(57)【要約】本明細書に提供されるものは、対象を治療する方法、対象の応答を予測する方法、及び喘息またはネザートン症候群などのＫＬＫ５と関連する疾患に罹患している対象を選択する方法である。特に、本明細書に提供されるものは、喘息またはネザートン症候群の治療または診断のためのＫＬＫ５アンタゴニスト、例えば、抗体またはＦｃ融合ポリペプチド、ならびにそれを含む薬学的製剤の使用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における喘息を治療するための方法であって、有効量のＫＬＫ５アンタゴニストを前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項２】
喘息に罹患している対象のＫＬＫ５アンタゴニストを含む治療に対する応答を予測する方法であって、
（ａ）前記対象からの生物学的試料中のＫＬＫ５レベルを測定することと、
（ｂ）前記試料中で検出された前記ＫＬＫ５レベルを参照レベルと比較することと、
（ｃ）前記試料中で測定された前記ＫＬＫ５レベルが前記参照レベルと比較して上昇している場合に前記対象が前記治療に応答するであろうと予測し、前記試料中で測定された前記ＫＬＫレベルが前記参照レベルと比較して低減している場合に前記対象が前記治療に応答しないであろうと予測することと、を含む、前記方法。
【請求項３】
ＫＬＫ５アンタゴニストを含む治療について喘息に罹患している対象を選択する方法であって、前記対象からの生物学的試料中のＫＬＫ５ゲノム配列中に位置する遺伝的変異の存在または不在を決定することを含み、前記遺伝的変異の前記存在が、前記対象がＫＬＫ５アンタゴニストでの治療に適していることを示す、前記方法。
【請求項４】
喘息に罹患している対象がＫＬＫ５アンタゴニストでの治療に適していることを示すＫＬＫ５ゲノム配列中の遺伝的変異の存在または不在を検出するための方法であって、
（ａ）前記対象からの試料を、前記ＫＬＫ５ゲノム配列中に位置する前記遺伝的変異の存在または不在を検出することができる試薬と接触させることと、
（ｂ）前記遺伝的変異の存在または不在を決定することであって、前記遺伝的変異の存在が、前記対象がＫＬＫ５アンタゴニストでの治療に適していることを示す、前記決定することと、を含む、前記方法。
【請求項５】
喘息が、前記ＫＬＫ５ゲノム配列中に位置する遺伝的変異と関連している、請求項１または２に記載の方法。
【請求項６】
喘息が、ＫＬＫ５の上昇したレベルと関連している、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
喘息が、好中球の上昇したレベルと関連している、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
喘息が、低２型喘息、低ペリオスチン喘息、及び低好酸球喘息からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
喘息が、ネザートン症候群と関連していない、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
喘息が、ＳＰＩＮＫ５の低減した活性と関連している、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
喘息が、ＳＰＩＮＫ５をコードする遺伝子またはその遺伝子産物における１つ以上の遺伝的変異と関連していない、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
喘息のための前記対象の前記治療が、前記遺伝的変異の存在または不在に基づく、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝的変異が、ＳＮＰである、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝的変異が、ＳＮＰ  ｒｓ１１７６３９５１２である、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＫＬＫ５アンタゴニストが、ＫＬＫ５の活性部位に結合することによってＫＬＫ５を阻害する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＫＬＫ５アンタゴニストが、完全長のプロセシングされていないＫＬＫ５の１０８、１４７、１５０、１５３、１６８、及び２４５位のアミノ酸残基からなる群から選択されるＫＬＫ５のアミノ酸残基のうちの１つ以上を含む結合領域に結合することによってＫＬＫ５を阻害する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＫＬＫ５アンタゴニストが、ＫＬＫ５のセリンプロテアーゼ活性を阻害する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＫＬＫ５アンタゴニストが、抗体、結合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び小分子からなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＫＬＫ５アンタゴニストが、抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が、完全長ＩｇＧ１抗体である、請求項１９〜２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記結合ポリペプチドが、Ｆｃ融合ポリペプチドである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記Ｆｃ融合ポリペプチドが、ＳＰＩＮＫ５の１つ以上のドメインを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｆｃ融合ポリペプチドが、配列番号１６または配列番号２１のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｆｃ融合ポリペプチドが、ＳＰＩＮＫ９の１つのドメインを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｆｃ融合ポリペプチドが、配列番号２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記小分子が、プロテアーゼ阻害剤である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２９】
前記プロテアーゼ阻害剤が、ロイペプチンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が、気管支肺胞洗浄、肺実質、気管支上皮下、脳脊髄液、血液、血清、痰、唾液、粘膜剥離物、組織検体、涙腺分泌物、精液、または汗からなる群から選択される、請求項２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
喘息の療法及び／または治療を含む医学的治療または診断における使用のためのＫＬＫ５アンタゴニスト。
【請求項３２】
ＫＬＫ５の活性を阻害する、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチド。
【請求項３３】
前記ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドが、ＳＰＩＮＫ５またはＳＰＩＮＫ９からの１つ以上のドメインを含む、請求項３２に記載のＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチド。
【請求項３４】
ＳＰＩＮＫ５からの前記１つ以上のドメインが、配列番号１７及び配列番号２２からなる群から選択される配列を含む、請求項３３に記載のＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチド。
【請求項３５】
ＳＰＩＮＫ９からの前記１つ以上のドメインが、配列番号２８を含む、請求項３３に記載のＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチド。
【請求項３６】
前記１つ以上のドメインが、マウスまたはヒト由来である、請求項３３〜３５のいずれか１項に記載のＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチド。
【請求項３７】
ＫＬＫ５を少なくとも約５０％阻害する、請求項３３〜３６のいずれか１項に記載のＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチド。
【請求項３８】
薬学的に活性な量の請求項３２〜３７のいずれか１項に記載のＦｃ融合ポリペプチドと、薬学的に許容される担体と、を含む、薬学的製剤。
【請求項３９】
ＫＬＫ５と関連する疾患の療法及び／または治療を含む医学的治療または診断における使用のための請求項３２〜３７のいずれか１項に記載のＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチド。
【請求項４０】
対象においてＫＬＫ５と関連する疾患を治療するための方法であって、有効量の請求項３２〜３７のいずれか１項に記載のＦｃ融合ポリペプチドを前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４１】
ＫＬＫ５と関連する前記疾患が、前記対象の試料中のＫＬＫ５の上昇したレベルと関連している、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ＫＬＫ５と関連する前記疾患が、前記対象の試料中の好中球の上昇した数と関連している、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ＫＬＫ５と関連する前記疾患が、ネザートン症候群である、請求項４１〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記試料が、気管支肺胞洗浄、肺実質、及び気管支上皮下からなる群から選択される、請求項４１〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象が、ヒトである、請求項１〜３０及び４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月２１日に出願された米国仮特許出願第６２／４８８，５１５号の優先権を主張し、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願には、ＡＳＣＩＩ形式にて電子的に提出されており、その全体が参照することにより本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１８年４月１１日に作成された上記ＡＳＣＩＩコピーは、Ｐ３４２４７−ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、９３キロバイトのサイズである。
【０００３】
本明細書に提供されるものは、対象を治療する方法、対象の応答を予測する方法、及び喘息またはネザートン症候群などのＫＬＫ５と関連する疾患に罹患している対象を選択する方法である。特に、本明細書に提供されるものは、喘息またはネザートン症候群の治療または診断のためのＫＬＫ５アンタゴニスト、例えば、抗体または結合ポリペプチド、ならびにそれを含む薬学的製剤の使用である。
【背景技術】
【０００４】
喘息は、遺伝的及び環境リスク因子の両方と関連する臨床的に異質の障害である。喘息双生児研究からの遺伝率の推定値は、３５％から８０％まで変動し、遺伝的リスクの重要な役割を示す。例えば、Ｕｌｌｅｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｌｌｅｒｇｙ  ７１，２３０−２３８（２０１６）を参照されたい。喘息及び喘息関連表現型についていくつかの大規模ＧＷＡＳが行われ、ＯＲＭＤＬ３、ＩＬ１３、ＩＬ１ＲＬ１、及びＴＳＬＰ遺伝子の近くのものなど特定された遺伝子座の多くが複数の研究集団において確認された。例えば、Ｂｏｎｎｅｌｙｋｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４６，５１−５５（２０１４）を参照されたい。これらの研究は、疾患の遺伝的基礎及び喘息の病態生理の両方を補足したが、公開ＧＷＡＳによって特定される一般的な変異型は、全体的な遺伝的リスクをほとんど説明しない。「失われた遺伝率」のこの概念は、深く議論及び討論され、遺伝子間相互作用を検出する能力の低さ、制限された構造変異分析、及び珍しい変異の潜在的な貢献を含むいくつかの因子ためであると仮定されている。Ｍａｎｏｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４６１，７４７−７５３（２００９）を参照されたい。一般的な疾患に対する遺伝的素因を解明するための別の戦略は、表現型的に類似する下位群の選択によるものであり、我々は喘息の遺伝的構造をより包括的に理解することを目指しているので、この戦略は有用であることが示されている。Ｂｏｎｎｅｌｙｋｋｅ  ａｎｄ  Ｏｂｅｒ，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３７，６６７−６７９（２０１６）を参照されたい。喘息患者における全体的なリスクに影響を及ぼす遺伝子は、別個の独立した生物学的プロセスに寄与し得、これらはまとめると疾患転帰に影響を及ぼす。亜表現型決定による研究集団の均質化は、試料サイズを低減しながら、その患者サブセットにおいて改良される変異型を明らかにし得る。
【０００５】
２型炎症のいくつかのバイオマーカーは、疾患が２型炎症によって誘導される喘息患者を定義するのに有効であることが示された。Ｗａｎ，ａｎｄ  Ｗｏｏｄｒｕｆｆ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ３６，５４７−５５７（２０１６）を参照されたい。これらのバイオマーカーから得られた知識は、２型炎症誘導疾患を有する喘息患者において改善された有効性を示す新規治療の特定をもたらした。Ｃｏｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５，１０８８−１０９８（２０１１）を参照されたい。しかしながら、低２型喘息の周辺の知識が不足しており、これらの患者は、進行する重度喘息における満たされていない医学的必要性の大部分を含む可能性が高い。例えば、Ａｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１，１１−２２（２０１５）を参照されたい。
【０００６】
下流２型バイオマーカーのうちの１つ、ペリオスチンは、気管支上皮細胞及び肺線維芽細胞から分泌され、ＩＬ−１３を含む、Ｔｈ２サイトカインによって誘導可能である。Ｔａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１８，９８−１０４（２００６）を参照されたい。ペリオスチンは、高レベルの治療前血清ペリオスチンを有する患者について改良された抗ＩＬ−１３（レブリキズマブ）臨床応答の予測バイオマーカーであり、反対に、低レベルの治療前血清ペリオスチンを有する患者は、顕著に低い臨床的有益性を得た。Ｃｏｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５，１０８８−１０９８（２０１１）を参照されたい。末梢ペリオスチンレベルは異なる治療応答を有する喘息患者の部分集団を定義するのに有効であるので、我々は、このバイオマーカーは異質の喘息研究集団を層化し、遺伝的研究における能力を増加させることもできると仮定した。ほとんどの喘息ＧＷＡＳは、２型炎症状態を問わず喘息患者集団に注目した。
【０００７】
喘息は、可逆性気道閉塞、気管支過敏症、及び気道炎症によって特徴付けられる広範囲の呼吸器関連症状を特定する。喘息重症度は患者間で大きく変動し、患者間の疾患分子異質性は十分に文書化されている。喘息、特に低レベルの２型気道炎症を伴う中等度〜重度喘息の改善した治療の必要性がある。
【発明の概要】
【０００８】
本明細書に提供されるものは、対象における喘息を治療するための方法であり、有効量のＫＬＫ５アンタゴニストを対象に投与することを含む。
【０００９】
本明細書にさらに提供されるものは、喘息に罹患している対象のＫＬＫ５アンタゴニストを含む治療への応答を予測する方法であり、方法は、（ａ）対象からの生物学的試料中のＫＬＫ５レベルを測定することと、（ｂ）試料中で検出されたＫＬＫ５レベルを参照レベルと比較することと、（ｃ）試料中で測定されたＫＬＫ５レベルが参照レベルと比較して上昇している場合に対象が治療に応答するであろうと予測し、試料中で測定されたＫＬＫ５レベルが参照レベルと比較して低減している場合に対象が治療に応答しないであろうと予測することと、を含む。
【００１０】
本明細書にさらに提供されるものは、ＫＬＫ５アンタゴニストを含む治療について喘息に罹患している対象を選択する方法であり、対象からの生物学的試料中のＫＬＫ５ゲノム配列中に位置する遺伝的変異の存在または不在を決定することを含み、遺伝的変異の存在は、対象がＫＬＫ５アンタゴニストでの治療に適していることを示す。
【００１１】
本明細書にさらに提供されるものは、喘息に罹患している対象がＫＬＫ５アンタゴニストでの治療に適していることを示すＫＬＫ５ゲノム配列中の遺伝的変異の存在または不在を検出するための方法であり、（ａ）対象からの試料を、ＫＬＫ５ゲノム配列中に位置する遺伝的変異の存在または不在を検出することができる試薬と接触させることと、（ｂ）遺伝的変異の存在または不在を決定することと、を含み、遺伝的変異の存在は、対象がＫＬＫ５アンタゴニストでの治療に適していることを示す。
【００１２】
方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、喘息は、ＫＬＫ５の上昇したレベルと関連している。方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、喘息は、好中球の上昇したレベルと関連している。方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、喘息は、低２型喘息、低ペリオスチン喘息、及び低好酸球喘息からなる群から選択される。方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、喘息は、ネザートン症候群と関連していない。方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、喘息は、ＳＰＩＮＫ５の低減した活性と関連している。方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、喘息は、ＳＰＩＮＫ５をコードする遺伝子またはその遺伝子産物における１つ以上の遺伝的変異と関連していない。方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、喘息のための対象の治療は、遺伝的変異の存在または不在に基づく。方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、喘息は、ＫＬＫ５ゲノム配列中に位置する遺伝的変異と関連している。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、ＳＮＰである。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、ＳＮＰ  ｒｓ１１７６３９５１２である。
【００１３】
方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ＫＬＫ５の活性部位に結合することによってＫＬＫ５を阻害する。方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、完全長のプロセシングされていないＫＬＫ５の１０８、１４７、１５０、１５３、１６８、及び２４５位のアミノ酸残基からなる群から選択される、すなわち、シグナルペプチドを含む、ＫＬＫ５のアミノ酸残基のうちの１つ以上を含む結合領域に結合することによってＫＬＫ５を阻害する。方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ＫＬＫ５のセリンプロテアーゼ活性を阻害する。
【００１４】
方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、抗体、結合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び小分子からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、完全長ＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、約５０μＭ〜１μＭ未満、約１μＭ〜５００ｎＭ未満、約５００ｎＭ〜１００ｎＭ未満、約１００ｎＭ〜１０ｎＭ未満、約１０ｎＭ〜１ｎＭ未満、または約１０００ｐＭ〜１００ｐＭ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、約１０ｎＭ〜１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、抗体は、約２ｎＭ〜１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、ＩＣ５０は、本明細書に記載される直接アッセイまたは結合アッセイによって決定される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドは、ＫＬＫ５結合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５結合ポリペプチドは、融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ＳＰＩＮＫ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＳＰＩＮＫ５の１つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５の１つ以上のドメインは、配列番号１７（Ｅ４２１−Ａ６９５）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５からの１つ以上のドメインは、配列番号２２（Ｍ２９３−Ｒ３５５）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５からの１つ以上のドメインは、マウス由来である。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５の１つ以上のドメインは、配列番号１５（Ｅ４９０−Ｙ７５７）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５からの１つ以上のドメインは、配列番号２０（Ｒ２９１−Ｒ３５２）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５からの１つ以上のドメインは、ヒト由来である。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＳＰＩＮＫ９の１つのドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ９の１つのドメインは、配列番号２８（Ｉ２０−Ｃ８６．Ｃ２２Ｓ．Ｈ４８Ｒ．Ｍ４９Ｅ）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ９の１つのドメインは、ヒト由来である。
【００１６】
いくつかの実施形態では、小分子は、プロテアーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、ロイペプチンである。
【００１７】
方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、試料は、気管支肺胞洗浄、肺実質、気管支上皮下、脳脊髄液、血液、血清、痰、唾液、粘膜剥離物、組織検体、涙腺分泌物、精液、または汗からなる群から選択される。
【００１８】
本明細書にさらに提供されるものは、喘息の療法及び／または治療を含む医学的治療または診断における使用のためのＫＬＫ５アンタゴニストである。
【００１９】
本明細書にさらに提供されるものは、ＳＰＩＮＫ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ融合ポリペプチドは、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＫＬＫ５の活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＳＰＩＮＫ５の１つ以上のドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５の１つ以上のドメインは、配列番号１７（Ｅ４２１−Ａ６９５）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５からの１つ以上のドメインは、配列番号２２（Ｍ２９３−Ｒ３５５）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５からの１つ以上のドメインは、マウス由来である。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５の１つ以上のドメインは、配列番号１５（Ｅ４９０−Ｙ７５７）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５からの１つ以上のドメインは、配列番号２０（Ｒ２９１−Ｒ３５２）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５からの１つ以上のドメインは、ヒト由来である。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＳＰＩＮＫ９の１つのドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ９の１つのドメインは、配列番号２８（Ｉ２０−Ｃ８６．Ｃ２２Ｓ．Ｈ４８Ｒ．Ｍ４９Ｅ）を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ９の１つのドメインは、ヒト由来である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ融合ポリペプチドは、約５０μＭ〜１μＭ未満、約１μＭ〜５００ｎＭ未満、約５００ｎＭ〜１００ｎＭ未満、約１００ｎＭ〜１０ｎＭ未満、約１０ｎＭ〜１ｎＭ未満、または約１０００ｐＭ〜１００ｐＭ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ融合ポリペプチドは、約１０ｎＭ〜１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ融合ポリペプチドは、約３ｎＭ〜１ｎＭ未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、ＩＣ５０は、本明細書に記載される直接アッセイまたは結合アッセイによって決定される。
【００２１】
本明細書にさらに提供されるものは、ＫＬＫ５と関連する疾患の療法及び／または治療を含む医学的治療または診断における使用のための本明細書に記載されるＳＰＩＮＫ融合ポリペプチドである。
【００２２】
本明細書にさらに提供されるものは、薬学的に活性な量の本明細書に記載されるＳＰＩＮＫ融合ポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む、薬学的製剤である。
【００２３】
本明細書にさらに提供されるものは、有効量の本明細書に記載されるＳＰＩＮＫ融合ポリペプチドを対象に投与することを含む、対象においてＫＬＫ５と関連する疾患を治療するための方法である。
【００２４】
ＳＰＩＮＫ融合ポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫＬＫ５と関連する疾患は、対象の試料中のＫＬＫ５の上昇したレベルと関連している。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５と関連する疾患は、対象の試料中の好中球の上昇した数と関連している。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５と関連する疾患は、ネザートン症候群である。いくつかの実施形態では、試料は、気管支肺胞洗浄、肺実質、及び気管支上皮下からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】高ペリオスチン（図１Ａ）及び低ペリオスチン（図１Ｂ）下位群の対照との比較。遺伝子座を改良コホートによってプロットした。８つの遺伝子座は、識別可能な差異を示さず、図示されない。各遺伝子座について、ＯＲをプロットし、対照比較の場合におけるＰ値を挙げた。
【図２】マンハッタンプロットの形態のメタ分析におけるゲノムワイド関連結果の要約を示す。６６７人の成人非２型炎症喘息患者及び１，８８７人の対照におけるゲノムワイド単一変異型分析を行った。Ｐ＜５ｘ１０−８のゲノムワイド有意水準は、上の線（「Ｘ」の印をつけた）によって示され、示唆的有意性（Ｐ＜１ｘ１０−５）は、下の線（「ＸＸ」の印をつけた）によって示された。
【図３】１９番染色体上のＫＬＫ遺伝子座の結果をまとめるＬｏｃｕｓＺｏｏｍ３９プロット。変異型を、それらの間の連鎖不平衡の程度及びｒｓ１１７６３９５１２、領域における最も強い関連のＳＮＰによって色コードで区別した。
【図４】ペリオスチンレベルとは関係なく喘息気管支肺胞洗浄において増加したＫＬＫ５。図４Ａ）健常ボランティアまたは重度の喘息患者の気管支肺胞洗浄におけるＫＬＫ５結合ポリペプチドのレベル、図４Ｂ）重度の喘息患者におけるＫＬＫ５のレベルと予測ＦＥＶ１値との関連。
【図５Ａ】組換えＫＬＫ５は、肺好中球溢出及び肺上皮サイトカイン産出を誘導する。ＷＴまたはＳＡ変異体ＫＬＫ５（マウスあたり２μｇ）をマウスに鼻腔内送達し、（Ｌｙ６Ｇ＋ＣＤ１１ｂ＋細胞によって定量化される）好中球数をフローサイトメトリー分析によって定量化した。
【図５Ｂ】組換えＫＬＫ５は、肺好中球溢出及び肺上皮サイトカイン産出を誘導する。肺上皮細胞を、２μｇ／ｍｌのＳＡ変異体もしくはＷＴで、または１０μｇのＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドの存在下で処理した。Ｔｓｌｐ、Ｔｎｆａ、ＩＬ−８、及びＩｃａｍ１の転写物を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって定量化した。
【図６−１】組換えＫＬＫ５活性は、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドによって直接アッセイにおいて阻害される。ＫＬＫ５を、蛍光基質、Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣの添加前に、ＳＰＩＮＫ５  Ｍ２９３−Ｒ３５５（図６Ａ）、ＳＰＩＮＫ５  Ｅ４２１−Ａ６９５（図６Ｂ）、またはＳＰＩＮＫ９（Ｉ２０−Ｃ８６．Ｃ２２Ｓ．Ｈ４８Ｒ．Ｍ４９Ｅ）−Ｆｃ（本明細書ではＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃとも呼ばれる）（図６Ｃ）と３０分間プレインキュベートした。反応を、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）Ｐｌｕｓリーダーを使用して監視した。ＲＦＵ／秒の反応速度を、線形範囲における読み取り値の線形回帰によって計算した。ＩＣ５０パラメータを、それらのそれぞれの曲線の４パラメータフィットから決定した。
