(57)【要約】  本発明は、家畜ワクチンの分野、特にＰＣＶ２及び関連する疾患に対するブタワクチンに関する。特に、本発明は、昆虫細胞での発現時のそれの核蓄積を防止するために、突然変異がＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質で必要であり；その突然変異がアミノ酸位置１３１にプロリンを導入するものであるという知見に関連する。これにより、昆虫細胞での効率的な発現、容易な回収が可能となり、多量のウィルス様粒子が得られる。ＶＬＰは、ＰＣＶ２による感染の又は関連する疾患徴候の軽減のためのブタ用ワクチンにおいて非常に有効である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．遺伝子型２ｂのブタサーコウィルス２（ＰＣＶ２ｂ）からのＯＲＦ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び
ｂ．前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結されている転写制御配列
を含む異種核酸を含む昆虫細胞であって、
前記ヌクレオチド配列が、アミノ酸位置番号１３１にプロリンを有する変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質をコードすることを特徴とする昆虫細胞。
【請求項２】
転写制御配列が、バキュロウィルスｐ１０遺伝子プロモーター又はバキュロウィルスポリへドリン遺伝子プロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載の昆虫細胞。
【請求項３】
異種核酸が、組換えバキュロウィルスゲノム中に含まれていることを特徴とする、請求項１又は２に記載の昆虫細胞。
【請求項４】
変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質のウィルス様粒子（ＶＬＰ）であって、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質がアミノ酸位置番号１３１にプロリンを有することを特徴とする粒子。
【請求項５】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の昆虫細胞での変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の発現方法であって、該方法は、バキュロウィルス−昆虫細胞発現系を用いる、方法。
【請求項６】
アミノ酸位置番号１３１にプロリンを有する変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の製造方法であって、該方法が、
−請求項１〜３のいずれか１項に記載の昆虫細胞を培養する段階；及び
−昆虫細胞培養液から変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を回収する段階
から選択される一方又は両方の段階を含む方法。
【請求項７】
薬学的に許容される担体中に変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を含む、ＰＣＶ２による感染の若しくは関連する疾患徴候の軽減のためのブタ動物用ワクチンであって、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質がアミノ酸位置番号１３１にプロリンを有することを特徴とするワクチン。
【請求項８】
変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質がＶＬＰの形態であることを特徴とする、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
アジュバントを含む、請求項７又は８に記載のワクチン。
【請求項１０】
更に、ブタ動物に対して病原性である微生物抗原を含む、請求項７〜９のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１１】
ブタ動物におけるＰＣＶ２による感染の又は関連する疾患徴候の軽減方法であって、請求項７〜１０のいずれか１項に記載のワクチンを前記ブタ動物に投与することを含む方法。
【請求項１２】
ＰＣＶ２による感染の又は関連する疾患徴候の軽減のためのブタ動物用ワクチンの製造のための、アミノ酸位置番号１３１にプロリンを有する変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の使用。
【請求項１３】
ＰＣＶ２による感染の又は関連する疾患徴候の軽減のためのブタ動物用ワクチンにおいて使用される、アミノ酸位置番号１３１にプロリンを有する変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質。
【請求項１４】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のワクチンの調製方法であって、該方法は、
−アミノ酸位置番号１３１にプロリンを有する変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を、薬学的に許容される担体と混合する段階；及び
−変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質及び薬学的に許容される担体の前記混合物を、アジュバントと製剤化する段階
から選択される１以上の段階を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、家畜ワクチン、特にＰＣＶ２に対するブタワクチンの分野に関する。具体的には、本発明は、変異体ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を発現する異種核酸配列を含む昆虫細胞、その変異体ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質のウィルス様粒子、前記昆虫細胞又は前記変異体ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の製造若しくは使用方法、並びにブタ用ワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
ブタサーコウィルス２（ＰＣＶ２）は、世界的に生じる、多くの動物を罹患させ、農業部門に重大な経済的損失を生じさせるブタの病原体である。総覧については、ギレスピーらの報告（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら，２００９，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．２３，ｐ．１１５１−１１６３）を参照する。
【０００３】
ＰＣＶ２は、サーコウィルス科に属し、約１．７６ｋｂの円形一本鎖ＤＮＡゲノムを含む、小さい（１７ｎｍ）２０面体非エンベロープビリオンを有する。そのゲノムは、数個のオープン・リーディング・フレームを含み、そのうち、ＯＲＦ２は、主要なウィルス中和エピトープを含むウィルスカプシドタンパク質をコードする。
【０００４】
ＰＣＶ２は、比較的安定であり、非常に感染性が高い。それは、異なる種類の身体分泌物を介して排出され、ブタの群れにおいて水平及び垂直の両方で広がり得る。ＰＣＶ２感染によって生じる主要な病変はリンパ欠乏であり、その結果生じる免疫抑制によって、感染動物は、二次又は同時感染も受けやすくなる。結果的にＰＣＶ２は、多くのブタ疾患症候群に関与し、それはブタサーコウィルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）と総称される。最も顕著なＰＣＶＡＤは、若いブタで認められる「離乳後多臓器消耗症候群」（ＰＭＷＳ）である。ＰＭＷＳの臨床徴候及び病理には、進行性の衰弱、呼吸困難、頻呼吸、そして場合により、黄疸（ｉｃｔｅｒｕｓ）及び黄疸（ｊａｕｎｄｉｃｅ）を含む。他のＰＣＶＡＤは、ブタ呼吸器疾患症候群、ブタ皮膚炎及び腎症症候群、生殖障害、肉芽腫性腸炎、先天性振戦及び滲出性表皮炎である。総覧については、ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １１ｔｈ  ｅｄ．，２０１６，ＩＳＢＮ：９７８０９１１９１０９３３；ａｎｄ：″Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｓｗｉｎｅ″，１０ｔｈ  ｅｄ．，２０１２，ＩＳＢＮ：９７８０８１３８２２６７９を参照する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅら，２００９，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．，  ｖｏｌ．２３，ｐ．１１５１−１１６３
【非特許文献２】ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  １１ｔｈ  ｅｄ．，２０１６，ＩＳＢＮ：９７８０９１１９１０９３３；ａｎｄ：″Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｓｗｉｎｅ″，１０ｔｈ  ｅｄ．，２０１２，ＩＳＢＮ：９７８０８１３８２２６７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
しかしながら、二次感染がなければ、ＰＣＶ２感染豚の大半は、見かけ上健常なブタでの成長低下及び動作低下を除き明瞭な疾患症状を示さない場合がある。ＰＣＶ２によって引き起こされるＰＣＶＡＤの（潜在性）臨床症状は、通常は３若しくは４週齢以降からブタで観察され得るものであり、その時期は、仔ブタが離乳し母体由来の防御抗体が低下し始める。
【０００７】
ＰＣＶ２感染及びそれの関連する疾患徴候に対して保護を行うため、いくつかのワクチンが市販されており、それらは非常に大量に世界中で使用されている。異なる種類のＰＣＶ２ワクチンには、例えば、不活化ＰＣＶ２ウィルス（Ｃｉｒｃｏｖａｃ（商標名）、Ｍｅｒｉａｌ）に基づくワクチン、又は不活化キメラＰＣＶ１／ＰＣＶ２ウィルス（Ｓｕｖａｘｙｎ（商標名）ＰＣＶ、Ｆｏｓｔｅｒａ（商標名）ＰＣＶ、Ｚｏｅｔｉｓ）に基づくワクチンがある。しかしながら、最も一般的なものは組換え発現ＰＣＶ２カプシドタンパク質に基づくサブユニットワクチンであり、一般に、ＯＲＦ２タンパク質（Ｉｎｇｅｌｖａｃ（商標名）ＣｉｒｃｏＦＬＥＸ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ；及び：Ｃｉｒｃｕｍｖｅｎｔ（商標名）ＰＣＶ、Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（商標名）ＰＣＶ、ＭＳＤＡＨ）と称される。ＯＲＦ２タンパク質サブユニットワクチンは、一般に組換え発現系でのＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子の発現によって産生され、バキュロウィルス−昆虫細胞発現系が最も多く使用される。発現ＯＲＦ２タンパク質は自己集合して、ウィルスゲノム量を持たない以外は天然ＰＣＶ２ビリオンに似るウィルス様粒子（ＶＬＰ）となることから、非複製的である。そのようなＰＣＶ２  ＯＲＦ２  ＶＬＰに基づくワクチンは、非常に安定であり、アジュバントとともに製剤した場合に高度に免疫原性であり、そして、ＰＣＶ２抗体に対して血清陽性であるか否かを問わず、全ての動物齢のブタに安全であることを示している。ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質に基づくワクチンの代表的な総用量は、投与体積２ｍＬ／動物中にＯＲＦ２タンパク質約８０μｇを含む。しかしながら、これらのサブユニットワクチンは、ＯＲＦ２約２０μｇ／動物の用量ですでに効力がある（ＥＰ１．９２６．４９６を参照する。）。それらは、シングル・ショット・ワクチンとして投与することができ、異なる投与経路によって、例えば筋肉投与（ＩＭ）、皮下投与（ＳＣ）、又は皮内投与（ＩＤ）によって投与することができる。
【０００８】
ＰＣＶ２種内で、そのウィルスの異なる遺伝子型がある。これらは、それらのＯＲＦ２遺伝子間の遺伝学的距離によって識別することができ、過去においては多様な命名法が用いられてきた。しかしながら、セガールズら（Ｓｅｇａｌｅｓら，２００８，Ｖｅｔ．Ｒｅｃ．，ｖｏｌ．１６２，ｐ．８６７−８６８）が、ＰＣＶ２遺伝子型を決定及び命名するために現在標準となっている方法を公開した。現在認められているＰＣＶ２の５種類の異なる遺伝子型のうち、ＰＣＶ２ａ、ＰＣＶ２ｂ及びＰＣＶ２ｄという３種類のみが、現在当該分野において動物学的関連性があるものである。
【０００９】
現在、市販のＰＣＶ２ワクチンは全てＰＣＶ２ａに基づくものであるが、遺伝子型ＰＣＶ２ｂ及び２ｄが当分野では優勢になりつつあるように思われる。総覧については、Ｋａｒｕｐｐａｎｎａｎ＆Ｏｐｒｉｅｓｓｎｉｇ，２０１７，Ｖｉｒｕｓｅｓ，ｖｏｌ．９，ｐ．９，  ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ９０５００９９を参照する。これらの著者は、これらの遺伝子型間で十分なレベルの交差保護があると結論付けているが、概して、型相同性ワクチンを用いることが好ましい。結果的に、やはりＰＣＶ２ａ以外のＰＣＶ２遺伝子型についても、安全、安価及び効果的なワクチンを製造することが当分野において必要とされている。
【００１０】
ＷＯ２００９／０００４５９（ゲント大学）には、ＯＲＦ２タンパク質に基づくＰＣＶ２の抗原性若しくは病原性変異体を確認するための診断法、特にそのために有用な方法及び抗体が記載されている。二つのＰＣＶ２ｂ株からのＯＲＦ２の核酸及びアミノ酸配列が記載されている。モノクローナル抗体による認識のプロファイルを変えることを目的として、ＯＲＦ２タンパク質のいくつかの突然変異が提案されている。多くの提案された突然変異の中で、一つは、アミノ酸位置１３１のトレオニンのプロリンへの変異である。しかしながら、ＷＯ２００９／０００４５９は、ＰＣＶ２ａの未変異（野生型）株（Ｓｔｏｏｎ  １０１０、１１２１）及びＰＣＶ２ｂ（４８２８５）の血清試験を十分に開示しているのみであり、昆虫細胞における野生型ＰＣＶ２ａ株の一つ（Ｓｔｏｏｎ  １０１０）からの未変異ＯＲＦ２の発現のみを開示している。
【００１１】
次に、サハら（Ｓａｈａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．９３，ｐ．１５４８−１５５５）は、特に、変異ＰＣＶ２ゲノムの感染性クローンのトランスフェクションによる、ＰＫ−１５細胞でのＴ１３１Ｐ突然変異があるＰＣＶ２ａ  ＯＲＦ２タンパク質の発現を記載している。
【００１２】
ＷＯ２０１０／０６８９６９（Ｖｅｃｔｏｇｅｎ）には、ＯＲＦ２のウィルスベクター送達によるＰＣＶ２に対するワクチン接種の方法が記載されており、それによって、「核局在化シグナル」、即ちＯＲＦ２のＮ末端４１アミノ酸の置換又は除去によりＯＲＦ２タンパク質が変異している。次に、結果的に、ＯＲＦ２が細胞質で発現されるようになるか、ベクター感染細胞から分泌される。好ましいウィルスベクターは、ブタアデノウィルスである。
【００１３】
ＷＯ２０１５／０５１０９９（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）には、ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２コード配列に突然変異を導入することで、バキュロウィルス−昆虫細胞でのＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質及びそれのウィルス様粒子の発現レベルを上昇させる方法が記載されており、開示の突然変異は、アミノ酸位置６３のアルギニンの、好ましくはトレオニンへの置換である。ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２のアミノ酸位置１３１での突然変異については全く言及がなく、昆虫細胞でのこのタンパク質の発現に伴う問題については全く情報がない。
【００１４】
ＥＰ１７１８４６３０（Ｉｎｔｅｒｖｅｔ  Ｉｎｔ．  ＢＶ）には、ＰＣＶ２ワクチンにおいて、ＰＣＶ２ｂ遺伝子型のＯＲＦ２タンパク質が、異種遺伝子型ＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｄに対する同種保護だけでなく、良好な交差保護も提供することが認められたことが開示されている。この効果は、予想外に、ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質２０μｇ未満／動物用量という非常に低量であっても得られた。結果的に、低用量のＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質でブタにワクチン接種することが、全ての現在のＰＣＶ２株に対する有効な免疫保護を提供するのに十分であろう。
【００１５】
タンパク質の組換え発現のための昆虫細胞の使用は公知であり、異なる方法で適用され、即ち、生存昆虫で、初代昆虫細胞で又は培養液中の不死化昆虫細胞系での発現である。最も使用される昆虫細胞は、例えばスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）属又はトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）属からのような鱗翅目起源のものである。これらの細胞の使用は、一般のバキュロウィルス−昆虫細胞発現系に関連することが多く、ここで、組換えバキュロウィルスを用いて、培養液中で鱗翅目細胞を感染させる。バキュロウィルスは、そのウィルスが細胞培養液中で複製する場合には必要ない多くの強いプロモーターを含み、そしてこれらを用いて異種遺伝子の発現を駆動することができる。
