(57)【要約】  本発明は、ペプチド等の分析物分子の質量分析決定において好適なスルホキシドベースの試薬ならびにそのような試薬および分析物分子の付加体、ならびに前記試薬および付加体の適用に関する。さらに、本発明は、分析物分子の質量分析決定のための方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析において使用するための試薬であって、一般式（Ｉ）の化合物：
Ｚ１−Ｌ１−（ＣＲ１Ｒ２）−Ｓ（Ｏ）−ＣＲ３Ｈ−ＣＨ２−Ｃ（−Ｌ２−Ｚ２）Ｒ４（−Ｌｘ−Ｘ）
［式中、
Ｚ１は、少なくとも１つの荷電部分を担持することができる電荷単位であり、
Ｌ１は、結合またはスペーサーであり、
Ｚ２は、少なくとも１つの荷電部分を担持することができる電荷単位であり、
Ｌ２は、結合またはスペーサーであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、独立して、水素またはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｘは、分析物分子と反応することができ、それにより、前記分析物分子との共有結合が形成される反応性基であり、
ＬＸは、結合またはスペーサーである］
である、試薬。
【請求項２】
電荷単位Ｚ１およびＺ２が、特に１０以上のｐＫａを有する、より特定すれば１２以上のｐＫａを有する、少なくとも１つの正に荷電した部分、例を挙げると、第一級、第二級、第三級または第四級アンモニウム基またはホスホニウム基をそれぞれ含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項３】
電荷単位Ｚ１およびＺ２が、特に１０以上のｐＫｂを有する、より特定すれば１２以上のｐＫｂを有する、少なくとも１つの負に荷電した部分、例を挙げると、ホスフェート、スルフェート、スルホネートまたはカルボキシレート基をそれぞれ含む、請求項１に記載の試薬。
【請求項４】
電荷単位Ｚ１およびＺ２が、同じ電荷を有する、請求項１から３のいずれかに記載の試薬。
【請求項５】
電荷単位Ｚ１およびＺ２が、恒久的に荷電されている、1請求項１から４のいずれかに記載の試薬。
【請求項６】
反応性基Ｘが、
（ｉ）分析物分子における、カルボニル基、例えばアルデヒドもしくはケト基、またはマスクされたカルボニル基、例えばヘミアセタール基と反応することができるカルボニル反応性基であって、ＮＨ２−Ｎ／Ｏ等の隣接するＯおよび／もしくはＮ原子によって引き起こされるα効果によって強化された超求核性Ｎ原子、またはジチオール基から選択されてよい、前記カルボニル反応性基Ｘ、あるいは
（ｉｉ）分析物分子における、チオール基、例えばＣｙｓ基と反応することができるアルケンまたはアルキン等のチオール反応性基、あるいは
（ｉｉｉ）分析物分子のアミン、例えばアミノ基と反応することができるアミン反応性基
である、請求項１から５のいずれかに記載の試薬。
【請求項７】
Ｘが、特に、
（ｉ）ヒドラジン基、例えばＨ２Ｎ−ＮＨ−またはＨ２Ｎ−ＮＲ１−基
［ここで、Ｒ１は、アリール、または、場合により置換されている、Ｃ１〜４アルキル、特にＣ１もしくはＣ２アルキルである］、
（ｉｉ）ヒドラゾン基、例えばＨ２Ｎ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−またはＨ２Ｎ−ＮＲ２−Ｃ（Ｏ）−基
［ここで、Ｒ２は、アリール、または、場合により置換されている、Ｃ１〜４アルキル、特にＣ１もしくはＣ２アルキルである］、
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノ基、例えばＨ２Ｎ−Ｏ−基、
（ｉｖ）ジチオール基、特に１，２−ジチオールまたは１，３−ジチオール基、
（ｖ）求電子性アルケン基、例えばＲ１Ｒ２Ｃ＝ＣＲ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−
［ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、ハロゲンまたはＣ１〜４アルキル、好ましくはＨである］、
（ｖｉ）活性エステル基、例を挙げると、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）もしくはスルホ−ＮＨＳ、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）基またはイミドエステル−ＣＨ２−Ｃ（＝ＮＨ２＋）−Ｏ−ＣＨ３
から選択されてよい、請求項１から６のいずれかに記載の試薬。
【請求項８】
一般式（Ｉａ）：
Ｚ１−Ｌ１−（ＣＲ１Ｒ２）−Ｓ（Ｏ）−ＣＲ３Ｈ−ＣＨ２−Ｃ（−Ｌ２−Ｚ２）Ｒ４（−Ｌｘ−Ｘ１）
［式中、
Ｚ１は、少なくとも１つの正に荷電した部分、例を挙げると、第一級、第二級、第三級または第四級アンモニウム基を含み、
Ｌ１は、スペーサー、特に−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎは、１から１０までの整数であり、ここで、ｎは、好ましくはｍであり、
Ｚ２は、Ｚ１に等しく、
Ｌ２は、スペーサー、特に−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−であり、ｍは、２から１０までの整数であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、水素であり、
Ｘ１は、アミン、例えば、ペプチド等の分析物分子のアミノ基と反応することができる、アミン反応性基であり、
ＬＸは、結合またはスペーサーである］
のものである、請求項１から７のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項９】
一般式（Ｉｂ）：
【化１】
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のものである、請求項１から８のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１０】
アイソトポログ、特に、Ｄ、１３Ｃ、１５Ｎおよび／または１８Ｏ、特に１３Ｃまたは１５Ｎから選択される少なくとも１つの同位体を含むアイソトポログである、請求項１から９のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項１１】
同重である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の少なくとも２つのアイソトポログ試薬を含む、組成物またはキット。
【請求項１２】
分析物分子の質量分析決定のための使用であって、前記質量分析決定が、特に、より特定すれば三連四重極デバイスにおけるタンデム質量分析決定を含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の試薬または請求項１１に記載の組成物もしくはキットの使用。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の化合物および分析物分子の反応によって形成される、共有結合付加体。
【請求項１４】
一般式（ＩＩ）の化合物：
Ｚ１−Ｌ１−（ＣＲ１Ｒ２）−Ｓ（Ｏ）−ＣＲ３Ｈ−ＣＨ２−Ｃ（−Ｌ２−Ｚ２）Ｒ４−（Ｌｘ−Ｘ’）−Ｔ
［式中、
Ｔは、分析物分子であり、
Ｘ’は、化合物（Ｉ）における基Ｘの、分析物分子Ｔとの反応から生じる部分であり、
Ｚ１、Ｌ１、Ｚ２、Ｌ２、Ｌｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、請求項１から１０のいずれか一項で定義されている通りである］
である付加体であって、
恒久的な正または負の電荷を担持し得る、請求項１３に記載の付加体。
【請求項１５】
分析物分子Ｔが、アミノ基含有ペプチドである、請求項１３または１４のいずれか一項に記載の付加体。
【請求項１６】
分析物分子の質量分析決定のための使用であって、前記質量分析決定が、特に、より特定すれば三連四重極デバイスにおけるタンデム質量分析決定を含む、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の付加体の使用。
【請求項１７】
分析物分子の定量的質量分析決定のための方法であって、
（ａ）比較するための少なくとも２つの分析物試料を提供するステップと、
（ｂ）各提供された試料中の前記分析物分子を、請求項１から９のいずれか一項に記載の一般式（Ｉ）の試薬と共有結合的に反応させ、それにより、各試料について、一般式（Ｉ）の異なるアイソトポログ試薬が使用され、それにより、異なる試料に使用される前記アイソトポログ試薬が、互いに同重であり、
それにより、各試料中で前記分析物分子および前記試薬の付加体が形成されるステップと、
（ｃ）前記分析物分子および前記同重試薬の付加体を含む少なくとも２つの試料を組み合わせるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの組み合わせた付加体を、質量分析解析に供するステップと
を含み、
質量分析解析ステップ（ｄ）が、好ましくは、
（ｉ）前記組み合わせた同重付加体のイオンを質量分析解析の第一段階に供し、
それにより、前記組み合わせた付加体のイオンが、それらの質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って特徴付けられること、
（ｉｉ）前記組み合わせた付加体イオンの断片化を引き起こし、
それにより、同じ電荷を有するレポーターイオンおよび相補的イオンが各付加体イオンから産出され、
それにより、非同重レポーターイオンおよび非同重相補的イオンが、比較される各当初提供された分析物試料に提供されること、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の非同重レポーターイオンおよび非同重相補的イオンを、質量分析解析の第二段階に供すること、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のレポーターイオンの相対的定量化、ならびに
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）の相補的イオンの相対的定量化
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチド等の分析物分子の質量分析決定において好適なスルホキシドベースの試薬ならびにそのような試薬および分析物分子の付加体、ならびに前記試薬および付加体の適用に関する。さらに、本発明は、分析物分子の質量分析決定のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