【図６−２】組換えＫＬＫ５活性は、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドによって直接アッセイにおいて阻害される。ＫＬＫ５を、蛍光基質、Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣの添加前に、ＳＰＩＮＫ５  Ｍ２９３−Ｒ３５５（図６Ａ）、ＳＰＩＮＫ５  Ｅ４２１−Ａ６９５（図６Ｂ）、またはＳＰＩＮＫ９（Ｉ２０−Ｃ８６．Ｃ２２Ｓ．Ｈ４８Ｒ．Ｍ４９Ｅ）−Ｆｃ（本明細書ではＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃとも呼ばれる）（図６Ｃ）と３０分間プレインキュベートした。反応を、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）Ｐｌｕｓリーダーを使用して監視した。ＲＦＵ／秒の反応速度を、線形範囲における読み取り値の線形回帰によって計算した。ＩＣ５０パラメータを、それらのそれぞれの曲線の４パラメータフィットから決定した。
【図７】組換えＫＬＫ５活性は、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドによってｐｒｏ−ＫＬＫ７結合アッセイにおいて阻害される。ＫＬＫ５を、ｐｒｏ−ＫＬＫ７及び蛍光基質、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ（配列番号２９）の添加前に、ＳＰＩＮＫ５  Ｍ２９３−Ｒ３５５（図７Ａ）、ＳＰＩＮＫ５  Ｅ４２１−Ａ６９５（図７Ｂ）、またはＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ（図７Ｃ）と３０分間プレインキュベートした。反応を、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）Ｐｌｕｓリーダーを使用して監視した。ＲＦＵ／秒の反応速度を、線形範囲における読み取り値の線形回帰によって計算した。ＩＣ５０パラメータを、それらのそれぞれの曲線の４パラメータフィットから決定した。
【図８】組換えＫＬＫ７活性は、ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．ＦｃまたはｍＡｂ１１０８ではなく、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドによって部分的に阻害される。ＫＬＫ５を、ｐｒｏ−ＫＬＫ７及び蛍光基質、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ（配列番号２９）の添加前に、ＳＰＩＮＫ５  Ｍ２９３−Ｒ３５５（図８Ａ）、ＳＰＩＮＫ５  Ｅ４２１−Ａ６９５（図８Ｂ）、ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ（図８Ｃ）、またはｍＡｂ１１０８（図８Ｄ）と５０分間プレインキュベートした。反応を、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）Ｐｌｕｓリーダーを使用して監視した。ＲＦＵ／秒の反応速度を、線形範囲における読み取り値の線形回帰によって計算した。ＩＣ５０パラメータを、それらのそれぞれの曲線の４パラメータフィットから決定した。
【図９】市販の抗体、ｍＡｂ１１０８は、ヒトＫＬＫ５の部分阻害剤である。２０ｎＭ（図９Ａ）、１０ｎＭ（図９Ｂ）、５ｎＭ（図９Ｃ）、及び２．５ｎＭ（図９Ｄ）のＫＬＫ５を、蛍光基質、Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣの添加前に、ｍＡｂ１１０８と３０分間インキュベートした。反応を、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）Ｐｌｕｓリーダーを使用して監視した。ＲＦＵ／秒の反応速度を、線形範囲における読み取り値の線形回帰によって計算した。ＩＣ５０値を、それぞれの曲線の４パラメータフィットから決定した。
【図１０】ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ融合タンパク質は、直接アッセイにおけるＫＬＫ５の強力な阻害剤である。ＫＬＫ５を、蛍光基質、Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣの添加前に、ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ融合（図１０Ａ）またはｍＡｂ１１０８（図１０Ｂ）と３０分間インキュベートした。反応を、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）Ｐｌｕｓリーダーを使用して監視した。ＲＦＵ／秒の反応速度を、線形範囲における読み取り値の線形回帰によって計算した。ＩＣ５０パラメータを、それらのそれぞれの曲線の４パラメータフィットから決定した。
【図１１】ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ融合タンパク質は、ｐｒｏ−ＫＬＫ７結合アッセイにおけるＫＬＫ５の強力な阻害剤である。ｐｒｏ−ＫＬＫ７結合アッセイでは、ＫＬＫ５を、ｐｒｏ−ＫＬＫ７及び蛍光基質、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ（配列番号２９）の添加前に、ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ融合（図１１Ａ）またはｍＡｂ１１０８（図１１Ｂ）と３０分間インキュベートした。反応を、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）Ｐｌｕｓリーダーを使用して監視した。ＲＦＵ／秒の反応速度を、線形範囲における読み取り値の線形回帰によって計算した。ＩＣ５０値を、それぞれの曲線の４パラメータフィットから決定した。
【図１２−１】ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ（図１２Ａ及び１２Ｃ）及びｍＡｂ１１０８（図１２Ｂ及び１２Ｄ）は、ｐｒｏ−ＫＬＫ７（図１２Ａ及び１２Ｂ）及びｐｒｏ−ＫＬＫ１（図１２Ｃ及び１２Ｄ）からのシグナルペプチドの組換えＫＬＫ５開裂を用量依存的に阻害する。ＫＬＫ７及びＫＬＫ１シグナルペプチドをＬＣ／ＭＳによって検出した。ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．ＦｃまたはｍＡｂ１１０８及びＫＬＫ５のプレインキュベーションを、５ｎＭのＫＬＫ５と１５ｎＭのｐｒｏ−ＫＬＫ７との２時間のインキュベーションまたは０．５ｎＭのＫＬＫ５と３００ｎＭ（図１２Ｃ）もしくは３５５ｎＭ（図１２Ｄ）のｐｒｏ−ＫＬＫ１との２０分のインキュベーションに先立って行った。
【図１２−２】ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ（図１２Ａ及び１２Ｃ）及びｍＡｂ１１０８（図１２Ｂ及び１２Ｄ）は、ｐｒｏ−ＫＬＫ７（図１２Ａ及び１２Ｂ）及びｐｒｏ−ＫＬＫ１（図１２Ｃ及び１２Ｄ）からのシグナルペプチドの組換えＫＬＫ５開裂を用量依存的に阻害する。ＫＬＫ７及びＫＬＫ１シグナルペプチドをＬＣ／ＭＳによって検出した。ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．ＦｃまたはｍＡｂ１１０８及びＫＬＫ５のプレインキュベーションを、５ｎＭのＫＬＫ５と１５ｎＭのｐｒｏ−ＫＬＫ７との２時間のインキュベーションまたは０．５ｎＭのＫＬＫ５と３００ｎＭ（図１２Ｃ）もしくは３５５ｎＭ（図１２Ｄ）のｐｒｏ−ＫＬＫ１との２０分のインキュベーションに先立って行った。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書に提供されるものは、ＫＬＫ５アンタゴニストを使用して治療する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるものは、ＫＬＫ５アンタゴニストを使用して喘息を治療する方法である。特に、本明細書に提供されるものは、有効量のＫＬＫ５アンタゴニストを対象に投与することによって喘息を治療する方法である。また本明細書に提供されるものは、対象の応答を予測する方法またはＫＬＫ５における遺伝的変異の存在もしくは不在を検出することに基づいてＫＬＫ５アンタゴニストでの治療について喘息を有する対象を選択する方法である。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるものは、ＫＬＫ５アンタゴニストを使用してネザートン症候群を治療する方法である。特に、本明細書に提供されるものは、ＫＬＫ５アンタゴニストを使用してネザートン症候群を治療する方法であり、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ＳＰＩＮＫ融合ポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチド）である。また本明細書に提供されるものは、喘息の治療または診断における使用のためのＫＬＫ５アンタゴニスト及びそれを含む薬学的製剤である。
【００２７】
Ｉ．定義
本明細書で使用される「ＫＬＫ５」及び「カリクレイン−５」という用語は、別途示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源に由来する任意の天然ＫＬＫ５を指す。用語は、「完全長」のプロセシングされていないＫＬＫ５、及び細胞におけるプロセシングから生じるＫＬＫ５の任意の形態を包含する。用語はまた、ＫＬＫ５の天然に存在する変異型、例えば、スプライス変異型または対立遺伝子変異型も包含する。いくつかの実施形態では、例示的なヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ９Ｙ３３７である。いくつかの実施形態では、例示的なヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、配列番号１、配列番号３（Ｎ１５３Ｄ変異型）、配列番号５（Ｇ５５Ｒ変異型）、及び配列番号７（Ｇ５５Ｒ、Ｎ１５３Ｄ変異型）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、例示的なヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ９Ｙ３３７のアミノ酸残基２３−２９３（マイナスシグナルペプチド）であり、配列番号２に示される。いくつかの実施形態では、例示的なヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、配列番号４に示されるＮ１５３Ｄ変異型のアミノ酸残基２３−２９３（マイナスシグナルペプチド）である。いくつかの実施形態では、例示的なヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、配列番号６に示されるＧ５５Ｒ変異型のアミノ酸残基２３−２９３（マイナスシグナルペプチド）である。いくつかの実施形態では、例示的なヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、配列番号８に示されるＧ５５Ｒ、Ｎ１５３Ｄ変異型のアミノ酸残基２３−２９３（マイナスシグナルペプチド）である。
【００２８】
以下のこの段落における番号付けは、完全長のプロセシングされていないＫＬＫ５に関する。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、１５３位のアミノ酸Ｎを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、１５３位のアミノ酸Ｄを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、５５位のアミノ酸Ｇを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、５５位のアミノ酸Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、５５位のアミノ酸Ｇ及び１５３位のアミノ酸Ｎを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、５５位のアミノ酸Ｇ及び１５３位のアミノ酸Ｄを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、５５位のアミノ酸Ｒ及び１５３位のアミノ酸Ｎを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５のアミノ酸配列は、５５位のアミノ酸Ｒ及び１５３位のアミノ酸Ｄを含む。
【００２９】
以下のこの段落における番号付けは、完全長のプロセシングされていないＫＬＫ５に関する。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５の核酸配列は、１５３位のＮをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５の核酸配列は、１５３位のＤをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５の核酸配列は、５５位のＧをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５の核酸配列は、５５位のＲをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５の核酸配列は、５５位のＧ及び１５３位のＮをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５の核酸配列は、５５位のＧ及び１５３位のＤをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５の核酸配列は、５５位のＲ及び１５３位のＮをコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＫＬＫ５の核酸配列は、５５位のＲ及び１５３位のＤをコードする配列を含む。
【００３０】
本明細書で使用される「ＳＰＩＮＫ５」及び「セリンプロテアーゼ阻害剤カザール型５」という用語は、別途示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源に由来する任意のＳＰＩＮＫ５を指す。用語は、「完全長」のプロセシングされていないＳＰＩＮＫ５、及び細胞におけるプロセシングから生じるＳＰＩＮＫ５の任意の形態を包含する。用語はまた、ＳＰＩＮＫ５の天然に存在する変異型、例えば、スプライス変異型または対立遺伝子変異型も包含する。いくつかの実施形態では、例示的なヒトＳＰＩＮＫ５のアミノ酸配列は、ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ９ＮＱ３８であり、配列番号９に示される。いくつかの実施形態では、例示的なヒトＳＰＩＮＫ５のアミノ酸配列は、ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ９ＮＱ３８のアミノ酸残基２３−１０６４（マイナスシグナルペプチド）であり、配列番号１０に示される。いくつかの実施形態では、例示的なマウスＳＰＩＮＫ５のアミノ酸配列は、ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ５Ｋ５Ｄ４であり、配列番号１１に示される。いくつかの実施形態では、例示的なマウスＳＰＩＮＫ５のアミノ酸配列は、ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ５Ｋ５Ｄ４のアミノ酸残基２３−１０６４（マイナスシグナルペプチド）であり、配列番号１２に示される。
【００３１】
本明細書で使用される「ＳＰＩＮＫ９」及び「セリンプロテアーゼ阻害剤カザール型９」という用語は、別途示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物供給源に由来する任意のＳＰＩＮＫ９を指す。用語は、「完全長」のプロセシングされていないＳＰＩＮＫ９、及び細胞におけるプロセシングから生じるＳＰＩＮＫ９の任意の形態を包含する。用語はまた、ＳＰＩＮＫ９の天然に存在する変異型、例えば、スプライス変異型または対立遺伝子変異型も包含する。いくつかの実施形態では、例示的なヒトＳＰＩＮＫ９のアミノ酸配列は、ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ５ＤＴ２１であり、配列番号２３に示される。いくつかの実施形態では、例示的なヒトＳＰＩＮＫ９のアミノ酸配列は、ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ５ＤＴ２１のアミノ酸残基２０−８６（マイナスシグナルペプチド）であり、配列番号２４に示される。
【００３２】
「ＫＬＫ５のアンタゴニスト」、「ＫＬＫ５アンタゴニスト」、「ＫＬＫ５の阻害剤」、または「ＫＬＫ５阻害剤」は、ＫＬＫ５の活性化または機能に干渉する、例えば、ＫＬＫ５によって媒介される生物活性を部分的にまたは完全に遮断、阻害、または中和する薬剤である。例えば、ＫＬＫ５のアンタゴニストは、ＫＬＫ５によって媒介される生物活性を部分的にまたは完全に遮断、阻害、または中和する任意の分子を指し得る。ＫＬＫ５アンタゴニストの例には、抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）、結合ポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドなどのＫＬＫ５結合ポリペプチド）、ポリヌクレオチド（例えば、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピートＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有するシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を含む、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ）などのＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニスト）、及び小分子（例えば、小分子プロテアーゼ阻害剤などのＫＬＫ５小分子アンタゴニスト）が含まれる。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、ＫＬＫ５に結合する抗体または小分子である。
【００３３】
本明細書で同義に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体であっても、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによってまたは合成反応によってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であってもよい。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾されたヌクレオチドを含んでもよい。存在する場合には、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組立ての前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって遮られ得る。ポリヌクレオチドは、標識との抱合などによって、合成後にさらに修飾されてもよい。他のタイプの修飾には、例えば、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上を類似体と置換する「キャップ」、ヌクレオチド間修飾、例えば、非電荷性結合（例えば、メチルホスホン酸塩、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）によるもの、及び電荷性結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）によるもの、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）の懸垂部分を含むもの、挿入剤（例えば、アクリジン、プソラーレンなど）によるもの、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾結合（例えば、αアノマー核酸など）によるもの、ならびにポリヌクレオチド（複数可）の未修飾形態が含まれる。さらに、糖内に通常存在するヒドロキシル基のうちのいずれかは、例えば、ホスホン酸基、リン酸基により代置されるか、標準的な保護基により保護されるか、もしくは活性化されて追加のヌクレオチドへの追加の結合を準備してもよく、または固体もしくは半固体支持体に抱合されてもよい。５′及び３′末端ＯＨをリン酸化するか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分と置換することができる。他のヒドロキシルもまた、標準的な保護基に誘導体化されてもよい。ポリヌクレオチドには、一般に当該技術分野において既知のリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態を含むこともでき、例えば、２′−Ｏ−メチル、−２′−Ｏ−アリル、２′−フルオロ−または２′−アジド−リボース、炭素環式糖類似体、α−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、またはリキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び脱塩基ヌクレオシド類似体、例えば、メチルリボシドも含まれる。１つ以上のホスホジエステル結合は、代替的な連結基によって代置されてもよい。これらの代替連結基には、限定されないが、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、「（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ′、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）に置き換えられる実施形態が含まれ、各ＲまたはＲ′は、独立してＨであるか、または任意にエーテル（−Ｏ−）結合を含む置換もしくは非置換アルキル（１−２��Ｃ）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジルである。ポリヌクレオチド内の全ての結合が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む本明細書で言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００３４】
本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、別途示されない限り、霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物源由来の目的の任意の天然ポリペプチド（例えば、ＫＬＫ５、ＳＰＩＮＫ５、またはＳＰＩＮＫ９）を指す。この用語は、「完全長」のプロセシングされていないポリペプチド、ならびに細胞内のプロセシングから生じるポリペプチドの任意の形態を包含する。この用語は、ポリペプチドの天然に存在する変異型、例えば、スプライス変異型または対立遺伝子変異型も包含する。
【００３５】
本明細書で使用される「ＳＰＩＮＫ融合ポリペプチド」という用語は、ＳＰＩＮＫポリペプチドまたはその断片（例えば、ＳＰＩＮＫポリペプチドの特定のドメイン（例えば、ＳＰＩＮＫ５及び／またはＳＰＩＮＫ９））が、別のポリペプチド（例えば、非ＳＰＩＮＫポリペプチド）に直接的または間接的に結合している融合ポリペプチドを指す。
【００３６】
本明細書で使用される「ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチド」という用語は、ＳＰＩＮＫポリペプチドまたはその断片（例えば、ＳＰＩＮＫポリペプチドの特定のドメイン（例えば、ＳＰＩＮＫ５及び／またはＳＰＩＮＫ９）がＦｃ領域に直接的または間接的に結合している融合ポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域、及びＩｇＧ４  Ｆｃ領域からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域は、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドまたはその断片は、ヒトＳＰＩＮＫポリペプチドまたはその断片である。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドまたはその断片は、マウスＳＰＩＮＫポリペプチドまたはその断片である。挿入、欠失、置換、特にＳＰＩＮＫポリペプチド、ＳＰＩＮＫドメイン、またはＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドの機能及び／または活性に影響を及ぼさないＳＰＩＮＫポリペプチド、ＳＰＩＮＫドメイン、またはＦｃの保存アミノ酸置換などのわずかな配列変化が本明細書に提供されることが理解される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＫＬＫ５に結合することができ、これはＫＬＫ５の阻害をもたらし得る。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドまたはその断片は、ＳＰＩＮＫ５である。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫポリペプチドまたはその断片は、ＳＰＩＮＫ９である。ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドの機能及び／または活性は、限定なしに、ＥＬＩＳＡ、リガンド−受容体結合アッセイ、及びＳｔａｔ３ルシフェラーゼアッセイを含む、当該技術分野で知られている方法によってアッセイすることができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ領域は、エフェクター活性を有さない（例えば、ＦｃγＩＩＩＲに結合しない）か、または全ＩｇＧ抗体よりも実質的に低いエフェクター活性を示す。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ領域は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）などの細胞傷害を誘発しない。別途特定されない限り、「ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合」、「ＳＰＩＮＫ  Ｉｇ融合ポリペプチド」、「ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチド」、または「ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ」は、本出願全体を通して同義に使用される。
【００３８】
「小分子」という用語は、約２０００ダルトン以下、好ましくは約５００ダルトン以下の分子量を有する任意の分子を指す。
【００３９】
「親和性」または「結合親和性」は、分子（例えば、抗体、結合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子）とその結合パートナー（例えば、抗原）との単一結合部位の間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途指示されない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体、結合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子、及び抗原のいずれか）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。パートナーＹに対する分子Ｘの親和性は、一般に解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されるものを含む、当該技術分野で知られている一般的な方法（例えば、ペプチド基質アッセイ、直接アッセイ、または結合アッセイ）によって測定することができる。
【００４０】
本明細書の「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含むがこれらに限定されない、様々な抗体構造を包含する。
【００４１】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、インタクトな抗体の一部分を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆａｂ′−ＳＨ、Ｆ（ａｂ′）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４２】
参照抗体と「同じエピトープに結合する抗体」または「同じ結合領域に結合する抗体」は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその結合パートナー（例えば、抗原）への結合を５０％以上遮断する抗体、及び逆に、競合アッセイにおいて、抗体のその結合パートナーへの結合を５０％以上遮断する参照抗体を指す。
【００４３】
「抗ＫＬＫ５抗体」及び「ＫＬＫ５に結合する抗体」という用語は、抗体がＫＬＫ５を標的とする際に診断剤及び／または治療剤として有用であるように、ＫＬＫ５に十分な親和性で結合可能である抗体を指す。いくつかの実施形態では、抗ＫＬＫ５抗体が非関連ポリペプチド（ＫＬＫ５以外のポリペプチド）に結合する程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって測定される、抗体のＫＬＫ５への結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５に結合する抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。いくつかの実施形態では、抗ＫＬＫ５抗体は、ＫＬＫポリペプチドの異なる種の間で保存されるＫＬＫ５の結合領域（例えば、エピトープ）に結合する。
【００４４】
「遮断抗体」または「アンタゴニスト抗体」は、それが結合する抗原の生物学的活性を阻害または低減するものである。好ましい遮断抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。
【００４５】
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／または軽鎖の一部分が、特定の源または種に由来する一方で、重鎖及び／または軽鎖の残りの部分が異なる源または種に由来する抗体を指す。
【００４６】
抗体の「クラス」とは、その重鎖が所有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。５つの主要なクラスの抗体、つまり：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちのいくつかは、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けられ得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００４７】
「結合領域」は、ＫＬＫ５アンタゴニスト（例えば、抗体、結合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子）が選択的に結合する結合パートナー（例えば、抗原）の部分である。結合ポリペプチド結合パートナーについて、線状結合領域は、約４〜１５個（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個）のアミノ酸残基のペプチド部分であり得る。非線形、立体配座結合領域は、結合ポリペプチド結合パートナーの三次元（３Ｄ）構造のすぐ近くに提供されるポリペプチド配列の残基を含み得る。
