(57)【要約】  本明細書中に開示される主題は、腫瘍溶解性ウイルスにより誘導される腫瘍浸潤型T細胞（「OV誘導型T細胞」）、該OV誘導型T細胞の作製方法および養子T細胞療法のための該OV誘導型T細胞の使用方法に関する。本明細書中に開示される主題はさらに、腫瘍溶解性ウイルス、武装化型腫瘍溶解性ウイルス、該腫瘍溶解性ウイルスの作製方法および使用方法、ならびに該腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物およびキットに関する。【選択図】図１Ａ
2020514324.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下のステップ：
(a) 癌への1種以上のT細胞の浸潤を誘導するために、有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップ；
(b) 被験体の癌から腫瘍浸潤型T細胞を単離するステップ；
(c) 腫瘍浸潤型T細胞をex vivoで増殖させるステップ；および
(d) 癌に罹患している被験体に、増殖された腫瘍浸潤型T細胞を移植するステップ
を含む、癌に罹患している被験体を治療する方法。
【請求項２】
腫瘍溶解性ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
腫瘍溶解性ウイルスが単純ヘルペスウイルスである、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍溶解性ウイルスが、そのチミジンキナーゼ遺伝子、ワクシニア増殖因子遺伝子、またはその両方の不活性化突然変異を有する組み換えワクシニアウイルスである、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
腫瘍溶解性ウイルスが、免疫調節因子分子をコードする核酸を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍溶解性ウイルスが、免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質をコードする核酸を含む、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
癌が局所浸潤性である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
癌が転移性である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
腫瘍浸潤型T細胞をex vivoで増殖させるステップが、該腫瘍浸潤型T細胞を樹状細胞および癌細胞と共培養するステップを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
腫瘍浸潤型T細胞を増殖させるステップが、該腫瘍浸潤型T細胞をサイトカインおよび/または薬剤と共に培養するステップを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
サイトカインおよび/または薬剤が、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、IFN-α、IFN-α2、IFN-β、またはIFN-γ、TNF-α、TNF-β、およびGM-CSFのうちの1種以上を含む、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
腫瘍浸潤型T細胞を増殖させるステップが、該腫瘍浸潤型T細胞をIL-2、IL-7および/またはGSK3bと共に培養するステップを含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
癌に罹患している被験体に腫瘍浸潤型T細胞を移植するステップの前に、癌に罹患している被験体が、癌療法を用いて治療される、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
癌に罹患している被験体を、癌療法を用いて治療するステップをさらに含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
癌に罹患している被験体に、1種以上の外因性サイトカインおよび/または薬剤を提供するステップをさらに含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
腫瘍浸潤型T細胞を移植するステップの後に、癌に罹患している被験体に、外因性IL-2を提供するステップをさらに含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
腫瘍浸潤型細胞が、腹腔内に移植される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１８】
腫瘍浸潤型細胞が、腫瘍内に移植される、請求項1〜16のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
以下のステップ：
(a) 癌への1種以上のT細胞の浸潤を誘導するために、有効量の腫瘍溶解性ウイルスを、癌に罹患している被験体に投与するステップ；
(b) 被験体の癌から腫瘍浸潤型T細胞を単離するステップ；および
(c) 腫瘍浸潤型T細胞をex vivoで増殖させるステップ
を含む、腫瘍浸潤型腫瘍溶解性ウイルス誘導型T細胞を作製するための方法。
【請求項２０】
腫瘍溶解性ウイルスがワクシニアウイルスである、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
腫瘍溶解性ウイルスが単純ヘルペスウイルスである、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
腫瘍溶解性ウイルスが、そのチミジンキナーゼ遺伝子、ワクシニア増殖因子遺伝子、またはその両方の不活性化突然変異を有する組み換えワクシニアウイルスである、請求項19に記載の方法。
【請求項２３】
腫瘍溶解性ウイルスが、免疫調節因子分子をコードする核酸を含む、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２４】
腫瘍溶解性ウイルスが、免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質をコードする核酸を含む、請求項19〜22のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２５】
IL-2、IL-7および/またはGSK3bの存在下で腫瘍浸潤型T細胞をex vivoで増殖させる、請求項19〜24のいずれか1項に記載の方法。
【請求項２６】
請求項19〜25のいずれか1項に記載の方法により作製される1種以上の腫瘍浸潤型腫瘍溶解性ウイルス誘導型T細胞を被験体に投与するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法。
【請求項２７】
アンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質をコードする、腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２８】
アンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質をコードする核酸をそのゲノム中に含む、腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項２９】
免疫調節因子分子がリンカーペプチドを介してアンカー性ペプチドに連結される、請求項27または28に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３０】
ワクシニアウイルスである、請求項27〜29のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３１】
そのチミジンキナーゼ遺伝子、ワクシニア増殖因子遺伝子、またはその両方の不活性化突然変異を有する組み換えワクシニアウイルスである、請求項27〜29のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３２】
アンカー性ペプチドに連結された免疫調節分子をコードする核酸が、p7.5 e/lプロモーターに機能的に連結される、請求項27〜31のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３３】
アンカー性ペプチドに連結された免疫調節分子をコードする核酸が、pSe/lプロモーターに機能的に連結される、請求項27〜31のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３４】
単純ヘルペスウイルスである、請求項27〜29のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３５】
アデノウイルスである、請求項27〜29のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３６】
アンカー性ペプチドがGPI-アンカーアクセプターペプチドを含む、請求項27〜35のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３７】
アンカー性ペプチドがPD-L1膜貫通ドメインを含む、請求項27〜35のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３８】
アンカー性ペプチドがリンカーを介して免疫調節因子分子に結合している、請求項27〜35のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項３９】
リンカーが柔軟性リンカーである、請求項38に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４０】
リンカーが剛性リンカーである、請求項38に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４１】
免疫調節因子分子がインターロイキン-2である、請求項27〜40のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４２】
免疫調節因子分子がインターフェロン-γである、請求項27〜40のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４３】
免疫調節因子分子が腫瘍壊死因子-αである、請求項27〜40のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項４４】
請求項27〜43のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルスを、生理的バッファーと共に含む、治療用組成物。
【請求項４５】
凍結乾燥形態である、請求項44に記載の治療用組成物。
【請求項４６】
有効量の請求項44に記載の治療用組成物を含むシリンジ。
【請求項４７】
免疫調節因子分子をコードする有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法。
【請求項４８】
免疫調節因子分子がインターロイキン-2である、請求項47に記載の方法。
【請求項４９】
請求項27〜43のいずれか1項に記載の有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法。
【請求項５０】
腫瘍溶解性ウイルスが治療用組成物として投与される、請求項47、48または49に記載の方法。
【請求項５１】
腫瘍溶解性ウイルスが請求項44または45に記載の治療用組成物として投与される、請求項47、48または49に記載の方法。
【請求項５２】
腫瘍溶解性ウイルスが請求項46に記載のシリンジを用いて投与される、請求項47、48または49に記載の方法。
【請求項５３】
癌が局所浸潤性である、請求項47〜52のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５４】
癌が転移性である、請求項47〜52のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５５】
腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍内投与される、請求項47〜54のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５６】
治療有効量の免疫調節剤の投与をさらに含む、請求項47〜54のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５７】
免疫調節剤が抗PD-1または抗PD-L1抗体である、請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
追加療法をさらに含む、請求項47〜57のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５９】
癌を有する被験体を治療するための、請求項27〜43のいずれか1項に記載の腫瘍溶解性ウイルスの使用。
【請求項６０】
腫瘍浸潤型腫瘍溶解性ウイルス誘導型T細胞を生成させるための、腫瘍溶解性ウイルスの使用。
【請求項６１】
癌を有する被験体を治療するための、腫瘍浸潤型腫瘍溶解性ウイルス誘導型T細胞の使用。
【請求項６２】
腫瘍浸潤型腫瘍溶解性ウイルス誘導型T細胞が、以下のステップ：
(a) 癌への1種以上のT細胞の浸潤を誘導するために、有効量の腫瘍溶解性ウイルスを、癌を有する被験体に投与するステップ；
(b) 被験体の癌から腫瘍浸潤型T細胞を単離するステップ；および
(c) 腫瘍浸潤型T細胞をex vivoで増殖させるステップ
を含む方法により作製される、請求項60または61に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本特許出願は、2017年2月3日出願の米国特許仮出願第62/454,526号に基づく優先権を主張し、該出願はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
助成金情報
適用なし。
【０００２】
1. 導入
本明細書中に開示される主題は、腫瘍溶解性ウイルス（oncolytic virus）、発現可能な形態で免疫調節因子分子をコードする武装化型（armed）腫瘍溶解性ウイルス、およびその組成物、ならびに該腫瘍溶解性ウイルスの作製方法および使用方法に関する。本明細書中に開示される主題はまた、腫瘍溶解性ウイルスにより誘導された腫瘍浸潤型T細胞（「OV誘導型T細胞」）、ならびに該OV誘導型T細胞の作製方法および養子T細胞療法のための該OV誘導型T細胞の使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
2. 発明の背景
癌細胞中で選択的に複製されて癌細胞を死滅させる腫瘍溶解性ウイルスは、多数の様式を通してその抗癌作用を発揮する（Bartlett DL et al., 2013, Molecular Cancer 12:103-120）。第1は、それらの名前が暗示する通り、細胞溶解であり、これはアポトーシス、ネクローシス、ピロプトーシス（pyroptosis）、自食作用、またはこれらの組み合わせを通して達成できる（Guo ZS et al., 2014, Front Oncol 4:74）。さらに、腫瘍溶解性ウイルスは、癌の血液供給を攻撃することができ、それにより、感染細胞ならびに非感染細胞のアポトーシスおよびネクローシスを生じさせる。最後に、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞の免疫原性細胞死（ICD）を誘導し、危険信号分子（シグナル0）、同時に炎症性サイトカインを放出および提示し、腫瘍関連抗原（TAA）をナイーブT細胞に交差提示し、それにより、抗腫瘍免疫が生起される（Guo ZS et al., 2014, Front Oncol 4:74）。強力な腫瘍溶解性ウイルスは、強力かつ全身性の適応性抗腫瘍免疫を生起するのみならず、腫瘍特異的CD8+ T細胞の腫瘍組織中への輸送も促進する（Bartlett DL et al., 2013, Mol Cancer 12:103；Guo ZS et al., 2017, 8:555）。
【０００４】
癌に対するこの免疫応答は、感染した癌細胞に限られず、転移病巣にも拡大する。2015年の進行型黒色腫を治療するためのこのクラスで最初の薬物であるT-VECのFDAによる承認は、このタイプの新規な癌治療の潜在能力を紹介した（Andtbacka RH et al., 2015, J Clin Oncol 33:2780-8）。それらの利点にもかかわらず、腫瘍溶解性ウイルスは、今日まで、適切なウイルス数での腫瘍小結節内部の癌細胞へのアクセスの獲得、抗ウイルス免疫応答、および高度に免疫抑制性である腫瘍環境をはじめとする困難に直面している（Zou W., 2005, Nat Rev Cancer 5:263-74）。加えて、腫瘍特異的T細胞の浸潤は、それらが実際に生成および活性化される場合には、障害に直面し、その主要なものは、それらが癌細胞および随伴する間質細胞に対する細胞傷害性を発揮する腫瘍組織へと浸潤することである。
【０００５】
これらの困難は、免疫系を調節する薬剤、例えば、抗癌免疫を増大させ、かつ/または抗ウイルス免疫を低減させる薬剤により、望ましくは改善されるであろう。しかしながら、そのような免疫調節が可能な薬剤（サイトカインなど）は、全身性に拡散した場合に、治療される被験体に対して、広範な、潜在的に危険な作用を有し得る。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Bartlett DL et al., 2013, Molecular Cancer 12:103-120
【非特許文献２】Guo ZS et al., 2014, Front Oncol 4:74
【非特許文献３】Guo ZS et al., 2017, Front Immunol. 8:555
【非特許文献４】Andtbacka RH et al., 2015, J Clin Oncol 33:2780-8
【非特許文献５】Zou W., 2005, Nat Rev Cancer 5:263-74
【発明の概要】
【０００７】
3. 発明のまとめ
本明細書中に開示される主題は、腫瘍溶解性ウイルス療法に関する、抗癌免疫を促進するための組成物および方法に関する。特定の実施形態では、養子T細胞療法が、癌細胞に対する免疫応答を促進するために腫瘍溶解性ウイルスを用いる抗癌レジメンの一部分として用いられ、腫瘍溶解性ウイルスは、任意により、免疫調節因子と共に投与される。特定の実施形態では、免疫調節因子は、腫瘍溶解性ウイルスに連結されている。
【０００８】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、以下のステップを含む、腫瘍浸潤型腫瘍溶解性ウイルス誘導型T細胞を生成させるための方法を提供する：
(a) 癌への1種以上のT細胞の浸潤を誘導するために、有効量の腫瘍溶解性ウイルスを、癌を有する被験体に投与するステップ；
(b) 被験体の癌から腫瘍浸潤型T細胞を単離するステップ；および
(c) ex vivoで腫瘍浸潤型T細胞を増殖させるステップ。
【０００９】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、本明細書中に開示される1種以上の腫瘍浸潤型腫瘍溶解性ウイルス誘導型T細胞を被験体に投与するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法を提供する。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、以下のステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法を提供する：
(a) 癌への1種以上のT細胞の浸潤を誘導するために、有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップ；
(b) 被験体の癌から腫瘍浸潤型T細胞を単離するステップ；
(c) ex vivoで腫瘍浸潤型T細胞を増殖させるステップ；および
(d) 癌に罹患している被験体に、増殖させた腫瘍浸潤型T細胞を移植するステップ。
【００１０】
特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスである。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、そのチミジンキナーゼ遺伝子、ワクシニア増殖因子遺伝子、またはその両方の不活性化突然変異を有する組み換えワクシニアウイルスである。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは単純ヘルペスウイルスである。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスはアデノウイルスである。
【００１１】
特定の実施形態では、腫瘍浸潤型T細胞は、IL-2およびIL-7の存在下で、ex vivoで増殖させる。特定の実施形態では、腫瘍浸潤型T細胞を増殖させるステップは、腫瘍浸潤型T細胞と、樹状細胞および癌細胞とを共培養するステップを含む。特定の実施形態では、腫瘍浸潤型T細胞を増殖させるステップは、腫瘍浸潤型T細胞を、サイトカインおよび/または薬剤と共に培養するステップを含む。特定の実施形態では、サイトカインおよび/または薬剤は、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、IFN-α、IFN-α2、IFN-β、またはIFN-γ、TNF-α、TNF-β、およびGM-CSFのうちの1種以上を含む。特定の実施形態では、腫瘍浸潤型T細胞を増殖させるステップは、腫瘍浸潤型T細胞を、IL-2、IL-7、および/またはGSK3bと共に培養するステップを含む。
【００１２】
特定の実施形態では、癌に罹患している被験体は、癌に罹患している被験体へと腫瘍浸潤型T細胞を移植する前に、癌治療を用いて治療される。特定の実施形態では、癌に罹患している被験体は、癌治療を用いてさらに治療される。特定の実施形態では、癌に罹患している被験体は、1種以上の外因性サイトカインおよび/または薬剤を用いてさらに治療される。特定の実施形態では、癌に罹患している被験体は、腫瘍浸潤型T細胞を移植するステップの後に、外因性IL-2をさらに与えられる。
【００１３】
特定の実施形態では、腫瘍浸潤型細胞は、腹腔内または腫瘍内に移植される。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、癌を有する被験体を治療するための腫瘍溶解性ウイルスの使用を目的とする。
【００１４】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、腫瘍浸潤型腫瘍溶解性ウイルス誘導型T細胞を生成させるための腫瘍溶解性ウイルスの使用を目的とする。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、癌を有する被験体を治療するための腫瘍浸潤型腫瘍溶解性ウイルス誘導型T細胞の使用を目的とする。
特定の実施形態では、腫瘍浸潤型腫瘍溶解性ウイルス誘導型T細胞は、以下のステップを含む方法により生成される：
(a) 癌への1種以上のT細胞の浸潤を誘導するために、有効量の腫瘍溶解性ウイルスを、癌を有する被験体に投与するステップ；
(b) 被験体の癌から腫瘍浸潤型T細胞を単離するステップ；および
(c) ex vivoで腫瘍浸潤型T細胞を増殖させるステップ。
【００１５】
種々の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、腫瘍溶解性ウイルス、誘導される腫瘍浸潤型T細胞、該ウイルスおよびT細胞を含む治療用組成物、ならびに種々の癌に罹患している患者をはじめとする、免疫調節により利益を得るであろう状態にある被験体を治療する方法を提供する。
【００１６】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、アンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質をコードする腫瘍溶解性ウイルスを提供する。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、アンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質をコードする核酸をそのゲノム中に含む、腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
【００１７】
特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスである。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、そのチミジンキナーゼ遺伝子、ワクシニア増殖因子遺伝子、またはその両方の不活性化突然変異を有する組み換えワクシニアウイルスである。特定の実施形態では、アンカー性ペプチドに連結された免疫調節分子をコードする核酸は、p7.5 e/lプロモーターに機能的に連結されている。
【００１８】
特定の実施形態では、アンカー性ペプチドは、GPI-アンカーアクセプターペプチドまたはPD-L1膜貫通ドメインを含む。特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、リンカーペプチドを介してアンカー性ペプチドに連結される。特定の実施形態では、リンカーは、柔軟性（flexible）リンカーまたは剛性（rigid）リンカーである。特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、インターロイキン-2および/またはインターフェロン-γおよび/または腫瘍壊死因子-αである。
【００１９】
特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、治療用組成物として投与される。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、腫瘍溶解性ウイルスを生理学的バッファーと共に含む治療用組成物を提供する。特定の実施形態では、治療用組成物は、凍結乾燥形態である。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、有効量の治療用組成物を含むシリンジを提供する。
【００２０】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、免疫調節因子分子をコードする有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、インターロイキン-2である。特定の実施形態では、癌は局所浸潤性である。特定の実施形態では、癌は転移性である。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍内に投与される。特定の実施形態では、治療上有効量の免疫調節剤が、癌に罹患している被験体にさらに投与される。特定の実施形態では、免疫調節剤は、抗PD-1または抗PD-L1抗体である。特定の実施形態では、追加の療法が、癌に罹患している被験体に提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ウイルス送達されたIL-2により生起される抗腫瘍免疫を示す図である。マウス腫瘍モデルでのvvDD-mIL-2の抗腫瘍作用：同系マウスでの様々なタイプの癌に対する、分泌可能IL-2を用いて武装化された腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの抗腫瘍作用。(A) 実験スキーム。(B〜D) (B) MC38-luc結腸癌細胞；(C) ID8-luc卵巣癌細胞；または(D) AB12-luc中皮腫細胞を用いた接種から5日後に、リン酸緩衝生理食塩液（PBS；点線）、非武装化型vvDDウイルス（黒色線）またはmIL-2「武装化型」vvDD-mIL-2（灰色線）のいずれかを用いて処置された免疫能のある（immunocompetent）マウスの生存率（％）。具体的には、B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞（C57BL/6（B6）マウスでのMC38結腸直腸癌モデル）(B)もしくは3.5×106個のID8-luc（B6マウスでのID8卵巣癌モデル）(C)を腹腔内接種するか、またはBALB/cマウスに、4×105個のAB12-luc（BALB/cマウスでのAB12中皮腫モデル）(D)を腹腔内接種し、腫瘍接種から5日後、PBS、vvDDおよびvvDD-IL-2を用いて処置した。腫瘍担持マウスの生存率は、カプラン・マイヤー分析により示した。すべての図において、P値についての標準的な記号は、* P＜0.05；** P＜0.01；*** P＜0.001；および**** P＜0.0001である。
