(57)【要約】  本発明は、従来のヘモグロビン系薬物の精製方法が、ヘモグロビンタンパク質と複合化され得る多様なステップにおいて、エンドトキシンへの露出を十分除去しないという驚く発見に関する。これらの複合化されたエンドトキシンは、深刻な健康上の合併症（例えば、一例として心臓病変の発生）をもたらし得る。また、多様なエンドトキシンのタイプ及び濃度は、ヘモグロビン系薬物を製造する際、バッチ間の可変性に寄与する。エンドトキシンは、より大きなタンパク質複合体と比較してペプチドに対しては大きな問題とならない。よって、本発明は、高性能クロマトグラフィシステムを含む多くの工程ステップにおいて、使い捨てシステムを用いてエンドトキシンを除去すると共に、処理コストを安価に維持する精製工程に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＰＤ抗凝固剤を含有する滅菌ポリマーバッグを用いてウシ血液を収集するステップと、
前記収集した血液を透析濾過によって洗浄するステップと、
前記ウシ赤血球を溶解してヘモグロビン溶液を製造するステップと、
酸素を除去することにより、前記ヘモグロビン溶液を安定化させて、脱酸素化ヘモグロビン溶液を製造するステップと、
前記脱酸素化ヘモグロビン溶液を濾過するステップと、
前記脱酸素化ヘモグロビン溶液を精製して非特異的血液細胞成分を減少させるステップであって、前記精製は、クロマトグラフィーにより達成され、精製ヘモグロビン溶液を製造するステップと、
約３０，０００Ｄａの中空糸膜を介した濾過によって脱酸素化することで、前記精製ヘモグロビン溶液を安定化させて所望のヘモグロビン濃度を達成するステップであって、前記精製ヘモグロビンは、多数のＬｉｑｕｉｃｅｌｌ膜を通過して脱酸素化されるステップと、
３０，０００Ｄａの中空糸膜を介して注入して保存緩衝液に対して透析濾過することで、前記脱酸素化精製ヘモグロビン溶液を濾過するステップと、
グルタルアルデヒドと架橋して前記精製脱酸素化ヘモグロビンを重合するステップと、
水素化ホウ素ナトリウムを用いる還元によって前記重合精製脱酸素化ヘモグロビンを安定化させるステップであって、前記重合ヘモグロビンの透析濾過を介して前記安定化された重合精製脱酸素化ヘモグロビンは、最終の重合ヘモグロビン溶液を製造するステップと、
前記最終の重合ヘモグロビン溶液を濾過するステップと、を含む、
エンドトキシンフリーヘモグロビン系薬物物質の製造方法。
【請求項２】
前記最終の重合ヘモグロビン溶液は、０．５μｍの深層フィルタ、滅菌グレードの０．２μｍの膜フィルタ、及び少なくとも１つのさらなる２つ目の滅菌グレードの０．２μｍの膜フィルタを介して濾過される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウシ赤血球の溶解は、細胞溶解をもたらす浸透圧の急速な減少及び１００ｋＤａ膜と３０ｋＤａ膜を介した連続の透析濾過によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヘモグロビン溶液を脱酸素化するステップは、溶存酸素数値が０．０２ ｍｇ−ｍＬ−１未満になるまで、７５ｐｓｉにおける窒素の対向流と共に、５００ｍｌ−分−１の流速で直列に整列された２つのＬｉｑｕｉｃｅｌｌ膜を介して、前記ヘモグロビン溶液を注入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記クロマトグラフィシステムは、７０±５ｃｍのベッド高さまでＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で満たされたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＸＫボロシリケートカラム（内径５ｃｍ×長さ１００ｃｍ）が装着されたＧＥ  Ａｋｔａ  Ｂｉｏｐｉｌｏｔクロマトグラフィシステムを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記クロマトグラフィシステムの緩衝液は、注射用水を用いて製造し、パイロジェンの含有量がさらに減少するように、１０ｋＤａ膜を介して濾過し、前記緩衝液は、（１）緩衝液Ａ；酢酸を用いてｐＨ９．０±０．１に調整された２.４２ｇ−Ｌ−１トリス塩基、（２）緩衝液Ｂ；酢酸を用いてｐＨ７．０±０．１に調整された６．０５ｇ−Ｌ−１トリス塩基、及び（３）緩衝液Ｃ；酢酸を用いてｐＨ８．９±０．１に調整された２.４２ｇ−Ｌ−１トリス塩基及び５８．３８ｇ−Ｌ−１ＮａＣｌからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヘモグロビン溶液は、前記溶液を４２±２℃に上昇させて重合し、グルタルアルデヒド溶液は、温度制御式ウェーブバッグＴ６０２で６．２ｇ／Ｌの濃度に製造し、４２±２℃に加熱し、前記グルタルアルデヒド溶液は、前記ヘモグロビンに対する前記グルタルアルデヒドの比がおよそ０．０２９：１になるまで、１０ｍＬ／分の速度でＴ６０３に注入する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記グルタルアルデヒドは、再循環ループでスタティックミキサを介して添加され、ヘモグロビンと迅速且つ均質に混合され、前記反応混合物の温度が２２±２℃に冷却される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記反応混合物は、３０，０００Ｄａの中空糸膜Ｆ６０１を介した透析濾過により８０±５ｇ／Ｌのヘモグロビン濃度に濃縮される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記水素化ホウ素ナトリウム溶液は、注射用水中に９．４５ｇ／Ｌの水素化ホウ素ナトリウム、４．５８ｇ／Ｌのホウ酸ナトリウム１０水和物、及び０．９１ｇ／Ｌの水酸化ナトリウムで構成され、前記水素化ホウ素ナトリウム溶液は、パイロジェンの含有量が減少するように、１０，０００Ｄａ膜を介して濾過される、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヘモグロビン系酸素担体などのヘモグロビン系薬物は、酸素運搬に基づいて血液製剤の製造や輸血などの薬物療法に使用するために開発されてきた。ヘモグロビン系薬物は、赤血球損失、即ち、「血液損失」（例えば、急性出血時や外科手術時）、貧血（循環による不十分な酸素運搬）（例えば、悪性貧血や鎌状赤血球貧血、及び急性血液希釈）、或いはショック（例えば、血液量不足によるショック、敗血性ショック、または出血性ショック）からもたらされる低酸素症を予防または治療するために使用されるように提案されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
従来のヘモグロビン系薬物及び酸素担体は、ペルフルオロ化合物、合成ヘモグロビン類似体、リポソーム封入ヘモグロビン、化学修飾ヘモグロビン、及びヘモグロビン分子が架橋されたヘモグロビン系酸素担体を含む。ヘモグロビン系薬物の製造には、深刻な免疫反応を引き起こす作用剤や細胞成分を除去するために、いくつかの精製ステップが含まれる。ヘモグロビン含有流液（例えば、収集した血液）から除去しなければならない成分の中には、凝固時にトロンビンの作用によりフィブリンに変換する可溶性タンパク質であるフィブリノゲンと、ヘモグロビン製剤に特異的に不一致性をもたらし得る免疫グロブリン及び細胞表面物質がある。血液を処理するための現在の技術は、凝固防止のために、クエン酸ナトリウムなどの化学剤を添加する場合がある。しかし、例えば、最終製品の純度などの他の品質を低下させることなく加工費用を低減させることができるさらなる方法が求められる。不幸にも、ウシ血液からヘモグロビン溶液を製造する従来の方法は、ほとんどの場合、バクテリアエンドトキシン物質に露出すると、ヘモグロビンタンパク質と複合化し得る細胞の脂質層、より具体的には、リポ多糖類などの要素を任意の取り扱いのステップから完全に除去しない薬物の精製方法を用いる。よって、従来の技術に比べて、コストの面でより効率的であり、製品の純度を増加させ、バッチ再現性に優れたヘモグロビン系薬物の精製及び取り扱いの方法を提供する緊急な必要性がある。この全てが合理的且つ再現可能な処理環境を提示している。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本発明は、従来のヘモグロビン系薬物の精製方法が、加工（タンパク質変性）時に変形物、より具体的には、ヘモグロビンタンパク質と複合化するエンドトキシンを生成し、且つ異質と見なされる多数の成分を除去しないという発見に基づいている。これらの特異的に複合化されたエンドトキシンは、深刻な健康上の合併症（例えば、心臓病変の発生）をもたらし得る。また、多様なエンドトキシンのタイプ及び濃度は、ヘモグロビン系薬物を製造する際、バッチ間の可変性に寄与する。エンドトキシンは、多くの場合、限外濾過できるので、より大きなタンパク質複合体と比較すると、ペプチドに対しては大きな問題とならない。
【０００４】
従って、本明細書には、かかるエンドトキシン及び他の物質を除去すると共に、処理コストを安価に維持するヘモグロビン系酸素担体の精製方法が記載されている。
【０００５】
（規定）
