(57)【要約】  本発明は、抗体に関し、その抗体は、短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンと特異的に反応性であるが、中アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンと、または長アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンとは反応しない。本発明はまた、短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンを検出または定量化するためのイムノアッセイの方法における抗体の使用に関し、方法は、血友病性疾患を評価するために使用され得る。
2020514368.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンと特異的に反応性である抗体であって、前記抗体が、中アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンと、または長アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンとは反応しない、抗体。
【請求項２】
前記抗体が、短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端エピトープと特異的に反応性である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、Ｈ２Ｎ−ＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ．．．（配列番号１）のＮ末端アミノ酸配列に含まれるＮ末端エピトープと特異的に反応性である、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＥＰＥＲＩＳ．．．（配列番号２）を含むＮ末端エピトープと特異的に反応性である、請求項２に記載の抗体。
【請求項５】
前記抗体が、Ｈ２Ｎ−ＡＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ（配列番号３）である前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ拡張伸長バージョンを特異的に認識もしくは結合しない、かつ／またはＨ２Ｎ−ＰＥＲＩＳＥＥＶＧ（配列番号４）である前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ切断バージョンを特異的に認識もしくは結合しない、請求項３または４に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜５のいずれかに記載の抗体。
【請求項７】
試料において短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンを検出または定量化するためのイムノアッセイの方法であって、前記方法が、前記短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンを含む試料を請求項１〜６に記載の抗体と接触させることと、前記抗体の結合の量を決定することと、を含む、方法。
【請求項８】
前記方法が、短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端エピトープを検出または定量化することを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｎ末端エピトープが、前記Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ．．．（配列番号１）に含まれる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｎ末端エピトープが、前記Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＥＰＥＲＩＳ．．．（配列番号２）を含む、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が、生物流体である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記生物流体が、血清、血漿、尿、脳脊髄液、または羊水である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記イムノアッセイが、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイである、請求項７〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイである、請求項７〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、前記方法によって決定される前記短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量を、既知の疾患重症度の標準血友病性疾患試料と相関させて、血友病性疾患の重症度を評価することをさらに含む、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記方法が、前記方法によって決定される前記短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量を、健康な対象と関連した標準値と比較して、血友病性疾患の存在および／または重症度を評価することをさらに含む、請求項７〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、対象から第１の時点および少なくとも１つのその後の時点で得られる少なくとも２つの試料中のＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量を定量化することをさらに含み、