【図２】後期マウス腫瘍モデルでのvvDD-mIL-2の毒性を示す図である：vvDD-mIL-2は、B6マウスでのより進行したMC38結腸癌モデルを処置する場合に、強い毒性作用を生じる。(A) 実験スキーム。(B) MC38-luc結腸癌細胞を用いる接種の9日後にリン酸緩衝生理食塩液（PBS；点線）、非武装化型vvDDウイルス（黒色線）またはmIL-2「武装化型」vvDD-mIL-2（灰色線）のいずれかを用いて処置されたマウスの生存率（％）。MC38腫瘍モデルは、通常は5日目に処置される。しかしながら、9日目に処置する場合、分泌型IL-2の発現が、腫瘍担持マウスで致死的作用をもたらした。
【図３】強力な適応性抗腫瘍免疫の生起のための免疫刺激分子を用いて武装化された腫瘍溶解性ウイルスの例を示す図である。例としては、限定するものではないが、vvDD-mIL-2-GPIおよびvvDD-IL-23が挙げられる。(A) vvDD-mIL-2-GPIと表記されるウイルス中での、(G4S)3リンカーおよびGPIアンカーコード配列に融合させた、マウスIL-2コード核酸に機能的に連結されたp7.5e/lウイルスプロモーターの、vvDDチミジンキナーゼ（tk）遺伝子への挿入の図。この構築物はまた、検出可能マーカーとしてpSe/lプロモーターに機能的に連結された黄色蛍光タンパク質（「yfp」）をコードする核酸も含む。(B) vvDD-mIL-23p19-IRESと表記されるウイルス中での、IRESリンカーおよびマウスIL-23p40アンカーコード配列に融合させたマウスIL-23p19コード核酸に機能的に連結されたp7.5e/lウイルスプロモーターの、vvDDチミジンキナーゼ（tk）遺伝子への挿入の図。この構築物はまた、検出可能マーカーとしてpSe/lプロモーターに機能的に連結された黄色蛍光タンパク質（「yfp」）をコードする核酸も含む。
【図４】フローサイトメトリーデータを示す図である。(A) vvDウイルス（最左パネル）、vvDD-mIL-2ウイルス（中央パネル）またはvvDD-mIL-2-GPIウイルス（最右パネル）のいずれかを感染させたB16黒色腫細胞。(B) vvDウイルス（最左パネル）、vvDD-mIL-2ウイルス（中央パネル）またはvvDD-mIL-2-GPI（最右パネル）のいずれかを感染させたMC38結腸癌細胞。
【図５】(A) vvDD-mIL-2またはvvDD-mIL-2-GPIを感染させたB16細胞での；(B) vvDD-mIL-2またはvvDD-mIL-2-GPIを感染させたMC38-luc細胞での、細胞膜上のIL-2の発現強度を示す図である。
【図６】IL-12を発現する腫瘍溶解性ウイルスが、早期結腸癌モデル（5日目）で顕著な治療効果を示すことを表わす図である。(A) 実験スキーム。(B) MC38-luc結腸癌細胞の接種から5日後にリン酸緩衝生理食塩液（PBS；点線）、vvDDウイルス（黒色線）、vvDD-mIL-2（100％で留まる黒色細線）またはIL-2「アンカー型」vvDD-mIL-2-GPI（灰色線）のいずれかを用いて処置されたマウスの生存率（％）（図面の上部に実験スキームを示す）。
【図７】(A) 実験スキームを示す図である。(B) MC38-luc結腸癌細胞の接種から9日後の、vvDD-mIL-2（左側バー）またはvvDD-mIL-2-GPI（右側バー）のいずれかを用いて処置されたMC38-luc腫瘍担持マウスの処置死亡率を示す図である。
【図８Ａ】腫瘍溶解性ウイルスにより誘導された腫瘍浸潤型T細胞（「OV誘導型T細胞」）（vvDD-IL-2処置されたMC38腫瘍担持マウスから単離され、ex vivoで増殖された）の養子移入が、腹腔内MC38腫瘍を担持する同系C57BL/6マウスでの著明な治療効果をもたらしたことを示す図である。(A) 実験設定の時間軸。
【図８Ｂ】腫瘍溶解性ウイルスにより誘導された腫瘍浸潤型T細胞（「OV誘導型T細胞」）（vvDD-IL-2処置されたMC38腫瘍担持マウスから単離され、ex vivoで増殖された）の養子移入が、腹腔内MC38腫瘍を担持する同系C57BL/6マウスでの著明な治療効果をもたらしたことを示す図である。(B) カプラン・マイヤー分析により、腫瘍担持マウスの生存率をモニタリングした。
【図８Ｃ】腫瘍溶解性ウイルスにより誘導された腫瘍浸潤型T細胞（「OV誘導型T細胞」）（vvDD-IL-2処置されたMC38腫瘍担持マウスから単離され、ex vivoで増殖された）の養子移入が、腹腔内MC38腫瘍を担持する同系C57BL/6マウスでの著明な治療効果をもたらしたことを示す図である。(C) 処置から21日後のMC38-luc腫瘍を有するマウスの生体イメージングである。
【図８Ｄ】腫瘍溶解性ウイルスにより誘導された腫瘍浸潤型T細胞（「OV誘導型T細胞」）（vvDD-IL-2処置されたMC38腫瘍担持マウスから単離され、ex vivoで増殖された）の養子移入が、腹腔内MC38腫瘍を担持する同系C57BL/6マウスでの著明な治療効果をもたらしたことを示す図である。(D) 処置から28日後のMC38-luc腫瘍を有するマウスの生体イメージングである。
【図９】ウイルスIL-2バリアントの模式図である。vvDD-IL-2、vvDD-IL-2-FG、vvDD-IL-2-RGおよびvvDD-IL-2-FPTMを、ワクシニアウイルスゲノムのtk遺伝子座へのマウスIL-2バリアントの相同組換えにより作製し、バリアントは、それぞれ、分泌型IL-2、IL-2-柔軟性リンカー(G4S)3-ヒトCD16bから増幅されたGPIアンカー配列、IL-2-剛性リンカーA(EA3K)4AAA-ヒトCD16bから増幅されたGPIアンカー配列、IL-2-柔軟性リンカー(G4S)3-マウスPD-L1膜貫通ドメインを含む。
【図１０】in vitroでのウイルス複製および細胞傷害性を示す図である。腫瘍細胞MC38-luc、B16およびAB12-lucを、モック感染させるか、または示したウイルスを用いて感染させた。感染後48時間での感染癌細胞からのウイルス子孫の産生を、プラークアッセイにより測定し(A)、またはウイルス感染細胞の生存をMTSアッセイにより測定した(B)。
【図１１】ウイルス送達されたIL-2の発現および抗腫瘍作用を示す図である。(A) 腫瘍細胞MC38-luc（3×105細胞）、B16（2×105細胞）またはAB12-luc（3×105細胞）に、モック感染させるか、またはvvDD、vvDD-IL-2、vvDD-IL-2-FG、vvDD-IL-2-RGおよびvvDD-IL-2-FPTMを、MOI＝1で感染させた。培養上清を、ELISAによる分泌型IL-2またはフローサイトメトリーによる膜結合型IL-2を感染後24時間で測定するために回収した。(B) B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、腫瘍接種5日後にPBS、vvDD、vvDD-IL-2、vvDD-IL-2-FG、vvDD-IL-2-RGおよびvvDD-IL-2-FPTMを2×108 PFU/マウスで処置した。(C) B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、腫瘍接種9日後にPBS、vvDD、vvDD-IL-2、vvDD-IL-2-FGおよびvvDD-IL-2-RGを2×108PFU/マウスで処置した。腫瘍担持マウスの生存率を、カプラン・マイヤー分析により示した。P値に関する標準的な記号は、* P＜0.05；** P＜0.01；*** P＜0.001；および**** P＜0.0001である。
【図１２】腫瘍細胞でのウイルス送達されたIL-2発現を示す図である。腫瘍細胞MC38-luc、B16、またはAB12-lucをモック感染させるか、またはvvDD、vvDD-IL-2、vvDD-IL-2-FG、vvDD-IL-2-RGおよびvvDD-IL-2-FPTMをMOI＝1で用いて感染させた。感染細胞を、RNA精製のために感染24時間後に回収した。精製された総RNAを、A34R mRNA（ウイルス遺伝子）(A)またはIL-2 (B)の定量的検出のためのRT-qPCRに供した。
【図１３】ウイルスIL-2バリアントにより生起された全身性抗腫瘍免疫を示す図である。示されたワクシニアウイルスを用いて処理され、60日間を超えて生存したMC38-luc腫瘍担持B6マウスに、マウス1匹当たり5×105個のMC38-luc細胞を用いて皮下的に再接種した。ナイーブB6マウスには、対照として、同じ用量の腫瘍接種を投与した。原発腫瘍の増殖曲線を示した。
【図１４】9日間腫瘍担持マウスでの、より免疫抑制性の微小環境を示す図である。B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、腫瘍接種から5日後または9日後に腫瘍組織を回収した。原発腫瘍を撮像し(A)、重量を計測し(B)、溶解させて単一細胞を作製し、腫瘍微小環境中のCD4+Foxp3+ (C)、G-MDSC（CD11b+Ly6G+Ly6Clo）(D)、CD4+PD-1+ (E)、CD8+PD-1+ (C)、CD3-NK1.1+ (G)、およびPD-L1+ (H)細胞の存在を決定するために染色した。
【図１５】9日間腫瘍担持マウスでの、免疫抑制因子の発現上昇および浮腫を示す図である。B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、腫瘍接種から5日後または9日後にマウス組織を回収した。(A) 原発腫瘍を、RT-qPCRのためのRNA抽出に適用し、免疫抑制因子の発現を測定した。肝臓および腎臓を回収し、重量を計測し、乾燥させて、肝臓浮腫(B)および肺浮腫(C)を決定するために含水量を測定した。
【図１６】ウイルス送達されたIL-2の毒性プロフィールを示す図である。B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、腫瘍接種から9日後にPBS、vvDD、vvDD-IL-2、vvDD-IL-2-FGおよびvvDD-IL-2-RGを2×108PFU/マウスで用いて処置した。PBS処置マウスよりも早く、一般的にはウイルス処置から7日以内に死亡したマウスは、IL-2誘導型死亡としてカウントした。処置関連死亡率は(A)に示した。処置マウスは、血清中のIL-2 (B)およびTNF-α(C)を測定する目的で採血するために、ならびに肺浮腫(D)および肝臓浮腫(E)をモニタリングするために、処置から4〜5日後に屠殺した。P値に関する標準的な記号は、* P＜0.05；** P＜0.01；*** P＜0.001；および**** P＜0.0001である。
【図１７】早期腫瘍モデルでのワクシニアウイルス送達IL-2の毒性プロフィールを示す図である。B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、腫瘍接種から5日後にvvDD、vvDD-IL-2、vvDD-IL-2-FG、vvDD-IL-2-RG、またはPBSを用いて処置した。肺(A)、肝臓(B)および腎臓(C)での浮腫を決定する目的で含水量を測定するために組織を回収するか、または血清中のIL-2 (D)を測定する目的で血液を回収するために、処置から8日後に処置マウスを屠殺した。
【図１８−１】ウイルス処置後の腫瘍微小環境での免疫状態変化を示す図である。B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、腫瘍接種から9日後にPBS、vvDD、vvDD-IL-2-FGおよびvvDD-IL-2-RGを2×108PFU/マウスで用いて処置した。腫瘍担持マウスを処置から5日後に屠殺し、原発腫瘍を回収し、フローサイトメトリーによりCD4+Foxp3-およびCD8+IFN-γ+ T細胞(A、B)、メモリー表現型T細胞（CD8+CD44hi）(C)、調節性T細胞（CD4+Foxp3+）(D)、CD8/Treg (E)を測定するために、またはRT-qPCRにより、IFN-γ、グランザイムB、パーフォリン、TGF-β、CD105、VEGFおよびIL-10（F〜I）を測定するために分析した。別個の実験では、B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、腫瘍接種から9日後に、vvDD-IL-2-RGまたはPBSを用いて処置した。α-CD8 Ab（250μg/注入）、α-NK1.1 Ab（300μg/注入）、α-CD4 Ab（150μg/注入）、またはα-IFN-γ Ab（200μg/注入）をマウスに腹腔内注入し、予定通りに、CD8+ T細胞、NK1.1+細胞、CD4+ T細胞を枯渇させるか、または循環IFN-γを中和し(M)、全生存をカプラン・マイヤー分析により示した(N)。
【図１８−２】図１８−１の続き。
【図１８−３】図１８−２の続き。
【図１９】9日間腫瘍担持マウスでの、メモリー表現型CD8+ T細胞およびNK細胞を示す図である。B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、図18に記載される通りに処置した。原発腫瘍および脾臓を、ウイルス処置から5日後に回収し、単一細胞の作製に適用し、脾臓でのCD8+CD44hi細胞(A)、腫瘍中(B)および脾臓(C)でのCD3-NK1.1+細胞、腫瘍中でのCD8+ T細胞(D)を決定するために染色した。
【図２０】9日間腫瘍担持マウスでのウイルス処置後のNKP46発現の上昇を示す図である。B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、図18に記載される通りに処置した。原発腫瘍を回収し、NKP46の発現を測定する目的でRT-qPCRのためのRNAの抽出に適用した。
【図２１】PD-L1遮断と組み合わせたvvDDの抗腫瘍効力を示す図である。B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、予定された通りに処置し(A)、カプラン・マイヤー分析により全生存を示した(B)。
【図２２−１】ウイルス処置は免疫チェックポイント療法と組み合わせ易いことを示す図である。B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を接種し、図18に記載される通りに処置した。腫瘍担持マウスを処置から5日後に屠殺し、原発腫瘍を回収し、PD-1、PD-L1、およびCTLA-4の発現を決定するためにRT-qPCRにより分析した(A〜C)。別個の実験では、B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、腫瘍接種から9日後にvvDD-IL-2-RGまたはPBSを用いて処置した。α-PD-1 Ab（200μg/注入）、α-PD-L1 Ab（200μg/注入）、またはα-CTLA-4 Ab（100μg/注入）を予定された通りにマウスに腹腔内注入し(D)、カプラン・マイヤー分析により全生存を示した(E)。
【図２２−２】図２２−１の続き。
【図２３】9日間腫瘍担持マウスでのウイルス処置後の疲弊T細胞およびPD-L1+細胞の上昇を示す図である。B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、図18に記載される通りに処置した。原発腫瘍を回収し、単一細胞の作製に適用し、CD4+PD-1+ T細胞(A)およびCD8+PD-1+ T細胞(B)、ならびにPD-L1+細胞(C)を測定するために染色した。
【図２４】免疫チェックポイント療法と組み合わせたvvDD-IL-2-FGの抗腫瘍効力を示す図である。B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、腫瘍接種から9日後にvvDD-IL-2-FGまたはPBSを用いて処置した。α-PD-1 Ab（200μg/注入）、α-PD-L1 Ab（200μg/注入）、またはα-CTLA-4 Ab（100μg/注入）を予定された通りにマウスに腹腔内注入し(A)、カプラン・マイヤー分析により全生存を示した(B)。
【図２５】ウイルス処置から10日後のMC38皮下腫瘍の腫瘍微小環境（TME）でのCD8+ T細胞応答を示す図である。(A) 実験設定：B6マウスに、5×105個のMC38癌細胞を皮下接種した。腫瘍面積が5×5mm2に到達したら、vvDD、vvDD-IL-2、vvDD-IL-15、vvDD-CXC11、vvDD-CCL5（1×108pfu/腫瘍）またはPBSを腫瘍内に注入した（1群当たり、n＝4〜5）。10日後に、腫瘍を回収し、単一細胞懸濁へと進め、その後に、IFN-γ ELISPOTのために磁性分離（CD8陰性選別）を行なった。(B) CD8+ T細胞は、ELISPOTによりIFN-γ産生について分析した。CD8+ T細胞（2×104個/ウェル）を、未刺激のままにするか（対照）、またはγ照射MC38腫瘍細胞（2×104個/ウェル）を用いて24時間刺激した。結果は、三連で評価した各マウスについてのCD8+ T細胞の個々のデータ点（各ウェル中のスポット数）およびバー（平均±標準偏差）として示す。MC38反応性応答を決定するために、対照ウェル由来のスポットの平均値を、MC38刺激ウェルのスポット数から減算した。データは、個別および平均として提示した。スチューデントt検定を用いて、統計学的有意性を分析した（*p＜0.05）。(C) TME中のウイルス誘導されたCD8+ T細胞は、腫瘍特異的である。B6マウスに5×105個のMC38癌細胞を皮下接種した。腫瘍面積が5×5mm2に到達したら、vvDD、vvDD-IL-2（1×108pfu/腫瘍）またはPBSを腫瘍内に注入した（1群当たり、n＝7；データは2回の独立した実験のまとめとして提示する）。10日後に、腫瘍を回収し、単一細胞懸濁へと進め、その後に、磁性分離（CD8陰性選別）を行なった。CD8+ T細胞は、ELISPOTによりIFN-γ産生について分析した。CD8+ T細胞（2×104個/ウェル）は、未刺激のままにするか（培地対照）、あるいはγ照射MC38腫瘍細胞（2×104個/ウェル）またはγ照射B16腫瘍細胞（2×104個/ウェル）もしくは非腫瘍担持B6マウス由来のナイーブ脾細胞（2×104個/ウェル）を無関係な標的細胞として用いて、24時間刺激した。結果は、二連で評価した各マウスについてのCD8+ T細胞の個別データ点（各ウェル中のスポット数）およびバー（平均±標準偏差）として示す。スチューデントt検定を用いて、統計学的有意性を分析した（*p＜0.05）。
【図２６】vvDD-IL-2により誘導されたMC38皮下腫瘍のTMEでのCD8+ T細胞応答が、IL-2処置よりも優れていることを示す図である。B6マウスに5×105個のMC38癌細胞を皮下接種した。腫瘍面積が5×5mm2に到達したら、IL-2（1×106IU/腫瘍）、vvDD、vvDD-IL-2（1×108pfu/腫瘍）またはPBSを腫瘍内に注入した（1群当たり、n＝4〜5）。10日後に、腫瘍を回収し、単一細胞懸濁へと進め、その後に、磁性分離（CD8陰性選別）を行なった。(A) 局所的免疫応答を測定するために、CD8+ T細胞を、ELISPOTによりIFN-γ産生について分析した。CD8+ T細胞（2×104個/ウェル）を、未刺激のままにするか（対照）、またはγ照射MC38腫瘍細胞（2×104個/ウェル）を用いて24時間刺激した。結果は、三連で評価した各マウスについてのCD8+ T細胞の個々のデータ点（各ウェル中のスポット数）およびバー（平均±標準偏差）として示す。腫瘍反応性応答を決定するために、対照ウェル由来のスポットの平均値を、MC38刺激ウェルのスポット数から減算した。スチューデントt検定を用いて、統計学的有意性を分析した（*p＜0.05）。(B) 全身性免疫応答の分析のために、追加的に、各マウスから脾臓を回収し、単一細胞懸濁へと進めた。脾細胞を、ELISPOTによりIFN-γ産生について分析した。脾細胞（1×105個/ウェル）を、未刺激のままにするか（対照）、またはγ照射MC38腫瘍細胞（2×104個/ウェル）を用いて24時間刺激した。結果は、三連で評価した各マウス由来の脾細胞の個々のデータ点（各ウェル中のスポット数）およびバー（平均±標準偏差）として示す。腫瘍反応性応答を決定するために、対照ウェル由来のスポットの平均値を、MC38刺激ウェルのスポット数から減算した。スチューデントt検定を用いて、統計学的有意性を分析した（*p＜0.05）。
【図２７】vvDD-IL-2およびvvDD処置が、腫瘍浸潤性T細胞数を増加させることを示す図である。(A) B6マウスに5×105個のMC38癌細胞を皮下接種した。腫瘍面積が5×5mm2に到達したら、PBSまたはvvDD、vvDD-IL-2（1×108pfu/腫瘍）を腫瘍内に注入した（1群当たり、n＝5）。10日後に、腫瘍を回収し、固定して、DAPI、CD3、CD4、CD8について染色した。各群由来の1個のサンプルの代表的免疫蛍光画像。(B) 面積当たりのCD3+ T細胞ならびにCD3+CD4+およびCD3+CD8+ T細胞の割合（％）のまとめ。
【図２８】vvDD-IL-2およびvvDD処置が、腫瘍中のT細胞数を増加させることを示す図である。B6マウスに5×105個のMC38癌細胞を皮下接種した。腫瘍面積が5×5mm2に到達したら、vvDD、vvDD-IL-2（1×108pfu/腫瘍）またはPBSを腫瘍内に注入した（1群当たり、n＝8）。10日後に、腫瘍を回収し、単一細胞懸濁へと進め、その後に、磁性分離（CD90.2ビーズ）を行なった。各個別のマウス由来のT細胞をカウントし、腫瘍1グラム当たりの数を算出した。スチューデントt検定を用いて、統計学的有意性を分析した（*p＜0.05）。
【図２９Ａ】腫瘍溶解性ウイルスにより誘導された腫瘍浸潤型T細胞（「OV誘導型T細胞」）は、ex vivoで培養およびその腫瘍特異性を維持することができることを示す図である。(A) 実験設定：B6マウスに5×105個のMC38癌細胞を皮下接種した。腫瘍面積が5×5mm2に到達したら、vvDD、vvDD-IL-2（1×108pfu/腫瘍）またはPBSを腫瘍内に注入した（1群当たり、n＝4；データは2回の独立した実験のまとめとして提示する）。10日後に、腫瘍を回収し、単一細胞懸濁へと進め、その後に、磁性分離（CD90.2ビーズ）を行なった。各個別のマウス由来のT細胞を、24ウェルプレート中（1×106個/ウェル）、IL-2（30IU/mL）およびIL-7（5ng/mL）の存在下でRPMI完全培地中で培養した。
【図２９Ｂ】腫瘍溶解性ウイルスにより誘導された腫瘍浸潤型T細胞（「OV誘導型T細胞」）は、ex vivoで培養およびその腫瘍特異性を維持することができることを示す図である。(B)培養条件下でのT細胞の腫瘍特異性を決定するために、各個別のマウス由来のT細胞を、4日後に、ELISPOTによりIFN-γ産生について試験した。T細胞（2×104個/ウェル）を、未刺激のままにするか（培地）、あるいはγ照射MC38腫瘍細胞（2×104個/ウェル）またはγ照射B16腫瘍細胞（2×104個/ウェル）もしくは非腫瘍担持B6マウス由来のナイーブ脾細胞（2×104個/ウェル）を無関係な標的細胞として用いて24時間、二連で刺激した。結果は、二連で評価した各マウスについてのT細胞の個別データ点（各ウェル中のスポット数）およびバー（平均±標準偏差）として示す。スチューデントt検定を用いて、統計学的有意性を分析した（* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；**** p＜0.0001）。
【図２９Ｃ】腫瘍溶解性ウイルスにより誘導された腫瘍浸潤型T細胞（「OV誘導型T細胞」）は、ex vivoで培養およびその腫瘍特異性を維持することができることを示す図である。(C) IFN-γ ELISPOTに加えて、フローサイトメトリーにより、4-1BBアップレギュレーションについて、T細胞を試験した。T細胞（2×104個/ウェル）を、未刺激のままにするか（培地対照）、あるいはγ照射MC38腫瘍細胞（2×104個/ウェル）またはγ照射B16腫瘍細胞（2×104個/ウェル）もしくは非腫瘍担持B6マウス由来のナイーブ脾細胞（2×104個/ウェル）を無関係な標的細胞として用いて、二連で刺激した。24時間後、フローサイトメトリー分析のために、CD3、CD4、CD8、4-1BBに対して細胞を染色した。結果は、二連で評価した各マウスについてのT細胞の個別データ点（CD8+4-1BB+ T細胞およびCD4+4-1BB+ T細胞の割合（％））およびバー（平均±標準偏差）として示す。スチューデントt検定を用いて、統計学的有意性を分析した（* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；**** p＜0.0001）。
【図３０−１】各群からの1個のサンプルのCD8+4-1BB+およびCD4+4-1BB+ T細胞の代表的フローサイトメトリープロットを示す図である。
【図３０−２】図３０−１の続き。
【図３０−３】図３０−２の続き。
【図３１Ａ】養子T細胞移入前のvvDD-IL-2誘導型T細胞およびナイーブT細胞のin vitro分析を示す図である。ACTに先立って、培養されたT細胞を、IFN-γ ELISPOTならびに4-1BB発現のフローサイトメトリー染色およびIFN-γ ELISAのための共培養アッセイを用いて、in vitroで腫瘍反応性について試験した。ELISPOTおよび共培養アッセイのために、T細胞（2×104個/ウェル）を、未刺激のままにするか（培地）、あるいはγ照射MC38腫瘍細胞（2×104個/ウェル）またはγ照射B16腫瘍細胞（2×104個/ウェル）もしくは非腫瘍担持B6マウス由来のナイーブ脾細胞（2×104個/ウェル）を無関係な標的細胞として用いて24時間、二連で刺激した。(A) ELISPOT結果を、二連で評価した各マウス由来のT細胞の個別データ点（各ウェル中のスポット数）およびバー（平均±標準偏差）として示す。(BおよびC) IFN-γ ELISPOTに加えて、フローサイトメトリーにより、4-1BB発現について、T細胞を試験した。細胞（2×104個/ウェル）を、未刺激のままにするか（培地対照）、あるいはγ照射MC38腫瘍細胞（2×104個/ウェル）またはγ照射B16腫瘍細胞（2×104個/ウェル）もしくは非腫瘍担持B6マウス由来のナイーブ脾細胞（2×104個/ウェル）を無関係な標的細胞として用いて、二連で刺激した。24時間後に、細胞を、FLOW分析のために、CD3、CD4、CD8、4-1BBに対して染色した。結果は、二連で評価した各マウスについてのT細胞の個別データ点（CD8+4-1BB+ T細胞およびCD4+4-1BB+ T細胞の割合（％））およびバー（平均±標準偏差）として示す。スチューデントt検定を用いて、統計学的有意性を分析した（* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；**** p＜0.0001）。
【図３１Ｂ】図３１Ａの続き。
【図３１Ｃ】図３１Ｂの続き。
【図３２−１】各群由来の1個のサンプルのCD8+4-1BB+およびCD4+4-1BB+ T細胞の代表的フローサイトメトリープロットを示す図である。
【図３２−２】図３２−１の続き。
【図３３Ａ】MC38腹腔内腫瘍担持マウスへのvvDD-IL-2誘導型T細胞の養子T細胞移入を示す図である。(A) 実験設定：養子T細胞移入のためのウイルス誘導型T細胞を作製するために、B6マウスに、5×105個のMC38癌細胞を皮下接種した（n＝12）。腫瘍面積が5×5mm2に達したら、vvDD-IL-2（1×108pfu/腫瘍）を腫瘍内注入した。10日後に、腫瘍を回収し（2個のサンプルを一緒にプールした；n＝6）、単一細胞懸濁へと進め、その後に、磁性分離（CD90.2ビーズ）を行なった。T細胞を、24ウェルプレート中（1×106個/ウェル）、IL-2（30IU/mL）およびIL-7（5ng/mL）の存在下でRPMI完全培地中で増殖させた。対照T細胞として、非腫瘍担持未処置マウス（n＝4）から脾臓を回収し、単一細胞懸濁へと進め、その後に、磁性分離（CD90.2ビーズ）を行なった。ナイーブT細胞を、ウイルス誘導型T細胞と同じ条件下で培養した。4日後に、養子移入（5×106個のT細胞/マウス）のためにT細胞を回収した。ACT処置マウスに、処置の7日前に5×105個のMC38-luc癌細胞を腹腔内接種し、腫瘍細胞注入の7日後の生体動物IVISイメージングに基づいて、腫瘍増殖条件に従って必要な群に分けた（n＝7）。T細胞移入に先立って、処置されたマウスに、臨床的プロトコールに類似したリンパ枯渇（lymphodepletion）を模倣するために、致死線量未満の5Gyの照射を施した。群分けされたマウスに、vvDD-IL-2誘導型T細胞、ナイーブT細胞またはPBSを腹腔内注入した。すべての処置マウスに、IL-2の外因性サイトカイン補助を受けさせた（100,000IU/マウス、腹腔内、12時間毎に3日間）。
【図３３Ｂ】MC38腹腔内腫瘍担持マウスへのvvDD-IL-2誘導型T細胞の養子T細胞移入を示す図である。(B) 腫瘍担持マウスの生存率を、カプラン・マイヤー分析によりモニタリングした。
【図３３Ｃ】MC38腹腔内腫瘍担持マウスへのvvDD-IL-2誘導型T細胞の養子T細胞移入を示す図である。(C) 腫瘍増殖を、生体動物イメージングによりモニタリングした。
【図３４】ACT後、17日目のイメージングを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
5. 発明の詳細な説明
明白性のために、かつ限定の意味ではなく、本明細書中に開示される主題の詳細な説明は、以下の部分節に分けられる：
(i) 腫瘍溶解性ウイルス；
