(57)【要約】本発明は、ある特定の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその抗原結合性断片、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物、細胞障害性薬物に結合した抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその抗原結合性断片を含む抗体−薬物コンジュゲート、ならびにがんを処置するためおよび／または転移を予防するためのそのような抗体、断片、組成物、およびコンジュゲートの使用に関する。具体的には、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍成長を阻害する、ある特定の抗体またはその抗原結合性断片、そのような抗体または断片を含む医薬組成物、そのような抗体または断片を含む抗体−薬物コンジュゲート、ならびにがんを処置するためまたは転移を予防するためのそのような抗体、断片、組成物、およびコンジュゲートの使用が、本明細書に記載される。
2020528936.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、ペプチドに特異的に結合し、前記ペプチドの配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）、またはＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）からなる、抗体またはその断片。
【請求項２】
前記ペプチドの配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）である、請求項１に記載の抗体または断片。
【請求項３】
前記ペプチドの配列が、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）である、請求項１に記載の抗体または断片。
【請求項４】
前記ペプチドの配列が、ＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）である、請求項１に記載の抗体または断片。
【請求項５】
ＨＤＭ２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片であって、（ｉ）ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）であって、前記ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号３６、配列番号３８、および配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲである、重鎖可変領域（ＶＨ）、または（ｉｉ）ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、前記ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号３７、配列番号３９、および配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲである、軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ヒト化抗体またはその断片。
【請求項６】
前記ＶＨを含み、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＨのものである、請求項５に記載のヒト化抗体または断片。
【請求項７】
前記ＶＬを含み、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬのものである、請求項５または６に記載のヒト化抗体または断片。
【請求項８】
前記ＶＨを含み、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨのものである、請求項５に記載のヒト化抗体または断片。
【請求項９】
前記ＶＬを含み、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＬのものである、請求項５または８に記載のヒト化抗体または断片。
【請求項１０】
前記ＶＨを含み、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３が、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨのものである、請求項５に記載のヒト化抗体または断片。
【請求項１１】
前記ＶＬを含み、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３が、配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬのものである、請求項５または１０に記載のヒト化抗体または断片。
【請求項１２】
ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）であって、
（ｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＨＹ（配列番号１８）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＮＫＡＫＧＹＴ（配列番号１９）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＤＩＧＤＮ（配列番号２０）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＨＹＹＭＳ（配列番号４２）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＦＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡＥ（配列番号４５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＤＩＧＤＮ（配列番号２０）を有する、
（ｉｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＨＹＹＭＳ（配列番号４３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＦＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡＥＹＳＡＳＶＫＧ（配列番号４６）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＤＩＧＤＮ（配列番号２０）を有する、
（ｉｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＴＨＹＹＭＳ（配列番号４４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＷＬＧＦＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡＥ（配列番号４７）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＤＩＧＤ（配列番号４８）を有する、または
（ｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＦＴＦＴＨＹＹ（配列番号１４４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡ（配列番号１４５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＤＩＧＤＮ（配列番号１４６）を有する、
重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体またはその断片。
【請求項１３】
ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）であって、
（ｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＤＴＬＳＧＳ（配列番号２４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＨＬＮＲＧＴ（配列番号２５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＰＧＦＡＹ（配列番号２６）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＤＴＬＳＧＳＷＭＨ（配列番号５２）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＥＩＨＬＮＲＧＴＴＮ（配列番号５５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＰＧＦＡＹ（配列番号２６）を有する、
（ｉｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＳＷＭＨ（配列番号５３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＥＩＨＬＮＲＧＴＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５６）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＰＧＦＡＹ（配列番号２６）を有する、
（ｉｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＳＧＳＷＭＨ（配列番号５４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＨＬＮＲＧＴＴＮ（配列番号５７）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＳＰＧＦＡ（配列番号５８）を有する、または
（ｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＤＴＬＳＧＳＷ（配列番号１４８）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＩＨＬＮＲＧＴＴ（配列番号１４３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＳＰＧＦＡ（配列番号５８）を有する、
重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体またはその断片。
【請求項１４】
ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）であって、
（ｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＹ（配列番号３０）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＮＰＲＮＧＧ（配列番号３１）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、ＳＧＹＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＹＹＭＹ（配列番号６２）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＧＩＮＰＲＮＧＧＴＮ（配列番号６５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＧＹＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を有する、
（ｉｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＳＹＹＭＹ（配列番号６３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＧＩＮＰＲＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮ（配列番号６６）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＧＹＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を有する、または
（ｉｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＴＳＹＹＭＹ（配列番号６４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＷＩＧＧＩＮＰＲＮＧＧＴＮ（配列番号６７）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＴＲＳＧＹＹＡＭＤ（配列番号６８）を有する、
重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体またはその断片。
【請求項１５】
前記抗体または断片が、ＶＬ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＬ  ＣＤＲ  ２、およびＶＬ  ＣＤＲ  ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
（ｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＲＳＳＫＮＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号２１）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＶＳＮＬＡＳ（配列番号２２）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＱＬＬＥＬＰＹＴ（配列番号２３）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹ（配列番号４９）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＬＬＩＳＲＶＳＮＬＡ（配列番号５０）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＱＬＬＥＬＰＹ（配列番号５１）を有する、または
（ｉｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＫＮＬＬＨＳＮＧＩＴＹ（配列番号１４７）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＶＳを有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＱＬＬＥＬＰＹＴ（配列番号２３）を有する、
軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む、請求項１２に記載の抗体または断片。
【請求項１６】
前記抗体または断片が、ＶＬ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＬ  ＣＤＲ  ２、およびＶＬ  ＣＤＲ  ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
（ｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮＳＹＬＹ（配列番号２７）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＭＳＮＬＡＳ（配列番号２８）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＭＱＨＬＥＹＰＦＴ（配列番号２９）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＬＨＳＮＧＮＳＹＬＹＷＦ（配列番号５９）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡ（配列番号６０）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＭＱＨＬＥＹＰＦ（配列番号６１）を有する、または
（ｉｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＫＳＬＬＨＳＮＧＮＳＹ（配列番号１４１）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＭＳを有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＭＱＨＬＥＹＰＦＴ（配列番号２９）を有する、
軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む、請求項１３に記載の抗体または断片。
【請求項１７】
前記抗体または断片が、ＶＬ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＬ  ＣＤＲ  ２、およびＶＬ  ＣＤＲ  ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
（ｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＩＳＮＦＬＮ（配列番号３３）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号３４）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＱＱＧＮＴＬＰＲＴ（配列番号３５）を有する、または
（ｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＳＮＦＬＮＷＹ（配列番号６９）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨ（配列番号７０）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＱＱＧＮＴＬＰＲ（配列番号７１）を有する、
軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む、請求項１４に記載の抗体または断片。
【請求項１８】
配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＨ、または配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨを含む、請求項１２に記載の抗体または断片。
【請求項１９】
配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）、または配列番号３７のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬを含む、請求項１、１２、または１８に記載の抗体または断片。
【請求項２０】
配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨ、または配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨを含む、請求項１３に記載の抗体または断片。
【請求項２１】
配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＬ、または配列番号３９のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬを含む、請求項１、１３、または２０に記載の抗体または断片。
【請求項２２】
配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨ、または配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＨを含む、請求項１４に記載の抗体または断片。
【請求項２３】
配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬ、または配列番号４１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するＶＬを含む、請求項１、１４、または２２に記載の抗体または断片。
【請求項２４】
前記抗体が、ヒト化抗体である、請求項１から４および１２から２３のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項２５】
前記抗体が、ヒト抗体である、請求項１から４および１２から２３のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項２６】
前記抗体が、キメラ抗体である、請求項１から４および１２から２３のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項２７】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項２８】
免疫グロブリンである、請求項１から２７のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項２９】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧである、請求項２８に記載の抗体または断片。
【請求項３０】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項２８に記載の抗体または断片。
【請求項３１】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ３アイソタイプのものである、請求項２８に記載の抗体または断片。
【請求項３２】
Ｆｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、またはヒトＩｇＭ  Ｆｃ領域である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項３３】
前記抗体または断片が、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する、請求項３２に記載の抗体または断片。
【請求項３４】
前記抗体または断片が、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を媒介する、請求項３３に記載の抗体または断片。
【請求項３５】
Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体分子、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項３６】
前記ＨＤＭ２が、核局在化シグナルドメインが欠如しているＨＤＭ２バリアント、配列番号４のアミノ酸１７９〜１８５の配列が欠如しているＨＤＭ２バリアント、および／または配列番号４のアミノ酸４６４〜４７１の配列が欠如しているＨＤＭ２バリアントである、請求項５から２３のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項３７】
精製されている、請求項１から３６のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項３８】
腫瘍細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｖｏで阻害する、請求項１から３７のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項３９】
Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、請求項１から３８のいずれか一項に記載の抗体または断片と競合する抗体またはその断片。
【請求項４０】
（ｉ）配列番号１の配列のペプチドへの結合について、配列番号３６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むマウス抗ＨＤＭ２  ＩｇＧ１抗体と競合するか、または（ｉｉ）配列番号２のペプチドへの結合について、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むマウス抗ＨＤＭ２  ＩｇＧ３抗体と競合するか、または（ｉｉｉ）配列番号３のペプチドへの結合について、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含むマウスＩｇＭ抗体と競合する抗体またはその断片。
【請求項４１】
細胞障害性薬物に結合した請求項１から４０のいずれか一項に記載の抗体または断片を含む抗体−薬物コンジュゲート。
【請求項４２】
治療有効量の、請求項１から４０のいずれか一項に記載の抗体もしくは断片または請求項４１に記載の抗体−薬物コンジュゲートを含む医薬組成物。
【請求項４３】
それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、前記対象に、（ｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した前記抗体もしくは断片を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉ）請求項１から４０のいずれか一項に記載の抗体もしくは断片、（ｉｉｉ）請求項４１に記載の抗体−薬物コンジュゲート、または（ｉｖ）請求項４２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４４】
それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、前記対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞傷害性成分に結合していない抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法。
【請求項４５】
がんを有する対象において転移を阻害または予防する方法であって、前記対象に、（ｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した前記抗体もしくは断片を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉ）請求項１から４０のいずれか一項に記載の抗体もしくは断片、（ｉｉｉ）請求項４１に記載の抗体−薬物コンジュゲート、または（ｉｖ）請求項４２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４６】
がんを有する対象において転移を阻害または予防する方法であって、前記対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞傷害性成分に結合していない抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法。
【請求項４７】
それを必要とする対象においてがん再発生を予防またはがん再発を予防する方法であって、前記対象に、（ｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した前記抗体もしくは断片を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉ）請求項１から４０のいずれか一項に記載の抗体または断片、（ｉｉｉ）請求項４１に記載の抗体−薬物コンジュゲート、または（ｉｖ）請求項４２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４８】
がんを有する対象においてがん再発生を予防またはがん再発を予防する方法であって、前記対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞傷害性成分に結合していない抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法。
【請求項４９】
抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片で処置していない対象と比べてがんを有する対象における生存を増加させる方法であって、前記対象に、（ｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した前記抗体もしくは断片を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉ）請求項１から４０のいずれか一項に記載の抗体または断片、（ｉｉｉ）請求項４１に記載の抗体−薬物コンジュゲート、または（ｉｖ）請求項４２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項５０】
抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片で処置していない対象と比べてがんを有する対象における生存を増加させる方法であって、前記対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞傷害性成分に結合していない抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法。
【請求項５１】
前記対象に、請求項１から４０のいずれか一項に記載の抗体または断片を投与するステップを含む、請求項４３から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象に、請求項１から４０のいずれか一項に記載の抗体もしくは断片、請求項４１に記載の抗体−薬物コンジュゲート、または請求項４２に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、請求項４３、４５、４７、および４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗体または断片が、細胞透過性ペプチドに結合していない、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体またはその断片を投与するステップを含む、請求項４３、４５、４７、および４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記抗体または断片が、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合するヒト化抗体またはその断片である、請求項４３から５２および５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体または断片が、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合するヒト抗体またはその断片である、請求項４３から５０および５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体または断片が、キメラ抗体である、請求項４３から５０および５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体または断片が、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその断片である、請求項４３から５０および５４から５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体または断片が、免疫グロブリンである、請求項４３から５０および５４から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ１アイソタイプのものである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記免疫グロブリンが、ＩｇＧ３アイソタイプのものである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗体または断片が、Ｆｃ領域を含み、前記Ｆｃ領域が、ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、またはヒトＩｇＭ  Ｆｃ領域である、請求項４３から５０および５４から５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記抗体または断片が、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗体または断片が、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を媒介する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記抗体または断片が、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体分子、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である、請求項４３から５０および５４から５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープが、配列番号４のアミノ酸１９〜５０内にある、請求項４３から５０および５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープが、配列番号４のアミノ酸１５４〜１６７内にある、請求項４３から５０および５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープが、配列番号４のアミノ酸１〜６０内にある、請求項４３から５２および５６から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープが、配列番号４のアミノ酸２６〜６０内にある、請求項４３から５０および５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープが、配列番号４のアミノ酸１０１〜２００内にある、請求項４３から５０および５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープが、配列番号４のアミノ酸５０〜６０内にある、請求項４３から５０および５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープが、前記がん細胞の形質膜上のＨＤＭ２のＣ末端における末端の６０個のアミノ酸内にある、請求項４３から５０および５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗体または断片が、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、マウス抗ＨＤＭ２抗体ＯＰ１４５と競合する、請求項４３から５０および５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗体または断片が、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、マウス抗ＨＤＭ２抗体９６５（ＳＭＰ１４）と競合する、請求項４３から５０および５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗体または断片が、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、ウサギ抗ＨＤＭ２抗体ｓｃ−８１３（Ｎ−２０）と競合する、請求項４３から５０および５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記抗体または断片が、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、ウサギ抗ＨＤＭ２抗体ｓｃ−８１２（Ｃ−１８）と競合する、請求項４３から５０および５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記抗体または断片が、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、マウス抗ＨＤＭ２抗体Ｍ０１、クローン１Ａ７と競合する、請求項４３から５０および５４から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４が、核局在化シグナルドメインが欠如しているＨＤＭ２バリアント、配列番号４のアミノ酸１７９〜１８５の配列が欠如しているＨＤＭ２バリアント、および／または配列番号４のアミノ酸４６４〜４７１の配列が欠如しているＨＤＭ２バリアントである、請求項４３から５０および５４から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記抗体または断片が、精製されている、請求項４３から５０および５４から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記対象に、抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含み、前記抗体−薬物コンジュゲートが、細胞障害性薬物に結合した、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体またはその断片を含む、請求項４３、４５、４７、および４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記抗体または断片が、細胞障害性薬物に結合していない、請求項５４から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記がんが、転移することが公知の種類のがんである、請求項４３から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記がんが、進行期がんである、請求項４３から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記がんが、転移性がんである、請求項４３から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記がんが、固形がんである、請求項４３から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記がんが、肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵臓がん、黒色腫、乳がん、結腸がん、膀胱がん、星状細胞新生物、膠芽腫、または小児横紋筋肉腫である、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記がんが、膵臓がん、肺がん、または結腸がんである、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記がんが、非固形がんである、請求項４３から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記がんが、白血病またはリンパ腫である、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記抗体または断片が、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または腫瘍内で投与される、請求項４３から９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記対象に、前記抗体もしくは断片または抗体−薬物コンジュゲートとは異なるがん療法を投与することをさらに含む、請求項４３から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記がん療法が、化学療法である、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記化学療法が、ゲムシタビンである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記化学療法が、ｎａｂ−パクリタキセルである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記化学療法が、シスプラチンである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９７】
前記化学療法が、５−ＦＵである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９８】
前記化学療法が、パクリタキセルである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９９】
前記がんが、膵臓がんであり、前記化学療法が、ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルの組合せである、請求項９３に記載の方法。
【請求項１００】
前記ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルが、ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルを抗がん抗体と組み合わせずに投与した場合に使用される用量よりも低い用量で投与される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記対象が、ヒトであり、前記ゲムシタビンが、１，０００ｍｇ／ｍ２に等しいかまたはそれよりも低い用量で投与され、前記ｎａｂ−パクリタキセルが、１２５ｍｇ／ｍ２に等しいかまたはそれよりも低い用量で投与される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
前記対象が、ヒトであり、ゲムシタビンが、５００ｍｇ／ｍ２に等しいかまたはそれよりも低い用量で投与され、前記ｎａｂ−パクリタキセルが、６２．５ｍｇ／ｍ２に等しいかまたはそれよりも低い用量で投与される、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルの組合せが、２週間に１回またはそれよりも低い頻度で投与される、請求項９９から１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記対象が、ヒトである、請求項４３から１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記がん療法が、免疫療法である、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０６】
前記免疫療法が、１つまたは複数の阻害性チェックポイント分子の阻害剤である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記１つまたは複数の阻害性チェックポイント分子が、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＯＸ４０、およびＬＡＧ−３からなる群から選択される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
がんを有する対象を選択および処置する方法であって、
がんを有する対象を識別するステップであって、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片が、前記がんのインタクトな細胞の表面に結合する、ステップと、
前記対象に、（ｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞傷害性成分に結合していない抗体もしくは断片、（ｉｉｉ）請求項１から４０のいずれか一項に記載の抗体もしくは断片、（ｉｖ）請求項４１に記載の抗体−薬物コンジュゲート、または（ｖ）請求項４２に記載の医薬組成物を投与するステップと
を含む、方法。
【請求項１０９】
ステップ（ｂ）の前に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する前記抗体またはその断片が、前記がんのインタクトな細胞の表面に結合するかどうかを判定するステップをさらに含み、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する前記抗体またはその断片が、請求項１から４０のいずれか一項に記載の抗体または断片である、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記判定するステップの前に、前記がんのインタクトな細胞を得るステップをさらに含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
対象におけるがんを診断する方法であって、
（ａ）請求項１から４０のいずれか一項に記載の抗体または断片が、前記対象のインタクトな細胞の表面に結合するかどうかを検出するステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）において結合が検出された場合に、前記対象をがんと診断するステップと
を含む、方法。
【請求項１１２】
ｅｘ  ｖｉｖｏ方法である、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１３】
ステップ（ａ）の前に、前記対象からインタクトな細胞を得るステップをさらに含む、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１４】
ステップ（ａ）における前記検出の前に、前記対象に、前記抗体または断片を投与するステップを含み、前記検出が、前記対象のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングによって行われる、請求項１１１に記載の方法。
【請求項１１５】
ステップ（ａ）において、前記抗体または断片が標識化される、請求項１０８から１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記対象が、ヒトである、請求項１０８から１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記抗体またはその断片が、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１１８】
前記対象に、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片を投与するステップを含む、請求項４３から５０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／５３７，９１４号の利益を主張し、この米国仮特許出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
２．電子的に提出された配列表の参照
本出願は、２０１８年７月２５日に作成された、サイズが８８，２８７バイトの「１４１６０−００６−２２８＿ＳＴ２５」と題されるＡＳＣＩＩテキストファイルとして本出願とともに提出された配列表を参照により組み込む。
【０００３】
３．分野
本発明は、ある特定の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその抗原結合性断片、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその抗原結合性断片を含む医薬組成物、細胞障害性薬物に結合した抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその抗原結合性断片を含む抗体−薬物コンジュゲート、ならびにがんを処置するためおよび／または転移を予防するためのそのような抗体、断片、組成物、およびコンジュゲートの使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
４．背景
ＭＤＭ２（ＭＤＭ２は、ＨＤＭ２のマウスホモログである）タンパク質は、４８９個のアミノ酸から構成され、ｐ５３結合ドメイン、２つの核局在化シグナル（アミノ酸１７６〜１８２および４６４〜４７１）、および亜鉛フィンガーモチーフ（アミノ酸２９７〜３２６および４３６〜４７７）を含有する（ＵｎｉＰｒｏｔウェブサイトのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２３８０４を参照されたい）。そのヒトホモログであるＨＤＭ２は、４９１個のアミノ酸から構成され、ｐ５３結合ドメイン、２つの核局在化シグナル（アミノ酸１７９〜１８５および４６６〜４７３）、ならびに亜鉛フィンガーモチーフ（アミノ酸２９９〜３２８および４３８〜４７９）を含む（ＵｎｉＰｒｏｔウェブサイトのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ００９８７を参照されたい）。マウスタンパク質ＭＤＭ４（ＭＤＭＸとしても識別されている）は、ＭＤＭ２タンパク質のホモログであり（ＵｎｉＰｒｏｔウェブサイトのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ３５６１８を参照されたい）、ＭＤＭ２およびＭＤＭ４のいずれも、ｐ５３の主要な負の制御因子である（Wade  et  al.,  2013,  Nat  Rev.  Cancer  13:83-96、Marine  et  al.,  2004,  Cell  Cycle  3:900-904、Momand  et  al.,  2011,  Gene  486:23-30）。ＨＤＭ４（ＨＤＭＸとしても識別されている）は、ＭＤＭ４のヒトホモログである（ＵｎｉＰｒｏｔウェブサイトのＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ１５１５１を参照されたい）。すべてのＭ（Ｈ）ＤＭ２およびＭ（Ｈ）ＤＭ４タンパク質内で最も保存されているドメインは、ＲＩＮＧドメインであり、これは、ｐ５３タンパク質を含む、その標的タンパク質のユビキチン化ならびにＭ（Ｈ）ＤＭ２およびＭ（Ｈ）ＤＭ４の間のヘテロ二量体化を担う。Ｍ（Ｈ）ＤＭ４は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２により媒介されるｐ５３のポリユビキチン化に必要とされる。Ｍ（Ｈ）ＤＭ２およびＭ（Ｈ）ＤＭ４の明確な特徴は、それらの非常に複雑な発現パターンである。複数のサイズのＭ（Ｈ）ＤＭ２の転写産物およびタンパク質産物が、いくつかのグループによってがん細胞において識別されている（Olson  et  al.,  1993,  Oncogene  8:2353-2360、Bartel  et  al.,  2002,  Cancer  Cell  2:9-15（”Bartel  2002”）、Sigalas  et  al.,  1996,  Nat.  Med.  2:912-917（”Sigalas  1996”）、Iwakuma  &  Lozano,  2003,  Mol.  Cancer  Res.  1:993-1000（”Iwakuma  &  Lozano  2003”））。多くの種類のヒトのがんは、ＭＤＭ２タンパク質を過剰発現し、これらのがんの間で共通している特徴は、関連するｍｄｍ２スプライスバリアントの増加である。これらのＭ（Ｈ）ＤＭ２バリアントは、様々な腫瘍、たとえば、ヒトの卵巣、乳房、および星状細胞の新生物、膠芽腫、白血病、ならびに小児横紋筋肉腫瘍において、発現されることが示されている（Iwakuma  &  Lozano  2003、Rosso  et  al.,  2014,  Subcell  Biochem.  85:247-61（”Rosso  2014”）によって考察されている）。最も興味深いことには、これらは、進行期の腫瘍では、より高頻度であることが見出されている（Bartel  2002）。Ｍ（Ｈ）ＤＭ２  ｍＲＮＡのスプライスバリアント形態であることが示されている複数サイズのＭ（Ｈ）ＤＭ２転写産物は、腫瘍細胞において、正常細胞においてよりも高い頻度で発現されることが報告されている（Bartel  et  al.,  2004,  Mol.  Cancer  Res.  2:29（”Bartel  2004”））。非形質転換細胞には、ｍＲＮＡ監視システムが存在し、スプライス転写産物を分解し、細胞を転写エラー、ｍＲＮＡプロセシング、またはｍＲＮＡ輸送から保護するが、一方で形質転換細胞においては、このシステムは正しく機能していない可能性があることが提示されている（Bartel  2004）。さらに、がん細胞におけるこれらのバリアントのうちの一部は、タンパク質産物をコードするが、これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＮＩＨ３Ｔ３細胞を形質転換させることが示されており、マウスモデルにおいて腫瘍形成を促進したものもあった（Sigalas  1996、Volk  el.  al.,  2009,  Mol  Cancer  Res.  7(6):  863-869）。
【０００５】
現在までに、７０個を上回る異なるＭ（Ｈ）ＤＭ２スプライスバリアントが、識別されている（Bartel  2002、Bartel  2004、Rosso  2014）。これらのバリアントのうちの一部、たとえば、ＭＤＭ２−ＡおよびＭＤＭ２−Ｂは、複数の腫瘍タイプに共通している（Sigalas  1996）。その他は、たとえば、小児横紋筋肉腫におけるＭＤＭ２−ＦＢ２５およびＭＤＭ２−ＦＢ２６など、特定の腫瘍においてのみ見出されている。これらの選択的にスプライシングされたＭＤＭ２転写産物のいくつかの短い形態は、ヒトの卵巣腫瘍、膀胱癌、および星状細胞腫瘍において、高悪性度の悪性腫瘍と相関性がある（Sigalas  1996、Matsumoto  et  al.,  1998,  Cancer  Res.  58:609-613、Tamborini  et  al.,  2001,  Int.  J.  Cancer  92:790-796、Steinman  et  al.,  2004,  JBC  279:4877-4886）。また、異常なｍｄｍ２（２８１、２５４、および２１９ｂｐ）および選択的ｍｄｍ２（６５３ｂｐ）スプライス産物は、乳がんにおいて、より短い全般的な患者生存期間と強く関連していることも、示されている（Lukas  et  al.,  2001,  Cancer  Res.  61:3212）。
【０００６】
いくつかの研究では、可能性のある活性を予測するために、様々なヒトおよびマウスＭ（Ｈ）ＤＭ２タンパク質バリアントの細胞内局在について評価している。非小細胞肺癌の２５％において、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２バリアントは、細胞質に異常に局在していた（Evans  et  al.,  2001,  Oncogene  20:4041-4049）。この結果から、全長Ｍ（Ｈ）ＤＭ２の細胞質区画への隔絶が、選択的にスプライシングされたＭ（Ｈ）ＤＭ２産物（ＨＤＭ２ＡＬＴ１）による結合および隔離に起因していたという発見がもたらされた。別の研究では、ＭＤＭ２−Ｄ１５０−２３０は、Ｕ２０Ｓ細胞の細胞質に局在していた（Schuster  et  al.,  2007,  Mol.  Cancer  Res.  5:403-412（”Schuster  2007”））。これらのＭ（Ｈ）ＤＭ２タンパク質バリアントのいずれも、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含有するＮＨ２末端領域の部分が欠如しており、このシグナルの欠如により、これらの２つのタンパク質の核内進入が防止されたことが示唆された（Schuster  2007）。合わせると、これらのデータは、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２タンパク質バリアントの細胞内局在が、高度に複雑であることを示す。
【０００７】
スプライシングバリアントＭＤＭＸ−Ｓを含む、様々なＭ（Ｈ）ＤＭ４タンパク質バリアントもまた、特徴付けられている（Lenos  and  Jochemsen,  2011,  J.  Biomed  Biotechnol.,  doi:10.1155/2011/876173）。
【０００８】
ＨＤＭ２は、がん細胞の形質膜に発現されることが見出された（Sarafraz-Yazdi  et  al.,  2010,  PNAS  107:1918-1923（”Sarafraz-Yazdi  2010”）。さらに、がん細胞膜に発現されるＨＤＭ２に結合し、壊死を誘導することによってがん細胞を死滅させる、抗がんペプチドＰＮＣ−２７およびＰＮＣ−２８が、開発されている（Sarafraz-Yazdi  2010、Davitt  et  al.,  2014,  Annals  Clin.  Lab.  Sci.  44:241248）（ＰＮＣ−２７およびＰＮＣ−２８のアミノ酸配列は、米国特許出願公開第２０１２／０１７７５６６号の表Ｉに提供されている）。ＰＮＣ−２７は、ＨＤＭ２のアミノ酸２５〜１０９内に結合することが報告されている（Do  et  al.,  2003,  Oncogene  22(10):1431-1444（”Do  2003”）、Chene,  2003,  Nat.  Rev.  Cancer  3(2):102-109）。また、米国特許出願公開第２０１２／０１７７５６６号は、細胞に、ＨＤＭ−２標的化成分と、ＨＤＭ−２標的化成分に結合した細胞傷害性成分とを含む化合物（たとえば、ＰＮＣ−２７およびＰＮＣ−２８）であって、膜活性形態を含む化合物を投与することによって、細胞を選択的に壊死させる方法を開示している。ＰＮＣ−２７およびＰＮＣ−２８ペプチド（膜常在性ペプチド（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｓｉｄｅｎｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ）（「ＭＲＰ」）およびｐ５３配列を含む）の膜活性機能は、細胞傷害性構造を形成することができるように、カーゴ（すなわち、ｐ５３配列成分）がＭＲＰ成分に結合している場合にしか達成されない（Kanovsky  et  al,  2001,  PNAS  98:12438-  12443（”Kanovsky  2001”）、Bowne  et  al.,  2008,  Ann  Surg  Oncol.  15:3588-3600  ”Bowne  2008”））。ＭＲＰ成分またはＨＤＭ−２標的化成分（すなわち、ｐ５３成分）のいずれかを別個に使用した場合、それらは、がん細胞に対して非細胞傷害性であることが見出され（Kanovsky  2001、Do  2003）、ＭＲＰ成分単独およびＨＤＭ−２標的化成分単独での活性の欠如が実証された。細胞内で組換え発現させた場合、ＨＤＭ−２標的化成分は、アポトーシスを引き起こすことが観察された（Bowne  2008）。米国特許第９，７６５，１１７号は、ＨＤＭ２標的化ペプチド、およびＨＤＭ２標的化ペプチドと膜貫通配列、たとえば、ＭＲＰとを含む融合ペプチドを開示しており、ＭＲＰが、細胞壊死の誘導に必要とされることが開示されている（第４段、２７〜２８行目を参照されたい）。米国特許第９，７６５，１１７号は、がん細胞において、ＭＲＰの非存在下でのｐ５３  ＨＤＭ２標的化配列の発現が、ｐ５３依存性アポトーシスを引き起こすが、腫瘍壊死は引き起こさないことを示している（第４段、２９〜３２行目を参照されたい）。
細胞透過性ペプチド（「ＣＰＰ」）（たとえば、ＭＲＰ、アンテナペディアの膜伝達ドメイン、トランス活性型転写活性化因子（「ＴＡＴ」）、およびペネトラチンペプチド）は、ペプチドおよびペプチドに結合した分子の、正常な健常細胞のものを含め、形質膜脂質二重層への細胞膜送達を可能にする。これらのペプチドは、生きた細胞の内部に、様々な生物学的に活性な分子を効率的に輸送することが示されている（Bechara  et  al.,  2013,  FEBS  Lett.  587:1693-1702、Dupont  et  al.,  2015,  Methods  Mol.  Biol.  1324:29-37）。様々なカーゴ（たとえば、他のペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、小分子、抗体、またはその断片）に連結したこれらＣＰＰ（たとえば、ＭＲＰ、アンテナペディアの膜伝達ドメイン、ＴＡＴ、およびペネトラチンペプチド）の使用は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、これらのカーゴの薬物動態、生体分布、保持時間、取込み、および様々な腫瘍への送達を改善することが実証されている（Torchilin  et  al.,  2003,  PNAS  100:1972-1977、Shin  et  al.,  2014,  J.  Biomed.  Mater  Res.  A.  102:575-587、Kleemann  et  al.,  2005,  J.  Control  Release  109:299-316、Olson  et  al.,  2009,  Integr.  Biol  (Camb)  1:382-393、Jain  et  al.,  2005,  Cancer  Res.  65:7840-7846、William  et  al.,  2002,  PNAS  99:10423-10428、Bolhassani,  2011,  Biochim  Biophys.  Acta  1816:232-246）。これらのＣＰＰの大半は、カーゴ送達エンティティとして使用されるが、ペネトラチンおよびＭＲＰペプチドは、それらがカーゴに連結されると、固有の細胞傷害性膜活性構造を形成することが報告されている（Rosal  et  al.,  2005,  Adv  Drug  Deliv  Rev  57:653-60（”Rosal  2005”）、Bowne  2008、Kanovsky  2001）。ＰＮＣ−２７およびＰＮＣ−２８ペプチドは、カーゴのＭＲＰへの結合および連結に依存する細胞傷害性機能を呈するペネトラチン−／ＭＲＰ−カーゴコンジュゲートの例であり、これが、それらの膜活性構造の形成、したがって細胞傷害性機能に必要である（Kanovsky  2001、Rosal  2005、Bowne  2008）。
当該技術分野において、がん、たとえば、転移性がんを効果的に処置し、患者における転移を予防することに対して、長年にわたり対処されていない必要性が存在する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許出願公開第２０１２／０１７７５６６号明細書
【特許文献２】米国特許第９，７６５，１１７号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Wade  et  al.,  2013,  Nat  Rev.  Cancer  13:83-96
【非特許文献２】Marine  et  al.,  2004,  Cell  Cycle  3:900-904
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【非特許文献３１】William  et  al.,  2002,  PNAS  99:10423-10428
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【非特許文献３３】Rosal  et  al.,  2005,  Adv  Drug  Deliv  Rev  57:653-60
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
５．発明の要旨
一態様では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片が、本明細書に記載される。具体的には、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍成長を阻害する（またはｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞の増殖を阻害する）抗体またはその断片が、本明細書に記載される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片は、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片は、細胞傷害性成分に結合していない（すなわち、細胞障害性薬剤に結合していない）。
【００１２】
