(57)【要約】  白斑症のようなＣＸＣＲ−３関連障害を処置するための方法及び抗ＣＸＣＲ３抗体の使用が提供される。特定の実施態様において、抗ＣＸＣＲ３抗体は、それらの表面上でＣＸＣＲ３を発現する細胞に対して増強されたエフェクター機能を有するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト化抗ヒトＣ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）抗体、又は白斑症を処置する方法における使用のためのその医薬組成物であって、ここでヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含み、ここで
ａ）  ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、配列番号２４／２０、２２／１８、８０／１３０、８１／２４、８２／１３０、８２／２４、８３／１２６、８３／１３０、８３／２４、８４／１２６、８４／２４、８５／２４、８６／１２６、８７／１２６、８７／１３３、８７／２４、８８／２４、８９／２４、９０／１２６、９１／１２６、９１／１３０、９２／１３０、９２／２４、９３／１２６、９４／１２６、９５／１２６、９６／１２６、９７／１２６、９８／１２６、９９／１２６、１００／１２６、１０１／１２６、１０２／１２６、１０３／１２６、１０４／１２６、１０５／１２６、１０６／１２６、１０７／１２６、１０８／１２６、１０９／１２６、１１０／１２６、１１１／１２６、１２１／２４、１１３／１３０、１１３／２４、１１４／１３０、１１５／１２６、１１５／１３０、１１５／２４、１１６／１２６、１１６／１３０、１１６／２４、１１７／１２６、１１８／１２６、２０／１２３、２０／１２４、２０／１２５、２０／１２６、２０／１２７、２０／１２８、２０／１２９、２０／１３０、２０／１３１、２０／１３２、２０／１３３、２０／１３４、１１９／１２６、１２２／１２６、及び１２０／１３０からなる群より選択される配列対のアミノ酸配列を含み、そしてここで
ｂ）  重鎖は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む、
上記ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体又はその医薬組成物。
【請求項２】
ＶＨは配列番号２０のアミノ酸配列を含み、そしてＶＬは配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項３】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項４】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項５】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項６】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号ｌｌのアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項７】
ＶＨは配列番号１８のアミノ酸配列を含み、そしてＶＬは配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項８】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項９】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項１０】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項１１】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号ｌｌのアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項１２】
ａ）  ＨＣは配列番号２５のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３５のアミノ酸配列を含み、
ｂ）  ＨＣは配列番号２６のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３５のアミノ酸配列を含む、
ｃ）  ＨＣ配列番号２７のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３５のアミノ酸配列を含む、
ｄ）  ＨＣは配列番号１３９のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３５のアミノ酸配列を含む、
ｅ）  ＨＣは配列番号３１のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、
ｆ）  ＨＣは配列番３２のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、
ｇ）  ＨＣは配列番号３２のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、
ｈ）  ＨＣは配列番号１４０のアミノ酸配列を含み、そしてＨＣは配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、
請求項３５に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体又はその医薬製剤。
【請求項１３】
ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は減少したフコース含有量を有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体又はその医薬製剤。
【請求項１４】
抗体は、グリコシル化阻害剤の存在下で培養される宿主細胞で製造される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体又はその医薬製剤。
【請求項１５】
グリコシル化阻害剤はキフネンシンである、請求項１４に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体又はその医薬製剤。
【請求項１６】
重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含むヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体を、それを必要とする被験体に投与することを含む、白斑症を処置する方法であって、ここで
ａ）  ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、配列番号２４／２０、２２／１８、８０／１３０、８１／２４、８２／１３０、８２／２４、８３／１２６、８３／１３０、８３／２４、８４／１２６、８４／２４、８５／２４、８６／１２６、８７／１２６、８７／１３３、８７／２４、８８／２４、８９／２４、９０／１２６、９１／１２６、９１／１３０、９２／１３０、９２／２４、９３／１２６、９４／１２６、９５／１２６、９６／１２６、９７／１２６、９８／１２６、９９／１２６、１００／１２６、１０１／１２６、１０２／１２６、１０３／１２６、１０４／１２６、１０５／１２６、１０６／１２６、１０７／１２６、１０８／１２６、１０９／１２６、１１０／１２６、１１１／１２６、１２１／２４、１１３／１３０、１１３／２４、１１４／１３０、１１５／１２６、１１５／１３０、１１５／２４、１１６／１２６、１１６／１３０、１１６／２４、１１７／１２６、１１８／１２６、２０／１２３、２０／１２４、２０／１２５、２０／１２６、２０／１２７、２０／１２８、２０／１２９、２０／１３０、２０／１３１、２０／１３２、２０／１３３、２０／１３４、１１９／１２６、１２２／１２６、及び１２０／１３０からなる群より選択される配列対のアミノ酸配列を含み、そしてここで
ｂ）  重鎖は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１１からなる群より選択されるヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む、
上記方法。
【請求項１７】
ＶＨは配列番号２０のアミノ酸配列を含み、そしてＶＬは配列番号２４のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項１９】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項２０】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項２１】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号ｌｌのアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項２２】
ＶＨは配列番号１８のアミノ酸配列を含み、そしてＶＬは配列番号２２のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項２４】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号９のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項２５】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号１０のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項２６】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号ｌｌのアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載のヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体。
【請求項２７】
ａ）  ＨＣは配列番号２５のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３５のアミノ酸配列を含む、
ｂ）  ＨＣは配列番号２６のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３５のアミノ酸配列を含む、
ｃ）  ＨＣは配列番号２７のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３５のアミノ酸配列を含む、
ｄ）  ＨＣは配列番号１３９のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３５のアミノ酸配列を含む、
ｅ）  ＨＣは配列番号３１のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、
ｆ）  ＨＣは配列番号３２のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、
ｇ）  ＨＣは配列番号３２のアミノ酸配列を含み、そしてＬＣは配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、
ｈ）  ＨＣは配列番号１４０のアミノ酸配列を含み、そしてＨＣは配列番号１３７のアミノ酸配列を含む、
請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
ＨＣは、減少したフコース含有量を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
抗体は、グリコシル化阻害剤の存在下で培養される宿主細胞で製造される、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
グリコシル化阻害剤はキフネンシンである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含むヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体を、それを必要とする被験体に投与するための指示書を提供することを含む、白斑症を処置する方法であって、ここで
ａ）  ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、配列番号２４／２０、２２／１８、８０／１３０、８１／２４、８２／１３０、８２／２４、８３／１２６、８３／１３０、８３／２４、８４／１２６、８４／２４、８５／２４、８６／１２６、８７／１２６、８７／１３３、８７／２４、８８／２４、８９／２４、９０／１２６、９１／１２６、９１／１３０、９２／１３０、９２／２４、９３／１２６、９４／１２６、９５／１２６、９６／１２６、９７／１２６、９８／１２６、９９／１２６、１００／１２６、１０１／１２６、１０２／１２６、１０３／１２６、１０４／１２６、１０５／１２６、１０６／１２６、１０７／１２６、１０８／１２６、１０９／１２６、１１０／１２６、１１１／１２６、１２１／２４、１１３／１３０、１１３／２４、１１４／１３０、１１５／１２６、１１５／１３０、１１５／２４、１１６／１２６、１１６／１３０、１１６／２４、１１７／１２６、１１８／１２６、２０／１２３、２０／１２４、２０／１２５、２０／１２６、２０／１２７、２０／１２８、２０／１２９、２０／１３０、２０／１３１、２０／１３２、２０／１３３、２０／１３４、１１９／１２６、１２２／１２６、及び１２０／１３０からなる群より選択される配列対のアミノ酸配列を含み、そしてここで
ｂ）  重鎖は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む、
上記方法。
【請求項３２】
ａ）  重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含むヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体、［ここで、
ｉ）  ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、配列番号２４／２０、２２／１８、８０／１３０、８１／２４、８２／１３０、８２／２４、８３／１２６、８３／１３０、８３／２４、８４／１２６、８４／２４、８５／２４、８６／１２６、８７／１２６、８７／１３３、８７／２４、８８／２４、８９／２４、９０／１２６、９１／１２６、９１／１３０、９２／１３０、９２／２４、９３／１２６、９４／１２６、９５／１２６、９６／１２６、９７／１２６、９８／１２６、９９／１２６、１００／１２６、１０１／１２６、１０２／１２６、１０３／１２６、１０４／１２６、１０５／１２６、１０６／１２６、１０７／１２６、１０８／１２６、１０９／１２６、１１０／１２６、１１１／１２６、１２１／２４、１１３／１３０、１１３／２４、１１４／１３０、１１５／１２６、１１５／１３０、１１５／２４、１１６／１２６、１１６／１３０、１１６／２４、１１７／１２６、１１８／１２６、２０／１２３、２０／１２４、２０／１２５、２０／１２６、２０／１２７、２０／１２８、２０／１２９、２０／１３０、２０／１３１、２０／１３２、２０／１３３、２０／１３４、１１９／１２６、１２２／１２６、及び１２０／１３０からなる群より選択される配列対のアミノ酸配列を含み、
ｉｉ）  ＨＣは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を更に含む］；並びに
ｂ）  ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３をそれを必要とするヒト被験体に投与するための指示書
を含む、白斑症を処置するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連技術
本出願は、米国仮特許出願第６２／４３７，８８９号（２０１６年１２月２２日出願）、及び欧州特許出願第１７３０６７７０．３号（２０１７年１２月１４日出願）（これらの内容全体は、参照により本明細書に加入される）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明は、白斑症のようなＣＸＣＲ３シグナル伝達に関連する障害を処置するための抗体及び抗体を使用する方法に関する。
【０００３】
白斑症は、自己反応性ＣＤ８＋  Ｔ細胞が表皮においてメラニン形成細胞を死滅させ、斑状の色素脱失を生じる外観を損なう自己免疫皮膚病である。これは世界中で人工の１％が患っている最も一般的な自己免疫疾患の１つであるが、現在白斑症のためのＦＤＡが認可した処置はない。
【０００４】
Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）は、抗原を経験した（メモリー）エフェクター及び活性化Ｔ細胞で主に発現され、そしてその一次リガンド：ＣＸＣＬ９（ＭＩＧ）、ＣＸＣＬ１０（ＩＰ−１０）、及びＣＸＣＬ１１（Ｉ−ＴＡＣ）に応じた組織炎症の部位へのこれらのＴ細胞サブセットの補充に関与するケモカイン受容体である。ＣＸＣＲ３及びＣＸＣＬ１０はヒトＴ１Ｄ患者において発現される（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。これらの患者において、ＣＸＣＬ１０は膵島において残存するインスリン産生ベータ細胞において発現される。ＣＸＣＲ３は、膵島を取り囲む浸潤するＴ細胞で発現される。同様の発現パターンは、１型糖尿病のマウスモデルである非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウスにおいて再現された（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。
【０００５】
ＣＸＣＲ３は皮膚ＣＤ３＋リンパ球及び形質細胞様樹状細胞により発現され、そしてそのケモカインリガンドＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ９は、乾癬病変において上方調節される（非特許文献７；非特許文献８）。ＣＸＣＲ３は特定の種類の炎症組織に存在する浸潤Ｔ細胞でも発現されるが、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１はしばしば炎症性病変において局所細胞により産生される。
【０００６】
ＣＸＣＲ３の上方調節は様々な自己免疫障害と関係づけられてきた。大部分はナイーブＴ細胞には不在であるが、ＣＸＣＲ３発現は抗原での活性化の際に上方調節される。ＣＸＣＲ３は、その一次リガンドに応じて、Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞を含むこれらの細胞を組織炎症部位に補充する。ランゲルハンス島におけるベータ細胞はＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０を発現し（非特許文献９）、そして膵臓に浸潤したＴ細胞はＣＸＣＲ３を発現する（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。Ｙｏｕｄらへの特許文献１は抗ＣＸＣＲ３抗体を記載する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許第８，８６５，８７０号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｊ  ５７：９９１−９６  （２０１０）
【非特許文献２】Ｒｏｅｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：３３８−４３  （２００３）
【非特許文献３】Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：２２８５−２２９１  （２００９）
【非特許文献４】Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：７０１７−２４  （２００４）
【非特許文献５】Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  １１（３０）：４７５０−２  （２００５）
【非特許文献６】Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６１（２）：４３６−４６  （２０１２）
