(57)【要約】本発明は、ヒトＢＭＰ７タンパク質の新規バリアントに関する。本発明は、前記タンパク質をコードする核酸配列の繁殖のためのベクター及び宿主細胞、ならびにその産生を具体化する。がん、軟骨の損傷及び変性、変形性関節症に伴う疼痛、または骨治癒の治療のための方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
【化５】
2020517706.tif 000030
のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むタンパク質であって、
式中、
Ｘａａ３３はＤまたはＭであり；Ｘａａ３７はＡまたはＰであり；Ｘａａ６０はＥまたはＱであり；Ｘａａ６５はＹ、Ｓ、またはＧであり；Ｘａａ８６はＩ、Ｖ、またはＬであり；Ｘａａ８７はＶまたはＬであり；Ｘａａ８９はＴ、Ｓ、またはＡであり；Ｘａａ９１はＶまたはＭであり；Ｘａａ９３はＦまたはＶであり；Ｘａａ９４はＩ、Ｆ、またはＭであり；Ｘａａ１１０はＧであり；Ｘａａ１１４はＶまたはＭであり；Ｘａａ１２０はＳまたはＱであり；Ｘａａ１２８はＹ、Ｆ、またはＷであり；Ｘａａ１３２はＶ、Ｑ、またはＳであり；かつＸａａ１３４はＲまたはＫである、前記タンパク質。
【請求項２】
Ｘａａ３３はＤであり；Ｘａａ３７はＡであり；Ｘａａ６０はＥであり；Ｘａａ８７はＶであり；Ｘａａ８９はＴまたはＡであり；Ｘａａ９１はＶであり；Ｘａａ９４はＩであり；Ｘａａ１２０はＳであり；Ｘａａ１３２はＶであり；かつＸａａ１３４はＲである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
Ｘａａ６５はＹまたはＧであり；Ｘａａ８６はＩまたはＬである、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
Ｘａａ６５はＧであり；Ｘａａ８６はＬであり；Ｘａａ８９はＴであり；Ｘａａ９３はＶであり；かつＸａａ１２８はＦまたはＷである、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
Ｘａａ１１４はＶである、請求項４に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号：８である、請求項５に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号：７、配列番号：９、及び配列番号：１０からなる群より選択される、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項８】
前記ポリペプチドのＮ末端は、配列番号：１８のアミノ酸配列を含むヒトＢＭＰ７プロドメインポリペプチドのＣ末端に共有結合で融合している、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、及び配列番号：１６からなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質、及び１種または複数種の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、またはキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項１１】
前記タンパク質は、ジスルフィド連結したホモ二量体である、請求項１０に記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記組成物は、配列番号：１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをさらに含む、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１１〜１２のいずれか１項に記載の有効量の薬学的組成物を、それを必要としているヒト患者に投与することを含む、がん、軟骨の損傷及び変性、変形性関節症に伴う疼痛、または骨治癒に対する治療の方法。
【請求項１４】
前記がんは、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、脳腫瘍、子宮頸癌、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、または結腸直腸癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
療法における使用のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１６】
がん、軟骨の損傷及び変性、変形性関節症に伴う疼痛、または骨治癒の治療における使用のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記がんは、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、脳腫瘍、子宮頸癌、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、または結腸直腸癌である、請求項１６に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項１８】
抗体が、電離放射線との同時の、別個の、または逐次的な組み合わせで投与される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項１９】
前記抗体が、１種または複数種の化学療法剤との同時の、別個の、または逐次的な組み合わせで投与される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項２０】
有効量の１種もしくは複数種の化学療法剤または電離放射線と、請求項１〜７のいずれか１項に記載の有効量のタンパク質との同時の、別個の、または逐次的な組み合わせで、それを必要としている患者に投与することを含む、がんを治療する方法。
【請求項２１】
前記がんは、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、脳腫瘍、子宮頸癌、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、または結腸直腸癌である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
がんの治療のためのキットであって、前記キットは、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質、及び許容されるキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む第一の薬学的組成物、ならびに１種もしくは複数種の化学療法剤、許容されるキャリア、希釈剤、または賦形剤を含む第二の薬学的組成物を含む、前記キット。
【請求項２３】
前記第一の薬学的組成物は、配列番号：１８のアミノ酸配列を有するポリペプチドをさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
がんの治療における同時の、別個の、または逐次的な使用のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質、及び１種または複数種の化学療法剤を含む、組み合わせ医薬。
【請求項２５】
前記がんは、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、脳腫瘍、子宮頸癌、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、または結腸直腸癌である、請求項２４に記載の使用のための組み合わせ医薬。
【請求項２６】
前記タンパク質は、電離放射線との同時の、別個の、または逐次的な組み合わせで投与される、請求項２４〜２５のいずれか１項に記載の使用のための組み合わせ医薬。
【請求項２７】
前記タンパク質は、１種または複数種の化学療法剤との同時の、別個の、または逐次的な組み合わせで投与される、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載の使用のための組み合わせ医薬。
【請求項２８】
がん、軟骨の損傷及び変性、変形性関節症に伴う疼痛、または骨治癒の治療のための医薬の製造のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【請求項２９】
前記がんは、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、脳腫瘍、子宮頸癌、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、または結腸直腸癌である、請求項２８に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項３０】
前記タンパク質は、電離放射線との同時の、別個の、または逐次的な組み合わせで投与される、請求項２８〜２９のいずれか１項に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項３１】
前記タンパク質は、１種または複数種の化学療法剤との同時の、別個の、または逐次的な組み合わせで投与される、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の使用のためのタンパク質。
【請求項３２】
がんの治療における、化学療法剤を含む薬学的組成物との同時の、別個の、または逐次的な組み合わせでの使用のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む薬学的組成物。
【請求項３３】
いずれかの薬学的組成物は、電離放射線との同時の、別個の、または逐次的な組み合わせで投与される、請求項３２に記載の使用のための薬学的組成物。
【請求項３４】
がんの治療における、電離放射線との同時の、別個の、または逐次的な組み合わせでの使用のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質を含む薬学的組成物。
【請求項３５】
前記がんは、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、脳腫瘍、子宮頸癌、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、または結腸直腸癌である、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の使用のための薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の分野、特に治療用タンパク質の分野におけるものである。具体的には、本発明は、がん、軟骨の損傷及び変性、変形性関節症に伴う疼痛、または骨治癒の治療に有用なヒト骨形態形成タンパク質−７（ＢＭＰ７）のバリアントに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨形態形成タンパク質は、多数の組織及び器官における細胞の増殖、移動、分化、及びアポトーシスを調節する成長因子の周知のファミリーである。ヒトＢＭＰ７は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーの分泌性シグナル伝達分子であり、骨形成を誘導し得るその能力に対してもともと同定された。それは、現在、多くの異なる細胞タイプの成長及び分化を媒介する多機能性サイトカインとして認識されている。
【０００３】
ＢＭＰ７は、骨形成、骨折治癒、及び脊椎固定を促進するために用いられている。それにもかかわらず、治療法としてのその使用は、その乏しい溶解度／生体利用能、及び注射部位における沈殿の結果として異所性骨形成（ＥＢＦ）または軟部組織における新生骨の急速な形成を引き起こす傾向が理由で、主として組織の表面への局所投与に限定されている。
【０００４】
発現収量の増加、溶解度の増加、特異的活性の増加、及び免疫原性の減少など、向上した特性を有するＢＭＰ７タンパク質バリアントがＷＯ２００５／０９７８２５において報告されている。しかしながら、治療法として有用であり得る、溶解度／生体利用能の向上、特異的活性の増加、内因性循環阻害因子への結合の減少、及びＥＢＦ活性の低下を有するヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントに対する必要性が依然として存在する。
固形腫瘍におけるがん幹様細胞（ＣＳＣ）は、がんの発生及び不良な治療転帰に寄与すると言われている。自己再生し得る、分化し得る、及び抗がん療法に抵抗し得る能力は、これら希少細胞の証であり、それらを分化系列決定（ｌｉｎｅａｇｅ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ）に導くことは、がんの発生または進行を抑える１つのストラテジーであり得る。しかしながら、この手法の認められた潜在性にもかかわらず、腫瘍細胞の分化転換を誘導しかつ従来の化学療法及び放射線療法による殺傷に対して抵抗性を示さないまたは低い抵抗性を示す系列にＣＳＣを戻す、有効ながん療法に対する必要性が依然として残る（例えば、Ｌｉ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６  Ｏｃｔ  １８；７（４２）：６８３６０−６８３７０を参照されたい）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌｉ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６  Ｏｃｔ  １８；７（４２）：６８３６０−６８３７０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、代替的なヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントを提供する。特に、本発明は、対応する野生型ヒトＢＭＰ７タンパク質と比較して、特異的活性の増加、溶解度／生体利用能特徴の向上、内因性循環阻害因子への結合の減少、及び／またはＥＢＦ活性の低下を有するヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントを提供する。加えて、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの投与を含む、がん、軟骨の損傷及び変性、変形性関節症に伴う疼痛、または骨折治癒を治療する方法が記載される。
【０００７】
本発明は、ヒトＢＭＰ７タンパク質の成熟ドメインが、
【化１】
2020517706.tif 000002
のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントを提供し、式中、
