(57)【要約】  本発明は、がんまたは前がん状態もしくは新生物状態を有する患者を処置するための方法に関する。それは、少なくとも部分的には、融合遺伝子を特異的に標的化するゲノム編集技術が、融合遺伝子を有する、前立腺がん細胞以外のがん細胞、例えば、肝細胞がん細胞の細胞死を誘導することができるという発見に基づくものである。本発明は、対象の1個以上の細胞内に存在する融合遺伝子を標的とするゲノム編集技術を実施して、抗がん効果をもたらすことを含む、がん患者を処置するための方法を提供する。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から得られた試料中に、少なくとも1つの融合遺伝子が存在することを決定すること、次いで、抗新生物作用を達成するために、対象の1個以上の細胞内の該融合遺伝子を標的化するゲノム編集技術を実施することを含み、対象が前立腺がんを有しない、対象を処置する方法。
【請求項２】
対象から得られた試料中に、少なくとも1つの融合遺伝子が存在することを決定すること、次いで、抗がん作用を達成するために、対象のがんの1個以上の細胞内の該融合遺伝子を標的化するゲノム編集技術を実施することを含み、対象が前立腺がんを有しない、がんを有する対象を処置する方法。
【請求項３】
融合遺伝子が、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1およびその組合せからなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
対象が前がん状態または新生物状態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
対象ががんを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
がんが、乳がん、肝臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、多形膠芽腫、結腸直腸がん、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、肉腫、急性および慢性リンパ球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または食道腺癌である、請求項２または５に記載の方法。
【請求項７】
融合遺伝子が、FISH分析によって検出される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
融合遺伝子が、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応によって検出される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項９】
融合遺伝子が、MAN2A1-FERである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１０】
融合遺伝子が、TMEM135-CCDC67である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１１】
融合遺伝子が、PTEN-NOLC1である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１２】
ゲノム編集技術がCRISPR/Casシステムを使用する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１３】
CRISPR/Casシステムが、細胞死を誘導するために、融合遺伝子ゲノム配列内の配列を切断して、融合遺伝子内に核酸を挿入する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
CRISPR/Casシステムが、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (CsnlまたはCsxl2としても知られる)、CaslO、Csyl 、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、CsxlS、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Cpfl、c2cl、c2c3、Cas9HiFiおよびその組合せからなる群から選択されるCasエンドヌクレアーゼを使用する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
CasエンドヌクレアーゼがCas9である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ゲノム編集技術が、1個以上の細胞またはがん細胞に、(i)Casタンパク質と2個のガイドRNA(gRNA)とをコードする核酸を含むベクターおよび(ii)ドナー核酸と、1個以上のターゲティング配列とを含むベクターを形質導入することを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
一方のgRNAが融合遺伝子の1個の遺伝子内の領域と相補的であり、他方のgRNAが融合遺伝子の第2の遺伝子内の領域と相補的である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ドナー核酸がHSV-1チミジンキナーゼをコードする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
方法が、対象に、治療有効量のガンシクロビルまたはバルガンシクロビルを投与することをさらに含む、請求項１６または１８に記載の方法。
【請求項２０】
一方のgRNAがMAN2A1-FER融合遺伝子のMAN2A1遺伝子内の領域と相補的であり、他方のgRNAがFER遺伝子内の領域と相補的であってよい、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
一方のgRNAがTMEM135-CCDC67融合遺伝子のTMEM135遺伝子内の領域と相補的であり、他方のgRNAがCCDC67遺伝子内の領域と相補的であってよい、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
対象の1個以上の細胞が、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1およびその組合せからなる群から選択される融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること、ならびに1個以上の細胞が融合遺伝子を含有する場合、対象の1個以上の細胞内に存在する該融合遺伝子を標的とするゲノム編集技術を実施することを含み、対象が前立腺がんを有しない、対象を処置する方法。
【請求項２３】
対象の1個以上の細胞が、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1およびその組合せからなる群から選択される融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること、ならびに1個以上の細胞が融合遺伝子を含有する場合、対象の1個以上の細胞内に存在する該融合遺伝子を標的とするゲノム編集技術を実施することを含み、対象が前立腺がんを有しない、前がん状態または新生物状態を有する対象を処置する方法。
【請求項２４】
対象の1個以上の細胞が、がん細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
がん細胞が、乳がん、肝臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、多形膠芽腫、結腸直腸がん、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、肉腫、急性および慢性リンパ球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または食道腺癌の細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
がんが、肺腺癌、多形膠芽腫または肝細胞癌ではない、請求項２〜３、５〜２１および２４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
細胞内に存在する融合遺伝子を標的とするゲノム編集技術を実施するためのキットであって、細胞が前立腺がん細胞ではなく、キットが、(i)Casタンパク質と1個以上のガイドRNA(gRNA)とをコードする核酸を含むベクターおよび(ii)ドナー核酸と1個以上のターゲティング配列とを含むベクターを含む、前記キット。
【請求項２８】
一方のgRNAが融合遺伝子の1個の遺伝子内の領域と相補的であり、他方のgRNAが融合遺伝子の第2の遺伝子内の領域と相補的である、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
ドナー核酸がHSV-1チミジンキナーゼをコードする、請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
キットがガンシクロビルおよび/またはバルガンシクロビルをさらに含む、請求項２７、２８または２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
融合遺伝子が、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1およびその組合せからなる群から選択される、請求項２７に記載のキット。
【請求項３２】
TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、MTOR-TP53BP、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1またはPCMTD1-SNTG11からなる群から選択される1個以上の融合遺伝子のPCR分析のための核酸プライマーをさらに含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項３３】
TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、MTOR-TP53BP1、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1およびPCMTD1-SNTG1からなる群から選択される1個以上の融合遺伝子のFISH分析のための核酸プローブをさらに含む、請求項２７に記載のキット。
【請求項３４】
細胞が、乳がん、肝臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、多形膠芽腫、結腸直腸がん、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、肉腫、急性および慢性リンパ球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または食道腺癌に由来する細胞である、請求項２７に記載のキット。
【請求項３５】
細胞が、新生物細胞および/または前がん細胞である、請求項２７に記載のキット。
【請求項３６】
Casタンパク質がCas9またはCas9D10Aである、請求項２７に記載のキット。
【請求項３７】
細胞が、肺腺癌、多形膠芽腫または肝細胞癌に由来する細胞ではない、請求項２７に記載のキット。
【請求項３８】
対象におけるがんを処置または防止するための方法における使用のための標的ゲノム編集を可能とする薬剤であって、該方法が、(i)対象の試料が融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること；および(ii)試料が1個以上の融合遺伝子を含有する場合、前記薬剤を用いてゲノム編集手順を実施して、対象内の1個以上のがん細胞中の該融合遺伝子を標的化することを含み、がんが前立腺がんではない、前記薬剤。
【請求項３９】
対象を処置するための方法における使用のための標的ゲノム編集を可能とする薬剤であって、該方法が、(i)対象の試料が融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること；および(ii)試料が1個以上の融合遺伝子を含有する場合、前記薬剤を用いてゲノム編集手順を実施して、対象内の1個以上の細胞中の該融合遺伝子を標的化することを含み、対象が前立腺がんを有しない、前記薬剤。
【請求項４０】
前がん状態または新生物状態を有する対象を処置するための方法における使用のための標的ゲノム編集を可能とする薬剤であって、該方法が、(i)対象の試料が融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること；および(ii)試料が1個以上の融合遺伝子を含有する場合、前記薬剤を用いてゲノム編集手順を実施して、対象内の1個以上の細胞中の該融合遺伝子を標的化することを含み、対象が前立腺がんを有しない、前記薬剤。
【請求項４１】
薬剤が、Cas9タンパク質である、請求項３８、３９または４０のいずれか一項に記載の薬剤。
【請求項４２】
Cas9タンパク質が、Cas9D10Aである、請求項４１に記載の薬剤。
【請求項４３】
がんが、乳がん、肝臓がん、肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、多形膠芽腫、結腸直腸がん、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、肉腫、急性および慢性リンパ球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、または食道腺癌である、請求項３８に記載の薬剤。
【請求項４４】
がんが、肺腺癌、多形膠芽腫または肝細胞癌ではない、請求項３８に記載の薬剤。
【請求項４５】
TMEM135-CCDC67、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1およびその組合せからなる群から選択される1個以上の融合遺伝子を含有する1個以上の細胞を有する対象を処置するのに使用するための組成物であって、1個以上の細胞内に存在する該1個以上の融合遺伝子を標的とするゲノム編集技術における使用のための1種以上の薬剤を含み、対象が前立腺がんを有しない、前記組成物。
【請求項４６】
ゲノム編集技術における使用のための1種以上の薬剤が、1個以上のgRNAとエンドヌクレアーゼとを含む、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
エンドヌクレアーゼがCas9である、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
1個以上のガイドRNAが、該融合遺伝子の1個の遺伝子内の領域と相補的な1個のgRNAと、該融合遺伝子の第2の遺伝子内の領域と相補的な第2のgRNAとを含む、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
1個以上のガイドRNAが、該1個以上の融合遺伝子の染色体切断点内の特定の配列と相補的な1個のgRNAを含む、請求項４５〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
1個以上の融合遺伝子を含有する1個以上の細胞を有する対象のための処置を決定する方法であって、
i)対象に由来する試料を提供すること；
ii)対象の1個以上の細胞が、TMEM135-CCDC67、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1およびその組合せからなる群から選択される1個以上の融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること；ならびに
iii)1個以上の融合遺伝子が1個以上の細胞中で検出された場合、1個以上の細胞中で検出された該1個以上の該融合遺伝子を標的とするゲノム編集技術を実施することを指示すること
を含み、対象が前立腺がんを有しない、前記方法。
【請求項５１】
ゲノム編集技術が、CRISPR/Cas9システムを用いて実施される、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権に関する情報
【０００２】
本出願は、2016年12月13日に出願された米国特許仮出願第62/433,608号、および2017年10月16日に出願された米国特許仮出願第62/572,960号に対する優先権を主張し、これらの両方の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００３】
認可に関する情報
本発明は、米国立衛生研究所により与えられた認可番号CA098249およびCA190766ならびに米陸軍医療研究・軍需品司令部により与えられた認可番号W81XWH-16-1-0541およびW81XWH-16-1-0364の下で政府の支援と共に為されたものである。政府は本発明におけるある特定の権利を有する。
【０００４】
1. 序論
本発明は、ゲノムターゲティング技術を実施することによって1つ以上の特異的融合遺伝子を担持する患者を処置する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
2. 発明の背景
クラスター化調節介在ショートパリンドロームリピート(CRISPR)/CRISPR-関連(Cas)は、原核細胞中で外来病原体に対する免疫防御機構として作用することが元々発見されたものである(Mojicaら(2005) J. of Molecular Evolution 60:174-182)。II型CRISPR/Casシステムのためのタンパク質であるCas9は、DNA切断活性を示すことがわかった。Cas9のヌクレアーゼ活性は、ゲノム中のCRISPR RNAおよびDNAの標的配列と相補的なトランス作用CRISPR RNAによって誘導され得る(Jinekら(2012) Science 337:816-821)。トランス作用CRISPR RNAおよびCRISPR RNAを、両方のRNA種の完全な機能を含有するキメラRNA中で作製することができるため、ガイドRNA(gRNA)とも呼ばれる、人工融合RNA配列を生成して、Cas9の活性を標的DNA配列に対して標的化した(Esveltら(2014) eLife:e03401)。Cas9の触媒ドメイン中に存在するD10A変異は、それを、標的DNAにおいて単一ヌクレオチドの切断をもたらすニッカーゼに変換する(Jinekら(2012) Science 337:816-821)。標的DNAのダブルニッキングは、ゲノム編集の特異性を50〜100倍増大させ(Ranら(2013) Cell 154:1380-1389)、オフターゲット率を1/10,000まで下げることができる。そのような特異性は、体細胞ゲノムターゲティングを、ヒト疾患の処置における実現可能な手法にすることができる。
【０００６】
米国では、前立腺がんは、男性のがんにおいて観察される最も頻繁な悪性腫瘍の1つである。前立腺がんの死亡率は、2014年で27,540に達し、2番目に最も致死率の高い男性のがんである(Siegelら(2015) A Cancer Journal For Clinicians 65:5-29)。WO 2015/103057およびWO 2016/011428に開示されたように、染色体再配置によって生成された融合遺伝子の数を、再発性および致死性であることが示された前立腺がんにおいて同定した。これらの融合遺伝子の発現は、侵攻性の前立腺がんの間では幅広いものであるが、正常組織には存在しない。WO 2016/011428は、マウスにおいて異種移植された前立腺がんの細胞死および寛解をもたらした、融合遺伝子TMEM135-CCDC67の染色体切断点のゲノムターゲティングを開示している。
【０００７】
がんは、一般的には、米国における死因の第1位である。がんの死亡率は、米国のみにおいて2015年で595,690に達し、心血管疾患の次の2番目に最も致死的な死因にしている(Siegelら(2016) A Cancer Journal For Clinicians 66(1):7-30)。がん、特に、転移性になるものの処置は、依然として問題が多く、がんの治癒は分かりにくいままである。したがって、がんを処置する方法に関する必要性が当業界において依然としてある。
【発明の概要】
【０００８】
3. 発明の概要
本発明は、がんまたは前がん状態または新生物状態に罹患する患者を処置するための方法に関する。それは、少なくとも部分的には、融合遺伝子を特異的に標的とするゲノム編集技術が、融合遺伝子を有する、がん細胞、例えば、前立腺がん以外のがん細胞、例えば、肝細胞がん細胞における細胞死を誘導することができるという発見に基づく。
【０００９】
様々な非限定的な実施形態において、本発明は、融合遺伝子を担持する対象を処置する方法を提供する。例えば、限定されるものではないが、対象は、がん、前がん状態または新生物状態を有してもよい。特定の実施形態において、本発明の方法は、対象の1個以上の細胞内に存在する融合遺伝子を標的とするゲノム編集技術を実施することを含む。そのような融合遺伝子の非限定例としては、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1およびPCMTD1-SNTG1が挙げられる。特定の実施形態において、融合遺伝子は、PTEN-NOLC1である。特定の実施形態において、融合遺伝子は、MAN2A1-FERである。特定の実施形態において、がんは、前立腺がんではない。特定の実施形態において、がんは、肺線癌、多形膠芽腫または肝細胞癌ではない。
【００１０】
特定の非限定的な実施形態において、本発明は、融合遺伝子を担持する対象を処置する方法を実施するためのキットをさらに提供する。例えば、限定されるものではないが、対象は、がん、前がん状態または新生物状態を有してもよい。特定の実施形態において、本発明のキットは、Cas9タンパク質、例えば、Cas9D10Aをコードする核酸を含む1つ以上のベクターまたはプラスミドを含んでもよい。特定の実施形態において、1つ以上のベクターは、融合遺伝子に特異的な、例えば、融合遺伝子の切断点および/または融合遺伝子の切断点に隣接する配列に特異的な1つ以上のgRNAをさらに含んでもよい。
【００１１】
特定の実施形態において、本発明のキットは、発現された場合に細胞死をもたらす核酸を含む1つ以上のベクターまたはプラスミドをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、核酸は、HSV-1チミジンキナーゼをコードする。特定の実施形態において、このベクターは、核酸の相同組換えおよび挿入を促進するための融合遺伝子内の配列と相補的である1つ以上の標的化配列をさらに含んでもよい。特定の実施形態において、核酸がHSV-1チミジンキナーゼをコードする場合、キットはガンシクロビルおよび/またはバルガンシクロビルをさらに含んでもよい。
【００１２】
特定の実施形態において、キットは、対象に由来する試料中の1つ以上の融合遺伝子の存在を検出するための、PCR分析のための核酸プライマーまたはRNA in situ分析のための核酸プローブを含んでもよい。特定の非限定的な実施形態において、1つ以上の融合遺伝子を、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、MTOR-TP53BP、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG11およびその組合せからなる群から選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】ユニークな融合遺伝子事象の図である。左パネル:融合遺伝子のゲノム、転写方向、連結遺伝子間の距離および融合物の方向のミニチュア図である。中央パネル:融合遺伝子の代表的な配列決定クロモグラムである。連結遺伝子配列を示した(配列番号45〜52)。右パネル:融合遺伝子の翻訳産物の図である。青色-ドライバー遺伝子翻訳産物；赤色-パッセンジャー遺伝子翻訳産物；オレンジ色-フレームシフトに起因する新規翻訳産物または非遺伝子領域からの翻訳産物。
【図１−２】図１−１の続きである。
【図１−３】図１−１の続きである。
【図２】融合遺伝子のゲノム切断点分析の図である。上パネル:融合遺伝子のゲノム、転写方向、連結遺伝子間の距離および染色体連結の方向のミニチュア図である。中央パネル:融合ゲノムおよび転写方向のミニチュアである。下パネル:染色体の連結切断点を包含する代表的な配列決定クロモグラム(配列番号53〜55)である。
【図３Ａ】PTEN-NOLC1融合遺伝子の図である。(A)PTEN-NOLC1融合転写物。上パネル:PTENおよびNOLC1遺伝子のゲノム、転写方向、連結遺伝子間の距離および融合物の方向のミニチュア図である。中央パネル:PTEN-NOLC1転写物の代表的な配列決定クロモグラムである。転結遺伝子配列を示した。下パネル:融合転写物の翻訳産物の図である。青色-頭部遺伝子翻訳産物；赤色-尾部遺伝子翻訳産物。（B)PTENおよびNOLC1ゲノム組換えならびにFISHプローブ位置の模式図である。
【図３Ｂ】図３Ａの続きである。
【図４】MAN2A1-FERのモチーフ分析の図である。MAN2A1、FERおよびMAN2A1-FER融合タンパク質の機能的ドメインならびに様々な細胞系においてMAN2A1-FER融合遺伝子について観察される染色体切断点の図である。融合遺伝子MAN2A1-FERにおいて、FERのN末端のSH2およびFHCドメインが失われる。これらのドメインは、MAN2A1に由来するグリコシドヒドロラーゼおよびα-マンノシダーゼ中央ドメインで置き換えられている。
【図５】CCNH-C5orf30について陽性のがん細胞における融合遺伝子切断点でのゲノム編集ターゲティングの模式図である。前立腺がん症例3Tにおけるゲノム組換えは、CCNHのイントロン6と、C5orf30のイントロン1とを接続する第5染色体中に切断点をもたらした。切断点領域に特異的なプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を含む23bpのガイドRNA(gRNA)を設計する。この標的配列に対応するDNA配列を、gRNAおよびCas9の残りを含有するベクター中に人工的にライゲートする。この配列を組み換え、組み換えウイルス(アデノウイルスまたはレンチウイルス)中にパッケージングする。プロモーターを含まない1型単純ヘルペスウイルス(HSV-1)チミジンキナーゼを、CCNHエクソン7のイントロン/エクソン接続部に由来するスプライスタグ配列と共にアデノウイルスのためのシャトルベクター中で構築する。それぞれの側に由来するCCNH-C5orf30切断点の周囲の500bpの配列もシャトルベクター中にライゲートして、ドナーDNA構築を完了するための効率的な相同組換えをもたらす。ベクターを組み換え、AdEasy中にパッケージングして、組換えウイルスを生成する。これらのウイルスを、CCNH-C5orf30融合転写物について陽性のがんを有する患者または動物に投与することができる。これは、ドナーDNAの、標的部位(融合物切断点)への挿入をもたらす。組換えウイルス中のHSV-1 TKはプロモーターを含まないため、HSV-1 TK cDNAが転写活性ゲノム中に組み込まれない場合、転写は起こらないであろう。しかしながら、HSV-1 TKが患者においてCCNH-C5orf30の標的部位に組み込まれる場合、HSV-1 TKの転写は活性であり、ガンシクロビルまたはその経口相同体であるバルガンシクロビルが患者に投与される場合、相同体はHSV-1 TKによってグアニン三リン酸類似体に容易に変換され、がん細胞のゲノム中に組み込まれる。これは、CCNH-C5orf30について陽性である細胞におけるDNA伸長の停止をもたらす。
【図６−１】融合遺伝子の模式図である。左パネル:融合パートナーのゲノムの模式図である。遺伝子座、パートナー間の距離、転写方向および融合物の方向を示す。中央パネル:それぞれの融合遺伝子の融合点の周囲のSanger配列決定のヒストグラム(配列番号40〜44)である。右パネル:融合遺伝子の予測されるタンパク質産物。青色：頭部遺伝子タンパク質；黄色：フレームシフト翻訳；赤色：尾部。
【図６−２】図６−１の続きである。
【図７】ZMPSTE24-ZMYM5融合物形成の模式図である。機能的ドメインを示す。ZMPSTE24とZMYM4との間の融合物形成は、ZMPSTE24のC末端からの159アミノ酸のトランケーションおよびZMYM4のN末端からの1315アミノ酸を含む。モチーフ分析により、ZMPSTE24-ZMYM5融合物がZMPSTE24に由来するペプチダーゼドメインの約50%を欠失し、ZMYM4に由来する全ての亜鉛フィンガーを除去するが、ZUF3504(未知の機能のドメイン)およびアポトーシスインヒビタードメインをインタクトなままにすることが示唆される。
【図８】CLTC-ETV1融合物形成の模式図である。機能的ドメインを示す。CLTC-ETV1融合物は、ETV1中の転写ドメインをほぼインタクトに保持し、CLTCから3個のクラスリンドメインを欠失させる。ETV1のN末端におけるトランケーションは、ETV1からこれらの全ての調節エレメントを除去する。