【００１６】
本発明の目的は、昆虫細胞でのＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質の組換え発現を最適化する方法を提供することによって、先行技術における欠点を克服し、当分野におけるニーズに対応することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
ＯＲＦ２タンパク質サブユニットに基づくＰＣＶ２ワクチンの製造を研究した時に、本発明者らは、昆虫細胞におけるＰＣＶ２ｂ遺伝子型ウィルス株からのＯＲＦ２タンパク質の組換え発現が、ＰＣＶ２ａ遺伝子型のＯＲＦ２タンパク質の場合ほど簡単ではないことを発見した。発現ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質は、それが発現される昆虫細胞の核で蓄積する自然の傾向を有することが認められた。この形態では、ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の合計発現レベルはかなり低下しており、そのタンパク質は、下流プロセシングによって回収及び精製することが非常に困難であることが明らかになり、アグレッシブ解離を用いた場合であってもＯＲＦ２タンパク質はごく少量しか単離できなかった。さらに、単離できた少量のタンパク質においてはＶＬＰはごく少量であり；明らかに、核局在化が、ＯＲＦ２タンパク質が自己アセンブリしてＶＬＰとなるのを著しい度合いで防止した。結果的に、この発現タンパク質の免疫原性がかなり低下した。
【００１８】
驚くべきことに、非常に特異的なアミノ酸置換がＰＣＶ２ｂのＯＲＦ２タンパク質に導入された場合、昆虫細胞における発現時の核蓄積が大きく防止できることが認められた。
【００１９】
その特異的アミノ酸置換には、全長ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の位置１３１において天然に起こるアミノ酸のプロリンアミノ酸への変化が関与していた。位置１３１にプロリンがあると、発現変異体ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質（「ＯＲＦ２ｂ−１３１Ｐ」）のほとんどが、核で蓄積するのではなく昆虫細胞の細胞質で生じた。これにより、合計発現レベルが上昇し、並びに、これらの昆虫細胞からの変異体ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の回収がかなり容易になることが認められており、この細胞質状態では、衝撃が少ない標準的な単離手順を用いることができたことから、多量のタンパク質を容易に単離できた。さらに、ＯＲＦ２ｂ−１３１Ｐのほとんどが、効果的にアセンブルされてブタ用のＰＣＶ２ワクチンで非常に有効なＶＬＰとなったことが認められた。
【００２０】
これは、特にＰＣＶ２ａ  ＯＲＦ２タンパク質での状況と比較した場合に予想外のものであり、一方、ＰＣＶ２ｂウィルスからのＯＲＦ２タンパク質では、位置１３１の天然アミノ酸は代表的にはトレオニンであるが、ＰＣＶ２ａウィルスでは一部は１３１位にトレオニンを有し、一部はプロリンを有する。しかしながら、昆虫細胞で発現される場合、ＰＣＶ２ａ  ＯＲＦ２の二つの変異体のいずれも核で蓄積しない。結果的に、この特定のアミノ酸位置が、昆虫細胞で発現される場合に、ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質について認められた核蓄積の原因であると推測するに足るものは全く示されていない。
【００２１】
さらにより顕著な点として、昆虫細胞での発現時にやはり核蓄積を示すＰＣＶ２ｄ  ＯＲＦ２タンパク質は、位置１３１のそれの天然トレオニンがプロリンに置換された後の細胞質発現パターンに逆戻りできなかった。
【００２２】
明らかに、昆虫細胞でのＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質の発現を取り巻く状況は、各遺伝子型ごとに特有のものである。
【００２３】
１３１Ｐへのアミノ酸置換が昆虫細胞での発現時に核でのＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の蓄積をどのようにして防止するかはわかっていない。本発明者らは、これらの所見を説明する可能性がある理論やモデルに拘束されることを望むものではないが、ＰＣＶ２ｂ遺伝子型のＯＲＦ２タンパク質においてこの特定位置にプロリンアミノ酸を有することで、このＯＲＦ２タンパク質の特性に変化が誘発されると推測される。その変化は、例えば、ＯＲＦ２タンパク質の３次元折りたたみ又は疎水性プロファイルに影響する可能性があり、それが昆虫細胞内部でのそれの経路に影響し得る。
【００２４】
この発見は、組換え発現ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の利用可能性及び抗原的性質を改善することで多くの有利な用途に道を開くものである。そして、これによって、有効なブタ用ＰＣＶ２サブユニットワクチンを容易に大規模製造できるようになるが、というのも、それを単離するのに解離性が高い化合物や複雑な技術が全く必要ないことから、その発現タンパク質を安価で安全かつ効率的な方法で製造することができる。
【００２５】
このようにして、本発明の１以上の目的を満たすことが可能であり、その結果、先行技術の１以上の欠点を克服することができる。
【００２６】
従って、１態様において、本発明は、
ａ．遺伝子型２ｂのブタサーコウィルス２（ＰＣＶ２ｂ）からのＯＲＦ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び
ｂ．前記ヌクレオチド配列に動作可能に連結されている転写制御配列
を含む異種核酸を含む昆虫細胞であって、
前記ヌクレオチド配列が、アミノ酸位置番号１３１にプロリンを有する変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質をコードすることを特徴とする昆虫細胞に関するものである。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】組換えバキュロウィルスによる感染を介して異なるＰＣＶ２  ＯＲＦタンパク質を発現する昆虫細胞の培養物からのサンプルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの走査を示す図である。
【００２８】
列番号及び列の内容についての表示は、ゲル画像の上に描かれている。
【００２９】
列１及び１８：分子量マーカー；ｋＤａでの分子量を画像の左に示してある。
【００３０】
列２〜５：ウィルス３によって感染した細胞；列２：上清；列３〜５：細胞ペレット、それぞれ３０、２０及び１０μＬ。
【００３１】
列６〜９：ウィルス６によって感染した細胞；列６：上清；列７〜９細胞ペレット、それぞれ３０、２０及び１０μＬ。
【００３２】
列１０〜１３：ウィルス７によって感染した細胞；列１０：上清；列１１〜１３細胞ペレット、それぞれ３０、２０及び１０μＬ。
【００３３】
列１４〜１７：ＢＳＡタンパク質の基準サンプル、それぞれ０．２５、０．５、１及び２μｇ。
【図２】組換えバキュロウィルスによる感染を介して異なるＰＣＶ２  ＯＲＦタンパク質を発現する昆虫細胞の培養物からのサンプルでのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの走査を示す図である。
【００３４】
列番号及び列の内容についての表示は、ゲル画像の上に描かれている。
【００３５】
列１及び１６：分子量マーカー；ｋＤａでの分子量を画像の左に示してある。
【００３６】
列２〜５：ウィルス８によって感染した細胞；列２：上清；列３〜５細胞パレット、それぞれ３０、２０及び１０μＬ。
【００３７】
列６〜９：ウィルス９によって感染した細胞；列６：上清；列７〜９細胞ペレット、それぞれ３０、２０及び１０μＬ。
【００３８】
列１０：空。
【００３９】
列１１〜１５：ＢＳＡタンパク質の基準サンプル、それぞれ０．２５、０．５、１、２及び３μｇ。
【図３】昆虫細胞発現ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質から調製したワクチン投与を受けた後の、ＰＣＶ２による攻撃感染を受けたブタの各種組織についての免疫組織化学検査からの結果をグラフで表したものである。組織結果は、扁桃腺、腸間膜リンパ節（「Ｍｅｓ．  ｌｎ」）及び鼠径リンパ節（「Ｉｎｇ．  ｌｎ」）について提供されている。
【００４０】
施した各種ワクチン（又は投与せず）を、横軸に示してある。縦軸は、特定の評点等級に従ったＩＨＣ強度の任意のスコアを示している。
【００４１】
図３は、毒性ＰＣＶ２ｂウィルスによる攻撃感染を受けた、セット１の群１〜７における動物についてのＩＨＣ結果を表す図である。
【図４】昆虫細胞発現ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質から調製したワクチン投与を受けた後の、ＰＣＶ２による攻撃感染を受けたブタの各種組織についての免疫組織化学検査からの結果をグラフで表したものである。組織結果は、扁桃腺、腸間膜リンパ節（「Ｍｅｓ．  ｌｎ」）及び鼠径リンパ節（「Ｉｎｇ．  ｌｎ」）について提供されている。
【００４２】
施した各種ワクチン（又は投与せず）を、横軸に示してある。縦軸は、特定の評点等級に従ったＩＨＣ強度の任意のスコアを示している。
【００４３】
図４は、動物が毒性ＰＣＶ２ｄウィルスによって攻撃された、セット２の群１〜７における動物についてのＩＨＣ結果を表す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明に関して、「昆虫細胞」は、昆虫類生物由来の細胞である。その細胞は生存能力を有しており（即ち、複製する能力を有する）、タンパク質発現可能とするのに十分完全性がある。その細胞は休止状態又は活動状態であることができ、細胞周期のあらゆる段階のものであることができる。昆虫細胞は、本発明において異なる方法；昆虫全体を用い；昆虫の抽出物又は一部を用い；昆虫由来の初代細胞を用い；昆虫の組織若しくは器官を用い；又は不死化昆虫細胞系を用いることで、で採用される。
【００４５】
本発明の昆虫細胞は、通常、好適な担体中に含まれている。そのような担体は、昆虫細胞の生存能力を維持する組成物であり、例えば、緩衝溶液又は培地のような液体である。昆虫全体の使用の文脈では、昆虫生物自体の身体が担体として機能する。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（並びに、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」のような派生語）という用語は、この用語が用いられている本文、段落、特許請求の範囲などにより保護され又は包含され、本発明に関して考え得る全ての要素及び任意の可能な組合せを、そのような要素又は組合せが明示的に列挙されていない場合であっても示すことを意図し、そのような要素又は組合せのいずれをも排除することを意図するものではない。
【００４７】
従って、いずれかのそのような本文、段落、特許請求の範囲などはまた、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（又はその派生語）なる語が「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」、「からなり（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」のような語によって置換されている１以上の実施形態に関するものであり得る。
【００４８】
本発明に関して、核酸は、その核酸が細胞が由来する親昆虫細胞の核酸中に存在しなかった場合、それを含む昆虫細胞に対して「異種」である。核酸は、あらゆる種類のものであることができ、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであることができる。
【００４９】
本発明の異種核酸は、各種方法で、例えばトランスフェクション又は恐らくは担体上での核酸のエレクトロポレーションにより、或いは、例えばウィルスのような組換え微生物による感染によって、本発明による昆虫細胞中に導入することができる。
【００５０】
ヌクレオチド配列は、それの転写及び／又は翻訳によってタンパク質が発現される場合に、そのタンパク質を「コードしている」又は類似の表現で「コードする」。代表的には、タンパク質をコードすることができるそのようなヌクレオチド配列は、オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）と称され、タンパク質の翻訳を早期に終了するであろう望ましくない終止コドンが全く存在しないことを示している。そのようなヌクレオチド配列は、完全タンパク質をコードする遺伝子であることができるか、タンパク質の一部分を例えば成熟又は分泌型のタンパク質のみをコードする、即ち「リーダー」、「アンカー」又は「シグナル配列」を持たない遺伝子断片であることができる。ヌクレオチド配列は、天然起源又は合成起源のものであることができる。
【００５１】
本発明に関して、「タンパク質」は、アミノ酸の分子鎖である。タンパク質は、天然若しくは成熟タンパク質、プレ若しくはプロタンパク質、又はタンパク質の一部であることができる。特に、ペプチド類、オリゴペプチド類及びポリペプチド類が、タンパク質の定義に含まれる。
【００５２】
本発明に関しての「ＯＲＦ２」タンパク質は、ＰＣＶのゲノム上のオープン・リーディング・フレーム２（ＯＲＦ２）によって又はＯＲＦ２の一部によってコードされるタンパク質を指す。全長ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質は、通常、長さ２３３アミノ酸であり、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で調べると、相対分子量約２６ｋＤａを示す。しかしながら、切断型のＯＲＦ２タンパク質が公知であり、本発明に有利に用いることができ、例えば、それのＮ末端側から３０アミノ酸を欠く切断型のＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質である。ＯＲＦ２タンパク質は、カプシドとも称され、そして、コードする核酸配列は、ＯＲＦ２遺伝子又はカプシド遺伝子と称される。
【００５３】
コード領域の分析を支援し、簡便な方法でそのようなデータを表すことができるコンピュータプログラムが、多様な供給者から市販されている。
【００５４】
「ブタサーコウィルス２」又はＰＣＶ２は、形態的、ゲノム的及び生化学的特徴のようなそれの分類群の特徴的特性、並びに生理的、免疫的若しくは病理的挙動のような生物学的特徴を有する、その種のサーコウィルスを指す。
【００５５】
当業界で公知のように、微生物の特定の種としての分類は、そのような特徴の組み合わせに基づくものである。従って、本発明は、例えば亜種、株、単離物、遺伝子型、変異体、サブタイプ若しくは下位群のようないずれかの方法で下位分類されるＰＣＶ２も含む。
【００５６】
本発明における特定のＰＣＶ２は、現在その種に割り当てることができるが、しかしながらそれは分類学的分類であって、新たな識見により新たな若しくは異なる分類群への再分類がなされ得ることから、時間が経つと変わり得るものであることは本発明の当業者には明らかであろう。しかしながら、その微生物自体又はそれの抗原性レパートリーを変えるのではなく、それの科学的名称若しくは分類を変えるだけであることから、そのような再分類された微生物は、本発明の範囲に留まる。
【００５７】
本発明で使用されるＰＣＶ２は、例えば野生の又は農場のブタからの又は各種研究室、（寄託）施設若しくは（獣医）大学からのフィールド単離物のような各種入手源から得ることができる。或いは、それのゲノム核酸を合成し、それを適切な細胞にトランスフェクションすることで、ＰＣＶ２をデジタル配列データから再構築することができる。
【００５８】
ヌクレオチド配列を比較することで、ＰＣＶ２の遺伝子型決定を行う。本発明に関して、「遺伝子型２ｂのＰＣＶ２」又は「ＰＣＶ２ｂ」は、セガールズの方法（Ｓｅｇａｌｅｓら，２００８，Ｖｅｔ．ｒｅｃ．ｖｏｌ．１６２，ｐ．８６７−８６８）を用いて遺伝子型群ｂに分類されるＰＣＶ２ウィルスである。この方法は、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子間のＰ−距離、即ちそれらのＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子のヌクレオチドの総数当たりの二つのＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子間で異なるヌクレオチドの比に基づくＰＣＶ２遺伝子型決定を用いる。セガールズ（Ｓｅｇａｌｅｓ）らによって確認されたＰＣＶ２の異なる遺伝子型についてのカットオフは、０．０３５のＯＲＦ２  Ｐ−距離であることから、Ｐ差がそれより小さい場合、その二つの配列は同じ遺伝子型に属する。
【００５９】
本発明については、遺伝子型２ｂのＰＣＶ２の基準ウィルスは、株４８２８５とも称される単離物「Ｉｍｐ．１０１１」であり、それについては、ゲノム配列が、受託番号ＡＦ０５５３９４下にＧｅｎＢａｎｋ（商標名）で公開されている。
【００６０】
結果的に、セガールズ（Ｓｅｇａｌｅｓ）ら（上記）の方法を用いて計算された株４８２８５のＯＲＦ２遺伝子で０．０３５未満のＯＲＦ２遺伝子Ｐ−距離を有するＰＣＶ２ウィルスが、本発明におけるＰＣＶ２ｂウィルスである。