前記第１の時点から前記少なくとも１つのその後の時点までのＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量の増加が、前記第１の時点から前記少なくとも１つのその後の時点までの血友病性疾患の悪化を示し、
前記第１の時点から前記少なくとも１つのその後の時点までのＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量の減少が、前記第１の時点から前記少なくとも１つのその後の時点までの血友病性疾患の改善を示す、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記血友病性疾患が、血友病性関節症であり得る、請求項１５〜１７に記載の方法。
【請求項１９】
血友病性疾患を治療するための薬物の有効性を評価するための方法であって、前記方法が、請求項７〜１４のいずれか一項に記載の方法を使用して、対象から第１の時点、および前記対象への前記薬物の投与の期間中の少なくとも１つのその後の時点で得られる少なくとも２つの試料中のＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量を定量化することを含み、
前記第１の時点から前記薬物の投与の期間中の前記少なくとも１つのその後の時点までのＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量の低減が、血友病性疾患を治療するための有効な薬物であることを示す、方法。
【請求項２０】
短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量を決定するためのアッセイキットであって、前記キットが、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗体と、
−ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート
−前記抗体と反応性であり、ビオチン化ペプチドＨ２Ｎ−ＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ−Ｌ−ビオチン（配列番号５）であり得、Ｌが、任意のリンカーである、ペプチド
−サンドイッチイムノアッセイにおける使用のための任意にビオチン化された二次抗体
−Ｎ末端配列Ｈ２Ｎ−ＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ・・・（配列番号６）を含むキャリブレータペプチド
−抗体ＨＲＰ標識キット
−抗体放射性標識キット
−アッセイ可視化キットのうちの少なくとも１つと、を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの短アイソフォームを検出するための方法、および血友病性疾患の評価におけるその方法の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管破裂による再発性関節血症は、血友病における主要な合併症であり、血友病性（ＨＦ）関節症を引き起こす進行性関節損傷の一因となっている。出血事象を低減するＨＦ分野における医療ニーズは、血友病患者における年間出血率（ＡＢＲ）の測定を必要とする。粗い尺度であるものの、ＡＢＲは、ＨＦ関節症と関連付けられる［１］が、臨床試験における重要なパラメータでもあり、患者に対する定量化可能な利益を保証する［２〜４］。内皮細胞機能障害およびマトリックス品質は、関節出血およびその後のＨＦ関節症の発症と関連付けられ得る。
【０００３】
血管破裂は、内皮細胞の直下に位置する基底膜（ＢＭ）の品質およびターンオーバーと関連付けられる。細胞外マトリックスターンオーバーは、上皮または内皮細胞損傷による多くの疾患における中心的な病理学的特徴である。内皮細胞機能は論じられているが、出血後、内皮細胞の基底をなすＢＭの露出をもたらす、血管内皮に対する損傷を特異的に定量化するための定量化可能な方法は存在しない。
【０００４】
内皮細胞に特異的なＢＭタンパク質を定量化することは、したがって、血友病患者における内皮細胞安定性および破裂に対する特定の関連性を有し得る。
【０００５】
ＩＶ、ＸＶ、およびＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、血管壁構造および膜の統合性の維持を担う、血管ＢＭの最もよく知られているコラーゲンを表す（図１Ａ）［５〜７］。
【０００６】
ＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、様々な基底膜領域に局在する、短、中、および長の３つのアイソフォームで存在する［４〜６］（図１Ｂ）。全ての３つのアイソフォームは、トロンボスポンジン１様ドメイン、および１１個の非コラーゲンドメイン（ＮＣ１〜１１）に隣接する１０個の三重らせんコラーゲンドメイン（Ｃｏｌ１〜１０）を含有する。ＮＣ１ドメインは、抗血管新生特性を有するＣ末端エンドスタチンドメインを含有する［７］。短アイソフォームは、内皮特異的であり、血管中および筋肉構造の周りに見られる。ここには、ゼロまたは非常に低い量のみの中および長アイソフォームが存在する［５］。血管ＢＭのリモデリング、損傷、および分解後、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの短アイソフォームは、他のタイプのコラーゲンで起こったように、影響および分解され、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの測定可能な断片を放出し得る［８、９］。
【０００７】