(ii) 免疫調節因子分子；
(iii) 武装化型腫瘍溶解性ウイルス；
a. 分泌型免疫調節因子分子；
b. 膜結合型免疫調節因子分子；
i. アンカー性ペプチド；
ii. リンカー；
iii. 非限定的実施形態；
(iv) 腫瘍溶解性ウイルス投与；
(v) 製造方法；
a. 腫瘍溶解性ウイルスにより誘導された腫瘍浸潤型T細胞（「OV誘導型T細胞」）の単離および調製；
(vi) 治療方法
a. 養子T細胞療法；
b. 武装化型腫瘍溶解性ウイルスを用いる治療；
(vii) 医薬組成物；および
(viii) キット。
【００２３】
5.1 腫瘍溶解性ウイルス
本明細書中に開示される主題は、当技術分野で公知のいずれかの腫瘍溶解性ウイルスに適用することができる。「腫瘍溶解性ウイルス」とは、比較可能な非癌細胞と比較して、癌細胞中での複製の増大、および癌細胞の溶解を示すウイルスである；例えば、Bartlett DL et al., 2013, Molecular Cancer 12:103-120；Kaufman HL et al., 2015, Nature Reviews Drug Discovery 14:642-662およびChiocca EA and Rabkin SD, 2014, Cancer Immunol Res; 2; 295-300を参照されたい。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、癌細胞中での選択的な複製を示し、非癌細胞中で複製がより少ないか、もしくは本質的に複製しない。特定の実施形態では、より少ない複製とは、同等の非癌細胞と比較した癌細胞中での複製が、少なくとも約30％多い、または少なくとも約50％多い、または少なくとも約80％多いことを意味する。
【００２４】
「約」または「概ね」との用語は、本明細書中で用いる場合、当業者により測定される特定の値に関する許容可能な誤差範囲内を意味することができ、これは、該値がどのように計測または測定されるのか（例えば、測定系の限界）に部分的には依存するであろう。例えば、「約」とは、所与の値での実行につき、1以上の標準偏差の範囲内を意味することができる。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載される場合、特に記載しない限り、用語「約」は、用語「約」により改変された値の±10％などの、特定の値に関する許容可能な誤差範囲を意味することができる。
【００２５】
腫瘍溶解性ウイルスの非限定的な例としては、以下のタイプが挙げられる：(i) アデノウイルス（「Ad」）（例えば、hTERT-Ad）；(ii) 単純ヘルペスウイルス（「HSV」）（例えば、G207、HSV-1716、T-VEC、およびHSV-2 ΔPK突然変異体）；(iii) ポックスウイルス、例えば、ワクシニアウイルス（例えば、vSPおよびvvDD（tk-/vgf-）；および以下を参照されたい）；(iv) アルボウイルス；(v) パラミクソウイルス（例えば、麻疹ウイルス、ムンプスウイルスおよびニューカッスル病ウイルス）；(vi) ラブドウイルス（例えば、水疱性口内炎ウイルス）；(vii) ピコルナウイルス（例えば、コクサッキーウイルス、セネカバレーウイルス（Seneca Valley Virus）、およびポリオウイルス）；(viii) レオウイルス；(ix) パルボウイルス；および(x) 上記のいずれか1種の組み換え/遺伝子操作バージョン。
【００２６】
特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、米国食品医薬品局（FDA）により承認されているか、または臨床試験を実施中の腫瘍溶解性ウイルスである。例えば、限定するものではないが、腫瘍溶解性ウイルスは、T-VECとも称されるタリモジーン・ラハーパレプベック（Talimogene laherparepvec）（ImlygicTM；Amgen, Inc.)であり得る。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ペラレオレプ（pelareorep）（Reolysin(登録商標)；Oncolytics Biotech, Inc.）であり得る。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、DNX-2401（DNAtrix Therapeutics）であり得る。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、H101（Oncorine(登録商標)；Shanghai Sunway Biotech Co., Ltd.）であり得る。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ペクサスチモジーン・デバシレプベック（pexastimogene devacirepvec）（JX-594；SillaJen Inc.）であり得る。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、CG0070（Cold Genesys, Inc.）であり得る。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、G47Δ（Daiichi-Sankyo Company, Limited）であり得る。
【００２７】
特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスである。特定の非限定的実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、遺伝子操作型（「組み換え型」とも称される）ワクシニアウイルスである。特定の非限定的実施形態では、ウイルスは、ワクシニアのウエスタンリザーブ（「WR」）株に基づく組み換え型ワクシニアウイルス、例えば、American Type Culture CollectionからATCC番号VR1354として市販されているWR株である。遺伝子操作のために好適な他のワクシニアウイルス株としては、限定するものではないが、ワイエス（Wyeth）株（ATCC VR-1536）、Lederle-Chorioallantoic株（ATCC VR-325）、およびCL株（ATCC VR-117）が挙げられる。
【００２８】
特定の非限定的実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、米国特許第7,208,313号、同第8,506,947号、および米国特許出願公開第2003/0031681号および同第2007/0154458号、McCart et al., 2001, Cancer Research 61:8751-8757および/またはThorne S et al., 2007, J. Clin. Invest. 117:3350-3358（それらのすべてがその全体で参照により本明細書中に組み入れられる）に記載されるウイルスの改変型を含む、遺伝子操作型vvDDワクシニアウイルス構築物である。例えば、限定するものではないが、ワクシニアウイルスは、チミジンキナーゼ（tk）および/またはワクシニア増殖因子（vgf）遺伝子の欠失を有することができる。
【００２９】
特定の非限定的実施形態では、ワクシニアウイルスは、遺伝子（1種類または複数種類）の生成物がウイルス複製で機能する、1種以上の遺伝子中に不活性化突然変異を有する。例えば、限定するものではないが、以下の遺伝子のうちの1種以上が、不活性化突然変異を保持することができる：リボヌクレアーゼレダクターゼ大サブユニットをコードする遺伝子、リボヌクレオチドレダクターゼ小サブユニットをコードする遺伝子、チミジル酸キナーゼをコードする遺伝子、DNAリガーゼをコードする遺伝子、dUTPaseをコードする遺伝子、tk遺伝子、およびワクシニアウイルス増殖因子（vgf）遺伝子。特定の実施形態では、不活性化突然変異は、遺伝子産物の活性を低下または排除する突然変異である。特定の実施形態では、遺伝子活性化を、突然変異誘発（例えば、部位特異的突然変異誘発またはPCR媒介突然変異誘発）により達成することができる。
【００３０】
あるいは、またはそれに加えて、特定の実施形態では、核酸を、不活性化を達成するために上記の遺伝子のうちの1種以上へと挿入することができる。特定の非限定的実施形態では、タンパク質をコードする核酸を、不活性化を達成するために、かつ該核酸の発現をさらに達成するために、上記の遺伝子のうちの1種以上へと挿入することができる。特定の実施形態では、免疫調節因子分子をコードする核酸を、不活性化を達成するために上記の遺伝子のうちの1種の内部に挿入することができる。特定の実施形態では、アンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子（例えば、ANCHIMタンパク質）をコードする核酸が、不活性化を達成するために上記の遺伝子のうちの1種の内部に挿入することができ、任意により、ANCHIMタンパク質を発現させることができる。
【００３１】
特定の非限定的実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、tk遺伝子中に不活性化突然変異（遺伝子産物の活性を低下または排除する突然変異）を有するワクシニアウイルスである。例えば、限定するものではないが、チミジンキナーゼ遺伝子の不活性化を、ワクシニアウイルスゲノムのチミジンキナーゼ遺伝子の遺伝子座内のシトシンデアミナーゼ（fcy1）遺伝子の挿入により生成して、それにより、tk遺伝子ではなく、fcy1遺伝子の発現を生じさせることができる。別の非限定的実施形態では、検出可能なタンパク質、例えば、蛍光タンパク質（例えば、黄色蛍光タンパク質（「yfp」））をコードする核酸をtk遺伝子中に挿入し、それにより、該遺伝子を不活性化することができる。特定の実施形態では、免疫調節因子をコードする核酸を、tk遺伝子中に挿入することができる。特定の実施形態では、ANCHIMタンパク質をコードする核酸を、tk遺伝子中に挿入することができる。
【００３２】
追加の、または代替的な実施形態では、組み換え型ワクシニアウイルスは、ワクシニア増殖因子遺伝子中に不活性化突然変異を有することができる。例えば、限定するものではないが、vgf遺伝子の遺伝子座内へのlacZ遺伝子の挿入が、vgfではなくlacZ遺伝子の発現を生じさせる。特定の実施形態では、免疫調節因子をコードする核酸を、vgf遺伝子中に挿入することができる。例えば、限定するものではないが、ANCHIMタンパク質をコードする核酸を、vgf遺伝子中に挿入することができる。
【００３３】
5.2 免疫調節因子分子
当技術分野で公知のいずれかの免疫調節因子分子を、本明細書中に開示される主題に従って利用することができる。一部のサイトカインは、免疫調節活性を有し、かつ、本明細書中における免疫調節因子分子（または、単純に「免疫調節因子」）と見なされるであろう。
【００３４】
特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、サイトカインを含むことができる。特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、ケモカインを含むことができる。本明細書中に開示される主題に従って用いることができる免疫調節因子分子の非限定的な例としては、インターロイキン（「IL」）、例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24もしくはIL-27、C-X-Cモチーフケモカイン11（CXCL11）、ケモカイン（C-Cモチーフ）リガンド5（CCL5）、インターフェロン（「IFN」）、例えば、IFN-α、IFN-α2、IFN-β、もしくはIFN-γ；または腫瘍壊死因子（「TNF」）、例えば、TNF-αもしくはTNF-β；および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）が挙げられる。
【００３５】
免疫調節因子分子は、ヒトまたは非ヒト免疫調節因子分子であり得る。そのような免疫調節因子分子をコードする核酸、およびコードされるタンパク質配列は、当技術分野で周知である。非ヒト生物種の例としては、非ヒト霊長類、げっ歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ウシ等が挙げられる。
【００３６】
特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題での使用のための免疫調節因子分子はIL-2である。特定の実施形態では、ヒトIL-2は、少なくとも、配列APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLT（配列番号13；GenBank登録番号CAA25742.1、残基21-153）の免疫活性化部分、またはその保存的置換、例えば、1箇所または2箇所のアミノ酸変異を有する該配列を含む。
【００３７】
特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題での使用のための免疫調節因子分子はTNF-αである。特定の非限定的実施形態では、ヒトTNF-αは、少なくとも配列MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL（配列番号15；NCBI参照配列番号NM_000594.3）の免疫活性化部分、またはその保存的置換、例えば、1箇所または2箇所のアミノ酸変異を有する該配列を含む。
【００３８】
特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題での使用のための免疫調節因子分子はIL-23であり、これは2種類のサブユニット、IL-23AおよびIL-12Bからなる。特定の非限定的実施形態では、ヒトIL-23Aタンパク質は、少なくとも配列MLGSRAVMLLLLLPWTAQGRAVPGGSSPAWTQCQQLSQKLCTLAWSAHPLVGHMDLREEGDEETTNDVPHIQCGDGCDPQGLRDNSQFCLQRIHQGLIFYEKLLGSDIFTGEPSLLPDSPVGQLHASLLGLSQLLQPEGHHWETQQIPSLSPSQPWQRLLLRFKILRSLQAFVAVAARVFAHGAATLSP（配列番号18；GenBank 登録番号XXX、残基1-189または配列番号18のアミノ酸残基28-184）の免疫活性化部分、または1箇所のアミノ酸変異を有する該配列を含む。
【００３９】
特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題は、非免疫調節因子サイトカインを使用して適用することができ、このとき、該サイトカインは、望ましくは、癌細胞環境に局在し、例えば、該サイトカインは、全身性に投与される場合に毒性作用を示す。
【００４０】
本明細書中で用いる場合、用語「保存的アミノ酸置換」および「保存的改変」とは、アミノ酸配列を含む本明細書中に開示されるタンパク質の機能および/もしくは活性に著明に影響しないか、またはこれを変化させないアミノ酸改変を意味する。そのような保存的改変としては、アミノ酸置換、付加および欠失が挙げられる。改変は、当技術分野で公知の標準的技術（部位特異的突然変異誘発およびPCR媒介突然変異誘発）により、本開示のタンパク質へと導入することができる。アミノ酸は、電荷および極性などのそれらの物理化学的特性に従うグループへと分類できる。
【００４１】
保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、同じグループ内のアミノ酸を用いて置き換えられるものである。例えば、アミノ酸は、電荷により分類することができ：正に荷電したアミノ酸としては、リジン、アルギニン、ヒスチジンが挙げられ、負に荷電したアミノ酸としては、アスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられ、中性荷電アミノ酸としては、アラニン、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。加えて、アミノ酸は、極性により分類することができ：極性アミノ酸としては、アルギニン（塩基性極性）、アスパラギン、アスパラギン酸（酸性極性）、グルタミン酸（酸性極性）、グルタミン、ヒスチジン（塩基性極性）、リジン（塩基性極性）、セリン、トレオニン、およびチロシンが挙げられ；非極性アミノ酸としては、アラニン、システイン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、およびバリンが挙げられる。特定の実施形態では、明記された配列内の、1個以下、2個以下、3個以下、4個以下、5個以下の残基が変更される。例示的な保存的アミノ酸置換を、以下の表1に示す。
【００４２】
【表１】
2020514324.tif 000003
【００４３】
5.3 武装化型腫瘍溶解性ウイルス
本明細書中に開示される主題は、上記で説明した通りの免疫調節因子分子をコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスを提供する。特定の実施形態では、該核酸によりコードされる免疫調節因子分子は分泌され得る（例えば、該核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスに感染した細胞から分泌され得る）。特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、アンカー性ペプチドに連結して膜結合型となることができる。
【００４４】
5.3.1 分泌型免疫調節因子分子
本明細書中に開示される主題は、分泌される対象である（例えば、核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスにより感染された細胞から分泌される）免疫調節因子分子をコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスを提供する。好適な腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫調節因子分子は、上記の節で議論されている。特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、治療対象であることが意図される被験体と同じ生物種のものであり得（例えば、ヒト被験体を治療するためのヒト免疫調節因子分子）、または異なる生物種のものであり得る（例えば、ヒト被験体を治療するためのマウス免疫調節因子分子）。
【００４５】
特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題は、そのゲノム中に、免疫調節因子分子をコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスを提供する。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスである。
【００４６】
特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、CXCL11、CCL5、IFN、IFN-α、IFN-α2、IFN-β、IFN-γ、TNF、TNF-α、TNF-β、GM-CSFまたはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-2である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-23である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はTNF-αである。
【００４７】
特定の実施形態では、免疫調節因子分子をコードする核酸は、腫瘍溶解性ウイルス感染細胞で活性または活性化可能であるプロモーター（例えば、腫瘍溶解性ウイルスのプロモーター）の制御下に配置されることができる。コード核酸は、それが挿入されるウイルスゲノムの核酸に適合するために、DNA、RNAまたはcDNAであり得る。
【００４８】
特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは単純ヘルペスウイルスである。特定の実施形態では、ヘルペスウイルスは、上記の通り、免疫調節因子分子をコードする核酸をそのゲノム中に含む。特定の実施形態では、免疫調節因子分子をコードする核酸は、単純ヘルペスウイルス感染細胞で活性または活性化可能であるプロモーター（例えば、単純ヘルペスウイルスのプロモーター）の制御下に配置されることができる。コード核酸は、単純ヘルペスウイルスのゲノムの核酸に適合するために、DNAであり得る。特定の実施形態では、本開示の腫瘍溶解性ウイルスは、IL-2をコードする核酸を含む単純ヘルペスウイルスであり得る。特定の実施形態では、本開示の腫瘍溶解性ウイルスは、IL-23をコードする核酸を含む単純ヘルペスウイルスであり得る。特定の実施形態では、本開示の腫瘍溶解性ウイルスは、TNF-αをコードする核酸を含む単純ヘルペスウイルスであり得る。
【００４９】
特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスはワクシニアウイルスである。特定の実施形態では、免疫調節因子分子をコードする核酸は、ワクシニアウイルス感染細胞で活性または活性化可能であるプロモーター（例えば、ワクシニアウイルスのプロモーター）に機能的に連結される。特定の非限定的実施形態では、免疫調節因子分子をコードする核酸は、ワクシニアプロモーター（例えば、p7.5 e/lプロモーター、またはpSe/lプロモーター）に機能的に連結され、プロモーター/免疫調節因子分子コード構築物を作製することができる。特定の非限定的実施形態では、プロモーター/免疫調節因子分子コード構築物は、tk遺伝子中に挿入されることができる。特定の他の非限定的実施形態では、プロモーター/免疫調節分子コード構築物は、vgf遺伝子中に挿入されることができる。特定の実施形態では、本開示の腫瘍溶解性ウイルスは、IL-2をコードする核酸を含むワクシニアウイルスであり得る。特定の実施形態では、本開示の腫瘍溶解性ウイルスは、IL-23をコードする核酸を含むワクシニアウイルスであり得る。特定の実施形態では、本開示の腫瘍溶解性ウイルスは、TNF-αをコードする核酸を含むワクシニアウイルスであり得る。
【００５０】
特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題は、IL-2をコードするデオキシリボース核酸である核酸をそのゲノム中に含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供する。具体的な非限定的実施形態では、核酸はヒトIL-2をコードし得る（例えば、少なくとも配列番号13のアミノ酸配列の一部分またはその保存的置換を含む）。特定の実施形態では、IL-2をコードする核酸は、ワクシニアウイルス感染細胞で活性または活性化可能であるプロモーター（例えば、ワクシニアウイルスのプロモーター）に機能的に連結される。例えば、しかし限定的ではなく、IL-2をコードする核酸は、ワクシニアプロモーター（例えば、p7.5 e/lプロモーター、またはpSe/lプロモーター）に機能的に連結され、プロモーター/IL-2コード構築物を作製することができる。特定の非限定的実施形態では、プロモーター/IL-2コード構築物は、tk遺伝子中に挿入されることができる。特定の他の非限定的実施形態では、プロモーター/IL-2コード構築物は、vgf遺伝子中に挿入されることができる。
【００５１】
特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題は、TNF-αをコードするデオキシリボース核酸である核酸をそのゲノム中に含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供する。具体的な非限定的実施形態では、核酸はヒトTNF-αをコードし得る（例えば、配列番号15のアミノ酸配列またはその保存的置換を含む）。特定の実施形態では、TNF-αをコードする核酸は、ワクシニアウイルス感染細胞で活性または活性化可能であるプロモーター（例えば、ワクシニアウイルスのプロモーター）に機能的に連結される。例えば、しかし限定的ではなく、TNF-αをコードする核酸は、ワクシニアプロモーター（例えば、p7.5 e/lプロモーター、またはpSe/lプロモーター）に機能的に連結され、プロモーター/TNF-αコード構築物を作製することができる。特定の非限定的実施形態では、プロモーター/TNF-αコード構築物は、tk遺伝子中に挿入されることができる。特定の他の非限定的実施形態では、プロモーター/IL-2コード構築物は、vgf遺伝子中に挿入されることができる。
【００５２】
特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題は、IL-23のサブユニット（例えば、IL-23p19およびIL-23p40）をコードするデオキシリボース核酸である核酸をそのゲノム中に含む、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供する。特定の実施形態では、IL-23p19およびIL-23p40をコードする核酸は、ワクシニアウイルス感染細胞で活性または活性化可能であるプロモーター（例えば、ワクシニアウイルスのプロモーター）に機能的に連結される。特定の非限定的実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、IL-23p19のヒトホモログ（例えば、IL-23A）、およびIL-23p40のヒトホモログ（例えば、IL-12B）をコードするデオキシリボース核酸である核酸をそのゲノム中に含み、IL-23を作製する。具体的な非限定的実施形態では、核酸は、IL-23p19もしくはそのヒトホモログ（例えば、IL-23A）および/またはIL-23p40もしくはそのヒトホモログ（例えば、IL-12B）をコードすることができ、かつ、ワクシニアプロモーター（例えば、p7.5 e/lプロモーター、またはpSe/lプロモーター）にさらに機能的に連結され、プロモーター/IL-23p19/IL-23p40コード構築物またはプロモーター/IL-23A/IL-12Bコード構築物を作製することができる。特定の非限定的実施形態では、プロモーター/IL-23p19/IL-23p40コード構築物またはプロモーター/IL-23A/IL-12Bコード構築物は、tk遺伝子中に挿入されることができる。特定の他の非限定的実施形態では、プロモーター/IL-23p19/IL-23p40コード構築物またはプロモーター/IL-23A/IL-12Bコード構築物は、vgf遺伝子中に挿入されることができる。
【００５３】
5.3.2. 膜結合型免疫調節因子分子
本明細書中に開示される主題は、アンカー性ペプチドに連結された上記で説明された通りの免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質をコードする腫瘍溶解性ウイルスを提供し、このとき、アンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子は、本明細書中で「ANCHIM」と称される。特定の実施形態では、膜結合ドメインは異種的である。特定の実施形態では、膜結合ドメインは自家的である。好適な腫瘍溶解性ウイルスおよび免疫調節因子分子は、上記の節で議論されている。アンカー性ペプチドは、下記の節で議論されている。
【００５４】
特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、治療が意図される被験体と同じ生物種のものであり得（例えば、ヒト被験体を治療するためのヒト免疫調節因子分子）、または異なる生物種のものであり得る（例えば、ヒト被験体を治療するためのマウス免疫調節因子分子）。
【００５５】
特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題は、そのゲノム中に、アンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質をコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスを提供する。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスである。特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、CXCL11、CCL5、IFN、IFN-α、IFN-α2、IFN-β、IFN-γ、TNF、TNF-α、TNF-β、GM-CSFまたはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-2である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-23である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はTNF-αである。
【００５６】
5.3.2.1. アンカー性ペプチド