【非特許文献７】Ｒｏｔｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８１（３）：３３５−４７  （２００１）
【非特許文献８】Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ａｒｃｈ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｒｅｓ  ３０２（２）：１１３−２３  （２０１０）
【非特許文献９】Ｆｒｉｇｅｒｉｏ  ａｔ  ａｌ．、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ８：１４１４−２０  （２００２）
【非特許文献１０】Ｃｈｒｉｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７１：６８３８−４５（２００３）
【非特許文献１１】Ｖａｎ  Ｈａｌｔｅｒｅｎ  ａｔ  ａｌ．、Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ４８：７５−８２  （２００５）
【非特許文献１２】Ｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．、Ｅｎｄｏｃｒ  Ｊ  ５７：９９１−９６  （２０１０）
【非特許文献１３】Ｒｏｅｐ  ｅｔ  ａｌ．、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５９：３３８−４３  （２００３）
【非特許文献１４】Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５８：２２８５−２２９１  （２００９）
【非特許文献１５】Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ６１（２）：４３６−４６  （２０１２）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ＣＸＣＲ３が関与した白斑症及びほかの障害の有病率を考慮して、例えば、患者における白斑症のような障害を処置するか又は進行を低減するための、ＣＸＣＲ３シグナル伝達を標的としたさらなる方法の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
ＣＸＣＲ３に特異的に結合するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントを投与することによる白斑症のようなＣＸＣＲ３関連疾患及び障害の処置方法が本明細書において提供される。特定の実施態様において、本明細書において方法及び使用のために提供される抗ＣＸＣＲ３抗体は、ＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を方向づける能力を有し、又は白斑症のようなＣＸＣＲ３関連疾患及び障害を処置するためにＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を方向づける増強された能力を有するよう操作され得る。
【００１１】
いくつかの実施態様において、本明細書における方法及び使用のために提供されるヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも０．８８５（ＶＨのＤ領域残基を除いてＶＨ及びＶＬ鎖の全ての残基を比較した場合）又は少なくとも０．９５０（ＩＭＴＧによってのみ決定されたフレームワーク領域の残基を比較した場合）のジャーミナリティ（ｇｅｒｍｉｎａｌｉｔｙ）スコアを有する。いくつかの実施態様において、本明細書において提供されるヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、少なくとも１ｘ１０−９ＭのＫＤを有する。いくつかの実施態様において、本明細書において提供されるヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、７ｘ１０−５ｌ／Ｍｓ未満のｋｄを有する。いくつかの実施態様において、本明細書において提供されるヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＶＨのＤ領域残基を除いてＶＨ及びＶＬ鎖の全ての残基を比較した場合）少なくとも０．８８５又は（ＩＭＴＧのみにより決定されたフレームワーク領域の残基を比較した場合）少なくとも０．９５０のジャーミナリティスコア及び少なくとも１ｘ１０−９ＭのＫＤ、並びに（ＶＨのＤ領域残基を除いてＶＨ及びＶＬ鎖の全ての残基を比較した場合）少なくとも０．８８５又は（ＩＭＴＧのみにより決定されたフレームワーク領域の残基を比較した場合）少なくとも０．９５０のジャーミナリティスコアを有する。いくつかの実施態様において、本明細書において提供されるヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントは、ＶＨのＤ領域残基を除いてＶＨ及びＶＬ鎖の全ての残基を比較した場合）少なくとも０．８８５又は（ＩＭＴＧのみにより決定されたフレームワーク領域の残基を比較した場合）少なくとも０．９５０のジャーミナリティスコア、少なくとも１ｘ１０−９ＭのＫＤ及び７ｘ１０−５ｌ／Ｍｓ未満のｋｄを有する。
【００１２】
特定の実施態様において、特定の重鎖可変領域と対になった特定の軽鎖可変領域を含むヒト化ＣＸＣＲ３抗体が提供される。特定の実施態様において、本明細書において提供されるヒト化ＣＸＣＲ３抗体は、ヒトＣＸＣＲ３をそれらの表面上に発現する細胞に対して増強されたエフェクター機能を付与する変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。
【００１３】
第一の局面において、被験体においてＣＸＣＲ３を発現する細胞を枯渇させる方法における使用のための、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体又はその医薬組成物が本明細書において提供され、ここでヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含む。いくつかの実施態様において、ＣＤ４＋  Ｔ細胞が枯渇する。いくつかの実施態様において、ＣＤ８＋  Ｔ細胞が枯渇する。いくつかの実施態様において、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔ細胞が枯渇する。いくつかの実施態様において、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞が枯渇する。いくつかの実施態様において、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞が枯渇する。いくつかの実施態様において、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞及びＣＤ８＋メモリーＴ細胞が枯渇する。一実施態様において、被験体はＴ細胞媒介自己免疫疾患を有する。別の実施態様において、被験体は白斑症を有する。
【００１４】
第一の局面の一実施態様において、本明細書において提供されるヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体のＶＨ及びＶＬは、表１に示される配列対のアミノ酸配列を含み、そしてＨＣは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１のいずれか１つのアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を更に含む。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
第一の局面の別の実施態様において、本明細書において提供されるヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体のＶＨは、配列番号２０のアミノ酸配列を含み、そしてＶＬは配列番号２４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、ヒト化ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号２、又は配列番号９、又は配列番号１０、又は配列番号ｌｌのアミノ酸配列を含む。
【００１７】
第一の局面の別の実施態様において、本明細書において提供されるヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体のＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列を含み、そしてＶＬは配列番号２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、抗体はヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施態様において、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号２、又は配列番号９、又は配列番号１０、又は配列番号ｌｌのアミノ酸配列を含む。
【００１８】
第一の局面の他の実施態様において、本明細書において提供されるヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体のＨＣ及びＬＣは、表２に示される配列番号対のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
【表２】
2020514273.tif 000003
【００２０】
第一の局面の別の実施態様において、本明細書において提供されるヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体のＨＣは、減少したフコース含有量を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施態様において、提供されるヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体は、グリコシル化阻害剤を含有する培地で培養される宿主細胞において産生される。一実施態様において、グリコシル化阻害剤はキフネンシン（ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅ）である。
【００２１】
第二の局面において、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患を処置する方法における使用のためのヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体又はその医薬組成物が本明細書において提供され、ここでヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体は、重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含む。一実施態様において、Ｔ細胞媒介疾患は白斑症である。
【００２２】
第三の局面において、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患を処置する方法が本明細書において提供され、該方法は、重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含むヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体を、それを必要とする被験体に投与することを含む。いくつかの実施態様において、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患は白斑症である。
【００２３】
第四の局面において、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患を処置する方法が本明細書において提供され、該方法は、重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含むヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体を、それを必要とする被験体に投与するための指示書を提供することを含む。いくつかの実施態様において、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患は白斑症である。
【００２４】
第五の局面において、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患を処置するためのキットが本明細書において提供され、該キットは、重鎖可変領域（ＶＨ）を有する重鎖（ＨＣ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を有する軽鎖（ＬＣ）を含むヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体、及びヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３をそれを必要とするヒト被験体に投与するための指示書を含む。
【００２５】
本明細書において提供される第一、第二、第三、第四、及び第五の局面のいくつかの実施態様において、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体のＶＨ及びＶＬは、表１に示される配列対のアミノ酸配列を含み、そしてＨＣは配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１のアミノ酸配列を含むヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。別の実施態様において、ＶＨは配列番号２０のアミノ酸配列を含み、そしてＶＬは配列番号２４のアミノ酸配列を含む。別の実施態様において、ＶＨは配列番号２０のアミノ酸配列を含み、そしてＶＬは配列番号２４のアミノ酸配列を含み、そしてヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は配列番号２、又は配列番号９、又は配列番号１０、又は配列番号ｌｌのアミノ酸配列を含む。
【００２６】
本明細書において提供される第二、第三、第四、第五、第六、及び第七の局面の他の実施態様において、ＶＨは配列番号１８のアミノ酸配列を含み、そしてＶＬは配列番号２２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、ヒト化ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号２、又は配列番号９、又は配列番号１０、又は配列番号１１のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本明細書において提供される第一、第二、第三、第四、及び第五の局面の他の実施態様において、抗体のＨＣ及びＬＣは、表２において示される配列対のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
本明細書において提供される第一、第二、第三、第四、及び第五の局面の他の実施態様において、本明細書において提供されるヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体のＨＣは、減少したフコース含有量を有するヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施態様において、提供されるヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体は、グリコシル化阻害剤を含有する培地で培養される宿主細胞において産生される。いくつかの実施態様において、グリコシル化阻害剤はキフネンシンである。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】図１は、以下のような抗体処置後の血中の様々なＴ細胞サブセットの量を示す一連の６つのグラフである：「ハムスターＣＸＣＲ３−１７３」（ハムスター抗マウスＣＸＣＲ３）、「ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｄａｂ」（エフェクター機能を除去するように変異でマウスＩｇＧ２ａ定常領域を置き換えるように操作されたハムスターＣＸＣＲ３−１７３）、「ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧ２ａ  ＷＴ」（マウス野生型ＩｇＧ２ａ定常領域を置換するように操作されたハムスターＣＸＣＲ３−１７３）、「ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧ１−ａｇｌｙ」（Ｎ２９７Ｇ変異でマウスＩｇＧ１定常領域を置換するように操作されたハムスターＣＸＣＲ３−１７３）、及び「未処置」は未処置対照を表す。
【図２Ａ】図２Ａは、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）結合アッセイにより測定した、組み換えマウスＦｃγＲＩ（ｍＦｃＲＩ）によるＣＸＣＲ３−１７３の様々なＦｃ操作バージョンの結合を示す一連の６つのグラフである。ＢＭＰ５、抗ＢＭＰ５  ｍｌｇＧ１アイソタイプコントロール；ｍＩｇＧ１  ａｇｌｙ、マウスＩｇＧｌ定常領域をＮ２９７Ｇ変異で置換するように操作されたＣＸＣＲ３−１７３；ｍＩｇＧ２ａ  ＷＴ、マウス野生型ＩｇＧ２ａ定常領域を置換するように操作されたＣＸＣＲ３−１７３；ｍＩｇＧ２ａ  Ｄａｂ、マウスＩｇＧ２ａ定常領域をエフェクター機能を除去するような変異で置換するように操作されたＣＸＣＲ３−１７３；ｍＩｇＧ３、マウス野生型ＩｇＧ３定常領域を置換するように操作されたＣＸＣＲ３−１７３；ハムスターＣＸＣＲ３、親ハムスターｍＡｂ  ＣＸＣＲ３−１７３。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイにより測定した、組み換えマウスＦｃγＲＩＩｂ  （ｍＦｃＲＩＩｂ）によるＣＸＣＲ３−１７３の様々なＦｃ操作バージョンの結合を示す一連の６つのグラフである。抗体の指定は図２Ａと同じである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイにより測定した、組み換えマウスＦｃγＲＩＩＩ（ｍＦｃＲＩＩＩ）によるＣＸＣＲ３−１７３の様々なＦｃ操作バージョンの結合を示す一連の６つのグラフである。抗体の指定は図２Ａと同じである。
【図２Ｄ】図２Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイにより測定した、組み換えマウスＦｃγＲＩＶ（ｍＦｃＲＩＶ）によるＣＸＣＲ３−１７３の様々なＦｃ操作バージョンの結合を示す一連の６つのグラフである。様々な抗体の指定は図２Ａと同じである。
【図３Ａ】図３Ａは、操作されたヒトＩｇＧ１定常領域を有する抗ヒトＣＸＣＲ３抗体についての構造−エフェクター機能特徴を要約する表である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、示された濃度及び５：１  エフェクター対標的（Ｅ：Ｔ）比で様々な抗ヒトＣＸＣＲ３抗体を用いたＣＨＯヒトＣＸＣＲ３標的細胞のインビトロ抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）媒介溶解を示す棒グラフである。エフェクター細胞は単一ドナー由来のナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ＩｇＧ、ヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロール。試験した抗ヒトＣＸＣＲ３  ｍＡｂはクローン４（ＣＸＣＲ３  ＣＬ４）、クローン１２（ＣＸＣＲ３  ＣＬ１２）、クローン８２（ＣＸＣＲ３  ＣＬ８２）、クローン１３５（ＣＸＣＲ３  ＣＬ１３５）、５３Ｈｕ３７、並びに図３Ａに記載されるように５３Ｈｕ３７  Ｍｌ、Ｍ２、及びＭ３の操作されたＦｃ変異体であった。Ｋｉｆ、キフネンシン処理。ＡＬＥＭ、アレムツズマブ。
