(57)【要約】  本開示は、組換え酵母宿主細胞の増殖期に発現される細胞結合型異種タンパク質を発現する組換え酵母宿主細胞およびそれを増殖させるためのプロセスに関する。組換え酵母宿主細胞を使用して、異種タンパク質が富化された酵母組成物または酵母製品を作製することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え酵母宿主細胞から細胞結合型異種タンパク質を作製する方法であって、細胞結合型異種タンパク質の発現を可能にするためにパン酵母生産法に従って容器中に入れた培地中で組換え酵母宿主細胞を増殖させることを含み、組換え酵母宿主細胞が、細胞結合型異種タンパク質をコードする異種核酸分子を有し、異種核酸分子が増殖中に異種核酸分子の発現を可能にする異種プロモーターと作動可能に結合している、方法。
【請求項２】
パン酵母生産法が連続法である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
パン酵母生産法がフェドバッチ法である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
増殖中の組換え酵母宿主細胞の比増殖速度が０．２５ｈ−１以下である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
容器への通気速度を、少なくとも約０．５空気容量／容器容量／分に制御することをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
通気速度が少なくとも約１．０空気容量／容器容量／分である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
培地が炭水化物源、窒素源およびリン源を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
炭水化物源が糖蜜、コーン、グリセロールおよび／またはリグノセルロース系バイオマスに由来する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
窒素源がアンモニアである、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
リン源がリン酸である、請求項７から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
培地が１つまたは複数の微量栄養素をさらに含む、請求項７から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
組換え酵母宿主細胞の増殖速度を制限するために、培地への炭水化物源の添加を制御することをさらに含む、請求項５から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
炭水化物源の濃度を、培地の総容量に対して０．１重量パーセンテージ以下に維持することを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
炭水化物源の濃度が、培地の総容量に対して０．０００１重量パーセンテージ以下に維持される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
組換え酵母宿主細胞の増殖速度を一致させるために窒素源および／またはリン源を添加することをさらに含む、請求項５から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
培地のｐＨを約４．０〜５．０に制御することをさらに含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
培地のｐＨを約４．５に制御することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
培地の温度を約２０℃〜約４０℃に制御することをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
培地の温度を約３０℃〜約３５℃に制御することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
増殖ステップの後、組換え酵母宿主細胞の濃度が培地の総容量の少なくとも０．２５重量％である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
増殖ステップの後、組換え酵母宿主細胞の濃度が培地の総容量の少なくとも１重量％である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
酵母組成物または酵母製品を作製するための組換え酵母宿主細胞であって、細胞結合型異種タンパク質をコードする異種核酸分子を有し、異種核酸分子が、増殖中に異種核酸分子の発現を可能にする異種プロモーターと作動可能に結合している、組換え酵母宿主細胞。
【請求項２３】
細胞結合型異種タンパク質が、酵母組成物または酵母製品中の総タンパク質の少なくとも０．１％（乾燥重量パーセントで）を占める、請求項２２に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項２４】
細胞結合型異種ポリペプチドが異種酵素である、請求項２２または２３に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項２５】
異種酵素がオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、ホスファターゼおよび／またはリガーゼである、請求項２４に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項２６】
異種酵素がマルトース生成アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−アミラーゼ、真菌アミラーゼ、フィターゼまたはグルコースオキシダーゼである、請求項２５に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項２７】
異種核酸分子が細胞結合型異種タンパク質の細胞内発現を可能にする、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項２８】
異種核酸分子が膜結合型異種タンパク質の発現を可能にする、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項２９】
異種核酸分子が係留された異種タンパク質の発現を可能にする、請求項２８に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項３０】
係留された異種タンパク質が、式（Ｉ）または（ＩＩ）：
（ＮＨ２）ＨＰ−Ｌ−ＴＴ（ＣＯＯＨ）  （Ｉ）
（ＮＨ２）ＴＴ−Ｌ−ＨＰ（ＣＯＯＨ）  （ＩＩ）
（式中、
ＨＰは、異種ポリペプチドである；
Ｌは、存在するか、または存在しないアミノ酸リンカーである；
ＴＴは、異種ポリペプチドを組換え酵母宿主細胞の細胞壁と結合させるためのアミノ酸係留部分である；
（ＮＨ２）は、キメラタンパク質のアミノ末端を示す；
（ＣＯＯＨ）は、キメラタンパク質のカルボキシル末端を示す；および
「−」はアミド結合である）
のキメラタンパク質である、請求項２９に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項３１】
Ｌが存在する、請求項３０に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項３２】
Ｌが１つまたは複数のＧ４Ｓ（配列番号４１）モチーフを含む、請求項３１に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項３３】
Ｌが１つもしくは複数のＥＡ２Ｋ（配列番号１００）またはＥＡ３Ｋ（配列番号１０１）モチーフを含む、請求項３１に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項３４】
ＴＴが膜貫通ドメイン、そのバリアントまたは断片を含む、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項３５】
ＴＴがＦＬＯ１タンパク質に由来する、請求項３４に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項３６】
ＴＴが、配列番号１４のアミノ酸配列を有する、配列番号１４のアミノ酸配列のバリアントである、または配列番号１４のアミノ酸配列の断片である、請求項３５に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項３７】
ＴＴを、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを有するように翻訳後機構によって改変することができる、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項３８】
ＴＴが、ＳＥＤ１タンパク質、ＴＩＲ１タンパク質、ＣＷＰ２タンパク質、ＣＣＷ１２タンパク質、ＳＰＩ１タンパク質、ＰＳＴ１タンパク質またはＡＧＡ１タンパク質とＡＧＡ２タンパク質との組合せに由来する、請求項３７に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項３９】
ＴＴがＳＰＩ１タンパク質に由来する、請求項３８に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項４０】
ＴＴが、配列番号７４のアミノ酸配列を有する、配列番号７４のアミノ酸配列のバリアントである、または配列番号７４のアミノ酸配列の断片である、請求項３９に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項４１】
ＴＴが、配列番号７６、７８、８０もしくは８２のアミノ酸配列を有する、配列番号７６、７８、８０もしくは８２のアミノ酸配列のバリアントである、または配列番号７６、７８、８０もしくは８２のアミノ酸配列の断片である、請求項３９に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項４２】
ＴＴがＣＣＷ１２タンパク質に由来する、請求項３８に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項４３】
ＴＴが、配列番号８４のアミノ酸配列を有する、配列番号８４のアミノ酸配列のバリアントである、または配列番号８４のアミノ酸配列の断片である、請求項４２に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項４４】
ＴＴが、配列番号８６、８８、９０もしくは９２のアミノ酸配列を有する、配列番号８６、８８、９０もしくは９２のアミノ酸配列のバリアントである、または配列番号８６、８８、９０もしくは９２のアミノ酸配列の断片である、請求項４２に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項４５】
ＴＴが、ＡＧＡ１タンパク質とＡＧＡ２タンパク質との組合せに由来する、請求項３８に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項４６】
ＡＧＡ１タンパク質とＡＧＡ２タンパク質との組合せが、配列番号２４のアミノ酸配列を有する、配列番号２４のアミノ酸配列のバリアントである、配列番号２４のアミノ酸配列の断片である、配列番号２６のアミノ酸配列を有する、配列番号２６のアミノ酸配列のバリアントである、または配列番号２６のアミノ酸配列の断片である、請求項４５に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項４７】
プロモーターが天然のプロモーターまたは異種プロモーターである、請求項２２から４６のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項４８】
異種プロモーターが、ｔｄｈ１遺伝子、ｈｏｒ７遺伝子、ｈｓｐ１５０遺伝子、ｈｘｔ７遺伝子、ｇｐｍ１遺伝子、ｐｇｋ１遺伝子および／またはｓｔｌ１遺伝子に由来するプロモーターを含む、請求項４７に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項４９】
異種プロモーターが、ｔｄｈ１遺伝子に由来するプロモーターを含む、請求項４８に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項５０】
異種プロモーターが、ｈｏｒ７遺伝子のプロモーターを含む、請求項４８または４９に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項５１】
異種核酸分子がターミネーターと作動可能に結合している、請求項２２から５０のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項５２】
ターミネーターが天然のターミネーターまたは異種ターミネーターである、請求項５１に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項５３】
ターミネーターが異種ターミネーターであり、ｄｉｔ１遺伝子、ｉｄｐ１遺伝子、ｇｐｍ１遺伝子、ｐｍａ１遺伝子、ｔｄｈ３遺伝子、ｈｘｔ２遺伝子、ａｄｈ３遺伝子および／またはｉｒａ２遺伝子に由来するターミネーターを含む、請求項５２に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項５４】
異種ターミネーターがｄｉｔ１遺伝子に由来するターミネーターを含む、請求項５３に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項５５】
異種ターミネーターがａｄｈ３遺伝子に由来するターミネーターを含む、請求項５３または５４に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項５６】
異種ターミネーターがｉｄｐ１遺伝子に由来するターミネーターを含む、請求項５３から５５のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項５７】
膜結合型異種ポリペプチドをコードする異種核酸分子が、異種シグナルペプチドをコードするさらなる核酸分子と結合している、請求項２８から５６のいずれか一項に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項５８】
異種シグナルペプチドが、インベルターゼタンパク質に由来し、配列番号６８のアミノ酸配列を有する、配列番号６８のアミノ酸配列のバリアントである、または配列番号６８のアミノ酸配列の断片である、請求項５７に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項５９】
異種シグナルペプチドが、ＡＧＡ２タンパク質に由来し、配列番号６９のアミノ酸配列を有する、配列番号６９のアミノ酸配列のバリアントである、または配列番号６９のアミノ酸配列の断片である、請求項５７に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項６０】
異種シグナルペプチドが、真菌アミラーゼタンパク質に由来し、配列番号１０７のアミノ酸配列を有する、配列番号１０７のアミノ酸配列のバリアントである、または配列番号１０７のアミノ酸配列の断片である、請求項５７に記載の組換え酵母宿主細胞。
【請求項６１】
組換え酵母宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属種に由来する、請求項１から６０のいずれか一項に記載の方法または組換え酵母宿主細胞。
【請求項６２】
組換え酵母宿主細胞がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種に由来する、請求項６１に記載の方法または組換え酵母宿主細胞。
【請求項６３】
酵母組成物を作製するための方法であって、
ａ）増殖した組換え酵母宿主細胞を得るために請求項２２から６２のいずれか一項に記載の細胞結合型異種タンパク質を有する組換え酵母宿主細胞を増殖させるステップ；および
ｂ）増殖した酵母宿主細胞を酵母組成物に製剤化するステップ
を含む方法。
【請求項６４】
酵母組成物がクリーム酵母である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
ステップａ）が培地中で行われる、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６６】
培地が糖蜜を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
請求項６３から６６のいずれか一項に記載の方法によって得られる増殖した酵母宿主細胞を含む酵母組成物。
【請求項６８】
酵母製品を作製するための方法であって、
ａ）請求項１から２１もしくは６３から６６のいずれか一項に記載の方法によって得られる増殖した組換え酵母宿主細胞または請求項６７に記載の増殖した組換え酵母宿主細胞を含む酵母組成物を提供するステップ；
ｂ）増殖した酵母宿主細胞を溶解して、溶解された組換え酵母宿主細胞を取得するステップ；
ｃ）必要に応じて、溶解された組換え酵母宿主細胞を乾燥させて、乾燥した組換え酵母宿主細胞を取得するステップ；および
ｄ）溶解された組換え酵母宿主細胞または乾燥した組換え酵母宿主細胞を酵母製品に製剤化するステップ
を含む方法。
【請求項６９】
ステップｂ）が、増殖した組換え酵母宿主細胞を自己溶解にかけて、溶解された組換え酵母宿主細胞を取得することを含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
ステップｃ）が、自己溶解物を酵母製品として提供するために、ステップｂ）の直後に行われる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
溶解された組換え酵母宿主細胞が、可溶性画分と不溶性画分とを含み、方法が、ステップｂ）の後に、不溶性画分から可溶性画分を分離することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
溶解された組換え宿主細胞を濾過して、不溶性画分から可溶性画分を分離することを含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
不溶性画分をステップｄ）にかけて、酵母細胞壁を酵母製品として提供することを含む、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
可溶性画分をステップｄ）にかけて、酵母抽出物を酵母製品として提供することを含む、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７５】
可溶性画分から、約１０ｋＤａに等しいか、またはそれ未満の分子量を有する成分を除去して、保持物を提供することをさらに含む、請求項７１、７２または７４に記載の方法。
【請求項７６】
保持物をステップｄ）にかけて、乾燥保持物を酵母製品として提供することを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
細胞結合型異種タンパク質が異種酵素である、請求項６３から６６および６８から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
溶解された酵母宿主細胞から異種タンパク質を実質的に精製して、精製された異種タンパク質を酵母製品として提供することをさらに含む、請求項６８から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
請求項６８から７８のいずれか一項に記載の方法によって得られる酵母製品。
【請求項８０】
不活性形態である、請求項７９に記載の酵母製品。
【請求項８１】
単離された異種タンパク質が、異種核酸分子および請求項３０から６０のいずれか一項に記載のさらなる核酸分子を有する組換え酵母宿主細胞によって産生され、さらなる核酸分子が異種シグナルペプチドをコードする、請求項７８に記載の方法によって得られる単離された異種タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表に関する陳述
本出願と関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、これによって、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名称は、ＰＣＴ−Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｉｓｔｉｎｇ  ａｓ  ｆｉｌｅｄである。このテキストファイルは、２２４ＫＢであり、２０１８年３月１３日に作成されたものであり、電子的に提出される。
【０００２】
技術分野
本開示は、細胞結合型異種ポリペプチド（異種酵素を含む）を発現する組換え酵母宿主細胞、それを含む組成物、ならびにそれらを含むプロセスに関する。
【背景技術】
【０００３】
感受性の細菌および真菌を使用する商業的酵素生産は、長期間の発酵、特殊な培地および滅菌条件を必要とする。酵素は排出されるため、大容量の液体培養液をバイオマスから分離した後、濃縮および精製して、酵素を回収しなければならない。酵母は、一般的には細菌および真菌よりも頑強であり、滅菌未満の条件下で、安価な培地で、より迅速に増殖させることができる。
【０００４】
酵母は、酵素組成物および製品を作製するための様々な工業プロセスにおいても使用されている。そのようなプロセスでは、酵母に精製された外因性タンパク質（酵母にとって異種であってもよい）を補充して、酵母含有または酵母由来製品をより迅速に、またはより効率的に取得することが一般的である。しかしながら、そのような外因性タンパク質を添加する費用はかなりのものであり、酵母製品の生産における外因性タンパク質の使用を低下させるか、またはその使用を廃止するインセンティブがある。
【０００５】
かくして、その後の商業的プロセスにおいて使用されるのに十分な量で、商業規模での異種タンパク質の使用を可能にする費用で取得することができる異種タンパク質を提供する必要がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本開示は、酵母宿主細胞が増殖する間に異種タンパク質を発現し、それと結合したままである組換え酵母宿主細胞、それを増殖させるためのプロセス、ならびにそれから酵母組成物および酵母製品を作製するためのプロセスに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様によれば、本開示は、組換え酵母宿主細胞から細胞結合型異種タンパク質を作製するためのプロセスに関する。組換え酵母宿主細胞は、細胞結合型異種タンパク質をコードする異種核酸分子を有し、異種核酸分子は、増殖中に異種核酸分子の発現を可能にする異種プロモーターと作動可能に結合している。プロセスは、細胞結合型異種タンパク質の発現を可能にするためにパン酵母生産法に従う容器に入れた培地中で組換え酵母宿主細胞を増殖させることを含む。ある実施形態では、パン酵母生産法は、連続法またはフェドバッチ法である。さらに別の実施形態では、増殖中の組換え酵母宿主細胞の比増殖速度は、０．２５ｈ−１以下である。さらなる実施形態では、プロセスは、容器の通気速度が少なくとも約０．５または約１．０空気容量／容器容量／分となるように制御することをさらに含む。さらなる実施形態では、培地は、炭水化物源、窒素源、リン源および必要に応じて、微量栄養素を含む。ある実施形態では、炭水化物源は、糖蜜、コーン、グリセロールおよび／またはリグノセルロース系バイオマスに由来する。さらなる実施形態では、窒素源は、アンモニアである。さらなる実施形態では、リン源は、リン酸である。別の実施形態では、プロセスは、組換え酵母宿主細胞の増殖速度を制限するために炭水化物源の培地への添加を制御することをさらに含む。さらなる実施形態では、プロセスは、炭水化物源の濃度を、培地の総容量に対して０．１または０．０００１重量パーセンテージ以下に維持することを含む。さらに別の実施形態では、組換え酵母宿主細胞の増殖速度を一致させるために窒素源および／またはリン源を添加することをさらに含む。さらに別の実施形態では、プロセスは、培地のｐＨを約４．０〜５．０、例えば、約４．５に制御することをさらに含む。さらに別の実施形態では、プロセスは、培地の温度を、約２０℃〜約４０℃、例えば、約３０℃〜約３５℃に制御することをさらに含む。ある実施形態では、増殖ステップの後、組換え酵母宿主細胞の濃度は、培地の総容量の少なくとも０．２５または１重量％である。ある実施形態では、組換え酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属種に由来する。さらなる実施形態では、組換え酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種に由来する。