【００４８】
「完全長抗体」、「インタクトな抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書において、天然抗体構造と実質的に類似する構造を有するか、またはＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）を指すために同義に使用される。
【００４９】
「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的には除外する。
【００５０】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲからのアミノ酸残基及びヒトＦＲからのアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、そこではＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト抗体のものに対応する。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含み得る。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化型」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
【００５１】
本明細書で使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」という用語は、配列が超可変であり（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）、及び／または構造的に規定されたループを形成し（「超可変ループ」）、及び／または抗原接触残基を含む（「抗原接触体」）、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。本明細書における例示的なＨＶＲは、
（ａ）アミノ酸残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）、２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））と、
（ｂ）アミノ酸残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）、３１〜３５ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））と、
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ〜３６（Ｌ１）、４６〜５５（Ｌ２）、８９〜９６（Ｌ３）、３０〜３５ｂ（Ｈ１）、４７〜５８（Ｈ２）、及び９３〜１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触体（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））と、
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６〜５６（Ｌ２）、４７〜５６（Ｌ２）、４８〜５６（Ｌ２）、４９〜５６（Ｌ２）、２６〜３５（Ｈ１）、２６〜３５ｂ（Ｈ１）、４９〜６５（Ｈ２）、９３〜１０２（Ｈ３）、及び９４〜１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／または（ｃ）の組み合わせと、を含む。
別途示されない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書において、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、上記に従って番号付けされる。
【００５２】
抗体、結合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子を参照して使用される「単離された」という用語は、その天然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施形態では、抗体、結合ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換もしくは逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％または９９％を超える純度に精製される。
【００５３】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、同一であり、及び／または同じ結合領域（例えば、エピトープ）に結合するが、例えば、自然発生突然変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる、起こり得る変異型抗体は例外であり、かかる変異型は一般的に少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して指向された異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向される。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本明細書に記載されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法、例えば、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法及び他の例示的な方法を含むが、これらに限定されない、多様な技法によって作製されてもよい。
【００５４】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体の重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は一般に、類似の構造を有し、各ドメインが４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。（例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈｅｄ．，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照されたい。）単一のＶＨドメインまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、ＶＨドメインまたはＶＬドメインを使用して抗原に結合する抗体から単離されて、それぞれ相補的ＶＬドメインまたはＶＨドメインのライブラリをスクリーニングすることができる。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：８８０−８８７（１９９３）、Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）を参照されたい。
【００５５】
「相関する」または「相関すること」は、任意の方法で、第１の分析またはプロトコルの性能及び／または結果を第２の分析またはプロトコルの性能及び／または結果と比較することを意味する。例えば、第２のプロトコルを実行する上で第１の分析もしくはプロトコルの結果を使用してもよいし、及び／または第１の分析もしくはプロトコルの結果を使用して、第２の分析もしくはプロトコルが実行されるべきかを決定してもよい。ポリヌクレオチド分析またはプロトコルの実施形態に関して、ポリヌクレオチド発現分析またはプロトコルの結果を使用して、特定の治療レジメンが実行されるべきかを決定してもよい。
【００５６】
「上昇した発現」、「上昇した発現レベル」、または「上昇したレベル」とは、疾患もしくは障害（例えば、喘息）に罹患していない対象（複数可）または内部対照（例えば、ハウスキーピングバイオマーカー）などの対照と比較した対象におけるバイオマーカーの発現の増加またはそのレベルの増加を指す。
【００５７】
「ハウスキーピングバイオマーカー」という用語は、典型的には全ての細胞型に同様に存在するバイオマーカーまたはバイオマーカーの群（例えば、ポリヌクレオチド及び／またはポリペプチド）を指す。いくつかの実施形態において、ハウスキーピングバイオマーカーは、「ハウスキーピング遺伝子」である。「ハウスキーピング遺伝子」は、本明細書において、その活性が細胞機能の維持に必須であるタンパク質をコードし、かつ全ての細胞型において典型的には同様に存在する遺伝子または遺伝子の群を指す。
【００５８】
本明細書で使用される「ＫＬＫ５ゲノム配列」という用語は、ＫＬＫ５遺伝子のｃＤＮＡ及び／またはゲノム形態のいずれかを指し、これはイントロンならびに上流及び下流調節配列を含み得る。
【００５９】
「発現のレベル」または「発現レベル」という用語は、一般に、同義に使用され、一般に、生物学的試料中のバイオマーカーの量を指す。「発現」とは、一般に、情報（例えば、遺伝子コード情報及び／またはエピジェネティック情報）が、細胞中に存在しかつそこで機能する構造に変換されるプロセスを指す。したがって、本明細書で使用されるとき、「発現」とは、ポリヌクレオチドへの転写、ポリペプチドへの翻訳、またはさらにはポリヌクレオチド及び／またはポリペプチド修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）を指し得る。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたポリペプチド、またはポリヌクレオチド及び／またはポリペプチド修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）の断片も、それらが選択的スプライシングによって生成された転写物もしくは分解された転写物に由来するか、または例えばタンパク質分解によるポリペプチドの翻訳後プロセシングに由来するかどうかにかかわらず、発現されたものと見なされるべきである。「発現遺伝子」は、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写され、その後、ポリペプチドに翻訳される遺伝子を含み、ＲＮＡに転写されるが、ポリペプチドに翻訳されない遺伝子（例えば、トランスファーＲＮＡ及びリボソームＲＮＡ）も含む。
【００６０】
対象への臨床的利益の増加に関連するバイオマーカーの「存在」、「量」、または「レベル」は、生物学的試料中で検出可能なレベルである。これらは、当業者にとって既知であり、かつ本明細書にも開示される方法によって測定され得る。評価されるバイオマーカーの発現レベルまたは量を使用して、治療に対する応答を決定することができる。
【００６１】
「低減した発現」、「低減した発現レベル」、または「低減したレベル」とは、疾患もしくは障害（例えば、喘息）に罹患していない対象（複数可）または内部対照（例えば、ハウスキーピングバイオマーカー）などの対照と比較した対象におけるバイオマーカーの発現の低減またはそのレベルの低減を指す。
【００６２】
本明細書で使用される「参照試料」、「参照細胞」、「参照組織」、「対照試料」、「対照細胞」、または「対照組織」とは、比較目的のために使用される試料、細胞、組織、標準物、またはレベルを指す。一実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、同じ対象の身体の健常及び／または非罹患部分（例えば、組織または細胞）から得られる。例えば、罹患細胞または組織に隣接する健常及び／または非罹患細胞または組織（例えば、腫瘍に隣接する細胞または組織）。別の実施形態では、参照試料は、同じ対象の身体の未治療組織及び／または細胞から得られる。また別の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、別の対象の身体の健常及び／または非罹患部分（例えば、組織または細胞）から得られる。さらに別の実施形態では、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織は、別の対象の身体の未治療組織及び／または細胞から得られる。
【００６３】
本明細書で使用される「試料」という用語は、例えば、物理的、生化学的、化学的、及び／または生理的特徴に基づいて特徴付け及び／または特定されることになる、細胞及び／または他の分子実体を含有する、目的の対象から得られるか、またはそれに由来する、製剤を指す。例えば、「疾患試料」という表現及びその変化形は、特徴付けられる細胞及び／または分子実体を含有することが予期されるか、または含有することが既知である、目的の対象から得られた任意の試料を指す。試料としては、初代または培養細胞または細胞株、細胞上清、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳、全血、血液由来の細胞、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液、腫瘍溶解物、及び組織培養培地、組織抽出物、例えば、均質化組織、腫瘍組織、細胞抽出物、ならびにそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
「組織試料」または「細胞試料」とは、対象の組織から得られる同様の細胞の集合を意味する。組織または細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結した、及び／または保存された器官、組織試料、生検、及び／または吸引液からなどの固形組織；血漿などの血液または任意の血液構成物；脳脊髄液、羊膜液、腹水、または間質液などの体液；対象の妊娠または発育における任意の時期の細胞であってもよい。組織試料はまた、初代または培養細胞または細胞株であってもよい。任意で、組織または細胞試料は、疾患組織／器官から得られる。組織試料は、保存剤、抗凝固剤、緩衝剤、固定剤、栄養剤、または抗生物質などの天然の組織と天然では混合しない化合物を含有し得る。
【００６５】
薬剤、例えば、薬学的製剤の「有効量」とは、所望の治療結果を実現するために必要な投薬量及び期間での有効な量を指す。
【００６６】
「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物には、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、ならびに齧歯類（例えば、マウス及びラット）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【００６７】
本明細書で使用される「患者」という用語は、哺乳動物などの動物を指す。一実施形態では、患者は、ヒトを指す。
【００６８】
「薬学的製剤」という用語は、調製物中に含有される活性成分の生物活性が有効になるような形態であり、かつ製剤が投与される対象にとって許容できないほど有毒である追加の成分を全く含有しない調製物を指す。
【００６９】
「薬学的に許容される担体」は、対象にとって無毒である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体としては、緩衝液、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、これらに限定されない。
【００７０】
本明細書で使用される「高Ｔｈ２喘息」という用語は、高レベルの１つ以上のＴｈ２細胞関連サイトカイン、例えば、ＩＬ１３、ＩＬ４、ＩＬ９、ＩＬ５を示すか、またはＴｈ２サイトカイン関連炎症を示す喘息を指す。いくつかの実施形態では、高Ｔｈ２喘息という用語は、高好酸球喘息と同義に使用され得る。いくつかの実施形態では、高Ｔｈ２喘息は、Ｔｈ２誘導性喘息である。いくつかの実施形態では、喘息患者は、好酸球性炎症陽性（ＥＩＰ）であると判定された。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ２０１５／０６１４４１号を参照されたい。いくつかの実施形態では、対象は、対照または参照レベルと比較して上昇したレベルの好酸球シグネチャー遺伝子のうちの少なくとも１つを有すると判定された。ＷＯ２０１５／０６１４４１を参照されたい。いくつかの実施形態では、高Ｔｈ２喘息は、高ペリオスチン喘息である。いくつかの実施形態では、対象は、高血清ペリオスチンを有する。いくつかの実施形態では、対象は、１８歳以上である。いくつかの実施形態では、対象は、対照または参照レベルと比較して上昇したレベルの血清ペリオスチンを有すると判定された。いくつかの実施形態では、対照または参照レベルは、集団におけるペリオスチンの中央値レベルである。いくつかの実施形態では、対象は、２０ｎｇ／ｍｌ以上の血清ペリオスチンを有すると判定された。いくつかの実施形態では、対象は、２５ｎｇ／ｍｌ以上の血清ペリオスチンを有すると判定された。いくつかの実施形態では、対象は、５０ｎｇ／ｍｌ以上の血清ペリオスチンを有すると判定された。いくつかの実施形態では、血清ペリオスチンの対照または参照レベルは、２０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌ、または５０ｎｇ／ｍｌである。いくつかの実施形態では、喘息は、高好酸球喘息である。いくつかの実施形態では、対象は、対照または参照レベルと比較して上昇した好酸球数を有すると判定された。いくつかの実施形態では、対照または参照レベルは、集団の中央値レベルである。いくつかの実施形態では、対象は、血液１μｌあたり１５０以上の好酸球数を有すると判定された。いくつかの実施形態では、対象は、血液１μｌあたり２００以上の好酸球数を有すると判定された。いくつかの実施形態では、対象は、血液１μｌあたり２５０以上の好酸球数を有すると判定された。いくつかの実施形態では、対象は、血液１μｌあたり３００以上の好酸球数を有すると判定された。いくつかの実施形態では、対象は、血液１μｌあたり３５０以上の好酸球数を有すると判定された。いくつかの実施形態では、対象は、血液１μｌあたり４００以上の好酸球数を有すると判定された。いくつかの実施形態では、対象は、血液１μｌあたり４５０以上の好酸球数を有すると判定された。いくつかの実施形態では、対象は、血液１μｌあたり５００以上の好酸球数を有すると判定された。いくつかの好ましい実施形態では、対象は、血液１μｌあたり３００以上の好酸球数を有すると判定された。いくつかの実施形態では、好酸球とは、末梢血好酸球である。いくつかの実施形態では、好酸球とは、喀痰好酸球である。いくつかの実施形態では、対象は、上昇したレベルのＦｅＮＯ（呼気中硝酸）及び／または上昇したレベルのＩｇＥを示す。例えば、いくつかの例では、対象は、約５ｐｐｂ（十億分率）、１０ｐｐｂ、１５ｐｐｂ、２０ｐｐｂ、２５ｐｐｂ、３０ｐｐｂ、３５ｐｐｂ、４０ｐｐｂ、４５ｐｐｂ、５０ｐｐｂ、６０ｐｐｂ、７０ｐｐｂ、８０ｐｐｂ、９０ｐｐｂ、及び１００ｐｐｂのうちのいずれも上回るＦｅＮＯレベルを示す。いくつかの例では、対象は、５０ＩＵ／ｍｌを上回るＩｇＥレベルを有する。
【００７１】
本明細書で使用される「低Ｔｈ２喘息」、「非高Ｔｈ２喘息」、「低２型喘息」、「低Ｔ２喘息」、「非好酸球性喘息」、「微量顆粒球喘息」、または「微量炎症喘息」という用語は、低レベルの１つ以上のＴｈ２細胞関連サイトカイン、例えば、ＩＬ１３、ＩＬ４、ＩＬ９、ＩＬ５を示すか、または非Ｔｈ２サイトカイン関連炎症を示す喘息を指す。いくつかの実施形態では、低Ｔｈ２喘息という用語は、低好酸球喘息と同義に使用され得る。いくつかの実施形態では、喘息患者は、好酸球性炎症陰性（ＥＩＮ）であると判定された。例えば、ＷＯ２０１５／０６１４４１を参照されたい。いくつかの実施形態では、低Ｔｈ２喘息は、Ｔｈ１７誘導性喘息である。いくつかの実施形態では、低Ｔｈ２喘息は、低ペリオスチン喘息である。いくつかの実施形態では、対象は、１８歳以上である。いくつかの実施形態では、対象は、対照または参照レベルと比較して低減したレベルの血清ペリオスチンを有すると判定された。いくつかの実施形態では、対照または参照レベルは、集団におけるペリオスチンの中央値レベルである。いくつかの実施形態では、対象は、２０ｎｇ／ｍｌ未満の血清ペリオスチンを有すると判定された。いくつかの実施形態では、喘息は、低好酸球喘息である。いくつかの実施形態では、対象は、対照または参照レベルと比較して低減した好酸球数を有すると判定された。いくつかの実施形態では、対照または参照レベルは、集団の中央値レベルである。いくつかの実施形態では、対象は、血液１μｌあたり１５０未満の好酸球数を有すると判定された。いくつかの実施形態では、対象は、血液１μｌあたり１００未満の好酸球数を有すると判定された。特定の好ましい実施形態では、対象は、血液１μｌあたり３００未満の好酸球数を有すると判定された。
【００７２】
「治療」（及び「治療する」または「治療すること」などの変形）は、治療される対象または細胞の自然の経過を改変する試みにおける臨床介入を指す。治療の望ましい効果としては、疾患の発生または再発の防止、症状の緩和、疾患の何らかの直接的または間接的な病理学的帰結の減少、安定した（すなわち、悪化しない）疾患の状態、疾患進行の速度の低下、病態の回復または軽減、治療を受けない場合の予想生存率と比較した生存率の延長、及び予後の改善のうちの１つ以上が挙げられる。
【００７３】
本明細書における実施形態を説明する文脈における「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語ならびに同様の用語の使用は、本明細書において別途示されない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を網羅すると解釈されるものである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、別途特筆されない限り、オープンエンド用語（すなわち、「〜を含むが、これらに限定されない」を意味する）として解釈されるものである。本明細書に提供される態様及び実施形態は、態様及び実施形態「からなる」及び／または「から本質的になる」を含むことが理解される。
【００７４】
当業者によって理解されるように、本明細書における「約」の値またはパラメータに対する言及は、その値またはパラメータ自体に向けられる実施形態を含む（及び説明する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述には「Ｘ」の記述が含まれる。
【００７５】
「実質的に異なる」という表現は、２つの数値（概して、一方はある分子に関連し、他方は参照／比較用分子に関連する）間の十分に高い度合いの差異を指し、これは、当業者が、２つの値の間の差異を、該値（例えば、Ｋｄ値）によって測定される生物学的特徴の文脈において統計的有意性があるものと見なすようなものである。その２つの値の間の差異は、参照／比較用分子に対する値の関数として、例えば、約１０％超、約２０％超、約３０％超、約４０％超、及び／または約５０％超であり得る。
【００７６】
「実質的に同様」という表現は、本明細書で使用されるとき、２つの数値（概して、一方はある分子に関連し、他方は参照／比較用分子に関連する）間の十分に高い度合いの類似を指し、これは、当業者が、２つの値の間の差異を、該値（例えば、Ｋｄ値）によって測定される生物学的特徴の文脈において統計的有意性がないものと見なすようなものである。その２つの値の間の差異は、参照／比較値の関数として、例えば、約２０％未満、約１０％未満、及び／または約５％未満であり得る。「実質的に正常」という表現は、参照（例えば、正常参照）と実質的に同様を指す。
【００７７】
ＩＩ．ＫＬＫ５アンタゴニストの使用方法
本明細書に提供されるものは、ＫＬＫ５の阻害のためにＫＬＫ５アンタゴニストを使用する方法である。例えば、本明細書に提供されるものは、対象における喘息を治療するための方法であり、有効量のＫＬＫ５アンタゴニストを対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ＫＬＫ５のセリンプロテアーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）、結合ポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドなどのＫＬＫ５結合ポリペプチド）、ポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有するｓｇＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡなどのＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニスト）、及び小分子（例えば、小分子プロテアーゼ阻害剤などのＫＬＫ５小分子アンタゴニスト）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。
【００７８】
本明細書にさらに提供されるものは、喘息に罹患している対象のＫＬＫ５アンタゴニストを含む治療への応答を予測する方法であり、（ａ）対象からの生物学的試料中のＫＬＫ５レベルを測定することと、（ｂ）試料中で検出されたＫＬＫ５レベルを参照レベルと比較することと、（ｃ）試料中で測定されたＫＬＫ５レベルが参照レベルと比較して上昇している場合に対象が治療に応答するであろうと予測し、試料中で測定されたＫＬＫ５レベルが参照レベルと比較して低減している場合に対象が治療に応答しないであろうと予測することと、を含む。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ＫＬＫ５のセリンプロテアーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）、結合ポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドなどのＫＬＫ５結合ポリペプチド）、ポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有するｓｇＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡなどのＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニスト）、及び小分子（例えば、小分子プロテアーゼ阻害剤などのＫＬＫ５小分子アンタゴニスト）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。
【００７９】
本明細書にさらに提供されるものは、ＫＬＫ５アンタゴニストを含む治療について喘息に罹患している対象を選択する方法であり、対象からの生物学的試料中のＫＬＫ５ゲノム配列中に位置する遺伝的変異の存在または不在を決定することを含み、遺伝的変異の存在は、対象がＫＬＫ５アンタゴニストでの治療に適していることを示す。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ＫＬＫ５のセリンプロテアーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）、結合ポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドなどのＫＬＫ５結合ポリペプチド）、ポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有するｓｇＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡなどのＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニスト）、及び小分子（例えば、小分子プロテアーゼ阻害剤などのＫＬＫ５小分子アンタゴニスト）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。
【００８０】
本明細書にさらに提供されるものは、喘息に罹患している対象がＫＬＫ５アンタゴニストでの治療に適していることを示すＫＬＫ５ゲノム配列中の遺伝的変異の存在または不在を検出するための方法であり、（ａ）対象からの試料を、ＫＬＫ５ゲノム配列中に位置する遺伝的変異の存在または不在を検出することができる試薬と接触させることと、（ｂ）遺伝的変異の存在または不在を決定することと、を含み、遺伝的変異の存在は、対象がＫＬＫ５アンタゴニストでの治療に適していることを示す。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ＫＬＫ５のセリンプロテアーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）、結合ポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドなどのＫＬＫ５結合ポリペプチド）、ポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有するｓｇＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡなどのＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニスト）、及び小分子（例えば、小分子プロテアーゼ阻害剤などのＫＬＫ５小分子アンタゴニスト）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。いくつかの実施形態では、試薬は、オリゴヌクレオチド、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、及びリボザイムから選択される。いくつかの実施形態では、試薬は標識される。
【００８１】
本明細書にさらに提供されるものは、ＫＬＫ５と関連する疾患を治療するための化合物を選択するための方法であり、試験化合物がＫＬＫ５アンタゴニストであるかを決定することを含み、ＫＬＫ５アンタゴニストである試験化合物は、ＫＬＫ５と関連する疾患を治療するための化合物として適している。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ＫＬＫ５のセリンプロテアーゼ活性を阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）、結合ポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドなどのＫＬＫ５結合ポリペプチド）、ポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有するｓｇＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡなどのＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニスト）、及び小分子（例えば、小分子プロテアーゼ阻害剤などのＫＬＫ５小分子アンタゴニスト）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、抗体（例えば、モノクローナル抗体）である。
【００８２】
方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、喘息は、対象からの試料中のＫＬＫ５の上昇したレベルと関連している。いくつかの実施形態では、喘息は、対象からの試料中のＳＰＩＮＫ５の低減した活性と関連している。いくつかの実施形態では、喘息は、対象からの試料中の好中球の上昇したレベルと関連している。いくつかの実施形態では、喘息は、低２型喘息、低ペリオスチン喘息、及び低好酸球喘息からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、喘息は、ネザートン症候群と関連していない。いくつかの実施形態では、喘息は、ＳＰＩＮＫ５をコードする遺伝子またはその遺伝子産物における１つ以上の遺伝的変異と関連していない。いくつかの実施形態では、喘息は、ＫＬＫ５ゲノム配列中に位置する遺伝的変異と関連している。いくつかの実施形態では、方法は、遺伝的変異の存在に基づいて喘息について対象を治療することをさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、ＳＮＰである。いくつかの実施形態では、遺伝的変異は、ＳＮＰ  ｒｓ１１７６３９５１２である。