一態様では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）、またはＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）からなる、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。具体的には、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合する抗体または断片であって、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）、またはＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）からなる、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。一実施形態では、抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに結合し、ここで、抗体または断片が、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列は、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）である。一実施形態では、抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに結合し、ここで、抗体または断片が、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）である。一実施形態では、抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに結合し、ここで、抗体または断片は、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、ＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）である。ある特定の実施形態では、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のペプチド内に含有されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片が、本明細書に記載される。一実施形態では、配列番号１のペプチド内に含有されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片が、本明細書に記載される。一実施形態では、配列番号２のペプチド内に含有されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片が、本明細書に記載される。一実施形態では、配列番号３のペプチド内に含有されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００１３】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片であって、（ｉ）ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）であって、前記ＶＨ  ＣＤＲ  １、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３が、配列番号３６、配列番号３８、および配列番号４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲである、重鎖可変領域（ＶＨ）、または（ｉｉ）配列番号３７、配列番号３９、および配列番号４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲであるＶＬ  ＣＤＲ  １、ＶＬ  ＣＤＲ  ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ヒト化抗体またはその断片が、本明細書に記載される。一実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合するヒト化抗体または断片は、ＶＨを含み、ＶＨ  ＣＤＲ  １、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＨのものである。一実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合するヒト化抗体または断片は、ＶＨを含み、ＶＨ  ＣＤＲ  １、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨのものである。一実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合するヒト化抗体または断片は、ＶＨを含み、ＶＨ  ＣＤＲ  １、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３は、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨのものである。一実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合するヒト化抗体または断片は、ＶＬを含み、ＶＬ  ＣＤＲ  １、ＶＬ  ＣＤＲ  ２、およびＶＬ  ＣＤＲ  ３は、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬのものである（また、必要に応じて、ＶＨ  ＣＤＲ  １、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３は、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＨのものであるＶＨ）。一実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合するヒト化抗体または断片は、ＶＬを含み、ＶＬ  ＣＤＲ  １、ＶＬ  ＣＤＲ  ２、およびＶＬ  ＣＤＲ  ３は、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＬのものである（また、必要に応じて、ＶＨ  ＣＤＲ  １、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３は、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨのものであるＶＨ）。一実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合するヒト化抗体または断片は、ＶＬを含み、ＶＬ  ＣＤＲ  １、ＶＬ  ＣＤＲ  ２、およびＶＬ  ＣＤＲ  ３は、配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬのものである（また、必要に応じて、ＶＨ  ＣＤＲ  １、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３は、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨのものであるＶＨ）。
【００１４】
一態様では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４に特異的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片が、ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、
（ｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＨＹ（配列番号１８）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＮＫＡＫＧＹＴ（配列番号１９）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＤＩＧＤＮ（配列番号２０）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＨＹＹＭＳ（配列番号４２）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＦＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡＥ（配列番号４５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＤＩＧＤＮ（配列番号２０）を有する、
（ｉｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＨＹＹＭＳ（配列番号４３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＦＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡＥＹＳＡＳＶＫＧ（配列番号４６）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＤＩＧＤＮ（配列番号２０）を有する、
（ｉｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＴＨＹＹＭＳ（配列番号４４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＷＬＧＦＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡＥ（配列番号４７）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＤＩＧＤ（配列番号４８）を有する、または
（ｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＦＴＦＴＨＹＹ（配列番号１４４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡ（配列番号１４５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＤＩＧＤＮ（配列番号１４６）を有する、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００１５】
一態様では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（例えば、ＨＤＭ２）に特異的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片が、ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、
（ｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＤＴＬＳＧＳ（配列番号２４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＨＬＮＲＧＴ（配列番号２５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＰＧＦＡＹ（配列番号２６）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＤＴＬＳＧＳＷＭＨ（配列番号５２）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＥＩＨＬＮＲＧＴＴＮ（配列番号５５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＰＧＦＡＹ（配列番号２６）を有する、
（ｉｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＳＷＭＨ（配列番号５３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＥＩＨＬＮＲＧＴＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５６）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＰＧＦＡＹ（配列番号２６）を有する、
（ｉｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＳＧＳＷＭＨ（配列番号５４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＨＬＮＲＧＴＴＮ（配列番号５７）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＳＰＧＦＡ（配列番号５８）を有する、または
（ｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＤＴＬＳＧＳＷ（配列番号１４８）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＩＨＬＮＲＧＴＴ（配列番号１４３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＳＰＧＦＡ（配列番号５８）を有する、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００１６】
一態様では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（例えば、ＨＤＭ２）に特異的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片が、ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、
（ｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＹ（配列番号３０）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＮＰＲＮＧＧ（配列番号３１）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、ＳＧＹＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＹＹＭＹ（配列番号６２）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＧＩＮＰＲＮＧＧＴＮ（配列番号６５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＧＹＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を有する、
（ｉｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＳＹＹＭＹ（配列番号６３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＧＩＮＰＲＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮ（配列番号６６）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＧＹＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を有する、または
（ｉｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＴＳＹＹＭＹ（配列番号６４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＷＩＧＧＩＮＰＲＮＧＧＴＮ（配列番号６７）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＴＲＳＧＹＹＡＭＤ（配列番号６８）を有する、抗体またはその断片が、本明細書に提供される。
【００１７】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片が、ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、
（ｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＨＹ（配列番号１８）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＮＫＡＫＧＹＴ（配列番号１９）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＤＩＧＤＮ（配列番号２０）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＨＹＹＭＳ（配列番号４２）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＦＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡＥ（配列番号４５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＤＩＧＤＮ（配列番号２０）を有する、
（ｉｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＨＹＹＭＳ（配列番号４３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＦＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡＥＹＳＡＳＶＫＧ（配列番号４６）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＤＩＧＤＮ（配列番号２０）を有する、
（ｉｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＴＨＹＹＭＳ（配列番号４４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＷＬＧＦＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡＥ（配列番号４７）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＤＩＧＤ（配列番号４８）を有する、または
（ｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＦＴＦＴＨＹＹ（配列番号１４４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡ（配列番号１４５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＤＩＧＤＮ（配列番号１４６）を有する、ヒト化抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００１８】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片であって、ＶＨを含み、ＶＨが、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含み、
（ｉ）ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＤＩＧＤＮ（配列番号２０）を有する、
（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＤＩＧＤ（配列番号４８）を有する、または
（ｉｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＤＩＧＤＮ（配列番号１４６）を有する、ヒト化抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００１９】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片であって、前記抗体または断片が、ＶＬ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＬ  ＣＤＲ  ２、およびＶＬ  ＣＤＲ  ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
（ｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＲＳＳＫＮＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号２１）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＶＳＮＬＡＳ（配列番号２２）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＱＬＬＥＬＰＹＴ（配列番号２３）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹ（配列番号４９）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＬＬＩＳＲＶＳＮＬＡ（配列番号５０）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＱＬＬＥＬＰＹ（配列番号５１）を有する、または
（ｉｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＫＮＬＬＨＳＮＧＩＴＹ（配列番号１４７）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＶＳを有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＱＬＬＥＬＰＹＴ（配列番号２３）を有する、抗体または断片が、本明細書に記載される。
【００２０】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合するヒト化抗体またはその断片であって、前記抗体または断片は、
（ａ）ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）であって、
（ｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＨＹ（配列番号１８）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＮＫＡＫＧＹＴ（配列番号１９）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＤＩＧＤＮ（配列番号２０）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＦＴＦＴＨＹＹＭＳ（配列番号４２）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＦＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡＥ（配列番号４５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＤＩＧＤＮ（配列番号２０）を有する、
（ｉｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＨＹＹＭＳ（配列番号４３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＦＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡＥＹＳＡＳＶＫＧ（配列番号４６）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＤＩＧＤＮ（配列番号２０）を有する、
（ｉｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＴＨＹＹＭＳ（配列番号４４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＷＬＧＦＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡＥ（配列番号４７）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＤＩＧＤ（配列番号４８）を有する、または
（ｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＦＴＦＴＨＹＹ（配列番号１４４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＩＲＮＫＡＫＧＹＴＡ（配列番号１４５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＤＩＧＤＮ（配列番号１４６）を有する、
重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
（ｂ）ＶＬ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＬ  ＣＤＲ  ２、およびＶＬ  ＣＤＲ  ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
（ｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＲＳＳＫＮＬＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹ（配列番号２１）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＶＳＮＬＡＳ（配列番号２２）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＱＬＬＥＬＰＹＴ（配列番号２３）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＬＨＳＮＧＩＴＹＬＹＷＹ（配列番号４９）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＬＬＩＳＲＶＳＮＬＡ（配列番号５０）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＱＬＬＥＬＰＹ（配列番号５１）を有する、または
（ｉｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＫＮＬＬＨＳＮＧＩＴＹ（配列番号１４７）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＶＳを有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＱＬＬＥＬＰＹＴ（配列番号２３）を有する、
軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、抗体または断片が、本明細書に記載される。
【００２１】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片が、ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、
（ｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＤＴＬＳＧＳ（配列番号２４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＨＬＮＲＧＴ（配列番号２５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＰＧＦＡＹ（配列番号２６）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＤＴＬＳＧＳＷＭＨ（配列番号５２）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＥＩＨＬＮＲＧＴＴＮ（配列番号５５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＰＧＦＡＹ（配列番号２６）を有する、
（ｉｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＳＷＭＨ（配列番号５３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＥＩＨＬＮＲＧＴＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５６）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＰＧＦＡＹ（配列番号２６）を有する、
（ｉｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＳＧＳＷＭＨ（配列番号５４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＨＬＮＲＧＴＴＮ（配列番号５７）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＳＰＧＦＡ（配列番号５８）を有する、または
（ｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＤＴＬＳＧＳＷ（配列番号１４８）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＩＨＬＮＲＧＴＴ（配列番号１４３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＳＰＧＦＡ（配列番号５８）を有する、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００２２】
一態様では、ＶＨを含み、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、ＶＨが、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含み、
（ｉ）ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＰＧＦＡＹ（配列番号２６）を有する、または
（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＳＰＧＦＡ（配列番号５８）を有する、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００２３】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片が、前記抗体または断片が、ＶＬ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＬ  ＣＤＲ  ２、およびＶＬ  ＣＤＲ  ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
（ｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮＳＹＬＹ（配列番号２７）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＭＳＮＬＡＳ（配列番号２８）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＭＱＨＬＥＹＰＦＴ（配列番号２９）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＬＨＳＮＧＮＳＹＬＹＷＦ（配列番号５９）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡ（配列番号６０）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＭＱＨＬＥＹＰＦ（配列番号６１）を有する、または
（ｉｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＫＳＬＬＨＳＮＧＮＳＹ（配列番号１４１）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＭＳを有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＭＱＨＬＥＹＰＦＴ（配列番号２９）を有する、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００２４】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片が、
（ａ）ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）であって、
（ｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＤＴＬＳＧＳ（配列番号２４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＨＬＮＲＧＴ（配列番号２５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＰＧＦＡＹ（配列番号２６）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＤＴＬＳＧＳＷＭＨ（配列番号５２）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＥＩＨＬＮＲＧＴＴＮ（配列番号５５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＰＧＦＡＹ（配列番号２６）を有する、
（ｉｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＳＷＭＨ（配列番号５３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＥＩＨＬＮＲＧＴＴＮＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号５６）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＰＧＦＡＹ（配列番号２６）を有する、
（ｉｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＳＧＳＷＭＨ（配列番号５４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＷＩＧＥＩＨＬＮＲＧＴＴＮ（配列番号５７）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＳＰＧＦＡ（配列番号５８）を有する、または
（ｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＤＴＬＳＧＳＷ（配列番号１４８）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＩＨＬＮＲＧＴＴ（配列番号１４３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＡＲＳＰＧＦＡ（配列番号５８）を有する、重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
（ｂ）ＶＬ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＬ  ＣＤＲ  ２、およびＶＬ  ＣＤＲ  ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
（ｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＮＧＮＳＹＬＹ（配列番号２７）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＭＳＮＬＡＳ（配列番号２８）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＭＱＨＬＥＹＰＦＴ（配列番号２９）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＬＨＳＮＧＮＳＹＬＹＷＦ（配列番号５９）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＬＬＩＹＲＭＳＮＬＡ（配列番号６０）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＭＱＨＬＥＹＰＦ（配列番号６１）を有する、または
（ｉｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＫＳＬＬＨＳＮＧＮＳＹ（配列番号１４１）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＲＭＳを有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＭＱＨＬＥＹＰＦＴ（配列番号２９）を有する、
軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００２５】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片が、ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、
（ｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＹ（配列番号３０）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＮＰＲＮＧＧ（配列番号３１）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、ＳＧＹＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＹＹＭＹ（配列番号６２）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＧＩＮＰＲＮＧＧＴＮ（配列番号６５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＧＹＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を有する、
（ｉｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＳＹＹＭＹ（配列番号６３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＧＩＮＰＲＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮ（配列番号６６）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＧＹＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を有する、または
（ｉｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＴＳＹＹＭＹ（配列番号６４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＷＩＧＧＩＮＰＲＮＧＧＴＮ（配列番号６７）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＴＲＳＧＹＹＡＭＤ（配列番号６８）を有する、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００２６】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、ＶＨを含み、ＶＨが、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含み、
（ｉ）ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＧＹＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を有する、または
（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＴＲＳＧＹＹＡＭＤ（配列番号６８）を有する、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００２７】
一態様では、ＶＬ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＬ  ＣＤＲ  ２、およびＶＬ  ＣＤＲ  ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
（ｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＩＳＮＦＬＮ（配列番号３３）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号３４）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＱＱＧＮＴＬＰＲＴ（配列番号３５）を有する、または
（ｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＳＮＦＬＮＷＹ（配列番号６９）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨ（配列番号７０）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＱＱＧＮＴＬＰＲ（配列番号７１）を有する、
軽鎖可変領域（ＶＬ）をさらに含む、抗体または断片が、本明細書に記載される。
【００２８】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、前記抗体またはその断片が、
（ａ）ＶＨ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＨ  ＣＤＲ  ２、およびＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）であって、
（ｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＹ（配列番号３０）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＮＰＲＮＧＧ（配列番号３１）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、ＳＧＹＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を有する、
（ｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＧＹＴＦＴＳＹＹＭＹ（配列番号６２）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＧＩＮＰＲＮＧＧＴＮ（配列番号６５）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＧＹＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を有する、
（ｉｉｉ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＳＹＹＭＹ（配列番号６３）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＧＩＮＰＲＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦＫＮ（配列番号６６）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＳＧＹＹＡＭＤＹ（配列番号３２）を有する、または
（ｉｖ）前記ＶＨ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＴＳＹＹＭＹ（配列番号６４）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＷＩＧＧＩＮＰＲＮＧＧＴＮ（配列番号６７）を有し、前記ＶＨ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＴＲＳＧＹＹＡＭＤ（配列番号６８）を有する、
重鎖可変領域（ＶＨ）；ならびに
（ｂ）ＶＬ相補性決定領域（「ＣＤＲ」）１、ＶＬ  ＣＤＲ  ２、およびＶＬ  ＣＤＲ  ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
（ｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＲＡＳＱＤＩＳＮＦＬＮ（配列番号３３）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号３４）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＱＱＧＮＴＬＰＲＴ（配列番号３５）を有する、または
（ｉｉ）前記ＶＬ  ＣＤＲ  １が、アミノ酸配列ＳＮＦＬＮＷＹ（配列番号６９）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ２が、アミノ酸配列ＬＬＩＹＹＴＳＲＬＨ（配列番号７０）を有し、前記ＶＬ  ＣＤＲ  ３が、アミノ酸配列ＱＱＧＮＴＬＰＲ（配列番号７１）を有する、
軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００２９】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＨ、または配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨを含む、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００３０】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ、または配列番号３７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬを含む（また、必要に応じて、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＨ、または配列番号３６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨを含む）、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００３１】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨ、または配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨを含む、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００３２】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＬ、または配列番号３９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬを含む（また、必要に応じて、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨ、または配列番号３８のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨを含む）、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００３３】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨ、または配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨを含む、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００３４】
一態様では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬ、または配列番号４１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＬを含む（また、必要に応じて、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨ、または配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％の配列同一性を有するＶＨを含む）、抗体またはその断片が、本明細書に記載される。
【００３５】
好ましい実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、モノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体（たとえば、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、またはキメラモノクローナル抗体）である。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、ヒト抗体である。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、ヒト化抗体である。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、キメラ抗体である。
【００３６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、精製された抗体である。
【００３７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、免疫グロブリン（たとえば、ＩｇＧまたはＩｇＭ）である。一実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧである。一実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＭである。ある特定の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。他の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ３アイソタイプのものである。他の実施形態では、免疫グロブリンは、ＩｇＧ２アイソタイプのものである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、Ｆｃ領域を含み、ここで、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域またはヒトＩｇＭ  Ｆｃ領域である。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域、またはヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域である、Ｆｃ領域を含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域を含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域を含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、ヒトＩｇＭ  Ｆｃ領域を含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、ヒトＩｇＥ  Ｆｃ領域を含む。
【００３８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体の抗原結合性断片である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、一本鎖抗体分子、または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。一実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片は、Ｆｖ断片である。一実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片は、Ｆａｂ断片である。一実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片は、Ｆａｂ’断片である。一実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片である。一実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片は、一本鎖抗体分子である。一実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。
【００３９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または抗原結合性断片は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する。一実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または抗原結合性断片は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を媒介する。
【００４０】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、エフェクター細胞（たとえば、Ｔ細胞、Ｂリンパ球、好中球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、または樹状細胞）の細胞表面抗原にも特異的に結合する、二重特異性抗体である。
【００４１】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、Ｍ（Ｈ）ＤＭ４（たとえば、ＨＤＭ４）には結合しない。別の実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２（たとえば、ＨＤＭ２）およびＭ（Ｈ）ＤＭ４（たとえば、ＨＤＭ４）の両方の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。一実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片は、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、必要に応じて、ＭＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープにも結合し得る。
【００４２】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体または断片は、配列番号１のアミノ酸（ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸１〜１５である）内で、ＨＤＭ２に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体は、配列番号２のアミノ酸（ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸１５〜２５である）内で、ＨＤＭ２に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体は、配列番号３のアミノ酸（ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸４７５〜４９１である）内で、ＨＤＭ２に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体は、配列番号４のアミノ酸１９〜５０内に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体は、配列番号４のアミノ酸１５４〜１６７内に特異的に結合する。さらに別の特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体は、配列番号４のアミノ酸１〜６０内に特異的に結合する。さらに別の特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体は、配列番号４のアミノ酸１〜１００内に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体は、配列番号４のアミノ酸１００〜１１０内に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体は、配列番号４のアミノ酸５０〜６０内に特異的に結合する。さらに別の特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体は、配列番号４のアミノ酸１〜１０９内に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体は、配列番号４のアミノ酸２６〜６０内に特異的に結合する。１つの特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体は、がん細胞の形質膜上のＨＤＭ２のＣ末端における末端の６０個のアミノ酸内に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体は、がん細胞の形質膜上のＨＤＭ２のＣ末端における末端の１００個のアミノ酸内に特異的に結合する。
【００４３】
一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、配列番号４のアミノ酸１０１〜２００内に結合しない。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、「ＭＤＭ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン１Ａ７」（Ａｂｎｏｖａカタログ番号Ｈ００００４１９３−Ｍ０１）が結合するＨＤＭ２またはＭＤＭ２のエピトープには結合しない。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、ＨＤＭ２への結合について、「ＭＤＭ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン１Ａ７」（Ａｂｎｏｖａカタログ番号Ｈ００００４１９３−Ｍ０１）と競合しない。
【００４４】
別の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、配列番号４のアミノ酸１０１〜２００内に結合する。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、「ＭＤＭ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン１Ａ７」（Ａｂｎｏｖａカタログ番号Ｈ００００４１９３−Ｍ０１）が結合するＨＤＭ２またはＭＤＭ２のエピトープに結合する。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、ＨＤＭ２への結合について、「ＭＤＭ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン１Ａ７」（Ａｂｎｏｖａカタログ番号Ｈ００００４１９３−Ｍ０１）と競合する。
【００４５】
一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、配列番号４のアミノ酸１５３〜２２２内に結合しない。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、配列番号４のアミノ酸２６〜１６９内に結合しない。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、配列番号４のアミノ酸２６〜２２２内に結合しない。
【００４６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片によって標的とされるがん細胞の表面上に露出しているＭ（Ｈ）ＤＭ２／４は、１つまたは複数の核局在化シグナルドメインが欠如しているＭ（Ｈ）ＤＭ２／４バリアントである。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片によって標的とされるがん細胞の表面上に露出しているＨＤＭ２は、配列番号４のアミノ酸１７９〜１８５の配列および／または配列番号４のアミノ酸４６４〜４７１の配列が欠如しているＨＤＭ２バリアントである。一実施形態では、本明細書に記載される抗体または断片によって標的とされるがん細胞の表面上に露出しているＨＤＭ２は、配列番号４のアミノ酸１８１〜１８５の配列が欠如しているＨＤＭ２バリアントである。
【００４７】
一態様では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体またはその断片と競合する抗体またはその断片が、本明細書において提供される。好ましくは、結合について競合するそのような抗体または断片は、モノクローナル抗体またはその断片である。
【００４８】
一態様では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む抗体、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体、ならびに（ｉｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含む抗体からなる群から選択されるマウス抗ＨＤＭ２免疫グロブリン（好ましくは、ＩｇＧ）抗体と競合する抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【００４９】
一態様では、（ｉ）配列番号１の配列のペプチドへの結合について、配列番号３６のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）および配列番号３７のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むマウス抗ＨＤＭ２  ＩｇＧ１抗体と競合するか、または（ｉｉ）配列番号２のペプチドへの結合について、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＬを含むマウス抗ＨＤＭ２  ＩｇＧ３抗体と競合するか、または（ｉｉｉ）配列番号３のペプチドへの結合について、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬを含むマウスＩｇＭ抗体と競合する、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【００５０】
一態様では、本明細書に記載される任意の抗体または断片を含む、抗体−薬物コンジュゲート（たとえば、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片が、細胞障害性薬物に共有結合により結合された、抗体−薬物コンジュゲート）が、本明細書において提供される。
【００５１】
一態様では、治療有効量の本明細書に記載される任意の抗体または断片を含む、医薬組成物が、本明細書において提供される。
【００５２】
一態様では、それを必要とする対象においてがんを処置するための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体、（ｉｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、それを必要とする対象においてがんを処置するための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞傷害性成分に結合していない抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、それを必要とする対象においてがんを処置するための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗ＨＤＭ２抗体または断片、（ｉｉ）ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、本方法は、対象に、細胞障害性薬物に結合した、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体またはその断片を含む、抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む。一実施形態では、それを必要とする対象においてがんを処置するための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片であって、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）、またはＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）からなる断片またはその抗体を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、それを必要とする対象においてがんを処置するための方法であって、対象に、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のペプチド内に含有されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００５３】
一態様では、それを必要とする対象において腫瘍成長を阻害するための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片、（ｉｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、それを必要とする対象において腫瘍成長を阻害するための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞傷害性成分に結合していない抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、それを必要とする対象において腫瘍成長を阻害するための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗ＨＤＭ２抗体または断片、（ｉｉ）ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、本方法は、対象に、細胞障害性薬物に結合した、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体またはその断片を含む、抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む。一実施形態では、それを必要とする対象において腫瘍成長を阻害するための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片であって、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）、またはＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）からなる断片またはその抗体を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、それを必要とする対象において腫瘍成長を阻害するための方法であって、対象に、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のペプチド内に含有されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００５４】