Ｘａａ３３はＤまたはＭであり；Ｘａａ３７はＡまたはＰであり；Ｘａａ６０はＥまたはＱであり；Ｘａａ６５はＹ、Ｓ、またはＧであり；Ｘａａ８６はＩ、Ｖ、またはＬであり；Ｘａａ８７はＶまたはＬであり；Ｘａａ８９はＴ、Ｓ、またはＡであり；Ｘａａ９１はＶまたはＭであり；Ｘａａ９３はＦまたはＶであり；Ｘａａ９４はＩ、Ｆ、またはＭであり；Ｘａａ１１０はＧであり；Ｘａａ１１４はＶまたはＭであり；Ｘａａ１２０はＳまたはＱであり；Ｘａａ１２８はＹ、Ｆ、またはＷであり；Ｘａａ１３２はＶ、Ｑ、またはＳであり；かつＸａａ１３４はＲまたはＫである。
【０００８】
本発明は、ヒトＢＭＰ７タンパク質の成熟ドメインが配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ヒトＢＭＰ７のバリアントも提供し、式中、（ａ）Ｘａａ３３はＤであり；（ｂ）Ｘａａ３７はＡであり；（ｃ）Ｘａａ６０はＥであり；（ｄ）Ｘａａ６５はＹ、Ｓ、またはＧであり；（ｅ）Ｘａａ８６はＩ、Ｖ、またはＬであり；（ｆ）Ｘａａ８７はＶであり；（ｇ）Ｘａａ８９はＴまたはＡであり；（ｈ）Ｘａａ９１はＶであり；（ｉ）Ｘａａ９３はＦまたはＶであり；（ｊ）Ｘａａ９４はＩであり；（ｋ）Ｘａａ１１０はＧであり；（ｌ）Ｘａａ１１４はＶまたはＭであり；（ｍ）Ｘａａ１２０はＳであり；（ｎ）Ｘａａ１２８はＹ、Ｆ、またはＷであり；（ｏ）Ｘａａ１３２はＶであり；かつ（ｐ）Ｘａａ１３４はＲである。
【０００９】
本発明は、ＢＭＰ７タンパク質の成熟ドメインが配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントも提供し、式中、（ａ）Ｘａａ３３はＤであり；（ｂ）Ｘａａ３７はＡであり；（ｃ）Ｘａａ６０はＥであり；（ｄ）Ｘａａ６５はＹまたはＧであり；（ｅ）Ｘａａ８６はＩまたはＬであり；（ｆ）Ｘａａ８７はＶであり；（ｇ）Ｘａａ８９はＴまたはＡであり；（ｈ）Ｘａａ９１はＶであり；（ｉ）Ｘａａ９３はＦまたはＶであり；（ｊ）Ｘａａ９４はＩであり；（ｋ）Ｘａａ１１０はＧであり；（ｌ）Ｘａａ１１４はＶまたはＭであり；（ｍ）Ｘａａ１２０はＳであり；（ｎ）Ｘａａ１２８はＹ、Ｆ、またはＷであり；（ｏ）Ｘａａ１３２はＶであり；かつ（ｐ）Ｘａａ１３４はＲである。
【００１０】
本発明は、ＢＭＰ７の成熟ドメインが配列番号：３のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントも提供し、式中、（ａ）Ｘａａ３３はＤであり；（ｂ）Ｘａａ３７はＡであり；（ｃ）Ｘａａ６０はＥであり；（ｄ）Ｘａａ６５はＧであり；（ｅ）Ｘａａ８６はＬであり；（ｆ）Ｘａａ８７はＶであり；（ｇ）Ｘａａ８９はＴまたはＡであり；（ｈ）Ｘａａ９１はＶであり；（ｉ）Ｘａａ９３はＶであり；（ｊ）Ｘａａ９４はＩであり；（ｋ）Ｘａａ１１０はＧであり；（ｌ）Ｘａａ１１４はＶまたはＭであり；（ｍ）Ｘａａ１２０はＳであり；（ｎ）Ｘａａ１２８はＦまたはＷであり；（ｏ）Ｘａａ１３２はＶであり；かつ（ｐ）Ｘａａ１３４はＲである。好ましくは、Ｘａａ１１４はＶであり、かつＸａａ１２８はＷである。
【００１１】
本発明は、ＢＭＰ７タンパク質の成熟ドメインが、配列番号：４に示されるＦ９３Ｖ／Ｎ１１０Ｇバリアント；配列番号：５に示されるＹ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｔ８９Ａ／Ｎ１１０Ｇバリアント；配列番号：６に示されるＹ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｎ１１０Ｇ／Ｙ１２８Ｆバリアント；配列番号：７に示されるＹ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｎ１１０Ｇ／Ｙ１２８Ｗバリアント；配列番号：８に示されるＹ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｆ９３Ｖ／Ｎ１１０Ｇ／Ｙ１２８Ｗバリアント；配列番号：９に示されるＹ６５Ｇ／Ｔ８９Ａ／Ｎ１１０Ｇ／Ｙ１２８Ｆバリアント；配列番号：１０に示されるＹ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｎ１１０Ｇバリアント；または配列番号：１１に示されるＹ６５Ｇ／Ｖ１１４Ｍバリアントを含む、ヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントをさらに提供する。より好ましくは、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントは、配列番号：７に示されるヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質のＹ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｎ１１０Ｇ／Ｙ１２８Ｗバリアント、または配列番号：８に示されるヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質のＹ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｆ９３Ｖ／Ｎ１１０Ｇ／Ｙ１２８Ｗバリアント（以降、ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９、またはヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９と称される）を含む。さらにより好ましくは、本発明のヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントは、ヒト成熟ＢＭＰ７のＹ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｆ９３Ｖ／Ｎ１１０Ｇ／Ｙ１２８Ｗバリアントであるヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９を含む（配列番号：８を参照されたい）。
【００１２】
本発明は、ＢＭＰ７タンパク質バリアントの成熟ドメインが配列番号：３のアミノ酸配列を含む、ヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントも提供し、式中、
Ｘａａ３３はＤまたはＭであり；Ｘａａ３７はＡまたはＰであり；Ｘａａ６０はＥまたはＱであり；Ｘａａ６５はＹ、Ｓ、またはＧであり；Ｘａａ８６はＩ、Ｖ、またはＬであり；Ｘａａ８７はＶまたはＬであり；Ｘａａ８９はＴ、Ｓ、またはＡであり；Ｘａａ９１はＶまたはＭであり；Ｘａａ９３はＦまたはＶであり；Ｘａａ９４はＩ、Ｆ、またはＭであり；Ｘａａ１１０はＧであり；Ｘａａ１１４はＶまたはＭであり；Ｘａａ１２０はＳまたはＱであり；Ｘａａ１２８はＹ、Ｆ、またはＷであり；Ｘａａ１３２はＶ、Ｑ、またはＳであり；かつＸａａ１３４はＲまたはＫであり、
当該バリアントタンパク質のＮ末端は、配列番号：１８のヒトＢＭＰ７プロドメイン配列のＣ末端に共有結合で融合している。
【００１３】
本発明は、ヒトプロＢＭＰ７タンパク質のバリアントをさらに提供し、当該タンパク質は、配列番号：１２；配列番号：１３；配列番号：１４；配列番号：１５；及び配列番号：１６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
【００１４】
本発明は、ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質のバリアントをさらに提供し、当該バリアントは、配列番号：１７に示されるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【００１５】
本発明は、対応する野生型ヒトＢＭＰ７タンパク質と比較して、特異的活性の増加、溶解度特徴の向上、生体利用能の向上、内因性循環阻害因子への結合の減少、及び／またはＥＢＦ活性の低下を有するヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントをさらに提供する。
【００１６】
本発明の別の態様は、薬学的に許容されるキャリア、希釈剤、または賦形剤、及び任意で１種または複数種の他の治療用成分とともに、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントを含む、薬学的組成物である。
【００１７】
本発明の別の態様は、有効量の１種もしくは複数種の化学療法剤または電離放射線と、有効量の本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントとの同時の、別個の、または逐次的な組み合わせで、それを必要としている患者に投与することを含む、がんを治療する方法を提供する。好ましくは、がんを治療する方法は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含むがそれに限定されない肺癌、脳腫瘍、子宮頸癌、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、または結腸直腸癌を治療するための方法である。好ましくは、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントは、１種もしくは複数種の化学療法剤（複数可）及び／または電離放射線の投与前に患者に投与される。
【００１８】
本発明の態様は、肺癌、脳腫瘍、子宮頸癌、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、口腔白板症、口腔扁平細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、卵巣癌、Ｔ細胞リンパ腫、軟部組織肉腫、膵臓癌、結腸直腸癌、ホジキンリンパ腫、または非ホジキンリンパ腫を含むがそれらに限定されない、レチノイド受容体ＲＡＲアルファ及びＲＡＲガンマが重要であることが公知であるがんの治療のための、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）と組み合わせた本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの使用である。
【００１９】
本発明の態様は、肺癌、脳腫瘍、子宮頸癌、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、口腔白板症、口腔扁平細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、卵巣癌、Ｔ細胞リンパ腫、軟部組織肉腫、膵臓癌、結腸直腸癌、ホジキンリンパ腫、または非ホジキンリンパ腫を含むがそれらに限定されない、レチノイド受容体ＲＡＲアルファ及びＲＡＲガンマが重要であることが公知であるがんの治療のための、ＡＴＲＡと組み合わせた、配列番号：７または８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの使用である。
【００２０】
本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントは、適当な遺伝子配列を作出することにより、すなわち適当なヌクレオチド配列を配置し及び適切な細胞株においてそれらを発現させることによって達成され得る。所望のヌクレオチド配列は、コドンに基づく突然変異導入などの方法を用いて産生され得る。そのような手順は、オリゴヌクレオチド内の任意の所望のコドン箇所におけるアミノ酸残基のありとあらゆる頻度の産生を可能にする。
【００２１】
本発明は、治療上有効量の本発明のヒトＢＭＰ７のバリアントをそれを必要としているヒト患者に投与することを含む、がん、軟骨の損傷及び変性、変形性関節症に伴う疼痛、または骨折治癒を治療するための方法を提供する。好ましくは、本発明は、治療上有効量の本発明のヒトＢＭＰ７のバリアントをそれを必要としているヒト患者に投与することを含む、がんを治療するための方法も提供し、当該がんは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含むがそれに限定されない肺癌、脳腫瘍、子宮頸癌、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、及び結腸直腸癌からなる群より選択される。
【００２２】
本発明は、全トランス型レチノイン酸と組み合わせて、治療上有効量の本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントをそれを必要としている患者に投与することを含む、がんを治療するための方法を提供する。
【００２３】
本発明は、医薬としての使用のための、ＡＴＲＡと組み合わせた本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントを提供する。
【００２４】
本発明は、がんの治療における使用のための、ＡＴＲＡと組み合わせたヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントを提供し、当該がんは、肺癌、脳腫瘍、子宮頸癌、皮膚癌、頭頸部癌、膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、口腔白板症、口腔扁平細胞癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、乳癌、卵巣癌、Ｔ細胞リンパ腫、軟部組織肉腫、膵臓癌、結腸直腸癌、ホジキンリンパ腫、及び非ホジキンリンパ腫からなる群より選択される。
【００２５】
レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）は、ＡＴＲＡ及び９−ｃｉｓレチノイン酸の両方によって活性化される核内受容体の１つのタイプである。ＲＡＲ−アルファ、ＲＡＲ−ベータ、及びＲＡＲ−ガンマという３種のＲＡＲが存在する。ＲＡＲの活性化は、アルカリホスファターゼ活性の刺激をもたらし、それは、本質的には実施例３に記載されるように測定され得る。
【００２６】
本発明は、がんの治療のための医薬の製造のための、ＡＴＲＡと組み合わせたヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントの使用をさらに提供する。
【００２７】
本発明の別の態様は、医薬としての使用のための、ＡＴＲＡと組み合わせたヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントを提供する。
【００２８】
本発明の別の態様は、がんの治療における使用のために、本発明に従い、ＡＴＲＡと組み合わせたヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントを具体化する。
【００２９】
本発明は、医薬としての使用のための、ヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントを提供する。
