(57)【要約】  リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体を含む製剤のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定するための方法が記載されている。方法は、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を使用して、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対する、ＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体、または類似体の結合を決定することを含む。そのような方法は、そのような化合物の医薬品製造管理および品質管理基準（ＧＭＰ）グレードの製造における品質管理アッセイとして使用することができる。方法を実施するためのプローブおよびキットもまた記載されている。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体を含む製剤のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定する方法であって、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いてＭＨＣクラスＩＩ分子に対する前記ＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体、または類似体の結合を決定することを含む、方法。
【請求項２】
ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞上に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子に対する前記ＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体または類似体の結合を決定するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体または類似体がＢＬＩプローブの試薬層に固定化されており、かつ、前記ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞が溶液中にある、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞が、少なくとも１Ｅ６／ｍＬ、好ましくは少なくとも４Ｅ６／ｍＬまたは８Ｅ６／ｍＬの密度で存在する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記試薬層に対する前記ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞の非特異的結合を最小限に抑えるために、前記試薬層がブロッキング試薬で前処理されている、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記ブロッキング試薬がアルブミン、好ましくはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞がＲａｊｉ細胞である、請求項２〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞が、凍結保存溶液から得られた、解凍されてすぐ使用できる細胞である、請求項２〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
複数の異なる濃度の前記ＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体、または類似体について、前記ＭＨＣクラスＩＩ分子への前記ＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体、または類似体の結合速度を決定するステップと、前記結合速度についての用量反応曲線を生成するステップとを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体の基準試料のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を、前記製剤の前記ＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体、または類似体の結合を決定するために使用したのと同じ条件下で、ＢＬＩを使用して前記ＭＨＣクラスＩＩ分子に対する前記基準試料の前記ＬＡＧ−３タンパク質、その断片、誘導体、もしくは類似体の結合を決定することによって決定するステップと、前記基準試料について決定された前記ＭＨＣクラスＩＩ結合活性を前記製剤について決定された前記ＭＨＣクラスＩＩ結合活性と比較するステップとをさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記基準試料の前記ＭＨＣクラスＩＩ結合活性が１００％に設定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記基準試料が、そのＭＨＣクラスＩＩ結合活性を低下させるように処理されているＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体を含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記基準試料の前記ＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体または類似体が、脱グリコシル化されているか、３７℃で少なくとも１２日間保存されているか、酸化されているか、酸もしくはアルカリ処理により変性されているか、または少なくとも５日間光に曝露されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
試薬層を含む、ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定するためのＢＬＩプローブであって、前記試薬層に前記ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体が固定化されている、ＢＬＩプローブ。
【請求項１５】
前記試薬層に対する前記ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞の非特異的結合を最小限に抑えるために、前記試薬層がブロッキング試薬で前処理されている、請求項１４に記載のプローブ。
【請求項１６】
前記ブロッキング試薬がアルブミン、好ましくはＢＳＡを含む、請求項１５に記載のプローブ。
【請求項１７】
ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定するためのキットであって、前記ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体が固定化されている試薬層を有するＢＬＩプローブと、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞とを含む、キット。
【請求項１８】
前記試薬層に対する前記ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞の非特異的結合を最小限に抑えるために、前記ＢＬＩプローブの前記試薬層がブロッキング試薬で前処理されている、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
前記ブロッキング試薬がアルブミン、好ましくはＢＳＡを含む、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞が凍結細胞である、請求１７〜１９のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２１】
前記細胞がＲａｊｉ細胞である、請求項１７〜２０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２２】
前記細胞が少なくとも１Ｅ６／ｍＬ、好ましくは少なくとも４Ｅ６／ｍＬまたは８Ｅ６／ｍＬの密度で存在する、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２３】
ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体、もしくは類似体を含む基準試料をさらに含む、請求項１７〜２２のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２４】
前記基準試料の前記ＭＨＣクラスＩＩ結合活性が既知である、請求項２３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月１９日に中国特許庁に提出された「結合アッセイ」という名称の中国特許出願第２０１６１１１８０９７１．４号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）タンパク質の製剤、またはその断片、誘導体もしくは類似体のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定する方法、ならびにその方法に使用するためのプローブおよびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
ＬＡＧ−３タンパク質は、４つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリードメインを有するＣＤ４ホモログＩ型膜タンパク質である。ＣＤ４と同様に、ＬＡＧ−３はＴ細胞の表面でオリゴマー化し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するが、ＣＤ４よりも著しく高い親和性で結合する。ＬＡＧ−３は活性化ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球に発現し、細胞表面でＣＤ３／Ｔ細胞受容体複合体と会合し、シグナル伝達を負に調節する。結果として、それはＴ細胞の増殖、機能、および恒常性を負に調節する。ＬＡＧ−３は、エフェクターまたはメモリーＴ細胞と比較して、疲弊したＴ細胞上で上方制御される。ＬＡＧ−３はまた、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）上で上方制御され、そして抗ＬＡＧ−３抗体を使用するＬＡＧ−３の遮断は抗腫瘍Ｔ細胞応答を増強し得る。
【０００４】