特定の実施形態では、アンカー性ペプチドは、免疫調節因子分子と融合される場合に、免疫調節因子分子を宿主細胞膜へと固定する、いずれかのタンパク質である。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題に従って、アンカー性ペプチドを用い、宿主細胞の膜へと結合させるために免疫調節因子分子を改変することができる（例えば、GPIまたは他の分子を付加することにより）。
特定の非限定的実施形態では、アンカー性ペプチドは、約10〜約50アミノ酸、または約15〜約30、または約20アミノ酸長である。
【００５７】
特定の実施形態では、アンカー性ペプチドは、グリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）-アンカーアクセプターペプチドである。特定の非限定的実施形態では、GPI-アンカーアクセプターペプチドは、少なくともその生来型ペプチドのC末端の一部分を含み、例えば、生来型ペプチドの、少なくとも100個のC末端アミノ酸の一部分を含み、または少なくとも50個のC末端アミノ酸の一部分を含み、または少なくとも30個のC末端アミノ酸の一部分を含む。
【００５８】
特定の実施形態では、アンカー性ペプチドは、本質的に同じ機能を果たすであろう様々なタンパク質ならびに細胞膜タンパク質の一部分の配列を含むことができる。GPIにより例示される通り、アンカー機能は、限定するものではないが、炭水化物、脂質等をはじめとする非ペプチド要素を含有する、基礎となるペプチドまたはタンパク質の修飾により達成することができる。
【００５９】
特定の実施形態では、アンカー性ペプチドは、ヒトCD16bアンカーアクセプターペプチドのグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）-アンカーアクセプター配列を含むことができる。特定の非限定的実施形態では、アンカーは、Fergusonら, “Chapter 11: Glycosylphosphatidyl Anchors” in Glycobiology, 2nd Edition, Varki et al., editors, Cold Spring Harbor Press, 2009に説明されるようなタンパク質由来のGPI-アンカーアクセプターペプチドであり、例えば、限定するものではないが、アルカリホスファターゼ、CD58、CD14、NCAM-120およびTAG-1である（該文献の内容は、参照により本明細書中にその全体が組み入れられる）。
【００６０】
特定の非限定的実施形態では、GPI-アンカーアクセプターペプチドは、GPI付加の途中で機能し、プロセス中に切断されるシグナルペプチド部分（「SPP」）を含む。特定の実施形態では、SPPは、3つのドメインを含む：(1) 3個の比較的小型のアミノ酸（例えば、限定するものではないが、Gly（G）、Ala（A）、Ser（S）、Asn（N）、Asp（D）、もしくはCys（C）またはそれらのいずれかの組み合わせ）ω、(ω＋1)、および(ω＋2)（このとき、ωはGPIアンカーに連結され、(ω＋1)および(ω＋2)は切断されたペプチドの最初の2残基である）を含む第1ドメイン；(2) 約5〜10アミノ酸残基の比較的極性のドメインスペーサーならびに(3) 約15〜20アミノ酸の疎水性ドメイン。特定の実施形態では、アンカー性ペプチドは、それが重要なウイルス感染（feature viral infection）でない場合に、GPIアンカーの付加を促進するために小胞体へと標的化させる配列をさらに含むことができる（Mayor S and Riezman H, 2004, Nature Reviews Molecular Cell Biology 5, 110-120を参照されたい；その内容は参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる）。タンパク質C末端から伸長するこのシグナルペプチド部分は、以下の通りに図示することができる：ω−(ω＋1) −(ω＋2)−極性スペーサー領域−〜疎水性ドメイン（Galian C et al., 2012, J. Biol. Chem. 287(20):16399-16409を参照されたい）。特定の非限定的実施形態では、ω−(ω＋1) −(ω＋2)−極性スペーサー領域は、そのうちの少なくとも約2個または少なくとも約3個の残基がGであり、かつ少なくとも約2個または少なくとも約3個または少なくとも約4個または少なくとも約5個の残基がSである、約10個のアミノ酸の配列を含むことができる。特定の非限定的実施形態では、該配列は、NSTGSGSSGS（配列番号17；Galian、上掲）であり得る。特定の非限定的実施形態では、疎水性ドメインは、約15〜約20アミノ酸を含むことができ、これは、A、Leu（L）、Val（V）、Phe（F）およびそれらの組み合わせの群から選択される少なくとも約10個の残基を含む。SPPの非限定的な例は、Galianの文献（上掲）のTable 1またはFigure 8に提供され、かつ以下の配列が挙げられる：
GGALQSTASLFVVSLSLLHLYS（配列番号2；ヒトCD24由来）；
NNSCSSPGGCRLFLSTIPVLWTLL（配列番号3；ヒトEFNA2由来）；
DAAHPGRSVVPALLPLLAGTLLLLETAT（配列番号4；ヒトPPB1由来）；
SAAPRLFPLAWTVLLLPLLLLQT（配列番号5；ヒトEFNA1由来）；
NGSISLAVPLWLLAASLLCLLSCK（配列番号6；ヒトLSAMP由来）；
SGAPTLSPSLLGLLLPAFGILVYLEF（配列番号7；ヒトCNTN1由来）；
NGTSRRAGCIWLLPLLVLHLLLKF（配列番号8；ラットNTRI由来）；
NSTGSGSSGSAAAAVAAAAVAAAAVAAAA（配列番号9）または
NSTGSGSSGSAAAAVVFVFVFVFVVAAAA（配列番号10）。
【００６１】
特定の実施形態では、GPIアンカーアクセプターペプチド配列は、約1箇所もしくは約2箇所のアミノ酸置換、挿入または欠失、または約1箇所、約2箇所もしくは約3箇所の保存的アミノ酸置換を保持する、配列番号2〜10を有するペプチドのうちのいずれか1種を含む。
【００６２】
特定の非限定的実施形態では、GPIアンカーアクセプターペプチドは、配列SSFSPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNI（配列番号1）の少なくとも一部分（例えば、少なくとも約10個または少なくとも約20個または少なくとも約25個の連続する残基）を含むCD16bのGPIアンカーアクセプターペプチド配列、あるいは約1箇所もしくは約2箇所のアミノ酸置換、挿入または欠失、または約1箇所、約2箇所もしくは約3箇所の保存的アミノ酸置換を保持する該配列を含む（Simmons D and Seed B, 1988, Nature 333:568-570を参照されたい）。
【００６３】
特定の非限定的実施形態では、GPIアンカーアクセプターペプチドは、配列VSTISSFSPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNI（配列番号11）の少なくとも一部分（例えば、少なくとも約10個または少なくとも約20個または少なくとも約25個の連続する残基）を含むCD16bのGPIアンカーアクセプターペプチド配列、あるいは約1箇所もしくは約2箇所のアミノ酸置換、挿入または欠失、または約1箇所、約2箇所もしくは約3箇所の保存的アミノ酸置換を保持する該配列を含む（Simmons D and Seed B, 1988, Nature 333:568-570を参照されたい）。特定の非限定的実施形態では、アンカー性ペプチドはGPIを介して機能しない。特定の非限定的実施形態では、アンカー性ペプチドは、脂肪酸/ジアシルグリセロールを介して細胞膜へとその連結されたタンパク質を固定することができる。特定の他の非限定的実施形態では、アンカー性ペプチドは、膜貫通ドメインを形成することができる領域（例えば、実質的に疎水性の領域および/または限定するものではないがTMpredなどの標準的なソフトウェアにより膜貫通ドメインであると予測される領域）を含む。特定の実施形態では、アンカー性ペプチドは、PD-L1膜貫通ドメインである。
【００６４】
特定の非限定的実施形態では、アンカー性ペプチドに（任意によりリンカーを介して）連結された免疫調節因子分子をコードする核酸は、腫瘍溶解性ウイルス感染細胞で活性または活性化可能であるプロモーター（例えば、腫瘍溶解性ウイルスのプロモーター）の制御下に配置されることができる。コード核酸は、それが挿入されるウイルスゲノムの核酸に適合するために、DNA、RNAまたはcDNAであり得る。
【００６５】
5.3.2.2. リンカー
特定の実施形態では、免疫調節因子分子を、アンカー性ペプチドに直接連結させることができる。あるいは、免疫調節因子分子は、リンカーを介してアンカー性ペプチドに連結させることができる。特定の実施形態では、リンカーは、切断可能リンカー、非切断可能リンカー、ペプチドリンカー、柔軟性リンカー、剛性リンカー、らせん状リンカー、非らせん状リンカーまたはそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、1個以上のリンカー（例えば、2個以上、3個以上または4個以上）を介してアンカー性ペプチドに連結させることができる。
【００６６】
特定の実施形態では、リンカーはペプチドリンカーである。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、GlyおよびSerを含む。特定の実施形態では、ペプチドリンカーは、例えば、限定するものではないが、約1〜約25または約5〜約20または約5〜約15アミノ酸長であり得る。本明細書中に開示される主題での使用のためのリンカーの非限定的な例は、国際公開 WO2017/165464号に開示され（例えば、配列番号42、44、45、75、76、77および78）、その内容はその全体が参照により本明細書中に組み入れられる。
【００６７】
特定の実施形態では、ペプチドリンカーは柔軟性リンカーである。特定の実施形態では、柔軟性リンカーは(G4S)3であり得、これはGGGGSGGGGSGGGGS（配列番号12）に対応する。特定の非限定的実施形態では、アンカー性ペプチドに連結されるリンカーは、アミノ酸配列GPAGGGGSGGGGSGGGGSVSTISSFSPPGYQVSFCLVMV LLFAVDTGLYFSVKTNI（配列番号16）あるいは約1箇所もしくは約2箇所のアミノ酸置換、挿入または欠失、または約1箇所、約2箇所もしくは約3箇所の保存的アミノ酸置換を保持する該配列を含むことができる。特定のGPIアンカー型サイトカインの非限定的な例は、米国特許出願公開第2003/0105054号（例えば、段落[0045]および[0075]）および米国特許第6,277,368号に提供され、それらの文献の内容はその全体が参照により本明細書中に組み入れられる。
【００６８】
特定の実施形態では、ペプチドリンカーは剛性リンカーを含む。特定の実施形態では、剛性リンカーは(A(EA3K)4AAA)（配列番号36）であり得、これはAEAAAKEAAAKEAAAKEAAAKAAAに対応する。特定の実施形態では、リンカーは、配列番号36のアミノ酸配列あるいは約1箇所もしくは約2箇所のアミノ酸置換、挿入または欠失、または約1箇所、約2箇所もしくは約3箇所の保存的アミノ酸置換を保持する該配列を含む。
【００６９】
5.3.2.3. 非限定的実施形態
特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題は、任意によりリンカーを介して、アンカー性ペプチドに連結された上記で説明された通りの免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質をコードする腫瘍溶解性ウイルスを提供する。
【００７０】
特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスである。特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、CXCL11、CCL5、IFN、IFN-α、IFN-α2、IFN-β、IFN-γ、TNF、TNF-α、TNF-β、GM-CSFまたはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-2である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-23である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はTNF-αである。
【００７１】
特定の非限定的実施形態では、アンカー性ペプチドは、配列番号1〜11のうちのいずれか1種の少なくとも一部分（例えば、少なくとも約10個または少なくとも約20個または少なくとも約25個の連続するアミノ酸残基を含む該一部分）を含む。具体的な非限定的実施形態では、アンカー性ペプチドは、配列番号11のアミノ酸配列、あるいは約1箇所もしくは約2箇所のアミノ酸置換、挿入または欠失、または約1箇所、約2箇所もしくは約3箇所の保存的アミノ酸置換を保持する配列を含む。
【００７２】
特定の非限定的実施形態では、免疫調節因子分子は、約1〜約25または約5〜約15アミノ酸長のペプチドリンカーにより、アンカー性ペプチドに連結される。特定の非限定的実施形態では、リンカーは、配列番号12および36のうちのいずれか1種の少なくとも一部分（例えば、少なくとも約10個または少なくとも約20個または少なくとも約25個の連続するアミノ酸残基を含む該一部分）を含む。特定の非限定的実施形態では、リンカーは、配列(G4S)3（配列番号12）またはその保存的置換を含む。特定の非限定的実施形態では、リンカーは、配列(A(EA3K)4AAA)（配列番号36）またはその保存的置換を含む。
【００７３】
特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、剛性リンカー（代替的に、本明細書中で「RGPI」または「RG」と称される）を介して、アンカー性ペプチド（例えば、GPIアンカー（例えば、ヒトCD16bのGPIアンカーアクセプター配列））に融合された免疫調節因子分子を含む膜結合型融合タンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、柔軟性リンカー（代替的に、本明細書中で「FGPI」または「FG」と称される）を介して、アンカー性ペプチド（例えば、GPIアンカー（例えば、ヒトCD16bのGPIアンカーアクセプター配列））に融合された免疫調節因子分子を含む膜結合型融合タンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。特定の実施形態では、GPIアンカー配列は、PD-L1膜貫通ドメインで置き換えることができる。
【００７４】
特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、剛性リンカーを介して、PD-L1膜貫通ドメインに融合された免疫調節因子を含む膜結合型融合タンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、(G4S)3リンカーを介して、PD-L1膜貫通ドメインに融合された免疫調節因子を含む膜結合型融合タンパク質をコードする遺伝子を含むことができる。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、柔軟性リンカーを介して、PD-L1膜貫通ドメインに融合された免疫調節因子を含む膜結合型融合タンパク質（代替的に、本明細書中で「FPTM」と称される）をコードする遺伝子を含むことができる。
【００７５】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、IL-2をコードするデオキシリボース核酸である核酸をそのゲノム中に含む腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）を提供する。特定の非限定的実施形態では、IL-2はヒトIL-2である。特定の非限定的実施形態では、ヒトIL-2は、配列番号13のアミノ酸配列の少なくとも一部分もしくはその保存的置換、または1個のアミノ酸もしくは2個のアミノ酸の変異を有する該配列を含む。特定の実施形態では、IL-2は、任意によりIL-2とアンカー性ペプチドとの間にリンカーペプチドを含んで、アンカー性ペプチドに連結される。特定の非限定的実施形態では、アンカー性ペプチドは、配列番号1〜11、17および37のうちのいずれか1種の少なくとも一部分（例えば、少なくとも約10個または少なくとも約20個または少なくとも約25個の連続するアミノ酸残基を含む該一部分）を含む。特定の非限定的実施形態では、IL-2は、約1〜約25または約5〜約15アミノ酸長のペプチドリンカーにより、アンカー性ペプチドに連結される。特定の実施形態では、IL-2をコードする核酸は、腫瘍溶解性ウイルス感染細胞で活性または活性化可能であるプロモーター、例えば、腫瘍溶解性ウイルスのプロモーター（例えば、ワクシニアウイルスプロモーター）に機能的に連結される。
【００７６】
特定の非限定的実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスのゲノム中に存在する核酸は、ペプチドリンカー（例えば、配列番号12のアミノ酸配列を含む）を介して、アンカー性ペプチド（例えば、配列番号11のアミノ酸配列を含む）に連結された、ヒトIL-2（例えば、配列番号13のアミノ酸配列を含む）をコードすることができる。例えば、限定するものではないが、核酸は、APTSSSTKKT QLQLEHLLLD LQMILNGINN YKNPKLTRML TFKFYMPKKA TELKHLQCLE EELKPLEEVL NLAQSKNFHL RPRDLISNIN VIVLELKGSE TTFMCEYADE TATIVEFLNR WITFCQSIIS TLTGPAGGGGSGGGGSGGGGS VSTISSFSPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNI（配列番号14）あるいは約1箇所もしくは約2箇所のアミノ酸置換、挿入または欠失、または約1箇所、約2箇所もしくは約3箇所の保存的アミノ酸置換を保持する該配列をコードする。特定の非限定的実施形態では、該コード核酸は、腫瘍溶解性ウイルスプロモーターに機能的に連結されることができる。特定の実施形態では、該コード核酸は、ワクシニアプロモーター（例えば、p7.5 e/lプロモーター、またはpSe/lプロモーター）に機能的に連結され、プロモーター/ANCHIMコード構築物を作製することができる。特定の非限定的実施形態では、プロモーター/ANCHIMコード構築物を、tk遺伝子中に挿入することができる。特定の他の非限定的実施形態では、プロモーター/ANCHIMコード構築物を、vgf遺伝子中に挿入することができる。
【００７７】
特定の非限定的実施形態では、核酸は、ペプチドリンカー（例えば、配列番号12および36のアミノ酸配列を含む）を介して、アンカー性ペプチド（例えば、配列番号11および37のアミノ酸配列を含む）に連結された、ヒトIL-2（例えば、配列番号13のアミノ酸配列を含む）をコードすることができる。特定の非限定的実施形態では、該コード核酸は、ワクシニアプロモーター（例えば、p7.5 e/lプロモーター、またはpSe/lプロモーター）に機能的に連結され、プロモーター/ANCHIMコード構築物を作製することができる。特定の非限定的実施形態では、プロモーター/ANCHIMコード構築物を、tk遺伝子中に挿入することができる。特定の他の非限定的実施形態では、プロモーター/ANCHIMコード構築物を、vgf遺伝子中に挿入することができる。
【００７８】
特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題は、TNF-αをコードするデオキシリボース核酸である核酸をそのゲノム中に含む、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供する。特定の実施形態では、TNF-αは、任意によりTNF-αとアンカー性ペプチドとの間にリンカーペプチドを含んで、アンカー性ペプチドに連結される。特定の実施形態では、核酸は、ワクシニアウイルス感染細胞で活性または活性化可能であるプロモーター（例えば、ワクシニアウイルスのプロモーター）に機能的に連結される。特定の非限定的実施形態では、TNF-αはヒトTNF-αである。特定の非限定的実施形態では、ヒトTNF-αは、少なくとも、配列番号15の免疫活性化部分あるいは1箇所もしくは2箇所のアミノ酸変異を保持する該配列を有する。特定の非限定的実施形態では、アンカー性ペプチドは、配列番号1〜11のうちのいずれか1種の少なくとも一部分（例えば、少なくとも約10個または少なくとも約20個または少なくとも約25個の連続するアミノ酸残基を含む該一部分）を含む。具体的な非限定的実施形態では、アンカー性ペプチドは、配列番号11、あるいは約1箇所もしくは約2箇所のアミノ酸置換、挿入または欠失、または約1箇所、約2箇所もしくは約3箇所の保存的アミノ酸置換を保持する該配列を含む。特定の非限定的実施形態では、TNF-αは、約1〜約25または約5〜約15アミノ酸長のペプチドリンカーにより、アンカー性ペプチドに連結される。特定の非限定的実施形態では、リンカーは、配列(G4S)3（配列番号12）を含む。特定の非限定的実施形態では、該コード核酸は、ワクシニアプロモーター（例えば、p7.5 e/lプロモーター、またはpSe/lプロモーター）に機能的に連結され、プロモーター/ANCHIMコード構築物を作製することができる。特定の非限定的実施形態では、プロモーター/ANCHIMコード構築物を、tk遺伝子中に挿入することができる。特定の他の非限定的実施形態では、プロモーター/ANCHIMコード構築物を、vgf遺伝子中に挿入することができる。特定の非限定的実施形態では、リンカーは、配列GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号12）を含む。特定の非限定的実施形態では、リンカーは、剛性リンカーの配列（配列番号36）を含む。
【００７９】
特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題は、IL-23p19およびIL-23p40をコードするデオキシリボース核酸である核酸をそのゲノム中に含む、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを提供する。特定の実施形態では、IL-23p19およびIL-23p40は、任意によりIL-23p40とアンカー性ペプチドとの間にリンカーペプチドを含んで、アンカー性ペプチドに連結される。特定の実施形態では、IL-23p19をコードする核酸は、ワクシニアウイルス感染細胞で活性または活性化可能であるプロモーター（例えば、ワクシニアウイルスのプロモーター）に機能的に連結される。特定の非限定的実施形態では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、IL-23p19のヒトホモログ（例えば、IL-23A）、およびIL-23p40のヒトホモログ（例えば、IL-12B）をコードするデオキシリボース核酸である核酸をそのゲノム中に含み、IL-23を作製する。特定の非限定的実施形態では、ヒトIL-23Aタンパク質は、少なくとも配列番号18の配列の免疫活性化部分または1箇所のアミノ酸変異を有する該配列を含む。
【００８０】
具体的な非限定的実施形態では、核酸は、IL-23p19またはそのヒトホモログ（例えば、IL-23A）（例えば、配列番号18のアミノ酸配列を含む）をコードすることができ、ペプチドリンカー（例えば、配列番号12および36のアミノ酸配列を含む）を介して、アンカー性ペプチド（例えば、配列番号11および37のアミノ酸配列を含む）に連結された、IL-23p40またはそのヒトホモログ（例えば、IL-12B）をさらにコードすることができる。特定の非限定的実施形態では、該コード核酸は、ワクシニアプロモーター（例えば、p7.5 e/lプロモーター、またはpSe/lプロモーター）に機能的に連結され、プロモーター/ANCHIMコード構築物を作製することができる。特定の非限定的実施形態では、プロモーター/ANCHIMコード構築物を、tk遺伝子中に挿入することができる。特定の他の非限定的実施形態では、プロモーター/ANCHIMコード構築物を、vgf遺伝子中に挿入することができる。
【００８１】
特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題は、上記の通り、任意により免疫調節因子分子とアンカー性ペプチドとの間にリンカーペプチドを含んで、アンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子をコードする核酸をそのゲノム中に含む、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスを提供する。特定の実施形態では、任意により免疫調節因子分子とアンカー性ペプチドとの間にリンカーペプチドを含んで、アンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子をコードする核酸は、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルス感染細胞で活性または活性化可能であるプロモーター（例えば、腫瘍溶解性単純ヘルペスウイルスのプロモーター）の制御下に配置されることができる。任意により免疫調節因子分子とアンカー性ペプチドとの間にリンカーペプチドを含んで、アンカー性ペプチドに連結されたコード核酸は、それが挿入されるウイルスゲノムの核酸に適合するために、DNA、RNAまたはcDNAであり得る。
【００８２】
本明細書中に開示される主題はさらに、例えば、生理的バッファー中の、上記の遺伝子操作型（組み換え型）腫瘍溶解性ウイルスのうちの1種以上を含む医薬組成物、および固体、液体、凍結、または凍結乾燥形態でのそのような治療用組成物を提供する。本明細書中に開示される主題はさらに、治療上有効量のそのような医薬組成物を含有する送達デバイス（例えば、シリンジ）を提供する。本明細書中に記載される1種以上の腫瘍溶解性ウイルスを含む医薬組成物の非限定的な例は、下記の5.7節に開示される。
【００８３】
5.4 腫瘍溶解性ウイルス投与
本明細書中に開示される腫瘍溶解性ウイルス（例えば、武装化型腫瘍溶解性ウイルス）は、当技術分野でのいずれかの公知の方法に従って投与することができる。例えば、限定するものではないが、本明細書中に記載される通りの腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）もしくはその医薬組成物または癌組織から単離された抗腫瘍T細胞を含む組成物を癌または腫瘍細胞へと送達するための方法は、腫瘍内注入を介し得る。特定の実施形態では、代替的投与方法、例えば、点滴を介する静脈内投与、非経口投与、静脈内投与、皮内投与、筋内投与、経皮投与、直腸投与、尿道内投与、膣内投与、鼻内投与、髄腔内投与、または腹腔内投与も用いることができる。投与経路は、腫瘍の位置および性質に応じて変わり得る。特定の実施形態では、投与経路は、歯内（intradental）投与、経皮（transdermal）投与、非経口投与、静脈内投与、筋内投与、鼻内投与、皮下投与、局所投与（例えば、特に脈管構造を伴うか、または腫瘍に近接する脈管構造を有する腫瘍の近傍での）、経皮（percutaneous）投与、髄腔内投与、気管内投与、腹腔内投与、動脈内投与、膀胱内投与、腫瘍内投与、吸入、灌流、洗浄による投与、または経口投与であり得る。特定の実施形態では、改変型ウイルスは、患者体内に移植された供給源から患者に投与することができる。
【００８４】
特定の実施形態では、改変型ウイルスの投与は、選択された期間にわたる持続注入により行なうことができる。特定の実施形態では、本明細書中に記載される通りの腫瘍溶解性ワクシニアウイルス、またはそれを含有する医薬組成物は、約15分間、約30分間、約45分間、約50分間、約55分間、約60分間、約75分間、約90分間、約100分間、もしくは約120分間またはそれ以上の期間にわたって、注入により治療上有効用量で投与することができる。
【００８５】
本開示の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスまたは医薬組成物は、液体剤型として投与することができ、この場合、合計投与体積は、約1mL〜約5mL、約5mL〜10mL、約15mL〜約20mL、約25mL〜約30mL、約30mL〜約50mL、約50mL〜約100mL、約100mL〜150mL、約150mL〜約200mL、約200mL〜約250mL、約250mL〜約300mL、約300mL〜約350mL、約350mL〜約400mL、約400mL〜約450mL、約450mL〜500mL、約500mL〜750mLまたは約750mL〜1000mLである。
【００８６】