ＸＶＩＩＩ型コラーゲンにおける突然変異はまた、常染色体劣性障害Ｋｎｏｂｌｏｃｈ症候群（ＫＳ）と関連付けられている。ＫＳは、若齢での失明を引き起こす様々な眼球異常によって特徴付けられる［１１、１２］。また、ｃｏｌ１８ａ１−／−ノックアウトマウスは、網膜の表面に沿った硝子体における血管の退行遅延、網膜血管の血管新生機能障害、および虹彩ＢＭ構造変化を示した［８、１３〜１６］。よって、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、目における血管形成を制御するために必須であり、場合によっては血管系全体のＢＭ領域における重要な成分である［１７］。
【０００８】
本出願人は、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの短アイソタイプに特異的ないずれのバイオマーカーおよび／または抗体についても把握していない。市販の抗体の大部分は、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＣ末端エンドスタチン末端を認識するので、それらの抗体を用いて３つのアイソタイプを区別することはできない。
【０００９】
よって、内皮ＸＶＩＩＩ型コラーゲン含有量の検出に関して血管特異的基底膜ターンオーバーを定量化するために、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの特異的短アイソタイプを測定し、２つの他のアイソフォームを除外する抗体および／またはバイオマーカーの必要性がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
出願人はここで、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの短アイソフォームを検出するためのアッセイを開発し、そのアッセイを使用して、ＨＦ関節症と診断された患者におけるＸＶＩＩＩ型コラーゲンのターンオーバーの臨床的関連性を評価した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の態様では、本発明は、短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンと特異的に反応性である抗体に関し、その抗体は、中アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンと、または長アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンとは反応しない。好ましくは、抗体は、短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端エピトープと特異的に反応性である。好ましくは、Ｎ末端エピトープは、短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端シグナルペプチドの切断および除去後に露出するエピトープである。好ましくは、抗体は、Ｈ２Ｎ−ＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ．．．（配列番号１）のＮ末端アミノ酸配列に含まれるＮ末端エピトープと特異的に反応性である。好ましくは、抗体は、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＥＰＥＲＩＳ．．．（配列番号２）を含むＮ末端エピトープと特異的に反応性である。
【００１２】
好ましくは、抗体は、Ｈ２Ｎ−ＡＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ（配列番号３）であるそのＮ末端アミノ酸配列のＮ拡張伸長バージョンを特異的に認識もしくは結合しない、かつ／またはＨ２Ｎ−ＰＥＲＩＳＥＥＶＧ（配列番号４）であるそのＮ末端アミノ酸配列のＮ切断バージョンを特異的に認識もしくは結合しない。
【００１３】
抗体は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体であり得る。好ましくは、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１４】
第２の態様では、本発明は、試料において短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンを検出または定量化するためのイムノアッセイの方法に関し、その方法は、その短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンを含む試料を上に記載の抗体と接触させることと、その抗体の結合の量を決定することと、を含む。
【００１５】
本発明は、ヒト患者において短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンを検出する方法を対象とし得、その方法は、
ａ．ヒト患者から試料を得ることと、
ｂ．試料を抗体（上に記載）と接触させ、短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンと抗体との間の結合を検出することによって、その短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンが試料中に存在するかを検出することと、を含む。
【００１６】
好ましくは、方法は、短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンのＮ末端エピトープを検出または定量化することを含む。Ｎ末端エピトープは、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ．．．（配列番号１）に含まれる。好ましくは、Ｎ末端エピトープは、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＥＰＥＲＩＳ．．．（配列番号２）を含む。
【００１７】
好ましくは、試料は、生物流体である。生物流体は、これらに限定されないが、血清、血漿、尿、脳脊髄液、または羊水であり得る。