【００８３】
方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、喘息は、致死的であり得る症状の悪化させる急性事象（増悪及び再発）を伴う持続的な慢性重度喘息である。いくつかの実施形態では、喘息は、アトピー性（別名アレルギー性）喘息、非アレルギー性喘息である（例えば、多くの場合は呼吸器ウイルス（例えば、インフルエンザ、パラインフルエンザ、ライノウイルス、ヒトメタニューモウイルス、及び呼吸器合胞体ウイルス）の感染または刺激因子（大気汚染物質、スモッグ、ディーゼル粒子、屋内もしくは屋外の揮発性化学物質及びガス、または冷たく乾燥した空気）の吸入によって誘発される）。いくつかの実施形態では、喘息は、断続的または運動誘発性喘息、「喫煙」（典型的には、シガレット、シガー、パイプ）への急性もしくは慢性一次もしくは二次曝露、吸入もしくは「ベーピング」（タバコ、マリファナ、または他のかかる物質）による喘息、またはアスピリンもしくは関連ＮＳＡＩＤＳの最近の摂取によって誘発される喘息である。いくつかの実施形態では、喘息は、軽度、またはコルチコステロイド無感作喘息、新たに診断された未治療の喘息、または症状（咳、呼気性喘鳴、息切れ、または胸部痛）を制御するために吸入された局所もしくは全身ステロイドの慢性使用を以前に必要としないものである。いくつかの実施形態では、喘息は、慢性、コルチコステロイド抵抗性喘息、コルチコステロイド難治性喘息、コルチコステロイドまたは他の慢性喘息制御剤医薬品で制御されていない喘息である。いくつかの実施形態では、喘息は、中等度〜重度喘息である。いくつかの実施形態では、喘息は、高Ｔｈ２喘息である。いくつかの実施形態では、喘息は、重度喘息である。いくつかの実施形態では、喘息は、アトピー性喘息、アレルギー性喘息、非アレルギー性喘息（例えば、感染及び／または呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）による）、運動誘発性喘息、アスピリン感受性／増悪性喘息、軽度喘息、中等度〜重度喘息、コルチコステロイド無感作喘息、慢性喘息、コルチコステロイド抵抗性喘息、コルチコステロイド難治性喘息、新たに診断された未治療の喘息、喫煙に起因する喘息、コルチコステロイドで制御されていない喘息である。いくつかの実施形態では、喘息は、Ｔヘルパーリンパ球２型（Ｔｈ２）もしくは高２型（Ｔｈ２）、または２型（Ｔ２）誘導性喘息である。いくつかの実施形態では、喘息は、好酸球性喘息である。いくつかの実施形態では、喘息は、アレルギー性喘息である。いくつかの実施形態では、対象は、好酸球性炎症陽性（ＥＩＰ）であると判定された。ＷＯ２０１５／０６１４４１を参照されたい。いくつかの実施形態では、喘息は、高ペリオスチン喘息である（例えば、血清１ｍＬあたり少なくとも約２０ｎｇ、２５ｎｇ、または５０ｎｇのいずれかのペリオスチンレベルを有する）。いくつかの実施形態では、喘息は、高好酸球喘息（例えば、血液１ｍｌあたり少なくとも約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００の好酸球数のいずれか）である。いくつかの実施形態では、喘息は、低Ｔｈ２喘息または非Ｔｈ２誘導性喘息である。いくつかの実施形態では、対象は、好酸球性炎症陰性（ＥＩＮ）であると判定された。ＷＯ２０１５／０６１４４１を参照されたい。いくつかの実施形態では、喘息は、低ペリオスチン喘息である（例えば、血清１ｍＬあたり約２０ｎｇ未満のペリオスチンレベルを有する）。いくつかの実施形態では、喘息は、低好酸球喘息（例えば、血液１μｌあたり約１５０未満の好酸球数または血液１μｌあたり約１００未満の好酸球数）である。
【００８４】
方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、試料は、脳脊髄液、血液、血清、痰、唾液、粘膜剥離物、組織検体、涙腺分泌物、精液、及び汗からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、試料は、気管支肺胞洗浄、肺実質、及び気管支上皮下からなる群から選択される。
【００８５】
バイオマーカーの存在及び／または発現レベル／量は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ポリペプチド、ポリペプチド断片、及び／または遺伝子コピー数を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の任意の好適な基準に基づいて、定性的かつ／または定量的に判定され得る。いくつかの実施形態では、第１の試料中のバイオマーカーの存在及び／または発現レベル／量が、第２の試料中の存在／不在及び／または発現レベル／量と比較して増加する。いくつかの実施形態では、第１の試料中のバイオマーカーの存在／不在及び／または発現レベル／量は、第２の試料中の存在及び／または発現レベル／量と比較して減少する。いくつかの実施形態では、第２の試料は、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織である。遺伝子の存在／不在及び／または発現レベル／量を決定するためのさらなる開示が本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５は、バイオマーカーとして使用することができる。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５は、バイオマーカーとして使用することができる。
【００８６】
方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、追加の治療剤と組み合わせて対象に投与される。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＩＬ−１３軸結合アンタゴニスト、ＩＬ−５軸結合アンタゴニスト、ＩＬ−３３軸結合アンタゴニスト、Ｍ１プライムアンタゴニスト、ＩｇＥアンタゴニスト、ＴＲＰＡ１アンタゴニスト、ＣＲＴＨ２アンタゴニスト、気管支拡張剤もしくは喘息症状制御剤医薬品、免疫調節剤、コルチコステロイド、Ｔｈ２経路阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、またはホスホジエステラーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＩＬ−１３軸結合アンタゴニストは、抗ＩＬ−１３抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＩＬ−１３抗体は、レブリキズマブである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−５軸結合アンタゴニストは、ＩＬ−５結合アンタゴニストまたはＩＬ−５受容体結合アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−３３軸結合アンタゴニストは、ＩＬ−３３結合アンタゴニストまたはＳＴ２結合アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＩＬ−３３結合アンタゴニストは、抗ＩＬ−３３抗体である。いくつかの実施形態では、Ｍ１プライムアンタゴニストは、キリズマブである。
【００８７】
方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、皮下、静脈内、筋肉内、局所、経口、経皮、腹腔内、眼窩内、移植による、吸入による、髄腔内、脳室内、または鼻腔内投与のためのものである。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、皮下投与のためのものである。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ヒト対象における使用のためのものである。
【００８８】
方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、上昇した発現とは、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織と比較した、本明細書に記載の方法などの標準の当該技術分野で既知の方法によって検出される、バイオマーカー（例えば、ポリペプチドまたは核酸（例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ））のレベルの約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のうちのいずれかの全体的な増加を指す。いくつかの実施形態では、上昇した発現とは、試料におけるバイオマーカーの発現レベル／量の増加を指し、増加は、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織におけるそれぞれのバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍、または１００倍のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、上昇した発現とは、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、対照組織、または内部対照（例えば、ハウスキーピング遺伝子）と比較した、約１．５倍、約１．７５倍、約２倍、約２．２５倍、約２．５倍、約２．７５倍、約３．０倍、または約３．２５倍を超える全体的な増加を指す。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＫＬＫ５経路に関与する分子である。いくつかの実施形態では、分子は、ＳＰＩＮＫ５である。いくつかの実施形態では、分子は、ＫＬＫ５である。いくつかの実施形態では、分子は、ＫＬＫ５の生物学的基質である。いくつかの実施形態では、生物学的基質は、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１４、ＰＡＲ２、及びインテグリン／組織マトリックスタンパク質からなる群から選択される。
【００８９】
方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、低減した発現とは、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織と比較した、本明細書に記載の方法などの標準の当該技術分野で既知の方法によって検出される、バイオマーカー（例えば、ポリペプチドまたは核酸（例えば、遺伝子またはｍＲＮＡ））のレベルの約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上のうちのいずれかの全体的な低減を指す。いくつかの実施形態では、低減した発現とは、試料におけるバイオマーカーの発現レベル／量の減少を指し、減少は、参照試料、参照細胞、参照組織、対照試料、対照細胞、または対照組織におけるそれぞれのバイオマーカーの発現レベル／量の少なくとも約０．９倍、０．８倍、０．７倍、０．６倍、０．５倍、０．４倍、０．３倍、０．２倍、０．１倍、０．０５倍、または０．０１倍のうちのいずれかである。
【００９０】
試料中の様々なバイオマーカーの存在及び／または発現レベル／量は、いくつかの方法論によって分析され得、これらの多くは、当該技術分野で既知であり、当業者に理解されており、免疫組織化学（「ＩＨＣ」）、ウエスタンブロット分析、免疫沈降、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光活性化細胞選別（「ＦＡＣＳ」）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、プロテオミクス、定量的血液ベースのアッセイ（例えば、血清ＥＬＩＳＡ）、生化学的酵素活性アッセイ、インサイツハイブリダイゼーション、サザン分析、ノーザン分析、全ゲノム配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、例えば、定量的リアルタイムＰＣＲ（「ｑＲＴ−ＰＣＲ」）及び他の増幅型検出方法、例えば、分岐状ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど）、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、ＦＩＳＨ、マイクロアレイ分析、遺伝子発現プロファイリング、及び／または遺伝子発現連続分析（「ＳＡＧＥ」）、ならびにポリペプチド、遺伝子、及び／または組織アレイ分析によって行われ得る多種多様なアッセイのうちのいずれか１つを含むが、これらに限定されない。遺伝子及び遺伝子産物の状態を評価するための典型的なプロトコルは、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｔｓ  ２（ノーザンブロッティング）、４（サザンブロッティング）、１５（イムノブロッティング）、及び１８（ＰＣＲ分析）において見出される。Ｒｕｌｅｓ  Ｂａｓｅｄ  ＭｅｄｉｃｉｎｅまたはＭｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（「ＭＳＤ」）から入手可能なものなどの多重化イムノアッセイもまた、使用されてもよい。
【００９１】
ＩＩＩ．ＫＬＫ５アンタゴニスト
本明細書に提供されるものは、本明細書に記載される方法のうちのいずれか、例えば、喘息またはネザートン症候群を治療または診断する方法における使用のためのＫＬＫ５アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）、結合ポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドなどのＫＬＫ５結合ポリペプチド）、ポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有するｓｇＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡなどのＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニスト）、及び小分子（例えば、小分子プロテアーゼ阻害剤などのＫＬＫ５小分子アンタゴニスト）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、完全長ＩｇＧ１抗体である。ＫＬＫ５アンタゴニストの詳細な説明は、以下の本明細書におけるセクションＡ．〜Ｅ．に見出すことができる。
【００９２】
例えば、上記実施形態のいずれかによるＫＬＫ５アンタゴニストは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれかの１つ以上の残基に結合する。ＫＬＫ５アンタゴニストのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８からなる群から選択されるアミノ酸配列のいずれかに結合する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、配列番号１のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９Ｙ３３７のアミノ酸残基１−２９３）の１つ以上の残基に結合する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、配列番号１のアミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｑ９Ｙ３３７のアミノ酸残基１−２９３）に結合する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ＫＬＫ５上の特異的結合領域に結合する。いくつかの実施形態では、結合領域は、ＫＬＫ５の活性部位内に位置する。いくつかの実施形態では、結合領域は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、及び／または１０個のいずれかのＫＬＫ５のアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、結合領域は、完全長のプロセシングされていないＫＬＫ５の１０８、１４７、１５０、１５３、１６８、及び２４５位のアミノ酸残基からなる群から選択される、すなわち、シグナルペプチドを含む、ＫＬＫ５のアミノ酸残基のうちの１つ以上を含む。
【００９３】
いくつかの実施形態では、結合領域は、ＫＬＫ５アンタゴニストの任意の原子の約１０、９、８、７、６、５、４、３、２、及び／または１オングストローム（Å）のいずれか以内であるアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、結合領域は、ＫＬＫ５アンタゴニストの任意の原子の１０、９、８、７、６、５、４、３、２、及び／または１Åのいずれか未満であるアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、結合領域は、ＫＬＫ５アンタゴニストの任意の原子の１０〜９、９〜８、８〜７、７〜６、６〜５、５〜４、４〜３、３〜２、及び／または２〜１Åのいずれか以内であるアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、結合領域は、ＫＬＫ５アンタゴニストの任意の原子の約９．５Å、９Å、８．５Å、８Å、７．５Å、７Å、６．５Å、６Å、５．５Å、５Å、４．５Å、４Å、３．５Å、３Å、２．５Å、２Å、１．５Å、及び／または１Åのいずれか以内であるアミノ酸残基を含む。結合領域（すなわち、パラトープ）と接触するＫＬＫ５アンタゴニストのアミノ酸残基は、例えば、結合領域と複合したＫＬＫ５アンタゴニストの結晶構造を決定することによって、または水素／重水素交換を行うことによって決定され得る。
【００９４】
さらに、上記実施形態のいずれかによるＫＬＫ５アンタゴニストは、ＫＬＫ５の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５の生物学的活性は、セリンプロテアーゼ活性である。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５の生物学的活性は、トリプシン様セリンプロテアーゼ活性である。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５の生物学的活性は、ＫＬＫ５促進ヒト平滑筋細胞増殖及び収縮である。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５の生物学的活性は、炎症性サイトカイン、ケモカイン、及び接着分子のＫＬＫ５誘導上皮発現である。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５の生物学的活性は、好中球走化性サイトカインのＫＬＫ５誘導上皮産生及び肺組織への好中球流入である。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５の生物学的活性は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び／またはそれ以上のいずれかで阻害される。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５の生物学的活性は、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び／またはそれ以上のいずれかで阻害される。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５の生物学的活性は、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、及び／または９０〜１００％のいずれかで阻害される。
【００９５】
ＫＬＫ５アンタゴニストのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ＳＰＩＮＫ５のＫＬＫ５への結合を実質的にまたは完全に阻害する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５のＫＬＫ５への結合は、少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び／またはそれ以上のいずれかで阻害される。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５のＫＬＫ５への結合は、約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び／またはそれ以上のいずれかで阻害される。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５のＫＬＫ５への結合は、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、及び／または９０〜１００％のいずれかで阻害される。
【００９６】
ＫＬＫ５アンタゴニストのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、約１０−７ｎＭ、１０−８ｎＭ、１０−９ｎＭ、１０−１０ｎＭ、１０−１１ｎＭ、１０−１２ｎＭ、及び／または１０−１３ｎＭのいずれか未満のＫＬＫ５に対する結合親和性（解離定数）を有する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、１０−７ｎＭ、１０−８ｎＭ、１０−９ｎＭ、１０−１０ｎＭ、１０−１１ｎＭ、１０−１２ｎＭ、及び／または１０−１３ｎＭのいずれか未満のＫＬＫ５に対する結合親和性を有する。
【００９７】
ＫＬＫ５アンタゴニストのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、約１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、及び／または１ｐＭのいずれか未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、１０００ｎＭ、５００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００ｐＭ、５０ｐＭ、１０ｐＭ、５ｐＭ、及び／または１ｐＭのいずれか未満のＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、約５０μＭ〜１μＭ、１μＭ〜５００ｎＭ、５００ｎＭ〜１００ｎＭ、１００ｎＭ〜１０ｎＭ、１０ｎＭ〜１ｎＭ、１０００ｐＭ〜５００ｐＭ、５００ｐＭ〜２００ｐＭ、２００ｐＭ〜１５０ｐＭ、１５０ｐＭ〜１００ｐＭ、１００ｐＭ〜１０ｐＭ、及び／または１０ｐＭ〜１ｐＭのいずれかのＩＣ５０を有する。
【００９８】
Ａ．抗体
本明細書に提供されるものは、本明細書に記載される方法における使用のための単離された抗ＫＬＫ５抗体である。上記の実施形態のいずれにおいても、抗ＫＬＫ５抗体は、ヒト化されている。さらに、上記の実施形態のいずれかによる抗ＫＬＫ５抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を含む、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＬＫ５抗体は、抗体断片、例えば、Ｆｖ断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦｖ断片、ダイアボディ断片、またはＦ（ａｂ’）２断片である。いくつかの実施形態では、抗ＫＬＫ５抗体は、完全長ＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＫＬＫ５抗体は、モノクローナルマウスＩｇＧ２Ｂ抗体である。いくつかの実施形態では、モノクローナルマウスＩｇＧ２Ｂ抗体は、ｍＡｂ１１０８（クローン番号１９３３１８、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）である。
【００９９】
さらなる態様では、上記実施形態のいずれかによる抗ＫＬＫ５抗体は、以下のセクションに記載されるように、特徴のうちのいずれかを、単独または組み合わせて組み込み得る。
【０１００】
１．親和性
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＫＬＫ５抗体は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、及び／または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）の解離定数（Ｋｄ）を有する。一実施形態では、Ｋｄは、放射性標識抗原結合アッセイ（ＲＩＡ）によって測定される。一実施形態では、ＲＩＡは、抗ＫＬＫ５抗体及びその抗原のＦａｂバージョンで行われる。例えば、抗原に対するＦａｂの溶液結合親和性は、Ｆａｂを、未標識抗原の一連の滴定の存在下で最小濃度の（１２５Ｉ）標識抗原と平衡化させ、次いで抗Ｆａｂ抗体コーティングプレートで結合した抗原を捕捉することによって、測定される（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい）。アッセイのための条件を確立するために、ＭＩＣＲＯＴＩＴＥＲ（登録商標）マルチウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、５０ｍＭの炭酸塩（ｐＨ９．６）中５μｇ／ｍｌの捕捉用抗Ｆａｂ抗体（Ｃａｐｐｅｌ  Ｌａｂｓ）で一晩コーティングし、続いて、室温（約２３℃）で２〜５時間、ＰＢＳ中２％（ｗ／ｖ）のウシ血清アルブミンによってブロッキングする。非吸着性プレート（Ｎｕｎｃ番号２６９６２０）において、１００ｐＭまたは２６ｐＭの［１２５Ｉ］−抗原を、目的とするＦａｂの段階希釈物と混合する（例えば、Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５７：４５９３−４５９９（１９９７）における抗ＶＥＧＦ抗体、Ｆａｂ−１２の評価と一貫する）。次に、目的とするＦａｂを一晩インキュベートするが、このインキュベーションは、平衡が達成されることを確実にするために、より長い期間（例えば、約６５時間）継続し得る。その後、混合物を、室温でのインキュベーション（例えば、１時間）のため、捕捉プレートに移す。次に、溶液を除去し、プレートを、ＰＢＳ中０．１％のポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（登録商標））で８回洗浄する。プレートが乾燥したら、１５０μｌ／ウェルのシンチラント（ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴ−２０（商標）；Ｐａｃｋａｒｄ）を添加し、プレートを１０分間ＴＯＰＣＯＵＮＴ（商標）ガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）で計数する。２０％以下の最大結合を付与する各Ｆａｂの濃度を競合結合アッセイにおける使用のために選択する。
【０１０１】
別の実施形態に従うと、Ｋｄは、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定される。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−２０００またはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）−３０００（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用するアッセイは、約１０の応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実施される。一実施形態では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサチップ（ＣＭ５、ＢＩＡＣＯＲＥ，Ｉｎｃ．）は、供給者の指示に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化される。抗原をｐＨ４．８の１０ｍＭの酢酸ナトリウムによって５μｇ／ｍｌ（約０．２μＭ）に希釈した後、５μｌ／分の流量で注射し、結合ポリペプチドの約１０応答単位（ＲＵ）を達成する。抗原の注射に続いて、１Ｍのエタノールアミンを注射して、未反応基を遮断する。動態測定のために、Ｆａｂの２倍段階希釈物（０．７８ｎＭ〜５００ｎＭ）を、０．０５％ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ−２０（商標））界面活性剤を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中、２５℃で、約２５μｌ／分の流量で注射する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、会合及び解離センサグラムを同時にあてはめることによって、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン３．２）を用いて計算する。平衡解離定数（Ｋｄ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算する。例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３：８６５−８８１（１９９９）を参照されたい。上記表面プラズモン共鳴アッセイによりオンレートが１０６Ｍ−１ｓ−１を超える場合、オンレートは、ストップトフローを備えた分光計（Ａｖｉｖ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、または撹拌キュベットを備えた８０００シリーズＳＬＭ−ＡＭＩＮＣＯ（商標）分光光度計（ＴｈｅｒｍｏＳｐｅｃｔｒｏｎｉｃ）などの分光計で測定されるように、増加する抗原濃度の存在下で、２５℃で、ＰＢＳ中２０ｎＭの抗抗原抗体（Ｆａｂ型）（ｐＨ７．２）の蛍光発光強度（励起＝２９５ｎｍ、発光＝３４０ｎｍ、１６ｎｍ帯域通過）の増加または減少を測定する蛍光消光技法を使用して決定することができる。
【０１０２】
２．抗体断片
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＫＬＫ５抗体は、抗体断片である。抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片、ならびに以下に記載される他の断片が含まれるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の概説については、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）を参照されたい。ｓｃＦｖ断片の概説については、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ），ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたく、また、ＷＯ９３／１６１８５、ならびに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有する、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片の考察については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照されたい。
【０１０３】