一態様では、それを必要とする対象において腫瘍の進行を阻害するための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片、（ｉｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、それを必要とする対象において腫瘍の進行を阻害するための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞傷害性成分に結合していない抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、それを必要とする対象において腫瘍の進行を阻害するための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗ＨＤＭ２抗体または断片、（ｉｉ）ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、本方法は、対象に、細胞障害性薬物に結合した、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体またはその断片を含む、抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む。一実施形態では、それを必要とする対象において腫瘍の進行を阻害するための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片であって、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）、またはＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）からなる断片またはその抗体を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、それを必要とする対象において腫瘍の進行を阻害するための方法であって、対象に、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のペプチド内に含有されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００５５】
一態様では、それを必要とする対象（たとえば、がんから寛解状態にある対象）においてがんの再発生または再発を予防するための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片、（ｉｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、それを必要とする対象（たとえば、がんから寛解状態にある対象）においてがんの再発生または再発を予防するための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞傷害性成分に結合していない抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、それを必要とする対象（たとえば、がんから寛解状態にある対象）においてがんの再発生または再発を予防するための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗ＨＤＭ２抗体または断片、（ｉｉ）ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、本方法は、対象に、細胞障害性薬物に結合した、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体またはその断片を含む、抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む。一実施形態では、それを必要とする対象（たとえば、がんから寛解状態にある対象）においてがんの再発生または再発を予防するための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片であって、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）、またはＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）からなる抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、それを必要とする対象（たとえば、がんから寛解状態にある対象）においてがんの再発生または再発を予防するための方法であって、対象に、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のペプチド内に含有されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００５６】
一態様では、がんを有する対象における生存を（たとえば、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片で処置していない対象と比べて）、増加させるための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片、（ｉｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、がんを有する対象における生存を（たとえば、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片で処置していない対象と比べて）、増加させるための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞傷害性成分に結合していない、抗体またはその断片を投与するステップを含む方法が、本明細書において提供される。一態様では、がんの対象における生存を（たとえば、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片で処置していない対象と比べて）、増加させるための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗ＨＤＭ２抗体または断片、（ｉｉ）ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、本方法は、対象に、細胞障害性薬物に結合した、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体またはその断片を含む、抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む。一実施形態では、がんを有する対象における生存を（たとえば、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片で処置していない対象と比べて）、増加させるための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片であって、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）、またはＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）からなる抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、がんを有する対象における生存を（たとえば、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片で処置していない対象と比べて）、増加させるための方法であって、対象に、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のペプチド内に含有されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００５７】
一態様では、がんを有する対象において転移を予防するための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片、（ｉｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、それを必要とする対象において転移を予防するための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞傷害性成分に結合していない抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、がんを有する対象において転移を予防するための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗ＨＤＭ２抗体または断片、（ｉｉ）ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、本方法は、対象に、細胞障害性薬物に結合した、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体またはその断片を含む、抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む。一実施形態では、がんを有する対象において転移を予防するための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片であって、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）、またはＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）からなる抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、がんを有する対象において転移を予防するための方法であって、対象に、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のペプチド内に含有されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００５８】
一態様では、転移性がんを有する対象において転移を阻害する（たとえば、転移の数、サイズ、または侵襲性を低減する）ための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片、（ｉｉ）露出しているＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、それを必要とする対象において転移を阻害するための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞傷害性成分に結合していない抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、転移性がんを有する対象において転移を阻害する（たとえば、転移の数、サイズ、または侵襲性を低減する）ための方法であって、対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意の抗ＨＤＭ２抗体または断片、（ｉｉ）ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくはその断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｉｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、本方法は、対象に、細胞障害性薬物に結合した、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体またはその断片を含む、抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む。一実施形態では、転移性がんを有する対象において転移を阻害する（たとえば、転移の数、サイズ、または侵襲性を低減する）ための方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片であって、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）、またはＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）からなる抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、転移性がんを有する対象において転移を阻害する（たとえば、転移の数、サイズ、または侵襲性を低減する）ための方法であって、対象に、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のペプチド内に含有されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００５９】
一態様では、がんを有する対象（たとえば、ヒト）を選択および処置する方法であって、（ａ）がんを有する対象を識別するステップであって、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片（たとえば、標識化抗体または断片）が、がんのインタクトな細胞の表面に結合する、ステップと、（ｂ）対象に、（ｉ）本明細書に記載される任意のＭ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体もしくは断片、または前記抗体もしくは断片（たとえば、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体もしくはその断片であって、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、配列番号１、配列番号２、もしくは配列番号３からなる、抗体もしくはその断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体もしくはその断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体もしくは断片、または細胞障害性薬物に結合した抗体もしくは断片（すなわち、細胞透過性ペプチドに結合していない前記抗体もしくは断片）を含む抗体−薬物コンジュゲート、（ｉｉｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞傷害性成分に結合していない、抗体またはその断片、（ｉｖ）本明細書に記載される任意の医薬組成物、あるいは（ｖ）本明細書に記載される任意の抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。ステップ（ｂ）における抗体またはその断片は、ステップ（ａ）における抗体またはその断片と同じであっても異なってもよい。ある特定の実施形態では、ステップ（ｂ）の前に、抗体または断片が、がんのインタクトな細胞の表面に結合するかどうかを（たとえば、ＦＡＣＳまたは細胞に基づくＥＬＩＳＡ分析を使用して）判定するステップ（本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体を使用する）をさらに含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、判定するステップの前に、がんのインタクトな細胞を（たとえば、対象におけるがん性腫瘍の生検によって、または循環がん細胞を有する血液試料を対象から得ることによって）得るステップをさらに含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、本方法は、対象に、細胞障害性薬物に結合した、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片であって、細胞透過性ペプチドに結合していない抗体またはその断片を含む、抗体−薬物コンジュゲートを投与するステップを含む。
【００６０】
一態様では、処置のための対象（たとえば、ヒト）の選択および対象におけるがんを処置するための方法であって、（ａ）処置のためのがんを有する対象を、（ｉ）インタクトながん細胞を（たとえば、対象におけるがん性腫瘍の生検によって、または循環がん細胞を有する血液試料を対象から得ることによって）対象から得ること、および（ｉｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４に特異的に結合する抗体またはその断片（たとえば、標識化抗体または断片）（たとえば、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体または断片、たとえば、本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片）が、対象から得られたインタクトながん細胞の表面に結合するかどうかを（たとえば、ＦＡＣＳまたは細胞に基づくＥＬＩＳＡ分析を使用して）判定することによって、選択するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において結合が検出された場合に、対象に、細胞透過性ペプチドに結合していない、前記抗体または断片を投与するステップとを含む、方法が、本明細書において提供される。一態様では、処置のための対象の選択および対象におけるがんの処置のための方法であって、（ａ）処置のためのがんを有する対象を、（ｉ）インタクトながん細胞を（たとえば、対象におけるがん性腫瘍の生検によって、または循環がん細胞を有する血液試料を対象から得ることによって）対象から得ること、および（ｉｉ）ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片（たとえば、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体または断片、たとえば、本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片）が、対象から得られたインタクトながん細胞の表面に結合するかどうかを（たとえば、ＦＡＣＳまたは細胞に基づくＥＬＩＳＡ分析を使用して）判定することによって、選択するステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において結合が検出された場合に、対象に、細胞透過性ペプチドに結合していない、前記抗体または断片を投与するステップとを含む、方法が、本明細書において提供される。
【００６１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、転移することが公知の種類のがんである。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、進行期がんである。他の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、初期がんである。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、転移性がんである。処置されるがんは、固形がんであっても非固形がん（たとえば、白血病）であってもよい。
【００６２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵臓がん、黒色腫（たとえば、ぶどう膜黒色腫）、乳がん、結腸直腸がん（たとえば、結腸がん）、膀胱がん、星状細胞新生物、膠芽腫、小児横紋筋肉腫、または肺がん（たとえば、非小細胞肺癌）である。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、黒色腫、膵臓がん、乳がん、または卵巣がんである。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、肺がんである。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、結腸直腸がんである。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、結腸がんである。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、黒色腫である。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、膵臓がんである。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、乳がんである。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、卵巣がんである。
【００６３】
本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、ヒトまたは非ヒト動物（たとえば、哺乳動物）であり得る。好ましい実施形態では、対象は、ヒトである。
【００６４】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、または腫瘍内に投与される。他の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、経口で投与される。
【００６５】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象には、前記抗体もしくは断片または抗体−薬物コンジュゲートとは異なる追加の抗がん療法（たとえば、ワクチン、標的化療法、化学療法、放射線療法、外科手術、または免疫療法）がさらに投与される。一実施形態では、追加の治療法は、ワクチンである。一実施形態では、追加の治療法は、標的化療法である。一実施形態では、追加の治療法は、化学療法（たとえば、ゲムシタビン、パクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル、またはゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルの組合せ）である。一実施形態では、追加の治療法は、免疫療法である。一実施形態では、追加の治療法は、放射線療法である。一実施形態では、追加の治療法は、外科手術（たとえば、処置されているがん性腫瘍の一部またはすべてを除去するための）である。特定の実施形態では、追加の治療法は、１つまたは複数のチェックポイント阻害性分子の機能の阻害剤（たとえば、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＯＸ４０、およびＬＡＧ−３のうちの１つまたは複数に対する阻害剤、たとえば、阻害性抗体）である。ある特定の実施形態では、追加の治療法は、細胞周期阻害剤ではない。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して処置される対象は、前記抗体または断片での処置の過程の間に、細胞周期阻害剤が投与されない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、いずれの追加の抗がん療法も伴わずに、単独で投与される（たとえば、本明細書に記載される方法を使用して処置される対象には、前記抗体または断片での処置の過程の間に、追加の抗がん療法が投与されない）。
【００６６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象には、化学療法がさらに投与され、化学療法は、シスプラチンである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象には、化学療法がさらに投与され、化学療法は、５−ＦＵである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象には、化学療法がさらに投与され、化学療法は、パクリタキセルである。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象には、化学療法がさらに投与され、化学療法は、アルブミン結合型粒子として製剤化されたパクリタキセル（たとえば、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象には、化学療法がさらに投与され、化学療法は、ゲムシタビンである（たとえば、処置されているがんが、膵臓がんである場合）。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象には、化学療法がさらに投与され、化学療法は、ｎａｂ−パクリタキセルである（たとえば、処置されているがんが、膵臓がんである場合）。ある特定の実施形態では、がんは、膵臓がんであり、本明細書に記載される方法に従って処置される対象には、化学療法がさらに投与され、化学療法は、ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルの組合せである。ある特定の実施形態では、ゲムシタビンおよび／またはｎａｂ−パクリタキセルは、ゲムシタビンおよび／またはｎａｂ−パクリタキセルが抗がん抗体（たとえば、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片）と組み合わせずに投与される場合に使用される用量よりも低い用量で、投与される。対象がヒトである、ある特定の実施形態では、ゲムシタビンは、１，５００ｍｇ／ｍ２よりも低い用量で投与され、および／またはｎａｂ−パクリタキセルは、３００ｍｇ／ｍ２よりも低い用量で投与される。対象がヒトである一実施形態では、ゲムシタビンは、１，０００ｍｇ／ｍ２に等しいかもしくはそれよりも低い用量で投与され、および／またはｎａｂ−パクリタキセルは、１２５ｍｇ／ｍ２に等しいかもしくはそれよりも低い用量で投与される。対象がヒトである一実施形態では、ゲムシタビンは、５００ｍｇ／ｍ２に等しいかもしくはそれよりも低い用量で投与され、および／またはｎａｂ−パクリタキセルは、６２．５ｍｇ／ｍ２に等しいかもしくはそれよりも低い用量で投与される。ある特定の実施形態では、ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルの組合せは、２週間に１回またはそれよりも低い頻度で投与される。
【００６７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、他のがん療法（たとえば、ワクチン、標的化療法、化学療法、放射線療法、外科手術、または免疫療法）に対して耐性である。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、化学療法に対して耐性である。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、化学療法耐性卵巣がんを有する。他の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、阻害性免疫チェックポイント分子の１つまたは複数の阻害剤に対して耐性である。他の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、放射線療法に対して耐性である。
【００６８】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、配列番号４のアミノ酸１９〜５０内に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、配列番号４のアミノ酸１５４〜１６７内に特異的に結合する。さらに別の特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、配列番号４のアミノ酸１〜６０内に特異的に結合する。さらに別の特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、配列番号４のアミノ酸１〜１００内に特異的に結合する。さらに別の特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、配列番号４のアミノ酸１〜１０９内に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、配列番号４のアミノ酸２６〜６０内に特異的に結合する。１つの特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、がん細胞の形質膜上のＨＤＭ２のＣ末端における末端の６０個のアミノ酸内に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、がん細胞の形質膜上のＨＤＭ２のＣ末端における末端の１００個のアミノ酸内に特異的に結合する。１つの特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、配列番号４のアミノ酸１０１〜２００内に特異的に結合する。
【００６９】
具体的な実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、マウス抗ＨＤＭ２抗体ＯＰ１４５と競合する（これは、本明細書に記載されており、たとえば、表１０を参照されたい）。他の具体的な実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、マウス抗ＨＤＭ２抗体９６５（ＳＭＰ１４）と競合する（これは、本明細書に記載されており、たとえば、表３および１０を参照されたい）。さらに他の具体的な実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、ウサギ抗ＨＤＭ２抗体ｓｃ−８１３（Ｎ−２０）と競合する（これは、本明細書に記載されており、たとえば、表１０を参照されたい）。別の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、ウサギ抗ＨＤＭ２抗体ｓｃ−８１２（Ｃ−１８）と競合する（これは、本明細書に記載されており、たとえば、表１０を参照されたい）。別の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、マウス抗ＨＤＭ２抗体Ｍ０１、クローン１Ａ７と競合する（これは、本明細書に記載されており、たとえば、表３を参照されたい）。
【００７０】
ある特定の態様では、それを必要とする対象においてがんを処置するまたは転移を予防するための方法であって、対象に、本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体（たとえば、前記がんの細胞の表面上のＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体）であって、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および／または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介するヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含む抗体を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。これらの実施形態のうちの一部では、本明細書において使用される抗ＨＤＭ２抗体または断片によって標的とされるＨＤＭ２の細胞外領域は、以下のＨＤＭ２のアミノ酸領域のうちの１つ内にある：配列番号１（これは、配列番号４のアミノ酸１〜１５である）のアミノ酸、配列番号２（これは、配列番号４のアミノ酸１５〜２５である）のアミノ酸、配列番号３（これは、配列番号４のアミノ酸４７５〜４９１である）のアミノ酸、配列番号４のアミノ酸１９〜５０、配列番号４のアミノ酸５０〜６０、配列番号４のアミノ酸１００〜１１０、配列番号４のアミノ酸１５４〜１６７、配列番号４のアミノ酸１〜６０、またはがん細胞の形質膜上のＨＤＭ２のＣ末端における末端の６０個のアミノ酸。この段落に記載されている方法の特定の実施形態では、がんは、白血病、肺がん、結腸がん、黒色腫、膵臓がん、乳がん、または卵巣がんである。
【００７１】
一態様では、対象（たとえば、ヒト）におけるがんを診断する方法であって、（ａ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合する抗体またはその断片（たとえば、標識化抗体または断片）が、対象のインタクトな細胞の表面に結合するかどうかを検出するステップであって、抗体または断片が、本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片である（好ましい例では、抗体または断片が、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のペプチドに特異的に結合する任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片である）、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において結合が検出された場合に、対象をがんと診断するステップとを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、診断する方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏ方法である。一実施形態では、診断する方法は、ステップ（ａ）の前に、インタクトな細胞を対象から得るステップをさらに含む。一実施形態では、診断する方法は、ステップ（ａ）における検出の前に、対象に抗体または断片を投与するステップを含み、検出が、対象のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングによって行われる。
【００７２】
５．１用語
本明細書で使用される場合、「ＨＤＭ２」という用語は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ００９８７（配列番号４）のヒトＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼ（すなわち、全長ＨＤＭ２タンパク質）、または当該技術分野において公知であるかもしくは本明細書に記載される全長ＨＤＭ２タンパク質の任意のスプライスバリアントのタンパク質産物を指す。全長ＨＤＭ２タンパク質の例示的なスプライスバリアントのアミノ酸配列は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、および配列番号１７として示されている。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「ＭＤＭ２」という用語は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ２３８０４（配列番号５）のマウスＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼ（すなわち、全長ＭＤＭ２タンパク質）、または当該技術分野において公知であるかもしくは本明細書に記載される全長ＭＤＭ２タンパク質の任意のスプライスバリアントのタンパク質産物を指す。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「Ｍ（Ｈ）ＤＭ２」という用語は、ＨＤＭ２、ＭＤＭ２、またはＨＤＭ２もしくはＭＤＭ２のホモログであるヒトおよびマウス以外の種に由来するＥ３ユビキチン−タンパク質リガーゼを指す。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「ＨＤＭ４」という用語は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ１５１５１（配列番号６）のヒトタンパク質（すなわち、全長ＨＤＭ４タンパク質）、または当該技術分野において公知であるかもしくは本明細書に記載される全長ＨＤＭ４タンパク質の任意のスプライスバリアントのタンパク質産物を指す。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「ＭＤＭ４」という用語は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｏ３５６１８のマウスタンパク質（すなわち、全長ＭＤＭ４タンパク質）、または当該技術分野において公知であるかもしくは本明細書に記載される全長ＭＤＭ４タンパク質の任意のスプライスバリアントのタンパク質産物を指す。全長ＭＤＭ４タンパク質の例示的なスプライスバリアントのアミノ酸配列は、配列番号６として示されている。当該技術分野において公知の全長ＭＤＭ４タンパク質の他のスプライスバリアントとしては、ＭＤＭ４−Ｓ、ＭＤＭ４−Ａ、ＭＤＭ４−Ｇ、ＭＤＭ４−ＸＡＬＴ１／ＸＡＬＴ２、およびＭＤＭ４−２１１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「Ｍ（Ｈ）ＤＭ４」という用語は、ＨＤＭ４（ＨＤＭＸとも称される）、ＭＤＭ４（ＭＤＭＸとも称される）、またはＨＤＭ４もしくはＭＤＭ４のホモログであるヒトおよびマウス以外の種に由来するタンパク質を指す。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４」という用語は、ＨＤＭ２、ＭＤＭ２、ＨＤＭ４、ＭＤＭ４、またはＨＤＭ２、ＭＤＭ２、ＨＤＭ４、もしくはＭＤＭ４のホモログであるヒトおよびマウス以外の種に由来するタンパク質を指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、数値を修飾して使用される場合、その数値の最大で上下１０％の偏差が、列挙された値の意図される意味に含まれることを示す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、細胞に関する「インタクト」という用語は、生存している細胞、または固定されているが透過処理されていない細胞を指す。
【００８１】
本明細書で使用される場合、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４のエピトープに関連する「細胞外からアクセス可能」という用語は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４がインタクトな細胞によって発現された場合に、エピトープが細胞外の抗体との結合に利用可能である（抗体の細胞内輸送を必要とすることなく）、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４のエピトープを指す。抗体またはその断片は、抗体が、細胞外から、インタクトな細胞によって発現されたＭ（Ｈ）ＤＭ２／４に結合する場合に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに結合すると判定することができる。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「ＶＬ」という用語は、抗体の軽鎖可変領域を指す。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「ＶＨ」という用語は、抗体の重鎖可変領域を指す。
【００８４】
本明細書で使用される場合、参照ポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」または「配列同一性パーセント」という用語は、配列をアライメントし、最大の配列同一性パーセントが達成されるように、必要に応じてギャップを導入した後に、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のアライメントは、当該技術分野において公知である様々な手段で、たとえば、ＢＬＡＳＴｐ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ（たとえば、ＡＬＩＧＮ−２）、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、達成することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１Ａ−１Ｄ】図１Ａ〜Ｄは、ペプチドＥＬＩＳＡ実験において、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３がそれぞれ、ＮＭＣ−Ｐ１（配列番号１）、ＮＭＣ−Ｐ２（配列番号２）、およびＮＭＣ−Ｐ３（配列番号３）ペプチド抗原に特異的に結合したことを示す。（Ａ）ＮＭＣ−１０３は、ＮＭＣ−Ｐ１ペプチドに結合したが、ＮＭＣ−２０４は、ＮＭＣ−Ｐ１への結合を示さなかった。（Ｂ）ＮＭＣ−２０４は、ＮＭＣ−Ｐ２ペプチドに結合したが、ＮＭＣ−１０３は、ＮＭＣ−Ｐ２に結合しなかった。（Ｃ）ＮＭＣ−３０３は、ＮＭＣ−Ｐ３ペプチドに結合したが、ＮＭＣ−２０４はＮＭＣ−Ｐ３に結合しなかった。（Ｄ）ＮＭＣ−１０３は、ＮＭＣ−Ｐ１に結合したが、ＮＭＣ−Ｐ１ペプチドをＮＭＣ−１０３と共にプレインキュベートすると、ＮＭＣ−１０３の、プレート上のＮＭＣ−Ｐ１ペプチドへの結合が消失した。これに対し、ＮＭＣ−１０３をＮＭＣ−Ｐ２またはＮＭＣ−Ｐ３のいずれと共にプレインキュベートしても、ＮＭＣ−１０３のＮＭＣ−Ｐ１への結合に影響を及ぼさなかった。
【００８６】
【図２】図２は、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、ＮＭＣ−３０３が、ＨＤＭ２組換えタンパク質に結合したことを示す。
【００８７】
【図３Ａ−３Ｂ】図３Ａ〜Ｂは、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３が、インタクトなヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）がん細胞上のＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに結合したことを示す。
【００８８】
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａ〜Ｂは、モノクローナル抗体ＮＭＣ−２０４が、インタクトなヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）がん細胞上のＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに結合したことを示す。
【００８９】
【図５Ａ−５Ｂ】図５Ａ〜Ｂは、モノクローナル抗体ＮＭＣ−３０３が、インタクトなヒト（Ａ）およびマウス（Ｂ）がん細胞上のＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに結合したことを示す。
【００９０】
【図６】図６は、モノクローナル抗体ＮＭＣ−２０４が、インタクトなヒトがん細胞上のＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに結合したが、インタクトな正常ヒト末梢血単核細胞には結合しなかったことを示す。
【００９１】
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ〜Ｂは、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３（Ａ）およびＮＭＣ−２０４（Ｂ）の、インタクトなＭＩＡＰａＣａ−２細胞への結合の結合曲線を表す。
【００９２】
【図８Ａ−８Ｃ】図８Ａ〜Ｃは、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３の、インタクトなヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞の形質膜上のＨＤＭ２のその細胞外からアクセス可能なエピトープへの結合が、ＮＭＣ−Ｐ１ペプチド（Ａ）によって競合されたこと、モノクローナル抗体ＮＭＣ−２０４の、インタクトなヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞の形質膜上のＨＤＭ２のその細胞外からアクセス可能なエピトープへの結合が、ＮＭＣ−Ｐ２ペプチド（Ｂ）によって競合されたこと、およびモノクローナル抗体ＮＭＣ−３０３の、インタクトなヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞の形質膜上のＨＤＭ２のその細胞外からアクセス可能なエピトープへの結合が、ＮＭＣ−Ｐ３ペプチド（Ｃ）によって競合されたことを示す。
【００９３】
【図９】図９は、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３の、インタクトなヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞の形質膜上のＨＤＭ２のその細胞外からアクセス可能なエピトープへの結合が、完全長組換えＨＤＭ２タンパク質によって競合されたことを示す。
【００９４】
【図１０】図１０は、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３、モノクローナル抗体ＮＭＣ−２０４、Ｅ−カドヘリンに対する抗体、およびシトクロムＣに対する抗体の、インタクトなヒト膵臓がんＭｉａＰａＣａ−２細胞への細胞−ＥＬＩＳＡ結合結果を示す。
【００９５】
【図１１Ａ−１１Ｃ】図１１Ａ〜Ｃは、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３（Ａ）、ＮＭＣ−２０４（Ｂ）、および抗Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼα−１（Ｃ）のそれぞれによって染色した％細胞上のフローサイトメトリーデータを表す。
【００９６】
【図１２Ａ−１２Ｃ】図１２Ａ〜Ｄは、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３（ＡおよびＤ）およびＮＭＣ−２０４（ＢおよびＤ）が、インタクトなヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞の細胞増殖を阻害したが、抗シトクロムＣ抗体（ＣおよびＤ）は、阻害しなかったことを示す。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜Ｄは、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３（ＡおよびＤ）およびＮＭＣ−２０４（ＢおよびＤ）が、インタクトなヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞の細胞増殖を阻害したが、抗シトクロムＣ抗体（ＣおよびＤ）は、阻害しなかったことを示す。
【００９７】
【図１３Ａ−１３Ｂ】図１３Ａ〜Ｃは、正常ヒト血清の存在下でのモノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３（ＢおよびＣ）が、任意の抗体の非存在下で正常ヒト血清によって処置した細胞（Ａ）と比較して、ヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞に対する補体媒介性細胞傷害性を誘導することを示す。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜Ｃは、正常ヒト血清の存在下でのモノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３（ＢおよびＣ）が、任意の抗体の非存在下で正常ヒト血清によって処置した細胞（Ａ）と比較して、ヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞に対する補体媒介性細胞傷害性を誘導することを示す。
【００９８】
【図１４Ａ−１４Ｂ】図１４Ａ〜Ｂは、市販の多くのモノクローナル抗体が、ＮＭＣ−Ｐ１（Ａ）またはＮＭＣ−Ｐ２（Ｂ）のいずれにも結合しないことを示す。
【００９９】
【図１５Ａ】図１５Ａ〜Ｂは、「ＭＤＭ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン１Ａ７」（Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ００００４１９３−Ｍ０１）と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体が、インタクトながん細胞と反応した（Ａ）が、「抗ＭＤＭ２（Ａｂ−４）マウスｍＡｂ（２Ａ９Ｃ１．１８）」（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＯＰ１４４）と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体および「抗ＭＤＭ２（Ａｂ−１）マウスｍＡｂ（ＩＦ２）」（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＯＰ４６）と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体は、インタクトながん細胞と反応しなかった（Ｂ）ことを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜Ｂは、「ＭＤＭ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン１Ａ７」（Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ００００４１９３−Ｍ０１）と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体が、インタクトながん細胞と反応した（Ａ）が、「抗ＭＤＭ２（Ａｂ−４）マウスｍＡｂ（２Ａ９Ｃ１．１８）」（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＯＰ１４４）と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体および「抗ＭＤＭ２（Ａｂ−１）マウスｍＡｂ（ＩＦ２）」（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＯＰ４６）と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体は、インタクトながん細胞と反応しなかった（Ｂ）ことを示す。
【０１００】
【図１６】図１６は、ＬＬ／２同系マウス肺がんモデルの腫瘍体積に及ぼすモノクローナル抗体ＮＭＣ−２０４の効果を表す。
【０１０１】
【図１７Ａ−１７Ｂ】図１７Ａ〜Ｂは、ＭＣ−３８同系マウス結腸がんモデルの腫瘍体積（Ａ）および腫瘍細胞増殖（Ｂ）に及ぼすモノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３の効果を表す。
【０１０２】
【図１８Ａ−１８Ｂ】図１８Ａ〜Ｂは、ＭＣ−３８同系マウス結腸がんモデルの腫瘍体積（Ａ）および腫瘍細胞増殖（Ｂ）に及ぼすモノクローナル抗体ＮＭＣ−２０４の効果を表す。
【０１０３】
【図１９】図１９は、Ｐａｎｃ−２同系マウス膵臓がんモデルの腫瘍体積に及ぼす、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３単独（２ｍｇ／ｋｇ）、低用量ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ）およびｎａｂ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）の組合せ、低用量ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ）、ｎａｂ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）、およびＮＭＣ−１０３（２ｍｇ／ｋｇ）の組合せ、ならびにアイソタイプ対照マウスＩｇＧ１（２ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれの効果を表す。マウスの腫瘍がおよそ７０ｍｍ３に達すると処置を開始した。
【０１０４】
【図２０】図２０は、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれの、ＤＮＡ配列およびタンパク質配列を表す。
【０１０５】
【図２１】図２１は、モノクローナル抗体ＮＭＣ−２０４の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のそれぞれの、ＤＮＡ配列およびタンパク質配列を表す。
【０１０６】
【図２２】図２２は、モノクローナル抗体ＮＭＣ−３０３の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の、ＤＮＡ配列およびタンパク質配列を示す。重鎖可変領域および軽鎖可変領域のＤＮＡ配列およびタンパク質配列の前のリーダー配列を、太字（下線ではない）で表す。
【０１０７】
【図２３】図２３は、「ＭＤＭ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン１Ａ７」（Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ００００４１９３−Ｍ０１）と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体によって処置したマウスの腫瘍サイズ、ＮＭＣ−１０３によって処置したマウスの腫瘍サイズ、ＮＭＣ−２０４によって処置したマウスの腫瘍サイズ、およびアイソタイプ対照によって処置したマウスの腫瘍サイズを示す。
【０１０８】
【図２４Ａ−２４Ｂ】図２４Ａ〜Ｆでは、抗ＨＤＭ２特異的抗体は、がん細胞の表面を染色するが、正常細胞は染色しない。ＥＤＴＡまたはトリプシンのいずれかによって放出したインタクトな細胞を、５％ヒト血清アルブミンによってブロックした。次に、細胞を、ポリクローナルＮ−２０Ｍ（Ｈ）ＤＭ２特異的抗体（ｓｃ−８１３、Ｎ−２０、ウサギＩｇＧ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；「Ｎ−２０」）またはモノクローナルＭ（Ｈ）ＤＭ２特異的ＯＰ１４５抗体（ＯＰ１４５、マウスＩｇＧ１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；「ＯＰ１４５」）のいずれかと共に氷中で９０分間インキュベートした。同じ条件で調製した別の組の細胞を、細胞とのインキュベーションの前に、その対応するブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした同じ抗体と共にインキュベートした。一次抗体のインキュベーション後、細胞を氷冷ＰＢＳによって３回洗浄した後、ＦＩＴＣ−二次抗体と共に６０分間インキュベートした。次に、細胞を、ＰＢＳによって３回洗浄し、ＦＡＣＳアナライザに供した。ヒト黒色腫細胞（２４Ａ、２４Ｂ、および２４Ｃ）、初代培養ヒト卵巣がん細胞（２４Ｄおよび２４Ｅ）、ならびに正常マウス脾細胞（２４Ｆ）。図２４Ａ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃３は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す。図２４Ｂ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗マウス二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２モノクローナル抗体ＯＰ１４５と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃３は、抗ＨＤＭ２モノクローナル抗体ＯＰ１４５と共にインキュベート後、ヤギ抗マウス二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す。図２４Ｃ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたトリプシン放出細胞を表す；曲線下面積＃３は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す；曲線下面積＃４は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す。図２４Ｄ＆Ｅ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃３は、抗ＨＤＭ２ポリ���ローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す。図２４Ｆ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたトリプシン放出細胞を表す；曲線下面積＃３は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す；曲線下面積＃４は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す。
【図２４Ｃ−２４Ｄ】図２４Ａ〜Ｆでは、抗ＨＤＭ２特異的抗体は、がん細胞の表面を染色するが、正常細胞は染色しない。ＥＤＴＡまたはトリプシンのいずれかによって放出したインタクトな細胞を、５％ヒト血清アルブミンによってブロックした。次に、細胞を、ポリクローナルＮ−２０Ｍ（Ｈ）ＤＭ２特異的抗体（ｓｃ−８１３、Ｎ−２０、ウサギＩｇＧ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；「Ｎ−２０」）またはモノクローナルＭ（Ｈ）ＤＭ２特異的ＯＰ１４５抗体（ＯＰ１４５、マウスＩｇＧ１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；「ＯＰ１４５」）のいずれかと共に氷中で９０分間インキュベートした。同じ条件で調製した別の組の細胞を、細胞とのインキュベーションの前に、その対応するブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした同じ抗体と共にインキュベートした。一次抗体のインキュベーション後、細胞を氷冷ＰＢＳによって３回洗浄した後、ＦＩＴＣ−二次抗体と共に６０分間インキュベートした。次に、細胞を、ＰＢＳによって３回洗浄し、ＦＡＣＳアナライザに供した。ヒト黒色腫細胞（２４Ａ、２４Ｂ、および２４Ｃ）、初代培養ヒト卵巣がん細胞（２４Ｄおよび２４Ｅ）、ならびに正常マウス脾細胞（２４Ｆ）。図２４Ａ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃３は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す。図２４Ｂ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗マウス二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２モノクローナル抗体ＯＰ１４５と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃３は、抗ＨＤＭ２モノクローナル抗体ＯＰ１４５と共にインキュベート後、ヤギ抗マウス二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す。図２４Ｃ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたトリプシン放出細胞を表す；曲線下面積＃３は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す；曲線下面積＃４は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す。図２４Ｄ＆Ｅ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃３は、抗ＨＤＭ２ポリ���ローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す。図２４Ｆ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたトリプシン放出細胞を表す；曲線下面積＃３は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す；曲線下面積＃４は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す。
【図２４Ｅ−２４Ｆ】図２４Ａ〜Ｆでは、抗ＨＤＭ２特異的抗体は、がん細胞の表面を染色するが、正常細胞は染色しない。ＥＤＴＡまたはトリプシンのいずれかによって放出したインタクトな細胞を、５％ヒト血清アルブミンによってブロックした。次に、細胞を、ポリクローナルＮ−２０Ｍ（Ｈ）ＤＭ２特異的抗体（ｓｃ−８１３、Ｎ−２０、ウサギＩｇＧ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；「Ｎ−２０」）またはモノクローナルＭ（Ｈ）ＤＭ２特異的ＯＰ１４５抗体（ＯＰ１４５、マウスＩｇＧ１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；「ＯＰ１４５」）のいずれかと共に氷中で９０分間インキュベートした。同じ条件で調製した別の組の細胞を、細胞とのインキュベーションの前に、その対応するブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした同じ抗体と共にインキュベートした。一次抗体のインキュベーション後、細胞を氷冷ＰＢＳによって３回洗浄した後、ＦＩＴＣ−二次抗体と共に６０分間インキュベートした。次に、細胞を、ＰＢＳによって３回洗浄し、ＦＡＣＳアナライザに供した。ヒト黒色腫細胞（２４Ａ、２４Ｂ、および２４Ｃ）、初代培養ヒト卵巣がん細胞（２４Ｄおよび２４Ｅ）、ならびに正常マウス脾細胞（２４Ｆ）。図２４Ａ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃３は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す。図２４Ｂ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗マウス二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２モノクローナル抗体ＯＰ１４５と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃３は、抗ＨＤＭ２モノクローナル抗体ＯＰ１４５と共にインキュベート後、ヤギ抗マウス二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す。図２４Ｃ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたトリプシン放出細胞を表す；曲線下面積＃３は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す；曲線下面積＃４は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す。図２４Ｄ＆Ｅ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃３は、抗ＨＤＭ２ポリ���ローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す。図２４Ｆ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたトリプシン放出細胞を表す；曲線下面積＃３は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す；曲線下面積＃４は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す。
【０１０９】
【図２５Ａ】図２５Ａ〜Ｃ。（Ａ）ヒト膵臓または卵巣がん細胞および正常ヒト線維芽細胞を、正常ヒト血清（ＮＨＳ）単独、ＮＨＳ＋抗ＨＤＭ２  ＯＰ１４５モノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、「ＯＰ１４５」）、または対照抗体（ＮＨＳ＋シトクロムＣ）によって処置した。がん細胞を、ＮＨＳの存在下でＯＰ１４５抗体によって処置すると（パネルｂおよびｅを参照されたい）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって明らかとなる広範囲の細胞死が観察されたが、同じ抗体は、正常ヒト線維芽細胞の生存率に対しては効果を有しなかった（パネルｇを参照されたい）。シトクロムＣに対する対照抗体は、無処置細胞において観察された細胞傷害性（パネルａを参照されたい）を上回る細胞傷害性を示さない（パネルｃを参照されたい）。細胞死がないことは、パネルａ、ｃ、ｄ、ｆ、およびｇにおいてＰＩ染色がないか、ほとんどないことによって明らかである。細胞死マーカーＰＩを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１倒立顕微鏡上のＯｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０００共焦点レーザースキャン生物顕微鏡を使用して、可視化した。（Ｂ）齧歯類膵臓がん細胞を、抗ＨＤＭ２抗体および対照のシトクロムＣ抗体によって処置した。細胞を抗ＨＤＭ２抗体、Ｎ−２０（ポリクローナル抗体、ｓｃ−８１３  Ｎ−２０、ウサギＩｇＧ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、「Ｎ−２０」）、またはＣ−１８（ポリクローナル、ｓｃ−８１２  Ｃ−１８、ウサギＩｇＧ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；「Ｃ−１８」）（パネルｂおよびｅを参照されたい）によって処置すると、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって明らかとなる広範囲の細胞死が観察されたが、細胞を抗ＨＤＭ２モノクローナルＯＰ４６抗体（ＯＰ４６（Ａｂ−１）；マウスＩｇＧ１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；「ＯＰ４６」）（パネルｄを参照されたい）、または対照のシトクロムＣ抗体（パネルｅを参照されたい）によって処置した場合、細胞傷害性は観察されなかった。（Ｃ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２特異的抗体は、ＮＨＳの存在下で膵臓がんＭｉａＰａＣａ−２細胞に対して細胞傷害性である。ヒト膵臓がん細胞に対するＭ（Ｈ）ＤＭ２特異的抗体依存性補体細胞傷害性の定量的表示。ＮＨＳの存在下で抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２（Ｃ−１８）抗体によって処置した細胞は、処置後１５〜３０分にわたる細胞傷害性を示したが、抗ＨＤＭ２  ＯＰ４６は、細胞を対照の抗シトクロムＣ抗体によって処置した場合、または細胞を抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２抗体の非存在下でＮＨＳによって処置した場合に観察される細胞傷害効果を上回る細胞障害効果を示さない。