ＩＭＰ３２１は、高い親和性でＭＨＣクラスＩＩに結合する組換え可溶性ＬＡＧ−３Ｉｇ融合タンパク質である。これはＭＨＣクラスＩＩ陽性抗原提示細胞（ＡＰＣ）を標的とするファーストインクラスの免疫増強剤である（Ｆｏｕｇｅｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ＬＡＧ−３  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｓ  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＭＰ３２１．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００６，２４：５４２６−５４３３、Ｂｒｉｇｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．：ＩＭＰ３２１  （ｓＬＡＧ−３）  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｓ  ａ  ｍｏｄｅｌ  ａｎｔｉｇｅｎ：Ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｂｌｉｎｄ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００７，２５：４６４１−４６５０、Ｂｒｉｇｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．：ＩＭＰ３２１  （ｓＬＡＧ−３），ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ＨＢｓＡｇ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ａｄｕｌｔｓ：ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｂｌｉｎｄ  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｂａｓｅｄ  Ｔｈｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ２００７，５：５、Ｂｒｉｇｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．：Ａ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ−３  （ＩＭＰ３２１）  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００７，１７９：４２０２−４２１１）。ＩＭＰ３２１は免疫抑制されていることが知られている以前に治療された進行性腎細胞癌患者で試験されており、３ヶ月以上にわたる反復注射によって治療されるすべての患者において循環活性化ＣＤ８  Ｔ細胞および長寿命エフェクターメモリーＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージの増加を誘導し、検出可能な毒性はない（Ｂｒｉｇｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．：Ａ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＩＭＰ３２１，ａ  ｎｏｖｅｌ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９，１５：６２２５−６２３１）。ほんの数ｎｇ／ｍＬの濃度のＩＭＰ３２１がＡＰＣに対してインビトロで活性であることが示されており、免疫系のアゴニストとしてのＩＭＰ３２１の大きな効力を示している（Ｂｒｉｇｎｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，２００９、前出）。
【０００５】
転移性乳がん（ＭＢＣ）患者における研究において、Ｂｒｉｇｎｏｎｅら（Ｆｉｒｓｔ−ｌｉｎｅ  ｃｈｅｍｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ａｎｄ  ＩＭＰ３２１  （ＬＡＧ−３Ｉｇ）  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１０，８：７１）は、ＩＭＰ３２１が結合する一次標的細胞（ＭＨＣクラスＩＩ陽性単球／樹状細胞）と、続いて活性化する二次標的細胞（ＮＫ／ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞）の両方が、ＩＭＰ３２１によって数か月間増殖および活性化されることを実証した。全部で３０人の患者からの結果をプールし、そして腫瘍退縮を適切な既存対照群と比較することによって、彼らは、ＩＭＰ３２１がこの臨床状況において有効な抗がん細胞性免疫応答の強力なアゴニストであることを示唆する客観的奏効率の倍増を観察した。
【０００６】
ＷＯ９９／０４８１０は、ワクチン接種のためのアジュバントとしての、およびがん治療におけるＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片もしくは誘導体の使用を記載している。がんおよび感染症の治療のためのＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片もしくは誘導体の使用は、ＷＯ２００９／０４４２７３に記載されている。
【０００７】
ＬＡＧ−３、およびその断片もしくは誘導体の医学的用途を考慮すると、医薬品製造管理および品質管理基準（ＧＭＰ）に準拠するそのような化合物の製剤を提供する必要がある。そのような実務は、活性医薬品の製造および販売のための認可および認可を管理する機関によって推奨されるガイドラインに準拠するために必要とされる。これらのガイドラインは、製品が高品質であり、消費者または公衆に危険を及ぼさないことを保証するために製薬メーカーが満たす必要がある最低限の要件を規定する。タンパク質のＧＭＰグレード製造における品質管理手順の一部として、そのような化合物の製剤が高レベルの生物活性を保持しているかどうかを決定することが必要である。
【０００８】
しかしながら、我々は、タンパク質−タンパク質相互作用を決定するためのいくつかの従来の方法が、免疫細胞の表面に発現するＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＬＡＧ−３誘導体ＩＭＰ３２１の特異的結合を決定するのに適していないことを見出した。特に、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）は、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞に結合する能力が異なるＩＭＰ３２１製剤を区別するのには適していなかった。ＦＡＣＳを使用して得られた結合曲線について、ＩＭＰ３２１の濃度を増加させても、上部プラトーは観察されなかった。これは、収束プラトー（平行性）を必要とする、異なる製剤の相対的効力の計算を妨げる。
【０００９】
我々はまた、ＩＭＰ３２１が、ＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイおよび酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に使用されるプレートに非特異的に結合することも見出した。ＥＬＩＳＡおよびＭＳＤアッセイに使用したプレートに対するＩＭＰ３２１の非特異的結合は、ブロッキング試薬としてカゼインを使用することによって劇的に減少したが、これはＭＳＤアッセイにおける絶対シグナルを低下させた。ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細胞を、ＭＳＤプレートに固定化したアッセイを用いて得られた結合曲線について、上部プラトーは観察されなかった。プレートに対するＩＭＰ３２１の非特異的結合の影響を最小限にするために、ＩＭＰ３２１の結合後にＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する細胞を別のプレートに移した、異なるＥＬＩＳＡ技術も試験した。しかしながら、ウェル間のシグナル変動は許容できないことがわかった。これを考慮して、ＧＭＰグレードの製品を試験するための品質管理アッセイにおいて、固定化細胞に対するＩＭＰ３２１の特異的結合を決定するために、ＭＳＤ  ＥＣＬアッセイもＥＬＩＳＡアッセイも使用することができないと結論付けられた。
【００１０】
したがって、そのような化合物のＧＭＰグレードの生産における品質管理アッセイとしての使用に適した、ＬＡＧ−３タンパク質の製剤、またはその断片、誘導体もしくは類似体のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定するための方法を提供することが必要とされている。
【発明の概要】
【００１１】
本発明によれば、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体を含む製剤のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定する方法であって、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いてＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体、または類似体の結合を決定することを含む、方法が提供される。
【００１２】
「バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）」という用語は、例えば米国特許第５，８０４，４５３号（Ｃｈｅｎ）に記載されているように、位相シフト干渉法に基づく光ファイバーアッセイを指すために本明細書で使用される。検体検出の感度および精度を向上させることを目的とした開発を含むＢＬＩ技術の開発は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．のＷＯ２００５／０４７８５４およびＷＯ２００６／１３８２９４に記載されている。
【００１３】
米国特許第５，８０４，４５３号は、光ファイバー端面に結合している検体を検出するためのプローブ、方法、およびシステムを記載している。検体検出は、検体分子の表面に対する結合から生じる光ファイバーの端面での厚さの変化に基づいており、検体の量が多いほど厚さに関連した干渉シグナルの変化が大きくなる。特に米国特許第５，８０４，４５３号の図７ａおよび図７ｂに示されるように、干渉シグナルの変化は、ファイバーの端部から反射された光とファイバー端部に担持された結合層から反射された光との間の位相シフトによる。
【００１４】
米国特許第５，８０４，４５３号に記載されているプローブは、近位端部先端部および遠位端部先端部を有する光ファイバー部と、遠位端部先端に配置された試薬層とを含む。試薬層は、検出されている物質（検体）と反応（または結合）する。光ファイバー部は第１の屈折率を有し、試薬層は第２の屈折率を有する。いずれかの物質が試薬層に結合すると、試薬層と物質とを含む結果として生じる層が形成される。得られた層は、均質な屈折率を有するものとして扱うことができる。
【００１５】
この方法は、光ファイバープローブを用いて試料溶液中の物質の濃度を決定することを可能にする。この方法は、（ｉ）光ファイバープローブの遠位端を試料溶液に浸すステップと、（ｉｉ）光源を光ファイバープローブの近位端と光学的に結合するステップと、（ｉｉｉ）光ファイバー部の先端面と試薬層との間の界面から反射される少なくとも第１の光線と、試薬層と試料溶液との間の界面から反射されて光ファイバープローブの先端部から反射された第２の光線とを検出するステップと、（ｉｖ）１回目に第１および第２の光線によって形成された干渉縞を検出するステップと、（ｖ）２回目に第１および第２の光線によって形成された干渉縞を検出するステップと、（ｖｉ）干渉縞にシフトが発生しているかどうかに基づいて試料溶液に存在するかどうかを決定するステップと、を含む。物質の濃度は、干渉縞のシフト、および第１回と第２回との間の差異に基づいて決定し得る。
【００１６】