【図９】ACPP-SEC13融合物形成の模式図である。機能的ドメインを示す。ACPP-SEC13融合物においては、ACPPのN末端の72アミノ酸のみが保持され、ホスファターゼドメインの2/3を超えるものがトランケートされるが、SEC13はそのN末端から196アミノ酸を失い、3個のWDリピートドメインが欠失している。
【図１０】DOCK7-OLR1融合物形成の模式図である。機能的ドメインを示す。DOCK7-OLR1は、キメラタンパク質を産生しない。DOCK7およびOLR1の別々の翻訳が融合転写物から起こる。融合遺伝子は、DOCKの細胞質分裂ドメインの有意な部分を欠失し、融合転写物はインタクトなOLR1タンパク質を産生する。
【図１１】PCMTD1-SNTG1融合物形成の模式図である。機能的ドメインを示す。PCMTD1-SNTG1融合物は、キメラタンパク質を産生しない。PCMTD1-SNTG1融合物は、PCMTD1のメチル-トランスフェラーゼドメインの半分を除去する、トランケートされたPCMTD1を産生し、SNTG1はインタクトなままである。
【図１２】SLC45A2-AMACRキメラタンパク質の模式図である。SLC45A2とAMACRとの融合物は、SLC45A2中のドメインの2/3(MFS)のトランケーションをもたらすが、AMACRのCoA-トランスフェラーゼドメインをほぼ保持する。SLC45A2-AMACRは、SLC45A2のN末端の187アミノ酸およびAMACRのC末端の311アミノ酸とのキメラタンパク質を産生する。SLC45A2-AMACRは、SLC45A2の5つの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインを、AMACRに由来するインタクトなラセマーゼドメインで置き換えるが、細胞外ドメインおよびN末端膜貫通ドメインをインタクトなままにする。
【図１３Ａ】EGFP-tkを、TMEM135-CCDC67融合遺伝子の切断点に導入するための戦略のスキームである。(A) TMEM135-CCDC67染色体切断点の略図およびSanger配列決定。転写の方向を矢印で示す。(BおよびC)EGFP-tkを、TMEM135-CCDC67の切断点に導入するための戦略の模式図である。gRNA-およびgRNA+の位置を囲みで示す。これらのgRNAを、VQAd5-CMBシャトルベクター中のCas9D10Aとライゲートし、pAd5ウイルス中に組み換えた。別に、プロモーターを含まないEGFP-tk cDNAをサンドイッチするように584bpのTMEM135イントロン13配列と、561bpのCCDC67イントロン9配列を設計し、PAdloxシャトルベクター中にライゲートし、アデノウイルス中に組み換えた。TMEM135のエクソン14に由来するスプライスアクセプターおよびスプライスドナーを、TMEMイントロン13とEGFP-tkとの間、およびEGFP-tkとCCDC67イントロン9との間にそれぞれ挿入して、適切なEGFP-tk RNAスプライシングを起こさせた。TMEM135-CCDC67染色体切断点を含有する細胞に、これらの組換えウイルスを感染させた。組み込まれたEGFP-tkは、これらの細胞中で融合物頭部遺伝子プロモーターによって転写され、スプライシングされ、EGFP-tkのタンパク質産物に翻訳されたが、次いで、これはガンシクロビルをガンシクロビル三リン酸に変換することによってDNA合成を遮断する。
【図１３Ｂ】図１３Ａの続きである。
【図１３Ｃ】図１３Ａの続きである。
【図１４】形質転換された前立腺がん細胞のゲノム中のTMEM135-CCDC67切断点およびpCMVベクター配列の相対コピー数を定量するためのqPCRの図である。PC3 BP(pCMV-TMEM135int13-CCDC67int9を形質転換したPC3細胞)、またはDU145 BP(pCMV-TMEM135int13-CCDC67int9を形質転換したDU145細胞)、またはPC3 CMV(pCMVscriptを形質転換したPC3細胞)またはDU145 CMV(pCMVscriptを形質転換したDU145細胞)の1マイクログラムのゲノムDNAを、表2に列挙されるプライマーを用いるqPCRにより、β-アクチンまたはTMEM135-CCDC67切断点について定量した。BPおよびβ-アクチンのコピー数を、それぞれ、BPおよびβ-アクチンの既知のコピー数の連続滴定を用いて生成された標準曲線を用いて適合させた。BP/β-アクチン比をプロットした。
【図１５−１】MAN2A1-FER切断点でのゲノム療法ターゲティングの図である。(A)MAN2A1-FER融合遺伝子のためのgRNAおよび組換えドナーアデノウイルスの設計。上パネル：HUH7細胞のMAN2A1-FER染色体切断点のSanger配列決定の略図；中央パネル：pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14のためのgRNAの設計；下パネル：pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14のための相同DNA配列およびEGFP-tkの設計。スプライシングアクセプターおよびドナー配列は、MAN2A1のイントロン13-エクソン14およびFERのエクソン15-イントロン15の連結配列に対応する。
【図１５−２】(B)HUH7細胞中でのMAN2A1-FERの発現。レーン1および2：FERまたはGAPDHに特異的な抗体を用いたHUH7およびHEP3B細胞に由来するタンパク質抽出物のイムノブロット。MAN2A1-FER(MF)およびFERタンパク質を示す。レーン3および4：MAN2A1-FER(MF)またはβ-アクチンに特異的なプライマーを用いたHUH7およびHEP3B細胞に由来するRNAのRT-PCR。(C)示されたような組換えCas9、S.pyogenesおよびin vitroで転写されたgRNA-またはgRNA+を用いて、BamH1で線状化したpTAMAN2A1int13-FERint14ベクター上でin vitro切断アッセイを実施した。切断により、gRNA-についてはpTAMAN2A1int13-FERint14ベクターの2446および1944bpの断片、ならびにgRNA+については2484および1906bpの断片が生成された。(D)HUH7およびHEP3B細胞の感染は、HUH7中ではEGFP-tkの発現をもたらしたが、HEP3B細胞中ではもたらさなかった。HUH7およびHEP3B細胞に、pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14(Ad-MF)およびpAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14(Ad-MF-EGFP-tk)を感染させた。Cas9D10A-RFPの発現は赤色の蛍光で示されるが、FGFP-tkの発現は緑色で示される。pAD5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9 (Ad-gTC)およびpADTMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9 (Ad-TC-EGFP-tk)に感染させたHUH7細胞を、特異性の対照として用いた。(E)フローサイトメトリーによるEGFP-tkの組込み/発現の定量。
【図１５−３】(F)ガンシクロビルによるHUH7細胞の殺傷。HUH7またはHEP3B細胞に、pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14/pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14 (Ad-MF)を感染させた。次いで、これらの細胞を、様々な濃度のガンシクロビルと共に24時間インキュベートした。次いで、フローサイトメトリーによりフィコエリトリン標識されたAnnexin Vを用いて細胞死を定量した。pAD5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9/pAD-TMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9 (Ad-TC)を感染させたHUH7細胞を、特異性の対照として用いた。（G)HUH7およびHEP3B細胞を、SCIDマウスの皮下領域に異種移植した。これらの腫瘍を、処置前に2週間増殖させた。これらのマウスを、示されたウイルスとガンシクロビル(G、80mg/kg)またはPBS(P)で処置した。対照処置に由来するマウスが全て死滅するまで、週に3回、腹腔内注射により示された薬物を適用した。腫瘍体積を毎週測定した。
【図１５−４】（H)MAN2A1-FER切断点療法で処置されたマウスはがん転移を含まない。(I)MAN2A1-FER切断点療法で処置されたマウスは死亡しななかった。
【図１６Ａ】(A)Ad-TCまたはpAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14/pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14 (Ad-MF)で処置されたHUH7またはHEP3B腫瘍中でのCas9D10AおよびHSV1-tkの発現。緑色の矢印は、未染色のマウス間質細胞を示す。
【図１６Ｂ】(B)ゲノム療法は融合遺伝子切断点を含有する異種移植されたがんのアポトーシスを誘導した。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ(TdT)dUTP Nick-End Labeling(TUNEL)アッセイを、Ad-TCまたはAd-MFで処置されたPC3 BP、DU145 BP、PC3 CMV、DU145 CMV、またはHUH7異種移植がんに対して実施した。
【図１７−１】Pten-NOLC1融合物の図である。(A)Pten-NOLC1融合物の模式図である。上パネル：融合遺伝子のゲノム、転写方向、連結遺伝子間の距離および融合物の方向のミニチュア図。中央パネル：融合転写物の代表的な配列決定クロモグラム。連結遺伝子配列を示した。下パネル：Pten-NOLC1融合転写物の翻訳産物の図。青色-頭部遺伝子翻訳産物；赤色-尾部遺伝子翻訳産物。(B)蛍光in situハイブリダイゼーションは、前立腺がん細胞中でのゲノム組換えを示す。PtenおよびNOLC1ゲノム組換えならびにFISHプローブ位置の模式図。代表的なFISH画像を、正常な前立腺上皮細胞およびPten-NOLC1融合物について陽性のがん細胞について示した。オレンジ色はプローブ1を示す；緑色はプローブ2を示す。融合物のシグナルは緑色の矢印で示される。
【図１７−２】(C)Pten-NOLC1融合物のゲノム切断点分析。上パネル：融合遺伝子のゲノム、転写方向、連結遺伝子間の距離および染色体連結の方向のミニチュア図。中央パネル：融合物ゲノムおよび転写方向のミニチュア図。下パネル：染色体の連結切断点を包含する代表的な配列決定クロモグラム。Ptenのイントロン11(青色)およびNOLC1のイントロン1(赤色)が示される。
【図１８−１】ユニークな融合遺伝子事象の図である。左パネル：融合遺伝子のゲノム、転写方向、連結遺伝子間の距離および融合物の方向のミニチュア図。中央パネル：融合転写物の代表的な配列決定クロモグラム。連結遺伝子配列を示した。右パネル：融合転写物の翻訳産物の図。青色-頭部遺伝子翻訳産物；赤色-尾部遺伝子翻訳産物；オレンジ色-フレームシフトに起因する新規翻訳産物または非遺伝子領域からの翻訳産物。
【図１８−２】図１８−１の続きである。
【図１９−１】蛍光in situハイブリダイゼーションが前立腺がん細胞におけるゲノム組換えを示唆することを示す図である。(A)DOCK7およびOLR1ゲノム組換えならびにFISHプローブ位置の略図。代表的なFISH画像を、正常な前立腺上皮細胞およびDOCK7-OLR1融合物について陽性のがん細胞について示した。オレンジ色は、プローブ1を示す；緑色は、プローブ2を示す。融合物連結シグナルは、緑色の矢印で示される。(B)SNTG1およびPCMTD1ゲノム組換えならびにFISHプローブ位置の略図。代表的なFISH画像を、正常な前立腺上皮細胞およびSNTG1-PCMTD1融合物について陽性のがん細胞について示した。オレンジ色は、プローブ1を示す；緑色は、プローブ2を示す。融合物連結シグナルは、緑色の矢印で示される。
【図１９−２】(C)ACPPおよびSEC13ゲノム組換えならびにFISHプローブ位置の略図。代表的なFISH画像を、正常な前立腺上皮細胞およびACPP-SEC13融合物について陽性のがん細胞について示した。オレンジ色は、プローブ1を示す；緑色は、プローブ2を示す。融合物連結シグナルは、緑色の矢印で示される。(D)ZMPSTE24およびZMYM4ゲノム組換えならびにFISHプローブ位置の略図。代表的なFISH画像を、正常な前立腺上皮細胞およびZMPSTE24-ZMYM4融合物について陽性のがん細胞について示した。オレンジ色は、プローブ1を示す；緑色は、プローブ2を示す。融合物連結シグナルは、緑色の矢印で示される。
【図１９−３】(E)CLTCおよびETV1ゲノム組換えならびにFISHプローブ位置の略図。代表的なFISH画像を、正常な前立腺上皮細胞およびCLTC-ETV1融合物について陽性のがん細胞について示した。オレンジ色は、プローブ1を示す；緑色は、プローブ2を示す。融合物連結シグナルは、緑色の矢印で示される。
【図２０−１】ヒトがんにおけるPten-NOLC1を示す図である。(A)ヒトがん細胞系および健康な臓器ドナーの前立腺試料中でPten-NOLC1を検出するためのTaqman qRT-PCR。
【図２０−２】(B)原発性ヒトがんにおけるPten-NOLC1の頻度。(C)Pten-NOLC1タンパク質の発現。上パネル：PtenおよびNOLC1タンパク質ならびにPten-NOLC1融合タンパク質の機能的ドメインの略図。トランケーション部位は矢印で示される。NLSは、核局在化シグナルを示す；SRP40は、S.cerevisiaeのSRP40タンパク質のC末端に対する相同体ドメインを示す；snoRNA結合は、低分子核RNAのための結合部位を示す；Tは、HSV1転写因子ICP4と相同なセリンに富む配列を示す。下パネル：原発性前立腺がん試料(PCa638T、PCa207T、PCa624T、PCa099TおよびPCa090T)または健康な臓器ドナーの前立腺試料(DO12およびDO17)、または示された細胞系(レーン8〜12)からのPtenおよびPten-NOLC1タンパク質のイムノブロッティング。
【図２１Ａ】ヒトがんの転移および複数の遺伝子座におけるPten-NOLC1を示す図である。(A)原発がん(P)およびその一致したリンパ節転移(LN)におけるPten-NOLC1。赤色-陽性；灰色-陰性；ブランク-試料なし。
【図２１Ｂ】(B)Pten-NOLC1は多くの前立腺がん遺伝子座に存在する。赤色-陽性；灰色-陰性；ブランク-試料なし。
【図２２−１】Pten-NOLC1が核に移行し、脂質ホスファターゼ活性を欠くことを示す図である。(A) NIH3T3およびPC3細胞中でのPten、NOLC1およびPten-NOLC1の免疫蛍光分析。上パネル：それぞれ、Pten、NOLC1またはFLAGに特異的な抗体を用いる、NIH3T3細胞中でのPten(左)、NOLC1(中央)およびPten-NOLC1-FLAG(右)の免疫染色。下パネル：PC3に、pPten-EGFP(左)、pNOLC1-mCherry(中央)およびpPten-NOLC1-EGFP(右)をトランスフェクトした。
【図２２−２】(B) Pten-NOLC1-FLAG (PNOL-FLAG)をトランスフェクトしたDU145細胞またはNIH3T3細胞の核および細胞質画分におけるPtenおよびPten-NOLC1のイムノブロッティング。GAPDHおよびヒストン3に特異的な抗体を用いたイムノブロッティングを、画分純度の対照として用いた。(C)Pten-NOLC1は、in vitroでPIP3ホスファターゼ活性を欠く。GST-グルタミン酸-S-トランスフェラーゼ；PNOL-Pten-NOLC1;IP-免疫沈降；T+-テトラサイクリン誘導；Ab-抗体。
【図２３−１】Pten-NOLC1ががん細胞の増殖および浸潤を促進することを示す図である。(A) Pten-NOLC1ノックアウト戦略の模式図。Ptenのイントロン11の配列を青色で示すが、NOLC1のイントロン1の配列を赤色で示す。pCas9D10A-EGFPおよびPtenドナー-ゼオシン-mCherry-NOLC1ドナーベクターを、DU145細胞中に同時トランスフェクトした。画像は、Cas9D10A-EGFPと組み込まれたゼオシン-mCherryの同時発現を表し、DU145KO1細胞中でのPten-NOLC1のノックアウトを表す。
【図２３−２】(B) Pten-NOLC1ノックアウトDU145およびMCF7細胞上でのTaqman定量的RT-PCR。β-アクチンに関するTaqman RT-PCRは、RNA量の対照のためのものである。
【図２３−３】(C) Pten-NOLC1発現は、S期への細胞進入を促進する。差し込み図は、DU145、DU145KO1、MCF7およびMCF7KO1の10,000個の細胞のBrdU標識化の代表画像である。3組の実験を行った。標準偏差を示す。(D) Pten-NOLC1は、コロニー形成を促進する。差し込み図は、DU145/DU145KO1およびMCF7/MCF7KO1細胞のコロニーの代表的なクリスタルバイオレット染色画像である。3組の実験を行った。標準偏差を示す。
【図２３−４】(E) Pten-NOLC1は、UV誘導性細胞死に対する耐性を促進する。差し込み図は、175mjのUV照射への曝露後の細胞のアネキシンVおよびPI染色の代表的な画像である。3組の実験を行った。標準偏差を示す。
【図２３−５】(F) Pten-NOLC1の除去は、がん細胞浸潤を低減した。Matrigel横断分析を、DU145、DU145KO1およびDU145KO2細胞上で行った。3組の実験を行った。標準偏差を示す。MCF7細胞は、マトリゲルを通って移動することができない。(G) Pten-NOLC1の除去は、異種移植したDU145細胞の腫瘍体積を減少させた。
【図２３−６】(H)Pten-NOLC1の除去は、異種移植したDU145がんの転移の発生を低減させた。(I)Pten-NOLC1の除去は、DU145がんを異種移植された動物の生存を改善する。
【図２４】Pten-NOLC1が増殖促進遺伝子の発現を促進することを示す図である。(A) Pten-NOLC1の除去は、DU145、DU145KO1およびDU145KO2のマイクロアレイ分析に基づいてEGFR、VEGFA、GAB1 EREG、AXLおよびc-METの下方調節を誘導した。(B) EGFR、AXL、EREG、VEGFA、c-METおよびGAB1のTaqman定量的RT-PCR。親DU145細胞に対する相対倍数変化を示す。3組の実験を行った。標準偏差を示す。(C)Pten-NOLC1の除去は、c-METおよびGAB1タンパク質の発現を減少させた。
【図２５−１】Pten-NOLC1の作出が自発的な肝臓がんを生成することを示す図である。(A) Ptenを体細胞的に欠失させるためのプロセス、およびpT3-Pten-NOLC1-mCherry/pSBの水力学的尾静脈注射の模式図。差し込み図は、pT3-Pten-NOLC1-mCherry/pSBをトランスフェクトしたPC3細胞の代表画像である。(B) AAV8-creおよびpT3-Pten-NOLC1-mCherry/pSB(右)またはAAV8-creおよびpT3/pSB(左)で処置したマウスに由来する肝臓の代表画像。(C) AAV8-creおよびpT3-Pten-NOLC1-mCherry/pSBで処置されたマウス(右)に由来する肝臓がんの代表的な組織学画像と、AAV8-creおよびpT3/pSBで処置されたマウス(左)に関する組織学画像。
【図２５−２】(D) 肝臓がん細胞中での高頻度のKi-67発現。結果は、より高倍率の視野あたりのKi-67について陽性の細胞数の平均である。試料あたり7つの視野を計数した。(E) Pten-NOLC1は、肝臓がん細胞中でのc-METおよびGAB1の発現を促進する。
【図２６】PtenおよびNOLC1遺伝子のトランスクリプトーム配列決定リード分布を示す図である。グラフは、最初のエクソンのリード数の、Pten(左上)もしくはNOLC1(左下)の全エクソンのリードに対する比または最後のエクソンのリード数の、Pten(右上)もしくはNOLC1(右下)の全エクソンのリードに対する比に対する個々の試料の分布を表す。オレンジ色-TCGAデータセットに由来する試料(550の試料)；青色-Luoらのデータセット(86の試料)。P値を示す。
【図２７−１】17種類のヒト悪性腫瘍におけるPtenエクソン11とNOLC1エクソン2との間のスパニング欠失(spanning deletion)を示す図である。(A) PtenおよびNOLC1のミニゲノムならびにTCGA Affymetrix SNP6.0データのコピー数分析による2個の遺伝子(赤色の線)間のスパニング欠失の検出の模式図。欠失について陽性であると考えられる試料の数を示す。
【図２７−２】(B) 17種の異なるヒト悪性腫瘍におけるPtenとNOLC1との間のスパニング欠失の頻度。(C) 示唆的Pten-NOLC1融合物を含む試料中でのPten欠失の頻度。示唆的Pten-NOLC1融合物を含む試料の総数を示す。
【図２８−１】Pten-NOLC1がゲノムDNAと相互作用し、増殖促進遺伝子の発現を活性化することを示す図である。(A) NOLC1に特異的な抗体を用いる、DU145とDU145KO1/KO2(上パネル)、およびMCF7とMCF7KO1/KO2(下パネル)のChIP配列決定に由来するマッピングされたDNA断片の分布。そのノックアウト対応物から差し引いた後のDU145またはMCF7細胞のDNA断片の分布を、右に示した。
【図２８−２】図２８−１の続きである。
【図２８−３】(B) MET、EGFR、RAF1、AXL、GAB1およびVEGFAのプロモーター/エンハンサー領域へのPten-NOLC1結合のTaqman Q-PCR定量化。
【図２８−４】(C) Pten-NOLC1の除去は、c-MET、EGFR、RAF1およびGAB1タンパク質発現、ならびにSTAT3およびRAF1のリン酸化を減少させた。
【図２８−５】（D) MET、EGFおよびECMのシグナル伝達経路は、Pten-NOLC1の存在によって影響される。赤色のアイコンは、NOLC1タンパク質によってではなく、Pten-NOLC1によって相互作用された遺伝子を示す。
【図２９−１】MET、EGFR、RAF1、AXLおよびVEGFAのプロモーター領域へのPten-NOLC1の結合を示す図である。Pten-NOLC1陽性試料からこれらの遺伝子のプロモーター領域までのChIP配列決定によりマッピングされたピークを、赤色で示す。マッピングされたDNAのゲノム位置(参照としてHG19を用いる)を示す。転写開始部位を矢印で示す。囲みはPten-NOLC1結合断片に富む領域を示す。
【図２９−２】図２９−１の続きである。
【図２９−３】図２９−１の続きである。
【図２９−４】図２９−１の続きである。
【図２９−５】図２９−１の続きである。
【図３０−１】Pten-NOLC1のゲノム中断により誘導される細胞死を示す図である。PC3(前立腺がん)、DU145(前立腺がん)、MCF7(乳がん)、H1299(肺がん)、SNU449(肝臓がん)、SNU475(肝臓がん)、HEP3B(肝臓がん)、T98G(多形膠芽腫)、MB231(乳がん)およびNIH3T3(マウス不死化線維芽細胞)細胞を、Cas9D10A、またはCas9D10A + Pten-NOLC1に特異的なgRNAまたはCas9D10A + Pten-NOLC1に特異的なgRNA + Pten-NOLC1ノックアウトカセットで処理した。次いで、Annexin Vおよびヨウ化プロピジウム染色を用いて、処理の2日後に細胞死を分析した。
【図３０−２】図３０−１の続きである。
【図３０−３】図３０−１の続きである。
【図３０−４】図３０−１の続きである。
【図３０−５】図３０−１の続きである。
【図３１】PC3細胞ゲノム中のTMEM135-CCDC67切断点へのTMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9の組込みの検出のための模式図である。矢印は、PCRのためのプライマー位置を示す。変異を生成した推定組込み部位を、黄色の星印で示す。ウイルス処理前にTMEM135-CCDC67切断点を含有する異種移植されたPC3細胞から得られたPCR産物を、参照対照として用いた。ウイルス(Ad-TC)感染後に得られたPCR産物を配列決定した。DNA組込みに起因する変異の位置を、Sangerの配列決定により検出した。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
5. 発明の詳細な説明
明確性のために、限定されるものではないが、発明の詳細な説明を、以下のサブセクションに分割する：
(i) 融合遺伝子；
(ii) 融合遺伝子検出；
(iii) がん標的；
(iv) 処置の方法；
(v) ゲノム編集技術；および
(vi) キット。
【００１５】
5.1 融合遺伝子
本明細書で用いられる用語「融合遺伝子」とは、野生型/正常核酸またはタンパク質配列には見出されない様式で記載される遺伝子またはそのRNA転写物のエレメントを組み合わせる核酸またはタンパク質配列を指す。例えば、限定されるものではないが、ゲノムDNAの形態の融合遺伝子においては、記載される遺伝子のゲノム配列の部分の相対位置を、野生型/正常配列と比較して変化させる(例えば、NCBI染色体位置または本明細書に記載の配列において反映される)。mRNAの形態の融合遺伝子においては、両方の構成要素遺伝子から生じるRNA転写物の部分が存在する(必ずしも野生型転写物と同じレジスター(register)にはなく、おそらく正常な成熟転写物中には通常は存在しない部分を含む)。非限定的な実施形態においては、ゲノムDNAまたはmRNAのそのような一部は、少なくとも約10個の連続するヌクレオチド、または少なくとも約20個の連続するヌクレオチド、または少なくとも約30個の連続するヌクレオチド、または少なくとも約40個の連続するヌクレオチドを含んでもよい。特定の実施形態において、ゲノムDNAまたはmRNAのそのような一部は、融合遺伝子中に存在する遺伝子のヌクレオチド配列の最大で約10個の連続するヌクレオチド、最大で約50個の連続するヌクレオチド、最大で約100個の連続するヌクレオチド、最大で約200個の連続するヌクレオチド、最大で約300個の連続するヌクレオチド、最大で約400個の連続するヌクレオチド、最大で約500個の連続するヌクレオチド、最大で約600個の連続するヌクレオチド、最大で約700個の連続するヌクレオチド、最大で約800個の連続するヌクレオチド、最大で約900個の連続するヌクレオチド、最大で約1,000個の連続するヌクレオチド、最大で約1,500個の連続するヌクレオチド、または最大で約2,000個の連続するヌクレオチドを含んでもよい。特定の実施形態において、ゲノムDNAまたはmRNAのそのような一部は、融合遺伝子中に存在する遺伝子のヌクレオチド配列の約10個以下の連続するヌクレオチド、約50個以下の連続するヌクレオチド、約100個以下の連続するヌクレオチド、約200個以下の連続するヌクレオチド、約300個以下の連続するヌクレオチド、約400個以下の連続するヌクレオチド、約500個以下の連続するヌクレオチド、約600個以下の連続するヌクレオチド、約700個以下の連続するヌクレオチド、約800個以下の連続するヌクレオチド、約900個以下の連続するヌクレオチド、約1,000個以下の連続するヌクレオチド、約1,500個以下の連続するヌクレオチド、または約2,000個以下の連続するヌクレオチドを含んでもよい。特定の実施形態において、ゲノムDNAまたはmRNAのそのような一部は、融合遺伝子中に存在する遺伝子の完全な野生型/正常ヌクレオチド配列を含まない。タンパク質の形態の融合遺伝子においては、両方の構成要素遺伝子から生じるアミノ酸配列の部分が存在する(限定されるものではないが、少なくとも約5個の連続するアミノ酸または少なくとも約10個の連続するアミノ酸または少なくとも約20個の連続するアミノ酸または少なくとも約30個の連続するアミノ酸)。特定の実施形態において、融合遺伝子タンパク質のそのような一部は、融合遺伝子中に存在する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の最大で約10個の連続するアミノ酸、最大で約20個の連続するアミノ酸、最大で約30個の連続するアミノ酸、最大で約40個の連続するアミノ酸、最大で約50個の連続するアミノ酸、最大で約60個の連続するアミノ酸、最大で約70個の連続するアミノ酸、最大で約80個の連続するアミノ酸、最大で約90個の連続するアミノ酸、最大で約100個の連続するアミノ酸、最大で約120個の連続するアミノ酸、最大で約140個の連続するアミノ酸、最大で約160個の連続するアミノ酸、最大で約180個の連続するアミノ酸、最大で約200個の連続するアミノ酸、最大で約220個の連続するアミノ酸、最大で約240個の連続するアミノ酸、最大で約260個の連続するアミノ酸、最大で約280個の連続するアミノ酸または最大で約300個の連続するアミノ酸を含んでもよい。特定の実施形態において、融合遺伝子タンパク質のそのような一部は、融合遺伝子中に存在する遺伝子によってコードされるアミノ酸配列の約10個以下の連続するアミノ酸、約20個以下の連続するアミノ酸、約30個以下の連続するアミノ酸、約40個以下の連続するアミノ酸、約50個以下の連続するアミノ酸、約60個以下の連続するアミノ酸、約70個以下の連続するアミノ酸、約80個以下の連続するアミノ酸、約90個以下の連続するアミノ酸、約100個以下の連続するアミノ酸、約120個以下の連続するアミノ酸、約140個以下の連続するアミノ酸、約160個以下の連続するアミノ酸、約180個以下の連続するアミノ酸、約200個以下の連続するアミノ酸、約220個以下の連続するアミノ酸、約240個以下の連続するアミノ酸、約260個以下の連続するアミノ酸、約280個以下の連続するアミノ酸または約300個以下の連続するアミノ酸を含んでもよい。特定の実施形態において、融合遺伝子タンパク質のそのような一部は、融合遺伝子中に存在する遺伝子によってコードされる完全な野生型/正常アミノ酸配列を含まない。この段落において、両方の遺伝子、転写物またはタンパク質から生じる部分は、両方の遺伝子の野生型形態において偶然に同一であり得る配列を指さない(すなわち、部分は「非共有」である)。そのようなものとして、融合遺伝子は、一般的に言えば、一緒のスプライシングまたは通常は一緒に連結されないゲノムエレメントの融合物である。開示される融合遺伝子に関するさらなる情報については、内容が参照により本明細書に組み入れられるWO2015/103057およびWO2016/011428を参照されたい。