【００３０】
本発明は、がん、軟骨の損傷及び変性、変形性関節症に伴う疼痛、または骨折治癒の治療における使用のための、ヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントを提供する。
【００３１】
本発明は、がん、軟骨の損傷及び変性、変形性関節症に伴う疼痛、または骨折治癒の治療のための医薬の製造のための、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントの使用をさらに提供する。
【００３２】
本発明の他の実施形態は、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントをコードするポリヌクレオチドに寄せられる。別の実施形態は、当該ポリヌクレオチド（複数可）を含有するベクター、及び当該ベクターを運ぶ宿主細胞である。別の実施形態は、当該タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを運ぶ宿主細胞を培養し、宿主細胞から当該タンパク質を発現させ、及び培養培地から当該タンパク質を回収することによって、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントを産生するための工程に寄せられる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明の目的上、本明細書において記載され及び主張されるように、用語は以下のように定義される。
【００３４】
「約」という用語は、値の最高で１０％の差異を意味し、そのような用語は、有効数字の桁数に応じて与えられる。例えば、「約２００」は１８０〜２２０を包含し、「約１」は０．９〜１．１を包含する。
【００３５】
「投与すること」という用語は、本発明の薬学的組成物を、それを必要としている哺乳類、好ましくはヒトの体内に移入する行為を指す。
【００３６】
投与は、通常の技能の医師による、有効であることが公知の任意の経路を介したものであり得る。非経口投与は、無菌の注射器、または点滴ポンプなどの他の何らかの機械的装置による体内への剤形の注射として、医学文献において一般に理解された投与の１つの形態である。非経口投与には、静脈内注射、皮下注射、筋肉注射、腹腔内注射、内皮投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、及び直腸投与が含まれ得る。手術時の投与またはｘ線イメージング（蛍光透視法）の使用を通じた投与は、付加的な形態である。
【００３７】
全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）及びレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の両方に対するリガンドである。ＲＡＲ及びＲＸＲは、正常細胞及び悪性細胞の両方の成長及び分化を調節するリガンド誘導性転写因子として機能する（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｉｌ  Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂ，３６２：９５９−９７１，２００７）。
【００３８】
「骨治癒」及び「骨折治癒」という用語は、本明細書において互換可能に用いられ、大腿骨及び脛骨の遅延治癒（ｄｅｌａｙｅｄ  ｕｎｉｏｎ）及び難治性（ｎｏｎ−ｕｎｉｏｎ）骨折、足指骨及び中足骨の骨折、上腕骨近位端骨折、他の骨折、歯科インプラント固定具に伴う歯槽骨欠損、椎間板変性、脊椎固定に伴う骨修復、ならびに頭蓋顎顔面手術に伴う骨修復、またはインプラント（ネジ、プレート、補綴物、歯科インプラント）の固定を安定させる骨統合の増強を指すことを意図される。
【００３９】
軟骨の損傷及び変性とは、関節脱臼、靭帯断裂、半月板断裂による外傷後膝関節軟骨負傷、外傷後肩関節軟骨負傷、股関節の外傷後軟骨負傷、肘関節の外傷後軟骨負傷、または変形性関節症などの他の軟骨損傷など、外傷、スポーツ、墜落、または衝突に伴う関節負傷により生じる軟骨負傷を指す。
【００４０】
変形性関節症に伴う疼痛とは、外傷後変形性関節症に伴う疼痛、膝関節の変形性関節症疼痛、骨軟骨欠損、または関連障害に伴う疼痛を指す。
【００４１】
薬学的に許容される賦形剤とは、薬学的に許容される製剤用キャリア、溶液、または製剤特徴を増強させる添加物を指す。そのような賦形剤は、製剤の他の成分と適合性でなければならずかつそのレシピエントに有害であってはならず、当業者に周知であり、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５を参照されたい。
【００４２】
安定した製剤とは、その中でタンパク質が保存の条件下で長期間可溶性のままであるものである。
【００４３】
硫酸化多糖類とは、糖単位あたり１つまたは複数の硫酸化部位を含有する２つまたはそれを上回る数の糖単位からなる化合物である。例示的な硫酸化多糖類には、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デキストラン硫酸、スクロースオクタ硫酸、硫酸化β−シクロデキストリン、ｍｙｏ−イノシトールヘキサ硫酸、ポリペントサン硫酸、フコイダン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｂ、コンドロイチン硫酸Ｃ、及びその誘導体が含まれる。
【００４４】
効力または特異的活性は、本発明のものを含めたヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントの相対活性についての測定であり、例えば下記の実施例５に記載されるＭＦｃ７細胞アッセイにおいて測定され得る。一般的に、相対活性を野生型ヒト成熟ＢＭＰ７と比較して、ヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントに対する相対効力をもたらす。
【００４５】
可溶性または溶解度とは、本明細書において実施例６に記載されるものなどの凝集アッセイによって判定される、凝集タンパク質の低下または相対欠如を指す。溶解度も、本質的には実施例７に記載される熱アンフォールディングアッセイにおいて測定され得る、ＢＭＰ７タンパク質バリアントの物理的安定性についての測定である。
【００４６】
「対象」、「患者」、または「個体」という用語は、本明細書において互換可能に用いられ、それらのすべては、マウス、サル、ヒト、哺乳類家畜（すなわち、ヒツジ等）、哺乳類スポーツ用動物（すなわち、ウマ）、及び哺乳類ペット（すなわち、イヌまたはネコ）を含むがそれらに限定されない哺乳類を指し；好ましくは、当該用語はヒトを指す。ある特定の実施形態において、対象、好ましくはヒトは、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントを用いた治療から恩恵を受けるであろう疾患または障害または病状を有するとさらに特徴付けされる。
【００４７】
本明細書において用いられる治療することとは、疾患、病状、または障害と闘う目的のための患者の管理及びケアを記載し、症状もしくは合併症を軽減するまたは疾患、病状、もしくは障害を排除するために、本発明の薬学的組成物の投与を含む。
【００４８】
「治療上有効量」という語句は、患者に治療的有益性を付与するのに必要な、活性剤の量を指す。
【００４９】
治療上有効量とは、患者に治療的有益性を付与するのに必要な、活性剤の量である。例えば、軟骨の損傷及び変性、変形性関節症に伴う疼痛、または骨治癒に対する治療を必要としているヒト患者に投与される治療上有効量は、軟骨の損傷及び変性、変形性関節症に伴う疼痛、または骨の修復／治癒に伴う病的症状、疾患進行、または生理学的状態の向上を誘導する、改善する、または別様に引き起こすような量である。さらに、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの治療上有効量は、がんに対する治療を必要としているヒト患者に投与される量であり、哺乳類、好ましくはヒトにおいて、がん細胞の数を低下させる；腫瘍サイズを低下させる；末梢組織器官へのがん細胞浸潤を阻害する（すなわち、ある程度遅らせるまたは停止させる）；腫瘍転移を阻害する（すなわち、ある程度遅らせるまたは停止させる）；腫瘍成長をある程度阻害する；及び／またはがんに伴う症状の１つもしくは複数をある程度緩和する量である。本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの有効量は、単回投薬または複数回投薬で投与され得る。さらに、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの有効量は、１回を上回って投与されない場合に有効量に満たないであろう量の複数回投薬で投与され得る。
【００５０】
医学の技術分野において周知であるように、任意の１人の対象に対する投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される対象となる特定の化合物、性別、投与の時間及び経路、全体的健康状態、ならびに並行して投与されている他の薬物を含めた多くの因子に依存する。用量は、疾患のタイプ及び重症度に応じてさらに変動し得る。本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの典型的な用量は、例えば、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ；好ましくは約５０ｍｇ〜約５００ｍｇ；より好ましくは約２００ｍｇ〜約５００ｍｇ；さらにより好ましくは約２００ｍｇ〜約４００ｍｇ；さらにより好ましくは約２００ｍｇ〜約３００ｍｇ；さらにより好ましくは約２２５ｍｇ〜約２７５ｍｇ；さらにより好ましくは約２５０ｍｇ〜約２７５ｍｇの値域内にあり得るが、しかしながら、とりわけ前述の因子を考慮して、この例示的な値域を下回るまたは上回る用量が想定される。毎日の非経口投薬量レジメンは、約２５０μｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇであり得る。進行は周期的査定によってモニターされ得、用量はそれに応じて調整され得る。
【００５１】
本発明の一部の実施形態において、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質の単回用量は、成人患者におけるがんを治療するために静脈内投与され得る。本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントの静脈内投与のための典型的な単回用量は、例えば、約１０ｍｇ〜約１０００ｍｇ；好ましくは約１０ｍｇ〜約５００ｍｇ；より好ましくは約１０ｍｇ〜約５００ｍｇ；より好ましくは約１０ｍｇ〜約４００ｍｇ；より好ましくは約１０ｍｇ〜約３５０ｍｇ；より好ましくは約１０ｍｇ〜約３００ｍｇ；さらにより好ましくは約１０ｍｇ〜約２７５ｍｇ；さらにより好ましくは約１０ｍｇ〜約２５０ｍｇ；さらにより好ましくは約１０ｍｇ〜約２００ｍｇ；さらにより好ましくは約１０ｍｇ〜約１７５ｍｇ；さらにより好ましくは約１０ｍｇ〜約１５０ｍｇ；または最も好ましくは約１０ｍｇ〜約１２５ｍｇの値域内にあり得るが、しかしながら、とりわけ前述の因子を考慮して、この例示的な値域を下回るまたは上回る用量が想定される。あるいは、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントの静脈内投与のための典型的な単回用量は、例えば、約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１５ｍｇ／ｋｇ体重；より好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ；さらにより好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約７．５ｍｇ／ｋｇ；さらにより好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ；さらにより好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約４ｍｇ／ｋｇ；さらにより好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ；さらにより好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇ；または最も好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇであり得る。そのような用量は、例えば、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、または１ヶ月に１回静脈内投与され得る。進行は周期的査定によってモニターされ得、用量はそれに応じて調整され得る。
【００５２】
本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントについてのこれら提案される量は、多くの治療的裁量に供される。適当な用量及びスケジュールを選択することにおける主要な因子は、獲得される結果である。この背景における考慮の因子には、治療されている特定の障害、個々の患者の臨床状態、障害の原因、タンパク質の送達の部位、タンパク質の特定のタイプの形態（例えば、プロＢＭＰ７タンパク質バリアントまたは成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアント）、投与の方法、投与のスケジュール、及び医師に公知の他の因子が含まれる。
【００５３】
ヒトＢＭＰ７タンパク質は、ＴＧＦ−ベータスーパーファミリーの分泌性シグナル伝達分子であり、骨形成を誘導し得るその能力に対してもともと同定されたが、その後、多くの異なる細胞タイプの成長及び分化を媒介する多機能性サイトカインとして認識されるようになった。ヒトＢＭＰ７タンパク質は、２９２アミノ酸の前駆体タンパク質として細胞内で発現され、成熟した生物学的に活性なＢＭＰ７は、シグナルペプチド及びプロペプチドのタンパク質分解除去によって作出される。シグナルペプチド（最初の２９個のアミノ酸）、プロドメイン、及び成熟ペプチド（下線が引かれた）を含有する野生型ヒトＢＭＰ７タンパク質アミノ酸配列は、配列番号：１：
【化２】
2020517706.tif 000003
として示される。シグナルペプチドはタンパク質分解切断によって除去され得、プロＢＭＰ７として指定される無傷のプロドメイン／成熟ペプチドをもたらすことが当業者によって理解されている。
【００５４】
野生型ヒト成熟ＢＭＰ７は、２箇所でグリコシル化された二量体で、１３９アミノ酸のジスルフィド連結した約３５ｋＤａのホモ二量体タンパク質である。各ホモ二量体タンパク質は、配列番号：２：