【００６１】
しかしながら、そして当業者にはわかるように、ＰＣＶのゲノムは一本鎖でありそして円形であることから、ＯＲＦ２遺伝子のコード領域は、特定の直線ヌクレオチド配列から直接明らかになることはできず、そのヌクレオチド配列を、反転、補完及び／又は回転させる必要があり得る。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ０５５３９４でのＰＣＶ２ｂ株４８２８５のゲノム配列において、ＯＲＦ２遺伝子は、ヌクレオチド番号３１４からｎｔ．１まで直線状の公開された鎖上を進み、ｎｔ．１７６７からｎｔ．１３８３（それを含む）まで続き；同時に、それはＯＲＦ２遺伝子の６９９ヌクレオチド（終止コドンを含まない）を表し、公開されている鎖のこの領域に対して相補的である鎖によってコードされている。やはり、コード領域のそのような分析及び表示は、市販のコンピュータプログラムを用いて簡便に行うことができる。
【００６２】
同様の手法が、本明細書で用いられる「ＰＣＶ２遺伝子型２ａ」（ＰＣＶ２ａ）、及び「ＰＣＶ２遺伝子型２ｄ」（ＰＣＶ２ｄ）に適用され；ＰＣＶ２ａについての基準ウィルスは、単離物「Ｉｍｐ．１０１０」（「Ｓｔｏｏｎ１０１０」とも称される）、受託番号：ＡＦ０５５３９２であり；及びＰＣＶ２ｄについての基準ウィルスは、単離物「Ｓ９９−１５４２／３ａ」、受託番号：ＪＸ５１２８５６である。
【００６３】
ウィルスをＰＣＶ２ウィルスと同定し、それのＯＲＦ２遺伝子のヌクレオチド配列を決定し、株４８２８５のＯＲＦ２遺伝子と比較したＰ−距離を計算する方法は公知であり、本発明の当業者には容易に利用可能である。
【００６４】
「転写制御配列」は、典型的にはＤＮＡ中の核酸の機能性領域であり、それは，制御因子の結合を介して、細胞のタンパク質−発現機構を誘発して、ＤＮＡの下流コード領域のＲＮＡへの転写を開始及び実行する。そのような転写制御領域（ＴＣＲ）は、プロモーターとも称することもでき、通常は、最初の開始コドンの約３０〜４０ヌクレオチド上流に位置する「転写開始部位」のような多くの制御領域を含む。他の公知の保存要素は、ＴＡＴＡボックス、ＣＡＡＴボックス及びＧＣボックスである。ＴＣＲは、転写の時期、期間、条件及びレベルに影響し得る結合制御因子に関与するいわゆるエンハンサーも含むことができる。
【００６５】
結果的に、転写（及びそれに続く翻訳）は、使用されるＴＣＲ及び全体としての遺伝子構築物の詳細に応じて一時的性質又は永久的性質のものであることができ、即ち一時的発現又は安定な発現であることができる。
【００６６】
（異種）遺伝子の発現のためのＴＣＲは、その下流コード領域の転写を効果的に駆動できる必要がある。これは一般に、遺伝子に「動作可能に連結されている」ＴＣＲと称され、それによって、その遺伝子は、ＴＣＲの「制御下」にあるか、ＴＣＲ「によって駆動される」。これは一般に、ＴＣＲ及びコード領域が有効な近位で同一分子上で連結されており、それらの間に、効果的な転写に介入すると考えられるシグナルや配列が全くないことを意味している。
【００６７】
「変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質」は、発現ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質がそのタンパク質の野生型と同一ではなく突然変異を含む、ことを示す働きをする。そのような突然変異は、イン・ビボ又はイン・ビトロ技術を用いて，異なる方法で導入することができる。しかしながら、最も有効なのは、組換えＤＮＡ技術を用いて細菌プラスミドにおけるＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２遺伝子をサブクローニングし、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）及び合成プライマーを用いて所望の位置に所望の突然変異を導入するというものである。詳細については、後述の実施例にある。このようにして、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５５３９４からの親ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２遺伝子のＤＮＡ配列を操作することで、アミノ酸位置１３１：５′−ａｃａ−３′でトレオニンをコードする野生型ヌクレオチドトリプレットを突然変異させて、プロリンをコードするトリプレット：５′−ｃｃｃ−３′とした。
【００６８】
ＯＲＦ２遺伝子のコドン最適化によりさらなる操作を行って、それを昆虫細胞及び／又はバキュロウィルスのコーディング選択とより良好に適合させることができる。例えば、Ｈｏｏｆｔ  ｖａｎ  Ｉｄｄｅｋｉｎｇｅら，１９８３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ.１３１，ｐ．５６１−５６５で公開されているＡｃＭＮＰＶバキュロウィルスからのポリへドリン遺伝子のコドン選択を用いる。異種発現のための遺伝子のコドン最適化の考え方は公知であり；典型的には、そのような突然変異は全てサイレントであり、それは、これがコードヌクレオチド配列を変えるが、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変えないことを意味している。詳細は実施例にある。
【００６９】
コドン最適化は、昆虫細胞でのＯＲＦ２タンパク質の発現のレベルを高めることが認められた。わずかではあるが、それは、昆虫細胞で発現される場合、野生型ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の核局在も変えた。しかしながら、昆虫細胞における核蓄積の実質的な防止は、ＰＣＶ２ｂからのＯＲＦ２タンパク質については、位置１３１のアミノ酸のプロリンによる置換によってのみ得られると考えられる。
【００７０】
本発明において、「野生型」は、野生の状態での天然の形である（微）生物の形態、例えば、ヒトによる介入によって変化する前の親生物の形態を指す。
【００７１】
本発明における変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を発現する異種核酸の発生、構築及びアセンブリは、クローニング、トランスフェクション、組換え、選択及び増幅を含む公知の分子生物学的技術によって行うことができる。これらの技術及び他の技術については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ＆Ｒｕｓｓｅｌｌ：″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ″（２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；ＩＳＢＮ：０８７９６９５７７３）；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＮＹ，２００３，ＩＳＢＮ：０４７１５０３３８Ｘ）；Ｃ．Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＆  Ｇ．Ｄｖｅｋｓｌｅｒ：″ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ″（ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ０８７９６９６５４０）；ａｎｄ″ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ″，Ｊ．Ｂａｒｔｌｅｔｔ  ａｎｄ  Ｄ．Ｓｔｉｒｌｉｎｇ（Ｈｕｍａｎａ  ｐｒｅｓｓ，ＩＳＢＮ：０８９６０３６４２１）のような標準的な書物にかなり詳細に説明されている。
【００７２】
本発明において、特定の「アミノ酸位置」は、そのＰＣＶ２遺伝子型についての基準株からの全長ＯＲＦ２タンパク質のアミノ酸配列におけるそのアミノ酸の番号に基づいて番号付けされる。ＰＣＶ２ｂの場合、基準株は４８２８５であり、それのＯＲＦ２タンパク質の全長アミノ酸配列は、受託番号ＡＡＣ３５３３１下でＧｅｎＢａｎｋで公開されている。
【００７３】
本発明による昆虫細胞は、ＯＲＦ２ｂ−１３１Ｐを発現することができ；変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質（大部分）はもはや核では蓄積せず、しかし、昆虫細胞の細胞質全体に分散される。未変異の対応物と比較した変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の細胞位置におけるこの相違は、特に、免疫蛍光技術を用いる（光学）顕微鏡検査及び肉眼観察によって容易に検出することができる。詳細は、実施例の部にある。
【００７４】
ＯＲＦ２ｂ−１３１Ｐタンパク質の核蓄積の残留レベルは、昆虫細胞において変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を発現するのに用いられる遺伝子構築物に応じて若干異なるのが認められ：Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムを用いて行われた組換えバキュロウィルスを介した発現はなお、若干の核蓄積を示しており、例えば、野生型ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質について観察されるレベルの約１０％であった。しかしながら、変異体タンパク質をＰｒｏＥａｓｙシステムを介して構築された組換えバキュロウィルスから産生させた場合、検出可能な核蓄積は全く認められなかった。さらに、タンパク質発現のレベルは、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ組換えバキュロウィルスによって産生されたものより高かった。
【００７５】
これは、恐らく使用される遺伝子構築物の構成から説明することができ：Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ構築物から製造される組換えバキュロウィルスは、まだそれらのゲノム中のトランスファーベクターの発現カセットからの要素、例えばトランスポゾン及び抗生物質抵抗遺伝子を有している。これらは、複製及び発現のレベルに影響し得る。しかしながら、ＰｒｏＥａｓｙ組換え物は、もはやそのような別の遺伝要素を持たない。
【００７６】
本発明の好ましい実施形態及び他の態様の詳細に関して、下記に記載する。
【００７７】
１実施形態において、変異体ＰＣＶ２ｂ  Ｏｒｆ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。より好ましくは、ＡｃＭＮＰＶバキュロウィルスのポリへドリン遺伝子のコドン選択に合致するようにコドン最適化されている。
【００７８】
最も好ましくは、変異体ＰＣＶ２ｂ  Ｏｒｆ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は配列番号１である。これは、ＰＣＶ２ｂ株４８２８５のＯＲＦ２配列を表し、ここで、トリプレットコードアミノ酸位置番号１３１は、プロリンをコードする５′−ｃｃｃ−３′に変異されている。さらに、コドン使用は、ＡｃＭＮＰＶポリへドリン遺伝子のコドン選択に適合するように調節されている。次に、配列番号２は、配列番号１によってコードされるＯＲＦ２ｂ−１３１Ｐタンパク質配列を列記している。
【００７９】
ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２遺伝子に適用された突然変異の結果として、特にコドン最適化のゆえに、配列番号１とＡＦ０５５３９４の相当する領域、野生型ＯＲＦ２ｂ遺伝子との間のヌクレオチド配列同一性は７７．２％である。しかしながら、コドン最適化突然変異がサイレントであることから、配列番号２とＡＡＣ３５３３１（株４８２８５からの野生型ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質のアミノ酸配列である）との間のアミノ酸配列同一性は９９．６％であり、即ち、位置１３１のアミノ酸における相違があるのみである。
【００８０】
各種昆虫からの細胞の使用は公知である。これらのいくつかは、バキュロウィルスで感染させることができることから、バキュロウィルス−昆虫細胞発現系の内容で使用することもできる。例えば、Ｃｈｅｎら，２００５，Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．Ａｎｉｍ．，ｖｏｌ．４１，ｐ．４３−４９を参照する。
【００８１】
従って、１実施形態において、本発明による昆虫細胞は、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）（アルファルファ・ルーパー）、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（ツマジロクサヨトウ）、スポドプテラ・エクシグア（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｅｘｉｇｕａ）（ビートアワヨトウ）、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）（キャベツルーパー）、リマントリア・ディスパー（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ  ｄｉｓｐａｒ）（マイマイガ）、ボムビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）（カイコ）、アンチカルシア・ゲンマタリス（Ａｎｔｉｃａｒｓｉａ  ｇｅｍｍａｔａｌｉｓ）（ベルベットビーン・キャタピラ（ｖｅｌｖｅｔｂｅａｎ  ｃａｔｅｒｐｉｌｌａｒ））、ヘリオチス・ビレセンス（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ）（オオタバコガ）、ヘリオチス・サブフレクサ（Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｓｕｂｆｌｅｘａ）（サブフレクス・ストロー・モス（Ｓｕｂｆｌｅｘｕｓ  ｓｔｒａｗ  ｍｏｔｈ））、マメストラ・ブラシカエ（Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅ）（コナガ）、ヘリコベルパ・アルミゲラ（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ）（オオタバコガ幼虫（ｃｏｔｔｏｎ  ｂｏｌｌｗｏｒｍ））、ヘリコベルパ・ゼア（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）（オオタバコガ幼虫（ｃｏｒｎ  ｅａｒｗｏｒｍ））、アグロチス・イプシロン（Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ）（タマナヤガ）、アナグラファ・ファルシフェラ（Ａｎａｇｒａｐｈａ  ｆａｌｃｉｆｅｒａ）（セロリルーパー（ｃｅｌｅｒｙ  ｌｏｏｐｅｒ））、ガレリア・メロネラ（Ｇａｌｌｅｒｉａ  ｍｅｌｌｏｎｅｌｌａ）（ハチノスツヅリガ）、ラチプルシア・オウ（Ｒａｃｈｉｐｌｕｓｉａ  ｏｕ）（クレー・ルーパー（ｇｒａｙ  ｌｏｏｐｅｒ））、プルテラ・キシロステラ（Ｐｌｕｔｅｌｌａ  ｘｙｌｏｓｔｅｌｌａ）（コナガ）、ドロソフィラ・メラノガスター（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）、及びアエデス・アエギプチ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）からなる群から選択される昆虫由来である。
【００８２】
１実施形態において、本発明による昆虫細胞は、鱗翅目からの；より好ましくはヤガ科からの；さらにより好ましくはスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）属若しくはトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）属の一つからの昆虫由来である。
【００８３】
１実施形態において、本発明による昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）種の昆虫由来である。
【００８４】
１実施形態において、本発明による昆虫細胞は、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）種の昆虫由来である。
【００８５】
異種タンパク質発現のために完全な昆虫を飼育することは、知られており、実施可能であり、そのように本発明による昆虫細胞を適用することができる。しかしながら、制御された条件下でのより柔軟な製造及び規模拡大を許容することから、不死化昆虫細胞系の形態で昆虫細胞を利用することがより簡便であろう。次に、そのような確立された昆虫細胞系を用いて、本明細書に記載の通常の方法によって、本発明による昆虫細胞を構築することができる。
【００８６】
そのような使用に好適な公知の昆虫細胞系は、Ｓｆ９及びＳｆ２１（両者ともＳ．フルギペルダ（Ｓ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来である）；Ｔ．ニ（Ｔ．ｎｉ）由来のＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標名）（Ｈｉ−５）；Ｂ．モリ（Ｂ．ｍｏｒｉ）由来のＢｍ５；並びにＬ．ディスパー（Ｌ．ｄｉｓｐａｒ）由来のＬｄ６５２Ｙ及びＬｄＥＩｔａである。
【００８７】
