様、これらの初代細胞は培地中に大量の物質を放出しており、その一部は細胞外小胞と確認されている（以前のデータ）。ここでも、この物質によりイメージングが困難となる。いくつかのＥＶはＰｒＳでは染まるが、アネキシンでは染まらず、この現象は、図１８の、ＴＳＣにおいて確認できる。このＴＳＣのクラスターの画像では、細胞によって放出されている小胞は、アネキシンでは染まるが、内部化されるＰｒＳでは染まらない。これらのパターンから、ＰｒＳおよびアネキシンの特異性および結合標的に関する、興味深い疑問が提起される。この２つのタンパク質はどちらもＰＳと結合すると言われている。しかし、ＥＶへの結合性の差異や細胞内局在パターンの違いから、両者は全く同じ様式で結合しているわけではないことが示唆される。この違いの根拠を明らかにするにはさらなる研究が必要となるが、その重要性が証明される可能性がある。また、インビトロでアストロサイトおよび他の神経細胞への分化が可能な形質転換細胞株である、神経前駆細胞株Ｃ１７．２のＰｒＳ染色を観察した（図１９）。この割合は推定値であるが、これらの形質転換細胞の約５％が染まった。驚くべきことに、ＴＳＣへの侵入は、細胞が４℃に冷やされた場合でも発生した（図２０）。しかしながら、チャンバーを顕微鏡上に置いてから、継続的に冷やすことができなかったことには留意されたい。それにもかかわらず、イメージング手順の５分間の時間枠内では、温度はそれほど上昇できなかった。この結果は、刺激的ではあるが、明らかに、より制御された条件の下で反復される必要がある。この発見が証明されれば、そのメカニズムは非常に興味深いものになることであろう。
【０１９６】
我々は造血幹細胞（ＨＳＣ）をＰｒＳで染色することに成功した。フローサイトメトリーを用いて、ＨＳＣがＰｒＳで染まっていることを確認し、これらの細胞におけるＰｒＳの内部移行を共焦点顕微鏡で観察した。ＨＳＣを同定し、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）を用いて単離した。この細胞は、骨髄において、リネージネガティブな、ＳＣＡ／ｃ−ｋｉｔ陽性細胞として同定された（図２１）。次に、これらをＦＩＴＣ−ＰｒＳで染色した。短期および長期の２つのＨＳＣ集団は、ＳＬＡＭマーカー染色のパターンで同定することができる。ＳＬＡＭ（Signaling Lymphocyte Activation Molecule）マーカーであるＣＤ４８、ＣＤ１５０、ＣＤ２２９、およびＣＤ２４４は、ＳＬＡＭパターン陽性の染色は自己複製と分化の両方の能力を示すのに対し、ＳＬＡＭパターン陰性のＨＳＣは分化のみ可能であることを示すというように、造血幹細胞の染色に特徴的なパターンで差異が生じる。ＰｒＳは長期のＨＳＣサブセットを染め（図２２）、短期のＨＳＣ（図２３）も染めた。図示されている細胞はヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陰性であり、これは、これらの細胞が全て生細胞であることを意味している。この結果は、幹細胞サブセットがアポトーシスの誘導なしでＰｒＳで染まることを示す以前の実験を裏付けるものである。
【０１９７】
次に我々は、ＰｒＳのＨＳＣへの内部移行についての試験へと進んだ。この実験は多くの要因により複雑なものとなった。おそらく、最も困難であったのは、一晩の間に培地中で大量に死んでしまう、ＨＳＣの培養下での生存であった。従って、フローサイトメトリー解析と共焦点顕微鏡観察が同じ日に行われるように実験の時間を設定する必要があった。さらに、この細胞は接着しないため、顕微鏡観察が最適なものにならない。顕微鏡観察をより効率的なものとするために、細胞を培地小滴中に再懸濁した。最後に、顕微鏡法で分析したＰｒＳ染色細胞がまだ生きていることを確認する必要があった。多くのＨＳＣは、分析および単離の過程で死滅した。そのため、Ｈｏｅｓｃｈｔ核染色に加えてＰＩを添加してスキャンし、別のチャネルを使用した。ＰＩで明るい核の存在により、死細胞が示された。このようにタイミングは困難で複雑であったが、実験を行うことができ、生きたＨＳＣへのＰｒＳの内部移行が確認された（図２４）。核内ＰＩ染色がないことにより、細胞の生存が確認された。しかし、図２５に示すように、一部の細胞は死滅したか、死滅しつつあった。図示された実験は複雑さで長期のものであったが、結果は内部移行を示している。
【０１９８】