【００１８】
イムノアッセイは、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイであり得る。イムノアッセイは、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイであり得る。
【００１９】
方法は、その方法によって決定されるその短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量を、既知の疾患重症度の標準血友病性疾患試料と相関させて、血友病性疾患の重症度を評価することをさらに含み得る。これに関して、「標準血友病性疾患試料」は、既知の重症度の血友病性疾患を有することが知られる対象から得られる試料を意味する。
【００２０】
あるいは、または加えて、方法は、その方法によって決定されるその短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量を、健康な対象と関連した標準値と比較して、血友病性疾患の存在および／または重症度を評価することをさらに含み得る。これに関して、「健康な対象と関連した標準値」は、健康である、すなわち、血友病性疾患を有さないとみなされる対象について上に記載される方法によって決定される短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンの標準化された量を意味する。標準化は、健康な対象の身長、体重、性別などに依存するであろう。
【００２１】
あるいは、または加えて、方法は、対象から第１の時点および少なくとも１つのその後の時点で得られる少なくとも２つの試料中のＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量を定量化することをさらに含み得、第１の時点から少なくとも１つのその後の時点までのＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量の増加は、第１の時点から少なくとも１つのその後の時点までの血友病性疾患の悪化を示すか、または第１の時点から少なくとも１つのその後の時点までのＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量の減少は、第１の時点から少なくとも１つのその後の時点までの血友病性疾患の改善を示す。
【００２２】
血友病性疾患は、血友病性関節症であり得る。上に記載される方法は、Ｋｎｏｂｌｏｃｈ症候群を評価するためにも使用され得る。
【００２３】
別の態様では、本発明は、血友病性疾患を治療するための薬物の有効性を評価するための方法を対象とする。方法は、上に記載の方法を使用して、対象から第１の時点および対象への薬物の投与の期間中の少なくとも１つのその後の時点で得られる少なくとも２つの生物学的試料中のＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量を定量化することを含む。第１の時点から薬物の投与の期間中の少なくとも１つのその後の時点までのＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量の低減は、血友病性疾患を治療するための有効な薬物であることを示す。
【００２４】
最後の態様では、本発明は、短アイソフォームＸＶＩＩＩ型コラーゲンの量を決定するためのアッセイキットに関し、上に記載の抗体と、
−ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート
−その抗体と反応性であり、ビオチン化ペプチドＨ２Ｎ−ＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ−Ｌ−ビオチン（配列番号５）であり得、Ｌが、任意のリンカーである、ペプチド
−サンドイッチイムノアッセイにおける使用のための任意にビオチン化された二次抗体
−Ｎ末端配列Ｈ２Ｎ−ＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ．．．（配列番号６）を含むキャリブレータペプチド
−抗体ＨＲＰ標識キット
−抗体放射性標識キット
−アッセイ可視化キットのうちの少なくとも１つと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】血管ＢＭの構造。毛細血管内皮下層は、ＢＭおよび間質マトリックス（ＩＭ）で構成される。血管ＢＭの主成分には、ＩＶ型コラーゲン、ラミニン、およびニドゲンが含まれる。微量成分には、ＸＶ型コラーゲンおよびＸＶＩＩＩ型コラーゲンが含まれる。ＢＭの成分は、シート状構造に自己組織化する。ＢＭは、ＩおよびＶＩ型コラーゲンとＩＶおよびＸＶ型コラーゲンとの間の相互作用によってＩＭに緊密に結合する。
【図１Ｂ】ＸＶＩＩＩ型コラーゲンのアイソフォーム。ＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、それらのＮ末端が異なる、３つのアイソフォームで存在する。ＣＯＬ１８Ａ１遺伝子は、２つのプロモーターおよび選択的スプライシングの使用によって、これらのバリアントをコードする。短アイソフォームは、他の２つとは異なるシグナルペプチドを有し、プロモーター１によってコードされ、他方は、同じシグナルペプチドを有し、共にプロモーター２によってコードされる。全てのアイソフォームは、トロンボスポンジン様ドメイン、ヘパリン硫酸鎖、およびＸＶＩＩＩ型コラーゲン断片、エンドスタチンを含有する球状Ｃ末端を含む。
【図２】ＸＶＩＩＩ型コラーゲンに対するＣＯＬ−１８Ｎ抗体特異的反応性。標準ペプチド、切断、伸長、および選択解除ペプチドに対するモノクローナルＮＢ６３２−１３Ｈ１１／Ｇ５抗体反応を示す。抗体は、標準ペプチドに対する高い反応性を有し、他のペプチドとの交差反応性を有さないか、または最小限の交差反応性を有する。
