(57)【要約】少なくとも２つのセンサーを含むセンサーアレイであって、各センサーがタンパク質バレル及びレポーター色素を含み、タンパク質バレルがルーメンを規定し、レポーター色素がルーメンに可逆的に結合しており、且つ少なくとも２つのセンサーでタンパク質バレルの構造が異なる、センサーアレイ。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２つのセンサーを含むセンサーアレイであって、各センサーがタンパク質バレル及びレポーター色素を含み、
前記タンパク質バレルがルーメンを規定し、前記レポーター色素がルーメンに可逆的に結合しており、且つ
少なくとも２つの前記センサーで前記タンパク質バレルの構造が異なる、
センサーアレイ。
【請求項２】
前記タンパク質バレルが、アルファヘリックスバレルとして配置された５つ以上のアルファヘリックスを含む、請求項１に記載のセンサーアレイ。
【請求項３】
各アルファヘリックスが、配列ａｂｃｄｅｆｇを有する反復単位を有する配列を独立して含み、配列中、ａ及びｄの位置の５０％以上が疎水性アミノ酸であり、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、及びｇの位置の５０％以上が極性アミノ酸である、請求項２に記載のセンサーアレイ。
【請求項４】
配列ａｂｃｄｅｆｇを有する前記反復単位が、ＬＱＫＩＥｆＩ、ＬＫＡＩＡｆＥ、ＬＫＥＩＡｆＳ、ＩＫＥＩＡｆＳ、ＬＫＥＩＡｆＡ、ＦＫＥＩＡｆＡ、ＩＫＥＩＡｆＡ、ＩＫＥＶＡｆＡ、ＶＫＥＶＡｆＡ、ＶＫＥＩＡｆＡ、ＭＫＥＩＡｆＡ、ＬＫＱＩＥｆＩ、ＬＫＥＶＡｆＡ、ＶＫＥＬＡｆＡ、ＩＫＥＬＳｆＡ、ＩＫＥＬＡｆＳ、ＬＫＥＬＡｆＳ、ＦＫＥＩＡｆＡ、及びＬＫＥＬＡｆＡからなるリストから選択され、式中、ｆが反復単位間で変化し得る、請求項３に記載のセンサーアレイ。
【請求項５】
各アルファヘリックスが少なくとも３つの反復単位を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載のセンサーアレイ。
【請求項６】
前記タンパク質バレルが非天然アミノ酸を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のセンサーアレイ。
【請求項７】
前記非天然アミノ酸が、タンパク質基質を化学的に連結することによって修飾されているアミノ酸である、請求項６に記載のセンサーアレイ。
【請求項８】
前記タンパク質基質が、酵素基質、受容体基質、及び／又は抗体基質を含む、請求項７に記載のセンサーアレイ。
【請求項９】
前記タンパク質バレルが、単一で連続的なアミノ酸骨格を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のセンサーアレイ。
【請求項１０】
前記タンパク質バレルが基質に固定されており、好ましくは、前記基質が固体基質であるか又はヒドロゲルである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のセンサーアレイ。
【請求項１１】
前記タンパク質バレル及び前記レポーター色素が乾燥した状態である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のセンサーアレイ。
【請求項１２】
前記レポーター色素が、ルーメンに結合すると光信号を生じさせる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のセンサーアレイ。
【請求項１３】
前記レポーター色素が、式Ｉに従った化合物であり、
【化１】
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式中、ｎが３以上であり、好ましくは、ｎが３、４、又は５であり、さらに好ましくは、ｎが３であり、且つ
Ｒ１及びＲ２が、アリール又はヘテロアリールから独立して選択され、好ましくはアリール、さらに好ましくはフェニルである、
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のセンサーアレイ。
【請求項１４】
少なくとも１０個のセンサー、好ましくは少なくとも５０個のセンサー、さらに好ましくは少なくとも１００個のセンサー、さらにより好ましくは少なくとも３００個のセンサーを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のセンサーアレイであって、前記タンパク質バレルが、少なくとも１０個、５０個、１００個、又は３００個のセンサーの各々でそれぞれ異なる、センサーアレイ。
【請求項１５】
少なくとも１つのさらなるセンサーを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のセンサーアレイであって、前記レポーター色素が、前記少なくとも１つのさらなるセンサーにおいて異なる、センサーアレイ。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のセンサーアレイを含む、マイクロアレイチップ。
【請求項１７】
分析物を感知するためのタンパク質バレル及びレポーター色素の使用であって、前記タンパク質バレルがルーメンを規定し、前記レポーター色素がルーメンに可逆的に結合している、使用。
【請求項１８】
前記タンパク質バレルが請求項２〜１１のいずれか一項に記載の特徴のいずれかを有する、請求項１７に記載のタンパク質バレルの使用。
【請求項１９】
（ａ）請求項１〜１５のいずれか一項に記載のセンサーアレイを用意するステップ、（ｂ）センサーアレイを試験するための組成物を適用するステップ、（ｃ）センサーアレイを発色させるステップ、及び（ｄ）発色したセンサーアレイを所定の標準と比較するステップを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のセンサーアレイを使用する方法。
【請求項２０】
ステップ（ｄ）が、コンピュータによるパターン認識を含む、請求項２１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質バレルからのレポーター色素の移動によって機能するセンサーアレイに関する。具体的には、本発明は、「人工嗅覚」法又は「人工鼻」法と呼ばれることが多い差別的方法によって分析されるセンサーアレイに関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子又はバイオインスパイアード分子を使用して感知するには、２つの主なアプローチが存在する。第１のアプローチは、抗体などの高度に特異的なセンサー分子が目的の分析物の各々について産生される、「ロック・アンド・キー」アプローチである。これらのタイプのセンサーは、標的分析物に対して高度に選択的となるように最適化されなければならず、したがって、各分析物について高額な開発プロセス及び最適化プロセスを経由する必要がある。
【０００３】
第２のアプローチは、嗅覚系に類似し、あまり特異的ではない受容体のアレイを使用する。その概念は、単一の標的分子又は混合物が異なる程度でこれらの受容体のうちのいくつかを結合する及び／又はこれらの受容体のうちのいくつかと反応し、アレイにおいて固有のサインを生じさせる、というものである。これによって、高度に特異的で且つ高額であることが多い受容体を各分析物について開発する必要性が回避される。この第２のアプローチは、差別的感知又はアレイ感知と呼ばれる。
【０００４】
差別的感知のための第１のアプローチは、色素分子のアレイが設計され、分析物が色素分子に直接結合する、又は色素分子と化学的に反応するものである。Ｙｏｕ、Ｚｈａ、及びＡｎｓｌｙｎ（２０１５）は、このようなアレイ及びその適用の包括的総説を提供している。しかし、このようなアレイは設計するのが複雑であり、その理由は、特注の色素が典型的には設計されなくてはならず、そしてこれらの色素が、（ａ）光信号を生じさせなくてはならず、（ｂ）様々な分析物を結合しなくてはならず、且つ（ｃ）結合すると光学特性を変化させなくてはならないためである。一度開発されても、これらの特注の色素は、複雑な合成及び高額な材料を伴い得、最終的なアレイのコストを増大させる。
【０００５】
差別的感知のための異なるアプローチは、受容体からのレポーター色素の移動を使用することである。これによって、色素よりもむしろ受容体に多様性を導入することが可能となり、これによって、低コストの通常の色素をレポーター色素として使用することが可能となる。このようなアレイの総説は、Ｙｏｕ、Ｚｈａ、及びＡｎｓｌｙｎ（２０１５）でも見ることができる。具体的な代表例を以下で論じる。
【０００６】
一般に使用される受容体／色素の組合せは、短鎖ペプチド、金属イオン、及びレポーター色素のアンサンブル（ｅｎｓｅｍｂｌｅ）である。金属イオンは、短鎖ペプチド及びレポーター色素の両方に結合し、分析物は、レポーター色素を金属イオンから移動させる。Ｕｍａｌｉ及びＡｎｓｌｙｎ（２０１０）は、異なる分析物クラスに使用することができるこのアンサンブルについての多くのバリエーションを記載している。例えば、一つのアレイでは、ペプチドは、リン酸ヌクレオチドを結合するためにグアニジウム基で装飾され、別のアレイでは、ペプチドは、グリコペプチド及び糖類を結合するために、ホウ酸基で装飾された。より最近の研究では、このようなアレイは、ワイン（Ｕｍａｌｉら、２０１５）及びカシャッサウッド抽出物（Ｇｈａｎｅｍら、２０１７）のポリフェノール組成物を特徴付けするために使用された。しかし、これらのアンサンブル感知アレイは、少なくとも３つの構成要素、すなわち、レポーター色素、金属イオン、及び少なくとも１つのペプチドからアンサンブルを慎重に調製する必要がある。金属イオンに結合するレポーター色素、及びレポーター色素を金属イオンとの結合から移動させ得る分析物が必要であることに起因して、このようなアレイはまた、非極性の疎水性分子に対する感度も欠いている。