特定の実施形態では、ウイルスの単回用量とは、1、2、5、10、15、20または24時間にわたって、被験体または腫瘍に投与される量を意味することができる。特定の実施形態では、用量は、時間をかけて投与するか、または別個の注入によることができる。特定の実施形態では、複数回用量（例えば、2、3、4、5、6またはそれ以上の用量）のワクシニアウイルスを被験体に投与することができ、例えば、その場合、2回目の処置は最初の処置の1、2、3、4、5、6、7日または週以内に行なうことができる。特定の実施形態では、改変型ウイルスの複数回用量は、1、2、3、4、5、6、7またはそれ以上の日数または週数にわたって被験体に投与することができる。特定の実施形態では、本明細書中に記載される通りの腫瘍溶解性ワクシニアウイルスまたは医薬組成物は、約1週間〜約2週間、約2週間〜約3週間、約3週間〜約4週間、約4週間〜約5週間、約6週間〜約7週間、約7週間〜約8週間、約8週間〜約9週間、約9週間〜約10週間、約10週間〜約11週間、約11週間〜約12週間、約12週間〜約24週間、約24週間〜約48週間、約48週間もしくは約52週間、またはそれ以上の期間にわたって投与することができる。本明細書中に記載される通りの腫瘍溶解性ワクシニアウイルスまたは医薬組成物の投与頻度は、特定の場合には、1日1回、1日2回、週1回、3週間に1回、4週間に1回（または1ヵ月に1回）、8週間に1回（または2ヵ月に1回）、12週間に1回（または3ヵ月に1回）、または24週間に1回（または6ヵ月に1回）であり得る。
【００８７】
本明細書中で相互に交換可能に用いられる用語「治療上有効量」または「有効量」とは、投与される場合に、治療対象の障害、疾患、または状態の症状のうちの1種以上の発症を予防するか、またはある程度まで軽減するために十分であり得る、腫瘍溶解性ウイルスの量を意味することができる。用語「治療上有効量」とはまた、細胞、組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を生起させるために十分である、腫瘍溶解性ウイルスの量を意味することもできる。そのような方法での有効量は、癌の生長速度もしくは拡散を低減させるか、または被験体での生存期間を延長する量を含むことができる。本開示は、上記の通りの改変型ウイルスの有効量を腫瘍に投与するステップを含むことができる、腫瘍の生長を低減させる方法を提供する。特定の実施形態では、改変型ウイルスまたはその医薬組成物の有効量は、腫瘍の生長もしくはサイズの遅延、阻害または低減を誘導するために十分な量を含むことができ、かつ、腫瘍の根絶を含むことができる。腫瘍の生長を低減させることは、例えば、生長速度の低下または腫瘍を担持する被験体の生存の延長により、現われ得る。特定の実施形態では、「治療上有効量」または「有効量」は、腫瘍および/または癌へのT細胞の浸潤を誘導するために十分な量を含むことができる。
【００８８】
ウイルスの有効量は、当技術分野で公知の方法により決定することができる。特定の実施形態では、ウイルスは、腫瘍中の細胞のうちの少なくとも約20％での、腫瘍中の細胞のうちの少なくとも約30％での、腫瘍中の細胞のうちの少なくとも約40％での、腫瘍中の細胞のうちの少なくとも約50％での、腫瘍中の細胞のうちの少なくとも約60％での、腫瘍中の細胞のうちの少なくとも約70％での、腫瘍中の細胞のうちの少なくとも約80％での、または腫瘍中の細胞のうちの少なくとも約90％での、腫瘍溶解を誘導するために十分な量で投与することができる。
【００８９】
特定の実施形態では、投与されるウイルスの量は、約1×107〜1×1010個の感染性ウイルス粒子もしくはプラーク形成単位（pfu）、または約1×107〜1×109pfu/治療対象被験体の体表面積m2であり得る。特定の実施形態では、ウイルスは、約1×108pfuを含むことができる用量で投与することができる。特定の実施形態では、投与されるウイルスの量は、約1×103〜1×1012個のウイルス粒子もしくはpfu、または約1×105〜1×1010pfu、または約1×105〜1×108pfu、または約1×108〜1×1010pfuであり得る。特定の実施形態では、ウイルスは、約1×103pfu/用量〜約1×104pfu/用量、約1×104pfu/用量〜約1×105pfu/用量、約1×105pfu/用量〜約1×106pfu/用量、約1×107pfu/用量〜約1×108pfu/用量、約1×109pfu/用量〜約1×1010pfu/用量、約1×1010pfu/用量〜約1×1011pfu/用量、約1×1011pfu/用量〜約1×1012pfu/用量、約1×1012pfu/用量〜約1×1013pfu/用量、約1×1013pfu/用量〜約1×1014pfu/用量、または約1×1014pfu/用量〜約1×1015pfu/用量を含むことができる用量で投与することができる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題の腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、約1×103ウイルス粒子/用量〜約1×104ウイルス粒子/用量、約1×104ウイルス粒子/用量〜約1×105ウイルス粒子/用量、約1×105ウイルス粒子/用量〜約1×106ウイルス粒子/用量、約1×107ウイルス粒子/用量〜約1×108ウイルス粒子/用量、約1×109ウイルス粒子/用量〜約1×1010ウイルス粒子/用量、約1×1010ウイルス粒子/用量〜約1×1011ウイルス粒子/用量、約1×1011ウイルス粒子/用量〜約1×1012ウイルス粒子/用量、約1×1012ウイルス粒子/用量〜約1×1013ウイルス粒子/用量、約1×1013ウイルス粒子/用量〜約1×1014ウイルス粒子/用量、または約1×1014ウイルス粒子/用量〜約1×1015ウイルス粒子/用量を含むことができる用量で投与することができる。
【００９０】
5.5. 製造方法
5.5.1. 腫瘍溶解性ウイルスにより誘導された腫瘍浸潤型T細胞（「OV誘導型T細胞」）の単離および調製
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、腫瘍微小環境への免疫細胞の浸潤を促進し、したがって腫瘍溶解性ウイルスにより誘導された腫瘍浸潤型免疫細胞とする腫瘍溶解性ウイルスに関する。
【００９１】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、全身性の強力な抗腫瘍免疫細胞を生じさせる腫瘍溶解性ウイルスに関し、このとき、抗腫瘍細胞は、腫瘍組織から単離し、ex vivoで増殖させ、癌治療のために（例えば、養子T細胞移入の様式で）癌患者に投与することができる。
【００９２】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、腫瘍微小環境へのT細胞の浸潤を促進し、したがってOV誘導型T細胞（本明細書中では「腫瘍浸潤型T細胞」または「TIL」とも称される）とする腫瘍溶解性ウイルスに関する。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍特異的CD8+およびCD4+ T細胞の浸潤を促進する。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、活性化された生得的免疫細胞の浸潤を促進する。特定の実施形態では、活性化された生得的免疫細胞は、ナチュラルキラー（NK）細胞を含む。
【００９３】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップ、および被験体の腫瘍組織へのT細胞の誘出を誘導し、かつ輸送するステップを含む、OV誘導型T細胞を作製する方法に関する。腫瘍溶解性ウイルスの非限定的な例は、上記の5.1節および5.3節に開示される。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスはワクシニアウイルスであり得る。例えば、限定するものではないが、ワクシニアウイルスはvvDDであり得る。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、vvDD）は、発現可能な形態で、免疫調節因子分子をコードする。例えば、限定するものではないが、免疫調節因子分子は、IL-2、IL-15、CXC11および/またはCCL5であり得る。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、発現可能な形態で、上記の通りの少なくとも1種の分泌型および/または少なくとも1種の膜結合型免疫調節因子分子をコードする腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（例えば、vvDD）に関する。特定の非限定的実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、発現可能な形態で、IL-2、例えば、分泌型または膜結合型IL-2をコードする。
【００９４】
特定の実施形態では、OV誘導型T細胞を作製する方法は、被験体から（例えば、被験体の腫瘍から）OV誘導型T細胞を単離するステップをさらに含む。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、リンパ組織および非リンパ組織から、または末梢血から単離することができる。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、癌組織から単離することができる。例えば、T細胞は、組織を消化して、密度勾配遠心分離を用いる（例えば、Percoll密度勾配を用いる）ことにより、組織から単離することができる。
【００９５】
特定の実施形態では、OV誘導型T細胞を作製する方法は、ex vivoで単離されたOV誘導型T細胞を増殖させるステップをさらに含む。特定の実施形態では、ex vivo増殖の間に、単離されたOV誘導型T細胞を、1種以上のサイトカイン、リンホカイン、および/または1種以上の薬剤（例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、IFN-α、IFN-α2、IFN-β、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、GM-CSFまたはそれらの組み合わせ）を用いて処理することができる。例えば、限定するものではないが、単離されたOV誘導型T細胞は、IL-7、IL-2および/またはGSK3b阻害剤を用いて処理することができる。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、IL-2を用いて処理することができる。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、IL-7を用いて処理することができる。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、IL-2およびIL-7を用いて処理することができる。特定の非限定的な例では、単離されたT細胞は、約2〜約10日間（例えば、約3日間）、処理することができる。
【００９６】
特定の実施形態では、単離されたOV誘導型T細胞は、樹状細胞および癌細胞と共に共培養される。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞を、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、本明細書中に開示される腫瘍溶解性ウイルス）に感染している癌細胞と共に共培養することができる。特定の実施形態では、癌細胞は、OV誘導型T細胞を作製するために用いられる腫瘍溶解性ウイルスとは異なる腫瘍溶解性ウイルスに感染させることができる。特定の実施形態では、単離されたOV誘導型T細胞は、樹状細胞および癌細胞と共に、約2〜約10日間（例えば、約2日間）、共培養される。特定の実施形態では、共培養されたT細胞は、続いて、1種以上のサイトカインおよび/または1種以上の薬剤を用いて処理される。
【００９７】
特定の実施形態では、腫瘍微小環境でのT細胞浸潤を促進する腫瘍溶解性ウイルスの能力を定量化するために、単離されたOV誘導型T細胞を、CD3、CD8、CD4、および4-1BBに対する抗体を用いて分析することができる。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍微小環境でのCD3+、CD8+、CD4+、および4-1BB+ T細胞の浸潤を促進する。特定の実施形態では、単離されたOV誘導型T細胞は、CD3+、CD8+、CD4+および/または4-1BB+である。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、CD3+である。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、CD3+である。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、CD4+である。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、CD8+である。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、CD4+ 4-1BB+である。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、CD8+ 4-1BB+である。
【００９８】
特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、下記の5.6.1.節に記載される通り、養子T細胞移入を介した癌療法のために用いることができる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、養子免疫療法に関し、この場合、腫瘍浸潤型T細胞は、腫瘍組織から単離され、ex vivoで増殖され、（例えば、養子T細胞移入の様式で）癌治療のために癌患者に投与されることができる。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、癌細胞および随伴する間質細胞を殺傷するそれらの機能を発揮することができる。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、細胞が単離された被験体に移植することができる。あるいは、および/またはそれに加えて、OV誘導型T細胞は、異なる被験体に移植することができる。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、同種異系である。
【００９９】
特定の実施形態では、被験体への単離されたOV誘導型T細胞の移植に先立って、単離されたOV誘導型T細胞を、共培養アッセイで腫瘍特異性について分析することができる。特定の実施形態では、単離されたOV誘導型T細胞は、標的癌細胞、無関係の癌細胞または脾細胞と共に、約1〜約10日間（例えば、約1日間）、共培養される。具体的な実施形態では、癌細胞はγ照射される。特定の実施形態では、単離されたOV誘導型T細胞は、標的癌細胞、無関係の癌細胞または脾細胞と共に共培養される。特定の実施形態では、移植のための単離されたOV誘導型T細胞は、標的腫瘍細胞に対して特異的反応性を提示することができる。特定の実施形態では、特異的反応性は、無関係な標的癌細胞または脾細胞と共に共培養される場合と比較して、それらが標的癌細胞と共に共培養される場合での、単離されたOV誘導型T細胞によるIFN-γ発現の増大を含む。
【０１００】
5.6. 治療方法
本開示は、癌を有する被験体の治療のための方法を提供する。特に、本開示は、養子T細胞免疫療法の様式として、癌を有する被験体に、単離されたOV誘導型T細胞を投与するステップを含む、癌を有する被験体の治療のための方法を提供する。本開示はさらに、免疫調節因子分子（例えば、分泌型または膜結合型）を用いて武装化されている腫瘍溶解性ウイルスの投与を含む、癌を有する被験体の治療のための方法を提供する。
【０１０１】
本明細書中に開示される方法での使用のための腫瘍溶解性ウイルスの非限定的な例は、上記の5.1節、5.3節および5.5節に開示されている。腫瘍溶解性ウイルスを投与する方法は、上記の5.4節に開示されている。被験体は、ヒトまたは非ヒト被験体であり得る。非ヒト被験体の非限定的な例としては、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、ハムスターおよび他のげっ歯類、ウサギ等が挙げられる。
【０１０２】
開示される方法により治療することができる癌の非限定的な例としては、消化管癌、結腸癌、結腸直腸癌、卵巣癌、中皮腫、黒色腫、乳癌、脳癌（例えば、膠芽腫）、前立腺癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、胆膵管癌、肝臓の腺癌、胃癌、肝臓癌、腹膜癌、胸膜癌、造血細胞癌、および転移癌が挙げられる。
【０１０３】
特定の実施形態では、単離されたOV誘導型T細胞の投与によるか、または改変型ウイルスを用いることによる治療は、単独で、または1種以上の免疫調節剤と組み合わせて用いることができる。免疫調節剤としては、腫瘍または癌に伴う抗ウイルス免疫を抑制することが可能であるいずれかの化合物、分子または物質が挙げられる。特定の実施形態では、免疫調節剤は、生得的な免疫または改変型ウイルスに対する適応免疫を抑制することが可能であり得る。免疫調節剤の非限定的な例としては、抗CD33抗体またはその可変領域、抗CD11b抗体またはその可変領域、COX2阻害剤（例えば、セレコキシブ）、IL-12、GM-CSF、IL-2、IFN3およびIFNγなどのサイトカイン、ならびにMIP-1、MCP-1およびIL-8などのケモカインが挙げられる。特定の実施形態では、免疫調節剤としては、限定するものではないが、抗CTLA4抗体、抗PD-1抗体、抗PDL1抗体およびTLRアゴニスト（例えば、Poly I:C）などの、免疫チェックポイント阻害因子が挙げられる。特定の実施形態では、チェックポイント阻害因子としては、PD-1、PD-L1および/もしくはCTLA4活性および/または機能を阻害および/または低下させる分子および/または化合物が挙げられる。特定の実施形態では、免疫調節剤は、全身的または局所的に投与することができる。
【０１０４】
本明細書中で用いる場合、「と組み合わせて」とは、本明細書中に記載される通りの腫瘍溶解性ワクシニアウイルスなどのウイルスまたはその医薬組成物、および追加の療法が、治療レジメンまたは治療計画の一部分として被験体に投与されることを意味する。特定の実施形態では、組み合わせて用いられることは、腫瘍溶解性ウイルスと1種以上の薬剤とが、投与前に物理的に組み合わされること、またはそれらが同じ時間枠にわたって投与されることを必要としない。例えば、限定するものではないが、腫瘍溶解性ウイルスと1種以上の薬剤とは、治療対象である被験体に同時に投与されることができ、あるいは、同じ時点もしくはいずれかの順序で連続的に、または異なる時点で投与されることができる。特定の実施形態では、本開示の方法は、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、免疫調節因子分子（例えば、IL-2）をコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルス）の投与に先立つ、免疫調節剤の投与を含むことができる。例えば、限定するものではないが、免疫調節剤は、例えば、全身的または局所的に投与される、IL-2であり得る。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題の方法は、本明細書中に開示される腫瘍溶解性ウイルス（例えば、免疫調節因子分子（例えば、IL-2）をコードする核酸を含む腫瘍溶解性ウイルス）の投与、および/または免疫調節剤（例えば、IL-2）の投与により、治療対象である被験体での初期免疫応答を促進するステップを含むことができる。
【０１０５】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題の方法は、1種以上の単離されたOV誘導型T細胞、本明細書中に開示される通りのウイルスまたはその医薬組成物と、それに続くか、先立つか、または組み合わせた1種以上の追加の療法を投与するステップを含むことができる。そのような療法の非限定的な例としては、化学療法、放射線照射、追加のウイルスを用いる腫瘍溶解性ウイルス療法、免疫調節因子タンパク質を用いる治療、抗癌剤またはそれらのいずれかの組み合わせが挙げられる。抗癌剤としては、限定するものではないが、化学療法剤、放射線療法剤、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、血管新生阻害剤、アポトーシス誘導剤、抗癌抗体および/またはサイクリン依存性キナーゼ阻害剤が挙げられる。特定の実施形態では、癌療法として、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、血管阻害療法（anti-vascular therapy）、凍結療法、毒物療法および/もしくは外科手術またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１０６】
本明細書中に開示される主題の特定の非限定的実施形態は、癌が早期癌である、癌を治療する方法を提供する。本明細書中に開示される主題の特定の非限定的実施形態は、癌が早期癌でない、上記で説明される通りの癌を治療する方法を提供する。例えば、限定するものではないが、癌は後期癌であり得る。特定の実施形態では、後期癌とは、もはや原発器官には限定されていない癌（例えば、原発器官を越えて局所的に拡大している場合があり、または身体内の別の箇所へと転移している場合がある）を意味することができる。特定の実施形態では、後期癌は、グレードIIIの癌であり得る。特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題は、局所浸潤性または転移性の癌を治療するために用いることができる。
【０１０７】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、ステージT3以上かつ/またはM1以上である結腸癌の治療に適用することができる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、ステージ1C以上である卵巣癌の治療に適用することができる。別の特定の非限定的実施形態では、本明細書中に開示される主題は、ステージ2またはステージ3以上である中皮腫の治療に適用することができる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、ステージIII以上である黒色腫の治療に適用することができる。
【０１０８】
5.6.1. 養子T細胞免疫療法
本明細書中に開示される主題は、単離されたOV誘導型T細胞を用いて、癌に罹患している被験体を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、上記の5.5.節に記載される通りに生成される。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、細胞が単離された被験体に移植することができる。あるいは、および/またはそれに加えて、OV誘導型T細胞は、異なる被験体に移植することができる。
【０１０９】
本明細書中に開示される主題は、OV誘導型T細胞を単離するステップ、それらをex vivoで増殖させるステップ、および癌に罹患している被験体へとそれらを移植し戻すステップを含む、養子T細胞免疫療法を提供する。養子T細胞移入のための方法は、米国特許出願公開第2003/0170238号に開示されている（その内容は参照により本明細書中に組み入れられる）。
【０１１０】
特定の実施形態では、癌に罹患している被験体を治療する方法は、治療上有効量のOV誘導型T細胞を被験体に投与するステップを含む。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、異なる被験体から単離された。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、OV誘導型T細胞を用いて治療される対象である被験体から単離された。
【０１１１】
特定の実施形態では、癌に罹患している被験体を治療する方法は、有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップ、強力な抗腫瘍T細胞の生起を誘導するステップ、誘導された強力な抗腫瘍T細胞の腫瘍組織中への輸送を促進してOV誘導型T細胞を生成させるステップ、OV誘導型T細胞を単離するステップ、および単離されたOV誘導型T細胞を被験体に投与するステップを含む。
【０１１２】
特定の実施形態では、癌に罹患している被験体を治療する方法は、(a) 有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップ；(b) OV誘導型T細胞を単離するステップ；(c) 腫瘍浸潤型T細胞を増殖させるステップ；および(d) 癌に罹患している被験体に腫瘍浸潤型T細胞を移植するステップ、を含む。
【０１１３】
特定の非限定的実施形態では、上記の通りに、1種以上のサイトカインおよび/または1種以上の薬剤を用いて処理され、ex vivoで増殖させた単離されたOV誘導型T細胞を、続いて、癌患者に、例えば、腹腔内（i.p.）に導入する。特定の実施形態では、単離されたOV誘導型T細胞は、癌患者に腫瘍内投与される。
【０１１４】
開示される方法での使用のための腫瘍溶解性ウイルスの非限定的な例は、上述されている。例えば、限定するものではないが、腫瘍溶解性ウイルスは、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスであり得る。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルスのウエスタンリザーブ株であり得る。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、vvDDワクシニアウイルスである。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、ワクシニアウイルス（例えば、vvDD）である。特定の非限定的実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、免疫調節因子分子をコードする核酸をそのゲノム中に含むことができる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、上記の通りの、膜結合ドメイン（例えば、アンカー性ペプチド）に連結された免疫調節因子分子を含む、少なくとも1種の分泌型および/または少なくとも1種の膜結合型免疫調節因子分子を、発現可能な形態でコードする、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに関する。特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、CXCL11、CCL5、IFN、IFN-α、IFN-α2、IFN-β、IFN-γ、TNF、TNF-α、TNF-β、GM-CSFまたはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-2である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-23である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はTNF-αである。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はCXC11である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はCCL5である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-15である。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）は、IL-2をコードする核酸を含むことができる。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、IL-2をコードする核酸を含むワクシニアウイルスのウエスタンリザーブ株である。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、IL-2をコードする核酸を含むvvDDワクシニアウイルスである。特定の
実施形態では、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）は、アンカー性ペプチドに連結されているIL-2をコードする核酸を含むことができる。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、アンカー性ペプチドに連結されたIL-2をコードする核酸を含むワクシニアウイルスのウエスタンリザーブ株である。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、アンカー性ペプチドに連結されたIL-2をコードする核酸を含むvvDDワクシニアウイルスである。特定の実施形態では、IL-2は、剛性リンカーを介してアンカー性ペプチドに連結される。例えば、限定するものではないが、腫瘍溶解性ウイルスは、剛性リンカー（例えば、(A(EA3K)4AAA)リンカーを含むリンカー）を介してアンカー性ペプチドに連結されたIL-2をコードする核酸を含む、ワクシニアウイルスのウエスタンリザーブ株である。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、剛性リンカー（例えば、(A(EA3K)4AAA)リンカーを含むリンカー）を介してアンカー性ペプチドに連結されたIL-2をコードする核酸を含む、vvDDワクシニアウイルスである。