本明細書で用いる「約」という用語は、文脈で具体的に言及したり明らかにしない限り、当業界における正常な許容誤差の範囲内、例えば、平均の２標準偏差内であることが理解される。「約」は、明示されている値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内と理解できる。文脈で特に明示しない限り、本明細書で提供する全ての数値は「約」という用語によって修飾される。
【０００６】
「異常な発現」という表現は、遺伝子の正常な参照発現レベルから外れる発現レベル（即ち、増加または減少した発現レベル）を指すことに用いる。
【０００７】
「製剤」とは、任意の低分子タンパク質系化合物または他の化合物、抗体、核酸分子、またはポリペプチド、或いは、それらの断片を意味する。
【０００８】
「変化」とは、本明細書に記載する公知の標準方法によって検出された安定化技術または反応の分子量分布における変化（増加または減少）を意味する。本明細書で用いるように、変化は、架橋レベルにおける少なくとも５％の変化、例えば、架橋された分子安定化レベルの少なくとも５％〜９５％、または１００％の変化を含む。例えば、変化は、タンパク質安定化における少なくとも５％〜１０％の変化、好ましくは２５％の変化、より好ましくは８０％の変化、そして、最も好ましくは安定した分子サイズにおける５９０％以上の変化を含む。
【０００９】
「改善」とは、疾病の発生または進行を減少、抑制、弱化、軽減、停止、または安定化させることを意味する。
【００１０】
本明細書で用いる「抗体（Ａｂ）」という用語は、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片を含む。本明細書において、「免疫グロブリン（Ｉｇ）」という用語は、「抗体」と同義で用いる。
【００１１】
分子に「結合する」とは、その分子に対して物理化学的親和性を有することを意味する。
【００１２】
「対照群」または「参照群」は、比較の基準を意味する。一態様において、本明細書で用いる「対照群と比較して変化した」サンプルまたは対象体は、正常群、未処理群、或いは対照群からのサンプルと統計的に異なるレベルを有することが理解される。対照群サンプルは、例えば、培養細胞、１つ以上の実験室の実験動物、または１つ以上のヒト対象体を含む。対照群サンプルを選択して試験する方法は、当業者の能力内にある。被分析物は、細胞または有機体（例えば、抗体、タンパク質）により特徴的に発現するか生成される自然発生物質であるか、或いは、共有結合（例えば、グルタルアルデヒド）を形成するために反応物質により生成された物質であり得る。検出に用いる方法によって変化量と測定値が変わり得る。統計的有意性の決定は、当業者の能力、例えば、陽性結果を構成する平均値からの標準偏差値内である。
【００１３】
「検出」は、検出されるべき作用剤（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）などの核酸分子）の存在、不在、または量を確認することを意味する。
【００１４】
「検出可能な標識」は、関心分子と結合する際（例えば、直接結合または間接結合の際）、例えば、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、免疫化学的手段、または化学的手段を通じて、前記関心分子の検出を可能とする組成物を意味する。直接標識は、標識を分子と結合させる結合または相互作用を通じて発生し得、間接標識は、直接標識若しくは間接標識されたリンカーまたは架橋部分を用いることから発生し得る。
【００１５】
「検出ステップ」は、核酸（例えば、メチル化ＤＮＡ）またはポリペプチドの存在を検出するために、任意の多様な公知の方法を使用し得る。プローブを使用できる検出方法のタイプには、ウエスタンブロット、サザンブロット、ドットブロットまたはスロットブロット、及びノーザンブロットが含まれる。
【００１６】
剤形または剤形成分の「有効量」及び「治療的有効量」という用語は、所望の効果を提供するのに十分な単独若しくは組み合わせの剤形または成分の量を意味する。例えば、「有効量」とは、未治療患者に比べて、例えば、低酸素症などの貧血及び／または鉄欠乏状態の症状を改善させるために必要な単独または組み合わせの化合物の量を意味する。疾病の治療的処置のために本発明を実施するのに用いる活性化合物の有効量は、投与方式、年齢、体重、及び対象体の全般的な健康状態によって異なる。究極的に、担当医または獣医師が適正量及び投薬計画を決定する。かかる量を「有効量」という。
【００１７】
「断片」とは、タンパク質分子の一部を意味する。この部分は、好ましくは、少なくとも分子のヘム鉄部分またはヘモグロビンの元々のタンパク質構造物を含有する。例えば、断片は、天然ヘモグロビン分子におけるα及びβ断片の１、２または４側鎖を含有し得る。しかし、本発明は、全長球状タンパク質構造から所望の生物学的活性を示す限り、タンパク質断片をさらに含む。例えば、（中間重量を全て含む）総重量の大きさが約１６，０００Ｋｄ〜約３２，０００Ｋｄである例示的なポリアミノ酸セグメントは、本発明の多数の具現例に含まれる。同様に、鉄担体（ヘム基）の場合、ほぼ全ての長さのタンパク質断片が用いられる。
【００１８】
「分離された」、「精製された」、または「生物学的に純粋な」という用語は、元々の環境で発見されるような一般に伴う成分を様々な程度に含有しない物質を意味する。「分離」は、元々の供給源または周辺環境とのある程度の分離を示す。「精製」は、分離よりも高い程度の分離を示す。
【００１９】
「精製された」または「生物学的に純粋な」タンパク質は、不純物がタンパク質の生物学的特性に実質的に影響を与えたり、他の否定的な結果を引き起こさないように、他の物質を十分含有しない。即ち、本発明において、ポリマーに対して安定化したタンパク質の断片は、組換えＤＮＡ技術により製造されるときに、細胞物質、ウイルス物質、または培養培地を実質的に含有しない場合に精製されるか、或いは、化学的に合成されるときに、化学前駆体または他の化合物、並びに、全ての他の基質赤血球または他の血液タンパク質または血液成分及び細胞残骸を実質的に含有しない場合に精製される。純度、均質性及び安定性は、通常、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィを用いて決定される。「精製された」という用語は、電気泳動ゲルで核酸またはタンパク質が必須に１つのバンドを精製させることを意味し得る。変形可能なタンパク質、例えば、リン酸化、グリコシル化、または重合化タンパク質に対して、互いに異なる変形は、個別に精製可能な互いに異なる分離タンパク質を生成し得る。
【００２０】
同様に、「実質的に純粋な」とは、自然に伴う成分から分離されたタンパク質またはポリペプチドを意味する。典型的に、タンパク質及びポリペプチドは、自然に結合する自然発生の有機分子及び他のタンパク質を少なくとも９５重量％または９９重量％含有しない場合に実質的に純粋である。
【００２１】
「分離されたポリペプチド」とは、自然に伴う成分から分離された本発明のポリペプチドを意味する。典型的に、ポリペプチドは、自然に結合する自然発生の有機分子及びタンパク質を少なくとも６０重量％含有しない場合に分離される。好ましくは、製造物中における本発明のポリペプチドは、７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％である。本発明における分離されたポリペプチド分画及び／またはタンパク質は、例えば、天然供給源から抽出し、かかる物質をエンコードする組換え核酸を発現するか、或いはタンパク質を化学的に合成することによって得られる。純度は、任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析によって測定できる。
【００２２】
「固定化した」または「付着した」という用語は、プローブ（例えば、核酸またはタンパク質）及び固体支持体と関連し、前記プローブと固体支持体との結合が、結合、洗浄、分析、及び除去の条件下で安定化するのに十分であることを意味する。結合は共有結合または非共有結合であり得る。共有結合は、プローブと固体支持体との間に直接形成されるか、架橋剤により形成されるか、 或いは、固体支持体やプローブまたは両方の分子上に特異的反応性基を含むことにより形成され得る。非共有結合は、静電気的相互作用、親水性相互作用、及び疎水性相互作用の１つ以上であり得る。非共有結合には、支持体と分子の共有付着、及び前記分子とビオチン化プローブの非共有結合が含まれる。また、固定化には、共有相互作用及び非共有相互作用の組み合わせが含まれ得る。
【００２３】
「マーカー」とは、疾病または障害、例えば、新生物に関する活性レベルまたは発現レベルにおける変化を有する任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。
【００２４】
「調節する」とは、変化（増加または減少）を意味する。かかる変化は、本明細書で記載する公知の標準方法によって検出される。
【００２５】