【０００７】
金属イオンの必要性を避けるアプローチは、血清アルブミンを受容体として使用することであった。異なる由来源動物に由来する血清アルブミンが、様々な受容体を提供するために使用されてきており、様々な疎水性色素が、血清アルブミン結合部位内で結合するために使用された。これらのアレイは、テルペン（Ａｄａｍｓ及びＡｎｓｌｙｎ、２００９）、脂肪酸及び油（Ｋｕｂａｒｙｃｈ、２０１０）、グリセリド（Ｄｉｅｈｌら、２０１５）、並びに異なるプラスチック爆薬で見られる可塑剤（Ｉｖｙら、２０１２）の間を差別化するために使用されている。有用ではあるが、血清アルブミンに基づくアレイは、上記で論じられたものなどの疎水性分子の検出及び差別化に限られている。
【０００８】
本発明は、非常に広範囲な分析物クラスからの分析物を検出し、その間を区別するためのアレイを形成し得る、単純で低コストの、且つ頑強な受容体及び色素系を提供することを目的としている。このように、本発明は、先行技術の限界を克服することを目的としている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
第１の態様に従うと、本発明は、少なくとも２つのセンサーを含むセンサーアレイであって、各センサーがタンパク質バレル及びレポーター色素を含み、タンパク質バレルがルーメンを規定し、レポーター色素がルーメンに可逆的に結合しており、且つ少なくとも２つのセンサーでタンパク質バレルの構造が異なる、センサーアレイを提供する。
【００１０】
レポーター色素は、その色素が、いかなる分析物も存在しない条件下でルーメンに結合している場合と、この結合が妨害されている場合との間で異なる光信号を生じさせる色素である。妨害としては、レポーター色素がルーメンから排出されること、又はレポーター色素がルーメン内で立体構造を変化させることが含まれる。分析物の存在しない条件下では、レポーター色素はルーメンに結合しており、最初の光信号を生じさせる。分析物の存在下では、レポーター色素は、ルーメンから全体が移動させられるか、又は、異なる立体構造でルーメン内に残って、レポーター色素の信号を変化させる。
【００１１】
任意の個々のセンサーは、複数のタンパク質バレルを典型的には含む。ルーメンからのレポーター色素の排出を生じさせる分析物は、センサー内の全てのタンパク質バレルからの色素の排出を典型的には生じさせるわけではない。このような分析物は、色素との直接的な競合によって、又はアロステリック効果を介して、レポーター色素の解離定数を変化させ、その結果、レポーター色素の結合と非結合との平衡位置がシフトする。
【００１２】
異なるセンサーで、構造が異なるタンパク質バレルを使用することによって、分析物は、異なるタンパク質バレル構造と異なる程度で相互作用し、センサーの光学特性に異なる程度で影響し、そして、分析物に特異的なセンサーアレイで光信号パターンを生じさせる。
【００１３】
移動に基づく差別的感知における、アルファヘリックスバレル、ベータバレル、又はイオンチャネルなどのタンパク質バレルの使用は、先行技術と比較して多くの利点をもたらす。例えば、先行技術とは対照的に、タンパク質バレルは、特異的な分析物クラスの検出に限定されておらず、疎水性分析物及び非疎水性分析物の両方を含む広範囲の標的分子及び混合物を成功裏に区別するための能力を提供する。
【００１４】
このことの１つの理由は、タンパク質バレルの構造によって、ルーメン表面が非常に大きな表面積となることである。結合したレポーター色素は、全ての側がルーメン表面によって囲まれており、このことは、レポーター色素の化学的環境が、ルーメン表面の多くのアミノ酸側鎖によって直接決定されることを意味する。より詳細には、アルファヘリックスバレルでは、ルーメン表面を形成するヘリックス当たり最大８つのアミノ酸側鎖があることが共通しており、すなわち、５つのへリックスを有するアルファヘリックスバレルでは４０のアミノ酸側鎖、６つのへリックスを有するアルファヘリックスバレルでは４８のアミノ酸側鎖であり、他も同様である。この大きな表面積が、堅固なタンパク質バレルに有利に提供され、ここで、ルーメン表面上の任意の又は理論上全てのアミノ酸側鎖が修飾されて、異なる化学的環境を有する広く様々な異なるタンパク質バレルが最終的に提供され得る。一実施形態では、アミノ酸側鎖の最大５０％が修飾されており、例えば、ヘプタマーのルーメン表面の鎖当たり４つ、したがって全部で２８個が修飾されている。
【００１５】
２０個のリボソームアミノ酸、標準的アミノ酸、又はタンパク質構成アミノ酸（ｐｒｏｔｅｉｎｏｇｅｎｉｃ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）が各残基で可能であると限定した場合であっても、このことによって、化学的環境の広い多様性が既にもたらされている。したがって、センサーアレイで使用される異なるバレルは、数百万の考えられるオプションから選択され得、非常に多様な特性を有するタンパク質バレルの使用が可能となる。血清アルブミンなどのタンパク質を使用してこのような多様性にアクセスする試みでは、三次構造が妨害される可能性が最も高く、それによって、結合能力を完全に失ったタンパク質の沈殿が生じる。
【００１６】
驚くべきことに、タンパク質バレルセンサーは、タンパク質バレルのルーメン内で結合し得る分析物には限定されない。分析物とタンパク質バレルの外面との相互作用は、したがって、天然で見られる受容体結合部位のアロステリック調節に類似の様式で、タンパク質バレルのルーメン内の環境を修飾し得る。この修飾は、レポーター色素の結合定数を変化させてレポーター色素の一部若しくは全てを追い出し得るか、又は、この変更は、レポーター色素が結合したままではあるが異なる光学特性となるように、ルーメンを変化させることができる。根底にある理由に関係なく、この効果によって、センサーアレイに、ルーメン内で結合し得るものよりも広範な分析物で使用される能力が付与される。大きな外表面積がここでも、堅固なタンパク質バレルに提供され、ここで、外表面上の任意の又は全てのアミノ酸側鎖が、広く様々な化学的環境をもたらすように修飾され得る。
【００１７】
さらに、各センサーで、観察される信号は、「蛍光」又は「非蛍光」などの単純な２値信号ではない。その代わり、全信号と信号なしとの間は連続している。考えられるタンパク質バレルのこのような広い化学的空間を伴って、及び連続応答をもたらす化学的空間内の各特異的なタンパク質バレルを伴って、本発明のセンサーアッセイは、これまでに達成できなかった分析空間へのアクセスを提供する。これの全体的な効果は、広範囲の分析物の間を区別する無比の能力を有するセンサーアレイである。
【００１８】
本発明者らは、非常に安定な三次構造の大きな利点が、この構造が、点突然変異を、特に、その側鎖の内部がルーメン内に向いているか又は外部がバルク溶媒に向いている残基の点突然変異を容易に達成させ得ることである、ということに既に気付いていた。このことは、上記の広い化学的空間へのアクセスが、タンパク質バレルのフォールディングを損なうことなく実行可能であることを意味する。タンパク質バレルの三次構造がこのように安定であることは、所望の多様性を有するアレイを作製するために構造をコンピュータによりモデリングすること及び合理的な設計概念を使用することが簡単であることをさらに意味する。
【００１９】
タンパク質バレルの安定な且つ明確に定義された三次構造の別の利点は、反復アッセイで再現性が高いことである。タンパク質バレルが安定であることは、タンパク質バレルが長期間にわたって安定であり続け、センサーアレイの長期の保存期間及び／又は反復使用を可能とし、同一の分析物に対する応答において同一の信頼性のある信号を生じさせることを意味する。さらに、バレルは凍結乾燥することができ、これによって、より良好な、より安全な、且つより長期の保管が可能となる。バレルは、次に、水性緩衝液を添加するだけで再構成される。
【００２０】
タンパク質バレルはまた、確立されたペプチド合成技術を介して、又は合成遺伝子の組換え発現を介して、非常に低いコストで生産することができる。この低コストによって、大量生産及び／又は使い捨てのセンサーアレイが可能となる。
【００２１】
センサーアレイは、したがって、広範な適用に展開することができる。例えば、センサーアレイは、複合混合物内の具体的な化合物を同定するため、複合混合物の間を差別化するため、又はエナンチオマー及びエナンチオマー混合物を含む非常に類似した分子の間を差別化するために使用することができる。本明細書において論じられる具体的な例は、様々な低分子及びタンパク質などの生体分子の両方の検出を包含する。水の汚染物質、食品の腐敗、毒素、爆薬、ファインケミカル及び医薬品の生産プロセスにおける目的の分子、感染、並びに疾患のバイオマーカーの検出などの、広範な適用が構想される。
【００２２】
食品及び飲料産業では、センサーアレイを人工鼻として使用して、腐敗の指標であり得る、食品又は飲料の上のヘッドスペースにおける気体化合物を検出することが望ましい。これは、本発明において、特に、ヒドロゲル基質を使用する場合に可能である。
【００２３】
センサーアレイのレポーター色素は、携帯用の手持ち式の装置又はスマートフォンを使用して読み取り及び処理が可能な、感度が高いがコストの低い使い捨てチップの開発を可能にする、光学的サインを生じさせる。長期的には、この装置の携帯性は、「インラインでの」、「フィールドでの」、又は「ベッドサイドでの」分析を容易にするであろう。言い換えると、問題の分析を行うことは、研究室の問題ではない。特に、この技術は、水質、食品由来の毒素、感染性疾患、及び他のものの迅速な試験などの第３世界又は人道主義的な適用で使用され得る、強力であるが安価なセンサー装置を可能にする。
【００２４】
上記で論じたように、タンパク質バレルは、アルファヘリックスバレル、ベータバレル、又はイオンチャネルであり得る。タンパク質バレルがアルファヘリックスバレルである場合、タンパク質バレルは、アルファヘリックスバレルとして配置された５つ以上のアルファヘリックスを含む。