従って、１実施形態において、本発明による昆虫細胞は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉ−５、Ｂｍ５、Ｌｄ６５２Ｙ及びＬｄＥＩｔａからなる群から選択される昆虫細胞系、又はこれらのうちの一つに由来する細胞系の細胞から産生される。
【００８８】
好ましくは本発明による昆虫細胞は、Ｓｆ９又はＳｆ２１の昆虫細胞系から産生される。
【００８９】
昆虫細胞系の培養のための手順、装置及び材料は公知であり、任意の所望の規模で、例えば５ｍＬから５０００リットルまでで使用することができる。特に、特殊化昆虫培地が入手可能であり、例えばＳｆ−９００（商標名）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；Ｅｘ−Ｃｅｌｌ（商標名）４００シリーズ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）；及び昆虫−ＸＰＲＥＳＳ（商標名）（Ｌｏｎｚａ）である。
【００９０】
これらの培地の特徴に応じて、それらは、一定パーセントの血清、例えばウシ胎仔血清の添加を必要とするか、無血清で用いることができる。グルタミン、抗生物質、消泡剤などのさらなる添加剤を加えることができる。
【００９１】
本発明による昆虫細胞が本発明における異種核酸を含むことができるようにする方法はいくつかあり、１例として昆虫細胞のゲノムでの安定な組み込みによるものがある。ゲノム組み込みを行う方法は、例えば、トランスポゾン技術によるようなランダム挿入によるもの、又は例えば相同組み換え若しくはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ技術を用いる定方向挿入によるものである。
【００９２】
別法として、昆虫細胞を、化学的手段（例えば、リポフェクチン（商標名））又は物理的手段（例えば、エレクトロポレーション）によって、自体がプラスミドのような担体上に存在することができる異種核酸でトランスフェクションすることができる。その異種核酸は、昆虫細胞中で、一時的に又は安定的に発現され得る。
【００９３】
しかしながら、そのような異種核酸を本発明による昆虫細胞に導入する好ましい方法は、組換えバキュロウィルスの使用によるものである。そのようなバキュロウィルスは、例えば、それのウィルスゲノムに安定に組み込まれ、強いバキュロウィルスプロモーター、例えば最晩期遺伝子ｐ１０若しくはポリへドリンのプロモーターに動作可能に連結された対象の異種遺伝子を含むであろう。
【００９４】
従って、本発明による昆虫細胞の１実施形態において、転写制御配列は、バキュロウィルスｐ１０遺伝子プロモーター又はバキュロウィルスポリへドリン遺伝子プロモーターである。
【００９５】
次に、組換えバキュロウィルスを昆虫細胞に進入させる：それは、例えば、組換えバキュロウィルスのゲノムのトランスフェクションによって受動的に、又は、感染性組換えバキュロウィルスによる感受性昆虫細胞の感染によって能動的に行うことができる。その昆虫細胞は、内部に組換えバキュロウィルス又はそのゲノムを含むことで、本発明における異種核酸も含むであろう。本発明に関して、「細胞内部に」は、単純に組換えバキュロウィルスゲノムの位置を指し、例えば細胞質中の昆虫細胞の細胞膜の内側にあるということである。
【００９６】
昆虫細胞内で組換えバキュロウィルス又はそれのゲノムを複製させて、昆虫細胞中で異種遺伝子の発現を生じさせる。次に、異種発現生成物を、その昆虫細胞から又は細胞培地のような細胞の環境から回収することができる。
【００９７】
従って、本発明による昆虫細胞の１実施形態において、異種核酸は、組換えバキュロウィルスゲノム中に含まれる。
【００９８】
「バキュロウィルス」は、バキュロウィルス科の構成員であり、好ましくはα−バキュロウィルス属の構成員である。
【００９９】
本発明におけるバキュロウィルスは、その野生型と比較してヒト介入によって変化して異種核酸を含むようになっている場合、それは「組換え体」である。好ましくは、そのような組換えバキュロウィルスは、遺伝子操作の方法によって産生される。
【０１００】
当業者にはわかるように、特定の培養容器中又は培養プレートのウェル中での本発明による昆虫細胞を考えると、本発明における異種核酸を実際に含む細胞の数はダイナミック（ｄｙｎａｍｉｃ）であろう。それは、細胞の周期状況又は感染若しくはトランスフェクションのレベルのような多くの生物学的理由による。異種核酸を含み発現する細胞ができるだけ多く有することが好ましいが、特定の時点でその群の各及び全ての個々の昆虫細胞がその異種核酸を含む必要はない。
【０１０１】
昆虫細胞及び組換えバキュロウィルスの併用は、異種タンパク質の発現に関して、一般に、「バキュロウィルス−昆虫細胞発現系」と称される。この系についての論文、書籍又は総覧の例は、Ｌｕｃｋｏｗら，１９８８，Ｂｉｏ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．６，ｐ．４７；Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｄａｖｉｄ  Ｒ．Ｏ′Ｒｅｉｌｌｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｐｒｅｓｓ，１９９３，ＩＳＢＮ：０７１６７７０１７２；Ｔｈｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｇｕｉｄｅ，ｅｄ．Ｋｉｎｇ＆Ｐｏｓｓｅｅ，１９９２，ＩＳＢＮ：９４０１０５０４７３であり、総覧はｖａｎ  Ｏｅｒｓら，２０１５，Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９６，ｐ．６−２３である。
【０１０２】
バキュロウィルス−昆虫細胞発現系を用いる効率的な発現は、研究室規模から非常に大きい工業的規模の製造まで用いることができる。バキュロウィルス−昆虫細胞発現系が知られている多様な起源の異種遺伝子はこれまで３０年間発現されており、この技術の適用に関して、多くのツールが市販されている。
【０１０３】
いくつかのバキュロウィルス種が、昆虫細胞での異種タンパク質の発現のための簡便なベクターとして用いられてきた。バキュロウィルス−昆虫細胞発現系で使用されるバキュロウィルスの例は、オートグラファ・カリフォルニカ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）（アルファルファ・ルーパー）：ＡｃＭＮＰＶの、又はボムビックス・モリ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）：ＢｍＮＰＶの（マルチカプシド（ｍｕｌｔｉｃａｐｓｉｄ））核多角体病ウィルスである。
【０１０４】
本発明における異種核酸を含む組換えバキュロウィルスの１実施形態において、前記バキュロウィルスは、ＡｃＭＮＰＶ又はＢｍＮＰＶである。
【０１０５】
本発明での使用のための組換えバキュロウィルスを効率的に発生及び選択するために、多くのツール及びキットが市販されている。例えば、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（商標名）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ．，ＵＳＡ）；ＰｒｏＥａｓｙ（商標名）（ＡＢ  Ｖｅｃｔｏｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．，ＵＳＡ）；及びｆｌａｓｈＢＡＣ（商標名）（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ）である。
【０１０６】
複製レベル及びタンパク質発現レベルを最適化するには、本発明における異種核酸を含む組換えバキュロウィルスは、好ましくは、当然のことながら異種核酸の挿入及びその後の挿入遺伝子座での破壊若しくは欠失を除いて、野生型バキュロウィルスにできるだけ近いものである。実際のところ、それは、組換えバキュロウィルスが好ましくは、それのゲノムにおける組換えプロセスからのさらなる遺伝的要素、例えばタグ、標識、マーカー遺伝子、トランスポゾン要素、抗生物質抵抗性遺伝子のような要素を含まないことを意味する。
【０１０７】
従って、１実施形態において、本発明における異種核酸を含む組換えバキュロウィルスは、そのゲノムに組換えプロセスからのさらなる遺伝的要素を含まない。
【０１０８】
好ましい実施形態において、組換えバキュロウィルスは、その組換えバキュロウィルスの構築に用いたトランスファーベクターからの抗生物質抵抗性遺伝子を含まない。
【０１０９】
本発明による昆虫細胞の１実施形態において、下記のものからなる群から選択される条件の１以上又は全てが適用される；
−変異体ＰＣＶ２ｂ  Ｏｒｆ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列が最適化されている、より好ましくは、ＡｃＭＮＰＶバキュロウィルスのポリへドリン遺伝子のコドン選択に一致するようにコドン最適化されている；
−変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１である；
−本発明による昆虫細胞は、鱗翅目からの；より好ましくはヤガ科からの；さらにより好ましくはスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）属若しくはトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）属の一つからの昆虫由来である；
−本発明による昆虫細胞は、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）種の昆虫由来である；
−本発明による昆虫細胞は、トリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）種の昆虫由来である；
−本発明による昆虫細胞は、Ｓｆ９、Ｓｆ２１、Ｈｉ−５、Ｂｍ５、Ｌｄ６５２Ｙ及びＬｄＥＩｔａからなる群から選択される昆虫細胞系、又はこれらのうちの一つに由来する細胞系の細胞から産生される；
−本発明による昆虫細胞は、Ｓｆ９又はＳｆ２１の昆虫細胞系から産生される；
−前記転写制御配列は、バキュロウィルスｐ１０遺伝子プロモーター又はバキュロウィルスポリへドリン遺伝子プロモーターである；
−前記異種核酸は、昆虫細胞内部にある組換えバキュロウィルスゲノム中に含まれる；
−本発明における異種核酸を含む組換えバキュロウィルスは、ＡｃＭＮＰＶ又はＢｍＮＰＶである；及び
−本発明における異種核酸を含む組換えバキュロウィルスは、そのゲノムにおける組換えプロセスからのさらなる遺伝的要素を含まない。
【０１１０】
本明細書で記載のように、本発明に関して記載のＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質への突然変異によって、本発明による昆虫細胞からのＯＲＦ２ｂ−１３１Ｐタンパク質の発現増加が可能となる。特に、それによって、この突然変異なしで可能であるよりもかなり高い程度までのＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を含むＶＬＰの発生が可能となる。
【０１１１】
従って、さらなる態様において、本発明は、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質がアミノ酸位置番号１３１にプロリンを有することを特徴とする、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質のウィルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。
【０１１２】
ＯＲＦ２ｂ−１３１Ｐタンパク質のＶＬＰの特性決定及び使用のための材料及び方法は、当業界で公知である。
【０１１３】
好ましくは、昆虫細胞での本発明における変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の発現は、上記のようなバキュロウィルス−昆虫細胞発現系の使用によって行われる。
【０１１４】
従って、さらなる態様において、本発明は、バキュロウィルス−昆虫細胞発現系の使用を用いる、本発明による昆虫細胞での変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の発現方法に関する。
【０１１５】
特に、本発明における変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の発現に使用される本発明による昆虫細胞が昆虫細胞系の細胞である場合、それらは、標準的な細胞培養装置を用いて簡便に培養することができ、それによって、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質が発現される。適切な温度でインキュベーションキャビネットに置かれた簡単なＴ型培養瓶若しくはスピナーフラスコから、最終的には温度、ｐＨ及び溶存酸素などの工程パラメータを自動制御された加熱マントル、攪拌機及びスパージャーを搭載した大規模工業用発酵槽までの任意の規模で昆虫細胞培養装置を使用可能である。
【０１１６】
本発明による昆虫細胞の培養に続き、発現された変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を、さらなる使用のために昆虫細胞培養物から回収する。培養と同様に、そのような回収は、当業界で公知の標準的手順を用いて行うことができる。さらに、必要な場合、培養物を最初に、物理的（例えば、熱、放射線照射）又は化学的（例えば、ブロモ−エチレンイミン（ＢＥＩ））手段によって失活（即ち、滅菌）させることができる。
【０１１７】
使用される昆虫細胞の特徴及び適用される発現の型に応じて、発現された変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質は、昆虫細胞内部又はその膜で蓄積するか、細胞から分泌される。実際に分泌されていない場合であっても、タンパク質は、細胞が破裂する時にある程度まで細胞の培地中に存在し得る。
【０１１８】
発現タンパク質の回収方法を選択することができる。
【０１１９】
発現タンパク質が主として培地中に存在している場合、これは、例えば、培養物の遠心後の上清として回収することができる。次に、培養物体積のバルクを、例えば濃縮を用いて、簡便にはいずれも当業界で公知の何らかの限外濾過方法によって、所望の程度まで低下させることができる。
【０１２０】
タンパク質が主として細胞中にある場合、これらは、例えば、培養物の遠心及びより小さい体積で細胞ペレットを再懸濁させることで、培養体積のバルクから単離することができる。次に、その細胞を、多かれ少なかれ侵襲性の技術を用いて破壊することができる。
【０１２１】
次に、何らかの抽出及び／又は精製方法を用いて、発現タンパク質を得ることができる。
【０１２２】
これはいずれも、公知の方法及び材料のみを用いて当業者が行うことができる。
【０１２３】
従って、さらなる態様において、本発明は、アミノ酸位置番号１３１にプロリンを有する変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の製造方法であって、
−本発明による昆虫細胞を培養すること；及び
−当該変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を昆虫細胞培養物から回収すること
から選択される一方又は両方の段階を含む方法に関する。
【０１２４】
本発明の特に有利な結果は、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質が、もはやそれが発現される昆虫細胞の核で蓄積しないという点である。それによって、総発現レベルが高くなっただけでなく、これらの昆虫細胞からの変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の回収も非常に容易になった。理由としては、この細胞質状態では、非常に衝撃が小さい標準的な単離手順を用いることができ、比較的多量の変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質が得られたからである。さらに、ＯＲＦ２ｂ−１３１ＰのほとんどがＶＬＰに効果的にアセンブリされたことが見出されたので、回収されたタンパク質は、優れた免疫学的品質であった。
【０１２５】
より具体的には、実質的な量で未変異のＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を回収するには、洗浄剤又はカオトロピック剤、例えばＳＤＳ、尿素、デオキシコール酸塩又はグアニジン−ＨＣｌなどのような化学剤を用いることによる抽出が必要であろう。次に、これらを再度除去する必要があろう。そのような攻撃的な化学剤を大規模で使用することは、当然のことながら望ましくない。
【０１２６】
しかしながら、化学剤を用いずに、安全、簡便、そして非常に温和な技術により昆虫細胞の超音波処理又は冷凍−解凍を行うことで、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の回収を行うことができる。
【０１２７】
従って、本発明による変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の製造方法の１実施形態において、昆虫細胞培養物から変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を回収する段階では、洗浄剤やカオトロピック剤は用いない。
【０１２８】
１実施形態において、その回収では、昆虫細胞の物理的であり、そして化学的ではない溶解方法を用い；物理的細胞溶解方法の例は、超音波処理、冷凍−解凍及びフレンチプレスである。