【０００８】
第２の態様によれば、本開示は、細胞結合型異種タンパク質をコードする異種核酸分子であって、増殖中に異種核酸分子の発現を可能にする異種プロモーターと作動可能に結合している異種核酸分子を有する、酵母組成物または酵母製品を作製するための組換え酵母宿主細胞に関する。ある実施形態では、細胞結合型異種タンパク質は、酵母組成物または酵母製品中の総タンパク質の少なくとも０．１％（乾燥重量パーセントで）を占める。ある実施形態では、細胞結合型異種ポリペプチドは、例えば、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、ホスファターゼおよび／またはリガーゼなどの異種酵素である。ある実施形態では、異種酵素は、例えば、異種アミラーゼなどのグリコシラーゼである。細胞結合型異種タンパク質がアミラーゼである実施形態では、それは、限定されるものではないが、マルトース生成アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−アミラーゼまたは真菌アミラーゼであってもよい。ある実施形態では、アミラーゼは、マルトース生成アミラーゼである。ある実施形態では、アミラーゼは、グルコアミラーゼである。ある実施形態では、アミラーゼは、アルファ−アミラーゼである。ある実施形態では、アミラーゼは、真菌アミラーゼである。さらなる実施形態では、オキシダーゼは、グルコースオキシダーゼである。さらに別の実施形態では、異種酵素は、例えば、フィターゼなどのホスファターゼである。さらなる実施形態では、異種酵素は、例えば、グルコースオキシダーゼなどのオキシダーゼである。別の実施形態では、異種核酸分子は、異種細胞結合型タンパク質の細胞内発現を可能にする。さらに別の実施形態では、異種核酸分子は、膜結合型異種タンパク質の発現を可能にする。さらなる実施形態では、異種核酸分子は、係留された異種タンパク質の発現を可能にする。さらなる実施形態では、係留された異種タンパク質は、式（Ｉ）：
（ＮＨ２）ＨＰ−Ｌ−ＴＴ（ＣＯＯＨ）  （Ｉ）
（式中、ＨＰは異種ポリペプチドであり、Ｌは存在するか、または存在しないアミノ酸リンカーであり、ＴＴは異種ポリペプチドを組換え酵母宿主細胞の細胞壁と結合させるためのアミノ酸係留部分であり、「−」はアミド結合である）
のキメラタンパク質である。式（Ｉ）のキメラタンパク質において、（ＮＨ２）は、キメラタンパク質のアミノ末端の位置を示すが、（ＣＯＯＨ）は、キメラタンパク質のカルボキシル末端を示す。別の実施形態では、係留された異種タンパク質は、式（ＩＩ）：
（ＮＨ２）ＴＴ−Ｌ−ＨＰ（ＣＯＯＨ）  （ＩＩ）
（式中、ＨＰは異種ポリペプチドであり、Ｌは存在するか、または存在しないアミノ酸リンカーであり、ＴＴは異種ポリペプチドを組換え酵母宿主細胞の細胞壁と結合させるためのアミノ酸係留部分であり、「−」はアミド結合である）
のキメラタンパク質である。式（ＩＩ）のキメラタンパク質において、（ＮＨ２）は、キメラタンパク質のアミノ末端の位置を示すが、（ＣＯＯＨ）は、キメラタンパク質のカルボキシル末端を示す。キメラタンパク質のある実施形態では、Ｌは存在し、例えば、１つもしくは複数のＧ４Ｓ（配列番号４１）モチーフおよび／または１つもしくは複数のＥＡ２Ｋ（配列番号１００）またはＥＡ３Ｋ（配列番号１０１）モチーフを含んでもよい。キメラタンパク質の他の実施形態では、ＴＴは、膜貫通ドメイン、そのバリアントまたは断片を含んでもよい。例えば、ＴＴは、FＬＯ１タンパク質に由来するものであってもよい。例えば、ＴＴは、配列番号１４のアミノ酸配列を有してもよく、配列番号１４のアミノ酸配列のバリアントであってもよく、または配列番号１４のアミノ酸配列の断片であってもよい。キメラタンパク質のさらなる実施形態では、ＴＴを、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを有するように翻訳後機構によって改変することができる。例えば、ＴＴは、ＳＥＤ１タンパク質、ＴＩＲ１タンパク質、ＣＷＰ２タンパク質、ＣＣＷ１２タンパク質、ＳＰＩ１タンパク質、ＰＳＴ１タンパク質またはＡＧＡ１タンパク質とＡＧＡ２タンパク質との組合せに由来するものであってもよい。特定の実施形態では、ＴＴは、ＳＰＩ１タンパク質に由来し、例えば、配列番号７４のアミノ酸配列を有してもよく、配列番号７４のアミノ酸配列のバリアントであってもよく、または配列番号７４のアミノ酸配列の断片であってもよい。さらなる実施形態では、ＴＴは、ＳＰＩタンパク質の断片であってもよく、配列番号７６、７８、８０もしくは８２のアミノ酸配列を有してもよく；配列番号７６、７８、８０もしくは８２のアミノ酸配列のバリアントであってもよく、または配列番号７６、７８、８０もしくは８２のアミノ酸配列の断片であってもよい。別の特定の実施形態では、ＴＴは、ＣＣＷ１２タンパク質に由来するものであってもよく、例えば、配列番号８４のアミノ酸配列を有してもよく、配列番号８４のアミノ酸配列のバリアントであってもよく、または配列番号８４のアミノ酸配列の断片であってもよい。さらなる実施形態では、ＴＴは、ＣＣＷ１２タンパク質の断片であってもよく、配列番号８６、８８、９０もしくは９２のアミノ酸配列を有してもよく；配列番号８６、８８、９０もしくは９２のアミノ酸配列のバリアントであってもよく、または配列番号８６、８８、９０もしくは９２のアミノ酸配列の断片であってもよい。別の実施形態では、ＴＴは、ＡＧＡ１タンパク質とＡＧＡ２タンパク質との組合せに由来する。さらに別の実施形態では、ＡＧＡ１タンパク質とＡＧＡ２タンパク質との組合せは、配列番号２４のアミノ酸配列を有する、配列番号２４のアミノ酸配列のバリアントである、配列番号２４のアミノ酸配列の断片である、配列番号２６のアミノ酸配列を有する、配列番号２６のアミノ酸配列のバリアントである、または配列番号２６のアミノ酸配列の断片である。さらなる実施形態では、プロモーターは、天然または異種プロモーターであり、例えば、ｔｄｈ１遺伝子、ｈｏｒ７遺伝子、ｈｓｐ１５０遺伝子、ｈｘｔ７遺伝子、ｇｐｍ１遺伝子、ｐｇｋ１遺伝��および／またはｓｔｌ１遺伝子に由来するプロモーターを含む。ある実施形態では、異種プロモーターは、ｔｄｈ１遺伝子に由来するプロモーターを含む。さらに別の実施形態では、異種プロモーターは、ｈｏｒ７遺伝子に由来するプロモーターを含む。さらに別の実施形態では、異種核酸分子は、ターミネーターと作動可能に結合している。さらなる実施形態では、ターミネーターは、天然または異種ターミネーターであり、例えば、ｄｉｔ１遺伝子、ｉｄｐ１遺伝子、ｇｐｍ１遺伝子、ｐｍａ１遺伝子、ｔｄｈ３遺伝子、ｈｘｔ２遺伝子および／またはｉｒａ２遺伝子に由来するターミネーターを含んでもよい。特定の実施形態では、異種ターミネーターは、ｄｉｔ１遺伝子に由来するものであってもよい。別の特定の実施形態では、異種ターミネーターは、異種ターミネーターは、ａｄｈ３遺伝子に由来するものであってもよい。さらに別の特定の実施形態では、異種ターミネーターは、ｉｄｐ１遺伝子に由来するものであってもよい。さらに別の実施形態では、膜結合型異種ポリペプチドをコードする異種核酸分子は、異種シグナルペプチドをコードするさらなる核酸分子と結合している。ある実施形態では、異種シグナルペプチドは、例えば、細菌タンパク質などの原核タンパク質に由来する。さらなる実施形態では、異種シグナルペプチドは、インベルターゼタンパク質（配列番号６８のアミノ酸配列を有する、配列番号６８のアミノ酸配列のバリアントである、もしくは配列番号６８のアミノ酸配列の断片である）、ＡＧＡ２タンパク質（配列番号６９のアミノ酸配列を有する、配列番号６９のアミノ酸配列のバリアントである、もしくは配列番号６９のアミノ酸配列の断片である）または真菌アミラーゼ（配列番号１０７のアミノ酸配列を有する、配列番号１０７のアミノ酸配列のバリアントである、もしくは配列番号１０７のアミノ酸配列の断片である）に由来するものであってもよい。ある実施形態では、組換え酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属種に由来する。さらなる実施形態では、組換え酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種に由来する。
【０００９】
第３の態様によれば、本開示は、酵母組成物を作製するためのプロセスを提供する。広くは、プロセスは、ａ）本明細書で定義される細胞結合型異種タンパク質を有する組換え酵母宿主細胞を増殖させて、増殖した組換え酵母宿主細胞を取得するステップ、およびｂ）増殖した酵母宿主細胞を、酵母組成物に製剤化するステップを含む。ある実施形態では、酵母組成物は、クリームである。さらに別の実施形態では、ステップａ）は、例えば、糖蜜を含んでもよい培養培地中で行われる。ある実施形態では、細胞結合型異種タンパク質は、酵母組成物中の総タンパク質の少なくとも０．１％（乾燥重量パーセントで）を占める。さらに別の実施形態では、細胞結合型異種タンパク質は、異種酵素である。プロセスは、細胞結合型異種タンパク質の発現を可能にするために、パン酵母生産法に従う容器に入れた培地中で組換え酵母宿主細胞を増殖させることを含んでもよい。ある実施形態では、パン酵母生産法は、連続法またはフェドバッチ法である。さらに別の実施形態では、増殖中の組換え酵母宿主細胞の比増殖速度は、０．２５ｈ−１以下である。さらなる実施形態では、プロセスは、容器の通気速度が少なくとも約０．５または約１．０空気容量／容器容量／分となるように制御することをさらに含む。さらなる実施形態では、培地は、炭水化物源、窒素源、リン源および必要に応じて、微量栄養素を含む。ある実施形態では、炭水化物源は、糖蜜、コーン、グリセロールおよび／またはリグノセルロース系バイオマスに由来する。さらなる実施形態では、窒素源は、アンモニアである。さらなる実施形態では、リン源は、リン酸である。別の実施形態では、プロセスは、組換え酵母宿主細胞の増殖速度を制限するために炭水化物源の培地への添加を制御することをさらに含む。さらなる実施形態では、プロセスは、炭水化物源の濃度を、培地の総容量に対して０．１または０．０００１重量パーセンテージ以下に維持することを含む。さらに別の実施形態では、プロセスは、組換え酵母宿主細胞の増殖速度を一致させるために窒素源および／またはリン源を添加することをさらに含む。さらに別の実施形態では、プロセスは、培地のｐＨを約４．０〜５．０、例えば、約４．５に制御することをさらに含む。さらに別の実施形態では、プロセスは、培地の温度を、約２０℃〜約４０℃、例えば、約３０℃〜約３５℃に制御することをさらに含む。ある実施形態では、増殖ステップの後、組換え酵母宿主細胞の濃度は、培地の総容量の少なくとも０．２５または１重量％である。ある実施形態では、組換え酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属種に由来する。さらなる実施形態では、組換え酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種に由来する。
【００１０】
第４の態様によれば、本開示は、本明細書に記載のプロセスによって得ることができる、または得られる増殖した酵母宿主細胞を含む酵母組成物を提供する。ある実施形態では、細胞結合型異種タンパク質は、酵母組成物中の総タンパク質の少なくとも０．１％（乾燥重量パーセントで）を占める。さらに別の実施形態では、細胞結合型異種タンパク質は、異種酵素である。
【００１１】
第５の態様によれば、本開示は、酵母製品を作製するためのプロセスを提供する。広くは、プロセスは、ａ）本明細書に記載のプロセスによって得ることができる増殖した組換え酵母宿主細胞または本明細書に記載の増殖した組換え酵母宿主細胞を含む酵母組成物を提供するステップ；ｂ）増殖した酵母宿主細胞を溶解して、溶解した組換え酵母宿主細胞を取得するステップ、ｃ）必要に応じて、溶解した組換え酵母宿主細胞を乾燥させて、乾燥した組換え酵母宿主細胞を取得するステップ、およびｄ）溶解した組換え酵母宿主細胞または乾燥した組換え酵母宿主細胞を酵素製品に製剤化するステップを含む。ある実施形態では、ステップｂ）は、増殖した組換え酵母宿主細胞を自己溶解させて、溶解した組換え酵母宿主細胞を取得することを含む。ある実施形態では、ステップｃ）は、自己溶解物を酵母製品として提供するために、ステップｂ）の直後に行われる。別の実施形態では、溶解した組換え酵母宿主細胞は、可溶性画分および不溶性画分を含み、プロセスは、ステップｂ）の後、かつステップｃ）の前に、不溶性画分から可溶性画分を分離すること（例えば、濾過による）をさらに含む。さらに別の実施形態では、不溶性画分をステップｄ）にかけて、酵素細胞壁を酵母製品として提供することを含む。さらなる実施形態では、プロセスは、可溶性画分をステップｄ）にかけて、酵母抽出物を酵母製品として提供することを含む。さらなる実施形態では、プロセスは、可溶性画分から約１０ｋＤａに等しいか、またはそれ未満の分子量を有する成分を除去して、保持物を提供することをさらに含む。さらに別の実施形態では、プロセスは、保持物をステップｃ）にかけて、乾燥保持物を酵母製品として提供することを含む。ある実施形態では、細胞結合型異種タンパク質は、酵母製品中の総タンパク質の少なくとも０．１％（乾燥重量パーセントで）を占める。さらに別の実施形態では、プロセスは、増殖した酵母宿主細胞から異種タンパク質を実質的に精製して、精製された異種タンパク質を酵母製品として提供することをさらに含む。
【００１２】
第６の態様によれば、本開示は、本明細書に記載のプロセスによって得ることができるか、または得られる酵母製品を提供する。ある実施形態では、細胞結合型異種タンパク質は、酵母製品中の総タンパク質の少なくとも０．１％（乾燥重量パーセントで）を占める。さらに別の実施形態では、酵母製品は、活性形態、半活性形態、または不活性形態またはその組合せとして提供される。
【００１３】
第７の態様によれば、本開示は、本明細書に記載のプロセスによって得ることができるか、または得られる単離された異種タンパク質を提供する。単離された異種タンパク質は、異種核酸分子と、本明細書で定義されるさらなる核酸分子とを有する組換え酵母宿主細胞によって産生される。さらに、さらなる核酸分子は、異種（例えば、細菌）シグナルペプチドをコードする。
【００１４】
本発明の性質をかくして一般的に記載してきたが、ここで、例として、その好ましい実施形態を示す、添付の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】野生型（Ｍ１０４７４）または組換え酵母宿主細胞の酵母細胞ペレット中で測定されたマルトース生成アミラーゼ（ＭＡＡ）酵素活性を提供する図である。結果を、試験した酵母の種類（左から右に、Ｍ１０４７４、Ｔ２９８６、Ｔ２９８７、Ｔ２９８８、Ｔ２９８９、Ｔ２９９０、Ｔ２９９１、Ｔ２９４４；株は表１に記載される）の関数におけるマルトース生成アミラーゼ活性（ＭＡＮＵ／ｍＬとして提供される）として示す。
【図２】Ｓｅｄ１テザーの非存在下（Ｍ８４９８株）および存在下（Ｍ１４２４４株）で異種グルコアミラーゼを発現する培養組換え酵母宿主細胞のペレット（「結合」、明灰色）および上清（「遊離」、暗灰色）中で測定されたグルコアミラーゼ酵素活性を提供する図である。結果を、使用した株の関数におけるグルコアミラーゼ活性として示す。
【図３】Ｓｅｄ１テザーおよびリンカーの存在下（Ｍ１４２５３株）、Ｓｅｄ１の存在下であるが、リンカーの非存在下（Ｍ１４２５４）、およびＳｅｄ１テザーの非存在下（Ｍ１００７４株）で異種アルファ−アミラーゼを発現する培養組換え酵母宿主細胞のペレット（「結合」、明灰色）および上清（「遊離」、暗灰色）中で測定されたアルファ−アミラーゼ酵素活性を提供する図である。結果を、使用した株の関数におけるアルファ−アミラーゼ活性として示す。
【図４】マルトース生成アミラーゼを発現する様々な株の小麦デンプン活性を提供する図である。結果を、Ｍ１０４７４、Ｍ１３８２２、Ｍ１３８１９、Ｍ１３８７９およびＴ３８９２株（表１に記載）の全培養物（左のバー）、上清（中央のバー）および洗浄されたペレット（右のバー）１ｍＬあたりの小麦デンプンのＭＡＮＵ（ＯＤ６００ｎｍで測定）として示す。「Ｍ」株に関するデータは、２つの培養物の平均である。Ｔ３８９２に関するデータは、８つの形質転換単離物の培養物にわたる平均活性および最高に機能する単離物の活性（□＝最高の単離物、全培養物；△＝最高の単離物、上清；○＝最高の単離物、洗浄された細胞ペレット）を含む。下のグラフは、それぞれの操作戦略の予測された酵素局在化表現型を示す。
【図５】遊離の、または係留されたＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉのフィターゼを発現する株に関する、培養上清中での（灰色のバー）または細胞と結合したフィターゼ活性（図５Ａ中の斜線入りのバーもしくは図５Ｂ中の□）を提供する図である。上清を、５ｍＭフィチン酸ナトリウム溶液、ｐＨ５．５と共に３０分間インキュベートし、細胞を、同じ溶液中で２時間インキュベートした。（図５Ａ）７００ｎｍでの吸光度を、既知のリン酸濃度の標準曲線と比較して、ＦＴＵで活性を表した。吸光度を、異なる株（Ｍ１２５４８、Ｔ２６３３、Ｔ２６３４、Ｔ２６３５、Ｔ２６３６、Ｔ２６３７およびＴ２６３８）において上清（灰色のバー）および細胞（斜線入りのバー）中で測定した。（図５Ｂ）ＦＴＵを、異なる株間で比較した。左側の垂直軸は、上清の活性を示し、それぞれの株のＦＴＵは、灰色のバーとして提供される。右側の軸は、細胞結合型ＦＴＵ活性を示し、それぞれの株（Ｍ１２５４８、Ｔ２６３３、Ｔ２６３４、Ｔ２６３５、Ｔ２６３６、Ｔ２６３７およびＴ２６３８）に関して□として提供される。親株およびＰｓｔ１テザー細胞結合型活性の値は、標準曲線の範囲の外側にあり、したがって、検出限界より下であった。
【図６】ＮまたはＣ末端テザーと融合したＥｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのフィターゼを発現する株に関する、培養上清中での（灰色のバー）または細胞と結合したフィターゼ活性（斜線入りのバー）を提供する図である。上清を、５ｍＭフィチン酸ナトリウム溶液、ｐＨ５．５と共に３０分間インキュベートし、細胞を同じ溶液中で２時間インキュベートした。結果を、それぞれの株（Ｍ１１３１２、Ｔ２７０５およびＴ２７０６）の関数における７００ｎｍでの光学密度として示す。
【図７】ＡＧＡ１を過剰発現した、または過剰発現しないＮ末端テザーと融合したＥ．ｃｏｌｉのフィターゼを発現する株に関する、培養上清中での（灰色のバー）または細胞と結合したフィターゼ活性（斜線入りのバー）を提供し、Ｃ末端Ｓｅｄ１テザーと融合したＥ．ｃｏｌｉフィターゼと比較した図である。上清を、５ｍＭフィチン酸ナトリウム溶液、ｐＨ５．５と共に３０分間インキュベートし、細胞を同じ溶液中で２時間インキュベートした。結果を、それぞれの株（Ｍ１２５５０、Ｍ１２７９５、Ｍ１２９８３およびＴ２８１６）の関数における７００ｎｍでの光学密度として示す。
【図８】マルトース生成アミラーゼを発現する株の小麦デンプン活性を提供する図である。結果を、異なる株（Ｍ１０４７４、Ｍ１３８１９、Ｍ１３８２２、Ｍ１４８５１、Ｔ４３２８、Ｔ４３２９、Ｔ４３３０、Ｍ１２９６２、Ｔ４３３６、Ｔ４３３７およびＴ４３３８）に関する、全培養物（左のバー）、上清（中央のバー）および洗浄された細胞（右のバー）の４５０ｎｍでの吸光度／６００ｎｍでの光学密度の比として提供する。「Ｍ」株に関するデータは、２つの培養物の平均である。「Ｔ」株に関するデータは、７つの形質転換単離物の培養物にわたる平均活性を含む。発現型１とは、インベルターゼシグナルペプチドおよび係留型酵素を生成するためのＳｐｉ１テザーの存在を指す。発現型２とは、インベルターゼシグナルペプチドの存在および分泌型酵素を生成するためのテザーの非存在を指す。発現型３とは、シグナルペプチドの非存在および細胞内酵素を生成するためのテザーの非存在を指す。
【図９】市販の酵素Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）の総タンパク質試料およびＭ１５５３２株のいくつかの試料：酵母クリーム（約２０％の固体）、５５℃で４８時間のインキュベーション後の自己溶解したクリームおよびビーズ粉砕によって均一化されたクリームの上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。矢印は、特に、細胞内酵素を放出させるための自己溶解またはビーズ粉砕後に、全てのＭ１５５３２試料中に存在するＮｏｖａｍｙｌ（登録商標）酵素と同じ分子量の主なバンドを示す。
【図１０】Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）酵素ならびにシグナルペプチドを含まない酵素（予測される細胞内酵素）を発現する２つの株：Ｍ１４８５１およびＭ１５５３２から精製されたマルトース生成アミラーゼのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。結果を、非還元条件（カラム３〜５）および還元条件（カラム７〜９）で生成した。
【図１１】異なる酵母製品を作製するための本開示のプロセスの実施形態を提供する図である。
【図１２】対照株（Ｍ２３９０）と比較した、ＳＰＩ１タンパク質に由来する異なる係留部分、または関連するトランケーションと共に、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来する耐熱性アルファ−アミラーゼ（配列番号７１）を含む様々なキメラタンパク質を発現する酵母株（Ｍ１５７７４、Ｍ１５７７１、Ｍ１５７７７、Ｍ１５７７２およびＭ１５２２２）の細胞と関連するアルファ−アミラーゼ活性を示す図である。結果を、使用した酵母株の関数における５４０ｎｍでの吸光度として示す。
【図１３】対照株（Ｍ２３９０）と比較した、ＣＣＷ１２タンパク質に由来する異なる係留部分、または関連するトランケーションと共に、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓに由来するアルファ−アミラーゼ（配列番号７２）を含む様々なキメラタンパク質を発現する酵母株（Ｍ１５７７３、Ｍ１５７７６、Ｍ１６２５１およびＭ１５２１５）の細胞と関連するアルファ−アミラーゼ活性を示す図である。結果を、使用した酵母株の関数における５４０ｎｍでの吸光度として示す。
【図１４】対照株（Ｍ２３９０）と比較した、ＣＣＷ１２タンパク質に由来する異なる係留部分および異なるリンカーと共に、Ｔ．ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓに由来するアルファ−アミラーゼ（配列番号７２）を含む様々なキメラタンパク質を発現する酵母株（Ｍ１５７８５、Ｍ１５７８６、Ｍ１５７８２、Ｍ１６２５２、Ｍ１６２２１およびＭ１６２２２）の細胞と関連するアルファ−アミラーゼ活性を示す図である。結果を、酵母株の関数における５４０ｎｍでの吸光度として示す。