【０１１５】
特定の非限定的実施形態では、T細胞移植に先立って、癌患者に、上記で開示される別の癌療法を投与することができる。特定の非限定的実施形態では、T細胞移植の後に、癌患者に、上記で開示される別の癌療法を投与することができる。例えば、限定するものではないが、癌療法としては、化学療法、生物学的療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、血管阻害療法（anti-vascular therapy）、凍結療法、毒物療法および/もしくは外科手術またはそれらの組み合わせが挙げられる。特定の非限定的実施形態では、癌患者に、T細胞移植に先立って、1種以上の外因性サイトカインおよび1種以上の薬剤（例えば、免疫調節剤）を投与することができる。特定の非限定的実施形態では、癌患者に、T細胞移植の後に、1種以上の外因性サイトカインおよび1種以上の薬剤を投与することができる。特定の実施形態では、サイトカインおよび/または薬剤は、局所的または全身的に投与することができる。特定の実施形態では、サイトカインおよび/または薬剤は、局所的に投与される。例えば、限定するものではないが、癌患者は、T細胞移植の前および/または後に、外因性IL-2を投与されることができる。
例えば、限定するものではないが、癌患者は、T細胞移植の後に、外因性IL-2を投与されることができる。
【０１１６】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題のOV誘導型T細胞を投与される被験体は、OV誘導型T細胞の投与の前および/または後に、放射線療法を受けることができる。例えば、限定するものではないが、放射線量は、約100Rad（1Gy）〜約500Rad（5Gy）、約5,000Rad（50Gy）〜約100,000Rad（1000Gy）、または約50,000Rad（500Gy）、または記載された範囲内の他の適切な線量であり得る。「Gy」は、本明細書中で用いる場合、100Radに等しい放射線照射の比吸収線量に対する単位を意味することができる。Gyは「Gray」の略語である。
【０１１７】
5.6.2. 武装化型腫瘍溶解性ウイルスを用いる治療
本明細書中に開示される主題はさらに、本明細書中に開示される、有効量の腫瘍溶解性ウイルス（例えば、武装化型腫瘍溶解性ウイルス）を被験体に投与するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法を提供する。本明細書中に開示される方法での使用のための腫瘍溶解性ウイルス（例えば、武装化型腫瘍溶解性ウイルス）の非限定的な例は、上記の5.1節、5.3節および5.5節に開示されている。腫瘍溶解性ウイルスを投与する方法は、上記の5.4節に開示されている。
【０１１８】
特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書中に記載される通りの免疫調節因子分子をコードする核酸をそのゲノム中に含む、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルスまたは水疱性口内炎ウイルスであり得る。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書中に記載される通りの免疫調節因子分子をコードする核酸をそのゲノム中に含む、ワクシニアウイルスのウエスタンリザーブ株であり得る。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、本明細書中に記載される通りの免疫調節因子分子をコードする核酸をそのゲノム中に含む、vvDDワクシニアウイルスである。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、上記の通りの少なくとも1種の分泌型免疫調節因子分子および/または少なくとも1種の膜結合型免疫調節因子分子を、発現可能な形態でコードする。特定の実施形態では、免疫調節因子分子は、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、CXCL11、CCL5、IFN、IFN-α、IFN-α2、IFN-β、IFN-γ、TNF、TNF-α、TNF-β、GM-CSFまたはそれらの組み合わせであり得る。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-2である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-23である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はTNF-αである。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はCXC11である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はCCL5である。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-15である。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）は、IL-2をコードする核酸を含むことができる。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、IL-2をコードする核酸を含むワクシニアウイルスのウエスタンリザーブ株である。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、IL-2をコードする核酸を含むvvDDワクシニアウイルスである。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス）は、アンカー性ペプチドに連結されたIL-2をコードする核酸を含むことができる。特定の実施形態では、腫瘍
溶解性ウイルスは、アンカー性ペプチドに連結されたIL-2をコードする核酸を含むワクシニアウイルスのウエスタンリザーブ株である。特定の実施形態では、IL-2は、剛性リンカーを介してアンカー性ペプチドに連結される。例えば、限定するものではないが、腫瘍溶解性ウイルスは、剛性リンカー（例えば、(A(EA3K)4AAA)リンカーを含むリンカー）を介してアンカー性ペプチドに連結されたIL-2をコードする核酸を含むワクシニアウイルスのウエスタンリザーブ株である。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスは、剛性リンカー（例えば、(A(EA3K)4AAA)リンカーを含むリンカー）を介してアンカー性ペプチドに連結されたIL-2をコードする核酸を含むvvDDワクシニアウイルスである。
【０１１９】
本明細書中に開示される主題は、有効量の武装化型腫瘍溶解性ウイルス（例えば、上記の通りの免疫調節因子分子を発現可能な形態でコードする腫瘍溶解性ウイルス）を被験体に投与するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスの投与は、ウイルスに感染した細胞からの免疫調節因子分子の分泌をもたらす。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-2である。
【０１２０】
本明細書中に開示される主題は、上記の通りの、アンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質を発現可能な形態でコードする有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法を提供する。特定の実施形態では、免疫調節因子分子はIL-2である。
【０１２１】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、治療上有効量の本明細書中に記載される腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを被験体に投与するステップを含む、被験体の癌細胞の生長および/もしくは増殖を阻害し、かつ/または癌細胞の死滅を促進する方法を提供する。
【０１２２】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、治療上有効量の本明細書中に記載される腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを被験体に投与するステップを含む、被験体の腫瘍の生長を阻害する方法を提供する。
【０１２３】
本発明はさらに、治療上有効量の本明細書中に記載される腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを腫瘍に対して投与し、かつ/または腫瘍に接触させるステップを含む、腫瘍の生長を低減させるかまたは阻害する方法を提供する。
【０１２４】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、治療上有効量の本明細書中に記載される腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを被験体に投与するステップを含む、癌を有する被験体の生存期間を延長するための方法を提供する。特定の実施形態では、癌を有する被験体の生存期間は、約1ヵ月、約2ヵ月、約4ヵ月、約6ヵ月、約8ヵ月、約10ヵ月、約12ヵ月、約14ヵ月、約18ヵ月、約20ヵ月、約2年、約3年、約5年またはそれ以上、延長される。
【０１２５】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題はさらに、感染細胞から分泌されることができる免疫調節因子分子を発現可能な形態でコードする有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップ、および強力な抗腫瘍T細胞の生起を誘導するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法を提供する。
【０１２６】
本明細書中に開示される主題はまた、上記の通りの異種アンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質を発現可能な形態でコードする有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップ、T細胞が癌細胞および随伴する間質細胞に対するその細胞傷害性を発揮し、つまり抗腫瘍機能を示すであろう腫瘍組織への、誘導された強力な抗腫瘍T細胞の輸送を促進するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法を提供する。
【０１２７】
本明細書中に開示される主題はまた、上記の通りのアンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質を発現可能な形態でコードする有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップ、強力な抗腫瘍T細胞の生起を誘導するステップ、およびT細胞が癌細胞および随伴する間質細胞に対するその細胞傷害性を発揮し、つまり抗腫瘍機能を示すであろう腫瘍組織への、誘導された強力な抗腫瘍T細胞の輸送を促進するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法を提供する。
【０１２８】
本明細書中に開示される主題の特定の非限定的実施形態は、癌が早期癌である、上記で説明される通りの癌を治療する方法を提供する。本明細書中に開示される主題の特定の非限定的実施形態は、癌が早期癌でない、上記で説明される通りの癌を治療する方法を提供する。本明細書中に開示される主題の特定の非限定的実施形態は、癌が後期癌である、上記で説明される通りの癌を治療する方法を提供する。
【０１２９】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題は、早期癌と比較して、肝臓および/もしくは腎臓での腫瘍負荷および/または浮腫が増大しているか、免疫抑制性CD4+Foxp3+、CD4+PD-1+およびCD8+PD-1+ T細胞、G-MDSCおよびPD-L1+細胞の存在が増加しているか、かつ/またはNK細胞の存在が低減している場合に、あるいは腫瘍微小環境でのPD-1、PD-L1、TGF-βおよびVEGF発現が増加している場合に、癌を治療する方法を提供する。
【０１３０】
特定の実施形態では、有効量の腫瘍溶解性ウイルスの投与は、分泌されることができる免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質を発現可能な形態でコードする腫瘍溶解性ウイルスを投与された腫瘍と比較して、上記の通りのアンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質を発現可能な形態でコードする腫瘍溶解性ウイルスを投与された腫瘍での、IFN-γ、グランザイムB、パーフォリンおよびTGF-β、IL-10のレベルの上昇および/または血管新生マーカー（例えば、CD105およびVEGF）のレベルの低下をもたらす。
【０１３１】
特定の実施形態では、直上で開示された主題は、任意によりチェックポイント阻害剤（例えば、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体および/または抗CTLA-4抗体）と組み合わせて、本明細書中に記載される有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法を提供する。
【０１３２】
特定の実施形態では、直上で開示された主題は、任意により抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体および/または抗CTLA-4抗体と組み合わせて、本明細書中に記載される有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法を提供する。例えば、限定するものではないが、本明細書中に開示される方法は、抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体と組み合わせて、IL-2をコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップを含み得る。特定の実施形態では、本明細書中に開示される方法は、抗CTLA-4抗体と組み合わせて、IL-2をコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップを含み得る。特定の実施形態では、癌に罹患している被験体を治療する方法は、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体および/または抗CTLA-4抗体と組み合わせて、IL-2をコードする核酸を含む有効量のワクシニアウイルスのウエスタンリザーブ株を被験体に投与するステップを含む。
【０１３３】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題はまた、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体および/または抗CTLA-4抗体と組み合わせて、上記の通りのアンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子分子を含む膜結合型タンパク質を発現可能な形態でコードする有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップを含む、癌に罹患している被験体を治療する方法を提供する。例えば、限定するものではないが、本明細書中に開示される方法は、抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体と組み合わせて、アンカー性ペプチドに連結されたIL-2を含む膜結合型タンパク質をコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップを含むことができる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される方法は、抗CTLA-4抗体と組み合わせて、アンカー性ペプチドに連結されたIL-2を含む膜結合型タンパク質をコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップを含むことができる。特定の実施形態では、癌に罹患している被験体を治療する方法は、抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体および/または抗CTLA-4抗体と組み合わせて、アンカー性ペプチドに連結されたIL-2をコードする核酸を含む有効量のワクシニアウイルスのウエスタンリザーブ株を被験体に投与するステップを含むことができる。特定の実施形態では、IL-2は、剛性リンカーを介してアンカー性ペプチドに連結される。例えば、限定するものではないが、腫瘍溶解性ウイルスは、剛性リンカー（例えば、(A(EA3K)4AAA)リンカーを含むリンカー）を介してアンカー性ペプチドに連結されたIL-2をコードする核酸を含むワクシニアウイルスのウエスタンリザーブ株である。
【０１３４】
特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題の方法は、ナチュラルキラー（NK）細胞、CD8+ T細胞および/またはCD4+ T細胞の枯渇を含むことができる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される主題の方法は、循環IFN-γの中和を含むことができる。例えば、限定するものではないが、本明細書中に開示される主題の方法は、本明細書中に開示される通りの腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップ、ならびに被験体体内のCD8+ T細胞、NK細胞および/またはCD4+ T細胞の枯渇ならびに/または被験体体内の循環IFN-γの中和を含むことができる。特定の実施形態では、枯渇および/または中和は、抗体（例えば、CD8、CD4、NK1.1および/またはIFN-γに対する抗体）を用いることにより得ることができる。特定の実施形態では、癌に罹患している被験体を治療する方法は、IL-2をコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップ、およびNK細胞の欠失を含むことができる。例えば、限定するものではないが、方法は、IL-2をコードする核酸を含む有効量のワクシニアウイルスのウエスタンリザーブ株を被験体に投与するステップ、およびNK細胞の欠失（例えば、抗NK1.1抗体の投与による）を含むことができる。特定の実施形態では、癌に罹患している被験体を治療する方法は、アンカー性ペプチドに連結された免疫調節因子を含む膜結合型タンパク質をコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップ、およびNK細胞の欠失を含むことができる。特定の実施形態では、本明細書中に開示される方法は、アンカー性ペプチドに連結されたIL-2を含む膜結合型タンパク質をコードする核酸を含む有効量の腫瘍溶解性ウイルスを被験体に投与するステップ、およびNK細胞の欠失を含むことができる。例えば、限定するものではないが、方法は、アンカー性ペプチドに連結されたIL-2を含む膜結合型タンパク質をコードする核酸を含む有効量のワクシニアウイルスのウエスタンリザーブ株を被験体に投与するステップ、およびNK細胞の欠失（例えば、抗NK1.1抗体の投与による）を含むことができる。
特定の実施形態では、被験体は、早期癌に罹患している。特定の実施形態では、癌は、早期癌でない。特定の実施形態では、被験体は、後期癌に罹患している。
【０１３５】
5.7. 医薬組成物
本開示はさらに、癌組織から単離された、1個以上の単離されたOV誘導型T細胞を含む医薬組成物を提供する。
【０１３６】
本開示はさらに、本明細書中に開示される改変型ウイルスを含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、本明細書中に記載される通りの改変型ウイルス（腫瘍溶解性ワクシニアウイルスなど）を含有する医薬組成物を、溶液剤、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよび油中のそれらのいずれかの組み合わせの中の分散液剤、固体投与剤型、吸入投与剤型、鼻内投与剤型、リポソーム製剤、ナノ粒子を含む剤型、微粒子を含む剤型、高分子投与剤型、またはそれらのいずれかの組み合わせとして調製することができる。
【０１３７】
医薬組成物は、特定の投与経路に関連して製剤化される。例えば、限定するものではないが、非経口的、静脈内、皮内、筋内、経皮または腹腔内投与することができる医薬組成物が、米国特許第5,543,158号、同第5,641,515号および同第5,399,363号に記載されている（これらの文献の内容は、その全体が参照により本明細書中に組み入れられる）。
【０１３８】
特定の実施形態では、本明細書中に記載される通りの医薬組成物は、製薬上許容される担体（例えば、賦形剤）を含むことができる。「製薬上許容される」とは、本明細書中で用いる場合、活性成分の生物学的活性の有効性に干渉せず、かつ/または投与される患者に対して毒性でない、いずれかの担体が挙げられる。賦形剤は、Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association (1986)に記載されている賦形剤であり得る。好適な賦形剤の非限定的な例としては、緩衝剤、保存剤、安定化剤、結合剤、圧縮剤、滑沢剤、キレート剤、分散促進剤、崩壊剤、香料、甘味料および着色料が挙げられる。
【０１３９】
特定の実施形態では、賦形剤は緩衝剤であり得る。好適な緩衝剤の非限定的な例としては、クエン酸ナトリウム、炭酸マグネシウム、重炭酸マグネシウム、炭酸カルシウム、および重炭酸カルシウムが挙げられる。緩衝剤として、重炭酸ナトリウム、重炭酸カリウム、水酸化マグネシウム、乳酸マグネシウム、グルコン酸マグネシウム（magnesium glucomate）、水酸化アルミニウム、クエン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、ポリリン酸ナトリウム、ポリリン酸カリウム、ピロリン酸ナトリウム、ピロリン酸カリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸三カリウム、メタリン酸カリウム、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、ケイ酸マグネシウム、酢酸カルシウム、グリセロリン酸カルシウム、塩化カルシウム、水酸化カルシウムおよび他のカルシウム塩またはそれらの組み合わせを、医薬製剤中で用いることができる。
【０１４０】
5.8. キット
本開示はさらに、本明細書中に記載される開示された腫瘍溶解性ウイルスのうちの1種以上を含むキットを提供する。実施形態では、本開示は、本明細書中に記載される通りの改変型ウイルスを投与するためのキットを提供する。特定の実施形態では、本開示のキットは、改変型ウイルスまたは上記の通りの改変型ウイルスを含む医薬組成物を含み得る。実施形態では、本開示は、1種以上のOV誘導型T細胞を含むキットを提供する。特定の実施形態では、本開示のキットは、使用説明書、デバイスおよび追加の試薬などの1種以上の構成要素、ならびに、上記に開示される方法を実行するための、試験管、容器およびシリンジなどの構成要素をさらに含むことができる。
【０１４１】
特定の実施形態では、本開示のキットは、使用説明書、被験体に改変型ウイルスを投与するためのデバイス、または被験体に追加の薬剤もしくは化合物を投与するためのデバイスを含むことができる。例えば、限定するものではないが、説明書は、改変型ウイルス、および任意により、キットに含められる他の構成要素、被験体の適切な状態を決定するための方法、適切な投与量および改変型ウイルスを投与するための適切な投与方法をはじめとする投与方法の説明を含むことができる。説明書はまた、治療の持続期間にわたって被験体をモニタリングするためのガイダンスも含むことができる。
【０１４２】
特定の実施形態では、本開示のキットは、被験体に改変型ウイルスを投与するためのデバイスを含むことができる。医薬品および医薬組成物を投与するための当技術分野で公知の様々なデバイスのうちのいずれかを、本明細書中に提供されるキットに含めることができる。例えば、限定するものではないが、そのようなデバイスとしては、皮下注射針、静脈内注射針、カテーテル、針なし注入デバイス、吸入器および液体分注器（点眼器など）が挙げられる。特定の実施形態では、例えば、静脈内注入により、全身的に送達される予定の改変型ウイルスを、皮下注射針およびシリンジと共にキットに含めることができる。
【０１４３】
特定の実施形態では、本開示は、本明細書中に記載される通りの改変型ウイルスを投与した後に、癌を有する被験体から、腫瘍溶解性ウイルスにより誘導された腫瘍浸潤型T細胞（「OV誘導型T細胞」）を単離するためのキットを提供する。本開示はさらに、本明細書中に記載される方法に従って増殖させた、単離されたOV誘導型T細胞を含むキットを提供する。特定の実施形態では、OV誘導型T細胞は、冷凍されている。あるいは、および/またはそれに加えて、OV誘導型T細胞は、培養培地中に提供される。特定の実施形態では、キットは、単離されたT細胞を提供することができ、かつ、樹状細胞および癌細胞、および/またはT細胞を処理するための1種以上のサイトカインおよび/もしくは1種以上の薬剤（例えば、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、IL-24、IL-27、IFN-α、IFN-α2、IFN-β、またはIFN-γ、TNF-α、TNF-β、およびGM-CSFを含む）をさらに提供することができる。
【０１４４】
特定の実施形態では、本開示のキットは、腫瘍溶解性ウイルスおよび/または単離されたOV誘導型T細胞と組み合わせて投与することができる1種以上の追加の薬剤を含むことができる。例えば、限定するものではないが、キットは、サイトカイン（例えば、IL-2）、および/または抗PD-1抗体および/もしくは抗PD-L1抗体を含むことができる。
【０１４５】
特定の実施形態では、本開示のキットは、被験体に改変型ウイルスを投与した後に被験体からT細胞を単離するためのデバイス、または被験体に処理済みT細胞を移植するためのデバイスを提供することができる。例えば、限定するものではないが、本開示のキットは、OV誘導型T細胞を単離するステップ、ならびに被験体の適切な状態を決定するための方法、適切な投与量および処理済みT細胞を移植するための適切な投与方法をはじめとする、患者に処理済みT細胞を移植するための方法の説明を含む説明書を提供することができる。特定の実施形態では、本開示のキットは、使用説明書、被験体に改変型ウイルスを投与するためのデバイス、および/または被験体に追加の薬剤もしくは化合物を投与するためのデバイス、および/またはOV誘導型T細胞を単離するためのデバイスを含むことができる。例えば、限定するものではないが、説明書は、改変型ウイルス、および任意により、キットに含められる他の構成要素、被験体の適切な状態を決定するための方法、適切な投与量および改変型ウイルスを投与するための適切な投与方法をはじめとする投与方法の説明を含むことができる。説明書はまた、OV誘導型T細胞を単離するステップ、単離されたT細胞を処理する方法、および患者に処理済みT細胞を移植する方法の説明も含むことができる。説明書はまた、治療の持続期間にわたって被験体をモニタリングするためのガイダンスも含むことができる。
【実施例】
【０１４６】
6. 実施例1：膜結合型IL-2を発現する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、強力な抗腫瘍効力および低下した毒性を示した
米国特許第7,208,313号（その開示はその全体が参照により本明細書中に組み入れられる）に記載される通りの腫瘍溶解性ワクシニアウイルスであるvvDD（またはVVDD）を、ウイルスtk遺伝子中に、ワクシニアp7.5e/lプロモーターの制御下にmIL-2コード核酸を挿入することにより、マウスIL-2（「mIL-2」）を発現させるために遺伝子操作し、感染細胞からのmIL-2の分泌を生じさせる「vvDD-mIL-2」と記載されるウイルスを作製した。このIL-2武装化型ウイルスの抗腫瘍効力を、腫瘍発達のモニタリングを可能にするために細胞がルシフェラーゼ（「luc」）により標識されているMC38-luc、ID8-luc、またはAB12-luc腫瘍細胞をそれぞれマウスに接種することにより生成された結腸癌、卵巣癌、および中皮腫のマウスモデルで試験した。図1Aに示される実験スキームを用いて、5.0e5個の腫瘍細胞を、0日目に皮下接種し、次いで5日目にマウスに、PBSまたは1.0e8pfuのvvDD-IL-2または、対照として、mIL-2で武装化されていないvvDDのいずれかを投与した。各試験群中のマウスの数は、10±4とした。マウスの生存をモニタリングし、結果を図1B〜Dに示し；それぞれの場合で、vvDD-mIL-2は、対照と比較して、生存期間を実質的に延長した。