【０１２９】
本発明において、昆虫細胞の「培養物」又は類似の「培養」は、適切な条件下で昆虫細胞をインキュベートすることを指し、その細胞が増殖及び分裂し、異種挿入物を発現できるようにする。
【０１３０】
昆虫細胞のそのような培養では、典型的には、適切な細胞培地及び簡便な装置の使用を含み；いずれも当業界では公知であり、市販されている。例えば、スポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）属又はトリコプルシア（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ）属の昆虫からの細胞系の培養物は、通常、２６〜２８℃で単層又は懸濁液で、好気性条件下で培養される。
【０１３１】
実際の条件下では、明昆虫細胞を発生させるための別個の培養容器を、感染若しくはトランスフェクションされる昆虫細胞の培養に用いられる装置から十分に見えるようにすることが便宜である。通常、昆虫細胞は、マスター細胞ストック及び作業用細胞ストックとして準備する。このアプローチによって、医薬用途用の組換えタンパク質の製造に必要な品質管理レベルが可能となる。
【０１３２】
本発明による変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の製造方法の１実施形態において、製造されたタンパク質は、ＶＬＰの形態のものである。
【０１３３】
本発明による変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の製造方法を行うことで、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を、十分な量で必要とされる免疫学的効力で製造し、ＰＣＶ２又は関連する疾患徴候に対するワクチンを製造することができる。
【０１３４】
従って、さらなる態様において、本発明は、ＰＣＶ２による感染又は関連する疾患徴候を軽減するためのブタ用ワクチンであって、当該ワクチンが薬学的に許容される担体中に変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を含み、前記変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質がアミノ酸位置番号１３１にプロリンを有することを特徴とするワクチンに関する。
【０１３５】
１実施形態において、本発明によるワクチンは、遺伝子型２ａ、２ｂ、及び／又は２ｄのＰＣＶ２による感染の低減のためのものである。
【０１３６】
より好ましくは、当該ワクチンは、ＰＣＶ２ｂによる感染の低減のためのものである。
【０１３７】
「ワクチン」は、薬学的に許容される担体中に免疫活性化合物を含む組成物であることが知られている。「免疫活性化合物」は、「抗原」の形態の場合、接種された標的の免疫系によって認識されて、免疫応答を誘発する。その応答は、先天性免疫系から及び／又は後天性免疫系を起源とし得るものであり、細胞型及び／又は体液型であり得る。
【０１３８】
本発明において、「ブタ」は、イノシシ科の動物、好ましくはイノシシ属の動物、例えば野生及び家畜のブタ、イノシシ、バビルサ又はイボイノシシを指す。これは、雌ブタ、雄ブタ、（成体）ブタ、雌ブタ（ｇｉｌｔ）、離乳仔、又は子ブタなどの性別若しくは動物齢を指す任意の名称によって示されるブタも含む。
【０１３９】
本発明によるワクチンは、「ＰＣＶ２による感染低減」を提供することができ、これは、標的動物におけるＰＣＶ２による増殖感染の確立若しくは増殖を予防若しくは低減することを指す。これは、例えば、ウィルス負荷の軽減又はウィルス複製期間の短縮によって達成される。次に、それによって、標的動物において、ウィルス感染によって生じる疾患の病変の数、強度若しくは重度及び結果として生じる臨床徴候の低減が生じる。そのようなワクチンは、口語表現で、ＰＣＶ２「に対する」ワクチン又は「ＰＣＶ２ワクチン」と称される。
【０１４０】
好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、ＰＣＶ２ウィルス血症の予防における補助として及び／又は感染動物によるＰＣＶ２の排出の防止における補助として作用する。
【０１４１】
ＰＣＶ２による感染に対するワクチン効力に加えて、本発明によるワクチンは、二次疾患又は併発症として起こり得るブタサーコウィルス関連疾患（ＰＣＶＡＤ）を指す「関連する疾患徴候の低減」も提供することができる。ＰＣＶ２の場合のように、本発明によるワクチンは、そのようなＰＣＶＡＤの症状若しくは結果の重度及び／又は期間の軽減／短縮を提供することができる。
【０１４２】
ＰＣＶ２ワクチンは、ＰＣＶ２ウィルスの複製及び蔓延を減らす。これによって、血液、肺、及びリンパ組織（例えば、扁桃腺、脾臓及びリンパ節）におけるＰＣＶ２ウィルス負荷を低減し、リンパ球枯渇、感染の蔓延に対して、そしてＰＣＶ２関連疾患に対して保護を行う。結果的に、これによって、死亡率低下、より良好な平均１日体重増、飼料効率向上及び繁殖歩留まりの向上というパラメータの１以上で反映されるように、ワクチン接種されたブタの群れにおける総体的健康及び成績が回復される。
【０１４３】
ＰＣＶ２ワクチンの有効性の一般的な確認は、通常の実務者の技術の範囲内である。これは例えば、ワクチン接種後の免疫応答をモニタリングすることで、又は攻撃感染後の臨床症状の出現若しくは死亡率を調べること、例えば、標的の疾患徴候、臨床スコア、血清学パラメータをモニタリングすることで、又は、攻撃病原体の再単離、及び擬似ワクチン接種動物で認められるワクチン接種−攻撃応答とこれらの結果を比較することで、行うことができる。具体的には、ワクチン効力及び保護は、ＰＣＶ２特異抗体レベルの血清学的測定により；血清での又は動物分泌（口、鼻、糞便、尿）でのウィルス検出により；又はＰＣＲ、（免疫）組織学、ハイブリダイゼーションを介して又は血清学的に、ＰＣＶＡＤに関与する他の病原体を検出することで測定することができる。
【０１４４】
本発明によるＰＣＶ２ワクチンについて、その効力は、好ましくはワクチン接種群対非ワクチン接種群でのＰＣＶ２感染の低減レベルを評価することによって求められ、それによって、そのような感染は、自然に例えば農場条件下で獲得され得るか、意図的なもの、例えば実験条件下での負荷によって生じ得る。
【０１４５】
使用されるアジュバントの種類に応じて、ＰＣＶ２ワクチン効力は、体液免疫又は細胞免疫により大きく基づくものであり得る。誘発抗体力価は、例えば多くの市販のＰＣＶ特異的ＥＬＩＳＡキットのうちの一つを用いて測定することができる。
【０１４６】
本発明によるワクチンの各種実施形態、好ましいもの及び例を、以下で説明する。
【０１４７】
アミノ酸位置番号１３１にプロリンを有する変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を含む本発明によるワクチンの１実施形態において、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質は、ウィルス様粒子の形態である。
【０１４８】
典型的には、ワクチンは、抗原を含む「薬学的に許容される担体」を含み、そして、（重度の）副作用を引き起こすことなく、ワクチンの製造、使用若しくは保存において役立ち得る。そのような担体は、水溶液、例えば緩衝液又は培地であり得る。
【０１４９】
本発明によるワクチン用の好ましい薬学的に許容される担体は、昆虫細胞培地、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、又はこれらの組み合わせである。
【０１５０】
さらに、薬学的に許容される担体は、さらなる添加剤及び賦形剤、例えば充填剤、安定剤、保存剤、界面活性剤又はアジュバントを含むことができる。詳細及び例については、例えば、″Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ″（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）、及び″Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ″（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔら編，１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ０４４４８１９６８１）のようなハンドブックに記載のように公知である。
【０１５１】
さらに、本発明によるワクチンは、アジュバントを含むことができる。特に、そのようなサブユニットワクチンの場合、これは、サブユニット抗原に対する標的の免疫応答を大きく高め得るものである。
【０１５２】
従って、１実施形態において、本発明によるワクチンはアジュバントを含む。
【０１５３】
「アジュバント」は、非特異的に標的の免疫応答を刺激する公知のワクチン成分である。多くの異なるアジュバントが当業界で公知である。アジュバントの例には、フロイントの完全及び不完全アジュバント、ビタミンＥ若しくはα−トコフェロール、非イオン性ブロックポリマー及びポリアミン類、例えば硫酸デキストラン、Ｃａｒｂｏｐｏｌ（商標名）、ピラン、サポニン、例えばＱｕｉｌ  Ａ（商標名）、又はＱ−ｖａｃ（商標名）がある。サポニン及びワクチン成分を、ＩＳＣＯＭ（商標名）中で組み合わせることができる。
【０１５４】
さらに、ムラミールジペプチド類、ジメチルグリシン、タフトシンのようなペプチドがアジュバントとして用いられることが多く、そして、鉱油、例えばＢａｙｏｌ（商標名）、Ｄｒａｋｅｏｌ（商標名）、Ｋｌｅａｒｏｌ（商標名）、又はＭａｒｃｏｌ（商標名）、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標名）又は軽鉱油（パラフィン）；非鉱物油、例えばスクアレン、スクアラン；植物油若しくはそれの誘導体、例えばオレイン酸エチルがある。さらに、組み合わせ製品、例えばＩＳＡ（商標名）（Ｓｅｐｐｉｃ）、又はＤｉｌｕｖａｃＦｏｒｔｅ（商標名）及びＸｓｏｌｖｅ（商標名）（いずれも、ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）を有利に用いることができる。さらなる選択肢は、ＥＰ１６２０６７８９に開示のＳＶＥＡアジュバント（スクアラン及びビタミンＥ−アセテートを含む）の使用である。
【０１５５】
アジュバント類並びにそれらの使用及び効果に関するハンドブックは、「Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．４２，Ｄ．Ｏ′Ｈａｇａｎ編，２０００，Ｈｕｍａｎａ  ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，ＩＳＢＮ：０８９６０３７３５５）である。
【０１５６】
アジュバントは、本発明によるワクチンの異なる製剤で使用され、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質に対する免疫応答を高めることができる。例えば、アジュバントが油状物質である場合、油相は、抗原をゆっくり放出することでワクチン接種動物で貯留効果を提供し、それにより標的の免疫系の長期刺激を提供することができる。
【０１５７】
その油状物質は、異なる方法でＯＲＦ２タンパク質を含む水相と組み合わせることができる。１実施形態において、本発明によるワクチンは水相及び油相のエマルジョンとして製剤することができ、好ましくはそのエマルジョンは、油中水型（ｗ／ｏ）、水中油型（ｏ／ｗ）、水中の油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）であるか、二重油−エマルジョンである。
【０１５８】
より好ましいものは、油をアジュバントとし水中油型エマルジョンとして製剤された本発明によるワクチンである。そのようなワクチンは、有利に、水相からの直接免疫刺激の特性と油相の貯留効果からの長期免疫刺激の特性の両方を示す。
【０１５９】
従って、本発明によるワクチンの１実施形態において、ワクチンは、水中油型エマルジョンとして製剤される。
【０１６０】
任意の所望の規模でのアジュバントワクチンエマルジョンの調製のための方法及び装置が市販されており、例えばＳｉｌｖｅｒｓｏｎ、Ｕｌｔｒａ  Ｔｕｒｒａｘ（商標名）、Ｄｉｓｐａｘリアクター（ＩＫＡ）、又はＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｓｅｒ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）のような装置を用いる均質化である。
【０１６１】
本発明によるワクチンの水中油型エマルジョンは、好ましくは非常に小さい、好ましくは１μｍ以下の分散相の粒径を有し、そのようなエマルジョンは「サブミクロンエマルジョン」と一般に呼ばれている。
【０１６２】
本発明によるワクチンの水中油型エマルジョンの１実施形態において、エマルジョンは、サブミクロンエマルジョンである。
【０１６３】
本発明によるワクチンの１実施形態において、アジュバントは、軽鉱油、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ、Ｅｍｕｎａｄｅ及びＳＶＥＡからなる群から選択される。
【０１６４】
そのようなアジュバントは、ブタワクチンの免疫原性に対して好ましい効果を有することが知られている。
【０１６５】
本発明によるワクチンの１実施形態において、ワクチンは水中油型エマルジョンであり、アジュバントは鉱油である。
【０１６６】
本発明によるワクチンの好ましい実施形態において、鉱油は、軽若しくは白色鉱油又はパラフィン油であり、Ｍａｒｃｏｌ（商標名）（ＥｘｘｏｎＭｏｂｉｌ）、Ｋｌｅａｒｏｌ（商標名）（Ｓｏｎｎｅｂｏｒｎ）、又はＤｒａｋｅｏｌ（商標名）（Ｐｅｎｒｅｃｏ）のような商標名で市販されている。
【０１６７】
より好ましくは、追加のアジュバントの使用であり、特にビタミンＥ、例えばα−トコフェロール又はα−トコフェロールアセテートである。
【０１６８】
好ましい実施形態において、本発明におけるワクチン製剤は、界面活性剤、軽パラフィン油及びα−トコフェロールアセテートを含む水中油型エマルジョンを含む。より好ましいものは、界面活性剤がポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ（商標名）８０）であり、及び／又はパラフィン油がＭａｒｃｏｌ（商標名）５２であり、及び／又はビタミンＥがα−トコフェロールアセテートである製剤である。最も好ましいものは、Ｍｉｃｒｏｓｏｌ  Ｄｉｌｕｖａｃ  Ｆｏｒｔｅ（商標名）、又はＸｓｏｌｖｅ（商標名）（両方とも、ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）を含む製剤である。
【０１６９】
本発明によるワクチンのさらなる有利な効果は、垂直方向には子孫に対する、及び／又は水平方向には群れ若しくは集団内で及び地理的区域内でのブタの群れにおけるＰＣＶ２の予防又は拡散低減である。結果的に、本発明によるワクチンを使用することで、ＰＣＶ２の有病率が低下する。
【０１７０】
従って、本発明によるワクチンの好ましい実施形態において、ワクチンは、ブタ集団又は地理的地域におけるＰＣＶ２の有病率低下を目的としたものである。
【０１７１】
１実施形態において、本発明によるワクチンは、安定剤を含むこともできる。これは、ワクチンエマルジョンの特性を改善し、分解しやすい成分を保護し、及び／又はワクチンの貯蔵寿命を延長するのに役立ち得る。一般に、そのような安定剤は高分子量の大分子であり、例えば脂質、炭水化物若しくはタンパク質であり、例えば粉乳、ゼラチン、血清アルブミン、ソルビトール、ショ糖、トレハロース、スペルミジン、タンパク質加水分解物、デキストラン又はポリビニルピロリドン、及び緩衝剤、例えばアルカリ金属リン酸塩である。
【０１７２】
好ましくは、安定剤は、動物起源の化合物を含まない（動物化合物非含有、ＡＣＦ）か、例えばＷＯ２００６／０９４９７４に開示のように化学的に定義される。
【０１７３】
本発明によるワクチンは、チメロサール、メルチオラート、フェノール性化合物、及び／又はゲンタマイシンのような保存剤を含み得る。好ましくは、保存剤を全く用いない。
【０１７４】
言うまでもなく、医薬安定性又は本発明によるワクチンの有効性に必要であるか有益である他の添加剤を加えることは当業者の通常の能力の範囲内であることから、本発明の範囲に含まれる。
【０１７５】
本発明によるワクチンにおける動物標的はブタである。ワクチン接種を受ける標的の動物齢、体重、性別、免疫状況及び他のパラメータはあまり重要ではないが、健康で感染していない動物にワクチン接種し、ＰＣＶ２による農場での感染を予防するためにできるだけ早期にワクチン接種することは好ましいことは明らかである。なぜなら、そのような感染は、若年齢ですでに確立する可能性があるからである。
【０１７６】
従って、本発明によるワクチンの１実施形態において、ワクチンは、生後間もない若いブタに施し、好ましくは生後２８日以内、より好ましくは生後２１、１４、１２、１０、８、７、６、５、４、３、２以内、若しくは１日以内（その望ましい順で）とする。
【０１７７】
或いは、本発明によるワクチンは、妊娠雌ブタに投与して、胎盤通過により及び／又は初乳を介した移動によって、母体由来のＰＣＶ２特異抗体を仔ブタに提供することができる。
【０１７８】
有利には、本発明によるワクチンの効力は、若いブタが母親から獲得していることができるＰＣＶ２に対する母体由来抗体のレベルにはほとんど影響されず、「若い」とは、４週齢以下の動物齢を指す。
【０１７９】
従って、本発明によるワクチンの１実施形態において、ＰＣＶ２に対する母体由来抗体を有する若いブタにワクチンを施す。
【０１８０】