【図１５】対照株（Ｍ２３９０）と比較した、ＳＰＩ１タンパク質に由来する異なる係留部分および異なるリンカーと共に、Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓに由来するアルファ−アミラーゼ（配列番号７１）を含む様々なキメラタンパク質を発現する酵母株（Ｍ１５７８４、Ｍ１５７７８、Ｍ１５７７９、Ｍ１５７８７、Ｍ１５７８０、Ｍ１５７８８およびＭ１５７８３）の細胞と関連するアルファ−アミラーゼ活性を示す図である。結果を、酵母株の関数における５４０ｎｍでの吸光度として示す。
【図１６】陰性対照株（Ｍ１０４７４）および陽性対照量の市販の精製グルコースオキシダーゼ（陽性対照、Ｇｌｕｚｙｍｅ  Ｍｏｎｏ（登録商標））と比較した、分泌型（Ｍ１６７８０）で、または細胞内（Ｍ１６２７３）で発現された、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに由来するグルコースオキシダーゼを発現する酵母株の全培養物（灰色のバー）、洗浄された細胞（斜線入りのバー）または破壊され洗浄された細胞の上清（白色のバー）と関連するグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）活性を示す図である。結果を、使用した酵母株／対照の関数における５１０ｎｍでの吸光度として示す。
【図１７】分泌型（Ｍ１６７８０）で、または細胞内（Ｍ１６２７３）で発現された、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに由来するグルコースオキシダーゼを発現する酵母株の全培養物（灰色のバー）、洗浄された細胞（斜線入りのバー）と関連するグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）活性を示す図である。結果を、使用した酵母株の関数における５１０ｎｍでの吸光度（対照株Ｍ１０４７４と関連する吸光度を除去するために補正される）として示す。
【図１８】陰性対照株（Ｍ１０４７４）および陽性対照量の市販の精製真菌アルファ−アミラーゼ（陽性対照、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（登録商標））と比較した、異なるシグナルペプチドを含む分泌型で発現された、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅに由来する真菌アミラーゼ（Ｍ１６７７２についてはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのインベルターゼ、Ｍ１６５４０についてはＡ．ｏｒｙｚａｅの天然アルファ−アミラーゼシグナルペプチド）を発現する酵母株の全培養物（灰色のバー）、洗浄された細胞（斜線入りのバー）または破壊され洗浄された細胞の上清（白色のバー）と関連する真菌アミラーゼ（ＦＡ）活性を示す図である。結果を、使用した酵母株／対照の関数における５４０ｎｍでの吸光度として示す。
【図１９】異なるシグナルペプチドを含む分泌型で発現された、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅに由来する真菌アミラーゼ（Ｍ１６７７２についてはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのインベルターゼ、Ｍ１６５４０についてはＡ．ｏｒｙｚａｅの天然アルファ−アミラーゼシグナルペプチド）を発現する酵母株の全培養物（灰色のバー）、洗浄された細胞（斜線入りのバー）または破壊され洗浄された細胞の上清（白色のバー）と関連する真菌アミラーゼ（ＦＡ）活性を示す図である。結果を、使用した酵母株の関数における５４０ｎｍでの吸光度（対照株Ｍ１０４７４と関連する吸光度を除去するために補正される）として示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示は、その増殖期の間に細胞結合型異種タンパク質を発現する組換え酵母宿主細胞を提供する。本開示の文脈で使用される場合、「増殖期」という表現は、基質のバイオマスへの変換を最大化する好気的条件下で酵母を増殖させる商業プロセスの拡張期を指す。一部の例では、増殖したバイオマスを、その後の発酵ステップ（通常は嫌気的条件下）において使用して、１つまたは複数の所望の代謝物の産生を最大化することができる。有利には、本開示の組換え酵母宿主細胞は細胞結合型異種タンパク質を発現するため、それは、遊離形態の（細胞結合型でも、係留されてもいない）異種タンパク質を発現する組換え酵母宿主細胞と比較した場合、異種タンパク質が富化された酵母組成物または酵母製品を提供する。ある実施形態では、酵母組成物または酵母製品は、酵母組成物または酵母製品の総タンパク質の少なくとも１％（乾燥重量で）の異種タンパク質を含んでもよい。一部の実施形態では、酵母組成物または酵母製品は、組換え酵母宿主細胞、酵母組成物または酵母製品のタンパク質の総重量と比較した場合、少なくとも０．１重量％の異種タンパク質を含む。一部の実施形態では、組換え酵母宿主細胞、酵母組成物または酵母製品は、酵母組成物または酵母製品のタンパク質の総重量と比較した場合、少なくとも０．００１ｇの異種タンパク質を含む。一部の実施形態では、酵母組成物または酵母製品は、組換え酵母宿主細胞の総重量と比較した場合、少なくとも０．０５重量％の異種タンパク質を含む。一部の実施形態では、酵母組成物または酵母製品は、組換え酵母宿主細胞の乾燥重量１ｇあたり、少なくとも０．０００５ｇの異種タンパク質を含む。異種タンパク質が酵素である一部の実施形態では、酵素、酵母組成物または酵母製品は、組換え酵母宿主細胞の乾燥細胞重量１ｇあたり、または組換え酵母宿主細胞の総タンパク質１ｇあたり、少なくとも５０酵素活性単位の最小酵素活性を提供する。ある実施形態では、細胞結合型異種タンパク質の細胞結合型活性は、遊離形態（例えば、分泌型）で発現される対応する異種タンパク質の細胞結合型活性と比較した場合、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはさらには２５倍高い。一部の実施形態では、組換え酵母宿主細胞は、異種タンパク質を発現しない（しかしながら、それにも拘わらず、対応する天然タンパク質を発現する）酵母宿主細胞と比較した場合、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、２０、３５、４０、４５、５０％以上の異種タンパク質を有する。ある実施形態では、細胞結合型異種タンパク質について、細胞培養上清（例えば、遊離）と関連する活性と比較した、細胞と関連する活性の比は、１：３３よりも高く、それは、例えば、約１：１２〜１：１．４である。別の実施形態では、細胞結合型異種タンパク質について、細胞と関連する活性のパーセンテージ（総活性と比較した場合）は、８〜４２％の間の任意のパーセンテージである。本開示の組換え酵母宿主細胞は、それらが伝統的に使用される精製された製品よりも費用の低い酵素活性供給源を提供するため、有利である。さらに、組換え酵母宿主細胞中での異種タンパク質の活性は、有利には、工業プロセスにそれらを含ませる前に容易に測定し、投与し、製剤化することができる。
【００１７】
組換え酵母宿主細胞
本開示の組換え酵母宿主細胞は、酵母製品を作製するための様々なプロセスにおいて使用することができる酵母組成物を作製するためのプロセスにおいて使用されることが意図される。本開示の組換え酵母宿主細胞（ならびに、同様に、酵母組成物および酵母製品）は、細胞内型の、またはその膜に結合した、細胞結合型の異種タンパク質を含む。本開示の文脈で使用される場合、「酵母組成物」は、増殖させた本開示の組換え酵母宿主細胞を含む組成物である。酵母の組合せを、例えば、その後の発酵（発酵中にｉｎ  ｓｉｔｕで異種タンパク質を提供するため）において、または酵母製品を作製するために使用することができる。ある実施形態では、組換え酵母宿主細胞は、酵母組成物中で活性形態または半活性形態で提供される。例えば、酵母組成物の実施形態は、本開示の組換え酵母宿主細胞から作製されるクリームである。
【００１８】
また、本開示の文脈で使用される場合、「酵母製品」は、本開示の組換え酵母宿主細胞によって作製される製品を含み、異種タンパク質を含む組成物である。ある実施形態では、酵母製品を、本開示の酵母提供細胞中で不活性形態として提供することができる。さらに別の実施形態では、酵母製品は、本開示の組換え酵母宿主細胞によって産生される代謝物、例えば、組換え酵母宿主細胞によって産生される異種タンパク質であってもよい。
【００１９】
本開示の組換え酵母宿主細胞を、必要に応じて、発酵プロセスにおいて使用してもよい。ある実施形態では、発酵プロセスは、比較的長いものであってもよく、組換え酵母宿主細胞を、例えば、バイオ燃料、蒸留製品、ワインおよびビールの作製において使用することができる。別の実施形態では、発酵プロセスは、比較的短いものであってもよく、組換え酵母宿主細胞を、例えば、酵母で発酵させたパン製品の作製において使用することができる。
【００２０】
本開示の組換え酵母宿主細胞を、発酵ステップを含まないプロセスにおいて使用することもできる。例えば、組換え酵母宿主細胞を、食品および飲料（例えば、酵母で発酵させていない（化学的に発酵させた）パン製品、乳製品、酵母抽出物、ジュース、脂肪および油ならびにデンプン）、飼料または他の工業製品（例えば、界面活性剤、繊維製品、革製品、パルプおよび紙、油およびガスならびに／またはバイオポリマー）を作製するために使用することができる。
【００２１】
本開示の組換え酵母宿主細胞を、活性形態（例えば、液体、圧縮された、または流動床で乾燥された酵母）、半活性形態（例えば、液体、圧縮された、または流動床で乾燥された）、不活性形態（例えば、ドラム乾燥または噴霧乾燥された）ならびにその混合物で提供することができる。例えば、組換え酵母宿主細胞は、酵母組成物を作製するのに必要とされる異種タンパク質の比および用量を提供するために、活性形態と、半活性形態または不活性形態との組合せであってもよい。
【００２２】
本開示は、遺伝子操作された組換え酵母宿主細胞に関する。遺伝子改変は、特定の標的遺伝子（酵母宿主細胞にとって異種であると考えられる）の発現を増加させることを目的とし、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８もしくはそれより多い）遺伝子位置において作製することができる。本開示の文脈では、組換え酵母細胞が「遺伝子操作されている」としての資格がある場合、それは少なくとも１つまたは複数の異種または外因性核酸残基を付加するように操作されていることを意味すると理解される。一部の実施形態では、付加される１つまたは複数の核酸残基は、異種細胞、または組換え宿主細胞自体に由来するものであってもよい。後者のシナリオでは、核酸残基は、天然のゲノム位置とは異なる１つまたは複数のゲノム位置に付加される。遺伝子操作は、天然に起こったものではなく、酵母のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの操作の結果である。
【００２３】
組換え酵母宿主細胞中で発現される場合、本明細書に記載の異種タンパク質は、１つまたは複数の異種核酸分子上にコードされる。核酸分子（プロモーター、ターミネーターもしくはコード配列）またはタンパク質を参照して使用される場合の用語「異種」とは、組換え宿主細胞中には天然に見出されない核酸分子またはタンパク質を指す。「異種」はまた、起源生物から除去された後、対応する天然遺伝子とは異なる形態で、例えば、生物のゲノム中でその天然の位置にはない形態で起源生物中に再導入された、天然のコード領域／プロモーター／ターミネーター、またはその一部も含む。異種核酸分子は、組換え宿主細胞中に目的をもって導入される。例えば、異種エレメントは、異なる株の宿主細胞、または異なる分類群（例えば、異なる界、門、綱、目、科、属、もしくは種、またはこれらの分類の１つの中の任意の亜群）の生物に由来するものであってよい。
【００２４】
組換え宿主細胞中に存在する異種核酸分子を、宿主細胞のゲノム中に組み込むことができる。本明細書で使用される用語「組み込まれた」とは、分子生物学技術によって、宿主細胞のゲノム中に入れられる遺伝子エレメントを指す。例えば、遺伝子エレメントを、宿主細胞によって担持されるプラスミドなどのベクター中とは対照的に、宿主細胞の染色体中に入れることができる。遺伝子エレメントを宿主細胞のゲノム中に組み込むための方法は、当業界で周知であり、相同組換えを含む。異種核酸分子は、酵母宿主細胞のゲノム中に１または複数のコピー（例えば、２、３、４、５、６、７、８またはさらにより多くのコピー）中に存在してもよい。あるいは、異種核酸分子を、酵母のゲノムから独立に複製させることができる。そのような実施形態では、核酸分子は、安定であり、自己複製性であってもよい。
【００２５】
本開示の文脈で使用することができる好適な酵母宿主細胞は、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ａｒｘｕｌａ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｐｉｃｈｉａ、Ｐｈａｆｆｉａ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ、Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ、ＴｏｒｕｌａまたはＹａｒｒｏｗｉａ属に由来するものであってもよい。好適な酵母種としては、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｂｕｌｄｅｒｉ、Ｓ．ｂａｒｎｅｔｔｉ、Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ、Ｓ．ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓまたはＫ．ｆｒａｇｉｌｉｓが挙げられる。一部の実施形態では、酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｐｈａｆｆｉａ  ｒｈｏｄｏｚｙｍａ、Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ、Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｈａｎｓｅｎｉｉ、Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅおよびＳｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓからなる群から選択される。１つの特定の実施形態では、酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。一部の実施形態では、宿主細胞は、油性酵母細胞であってもよい。例えば、油性酵母宿主細胞は、Ｂｌａｋｅｓｌｅａ、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｅｌｌａ、Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｔｈｉｕｍ、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｕｍ、Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ、ＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎまたはＹａｒｒｏｗｉａ属に由来するものであってもよい。一部の代替的な実施形態では、宿主細胞は、油性微細藻類宿主細胞（例えば、ＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍまたはＳｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属に由来する）であってもよい。ある実施形態では、組換え酵母宿主細胞は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に由来し、一部の実施形態では、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ種に由来する。
【００２６】
本開示の組換え酵母宿主細胞は、１つまたは複数の異種タンパク質の発現を可能にするように意図される（例えば、コードする）異種核酸分子を含む。ある実施形態では、異種タンパク質は、異種酵素である。本出願の文脈では、異種酵素は、限定されるものではないが、異種オキシドレダクターゼ、異種トランスフェラーゼ、異種ヒドロラーゼ、異種リアーゼ、異種イソメラーゼ、異種ホスファターゼおよび／または異種リガーゼであってもよい。
【００２７】
本開示の文脈で使用される場合、「オキシドレダクターゼ」という表現（オキシダーゼ、Ｅ．Ｃ．１とも呼ばれる）は、酵素活性を有し、ある分子（還元剤または電子供与体）から別の分子（酸化剤または電子受容体）への電子の移動を触媒することができるタンパク質を指す。ある実施形態では、オキシドレダクターゼは、ヘキソースオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．３．５）であり、例えば、ヘキソースオキシダーゼは、グルコースオキシダーゼ（Ｅ．Ｃ．１．１．３．４）であってもよい。一部の実施形態では、オキシダーゼ（グルコースオキシダーゼなど）は、生地被削性を改善することができる。ある実施形態では、１つまたは複数のオキシドレダクターゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに由来するグルコースオキシダーゼ（例えば、配列番号４４または１０３のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）であってもよい。オキシドレダクターゼを、バイオ燃料、蒸留製品、ワイン、ビールおよび酵母で発酵させたパン製品を作製するための発酵プロセスにおいて使用することができる。オキシドレダクターゼを、食品および飲料（例えば、酵母で発酵させない（化学的に発酵させた）パン製品）、飼料または他の工業製品（例えば、界面活性剤、繊維製品、革製品、パルプおよび紙、油およびガスならびに／またはバイオポリマー）を作製するために使用することができる。
【００２８】
本開示の文脈で使用される場合、「トランスフェラーゼ」（Ｅ．Ｃ．２）という表現は、酵素活性を有し、ある分子（供与体と呼ばれる）から別の分子（受容体と呼ばれる）への特定の官能基（例えば、メチルまたはグリコシル基）の移動を触媒することができるタンパク質を指す。例えば、トランスフェラーゼは、アシルトランスフェラーゼ（例えば、トランスグルタミナーゼ（Ｅ．Ｃ．２．３．２．１３）などのＥ．Ｃ．２．３）またはグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、アミロマルターゼ（Ｅ．Ｃ．２．４．１．３）などのＥ．Ｃ．２．４）であってもよい。トランスグルタミナーゼを、ベーキング商品において使用して、生地の強度を改善することができる。
【００２９】
本開示の文脈で使用される場合、「リアーゼ」（Ｅ．Ｃ．４）という表現は、酵素活性を有し、加水分解（例えば、「置換」反応）および酸化以外の手段による様々な化学結合の除去を触媒することができるタンパク質を指す。例えば、リアーゼは、マロラクティック酵素（ＥＣ４．１．１．１０１）、アセト乳酸デカルボキシラーゼ（もしくは、アルファ−アセト乳酸デカルボキシラーゼ、ＥＣ４．１．１．５）および／またはペクチン酸リアーゼ（Ｅ．Ｃ．４．２．２．２）であってもよい。リアーゼを、バイオ燃料、蒸留製品、ワイン、ビールおよび酵母で発酵させたパン製品を作製するための発酵プロセスにおいて使用することができる。リアーゼを、食品および飲料（例えば、酵母で発酵させない（化学的に発酵させた）パン製品）、飼料または他の工業製品（例えば、界面活性剤、繊維製品、革製品、パルプおよび紙、油およびガスならびに／またはバイオポリマー）を作製するために使用することもできる。
【００３０】
本開示の文脈で使用される場合、「イソメラーゼ」（Ｅ．Ｃ．５）という表現は、酵素活性を有し、分子のある異性体から別の異性体への変換を触媒することができるタンパク質を指す。例えば、イソメラーゼは、グルコースイソメラーゼ（Ｅ．Ｃ．５．１．３）またはキシロースイソメラーゼ（Ｅ．Ｃ．５．１．３．５）であってもよい。イソメラーゼを、バイオ燃料、蒸留製品、ワイン、ビールおよび酵母で発酵させたパン製品を作製するための発酵プロセスにおいて使用することができる。イソメラーゼを、食品および飲料（例えば、酵母で発酵させない（化学的に発酵させた）パン製品）、飼料または他の工業製品（例えば、界面活性剤、繊維製品、革製品、パルプおよび紙、油およびガスならびに／またはバイオポリマー）を作製するために使用することもできる。
【００３１】
本開示の文脈で使用される場合、「リガーゼ」（Ｅ．Ｃ．６）という表現は、酵素活性を有し、新しい化学結合を形成させることによって２つの分子の結合を触媒することができるタンパク質を指す。例えば、リガーゼは、尿素アミドリアーゼ（Ｅ．Ｃ．６．３．４．６）であってもよい。リガーゼを、バイオ燃料、蒸留製品、ワイン、ビールおよび酵母で発酵させたパン製品を作製するための発酵プロセスにおいて使用することができる。リガーゼを、食品および飲料（例えば、酵母で発酵させない（化学的に発酵させた）パン製品）、飼料または他の工業製品（例えば、界面活性剤、繊維製品、革製品、パルプおよび紙、油およびガスならびに／またはバイオポリマー）を作製するために使用することもできる。
【００３２】