【００２５】
アルファヘリックスバレルは、タンパク質バレルとして特に好ましい。アルファヘリックスバレルは、典型的には、疎水性のルーメンを伴って水溶性である。天然のアルファヘリックスバレル及びデノボ設計されたアルファヘリックスバレルの両方が公知であり、Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈら、１９９６；Ｋｏｒｏｎａｋｉｓら、２０００；Ｚａｃｃａｉら、２０１１；Ｆｌｅｔｃｈｅｒ、２０１２；Ｍｅｕｓｃｈら、２０１４；Ｓｕｎら、２０１４；Ｔｈｏｍｓｏｎら、２０１４；Ｃｏｌｌｉｅ、２０１５；及びＬｏｍｂａｒｄｏら、２０１６を参照されたい。アルファヘリックスバレルは、その定義のための特徴がルーメンの存在である、コイルドコイルオリゴマーを含む。５つ未満のアルファヘリックスを有するコイルドコイルオリゴマーは公知であるが、５つのアルファヘリックスは、ルーメンを規定するために必要な最小数であると考えられる。５つ、６つ、７つ、８つ、１０個、及び１２個のアルファヘリックスを有するアルファヘリックスバレルが報告されている。
【００２６】
アルファヘリックスバレルのサイズは、非常に正確に制御することができる。構成要素であるアルファヘリックスの長さを制御すると、アルファヘリックスバレルの長さを制御することができる。アルファヘリックスバレルを構成するアルファヘリックスの数を変化させると、ルーメンの直径を制御することができる。
【００２７】
アルファヘリックスバレルは、非常に安定な３次（３Ｄ）構造を有する。さらに、アルファヘリックスは、非常に予測可能な７つでできた反復配列を含む。これによって、アルファヘリックスバレルの３次（３Ｄ）構造を形成し安定化させるアミノ酸残基、並びに、ルーメン表面及びアルファヘリックスバレルの外表面のアミノ酸残基の正確なモデリングが可能となる（例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎら、２０１４において報告されているように）。アルファヘリックスバレルの安定性によって、センサーアレイを乾燥させ、再構成し、非水性溶媒中で洗浄し、及び／又は固体支持体に固定することも可能となる。
【００２８】
アルファヘリックスバレルは、合成で得ることが可能である。アルファヘリックスバレルは、同一のアルファヘリックスを含み得、ここで、各アルファヘリックスは、同一であるが別個のアミノ酸鎖を含む。このことは、単一のアルファヘリックスのみを合成すればよく、この後に、アルファヘリックスバレルが自己組織化されることを意味する。このことによって、アルファヘリックスバレルの合成が単純になり、コストが下がる。
【００２９】
アルファヘリックスは、配列ａｂｃｄｅｆｇを有する反復単位を有する配列を典型的には含み、配列中、ａ及びｄの位置の５０％以上が疎水性アミノ酸であり、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、及びｇの位置の５０％以上が極性アミノ酸である。
【００３０】
アルファヘリックス状の７つでできた反復単位の性質は、ａ及びｄの位置がルーメン表面を、すなわち、ルーメンを規定するアルファヘリックスバレルの内表面を形成することを典型的には意味する。
【００３１】
アルファヘリックスバレルの重要な特徴は、３次（３Ｄ）構造の堅固な性質によって、複数のアミノ酸残基が同時に変化することが可能となることである。アルファヘリックスバレルのルーメンは、典型的には疎水性である。しかし、ルーメンに面しているアミノ酸側鎖の最大５０％が、任意の他のアミノ酸に変化し得る。非常に極性の又は荷電した官能基であっても使用することができる。アルファヘリックスバレルの堅固な性質に起因して、バレルは、アルファヘリックスバレルのアンフォールディングを生じさせることなく、極性官能基をさもなければ疎水性であるルーメン内で非常に正確に位置決定することができるように、設計され得る。
【００３２】
疎水性のルーメンでは、レポーター色素は典型的には疎水性となる。しかし、ルーメン内に極性残基があると、色素のより広い多様性が達成され得る。ルーメン内で結合する分析物については、類似の多様性の分析物が達成され得る。しかし、上記で論じたように、分析物は、アルファヘリックスバレルの外表面とも相互作用し得る。
【００３３】
具体的な実施形態では、反復単位は、ＬＱＫＩＥｆＩ、ＬＫＡＩＡｆＥ、ＬＫＥＩＡｆＳ、ＩＫＥＩＡｆＳ、ＬＫＥＩＡｆＡ、ＦＫＥＩＡｆＡ、ＩＫＥＩＡｆＡ、ＩＫＥＶＡｆＡ、ＶＫＥＶＡｆＡ、ＶＫＥＩＡｆＡ、ＭＫＥＩＡｆＡ、ＬＫＱＩＥｆＩ、ＬＫＥＶＡｆＡ、ＶＫＥＬＡｆＡ、ＩＫＥＬＳｆＡ、ＩＫＥＬＡｆＳ、ＬＫＥＬＡｆＳ、ＦＫＥＩＡｆＡ、及びＬＫＥＬＡｆＡからなるリストから選択され得、式中、ｆは反復単位間で変化し得る。これらの反復配列は、５つ、６つ、７つ、及び８つの要素からなるアルファヘリックスバレルを形成する、デノボアルファヘリックスバレルの反復単位を反映する。これらの反復単位はアルファヘリックスの基本的な構成要素を表すが、当然のことながら点突然変異が存在し得、全ての単位が同一の反復という訳ではなくなる。任意の所与のアルファヘリックスでは、又はアルファヘリックスバレルでは、アミノ酸残基の最大４０％、好ましくは最大２５％、さらに好ましくは最大１０％が、反復単位から逸脱し得る。
【００３４】
ａ及びｄの位置が疎水性の核を形成する、７つでできた反復単位では、ｆの位置は、その側鎖がバルク溶媒に直接向けられるアミノ酸を典型的には表す。このように、ｆの位置のアミノ酸は、反復単位間で変化し得る。
【００３５】
各アルファヘリックスは、少なくとも３つの反復単位を含み得る。３つの反復単位は、広範なレポーター色素を結合するのに十分な長さのルーメンを提供する。
【００３６】
タンパク質バレル全体は、リボソームアミノ酸のエナンチオマー、標準的なアミノ酸のエナンチオマー、又はタンパク質構成アミノ酸のエナンチオマーを含み得る。或いは、タンパク質バレルは、非天然アミノ酸を含み得る。完全にエナンチオマー性のタンパク質バレルは、エナンチオマー分析物を検出するための基礎を形成し得る。人工アミノ酸もまた組み込むことができる。人工アミノ酸としては、さらに機能化された天然アミノ酸が含まれる。特定の一実施形態では、天然アミノ酸は、翻訳後修飾によって、例えばリン酸化又はグリコシル化によって、さらに機能化されていてよい。
【００３７】
非天然アミノ酸は、タンパク質基質を化学的に連結させることによって修飾されているアミノ酸であり得る。具体的には、タンパク質基質は、酵素基質、受容体基質、及び／又は抗体基質を含み得る。タンパク質基質は、単に、タンパク質結合部位が結合するためのものである。タンパク質基質はまた、酵素が修飾し得る反応部位でもあり得る。例えば、タンパク質基質は、キナーゼにとってのリン酸化基質であり得る。このように、レポーター色素の信号は、キナーゼが結合すると、又はリン酸化によって、影響を受け得る。
【００３８】
タンパク質バレルは、単一で連続的なアミノ酸骨格を含み得る。このように、タンパク質は、別個のタンパク質サブユニットからは自己組織化しない。このように、タンパク質サブユニットからの自己組織化の様式（すなわち四次構造）は、考慮する必要はない。単一で連続的なアミノ酸骨格は、したがって、タンパク質の二次構造のエレメントがフォールディング内において置かれる位置を、さらに制約し得る。
【００３９】
アルファヘリックスバレルでは、例えば、各ヘリックスが異なる構造を有し得るか、又は、バレルのただ１つのヘリックスが、荷電した残基を含有し得る。別個のアルファヘリックスサブユニットでは、形成され得るヘリックスバレルの異なる順列について考慮する必要がある。単一で連続的なアミノ酸骨格では、この考慮は、アルファヘリックス（すなわち二次構造）にフォールディングされ、それ自体が次いでアルファヘリックスバレル（すなわち三次構造）にフォールディングされる、単一で連続的なアミノ酸骨格を慎重に設計することによって、ほとんど不要となり得る。
【００４０】
総合的に言えば、タンパク質バレルの構造に明確な変化がもたらされることを、かなり制御することができるようになる。
【００４１】
タンパク質バレルは溶液中にあり得るが、本発明の一実施形態では、タンパク質バレルは基質に固定されている。これによって、そこで分析物の溶液をセンサー上に流すことができる、又はセンサーを洗浄し、再び使用することができる、センサーアレイが可能となる。さらに、固定することによって、センサー間に物理的障壁がないセンサーアレイが提供され、それによって、アレイマイクロチップの基礎が提供される。このようなアレイマイクロチップに必要なタンパク質バレルの量は非常に小さく、おそらくは１マイクログラム未満、例えば０．０１〜１マイクログラムである。
【００４２】
レポーター色素もまた、レポーター色素がタンパク質バレルのルーメンに依然として可逆的にアクセスし得る限りにおいて、基質又はタンパク質バレルに固定することができる。このような固定によって、隣接するセンサーを洗い流すことができない又は隣接するセンサーに干渉し得ないタンパク質バレル及びレポーター色素が提供され、再利用可能なセンサーアレイ又はインラインでの感知に使用され得るセンサーアレイが提供される。
【００４３】
タンパク質バレルはまた、ヒドロゲル又は３次元の多孔質足場の上に又はその中に置くことができる。このことは、ヒドロゲルに溶解可能でバレルにアクセス可能となる気体分析物を感知するためにバレルを使用することが可能となることを助ける。
【００４４】
タンパク質バレル及びレポーター色素は、乾燥した状態であり得る。言い換えると、タンパク質バレルとレポーター色素との複合体は、乾燥している。センサーアレイは、したがって、乾燥した状態である。乾燥した状態は保管に適しているが、分析を行う前に典型的には再水和される。分析物が水性である場合、再水和は、分析物によって単純な様式で達成され得る。乾燥した状態での使用は、タンパク質バレルが非常に安定であることによって可能となる。