【図３Ｃ】図３Ｃは、示された濃度及び３：１  エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比で様々な抗体を用いたＣＨＯ−ヒトＣＸＣＲ３標的細胞のインビトロＡＤＣＣ媒介溶解を示す棒グラフである。エフェクター細胞はＮＫ様細胞株（ＮＫ９２−ＣＤ１６Ｖ）由来であった。ＩｇＧ、ヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロール。試験された抗ヒトＣＸＣＲ３  ｍＡｂは、５３Ｈｕ３７及び図３Ａにおけるような操作されたＦｃ変異体Ｍｌであった。ＣＸＣＲ３  ＣＬ４、抗ヒトＣＸＣＲ３  ｍＡｂクローン４。Ｋｉｆ、キフネンシン処理。ＡＬＥＭはアレムツズマブである。
【図４】図４は、ヒトＦｃγＲＩＩａ（ｒｈＦｃγＲＩＩａ）、ヒトＦｃγＲＩＩＩ−Ｆ１５８（ｒｈＦｃγＩＩＩ−Ｆ１５８）、ヒトＦｃγＲＩＩＩ−Ｖ１５８（ｒｈＦｃγＩＩＩ−Ｖ１５８）、及びマウスＦｃγＲＩＶ（ｒｍＦｃγＲＩＶ）に対する結合親和性、ＫＤを示す、５３Ｈｕ３７及び示された変異体についてのＢｉａｃｏｒｅデータを要約する表である。Ｍ１〜Ｍ３は図３Ａに記載され、そしてｋｉｆ  脱フコシル化５３Ｈｕ３７。
【図５Ａ】図５Ａは、２ｍｇ／体重ｋｇの用量で投与された示された抗体を用いて処置されたカニクイザルにおけるインビボでの示されたＴ細胞サブセットの枯渇を示す一連の６つのグラフである。Ｍｌ：５３Ｈｕ３７のＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ変異体；Ｋｉｆ：脱フコシル化５３Ｈｕ３７；Ｖｅｈ：ビヒクルコントロール。ＣＸＣＲ３抗体群についてＮ＝８。ビヒクル群についてＮ＝６。
【図５Ｂ】図５Ｂは、２ｍｇ／体重ｋｇの用量で投与された示された抗体の単回用量に先んじた時間の示された量で処置されたカニクイザルの血清における示された抗体の濃度を評価する組み合わせた薬物動態データを示すグラフである。試験された抗ヒトＣＸＣＲ３  ｍＡｂは、５３Ｈｕ３７、キフネンシン処理５３Ｈｕ３７（５３Ｈｕ３７  ｋｉｆ）、及び５３Ｈｕ３７のＭｌ変異体（５３Ｈｕ３７  Ｍｌ）であった。
【図６−１】図６は、配列番号及び対応する配列を示す表である。
【図６−２】図６−１の続き。
【図６−３】図６−２の続き。
【図６−４】図６−３の続き。
【図６−５】図６−４の続き。
【図６−６】図６−５の続き。
【図６−７】図６−６の続き。
【図６−８】図６−７の続き。
【図６−９】図６−８の続き。
【図６−１０】図６−９の続き。
【図６−１１】図６−１０の続き。
【図６−１２】図６−１１の続き。
【図６−１３】図６−１２の続き。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
詳細な説明
ここで本開示に従う特定の例となる実施態様に詳細に言及し、これらの特定の例は添付の図面において説明される。
【００３１】
ヒトＣＸＣＲ３に特異的に結合するヒト化抗体又はその抗原結合フラグメントのための方法及び使用が本明細書において提供される。特定の実施態様において、本明細書において提供される抗ＣＸＣＲ３抗体は、ＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を方向づける能力を有するか、又はＣＸＣＲ３関連疾患及び障害を処置するためにＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を方向づける増強された能力を有するように操作される。いくつかの実施態様において、白斑症を処置するためにＣＸＣＲ３を標的化するための治療が開示される。
【００３２】
抗体
本明細書で使用される用語「抗体」は、ジスルフィド結合により相互接続された２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖の４つのポリペプチド鎖を含む免疫グロブリン分子、さらにはそのマルチマー（例えば、ＩｇＭ）を指す。各重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ又はＶＨと略される）及び重鎖定常領域（ＣＨ又はＣＨ）を含む。重鎖定常領域は３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む。重鎖のＦｃ部分はＣＨ２及びＣＨ３を含む。
【００３３】
各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬと略される）及び軽鎖定常領域（ＣＬ又はＣＬ）を含む。軽鎖定常領域は１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。
【００３４】
ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域へとさらに細分され得る。各ＶＨ及びＶＬは、以下の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、及びＦＲ４。
【００３５】
本明細書で使用される用語抗体の「抗原結合フラグメント」は、抗原に特異的に結合して複合体を形成する、天然に存在する、酵素的に入手可能な、合成の又は遺伝子操作されたポリペプチド又は糖タンパク質を含む。抗体の抗原結合フラグメントは、タンパク質分解消化又は抗体の可変ドメイン及び場合により定常ドメインをコードするＤＮＡの操作及び発現を含む組み換え遺伝子操作技術のようないずれかの適切な標準的技術を使用して、例えば完全抗体分子から誘導され得る。抗原結合部分の非限定的な例としては：（ｉ）Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）Ｆｄフラグメント；（ｉｖ）Ｆｖフラグメント；（ｖ）単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子；（ｖｉ）ｄＡｂフラグメント；及び（ｖｉｉ）抗体の超可変領域を模倣したアミノ酸残基を含む最小認識単位（例えば、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））が挙げられる。他の操作された分子、例えば二重、三重、四重特異的抗体、及びミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｉｅｓ）もまた表現「抗原結合フラグメント」内に包含される。
【００３６】
特定の実施態様において、ＣＸＣＲ３抗体又は抗原結合フラグメントは、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施態様において、抗体又はフラグメントは多選択性（ｍｕｌｔｉ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ）であり、そして２つ又はそれ以上（例えば、２、３、４、５、又はそれ以上）の抗原結合ドメインを有し、その結果抗体又はフラグメントは、２つ若しくはそれ以上のＣＸＣＲ３分子に同じか若しくは異なるエピトープで結合することができ、又はＣＸＣＲ３及び少なくとも１つの他の抗原に高い親和性で結合することができる。抗原結合部分は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ又はそれ以上のフラグメントを含み得る。これらのフラグメントは、親抗体から又は親抗体の変異体からの重鎖及び／又は軽鎖可変領域を含み得る。
【００３７】
本明細書において使用される用語「抗原」は、抗体又はその抗原結合フラグメントにより認識される結合部位又はエピトープを指す。
【００３８】
「エピトープ」又は「抗原性決定基」は、抗体の抗原結合ドメインとの特異的相互作用の原因である抗原分子の部分である。
【００３９】
抗体又はその抗原結合フラグメントに関して本明細書で使用される「結合する」は、抗体の抗体結合部位と抗原との間の非共有結合相互作用により同族抗原と１つ又はそれ以上の非共有結合を形成する抗体又は抗原結合フラグメントの能力を指す。抗原は単離された抗原であっても、ポリペプチドの文脈において細胞表面上のような別の実体に結合して存在していてもよい。
【００４０】
本明細書で使用される用語「〜に特異的に結合する」は、少なくとも約１ｘ１０−６  Ｍ、１ｘ１０−７Ｍ、１ｘ１０−８Ｍ、１ｘ１０−９Ｍ、１ｘ１０−１０Ｍ、１ｘ１０−１１Ｍ、１ｘ１０−１２Ｍ、又はそれ以上のＫｄで抗原に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントの能力を指す。特定の実施態様において、この用語は、非特異的抗原に対するその親和性よりも少なくとも２倍高い親和性で抗原に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントの能力を指す。しかし当然のことながら、抗体又はその抗原結合フラグメントは、配列が関連している２つ又はそれ以上の抗原（例えば、ヒト及びカニクイザルＣＸＣＲ３）に特異的に結合することができる。非特異的結合は、中程度から高い能力で低い親和性を通常は有する。必要な場合、非特異的結合は、結合条件を変更することにより特異的結合に実質的に影響を及ぼすことなく減少され得る。このような条件は当該分野で公知であり、そして慣用の技術を使用する当業者は、適切な条件を選択することができる。条件は通常、抗体の濃度、溶液のイオン強度、温度、結合を可能にする時間、並びに血清アルブミン及びミルクカゼインのようなブロッキング分子の濃度に関して定義される。
【００４１】
親和性定数は、抗体反応のための標準的な動力学的方法、例えば、イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定され得る。実時間検出及び結合速度のモニタリングのための機器及び方法は、公知であり市販されている（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【００４２】
本明細書で使用される「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」は、抗体の抗原結合部位を一緒に形成する、抗体又は抗原結合フラグメントの各可変領域内の複数の部分のうちの一つを指す。各可変領域ドメインは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と名付けられた３つのＣＤＲを含有する。従って、可変重鎖ドメイン（ＶＨ）は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３を含み、そして可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）はＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、及びＣＤＲ−Ｌ３を含む。３つのＣＤＲは線状アミノ酸配列に沿って不連続であるが、折り畳まれたポリペプチドでは近位にある。ＣＤＲは可変ドメインのベータシートの平行ストランドを連結するループ内に位置する。
【００４３】
本明細書で使用される用語「フレームワーク（ＦＲ）アミノ酸残基」は、Ｉｇ鎖のフレームワーク領域におけるアミノ酸を指す。本明細書で使用される用語「フレームワーク領域」又は「ＦＲ領域」は、可変領域の一部であるがＣＤＲの一部ではないアミノ酸残基を含む。従って、可変領域フレームワークは、約１００〜１２０の間のアミノ酸長であるが、ＣＤＲの外側のアミノ酸のみを含む。
【００４４】
本明細書で使用される用語「％同一である」又は「パーセント同一である」は、特定の領域にわたる２つの配列の比較において、それら２つの配列が特定の数の同一の残基を同じ位置に有することを意味する。用語「％類似した」又は「パーセント類似した」は、同様の意味を有するが、２つの配列間の同一のアミノ酸の数に加えて、アミノ酸が同一ではないが保存的な置換である場合も考慮される。同一性パーセンテージは、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ、ＳＦ、ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２１５：４０３  （１９９０））のような公知のコンピューターアルゴリズムを使用して、例えばＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５  ：２４４４  （１９８８）におけるようなデフォルトパラメーターを使用して決定することができる。例えば、国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ＮＣＢＩ）データベースのＢＬＡＳＴ機能を使用して同一性を決定することができる。
【００４５】
特定の実施態様において、本明細書において提供される抗体はヒト化抗体である。「ヒト化抗体」は、所望の抗原に結合し、非ヒト種由来の１つ又はそれ以上のＣＤＲを有し（例えばマウス抗体）、そしてヒト由来のフレームワーク領域及び／又は定常ドメインの少なくともいくつかの部分を有する抗体分子である。
【００４６】
公知のヒトＩｇ配列は、例えばｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ−／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ；ａｂｃａｍ．ｃｏｍ；ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ  ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；及びＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ  （１９８３）において開示される。移入されるヒト配列は、免疫原性を減少させるため、又は結合、親和性、結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）、解離速度（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、アビディティ、特異性、半減期、若しくは当該分野で公知のいずれかの他の適切な特徴を減少、増強若しくは改変するために使用され得る。抗体ヒト化のための当該分野で認められた方法は、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１  ：５２２  （１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４  （１９８８）；Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１  ：２２９６  （１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：９０１  （１９８７）；Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５  （１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５１  ：２６２３（１９９３）；米国特許第５，５８９，２０５号；同第５，５６５，３３２号；同第６，１８０，３７０号；同第６，６３２，９２７号；同第７，２４１，８７７号；同第７，２４４，６１５号；同第７，２４４，８３２号；同第７，２６２，０５０号；及び米国特許公開第２００４／０２３６０７８号（２００４年４月３０日出願）、（これらは参照によりそれら全体として本明細書に加入される）において記載される。
【００４７】
特定の実施態様において、本明細書において提供されるヒト化抗体における特定のフレームワーク残基は、抗原結合を変更、例えば、改善するために、ＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換されており、例えば、マウス抗ヒトＣＸＣＲ３抗体からのフレームワーク残基で置換されている。これらのフレームワーク置換は、ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデリングして抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定すること、及び配列を比較して特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定することにより同定された。いくつかの実施態様において、４Ｄヒト化を使用して、本開示のヒト化抗体変異体が製造された。ＷＯ  ２００９／０３２６６１（参照によりその全体として本明細書に加入される）の例えばＤヒト化において使用される方法について段落［００３７］〜［００４４］を参照のこと。手短には、４Ｄヒト化は：（ａ）ヒト化しようとする可変ドメインの３Ｄモデルを構築すること；（ｂ）そのドメインの３Ｄモデルの分子動力学シミュレーションを使用して可変ドメインにおける可動性残基を同定すること；（ｃ）３Ｄモデルの分子動力学的軌道（ｔｒａｊｅｃｔｏｒｙ）を４９のヒト生殖系列の分子動力学的軌道と比較することにより最も近いヒト生殖系列を同定すること；及び（ｄ）ＣＤＲの一部ではない可動性残基をそれらのヒト生殖系列カウンターパート（工程（ｃ）において同定された）に変異させることを含み得る。
【００４８】
いくつかの実施態様において、表１に示されるＶＨ及びＶＬ配列を含むヒト化ＣＸＣＲ３抗体、又はその抗原結合フラグメントが提供される。
【００４９】
いくつかの実施態様において、表２に示される重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）配列を含むヒト化ＣＸＣＲ３抗体、又はその抗原結合フラグメントが提供される。
【００５０】
抗体エフェクター機能／枯渇活性
特定の実施態様において、本明細書において開示される抗ＣＸＣＲ３抗体は、ＣＸＣＲ３を発現している細胞の枯渇を方向づける能力を有するか、又はＣＸＣＲ３関連疾患及び障害を処置するためにＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を方向づける増強された能力を有するように操作されていてもよい。本明細書において開示される抗体により枯渇され得るＣＸＣＲ３を発現する細胞としては、ＣＤ４＋  Ｔ細胞及び／又はＣＤ８＋  Ｔ細胞が挙げられ得る。本明細書において開示される抗体により枯渇され得るＣＸＣＲ３を発現する細胞としては、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞及び／又はＣＤ８＋メモリーＴ細胞が挙げられ得る。ＣＸＣＲ３＋細胞（すなわち、それらの細胞表面上にＣＸＣＲ３を発現する細胞）に関して本明細書で使用される「枯渇」は、細胞の集団からのこれらの細胞の除去を指す。枯渇への言及は完全な又は部分的な枯渇を含む。さらに、枯渇は永続的でも一時的でもよく、そして大きさ及び／又は位置は様々な程度になり得る。枯渇はアポトーシス又は壊死によるような細胞死の結果であり得る。枯渇は、本明細書において提供される抗体若しくは抗原結合フラグメントへの曝露の前及び後に、又は本明細書において提供される抗体若しくは抗原結合フラグメントの不在下及び存在下で、当該分野で公知のいずれかの方法（例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学など）を使用して、集団中のＣＸＣＲ３＋細胞の数を測定することにより評価され得る。本明細書において提供される抗体又は抗原結合フラグメントへの曝露後に、ＣＸＣＲ３＋細胞は、少なくとも又は約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上枯渇され得る。
【００５１】
特定の実施態様において、ヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体は、野生型Ｆｃ領域、例えば、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃを有する対応するヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体と比較して、それらの表面上にヒトＣＸＣＲ３を発現する細胞に対して増強されたエフェクター機能を示す。本明細書で使用される「増強されたエフェクター機能」は、同じ抗原特異性及び野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を有する参照抗体と同じ条件下で比較して、適切な標的細胞に対して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体媒介細胞傷害（ＣＤＣ）、又は抗体依存性細胞媒介貪食（ＡＤＣＰ）のいずれか１つ又はそれ以上を方向づける抗体の測定可能に増加した能力を指す。特定の実施態様において、参照抗体は変異ヒトＦｃ領域を含む。特定の実施態様において、エフェクター機能はＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、若しくはＣＤＣ、又はそれらの組み合わせである。特定の実施態様において、エフェクター機能はＡＤＣＣ、又はＣＤＣ、又はＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方である。特定の実施態様において、エフェクター機能はＡＤＣＣである。特定の実施態様において、エフェクター機能はＣＤＣである。特定の実施態様において、エフェクター機能はＡＤＣＣ及びＣＤＣの両方である。特定の実施態様において、エフェクター機能はＡＤＣＰである。