ダイアボディは、二価であってもまたは二重特異性であってもよい、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ  ４０４，０９７、ＷＯ  １９９３／０１１６１、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ（Ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）及びテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）はまた、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．９：１２９−１３４（２００３）にも記載される。
【０１０４】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部、または軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部を含む、抗体断片である。いくつかの実施形態では、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、例えば、米国特許第６，２４８，５１６号を参照されたい）。
【０１０５】
抗体断片は、本明細書に記載される、インタクトな抗体のタンパク分解、ならびに組換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）の産生を含むが、これらに限定されない、様々な技法によって作製され得る。
【０１０６】
３．キメラ抗体及びヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＫＬＫ５抗体は、キメラ抗体である。特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、または非ヒト霊長類、例えばサルに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のクラスまたはサブクラスから変化した「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体には、その抗原結合断片が含まれる。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、非ヒト親抗体の特異性及び親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるために、ヒト化される。一般に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体に由来し、及びＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、任意選択で、ヒト定常領域の少なくとも一部も含むことになる。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を復元または改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０１０８】
ヒト化抗体及びそれらを作製する方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に概説され、さらに例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１００２９−１００３３（１９８９）、米国特許第５，８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号、Ｋａｓｈｍｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：２５−３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフティングを記載）、Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８（１９９１）（「リサーフェイシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）」を記載）、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：４３−６０（２００５）（「ＦＲシャフリング」を記載）、ならびＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３６：６１−６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２−２６０（２０００）（ＦＲシャフリングへの「誘導選択」アプローチを記載）に記載される。
【０１０９】
ヒト化に使用され得るヒトフレームワーク領域には、これらに限定されないが、「最良適合（ｂｅｓｔ−ｆｉｔ）」法を使用して選択されるフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６（１９９３）を参照されたい）、軽鎖または重鎖可変領域の特定の下位集団のヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）、及びＰｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）、ヒト成熟（体細胞突然変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞株フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照されたい）、及びＦＲライブラリをスクリーニングすることから誘導されるフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８−１０６８４（１９９７）及びＲｏｓｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：２２６１１−２２６１８（１９９６）を参照されたい）が含まれる。
【０１１０】
４．ヒト抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＫＬＫ５抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当該技術分野で知られている様々な技法を用いて産生することができる。ヒト抗体は、概して、ｖａｎ  Ｄｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：３６８−７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：４５０−４５９（２００８）に記載されている。
【０１１１】
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体またはヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製され得る。かかる動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体内にランダムに組み込まれているヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含有する。かかるトランスジェニックマウスにおいて、内因性免疫グロブリン遺伝子座は一般に、不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照のこと。例えば、米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号（ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術について記載）、米国特許第５，７７０，４２９号（ＨｕＭａｂ（登録商標）技術について記載）、米国特許第７，０４１，８７０号（Ｋ−Ｍ  ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術について記載）、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２００７／００６１９００号（ＶｅｌｏｃｉＭｏｕｓｅ（登録商標）技術について記載）も参照されたい。かかる動物により生成されたインタクトな抗体由来のヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによりさらに修飾されてもよい。
【０１１２】
ヒト抗体は、ハイブリドーマに基づく方法によっても作製され得る。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、ＫｏｚｂｏｒＪ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）、Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８７）、及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照されたい。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術により生成されるヒト抗体についても、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１０３：３５５７−３５６２（２００６）に記載されている。さらなる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の産生について記載）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ  Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５−２６８（２００６）（ヒト−ヒトハイブリドーマについて記載）に記載の方法が挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）もまた、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔ．＆Ｈｉｓｔｏｐａｔｈ．，２０（３）：９２７−９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｆｉｎｄ  Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２７（３）：１８５−９１（２００５）に記載される。
【０１１３】
ヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されるＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。次いで、かかる可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わされてもよい。抗体ライブラリからヒト抗体を選択するための技術は、以下に記載される。
【０１１４】
５．ライブラリ由来抗体
抗ＫＬＫ５抗体は、コンビナトリアルライブラリを、所望の活性（複数可）を有する抗体についてスクリーニングすることによって単離され得る。例えば、ファージディスプレイライブラリを生成し、所望の結合特性を保有する抗体に関してかかるライブラリをスクリーニングするための様々な方法が当該技術分野で公知である。かかる方法は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）に概説され、さらに、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）、Ｍａｒｋｓ  ａｎｄ  Ｂｒａｄｂｕｒｙ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：１６１−１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３）、Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）、Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−１２４７２（２００４）、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）に記載される。
【０１１５】
ある特定のファージ提示法において、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別個にクローニングされ、ファージライブラリ内で無作為に組換えられ、これがその後、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングされ得る。ファージは典型的には、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして抗体断片をディスプレイする。免疫化供給源由来のライブラリは、ハイブリドーマの構築を必要とすることなく、高親和性抗体を免疫原に提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ，１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載されるように、ナイーブレパートリーは、（例えば、ヒトから）クローニングされて、いかなる免疫化も伴わずに、幅広い非自己抗原及び自己抗原に対する抗体の単一源を提供することができる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞からの再編成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して高度に可変的なＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再編成を達成することによってナイーブライブラリを合成的に作製することもできる。ヒト抗体ファージライブラリについて記載する特許公報としては、例えば：米国特許第５，７５０，３７３号、ならびに米国特許公開第２００５／００７９５７４号、同第２００５／０１１９４５５号、同第２００５／０２６６０００号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０１６０５９８号、同第２００７／０２３７７６４号、同第２００７／０２９２９３６号、及び同第２００９／０００２３６０号が挙げられる。
【０１１６】
ヒト抗体ライブラリから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体断片と見なされる。
【０１１７】
６．多重特異性抗体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗ＫＬＫ５抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、結合特異性の一方は、ＫＬＫ５であり、他方は、任意の他の抗原へのものである。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は、ＫＬＫ５の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体を使用して、ＫＬＫ５を発現する細胞に細胞傷害性剤を局所化することもできる。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る。
【０１１８】
多重特異性抗体を作製するための技法としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え同時発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ３０５：５３７（１９８３））、ＷＯ９３／０８８２９、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３６５５（１９９１）を参照されたい）、及び「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、静電的ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ）効果を操作して抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製すること（ＷＯ２００９／０８９００４Ａ１）、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）、ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）を参照されたい）、「ダイアボディ」技術を使用して二重特異性抗体断片を作製すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照されたい）、及び１本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照されたい）、ならびに例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載される三重特異性抗体を調製することによって、作製されてもよい。
【０１１９】
「オクトパス抗体」を含む３つ以上の機能的抗原結合部位を有する操作された抗体も、本明細書に含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。
【０１２０】
本明細書の抗体または断片には、ＫＬＫ５及び別の異なる抗原などの目的のポリペプチドに結合する抗原結合部位を含む「二重作用（Ｄｕａｌ  Ａｃｔｉｎｇ）ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、ＵＳ２００８／００６９８２０を参照されたい）。
【０１２１】
Ｂ．ＫＬＫ５結合ポリペプチド
本明細書に記載される方法における使用のためのＫＬＫ５に結合する結合ポリペプチド（ＫＬＫ５結合ポリペプチド）も提供される。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５結合ポリペプチドは、ＫＬＫ５アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５結合ポリペプチドは、融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ＳＰＩＮＫ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ融合ポリペプチドは、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドは、２  ＳＰＩＮＫポリペプチドまたはそれらの断片を含む。結合ポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、２  ＳＰＩＮＫポリペプチドまたはそれらの断片の各々は、ＳＰＩＮＫ５の１つ以上ドメインを含む。いくつかの実施形態では、２  ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドまたはそれらの断片の各々は、１、２、３、４、５、６、７、及び／または８カザールドメインを含む。いくつかの実施形態では、２  ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドまたはそれらの断片の各々は、１カザールドメイン（すなわち、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドあたり２カザールドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、２  ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドまたはそれらの断片の各々は、４カザールドメイン（すなわち、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドあたり８カザールドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、４カザールドメインは、カザールドメイン６、７、８、及び／または９である。いくつかの実施形態では、カザールドメイン６、７、８、及び／または９は、マウスＳＰＩＮＫ５（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ５Ｋ５Ｄ４）由来である。いくつかの実施形態では、カザールドメイン６、７、８、及び／または９は、マウスＳＰＩＮＫ５（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ５Ｋ５Ｄ４）からのアミノ酸残基Ｅ４２１−Ａ６９５を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１７のＳＰＩＮＫ５アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域、及びＩｇＧ４  Ｆｃ領域からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域は、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２  ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドまたはそれらの断片の各々は、１カザールドメイン（すなわち、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドあたり２カザールドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、１カザールドメインは、カザールドメイン４である。いくつかの実施形態では、カザールドメイン４は、マウスＳＰＩＮＫ５（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ５Ｋ５Ｄ４）由来である。いくつかの実施形態では、カザールドメイン４は、マウスＳＰＩＮＫ５（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ５Ｋ５Ｄ４）からのアミノ酸残基Ｍ２９３−Ｒ３５５を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域、及びＩｇＧ４  Ｆｃ���域からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域は、マウスＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号２２のＳＰＩＮＫ５アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号２１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、４カザールドメインは、カザールドメイン８、９、１０、及び／または１１である。いくつかの実施形態では、カザールドメイン８、９、１０、及び／または１１は、ヒトＳＰＩＮＫ５（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ９ＮＱ３８）由来である。いくつかの実施形態では、カザールドメイン８、９、１０、及び／または１１は、ヒトＳＰＩＮＫ５（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ９ＮＱ３８）からのアミノ酸残基Ｅ４９０−Ｙ７５７を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１５のＳＰＩＮＫ５アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域、及びＩｇＧ４  Ｆｃ領域からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、３５６位のアミノ酸Ｅを有する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、３５８位のアミノ酸Ｍを有する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、２２８位のアミノ酸Ｓを有する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、２２８位のアミノ酸Ｐを有する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、２  ＳＰＩＮＫ５ポリペプチドまたはそれらの断片の各々は、１カザールドメイン（すなわち、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドあたり２カザールドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、１カザールドメインは、カザールドメイン５である。いくつかの実施形態では、カザールドメイン５は、ヒトＳＰＩＮＫ５（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ９ＮＱ３８）由来である。いくつかの実施形態では、カザールドメイン５は、ヒトＳＰＩＮＫ５（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ９ＮＱ３８）からのアミノ酸残基Ｒ２９１−Ｒ３５２を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドのＦｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域、及びＩｇＧ４  Ｆｃ領域からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、３５６位のアミノ酸Ｅを有する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ��域は、３５８位のアミノ酸Ｍを有する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号２０のＳＰＩＮＫ５アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、２２８位のアミノ酸Ｓを有する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、２２８位のアミノ酸Ｐを有する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
結合ポリペプチドのうちのいずれかのいくつかの実施形態では、２  ＳＰＩＮＫポリペプチドまたはそれらの断片の各々は、ＳＰＩＮＫ９の１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、２  ＳＰＩＮＫ９ポリペプチドまたはそれらの断片の各々は、１カザールドメイン（すなわち、ＳＰＩＮＫ９  Ｆｃ融合ポリペプチドあたり２カザールドメイン）を含む。いくつかの実施形態では、１カザールドメインは、カザールドメイン１である。いくつかの実施形態では、カザールドメイン１は、ヒトＳＰＩＮＫ９（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ５ＤＴ２１）由来である。いくつかの実施形態では、カザールドメイン１は、ヒトＳＰＩＮＫ９（ＵＮＩＰＲＯＴ  Ｑ５ＤＴ２１）からのアミノ酸残基Ｉ２０−Ｃ８６を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ９からのＩ２０−Ｃ８６は、２２位のアミノ酸Ｃを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ９からのＩ２０−Ｃ８６は、２２位のアミノ酸Ｓを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ９からのＩ２０−Ｃ８６は、４８位のアミノ酸Ｈを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ９からのＩ２０−Ｃ８６は、４８位のアミノ酸Ｒを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ９からのＩ２０−Ｃ８６は、４９位のアミノ酸Ｍを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ９からのＩ２０−Ｃ８６は、４９位のアミノ酸Ｅを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＳＰＩＮＫ９からのＩ２０−Ｃ８６は、配列番号２８のＳＰＩＮＫ９アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ９  Ｆｃ融合ポリペプチドのヒトＦｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域、及びＩｇＧ４  Ｆｃ領域からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、３５６位のアミノ酸Ｅを有する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、３５８位のアミノ酸Ｍを有する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ９  Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ２ａ  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ９  Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、２２８位のアミノ酸Ｓを有する。いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、２２８位のアミノ酸Ｐを有する。いくつかの実施形態では、ＳＰＩＮＫ９  Ｆｃ融合ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
ＫＬＫ５結合ポリペプチドは、既知のポリペプチド合成方法を使用して化学合成されてもよく、または組換え技術を使用して調製及び精製されてもよい。ＫＬＫ５結合ポリペプチドは、通常、少なくとも約５アミノ酸長、あるいは少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、及び／または１００アミノ酸長、及び／またはそれ以上であるが、かかるＫＬＫ５結合ポリペプチドは、ＫＬＫ５に、好ましくは特異的に、結合することができる。
【０１２４】