【００４５】
好ましい実施形態では、レポーター色素は、ルーメンに結合すると光信号を生じさせる。このことで、本発明者らは、レポーター色素がルーメンに結合すると測定可能な光信号があることを意味する。典型的には、このことは、レポーター色素が自由溶液中にある場合は光信号がないことを意味する。これは、レポーター色素が自由溶液中で信号を生じさせるがルーメンに結合した場合には信号を生じさせない逆のシナリオよりも利点を有するが、逆のシナリオもまた可能である。
【００４６】
任意の分析物が添加される前の、タンパク質バレルに結合しているレポーターの静止状態は、正の信号が測定され得る状態である。これは、各センサーのレポーター色素及びタンパク質バレルがアッセイの開始前に無傷であることをチェックするための迅速な手段を提供する。さらに、ある特定のケースでは、レポーター色素は分析物に応じてルーメンを離れられないということが前提とされる。レポーター色素は、その代わり、ルーメンの立体構造の変化におそらく応じて、ルーメン内で異なる立体構造を取り、立体構造のこの変化はまた、光学特性の変化も生じさせる。レポーター色素が結合されてクエンチされれば、このような変化は見られなくなる。これによって、レポーター色素が結合した後にルーメンのいずれかの端の上に遮断基をおそらく付け加えることによって、レポーター色素をルーメン内にカプセル化することがさらに可能となる。このような複合体は、標的分析物に応じたルーメン内のレポーター色素の立体構造の変化によって作動する。レポーター色素をこの手段でカプセル化することによって、レポーター色素が洗い流されないため、再利用され得る又はインラインセンサーなどの適用において使用される頑強なセンサーが可能となる。
レポーター色素は、式Ｉに従った化合物であり得、
【００４７】
【化１】
2020533568.tif 000003
【００４８】
式中、ｎは３以上であり、好ましくは、ｎは３、４、又は５であり、さらに好ましくは、ｎは３であり、Ｒ１及びＲ２は、アリール又はヘテロアリールから独立して選択され、好ましくはアリール、さらに好ましくはフェニルである。好ましくは、レポーター色素は、１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエンである。これらなどのレポーター色素は、長く、薄く、且つ疎水性であり、これは、これらのレポーター色素が、タンパク質バレルのルーメン内での結合に非常に適していることを意味する。さらに、これらなどのレポーター色素は、自由溶液中では光信号を生じさせない。しかし、タンパク質バレルのルーメンに結合すると、コンジュゲートしていない鎖はねじれ、紫外線光に応答して蛍光信号を生じさせ得る。
【００４９】
センサーアレイは、少なくとも１０個のセンサー、好ましくは少なくとも５０個のセンサー、さらに好ましくは少なくとも１００個のセンサー、さらにより好ましくは少なくとも３００個のセンサーを含み得、ここで、タンパク質バレルは、少なくとも１０個、５０個、１００個、又は３００個のセンサーの各々でそれぞれ異なる。各々が異なるタンパク質バレルを有する約１６個のセンサーが、ほとんどの商業的に関連する低分子分析物及び高分子分析物を検出するために必要であることが予測される。当然のことながら、平台型のプレートリーダーは、９６ウェル、３８４ウェル、及び１５３６ウェルのプレートを読み取るように典型的には設定されているが、制御及び反復によって、任意のプレートの固有のセンサーの数を通常、減少させている。
【００５０】
センサーアレイは少なくとも１つのさらなるセンサーを含み得、ここで、レポーター色素は、この少なくとも１つのさらなるセンサーにおいて異なる。レポーター色素を変化させることは、アレイごとに信号を変化させるための別の手段である。式Ｉのものと異なる物理化学的特性を有するレポーター色素を使用することによって、異なる分析物を区別する能力はさらに改善される。使用され得る典型的なレポーター色素としては、６−プロピオニル−２−ジメチルアミノナフタレン（プロダン）などの全てのナフタレン色素が含まれる。
【００５１】
第２の態様に従うと、本発明は、本発明の第１の態様に従ったセンサーアレイを含むマイクロアレイチップを提供する。上記のように、タンパク質バレル及びレポーター色素を使用してマイクロアレイチップを作り上げることが可能である。これは、広範囲の分析物を同定する強力な能力を有する、低コストの、使い捨ての、又は再利用可能なマイクロアレイであり得る。マイクロアレイはスマートフォンによって読み取ることができ、このセンサー技術を人口全般による使用にとって利用可能としている。
【００５２】
第３の態様に従うと、本発明は、分析物を感知するためのタンパク質バレル及びレポーター色素の使用であって、タンパク質バレルがルーメンを規定し、レポーター色素がルーメンに可逆的に結合している、使用を提供する。タンパク質バレルは、本発明の第１の態様に従ったタンパク質バレルの特徴のいずれかを有し得る。レポーター色素は、本発明の第１の態様に従ったレポーター色素の特徴のいずれかを有し得る。
【００５３】
第４の態様に従うと、本発明は、（ａ）本発明の第１の態様に従ったセンサーアレイを用意するステップ、（ｂ）センサーアレイを試験するための組成物を適用するステップ、（ｃ）センサーアレイを発色させるステップ、及び（ｄ）発色したセンサーアレイを所定の標準と比較するステップを含む、本発明の第１の態様に従ったセンサーアレイを使用する方法を提供する。
【００５４】
ステップ（ｄ）は、コンピュータによるパターン認識の使用を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】コイルドコイルの配置にある２つのアルファヘリックスのａｂｃｄｅｆｇの７つでできた反復単位を示す略図である。
【図２】コイルドコイル状のアルファヘリックスバレルにおける、５つ以上のアルファヘリックスの、ａｂｃｄｅｆｇの７つでできた反復単位を示す略図である。
【図３】６つのヘリックスからなるバレルの、ａｂｃｄｅｆｇの７つでできた反復単位を示す略図である。
【図４】ＰＤＰ  ＩＤ  ４ＤＺＭ、４ＤＺＬ、３Ｒ４Ａ、４ＰＮ８、４ＰＮ９、及び４ＰＮＡにそれぞれ対応する、３つ、４つ、５つ、６つ、及び７つのアルファヘリックスを含むコイルドコイルのフォールディングのＸ線結晶構造の上面図及び側面図である。
【図５Ａ】アルファヘリックスバレルのルーメン内で結合したファルネソールを有するＣＣ−Ｈｅｘ２を含むアルファヘリックスバレルのＸ線結晶構造の部分断面図である。
【図５Ｂ】図５ＡのＸ線結晶構造の上面図である。
【図６】異なるアルファヘリックスバレルのセンサーアレイを示す図である。
【図７】いかにしてセンサーアレイを実行するかを示す略図であり、図中、タンパク質バレルがアレイに加えられ、ＤＰＨレポーター色素が結合し、そして異なる分析物が異なる移動パターン又はフィンガープリントを生じさせている。
【図８】図６で記載したアルファヘリックスバレルのアレイに対する、７つの異なる分析物についての移動パターンを示す図である。
【図９】コレステロールの反復された移動パターンを示す図である。
【図１０】コンピュータによる方法を使用して移動パターンを分析するためのプロセスを示す図である。
【図１１】いかにしてコンピュータによるパターン認識がトレーニングで改善されるかを示すチャートである。
【図１２】複合混合物が成功裏に分析され得ることを実証する、選択された茶試料によって得られるＤＰＨ移動フィンガープリントを示す図である。
【図１３】上部で、グルコース、ガラクトース、及びマンノースについてのＤＰＨ移動フィンガープリントを示し、下部でエピマーの構造を示し、また、本発明がエピマーを区別するために使用され得ることを実証する図である。
【図１４】タンパク質構成ペプチドアレイ（左側）及び非タンパク質構成ペプチドアレイ（中央）を使用しての、１μΜの最終濃度のコレステロール（右側）のＤＰＨ移動フィンガープリントの比較を示す図である。
【図１５】各フィンガープリントの左側の下から２番目に描かれているブロックによって表されている、全てがＤ−アミノ酸である１つのペプチド（ｄ−（ａｖｋｅｖａ））を含むペプチドバレルのアレイを使用しての、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸（パネルＡ）及びＮＧ，ＮＧ−ジメチルアルギニン（パネルＢ）のＤＰＨ移動フィンガープリントを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
本発明の第１の態様は、少なくとも２つのセンサーを含むセンサーアレイを提供する。センサーアレイは、例えば、マルチウェルプレートで提供され得る。このケースでは、異なるセンサーは異なるウェル内にある。
【００５７】
センサーアレイは、少なくとも２つのセンサーを含む。２つのセンサーは、アレイを規定するために必要なセンサーの最小数である。多数のセンサーをアレイに含めることができる。例えば、アレイは、少なくとも１０個のセンサー、好ましくは少なくとも５０個のセンサー、さらに好ましくは少なくとも１００個のセンサー、さらにより好ましくは少なくとも３００個のセンサーを含み得る。
【００５８】
タンパク質バレルは、少なくとも２個、１０個、５０個、１００個、又は３００個のセンサーの各々がそれぞれ異なる。
【００５９】
特許請求の範囲に記載のセンサーにおいて、タンパク質バレルの構造が異なるための要件は、センサーアレイが、単にセンサーを反復する、制御する、又は同一のタンパク質バレルを使用するがレポーター色素は異なる、さらなるセンサーを含有し得ることは排除しない。実際、反復のセンサーの使用は、データの質を向上させるための一般的な戦略である。言い換えると、センサーアレイは、異なるタンパク質バレルを有する多くの異なるセンサーを含むが、通常は、同一のタンパク質バレルを有するセンサーアレイ内に、さらなるセンサーがあるであろう。これらのさらなるセンサーは、データの質、制御、又は異なるレポーター色素を使用するセンサーのために、通常は反復させる。しかし、センサーアレイ内には、タンパク質バレルの構造が異なる、特許請求の範囲に記載の数のセンサーが、少なくともなくてはならない。