わずか数時間でヒトゲノミクス研究を可能にする新たなゲノム配列決定法の開発後［１］、今日では、今や細胞および組織の完全なプロテオームの調査を可能にする新規質量分析方法の出現を我々は目の当たりにしている［２−４］。
【０００３】
プロテオームは、試料中に存在するすべてのタンパク質の収集物として定義され、それ故、プロテオームは、細胞型ごとにおよび異なる組織において、劇的に異なる［５］。
したがって、プロテオミクスデータは、細胞の状況および潜在的に存在する病状についての指紋型情報を提供する［６］。生体系のプロテオームを深く洞察するためには、異なる試料における個々のタンパク質のレベルについての定量的情報を取得することが必要である。今日では、これは質量分析を用いて実施されている。無傷のタンパク質の厳密な定量化は困難であるため、方法は、対応するペプチドを得るためにプロテオームの消化（トリプシン処理）を必要とする。これらのペプチドの定量化のために、代謝標識化［７−８］、無標識定量化［９］または同重標識化［１０−１１］等の方法が実施される。
【０００４】
同重標識化は、ペプチド存在度における小さな差異でさえも明らかにすることができ、多くの試料が１つの測定で比較され得ることから、最も一般的に使用される定量化方法の１つである［１２］。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
しかしながら、特に、低い存在度を有するペプチドのまたは少量の材料（生検組織等）のみが利用可能である場合の、ＭＳによる定量的解析のために、ＭＳ解析方法の感度を増大させる必要性が依然としてある。
【０００６】
現在利用可能なＭＳ試薬の主な欠陥は、それらの低い開裂効率であり、これは、定量的解析に利用可能なレポーターイオン、およびしたがって、相補的イオンの数を低減させる［１３］。加えて、レポーターおよびバランサー単位の間の開裂は、相補的イオンペプチドの電荷状態を低減させ、これが、ＭＳ不可視中性種の形成につながり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
故に、本発明は、生物学的試料におけるペプチド等の分析物分子の極めて感度の高い決定を可能にするＭＳにおいて使用するための、新規スルホキシドベースの試薬に関する。さらに、試薬の同位体修飾されたバージョンの使用は、比較研究のための正確な定量的ＭＳデータを取得することを可能にする。特に、本発明の試薬は、複合混合物におけるペプチドの厳密な定量化を可能にするプロテオミクスにおいて使用されてよい。
【０００８】
故に、本発明の第一の態様は、一般式（Ｉ）：
Ｚ１−Ｌ１−（ＣＲ１Ｒ２）−Ｓ（Ｏ）−ＣＲ３Ｈ−ＣＨ２−Ｃ（−Ｌ２−Ｚ２）Ｒ４（−Ｌｘ−Ｘ）
［式中、
Ｚ１は、少なくとも１つの荷電部分を担持することができる電荷単位であり、
Ｌ１は、結合またはスペーサーであり、
Ｚ２は、少なくとも１つの荷電部分を担持することができる電荷単位であり、
Ｌ２は、結合またはスペーサーであり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、独立して、水素またはＣ１〜Ｃ３アルキルであり、
Ｘは、分析物分子と反応することができ、それにより、分析物分子との共有結合が形成される反応性基であり、
ＬＸは、結合またはスペーサーである］
のものである、質量分析のための試薬として好適な化合物である。
【０００９】
特定の態様において、化合物（Ｉ）は、アイソトポログ、すなわち、化合物の同位体的に中性の原子とも称される１つまたは複数の本明細書における主要な同位体、例えば、１Ｈ、１２Ｃ、１４Ｎおよび／または１６Ｏ原子が、少数の安定同位体、すなわち、Ｄ、１３Ｃ、１５Ｎおよび１８Ｏ等の安定同位体によって置きかえられた化合物として存在してよい。特に好ましいのは、１３Ｃおよび１５Ｎである。
【００１０】
本発明は、少なくとも１つの化合物（Ｉ）、および特に、好ましくは同重（ｉｓｏｂａｒｉｃ）であるそのような化合物（Ｉ）の複数の同位体的に異なる種を含む、試薬組成物または試薬キットにも関する。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、分析物分子の、特に、ペプチドまたはタンパク質等のアミノ基を含む分析物分子の質量分析決定のための、化合物（Ｉ）または少なくとも１つの化合物（Ｉ）を含む組成物もしくはキットの使用である。
【００１２】
本発明のまたさらなる態様は、化合物（Ｉ）および分析物分子の反応によって形成される共有結合付加体である。付加体は、一般式（ＩＩ）の化合物：
Ｚ１−Ｌ１−（ＣＲ１Ｒ２）−Ｓ（Ｏ）−ＣＲ３Ｈ−ＣＨ２−Ｃ（−Ｌ２−Ｚ２）Ｒ４−（Ｌｘ−Ｘ’）−Ｔ
［式中、
Ｔは、分析物分子であり、
Ｘ’は、化合物（Ｉ）における基Ｘの、分析物分子Ｔとの反応から生じる部分であり、
Ｚ１、Ｌ１、Ｚ２、Ｌ２、Ｌｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、請求項１から１０のいずれか一項で定義されている通りである］
であってよく、ここで、付加体は、恒久的な正または負の電荷を担持し得る。
【００１３】
式（Ｉ）の化合物および分析物分子、特にペプチド部分を含む分析物分子の付加体は、質量分析決定に使用され得る。付加体は、試料中に存在する分析物分子を化合物（Ｉ）と反応させることによって生成され得る。しかしながら、付加体は、校正物質および／または標準物質として使用するための純物質として提供されてもよい。
【００１４】
本発明のまたさらなる態様は、試料中における分析物分子の質量分析決定のための方法であって、
（ａ）分析物分子を本明細書において定義される通りの式（Ｉ）の化合物と共有結合的に反応させ、それにより、分析物分子および化合物（Ｉ）の共有結合付加体が形成されるステップと、
（ｂ）ステップ（ａ）からの付加体を質量分析解析に供するステップと
を含む、方法である。
【００１５】
本発明はさらに、ＭＳによるおよび特に定量的ＭＳによる分析物分子の決定に関する。分析物分子は、本発明の化合物（Ｉ）における反応性基Ｘと共有結合を形成することができる任意の物質であってよい。
【００１６】
例えば、分析物は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、アミノ酸、脂肪酸、脂質、ヌクレオシド、ヌクレオチド、核酸ならびに小分子代謝物および補因子を含む他の生体分子から選択される生体分子、ならびにそれらの薬物、農薬、毒素または代謝物であってよい。
【００１７】
概して、分析物分子は、生物学的、臨床的または環境的試料、例を挙げると、体液、例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液等、組織または細胞抽出物等中に存在し得る。本発明の一部の実施形態において、細胞または組織の完全溶解物は、さらに精製することなく使用され得る。しかし、当然ながら、分析物分子は、精製または部分的に精製された試料、例えば、精製または部分的に精製されたタンパク質混合物または抽出物である試料中に存在し得る。
【００１８】
とりわけ好ましい実施形態によれば、分析物分子は、ペプチドまたはタンパク質、特に、複合試料に含まれるペプチドまたはタンパク質である。例えば、細胞または組織の完全なプロテオームは、１つのＭＳ測定内で、目的のペプチドまたはタンパク質について解析され得る。好ましくは、単離後、プロテオーム、すなわち試料中のすべてのタンパク質の収集物が消化されて、より小さいペプチドを提供した後、本明細書において記述される試薬で標識化される。
【００１９】
特に好ましい実施形態において、分析物分子は、化合物（Ｉ）の反応性基Ｘと共有結合を形成することができる、アミノ基を有するタンパク質、ペプチドまたは物質である。そのようなアミノ基は、ペプチド鎖のＮ−末端アミノ基および／または側鎖の、例としてリジンのアミノ基であってよい。
【００２０】
別の実施形態によれば、分析物分子は、Ｃｙｓ含有ペプチド等の、化合物（Ｉ）の反応性基Ｘと共有結合を形成することができる少なくとも１つのチオール（ｔｈｉｏｌｅ）を含む。
【００２１】
当然ながら、解析されるペプチドまたはタンパク質は、グリコシル化、アシル化等の翻訳後修飾を含んでもよい。翻訳後修飾によってタンパク質に添加されるそのような残基も、本発明の試薬によって標的化され得る。
【００２２】
さらに、分析物分子は、炭水化物、または炭水化物部分、例えば糖タンパク質もしくはヌクレオシドを有する物質であってもよい。例えば、分析物分子は、単糖、例を挙げると、リボース、デオキシリボース（ｄｅｓｏｘｙｒｉｂｏｓｅ）、アラビノース、リブロース、グルコース、マンノース等、またはオリゴ糖、例えば、二糖、例を挙げると、スクロース、マルトースもしくはラクトースまたは三糖もしくは四糖および多糖、あるいはそのような単糖、オリゴ糖または多糖部分を含む物質であってよい。
【００２３】
分析物分子は、化合物（Ｉ）の反応性基Ｘと共有結合を形成することができる、カルボニル基、例えばアルデヒドもしくはケト基、またはマスクされたアルデヒドもしくはケト基、例えばヘミアセタール基、特に環式ヘミアセタール基を含んでよい。分析物分子は、化合物（Ｉ）との反応の前に、アルデヒド、ケトまたはヘミアセタール基に変換され得る、アセタール基を含んでもよい。
【００２４】
本発明の化合物（Ｉ）は、分析物分子と反応することができ、それにより、分析物分子との共有結合が形成される、反応性基Ｘを含む。好ましい実施形態において、基Ｘは、
（ｉ）カルボニル基を有する任意の種類の分子、例えば炭水化物分子と反応することができる、カルボニル反応性基、
（ｉｉ）チオール基を有する任意の種類の分子、例えばＣｙｓ含有ペプチドと反応することができる、チオール反応性基、または
（ｉｉｉ）アミノ基を有する任意の種類の分子、例えばアミノ基含有ペプチドと反応することができる、アミン反応性基
から選択される。
【００２５】
とりわけ好ましいのは、アミン反応性基である。
カルボニル反応性基は、隣接するＯもしくはＮ原子ＮＨ２−Ｎ／Ｏを介するα効果によって強化された超求核性Ｎ原子、またはジチオール分子のいずれかを有してよい。これは、
（ｉ）ヒドラジン基、例えばＨ２Ｎ−ＮＨ−またはＨ２Ｎ−ＮＲ１−基
［ここで、Ｒ１は、アリール、または、例えばハロ、ヒドロキシルおよび／もしくはＣ１〜３アルコキシで場合により置換されている、Ｃ１〜４アルキル、特にＣ１もしくはＣ２アルキルである］、
（ｉｉ）ヒドラゾン基、例えばＨ２Ｎ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−またはＨ２Ｎ−ＮＲ２−Ｃ（Ｏ）−基
［ここで、Ｒ２は、アリール、または、例えばハロ、ヒドロキシルおよび／もしくはＣ１〜３アルコキシで場合により置換されている、Ｃ１〜４アルキル、特にＣ１もしくはＣ２アルキルである］、
（ｉｉｉ）ヒドロキシルアミノ基、例えばＨ２Ｎ−Ｏ−基、
（ｉｖ）ジチオール基、特に１，２−ジチオール基または１，３−ジチオール基