ＫＬＫ５結合ポリペプチドは、過度の実験なしに周知の技法を使用して特定され得る。これに関して、ポリペプチドライブラリをＫＬＫ５に特異的に結合することができる結合ポリペプチドについてスクリーニングするための技法は、当該技術分野で周知であることが留意される（例えば、米国特許第５，５５６，７６２号、同第５，７５０，３７３号、同第４，７０８，８７１号、同第４，８３３，０９２号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５７１，６８９号、同第５，６６３，１４３号、ＰＣＴ公開第ＷＯ８４／０３５０６号及び第ＷＯ８４／０３５６４号、Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８１：３９９８−４００２（１９８４）、Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：１７８−１８２（１９８５）、Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，１３０−１４９（１９８６）、Ｇｅｙｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．，１０２：２５９−２７４（１９８７）、Ｓｃｈｏｏｆｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４０：６１１−６１６（１９８８），Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６３７８、Ｌｏｗｍａｎ，Ｈ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０：１０８３２、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４、Ｍａｒｋｓ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１、Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：８３６３、及びＳｍｉｔｈ，Ｇ．Ｐ．（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２：６６８を参照されたい）。
【０１２５】
ペプチドライブラリを生成する方法及びこれらのライブラリをスクリーニングする方法は、米国特許第５，７２３，２８６号、同第５，４３２，０１８号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，４９８，５３０号、同第５，７７０，４３４号、同第５，７３４，０１８号、同第５，６９８，４２６号、同第５，７６３，１９２号、及び同第５，７２３，３２３号にも開示される。
【０１２６】
Ｃ．ＫＬＫ５小分子アンタゴニスト
本明細書に提供されるものは、上に記載される方法における使用のためのＫＬＫ５小分子アンタゴニストとしての使用のための小分子である。いくつかの実施形態では、小分子アンタゴニストは、ＫＬＫ５生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。いくつかの実施形態では、生物学的活性は、セリンプロテアーゼ活性である。いくつかの実施形態では、生物学的活性は、トリプシン様セリンプロテアーゼ活性である。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５小分子アンタゴニストは、プロテアーゼ阻害剤である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ阻害剤は、ロイペプチンである。
【０１２７】
小分子は、好ましくは、本明細書に記載されるＫＬＫ５に、好ましくは特異的に、結合する、本明細書に定義される結合ポリペプチドまたは抗体以外の有機分子である。結合有機小分子は、既知の方法論を用いて特定または化学合成され得る（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号及び同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）。結合有機小分子は、通常、約２０００ダルトン未満の大きさであり、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０、または２００ダルトン未満の大きさであり、本明細書に記載されるポリペプチドに、好ましくは特異的に、結合することができる、かかる有機小分子は、周知の技法を用いて過度な実験なしに特定され得る。これに関して、有機小分子ライブラリを目的のポリペプチドに結合することができる分子についてスクリーニングするための技法は、当該技術分野で周知であることが留意される（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／００８２３号及び同第ＷＯ００／３９５８５号を参照されたい）。結合有機小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミン、Ｎ置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、ウレア、カルバメート、カルボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、ハロゲン化アリール、スルホン酸アリール、ハロゲン化アルキル、スルホン酸アルキル、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、酸クロリドなどであり得る。
【０１２８】
Ｄ．ＫＬＫ５アンタゴニストポリヌクレオチド
本明細書に提供されるものはまた、本明細書に記載される方法における使用のためのＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニストである。ＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニストは、アンチセンス核酸及び／またはリボザイムであり得る。アンチセンス核酸は、ＫＬＫ５のＲＮＡ転写物の少なくとも一部分に相補的な配列を含む。しかしながら、絶対相補性は、好ましいが、必要ではない。
【０１２９】
ＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニストは、ＫＬＫ５核酸配列（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有するｓｇＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡ及びＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸であり得る。Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３３９：８２３−２６，（２０１３）を参照されたい。
【０１３０】
本明細書において言及される「ＲＮＡの少なくとも一部分に相補的な」配列とは、ＲＮＡとハイブリダイズすることができ、安定な三本鎖を形成する十分な相補性を有する配列を意味し、二本鎖アンチセンス核酸の場合、二本鎖ＤＮＡの一本鎖がよって試験され得るか、または三本鎖形成がアッセイされ得る。ハイブリダイズする能力は、相補性の程度及びアンチセンス核酸の長さの両方に依存するであろう。一般的には、ハイブリダイズ核酸が大きいほど、ＲＮＡとの塩基ミスマッチが多く、安定な二本鎖（または場合によっては三本鎖）を含有し、依然として形成し得る。当業者は、ハイブリダイズされた複合体の融点を決定するための標準的な手順の使用によって許容可能な程度のミスマッチを確認することができる。
【０１３１】
メッセージの５’末端、例えば、ＡＵＧ開始コドンまで及びこれを含む５’未翻訳配列に相補的であるポリヌクレオチドは、翻訳を阻害するのに最も効率的に機能すべきである。しかしながら、ｍＲＮＡの３’未翻訳配列に相補的な配列は、ｍＲＮＡの翻訳を阻害するのに有効であることも示された。一般的には、Ｗａｇｎｅｒ，Ｒ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３７２：３３３−３３５を参照されたい。よって、遺伝子の５’−または３’−非翻訳、非コード領域のいずれかに相補的なオリゴヌクレオチドは、内在性ｍＲＮＡの翻訳を阻害するためのアンチセンスアプローチにおいて使用することができる。ｍＲＮＡの５’未翻訳領域に相補的なポリヌクレオチドは、ＡＵＧ開始コドンの補体を含むべきである。ｍＲＮＡコード領域に相補的なアンチセンスポリヌクレオチドは、翻訳の効率的でない阻害剤である。ｍＲＮＡの５’−、３’−、またはコード領域にハイブリダイズするように設計されるかにかかわらず、アンチセンス核酸は、少なくとも６個のヌクレオチドの長さであるべきであり、好ましくは６〜約５０個の範囲のヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドである。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、少なくとも１０ヌクレオチド、少なくとも１７ヌクレオチド、少なくとも２５ヌクレオチド、または少なくとも５０ヌクレオチドである。
【０１３２】
Ｅ．本明細書に記載される抗体及び結合ポリペプチドの変異型
１．グリコシル化変異型
上記実施形態のいずれかでは、本明細書に提供される抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）または結合ポリペプチド（例えば、ＫＬＫ５結合ポリペプチド）は、抗体または結合ポリペプチドがグリコシル化される程度を増加または減少させるように改変される。グリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作製または除去されるようにアミノ酸配列を改変することによって好都合に達成され得る。
【０１３３】
抗体または結合ポリペプチドがＦｃ領域を含む場合、それに結合した炭水化物が改変され得る。哺乳動物細胞によって産生された天然抗体は、典型的には、Ｎ結合によってＦｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般に結合される分岐状の二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体または結合ポリペプチドにおけるオリゴ糖の修飾は、特定の改善された特性を有する変異型を作製するために行われ得る。
【０１３４】
一実施形態では、Ｆｃ領域に（直接的にまたは間接的に）結合したフコースを欠く炭水化物構造を有する抗体または結合ポリペプチド変異型が提供される。例えば、かかる抗体またはＦｃ融合ポリペプチド中のフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％、または２０％〜４０％であり得る。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６で説明されているＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合体、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計に対する、Ａｓｎ２９７での糖鎖内のフコースの平均量を計算することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指すが、Ａｓｎ２９７はまた、抗体または結合ポリペプチドにおける小規模な配列変異に起因して、２９７位から約±３アミノ酸の上流または下流、すなわち、２９４〜３００位の間に位置してもよい。かかるフコシル化変異型は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）、同第ＵＳ２００４／００９３６２１号（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異型に関する刊行物の例としては：ＵＳ２００３／０１５７１０８、ＷＯ２０００／６１７３９、ＷＯ２００１／２９２４６、ＵＳ２００３／０１１５６１４、ＵＳ２００２／０１６４３２８、ＵＳ２００４／００９３６２１、ＵＳ２００４／０１３２１４０、ＵＳ２００４／０１１０７０４、ＵＳ２００４／０１１０２８２、ＵＳ２００４／０１０９８６５、ＷＯ２００３／０８５１１９、ＷＯ２００３／０８４５７０、ＷＯ２００５／０３５５８６、ＷＯ２００５／０３５７７８、ＷＯ２００５／０５３７４２、ＷＯ２００２／０３１１４０、Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。脱フコシル化抗体を産生することができる細胞株の例としては、ポリペプチドフコシル化が不足したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２４９：５３３−５４５（１９８６）、米国特許出願第ＵＳ２００３／０１５７１０８Ａ１号、Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ、及びＷＯ２００４／０５６３１２Ａ１、Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８、ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）、Ｋａｎｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０−６８８（２００６）、及びＷＯ２００３／０８５１０７を参照されたい）が挙げられる。
【０１３５】
例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖を有する抗体変異型がさらに提供される。かかる抗体変異型は、低減されたフコシル化機能を有しても、及び／または改善されたＡＤＣＣ機能を有してもよい。かかる抗体変異型の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）、米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）、及びＵＳ２００５／０１２３５４６号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に付着しているオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を含む抗体変異型も提供される。かかる抗体変異型は、改善されたＣＤＣ機能を有し得る。かかる抗体変異型は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）、ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）、及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０１３６】
２．Ｆｃ領域変異型
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸修飾は、抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）または結合ポリペプチド（例えば、ＫＬＫ５結合ポリペプチド）のＦｃ領域に導入され得る。Ｆｃ領域変異型は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含み得る。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、提供されるものは、全てではないがいくつかのエフェクター機能を有し、そのためインビボでの抗体または結合ポリペプチドの半減期が重要であるが、特定のエフェクター機能（補体及びＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途に望ましい候補である抗体変異型または結合ポリペプチドである。インビトロ及び／またはインビボ細胞傷害アッセイを行って、ＣＤＣ及び／またはＡＤＣＣ活性の低減／欠乏を確認してもよい。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを実行して、抗体または結合ポリペプチドがＦｃγＲ結合を欠く（故にＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）が、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確実にし得る。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃ（ＲＩＩＩ）のみを発現する一方で、単球は、Ｆｃ（ＲＩ）、Ｆｃ（ＲＩＩ）、及びＦｃ（ＲＩＩＩ）を発現する。造血細胞でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約される。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照されたい）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）、同第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載される。あるいは、非放射性アッセイ法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリーのためのＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ、及びＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照のこと）。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。あるいは、または加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示される動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行して、抗体がＣ１ｑに結合することができないためにＣＤＣ活性を欠くことを確認してもよい。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）、Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １０１：１０４５−１０５２（２００３）、及びＣｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．  ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ  １０３：２７３８−２７４３（２００４）を参照されたい）。ＦｃＲｎ結合及びインビ���クリアランス／半減期の決定は、当該技術分野で既知の方法を使用して行うこともできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：１７５９−１７６９（２００６）を参照されたい）。
【０１３８】
低減したエフェクター機能を有する抗体としては、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９のうちの１つ以上の置換を有するものが挙げられる（米国特許第６，７３７，０５６号）。かかるＦｃ変異体としては、アミノ酸２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７位のうちの２つ以上での置換を有するＦｃ変異体、例えば、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有するいわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体が挙げられる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０１３９】
ＦｃＲへの結合が改善または減少した特定の抗体または結合ポリペプチド変異型が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号、ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい。）いくつかの実施形態では、抗体変異型または結合ポリペプチド変異型は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の２９８、３３３、及び／または３３４位（残基のＥＵ番号付け）での置換を有するＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載されるように、変化した（すなわち、改善されたかまたは減少したかのいずれかの）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらす変化が、Ｆｃ領域において行われる。
【０１４０】
母体ＩｇＧの胎児への移入の原因である、増加した半減期及び新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善された結合を有する抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））は、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載される。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する、１つ以上の置換を内部に有するＦｃ領域を含む。かかるＦｃ変異型は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、または４３４のうちの１つ以上での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換を有するものを含む（米国特許第７，３７１，８２６号）。Ｆｃ領域変異型の他の例に関して、Ｄｕｎｃａｎ＆Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）、米国特許第５，６４８，２６０号、米国特許第５，６２４，８２１号、及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
【０１４１】
３．システイン操作変異型
いくつかの実施形態では、１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン操作された抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）または結合ポリペプチド（例えば、ＫＬＫ５結合ポリペプチド）を作製することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体または結合ポリペプチドのアクセス可能な部位で生じる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それにより抗体のアクセス可能な部位に位置付けられ、抗体または結合ポリペプチドを薬物部分またはリンカー−薬物部分などの他の部分に抱合して、本明細書にさらに記載される免疫抱合体を作製するために使用され得る。いくつかの実施形態では、以下の残基のうちの任意の１つ以上を、システインで置換してもよい：軽鎖のＶ２０５（Ｋａｂａｔ番号付け）；重鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン操作された抗体またはＦｃ融合ポリペプチドは、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。
【０１４２】
４．アミノ酸変異型抗体変異型
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）または結合ポリペプチド（例えば、ＫＬＫ５結合ポリペプチド）のアミノ酸配列変異型が企図される。例えば、抗体または結合ポリペプチドの結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体または結合ポリペプチドのアミノ酸配列変異型は、抗体もしくは結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列中に適切な修飾を導入することによるか、またはペプチド合成により調製され得る。かかる修飾としては、例えば、抗体または結合ポリペプチドのアミノ酸配列内における、残基からの欠失、及び／または残基への挿入、及び／または残基の置換が挙げられる。最終構築物に到達するために欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを行うことができるが、最終構築物が所望の特性、例えば、抗原結合を保有することを条件とする。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異型または結合ポリペプチド変異型が提供される。置換変異原性のための目的の部位は、ＨＶＲ及びＦＲを含む。保存的置換は、表１において「好ましい置換」の見出しの下に示される。より実質的な変化は、表１において「例示的な置換」の見出しの下に提供され、アミノ酸側鎖クラスを参照してさらに以下に記載される。アミノ酸置換は、抗体または結合ポリペプチドに導入され得、生成物は、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについてスクリーニングされ得る。
表１
2020517628.tif 000002
【０１４４】
アミノ酸は、一般的な側鎖特性に従って分類してもよい：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の配向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１４５】
非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【０１４６】
５．誘導体
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）または結合ポリペプチド（例えば、ＫＬＫ５結合ポリペプチド）は、当該技術分野で既知であり、容易に利用可能である追加の非タンパク質性部分を含有するようにさらに修飾することができる。抗体または結合ポリペプチドの誘導体化に適した部分としては、限定するものではないが、水溶性ポリマーが挙げられる。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（ホモポリマーまたはランダムコポリマーのいずれか）、及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、ならびにこれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中でのその安定性のため、製造時に有利であり得る。ポリマーは、いずれの分子量のものであってもよく、分岐状であっても非分岐状であってもよい。抗体及び／または結合ポリペプチドに結合したポリマーの数は異なってもよく、２つ以上のポリマーが結合している場合、それらは同じまたは異なる分子であり得る。一般に、誘導体化に使用されるポリマーの数及び／または種類は、改善される抗体及び／または結合ポリペプチドの特定の特性または機能、抗体誘導体及び／または結合ポリペプチドが定義された条件下である療法に使用されるかなどを含むが、これらに限定されない、考慮すべき事項に基づいて決定され得る。
【０１４７】
別の実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱され得る、抗体及び／または結合ポリペプチドの非タンパク質性部分との抱合体が提供される。一実施形態では、非タンパク質性部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２：１１６００−１１６０５（２００５））。放射線は、いずれの波長のものであってもよく、これには、限定するものではないが、通常の細胞を傷つけないが、抗体及び／または結合ポリペプチド−非タンパク質性部分に近接する細胞が殺滅される温度まで非タンパク質性部分を加熱する波長が含まれる。
【０１４８】
ＩＶ．薬学的製剤及び投与方法
本明細書に記載されるＫＬＫ５アンタゴニストの薬学的製剤は、所望の純度を有するかかるアンタゴニストを、凍結乾燥した製剤または水溶液の形態にある１つ以上の任意の薬学的に許容される担体と混合することによって調製される。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＫＬＫ５アンタゴニストは、抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）、結合ポリペプチド（例えば、ＫＬＫ５結合ポリペプチド）、ポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有するｓｇＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡなどのＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニスト）、及び小分子（例えば、小分子プロテアーゼ阻害剤）である。
【０１４９】
薬学的に許容される担体は、一般に、用いられる投薬量及び濃度ではレシピエントに非毒性であり、それらとしては、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質；防腐剤（例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書における例示的な薬学的に許容される担体は、可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）などのヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質などの介在性薬物分散剤をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び同第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、コンドロイチナーゼなどの１つ以上の追加のグリコサミノグリカナーゼと組み合わせられる。
【０１５０】
例示的な凍結乾燥製剤は、米国特許第６，２６７，９５８号に記載されている。水性抗体製剤には、米国特許第６，１７１，５８６号及びＷＯ２００６／０４４９０８号に記載されるものが含まれ、後者の製剤は、ヒスチジン−酢酸緩衝液を含む。
【０１５１】
本明細書における製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な２つ以上の活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有してもよい。かかる活性成分は、意図される目的に有効な量で組み合わせて好適に存在する。
【０１５２】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、もしくは界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチンマイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルにより、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロ乳濁液、ナノ粒子、及びナノカプセル）内、またはマクロ乳濁液中にも取り込まれ得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照されたい。
【０１５３】
徐放性調製物が調製されてもよい。徐放性調製物の好適な例としては、ＫＬＫ５アンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられ、これらのマトリックスは、成形物品、例えば、フィルム、またはマイクロカプセルの形態である。
【０１５４】
インビボ投与に使用される製剤は一般に、滅菌される。滅菌性は、例えば、滅菌ろ過膜を通したろ過によって容易に達成され得る。
【０１５５】
本明細書にさらに提供されるものは、本明細書に記載される方法における使用のためのＫＬＫ５アンタゴニストを含む薬学的製剤である。いくつかの実施形態では、製剤は、薬学的に許容される担体、アジュバント、またはビヒクルを含む。いくつかの実施形態では、製剤は、ＫＬＫ５プロテアーゼ活性を測定可能な程度に阻害するのに有効な量の化合物を含む。いくつかの実施形態では、製剤は、それを必要とする対象への投与のために製剤化される。
【０１５６】
ＫＬＫ５アンタゴニストを含む製剤は、経口、非経口、吸入スプレーにより、局所、経皮、直腸、経鼻、口腔内、舌下、経膣、腹腔内、肺内、皮内、硬膜外、または移植リザーバーを介して投与され得る。本明細書で使用される場合、「非経口」という用語は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内及び頭蓋内注射または注入技術を含む。