最後に、図２６では、ＴＳＣの予備的な毒性試験を行っており、１３５μｇ／ｍｌの濃度では、ＰＢＳと比較して、３０分後に生存率が７８％から７４％へと、ごく最小限の範囲でのみ低下することが確認された。このレベルでは、培養液量の１０％がＰｒＳ含有液であったことを考慮すると、この結果は、ＰｒＳは基本的に幹細胞に無毒であり、観察された軽度の毒性は調製物それ自体の汚染内容物に起因する可能性が高いという、定性的な観察を裏付けるものであった。ＰｒＳの濃度が低い場合は、生存率に対する影響は示されなかった。試験した最高レベルのタンパク質は、染色に使用した濃度の１０００倍超であった。この毒性試験は正式にはこのプロジェクトの一部ではなく、完全な毒性研究にはより広範な試験が必要にとなるが、この毒性試験では、ＰｒＳはほとんど毒性を示さなかった。
【０１９９】
要約
以上の結果から、ＰｒＳが様々な種類の幹細胞を含む様々なＰｒＳ発現細胞に迅速に内部移行することが示されたが、このことは、ＰｒＳが治療薬の開発を目的とした操作に適したユニークな特徴を持っていることを示唆している。また、図３および図７などから分かる、ＰｒＳとアネキシンの特異性の差異は、これら２つのタンパク質の間では結合それ自体が異なることを示唆している。アネキシンが四量体であり、ＰｒＳが単量体であるという事実だけでは、これらの違いを説明することはできず、これらのデータは、細胞表面上のいくつかの他の成分がＰｒＳの結合に関与している可能性を示唆している。ＰｒＳの結合、特異性、および内部移行の機構、並びにモジュラー操作性は、多くの可能性を提供している。
【０２００】
実施例２
幹細胞は、分化細胞とは表現型が異なり、免疫応答の誘導を避けるために非アポトーシス的にＰＳを発現することがある。幹細胞を、アポトーシスを誘導せずに、蛍光標識のペイロードを含む本開示のＧＬＡドメイン分子で染色した。
【０２０１】
胎盤内の数種類のトロホブラストに分化する栄養膜幹細胞（図１４）は、プロテインＳで染まったが、培養下のこれらの細胞から派生した分化後のトロホブラストは染まらなかった。この染色によって、インビボで分化した幹細胞とインビトロで分化した細胞を区別することができた。
【０２０２】
このデータから、本開示の分子は、インビボの標的細胞に対して、またはエキソビボの試料中で、使用することができる。
【０２０３】
結論
様々な細胞型を用いて、プロテインＳがアポトーシス細胞と結合することが示された。非アポトーシス対照細胞のバックグラウンド染色は最小限であった。また、いくつかの細胞タイプを用いて、プロテインＳの染色がアネキシンの染色と比較された。興味深いことに、プロテインＳは、アネキシンでは全く染まらなかった見かけのアポトーシス小体を染めることがわかった。この結果は予想外であり、プロテインＳとアネキシンは共にＰＳと結合するため、特異性に違いがあるとは予想されていなかった。このような違いを示す更なる証拠として、１，０００倍の過剰アネキシンがプロテインＳの結合を阻止できなかったことがある。繰り返しになるが、この結果は、この２つのタンパク質が全く同じ分子標的に結合するならば、理解が困難なものであった。共焦点顕微鏡を用いて、プロテインＳとアネキシンの細胞内局在を研究したところ、同じ細胞内であっても、これら２つのタンパク質には顕著な違いが示された。種々の細胞型で、アネキシンが主に表面に局在していたのに対し、プロテインＳはほとんどの場合で細胞内に存在していた。このことは、プロテインＳがバイオデリバリービヒクルとして開発できることを示唆している。タイムコース実験では、プロテインＳは結合後１０分以内に内部移行することが明らかになった。これらの実験ではまた、プロテインＳがアポトーシスの過程でアネキシンよりも早期に結合するという可能性の証拠も得られている。この急速な取り込みについて、この興味深いメカニズムの更なる研究が必要であることは明らかであり、プロテインＳのバイオデリバリー剤としての開発に重要な意味を持つ可能性がある。また、アポトーシス腫瘍や化学的に誘導された肝臓のアポトーシスのＳＰＥＣＴイメージングのために、プロテインＳをＨＹＮＩＣ結合型の９９ｍＴｃで標識し、同様に標識したアネキシンと比較したところ、シクロヘキサミド処置した動物では、９９ｍＴｃプロテインＳの肝臓シグナルのわずかな増加が観察された。リステリアモデルと乳がんモデルの両方において、Ｃｙ５  プロテインＳはアポトーシス組織に優先的に局在し、どちらの場合も強い信号対雑音を示した。
【０２０４】
要約すると、プロテインＳは細胞培養液中および生体内でアポトーシスに対して特異性を示した。注目すべきことに、このタンパク質は、アネキシンと比較した場合に、異なる特異性と細胞内局在性を示し、プロテインＳの内部移行は迅速に起こり、これは、さらなる研究に値する側面である。