【００６０】
各センサーは、タンパク質バレルを含む。タンパク質バレルは、ルーメンを規定するタンパク質である。タンパク質バレルは、したがって、ルーメン表面及び外表面を有する。ルーメンは、タンパク質内の管状の空洞である。管状の空洞は、典型的には延びており、すなわち、長く、狭い。通常は、ルーメンは、両端が開いており、ルーメン内の分子の移動が可能となる。しかし、ある特定の実施形態では、ルーメンは、一方の又は両方の端で遮断され得、特異的分子をルーメン内に閉じ込める。
【００６１】
タンパク質バレルは、異なるセンサーにおいて構造が異なる。このことで、本発明者らは、少なくとも１つの違いが存在することを意味させており、それによってタンパク質バレルが区別され得る。この違いとしては、アミノ酸の点突然変異、又は誘導体化若しくは機能化されているアミノ酸が含まれ得る。この違いとしてはまた、タンパク質バレルの長さ又は幅の変化も含まれ得る。この違いとしてはまた、タンパク質バレルのタイプの変化も含まれ得る。
【００６２】
タンパク質骨格における限られた数の違いを使用することによって非常に異なる化学的環境が作り出される可能性に起因して、本発明のある特定の実施形態では、異なるタンパク質バレルは、類似のタンパク質骨格を有し得る。例えば、異なるタンパク質バレルは全て、同一のタイプのものであり得る。一実施形態では、異なるタンパク質バレルは全て、アルファヘリックスバレルであり得る。別の実施形態では、異なるタンパク質バレルは、５０％の配列同一性、７０％の配列同一性、又は９０％の配列同一性に収まり得る。
【００６３】
アルファヘリックスバレル、ベータバレル、イオンチャネル、ＴＩＭバレル、及び他の孔形成タンパク質を含む、多くのタンパク質バレルのタイプが公知である。
【００６４】
アルファヘリックスバレルは、５つ以上のアルファヘリックスを含むタンパク質バレルである。アルファヘリックスは、それらが並んで互いに実質的にアラインされて管様の形状を形成するパターンで配置される。これは、コイルドコイルフォールディングとして公知であり（コイルドコイル構造又はコイルドコイルアセンブリとしても公知である）、これまでに良く特徴付けされている。代表的な例としては、Ｍａｌａｓｈｋｅｖｉｃｈら、１９９６；Ｋｏｒｏｎａｋｉｓら、２０００；Ｚａｃｃａｉら、２０１１；Ｆｌｅｔｃｈｅｒら、２０１２；Ｍｅｕｓｃｈら、２０１４；Ｓｕｎら、２０１４；Ｔｈｏｍｓｏｎら、２０１４；Ｃｏｌｌｉｅら、２０１５；及びＬｏｍｂａｒｄｏら、２０１６が含まれる。異なるアルファヘリックス数を含むコイルドコイルフォールディングの例は、図１〜４で見ることができる。
【００６５】
図４で見ることができるように、コイルドコイルフォールディングは、３つ及び４つのアルファヘリックスで生じ得る。しかし、アルファヘリックスの数が５に達するまでは、ルーメンは形成されない。５つ以上のアルファヘリックスを有するコイルドコイルがルーメンを形成し、したがって、アルファヘリックスバレルを構成する。
【００６６】
Ｔｈｏｍｓｏｎ、２０１４は、Ｘ線結晶学によって測定すると、５つのアルファヘリックスバレルが約５．７Åのルーメン直径を有し、６つのアルファヘリックスバレルが約６．０Å又は約７．４Åのルーメン直径を有し、７つのアルファヘリックスバレルが約７．６Åのルーメン直径を有することを報告している。ある特定の実施形態では、タンパク質バレルは、約５Åを超える、さらに好ましくは約５．５Åを超えるルーメン直径を有する。ある特定の実施形態では、タンパク質バレルは、約１０Å未満、さらに好ましくは約８Å未満のルーメン直径を有する。
【００６７】
アルファヘリックスバレルなどの、コイルドコイルフォールディングの共通の構造的特徴は、各アルファヘリックスが配列ａｂｃｄｅｆｇを有する反復単位を有する配列を独立して含み得ることであり、式中、ａ及びｄの位置の５０％以上が疎水性アミノ酸であり、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、及びｇの位置の５０％以上が極性アミノ酸である。特に、図２及び３で見ることができるように、ｅ及びｇの位置に疎水性アミノ酸を有することが、アルファヘリックスバレルの形成を促し得る。一実施例では、ｂ、ｃ、及びｆの位置の全てが極性アミノ酸であり得るが、全てのｅの位置及び／又は全てのｇの位置は疎水性アミノ酸である。
【００６８】
さらなる実施形態では、ａ及びｄの位置の６０％以上、７５％以上、又は９０％以上が、疎水性アミノ酸である。さらなる実施形態では、ｂ、ｃ、ｅ、ｆ、及びｇの位置の６０％以上、７５％以上、又は８０％以上が、極性アミノ酸である。
【００６９】
特定の例では、配列ａｂｃｄｅｆｇを有する反復単位は、ＬＱＫＩＥｆＩ、ＬＫＡＩＡｆＥ、ＬＫＥＩＡｆＳ、ＩＫＥＩＡｆＳ、ＬＫＥＩＡｆＡ、ＦＫＥＩＡｆＡ、ＩＫＥＩＡｆＡ、ＩＫＥＶＡｆＡ、ＶＫＥＶＡｆＡ、ＶＫＥＩＡｆＡ、ＭＫＥＩＡｆＡ、ＬＫＱＩＥｆＩ、ＬＫＥＶＡｆＡ、ＶＫＥＬＡｆＡ、ＩＫＥＬＳｆＡ、ＩＫＥＬＡｆＳ、ＬＫＥＬＡｆＳ、ＦＫＥＩＡｆＡ、及びＬＫＥＬＡｆＡからなるリストから選択され得、式中、ｆは反復単位間で変化し得る。これらの反復単位はアルファヘリックスの基本的な基礎的要素に相当するが、当然のことながら点突然変異が存在し得、全ての単位が同一の反復という訳ではなくなる。任意の所与のアルファヘリックスでは、又はアルファヘリックスバレルでは、アミノ酸残基の最大４０％、好ましくは２５％、さらに好ましくは１０％が、反復単位から逸脱し得る。位置ｆがバルク溶媒に向いており、アルファヘリックス同士の組織化においてほとんど役割を果たさないことが、図２及び３で見ることができる。位置ｆのアミノ酸残基は、したがって、ほとんど重要ではなく、反復単位間で変化し得る。位置ｆは、したがって、通常は極性アミノ酸であり、アルファヘリックスバレルの水溶解を性を促進する。しかし、位置ｆはまた、さらなる機能化のための良好な候補でもある。
【００７０】
各アルファヘリックスは、少なくとも３つの反復単位を含み得る。上記の反復単位に基づく完全長配列の例としては、以下のものが含まれる。
【表１−１】
2020533568.tif 000004
【００７１】
【表１−２】
2020533568.tif 000005
【００７２】
上記に列挙した各アルファヘリックスは、完全に形成されたアルファヘリックスバレル内で、いずれの他のアルファヘリックスにも共有結合していない。その代わり、アルファヘリックスは、自己組織化する。上記に列挙したペプチドから形成されたアルファヘリックスバレルは、同一のアルファヘリックスを含む。しかし、異なる実施形態では、アルファヘリックスバレル内のアルファヘリックスは、非同一であり得る。共有結合していない非同一のアルファヘリックスでは、自己組織化し得るアルファヘリックスバレルの異なる順列に注意が向けられるべきである。或いは、アルファヘリックスバレルは、単一の連続するアミノ酸骨格を含み得る。これによって、組織化されてアルファヘリックスバレルを形成するアルファヘリックスに対するかなり優れたレベルの制御がもたらされる。
【００７３】
ベータバレル及びイオンチャネルは、アルファヘリックスバレルに類似の手段で本発明において使用され得る、周知の天然タンパク質バレルモチーフである。ＴＩＭバレルもまた使用することができる。これらは水溶性である。
【００７４】
タンパク質バレルは、非天然アミノ酸を含み得る。これは、天然アミノ酸、さらに機能化されている天然アミノ酸、又はあらゆる他のアミノ酸のエナンチオマーであり得る。タンパク質バレルの堅固な構造によって、タンパク質バレルのフォールディングを損なうことなく、多くのアミノ酸の置換が一般に可能となる。
【００７５】
例えば、以下の表は、どのように３つの非タンパク質構成ペプチドが１５個のバレルからなるアレイ内に組み込まれているか、及び３つのタンパク質構成ペプチドを置き換えることによるＤＰＨ対照を示す。
【００７６】
【表２】
2020533568.tif 000006
見て分かるように、標準的なタンパク質構成アレイ内のペプチドが左側に示されており、右側の非タンパク質構成アレイは、非天然アミノ酸を有する３つのペプチド配列を組み込んでいる。Ｎｌｅ＝ノルロイシン、ｄＬ＝デヒドロロイシン。
【００７７】
一実施形態では、非天然アミノ酸は、タンパク質基質を化学的に連結することによって修飾されているアミノ酸である。化学的連結のこのような方法は周知である。タンパク質基質は、典型的には、タンパク質バレルの外表面上の残基に連結される。アルファヘリックスバレルを使用する場合、アルファヘリックスの７つでできた反復の位置ｆは、リンカーのためのアンカーの適切な候補である。タンパク質基質は、酵素基質、受容体基質、及び／又は抗体基質を含み得る。タンパク質基質を提供することによって、標的タンパク質は、タンパク質バレルに結合し得、及び／又はタンパク質基質を化学的に修飾し得る。タンパク質の結合又はタンパク質基質の化学的修飾のいずれかが、タンパク質バレルのルーメンの立体構造を変化させ得、それが次いで、レポーター色素の結合を妨害する。
【００７８】
センサーアレイの各センサーは、レポーター色素を含む。色素は、光信号を生じさせ得る分子である。光信号は、紫外線及び／又は可視光スペクトルの中に典型的にはある。このことで、本発明者らは、電磁スペクトルの紫外線−可視光領域の中の信号を生じさせ得る分子を意味する。光信号は、吸収信号又は発光信号であり得る。好ましくは、光信号は蛍光である。
【００７９】