本開示の文脈で使用される場合、「ヒドロラーゼ」（Ｅ．Ｃ．３）という表現は、酵素活性を有し、化学結合の加水分解を触媒することができるタンパク質を指す。例えば、ヒドロラーゼは、エステラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．１、例えば、リパーゼ、ホスホリパーゼＡ１および／またはホスホリパーゼＡ２）であってもよく、Ｃ−Ｎ非ペプチド結合を切断することができ（Ｅ．Ｃ．３．５、例えば、アスパラギナーゼ）、グリコシラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２、例えば、アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１）、グルカナーゼ、グリコシダーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１）、セルラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４））、ペクチナーゼおよび／またはラクターゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１０８）、プロテアーゼ（Ｅ．Ｃ．３．４、例えば、細菌プロテアーゼ、植物プロテアーゼもしくは真菌プロテアーゼ）であってもよい。ヒドロラーゼがアミラーゼである場合、それは、例えば、真菌アルファアミラーゼ、細菌アルファアミラーゼ、マルトース生成アルファアミラーゼ、マルトテトラヒドロラーゼ、植物（例えば、大麦）アルファもしくはベータアミラーゼおよび／またはグルコアミラーゼであってもよい。ヒドロラーゼがグリコシダーゼである場合、それは、例えば、ベータグルコシダーゼであってもよい。ヒドロラーゼがセルラーゼである場合、それは、例えば、セルラーゼ、ヘミセルラーゼおよび／またはキシラナーゼであってもよい。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ホスファターゼ」という表現は、酵素活性を有し、水の存在下で、リン酸モノエステルの、リン酸イオンおよびアルコールへの切断を触媒することができるタンパク質を指す。ホスファターゼの実施形態は、酵素活性を有し、フィチン酸（ミオ−イノシトールヘキサキスリン酸）の無機リンへの加水分解を触媒することができる、フィターゼである。４つの異なるクラスのフィターゼ：ヒスチジン酸ホスファターゼ（ＨＡＰＳ）、β−プロペラフィターゼ、紫酸性ホスファターゼおよびタンパク質チロシンホスファターゼ様フィターゼ（ＰＴＰ様フィターゼ）が存在する。フィチン酸は、異なる速度および異なる順序でフィターゼによって放出され得る６個のリン酸基を有する。フィターゼは、段階的様式でフィチン酸に由来するリン酸を加水分解し、さらなる加水分解のための基質に再びなる生成物をもたらす。フィターゼは、加水分解されるフィチン酸の第１のリン酸の位置に基づいてグループ化されており、３−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．８）、４−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．２６）および５−フィターゼ（ＥＣ３．１．３．７２）である。ある実施形態では、フィターゼは、例えば、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属種またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種などの細菌種に由来する。特定の実施形態では、異種フィターゼは、例えば、Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉなどのＣｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ属種に由来し、例えば、配列番号６６のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有してもよい。別の実施形態では、異種フィターゼは、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉなどのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属種に由来し、例えば、配列番号６７のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有してもよい。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「デンプン分解酵素」という表現は、デンプンまたは加水分解デンプンを加水分解することができる酵素のクラスを指す。デンプン分解酵素としては、限定されるものではないが、アルファ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１、真菌アルファ−アミラーゼと呼ばれることもある、以下を参照）、マルトース生成アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１３３）、グルコアミラーゼ（ＥＣ３．２．１．３）、グルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ（ＥＣ３．２．１．６０）、プルラナーゼ（ＥＣ３．２．１．４１）、イソ−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．６８）およびアミロマルターゼ（ＥＣ２．４．１．２５）が挙げられる。ある実施形態では、１つまたは複数のデンプン分解酵素は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅに由来するアルファ−アミラーゼ（例えば、配列番号２もしくは１０５のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するマルトース生成アルファ−アミラーゼ（例えば、配列番号１、５１、６５、もしくは１０８のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｆｉｂｕｌｉｇｅｒａに由来するグルコアミラーゼ（例えば、配列番号３のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓａｃｃｈａｒｏｐｈｉｌａに由来するグルカン１，４−アルファ−マルトテトラヒドロラーゼ（例えば、配列番号４のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｎａｇａｎｏｅｎｓｉｓに由来するプルラナーゼ（例えば、配列番号５のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｕｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓに由来するプルラナーゼ（例えば、配列番号６のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｍｙｌｏｄｅｒａｍｏｓａに由来するイソ−アミラーゼ（例えば、配列番号７のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）、および／またはＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するアミロマルターゼ（例えば、配列番号８のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）であってもよい。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「セルラーゼ／ヘミセルラーゼ」という表現は、それぞれ、セルロースまたはヘミセルロースを加水分解することができる酵素のクラスを指す。セルラーゼ／ヘミセルラーゼとしては、限定されるものではないが、セルラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．４）およびエンドＢ（１，４）Ｄ−キシラナーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．８）が挙げられる。ある実施形態では、１つまたは複数のセルラーゼ／ヘミセルラーゼは、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍに由来するセルラーゼ（例えば、配列番号４２のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）および／またはＲａｓａｍｓｏｎｉａ  ｅｍｅｒｓｏｎｉｉに由来するエンドＢ（１，４）Ｄ−キシラナーゼ（例えば、配列番号４３のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）であってもよい。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「リパーゼ」という表現は、脂質を加水分解することができる酵素のクラスを指す。ある実施形態では、１つまたは複数のリパーゼは、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓｉｓに由来するトリアシルグリセロールリパーゼ（例えば、配列番号４５のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａに由来するホスホリパーゼＡ２（例えば、配列番号４６のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｉａｌａｃｅｏｒｕｂｅｒに由来するホスホリパーゼＡ２（例えば、配列番号４７のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）および／またはＡｓｐｅｒｕｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚｅａに由来するホスホリパーゼＡ２（例えば、配列番号４８のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する）であってもよい。
【００３７】
本開示で使用される場合、用語「マルトース生成アミラーゼ」とは、デンプンまたは加水分解デンプンをマルトースに加水分解することができるポリペプチドを指す。マルトース生成アミラーゼとしては、限定されるものではないが、真菌アルファ−アミラーゼ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ属種（例えば、Ａ．Ｎｉｇｅｒ、Ａ．ｋａｗａｃｈｉおよびＡ．ｏｒｙｚａｅ）；Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属種（例えば、Ｔ．ｒｅｅｓｉｅ）、Ｒｈｉｓｏｐｕｓ属種、Ｍｕｃｏｒ属種、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ属種に由来する）、酸安定性真菌アミラーゼ（例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒに由来する）、β−アミラーゼ（例えば、植物（小麦、大麦、ライ麦、ソルガム、大豆、サツマイモ、コメ）および微生物（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｙｍｉｘａ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）に由来する）、マルトース生成アミラーゼ（Ｅ．Ｃ．３．２．１．１３３）（例えば、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ、Ｔｈｅｒｍｕｓ属種などの微生物に由来する）が挙げられる。特定の実施形態では、本開示の組換え酵母宿主細胞は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来し、例えば、配列番号１、５１、６５もしくは１０８のアミノ酸配列、そのバリアントまたはその断片を有する異種マルトース生成アミラーゼをコードする異種核酸分子を含む。
【００３８】
異種タンパク質は、既知／天然のタンパク質のバリアントであってもよい。バリアントは、天然／既知のタンパク質のアミノ酸配列と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸の相違を含む。本明細書で使用される場合、バリアントとは、異種タンパク質の生物学的機能に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列中の変化を指す。置換、挿入または欠失は、変化した配列が異種タンパク質と関連する生物学的機能を防止する、または破壊する場合、タンパク質に悪影響を及ぼすと言われる。例えば、タンパク質の全電荷、構造または疎水−親水特性を、生物活性に悪影響を及ぼすことなく変化させることができる。したがって、アミノ酸配列を変化させて、例えば、異種タンパク質の生物活性に悪影響を及ぼすことなく、ペプチドをより疎水性または親水性にすることができる。タンパク質バリアントは、本明細書に記載の異種タンパク質に対する少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。当業界で公知のように、用語「パーセント同一性」は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。同一性のレベルを、公知のコンピュータープログラムを使用して従来通り決定することができる。同一性を、限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９１）に記載されたものなどの公知の方法によって容易に算出することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共的に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。配列アラインメントおよびパーセント同一性の算出を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）のＭｅｇａｌｉｇｈプログラムを使用して実施することができる。本明細書に開示される配列の複数のアラインメントを、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３頁）を、デフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）と共に使用して実施した。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＢ１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であった。
【００３９】
本明細書に記載の異種タンパク質バリアントは、（ｉ）１つもしくは複数のアミノ酸残基が保存された、もしくは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）で置換され、そのような置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによってコードされたものであっても、なくてもよいもの、または（ｉｉ）１つもしくは複数のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などの別の化合物と融合されているもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、ポリペプチドの精製のために成熟ポリペプチドに融合されているものであってもよい。異種タンパク質の「バリアント」は、保存的バリアントまたは対立遺伝子バリアントであってもよい。
【００４０】
異種タンパク質は、既知／天然のタンパク質の断片または既知／天然のタンパク質のバリアントの断片であってもよい。ある実施形態では、断片は、シグナルペプチド配列が除去された既知／天然のタンパク質に対応する。一部の実施形態では、異種タンパク質「断片」は、異種タンパク質の少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００個以上の連続するアミノ酸を有する。断片は、既知／天然の異種タンパク質のアミノ酸配列と比較した場合、少なくとも１個少ないアミノ酸残基を含み、完全長異種タンパク質の酵素活性を依然として有する。ある実施形態では、断片は、シグナルペプチドを欠くタンパク質のアミノ酸配列に対応する。一部の実施形態では、異種タンパク質の断片を、ペプチド合成によって対応する完全長異種タンパク質を産生するために使用することができる。したがって、断片を、完全長タンパク質を産生するための中間体として使用することができる。
【００４１】
本開示の組換え酵母宿主細胞において、異種タンパク質は、それが発現され、組換え酵母宿主細胞と物理的に結合したままであるように設計されるため、組換え酵母宿主細胞にとって「細胞結合型」である。ある実施形態では、異種タンパク質を、組換え酵母宿主細胞の内部（細胞内）で発現させることができる。そのような実施形態では、異種タンパク質は、組換え酵母宿主細胞の壁と結合している必要はない。異種タンパク質を細胞内で発現させることが意図される場合、天然配列中に存在する場合、そのシグナル配列を欠失させて、細胞内発現を可能にすることができる。
【００４２】
別の実施形態では、本開示の異種タンパク質を分泌させることができるが、その場合、それは組換え酵母宿主細胞と物理的に結合したままである必要がある。ある実施形態では、異種タンパク質の少なくとも１つの部分（通常、少なくとも一方の末端）は、細胞壁（一部の実施形態では、細胞質膜）に、例えば、共有的、非共有的および／または静電気的に結合する。例えば、異種タンパク質を、１つもしくは複数の膜貫通ドメインを担持する、１つもしくは複数の脂質改変（ミリストイル化、パルミトイル化、ファルネシル化および／もしくはプレニル化）を有する、１つもしくは複数の膜結合タンパク質と相互作用する、ならびに／または細胞脂質ラフトと相互作用するように改変することができる。異種タンパク質は細胞膜または細胞壁に直接的に結合していなくてもよい（例えば、結合が係留部分によって起こる場合など）が、それにも拘わらず、タンパク質は、本開示によれば「細胞結合型」異種タンパク質であると考えられる。
【００４３】
一部の実施形態では、異種タンパク質を、組換え酵母宿主細胞の細胞壁に位置し、それと結合するように発現させることができる。一部の実施形態では、異種タンパク質を、宿主細胞の細胞壁の外表面に位置し、それと結合するように発現させる。組換え酵母宿主細胞は全て、細胞内（例えば、核に内部的に面する）および細胞外（例えば、外部に面する）環境を規定する細胞壁（細胞質膜を含む）を有する。異種タンパク質は、組換え酵母宿主細胞の細胞壁の外部面、さらなる実施形態では、組換え酵母宿主細胞の細胞質膜の外部面に位置してもよい（一部の実施形態では、それと物理的に結合していてもよい）。本開示の文脈では、「組換え酵母宿主細胞の細胞壁／細胞質膜の外部面と結合している」という表現は、異種タンパク質が、少なくとも部分的には、組換え酵母宿主細胞の細胞壁（一部の実施形態では、細胞質膜）に物理的に組み込まれる（共有または非共有様式で）能力を指す。物理的組込みは、例えば、異種タンパク質上の膜貫通ドメイン、異種タンパク質上の細胞質膜タンパク質と相互作用することができるドメイン、異種タンパク質に対して行われる翻訳後改変（例えば、脂質化）などの存在に起因してもよい。
【００４４】
一部の異種タンパク質は、組換え酵母宿主細胞の細胞壁に位置し、それと結合する本質的な能力を有する（例えば、細胞結合型である）。細胞結合型である本質的な能力を有する異種タンパク質の一例を、図１Ａ部分（例えば、図１中のＴ２９９４株）に示す。この図面において、結果は、係留部分の非存在下でＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現されたＧｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのマルトース生成アルファ−アミラーゼについて提供されており、この異種タンパク質が本質的に「細胞結合型」であり、酵素活性（例えば、マルトース生成アルファ−アミラーゼ活性）を示すことを明確に示している。
【００４５】
しかしながら、一部の状況では、一部の異種タンパク質は不十分な本質的な細胞結合を示すか、または単に本質的な細胞結合を欠くため、それらに対する細胞結合を増加させるか、または提供することが保証されていてもよい。そのような実施形態では、異種タンパク質を、組換え酵母宿主細胞の細胞壁への結合を提供するか、または増加させる係留アミノ酸部分と組み合わせることによって、異種タンパク質をキメラ構築物として提供することが可能である。そのような実施形態では、キメラ異種タンパク質は、「係留された」と考えられるであろう。キメラタンパク質のアミノ酸係留部分は、異種タンパク質の生物活性に関して中性である、例えば、異種タンパク質の生物活性（例えば、酵素活性など）を妨げないことが好ましい。一部の実施形態では、アミノ酸係留部分と異種タンパク質との結合は、異種タンパク質の生物活性を増加させることができる（係留されていない「遊離」形態と比較した場合）。
【００４６】
ある実施形態では、係留部分を使用して、異種タンパク質と共に発現させて、異種タンパク質を組換え酵母宿主細胞の壁に位置させることができる。様々な係留アミノ酸部分が当業界で公知であり、本開示のキメラタンパク質において使用することができる。係留部分は、別のタンパク質上に見出される膜貫通ドメインであってよく、キメラタンパク質が膜貫通ドメインを有するようにする。そのような実施形態では、係留部分は、ＦＬＯ１タンパク質に由来する（例えば、配列番号１０のアミノ酸配列、そのバリアントもしくはその断片を有するか、または配列番号９の核酸配列によってコードされる）ものであってもよい。
【００４７】
さらに別の例では、アミノ酸係留部分を翻訳後改変して、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを含み、キメラタンパク質がＧＰＩアンカーを有するようにすることができる。ＧＰＩアンカーは、タンパク質の、細胞膜の細胞質膜への固定を可能にするタンパク質の末端（一部の実施形態では、タンパク質のカルボキシル末端）に結合した糖脂質である。ＧＰＩアンカーを提供することができる係留アミノ酸部分としては、限定されるものではないが、ＳＥＤ１タンパク質（例えば、配列番号１２のアミノ酸配列、そのバリアントもしくはその断片を有するか、または配列番号１１の核酸配列によってコードされる）、ＴＩＲ１タンパク質（例えば、配列番号１４のアミノ酸配列、そのバリアントもしくはその断片を有するか、または配列番号１３の核酸配列によってコードされる）、ＣＷＰ２タンパク質（例えば、配列番号１６のアミノ酸配列、そのバリアントもしくはその断片を有するか、または配列番号１５の核酸配列によってコードされる）、ＣＣＷ１２タンパク質（例えば、配列番号１８もしくは８４のアミノ酸配列、そのバリアントもしくはその断片を有するか、または配列番号１７の核酸配列によってコードされる）、ＳＰＩ１タンパク質（例えば、配列番号２０もしくは７４のアミノ酸配列、そのバリアントもしくはその断片を有するか、または配列番号１９の核酸配列によってコードされる）、ＰＳＴ１タンパク質（例えば、配列番号２２のアミノ酸配列、そのバリアントもしくはその断片を有するか、または配列番号２１の核酸配列によってコードされる）またはＡＧＡ１とＡＧＡ２タンパク質との組合せ（例えば、配列番号２４のアミノ酸配列、そのバリアントもしくはその断片を有するか、または配列番号２３の核酸配列によってコードされる、または例えば、配列番号２６のアミノ酸配列、そのバリアントもしくはその断片を有するか、または配列番号２５の核酸配列によってコードされる）と結合したもの／それに由来するものが挙げられる。ある実施形態では、係留部分は、ＧＰＩアンカーを提供し、さらなる実施形態では、係留部分は、ＳＰＩ１タンパク質（例えば、配列番号２０のアミノ酸配列、そのバリアントもしくはその断片を有するか、または配列番号１９の核酸配列によってコードされる）、またはＣＣＷ１２タンパク質（例えば、配列番号１８のアミノ酸配列、そのバリアントもしくはその断片を有するか、または配列番号１７の核酸配列によってコードされる）に由来する。
【００４８】
ある実施形態では、係留部分は、細胞膜に局在化する能力を保持したＳＰＩ１タンパク質の断片である。ＳＰＩ１タンパク質の断片は、配列番号７４のアミノ酸配列の１２９アミノ酸未満の連続する残基を含む。例えば、ＳＰＩ１タンパク質に由来する係留部分断片は、配列番号７４のアミノ酸配列に由来する少なくとも１０、２０、２１、３０、４０、５０、５１、６０、７０、８０、８１、９０、１００、１１０、１１１または１２０個の連続するアミノ酸残基を含んでもよい。さらに別の実施形態では、ＳＰＩ１タンパク質に由来する係留部分断片は、配列番号７６、７８、８０または８２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、または本質的にそれからなってもよい。
【００４９】
別の実施形態では、係留部分は、細胞膜に局在化する能力を保持したＣＣＷ１２タンパク質の断片である。ＣＣＷ１２タンパク質の断片は、配列番号８４のアミノ酸配列の１１２アミノ酸未満の連続する残基を含む。例えば、ＣＣＷ１２タンパク質に由来する係留部分断片は、配列番号８４のアミノ酸配列に由来する少なくとも１０、２０、２４、３０、４０、４９、５０、６０、７０、７４、８０、９０、９９、１００または１１０個の連続するアミノ酸残基を含んでもよい。さらに別の実施形態では、ＣＣＷ１２タンパク質に由来する係留部分断片は、配列番号８６、８８、９０または９２のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、または本質的にそれからなってもよい。