【図２５Ｂ】図２５Ａ〜Ｃ。（Ａ）ヒト膵臓または卵巣がん細胞および正常ヒト線維芽細胞を、正常ヒト血清（ＮＨＳ）単独、ＮＨＳ＋抗ＨＤＭ２  ＯＰ１４５モノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、「ＯＰ１４５」）、または対照抗体（ＮＨＳ＋シトクロムＣ）によって処置した。がん細胞を、ＮＨＳの存在下でＯＰ１４５抗体によって処置すると（パネルｂおよびｅを参照されたい）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって明らかとなる広範囲の細胞死が観察されたが、同じ抗体は、正常ヒト線維芽細胞の生存率に対しては効果を有しなかった（パネルｇを参照されたい）。シトクロムＣに対する対照抗体は、無処置細胞において観察された細胞傷害性（パネルａを参照されたい）を上回る細胞傷害性を示さない（パネルｃを参照されたい）。細胞死がないことは、パネルａ、ｃ、ｄ、ｆ、およびｇにおいてＰＩ染色がないか、ほとんどないことによって明らかである。細胞死マーカーＰＩを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１倒立顕微鏡上のＯｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０００共焦点レーザースキャン生物顕微鏡を使用して、可視化した。（Ｂ）齧歯類膵臓がん細胞を、抗ＨＤＭ２抗体および対照のシトクロムＣ抗体によって処置した。細胞を抗ＨＤＭ２抗体、Ｎ−２０（ポリクローナル抗体、ｓｃ−８１３  Ｎ−２０、ウサギＩｇＧ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、「Ｎ−２０」）、またはＣ−１８（ポリクローナル、ｓｃ−８１２  Ｃ−１８、ウサギＩｇＧ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；「Ｃ−１８」）（パネルｂおよびｅを参照されたい）によって処置すると、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって明らかとなる広範囲の細胞死が観察されたが、細胞を抗ＨＤＭ２モノクローナルＯＰ４６抗体（ＯＰ４６（Ａｂ−１）；マウスＩｇＧ１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；「ＯＰ４６」）（パネルｄを参照されたい）、または対照のシトクロムＣ抗体（パネルｅを参照されたい）によって処置した場合、細胞傷害性は観察されなかった。（Ｃ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２特異的抗体は、ＮＨＳの存在下で膵臓がんＭｉａＰａＣａ−２細胞に対して細胞傷害性である。ヒト膵臓がん細胞に対するＭ（Ｈ）ＤＭ２特異的抗体依存性補体細胞傷害性の定量的表示。ＮＨＳの存在下で抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２（Ｃ−１８）抗体によって処置した細胞は、処置後１５〜３０分にわたる細胞傷害性を示したが、抗ＨＤＭ２  ＯＰ４６は、細胞を対照の抗シトクロムＣ抗体によって処置した場合、または細胞を抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２抗体の非存在下でＮＨＳによって処置した場合に観察される細胞傷害効果を上回る細胞障害効果を示さない。
【図２５Ｃ】図２５Ａ〜Ｃ。（Ａ）ヒト膵臓または卵巣がん細胞および正常ヒト線維芽細胞を、正常ヒト血清（ＮＨＳ）単独、ＮＨＳ＋抗ＨＤＭ２  ＯＰ１４５モノクローナル抗体（マウスＩｇＧ１、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、「ＯＰ１４５」）、または対照抗体（ＮＨＳ＋シトクロムＣ）によって処置した。がん細胞を、ＮＨＳの存在下でＯＰ１４５抗体によって処置すると（パネルｂおよびｅを参照されたい）、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって明らかとなる広範囲の細胞死が観察されたが、同じ抗体は、正常ヒト線維芽細胞の生存率に対しては効果を有しなかった（パネルｇを参照されたい）。シトクロムＣに対する対照抗体は、無処置細胞において観察された細胞傷害性（パネルａを参照されたい）を上回る細胞傷害性を示さない（パネルｃを参照されたい）。細胞死がないことは、パネルａ、ｃ、ｄ、ｆ、およびｇにおいてＰＩ染色がないか、ほとんどないことによって明らかである。細胞死マーカーＰＩを、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１倒立顕微鏡上のＯｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０００共焦点レーザースキャン生物顕微鏡を使用して、可視化した。（Ｂ）齧歯類膵臓がん細胞を、抗ＨＤＭ２抗体および対照のシトクロムＣ抗体によって処置した。細胞を抗ＨＤＭ２抗体、Ｎ−２０（ポリクローナル抗体、ｓｃ−８１３  Ｎ−２０、ウサギＩｇＧ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、「Ｎ−２０」）、またはＣ−１８（ポリクローナル、ｓｃ−８１２  Ｃ−１８、ウサギＩｇＧ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ；「Ｃ−１８」）（パネルｂおよびｅを参照されたい）によって処置すると、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色によって明らかとなる広範囲の細胞死が観察されたが、細胞を抗ＨＤＭ２モノクローナルＯＰ４６抗体（ＯＰ４６（Ａｂ−１）；マウスＩｇＧ１；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ；「ＯＰ４６」）（パネルｄを参照されたい）、または対照のシトクロムＣ抗体（パネルｅを参照されたい）によって処置した場合、細胞傷害性は観察されなかった。（Ｃ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２特異的抗体は、ＮＨＳの存在下で膵臓がんＭｉａＰａＣａ−２細胞に対して細胞傷害性である。ヒト膵臓がん細胞に対するＭ（Ｈ）ＤＭ２特異的抗体依存性補体細胞傷害性の定量的表示。ＮＨＳの存在下で抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２（Ｃ−１８）抗体によって処置した細胞は、処置後１５〜３０分にわたる細胞傷害性を示したが、抗ＨＤＭ２  ＯＰ４６は、細胞を対照の抗シトクロムＣ抗体によって処置した場合、または細胞を抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２抗体の非存在下でＮＨＳによって処置した場合に観察される細胞傷害効果を上回る細胞障害効果を示さない。
【０１１０】
【図２６】図２６は、抗ＨＤＭ２抗体ＯＰ１４５によって処置したマウスの腫瘍サイズおよびＰＢＳ対照によって処置したマウスの腫瘍サイズを示す（Ｐａｎｃ０２同系マウス膵臓がんモデルにおいて）。ｘ軸は、マウスに腫瘍細胞注射後の日数を示す。ｙ軸は、腫瘍体積をｍｍ３で示す。矢印は、処置を開始した日を示す。
【０１１１】
【図２７】図２７は、Ｐａｎｃ−２同系マウス膵臓がんモデルの腫瘍体積に及ぼす、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３単独（１０ｍｇ／ｋｇ）、低用量ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ）およびｎａｂ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）の組合せ、低用量ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ）、ｎａｂ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）、およびＮＭＣ−１０３（１０ｍｇ／ｋｇ）の組合せ、ならびにアイソタイプ対照マウスＩｇＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれの効果を表す（マウスの数／群＝８）。本試験における処置は、マウスの腫瘍がおよそ８０〜１００ｍｍ３に達した場合に開始した。
【０１１２】
【図２８】図２８は、図２７に記載の実験条件で化学療法単独または対照抗体と比較した場合の、ＮＭＣ−１０３単独、または化学療法との組合せを投与したマウスにおける生存利益を実証するカプラン／マイヤー生存分析を表す。
【０１１３】
【図２９】図２９は、図２７で記載したＮＭＣ−１０３によって前回処置したマウスが、薬物の中止後の腫瘍の再チャレンジに対して免疫となることを示す。ＮＭＣ−１０３の長期の抗腫瘍効果を評価するために、試験開始後６２日目に、Ｇ＋ｎＰの組合せを前回投与されているマウス、Ｃ群のマウス（ＮＭＣ−１０３によって前回処置されているマウス）、およびＤ群のマウス（ＮＭＣ−１０３＋Ｇ＋ｎＰの組合せによって前回処置されているマウス）の左背部脇腹に２回目のＰａｎｃ−２の接種（細胞２×１０６個／マウスの皮下注射）によって再チャレンジした。腫瘍成長を、１０日間モニターし、その時点でＢ群のマウスでは９０ｍｍ３の腫瘍が測定された。ＮＭＣ−１０３抗体を前回投与されていた２つの群（群ＣおよびＤ）のマウスでは、腫瘍は観察されなかった。
【０１１４】
【図３０】図３０は、大きいサイズの腫瘍（すなわち、進行がん）の処置におけるＰａｎｃ−２同系マウス膵臓がんモデルの腫瘍体積に及ぼす、モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３（１０ｍｇ／ｋｇ）またはアイソタイプ対照マウスＩｇＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ）の１用量に、低用量ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ）およびｎａｂ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）の組合せの処置レジメンを追加した場合の効果を表す。マウスを、膵臓がんの標準治療（ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ）＋ｎａｂ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ））によって１９日間処置し、その時点で、腫瘍サイズはおよそ４５０ｍｍ３に達した。次に、マウスを２つの群に無作為に分け、アイソタイプ対照マウスＩｇＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＮＭＣ−１０３（１０ｍｇ／ｋｇ）の１用量を投与した。この図に示すように、ＮＭＣ−１０３の１回腹腔内注射は、処置後６日目で腫瘍サイズをほぼ半減させた（４３８ｍｍ３から２３３ｍｍ３に）。
【０１１５】
【図３１】図３１は、ＭＣ−３８同系マウス結腸がんモデルの腫瘍体積に及ぼすモノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３の効果を表す。この図に示すように、１０ｍｇ／ｋｇのＮＭＣ−１０３の週に２回、２週間によって処置したマウスは、平均腫瘍サイズ２１０ｍｍ３に達したが、１０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体によって処置した群のマウスでは、急速に成長し、１２日目までに１１６８ｍｍ３に達した。０．４ｍｇ／ｋｇのＮＭＣ−１０３によって処置したマウスと比較すると（図１７）、これらのデータはＮＭＣ−１０３抗体の用量依存的抗腫瘍効果を裏付ける。
【０１１６】
【図３２Ａ】図３２Ａおよび３２Ｂは、モノクローナル抗体ＮＭＣ−３０３のキメラ型の効果を表す。マウスＮＭＣ−３０３について、アイソタイプクラススイッチを実施し、マウスＩｇＭをキメラＩｇＧ１に変換した。マウス重鎖および軽鎖可変領域を、定常領域としてのヒトＩｇガンマ−１鎖およびヒトＩｇカッパ鎖にクローニングした。全体で８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ−２６を皮下注射した。次に、マウスを２群（ｎ＝４）に分けて、Ａ）対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＢ）ＮＭＣ−３０３抗体のキメラ型（１０ｍｇ／ｋｇ）を週に２回、３週間投与した。図３２Ａは、腫瘍接種後２４日までに、ＮＭＣ−３０３のキメラ型（１０ｍｇ／ｋｇ）によって処置したマウスが、平均腫瘍サイズ７２６ｍｍ３に達したが、対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）によって処置したマウスは平均腫瘍サイズが１７４６ｍｍ３であったことを示す。さらに、図３２Ｂは、腫瘍接種後２４日目での個々のマウス腫瘍サイズを示す。
【図３２Ｂ】図３２Ａおよび３２Ｂは、モノクローナル抗体ＮＭＣ−３０３のキメラ型の効果を表す。マウスＮＭＣ−３０３について、アイソタイプクラススイッチを実施し、マウスＩｇＭをキメラＩｇＧ１に変換した。マウス重鎖および軽鎖可変領域を、定常領域としてのヒトＩｇガンマ−１鎖およびヒトＩｇカッパ鎖にクローニングした。全体で８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＴ−２６を皮下注射した。次に、マウスを２群（ｎ＝４）に分けて、Ａ）対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＢ）ＮＭＣ−３０３抗体のキメラ型（１０ｍｇ／ｋｇ）を週に２回、３週間投与した。図３２Ａは、腫瘍接種後２４日までに、ＮＭＣ−３０３のキメラ型（１０ｍｇ／ｋｇ）によって処置したマウスが、平均腫瘍サイズ７２６ｍｍ３に達したが、対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）によって処置したマウスは平均腫瘍サイズが１７４６ｍｍ３であったことを示す。さらに、図３２Ｂは、腫瘍接種後２４日目での個々のマウス腫瘍サイズを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１７】
７．詳細な説明
Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、細胞外からアクセス可能なエピトープは、配列番号１、配列番号２、または配列番号３内に含有される。本明細書において提供される抗体は、以下の節５．１において説明されている。細胞障害性薬物に（たとえば、共有結合により）結合した、本明細書に記載されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体または断片を含む、抗体−薬物コンジュゲートもまた、本明細書において提供される。Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、細胞傷害性成分に結合していない、抗体またはその抗原結合性断片もまた、本明細書において提供される。
【０１１８】
本明細書に記載されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体または断片を含む、医薬組成物もまた、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、そのような医薬組成物は、治療有効量のそのような抗体または断片を含む（すなわち、たとえば、本明細書に記載される１つまたは複数の抗腫瘍作用を達成することによって、対象におけるがんを処置するために使用することができる量）。
【０１１９】
本明細書に記載される抗体および抗原結合性断片をコードする核酸もまた、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、そのような抗体またはその抗原結合性断片をコードする核酸を含む、ベクターおよび細胞が、本明細書において提供される。本明細書に記載される抗体またはその抗原結合性断片を組換え産生する細胞もまた、提供される。
【０１２０】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、抗原結合機能および免疫細胞活性化機能の両方を提供する、操作された受容体である（Sadelain  et  al.,  2013,  Cancer  Discovery  3:388-398）。リンカーにより、細胞内Ｔ細胞活性化ドメイン、たとえば、ＣＤ３ゼータ細胞内ドメインに融合され、必要に応じて、共刺激ドメイン（たとえば、ＣＤ２８細胞内ドメイン）にさらに融合された、膜貫通ドメイン（たとえば、ＣＤ３ゼータの）に融合された、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、たとえば、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体のＶＨおよびＶＬを含むｓｃＦｖを含む、ＣＡＲもまた、本明細書において提供される。そのようなＣＡＲを発現するＴ細胞もまた、提供される。
【０１２１】
アミノ酸配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）、またはＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）である、ペプチドもまた、本明細書において提供される。ペプチドは、たとえば、合成または組換えであり得る。一部の実施形態では、ペプチドは、精製されている。一部の実施形態では、ペプチドは、検出可能なマーカー（たとえば、蛍光マーカーまたは同位体）で標識されている。一部の実施形態では、ペプチドは、（たとえば、ＧＳＴ、Ｈｉｓ、Ｓｔｒｅｐ、ｍｙｃ、ＦＬＡＧ、またはＨＡタグで）タグ付けされている。一部の実施形態では、システインが、ペプチドの端部のうちの一方に付加されている（これにより、担体タンパク質への連結が可能となり得る）。一部の実施形態では、ペプチドは、担体タンパク質に連結されている（たとえば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵白アルブミン、サイログロブリン、破傷風トキソイド、またはジフテリア毒素に連結されている）。本明細書に記載されるペプチドをコードする核酸もまた、本明細書において提供される。本明細書に記載されるペプチドをコードする核酸を含むベクターおよび細胞もまた、本明細書において提供される。本明細書に記載されるペプチドを組換え産生する細胞もまた、提供される。本明細書に記載されるペプチドの免疫原としての使用もまた、本明細書において提供される。本明細書に記載される配列番号１、配列番号２、および配列番号３のペプチドは、ＭＤＭ２およびＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープを含有する。具体的には、動物（たとえば、マウスまたはウサギ）に本明細書に記載されるペプチドで免疫付与を行うことによって、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体（Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４に特異的に結合する抗体）を作製する方法が、本明細書において提供される。本明細書に記載されるペプチドのうちの１つまたは複数への結合について、（たとえば、プレートに結合したペプチドを用いたＥＬＩＳＡを使用して）抗体をスクリーニングする方法もまた、本明細書において提供される。抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体を、本明細書に記載されるペプチドと、抗体とペプチドとの間の結合に好適な条件下において接触させ、抗体とペプチドとの間に生じる結合を検出または測定することによって、がんの処置もしくは転移の予防における治療的使用に好適であるか、またはがんの診断における使用に好適である抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体を識別する方法であって、抗体とペプチドとの間の結合の検出が、抗体が治療的または診断的使用に好適であることを示す、方法もまた、本明細書において提供される。たとえば、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体を、本明細書に記載されるペプチドと、抗体とペプチドとの間の結合に好適な条件下において接触させ、抗体とペプチドとの間に生じる結合を検出または測定することによって、治療的使用に好適な抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体を識別する方法であって、抗体とペプチドとの間の結合が検出された場合に、抗体を、本明細書に記載されるがんを処置する方法において使用する、方法が、本明細書において提供される。別の例では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体を、本明細書に記載されるペプチドと、抗体とペプチドとの間の結合に好適な条件下において接触させ、抗体とペプチドとの間に生じる結合を検出または測定することによって、診断的使用に好適な抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体を識別する方法であって、抗体とペプチドとの間の結合が検出された場合に、抗体を、本明細書に記載されるがんを診断する方法において使用する、方法が、本明細書において提供される。
【０１２２】
対象に、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片、特に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープ（特に、がん細胞の形質膜表面上に露出している領域）に特異的に結合する抗体またはその断片を投与することによって、対象におけるがんを処置、腫瘍の成長もしくは増殖を阻害、腫瘍の進行を阻害、および／または転移を予防するための方法もまた、本明細書において提供される。好ましくは、抗体またはその断片は、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープ（特に、がん細胞の形質膜表面上に露出している領域）に特異的に結合する。ある特定の実施形態では、抗体または断片は（たとえば、本明細書に記載される方法において使用するための）は、対象におけるがんの起源である組織型の正常な細胞の形質膜表面には、結合しないか、または最小限にしか結合しない。
【０１２３】
治療される対象がヒトである場合、ある特定の実施形態では、本明細書において使用される抗体またはその断片は、ＨＤＭ２および／またはＨＤＭ４の細胞外からアクセス可能なエピトープ（がん細胞の形質膜表面上に露出している領域）に特異的に結合する。ヒトを処置する一実施形態では、本明細書において使用される抗体またはその断片は、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープ（がん細胞の形質膜表面上に露出している領域）に特異的に結合する（必要に応じて、ＨＤＭ４に結合しないような抗体または断片）。ヒトを処置する一実施形態では、本明細書において使用される抗体またはその断片は、ＨＤＭ４の細胞外からアクセス可能なエピトープ（がん細胞の形質膜表面上に露出している領域）に特異的に結合する（必要に応じて、ＨＤＭ２に結合しないような抗体または断片）。
【０１２４】
対象が、非ヒト動物（たとえば、イヌまたはネコなどの哺乳動物）である場合、本明細書において使用される抗体またはその断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープ（がん細胞の形質膜表面上に露出している領域）に結合し、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４は、そのような動物において発現される、ＨＤＭ２および／またはＨＤＭ４のホモログである。一実施形態では、本明細書において使用される抗体またはその断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープ（がん細胞の形質膜表面上に露出している領域）に結合し、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２は、そのような動物において発現される、ＨＤＭ２のホモログである（必要に応じて、そのような抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ４には結合しない）。一実施形態では、本明細書において使用される抗体またはその断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ４の細胞外からアクセス可能な部分（がん細胞の形質膜表面上に露出している領域）に結合し、Ｍ（Ｈ）ＤＭ４は、そのような動物において発現される、ＨＤＭ４のホモログである（必要に応じて、そのような抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２には結合しない）。
【０１２５】
以下の本発明の説明は、主として、ＨＤＭ２、ならびにそれに対する抗体および抗体断片に関してのものであり、これは、ヒトを処置することに使用するためのものであると理解されるべきであるが、これらの説明は、（ｉ）ＨＤＭ４ならびにそれに対する抗体および抗体断片、ならびにヒトの処置のためのそれらの使用（別途明示的に示されるか文脈により示されない限り）、ならびに（ｉｉ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４ならびにそれに対する抗体および抗体断片、ならびに非ヒト動物、たとえば、哺乳動物の処置のためのそれらの使用（別途明示的に示されるか文脈により示されない限り）にも該当すると考えられるべきであることが、当業者には明らかであろう。好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して処置される患者および対象は、ヒトである。
【０１２６】
好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用される抗ＨＤＭ２抗体またはその断片は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を媒介し、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介し、かつ／または細胞障害性薬物（単数または複数）に結合されている（たとえば、抗体−薬物コンジュゲートである）。好ましい実施形態では、本発明は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の使用を提供する。
【０１２７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用される抗ＨＤＭ２抗体またはその断片は、細胞透過性ペプチドに結合していない。細胞透過性ペプチドは、細胞の形質膜に挿入され、それらに結合している分子を、細胞内へと輸送することができる。そのような細胞透過性ペプチドとしては、膜常在性ペプチド（ＭＲＰ）、アンテナペディアの膜伝達ドメイン、トランス活性型転写活性化因子（ＴＡＴ）、およびペネトラチンペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用される抗ＨＤＭ２抗体またはその断片は、膜常在性ペプチド（ＭＲＰ）、アンテナペディアの膜伝達ドメイン、ＴＡＴ、および／またはペネトラチンペプチドに結合していない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用される抗ＨＤＭ２抗体またはその断片は、細胞の形質膜の脂質二重層に挿入され得る任意のペプチド配列に結合していない。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用される抗ＨＤＭ２抗体またはその断片は、ＭＲＰに結合していない。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って使用される抗ＨＤＭ２抗体またはその断片は、ペネトラチンペプチドに結合していない。
【０１２８】
本明細書に記載される実施例は、ＨＤＭ−２を標的とする抗体が、単独で、がん細胞に選択的に細胞傷害性であることを実証する。さらに、本明細書の実施例に記載されているように、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープが、抗ＨＤＭ２抗体の適切な治療標的であること、およびＨＤＭ２を表面上に発現するがん細胞を、ＨＤＭ２のそのような細胞外領域に対する抗体によって標的とし、破壊することに成功し得ることが、実証されている。具体的には、実施例において提示されるデータにより、選択的なＨＤＭ２特異的抗体は、インタクトながん細胞の表面膜上のＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能な配列に結合することができるが、正常なヒト血液単核細胞の表面膜にはごくわずかな結合を呈することが、実証される。加えて、実施例において提示されるデータにより、そのようなＨＤＭ２特異的抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでがん細胞の成長を阻害し得ることが示され、これらを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて治療剤として使用することができることが、強く示唆される。さらに、実施例において提示されるデータにより、そのようなＨＤＭ２特異的抗体が、化学療法薬と組み合わせた場合に、相乗的な抗腫瘍作用を有し得ることが、示される。
【０１２９】
７．１抗体
Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープ（細胞の形質膜表面上に露出している領域）に（免疫）特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片が、本明細書において提供される。本明細書において使用される「特異的に結合する（ｂｉｎｄ［ｓ］／ｂｉｎｄｉｎｇ）」という用語は、抗体または抗原結合性断片の交差反応性を除外するものではなく、したがって、たとえば、細胞の形質膜表面上に露出しているＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに（免疫）特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片は、ＭＤＭ２にも特異的に結合してもよい（それと交差反応してもよい）。具体的には、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに（免疫）特異的に結合し、抗腫瘍作用を有する（たとえば、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍成長を阻害する）抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体およびその断片が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、がん細胞上において細胞外からアクセス可能であるが、非がん細胞（たとえば、がん細胞と同じ器官型または組織型の非がん性細胞）上ではそうではない、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４のエピトープに特異的に結合する。他の特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４のエピトープに特異的に結合し、がん細胞の形質膜表面上でのこのエピトープの露出またはアクセス可能性は、非がん細胞（たとえば、宿主の器官または組織の非がん性細胞）の形質膜表面上でのその露出またはアクセス可能性と比べて、増加している。Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに（免疫）特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、細胞透過性ペプチド（たとえば、膜常在性ペプチド）に結合していない、抗体またはその抗原結合性断片もまた、本明細書において提供される。
【０１３０】
Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に、具体的には、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに、（免疫）特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、抗体または断片が、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）、またはＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）からなる、抗体またはその抗原結合性断片もまた、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に、具体的には、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに、（免疫）特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であって、ペプチドに特異的に結合し、ペプチドの配列が、ＭＣＮＴＮＭＳＶＰＴＤＧＡＶＴ（配列番号１）、ＴＴＳＱＩＰＡＳＥＱＥ（配列番号２）、またはＣＰＶＣＲＱＰＩＱＭＩＶＬＴＹＦＰ（配列番号３）からなり、そのような抗体または断片が、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗腫瘍作用を有する、および／またはそのような抗体または断片が、細胞透過性ペプチドに結合していない、抗体またはその抗原結合性断片もまた、本明細書において提供される。
【０１３１】
本明細書に記載される重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域を有する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体および断片もまた、本明細書において提供される（たとえば、本明細書において提供される抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３の重鎖可変領域および／または軽鎖可変領域の配列を有し、たとえば、第８節および図２０〜２２を参照されたい）。本明細書に記載される１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体および断片もまた、本明細書において提供される（たとえば、表４〜９および図２０〜２２に提供されるＣＤＲを参照されたい）。
【０１３２】
ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＡｂＭ、Ｃｏｎｔａｃｔ、およびＩＭＧＴを含む、当該技術分野における様々な手法で定義される。ある特定の態様では、抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムに従って定義することができ、これは、配列可変性に基づく（たとえば、Kabat  EA  &  Wu  TT  (1971)  Ann  NY  Acad  Sci  190:  382-391、Kabat  EA  et  al.,  (1991)  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  Fifth  Edition,  U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services,  NIH  Publication  No.  91-3242を参照されたい。特定の実施形態では、Ｋａｂａｔシステムに関して、（ｉ）ＶＨ  ＣＤＲ１は、重鎖のアミノ酸３１位〜３５位に存在し、（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ２は、重鎖のアミノ酸５０位〜６８位または５０位〜６６位に存在し、（ｉｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３は、重鎖のアミノ酸１０１位〜１０５位または９９位〜１０４位または９９位〜１０６位に存在する。特定の実施形態では、Ｋａｂａｔシステムに関して、（ｉ）ＶＬ  ＣＤＲ１は、軽鎖のアミノ酸２４位〜３９位または２４位〜３４位に存在し、（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ２は、軽鎖のアミノ酸５５位〜６１位または５０位〜５６位に存在し、（ｉｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３は、軽鎖のアミノ酸９４位〜１０２位または８９位〜９７位に存在する。当業者には周知のように、Ｋａｂａｔシステムに関して、抗体可変ドメインの実際の線形アミノ酸配列は、フレームワーク領域（ＦＲ）および／またはＣＤＲの短縮または伸長に起因して、より少ないアミノ酸または追加のアミノ酸を含有し得、そのため、アミノ酸のＫａｂａｔ番号は、必ずしも、その線形アミノ酸の番号と同じではない。ＫａｂａｔのＣＤＲ位置は、抗体に応じて変動し得、当該技術分野において公知の方法に従って判定することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体のＣＤＲは、Ｋａｂａｔシステムを使用して判定される。
【０１３３】
ある特定の態様では、抗体のＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａシステムに従って定義することができ、これは、免疫グロブリンの構造ループ領域の位置に基づく（たとえば、Chothia  C  &  Lesk  AM,  (1987),  J  Mol  Biol  196:  901-917、Al-Lazikani  B  et  al.,  (1997)  J  Mol  Biol  273:  927-948、Chothia  C  et  al.,  (1992)  J  Mol  Biol  227:  799-817、Tramontano  A  et  al.,  (1990)  J  Mol  Biol  215(1):  175-82、および米国特許第７，７０９，２２６号を参照されたい）。「ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ」という用語および同様の用語は、当該技術分野において認識されており、Chothia  and  Lesk,  1987,  J.  Mol.  Biol.,  196:901-917の方法に従って判定される抗体のＣＤＲ配列を指し、これが、本明細書において、「ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ」と称される（たとえば、米国特許第７，７０９，２２６号およびMartin,  A.,  "Protein  Sequence  and  Structure  Analysis  of  Antibody  Variable  Domains,"  in  Antibody  Engineering,  Kontermann  and  Dubel,  eds.,  Chapter  31,  pp.  422-439,  Springer-Verlag,  Berlin  (2001)もまた、参照されたい）。特定の実施形態では、Ｃｈｏｔｈｉａシステムに関して、ＶＨ領域におけるアミノ酸残基の番号付けのＫａｂａｔ番号付けシステムを使用して、（ｉ）ＶＨ  ＣＤＲ１は、重鎖のアミノ酸２６位〜３２位に存在し、（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ２は、重鎖のアミノ酸５２位〜５９位または５２位〜５７位に存在し、（ｉｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３は、重鎖のアミノ酸１０１位〜１０５位または９９位〜１０４位または９９位〜１０６位に存在する。特定の実施形態では、Ｃｈｏｔｈｉａシステムに関して、ＶＬ領域におけるアミノ酸残基の番号付けのＫａｂａｔ番号付けシステムを使用して、（ｉ）ＶＬ  ＣＤＲ１は、軽鎖のアミノ酸２４位〜３９位または２４位〜３４位に存在し、（ｉｉ）ＶＬ  ＣＤＲ２は、軽鎖のアミノ酸５５位〜６１位または５０位〜５６位に存在し、（ｉｉｉ）ＶＬ  ＣＤＲ３は、軽鎖のアミノ酸９４位〜１０２位または８９位〜９７位に存在する。ＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲ位置は、抗体に応じて変動し得、当該技術分野において公知の方法に従って判定することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体のＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａシステムを使用して判定される。
【０１３４】
ある特定の態様では、抗体のＣＤＲは、ＡｂＭシステムに従って定義することができ、これは、ＫａｂａｔのＣＤＲおよびＣｈｏｔｈｉａの構造ループの間の折衷案を表すＡｂＭ超可変領域に基づき、ＣＤＲは、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｉｎｃ．）を使用して判定される。特定の実施形態では、ＡｂＭシステムに関して、ＶＨ領域におけるアミノ酸残基の番号付けのＫａｂａｔ番号付けシステムを使用して、（ｉ）ＶＨ  ＣＤＲ１は、重鎖のアミノ酸２６位〜３５位に存在し、（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ２は、重鎖のアミノ酸５０位〜６１位または５０位〜５９位に存在し、（ｉｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３は、重鎖のアミノ酸１０１位〜１０５位または９９位〜１０４位または９９位〜１０６位に存在する。特定の実施形態では、ＡｂＭシステムに関して、ＶＬ領域におけるアミノ酸残基の番号付けのＫａｂａｔ番号付けシステムを使用して、（ｉ）ＶＬ  ＣＤＲ１は、軽鎖のアミノ酸２４位〜３９位または２４位〜３４位に存在し、（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ２は、軽鎖のアミノ酸５５位〜６１位または５０位〜５６位に存在し、（ｉｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３は、軽鎖のアミノ酸９４位〜１０２位または８９位〜９７位に存在する。ＡｂＭのＣＤＲ位置は、抗体に応じて変動し得、当該技術分野において公知の方法に従って判定することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体のＣＤＲは、ＡｂＭ番号付けシステムを使用して判定される。
【０１３５】
ある特定の態様では、抗体のＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムに従って定義することができる（「ＩＭＧＴ（登録商標）、ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）のウェブサイトimgt.org、founder  and  director:  Marie-Paule  Lefranc,  Montpellier,  Franceを参照されたく、たとえば、Lefranc,  M.-P.,  1999,  The  Immunologist,  7:132-136およびLefranc,  M.-P.  et  al.,  1999,  Nucleic  Acids  Res.,  27:209-212を参照されたく、これらのいずれも、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。特定の実施形態では、ＩＭＧＴシステムに関して、（ｉ）ＶＨ  ＣＤＲ１は、重鎖のアミノ酸２７位〜３３位または２６位〜３３位に存在し、（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ２は、重鎖のアミノ酸５１位〜６０位または５１位〜５８位に存在し、（ｉｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３は、重鎖のアミノ酸９９位〜１０５位または９７位〜１０３位に存在する。特定の実施形態では、ＩＭＧＴシステムに関して、（ｉ）ＶＬ  ＣＤＲ１は、軽鎖のアミノ酸２７位〜３７位に存在し、（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ２は、軽鎖のアミノ酸５５位〜５７位に存在し、（ｉｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３は、軽鎖のアミノ酸９４位〜１０２位に存在する。ＩＭＧＴのＣＤＲ位置は、抗体に応じて変動し得、当該技術分野において公知の方法に従って判定することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体のＣＤＲは、ＩＭＧＴシステムを使用して判定される。
【０１３６】
ある特定の態様では、抗体のＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔシステムに従って定義することができる。Ｃｏｎｔａｃｔの定義は、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づく（bioinf.org.uk/abs）（MacCallum  RM  et  al.,  (1996)  J  Mol  Biol  5:  732-745を参照されたく、たとえば、Martin  A.  "Protein  Sequence  and  Structure  Analysis  of  Antibody  Variable  Domains,"  in  Antibody  Engineering,  Kontermann  and  Dubel,  eds.,  Chapter  31,  pp.  422-439,  Springer-Verlag,  Berlin  (2001)もまた参照されたい）。特定の実施形態では、Ｃｏｎｔａｃｔシステムに関して、ＶＨ領域におけるアミノ酸残基の番号付けのＫａｂａｔ番号付けシステムを使用して、（ｉ）ＶＨ  ＣＤＲ１は、重鎖のアミノ酸３０位〜３５位に存在し、（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ２は、重鎖のアミノ酸４７位〜６１位または４７位〜５９位に存在し、（ｉｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３は、重鎖のアミノ酸９９位〜１０４位または９７位〜１０３位または９７位〜１０５位に存在する。特定の実施形態では、Ｃｏｎｔａｃｔシステムに関して、ＶＬ領域におけるアミノ酸残基の番号付けのＫａｂａｔ番号付けシステムを使用して、（ｉ）ＶＬ  ＣＤＲ１は、軽鎖のアミノ酸３０位〜４１位または３０位〜３６位に存在し、（ｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ２は、軽鎖のアミノ酸５１位〜６０位または４６位〜５５位に存在し、（ｉｉｉ）ＶＨ  ＣＤＲ３は、軽鎖のアミノ酸９４位〜１０１位または８９位〜９６位に存在する。ＣｏｎｔａｃｔのＣＤＲ位置は、抗体に応じて変動し得、当該技術分野において公知の方法に従って判定することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体のＣＤＲは、Ｃｏｎｔａｃｔシステムを使用して判定される。
【０１３７】
具体的な実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＣＤＲを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供され、ＣＤＲは、上述のシステムのうちのいずれかに従って定義される。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、本明細書に記載される任意の抗ＨＤＭ２抗体（たとえば、ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３）の１つ、２つ、または３つすべてのＶＨ  ＣＤＲ（好ましくは、３つすべてのＶＨ  ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体またはその抗原結合性断片が、本明細書において提供される。当該技術分野において公知のように、ＶＨは、フレームワーク領域によって包囲されたＶＨ  ＣＤＲ（ＣＤＲおよびＦＲ配列は、ＶＨにおいて、以下の順序で出現する：ＦＲ１−ＶＨ  ＣＤＲ  １−ＦＲ２−ＶＨ  ＣＤＲ  ２−ＦＲ３−ＶＨ  ＣＤＲ  ３−ＦＲ４）を含有し、必要に応じて、フレームワーク領域は、ヒトフレームワーク領域である。ある特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＨ（これは、ＮＭＣ−１０３のＶＨである）の１つ、２つ、または３つすべてのＶＨ  ＣＤＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体またはその抗原結合性断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨ（これは、ＮＭＣ−２０４のＶＨである）の１つ、２つ、または３つすべてのＶＨ  ＣＤＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体またはその抗原結合性断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨ（これは、ＮＭＣ−３０３のＶＨである）の１つ、２つ、または３つすべてのＶＨ  ＣＤＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体またはその抗原結合性断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、そのような抗体または断片は、ヒト化抗体または断片である。
【０１３９】
ある特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、本明細書に記載される任意の抗ＨＤＭ２抗体（たとえば、ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３）の１つ、２つ、または３つすべてのＶＬ  ＣＤＲ（好ましくは、３つすべてのＶＬ  ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体またはその抗原結合性断片が、本明細書において提供される。当該技術分野において公知のように、ＶＬは、フレームワーク領域によって包囲されたＶＬ  ＣＤＲ（ＣＤＲおよびＦＲ配列は、ＶＬにおいて、以下の順序で出現する：ＦＲ１−ＶＬ  ＣＤＲ  １−ＦＲ２−ＶＬ  ＣＤＲ  ２−ＦＲ３−ＶＬ  ＣＤＲ  ３−ＦＲ４）を含有し、必要に応じて、フレームワーク領域は、ヒトフレームワーク領域である。ある特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ（これは、ＮＭＣ−１０３のＶＬである）の１つ、２つ、または３つすべてのＶＬ  ＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体またはその抗原結合性断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＬ（これは、ＮＭＣ−２０４のＶＬである）の１つ、２つ、または３つすべてのＶＬ  ＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体またはその抗原結合性断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＬ（これは、ＮＭＣ−３０３のＶＬである）の１つ、２つ、または３つすべてのＶＬ  ＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体またはその抗原結合性断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、そのような抗体または断片は、ヒト化抗体または断片である。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、本明細書に記載される任意の抗ＨＤＭ２抗体（たとえば、ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３）の１つ、２つ、または３つすべてのＶＨ  ＣＤＲ（好ましくは、３つすべてのＶＨ  ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、そのような抗ＨＤＭ２抗体の１つ、２つ、または３つすべてのＶＬ  ＣＤＲ（好ましくは、３つすべてのＶＬ  ＣＤＲ）を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体またはその抗原結合性断片が、本明細書において提供される。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合し、表４（ＮＭＣ−１０３のＶＨ  ＣＤＲを提供する）において識別される１つ、２つ、または３つすべてのＶＨ  ＣＤＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合し、表４において識別されるＶＨ  ＣＤＲ３（「ＣＤＲ−Ｈ３」）を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合し、表５（ＮＭＣ−１０３のＶＬ  ＣＤＲを提供する）において識別される１つ、２つ、または３つすべてのＶＬ  ＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合し、表４において識別される１つ、２つ、または３つすべてのＶＨ  ＣＤＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、表５において識別される１つ、２つ、または３つすべてのＶＬ  ＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合し、表６（ＮＭＣ−２０４のＶＨ  ＣＤＲを提供する）において識別される１つ、２つ、または３つすべてのＶＨ  ＣＤＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合し、表６において識別されるＶＨ  ＣＤＲ３（「ＣＤＲ−Ｈ３」）を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合し、表７（ＮＭＣ−２０４のＶＬ  ＣＤＲを提供する）において識別される１つ、２つ、または３つすべてのＶＬ  ＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合し、表６において識別される１つ、２つ、または３つすべてのＶＨ  ＣＤＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、表７において識別される１つ、２つ、または３つすべてのＶＬ  ＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合し、表８（ＮＭＣ−３０３のＶＨ  ＣＤＲを提供する）において識別される１つ、２つ、または３つすべてのＶＨ  ＣＤＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合し、表８において識別されるＶＨ  ＣＤＲ３（「ＣＤＲ−Ｈ３」）を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合し、表９（ＮＭＣ−３０３のＶＬ  ＣＤＲを提供する）において識別される１つ、２つ、または３つすべてのＶＬ  ＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合し、表８において識別される１つ、２つ、または３つすべてのＶＨ  ＣＤＲを有する重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、表９において識別される１つ、２つ、または３つすべてのＶＬ  ＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、本明細書に記載される任意の抗体のＶＨ、たとえば、第８節または図２０〜２２に提供される任意の抗体のＶＨ（たとえば、ＮＭＣ−１０３のＶＨ、ＮＭＣ−２０４のＶＨ、またはＮＭＣ−３０３のＶＨ）、またはそれらに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＶＨを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、本明細書に記載される任意の抗体のＶＬ、たとえば、第８節または図２０〜２２に提供される任意の抗体のＶＬ（たとえば、ＮＭＣ−１０３のＶＬ、ＮＭＣ−２０４のＶＬ、またはＮＭＣ−３０３のＶＬ）、またはそれらに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＶＬを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、これらの配列における置換、挿入、または欠失は、ＣＤＲの外部の領域（すなわち、ＦＲ）において生じる。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、本明細書に記載される任意の抗体のＶＨおよびＶＬ、たとえば、第８節または図２０〜２２に提供される任意の抗体のＶＨおよびＶＬ（たとえば、ＮＭＣ−１０３のＶＨおよびＶＬ、ＮＭＣ−２０４のＶＨおよびＶＬ、またはＮＭＣ−３０３のＶＨおよびＶＬ）、またはそれらに対して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは９９％の配列同一性を有するＶＨおよびＶＬを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【０１４６】
ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を有するＶＨ、もしくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有するＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を有するＶＬ、もしくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有するＶＬを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【０１４７】
ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、（ｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を有するＶＨ、もしくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有するＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を有するＶＬ、もしくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有するＶＬを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２に特異的に結合する抗体またはその断片であって、（ｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を有するＶＨ、もしくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有するＶＨ、および／または（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を有するＶＬ、もしくはそれに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性を有するＶＬを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【０１４９】
ある特定の態様では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＬの１つもしくは複数のＫａｂａｔのＶＬ  ＣＤＲ、ならびに／または本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨの１つもしくは複数のＫａｂａｔのＶＨ  ＣＤＲを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨのＫａｂａｔのＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＬの３つのＫａｂａｔのＶＬ  ＣＤＲ、ならびに／または本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨの３つのＫａｂａｔのＶＨ  ＣＤＲを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【０１５０】
ある特定の態様では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＬの１つもしくは複数のＣｈｏｔｈｉａのＶＬ  ＣＤＲ、ならびに／または本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨの１つもしくは複数のＣｈｏｔｈｉａのＶＨ  ＣＤＲを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨのＣｈｏｔｈｉａのＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＬの３つのＣｈｏｔｈｉａのＶＬ  ＣＤＲ、ならびに／または本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨの３つのＣｈｏｔｈｉａのＶＨ  ＣＤＲを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【０１５１】
ある特定の態様では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＬの１つもしくは複数のＡｂＭのＶＬ  ＣＤＲ、ならびに／または本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨの１つもしくは複数のＡｂＭのＶＨ  ＣＤＲを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨのＡｂＭのＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＬの３つのＡｂＭのＶＬ  ＣＤＲ、ならびに／または本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨの３つのＡｂＭのＶＨ  ＣＤＲを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【０１５２】
ある特定の態様では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＬの１つもしくは複数のＣｏｎｔａｃｔのＶＬ  ＣＤＲ、ならびに／または本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨの１つもしくは複数のＣｏｎｔａｃｔのＶＨ  ＣＤＲを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨのＣｏｎｔａｃｔのＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＬの３つのＣｏｎｔａｃｔのＶＬ  ＣＤＲ、ならびに／または本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨの３つのＣｏｎｔａｃｔのＶＨ  ＣＤＲを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【０１５３】
ある特定の態様では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＬの１つもしくは複数のＩＭＧＴのＶＬ  ＣＤＲ、ならびに／または本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨの１つもしくは複数のＩＭＧＴのＶＨ  ＣＤＲを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨのＩＭＧＴのＶＨ  ＣＤＲ  ３を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。一実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＬの３つのＩＭＧＴのＶＬ  ＣＤＲ、ならびに／または本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つ（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＶＨの３つのＩＭＧＴのＶＨ  ＣＤＲを含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合し、ＫａｂａｔのＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、ＡｂＭ  ＣＤＲ、ＩＭＧＴ  ＣＤＲ、およびＣｏｎｔａｃｔ  ＣＤＲの組合せ（またはこれらのＣＤＲ定義システムのうちのいずれか２つ、３つ、４つ、または５つによって定義されるＣＤＲの組合せ）を含む、抗体またはその断片が、本明細書において提供される。