「正常量」という用語は、がんまたは多様な代謝性疾病及び生理学的疾病状態と診断されていないことが知られている固体において、複合体の正常量を指す。分子の量は、試験サンプルで測定でき、（例えば、新生物症、低酸素症、局所貧血に対して）カットオフポイント及び異常値を規定するために、参照限界、区別限界、または危険を規定する臨界値のような技術を用いて「正常対照群レベル」と比較することができる。「正常対照群レベル」は、がんまたは生理的酸素欠乏状態を患っていないことが知られている対象体から典型的に発見される１つ以上のタンパク質（或いは核酸）または組み合わせのタンパク質インデックス（或いは組み合わせの核酸インデックス）のレベルを意味する。かかる正常対照群レベル及びカットオフポイントは、分子が単独で用いられるか、またはインデックスに他のタンパク質と組み合わせてフォーミュラで用いられるかに基づいて変化し得る。代案として、正常対照群レベルは、臨床的に適合する時間範囲にわたってがんに転換する前に試験された対象体からのタンパク質パターンのデータベースである。また、低酸素症または局所貧血は、ｍｍＨｇの単位で減少する酸素分圧の状態を特徴とする。他の態様において、正常対照群レベルは、規則的な細胞機能及び酸素化レベルに関するレベルであり得る。
【００２６】
決定されたレベルは、制御レベル、カットオフレベルまたは臨界レベルと同一であるか、制御レベル、カットオフレベルまたは臨界レベルに比べて増加または減少し得る。一部の態様において、対照群対象体は、同一の種、性別、民族性、年齢層、喫煙状態、体格指数（ＢＭＩ）、現在の治療療法の状態、病歴またはこれらの組み合わせが一致している対照群であるが、前記対照群は、問題の疾病を患っていなかったり前記疾病にかかるリスクがなかったり、または酸素欠乏の兆候や症状を示さないという点で、診断・評価される対象体とは異なる。
【００２７】
対照群レベルと比較して、決定されるレベルは、増加したレベルであり得る。本明細書で用いるように、例えば、発現レベル、生物学的活性レベルなどのレベルについて、「増加した」という用語は、対照群レベルを超える任意の％の増加を意味する。増加したレベルは、対照群レベルと比較して、少なくともまたは約５％増加、少なくともまたは約１０％増加、少なくともまたは約１５％増加、少なくともまたは約２０％増加、少なくともまたは約２５％増加、少なくともまたは約３０％増加、少なくともまたは約３５％増加、少なくともまたは約４０％増加、少なくともまたは約４５％増加、少なくともまたは約５０％増加、少なくともまたは約５５％増加、少なくともまたは約６０％増加、少なくともまたは約６５％増加、少なくともまたは約７０％増加、少なくともまたは約７５％増加、少なくともまたは約８０％増加、少なくともまたは約８５％増加、少なくともまたは約９０％増加、少なくともまたは約９５％増加であり得る。
【００２８】
対照群レベルと比較して、決定されるレベルは、減少したレベルであり得る。 本明細書で用いるように、例えば、発現レベル、生物学的活性レベルなどのレベルについて、「減少した」という用語は、対照群レベル未満の任意の％の減少を意味する。減少したレベルは、対照群レベルと比較して、少なくともまたは約１％減少、少なくともまたは約５％減少、少なくともまたは約１０％減少、少なくともまたは約１５％減少、少なくともまたは約２０％減少、少なくともまたは約２５％減少、少なくともまたは約３０％減少、少なくともまたは約３５％減少、少なくともまたは約４０％減少、少なくともまたは約４５％減少、少なくともまたは約５０％減少、少なくともまたは約５５％減少、少なくともまたは約６０％減少、少なくともまたは約６５％減少、少なくともまたは約７０％減少、少なくともまたは約７５％減少、少なくともまたは約８０％減少、少なくともまたは約８５％減少、少なくともまたは約９０％減少、少なくともまたは約９５％減少であり得る。
【００２９】
本発明の方法に有用なタンパク質分子は、本発明のヘム鉄組成物のポリペプチドまたはその断片をエンコードする任意の核酸分子を含む。かかるタンパク質安定化分子は、内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、通常、実質的な同一性、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％の同一性を示す。
【００３０】
また、大半の応用分野で、混成化後の洗浄ステップは、厳格性において異なり得る。厳格に制御される洗浄／混合の条件は、分散液の緩衝液濃度、グルタルアルデヒドの反応条件及び温度によって規定できる。前記のように、塩の濃度を減少させたり温度を増加させることにより、制御された厳格性を増加させることができる。これらの条件に対するさらなる変形は、当業者にとって明らかに容易である。混成化／コンジュゲーション技術は、当業者に広く公知となっており、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ及びＤａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０,  １９７７年）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ及びＨｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ７２：３９６１，１９７５年）；Ａｕｓｕｂｅｌなど（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，米国ニューヨーク州，２００１年）；Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７年，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，米国ニューヨーク州）；及びＳａｍｂｒｏｏｋなど（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，米国ニューヨーク州）に記載されている。
【００３１】
「新生物症」とは、過剰増殖または減少したアポトーシスを特徴とする疾病または障害を意味する。本発明で使用できる例示的な新生物は、膵臓がん、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病）、真性多血症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、並びに、肉腫及び癌腫（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮細胞癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭状癌腫、乳頭状腺癌腫、嚢胞腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、肝細胞がん、胆管がん、絨毛がん、精上皮腫、胚性癌腫、ウイルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮性癌腫、神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣細胞腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽細胞腫）などの固形腫瘍を含むが、これに限定されない。
【００３２】
本明細書で用いるように、「製剤を得ること」における「得ること」は、製剤を合成、購入、または獲得することを含む。
【００３３】
本明細書で用いるように、文脈で具体的に言及したり明らかにしない限り、「または」、「或いは」、「若しくは」という用語は、包括的なものであることが理解される。
【００３４】
「薬学的に許容可能な担体」という表現は、当業界で認知されており、本発明の化合物を哺乳動物に投与するのに好適な薬学的に許容可能な物質、組成物またはビヒクルを含む。担体は、液体充填剤または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶剤またはカプセル化物質を含み、対象作用剤を１つの器官または身体の一部から、他の器官または身体の一部に運搬或いは輸送することに関与する。各担体は、剤形の他の成分と親和性であり、患者に有害ではないという意味で「許容可能」でなければならない。薬学的に許容可能な担体として提供できる物質の一部の例は、以下のラクトース、グルコース及びスクロースなどの糖、ゼラチン、賦形剤、パイロジェンを含有しない水、等張食塩水、リンガー溶液、エチルアルコール、リン酸緩衝液、及び薬学剤形に用いられる他の無毒親和性物質を含む。
【００３５】
「タンパク質」、「ポリペプチド」または「ペプチド」とは、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化）にかかわらず、本明細書に記載するように、天然発生のポリペプチド若しくはペプチド、或いは、非天然発生のポリペプチド若しくはペプチドの全部または一部を構成する２つを超える天然アミノ酸または非天然アミノ酸の任意の鎖を意味する。
【００３６】
「プライマーセット」は、例えば、ＰＣＲに用いられ得るオリゴヌクレオチドのセットを意味する。プライマーセットは、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、２００、２５０、３００、４００、５００、６００以上のプライマーから構成され得る。
【００３７】
「予防する」及び「予防」という用語は、特定の否定的状態、障害、または疾病に発病したり、脆弱であったり、かかりやすい恐れのある臨床的に無症状の個体に、作用剤または組成物を投与することを意味する。よって、症状の発生及び／または根本的な原因の予防と関連する。
【００３８】