【００１６】
融合遺伝子TRMT11-GRIK2は、tRNAメチルトランスフェラーゼ11相同体(「TRMT11」)と、グルタミン酸受容体、イオンチャンネル型、カイニン酸2(「GRIK」)遺伝子との融合物である。ヒトTRMT11遺伝子は、典型的には、染色体6q11.1上に位置し、ヒトGRIK2遺伝子は、典型的には、染色体6q16.3上に位置する。特定の実施形態において、TRMT11遺伝子は、NCBI Gene ID番号60487、配列染色体6；NC_000006.11(126307576..126360422)を有するヒト遺伝子である、および/またはGRIK2遺伝子は、NCBI Gene ID番号2898、配列染色体6；NC_000006.11(101841584..102517958)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態において、TRMT11-GRIK2融合遺伝子の連結部(本明細書では染色体切断点および/または連結断片とも呼ばれる)は、図1および/または表1に示される配列を含む。
【００１７】
融合遺伝子SLC45A2-AMACRは、溶質運搬ファミリー45、メンバー2(「SLC45A2」)と、アルファ-メチルアシル-CoAラセマーゼ(「AMACR」)遺伝子との融合物である。ヒトSLC45A2遺伝子は、典型的には、ヒト染色体5p13.2上に位置し、ヒトAMACR遺伝子は、典型的には、染色体5p13上に位置する。特定の実施形態において、SLC45A2遺伝子は、NCBI Gene ID番号51151、配列染色体5; NC_000005.9 (33944721..33984780、相補体)を有するヒト遺伝子である、および/またはAMACR 遺伝子は、NCBI Gene ID番号23600、配列染色体5; NC_000005.9 (33987091..34008220、相補体)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態において、SLC45A2-AMACR融合遺伝子の連結部および/または連結断片は、図1および/または表1に示される配列を含む。
【００１８】
融合遺伝子MTOR-TP53BP1は、ラパマイシンの機構的標的(「MTOR」)と、腫瘍タンパク質p53結合タンパク質1(「TP53BP1」)遺伝子との融合物である。ヒトMTOR遺伝子は、典型的には、染色体1p36.2上に位置し、ヒトTP53BP1遺伝子は、典型的には、染色体15q15-q21上に位置する。特定の実施形態において、MTOR遺伝子は、NCBI Gene ID番号2475、配列染色体1 NC_000001.10 (11166588..11322614、相補体)を有するヒト遺伝子である、および/またはTP53BP1遺伝子は、NCBI Gene ID番号7158、配列染色体15; NC_000015.9 (43695262..43802707、相補体)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態において、MTOR-TP53BP1融合遺伝子の連結部および/または連結断片は、図1および/または表1に示される配列を含む。
【００１９】
融合遺伝子LRRC59-FLJ60017は、ロイシンリッチリピート含有59(「LRRC59」)遺伝子と、「FLJ60017」核酸との融合物である。ヒトLRRC59遺伝子は、典型的には、染色体17q21.33上に位置し、ヒトFLJ60017をコードする核酸は、典型的には、染色体11q12.3上に位置する。特定の実施形態において、LRRC59遺伝子は、NCBI Gene ID番号55379、配列染色体17; NC_000017.10 (48458594..48474914、相補体) を有するヒト遺伝子である、および/またはFLJ60017は、GeneBank AK_296299に記載の核酸配列を有する。特定の実施形態において、LRRC59-FLJ60017融合遺伝子の連結部および/または連結断片は、図1、図2および/または表1に示される配列を含む。
【００２０】
融合遺伝子TMEM135-CCDC67は、膜貫通タンパク質135(「TMEM135」)と、コイルドコイルドメイン含有67(「CCDC67」)遺伝子との融合物である。ヒトTMEM135遺伝子は、典型的には、染色体11q14.2上に位置し、ヒトCCDC67遺伝子は、典型的には、染色体11q21上に位置する。特定の実施形態において、TMEM135遺伝子は、NCBI Gene ID番号65084、配列染色体11; NC_000011.9 (86748886..87039876)を有するヒト遺伝子である、および/またはCCDC67遺伝子は、NCBI Gene ID番号159989、配列染色体11; NC_000011.9 (93063156..93171636)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態において、TMEM135-CCDC67融合遺伝子の連結部および/または連結断片は、図1、図2、図13および/または表1に示される配列を含む。
【００２１】
融合遺伝子CCNH-C5orf30は、サイクリンH(「CCNH」)と第5染色体オープンリーディングフレーム30(「C5orf30」)遺伝子との融合物である。ヒトCCNH遺伝子は、典型的には、染色体5q13.3-q14上に位置し、ヒトC5orf30遺伝子は、典型的には、染色体5q21.1上に位置する。特定の実施形態において、CCNH遺伝子は、NCBI Gene ID番号902、配列染色体5; NC_000005.9 (86687310..86708850、相補体)を有するヒト遺伝子である、および/またはC5orf30遺伝子は、NCBI Gene ID番号90355、配列染色体5; NC_000005.9 (102594442..102614361)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態において、CCNH-C5orf30融合遺伝子の連結部および/または連結断片は、図1、図2および/または表1に示される配列を含む。
【００２２】
融合遺伝子KDM4B-AC011523.2は、リシン(K)特異的デメチラーゼ-4B(「KDM4B」)と、染色体領域「AC011523.2」との融合物である。ヒトKDM4B遺伝子は、典型的には、染色体19p13.3上に位置し、ヒトAC011523.2領域は、典型的には、染色体19q13.4上に位置する。特定の実施形態において、KDM4B遺伝子は、NCBI Gene ID番号23030、配列染色体19; NC_000019.9 (4969123..5153609)を有するヒト遺伝子である；および/またはAC011523.2領域は、図1に示される配列を含む。特定の実施形態において、KDM4B-AC011523.2融合遺伝子の連結部および/または連結断片は、図1および/または表1に示される配列を含む。
【００２３】
融合遺伝子MAN2A1-FERは、マンノシダーゼ、アルファ、クラス2A、メンバー1(「MAN2A1」)と、(fps/fes関連)チロシンキナーゼ(「FER」)との融合物である。ヒトMAN2A1遺伝子は、典型的には、染色体5q21.3上に位置し、ヒトFER遺伝子は、典型的には、染色体5q21上に位置する。特定の実施形態において、MAN2A1遺伝子は、NCBI Gene ID番号4124、配列染色体5; NC_000005.9 (109025156..109203429)もしくはNC_000005.9 (109034137..109035578)を有するヒト遺伝子である；および/またはFER遺伝子は、NCBI Gene ID番号2241、配列染色体5: NC_000005.9 (108083523..108523373)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態において、MAN2A1-FER融合遺伝子の連結部および/または連結断片は、図1、図4、図15および/または表1に示される配列を含む。
【００２４】
融合遺伝子PTEN-NOLC1は、ホスファターゼおよびテンシン相同体(「PTEN」)と、核およびコイル体ホスホタンパク質1(「NOLC1」)との融合物である。ヒトPTEN遺伝子は、典型的には、染色体10q23.3上に位置し、ヒトNOLC1遺伝子は、典型的には、染色体10q24.32上に位置する。特定の実施形態において、PTEN遺伝子は、NCBI Gene ID番号5728、配列染色体10; NC_000010.11 (87863438..87970345)を有するヒト遺伝子である、および/またはNOLC1遺伝子は、NCBI Gene ID番号9221、配列染色体10; NC_000010.11 (102152176..102163871)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態において、PTEN-NOLC1融合遺伝子の連結部および/または連結断片は、図3、図17および/または表1に示される配列を含む。
【００２５】
融合遺伝子ZMPSTE24-ZMYM4は、亜鉛メタロペプチダーゼSTE24(「ZMPSTE24」)と、亜鉛フィンガーMYM-4型(「ZMYM4」)との融合物である。ヒトZMPSTE24は、典型的には、染色体1p34上に位置し、ヒトZMYM4遺伝子は、典型的には、染色体1p32-p34上に位置する。特定の実施形態において、ZMPSTE24遺伝子は、NCBI Gene ID番号10269、配列染色体1; NC_000001.11 (40258050..40294184)を有するヒト遺伝子である、および/またはZMYM4遺伝子は、NCBI Gene ID番号9202、配列染色体1; NC_000001.11 (35268850..35421944)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態において、ZMPSTE24-ZMYM4融合遺伝子の連結部および/または連結断片は、図6および/または図18に示される配列を含む。
【００２６】
融合遺伝子CLTC-ETV1は、クラスリン、重鎖(Hc)(「CLTC」)と、etsバリアント1(「ETV1」)との融合物である。ヒトCLTCは、典型的には、染色体17q23.1上に位置し、ヒトETV1遺伝子は、典型的には、染色体7p21.3上に位置する。特定の実施形態において、CLTC遺伝子は、NCBI Gene ID番号1213、配列染色体17; NC_000017.11 (59619689..59696956)を有するヒト遺伝子である、および/またはETV1遺伝子は、NCBI Gene ID番号2115、配列染色体7; NC_000007.14 (13891229..13991425、相補体)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態において、CLTC-ETV1融合遺伝子の連結部および/または連結断片は、図6および/もしくは図18に示される配列またはその断片を含む。
【００２７】
融合遺伝子ACPP-SEC13は、酸ホスファターゼ、前立腺(「ACPP」)と、SEC13相同体(「SEC13」)との融合物である。ヒトACPPは、典型的には、染色体3q22.1上に位置し、ヒトSEC13遺伝子は、典型的には、染色体3p25-p24上に位置する。特定の実施形態において、ACPP遺伝子は、NCBI Gene ID番号55、配列染色体3; NC_000003.12 (132317367..132368302)を有するヒト遺伝子である、および/またはSEC13遺伝子は、NCBI Gene ID番号6396、配列染色体3; NC_000003.12 (10300929..10321188、相補体)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態において、ACPP-SEC13融合遺伝子の連結部および/または連結断片は、図6および/または図18に示される配列を含む。
【００２８】
融合遺伝子DOCK7-OLR1は、細胞質分裂のデディケーター7(「DOCK7」)と、酸化低密度リポタンパク質(レクチン様)受容体1(「OLR1」)との融合物である。ヒトDOCK7は、典型的には、染色体1p31.3上に位置し、ヒトOLR1遺伝子は、典型的には、染色体12p13.2-p12.3上に位置する。特定の実施形態において、DOCK7遺伝子は、NCBI Gene ID番号85440、配列染色体1; NC_000001.11 (62454726..62688368、相補体)を有するヒト遺伝子である、および/またはOLR1遺伝子は、NCBI Gene ID番号4973、配列染色体12; NC_000012.12 (10158300..10172191、相補体)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態において、DOCK7-OLR1融合遺伝子の連結部および/または連結断片は、図6および/または図18に示される配列を含む。
【００２９】
融合遺伝子PCMTD1-SNTG1は、タンパク質-L-イソアスパラギン酸(D-アスパラギン酸)O-メチルトランスフェラーゼドメイン含有1(「PCMTD1」)と、シントロフィン、ガンマ1(「SNTG1」)との融合物である。ヒトPCMTD1は、典型的には、染色体8q11.23上に位置し、ヒトSNTG1遺伝子は、典型的には、染色体8q11.21上に位置する。特定の実施形態において、PCMTD1遺伝子は、NCBI Gene ID番号115294、配列染色体8; NC_000008.11 (51817575..51899186、相補体)を有するヒト遺伝子である、および/またはSNTG1遺伝子は、NCBI Gene ID番号54212、配列染色体8; NC_000008.11 (49909789..50794118)を有するヒト遺伝子である。特定の実施形態において、PCMTD1-SNTG1融合遺伝子の連結部および/または連結断片は、図6および/または図18に示される配列を含む。
【００３０】
5.2 融合遺伝子検出
セクション5.1に上記された前記融合遺伝子のいずれかを、当業界で公知の方法によって同定および/または検出することができる。DNA分子、RNA分子またはタンパク質中に現れる融合遺伝子を検出することによって、融合遺伝子を検出することができる。特定の実施形態において、融合遺伝子によってコードされるDNA分子、RNA分子またはタンパク質の存在を決定することによって、融合遺伝子を検出することができる。例えば、限定されるものではないが、融合遺伝子によりコードされるタンパク質の存在を決定することによって、融合遺伝子の存在を検出することができる。
【００３１】
融合遺伝子を、対象の試料中で検出することができる。本明細書で互換的に用いられる「患者」または「対象」とは、ヒトまたは非ヒト対象を指す。非ヒト対象の非限定例としては、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、マウスなどが挙げられる。対象は、がんを有すると以前に診断されていても、またはされていなくてもよい。
【００３２】
特定の非限定的な実施形態において、試料としては、限定されるものではないが、培養物中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的流体(例えば、血液、血漿、血清、糞便、尿、リンパ液、腹水、乳管内洗浄、唾液および脳脊髄液)および組織試料が挙げられる。試料の供給源は、固形組織(例えば、新鮮な、凍結された、および/もしくは保存された臓器、組織試料、生検、または吸引物に由来する)、血液もしくは任意の血液構成要素、体液(例えば、尿、リンパ液、脳脊髄液、羊水、腹腔液もしくは間質液)、または循環がん細胞を含む、個体に由来する細胞であってもよい。特定の非限定的な実施形態において、試料は、がんから得られる。特定の実施形態において、試料は、対象に由来する試料である、「生検試料」または「臨床試料」であってもよい。特定の実施形態において、試料は、対象に由来する1個以上のがん細胞を含む。特定の実施形態において、1つ以上の融合遺伝子を、対象から得られる1つ以上の試料、例えば、1つ以上のがん細胞試料中で検出することができる。特定の実施形態において、試料は、前立腺がん試料または1つ以上の前立腺がん細胞ではない。特定の実施形態において、試料は、肺腺癌、多形膠芽腫または肝細胞癌試料ではない。
【００３３】
特定の非限定的な実施形態において、融合遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーション分析によって検出される。
【００３４】
特定の非限定的な実施形態において、融合遺伝子は、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)分析によって検出される。FISHは、細胞または生物学的試料中のDNAまたはRNAの特異的配列を直接同定することができ、組織試料中での融合遺伝子の存在および/または発現の視覚的決定を可能にする技術である。融合遺伝子が典型的には同じ染色体上に存在しない遺伝子を組み合わせる、特定の非限定的な実施形態において、FISH分析は、同じ染色体に結合するプローブを示すことができる。例えば、限定されるものではないが、分析は、1つの遺伝子が正常に存在する染色体に焦点を当ててもよく、次いで、ハイブリダイゼーション分析を行って、他の遺伝子が同様にその染色体上に存在するかどうかを決定することができる。
【００３５】
特定の非限定的な実施形態において、融合遺伝子は、限定されるものではないが、サザンブロット分析などのDNAハイブリダイゼーションによって検出される。
【００３６】
特定の非限定的な実施形態において、融合遺伝子は、限定されるものではないが、ノーザンブロット分析などのRNAハイブリダイゼーションによって検出される。特定の実施形態において、ノーザンブロット分析を、融合遺伝子の検出のために使用することができ、ここで、単離されたRNA試料を変性アガロースゲル上で泳動し、活性化セルロース、ニトロセルロースまたはガラスもしくはナイロン膜などの好適な支持体に移す。次いで、放射標識されたcDNAまたはRNAを調製物にハイブリダイズさせ、洗浄し、オートラジオグラフィーによって分析して、RNA試料中の融合遺伝子の存在を検出する。
【００３７】
特定の非限定的な実施形態において、融合遺伝子は、核酸配列決定分析によって検出される。
【００３８】
特定の非限定的な実施形態において、融合遺伝子は、DNAアレイ、チップまたはマイクロアレイ上に存在するプローブによって検出される。例えば、限定されるものではないが、1つ以上の融合遺伝子に対応するオリゴヌクレオチドをチップ上に固定した後、対象から得られた試料の標識された核酸とハイブリダイズさせることができる。陽性のハイブリダイゼーションシグナルは、融合遺伝子転写物を含有する試料に関して得られる。
【００３９】
特定の非限定的な実施形態において、融合遺伝子は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(「RT-PCR」)を含む方法によって検出される。特定の実施形態において、融合遺伝子は、本明細書に開示される1つ以上のプライマー対を用いるRT-PCRを含む方法によって検出される(例えば、表5を参照されたい)。
【００４０】
特定の非限定的な実施形態において、融合遺伝子は、限定されるものではないが、ウェスタンブロット分析および免疫組織化学などの抗体結合分析によって検出される。
【００４１】
【表１】
2020510623.tif 000003
2020510623.tif 000004
【００４２】
5.3 がん標的
本明細書で開示される発明の対象となり得るがんの非限定例としては、前立腺がん、乳がん、肝臓がん、肝細胞癌、肝癌、肺がん、非小細胞肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、多形膠芽腫(多形成グリア芽細胞腫)、結腸直腸がん、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、肉腫、急性および慢性リンパ球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および腺癌、例えば、食道腺癌が挙げられる。特定の実施形態において、処置の標的は、肺、子宮頸部、子宮内膜、膵臓、卵巣、胃、甲状腺、グリア、腸、食道、筋肉またはB細胞を含む前がん状態または新生物状態である。特定の実施形態において、がんは前立腺がんではない。特定の実施形態において、がんは、肺腺癌、多形膠芽腫または肝細胞癌ではない。特定の実施形態において、処置の標的は、少なくとも1つの融合遺伝子、例えば、PTEN-NOLC1またはMAN2A1-FERを担持する細胞である。
【００４３】
5.4 処置の方法
本発明は、融合遺伝子を担持する1個以上の細胞を有する対象を処置する方法を提供する。特定の実施形態において、対象は、1個以上の融合遺伝子を担持するがんまたは新生物もしくは前がん状態(前がん状態は、特に、前がんまたは新生物細胞の存在を特徴とする)を有する、または有することが疑われる。融合遺伝子の非限定例は、本明細書およびセクション5.1に開示される。特定の実施形態において、処置の方法は、対象内の1個以上のがん細胞に対して標的ゲノム編集技術を実施して、抗がんまたは抗新生物または抗増殖効果をもたらすことを含む。開示される方法を用いて処置することができるがんの非限定例は、セクション5.3に提供される。ゲノム編集技術の非限定例は、セクション5.5に開示される。
【００４４】
「抗がん効果（抗がん作用）」とは、凝集がん細胞塊の減少、がん細胞増殖速度の低下、がん進行の低減、がん細胞増殖の低減、腫瘍塊の減少、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍増殖速度の低下および/または腫瘍転移の減少のうちの1つ以上を指す。特定の実施形態において、抗がん効果は、がんと診断された患者における、完全寛解、部分的寛解、安定疾患(進行もしくは再発がない)、より遅い再発を示す寛解または無進行生存を指してもよい。特定の実施形態において、抗がん効果は、例えば、がんの1個以上の細胞における、細胞死の誘導、および/または腫瘍塊内での細胞死の増加を指してもよい。同様に、「抗新生物効果」とは、凝集新生物細胞塊の減少、新生物細胞増殖速度の低下、新生物進行(例えば、進行性脱分化もしくは上皮間葉移行)の低減、新生物細胞増殖の減少、新生物塊の減少、新生物体積の減少、および/または新生物増殖速度の低下を指す。
【００４５】
特定の実施形態において、対象を処置する方法は、対象に由来する試料中の1個以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1個以上の融合遺伝子が試料中に存在する場合、対象内の1個以上の細胞に対して標的ゲノム編集技術を実施する。特定の実施形態において、ゲノム編集技術は、対象の1個以上の細胞中での融合遺伝子の発現および/または融合遺伝子によりコードされるタンパク質の発現の減少および/または除去をもたらす。特定の実施形態において、ゲノム編集技術は、例えば、融合遺伝子の核酸配列を特異的に標的化することによって、融合遺伝子を担持する細胞を特異的に標的化する。例えば、限定されるものではないが、本発明の方法は、1個以上の融合遺伝子の染色体切断点を特異的に標的化する。特定の実施形態において、本発明の方法は、切断点に隣接する配列の標的化を含む。特定の実施形態において、本発明の方法は、切断点に隣接し、それと部分的に重複する配列の標的化を含む。融合遺伝子を同定および/または検出するための技術の非限定例は、セクション5.2に開示される。
【００４６】
特定の実施形態において、対象におけるがんを処置する方法は、対象に由来するがん細胞含有試料中の1個以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1個以上の融合遺伝子が試料中に存在する場合、対象内の1個以上のがん細胞に対して標的ゲノム編集技術を実施して、抗がん効果または抗新生物効果をもたらす。
【００４７】
特定の実施形態において、方法は、融合遺伝子の存在または非存在を決定することを含んでもよい。例えば、限定されるものではないが、方法は、1個以上、2個以上、3個以上、4個以上、5個以上、6個以上、7個以上、8個以上、9個以上、10個以上、11個以上、12個以上、13個以上または14個全部の本明細書に開示される融合遺伝子を決定することを含んでもよい。特定の実施形態において、1個以上の融合遺伝子は、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1またはその組合せであってもよい。
【００４８】
特定の実施形態において、融合遺伝子は、TMEM135-CCDC67であってもよい。
【００４９】
特定の実施形態において、融合遺伝子は、CCNH-C5orf30であってもよい。
【００５０】
特定の実施形態において、融合遺伝子は、MAN2A1-FERであってもよい。
【００５１】
特定の実施形態において、融合遺伝子は、PTEN-NOLC1であってもよい。
【００５２】
特定の実施形態において、融合遺伝子は、TMEM135-CCDC67またはCCNH-C5orf30ではない。
【００５３】
特定の実施形態において、対象を処置する方法は、対象の試料中の1個以上の融合遺伝子(例えば、MAN2A1-FER、TMEM135-CCDC67、TRMT11-GRIK2、CCNH-C5orf30、LRRC59-FLJ60017、SLC45A2-AMACR、KDM4B-AC011523.2、PTEN-NOLC1、MTOR-TP53BP1またはその組合せからなる群から選択される)の存在を決定することを含み、1個以上の融合遺伝子が試料中で検出される場合、対象内の1個以上のがん細胞中の融合遺伝子に対して標的ゲノム編集技術を実施して、抗がん効果をもたらす。
【００５４】
特定の実施形態において、がんを有する対象を処置する方法は、対象の1個以上のがん細胞中の、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1またはその組合せからなる群から選択される1個以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1個以上の融合遺伝子ががん細胞中で検出される場合、対象の1個以上のがん細胞内に存在する融合遺伝子を標的化するゲノム編集技術を実施して、抗がん効果をもたらす。特定の実施形態において、がん細胞に隣接する正常細胞または非がん性細胞は、gRNAが融合遺伝子の配列に特異的である、例えば、切断点の配列に特異的であるため、ゲノム編集技術を受けない。
【００５５】
特定の実施形態において、がんを有する対象を処置する方法は、対象の1個以上がん細胞中の、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1またはその組合せからなる群から選択される1個以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1個以上の融合遺伝子ががん細胞中で検出される場合、対象内の1個以上のがん細胞に対して標的ゲノム編集技術を実施して、抗がん効果をもたらす。
【００５６】