【００５０】
係留アミノ酸部分は、既知／天然の係留アミノ酸部分のバリアント、例えば、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０または９２のアミノ酸配列を有する係留アミノ酸部分のバリアントであってもよい。バリアントは、天然の係留アミノ酸部分のアミノ酸配列と比較した場合、少なくとも１個のアミノ酸の相違を含む。本明細書で使用される場合、バリアントとは、係留アミノ酸部分の生物学的機能（例えば、細胞質膜中の異種タンパク質の外部面および固定での位置）に悪影響を及ぼさないアミノ酸配列の変化を指す。置換、挿入または欠失は、変化した配列が係留アミノ酸部分と関連する生物学的機能（例えば、細胞質膜中の異種タンパク質の外部面および固定での位置）を防止する、または破壊する場合、タンパク質に悪影響を及ぼすと言われる。例えば、タンパク質の全電荷、構造または疎水−親水特性を、生物活性に悪影響を及ぼすことなく変化させることができる。したがって、アミノ酸配列を変化させて、例えば、係留アミノ酸部分の生物活性に悪影響を及ぼすことなく、ペプチドをより疎水性または親水性にすることができる。係留アミノ酸部分バリアントは、本明細書に記載の係留アミノ酸部分に対する少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する。当業界で公知のように、用語「パーセント同一性」は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。同一性のレベルを、公知のコンピュータープログラムを使用して従来通り決定することができる。同一性を、限定されるものではないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＪ（１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８７）；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．）Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９１）に記載されたものなどの公知の方法によって容易に算出することができる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験される配列間の最良の一致を与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公共的に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。配列アラインメントおよびパーセント同一性の算出を、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  ｓｕｉｔｅ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）のＭｅｇａｌｉｇｈプログラムを使用して実施することができる。本明細書に開示される配列の複数のアラインメントを、アラインメントのＣｌｕｓｔａｌ法（ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３頁）を、デフォルトパラメータ（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）と共に使用して実施した。Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用するペアワイズアラインメントのためのデフォルトパラメータは、ＫＴＵＰＬＢ１、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５であった。
【００５１】
本明細書に記載の係留アミノ酸部分バリアントは、（ｉ）１つもしくは複数のアミノ酸残基が保存された、もしくは保存されていないアミノ酸残基（好ましくは、保存されたアミノ酸残基）で置換され、そのような置換されたアミノ酸残基が遺伝子コードによってコードされたものであっても、なくてもよいもの、または（ｉｉ）１つもしくは複数のアミノ酸残基が置換基を含むもの、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドが、ポリペプチドの半減期を増加させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）などの別の化合物と融合されているもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸が、ポリペプチドの精製のために成熟ポリペプチドに融合されているものであってもよい。係留アミノ酸部分の「バリアント」は、保存的バリアントまたは対立遺伝子バリアントであってもよい。
【００５２】
係留アミノ酸部分は、既知／天然の係留アミノ酸部分の断片または既知／天然の係留アミノ酸部分のバリアントの断片（例えば、配列番号１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０もしくは９２のアミノ酸配列を有する係留アミノ酸部分の断片またはそのバリアント）であってもよい。係留アミノ酸部分「断片」は、係留アミノ酸部分の少なくとも１０、２０、３０、４０、６０、７０、８０、９０、１００個以上の連続するアミノ酸を有する。断片は、既知／天然の係留アミノ酸部分のアミノ酸配列と比較した場合、少なくとも１個少ないアミノ酸残基を含み、完全長係留アミノ酸部分の生物活性を依然として有する（例えば、細胞壁に対する位置）。
【００５３】
アミノ酸係留部分が望ましい実施形態では、異種タンパク質を、組換え酵母宿主細胞によって発現され、以下の式（アミノ（ＮＨ２）からカルボキシル（ＣＯＯＨ）への向きに提供される）の１つを有するキメラタンパク質として提供することができる：
ＨＰ−Ｌ−ＴＴ（Ｉ）またはＴＴ−Ｌ−ＨＰ（ＩＩ）。
【００５４】
これらの式の両方において、残基「ＨＰ」は、異種タンパク質部分を指し、残基「Ｌ」は任意選択のリンカーの存在を指すが、残基「ＴＴ」は、アミノ酸係留部分を指す。式（Ｉ）のキメラタンパク質において、アミノ酸テザーのアミノ末端は、異種タンパク質部分のカルボキシル（ＣＯＯＨまたはＣ）末端に（直接的または間接的に）位置する。式（ＩＩ）のキメラタンパク質においては、アミノ酸テザーのカルボキシ末端は、異種タンパク質部分のアミノ（ＮＨ２またはＮ）末端に（直接的または間接的に）位置する。
【００５５】
アミノ酸リンカー（Ｌ）が存在しない場合、係留アミノ酸部分は、異種タンパク質と直接結合する。式（Ｉ）のキメラにおいては、これは、異種タンパク質部分のカルボキシル末端が係留アミノ酸部分のアミノ末端と直接結合する（アミド結合によって）ことを意味する。式（ＩＩ）のキメラにおいては、これは、係留アミノ酸部分のカルボキシル末端が異種タンパク質のアミノ末端と直接結合する（アミド結合によって）ことを意味する。
【００５６】
一部の実施形態では、アミノ酸リンカー（Ｌ）の存在は、例えば、異種タンパク質部分と係留アミノ酸部分との間のいくらかの可撓性を提供するために、または異種核酸分子の構築を容易にするために望ましい。本開示で使用される場合、「アミノ酸リンカー」または「Ｌ」とは、異種タンパク質部分ＨＰと、アミノ酸係留部分ＴＴとを分離する（例えば、異種タンパク質ＨＰをアミノ酸係留部分ＴＴに間接的に連結する）１つまたは複数のアミノ酸の伸長物を指す。アミノ酸リンカーは中性である、例えば、異種タンパク質の生物活性とも、アミノ酸係留部分の生物活性とも干渉しないことが好ましい。一部の実施形態では、アミノ酸リンカーＬは、異種タンパク質部分および／またはアミノ酸係留部分の生物活性を増加させることができる。リンカー（Ｌ）が式（Ｉ）のキメラ中に存在する例では、そのアミノ末端は、異種タンパク質部分のカルボキシル末端に結合し（アミド結合によって）、そのカルボキシル末端は、アミノ酸係留部分のアミノ末端に結合する（アミド結合によって）。リンカー（Ｌ）が式（ＩＩ）のキメラ中に存在する例では、そのアミノ末端は、アミノ酸係留部分のカルボキシル末端に結合し（アミド結合によって）、そのカルボキシル末端は、異種タンパク質部分のアミノ末端に結合する（アミド結合によって）。様々なアミノ酸リンカーが存在し、限定されるものではないが、（Ｇ）ｎ、（ＧＳ）ｎ；（ＧＧＳ）ｎ；（ＧＧＧＳ）ｎ；（ＧＧＧＧＳ）ｎ；（ＧＧＳＧ）ｎ；（ＧＳＡＴ）ｎ（式中、ｎは１〜８（以上）の整数である）が挙げられる。ある実施形態では、アミノ酸リンカーＬは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（Ｇ４Ｓとも呼ばれる）であり、さらなる実施形態では、アミノ酸リンカーＬは、１より多いＧ４Ｓ（配列番号４１）モチーフを含む。例えば、アミノ酸リンカーＬは、（Ｇ４Ｓ）３であり、配列番号９３のアミノ酸配列を有してもよい。別の例では、アミノ酸リンカーＬは、（Ｇ）８であり、配列番号９４のアミノ酸配列を有してもよい。さらに別の例では、アミノ酸リンカーＬは、（Ｇ４Ｓ）８であり、配列番号９５のアミノ酸配列を有してもよい。
【００５７】
アミノ酸リンカーはまた、一部の実施形態では、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号９６）であってもよい。
【００５８】
さらなるアミノ酸リンカーが存在し、限定されるものではないが、（ＥＡＡＫ）ｎおよび（ＥＡＡＡＫ）ｎ（式中、ｎは、１〜８（以上）の整数である）が挙げられる。一部の実施形態では、１つまたは複数の（ＥＡＡＫ）ｎ／（ＥＡＡＡＫ）ｎモチーフを、１つまたは複数のさらなるアミノ酸残基によって分離することができる。ある実施形態では、アミノ酸リンカーは、１つもしくは複数のＥＡ２Ｋ（配列番号１００）またはＥＡ３Ｋ（配列番号１０１）モチーフを含む。ある実施形態では、アミノ酸リンカーは、（ＥＡＡＫ）３であってもよく、配列番号９７のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、アミノ酸リンカーは、（Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ）であってもよく、配列番号９９のアミノ酸配列を有する。
【００５９】
さらなるアミノ酸リンカーとしては、１つまたは複数の（ＡＰ）ｎモチーフ（式中、ｎは１〜１０（以上）の整数である）を有するものが挙げられる。ある実施形態では、リンカーは、（ＡＰ）１０であり、配列番号９８のアミノ酸を有する。
【００６０】
一部の実施形態では、リンカーはまた、１つまたは複数のＨＡタグ（配列番号５３）を含む。
【００６１】
組換え酵母宿主細胞を作製するための手段
組換え酵母宿主細胞を作製するために、異種核酸分子（発現カセットとも呼ばれる）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製し、酵母宿主細胞中に導入して、異種タンパク質の組換え発現を可能にする。
【００６２】
本開示の異種核酸分子は、異種ポリペプチド、例えば、異種タンパク質またはそれを含むキメラタンパク質のためのコード領域を含む。ＤＮＡまたはＲＮＡ「コード領域」は、適切な調節配列の制御下に置かれた場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞中で異種タンパク質に転写および／または翻訳されるＤＮＡまたはＲＮＡ分子（好ましくは、ＤＮＡ分子）である。「好適な調節領域」とは、コード領域の上流（５’非コード配列）、中、または下流（３’非コード配列）に位置し、結合したコード領域の転写、ＲＮＡプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響する核酸領域を指す。調節領域としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造が挙げられる。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端の開始コドンおよび３’（カルボキシル）末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード領域としては、限定されるものではないが、原核領域、ｍＲＮＡに由来するｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ分子、合成ＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子が挙げられる。コード領域が真核細胞中での発現を意図される場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列は、通常、コード領域の３’側に位置するであろう。ある実施形態では、コード領域を、オープンリーディングフレームと呼ぶことができる。「オープンリーディングフレーム」はＯＲＦと省略され、翻訳開始シグナルまたはＡＴＧもしくはＡＵＧなどの開始コドンと、終止コドンを含み、ポリペプチド配列に潜在的に翻訳され得る、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかである核酸の長さを意味する。
【００６３】
本明細書に記載の異種核酸分子は、転写および／または翻訳制御領域を含んでもよい。「転写および翻訳制御領域」は、宿主細胞中でのコード領域の発現を提供する、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなどのＤＮＡ調節領域である。真核細胞中で、ポリアデニル化シグナルは制御領域である。
【００６４】
一部の実施形態では、本開示の異種核酸分子は、異種タンパク質（それを含むキメラタンパク質を含む）のためのプロモーターならびにコード配列を含む。異種核酸配列はまた、ターミネーターを含んでもよい。本開示の異種核酸分子において、プロモーターおよびターミネーター（存在する場合）は、異種タンパク質（それを含むキメラタンパク質を含む）の核酸コード配列に作動可能に連結される、例えば、それらは異種タンパク質（それを含むキメラタンパク質を含む）の核酸配列の発現および発現の終結を制御する。本開示の異種核酸分子はまた、シグナルペプチド、例えば、異種タンパク質を宿主細胞の外部に輸送するための短いペプチド配列をコードする核酸も含んでもよい。存在する場合、シグナルペプチドをコードする核酸配列は、異種タンパク質（それを含むキメラタンパク質を含む）をコードする核酸配列のすぐ上流に位置し、それと読み枠が合っている。
【００６５】
本明細書に記載の異種核酸分子において、プロモーターと、異種タンパク質（それを含むキメラタンパク質を含む）をコードする核酸分子とは、互いに作動可能に連結される。本開示の文脈では、「作動可能に連結された」または「作動可能に結合された」という表現は、プロモーターが、ある特定の条件下で、核酸分子からの異種タンパク質の発現を可能にする様式で異種ポリペプチドをコードするヌクレオチド酸分子に物理的に結合しているという事実を指す。ある実施形態では、プロモーターは、異種タンパク質をコードする核酸配列の上流（５’側）に位置してもよい。さらに別の実施形態では、プロモーターは、異種タンパク質をコードする核酸配列の下流（３’側）に位置してもよい。本開示の文脈では、１つまたは１つより多いプロモーターを、異種核酸分子中に含ませることができる。１つより多いプロモーターが異種核酸分子中に含まれる場合、それぞれのプロモーターを、異種タンパク質をコードする核酸配列に作動可能に連結する。プロモーターは、異種タンパク質をコードする核酸分子を考慮して、上流、下流ならびに上流と下流の両方に位置してもよい。
【００６６】
「プロモーター」とは、コード配列または機能的ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ断片を指す。本明細書で使用される用語「発現」とは、本明細書に記載の異種核酸分子からのセンス（ｍＲＮＡ）の転写および安定な蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。プロモーターは、その全体が天然の遺伝子に由来するか、または天然に見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成されるか、またはさらには、合成ＤＮＡセグメントを含んでもよい。異なるプロモーターが発生の異なる段階で、または異なる環境条件もしくは生理的条件に応答して発現を指令することができることが、当業者によって理解される。実質的に類似するレベルで最も多くの時間で最も多くの細胞中で遺伝子を発現させるプロモーターは、一般的に、「構成的プロモーター」と呼ばれる。酵母細胞の増殖期に遺伝子を発現させるプロモーターは、本明細書では「増殖プロモーター」と呼ばれる。増殖プロモーターは、例えば、グルコース調節、糖蜜調節、ストレス応答プロモーター（浸透圧ストレス応答プロモーターを含む）および好気的調節プロモーターなどの構成的および誘導性プロモーターの両方を含む。本開示の文脈では、選択されるプロモーターは、十分な量の細胞結合型異種タンパク質を発現させるために組換え酵母宿主細胞の増殖期に異種核酸分子の発現を可能にすることが重要である。多くの場合、調節配列の正確な境界は完全に規定されていないため、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよいことがさらに認識される。プロモーターは、一般的には、転写開始部位によってその３’末端に境界があり、上流（５’方向）に向かって伸長し、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター内に、転写開始部位（例えば、ヌクレアーゼＳ１を用いてマッピングすることによって都合良く定義される）、ならびにポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出されるであろう。
【００６７】
プロモーターは、異種ポリペプチドをコードする核酸分子に対して天然であるか、または異種であってよい。プロモーターは、異種であってよいか、または組換え宿主細胞と同じ属もしくは種に由来する株に由来してもよい。ある実施形態では、プロモーターは、酵母宿主細胞の同じ属または種に由来し、異種ポリペプチドは、宿主細胞とは異なる属に由来する。プロモーターは、単一のプロモーターまたは異なるプロモーターの組合せであってもよい。
【００６８】
本開示では、組換え酵母宿主細胞の増殖期の異種タンパク質の発現を可能にするか、または好むプロモーターが好ましい。通性嫌気性菌である酵母は、好気条件下で呼吸的に繁殖し、嫌気的条件下で発酵的に繁殖することができる。多くの商業的適用では、酵母を、基質からバイオマスへの変換を最大化するために好気的条件下で増殖させる。必要に応じて、バイオマスを、嫌気的条件下でその後の発酵において使用して、所望の代謝物を産生することができる。本開示の文脈では、異種核酸中に存在するプロモーターまたはプロモーターの組合せは、組換え酵母宿主細胞の増殖期に異種タンパク質またはその対応するキメラの発現を可能にすることができることが重要である。これは、発酵におけるその後の使用（もしあれば）の前に組換え酵母宿主細胞と結合した異種タンパク質の蓄積を可能にするであろう。一部の実施形態では、プロモーターは、組換え酵母宿主細胞の生活環の発酵期（もしあれば）ではなく、増殖期に異種タンパク質またはその対応するキメラの発現を可能にする。
【００６９】
プロモーターは、天然であるか、または異種タンパク質をコードする異種遺伝子にとって異種であってもよい。異種核酸分子中に含ませることができるプロモーターは、構成的または誘導性プロモーターであってもよい（Ｐｅｒｅｚ−Ｔｏｒｒａｄｏら、２００５に記載されたものなど）。誘導性プロモーターとしては、限定されるものではないが、グルコース調節プロモーター（例えば、ｈｘｔ７遺伝子のプロモーター（ｈｘｔ７ｐと呼ばれる）であり、配列番号３０、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｃｔｔ１遺伝子のプロモーター（ｃｔｔ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号６０、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｇｌｏ１遺伝子のプロモーター（ｇｌｏ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号５９、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｙｇｐ１遺伝子のプロモーター（ｙｇｐ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号６１、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｇｓｙ２遺伝子のプロモーター（ｇｓｙ２ｐと呼ばれる）であり、配列番号５３、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する）、糖蜜調節プロモーター（例えば、Ｐｒａｅｋｅｌｔら、１９９２に記載のｍｏｌ１遺伝子のプロモーター（ｍｏｌ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号６４、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する）、熱ショック調節プロモーター（例えば、ｇｌｏ１遺伝子のプロモーター（ｇｌｏ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号５９、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｓｔｉ１遺伝子のプロモーター（ｓｔｉ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号５６、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｙｇｐ１遺伝子のプロモーター（ｙｇｐ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号６１、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｇｓｙ２遺伝子のプロモーター（ｇｓｙ２ｐと呼ばれる）であり、配列番号５３、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する）、酸化ストレス応答プロモーター（例えば、ｃｕｐ１遺伝子のプロモーター（ｃｕｐ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号５８、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｃｔｔ１遺伝子のプロモーター（ｃｔｔ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号６０、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｔｒｘ２遺伝子のプロモーター（ｔｒｘ２ｐと呼ばれる）であり、配列番号５５、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｇｐｄ１遺伝子のプロモーター（ｇｐｄ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号５７、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｈｓｐ１２遺伝子のプロモーター（ｈｓｐ１２ｐと呼ばれる）であり、配列番号６３、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する）、浸透圧ストレス応答プロモーター（例えば、ｃｔｔ１遺伝子のプロモーター（ｃｔｔ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号６０、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｇｌｏ１遺伝子のプロモーター（ｇｌｏ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号５９、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｇｐｄ１遺伝子のプロモーター（ｇｐｄ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号５７、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する；ｙｇｐ１遺伝子のプロモーター（ｙｇｐ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号６１、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する）および窒素調節プロモーター（例えば、ｙｇｐ１遺伝子のプロモーター（ｙｇｐ１ｐと呼ばれる）であり、配列番号６１、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する）が挙げられる。