【図３】ＡＢＲとのＣＯＬ−１８Ｎ相関。３５人の２６歳以上の男性ＨＦ患者からの血清を、ＣＯＬ−１８Ｎ  ＥＬＩＳＡで測定した。血管内皮ＸＶＩＩＩ型コラーゲン濃度とＡＢＲとの間の相関は、Ｓｐｅａｒｍａｎ順位相関係数を用いて分析され、ｒ＝０．４５、ｐ＜０．００６を示した。ＡＢＲとＣＯＬ−１８Ｎレベルとの間の差は、ｐ＜０．０５である場合に統計的に有意とみなし、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、および＊＊＊＝ｐ＜０．００１と示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
本明細書で使用されるとき、「Ｎ末端エピトープ」という用語は、ポリペプチドの末端にある、すなわち、ポリペプチドのＮ末端にある、Ｎ末端ペプチド配列を指し、その一般的な方向における意味として解釈されるものではない。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、「競合ＥＬＩＳＡ」という用語は、競合酵素結合免疫吸着アッセイを指し、当業者に知られている技法である。
【００２８】
本明細書で使用されるとき、「サンドイッチイムノアッセイ」という用語は、試料中の抗原の検出のための少なくとも２つの抗体の使用を指し、当業者に知られている技法である。
【００２９】
本明細書で使用されるとき、「ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの短アイソフォーム」という用語は、プロモーター１によって生成されるＸＶＩＩＩ型コラーゲンのアイソフォームを指し、Ｎ末端非コラーゲン領域は、トロンボスポンジン−１様ドメイン（ＴＳＰ−１）を含むが、未知機能のドメイン（ＤＵＦ）またはＦｒｉｚｚｌｅｄドメイン（ＦＺ）を含有しない。「ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの中アイソフォーム」という用語は、プロモーター２によって生成されるＸＶＩＩＩ型コラーゲンの選択的スプライシングされたアイソフォームを指し、Ｎ末端非コラーゲン領域は、ＴＳＰ−１およびＤＵＦを含むが、ＦＺを含まない。「ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの長アイソフォーム」という用語は、プロモーター２によって生成されるＸＶＩＩＩ型コラーゲンの選択的スプライシングされたアイソフォームを指し、Ｎ末端非コラーゲン領域は、ＴＳＰ−１、ＤＵＦ、およびＦＺを含む。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、「ＣＯＬ−１８Ｎ」という用語は、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの短アイソフォームのＮ末端配列ＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ（配列番号１）に特異的な本明細書で開示されるアッセイを記載するための省略表現として使用される。
【実施例】
【００３１】
本開示の実施形態は、以下の実施例に記載され、これは、本開示の理解を助けるために記述され、その後に続く特許請求の範囲において定義される本開示の範囲をいずれの方法でも限定するものと解釈されるべきではない。以下の例は、当業者に、記載される実施形態の作製および使用方法の完全な開示および説明を提供するように記述され、本開示の範囲を限定することは意図されず、以下の実験が行われた全てまたは唯一の実験であることを表すことも意図されない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関する精度を確保する努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気またはそれに近い。
【００３２】
患者試料
血清を、３５人の２６歳以上の男性ＨＦ患者から収集した。このカットオフ年齢は、コラーゲンターンオーバーが約２５歳の年齢での成長板の閉鎖で徐々に減少するため、選択された［２１］。患者は、出血エピソード時の必要に応じた投薬、または５〜１０ＩＵ／ｋｇの組換えＦＶＩＩＩ、２〜３回／週の低用量の予防薬の摂取のいずれかの治療歴を有した。患者は、世界血友病連盟身体検査スコア（Ｇｉｌｂｅｒｔスコア）によって、およびＰｅｔｔｅｒｓｓｏｎスコアに従った放射線学的評価によって定義される様々な程度のＨＦ関節症を有した。患者の平均ＡＢＲは１８．１であり、２〜４６の範囲であった。除外基準は、血友病以外の出血障害、ヒト免疫不全ウイルス感染、慢性閉塞性肺疾患、関節疾患または肝線維症の病歴、および抗炎症性生物学的製剤またはステロイドでの治療であった。研究参加者は、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｐｅｋｉｎｇ  Ｕｎｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｂｅｉｊｉｎｇ，Ｃｈｉｎａに登録された。研究は、Ｐｅｋｉｎｇ  Ｕｎｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｔｈｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄによって整理番号Ｓ−７２０で承認された。署名されたインフォームドコンセントを全ての対象から得た。
【００３３】
ＣＯＬ−１８Ｎのためのモノクローナル抗体開発