特定の実施形態において、対象を処置する方法は、対象の1個以上の細胞中の、CCNH-C5orf30、TMEM135-CCDC67、PTEN-NOLC1、MAN2A1-FERおよびその組合せからなる群から選択される1個以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1個以上の融合遺伝子が細胞中で検出される場合、対象内の1個以上のがん細胞に対して標的ゲノム編集技術を実施して、例えば、対象の1個以上の細胞中での融合遺伝子の発現を減少させる、および/もしくは除去する、ならびに/または融合遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を減少させる、および/もしくは除去する。
【００５７】
特定の実施形態において、がんを有する対象を処置する方法は、対象の1個以上の細胞中の、CCNH-C5orf30、TMEM135-CCDC67、PTEN-NOLC1、MAN2A1-FERおよびその組合せからなる群から選択される1個以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1個以上の融合遺伝子ががん細胞中で検出される場合、対象内の1個以上のがん細胞に対して標的ゲノム編集技術を実施して、抗がん効果をもたらす。
【００５８】
特定の実施形態において、本発明は、がんを有する対象において抗がん効果をもたらす方法であって、例えば、融合遺伝子を標的化することによって、対象内の融合遺伝子を含有する1個以上のがん細胞に対して標的ゲノム編集技術を実施して、抗がん効果をもたらすことを含む、前記方法を提供する。
【００５９】
本発明はさらに、腫瘍の増殖を防止する、最小化する、および/または低減する方法であって、対象の試料中の1個以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1個以上の融合遺伝子が試料中に存在する場合、対象の腫瘍内に存在する融合遺伝子を標的化するゲノム編集技術を実施して、腫瘍の増殖を防止する、最小化する、および/または低減する方法を提供する。
【００６０】
本発明は、がん細胞の成長および/または増殖を防止する、最小化する、および/または低減する方法であって、対象の試料中の1個以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1個以上の融合遺伝子が試料中に存在する場合、例えば、対象のがん細胞内に存在する、染色体切断点を標的化することにより、融合遺伝子を標的化するゲノム編集技術を実施して、がん細胞の成長および/または増殖を防止する、最小化する、および/または低減する、前記方法を提供する。特定の実施形態において、切断点に隣接する配列を、ゲノム編集技術によって標的化することができる。
【００６１】
特定の非限定的な実施形態において、本発明は、対象におけるがんおよび/または腫瘍および/または新生物増殖の進行を処置する、および/または阻害する方法であって、対象の試料中の1個以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1個以上の融合遺伝子が試料中に存在する場合、対象のがんおよび/または腫瘍に由来する1個以上の細胞に対して標的ゲノム編集技術を実施して、がんおよび/または腫瘍の進行を処置および/または阻害する、前記方法を提供する。
【００６２】
特定の実施形態において、本発明は、がんを有する対象の生存期間を延長するための方法を提供する。特定の実施形態において、方法は、対象の試料中の1個以上の融合遺伝子の存在を決定することを含み、1個以上の融合遺伝子が試料中に存在する場合、対象内の1個以上のがん細胞に対して標的ゲノム編集技術を実施して、抗がん効果をもたらす。特定の実施形態において、がんを有する対象の生存期間を、開示される方法を用いて、約1ヶ月、約2ヶ月、約4ヶ月、約6ヶ月、約8ヶ月、約10ヶ月、約12ヶ月、約14ヶ月、約18ヶ月、約20ヶ月、約2年、約3年、約5年以上延長することができる。
【００６３】
特定の実施形態において、本発明は、少なくとも1個の融合遺伝子が、対象から得られた試料中に存在することを決定すること、次いで、対象の1個以上の細胞内の融合遺伝子を標的化するゲノム編集技術を実施して、抗新生物効果を達成することを含み、対象が前立腺がんを有しない、対象を処置するための方法を提供する。
【００６４】
特定の実施形態において、本発明は、対象を処置するための方法における使用のための標的ゲノム編集を行うことができる薬剤、または薬剤を含む組成物を提供する。例えば、限定されるものではないが、本発明は、対象におけるがんを処置または防止するための方法における使用のための標的ゲノム編集を行うことができる薬剤であって、前記方法が、対象内の融合遺伝子を含有する、1個以上の細胞、例えば、がん細胞に対して、前記薬剤を用いた標的ゲノム編集手順を実施することを含む、前記薬剤を提供する。特定の実施形態において、本発明は、対象におけるがんを処置または防止するための方法における使用のための標的ゲノム編集を行うことができる薬剤、またはその組成物であって、前記方法が、(i)対象のがん試料中の1個以上の融合遺伝子の存在を決定すること、および(ii)試料が融合遺伝子を含有する場合、対象内の1個以上のがん細胞に対して前記薬剤を用いて標的ゲノム編集手順を実施することを含む、前記薬剤、またはその組成物を提供する。特定の実施形態において、薬剤は、1個以上の融合遺伝子の特定の染色体切断点を標的とする。特定の実施形態において、本発明の方法は、切断点に隣接する配列の標的化を含む。特定の実施形態において、薬剤は、エンドヌクレアーゼである。例えば、限定されるものではないが、エンドヌクレアーゼは、Cas9タンパク質である。特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、変異型のCas9、例えば、Cas9D10Aである。特定の実施形態において、薬剤は、1つ以上のgRNA(例えば、リボ核タンパク質)との複合体にある、エンドヌクレアーゼ、例えば、Cas9である。特定の実施形態において、薬剤は、siRNA分子である。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明は、1個以上の融合遺伝子を含有する1個以上の細胞を有する対象のための処置を決定する方法を提供する。特定の実施形態において、方法は、i)対象に由来する試料を提供すること（用意すること）；ii)対象の1個以上の細胞が、TMEM135-CCDC67、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1およびその組合せからなる群から選択される1個以上の融合遺伝子を含有するかどうかを決定すること；ならびにiii)1個以上の融合遺伝子が1個以上の細胞中で検出される場合、ゲノム編集技術の実施を指示することを含んでもよく、ゲノム編集技術は、1個以上の細胞中で検出された1個以上の融合遺伝子を標的とし、対象は前立腺がんを有しない。特定の実施形態において、ゲノム編集技術は、CRISPR/Cas9システムを用いて実施される。
【００６６】
特定の実施形態において、1個以上の融合遺伝子が検出される試料は、前立腺がん、乳がん、肝臓がん、肝細胞癌、腺癌、肝癌、肺がん、非小細胞肺がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、膵がん、卵巣がん、胃がん、甲状腺がん、多形膠芽腫、結腸直腸がん、肉腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、および食道腺癌である。
【００６７】
特定の実施形態において、試料は、グリア芽細胞腫試料、乳がん試料、肺がん試料、肝臓がん試料、卵巣がん試料、腺癌または結腸がん試料である。
【００６８】
特定の実施形態において、1個以上の融合遺伝子が検出される試料は、乳がん試料、肺がん試料または結腸がん試料である。
【００６９】
特定の実施形態において、1個以上の融合遺伝子が検出される試料は、前立腺がん試料ではない。
【００７０】
特定の実施形態において、試料は、肺腺癌、多形膠芽腫または肝細胞癌試料ではない。
【００７１】
特定の実施形態において、試料中の融合遺伝子は、ゲノム配列決定によって検出される。特定の実施形態において、試料中の融合遺伝子は、RNA配列決定によって検出される。例えば、限定されるものではないが、RNA配列決定を、表5に開示されるプライマーを用いて実施することができる。特定の実施形態において、試料中の融合遺伝子は、FISHによって検出される。
【００７２】
特定の実施形態において、対象、例えば、本明細書に開示される融合遺伝子を担持するがんを有する対象を処置する方法は、治療有効量の抗がん剤または抗新生物効果をもたらす薬剤を投与することをさらに含んでもよい。「治療有効量」とは、以下：抗がん効果、抗新生物効果、生存の延長および/または再発までの期間の延長のうちの1つ以上を達成することができる量を指す。抗がん剤は、抗がん効果を有する任意の分子、化合物または組成物であってもよい。抗がん剤としては、限定されるものではないが、化学療法剤、放射線療法剤、サイトカイン、抗血管新生剤、アポトーシス誘導剤または抗がん抗毒素が挙げられる。特定の非限定的な実施形態において、本明細書に開示されるゲノム編集技術を、1つ以上の抗がん剤と組み合わせて使用することができる。本明細書で用いられる場合、「と組み合わせて（併用して）」とは、ゲノム編集技術と、1つ以上の抗がん剤(または抗新生物効果をもたらす薬剤)とが、対象のための処置レジメンまたは計画の一部であることを意味する。
【００７３】
5.5 ゲノムターゲティング/編集技術
ゲノム編集は、対象内の1個以上の細胞中に存在する内因性染色体配列を、標的エンドヌクレアーゼおよび一本鎖核酸を用いて、編集、例えば、改変することができる技術である。ゲノム編集法は、ゲノム内の特定の領域での核酸配列の挿入、ゲノムからの特定の配列の切り出しおよび/または特定のゲノム配列の、新しい核酸配列による置き換えをもたらすことができる。特定の実施形態において、ゲノム編集技術は、遺伝子、例えば、融合遺伝子の発現の抑制をもたらすことができる。例えば、限定されるものではないが、核酸配列を、融合遺伝子の染色体切断点に挿入することができる。開示される方法における使用のためのゲノム編集技術の非限定例は、CRISPRシステム、例えば、CRISPR/Cas9システムである。そのようなゲノム編集技術の非限定例は、PCT出願第WO2014/093701号および第WO2014/165825号に開示されており、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００７４】
特定の実施形態において、ゲノム編集技術は、ゲノム内の特定の配列、例えば、ヌクレアーゼ、例えば、エンドヌクレアーゼを、特定のゲノム配列に誘導するための、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)を含む、融合遺伝子と関連する染色体切断点と相補的な、1つ以上のガイドRNA(gRNA)の使用を含んでもよい。特定の実施形態において、ゲノム編集技術は、1つ以上のヌクレアーゼを誘導するための、染色体切断点(例えば、図13、15および23を参照されたい)に隣接する、および/またはそれと重複する配列と相補的な1つ以上のガイドRNA(gRNA)の使用を含んでもよい。
【００７５】
特定の実施形態において、1つ以上のgRNAは、融合遺伝子内に存在する配列と相補的である、例えば、染色体切断点に隣接する、および/またはそれと重複する配列と相補的であるターゲティング配列を含んでもよい。特定の実施形態において、融合遺伝子を標的化するために使用される1つ以上のgRNAは、融合遺伝子の切断点配列と少なくとも部分的に相補的であり、融合遺伝子を含む遺伝子の1つの配列と少なくとも部分的に相補的である配列を含んでもよい。特定の実施形態において、ターゲティング配列は、約10〜約50ヌクレオチド長、例えば、約10〜約45ヌクレオチド長、約10〜約40ヌクレオチド長、約10〜約35ヌクレオチド長、約10〜約30ヌクレオチド長、約10〜約25ヌクレオチド長、約10〜約20ヌクレオチド長、約10〜約15ヌクレオチド長、約15〜約50ヌクレオチド長、約20〜約50ヌクレオチド長、約25〜約50ヌクレオチド長、約30〜約50ヌクレオチド長、約35〜約50ヌクレオチド長、約40〜約50ヌクレオチド長または約45〜約50ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、ターゲティング配列は、約50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100を超える、またはそれより多いヌクレオチドの長さである。
【００７６】
特定の実施形態において、1つ以上のgRNAは、標的部位の反対の鎖と相補的なオフセットgRNAの対を含む。特定の実施形態において、1つ以上のgRNAは、エンドヌクレアーゼによりオフセットニックを生成するための標的部位の反対の鎖と相補的なオフセットgRNAの対を含む。特定の実施形態において、オフセットニックは、ニッカーゼ、例えば、Cas9D10AなどのCas9ニッカーゼを含むオフセットgRNAの対を用いて誘導される。特定の実施形態において、オフセットgRNAの対は、少なくとも約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または少なくとも100ヌクレオチドによって相殺される。特定の実施形態において、オフセットsgRNAの対は、約5〜約100ヌクレオチド、約10〜約50ヌクレオチド、約10〜約40ヌクレオチド、約10〜約30ヌクレオチド、約10〜約20ヌクレオチドまたは約10〜30ヌクレオチドによって相殺される。
【００７７】
特定の非限定的な実施形態において、PAMは、Casタンパク質などのCRISPRエンドヌクレアーゼによって認識され得る。Casタンパク質の非限定例としては、限定されるものではないが、Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9 (CsnlまたはCsxl2としても知られる)、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Cse l、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、CsxlS、Csfl、Csf2、CsO、Csf4、Cpfl、c2cl、c2c3、Cas9HiFi、その相同体またはその改変型が挙げられる。
【００７８】
特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、クラスター化調節介在ショートパリンドロームリピート(CRISPR)関連タンパク質9(Cas9)エンドヌクレアーゼであってもよい。特定の実施形態において、Cas9エンドヌクレアーゼは、Streptococcus pyogenesから得られる。特定の実施形態において、Cas9エンドヌクレアーゼは、Staphylococcus aureusから得られる。特定の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、標的ゲノム配列の切断をもたらし、非相同末端結合(NHEJ)または相同組換えによる切断部位でのゲノムの改変を可能にすることができる。特定の実施形態において、Cas9エンドヌクレアーゼは、例えば、一本鎖切断または「ニック」を生成する、変異型のCas9であってもよい。例えば、限定されるものではないが、Cas9タンパク質は、D10A変異、すなわち、Cas9D10Aを含んでもよい(Congら、Science. 339:819-823 (2013); Gasiunasら、PNAS 109:E2579-2586 (2012); およびJinekら、Science. 337:816-821 (2012)(これらの内容は参照により本明細書に組み入れられる)を参照されたい)。
【００７９】
特定の実施形態において、ゲノム編集法および/または技術を用いて、細胞、例えば、がん細胞中に存在する融合遺伝子の1つ以上の配列を標的化して、核酸を細胞のゲノム中に挿入するための相同組換えを促進することができる。例えば、限定されるものではないが、ゲノム編集技術を用いて、融合遺伝子の2つの遺伝子が一緒に連結される領域(すなわち、連結部および/または染色体切断点)を標的化することができる。
【００８０】
特定の実施形態において、ゲノム編集法および/または技術を用いて、例えば、融合遺伝子の少なくとも一部を切り出して、融合遺伝子配列を破壊することによって、融合遺伝子をノックアウトすることができる。例えば、限定されるものではないが、エンドヌクレアーゼ、例えば、野生型Cas9エンドヌクレアーゼを用いて、融合遺伝子の二本鎖DNA配列を特異的に切断することができ、相同的鋳型修復の非存在下で、非相同末端結合は融合遺伝子配列を破壊するインデルをもたらすことができる。
【００８１】
特定の実施形態において、ゲノム編集法および/または技術を用いて、例えば、ヌクレアーゼ欠損Cas9を使用することにより、融合遺伝子の発現を抑制することができる。例えば、限定されるものではないが、Cas9の触媒ドメイン中の変異、例えば、HNHドメイン中のH840AおよびRuvCドメイン中のD10Aは、Cas9の切断活性を不活化するが、DNA結合を防止しない。特定の実施形態において、Cas9D10AH840A(本明細書ではdCas9と呼ばれる)を用いて、融合遺伝子の2つの遺伝子が切断なしに一緒に連結される領域を標的化することができ、様々なエフェクタードメインと融合させることにより、dCas9を用いて融合遺伝子を沈黙化することができる。
【００８２】
正常な非がん性細胞は融合遺伝子を含有せず、したがって、融合遺伝子と関連する染色体切断点を含有しないため、このゲノム編集技術を用いて細胞を特異的に標的化することができる。特定の実施形態において、ゲノム編集技術を用いて、限定されるものではないが、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1およびPCMTD1-SNTG1を含む、融合遺伝子の連結部(すなわち、切断点)を標的化することができる。
【００８３】
特定の実施形態において、開示される方法において用いることができる1つ以上のgRNAは、配列番号40〜56、106および113に記載のヌクレオチド配列を含む切断点ならびに/または図4、15、17および18に開示されるヌクレオチド配列、例えば、配列番号143〜145および148〜154を含む切断点を標的化することができる。特定の実施形態において、開示される方法において用いられる1つ以上のgRNAは、本明細書に開示される染色体切断点と約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%相同および/または相補的であってよい。
【００８４】
特定の実施形態において、gRNAを、エンドヌクレアーゼ、例えば、Cas9D10Aを、染色体切断点領域または切断点の周囲の領域に誘導するための、染色体切断点領域(例えば、図13、15、23および31を参照されたい)に隣接する配列を標的化する(例えば、それと相補的である)ように設計することができる。開示される方法において用いることができるgRNAの配列の非限定例は、図13B、図15Aおよび図23A(例えば、配列番号107、112、146、147、272および274)に詳述されている。特定の実施形態において、開示される方法において用いられる1つ以上のgRNAは、本明細書に開示されるgRNAと約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%相同であってよい。特定の実施形態において、開示されるgRNAは、約1、約2、約3、約4または約5個のヌクレオチド置換および/または変異を含んでもよい。
【００８５】
特定の実施形態において、1つ以上のgRNAが、TMEM135-CCDC67融合遺伝子の切断点に隣接する、TMEM135のイントロン13およびCCDC67のイントロン9を標的化することができ、例えば、1つのgRNAは、TMEM135のイントロン13を標的化することができ、第2のgRNAは、CCDC67のイントロン9を標的化することができる。特定の実施形態において、TMEM135-CCDC67融合遺伝子を標的化するために用いられる1つ以上のgRNAは、図13Bまたは13Cに記載の1つ以上のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を有してもよい。特定の実施形態において、TMEM135-CCDC67を標的化するための1つ以上のgRNAは、図13に開示されるgRNAと約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%相同であってよい。
【００８６】
特定の実施形態において、1つ以上のgRNAが、MAN2A1-FER融合遺伝子の切断点に隣接する、MAN2A1のイントロン13および/またはエクソン14(またはイントロン13およびエクソン14のスプライスアクセプター部位)ならびにFERのイントロン14を標的化することができる。特定の実施形態において、MAN2A1-FER融合遺伝子を標的化するために用いられる1つ以上のgRNAは、図15Aに記載の1つ以上のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を有してもよい。特定の実施形態において、MAN2A1-FERを標的化するための1つ以上のgRNAは、図15に開示されるgRNAと約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%相同であってよい。
【００８７】
特定の実施形態において、1つ以上のgRNAが、PTEN-NOLC1融合遺伝子の切断点に隣接する、PTENのイントロン11およびNOLC1のイントロン1を標的化することができる。特定の実施形態において、PTEN-NOLC1融合遺伝子を標的化するために用いられる1つ以上のgRNAは、図17Aまたは図23Aに記載の1つ以上のヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列を有してもよい。特定の実施形態において、1つ以上のgRNAが、PTEN-NOLC1融合遺伝子の切断点に隣接する、PTENのイントロン11およびNOLC1のイントロン1を標的化することができる。特定の実施形態において、PTEN-NOLC1を標的化するための1つ以上のgRNAは、図17および図23に開示されるgRNAと約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%または約99%相同であってよい。
【００８８】
特定の実施形態において、融合遺伝子は、CCNH-C5orf3である。
【００８９】
特定の実施形態において、融合遺伝子は、TMEM135-CCDC67である。
【００９０】
特定の実施形態において、融合遺伝子は、MAN2A1-FERである。
【００９１】
特定の実施形態において、融合遺伝子は、PTEN-NOLC1であってよい。
【００９２】
特定の実施形態において、融合遺伝子は、CCNH-C5orf30またはTMEM135-CCDC67ではない。
【００９３】
特定の実施形態において、開示されるゲノム編集技術を用いて、例えば、対象の1個以上の細胞中の、融合遺伝子の染色体切断点(連結部)での、融合遺伝子の配列との相同組換えを促進して、発現された場合に、1個以上の細胞の死滅、例えば、アポトーシスをもたらす核酸配列の挿入を可能にすることができる。例えば、限定されるものではないが、核酸配列(本明細書ではドナー核酸とも呼ばれる)は、単純ヘルペスウイルス1(HSV-1)チミジンキナーゼ、Pseudomonas aeruginosaに由来する外毒素A、Corynebacterium diphtheriに由来するジフテリア毒素、Ricinus communi(ヒマシ油植物)に由来するリシンもしくはアブリン、細菌もしくは酵母に由来するシトシンデアミナーゼ、カルボキシルエステラーゼまたは水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)チミジンキナーゼをコードしてもよい。細胞死を誘導するために融合遺伝子を担持する細胞のゲノム中に挿入することができる核酸および/または遺伝子のさらなる非限定例は、Rajabら(2013) (J. of Genetics Syndromes and Gene Therapy, 4(9):187)およびZarogoulidisら(2013) (J. of Genetics Syndromes and Gene Therapy, 4(9):pii: 16849)に開示されている。特定の非限定的な実施形態において、核酸配列、例えば、HSV-1チミジンキナーゼ核酸配列は、調節配列プロモーター(例えば、プロモーター)に機能し得る形で連結されておらず、発現のためにはゲノム中への組込みを必要とする。例えば、限定されるものではないが、融合遺伝子の頭部遺伝子のプロモーターは、ドナー核酸配列の発現を促進することができる。
【００９４】
HSV-1チミジンキナーゼをコードする核酸が対象の1個以上の細胞のゲノム中に挿入される特定の実施形態において、治療有効量のグアニン誘導体、ガンシクロビル、またはその経口相同体であるバルガンシクロビルを、対象に投与することができる。HSV-1チミジンキナーゼは、対象の1個以上の細胞中で、ガンシクロビルおよび/またはバルガンシクロビルを、三リン酸型のガンシクロビルおよび/またはバルガンシクロビルにリン酸化および変換することができる。三リン酸型のガンシクロビルおよび/またはバルガンシクロビルは、デオキシグアノシン三リン酸(dGTP)の競合的阻害剤として作用し、DNA伸長の弱い基質であり、DNA合成の阻害をもたらすことができる。DNA合成の阻害は、順に、標的染色体切断点および組み込まれたHSV-1チミジンキナーゼ核酸配列を含有するがん細胞の増殖および/もしくは生存の低減および/もしくは阻害ならびに/または細胞死をもたらし得る。このゲノム編集法を用いて、融合遺伝子を有すると決定された対象において抗がん効果をもたらすことができる。
【００９５】
特定の実施形態において、本開示のゲノム編集技術は、Casタンパク質またはその変異体、例えば、Cas9D10Aをコードする核酸配列を含む発現ベクターの、融合遺伝子を担持する対象の1個以上の細胞、例えば、がん細胞中への導入を含んでもよい。特定の実施形態において、細胞は、前立腺がん細胞ではない。特定の実施形態において、ベクターは、Cas9タンパク質をゲノム内の特定の核酸配列に標的化するための1つ以上のgRNAをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、発現ベクターは、ウイルスベクターであってもよい。
【００９６】
特定の実施形態において、1つ以上のgRNAは、融合遺伝子内の標的配列とハイブリダイズすることができる。例えば、限定されるものではないが、1つ以上のgRNAは、融合遺伝子の染色体切断点を標的化する、および/または染色体切断点領域に隣接する1つ以上の配列を標的化することができる。融合遺伝子染色体切断点の配列の非限定例は、本明細書および図面の中に開示される(例えば、表1を参照されたい)。特定の実施形態において、一方のgRNAは、融合遺伝子の1つの遺伝子内の領域と相補的であってよく、別のgRNAは、融合遺伝子の他方の遺伝子内の領域と相補的であってよい。例えば、限定されるものではないが、一方のgRNAは、TMEM135-CCDC67融合遺伝子のTMEM135遺伝子内の領域と相補的であってよく、別のgRNAは、CCDC67遺伝子内の領域と相補的であってよい。特定の実施形態において、一方のgRNAは、MAN2A1-FER融合遺伝子のMAN2A1遺伝子内の領域と相補的であってよく、別のgRNAは、FER遺伝子内の領域と相補的であってよい。特定の実施形態において、一方のgRNAは、PTEN-NOLC1融合遺伝子のPTEN遺伝子内の領域と相補的であってよく、別のgRNAは、NOLC1遺伝子内の領域と相補的であってよい。特定の実施形態において、一方のgRNAは、融合遺伝子の染色体切断点の上流の領域と相補的であってよく、別のgRNAは、染色体切断点の下流の領域と相補的であってよい。特定の実施形態において、ゲノム配列決定を行って、gRNAによって標的化され得る融合遺伝子の領域を決定することができる。特定の実施形態において、gRNAによって標的化される遺伝子の領域は、イントロンおよび/またはエクソンであってよい。
【００９７】
特定の実施形態において、Casタンパク質、例えば、Cas9をコードする核酸配列を、調節エレメントに機能し得る形で連結することができ、転写された場合、1つ以上のgRNAは、Casタンパク質を、ゲノム中の標的配列に指向させ、Casタンパク質によるゲノム遺伝子座の切断を誘導することができる。特定の実施形態において、Cas9タンパク質は、標的配列に隣接して存在するPAM配列の上流の約3〜4ヌクレオチドを切断する。特定の実施形態において、Casタンパク質をコードする核酸配列に機能し得る形で連結された調節エレメントは、プロモーター、例えば、誘導性プロモーター、例えば、ドキシサイクリン誘導性プロモーターであってもよい。例えば、発現ベクター中の、DNA配列に適用される場合、用語「機能し得る形で連結された」は、配列が協働的に機能して、その意図される目的を達成するように配置されることを示す、すなわち、プロモーター配列は、連結されたコード配列から終結シグナルまで進行する転写の開始を可能にする。