本明細書において、範囲は、「約」１つの特定値から及び／または「約」別の特定値まで表現できる。かかる範囲を表現するとき、他の態様は、１つの特定値から及び／または他の特定値までを含む。同様に、先行の「約」を用いて値を近似値で表現する場合、特定値は他の態様を形成するということが理解される。さらに、各範囲の終点は、他の終点に関して重要であり、また、他の終点と独立しても重要であることが理解される。また、本明細書に多数の値を開示し、この各々の値は、それ自体の値に加えてその特定値を「約」として開示しているということが理解される。明細書全般にわたって、データを多数の相違する形式で提供し、このデータは、データ点の任意の組み合わせに対する終点と開始点及びその範囲を表す。例えば、特定のデータ点「１０」と特定のデータ点「１５」が開示されている場合、１０と１５との間だけでなく、１０及び１５に対して、超過、以上、未満、以下、及び同等であるということも記載していると見なしていることが理解される。また、２つの特定のユニットとの間における各ユニットも開示されていることが理解される。例えば、１０及び１５が開示されている場合、１１、１２、１３及び１４も開示されている。
【００３９】
本明細書に提供する範囲は、範囲内における全ての値を縮約して表現していることが理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４1、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０よりなる群からの任意の数、数の組み合わせ、或いは下位範囲を含むだけでなく、例えば、上述した整数との間に介在する１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、及び１．９などの全ての小数値も含んでいることが理解される。下位範囲に関して、その範囲におけるいずれかの終点から延びる「重複した下位範囲」が具体的に考慮される。例えば、１〜５０の例示的な範囲の重複した下位範囲は、一方向には１〜１０、１〜２０、１〜３０、及び１〜４０、または他方向には５０〜４０、５０〜３０、５０〜２０、及び５０〜１０を含み得る。
【００４０】
「減少する」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の負の変化を意味する。
【００４１】
「参照配列」は、配列比較または遺伝子発現比較の基礎として用いる規定された配列である。参照配列は、例えば、全長ｃＤＮＡのセグメントまたは遺伝子配列、完全なｃＤＮＡまたは遺伝子配列のような特定配列の部分集合であるか、或いは全体であり得る。ポリペプチドに対して、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６個のアミノ酸、好ましくは少なくとも約２０個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５個のアミノ酸、さらに好ましくは約３５個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、または約１００個のアミノ酸である。核酸に対して、参照核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約４０個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０個のヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５個のヌクレオチド、さらに好ましくは約１００個のヌクレオチド、約３００個または約５００個のヌクレオチド、或いはその辺りまたはそれらの間の任意の整数である。
【００４２】
本明細書で用いる「サンプル」という用語は、試験管内（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）評価のために得られた生物学的サンプルを指す。本明細書に記載の方法における例示的な組織サンプルは、新生物または血中エクソソームからの組織サンプルを含む。本明細書で開示する方法に関して、サンプルまたは患者サンプルは、好ましくは任意の体液または組織を含み得る。一部の実施形態において、体液は、対象体から得られた血液、血漿、血清、リンパ液、母乳、唾液、粘液、精液、膣分泌物、細胞抽出物、炎症性液、脳脊髄液、糞便、硝子体液、または尿を含むが、これに限定されない。一部の態様において、サンプルは、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、及び尿サンプルのうち少なくとも２つの複合パネルである。例示的な態様において、サンプルは、血液またはその分画（例えば、白血球アフェレーシス（ｌｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって得られた血漿、血清、分画）を含む。好ましいサンプルは、全血、血清、血漿、または尿である。また、サンプルは、組織または体液の一部が精製された分画であり得る。
【００４３】
参照サンプルは、疾病または病態の流液を有していない供与体からの「正常」サンプル、或いは、疾病または病態を有する対象体の正常組織からの「正常」サンプルであり得る。また、参照サンプルは、活性剤で処理されていない（例えば、未処理またはビヒクルのみ投与された）細胞培養物または未処理供与体からのサンプルであり得る。さらに、参照サンプルは、前向き研究の開始前の「ゼロ時点」、或いは、試験される作用剤または治療的介入物に細胞または対象体を接触させる前の「ゼロ時点」において採取できる。
【００４４】
「固体支持体」は、ストリップ、ポリマー、ビーズ、またはナノ粒子を説明する。ストリップは、核酸プローブを担体に連結してコンジュゲートを製造し、そのコンジュゲートを多孔性固体支持体上に固定化することを含む核酸プローブ（またはタンパク質）がコーティングされた多孔性または非多孔性の固体支持ストリップであり得る。広く公知となっている支持体または担体には、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然セルロース及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、カブロース及びマグネタイトが含まれる。担体の性質は、本発明の目的のために、ある程度可溶性または不溶性であり得る。カップリングされた分子が結合剤（例えば、抗体または核酸分子）に結合可能である限り、支持体物質は、実質的にあらゆる構造的構成を有し得る。よって、支持体の構成は、ビーズの場合のように球状であるか、或いは、テストチューブの内部表面またはロッドの外部表面の場合のように円筒状であり得る。代案として、表面はシートまたは試験ストリップなどの平面であり得る。例えば、支持体はポリスチレンビーズを含む。当業者は、抗体または抗原への結合に好適な多くの他の担体を知っていたり、繰り返し実験を通じてこれを確認することができる。他の態様において、固体支持体は、製剤が化学的に結合したり、固定化したり、分散したり、または結合しているポリマーを含む。ポリマー支持体は、ネットワーク状ポリマーであり得、また、例えば、懸濁重合によりビーズ状で製造され得る。ポリマー支持体に導入された活性部位の位置は、ポリマー支持体のタイプによって異なる。例えば、膨潤ゲルビーズのポリマー支持体においては、活性部位がビーズ全体に均一に分布しているのに対し、マクロ多孔性ビーズのポリマー支持体においては、活性部位が主にマクロ多孔の内部表面上に存在する。固体支持体、例えば、装置は、結合剤を単独で含むか、或いは結合剤を少なくとも１つ、２つ、３つまたはそれ以上の他の分子と共に含む。
【００４５】
「特異的に結合する」とは、本発明のポリペプチドを認識して結合するが、サンプル、例えば、本発明のポリペプチド／コンジュゲートされた精製タンパク質を天然に含む生物学的サンプルにおいては、他の分子を実質的に認識して結合しない化合物または抗体を意味する。
【００４６】
「実質的に同一である」とは、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載する任意の１つのアミノ酸配列）または核酸配列（例えば、本明細書に記載する任意の１つの核酸配列）と少なくとも８０％の同一性を示すポリペプチド／タンパク質若しくは核酸分子を意味する。好ましくは、かかる配列は、核酸またはアミノ酸レベルにおいて、比較のために用いられた配列と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一である。
【００４７】
本明細書で用いる「対象体」という用語は、表示された障害を患いやすい動物界の全ての構成員を含む。一部の態様においては、対象体が哺乳動物であり、一部の態様においては、対象体がヒトである。また、上記方法は、イヌ及びネコなどの伴侶動物だけでなく、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタなどの家畜、並びにその他の飼育動物及び野生動物にも適用可能である。
【００４８】
特定の疾病、病態または症候群を患っているか患っていると疑われる対象体は、専門家が対象体を疾病、病態または症候群を患っていると診断したり疑うことができるよう、疾病、病態または症候群に対して十分な数または組み合わせの兆候或いは症状を示したり、十分な数の危険因子を有する。がん関連の病態を患っているか患っていると疑われる対象体を確認する方法は、当業者の能力内に存在する。特定の疾病、病態または症候群を患っているか患っていると疑われる対象体は、必ずしも２つの別のグループではない。