ヒトＸＶＩＩＩ型コラーゲンα１鎖の短アイソフォームのＮ末端エピトープの最初の１０個のアミノ酸に対応するペプチド（シグナルペプチド、３４’ＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ’４３を除く）を用いて、モノクローナルネオエピトープ特異的抗体を産生した。Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＡｎｉｍａｌおよびＮｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅの動物倫理委員会が動物実験を承認した。モノクローナル抗体の産生を、６０μｇのキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合したペプチドを含む２００μＬの乳化したフロイント完全アジュバントを用いる６〜８週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウスの皮下免疫化によって開始した。連続免疫化を、安定な力価レベルに到達するまで、フロイント不完全アジュバントにおいて２週間間隔で行った。マウスに１００μＬの０．９％塩化ナトリウム溶液中の５０μｇの免疫原を追加で静脈内投与し、３日後、脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞（ＬＧＣ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ＡＢ，Ｂｏｒａｓ，Ｓｗｅｄｅｎ）と融合した。ハイブリドーマを、９６ウェルプレートにおいて成長させ、モノクローナル成長を、限界希釈によって確認した。クローンを、特異的エピトープ（ＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ、配列番号１）、伸長エピトープ（ＡＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ、配列番号３）、および切断エピトープ（ＰＥＲＩＳＥＥＶＧ、配列番号４）に対してスクリーニングした。ｍＡｂ産生クローン、ＮＢ６３２−１３Ｈ１１／Ｇ５を、上記ペプチドに対する反応性に基づいて選択し、抗体を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｈｉｌｌｅｒｏｅｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて精製した。
【００３４】
ＣＯＬ−１８Ｎ  ＥＬＩＳＡプロトコル
競合ＣＯＬ−１８Ｎ  ＥＬＩＳＡを次の通り行った。９６ウェルストレプトアビジン被覆プレート（Ｒｏｃｈｅ  ｃａｔ．：１１９４０２７９）を、１００μｌ／ウェルのコーティングバッファー（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３．７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣＬ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ、ｐＨ７．４）に溶解した１．２５ｎｇ／ｍＬのビオチン化合成ペプチドＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ−Ｋ−ビオチン（配列番号７）で被覆し、３０分間２０℃でインキュベートした。プレートを、洗浄バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）で５回洗浄した。インキュベーションバッファー（２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３．７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣＬ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、１％ＢＳＡ、５％Ｌｉｑｕｉｄ  ＩＩ  ｐＨ７．４）に希釈した２０μＬの標準ペプチド（ＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ、配列番号６）または試料を、適切なウェルに添加し、続いて１００μＬ／ウェルのモノクローナル抗体ＮＢ６３２−１３Ｈ１１／Ｇ５を添加し、１時間２０℃でインキュベートした。洗浄後、１００μｌのウサギ抗マウス抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ、３１５−０３５−０４５）を添加し、コーティングバッファーに１：３０００で溶解し、１時間２０℃、３００ｒｐｍでインキュベートした。最後の５回の洗浄後、ウェルを１００μＬのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  ｃａｔ．４３８ＯＨ）と暗所で１５分間２０℃、３００ｒｐｍでインキュベートし、続いて１００μＬ／ウェルの停止溶液（１％Ｈ２ＳＯ４）を添加した。比色反応を、６５０ｎｍを参照として４５０ｎｍで測定し、検量線を、４パラメトリック数理あてはめモデルを用いてプロットした。
【００３５】
ＣＯＬ−１８Ｎ技術的評価
技術的アッセイ検証を国際的ガイドラインに従って行った。検出下限（ＬＬＯＤ）を、２１個のゼロ試料（すなわち、アッセイバッファー）から決定される平均＋３×標準偏差（ＳＤ）として計算した。検出上限（ＵＬＯＤ）を、標準Ａ（１０００ｎｇ／ｍｌ）の１０個の測定値の平均−３×ＳＤとして決定した。定量下限（ＬＬＯＱ）を、３０％未満の不正確性で可能な最低濃度によって決定した。アッセイ内およびアッセイ間変動を、２通りの１０の独立したランによる７つのヒト試料の変動の平均として計算した。希釈回収を、２つのヒト血清および３つのヒトクエン酸血漿の２倍希釈物において決定し、未希釈物と比較した希釈マトリックスの回収パーセンテージとして計算した。添加回収を、測定範囲全体を網羅する濃度で標準ペプチドが添加されたヒト血清およびクエン酸血漿において、または濃度を２倍にするために同様の濃度の２つの試料を組み合わせることによって評価した。添加回収を、理論量の測定量回収パーセンテージとして計算した。ヘモグロビン、血清脂質、ビオチン、およびヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）によるマウス抗原に対するヒト抗体による干渉を、２倍希釈物を既知の濃度の血清試料に添加することによって決定した。濃度は、０．