【化３】
2020517706.tif 000004
に示されるアミノ酸配列を有する。
【００５５】
本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントには、配列番号：３に示されるコンセンサス配列において表示される変化した特異的アミノ酸箇所を有する、配列番号：２のヒト成熟ＢＭＰ７のバリアントが含まれる。本発明のヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質の特定のバリアントは、野生型成熟ヒトＢＭＰ７タンパク質と比較して、特異的活性の増加、溶解度特徴の向上、生体利用能の向上、内因性循環阻害因子への結合の減少、及び／またはＥＢＦ活性の低下を有する。
【００５６】
ヒトＢＭＰ７タンパク質の好ましいバリアントは、Ｆ９３Ｖ／Ｎ１１０Ｇ、配列番号：４；Ｙ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｔ８９Ａ／Ｎ１１０Ｇ、配列番号：５；Ｙ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｎ１１０Ｇ／Ｙ１２８Ｆ、配列番号：６；Ｙ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｎ１１０Ｇ／Ｙ１２８Ｗ、配列番号：７；Ｙ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｆ９３Ｖ／Ｎ１１０Ｇ／Ｙ１２８Ｗ、配列番号：８；Ｙ６５Ｇ／Ｔ８９Ａ／Ｎ１１０Ｇ／Ｙ１２８Ｆ、配列番号：９；Ｙ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｎ１１０Ｇ、配列番号：１０；及びＹ６５Ｇ／Ｖ１１４Ｍ、配列番号：１１からなる群より選択される。本発明のＢＭＰ７の最も好ましいバリアントは、Ｙ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｎ１１０Ｇ／Ｙ１２８Ｗ（配列番号：７）及びＹ６５Ｇ／Ｉ８６Ｌ／Ｆ９３Ｖ／Ｎ１１０Ｇ／Ｙ１２８Ｗ（配列番号：８）からなる群より選択される。
【００５７】
本発明は、ヒトプレＢＭＰ７のバリアント（すなわち、配列番号：１）ならびにヒトプロＢＭＰ７のバリアント（すなわち、配列番号：２１）も提供する。ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントのＮ末端に融合したプロドメインを含有する、本発明のヒトプロＢＭＰ７の好ましいバリアントは、配列番号：１２；配列番号：１３；配列番号：１４；配列番号：１５；及び配列番号：１６からなる群より選択される。
【００５８】
本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントは、当技術分野において周知の方法を用いて操作された組み換え生物によって、あるいは化学合成によって合成され得る。したがって、本発明の他の実施形態は、ヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントをコードするポリヌクレオチドに向けられる。別の実施形態は、当該ポリヌクレオチドを含有するベクター、及び当該ベクターを運ぶ宿主細胞である。別の実施形態は、当該タンパク質をコードするＤＮＡを含有するベクターを運ぶ宿主細胞を培養し、宿主細胞から当該タンパク質を発現させ、及び培養培地から当該タンパク質を回収することによって、タンパク質を産生するための工程に向けられる。
【００５９】
本発明のヒトＢＭＰ７のバリアントをコードするポリヌクレオチドには、以下のもの：ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントに対するコード配列のみ；当該バリアントに対するコード配列、及び機能的タンパク質などの付加的なコード配列、あるいはシグナル配列もしくは分泌配列またはプロドメイン配列；ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントに対するコード配列、及びイントロンあるいは当該バリアントに対するコード配列の５’及び／または３’非コード配列などの非コード配列、が含まれ得る。ゆえに、「バリアントをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントに対するコード配列だけでなく、付加的なコード及び／または非コード配列を含むポリヌクレオチドも含み得るポリヌクレオチドを包含する。特異的な宿主細胞／発現系に対して最適化されるポリヌクレオチド配列が、所望のタンパク質のアミノ酸配列から容易に獲得され得ることは、当技術分野において公知である。本発明のポリヌクレオチドの例は、配列番号：７及び配列番号：８に示されるヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントのプレＢＭＰ７形態をコードするＤＮＡ配列である配列番号：１９及び配列番号：２０である。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドは、配列が発現制御配列に作動的に連結された後に、宿主細胞において発現される。これらの発現ベクターは、典型的に、エピソームとしてまたは宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分として、宿主生物において複製可能である。一般に、発現ベクターは、選択マーカー、例えばテトラサイクリン、ネオマイシン、及び／またはジヒドロ葉酸レダクターゼを含有して、所望のＤＮＡ配列で形質転換されたそうした細胞の検出を可能にする。関心対象のポリヌクレオチド配列（例えば、ＢＭＰ７タンパク質のバリアント及び発現制御配列）を含有するベクターは、周知の方法によって宿主細胞内に移入され、それは細胞宿主のタイプに応じて変動する。
【００６１】
本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントは、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＨＥＫ２９３、もしくはＣＯＳ細胞などの哺乳類細胞において、Ｅ．ｃｏｌｉもしくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅなどの細菌細胞において、または真菌もしくは酵母細胞において容易に産生され得る。好ましくは、宿主細胞は哺乳類細胞である。好ましい哺乳類細胞はＣＨＯ細胞である。宿主細胞は、当技術分野において周知の技法を用いて培養される。
【００６２】
１つの実施形態において、本発明は、プレＢＭＰ７遺伝子、プロＢＭＰ７遺伝子、または成熟ＢＭＰ７遺伝子を含有し、及びそれを宿主において発現させるベクターに関する。プレＢＭＰ７タンパク質、プロＢＭＰ７タンパク質、または成熟ＢＭＰ７タンパク質をコードするＢＭＰ７遺伝子は、哺乳類に由来し得る。好ましい実施形態において、発現ベクターは、ヒトプレＢＭＰ７のバリアント、ヒトプロＢＭＰ７のバリアント、またはヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質のバリアントをコードするポリヌクレオチドを含み得る。これらヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントをコードするポリヌクレオチドは、プロモーター、及び任意でエンハンサーに作動的に連結され得る。
【００６３】
一部の実施形態において、本発明は、ヒトプレＢＭＰ７タンパク質バリアント、ヒトプロＢＭＰ７タンパク質バリアント、またはヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを持する哺乳類宿主細胞に関し、当該プロＢＭＰ７タンパク質バリアントは、Ｎ末端における「プレ」または「シグナル」ペプチドを欠失している。好ましくは、哺乳類宿主細胞は、配列番号：３〜１１のいずれか１つのアミノ酸配列を有するヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアント、またはそのプレもしくはプロ形態の発現をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを持する。より好ましくは、哺乳類宿主細胞は、配列番号：１２〜１６のいずれか１つのアミノ酸配列を有するヒトプロＢＭＰ７タンパク質バリアント、またはそのプレ形態の発現をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを持する。一部の実施形態において、異なる起源由来の「プレ」または「シグナル」ペプチド配列が、ヒトプロＢＭＰ７タンパク質バリアントのＮ末端に融合される。本発明の一部の実施形態において、「プレ」または「シグナル」ペプチド配列は、例えば、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）または組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）ペプチドシグナル配列であり得る。
【００６４】
タンパク質精製の様々な方法が採用され得、そのような方法は当技術分野において公知であり、例えばＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｉｎｃ．（Ｇｅｒｍａｎｙ，１９９８）に記載されている。
【００６５】
本発明の薬学的組成物は、従来の溶解及び混合手順を用いて調製され得る。製剤科学における当業者であれば、医学的に有用なタンパク質、オスモライト、及び疎水性防腐剤の添加の順序は、製剤の有効性を損なうことなく変動し得ることを認識するであろう。本発明の薬学的組成物の生体利用能をさらに向上させるために、標的化ストラテジーが、関節腔におけるヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの保持のために採用され得る。これは、ラクトースバッファー中での製剤化、または関節腔に分子を物理的に封入するカプセル化技法（例えば、ヒドロゲル、ナノ粒子、リポソーム）、またはコラーゲン（Ｉ及びＩＩ型）もしくはインテグリンを含むがそれらに限定されない、細胞外空間におけるタンパク質に標的化することを伴う。骨治癒に関して、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントは、１型コラーゲンなどのキャリアと混合され得る。
【００６６】
疎水性防腐剤とは、抗微生物剤として作用する、薬学的製剤に添加され得る疎水性化合物を指す。非経口製剤において許容される疎水性防腐剤の例は、アルキルパラベン、フェノール系防腐剤、すなわちフェノール及びクレゾール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、安息香酸、ならびにその様々な混合物である。
【００６７】
配列番号への参照または固有の参照コード（例えば、「Ｆ９」）によるものを含めた、本明細書における野生型ヒトＢＭＰ７タンパク質またはそのバリアントへの参照は、そのホモ二量体を指す。非限定的な例として、本明細書において用いられる「ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）」または互換可能な「ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９」または同様のものは、各単量体サブユニットが配列番号：８に示される配列を有しかつ当該サブユニットがジスルフィド結合（複数可）を介して連結されているホモ二量体を指す。
【００６８】
下で記載される機能アッセイに関して、特定のプロＢＭＰ７タンパク質またはそのバリアントを用いた治療またはその投与とは、一般的に野生型ヒトプロドメインと非共有結合で複合している、特定のヒト成熟ＢＭＰ７、すなわち野生型またはそのバリアントのいずれかのホモ二量体を用いた治療またはその投与を指す。
【００６９】
クレゾールとは、メタ−クレゾール、オルト−クレゾール、パラ−クレゾール、クロロ−クレゾール、またはその混合物を指す。
【００７０】
等張剤とは、生理学的に忍容され、かつ製剤に適切な張度を付与して細胞膜を越えた水の正味の流れを阻止する化合物を指す。等張剤の例は、グリセリン、塩、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ、及び糖類、例えばデキストロース、マンニトール、及びスクロースである。
【００７１】
オスモライトとは、タンパク質を変性及び凝集に対して安定させ得る能力を有する化合物である。例示的なオスモライトには、アミノ酸、ポリオール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、及びグリセロール）、糖類、糖アルコール、糖酸等が含まれる。好ましいオスモライトには、ヒスチジン、ヒスチジンの塩、グリシン、アスパラギン酸の塩、グルタミン酸の塩、リジンの塩、アルギニンの塩、セリン、プロリン、及びアラニンが含まれる。好ましいオスモライトはアルギニンである。好ましくは、アルギニンの濃度は、約１００ｍＭ〜１Ｍ；より好ましくは約１２５ｍＭ〜約８００ｍＭ；さらにより好ましくは約２００ｍＭ〜約５００ｍＭ；及び最も好ましくは約２５０ｍＭである。
【００７２】
好ましい疎水性防腐剤は、フェノール、ｍ−クレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、ベンジルアルコール、クロロクレゾール、及びその混合物からなる群より選択される。
【００７３】
本発明の薬学的組成物は、医学的に有用なタンパク質、疎水性防腐剤、及びオスモライトに加えて、任意で他の化合物を含有し得る。例えば、Ｔｗｅｅｎ２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート）、Ｔｗｅｅｎ４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、Ｔｗｅｅｎ８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）、プルロニックＦ６８（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール）、及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）のような薬学的に許容される界面活性剤を、製剤に任意で添加して凝集を低下させ得る。これらの添加物は、ポンプまたはプラスチック容器を用いて製剤を投与する場合に特に有用である。薬学的に許容される界面活性剤は、タンパク質凝集をさらに低下させ得る。
【００７４】
本発明の薬学的組成物は、硫酸化多糖類を含有し得る。好ましい硫酸化多糖類は、ヘパリン、ヘパリン硫酸、及びデキストラン硫酸からなる群より選択される。
【００７５】