【００９８】
特定の実施形態において、本発明のベクターによってコードされるCas9酵素は、1つ以上の変異を含んでもよい。変異は、人工的に導入された変異または機能獲得もしくは機能喪失変異であってもよい。そのような変異の非限定例としては、Cas9タンパク質の触媒ドメイン、例えば、RuvCおよびHNH触媒ドメインにおける変異、例えば、RuvC触媒ドメイン内のD10変異およびHNH触媒ドメイン中のH840が挙げられる。特定の実施形態において、Cas9タンパク質の触媒ドメインの1つにおける変異は、変異したCas9タンパク質が標的DNAの一方の鎖のみを切断し、一本鎖切断または「ニック」を作出する、「ニッカーゼ」として機能するCas9タンパク質をもたらす。特定の実施形態において、変異したCas9タンパク質、例えば、Cas9D10Aの使用は、標的DNAの両方の鎖の切断を促進するための2つのgRNAの使用を可能にする。Cas9変異のさらなる非限定例としては、VP64、KRABおよびSID4X、FLAG、EGFPおよびRFPが挙げられる。特定の実施形態において、本開示のゲノム編集技術は、1個以上の細胞中に、発現された場合に、1個以上の細胞の死滅、例えば、アポトーシスをもたらす核酸を含むさらなるベクターを導入することをさらに含んでもよい。特定の実施形態において、このベクターは、相同組換えを起こさせ、核酸配列(すなわち、ドナー核酸配列)のゲノム中への挿入を可能にする、gRNAによって標的化されるゲノム配列と相補的である(例えば、ハイブリダイズすることができる)および/またはそれに隣接する1つ以上のターゲティング配列をさらに含んでもよい。特定の実施形態において、さらなるベクターは、融合遺伝子を作り上げる遺伝子のエクソン/イントロン連結部の1つ以上のスプライスタグ配列をさらに含んでもよい。特定の実施形態において、ターゲティング配列は、融合遺伝子の遺伝子内のイントロン、エクソン配列および/またはイントロン/エクソンスプライシング配列と相補的であってよい。特定の実施形態において、1つのターゲティング配列は、gRNAによって標的化される融合遺伝子の一方の遺伝子内の領域と相補的であってよく、第2のターゲティング配列は、融合遺伝子の他方の遺伝子内の領域と相補的であってよく、ドナー核酸を含むベクターと、Cas9タンパク質によって切断されるゲノム配列との相同組換えを可能にする。例えば、限定されるものではないが、1つのターゲティング配列は、TMEM135-CCDC67融合遺伝子のTMEM135遺伝子内の領域と相補的であってよく、別のターゲティング配列は、CCDC67遺伝子内の領域と相補的であってよい。特定の実施形態において、1つのターゲティング配列は、MAN2A1-FER融合遺伝子のMAN2A1遺伝子内の領域と相補的であってよく、別のターゲティング配列は、FER遺伝子内の領域と相補的であってもよい。特定の実施形態において、1つのターゲティング配列は、PTEN-NOLC1融合遺伝子のPTEN遺伝子内の領域と相補的であってよく、別のターゲティング配列は、NOLC1遺伝子内の領域と相補的であってよい。特定の実施形態において、1つのターゲティング配列は、Cas9タンパク質によって生成される切断部位の上流の領域と相補的であってよく、別のターゲティング配列は、染色体切断点の下流の領域と相補的であってよい。ゲノム中に挿入することができる核酸配列の型の非限定例は、上に開示されている。特定の実施形態において��ゲノム中に挿入される核酸は、HSV-1チミジンキナーゼをコードする。細胞死を誘導するために融合遺伝子を担持する細胞のゲノム中に挿入することができる核酸および/または遺伝子のさらなる非限定例は、上記されている。
【００９９】
本開示における使用のためのベクターは、当業界で公知の任意のベクターであってもよい。例えば、限定されるものではないが、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルスベクターおよび酵母人工染色体に由来するものであってもよい。特定の実施形態において、ベクターは、いくつかの供給源に由来するDNA配列を含有する組換え分子であってもよい。特定の実施形態において、ベクターは、限定されるものではないが、プロモーター、転写ターミネーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位、非翻訳領域、ポリアデニル化シグナル、選択マーカー、複製起点などのさらなる断片を含んでもよい。特定の実施形態において、ベクターを、エレクトロポレーション、トランスフェクションおよび形質導入などの当業界で公知の任意の技術によって1個以上の細胞中に導入することができる。特定の実施形態において、ベクターを、アデノウイルス形質導入によって導入することができる。
【０１００】
【表２】
2020510623.tif 000005
2020510623.tif 000006
2020510623.tif 000007
【０１０１】
5.5.1 特定の非限定例
特定の実施形態において、本発明のゲノム編集技術は、対象の1個以上の細胞、例えば、がん細胞中に、(i)Cas9タンパク質、またはその変異体をコードする核酸配列を含むベクター；(ii)発現された場合に、融合遺伝子内のCas9媒介性DNA切断を誘導する、融合遺伝子の1つ以上の標的配列と相補的である1つ以上のgRNAを含むベクター；ならびに(iii)発現された場合に、細胞死をもたらすドナー核酸配列と、相同組換えおよび融合遺伝子へのドナー核酸配列の挿入を促進するための融合遺伝子の1つ以上の配列と相補的である1つ以上の標的配列とを含むベクターを導入することを含む。特定の実施形態において、がん細胞は、前立腺がん細胞ではない。
【０１０２】
特定の実施形態において、本発明のゲノム編集技術は、対象の1個以上の細胞中に、(i)Cas9タンパク質、またはその変異体(例えば、Cas9D10A)をコードする核酸配列と、転写された場合、1つ以上のgRNAが、1つ以上のCas9タンパク質の、融合遺伝子の1つ以上の標的配列への配列特異的結合を指令して、融合遺伝子の切断を促進する、融合遺伝子の1つ以上の標的配列と相補的である1つ以上のgRNAとを含むベクター；ならびに(ii)発現された場合に、細胞死をもたらすドナー核酸配列と、相同組換えおよび融合遺伝子へのドナー核酸配列の挿入を促進するための融合遺伝子の1つ以上の配列と相補的である1つ以上の標的配列とを含むベクターを導入することを含む。特定の実施形態において、1つ以上のターゲティング配列は、融合遺伝子の染色体切断点および/または染色体切断点領域に隣接する1つ以上の配列またはその組合せを含んでもよい。例えば、限定されるものではないが、標的配列は、融合遺伝子の切断点配列の少なくとも一部と、融合遺伝子を含む1つの遺伝子の配列の少なくとも一部とを含んでもよい。
【０１０３】
特定の実施形態において、本発明のゲノム編集技術は、対象の1個以上の細胞中に、(i)Cas9タンパク質、またはその変異体をコードする核酸配列と、転写された場合、1つ以上のgRNAが、Cas9タンパク質の、融合遺伝子の1つ以上の標的配列への配列特異的結合を指令して、融合遺伝子の切断を促進する、融合遺伝子の1つ以上の標的配列と相補的である1つ以上のgRNAとを含むベクター；ならびに(ii)HSV-1チミジンキナーゼをコードするドナー核酸配列と、相同組換えおよび融合遺伝子へのHSV-1チミジンキナーゼをコードするドナー核酸配列の挿入を促進するための融合遺伝子の1つ以上の配列と相補的である1つ以上の標的配列とを含むベクターを導入することを含む。特定の実施形態において、ゲノム編集技術は、治療有効量のガンシクロビルおよび/またはバルガンシクロビルの投与をさらに含む。
【０１０４】
5.6 キット
本発明は、本明細書に開示される1つ以上の融合遺伝子を担持する対象を処置するため、および/または上に列挙された検出および治療方法のいずれか1つを実行するためのキットをさらに提供する。特定の実施形態において、本開示は、本明細書に開示される1つ以上の融合遺伝子を担持する対象内の1個以上のがん細胞に対して標的ゲノム編集技術を実施するためのキットを提供する。特定の実施形態において、1個以上のがん細胞は、前立腺がん細胞ではない。
【０１０５】
キットの種類としては、限定されるものではないが、1つ以上の融合遺伝子を検出するための1つ以上のプローブ、プライマー、もしくは他の試薬をさらに含有する、および/またはゲノム編集技術を実施するための手段を含んでもよい、包装された融合遺伝子特異的プローブおよびプライマーセット(例えば、TaqManプローブ/プライマーセット)、アレイ/マイクロアレイ、抗体が挙げられる。
【０１０６】
特定の実施形態において、キットは、本明細書に開示されるゲノム編集技術を実施するための手段を含んでもよい。例えば、限定されるものではないが、本開示のキットは、Casタンパク質またはその変異体、例えば、Cas9D10Aをコードする核酸を含む1つ以上のベクターまたはプラスミドを含む容器を含んでもよい。特定の実施形態において、Casタンパク質をコードする核酸を、プロモーターなどの調節エレメントに機能し得る形で連結することができる。特定の実施形態において、1つ以上のベクターは、融合遺伝子に特異的な、例えば、融合遺伝子の切断点および/または融合遺伝子の切断点に隣接する配列に特異的な1つ以上のgRNAをさらに含んでもよい。
【０１０７】
特定の実施形態において、本発明のキットは、場合により、Casタンパク質をコードする核酸を含むベクターと同じ容器中に、または別の容器中に、発現された場合(化合物の存在下または非存在下で)、細胞死をもたらす核酸を含む1つ以上のベクターまたはプラスミドを含んでもよい。例えば、限定されるものではないが、核酸配列は、単純ヘルペスウイルス1(HSV-1)チミジンキナーゼ、Pseudomonas aeruginosaに由来する外毒素A、Corynebacterium diphtheriに由来するジフテリア毒素、Ricinus communi(ヒマシ油植物)に由来するリシンもしくはアブリン、細菌もしくは酵母に由来するシトシンデアミナーゼ、カルボキシルエステラーゼまたは水痘帯状疱疹ウイルス(VZV)チミジンキナーゼをコードしてもよい。特定の実施形態において、このベクターはさらに、相同組換えおよびドナー核酸の挿入を促進するために融合遺伝子内の配列と相補的である1つ以上のターゲティング配列をさらに含んでもよい。
【０１０８】
ドナー核酸がHSV-1チミジンキナーゼをコードする、特定の実施形態において、キットは、ガンシクロビルおよび/またはバルガンシクロビルをさらに含んでもよい。
【０１０９】
特定の非限定的な実施形態において、本開示のキットは、上に列挙された方法のいずれかの実行における使用のための1つ以上の核酸プライマーまたはプローブおよび/または抗体プローブをさらに含んでもよい。前記プローブを、例えば、ビオチン、比色、蛍光または放射性マーカーを用いて、検出可能に標識することができる。核酸プライマーを、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応における使用のために、対の一部として提供することができる。特定の非限定的な実施形態において、核酸プライマーは、少なくとも約10ヌクレオチド長もしくは少なくとも約15ヌクレオチド長もしくは少なくとも約20ヌクレオチド長および/または最大約200ヌクレオチド長もしくは最大約150ヌクレオチド長もしくは最大約100ヌクレオチド長もしくは最大約75ヌクレオチド長もしくは最大約50ヌクレオチド長であってもよい。核酸プローブは、オリゴヌクレオチドプローブおよび/またはFISH分析にとって好適なプローブであってもよい。特定の非限定的な実施形態においては、キットは、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1およびPCMTD1-SNTG1のうちの少なくとも2種、少なくとも3種、少なくとも4種、少なくとも5種、6種、7種、8種、9種、10種、11種、12種、13種、14種の分析のためのプライマーおよび/またはプローブを含む。特定の実施形態において、キットは、TMEM135-CCDC67、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1およびCCNH-C5orf30の分析のためのプライマーを含む。
【０１１０】
特定の非限定的な実施形態において、核酸プライマーおよび/またはプローブを、固相表面または支持体に結合した各プライマーおよび/またはプローブの位置が既知であり、同定可能である、固相表面、基質または支持体、例えば、核酸マイクロアレイ上に固定することができる。核酸プライマーおよび/またはプローブを、ガラス、プラスチック、紙、ナイロンもしくは他の型の膜、フィルター、チップ、ビーズ、または他の任意の好適な固相支持体などの基質に固定することができる。核酸プライマーおよび/またはプローブを、基質上で直接合成するか、または基質とは別々に合成した後、基質に固定することができる。アレイを、公知の方法を用いて調製することができる。
【０１１１】
非限定的な実施形態においては、キットは、対象から得られた試料中の1個以上の融合遺伝子の存在を決定するためのFISH分析のための核酸プローブを提供する。特定の実施形態において、1個以上の融合遺伝子は、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、CCNH-C5orf30、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、MTOR-TP53BP1、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1、PCMTD1-SNTG1およびその組合せからなる群から選択される。非限定的な実施形態においては、キットは、1個以上の融合遺伝子のFISH分析のための核酸プローブを提供する。特定の実施形態において、1個以上の融合遺伝子は、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、PTEN-NOLC1およびCCNH-C5orf30、およびTRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、MTOR-TP53BP1またはその組合せを含んでもよい。特定の非限定的な実施形態においては、別々のプローブがそれぞれ融合遺伝子の2つの成分に結合するか、またはプローブがスプライスされる遺伝子間の境界を包含する「連結部（ジャンクション）」に結合することができるような、融合遺伝子を検出するためのプローブを提供することができる。例えば、限定されるものではないが、連結部は、2個の遺伝子が一緒に連結される領域である。特定の非限定的な実施形態においては、キットは、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1またはPCMTD1-SNTG1の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個または5個全部の分析のための前記プローブを含む。
【０１１２】
非限定的な実施形態においては、キットは、対象から得られた試料中の1個以上の融合遺伝子の存在を決定するためのPCR分析のための核酸プライマーを提供する。特定の実施形態において、1個以上の融合遺伝子は、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、MTOR-TP53BP1およびその組合せからなる群から選択される。非限定的な実施形態においては、キットは、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1またはPCMTD1-SNTG1からなる群から選択される1個以上の融合遺伝子のPCR分析のための核酸プライマーを提供する。特定の非限定的な実施形態においては、キットは、TRMT11-GRIK2、SLC45A2-AMACR、MTOR-TP53BP1、LRRC59-FLJ60017、TMEM135-CCDC67、KDM4B-AC011523.2、MAN2A1-FER、PTEN-NOLC1、CCNH-C5orf30、ZMPSTE24-ZMYM4、CLTC-ETV1、ACPP-SEC13、DOCK7-OLR1およびPCMTD1-SNTG1の少なくとも2個、少なくとも3個、少なくとも4個、少なくとも5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個の分析のための前記プライマーを含む。
【０１１３】
以下の実施例は、本開示をより完全に例示するために提供されるものであるが、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
(実施例)
【実施例１】
【０１１４】
6. 実施例1：融合遺伝子の染色体切断点でのゲノム療法ターゲティングは異種移植されたヒトがんの寛解をもたらした
6.1 序論
本実施例においては、ゲノム介入手法を開発して、ゲノム再配置の結果生じるユニークな配列に基づいてがん細胞を殺傷した。MAN2A1-FERおよびTMEM135-CCDC67融合遺伝子に由来する染色体切断点を、治療標的として活用した。MAN2A1-FERおよびTMEM135-CCDC67融合遺伝子は、前立腺がんに存在することが以前に決定されている(その内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるWO2016/011428を参照されたい)。さらに、MAN2A1-FER融合遺伝子は、多形膠芽腫、非小細胞肺がん、卵巣がん、食道腺癌および肝臓がんに、2〜25.9%の範囲のパーセンテージで存在することが示されている。MAN2A1-FER融合遺伝子は、非小細胞肺がんの16.8%、肝臓がんの15.7%、GBMの7.1%、食道腺癌の25.9%、前立腺がんの5.2%および卵巣がんの1.7%に存在することが示されている。
【０１１５】
クラスター化され規則的に間隔を有するショートパリンドロームリピート(CRISPR)/CRISPR関連(Cas)は、原核細胞における外来病原体に対する免疫防御機構の1つとして元々発見された2。II型のCRISPR/Casシステム(系)の重要なタンパク質であるCas9は、DNA切断活性を含有することがわかった。Cas9のヌクレアーゼ活性は、CRISPR RNAおよびトランス活性化CRISPR RNAから標的DNAまでの20塩基の相補配列によって誘導された3。トランス活性化CRISPR RNAおよびCRISPR RNAは両方のRNA種の完全な機能を含有するキメラRNAに作製することができるため、ガイドRNA(gRNA)を人工融合RNAのために作った4。Cas9の触媒ドメイン中のD10A変異は、それを、標的DNAにおいて単一のヌクレオチド切断を生じるニッカーゼに変換する4。ゲノムDNAをニッキングすることは、細胞性相同組換え修復(HDR)経路を用いることにより、配列を特定のゲノム遺伝子座に正確に導入することに用いることができる。標的DNAの近くに2個のニックを導入すること(ダブルニッキング)により、配列の導入効率が、天然の相同組換え率よりも50〜1,500倍増大し5、そのときのオフターゲット率は1/10,000である。そのような特異性は、体細胞ゲノムターゲティングを、ヒト疾患、特に、正常細胞中には存在しない融合遺伝子を担持する新生物の処置における実行可能な手法にする。
【０１１６】
単純ヘルペスウイルス1チミジンキナーゼ(HSV1-tk)は、チミジンをリン酸化し、DNA合成のための構成要素である、チミジン一リン酸を形成する。しかしながら、HSV1-tkの基質特異性は、哺乳動物チミジンキナーゼによって認識されない、合成ヌクレオシド相同体であるガンシクロビル(プロドラッグ)7をリン酸化するという点で、その哺乳動物対応物のものとは異なる。このリン酸化は、ガンシクロビルによる処理後にHSV1-tkを発現する哺乳動物細胞中でのガンシクロビル一リン酸の蓄積をもたらす。ガンシクロビル一リン酸は、2つの他のキナーゼによりその三リン酸型に変換される8。ガンシクロビル三リン酸は、伸長終結を介してDNA合成を遮断する。対照的に、HSV1-tkについて陰性の哺乳動物細胞は、ガンシクロビルをリン酸化することができないことのため、この効果から免疫される。
【０１１７】
本実施例においては、本発明者らは、Cas9D10A媒介性ゲノム編集を用いることにより、本発明者らは、融合遺伝子MAN2A1-FERの染色体切断点にHSV1-tkを成功裏に挿入したことを示す。ガンシクロビルを用いたこの染色体切断点を担持する腫瘍の処置は、細胞培養物中での細胞死ならびに重症複合免疫不全(SCID)マウスにおける異種移植された前立腺がんおよび肝臓がんの寛解をもたらした。
【０１１８】
6.2 材料および方法
材料およびベクター構築。PC3(前立腺がん)、Du145(前立腺がん)ならびに肝細胞癌細胞系、HUH7およびHEP3B細胞を、American Type Cell Culture (Manassas、VA)から購入した。PC3細胞を、10%ウシ胎仔血清(InVitrogen、Carlsbad、CA)を添加したF12K培地を用いて培養した。Du145細胞を、10%ウシ胎仔血清(Invitrogen)を添加した改変Eagle培地を用いて培養した。HEP3B細胞を、10%ウシ胎仔血清(Invitrogen)を添加した改変Eagle培地を用いて培養した。HUH7細胞を、10%ウシ胎仔血清を添加したDulbeccoの改変Eagle培地を用いて培養した。これらの細胞系のゲノムを、以下のプライマーセット：
CSF1PO: AACCTGAGTCTGCCAAGGACTAGC (配列番号78)/TTCCACACACCACTGG CCATCTTC (配列番号79);
D13S317: ACAGAAGTCTGGGATGTGGA (配列番号80)/ GCCCAAAAAGACAGACAGAA (配列番号81),
D16S539: GATCCCAAGCTCTTCCTCTT (配列番号82)/ACGTTTGTGTGTGCATCTGT (配列番号83);
D5S818: GGGTGATTTTCCTCTTTGGT (配列番号84)/TGATTCCAATCATAGCCACA (配列番号85);
D7S820: TGTCATAGTTTAGAACGAACTAACG (配列番号86)/ CTGAGGTATCAAAAACTC AGAGG (配列番号87);
TH01: GTGGGCTGAAAAGCTCCCGATTAT (配列番号88)/ ATTCAAAGGGTATCTGGGCTCTGG (配列番号89);
TPOX: ACTGGCACAGAACAGGCACTTAGG (配列番号90)/ GGAGGAACTGGGAACCACACAGGT (配列番号91); 
vWA: CCCTAGTGGATGATAAGAATAATCAGTATG (配列番号92)/ GGACAGATGATAAATACATAGGATGGATGG (配列番号93)
を用いるPCRにより、ゲノムの8個の異なる遺伝子座(CSF1PO、D13S317、D16S539、D5S818、D7S820、THO1、TPOX、およびvWA)上の短縦列反復(STR)DNAプロファイルについて試験した。
【０１１９】
これらの細胞系のSTRプロファイルはATCCにより公開されたものと完全に一致したため、これらの細胞系が本物であることが証明された。ウサギポリクローナル抗Cas9抗体を、Clontech Inc.,CAから購入した。ウサギ抗HSV-1 TKポリクローナル抗体を、Sigma Inc., OHから購入した。
【０１２０】
ベクターの構築。gRNA発現ベクターを構築するために、TMEM135-CCDC67の切断点領域に隣接する配列を分析し、DNA 2.0ツール：https://www.dna20.com/eCommerce/cas9/inputを用いてgRNAを設計した。gRNA-とgRNA+の両方を、Cas9D10Aも含有するAll-in-One NICKASRNINJA(登録商標)ベクター中にライゲートした。次いで、XbaIを用いる制限処理によって挿入物を遊離させ、同様に制限処理されたVQAd5シャトルベクター中にライゲートして、VQAd5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9を作出した。次いで、以前に記載された方法(14)を用いて、組換えシャトルベクターを、pAD5ウイルスを用いて組み換えて、pAD5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9を生成した。
【０１２１】
ドナーDNA組換えウイルスを構築するために、以下のプライマー：GTACTCACGTAAGCTTTCGCCACCATGGTGAGCAAGG (配列番号94); およびGACTCAGATGGGCGCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCC (配列番号95)
を用いて、pEGFP-N1に対してPCRを実施した。PCR産物を、KasIおよびHindIIIで制限処理し、同様に制限処理されたpSELECT-zeo-HSV1tkベクター中にライゲートして、pEGFP-HSV1-tkを作出した。
【０１２２】
以下のプライマー：GACTCAGATGGCGGCCGCCTGTATTCTTTGTTTTACAGATTTGCTGTCAGGGGTTAGATAGCTTGCCAG (配列番号96)/ GTACTCACGTAAGCTTGAGCTAACATTACCAATGAGGC (配列番号97)
を用いて、TMEM135-CCDC67融合物がTMEM135のイントロン13配列を得ることが発見された試料に由来するゲノムDNAに対してPCRを実施した。次いで、PCR産物をNotIおよびHindIIIで制限処理し、同様に制限処理されたpEGFPtkベクター中にライゲートして、pTMEM135int13-EGFP-tkを作出した。続いて、以下のプライマー：GACTCAGATGGCTAGCAGTTCACTGAGTGTGCCATGC (配列番号98) / GTACTCACGTGAATTCCTATTCTGCCTGCTTGCATACCTTTTGTTTTGGTTGCA GTATAGTGGGCTGAG (配列番号99)を用いて、TMEM135-CCDC67融合物がCCDC67のイントロン9配列を得ることが発見された試料に由来するゲノムDNAに対してPCRを実施した。次いで、PCRをNheIおよびEcoRIで制限処理し、同様に制限処理されたpTMEM135int13-EGFP-tkベクター中にライゲートして、pTMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9を作出した。次いで、ベクターをEcoRIおよびNotIで制限処理し、同様に制限処理されたpAdlox中にライゲートして、pAdlox- pTMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9を作出した。次いで、組換えシャトルベクターをアデノウイルスで組み換えて、pAd-TMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9を作出した。pCMV-TMEM135-CCDC67bpベクターの構築のために、以下のプライマー：GACTCAGATGAAGCTTAAGAGCATGGGCTTTGGAGTC (配列番号100)/ GTACTCACGTTCTAGACTGGAATCTAGGACTCTTGGC (配列番号101)を用いて、TMEM135-CCDC67融合物について陽性である前立腺がん試料に由来するゲノムDNAに対してPCRを実施した。次いで、PCR産物を配列決定して、TMEM135-CCDC67切断点の存在を確認した。PCR産物をHindIIIおよびXbaIで消化し、同様に消化されたpCMVscriptベクター中にライゲートした。続いて、構築物を、lipofectamine 3000を用いて、PC3およびDU145細胞中にトランスフェクトした。TMEM135-CCDC67切断点転写物を安定に発現する細胞を、G418(200μg/ml)を含有する培地中でのトランスフェクト細胞のインキュベーションによって選択した。
【０１２３】
pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14の構築、次いで、上記のTMEM135-CCDC67融合遺伝子を標的化するためのgRNAを構築する類似の手順に沿ったものであった。pAdlox-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14の構築のために、以下のプライマー：GACTCAGATGGCGGCCGCGAACATCAGAACTGGGAGAGG (配列番号102)/GTACTCACGTAAGCTTCAGGAGAATCACTTGAACCCG (配列番号103)を用いて、HUH7細胞に由来する1μgのゲノムDNAに対して延長ロングPCRを実施した。次いで、PCR産物をHindIIIおよびNotIで消化し、同様に消化されたpEGFP-tkベクター中にライゲートして、pMAN2A1int13-EGFP-tkを作出した。MAN2A1イントロン13/エクソン14のスプライシングアクセプター部位に対応する合成配列(TAATGTTGGTTTTACCAAAAATATAAATGGTTTGCCTCTCAGTAGATAACATTTATCTTTAATAAATTCCCTTCCCTATCTTTTAAAGATCTCTTTTCGAGCACATAT (配列番号104)/TAATATGTGCTCGAAAAGAGATCTTTAAAAGATAGGGAAGGGAATTTATTAAAGATAAATGTTATCTACTGAGAGGCAAACCATTTATATTTTTGGTAAAACCAACAT(配列番号105))を、ASE1で制限処理されたpMAN2A1int13-EGFP-tk中にライゲートした。別に、プライマーGACTCAGATGGAATTCAAGGTGGAACACAGAAGGAGG(配列番号121)/GTACTCACGTGAATTCGATTACTTTAAATAACTCACTTGGCTTCTTGCAGAGGTAGAGCTGAGAGAAG (配列番号122)を用いてHUH7ゲノムDNAに対してPCRを実施して、FERのエクソン15/イントロン15に対応する31bpのスプライスドナー部位配列を含むFERのイントロン14に対応する1984bpの配列を生成した。次いで、PCRをEcoRIで制限処理し、同様に制限処理されたpMAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14中にライゲートして、pMAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14を作出した。次いで、ベクターをNotIで制限処理し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した。次いで、産物をXmaIで制限処理した。別に、pAdloxベクターをHindIIIで制限処理し、T4 DNAポリメラーゼで平滑末端化した。産物をXmaIで制限処理し、pMAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14の消化産物とライゲートした。次いで、組換えシャトルベクターをアデノウイルスと組み換えて、pAd-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14を作出した。
【０１２４】
in vitroでのCas9標的切断アッセイ。gRNA DNA配列と、+または-DNA鎖のための足場DNA配列とを、以下のプライマー：MAN2A1-FERのgRNA+鋳型についてはGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTAGCATTAAGGGCCCCCTAAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG (配列番号108)、およびMAN2A1-FERのgRNA-鋳型についてはGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGATAGCTAGAAGGTGGATCACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG (配列番号109)を用いてオールインワンベクターから増幅した。PCR産物を、Ambion, CAからのin vitro転写キットを用いてin vitroで転写して、gRNA+およびgRNA-産物を得た。切断アッセイを25℃で10min実施した後、以下の条件：1x Cas9ヌクレアーゼ反応バッファー、30nM gRNA 3nM DNA鋳型および30nM Cas9ヌクレアーゼ、S.pyogenesの下、37℃で1時間実施した。切断されたDNAを、1%アガロースゲル電気泳動中で可視化した。
【０１２５】
アポトーシス細胞の蛍光活性化細胞選別(FACS)分析。このアッセイは以前に記載されたものである(8、9)。簡単に述べると、pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14/pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14および様々な濃度のガンシクロビルで処理された細胞をトリプシン処理し、冷PBSで2回洗浄した。次いで、細胞を100μlのアネキシン結合バッファー(Invitrogen)中に再懸濁し、5μlのフィコエリトリン(PE)コンジュゲート化アネキシンVおよび1μlの100μg/mlヨウ化プロピジウムと共に暗室中、室温で15minインキュベートした。400μlの冷アネキシン結合バッファーの添加によって結合アッセイを終結させた。FACS分析を、BD-LSR-IIフローサイトメーター(BD Science, San Jose, CA)を用いて実施した。蛍光染色された細胞を、533nm(FL2)での蛍光放出で分析した。陰性対照として、インキュベーション培地中にPEもPIも含まない細胞を用いて、獲得のためのバックグラウンドを設定した。UV処理された細胞を、アポトーシスのための陽性対照として用いた。それぞれの獲得のために、10,000〜20,000個の細胞を分析し、細胞の蛍光色に基づいて選別した。HUH7およびHEP3BのFACS分析のために、これらの細胞を、ウイルス感染と共に1μMのscr-7で処理して、ゲノム編集効率を改善した(10)ことを除いて、同様の手順を実施した。
【０１２６】
腫瘍増殖および自発的転移。異種移植手順は以前に記載されたものである(11、12)。HUH7およびHEP3B異種移植腫瘍処置のために、がんの急速な増殖のため、腫瘍異種移植後2週間で処置を開始したことを除いて、WO2016/011428の実施例7に以前に記載されたように同様の手順を適用した。処置群の概要は、以下の通りである：HUH7細胞を異種移植した5匹のマウスを、pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14/pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14およびガンシクロビルで処置した；HUH7細胞を異種移植した5匹のマウスを、pAD5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9/pAD-TMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9およびガンシクロビル(対照)で処置した；HUH7細胞を異種移植した5匹のマウスを、pAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14/pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14およびPBS(対照)で処置した；HEP3B細胞を異種移植した5匹のマウスを、pAD5-Cas9D10AgRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14/pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14およびガンシクロビル(対照)で処置した。全ての動物を、ウイルスと共にscr-7(10mg/kg)で処置した。全ての動物手順は、University of Pittsburgh Institutional Animal Care and Use Committeeによって認可されたものである。
【０１２７】
免疫組織化学分析。HSV-1 TK(1:100希釈率)またはCas9(1:100希釈率)に特異的な抗体を用いて以前に記載されたように(6)、免疫組織化学分析を実施した。陰性対照では抗体を省略した。次いで、切片を西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート抗ウサギIgGと共に、室温で30分間インキュベートした(Vector Labs, IncからのABCキット)。次いで、スライドを3,3'-ジアミノベンジジン溶液に曝露して、免疫染色を可視化した。スライドを1%ヘマトキシリン溶液中で、室温で2分間インキュベートすることによって、対抗染色を実施した。次いで、スライドを蒸留水中で簡単に洗浄して、過剰の染料を除去した。TUNELアッセイの手順は、以前に記載されたもの(13)と同様である。
【０１２８】
6.3 結果
前立腺がんにおいて発見された、ある頻発性融合遺伝子は、膜貫通タンパク質135(TMEM135)をコードする遺伝子と、コイルドコイルドメイン含有67(CCDC67)との間に位置する、すなわち、TMEM135-CCDC67である6、16。融合遺伝子は、染色体11q14.2-21の領域における6Mbの欠失によって作出される。この欠失は、第11染色体中のTMEM135のイントロン13と、CCDC67のイントロン9とを連結し(図13A)、正常組織には存在しないユニークな配列切断点を作出し、かくして、治療的介入のためのがん細胞におけるユニークな標的を提供する。
【０１２９】
この連結配列を標的化するために、それぞれ、反対の鎖上の染色体切断点に隣接する領域の1つと相補的である2個のsgRNAを設計した(図13B)。これらのガイドRNA(gRNA)およびCas9D10A配列をVQAd5-CMVシャトルベクター中にライゲートし、pAD5アデノウイルス中に組み換えて、pAD5-Cas9D10A-gRNATMEM135int13-gRNACCDC67int9を作出した。標的がん細胞のための潜在的な致死遺伝子を提供するために、HSV-1tkのcDNAを、読み枠を合わせてEGFP cDNAとライゲートし、かくして、キメラ遺伝子EGFP-tkを得た。キメラcDNAはプロモーターを含まなかったが、完全なオープンリーディングフレームと、独立した翻訳開始のためのリボソーム結合部位とを含有していた。HDR経路と係合する相同配列を提供するために、次いで、構築物を、5'末端でTMEM135のイントロン13配列の584bpおよび3'末端でCCDC67のイントロン9配列の561bpとライゲートした。続いて、これらの配列をPAdloxシャトルベクター中にライゲートし、アデノウイルス中で組み換えて、かくして、pAD-TMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9を得た(図13C)。TMEM135int13-EGFP-tk-CCDC67int9の組込み、EGFP-tkの発現およびアポトーシスを、TMEM135-CCDC67切断点を含有するPC3またはDU145細胞中で検出し、組み換えウイルスで処理した(図31)。前立腺がんにおけるTMEM135-CCDC67の遺伝子ターゲティングは、WO2016/011428に開示されており、その内容は全体が参照により本明細書に開示されるものとする(WO2016/011428の図30、31および32、ならびに添付の本文を参照されたい)。
【０１３０】
さらなるがんを、融合遺伝子発現について分析した。ヒト肝細胞癌細胞系HUH7のスクリーニングにより、それが融合遺伝子の1つ、MAN2A1-FERを発現することが示された(図15AおよびB)。MAN2A1-FER mRNAとタンパク質が両方とも、この細胞系において検出された(図15AおよびB)。ゲノム切断点は、HUH7細胞においてはMAN2A1のイントロン13と、FERのイントロン14との間で同定された。キメラタンパク質は、FERに由来するインタクトなチロシンキナーゼドメインを保持するが、キナーゼ活性を調節するSH2ドメインを喪失する。天然の融合遺伝子切断点を有するがん細胞を標的とするゲノム療法の適用可能性を評価するために、本発明者らは、MAN2A1のイントロン13およびFERのイントロン14に特異的な一対のgRNAを設計した(図15A)。このgRNAおよびCas9D10Aをアデノウイルス中にパッケージングして、pAD5-Cas9D10AgRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14を作出した。この組換えウイルスを、ニック部位に隣接する配列(pAD-MAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14)を含有する「ドナー」組換えアデノウイルスと同時感染させた。この「ドナー」ウイルスはまた、EGFP-tkがMAN2A1-FERのmRNA中で中断されるように、それぞれ、MAN2A1のイントロン14のアクセプターと、FERのイントロン15のドナーとに対応するスプライシング配列を含有する。その結果、これらのウイルスに感染したHUH7細胞の最大で27%がEGFP-tkを発現する(図15DおよびE；図16A)が、MAN2A1-FER融合物について陰性である、HEP3B細胞の、これらのウイルスによる同様の感染は、最小限の蛍光タンパク質発現を誘導することが示された。TMEM135-CCDC67融合物について陰性であるHUH7細胞を、TMEM135-CCDC67切断点に特異的なアデノウイルスに感染させた場合、EGFP-tkの発現はわずかである(図15DおよびE；図16A)。これらの結果は、このゲノムターゲティング技術の特異性を確認するものである。
【０１３１】
【表３】
2020510623.tif 000008
【０１３２】
HUH7細胞をpAD5-Cas9D10A-gRNAMAN2A1int13-gRNAFERint14/pADMAN2A1int13-EGFP-tk-FERint14 (Ad-MF)に感染させ、様々な濃度のガンシクロビルで処理した場合、最大で27%の細胞が10μg/mlのガンシクロビルで死滅したが、同じウイルスに感染させたHEP3B細胞は、高濃度のガンシクロビルでも最小限の細胞死しか示さなかった(表3)。HUH7細胞をAd-TCに感染させ、ガンシクロビルで処理した場合、細胞死の感知できるほどの増加はなく、ガンシクロビルにより誘導される細胞死が、TMEM135-CCDC67切断点を含有するPC3 BPクローンおよびDU145 BPクローンと比較して、MAN2A1-FER切断点依存的であることを明確に示している(表3；図16B)。図14に示されるように、形質転換されたPC3細胞のクローンを、ゲノム中のβ-アクチンのものと比較したTMEM135-CCDC67切断点のコピー数について定量するように選択した。PC3 BPクローンを、ゲノムあたり1コピーのTMEM135-CCDC67切断点を含有すると見積もられ、β-アクチンに対するその比(約1:4、PC3細胞はβ-アクチンを含有する染色体領域について高倍数体である)に基づいて選択された(図14)15。また、TMEM135-CCDC67切断点を含有するDU145細胞(DU145 BP)に対して同様の選択を適用した。ガンシクロビルで処理したPC3 BPおよびDU145 BPクローンは、tunel染色によって観察されたように有意な細胞死を示した(図16B)。
【０１３３】
in vivoでMAN2A1-FERを標的とするゲノム療法の有効性を試験するために、SCIDマウスにHUH7およびHEP3B細胞を異種移植し、異種移植の2週間後に組換えウイルスおよびガンシクロビルで処置した(平均で約400mm3)。HUH7細胞を異種移植し、Ad-MFおよびガンシクロビルで処置したマウスは、ピークからの最大で29%の腫瘍サイズの減少を経験し、処置期間に顕著な転移も死亡も示さなかった。対照的に、ガンシクロビルおよびHUH7細胞によって担持されないTMEM135-CCDC67切断点に特異的なアデノウイルスであるAd-TCで処置したHUH7細胞を異種移植したマウスは、腫瘍サイズの73倍の増加を経験した。5匹のこれらのマウスのうちの4匹が肺および肝臓に転移を有していた。5匹全部のマウスが、異種移植の40日後に死亡した。同様の死亡率、転移および腫瘍体積の増加は、AD-MFおよびPBSで処置したマウスにおいても生じた。MAN2A1-FER融合物について陰性の肝細胞がん細胞系であるHEP3Bを異種移植したマウスの、Ad-MFおよびガンシクロビルによる処置は、同様に無効であった。これらの結果は、がんゲノムを標的とする療法が高度に特異的であり、有効であることを示している。
【０１３４】
さらに、本発明者らの手法は、高度に特異的であり、平均機能的オフターゲット率は、HEP3B細胞およびHUH7細胞(アデノ-MFで処理したEGFP-tk+細胞/Cas9D10A-RFP+細胞、表4)について1%未満である。これらのオフターゲット率を、定量的配列決定法によって大まかに確認した： in vitro組織培養実験に由来する試料、組換えウイルスで処置したマウスに由来する異種移植されたがんおよび肝臓試料を含む、1億リード中、オフターゲット率は0.1%未満から2.5%の範囲であった(表18〜21)。配列決定に基づく、in vitroでのオンターゲット組込み率は、15.9%〜25.5%の範囲であったが、異種移植された腫瘍に関する率は21.1%〜33.5%の範囲であった。異種移植された腫瘍におけるより高い組込み率は、おそらく組換えアデノウイルスの反復的適用を反映するものである。
【０１３５】
【表４】
2020510623.tif 000009
【０１３６】
【表５】
2020510623.tif 000010
【０１３７】
6.4 考察
含まれる遺伝子の機能に対する融合遺伝子の影響は、新しいタンパク質の作出またはタンパク質ドメインの大きいトランケーションの生成のため、劇的であり得る。例えば、特定の理論に限定されるものではないが、MAN2A1-FER融合遺伝子中のFERのSH2ドメインの除去は、FERチロシンキナーゼの構成的活性化をもたらし得ると考えられる。
【０１３８】
本発明者らのgRNA標的設計は、MAN2A1-FER切断点について37bp離れた異なる鎖での2個のニックをもたらす。これらのニックが二本鎖DNAの完全な切断を生成する可能性は低い。結果として、これらのDNA損傷は、非相同末端結合によるよりもむしろ、相同組換えプロセスによって修復される可能性が高い。本発明者らの結果は、CRISPR/Cas媒介性相同組換え率が20〜30%に達し得るいくつかの他の研究と一致している7。
【０１３９】
本発明者らの知識では、これは、そのような系を、がんゲノムを特異的に標的化するために適用することができ、異種移植されたがんの寛解を達成するのに十分な組換え率を有することを示す初めての報告である。ゲノム療法におけるEGFP-tkの正確な特異性および組込み率は、この手法を臨床設定に適用することができるようにする。ゲノム標的部位へのターゲティングカセットの組込み率を増強する将来の開発は、ゲノム療法の効率の増強において役立ち得る。注目すべきことに、アデノウイルスGFP-tkゲノムのドナー配列は、gRNA標的部位の外部にあり、かくして、ウイルスはgRNA-Cas9活性によって認識可能な標的配列を含有しない。2つのウイルス間の組換え率は、おそらく低い。300,000を超える組み込まれたEGFP-tkの配列決定リードにおいて(表20〜22)、本発明者らは、EGFP-tkとCas9との間の組換えを示すいかなるリードも見出さなかった。
【０１４０】
ヒトがんに対する現在の治療手法は、がん増殖を駆動するシグナル伝達経路の遮断に大きく依拠している。しかしながら、がんゲノムはその遺伝子発現パターンを調節し、シグナル伝達遮断を迂回する新しい変異によって、増殖を支援するための新しい経路を生じるため、そのような手法は、薬物耐性および薬物処置に対する抵抗性を必ず誘導する。二番手の化学療法のその後の適用は、がんと正常組織の両方に影響し、かくして、一般的には、治療転帰不良をもたらし得る。ゲノム手法は、がんゲノム配列にとって特異的であり、変異ががんを駆動するか否かに関係なくがん細胞を殺傷するため、化学療法を超える実質的な利点を有し得る。がん療法の圧力下では、さらなる新しい変異および融合遺伝子が生成される可能性がある。原理的には、これらのゲノム病変を標的化するためにさらなるベクターを設計することができ、これは細胞あたり複数の組込みのため、組込み率を増加させることさえできる可能性がある(表22)。そのような適応戦略が臨床において実現可能であるかどうかはまだ決定されていない。いくつかの異なる融合遺伝子標的を有するがん細胞の複数の集団を含むがんについては、これらの標的をゲノムターゲティングスキームによって同時に標的化することができる。さらに、本発明者らの手法は、治療カセットにおけるHSV-tkの使用に限定されず、むしろウイルスに由来する免疫原または植物もしくは細菌に由来する毒素などの、広範囲の遺伝子デバイスを使用することができる。腫瘍細胞殺傷に対するいくつかのプロドラッグの文書で十分に立証された「バイスタンダー」効果は、このゲノムターゲティング戦略の治療効果を増強することができる17。必要に応じて、ゲノムターゲティングを、腫瘍免疫療法またはシグナル伝達分子ターゲティングなどの他のがん治療処置と組み合わせて、より良好な治療結果を達成することができる。
【０１４１】
【表６】
2020510623.tif 000011
【０１４２】
【表７】
2020510623.tif 000012
【０１４３】
【表８】
2020510623.tif 000013
【０１４４】
【表９】
2020510623.tif 000014
【０１４５】
【表１０】
2020510623.tif 000015
【０１４６】
6.5 参考文献
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【実施例２】
【０１４７】
7. 実施例2：核PTEN-NOLC1融合物はヒトがんにおいて腫瘍原性である
7.1 序論
本実施例においては、ゲノム再配置の結果生じるユニークな配列に基づいてがん細胞を殺傷するためにゲノム介入手法を開発した。Pten-NOLC1融合遺伝子に由来する染色体切断点を、治療標的として活用した。Pten-NOLC1融合遺伝子は、前立腺がんに存在すると以前に決定されている(内容の全体が参照により本明細書に組み入れられるWO2016/011428を参照されたい)。
【０１４８】
ホスファターゼおよびテンシン相同体(Pten)(1、2)、PIP3のためのホスファターゼ(3、4)は、恒常性Akt/PI3Kシグナル伝達を維持し、細胞生存および増殖の重要な調節因子(5、6)である。Ptenのポリユビキチン化は、細胞質ゾルでのPtenの不活化をもたらすが、Ptenのモノユビキチン化は、タンパク質を核に移行させる(7、8)。核Ptenは、Rad51のDNA修復活性を調節し、染色体安定性を維持する(9)。Ptenの欠失は、ゲノム再配置と関連し得る(10)。Ptenの欠失または変異は、様々なヒト悪性腫瘍において報告されており、ヒトがん発生の最も重要な誘導事象の1つであると考えられる(11)。しかしながら、Ptenの唯一の調査されていないAkt/PI3Kシグナル伝達または核機能が、がん発生にとって十分であるかどうかは、依然として不明である。
【０１４９】
ここで、健康な個体に由来する20の臓器ドナーの前立腺試料、がんに隣接する3つの良性前立腺組織、および64の前立腺がんを含む87の前立腺試料上で、新規Pten関連融合タンパク質を特徴付け、高倍率(600〜1500x)のトランスクリプトーム配列決定分析によって同定した。融合物-キャッチャースクリーニングおよびマルチフィルタリングによって、96のがん特異的融合転写物を同定した(表6)。これらの融合遺伝子のうちの6つを、Sanger配列決定および蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH、図17〜19)によって検証した。これらの融合遺伝子の1つは、PtenおよびNOLC1を含む。腫瘍抑制遺伝子であるPten(1)は、核小体器官形成のための核小体およびコイル体ホスホタンパク質(13)であるNOLC1(12、13)と読み枠を合わせて融合して、Pten-NOLC1のキメラタンパク質を産生する。
【０１５０】
PTENの検出または変異は、様々なヒトがんにおいて頻繁であり、ヒトがん発生の原因となる機構の1つである。ここで、本発明者らは、ヒト悪性腫瘍におけるPtenと、核小体器官形成タンパク質NOLC1との融合タンパク質を報告する。
【０１５１】
Pten-NOLC1融合物は、8つの型のヒト悪性腫瘍において高度に頻発性である(66〜85%)。Pten-NOLC1間の遺伝子融合は、Ptenタンパク質のC2ドメインの喪失、および融合遺伝子産物の核への移行を誘導する。DU145およびMCF7細胞のPten-NOLC1ゲノム切断点の標的化された中断は、腫瘍細胞増殖を阻害し、S期への進入を遅延させ、細胞移動および浸潤を遅らせ、UV誘導性アポトーシスを起こす傾向があった。Pten-NOLC1のノックアウトは、SCIDマウスにおいて異種移植されたDU145腫瘍増殖を遮断したが、マウスへの水力学的注入によるPten-NOLC1の強制的発現は、肝細胞癌の発生をもたらした。C-Met/HGFRシグナル伝達の上方調節は、Pten-NOLC1誘導腫瘍において検出された。これらの結果は、Pten-NOLC1融合物が、機能の獲得をもたらし、腫瘍抑制遺伝子をがん遺伝子に変換することを示している。
【０１５２】
7.2 材料および方法
組織試料：試験において用いられた合計815の組織標本は、268の前立腺がん、10の一致した血液試料、20のドナー前立腺、102の非小細胞肺がん、61の卵巣がん、60の結腸がん、70の肝臓がん、156のグリア芽腫、60の乳がん、および34の食道腺癌からなっており、規制当局の指針を順守してUniversity of Pittsburgh Tissue Bankから得られたものであった(表7および表12)。PCa試料の顕微解剖およびDNA抽出の手順は、以前に記載されている(21〜23)。組織の調達のプロトコールおよび手順は、Institution Board of Review of University of Pittsburghによって認可された。全ての細胞系を、American Type Cell Culture, Inc (ATCC)から購入した。細胞培養の手順は、製造業者からのマニュアルに従った。
【０１５３】
また、がん組織を、他の機関から取得した：16の非小細胞肺がん試料を、University of Kansasから得た；28の非小細胞肺がん試料を、University of Iowaから得た；3の前立腺がん試料を、Stanford Universityから得た；および163の試料をUniversity of Wisconsin Madisonから得た；全てのプロトコールは、Institution Review Boardによって認可された。試験において用いられた細胞系を、American Type Cell Culture(ATCC)から購入し、製造業者の推奨に従って培養および維持した。
【０１５４】
ベクターの構築：Pten-NOLC1のcDNAを構築するために、プライマー：AGGGGCATCAGCTACCCTTAAGTCCAGAGCCATTTC (配列番号127)/GGCATTGGCATCCTGCTGTGT CTTAAAATTTGGAGAAAAGTA (配列番号128)を用いてPtenのcDNA鋳型に対してPCRを実施して、以下の条件：94℃で2min、次いで、95℃で30秒、61℃で30秒、72℃で30秒を35サイクルの下で、Ptenの5'末端に対応するcDNAを得た。別に、プライマー：TACTTTTCTCCAAATTTTAAGACACAGCAGGATGCCAATGCC (配列番号129)/ ACCGAAGATGGCCTCTCTAGACTCGCTGTCAAACTT (配列番号130)を用いてNOLC1のcDNA鋳型に対してPCRを実施して、同じ条件下でNOLC1の3'末端を得た。2つの反応のPCR産物をプールした。同じ条件下でAGGGGCATCAGCTACCCTTAAGTCCAGAGCCATTTC (配列番号131)/ ACCGAAGATGGCCTCTCTAGACTCGCTGTCAAACTT (配列番号132)を用いてPCRを実施して、完全長Pten-NOLC1 cDNAを得た。次いで、PCR産物をAflIIおよびXbaIで制限処理し、同様に消化されたpCDNA4-FLAGベクター中にライゲートして、pPten-NOLC1-FLAGベクターを作出した。
【０１５５】
Pten-EGFPベクターを構築するために、プライマー：CTTAAAATTTGGAGATCTAGATCGGTTGGCTTTGTC (配列番号133)/ACCGAAGATGGCCTCTCTAGAGACTTTTGTAATTTGTGTATGCTGATC (配列番号134)を用いてPtenのcDNA鋳型に対してPCRを実施した。PCR産物をNdeIおよびXbaIで制限処理し、同様に制限処理されたpEGFPベクター中にライゲートして、pPten-EGFPを作出した。pNOLC1-cherryを構築するために、プライマー：TCAGCTACCCTTAAGCGGTAGTGACGCGTATTGC (配列番号135)/ACCGAAGATGGCCTCTCTAGACTCGCTGTCAAACTT (配列番号136)を用いてNOLC1のcDNA鋳型に対してPCRを実施した。PCR産物をAflIIおよびXbaIで制限処理し、同様に制限処理されたpCDNA4-Cherryベクター中にライゲートした。
【０１５６】
pGST-Ptenベクターを構築するために、プライマー：GTGGGATCCACATGACAGCCATCATCAAAGAG (配列番号137)/ CATACACAAATTACAAAAGTCTGAGGATCCCCAGGAATTCCCGGGTCGACTC (配列番号138)を用いて、以下の条件：94℃で2min、次いで、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒を35サイクルの下でPCRを実施した。PCR産物をBamH1で制限処理し、同様に制限処理されたpGEX5Tベクターにライゲートして、pGST-Ptenを作出した。