５００ｍｍｏｌ／ｌのヘモグロビン、０．５６ｍｍｏｌ／ｌの血清脂質、１６０μｇ／ｌのビオチン、および２０１０ｎｇ／ｍｌのＨＡＭＡで開始した。回収パーセンテージを、正常血清試料を参照値として計算した。分析物安定性を、４つの凍結−融解サイクルにわたる２つの健康なヒト血清試料および１つの健康なクエン酸血漿試料について決定し、第１の凍結−融解サイクルの回収パーセンテージとして計算した。同じ試料を、非ストレス分析物に対して４℃および２０℃で２時間、４時間、および２４時間で試験した。最後に、抗体特異性を、標準（ＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ、配列番号１）、伸長（ＡＥＰＥＲＩＳＥＥＶＧ、配列番号３）、切断（ＰＥＲＩＳＥＥＶＧ、配列番号４）、および選択解除ペプチド（ＥＰＱＩＤＥＫＫＫ（配列番号８）およびＣＰＥＲＡＬＥＲＲ（配列番号９））に対する反応性を試験するサニティーチェックによって評価した。
【００３６】
統計
血清ＣＯＬ１８−Ｎ濃度とＡＢＲとの間の相関は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）でＳｐｅａｒｍａｎ順位相関係数を用いて分析した。差は、ｐ＜０．０５である場合に統計的に有意とみなした。
【００３７】
結果および考察
ヒト血清および血漿（クエン酸、ＥＤＴＡ、ヘパリン）中のＣＯＬ−１８Ｎを検出するためにモノクローナル抗体を用いる新規競合ＥＬＩＳＡを開発および評価した。
【００３８】
主な所見は次の通りであった。
●血清ＣＯＬ−１８Ｎレベルは、ＨＦ患者においてＡＢＲと相関した。
●許容可能なアッセイ内−アッセイ間変動ならびに許容可能な希釈および添加回収を有するヒト血清およびヒト血漿中のＣＯＬ−１８Ｎを検出するための技術的に安定なアッセイ。
【００３９】
ＣＯＬ−１８Ｎ  ＥＬＩＳＡの特徴分析
内皮ＢＭ分解を評価することができる競合ＣＯＬ−１８Ｎ  ＥＬＩＳＡを開発した。ＥＬＩＳＡの技術的性能を表１にまとめ、４．８〜６７１ｎｇ／ｍｌの測定範囲、それぞれ７％および１３％のアッセイ内およびアッセイ間変動性、１００±２０％以内の希釈および添加回収、ならびにイムノアッセイ干渉なしの分析安定性を提供する。血清（１６．６ｎｇ／ｍｌ）、クエン酸血漿（１２．５ｎｇ／ｍｌ）、ＥＤＴＡ血漿（１３．２ｎｇ／ｍｌ）、およびヘパリン血漿（１５．８ｎｇ／ｍｌ）中のＣＯＬ−１８Ｎの正常濃度は、マトリックスにかかわらず一貫していた。
【００４０】
ＮＢ６３２−１３Ｈ１１／Ｇ５抗体は、Ｎ末端ＸＶＩＩＩ型コラーゲンα１鎖の最初の１０個のアミノ酸、短アイソフォーム（選択）を特異的に認識した（図２）。抗体は、関連ペプチドに対する反応性を示さないか、最小限の反応性を示し、高い特異性を示した（図２）。ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの中および長形態のＮ末端との交差反応性の可能性は、もっともらしくない。ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの３つのアイソフォームは、ＣＯＬ１８Ａ１遺伝子によって、２つの異なるプロモーターおよび選択的スプライシングの使用によってコードされる（１８、１９）（図１Ｂ）。結果として、短アイソフォームのＮ末端は、他の２つのアイソフォームのＮ末端とは全く異なってくる。
【００４１】
競合ＣＯＬ−１８Ｎ  ＥＬＩＳＡの技術的評価は、アッセイの高い正確性および精度を含むＸＶＩＩＩ型コラーゲンの血管形態のＮ末端に対する高い特異性を有する安定な感度のよいアッセイを明らかにした。
表１．ＣＯＬ−１８Ｎ  ＥＬＩＳＡの技術的性能
【表１】
2020514368.tif 000003
【００４２】
ＣＯＬ−１８Ｎは、ＨＦ患者において年間出血率と相関する。出血性障害血友病は、適切な治療の不在下で不可避の関節症を引き起こす反復性関節血症によって臨床的に明らかになる。血友病における医薬介入の１つの基本的な特徴は、ＡＢＲの低下であるが、高分解能を有する客観的な定量化可能なパラメータが欠如している。
【００４３】
血友病の出血重症度は、一般的には血漿中のＦＶＩＩＩ／ＩＸ活性の程度と反比例するが、出血傾向の実質的な変動性は周知である。低減した特発性出血およびより低い因子濃縮物の要件が、重症ＨＦ患者の１０〜１５％のサブセットで報告されている［２３、２４］。また、非重症ＨＦ患者における阻害剤の開発は、出血表現型をかなり高め得る［２５］。
【００４４】
出血表現型は、アッセイの標準化によって引き起こされるＦＶＩＩＩアッセイ間の大きな相違によってさらに損なわれ得［２６］、療法中に使用されるＦＶＩＩＩ濃縮物のタイプによっても影響され得る［２７、２８］。他のアッセイは、トロンビン生成と同様に、ＨＦ患者において出血表現型と相関する［２９］が、トロンビン生成の発生にかかわらずＦＶＩＩＩ阻害剤を有するＨＦ患者において一貫性がない［３０］。
【００４５】
血友病では、ｉ）内皮細胞損傷、ｉｉ）出血、ならびにｉｉｉ）血栓形成および創傷治癒の遅延の結果として、血友病の臨床症状および病態生理学的疾患表現の一因となる内皮リモデリングが影響を受け得る。本明細書に記載されるアッセイを使用して、血管内皮ＸＶＩＩＩ型コラーゲンは、ＨＦ患者においてＡＢＲと相関することがここで見出された（図３、ｒ＝０．４５、ｐ＜０．００６）。病理学的プロセスの客観的バイオマーカーは、ＡＢＲと関連する分解されたＸＶＩＩＩ型コラーゲンのものと同様に、治療をベンチマークし、患者を監視するのを補助し得、結果として患者の利益のための薬物開発を補助し得る。
【００４６】
結論
要約すると、組み合わされたデータは、技術的にロバストなＣＯＬ−１８Ｎバイオマーカーが、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンの短アイソフォームの分解に影響を及ぼす、血管ＢＭ分解およびリモデリングを含む病理に関連し得ることを示す。加えて、データは、ＣＯＬ−１８Ｎバイオマーカーが、関節症の発症を予防するために患者の最適な治療および監視のためにＡＢＲを評価することを可能にする。