本発明の薬学的組成物は、水性バッファーを含有し得る。本発明に適したバッファーは、約ｐＨ６〜約ｐＨ８の値域内にあるｐＨ緩衝能を有するものであり、乾燥タンパク質に適合する。製剤溶液のｐＨは約６．５〜約７．５である。より好ましくは、６．８〜約７．５。さらにより好ましくは、約７．０〜約７．４のｐＨ。
【００７６】
有効なｐＨ制御を維持する代表的なバッファー系には、トリス−酢酸、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、クエン酸−グリシン、及びリン酸ナトリウムが含まれる。より好ましいバッファー系には、クエン酸ナトリウム及びリン酸ナトリウムが含まれる。最も好ましいバッファーはクエン酸ナトリウムである。バッファー系の好ましい濃度は約１ｍＭ〜約５０ｍＭである。より好ましい濃度は約５ｍＭ〜約３０ｍＭである。最も好ましい濃度は約１０ｍＭである。当業者であれば、他の多くのバッファー系が使用可能であり、それも用いて好ましい値域内にｐＨを維持し得ることを認識するであろう。
【００７７】
加えて、等張剤、好ましくはＮａＣｌまたはＫＣｌが、可溶性の薬学的組成物／製剤に任意で添加され得る。最も好ましい等張剤はＮａＣｌである。等張剤の濃度は、非経口製剤に関して当技術分野において公知の値域内、好ましくは約１００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、より好ましくは約１２５ｍＭ〜約２００ｍＭにある、及びさらにより好ましくは約１５０ｍＭである。
【００７８】
本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの薬学的組成物は、がん、軟骨の損傷及び変性、変形性関節症に伴う疼痛、または骨治癒に対する治療の一般的に意図される目的を達成する、当技術分野において公知の任意の手段によって投与され得る。
【００７９】
投与の好ましい経路は、関節内、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下への注射及び注入を含むがそれらに限定されない投与の様態を指すものとして本明細書において規定される非経口である。最も好ましくは、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの非経口投与は、軟骨修復またはＯＡ疼痛適応症に対する関節腔における関節内投与によるものである。
【００８０】
投与される投薬量は、レシピエントの年齢、健康状態、及び重量、もしある場合には並行治療の種類、治療の頻度、ならびに望まれる効果の性質に依存する。典型的な投薬量レベルは、標準的な臨床技法を用いて最適化され得、投与の様態及び患者の病状に依存する。
【００８１】
ゆえに、本発明の実施形態は、治療上有効量の本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントを投与することによる、それを必要としている対象における軟骨の損傷及び変性、変形性関節症に伴う疼痛、または骨治癒に対する治療の方法である。対象は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００８２】
本発明の別の実施形態は、治療上有効量の本発明のヒトＢＭＰ７のバリアントの投与を含む、それを必要としている哺乳類における軟骨の損傷及び変性、または変形性関節症に伴う疼痛に対する治療の方法であり、当該哺乳類は、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、またはヒツジからなる群より選択される。
【００８３】
本発明の別の実施形態は、治療上有効量の本発明のヒトＢＭＰ７のバリアントの投与を含む、それを必要としている哺乳類における骨治癒に対する治療の方法であり、当該哺乳類は、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、またはヒツジからなる群より選択される。
【００８４】
本発明をここで詳細に記載してきたものの、それは、単なる例示の目的のために本明細書に含まれ、本質的には記載されるように実施され、かつ本発明を限定することを意図されるものではない以下の実施例への参照によってより明確に理解されるであろう。
【００８５】
略語（網羅的なリストではない）
ＡＴＲＡ：全トランス型レチノイン酸
ＢＭＰ７：骨形態形成タンパク質７
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
ＥＧＦ：上皮成長因子
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＮＰＰ：ｐ−ニトロ−フェニルリン酸二ナトリウム塩
ＶＥＧＦ：血管内皮成長因子
ＷＴ：野生型
【実施例】
【００８６】
実施例１
発現方法
本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質及びヒトＢＭＰ７タンパク質のバリアントは、ヒトＢＭＰ７タンパク質またはそのバリアントの発現を誘導するまたは引き起こす適当な条件下で、ヒトＢＭＰ７タンパク質またはそのバリアントをコードする核酸を含有する発現ベクターで形質転換された宿主細胞を培養することによって産生され得る。一過性のまたは安定したトランスフェクション法のいずれかを用い得る。ＢＭＰ７タンパク質またはそのバリアントの発現に適当な条件は、発現ベクター及び宿主細胞の選定によって変動し得、ルーチン的実験を通じて当業者によって解明され得る。
【００８７】
実施例２
ＢＭＰ７によるＲＡＲアルファ及びＲＡＲガンマの刺激
３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞及びＭＦｃ７マウス腎臓筋線維芽細胞は、それぞれＤＭＥＭ／１０％仔ウシ血清培地またはＯＰＴＩ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地中、ルーチン的細胞培養条件下で維持され得る。細胞を、１０ｃｍ組織培養プレートに５００，０００個細胞／プレートの播種密度で播き得る。４８時間後、１μｇ／ｍＬヒトＢＭＰ７タンパク質または１μｇ／ｍＬのヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントを含有するＤＭＥＭ／２％透析ＦＢＳまたはＯＰＴＩ−ＭＥＭ／２％透析ＦＢＳ培地のいずれかの添加前に、細胞をＰＢＳで洗浄し得る。細胞を４８時間インキュベートし得、次いで氷冷ＰＢＳでリンスし得、次いでタンパク質抽出試薬で溶解し得る。次いで、溶解物を、１４，０００×ｇで１５分間遠心分離し得る。Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを実施して、各溶解物のタンパク質濃度を決定し得る。等量のタンパク質（例えば、２５μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分解し得、次いでウェスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜に移し得る。膜を、抗ＲＡＲアルファ抗体及び／または抗ＲＡＲガンマ抗体でプローブし得る。
【００８８】
本質的には本実施例２において上で記載されるように行われた実験において、ウェスタンブロットの強度により、ＭＦｃ７及び３Ｔ３−Ｌ１細胞株の両方に関して、ヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９を含めたヒトＢＭＰ７タンパク質及びヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントは、ＲＡＲアルファ及びＲＡＲガンマタンパク質発現を刺激することが実証された（データ示さず）。したがって、ＲＡＲアルファ及びＲＡＲガンマは、ＢＭＰ７に対する主要なシグナル伝達経路に関与すると思われる。
【００８９】
実施例３
３Ｔ３−Ｌ１及びＭＦｃ７細胞におけるヒトＢＭＰ７タンパク質及びＡＴＲＡを用いた組み合わせ処理
３Ｔ３−Ｌ１線維芽細胞及びＭＦｃ７マウス腎臓筋線維芽細胞は、本質的には上の実施例２に記載されるように成長し得る。４８時間後、対照ビヒクル、１μｇ／ｍｌヒトプロＢＭＰ７タンパク質、１μＭ  ＡＴＲＡ、またはヒトＢＭＰ７タンパク質（１μｇ／ｍｌ）及びＡＴＲＡ（１μＭ）の両方の組み合わせを含有するＤＭＥＭ／２％透析ＦＢＳまたはＯＰＴＩ−ＭＥＭ／２％透析ＦＢＳ培地のいずれかが４８時間添加され得る前に、細胞をＰＢＳで洗浄し得る。処理の後、細胞をＰＢＳでリンスし得、−８０℃でおよそ２０分間保存し得る。細胞を３７℃で３０分間融解し得、１００μｌのＰＮＰＰを全ウェルに添加し得る。プレートを３７℃で１時間インキュベートし得る。４０５ｎｍにおける吸光度をプレートリーダーで読み取り得る。
【００９０】
本質的には本実施例３において上で記載されるように行われた実験において、野生型ヒトプロＢＭＰ７タンパク質とＡＴＲＡとの組み合わせ処理は、アルカリホスファターゼの相乗的刺激をもたらした。表１に示されるデータは、対照ビヒクルで処理された細胞と比べた、アルカリホスファターゼ刺激の倍変化を表す。
【表１】
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【００９１】
実施例４
ＡＴＲＡと組み合わせてヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントで処理されたＧＢＭ細胞におけるＳＯＸ２及びＫｉ６７発現
ＳＯＸ２は、神経幹細胞によって発現される転写因子である。その発現は、細胞が分化した場合に失われる。それゆえ、ＳＯＸ２は、多能性脳腫瘍細胞の最終分化のマーカーであると見なされる。
【００９２】
Ｋｉ６７は、増殖細胞において発現される核タンパク質である。それは、細胞周期の後期Ｇ１、Ｓ、Ｇ２、及びＭ期に優先的に発現され、Ｇ０または静止細胞は、このタンパク質に対して陰性である。急成長中の細胞株は、Ｋｉ６７陽性細胞の高いパーセンテージを有する。細胞が分化するにつれてＫｉ６７発現は低下してまたは失われて、細胞集団が最終分化するようになるにつれて成長が減速していることを示す。
【００９３】
膠芽細胞腫幹細胞培養物の調製：
多形膠芽細胞腫幹細胞（ＧＢＭ）は、完全なまたは部分的な外科的切除を受けた未分化脳腫瘍を有する患者から獲得され得る。これらの細胞は、滅菌蒸留水中で再構成された３．３４ｇ／ＬのＤＭＥＭ及び２．６６ｇ／Ｌ  Ｆ１２を有しかつ１％グルコース、０．１２％重炭酸ナトリウム、５ｍＭ  ｈｅｐｅｓ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、４ｍｇ／Ｌヘパリン、１０ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬ  ＥＧＦ、０．４％ＢＳＡ、１００μｇ／ｍＬアポトランスフェリン、２５μｇ／ｍＬインスリン、６０ｕＭプトレシン、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、及び２０ｎＭプロゲステロンを含有する規定培地中で、ニューロスフェアとして維持され得る。細胞を、５％ＣＯ２中３７℃で培養し得る。ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ細胞解離酵素との３７℃で２〜５分間のインキュベーションにより、スフェアを単細胞に酵素的に分散させることによって、細胞をプレートに播き得る。酵素は、Ｃａ＋及びＭｇ＋を含有するダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）でクエンチングされ得る。次いで、細胞を遠心分離してＴｒｙｐＬＥ及びＤＰＢＳを除去し得、規定培地中に単細胞として再懸濁し得、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｚ２細胞及び粒子カウンターによってカウントし得る。
【００９４】
実験手順：
単一ＧＢＭ細胞を、ハイコンテントイメージングに関しては２×１０６個細胞／１５ｍＬ／Ｔ７５フラスコで、または光学顕微鏡法に関しては６ウェルプレート中５×１０５個細胞／２ｍＬ／ウェルで規定培地中に播き得る。細胞を、０．０１％ＤＭＳＯ、１μｇ／ｍＬ  ＡＴＲＡ、１００ｎｇ／ｍＬの本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアント（例えば、ヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８））、または１μｇ／ｍＬ  ＡＴＲＡと１００ｎｇ／ｍＬの本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントとの組み合わせで処理し得る。対照ＢＭＰ（ＢＭＰ２及びＢＭＰ４）の効果についての光学顕微鏡イメージングに関しては、細胞を上記のように６ウェルディッシュに播き得、０．０１％ＤＭＳＯ、１μｇ／ｍＬ  ＡＴＲＡ、１００ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ２、５０ｎｇ／ｍＬ  ＢＭＰ４、または同じ濃度のＢＭＰ＋１μｇ／ｍＬ  ＡＴＲＡの組み合わせで処理し得る。例となる画像を、処理後３、７、及び３０日目に、例えば２０×対物を用いたＬｅｉｃａ  ＤＭＩＲＭ倒立顕微鏡で撮り得る。７日間より長い成長に関しては、１０日目に始まっておよそ１０日ごとに、培地及び処理を変更し得る。
【００９５】
各条件に対する浮遊ニューロスフェアを含有する培地を回収した後、スフェアをペレットにし得、調製２に記載されるようにＴｒｙｐＬＥとともにインキュベートして単細胞に分散させ得、一方で各条件に対する付着細胞を、ＴｒｙｐＬＥを用いて剥離し得、次いで、分散したニューロスフェアに戻し加える。細胞を、ポリ−Ｄ−リジンコーティングされた９６ウェルプレートに、１００μＬ規定培地中５，０００〜１０，０００個細胞／ウェルの密度で播き得る。細胞を、０．０１％ＤＭＳＯ、ＡＴＲＡ、ヒトＢＭＰ７タンパク質、または上記２つの組み合わせで再度処理し得、５％ＣＯ２中３７℃でさらに４８時間インキュベートし得る。細胞を、３．７％ホルムアルデヒドでおよそ２０分間固定し得る。すべての希釈及び洗浄は、ＰＢＳ中で実施され得る。細胞を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ポリエチレングリコールオクチルフェニルエーテル）で２５℃にておよそ１０分間透過処理し得、次いで洗浄し得る。細胞を、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）中で１時間ブロッキングし得、次いで、１％ＢＳＡ中２μｇ／ｍＬのマウスモノクローナル抗ＳＯＸ２抗体、または１％ＢＳＡ中に１：５００希釈されたウサギモノクローナル抗Ｋｉ６７とともに一晩インキュベートし得る。細胞をさらに洗浄し得（例えば、２回）、次いで、１％ＢＳＡ溶液中に希釈されたヤギα−マウス−Ａｌｅｘａ−４８８  ＩｇＧまたはヤギα−ウサギ−Ａｌｅｘａ−４８８  ＩｇＧ、及び２００ｎｇ／ｍＬ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２とともにおよそ１時間インキュベートし得る。細胞を再度洗浄し得（例えば、２回）、１０×対物を用いたＡｒｒａｙＳｃａｎ  Ｖｔｉ（Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）を用いて、細胞画像を撮り得る。Ｔａｒｇｅｔ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｂｉｏａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎを用いて、２チャンネル分析を実施し得る。