【００５２】
本明細書で使用される「変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域」は、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃと比較して１つ又はそれ以上のアミノ酸変異又はアミノ酸修飾を含むように操作又は改変されたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を指す。特定の実施態様において、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、アミノ酸配列
SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKD TLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ GNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG （Ｅｕ番号付け１９２〜４４６）（配列番号２）。
【００５３】
特定の実施態様において、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は以下のアミノ酸置換：Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｆ、Ｓ３２４Ｔ、Ｉ３３２Ｅ  （Ｅｕ番号付け）の少なくとも１つ、又はそれらのいずれかの組み合わせを含む。特定の実施態様において、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、以下のアミノ酸置換のセットの少なくとも１つを含む：
Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、及びＳ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（Ｅｕ番号付け）。特定の実施態様において、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域はアミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅを含む。他の実施態様において、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、アミノ酸置換Ｇ２３６Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅを含む。さらに他の実施態様において、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、アミノ酸置換Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅを含む。
【００５４】
例えば、特定の実施態様において、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号３、４、５、６、７又は８のアミノ酸配列を含む。
【００５５】
特定の実施態様において、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号３〜８のいずれか１つ又はそれ以上に対して少なくとも９０パーセント同一である配列を含むが、ただし、各場合において、特定されたアミノ酸置換は維持される。様々な実施態様において、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号３〜８のいずれか１つ又はそれ以上に対して少なくとも９０パーセント同一である、少なくとも９１パーセント同一である、少なくとも９２パーセント同一である、少なくとも９３パーセント同一である、少なくとも９４パーセント同一である、少なくとも９５パーセント同一である、少なくとも９６パーセント同一である、少なくとも９７パーセント同一である、少なくとも９８パーセント同一である、又は少なくとも９９パーセント同一である配列を含むが、ただし、各場合において、特定されたアミノ酸置換は維持される。
【００５６】
特定の実施態様において、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、アミノ酸置換の以下のセット：Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、及びＳ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ  （Ｅｕ番号付け）の少なくとも１つを含む。例えば、特定の実施態様において、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号９、１０、又は１１のアミノ酸配列を含む。
【００５７】
特定の実施態様において、少なくとも１つのアミノ酸置換はＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（Ｅｕ番号付け）である。他の実施態様において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｇ２３６Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（Ｅｕ番号付け）である。特定の実施態様において、少なくとも１つのアミノ酸置換は、Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（Ｅｕ番号付け）である。
【００５８】
特定の実施態様において、本明細書において提供される抗ヒト化ＣＸＣＲ３抗体の変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号９〜１１のいずれか１つに対して少なくとも９０パーセント同一である配列を含むが、ただし、各場合において、特定されたアミノ酸置換及び増強されたエフェクター機能は維持される。維持される。様々な実施態様において、変異ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、配列番号９〜１１のいずれか１つ又はそれ以上に対して、少なくとも９０パーセント同一である、少なくとも９１パーセント同一である、少なくとも９２パーセント同一である、少なくとも９３パーセント同一である、少なくとも９４パーセント同一である、少なくとも９５パーセント同一である、少なくとも９６パーセント同一である、少なくとも９７パーセント同一である、少なくとも９８パーセント同一である、又は少なくとも９９パーセント同一である配列を含むが、ただし、各場合において、特定されたアミノ酸置換は維持される。
【００５９】
ＣＤＲ変異体：
前述の実施態様に加えて、ＶＨが：
（ｉ）配列番号１２、配列番号３５、及び配列番号１４；
（ｉｉ）配列番号１２、配列番号３５、及び配列番号４５；
（ｉｉｉ）配列番号１２、配列番号３６、及び配列番号４５；
（ｉｖ）配列番号１２、配列番号３７、及び配列番号１４；
（ｖ）配列番号１２、配列番号３７、及び配列番号４５；
（ｖｉ）配列番号１２、配列番号３７、及び配列番号４６  
（ｖｉｉ）配列番号１２、配列番号３８、及び配列番号１４；
（ｖｉｉｉ）配列番号１２、配列番号３８、及び配列番号４５；
（ｉｘ）配列番号１２、配列番号３９、及び配列番号１４；
（ｘ）配列番号１２、配列番号３９、及び配列番号４７；
（ｘｉ）配列番号１２、配列番号４０、及び配列番号１４；
（ｘｉｉ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号４５  
（ｘｉｉｉ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号４６；
（ｘｉｖ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号４８；
（ＸＶ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号４９；
（ｘｖｉ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５０；
（ｘｖｉｉ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５１；
（ｘｖｉｉｉ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５２；
（ｘｉｘ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５３；
（ｘｘ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５４；
（ｘｘｉ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５５；
（ｘｘｉｉ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５６；
（ｘｘｉｉｉ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５７；
（ｘｘｉｖ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５８；
（ｘｘｖ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５９；
（ｘｘｖｉ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６０；
（ｘｘｖｉｉ）配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６１；
（ｘｘｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６２；
（ｘｘｉｘ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６３；
（ｘｘｘ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６４；
（ｘｘｘｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６５；
（ｘｘｘｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６６；
（ｘｘｘｉｉｉ）  配列番号３４、配列番号１３、及び配列番号１４；
（ｘｘｘｉｖ）  配列番号１２、配列番号４１、及び配列番号１４；
（ｘｘｘｖ）  配列番号１２、配列番号４１、及び配列番号４６；
（ｘｘｘｖｉ）  配列番号１２、配列番号４２、及び配列番号１４；
（ｘｘｘｖｉｉ）  配列番号１２、配列番号４２、及び配列番号４５；
（ｘｘｘｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号４３、及び配列番号１４；
（ｘｘｘｉｘ）  配列番号１２、配列番号４４、及び配列番号１４；
（ｘｌ）  配列番号１２、配列番号４１、及び配列番号１４；又は
（ｘｌｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６８
のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；そして
ＶＬが：
（ｉ）  配列番号６９、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｉ）  配列番号７０、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｉｉ）  配列番号７１、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｖ）  配列番号７１、配列番号１６、及び配列番号７５；
（ｖ）  配列番号７２、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉ）  配列番号７３、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉｉ）  配列番号７４、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７５；
（ｉｘ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７６；
（ｘ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７７；
（ｘｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７８；又は
（ｘｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７９
のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、６つのＣＤＲを含む抗ＣＸＣＲ３抗体が本明細書において提供される。
【００６０】
前述の実施態様に加えて、ＶＨが：
（ｉ）  配列番号１２、配列番号３５、及び配列番号１４；
（ｉｉ）  配列番号１２、配列番号３５、及び配列番号４５；
（ｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号３６、及び配列番号４５；
（ｉｖ）  配列番号１２、配列番号３７、及び配列番号１４；
（ｖ）  配列番号１２、配列番号３７、及び配列番号４５；
（ｖｉ）  配列番号１２、配列番号３７、及び配列番号４６；
（ｖｉｉ）  配列番号１２、配列番号３８、及び配列番号１４；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号３８、及び配列番号４５；
（ｉｘ）  配列番号１２、配列番号３９、及び配列番号１４；
（ｘ）  配列番号１２、配列番号３９、及び配列番号４７；又は
（ｘｉ）  配列番号１２、配列番号４０、及び配列番号１４
のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；そして
ＶＬが：
（ｉ）  配列番号６９、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｉ）  配列番号７０、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｉｉ）  配列番号７１、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｖ）  配列番号７１、配列番号１６、及び配列番号１００；
（ｖ）  配列番号７２、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉ）  配列番号７３、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉｉ）  配列番号７４、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７５；
（ｉｘ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７６；
（ｘ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７７；
（ｘｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７８；又は
（ｘｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７９
のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、６つのＣＤＲを含む抗ＣＸＣＲ３抗体が本明細書において提供される。
【００６１】
前述の実施態様に加えて、ＶＨが：
（ｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号４５；
（ｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号４６；
（ｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号４８；
（ｉｖ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号４９；
（ｖ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５０；
（ｖｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５１；
（ｖｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５２；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５３；
（ｉｘ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５４；
（ｘ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５５；
（ｘｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５６；
のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；そして
ＶＬが：
（ｉ）  配列番号６９、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｉ）  配列番号７０、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｉｉ）  配列番号７１、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｖ）  配列番号７１、配列番号１６、及び配列番号７５；
（ｖ）  配列番号７２、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉ）  配列番号７３、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉｉ）  配列番号７４、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７５；
（ｉｘ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７６；
（ｘ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７７；
（ｘｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７８；又は
（ｘｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７９
のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、６つのＣＤＲを含む抗ＣＸＣＲ３抗体が本明細書において提供される。
【００６２】
前述の実施態様に加えて、ＶＨが：
（ｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５７；
（ｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５８；
（ｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号５９；
（ｉｖ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６０；
（ｖ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６１；
（ｖｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６２；
（ｖｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６３；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６４；
（ｉｘ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６５；又は
（ｘ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６６のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；そして
ＶＬが：
（ｉ）  配列番号６９、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｉ）  配列番号７０、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｉｉ）  配列番号７１、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｖ）  配列番号７１、配列番号１６、及び配列番号７５；
（ｖ）  配列番号７２、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉ）  配列番号７３、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉｉ）  配列番号７４、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７５；
（ｉｘ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７６；
（ｘ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７７；
（ｘｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７８；又は
（ｘｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７９
のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、６つのＣＤＲを含む抗ＣＸＣＲ３抗体が本明細書において提供される。
【００６３】
前述の実施態様に加えて、ＶＨが：
（ｉ）  配列番号３４、配列番号１３、及び配列番号１４；
（ｉｉ）  配列番号１２、配列番号４１、及び配列番号１４；
（ｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号４１、及び配列番号７１；
（ｉｖ）  配列番号１２、配列番号４２、及び配列番号１４；
（ｖ）  配列番号１２、配列番号４２、及び配列番号７０；
（ｖｉ）  配列番号１２、配列番号４３、及び配列番号１４；
（ｖｉｉ）  配列番号１２、配列番号４４、及び配列番号１４；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１２、配列番号４１、及び配列番号１４；又は
（ｉｘ）  配列番号１２、配列番号１３、及び配列番号６８
のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み；そして
ＶＬが：
（ｉ）  配列番号６９、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｉ）  配列番号７０、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｉｉ）  配列番号７１、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｉｖ）  配列番号７１、配列番号１６、及び配列番号７５；
（ｖ）  配列番号７２、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉ）  配列番号７３、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉｉ）  配列番号７４、配列番号１６、及び配列番号１７；
（ｖｉｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７５；
（ｉｘ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７６；
（ｘ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７７；
（ｘｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７８；又は
（ｘｉｉ）  配列番号１５、配列番号１６、及び配列番号７９
のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む、６つのＣＤＲを含む抗ＣＸＣＲ３抗体が本明細書において提供される。
【００６４】
前述の実施態様に加えて、
配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号８８、配列番号８９、又は配列番号９０のアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＸＣＲ３抗体が本明細書において提供される。
【００６５】
前述の実施態様に加えて、
配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３、配列番号９４、配列番号９５、配列番号９６、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、又は配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＸＣＲ３抗体が本明細書において提供される。
【００６６】
前述の実施態様において、
配列番号１０２、配列番号１０３、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１０９、配列番号１１０、又は配列番号１１１の選択されたアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＸＣＲ３抗体が本明細書において提供される。
【００６７】
前述の実施態様に加えて、
配列番号１１２、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１５、配列番号１１６、（配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２１、又は配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＶＨを含む抗ＣＸＣＲ３抗体が本明細書において提供される。
【００６８】
前述の実施態様に加えて、
配列番号１２３、配列番号１２４、配列番号１２５、配列番号１２６、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、又は配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む抗ＣＸＣＲ３抗体が本明細書において提供される。
【００６９】
特定の実施態様において、抗ヒトＣＸＣＲ３抗体は、それぞれ表３に示されるアミノ酸配列を含むＶＨ／ＶＬ対を含む。（示された変化はそれぞれ対応する５３Ｈｕ３７  ＶＨ又はＶＬ配列（配列番号２０、及び２４）に関するものである）：
【００７０】
【表３】
2020514273.tif 000004
【００７１】
【表４】
2020514273.tif 000005
【００７２】
中和抗体
特定の実施態様において、本明細書において提供されるヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体は、ＣＸＣＲ３中和抗体である。特定の例となる実施態様において、ＣＸＣＲ３抗体は、増強されたエフェクター機能に加えて中和活性を有する。ＣＸＣＲ３中和及びＣＸＣＲ３＋細胞枯渇の組み合わされた効果は、ＣＸＣＲ３媒介効果を減少させるか又は除去するため、例えばＴ細胞の動員が望ましい場合にはいつも有利であり得る。
【００７３】
「ＣＸＣＲ３中和抗体」はＣＸＣＲ３に結合し、そしてＣＸＣＲ３に結合するＣＸＣＲ３リガンドから生じる典型的な生理的及び遺伝的応答のような受容体の活性を遮断する。中和活性は、完全（１００％中和）でも部分的、例えば、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５（又はその間のいずれかのパーセンテージ）又はそれ以上の中和でもよく、そして抗体濃度、親和性、及びエピトープ、さらには中和活性を評価するために使用した特定のアッセイのような当業者に公知の様々な因子に依存する。ＣＸＣＲ３中和抗体の中和活性は、例えば、リガンド結合、ＧＴＰ結合、カルシウム動員、細胞走化性、及び／又は受容体内部移行の阻害を測定するためのアッセイにより示され得る。中和抗体、及び特にＣＸＣＲ３中和抗体の活性を決定するための多数のアッセイは、当業者に公知であり、そして特定の抗体が中和していることを検証するために容易に適合され得る。
【００７４】
例えば、いくつかの実施態様において、抗ＣＸＣＲ３抗体の中和活性は、実質的に、クローン４９８０１により産生され、そしてＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｒ）（カタログ番号ＭＡＢ１６０）により販売される抗体についての添付文書に記載されるように、走化性アッセイにより評価され得る。５０％中和量（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｏｓｅ−５０）（ＮＤ５０）は、特定のｒｈＣＸＣＬ１１濃度で反応性細胞株における細胞表面ＣＸＣＲ３媒介組み換えヒトＣＸＣＬ１１（ｒｈＣＸＣＬ１１）応答の最大の半分の阻害を生じるために必要とされる抗体の濃度として定義される。ｈＣＸＣＲ３トランスフェクトＢａＦ／３細胞のｒｈＣＸＣＬ１１誘導走化性を遮断する抗体の能力を測定するために、７ｎｇ／ｍＬのｒｈＣＸＣＬ１１を、９６ウェル走化性チャンバー（ＮｅｕｒｏＰｒｏｂｅ、Ｃａｂｉｎ  Ｊｏｈｎ、Ｍｄ．）の下部コンパートメントに加える。ついで走化性チャンバーを、ＰＶＰ非含有ポリカーボネートフィルター（５μｍ孔径）を使用して組み立てる。抗体の段階希釈（例えば、０．００１から１００００μｇ／ｍＬ）及び０．２５ｘ１０６細胞／ウェルを、チャンバーの上部ウェルに加える。３時間３７℃にて５％  ＣＯ２−加湿インキュベーターにおいてインキュベートした後、チャンバーを分解し、そして下部チャンバーに遊走した細胞を作業プレートに移し、そして例えば、レサズリン蛍光（Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を使用して定量する。
【００７５】
Ｃｏｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２６：５８３８−４９（２００６）は、特定の実施態様において、抗ＣＸＣＲ３抗体を中和する中和活性を決定するために使用することができるさらなるアッセイを記載する。手短には、ＣＸＣＲ４を機能的に発現するマウスプレ−Ｂ細胞白血病細胞株である３００−１９細胞が使用され得る。トランスフェクションの後、この細胞株は他のケモカイン受容体、例えばヒトＣＸＣＲ３を機能的に発現することができる（例えば、米国特許出願公開第２０１０／００６１９８３号（参照により本明細書に加入される）の段落２０１〜２０９を参照のこと）。ヒトＣＸＣＲ３を発現する３００−１９細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有する完全ＲＰＭＩ培地で増殖され得る。ＣＸＣＲ３抗体を中和する候補の存在下でＣＸＣＲ３リガンドのＣＸＣＲ３への結合を評価するために、４００，０００個のＣＸＣＲ３／３００−１９細胞を９６ウェル組織培養プレートに結合緩衝液（０．５％  ＢＳＡ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）総体積１５０μＬ中に入れた。合計で０．０４ｎＭの１２５Ｉ標識されたＣＸＣＬ１０（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）又はＣＸＣＬ１１（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）及び５ｘｌ０６ｎＭ〜５００ｎＭの未標識ＣＸＣＬ１０又はＣＸＣＬ１１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、Ｎ．Ｊ．）を細胞に加え、そして９０分間室温で振盪しながらインキュベートし得る。０．３％ポリエチレンイミンに予め浸した９６ウェルフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、Ｍａｓｓ．）に細胞を移し、そして０．５Ｍ  ＮａＣｌを補充した２００結合緩衝液を用いて３回洗浄する。プレートを乾燥し、そして放射能を、シンチレーション液を加えた後Ｗａｌｌａｃ  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａシンチレーションカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．）で測定した。ＣＸＣＬ９の結合は、ＣＸＣＬ１０及びＣＸＣＬ１１に対して同様に評価され得る。
【００７６】
特定の実施態様において、本明細書において開示される抗体は、ＣＸＣＲ３を発現する細胞へのカルシウム流動を防止または減少することができる。いくつかの実施態様において、カルシウム流動は、ＣＸＣＲ３／３００−１９細胞のような細胞において検出され得る。約５ｘｌ０６個の細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＲＰＭＩ培地２ｍＬに懸濁させた。Ｆｕｒａ−２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）１５マイクログラムを加え、そして細胞を３７℃で２０分間インキュベートする。細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そしてカルシウム流動緩衝液（１４５ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＮａＨＰＯ４、１．８ｍＭ  ＣａＣｌ２、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、０．８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び２２ｍＭグルコース）２ｍＬに懸濁させる。蛍光読み取りを３７℃でＤｅｌｔａＲＡＭ蛍光光度計（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｌａｗｒｅｎｃｅｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）にて測定した。ケモカイン（例えば、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、又はＣＸＣＬ１１）を加える前及び後に、細胞内カルシウム濃度を、３４０ｎｍ及び３８０ｎｍでの逐次励起に応じて５１０ｎｍで放射される励起蛍光強度として記録し、そして３８０ｎｍでの蛍光に対する３４０ｎｍでの蛍光の相対的比として示す。
【００７７】
特定の実施態様において、ＣＸＣＲ３中和は受容体内部移行の減少を測定することにより評価され得る。いくつかの実施態様において、受容体に内部移行アッセイは、ＣＸＣＲ３／３００−１９細胞のような細胞約２．５ｘｌ０５個を、様々な濃度のＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、又はＣＸＣＬ９を含む１％ＢＳＡを含むＲＰＭＩ培地中で３０分間３７℃でインキュベートすることにより行われ得る。ついで細胞を氷冷フローサイトメトリー染色緩衝液で洗浄し得、そしてその後ＰＥ結合ＣＸＣＲ３抗体を使用してＣＸＣＲ３の表面発現について分析する。
【００７８】
上記アッセイのいずれかにより評価して、中和抗ＣＸＣＲ３抗体は、特定の実施態様において、約０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、４０、５０、又は１００μｇ／ｍＬのＮＤ５０を有し得る。特定の実施態様において、ＮＤ５０は０．５〜１２μｇ／ｍＬ、そしてより特定の実施態様において、１〜６μｇ／ｍＬであり得る。
【００７９】
本明細書において提供される抗体又は抗原結合フラグメントによる細胞遊走、動員又は蓄積は、当業者により公知のいずれかの方法により評価され得る。このような方法としては、例えば、ＣＸＣＲ３＋細胞のような細胞の数、細胞の１つ若しくはそれ以上の集団又は体内若しくは器官内の１つ若しくはそれ以上の位置を評価するための、免疫組織化学による生検の分析、フローサイトメトリー、ＲＴ−ＰＣＲ等が挙げられ得る。細胞遊走、動員、又は蓄積は、本明細書において提供される抗体又は抗原結合フラグメントが存在しない場合の遊走、動員、又は蓄積と比較して、少なくとも又は約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上阻害され得る。
【００８０】
ヌクレオチド配列
本明細書に開示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列もまた本明細書において提供される。いくつかの実施態様において、ヌクレオチド配列は、インビトロ及び／又はインビボでＣＸＣＲ３＋細胞を枯渇させることができる抗体又はフラグメントをコードする。特定の実施態様において、ヌクレオチド配列は、抗ＣＸＣＲ３抗体又はその抗原結合フラグメントの細胞における発現（例えば、哺乳動物細胞における発現）のための発現ベクターを製造するために使用され得る。
【００８１】
特定の実施態様において、本明細書において開示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドと実質的に同一であるポリヌクレオチドもまた本明細書に開示される。
実質的に同一の配列は、多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ）配列、すなわち、集団中の代替の配列又は対立遺伝子であり得る。実質的に同一な配列はまた、サイレント変異を含む配列を含めて、変異誘発された配列を含んでいてもよい。変異は１つ若しくはそれ以上のヌクレオチド残基変化、１つ若しくはそれ以上のヌクレオチド残基の欠失、又は１つ若しくはそれ以上のさらなるヌクレオチド残基の挿入を含み得る。実質的に同一な配列はまた、核酸コードの縮重に起因して、本明細書において開示されるアミノ酸配列におけるいずれかの所定のアミノ酸位置で同じアミノ酸をコードする様々なヌクレオチド配列を含んでいてもよい。インビトロかつ／又はインビボでＣＸＣＲ３＋細胞を枯渇させる能力を保持する抗体の鎖をコードする配列もまた実質的に同一な配列内に含まれる。
【００８２】
特定の実施態様において、本明細書において提供される核酸は、本明細書において提供されるＣＸＣＲ３を発現している細胞を枯渇させることができる抗体若しくはフラグメントにおける鎖のアミノ酸配列をコードし、又は核酸は、ストリンジェントな条件下で、抗体若しくはその抗原結合フラグメントにおける鎖のアミノ酸配列をコードする核酸とハイブリダイズし得る。
【００８３】
特定の実施態様において、抗ＣＸＣＲ３抗体又はその抗原結合フラグメントのＶＨドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列が本明細書において開示され、そしてこれは抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列に対して少なくとも約８０〜１００％、（例えば、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）（又はそれらの間のいずれかのパーセンテージ）同一である。特定の実施態様において、ポリヌクレオチド配列は、抗体の重鎖をコードするヌクレオチド配列と比較して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の変異（付加、欠失、及び保存的置換のような置換を含む）を有するヌクレオチド配列を含み得る。
【００８４】