本発明によるワクチンは、有効なプライミングワクチン接種として作用し得て、それに続いて、ブースターワクチン接種を行って増幅することができる。例えば、本発明によるワクチンを約２〜１０日齢の仔ブタに投与し、再度約３週間後に投与することができ、各ワクチン接種は体積約１ｍＬで行う。
【０１８１】
しかしながら、本発明によるワクチンは単回投与後に既に有効であることから、好ましい実施形態は、例えば約３週齢からの約２ｍＬの単回投与である。このワクチン接種によって、約５〜６ヶ月齢までの肥育期間全体にわたってブタが保護される。
【０１８２】
本発明によるワクチンのブタ標的が繁殖用雌ブタ又は精子生産用の雄ブタのような６ヶ月を超えて維持されるべきである場合、例えば雌ブタの場合は、年１、２若しくは３回の定期的ブースターワクチン接種を行うことができ；各分娩前に１回のブースターワクチン接種を行い、それは平均約２回／年である。
【０１８３】
本発明に関して、「約」は、ある数がそれの示された値近傍±２５％で変動可能であることを示している。好ましくは、「約」はそれの値近傍±２０％を意味し、より好ましくは、「約」はそれの値の近傍±１５、１２、１０、８、６、５、４、３、２％を意味し、さらには、「約」はそれの値の近傍±１％を意味する（その望ましい順で）。
【０１８４】
本発明によるワクチンは、それがＰＣＶ２による感染若しくは関連する疾患の確立又は進行の両方を妨害することから、予防的処置として又は治療的処置として、又はその両方として用いることができる。
【０１８５】
好ましくは、本発明によるワクチンは、非経口注射用に好適な形態に製剤され、即ち注射用液体、例えば懸濁液、液剤、分散液又はエマルジョンとして製剤される。
【０１８６】
本発明によるワクチンの投与レジメは、好ましくは、動物へのストレスを軽減するため、そして人件費を削減するために、標的ブタが必要とし得る他のワクチンの既存のワクチン接種スケジュールに組み込まれる。これらの他のワクチンは、それらの登録された用途に適合するやり方で、一斉に、同時に又は順次に投与することができる。
【０１８７】
本発明によるワクチンは、動物用量当たりＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２ｂ−１３１Ｐタンパク質約０．１〜約１０００μｇを含む。好ましくは、ワクチンは、動物用量当たりＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２ｂ−１３１Ｐタンパク質０．５〜５００μｇ、１〜２５０、又は２〜２００μｇを含む（その望ましい順で）。用量当たりのタンパク質の量の選択は、ワクチン及び標的動物の特性に基づいて当業者が行うことができる。
【０１８８】
動物用量当たりのＯＲＦ２ｂ−１３１Ｐタンパク質の量は、準備したワクチンエマルジョンで、標準的な生化学研究室手順を用い、乳化を破壊し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて水相を調べることで求めることができる。次に、既知量の基準タンパク質、例えばウシ血清アルブミンと比較することで量の測定を行う。例えば、Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ  ２００２，ｅｄ．Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ２９，ｐ．２３７−２４２を参照する。
【０１８９】
或いは、質量分析を用いてＯＲＦ２タンパク質の定量を行うことができる。
【０１９０】
好ましくは、動物用量当たりのＰＣＶＯＲＦ２ｂ−１３１Ｐタンパク質の量は、油相との混合及び／又は乳濁の前に、抗原相の水系部分で測定する。
【０１９１】
本発明によるワクチンは、標的動物に許容される体積で投与することができ、例えば、体積約０．１〜約１０ｍＬであり得る。好ましくは、１用量は、約０．１〜約５ｍＬの体積、より好ましくは、１動物用量は０．２〜３ｍＬである。
【０１９２】
筋肉経路によって投与する場合、１用量の体積は、好ましくは約１〜約３ｍＬ、より好ましくは約２ｍＬであり；皮内経路によって投与する場合、１用量の体積は、好ましくは約０．１〜約０．５ｍＬ、より好ましくは約０．２ｍＬである。
【０１９３】
本発明によるワクチンは、当業界で公知の方法に従って標的ブタに投与することができる。好ましい投与は、非経口経路によるもの、即ち皮膚から、例えば筋肉、腹腔内、皮内、粘膜下又は皮下である。本発明によるワクチンのより好ましい投与経路は、筋肉注射又は皮下注射によるものである。さらにより好ましくは、後足又は首での筋肉投与である。
【０１９４】
当然のことながら、最適な投与経路は、使用されるワクチンの詳細及び標的の特定の特徴によって決まる。
【０１９５】
１実施形態において、本発明によるワクチンは、約３週齢からのブタに単回投与約２ｍＬとして筋肉投与される。
【０１９６】
筋肉投与の好ましい部位は、首である。
【０１９７】
１実施形態において、筋肉経路による本発明によるワクチンの投与の用量体積は柔軟であり、即ち、そのワクチンは、２ｍＬ／動物の単回投与として又は１ｍＬ／動物の二連続投与として投与される。２用量として投与される場合、両用量は、好ましくは、少なくとも１週間、好ましくは２〜５週間、より好ましくは約３週間の時間間隔をあけて投与される。
【０１９８】
１実施形態において、本発明によるワクチンは、約０．２ｍＬの単回投与として、約３週齢からのブタに皮内投与される。
【０１９９】
皮内投与に好ましい部位は、首、背及び後足から選択される。
【０２００】
本発明によるワクチンをさらに最適化することは、当業者の技術の範囲内である。一般に、それには、その提供される免疫保護をさらに改善するための、ワクチンの効力微調整が含まれる。それは、ワクチンの用量、体積若しくは抗原含有量を調節し；別の形態若しくは製剤でワクチンを用い；ワクチンの他の構成成分（例えば、安定剤又はアジュバント）を調節し；又は異なる経路、方法若しくは投与法によって投与することで、行うことができる。これらはいずれも本発明の範囲内である。
【０２０１】
本発明によるワクチンはさらに、追加の抗原、サイトカイン又は非メチル化ＣｐＧなどを含む免疫刺激核酸のような他の化合物を含むことができる。或いは、本発明によるワクチンは、有利には、医薬成分、例えば抗生物質、ホルモン、抗炎症薬又は抗寄生虫薬と組み合わせることができる。又は、本発明によるワクチン自体を、ワクチンに加えることができる。
【０２０２】
本発明によるワクチンは、有利には例えば別のブタ病原体由来の１以上のさらなる抗原と組み合わせることができる。そのような組み合わせワクチンの利点は、それがＰＣＶ２に対する免疫応答を誘発するだけでなく、他の病原体に対する免疫応答も誘発し、一方、ワクチン接種のために必要なのは標的動物を１回扱うことのみであり、それによって、動物へのワクチン接種ストレスが軽減され、並びに、時間コスト及び労働コストが削減される。
【０２０３】
従って、好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、ブタに対する病原性の微生物のさらなる抗原を含む。
【０２０４】
「さらなる抗原」自体が感染性微生物であることができるか、失活されていることができるか、サブユニットであることができ、そして、アジュバントを含んでいても含んでいなくても良い。さらなる抗原は、タンパク質、炭水化物、リポ多糖、脂質若しくは核酸分子のような生体分子又は合成分子からなるものであることができる。或いは、それは、その他の微生物からの核酸からの発現産生物、又はそのような核酸を含むベクターであることができ；そのベクターは、自体が微生物又は真核宿主細胞であることができる。
【０２０５】
前記さらなる抗原は、例えば抽出物、分画、溶解物、ホモジネート又は超音波処理物としての、何らかの形でブタ動物に対して病原性である他の微生物「由来」であり得る。
【０２０６】
本発明における「ブタ動物に対して病原性の微生物」は、当業界で公知である。従って、前記さらなる抗原は、基本的に、ブタに対して病原性であるウィルス、細菌、寄生虫、真菌、リケッチア、原虫及び／又は寄生虫由来であり得る。
【０２０７】
ブタ動物に対して病原性であるそのような微生物の例には、ブタ繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳＶ）、仮性狂犬病ウィルス、ブタパルボウィルス、ブタコレラウィルス、ブタインフルエンザウィルス、口蹄疫ウィルス、ブタ流行性下痢ウィルス、伝染性胃腸炎ウィルス、水疱性口内炎ウィルス、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ローソニア・イントラセルラリス（Ｌａｗｓｏｎｉａ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ヘモフィルス・パラスライス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ストレプトコッカス・スイス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓ）、又はサルモネラ菌、ブラキスピラ属、クロストリジウム菌、パスツレラ菌、エリジペロスリックス属、ボルデテラ属、トキソプラズマ、イソスポラ属、又は旋毛虫属がある。
【０２０８】
本発明によるワクチンの好ましい実施形態では、当該ワクチンは、ＰＣＶ２からの抗原に隣接して、Ｍ．ヒオニューモニエ（Ｍ．  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｌ．イントラセルラリス（Ｌ．  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）及びＰＲＲＳＶからなる群から選択される、ブタに対して病原性である微生物からの１以上の抗原を含む。
【０２０９】
これらは現在のところ最も顕著なブタ病原体であることから、単発の即時使用ワクチンへのそれらの組み合わせが、経済的観点並びに獣医学的観点の両方から非常に好ましい。
【０２１０】
好ましい実施形態において、前記１以上のさらなる抗原を、凍結乾燥製剤として本発明によるワクチンに加えることで、前記組み合わせワクチンを、本発明のワクチンエマルジョンによる再構築によって調製する。これは、例えばＷＯ２０１０／１０６０９５に記載されている。
【０２１１】
好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質及びＭ．ヒオニューモニエ（Ｍ．  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの抗原を含む組み合わせワクチンであり、前記組み合わせワクチンを用いて、Ｌ．イントラセルラリス（Ｌ．  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）及び／又はＰＲＲＳＶからの抗原の凍結乾燥製剤を再構築させる。
【０２１２】
好ましい実施形態において、本発明によるワクチンは、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質、Ｍ．ヒオニューモニエ（Ｍ．  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からの抗原、及びＬ．イントラセルラリス（Ｌ．  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｉｓ）からの抗原を含む組み合わせワクチンであり、前記組み合わせワクチンを用いて、ＰＲＲＳＶからの抗原の凍結乾燥製剤を再構築させる。
【０２１３】
さらなる態様において、本発明は、ブタ動物におけるＰＣＶ２による感染又は関連する疾患徴候の軽減方法であって、該方法は、本発明によるワクチンを前記ブタへ投与することを含む方法に関する。
【０２１４】
本発明によるワクチンは、当業者に公知の手段によって製造することができる。記載のように、本発明に関して記載の変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質、又は本発明に関して記載の昆虫細胞の使用によって、本発明について記載のようにブタ用ワクチンの製造が可能となる。これに関して、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質は、本発明による方法によって得ることもできる。
【０２１５】
従って、さらなる態様において、本発明は、ＰＣＶ２による感染又は関連する疾患徴候の軽減のためのブタ用ワクチンの製造のための、アミノ酸位置番号１３１にプロリンを有する変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の使用に関する。
【０２１６】
さらなる態様において、本発明は、ＰＣＶ２による感染又は関連する疾患徴候の軽減のためにブタ用ワクチンで使用されるための、アミノ酸位置番号１３１にプロリンを有する変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質に関する。
【０２１７】
さらなる態様において、本発明は、本発明によるワクチンの製造方法であって、該方法は、
−アミノ酸位置番号１３１にプロリンを有する変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を、薬学的に許容される担体と混合する段階；及び
−変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質及び薬学的に許容される担体の前記混合物をアジュバントと製剤する段階
から選択される１以上の段階を含む方法に関する。
【０２１８】
本発明によるワクチンの製造方法での使用に関して、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質は、本発明による昆虫細胞における変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の発現方法によって得ることができ、及び／又は本発明による変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の製造方法によって得ることができる。
【０２１９】
本発明によるワクチンの製造方法の１実施形態において、変異体ＯＲＦ２タンパク質は、ＶＬＰの形態のものである。
【０２２０】
本発明によるワクチンは、ブタ標的への投与に好適であり、所望の投与経路及び所望の効果と適合する形態で当業者が製造することができる。一般に、そのようなワクチンは、無菌的にそして生理的ｐＨで製造される。
【０２２１】
本発明によるワクチンの製造についての方法、使用又はプロセスの詳細及び実施例を本明細書において記載し、そのような手順は、通常の材料及び方法を用いて当業者が容易に実施可能である。例えば、本発明について記載の変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質は、工業的規模で昆虫細胞において製造することができ、そして、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせ、例えば油状アジュバントと乳濁させることでワクチンに製剤し、適切な大きさの容器に充填される。製造方法の各種段階は、十分な試験によって、例えば抗原の品質及び量についての免疫学的試験により；失活、無菌性及び外部作用剤がないことについての微生物学的試験により；及び最終的に、効力及び安全性を確認するための動物でのワクチン接種試験によってモニタリングされる。品質、量及び無菌性についての試験が完了した後、そのワクチン製品を発売することができる。
【０２２２】
これらはいずれも当業者には公知であり、ワクチン製造に適用される一般的な技術及び留意事項が、例えば、政府指令及び規則（薬局方、９ＣＦＲ）及び公知のハンドブック（Ｐａｓｔｏｒｅｔ、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ、上述）に記載されている。
【０２２３】
以下、下記の非限定的実施例によって、本発明についてさらに説明する。
【実施例】
【０２２４】
実施例１：異なるＰＣＶ２  ＯＲＦ２発現組換え構築物のアセンブリ
昆虫細胞でのＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質の発現のため、標準的手順を用いて、組換えバキュロウィルスを産生した。即ち：
これらの実験で用いた野生型ＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子は、異なる入手先から得た：ＰＣＶ２ａ親ウィルスは、ＵＳＡからのワクチン株からのものであり；ＰＣＶ２ｂは、フランスの単離株Ｉｍｐ１０１１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０５５３９４からのものであり；ＰＣＶ２ｄは、中国、株ＢＤＨ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＨＭ０３８０１７からのものであった。
【０２２５】
ＯＲＦ２遺伝子を、ＰＣＲを用いる増殖によりサブクローニングし、そしてクローニングプラスミドへ挿入した。次に、ＯＲＦ２遺伝子の一部を、ＰＣＲ−定方向突然変異を用いることで突然変異させて、アミノ酸位置１３１にプロリンをコードした。或いは又はさらに、ＯＲＦ２遺伝子をコドン最適化して、ＡｃＭＮＰＶポリへドリン遺伝子のコドン使用頻度表に似せた。ＰＣＶ２ｂ用に本明細書で使用される変異配列は、上記の添付の配列表にある。
【０２２６】
変異ＯＲＦ２遺伝子挿入物の合成構築物は、商業的供給者から注文した（ＢａｓｅＣｌｅａｒ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；ｏｒ  Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）。