【００４９】
本明細書で用いるように、特定の疾病または病態に対して、「脆弱な」、「かかる傾向がある」、「かかりやすい」、または「発病する危険がある」とは、遺伝的、環境的、健康、及び／または他の危険因子に基づいて、一般的な個体群よりも疾病や病態が発病する可能性がさらに高い個体を意味する。疾病の発病可能性の増加は、約１０％、２０％、５０％、１００％、１５０％、２００％、またはそれ以上の増加であり得る。
【００５０】
本明細書で用いるように、「治療する」及び「治療」は、症状の重症度及び／または頻度の減少に影響を与え、症状及び／または根本的な病因を除去し、及び／または、損傷の改善または治療が可能であるよう、不利な病態、障害、または疾病を患っている臨床的症状を示す個体に製剤または剤形を投与することを意味する。障害及び病態を治療することは排除しないが、これに関する障害、病態または症状の完全な除去を求めるのではないということが理解される。
【００５１】
一部の場合において、本発明の組成物は経口投与または全身投与される。他の投与方式は、局所、眼球内、口腔、インプラント内／インプラント上、または非経口経路を含む。「非経口」という用語は、皮下、髄腔内、静脈内、筋肉内、腹腔内、または注入を含む。静脈内または筋肉内経路は、長期間の治療及び予防には特に適切ではないが、緊急事態では好ましい場合もある。本発明の組成物を含む組成物は、血液などの生理的流液に添加され得る。患者への利便性だけでなく、投薬スケジュールにより、予防的治療には経口投与が好ましい。非経口方式（皮下または静脈内）は、胃腸不耐症、腸閉塞症、またはその他の重大な疾患が伴うことにより、腸内投与に耐えることができない患者の治療、またはより急性な疾患に好ましい。
【００５２】
薬学組成物は、急速に分裂する細胞、例えば、がん細胞における細胞周期に対する補助療法として用いるためのキットまたは薬物システムに組み立てられ得る。本発明のかかる態様によるキットまたは薬物システムは、バイアル、チューブ、アンプル、ボトル、シリンジ、またはバッグなどの１つ以上の容器手段を閉じ込めて有するボックス、カートン、チューブなどの運搬手段を含む。また、本発明のキットまたは薬物システムは、キットを用いるための関連説明書を含み得る。
【００５３】
本明細書で提供する任意の組成物または方法は、本明細書で提供する任意の他の組成物及び方法のうち１つ以上と組み合わせることができる。
【００５４】
本明細書で提供する任意の組成物または方法は、本明細書で提供する任意の他の組成物及び方法のうち１つ以上と組み合わせることができる。
【００５５】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する」または「特徴とする」と同義である用語の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、閉鎖型または開放型があり、言及していないさらなる要素または方法のステップを排除しない。対照的に、「構成される」という用語は、請求項に明示されていない任意の要素、ステップ、または成分を排除する。「必須に構成される」という語句は、請求された発明の明示されている材料またはステップ、「並びに基本特徴や新規特徴に実質的に影響を与えないもの」に請求項の範疇を限定する。
【００５６】
本発明の他の特徴及び長所は、下記の好ましい実施形態の説明及び請求範囲から明らかである。特に規定しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語や学術用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者が通常理解するものと同一の意味を有する。本明細書に記載するものと類似するまたは同等な方法及び材料が本発明の実施または試験に用いることができ、以下に好適な方法及び材料を説明する。本明細書で引用する公開となった全ての外国の特許及び特許出願は、本明細書で参照として含まれる。本明細書で引用する他の全ての公開となった参考文献、文書、原稿及び学術文献は、本明細書で参照として含まれる。矛盾が生じた場合、規定を含む本明細書が優先される。また、材料、方法及び例は単に例示的なものであり、制限するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】精製されたヘモグロビンを得ることができる流液（例えば、血液）の画像である。
【図２】流液からのタンパク質（例えば、ヘモグロビン）を精製するための細胞洗浄工程ステップの概略図である。
【図３】タンパク質（例えば、ヘモグロビン）溶液を精製するための細胞溶解工程の概略図である。
【図４】タンパク質（例えば、ヘモグロビン）溶液の脱酸素化及び濾過工程の概略図である。
【図５】タンパク質（例えば、ヘモグロビン）溶液を濾過するための陰イオン交換クロマトグラフィ精製工程の概略図である。
【図６Ａ】タンパク質（例えば、ヘモグロビン）脱酸素化工程の概略図である。タンパク質溶液脱酸素化の第１ステップのための濃縮及び脱酸素化システムの概略図である。
【図６Ｂ】タンパク質（例えば、ヘモグロビン）脱酸素化工程の概略図である。タンパク質溶液脱酸素化の第２ステップのための緩衝液交換及び濾過システムの概略図である。
【図７】タンパク質（例えば、ヘモグロビン）の安定化のための重合工程の概略図である。
【図８】ホウ化水素還元工程の概略図である。
【図９】流液からのタンパク質（例えば、ヘモグロビン）を精製するための細胞洗浄工程の代案の実施形態を示す概略図である。
【図１０】タンパク質（例えば、ヘモグロビン）溶液を精製するための細胞溶解工程の代案の実施形態を示す概略図である。
【図１１】タンパク質（例えば、ヘモグロビン）溶液の脱酸素化及び濾過工程の代案の実施形態を示す概略図である。
【図１２】タンパク質（例えば、ヘモグロビン）溶液を濾過するための陰イオン交換クロマトグラフィ精製工程の代案の実施形態を示す概略図である。
【図１３Ａ】タンパク質（例えば、ヘモグロビン）脱酸素化工程の代案の実施形態を示す概略図である。タンパク質溶液脱酸素化の第１ステップのための濃縮及び脱酸素化システムの代案の実施形態を示す概略図である。
【図１３Ｂ】タンパク質（例えば、ヘモグロビン）脱酸素化工程の代案の実施形態を示す概略図である。タンパク質溶液脱酸素化の第２ステップのための緩衝液交換及び濾過システムの代案の実施形態を示す概略図である。
【図１４】タンパク質（例えば、ヘモグロビン）の安定化のための重合工程の代案の実施形態を示す概略図である。
【図１５】ホウ化水素還元工程の代案の実施形態を示す概略図である。
【図１６】タンパク質（例えば、ヘモグロビン）溶液に対する滅菌濾過工程を示す概略図である。
【図１７】細胞回収または遠心分離液浄化のための装置（例えば、ＣＡＲＲ  ＣｅｎｔｒｉｔｅｃｈのＵｎｉＦｕｇｅ）の画像である。
【図１８】使い捨て可能なモジュール、ＣＩＰまたはＳＩＰの不要、完全自動化、高い細胞回収率、哺乳動物細胞や昆虫細胞の処理可能性、統合トロリー、直感的ソフトウェア、低せん断処理、及び回収された細胞生存力における最小限の減少などのような特徴を有する分離システム（例えば、ＣＡＲＲ  ＵｎｉＦｕｇｅ  Ｐｉｌｏｔ  Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈの分離システム）の画像である。装置は、最先端の製造施設で製作され得る。
【図１９Ａ】ガラス強化フィード及び分離液チューブ、ベイン加速器フランジを有する先端コア、及び０．２インチのクリアランスなどの特徴を有する分離チャンバ（例えば、ＵｎｉＦｕｇｅ使い捨て「ＧＲ―ＡＣ」分離チャンバ）の画像である。装置の規格には、１分当たり０．１〜４．０のフィード流量範囲が含まれる。分離チャンバ（例えば、ＵｎｉＦｕｇｅ使い捨て「ＧＲ―ＡＣ」分離チャンバ）の斜視図である。
【図１９Ｂ】ガラス強化フィード及び分離液チューブ、ベイン加速器フランジを有する先端コア、及び０．２インチのクリアランスなどの特徴を有する分離チャンバ（例えば、ＵｎｉＦｕｇｅ使い捨て「ＧＲ―ＡＣ」分離チャンバ）の画像である。装置の規格には、１分当たり０．１〜４．０のフィード流量範囲が含まれる。分離チャンバ（例えば、ＵｎｉＦｕｇｅ使い捨て「ＧＲ―ＡＣ」分離チャンバ）の上面図である。
【図２０】システム（例えば、ＵｎｉＦｕｇｅシステム）に分離チャンバ及びチューブセットが完全に組み立てられたモジュールの典型的な設置の画像である。
【図２１】４ピンチ弁の構成、ガラス強化フィードチューブ及び分離液チューブ、ベイン加速器フランジを有する先端コア、並びに０．２インチのクリアランスなどの特徴を有する分離チャンバ及びチューブセットが完全に組み立てられたモジュール（例えば、ＵｎｉＦｕｇｅ使い捨て「ＧＲ―ＡＣ」モジュール）の画像であり、２４インチ／１８インチのＣ−ｆｌｅｘを有するチューブセット及びＭｅｉｓｓｎｅｒフィルタを含む。フィードの流量範囲は、１分当たり０．１〜４．０Ｌである。