から選択されてよい。
【００２６】
当然ながら、上述した通りのヒドラジンまたはヒドロキシルアミノ基は、分析物分子において存在する他の求電子性基と反応するために使用されてもよい。
チオール反応性基は、例えば、求電子性アルケン基、例えばＲ１Ｒ２Ｃ＝ＣＲ３−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−であってよく、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｈ、ハロゲンまたはＣ１〜４アルキル、好ましくはＨである。さらなるチオール反応性剤は、マレイミド、ハロゲン化アルキルまたはハロアセトアミド、特にヨードアセトアミドであってよい。
【００２７】
第一級または第二級アミン、例を挙げると、ペプチドまたはタンパク質のＮ−末端アミノ基、および例えばメチル化されたリジン側鎖からのメチル化アミンと、化学結合を形成することができる多数のアミノ反応性基がある。故に、本発明によれば、「アミノ反応性基」は、アシルアジド、イソチオシアネート、イソシアネート、ＮＨＳエステル、ペンタフルオロフェニルエステル（ｐｅｎｔａｆｌｕｏｒｐｈｅｎｙｌｅｓｔｅｒｓ）、ヒドロキシベンゾトリアゾールエステル、塩化スルホニル、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、ハロゲン化アリール、イミドエステル、カルボジイミド、無水物およびフルオロフェニルエステルを含む。
【００２８】
しかしながら、好ましい実施形態によれば、本明細書において使用される「アミノ反応性」基は、好ましくは、活性エステル基、例を挙げると、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）もしくはスルホ−ＮＨＳ、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）基またはイミドエステル−ＣＨ２−Ｃ（＝ＮＨ２＋）−Ｏ−ＣＨ３である。特に好ましいのは、ＮＨＳである。
【００２９】
化合物（Ｉ）は、少なくとも１つの荷電部分をそれぞれ担持することができる電荷単位Ｚ１およびＺ２を有し、すなわち、電荷単位Ｚ１およびＺ２は、例えば第四級アンモニウム基を使用する場合、恒久的に荷電されてよく、またはプロトン化（正の電荷）もしくは脱プロトン化（負の電荷）によって生成されてよい。
【００３０】
好ましくは、Ｚ１およびＺ２は等しく、かつ／またはＺ１およびＺ２は同じ電荷を有する。
特定の実施形態において、必ずしもそうとは限らないが、化合物（Ｉ）は、少なくとも１つの荷電部分、すなわち、実質的に中性条件下、荷電状態で主に存在する部分をそれぞれ含む、電荷単位Ｚ１およびＺ２を有する。
【００３１】
例えば、電荷単位Ｚ１およびＺ２は、
（ｉ）特に１０以上のｐＫａを有する、より特定すれば１２以上のｐＫａを有する、少なくとも１つの正に荷電した部分、例を挙げると、第一級、第二級、第三級または第四級アンモニウム基またはホスホニウム基、あるいは
（ｉｉ）特に１０以上のｐＫｂを有する、より特定すれば１２以上のｐＫｂを有する、少なくとも１つの負に荷電した部分、例を挙げると、ホスフェート、スルフェート、スルホネートまたはカルボキシレート基
をそれぞれ含んでよい。
【００３２】
好ましい実施形態によれば、Ｚ１およびＺ２は、いずれもｔｅｒｔ−アミノ基、すなわち−ＮＲ１Ｒ２であり、Ｒ１およびＲ２は、好ましくは、Ｃ１〜Ｃ５−アルキルであるか、またはＮ等の１もしくは２個のさらなるヘテロ原子を場合により含む５もしくは６員の環式アルキル環を形成する。Ｒ１およびＲ２等は、独立して選択されてよいが、好ましくは、Ｒ１およびＲ２は等しい。とりわけ、Ｒ１およびＲ２は、ジメチル−アミノおよびジエチル−アミノから選択されるか、または一緒になってピペリジンまたはピロリジン（ｐｙｒｏｌｉｄｉｎｅ）を形成する。
【００３３】
Ｚ１およびＺ２のそのようなプロトン化は、本発明の試薬の合成の最終ステップとして行われることができ、プロトン化された試薬は貯蔵されてよい。しかしながら、Ｚ１およびＺ２は、本発明の試薬の分析物分子との反応後であっても、より好ましいＭＳ解析の直前に、気相においてプロトン化されてもよい。Ｚ１およびＺ２のプロトン化により、試薬開裂中における中性種の形成が回避される。
【００３４】
一般式（Ｉ）における基Ｌ１、Ｌ２およびＬｘは、独立して、結合、すなわち共有結合、あるいは、スペーサー、すなわち、１から最大で通常４、６、８もしくは１０個までまたはさらに多くの原子の鎖長、例えば少なくとも１個のヘテロ原子、特にＮおよびまたはカルボニル基を場合により含むＣ原子を有する、線状または分枝鎖状スペーサーを表す。好ましくは、Ｌ１およびＬ２は、鎖長に関して等しく、場合によりヘテロ原子および／またはカルボニル基を含んでいたが、同位体組成により異なる場合がある、すなわち、Ｌ１およびＬ２は、互いにアイソトポログであってよい。
【００３５】
とりわけ好ましい実施形態によれば、Ｌ１および／またはＬ２基は、−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎおよび／または−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−であり、ｍおよびｎは、１から１０の間の整数である。
【００３６】
好ましい実施形態において、式（Ｉ）の化合物は、ペプチドまたはタンパク質分子の決定のための試薬として好適であり、一般式（Ｉａ）の化合物：
Ｚ１−Ｌ１−（ＣＲ１Ｒ２）−Ｓ（Ｏ）−ＣＲ３Ｈ−ＣＨ２−Ｃ（−Ｌ２−Ｚ２）Ｒ４（−Ｌｘ−Ｘ１）
［式中、
Ｚ１は、少なくとも１つの正に荷電した部分、例を挙げると、第一級、第二級、第三級または第四級アンモニウム基、特にプロトン化されたｔｅｒｔ−アミノ基、例を挙げると、プロトン化されたジメチル−アミノおよびジエチル−アミノ、ピペリジン（ｐｉｐｅｒｉｄｉｎ）またはピロリジン（ｐｙｒｏｌｉｄｉｎ）を含み、
Ｌ１は、スペーサー、特に−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎは、１から１０までの整数であり、ここで、ｎは、好ましくはｍであり、
Ｚ２は、Ｚ１に等しく、
Ｌ２は、スペーサー、特に−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−であり、ｍは、２から１０までの整数であり、
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、水素であり、
Ｘ１は、アミン、例えば、ペプチド等の分析物分子のアミノ基と反応することができる、アミン反応性基であり、
ＬＸは、結合またはスペーサーである］
であってよい。
【００３７】
Ｘ１は、好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、スルホ−ＮＨＳ、ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）またはイミドエステル−ＣＨ２−Ｃ（＝ＮＨ２＋）−Ｏ−ＣＨ３から選択される。
【００３８】
本発明に従う化合物の具体例は、式（Ｉｂ）の化合物：
【００３９】
【化１】
2020533579.tif 000003
【００４０】
である。
本発明のさらなる態様は、アイソトポログである式（Ｉ）の化合物に関する。用語「アイソトポログ」は、主要な同位体の少なくとも１つが、それぞれの主要な同位体の分子質量とは異なる分子質量を有するそれぞれの元素の安定な少数の同位体によって置きかえられている、化合物（Ｉ）に関する。故に、得られる（Ｉ）のアイソトポログは、同位体的に中性と称されるここでの主要な同位体からなるそれぞれの化合物の分子質量とは異なる分子質量を有する。分子質量におけるこの差異は、同位体的に中性の化合物およびそのアイソトポログの質量分析による差別化を可能にする。好ましい実施形態において、アイソトポログは、Ｄ（Ｈの置きかえとして）、１３Ｃ（１２Ｃの置きかえとして）、１５Ｎ（１４Ｎの置きかえとして）および１８Ｏ（１６Ｏの置きかえとして）から選択される少なくとも１つの同位体を含む。
【００４１】
アイソトポログにおいて、それぞれの同位体的に中性の原子の１つまたは複数および最大ですべては、同位体によって置きかえられてよい。それにより、単一化合物の多数の異なるアイソトポログが提供され得る。
【００４２】
例えば、上記で示した通りの式（Ｉａ）または（Ｉｂ）の化合物において、Ｌ１スペーサー、それぞれ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ［好ましくはｎ＝ｍである］および／またはＬ２スペーサー、それぞれ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｍ−［好ましくはｍ＞１である］における１つまたは複数またはすべての１４Ｎおよび１２Ｃ原子は、１５Ｎまたは１３Ｃによって置きかえられてよい。
【００４３】
化合物（Ｉ）は、同位体的に中性の化合物として、またはそれぞれの同位体的に中性の化合物からＭＳで区別可能であるアイソトポログとして、または同じ化合物の複数の異なるＭＳで区別可能なアイソトポログを含む組成物として、または同じ化合物の複数の異なるＭＳで区別可能なアイソトポログを別個の形態で含むキットとして、提供されてよい。試薬の複数の異なるＭＳで区別可能なアイソトポログを含む組成物またはキットは、後述される通りの多目的適用に特に好適である。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態において、組成物またはキットは、同重である、本明細書において記述される通りの少なくとも２つのアイソトポログ試薬を含む。例えば、式（Ｉ）に従う第一の試薬Ａには、１５Ｎまたは１３Ｃ等の重い安定同位体がＺ１またはＬ１に導入される。Ｚ２およびＬ２は変化しないままである。第二の試薬Ｂにおいて、Ｚ１およびＬ１は変化しないままであるが、試薬Ａのように同じ同位体がＺ２またはＬ２に導入される。得られる作用物質ＡおよびＢは、同重である（図１も参照）。
【００４５】
式（Ｉｂ）に従う試薬は、１５Ｎまたは１３Ｃ等の最大７つの重い安定同位体の、レポーターを生成する構造への、Δｍ／ｚ＝１での導入を、同重性（ｉｓｏｂａｒｉｃｉｔｙ）を保ちながら可能にする。
【００４６】
試薬の同重の特徴により、２つの試料に由来する同じ分析物分子は、付加体としてＭＳ分離中に同じ保持時間を特色とすることになる。同時に質量分析計に入ることで、異なる試料に由来し、異なるが同重な本発明の試薬で標識化された付加体は、ＭＳスクリーンにおける１つの区別不可能なｍ／ｚ値に至る。これは、ＭＳ２のための単一の前駆体ｍ／ｚを選択することによって、質量分析ベースの同定を実施することを可能にする。
【００４７】