【０１５５】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体のＶＨ（たとえば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）および／またはＶＬ（たとえば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）領域に沿った１つまたは複数のＣＤＲの位置は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）への免疫特異的結合が維持される（たとえば、実質的に、たとえば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％維持される）限り、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸位で変動してもよい。たとえば、一実施形態では、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか（抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）のＣＤＲを定義する位置は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）への免疫特異的結合が維持される（たとえば、実質的に、たとえば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％維持される）限り、ＣＤＲのＮ末端および／またはＣ末端の境界部を、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのアミノ酸、偏位させることによって、変動してもよい。別の実施形態では、本明細書に記載される抗体のＶＨ（たとえば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）および／またはＶＬ（たとえば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）領域に沿った１つまたは複数のＣＤＲの長さは、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）への免疫特異的結合が維持される（たとえば、実質的に、たとえば、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％維持される）限り、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはそれを上回るアミノ酸で、変動してもよい（たとえば、短くてもよく、または長くてもよい）。
【０１５６】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）抗体は、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか（マウス抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のうちのいずれか１つ）の、それぞれ３つのＶＨ  ＣＤＲおよび３つのＶＬ  ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３）、ヒトまたはヒトに由来するフレームワーク領域、ならびにヒトまたはヒトに由来する定常領域を含む、ヒト化免疫グロブリン（たとえば、ＩｇＧ）であり、そのようなヒト化抗体の抗原結合性断片もまた、本発明によって提供される。ヒトフレームワーク領域の非限定的な例は、当該技術分野において説明されており、たとえば、Kabat  et  al.  (1991)  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  Fifth  Edition,  U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services,  NIH  Publication  No.  91-3242）を参照されたい。ある特定の実施形態では、ヒト化抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書に記載されるＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３（たとえば、ＭＮＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３のもの）が、ヒトフレームワーク領域であるかまたはヒトフレームワーク領域に由来するＶＨフレームワーク領域によって包囲された、ＶＨを含む。ある特定の実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）抗体またはその抗原結合性断片は、本明細書に記載されるＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３（たとえば、ＭＮＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３のもの）が、ヒトフレームワーク領域であるかまたはヒトフレームワーク領域に由来するＶＬフレームワーク領域によって包囲された、ＶＬを含む。ある特定の実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）抗体またはその抗原結合性断片は、（ｉ）本明細書に記載されるＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３（たとえば、ＭＮＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３のもの）が、ヒトフレームワーク領域であるかまたはヒトフレームワーク領域に由来するＶＨフレームワーク領域によって包囲された、ＶＨ、ならびに（ｉｉ）本明細書に記載されるＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３（たとえば、ＭＮＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３のもの）が、ヒトフレームワーク領域であるかまたはヒトフレームワーク領域に由来するＶＬフレームワーク領域によって包囲された、ＶＬを含む。
【０１５７】
使用することができるヒトフレームワーク領域としては、（ｉ）「最適適合（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」方法（たとえば、Sims  et  al.  J.  Immunol.  151:2296  (1993)を参照されたい）を使用して選択されるフレームワーク領域、（ｉｉ）軽鎖または重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（たとえば、Carter  et  al.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  89:4285  (1992)、およびPresta  et  al.  J.  Immunol.,  151:2623  (1993)を参照されたい）、（ｉｉｉ）ヒト成熟（体細胞変異型）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域（たとえば、Almagro  and  Fransson,  Front.  Biosci.  13:1619-1633  (2008)を参照されたい）、ならびに（ｉｖ）ＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（たとえば、Baca  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  272:10678-10684  (1997)およびRosok  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  271:22611-22618  (1996)を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。ヒトフレームワーク領域の一覧については、たとえば、Chothia  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  278:  457-479  (1998)を参照されたい。
【０１５８】
特定の実施形態では、慣例的な組換えＤＮＡ技法を使用して、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）またはその抗原結合性断片のＣＤＲのうちの１つまたは複数を、公知のフレームワーク領域内に挿入することができる。フレームワーク領域は、天然に存在するフレームワーク領域またはコンセンサスフレームワーク領域、好ましくは、ヒトフレームワーク領域であり得る。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合する抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）またはその抗原結合性断片をコードする、フレームワーク領域およびＣＤＲの組合せを含むポリヌクレオチドが、本明細書に記載される。１つまたは複数の（たとえば、１つまたは２つまたは３つの）アミノ酸置換が、フレームワーク領域内に行われてもよく、好ましくは、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）への抗体の結合を改善する１つまたは複数の（たとえば、１つまたは２つまたは３つの）アミノ酸置換が、行われ得る。
【０１６０】
抗体またはその断片がヒト化されていない代替的な実施形態では、可変ドメイン内のフレームワーク領域は、本来の（たとえば、マウス）抗体のものであってもよい）。
【０１６１】
本明細書において提供される抗体には、がん細胞の形質膜表面上でアクセス可能なＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外領域（エピトープ）（たとえば、がん細胞の形質膜上に、非がん細胞上よりも高いレベルで発現または露出されているエピトープ（たとえば、そのようながん細胞および非がん細胞が、同じ組織を起源とする場合））に特異的に結合する、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片（すなわち、抗原結合性部位を有する分子）が含まれる。
【０１６２】
好ましい実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、モノクローナル抗体またはその断片である。本明細書に記載される抗体および断片は、好ましくは、ヒト、ヒト化、またはキメラである。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリンであってもよく、これは、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離されてもよく、またはヒト遺伝子に由来する抗体を発現するマウスもしくは他の動物から単離されてもよい。一実施形態では、本明細書において提供される抗体は、ヒト（またはヒト抗体の断片）である。一実施形態では、本明細書において提供される抗体は、ヒト化（またはヒト化抗体の断片）である。一実施形態では、本明細書において提供される抗体は、キメラ（またはキメラ抗体の断片）である（キメラ抗体は、１つの種（たとえば、マウス）の可変領域および別の種（たとえば、ヒト）の定常領域を有する抗体である）。好ましくは、本明細書において提供される抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラモノクローナル抗体である（これは、ヒト対象の処置に特に好適である）。一実施形態では、本明細書において提供される抗体は、合成抗体である。一実施形態では、本明細書において提供される抗体は、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）である。一実施形態では、本明細書において提供される抗体は、一本鎖抗体、たとえば、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。一実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体の抗原結合性断片が、本明細書において提供され、この断片は、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、またはジスルフィド結合型Ｆｖ（ｓｄＦｖ）であり得るが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書において提供される抗原結合性断片は、Ｆｖ断片である。一実施形態では、本明細書において提供される抗原結合性断片は、Ｆａｂ断片である。一実施形態では、本明細書において提供される抗原結合性断片は、Ｆ（ａｂ’）２断片である。一実施形態では、本明細書において提供される抗原結合性断片は、Ｆ（ａｂ’）断片である。
【０１６３】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、がん細胞の形質膜表面上に露出しているＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、第２の抗原に特異的に結合する、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）であり、そのような結合により、エフェクター細胞を、腫瘍細胞へと再標的化することが可能となる（異なる標的を目的とするそのような操作された二重特異性抗体の例としては、Ｔ細胞標的化剤であるカツマキソマブと称される抗体について記載しているChames  et  al.,  2009,  MAbs  1:539-547を参照されたい）。一実施形態では、本明細書において提供される抗体は、がん細胞の形質膜表面上に露出しているＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、エフェクター細胞の形質膜表面上に露出している抗原にも結合する、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）である。エフェクター細胞としては、Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、樹状細胞、およびＢリンパ球が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書において提供される抗体は、がん細胞の形質膜表面上に露出しているＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、Ｔ細胞（たとえば、細胞傷害性Ｔ細胞）の表面上に露出している抗原にも特異的に結合する、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）である。一実施形態では、本明細書において提供される抗体は、がん細胞の形質膜表面上に露出しているＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、ＣＤ３にも特異的に結合する、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）である。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、がん細胞の形質膜表面上に露出しているＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、樹状細胞、および／またはＢリンパ球の表面上に露出している抗原にも特異的に結合する、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）である。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、がん細胞の形質膜表面上に露出しているＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、好中球、マクロファージ、樹状細胞、および／またはＢリンパ球の表面上に露出している抗原にも特異的に結合する、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）である。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体は、がん細胞の形質膜表面上に露出しているＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合し、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および／または樹状細胞の表面上に露出している抗原にも特異的に結合する、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体）である。
【０１６４】
ヒト対象が処置される好ましい実施形態では、使用される抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラであるモノクローナル抗体またはその抗原結合性断片である。
【０１６５】
たとえば、非ヒト対象、たとえば、ネコ、イヌ、ウシ、ならびに他の飼育動物、家畜、および野生動物が処置されるある特定の実施形態では、抗体は、処置される種における使用に適切な抗体または断片（すなわち、その種のもの）であり得る。本明細書に記載される抗体は、任意の動物種、たとえば、哺乳動物（たとえば、マウス、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、イヌ、ネコ）、または鳥類（たとえば、ニワトリ）に由来し得る。
【０１６６】
抗体が免疫グロブリンである特定の実施形態では、使用することができる免疫グロブリン分子は、任意の種類（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、またはサブクラスの免疫グロブリン分子のものである。好ましい実施形態では、抗体は、免疫グロブリンであり、具体的には、ＩｇＧである。別の実施形態では、抗体は、ＩｇＭである。
【０１６７】
好ましい実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、および／または抗体もしくは断片に結合した細胞障害性薬物に起因する細胞傷害性を媒介する、抗体または断片である。
【０１６８】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、そのような抗体または断片によって標的とされているがん細胞に対して細胞傷害性を誘導することができる抗体または断片であり、細胞傷害性は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）に起因するものであってもよく、または抗体に結合した薬物の細胞傷害性に起因するものであってもよい（使用される抗体が、抗体−薬物コンジュゲートの形態である場合）。
【０１６９】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を媒介する抗体または断片である。ＣＤＣ機能を有する抗体を作製する方法は、当該技術分野において公知である。ＣＤＣ活性が所望される一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）型またはヒトＩｇＭ型のものである。ＣＤＣ活性が所望される一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、マウスＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３）またはマウスＩｇＭ型のものである。一実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのものである。一実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ３アイソタイプのものである。一実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ２アイソタイプのものである。一実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、そのＣＤＣ活性を増加させるように生体操作（たとえば、変異）されている。一実施形態では、抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４上の２つの異なる細胞外エピトープに特異的に結合する二重特異性抗体または断片である（たとえば、これにより、補体活性化の増幅、がん細胞表面膜上の断片（Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄ、Ｃ３ｇ、Ｃ４ｂ）の沈着の増加、および／またはＭＡＣによるがん細胞死滅の増加がもたらされ得る）。別の実施形態では、抗体または断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外エピトープに特異的に結合し、補体調節タンパク質（ＣＲＰ）の細胞外エピトープに特異的に結合する、二重特異性抗体または断片である（たとえば、ＣＲＰによる新たに沈着した免疫学的に活性な断片（Ｃ３ｂ、ｉＣ３ｂ、Ｃ３ｄ、Ｃ３ｇ、Ｃ４ｂ）の分解が予防され得、補体カスケードの活性化が増幅され得、かつ／またはＭＡＣにより誘導されるがん細胞の溶解が増幅され得る）。そのような二重特異性抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、ＣＤＣ活性を増加させ得るか、ＡＤＣＣ活性を増加させ得るか、好中球およびマクロファージによる抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を増加させ得るか、またはＣＤＣ、ＡＤＣＣ、およびＡＤＣＰを増加させ得る。
【０１７０】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）および／または抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を媒介する抗体または断片である。
【０１７１】
ＡＤＣＣ機能を有する抗体を作製する方法は、当該技術分野において公知である。ＡＤＣＰ機能を有する抗体を作製する方法は、当該技術分野において公知である。一般に、抗体のＦｃ領域は、好中球、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、好酸球、およびマスト細胞上のＦｃ受容体、ＦｃＲへのその結合を媒介し、これにより、ＡＤＣＣが引き起こされ、好中球、マクロファージ、および樹状細胞上において、ＡＤＣＰが生じる。ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ活性が所望される一部の実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３）型またはヒトＩｇＥ型のものである。一実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのものである。
【０１７２】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、そのＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を増加させるように、（たとえば、架橋により、ジスルフィド結合の形成により、オリゴ糖付加により、または変異により）生体操作されている。一実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、インタクトな抗体の寿命を増加させるように変異されている（たとえば、Vaccaro  et  al.,  2005,  Nat  Biotechnol.  23:1283-8128に記載される方法によるものであり、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。別の実施形態では、効力をＣＤＣではなくＡＤＣＣ／ＡＤＣＰの方へと指向させるため、または３つすべての細胞傷害性活性（すなわち、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣ）の効率性を増加させるために、Ｆｃ  ＣＨ２およびＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸置換を、用いることができる。別の実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域のＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインは、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰ機能を改善するために、たとえば、例として、Satoh  et  al.,  2006,  Expert  Opin  Biol  Ther.  6:1161-1173および／またはLiu  et  al.,  2015,  Ca  Immunol  Res.  3:173-183に記載される方法に従って、フコース残基を除去／低減させるように、それらのグリコシル化部位が修飾されており、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１７３】
特定の実施形態では、ＩｇＧ  Ｆｃ領域を有する本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、それらのグリコシル化部位におけるＮ−グリカン構造をＧｌｃＮＡｃ（Ｎ−アセチルグルコサミン）で終結するＧ０グリカン型に変化させ、フコースおよびシアル酸残基（これらは、たとえば、補体経路の古典的経路および代替的な経路の両方の活性化、ならびに炎症性応答中に分泌されるマンノース結合レクチンを含むレクチンへの結合の増加をもたらし得る）を有さないように、それらのＦｃ領域が生体操作されている。
【０１７４】
一実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのものであり、そのＣＨ２ドメインの３３３位に、アラニン置換を有する。一実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのものであり、三重変異Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ（これは、ＦｃγＲＩＩＩａに対するより高い親和性およびＦｃγＲＩＩｂに対するより低い親和性をもたらし、ＡＤＣＣの増強をもたらす）を有する（そのようなＦｃ修飾は、たとえば、Lazar  et  al.,  2006,  PNAS  103:4005-4010に記載される方法に従って行うことができる）。一実施形態では、本明細書に記載される抗体のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１アイソタイプのものであり、三重変異Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ｇ２３６Ａ（これは、ＦｃγＲＩＩＩａ親和性およびＦｃγＲＩＩａ／ＦｃγＲＩＩｂ比の改善をもたらし、マクロファージによる標的細胞のファゴサイトーシスの増強を媒介する）を有する（そのようなＦｃ修飾は、たとえば、Richards  et  al.,  2008,  Mol.Cancer  Ther.  7:2517-27に記載される方法に従って行うことができる）。
【０１７５】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の両方を媒介する抗体または断片である。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、および抗体依存性細胞ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）を媒介する抗体または断片である。他の実施形態では、ＣＤＣ活性のみまたはＡＤＣＣ活性のみを媒介する抗体または断片が、本明細書において企図される。本明細書に記載される抗体のＣＤＣおよびＡＤＣＣ機能は、当該技術分野において公知の任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性アッセイによって試験することができる。ある特定の実施形態では、本明細書において使用される抗体または断片は、そのＣＤＣまたはＡＤＣＣ活性を改善する１つまたは複数のアミノ酸変異または置換（たとえば、本明細書に記載されるかまたは当該技術分野において公知の任意の変異または置換（たとえば、Idusogie  et  al.,  2001.  J  Immunol.  166(4):2571-5、Strohl,  2009,  Curr  Opin  Biotechnol.  20(6):685-91、Lazar  et  al.,  2006,  PNAS  103(11):  4005-4010を参照されたく、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる））を、Ｆｃ領域に含む。
【０１７６】
特定の実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、コンジュゲートされていない、たとえば、細胞障害性薬物にコンジュゲートされていない）。
【０１７７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、薬物に（たとえば、細胞障害性薬物に）結合していない（たとえば、コンジュゲートされていない）。これらの実施形態のうちの一部では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣを媒介する。
【０１７８】
一実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸１〜１５、１５〜２５、または４７５〜４９１内の細胞外からアクセス可能なセグメント（すなわち、エピトープ）に特異的に結合する。
【０１７９】
一実施形態では、抗ＨＤＭ２抗体またはその断片は、配列番号１（ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸１〜１５である）のアミノ酸内で、ＨＤＭ２に特異的に結合する。配列番号１（配列番号４のアミノ酸１〜１５である）のアミノ酸は、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに含まれる。
【０１８０】
一実施形態では、抗ＨＤＭ２抗体またはその断片は、配列番号２（ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸１５〜２５である）のアミノ酸内で、ＨＤＭ２に特異的に結合する。配列番号２（配列番号４のアミノ酸１５〜２５である）のアミノ酸は、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに含まれる。
【０１８１】
一実施形態では、抗ＨＤＭ２抗体またはその断片は、配列番号３（ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸４７５〜４９１である）のアミノ酸内で、ＨＤＭ２に特異的に結合する。配列番号３（配列番号４のアミノ酸４７５〜４９１である）のアミノ酸は、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに含まれる。
【０１８２】
一実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（配列番号４または配列番号６）のアミノ酸５０〜６０内のＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０１８３】
一実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（配列番号４または配列番号６）のアミノ酸１００〜１１０内のＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０１８４】
一実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（配列番号４または配列番号６）のアミノ酸１〜１２６内のＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外エピトープに特異的に結合する。
【０１８５】
一実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（配列番号４または配列番号６）のアミノ酸４３６〜４８２内のＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０１８６】
一実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、処置されているがん型の細胞の形質膜上に発現されることが公知であるかもしくは予測されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４タンパク質バリアント（スプライスバリアント）、または処置されている対象のがん細胞の形質膜上に発現されると判定されているＭ（Ｈ）ＤＭ２／４タンパク質バリアント（スプライスバリアント））のＣ末端における末端の１００個のアミノ酸内の、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０１８７】
本発明はまた、ＨＤＭ２への結合について、配列番号１のアミノ酸配列内でＨＤＭ２に特異的に結合する抗体（たとえば、本明細書に記載されるＮＭＣ−１０３抗体、またはＮＭＣ−１０３のＶＨ（すなわち、配列番号３６のＶＨ）およびＮＭＣ−１０３のＶＬ（すなわち、配列番号３７のＶＬ）を有する任意の抗体もしくは断片、またはＮＭＣ−１０３のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲを有する任意の抗体もしくは断片）と競合する、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片も、提供する。本発明はまた、ＨＤＭ２への結合について、配列番号２のアミノ酸配列内でＨＤＭ２に特異的に結合する抗体（たとえば、本明細書に記載されるＮＭＣ−２０４抗体、またはＮＭＣ−２０４のＶＨ（すなわち、配列番号３８のＶＨ）およびＮＭＣ−２０４のＶＬ（すなわち、配列番号３９のＶＬ）を有する任意の抗体もしくは断片、またはＮＭＣ２０４のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲを有する任意の抗体もしくは断片）と競合する、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片も、提供する。本発明はまた、ＨＤＭ２への結合について、配列番号３のアミノ酸配列内でＨＤＭ２に特異的に結合する抗体（たとえば、本明細書に記載されるＮＭＣ−３０３抗体、またはＮＭＣ−３０３のＶＨ（すなわち、配列番号４０のＶＨ）およびＮＭＣ−３０３のＶＬ（すなわち、配列番号４１のＶＬ）を有する任意の抗体もしくは断片、またはＮＭＣ−３０３のＶＨおよびＶＬ  ＣＤＲを有する任意の抗体もしくは断片）と競合する、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片も、提供する。
【０１８８】
当該技術分野において公知の任意の競合アッセイを使用して、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、本明細書に記載される抗体と競合する抗体を識別することができる（Harlow  and  Lane  (1988)  Antibodies:  A  Laboratory  Manual  ch.14  (Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  Cold  Spring  Harbor,  NY)を参照されたい）。例示的な競合アッセイでは、固定化されたＭ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、マイクロプレートまたはウェルに固定化されている）を、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４に結合する第１の標識化抗体、およびＭ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について第１の抗体と競合するその能力について試験される第２の未標識抗体を含む溶液中で、インキュベートする。対照として、固定化されたＭ（Ｈ）ＤＭ２／４を、第１の標識化抗体を含むが第２の未標識抗体を含まない溶液中で、インキュベートしてもよい。インキュベーションの後に、過剰な未結合抗体を除去し、固定化されたＭ（Ｈ）ＤＭ２／４に会合した標識の量を測定する。試験試料中の標識の量の、対照試料と比べた実質的な低減は、第２の抗体が、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、第１の抗体と競合することを示す。
【０１８９】
特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、本明細書に記載される抗体（たとえば、ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３のＶＨおよびＶＬを有する抗体）と競合する抗体はまた、そのような抗体が結合するＭ（Ｈ）ＤＭ２／４に由来する同じペプチド（たとえば、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のペプチド）にも結合する。特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、本明細書に記載される抗体（たとえば、ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３のＶＨおよびＶＬを有する抗体）と競合する抗体は、そのような抗体が結合するＭ（Ｈ）ＤＭ２／４中の同じエピトープにも結合する。
【０１９０】
一実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、配列番号３６のＶＨおよび配列番号３７のＶＬを有する抗体または断片と同じ、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４のエピトープに結合する。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、配列番号３８のＶＨおよび配列番号３９のＶＬを有する抗体または断片と同じ、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４のエピトープに結合する。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、配列番号４０のＶＨおよび配列番号４１のＶＬを有する抗体または断片と同じ、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４のエピトープに結合する。
【０１９１】
一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸１９〜５０内の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０１９２】
一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸１９〜１０８内の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０１９３】
一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸１５４〜１６７内の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０１９４】
一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸１〜６０内の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０１９５】
一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸１〜１００内の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０１９６】
一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸１〜１０８内の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０１９７】
一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸２６〜６０内の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０１９８】
一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２（たとえば、処置されているがん型の細胞の形質膜上に発現されることが公知もしくは予測されるＨＤＭ２タンパク質バリアント（スプライスバリアント）、または処置されている対象のがん細胞の形質膜上に発現されると判定されているＨＤＭ２タンパク質バリアント（スプライスバリアント））のＣ末端における末端の６０個のアミノ酸内の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０１９９】
一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２（たとえば、処置されているがん型の細胞の形質膜上に発現されることが公知もしくは予測されるＨＤＭ２タンパク質バリアント（スプライスバリアント）、または処置されている対象のがん細胞の形質膜上に発現されると判定されているＨＤＭ２タンパク質バリアント（スプライスバリアント））のＣ末端における末端の１００個のアミノ酸内の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０２００】
一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２（配列番号４）のアミノ酸１０１〜２００内の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する。
【０２０１】
一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２への結合について、抗体ＯＰ１４５（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍから市販入手可能なモノクローナル抗体、カタログ番号ＯＰ１４５−１００ＵＧ、ＯＰ１４５に関するさらなる詳細については以下の表１０を参照されたい）と競合する。一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２への結合について、抗体９６５（ＳＭＰ１４）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから市販入手可能なモノクローナル抗体、カタログ番号Ｓｃ−９６５、９６５（ＳＭＰ１４）に関するさらなる詳細については以下の表３および１０を参照されたい）と競合する。一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２への結合について、抗体ｓｃ−８１３（Ｎ−２０）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから市販入手可能なポリクローナル抗体、カタログ番号Ｓｃ−８１３、ｓｃ−８１３（Ｎ−２０）に関するさらなる詳細については以下の表１０を参照されたい）と競合する。一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２への結合について、抗体ｓｃ−８１２（Ｃ−１８）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから市販入手可能なポリクローナル抗体、カタログ番号Ｓｃ−８１２、ｓｃ−８１２（Ｃ−１８）に関するさらなる詳細については以下の表１０を参照されたい）と競合する。一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＨＤＭ２への結合について、抗体Ｍ０１、クローン１Ａ７（Ａｂｎｏｖａから市販入手可能なモノクローナル抗体、カタログ番号Ｈ００００４１９３−Ｍ０１、Ｍ０１、クローン１Ａ７に関するさらなる詳細については以下の表３を参照されたい）と競合する。
【０２０２】
当該技術分野において公知の任意の競合アッセイを使用して、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）への結合について、抗体ＯＰ１４５、ＳＭＰ１４、Ｎ−２０、Ｃ−１８、またはＭ０１、クローン１Ａ７と競合する抗体を識別することができる（Harlow  and  Lane  (1988)  Antibodies:  A  Laboratory  Manual  ch.14  (Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  Cold  Spring  Harbor,  NY)を参照されたい）。
【０２０３】
特定の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４への結合について、抗体ＯＰ１４５、ＳＭＰ１４、Ｎ−２０、Ｃ−１８、またはＭ０１、クローン１Ａ７と競合する抗体はまた、そのような抗体が結合する同じエピトープに結合する。
【０２０４】
一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、抗体ＯＰ１４５と同じ、ＨＤＭ２のエピトープに結合する（ＯＰ１４５に関するさらなる詳細については、以下の表１０を参照されたい）。一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、抗体９６５（ＳＭＰ１４）と同じ、ＨＤＭ２のエピトープに結合する（９６５（ＳＭＰ１４）に関するさらなる詳細については、以下の表３および１０を参照されたい）。一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ポリクローナル抗体ｓｃ−８１３（Ｎ−２０）と同じ、ＨＤＭ２のエピトープのうちの１つに結合する（８１３（Ｎ−２０）に関するさらなる詳細については、以下の表１０を参照されたい）。一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ポリクローナル抗体ｓｃ−８１２（Ｃ−１８）と同じ、ＨＤＭ２のエピトープのうちの１つに結合する（ｓｃ−８１２（Ｃ−１８）に関するさらなる詳細については、以下の表１０を参照されたい）。一実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、抗体Ｍ０１、クローン１Ａ７（すなわち、Ａｂｎｏｖａから市販入手可能なモノクローナル抗体、カタログ番号Ｈ００００４１９３−Ｍ０１、Ｍ０１、クローン１Ａ７に関するさらなる詳細については以下の表３を参照されたい）と同じ、ＨＤＭ２のエピトープに結合する。
【０２０５】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、精製されている。ある特定の実施形態では、抗体または断片は、たとえば、電気泳動法（たとえば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）、またはクロマトグラフィー法（たとえば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって判定した場合に、９５％または９９％を上回る純度まで、精製されている（たとえば、抗体純度の評価のための方法の考察については、Flatman  et  al.,  J.  Chromatogr.  B  848:79-87  (2007)を参照されたい）。
【０２０６】
本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、検出可能な標識または物質に融合またはコンジュゲートされていてもよい（たとえば、共有結合または非共有結合により連結されていてもよい）。そのような標識化抗体または断片は、細胞の形質膜表面上のＭ（Ｈ）ＤＭ２／４を検出するために使用することができる。
【０２０７】
検出可能な標識または物質の例としては、酵素標識、放射性同位体（たとえば、ヨウ素、炭素、硫黄、トリチウム、インジウム、およびテクネチウム）、発光標識、蛍光標識、およびビオチンが挙げられる。この手法は、ある特定のがんの細胞（たとえば、患者におけるがんの細胞）が、形質膜上において、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４またはＭ（Ｈ）ＤＭ２／４のある特定のスプライスバリアントを発現するかどうかを判定するために使用することができ、抗体（または断片）を使用したＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の検出は、抗体（または断片）（検出可能な標識または物質を有するまたは有さない）を、がんの診断および処置またはがんの転移の予防に使用することができることを示し得る。
【０２０８】
７．２  抗体−薬物コンジュゲート
特定の実施形態では、本発明は、細胞障害性薬物に結合した（たとえば、共有結合により結合した）、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片を含む、抗体−薬物コンジュゲートを提供する。そのような実施形態では、抗体−薬物コンジュゲートは、がんの細胞への細胞障害性薬物の送達による細胞傷害性を媒介することが意図される。
【０２０９】
したがって、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または抗原結合性断片は、１つまたは複数の細胞障害性薬剤に結合またはコンジュゲートされ得る。細胞障害性薬剤は、生体細胞機能（たとえば、細胞分裂）を阻害もしくは予防する、および／または細胞死もしくは破壊を引き起こす、任意の薬剤であり得る。抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片に結合またはコンジュゲートされ得る細胞障害性薬剤としては、化学療法剤（たとえば、当該技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載される任意の化学療法剤）、毒素（たとえば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素的に活性な毒素、またはそれらの断片）、放射性同位体、成長阻害剤、および核酸分解酵素が挙げられるが、これらに限定されない。抗体−薬物コンジュゲートおよびそれらを作製する方法（そのようなコンジュゲートにおいて使用することができる抗体、そのようなコンジュゲートにおいて使用することができる薬物、および抗体を薬物に連結させるために使用することができるリンカーの種類を含む）は、当該技術分野において公知である（たとえば、Peters  &  Brown,  2015,  Biosci.  Rep.  35,  e00225,  doi:10.1042/BSR20150089を参照されたい）。
【０２１０】
本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片にコンジュゲートされ得る細胞障害性薬剤の例としては、アントラサイクリン、ドキソルビシン、メトトレキサート、抗代謝剤、抗葉酸剤、オーリスタチン（たとえば、ＭＭＡＥまたはＭＭＡＦ）、マイタンシン、カリケアマイシン、デュオカリムチン（duocarymucin）、およびピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２１１】
特定の実施形態では、本明細書に記載されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、以下の薬物のうちの１つまたは複数にコンジュゲートされる：マイタンシノイド、オーリスタチン（たとえば、モノメチルオーリスタチン薬物部分ＤＥおよびＤＦ（ＭＭＡＥおよびＭＭＡＦ））、ドラスタチン、カリケアマイシンまたはそれらの誘導体、アントラサイクリン（たとえば、ダウノマイシンまたはドキソルビシン）、メトトレキサート、ビンデシン、タキサン（たとえば、ドセタキセル）、パクリタキセル、ラロタキセル、テセタキセル、オルタタキセル、ならびにトリコテセン。
【０２１２】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、毒素またはその断片（たとえば、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ（Phytolaca）・アメリカナ（Ｐｈｙｔｏｌａｃｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ）タンパク質、モモルディカ・カランティア（ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ）阻害剤、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィキナリス（ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、またはトリコテセン）にコンジュゲートされる。
【０２１３】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、放射性同位体（たとえば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、またはＬｕの放射性同位体）にコンジュゲートされる。
【０２１４】
別の実施形態では、本明細書に記載されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、腫瘍部位に集中した抗体の送達およびその保持を促進するために、ナノ粒子または他の標的化ツールにコンジュゲートされる。
【０２１５】
７．３  抗体の作製
本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片は、当該技術分野において公知の任意の方法によって産生することができる。
【０２１６】
ポリクローナル抗体を産生するための方法は、当該技術分野において公知である（たとえば、Chapter  11  in:  Short  Protocols  in  Molecular  Biology,  (2002)  5th  Ed.,  Ausubel  FM  et  al.,  eds.,  John  Wiley  and  Sons,  New  Yorkを参照されたい）。
【０２１７】
モノクローナル抗体を産生するための方法もまた、当該技術分野において公知であり、ハイブリドーマの使用、組換えおよびファージディスプレイ技術、ならびにヒト化マウスの使用が含まれる。たとえば、モノクローナル抗体は、たとえば、Harlow  E  &  Lane  D,  Antibodies:  A  Laboratory  Manual,  (Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  2nd  ed.  1988)、Hammerling  GJ  et  al.,  in:  Monoclonal  Antibodies  and  T-Cell  Hybridomas  563  681  (Elsevier,  N.Y.,  1981)、またはKohler  G  &  Milstein  C  (1975)  Nature  256:  495に教示されるように、ハイブリドーマ技法を使用して、産生することができる。別の例では、ヒトモノクローナル抗体は、たとえば、Laffleur  et  al.,  2012,  Methods  Mol.  Biol.  901:149-59に教示されるように、ヒト化マウスを使用して、産生することができる。
【０２１８】
ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を産生するための方法は、慣例的であり、当該技術分野において周知である。具体的には、マウスまたは別の適切な宿主動物に、免疫付与に使用される標的タンパク質（すなわち、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外領域）に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生することができるリンパ球を誘起するように、免疫付与を行うことができる。リンパ球を、次いで、骨髄腫細胞に融合して、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding  JW  (Ed),  Monoclonal  Antibodies:  Principles  and  Practice,  pp.  59-103  (Academic  Press,  1986)を参照されたく、また、Kozbor  D  (1984)  J  Immunol  133:  3001-5、Brodeur  et  al.,  Monoclonal  Antibody  Production  Techniques  and  Applications,  pp.  51-63  (Marcel  Dekker,  Inc.,  New  York,  1987)も参照されたい）。ハイブリドーマ細胞を、次いで、好適な培養培地において成長させ、これを、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４に対するモノクローナル抗体の産生について、アッセイすることができる。この方法によって産生されたモノクローナル抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体の結合特異性は、当該技術分野において公知の方法、たとえば、免疫沈降またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、たとえば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）もしくは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって、判定することができる。このようにして選択されたハイブリドーマクローンを、次いで、標準的な方法によって成長させる（Goding  JW  (Ed),  Monoclonal  Antibodies:  Principles  and  Practice（上記）を参照されたい）。モノクローナル抗体を、次いで、培養培地から分離させ、精製することができる。
【０２１９】
さらに、本明細書に記載される抗体または断片はまた、当該技術分野において公知の様々なファージディスプレイ技術を使用して作製することもできる（Brinkman  U  et  al.,  (1995)  J  Immunol  Methods  182:  41-50、Ames  RS  et  al.,  (1995)  J  Immunol  Methods  184:  177-186、Kettleborough  CA  et  al.,  (1994)  Eur  J  Immunol  24:  952-958、Persic  L  et  al.,  (1997)  Gene  187:  9-18、およびBurton  DR  &  Barbas  CF  (1994)  Advan  Immunol  57:  191-280を参照されたい）。
【０２２０】
キメラ抗体（すなわち、１つの種（たとえば、マウス）の可変領域および別の種（たとえば、ヒト）の定常領域を有する抗体）を産生するための方法は、当該技術分野において公知である（Morrison  SL  (1985)  Science  229:  1202-7、Oi  VT  &  Morrison  SL  (1986)  BioTechniques  4:  214-221、Gillies  SD  et  al.,  (1989)  J  Immunol  Methods  125:  191-202、ならびに米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、同第４，８１６，３９７号、および同第６，３３１，４１５号を参照されたい）。
【０２２１】
抗体断片を作製する方法は、当該技術分野において公知である。たとえば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、酵素、たとえば、パパイン（Ｆａｂ断片を産生する）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を産生する）を使用する、免疫グロブリン分子のタンパク質分解切断によって、産生することができる。
【０２２２】
ヒト化抗体を作製する方法もまた、当該技術分野において公知である（国際公開番号ＷＯ９１／０９９６７、Padlan  EA  (1991)  Mol  Immunol  28(4/5):  489-498、Studnicka  GM  et  al.,  (1994)  Prot  Engineering  7(6):  805-814、およびRoguska  MA  et  al.,  (1994)  PNAS  91:  969-973、国際公開番号ＷＯ９３／１７１０５、Tan  P  et  al.,  (2002)  J  Immunol  169:  1119-25、Caldas  C  et  al.,  (2000)  Protein  Eng.  13(5):  353-60、Morea  V  et  al.,  (2000),  Methods  20(3):  267-79、Baca  M  et  al.,  (1997)  J  Biol  Chem  272(16):  10678-84、Roguska  MA  et  al.,  (1996)  Protein  Eng  9(10):  895  904、Couto  JR  et  al.,  (1995)  Cancer  Res.  55  (23  Supp):  5973s-5977s、Couto  JR  et  al.,  (1995)  Cancer  Res  55(8):  1717-22、Sandhu  JS  (1994)  Gene  150(2):  409-  10、ならびにPedersen  JT  et  al.,  (1994)  J  Mol  Biol  235(3):  959-73を参照されたい）。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフトによって作製される。
【０２２３】
ヒト抗体を作製する方法は、当該技術分野において公知であり、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用するファージディスプレイ方法が含まれる（米国特許第４，４４４，８８７号、同第４，７１６，１１１号、および同第５，８８５，７９３号、ならびに国際公開番号ＷＯ９８／４６６４５、同第ＷＯ９８／５０４３３、同第ＷＯ９８／２４８９３、同第ＷＯ９８／１６６５４、同第ＷＯ９６／３４０９６、同第ＷＯ９６／３３７３５、および同第ＷＯ９１／１０７４１を参照されたい）。一部の実施形態では、ヒト抗体は、マウス−ヒトハイブリドーマを使用して産生することができる（Shinmoto  H  et  al.,  (2004)  Cytotechnology  46:  19-23、Naganawa  Y  et  al.,  (2005)  Human  Antibodies  14:  27-31を参照されたい）。
【０２２４】
単一ドメイン抗体、たとえば、軽鎖が欠如した抗体を作製する方法もまた、当該技術分野において公知である（Riechmann  L  &  Muyldermans  S  (1999)  J  Immunol  231:  25-38、Nuttall  SD  et  al.,  (2000)  Curr  Pharm  Biotechnol  1(3):  253-263、Muyldermans  S,  (2001)  J  Biotechnol  74(4):  277-302を参照されたい）。
【０２２５】
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体を作製する方法もまた、当該技術分野において公知である（Ahmad  et  al.,  2012,  Clinical  and  Developmental  Immunology,  doi:10.1155/2012/980250、Wang  et  al.,  2006,  Anal.  Chem.  78,  997-1004、Pansri  et  al.,  2009,  BMC  Biotechnology  9:6を参照されたい）。たとえば、ｓｃＦｖ抗体は、（組換え発現技法を使用して）短いポリペプチドリンカーにより免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変ドメインを融合することによって構築することができ、所望される抗原結合特性を有するｓｃＦｖ抗体を、ファージディスプレイ技術によって選択することができる。
【０２２６】