【図２２】Ｍｅｉｓｓｎｅｒフィルタを有する４ピンチ弁、長さ２４インチ、内径３／８インチのＣ−ｆｌｅｘコネクションチューブなどの特徴を有するチューブセットアセンブリ（例えば、ＵｎｉＦｕｇｅチューブセットアセンブリ）の一連の画像である。チューブセットアセンブリは、品目ａ〜品目ｕを用いる。品目ａは、部品番号Ｐ００３であり得る１／２インチの内径×３／４インチの外径のファームチューブ（全長３６．００）である。品目ｂは、部品番号Ｐ００６であり得る１／２インチのＷＹＥコネクタ（ポリプロピレン製）である。品目ｃは、部品番号Ｐ００２であり得る１／２インチの内径×３／４インチの外径の白金硬化シリコーンチューブ（全長３６．００インチ）である。品目ｄは、部品番号Ｐ００５であり得る１／２インチの直線型コネクタ（ポリプロピレン製）である。品目ｅは、部品番号Ｐ００４であり得る１／２インチの内径×３／４インチの外径のチューブ３７  Ｃ−ｆｌｅｘ（全長２４．００インチ）である。品目ｆは、部品番号Ｐ００７であり得る１／２インチのチューブプラグ（ポリプロピレン製）である。品目ｇは、部品番号Ｐ０２７であり得る大型チューブクランプポリである。品目ｈは、部品番号Ｐ０７６であり得る黄色テープである。品目ｉは、部品番号Ｐ０７５であり得る緑色テープである。品目ｊは、部品番号Ｐ００２であり得る１／２インチの内径×３インチの外径の白金硬化シリコーンチューブ（全長６．００インチ）である。品目ｋは、部品番号Ｐ００９であり得る１／２インチの圧力センサ（ポリカーボネート製）である。品目ｌは、部品番号Ｐ０１５であり得る３／１６インチの内径×３／１６インチの外径の白金硬化シリコーンチューブ（全長１８．００インチ）である。品目ｍは、部品番号Ｐ０１６であり得る３／１６インチの内径のＭｅｉｓｓｎｅｒ  ＨＢ  ０．２ステリジンフィルタ、ＣＦＶＭＶ０．２―３３Ａ１である。品目ｎは、部品番号Ｐ００１５であり得る３/１６インチの内径×５／１６インチの外径の白金硬化シリコーンチューブ（全長４．００インチ）である。品目ｏは、部品番号Ｐ０６３であり得る１／４インチ〜５／１６インチの内径のチューブに用いるＭＩＮケーブルタイである。品目ｐは、部品番号Ｐ０６２であり得る３／８インチ以上の内径のチューブに用いるＳＴＤケーブルタイである。品目ｑは、部品番号Ｐ０７４であり得る青色テープである。品目ｒは、部品番号Ｐ０８０であり得る白色テープである。品目ｓは、部品番号Ｐ０５２であり得る１／２インチ×３／８インチのリデューサ（ポリプロピレン製）である。品目ｔは、部品番号Ｐ０５０であり得る３／８インチの内径×５／６インチの外径のチューブ３７  Ｃ−ｆｌｅｘ（全長１８．００インチ）である。品目ｕは、部品番号Ｐ０５３であり得る３／８インチのチューブプラグ（ポリプロピレン製）である。
【図２４】血液深層濾過（６０μｍ及び０．０２７ｍ２／０．２９ｆｔ２）のためのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ  ６０ＨＸまたはその類似装置の画像である。
【図２５】血液深層濾過のためにアセンブリに連結されたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ  ６０ＨＸまたはその類似装置の画像である。
【図２６】重合ステップのデータに関するタンパク質架橋分布の例を示すチャートである。
【図２７】タンパク質架橋分布の重合ステップデータを示す一連のグラフである。異なる架橋ステップでの多様なタンパク質ピークを示している。
【図２８】重合ステップアセンブリの画像である。異なるグルタルアルデヒド／ｂＨＢの割合及びタイプのマニホールドを試験した。最適化されたマニホールドで再現性を評価するために、３回の重合反応を２日間行った。試験パラメータは、１試験当たり１８ｇの物質及びヘモグロビン（ｂＨＢ）１グラム当たり２９ｍｇのグルタルアルデヒドを用いた５月４日付１ロット、及び５月５日付２ロットを含む。図２８の試験装置は、３／１６インチの外径×４ｃｍの長さのスタティックミキサ、過剰還流（Ｇｌｕｔ  ｒｅｆｌｕｘ）を回避するためにＹ字形の代わりにＴ字形のコネクタ、閉鎖型システム濃縮／透析濾過のための保持液チューブ上の弁、及び持続的なＮ２散布を有する。
【図２９】重合工程セットアップの他の実施形態を示す概略図である。
【図３０】Ｃ８００  ＱＥＸ（または等価物）クロマトグラフィの勾配最適化１を示す一連のグラフ及び画像である。勾配最適化２は、７５％収率と共に最大３０ＫＤａの不純物の除去により著しい改善をもたらした。１６３ｍｇ ｂＨＢ／ｍｌを超える樹脂をロードすることが可能であり得る。
【図３１】Ｃ８００  ＱＥＸ（または等価物）クロマトグラフィの勾配最適化１の技術規格を示すチャートである。
【図３２】Ｃ８００  ＱＥＸ（または等価物）クロマトグラフィの勾配最適化２を示す一連のグラフ及び画像である。勾配最適化２は、最適化１と比較して、より低い勾配及びより高いタンパク質ロードを有する（図３０及び図３）。勾配最適化２は、ＦＴにおける少量のｂＨＢ、８０％収率、ＣＩＰ（１×）方法の優れた効率、優れた解像度、及び２３６ｍｇ  ｂＨＢ／ｍｌの樹脂における良好な回収性を有する。
【図３３】Ｃ８００  ＱＥＸ（または等価物）クロマトグラフィの勾配最適化２の技術規格を示すチャートである。
【図３４】Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬのＣＩＰのＣ８００  ＱＥＸ（または等価物）クロマトグラフィの最適化を示す流れ図である。
【図３５】Ｃ８００  ＱｅＸクロマトグラフィ（または等価物）に対するアセンブリの画像である。この画像は、４１２ｍｌカラム（５ｃｍ直径）、１８０〜２２０ｍｇｂＨＢ／ｍｌの樹脂、Ｃ５００  １７０５Ａを処理するための３回の実行、１回目の実行に用いる分画収集器、持続的にＮ２散布されるバッファ、及びＮ２で膨張したアトモスバッグ（ａｔｍｏｓｂａｇ）で覆われている分画収集器を用いるアセンブリ及び工程を示す。この勾配方法は、２、６ｃｍ直径のカラムで４月に最適化された。
【図３６】Ｃ５００の保存を示す一連の画像である。前記製品は、４℃で最大４週間保存し得る。製品は、真空Ｎ２の３周期後にＮ２で充填されたアトモスバッグに密封されたボトルである。
【図３７Ａ】１０ＫＤａ透析濾過を示す一連のチャートである。１０ＫＤａ透析濾過に関するデータを示すチャートである。
【図３７Ｂ】１０ＫＤａ透析濾過を示す一連のグラフである。Ｃ５００１７０５Ａ  １０ＫＤａ透析濾過に対する透過液容量Ｌ及びフラックスＬＭＨを示すプロットである。
【図３７Ｃ】１０ＫＤａ透析濾過を示す一連のグラフである。Ｃ５００１７０５Ａ  １０ＫＤａ透析濾過に対するＴＭＰ及びフラックスＬＭＨを示すプロットである。
【図３７Ｄ】１０ＫＤａ透析濾過を示す一連のイメージである。１０ｋＤａ透析濾過工程の概略図である。
【図３７Ｅ】１０ＫＤａ透析濾過を示す一連の画像である。１０ＫＤａ透析濾過装置の画像である。透過液が少し赤色であるにもかかわらず、ｂＨＢが一酸化炭素酸素測定器（ｃｏｏｘｉｍｅｔｅｒ）によって検出されなかった。保持液をＳａｒｔｏｐｏｒｅ  ２滅菌Ｍ内径ｉＣａｐ  ０，４５μｍ＋０，２μｍフィルタによって濾過した。
【図３８Ａ】１００ＫＤａ透析濾過を示す一連のグラフである。１００ＫＤａ透析濾過に対する透過液容量Ｌ及び透過液ｂＨＢ濃度（ｇ／ｄＬ）のプロットである。透析濾過（１ｇ、７ｇ／２４７ｇ）後に一酸化炭素酸素測定器により保持液において１％未満のｂＨＢを測定した。
【図３８Ｂ】１００ＫＤａ透析濾過を示す一連のグラフである。１００ＫＤａ透析濾過に対する透過液容量Ｌ及び保持液の総ｂＨＢ（％）のプロットである。
【図３８Ｃ】１００ＫＤａ透析濾過を示す一連のチャートである。１００ＫＤａ透析濾過工程からのデータを示すチャートである。
【図３９】１００ＫＤａ透析濾過工程のためのアセンブリの一連の画像である。
【図４０】１００ＫＤａ透析濾過工程の概略図である。透析濾過工程は以下の（１）保持液、透過液、及び透析濾過緩衝液（Ｈ２Ｏ）に持続的にＮ２を散布すること、（２）透析濾過Ｈ２Ｏは、＜０，００５ＥＵｍｌで１０ｋＤａ膜によって透析濾過されたＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏであること、（３）透析濾過緩衝液の添加は、マグネット撹拌機を用いずに、保持液の均質性を改善させるために、保持液チューブにスタティックミキサをＴ字形に嵌合することで行うこと、（４）ゲル層の形成及びフラックスの減少を防止し、大規模なパイロット規模でブリッジするために、蠕動ポンプ（ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  ｐｕｍｐ）により透過流動を制御すること、（５）透析濾過の効率及び収率を改善させるために、一時的な二量体ｂＨＢ形態の比率増加を促進させるよう、膜に入る前にフィードを４０℃の熱交換器に短時間で通過させることを含む。
【図４１】次のバッチの血液洗浄のための中空糸を示す概略図である。次のバッチには０，６５μｍの中空糸が使用できる。セットアップには保持液の流動制御を含み得る。
【図４２Ａ】血液洗浄及び溶解を示す一連のチャートである。血液洗浄及び溶解工程におけるデータを示すチャートである。
【図４２Ｂ】血液洗浄及び溶解を示す一連の画像である。血液洗浄及び溶解工程装置の画像である。
【図４２Ｃ】血液洗浄及び溶解を示す一連の画像である。血液洗浄及び溶解工程装置のより完全な画像である。洗浄のために、中空糸カートリッジは使用することができなかった。赤血球は遠心分離により洗浄される。クエン酸食塩水（ＣＳＢ）にて血液を１：１で希釈し、遠心分離する。細胞ペレットをＣＳＢで再懸濁させ、３回遠心分離する（合わせて４回の遠心分離）。溶解のために、スタティックミキシングによりＨ-２Ｏで１：１で希釈する。細胞残骸を除去するために、１４０００×ｇで遠心分離する。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