センサーアレイにおいて、レポーター色素は、ルーメンに可逆的に結合している。このことで、本発明者らは、レポーター色素が、完全に又は実質的に、タンパク質バレルのルーメン内で結合していることを意味する。結合は可逆的であり、このことは、レポーター色素がルーメンから脱結合してもよいこと、又はルーメン内での結合の変化を受けることを意味する。この可逆的な結合は、非共有結合的な相互作用によって典型的には媒介される。可逆的な結合の特に好ましい形態は、疎水性ルーメン内での疎水性レポーター色素の結合によって媒介される。求核置換によって容易に切断され得るイミンを例えば用いる不安定な共有結合もまた、使用することができる。
【００８０】
レポーター色素として適格となるために、分子は、ルーメンに結合している場合とこの結合が妨害されている場合との間で異なる信号を生じさせなくてはならない。妨害としては、レポーター色素がルーメンから排出されること、又はレポーター色素がルーメン内で立体構造を変化させることが含まれる。排出は、分析物がルーメン内に入りレポーター色素を移動させると、言い換えると競合的結合によって、生じ得る。排出はまた、分析物がタンパク質バレルの外面に結合して、レポーター色素がもはやルーメンに結合できなくなる程度までルーメンが立体構造を変化させると、生じ得る。或いは、このシナリオでは、ルーメンの立体構造の変化は、レポーター色素の立体構造の変化をもたらす。
【００８１】
レポーター色素は、例えばルーメンの両端が開いている場合には、ルーメンを自由に離れることができる。代替的な実施形態では、レポーター色素は、ルーメン内にカプセル化されている。この実施形態では、センサーは、ルーメンの立体構造を変化させる分析物に依拠し、このルーメンの立体構造の変化によって、レポーター分子が立体構造を変化させ、異なる信号を示す。
【００８２】
好ましい実施形態では、レポーター色素は、ルーメンに結合すると光信号を生じさせる。環境に応じて正の信号又は信号なしを構成する信号を生じさせ得るレポーター色素（例えば、１つの環境では蛍光を生じさせ得るが異なる環境では蛍光を生じさせ得ないレポーター色素）では、正の信号は、レポーター色素がルーメンに結合していると存在する。これは、光信号が自由溶液中では存在するがタンパク質のルーメンに結合していると存在しないレポーター色素とは対照的である。
レポーター色素は、式Ｉに従った化合物であり得、
【００８３】
【化２】
2020533568.tif 000007
【００８４】
式中、ｎは３以上であり、好ましくは、ｎは３、４、又は５であり、さらに好ましくは、ｎは３であり、Ｒ１及びＲ２は、アリール又はヘテロアリールから独立して選択され、好ましくはアリール、さらに好ましくはフェニルである。式Ｉに従ったレポーター色素は、したがって、一般に疎水性であり、延びた立体構造を取り得る。好ましい実施形態では、色素は、１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエンである。
【００８５】
６−プロピオニル−２−ジメチルアミノナフタレン（プロダン）などの任意のナフタレンを含む、代替的な色素を使用することができる。
【００８６】
センサーアレイは少なくとも１つのさらなるセンサーを含み得、ここで、レポーター色素は、この少なくとも１つのさらなるセンサーにおいて異なる。このことによって、非常に異なる特性を有する色素が使用される、センサー又はセンサー群が可能となる。これによって、より大きな多様性がセンサーアレイにもたらされ得る。
【００８７】
タンパク質バレルは、基質上に固定され得る。基質は、例えば、ガラス材料又はプラスチック材料を含む表面であり得る。任意の所与のセンサーのタンパク質バレルは、マルチウェルプレートのウェル内に固定され得る。これによって、タンパク質バレルを洗浄及び再利用することが可能となる。任意の所与のセンサーのタンパク質バレルは、センサーアレイ内の異なるセンサーの隣接する固定されたタンパク質バレルに沿って、平らな表面に固定され得る。これによって、タンパク質バレルが広がること及び互いに干渉することなく、単一の分析物を異なるセンサーで容易に適用することが可能となる。これによって、センサーアレイの小型化も可能となり、それによって、相当な数のセンサー（すなわち、おそらく少なくとも５００個又は少なくとも１０００個のセンサー）を小さな表面積（すなわち、おそらく５平方センチメートル未満又はさらには２平方センチメートル未満）の表面積に存在させることが可能となる。このようなアレイは、便利で低コストのアレイで異なる分析物の間を区別するための著しい能力を提供する。このようなアレイは、時として、マイクロチップアレイと呼ばれる。
【００８８】
タンパク質バレルを基質に固定するための技術は周知である（一例（Ｐａｉら、２０１２）は、マイクロアレイ内でのペプチドの固定を開示している）。タンパク質バレルが多くの自己組織化されたサブユニットを含む場合、ただ１つの、複数の、又は全てのサブユニットを個別に固定することができる。典型的には、Ｎ末端残基又はＣ末端残基が固定に使用され、それは、このことによって、タンパク質のフォールディング／３Ｄ構造が妨害される機会が減少し得るためである。しかし、末端ではない残基は、その代わり、タンパク質バレルを基質に連結させるために使用することができる。例えば、アルファタンパク質バレルを使用する場合、ｆの位置のアミノ酸残基は、固定のための適切なアンカーポイントを提供し得る。多くは、可動性リンカーは、固定されたタンパク質バレルのある程度の動きを可能にするように、タンパク質バレルと基質との間で使用することができる。
【００８９】
レポーター色素もまた固定することができる。レポーター色素は、レポーター色素がタンパク質バレルのルーメンに入り及びそこから離れるために十分に自由に動くことを可能にするリンカーを用いて、基質に固定することができる。或いは、レポーター色素は、タンパク質バレルに連結することによって固定することができる。ここでも、レポーター色素がタンパク質バレルに入り及びそこから離れるように十分に自由に動くことを可能にするリンカーが使用される。異なる可能性は、レポーター色素がルーメン内にカプセル化されているということである。この可能性では、ルーメンの端は、レポーター色素がルーメンに結合した後に遮断される。色素及びバレルの固定によって、タンパク質バレル又は色素が洗い流され得るかどうかを考慮する必要性を伴わない、再利用可能な又はインラインで使用され得るセンサーアレイがさらに可能となる。
【００９０】
タンパク質バレル及びレポーター色素は、乾燥した状態であり得る。このことで、本発明者らは、タンパク質バレル及びレポーター色素の複合体が乾燥していることを意味する。乾燥は、空気乾燥及び凍結乾燥を含む技術によって行うことができる。乾燥した状態では、センサーアレイは容易に保管及び輸送することができる。使用する前に、センサーアレイは再水和されなければならない。再水和は、試験試料を適用する前に水性溶液を加えることによって、又は水性試験試料を加えることによって、達成することができる。
【００９１】
検出される分析物は、通常、液体又は溶液である。気体分析物を分析し得ることも有利であろう。固体基質への固定の代わりとして、タンパク質バレルは、ヒドロゲル又は３次元の多孔質足場基質内に又はその上に固定することができる。これは、センサーアレイが気体分析物を検出するために使用され得るという利点を有し、それは、気体分析物がヒドロゲルに溶解可能であり、したがってバレルにアクセス可能であるためである。特に、バレルは、共有結合的に又は非共有結合的に、ヒドロゲル又は３次元の多孔質足場にロードすることができる。ポリマー（ポリ（エチレングリコール）、ポリジメチルシロキサン、及びポリアクリルアミドなど）、多糖（キトサン、アルギン酸塩、及びアガロースなど）、並びにペプチドヒドロゲルは、ヒドロゲルを形成するために使用され得る材料の例である。
【００９２】
本発明はまた、本発明の第１の態様に従ったセンサーアレイを含むマイクロアレイチップを提供する。マイクロアレイチップ技術は周知である。マイクロアレイチップは、３Ｄプリントすることができる。マイクロアレイチップは、乾燥した状態のセンサーアレイを含み得、ここで、水性試験試料は、チップに浸漬される。マイクロアレイチップは、スマートフォンによって分析可能であり得る。
【００９３】
本発明はまた、分析物を感知するためのタンパク質バレル及びレポーター色素の使用であって、タンパク質バレルがルーメンを規定し、レポーター色素がルーメンに可逆的に結合している、使用を提供する。
【００９４】
本発明はまた、（ａ）本発明の第１の態様に従ったセンサーアレイを用意するステップ、（ｂ）センサーアレイを試験するための組成物を適用するステップ、（ｃ）センサーアレイを発色させるステップ、及び（ｄ）発色したセンサーアレイを所定の標準と比較するステップを含む、本発明の第１の態様に従ったセンサーアレイを使用する方法を提供する。
【００９５】
本発明のセンサーアレイは、大量のデータを提供する。人間の眼には、分析物の間を区別する違いを検出することは非常に困難であり得るか、又はさらには不可能であり得る。しかし、これらの違いはコンピュータによるアプローチに一段と適している。このように、ステップ（ｄ）は、コンピュータによるパターン認識の使用を含み得る。当技術分野において使用されるコンピュータによるパターン認識の例としては、主成分分析（ＰＣＡ）、線形判別分析（ＬＤＡ）、階層的クラスター分析（ＨＣＡ）、及び人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）が含まれる。
【実施例】
【００９６】
実施例１−タンパク質バレルの合成
以下の配列を有するアルファヘリックスに基づくアルファヘリックスバレル（図６で言及されるアルファヘリックスバレルに対応する）を合成した。
【００９７】
【表３】
2020533568.tif 000008
【００９８】
ペプチド配列を合成し、先に記載された技術を使用して特徴付けした（Ｔｈｏｍｓｏｎら、２０１４）。
【００９９】