特定の実施態様において、抗ＣＸＣＲ３抗体又はフラグメントのＶＬドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列が本明細書において開示され、そしてこれは抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列と少なくとも約８０〜１００％、（例えば、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）（又はそれらの間のいずれかのパーセンテージ）同一である。特定の実施態様において、ポリヌクレオチド配列は、抗体の軽鎖をコードするヌクレオチド配列と比較して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個の変異（付加、欠失、及び保存的置換のような置換を含む）を含み得る。
【００８５】
特定の実施態様において、ＶＨアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％  ９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又は間のいずれかのパーセンテージ）同一であり、そしてＶＬアミノ酸配列に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１  ％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％（又は間のいずれかのパーセンテージ）同一であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド配列が本明細書に開示され、ここでヌクレオチド配列は、本明細書に開示される抗体のいずれかの重鎖及び軽鎖アミノ酸配列をコードする。
【００８６】
開示されたポリヌクレオチドは、当該分野で公知のいずれかの方法により得られ得る。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知である場合、抗体をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築され得る。これは、例えば、抗体をコードする配列のオーバーラップオリゴヌクレオチド部分の合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリング及び連結、ついでＰＣＲによる連結されたオリゴヌクレオチドの増幅を含み得る。開示されたポリヌクレオチドはまた、抗体を発現するいずれかの組織又は細胞から（例えば抗体を発現するように選択されたハイブリドーマ細胞から）単離された抗体ｃＤＮＡライブラリー、又はｃＤＮＡライブラリーのような核酸のいずれかの他の適切な供給源から生成され得る。
【００８７】
抗ＣＸＣＲ３抗体又はその抗原結合フラグメントの発現
本明細書において提供されるヒト化抗ＣＸＣＲ３抗体又はその抗原結合フラグメントをコードする核酸の操作後に、コードする核酸を典型的には、コードされる抗体又はその抗原結合フラグメントの所望する量を産生するために使用され得る宿主細胞中に導入するための発現ベクターに挿入する。発現に適したベクターは当該分野で公知である。適切な宿主細胞としては、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、Ｓｆ９、及び／又は他のヒト若しくは非ヒト細胞株が挙げられる。いくつかの実施態様において、宿主細胞は、培地で培養された場合、一過性に又は安定にベクター上の核酸を発現し、それにより、本明細書に開示される抗体又はフラグメントを製造するための方法を提供する。
【００８８】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、本明細書において、細胞に所望される遺伝子を導入し、そして発現させるための媒介物を記載するために使用される。当業者に公知のように、このようなベクターとしては、例えば、プラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスが挙げられる。一般に、適切なベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易にするための適切な制限部位、及び真核生物細胞又は原核生物細胞に新入しかつ／又は複製する能力を含み得る。
【００８９】
多数の発現ベクター系が、本明細書において提供される抗ＣＸＣＲ３抗体を発現する目的のために使用され得る。例えば、ベクターの１つのクラスは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（ＲＳＶ、ＭＭＴＶ又はＭＯＭＬＶ）又はＳＶ４０ウイルスのような動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。他は、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロニックな系の使用を含む。さらに、ＤＮＡをそれらの染色体に組み込まれた細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１つ又はそれ以上のマーカーを導入することにより選択され得る。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤抵抗性（例えば、抗生物質）又は銅のような重金属に対する抵抗性を提供し得る。選択可能マーカー遺伝子は、発現しようとするＤＮＡ配列に直接連結されても、同時形質転換により同じ細胞に導入されてもよい。ｍＲＮＡの最適な合成のためにさらなるエレメントも必要かもしれない。これらのエレメントは、シグナル配列、スプライスシグナル、さらには転写プロモーター、エンハンサー、及び終止シグナルを含み得る。いくつかの実施態様において、クローンされた可変領域遺伝子は、上で考察されたような重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子とともに発現ベクターに挿入される。いくつかの実施態様において、重鎖及び軽鎖定常領域はヒトである。
【００９０】
他の実施態様において、本明細書において提供される抗ＣＸＣＲ３抗体又はその抗原結合フラグメントは、ポリシストロニック構築物を使用して発現され得る。このような発現系において、抗体の重鎖及び軽鎖のような同義遺伝子産物は、単一のポリシストロニック構築物から製造され得る。これらの系は、真核生物宿主細胞において比較的高いレベルの本明細書において提供されるポリペプチドを生じるために内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有利に利用する。適合するＩＲＥＳ配列は米国特許第６，１９３，９８０号（これは本明細書に参照により加入される）に開示される。当業者には当然のことながら、このような発現系は、本出願において開示されるポリペプチドの全範囲を有効に製造するために使用され得る。
【００９１】
抗体又はその抗原結合フラグメントをコードするベクター又はＤＮＡ配列はが製造されると、発現ベクターは適切な宿主細胞に導入され得る。すなわち、宿主細胞はが形質転換され得る。宿主細胞へのプラスミドの導入は、当業者に周知の様々な技術により達成され得る。これらとしては、限定されないが、トランスフェクション（電気泳動及び電気穿孔を含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈降、エンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）ＤＮＡを用いた細胞融合、微量注入法、及びインタクトなウイルスを用いた感染が挙げられる。Ｒｉｄｇｗａｙ、Ａ．Ａ．Ｇ．「Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ」Ｃｈａｐｔｅｒ  ２４．２、ｐｐ．４７０−４７２  Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ａｎｄ  Ｄｅｎｈａｒｄｔ、Ｅｄｓ．（Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓ．１９８８）を参照のこと。いくつかの実施態様において、宿主へのプラスミド導入は電子穿孔による。形質転換された細胞は、コードされたアミノ酸配列、例えば抗体軽鎖及び重鎖の産生に適した条件下で増殖され、そしてコードされたアミノ酸配列の産生についてアッセイされる。例となるアッセイ技術としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、フローサイトメトリー、免疫組織化学などが挙げられる。
【００９２】
「宿主細胞」は、組み換え核酸技術を使用して構築され、そして少なくとも１つの異種タンパク質をコードするベクターが導入されている細胞を指す。組み換え宿主からのポリペプチドの単離のためのプロセスの記載において、用語「細胞」及び「細胞培養」は、明確に別に指定されていなければ、コードされたタンパク質、例えば抗体又はその抗原結合フラグメントの供給源を示すために交換可能に使用される。換言すると、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心沈殿した全細胞から、又は培地及び懸濁した細胞の両方を含有する細胞培養物のいずれかからを意味し得る。
【００９３】
一実施態様において、抗体発現に使用される宿主細胞株は哺乳動物起源のものである；当業者は、そこで発現しようとする所望の遺伝子産物に最も適している特定の宿主細胞株を決定することができる。例となる宿主細胞株としては、限定されないが、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣株、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌）、ＣＶＩ（サル腎臓株）、ＣＯＳ（ＳＶ４０  Ｔ抗原を有するＣＶＩ派生体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）  ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ−ｌｃｌＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、２９３（ヒト腎臓）が挙げられる。一実施態様においてＮＳ０細胞が使用され得る。いくつかの実施態様においてＣＨＯ細胞が使用される。宿主細胞株は、典型的には商業サービス、アメリカン・タイプ・．カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、又は公開された文献から入手可能である。
【００９４】
一実施態様において、細胞株は、それらから発現された抗体の変更されたグリコシル化、例えば、脱フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）をもたらす（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６．ＲＴＭ．（Ｃｒｕｃｅｌｌ）又はＦＵＴ８−ノックアウトＣＨＯ細胞株（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ．ＲＴＭ．Ｃｅｌｌｓ）（Ｂｉｏｗａ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．））。あるいは、細胞は、Ｎ−グリカンの初期段階プロセシングに必要な１つ若しくはそれ以上のグリコシダーゼを欠乏していても、かつ／又は培養条件は、これらのグリコシダーゼの１つ若しくはそれ以上が阻害されるような条件であってもよい。例えば、細胞は、アルファ−グルコシダーゼＩ、アルファ−グルコシダーゼＩＩ、及びアルファ−マンノシダーゼＩのような１つ又はそれ以上のグリコシダーゼを欠乏し得る。さらに又はあるいは、操作された細胞は、アルファ−グルコシダーゼＩ、アルファ−グルコシダーゼＩＩ、及びアルファ−マンノシダーゼＩのような１つ又はそれ以上のグリコシダーゼの阻害剤と接触され得る。特定の実施態様において、阻害剤はアルファマンノシダーゼＩの阻害剤、例えば、アルファ−マンノシダーゼＩ特異的阻害剤、キフネンシン（ｋｉｆｕｎｅｎｓｉｎｅ）である。キフネンシン及び他の阻害剤とともに宿主細胞を培養するための例となる方法は、米国特許第８，０７１，３３６号（参照によりその全体として本明細書に加入される）に開示される。特定の実施態様において、キフネンシン処理は、少なくとも５０％のＭａｎ５−９（ＧｌｃＮＡｃ）２  Ｎ−グリカンを有する抗体を生じ、ここでＭａｎ８及びＭａｎ９含有Ｎ−グリカンはともに主要化学種である。
【００９５】
インビトロ産生は、大量の所望のポリペプチドを得るためのスケールアップを可能にする。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養のための技術は当該分野で公知であり、そしてエアリフトリアクター若しくは連続撹拌リアクター、又は固定化若しくは捕捉細胞培養、例えば中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ若しくはセラミックカートリッジにおける均一懸濁培養を含む。必要な場合かつ／又は所望の場合、ポリペプチドの溶液は、慣用のクロマトグラフィー法、例えばゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セルロース上でのクロマトグラフィー及び／又は（イムノ−）アフィニティークロマトグラフィーにより精製され得る。
【００９６】
本明細書において提供される抗ＣＸＣＲ３抗体又はそのフラグメントをコードする核酸はまた、細菌又は酵母又は植物細胞のような非哺乳動物細胞でも発現され得る。この点において、当然のことながら、細菌のような様々な単細胞非哺乳動物微生物も、本明細書において提供される抗体及びその抗原結合フラグメントを発現させるために使用され得る；すなわち、培養又は発酵で増殖させることができるもの。適切な細菌としては、腸内細菌科（ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又はサルモネラ族（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の系統；バチルス科（Ｂａｃｉｌｌａｃｅａｅ）、例えば枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）；レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、及びインフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）のメンバーが挙げられる。さらに当然のことながら、細菌において発現される場合、ポリペプチドは封入体の一部になり得る。ポリペプチドは単離され、精製され、ついで機能的分子へと構築されなければならない。
【００９７】
原核生物に加えて、真核生物微生物も使用され得る。サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、又は一般的にはパン酵母は、真核生物微生物の中で最も一般的に使用されるが、多数の他の系統も広く利用可能である。サッカロマイセスにおける発現のために、プラスミドＹＲｐ７、例えば、（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、２８２：３９  （１９７９）；Ｋｉｎｇｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、７：１４１  （１９７９）；Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｅｎｅ、１０：１５７  （１９８０））が一般的に使用される。このプラスミドは、すでにＴＲＰ１遺伝子を含有し、これがトリプトファンで増殖する能力を欠いた酵母の変異株についての選択マーカーを提供する、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６又はＰＥＰ４−１  （Ｊｏｎｅｓ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、８５  ：１２  （１９７７））。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのＴｒｐ１損傷はついで、トリプトファンが存在しない場合の増殖により形質転換を検出するための有効な環境を提供する。
【００９８】
医薬製剤及び投与方法
本明細書において開示されるヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体、及び薬学的に許容しうる単体を含む医薬組成物が本明細書において提供される。
【００９９】
本明細書において提供される抗体又はその抗原結合フラグメントの製造方法及び被験体への投与方法は、周知であるか又は当業者により容易に決定される。抗体又はそのフラグメントの投与経路は、経口、非経口（例えば静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下）、吸入又は局所である。いくつかの実施態様において、本明細書において提供される抗体は、静脈内投与用に処方される。いくつかの実施態様において、注射に適した医薬組成物は、緩衝液（例えば酢酸緩衝液、リン酸化漿液又はクエン酸緩衝液）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、場合により安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含む。
【０１００】
注射用途に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は水性分散及び滅菌注射可能溶液又は分散の即時調製のための滅菌散剤を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散の場合には必要な粒径の維持により、及び界面活性剤の使用により適切な流動性が維持され得る。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどにより達成され得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖類、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、又は塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。注射可能組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばアルミニウムモノステアレート及びゼラチンを組成物に含めることにより起こり得る。
【０１０１】
いずれの場合も、滅菌注射可能液剤は、活性化合物（例えば、抗体自体又は他の活性薬剤と組み合わせて）を必要な量で、必要に応じて本明細書において挙げられる成分のうちの１つ又はそれらの組み合わせとともに適切な溶媒中に組み込み、続いて滅菌ろ過することにより製造され得る。一般に、基本的分散媒及び上に上げたものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み込むことにより分散が製造される。滅菌注射液剤の製造のための滅菌散剤の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥及び凍結乾燥であり、これにより予め滅菌ろ過されたその溶液から活性成分及びいずれかのさらなる所望の成分の粉末が得られる。注射用製剤は、処理され、アンプル、バッグ、ボトル、シリンジ又はバイアルのような容器中に充填され、そして当該分野で公知の方法に従って無菌条件下で密封される。このような製品は、好ましくは、添付の組成物が自己免疫又は新生物障害に罹患しているか又はかかりやすい被験体を処置するために有用であるということを示すラベル又は添付文書を有する。
【０１０２】
本明細書において提供される抗体又はその抗原結合フラグメントの、上記の状態の処置のための用量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトでるか動物であるか、投与される他の医薬、及び処置が予防的であるか治療的であるかを含む多くの様々な因子に依存して変化する。通常は、患者はヒトであるが、トランスジェニック動物を含む非ヒト哺乳動物も処置され得る。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、用量は、例えば、約０．０００１〜１００ｍｇ／ホスト体重ｋｇ、又は０．０１〜５ｍｇ／ホスト体重ｋｇの範囲に及び得る。