二重特異性抗体を産生する方法は、当該技術分野において周知である（Konterman,  2012,  MAbs  4:182-197、Gramer  et  al.,  2013,  MAbs  5:962-973）。
【０２２７】
抗体（たとえば、開始時にＣＤＣまたはＡＤＣＣ活性を有さない抗体）にＣＤＣまたはＡＤＣＣ活性を付与する方法は、当該技術分野において公知である（Kellner  et  al.,  2014,  Methods  65:105-113、国際公開番号ＷＯ２０１２０１０５６２、Natsume  et  al.,  2009,  Drug  Design,  Development  and  Therapy  3(3):7-16を参照されたい）。そのような方法としては、Ｆｃ領域アイソタイプシャッフリング、増強または最適化されたＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性を付与するＦｃ領域におけるアミノ酸変異、ならびに増強または最適化されたＣＤＣおよび／またはＡＤＣＣ活性を付与するＦｃ領域グリコシル化プロファイルの変更）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２８】
７．４  抗体の選択
本明細書において提供される治療的および診断の方法において使用するための候補抗体または断片が、まだ判明していないか、またはがん細胞の表面上に露出しているＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の領域に結合することがまだ示されていない場合、抗体または断片は、必要に応じて、以下の方法のうちのいずれかによって試験され得る。
【０２２９】
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法（たとえば、がんの診断、がんの処置、または転移の予防のための）において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片を識別するための方法であって、（ａ）インタクトながん細胞（たとえば、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４を発現することが予測されるか、公知であるか、または判定される、がん細胞）を、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片と接触させるステップと、（ｂ）抗体または断片が、インタクトながん細胞、特に、がん細胞の細胞外表面上に結合するかどうか（たとえば、前記抗体または断片が接触していないインタクトながん細胞と比べて）を判定するステップとを含み、そのような抗体または断片と接触したインタクトながん細胞への抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片の結合が、前記抗体または断片が本明細書に記載される方法において使用するのに好適であることを示す、方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、がん細胞は、抗体またはその断片で処置するように提案される患者に由来する。
【０２３０】
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法（たとえば、がんの診断、がんの処置、または転移の予防のための）において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片を識別するための方法であって、（ａ）インタクトながん細胞（たとえば、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４を発現することが予測されるか、公知であるか、または判定される、がん細胞）を、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片と接触させるステップと、（ｂ）抗体または断片が、インタクトながん細胞（特に、がん細胞の細胞外表面上）に、インタクトな正常細胞（たとえば、がん細胞と同じ組織または器官種の非がん性細胞）への結合と比べて増加したレベルで結合するかどうかを判定するステップとを含み、インタクトながん細胞への抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片の結合の、正常細胞と比べた増加が、前記抗体または断片が本明細書に記載される方法において使用するのに好適であることを示す、方法が、本明細書において提供される。
【０２３１】
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法（たとえば、がんの処置または転移の予防のための）において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片を識別するための方法であって、（ａ）インタクトながん細胞（たとえば、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４を発現することが公知であるか、予測されるか、または判定される、がん細胞）を、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片と接触させるステップと、（ｂ）接触させるステップが、インタクトながん細胞の細胞死または破壊（たとえば、細胞死マーカー、たとえば、ヨウ化プロピジウム染色によって判定される）の量の、前記抗体もしくは断片が接触していないインタクトながん細胞の死もしくは破壊の量と比べた、および／または前記抗体もしくは断片が接触したインタクトな正常細胞（たとえば、がん細胞と同じ組織または器官の非がん性細胞）の死もしくは破壊の量と比べた増加をもたらすかどうかを判定するステップとを含み、抗体または断片と接触したインタクトながん細胞の細胞死または破壊の量の増加が、前記抗体または断片が本明細書に記載される方法において使用するのに好適であることを示す、方法が、本明細書において提供される。
【０２３２】
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法（たとえば、がんの処置または転移の予防のための）において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片を識別するための方法であって、（ａ）インタクトながん細胞（たとえば、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４を発現することが公知であるか、予測されるか、または判定される、細胞）を、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片と接触させるステップと、（ｂ）接触させるステップが、インタクトながん細胞に対する補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）（１つまたは複数の細胞傷害性アッセイによって判定される）のレベルの、前記抗体もしくは断片と接触していないインタクトながん細胞に対するＣＤＣもしくはＡＤＣＣのレベルと比べた、および／または前記抗体もしくは断片が接触したインタクトな正常細胞（たとえば、がん細胞と同じ組織または器官の非がん性細胞）に対するＣＤＣもしくはＡＤＣＣのレベルと比べた増加をもたらすかどうかを判定するステップとを含み、インタクトながん細胞に対するＣＤＣまたはＡＤＣＣのレベルの増加が、前記抗体または断片が本明細書に記載される方法において使用するのに好適であることを示す、方法が、本明細書において提供される。
【０２３３】
ある特定の態様では、本明細書に記載される方法（たとえば、がんの処置または転移の予防のための）において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片を識別するための方法であって、（ａ）インタクトながん細胞（たとえば、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４を発現することが公知であるか、予測されるか、または判定される、細胞）を、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片と接触させるステップと、（ｂ）接触させるステップが、インタクトながん細胞の成長および増殖の阻害の、前記抗体もしくは断片が接触していないインタクトながん細胞の成長および増殖の阻害と比べた、および／または前記抗体もしくは断片が接触したインタクトな正常細胞（たとえば、がん細胞と同じ組織または器官の非がん性細胞）の成長および増殖の阻害と比べた増加をもたらすかどうかを判定するステップとを含み、抗体または断片と接触したインタクトながん細胞の成長および増殖の阻害の増加が、前記抗体または断片が本明細書に記載される方法において使用するのに好適であることを示す、方法が、本明細書において提供される。
【０２３４】
７．５  医薬組成物
抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその抗原結合性断片と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物が、本明細書において提供される。本明細書に記載される抗体−薬物コンジュゲートと、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物もまた、本明細書において提供される。賦形剤および安定剤）を含むがこれらに限定されない、適切な薬学的に許容される担体は、当該技術分野において公知である（たとえば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences  (1990)  Mack  Publishing  Co.,  Easton,  PAを参照されたい）。本明細書に記載される医薬組成物中の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体もしくは断片または抗体−薬物コンジュゲートは、精製されていてもよい。
【０２３５】
薬学的に許容される担体としては、等張剤、緩衝液、懸濁化剤、分散剤、乳化剤、湿潤剤、封鎖剤もしくはキレート剤、ｐＨ緩衝剤、可溶性増強剤、抗酸化剤、麻酔剤、および／または抗微生物剤を挙げることができる。好適な賦形剤としては、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、デンプン、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、プロピレン、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、クリーム基剤、およびデキストロースが挙げられるが、これらに限定されない。非経口で投与される場合、好適な薬学的に許容される担体としては、生理食塩水もしくはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、およびグルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールなどの薬剤または他の薬剤を含有する溶液を挙げることができる。
【０２３６】
特定の実施形態では、本明細書において提供される医薬組成物は、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体もしくはその抗原結合性断片または抗体−薬物コンジュゲート、ならびに必要に応じて、１つまたは複数の他の治療（たとえば、抗がん）剤を、薬学的に許容される担体中に含む。
【０２３７】
医薬組成物は、対象への任意の経路の投与用に、製剤化することができる。注射用製剤は、液体溶液剤、懸濁液剤、エマルジョン剤、または注射の前に溶液もしくは懸濁液にするのに好適な固体の形態として、調製することができる。
【０２３８】
抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体もしくはその断片または抗体−薬物コンジュゲートは、医薬組成物において、治療有効量で使用され得るか、または存在し得る。抗体またはコンジュゲートの治療有効量は、標準的な臨床技法によって判定することができる。
【０２３９】
特定の実施形態では、本明細書に記載される治療方法において使用することが企図される医薬組成物は、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体もしくはその抗原結合性断片または抗体−薬物コンジュゲートを含み、いずれの追加の抗がん剤も抗がん療法も含まない。別の特定の実施形態では、本明細書に記載される治療方法において使用することが企図される医薬組成物は、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体もしくはその抗原結合性断片または抗体−薬物コンジュゲートを含み、追加の抗がん剤または抗がん療法（たとえば、いずれか１つ、２つ、またはそれを上回る、本明細書に記載される追加の抗がん剤または抗がん療法）をさらに含む。
【０２４０】
７．６  治療方法
一態様では、本発明は、それを必要とする対象においてがんを処置すること（たとえば、がん増殖を阻害、がん進行を阻害すること）であって、対象に、本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体または断片を投与することを含む、処置することを提供する。特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象においてがんを処置する方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法を提供する。別の特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする対象において転移を予防する方法であって、対象に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体またはその断片を投与するステップを含む、方法を提供する。本明細書に記載される方法の特定の実施形態では、抗体または断片は、細胞透過性ペプチドに結合していない。
【０２４１】
一態様では、本発明は、それを必要とする対象においてがんを処置すること（たとえば、がん増殖を阻害、がん進行を阻害すること）であって、対象に、がん細胞の表面上に露出しているＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープ（たとえば、処置されている種類のがんの細胞が、それらの形質膜表面上に露出しているＨＤＭ２のそのような細胞外領域を有することが公知であるかまたは予測される場合）に特異的に結合する抗体またはその断片を投与することを含み、好ましくは、抗体または断片が、細胞透過性ペプチドに結合していない、処置することを提供する。一実施形態では、がんを処置する方法は、がんの転移を予防するステップを包含する。一実施形態では、がんを処置する方法は、腫瘍のサイズ（たとえば、腫瘍の体積もしくは直径によって測定される）を低減するため、腫瘍の成長を阻害するため、腫瘍の成長を低減するため、または腫瘍を根絶するための方法である。
【０２４２】
別の態様では、本発明は、がんを有する対象において転移を予防することであって、対象に、本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体または断片を投与することを含む、予防することを提供する。別の態様では、本発明は、がんを有する対象において転移を予防することであって、対象に、がん細胞の表面上に露出しているＨＤＭ２の細胞外領域（たとえば、処置されている種類のがんの細胞が、それらの形質膜表面上に露出しているＨＤＭ２のそのような細胞外領域を有することが公知であるかまたは予測される場合）に特異的に結合する抗体またはその断片を投与することを含む、予防することを提供する。
【０２４３】
別の態様では、本発明は、転移性がんを有する対象において、転移の数、サイズ、もしくは侵襲性を低減すること、または転移を根絶することをであって、対象に、本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体または断片を投与することを含む、低減または根絶することを提供する。別の態様では、本発明は、転移性がんを有する対象において、転移の数、サイズ、もしくは侵襲性を低減すること、または転移を根絶することであって、対象に、がん細胞の表面上に露出しているＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープ（たとえば、処置されている種類のがんの細胞が、それらの形質膜表面上に露出しているＨＤＭ２のそのような細胞外からアクセス可能なエピトープを有することが公知であるかまたは予測される場合）に特異的に結合する抗体またはその断片を投与することを含む、低減または根絶することを提供する。
【０２４４】
一態様では、本発明は、別のがん療法（単数または複数）（たとえば、ワクチン、標的化療法（たとえば、小分子標的化療法）、化学療法、放射線療法、または免疫療法（たとえば、別のモノクローナル抗体での処置））に対して耐性であるがんの処置を提供する。一実施形態では、本発明は、化学療法に対して耐性（すなわち、１つまたは複数の化学療法薬に対して耐性）のがんを処置することを提供する。一実施形態では、本発明は、別のモノクローナル抗体（単数または複数）での処置に対して耐性のがんを処置することを提供する。一実施形態では、本発明は、放射線療法に対して耐性のがんを処置することを提供する。一実施形態では、本発明は、小分子標的化療法に対して耐性のがんを処置することを提供する。
【０２４５】
がんを有する（たとえば、がんと診断されている）患者における、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体またはその抗原結合性断片の治療的使用が、本明細書において開示される。好ましい実施形態では、転移することが公知のがん（すなわち、一般に、転移性がんとなることが公知である種類のがん）を有する患者における、抗ＨＤＭ２抗体（またはその断片）の治療的使用が、本明細書において開示される。一部の実施形態では、処置される患者は、転移性がんを有する。他の実施形態では、転移していないがんを有する患者は、がんの転移を予防するために、本明細書に記載される方法に従って処置される。一部の実施形態では、処置される患者は、以前に、他のがん療法（たとえば、ワクチン、標的化療法、化学療法、免疫療法）で処置されている。特定の実施形態では、転移しているがんを有する患者は、転移を低減、遅延、もしくは停止させるため、またはがんの転移の数もしくはサイズを減少させるために、本明細書に記載される方法に従って処置される。
【０２４６】
本明細書に記載される方法は、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）をがんの細胞の表面上に発現することが予測されるか、公知であるか、または判定される、がんを処置するために好適である。本明細書に記載される方法によって標的とされるがん細胞の表面上のＨＤＭ２は、当該技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載されるＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアントのうちの１つであり得る。作用機序によって束縛されることを意図するものではないが、がん細胞の表面上のＨＤＭ２は、通常、少なくとも１つまたはすべての核局在化シグナル（たとえば、ＨＤＭ２のＮ末端部分における核局在化配列、ＨＤＭ２のＣ末端部分における核局在化シグナル、または両方の核局在化シグナル）が欠如しているＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアントであると考えられる。特定の実施形態では、がん細胞の表面上のＨＤＭ２は、少なくとも１つまたはすべての核局在化シグナルが欠如しており、核外輸送シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｐｏｒｔ  ｓｉｇｎａｌ）がさらに欠如している、ＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアントである。一実施形態では、がん細胞の表面上のＨＤＭ２は、配列番号４のアミノ酸１７９〜１８５における核局在化シグナルが欠如している（すなわち、配列番号４のアミノ酸１７９〜１８５が欠如している）ＨＤＭ２である。一実施形態では、がん細胞の表面上のＨＤＭ２は、配列番号４のアミノ酸４６６〜４７３における核局在化シグナルが欠如している（すなわち、配列番号４のアミノ酸４６６〜４７３が欠如している）ＨＤＭ２である。一実施形態では、がん細胞の表面上のＨＤＭ２は、配列番号４のアミノ酸１７９〜１８５およびアミノ酸４６６〜４７３における核局在化シグナルが欠如している（すなわち、配列番号４のアミノ酸１７９〜１８５および４６６〜４７３が欠如している）ＨＤＭ２である。一部の実施形態では、がん細胞の表面上のＨＤＭ２は、核外輸送シグナル、たとえば、配列番号４のアミノ酸１９０〜２０２における核外輸送シグナルが欠如している（すなわち、配列番号４のアミノ酸１９０〜２０２が欠如している）ＨＤＭ２である。
【０２４７】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法によって標的とされるがん細胞の表面上のＨＤＭ２は、ＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアント、たとえば、当該技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載されるスプライスバリアントのうちの１つである（ＨＤＭ２バリアントの一覧については、表１および表２ならびに第８節を参照されたい）。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって標的とされるがん細胞の表面上のＨＤＭ２は、ＭＤＭ２−Ａ（配列番号８）として公知のＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアントであり、これは、配列番号４のアミノ酸２８〜２２２が欠如している。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって標的とされるがん細胞の表面上のＨＤＭ２は、ＭＤＭ２−Ａ１（配列番号９）として公知のＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアントであり、これは、配列番号４のアミノ酸２８〜２２２および２７５〜３００が欠如している。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって標的とされるがん細胞の表面上のＨＤＭ２は、ＭＤＭ２−Ｂ（配列番号１０）として公知のＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアントであり、これは、配列番号４のアミノ酸２８〜３００が欠如している。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって標的とされるがん細胞の表面上のＨＤＭ２は、ＭＤＭ２−Ｃ（配列番号１１）として公知のＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアントであり、これは、配列番号４のアミノ酸５３〜２２２が欠如している。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって標的とされるがん細胞の表面上のＨＤＭ２は、ＭＤＭ２−Ｄ（配列番号１２）として公知のＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアントであり、これは、配列番号４のアミノ酸３０〜３８８が欠如している。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって標的とされるがん細胞の表面上のＨＤＭ２は、ＭＤＭ２−Ｅ（配列番号１３）として公知のＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアントであり、これは、配列番号４のアミノ酸７６〜１０２および１０３〜４９１が欠如している。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって標的とされるがん細胞の表面上のＨＤＭ２は、ＭＤＭ２−Ｆ（配列番号１４）として公知のＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアントであり、これは、配列番号４のアミノ酸５３〜９７が欠如している。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって標的とされるがん細胞の表面上のＨＤＭ２は、ＭＤＭ２−Ｇ（配列番号１５）として公知のＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアントであり、これは、配列番号４のアミノ酸１１５〜１６９が欠如している。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって標的とされるがん細胞の表面上のＨＤＭ２は、ＭＤＭ２−１１（配列番号１６）として公知のＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアントであり、ここで、アミノ酸Ｍは、配列番号４において、ＭからＭＶＲＳＲＱＭで置換されている。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法によって標的とされるがん細胞の表面上のＨＤＭ２は、ＭＤＭ２−ＫＢ２（配列番号１７）として公知のＨＤＭ２タンパク質のスプライスバリアントであり、これは、配列番号４のアミノ酸１５７〜２４８が欠如している。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法は、がん細胞の表面上のＭ（Ｈ）ＤＭ４のスプライスバリアントを標的とし、たとえば、以下のスプライスバリアントのうちの１つまたは複数を標的とする：ＭＤＭＸ−Ｓ、ＭＤＭ４−Ｓ、ＭＤＭ４−Ａ、ＭＤＭ４−Ｇ、ＭＤＭ４−ＸＡＬＴ１／ＸＡＬＴ２、およびＭＤＭ４−２１１（または列挙されたスプライスバリアントのヒト相当物）。
【０２４８】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体またはその断片は試験され、処置しようとするがんの細胞の表面上に露出しているＨＤＭ２に結合すると予測されることが判定されている。このＨＤＭ２への結合は、たとえば、抗ＨＤＭ２抗体または断片が、処置されるがんの起源となる組織型の組織のインタクトながん細胞（処置される対象に由来し得るが、必ずしもそうである必要はない）に結合する能力によって、示すことができる。一実施形態では、抗体または断片を対象に投与する前に、抗ＨＤＭ２抗体またはその断片は試験され、対象のがんのインタクトな細胞に結合すると予測されることが判定されている。この試験は、たとえば、抗ＨＤＭ２抗体または断片の、生検によって得られたインタクトながん細胞の表面または適切な組織型のがん細胞株への結合を示すことによって、行うことができる。
【０２４９】
必要に応じて、処置しようとする見込み患者のがん細胞は、対象が、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２療法の適切な候補であるかどうかを判定するために、当該技術分野において公知の技法を使用して、がん細胞の表面上のＭ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）の発現について、試験することができるが、そのようなことは、患者が、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープを有することが公知であるかまたは予測される組織型のがんを有する場合には、通常、必要とは考えられないであろう。特定の実施形態では、処置される対象におけるがんの細胞は、それらの形質膜表面上に露出しているＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープ（抗ＨＤＭ２抗体またはその断片によって標的とされる）を有すると、試験され、判定されている（たとえば、形質膜表面上に露出しているこの細胞外領域を有することが公知であるＨＤＭ２のバリアントを発現すると判定されている）。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して処置されるがんは、ＨＤＭ２のスプライスバリアント（たとえば、ＭＤＭ２−Ａ（配列番号８）、ＭＤＭ２−Ａ１（配列番号９）、ＭＤＭ２−Ｂ（配列番号１０）、ＭＤＭ２−Ｃ（配列番号１１）、ＭＤＭ２−Ｄ（配列番号１２）、ＭＤＭ２−Ｅ（配列番号１３）、ＭＤＭ２−Ｆ（配列番号１４）、ＭＤＭ２−Ｇ（配列番号１５）、ＭＤＭ２−１１（配列番号１６）またはＭＤＭ−ＫＢ２（配列番号１７））を、その細胞の形質膜表面上に発現することが公知であるかまたは判定されているがんである。そのようなことは、当該技術分野において公知の技法（たとえば、がん生検に由来する核酸試料に対するＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、検出することができる。
【０２５０】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法による、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体またはその抗原結合性断片の投与は、以下の作用のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれよりも多くを、（たとえば、がん性腫瘍を有する対象において）達成するために実行され得るか、またはその達成をもたらすことが見出され得る：（ｉ）腫瘍サイズ（たとえば、体積または直径）の減少、（ｉｉ）腫瘍の成長の低減、（ｉｉｉ）腫瘍成長の進行の阻害、（ｉｖ）腫瘍の退縮、（ｖ）腫瘍の再発生の阻害、（ｖｉ）腫瘍（たとえば、原発性腫瘍または転移性腫瘍）の根絶、（ｖｉｉ）腫瘍の転移の予防、（ｖｉｉ）腫瘍の転移の数、サイズ、または侵襲性の低減、（ｖｉｉｉ）腫瘍の１つまたは複数の症状の重症度または持続期間の低減または改善、（ｉｘ）がんと関連する１つまたは複数の症状の発達または発症の阻害、（ｘ）別の治療法の治療効果の増強または改善、（ｘｉ）対象の入院（たとえば、入院の長さ）の低減、（ｘｉｉ）対象の生活の質の改善、（ｘｉｉｉ）死亡率の低減、（ｘｉｖ）対象における無再発生存期間または寛解の長さの増加。これらの作用のいずれも、当該技術分野において公知の任意の方法によって評定することができる。たとえば、腫瘍サイズは、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、動的コントラスト強調ＭＲＩ（ＤＣＥ−ＭＲＩ）、Ｘ線、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）スキャン、またはポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）スキャンを使用して、評定することができる。
【０２５１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法による、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体またはその抗原結合性断片の投与は、単独または別の治療法と組み合わせて使用した場合に、対象におけるがんを処置するのに有効である（たとえば、腫瘍の体積もしくは直径を低減するか、腫瘍成長を低減するか、腫瘍増殖を低減するか、腫瘍を根絶するか、またはがんの１つもしくは複数の症状を改善する）。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法による、抗ＨＤＭ２抗体またはその抗原結合性断片の投与は、単独または別の治療法と組み合わせて使用した場合に、がんを有する対象において転移を予防するのに有効である。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法による、抗ＨＤＭ２抗体またはその抗原結合性断片の投与は、単独または別の治療法と組み合わせて使用した場合に、転移性がんを処置するのに有効である（たとえば、転移の数、サイズ、もしくは侵襲性を低減するか、または転移を根絶する）。
【０２５２】
具体的な実施形態では、本明細書に記載される方法による、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体またはその抗原結合性断片の投与は、単独で（すなわち、追加の治療法を伴わずに）使用した場合に、対象におけるがんを処置するかまたは転移を予防するのに有効である。他の具体的な実施形態では、本明細書に記載される方法による、抗ＨＤＭ２抗体またはその抗原結合性断片の投与は、本明細書に記載される追加の治療法のうちの１つまたは複数と組み合わせて使用した場合に、対象におけるがんを処置するかまたは転移を予防するのに有効である。
【０２５３】
本明細書に記載される治療法の有効性は、処置されている対象への本明細書に記載される治療法の投与の前および後に、パラメーター（たとえば、腫瘍サイズ）を評価することによって、評定することができる。あるいは、治療法の有効性は、動物モデル（たとえば、処置されているがんのマウスモデル、ラットモデル、またはハムスターモデルなどの動物モデルにおいて）への本明細書に記載される治療法の投与の前および後に、パラメーター（たとえば、腫瘍サイズ）を評価することによって、評定することができる。当該技術分野において公知の任意のアッセイを使用して、本明細書に記載される治療法の治療的有効性を評価することができる。
【０２５４】
抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体またはその抗原結合性断片を使用した本明細書に記載される治療方法では、本明細書に記載される抗体−薬物コンジュゲートを、代替的に使用することができることが、理解されるであろう。
【０２５５】
７．６．１  処置しようとするがん
本明細書に記載される方法に従って処置することができるがんの例としては、乳がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮がん、膵臓がん、皮膚がん（たとえば、黒色腫）、前立腺がん（たとえば、ホルモン不応性の、たとえば、去勢耐性の前立腺がん）、肺がん（たとえば、小細胞肺がん、または非小細胞肺がん）、結腸直腸がん（たとえば、結腸がん、または直腸がん）、消化器がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、虫垂がん、食道がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、腎臓がん（renal  cancer）、膀胱がん、胆嚢がん、腎臓がん（ｋｉｄｎｅｙ  ｃａｎｃｅｒ）（たとえば、腎細胞癌、またはウィルムス腫瘍））、肝臓がん（たとえば、肝癌、または肝細胞癌）、中枢神経系のがん（たとえば、脳がん）、末梢神経系のがん、気管支がん、口腔または咽頭のがん（たとえば、中咽頭がん、喉頭がん）、甲状腺がん（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｃａｎｃｅｒ）、胆管がん、唾液腺がん、甲状腺がん（ｔｈｙｒｏｉｄ  ｇｌａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ）、副腎がん、外陰部がん、精巣がん、尿道がん、膣がん、陰茎がん、骨がん、眼がん（たとえば、網膜芽細胞腫またはぶどう膜黒色腫）、および頭頸部がん（たとえば、頭頸部扁平上皮細胞癌）が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、がんは、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵臓がん、黒色腫、乳がん、または結腸がんである。一実施形態では、がんは、膵臓がんである。一実施形態では、がんは、黒色腫である。一実施形態では、がんは、乳がんである。一実施形態では、がんは、卵巣がんである。
【０２５６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置することができるがんは、別のがん療法（単数または複数）（たとえば、ワクチン、標的化療法（たとえば、小分子標的化療法）、化学療法、放射線療法、または免疫療法（たとえば、別のモノクローナル抗体での処置））に対して耐性である。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置することができるがんは、化学療法に対して耐性である。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置することができるがんは、別のモノクローナル抗体（単数または複数）での処置に対して耐性である。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置することができるがんは、放射線に対して耐性である。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置することができるがんは、小分子標的化療法に対して耐性である。
【０２５７】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、固形がんである。別の特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、非固形がん（たとえば、造血がん）である。
【０２５８】
特定の実施形態では、本発明に従って処置されるがんは、白血病（たとえば、急性白血病（たとえば、急性リンパ球性白血病または急性骨髄球性白血病）、慢性白血病（たとえば、慢性骨髄球性白血病または慢性リンパ球性白血病）、または有毛細胞性白血病）、リンパ腫（たとえば、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、リンパ芽球性リンパ腫、マントル細胞性リンパ腫、またはＴ細胞性リンパ腫）である。
【０２５９】
特定の実施形態では、本発明に従って処置されるがんは、癌腫（たとえば、腺癌、基底細胞癌、腎細胞癌、扁平上皮細胞癌、骨癌、胸腺癌（ｔｈｙｏｍａ）／胸腺癌（ｔｈｙｍｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、または絨毛腫）、芽細胞腫、肉腫（たとえば、軟部組織肉腫、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、または滑膜肉腫）、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、骨髄腫（たとえば、多発性骨髄腫）、扁平上皮細胞がん、中皮腫、膠芽腫（たとえば、多型膠芽細胞腫）、神経膠腫、神経芽細胞腫、黒色腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、肝細胞癌、精上皮腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、または網膜芽細胞腫である。
【０２６０】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、肉腫または癌腫、たとえば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮細胞肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、子宮内膜間質肉腫、マスト細胞肉腫、成人軟部組織肉腫、子宮肉腫、カポジ肉腫、メルケル細胞癌、尿路上皮癌、結腸癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、嚢胞腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、胆管癌、胚性癌、肺癌（たとえば、小細胞肺癌）、膀胱癌、または上皮癌である。
【０２６１】
ある特定の実施形態では、本発明の方法に従って処置されるがんは、転移性である。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置されるがんは、転移性黒色腫、転移性卵巣がん、転移性子宮頸がん、転移性子宮内膜がん、転移性膵臓がん、転移性乳がん、転移性結腸がん、または転移性脳がんである。
【０２６２】
７．６．２  投与の方法
本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体または断片（およびそのような抗体を含む医薬組成物）は、非経口（たとえば、静脈内、動脈内、筋肉内、骨内、脳内、脳室内、髄腔内、皮下）、腹腔内、腫瘍内、肺内、皮内、経皮、結膜、眼内、鼻内、気管内、経口、および局所病変内の投与経路を含むがこれらに限定されない、任意の好適な手段によって、対象に投与することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体または断片は、静脈内、動脈内、筋肉内、腹腔内、腫瘍内、または皮下に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体または断片は、静脈内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体または断片は、腹腔内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体または断片は、筋肉内に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体または断片は、皮下に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体または断片は、腫瘍内に（たとえば、処置されているがんの腫瘍への注射によって）投与される。具体的な実施形態では、本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体または断片は、静脈内、腹腔内、または腫瘍内に投与される。
【０２６３】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体またはその断片がコーティングされたナノ粒子が、腫瘍の標的化および処置に使用される（抗体をコーティングしたナノ粒子については、たとえば、Cardoso  et  al.,  2012,  Curr.  Med.  Chem.  19(19):3103-27およびArruebo  et  al.,  2009,  J.  of  Nanomater.  2009:Article  ID  439389を参照されたい）。一実施形態では、がんを有する対象におけるがんを処置するかまたは転移を予防するための方法であって、対象に、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体またはその断片がコーティングされたナノ粒子を投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【０２６４】
単回投与またはある期間にわたる複数回投与を含め、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体または断片（およびそのような抗体を含む医薬組成物）の様々な投薬スケジュールが、企図される。投与の方法としては、ボーラス投与、パルス注入、および連続注入が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６５】
本明細書に記載される方法において使用するための治療レジメンとしては、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、６週間に１回、８週間に１回、または１２週間に１回の、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体またはその断片（およびそのような抗体を含む組成物）の投与を挙げることができる（たとえば、結果として、対象は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも８、もしくは少なくとも１０用量の抗体、または２〜２０用量の抗体を受容する）。ある特定の実施形態では、抗ＨＤＭ２抗体またはその断片（およびそのような抗体を含む組成物）は、（たとえば、ある期間、たとえば、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２ヶ月間、または３ヶ月間の間）毎日、１日おき、または１週間に２回、３回、もしくは４回、投与される。本明細書において企図される処置レジメンには、初回のより高い用量の抗体に続いて、１回もしくは複数回のより低い用量があり得るか、または初回のより低い用量の抗体に続いて、１回もしくは複数回のより高い用量がある、レジメンが含まれる。例示的な処置過程（抗ＨＤＭ２抗体または断片が投与される）は、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間、または数年間にわたり、継続され得る。
【０２６６】
一部の実施形態では、最初の処置期間（抗体が、たとえば、１ヶ月に１回、２週間に１回、１週間に１回、１週間に２回、または１週間に３回投与される）に続いて、抗体が投与されない休薬期間（たとえば、１週間、２週間、３週間、４週間、６週間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、６ヶ月間、または１年間）があり、次に、第２の処置期間（抗体が、たとえば、１ヶ月に１回、２週間に１回、１週間に１回、１週間に２回、または１週間に３回投与される）がある。そのような最初の処置およびそのような第２の処置の期間は、たとえば、２週間、３週間、４週間、６週間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、または６ヶ月間継続され得る（この場合、最初の処置期間は、第２の処置期間と同じであっても、異なってもよい）。この処置過程（最初の処置期間、休薬期間、および第２の処置期間を有する）は、２回、３回、４回、５回、６回、１０回、または１０回を上回って、反復されてもよい。
【０２６７】
一部の実施形態では、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に対して異なる結合特異性を有する２つまたはそれを上回る抗体またはその断片が、処置されている対象に、同時または逐次的に投与される。
【０２６８】
本明細書に記載される方法において使用するための抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体または断片の適切な投薬量は、使用される抗体の種類、処置されているがんの種類、処置されているがんの重症度、投与の経路、標的部位、患者の状態（たとえば、年齢、体重、健康状態）、抗体に対する患者の応答性、患者が使用している他の医薬、および処置を行う医療従事者の判断で考慮される他の要因に依存するであろう。
【０２６９】
ある特定の実施形態では、対象に投与される本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体または断片の投薬量は、患者の体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜２００ｍｇであり得る。ある特定の実施形態では、対象に投与される本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体または断片の投薬量は、患者の体重１ｋｇ当たり約１μｇ〜１００ｍｇ（たとえば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ）であり得る。ある特定の実施形態では、対象に投与される本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体または断片の投薬量は、患者の体重１ｋｇ当たり約１ｍｇ〜２００ｍｇであり得る。一実施形態では、対象に投与される本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体または断片の投薬量は、０．０２５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇである。一実施形態では、対象に投与される本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体または断片の投薬量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇである。一実施形態では、対象に投与される本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体または断片の投薬量は、５ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇである。特定の実施形態では、約０．０２５ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇの用量（たとえば、１回または複数回の用量）の本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体または断片が、処置される対象に投与され得る。一実施形態では、約０．１ｍｇ／ｋｇの用量（たとえば、１回または複数回の用量）の本明細書に記載される抗ＨＤＭ２抗体または断片が、処置される対象に投与され得る（たとえば、抗体が腫瘍内に投与される場合）。
【０２７０】
７．７  診断、コンパニオン診断、および予後診断の方法
一態様では、対象（たとえば、ヒト）におけるがんを診断する方法であって、（ａ）Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）に特異的に結合する抗体またはその断片（たとえば、標識化抗体または断片）が、対象のインタクトな細胞の表面に結合するかどうかを検出するステップであって、抗体または断片が、本明細書に記載される任意の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片（具体的には、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に特異的に結合する任意の抗体または断片）である、ステップと、（ｂ）ステップ（ａ）において結合が検出された場合に、対象をがんと診断するステップとを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、診断の方法は、ステップ（ａ）における検出の前に、対象からインタクトな細胞を得るステップ、および次いで、たとえば、標識化抗体または断片が、対象から得られたインタクトな細胞に結合するかどうかを、たとえば、ＦＡＣＳまたは細胞に基づくＥＬＩＳＡ分析を使用して判定することによって、検出を実行するステップをさらに含む。一実施形態では、診断する方法は、ステップ（ａ）における検出の前に、対象に抗体または断片を投与するステップを含み、検出が、対象のｉｎ  ｖｉｖｏイメージングによって行われる。
【０２７１】
一態様では、患者は、患者から得られたインタクトながん細胞の表面への、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体または抗体断片の結合の検出に基づいて、そのような抗体または断片を使用する処置に選択される。ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体または断片での処置のための、がんを有する患者を選択する方法であって、インタクトながん細胞を（たとえば、患者におけるがん性腫瘍の生検によって、または循環がん細胞を有する血液試料を患者から得ることによって）患者から得るステップ、および抗体または断片が、患者のインタクトながん細胞の表面に結合するかどうかを（当該技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載される任意の方法を使用して、たとえば、細胞に基づくＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ解析を使用して）判定するステップを含み、結合の検出が、患者を抗体または断片で処置することができることを示す、方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体または断片での処置のための、がんを有する患者を選択する方法であって、インタクトながん細胞を（たとえば、患者におけるがん性腫瘍の生検によって、または循環がん細胞を有する血液試料を患者から得ることによって）患者から得るステップ、抗体または断片が、患者のインタクトながん細胞の表面に結合するかどうかを（当該技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載される任意の方法を使用して、たとえば、細胞に基づくＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ解析を使用して）判定するステップ、および結合が検出された場合に、抗体または断片を患者に投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。患者に投与される抗体または断片は、処置しようとする患者の選択に使用される抗体または断片と同じであっても異なってもよい。一実施形態では、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体または断片での処置のための、卵巣がんを有する患者を選択する方法であって、インタクトな卵巣がん細胞を患者から得るステップ、抗体または断片が、患者のインタクトながん細胞の表面に結合するかどうかを判定するステップ、および結合が検出された場合に、抗体または断片を患者に投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。一実施形態では、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に特異的に結合する任意の抗体またはその断片が、そのような患者の選択および／または処置に使用される。一実施形態では、細胞透過性ペプチドに結合していない、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する任意の抗体またはその断片が、そのような患者の選択および／または処置に使用される。一実施形態では、細胞透過性ペプチドに結合していない、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する任意の抗体またはその断片が、そのような患者の選択に使用され、配列番号１、配列番号２、または配列番号３に特異的に結合する任意の抗体またはその断片が、患者の処置に使用される。
【０２７２】
本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体（たとえば、抗ＨＤＭ２抗体）またはその断片を使用する診断方法または患者選択方法において使用することができる非限定的で例示的な試料としては、組織生検、悪性組織から得られたインタクトな細胞、および血液から単離された循環がん細胞が挙げられる。たとえば、組織試料は、患者から得ることができ、免疫組織化学的検査を行って、標識された抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体（たとえば、抗ＨＤＭ２抗体）またはその断片が、組織試料に結合するかどうかを検出することができる。あるいは、インタクトな細胞（悪性であることが判明しているかまたは疑われる）を、患者から単離してもよく、ＦＡＣＳまたは細胞に基づくＥＬＩＳＡ分析を行って、標識された抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体（たとえば、抗ＨＤＭ２抗体）またはその断片が、そのような細胞に結合するかどうかを検出することができる。さらに別の例では、循環がん細胞を有する血液試料を、患者から得ることができ、ＦＡＣＳまたは細胞に基づくＥＬＩＳＡ分析を行って、標識された抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体（たとえば、抗ＨＤＭ２抗体）またはその断片が、そのような細胞に結合するかどうかを検出することができる。
【０２７３】
一態様では、患者の処置に使用しようとする本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体または抗体断片の処置の持続期間および／または投薬量は、患者から得られたインタクトながん細胞の表面へのそのような抗体または断片の結合の検出に基づいて判定される。ある特定の実施形態では、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体または断片での、がんを有する患者の処置を継続するかどうかを判定する方法であって、患者に、第１の期間の間、抗体または断片を投与するステップ（たとえば、患者は、上述のように、処置に選択されている）、インタクトながん細胞を（たとえば、患者におけるがん性腫瘍の生検によって、または循環がん細胞を有する血液試料を患者から得ることによって）患者から得るステップ、および抗体または断片が、患者のインタクトながん細胞の表面に結合するかどうかを（当該技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載される任意の方法を使用して、たとえば、細胞に基づくＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ解析を使用して）判定するステップ、ならびに結合が検出された場合に、第２の期間の間、抗体または断片を患者に投与することを継続するステップ（しかしながら、たとえば、結合が検出されなかった場合には、処置は中止される）を含む、方法が、本明細書において提供される。ある特定の実施形態では、がんを有する患者の処置において使用するための、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに特異的に結合する抗体または断片の用量を増加させるかどうかを判定する方法であって、患者に、ある期間の間、ある用量の抗体または断片を投与するステップ（たとえば、患者は、上述のように、処置に選択されている）、インタクトながん細胞を（たとえば、患者におけるがん性腫瘍の生検によって、または循環がん細胞を有する血液試料を患者から得ることによって）患者から得るステップ、および抗体または断片が、患者のインタクトながん細胞の表面に結合するかどうかを（当該技術分野において公知であるかまたは本明細書に記載される任意の方法を使用して、たとえば、細胞に基づくＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ解析を使用して）判定するステップ、ならびに結合が検出された場合に、第２の期間の間、ある用量の抗体または断片を患者に投与するステップを含み、第２の期間中に投与される用量が、第１の期間中に投与される用量よりも高い（たとえば、２倍、または３倍高い）（しかしながら、たとえば、結合が検出されない場合には、第２の期間の間、処置を中止するか、またはより低い用量の抗体もしくは断片を投与する）、方法が、本明細書において提供される。
【０２７４】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、抗ＨＤＭ２）抗体または抗体断片での処置は、処置の前および後に、患者から得られたがん細胞の表面上に発現されるＨＤＭ２の量を判定することによって、患者においてモニタリングされ、量の減少は、肯定的な予後である。
【０２７５】
７．８  患者集団
本明細書に記載される方法に従って処置される患者または対象としては、ヒトおよび非ヒト脊椎動物が挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、処置される対象は、哺乳動物、たとえば、ヒト、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、またはブタである。好ましい実施形態では、処置される対象は、ヒトである。
【０２７６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、（たとえば、生検または当該技術分野において公知の任意の別の方法を使用して）がんと診断されている。具体的な実施形態では、処置される対象は、初期がんと診断されている。他の実施形態では、処置される対象は、進行期がんと診断されている。具体的な実施形態では、処置される対象は、高悪性度の腫瘍と診断されている。他の実施形態では、処置される対象は、低悪性度の腫瘍と診断されている。ある特定の実施形態では、処置される対象は、転移し得るがんと診断されている。特定の実施形態では、処置される対象は、転移性がんと診断されている。
【０２７７】
特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、子宮頸がん、子宮内膜がん、卵巣がん、膵臓がん、黒色腫、乳がん、結腸直腸がん（たとえば、結腸がん）、膀胱がん、星状細胞新生物、膠芽腫、小児横紋筋肉腫、または肺がん（たとえば、非小細胞肺癌）と診断されている。特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、黒色腫、膵臓がん、乳がん、または卵巣がんと診断されている。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、黒色腫と診断されている。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、膵臓がんと診断されている。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、乳がんと診断されている。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、卵巣がんと診断されている。一実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、肺がんと診断されている。
【０２７８】
ある特定の実施形態では、処置される対象は、これまでに、１つまたは複数の他のがん療法（たとえば、ワクチン、標的化療法（たとえば、小分子標的化療法）、化学療法、放射線療法、または免疫療法（たとえば、別のモノクローナル抗体での処置））を受けており、対象のがんは、１つまたは複数の他のがん療法に対する耐性を発生している。一実施形態では、処置される対象は、化学療法に対して耐性である。一実施形態では、処置される対象は、放射線療法に対して耐性である。一実施形態では、処置される対象は、小分子標的化療法に対して耐性である。一実施形態では、処置される対象は、別のモノクローナル抗体での処置に対して耐性である。
【０２７９】
ある特定の実施形態では、処置される対象は、がんの細胞の表面上にＭ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）を有することが公知であるかまたは予測される種類のがんを有する。特定の実施形態では、処置される対象は、ある種類のがんを有し、その細胞は、その細胞表面上にＨＤＭ２のスプライスバリアントのうちの１つまたは複数、たとえば（限定されないが）、以下のスプライスバリアントのうちの１つまたは複数を発現する：ＭＤＭ２−Ａ（配列番号８）、ＭＤＭ２−Ａ１（配列番号９）、ＭＤＭ２−Ｂ（配列番号１０）、ＭＤＭ２−Ｃ（配列番号１１）、ＭＤＭ２−Ｄ（配列番号１２）、ＭＤＭ２−Ｅ（配列番号１３）、ＭＤＭ２−Ｆ（配列番号１４）、ＭＤＭ２−Ｇ（配列番号１５）、ＭＤＭ２−１１（配列番号１６）またはＭＤＭ−ＫＢ２（配列番号１７）
【０２８０】
ある特定の実施形態では、処置される対象は、がんの細胞の形質膜上にＭ（Ｈ）ＤＭ２／４（たとえば、ＨＤＭ２）を有することが（当該技術分野において公知の任意のアッセイを使用して）試験され、判定されている、がんを有する。具体的な実施形態では、処置される対象は、あるがんを有し、その細胞は、その形質膜表面上に、抗ＨＤＭ２抗体または断片によって標的とされ得るＨＤＭ２の細胞外領域が露出していることが（当該技術分野において公知の任意の方法によって）試験され、判定されている（そして、そのような抗体は、次いで、対象に投与され得る）。特定の実施形態では、処置される対象は、あるがんを有し、その細胞は、その細胞表面上に、ＨＤＭ２のスプライスバリアントのうちの１つまたは複数、たとえば（限定されないが）、以下のスプライスバリアントのうちの１つまたは複数を発現することが（当該技術分野において公知の任意の方法を使用して）試験され、判定されている：ＭＤＭ２−Ａ（配列番号８）、ＭＤＭ２−Ａ１（配列番号９）、ＭＤＭ２−Ｂ（配列番号１０）、ＭＤＭ２−Ｃ（配列番号１１）、ＭＤＭ２−Ｄ（配列番号１２）、ＭＤＭ２−Ｅ（配列番号１３）、ＭＤＭ２−Ｆ（配列番号１４）、ＭＤＭ２−Ｇ（配列番号１５）、ＭＤＭ２−１１（配列番号１６）またはＭＤＭ−ＫＢ２（配列番号１７）
【０２８１】
７．９  組合せ療法およびキット
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、前記抗体または断片とは異なる１つまたは複数の抗がん療法、たとえば、化学療法、外科手術、放射線療法、抗がん活性を有する別の抗体、サイトカイン、Ｔ細胞療法、ワクチン（たとえば、細胞ワクチン）、抗がん活性を有する小分子、抗ホルモン剤、または当該技術分野において公知の任意の他の抗がん療法と組み合わせて、対象に投与される。