【０１５７】
任意の特定の対象に対する特定の投薬量及び治療レジメンは、年齢、体重、一般的健康状態、性別、食事、投与時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、治療する医師の判断、及び治療される特定の疾患の重症度を含む、様々な因子に依存するであろう。製剤中の提供されるＫＬＫ５アンタゴニストの量も、製剤中の特定の化合物に依存するであろう。
【０１５８】
一実施形態では、用量あたり投与されるＫＬＫ５アンタゴニストの有効量は、１日あたり対象体重の約０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇ、代替的に約０．１〜２０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、使用される化合物の典型的な初期範囲は、０．３〜１５ｍｇ／ｋｇ／日である。
【０１５９】
ＫＬＫ５アンタゴニストは、単独でまたは上述の治療のための他の薬剤と組み合わせて使用され得る。例えば、薬学的併用製剤または投与計画の第２の薬剤は、それらが互いに悪影響を及ぼさないように、ＫＬＫ５アンタゴニストに対して相補的な活性を有し得る。化合物は、単位薬学的製剤において共に、または別々に投与され得る。
【０１６０】
「同時投与する」という用語は、ＫＬＫ５アンタゴニストと、さらなる活性薬学的成分（複数可）との、同時投与、または別個の連続投与の任意の方法のいずれかを指す。投与が同時ではない場合、化合物は、互いに近い時間で投与される。さらに、化合物が同じ剤形で投与されるかは問題ではなく、例えば、１つの化合物は局所投与され得、別の化合物は経口投与され得る。
【０１６１】
典型的には、治療される疾患または状態に対する活性を有する任意の薬剤は、同時投与され得る。かかる薬剤の例は、Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｖ．Ｔ．Ｄｅｖｉｔａ  ａｎｄ  Ｓ．Ｈｅｌｌｍａｎ（ｅｄｉｔｏｒｓ），６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｆｅｂｒｕａｒｙ  １５，２００１），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにおいて見出すことができる。当業者であれば、関与する薬物及び疾患の特定の特徴に基づいて、薬剤のどの組み合わせが有用であるか識別することができるであろう。
【０１６２】
Ｖ．所望の機能を有するＫＬＫ５アンタゴニストをスクリーニング及び／または特定する方法
抗体（例えば、抗ＫＬＫ５抗体）、結合ポリペプチド（例えば、ＫＬＫ５結合ポリペプチド）、ポリヌクレオチド（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を有するｓｇＲＮＡを含む、ｓｉＲＮＡまたはＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡなどのＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニスト）、及び小分子（例えば、小分子プロテアーゼ阻害剤などのＫＬＫ５小分子アンタゴニスト）を含む、本明細書に記載される方法における使用のための追加のＫＬＫ５アンタゴニストは、それらの物理的／化学的特性及び／または生物学的活性について、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、特定され得るか、スクリーニングされ得るか、または特徴付けられ得る。
【０１６３】
候補ＫＬＫ５アンタゴニストは、化学実体または断片がＫＬＫ５上の個別の結合標的部位と関連するそれらの能力についてスクリーニング及び選択される、一連のステップの手段によって計算的に評価及び設計され得る。当業者は、ＫＬＫ５、及びより具体的にはＫＬＫ５上の標的部位と関連するそれらの能力について化学実体または断片をスクリーニングするいくつかの方法のうちの１つを使用し得る。プロセスは、例えば、コンピュータ画面上の標的部位の、ＫＬＫ５座標、または当該技術分野で既知のそれらの座標のサブセットに基づく、目視検査によって開始し得る。
【０１６４】
スクリーニング及び／または特定する方法のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、候補ＫＬＫ５アンタゴニストは、抗ＫＬＫ５抗体、ＫＬＫ５結合ポリペプチド（例えば、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドまたはＳＰＩＮＫ９  Ｆｃ融合ポリペプチド）、ＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニスト、またはＫＬＫ５小分子アンタゴニストである。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ＫＬＫ５の生物学的活性を実質的にまたは完全に阻害する。いくつかの実施形態では、生物学的活性は、セリンプロテアーゼ活性である。いくつかの実施形態では、生物学的活性は、トリプシン様セリンプロテアーゼ活性である。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ＫＬＫ５上の特異的結合領域に結合する。いくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、ＫＬＫ５の活性部位に結合する。
【０１６５】
本明細書に提供される抗ＫＬＫ５抗体、ＫＬＫ５結合ポリペプチド、ＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニスト、及び／またはＫＬＫ５小分子アンタゴニストは、それらの物理的／化学的特性及び／または生物学的活性について、当該技術分野で既知の様々なアッセイによって、特定され得るか、スクリーニングされ得るか、または特徴付けられ得る。
【０１６６】
一態様では、本明細書に提供される抗ＫＬＫ５抗体、ＫＬＫ５結合ポリペプチド、ＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニスト、及び／またはＫＬＫ５小分子アンタゴニストは、そのＫＬＫ５結合活性について、例えば、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロッティング分析、スキャッチャードによる細胞表面結合、または表面プラズモン共鳴などの既知の方法によって試験される。別の態様では、ＫＬＫ５への結合について本明細書に提供される抗ＫＬＫ５抗体またはＫＬＫ５結合ポリペプチドと競合する抗体を特定するために、競合アッセイが使用され得る。さらなる態様では、本明細書に提供される抗ＫＬＫ５抗体またはＫＬＫ５結合ポリペプチドは、生物学的試料中に存在するＫＬＫ５の存在または量を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、生物学的試料は、試料中の任意のＦｃ受容体を飽和するために、まず非特異的アイソタイプ対照抗体で遮断される。
【０１６７】
一態様では、アッセイは、本明細書に提供される抗ＫＬＫ５抗体またはＫＬＫ５結合ポリペプチドの生物学的活性を特定するために提供される。いくつかの実施形態では、生物学的活性を特定するためのかかるアッセイは、例えば、ペプチド基質アッセイまたは結合アッセイである。抗ＫＬＫ５抗体またはＫＬＫ５結合ポリペプチドの生物学的活性は、例えば、ＫＬＫ５に結合すること、及びそれによってＫＬＫ５の生物学的活性を低減することを含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＫＬＫ５抗体またはＫＬＫ５結合ポリペプチドの生物学的活性は、ＫＬＫポリペプチド（例えば、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、及びＫＬＫ１４）の他の種に結合すること、及びそれによってそれらの生物学的活性を低減することを含み得る。
【０１６８】
ＶＩ．製造物品
別の態様では、上述の障害の治療、予防、及び／または診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器上のもしくは容器に関連するラベルまたは添付文書とを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る。容器は、それ自体で、または別の製剤との組み合わせで、状態の治療、予防、及び／または診断に有効な製剤を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈注射用溶液バッグまたは皮下注射針によって穿孔可能な栓を有するバイアルであり得る）。製剤中の少なくとも１つの活性剤は、本明細書に記載されるＫＬＫ５アンタゴニストである。ラベルまたは添付文書は、製剤が、選択される状態を治療するために使用されることを示す。また、製造物品は、（ａ）ＫＬＫ５アンタゴニストを含む製剤を内部に収容した第１の容器と、（ｂ）喘息療法剤を含む製剤を内部に収容した第２の容器とを含み得る。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、製造物品は、容器、その容器上のラベル、及びその容器内に収容される製剤を含み、製剤は、１つ以上の試薬（例えば、１つ以上のバイオマーカーまたは本明細書に記載されるバイオマーカーのうちの１つ以上に対するプローブ及び／またはプライマーに結合する一次抗体）を含み、容器上のラベルは、製剤が試料中の１つ以上のバイオマーカーの存在を評価するために使用され得ること、及び試料中の１つ以上のバイオマーカーの存在を評価するために試薬を使用するための説明を示す。製造物品は、試料の調製及び試薬の利用のための説明及び材料のセットをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、製造物品は、一次抗体及び二次抗体の両方などの試薬を含んでもよく、二次抗体は、標識、例えば、酵素標識に抱合される。いくつかの実施形態では、製造物品は、本明細書に記載されるバイオマーカーのうちの１つ以上に対する１つ以上のプローブ及び／またはプライマーを含む。
【０１７０】
製造物品のうちのいずれかのいくつかの実施形態では、ＫＬＫ５アンタゴニストは、本明細書に提供される抗ＫＬＫ５抗体、ＫＬＫ５結合ポリペプチド、ＫＬＫ５ポリヌクレオチドアンタゴニスト、及び／またはＫＬＫ５小分子アンタゴニストである。
【０１７１】
この実施形態における製造物品は、製剤が特定の状態を治療するために使用され得ることを示す添付文書をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、添付文書は、ＫＬＫ５アンタゴニストを喘息療法剤として投与するための説明を含む。あるいは、または加えて、製造物品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液、及びデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の（または第３の）容器をさらに含み得る。これは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業的及びユーザー観点から望ましい他の材料をさらに含み得る。
【０１７２】
製造物品における他の任意の成分としては、１つ以上の緩衝液（例えば、ブロック緩衝液、洗浄緩衝液、基質緩衝液など）、酵素標識により化学的に変化する基質（例えば、クロモゲン）などの他の試薬、エピトープ抽出溶液、対照試料（正及び／または負の対照）、対照スライド（複数可）などが挙げられる。
【実施例】
【０１７３】
以下は、方法及び製剤の例である。上述の概要を考慮すると、様々な他の実施形態が実施され得ることが理解される。本明細書に提供される任意及び全ての例または例示的な言語（例えば、「〜など」）の使用は、単に実施形態を良好に解明することを意図しており、特許請求の範囲において特に具体的に列挙されない限り、必ずしも任意の制限を課すものではない。本明細書に引用される全ての文書は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【０１７４】
実施例１
材料及び方法
全ての施設内研究は、地方施設内審査委員会によって審査及び承認された。加えて、全ての対象は、遺伝子型判定前にインフォームドコンセントを与えた。遺伝子型判定は、表２にまとめる様々な異なるプラットフォーム上で行われた。
表２
2020517628.tif 000003
【０１７５】
試料ＱＣを、この順序（１）コールレート＜９５％（Ｎ＝８４除去）（２）ヘテロ接合性（Ｎ＝８２除去）（３）関連性／重複／ＩＢＤ（Ｎ＝２２除去）（４）祖先外れ値（Ｎ＝２６２除去）で行った。各別個のデータセットについて、ＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴ分析をＨａｐＭａｐ試料で行い、ヨーロッパ（ＣＥＰＨ及びＴＳＩ）群に関して外れ値であった場合に試料を除外した（Ｎ＝３８３）。
【０１７６】
ＳＮＰ  ＱＣを行い、（１）コールレート＜９５％を有した場合、（２）単型であった場合、及び（３）ハーディー−ワインベルグ平衡（Ｐ＜１ｘ１０−７）から強く逸脱した場合、ＳＮＰを除外した。そのビルドにアラインされていないデータセットについてｈｇ１９へのリフトオーバーを行った。加えて、代入パイプラインは、ＨａｐＭａｐデータがプラス鎖上にあったので、全てのデータセットがプラスにアラインされることを必要とする。Ｓｈａｐｅｉｔを使用して鎖の問題を確認し、可能な場合はプラス鎖にひっくり返した。最後に、代入についてｃｈｒ１−ｃｈｒ２２におけるＳＮＰを選択した。合わせた発見データセットは、喘息症例データセット及び集団に基づくデータセットに重複する２９９，７８４個のＳＮＰを有した。複製データセットを構成する８つの異なる症例及び対照データセットに重複する２３０，８５３個のＳＮＰがあった。
【０１７７】
ゲノムワイド代入を、ＨａｐＭａｐ参照ハプロタイプ及び品質管理を通る遺伝子型データを推論として用いて行った。代入後遺伝子型隔離をＳＮＰＴＥＳＴｖ２においてロジスティック回帰モデルに使用した。加えて、発見データセットを、重要な主成分について調節することによって集団層化及び複製データセットのために調節し、分散の＞１％を説明するＰＣを選択した（以下参照）。代入情報＜０．６を有するＳＮＰを分析から除外した。追加の分析後ＱＣは、対照においてＭＡＦ＜２％を有する任意のＳＮＰならびに組み合わされた症例及び対照においてＨＷＥ  ｐ値＜１Ｅ−１０を有するＳＮＰの除去を含む。次いでＰＬＩＮＫを用いて、発見及び複製結果についてメタ分析を行った。０．１の異質性ｐ値カットオフを用いて、メタ分析には固定効果またはランダム効果モデルが使用されるべきかを決定した。
【０１７８】
この分析において使用されるＧＴＥｘデータは、オンラインＧＴＥｘ  Ｐｏｒｔａｌ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｔｅｘｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ／ｔｅｓｔｙｏｕｒｏｗｎ）から得た。検索は、２０１６年１１月１１日に行われ、ＫＬＫ５について入力されたコマンドは、ｒｓ１１７６３９５１２，ＫＬＫ５，Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ＿Ｇａｓｔｒｏｅｓｏｐｈａｇｅａｌ＿Ｊｕｎｃｔｉｏｎ；  ｒｓ１１７６３９５１２，ＫＬＫ５，Ｅｓｏｐｈａｇｕｓ＿Ｍｕｓｃｕｌａｒｉｓ；  ｒｓ１１７６３９５１２，ＫＬＫ５，Ｓｋｉｎ＿Ｎｏｔ＿Ｓｕｎ＿Ｅｘｐｏｓｅｄ＿Ｓｕｐｒａｐｕｂｉｃ；  ｒｓ１１７６３９５１２，ＫＬＫ５，Ｓｋｉｎ＿Ｓｕｎ＿Ｅｘｐｏｓｅｄ＿Ｌｏｗｅｒ＿ｌｅｇであった。ＫＬＫ４について入力されたコマンドは、ｒｓ１１７６３９５１２，ＫＬＫ４，Ｐｒｏｓｔａｔｅ；  ｒｓ１１７６３９５１２，ＫＬＫ４，Ｕｔｅｒｕｓであった。
【０１７９】
ＫＬＫ５に対するＳＰＩＮＫ９の結合親和性を、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）−Ｔ２００装置を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）によって測定した。インハウスで発現したマウスＩｇＧ２ａ断片結晶化可能領域（Ｆｃ）を有するＳＰＩＮＫ９を、タンパク質Ａバイオセンサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号２９１２７５５７）によって捕捉して約１００応答単位（ＲＵ）を達成した。動態測定のために、ヒトＫＬＫ５結合ポリペプチドの４倍段階希釈物（２００ｎＭ〜０．１９５３ｎＭ）を、３０μｌ／分でＨＢＳ−Ｔ緩衝液に２５℃で注入した。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデル（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｔ２００  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン２．０）を用いて計算した。平衡解離定数（ＫＤ）をｋｏｆｆ／ｋｏｎ比として計算した。
【０１８０】
メタ分析において使用される対象
合計１，３５０人の成人喘息患者及び３，６９０人の対照をメタ分析に使用した。これらのうち、品質管理手段後、６６７人の喘息患者は低２型喘息（低ペリオスチンと呼ばれる）群に、６２６人は２型炎症（高ペリオスチンと呼ばれる）群に含まれた。症例の平均年齢は４５歳（ＳＤ＝１５）であり、対照について４１歳（ＳＤ＝１５）であった。全ての対象はヨーロッパコーカソイド系であった。対象の大部分（５７．８％）は女性であった。予測された平均ＦＥＶ１％は、症例において７２．９（ＳＤ＝１７）及び対照において１０１．６（ＳＤ＝８）であった。症例及び対照は２つのコホートに分けられた。コホート１は、レブリキズマブ（抗ＩＬ−１３）及びＸｏｌａｉｒ（抗ＩｇＥ）についてのＧｅｎｅｎｔｅｃｈ観察及び臨床試験から得られた喘息患者のＤＮＡ試料を含んだ（合計Ｎ＝５２０）。コホート２は、レブリキズマブ（Ｎ＝２３４）についてのＧｅｎｅｎｔｅｃｈ臨床試験から、ならびにＱｕｅｅｎｓｌａｎｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｎ＝７７４）及びＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ（Ｎ＝２２６）で確認された成人喘息患者から得られたＤＮＡ試料の完全に独立したセットを含んだ。試料は、遺伝的に決定された祖先に基づいて選択された対照と比較され（コホート１、Ｎ＝３、１２０）、喘息について陰性であることが呼吸器科医によってスクリーニングされた（コホート２、Ｎ＝１、１４６）。全ての症例、及びコホート２からの対照を血清ペリオスチンレベルについてアッセイし、ペリオスチンレベル中央値を使用して、対象を低ペリオスチン及び高ペリオスチン下位群に分けた。各コホートの特徴を表３に示した。表は、ＱＣを通り、分析に含まれた試料のみを含む。
表３
2020517628.tif 000004
＊）年齢データは、６９≦５４歳、４８９＝５５〜５９歳、７６１＝６０〜６４歳、８１０＝６５〜６９歳、５０３＝７０〜７４歳、１５３≧７５歳の範囲内である。
【０１８１】
既知の喘息リスクアレル分析
現在、２型炎症及び低２型喘息患者の間の遺伝的異質性は不明である。研究集団を、記載されるように、ペリオスチンレベルに基づいて層化した。Ｃｏｒｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５，１０８８−１０９８（２０１１）を参照されたい。既知の喘息リスクアレルのアレル頻度をまず、高ペリオスチン症例（Ｎ＝６２６）と対照（Ｎ＝１，６９６）、及び低ペリオスチン症例（Ｎ＝６６７）と対照（Ｎ＝１，８８７）との間で比較した。高ペリオスチン及び低ペリオスチン下位群について対照と比較した効果サイズの改良を決定した。結果を図１及び表４に示す。既知の喘息遺伝子（例えば、ＴＳＬＰ、ＩＬ４、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ６Ｒ）のうちのいくつかは、下位群間で差異を示さなかった。いくつかのＴｈ２関連遺伝子座（例えば、ＧＡＴＡ３及びＩＬ３３）のオッズ比（ＯＲ）は、高ペリオスチン下位群において改良された。ＰＤＥ４Ｄ遺伝子座は、高ペリオスチン下位群において本質的にゼロのＯＲ（ＯＲ＝０．９６）及び低ペリオスチン下位群において強力な改良（Ｐ＝６．０ｘ１０−４、ＯＲ＝１．３）を示した。これは、直接的に低及び高ペリオスチン症例の間に統計的に異なるアレル頻度を示す唯一の遺伝子座であった（Ｐ＝０．０２）。よって、観察された公開喘息遺伝子座の多くは全喘息遺伝子座であり、これは、これらの研究が２型炎症状態に基づいて対象を区別しなかったとすると、直感的である。しかしながら、他の遺伝子座は下位群間で異なり、新規遺伝子座が喘息集団をペリオスチン状態によって分けるとき明らかになるであろうことを示した。前述の知識不足及びこの患者集団の周りの予測される満たされていない医学的必要性を考慮して、低ペリオスチン喘息下位群に注目した。
2020517628.tif 000005
【０１８２】
低ペリオスチン喘息対対照ＧＷＡＳ
血清ペリオスチンレベル測定値を有する健常対照（Ｎ＝７９０）を使用して、ペリオスチンを連続形質として使用するＧＷＡＳを行い、ゲノムワイド有意性に到達する遺伝子座がないことを見出した。これは、正常対照におけるペリオスチンレベルが強い遺伝的影響下になかったことを示した。したがって、低ペリオスチン喘息（Ｎ＝６６７）対対照（Ｎ＝１，８８７）ＧＷＡＳにおける全体的な対照集団を使用した。対照におけるペリオスチンレベルとの関連についてこの分析においてゲノムワイド有意性に到達する全ての興味深いＳＮＰは、ＳＮＰ（複数可）が、単純に末梢ペリオスチンのレベルとではなく、低２型炎症喘息と特異的に関連していたことを決定するために試験した。合計で、ＳＮＰ  ｒｓ１１７６３９５１２の１つの関連は、ゲノムワイド有意性の閾値を超えることが観察された（Ｐ＝２．７５ｘ１０−８、ＯＲ＝０．３３、図２）。Ｐ＜１ｘ１０−５（ＬＤプルーン）を有するＳＮＰの完全リストを表５に示す。ＳＮＰ  ｒｓ１１７６３９５１２の詳細情報を表６に示す。ｒｓ１１７６３９５１２  ＳＮＰは、ペリオスチン測定値を有する対照のサブセットにおける末梢ペリオスチンレベルと関連付けられなかった（Ｐ＝０．９９）。加えて、集団はまた、低ペリオスチン喘息患者における関連が低ＥＯＳ喘息患者においても見られたかを確認するために、好酸球（ＥＯＳ）レベル（低ＥＯＳのレベル＜３００ｎｇ／ｍＬ）について層化した。両方は、２型活性の指標であったが、完璧には相関しなかった（ρ＝０．２３）。Ａｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ａｍ  Ｔｈｏｒａｃ  Ｓｏｃ  １０  Ｓｕｐｐｌ，Ｓ２０６−２１３（２０１３）を参照されたい。ＳＮＰ  ｒｓ１１７６３９５１２を、対照（Ｎ＝１，７６８）と比較して低ＥＯＳを有する喘息症例（Ｎ＝３９０）における関連について試験し、低ペリオスチン分析（Ｐ＝０．００８、ＯＲ＝０．５１）において見られるものと同様の方向の効果を見出した。ＳＮＰ  ｒｓ１１７６３９５１２は、ＤＮＡの５００ｋｂストレッチ以内に１１個のＫＬＫを含有する大カリクレイン（ＫＬＫ）遺伝子クラスター遺伝子座に位置した（図３）。このＳＮＰは、ＫＬＫ５遺伝的配列に位置した。関連は、Ｐ値が高２型炎症患者において有意でなかったように、低２型喘息に特異的であると思われた（表６：ｒｓ１１７６３９５１２の詳細関連分析、Ｐ＝０．６３、ＯＲ＝１．１１）。
2020517628.tif 000006
2020517628.tif 000007
【０１８３】
ＫＬＫ５は、この遺伝子座の候補遺伝子である
この遺伝子座における関連遺伝子を特定するために、ｍＲＮＡ発現パターンをまず調査した。公表されているデータベースを使用して、ＫＬＫ４は主に前立腺及び子宮内膜において発現し、ＫＬＫ５は主に食道及び皮膚において発現した。Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４４，Ｄ３１３−３１６（２０１６）を参照されたい。ＧＴＥｘポータルデータベース（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４８，６４８−６６０（２０１５）参照）をクエリして、主に発現した組織におけるＫＬＫ４及びＫＬＫ５  ｍＲＮＡレベルに対するｒｓ１１７６３９５１２の考えられる機能的効果を調査した。ＫＬＫ４に対するｒｓ１１７６３９５１２の効果は、ＧＴＥｘデータベースでは両方の組織において単型であったように、前立腺または子宮において評価することができなかった。ＧＴＥｘは、食道及び皮膚（食道−胃食道接合部及び筋層、皮膚−日光曝露及び日光非曝露）について合計４つの組織を含有する。ＫＬＫ５  ｅＱＴＬは、少なくとも部分的にＳＮＰの低マイナーアレル頻度（ヨーロッパコーカソイド集団において０．０１〜０．０５、Ｇｅｎｏｍｅｓ  Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ａｕｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５２６，６８−７４（２０１５）参照）のために、これらの組織のうちのいずれにおいても統計的有意性（日光曝露皮膚において最低Ｐ＝０．０５１）に到達しなかった。ヒト遺伝的変異の汎用参照。食道−ＧＥ接合部を除く全ての組織は、メジャーアレルホモ接合体と比較してヘテロ接合体においてＫＬＫ５のより低いｍＲＮＡレベルを示した。比較のためのデータベースには、マイナーアレルホモ接合体は存在しなかった。よって、ｒｓ１１７６３９５１２のマイナーアレルは、より低いＫＬＫ５  ｍＲＮＡレベルと関連していたと思われるが、ｒｓ１１７６３９５１２の低マイナーアレル頻度のために、この仮説を確認するのにより大きなデータベースが必要である。目的の、ネザートン症候群は、遺伝子ＳＰＩＮＫ５における突然変異によって引き起こされる。Ｄｅｓｃａｒｇｕｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３７，５６−６５（２００５）を参照されたい。ＳＰＩＮＫ５はＬＥＫＴＩをコードし、これはＫＬＫ５及びＫＬＫ７のセリンプロテアーゼ阻害剤である。Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３８６，１１７３−１１８４（２００５）を参照されたい。ＳＰＩＮＫ５における突然変異は、高度に上方調節されたＫＬＫ５発現をもたらし、これはひいてはＰＡＲ２（プロテアーゼ活性化受容体２）依存性及び非依存性経路によって炎症を誘発する。Ｈｏｖｎａｎｉａｎ，Ａ．，Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ  ３５１，２８９−３００（２０１３）を参照されたい。ネザートン症候群は最も一般的には皮膚障害と関連付けられたが、喘息はいくつかの症例における併存症である。Ｊｕｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １３１，６１５−６２１（１９９４）を参照されたい。よって、連鎖不平衡、発現パターン、及び症候性併存症に基づき、ＫＬＫ５は、この遺伝子座の最適な候補遺伝子である。さらに、ｅＱＴＬ分析からの効果の方向は、このＳＮＰの保護ＯＲと一貫しており、より低いＫＬＫ５レベルは、喘息リスク��ら保護すると思われる。
【０１８４】
ＫＬＫ５阻害の決定のためのアッセイ
組換えＫＬＫ５直接活性アッセイを使用して、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチド及びｍＡｂ１１０８などのＫＬＫ５阻害剤によってヒトカリクレイン５（ＫＬＫ５）の阻害を測定した。組換えヒトＫＬＫ５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、直接アッセイ緩衝液（７５ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）に５ｎＭまで希釈し、３８４ウェルアッセイプレート（３８４ウェルローボリューム、黒色、丸底、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４５１４）において抗ＫＬＫ５抗体と組み合わせた。抗体は、リン酸試料緩衝液（７０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６）、２００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）またはクエン酸／トリス試料緩衝液（１０ｍＭのクエン酸、３０ｍＭのトリス（ｐＨ６）、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）のいずれかにおいて供給された。抗体希釈物を、適切な試料緩衝液中または直接アッセイ緩衝液中で作製した。プレートを３０分間周囲温度でインキュベートした。蛍光ペプチド基質、Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｐａｒｔ  Ｎｏ．Ｉ−１１２０）をアッセイプレートに直接添加した。最終ウェル中濃度は、５０μＭのＢｏｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣ、５ｎＭの組換えヒトＫＬＫ５、及び０．１９〜１００ｎＭの抗ＫＬＫ５抗体であった。プレートを、３４０ｎｍ励起／４６０ｎｍ発光モジュールを使用するＰＨＥＲＡｓｔａｒ（登録商標）Ｐｌｕｓリーダーを用いて３０〜６０分間にわたって１０２秒毎に調査した。ＲＦＵ／秒の反応速度を、典型的には２０４秒で開始し、アッセイ終了まで継続する、線形範囲における読み取り値の線形回帰によって計算した。緩衝液単独及び１００ｎＭの最終ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、それぞれ、１００％及び０％の活性対照として使用した。抗ＫＬＫ５抗体のＩＣ５０は、それらのそれぞれの曲線の４パラメータフィットから決定した。
【０１８５】
結合ｐｒｏ−ＫＬＫ７蛍光ペプチドアッセイを使用して、抗ＫＬＫ５抗体によってヒトカリクレイン５（ＫＬＫ５）の阻害を測定した。組換えヒトＫＬＫ５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、抗体試料がクエン酸／トリス試料緩衝液中にある場合、ｐｒｏ−ＫＬＫ７クエン酸／トリス結合緩衝液（５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）、または抗体試料がリン酸試料緩衝液中にある場合、ｐｒｏ−ＫＬＫ７リン酸結合緩衝液（５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）に５ｎＭまで希釈した。希釈したＫＬＫ５を次いで、３８４ウェルアッセイプレート（３８４ウェルローボリューム、黒色、丸底、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４５１４）において抗ＫＬＫ５抗体と組み合わせた。抗体希釈物を、直接ＫＬＫ５アッセイについて記載されるように作製した。プレートを３０分間周囲温度でインキュベートした。蛍光ペプチド基質、ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｐａｒｔ  Ｎｏ．Ｉ−１３９５）及びｐｒｏ−ＫＬＫ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、アッセイプレートに直接添加し、周囲温度でインキュベートした。最終ウェル中濃度は、１００μＭのｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、１２５ｎＭのｐｒｏ−ＫＬＫ７、５ｎＭの組換えヒトＫＬＫ５、及び０．１９〜１００ｎＭの抗ＫＬＫ５抗体であった。２４時間後、蛍光読み取りを３０〜６０分間にわたって１０２秒毎に行い、最後の５つの読み取り値を平均することによってＲＦＵエンドポイント値を計算した。緩衝液単独及び１００ｎＭの最終ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、それぞれ、１００％及び０％の活性対照として使用した。抗ＫＬＫ５抗体のＩＣ５０は、それらのそれぞれの曲線の４パラメータフィットから決定した。