【０１０４】
被験体は、このような用量を、毎日、１日おきに、毎週、又は経験的分析により決定されたいずれかの他のスケジュールに従って投与され得る。本明細書において提供される抗体、又はその抗原結合フラグメントは、複数回投与され得る。
【０１０５】
単一の投薬間の間隔は、例えば、毎日、毎週、毎月又は毎年であり得る。間隔は、患者におけるポリペプチド又は標的分子の血中レベルを測定することにより示されるように不規則であり得る。
【０１０６】
本明細書において提供される抗体又はその抗原結合フラグメントは、処置を必要とする障害又は状態を処置する際に使用される他の薬剤と組み合わせて投与され得る（例えば、予防的又は治療的）。好ましいさらなる薬剤は、特定の障害について当該分野で認識され、そして標準的に投与されるものである。
【０１０７】
ＣＸＣＲ３関連疾患又は障害を処置する方法
本明細書において提供されるＣＸＣＲ３抗体、又はその抗原結合フラグメントは、ＣＸＣＲ３活性をアンタゴナイズするために有用である。いくつかの実施態様において、抗体及び抗原結合フラグメントは、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、及び／若しくはＣＸＣＬ１１のような１つ若しくはそれ以上のリガンドへのＣＸＣＲ３結合を阻害するため；例えば炎症部位へのＣＸＣＲ３＋細胞の遊走、蓄積、動員、若しくは浸潤を阻害するため；並びに／又はＣＸＣＲ３＋細胞を枯渇させるための方法において使用される。いくつかの実施態様において、抗体及び抗原結合フラグメントは、インビボでＣＸＣＲ３＋細胞を枯渇させるための方法において使用される。ＣＸＣＲ３＋細胞としては、限定されないが、ＣＸＣＲ３＋／ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＸＣＲ３＋／ＣＤ８＋  Ｔ細胞、及びＣＸＣＲ３＋／ＣＤ１９＋  Ｂ細胞サブセットが挙げられる。
【０１０８】
特定の実施態様において、１つ又はそれ以上のＣＸＣＲ３抗体、又はその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することにより、ＣＸＣＲ３関連疾患又は障害を処置するための方法が提供される。一実施態様において、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患を処置又は進行を低減する方法が提供される。この方法は、本明細書に開示されるヒト化抗ヒトＣＸＣＲ３抗体又はその抗原結合フラグメントを、それを必要とする被験体に投与し、それによりＴ細胞媒介自己免疫疾患の進行を処置又は低減する工程を含む。特定の実施態様において、Ｔ細胞媒介自己免疫疾患は白斑症である。いくつかの実施態様において、それを必要とする被験体は、本明細書に記載されるような、ＣＸＣＲ３関連疾患若しくはＴ細胞媒介自己免疫疾患と診断されたか、又はＣＸＣＲ３関連疾患若しくはＴ細胞媒介自己免疫疾患を発症しやすい被験体を含む。
【０１０９】
本明細書において提供される方法により処置しようとする被験体は、ヒト又は他の哺乳動物を含み得る。一実施態様において被験体はヒトである。様々な実施態様において、被験体は、異常なＣＸＣＲ３活性に関連するいずれかの状態、又はＣＸＣＲ３シグナル伝達の破損が治療的に有益であり得るいずれかの状態を予防的に又は発生後に処置され得る。
【０１１０】
いくつかの実施態様において、被験体は白斑症を予防的に又は発症後に処置され得る。
【０１１１】
「白斑症を有する被験体」は、自己免疫又は未知の原因の斑状の皮膚色素減少を有する被験体であり、これは白斑症の医学的診断と一致する。患部領域は、顔、手、足、腕、脚、唇、又はそれらのいずれかの組み合わせを含み得るが、他の領域、例えば、頸部又は体躯が含まれ得る。いくつかの場合において、減少した毛髪色素沈着がある。
【実施例】
【０１１２】
抗体、物質の組成物、及び方法は、以下の実施例によりさらに説明され、これらはさらなる限定と解釈されるべきではない。配列表、図面並びに本出願全体をとおして引用される全ての参考文献、特許及び公開された特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に加入される。
【０１１３】
実施例１：ヒト化抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体の生成
抗ＣＸＣＲ３モノクローナル抗体をＷＯ２０１３／１０９９７４に記載されるように生成した。ヒト化クローン５３モノクローン抗体を以下に記載されるように生成した。
【０１１４】
ＣＸＣＲ３を発現する細胞の枯渇を方向づけることができるクローン５３のヒト化バージョンを作製した。表４に示されるＶＨ及びＶＫ配列を有するヒト化クローン５３のモノクローナル抗体を生成した。
【０１１５】
表４に示されるヒト化変異体の各々についてのジャーミナリティインデックススコア。重鎖をＩＧＨＶ３−２３＊０３／ＩＧＨＪ４＊０３生殖系列配列と比較し；軽鎖をＩＧＫＶ１−９＊０１／ＩＧＫＪ２＊０１生殖系列配列と比較した。
【０１１６】
【表５】
2020514273.tif 000006
【０１１７】
本明細書において提供されるヒト化モノクローナル抗体のそれぞれについての結合特徴を表５に示す。
【０１１８】
【表６】
2020514273.tif 000007
【０１１９】
表６はクローン５３（５３）、キメラクローン５３（Ｃｈ５３）及びクローン５３のヒト化バージョン（５３Ｈｕ１〜５３Ｈｕ２０）についての結合特徴及びジャーミナリティインデックスを示す。
【０１２０】
【表７】
2020514273.tif 000008
【０１２１】
上のデータにより示されるように、本明細書において提供されるヒト化抗体は、有意に改善された結合特徴を有しながら、好ましいジャーミナリティインデックスを有する。
【０１２２】
実施例２：ＣＤＲ最適化
多数のＶＨ  ＣＤＲ及び／又はＶＬ  ＣＤＲ変異体を作製した。組み換えヒトＣＸＣＲ３に対する結合アビディティをＢｉａｃｏｒｅを使用して測定した。少なくとも５３Ｈｕ３７と同程度の強さの結合を有する変異体を表３に示す。
【０１２３】
実施例３：ＣＸＣＲ３−１７３は枯渇抗体である。
【０１２４】
ハムスター抗マウスＣＸＣＲ３モノクローナル（クローンＣＸＣＲ３−１７３）を、前臨床実験において代用抗体として使用した。ＣＸＣＲ３−１７３は、インビボでＣＤ４＋  Ｔ細胞を枯渇させないブロッキング抗体として以前に記載された（Ｕｐｐａｌｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ８６：１３７−４７  （２００８）を参照のこと）。
【０１２５】
ハムスターＣＸＣＲ３−１７３  ｍＡｂの以下のＦｃ変異体を、抗体のエフェクター機能を試験するために製造した：マウスＩｇＧ１の無糖化（ａｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ）Ｎ２９７Ｇ変異体（ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧｌ  ａｇｌｙ）；野生型マウスＩｇＧ２ａキメラ（ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧ２ａ  ＷＴ）；枯渇能を抑制するように改変されたマウスＩｇＧ２ａキメラ（ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧ２ａ  Ｄａｂ）；及び野生型マウスＩｇＧ３（ＣＸＣＲ３  ｍＩｇＧ３）。
【０１２６】
８〜１０週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、群あたりｎ＝５）に、単回５ｍｇ／ｋｇ静脈内用量の抗体を投与し、ついで血液を２４時間後に以下のマーカーを使用したフローサイトメトリー分析のために採取した：ＴＣＲａｂ、ＣＤ４、及びＣＤ８によるＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞；ＴＣＲａｂ、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６２Ｌ及びＣＤ４４によるメモリーＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞。Ｃｏｕｎｔ  Ｂｒｉｇｈｔビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して製造者のプロコトルに従って細胞を定量し、総細胞／血液マイクロリットルを決定した。
【０１２７】
総Ｔリンパ球及びＴリンパ球のサブセットに対するゲーティングからの結果を図１に示す。図に示されるように、ハムスターＣＸＣＲ３−１７３がマウスに投与された場合にＣＤ４＋及びＣＤ８＋メモリーＴ細胞を枯渇させるということが、驚くべきことに初めて実証された。
【０１２８】
実施例４：ＣＸＣＲ３−１７３のＦｃ変異体のエフェクター機能
Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００機器を使用して、抗体捕捉アプローチを使用してＣＸＣＲ３−１７３のＦｃ操作バージョンのマウスＦｃγ受容体結合を評価した。組み換えタンパク質Ａ／Ｇ  （Ｐｉｅｒｃｅ）を、アミン化学を使用してＣＭ５センサーチップに共有結合で固定した。ＣＸＣＲ３−１７３抗体をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で５μｇ／ｍＬに希釈し、そしてタンパク質Ａ／Ｇチップに３０秒間１０μＬ／分の流量で注入した。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓからの組み換えマウスＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩｂ  （ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、及びＦｃγ１Ｖ（ＣＤ１６−２）を、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で３００から３．７ｎＭに３倍希釈し、そして３０μＬ／分流量で補足された抗体へ二連で注入した。表面をグリシン２．０（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて再生した。結合応答をタンパク質Ａ／Ｇ捕捉のＲＵ量に正規化した。結果を図２Ａ〜２Ｄに示す。
【０１２９】
図に示されるように、野生型マウスＩｇＧ２ａアイソタイプを有するように改変されたハムスターＣＸＣＲ３−１７３は、全ての４つの組み換えマウス（ｒｍ）Ｆｃγ受容体に結合するが、ｄＡＢ変異はこの結合を有意に減少させる。野生型マウスＩｇＧ３アイソタイプを有するように改変されたＣＸＣＲ３−１７３はまた、全ての４つの組み換えマウスＦｃγ受容体に結合する。元の非改変ハムスターＣＸＣＲ３−１７３は、ｒｍＦｃγＲＩＩｂ及びｒｍＦｃγＲＩＩＩにＩｇＧ２ａアイソタイプ変異体よりも良好に結合し、そして無糖化ｍＩｇＧ１アイソタイプ変異体はいずれのｒｍＦｃγＲにも結合しない。
【０１３０】
実施例５：インビトロエフェクター機能
ヒト化抗ＣＸＣＲ３  ｍＡｂ及びそのＦｃ操作バージョンを一連のＡＤＣＣアッセイにおいて調べた。ヒト化抗ＣＸＣＲ３  ｍＡｂのＦｃ操作バージョンを標準的な方法を使用して製造した。脱フコシル化バージョンを、キフネンシンの存在下でヒト化ｍＡｂを発現する細胞を培養することにより製造した。
【０１３１】
ＡＤＣＣアッセイを、エフェクター細胞としてバリン多型を有するＣＤ１６を過剰発現する初代ヒトＮＫ細胞又はＮＫ９．２細胞株（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ）を使用して、そして標的細胞としてヒトＣＸＣＲ３を過剰発現するＣＨＯトランスフェクト細胞（Ａアイソフォーム）を使用して行った。
【０１３２】
初代ＮＫ細胞がエフェクター細胞として使用された場合のアッセイについて、ＮＫ細胞を正常ドナーからのｌｅｕｃｏｐａｋから精製し、そしてＩＬ−２で２４時間培養し、ついでクロムで終夜標識されたＣＨＯ−ヒトＣＸＣＲ３標的細胞と５：１  Ｅ：Ｔ比でプレーティングした。培養物を３時間組織培養インキュベーターでインキュベートし、続いて１％  Ｔｒｉｔｒｏｎ−Ｘで洗浄及びリンスした後、ガンマカウンターで上清を読み取った。
【０１３３】
ＮＫ９．２細胞がエフェクターとして使用された場合のアッセイについて、ＮＫ９．２細胞を２週間ＩＬ−２で製造者の推奨に従って増殖させた。アッセイの日に、ＮＫ９．２細胞（７０，０００細胞）をカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、そして適切に希釈された抗体とともに３０分間インキュベートして抗体が標的細胞上のＣＸＣＲ３に結合することを可能にした。ＮＫ細胞を３：１  エフェクター対標的細胞比でプレーティングし、そして培養物を１時間組織培養インキュベーターでインキュベートした。細胞を培養期間の終わりにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で溶解し、そしてプレートをＭ５プレートリーダーを使用して読み取った（４９２ｎｍ励起及び５１５ｎｍ発光）。
【０１３４】
ヒトＩｇＧｌ（Ｓｉｇｍａ）をネガティブコントロールとして使用し、そしてアレムツズマブ（モノクローナル抗ＣＤ５２抗体）で処理したＣＤ５２を過剰発現するＣＨＯ細胞は、溶解についてのポジティブコントロールとして役立った。シグナルは任意蛍光単位（ＡＦＵ）で表される。細胞傷害パーセントは、（実験的溶解  −  自発的溶解）／（最大溶解  −  自発的溶解）ｘ１００％により表される。
【０１３５】
ヒトＩｇＧ１  Ｆｃを有するヒト化抗ＣＸＣＲ３  ｍＡｂ  ５３Ｈｕ３７及びＦｃ操作バージョンをＡＤＣＣアッセイで試験した。Ｆｃ操作バージョンＭ１
（Ｓ２３９Ｄ／Ｄ３３２Ｅ（ＥＵ表示法）、Ｍ２（Ｇ２３６Ａ／Ｓ２６７Ｅ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（ＥＵ表示法）、「ＡＥＦＴＥ」）、及びＭ３（Ｓ２３９Ｄ／Ｈ２６８Ｆ／Ｓ３２４Ｔ／Ｉ３３２Ｅ（ＥＵ表示法）、「ＤＦＴＥ」）は、増強されたＡＤＣＣ又はＣＤＣ活性を可能にするアミノ酸変化を含有する。第四のＦｃ操作バージョンを、野生型抗体を作製する細胞株のキフネンシン処理により生成した。
【０１３６】
抗ヒトＣＸＣＲ３クローン  クローン４（ＣＸＣＲ３  ＣＬ４）、クローン１２（ＣＸＣＲ３  ＣＬ１２）、クローン８２（ＣＸＣＲ３  ＣＬ８２）、クローン１３５（ＣＸＣＲ３  ＣＬ１３５）も試験した。独立した実験において、異なるエフェクター細胞、エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比、及び抗体の濃度を用いてアッセイを行った。代表的な結果を図３Ｂ及び図３Ｃに示す。
【０１３７】
図３Ａは５３Ｈｕ３７のＭｌ、Ｍ２、Ｍ３、及び脱フコシル化バージョンのエフェクター機能を要約する。図３Ｂは初代ＮＫ細胞をエフェクターとして使用したアッセイの結果を示す。図３ＣはＮＫ９．２細胞をエフェクターとして使用したアッセイの結果を示す。
【０１３８】
実施例６：Ｆｃγ受容体結合
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を使用して、ヒト化抗ＣＸＣＲ３  ｍＡｂ  ５３Ｈｕ３７及び５３Ｈｕ３７のＦｃ操作バージョンのヒト及びマウスＦｃγ受容体結合親和性を評価した。ＳｉｇｍａからのプロテインＡをＣＭ５シリーズＳチップにアミン化学を使用して固定した。抗体をプロテインＡチップに注入し、そして多数の濃度の組み換えヒト及びマウスＦｃγ受容体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を捕捉された抗体に注入した。広範囲の濃度の受容体を使用して、低親和性結合剤及び高親和性結合剤（１．２ｎＭから５μＭまで）に及んだ。各サンプルを二連で注入した。結合センサーグラムを１：１動力学結合モデルにフィッティングした。定量的結果を図４にまとめる。
【０１３９】
図４に示されるように、Ｍ１及びＭ３  Ｆｃ操作バージョンはｈＦｃγＲＩＩＩ及びｍＦｃγＲＩＶの両方に対する改善された親和性を有し、Ｍ２はｈＦｃγＲＩＩａに対する増加した結合を有し、そしてキフネンシン処理５３Ｈｕ３７は、Ｆｃ操作バージョンと比較してｈＦｃγＲＩＩＩ及びｍＦｃγＲＩＶにおいて中程度の増加を示した。
【０１４０】
実施例７：
カニクイザルに５３Ｈｕ３７、Ｍｌ変異体、若しくはキフネンシン処理バージョン（抗体処置群あたりｎ＝８）、又はビヒクルコントロール（ｎ＝６）の２ｍｇ／体重ｋｇの単回静脈内注射を行った。血液サンプルを注入の前、ついで１、３、７、及び１４日後に集め、そしてフローサイトメトリーにより総Ｔ細胞及びＴ細胞サブセットについて分析した。フローサイトメトリーのために、赤血球を溶解し、そして細胞を以下のマーカーについて抗体で染色し、総及びメモリーＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞を同定した：ＣＤ３（クローンＳＰ３４−２）、ＣＤ４（クローンＯＫＴ４）、ＣＤ８ａ（クローンＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ４５ＲＡ（クローン５Ｈ９）、ＣＣＲ７（クローンＧ０４３Ｈ７）、及びＣＸＣＲ３（クローン１Ｃ６）。Ｃｏｕｎｔ  Ｂｒｉｇｈｔビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞を定量し、細胞／マイクロリットル（細胞／μＬ）を決定した。データを、時間にわたる群についての各細胞サブセットの採血前（ｐｒｅ−ｂｌｅｅｄ）の値の平均パーセンテージとして表す。注入の１４日後に各処置群のサブセットから得られた脾臓サンプルの組織学を、抗ヒトＣＸＣＲ３クローン４抗体及び適切な二次抗体を使用してＣＸＣＲ３について固定されたサンプル切片を染色することにより調べた。結果を図５Ａ〜５Ｃに示す。ペプチドＥＬＩＳＡを使用して、血液サンプルからの血清を、投与された抗体の循環レベルを測定して薬物動態についてもアッセイした。
【０１４１】
図に示されるように、５３Ｈｕ３７、５３Ｈｕ３７のＭ１バージョン、及びＫｉｆ処理５３Ｈｕ３７は、エフェクターメモリーＣＤ４  Ｔ細胞を減少させ、そして５３Ｈｕ３７、Ｈｕ３７のＭ１バージョン、及びＫｉｆ処理５３Ｈｕ３７はエフェクターメモリーＣＤ８  Ｔ細胞を減少させた。さらに、５３Ｈｕ３７のＭ１バージョン及びＫｉｆ処理５３Ｈｕ３７は、抗体の単回静脈内注入の１４日後に脾臓においてＣＸＣＲ３染色を劇的に減少させた。
【０１４２】
実施例８：生化学分析
熱的安定性、せん断応力及びウイルス不活化に対する安定性、凍結−解凍ストレスに対する安定性、撹拌ストレスに対する安定性、及びｐＨ安定性を、５３Ｈｕ３７、Ｍｌバージョン、及びキフネンシン処理５３Ｈｕ３７について測定した。
【０１４３】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）
サンプルをハイスループットＶＰ−ＤＳＣ（Ｍｉｃｒｏｃａｌ）を用いて分析した。サンプルを対応する緩衝液を用いて約０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、そして９６ウェルプレート上にロードした。スキャンパラメーターは、開始温度２５℃及び終了温度１００℃からなるものであった。スキャン速度２００℃／ｈを使用した。
【０１４４】
濁度
３４０〜３６０ｎｍでのサンプル吸光度を５ｎｍ増分でＳｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で測定し、そして値を平均して最終濁度測定値を得た。９６ウェルＵＶ平底プレートを１５０〜２００の材料に使用した。プレートをサンプルを加える前に事前に読み取り、そしてパスチェックをサンプル値に適用した。Ｂｒｉｇｉｔｔｅ  Ｅｃｋｈａｒｄｔ、Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｖｏｌ．４８、Ｎｏ．２  Ｍａｒ．−Ａｐｒ．１９９４による「Ａ  Ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ  Ｖｉｓｕａｌ  Ａｐｐｅａｒａｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ」に基づいて濁度標準のＵＶ吸光度から得られた値とサンプルを比較して濁度の程度を分類した。