試料溶液中の物質の濃度を検出するためのシステムは、光線を提供するための光源、光ファイバープローブ、検出器、光ファイバーカプラ、光ファイバーコネクタ、およびプロセッサを有する。光ファイバーカプラは、入射光線を受光するための近位端を有する第１の光ファイバー部と、反射された干渉光線を検出器に送るための近位端を有する第２の光ファイバー部と、光ファイバープローブに接続するための遠位端を有する第３の光ファイバー部と、を含む。光ファイバープローブは、光ファイバーカプラに接続するための近位端と、その上に配置された試薬層を有する遠位端チップとを含む。光ファイバープローブは、入射光線から少なくとも第１の反射ビームと第２の反射ビームとを生成する。検出器は、第１および第２の反射ビームによって形成された干渉縞を検出する。カプラは、光源を光ファイバープローブと光学的に結合し、光ファイバープローブを検出器と光学的に結合する。プロセッサは、１回目に検出器によって検出された干渉縞に関連する位相を決定し、２回目に検出器によって検出された干渉縞に関連する位相を決定し、１回目および２回目に検出器によって検出された干渉縞に関連する位相のシフトに基づいて物質の濃度を決定する。
【００１７】
ＢＬＩ技術は、ＬＡＧ−３タンパク質の製剤、またはその断片、誘導体もしくは類似体のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定するために使用することができ、そのような方法は、そのような化合物のＧＭＰグレードの生産における品質管理アッセイとして特に有用であることを認識した。
【００１８】
特定の実施形態では、本発明の方法は、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞上に存在するＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体、または類似体の結合を決定することを含む。そのような実施形態では、ＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体、または類似体は、ＢＬＩプローブの試薬層に固定化されてもよく、そしてＭＨＣクラスＩＩ発現細胞は溶液中にある。
【００１９】
米国特許第５，８０４，４５３号に記載されているプローブ、方法、およびシステムは、以下にＭＨＣクラスＩＩ発現Ｒａｊｉ細胞に対する組換えＬＡＧ−３タンパク質誘導体ＩＭＰ３２１の結合によって例示するように、ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体の製剤のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定するために本発明に従って使用され得る。
【００２０】
以下の図１ａを参照すると、バイオセンサープローブ１００は、光ファイバー１０２と、光ファイバー１０２の遠位先端にブロッキング試薬（例えばＢＳＡ）およびＩＭＰ３２１を含む試薬層１０４とを含む。ブロッキング試薬およびＩＭＰ３２１は、所定の濃度のＩＭＰ３２１またはブロッキング試薬を有する溶液中にチップを所定の時間浸すことによって光ファイバー１０２のチップに結合し得る。
【００２１】
入射光線１１０は光ファイバー１０２を通ってその遠位端に向かって送られる。第１の屈折率を有する光ファイバー１０２と第２の屈折率を有する試薬層１０４との間に画定された界面１０６において、入射光線１１０の第１の部分１１２は反射され、入射光線１１０の第２の部分１１４は試薬層１０４を通って続く。典型的には、ブロッキング試薬およびＩＭＰ３２１は、光学的観点から、入射光線１１０の波長に対して小さいので、ブロッキング試薬およびＩＭＰ３２１は単一の試薬層１０４を形成するものとして扱うことができる。入射ビーム１１０の第２の部分１１４の、試薬層１０４の露出面に画定された界面１０８で、第１の部分１１６が反射され、第２の部分１１８が隣接する媒体に入る。入射ビーム１１０の第２の部分１１４の第１の部分１１６のうち、第１の部分１６０は光ファイバー１０２を通って逆方向に伝送され、第２の部分（図示せず）は界面１０６で試薬層１０４に反射される。
【００２２】
光ファイバー１０２の近位端において、反射ビーム１１２および１６０が検出され分析される。その近位端を含む光ファイバー１０２に沿った任意の所与の点において、反射ビーム１１２および１６０は位相差を示すであろう。この位相差に基づいて、試薬層１０４の厚さＳ１を決定することができる。
【００２３】
以下の図１ｂを参照すると、プローブ１００は、Ｒａｊｉ細胞１３６を含む溶液１３４に浸されて、固定化ＩＭＰ３２１に対する細胞の結合を決定する。細胞１３６は試薬層１０４内の固定化ＩＭＰ３２１に結合し、それによってある期間にわたって細胞層１３２を形成する。層の厚さＳ２は、試料流体１３４中のプローブ１００の浸漬時間、ならびに試料流体１３４中の細胞１３６の濃度の関数となる。試料溶液中の他の分子１３８（図示せず）は試薬層１０４に結合しないであろう。
【００２４】
この結合層の合計厚さＳ２は、試薬層１０４単独の厚さＳ１よりも大きくなるであろう。したがって、図１ａのプローブ１００と同様に、入射ビーム１１０が光ファイバー１０２と結合層との間の界面１０６において、光ファイバー１０２の遠位先端に向けられると、入射ビーム１１０の第１の部分１１２が反射され、入射ビーム１１０の第２の部分１２０は結合層を通って続く。第２の部分１２０が細胞層１３２の細胞に達すると、それの第１の部分（図示せず）は、それが細胞の細胞膜および細胞骨格構造を満たすときに反射されるであろう。
【００２５】
結合層と試料溶液１３４との間の第２の界面１２８では、入射ビーム１１０の第２の部分１２０の第２の部分１２４が反射され、入射ビーム１１０の第２の部分１２０の第３の部分１２２は試料溶液１３４を通って続く。入射ビーム１１０の第２の部分１２０の第２の部分１２４のうち、第１の部分１２６は光ファイバー１０２を通って戻り続け、第２の部分（図示せず）は界面１０６で結合層に反射して戻る。
【００２６】
光ファイバー１０２の近位端において、反射ビーム１１２および１２６が検出され分析される。その近位端を含む光ファイバー１０２に沿った任意の所与の点において、反射ビーム１１２および１２６は位相差を示すであろう。この位相差に基づいて、結合層の厚さＳ２を決定することができる。
【００２７】
結合層の厚さＳ２と試薬層１０４の厚さＳ１との間の差を決定することによって、細胞層１３２の厚さを決定することができる。結合層の厚さＳ２は、離散的な時点で決定（または「サンプリング」）される。このようにして、結合層の厚さＳ２と試薬層１０４の厚さＳ１との差の増加速度（すなわち、セル層１３２の厚さの増加速度）を決定することができる。この速度に基づいて、Ｒａｊｉ細胞上のＭＨＣクラスＩＩ分子に対する固定化ＩＭＰ３２１の結合速度は、非常に短いインキュベーション期間内に決定することができる。
【００２８】
Ｒａｊｉ細胞の直径は約５〜７μＭで、光の波長の１０００倍なので、得られる結果に影響を与えることが予想される。しかしながら、シグナル読み出しは約１〜２ｎＭであり、これは光が細胞の表面近くで反射されることを示す。シグナルの変化は再現性があり、細胞の結合と相関しており、結合速度の変化は測定範囲内であるため、光ファイバーの先端に固定化されたＩＭＰ３２１に対するＲａｊｉ細胞の結合を決定することができる。
【００２９】
製剤のＭＨＣクラスＩＩ結合活性は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体、または類似体の結合速度として決定され得る。
【００３０】
ＢＬＩアッセイを用いて得られた結合速度は溶液中のＭＨＣクラスＩＩ発現細胞の密度に依存するが、非ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞の密度が増加すると結合速度は低くかつ比較的平坦であることを我々は見出した。ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞が少なくとも４Ｅ６／ｍＬ、好ましくは少なくとも６Ｅ６／ｍＬまたは８Ｅ６／ｍＬの密度で存在する場合、より高い速度および結合曲線のより高い上部プラトーが得られる。
【００３１】
ＢＬＩプローブの試薬層をブロッキング試薬で前処理して試薬層に対するＭＨＣクラスＩＩ発現細胞の非特異的結合を最小限に抑えると、ＢＬＩアッセイの特異性が改善されることを我々は見出した。任意の適切なブロッキング試薬、例えば、アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの不活性タンパク質を含むブロッキング試薬を使用することができる。
【００３２】
ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ分子を発現する免疫細胞であり得る。適切な例には、抗原提示細胞、または免疫細胞由来の細胞株の細胞が含まれる。特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞はＢ細胞またはＢ細胞株の細胞、例えばＲａｊｉ細胞である。
【００３３】
本発明の方法に使用されるＭＨＣクラスＩＩ発現細胞は、凍結保存溶液から得られる解凍済みのすぐ使用できる細胞であり得ることを我々は見出した。そのような細胞の使用は、本発明の方法が実施される直前に細胞を培養する必要性を排除し、本発明の方法によって得られた結果の信頼性および再現性を確実にするのを助け得、異なる時点で得られた結果を比較することも可能にする。
【００３４】
本発明の方法は、複数の異なる濃度のＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体、または類似体について、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体、または類似体の結合速度を決定することと、例えば下記の実施例６に記載されるように、結合速度についての用量反応曲線を生成することと、を含み得る。
【００３５】
本発明の方法は、ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体の基準試料のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を、製剤のＬＡＧ−３タンパク質、断片、誘導体、または類似体の結合を決定するために使用したのと同じ条件下で、ＢＬＩを使用してＭＨＣクラスＩＩに対する基準試料のＬＡＧ−３タンパク質、その断片、誘導体、もしくは類似体の結合を決定することによって、決定することと、基準試料について決定されたＭＨＣクラスＩＩ結合活性を製剤について決定されたＭＨＣクラスＩＩ結合活性と比較することとをさらに含む。
【００３６】
基準試料のＭＨＣクラスＩＩ結合活性は、所定の濃度で、１００％に設定し、例えば、本発明の方法を用いて作製されたＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体を含む製剤のＭＨＣクラスＩＩ結合活性の測定値の定性または検証を可能にするために様々な所望の濃度に希釈することができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、基準試料は、そのＭＨＣクラスＩＩ結合活性を低下させるように処理されているＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体を含む。適切な処理としては、例えば、脱グリコシル化（例えば、ＰＮＧａｓｅでの処理による）、３７℃で少なくとも１２日間の保存、酸化（例えば、１％もしくは０．１％の過酸化水素での処理による）、酸もしくはアルカリでの処理、または少なくとも５日間の光への曝露が含まれる。