【００９６】
本質的には本実施例４において上で記載されるように行われた実験において、ＧＢＭ細胞（条件ごとに１０００〜２０００個細胞が測定された）を、対照ビヒクル、ヒトプロＢＭＰ７タンパク質バリアントのみ、ＡＴＲＡのみ、またはヒトプロＢＭＰ７タンパク質バリアントとＡＴＲＡとの組み合わせのいずれかで処理した。値はビヒクル対照に対して正規化され、集団の応答者パーセントを反映する。表２に要約されたデータは、ＧＢＭ細胞の２つの異なるクローンＣＬ−６１及びＣＬ−１の処理を表す。簡潔に要約すると、３日目に、ヒトプロＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９とＡＴＲＡとの組み合わせ処理を有するＣＬ−６１において、ＳＯＸ２及びＫｉ６７マーカーの両方を用いて、明確な相乗効果が観察され、ＧＢＭ幹細胞が最終分化した良性状態にあることを示した。ＣＬ−１に関して、ＳＯＸ２マーカーを用いて同様の相乗効果が観察されたが、Ｃ６１に関して見られる３日目ではなく２５日目に読み出された。これらのデータは、ＧＢＭ幹細胞の成長の変動性、及び分化剤に対する示差的応答を例示しているが、より重要なことに、多能性脳腫瘍細胞の最終分化のバイオマーカーに対する、ヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９とＡＴＲＡとの組み合わせ処理の驚くべき相乗効果を示している。
【表２】
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【００９７】
驚くべきことに、ヒトプロＢＭＰ７タンパク質のバリアント（すなわち、Ｆ９）とＡＴＲＡとの組み合わせは、膠芽細胞腫幹細胞の処理において示されるように、ＳＯＸ２の喪失に関して有意な相乗作用をもたらした。
【００９８】
実施例５
ＭＦｃ７バイオアッセイを用いたＢＭＰ７タンパク質バリアントの特徴付け
ＭＦｃ７マウス腎臓筋線維芽細胞（マウス腎臓線維芽細胞細胞株）は、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ／１０％ＦＢＳ培地中、ルーチン的細胞培養条件下で維持され得る。細胞を、１０ｃｍ組織培養プレートに５００，０００個細胞／プレートの播種密度で播き得る。およそ４８時間後、１μｇ／ｍｌ  ＢＭＰ７タンパク質または１μｇ／ｍｌのＢＭＰ７タンパク質バリアントを含有するＯＰＴＩ−ＭＥＭ／２％透析胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）培地の添加前に、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し得、４８時間インキュベートし得る。処理の後、細胞をＰＢＳでリンスし得、−８０℃で２０分間保存し得る。細胞を３７℃で３０分間融解した後、１００μｌのパラ−ニトロフェニルリン酸（ＰＮＰＰ）を添加し得る。プレートを３７℃で１時間インキュベートし得る。４０５ｎｍにおける吸光度を、プレートリーダーを利用して読み取り得る。本発明のある特定のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの平均相対効力（野生型ＢＭＰ７タンパク質のＥＣ５０／ＢＭＰ７タンパク質バリアントのＥＣ５０）を、そのような読み取りに基づいて算出し得る。
【００９９】
本質的には本実施例５において上で記載されるように行われた実験において、本発明の様々なヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントは、対応する野生型ヒトＢＭＰ７タンパク質と比べて、平均相対効力または特異的活性の増加を有する。より具体的には、複数のアミノ酸箇所変化を有する様々なヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントに対する、野生型ヒトＢＭＰ７と比べた平均相対効力または特異的活性の増加が表３に提供されており、一方で表４は、単一アミノ酸箇所変化を有する様々なヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントに対するそれを提供している。これらのデータは、本発明のある特定のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントが、対応する野生型ヒトＢＭＰ７タンパク質と比べて、平均相対効力または特異的活性の増加を有することを実証している。
【表３】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【０１００】
実施例６
ヒトＢＭＰ７タンパク質及びヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントに対する溶解度アッセイ
ヒトＢＭＰ７タンパク質及びヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの溶解度／物理的安定性は、撹拌誘導性凝集アッセイにおいて測定され得る。タンパク質を、２ｍＬの総容量までアッセイバッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で４０μｇ／ｍＬに希釈する。この溶液を、１本の「ノミ」スターラーバーを含有する７ｍＬガラスバイアルに入れ得、室温にて４００ｒｐｍで撹拌し得る。周期的間隔（典型的には、０、３０、６０、９０、１２０、及び１５０分間）で、１５０μＬアリコートを１．５ｍＬチューブに取り出し得、１６，０００×ｇで２分間遠心分離し得る。上清（１２０μＬ）をＨＰＬＣバイアルに移し得、残存タンパク質の量を、以下の条件下で逆相ＨＰＬＣによって決定し得る：Ｚｏｒｂａｘ  Ｃ８  ＳＢ−３００（登録商標）カラム（３．５ミクロン、４．６×５０ｍｍ）、移動相：Ａバッファー＝水中０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、Ｂバッファー＝アセトニトリル中０．０８５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）；流速１ｍＬ／分；６０℃に加熱されたカラム；１０℃に冷却されたオートサンプラー、２１４ｎｍ  ＵＶ検出、８０μＬインジェクション、及び下で示される線形勾配を用いた２０分間のラン時間。ＨＰＬＣクロマトグラム（示されず）から、タンパク質の１つまたは複数のピーク（例えば、成熟及びプロドメイン）が積分され、初期ピークエリアからの変化パーセントが算出され得る。
【０１０１】
下の表５に示されるように、野生型ヒト成熟ＢＭＰ７は、アッセイの開始から不溶性である。対照的に、ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（すなわち、配列番号：８）は、１５０分の時点でさえ有意により可溶性である。ゆえに、ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（すなわち、配列番号：８）は、野生型成熟ＢＭＰ７と比べて有意に向上した溶解度を提供する。
【表５−１】
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【表５−２】
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【０１０２】
実施例７
熱アンフォールディングアッセイ
ヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの立体構造安定性に対する温度の効果は、熱電サンプルコンパートメントを備えたＪａｓｃｏ  Ｊ−８１０機器で円偏光二色性（ＣＤ）によって追跡され得る。簡潔に述べると、０．２〜１．０ｍｇ／ｍＬプロＢＭＰ７を、保存バッファー（１０ｍＭシトレート、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中に調合し得、０．０２ｃｍ光路長のＣＤキュベットに装填し得る。サンプルは１℃／分の線形速度で２０から８０度まで加熱され得、結果として生じる２０８ｎｍにおけるＣＤシグナルは、１秒間のシグナル応答時間を用いて０．２℃おきに記録され得る。方程式１への非線形フィットをＪＭＰプログラム（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）によって実施して、熱アンフォールディング中間点（Ｔｍ）を獲得し得る。
【０１０３】
【数１】
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式中、Ｙｕ及びＹｆはフィットし、それぞれ遷移前及び遷移後ベースラインのＹ切片を表す。Ｍｕ及びＭｆはフィットし、それぞれ遷移前及び遷移後ベースラインの傾きを表す。Ｈｍ及びＳはフィットし、それぞれエンタルピー及びエントロピーを表す。Ｔは、ケルビン単位での測定温度である。
【０１０４】
本質的には本実施例７において上で記載されるように行われた実験において、ヒトプロＢＭＰ７野生型及びヒトプロＢＭＰ７タンパク質バリアントＶ１１４Ｍに対するＴｍ値は、それぞれ６１℃及び６４．５℃であり、本発明のヒトプロＢＭＰ７のバリアントが、野生型ヒトプロＢＭＰ７よりも熱アンフォールディング安定性の増加を有する、すなわちより安定していることを示す。
【０１０５】
実施例８
異所性骨形成モデル
異所性骨形成（ＥＢＦ）は、野生型ヒト成熟ＢＭＰ７と比較して、本発明のある特定のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの皮下投与があると、雌ＣＢ１７ＳＣ−Ｍ  ＳＣＩＤマウスにおいて測定され得る。
【０１０６】
簡潔に記載すると、マウスに３％イソフルランで麻酔をかけ得、背中左脇腹に３μｇ／１００μｌのヒトＢＭＰ７タンパク質バリアント、野生型ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質、またはビヒクル対照を注射する。各マウスの背中右脇腹が対照（注射なし）として働き得る。ビヒクル（ｐＨ４．５）：０．５％スクロース、２．５％グリシン、５ｍＭ  Ｌ−グルタミン酸、５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％ポリソルベート８０、及び０．１％ＢＳＡ。
【０１０７】
ＥＢＦは、ヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントまたは野生型ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質の注射後１３日目にＣＴスキャンによって測定され得る。
【０１０８】
本質的には本実施例８において上で記載されるように行われた実験から獲得されたデータは、本発明のある特定のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの効力の増加にもかかわらず、それらはより低いＥＢＦ能を示すことを示唆している（表６を参照されたい）。
【表６】
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【０１０９】
実施例９
変形性関節症疼痛のＭＩＡラットモデル
ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）の効果を、ＯＡ疼痛のヨード酢酸モノナトリウム（ＭＩＡ）誘発性ラットモデルにおいて評価し得る（Ｂｏｖｅ，ｅｔ．ａｌ．，Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ，２００３，１１：８２１−８３０）。
【０１１０】
簡潔に述べると、ＭＩＡ注射の時点で７〜８週齢の雄Ｌｅｗｉｓラットが本調査に用いられ得る。変形性関節症の誘発のために、ラットにイソフルランで麻酔をかけ得、右膝関節の膝蓋下靭帯を介して０．３ｍｇ／５０μｌ  ＭＩＡの単回関節内注射を与え得る。左対側対照膝関節には、５０μｌ滅菌生理食塩水を注射し得る。ＭＩＡ後９及び１４日目に、動物を、関節内注射により、膝関節あたり１．０μｇの用量の野生型ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質、ならびに膝関節あたり０．１７５μｇ及び０．７μｇのヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）で処理する。
【０１１１】
疼痛測定は、インキャパシタンス（ｉｎｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ）テスター（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）を用いて、ＭＩＡ注射後１７、２４、３１、３８、４５、５２、５８、及び６６日目にインキャパシタンス試験によって行われ得る。変形性関節症肢（右）及び対側対照肢（左）の間での後足重量分布の変化を、変形性関節症膝関節における関節不快感の指標（疼痛の測定）として利用し得る。結果は、対側対照（左）及び変形性関節症（右）の間の重量負荷の差として提示され得る。
【０１１２】
本質的には本実施例９において上で記載されるように行われた実験において、膝関節あたり０．１７５μｇの用量のヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）での処理は、ビヒクル処理された対照と比較して、ＭＩＡ後３８日目に始まり、４５日目の例外を有して６６日目まで持続する疼痛の有意な減少を示す。他方で、１μｇの用量の野生型ヒト成熟ＢＭＰ７（配列番号：２）は、５８日目に始まる疼痛の有意な減少のみを示す。データは、ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）が、野生型ヒト成熟ＢＭＰ７（配列番号：２）と比較して、疼痛を減少させることにおいてより強力であることを示している（表７を参照されたい）。
【表７】
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【０１１３】
実施例１０
軟骨変性の半月板断裂ラットモデル
ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアント（配列番号：８）の効果を、軟骨変性の半月板断裂（ＭＴ）誘発ラットモデルにおいて変形性関節症（ＯＡ）疼痛を用いて評価し得る。雄Ｌｅｗｉｓラット（およそ２５週齢）がそのような調査に用いられ得る。簡潔に記載すると、手術前にラットに３％イソフルランで麻酔をかけ得る。右膝関節を屈曲させ得、脛骨の近位前内側面に沿って横正中切開を行い、内側対側靭帯を露出する。対側靭帯及び関節包を同時に切開し得、内側半月板の脛骨付着を解放する。半月板のおよそ３ｍｍを、脛骨プラトーの縁へのその付着から解放し得、半月板を切断して完全な断裂を模倣し得る。切開は、外科用接着剤で閉じられ得る。
【０１１４】
動物を、５０μｌリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４中、膝関節あたり３５０ｎｇの用量の野生型ヒト成熟ＢＭＰ７、または膝関節あたり４９ｎｇもしくは２４５ｎｇの２つの用量のヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）で処理し得る。処理は、ＭＴ手術の３週間後に開始され得、およそ８週間継続され得る。動物に、手術を受けた膝関節に５週間、様々な用量の野生型ヒト成熟ＢＭＰ７またはヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）またはビヒクルの関節内注射を週１回施し得る。疼痛測定は、インキャパシタンステスター（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）を用いて、ＭＴ手術後１８（ベースライン）、２５、３１、４２、及び５３日目にインキャパシタンス試験によって行われ得る。変形性関節症肢（右）及び対側対照肢（左）の間での後足重量分布の変化を、変形性関節症膝関節における関節不快感の指標（疼痛の測定）として利用し得る。結果は、対側対照（左）及び変形性関節症（右）の間の重量負荷の差として提示され得る。
【０１１５】
本質的には本実施例１０において上で記載されるように行われた実験において、右膝関節におけるＭＴ手術は、後足重量分布の変化（疼痛の測定）によって規定される関節不快感の増加をもたらす（表８を参照されたい）。関節あたり２４５ｎｇの用量または関節あたり４９ｎｇの用量のヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）は、３１日目に始まり５３日目まで持続する、ビヒクル処理された対照と比較して、疼痛の有意な減少を示した。膝関節あたり３５０ｎｇの用量の野生型ヒト成熟ＢＭＰ７での処理は、ビヒクル処理された対照と比較して、ＭＴ手術後４２日目のみで疼痛の減少を示した。データは、ＯＡ疼痛のラットＭＴ誘発モデルにおいて、ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）での処理が、野生型ヒト成熟ＢＭＰ７と比較して、疼痛を減少させることにおいてより有効であることを示している。
【表８】
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【０１１６】
実施例１１
ヒト変形性関節症関節軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成
ヒト変形性関節症（ＯＡ）関節軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成は、軟骨細胞活性のインビトロモデルである。ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントの効果を、インビトロでのヒトＯＡ関節軟骨細胞におけるプロテオグリカン合成に対しても評価し得、野生型ヒト成熟プロＢＭＰ７と比較し得る。プロテオグリカン合成は、３５Ｓ取り込みを用いて測定され得る。関節炎のヒト膝関節軟骨を、手術時にドナーから獲得する。軟骨片を細かく刻み得、軟骨細胞を、酵素消化によって付随マトリックスから単離し得る。軟骨を、まず、５％Ｆｅ補給仔ウシ血清（ＦＣＳ）及び２％ペニシリン−ストレプトマイシン−抗真菌薬を有するＤＭＥＭ／ＰＲＦ（フェノールレッド不含）培地中１ｍｇ／ｍｌプロナーゼで消化し得、その後に、５％ＦＣＳ及び２％ペニシリン−ストレプトマイシン−抗真菌薬を有するＤＭＥＭ／ＰＲＦ培地中１ｍｇ／ｍｌコラゲナーゼＩＩでの３７℃で一晩の消化が続く。細胞をＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地で洗浄し得、次いで５％ＦＣＳを有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２中に再懸濁し得、Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターでカウントし得る。細胞を、ＤＭＥＭ、５％ＦＣＳ、ＩＴＳ（インスリン、トランスフェリン、セレニウム）、及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン−抗真菌薬を含有する成長培地中、９６ウェルのコラーゲンコーティングされたＣｙｔｏＳｔａｒ  Ｔプレートに３０，０００個細胞／ウェルの密度で播き得る。２４時間後、培地を、１０μＣｉ／ｍｌ（１μＣｉ／ウェル）の３５Ｓを含有する１００μｌの成長培地で置き換え得、様々な用量の野生型ヒトプロＢＭＰ７またはヒトプロＢＭＰ７タンパク質バリアントで処理し得る。次いで、細胞を、５％ＣＯ２を有する３７℃でおよそ７日間インキュベートし得る。処理期間の終了時に、培地を除去し得、リン酸緩衝生理食塩水で置き換え得、３５Ｓ取り込みをＷａｌｌａｃ  １４５０  ＭｉｃｒｏＢｅｔａ  ＴｒｉＬｕｘ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｕｎｔｅｒ＆Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒを用いてカウントする。
【０１１７】
本質的には本実施例１１において上で記載されるように行われた実験において、ヒトプロＢＭＰ７タンパク質バリアント（配列番号：１６）で処理された細胞は、１．２〜３００ｎｇ／ｍｌに及ぶ用量で、プロテオグリカン合成の有意な増加を示す（表９を参照されたい）。対照的に、野生型ヒトプロＢＭＰ７は、３００ｎｇ／ｍｌ用量でのみ有意な増加を示している。ゆえに、ヒトプロＢＭＰ７タンパク質バリアント（配列番号：１６）は、ラット初代ヒトＯＡ関節軟骨細胞において、野生型ヒトプロＢＭＰ７と比較して、プロテオグリカン合成を刺激することにおいてより強力である。
【表９】
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【０１１８】
実施例１２
軟骨形成アッセイ
野生型ヒト成熟ＢＭＰ７及びそのバリアントの効果を、ラット初代関節軟骨細胞（ＲＰＡＣ）を利用したインビトロモデルにおける軟骨細胞の分化について評価し得る。ＲＰＡＣを獲得するために、関節軟骨を２〜３日齢のラットから単離し得る。軟骨を０．４％コラゲナーゼで２時間消化し得、次いで結果として生じる細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し得、その後、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、及び１％ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する培地中、５％ＣＯ２を有する加湿空気中で３７℃にて培養し得る。
【０１１９】
軟骨形成分化を査定するために、ペレット培養システムを用い得る。継代２〜３代からのおよそ２×１０５個細胞を１．５ｍｌチューブに入れ得、５００ｇで１０分間遠心分離し得る。ペレットを、５００μｌの培地中にて、５％ＣＯ２を有する３７℃で培養し得る。野生型ヒト成熟ＢＭＰ７またはヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントの効果を、０．０２、０．２、及び／または２μＭなどの様々濃度で試験し得る。培地を、２週間の間、週あたり２回置き換え得る。培養下で２週間後、ペレットを収穫し得、巨視的分析を実体顕微鏡手順によって実施した。画像を分析し得、ペレットサイズを２次元画像において算出し得る。
【０１２０】
本質的には本実施例１２において上で記載されるように行われた実験において、ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）で処理されたペレットは、野生型ヒト成熟ＢＭＰ７で処理されたものまたは未処理対照と比較して有意に大きい（表１０を参照されたい）。ペレットサイズの増加は用量依存的様式で観察されるが、０．１４及び１．４ｎＭ濃度で最も顕著である。データは、ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）が、ラット初代関節軟骨細胞において、野生型ヒト成熟ＢＭＰ７と比較して、ペレットサイズを増加させることにおいてより強力であることを実証している（表１０を参照されたい）。細胞ペレットサイズは細胞増殖の増加を指し示すことから、ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）は、野生型ヒト成熟ＢＭＰ７と比較して、ラット初代関節軟骨細胞の増殖を増加させることにおいてはるかに強力であるように見える。
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【０１２１】
実施例１３
骨治癒モデル
野生型ヒト成熟ＢＭＰ７及びそのバリアントの効果を、ラット外科的骨折モデルにおける骨の再生及び修復または骨治癒に対して評価し得る。動物を６ヶ月齢の時点で卵巣切除し得、骨折手術前に２ヶ月間骨を喪失させ得る。皮質欠損手術を、本質的には以前に記載されたように実施し得る（Ｋｏｍａｔｓｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１５０：１５７０−１５７９，２００９）。簡潔には、手順は、遠位大腿骨幹を露出するために、外側大腿面の皮膚を切開すること及び大腿四頭筋の鈍的剥離を伴う。次いで、２ｍｍ整形外科用ドリルビット（Ｚｉｍｍｅｒ  Ｉｎｃ，Ｗａｒｓａｗ，ＩＮ）を備えたＤｒｅｍｅｌツール（Ｒｏｂｅｒｔ  Ｂｏｓｃｈ  Ｔｏｏｌ  Ｃｏｒｐ，Ｇｅｒｌｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、前部及び後部皮質を通じて皮質欠損を生み出し得る。その後、筋肉を元の位置に戻し、皮膚を組織接着剤で閉じ得る。動物の群を、クエン酸ナトリウムバッファーｐＨ３．０中に調製されかつ５０μｌの容量でＨｅｌｉｓｔａｔ１型コラーゲンスポンジに吸着された様々な量の野生型ヒト成熟ＢＭＰ７またはそのバリアントで処理し得る。処理は、手術中に欠損の部位に局所的に施され得、３５日間処理され得る。対照群は、治療用タンパク質なしでコラーゲンスポンジに同じ構成要素を含有するビヒクルを受け得る。インビボ骨折修復及び骨塩量（ＢＭＣ）を、以前に記載されたように（Ｋｏｍａｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、ＧＥ  Ｌｏｃｕｓ  Ｕｌｔｒａ  ＣＴスキャナ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて、定量的コンピューター断層撮影法（ＱＣＴ）によって評価し得る。
【０１２２】
本質的には本実施例１３において上で記載されるように行われた実験において、１６．５μｇのヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）での処理は、処理後３５日目に、新生皮質骨（ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｓｈｅｌｌ）を形成することによるＢＭＣ及び皮質領域の有意な増加を示した（表１１を参照されたい）。他方で、１６．５μｇの野生型ヒト成熟ＢＭＰ７での処理は、３５日目にＢＭＣの有意な変化を示さなかった。データは、ヒト成熟ＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９（配列番号：８）が、ラット皮質欠損骨治癒モデルにおいて、野生型ヒト成熟ＢＭＰ７と比較して、ＢＭＣ及び皮質領域を増加させることにおいて強力であることを実証している。
【表１１−１】
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【表１１−２】
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【０１２３】
実施例１４
確立される索アッセイ