故に、１から７つの安定同位体が導入されていながら同重である、式（Ｉｂ）の試薬を含むキットまたは組成物は、本発明の別の好ましい実施形態を表す。そのような設計は、１つの単一ＭＳ測定で並行して最大８つの異なる試料の質量分析定量化を可能にする。
【００４８】
そのアイソトポログを含む式（Ｉ）の好ましい化合物の合成は、実施例の項および図４において後述される。
本発明のまたさらなる態様は、分析物分子の質量分析決定のための、特に上述した通りのペプチド分析物分子の決定のための、式（Ｉ）の化合物の使用に関する。この使用は、化合物（Ｉ）との反応を利用する分析物分子の誘導体化を伴い、それにより、共有結合付加体が形成され、その後、ＭＳによる解析に供される。
【００４９】
ＭＳによるペプチド分子の定量的決定のための試薬としての化合物（Ｉ）の使用を伴う一般的なスキームが、図１に示される。特に、本発明に従う試薬（式１ｂ；ＳＯＴ）が、先行技術から公知の試薬と比較される。
【００５０】
付加体が正の電荷を含む場合、ＭＳ検出は正モードで発生する。付加体が負の電荷を有する場合、検出は負のＭＳモードで実施されることになる。
質量分析決定は、クロマトグラフ法、例を挙げると、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、特にＨＰＬＣ、および／またはイオン移動度ベースの分離技術を含む、追加の解析方法によって組み合わせられてよい。
【００５１】
本発明のさらなる態様は、上述した通りの一般式（Ｉ）の化合物および分析物分子の反応によって形成される付加体である。この反応を利用して、化合物（Ｉ）と分析物分子との間の共有結合が形成される。
【００５２】
好ましい実施形態において、付加体は、一般式（ＩＩ）の化合物：
Ｚ１−Ｌ１−（ＣＲ１Ｒ２）−Ｓ（Ｏ）−ＣＲ３Ｈ−ＣＨ２−Ｃ（−Ｌ２−Ｚ２）Ｒ４−（Ｌｘ−Ｘ’）−Ｔ
［式中、
Ｔは、分析物分子であり、
Ｘ’は、化合物（Ｉ）における基Ｘの、分析物分子Ｔとの反応から生じる部分であり、
Ｚ１、Ｌ１、Ｚ２、Ｌ２、Ｌｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、上記で定義されている通りである］
であり、ここで、付加体は、恒久的な正または負の電荷を担持し得る。
【００５３】
ＭＳ検出のために、式（ＩＩ）の付加体化合物は、正または負の電荷を担持する。この電荷は、好ましくは、化合物（Ｉ）の電荷単位Ｚ１およびＺ２によって、好ましくはＺ１およびＺ２のプロトン化によって提供される。しかしながら、化合物（Ｉ）における電荷の存在は、必要ではなく、なぜなら、例えば、分析物分子自体が電荷を担持する場合および／または付加体にプロトン化もしくは脱プロトン化を利用して電荷が提供され得る場合、他の手段によって電荷が提供され得るためである。
【００５４】
２つの電荷単位Ｚ１およびＺ２、好ましくはプロトン化されたｔｅｒｔ−アミノ基の存在は、より高い電荷状態につながり、これが、高い分析物分子／付加体断片化およびそれ故より正確な分析物分子同定をもたらす。その上、２つの荷電単位Ｚ１およびＺ２の存在は、付加体開裂／断片化中における中性種の形成を回避する。増大した電荷密度は、検出および断片化を容易にする。
【００５５】
本発明のまたさらなる態様は、分析物分子の質量分析決定のための付加体化合物（ＩＩ）の使用である。特に好ましい実施形態において、質量分析決定は、より特定すれば三連四重極デバイスにおけるタンデム質量分析決定を含み、ここで、分析物付加体の分子イオンは、例えば衝突誘起解離（ＣＩＤ）により、断片化に供される。
【００５６】
断片化中に、Ｚ１およびＬ１を含むレポーターイオンに加えて、相補的イオンであるバランサー−付加体コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔ）が、Ｚ２およびＬ２を含むバランサーを持つアーチ付加体（図１も参照）から生成される。結合したバランサーは、同重標識化試薬からの明確な同位体パターンを保持し、故に、相補的イオンは、定量化も可能にする。これは、レポーターイオンを目的のレポーターシグナルから区別不可能にする共溶出ペプチドが、シグナルを妨害することができないという利点を提供する。望ましくは、レポーターイオン解析に基づく正確な定量化を妨げている速度ひずみの公知の問題は、このようにして克服され得る。
【００５７】
一実施形態において、付加体化合物（ＩＩ）は、解析される試料中に存在する分析物分子の、試料に添加された化合物（Ｉ）との反応によって生成され得る。
さらなる実施形態において、付加体化合物（ＩＩ）は、校正物質としておよび／または標準物質として使用するための、純物質としても提供され得る。校正物質としての付加体化合物（ＩＩ）の使用は、具体的な分析物分子の検量線を生成することを伴い得、ここで、異なる公知の量の付加体化合物（ＩＩ）がＭＳ解析に供され、試料中に存在する未知の量の分析物分子の正確な定量的決定を可能にするために、それぞれのシグナル強度が測定される。
【００５８】
本発明のまたさらなる態様は、分析物分子の定量的質量分析決定のための方法であって、
（ａ）比較するための少なくとも２つの分析物試料を提供するステップと、
（ｂ）各提供された試料中の分析物分子を、本明細書において定義される通りの一般式（Ｉ）の試薬と共有結合的に反応させ、それにより、各試料について、一般式（Ｉ）の異なるアイソトポログ（ｉｓｏｔｏｐｏｌｏｇｏｕｓ）試薬が使用され、それにより、異なる試料に使用されるアイソトポログ試薬が、互いに同重であり、
それにより、各試料中で分析物分子および試薬の付加体が形成されるステップと、
（ｃ）分析物分子および同重試薬の付加体を含む少なくとも２つの試料を組み合わせるステップと、
（ｄ）ステップ（ｃ）からの組み合わせた付加体を、質量分析解析に供するステップと
を含み、
質量分析解析ステップ（ｄ）が、好ましくは、
（ｉ）組み合わせた同重付加体のイオンを質量分析解析の第一段階に供し、
それにより、組み合わせた付加体のイオンが、それらの質量／電荷（ｍ／ｚ）比に従って特徴付けられること、
（ｉｉ）組み合わせた付加体イオンの断片化を引き起こし、
それにより、同じ電荷を有するレポーターイオンおよび相補的イオンが各付加体イオンから産出され、
それにより、非同重レポーターイオンおよび非同重相補的イオンが、比較される各当初提供された分析物試料に提供されること、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の非同重レポーターイオンおよび非同重相補的イオンを、質量分析解析の第二段階に供すること、
（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）のレポーターイオンの相対的定量化、ならびに
（ｉｖ）ステップ（ｉｉ）の相補的イオンの相対的定量化
を含む、方法に関する。
【００５９】
当然ながら、ステップ（ａ）の分析物試料の１つは、標準または参照試料であってよい。このような手法で、１つの未知の試料中における分析物の量が決定され得る。しかしながら、本発明の方法によれば、複数の試料の同じ分析物が、１つのＭＳ測定内で定量化されることもでき、異なる試料の分析物含有量が比較されることもできる。
【００６０】
本発明は、対象、好ましくはヒト対象についての診断および／または予後情報を提供する等、臨床適用に好適である。具体的な適用は、細胞または組織のプロテオームにおける変更に関連する、それに付随するまたはそれによって引き起こされる疾患の診断、例えば、がん等の過剰増殖性疾患の診断、例えば、腫瘍の攻撃性および侵襲性の決定、血小板の特徴付けおよび肝線維症のレベルの測定、抗体の特徴およびＴ細胞等の免疫細胞の特徴の調査である。概して、試薬（Ｉ）およびそのアイソトポログは、細胞および／または組織における特異的タンパク質またはペプチドの存在およびレベルについての定量的情報を取得するために使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図１Ａは、定量的プロテオミクスについての同重標識化実験の図である。試料は、試薬１または２のアイソトポログで個々に標識化され、ＬＣ−ＭＳ研究のために組み合わせられる。気相における断片化は、相対的定量化のためのレポーターおよび相補的イオンを産出する。レポーターイオン比は、共単離ペプチド（紫色、＊）によってひずむ。相補的イオンクラスターは、そのようなひずみなしに解析され得る。図１Ｂは、現在使用されているＴＭＴ（１）試薬の図である。断片化は、バランサーに負の電荷を導入し、相補的イオンにおける全体的な電荷状態を低減させる。図１Ｃは、相補的イオンにおけるすべての電荷を保持して断片化を容易にする電荷中性断片化を用いる、この研究において報告されるスルホキシドタグ（ＳＯＴ、２）の図である。
【図２】図２Ａは、ペプチドにおけるＴＭＴ１およびＳＯＴ２の間の断片化効率の比較の図である。２８％ＨＣＤの正規化された衝突エネルギーにおいて、ＳＯＴ標識化ペプチド断片はより容易に、高いレポーターイオンシグナルを産出する。タグ＝反応した試薬。図２Ｂは、ＭＳ２実験において観察されたレポーターイオンＳＯＴ１８０相対強度の統計的解析の図である。レポーターイオンは、容易なレポーターイオン定量化を可能にする優れた視認性を呈する。図２Ｃは、ＴＭＴ（１）またはＳＯＴ（２）二重で標識化された前駆体ペプチドの電荷状態分布の図である。ＳＯＴ試薬を使用することにより、電荷状態が高くなるほど存在度が高くなり、これは、より高い電荷密度によるより効率的な断片化につながるはずである。
【図３】図３Ａは、相補的イオンクラスターの形成につながる、無傷の標識（レポーター＋バランサー）のいずれかを含有するまたはレポーターイオンの喪失を示すすべての同定された断片イオン（６７７２０）の比率の図である。図３Ｂは、同定されたペプチド種の統計的解析の図である。平均して、各ペプチドは、１５の個々の相補的イオンを形成し、これは、７〜８つの相補的イオンクラスターをもたらす。無傷の未開裂の標識を含有するペプチド断片の数は、信頼性の高いペプチド同定を確実にする。図３Ｃは、レポーターイオン（赤色）、７つの相補的イオンクラスター（橙色）および同定に使用される断片イオン（灰色）を描写する、標識化ペプチドＥＭＬＰＶＬＥＡＶＡＫ４＋のＭＳ２スペクトル例の図である。
【図４】図４Ａは、本発明の試薬２ならびにアイソトポログ２１７９および２１８０の描写の図である。図４Ｂは、ａ）３−（ジメチルアミノ）プロピオン酸塩酸塩、ＮＥｔ３、ＨＯＢｔ、６０℃、２時間、８５％；ｂ）インサイチュで２ステップにわたりｉ）ＴＣＥＰ＊ＨＣｌ、ＮａＨＣＯ３、Ｈ２Ｏ／ＤＭＦ（４：１）、室温、１０分；ｉｉ）ブロモ酢酸ベンジル、室温、２時間、９５％；ｃ）ＭｅＯＨ中１０％ギ酸、１００ｗｔ％Ｐｄ黒、４０℃、２時間、８１％；ｄ）Ｎ，Ｎ’−ジメチルエタン−１，２−ジアミン、ＤＩＰＥＡ、ＰｙＢＯＰ、ＤＭＦ、４０℃、１時間、７３％；ｅ）ＬｉＯＨ、ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ（２．５：１）、室温、１時間、１００％；ｆ）ｐＨ＝２、ｍＣＰＢＡ、Ｈ２Ｏ、室温、２０分、７５％；ｇ）ＮＨＳ−ＴＦＡ、ピリジン、ＤＭＦ、室温、２時間、３５％の図である。１７９Ｄａおよび１８０Ｄａは、生成されたレポーターイオンの分子量である。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