参考文献
1. Thompson, W.W., et al., Estimates of US influenza-associated deaths made using four different methods. Influenza Other Respir Viruses, 2009. 3(1): p. 37-49.
2. Osterholm, M.T., et al., Efficacy and effectiveness of influenza vaccines: a systematic review and meta-analysis. Lancet Infect Dis, 2012. 12(1): p. 36-44.
3. Dixit, R., et al., Emergence of oseltamivir resistance: control and management of influenza before, during and after the pandemic. Infect Disord Drug Targets, 2013. 13(1): p. 34-45.
4. Jefferson, T., et al., Oseltamivir for influenza in adults and children: systematic review of clinical study reports and summary of regulatory comments. BMJ, 2014. 348: p. g2545.
5. Godfrey, C., et al., Delivery is key: lessons learnt from developing splice-switching antisense therapies. EMBO Mol Med, 2017. 9(5): p. 545-557.
6. Kaczmarek, J.C., P.S. Kowalski, and D.G. Anderson, Advances in the delivery of RNA therapeutics: from concept to clinical reality. Genome Med, 2017. 9(1): p. 60.
7. Ling, H., Non-coding RNAs: Therapeutic Strategies and Delivery Systems. Adv Exp Med Biol, 2016. 937: p. 229-37.
8. Poon, I.K., et al., Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nat Rev Immunol, 2014. 14(3): p. 166-80.
9. Birge, R.B., et al., Phosphatidylserine is a global immunosuppressive signal in efferocytosis, infectious disease, and cancer. Cell Death Differ, 2016. 23(6): p. 962-78.
10. Amara, A. and J. Mercer, Viral apoptotic mimicry. Nat Rev Microbiol, 2015. 13(8): p. 461-9.
11. Moller-Tank, S. and W. Maury, Phosphatidylserine receptors: enhancers of enveloped virus entry and infection. Virology, 2014. 468-470: p. 565-80.
12. Ludwig, S., et al., MEK inhibition impairs influenza B virus propagation without emergence of resistant variants. FEBS Lett, 2004. 561(1-3): p. 37-43.
13. Sharma, R., et al., Detection of phosphatidylserine-positive exosomes for the diagnosis of early-stage malignancies. Br J Cancer, 2017. 117(4): p. 545-552.