【００７０】
本開示の異種核酸分子中に含ませることができるプロモーターとしては、限定されるものではないが、ｔｄｈ１遺伝子のプロモーター（ｔｄｈ１ｐと呼ばれ、例えば、配列番号２７、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する）、ｈｏｒ７遺伝子のプロモーター（ｈｏｒ７ｐと呼ばれ、例えば、配列番号２８、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する）、ｈｓｐ１５０遺伝子のプロモーター（ｈｓｐ１５０ｐと呼ばれ、例えば、配列番号２９、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する）、ｈｘｔ７遺伝子のプロモーター（ｈｘｔ７ｐと呼ばれ、例えば、配列番号３０、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する）、ｇｐｍ１遺伝子のプロモーター（ｇｍｐ１ｐと呼ばれ、例えば、配列番号３１、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する）、ｐｇｋ１遺伝子のプロモーター（ｐｇｋ１ｐと呼ばれ、例えば、配列番号３２、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する）および／またはｓｔｌ１遺伝子のプロモーター（ｓｔｌ１ｐと呼ばれ、例えば、配列番号３３、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有する）が挙げられる。ある実施形態では、プロモーターは、ｔｄｈ１ｐおよび／またはｈｏｒ７ｐであるか、またはそれを含む。さらに別の実施形態では、プロモーターは、ｔｄｈ１ｐおよびｈｏｒ７ｐを含むか、または本質的にそれからなる。さらなる実施形態では、プロモーターは、ｔｈｄ１ｐである。
【００７１】
１つまたは複数のプロモーターを使用して、組換え酵母宿主細胞中でのそれぞれの異種ポリペプチドの発現を可能にすることができる。本開示の文脈では、プロモーターと共に使用される場合の「プロモーターの機能的断片」という表現は、組換え酵母宿主細胞の増殖期に異種タンパク質またはそのキメラをコードする核酸配列の発現を制御する能力を保持する天然のプロモーターよりも短い核酸配列を指す。通常、機能的断片は、天然プロモーターの核酸配列に由来する１つまたは複数の核酸残基の５’および／または３’トランケーションである。
【００７２】
一部の実施形態では、核酸分子は、異種タンパク質（またはそれを含むキメラタンパク質）の翻訳を終了させるための１つのターミネーター配列またはターミネーター配列の組合せを含む。ターミネーターは、天然であるか、または異種タンパク質もしくはその対応するキメラをコードする核酸配列に対して異種であってもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のターミネーターを使用することができる。一部の実施形態では、ターミネーターは、ｄｉｔ１遺伝子に由来するターミネーター（ｄｉｔ１ｔと呼ばれ、例えば、配列番号３４、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有してもよい）、ｉｄｐ１遺伝子に由来するターミネーター（ｉｄｐ１ｔと呼ばれ、例えば、配列番号３５、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有してもよい）、ｇｐｍ１遺伝子に由来するターミネーター（ｇｐｍ１ｔと呼ばれ、例えば、配列番号３６、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有してもよい）、ｐｍａ１遺伝子に由来するターミネーター（ｐｍａ１ｔと呼ばれ、例えば、配列番号３７、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有してもよい）、ｔｄｈ３遺伝子に由来するターミネーター（ｔｄｈ３ｔと呼ばれ、例えば、配列番号３８、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有してもよい）、ｈｘｔ２遺伝子に由来するターミネーター（ｈｘｔ２ｔと呼ばれ、例えば、配列番号３９、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有してもよい）、ａｄｈ３遺伝子に由来するターミネーター（ａｄｈ３ｔと呼ばれ、例えば、配列番号７０、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有してもよい）、および／またはｉｒａ２遺伝子に由来するターミネーター（ｉｒａ２ｔと呼ばれ、例えば、配列番号４０、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有してもよい）を含む。ある実施形態では、ターミネーターは、ｄｉｔ１遺伝子を含むか、またはそれに由来する（ｄｉｔ１ｔと呼ばれ、例えば、配列番号３４、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有してもよい）。別の実施形態では、ターミネーターは、ａｄｈ３遺伝子を含むか、またはそれに由来する（例えば、配列番号７０、その機能的バリアントもしくはその機能的断片の核酸配列を有してもよい）。本開示の文脈では、「ターミネーターの機能的バリアント」という表現は、異種タンパク質またはその対応するキメラをコードする核酸配列の発現を終了させる能力を保持する天然ターミネーターと比較した場合、少なくとも１個の核酸位置において置換された核酸配列を指す。本開示の文脈では、「ターミネーターの機能的断片」という表現は、異種タンパク質またはその対応するキメラをコードする核酸配列の発現を終了させる能力を保持する天然ターミネーターよりも短い核酸配列を指す。
【００７３】
一部の実施形態では、異種核酸分子は、異種タンパク質（またはそれを含むキメラタンパク質）酵母宿主細胞の壁の外部への輸送を可能にする１つのシグナル配列またはシグナル配列の組合せを含む。シグナル配列は、単に核酸分子に付加する（通常は、異種タンパク質をコードする配列と読み枠を合わせて）か、または異種タンパク質中に既に存在するシグナル配列を置き換えることができる。シグナル配列は、天然であるか、または異種タンパク質もしくはその対応するキメラをコードする核酸配列に対して異種であってもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数のシグナル配列を使用することができる。一部の実施形態では、シグナル配列は、インベルターゼタンパク質（例えば、配列番号６８のアミノ酸配列を有する、配列番号６８のアミノ酸配列のバリアントである、もしくは配列番号６８のアミノ酸配列の断片であってもよい）、ＡＧＡ２タンパク質（例えば、配列番号６９のアミノ酸配列を有する、配列番号６９のアミノ酸配列のバリアントである、もしくは配列番号６９のアミノ酸配列の断片であってもよい）または真菌アミラーゼ（例えば、配列番号１０７のアミノ酸配列を有する、配列番号１０７のアミノ酸配列のバリアントである、もしくは配列番号１０７のアミノ酸配列の断片であってもよい）をコードする遺伝子に由来する。本開示の文脈では、「シグナル配列の機能的バリアント」という表現は、細胞の外部での異種食品および／または飼料酵素またはその対応するキメラの発現を指令する能力を保持する天然のシグナル配列と比較した場合、少なくとも１つの核酸位置において置換された核酸配列を指す。本開示の文脈では、「シグナル配列の機能的断片」という表現は、細胞の外部での異種食品および／または飼料酵素またはその対応するキメラの発現を指令する能力を保持する天然のシグナル配列よりも短い核酸配列を指す。
【００７４】
異種タンパク質を組換え酵母宿主細胞の内部で発現させることが望ましい一部の実施形態では、異種核酸分子は、食品および／または飼料酵素をコードする天然遺伝子に見出されるシグナル配列をコードする部分を含まなくてもよい。
【００７５】
異種タンパク質、そのキメラ、バリアントまたは断片をコードする異種核酸分子を、酵母宿主細胞のゲノム中に組み込むことができる。本明細書で使用される用語「組み込まれた」とは、分子生物学技術によって、宿主細胞のゲノム中に入れられる遺伝子エレメントを指す。例えば、遺伝子エレメントを、宿主細胞によって担持されるプラスミドなどのベクター中とは対照的に、宿主細胞の染色体中に入れることができる。遺伝子エレメントを宿主細胞のゲノム中に組み込むための方法は、当業界で周知であり、相同組換えを含む。異種核酸分子は、酵母宿主細胞のゲノム中に１または複数のコピーで存在してもよい。あるいは、異種核酸分子を、酵母のゲノムから独立に複製させることができる。そのような実施形態では、核酸分子は、安定かつ自己複製性であってよい。
【００７６】
本開示はまた、異種タンパク質、そのキメラ、バリアントまたは断片の発現を可能にするための酵母宿主細胞を改変するための核酸分子も提供する。核酸分子は、ＤＮＡ（相補的ＤＮＡ、合成ＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ）またはＲＮＡ（合成ＲＮＡを含む）であってもよく、一本鎖（センスもしくはアンチセンス鎖のいずれかで）または二本鎖形態で提供することができる。企図される核酸分子は、コード領域、非コード領域、またはその両方に変化を含んでもよい。例は、サイレント置換、付加、または欠失をもたらすが、コードされる異種タンパク質、キメラ、バリアントまたは断片の特性または活性を変化させない変化を含有する核酸分子バリアントである。
【００７７】
一部の実施形態では、組換え宿主細胞中に導入することができる異種核酸分子は、意図されるレシピエント組換え酵母宿主細胞に関してコドン最適化される。本明細書で使用される用語「コドン最適化されたコード領域」は、少なくとも１つ、または１つより多いコドンを、その生物の遺伝子においてより頻繁に使用される１つまたは複数のコドンで置き換えることによって所与の生物の細胞中での発現のために適合された核酸コード領域を意味する。一般に、生物において高度に発現される遺伝子は、その生物における最も豊富なｔＲＮＡ種によって認識されるコドンに向かって偏っている。この偏りの１つの尺度は、特定の遺伝子中のそれぞれのアミノ酸をコードするために使用されるコドンが、生物に由来する高度に発現される遺伝子の参照セットにおいて最も頻繁に出現する程度を測定する「コドン最適化指数」または「ＣＡＩ」である。本明細書に記載のコドン最適化された異種核酸分子のＣＡＩは、約０．８〜１．０、約０．８〜０．９、または約１．０に対応する。
【００７８】
異種核酸分子を、ベクターを使用して酵母宿主細胞中に導入することができる。「ベクター」、例えば、「プラスミド」、「コスミド」または「人工染色体」（例えば、酵母人工染色体など）は、染色体外エレメントであり、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある。そのようなベクターは、いくつかのヌクレオチド配列が、適切な３’非翻訳配列と共に選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができるユニークな構築物に連結されるか、またはその中に組み換えられる、任意の供給源に由来する、一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、線状、環状、またはスーパーコイルの自律的に複製する配列、ゲノム組込み配列、ファージまたはヌクレオチド配列であってもよい。
【００７９】
本開示はまた、異種ポリペプチドならびにバリアントまたは断片をコードする相補的核酸分子にハイブリダイズする核酸分子も提供する。一本鎖形態の核酸分子が温度および溶液イオン強度の適切な条件下で他の核酸分子にアニーリングすることができる場合、核酸分子は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子に「ハイブリダイズ」する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、特に、その第１１章および表１１．１に例示されている。温度およびイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定付ける。ストリンジェンシー条件を調整して、遠縁の生物に由来する相同配列などの中程度に類似する断片について、近縁の生物に由来する機能的酵素を複製する遺伝子などの高度に類似する断片に対してスクリーニングすることができる。ハイブリダイゼーション後の洗浄は、ストリンジェンシー条件を決定付ける。１セットの条件は、室温で１５分の６Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで開始した後、４５℃で３０分、２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで反復し、次いで、５０℃で３０分、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで２回反復する一連の洗浄を使用する。よりストリンジェントな条件については、洗浄は、より高温で行われ、洗浄が０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での最後の２回の３０分の洗浄の温度を６０℃に上昇させる以外は上記のものと同一である。別のセットの高度にストリンジェントな条件は、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２回の最終的な洗浄を使用する。さらなるセットの高度にストリンジェントな条件は、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーションによって規定され、２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、次いで、０．１Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄される。
【００８０】
ハイブリダイゼーションには、２つの核酸分子が相補配列を含有することが必要であるが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて、塩基間の不一致も可能である。核酸をハイブリダイズさせるための適切なストリンジェンシーは、当業界で周知の変数である、核酸の長さおよび相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高いほど、これらの配列を有する核酸のハイブリッドのＴｍの値は高くなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対的安定性（より高いＴｍに対応する）は、以下の順序で低下する：ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さ１００ヌクレオチドを超えるハイブリッドについて、Ｔｍを算出するための式が導かれている。より短い核酸、すなわち、オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションについては、不一致の位置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定付ける。一実施形態では、ハイブリダイズする核酸のための長さは、少なくとも約１０ヌクレオチドである。好ましくは、ハイブリダイズする核酸のための最小の長さは、少なくとも約１５ヌクレオチドであり、より好ましくは、少なくとも約２０ヌクレオチドであり、最も好ましくは、長さは少なくとも３０ヌクレオチドである。さらに、当業者であれば、温度および洗浄溶液の塩濃度を、プローブの長さなどの因子に応じて必要に応じて調整することができることを認識するであろう。
【００８１】
酵母組成物および酵母組成物を作製するためのプロセス
本明細書に示されるように、本開示は、本開示の組換え酵母宿主細胞から酵母組成物を作製するのを可能にする。ある実施形態では、酵母組成物は、酵母組成物の総タンパク質と比較した場合、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０重量％以上の異種タンパク質を含む。特定の実施形態では、酵母組成物は、酵母組成物の総タンパク質と比較した場合、少なくとも０．２重量％の異種タンパク質を含む。別の実施形態では、酵母組成物は、組換え酵母宿主細胞の総タンパク質１ｇあたり、少なくとも０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０１１、０．０１２、０．０１３、０．０１４、０．０１５、０．０１６、０．０１７、０．０１８、０．０１９、０．０２、０．０２１、０．０２２、０．０２３、０．０２４、０．０２５ｇ以上の異種タンパク質を含む。特定の実施形態では、酵母組成物は、組換え酵母宿主細胞の総タンパク質１ｇあたり、少なくとも０．０２ｇの異種タンパク質を含む。さらに別の実施形態では、酵母組成物は、組換え酵母宿主細胞の総重量と比較した場合、少なくとも０．０５、０．０７５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５重量％以上の異種タンパク質を含む。さらに別の実施形態では、酵母組成物は、組換え酵母宿主細胞の総重量と比較した場合、少なくとも０．１重量％の異種タンパク質を含む。さらなる実施形態では、酵母組成物は、組換え酵母宿主細胞の乾燥重量と比較した場合、少なくとも０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１ｇ以上の異種タンパク質を含む。特定の実施形態では、酵母組成物は、組換え酵母宿主細胞の（乾燥重量）１ｇあたり、少なくとも０．００１１ｇの異種タンパク質を含む。組換え酵母宿主細胞が酵母クリームとして製剤化される実施形態では、酵母クリームは、酵母クリームの総重量と比較した場合、少なくとも４５、４６、４７、４８、４９、５０、５０．２、５１、５２、５３、５４、５５重量％以上の異種タンパク質を含む。特定の実施形態では、酵母クリームは、酵母クリームの総重量と比較した場合、少なくとも５０．２重量％の異種タンパク質を含む。そのような実施形態は、その後の発酵ステップにおいて酵母組成物に外因性タンパク質（外因性酵素など）を補充する必要性を減少させるか、または放棄する。異種タンパク質が異種酵素である別の実施形態では、本開示は、特定の最小酵素活性および／または特定の範囲の酵素活性を有するプロセスならびに酵母組成物を提供する。例えば、酵母組成物は、例えば、乾燥細胞重量１ｇあたり少なくとも１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００以上の酵素活性単位であってもよい、乾燥細胞重量１ｇあたりの最小酵素活性を提供することができる酵素活性の最小量を含んでもよい。特定の実施形態では、酵母組成物は、乾燥細胞重量１ｇあたり少なくとも約３００酵素活性単位の酵素活性の最小量を含んでもよい。代替的に、または組み合わせて、酵母組成物は、例えば、組換え酵母宿主細胞の総タンパク質１ｇまたは１ｍｇあたり、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０以上の酵素活性単位であってもよい、組換え酵母宿主細胞の総タンパク質１ｇまたは１ｍｇあたりの最小酵素活性を提供することができる。特定の実施形態では、酵母組成物は、組換え酵母宿主細胞の総タンパク質１ｇまたは１ｍｇあたり、少なくとも約２００酵素活性単位の酵素活性の最小量を含んでもよい。別の例では、異種酵素がマルトース生成アミラーゼなどのアミラーゼである場合、酵母組成物は、例えば、組換え酵母宿主細胞の乾燥細胞重量１ｇあたり、少なくとも約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００以上のＭＡＮＵまたは総タンパク質１ｇあたり、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０以上のＭＡＮＵであってもよいであってもよい、マルトース生成アミラーゼ活性（例えば、酵母組成物の乾燥重量１ｇあたりのＭＡＮＵとして測定される）の最小量を含んでもよい。特定の実施形態では、酵母組成物は、組換え酵母宿主細胞の総タンパク質の乾燥細胞重量１ｇあたり少なくとも約１０００ＭＡＮＵであってよいマルトース生成アミラーゼ活性（例えば、酵母組成物の乾燥重量１ｇあたりのＭＡＮＵとして測定される）の最小量を含んでもよい。さらに別の例では、異種酵素がグルコアミラーゼなどのアミラーゼである場合、酵母組成物は、例えば、乾燥細胞重量１ｇあたり１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００以上のグルコアミラーゼ単位であってよい、グルコアミラーゼ活性（例えば、酵母組成物の乾燥重量１ｇあたりのグルコアミラーゼ活性の単位として測定される）の最小量を含んでもよい。例えば、異種酵素がグルコアミラーゼなどのアミラーゼである場合、酵母組成物は、乾燥細胞重量１ｇあたり３００グルコアミラーゼ単位の最小量を含んでもよい。さらなる実施形態では、異種酵素がアルファ−アミラーゼなどのアミラーゼである場合、酵母組成物は、例えば、乾燥細胞重量１ｇあたり１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００以上のアルファ−アミラーゼ単位であってよい、アルファ−アミラーゼ活性（例えば、酵母組成物の乾燥重量１ｇあたりのアルファ−アミラーゼ活性の単位として測定される）の最小量を含んでもよい。例えば、異種酵素がアルファ−アミラーゼなどのアミラーゼである場合、酵母組成物は、乾燥細胞重量１ｇあたり３００アルファ−アミラーゼ単位の最小量を含んでもよい。さらに別の実施形態では、異種酵素がフィターゼなどのホスファターゼである場合、酵母組成物は、例えば、乾燥細胞重量１ｇあたり１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００以上のフィターゼ活性単位であってよい、フィターゼ活性（例えば、酵母組成物の乾燥重量１ｇあたりのフィターゼ活性の単位として測定される）の最小量を含んでもよい。例えば、異種酵素がフィターゼなどのホスファターゼである場合、酵母組成物は、乾燥細胞重量１ｇあたり３００フィターゼ活性単位のフィターゼ活性の最小量を含んでもよい。さらに別の例では、異種酵素がグルコースオキシダーゼなどのオキシダーゼである場合、酵母組成物は、例えば、乾燥細胞重量１ｇあたり１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００以上のグルコースオキシダーゼ活性単位であってもよい、グルコースオキシダーゼ活性（例えば、酵母組成物の乾燥重量１ｇあたりのグルコースオキシダーゼ活性の単位として測定される）の最小量を含んでもよい。例えば、異種酵素がグルコースオキシダーゼなどのオキシダーゼである場合、酵母組成物は、乾燥細胞重量１ｇあたり３００グルコースオキシダーゼ活性単位の最小量を含んでもよい。