【実施例】
【００６３】
１．序論
２つの試料のプロテオームを単離し、消化し、ペプチドを、ＴＭＴ１等の同重標識化試薬（図１Ｂ）または本発明の標識化試薬２（図１Ｃ）と反応させる。
【００６４】
次に、調製された誘導体化ペプチド混合物を合わせ、混合物をＨＰＬＣ−ＭＳ［１４］またはさらにはＣＥ−ＭＳ［１５−１６］によって解析する。
分離中に、２つの試料（図１における青色および赤色）に由来する同じペプチドは、標識の同重の特徴により、同じ保持時間を特色とすることになる。これらは、その結果、同時に質量分析計に入ることになり、完全ＭＳ走査における１つの区別不可能なｍ／ｚ値に至る。これは、ＭＳ２のために単一の前駆体ｍ／ｚを選択することにより、質量分析ベースの同定を実施することを可能にする。同重標識の開裂は、現在２つの異なるレポーターイオン（Δ、図１Ａ）を提供しており、これは、相対的定量化を可能にする。
【００６５】
レポーターイオンに加えて、相補的イオンであるバランサー−ペプチドコンジュゲートも各ペプチドから生成される。結合したバランサーは、同重標識化試薬からの明確な同位体パターンを保持するため、相補的イオンは、定量化も可能にする［１３］。
【００６６】
これは、レポーターイオンを目的のレポーターシグナルから区別不可能にする共溶出ペプチド（紫色）が、シグナルを妨害することができないという利点さえも有する。速度ひずみとして公知であるこの問題は、多くの場合、レポーターイオン解析に基づく正確な定量化を妨げる［１７］。
【００６７】
現在利用可能な試薬の欠陥は、それらの低い開裂効率であり、これは、解析に利用可能なレポーターイオン、およびしたがって相補的イオンの数を低減させる。
加えて、レポーターおよびバランサー単位の間の開裂は、相補的イオンペプチドの電荷状態を低減させ、これが、ＭＳ不可視中性種の形成につながり得る。
【００６８】
２．結果および考察
ここで、本発明者らは、手際よくかつ高収率で断片化する新たなスルホキシドタグ試薬２（ＳＯＴ、図１）の開発を報告する。レポーターおよび相補的イオンの両方についての強い信号は、気相におけるスルホキシド断片化に基づいて生成される。重要なことに、試薬は、２つの塩基性ｔｅｒｔ−アミノ基を特色とし、これは、気相においてプロトン化される。これは、試薬開裂中における中性種の形成を回避する。対照的に、これは、電荷密度をさらに増大させ、これが検出および断片化を容易にする。ＳＯＴ試薬２は、原理上、最大７つの重い安定同位体の、レポーターを生成する構造への、Δｍ／ｚ＝１での導入を、同重性を保ちながら可能にする。この設計は、１つの単一測定で並行して８つの異なる試料の質量分析定量化を可能にするために選択された。
【００６９】
本発明の試薬２および２つの同重同位体誘導体（２１７９および２１８０）の合成は、異なるレポーターイオン分子量（１７９Ｄａおよび１８０Ｄａ）を特色とし、図４に示される（実施例の項目４も参照）。合成は、ホモシスチン二量体３のメチルエステルで出発し、これは、最初にジメチルアミノプロピオン酸でビス−アミド４に変換される。ジスルフィドの還元およびブロモ酢酸ベンジルによるチオールのアルキル化により、重要中間体５を得る。ベンジルエステルの６への開裂および６の１，１−ジメチルエチレンジアミンとの反応により、ビスアミド７を得る。７から８におけるメチルエステルの鹸化、スルフィドのスルホキシド９への酸化、および酸の変換により、試薬２を活性エステルとして提供する。必要とされるアイソトポログにアクセスするために、本発明者らは、第二の合成において、ジメチルアミノプロピオン酸を、１つのメチル基が１３Ｃ原子を担持する同じ化合物１０によって置きかえた（ＳＩ）。第三の合成において、本発明者らは、１３Ｃ標識化ベンジルブロモアセテート１１を使用した（ＳＩ）。これにより、対応する試薬２１７９および２１８０を同様の収率で得た。
【００７０】
本発明の試薬ＳＯＴ２の断片化特性を検査するために、本発明者らは、標準プロトコール（ＳＩ）に準拠し、すべての翻訳されたタンパク質を対応するペプチド中に含有する完全大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物を消化した。取得された複合ペプチド混合物（Ｐ）を２つの部分に分割した。一方の部分を試薬２１７９（Ｐ−２１７９）と反応させる間に、他方を２１８０と合わせて、Ｐ−２１８０を得た（ｐＨ＝８．５、１５０ｍＭ重炭酸トリエチルアンモニウム緩衝液、３ｍｇ２、６０分）。本発明者らは、その後、未反応の試薬２をヒドロキシルアミンでクエンチした。次に、標識化された混合物｛Ｐ−２１７９＋Ｐ−２１８０｝を１：１比で合わせ、複合混合物を脱塩し、報告された手順に従って濃縮した［１８］。
【００７１】
比較のために、本発明者らは、市販の同位体で標識化されたＴＭＴ試薬１（二重）を用い、製造業者の推奨事項に従って同じ実験を実施して、混合物｛Ｐ−ＴＭＴ１２６＋Ｐ−ＴＭＴ１２７｝を取得した。ペプチド混合物｛Ｐ−２１７９＋Ｐ−２１８０｝および｛Ｐ−ＴＭＴ１２６＋Ｐ−ＴＭＴ１２７｝を次にナノＨＰＬＣ−ＭＳ２によって測定し、ＭａｘＱｕａｎｔソフトウェアおよび自社開発したソフトウェアパッケージを使用してデータを解析した（ＳＩ）［１９］。取得されたデータは図２および図３に描写される。
【００７２】
一例として、図２Ａは、ペプチドＡＬＥＧＤＡＥＷＥＡＫ２＋（２つの標識）との反応後のＳＯＴ試薬２の開裂を、複合混合物中の対応するＴＭＴ標識化ペプチドとの直接比較で示す。本発明者らは、２８％ＨＣＤの正規化した断片化エネルギー（高エネルギー衝突解離）で測定し、これは、それらの同定のためにペプチドを断片化するために理想的に適合する。ＳＯＴ試薬２は、明らかにより多くのレポーターイオンを生成し、加えて、本発明者らがより多くの断片イオンを観察することから、試薬は、ペプチド断片化を支持するように思われる。図２Ｂは、ＳＯＴ標識化試料において同定されたすべてのペプチドの解析を示し、ここで、本発明者らは、ＭＳ２スペクトルの大多数において、相対的レポーターイオン強度が、前代未聞である８０〜１００％の高さに達することが分かる。
【００７３】
これは、利用可能なソフトウェアパッケージを用いてレポーターイオン比率を決定することにより、簡単な相対的定量化を可能にする。図２Ｃは、断片化の前の無傷の標識化ペプチド（前駆体）の電荷状態を示す。本発明者らの設計に一致して、本発明者らは、ＳＯＴ試薬２が、はるかに高い電荷状態を持つ標識化ペプチドを生成することが分かる。重要なことに、標識化ペプチドの６０％超が、＋３以上の電荷状態を有する。この高い電荷密度は、その後の断片化を容易にし、これが、厳密な解析のためのさらなるデータをもたらす。
【００７４】
レポーターイオン強度はＰ−２１８０対Ｐ−２１７９中に存在するすべてのペプチド間の相対比を測定することを可能にするが、多くの場合、バランサー−ペプチドコンジュゲートによって生成された相補的イオンクラスターを用いて定量化することが望ましい。これらのバランサー−コンジュゲートは質量分析計においてさらに断片化するため、多数の相補的イオンクラスターが形成され、これらは配列特異的であり、すべて定量化に使用され得る。これは、より高いデータ密度を提供し、これが速度ひずみに関連する問題を回避する。本発明者らの実験において、本発明者らは、ＳＯＴ試薬２が、そのような相補的イオンクラスター解析のためのほぼ完璧な特性を有することを観察する。本発明者らが標識含有ペプチド断片イオンを研究した際、本発明者らは、これらの断片の５３％が依然として無傷の試薬２を含有するが、４７％がレポーター基を喪失して相補的イオンクラスターを産出することが分かった（図３Ａ）。この完璧に近い１：１比は、標準的なデータベース検索アルゴリズムおよび豊富に形成された相補的イオンクラスターを介する定量化を用いて、（無傷の）ペプチドの並行同定を可能にする。図３Ｂは、ＳＯＴ試薬２がすべての前駆体から後の定量化のために平均して１５のペプチド−バランサー断片を作成し、これはおよそ７〜８つの相補的イオンクラスターに対応することを示す。図３Ｃは、１つのペプチドからのスペクトルを例として示す。レポーターイオン（赤色）および１４の相補的イオンを包括する７つの相補的イオンクラスター（橙色）のシグナルは、高い相対強度で明らかに可視である。ペプチドの同定のために、複数の高強度イオンが利用可能である（灰色）。
【００７５】
３．結論
要約すると、本発明者らは、精密なペプチド定量化のためのレポーターイオンおよび相補的イオンクラスターの効率的な並行形成を可能にする、新たな同重標識化試薬の設計を報告する。試薬は、速度ひずみによって引き起こされる定量化誤差を排除するのを助ける。これは、複合試料中であっても相対的なペプチドおよびそれ故タンパク質存在度の正確な決定を初めて可能にする。ＳＯＴ試薬２の最も重要な特性は、レポーターイオンおよび相補的イオンクラスターが並行して形成されること、ならびに複数のｔｅｒｔ−アミノ基の導入が、期待されるより高い電荷状態を生成し、これがより良好なペプチド断片化およびそれ故より正確なペプチド同定をもたらすことである。
【００７６】
４．化学合成手順
４．１  出発材料の合成
【００７７】
【化２】
2020533579.tif 000004
【００７８】
ブロモ酢酸ベンジル（１２）典型的な手順１（ＴＰ１）
撹拌子およびセプタムを備えた乾燥およびＡｒフラッシュした５０ｍＬのシュレンクフラスコに、市販のブロモ酢酸（１．００ｇ、７．１９ｍｍｏｌ、１．１６当量）、フェニルメタノール（０．６４ｍＬ、６．２０ｍｍｏｌ、１．００当量）および４−メチルベンゼン−１−スルホン酸（２１．３６ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ、０．０２当量）を、１０ｍＬトルエンの存在下、２時間還流で添加した。完了後、反応混合物を室温に冷却し、２０ｍＬの水中２０％重炭酸ナトリウム溶液で２回洗浄し、続いて、ブラインおよび水洗浄した。合わせた有機層を硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ  １：４）による精製により、１２を無色油として産出した（１．３８ｇ、８４％）。
1H-NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 7.46 - 7.13 (m, 1H), 5.16 (s, 1H), 3.95 (s, 6H) ppm.