【００３８】
下記の実施例６は、溶液中のＲａｊｉ細胞に対する固定化ＩＭＰ３２１のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定するためのＢＬＩアッセイを詳細に記載する。
【００３９】
本発明によれば、試薬層を含む、ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定するためのＢＬＩプローブであって、試薬層に、ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体が固定化されているプローブもまた提供される。
【００４０】
ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定するためのキットであって、ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体が固定化されている試薬層を有するＢＬＩプローブと、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞と、を含む、キットがさらに提供される。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＢＬＩプローブの試薬層をブロッキング試薬で前処理して試薬層に対するＭＨＣクラスＩＩ発現細胞の非特異的結合を最小限に抑える。任意の適切なブロッキング試薬、例えば、アルブミン、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの不活性タンパク質を含むブロッキング試薬を使用することができる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞は凍結細胞である。
【００４３】
いくつかの態様において、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞はＲａｊｉ細胞である。
【００４４】
ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞は、少なくとも１Ｅ６／ｍＬ、好ましくは少なくとも４Ｅ６／ｍＬ、または８Ｅ６／ｍＬの密度で存在し得る。
【００４５】
本発明のキットは、例えば上記のように、ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体を含む基準試料をさらに含み得る。好ましくは、基準試料のＭＨＣクラスＩＩ結合活性は既知である（例えば、以下に記載されるＣＣＬ４放出アッセイによって決定されるように）。
【００４６】
本発明のプローブおよびキットは、本発明の方法において使用することができる。
【００４７】
ＬＡＧ−３タンパク質は、単離された天然ＬＡＧ−３タンパク質または組換えＬＡＧ−３タンパク質であり得る。ＬＡＧ−３タンパク質は、霊長類またはマウスのＬＡＧ−３タンパク質、好ましくはヒトＬＡＧ−３タンパク質などの任意の適切な種に由来するＬＡＧ−３タンパク質のアミノ配列を含み得る。ヒトおよびマウスのＬＡＧ−３タンパク質のアミノ酸配列は、Ｈｕａｒｄらの図１に提供されている（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１：５７４４−５７４９，１９９７）。ヒトＬＡＧ−３タンパク質の配列は、以下の図２５において繰り返される（配列番号１）。ヒトＬＡＧ−３の４つの細胞外Ｉｇスーパーファミリードメイン（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４）のアミノ酸配列はまた、Ｈｕａｒｄらの図１のアミノ酸残基：１〜１４９（Ｄ１）、１５０〜２３９（Ｄ２）、２４０〜３３０（Ｄ３）、および３３１〜４１２（Ｄ４）に同定されている。
【００４８】
ＬＡＧ−３タンパク質の誘導体には、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができるＬＡＧ−３タンパク質の可溶性断片、バリアント、または変異体が含まれる。ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができるＬＡＧ−３タンパク質のいくつかの誘導体は公知である。そのような誘導体の多くの例は、Ｈｕａｒｄら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１：５７４４−５７４９，１９９７）に記載されている。この文献は、ＬＡＧ−３タンパク質上のＭＨＣクラスＩＩ結合部位の分析を記載している。ＬＡＧ−３の変異体を作製する方法、およびＬＡＧ−３変異体がクラスＩＩ陽性Ｄａｕｄｉ細胞に結合する能力を決定するための定量的細胞接着アッセイが記載されている。ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＬＡＧ−３のいくつかの異なる変異体の結合を決定した。いくつかの変異はクラスＩＩ結合を減少させることができたが、他の変異はクラスＩＩ分子に対するＬＡＧ−３の親和性を増加させた。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質を結合するのに必須の残基の多くは、ＬＡＧ−３  Ｄ１ドメイン中の大きな３０アミノ酸のエクストラループ構造の基部に集まっている。ヒトＬＡＧ−３タンパク質のＤ１ドメインのエクストラループ構造のアミノ酸配列はＧＰＰＡＡＡＰＧＨＰＬＡＰＧＰＨＰＡＡＰＳＳＷＧＰＲＰＲＲＹ（配列番号２）であり、図２５の下線を付した配列である。
【００４９】
ＬＡＧ−３タンパク質誘導体は、ヒトＬＡＧ−３  Ｄ１ドメインの３０アミノ酸のエクストラループ配列、または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのような配列のバリアントを含み得る。バリアントは、ヒトＬＡＧ−３  Ｄ１ドメインの３０アミノ酸のエクストラループ配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
【００５０】
ＬＡＧ−３タンパク質の誘導体は、ＬＡＧ−３タンパク質、好ましくはヒトＬＡＧ−３タンパク質のドメインＤ１、および任意選択でドメインＤ２のアミノ酸配列を含み得る。
【００５１】
ＬＡＧ−３タンパク質の誘導体は、ＬＡＧ−３タンパク質、好ましくはヒトＬＡＧ−３タンパク質のドメインＤ１と、またはドメインＤ１およびＤ２と、少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００５２】
ＬＡＧ−３タンパク質の誘導体は、ＬＡＧ−３タンパク質、好ましくはヒトＬＡＧ−３タンパク質のドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３、および任意選択でのＤ４のアミノ酸配列を含み得る。
【００５３】
ＬＡＧ−３タンパク質の誘導体は、ＬＡＧ−３タンパク質、好ましくはヒトＬＡＧ−３の、ドメインＤ１、Ｄ２、およびＤ３と、またはドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３、およびＤ４と、少なくとも７０％、８０％、９０％、または９５％のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００５４】
アミノ酸配列間の配列同一性は、配列のアラインメントを比較することによって決定することができる。比較された配列中の同等の位置が同一のアミノ酸によって占められているとき、分子はその位置で同一である。同一性のパーセンテージとしてアラインメントを採点することは、比較された配列によって共有される、同一の位置におけるアミノ酸の数の関数である。配列を比較するとき、最適アラインメントは、配列中の可能性のある挿入および欠失を考慮に入れるために、１つ以上の配列にギャップを導入することを必要とし得る。配列比較法は、比較される配列中の同数の同一分子について、比較される２つの配列間のより高い関連性を反映して、できるだけ少ないギャップを有する配列アラインメントが、多くのギャップを有する配列より高いスコアを達成するようにギャップペナルティを使用し得る。最大同一性パーセントの計算は、ギャップペナルティを考慮に入れた最適アラインメントの生成を含む。
【００５５】
配列比較を実施するための適切なコンピュータープログラムは、商業的および公的に広く利用可能である。例としては、ＭａｔＧａｔ（Ｃａｍｐａｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ４：２９、ｈｔｔｐ：／／ｂｉｔｉｎｃｋａ．ｃｏｍ／ｌｅｄｉｏｎ／ｍａｔｇａｔから入手可能なプログラム）、Ｇａｐ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｆａｓｔａから入手可能なプログラム）、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ２．０およびＸ２．０（Ｌａｒｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３：２９４７−２９４８、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２から入手可能なプログラム）、ならびにＥＭＢＯＳＳ  Ｐａｉｒｗｉｓｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０、前出、Ｋｒｕｓｋａｌ，１９８３，Ｉｎ：Ｔｉｍｅ  ｗａｒｐｓ，ｓｔｒｉｎｇ  ｅｄｉｔｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ：ｔｈｅ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ，Ｓａｎｋｏｆｆ＆Ｋｒｕｓｋａｌ（ｅｄｓ），ｐｐ１−４４，Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｔｏｏｌｓ／ｅｍｂｏｓｓ／ａｌｉｇｎから入手可能なプログラム）が含まれる。すべてのプログラムは、デフォルトのパラメータを使用して実行できる。
【００５６】
例えば、ＥＭＢＯＳＳペアワイズアラインメントアルゴリズムの「ニードル」法を用いて配列比較を行うことができ、これはそれらの全長にわたって考慮したときに２つの配列の最適アラインメント（ギャップを含む）を決定し、同一性パーセントスコアを提供する。アミノ酸配列比較のデフォルトのパラメータ（「タンパク質分子」オプション）は、Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｄペナルティ：０．５、Ｇａｐ  Ｏｐｅｎペナルティ：１０．０、Ｍａｔｒｉｘ：Ｂｌｏｓｕｍ  ６２とすることができる。
【００５７】
配列比較は、基準配列の全長にわたって実施することができる。
【００５８】
ＬＡＧ−３タンパク質誘導体は、免疫グロブリンＦｃアミノ酸配列、好ましくはヒトＩｇＧ１  Ｆｃアミノ酸配列に、場合によりリンカーアミノ酸配列によって融合されていてもよい。
【００５９】