【０２２７】
Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムで用いるためには、これらをクローニングベクターｐＦａｓｔＢａｃ１にサブクローニングし、ＰｒｏＥａｓｙシステムで用いるためには、トランスファーベクターｐＶＬ１３９３にサブクローニングする。両方の場合で、挿入物は、ポリへドリンプロモーターの後ろにあった。組換えバキュロウィルスの発生及び選択を、製造者の説明書に従って行った。ＰＣＶ２ａ組換えバキュロウィルス構築物の一部は、軟寒天下での感染昆虫細胞のプレーティング、及びプラークピッキングによる組換え体のトランスフェクション及び単離の旧来の選択技術を用いて構築された。
【０２２８】
全ての組換えバキュロウィルスをＳｆ９細胞で増幅させ、回収し、冷蔵若しくは冷凍保存し、力価測定した。さらなる実験に用いたウィルスストックは、代表的には７．５〜８．５Ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬであった。
【０２２９】
昆虫細胞でのＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質の発現に用いた組換えバキュロウィルスの選択を、下記のスケジュールに列記している。
【０２３０】
注：全ての挿入物は、ポリへドリンプロモーターの後ろに挿入した。コドン最適化（適用される場合）は、ＡｃＭＮＰＶポリへドリン遺伝子のコドン使用に向けたものであった。
【表１】
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【０２３１】
実施例２：昆虫細胞での発現
上記の各種組換えバキュロウィルス構築物を用いて、昆虫細胞を感染させ、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質の各種変異体を発現させた。産生されたタンパク質を目視で観察し、分析して、ＰＣＶ２の未修飾のタンパク質又は別の遺伝子型のタンパク質と比較することで生じた各種突然変異の効果を評価した。一部の組換えバキュロウィルスをスケールアップして、ブタでの試験用のＰＣＶ２サブユニットワクチンの製剤用のタンパク質を製造した。
【０２３２】
２．１  昆虫細胞培養物
標準的な感染及び発現実験を、級数的増殖を維持するために定期的に分割したクリーンな細胞の攪拌培養物から取ったＳｆ９昆虫細胞を用いて小規模で行った。典型的な感染率は０．０１〜０．１ｍｏｉであり、培養期間は３〜５日であった。培養物は、光学顕微鏡によって定期的にモニタリングして、未感染細胞の健康を調べ、感染培養物でのウィルス複製の進行をモニタリングした。
【０２３３】
使用した培養容器は、それぞれ５又は１５ｍＬの単層培養物を入れるＴ２５又はＴ７５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）であった。或いは、１００ｍＬ懸濁液培養を、スピナーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で行った。フラスコを２７℃でインキュベートし、使用した培地は、Ｓｆ−９００（商標名）ＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。血清は加えずに、抗生物質の混合物：５０μｇ／ｍＬゲンタマイシン及び０．２５‰ナタマイシンを加えた。
【０２３４】
細胞のほとんどが細胞変性効果（ｃｐｅ）を示した時点で培養物を回収し；細胞を離すために、Ｔ型培養瓶培養物をしっかり叩く必要があった。次に、細胞回収物を遠心し、産生されたＯＲＦ２タンパク質はほとんど昆虫細胞内に含まれていたことから、細胞上清は廃棄した。所期のさらなる使用に応じて、次に、必要な液体に細胞ペレットを所望の濃度で再懸濁させることができた。
【０２３５】
その小規模培養物は通常のようには失活されず；サンプルは収納設備で使用するか、変性電気泳動サンプル緩衝剤で処理し、そして失活したと見なした。
【０２３６】
大規模培養は基本的に同じ内容に従って行い、体積及び装置を調整した。実験設定では、中間大規模昆虫細胞懸濁培養を、自動プロセス制御を行う工業的発酵槽で２〜１０リットル体積で行った。クリーンなＳｆ９昆虫細胞を、前培養物から得た。Ｍｏｉは０．０１〜０．１であり、培養は５〜７日間行った。感染が十分に進行したら、細胞を重力で沈降させた。次に、培養物体積の上９０％を除去し、細胞を元の培養物体積の１／１０で回収し、超音波処理によって溶解させた。中規模では、超音波処理は、チップ超音波装置（ｔｉｐ  ｓｏｎｉｆｉｅｒ）（Ｖｉｂｒａ  Ｃｅｌｌ（商標名）、Ｓｏｎｉｃｓ，  ＣＴ，ＵＳＡ）を用いて氷上でバッチ式で行った。大規模では（体積１００リットル以上）、超音波処理は、フロースルー超音波セル（Ｓｏｎｏｂｌｏｃ（商標名）、Ｂａｎｄｅｌｉｎ）に通すことで行った。
【０２３７】
次に、超音波処理物を、ＢＥＩを用いて失活させた。次に、それをチオ硫酸Ｎａを用いて中和した。次に、失活させた回収物を、遠心によって透明とし、ＯＲＦ２タンパク質を含む上清をバルク抗原の水相として維持した。これを、品質管理及びさらなる処理のために２〜８℃で保存した。従って、これらの生成物において、抗原用の薬学的に許容される担体は、昆虫細胞からの使用済み培地である。必要な場合、バルク抗原を濃縮することができるか、ＰＢＳに対して透析することができよう。或いは、抗原を新鮮な細胞培地で、又はＰＢＳで希釈することができよう。
【０２３８】
２．２  ＥＬＩＳＡ
２．２．１  ＥＬＩＳＡの概要
昆虫細胞培養物を、組換えバキュロウィルス番号６（１３１のトレオニン）又はウィルス番号８（Ｔ１３１Ｐ置換）で感染させて、ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質におけるＴ１３１Ｐ置換の効果を調べた。両方ともＢｉｃ−２−Ｂａｃ様式での構築物であり、コドン最適化を持たなかった。ウィルス６のうち、二つの単離物を調べた。
【０２３９】
Ｓｆ９細胞のＴ１７５フラスコ培養物を感染させ、インキュベートし、そして、全培養物の遠心によって回収した。細胞ペレットを、注射用水１０ｍＬに溶解し、それによって全細胞を効果的に溶解させた。次に、細胞溶解物について、サンドイッチＥＬＩＳＡでそれらの抗原質量（ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｍａｓｓ）を調べた。即ち、下記の通りである；
ポリスチレンミクロタイトレーションプレートのウェルを、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２ａに対するモノクローナル抗体でコーティングした。溶解物サンプルの連続希釈液を、ＰＣＶ２ａ  ＯＲＦ２の既知の基準標準の一連の希釈液と一緒にインキュベートした。次に、ビオチンと結合した、やはりＰＣＶ２  ＯＲＦ２ａに対する二次抗体の固定量とともにインキュベートした。最後に、ペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジンとともにインキュベートし、次に自動プレートリーダーによって色素体検出することで結合複合体の量を定量した。
【０２４０】
溶解物中の抗原の量を、抗原の量を任意に１００抗原単位（ＡＵ）／ｍＬに設定した基準標準に対して計算した。
【０２４１】
２．２．２  ＥＬＩＳＡの結果及び結論
溶解物で検出されたＯＲＦ２タンパク質の量は、下記の通りであった；
−ウィルス６感染細胞（二つの変異体）：５．５及び７．４ＡＵ／ｍＬ、
−ウィルス８感染細胞：６８ＡＵ／ｍＬ。
【０２４２】
１３１位に突然変異を持たないＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を発現する組換えウィルスで感染した細胞からの純水中で調製された溶解物は、ＥＬＩＳＡによる検出でごく少量のみのＯＲＦ２タンパク質を含んでいた。しかしながら、Ｔ１３１Ｐ置換を有するＯＲＦ２を発現する組換えバキュロウィルスで感染した細胞からのそのような溶解物は、約１０倍多いタンパク質を含んでいた。
【０２４３】
これらのＥＬＩＳＡ結果は、ＯＲＦ２アミノ酸番号１３１の置換の有無で感染昆虫細胞から容易に単離できたＯＲＦ２タンパク質の量に大きな違いを示した。一方で、それは、そのタンパク質が非変性溶解物で放出される容易さに関係するものであった。他方、それは、位置１３１にアミノ酸の変異が無い若しくは無い昆虫細胞におけるＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の総産生量における差を反映したものでもあった。
【０２４４】
２．３  免疫蛍光アッセイ
２．３．１  ＩＦＴアッセイの概要
免疫蛍光試験（ＩＦＴ）においては、クリーンな昆虫細胞を、典型的には培地１００μＬ中２．５×１０４細胞／ウェルで、９６ウェルマイクロタイトレーションプレートのウェルに蒔いた。付着後、細胞を特定の被験組換えバキュロウィルスで感染させた。典型的には、ウィルスの希釈範囲を接種して、異なるｍｏｉで観察できるようにした。昆虫細胞が適切に感染しているがまだ溶解していないとき、接種から４〜５日後にプレートを分析した。培地を除去し、細胞を冷エタノールで固定し、そして、標準的手順に従って適切な抗体で染色した。ＦＩＴＣ結合第２抗体を肉眼観察に用いた。昆虫細胞をエバンスブルーで対比染色して、バックグラウンドとの対比を高めた。
【０２４５】
これらのＩＦＴ試験において、使用した一次抗体はブタポリクローナル抗ＰＣＶ２ａ抗血清であり、それは、ＰＣＶ２ｂ及びＰＣＶ２ｄ遺伝子型のＯＲＦ２タンパク質を染色するのにも十分に強力であった。
【０２４６】
２．３．２  ＩＦＴアッセイの結果
異なるＯＲＦ２タンパク質発現産生物について観察されたＩＦＴ結果を比較すると、次のいくつかの所見が得られた；
−上記の組換えウィルス１〜５（いずれも、ＰＣＶ２ａ  ＯＲＦ２タンパク質を発現）は全て、必ず細胞質染色パターンを生じ、実質的に昆虫細胞の全体が鮮明な発色を示した。
【０２４７】
−しかしながら、野生型ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を発現する、組換えバキュロウィルス番号６で感染した昆虫細胞は、実質的に異なるパターンを示し、ここで、染色は、専ら昆虫細胞の核周囲であった。細胞質染色は全く認められなかった。
【０２４８】
−このＩＦＴパターンは、コドン最適化遺伝子からのものであるウィルス番号７で感染した昆虫細胞とかなり同じであったが、やはりＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を発現している。唯一の相違は、少量（昆虫細胞の約１０％）が細胞質染色を示したが、大半の細胞がやはり核染色を示したという点であった。
【０２４９】
−驚くべきことに、ウィルス番号８で感染した昆虫細胞は、蛍光パターンが組換えウィルス番号７についてのものと逆であるＩＦＴパターンを与えた；ほとんどの昆虫細胞が細胞質染色を示し、一部の細胞はなお核染色を示した。ウィルス番号８は、アミノ酸番号１３１をコードするコドンがトレオニンからプロリンに変異している（Ｔ１３１Ｐ）ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２遺伝子を有していた。
【０２５０】
−最後に、ウィルス番号９（明構築物中の、コドン最適化を有し、Ｔ１３１Ｐ置換を有するＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２遺伝子）で感染した昆虫細胞は、いずれも専ら細胞質染色を示した。
【０２５１】
−とりわけ、組換えバキュロウィルス番号１０（Ｔ１３１Ｐ置換、コドン最適化を有し、明構築物中で、ＰＣＶ２ｄ  ＯＲＦ２タンパク質をコード）で感染した昆虫細胞は、いずれもやはり核染色パターンを示した。
【０２５２】
２．３．３  ＩＦＴアッセイからの結論
結論として、昆虫細胞におけるＰＣＶ２ｂからのＯＲＦ２タンパク質の効果的発現には、位置番号１３１のアミノ酸のプロリンによる置換が必要であり、抗ＰＣＶ２ａ抗体を有するＩＦＴで細胞質染色パターンを示した。そのような突然変異がないと、ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質は、専らそのタンパク質を発現する昆虫細胞の核で又はその核周囲で染色を示した。
【０２５３】
コドン最適化のみによるＯＲＦ２遺伝子の突然変異によって、恐らくは発現の効率上昇の結果として、ＩＦＴ染色パターンのわずかなシフトが生じた。
【０２５４】
組換えバキュロウィルスがクローニングベクターからの残留要素を含む構築物（例えば、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃシステムを用いて生じた組換えで）に基づくものではなく、「クリーンな」バキュロウィルス構築物である、即ち、それのゲノムにおける組換えプロセスからのさらなる遺伝的要素を含まない場合、その核染色パターンは、さらに逆転し得ると考えられる。そのようなクリーンな組換えバキュロウィルスは、旧来の相同組換え及びプラーク精製を用いることで、又はより簡便には、ＰｒｏＥａｓｙシステムのような市販キットを用いることで得られよう。
【０２５５】
従って、ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を発現する昆虫細胞で認められたＩＦＴ核染色パターンの逆転は、ＯＲＦ２アミノ酸番号１３１をコードするトリプレットの突然変異によるプロリンコードによって得ることができる。細胞質ＯＲＦ２タンパク質発現のさらなる最適化は、コードする遺伝子をコドン最適化することで、そしてクリーンな組換えバキュロウィルス構築物を用いることで行うことができる。
【０２５６】
２．４  ゲル電気泳動による定量
２．４．１  ゲル電気泳動アッセイの概要
異なるＯＲＦ２タンパク質の発現レベルの定量を可能とするため、感染昆虫細胞培養物からのサンプルについて、マーカータンパク質として既知量のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）での列と一緒にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。染色後、ゲルを走査し、分析した。強変性サンプル緩衝液を用いることで、この実験によって、各種組換えバキュロウィルス構築物で感染した昆虫細胞の総発現能力が明らかになった。
【０２５７】
試験対象の異なる組換えバキュロウィルスを、上記のＴ７５フラスコで培養し、回収し、遠心し、細胞ペレットをＰＢＳ  ７．５ｍＬに溶解した。次に、上清のサンプル及び再懸濁細胞のサンプルを、標準変性Ｌａｅｍｍｌｉ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（ブロモフェノールブルー指示薬及びβ−メルカプトエタノールを含む）に溶解した。
【０２５８】
サンプルについて、標準的なトリス−グリシン−ＳＤＳ緩衝液中での、標準的なポリアクリルアミドゲル（プレキャストＣｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ（商標名）、あらゆるｋＤ（１５％）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を行った。電気泳動後、ゲルを、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｂｌｕｅ（商標名）（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色した。最後に、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂ（商標名）ソフトウェア、バージョン５．２．１を用いて、ゲルをデジタル化し、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＧＳ−９００較正密度計で分析して、タンパク質の量をそのゲルにおける個々のバンドに割り当てた。
【０２５９】
２．４．２  ゲル電気泳動アッセイの結果
図１及び２において、これらの実験で用いたもののようなゲルについてのいくつかの代表的な画像を提供しており、図１は、ウィルス番号３、６若しくは７で感染した昆虫細胞の培養物からのサンプルであり、図２は、ウィルス番号８若しくは９での培養液からのサンプルである。ウィルスの型ごとに、第１の列は培養上清のサンプルを含み、次の３列は２倍濃縮細胞のサンプルを含み、左から右に向かって３０、２０及び１０μｍＬであった。最も左及び最も右の列は、分子量マーカー１０〜２５０ｋＤａ（Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（商標名）  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）であり、バンドの大きさは図に示している。
【０２６０】
各ゲルは希釈範囲のＢＳＡ（高品質アルブミン標準（Ａｌｂｕｍｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ｈｉｇｈ−ｑｕａｌｉｔｙ）、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）も含み、それは１００ｎｇ／μＬ溶液として用いた。使用した量は、図１：列１４〜１７で、０．２５、０．５、１及び２μｇＢＳＡであり、図２：列１１〜１５で、０．２５、０．５、１、２及び３μｇＢＳＡであった。
【０２６１】
密度計による分析は、２６ｋＤａでのＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質のバンドに焦点を当てたものであった。全てのサンプルをゲル上で２回分析し、計算収量結果は、その二連の平均である。