血液内細胞の９９％を超えるのが赤血球である。赤血球の主な機能は、肺から組織に酸素を運搬し、組織から肺にＣＯ２を運搬するヘモグロビンを輸送することである。正常な赤血球は、細胞１００ｍｌ当たりおよそ３４グラムのヘモグロビンを含有する。ヘモグロビン１グラムは、およそ１．３３ｍｌの酸素と結合可能である。ウシ血液において、ヘモグロビン（ｂＨＢ）の濃度はｇ／ｄＬで１０．１であり、血液の容量は２．９６Ｌであり、これは２９９ｇのｂＨＢに該当する。よって、ウシ血液は、大規模なヘモグロビン回収のための確実な選択である。
【００５９】
（タンパク質精製のための分離システム）
例えば、一部の実施形態において、タンパク質精製のために用いる分離システムは、ＰｎｅｕｍａｔｉｃＳｃａｌｅＡｎｇｅｌｕｓのＣＡＲＲ  Ｃｅｎｔｒｉｔｅｃｈ  ＵｎｉＦｕｇｅシステム（または等価システム）である。ＵｎｉＦｕｇｅシステムは、ＣＩＰ及びＳＩＰが必要ないγ線を照射した使い捨てモジュールを使用する。全ての工程の接触面は設置が容易であり、毎回実行した後、１００％交換可能である。哺乳動物及び昆虫細胞の低いせん断収穫が可能であり、回収した細胞の生存力における最小限の減少が達成可能である。細胞が溶解しないので、遠心分離機での細胞残骸の生成が最小化され、ＵｎｉＦｕｇｅは、細胞回収または遠心分離浄化の何れにおいても優れた選択となる。ＵｎｉＦｕｇｅモジュールは、使い捨てのバイオリアクター連結部に容易に溶接されるチューブである。ＵｎｉＦｕｇｅは、柔軟な周期のパラメータ入力により完全に自動化されている。フィード懸濁液は、モジュールに静かに注入され、透明な上清液が連続して排出される間、細胞は外半径に沈澱する。モジュールが細胞で充填されると、コントローラがロータを中止させ、細胞を放流させる。バイオリアクターの容量が処理されるまで、このサイクルが繰り返される。
【実施例】
【００６０】
下記の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニング、治療方法の製造方法及び使用方法に関する完全な開示や説明を当業者に提供するために提示され、発明者がその発明と見なす範囲を制限するものではない。
【００６１】
（実施例１）
２．３．Ｓ．２．２．小規模なバッチのＯｘｙＰｌｙ薬物物質製造のための製造工程及び工程制御に関する説明
（血液収集）
ウシ血液は、モントリオール大学の獣医学部と提携している農場から得られる。動物は、学校の文書化された健康プログラムにより持続的に観察される。
【００６２】
静脈穿刺により、尾静脈から動物当たり最大１リットル容量の血液を得る。５００ミリリットル（ｍＬ）の二重血液パック収集システムを用いて収集を行う（図１、Ｆｅｎｗａｌ、部品番号４Ｒ３４２９、米国イリノイ州レークズリク）。バッグには、ＣＰＤ抗凝固剤が含まれ、衛星コンテナ及び滅菌ニードル／チューブサンプリングシステムが装着されている。雌牛の尾を上げて、１６ゲージのニードルを尾の最下位から３〜６インチで、尾と下側の正中線に垂直になるよう約０．５インチの深さで挿入する。血液は、４５０〜５００ｍＬが得られるまで重力によってバッグに収集する。収集直後、バッグを氷の上に載せて、処理施設（例えば、Ｂｉｏｄｅｘｔｒｉｓ）に輸送する。
【００６３】
（細胞洗浄）
収集した血液は、図２に示す工程によって洗浄する。先の２４時間以内に行った多数の収集物からの３〜５リットル（Ｌ）の血液は、蠕動ポンプを用いて単一のＭｏｂｉｕｓ  ５ＬのフレキシブルバッグＴ１００に送る。５０Ｌのクエン酸ナトリウム溶液（精製水と６．０ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム二水和物及び７．９ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）を滅菌混合タンクで製造し、５０ＬのフレキシブルバッグＴ１０１に１０ｋＤａの膜フィルタを通過させることで脱パイロジェン化させる。２８０ｍＬ−分−１の流速でクエン酸ナトリウム溶液を注入すると共に、クエン酸血液を２００ｍＬ−分−１の流速でスタティックインラインミキサに注入する。混合物は、０．６μＭ及び０．４μＭの連続の深層濾過膜を介して２０ＬのフレキシブルバッグＴ１０２に送る。バッグＴ１０２が５Ｌの濾過血液を含む場合、洗浄工程は、０．２μＭの中空糸膜を介した再循環によって１Ｌ−分−１の速度で開始される。膜差圧（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）が１５ｐｓｉに調整され、３００ｍＬ−分−１の平均透過流速を可能とする。透析濾過による細胞洗浄は、３００ｍＬ−分−１の流速でクエン酸ナトリウム溶液をバッグＴ１０２に注入することで開始となり、細胞が７つの容量に洗浄されるまで継続する。透析濾過透過液は、５０Ｌのフレキシブル廃棄物バッグＴ１０３に送る。透析濾過は、７血液量と等価の透過液が収集されるまで継続する。細胞洗浄工程に用いる部品の例を下記表１に提供する。
【００６４】
【表１】
2020533416.tif 000002
【００６５】
この工程の代案は、さらに大きな規模の装備を用いてこのステップを実施するか、遠心分離機を設置して２５Ｌでｃ５００ステップを実施することである。現在のセットアップは、バッグを移動式ラックに装着できるよう、タンク（バッグサイズ）を５０Ｌに制限して設計されている。
【００６６】
（細胞溶解）
浸透圧の急激な減少によって細胞が溶解したとき、ウシ赤血球からヘモグロビンが遊離する。図３に示すように、１００ｋＤａ膜及び３０ｋＤａ膜を介した細胞溶解及び連続の透析濾過を実施する。クエン酸全血が２５０ｍＬ−分−１の流速でスタティックインラインミキサに注入されると共に、注射用水が２５０ｍＬ−分−１の流速で１０ＬのフレキシブルバッグＴ１０５に注入される。Ｔ１０５が２.０〜２.５Ｌの希釈全血で充填されると、１０００ｍＬ−分−１の流速で１００，０００ｋＤａの中空糸膜カートリッジＦ１０３を介した再循環が開始される。透過液は、５ＬのフレキシブルバッグＴ１０６に送られる。１．０〜１．５Ｌの透過液がＴ１０６に蓄積されると、１０００ｍＬ−分−１の流速で３０，０００ｋＤａ膜Ｆ１０４を介した再循環が開始される。Ｆ１０４透過液は廃棄物に送られる。全血Ｔ１０２の容量が２５０ｍＬ未満であるとき、ポンプ１０４及び１０５が停止する。次いで、例えば、透析濾過は、２５０ｍＬ−分−１の流速でＷＦＩをＴ１０５に直接注入することで開始し、およそ２５〜３０Ｌの透析濾過容量に相応する１００，０００ｋＤａ透過液中におけるヘモグロビン濃度が０．２ｍｇ−ｍＬ−１未満になるまで継続する。細胞溶解工程に用いる部品の例を下記表２に提供する。
【００６７】
【表２】
2020533416.tif 000003
【００６８】
（ヘモグロビン溶液の脱酸素化）
ヘモグロビン溶液は、酸素を除去することで安定化され、図４に示す工程を用いて中間体として保存のために濾過される。最初に、ヘモグロビン溶液は、７５ｐｓｉにおける窒素の対向流と共に、５００ｍｌ−分−１の流速で直列に整列された２つのＬｉｑｕｉｃｅｌｌ膜を介して注入される。溶存酸素数値が０．０２ｍｇ−ｍＬ−１未満になるまで脱酸素化を継続する。脱酸素化が十分達成されると、ヘモグロビン溶液は、０．３μＭ及び２つの０．２２のμＭ深層フィルタを介して５Ｌのフレキシブルバッグに注入することで濾過される。濾過したヘモグロビンは、さらなる処理の前に最大２週間保存できる。ヘモグロビン濾過脱酸素化工程に用いる部品の例を下記表３に提供する。
【００６９】
【表３】
2020533416.tif 000004
【００７０】
（クロマトグラフィ）
クロマトグラフィを用いてヘモグロビン溶液をさらに精製し、非特異的血液細胞成分を減少させる（図５に示す工程）。これは、７０±５ｃｍのベッド高さまでＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で満たされたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＸＫボロシリケートカラム（内径５ｃｍ×長さ１００ｃｍ）が装着されたＧＥ  Ａｋｔａ  Ｂｉｏｐｉｌｏｔクロマトグラフィシステムを用いて行われる。緩衝液は、注射用水を用いて製造し、パイロジェンの含有量がさらに減少するように、１０ｋＤａ膜を介して濾過する。緩衝液は、（１）緩衝液Ａ；酢酸を用いてｐＨ９．０±０．１に調整された２.４２ｇ−Ｌ−１トリス塩基、（２）緩衝液Ｂ；酢酸を用いてｐＨ７．０±０．１に調整された６．０５ｇ−Ｌ−１トリス塩基、及び（３）緩衝液Ｃ；酢酸を用いてｐＨ８．９±０．１に調整された２.４２ｇ−Ｌ−１トリス塩基及び５８．３８ｇ−Ｌ−１ＮａＣｌである。
【００７１】
クロマトグラフィの作業前に、新たに満たされたＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを介して５回の完全な緩衝液サイクルを実行する。クロマトグラフィは１２５ｍＬ−分−１の流速で実施する。最初に、１３０±１０ｍｇ−ｍＬ−１のヘモグロビンを含有する１Ｌのヘモグロビン溶液をカラムにロードした後、同じ容量の緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂを添加することで形成されるｐＨ勾配を生成する。カラムから溶出するタンパク質は、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって測定される。溶出液の吸光度が０．０５ＡＵ未満に低下すると、１００％の緩衝液Ｂで溶出してカラムｐＨが増加する。クロマトグラフィのこの部分を実行する間にヘモグロビンが溶出する。ヘモグロビン分画は、吸光度が０．４３ＡＵに達すると、２０ＬのフレキシブルバッグＴ１１１に収集され、吸光度が０．０５ＡＵ未満に低下するとき終了する。ヘモグロビンの溶出後、３Ｌの緩衝液Ｃをカラムを介して注入して、しっかりと結合している成分を溶出させる。