Ｆｍｏｃアミノ酸、ＤＭＦ及びＣｌ−ＨＯＢｔを、ＡＧＴＣ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｈｅｓｓｌｅ、ＵＫ）から購入した。Ｒｉｎｋ  アミド  ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ固体支持体を、ＰＣＡＳ  ＢｉｏＭａｔｒｉｓ  Ｉｎｃ（Ｓａｉｎｔ−Ｊｅａｎ−ｓｕｒ−Ｒｉｃｈｅｌｉｅｕ、Ｃａｎａｄａ）から購入した。ＴＭＡ−ＤＰＨ及びファルネシルピロホスフェート（ＦＰＰ）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｇｉｌｌｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）から購入した。ファルネソールをＡｌｆａ  Ａｅｓａｒ（Ｈｅｙｓｈａｍ、ＵＫ）から購入した。全ての他の化学物質は、Ｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ、ＵＫ）から購入した。別段の記載が無い限り、生物物理学的測定は、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ；２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で行った。ペプチドの濃度を、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｓｔｅａｄ、ＵＫ）Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ２０００分光計（ε２８０＝５６９０ｃｍ−１）でＵＶ−Ｖｉｓによって判定した。
【０１００】
標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成を、インラインＵＶモニタリングを備えたＣＥＭ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）Ｌｉｂｅｒｔｙ  Ｂｌｕｅ自動ペプチド合成装置で行った。
【０１０１】
活性化は、ＤＩＣ／Ｃｌ−ＨＯＢｔで行った。Ｆｍｏｃの脱保護を、２０％ｖ／ｖのモルホリン／ＤＭＦで行った。全てのペプチドを、ＲｉｎｋアミドＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ固体支持体上のＣ末端アミドとして生産し、Ｎ末端は、ＤＭＦ（５ｍＬ）中の無水酢酸（０．２５ｍＬ）及びピリジン（０．３ｍＬ）を添加して、３０分間、室温（ｒｔ）でアセチル化した。ペプチドを、トリフルオロ酢酸（９．５ｍＬ）、トリイソプロピルシラン（０．２５ｍＬ）、及び水（０．２５ｍＬ）を添加して、３時間、振とうしながら、ｒｔで固体支持体から切断した。切断溶液を窒素流のもとでおよそ５ｍＬまで減少させた。粗ペプチドを、ジエチルエーテル（４０ｍＬ）を添加して沈殿させ、遠心分離を介して回収した。得られた沈殿物を１：１のアセトニトリル及び水（≒１５ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥して、粗ペプチドを白色固体として得た。
【０１０２】
ペプチドを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ（Ｍａｃｃｌｅｓｆｉｅｌｄ、ＵＫ）Ｌｕｎａ  Ｃ１８固定相カラム（１５０×１０ｍｍ、５μΜの粒子サイズ、１００Åの孔サイズ）上で、逆相ＨＰＬＣによって精製した。２０〜８０％の勾配のアセトニトリル及び水（０．１％ＴＦＡを伴う）を３０分間にわたり適用した。純粋なペプチドを含有する画分を、分析的ＨＰＬＣ及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって同定し、プールし、凍結乾燥した。
【０１０３】
実施例２−ルーメンへの色素の結合
最初の実験は、レポーター色素がアルファヘリックスバレルのルーメン内で結合することを実証することを目的としたものであった。色素である１，６−ジフェニル−１，３，５−ヘキサトリエン（ＤＰＨ）及び６−プロピオニル−２−ジメチルアミノナフタレン（プロダン）を、多くのアルファヘリックスバレルに対してアッセイして、その解離定数ＫＤを決定した。ＤＰＨ又はプロダン（１μΜ）を、濃度を変化させたアルファヘリックスバレル（０．５〜５００μΜ）と最大２時間インキュベートし、蛍光信号を、対応する発光波長で測定した。
【０１０４】
【表４】
2020533568.tif 000009
【０１０５】
上の表から、ＤＰＨが４つのアルファヘリックスバレルの全てに結合し、その一方で、プロダンが、ＣＣ−Ｐｅｎｔ又はＣＣ−Ｈｅｘを含むアルファヘリックスバレルには結合しなかったことが分かる。プロダンは、ＤＰＨのようにはこれらのアルファヘリックスバレルに緊密に結合しなかった。
【０１０６】
実施例３−ある特定の分析物による色素の移動
レポーター色素がアルファヘリックスバレルのルーメン内で結合し得るという概念の証拠が提供された後、次のステップは、結合したレポーター色素が分析物によって移動し得ることを実証するものであった。以下の４つの分析物を、疎水性の特性を有すること、及び延びた立体構造を取り得ることに基づいて選択したが、それは、これらのことが、レポーター色素を移動させる最良の機会を有すると想定されたためである。
【０１０７】
【化３】
2020533568.tif 000010
【０１０８】
ＤＰＨをレポーター色素として使用し、ＤＰＨの移動を、標準的な競合阻害アッセイを使用して記録した。言い換えると、分析物がＤＰＨの結合を阻害する能力を、阻害定数Ｋｉによって記録した。アルファヘリックスバレルをＤＰＨ又はその陽イオン性のバリアント１−（４−トリメチルアンモニウムフェニル）−６−フェニル−１，３，５−ヘキサトリエンｐ−トルエンスルホネート（ＴＭＡ−ＤＰＨ）とインキュベートした。分析物を添加し（０．０５〜３００μΜ）、蛍光信号を測定した。
【０１０９】
【表５】
2020533568.tif 000011
【０１１０】
競合的結合が観察された全てのケースで、阻害定数は、ＤＰＨの解離定数に類似の低マイクロモル範囲にあり、このことは、類似の結合強度を示し、レポーター色素が分析物によって移動し得ることを実証している。
【０１１１】
分析物の結合のさらなる証拠が、ＣＣ−Ｈｅｘ２アルファヘリックスバレルのルーメン内で結合するファルネソールのｘ線結晶構造によって示された。これは、図５Ａ及び５Ｂで示されている。この結晶構造を得るために、ＣＣ−Ｈｅｘ２の凍結乾燥試料を脱イオン水に５ｍｇ・ｍｌ−１の濃度まで再懸濁した。蒸気拡散結晶化試験を、以前に最適化された条件１（０．１ＭのＮａ  ＨＥＰＥＳ、４．３Ｍの塩化ナトリウム、ｐＨ７．５）を使用して、１μｌのＣＣ−Ｈｅｘ２と１μｌのリザーバー溶液とを混合することによって、１９℃で設定した。回折に適した質の結晶が４日間で得られた。ファルネソール（２ｍＭ）の溶液を４０％ｖ／ｖのＤＭＳＯ：Ｈ２Ｏ中で調製し、結晶を１、５、２０、６０、及び１２０分間浸漬させた。各時点で、結晶を、２０％グリセロールを含有するリザーバー溶液中に浸漬させ、その後、凍結させた。
【０１１２】
Ｘ線回折データを、０．９８Åの波長のビームラインＩ０４−１のＤｉａｍｏｎｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｄｉｄｃｏｔ、ＵＫ）で収集した。データを、ＣＣＰ４スイート（Ｗｉｎｎら、２０１１）で実行される、ＭＯＳＦＬＭ（Ｂａｔｔｙｅら、２０１１）及びＡＩＭＬＥＳＳ（Ｅｖａｎｓ及びＭｕｒｓｈｕｄｏｖ、２０１３）で処理した。回折データの異方性が高いことから、得られたｍｔｚファイルを、Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ  Ｓｅｒｖｅｒ（Ｓｔｒｏｎｇら、２００６）を使用してｂ軸方向で２Åに切り詰めた。
【０１１３】
結晶構造を、ＣＣ−Ｈｅｘ２のポリアラニンモデル（ＰＤＢ  ４ｐｎ８）を使用して、分子置き換えによって解析した。ＣＯＯＴ（Ｅｍｓｌｅｙ及びＣｏｗｔａｎ、２００４）で反復ラウンドのモデル構築を行い、ＰＨＥＮＩＸリファイン（Ａｆｏｎｉｎｅら、２０１２）でリファインした後に、構造が得られた。リファインメントは、ｔｏｒｓｉｏｎ−ｌｉｂｒａｔｉｏｎ−ｓｃｒｅｗ（ＴＬＳ）（Ｚｕｃｋｅｒ、Ｃｈａｍｐ及びＭｅｒｒｉｔｔ、２０１０）のパラメータ及び非結晶学的対称性（ＮＣＳ）のパラメータで行った。オミットマップを、リガンドを除去し、Ｐｈｅｎｉｘでリファインした後に、最終モデルから計算した。リガンドの構造及び幾何学的制限を、Ｐｈｅｎｉｘ  ｅＬＢＯＷ（Ｍｏｒｉａｒｔｙ、Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ及びＡｄａｍｓ、２００９）を使用して計算した。
【０１１４】
最終的なリファインされた構造は、ＭＯＬＰＲＯＢＩＴＹ（Ｃｈｅｎら、２０１０）によって分析したところ、良好な立体化学を示し、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎプロットは、骨格の立体構造空間の好ましい領域の外側に外れる残基がないことを示した。
【０１１５】
実施例４−差別的アレイ
原理証明実験では、図６に示すような、１５個の異なるアルファヘリックスバレルの設計を、９６ウェルプレートに整列させた。異なるアルファヘリックスバレルは５〜７つのアルファヘリックスを有し、様々なサイズを有する。異なるアルファヘリックスバレルは異なる電荷を有しており、一部は中性であり、一部はルーメンに負に荷電したカルボキシレート基を有しており、一部はルーメンに正に荷電したアンモニウム基を有している。
【０１１６】
レポーター色素ＤＰＨを各ウェルに加え、各アルファヘリックスバレルのルーメン内で結合させた。７つの異なる低分子及び高分子を次いで、センサーアッセイにかけた。各センサーアッセイにおける各センサーの分子及び光信号を図７に示す。この図は、分子の各々についての固有の結合サインを示す。