ＬＡＧ−３タンパク質の誘導体がＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する能力は、Ｈｕａｒｄら（前出）に記載されているように定量的細胞接着アッセイを用いて決定することができる。ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＬＡＧ−３タンパク質の誘導体の親和性は、クラスＩＩ分子に対するヒトＬＡＧ−３タンパク質の親和性の、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％であり得る。ＭＨＣクラスＩＩ分子に対するＬＡＧ−３タンパク質の誘導体の親和性は、クラスＩＩ分子に対するヒトＬＡＧ−３タンパク質の親和性の、少なくとも５０％である。
【００６０】
ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合することができるＬＡＧ−３タンパク質の適切な誘導体の例には、以下を含む誘導体が含まれる。
ヒトＬＡＧ−３配列のアミノ酸残基２３〜４４８、
ＬＡＧ−３のドメインＤ１およびＤ２のアミノ酸配列、
以下の位置の１つ以上にアミノ酸置換を有するＬＡＧ−３のドメインＤ１およびＤ２のアミノ酸配列、ＡＲＧがＧＬＵで置換されている７３位、ＡＲＧがＡＬＡまたはＧＬＵで置換される７５位、ＡＲＧがＧＬＵで置換されている７６位、ＡＳＰがＡＬＡに置換されている位置３０位、ＨＩＳがＡＬＡで置換されている５６位、ＴＹＲがＰＨＥで置換されている７７位、ＡＲＧがＡＬＡで置換されている８８位、ＡＲＧがＡＬＡで置換されている１０３位、ＡＳＰがＧＬＵで置換されている１０９位、ＡＲＧがＡＬＡで置換されている１１５位、
アミノ酸残基５４〜６６が欠失したＬＡＧ−３のドメインＤ１のアミノ酸配列、
組換え可溶性ヒトＬＡＧ−３Ｉｇ融合タンパク質（ＩＭＰ３２１）−ヒトＩｇＧ１  Ｆｃに融合したｈＬＡＧ−３の細胞外ドメインをコードするプラスミドでトランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣細胞において産生された２００ｋＤａ二量体。ＩＭＰ３２１の配列は、ＵＳ２０１１／０００８３３１の配列番号１７に示されている。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
本発明の実施形態は、以下の図面を参照して、ほんの一例として以下に記載される。
【００６２】
【図１】本発明の一実施形態による、ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体、もしくは類似体のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定するために使用されるプローブの動作を示す図である（米国特許第５，８０４，４５３号から得られる図）。
【図２】Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の結合を測定するためのＦＡＣＳアッセイの結果を示す。
【図３】Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の結合を決定するためのＭｅｓｏＳｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）電気化学発光（ＥＣＬ）アッセイを概略的に示す。
【図４】図４（ａ）は、Ｒａｊｉ細胞の存在下および非存在下で、異なる濃度のＩＭＰ３２１でのＭＳＤアッセイについて得られたＥＣＬシグナルのプロットを示す。図４（ｂ）は、Ｒａｊｉ細胞の存在下および非存在下で、異なる濃度のリツキサンでのＭＳＤアッセイについて得られたＥＣＬシグナルのプロットを示す。
【図５】図５（ａ）は、５％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳでＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした後の、異なる濃度のＩＭＰ３２１でのＥＬＩＳＡについて得られたＯＤシグナルのプロットを示す。図５（ｂ）は、ＰＢＳ中の３０％ＦＢＳでＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした後の、異なる濃度のＩＭＰ３２１またはリツキサンでのＥＬＩＳＡについて得られたＯＤシグナルのプロットを示す。図５（ｃ）は、ＲＰＩＭ１６４０中の５％ＢＳＡでＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした後の、異なる濃度のＩＭＰ３２１またはリツキサンでのＥＬＩＳＡについて得られたＯＤシグナルのプロットを示す。
【図６】図６（ａ）は、異なるブロッキング試薬（１％脱脂乳、３％脱脂乳、カゼイン）でＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした後の、異なる濃度のＩＭＰ３２１またはリツキサンでのＥＬＩＳＡについて得られたＯＤシグナルのプロットを示す。図６（ｂ）は、異なるブロッキング試薬（１％ゼラチン、３％ゼラチン、またはＰＢＳ）でＥＬＩＳＡプレートをブロッキングした後の、異なる濃度のＩＭＰ３２１またはリツキサンでのＥＬＩＳＡについて得られたＯＤシグナルのプロットを示す。
【図７】図７（ａ）は、異なる播種密度のＲａｊｉ細胞に対して、異なる濃度のＩＭＰ３２１でのＭＳＤアッセイについて得られた生のＥＣＬシグナルのプロットを示す。図７（ｂ）は、異なる播種密度のＲａｊｉ細胞に対して、異なる濃度のＩＭＰ３２１でのＭＳＤアッセイについて得られた特異的ＥＣＬシグナルのプロットを示す。
【図８】カゼインでＭＳＤプレートをブロッキングした後の、Ｒａｊｉ細胞またはＨＬＡ−ＤＲｄｉｍＬ９２９細胞に対する異なる濃度のＩＭＰ３２１の結合についてのＭＳＤアッセイについて得られたＥＣＬシグナルのプロットを示す。
【図９】Ｒａｊｉ細胞を含む試料溶液中にセンサーの先端を浸した状態で、センサーの光ファイバーの遠位先端に固定されたプロテインＡ結合センサーおよびＩＭＰ３２１を有するＢＬＩプローブを左側に概略的に示す。この方法の基本的なステップは図の右側に示されている。
【図１０】図１０（ａ）は、会合ステップにおいて溶液中のＲａｊｉ細胞に対する固定化ＩＭＰ３２１の用量依存的結合についてのＢＬＩアッセイにおいて得られた結合シグナルのプロットを示す。図１０（ｂ）は、ＢＬＩアッセイにおけるＲａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の用量依存的結合の標準曲線を示す。
【図１１】図１１（ａ）は、ＢＬＩアッセイでの、溶液中の異なる濃度のＲａｊｉ細胞（ＭＨＣクラスＩＩを発現している）またはＪｕｒｋａｔ細胞（ＭＨＣクラスＩＩを発現していない）に対する固定化ＩＭＰ３２１の結合の結合曲線および解離曲線を示す。図１１（ｂ）は、さまざまな濃度のＲａｊｉ細胞について得られた結合シグナルのグラフを示す。
【図１２】図１２（ａ）は、ＢＬＩアッセイでの、溶液中のＲａｊｉ細胞に対する固定化ＩＭＰ３２１、ヒュミラ、またはアバスチンの結合の結合曲線および解離曲線を示す。図１２（ｂ）は、異なる固定化タンパク質について得られた結合シグナルのグラフを示す。
【図１３】溶液中のＲａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の異なる固定化製剤の結合についてのＢＬＩアッセイにより測定された、それらの予想される効力に対する結合効力のパーセンテージのプロットを示す。
【図１４】図１４（ａ）は、溶液中で予め培養したＲａｊｉ細胞に対する異なる濃度の固定化ＩＭＰ３２１の結合についてのＢＬＩアッセイによって得られた結合シグナルのプロットを示す。図１４（ｂ）は、溶液中の予め凍結したＲａｊｉ細胞に対する異なる濃度の固定化ＩＭＰ３２１の結合についてのＢＬＩアッセイによって得られた結合シグナルのプロットを示す。
【図１５】図１５（ａ）は、Ｒａｊｉ細胞に対する異なる濃度の固定化ＩＭＰ３２１または脱グリコシル化ＩＭＰ３２１の結合についての細胞に基づくアッセイによって得られた下流のＣＣＬ４放出のプロットを示す。図１５（ｂ）は、Ｒａｊｉ細胞に対する異なる濃度の固定化ＩＭＰ３２１または脱グリコシル化ＩＭＰ３２１の結合についてのＢＬＩアッセイによって得られた結合シグナルのプロットを示す。
【図１６】Ｒａｊｉ細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、ＩＭＰ３２１または不適切に（３７℃で１２日間）保存したＩＭＰ３２１の結合シグナルのプロットを示す。図１６（ａ）に示される結果はＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイによって得られ、そして図１６（ｂ）に示される結果はＢＬＩアッセイによって得られた。
【図１７】Ｒａｊｉ細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、ＩＭＰ３２１または不適切に（３７℃で１ヶ月間）保存したＩＭＰ３２１の結合シグナルのプロットを示す。図１７（ａ）に示される結果はＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイによって得られ、そして図１７（ｂ）に示される結果はＢＬＩアッセイによって得られた。
【図１８】Ｒａｊｉの細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または酸化ＩＭＰ３２１（１％の過酸化水素による）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図１８ａ）またはＢＬＩアッセイ（図１８ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
【図１９】Ｒａｊｉの細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または酸化ＩＭＰ３２１（０．１％の過酸化水素による）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図１９ａ）またはＢＬＩアッセイ（図１９ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
【図２０】Ｒａｊｉの細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または酸処理ＩＭＰ３２１（ｐＨ３．０での）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図２０ａ）またはＢＬＩアッセイ（図２０ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
【図２１】Ｒａｊｉの細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または酸処理ＩＭＰ３２１（ｐＨ３．１またはｐＨ３．６での）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図２１ａ）またはＢＬＩアッセイ（図２１ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
【図２２】Ｒａｊｉの細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または塩基処理ＩＭＰ３２１（ｐＨ９．２またはｐＨ９．７５での）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図２２ａ）またはＢＬＩアッセイ（図２２ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