【０１８６】
組換えＫＬＫ７蛍光ペプチドアッセイを使用して、ＫＬＫ５阻害剤の選択性を決定した。組換えヒトＫＬＫ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、ｐｒｏ−ＫＬＫ７リン酸結合緩衝液（５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）中のＫＬＫ５で活性化した。希釈したＫＬＫ７を次いで、３８４ウェルアッセイプレート（３８４ウェルローボリューム、黒色、丸底、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号４５１４）においてＫＬＫ５阻害剤と組み合わせた。阻害剤希釈物を、直接ＫＬＫ５アッセイについて記載されるように作製した。プレートを５０分間周囲温度でインキュベートした。蛍光ペプチド基質、ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ（Ｂａｃｈｅｍ、Ｐａｒｔ  Ｎｏ．Ｉ−１３９５）及びｐｒｏ−ＫＬＫ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、アッセイプレートに直接添加し、周囲温度でインキュベートした。最終ウェル中濃度は、１００μＭのｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣ、１２５ｎＭのｐｒｏ−ＫＬＫ７、５ｎＭの組換えヒトＫＬＫ５、及び０．１９〜１００ｎＭのＫＬＫ５阻害剤であった。２４時間後、蛍光読み取りを３０〜６０分間にわたって１０２秒毎に行い、最後の５つの読み取り値を平均することによってＲＦＵエンドポイント値を計算した。緩衝液単独及び１００ｎＭの最終ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を、それぞれ、１００％及び０％の活性対照として使用した。ＫＬＫ５阻害剤のＩＣ５０は、それらのそれぞれの曲線の４パラメータフィットから決定した。
【０１８７】
ｐｒｏ−ＫＬＫ７アッセイを、ＩＣ５０決定のためのＬＣ／ＭＳによるＫＬＫ５誘導開裂ペプチド検出を用いて行った。ｐｒｏ−ＫＬＫ７アッセイを行うために、酵素ＫＬＫ５と基質ｐｒｏ−ＫＬＫ７との間の反応からの生成物ペプチドＥＥＡＱＧＤＫ（配列番号３０）を、液体クロマトグラフィーと結合した質量分析法によって検出した。全ての化合物を、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液（粉末／認定、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａ６４３−５００）で希釈し、５ｎＭのＫＬＫ５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及び０．０１〜１２ｎＭの範囲の阻害剤でのアッセイにおける最終濃度で、９６ウェルプレート（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈａｒｄ−Ｓｈｅｌｌ  ９６−Ｗｅｌｌ  ＰＣＲ  Ｐｌａｔｅｓ、低プロファイル、薄肉、スカート状、青／透明＃ＨＳＰ９６３１）において希釈した。使用された阻害剤は、ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びｍＡｂ１１０８（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ  Ｃｌｏｎｅ  ＃１９３３１８、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）であった。プレートを３０分間室温でインキュベートした。その後、１５ｎＭの基質ｐｒｏ−ＫＬＫ７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を酵素及び阻害剤に添加した。２時間後、反応物を、０．５ｕＬのギ酸（９９．５＋％、Ｏｐｔｉｍａ（商標）ＬＣ／ＭＳグレード、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａ１１７−１０Ｘ１ＡＭＰ）を用いて反応停止させた。ペプチドを、以下の質量の組み合わせを用いて検出した：ＱＴＲＡＰ  ６５００  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析計（Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）においてＱ１、３８８．７ｍ／ｚ及びＱ３、３１９．０ｍ／ｚ。生成されたペプチドの定量を、合成ＫＬＫ７ペプチド較正曲線を用いて測定した。ＩＣ５０値は、Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて決定した。
【０１８８】
ｐｒｏ−ＫＬＫ１アッセイを、ＩＣ５０決定のためのＬＣ／ＭＳによるＫＬＫ５誘導開裂ペプチド検出を用いて行った。ｐｒｏ−ＫＬＫ１アッセイを行うために、酵素ＫＬＫ５と基質ｐｒｏ−ＫＬＫ１との間の反応からの生成物ペプチドＡＰＰＩＱＳＲ（配列番号３１）を、液体クロマトグラフィーと結合した質量分析法によって検出した。全ての化合物を、５０ｍＭの重炭酸アンモニウム緩衝液（粉末／認定、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａ６４３−５００）で希釈し、０．５ｎＭのＫＬＫ５（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及び０．０１〜１２ｎＭの範囲の阻害剤でのアッセイにおける最終濃度で、９６ウェルプレート（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈａｒｄ−Ｓｈｅｌｌ  ９６−Ｗｅｌｌ  ＰＣＲ  Ｐｌａｔｅｓ、低プロファイル、薄肉、スカート状、青／透明＃ＨＳＰ９６３１）において希釈した。使用された阻害剤は、ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）及びｍＡｂ１１０８（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ２ｂ  Ｃｌｏｎｅ  ＃１９３３１８、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）であった。プレートを６０分間室温でインキュベートした。その後、３００ｎＭの基質ｐｒｏ−ＫＬＫ１（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）を酵素及び阻害剤に添加した。２０分後、反応物を、０．５ｕＬのギ酸（９９．５＋％、Ｏｐｔｉｍａ（商標）ＬＣ／ＭＳグレード、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａ１１７−１０Ｘ１ＡＭＰ）を用いて反応停止させた。ペプチドを、以下の質量の組み合わせを用いて検出した：ＱＴＲＡＰ  ６５００  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析計（Ｓｃｉｅｘ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、ＭＡ）においてＱ１、３８４．７ｍ／ｚ及びＱ３、６００．３ｍ／ｚ。ＩＣ５０値は、ピーク面積及びＰｒｉｓｍ  ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を用いて決定した。
【０１８９】
実施例２−喘息におけるＫＬＫ５の特徴付け
ＫＬＫ５は、喘息患者の肺組織において発現及び上昇した。
肺組織におけるＫＬＫ５発現を調査した。高感度イムノアッセイを開発して、健常ドナー（ＭＡＳＴ−Ａコホート）及びコルチコステロイド難治性喘息患者（ＢＯＢＣＡＴコホート）の気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）においてＫＬＫ５を測定した。Ｊｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３０，６４７−６５４  ｅ６１０（２０１２）及びＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｓｉｇｎａｌ  ８，ｒａ１２２（２０１５）を参照されたい。ＫＬＫ５の平均レベルは、健常ボランティアと比較して喘息患者において約４倍上昇した（図４）。加えて、喘息患者のＢＡＬにおけるＫＬＫ５のレベルは、予測される努力呼気肺活量１（ＦＥＶ１）とマイナスに相関し（Ｐ＜０．０５）、増加したＫＬＫ５を有する患者がより重度の気管支閉塞及び気道疾患を有し得ることを示した。肺におけるＫＬＫ５のレベルは、血清Ｔｈ２バイオマーカー（ペリオスチン及び血中好酸球）と関連付けられず、高及び低ペリオスチン喘息患者の両方は、同様のレベルのＢＡＬ  ＫＬＫ５を有した。ＫＬＫ５の細胞源を理解するために、ＫＬＫ５転写物レベルを様々な初代肺常在細胞において比較した。ＫＬＫ５  ｍＲＮＡは、気管支上皮細胞によって強く発現し、肺平滑筋、線維芽、内皮細胞、または単核細胞において検出不能であった。ＫＬＫ５発現をインサイツで調査するために、その発現を、ＫＬＫ５プロモーターのオープンリーディングフレームにおいてＬａｃＺを有するＫＬＫ５−ＬａｃＺレポーターマウス株を使用することによって調査した。ＬａｃＺ陽性細胞を、主に気管支上皮細胞に制限した。まとめると、これらのデータは、気管支上皮細胞が、肺におけるＫＬＫ５の主な細胞源であり、気管支肺胞洗浄におけるＫＬＫ５に寄与する可能性があることを示す。
【０１９０】
組換えＫＬＫ５誘導肺好中球溢出及び肺上皮サイトカイン産出
次に組換えＫＬＫ５を生成し、その生化学機能を特徴付けた。Ｃ末端ｈｉｓタグを有する組換え完全長ＫＬＫ５を２９３個の細胞において発現した。分泌ＫＬＫ５は、ｐｒｏ−配列（ａａ２３−６６）が除去され、６７位のＮ末端イソロイシンで開始した。２４５位のセリン−アラニン突然変異（Ｓ２４５Ａ）は、ＫＬＫ５触媒活性を無効にし、Ｓ２４５Ａ  ＫＬＫ５変異体は、インタクトなＮ末端ｐｒｏ−配列を有した。結果は、自動活性化及びシグナルペプチド除去が、ＫＬＫ５に対して自己内因性であった可能性があることを示す。
【０１９１】
肺におけるＫＬＫ５の効果を調査するために、組換えＫＬＫ５をマウスに鼻腔内投与した。ＫＬＫ５投与の２４時間後、気管支肺胞洗浄液中の好中球の数における１０倍超の増加が観察された（図５Ａ）。好酸球、マクロファージ、またはリンパ球の数における有意な変化はなかった。好中球の選択的動員もまた肺実質の組織切片において増加し、これらの顆粒球を気管支上皮下に局在化した。触媒変異体ＫＬＫ５の鼻腔内投与は、好中球溢出をもたらさなかった。よって、好中球を肺コンパートメントに動員するＫＬＫ５の能力は、プロテアーゼの酵素活性に高度に依存した。
【０１９２】
どのようにＫＬＫ５が好中球動員に影響を及ぼすかを理解するために、組換えＫＬＫ５をＡ５４９肺上皮細胞株に添加し、定量的ＰＣＲによって炎症サイトカイン及びケモカインの発現を調査した。その触媒的に不活性な変異体ではなく、ＫＬＫ５は、Ｔｓｌｐ、Ｔｎｆａ、Ｉｌ８、及びＩｃａｍ１を含む、炎症誘発遺伝子転写物を急速に誘導した（図５Ｂ）。Ｔｓｌｐ、Ｔｎｆａ、ＩＬ−８、及びＩｃａｍ１の誘導は、初代単離気管支上皮細胞でも見られた。さらに、ＳＰＩＮＫ５  Ｆｃ融合ポリペプチドは、ＫＬＫ５刺激炎症サイトカイン及びケモカイン産生を阻害した。
【０１９３】
実施例３−直接アッセイ及び結合アッセイにおけるＫＬＫ５の阻害
ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドの阻害プロファイルを評価するために、ＫＬＫ５によって蛍光ペプチド基質の開裂を監視するインビトロアッセイを開発した。簡潔に、ＫＬＫ５は、基質、Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣの末端アルギニン間のペプチド結合を開裂し、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）を放出し、蛍光の増加をもたらす。蛍光基質の添加前のＳＰＩＮＫ５  Ｍ２９３−Ｒ３５５（図６Ａ）、ＳＰＩＮＫ５  Ｅ４２１−Ａ６９５（図６Ｂ）、またはＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ（図６Ｃ）とのＫＬＫ５のインキュベーションは、ＫＬＫ５の不活性化によって低減した蛍光シグナルをもたらす。よって、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドは、Ｂｏｃ−ＶＰＲ−ＡＭＣ開裂によって監視されるようにＫＬＫ５の強力な阻害剤である。
【０１９４】
図６において示されるように、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドは、小ペプチド基質の開裂によって監視されるようにＫＬＫ５の強力な阻害剤である。これらのＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドの阻害プロファイルをさらに評価するために、結合アッセイを、ｐｒｏ−ＫＬＫ７及び特異的ＫＬＫ７蛍光ペプチド基質、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣを利用して開発した（図７）。手短に、ＫＬＫ５は、ｐｒｏ−ＫＬＫ７とインキュベートし、ＫＬＫ７  ｐｒｏ−ドメインの開裂及び除去をもたらす。ｐｒｏ−ドメインの除去は、次いで蛍光基質に作用してＡＭＣフルオロフォアを放出することができるＫＬＫ７を活性化する。小ペプチド基質を用いるデータ（図６）と同様に、ＳＰＩＮＫ５  Ｍ２９３−Ｒ３５５（図７Ａ）、ＳＰＩＮＫ５  Ｅ４２１−Ａ６９５（図７Ｂ）、またはＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ（図７Ｃ）とのＫＬＫ５のインキュベーションは、ｐｒｏ−ＫＬＫ７の活性化及びＫＬＫ７特異的ペプチド基質のその後の開裂の強力な阻害をもたらした。まとめると、図６及び７は、ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドがペプチドまたは高分子（ｐｒｏ−ＫＬＫ７）基質のいずれかを用いるＫＬＫ５の強力な阻害剤であることを示す。
【０１９５】
ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドの特異性を評価するために、阻害剤を活性化ＫＬＫ７に対してアッセイし、蛍光ペプチド基質、Ｓｕｃ−ＬＬＶＹ−ＡＭＣの開裂を監視した（図８）。ＫＬＫ特異性の対照として、市販の抗ＫＬＫ５抗体、ｍＡｂ１１０８もアッセイした。この抗体はＫＬＫ５に特異的であるので、ＫＬＫ７または基質の開裂を阻害するはずがないと予想された。図８において見られるように、ＳＰＩＮＫ５  Ｍ２９３−Ｒ３５５（図８Ａ）及びＳＰＩＮＫ５  Ｅ４２１−Ａ６９５（図８Ｂ）の両方はＫＬＫ７を部分的に阻害したが、ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ（図８Ｃ）及びｍＡｂ１１０８（図８Ｄ）は阻害を示さなかった。これは、ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ及びｍＡｂ１１０８がＫＬＫ５を特異的に相互作用及び阻害し、ＳＰＩＮＫ５  Ｍ２９３−Ｒ３５５及びＳＰＩＮＫ５  Ｅ４２１−Ａ６９５が無差別のＫＬＫ阻害剤であり得ることを示した。
【０１９６】
抗ＫＬＫ５抗体、ｍＡｂ１１０８の阻害プロファイルを特徴付けるために、ＩＣ５０値を直接アッセイ（図６）において様々なＫＬＫ５濃度（図９）で決定した。ＳＰＩＮＫ  Ｆｃ融合ポリペプチドとは異なり、ｍＡｂ１１０８は、ＫＬＫ５の部分阻害剤であり、蛍光ペプチド基質の開裂において約３０％の低減をもたらす（図９）。加えて、ｍＡｂ１１０８のＩＣ５０値は、ＫＬＫ５濃度への依存性を示し、抗体がＫＬＫ５の強固結合型阻害剤である可能性が高いことを示す。
【０１９７】
ｍＡｂ１１０８の阻害プロファイルをさらに評価するために、市販の抗体を、直接（図６）及びｐｒｏ−ＫＬＫ７結合（図７）アッセイの両方においてＳＰＩＮＫ９  Ｆｃ融合ポリペプチドに対してアッセイした。直接アッセイ（図１０）では、ＳＰＩＮＫ９  Ｆｃ融合ポリペプチドは、蛍光ペプチド基質のＫＬＫ５開裂の強力な阻害剤であったが、ｍＡｂ１１０８は部分阻害を示した。高分子基質、ｐｒｏ−ＫＬＫ７を使用するため、結合アッセイ（図１１）では、ＳＰＩＮＫ９  Ｆｃ融合ポリペプチド及びｍＡｂ１１０８の両方は、ＫＬＫ５活性の強力な阻害剤であった。まとめると、これらのデータは、ｍＡｂ１１０８が直接アッセイ（図８及び９）においてＫＬＫ５の部分阻害、ならびに結合アッセイ（図１１Ｂ）において完全阻害を示し、ＳＰＩＮＫ９  Ｆｃ融合ポリペプチドが直接（図６及び１０）及び結合アッセイ（図７及び１１）の両方においてＫＬＫ５の強力な阻害剤であることを示す。
【０１９８】
実施例４−ＩＣ５０決定のためのＬＣ／ＭＳによるＫＬＫ５誘導開裂ペプチド検出
組換えＫＬＫ５によってｐｒｏ−ＫＬＫ７またはｐｒｏ−ＫＬＫ１のタンパク質分解を阻害するＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ及びｍＡｂ１１０８の能力を、ＫＬＫ５誘導開裂産物ペプチドを監視するＬＣ／ＭＳアッセイを使用して評価した。ＫＬＫ７アッセイでは、ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ及びｍＡｂ１１０８は、それぞれ、１．１３ｎＭ（図１２Ａ）または１．８６ｎＭ（図１２Ｂ）のＩＣ５０値でｐｒｏ−ＫＬＫ７のＫＬＫ５（５ｎＭ）開裂を完全に阻害する。一方でＫＬＫ１アッセイでは、ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃ及びｍＡｂ１１０８は共にｐｒｏ−ＫＬＫ１のＫＬＫ５（０．５ｎＭ）開裂を阻害するが、ＳＰＩＮＫ９．ＳＲＥ．Ｆｃのみが０．５８ｎＭのＩＣ５０でＫＬＫ５を完全に阻害し（図１２Ｃ）、ｍＡｂ１１０８は０．３４ｎＭのＩＣ５０の最大約４０％のＫＬＫ５阻害を示す（図１２Ｄ）。
【０１９９】
結論
まとめると、これらのデータは、ＫＬＫ５が好中球走化性サイトカインの上皮産生及び肺組織への好中球流入を誘導することを示した。本明細書では、低ペリオスチン、または低２型炎症喘息患者に特に注目する第１のＧＷＡＳからの結果が提供される。ＫＬＫ４／５遺伝子座のＳＮＰは、低ペリオスチン喘息集団において喘息リスクを保護したことが特定された。この所見は、低好酸球喘息患者においても見られれた。１９ｑ１３のカリクレイン遺伝子座は以前に、連鎖研究及びＧＷＡＳによって喘息と関連付けられた。Ｍｙｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３０，１２９４−１３０１（２０１２）を参照されたい。ＧＷＡＳによって特定されたＳＮＰ、ｒｓ１０６１４７７は、ＳＮＰ  ｒｓ１１７６３９５１２の約６３ｋｂ３’に位置したＫＬＫ３のイントロン２中に存在する。これらのＳＮＰは、互いとの連鎖不均衡ではなかった（ｒ２＝０．００４、Ｄ’＝０．２９３）。好酸球レベルの遺伝学を考察したものもある。Ｇｕｄｂｊａｒｔｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４１，３４２−３４７（２００９）を参照されたい。ＩＬ１３及びＩＬ３３遺伝子座のＳＮＰは、好酸球レベルと関連することが見出された。十分に複製された喘息リスク遺伝子座もあった。しかしながら、ＫＬＫ４／５領域の１ＭＢ以内のＳＮＰは、いずれの研究においても示唆的な有意性に到達するものとして特定された。これは、この遺伝子座が低ペリオスチン、または低２型喘息に特異的であり得ることを示す。
【０２００】
ＳＮＰ  ｒｓ１１７６３９５１２は、遺伝子内であり、ＫＬＫ４とＫＬＫ５との間に位置した。このＳＮＰの比較的に低い頻度によって、ＫＬＫ４に対する作用は、オンラインデータベースにおいて試験することができず、ＫＬＫ５の異なるｍＲＮＡレベルに関して統計的有意性を観察することができなかった。しかしながら、試験された組織の大部分において、マイナーアレルのキャリアについてＫＬＫ５のより低いｍＲＮＡレベルをもたらす同様の方向の効果が見られた。これは、ＳＮＰについて見られる保護ＯＲと組み合わせて、より低いレベルのＫＬＫ５が喘息リスクから保護したことを示す。これは、ＫＬＫ５の重度に上方調節されたレベルが、喘息を含む、多くのアトピー性表現型をもたらす、ネザートン症候群患者からの所見と一貫している。ネザートン症候群を、ＫＬＫ５調節因子ＳＰＩＮＫ５における機能喪失突然変異と関連付けた。ＳＰＩＮＫ５のｍＲＮＡレベルに影響を及ぼすＳＮＰのＧＴＥｘデータベースを評価した。ＳＮＰ  ｒｓ１３６３７２７での、最も強いヒットを、交互のアレルキャリアについてのＧＴＥｘデータベースにおける有意により低いＳＰＩＮＫ５  ｍＲＮＡレベル（１０個の組織においてＰ＜１．２ｘ１０−８）と関連付けた。このＳＮＰは、低ペリオスチン喘息集団において試験され、喘息リスクの統計的有意性（Ｐ＝０．０６３、ＯＲ＝１．１４）に到達しなかったが、ＫＬＫ４／ＫＬＫ５遺伝子座ＳＮＰと比較して反対方向の効果を有した。これは、ＳＰＩＮＫ５のより低いレベルが、喘息を発症するリスクを増加し得ることを示す。ＳＰＩＮＫ５の低減した機能及びＫＬＫ５の増加した活性は、ネザートン症候群からの所見と一貫している。よって、遺伝的証拠は、ＫＬＫ５レベルを低下させることが、ネザートン症候群の文脈外の喘息を保護し得ることを示す。
【０２０１】
ＫＬＫ５結合ポリペプチドレベルは、重度の喘息患者の気管支肺胞洗浄液において上昇し、予測ＦＥＶ１（ｐ＜０．０５）とマイナスに相関し、ＫＬＫ５が気管支閉塞及び喘息病因において病因的役割を果たし得るという仮説を支持する。喘息及び他のアレルギー性疾患におけるＫＬＫ５の調節は、不明のままである。ＫＬＫ５と２型炎症バイオマーカー（例えば、ペリオスチン、ＦｅＮＯ、及び血中好酸球数）との間に相関はなかった。ＫＬＫ５は、主に肺上皮によって発現した。喘息患者は、上皮性関門の頻繁な傷害及び喪失を有し、これは誘導成長因子、修復プロセシング、及び組織リモデリングを含む再生プロセスと関連付けられる。重度の喘息における調節不全の上皮細胞活性化、再生プロセス、及び組織リモデリングは、喘息患者肺コンパートメントにおける異常ＫＬＫ５レベルに起因し得る。
【０２０２】
ＳＰＩＮＫ５は、その触媒活性部位への直接結合によるＫＬＫ５の天然の可逆的阻害剤である。ＳＰＩＮＫ５は、皮膚、肺、食道、及び胃腸管を含む、多くの粘膜組織によって発現する。ネザートン症候群において、ＳＰＩＮＫ５の欠損は、増加したＫＬＫ５活性、皮膚炎症、及びアレルギー症状をもたらす。Ｂｒｉｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０６，１１３５−１１４７（２００９）を参照されたい。ＳＰＩＮＫ５は、炎症性サイトカイン、特にインターロイキンＩＬ−１３によって直接誘導されることが見出された（データ示さず）。この観察と一致して、ＳＰＩＮＫ５転写物は、高Ｔｈ２喘息患者と比較して低Ｔｈ２喘息患者において低減した。主に低減したＳＰＩＮＫ５発現によって誘導された、ＫＬＫ５／ＳＰＩＮＫ５のより高い比は、低Ｔｈ２喘息患者において喘息病理に寄与し得る。
【０２０３】
ＫＬＫ５の組換え形態が生成され、酵素的に活性のある少量のＫＬＫ５が気管支肺胞洗浄及び肺組織への好中球流入を強く誘導したことが見出された。好中球は、動物の肺に所定の触媒不活性ＫＬＫ５（または熱不活性化ＫＬＫ５、データ示さず）を溢出させないので、触媒活性は、好中球動員に必須である。これは、ＫＬＫ５トランスジェニックマウスが皮膚病変において大きな好中球浸潤を有するという報告と一貫していた。Ｆｕｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１１，４９９−５１３（２０１４）を参照されたい。ＫＬＫ５は、炎症サイトカイン、ケモカイン、及び接着分子の上皮発現を誘導する。特に、ＩＬ−８は、重要な好中球走化性サイトカインである。ＩＣＡＭ−１は、ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８インテグリンとのその相互作用を通した好中球接着のための重要な接着分子であった。ＴＮＦ−αは、血管漏出を誘導し、末梢組織への細胞溢出を促進する。ＫＬＫ５によって誘導される炎症性サイトカイン、ケモカイン、及び接着分子は、共働して局所組織への好中球流入を促進し得る。炎症性ケモカイン／サイトカインの急速誘導は、細胞表面受容体（複数可）が存在して細胞シグナル伝達事象を媒介し得ることを示す。
【０２０４】
要約すると、本明細書に提供されるものは、低ペリオスチン、または低２型炎症喘息症例に特異的であった喘息リスクを有するＫＬＫ５遺伝子座でのＳＮＰとの遺伝的関連を示すデータである。さらに、提示されるデータは、喘息症状及び亜表現型に対するＫＬＫ５の効果を説明する。本明細書に提示される結果は、ＫＬＫ５活性を低減することが喘息に対して保護効果を有し得ることを示す。
配列番号１＞ｓｐ｜Ｑ９Ｙ３３７｜ＫＬＫ５＿ＨＵＭＡＮカリクレイン−５ＯＳ＝ホモ・サピエンスＧＮ＝ＫＬＫ５  ＰＥ＝１  ＳＶ＝２、（下線のシグナルペプチドアミノ酸１−２２を含む完全長ＫＬＫ５）
2020517628.tif 000008
配列番号２ＫＬＫ５（マイナスシグナルペプチドアミノ酸１−２２）の成熟形態
2020517628.tif 000009
配列番号３｜ＫＬＫ５＿ＨＵＭＡＮカリクレイン−５（下線のシグナルペプチドアミノ酸１−２２を含む完全長ＫＬＫ５のＮ１５３Ｄ変異型）
2020517628.tif 000010
配列番号４ＫＬＫ５（Ｎ１５３Ｄ変異型、マイナスシグナルペプチドアミノ酸１−２２）の成熟形態
2020517628.tif 000011
配列番号５｜ＫＬＫ５＿ＨＵＭＡＮカリクレイン−５（下線のシグナルペプチドアミノ酸１−２２を含む完全長ＫＬＫ５のＧ５５Ｒ変異型）
2020517628.tif 000012
配列番号６ＫＬＫ５（Ｇ５５Ｒ変異型、マイナスシグナルペプチドアミノ酸１−２２）の成熟形態
2020517628.tif 000013
配列番号７｜ＫＬＫ５＿ＨＵＭＡＮカリクレイン−５（下線のシグナルペプチドアミノ酸１−２２を含む完全長ＫＬＫ５のＧ５５Ｒ、Ｎ１５３Ｄ変異型）
2020517628.tif 000014
配列番号８ＫＬＫ５（Ｇ５５Ｒ、Ｎ１５３Ｄ変異型、マイナスシグナルペプチドアミノ酸１−２２）の成熟形態
2020517628.tif 000015
配列番号９＞ｓｐ｜Ｑ９ＮＱ３８｜ＩＳＫ５＿ＨＵＭＡＮセリンプロテアーゼ阻害剤カザール５型ＯＳ＝ホモ・サピエンスＧＮ＝ＳＰＩＮＫ５  ＰＥ＝１  ＳＶ＝２（下線のシグナルペプチドアミノ酸１−２２を含む完全長ヒトＳＰＩＮＫ５）
2020517628.tif 000016
配列番号１０ヒトＳＰＩＮＫ５（マイナスシグナルペプチドアミノ酸１−２２）の成熟形態
2020517628.tif 000017
2020517628.tif 000018
配列番号１１＞ｔｒ｜Ｑ５Ｋ５Ｄ４｜Ｑ５Ｋ５Ｄ４＿ＭＯＵＳＥ  Ｓｐｉｎｋ５タンパク質ＯＳ＝ハツカネズミＧＮ＝Ｓｐｉｎｋ５  ＰＥ＝２  ＳＶ＝１（下線のシグナルペプチドアミノ酸１−２２を含む完全長マウスＳＰＩＮＫ５）
2020517628.tif 000019
配列番号１２マウスＳＰＩＮＫ５（マイナスシグナルペプチドアミノ酸１−２２）の成熟形態
2020517628.tif 000020
配列番号１３（Ｈｕ  ＳＰＩＮＫ５（Ｅ４９０−Ｙ７５７、カザールドメインＤ８−Ｄ１１、二重下線：リンカー、下線：ＦｃヒトＩｇＧ１  Ｅ３５６．Ｍ３５８）
2020517628.tif 000021
配列番号１４；（Ｈｕ  ＳＰＩＮＫ５（Ｅ４９０−Ｙ７５７、カザールドメインＤ８−Ｄ１１、二重下線：リンカー、下線：ＦｃヒトＩｇＧ４．Ｓ２２８Ｐ）
2020517628.tif 000022
配列番号１５（Ｈｕ  ＳＰＩＮＫ５（Ｅ４９０−Ｙ７５７、カザールドメインＤ８−Ｄ１１）
2020517628.tif 000023
配列番号１６（Ｍｕ  ＳＰＩＮＫ５（Ｅ４２１−Ａ６９５）−Ｆｃ、（カザールドメインＤ６−Ｄ９、二重下線：リンカー、下線：ＦｃマウスＩｇＧ２ａ）
2020517628.tif 000024
配列番号１７（Ｍｕ  ＳＰＩＮＫ５（Ｅ４２１−Ａ６９５、カザールドメインＤ６−Ｄ９）
2020517628.tif 000025
配列番号１８（Ｈｕ  ＳＰＩＮＫ５（Ｒ２９１−Ｒ３５２、カザールドメインＤ５、二重下線：リンカー、下線：ＦｃヒトＩｇＧ１  Ｅ３５６．Ｍ３５８）
2020517628.tif 000026
配列番号１９（Ｈｕ  ＳＰＩＮＫ５（Ｒ２９１−Ｒ３５２、カザールドメインＤ５、二重下線：リンカー、下線：ＦｃヒトＩｇＧ４．Ｓ２２８Ｐ）
2020517628.tif 000027
配列番号２０（Ｈｕ  ＳＰＩＮＫ５（Ｒ２９１−Ｒ３５２、カザールドメインＤ５）
2020517628.tif 000028
配列番号２１（Ｍｕ  ＳＰＩＮＫ５（Ｍ２９３−Ｒ３５５、カザールドメインＤ４、二重下線：リンカー、下線：ＦｃマウスＩｇＧ２ａ）
2020517628.tif 000029
配列番号２２（Ｍｕ  ＳＰＩＮＫ５（Ｍ２９３−Ｒ３５５、カザールドメインＤ４）
2020517628.tif 000030
配列番号２３＞ｓｐ｜Ｑ５ＤＴ２１｜ＩＳＫ９＿ＨＵＭＡＮセリンプロテアーゼ阻害剤カザール９型ＯＳ＝ホモ・サピエンスＧＮ＝ＳＰＩＮＫ９  ＰＥ＝１  ＳＶ＝１（下線のシグナルペプチドアミノ酸１−１９を含む完全長ヒトＳＰＩＮＫ９）
2020517628.tif 000031
配列番号２４ヒトＳＰＩＮＫ９（マイナスシグナルペプチドアミノ酸１−１９）の成熟形態
2020517628.tif 000032
配列番号２５（Ｈｕ  ＳＰＩＮＫ９（Ｉ２０−Ｃ８６．Ｃ２２Ｓ．Ｈ４８Ｒ．Ｍ４９Ｅ、二重下線：リンカー、下線：ＦｃヒトＩｇＧ１  Ｅ３５６．Ｍ３５８）
2020517628.tif 000033
配列番号２６（Ｈｕ  ＳＰＩＮＫ９（Ｉ２０−Ｃ８６．Ｃ２２Ｓ．Ｈ４８Ｒ．Ｍ４９Ｅ、二重下線：リンカー、下線：ＦｃヒトＩｇＧ４．Ｓ２２８Ｐ）
2020517628.tif 000034
配列番号２７（Ｈｕ  ＳＰＩＮＫ９（Ｉ２０−Ｃ８６．Ｃ２２Ｓ．Ｈ４８Ｒ．Ｍ４９Ｅ、二重下線：リンカー、下線：ＦｃマウスＩｇＧ２ａ）
2020517628.tif 000035
配列番号２８（Ｈｕ  ＳＰＩＮＫ９（Ｉ２０−Ｃ８６．Ｃ２２Ｓ．Ｈ４８Ｒ．Ｍ４９Ｅ））
2020517628.tif 000036
【図１】
2020517628.tif 000037
【図２】
2020517628.tif 000038
【図３】
2020517628.tif 000039
【図４】
2020517628.tif 000040
【図５Ａ】
2020517628.tif 000041
【図５Ｂ】
2020517628.tif 000042
【図６−１】
2020517628.tif 000043
【図６−２】
2020517628.tif 000044
【図７】
2020517628.tif 000045
【図８】
2020517628.tif 000046
【図９】
2020517628.tif 000047
【図１０】
2020517628.tif 000048
【図１１】
2020517628.tif 000049
【図１２−１】
2020517628.tif 000050
【図１２−２】
2020517628.tif 000051
【配列表】
2020517628000001.app
【国際調査報告】
2020517628.tif 000052
2020517628.tif 000053
2020517628.tif 000054