血管新生の代理であるインビトロ内皮索（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｏｒｄ）形成アッセイを用いて、ＶＥＧＦ、塩基性ＦＧＦ、及びＥＧＦにより確立される索を含むがそれらに限定されない様々な成長因子により確立される索に対するヒトＢＭＰ７タンパク質の役割を検討し得る。内皮索形成細胞（ＥＣＦＣ；索形成に適した継代４〜１０代）を、１０％ＦＢＳの最終濃度を含有するＥＧＭ−２  ＭＶ（Ｌｏｎｚａ）培地中で培養し得、インビトロでの索形成アッセイに播種する前に、Ｉ型コラーゲン（線維性）コーティングされたフラスコに継代し得る。脂肪細胞由来幹細胞（Ｚｅｎ−Ｂｉｏ、継代４代目で凍結された細胞；継代５代目またはそれを上回る代数における細胞はアッセイされない）を、共培養培地［例えば、３０μｇ／ｍｌ  Ｌ−アスコルビン酸２−リン酸、１μＭデキサメタゾン、５０μｇ／ｍｌトブラマイシン、１０μｇ／ｍｌインスリン（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから）、及び１０μｇ／ｍｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｉｍｅ  ｒ−トランスフェリンＡＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を補給されたＭＣＤＢ−１３１培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）］中、ウェル（９６ウェル黒色ポリ−Ｄ−リジンコーティングされたプレート）あたり５０，０００個細胞で播く前に、ＥＧＭ−２  ＭＶ（Ｌｏｎｚａ）培地中で２４時間培養し得る。脂肪細胞由来幹細胞（ＡＤＳＣ）培地を除去し得、ウェルあたり５，０００個のＥＣＦＣ（Ｌｏｎｚａ）を上に重ねて播種し得る。ＥＣＦＣを播いたおよそ４時間後、索を、１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦ、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、または１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦ（すべてＢｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから）で処理し得、成長因子への曝露をおよそ１２０時間継続し得る。次いで、ＰＢＳ対照、本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントを含めたヒトＢＭＰ７タンパク質（１００ｎｇ／ｍｌ）、またはスニチニブを添加し得、９６時間インキュベートし得る。すべての細胞培養インキュベーションは、３７℃、５％ＣＯ２で行われ得る。次いで、細胞を、３．７％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）で１０分間直接固定し得、その後に２５℃で２０分間の氷冷７０％エタノールが続く。細胞をＰＢＳで１回リンスし得、１％ＢＳＡで３０分間ブロッキングし得、１％ＢＳＡ中１μｇ／ｍｌに希釈したＣＤ３１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に向けられた抗血清で１時間免疫染色し得る。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し得、１％ＢＳＡ中５μｇ／ｍｌロバα−ヒツジ−Ａｌｅｘａ−４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、α−平滑筋アクチンＣｙ３抱合体（１：２００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及び２００ｎｇ／ｍｌ  Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに１時間インキュベートし得る。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し得、次いで、５×の画像倍率でＣｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）にて索形成アルゴリズムを用いて撮像し得る。
【０１２４】
本質的には本実施例１４において上で記載されるように行われた実験において、抗血管新生メカニズムの作用を有する作用物質であるスニチニブ（１００ｎＭ）を陽性対照として用いた。ヒトプロＢＭＰ７−Ｆ９（１００、５０、２５、及び１２．５ｎｇ／ｍｌ）は、化合物処理の前に、表示された成長因子の存在下で１２０時間形成させた内皮索の確立された索に接続した管腔領域（％ＰＢＳ対照）を低下させると判定された（成長因子は、実験の継続期間の間残存した）。
【０１２５】
ヒトプロＢＭＰ７バリアントＦ９は、ＶＥＧＦにより推進される索形成を低下させた
ＡＤＳＣ／ＥＣＦＣ共培養物を、ＣＤ３１（緑）、α−平滑筋アクチン（赤）、及びすべての核を染色するＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（青）に対する免疫組織化学の前に、１０ｎｇ／ｍｌ  ＶＥＧＦで刺激しない（基礎）または刺激し、ＰＢＳまたは１００ｎｇ／ｍｌヒトプロＢＭＰ７バリアントＦ９または１００ｎＭスニチニブで９６時間同時に処理した。結果として生じるＣＤ３１陽性内皮索を可視化し、ハイコンテントイメージングを用いて定量した。結果は表１２に示されている。値は、％ＰＢＳ対照、平均±ＳＤを表す；ｎ＝８／処理群、ＰＢＳ対照群においてｎ＝１６。
【表１２】
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【０１２６】
ヒトプロＢＭＰ７バリアントＦ９は、ＦＧＦにより推進される索形成を低下させた
ＡＤＳＣ／ＥＣＦＣ共培養物を、ＣＤ３１（緑）、α−平滑筋アクチン（赤）、及びすべての核を染色するＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（青）に対する免疫組織化学の前に、１０ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦで刺激しない（基礎）または刺激し、ＰＢＳまたは１００ｎｇ／ｍｌヒトプロＢＭＰ７バリアントＦ９または１００ｎＭスニチニブで９６時間同時に処理した。結果として生じるＣＤ３１陽性内皮索を可視化し、ハイコンテントイメージングを用いて定量した。結果は表１３に示されている。値は、％ＰＢＳ対照、平均±ＳＤを表す；ｎ＝８／処理群、ＰＢＳ対照群においてｎ＝１６。
【表１３】
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【０１２７】
ヒトプロＢＭＰ７バリアントＦ９は、ＥＧＦにより推進される索形成を低下させた
ＡＤＳＣ／ＥＣＦＣ共培養物を、ＣＤ３１（緑）、α−平滑筋アクチン（赤）、及びすべての核を染色するＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２（青）に対する免疫組織化学の前に、１０ｎｇ／ｍｌ  ＥＧＦで刺激しない（基礎）または刺激し、ＰＢＳまたは１００ｎｇ／ｍｌヒトプロＢＭＰ７バリアントＦ９または１００ｎＭスニチニブで９６時間同時に処理した。結果として生じるＣＤ３１陽性内皮索を可視化し、ハイコンテントイメージングを用いて定量した。結果は表１４に示されている。値は、％ＰＢＳ対照、平均±ＳＤを表す；ｎ＝８／処理群、ＰＢＳ対照群においてｎ＝１６。
【表１４】
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【０１２８】
これらの結果は、ヒトプロＢＭＰ７タンパク質バリアントＦ９が、代理のインビトロ血管新生アッセイにおいて、既存の確立された成長因子誘導性内皮索を低下させることを示す。
【０１２９】
実施例１５
結腸癌のマウス異種移植モデルにおける腫瘍成長のＢＭＰ７タンパク質バリアント阻害異種移植動物モデルを用いて、特異的タイプのがんに対する本発明のヒトＢＭＰ７タンパク質バリアントの有効性（対応する野生型ヒトＢＭＰ７タンパク質と比較して）を査定し得る。より具体的には、免疫欠陥があるマウスまたはラットモデルにおいて、皮下または同所接種により移植されている段階的腫瘍成長に対して化合物を試験し得る。異種移植調査は、適当な動物モデルの選択、腫瘍形成細胞株の選定、投与方法、投与レジメン、投薬、腫瘍成長速度の分析、及び腫瘍分析（組織学、ｍＲＮＡ及びタンパク質発現レベル）に始まり、非常に複雑であり得る。
【０１３０】
特異的タイプのがんの異種移植モデルに対する様々なＢＭＰ７タンパク質バリアントの効果を、下で記載されるように試験した。
【０１３１】
６〜７週齢の雌無胸腺ヌードマウスは、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を含めて、市販されている。マウスを１週間順応させ、通常の低脂肪（４．５％）食を自由に給餌し、それを調査の継続期間の間継続し得る。腫瘍細胞は、ＡＴＣＣから購入可能であり、１０％ＦＢＳ及び１ｍＭピルビン酸Ｎａを補給された、Ｌ−グルタミン、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳを有するＲＰＭＩ１６４０（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの細胞培養培地中で培養され得る。細胞を剥離し得、血清不含培地で洗浄し得、次いで、血清不含ＲＰＭＩ１６４０中に５０×１０６個細胞／ｍＬの最終濃度で再懸濁し得る。血清不含成長培地及びマトリゲル（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）の１：１混合物中、およそ５×１０６個の腫瘍細胞を、対象マウスの背面脇腹に皮下注射し得る。腫瘍及び体重の測定を週２回実施し得る。処理の前に、マウスを、ランダム化アルゴリズムを用いて腫瘍サイズに基づきランダム化し得る。処理は、平均腫瘍容積が１００ｍｍ３に達した時点で開始し得る。ランダム化されたマウスを種々の群に分け、尾静脈注射により週１回化合物を投薬した。
【０１３２】
すべての試験または対照タンパク質を、投薬前にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に調製する。腫瘍サイズはカリパス測定によって決定され得る。腫瘍容積（ｍｍ３）は、式Ａ２×Ｂ×０．５３６から推定され得、式中、Ａは垂直径の小さいほうであり、Ｂは大きいほうである。腫瘍容積データを対数スケールに変換して、時間及び処理群にわたる分散を均等化し得る。対数容積データを、ＳＡＳ  ＰＲＯＣ  ＭＩＸＥＤソフトウェア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  Ｉｎｃ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）を用いて、時間及び処理による二元配置の反復測定ＡＮＯＶＡで分析し得る。処理群を、各時点において、指定の対照群と比較する。
【０１３３】
ＤＬＤ１  Ｃ５腫瘍異種移植片を持する免疫不全マウス（Ｗｎｔ／ＴＣＦ−１により推進される結腸癌モデル）を、本実施例１５において上で記載されるように作出し得、ビヒクル対照、ヒト成熟ＢＭＰ７バリアントＦ９、イリノテカン、またはヒト成熟ＢＭＰ７バリアントＦ９とイリノテカンとの組み合わせのいずれかで、連続およそ３〜６週間、３回／週（ＢＭＰ７バリアントＦ９）または２回／週（イリノテカン）処理し得る。
【０１３４】
本質的には本実施例１５において上で記載されるように行われたＤＬＤ１  Ｃ５マウス異種移植腫瘍モデルにおいて、それらがヒト成熟ＢＭＰ７バリアントＦ９で３週間前処理され、その後にイリノテカンを用いた３週間の療法が続いた場合に、腫瘍退縮がＤＬＤ１  Ｃ５マウス異種移植モデルにおいて観察された。具体的には、ヒト成熟ＢＭＰ７バリアントＦ９の３週間の投与、それに続くイリノテカンを用いた３週間の療法（それぞれ０．０４ｍｇ／ｋｇ  ＭＷＦ、ならびに２０ｍｇ／ｋｇ  Ｍ及びＴｈでＩＰ投薬した）は、生理食塩水で処理され次いでイリノテカンで処理された動物（それは腫瘍成長をもたらした）と比べて、化学療法剤イリノテカンに対するＤＬＤ１  Ｃ５腫瘍感受性（即時の腫瘍退縮）を誘導した。
【０１３５】
実施例１６
ＢＭＰ７タンパク質バリアントに対する内因性ＢＭＰ７阻害因子活性
ノギン、Ｓｏｓｔ、フォリスタチン、ねじれ原腸形成（ｔｗｉｓｔｅｄ  ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）（ＴＳＧ）、コーディン（ｃｈｏｒｄｉｎ）、ならびにグレムリン（ｇｒｅｍｌｉｎ）、セルベラス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）、及びＤａｎファミリーのタンパク質のメンバーなどの内因性ＢＭＰアンタゴニストは、例えば、インビボでＢＭＰファミリーのタンパク質に作用して、多様な細胞の成長、分化、及び活性に関係するものを含めたＢＭＰ活性を変調する。ＢＭＰそれ自身と同様に、様々なアンタゴニストの発現は、厳重な時空制御下にある。（Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ，Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ（２０１５），ｖｏｌｕｍｅ９９，ｐａｇｅｓ６３−９０；Ｅｄｉｔｏｒ  Ｇｅｒａｌｄ  Ｌｉｔｗａｃｋを参照されたい）。ヒトＢＭＰ７タンパク質及びそのバリアントに対する様々なＢＭＰアンタゴニストの効果を、本実施例１６において下で記載されるようにインビトロアッセイにおいて試験し得る。
【０１３６】
簡潔に記載すると、ヘプシジンプロモータールシフェラーゼ構築物（以降、Ｈｅｐ３Ｂ２＿ＨｅｐＰｒｏ＿ｌｕｃ細胞と称される）を安定にトランスフェクトされたＨｅｐ３Ｂ２細胞を、ＢＭＰ阻害因子実験に用いた。Ｈｅｐ３Ｂ２＿ＨｅｐＰｒｏ＿ｌｕｃ細胞を、非必須アミノ酸（Ｈｙｃｌｏｎｅ）及び２００μｇ／ｍｌゲンテシン（ｇｅｎｔｅｃｉｎ）（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補給されたＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）５％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）中、組織培養処理された９６ウェルプレートにウェルあたり３０，０００個細胞で２４時間播き得る。次いで、細胞をＯＭＥＭ＋０．２％ＢＳＡ中にて５時間飢餓させた。細胞を、ＯＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋０．２％ＢＳＡ（Ｇｉｂｃｏ）中、ヒトＢＭＰ７タンパク質及びそのバリアントの混合物で１８時間処理し、次いで、ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイキット（Ｒｏｃｈｅ）を利用してルシフェラーゼ活性に対して展開した。ＢＭＰ７タンパク質を、１ｎＭ及び１００ｐＭというアッセイの線形域にある濃度で添加した。試験されている過剰モルの特定のＢＭＰ７タンパク質に、阻害因子を様々なモル濃度で添加した。フォリスタチンを除くすべてのＢＭＰ阻害因子は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入された。フォリスタチンならびにＢＭＰ７タンパク質及びそのバリアントは、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙで作出された。
【０１３７】
本質的には本実施例１６において上で記載されるように行われた実験において、野生型ＢＭＰ７タンパク質は、本発明のＢＭＰ７  Ｆ９バリアントの対応する（すなわち、プロまたは成熟）形態と比較して、ある特定のＢＭＰアンタゴニストによる阻害の影響を有意に受けやすかった（表１５を参照されたい）。
【表１５−１】
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【表１５−２】
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【０１３８】
様々な配列のリスト
【化４−１】
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【化４−２】
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【化４−３】
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【化４−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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