【００７９】
【化３】
2020533579.tif 000005
【００８０】
ベンジルブロモ（２−１３Ｃ）アセテート（１１）
ＴＰ１に準拠して、ブロモ酢酸−２−１３Ｃ（５００ｍｇ、３．６０ｍｍｏｌ、１．１６当量）およびフェニルメタノール（０．３２ｍＬ、３．１０ｍｍｏｌ、１．００当量）を、４−メチルベンゼン−１−スルホン酸（１０．６８ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ、０．０２当量）と、５ｍＬのトルエンの存在下、２時間還流で反応させ、通常通りに後処理した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＥｔＯＡｃ／ＤＣＭ  １：４）による精製により、１１を無色油として産出した（４２７ｍｇ、５２％）。
1H-NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 7.41 - 7.33 (m, 5H), 5.20 (s, 2 H), 4.18 (s, 1H), 3.80 (s, 1H) ppm. ＨＲＭＳ（ＥＩ＋）：Ｃ８１３ＣＨ１０ＢｒＯ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：２２９．９８１９；実測値：２２９．９７１８。ＩＲ（ｃｍ−１）：ｖ＝３０６５、１７３３、１５８７、１４９７、１４５５、１３７６、１２７８、１２１３、１１４７、１１０６、９６７、７３６。
【００８１】
【化４】
2020533579.tif 000006
【００８２】
メチル３−［ベンジル（メチル）アミノ］プロパノエート（１３）
メチル−３−ブロモプロパノエート（３．００ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）およびＮ−メチル−１−フェニルメタンアミン（２．１８ｇ、１８．０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１２０ｍＬ）に溶解した。室温で２分間撹拌した後、Ｎａ２ＣＯ３（１９．０ｇ、１８０ｍｍｏｌ）を添加し、温度を７０℃に２４時間にわたって上昇させた。冷却した後、反応溶液を濾過し、１２０ｍＬのＤＣＭを濾液に添加した。有機相を０．５Ｍ  ＮａＯＨ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濾過後、生成物を減圧下で濃縮して、１３を無色油として産出した（３．４４ｇ、１６．５ｍｍｏｌ  ９２％）。
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 7.30 - 7.18 (m, 5H, C6H5-CH2-N), 3.63 (s, 3H, -COOCH3), 3.48 (s, 2H, C6H5-CH2-N), 2.71 (t, J = 7.2 Hz, 2H, -N-CH2-CH2-), 2.49 (t, J = 7.2 Hz, 2H, -CH2-COOCH3), 2.17 (s, 3H, -N-CH3). 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 173.00 (-COOCH3), 138.85 (q), 128.95, 128.24および127.04 (C6H5-CH2), 62.12 (C6H5-CH2), 52.75 (-N-CH2-CH2-), 51.56 (-COOCH3), 41.91 (-N-CH3), 32.75 (CH2-COOCH3). ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１２Ｈ１８ＮＯ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：２０８，１３３２１；実測値：２０８．１３３１３。ＩＲ（ｃｍ−１）：ｖ＝２９５０（ｗ）、２８４１（ｗ）、２７９０（ｗ）、１７３７（ｓ）、１４９５（ｗ）、１４５２（ｍ）、１２３６（ｍ）、１３５７（ｗ）、１３２５（ｗ）、１２０２（ｍ）、１１６８（ｓ）、１１２５（ｍ）、１９７５（ｗ）、１０３８（ｍ）、１０２５（ｍ）。
【００８３】
【化５】
2020533579.tif 000007
【００８４】
３−（メチルアミノ）プロパン酸塩酸塩（１４）
火炎乾燥したシュレンク管中、メチル３−［ベンジル（メチル）アミノ］プロパノエート１３（１ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（６０ｍＬ）に溶解した。次いで、管の雰囲気をＮ２でパージし、１０ｗｔ％のＰｄ／Ｃ（１００ｍｇ）を溶液に少量ずつ添加した。雰囲気をＮ２で再度パージして、酸素が残っていないことを確認した。Ｈ２を充填した二層ラテックスバルーンをシュレンク管に取り付け、反応物を室温で１６時間にわたって撹拌した。６時間および１０時間後、バルーンにＨ２を補充した。Ｐｄ／Ｃをセライトで濾過除去した。蒸発は帯黄色油をもたらした。粗揮発性生成物を、さらに精製することなく次のステップに使用した。得られたメチルエステルを５Ｍ  ＨＣｌに溶解し、８時間にわたって還流した。溶液を蒸発乾固させた。ＭｅＯＨ／エトキシエタンからの再結晶により、所望生成物１４を無色の吸湿性結晶として産出した（４７８ｍｇ、３．４２ｍｍｏｌ、７１％）。
融点：８９〜９２℃。1H-NMR (400 MHz, D2O) δ 3.28 (t, J = 6.4 Hz, 2H, -N-CH2-CH2-), 2.81 (t, J = 6.5 Hz, 2H, -CH2-COOH), 2.72 s (3H, CH3) ppm. 13C NMR (101 MHz, CDCl3): δ 174.11 (-COOH), 44.36 (-N-CH2-CH2-), 32.99 (-CH2-COOH), 29.90 (CH3) ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ４Ｈ１０ＮＯ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：１０４．０７０６０；実測値：１０４．０７０６３。ＩＲ（ｃｍ−１）：ｖ＝３３７６（ｗ）、２９６８（ｓ）、２８１９（ｓ）、１７２９（ｓ）、１５５７（ｗ）  １４６５（ｍ）、１４０２（ｓ）  １３５１（ｗ）、１２８９（ｗ）、１１８９（ｓ）、１１５６（ｓ）、１０２４（ｓ）。
【００８５】
【化６】
2020533579.tif 000008
【００８６】
３−｛メチル［（１３Ｃ）メチル］アミノ｝プロパン酸塩酸塩
（１０）３−（メチルアミノ）プロパン酸塩酸塩１４（４０１ｍｇ、２．８７ｍｍｏｌ、１．００当量）を８８％ギ酸（１．７９ｍＬ、４４．８ｍｍｏｌ、１５．６当量）に溶解した。次いで、（１３Ｃ）ホルムアルデヒド（水中２０％；１ｇ、６．４５ｍｍｏｌ、２．２５当量）を添加し、溶液を、１１０℃、１００Ｗのマイクロ波照射（ｉｒｒｉｄａｔｉｏｎ）を介し、１時間にわたって加熱した。２００μＬのＨＣｌを添加し、溶媒を真空で除去した。微量のギ酸を真空でトルエンと共沸させて除去した。わずかに黄色を帯びた固体をＭｅＯＨ／エトキシエタンから再結晶させて、無色固体（３８３ｍｇ、２．４８ｍｍｏｌ、８６％）を取得した。
融点：１８３℃。1H-NMR (400 MHz, D2O): δ 3.30 (td, J = 6.7, 3.0 Hz, 2H, -N-CH2-CH2-), 2.97 - 2.60 (m, 8H, -CH2-COOH, -CH3, -13CH3) ppm. 13C-NMR (101 MHz, D2O): δ = 174.06 (-COOH), 53.10 (-N-CH2-CH2-), 43.34 (-CH3), 42.78 (-13CH3), 28.78 (-CH2-COOH) ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ４１３ＣＨ１２ＮＯ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値１１９．０８９６１、実測値１１９．０８９６０。ＩＲ（ｃｍ−１）：ｖ＝２９５７（ｍ）、２６９２（ｍ）、２５９２（ｗ）、２４８１（ｗ）、１７１７（ｓ）、１４６８（ｗ）、１４２０（ｍ）、１３７０（ｗ）、１３００（ｗ）、１２０１（ｓ）  １１６１（ｍ）、１００６（ｗ）、９６６（ｍ）、８５４（ｓ）、７９８（ｍ）。
【００８７】
４．２  一般的な合成手順
下記の項において、化合物２１７９は２＊＊として割り当てられ、化合物２１８０は２＊として割り当てられる。
【００８８】
【化７】
2020533579.tif 000009
【００８９】
メチル（２Ｒ）−２−アミノ−４−｛［（３Ｓ）−３−アミノ−４−メトキシ−４−オキソブチル］ジスルファニル｝ブタノエート（３）
撹拌子およびセプタムを備えた乾燥およびＡｒフラッシュした２５０ｍＬのシュレンクフラスコに、無水ＭｅＯＨ（８０ｍＬ）に溶解した市販のＤＬ−ホモシスチン（４，４’−ジスルファンジイルビス（２−アミノブタン酸）、６．０ｇ、２２．３６ｍｍｏｌ、１．０当量）を投入した。白色スラリー溶液を０℃に冷却し、シリンジを介して塩化チオニル（ｔｈｉｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄ）（６．４８ｍＬ、８９．４４ｍｍｏｌ、４．０当量）を滴下添加した。得られた無色の反応混合物を、３時間かけて室温に加温させた。次いで、反応混合物を真空で終夜濃縮して、３を白色固体として産出した（６．６ｇ、１００％）。
1H-NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 4.21 (t, J = 6.5 Hz, 2H), 3.86 (s, 6H), 3.35 (s, 2H), 2.84 (m, 5H), 2.47 - 2.22 (m, 5H) ppm. 13C-NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 170.53, 53.87, 52.61, 33.57, 30.91 ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１０Ｈ２１Ｎ２Ｏ４Ｓ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：２９７．０８６４；実測値：２９７．０９３８０。ＩＲ（ｃｍ−１）：ｖ＝３３７３、２８５４、２６１１、２００３、１７３８、１５９１、１５０３、１４３９、１２２４、１１３９、８６０。
【００９０】
【化８】
2020533579.tif 000010
【００９１】
メチル（２Ｒ）−２−［３−（ジメチルアミノ）プロパンアミド］−４−（｛（３Ｓ）−３−［３−（ジメチル−アミノ）プロパンアミド］−４−メトキシ−４−オキソブチル｝ジスルファニル）ブタノエート（４）典型的な手順２（ＴＰ２）
撹拌子およびセプタムを備えた乾燥およびＡｒフラッシュした５０ｍＬのシュレンクフラスコに、市販の３−（ジメチルアミノ）プロパン酸塩酸塩（３７０ｍｇ、２．４０ｍｍｏｌ、２．４当量）およびメチルエステル３（３００ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、５ｍＬの無水ＤＭＦに溶解した。次いで、ＴＥＡ（０．２９ｍＬ、２．１２ｍｍｏｌ、３．５当量）、ＨＯＢＴ（３４０ｍｇ、２．５０ｍｍｏｌ、２．５当量）およびＥＤＣ（５０２ｍｇ、２．６１ｍｍｏｌ、２．６当量）を添加し、６０℃で２時間にわたって撹拌した。得られた橙色のスラリー反応混合物を真空で濃縮した。フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ  １６：１）による精製により、４を白色固体として得た（４２６ｍｇ、８５％）。
1H-NMR (800 MHz, メタノール-d4) δ = 4.62 - 4.55 (m, 1H), 3.75 (d, J=1.5, 2H), 3.37 (s, 1H), 2.84 - 2.79 (m, 1H), 2.78 - 2.72 (m, 1H), 2.71 - 2.63 (m, 2H), 2.46 (td, J=7.3, 2.8, 2H), 2.30 (s, 6H), 2.10 - 2.04 (m, 1H) ppm. 13C-NMR (201 MHz, メタノール-d4) δ = 174.37, 173.54, 52.88, 52.37, 49.85, 35.59, 35.52, 34.14, 32.13 ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ２０Ｈ３９Ｎ４Ｏ６Ｓ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：４９４．２２３３；実測値：４９５．２３０３４。ＩＲ（ｃｍ−１）：ｖ＝３３８２、２９５３、２８３３、２４９８、２０６９、１７３３、１６４３、１５４８、１４３９、１２２２、１１７３、１１１９、９７７、８５６。
【００９２】
【化９】
2020533579.tif 000011
【００９３】
ジメチル−４，４’−ジスルファンジイル（２Ｒ，２’Ｓ）−ビス（２−（３−（メチル（メチル−１３Ｃ）アミノ）−プロパンアミド）−ブタノエート）（４＊＊）
ＴＰ２に準拠し、先に合成した３−｛メチル［（１３Ｃ）メチル］アミノ｝プロパン酸塩酸塩１０（２２０ｍｇ、１．４２ｍｍｏｌ、２．２０当量）およびメチルエステル３（２３８ｍｇ、０．６４５ｍｍｏｌ、１．００当量）により、４＊＊を白色固体として得た（２００ｍｇ、６２％）。
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ 4.57 (ddd, J = 8.5, 4.8, 3.1 Hz, 1H), 3.73 (s, 6H), 2.83 - 2.59 (m, 4H), 2.46 - 1.99 (m, 20H). ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１８１３Ｃ２Ｈ３９Ｎ４Ｏ６Ｓ２＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：４９７．２２８８９；実測値：４９７．２３７９２。
【００９４】
【化１０】
2020533579.tif 000012
【００９５】
メチル（２Ｓ）−４−｛［２−（ベンジルオキシ）−２−オキソエチル］スルファニル｝−２−［３−（ジメチルアミノ）プロパンアミド］ブタノエート（５）典型的な手順３（ＴＰ３）
先に合成したジスルフィド４（７５０ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ、１．０当量）を、撹拌子およびセプタムを備えた乾燥およびＡｒフラッシュした５０ｍＬのシュレンクフラスコに添加し、５ｍＬのＨ２Ｏおよび１５ｍＬのＤＭＦの混合物に溶解した。次いで、ＮａＨＣＯ３（５３５ｍｇ、６．３７ｍｍｏｌ、４．２当量）およびＴＣＥＰ（４３５ｍｇ、１．５１ｍｍｏｌ、１．０当量）を反応混合物に添加した。質量を介する低減の完了後、市販のブロモ酢酸ベンジル（０．６ｍＬ、３．７９ｍｍｏｌ、２．５０当量）を添加し、室温で２時間にわたって撹拌した。次いで、得られた反応混合物を真空で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中５％ＭｅＯＨ）により精製して、５を無色油として得た（５１０ｍｇ、４２％）。