【００４７】
本明細書において、特に明示的に指示されない限り、「または（論理和）」という語は、条件のうちの１つのみが満たされることを必要とする演算子「排他的論理和」とは対照的に、記述される条件の一方または両方が満たされる場合に真の値を返すという演算子の意味で使用される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を意味するものではなく、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で使用される。上記で認識される全ての先行する教示は、本明細書に参照により組み込まれる。いずれの先行公表文献の認識も、その教示が、これに関する日付でオーストラリアまたは他の場所において共有一般知識であったことを認めるか、または表すものであると解釈されるべきではない。
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２３  Ａｌｅｄｏｒｔ  ＬＭ，Ｈａｓｃｈｍｅｙｅｒ  ＲＨ，Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  Ｈ．Ａ  ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒｅ  ｆａｃｔｏｒ−ＶＩＩＩ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａｃｓ．Ｔｈｅ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｏｕｔｃｏｍｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ｊ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １９９４；２３６：３９１−９．
２４  Ａｚｎａｒ  ＪＡ，Ｍａｇａｌｌｏｎ  Ｍ，Ｑｕｅｒｏｌ  Ｆ，Ｇｏｒｉｎａ  Ｅ，Ｔｕｓｅｌｌ  ＪＭ．Ｔｈｅ  ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  ｓｔａｔｕｓ  ｏｆ  ｓｅｖｅｒｅ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａｃｓ  ｉｎ  Ｓｐａｉｎ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ２０００；６：１７０−６．
２５  ｖａｎ  Ｖｅｌｚｅｎ  ＡＳ，Ｅｃｋｈａｒｄｔ  ＣＬ，Ｓｔｒｅｅｆｋｅｒｋ  Ｎ，Ｐｅｔｅｒｓ  Ｍ，Ｈａｒｔ  ＤＰ，Ｈａｍｕｌｙａｋ  Ｋ，Ｋｌａｍｒｏｔｈ  Ｒ，Ｍｅｉｊｅｒ  Ｋ，Ｎｉｊｚｉｅｌ  Ｍ，Ｓｃｈｉｎｃｏ  Ｐ，Ｙｅｅ  ＴＴ，ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｏｍ  ＪＧ，Ｆｉｊｎｖａｎｄｒａａｔ  Ｋ．Ｔｈｅ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｅｐｉｓｏｄｅｓ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｅｖｅｒｅ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２０１５；１１５：５４３−５０．
２６  Ｂａｒｒｏｗｃｌｉｆｆｅ  ＴＷ，Ｒａｕｔ  Ｓ，Ｓａｎｄｓ  Ｄ，Ｈｕｂｂａｒｄ  ＡＲ．Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ａｓｓａｙｓ  ｏｆ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ：Ｇｅｎｅｒａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ，Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ  ２００２；２８：２４７−５６．
２７  Ｍｉｋａｅｌｓｓｏｎ  Ｍ．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  １９９８；４．
２８  Ｍｉｋａｅｌｓｓｏｎ  Ｍ，Ｏｓｗａｌｄｓｓｏｎ  Ｕ．Ａｓｓａｙｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  Ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ  Ａ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ  ２００２；２８：２５７−６４．
２９  Ｂｒｕｍｍｅｌ−Ｚｉｅｄｉｎｓ  ＫＥ，Ｂｒａｎｄａ  ＲＦ，Ｂｕｔｅｎａｓ  Ｓ，Ｍａｎｎ  ＫＧ．Ｄｉｓｃｏｒｄａｎｔ  ｆｉｂｒｉｎ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２００９；７：８２５−３２．
３０  Ｒａｇｎｉ  Ｍ  Ｖ．，ＤｉＭｉｃｈｅｌｅ  ＤＭ，Ｈａｙ  ＣＭ，Ｍａｌｅｃ  ＬＭ，Ｓｅａｍａｎ  ＣＤ，Ｌｉ  Ｊ，Ｙａｂｅｓ  ＪＧ，Ｂｕｔｅｎａｓ  Ｓ，Ｂｒｕｍｍｅｌ−Ｚｉｅｄｉｎｓ  Ｋ．Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｂｌｅｅｄｉｎｇ  ｉｎ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ  ２０１６；２２：２４０−７．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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