【０１４５】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＨＰ１１００又は１２００シリーズシステムは、ＳＷＸＬガードカラムと連結されたＴＳＫ  ＳＷＸＬサイズ排除カラムを備えていた。サンプルを３５分間、２０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０の移動相を使用して流した。流量０．５ｍＬ／分を使用した。５０μｇの注入を行い、そしてＵＶシグナルを２８０ｎｍでモニタリングした。
【０１４６】
熱誘導相対的凝集性（ＴＩ−ＲＡＰ）
０．２ｍｇ／ｍＬ抗ヒトＣＸＣＲ３抗体（個別又は抗体の混合物）をＰＢＳ緩衝液及び１０ｍＭヒスチジン及び９％スクロース緩衝液中５℃（対照）、６４℃、６７℃、７０℃、又は７３℃で１０分間インキュベートすることにより温度誘導凝集が生じた。熱インキュベーション後に、サンプルを７０００  ｘ  ｇで２分間５℃にて遠心分離して不溶性のタンパク質沈殿物を除き、そして上清をカチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）により分析した。可溶性モノマーのパーセント（及び相対的凝集性）を、クロマトグラフィーピーク面積を、対照（５℃）サンプルのピーク面積を使用して熱ストレスを与えたサンプルについて正規化することにより計算した。
【０１４７】
撹拌誘導相対的凝集性（ＡＩ−ＲＡＰ）
撹拌誘導相対的凝集性について、０及び０．０１％ポリソルベート８０を含むＰＢＳ緩衝液及び１０ｍＭヒスチジン及び９％スクロース緩衝液中０．２ｍｇ／ｍＬの抗ヒトＣＸＣＲ３抗体の最終タンパク質濃度を含有する溶液を５℃にて厳しい撹拌ストレスをかけた。抗ヒトＣＸＣＲ３抗体の溶液を、ＶＸ−２５００  Ｍｕｌｔｉ−Ｔｕｂｅ  Ｖｏｒｔｅｘｅｒ（ＶＷＲ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）からの最高速度で合計２４時間の間撹拌した。
【０１４８】
ＣＥＸ分析のための少量のサンプルアリコートを除くことにより、研究全体を通して様々な時点を分析した。サンプルアリコート７０００  ｘ  ｇ（５℃）で２分間遠心分離して不溶性タンパク質沈殿物を除き、そして上清をＣＥＸにより分析した。可溶性モノマーのパーセント（及び相対的凝集性）を、対照（０時間）サンプルのピーク面積を使用して撹拌されたサンプルのクロマトグラフィーピーク面積を正規化することにより計算した。
【０１４９】
カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）
ＣＥＸ分析をＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０  ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＨＰＬＣシステムでＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０分析用カラム（弱カチオン交換、４  ｘ  ２５０  ｍｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して２５℃で行った。タンパク質サンプル２０マイクログラムをカラムにロードし、そして流量０．８ｍＬ／分で分析した。カラムを緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、０．００２５％アジ化ナトリウム、ｐＨ  ５．２）で平衡化し、そしてタンパク質を緩衝液Ｂ（２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１Ｍ塩化ナトリウム、０．００２５％アジ化ナトリウム、ｐＨ  ５．２）の０から１００％への４０分にわたる線形グラジエントを用いて溶出した。２８０ｎｍでの吸光度を測定し、そして２８０ｎｍ吸光度ピークを積分してタンパク質ピーク面積を決定した。
【０１５０】
実験設計
ｐＨ／温度ストレス
各クローンからの材料の一部を２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ５．０及びリン酸ナトリウムｐＨ７．０に対してＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＰＮ  ６６８１０）を使用して透析した。この材料を対応する緩衝液を使用して希釈し、そしてＭｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＮ  ＳＬＧＶ０３３ＲＢ）を使用してろ過して約２ｍｇ／ｍＬとした。ｐＨ５及びｐＨ７の両方のリン酸ナトリウムを３及び５週目の試験前に３７℃で保存した。
【０１５１】
凍結−解凍ストレス
示された抗ヒトＣＸＣＲ３抗体を、２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ  ６．０にＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＰＮ  ６６８１０）を使用して透析した。この材料を対応する緩衝液で希釈し、そしてＭｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＮ  ＳＬＧＶ０３３ＲＢ）を使用してろ過して約１ｍｇ／ｍＬとした。凍結−解凍ストレスサンプルを、合計５回、−８０℃で凍結し、そして室温で解凍した。１及び３回の凍結−解凍サイクルの後に、材料を選択アッセイにより試験するために取り出した。試験の完全な一連の分析を最終凍結−解凍後に行った。
【０１５２】
せん断応力
抗体サンプルを２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ  ６．０にＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＰＮ  ６６８１０）を使用して透析した。この材用を対応する緩衝液を使用して希釈し、そしてＭｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＮ  ＳＬＧＶ０３３ＲＢ）を使用してろ過して約１ｍｇ／ｍＬとした。せん断応力サンプルを２００μＬピペットを用いて合計５０回繰り返しピペット操作した。
【０１５３】
模擬ウイルス不活化
抗体サンプルを２０ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ６．０にＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＰＮ  ６６８１０）を使用して透析した。この材料を対応する緩衝液で希釈し、そしてＭｉｌｌｅｘ  ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＰＮ  ＳＬＧＶ０３３ＲＢ）を使用してろ過して約１ｍｇ／ｍＬとした。ウイルス不活化サンプルを１Ｎ  ＨＣｌを用いてｐＨ３．５にして、そのｐＨを室温で１００分間維持した。保持期間の後に、サンプルを１Ｎ  ＮａＯＨを使用してｐＨ７．２に戻し、そして１００分間保持した。ついでサンプルを１Ｎ  ＨＣｌを使用してｐＨ６．０にし、そして試験した。
【０１５４】
結果
示差走査熱量測定：
Ｍ１バージョン（Ｄ／Ｅ変異体）は、Ｋｉｆバージョンよりもわずかに不安定であることがわかり、Ｋｉｆバージョンは今度は５３Ｈｕ３７よりわずかに不安定であった。
【０１５５】
せん断応力：
Ｍ１バージョン（Ｄ／Ｅ変異体）は、５３Ｈｕ３７及びＫｉｆバージョンよりわずかに不安定であることがわかり、後者の２つはおおよそ等しく安定であった。
【０１５６】
ウイルス不活化ストレス：
Ｍ１バージョン（Ｄ／Ｅ変異体）はＫｉｆバージョンより安定であることがわかり、これらは両方共５３Ｈｕ３７より不安定であった。
【０１５７】
凍結−解凍ストレス：
Ｍ１バージョン（Ｄ／Ｅ変異体）、Ｋｉｆバージョン、及び５３Ｈｕ３７はおおよそ等価であることがわかった。
【０１５８】
撹拌誘導相対的凝集性：
抗体の全てのバージョンの約８０パーセントが撹拌２時間以内に沈殿したが、ｐＨ５．５では、Ｍ１バージョン（Ｄ／Ｅ変異体）は他の２つのバージョンよりも比較的安定であった。
【０１５９】
凝集体形成：
ｐＨ５．０での対照（非加速）条件下で、Ｍ１バージョン（Ｄ／Ｅ変異体）及び５３Ｈｕ３７は５週間の期間にわたって本質的に安定であったが、Ｋｉｆバージョンは乳白色になった；この同じパターンは、加速条件下で見られた。ｐＨ７．０での対照（非加速）条件下で、抗体の３つのバージョンは５週間の期間にわたっておおよそ同じであった。加速条件下では、ＤＥ変異体は５３Ｈｕ３７よりもわずかに安定であり、これはＫｉｆバージョンよりも安定であった。
【０１６０】
実施例９：抗ＣＸＣＲ３を非枯渇ではないが枯渇させることは、白斑症のマウスモデルにおいて保護的かつ治療的である
マウス。  ＫＲＴ１４−Ｋｉｔｌ＊４ＸＴＧ２Ｂｊｌ（Ｋｒｔｌ４−Ｋｉｔｌ＊）マウスは、ＢＪ  Ｌｏｎｇｌｅｙ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎからの贈与品であった。ＰＭＥＬ  ＴＣＲトランスジェニックマウスはＴｈｙｌ．ｌ＋であり、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号００５０２３、Ｂ６．Ｃｇ  Ｔｈｙｌ  ＣｙＴｇ（ＴｃｒａＴｃｒｂ）８Ｒｅｓｔ／Ｊから得られた。全てのマウスはＣ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドであり、病原体不在施設で維持され、そしてＮＩＨの実験動物の管理と使用に関する指針（Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従って手順が行われた。
【０１６１】
抗体。  デルタＡＢ  ＣＸＣＲ３はＣＸＣＲ３活性を中和する抗体である（本明細書においてＩｇＧ２ａ−ｄＡＢ、ｄＡＢ、又はΔＡＢとも呼ばれる）。ＷＴマウスＣＸＣＲ３は、枯渇活性を有する野生型マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃを有する抗体である。
【０１６２】
白斑症誘導及び抗体処置。  プレメラノソーム特異的（ＰＭＥＬ）ＣＤ８＋  Ｔ細胞の養子移入により以前に記載されたように白斑症を誘導した。Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３２：１８６９−７６  （２０１２）。手短には、ＰＭＥＬ  ＣＤ８＋  Ｔ細胞を、ＰＭＥＬ  ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ストック番号００５０２３）の脾臓からマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）でのネガティブ選択により製造者の指示に従って単離した。精製されたＣＤ８＋  Ｔ細胞（１ｘ１０６）を、亜致死的に照射された（移入前１日に５００ｒａｄ）Ｋｒｔ１４−Ｋｉｔｌ＊宿主（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙストック番号００９６８７、８〜１２週齢）に静脈内注射した。レシピエントマウスにも、移入の同日に１ｘ１０６  ｐｆｕ  ｒＶＶ−ｈＰＭＥＬ（Ｎ  Ｒｅｓｔｉｆｏ、ＮＣＩ、ＮＩＨ）の腹腔内（ｉ．ｐ．）注射を投与した。
【０１６３】
抗体又はアイソタイプコントロール１００μｇの毎週３回観察期間の間ｉ．ｐ．注射することにより処置を行った。
【０１６４】
予防研究のために、マウスを白斑症誘導２〜６週後から処置した。この期間は、疾患を誘導するために使用されたウイルスのクリアランス後であるが、自己免疫の開始前にあるため、重要である。白斑症スコアを、以前に記載されるように、耳、鼻、後足蹠、及び尾を含む４つの容易に見ることができる位置における色素脱失の程度に基づくポイント尺度を使用して定量した。Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３２：１８６９−７６  （２０１２）。各位置を調べて、その色素脱失の程度を解剖的部位のパーセンテージとして見積もった；左右両耳、及び左右後足蹠は一緒に見積もりを行ったので単一の部位として評価した。ポイントを以下のように与えた：色素脱失の証拠無し（０％）はスコア０、＞０〜１０％＝１ポイント、＞１０〜２５％＝２ポイント、＞２５〜７５％＝３ポイント、＞７５〜＜１００％＝４ポイント、１００％＝５ポイントを与えられる。「白斑症スコア」は、４部位全ての合計であり、最大スコアは２０ポイントであった。
【０１６５】
再色素沈着（ｒｅｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）研究のために、それらの尾に７５％より高い色素消失を有するマウスを、ＷＴマウスＣＸＣＲ３枯渇Ａｂ又はアイソタイプコントロールを用いて、疾患が通常安定である白斑症誘導１２〜２０週後から処置した。再色素沈着分析を、以前に記載されたようにＩｍａｇｅＪを用いて行った。Ａｇａｒｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３５：１０８０−８（２０１５）。
【０１６６】
血液及び脾臓における細胞数に対するＣＸＣＲ３の効果。  マウスに各抗体１００μｇを注入し、そして血液（Ｃｏｕｎｔｂｒｉｇｈｔビーズを使用して決定された１マイクロリットルあたりの細胞）及び脾臓（Ｂｅｃｔｏｎ  ＣｏｕｌｔｅｒからのＶｉａ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ機器を使用した総細胞数）からのメモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞数を２４時間目に評価した。投与された抗体は、ＣＸＣＲ３染色に使用されてＣＸＣＲ３への結合から抗体染色をブロックすることができる抗体と本質的同じ抗体（同じＣＤＲ）であるので、メモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞（ＣＤ４４及びＣＤ６２Ｌ染色により定義される）はこれらの細胞の５０％より多くがＣＸＣＲ３を発現するので、メモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞の数を評価することによりＣＸＣＲ３非依存性尺度を使用して枯渇を評価した。
【０１６７】
フローサイトメトリー。  血液、尾、脾臓、及び皮膚−流入領域リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ）を採取し、そしてフローサイトメトリーにより分析した。脾臓を分裂させ、そして赤血球をＲＢＣ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して溶解させた。血液サンプルを染色し、そしてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ溶解／固定緩衝液を用いて製造者のプロトコルにしたがって処理した。真皮及び表皮の分離のために、尾皮膚サンプルを５Ｕ  ｍＬ−１ディスパーゼＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）とともに１時間３７℃でインキュベートした。表皮を除去し、そして７０μｍ細胞ろ過器を使用して機械的に崩壊させ、そして真皮サンプルを１〜２ｍｇ  ｍＬ−１ＤＮＡｓｅ  Ｉを含む１ｍｇ  ｍＬ−１コラゲナーゼＩＶ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とともに１時間３７℃でインキュベートした。分析の前に全ての細胞を７０μｍメッシュを通してろ過した。ＰＭＥＬ及びそれらの表現型を同定するために、サンプルを以下の抗体でＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）中１：２００で染色した：ＣＤ４５  ＡＦ７００、ＣＤ８ｂ  ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、Ｔｈｙｌ  ．ｌ  Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ  Ｂｌｕｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をＦＡＣＳ緩衝液中１：１０００で使用して、生存細胞を区別した。データを集め、そしてＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を使用して解析した。
【０１６８】
結果。  血液及び脾臓における細胞数に対するＣＸＣＲ３抗体の効果。血液及び脾臓において、メモリーＣＤ８＋  Ｔ細胞の総数は、ＷＴマウス又はハムスターＣＸＣＲ３抗体で処置されたマウスにおいて有意に減少したが、一方で細胞数は、未処置のマウスと比較して、ｄｅｌｔａＡＢ  ＣＸＣＲ３で処置されたマウスにおいて変化なかった。
【０１６９】
予防。  ハムスター抗マウスＣＸＣＲ３（枯渇）、ＷＴマウスＣＸＣＲ３（優れた枯渇）、ｄｅｌｔａＡＢ  ＣＸＣＲ３（中和；非枯渇）、又はアイソタイプコントロール抗体を用いてマウスを処置した。当然のことながら、枯渇抗体ＷＴマウスＣＸＣＲ３は、処置の５週間後に有意に減少したスコア（一元配置（ｏｎｅ−ｗａｙ）ＡＮＯＶＡ  ｐ＝０．００６６、Ｄｕｎｎｅｔｔの事後検定  対  アイソタイプｎｓ；Ｔｕｋｅｙの事後検定  ΔＡＢ対ＷＴ及びΔＡＢ対ハムスターについて有意）により裏付けられるように、臨床疾患の予防において最も良好に機能した。この観察はデータと一致し、ＷＴマウスＣＸＣＲ３  ＡｂがハムスターＣＸＣＲ３  Ａｂよりも良好な枯渇活性を有するということを示す。マウスにおける白斑症予防において試験した全てのＡｂは、皮膚においてより少ないＰＭＥＬを生じた。ＰＭＥＬ数は、ＣＸＣＲ３  Ａｂのいずれかを用いた処置の後、表皮において有意に減少し（アイソタイプコントロールと比較してＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定を用いて二元配置（ｔｗｏ−ｗａｙ）ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０００１）、そして真皮において減少する傾向であった。しかし、皮膚においてＰＭＥＬ数を減少させるその能力にもかかわらず、中和抗体は、枯渇抗体よりも低い有効性であり、これはおそらくＰＭＥＬの低い閾値数が完全臨床疾患には十分であるという事実に起因する。宿主Ｔ細胞でのＣＸＣＲ３枯渇抗体の効果を、リンパ節（ＬＮ）、脾臓、血液、表皮、及び真皮における宿主ＣＤ８＋  Ｔ細胞の数及び総ＣＤ４５＋細胞を測定することにより評価した。Ｂｙｓｔａｎｄｅｒ宿主ＣＤ８＋  Ｔ細胞数は、ハムスター又はＷＴマウスＣＸＣＲ３  Ａｂ処置により脾臓及びリンパ節（ＬＮ）において有意に減少したが、皮膚では減少しなかった（アイソタイプコントロールと比較してＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの事後検定を用いた二元配置ＡＮＯＶＡ  ｐ＜０．０００１）。しかし、ＣＤ４５＋細胞の総数は、ＣＸＣＲ３  Ａｂのいずれを用いた処置のあとも変化しなかった。
【０１７０】
再色素沈着。  マウスＷＴ  ＣＸＣＲ３  Ａｂ処置は、臨床疾患を有意に逆転させ、そして表皮におけるＰＭＥＬ数を減少させた。宿主ＣＤ８＋  Ｔ細胞数は処置されたマウスにおいてわずかに減少したが、総ＣＤ４５＋細胞数は変化しなかった。総合すると、これらのデータは、ＣＸＣＲ３枯渇Ａｂが自己反応性Ｔ細胞数を減少させ、そして免疫系の他のコンパートメントに対する影響を最小にしながら疾患を逆転させることができるということを示す。
【０１７１】
前記実施例は、本開示を説明することを意図され、いかなるようにも限定することは意図されない。開示される化合物および方法の他の実施態様は、明細書及び本明細書に開示される化合物及び方法の実施を考慮して当業者に明らかとなるだろう。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図６−１１】
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【図６−１２】
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【図６−１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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