【図２３】Ｒａｊｉの細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または光曝露ＩＭＰ３２１（２５℃で５日間）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図２３ａ）またはＢＬＩアッセイ（図２３ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
【図２４】Ｒａｊｉの細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または光曝露ＩＭＰ３２１（２５℃で１０日間）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図２４ａ）またはＢＬＩアッセイ（図２４ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
【図２５】成熟型ヒトＬＡＧ−３タンパク質のアミノ酸配列を示す。４つの細胞外Ｉｇスーパーファミリードメインはアミノ酸残基１〜１４９（Ｄ１）、１５０〜２３９（Ｄ２）、２４０〜３３０（Ｄ３）、３３１〜４１２（Ｄ４）にある。ヒトＬＡＧ−３タンパク質のＤ１ドメインのエクストラループ構造のアミノ酸配列は太字で下線を付している。
【発明を実施するための形態】
【００６３】
以下の実施例１〜５は、それらが組換えＬＡＧ−３タンパク質誘導体ＩＭＰ３２１のＧＭＰグレード生産のための品質管理アッセイとしての使用に適しているかどうかを決定するための、様々な異なる結合アッセイの評価を記載する。どのアッセイも適切であるとは認められなかった。実施例６〜１１は、細胞に基づくＢＬＩ方法、およびＩＭＰ３２１の製剤のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定するためのそれらの適合性の実証を記載する。
【００６４】
実施例１
Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の結合を決定するための蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）アッセイの使用の評価
ＦＡＣＳアッセイを実施して、Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の結合を決定した。１００％、７５％、および５０％のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有するＩＭＰ３２１試料を試験した。１００％活性を有する試料は、所定の濃度で既知のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を有する基準試料であった。７５％および５０％の活性を有する試料は、基準試料の希釈によって調製された。
【００６５】
得られた結合曲線を図２に示す。それらは、上部プラトーに達していないことを示し、それ故、１００％活性を有する基準試料と他の試料との結合曲線の間に平行性はなかった。これは、異なる試料の相対的効力の計算を妨げた。
【００６６】
実施例２
Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の結合を決定するためのＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイの使用の評価
この実施例は、Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の結合を決定するためのメソスケールディスカバリー（ＭＳＤ）アッセイの評価を記載する。
【００６７】
Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォーム（ＭＳＤ−ＥＣＬ）は、検出抗体にコンジュゲートしている電気化学発光標識を使用する。これらの標識は、適切な化学的環境で電気によって刺激されたときに光を発しし、次いでそれは主要なタンパク質と分子を測定するために使用することができる。
【００６８】
Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォーム（ＭＳＤ−ＥＣＬ）によってプレート電極に電気が印加され、標識による発光がもたらされる。次いで、光強度を測定して試料中の検体を定量する。
【００６９】
検出プロセスは、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ−ＥＣＬ）のマイクロプレートの底部にある電極で開始され、電極付近の標識のみが励起され検出される。このシステムは、６２０ｎｍで発光するルテニウムとの二重還元反応のための触媒として高濃度のトリプロピルアミンを含む緩衝液を使用する。
【００７０】
使用したＭＳＤアッセイを図３に概略的に示す。手短に、ＰＢＳ中の１ウェルあたり約２×１０４細胞のＲａｊｉ細胞を、２５ｕＬ／ウェルで、Ｓｉｎｇｌｅ−ＳＰＯＴ９６ウェルＭＳＤプレート（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，  ＭＤ）に播種した。ブロッキング緩衝液（２５ｕＬ／ウェル）でブロッキングする前に、プレートを室温で１〜１．５時間インキュベートした。次いで、ＩＭＰ３２１基準標準物質または試料の段階希釈物を、５０ｕＬ／ウェルで二重のウェルにロードした。室温での約１時間のインキュベーションの後、ルテニウムをコンジュゲートした抗ヒトＦｃを５０ｕＬ／ウェルで用いて結合ＩＭＰ３２１を検出した。界面活性剤なしのＭＳＤ読み取り緩衝液を用いて電気化学発光シグナルを得た。ＥＣＬ数は、アッセイ範囲内で細胞表面に対するＩＭＰ３２１の結合に比例するはずである。
【００７１】
マイクロプレートの底部にある高結合炭素電極は、Ｒａｊｉ細胞の容易な付着を可能にする。このアッセイは、抗ＩＭＰ３２１抗体にコンジュゲートしている電気化学発光標識を使用する。ＭＳＤ機器によってプレート電極に電気が印加され、標識による発光がもたらされる。次いで光強度を測定して、固定化Ｒａｊｉ細胞の表面上のＭＨＣクラス分子に結合したＩＭＰ３２１の存在を定量する。
【００７２】
Ｒａｊｉ細胞を含むおよび含まないＩＭＰ３２１を含む試料について得られた結果を図４（ａ）に示し、Ｒａｊｉ細胞を含むまたは含まないリツキサンを含む試料について得られた結果を図４（ｂ）に示す。
【００７３】
結果は、ＭＳＤプレートに対するＩＭＰ３２１の非特異的結合がＲａｊｉ細胞の非存在下で観察されたことを示している。比較すると、リツキサンのＲａｊｉ細胞に対する特異的結合が観察された。
【００７４】
Ｒａｊｉ細胞は、１９６３年の１１歳のナイジェリアのバーキットリンパ腫の男性患者のＢリンパ球に由来する細胞株の細胞である。リツキサン（リツキシマブ）は、Ｂ細胞の表面に主に見られるタンパク質ＣＤ２０に対するキメラモノクローナル抗体である。
【００７５】
実施例３
ＥＬＩＳＡプレートに対するＩＭＰ３２１の非特異的結合の評価
この実施例は、異なるブロッキング試薬を使用する酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）に使用されるプレートに対するＩＭＰ３２１およびリツキサンの非特異的結合の評価を記載する。
【００７６】
手短に、マイクロプレートをブロッキング試薬によって２５℃で２時間ブロッキングした。試料およびリツキサン対照を希釈緩衝液で２μｇ／ｍｌに希釈し、次いで２倍希釈系列によりさらに希釈した。希釈した試料を添加してインキュベートする前後にマイクロプレートを洗浄し、十分に排水した。二次抗体と共にインキュベートした後、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２（４５０〜６５０ｎｍ）を用いた分光測定法によりシグナルを測定した。
【表１】
2020514696.tif 000003
【００７７】
結果を図５に示す。図５（ａ）は、増加する濃度のＩＭＰ３２１および５％ＢＳＡまたは１０％ＦＢＳでブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートを用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。図５（ｂ）は、増加する濃度のＩＭＰ３２１またはリツキサンおよびＰＢＳ中３０％ＦＢＳでブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートを用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。図５（ｃ）は、増加する濃度のＩＭＰ３２１またはリツキサンおよびＲＰＩＭ  １６４０中５％ＢＳＡでブロッキングしたＥＬＩＳＡプレートを用いたＥＬＩＳＡの結果を示す。
【００７８】
結果は、ブロッキング試薬としてＢＳＡまたはＦＢＳを使用したとき、ＥＬＩＳＡプレートに対するＩＭＰ３２１の強い非特異的結合があるが、リツキサンではそうならないことを示している。
【００７９】
次いで、ＥＬＩＳＡプレートに対するＩＭＰ３２１の非特異的結合を排除することができるかどうかを確かめるために、ＩＭＰ３２１またはリツキサンと共に様々な種類のブロッキング試薬を試験した。
【表２】
2020514696.tif 000004
【００８０】
結果を図６に示す。図６（ａ）は、ブロッキング試薬として１％の脱脂乳、３％の脱脂乳、またはブロッカーカゼインブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ）を用いたＩＭＰ３２１またはリツキサンの結果を示す。図６（ｂ）は、ブロッキング試薬として１％ゼラチン、３％ゼラチン、またはＰＢＳを用いたＩＭＰ３２１またはリツキサンの結果を示す。
【００８１】
結果は、カゼインがＥＬＩＳＡプレートに対するＩＭＰ３２１の非特異的結合を減少させるための最良のブロッキング試薬であることを示している。
【００８２】
実施例４
Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の結合を決定するための、カゼインブロッキング緩衝液を用いたＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイの使用の評価
この実施例は、カゼインブロッキング緩衝液を使用して異なる播種密度のＲａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の結合を決定するためのＭＳＤアッセイの評価を記載する。
【００８３】
実施例２に記載したものと同様にＭＳＤアッセイを実施して、その実施例で観察されたＭＳＤプレートに対するＩＭＰ３２１の非特異的結合がカゼインブロッキング緩衝液を用いて最小化され得るかどうかを評価した。
【表３】
2020514696.tif 000005
【００８４】
結果を図７に示す。図７（ａ）は、異なる濃度のＩＭＰ３２１での異なる播種密度のＲａｊｉ細胞（０〜５×１０４細胞／ウェル）に対するＩＭＰ３２１の結合の結果を示す。結果は、最大ＩＭＰ３２１結合の細胞密度依存的増加を示す。図７（ｂ）は、異なる播種密度（１×１０３〜５×１０４細胞／ウェル）のＲａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の特異的結合の結果を示す。結果は、特異的ＩＭＰ３２１結合の細胞密度依存的増加を示す。
【００８５】