1H-NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 7.53 - 7.15 (m, 5H), 5.18 (s, 2H), 4.56 (dd, 3J = 8.9, 2J = 4.8 Hz, 1H), 3.71 (s, 3H), 3.33 (s, 2H), 2.75 - 2.58 (m, 4H), 2.45 (t, 3J = 7.2 Hz, 2H), 2.29 (s, 6H), 2.17 - 2.05 (m, 1H), 2.02 - 1.90 (m, 1H) ppm. 13C-NMR (151 MHz, CDCl3) δ = 172.58, 172.51, 170.15, 135.60, 128.73, 128.52, 128.37, 67.18, 55.11, 52.47, 51.05, 44.59, 33.52, 32.82, 31.82, 28.47 ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１９Ｈ２９Ｎ２Ｏ５Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３９７．１７１９；実測値：３９７．１７９０８。ＩＲ（ｃｍ−１）：ｖ＝３２８５、２９５０、２８６４、１７３６、１６５５、１５３９、１４５５、１４４０、１３７４、１２７１、１２１３、１１７０、１１４６、１０２５、７４８、６９８。
【００９６】
【化１１】
2020533579.tif 000013
【００９７】
メチル（２Ｓ）−４−｛［２−（ベンジルオキシ）−２−オキソ（１−１３Ｃ）エチル］スルファニル｝−２−［３−（ジメチルアミノ）プロパンアミド］ブタノエート（５＊）
ＴＰ３に準拠し、ジスルフィド４（３７０ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、１．０当量）を、先に合成したベンジルブロモ（２−１３Ｃ）アセテート１１（２９４μＬ、１．８６ｍｍｏｌ、２．３当量）と反応させて、５＊を無色油として得た（５５０ｍｇ、９２％）。
1H-NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 7.42 - 7.28 (m, 5H), 5.16 (s, 2H), 4.59 - 4.52 (m, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.50 (s, 1H), 3.15 (s, 1H), 2.93 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.75 - 2.60 (m, 2H), 2.56 (t, J = 7.0 Hz, 2H), 2.50 (s, 6H), 2.19 - 2.05 (m, 1H), 2.04 - 1.86 (m, 1H) ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１８１３ＣＨ２９Ｎ２Ｏ５Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３９８，１７５２；実測値：３９８．１８２３５。
【００９８】
【化１２】
2020533579.tif 000014
【００９９】
メチル（２Ｓ）−４−｛［２−（ベンジルオキシ）−２−オキソエチル］スルファニル｝−２−（３−｛メチル［（１３Ｃ）メチル］アミノ｝プロパンアミド）ブタノエート（５＊＊）
ＴＰ３に準拠し、ジスルフィド４＊＊（２００ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ、１．０当量）により、５＊＊を無色油として得た（２５２ｍｇ、７９％）。
1H-NMR (400 MHz, メタノール-d4): δ = 7.40 - 7.28 (m, 5H), 5.15 (s, 2H), 4.53 (dd, J = 8.93, 4.90 Hz), 3.69 (s, 3H), 2.73 - 2.56 (m, 4H), 2.44 - 1.87 (m, 10H). 13C-NMR (101 MHz, メタノール-d4) δ = 174.49, 173.61, 171.96, 137.34, 129.58, 129.32, 129.25, 67.94, 56.03, 52.80, 52.55, 45.08, 34.17, 33.97, 32.01, 29.51. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）Ｃ１８１３ＣＨ２９Ｎ２Ｏ５Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３９８．１８２５２；実測値：３９８．１８２５６。
【０１００】
【化１３】
2020533579.tif 000015
【０１０１】
（｛（３Ｓ）−３−［３−（ジメチルアミノ）プロパンアミド］−４−メトキシ−４−オキソブチル｝スルファニル）酢酸（６）典型的な手順４（ＴＰ４）
先に合成したベンジル保護スルフィド５（１６０ｍｇ、０．４０ｍｍｏｌ、１．０当量）を、撹拌子およびセプタムを備えた乾燥およびＡｒフラッシュした２５ｍＬのシュレンクフラスコに添加し、３〜４ｍＬの１０％ギ酸−メタノールに溶解した。次いで、およそ１６０ｍｇのパラジウム黒触媒を反応混合物に添加し、４０℃で２時間にわたって撹拌した。質量およびＴＬＣを介する脱保護の完了後、反応混合物を濾過し、真空で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＤＣＭ中２５％ＭｅＯＨ）により精製して、６を無色油として得た（１００ｍｇ、８１％）。
1H-NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 4.61 (dd, J = 9.4, 4.2 Hz, 1H), 3.27 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.21 (t, J = 6.5 Hz, 1H), 3.12 (s, 2H), 2.75 (s, 6H), 2.73 - 2.55 (m, 3H), 2.18 - 2.07 (m, 1H), 2.05 - 1.93 (m, 1H) ppm. ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１２Ｈ２３Ｎ２Ｏ５Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３０７，１２４９；実測値：３０７．１０。ＩＲ（ｃｍ−１）：ｖ＝３２５３、１７３４、１６５２、１５７４、１４６８、１３７２、１２１７、１１４７、１０８４、９７７、７６１。
【０１０２】
【化１４】
2020533579.tif 000016
【０１０３】
（｛（３Ｓ）−３−［３−（ジメチルアミノ）プロパンアミド］−４−メトキシ−４−オキソブチル｝スルファニル）（２−１３Ｃ）酢酸（６＊）
ＴＰ４に準拠：５＊（５８０ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ、１．０当量）により、６＊を無色油として得た（２８０ｍｇ、６２％）。
1H-NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 4.62 (dd, J = 4.62 (dd, J=9.4, 4.2, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.35 (s, 2H), 3.30 - 3.24 (m, 2H), 3.17 (dq, J=13.0, 6.4, 1H), 2.74 (s, 6H), 2.72 - 2.60 (m, 4H), 2.18 - 1.94 (m, 2H) ppm. 13C-NMR (101 MHz, メタノール-d4) δ = 173.85, 172.39, 170.21, 55.22, 52.79, 49.85, 44.01, 37.30, 31.80, 31.62, 29.24 ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１１１３ＣＨ２３Ｎ２Ｏ５Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３０８．１２８３；実測値：３０８．１３５６４。
【０１０４】
【化１５】
2020533579.tif 000017
【０１０５】
｛［（３Ｓ）−４−メトキシ−３−（３−｛メチル［（１３Ｃ）メチル］アミノ｝プロパンアミド）−４−オキソブチル］スルファニル｝酢酸（６＊＊）
ＴＰ４に準拠：５＊＊（２５２ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌ、１．０当量）により、６＊＊を無色油として得た（１８１ｍｇ、９３％）。
1H NMR (400 MHz, メタノール-d4): δ 4.61 (dd, J = 9.5, 4.2 Hz, 1H), 3.70 (s, 3H), 3.38 - 3.16 (m, 4H), 3.08 (d, J = 3.26 Hz, 2H), 2.94 - 2.59 (s, 10H) ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１１１３ＣＨ２３Ｎ２Ｏ５Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３０８．１３５５７；実測値３０８．１３５６９。
【０１０６】
【化１６】
2020533579.tif 000018
【０１０７】
メチル（２Ｓ）−４−［（２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）スルファニル］−２−［３−（ジメチルアミノ）プロパンアミド］ブタノエート（７）：典型的な手順５（ＴＰ５）：先に合成した酸６（１００ｍｇ、０．３３ｍｍｏｌ、１．０当量）を、撹拌子およびセプタムを備えた乾燥およびＡｒフラッシュした５０ｍＬのシュレンクフラスコに添加し、１０ｍＬの乾燥ＤＭＦに溶解した。次いで、市販のＮ１，Ｎ２−ジメチルエタン−１，２−ジアミン（４２μＬ、０．３９ｍｍｏｌ、１．２当量）、ＤＩＰＥＡ（８３μＬ、０．４９ｍｍｏｌ、１．５当量）およびＰｙＢＯＰ（２０３ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１．２当量）を添加し、反応混合物を室温で１時間にわたって撹拌した。質量を介するアミド化の完了後、反応混合物を真空で濃縮し、フラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、１：１２  ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）により精製して、７を無色油として得た（９０ｍｇ、７３％）。
1H-NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 4.56 (dd, J = 9.0, 4.8, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.38 - 3.32 (m, 2H), 3.19 (d, J=1.3, 2H), 2.74 - 2.57 (m, 4H), 2.47 (dt, J = 11.6, 6.8, 4H), 2.30 (d, J = 4.3, 12H), 2.12 (dddd, J = 13.2, 8.3, 7.2, 4.9, 1H), 2.03 - 1.92 (m, 1H) ppm. 13C-NMR (101 MHz, メタノール-d4) δ = 174.36, 173.65, 172.47, 59.04, 55.99, 52.82, 52.64, 45.47, 45.03, 38.22, 35.97, 34.00, 32.11, 29.70 ppm. ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１６Ｈ３３Ｎ４Ｏ４Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３７７．２１４４；実測値：３７７．１９。ＩＲ（ｃｍ−１）：ｖ＝３３７５、２８７８、１７７４０、１５９７、１５０９、１４３９、１２２６、１１４４、１０６６、１０２２、９０３、８４３、７４４。
【０１０８】
【化１７】
2020533579.tif 000019
【０１０９】
メチル（２Ｓ）−４−｛［２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソ（１−１３Ｃ）エチル］スルファニル｝−２−［３−（ジメチルアミノ）プロパンアミド］ブタノエート（７＊）：ＴＰ５に準拠し、６＊（２７０ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ、１．０当量）により、７＊を無色油として得た（２４６ｍｇ、７４％）。
1H-NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 4.56 (dd, J = 9.0, 4.8, 1H), 3.72 (s, 3H), 3.36 (d, J = 6.2, 2H), 3.33 (s, 1H), 3.01 (s, 1H), 2.74 - 2.58 (m, 4H), 2.47 (dt, J = 11.4, 7.0, 4H), 2.30 (d, J=4.1, 13H), 2.18 - 1.92 (m, 3H), 1.29 - 1.15 (m, 1H) ppm. ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１５１３ＣＨ３３Ｎ４Ｏ４Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３７８．２１７８；実測値：３７８．２４。
【０１１０】
【化１８】
2020533579.tif 000020
【０１１１】
メチル（２Ｓ）−４−［（２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）スルファニル］−２−（３−｛メチル［（１３Ｃ）メチル］アミノ｝プロパンアミド）ブタノエート（７＊＊）：ＴＰ５に準拠し、６＊＊（１８１ｍｇ、０．５９ｍｍｏｌ、１．０当量）により、７＊＊を無色油として得た（１７３ｍｇ、７８％）。