【０１４７】
しかしながら、ウイルス処置に先立ってマウス体内で腫瘍を進行させた場合、vvDD-mIL-2処置マウスの生存は、対照よりも劣っていた。図2Aに示される通り、mIL-2武装化型ウイルスを、MC38-luc（結腸癌）腫瘍細胞接種から9日後に投与した場合、レシピエントマウスは1週間以内に死亡した（図2B）。これらのマウスの腫瘍負荷は本研究での対照マウスと同等であろうから、動物は、分泌されたIL-2の毒性作用により死亡したと推察される。
【０１４８】
IL-2の考えられる毒性作用を軽減する目的で、感染腫瘍細胞中で膜アンカー型IL-2を発現させるために、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを遺伝子操作した。図3Aは、遺伝子操作されたvvDDウイルスの一部分の模式図を示し、この中で、すべてがp7.5e/lプロモーターに機能的に連結された、配列GPAGGGGSGGGGSGGGGSVSTISSFSPPGYQVSFCLVMVLLFAVDTGLYFSVKTNI（配列番号16）を有する(G4S)3リンカーおよびGPIアンカー性ペプチドをコードする核酸にインフレームで融合されているmIL-2コード核酸がtk遺伝子中に挿入され、「vvDD-mIL-2-GPI」と記載されるウイルスが作製される。ウイルス感染細胞を検出する目的で、pSe/lプロモーターに機能的に連結され、かつmIL-2とは反対の方向で転写される黄色蛍光タンパク質（「YFP」）をコードする遺伝子もまた、tk遺伝子を破壊している。MC38結腸癌細胞株およびB16黒色腫細胞株で試験される場合、フローサイトメトリーにより実証される通りに、vvDD-mIL-2-GPIは、大部分が感染細胞の膜上に保持されたmIL-2を発現し、一方vvDD-mIL-2により発現されたmIL-2は膜上に保持されなかった（図4A〜B）。感染細胞をYFPによりゲーティングし、続いて、ゲーティングされたYFP+細胞上でのIL-2発現について分析した。図5A〜Bは、細胞膜上でのIL-2の発現強度を表わす。これらのデータは、vvDD-mIL-2-GPIが、感染癌細胞上ではるかに多くの膜アンカー型IL-2を発現することを明白に実証した。
【０１４９】
図6は、「非武装化型」vvDD（親ウイルス）をvvDD-mIL-2およびvvDD-mIL-2-GPIと比較する実験の結果を示す。マウスに、腫瘍細胞接種の5日後に、PBSまたは（非武装化型）vvDD、vvDD-mIL-2、もしくはvvDD-mIL-2-GPI（1.0e8pfuの用量で）のいずれかを投与した。図6に示される通り、PBS対照処置マウスは、腫瘍細胞接種後、約20日間以内に死亡し、非武装化型vvDDを用いて処置された大多数のマウスは腫瘍接種の約30日間以内に死亡した（この群のすべてのマウスが、43日目までに死亡した）が、50日後に、vvDD-mIL-2を用いて処置されたすべてのマウスが生存しており、vvDD-mIL-2-GPIを用いて処置されたマウスの80％超が生存し、このことは、「アンカー型」IL-2は有益なIL-2機能を保持していることを示した（n＝8）。
【０１５０】
図7は、MC38-luc細胞を用いた接種の9日後に、vvDD-mIL-2またはvvDD-mIL-2-GPIのいずれかの2.0e8 pfu（2.0×108pfu）を用いて処置したマウスでの、IL-2関連毒性作用を比較する。ウイルス処置の5日後、vvDD-mIL-2を用いて処置されたマウスのうちの80％超は死亡し、vvDD-mIL-2-GPI処置マウスはすべて生存していた（n＝13〜15）。
【０１５１】
7. 実施例2：腫瘍溶解性ウイルスにより誘導された腫瘍浸潤型T細胞（「OV誘導型T細胞」）の養子移入は、腹腔内MC38腫瘍を担持する同系C57BL/6マウスでの著明な治療効果をもたらした
本実施例では、膜結合型の免疫刺激性サイトカインを発現する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの研究を提供する。
【０１５２】
B6マウスに5×105個のMC38-luc癌細胞を腹腔内接種し、腫瘍細胞注入の7日後の生体動物IVISイメージングに基づいて、腫瘍生長条件に従って必要とされる群に分けた。群分けされたマウスに、100μL当たり5×106個のT細胞または対照として100μL PBSを腹腔内注入した。T細胞は、MC38皮下腫瘍担持マウスへの腫瘍内vvDD-IL-2-GPI（1.0e8pfu）注入により生成させた。ウイルス処置から10日後、腫瘍を回収し、T細胞を、CD90.2ビーズ（Miltenyl Biotec, CA, USA）を用いて分離した。T細胞を、αDC-MC38と共に2日間共培養した。2日目に、IL-2（4ng/mL）およびIL-7（5ng/mL）または追加的にGSK3b阻害剤（7μM）を加えた。5日目に、T細胞を、MC38-luc腫瘍担持マウスへと腹腔内（i.p.）注入により移植した。T細胞移植に先立って、処置マウスに、臨床プロトコールと同様のリンパ枯渇を模倣するための、致死線量未満の5Gyの照射を行なった。すべての処置マウスに、IL-2（100,000IU/マウス、腹腔内、12時間毎に3日間）の外因性サイトカイン補助を施した。図8Aは、実験設定の時間軸を示す。
【０１５３】
図8Bに示される通り、IL-2、IL-7およびGSK3b阻害剤を用いてex vivoで処理されたOV誘導型T細胞を投与した場合、腫瘍担持マウスのうちの100％が接種後に少なくとも100日間生存し、IL-2およびIL-7を用いてex vivoで処理されたOV誘導型T細胞を投与した場合、腫瘍担持マウスのうちの約50％が接種後に少なくとも100日間生存した。MC38-luc腫瘍を有するマウスの処置後21日目の生体画像を図8Cに示し、処置後28日目の画像を図8Dに示す。図8に示される通り、新規形態の免疫刺激性サイトカイン（膜結合型など）を発現する腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、強力な腫瘍特異的T細胞を誘導することができ、かつ、その場で腫瘍生長に対するT細胞の機能を発揮する腫瘍組織中へのそのようなT細胞の輸送を促進することができる。加えて、OV誘導型T細胞を単離し、適切な条件下でex vivoで増殖させることができる。これらの培養および増殖された腫瘍特異的T細胞を第2の腫瘍担持マウスに注入し戻した場合に、それらのT細胞は、同系マウスのMC38結腸腫瘍モデルで強力な抗腫瘍活性を示した。本アプローチは、腫瘍溶解性ウイルスにより生起されかつ富化された抗腫瘍T細胞が、癌療法のために用いることができることを実証した。
【０１５４】
8. 実施例3：強力な効力および高い安全性を伴う剛性膜結合型インターロイキン-2の提示
8.1. 導入
多機能性サイトカインであるインターロイキン-2（IL-2）は確立された癌療法剤であるが、その臨床応用は、高用量のIL-2の全身的使用が後に続く、重篤な生命を脅かす副作用のために限定されている1-4。in vivo半減期を伸長し、かつ生物学的活性および安全性を改善するために、IL-2融合タンパク質、IL-2/抗IL-2抗体複合体および「スーパーカイン」、または化学的修飾型IL-2などのIL-2改変体を開発することに、相当な努力が注がれてきた5-13。本実施例は、腫瘍標的化型腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる腫瘍床での細胞膜結合型IL-2の局所送達を介する新たな形態のIL-2免疫療法を開示する。柔軟性または剛性のいずれかで細胞膜上にIL-2を提示することは、確立された早期腹膜結腸癌を有するマウスを治癒させ、これはワクシニアウイルスによる分泌型IL-2の送達に類似する作用であった。ワクシニアウイルスにより送達される分泌型IL-2が、ウイルス複製期間中の後期腫瘍モデルでの高い致死性をもたらす一方で、剛性を伴って細胞膜上にIL-2を提示させることにより、後期腹膜結腸癌を有するマウスの生存率は著明に高められた。剛性を伴って細胞膜上にIL-2を提示させることにより、腫瘍微小環境の免疫状態での大きな変化がもたらされ、このことは、後期腹膜結腸癌を有する大多数のマウスを治癒させるために抗PD-1/PD-L1 Abを組み合わせることを実現可能にした。これらの知見は、新規形態のIL-2免疫療法が、癌治療に関して臨床に適用可能であり得ることを示す。
【０１５５】
ウイルス送達された分泌型IL-2は、マウスモデルでの確立された腫瘍を治療する能力を有することが示唆されている（図1）14。高用量のIL-2の全身的使用により引き起こされる重篤な毒性副作用を低減させるために、かつ胸膜、腹膜、造血系または転移性癌を治療するために、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスvvDDを用いた。腫瘍内ウイルス注入により、胸膜、腹膜、造血系または転移性癌を治療することは、困難であり得る。膜結合型サイトカインは、明らかに欠損したサイトカイン機能を有さずに膜上に保持されることが示唆されているので15-17、安全であることが認められている腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを、腹膜結腸癌を治療する目的で膜結合型IL-2を送達するために用いた。腫瘍溶解性ワクシニアウイルスvvDDを用いるアプローチは、より少ないウイルスの使用をもたらすことができ、かつより少ない副作用を生じさせる可能性がある。
【０１５６】
8.2. 方法
マウスおよび細胞株：雌性C57BL/6（略記する場合はB6）マウスおよびBALB/cマウスを、The Jackson Laboratory（Bar Harbor, ME）から購入し、ピッツバーグ大学動物施設の特定病原体非存在条件下で飼育した。すべての動物研究は、施設の動物ケアおよび使用委員会により承認された。マウス結腸癌MC38-luc、卵巣癌ID8-luc、中皮腫AB12-lucを、以前に記載された通りに作製した31。マウス黒色腫B16は、ATCCから入手した。すべての細胞株を、10％胎児ウシ血清（FBS）、2mL L-グルタミン、ペニシリン/ストレプトマイシン（Invitrogen, Carlsbad, CA）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で、37℃にて5％CO2インキュベーターで増殖させた。
【０１５７】
ウイルス作製：vSC20、vgf遺伝子欠失ウエスタンリザーブ（WR）株VVを、相同組換えのための親ウイルスとして使用した。pLVX-IRES-ZsGreen由来のIRES配列により隔てられた2箇所のマルチクローニング部位を有するプラスミドpCMS1-IRESを、シャトルプラスミドpSEM-132から構築した。次に、pCMS1-IRESに、柔軟性リンカーまたは剛性リンカー＋PCRによりヒトCD16bから増幅されたGPIアンカー配列を含む断片を挿入し、それにより、それぞれプラスミドpCMS1-IRES-FGまたはpCMS1-IRES-RGを得た。マウスIL-2 cDNAを、pCMS1-IRES、pCMS1-IRES-FGまたはpCMS1-IRES-RGへと挿入し、シャトルプラスミドpCMS1-IL-2、pCMS1-IL-2-FGまたはpCMS1-IL-2-RGを得た。pCMS1-IL-2-FG中のGPIアンカー配列をさらに、マウスPD-L1膜貫通ドメインと置き換え、シャトルプラスミドpCMS1-IL-2-FPTMを得た。すべてのこれらシャトルベクターは、ワクシニアウイルスゲノムのtk遺伝子座へのマウスIL-2バリアントの相同組換えのために用いた。PCRに基づくプラスミドクローニングのためのプライマーを、表2に列記した。
【０１５８】
【表２】
2020514324.tif 000004
【０１５９】
新規ウイルスvvDD-IL-2、vvDD-IL-2-FG、vvDD-IL-2-RGおよびvvDD-IL-2-FPTMを作製するために、CV-1細胞に、感染多重度（MOI）0.1でvSC20を感染させ、続いてシャトルプラスミドをトランスフェクションして、ウイルスシードを生じさせた。新規組み換えウイルスの選別は、シードウイルス感染の24時間後のCV1細胞での黄色蛍光タンパク質の発現に基づいた。vvDD-YFP、または略記する場合はvvDD（tk遺伝子座にyfp cDNAを担持する二重ウイルス遺伝子欠失型（tk-およびvgf-）VV）が、本研究での対照ウイルスである。
【０１６０】
in vitroウイルス複製アッセイ：腫瘍細胞を、6ウェルプレート中に1.0×105個/ウェルで播種し、次の日に、2％胎児ウシ血清を含有する1mL培地中でMOI 0.1、1.0、または10で2時間、示されたウイルスに感染させた。感染後、細胞に、10％胎児ウシ血清を含有する3mLの培地を加え、ウイルス感染の24時間後、48時間後、および72時間後に回収するまで培養した。細胞ペレットを、FastPrep Cell Disrupter（型番FP120；Qbiogene, Carlsbad, CA）を用いてホモジナイズしてビリオンを放出させ、得られた細胞溶解物を、CV-1細胞を用いて力価測定し、プラークアッセイによりウイルス量を測定した。
【０１６１】
in vitro MTS細胞傷害性アッセイ：腫瘍細胞を、96ウェルプレート中に1.0×104細胞/ウェルで播種し、次の日、MOI 0.05、0.1、0.5、1.0、および5.0で示されたウイルスに感染させた。CellTiter 96 Aqueous Nonradioactive細胞増殖アッセイ、またはMTSアッセイ（Promega, Madison, MI）により、感染の48時間後および72時間後に、細胞生存率を決定した。
【０１６２】
in vitroでのウイルス送達されたIL-2発現：MC38-luc（3×105）細胞、B16（2×105）細胞またはAB12-luc（3×105）細胞を、24ウェルプレートに一晩播種し、vvDD、vvDD-IL-2、vvDD-IL-2-FG、vvDD-IL-2-RGまたはvvDD-IL-2-FPTMにMOI＝1で0.15mLの2％FBS含有DMEM中で2時間感染させた。細胞に0.35 mL 10％FBS含有DMEMを加え、ウイルス感染の24時間後に回収するまで培養した。ELISA（BD Bioscience, San Jose, CA）によりIL-2を測定するために培養上清を回収し、フローサイトメトリーにより膜結合型IL-2を測定するか、またはRT-qPCRによりIL-2発現を測定する目的でRNAを抽出するために、細胞ペレットを用いた。
【０１６３】
げっ歯類腫瘍モデル：それぞれ、B6マウスに、5×105個のMC38-luc癌細胞、3.5×106個のID8-luc癌細胞を腹腔内接種するか、またはBALB/cマウスに、4×105個のAB12-luc細胞を腹腔内接種し、Xenogen IVIS 200 Optical In Vivo Imaging System（Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA）を用いて行なわれる生体動物IVISイメージングに基づく腫瘍サイズに従って、腫瘍細胞接種から5日後または9日後に、必要な群に分けた。群分けされたマウスに、示されたウイルス、抗体、組み合わせまたはPBSをそれぞれ腹腔内注入した。一部の実験では、α-CD8 Ab（250μg/注入；クローン53-6.7；Bio X Cell）、α-CD4 Ab（クローンGK1.5、Bio X Cell；150μg/注入）、α-NK1.1（クローンPK136、Bio X Cell；300μg/注入）またはα-IFN-γ Ab（クローンXMG1.2、Bio X Cell；200μg/注入）を、CD8+T細胞、CD4+T細胞、NK1.1+細胞を枯渇させるか、または循環IFN-γを中和するために、マウスに腹腔内注入した。一部の実験では、示された時点で、腫瘍組織および脾臓を回収するために、マウスを屠殺した。
【０１６４】
示されたワクシニアウイルスを用いて処置し、60日間を超えて生存したMC38-luc腫瘍担持B6マウスに、5×105個のMC38-luc細胞/マウスを皮下的に再接種した。ナイーブB6マウスには、対照として、同じ用量の腫瘍接種を行なった。原発腫瘍サイズを、2種類の鉛直直径で電子ノギスを用いて測定した。
【０１６５】
処置関連毒性の評価：ウイルス処置マウスを、血液、肺、腎臓および脾臓の回収のために、処置から4〜5日後に屠殺した。血液サンプルは、市販のキット（それぞれ、BD Biosciences社およびBioLegend社）を販売業者の説明書に従って用いてIL-2およびTNF-αを測定するために、室温で2時間維持し、遠心分離により血清を分離した。含水量を用いて組織浮腫をモニタリングした。簡潔には、湿った組織の重量を測定し、化学フード中で90℃で一晩脱水させた。湿った組織と乾燥組織との重量差を算出した。
【０１６６】
フローサイトメトリー：回収した腫瘍組織の重量を測定し、2％FBS、1mg/mLコラゲナーゼ、0.1mgヒアルロニダーゼ、および200U DNase I（すべての酵素をSigma, St. Louis, MOから入手した）を含有するRPMI 1640培地中、37℃で1〜2時間インキュベートし、単一細胞を作製した。in vitroウイルス感染細胞または腫瘍組織由来の単一細胞を、α-CD16/32 Ab（クローン93）を用いてブロッキングし、続いて、マウスCD45（APCまたはPerCP-Cy5.5、クローン：30-F11）、CD11b（PE、クローン：M1/70）、Ly6G（APC、クローン：1A8）、Ly6C（クローン：HK1.4）、F4/80（FITC、クローン：BM8、e-Bioscience社）、CD4（APCまたはFITC、クローン：RM4-5、BD Biosciences社）、Foxp3（PE、クローン：FJK-16s、e-Bioscience社）、CD8（APCまたはPE、クローン：53-6.7）、CD44（FITC、クローン：IM7）、PD-1（PE、クローン：J43、e-Bioscience社）、IFN-γ（APC、クローン：XMG1.2、e-Bioscience社）、CD3（FITC、クローン：17A2、eBioscience社）、NK1.1（PE、クローン：PK136）、PD-L1（APC、クローン：10F.9G2）、IL-2（APC-SA＋ビオチン-IL-2、クローン：JES6-5H4）に対する抗体を用いて染色した。供給元が明記されていないすべての抗体は、BioLegend社から購入した。BD Accuri C6サイトメーターを用いてサンプルを回収し、BD Accuri C6サイトメーターソフトウェアを用いてデータを分析した。
【０１６７】
RT-qPCR：RNeasyキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて、ウイルス感染細胞または腫瘍組織から総RNAを抽出した。1マイクログラムのRNAをcDNA合成のために用い、得られた25〜50ngのcDNAを用いて、StepOnePlusシステム（Life Technologies, Grand Island, NY）でのTaqMan分析により、mRNA発現解析を行なった。分析のためのすべてのプライマーは、Thermo Fisher Scientific社（Waltham, MA）から購入した。遺伝子発現を、ハウスキーピング遺伝子HPRT1に対して標準化し、増加倍率（2-ΔCT）として表わし、式中、ΔCT＝CT(標的遺伝子)−CT(HPRT1)である。
【０１６８】
統計学：統計学的分析は、スチューデントt検定（GraphPad Prism version 7）を用いて行なった。動物生存率はカプラン・マイヤー生存曲線を用いて表わし、ログランク検定を用いて統計学的に解析した（GraphPad Prism version 7）。P＜0.05の値が統計学的に有意であると見なされ、かつすべてのP値は両側とした。図面中、標準的な記号を用いた：* P＜0.05；** P＜0.01；*** P＜0.001；および**** P＜0.0001。
【０１６９】
8.3. 結果
ウイルスvvDD-IL-2、vvDD-IL-2-FPTM、vvDD-IL-2-FGおよびvvDD-IL-2-RGを、vvDDに基づいて作製した（図9）。簡潔には、vvDD-IL-2は分泌型マウスIL-2を産生し、vvDD-IL-2-FPTM、vvDD-IL-2-FGおよびvvDD-IL-2-RGは、感染後に細胞膜上にマウスIL-2を提示した。vvDD-IL-2-FPTMは、マウスPD-L1膜貫通ドメインおよびその間の柔軟性リンカー(G4S)3と融合されたIL-2を産生した。vvDD-IL-2-FGおよびvvDD-IL-2-RGは、ヒトCD16bのグリコイノシトールリン脂質（GPI）アンカー配列と、その間にそれぞれ柔軟性リンカー(G4S)3および剛性リンカー(A(EA3K)4AAA)と融合されたIL-2を産生した。これらの4種類のウイルスは、親ウイルスvvDDと比較して、同様の複製能および腫瘍細胞での細胞傷害性を有する（図10）。vvDD-IL-2は、他のウイルスよりも上清中に顕著に多くのIL-2を産生するが、膜結合型IL-2は産生しなかった。vvDD-IL-2-FPTM、vvDD-IL-2-FGおよびvvDD-IL-2-RGは、上清中にはわずかなIL-2しか産生しなかったが、VVDD-IL-2よりも顕著に多くの膜結合型IL-2を産生した。vvDD-IL-2-RGでの膜結合型IL-2の量はvvDD-IL-2-FGよりも多く、vvDD-IL-2-FGでの膜結合型IL-2の量はvvDD-IL-2-FPTMよりも多かった（図11A）。
【０１７０】
次に、IL-2およびウイルスマーカー遺伝子A34RのmRNAレベルを、in vitroでのウイルス感染後の腫瘍細胞で決定した。データは、ウイルス遺伝子A34R mRNAは同様であったが、IL-2 mRNAパターンは、上記の膜結合型IL-2量のパターンに類似していたことを示した。特定の理論に拘泥するものではないが、このことは、キメラタンパク質の正確な構成要素が、mRNA安定性に影響を与えることができ、さらに細胞膜上に提示されるIL-2の量に影響を与え得ることを示す（図12）。
【０１７１】
4種類のウイルスの抗腫瘍効力を評価するために、各ウイルスを、5日前にマウス結腸癌細胞MC38-luc接種を受けたB6マウス（早期腫瘍モデル）を処置するために、2×108PFU/マウスの用量で腹腔内注入した。生存率結果は、vvDD-IL-2、vvDD-IL-2-FGおよびvvDD-IL-2-RGは、PBSまたはvvDDと比較してより強い抗腫瘍作用を生じたが、vvDD-IL-2-FPTMはそうではなかったことを示した（図11B）。特定の理論に拘泥するものではないが、このことは、vvDD-IL-2-FPTM感染後に細胞膜上に提示されたIL-2の量の少なさにより説明できる（図11Aおよび図12）。vvDD-IL-2を用いて処置されたマウスは、vvDD-IL-2-FGを用いて処置されたものよりも長く生存したが、vvDD-IL-2-RGを用いて処置されたものより長くは生存しなかった（図11B）。
【０１７２】
vvDD-IL-2、vvDD-IL-2-FGおよびvvDD-IL-2-RG処置を生き延びたすべてのマウスは、皮下的腫瘍再接種を拒絶し、このことは、全身性抗腫瘍応答が生起されたことを示した（図13）。vvDD-IL-2処置後の1週間以内に、数匹のマウスが死亡した（図11B）。特定の理論に拘泥するものではないが、このことは、IL-2により誘導された毒性の兆候であり得るであろう。vvDD-IL-2処置により産生される分泌型IL-2が、ある程度の全身性毒性を誘導し得るのか、および大きな腫瘍負荷を有するマウスに対してより高い毒性であり得るかを調べるために、同じウイルス投与量を用いて、ウイルスの安全性および抗腫瘍効力を、5日間腫瘍担持マウスモデル（早期腫瘍モデル）から、より免疫抑制性の腫瘍モデル（マウスは、早期腫瘍モデルと比較して、より大きな腫瘍負荷、より多くの免疫抑制性CD4+Foxp3+、CD4+PD-1+およびCD8+PD-1+T細胞、G-MDSCおよびPD-L1+細胞、より少ないNK細胞ならびに腫瘍微小環境でのより高いPD-1、PD-L1、TGF-βおよびVEGF発現を有する）である9日間腫瘍担持マウスモデル（後期腫瘍モデル）へと切り替えることにより評価した（図14および15）。後期腫瘍マウスはまた、早期腫瘍モデルと比較して、肝臓および腎臓での増大した重度浮腫も有する（図15）。後期腫瘍モデルからの治療結果により、vvDD-IL-2処置は処置後1週間以内で高い死亡率をもたらしたが、他のウイルスを用いた処置は安全であったことが示された。vvDD-IL-2-FGおよびvvDD-IL-2-RG処置は、vvDD処置と比較して、動物の生存期間を有意に延長したが、vvDD-IL-2-RG処置は、顕著によりよい生存期間を生じさせた（図11Cおよび図16A）。
【０１７３】
ウイルスにより引き起こされる毒性をさらに調べるために、IL-2血清レベルを測定し、他のウイルスを用いて処置されたマウスの血清と比較して、vvDD-IL-2を用いて処置されたマウスの血清では100倍高く、約24950pg/mLに達することが見出された（図16B）。低レベルのIL-2は、vvDD-IL-2-FGおよびvvDD-IL-2-RGを用いて処置されたマウスの血清中でも検出された。いずれかの特定の理論に拘泥するものではないが、このことは、膜貫通タンパク質と比較してGPIアンカー型タンパク質の細胞膜との比較的緩やかな結合により説明することができ、GPIアンカー型タンパク質は脱落またはタンパク質分解切断に起因して細胞膜から自発的に放出され得るであろうこと、また遊離GPIアンカー型タンパク質もまた「細胞表面ペインティング」18と命名されるプロセスを介して細胞膜へと移行し得ることが考えられる。
【０１７４】
IL-2がTNF-α血清レベルの上昇を誘導できる19かを検討するために、TNF-α血清レベルをvvDD-IL-2処置後に測定し、vvDD-IL-2処置がTNF-α血清レベルの有意な上昇を誘導したことが見出された（図16C）。マウスはまた、IL-2により誘導される血管漏出症候群20を測定するための指標である組織浮腫についても評価された。vvDD-IL-2処置のみが、肺および肝臓での含水量増加により証明される通り、実質的により多い肺浮腫および肝臓浮腫を誘導した（図16D〜16E）。組織浮腫もまた見出された。加えて、上昇したIL-2血清レベルが、早期腫瘍モデルでさえも、vvDD-IL-2処置マウスで見出された（図17A〜17D）。併せて考えると、これらのデータは、vvDD-IL-2-FG処置およびvvDD-IL-2-RG処置が、vvDD-IL-2よりも安全であることを示した。
【０１７５】
vvDD-IL-2-FGおよびvvDD-IL-2-RGを用いた処置は、早期腫瘍モデルでは同様の治療効力を有する。しかしながら、両方の処置が同様の安全性プロフィールを有したにもかかわらず、vvDD-IL-2-RG処置のみが、後期腫瘍モデルでの実質的によりよい生存期間をもたらした。この結果をもたらす理由を探るために、腫瘍微小環境および脾臓での免疫細胞プロフィールを、後期腫瘍モデルを用いて調べた。vvDD-IL-2-RG処置を受けた腫瘍由来の活性化型CD4+Foxp3-T細胞およびCD8+IFN-γ+T細胞の割合（％）は、他のウイルス処置を受けた腫瘍と比較して高かった（図18Aおよび18B）。メモリーCD8+T細胞およびNK細胞が容易にIL-2に応答し得る21かを検討するために、メモリーCD8+CD44hiT細胞およびCD3-NK1.1+細胞を調べた。ウイルス処置後の腫瘍由来の両方のタイプの細胞の割合（％）は、上記の活性化型T細胞と同じパターンを有した。類似の結果が、脾臓でさえも観察された（図18Cおよび図19A〜19C）。
【０１７６】
さらに、ウイルス処置を受けた腫瘍中のCD4+Foxp3+T細胞の存在を調べた。腫瘍中のCD4+T調節細胞の割合（％）は、上記のものと同様であった（図18D）。つまり、他のウイルス処置を受けた腫瘍と比較して、vvDD-IL-2-RG処置後の腫瘍ではCD8+T細胞が上昇しているので、vvDD-IL-2-RG処置を受けた腫瘍でのCD8+/Treg比は有意に高かった（図18Eおよび図19D）。
【０１７７】
次に、腫瘍促進因子および抗腫瘍因子の発現を、ウイルス処置後の後期腫瘍モデルから回収された腫瘍で検討した。他のウイルス処置を受けた腫瘍と比較して、vvDD-IL-2-RG処置を受けた腫瘍では、IFN-γ、グランザイムB、パーフォリンの発現が増加し、かつTGF-βおよび血管新生マーカーCD105およびVEGFの発現が減少していた（図18F〜18K）。IL-10の発現もまた、vvDD-IL-2-RG処置を受けた腫瘍で有意に上昇していることが見出された（図18L）。特定の理論に拘泥するものではないが、IL-10は癌において免疫刺激および免疫抑制の両方として機能し得るが、ここでは、IL-10は、IL-2により上昇し、かつ最小残存腫瘍に対する腫瘍増殖因子であると近年示唆されたTNF-αの発現に対して阻害的作用を有することができ、それにより、vvDD-IL-2-RG処置をより安全かつより効果的にし得る（図16C）19,22-24。