【０２８２】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、化学療法と組み合わせて、対象に投与される。本明細書に記載される方法において使用することができる化学療法剤の種類の例としては、アルキル化剤、ニトロソ尿素剤、抗代謝剤、トポイソメラーゼ阻害剤、アロマターゼ阻害剤、抗腫瘍抗生物質、植物由来のアルカロイド、ホルモンアンタゴニスト、Ｐ−糖タンパク質阻害剤、および白金錯体誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される方法において使用することができる化学療法薬の特定の例としては、タキソール、パクリタキセル、ｎａｂ−パクリタキセル、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、コルヒチン、ミトキサントロン、タモキシフェン、シクロホスファミド、メクロレタミン、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ウラムスチン、ムスタルゲン、イホスファミド、ベンダムスチン、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ストレプトゾシン、チオテパ、マイトマイシン、ジアジクオン、テトラジン、アルトレタミン、ダカルバジン、ミトゾロミド、テモゾロミド、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、アルトレタミン、ヘキサレン、トロホスファミド、エストラムスチン、トレオスルファン、マンノスルファン、トリアジクオン、カルボクオン、ニムスチン、ラニムスチン、アザチオプリン、スルファニラミド、フルオロピリミジン、チオプリン、チオグアニン、メルカプトプリン、クラドリビン、カペシタビン、ペメトレキセド、フルダラビン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、ネララビンまたはクロファラビン、シタラビン、デシタビン、プララトレキセート、フロクスウリジン、チオクアニン、アザシチジン、クラドリビン、ペントスタチン、メルカプトプリン、イマチニブ、ダクチノマイシン、セルビジン、ブレオマイシン、アクチノマイシン、ルテオマイシン、エピルビシン、イダルビシン、プリカマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ビンデシン、ビンフルニン、パクリタキセル、ドセタキセル、エトポシド、テニポシド、ペリウィンクル、ビンカ、タキサン、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、テニポシド、ピラルビシン、ノボビオシン、メルバロン、アクラルビシン、アムサクリン、抗アンドロゲン薬、抗エストロゲン薬、ビカルタミド、メドロキシプロゲステロン、フルオキシメステロン、ジエチルスチルベストロール、エストラース、オクトレオチド、メゲストロール、ラロキシフェン、トレミフェン、フルベストラント、プレドニゾン、フルタミド、ロイプロリド、ゴセレリン、アミノグルテチミド、テストラクトン、アナストロゾール、レトロゾール、エキセメスタン、ボロゾール、フォルメスタン、ファドロゾール、アンドロステン、レスベラトロール、ミオスミン、カテキン、アピゲニンエリオジクチオールイソリキリチゲニン、マンゴスチン、アミオダロン、アジスロマイシン、カプトプリル、クラリスロマイシン、シクロスポリン、ピペリン、ケルセチン、キニジン、キニン、レセルピン、リトナビル、タリキダル、ベラパミル、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、トランスプラチン、ネダプラチン、サトラプラチン、トリプラチン、およびカルボプラチンが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、以下の化学療法剤のうちの１つまたは複数と組み合わせて、対象に投与される：ゲムシタビン、ｎａｂ−パクリタキセル、カペシタビン、イリノテカン、およびセレコキシブ。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、以下の化学療法剤のうちの１つまたは複数と組み合わせて、対象に投与される：ゲムシタビン、ｎａｂ−パクリタキセル、シスプラチン、５−ＦＵ、およびパクリタキセル（たとえば、アルブミン結合型粒子として製剤化されたパクリタキセル、たとえば、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））。特定の実施形態では、本明細書に記載される組合せ療法を使用して処置されるがんは、膵臓がん、乳がん、肺がん、または卵巣がんである。
【０２８３】
一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ゲムシタビンと組み合わせて、対象に投与される（たとえば、非小細胞肺がん、膵臓がん、または卵巣がんの処置のため）。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、カペシタビンと組み合わせて、対象に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、イリノテカンと組み合わせて、対象に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、セレコキシブと組み合わせて、対象に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、パクリタキセル（たとえば、アルブミン結合型粒子として製剤化されたパクリタキセル、たとえば、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））と組み合わせて、対象に投与される（たとえば、転移性乳がんの処置のため）。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ｎａｂ−パクリタキセルと組み合わせて、対象に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、シスプラチンと組み合わせて、対象に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、５−ＦＵと組み合わせて、対象に投与される（たとえば、結腸直腸がん、たとえば、結腸がんの処置のため）。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、カルボプラチンと組み合わせて、対象に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルと組み合わせて、対象に投与される（たとえば、膵臓がんの処置のため）。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ゲムシタビンおよびカルボプラチンと組み合わせて、対象に投与される（たとえば、卵巣がんの処置のため）。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、パクリタキセル（たとえば、アルブミン結合型粒子として製剤化されたパクリタキセル、たとえば、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））およびゲムシタビンと組み合わせて、対象に投与される（たとえば、乳がん、または膵臓がん、たとえば、膵臓の腺癌または膵臓の転移性腺癌の処置のため）。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ゲムシタビンおよびシスプラチンと組み合わせて、対象に投与される（たとえば、非小細胞肺がんの処置のため）。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ゲムシタビンおよび５−ＦＵと組み合わせて、対象に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、パクリタキセル（たとえば、アルブミン結合型粒子として製剤化されたパクリタキセル、たとえば、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標））およびカルボプラチンと組み合わせて、対象に投与される（たとえば、非小細胞肺がんの処置のため）。
【０２８４】
対象がヒトである、ある特定の実施形態では、ゲムシタビンは、１，５００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。対象がヒトである、ある特定の実施形態では、ｎａｂ−パクリタキセルは、３００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。対象がヒトである、ある特定の実施形態では、ゲムシタビンは、１，０００ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。対象がヒトである、ある特定の実施形態では、ｎａｂ−パクリタキセルは、１２５ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０２８５】
ある特定の実施形態では、ゲムシタビンおよび／またはｎａｂ−パクリタキセルは、ゲムシタビンおよび／またはｎａｂ−パクリタキセルが抗がん抗体（たとえば、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片）と組み合わせずに投与される場合に使用される用量よりも低い用量で、投与される。対象がヒトである、ある特定の実施形態では、ゲムシタビンは、１，５００ｍｇ／ｍ２よりも低い用量で投与される、および／またはｎａｂ−パクリタキセルは、３００ｍｇ／ｍ２よりも低い用量で投与される。対象がヒトである、ある特定の実施形態では、ゲムシタビンは、１，０００ｍｇ／ｍ２よりも低い用量で投与される、および／またはｎａｂ−パクリタキセルは、１２５ｍｇ／ｍ２よりも低い用量で投与される。対象がヒトである一実施形態では、ゲムシタビンは、５００ｍｇ／ｍ２、４００ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、もしくは２００ｍｇ／ｍ２に等しいかもしくはそれらよりも低い用量で投与される、および／またはｎａｂ−パクリタキセルは、６２．５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、もしくは２０ｍｇ／ｍ２に等しいかもしくはそれらよりも低い用量で投与される。対象がヒトである一実施形態では、ゲムシタビンは、９００ｍｇ／ｍ２、８００ｍｇ／ｍ２、７００ｍｇ／ｍ２、もしくは６００ｍｇ／ｍ２に等しいかもしくはそれらよりも低い用量で投与される、および／またはｎａｂ−パクリタキセルは、１１０ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、８０ｍｇ／ｍ２、もしくは７０ｍｇ／ｍ２に等しいかもしくはそれらよりも低い用量で投与される。ある特定の実施形態では、ゲムシタビンおよび／またはｎａｂ−パクリタキセルは、２週間に１回またはそれよりも低い（たとえば、３週間に１回、４週間に１回、６週間に１回、もしくは８週間に１回、またはそれよりも低い）頻度で、投与される。ある特定の実施形態では、ゲムシタビンは、１日１回、１週間に４回、１週間に３回、１週間に２回、または１週間に１回の頻度で、投与される。ある特定の実施形態では、ｎａｂ−パクリタキセルは、１日１回、１週間に４回、１週間に３回、１週間に２回、または１週間に１回の頻度で、投与される。ある特定の実施形態では、ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルは、１日１回、１週間に４回、１週間に３回、１週間に２回、または１週間に１回の頻度で、投与される。一実施形態では、ゲムシタビンおよび／またはｎａｂ−パクリタキセル（nab-psclitazel）は、１週間に１回投与される。ある特定の実施形態では、ゲムシタビンおよび／またはｎａｂ−パクリタキセルでの処置の合計期間は、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、または１２週間であるか、またはそれを上回る。
【０２８６】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、がんを有する対象に、前記がんについて示されている化学療法薬と組み合わせて投与され、この化学療法薬は、必要に応じて、前記がんについて示されている投薬量および／または投与レジメンで投与される。様々ながんについて示されている化学療法薬ならびにそれらの投薬量および投与レジメンの非限定的な例は、以下に提供されている。
【０２８７】
卵巣がん：以下の情報は、Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）（注射用ゲムシタビン）、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、http://pi.lilly.com/us/gemzar.pdfの２０１７年３月に改正されているＨｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから取得したものである（２０１７年７月２７日に最終アクセス）。カルボプラチンと組み合わせたゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））は、白金系療法の完了から少なくとも６ヶ月後に再発した進行卵巣がんを有する患者の処置に示されている。Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）の推奨される用量は、各２１日サイクルの１日目および８日目に３０分間にわたる静脈内注入として１０００ｍｇ／ｍ２であり、これは、各２１日サイクルの１日目におけるＧｅｍｚａｒ（登録商標）の投与後の静脈内カルボプラチン（ＡＵＣ  ４）との組合せである。
【０２８８】
乳がん：以下の情報は、Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）（注射用ゲムシタビン）、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、http://pi.lilly.com/us/gemzar.pdfの２０１７年３月に改正されているＨｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから取得したものである（２０１７年７月２７日に最終アクセス）。パクリタキセルと組み合わせたゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））は、アントラサイクリンが臨床上禁忌である場合を除き、先行するアントラサイクリン含有アジュバント化学療法の失敗後の、転移性乳がんを有する患者の第１選択肢の処置に示されている。Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）の推奨される用量は、パクリタキセルを含めた各２１日サイクルの１日目および８日目に、３０分間にわって静脈内に１２５０ｍｇ／ｍ２である。パクリタキセルは、Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）の投与の前に、３時間の静脈内注入として、１日目に、１７５ｍｇ／ｍ２で投与され得る。
【０２８９】
非小細胞肺がん：以下の情報は、Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）（注射用ゲムシタビン）、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、http://pi.lilly.com/us/gemzar.pdfの２０１７年３月に改正されているＨｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから取得したものである（２０１７年７月２７日に最終アクセス）。ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））は、シスプラチンとの組合せで、制御不能な局所進行性（ステージＩＩＩＡまたはＩＩＩＢ）または転移性（ステージＩＶ）非小細胞肺がんを有する患者の第１選択肢の処置に示されている。４週間ごとのスケジュール：Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）の推奨される用量は、シスプラチン療法との組合せで、１日目、８日目、および１５日目に、３０分間にわたって静脈内に１０００ｍｇ／ｍ２であり、シスプラチンは、１日目に、Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）の注入後に１００ｍｇ／ｍ２で静脈内に投与され得る。３週間ごとのスケジュール：Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）の推奨される用量は、シスプラチン療法との組合せで、１日目および８日目に、３０分間にわたって静脈内に１２５０ｍｇ／ｍ２であり、シスプラチンは、１日目に、Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）の注入後に１００ｍｇ／ｍ２で静脈内に投与され得る。
【０２９０】
膵臓がん：以下の情報は、Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）（注射用ゲムシタビン）、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、http://pi.lilly.com/us/gemzar.pdfの２０１７年３月に改正されているＨｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから取得したものである（２０１７年７月２７日に最終アクセス）。ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ（登録商標））は、局所進行性（切除不能性ステージＩＩまたはステージＩＩＩ）または転移性（ステージＩＶ）の膵臓の腺癌を有する患者の第１選択肢の処置として示されている。Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）は、以前に５−ＦＵで処置した患者に示されている。Ｇｅｍｚａｒ（登録商標）の推奨される用量は、３０分間にわたって静脈内に１０００ｍｇ／ｍ２である。推奨される処置スケジュールは、以下の通りである：１〜８週目−−最初の７週間は週１回で投薬、続いて１週間の休薬；８週目以降−−２８日サイクルの１日目、８日目、および１５日目に週１回で投薬。
【０２９１】
転移性乳がん：以下の情報は、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（注射用懸濁液用のパクリタキセル−タンパク質結合型粒子、アルブミン結合型）、Ｃｅｌｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、http://www.abraxane.com/wp-content/pi/prescribing-info.htmlの２０１５年７月に改正された、Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから取得したものである（２０１７年７月２７日に最終アクセス）。ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）は、転移性疾患の組合せ化学療法の失敗後またはアジュバント化学療法の６ヶ月以内の再発後の、乳がんの処置に示されている。以前の治療法には、臨床上禁忌でない限り、アントラサイクリンが含まれているはずである。転移性乳がんの組合せ化学療法の失敗後またはアジュバント化学療法の６ヶ月以内の再発後の、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）の推奨されるレジメンは、３週間ごとに、３０分間にわたる静脈内への２６０ｍｇ／ｍ２の投与である。
【０２９２】
非小細胞肺がん：以下の情報は、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（注射用懸濁液用のパクリタキセルタンパク質結合型粒子、アルブミン結合型）、Ｃｅｌｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、http://www.abraxane.com/wp-content/pi/prescribing-info.htmlの２０１５年７月に改正された、Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから取得したものである（２０１７年７月２７日に最終アクセス）。ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）は、カルボプラチンとの組合せで、治癒的な外科手術または放射線療法の候補ではない患者における、局所進行性または転移性非小細胞肺がんの第１選択肢の処置に示されている。ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）の推奨される用量は、各２１日サイクルの１日目、８日目、および１５日目に、３０分間にわたる静脈内注入としての１００ｍｇ／ｍ２の投与である。カルボプラチンは、各２１日サイクルの１日目に、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）の直後に投与され得る。
【０２９３】
膵臓の腺癌：以下の情報は、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）（注射用懸濁液用のパクリタキセルタンパク質結合型粒子、アルブミン結合型）、Ｃｅｌｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、http://www.abraxane.com/wp-content/pi/prescribing-info.htmlの２０１５年７月に改正された、Ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｏｆ  Ｐｒｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎから取得したものである（２０１７年７月２７日に最終アクセス）。ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）は、ゲムシタビンとの組合せで、膵臓の転移性腺癌を有する患者の第１選択肢の処置に示されている。ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）の推奨される用量は、各２８日サイクルの１日目、８日目、および１５日目に、３０〜４０分間にわたる静脈内注入としての１２５ｍｇ／ｍ２の投与である。ゲムシタビンは、各２８日サイクルの１日目、８日目、および１５日目に、ＡＢＲＡＸＡＮＥ（登録商標）の直後に投与され得る。
【０２９４】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、免疫調節剤（たとえば、サイトカイン、抗原、またはチェックポイント標的化剤）と組み合わせて、対象に投与される。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、チェックポイント標的化剤、たとえば、限定されないが、ＰＤ−１のアンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１のアンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ２のアンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４のアンタゴニスト、ＴＩＭ−３のアンタゴニスト、ＧＩＴＲのアンタゴニスト、ＯＸ４０のアンタゴニスト、ＬＡＧ−３のアンタゴニストと組み合わせて、対象に投与される（たとえば、上述のチェックポイント分子のいずれかのアンタゴニストは、抗体、たとえば、これらの分子に対する阻害性抗体、抗体断片、または小分子であり得る）。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＰＤ−１の阻害剤、ＰＤ−Ｌ１の阻害剤、またはＣＴＬＡ−４の阻害剤と組み合わせて、対象に投与される（阻害剤は、アンタゴニスト抗体、抗体断片、または小分子であり得る）。
【０２９５】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、放射線療法（たとえば、ｘ線、ガンマ線、または別の放射線源）と組み合わせて、対象に投与される。
【０２９６】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、外科手術（たとえば、処置されているがん性腫瘍の一部またはすべてを除去するための外科手術）と組み合わせて、対象に投与される。
【０２９７】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、Ｔｒｅｇ阻害剤と組み合わせて、対象に投与される。
【０２９８】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、Ｔ細胞療法と組み合わせて、対象に投与される。
【０２９９】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、腫瘍ワクチンと組み合わせて、対象に投与される。
【０３００】
特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、ＥＧＦＲ阻害剤（たとえば、エルロチニブ）と組み合わせて、対象に投与される。
【０３０１】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、細胞周期阻害剤で処置されない対象を処置するために使用される（すなわち、追加の治療法は、細胞周期を阻害する薬剤ではない）。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、細胞周期阻害剤で同時に（同じ処置期間中に）処置されない対象を処置するために使用される（すなわち、対象は、同じ期間、たとえば、日または週の間に、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片および細胞周期阻害剤で処置されない）。一実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、細胞周期阻害剤で以前に処置されておらず、それで同時に処置されない、対象を処置するために使用される。
【０３０２】
具体的な実施形態では、本明細書に記載される抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、第２の治療法（たとえば、化学療法、放射線療法、外科手術、または本明細書に記載されるかもしくは当該技術分野において公知の任意の他の治療法）の前、最中、または後に、使用することができる。
【０３０３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法に従って処置される対象は、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片の投与の前に、抗がん療法を受容していない。他の実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、抗体または断片の投与の前に抗がん療法を受容している対象に投与される。具体的な実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片は、免疫抑制療法から回復しているかまたはそれを受容している対象に投与される。
【０３０４】
ある特定の実施形態では、抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片と、１つまたは複数の追加の抗がん剤とを含む、キットが、本明細書において提供される。一実施形態では、（ｉ）抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体またはその断片（たとえば、治療有効量の）と、（ｉｉ）化学療法薬、たとえば、ゲムシタビン、パクリタキセル、またはゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルのうちの１つまたは複数（たとえば、治療有効量、たとえば、本明細書に記載される任意の量、これは、薬物が抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体または断片を伴わずに使用される場合の薬物（単数または複数）の治療有効量よりも少ない場合がある）とを含む、キットが、本明細書において提供される。
【０３０５】
以下の実施例は、限定としてではなく、例示として提供されるものである。本発明の様々な他の実施形態は、本明細書に提供される一般的な説明を踏まえて、実施することができる。
【実施例】
【０３０６】
８．実施例
本明細書に表すデータは、ＨＤＭ２の特定のセグメント（すなわちエピトープ）が、インタクトな（すなわち、生存していて透過処理されていない）がん細胞の形質膜表面上において細胞外からアクセス可能であることを実証する。３つの異なる細胞外からアクセス可能なエピトープが識別されている。細胞外からアクセス可能なＨＤＭ２の特定のセグメントは、ＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、およびＮＭＣ−Ｐ３ペプチド配列（それぞれ、配列番号１、配列番号２、および配列番号３）に存在するエピトープを含むがこれらに限定されない。これらの細胞外からアクセス可能な配列は、抗ＨＤＭ２抗体の適切な治療および診断標的である。したがって、その表面膜上にＨＤＭ２を発現するがん細胞は、診断および治療（すなわち、抗腫瘍細胞傷害効果および阻害効果）目的のためにＨＤＭ２に対する抗体によって標的化され得る。
【０３０７】
特に、本明細書に表すデータは、選択したＨＤＭ２特異的抗体が、いくつかの齧歯類およびヒトがん細胞系ならびにヒト患者からの初代培養腫瘍細胞のインタクトな細胞の表面膜上のＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能な配列に結合することを実証した。これに対し、同じＨＤＭ２特異的抗体は、正常ヒト血液単核細胞の表面膜にはごくわずかな結合を呈した。これらのＨＤＭ２特異的抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで様々ながん細胞、たとえばインタクトなヒト黒色腫、ぶどう膜黒色腫、膵臓がん、乳がん、結腸がん、肺がん、および卵巣がん細胞に選択的に結合することが見出された。加えて、本明細書に表すデータは、ＨＤＭ２特異的抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでがん細胞の成長を阻害することを示し、それらがｉｎ  ｖｉｖｏで治療剤として使用できることを強く指摘した。ｉｎ  ｖｉｖｏ試験のデータおよび本明細書に記載のデータは、選択したＨＤＭ２特異的抗体が腫瘍成長を阻害し、齧歯類腫瘍モデルにおいて腫瘍に対して細胞傷害性であることを示した。以下の例は、選択したＨＤＭ２特異的抗体が、腫瘍細胞に対して細胞傷害性であるのみならず、マウスの膵臓がん、肺がん、および結腸がんモデルにおいて腫瘍成長も阻害することを実証した。本明細書に記載のデータは、選択した抗体のみが、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープを認識することをさらに実証した。
【０３０８】
実施例で使用した抗体を作製する方法
（ｉ）ＮＭＣ−Ｐ１、すなわち配列番号１のペプチド（「ＮＭＣ−１００シリーズのモノクローナル抗体」）、（ｉｉ）ＮＭＣ−Ｐ２、すなわち配列番号２のペプチド（「ＮＭＣ−２００シリーズのモノクローナル抗体」）、および（ｉｉｉ）ＮＭＣ−Ｐ３、すなわち配列番号３のペプチド（「ＮＭＣ−３００シリーズのモノクローナル抗体」）に特異的に結合する抗ＨＤＭ２抗体を、ハイブリドーマアプローチを使用して生成した。ＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、およびＮＭＣ−Ｐ３ペプチドを、スルホ−ＳＭＣＣ法（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号２２１２２）を使用してキーホール・リンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートした。簡単に説明すると、タンパク質−ＮＨ２を、コンジュゲーション緩衝液（製造業者によって提供）中で作製した。２０倍モル過剰量の架橋剤をタンパク質溶液に添加し、反応混合物を室温で３０分間インキュベートした。次に、過剰量の架橋剤を、コンジュゲーション緩衝液によって平衡にした脱塩カラムを使用して除去した。タンパク質−ＳＨおよび脱塩したタンパク質−ＮＨ２を組み合わせて、混合し、室温で３０分間インキュベートした。コンジュゲーション反応を、タンパク質−ＳＨのスルフヒドリルより数倍高い濃度の還元システインを含有する緩衝液を添加することによって停止させた。ペプチドコンジュゲーション後、マウス（ＢＡＬＢ／ｃ、雌性）を、ペプチドＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、またはＮＭＣ−Ｐ３の１００μｇ／マウスの腹腔内注射によって免疫した。追加免疫を５〜７回注射し、免疫応答を誘発した。次に、特異的抗体産生を、抗体滴定のためにマウス血清のペプチド−ＥＬＩＳＡによって評価した。高い抗体力価を有するマウスの脾臓を、各マウスから収集し、脾細胞の単細胞懸濁液を調製した。次に、脾細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞（比率１：５）と融合した。簡単に説明するとＥＤＴＡ  ２５０μｌを、脾細胞と骨髄腫細胞の混合物に添加した。次に、細胞を遠心沈降させ、上清を除去した。次に、細胞沈降物をほぐし、ＰＥＧ  １ｍＬを管に沿って１分間にわたってゆっくり加え、混合物を３７℃の水浴中で５分間インキュベートした。１００×ＦＢＳ  １ｍＬおよびＩＭＤＭ培地（１０％ＦＢＳ）１０ｍＬを添加して、インキュベータ中で１時間維持した。次に、細胞を遠心分離し、上清を除去した。次に、細胞沈降物をＩＭＤＭ（２０％ＦＢＳ）含有ＨＡＴ融合培地（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン培地）に再懸濁させた。細胞を９６ウェル培養皿に播種し、およそ１０〜１４日間インキュベートした。１０〜１４日後、クローンが目に見えるようになると、各ウェルの培地上清を、その対応する特異的免疫原性ペプチド（ＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、またはＮＭＣ−Ｐ３）への結合について、ＥＬＩＳＡによって試験した。ＥＬＩＳＡ陽性ウェルを、さらなるクローン選択、単細胞サブクローニング、およびモノクローナル抗体精製のために選択した。モノクローナル抗体選択を、ＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、またはＮＭＣ−Ｐ３ペプチド抗原を使用するペプチド−ＥＬＩＳＡによって実施した。ペプチド抗原ならびに形質膜ＨＤＭ２と反応する抗体をさらに選択するために、インタクトながん細胞���の細胞−ＥＬＩＳＡによるｍＡｂ選択に関して、結合アッセイもまた実施した。
【０３０９】
生成された抗体の予想される反応性
異なるＨＤＭ２アイソフォーム／バリアントを有するＮＭＣ−１００シリーズ、ＮＭＣ−２００シリーズ、およびＮＭＣ−３００シリーズのモノクローナル抗体の予想される反応性を表１および表２に表す。それぞれのアイソフォームが、Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３の配列に対応する配列を含有するかどうか（およびそのシリーズの免疫原としてどのペプチドを使用したかに基づく、それぞれのＮＭＣシリーズｍＡｂが結合するペプチド（Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３）に関する知識）に基づいて予測を行った。
【０３１０】
【表１−１】
2020528936.tif 000003
【表１−２】
2020528936.tif 000004
【０３１１】
【表２−１】
2020528936.tif 000005
【表２−２】
2020528936.tif 000006
【表２−３】
2020528936.tif 000007
【０３１２】
実施例で使用した抗体
モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３は、ＮＭＣ−Ｐ１（配列番号１）に結合する抗体である（これは、ＮＭＣ−１００シリーズ抗体の１つである）。モノクローナル抗体ＮＭＣ−２０４は、ＮＭＣ−Ｐ２（配列番号２）に結合する抗体である（これは、ＮＭＣ−２００シリーズ抗体の１つである）。モノクローナル抗体ＮＭＣ−３０３は、ＮＭＣ−Ｐ３（配列番号３）に結合する抗体である（これは、ＮＭＣ−３００シリーズ抗体の１つである）。これらの抗体の重鎖／軽鎖フレームワーク領域配列、相補性決定領域（ＣＤＲ）配列、および可変領域配列を以下の８節に列挙する。
【０３１３】
以下の抗ＨＤＭ２抗体を、実施例１〜９に記載の実験に使用した：（ｉ）ＩｇＧ１アイソタイプの精製ＮＭＣ−１０３マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（単細胞クローニングしたハイブリドーマ細胞によって産生されたＮＭＣ−１０３  ｍＡｂを、プロテインＧ／Ａカラム上で精製した）、（ｉｉ）ＩｇＧ３アイソタイプの精製ＮＭＣ−２０４マウスｍＡｂ（単細胞クローニングしたハイブリドーマ細胞によって産生されたＮＭＣ−２０４  ｍＡｂを、プロテインＧ／Ａカラム上で精製した）；（ｉｉｉ）ＩｇＭアイソタイプの精製ＮＭＣ−３０３マウスｍＡｂ（単細胞クローニングしたハイブリドーマ細胞によって産生されたＮＭＣ−３０３  ｍＡｂを、プロテインＧ／Ａカラム上で精製した）；（ｉｖ）「ＭＤＭ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン１Ａ７」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ００００４１９３−Ｍ０１）；（ｖ）「ＭＤＭ２抗体（Ｄ−７）」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−１３１６１）；（ｖｉ）「ｐ−ＭＤＭ２抗体（２Ｇ２）」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−５３３６８）；（ｖｉｉ）「ＭＤＭ２抗体（ＳＰＭ３４４）」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−５６４３０）；（ｖｉｉｉ）「ＭＤＭ２抗体（ＳＭＰ１４）」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−９６５）；（ｉｘ）「抗ＭＤＭ２クローン４Ｂ２Ｃ１．１１」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＡＢＥ３３１）；（ｘ）「抗ＭＤＭ２クローン３Ｇ９」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０４−１５３０）；（ｘｉ）「抗ＭＤＭ２クローン２Ａ１０」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＡＢＥ２８１）；（ｘｉｉ）「抗ＭＤＭ２（Ａｂ−１）マウスｍＡｂ（ＩＦ２）」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＯＰ４６）；（ｘｉｉｉ）「抗ＭＤＭ２（Ａｂ−３）マウスｍＡｂ（４Ｂ１１）」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＯＰ１４３）；（ｘｉｖ）「抗ＭＤＭ２（Ａｂ−４）マウスｍＡｂ（２Ａ９Ｃ１．１８）」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＯＰ１４４）；（ｘｖ）「抗ＭＤＭ２（Ａｂ−５）マウスｍＡｂ（４Ｂ２Ｃ１．１１）」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＯＰ１４５）；（ｘｖｉ）「ＭＤＭ２抗体（Ｃ−１８）：ｓｃ−８１２」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ポリクローナル、カタログ番号ｓｃ−８１２）；および（ｘｖｉｉ）「ＭＤＭ２抗体（Ｎ−２０）：ｓｃ−８１３」と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ポリクローナル、カタログ番号ｓｃ−８１３）。
【０３１４】
（実施例１）
８．１  ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに対するＨＤＭ２特異的ｍＡｂの選択。
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を利用して、本明細書に表すデータは、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３が、ＨＤＭ２のアミノ酸１〜１５に対応するペプチドＮＭＣ−Ｐ１（配列番号１）に特異的に結合し、ｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４が、ＨＤＭ２のアミノ酸１５〜２５に対応するＮＭＣ−Ｐ２ペプチド（配列番号２）に特異的に結合し、ｍＡｂ  ＮＭＣ−３０３がＨＤＭ２のアミノ酸４７５〜４９１に対応するＮＭＣ−Ｐ３ペプチド（配列番号３）に特異的に結合することを示した。その上、本明細書に表すイムノブロット分析は、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３が、完全長組換えＨＤＭ２タンパク質を認識したことを示す。
【０３１５】
ペプチド−ＥＬＩＳＡ方法論：５μｇ／ｍｌのＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、またはＮＭＣ−Ｐ３ペプチド抗原を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上で一晩乾燥させた。次に、プレートを、１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）（１００μｌ／ウェル）中の５％ＢＳＡによって室温で２時間ブロックした。次に、マイクロプレートウェルを氷冷１×ＰＢＳ  ３００μｌによって５回洗浄した。モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３の、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のＰＢＳ溶液中での適切な希釈液を、そのそれぞれの対応するペプチド（それぞれ、ＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、またはＮＭＣ−Ｐ３）と共に室温でインキュベートした。２時間後、ウェルを氷冷ＰＢＳ  ３００μｌ／ウェルによって５回洗浄し、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ溶液中で１：２５００〜１：５０００に希釈した二次抗体（ＨＲＰ標識ヤギ抗マウスＦ（ａｂ’）２Ｈ＆Ｌ交差吸着二次抗体（ＨＲＰ−ＧａＭ  Ｆ（ａｂ’）２）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ２４５２４）１００μｌを添加し、室温でインキュベーションを継続した。１時間後、ウェルを氷冷ＰＢＳ  ２００μｌによって５回洗浄し、ＴＭＢ基質溶液（１−ＳｔｅｐＴＭ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号３４０２８）５０μＬを各ウェルに添加し、室温で３０分間発色させた。停止溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＳＳ０４）５０μＬを各ウェルに添加することによって、反応を停止させ、各ウェルの吸収を、４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）に関して直ちに読み取った。
【０３１６】
競合アッセイ：ペプチド抗原結合競合実験に関して、１μｌ／ｍｌのｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３を、１０μｌ／ｍｌのＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、またはＮＭＣ−Ｐ３と共に室温で１時間プレインキュベートした。次に、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３を、上記のようにＮＭＣ−Ｐ１によってコーティングしたＥＬＩＳＡプレートと共にインキュベートした。
【０３１７】
ウエスタンブロット：イムノブロットに関して、１μｇ／ウェルの組換えＨＤＭ２タンパク質（ＧＳＴタグ付き、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８８７２７）を、８〜１６％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲル上で分離し、次に、タンパク質をポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）メンブレンに転写した。メンブレンを５％ミルクによってブロックした後、１％ミルクのＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのモノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３と共に２時間インキュベートした。次に、メンブレンを３回（各１０分間）洗浄し、１％ＢＳＡ−ＰＢＳ中で１：５０００に希釈した対応するＨＲＰコンジュゲート二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）、Ｆ（ａｂ’）２交差吸着ＨＲＰ（ＨＲＰ−ＧａＭ  Ｆ（ａｂ’）２）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ２４５２４）と共に１時間インキュベートした。次に、メンブレンを３回洗浄し、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬ  Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号＃３２１３２）と共に１０分間インキュベートした後、ＬＩＣＯＲスキャナ上で発色させた。
【０３１８】
図１で示したペプチド−ＥＬＩＳＡ実験は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３の、その対応するペプチド抗原への選択的かつ特異的結合を実証した。図１Ａは、ＮＭＣ−１０３がＮＭＣ−Ｐ１ペプチドに結合したが、ＮＭＣ−２０４はＮＭＣ−Ｐ１に結合しなかったことを示す。図１Ｂは、ｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４がＮＭＣ−Ｐ２ペプチドに結合したが、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３はＮＭＣ−Ｐ２に結合しなかったことを示す。図１Ｃは、ｍＡｂ  ＮＭＣ−３０３がＮＭＣ−Ｐ３ペプチドに結合したが、ＮＭＣ−２０４はＮＭＣ−Ｐ３に結合しなかったことを示す。このように、ペプチド−ＥＬＩＳＡの結果は、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３の各々がＥＬＩＳＡプレート上でその対応する抗原ペプチドに選択的に結合し、他のペプチドには結合しないことを実証した。図１Ｄは、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３がＮＭＣ−Ｐ１に結合したが、ＮＭＣ−Ｐ１ペプチドをｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３と共にプレインキュベートすると、ＮＭＣ−１０３の、プレート上のＮＭＣ−Ｐ１ペプチドへの結合を消失させることを示す。これに対し、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３を、ＮＭＣ−Ｐ２またはＮＭＣ−Ｐ３のいずれと共にプレインキュベートしても、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３のＮＭＣ−Ｐ１への結合に影響を及ぼさなかった。これらの実験は、その対応するペプチド抗原に関するｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３の特異性を実証する。
【０３１９】
図２のイムノブロット実験の結果は、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３が、組換え完全長ＨＤＭ２タンパク質と反応することを実証した。組換えタンパク質は、そのＮ末端にＧＳＴタグを有し、これによって分子量はおよそ８３ｋＤとなる。イムノブロットのレーン２は、ヒト起源のＭＤＭ２のアミノ酸１００〜３２０に対して作製した市販の抗体（ＭＤＭ２（Ｄ−７）；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−１３１６１）の、完全長組換えＨＤＭ−２タンパク質に対する反応性を示す。イムノブロットのレーン３は、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３の、組換えＨＤＭ２−ＧＳＴタンパク質に対応するおよそ８３ｋＤでのシングルバンドに対する反応性を示す。イムノブロットのレーン４は、ｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４の、組換えＨＤＭ２−ＧＳＴタンパク質に対応するおよそ８３ｋＤでのシングルバンドへの結合を示す。イムノブロットのレーン５は、ｍＡｂ  ＮＭＣ−３０３の、８３ｋＤでの組換えＨＤＭ２−ＧＳＴタンパク質に対する反応性を示す。これに対し、レーン１では、対照マウスＩｇＧ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８４４７）は、組換えＨＤＭ２−ＧＳＴタンパク質と反応しなかった。本明細書に表すデータは、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３が、完全長ＨＤＭ２を認識することをさらに実証した。
【０３２０】
（実施例２）
８．２  ＨＤＭ２特異的抗体は、異なる齧歯類およびヒトがん細胞系からの、ならびに新たに単離した初代培養ヒトがん細胞からのインタクトながん細胞上のＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに結合したが、正常細胞には結合しなかった。
一般的説明：ＥＬＩＳＡを利用して、本明細書に表すデータは、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３の、ヒト乳がん細胞、ヒトトリプルネガティブ乳がん細胞、ヒト黒色腫細胞、化学療法耐性ヒト卵巣がん細胞、ならびに初代培養患者由来ヒト卵巣がん細胞、ヒトおよびマウス膵臓がん細胞、マウス結腸がん細胞、ならびにマウス肺がん細胞の形質膜上のＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、およびＮＭＣ−Ｐ３配列内のＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープへのそれぞれの結合を実証した。本明細書に表すデータは、これらのｍＡｂががん細胞に選択的に結合するが、正常な非形質転換細胞には結合しないことも実証した。その上、ペプチド−抗原競合結果は、これらのｍＡｂの各々が、形質膜Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４のその対応するＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、またはＮＭＣ−Ｐ３領域に特異的に結合することを示した。
【０３２１】
細胞−ＥＬＩＳＡ方法論：９６ウェルマイクロプレートのウェルあたり細胞８，０００〜１０，０００個を、一晩成長させた。翌日、非結合細胞を滅菌１×ＰＢＳによって洗浄して除去した。各ウェルの細胞を、新たに調製した４％緩衝パラホルムアルデヒド（ｐＨ７．２）によって１時間固定後、１×ＰＢＳによって３回洗浄した。次に、ウェルをＰＢＳ（１００μｌ／ウェル）中の５％ＢＳＡによって室温で２時間ブロックした。次に、マイクロプレートウェルを、氷冷１×ＰＢＳ  ３００μｌによって５回洗浄した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中の１μｇ／ｍＬのｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３を、様々ながん細胞または正常な非形質転換細胞と共に室温で２時間インキュベートした。次に、ウェルを氷冷１×ＰＢＳ  ３００μｌによって５分間洗浄し、１％ＢＳＡのＰＢＳ中で１：２５００または１：５０００に希釈した対応する二次抗体ＨＲＰ−ＧａＭ  Ｆ（ａｂ’）２  １００μｌ／ウェルを、室温で添加し１時間おいた後、氷冷１×ＰＢＳ  ３００μｌによって５回洗浄した。次に、ＴＭＢ基質溶液（１−ＳｔｅｐＴＭ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号３４０２８）５０μＬを各マイクロプレートウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。停止溶液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＳＳ０４）５０μＬを各ウェルに添加することによって反応を停止させ、各ウェルの吸光度をＯＤ４５０ｎｍで測定した。各実験ウェルの吸光度の値を、各実験に含めたアイソタイプが同一のｍＡｂによって処置したウェルから得た吸光度の値に関して補正した。このように、結果を「相対的結合」として表記する。
【０３２２】
図３〜５は、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３の、異なるタイプのヒト（Ａ）がん、および齧歯類（Ｂ）がんのインタクトな細胞への相対的結合を示す。図３は、ヒト乳がんＭＣＦ−７細胞、ヒトトリプルネガティブ乳がんＨＣＣ１８０６細胞、ヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞、アドリアマイシン、メルファラン、およびシスプラチンに対して耐性であるヒト卵巣がんＯＶＣＡＲ−３細胞、初代培養患者由来ヒト卵巣がんＯＶＣＡ４細胞、ヒト黒色腫Ａ２０５８細胞、ヒトぶどう膜黒色腫９２．１細胞、マウス結腸がんＭＣ−３８細胞、マウスルイス肺ＬＬ／２細胞、およびマウス膵臓がんＰａｎｃ０２細胞に対するｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３の反応性を示す。図４は、ヒト乳がんＭＣＦ−７細胞、ヒトトリプルネガティブ乳がんＨＣＣ１８０６細胞、ヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞、ヒト卵巣がんＯＶＣＡＲ−３細胞、初代培養患者由来ヒト卵巣がんＯＶＣＡ．４細胞、ヒト黒色腫Ａ２０５８細胞、ヒトぶどう膜黒色腫９２．１細胞、マウス結腸がんＭＣ−３８細胞、マウスルイス肺ＬＬ／２細胞、およびマウス膵臓がんＰａｎｃ０２細胞に対するＮＭＣ−２０４モノクローナル抗体の反応性を表す。図５は、ヒト乳がんＭＣＦ−７細胞、ヒトトリプルネガティブ乳がんＨＣＣ１８０６細胞、ヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞、ヒト卵巣がんＯＶＣＡＲ−３細胞、初代培養患者由来ヒト卵巣がんＯＶＣＡ．４細胞、ヒト黒色腫Ａ２０５８細胞、ヒトぶどう膜黒色腫９２．１細胞、マウス結腸がんＭＣ−３８細胞、マウスルイス肺ＬＬ／２細胞、およびマウス膵臓がんＰａｎｃ０２細胞に対するＮＭＣ−３０３モノクローナル抗体の反応性を示す。
【０３２３】
図６は、ＮＭＣ−２０４が、正常ヒトＰＢＭＣに反応しなかったことを実証する。がん細胞とは対照的に、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３のいずれも、正常なインタクトな細胞には結合しなかった（ＮＭＣ−１０３およびＮＭＣ−３０３のデータは示さず）。本明細書に表すデータは、ｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４がヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞に反応したが、ｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４を、新たに単離した正常ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と共にインキュベートしてもバックグラウンドを上回る結合は見られなかったことを示す。その上、図６は、ｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４が正常ヒトＰＢＭＣと反応しなかったが（図６左；白色の棒グラフ）、これらの細胞が、Ｔ細胞の細胞表面マーカーであるＣＤ３ｅに対するｍＡｂに対して強い反応性を示した（図６左；影をつけた棒グラフ）ことを実証する。
【０３２４】
図７は、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３およびＮＭＣ−２０４の飽和曲線を表す。図７Ａは、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３の、インタクトなＭＩＡＰａＣａ−２細胞への細胞−ＥＬＩＳＡ結合が、抗体濃度が増加すると、増加したことを示す。しかし、この結合は、５０μｇ／ｍＬを上回る濃度のｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３で平衡に達し、抗原結合部位が特異的抗体ＮＭＣ−１０３によって飽和したことを実証する。その上、図７Ｂは、ｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４の、インタクトなＭＩＡＰａＣａ−２細胞への結合飽和曲線を表す。ｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４の、インタクトなＭＩＡＰａＣａ−２細胞上のその抗原への結合は、５０μｇ／ｍＬを上回る濃度のｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４で飽和に達し、ｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４に関する抗原部位の結合飽和を実証した。
【０３２５】
（実施例３）
８．３  ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３はそれぞれ、インタクトながん細胞上のＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、およびＮＭＣ−Ｐ３配列に対して特異的であった。
図８に示すデータは、がん細胞の膜上の細胞外からアクセス可能なＨＤＭ２のＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、およびＮＭＣ−Ｐ３配列に関するｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３の特異性を実証した。図８Ａは、インタクトなヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞へのｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３の結合を示す（左、黒い棒グラフ）。モノクローナル抗体ＮＭＣ−１０３の、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞の表面形質膜上でアクセス可能なＨＤＭ２のそのエピトープへの結合は、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３を可溶性のＮＭＣ−Ｐ１と競合させると完全に消失した（中央の列、黒い棒グラフ）。これに対し、ＮＭＣ−Ｐ２との競合は、それが結合し、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞の細胞表面上でアクセス可能なＨＤＭ２のエピトープに対するＮＭＣ−１０３の反応性にいかなる効果も有しなかった（黒く塗りつぶした棒グラフ）。
【０３２６】
一方、図８Ｂに示すように、インタクトなＭＩＡＰａＣａ−２細胞に対するｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４の反応性は、ＮＭＣ−Ｐ２ペプチドと競合したが、ＮＭＣ−Ｐ１とは競合せず、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞の形質膜上で発現されたＨＤＭ２の別の細胞外からアクセス可能なエピトープ／ペプチドに関するエピトープ特異性を実証する。
【０３２７】
ＨＤＭ２上のある特定のエピトープに関する新たに生成されたｍＡｂの特異性に関する観察は、インタクトなＭＩＡＰａＣａ−２に対するｍＡｂ  ＮＭＣ−３０３の結合が、ＮＭＣ−Ｐ３ペプチドと競合したが、ＮＭＣ−Ｐ２とは競合しなかったという観察によってさらに拡張された（図８Ｃ）。まとめると、これらのデータは、ＨＤＭ２の３つの異なる細胞外からアクセス可能な配列、すなわちＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、およびＮＭＣ−Ｐ３のそれぞれに関するｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３の特異性を実証する。
【０３２８】
図９で実証したように、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３を完全長組換えＨＤＭ２と共にプレインキュベートすると、抗体のインタクトなＭＩＡＰａＣａ−２細胞への結合は低減された。この結果は、ＮＭＣ抗体のＨＤＭ２への特異的結合をさらに確認する。
【０３２９】
（実施例４）
８．４  形質膜マーカー抗体、抗体ＮＭＣ−１０３および抗体ＮＭＣ−２０４は、インタクトな細胞の形質膜表面を染色するが、細胞内マーカー抗体は染色しない。
本明細書に表すデータ（図１０）は、選択したＨＤＭ２特異的抗体が、ＥＤＴＡ（１０ｍｍｏｌ；ｐＨ７．２；５分間、３７℃）によって処置したインタクトながん細胞（ヒト膵臓がんＭｉａＰａＣａ−２細胞）の形質膜上の細胞外からアクセス可能なＨＤＭ２に結合することを示した。したがって、ＥＤＴＡ処置は、がん細胞の表面膜上のＨＤＭ２の発現に対してほとんどまたは全く効果を有しないように思われ、ＨＤＭ２タンパク質抗原が、膜内在性タンパク質であることを強く示唆している。本明細書で表す追加のデータは、Ｅ−カドヘリンなどの形質膜マーカーに対する抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂ、カタログ番号Ｃ３７０２０）がインタクトな細胞に結合したが、シトクロムＣなどの細胞内に位置するマーカーに対して特異的な抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−１３１５６）は、インタクトな細胞の細胞内区画にアクセス不可能であることによりその標的に結合することができなかったことを示す。
【０３３０】
（実施例５）
８．５  インタクトながん細胞の細胞外プロテアーゼ消化は、インタクトながん細胞の形質膜上のＭ（Ｈ）ＤＭ２の細胞外からアクセス可能な配列を除去した。
ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３をそれぞれ、ＨＤＭ２のアミノ酸１〜１５（ＮＭＣ−Ｐ１）、１５〜２５（ＮＭＣ−Ｐ２）、および４７５〜４９１（ＮＭＣ−Ｐ３）に対して作製し、これらはＨＤＭ２に対して高度に特異的であった。図２のイムノブロットに示したように、３つのｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のそれぞれはすべて、精製ＨＤＭ２タンパク質を認識して結合し、ＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、およびＮＭＣ−Ｐ３における３つのｍＡｂによって認識されるユニークな抗原性エピトープが、インタクトなＨＤＭ２のデファクト（ｄｅ  ｆａｃｔｏ）構造であるという証拠を提供する。図３〜５、および８における細胞−ＥＬＩＳＡの結果は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２エピトープがインタクトな齧歯類およびヒトがん細胞の表面膜において細胞外に発現されるという証拠をさらに提供することによってこの観察を一歩さらに進めた：（１）ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３は、インタクトながん細胞に結合した（図３〜５）；（２）各々のｍＡｂの結合は、その特異的ペプチドが有効に競合したが、他のペプチドとは競合しなかった（図８）；（３）ＮＭＣ−ｍＡｂの結合はまた、インタクトなＨＤＭ２−タンパク質とも有効に競合した（図９）；（４）ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、またはＮＭＣ−３０３の、インタクトな正常ヒトＰＢＭＣへの結合は事実上見られなかった（図６）。
【０３３１】
がん細胞の表面膜上のＭ（Ｈ）ＤＭ２の発現に関する知見をさらに固めるために、間接的免疫蛍光による、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３のそれぞれのがん細胞への結合を、細胞のプロテアーゼ処置の前後で調べた。細胞外プロテアーゼ消化は、形質膜タンパク質の細胞表面局在を評価するための強力な手段として検証されている（Besingi  and  Clark,  2015,  Nat.  Protoc.  10  (12)  :  2074-2080;  Schulein  et  al.,  1996,  J.  Biol.  Chem.  271  (46):  28844-28852）：プロテアーゼ処置後に細胞表面抗原特異的抗体の細胞への結合が失われると、抗原が、タンパク質分解に対してアクセス可能であるのみならず、最も重要なことに抗原が細胞の細胞外表面上に露出していることを示す。したがって、細胞外に表示されたＭ（Ｈ）ＤＭ２タンパク質抗原、ならびに特にＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、およびＮＭＣ−Ｐ３のアミノ酸配列のアクセス可能性を、トリプシンによる消化に対する抗原の感受性によって評価した。次に、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３の結合に及ぼすトリプシンの効果を、上記のように細胞ＥＬＩＳＡおよびＯＤ４５０ｎｍでのＨＲＰ反応性を使用して調べた。