14. Azuma, K., et al., Liver-specific gamma-glutamyl carboxylase-deficient mice display bleeding diathesis and short life span. PLoS One, 2014. 9(2): p. e88643.
15. Hjortoe, G., et al., Factor VIIa binding and internalization in hepatocytes. J Thromb Haemost, 2005. 3(10): p. 2264-73.
16. Meliopoulos, V.A., et al., Host gene targets for novel influenza therapies elucidated by high-throughput RNA interference screens. FASEB J, 2012. 26(4): p. 1372-86.
17. Pleschka, S., et al., Influenza virus propagation is impaired by inhibition of the Raf/MEK/ERK signalling cascade. Nat Cell Biol, 2001. 3(3): p. 301-5.
18. Makkoch, J., et al., Human microRNAs profiling in response to influenza A viruses (subtypes pH1N1, H3N2, and H5N1). Exp Biol Med (Maywood), 2016. 241(4): p. 409-20.
19. Wolf, S., et al., MicroRNA Regulation of Human Genes Essential for Influenza A (H7N9) Replication. PLoS One, 2016. 11(5): p. e0155104.
20. Skalickova, S., et al., Perspective of Use of Antiviral Peptides against Influenza Virus. Viruses, 2015. 7(10): p. 5428-42.
21. Matsubara, T., et al., Sialic acid-mimic peptides as hemagglutinin inhibitors for anti-influenza therapy. J Med Chem, 2010. 53(11): p. 4441-9.
22. Wunderlich, K., et al., Identification of a PA-binding peptide with inhibitory activity against influenza A and B virus replication. PLoS One, 2009. 4(10): p. e7517.
23. Ozcan, G., et al., Preclinical and clinical development of siRNA-based therapeutics. Adv Drug Deliv Rev, 2015. 87: p. 108-19.
24. Mack, S., et al., Pseudo-Ligandless Click Chemistry for Oligonucleotide Conjugation. Curr Protoc Chem Biol, 2016. 8(2): p. 83-95.
25. Paredes, E. and S.R. Das, Click chemistry for rapid labeling and ligation of RNA. Chembiochem, 2011. 12(1): p. 125-31.
26. Zheng, Y. and P.A. Beal, Synthesis and evaluation of an alkyne-modified ATP analog for enzymatic incorporation into RNA. Bioorg Med Chem Lett, 2016. 26(7): p. 1799-802.
27. Jain, N., et al., Current ADC Linker Chemistry. Pharm Res, 2015. 32(11): p. 3526-40.
【図１Ａ】
2020533404.tif 000003
【図１Ｂ】
2020533404.tif 000004
【図１Ｃ】
2020533404.tif 000005
【図１Ｄ】
2020533404.tif 000006
【図１Ｅ】
2020533404.tif 000007
【図２】
2020533404.tif 000008
【図３】
2020533404.tif 000009
【図４】
2020533404.tif 000010
【図５】
2020533404.tif 000011
【図６】
2020533404.tif 000012
【図７】
2020533404.tif 000013
【図８】
2020533404.tif 000014
【図９】
2020533404.tif 000015
【図１０】
2020533404.tif 000016
【図１１】
2020533404.tif 000017
【図１２】
2020533404.tif 000018
【図１３】
2020533404.tif 000019
【図１４】
2020533404.tif 000020
【図１５】
2020533404.tif 000021
【図１６】
2020533404.tif 000022
【図１７】
2020533404.tif 000023
【図１８】
2020533404.tif 000024
【図１９】
2020533404.tif 000025
【図２０】
2020533404.tif 000026
【図２１】
2020533404.tif 000027
【図２２】
2020533404.tif 000028
【図２３】
2020533404.tif 000029
【図２４】
2020533404.tif 000030
【図２５】
2020533404.tif 000031
【図２６】
2020533404.tif 000032
【配列表】
2020533404000001.app
【国際調査報告】
2020533404.tif 000033
2020533404.tif 000034
2020533404.tif 000035