【０１５７】
pGST-Pten-NOLC1ベクターを構築するために、プライマー：GTGGGATCCACATGACAGCCATCATCAAAGAG (配列番号139)/CGAGTCGACCCGGGAATTCCTGGGGATCCTCACTCGCTGTCAAACTTAATAG (配列番号140)を用いてPten-NOLC1 cDNAに対してPCRを実施し、BamH1で制限処理し、同様に制限処理されたpGEX5Tベクター中にライゲートして、pGST-Pten-NOLC1を作出した。
【０１５８】
pPT3-EF1α-Pten-NOLC1を構築するために、プライマー：5’CTCCGGACTCTAGCGTCGACACTTAAGTCCAGAGCC (配列番号224) /5’ ATGGTGATGGTGATGGCGGCCGCTTAACTAGATCCGG (配列番号225)を用いて、鋳型としてpcDNA4-Pten-NOLC1-Cherryに対してPCRを実施して、Sal1およびNot1制限部位を含有する完全長のPten-NOLC1-cherryを得た。次いで、PCR産物をSal1およびNot1で制限処理し、同様に制限処理されたpENTR 1Aデュアルベクター(Invitrogen)中にライゲートして、pENTR-attL1-Pten-NOLC1-attL2を作出した。次いで、Gateway(登録商標)LR Clonase(商標)II酵素ミックス(Invitrogen)を用いて、pENTR-attL1-Pten-NOLC1-attL2を、目標ベクターpPT3-EF1αと組み換えて、Pten-NOLC1-cherry発現ベクターを生成した。
【０１５９】
ゲノムおよびトランスクリプトーム配列決定ライブラリーの調製およびスクリーニング：前立腺試料を、新鮮に凍結し、-80℃で保存した。それらは、University of Pittsburgh Tissue Bankから得られたものである。プロトコールは、University of Pittsburgh Institutional Review Boardによって認可された。トランスクリプトーム配列決定のために、総RNAを、泌尿器疾患を有しない個体に由来する20の臓器ドナーの前立腺の試料、がんに隣接する3つの良性前立腺組織および64の前立腺試料から、Trizolを用いて抽出し、DNAse1で処理した。次いで、リボソームRNAを、RIBO-Zero(商標)Magneticキット(Epicentre、Madison、WI）を用いて、試料から除去した。RNAをcDNAに逆転写し、Illumina, Inc (San Diego、CA)からのTruSeq(商標)RNA Sample Prep Kit v2を用いて増幅した。アデニル化、ライゲーションおよび増幅などのライブラリー調製プロセスを、製造業者によって提供されるマニュアルに従って実施した。次いで、トランスクリプトームライブラリーの品質を、Illumina配列決定プライマーを用いるqPCRを用いて分析し、Agilent 2000 Bioanalyzerを用いて定量した。Illumina HiSeq2500における200サイクルのペアエンド配列決定の手順は、製造業者のマニュアルに従った。
【０１６０】
Pten-NOLC1ゲノム再配置のゲノム切断点の検出：PtenとNOLC1とのゲノムの切断点を検出するために、複数のプライマーを設計した。Ptenのエクソン11およびイントロン11の領域にアニーリングするフォワードプライマーを設計し、NOLC1のイントロン1およびエクソン2の領域にアニーリングするリバースプライマーを設計した(表16)。95℃で15秒、65℃で30秒、および72℃で10分の35の熱サイクルを用いるAccuPrime(商標)Pfx DNAポリメラーゼ(Invitrogen)を用いる様々なプライマーの組合せを用いて、複数のネステッドPCRを実施した。イントロンプライマー対、5’ATTCACCACACTCGTTTCTTTCTC (配列番号226) /5’CCTGCCTGCCAATCTATATTGATC (配列番号227)は、PCR産物を産生することが証明された。精製されたPCR産物の直接配列決定により、Pten-NOLC1のゲノムイントロン切断点配列を確認した。
【０１６１】
CRISP/Cas9ゲノム編集を用いたPten-NOLC1のノックアウト：ベクターpSPCAS9N(BB)-2A-GFPを、Addgene, inc(Addgene #PX461)から取得した。gRNAの標的配列を、CRISPR gRNAデザインツールDNA2.0TMソフトウェアを用いて分析し、PtenとNOLC1との切断接続部に隣接するCGGTTATACCGCTTTGGGATcaaa (Pten) (配列番号228) / caccGAGATGGGGTTTCACCATGT (NOLC1) (配列番号229)として選択した。gRNA(Pten)およびgRNA(NOLC1)に対応する合成オリゴヌクレオチドを、それぞれ、改変されたpSPCAS9N(BB)-2A-GFPおよびpX330s-2ベクターのBbs1部位中で構築した。次いで、両ベクターをBsa1で制限処理した後、Bsa1切断を用いてpX330s-2ベクターから遊離したgRNA(NOLC1)を、gRNA(Pten)-pSPCAS9n (BB)-2A-GFPのBsa1部位中に挿入した。T7リガーゼをクローニングにおいて用いた。切断点での挿入遺伝子の相同組換えのために、ドナーベクターを構築した：mCherryベクター(Clontech inc、CA)を、骨格として用いて、mCherryコード領域の上流にZeocinのcDNAを構築した。mCherryベクターのプロモーター配列を除去した；gRNA(Pten)配列の上流のPtenイントロン11の952bpの配列と、スプライスアクセプター配列の55bpとの断片と同一の相同アーム配列を、ゼオシンのためのリボソームRNA結合コザック配列の上流に挿入した。gRNA(NOLC1)から下流のNOLC1イントロン1の845bpの断片の第2の相同アーム配列を、mcherryコード配列のためのSV40ポリAの下流の領域中に挿入した。ドナーベクターを、lipofectamine 3000(Invitrogen)を用いて、DU145およびMCF7細胞系にgRNA-Cas9D10Aベクターと共に同時トランスフェクトした。挿入遺伝子の組込みを、mCherry発現およびゼオシン耐性によって認識した。Pten-NOLC1発現の喪失を、Pten-NOLC1融合物検出のためのプライマーを用いるTaqman qRT-PCRならびにPtenのN末端またはNOLC1のC末端に対する抗体を用いるdKO1およびdKO2、mKO1およびmKO2クローンに関するイムノブロッティングによって確認した。
【０１６２】
融合転写物の検出：融合転写事象を同定するために、Fusioncatcher(v0.97)アルゴリズム(24)を、RNA配列決定試料に適用した。fusioncatcherに組み込まれた、BOWTIEおよびBLATを用いて、配列を参照ゲノムに対して整列させた。候補融合転写物の予備的一覧を、(1)遺伝子がEnsemblにおいて他のパラログであることが公知である場合；(2)融合転写物の1つがパートナーの偽遺伝子である場合；(3)融合転写物の1つがマイクロ/転移/低分子核RNAである場合；(4)融合転写物が偽陽性事象であることが公知である場合(例えば、Conjoin遺伝子データベース(25))；(5)それが健康な試料中に見出された場合(Illumina Body Map 2.0 [http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-513/])；(6)頭部および尾部遺伝子が同じ鎖上で互いに重複している場合など、文献の現存する生物学的知識に基づいて、Fusioncatcher中でフィルタリングする。融合遺伝子を、CIRCOSソフトウェア(26)を用いて可視化した。
【０１６３】
TCGA SNP 6.0データ分析：CNV断片化データを、TCGAレベル3データ(http://cancergenome.nih.gov/)からダウンロードした。10種未満のマーカーを有するCNVを、フィルタリングにより除いた。Ptenのエクソン11と、NOLC1領域のエクソン2との間で重複する断片のみ(89728532-89728532/hg19)を選択した。-0.23よりも小さい平均値の断片を有するCNVを、欠失と定義する。それぞれの試料について、PtenとNOLC1との間のスパニング欠失を、0.8に等しい、またはそれより大きいPtenとNOLC1との間の領域の全長にわたる欠失断片の長さと定義する(図23に示される)。17の型のがんを、PtenとNOLC1との間のスパニング欠失について分析した：膀胱がん(BLCA)、乳がん(BRCA)、結腸がん(COAD)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBC)、食道癌(ESCA)、多形膠芽腫(GBM)、頭頸部扁平上皮癌(HNSC)、肝臓がん(LIHC)、肺腺癌(LUAD)、肺扁平上皮癌(LUSC)、卵巣がん(OV)、膵臓腺癌(PAAD)、前立腺がん(PRAD)、直腸腺癌(READ)、肉腫(SARC)、甲状腺がん(THCA)および子宮内膜癌(UCEC)。
【０１６４】
蛍光in situハイブリダイゼーション：同様の手順は以前に記載されている(12〜14)。簡単に述べると、組織スライド(4μm)を、0.2N HCl中に20分間入れた後、予備処理溶液(32〜801200、Vysis)、80℃に30分間入れた。次いで、組織を37℃で36分間、プロテアーゼ溶液中で消化し、空気乾燥した。SpectrumOrangeで標識された、Ptenの5'末端を含有する細菌人工染色体(BAC)配列7ml(RP11-124B18, InVitrogen, Inc, Grand Island, NY)/SpectrumGreenで標識された、NOLC1の3'末端を含有するBAC配列(CTD-3082D22)1mlを含む50%ホルムアミドを混合することによって、FISHプローブを調製した。プローブを75℃で5min変性させた。ホルマリン固定組織の切片を、70%ホルムアミド中で3min変性させ、70%、85%、および100%エタノール中でそれぞれ2min、室温で脱水した。変性したプローブをスライド上に置き、カバースリップし、ゴムセメントで密封し、加湿チャンバー中に入れ、37℃で一晩ハイブリダイズさせた。カバースリップを除去し、スライドを2XSSC/0.3% Igepal(Sigma)中、72℃で2min洗浄した。スライドを暗室中で空気乾燥した。スライドをDAPIで対抗染色した。SpectrumOrange、SpectrumGreenおよびDAPI(uv 360nm)に関するシングルバンド励起子を有するChroma Technology 83000フィルターセットを備えたCytoVisionを含むOlympus BX61を用いて、分析を実施した。2つのハイブリダイゼーションシグナルを有する個体およびよく描写された細胞のみをスコア化した。重複する細胞を、分析から除外した。試料あたり50〜100個の細胞をスコア化して、シグナルの平均を得た。MCM8の獲得のためのカットオフは、ゲノム1個あたり少なくとも2.5コピーの平均である。統合したPtenとNOLC1シグナルを示す10%を超える細胞を含む試料を、Pten-NOLC1融合物について陽性であると考えた。
【０１６５】
RNA抽出、cDNA合成およびTaqman RT-PCR：顕微解剖をFFPE試料のスライド上で実施して、少なくとも50%のがん細胞を得た。総RNAを、Trizol法(InVitrogen, CA)を用いて上皮細胞から抽出した。抽出手順を、製造業者の推奨に従って実施した。ランダムヘキサマーを、1μgの総RNAおよびSuperscript II(商標)(InVitrogen, Inc, CA)を用いる第1鎖cDNA合成において用いた。この後、プライマー：GAGCGTGCAGATAATGACAAGG (配列番号141)/GCCAGAAGCTATAGATGTCTAAGAG (配列番号142)およびTaqmanプローブ: 5’-/56-FAM/CAG GAT GCC/ZEN/AAT GCC TCT TCC C/3IABkFQ/-3’を用いて、EppendorfRealplex(商標)サイクラー中でTaqman PCR(94℃で2min、次いで、94℃で30秒、61℃で30秒、72℃で30秒を50サイクル)を行った。Pten-NOLC1検出のCt閾値：ホルマリン固定パラフィン包埋組織については38 5サイクル、凍結組織については35サイクル。鋳型なしの陰性対照およびPten-NOLC1 cDNA鋳型を、それぞれ、各バッチにおいて陰性および陽性対照として用いた。
【０１６６】
イムノブロット分析および免疫沈降：Pten-NOLC1発現を、H522、H358、PC3 DU145およびA-172細胞中で試験した。最初に、細胞をPBSで洗浄し、RIPAバッファー(50mM Tris-HCl、pH7.4、1%Nonidet P-40、0.25%デオキシコール酸ナトリウム、150mM NaCl、1mM EDTA、1mMフェニルメチルスルホニルフルオリド、1μg/mLのアプロチニン、1μg/mLのロイペプチン、1μg/mLのペプスタチン、および1mM Na3VO4)により溶解した。溶解物を超音波処理し、12,000g、4℃で30分間遠心分離して、不溶性材料を除去した。8.5%ポリアクリルアミドゲル中でのドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によってタンパク質を分離し、バンドをポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜上にブロットした。膜を、室温で1時間、Tris-Tween 20バッファー(0.1M Tris-HClおよび0.1%Tween-20、pH7.4)中の5%粉末化スキムミルクを用いてブロックした後、一次抗Pten抗体(1:1000希釈、Santa Cruz)、抗NOLC1抗体(1:1000希釈；Santa Cruz, CA)、抗FLAG (Santa Cruz)、抗β-アクチン抗体(1:500希釈; Santa Cruz)またはC-MET、GAB1 C-RAF、Akt、MAPK、p-MAPK、Stat3、pStat3の抗体 (Cell Signaling)と共に2時間インキュベートした。次いで、膜をTris-Tween 20バッファーで3回洗浄し、ウサギ(抗β-アクチン、1:1000希釈)、マウス(抗Pten、1:1000希釈)、またはヤギ(抗NOLC1、1:1000希釈)に特異的な西洋わさびペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体と共に室温で1時間インキュベートした。タンパク質発現を、製造業者のプロトコールに従ってECLシステム(Amersham Life Science)を用いて検出した。また、同様のイムノブロッティングを、前立腺がん試料PCa638T、PCa207T、PCa624T、PCa099T、PCa090T、ならびに泌尿器疾患を有しない個体に由来する臓器ドナーの前立腺DO12およびDO17に由来するタンパク質抽出物に対して実施した。免疫沈降させるために、細胞溶解物をA/G磁気ビーズ(Millipore)と共に20分間インキュベートして、非特異的結合を除去した。上清を、4℃で一晩、4〜6μgの一次抗体と共にインキュベートし、A/G磁気ビーズを免疫複合体に添加し、4℃で2時間、反応物を揺り動かし続けた。磁気ビーズを磁気スタンド上に収集し、プロテイナーゼ阻害剤を含有する1xPBSで3回洗浄した。SDS-PAGEローディングバッファーを直接用いて、タンパク質を再懸濁し、ビーズからタンパク質を溶出させた。
【０１６７】
PtenおよびPten-NOLC1のホスファチジルイノシトール3,4,5-三リン酸(PI(3,4,5)P3)ホスファターゼアッセイ：精製されたGST-Pten、Pten-NOLC1-FLAGまたはGST-Pten-NOLC1のPI(3,4,5)P3に対するホスファターゼ活性を定量化するために、Pten-NOLC1-FLAGを、FLAG抗体を用いて免疫精製し、GST-Pten-NOLC1を、GSTカラムを用いて精製した。精製されたPten-NOLC1のホスファターゼを、競合ELISAアッセイにかけた：2〜10pmolの精製されたタンパク質を、37℃で1時間、8μMのPI(3,4,5)P3と共にインキュベートした。次いで、95℃に3min加熱することにより、反応を停止させた。次いで、反応物を「Detection Plate」(Echelon, Inc, UT)に移し、37℃で60minインキュベートした。この後、「Detection Plate」をPBS-tween 20で3回洗浄した。プレートに、Echelon, Incによって提供された100μlの二次ディテクターを添加し、室温で30minインキュベートした後、PBS-tween 20で3回洗浄した。次いで、Echelonによって提供された100μlのTMB溶液を15min添加することによって、発色させた。分光光度計において450nmでの吸光度を読み取り、既知量のPI(3,4)P2の標準曲線を用いて適合させることにより、PI(3,4)P2の量を定量した。反応物中の精製されたPtenタンパク質(Echelon)を陽性対照として使用し、GSTのみのタンパク質またはFlagのみまたはIgGのみを、陰性対照として使用した。
【０１６８】
細胞増殖および細胞周期の分析：DU145またはそのPten-NOLC1ノックアウト対応物を、コロニー形成分析において使用し、各クローンの1000個の細胞を、各ウェル上に3組播種した。個々の単一細胞を増殖させて、7〜10日間コロニーを形成させた。次いで、コロニーを氷冷メタノールで10分間固定し、0.025%クリスタルバイオレットで15分間染色した。コロニー数を計数し、画像化した。細胞周期分析において、FITC BrdUフローキット(BD Biosciences)を用いた。培養物中のFBSを48時間かけて除去した後、4時間かけて10%FBSおよびBrdUをフィードバックすることによって、DU145、またはDU145 KO1もしくはKO2を同期させた。次いで、FITC-BrdU抗体およびヨウ化プロピジウム核染色(BD bioscience)を用いる分析のために細胞を収獲した。異なる細胞周期にある細胞を、フローサイトメトリー(BD Facscalibur)によって分析した。また、同様の分析を、MCF7細胞とmKO1またはmKO2、PC3-PNOL(T+)とPC3-PNOL(T-)、NIH3T3-PNOL(T+)とNIH3T3-PNOL(T-)についても実施した。
【０１６９】
UV誘導性細胞死：60〜70%の集密度のDu145、dKO1、dKO2、MCF7またはmKO1の培養細胞に、50mj〜200mjの範囲のUVを照射した。17時間後、これらの細胞をアポトーシス分析のために収獲した。Alexa Fluor 488-アネキシンVアポトーシスアッセイキット(BD Biosciences)を使用し、アポトーシス細胞をフローサイトメトリー(BD Facscalibur)において定量した。また、同じアポトーシス分析を、PC3-PNOL(T+)、PC3-PNOL (T-)、NIH3T3-PNOL(T+)およびNIH3T3-PNOL (T-)クローンにも適用した。
【０１７０】
Pten-NOLC1ノックアウト細胞死分析：Pten-NOLC1の切断点を担持するがん細胞系を用いた。細胞を、PtenおよびmCherry-ノックアウトカセットのためのgRNAと共にCas9D10Aを含有する組換えアデノウイルス、PtenドナーカセットのためのgRNAと共にCas9D10Aを含有するウイルス、または対照としてCas9D10Aのみを含有するウイルスで処理した。細胞培養物が18〜24時間で70〜80%の集密度に達した時、これらのウイルスを細胞培養物に適用した。次いで、培養培地を交換した。細胞を、Pten-NOLC1破壊を起こすために3日間インキュベートした。次いで、細胞死分析のために細胞を収獲した。PE-アネキシンVアポトーシスアッセイキット(BD Biosciences)を用いた：細胞を100μlのアネキシン結合バッファー(Invitrogen)中に再懸濁し、5μlのPEコンジュゲート化アネキシンVおよび5μlのヨウ化プロピジウムと共に暗室中、室温で20minインキュベートした。400μlのアネキシン結合バッファーを添加することにより、結合アッセイを終結させた。BD Facscalibur (BD Sciences, San Jose, CA)を用いて、FACS分析を実施した。10000個の細胞を獲得し、選別した。WinMDI2.9ソフトウェア(Joseph Trotterからのフリーウェア)を用いて、データを分析した。
【０１７１】
細胞移動および浸潤アッセイ：見積もりで5x104個の細胞を、それぞれのマトリックスゲルチャンバー(24ウェル)、およびマトリゲル膜を含まない対照ウェルに入れた。22時間後、膜頂部の細胞を拭き取り、細胞を、チャンバー膜を通して移動させたか、または対照の分割物をH&Eで染色し、細胞数を計測した。膜を通って浸潤した細胞数を、対照における分割物を通って移動した細胞を用いて正規化した。3組の各クローンを含有させ、DU145とDU145KO1またはDU145KO2; MCF7またはMCF7KO1またはKO2; PC3-PNOL(T+)とPC3-PNOL (T-); NIH3T3-PNOL(T+)とNIH3T3- PNOL (T-)のクローン間で比較を行った。
【０１７２】
Pten-NOLC1のスリーピングビューティ/トランスポゾン媒介性水力学的トランスフェクション：pPt3-EF1α-Pten-NOLC1-Cherryを、PC3細胞中にトランスフェクトし、mCherry蛍光タグの発現によって、Pten-NOLC1-Cherryタンパク質の発現を確認した。次いで、pT3-EF1α-Pten-NOLC1-Cherry(20μg)およびSB(1μg)を、2ml塩水中にプールした。プールしたプラスミドの水力学的注入を、肝臓中でのPten-NOLC1-mCherryのトランスフェクションのために実施した(Chenら、2017a; Liuら、1999)。4〜6週齢のloxP-Ptenマウスを、トランスフェクション前に1010のAAV8-Cre (Penn Vector Core, University of Pennsylvania)の腹腔内注射のために用いた。
【０１７３】
クロマチン免疫沈降(ChIP)：Pten-NOLC1ノックアウトクローン、dKO1、dKO2、mKO1、mKO2ならびにその親細胞、Du145およびMCF7を、ChIP分析のために用いた。MagnaChiIP A/Gキット(Millipore, USA)を使用し、製造業者のプロトコールに従った。簡単に述べると、培養物中の80%の集密度の2〜3x105個の細胞を、室温で10分間、冷4%ホルムアルデヒド中でインキュベートして、タンパク質とDNAとを架橋させた後、室温で5分間、グリシンを用いてクエンチし、氷冷1xPBSで3回洗浄し、細胞ペレットをスピンダウンした。次いで、細胞を、氷上で15分間、プロテアーゼ阻害剤を含有する溶解バッファーで溶解し、4℃で5分間、800gで遠心分離した。ペレットを核溶解バッファーでさらに溶解した。次いで、核溶解物(タンパク質/DNA)を超音波処理によって100〜800bpのサイズのDNA断片に剪断した。Focused ultrasonicator M220(COVARIS)を、パワー7.5、200バースト/サイクルおよび係数10%に設定して用いた。断片化および架橋されたクロマチンを、NOLC1のC末端またはPtenのN末端に対する抗体を用いて免疫沈降させた。A/G磁気ビーズを用いて、DNA断片を含む免疫複合体を収集した。次いで、DNAをライブラリー調製のために溶出および精製した(Illumina, CA)。また、同様のアッセイを、FLAGタグに特異的な抗体を用いることにより、PC3-PNOL-Flag、RWPE1-PNOL-Flagならびにその対照PC3-FlagおよびRWPE1-Flag; ならびにPC3に由来する溶解物に対しても実施した。
【０１７４】
ChIP配列決定：製造業者により推奨される手順に従った(Illumina)：DNA断片の量およびサイズを、Bio-analyzer (Agilent)中で分析した；DNAを、末端修復試薬を用いて最初に平滑末端化した後、3'末端アデニル化し、インデックスアダプターとライゲートした；改変DNAを、Ampure XP磁気ビーズを用いて精製し、SYBR Goldゲルを含む2%アガロース中で分解した。250〜300bpのDNAサイズを切り出し、MinElute Gel Extraction Kitを用いて精製し、TruSeq(商標)試薬(Illumina)を用いる17熱サイクルのPCRを用いて富化した。各ライブラリーを、Agilent Bioanalyzer中で再度定量し、ローディングのために各試料について2nMに対して正規化した。配列決定のプロセスは、製造業者の標準プロトコールに従ってIllumina Highseq 2500中で行った。2レーンの70G配列決定能力を、15のChip試料を配列決定するために用いた。ChIP富化されたリードのピークの同定。Chip-Seqデータを、Burrows-Wheeler Aligner(BWA)(LiおよびDurbin、2009)によりヒトゲノム参照に対して整列させた。Model-based Analysis of ChIP-Seq(MACS)ツール(Zhangら、2008)により、それぞれ個々の試料からピークをコールした。有意なピークを、部分バックグラウンドアラインメントと比較してリードが富化されたDNA領域と定義する。多重仮説検定のためBenjamini-Hochberg手順によってp値を調整し、FDRを0.05に設定して、有意性を定義した(BenjaminiおよびHochberg、1995)。有意なピークを、ペアワイズ試料間でさらに比較して、ピーク差を検出した(補足表1)。所与のピーク領域に対して整列されたリードを、さらなる分析のためにSAMツールによって抽出した(Liら、2009)。
【０１７５】
プロッティングおよび統計分析のための全てのプログラミングは、Rパッケージ中に実装されている。グローバルマンハッタンプロットと、特定の遺伝子の転写開始部位(TSS)の上流周辺のリードの部分プロット(補足図4)との両方を生成した。Rパッケージ「qqman」(biorXiv DOI: 10.1101/005165)を用いて、グローバルマンハッタンプロットを生成した。野生型試料からノックアウト試料中の重複ピークを減算すること(マッチングさせながら+/-2kbの範囲でピークを伸長させること)によって、減算結果を得た。減算結果に由来するピーク(特に、「DU145-(DKOR1+DKOR2)」+「MCF7-(MKO1+MKO2)」)を遺伝子に対して注釈を付け、Ingenuity Pathway Analysis (IPA(登録商標), QIAGEN Redwood City, www.qiagen.com/ingenuity)により分析し、トップの富化された経路を報告した。野生型Du145における示差的に富化されたリードに達し、注釈を付けたため、いくつかの同定された遺伝子、MET、EGFR、AXL、VGEFA、RAF1およびGAB1のプロモーター領域におけるリードをさらに分析した。8つの野生型試料および7つのノックアウトまたは他の陰性対照において同定された、METなどの各遺伝子の全てのリードを、プロモーター候補領域、tss部位の-4kb〜+500bpに沿ってプロットした。異なる野生型試料に由来するリードは、近いゲノム位置にマッピングされることが多かった。100bp以内の距離の近い位置にマッピングされた2個以上のリードを、プロット中の同じ位置における2〜3個以上のリードとして合わせた。野生型群試料について密に分布した領域中のリード配列を用いて、表17に列挙されるTaqman PCRプライマーおよびプローブを設計した。富化されたDNAエレメントを、ChIP試料を用いてTaqman PCRによって検証し、3%アガロースゲル上で分解した。
【０１７６】
7.3 結果
Pten-NOLC1融合物は第10染色体再配置の結果である
Pten-NOLC1融合転写物形成の基礎となる機構を調査するために、Ptenゲノムの5'末端(spectrum red)およびNOLC1の3'末端(spectrum green)に対応する2つのプローブを用いて、Pten-NOLC1融合転写物が検出された前立腺がん試料に対して蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)分析を実施した。その結果、PtenおよびNOLC1のシグナルは重複して、がん細胞中で単一のハイブリダイゼーションシグナル(黄色っぽい)を形成することが示された。また、無関係のNOLC1シグナル(緑色)も同定されたが、野生型Ptenシグナル(赤色)はこの前立腺がん症例では存在しなかった。これは、正常な臓器ドナーの前立腺組織において可視化されたPten(赤色)およびNOLC1(緑色)の異なる2対の別々のシグナルとは対照的である。がんゲノムにおけるPten-NOLC1ゲノム組換えと、半接合性Pten欠失との同時的存在は、このがんにおけるPten対立遺伝子の完全な機能的喪失を示唆する。