【０１１７】
スクリーニングされる分子の重要性を実現することが重要である。コレステロール及びネルボン酸は、アルファヘリックスバレルのルーメン内で容易に結合することが予想され得る、非常に疎水性の分子である。さらに、両者ともバイオマーカーとして作用し得、コレステロールは心血管疾患の、ネルボン酸は精神病のバイオマーカーとして作用し得る。
【０１１８】
ジメチルアルギニン及びＮ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸は、複数の電荷を担持する、非常に極性のアミノ酸である。これらの分子は、荷電しておらず疎水性のルーメンを有するアルファヘリックスバレルに対する影響はほとんど有さないことが予想され得るが、しかし、移動パターンは、このようなアルファヘリックスバレルでも見られる。
【０１１９】
ヘキサメチルテトラミンは爆薬前駆体であり、これも、異なる移動パターンを生じさせる。トリイソプロピルホスフェートは、立体的にかさの大きい神経作用物質類似体である。
【０１２０】
重要な結果としては、インスリンによって生じるセンサーアレイパターンがあった。インスリンは、アッセイにおいて使用されるアルファヘリックスバレルのルーメン内でフィットし得ないペプチドである。しかし、固有のレポーター色素の移動パターンは依然として生じた。このことは、分析物がアルファヘリックスバレルの外表面と相互作用する場合であっても、レポーター色素の移動が生じ得ることの証拠を提供する。
【０１２１】
図９で提示される反復データで見られるように、高い再現性が繰り返しアッセイにおいて見られた。
【０１２２】
図１０は、コンピュータによるパターン認識をセンサーアレイの結果に適用するためのワークフローを示す。生データを正規化し、その後、分析物を固有に同定するパターンを探す。各分子についてのセンサーアレイパターンに機械学習を適用することによって、予測力は、９５％よりも大きい正確な予測を示した。
【０１２３】
図１１は、公知のトレーニングセットのデータの割合が増大するにつれてどの程度ナイーブ（見られていない）データからの分析物の予測が改善するかを示す。このケースでは、公知の化合物の各々について記録されたアレイサインの１５０のデータセットのほんの≒３０％のランダム選択を使用することによって、非トレーニングセットデータからの予測の＞９０％が正確である。
【０１２４】
実施例５−複合混合物の分析
茶の選択を、複合混合物の分析のためのテストベッドとして分析した。ティーバッグの全部で９つの異なる箱を、地域のスーパーマーケットから購入した。これは、３つの紅茶（ＰＧチップス、ヨークシャーティー、及びパッカイングリッシュブレックファスト）、３つのアールグレーティー（トワイニング・ザ・アールグレー、パッカゴージャスアールグレー、及びクリッパーオーガニックアールグレー）、並びに３つの緑茶（クリッパーオーガニックグリーンティー、トワイニングピュアグリーンティー、及びテトリーピュアグリーンティー）を含んでいた。
【０１２５】
茶を実験室において以下のように淹れた：まず、当てはまる場合は、紐及びラベルはティーバッグから外した。次に、脱イオン水を、水垢の付いていない新たに購入した薬缶の中で沸騰させた。単一のティーバッグを、５０ｍｍのスターラーバーを入れた５００ｍＬのＳｃｈｏｔｔボトルの中に置き、その後、２５０ｍＬの脱イオン水を加え、茶を、撹拌しながら（１００ｒｐｍ）５分間淹れた。この時間の後、１ｍＬの茶溶液を取り出し、１：１０で、脱イオン水で希釈し、溶液を液体窒素中で瞬間冷凍し、次いで、−８０℃で保管した。新たな茶試料を調製し、同一のプロトコルを使用して各実験反復を行った。
【０１２６】
１５個のバレル形成ペプチド１組と、ペプチドを含有しない対照とを使用して、茶を、ＤＰＨの移動を観察することによって分析して、図１２に示すようなフィンガープリントを得た。図１２は、以下の選択された茶試料によって産生されるＤＰＨ移動フィンガープリントを示す：パネルＡはＰＧチップス、パネルＢはパッカイングリッシュブレックファスト、パネルＣはヨークシャーティー、パネルＤはクリッパーオーガニックアールグレー、パネルＥはパッカゴージャスアールグレー、パネルＦはトワイニング・ザ・アールグレー、パネルＧはクリッパーオーガニックグリーンティー、パネルＨはテトリーピュアグリーンティー、及びパネルＩはトワイニングピュアグリーンティー。
【０１２７】
機械学習技術を実行して、茶は、８２．３％の正確度で成功裏にクラスごとに（すなわち、紅茶、アールグレー、又は緑茶）分類され得、９０．０％の正確度で具体的なタイプごとに分類され得た。
【０１２８】
実施例６−エピマーの分析
グルコース、ガラクトース、及びマンノースを、１５個のペプチド及び１つのＤＰＨ対照からなるアレイで分析した。これらの３つの糖は、立体構造が異なり、立体中心が１つであるという点で、エピマーである。３つの各々の水溶液を１０ｍΜの濃度で調製し、その後、バレルアレイにおいて１ｍΜの最終濃度で分析し、このアレイにおいてＤＰＨの移動を測定した。各糖を、別個の２つの日に、２つの３８４ウェルプレートの各々において、各バレルにつき２４の反復を使用して調べた（すなわち、各糖につき４プレート）。
【０１２９】
ペプチドアレイは、図１３に示すこれらの３つの非常に類似の分子の間を区別することができ、図１３は、上部で、グルコース、ガラクトース、及びマンノースについてのＤＰＨ移動フィンガープリントを示し、下部で、エピマーの各々の構造を示す。
【０１３０】
実施例７−非天然アミノ酸
非天然アミノ酸の使用を実証するために、３つのタンパク構成ペプチドを置き換えることによって、３つの非タンパク構成ペプチドを、１５のバレル及び１つのＤＰＨ対照からなるアレイに組み込んだ。
【０１３１】
【表６】
2020533568.tif 000012
【０１３２】
見て分かるように、標準的なタンパク質構成アレイのペプチドが左側に示され、右側の非タンパク質構成アレイは、非天然アミノ酸を有する３つのペプチド配列を組み込んでいる。Ｎｌｅ＝ノルロイシン、ｄＬ＝デヒドロロイシン。
【０１３３】
コレステロールを１μΜで分析し、ＤＰＨ移動フィンガープリントを分析した。
【０１３４】
図１４で見ることができるように、タンパク質構成フィンガープリント（左側）と非タンパク質構成フィンガープリント（右側）とを比較した場合、明らかな違いが観察される。
【０１３５】
実施例８−Ｄアミノ酸ペプチド
バレルアレイにおけるＤ−アミノ酸の使用を実証するために、全てがＤ−アミノ酸であるペプチドＡＬＫＥＶＡの類似体を調製した（すなわち、以下のペプチドｄ−（ＡＶＫＥＶＡ））。
【０１３６】
ｄ−（ＡＶＫＥＶＡ）：Ａｃ−ＧｅｖａｑａｖｋｅｖａｋａｖｋｅｖａｗａｖｋｅｖａｑａｋｖＧ−ＮＨ２
【０１３７】
各キラル中心でペプチドＡＬＫＥＶＡと反対のキラリティを有するこのペプチドを、ペプチドＡＶＫＥＩＡではなく、１５個のペプチドのバレルアレイ（実施例１で列挙したもの）に置換した。この修飾されたアレイを使用して、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸及びＮＧ，ＮＧ−ジメチルアルギニンという２つの低分子をＤＰＨの移動について分析した。各分子の溶液を水中に１０μΜで調製し、その後、３つの３８４ウェルプレートの各々において２４の反復で、１μΜの濃度で調べた。図１５は、これらの２つ分子の各々についてのＤＰＨ移動のサインを示す。特に、図１５は、全てがＤ−アミノ酸である１つのペプチド（ｄ−（ＡＶＫＥＶＡ））を含むペプチドバレルアレイを使用した、Ｎ−アセチル−Ｌ−アスパラギン酸（パネルＡ）及びＮＧ，ＮＧ−ジメチルアルギニン（パネルＢ）についてのＤＰＨ移動フィンガープリントを示し、図中、ｄ−（ＡＶＫＥＶＡ）は、各フィンガープリントの左側の下から２番目に描かれているブロックによって表されている。これらのデータから、機械学習技術は実行され、２つの分子は９５．５％の正確度で区別された。
【０１３８】
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【図１】
2020533568.tif 000014
【図２】
2020533568.tif 000015
【図３】
2020533568.tif 000016
【図４】
2020533568.tif 000017
【図５Ａ】
2020533568.tif 000018
【図５Ｂ】
2020533568.tif 000019
【図６】
2020533568.tif 000020
【図７】
2020533568.tif 000021
【図８】
2020533568.tif 000022
【図９】
2020533568.tif 000023
【図１０】
2020533568.tif 000024
【図１１】
2020533568.tif 000025
【図１２Ａ】
2020533568.tif 000026
【図１２Ｂ】
2020533568.tif 000027
【図１２Ｃ】
2020533568.tif 000028
【図１２Ｄ】
2020533568.tif 000029
【図１２Ｅ】
2020533568.tif 000030
【図１２Ｆ】
2020533568.tif 000031
【図１２Ｇ】
2020533568.tif 000032
【図１２Ｈ】
2020533568.tif 000033
【図１２Ｉ】
2020533568.tif 000034
【図１３】
2020533568.tif 000035
【図１４】
2020533568.tif 000036
【図１５Ａ】
2020533568.tif 000037
【図１５Ｂ】
2020533568.tif 000038
【配列表】
2020533568000001.app
【国際調査報告】
2020533568.tif 000039
2020533568.tif 000040
2020533568.tif 000041