1H-NMR (400 MHz, メタノール-d4): δ 4.46 (dd, J = 9.0, 4.8 Hz, 1H), 3.62 (s, 3H), 3.25 (t, J = 6.95 Hz, 2H), 3.09 (s, 2H), 2.66 - 2.48 (m, 4H), 2.44 - 1.80 (m, 18H) ppm. 13C-NMR (101 MHz, メタノール-d4): δ 172.94, 172.29, 171.13, 57.62, 54.56, 51.45, 51.26, 44.04, 43.59, 36.81, 34.57, 34.22, 32.49, 30.69, 28.31 ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１５１３ＣＨ３３Ｎ４Ｏ４Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３７８．２２５０６；実測値３７８．２２５１６。
【０１１２】
【化１９】
2020533579.tif 000021
【０１１３】
（２Ｓ）−４−［（２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）スルファニル］−２−［３−（ジメチルアミノ）プロパンアミド］ブタン酸（８）：典型的な手順６（ＴＰ６）：先に合成した化合物７（９０ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、１．０当量）を、２ｍＬのＨ２Ｏおよび５ｍＬのＭｅＯＨの混合物に溶解した。次いで、ＬｉＯＨ（１７ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ、３．０当量）を添加し、反応混合物を室温で１時間にわたって撹拌した。鹸化の完了後、生成物を脱塩して、８を白色固体として得た（８６．６ｍｇ、１００％）。
1H-NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 4.55 (dd, J = 9.3, 4.5, 1H), 3.64 (t, J = 5.9, 2H), 3.46 (t, J = 6.7, 2H), 3.35 (t, J = 6.0, 2H), 2.95 (d, J = 13.2, 13H), 2.90 - 2.83 (m, 2H), 2.81 - 2.64 (m, 2H), 2.22 - 2.11 (m, 1H), 2.09 - 1.97 (m, 1H) ppm. 13C-NMR (101 MHz, メタノール-d4) δ = 174.78, 173.70, 171.90, 58.04, 54.90, 52.72, 43.88, 43.72, 43.63, 36.19, 36.00, 32.07, 30.75, 30.10 ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）：Ｃ１５Ｈ２９Ｎ４Ｏ４Ｓ−［Ｍ−Ｈ］−の計算値：３６１，１９１０；実測値：３６１．１９１８８。ＩＲ（ｃｍ−１）：ｖ＝３３６８、２９１６、１７４３、１６３２、１５２４、１４３９、１３１１、１２２７、１１６０、１０５９、９８４、８４５。
【０１１４】
【化２０】
2020533579.tif 000022
【０１１５】
（２Ｓ）−４−｛［２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソ（１−１３Ｃ）エチル］スルファニル｝−２−［３−（ジメチルアミノ）プロパンアミド］ブタン酸（８＊）ＴＰ６に準拠：７＊（２２０ｍｇ、０．５８ｍｍｏｌ、１．０当量）により、８＊を白色固体として得た（２１０ｍｇ、９９％）。
1H-NMR (400 MHz, メタノール-d4) δ = 4.33 (dd, J = 7.8, 4.6, 1H), 3.39 - 3.32 (m, 3H), 3.02 (s, 1H), 2.67 - 2.56 (m, 4H), 2.45 (dt, J = 14.7, 7.1, 4H), 2.27 (d, J = 3.2, 13H), 2.18 - 1.87 (m, 2H) ppm. 13C-NMR (101 MHz, メタノール-d4) δ = 176.77, 172.29, 172.26, 57.64, 54.84, 54.15, 44.12, 43.73, 36.99, 36.91, 33.25, 32.65, 28.61 ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ−）：Ｃ１４１３ＣＨ２９Ｎ４Ｏ４Ｓ−［Ｍ−Ｈ］−の計算値：３６２．２０２１；実測値：３６２．１９５１７。
【０１１６】
【化２１】
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【０１１７】
（２Ｓ）−４−［（２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）スルファニル］−２−（３−｛メチル［（１３Ｃ）メチル］アミノ｝プロパンアミド）ブタン酸（８＊＊）ＴＰ６に準拠：７＊＊（１７３ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ、１．０当量）により、８＊＊を白色固体として得た（１０５ｍｇ、６２％）。
1H NMR (400 MHz, メタノール-d4): δ 4.33 (dd, J = 7.8, 4.6 Hz, 1H), 3.35 (t, J = 6.41 Hz, 2H), 3.19 (s, 2H), 2.67 - 2.56 (m, 4H), 2.50 - 1.88 (m, 18H). ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１４１３ＣＨ３１Ｎ４Ｏ４Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３６４．２０９４１；実測値：３６４．２０９６２。
【０１１８】
【化２２】
2020533579.tif 000024
【０１１９】
（２Ｓ）−４−（２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエタンスルフィニル）−２−［３−（ジメチルアミノ）プロパンアミド］−ブタン酸（９）典型的な手順７（ＴＰ７）：８（５０ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１．０当量）を２ｍＬの蒸留（ｄｅｓｔ．）Ｈ２Ｏに溶解した。ｐＨ値をｐＨ＝２に設定した後、ｍＣＰＢＡ（３０．８ｍｇ、０．１４ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、反応混合物を室温で２０分間にわたって撹拌した。質量を介する酸化の完了後、得られた反応混合物をＤＣＭ（４×１０ｍＬ）で抽出し、真空で濃縮して、９を白色固体として得た（４０ｍｇ、７５％）。
1H-NMR (400 MHz, D2O) δ = 4.46 (td, J = 8.1, 5.1, 1H), 3.90 (d, J = 14.1, 1H), 3.72 (d, J = 14.1, 1H), 3.64 - 3.51 (m, 2H), 3.34 (td, J = 6.7, 1.8, 2H), 3.25 (t, J = 6.0, 2H), 3.06 - 2.85 (m, 2H), 2.82 (d, J = 9.5, 13H), 2.76 (t, J = 6.8, 2H), 2.34 - 2.19 (m, 1H), 2.17 - 2.04 (m, 1H) ppm. 13C-NMR (101 MHz, D2O) δ = 174.42, 171.66, 166.86, 56.23, 55.98, 55.88, 53.32, 47.34, 47.19, 42.96, 42.81, 34.87, 29.50, 23.97 ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１５Ｈ３１Ｎ４Ｏ５Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３７９．１９３７；実測値：３７９．１９６２４。
【０１２０】
【化２３】
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【０１２１】
（２Ｓ）−４−［２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソ（１−１３Ｃ）エタンスルフィニル］−２−［３−（ジメチルアミノ）プロパンアミド］−ブタン酸（９＊）ＴＰ７に準拠：８＊（１４５ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ、１．０当量）により、９＊を白色固体として得た（１５０ｍｇ、９９％）。
1H-NMR (400 MHz, D2O) δ = 4.46 (ddt, J = 15.6, 10.1, 5.0, 1H), 4.10 - 3.50 (m, 4H), 3.35 (dt, J = 8.0, 4.0, 2H), 3.24 (t, J = 6.2, 2H), 3.07 - 2.95 (m, 2H), 2.82 (d, J = 9.4, 13H), 2.75 (q, J = 6.7, 3H), 2.60 (s, 1H), 2.29 (dp, J = 13.5, 7.4, 1H), 2.19 - 2.00 (m, 1H) ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１４１３ＣＨ３１Ｎ４Ｏ５Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３８０．２０４３２実測値：３８０．２０４５２。
【０１２２】
【化２４】
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【０１２３】
（２Ｓ）−４−（２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエタンスルフィニル）−２−（３−｛メチル［（１３Ｃ）メチル］アミノ｝プロパンアミド）ブタン酸（９＊＊）ＴＰ７に準拠：８＊＊（１０５ｍｇ、０．２９ｍｍｏｌ、１．０当量）により、９＊＊を白色固体として得た（７５ｍｇ、６９％）。
1H-NMR (400 MHz, D2O) δ = 4.52 (dd, J = 8.7, 5.1 Hz, 1H), 3.71 - 3.29 (m, 8H), 3.10 - 2.62 (m, 16H), 2.50 - 2.17 (m, 2H) ppm. ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１４１３ＣＨ３１Ｎ４Ｏ５Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：３８０．２０４３２；実測値：３８０．２０４２４。
【０１２４】
【化２５】
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【０１２５】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２Ｓ）−４−［（２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）スルファニル］−２−［３−（ジメチルアミノ）プロパンアミド］ブタノエート（２）典型的な手順８（ＴＰ８）：先に合成したスルホキシド９（８０ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ、１．０当量）を、５ｍＬのＤＭＦに溶解した。次いで、乾燥ピリジン（３４μＬ、０．４２ｍｍｏｌ、２．０当量）およびＮＨＳ−ＴＦＡ（８９ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、２．０当量）を反応混合物に添加した。質量を介するエステル活性化の完了後、得られた反応混合物を真空で濃縮した。得られた橙色油をアセトニトリルに溶解し、アセトンを介して沈殿させて、２を白色固体として得た（３５ｍｇ、３５％）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１８１３ＣＨ３４Ｎ５Ｏ７Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：４７６．２１０１；実測値：４７６．２１７２７。
【０１２６】
【化２６】
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【０１２７】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２Ｓ）−４−｛［２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソ（１−１３Ｃ）エチル］スルファニル｝−２−［３−（ジメチルアミノ）プロパンアミド］ブタノエート（２＊）ＴＰ８に準拠：９＊（５０ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ、１．０当量）により、２＊を白色固体として得た（２０ｍｇ、３２％）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１８１３ＣＨ３４Ｎ５Ｏ７Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：４７７．２１３４；実測値：４７７．２２１２４。
【０１２８】
【化２７】
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【０１２９】
２，５−ジオキソピロリジン−１−イル（２Ｓ）−４−［（２−｛［２−（ジメチルアミノ）エチル］アミノ｝−２−オキソエチル）スルファニル］−２−（３−｛メチル［（１３Ｃ）メチル］アミノ｝プロパンアミド）ブタノエート（２＊＊）ＴＰ８に準拠：９＊＊（７５ｍｇ、０．２０ｍｍｏｌ、１．０当量）により、２＊＊を白色固体として得た（３０ｍｇ、３１％）。
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ１８１３ＣＨ３４Ｎ５Ｏ７Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：４７７．２１３４；実測値：４７７．２２０６４。
【０１３０】
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【図１】
2020533579.tif 000031
【図２】
2020533579.tif 000032
【図３】
2020533579.tif 000033
【図４】
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【国際調査報告】
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2020533579.tif 000036
2020533579.tif 000037
2020533579.tif 000038
2020533579.tif 000039