カゼインブロッキング緩衝液を用いるＭＳＤアッセイを用いて、Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の結合を、異なる濃度のＩＭＰ３２１でのＨＬＡ−ＤＲｄｉｍＬ９２９細胞（これらの細胞はＭＨＣクラスＩＩを発現しない）に対するＩＭＰ３２１の結合と比較した。Ｌ９２９は、株Ｌからクローン化された線維芽細胞様細胞株である。結果を図８に示す。結果は、ＭＳＤプレートに対するＩＭＰ３２１の非特異的結合がカゼインブロッカーの存在下で顕著に減少したことを示す。しかしながら、特異的結合シグナルは低く、そしてＩＭＰ３２１用量−結合曲線の上部プラトーは観察されなかった。
【００８６】
カゼインブロッキング緩衝液を使用するＭＳＤアッセイは、プレート固定化Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の特異的結合を実証するために使用することはできないと結論付けられた。
【００８７】
実施例５
Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の結合を決定するためのＥＬＩＳＡアッセイの使用の評価
この実施例は、Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の結合を決定するための細胞に基づく直接ＥＬＩＳＡおよび細胞に基づくトランスファーＥＬＩＳＡの能力の評価を記載する。
【００８８】
直接ＥＬＩＳＡ（実施例３に記載のアッセイと同様に）を、異なるブロッキング試薬（５％ＢＳＡ、１０％ＦＢＳ、０．５％カゼイン、または３％ゼラチン）の存在下で、異なる量のプレート固定化Ｒａｊｉ細胞（１０，０００、５，０００、または２，５００細胞）、および異なる濃度のＩＭＰ３２１またはペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅ  Ｆ、Ｎ結合型糖タンパク質からの高マンノース型、ハイブリッド型、および複合型オリゴ糖の最も内側のＧｌｃＮＡｃとアスパラギン残基の間を切断するアミダーゼ）で処理されたＩＭＰ３２１によって実施した。直接ＥＬＩＳＡアッセイに使用される条件は、以下の表に要約されている。
【表４】
2020514696.tif 000006
【００８９】
結果を以下の表に示す。
【表５】
2020514696.tif 000007
【００９０】
結果は、プレート固定化Ｒａｊｉ細胞に対する用量依存的ＩＭＰ３２１結合を示す。
【００９１】
ＩＭＰ３２１がＥＬＩＳＡプレートに非特異的に結合するかどうかを調べるために、以下の表に要約される条件下で、Ｒａｊｉ細胞の非存在下で直接ＥＬＩＳＡを実施した。
【表６】
2020514696.tif 000008
【００９２】
結果を以下の表に示す。
【表７】
2020514696.tif 000009
【００９３】
結果は、プレート固定化Ｒａｊｉ細胞の非存在下でのＥＬＩＳＡプレートに対するＩＭＰ３２１の強い非特異的結合を示す。カゼインブロッキング試薬もゼラチンブロッキング試薬も、ＩＭＰ３２１のＰＮＧａｓｅ処理も非特異的結合を除去しなかった。
【００９４】
細胞に基づく直接ＥＬＩＳＡは、プレート固定化Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の特異的結合を実証するために使用することはできないと結論付けられた。
【００９５】
トランスファーセルＥＬＩＳＡを実施して、固定化Ｒａｊｉ細胞に対する、異なる濃度のＩＭＰ３２１、またはＰＮＧａｓｅで処理したＩＭＰ３２１の結合を決定した。Ｒａｊｉ細胞を、ＩＭＰ３２１または処理したＩＭＰ３２１に結合させた後に別のプレートに移した。アッセイに使用した条件は以下の表に要約されている。
【表８】
2020514696.tif 000010
【００９６】
結果を以下の表に示す。
【表９】
2020514696.tif 000011
【００９７】
結果は、ウェル間のシグナル変動は品質管理方法には許容できないことを示している。この方法もまた労働集約的である。細胞に基づくトランスファーＥＬＩＳＡは、プレート固定化Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の特異的結合を実証するために使用することはできないと結論付けられた。
【００９８】
実施例６
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いたＬＡＧ−３タンパク質誘導体ＩＭＰ３２１の製剤の結合活性を測定するための細胞に基づくアッセイ
ＩＭＰ３２１は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に対して高い親和性を有するＬＡＧ−３タンパク質の可溶性組換え誘導体である。この実施例は、ＢＬＩを使用して、ＭＨＣクラスＩＩ発現Ｒａｊｉ細胞に対するＩＭＰ３２１の結合活性を測定するための細胞に基づくアッセイを記載する。アッセイは簡単かつ迅速であり、そして基準標準物質と試料との間の比較を可能にする。
【００９９】
図９は、Ｒａｊｉ細胞を含む試料溶液中にセンサーの先端を浸した状態で、センサーの光ファイバーの遠位先端に固定されたプロテインＡ結合センサーおよびＩＭＰ３２１を有するＢＬＩプローブを左側に概略的に示す。この方法の基本的なステップは図の右側に示されている。アッセイは以下により詳細に記載される。
【０１００】
材料：
１）Ｒａｊｉ細胞：ＡＴＣＣ／ＣＣＬ−８６
２）ＲＰＭＩ  １６４０：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／２２４００−０８９
３）ＨＩ−ＦＢＳ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／１０１００１４７
４）ＤＰＢＳ：ハイクローン／ＳＨ３００２８．０１Ｂ
５）ＢＳＡ：Ｓｉｇｍａ／Ａ３０３２
６）ＩＭＰ３２１基準試料
７）Ｒａｊｉ細胞増殖培地：ＲＰＭＩ  １６４０、１０％ＨＩ−ＦＢＳ
８）結合アッセイ希釈液：ＤＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ
９）プロテインＡトレイ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ−１８−５０１０）
１０）９６平底ウェル黒色プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ−６５５２０９）
１１）シングルおよびマルチチャンネルピペット：Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ａｎｄ  Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ／ｖａｒｉｏｕｓ
１２）細胞計数器：Ｒｏｃｈｅ／Ｃｅｄｅｘ  ＨｉＲｅｓおよびＢｅｃｋｍａｎ／ＶｉＣｅｌｌ
１３）バイオレイヤー干渉計：ソフトウェアバージョン７．０以降を搭載したＦｏｒｔｅｂｉｏ／Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ
【０１０１】
方法：
１．すぐ使用できるＲａｊｉ細胞の調製
１）液体窒素フリーザーからＮバイアルのＲａｊｉ細胞を取り出し、３７℃のウォーターバスで素早く解凍する。
２）バイアルの内容物を無菌的に、およそＮ×９ｍＬのＲａｊｉ細胞増殖培地を含む滅菌遠心分離チューブに移す。静かにピペッティングしてよく混ぜる。
３）細胞を３００×ｇで５分間遠心する。結合アッセイ希釈液に細胞を再懸濁し、細胞計数器または血球計でそれらを計数する。
４）１ｍＬあたり４．０Ｅ６〜８．０Ｅ６細胞に細胞密度を調整するために十分な量の結合アッセイ希釈液に一定量の細胞ストック懸濁液を加え、使用するために氷上に保つ。
【０１０２】
２．ＩＭＰ３２１基準標準物質、対照および試料の調製
注：１）精度を確保するために逆ピペッティングを使用する。
２）泡沫と泡の発生を避けるか最小限に抑えるために、穏やかにボルテックスする。
１）基準標準物質：
１．１）必要に応じてＩＭＰ３２１基準標準物質のバイアルを解凍する。２〜８ｏＣで保存する。有効期限は解凍日から７日間である
１．２）ＩＭＰ３２１基準標準物質を製剤緩衝液中で約１．０ｍｇ／ｍＬに希釈する。新鮮なものを調製し、新鮮なものを使用する。ブランクとして製剤緩衝液を用いて分光光度的にタンパク質濃度を決定する。
１．３）測定されたタンパク質濃度に基づいて、ＲＭを希釈して以下に記載されるような適切な濃度に標準曲線を調製する。ボテックス（ｖｏｔｅｘ）により希釈液を混合する。
【表１０】
2020514696.tif 000012
【０１０３】
１．４）標準曲線のために希釈Ｃ−Ｊを使用する。曲線の直線部分および上部および下部のプラトーを含めるために、必要に応じて追加の濃度を使用することができる。
２）対照の準備
２．１）対照は、上記ステップ１．３で調製したチューブＣからの基準試料の独立した希釈物である。上記の表に記載されているようにさらに希釈する。ボテックスにより希釈液を混合する。
２．２）対照に希釈Ｃ−Ｊを使用する。
３）試料の調製
３．１）タンパク質濃度に基づいて、ＩＭＰ３２１試料をアッセイ希釈液で約１．０ｍｇ／ｍＬに希釈する。新鮮なものを調製し、新鮮なものを使用する。
３．２）上記表に記載されるように、標準曲線を作成するためにさらに希釈して適切な濃度にする。ボテックスにより希釈液を混合する。
３．３）試料に希釈Ｃ−Ｊを使用する。曲線の直線部分および上部および下部のプラトーを含めるために、必要に応じて追加の濃度を使用することができる。
【０１０４】
３．Ｏｃｔｅｔシステムの検出ステップ
１）バイオセンサーをＰＢＳ中で少なくとも１０分間水和する。
２）アッセイプレートを準備する。黒色のポリプロピレン製マイクロプレートで、以下の試料プレートマップに従って、ウェル当たり２００μＬのＰＢＳ、アッセイ希釈液、ＡＤ中のＩＭＰ３２１の滴定、またはＲａｊｉ細胞をそれぞれ適切なウェルに移す。
【表１１】
2020514696.tif 000013
３）下記のパラメータ設定で動的アッセイを設定する。
４）データを保存する場所とファイル名を入力する。
５）ＧＯをクリックしてアッセイを実施する。
【表１２】
2020514696.tif 000014
【０１０５】
４．データを分析する
１）Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアで、分析するデータフォルダをロードする。
２）加工タブで、結合ステップを選択する。次に「選択したステップの定量化」をクリックする。
３）濃度情報を適宜入力する。
４）結果タブで、結合速度式としてＲ平衡（Ｒｅｑ）を選択する。この式は、実験中に生成された結合曲線に適合し、平衡時の応答を出力シグナルとして計算する。
５）結合速度を計算するをクリックする。結果は自動的に表に表示される。
６）レポートを保存ボタンをクリックしてＭＳエクセルレポートファイルを生成する。
７）４パラメータロジスティック曲線近似プログラムであるＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏを使用して、ｕｇ／ｍＬで表されるＩＭＰ３２１濃度に対する結合速度（ｎｍ）により標準曲線または試料曲線を作成する。例を図１０に示す。
８）基準標準物質と試料のＥＣ５０比を用いて試料の相対結合効力を計算する。
【０１０６】
５．システムの適合性とアッセイの許容基準
以下の基準をすべて満たす場合、アッセイは有効である。
１）すぐ使用できるＲａｊｉ細胞生存率＞＝６０％
２）対照の相対活性は８０％〜１２０％以内である。
３）対照のシグナル対バックグラウンド比（パラメータＤ／パラメータＡ）＞＝２。
４）平行度（比較可能性）：標準との勾配比は０．８から１．４の間である。
５）アッセイ対照の結果が上記の基準を満たさない場合、アッセイは無効とみなされる。
【０１０７】
６．報告可能な値