【０２６２】
ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質の収量は、元のＴ７５培養物（１５ｍＬ体積）１ｍＬ当たりのタンパク質のμｇ数で表している。収量は、下記の通りであることが認められた。
【表２】
2020537651.tif 000003
【０２６３】
いくつかの所見が得られた；
−ウィルス番号８及び９によるウィルス感染では、Ｔ１３１Ｐ置換があるＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２の二つの構築物の場合、ゲル列（図２参照）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって比較した全ての培養物について、ｍｏｉ（０．１）、培養時間（４日間）、及び他の条件は全て同一であったが、調べた他のウィルスの場合より若干暗いように見えた。これは、感染が、他のウィルスの場合ほど進行していなかったことで、サンプル中により多くの細胞材料があった可能性があることを示していると考えられる。恐らく、プロリン置換によって、組換えバキュロウィルスが若干減弱されたものである。しかしながら、タンパク質−発現レベルは影響されていないように見え、この突然変異がないＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２より良好であった。
【０２６４】
−使用されたＣＢＢ染色によって肉眼観察できる量のＯＲＦ２タンパク質を示した上清サンプルはなかった。結果的に、これらの実験で適用された条件下では、事実上、発現ＯＲＦ２タンパク質の全てが昆虫細胞に含まれていた。
【０２６５】
−未変異のＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質（ウィルス６）の発現レベルは、ＰＣＶ２ａ  ＯＲＦ２（ウィルス３）の場合より低く、２６μｇ／ｍＬに対して３２μｇ／ｍＬであった。留意すべき点として、これらのサンプルは、積極的（ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ）変性を用いた（ＳＤＳ及びβ−メルカプトエタノール中で煮沸）ことから、産生した全てのタンパク質の合計を示している。これは、未変異のＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２遺伝子からの総タンパク質発現が、実際には、昆虫細胞全体ではより低いことを示している。
【０２６６】
注：収量におけるこの差は、回収が（強い）変性なしである場合、実際にはそれよりかなり悪い。その場合、未変異のＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２を発現する昆虫細胞からの溶解物は、検出可能なＯＲＦ２タンパク質を示すことはほとんどなかった。
【０２６７】
−未変異のＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の収量は、コドン最適化ＯＲＦ２遺伝子を用いることで若干上昇させることができ、ウィルス−培養物６及び７の収量を比較すると、それぞれ総収量は２６μｇ／ｍＬ及び３６μｇ／ｍＬである。
【０２６８】
−しかしながら、最も大きい増加は、ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦタンパク質にＴ１３１Ｐ置換を導入することで達成されたものであり、ウィルス−培養物６及び８の収量２６μｇ／ｍＬ対５６μｇ／ｍＬを参照する。従って、Ｔ１３１Ｐ置換は、最適化を行っていないこれらの小規模培養物であっても、ＯＲＦ２タンパク質の合計収量を倍以上とすることができた。
【０２６９】
−全ての突然変異を組み合わせた場合に、即ちＴ１３１Ｐ置換、コドン最適化及びクリアーなバキュロウィルス構築物の使用を組み合わせた場合に、さらにより良好なＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質が達成されると考えられ；ウィルス−培養物６及び９の収量を比較すると、２６μｇ／ｍＬから７６μｇ／ｍＬへのタンパク質収量の三倍化が示される。
【０２７０】
タンパク質収量の同様の分析を、２リットルという中間規模の培養液中で産生されたサンプルについても行った。回収物は、総培養物体積と比較して７．７倍濃度で得た。やはり、これらの培養物からのＯＲＦ２タンパク質を用いて、後述する実験的ＰＣＶ２ワクチンを製造した。
【０２７１】
得られたＯＲＦ２タンパク質収量は下記の通りであり、元の２リットル培養体積のμｇ／ｍＬで示した。
【表３】
2020537651.tif 000004
【０２７２】
発酵槽中の培養条件は、Ｔ−フラスコでの小規模培養の場合より明らかに至適なものであった。温度、ｐＨ及び溶存酸素の自動制御のためだけでなく、さらにはこれらが懸濁培養であったため、培養液１ｍＬ当たりの細胞密度がより高くなった。
【０２７３】
使用した組換えバキュロウィルスはまた、それらがクリアーなバキュロウィルス構築物（ＰｒｏＥａｓｙシステムを用いて製造）中で、コドン最適化ＯＲＦ２遺伝子を有していたという意味で、至適に構築された。
【０２７４】
それにより、１００μｇ／培養液ｍＬを超えるウィルス番号９に感染した昆虫細胞についてのタンパク質収量となったが、Ｔ−フラスコでは、それは７６μｇ／ｍＬであった。
【０２７５】
アミノ酸番号１３１のプロリンによる置換を有する変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質を発現する昆虫細胞からのタンパク質の収量は、同じ構築物及び培養条件を用いても、格段に未変性ＰＣＶ２ａ  ＯＲＦ２タンパク質の場合よりかなり高かった。特に、ここで使用されるＰＣＶ２ａのＯＲＦ２遺伝子も、それの天然配列からアミノ酸位置１３１にプロリンを有していたからである。それはＰＣＶ２に対するサブユニットワクチンの製造のためのＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の製造に明らかに非常に好ましいが、何がこの差の原因である可能性があるかは直ちに明らかではない。
【０２７６】
２．４．３  ゲル電気泳動アッセイからの結論
観察された効果が全てこの時点で説明できるとは限らないが、ゲル電気泳動による分析によって、調整のないＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の昆虫細胞での発現によっては、せいぜいＰＣＶ２ａ  ＯＲＦ２の発現の場合よりも低いタンパク質量を生じることが明らかになった。この差は、細胞を非変性条件を用いて回収した場合は、さらに悪くなる。
【０２７７】
しかしながら、収量の不足は、ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２における位置１３１のアミノ酸をプロリンに代えることで十分以上に補償できるものであり、それによって、未変異のＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質の場合と比較して収量は少なくとも倍加する。
【０２７８】
コドン最適化ＯＲＦ２遺伝子からの１３１Ｐ突然変異を発現させ、そして、クリーンなバキュロウィルス構築物を用いることで、収量をさらに高めることができる。大規模懸濁培養で、収量をさらに改善することができる。
【０２７９】
これらの所見を総合すると、組換え発現系によりＰＣＶ２ｂ遺伝子型からのＯＲＦ２タンパク質の商業的な大規模製造が初めて可能となる。
【０２８０】
実施例３：ブタでのワクチン接種−攻撃実験
３．１  イントロダクション
３．１．１  目的
本試験は、本発明による昆虫細胞発現変異体ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質に基づいて、ブタワクチンの効力を比較及び評価するために実施した。保護能力についての徹底的な試験を提供するため、異なる遺伝子型のＯＲＦ２タンパク質を、同種だけでなく異種ＰＣＶ２攻撃−感染に対しても用いた。さらに、使用したワクチン用量は、比較的低量のＯＲＦ２タンパク質を含んでいた。
【０２８１】
３．１．２  試験概要
本試験においては、仔ブタ１４０頭を用い、２セットの動物各１０頭の７処理群に割り当て、二つの攻撃のそれぞれにつき１セットとした。動物１４０頭は、１４頭の雌ブタ由来であった。仔ブタは、低力価から非常に高力価にわたる検出可能レベルの抗ＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗体を有しており；全動物についての平均ＭＤＡ力価は、抗体−ＥＬＩＳＡにより５．８ｌｏｇ２であった。
【０２８２】
仔ブタがほぼ３週齢となった時に、首に各２ｍＬの筋肉注射によってワクチン接種した。使用したワクチンは、三つの遺伝子型：ＰＣＶ２ａ、２ｂ又は２ｄのうちの一つからのバキュロウィルス−昆虫細胞発現系を介して産生された異なる量のＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質を含んでいた。使用した組換えバキュロウィルスは、クリーンなバキュロウィルス構築物を用いて、ＡｃＭＮＰＶポリへドリン遺伝子向けにコドン最適化されたコードＯＲＦ２遺伝子から発現される、アミノ酸位置１３１にプロリンを有する上記の番号５、９及び１０であった。ワクチンは、Ｅｍｕｎａｄｅ（商標名）アジュバントを用いて水中油型エマルジョンとして製剤した。そのワクチンはさらに、マイコプラズマ・ヒオニューモニエ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）（Ｊ株）からの抗原を含み、市販のワクチン：Ｐｏｒｃｉｌｉｓ（商標名）ＰＣＶ  Ｍ  Ｈｙｏに似たものとした。ＰＣＶ２  ＯＲＦ２抗原に関して、被験ワクチンは、動物当たり、標準総用量の１／４又は１／１６を含んでいた。
【０２８３】
両方のセットにおいて、群へのワクチン処理の割り当ては、下記のスケジュールに示した通りとした。
【０２８４】
注：両セットの群７における動物は、攻撃対照として使うためワクチン接種しなかった。
【表４】
2020537651.tif 000005
【０２８５】
ワクチン接種から２週間後、全ての動物は攻撃施設に移動された。ワクチン接種から３週間後（６週齢）、全ての動物に、２ｂ遺伝子型又は２ｄ遺伝子型からの有毒ＰＣＶ２による攻撃感染を行った。攻撃は、セット１についてはＰＣＶ２ｂ攻撃ウィルス（オランダ単離物、２００３）を用い、セット２についてはＰＣＶ２ｄ攻撃ウィルス（ドイツ単離物、２０１５）を用いて、５ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬでＰＣＶ２／ＰＢＳ  ６ｍＬ（３ｍＬ／鼻孔）を経鼻投与することで行った。攻撃ウィルスは、ＰＣＶを含まないＰＫ１５細胞で産生させたものであり、細菌及び真菌無菌性について検査済みのものであった。
【０２８６】
攻撃から３週間後（９週齢）、全動物を屠殺し、調べた：肺、鼠径リンパ節及び腸間膜リンパ節、扁桃腺、胸腺、脾臓、肝臓及び腎臓に特に注意を払いながら、内臓をイン・サイツで調べた。次に、扁桃腺、肺、腸間膜リンパ節及び鼠径リンパ節からの検体を摘出し、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）によるＰＣＶ２攻撃ウィルスの検出のために固定した。
【０２８７】
他の分析、例えば血液検体についての血清検査、組織及び綿棒検体についてのｑＰＣＲも行った。しかしながら、ＩＨＣデータが、最も明確な結果を与えた。
【０２８８】
３．２  材料及び方法
３．２．１  ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質
ＰＣＶ２ａ、２ｂ及び２ｄのＰＣＶ２  ＯＲＦ２遺伝子配列を、上記のセクション２．１に記載のように中間規模培養で製造した。ゲル電気泳動によるそれらの定量については、上記セクション２．３．２に記載されている。
【０２８９】
３．２．２  試験動物
試験動物は、ＰＣＶ２ウィルス負荷に関して陰性であり、中等度レベルの抗ＰＣＶ２抗体を有していた。動物が攻撃前にＰＣＶ２感染の臨床徴候を発症していたら、試験は除外となっていたであろう。
【０２９０】
健常動物のみを試験に含めた。全ての仔ブタを、全体的な健康、並びに疾患の臨床若しくは全身徴候、例えば食欲低下、運動を嫌がること、横たわる傾向、倦怠若しくは眠気、震え、毛の逆立ち、浮腫（特に眼球周囲）、嘔吐及び下痢及び呼吸困難について１日１回観察した。
【０２９１】
仔ブタを個々に耳タグによって標識し、１４種の同腹仔の仔ブタを試験群全体に等しく分けた。離乳後、水道水を自由に摂取させ、給餌は標準的な手順に従って行った。
【０２９２】
ワクチン接種は、分娩農場で行った。攻撃施設に移動した後、１週間の馴致を行った。
【０２９３】
３．２．３  検査室実験手順
３．２．３．１  免疫組織化学検査
１０％ホルマリンで固定しパラフィンに包埋することで、組織学的検査用に組織検体を準備した。顕微鏡検査スライドを準備した。これらを、一次抗体としてのウサギポリクローナル抗ＰＣＶ２血清とともにインキュベートし、ペルオキシダーゼ染色（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋（商標名）、ＤＡＫＯ）によって視覚化した。スライドを、ヘマトキシリンによって対比染色した。扁桃腺及びリンパ節の顕微鏡検査で、特徴的な褐色染色が得られ、着色の程度に応じたスコアとした；
スコア０：リンパ濾胞が、特異的陽性染色を全く示さなかった。
【０２９４】
スコア１：１０％未満のリンパ濾胞が、特異的陽性染色を有する細胞を最大１５個含んでいた。
【０２９５】
スコア２：１０〜５０％のリンパ濾胞が特異的陽性染色を有する細胞を最大１５個含んでいたか、又は１０％未満のリンパ濾胞が特異的陽性染色を有する細胞を１５個より多く含んでいた。
【０２９６】
スコア３：５０％を超えるリンパ濾胞が、特異的陽性染色を有する細胞を含んでいた。
【０２９７】
個々の組織のスコアの合計を、動物当たりの合計ＩＨＣスコアとして記録し、それらの値を群の全動物について合わせた。
【０２９８】
３．２．３．２ワクチン製剤
被験ワクチンを、Ｅｍｕｎａｄｅ（商標名）を含む水中油型エマルジョンとして製剤し、それは、ワクチン抗原並びに水酸化アルミニウムを含む水相中に分散した鉱油を含む二重アジュバントである。９％Ｍｈｙｏ抗原を含む製剤は、ＷＯ２０１６／０９１９９８に記載の手順によるものであった。
【０２９９】
さらに、ＥＰ１．９２６．４９６に従って、全用量（２ｍＬ／動物）の２５％がＯＲＦ２タンパク質約２０μｇを含み、６．２５％の用量がＯＲＦ２タンパク質／動物用量５μｇを含むようにワクチンを製造した。
【０３００】
３．３  結果及び結論
免疫組織化学的検査によって、死後に摘出した扁桃腺、腸間膜リンパ節及び鼠径リンパ節の組織検体を分析し、検出可能な攻撃ウィルスの量を評価した。これらの結果のグラフによる概観を図３及び４で提供し；図３は、毒性ＰＣＶ２ｂウィルスによる攻撃感染を受けたセット１の群１〜７における動物についての結果を表し；図４は、動物が毒性ＰＣＶ２ｄウィルスによる攻撃を受けたセット２の全ての動物についてのＩＨＣデータを表す。
【０３０１】
縦軸は、上記スケールに従ったＩＨＣ強度のスコアを示すものである。そのＩＨＣ結果を用いてワクチン接種群と非ワクチン接種群でのＰＣＶ２感染の低減レベルを比較することで、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２タンパク質に基づくワクチンの効力を求めることができる。
【０３０２】
いくつかの所見を得ることができた；
−非ワクチン接種動物は、ワクチン接種群と比較してかなり高いＩＨＣスコアを示し、それは、攻撃の用量が十分高いこと、及びその攻撃感染が、仔ブタでの中等度レベルの抗ＰＣＶ２母体抗体のものであっても有効であったことを示している。
【０３０３】
−以上のように、ＯＲＦ２タンパク質５μｇ又は２０μｇを含むワクチン用量は、攻撃ウィルスの複製に対する強力な保護を提供し、最大９０％のＩＨＣスコア低下に達した。従って、これらのＰＣＶ２ワクチンは、非常に有効であった。
【０３０４】
−ＰＣＶ２ｄ攻撃に対して、最低用量のＰＣＶ２ａ  ＯＲＦ２タンパク質について、やや低い保護が認められた。これは、本発明によるＰＣＶ２ｂ若しくはＰＣＶ２ｄからの昆虫細胞発現変異体ＯＲＦ２タンパク質に基づくＰＣＶ２ワクチンが、単回投与であっても、そして母体由来抗体に関連するものであっても、ＰＣＶ２感染に対するワクチンとして非常に有効であることを示している。等しい用量で、ＰＣＶ２ｂから若しくはＰＣＶ２ｄからの変異体ＯＲＦ２タンパク質に基づくこれらのワクチンであっても、ＰＣＶ２ａ  ＯＲＦ２タンパク質に基づく従来のワクチンより効果が高いように見えた。
【０３０５】
−大概の場合、同種保護が異種保護より良好であったが、調べた３種類全てのワクチン遺伝子型により、ＰＣＶ２ｂ及びＰＣＶ２ｄ攻撃ウィルスに対する明らかなレベルの交差保護があり；ＰＣＶ２ａ及びＰＣＶ２ｄ  ＯＲＦ２タンパク質ワクチンは、ＰＣＶ２ｂ攻撃に対して最低用量で保護効果は匹敵するが、それより高い用量ではＰＣＶ２ａ  ＯＲＦ２タンパク質の方が良好であった。しかしながら、変異ＰＣＶ２ｂ  ＯＲＦ２タンパク質に基づくワクチンは、両方の用量でＰＣＶ２ｄ攻撃に対してＰＣＶ２ａ  ＯＲＦ２タンパク質より良好であった。
【図１】
2020537651.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020537651.tif 000011
2020537651.tif 000012
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