【０１７７】
Pten-NOLC1の染色体切断点の位置を同定するために、一連のネステッドロング伸長PCRを、切断点接続部に隣接するエクソンに隣接するゲノム配列に対応するプライマーを用いて、この前立腺がん試料のゲノムDNAに対して実施した。
【０１７８】
PCR産物を精製し、Sanger配列決定にかけた。これらのPCR産物の配列決定の結果(図17C)により、Pten-NOLC1のゲノム切断点がPtenのイントロン11と、NOLC1のイントロン1との間の配列に位置し、8bp(TAGCTGGG)が、PtenとNOLC1イントロンの両方によって共有される配列と重複することが示された。その後のPten-NOLC1切断点分析において、本発明者らは、がん細胞系LNCaP、DU145、VCaP、HEP3B、MCF7およびPC3のゲノムが、多様な生物学的特徴を有する異なる型の悪性腫瘍に由来するものであったとしても、同一の切断点配列を含有することを見出した。これらの結果は、ヒトがんゲノムにおけるPten-NOLC1融合物形成の原因となる共通の組換え機構を示唆する。
【０１７９】
Pten-NOLC1はヒト悪性腫瘍において高度に頻発性である
Pten-NOLC1融合物がヒトがんにおいて頻繁であるかどうかを調査するために、図20Aに示されるプライマーおよびプローブを用いて6つの異なるヒトがんの26のがん細胞系に対してTaqman RT-PCR分析を実施したところ、Pten-NOLC1融合転写物は、試験した4つの前立腺がん細胞系(PC3、DU145、LNCaPおよびVCaP)、肺がん細胞系(H358、H1299、H522およびH23)、乳がん細胞系(MDAMB231、VACC3133、MDA-MB330、MCF7)、肝臓がん細胞系(HUH7、HEP3B、SNU449、SNU475、SNU375、SNU182およびHEPG2)、ならびにグリア芽細胞腫細胞系(A-172、LN229、T98G、U138およびU118)、および結腸がん細胞系(HCT8およびHCT15)を含む、試験した多くの腫瘍細胞系に存在することが見出された。Pten-NOLC1融合物は、20の正常な臓器ドナーの前立腺試料および前立腺がん患者に由来する10の血液試料中では検出されなかった。Pten-NOLC1が原発性ヒトがん試料中に存在するかどうかを調査するために、8つの異なる型のヒト悪性腫瘍に由来する1030のがん試料に対してTaqman RT-PCR分析を実施した。その結果、Pten-NOLC1がこれらのがんに広範囲に存在することが示された：70.1%(481のうちの337)のPCa、83%(60のうちの50)の乳がん、75%(60のうちの45)の結腸がん、83%(153のうちの127)のGBM、82.9%(70のうちの58)の肝臓がん、75.2%(145のうちの109)のNSCLC、70.5%(61のうちの43)の卵巣がんおよび85%(34のうちの29)の食道腺癌(図20B、18および19ならびに表7〜12)。
【０１８０】
Pten-NOLC1のこの広く存在する転写物ががん細胞または組織中でタンパク質に翻訳されたかどうかを調査するために、Ptenに特異的な抗体を用いて腫瘍試料に対してウェスタンブロットを実施した。Pten-NOLC1融合物は、約120Kdの推定分子量を有し、そのサイズはPten(48.3Kd)よりも有意に大きい。細胞系H522、H538、PC3、DU145およびA-172からのタンパク質抽出物のブロッティングにおいてであるが、110kDaのバンドがPtenに対する抗体によってがん細胞系試料中で容易に検出された(図20C、8〜12行目)。また、Pten-NOLC1タンパク質は、Pten-NOLC1 mRNAについて陽性である原発性がん組織試料においても検出されたが、Pten-NOLC1融合物が存在しない健康なドナーの前立腺試料中では陰性であった(図20C、1〜7行目)。総合すると、Pten-NOLC1は、体細胞ゲノム再配置の産物であり、異なる起源のヒトがんにおいて融合転写物およびキメラタンパク質として頻発的に検出された。
【０１８１】
Pten-NOLC1のみは核に位置し、ホスファターゼ機能を含有しない
細胞質PIP3は、Ptenホスファターゼの特異的標識であるが、NOLC1は専ら核小体タンパク質である。かくして、細胞内位置は融合タンパク質の機能に有意な関係を有するため、Pten-NOLC1融合タンパク質の細胞内位置を同定することは興味がもたれる。Pten-NOLC1のcDNAを作出し、哺乳動物発現ベクター中で構築して、pCDNA4-Pten-NOLC1-Flagを作出し、免疫染色を用いてPten-NOLC1の位置を分析するためにNIH3T3細胞系にトランスフェクトした。図22に示されるように、pCDNA4-Pten-NOLC1-FLAGをトランスフェクトしたNIH3T3細胞を分析するためのFLAGタグに特異的な抗体を用いて、NOLC1抗体を用いて染色する細胞核と同様、Pten-NOLC1のシグナルを核にのみ局在化させたが、Pten抗体は、細胞質と核の両方を包含するNIH3T3細胞中でのPtenの広範な分布を示した。また、pCDNA4-Pten-NOLC1-FLAGをトランスフェクトしたPC3細胞においても同様の結果が観察された(データは示さない)。さらに、蛍光タグを有するタンパク質を発現するpCDNA4を作出して、PC3細胞中でのキメラPten-NOLC1-EGFP、トランケートされたPtendel343-403-EGFPおよびトランケートされたNOLC1del1-40-mCherryの発現を追跡した。ベクターを、それぞれ、PC3細胞中に別々にトランスフェクトした場合、Pten-NOLC1-EGFPと、NOLC1-mCherryタンパク質は両方とも、専ら核に局在化したが、Pten-EGFPはほとんど細胞質にあり、分裂段階では稀にしか核になかった（1個の細胞を除き）。さらに、Du145溶解物の核または細胞質画分を、Pten抗体を用いてブロットした場合、Ptenのバンド(48kDa)は専ら細胞質画分に見出されたが、Pten-NOLCタンパク質は、ウェスタンブロット分析中に、それぞれ、PtenおよびFLAGに対する抗体を用いた同じタンパク質バンドの検出によって示されたとおり、核画分において検出された(図22B)。
【０１８２】
Ptenのホスファターゼドメインは、Pten-NOLC1融合タンパク質においてインタクトであるが、Ptenの脂質結合C2ドメインはトランケートされるため、Pten-NOLC1がリン脂質ホスファターゼ活性を有するかどうかは不明である。ELISAアッセイ(Echelon Pten Activity Elisaキット)を実施して、精製された組換えGST-PtenまたはGST-Pten-NOLC1がPI(3,4,5)P3をPI(4,5)P2に変換する能力を試験した。その結果、GST-Ptenが28pmolのPIP2を産生したことが示された(GST-Pten 1ngあたり)。対照的に、GST-Pten-NOLC1は、測定可能なPIP2を産生することができなかった(図22C)。同様の結果は、細胞により産生されたPtenまたはPten-NOLC1についても見出された：PtenまたはNOLC1またはFLAGに特異的な抗体を免疫沈降において用いて、Pten-NOLC1を発現するPC3クローン中でPten-NOLC1またはPten関連タンパク質を精製したが、これらの免疫精製されたタンパク質はいずれも、いかなるホスファターゼ活性も示さなかった。PC3細胞中の内因性PtenがPIP3ホスファターゼ活性を示すことができないことは、おそらくがん細胞系における変異した酵素を反映する(14)。結論として、Pten-NOLC1は、専ら核に存在するが、野生型のPten脂質ホスファターゼ機能を有しない。
【０１８３】
Pten-NOLC1は腫瘍増殖を促進し、腫瘍生存を増加させる
以下、Pten-NOLC1の発現が腫瘍増殖に対する影響を有するかどうかの試験を実施した。Pten-NOLC1の弱い発現から中程度の発現を含有する異なる臓器起源の多くのがん細胞系を試験した(図20A)。siRNAによるPten-NOLC1融合物の特異的ノックダウンを用いて、細胞増殖に対するPten-NOLC1の影響を調査することができる。しかしながら、そのような手法は、Pten-NOLC1とPtenの間、またはPten-NOLC1とNOLC1の間で配列を共有するため、実現可能ではないかもしれない。
【０１８４】
最初に、CRISPR-Cas9D10A手法を用いて、DU145細胞およびMCF7細胞中でPten-NOLC1ゲノムノックアウトを調製した。図23Aに示されるように、Pten-NOLC1のゲノム切断点を、切断点に隣接する2つのgRNAによって標的化した。次いで、gRNA特異的Cas9D10Aニッカーゼによって、標的部位でニッキングし(gRNA-Cas9D10Aベクター)、プロモーターを含有しないが、リボソーム結合部位を含有するゼオシン-mCherry cDNA(ドナーベクター)を、相同組換えによって切断点に挿入した。これらのベクターの両方をDU145(前立腺がん細胞)、MCF7(乳がん細胞)および他のがん細胞系にトランスフェクトした場合、ゼオシン耐性およびmCherry蛍光の表示によって、Pten-NOLC1融合物の中断の成功が示された。Pten-NOLC1ノックアウトのクローンを、ゼオシン耐性選択によって取得した。図23Bに示されるように、Pten-NOLC1発現のノックアウトを示すDU145およびMCF7のクローンを取得した。
【０１８５】
続いて、これらのクローンを、細胞周期特性について分析した。図23Cに示されるように、S期にある細胞集団は、それぞれ、Pten-NOLC1ノックアウトクローンDU145KO1およびDU145KO2において、その親DU145細胞と比較して、23.3%から13%(p<0.05)および8%(p<0.05)に減少し、MCF7KO1細胞においては、23%から15%(p<0.05)に減少したが、これらのPten-NOLC1ノックアウト細胞のG0/G1期は、穏やかに増加した。対照的に、NIH3T3およびPC3細胞中でのPten-NOLC1の強制的発現は、これらの細胞についてS期への進入を増加させた(NIH3T3については7%から26%、p<0.05；およびPC3については9%から32%、p<0.05)。Pten-NOLC1のノックアウトは、Du145細胞についてはコロニー形成の8〜13倍の減少(p<0.05)をもたらし、MCF7細胞については2.4倍の低下(p<0.05)をもたらした(図23D)。Pten-NOLC1をNIH3T3(2.83倍の増加、p<0.05)およびPC3(2.8倍の増加、p<0.05)細胞中で強制的に発現させた場合、この知見は逆転した。別に、本発明者らは、Alexa Fluor 488アネキシンV結合アッセイのFACS分析の例において示されるように、これらのDU145およびMCF7KO細胞のUV誘導性細胞死分析を実施したところ、175mjのUVで処理した親DU145細胞の36%が死滅したのに対して、そのノックアウト対応物(DU145-KO1;p<0.05)は56%であったが、これは、Pten-NOLC1の存在が、UV照射に対するがん細胞の耐性を増大させることを示唆している。実際、Pten-NOLC1の除去により、細胞はより感受性になり、DU145細胞のED50は174mjから135mjに、MCF7のED50は175から127mjになった(図23E)。がん浸潤に対するPten-NOLC1の影響を調査するために、マトリゲル横断分析を実施した。図23Fに示されるように、DU145腫瘍細胞中のPten-NOLC1の除去は、浸潤指数を3.8〜4倍減少させた。in vivoでのこれらの細胞の侵攻性を試験するために、5x106個のこれらの細胞を、SCIDマウスの左脇腹領域に皮下移植した。DU145腫瘍は急速に増殖し、移植後第2週に脇腹領域に目に見える瘤を示し始め、観察の終わりまでに、瘤は第2週でのその元のサイズのほぼ35倍になったが、DU145の2つのPten-NOLC1KOクローンの移植片のみが、異種移植後第4週で目に見えるようになった(図23G)。DU145腫瘍を有するマウスの多くは転移病変および腹水を有していたが、ノックアウト群に由来するわずか1匹の動物がそのような兆候を示した(図23H)。Pten-NOLC1を含まないDU145細胞を異種移植した全ての動物が、異種移植の6週間を生存したが、DU145細胞腫瘍を異種移植したSCIDマウスの42%(3/7)が同じ期間に死亡した。MCF7細胞はマトリゲル中に移動することができず、その異種移植片はSCIDマウス中で増殖しなかった。総合すると、これらの結果は、Pten-NOLC1融合物が、腫瘍増殖および浸潤に大きく寄与することを示している。
【０１８６】
c-met、GAB1およびEGFRの過剰発現はPten-NOLC1に依存する
NOLC1はRNAポリメラーゼI12のコファクターであり、同時転写因子として関与している(15、16)。NOLC1とPtenとの融合物がその転写スペクトルを変化させ得るかどうかを試験するために、DU145およびMCD7のDNA断片ならびにNOLC1抗体を用いたクロマチン免疫沈降に由来するそのノックアウト対応物を配列決定した(ChIPseq)。図28Aに示されるように、6179のDNA断片のピークがDU145細胞中で検出された。ピーク事象は、2つのPten-NOLC1ノックアウトクローンにおいて2868に減少した。同様の結果は、MCF7細胞においても同定された：MCF7における合計で4347のピーク、ならびにMKO1およびMKO2における1196のピーク。NOLC1におけるPtenドメインの存在は、2.2〜3.6倍多いゲノム結合領域をもたらし、NOLC1 DNA結合活性を有意に広げた。これらのDNA結合活性がPten-NOLC1融合物の直接的な結果であるかどうかを検証するために、Pten-NOLC1-FLAGをPC3およびRWPE1細胞中で強制的に発現させたところ、多数のDNAピークがFLAG抗体-ChIPseqにおいて同定された。多くのピークは、DU145およびMCF7細胞中で見出されたものと重複していた。これらのPten-NOLC1関連DNA断片の経路分析により、「HGFシグナル伝達」および「がん機構」経路が最も影響されるシグナルであることが示された(表15)。富化は、MET、EGFR、RAF1、AXL、GAB1およびVEGFAのプロモーター/エンハンサー領域に由来するDNA断片を含む(図29および図28B)。
【０１８７】
DU145細胞からのPten-NOLC1の除去の影響を調査するために、DU145細胞およびそのノックアウト対応物に対して遺伝子発現マイクロアレイアッセイを実施した。その結果、親DU145細胞と比較して、Du145KO1とDu145KO2クローンの両方において、500個を超える遺伝子および転写物が下方調節されることが示された。これらの遺伝子のうち、c-METは2.8〜6倍、EGFRは1.4〜1.41倍、GAB1は1.8〜1.9倍、AXLは1.8〜2.3倍、VEGFAは1.5〜1.6倍下方調節された(図24A)。これらの遺伝子発現の同様の下方調節は、定量的RT-PCRアッセイ法を用いても同定された(図24B)。興味深いことに、これらの知見は、Pten-NOLC1がノックアウトされたMCF7細胞においても同様に同定された(図24B)。DU145KO1、DU145KO2およびMCF7KO1におけるMET、EGFR、RAF1、およびGAB1タンパク質発現の劇的な下方調節が同定された(図24Cおよび図28C)。RAF1とSTAT3は両方とも、非常にわずかなリン酸化を示した。これらの結果は、これらのシグナル伝達経路の活性化がPten-NOLC1の存在に大きく依存することを示唆している。ChIPseq/マイクロアレイおよびイムノブロット分析と組み合わせた場合、本発明者らは、ECM、EGFおよびHGFシグナル伝達経路における多くの分子の発現がPten-NOLC1に依存することを見出した(図28D)。実際、ゼオシン-cherryカセットのノックインによるPC3、DU145、SNU479、SNU449、HEP3B、T98G、MCF7、MB231およびH1299細胞を含む9種の異なるがん細胞系におけるPten-NOLC1発現の破壊は、影響が最小限であるPten-NOLC1陰性NIH3T3細胞と対照的に、多数の細胞死をもたらした(図30および表18)。これらの結果は、多くのがん細胞が生存のためにPten-NOLC1に依存し得ることを示唆している。
【０１８８】
【表１１】
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【０１８９】
Pten-NOLC1はマウスにおいて肝がんを誘導した
PtenのPten-NOLC1への変換は、1つの事象における野生型Ptenの喪失およびがん遺伝子の作出である。仮説は、この単一の事象が哺乳動物においてがんを生成するのに十分であり得るということであった。この仮説を試験するために、AAV8-creの腹腔内注射によって、C57BlloxPten+/+マウスの肝臓から、Ptenを体細胞的にノックアウトした。この後、pT3-Pten-NOLC1-mCherryおよびpSBの水力学的尾静脈注射を行って、約1〜5%の肝細胞にPten-NOLC1-mCherry遺伝子をトランスフェクトした(図25A)。18週以内に、7匹のマウスのうちの6匹が肝細胞癌を発症し、肝臓における特徴的な腫瘍小結節を示した(図25B)。1匹のマウスは、腹腔中にがん転移を発症した。2匹の動物は腹水貯留を有する。対照的に、体細胞PtenノックアウトおよびpT3/pSB注射を行った対照マウスはいずれも、同じ期間に腫瘍の兆候を生じなかった。これらの腫瘍細胞は、大きな核小体を有し、おそらく、Pten遺伝子ノックアウトのため、細胞質中への有意な脂肪蓄積を含有する。腫瘍細胞はまた、高頻度のKi-67染色を示し、非がん細胞のものよりも4.6倍の頻度を示した(図25D)。イムノブロット分析により、PtenまたはNOLC1に特異的な抗体によって検出された、全てのがん試料におけるPten-NOLC1-mCherryタンパク質発現が示されたが、そのようなタンパク質は、pT3/pSBをトランスフェクトされた、およびAAV8-creで処理されたマウス肝臓組織には存在しなかった(図25E)。転移がん試料を含む、全ての腫瘍組織において、c-METおよびGAB1の劇的な上方調節が検出された。かくして、これらの結果は、Pten-NOLC1融合物作出の単一の事象が、自発的な肝臓がんの発症を誘導するのに十分であり、Pten-NOL1の腫瘍形成活性がc-METシグナル伝達経路の過剰活性化によって大きく寄与されることを示している。
【０１９０】
7.4 考察
本実施例は、がん発症におけるPten-NOLC1融合物の基本的役割を示唆する、ヒトがんにおけるPten-NOLC1融合物の幅広い存在があることを示す。がん転移におけるPten-NOLC1の陽性率はさらに高く、いくつかの型のがんにおいては90%に達する(図21)。高頻度のPten-NOLC1融合物にも拘わらず、本発明者らの知識では、これはヒトがんにおけるそのような融合物を記載する初めての報告である。TCGAに由来する17種の異なるがん型を包含する2586のがん試料のトランスクリプトーム配列決定データセットのスクリーニングにおいて、本発明者らは、Pten-NOLC1融合転写物の存在を検出することができなかった。その相違に興味をそそられて、本発明者らは、PtenまたはNOLC1遺伝子の頭部または尾部エクソンに関する正規化された番号リードのアラインメントを比較することによって、2つのデータセット間の可能な差異を調査した。分析により、有意に小さい割合のマッピングされたリードが、本発明者らのデータと比較して、TCGA前立腺がんデータセットに由来するPtenまたはNOLC1遺伝子のいずれかの最初のエクソンと整列することが示された(図26)。Pten-NOLC1の検出には、NOLC1に関する多数のエクソン1にマッピングされたリードが必要であるため、3'末端のバイアスおよび相対的に低い配列決定範囲はPten-NOLC1融合転写物の検出を妨げ得る。
【０１９１】
Pten-NOLC1融合物の作出は、Ptenのエクソン11と、NOLC1のエクソン1との間に広がる第10染色体配列の大きな欠失(14.2MB)の結果である。そのような欠失は、コピー数分析によって容易に検出可能である。実際、Affymetrix SNP6.0アレイによっても分析された12のPten-NOLC1融合物陽性前立腺がん試料のうち、全部がPtenのエクソン11とNOLC1のエクソン1との間に同様の14.2MBのスパニング欠失を示した(図27)。反対に、Pten-NOLC1融合物について陰性である10種の前立腺がん試料は、そのようなスパニング欠失について陰性であることが見出される。かくして、Ptenのエクソン11とNOLC1のエクソン1との間のスパニング欠失は、Pten-NOLC1融合物の存在に関する代理指標として役立ち得る。本発明者らは次いで、この分析を、TCGAデータベースに由来するSNP6.0データに適用した。多数のがん試料が、そのようなスパニング欠失を含有することが見出され、甲状腺がんデータセットに関する2%から、多形膠芽腫データセットに関する79%の範囲であった(図27A〜C)。がんゲノムにおけるPten-NOLC1スパニング欠失の広い存在は、これらのがん試料中でのPten-NOLC1融合遺伝子の存在を示唆する。
【０１９２】
Ptenの欠失および変異は、多くのヒトがんにおいて生じる。これらの変異は、脂質ホスファターゼ活性の喪失をもたらし、ゲノム安定性をもたらす。ここで、本発明者らは、Pten由来融合分子がMETシグナル伝達系を介してがん細胞増殖を機能的に促進することを同定した。METの上昇は、生存を増加させる膜上でのMET-FAS相互作用を容易にすることが知られている(17)。Pten-NOLC1は、それがFAS細胞死シグナル伝達の影響を無効化するように、c-METの発現レベルを上昇させることによって癌細胞の生存を増加させることができる。これは、UV照射に対するPten-NOLC1誘導細胞死耐性の影響を説明することができる。興味深いことに、半接合性Pten欠失を含む多くのがん試料も、Pten-NOLC1について陽性である(図27C)。結果として、Pten-NOLC1はリン脂質ホスファターゼ活性について陰性であり、核に移行するため、これらのがんは、機能的なPtenタンパク質を含まない。これらのがんはまた、PIP3(1,4,5)の脱活性化の欠如のため、PI3K/Aktシグナル伝達の過剰活性化を有し得る。分析により、Pten-NOLC1の作出の単一の事象は、短期間に動物において自発的肝臓がんを産生するのに十分であることが示された。
【０１９３】
Pten-NOLC1融合物は、有意な臨床的意義を有し得る。Ptenシグナル伝達経路を標的とする薬物を用いる臨床試験が開始されている(18、19)。最近、CRISPR-cas9システムによる融合遺伝子の染色体切断点を標的とするゲノム療法戦略が開発された(20)。この手法を用いて、融合遺伝子切断点について陽性のがんを異種移植された動物上での部分寛解が達成された。他の融合遺伝子と違って、原発性がん試料または異なる臓器起源のがん細胞系に由来するPten-NOLC1の切断点は同一であると考えられ、これはおそらく、染色体組換えプロセスにおける同じアンカー配列の使用に起因する。これは、Pten-NOLC1を含有する全てのがんに関するこの融合遺伝子の染色体切断点に対するターゲティング戦略を設計するのを非常に容易にすることができる。かくして、Pten-NOLC1融合遺伝子の発見は、将来のがん処置のための重要な基礎を定めることができる。
【０１９４】
【表１２】
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【０１９５】
【表１３】
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【０１９６】
【表１４】
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【０１９７】
【表１５】
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【０１９８】
【表１６】
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【０１９９】
【表１７】
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【０２００】
【表１８】
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【０２０１】
【表１９】
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【０２０２】
【表２０】
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【０２０３】
【表２１】
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【０２０４】
【表２２】
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【０２０５】
【表２３】
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【０２０６】
【表２４】
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【０２０７】
【表２５】
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【０２０８】
【表２６】
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【０２０９】
【表２７】
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【０２１０】
【表２８】
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【０２１１】
【表２９】
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【０２１２】
7.5 参考文献
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【０２１３】
様々な参考文献が本明細書で引用され、それらはその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２】
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【図３Ａ】
2020510623.tif 000087
【図３Ｂ】
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【図４】
2020510623.tif 000089
【図５】
2020510623.tif 000090
【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２３−５】
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【図２３−６】
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【図２４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２８−３】
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【図２８−４】
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【図２８−５】
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【図２９−１】
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【図２９−２】
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【図２９−３】
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【図２９−４】
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【図２９−５】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３０−４】
2020510623.tif 000147
【図３０−５】
2020510623.tif 000148
【図３１】
2020510623.tif 000149
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2020510623.tif 000154
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