【００８２】
酵母組成物を作製するためのプロセスは、広くは２つのステップ：組換え酵母宿主細胞を増殖させる第１のステップおよび酵母組成物を製剤化する第２のステップを含む。
【００８３】
本明細書に記載の組換え酵母宿主細胞を用いる伝統的なパン酵母生産法に従って、増殖を行うことができる。このプロセスは、組換え酵母宿主細胞中で天然に発現される相同タンパク質のものと少なくとも類似するレベル（１桁分以内）での異種タンパク質の発現を可能にする（組換え酵母宿主細胞に対する生理学的利益を有しない）ため、有利である（例えば、一部の実施形態では、乾燥酵母クリーム中で測定された場合、１１７００Ｕ／ｇ；総タンパク質の比活性２９００Ｕ／ｍｇ酵素；組換え酵母宿主細胞の乾燥重量１ｇあたり０．００４ｇ；組換え酵母宿主細胞の重量と比較した場合０．４重量％；酵母クリーム中、５０．２重量％；総タンパク質１ｇあたり０．００８ｇ；Ｇａｓｃｏｎ、１９６８年に示されたように総タンパク質の０．８重量％として存在してもよいインベルターゼタンパク質など）。増殖プロセスは、連続法、バッチ法またはフェドバッチ法であってもよい。（培養）培地は、炭素源（例えば、糖蜜、スクロース、グルコース、デキストロースシロップ、エタノール、コーン、グリセロール、コーン浸出液および／またはリグノセルロース系バイオマスなど）、窒素源（例えば、アンモニアまたは別の無機窒素源など）およびリン源（例えば、リン酸または別の無機リン源など）を含んでもよい。培養培地はさらに、組換え酵母宿主細胞の増殖を支援するためのビタミンおよび／またはミネラルなどのさらなる微量栄養素を含んでもよい。
【００８４】
増殖プロセスにおいて、組換え酵母宿主細胞は、一部の実施形態では、０．２５、０．２４、０．２３、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６または０．１５ｈ−１以下の比増殖速度を可能にし得る培養培地中に入れられる。組換え酵母宿主細胞の増殖速度を制限するために、一部の実施形態では、プロセスは、炭水化物などの栄養素の添加を制御することをさらに含んでもよい。増殖中の組換え酵母宿主細胞の増殖速度の制限を、培養培地の容量に関して０．１、０．０１、０．００１または０．０００１重量％より低い炭水化物の濃度を維持することによって達成することができる。培養培地の炭水化物濃度の制御を、当業界で公知の様々な手段によって行うことができ、様々な間隔で培養培地をサンプリングすること、これらの試料中の炭水化物濃度、アルコール濃度および／または気体（ＣＯ２）濃度を決定すること、ならびに必要に応じて、組換え酵母宿主細胞の増殖を加速または減速させるために、培養培地中にさらなる炭水化物を添加すること、または添加を控えることを含んでもよい。一部の実施形態では、プロセスは、組換え酵母宿主細胞の増殖速度を一致／支援するために、窒素および／またはリンを添加することを提供する。
【００８５】
増殖プロセスは、好ましくは、高通気条件下で行われる。例えば、一部の実施形態では、プロセスは、容器の通気を制御して、例えば、少なくとも０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２または１．３空気容量／容器容量／分の特定の通気速度を達成することを含んでもよい。
【００８６】
増殖プロセスを、異種タンパク質の発現にとって最適である特定のｐＨおよび／または特定の温度で行うことができる。そのため、酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に由来する実施形態では、プロセスは、培養培地のｐＨを、約３．０〜約６．０、約３．５〜約５．５または約４．０〜約５．５に制御することを含んでもよい。特定の実施形態では、ｐＨは、約４．５で制御される。別の例では、酵母がＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に由来する実施形態では、プロセスは、培養培地の温度を、約２０℃〜約４０℃、約２５℃〜約３０℃または約３０℃〜約３５℃に制御することを含んでもよい。特定の実施形態では、温度は、約３０℃〜約３５℃（例えば、３２℃）で制御される。
【００８７】
増殖プロセスの終わりに、特定の濃度を求めるか、または達成することができる。一部の実施形態では、培養培地中の増殖した組換え酵母宿主細胞の濃度は、培養培地の容量に対して少なくとも約０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４、０．４５、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０重量％以上である。組換え酵母宿主細胞がフェドバッチプロセスを使用して増殖される特定の実施形態では、培養培地中の増殖した組換え酵母宿主細胞の濃度は、培養培地の容量に対して少なくとも約０．２５重量％である。
【００８８】
製剤化ステップにおいては、増殖後に得られた混合物（増殖した組換え酵母宿主細胞を含む）を改変して、酵母組成物を提供する。本開示の組換え酵母宿主細胞の利点の１つは、異種タンパク質が組換え酵母宿主細胞と結合しており、したがって、増殖後のバイオマスの濃縮も、異種タンパク質の量／活性を増加させるということである。酵母組成物を提供するための実施形態では、増殖後に得られた混合物の少なくとも１つの成分を培養培地から取り出して、酵母組成物を提供する。この成分は、限定されるものではないが、水、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質、核酸残基および核酸分子、細胞破片、発酵産物などであってもよい。ある実施形態では、製剤化ステップは、培養培地の成分から、増殖した組換え酵母宿主細胞（例えば、バイオマス）を実質的に単離することを含む。本開示の文脈で使用される場合、「実質的に単離すること」という表現は、増殖した組換え酵母宿主細胞からの培養培地の成分の大部分の除去を指す。一部の実施形態では、「実質的に単離すること」とは、単離前の組換え酵母宿主細胞の濃度と比較した場合、増殖した組換え酵母宿主細胞を少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４５％以上まで濃縮することを指す。酵母組成物を提供するために、増殖した組換え酵母宿主細胞を、遠心分離（必要に応じて、増殖した組換え酵母宿主細胞を含む得られる細胞ペレットを洗浄してもよい）、濾過および／または乾燥（必要に応じて、減圧乾燥技術を使用する）することができる。次いで、単離された組換え酵母宿主細胞を、酵母組成物に製剤化することができる。製剤化ステップは、一部の実施形態では、組換え酵母宿主細胞の生存能力（少なくとも一部）を保持することができる。そのため、酵母組成物を、活性または半活性形態で提供することができる。酵母組成物を、液体、半固体または乾燥形態で提供することができる。ある実施形態では、酵母組成物を、クリーム酵母の形態で提供することができる。
【００８９】
酵母製品および酵母製品を作製するためのプロセス
本開示の組換え酵母宿主細胞を、最終的には酵母製品を作製するために酵母組成物の調製において使用することができる。ある実施形態では、酵母製品は、酵母製品の総タンパク質と比較した場合、少なくとも０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０重量％以上の異種タンパク質を含む。特定の実施形態では、酵母製品は、酵母製品の総タンパク質と比較した場合、少なくとも０．２重量％の異種タンパク質を含む。別の実施形態では、酵母製品は、組換え酵母宿主細胞の総タンパク質１ｇあたり、少なくとも０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０１１、０．０１２、０．０１３、０．０１４、０．０１５、０．０１６、０．０１７、０．０１８、０．０１９、０．０２、０．０２１、０．０２２、０．０２３、０．０２４、０．０２５ｇ以上の異種タンパク質を含む。特定の実施形態では、酵母製品は、組換え酵母宿主細胞の総タンパク質１ｇあたり、少なくとも０．０２ｇの異種タンパク質を含む。さらに別の実施形態では、酵母製品は、組換え酵母宿主細胞の総重量と比較した場合、少なくとも０．０５、０．０７５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５重量％以上の異種タンパク質を含む。さらに別の実施形態では、酵母製品は、組換え酵母宿主細胞の総重量と比較した場合、少なくとも０．１重量％の異種タンパク質を含む。さらなる実施形態では、酵母製品は、組換え酵母宿主細胞の乾燥重量と比較した場合、少なくとも０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１、０．００１１、０．００１２、０．００１３、０．００１４、０．００１５、０．００１６、０．００１７、０．００１８、０．００１９、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１ｇ以上の異種タンパク質を含む。特定の実施形態では、酵母製品は、組換え酵母宿主細胞１ｇ（乾燥重量）あたり、少なくとも０．００１１ｇの異種タンパク質を含む。そのような実施形態は、その後の発酵ステップにおいて酵母製品に外因性タンパク質（外因性酵素など）を補充する必要性を減少させるか、または放棄する。異種タンパク質が異種酵素である別の実施形態では、本開示は、特定の最小酵素活性および／または特定範囲の酵素活性を有するプロセスならびに酵母製品を提供する。例えば、酵母製品は、例えば、乾燥細胞重量１ｇあたり１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００以上の酵素活性単位であってもよい、乾燥細胞重量１ｇあたりの最小酵素活性を提供することができる酵素活性の最小量を含んでもよい。特定の実施形態では、酵母製品は、乾燥細胞重量１ｇあたり少なくとも約３００酵素活性単位の酵素活性の最小量を含んでもよい。代替的に、または組み合わせて、酵母製品は、例えば、組換え酵母宿主細胞の総タンパク質１ｇあたり、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０以上の酵素活性単位であってもよい、組換え酵母宿主細胞の総タンパク質１ｇまたは１ｍｇあたりの最小酵素活性を提供することができる。特定の実施形態では、酵母製品は、組換え酵母宿主細胞の総タンパク質１ｇあたり、少なくとも約２００酵素活性単位の酵素活性の最小量を含んでもよい。別の実施形態では、異種酵素がマルトース生成アミラーゼなどのアミラーゼである場合、酵母製品は、例えば、組換え酵母宿主細胞の乾燥細胞重量１ｇあたり、少なくとも約１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００以上のＭＡＮＵまたは総タンパク質１ｇあたり、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００以上のＭＡＮＵであってもよい、マルトース生成アミラーゼ活性（例えば、酵母製品の乾燥重量１ｇあたりのＭＡＮＵとして測定される）の最小量を含んでもよい。例えば、酵母製品は、組換え酵母宿主細胞の乾燥細胞重量１ｇあたり、少なくとも約１０００ＭＡＮＵであってもよい、マルトース生成アミラーゼ活性（例えば、酵母製品の乾燥重量１ｇあたりのＭＡＮＵとして測定される）の最小量を含んでもよい。さらに別の実施形態では、異種酵素がグルコアミラーゼなどのアミラーゼである場合、酵母製品は、例えば、乾燥細胞重量１ｇあたり１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００以上のグルコアミラーゼ単位であってよい、グルコアミラーゼ活性（例えば、酵母製品の乾燥重量１ｇあたりのグルコアミラーゼ活性の単位として測定される）の最小量を含んでもよい。例えば、異種酵素がグルコアミラーゼなどのアミラーゼである場合、酵母製品は、乾燥細胞重量１ｇあたり３００グルコアミラーゼ単位の最小量を含んでもよい。さらなる実施形態では、異種酵素がアルファ−アミラーゼなどのアミラーゼである場合、酵母製品は、例えば、乾燥細胞重量１ｇあたり１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００以上のアルファ−アミラーゼ単位であってよい、アルファ−アミラーゼ活性（例えば、酵母製品の乾燥重量１ｇあたりのアルファ−アミラーゼ活性の単位として測定される）の最小量を含んでもよい。例えば、異種酵素がアルファ−アミラーゼなどのアミラーゼである場合、酵母製品は、乾燥細胞重量１ｇあたり３００アルファ−アミラーゼ単位の最小量を含んでもよい。さらに別の実施形態では、異種酵素がフィターゼなどのホスファターゼである場合、酵母製品は、例えば、乾燥細胞重量１ｇあたり１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００以上のフィターゼ活性単位であってよい、フィターゼ活性（例えば、酵母製品の乾燥重量１ｇあたりのフィターゼ活性の単位として測定される）の最小量を含んでもよい。例えば、異種酵素がフィターゼなどのホスファターゼである場合、酵母製品は、乾燥細胞重量１ｇあたり３００フィターゼ活性単位のフィターゼ活性の最小量を含んでもよい。さらに別の実施形態では、異種酵素がグルコースオキシダーゼなどのオキシダーゼである場合、酵母製品は、例えば、乾燥細胞重量１ｇあたり１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００以上のグルコースオキシダーゼ活性単位であってもよい、グルコースオキシダーゼ活性（例えば、酵母製品の乾燥重量１ｇあたりのグルコースオキシダーゼ活性の単位として測定される）の最小量を含んでもよい。例えば、異種酵素がグルコースオキシダーゼなどのオキシダーゼである場合、酵母製品は、乾燥細胞重量１ｇあたり３００グルコースオキシダーゼ活性単位の最小量を含んでもよい。
【００９０】
異種タンパク質が異種酵素である別の実施形態では、本開示は、特定の最小酵素活性および／または特定範囲の酵素活性を有するプロセスならびに酵母製品を提供する。有利には、酵母組成物中に存在する細胞結合型異種タンパク質を、プロセシング中に濃縮することができ、それは酵母製品中でその意図される機能を果たすために生物活性を保持し得る。
【００９１】
酵母製品を作製するためのプロセスは、広くは、２つのステップ：増殖した組換え酵母宿主細胞を提供する第１のステップ（例えば、本明細書に示されるような酵母組成物を作製するためのプロセスによって取得することができる）および増殖した酵母宿主細胞を溶解する第２のステップを含む。このプロセスは、任意選択の分離ステップおよび任意選択の乾燥ステップを含んでもよい。
【００９２】
酵母製品を作製するためのプロセスの実施形態を、図１１に示す。ステップ０１０では、増殖した組換え宿主細胞を提供する。図１１に示される実施形態では、増殖した組換え宿主細胞は、２０％のクリーム酵母として提供されるが、増殖した組換え宿主細胞のさらなる実施形態（図１１には示されない）を提供することができる。次いで、ステップ０２０では、増殖した組換え酵母宿主細胞を溶解して、溶解された組換え酵母宿主細胞を提供する。例えば、細胞を、自己溶解（必要に応じて、さらなる外因性酵素の存在下で実施することができる）を使用して溶解するか、またはホモジェナイズする（例えば、ビーズ粉砕技術を使用する）ことができる。ある実施形態では、増殖した組換え酵母宿主細胞を、自己溶解を使用して溶解することができる。図１１に示される実施形態では、増殖した組換え細胞を、増殖した組換え酵母宿主細胞の自己溶解を引き起こして、溶解された組換え酵母宿主細胞を提供するために、特定の時間量（例えば、２４時間）にわたって熱処理とｐＨ処理との組合せにかけることができる。例えば、増殖した組換え細胞を、約４０℃〜約７０℃または約５０℃〜約６０℃の温度にかけることができる。増殖した組換え細胞を、少なくとも約４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃または７０℃の温度にかけることができる。代替的に、または組み合わせて、増殖した組換え細胞を、約７０℃、６９℃、６８℃、６７℃、６６℃、６５℃、６４℃、６３℃、６２℃、６１℃、６０℃、５９℃、５８℃、５７℃、５６℃、５５℃、５４℃、５３℃、５２℃、５１℃、５０℃、４９℃、４８℃、４７℃、４６℃、４５℃、４４℃、４３℃、４２℃、４１℃または４０℃以下の温度にかけることができる。別の例では、増殖した組換え細胞を、約４．０〜８．５または約５．０〜７．５のｐＨにかけることができる。増殖した組換え細胞を、少なくとも約４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４または８．５のｐＨにかけることができる。代替的に、または組み合わせて、増殖した組換え細胞を、８．５、８．４、８．３、８．２、８．１、８．０、７．９、７．８、７．７、７．６、７．５、７．４、７．３、７．２、７．１、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．６、５．５、５．４、５．３、５．２、５．１、５．０、４．９、４．８、４．７、４．６または４．５以下のｐＨにかけることができる。
【００９３】
プロセスはまた、乾燥ステップを含んでもよい。乾燥ステップは、例えば、噴霧乾燥および／または流動床乾燥を含んでもよい。このステップは、図１１にステップ０３１、０３２、０３３または０３４として示される。酵母製品が自己溶解物である場合、プロセスは、溶解した混合物のさらなる分離を実施することなく、溶解ステップの後に溶解された組換え酵母宿主細胞を直接乾燥することを含む。溶解ステップ後の直接乾燥ステップは、図１１にステップ０３１として示される。
【００９４】
さらなる酵母製品を提供するために、溶解された組換え酵母宿主細胞の成分をさらに分離することが必要であり得る。例えば、溶解された組換え酵母宿主細胞の細胞壁成分（「不溶性画分」と呼ばれる）を、溶解された組換え酵母宿主細胞の他の成分（「可溶性画分」と呼ばれる）から分離することができる。この分離ステップを、例えば、遠心分離および／または濾過を使用することによって行うことができる。分離ステップは、図１１にステップ０４０として示される。
【００９５】
図１１に示される実施形態では、酵母製品として細胞壁（「図１１で「ＣＷ」）を提供するために、その後の乾燥ステップ０３２の前に、または酵母製品として酵母抽出物（図１１で「ＹＥ」）を提供するために、その後の乾燥ステップ０３３の前に、不溶性画分を洗浄ステップにかけない。しかしながら、本開示のプロセスは、細胞壁を提供するためにステップ０４０と０３２との間に、または酵母抽出物を提供するためにステップ０４０と０３３との間に１つまたは複数の洗浄ステップを含んでもよい。
【００９６】
プロセスの実施形態では、不溶性画分を、乾燥の前にさらに分離することができる。例えば、図１１にステップ０５０として示されるように、１０ｋＤａより大きい分子量を有する可溶性画分の成分を、可溶性画分から分離することができる。この分離を、例えば、濾過（より具体的には、限外濾過）を使用することによって達成することができる。濾過を使用して成分を分離する場合、約１０ｋＤａ未満の分子量を有する成分を濾過除去（例えば、除去）し、約１０ｋＤａより大きい分子量を有する成分を保持することができる。次いで、１０ｋＤａより大きい分子量を有する可溶性画分の成分を、必要に応じて、ステップ０３４で乾燥して、保持物を酵母製品として提供することができる。
【００９７】
本明細書に記載のプロセスでは、酵母製品は、不活性形態として提供される。酵母製品を、液体、半液体または乾燥形態で提供することができる。
【００９８】
ある実施形態では、プロセスはまた、酵母製品から異種タンパク質を実質的に単離／精製することを含んでもよい。本開示の文脈で使用される場合、「溶解された組換え酵母宿主細胞から異種タンパク質を実質的に単離／精製すること」という表現は、異種タンパク質から溶解された組換え酵母宿主細胞の成分の大部分を除去すること、およびそれを単離／精製された形態で提供することを指す。異種タンパク質を、液体形態または固体（乾燥）形態で提供することができる。そのため、本開示は、本明細書に記載のプロセスによって得られる、または得られた単離された異種タンパク質を提供する。ある実施形態では、単離された異種タンパク質は、そのシグナル配列が、例えば、原核生物、細菌などの異種生物中で天然に発現されるタンパク質に由来するシグナルペプチドで交換された組換え酵母宿主細胞によって産生される。代替的な実施形態では、シグナル配列は、異種タンパク質に付加されており、この新しいシグナル配列は、細菌などの原核生物中で天然に発現されるタンパク質に由来する。
【００９９】
本発明は、その範囲を限定するよりもむしろ本発明を例示するために与えられる以下の実施例を参照することによって、より容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１００】
（実施例Ｉ）
材料および方法
【０１０１】
【表１−１】
2020510442.tif 000002
【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【０１０２】
細胞増殖。細胞を、５ｍＬのＹＰＤ（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌの細菌用ペプトン、４０ｇ／Ｌのグルコース）中で一晩増殖させた。１ｍＬの全培養物を収獲し、細胞を遠心分離によって沈降させた。無細胞上清を除去し、後の分析のために確保した。細胞ペレットを１回洗浄し、脱イオン水中に再懸濁した。
【０１０３】
クリーム酵母および不活化クリーム酵母。発酵後、収獲された発酵培養液を遠心分離し、実験室規模の分離器（ＧＥＡから）を使用して洗浄して、２０％に近い最終乾燥重量を有する酵母クリームを調製した。不活化クリーム酵母を作製するために、約６００ｇのクリーム酵母を、７５℃に達するまで温度制御された撹拌／ホットプレート上で加熱した。クリームを７５℃で１５分間保持した後、熱源を除去した。
【０１０４】
噴霧乾燥。噴霧乾燥された試料を、ミニスプレードライヤー（Ｂｕｃｈｉ  Ｂ−２９０）を用いて１５０℃で乾燥することによって調製した。排出温度を約８０〜８５℃に維持するために、供給速度を維持した。
【０１０５】
ビーズ粉砕／ビーズ粉砕されたホモジェネートの作製。クリーム酵母を、以下のビーズ粉砕条件下でのビーズ粉砕によって破壊した（典型的な破壊効率は９５％を超える細胞である）。クリーム酵母（約２０％の固体）を、１．６ｇ／ｍＬの充填容量で８０％までチャンバーを充填する０．５〜０．７５ｍｍのガラスビーズおよび１０ｍ／ｓの周速度で６４ｍｍ直径の撹拌子を使用して、４℃で０．６Ｌチャンバー容量を有するＤｙｎｏ  ＫＤＬを用いてビーズ粉砕した。クリーム酵母の流量は、６ｋｇ／Ｌ／ｈであった。
【０１０６】