１）臨床試料については、試料についての報告可能な値は、以下に詳述するように、２つまたは３つの有効かつ独立したアッセイ結果の平均として定義される。
差異％は次のように計算される。
絶対値（アッセイ１の結果−アッセイ２の結果）／平均値（アッセイ１の結果、アッセイ２の結果）×１００％
２）２つのアッセイの差異％が２０％以下の場合、２つのアッセイの平均結果を報告する。
３）２つのアッセイの差異％が２０％を超える場合、１つの追加の有効なアッセイを実行する。
４）３試料アッセイのＣＶが２５％以下の場合、３アッセイの平均結果を報告する。
５）３試料アッセイのＣＶが２５％を超える場合、報告可能な値はない。再試験計画との不一致を起こす。
６）試料の報告可能な値がＣＯＡに記載されている仕様を満たしていない場合は、再試験計画との不一致を起こす。
【０１０８】
７．再試験計画
次のように試料の再試験を実行します。
１）３つの有効で独立したアッセイで試料を再試験する
２）３試料アッセイのＣＶが２５％以下の場合、３アッセイの平均結果を報告する。
３）３試料アッセイのＣＶが２５％を超える場合、報告可能な値はない。
４）再試験の結果がＣＯＡに記載されている規格外（ＯＯＳ）である場合、結論は不合格である。
【０１０９】
実施例７
ＢＬＩアッセイにおける溶液中のＲａｊｉ細胞に対する固定化ＩＭＰ３２１の特異的結合の決定
実施例６に記載のＢＬＩアッセイを使用して、溶液中の異なる濃度（８Ｅ６／ｍＬ、４Ｅ６／ｍＬ、２Ｅ６／ｍＬ、１Ｅ６／ｍＬ）のＲａｊｉ細胞に対する固定化ＩＭＰ３２１の結合を決定した。Ｊｕｒｋｅｔ細胞を陰性対照として使用した。得られた結合曲線および解離曲線を図１１（ａ）に示す。図１１（ｂ）は、異なるＲａｊｉ細胞濃度について得られた結合シグナルのグラフを示す。結果は、結合シグナルがＲａｊｉ細胞の濃度に依存すること、すなわち、Ｒａｊｉ細胞の濃度が高いほど、高い結合速度およびより高い上部プラトーが得られることを示している。同じアッセイにおいて、Ｊｕｒｋｅｔ細胞の特異的結合は観察されなかった。
【０１１０】
Ｒａｊｉ細胞に対する固定化ＩＭＰ３２１の結合を固定化ヒュミラまたはアバスチンによる結合と比較すること以外は実施例６に記載したようにさらなるＢＬＩアッセイを行った。得られた結合曲線および解離曲線を図１２（ａ）に示す。図１２（ｂ）は、異なる固定化タンパク質について得られた結合シグナルのグラフを示す。結果は、ヒュミラまたはアバスチンではなく、ＩＭＰ３２１がＲａｊｉ細胞に結合することを示している。
【０１１１】
これらの結果から、ＢＬＩアッセイは溶液中のＲａｊｉ細胞に対する固定化ＩＭＰ３２１の特異的結合を決定することができると結論付けられた。
【０１１２】
実施例８
ＢＬＩアッセイにより測定したＩＭＰ３２１結合活性と既知の結合効力との相関
種々のレベルのＲａｊｉ細胞結合効力を有する基準標準物質から希釈したＩＭＰ３２１の試料をＢＬＩアッセイに用いて、アッセイにより測定された結合活性が試料の既知の結合効力と相関するかどうかを決定した。結果を以下の表に示す。図１３は、ＢＬＩアッセイによって測定された結合効力パーセンテージ対それらの予想される効力のプロットを示す。
【表１３】
2020514696.tif 000015
【０１１３】
結果は、ＢＬＩアッセイによって測定された結合効力と予想される結合効力との間の良好な相関関係を示す。各試料の平均回収率は９０％から１１０％であり、結合曲線の良好な平行性（すなわち許容可能な勾配比および収束プラトー）を伴った。
【０１１４】
実施例９
ＭＨＣクラスＩＩ結合活性を測定するためのＢＬＩアッセイにおける凍結細胞の使用
実施例６に記載のＢＬＩアッセイを実施して、培養または凍結保存溶液から得られた溶液中のＲａｊｉ細胞に対する固定化ＩＭＰ３２１の結合を比較した。溶液中の培養Ｒａｊｉ細胞に対する異なる濃度の固定化ＩＭＰ３２１の結合について得られた結合シグナルのプロットを図１４（ａ）に示す。溶液中の予め凍結したＲａｊｉ細胞に対する異なる濃度の固定化ＩＭＰ３２１の結合について得られた結合シグナルのプロットを図１４（ｂ）に示す。
【０１１５】
結果は、凍結されたＲａｊｉ細胞が培養されたＲａｊｉ細胞と非常によく似た挙動をするので、凍結保存溶液を新鮮な培養溶液の代わりに使用することができ、それによってアッセイの頑健性および転写性が改善される。
【０１１６】
実施例１０
インプロセス試料試験
実施例６に記載のＢＬＩアッセイを実施して、ＩＭＰ３２１の様々な異なる製剤のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を決定し、ＣＣＬ４放出アッセイによって決定されるように製剤の生物活性を比較した。
【０１１７】
ＴＨＰ−１はヒト単核白血病細胞株である。ＬＡＧ−３タンパク質またはストレスを受けた試料で誘導されると、ＴＨＰ−１細胞はサイトカインＣＣＬ４を分泌し、これはＣＣＬ４  ＥＬＩＳＡキットで定量することができる。ＣＣＬ４放出のレベルは、ＬＡＧ−３タンパク質、またはその断片、誘導体もしくは類似体の製剤の生物活性を測定するために使用することができる。
【表１４】
2020514696.tif 000016
【０１１８】
異なるＩＭＰ３２１試料の生物活性は、ＣＣＬ４放出アッセイによって決定された生物活性と相関していると結論付けられた。
【０１１９】
実施例１１
ストレスを受けたＩＭＰ３２１試料のＢＬＩアッセイ試験および細胞に基づくＣＣＬ４放出アッセイとの相関
実施例６に記載のＢＬＩアッセイを用いて、異なる処理（ＰＮＧａｓｅでの処理による脱グリコシル化、３７℃での保存、１％または０．１％過酸化水素処理による酸化、ｐＨ３．０、３．６、または３．１の酸による処理、ｐＨ９．２、９．７５のアルカリによる処理、または光への曝露）にさらされたＩＭＰ３２１試料のＭＨＣクラスＩＩ結合活性を測定した。結果を図１５〜２４に示す。
【０１２０】
図１５（ａ）は、Ｒａｊｉ細胞に対する異なる濃度の固定化ＩＭＰ３２１または脱グリコシル化ＩＭＰ３２１の結合についての細胞に基づくアッセイによって得られた下流のＣＣＬ４放出のプロットを示す。
図１５（ｂ）は、Ｒａｊｉ細胞に対する異なる濃度の固定化ＩＭＰ３２１または脱グリコシル化ＩＭＰ３２１の結合についてのＢＬＩアッセイによって得られた結合シグナルのプロットを示す。
図１６は、Ｒａｊｉ細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、ＩＭＰ３２１または不適切に（３７℃で１２日間）保存したＩＭＰ３２１の結合シグナルのプロットを示す。図１６（ａ）に示される結果はＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイによって得られ、そして図１６（ｂ）に示される結果はＢＬＩアッセイによって得られた。
図１７は、Ｒａｊｉ細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、ＩＭＰ３２１または不適切に（３７℃で１ヶ月間）保存したＩＭＰ３２１の結合シグナルのプロットを示す。図１７（ａ）に示される結果はＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイによって得られ、そして図１７（ｂ）に示される結果はＢＬＩアッセイによって得られた。
図１８は、Ｒａｊｉの細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または酸化ＩＭＰ３２１（１％の過酸化水素による）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図１８ａ）またはＢＬＩアッセイ（図１８ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
図１９は、Ｒａｊｉの細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または酸化ＩＭＰ３２１（０．１％の過酸化水素による）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図１９ａ）またはＢＬＩアッセイ（図１９ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
図２０は、Ｒａｊｉの細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または酸処理ＩＭＰ３２１（ｐＨ３．０での）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図２０ａ）またはＢＬＩアッセイ（図２０ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
図２１は、Ｒａｊｉの細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または酸処理ＩＭＰ３２１（ｐＨ３．１またはｐＨ３．６での）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図２１ａ）またはＢＬＩアッセイ（図２１ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
図２２は、Ｒａｊｉの細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または塩基処理ＩＭＰ３２１（ｐＨ９．２またはｐＨ９．７５での）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図２２ａ）またはＢＬＩアッセイ（図２２ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
図２３は、Ｒａｊｉの細胞に対する、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または光曝露ＩＭＰ３２１（２５℃で５日間）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図２３ａ）またはＢＬＩアッセイ（図２３ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
図２４は、異なる濃度の、固定化した、未処理のＩＭＰ３２１または光曝露ＩＭＰ３２１（２５℃で１０日間）の結合について、ＣＣＬ４放出を測定する細胞に基づくアッセイ（図２４ａ）またはＢＬＩアッセイ（図２４ｂ）によって得られたシグナルのプロットを示す。
【０１２１】
（実施例６に記載されるような方法により決定される）それらのＭＨＣクラスＩＩ結合活性と比較した生物活性を（異なるＩＭＰ３２１試料のＣＣＬ４放出により決定されるように、以下の表に示す。
【表１５】
2020514696.tif 000017
【０１２２】
結果は、ＣＣＬ４放出によって決定されるように、処理された各ＩＭＰ３２１試料の生物活性と、本発明によるＢＬＩアッセイによって決定されるようにそのＭＨＣクラスＩＩ結合活性との間に良好な相関関係を示す。ＢＬＩアッセイによるＭＨＣクラスＩＩ結合活性の決定は、ＩＭＰ３２１製剤の生物活性を決定するために使用され得ると結論付けられた。
【図１】
2020514696.tif 000018
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020514696.tif 000024
【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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