【０１７８】
vvDD-IL-2-RG処置により生起される抗腫瘍作用がIFN-γおよびCD8+T細胞依存的であるか、またはCD4+T細胞依存的であるかを検討するために、IFN-γ、CD4+およびCD8+T細胞ならびにNK1.1+細胞を、vvDD-IL-2-RG処置後に抗体により枯渇させた。その結果、vvDD-IL-2-RG処置により生起される抗腫瘍作用はIFN-γおよびCD8+T細胞依存的であり、CD4+T細胞依存的ではないことが実証された（図18M）。結果はまた、NK細胞枯渇は、vvDD-IL-2-RG処置単独と比較して、有意によりよい生存率をもたらしたことも実証した。特定の理論に拘泥するものではないが、その理由は、NK細胞が、天然の細胞傷害性受容体であるNKP46を介してウイルス療法を妨げ得ることであり得るであろう。NKP46の発現は、vvDD-IL-2-RG処置により有意に増大し、つまり、NK細胞枯渇が、この妨害を除去した可能性がある（図20）25。
【０１７９】
総合すると、これらのデータにより、vvDD-IL-2-RG処置が、腫瘍担持マウスでの免疫状態を、免疫抑制性から免疫良好状態へと変化させ、このことが、最終的にはよりよい生存率をもたらしたことが実証された。
【０１８０】
腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと抗PD-L1抗体との組み合わせは、早期腫瘍モデルに対する治療効力を高めるために相乗的に働くことが以前に示唆された26。しかしながら、vvDDと抗PD-L1抗体との組み合わせは、後期腫瘍モデルでは機能しなかった（図21）。vvDD-IL-2-FG処置およびvvDD-IL-2-RG処置の両方が、後期腫瘍モデルに対する抗腫瘍作用を生じ、腫瘍中での高いPD-1、PD-L1およびCTLA-4発現を誘導した（図11C、図22A〜22C、および図23A〜23C）。したがって、組み合わせが9日間腫瘍担持マウスを治療し得るか否かを調べるために、vvDD-IL-2-FGおよびvvDD-IL-2-RGと抗PD-1/PD-L1抗体または抗CTLA-4抗体との組み合わせを試験した。その結果、抗PD-1/PD-L1抗体と組み合わせたvvDD-IL-2-RGは腫瘍担持マウスを治癒させたが、抗CTLA-4抗体との組み合わせは治癒させなかったことが示された（図22D）。特定の理論に拘泥するものではないが、このことは、抗CTLA-4および抗PD-1/PD-L1チェックポイント遮断についての異なるメカニズムに起因し得るであろう。抗CTLA-4抗体は、主にプライミング相でCD4+T細胞に作用するが、抗PD-1/PD-L1抗体は腫瘍内の疲弊したT細胞に対して優勢的に作用し、このことは、後期の大型固形腫瘍でのさらに免疫抑制性の微小環境を克服するために重要であり得る。vvDD-IL-2-FGと抗PD-1/PD-L1抗体との組み合わせは、生存率を改善しなかった。特定の理論に拘泥するものではないが、このことは、腫瘍担持マウス、特に後期腫瘍担持マウスでの免疫状態の変化が、単独療法および組み合わせ療法の有効性において必須であることを示唆する。このことは、前臨床モデルおよび臨床試験での、免疫チェックポイント遮断と組み合わせた腫瘍溶解性ウイルスの有効性を示す数葉の近年の報告により証明できるであろう（図22Dおよび図24）27-30。
【０１８１】
まとめると、本実施例は、vvDD-IL-2-RG処置が、IL-2利用により誘導される全身性毒性を顕著に低下させ、後期腫瘍担持マウスでの抗腫瘍免疫状態の変化を効果的に生じさせることができ、最終的にはるかに良好な生存をもたらすことができたことを実証した。vvDD-IL-2-RGと抗PD-1およびPD-L1抗体との組み合わせは、後期腫瘍を有するマウスを治癒させることができる。つまり、本実施例は、vvDD-IL-2-RG処置が、癌および免疫抑制性癌に対して臨床に適用可能であり得るIL-2免疫療法の新規形態であり得ることを示した。
【０１８２】
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【０１８３】
9. 実施例4：腫瘍特異的腫瘍浸潤型T細胞の養子移入は、腹膜MC38腫瘍を担持する同系C57BL/6マウスでの顕著な治療効果をもたらした
9.1 導入
免疫療法は、急速に発展しており、患者免疫系を再活性化することにより癌と闘い、外科手術、化学療法および放射線療法のような標準治療に加えて、消化管癌に対する魅力的な治療戦略を提示する。結腸直腸癌、胃癌、肝臓癌および胆膵管癌をはじめとする消化管癌は、全世界で最も頻度の高い悪性腫瘍の上位10種類に入る(1)。免疫浸潤は、腫瘍進行および患者生存期間に影響を及ぼし、高度なリンパ球浸潤は抗腫瘍応答に関連することが報告され、かつ数種類のGI腺癌での臨床帰結を改善している(2-9)。癌ワクチン、自家T細胞の養子T細胞移入またはチェックポイント遮断などの様々な免疫療法戦略が開発されてきたが、腫瘍の不均一性および免疫浸潤の乏しさに起因して、広範囲のGI腫瘍に対して利用可能とはなっていない。腫瘍細胞は、エフェクター細胞による検出を回避するために免疫系を変化させる、免疫脱出メカニズムを発現させる。これには、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）などの免疫系チェックポイントリガンドの細胞表面発現(10,11)、形質転換増殖因子β（TGF-β）、血管内皮増殖因子（VEGF）、インターロイキン-10（IL-10）、ガレクチン-1、インドールアミン2,3-デヒドロゲナーゼなどの可溶性免疫抑制因子の分泌(12-14)、および主要組織適合性複合体（MHC）クラスI発現のダウンレギュレーション；C-X-Cケモカイン受容体4型（CXCR4）、塩基性線維芽細胞増殖因子および上皮増殖因子などの受容体の過剰発現(15,16)が含まれる。
【０１８４】
免疫抑制性腫瘍微小環境は、効果的な抗腫瘍T細胞応答を妨げる、免疫抑制性マクロファージ、MDSCおよびTregの動員に対して最適な条件を提示する。CTL-4、PD-1、TIM3、LAG3などの阻害的チェックポイント分子は、慢性的に刺激されたT細胞でアップレギュレーションされ、これにより、T細胞アネルギーがさらにまた促進される。免疫抑制性腫瘍微小環境（TME）を逆転させ、免疫耐性を打破するための戦略が、腫瘍溶解性ウイルス療法により提示される。選択的に感染し、癌細胞および随伴する内皮細胞中で複製した後、腫瘍溶解性ウイルスはそれらの細胞を癌組織中で死滅させつつ、罹患していない健康な組織は傷害されないままに残す(17,18)。OVにより誘導される間質細胞および癌細胞の免疫原性細胞死（ICD）は、危険信号（損傷関連分子パターン（DAMP））およびOV由来病原体関連分子パターン（PAMP）分子ならびに炎症性サイトカインと同時に腫瘍関連抗原（TAA）の天然のレパートリーを曝露し、これにより抗腫瘍免疫を生じる(19-21)。進行性肝細胞癌を有する患者での無作為化第II相臨床試験では、GM-CSFを用いて武装化された腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（Pexa-Vec）は、15％の客観的奏効率を伴った(22)。第I相臨床試験では、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ウエスタンリザーブ株）vvDDが、腫瘍選択的であること、および抗腫瘍応答を促進することが示された(23,24)。免疫応答を改善するために、腫瘍抗原、T細胞共刺激分子および炎症性サイトカインを発現させる目的で、様々な腫瘍溶解性VVが遺伝子操作された(25)。それらの効力および安全性は、前臨床試験で実証されている(26-30)。本実施例は、腫瘍溶解性ワクシニアウイルス誘導型腫瘍浸潤性T細胞（OV誘導型T細胞）（本明細書中では、「腫瘍浸潤型T細胞」または「TIL」とも称される）が、新規免疫療法アプローチとして、ex vivo増殖および養子T細胞移入のために用いることができることを初めて示した。
【０１８５】
9.2 方法
マウスおよび細胞株：雌性C57BL/6マウスをThe Jackson Laboratory社（Bar, Harbor, ME, USA）から入手し、ピッツバーグ大学動物施設の特定病原体非存在条件下で飼育した。すべての動物研究は、大学の施設動物ケアおよび使用委員会により承認された。マウス結腸癌細胞株MC38およびB16は、ATCCから入手した。マウス結腸癌MC38-lucは、以前に記載された通りに作製した。すべての細胞株を、10％胎児ウシ血清（FBS）、2mM L-グルタミン、および1×ペニシリン/ストレプトマイシン溶液（Invitrogen, Carlsbad, CA）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中で、37℃にて5％CO2インキュベーターで増殖させた。
【０１８６】
ウイルス：組み換えワクシニアウイルス（ウエスタンリザーブ株）vvDD、vvDD-CCL5 (31)およびvvDD-CXC11 (32)は以前に記載されている。本明細書中に開示される主題では、新規に開発されたvvDD-IL-15およびvvDD-IL-2もまた提供される。ウイルスはHeLa細胞中で純化させた。ウイルス力価は、プラークアッセイを用いてCV-1細胞で決定された。腫瘍内ウイルス投与のために、1e8pfu/マウスを用いた。
【０１８７】
げっ歯類腫瘍モデル：皮下（s.c.）腫瘍モデルのために、B6マウスに、5×105個のMC38癌細胞を皮下接種した。s.c.腫瘍面積が5×5mm2に達したら、vvDD-IL-2、vvDD-IL-15、vvDD-CXC11、vvDD-CCL5、vvDDまたはPBSを、1e8pfu/腫瘍で腫瘍内注入した。一部の実験では、IL-2を、1×106IU/腫瘍で腫瘍内投与した（Prometheus, San Diego, CA）。原発腫瘍サイズは、2種類の鉛直直径で電子ノギスを用いて測定し、その後、1日おきに測定した。ウイルス処置の10日後に、腫瘍組織または脾臓を回収し、T細胞分離およびさらなる分析のために単一細胞懸濁へと進めた。腹膜（i.p.）腫瘍モデルのために、B6マウスに5×105個のMC38-luc細胞を腹腔内接種し、Xenogen IVIS 200 Optival In Vivo Imaging System（Caliber Life Sciences, Hoptikon, MA）を用いた腫瘍細胞注入の7日後の生体動物IVISイメージングに基づいて、腫瘍サイズに従って無作為化した。
【０１８８】
養子移入のための腫瘍反応性T細胞の作製：B6マウスに5×105個のMC38癌細胞を皮下接種した。腫瘍面積が5×5mm2に達したら、vvDD-IL-2（1e8pfu/腫瘍）を腫瘍内注入した。10日後に、腫瘍を回収し、消化バッファー（Miltenyl Biotec, San Diego, CA）中で37℃にてインキュベートし、100μm組織ストレイナーを通して押し潰した。赤血球の溶解は、ACK溶解バッファー（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を用いて行なった。白血球分離のために、Percoll（GE, Healthcare Life Science, Marlborough, MA）勾配遠心分離を、Liuら（Liu, Y., Chen, K., Wang, C., Gong, W., Yoshimura, T., Wang, J. M.およびLiu, M. (2013) Isolation of Mouse Tumor-Infiltrating Leukocytes by Percoll Gradient Centrifugation. Bio-protocol 3(17): e892. DOI: 10.21769/BioProtoc.892）によるプロトコールに合わせて用いた。白血球を、40％と80％の不連続Percoll勾配の間の界面で回収し、続いて磁性分離（CD90.2ビーズ、Miltenyl Biotec, San Diego, CA）した。T細胞は、30IU/mL IL-2（Miltenyl Biotec, San Diego, CA）および5ng/mL IL-7（Biolegend, San Diego, CA）を含むRPMI完全培地中、1×106細胞/ウェルの濃度で、24ウェルプレート中で4日間培養した。対照T細胞として、非腫瘍担持未処置マウスから脾臓を回収し、単一細胞懸濁およびその後の磁性分離（CD90.2ビーズ）へと進めた。ナイーブT細胞は、ウイルス誘導型T細胞と同じ条件下で培養した。養子T細胞移入に先立って、T細胞を、共培養アッセイで腫瘍特異性に関して分析した。T細胞（2×104細胞/ウェル）を、未刺激のままとするか（培地）、あるいはγ照射されたMC38腫瘍細胞（2×104細胞/ウェル、96ウェルプレート）またはγ照射されたB16腫瘍細胞（2×104細胞/ウェル）もしくは非腫瘍担持B6マウス由来のナイーブ脾細胞（2×104細胞/ウェル）などの無関係の標的細胞を用いて、24時間、二連で刺激した。プレート設定を、上記の通りのIFN-γELISPOTまたはフローサイトメトリー分析のために用いた。
【０１８９】
養子細胞移入およびサイトカイン投与：B6マウスに、5×105個のMC38-luc癌細胞を腹腔内接種し、腫瘍細胞注入の7日後の生体動物IVISイメージングに基づいて、腫瘍生育条件に従って必要とされる群に分けた。群分けしたマウスに、1×106個のvvDD-IL-2誘導型T細胞、ナイーブT細胞またはPBSを投与した。すべての処置マウスに、臨床的プロトコールに従ってリンパ枯渇を模倣するための致死線量未満の5Gyの照射を施し、その後、細胞移入およびIL-2の外因性サイトカイン補助（100,000IU/マウス、腹腔内、移植後12時間毎に3日間）（Prometheus, San Diego, CA）を施した。
【０１９０】
フローサイトメトリー：24時間後に、共培養アッセイを上記の通りに行なった。T細胞を、Zombi aqua（Biolegend, San Diego, CA）を用いて染色し、その後、マウスCD3、CD8、CD4、4-1BBに対する抗体（Biolegend, San Diego, CA）を用いて染色した。サンプルを、BD Bioscience LSRII Fortessaにより回収した。データを、BD FACS DivaソフトウェアおよびFlowJoソフトウェア（Tree Star Inc., Ashland, OR）を用いて解析した。
【０１９１】
IFN-γ ELISPOT：回収された腫瘍組織を消化バッファー（Miltenyl Biotec, San Diego, CA）中で37℃にてインキュベートし、100μm組織ストレイナーを通して押し潰した。赤血球の溶解は、ACK溶解バッファー（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を用いて行ない、40μmフィルターに細胞懸濁物を通すことにより、単一細胞懸濁に進めた。CD8+T細胞の単離は、陰性αマウスCD8マイクロビーズ単離プロトコール（Miltenl Biotec, San Diego, CA）を用いて行なった。96ウェルプレート（MAHAS4510, Millipore, Burlington, MA）を、抗マウスIFN-γ mAb 15mg/mL（クローンAN18, Mabtech Inc., Cincinnati, OH）を用いてコーティングした。T細胞（2×104細胞/ウェル）を、未刺激のままとするか（培地）、あるいはγ照射されたMC38腫瘍細胞（2×104細胞/ウェル、96ウェルプレート）またはγ照射されたB16腫瘍細胞（2×104細胞/ウェル）もしくは非腫瘍担持B6マウス由来のナイーブ脾細胞（2×104細胞/ウェル）などの無関係の標的細胞を用いて、24時間、二回反復で刺激した。
【０１９２】
適切な洗浄後、ビオチン化二次抗体（クローンR4-6A2-ビオチン、Mabtech, Inc）を加え、室温で2時間インキュベートした。スポット発色は、Vectastain Elite ABC and AEC Peroxidase substrate（SK-4200）キット（Vector Laboratories, Inc. Burlingame, CA）を用いて行った。IFN-γスポット数を、ImmunoSpotTM（Cellular Technology, Ltd., Shaker Heights, OH）により分析した。
【０１９３】
マウスの長期生存：処置されたマウスの健康状態および生存期間を、入念にモニタリングした。皮下または腹膜腫瘍を担持するすべてのマウスを、腫瘍サイズまたは腹囲の変化に関してノギス測定を介してモニタリングした。マウスの皮下腫瘍サイズが直径20mmを超えたか、または腹囲が元の測定値の1.5倍を超えた場合、マウスは疾患に起因して自然死するか、または屠殺された。
【０１９４】
統計学：統計学的分析は、スチューデントt検定（GraphPad Prism version 5）を用いて行なった。動物生存率はカプラン・マイヤー生存曲線を用いて表わし、ログランク検定を用いて統計学的に解析した（GraphPad Prism version 5）。p＜0.05の値が統計学的に有意であると見なされ、かつすべてのp値は両側とした。図面中、標準的な記号を用いた：* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001；およびNS：有意でない。
【０１９５】
9.3. 結果
vvDD-IL-2は、多数の腫瘍反応性T細胞を誘引するTMEの強力な調節因子である
種々のワクシニアウイルス構築物が抗腫瘍免疫応答を促進し、かつTMEへとT細胞を誘引するかを試験するために、MC38皮下腫瘍担持マウスのTMEでのT細胞免疫応答を、vvDD、vvDD-CXC11、vvDD-CCL5、vvDD-IL-15、vvDD-IL-2またはPBSを用いて、腫瘍内ウイルス処置の10日後に試験した。ウイルス処置腫瘍由来のCD8+T細胞を、ELISPOTによりIFN-γ応答に関して分析した。PBS対照と比較して、すべてのウイルス処置腫瘍が、γ照射MC38腫瘍細胞に対して試験した場合に反応性CD8+T細胞の顕著な増加を示した。vvDD-IL-2処置腫瘍は、vvDDまたはvvDD-IL-15処置腫瘍と比較して、最も高い反応性CD8+T細胞のレベルを示した（図25A）。
【０１９６】
ウイルス誘導型CD8+T細胞が腫瘍特異的であるか否かを調べるために、vvDD-IL-2、vvDDまたはPBS処置腫瘍由来のCD8+T細胞のIFN-γ応答を、無関係な標的細胞（例えば、γ照射B16腫瘍細胞、非腫瘍担持B6マウス由来のナイーブ脾細胞）およびγ照射MC38腫瘍細胞との共培養後に測定した。ウイルス処置腫瘍は、PBS対照と比較して、MC38反応性CD8+T細胞の顕著な増加を示した。vvDD-IL-2誘導型CD8+T細胞は、無関係な標的細胞（例えば、B16およびナイーブ脾細胞）と比較してMC38腫瘍細胞に対して非常に特異的な反応性を示した。vvDD誘導型T細胞は、vvDD-IL-2と比較して同様のレベルのMC38反応性を表わしたが、vvDD-IL-2と比較して、B16およびナイーブ脾細胞などの非特異的対照細胞に対するより高いバックグラウンド反応性を示した（図25B）。まとめると、vvDD-IL-2誘導型T細胞は、非常にMC38特異的である。
【０１９７】
ウイルスにより発現されるIL-2は、単独IL-2処置と比較してTMEでの腫瘍反応性CD8+T細胞の強い浸潤を促進する。IL-2武装化型ウイルス療法と比較して、単独IL-2処置がT細胞をTMEへと誘引する能力を調べるために、MC38皮下腫瘍担持マウスを、IL-2、vvDD-IL-2、vvDDまたはPBSを用いて腫瘍内処置した。10日後、腫瘍浸潤性CD8+T細胞を、ELISPOTによりIFN-γ応答に関して分析した。vvDD-IL-2誘導型CD8+T細胞のIFN-γ応答は、IL-2処置、対照ウイルスまたはPBSと比較して優れていた（prior）（図26）。
【０１９８】
vvDD-IL-2は、MC38腫瘍担持マウスのTMEでのT細胞浸潤を促進する。vvDD-IL-2がTMEでのT細胞浸潤を促進する能力を定量化するために、処置された腫瘍を、総CD3+浸潤性細胞ならびにCD3+CD8+およびCD3+CD4+T細胞に対する免疫蛍光染色により分析した（図27および28）。両方のウイルス構築物が、PBS対照と比較してTME中での総CD3+細胞およびCD8+T細胞浸潤の顕著な増加を促進する。ウイルス処置は、PBSサンプルと比較してCD4+T細胞浸潤の増加を示した。T細胞を腫瘍組織から精製し、1グラムの腫瘍当たりで定量化した場合、他の実験設定で同様の結果が観察された（図28）。
【０１９９】
vvDD-IL-2誘導型腫瘍浸潤性T細胞は、増殖させることができ、かつその腫瘍特異性を維持することができる。ワクシニアウイルス誘導型T細胞が養子T細胞移入のための新規戦略を提示することができるかを試験するために、腫瘍浸潤性T細胞のex vivo培養プロトコールを、vvDD-IL-2、vvDDまたはPBSを用いて処置されたMC38皮下腫瘍担持マウスでのT細胞誘導に関して確立した（図29A）。10日後に、腫瘍を回収し、各腫瘍由来の浸潤性CD8+T細胞およびCD4+T細胞を、RPMI完全培地中でIL-2およびIL-7の存在下で培養した。
【０２００】
培養されたT細胞がその腫瘍特異性を維持しているかを試験するために、関連する標的細胞（放射線照射されたMC38腫瘍細胞）および無関係な標的細胞（γ照射B16腫瘍細胞または非腫瘍担持B6マウス由来のナイーブ脾細胞など）を含む、共培養アッセイを用いて、T細胞をそれらの腫瘍認識について試験した。24時間後、細胞を、IFN-γELISPOTまたはフローサイトメトリーによる4-1BB発現を用いて腫瘍特異性について分析した。IFN-γELISPOTによれば、vvDD-IL-2、vvDDまたはPBS処置腫瘍由来のT細胞は、無関係の標的細胞（例えば、B16またはナイーブ脾細胞）と比較して、腫瘍特異的IFN-γ分泌を提示した（図29B）。
【０２０１】
CD8+腫瘍特異的T細胞応答とCD4+腫瘍特異的T細胞応答とを区別するために、各サンプルからのフローサイトメトリー結果を図29Cにまとめた。vvDD-IL-2誘導型T細胞は、vvDDまたはPBS群と比較した場合に、無関係な標的細胞に対してより低い非特異的反応性を伴って、非常に腫瘍特異的なCD8+およびCD4+T細胞を示した（図29C）。各群由来の1個のサンプルのCD8+ 4-1BB+T細胞およびCD4+ 4-1BB+T細胞の代表的フローサイトメトリープロットを、図30に示す。
【０２０２】
vvDD-IL-2により生成される腫瘍反応性T細胞は、養子T細胞移入における新規戦略を提示する。ACTのための腫瘍溶解性ウイルス誘導型T細胞の新規に開発されたアプローチを、MC38腹腔内腫瘍担持マウスで試験した。T細胞移植に先立って、処置されたマウスに、臨床プロトコールと同様のリンパ枯渇を模倣するために、致死線量未満の5Gy照射を施した。群分けされたマウスに、vvDD-IL-2誘導型T細胞、ナイーブT細胞またはPBSを腹腔内注入した。すべての処置マウスに、IL-2の外因性サイトカイン補助を施した。腫瘍生長の経時的な動態をモニタリングするために、治療的応答を、生体動物生物発光イメージングによりモニタリングした（図33C）。vvDD-IL-2誘導型T細胞を投与されたマウスは、対照マウスと比較して最も強い腫瘍退縮を示した。動物生存期間に関しては、ウイルスにより生成されたT細胞が、ナイーブT細胞またはIL-2と共に照射のみまたはPBSを投与されたマウスと比較して、最良の全生存をもたらした（図33C）。ACT後17日目のイメージングを、図34に示す。
【０２０３】
まとめると、本明細書中に開示される前臨床モデルでは、ウイルス誘導型T細胞は、治療的潜在能力を示す。移植されたT細胞の腫瘍特異性を探るために、ACTに先立って、確立された共培養アッセイを行なった（図31）。各群由来の1個のサンプルのCD8+ 4-1BB+T細胞およびCD4+ 4-1BB+T細胞の代表的フローサイトメトリープロットを、図32に示す。T細胞を、フローサイトメトリーにより4-1BB発現に関して、ELISPOTによりIFN-γ分泌に関して分析した。ウイルス誘導型T細胞は、ナイーブT細胞と比較して、無関係の標的細胞に対してほとんど反応性を有しない、腫瘍特異的IFN-γスポットを提示した（図31Bおよび31C）。ELISPOTのために用いたものと同じサンプル由来のT細胞を4-1BB発現に関して分析すると、ウイルス誘導型T細胞のみが、対照群と比較して、顕著な腫瘍特異的CD8+4-1BB+およびCD4+4-1BB発現を示した。 
【０２０４】
9.4 考察
本実施例は、サイトカイン武装化型腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが、腫瘍内T細胞浸潤を促進することができ、かつ養子T細胞移入のための腫瘍特異的T細胞（OV誘導型T細胞）を生成することを示す。
【０２０５】
強いリンパ球浸潤が、抗腫瘍応答および臨床帰結の改善に関連することが報告されている。しかしながら、消化管悪性腫瘍を有する患者のうちの多数は、非常に免疫抑制性である微小環境を伴う腫瘍に浸潤した純粋な免疫細胞を示す。免疫原性細胞死の誘導を伴う、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの利用は、免疫原性が弱い腫瘍を克服するための有効な戦略を提供する。ウイルス媒介細胞死は、考えられる危険信号の放出および腫瘍関連抗原の交差提示をもたらし、これが、抗腫瘍性の生得的免疫および適応免疫をもたらす。本実施例では、ワクシニアウイルス誘導型腫瘍浸潤性T細胞の、ex vivo増殖および前臨床的マウス結腸癌モデルでの養子T細胞移入のための使用が実証された。サイトカイン武装化型腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの腫瘍内投与は、TMEへのT細胞浸潤を促進する。ウイルス誘導型T細胞は非常に腫瘍特異的であり、ex vivoで増殖され、腫瘍担持マウスに移植された場合にそれらの治療的能力を維持した。本実施例は、腫瘍内T細胞浸潤を促進し、かつ養子T細胞移入のための腫瘍微小環境で腫瘍特異的T細胞を生成させるための戦略を提示する。
【０２０６】
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【０２０７】
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【０２０８】
示されかつ特許請求される様々な実施形態に加えて、開示される主題はまた、本明細書中に開示および特許請求される特徴の他の組み合わせを有する他の実施形態にも向けられる。従って、本明細書中に提示される特定の特徴は、開示される主題が本明細書中に開示される特徴のいずれかの好適な組み合わせを含むように、開示される主題の範囲内の他の様式で互いに組み合わせることができる。開示される主題の具体的な実施形態の上記の説明は、例示および説明の目的で提示されたものである。開示される主題が網羅的であるか、または開示されたそれらの実施形態に限定されることは意図されない。
【０２０９】
様々な改変および変更を、開示される主題の精神または範囲から逸脱することなく、開示される主題のシステムおよび方法で作成できることは、当業者には明らかであろう。つまり、開示される主題は、添付の特許請求の範囲およびそれらの等価物の範囲内に入る改変および変更を含むことが意図される。
様々な参考文献、特許および特許出願が本明細書中で参照され、それらの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020514324.tif 000011
【図８Ａ】
2020514324.tif 000012
【図８Ｂ】
2020514324.tif 000013
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2020514324.tif 000018
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
2020514324.tif 000030
【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2020514324.tif 000038
【図２９Ａ】
2020514324.tif 000039
【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０−１】
2020514324.tif 000042
【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３２−１】
2020514324.tif 000048
【図３２−２】
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【図３３Ａ】
2020514324.tif 000050
【図３３Ｂ】
2020514324.tif 000051
【図３３Ｃ】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020514324.tif 000054
2020514324.tif 000055
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