即時乾燥酵母（ＩＤＹ）の調製。ＩＤＹ試料の産生を標的とする商業的発酵の後、収獲された培養液を、実験室規模のＧＥＡ分離器を使用して遠心分離し、洗浄して、２０％に近い最終乾燥重量を有する酵母クリームを調製した。次いで、クリームを減圧濾過システム中で濾過して、ケーキ酵母を作製した。さらなる水を除去するために、酵母ケーキをさらに圧縮して、押出しの前に約３５％の乾燥重量を達成した。次いで、５分間のスピンによってよく混合した後、圧縮されたケーキを押し出した。スピン付加速度は、酵母乾燥物質ベースで１％であった。押出し後、酵母を実験室規模の流動床乾燥器（Ａｅｒｏｍａｔｉｃ  ＡＧ）中で乾燥した。乾燥温度を、３５〜４０℃に設定し、制御した。乾燥を約２０〜２５分間継続して、９４％を超える固体含量を達成した。発酵レシピに関しては、ＩＤＹ発酵レシピに関する大きな差異は、それが、アンモニア（Ｎ）が停止され、発酵温度が３５℃まで上昇する発酵の終わりに向かって２時間の成熟期間を有することである。
【０１０７】
発酵器の自己溶解。少なくとも３Ｌ（最小作業容量）の２０％固体クリームを、２０Ｌの発酵器（ＢｉＯＥＮＧｉＮＥＥＲｉＮＧ）に移した。自己溶解を、７０ｒｐｍで穏やかに撹拌しながら、５５℃およびｐＨ５．５（２Ｎ硫酸を用いる自動化されたｐＨ制御）で実施した。自己溶解物（約２０％の乾燥重量）を、２４時間のインキュベーション後に収獲し、以下に記載のように分離した。
【０１０８】
実験室規模の自己溶解。この自己溶解は、上記の発酵器による自己溶解と類似しているが、より小さい規模で、わずかに異なるパラメーターを用いて実施した。クリーム酵母（２０％固体）を自己溶解にかけ、ｐＨをｐＨ７に調整した。混合物を５０ｍＬの円錐チューブ中、５５℃の水浴中で４８時間インキュベートした。
【０１０９】
洗浄しない自己溶解物の分離。発酵器による自己溶解の後、総自己溶解物を、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｌｙｎｘ  ６０００遠心分離器中、１Ｌボトル中で１１，０００ＲＣＦで１０分間分離して、可溶性画分（１１〜１３％乾燥重量、酵母抽出物）および不溶性画分（酵母細胞壁）を得た。乾燥重量および酵素活性を、総自己溶解物、酵母抽出物および細胞壁画分について、乾燥重量およびＭＡＮＵ平衡に関して測定した。
【０１１０】
洗浄する自己溶解物の分離。５０ｍＬ円錐チューブ中、３，０００ＲＣＦで１０分間、発酵器による自己溶解物を遠心分離することによって、分離を実施した。遠心分離ステップから得られた上清の重量に等しい水を添加することによって、２回のさらなる洗浄を実施した。ＹＥ（酵母抽出物）の分離収率を、自己溶解物中の出発固体に対する、分離のみ（ＷＦ＝０）に由来する、および分離＋１回または２回の洗浄（それぞれ、ＷＦ＝１または２）に由来する固体の回収として算出する。ＹＥのＭＡＮＵ回収を、自己溶解物中の出発総Ｐｈａｄｅｂａｓ  ＭＡＮＵに対する、分離のみ（ＷＦ＝０）に由来する、および分離＋１回または２回の洗浄（ＷＦ＝１または２）に由来する活性（Ｐｈａｄｅｂａｓ  ＭＡＮＵ）として算出する。
【０１１１】
限外濾過。発酵器による自己溶解物を、１Ｌボトル中、１１，０００ＲＣＦで遠心分離することによって分離し、酵母抽出物画分を、１０ｋＤａ分子量カットオフのＰＥＳ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｏｍａｘ−１０）を用いる限外濾過によってさらに濃縮した。保持物画分は膜によって保持され、透過画分は膜を通過する。
【０１１２】
マルトース生成アミラーゼアッセイ。１マルトース生成アミラーゼＮｏｖｏ単位、ＭＡＮＵは、標準的な条件下で、１分あたりに１マイクロモルのマルトトリオースを切断する酵素の量である。酵素活性についてアッセイする前に、クリーム酵母試料を、ＭＡＮＵアッセイバッファー（０．１Ｍクエン酸、ｐＨ５．０）中、６０℃で１０分間インキュベートすることによって不活化した。次いで、試料を２０ｍｇ／ｍｌのマルトトリオース基質と混合し、３７℃で３０分間インキュベートした。等量の１Ｎ水酸化ナトリウム停止試薬の添加によって、反応を停止させた。マルトース生成アミラーゼ活性によって加水分解されたグルコースを、グルコース（ＨＫ）アッセイ試薬（Ｓｉｇｍａ  Ｇ３２９３）との１５分間の室温でのインキュベーション後に測定した。分光光度計中、３４０ｎｍで吸光度を読み取った。未知の試料を、既知の酵素活性を有するＮｏｖａｍｙｌ（登録商標）の用量曲線と比較した。図１の結果だけを生成するために、この方法を適用した。
【０１１３】
Ｐｈａｄｅｂａｓ  ＭＡＮＵ酵素活性アッセイ。Ｐｈａｄｅｂａｓ錠剤は、水に不溶性のデンプン基質と、架橋で染料に結合した青色染料とを含有する。基質は、マルトース生成アミラーゼによって加水分解され、可溶性である青色染料を放出する。反応を停止させ、遠心分離した後、溶液の吸光度を分光測光的に測定し、酵素活性の代理と考える。それぞれの試料について、１個のＰｈａｄｅｂａｓ錠剤を、４．９ｍＬのクエン酸−リン酸バッファー（７０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、ｐＨ５．５）に添加し、６０℃の水浴中で５分間インキュベートした。次いで、クエン酸−リン酸バッファー中に希釈された、０．１ｍＬの標準物または試料を錠剤およびバッファー溶液に添加し、６０℃水浴中で１５分間インキュベートした。１ｍＬの０．５Ｍ水酸化ナトリウム溶液を添加し、混合することによって反応を停止させた。チューブを遠心分離して固体を除去し、基質の吸光度を、分光光度計を用いて６２０ｎｍで測定した。試料（乾燥または液体）を、既知の活性を有するＮｏｖａｍｙｌ（登録商標）の用量曲線と比較する。図１を除く、全てのＭＡＮＵ結果を生成するために、この方法を適用した。
【０１１４】
グルコースオキシダーゼアッセイ。細胞を、酵母抽出物ペプトン培地＋２％グルコース中、３０℃で２４時間、バッチ式で増殖させた。破壊され、洗浄された細胞上清を得るために、合間に１分間休止しながら、アッセイバッファー中、２ｘ１分、ガラスビーズでデッドビートした。上清を、遠心分離によって全溶解物から分離した。全培養物、上清、破壊され洗浄された細胞上清（細胞内細胞結合型活性を反映する）、洗浄された細胞またはＧｌｕｚｙｍｅ（登録商標）の陽性対照（１００００ＢＧに対応する２．４０  ＧＯＤＵ／ｍＬ）を、Ｋ−ＧＬＯＸ（商標）キット（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）を用いて測定した：アッセイバッファー（０．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび０．０２％（ｗ／ｖ）のアジ化ナトリウムを含有する１００ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７）中の試料を、９０ｍｇ／ｍＬのグルコースおよびＰＯＤ混合物と混合し、室温で２０分間インキュベートした。吸光度を、５１０ｎｍで分光光度計を用いて測定した。
【０１１５】
アルファ−アミラーゼアッセイ（図３）。２５μＬの洗浄された細胞または無細胞上清を、５０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５中の２５μＬの５ｍＭ  ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−ヘキサオシドに添加することによって、アルファ−アミラーゼ活性を測定した。反応を３５℃で２時間インキュベートし、５０μＬの１Ｍ重炭酸ナトリウムの添加によって終結させた。細胞を沈降させ、５０μＬのアッセイ混合物をマイクロタイタープレートに移し、４０５ｎｍでの吸光度を測定した。細胞画分の活性を、総活性（「結合」＋「遊離」）のパーセンテージとして表した。
【０１１６】
アルファ−アミラーゼアッセイ（図１２〜１５）。株を、９００ｒｐｍの振盪器上、９６ウェルプレート中、３５℃で４８時間、６００μＬのＹＰＤ４０中で最初に増殖させた。２５μＬの洗浄された細胞または無細胞上清を、５０ｍＭの酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）を含む１００μＬの１％生デンプンに添加することによって、アルファ−アミラーゼ活性を決定した。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｃｙｃｌｅｒを使用して、８５℃で３０分、アッセイを処理した。２：１のＤＮＳ：デンプンアッセイ比を使用する、ジニトロサリチル酸試薬溶液（ＤＮＳ）法を使用して還元糖を測定し、１００℃で５分間沸騰させた。吸光度を５４０ｎｍで測定した。
【０１１７】
小麦デンプン活性アッセイ。細胞を、酵母抽出物ペプトン培地＋４％グルコース中、３５℃で４８時間、バッチ式で増殖させた。アッセイバッファー（５０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５）中に再懸濁された全培養物、上清および洗浄された細胞を、アッセイバッファー中の１％小麦デンプンと混合し、６０℃で５分間インキュベートした。次いで、３，５−ジニトロサリチル酸を添加して、還元末端と反応させ、９９℃で５分間沸騰させた。吸光度を、５４０ｎｍで分光光度計を用いて測定した。
【０１１８】
真菌アミラーゼ活性。細胞を、酵母抽出物ペプトン培地＋２％グルコース中、３０℃で２４時間、バッチ式で増殖させた。全培養物、上清、および破壊された細胞上清または洗浄された細胞のいずれかを、アッセイバッファー（７０ｍＭリン酸水素二ナトリウム、３０ｍＭクエン酸、ｐＨ５．５）中に再懸濁し、アッセイバッファー中の１％ゼラチン化小麦デンプンと混合し、３０℃で１時間インキュベートした。３，５−ジニトロサリチル酸（ＤＮＳ）を添加して、還元末端と反応させ、９９℃で５分間沸騰させた。吸光度を、５４０ｎｍで分光光度計を用いて測定した。
【０１１９】
フィターゼ活性アッセイ。１Ｍリン酸二水素カリウムの２倍連続希釈液を、ＦＴＵを算出するための標準物として調製した。１９０μｌの５ｍＭフィチン酸ナトリウム溶液ｐＨ５．５を、９６ウェルＰＣＲプレートの各ウェルに添加した。標準物または酵母抽出物ペプトン培地＋４％グルコース中の酵母の一晩培養物の上清を、５ｍＭフィチン酸ナトリウム溶液ｐＨ５．５と混合し、３７℃で３０分インキュベートした。細胞に結合した試料を、２時間のインキュベーション後、再度測定した。等量の反応物および着色変化溶液（４部の試薬Ａと１部の試薬Ｂ、ここで、試薬Ａは水中の１２ｍＭヘプタモリブデン酸アンモニウム−ＨＣｌであり、試薬Ｂは水中の２．７％硫酸鉄である）を混合し、室温で１０分間インキュベートした後、３５００ｒｐｍで３分間沈降させた。各試料または標準物の吸光度を、分光光度計中、７００ｎｍで読み取った。
【０１２０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。等量の試料およびローディングバッファー（２５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ６．８、３０％グリセロール、１０％ＳＤＳ、０．１％ブロモフェノールブルー；それぞれ、還元条件または非還元条件のために５０ｍＭ  ＤＴＴを含む、または含まない）を混合し、１００℃で２分間加熱した。２０μｌの各試料＋バッファーを、４〜２０％Ｔｒｉｓグリシンゲル上にロードし、１７５Ｖで７５分間泳動した。電気泳動後、ゲルを水中で洗浄し、ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ（登録商標）で染色して、総タンパク質を可視化した。Ｂｉｏ−ｒａｄ  Ａｌｌ  Ｂｌｕｅ（登録商標）タンパク質標準を、分子量参照として使用した。
【０１２１】
（実施例ＩＩ）
細胞結合型マルトース生成アルファ−アミラーゼの発現
特に、テザーの存在下での、異種ＭＡＡの発現は、細胞ペレット（図１Ａ）と、より大規模では、クリーム酵母（図１Ｂ）との両方において、マルトース生成アミラーゼ活性を有する組換え酵母を提供した。比較すると、対応する野生型株は、いかなるマルトース生成アミラーゼ活性も示すことができなかった（図１Ａおよび１Ｂ）。
【０１２２】
図１に示される結果は、ｔｄｈ１遺伝子のプロモーターから異種ＭＡＡを発現させることによって得られたものであった。２つのプロモーターの組合せ（ｔｄｈ１遺伝子およびｈｏｒ７遺伝子に由来する、データは示さない）の場合にも同様の結果が得られた。酵素活性は、異種マルトース生成アミラーゼを発現する株においてより高い。
【０１２３】
細胞内Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＭＡＡを発現する酵母株（Ｍ１５５３２）を、糖蜜上で好気的フェドバッチによって増殖させた後、酵母クリームを作製した。そのＭＡＮＵ活性を決定した。表２に示されるように、異種酵素は、総細胞タンパク質の３．７％であると算出される。
【０１２４】
【表２】
2020510442.tif 000012
【０１２５】
細胞内Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＭＡＡを発現する別の株（Ｍ１４８５１）を増殖させ（糖蜜上でのフェドバッチ）、ＭＡＮＵ活性を決定した。表３に示されるように、未処理の総培養液中、２５．６〜３９．３のＭＡＮＵ活性が検出された。クリームを洗浄および濃縮した後、１１２〜２８８のＭＡＮＵ活性が検出された。
【０１２６】
【表３】
2020510442.tif 000013
【０１２７】
係留されたＧ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＭＡＡを発現する別の株（Ｍ１３８７９）を増殖させ（糖蜜上でのフェドバッチ）、様々な酵母調製物中でＭＡＮＵ活性を決定した。その結果を表４に示す。商業的増殖の１日後のクリーム酵母の活性データは、その元の形態のクリームの最も代表的な尺度である。全ての他のデータを、商業的増殖の８日後に得た。
【０１２８】
【表４】
2020510442.tif 000014
【０１２９】
ＭＡＮＵおよび小麦デンプン活性を、Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するマルトース生成アルファアミラーゼを細胞内的に発現する、糖蜜上でフェドバッチ式に増殖させた酵母株（Ｍ１５５３２）の異なる調製物中で決定した。その結果を、観察された酵素活性のレベルに対する異なる調製物の効果を示す表５〜９に提供する。
【０１３０】
【表５】
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【０１３１】
【表６】
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【０１３２】
【表７】
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【０１３３】
【表８】
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【０１３４】
【表９】
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【０１３５】
Ｇ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するマルトース生成アルファアミラーゼを発現する酵母株の様々な調製物を作製し、そのＭＡＮＵ活性を決定した。一部の株は、分泌型でＭＡＡを発現し（Ｍ１３８２２）、他の株は係留型でＭＡＡを発現した（Ｍ１３８１９およびＭ１３９７９）が、別の株は細胞内的にＭＡＡを発現した（Ｔ３８９２）。図４に見られるように、最も高い活性は、ＭＡＡを細胞内的に発現する株において観察された（Ｔ３８９２）。
【０１３６】
図８の凡例で説明されるように、分泌型、係留型で発現された、または細胞内で発現されたＧ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来するマルトース生成アルファアミラーゼを発現する様々な酵母株の全培養物、培養上清および洗浄された細胞中で、細胞密度に対して正規化された小麦デンプン活性を決定した。その結果を図８に示し、ＭＡＡが細胞内で発現される場合に最も高い活性が観察されることを示した。
【０１３７】
Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）酵素のタンパク質含量を、ＳＤＳ−ｐａｇｅ上で、酵母株Ｍ１５５３２の未処理のクリーム、熱処理されたクリームおよびビーズ粉砕処理されたクリームのタンパク質含量と比較した。その結果を図９に示す。図９上の矢印は、全ての処理された調製物ならびにＮｏｖａｍｙｌ（登録商標）酵素に見られた主なタンパク質バンドを指示する。
【０１３８】
図１０では、Ｎｏｖａｍｙｌ（登録商標）酵素のタンパク質含量を、ＳＤＳ−ｐａｇｅ上で、非還元条件（レーン３〜５）および還元条件（レーン７〜９）下での酵母株Ｍ１４８５１およびＭ１５５３２に由来するタンパク質含量と比較した。主なタンパク質バンドは、試験した全てのタンパク質試料において見られる。
【０１３９】
（実施例ＩＩＩ）
異種アルファ−アミラーゼ、グルコアミラーゼ、フィターゼ、グルコースオキシダーゼおよび真菌アミラーゼの発現
異種グルコアミラーゼ（ＧＡ）を、ｔｅｆ２遺伝子のプロモーターから、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中で発現させた。ＧＡを係留された酵素として発現させた場合、細胞ペレットと関連する活性が増加する（図２）。
【０１４０】
異種アルファ−アミラーゼ（ＡＡ）を、ｔｅｆ２遺伝子のプロモーターから発現させた。ＡＡを係留された酵素として発現させた場合、ペレットと関連する活性は、特に、リンカーの存在下で増加する（図３）。
【０１４１】
Ｃ．ｂｒａａｋｉｉに由来するフィターゼを発現する酵母株の様々な調製物を作製し、そのＦＴＵ活性を決定した。一部の株は分泌型のフィターゼを発現し（Ｔ２６３３）、他の株は異なるテザーを使用して係留型のフィターゼを発現した（Ｔ２６３４、Ｔ２６３５、Ｔ２６３６、Ｔ２６３７およびＴ２６３８）。その結果を、上清と細胞自体の両方について、図５Ａおよび５Ｂに示す。
【０１４２】
Ｅ．ｃｏｌｉに由来するフィターゼを発現する酵母株の様々な調製物を作製し、そのＦＴＵ活性を決定した。一部の株は分泌型のフィターゼを発現し（Ｍ１１３１２）、他の株は異なる構成のテザーを使用して係留型のフィターゼを発現した（Ｔ２７０５、Ｔ２７０６、Ｍ１２７９５、Ｍ１２９３８、Ｔ２８１６）。その結果を、上清と細胞自体の両方について、図６および７に示す。
【０１４３】
異種キメラ耐熱性Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓアルファ−アミラーゼ−ＳＰＩ１構築物およびＴ．ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓアルファ−アミラーゼ−ＣＣＷ１２構築物を、係留部分の様々なトランケーションを使用して作製した。トランケートされたＧＰＩアンカー部分を有するキメラポリペプチドを発現する株の洗浄された細胞と関連するアルファ−アミラーゼ活性を、トランケートされていないＧＰＩアンカー部分と比較し、図１２および１３に示す。
【０１４４】
図１２に見られるように、完全長係留部分を有するキメラポリペプチド（Ｍ１５２２２株から発現される）は、トランケートされた係留部分を有するポリペプチド（Ｍ１５７７４株（２１アミノ酸長のトランケーション）、Ｍ１５７７１株（５１アミノ酸長のトランケーション）、Ｍ１５７７株（８１アミノ酸長のトランケーション）またはＭ１５７７２株（１３０アミノ酸長のトランケーション）から発現される）と同じであるか、またはそれよりも高いアルファ−アミラーゼ活性を示した。
【０１４５】
図１３に見られるように、完全長係留部分を有するキメラポリペプチド（Ｍ１５２１５株からの発現）は、トランケートされた係留部分を有するキメラポリペプチド（Ｍ１５７７３株（２４アミノ酸長のトランケーション）、Ｍ１５７７６株（４９アミノ酸長のトランケーション）、Ｍ１６２５１株（７４アミノ酸長のトランケーション）またはＭ１５７７５株（９９アミノ酸長のトランケーション）から発現される）と類似するか、またはそれより高いアルファ−アミラーゼ活性を示した。
【０１４６】
異種キメラ耐熱性Ｐ．ｆｕｒｉｏｓｕｓアルファ−アミラーゼ−ＳＰＩ１構築物およびＴ．ｈｙｄｒｏｔｈｅｒｍａｌｉｓアルファ−アミラーゼ−ＣＣＷ１２構築物を、様々なリンカーおよび同じ係留部分を使用して作製した。異なるリンカーを有するキメラポリペプチドを発現する株の洗浄された細胞と関連するアルファ−アミラーゼ活性を、図１４および１５に示す。
【０１４７】
図１４に見られるように、全ての株のアルファ−アミラーゼ活性は、使用したリンカーの種類に関係なく、対照株（Ｍ２３９０）よりも高かった。アルファ−アミラーゼ活性は、リンカー７（配列番号９９）を使用した場合（Ｍ１６２２２株）に最も高かった。
【０１４８】
図１５に見られるように、全ての株のアルファ−アミラーゼ活性は、使用したリンカーの種類に関係なく、対照株（Ｍ２３９０）よりも高かった。アルファ−アミラーゼ活性は、リンカー５（配列番号９７）を使用した場合（Ｍ１５７８０株）に最も高かった。
【０１４９】
異種キメラグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）構築物を、細胞内で、または分泌型で発現させた。様々な細胞画分から得られたＧＯ活性を、対照株（Ｍ１０４７４）または陽性対照酵素調製物Ｇｌｕｚｙｍｅ  Ｍｏｎｏ（登録商標）と比較した（図１６）。Ｍ１６７８０株およびＭ１６２７３株と関連するＧＯ活性は、親株であるＭ１０４７４と関連する対照ＧＯ活性よりも高かった（図１７）。
【０１５０】
異種キメラ真菌アミラーゼ（ＦＡ）構築物を、分泌型で発現させた。様々な細胞画分から得られたＦＡ活性を、対照株Ｍ１０４７４または陽性対照酵素調製物Ｆｕｎｇａｍｙｌ（登録商標）と比較した（図１８）。Ｍ１６７７２株およびＭ１６５４０株と関連するＦＡ活性は、親株であるＭ１０４７４と関連する対照活性よりも高かった（図１９）。
【０１５１】
本発明をその特定の実施形態に関連して記載してきたが、特許請求の範囲は実施例に記載された好ましい実施形態によって限定されるべきではないが、全体として記載と一致する最も広い解釈を与えられるべきであることが理解されるであろう。
【０１５２】
参考文献
Gascon S, Neumann NP, Lampen JO. Comparative study of the properties of the purified internal and external invertases from yeast. J Biol Chem. 1968 Apr 10;243(7):1573-7.
Perez-Torrado R, Bruno-Barcena JM, Matallana E. Monitoring stress-related genes during the process of biomass propagation of Saccharomyces cerevisiae strains used for wine making. Appl Environ Microbiol. 2005 Nov;71(11):6831-7.
Praekelt UM, Meacock PA. MOL1, a Saccharomyces cerevisiae gene that is highly expressed in early stationary phase during growth on molasses. Yeast. 1992 Sep;8(9):699-710.
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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