【０３３２】
フローサイトメトリー方法論：２５ｃｍ２組織培養フラスコにおいて約８０％コンフルエンシーとなるまで成長させた細胞を、ＥＤＴＡ（１０ｍｍｏｌ；ｐＨ７．２；５分間、３７℃）またはトリプシン（Ｇｉｂｃｏ  ＴｒｙｐＬＥ  Ｅｘｐｒｅｓｓ）のいずれかによって放出し、新たに作製した４％緩衝（ｐＨ  ７．４）パラホルムアルデヒドによって室温で１時間固定し、大量の氷冷ＰＢＳによって数回洗浄し、ＰＢＳ（インタクト、非透過処理細胞）中の５％ヒト血清アルブミンによって室温で３０分間ブロックした。生存率を確立後、細胞数を、細胞１０６個／ｍｌに調整し、染色するまで氷冷ＰＢＳ中で維持した。同じ細胞の別の組をＥＤＴＡまたはトリプシンのいずれかによって放出させ、上記のように４％緩衝パラホルムアルデヒドによって固定した後、洗浄し、ＰＢＳ中の５％ヒト血清アルブミンによってブロックし、膜を透過処理するためにＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＰＢＳ中で０．１％）（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、０７１００）によって室温で５分間、別々に処置した。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液をＰＢＳによって洗浄して除去後、細胞を、細胞１０６個／ｍｌとなるように調整し、氷冷ＰＢＳ中で保存した。各調製物からの細胞（１０６個／ｍｌ）を、５μｇ／ｍｌのＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼα−１に対するｍＡｂ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２８２６）、５μｇ／ｍｌのｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、または５μｇ／ｍｌのｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４のいずれかと共に室温で９０分間インキュベートした。一次抗体のインキュベーション後、細胞を、氷冷ＰＢＳによって３回洗浄後、ウサギ抗マウスＰＥ−Ｃｙ５標識二次抗体（ＰＥ−Ｃｙ５−ＲａＭ  ＩｇＧ（Ｈ＆Ｌ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｍ３５０１８）と共に室温でインキュベートした。６０分後、細胞をＰＢＳによって３回洗浄し、フローサイトメトリー分析（ＢＤ  Ｃａｎｔｏ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）に供した。バックグラウンド蛍光を確立するための対照は、非染色細胞試料、ならびに実験試料に使用した同じ条件下で二次抗体によって処理した細胞試料の分析を含んだ。
【０３３３】
インタクトな細胞における抗体の細胞外アクセス可能性と細胞内アクセス可能性を比較して評価するために、形質膜マーカーであるＥ−カドヘリンに対する抗体（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂ  Ｃ３７０２０）の結合、および細胞内タンパク質であるシトクロムＣに対する抗体（ｓａｎｔａ  ｃｒｕｚ  ｓｃ−１３１５６）の結合を、インタクトなヒト膵臓がんＭｉａＰａＣａ−２細胞を使用して試験した。図１０の細胞−ＥＬＩＳＡの結果は、Ｅ−カドヘリン抗体のインタクトなＥＤＴＡ放出ＭｉａＰａＣａ−２細胞への結合を実証する（左から１番目の棒グラフ）。これに対し、シトクロムＣに対するｍＡｂは、ＥＤＴＡ放出細胞に対してごくわずかな結合を示したに過ぎず（左から２番目の棒グラフ）、インタクトな細胞における細胞内標的が抗体などの大きい分子に対してアクセス不可能であることを示す。一方、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３およびＮＭＣ−２０４はいずれも、インタクトなＥＤＴＡ放出ＭＩＡＰａＣａ−２細胞に結合し、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能な配列に存在するそのエピトープとの相互作用に関する強い証拠を確立した。
【０３３４】
形質膜Ｍ（Ｈ）ＤＭ２のエピトープが実際にがん細胞上の細胞外からアクセス可能な配列であることをさらに検証するために、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、およびＮＭＣ−３０３の結合を、ＥＤＴＡ対トリプシンの処置条件下でマウスルイス肺ＬＬ／２がん細胞において実施した。また、これらの条件の両方を、インタクトな細胞と透過処理細胞について試験して比較した。図１１のパネルＡ、Ｂ、およびＣはそれぞれ、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、および抗Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼα−１によって染色した％細胞に関するフローサイトメトリーデータを表す。各抗体を、４つの処置条件からの細胞と反応させた：ＥＤＴＡ処置インタクト細胞、ＥＤＴＡ処置透過処理細胞、トリプシン処置インタクト細胞、トリプシン処置透過処理細胞。ＥＤＴＡ処置インタクト細胞は、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３（７０．４％）、ＮＭＣ−２０４（５１．２％）、および抗Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼα−１抗体（２９．９％）による染色を示した。ＥＤＴＡ処置細胞を透過処理すると、ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、および抗Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼα−１による染色はそれぞれ、７５．８％、５２．８５、および６３．８％に増加した。しかし、ＥＤＴＡ処置細胞と比較すると、抗体認識エピトープの細胞外プロテアーゼ消化により、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、および抗Ｎａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼα−１の、トリプシン処置したインタクトな細胞への結合はそれぞれ、３６．８％、２７％、および２０．５％に減少した。しかし、トリプシン処置細胞を透過処理すると、上記の結合の低減は、細胞内ＭＤＭ２またはＮａ＋／Ｋ＋ＡＴＰアーゼα−１に対する抗体の反応性によって相殺された。まとめると、本明細書に表す結果は、細胞外プロテアーゼ処置によって切断することができるインタクトながん細胞上の膜貫通Ｍ（Ｈ）ＤＭ２の細胞外配列のアクセス可能性をさらに実証する。
【０３３５】
（実施例６）
８．６  特異的ＨＤＭ２抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのインタクトながん細胞の成長を阻害した。
本明細書に表すデータは、ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能な配列を認識する抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでがん細胞の成長を阻害することができたことを実証する。
【０３３６】
使用した方法論：ヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞（細胞８，０００個／ウェル）を、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３、ＮＭＣ−２０４、および抗シトクロムＣ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−１３１５６）のそれぞれ、１、５、および１０μｇ／ｍＬと共にプレインキュベートした。様々な濃度の抗体の１つの存在下で、細胞を、９６ウェル細胞培養プレートに３連で一晩播種した。翌日、各プレートのウェルを形態学的に分析し、ＥＶＯＳ  ＦＬ顕微鏡を使用して各ウェルの写真を撮影した。細胞カウントもまた実施し、生存細胞数を対照の％としてグラフとした。
【０３３７】
図１２（Ａ〜Ｄ）は、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３またはＮＭＣ−２０４によって処置したヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞が、濃度依存的成長阻害を呈したが、細胞内マーカー（すなわち、シトクロムＣ）に対する抗体は、これらのがん細胞の成長に影響を及ぼさなかったことを実証する。図１２Ａで実証したように、１μｇ／ｍＬ（上のパネル、左の画像）、５μｇ／ｍＬ（上のパネル、中央の画像）、および１０μｇ／ｍＬ（上のパネル、左の画像）のｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３によって処置したＭＩＡＰａＣａ−２細胞は、その成長阻害の増加効果を示した。図１２Ｂは、１、１０、および２０μｇ／ｍＬのｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４によって処置した細胞の画像を表し、細胞成長の濃度依存的阻害を示す。これに対し、図１２Ｃは、ＭＩＡＰａＣａ−２細胞を、細胞内マーカー対照として使用するシトクロムＣに対する抗体によって処置すると、１、１０、および２０μｇ／ｍＬ濃度のいずれにおいてもこれらの細胞の成長に影響を及ぼさなかったことを実証する。図１２Ｄは、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３の１μｇ／ｍＬ（６５％）、５μｇ／ｍＬ（８４％）、および１０μｇ／ｍＬ（９１％）（黒色の実線）、およびＮＭＣ−２０４の１μｇ／ｍＬ（６５％）、５μｇ／ｍＬ（７３％）、および１０μｇ／ｍＬ（７７％）（黒色の破線）の成長阻害効果を定量する。これに対し、シトクロムＣに対する抗体（細胞内標的；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カタログ番号ｓｃ−１３１５６）による処置は、１μｇ／ｍＬ（１００％）、５μｇ／ｍＬ（１００％）、および１０μｇ／ｍＬ（１０４％）で成長阻害の兆候を示さなかった（灰色の実線）。
【０３３８】
（実施例７）
８．７  ＨＤＭ２特異的抗体は、がん細胞に対する補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）を開始した。
本明細書に表すデータは、ＨＤＭ２特異的抗体が、がん細胞の表面膜上のＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能な配列に結合することができるのみならず、新鮮な正常ヒト血清（ＮＨＳ）の存在下で強力な細胞傷害効果を開始することができることを示す。細胞傷害効果を、膵臓がん細胞ならびに正常ヒト線維芽細胞において測定した。本明細書に表すデータは、ヒト膵臓がんＭＩＡＰａＣａ−２細胞をＮＨＳの存在下でｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３によって処置した場合に、そのような１つの細胞傷害効果を実証した。
【０３３９】
使用した方法論：２４ウェル培養皿に播種した細胞を、５％ＣＯ２−９５％空気混合物を供給する３７℃の湿潤雰囲気下で一晩成長させた。翌日、細胞を氷冷ＰＢＳによって十分に洗浄し、１％ＢＳＡを含有する培養培地で最終抗体濃度３０μｇ／ｍｌとなるように希釈したＨＤＭ２特異的ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３と共にインキュベートした。３０分後、ＮＨＳを、１％ＢＳＡを有する培養培地中で１：１０の最終濃度で１％ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液と共に細胞に添加した。次に、細胞をＮＨＳと共に２時間インキュベートし、ＥＶＯＳ  ＦＬ蛍光顕微鏡（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して画像を得た。
【０３４０】
図１３は、ヒト膵細胞に対するＨＤＭ２特異的ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３の細胞傷害効果を実証する。ＮＨＳの存在下でのｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３は、がん細胞における補体媒介性細胞傷害性を誘発し、細胞死マーカーであるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の核取込みによって明らかとなるがん細胞の死をもたらした。図１３Ｃは、ヒト膵臓がん細胞に対するＨＤＭ２特異的抗体補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）の定量的表示を提供する。ＮＨＳの存在下でｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３（図１３Ｂ）によって処置した細胞は、任意の抗体の非存在下でＮＨＳによって処置した細胞（図１３Ａ）と比較して処置後２時間にわたる細胞傷害性を実証した。対照実験を、抗シトクロムＣ抗体によって、またはＮＨＳの存在下で無処置のままの細胞によって実施した。
【０３４１】
（実施例８）
８．８  ＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、およびＮＭＣ−Ｐ３、ならびにインタクトながん細胞へのその結合に関する他の抗ＨＤＭ２  ｍＡｂ抗体の評価。
市販されているいくつかのＨＤＭ２特異的モノクローナル抗体が存在する。市販のｍＡｂのＨＤＭ２への結合を評価するために、ペプチド−ＥＬＩＳＡおよび細胞−ＥＬＩＳＡを利用して、本発明者らは、インタクトながん細胞へのその結合についてそのようないくつかのｍＡｂを試験した。これらのｍＡｂは、Ｎ末端またはＣ末端の様々な領域、またはＨＤＭ２タンパク質の中央のセグメントに対して作製した抗体を含み、新たに識別された細胞外からアクセス可能なＮＭＣ−Ｐ１およびＮＭＣ−Ｐ２配列、ならびにインタクトながん細胞へのその結合について試験した。
【０３４２】
表３は、試験した市販のｍＡｂ、これらのｍＡｂを生成した企業、およびそれらに対して作製したＨＤＭ２のアミノ酸残基を要約する。
【０３４３】
【表３】
2020528936.tif 000008
【０３４４】
ペプチド−ＥＬＩＳＡを利用して、図１４Ａおよび１４Ｂは、これらのｍＡｂのいずれも、ＮＭＣ−Ｐ１またはＮＭＣ−Ｐ２のいずれにも結合しないことを実証した。これに対し、ＮＭＣ−１０３およびＮＭＣ−２０４はそれぞれ、ＮＭＣ−Ｐ１およびＮＭＣ−Ｐ２への強い結合を示した。
【０３４５】
これらの実験において、ペプチドなどのＨＤＭ−２結合成分、たとえばＰＮＣ−２７がｍＡｂ抗体のＮＭＣ−Ｐ１およびＮＭＣ−Ｐ２への結合を干渉するかどうかをさらに評価した。ＰＮＣ−２７およびＰＮＣ−２８ペプチドのＨＤＭ２結合成分がＨＤＭ２上で結合する正確な場所は不明であるが、ＨＤＭ２のアミノ酸２５〜１０９内で結合することが報告されている（Do  et  al.,  2003,  Oncogene  22  (10):1431-1444  ("Do  2003");  Chene,  2003,  Nat.  Rev.  Cancer  3  (2):  102-109）。ＰＮＣ−２７およびＰＮＣ−２８ペプチドがＮＭＣ−Ｐ１またはＮＭＣ−Ｐ２に結合することを除外するために、これらのＨＤＭ２配列へのペプチドの結合を、ペプチド−ＥＬＩＳＡによって評価した。図１４Ａおよび１４Ｂに示すように、ＰＮＣ−２７（１０μｇ／ｍＬ）は、ＮＭＣ−１０３およびＮＭＣ−２０４（１μｇ／ｍＬ）の、それぞれ、ＮＭＣ−Ｐ１およびＮＭＣ−Ｐ２への結合と競合しなかった。ＰＮＣ−２７は、ＨＤＭ２のＮＭＣ−Ｐ１領域にもＮＭＣ−Ｐ２領域にも結合しないことが見出された。全体として、これらの観察は、ＰＮＣ−２７のＨＤＭ２結合成分が、ＮＭＣ−Ｐ１にもＮＭＣ−Ｐ２にも反応しないことを実証する。その上、ＰＮＣ−２７およびＰＮＣ−２８のＨＤＭ２結合成分は、それ自身抗がん活性を有していないこと、および膜常在性ペプチド（ＭＲＰまたはペネトラチン配列）に結合している場合に限って活性であることが実証されている（Kanovsky  2001,  Do  2003、およびBowne  2008を参照されたい）。
【０３４６】
細胞−ＥＬＩＳＡによるｍＡｂの分析では、試験した市販の抗体のいずれも、ＮＭＣ−Ｐ１にもＮＭＣ−Ｐ２にも結合しなかったという事実にもかかわらず、「抗ＭＤＭ２（Ａｂ−５）マウスｍＡｂ（４Ｂ２Ｃ１．１１）」（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＯＰ１４５）と呼ばれるＨＤＭ２のアミノ酸残基１９〜５０に対する作製された抗ＨＤＭ２抗体、および「ＭＤＭ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン１Ａ７」（Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ００００４１９３−Ｍ０１）と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体は、インタクトながん細胞と反応性であると識別された（ＭＤＭ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン１Ａ７のデータを示す図１５Ａを参照されたい）。ＭＤＭ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン１Ａ７は、完全長ＨＤＭ２のアミノ酸１０１〜２００に対して作製された。このように、データは、ＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、およびＮＭＣ−Ｐ３以外のＨＤＭ２のエピトープが、結合についてがん細胞上において細胞外からアクセス可能であり得ることを実証する。類似の実験において、インタクトながん細胞と反応しない２つのＨＤＭ２特異的モノクローナル抗体が識別された（図１５Ｂ）。１つのｍＡｂは、「抗ＭＤＭ２（Ａｂ−４）マウスｍＡｂ（２Ａ９Ｃ１．１８）」（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＯＰ１４４）と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体であり、これは、１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）および１つの核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を含む完全長ＨＤＭ２のアミノ酸１５３〜２２２（配列番号４）に対して作製される。インタクトながん細胞膜と反応しない別のＨＤＭ２特異的ｍＡｂは、「抗ＭＤＭ２（Ａｂ−１）マウスｍＡｂ（ＩＦ２）」（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＯＰ４６）と呼ばれる抗ＨＤＭ２抗体であり、これは、ＨＤＭ２のアミノ酸２６〜１６９に対して作製される（図１５Ｂ）。
【０３４７】
（実施例９）
８．９  がん細胞におけるＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能な配列を標的とする抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果。
上記で実証したように、がん細胞上には、細胞外からアクセス可能なＨＤＭ２の選択されたエピトープが存在する。本明細書において、ＨＤＭ２のそのような３つの細胞外からアクセス可能なセグメント、すなわちＮＭＣ−Ｐ１（配列番号１）、ＮＭＣ−Ｐ２（配列番号２）、およびＮＭＣ−Ｐ３（配列番号３）を記載する。本明細書のデータは、これらの３つのセグメントに対して作製した選択した抗体が、様々なタイプのがんに選択的かつ特異的に結合するが、正常な健康な細胞には結合しないことを実証した（図３〜９）。その上、本明細書に表す結果は、がん細胞上のＨＤＭ２のこれら３つのセグメントの細胞外からのアクセス可能性を実証した（図１０および１１）。さらに、本明細書のデータは、ＨＤＭ２特異的抗体が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでがん細胞に対して成長阻害および細胞傷害効果の両方を有したことを示す。最後に、ＨＤＭ２特異的抗体の抗腫瘍活性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価した。一例として、肺がん、結腸がん、および膵臓がんに及ぼすｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３およびＮＭＣ−２０４の有効性を試験した。
【０３４８】
使用した方法論（同系マウスの肺、結腸、および膵臓がんモデル）：肺、結腸、および膵臓腫瘍に及ぼすＨＤＭ２特異的抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果を調べるために、３つの周知の同系マウス肺がん、結腸がん、および膵臓がんモデルを使用した（Sharma  et  al.,  1999,  J.  Immunol.  163  (9):  5020-5028;  McIntyre,  2015,  Bioassays  37  (8):  909-920;  Li,  et  al.,  2015,  Sci.  Rep.  5  :7856）。マウスルイス肺がんＬＬ／２細胞（細胞２．５×１０５個／マウス）、マウス結腸がんＭＣ−３８細胞（５×１０５個／マウス）、またはマウス膵臓がんＰａｎｃ−２細胞（細胞２×１０６個／マウス）のいずれかを８週齢の雌性Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝６〜７）の右脇腹に移植することによって、皮下腫瘍を調製した。腫瘍移植後、マウスをそのそれぞれのケージに戻した。腫瘍移植後７日目から、腫瘍体積をデジタルキャリパーによって週に２回測定した。ＭＣ−３８およびＰａｎｃ−２試験の場合、腫瘍が平均で７０〜８０ｍｍ３に達すると処置を開始した。ＬＬ／２試験の場合、腫瘍細胞の接種と処置を同時に開始した。腫瘍移植後に、マウスにマイクロチップを埋め込み、登録した。腫瘍体積測定および体重を記録し、マウスを以下の群へと無作為化した：Ａ）ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３の０．４ｍｇ／ｋｇ（週に３回、３週間）、２ｍｇ／ｋｇ（週に２回、３週間）、または４ｍｇ／ｋｇ（週に２回、３週間）；Ｂ）ＮＭＣ−２０４の０．４ｍｇ／ｋｇ（週に３回、３週間）；Ｃ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ１（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８４４７）、またはＩｇＧ３（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１８３９２）の０．４ｍｇ／ｋｇ（週に３回、３週間）、または４ｍｇ／ｋｇ（週に２回、３週間）；Ｄ）ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ）およびｎａｂ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）を週に２回、３週間；またはＥ）ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ）、ｎａｂ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）、およびｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３（２ｍｇ／ｋｇ；週に２回、３週間）または（１０ｍｇ／ｋｇ；週に２回、２週間）の組合せを投与した。すべての腫瘍を皮下に注射し、すべての処置を腹腔内注射によって実施した。持続的な有害な臨床徴候を示す、または０日目の体重と比較して１５％を上回る体重減少を示したいかなるマウスも安楽死させた。ＨＤＭ２特異的抗体と、アイソタイプ対照マウス抗体と、標準治療の処置（ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセル）による後処置の腫瘍測定の比較を行い、結果を図１６〜１９に表す。
【０３４９】
図１６は、ＬＬ／２ルイス肺がん細胞を同時に接種したマウスにおけるｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４（０．４ｍｇ／ｋｇ、週に３回、３週間；破線）の抗腫瘍有効性を実証する。腫瘍体積測定グラフに表すように、２１日目までに、ＮＭＣ−２０４による処置は、アイソタイプ対照マウスＩｇＧ３による処置（２１３８ｍｍ３）と比較して、腫瘍体積を低減させた（１４４６ｍｍ３）。これらの結果は、肺がん細胞上のＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープを標的とする抗ＨＤＭ２特異的抗体（すなわち、ｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４）の有効性を実証する。さらなる患者の処置のために、投薬および投与方法を、たとえば最適な効果のために薬物の経口または静脈内送達へとさらに発展させることができる。
【０３５０】
図１７および１８はそれぞれ、ＭＣ−３８同系マウス結腸がんモデルに対するｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３およびＮＭＣ−２０４の有効性を実証する。図１７Ａに表すように、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３（０．４ｍｇ／ｋｇ；週に３回、２．５週間；破線）によって１８日間処置したマウスは、１２６８ｍｍ３に成長したが、アイソタイプ対照マウスＩｇＧ１によって処置したマウスの腫瘍体積は、２２０５ｍｍ３（実線）に達した。その上、良好に確立された細胞増殖マーカーであるＫｉ６７タンパク質（Li  et  al.,  2015,  Mol.  Med.  Rep.  11  (3):  1566-72）の免疫組織化学染色は、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３によって処置したマウスの腫瘍細胞でＫｉ６７に関して染色陽性であったのはわずか５％であったのに対し、アイソタイプ対照抗体によって処置したマウスにおける腫瘍の８０％がＫｉ６７に関して染色陽性であることを明らかにした（図１７Ｂ）。これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された成長阻害結果をさらに確認し、それと一致する（図１２）。さらに、膜ＨＤＭ２の異なる細胞外からアクセス可能なセグメント、すなわちＮＭＣ−Ｐ２（配列番号２）を認識する別のＨＤＭ２特異的抗体、ｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４の抗腫瘍有効性を評価した。図１８Ａに示すように、ｍＡｂ  ＮＭＣ−２０４（０．４ｍｇ／ｋｇ；週に３回、３週間）によって処置したマウスの腫瘍体積は、１６７０ｍｍ３へと成長したが、対照抗体処置群の腫瘍体積は２５５５ｍｍ３に達した。さらに、図１８Ｂは、ＮＭＣ−２０４によって処置したマウスでは、Ｋｉ６７に関して染色陽性であったのはその腫瘍細胞の３０％であったのに対し、対照群のマウスでは、その腫瘍細胞のおよそ８０％がＫｉ６７に関して染色陽性であることを示し、腫瘍成長に及ぼすＮＭＣ−２０４処置の抗増殖効果を実証した。
【０３５１】
ＨＤＭ２特異的抗体処置と、標準治療化学療法の有効性をさらに比較した。Ｐａｎｃ−２同系マウス膵臓がんモデルを利用して、図１９は、膵臓がんの標準治療薬：ゲムシタビン（Ｇ）＋ｎａｂ−パクリタキセル（ｎＰ）と組み合わせたＮＭＣ−１０３の相乗効果を実証する。図１９の腫瘍体積グラフに示すように、マウスの腫瘍が、およそ７０ｍｍ３に達すると、マウスを４群（ｎ＝６）に分けて、以下を投与した：Ａ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ１（２ｍｇ／ｋｇ）；Ｂ）低用量ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ）およびｎａｂ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）；Ｃ）ＮＭＣ−１０３（２ｍｇ／ｋｇ）；またはＤ）低用量ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ）、ｎａｂ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）、およびＮＭＣ−１０３（２ｍｇ／ｋｇ）の組合せ。すべての薬物を週に２回、３週間腹腔内注射した。１９日目に６回目の用量を投与後、処置を２週間停止した。３５日目までに、アイソタイプ対照ＩｇＧ（群Ａ）、または低用量ゲムシタビンおよびｎａｂ−パクリタキセルの組合せ（群Ｂ）のいずれかを投与した群のマウスはそれぞれ、平均で２１７５ｍｍ３（△）および２３１４ｍｍ３（○）に達した。これらの群のいずれも、罹病率基準に達しており、終了した。３５日目までに、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３（２ｍｇ／ｋｇ）を投与した群Ｃのマウスの腫瘍のみが平均で１５２３ｍｍ３（▲）に達したが、ＮＭＣ−１０３（２ｍｇ／ｋｇ）、ゲムシタビン、およびｎａｂ−パクリタキセルの組合せを投与した群Ｄのマウスの腫瘍は平均で７９７ｍｍ３（●）であると測定された。次に、これらの２群（群ＣおよびＤ）のマウスを、ＮＭＣ−１０３（１０ｍｇ／ｋｇ）、ゲムシタビン、およびｎａｂ−パクリタキセルの組合せを用いて、週に２回、２週間処置した。図１９で実証したように、両方の群（ＣおよびＤ）の腫瘍は、２週間以内に、測定可能な腫瘍が見出されない点に達した。
【０３５２】
ＮＭＣ−１０３、ならびに膵臓がんの標準治療であるゲムシタビン（Ｇ）およびｎａｂ−パクリタキセル（ｎＰ）とのその組合せの抗腫瘍有効性を、上記のＰａｎｃ−２同系マウス膵臓がんモデルを利用してｉｎ  ｖｉｖｏでさらに評価した。このＰａｎｃ−２試験では、図１９の試験で使用したマウスより多数のマウス（ｎ＝８／群）において、Ｐａｎｃ−２細胞の接種後、腫瘍が８０〜１００ｍｍ３に達すると処置を開始し、ｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３を１０ｍｇ／ｋｇで週に２回投与した。
【０３５３】
図２７は、Ｐａｎｃ−０２腫瘍のサイズが８０〜１００ｍｍ３に達した後、マウスを４群（ｎ＝８／群）に無作為に分け、Ａ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ）；Ｂ）低用量ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ）およびｎａｂ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）；Ｃ）ＮＭＣ−１０３（１０ｍｇ／ｋｇ）；またはＤ）低用量ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ）、ｎａｂ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ）、およびＮＭＣ−１０３（１０ｍｇ／ｋｇ）の組合せを投与した試験の結果を示す。すべての薬物を、週に２回、４週間腹腔内注射した。３０日までに、アイソタイプ対照抗体を投与した群Ａのマウスの平均腫瘍サイズは２０２８ｍｍ３に達し、試験を終了した。３４日目までに、標準治療のＧ＆ｎＰ化学療法の低用量を投与した群Ｂのマウスの半数が死亡し（ｎ＝４）、および他の半数のマウス（ｎ＝４）の腫瘍の平均サイズは１６５４ｍｍ３に達した。これに対し、ＮＭＣ−１０３を投与した群Ｃのすべてのマウス（ｎ＝８）が、生存しており、平均測定値は２３０ｍｍ３であったが、これは初回腫瘍接種部位の瘢痕および炎症によるものであった。他方で、ＮＭＣ−１０３をＧ＋ｎＰと組み合わせて投与した群Ｄでは、マウス１匹が死亡したが、その群の残りのマウス（ｎ＝７）の平均測定値は、１１７ｍｍ３であり、これは腫瘍接種部位の瘢痕および炎症によるものであった。群Ｃ（ｎ＝８）およびＤ（ｎ＝７）の両方のマウスを、さらなる薬物処置を行わずにさらに４週間（試験開始後６２日間）維持したが、初回の瘢痕サイズを上回る腫瘍成長の兆候は観察されず、これらのマウスでは腫瘍が存在しないことを実証した。
【０３５４】
図２８に示すように、カプランマイヤー生存分析は、図２７に記載の実験条件下で、化学療法単独または対照抗体と比較した場合に、ＮＭＣ−１０３単独または化学療法との組合せを投与したマウスにおける有意な生存利益を実証した。この試験は、図１９に関連して上記で考察した観察を確認し、ＮＭＣ−１０３抗体をシングルアームとして、または化学療法と組み合わせて使用できることを確認する。
【０３５５】
試験開始後６２日目でのＮＭＣ−１０３の長期間の抗腫瘍効果の基礎となる免疫応答をさらに評価するために、図２７に記載されるように、Ｇ＋ｎＰの組合せによって前回処置したマウス、群Ｃのマウス（ＮＭＣ−１０３によって前回処置したマウス）、および群Ｄのマウス（ＮＭＣ−１０３＋Ｇ＋ｎＰの組合せによって前回処置したマウス）に、２回目の左背部脇腹へのＰａｎｃ−２の接種（細胞２×１０６個／マウスを皮下注射）を再チャレンジした。腫瘍成長を１０日間モニターし、その時点でＢ群のマウスでは９０ｍｍ３（図２９）の腫瘍が測定された。これに対し、図２９に示すように、ＮＭＣ−１０３抗体を前回投与した２群（群ＣおよびＤ）のマウスでは、腫瘍は観察されなかった。これらの試験は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープを標的とする抗体が宿主免疫系を強力に活性化して、がんに対する長期間の抗腫瘍免疫を提供することができることを実証する。
【０３５６】
大きいサイズの腫瘍（すなわち、進行がん）の処置におけるＮＭＣ−１０３抗体の有効性をさらに確立するために、別のＰａｎｃ−２試験（結果を図３０に示す）において、マウスを膵臓がんの標準治療（ゲムシタビン（２５ｍｇ／ｋｇ）＋ｎａｂ−パクリタキセル（５ｍｇ／ｋｇ））によって１９日間処置し、その時点で、腫瘍サイズはおよそ４５０ｍｍ３に達した。次に、マウスを２群に無作為に分け、Ａ）アイソタイプ対照マウスＩｇＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＢ）ＮＭＣ−１０３（１０ｍｇ／ｋｇ）の１用量を投与した。図３０に示すように、ＮＭＣ−１０３の１回腹腔内注射は、処置後６日目で、腫瘍サイズをほぼ半減させた（４３８ｍｍ３から２３３ｍｍ３）。
【０３５７】
ＮＭＣ−１０３の用量依存的抗腫瘍効果をさらに評価するために、別の試験において、ＭＣ−３８同系腫瘍をマウス（ｎ＝５）において再度確立し、図１７の試験と類似であるが、以下の変更を加えて、すなわち抗体濃度を０．４ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇに増加させて処置を行った。図３１に示すように、１０ｍｇ／ｋｇのＮＭＣ−１０３によって週に２回、３週間処置したマウスは、０．４ｍｇ／ｋｇのＮＭＣ−１０３によって処置したマウスと比較して腫瘍のより大きい低減をもたらした（図１７）。これらのデータは、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープに結合する抗体の用量依存的抗腫瘍効果を裏付ける。
【０３５８】
別の同系マウス結腸がんモデル、ＣＴ−２６（Selby  et  al.,  2016,  PLoS  One.  9;  11  (9):  e0161779）を利用して、モノクローナル抗体ＮＭＣ−３０３のキメラ型の抗腫瘍有効性を評価した。モノクローナル抗体ＮＭＣ−３０３のキメラ型を創出するために、マウスＮＭＣ−３０３（配列番号４０の重鎖可変領域および配列番号４１の軽鎖可変領域を有する）についてアイソタイプクラススイッチを行って、これをマウスＩｇＭからキメラＩｇＧ１に変換した。マウス重鎖および軽鎖可変領域（それぞれ、配列番号４０および配列番号４１）を、定常領域としてのヒトＩｇガンマ−１鎖およびヒトＩｇカッパ鎖にクローニングした。全体で８匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに、ＣＴ−２６（細胞８００，０００個／マウス）を皮下注射した。次に、マウスを２群（ｎ＝４）に分け、Ａ）対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＢ）モノクローナル抗体ＮＭＣ−３０３のキメラ型（１０ｍｇ／ｋｇ）を週に２回、３週間投与した。図３２Ａは、腫瘍接種後２４日目までに、モノクローナル抗体ＮＭＣ−３０３のキメラ型（１０ｍｇ／ｋｇ）によって処置したマウスの平均腫瘍サイズが７２６ｍｍ３に達したが、対照抗体（１０ｍｇ／ｋｇ）によって処置したマウスの平均腫瘍サイズは１７４６ｍｍ３であったことを示す。さらに、図３２Ｂは、腫瘍接種後２４日目での個々のマウス腫瘍サイズを示す。モノクローナル抗体ＮＭＣ−３０３のキメラ型のヒト定常領域により、この抗体の抗腫瘍有効性は、ヒト免疫バックグラウンドを有するマウスモデルにおいて試験した場合に改善されるであろう。上記のｉｎ  ｖｉｖｏ結果はさらに、がん細胞上のＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープを標的とする、ＮＭＣ−Ｐ３免疫原に対して作製した抗体の抗腫瘍有効性を裏付ける。
【０３５９】
まとめると、これらの結果は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４特異的抗体の２つの重要な治療的態様を実証する。第１に、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能な配列を標的とする抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、それ自身有効な抗がん剤である。第２に、低濃度の化学療法薬と組み合わせて使用したＭ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、強力に相乗的な抗腫瘍効果を有する。このことは、その臨床的に有効な濃度で使用される化学療法の頻繁に観察される副作用および制限を考慮すると、特に重要である。加えて、これらの結果は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体によって前回処置した動物のがんの再発生の予防および長期生存によって実証されるように、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体が長期間の抗腫瘍免疫の発生をもたらしたことを実証する。
【０３６０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは、細胞を、ゲムシタビンおよびパクリタキセルなどの様々なタイプの化学療法剤によって処置した場合に、形質膜Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４が増加することを示した（データは示さず）。この処置によって、それらの細胞はおそらく、抗ＨＤＭ２抗体治療に対してより感受性となり、その組合せ投与の相乗効果をさらに説明する（図１９）。
【０３６１】
８．１０  実施例１〜９に基づく結論：
まとめると、本明細書に表すデータは、がん細胞におけるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なセグメントを認識する選択したＭ（Ｈ）ＤＭ２／４特異的抗体が、多様ながんに対して成長阻害および細胞傷害効果を有するが、正常な非形質転換細胞には効果を有しないことを実証する。これらの抗体の選択的抗腫瘍効果は、がん細胞の表面上に発現されるＭ（Ｈ）ＤＭ２／４タンパク質バリアントの細胞外からアクセス可能なエピトープを抗体が認識していることに少なくとも部分的によると考えられるが、正常細胞の表面上のこれらのＭ（Ｈ）ＤＭ２／４バリアントの発現レベルは低いかまたは存在しない。
【０３６２】
以下の実施例１０〜１２は、がん細胞上の細胞外からアクセス可能なＨＤＭ２のセグメントに結合する他の抗ＨＤＭ２抗体を使用して得たデータを記載する。
【０３６３】
（実施例１０）
８．１１  異なるヒトがん細胞系および新たに単離した初代培養ヒトがん細胞からのインタクトな細胞にも結合したが、正常細胞には結合しなかった他のＨＤＭ２特異的抗体。
Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４に対して作製した他の抗体の治療および診断能をさらに拡張するために、本発明者らは、いくつかの他の入手可能な抗体をその結合および抗腫瘍活性について評価した。上記のように、これらの抗体のいくつか（すなわち、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ／Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＯＰ−４６およびＯＰ−１４４）は、Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４の細胞外からアクセス可能なエピトープと反応せず、がん細胞膜におけるエピトープ利用能の欠如を実証し、必ずしもすべての抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体ががんの処置として使用できるわけではないことを示した。しかし、いくつかの他の抗Ｍ（Ｈ）ＤＭ２／４抗体は、がん細胞膜上の細胞外からアクセス可能なエピトープと相互作用するのみならず、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性も有することが示された。
【０３６４】
以下の抗ＨＤＭ２抗体を、実施例１０〜１２に記載の実験に使用した：（ｉ）ポリクローナルｓｃ−８１３、Ｎ−２０、ウサギＩｇＧ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（本明細書を通して「Ｎ−２０」または「ｓｃ−８１３（Ｎ−２０）」と省略する）；（ｉｉ）モノクローナルＯＰ１４５、マウスＩｇＧ１、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（本明細書を通して「ＯＰ１４５」と省略する）；（ｉｉｉ）モノクローナルＯＰ４６（Ａｂ−１）、マウスＩｇＧ１、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（本明細書を通して「ＯＰ４６」と省略する）；（ｉｖ）モノクローナルＯＰ１４４（Ａｂ−４）、マウスＩｇＧ１、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（本明細書を通して「ＯＰ１４４」と省略する）；（ｖ）ポリクローナルｓｃ−８１２、Ｃ−１８、ウサギＩｇＧ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（本明細書を通して「Ｃ−１８」または「ｓｃ−８１２（Ｃ−１８）」と省略する）；および（ｖｉ）モノクローナル９６５（ＳＭＰ１４）、マウスＩｇＧ１、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ（本明細書を通して「ＳＭＰ１４」または「９６５（ＳＭＰ１４）」と省略する）。以下の表１０は、これらの抗体のＨＤＭ２認識部位（すなわち、これらの抗体によって認識されるＨＤＭ２のアミノ酸）、およびこれらの抗体ががん細胞に対して細胞傷害性であるかどうかに関する情報を提供する。ＯＰ１４５、Ｎ−２０、Ｃ−１８、およびＳＭＰ１４は、試験したがん細胞に対して細胞傷害性であったが、ＯＰ４６およびＯＰ１４４は、試験したがん細胞に対して細胞傷害性ではなかった。
【０３６５】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、本明細書に表すデータは、選択したＨＤＭ２特異的抗体が、生存しているヒトがん細胞、培養において維持したヒト黒色腫Ａ２０５８細胞、ならびに卵巣がん組織から新たに単離されている２つの初代培養患者由来卵巣がん細胞ＯＶＣＡ−１およびＯＶＣＡ−４の表面膜に結合することを示す。これに対し、生存している正常マウス脾細胞のＦＡＣＳ解析は、同じＨＤＭ２特異的抗体による形質膜染色が存在しないことを実証した。
【０３６６】
使用した方法論：ＥＤＴＡまたはトリプシンのいずれかによって放出したインタクトな細胞を、５％ヒト血清アルブミンによってブロックした。次に細胞を、ポリクローナル（Ｎ２０）またはモノクローナル（ＯＰ１４５）ＨＤＭ２特異的抗体のいずれかと共に氷中で９０分間インキュベートした。同じ条件下で調製した別の組の細胞を、細胞とのインキュベーションの前にその対応するブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした同じ抗体と共にインキュベートした。一次抗体のインキュベーション後、細胞を氷冷ＰＢＳによって３回洗浄後、ＦＩＴＣ−二次抗体と共に６０分間インキュベートした。次に、細胞を、ＰＢＳによって３回洗浄し、ＦＡＣＳアナライザに供した。
【０３６７】
図２４は、ヒト黒色腫、初代培養卵巣がん、および正常マウス脾細胞のＦＡＣＳ解析の結果を表す。図２４Ａ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃３は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す。図２４Ｂ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗マウス二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２モノクローナル抗体ＯＰ１４５と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃３は、抗ＨＤＭ２モノクローナル抗体ＯＰ１４５と共にインキュベート後、ヤギ抗マウス二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す。図２４Ｃ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたトリプシン放出細胞を表す；曲線下面積＃３は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す；曲線下面積＃４は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す。図２４Ｄ＆Ｅ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃３は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートした細胞を表す。図２４Ｆ：曲線下面積＃１は、ヤギ抗ウサギ二次抗体単独と共にインキュベートした細胞を表す；曲線下面積＃２は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたトリプシン放出細胞を表す；曲線下面積＃３は、そのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す；曲線下面積＃４は、抗ＨＤＭ２ポリクローナル抗体Ｎ−２０と共にインキュベート後、ヤギ抗ウサギ二次抗体と共にインキュベートしたＥＤＴＡ放出細胞を表す。
【０３６８】
抗ＨＤＭ２ポリクローナルＮ−２０抗体（図２４Ａ；曲線下面積＃３）またはモノクローナルＯＰ１４５抗体（図２４Ｂ；曲線下面積＃３）のいずれかと共にインキュベートした、ＥＤＴＡによって放出されたインタクトなヒト黒色腫Ａ２０５８細胞は、その細胞表面上のＨＤＭ２に関して染色陽性である細胞を示す。エピトープ特異性の対照とするために、これらの抗体のいずれか１つを、細胞とのインキュベーションの前に、その対応するブロッキングペプチドと共にプレインキュベートしても、バックグラウンドを上回る特異的染色は観察されなかった（図２４Ａおよび２４Ｂ；曲線下面積＃２を参照されたい）。興味深いことに、細胞表面タンパク質の外部部分を切断するトリプシンを使用して放出されたヒト黒色腫細胞の場合、ＨＤＭ２の細胞表面染色は観察されず（図２４Ｃ；ＥＤＴＡによって放出した細胞と比較する場合の曲線下面積＃３、曲線下面積＃４を参照されたい）、形質膜の外部表面上にＨＤＭ２タンパク質が少なくとも一部存在することをさらに示した。その上、卵巣がんを有する患者２人から新たに単離した腫瘍（ＯＶＣＡ−１、およびＯＶＣＡ−４）は、ポリクローナルＮ−２０抗体と共にインキュベートすると広範な表面染色を示した（図２４Ｄおよび２４Ｅ；曲線下面積＃３を参照されたい）。この染色は、細胞とのインキュベーションの前に、抗体をそのブロッキングペプチドと共にプレインキュベートすると完全にブロックされた（図２４Ｄおよび２４Ｅ；曲線下面積＃２を参照されたい）。しかし、インタクトなマウス正常脾細胞は、同じ抗体によってバックグラウンドを上回る染色を示さなかった（図２４Ｆを参照されたい；ＨＤＭ２特異的Ｎ−２０抗体と共にインキュベートした場合の染色、曲線下面積＃４を、Ｎ−２０ブロッキングペプチドと共にプレインキュベートした抗体によって処置した試料の染色、曲線下面積＃３と比較する）。まとめると、ＦＡＣＳ解析の結果は、インタクトながん細胞の形質膜上にＭ（Ｈ）ＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープが存在すること、および正常な非形質転換細胞には存在しないことを強く示す。
【０３６９】
（実施例１１）
８．１２  ある特定のＨＤＭ２特異的抗体は、異なるタイプのがんに対する補体媒介性細胞傷害性を開始する。
本明細書に表すデータは、選択したＨＤＭ２特異的抗体が、がん細胞の表面膜に結合するのみならず、新鮮な正常ヒト血清（ＮＨＳ）の存在下で細胞傷害効果を開始することができることを示す。細胞傷害効果を、ヒト黒色腫、膵臓がん、乳がん、および卵巣がん細胞などの様々ながん細胞、ならびに正常ヒト線維芽細胞および血液細胞において測定した。
【０３７０】
使用した方法論：２４ウェル培養皿に播種した細胞を、５％ＣＯ２−９５％空気混合物を供給する３７℃の湿潤雰囲気下で一晩成長させた。翌日、細胞を氷冷ＰＢＳによって十分に洗浄し、１％ＢＳＡを含有する培養培地中で最終抗体濃度５〜１０μｇ／ｍｌとなるように希釈した様々なＨＤＭ２特異的抗体（すなわち、ＯＰ１４５、Ｎ−２０、およびＣ−１８抗体；表１０の抗体の説明を参照されたい）、または対照抗体（細胞内タンパク質シトクロムＣに対する抗体）と共にインキュベートした。３０分後、ＮＨＳを、１％ＢＳＡを含む培養培地中で１：３０の最終濃度となるように、１％ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）溶液と共に細胞に添加した。新鮮なヒト血清における補体の役割の対照として、ＨＤＭ２特異的抗体によって処置した並行培養を、補体活性を不活化することが知られているプロセスである５６℃で３０分間インキュベートした新鮮なヒト血清（ＨｉＮＨＳ）に曝露した。インキュベーションの１５、３０、４５、および６０分後に、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ８１倒立顕微鏡上のＯｌｙｍｐｕｓ  ＦｌｕｏＶｉｅｗ  ＦＶ１０００共焦点レーザースキャン生物顕微鏡を使用して、画像を得た。
【０３７１】
図２５は、ヒト膵臓および卵巣がん細胞（図２５Ａ）、ならびに齧歯類膵細胞（図２５Ｂ）に対するＨＤＭ２特異的抗体の細胞傷害効果を実証する。ＮＨＳの存在下でのＯＰ１４５、Ｎ−２０、およびＣ−１８抗体は、そのような抗体と共にインキュベートしたがん細胞において補体媒介性細胞傷害性を誘発し、それによって細胞死マーカーであるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）の核取込みによって明らかとなるがん細胞の死をもたらす（ＯＰ１４５と共にインキュベートした卵巣がん細胞に関しては図２５Ａ、パネルｂおよびｅを参照されたく、Ｎ−２０およびＣ−１８と共にインキュベートした膵臓がん細胞に関しては、それぞれ、図２５Ｂ、パネルｂおよびｃを参照されたい）。対照抗体（すなわち、抗シトクロムＣ抗体、図２５Ａ、パネルｃ、および図２５Ｂ、パネルｅを参照されたい）の存在下では、がん細胞死は、いかなる抗体も含まない対照のＮＨＳ単独（図２５Ａ、パネルａおよびｄ、ならびに図２５Ｂ、パネルａを参照されたい）、またはＨＤＭ２特異的抗体によって処置した正常細胞（線維芽細胞、図２５Ａ、パネルｇ）の細胞死と類似であった（すなわち、ＰＩ染色の欠如によって示されるように、細胞死がないかまたはほとんどない、図２５Ａ、パネルａ、ｃ、ｄ、ｆ、およびｇ、ならびに図２５Ｂ、パネル１を参照されたい）。さらに、細胞を、抗ＨＤＭ２モノクローナルＯＰ４６抗体によって処置した場合、細胞傷害性は観察されなかった（図２５Ｂ、パネルｄを参照されたい）。図２５Ｃは、ヒト膵臓がん細胞に対するＨＤＭ２特異的抗体依存性補体細胞傷害性の定量的表示を提供する。ＮＨＳの存在下で抗ＨＤＭ２（Ｃ−１８）抗体によって処置した細胞は、処置後１５〜３０分にわたる細胞傷害性を示したが、抗ＨＤＭ２  ＯＰ４６は、細胞を、対照の抗シトクロムＣ抗体によって処置した場合、または細胞をＮＨＳの存在下で無処置のままであった場合に観察される効果を上回る細胞傷害効果を示さなかった。
【０３７２】
その上、熱不活化ヒト血清（すなわち、５６℃で３０分間インキュベートした新鮮なヒト血清（ＨｉＮＨＳ））の存在下でのＨＤＭ２特異的抗体は、がん細胞に対していかなる細胞傷害効果も及ぼさず（すなわち、ＰＩ染色によって明らかとなるがん細胞の死をもたらさなかった）、細胞傷害効果が補体活性によるものであることを実証した。
【０３７３】
表１０は、本発明によって試験した抗体を列挙し、がん細胞に対する様々な抗ＨＤＭ２抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞傷害効果に関連して得た結果を要約する。
【表１０】
2020528936.tif 000009
【０３７４】
（実施例１２）
８．１３  ＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに結合する他の抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍効果に関する結果。
がん細胞上のＨＤＭ２の細胞外からアクセス可能なエピトープに対して作製されたｍＡｂ（ＮＭＣ−Ｐ１、ＮＭＣ−Ｐ２、およびＮＭＣ−Ｐ３以外）の抗がん活性をさらに評価するために、抗ＨＤＭ２モノクローナル抗体ＯＰ−１４５（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）および「ＭＤＭ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン１Ａ７」（Ａｂｎｏｖａ、カタログ番号Ｈ００００４１９３−Ｍ０１）の抗腫瘍有効性の試験を実施した。上記で実証したように、これらの抗体のいずれの１つもＮＭＣ−Ｐ１およびＮＭＣ−Ｐ２に対して反応性を示さなかったが（図１４Ａ〜Ｂを参照されたい）、これらの抗体の両方が、インタクトながん細胞と反応性を示した（図１５Ａおよび２４Ｂを参照されたい）。
【０３７５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの膵臓腫瘍成長に及ぼす抗体ＯＰ１４５の抗腫瘍効果の評価：Ｐａｎｃ０２細胞（２×１０６個／マウス）を雌性８週齢Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹に移植することによって皮下腫瘍を調製した。腫瘍移植後、マウスをそのそれぞれのケージに戻した。腫瘍移植後７日目から、腫瘍体積をデジタルキャリパーによって週に２回測定した。腫瘍が平均で２００ｍｍ３に達すると処置を開始した（図２６を参照されたい、１４日目）。腫瘍移植後、マウスにマイクロチップを埋め込んで登録した。腫瘍体積測定および体重を記録し、マウスを２群に無作為化し、ＯＰ１４５抗体（０．１ｍｇ／ｋｇのマウスモノクローナル抗体ＯＰ１４５の週３回の腫瘍内注射による）またはＰＢＳのいずれかを投与した。マウス３匹を、ＯＰ１４５によって処置し、マウス５匹をＰＢＳによって処置した。持続的な有害な臨床徴候を示すマウス、または０日目の体重から１５％を上回る体重減少を示すマウスはすべてを安楽死させた。ＯＰ１４５抗体と、ＰＢＳによる処置後最初の１０日間の腫瘍測定を比較し、結果を図２６に表す。
【０３７６】
ＯＰ１４５抗体を投与したマウスにおける皮下腫瘍は、腫瘍細胞注射後２１日目で２６０ｍｍ３のサイズを有したが、ＰＢＳを投与したマウスにおける皮下腫瘍は、３７５ｍｍ３のサイズを有した（図２６を参照されたい）ことが見出された。
【０３７７】
ＭＣ−３８同系マウス結腸がんモデルに対する「ＭＤＭ２モノクローナル抗体（Ｍ０１）、クローン１Ａ７」の効果のｉｎ  ｖｉｖｏ試験（０．４ｍｇ／ｋｇのＭ０１、クローン１Ａ７抗体の週に３回、３週間の腹腔内投与を使用する；ｎ＝４）は、抗体処置マウスが、最初に処置に応答する（６回投与後の平均腫瘍サイズは、抗体処置群で１５８８ｍｍ３であったのに対し、アイソタイプ対照処置群では１９９９ｍｍ３であった）が、対照処置および抗体処置マウスの腫瘍は、３週目までにおよそ２５００ｍｍ３に達することを実証した（図２３）。同じ期間で、マウスに同じ用量（０．４ｍｇ／ｋｇ；週に３回、３週間の腹腔内投与）で投与されたｍＡｂ  ＮＭＣ−１０３およびＮＭＣ−２０４は、腫瘍体積の有意な（ｐ＜０．００５）低減を示し、抗腫瘍活性が持続した（図１９；それぞれ、○および白四角；同様に図１７Ａおよび１８Ａも参照されたい）。この知見は、ｍＡｂ  Ｍ０１が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞への強い結合を有するが、ＮＭＣ−１０３およびＮＭＣ−２０４の抗腫瘍効果は、ｍＡｂ  Ｍ０１の抗腫瘍効果より優れていたことを示す（図２３）。
【０３７８】
モノクローナル抗体ＯＰ−１４５およびＭ０１のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍有効性に関するこれらの結果は、使用した市販の抗体調製物が、ｉｎ  ｖｉｖｏ有効性試験にとって必ずしも所望のクローン性、純度、または薬学的に許容される製剤を有していない場合があることから、注意して解釈しなければならないことに注意しなければならない。
【０３７９】
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Bowne  WB1,  Sookraj  KA,  Vishnevetsky  M,  Adler  V,  Sarafraz-Yazdi  E,  Lou  S,  Koenke  J,  Shteyler  V,  Ikram  K,  Harding  M,  Bluth  MH,  Ng  M,  Brandt-Rauf  PW,  Hannan  R,  Bradu  S,  Zenilman  ME,  Michl  J,  Pincus  MR.,  2008,  “The  penetratin  sequence  in  the  anticancer  PNC-28  peptide  causes  tumor  cell  necrosis  rather  than  apoptosis  of  human  pancreatic  cancer  cells,”  Ann  Surg  Oncol.  15(12):3588-600.
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【０４３１】
Do  TN,  Rosal  RV,  Drew  L,  Raffo  AJ,  Michl  J,  Pincus  MR,  Friedman  FK,  Petrylak  DP,  Cassai  N,  Szmulewicz  J,  Sidhu  G,  Fine  RL,  Brandt-Rauf  PW,  2003,  “Preferential  induction  of  necrosis  in  human  breast  cancer  cells  by  a  p53  peptide  derived  from  the  MDM2  binding  site”,  Oncogene.  22(10):1431-44.
【０４３２】
Sookraj  KA,  Bowne  WB,  Adler  V,  Sarafraz-Yazdi  E,  Michl  J,  Pincus  MR.,  2010,  “The  anti-cancer  peptide,  PNC-27,  induces  tumor  cell  lysis  as  the  intact  peptide”,  Cancer  Chemother  Pharmacol,  66(2):325-31.
【０４３３】
Rosal  R,  Brandt-Rauf  PW,  Pincus  MR,  Wang  H,  Mao  Y,  Fine  RL,  2004,  “The  role  of  alpha-helical  structure  in  p53  peptides  as  a  determinant  for  their  mechanism  of  cell  death:  necrosis  versus  apoptosis”,  Adv  Drug  Devl  Rev  57:653−660
【０４３４】
１０．配列
【化１】
2020528936.tif 000010
【化２】
2020528936.tif 000011
【化３】
2020528936.tif 000012
【化４】
2020528936.tif 000013
【化５】
2020528936.tif 000014
【表４】
2020528936.tif 000015
【表５】
2020528936.tif 000016
【表６】
2020528936.tif 000017
【表７】
2020528936.tif 000018
【表８】
2020528936.tif 000019
【表９】
2020528936.tif 000020
【化６】
2020528936.tif 000021
【化７】
2020528936.tif 000022
【化８】
2020528936.tif 000023
【化９】
2020528936.tif 000024
【０４３５】
参照による組込み
特許、特許出願、および刊行物などの様々な参考文献を本明細書において引用し、その開示は、その全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ−１Ｄ】
2020528936.tif 000025
【図２】
2020528936.tif 000026
【図３Ａ−３Ｂ】
2020528936.tif 000027
【図４Ａ−４Ｂ】
2020528936.tif 000028
【図５Ａ−５Ｂ】
2020528936.tif 000029
【図６】
2020528936.tif 000030
【図７Ａ−７Ｂ】
2020528936.tif 000031
【図８Ａ−８Ｃ】
2020528936.tif 000032
【図９】
2020528936.tif 000033
【図１０】
2020528936.tif 000034
【図１１Ａ−１１Ｃ】
2020528936.tif 000035
【図１２Ａ−１２Ｃ】
2020528936.tif 000036
【図１２Ｄ】
2020528936.tif 000037
【図１３Ａ−１３Ｂ】
2020528936.tif 000038
【図１３Ｃ】
2020528936.tif 000039
【図１４Ａ−１４Ｂ】
2020528936.tif 000040
【図１５Ａ】
2020528936.tif 000041
【図１５Ｂ】
2020528936.tif 000042
【図１６】
2020528936.tif 000043
【図１７Ａ−１７Ｂ】
2020528936.tif 000044
【図１８Ａ−１８Ｂ】
2020528936.tif 000045
【図１９】
2020528936.tif 000046
【図２０】
2020528936.tif 000047
【図２１】
2020528936.tif 000048
【図２２】
2020528936.tif 000049
【図２３】
2020528936.tif 000050
【図２４Ａ−２４Ｂ】
2020528936.tif 000051
【図２４Ｃ−２４Ｄ】
2020528936.tif 000052
【図２４Ｅ−２４Ｆ】
2020528936.tif 000053
【図２５Ａ】
2020528936.tif 000054
【図２５Ｂ】
2020528936.tif 000055
【図２５Ｃ】
2020528936.tif 000056
【図２６】
2020528936.tif 000057
【図２７】
2020528936.tif 000058
【図２８】
2020528936.tif 000059
【図２９】
2020528936.tif 000060
【図３０】
2020528936.tif 000061
【図３１】
2020528936.tif 000062
【図３２Ａ】
2020528936.tif 000063
【図３２Ｂ】
2020528936.tif 000064
【配列表】
2020528936000001.app
【国際調査報告】
2020528936.tif 000065
2020528936.tif 000066
2020528936.tif 000067
2020528936.tif 000068
2020528936.tif 000069
2020528936.tif 000070
2020528936.tif 000071