【００７２】
カラムは、各クロマトグラフィの実行の間で、０．２Ｎリン酸及び後続する２回の完全な緩衝液サイクルを用いて洗浄される。カラムは、２４時間以内に他の実行が開始されなければ、０．２Ｎリン酸で保存される。クロマトグラフィ工程に用いる部品の例を下記表４に提供する。
【００７３】
【表４】
2020533416.tif 000005
【００７４】
（脱酸素化）
図６Ａ〜図６Ｂに示すように、精製ヘモグロビンを脱酸素化して安定性を増加させる。陰イオン交換クロマトグラフィのステップから精製された分画を３０，０００Ｄａの中空糸膜Ｆ１１０を介した濾過によって１１．０±１ｍｇ−ｍＬ−１に濃縮させる。所望のヘモグロビン濃度に達すると、精製ヘモグロビンは７５ｐｓｉにおける窒素の対向流と共に、５００ｍｌ−分−１の流速で直列に整列された２つのＬｉｑｕｉｃｅｌｌ膜Ｆ１０８、Ｆ１０９を通過して脱酸素化する。溶存酸素数値が０．０２ｍｇ−ｍＬ−１未満になるまで脱酸素化を継続する。
【００７５】
その後、脱酸素化精製ヘモグロビンは、３０，０００Ｄａの中空糸膜Ｆ１１０を介して注入することで、６つの容量の保存緩衝液に対して透析濾過される。保存緩衝液の組成は、２．６３ｇ−Ｌ−１の三塩基性リン酸ナトリウム１２水和物、７．０ｇ−Ｌ−１の二塩基性リン酸ナトリウム７水和物、及び２．０ｇ−Ｌ−１のアセチルシステインである。緩衝液の交換が完了すると、溶液は０．５μＭ及び２つの０．２２μＭの深層フィルタを介して５ＬのフレキシブルバッグＴ１１３に注入することで濾過される。精製ヘモグロビンは、さらなる処理の前に室温（１７〜２３℃)で最大６０日間窒素グローブボックスに保存できる。脱酸素化工程に用いる部品の例を下記表５に提供する。
【００７６】
【表５】
2020533416.tif 000006
【００７７】
（重合）
精製ヘモグロビンは、図７に示す工程を用いてグルタルアルデヒドと架橋することで重合される。精製ヘモグロビン（４〜５Ｌ、１１０ｇ／Ｌ）は、窒素圧力下で保存タンクＴ１１３から２０Ｌの温度制御式ウェーブバッグＴ６０３に送られる。注射用水が精製ヘモグロビン移送ラインを介してＴ６０３に注入され、ヘモグロビン濃度が４０ｇ／Ｌに減少する。次いで、希釈ヘモグロビン溶液の温度を４２±２℃まで上昇させる。グルタルアルデヒド溶液は、温度制御式ウェーブバッグＴ６０２で６．２ｇ／Ｌの濃度で製造し、４２±２℃に加熱する。ヘモグロビンに対するグルタルアルデヒドの比がおよそ０．０２９：１になるまで、グルタルアルデヒド溶液を１０ｍＬ／分の速度でＴ６０３に注入する。グルタルアルデヒドは、再循環ループでスタティックミキサＭ６０１を介して添加され、ヘモグロビン溶液と迅速且つ均質に混合する。グルタルアルデヒドの添加が完了すると、反応混合物の温度は２２±２℃に冷却され、溶液は３０，０００Ｄａの中空糸膜Ｆ６０１を介した透析濾過によって８０±５ｇ／Ｌのヘモグロビン濃度に濃縮される。
【００７８】
図８で要約するように、グルタルアルデヒドとヘモグロビンの結合は、水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元により安定化される。水素化ホウ素ナトリウムは、中性ｐＨの水溶液で分解され、分子状水素及びホウ酸ナトリウムを形成する。水素化ホウ素ナトリウムを安定化させて水素ガスの形成を制限するために、ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いて、重合ヘモグロビンに対して透析濾過を実施する。ホウ酸塩緩衝液は、注射用水中に４．５８ｇ／Ｌのホウ酸ナトリウム１０水和物及び０．９１ｇ／Ｌの水酸化ナトリウムで構成される。
【００７９】
パイロジェンの含有量を減少させるよう、緩衝液が１０，０００Ｄａ膜を介して濾過され、２０ＬのフレキシブルバッグＴ６０５に保存される。最初に、ホウ酸塩緩衝液は、２５０ｍＬ／分の流速で再循環ループを介してＴ６０３に注入される。同時に、重合ヘモグロビン溶液は、１，０００ｍＬ／分の流速で３０，０００Ｄａの中空糸膜を介して注入することで透析濾過される。ホウ酸の添加流速は、透析濾過の透過率であるおよそ２５０ｍＬ／分と同等に調整される。ホウ酸塩緩衝液による透析濾過は、重合ヘモグロビン溶液の３倍に該当する容量が添加されるまで継続する。
【００８０】
水素化ホウ素ナトリウム溶液は、注射用水中に９．４５ｇ／Ｌの水素化ホウ素ナトリウム、４．５８ｇ／Ｌのホウ酸ナトリウム１０水和物、及び０．９１ｇ／Ｌの水酸化ナトリウムで構成される。この溶液は、パイロジェンの含有量を減少させるために、１０，０００Ｄａ膜を介して濾過され、２ＬのフレキシブルバッグＴ６０６に保存される。最初に、水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．６Ｌ）は、７ｍＬ／分の流速で再循環ループを介してＴ６０３に注入され、Ｔ６０３の温度は２０±２℃に制御される。ホウ化水素反応は、重合ヘモグロビン溶液を連続して再循環させるとともに、全ての溶液を添加した後、６０分間継続する。
【００８１】
安定化した重合ヘモグロビン溶液は、３０ｋＤ限外濾過膜Ｆ６０１を介して１００±５ｇ／Ｌのヘモグロビン濃度に濃縮する。ホウ素含有成分（ホウ酸ナトリウム／水素化ホウ素ナトリウム）を除去し、透析濾過溶液Ａ（６．６７ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、０．３０ｇ／Ｌの塩化カリウム、０．２０ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物、０．４４５ｇ／Ｌの水酸化ナトリウム、２．０２ｇ／ＬのＮ―アセチル―Ｌ―システイン、３．０７ｇ／Ｌの乳酸ナトリウム、ｐＨ＝４．９〜５．１）を用いて、３０ｋＤ限外濾過膜Ｆ６０１を介して重合ヘモグロビンを透析濾過することでｐＨを８．０〜８．４に減少させる。重合工程に用いる部品の例を下記表６に提供する。
【００８２】
【表６】
2020533416.tif 000007
【００８３】
（滅菌濾過）
最終の重合ヘモグロビン溶液は、０．５μｍの深層フィルタ、滅菌グレード０．２μｍの膜フィルタ、及び２つ目の滅菌グレード０．２μｍの膜フィルタを介して、２７５リットルの蒸気殺菌された携帯用の大容量保有タンクに濾過される。大容量保有タンクは、使用するまで窒素下で保存される。
【００８４】
（実施例２）
ＯｘｙＰｌｙ薬物物質の大容量製造のための製造工程及び工程制御に関する説明
（導入）
ＯｘｙＰｌｙ薬物物質の大容量の製造は下記の主要ステップを含む。
【００８５】
１．血液収集―クエン酸ナトリウム抗凝固剤に収集されたウシ血液
（血液収集）
ウシ血液は、モントリオール大学の獣医学部と提携している農場から得られる。動物は、学校の文書化された健康プログラムにより持続的に観察される。
【００８６】
静脈穿刺により、尾静脈から動物当たり最大１リットル容量の血液を得る。５００ミリリットル（ｍＬ）の二重血液パック収集システムを用いて収集が行われる（Ｆｅｎｗａｌ、部品番号４Ｒ３４２９、米国イリノイ州レークズリク）。バッグには、ＣＰＤ抗凝固剤が含まれ、衛星コンテナ及び滅菌ニードル／チューブサンプリングシステムが装着されている。雌牛の尾を上げて、１６ゲージのニードルを尾の最下位から３〜６インチで、尾と下側の正中線に垂直になるよう約０．５インチの深さで挿入する。血液は、４５０〜５００ｍＬが得られるまで重力によってバッグに収集する。収集直後、バッグを氷の上に載せて処理施設に輸送する。
【００８７】
（細胞洗浄）
収集した血液は、図９に示す工程によって洗浄する。先の２４時間以内に行った多数の収集物からの１５〜２０Ｌの血液は、蠕動ポンプを用いて単一の２０ＬのＧＥ  Ｒｅａｄｙ  ＣｉｒｃｕｉｔフレキシブルバッグＴ１００に送る。２００Ｌのクエン酸ナトリウム溶液（精製水と６．０ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウム二水和物及び７．９ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）を滅菌混合タンクで製造し、２００Ｌの超低密度ポリエチレン（ＵＬＤＰ）使い捨てバッグＴ１０１に１０，０００Ｄａ膜フィルタを通過させることで脱パイロジェン化させる。７００ｍＬ−分−１の流速でクエン酸ナトリウム溶液を注入すると共に、クエン酸血液を５００ｍＬ−分−１の流速でスタティックインラインミキサに注入する。混合物は、０．６μＭ及び０．４μＭの連続の深層濾過膜を介して５０ＬのＵＬＤＰ使い捨てバッグＴ１０２に送る。バッグＴ１０２が１０Ｌの濾過血液を含む場合、洗浄工程は２Ｌ−分−１の速度で０．２μＭの中空糸膜を介した再循環によって開始される。膜差圧が１５ｐｓｉに調整され、５００ｍＬ−分−１の平均透過流速を可能とする。透析濾過による細胞洗浄は、５００ｍＬ−分−１の流速でクエン酸ナトリウム溶液をバッグＴ１０２に注入することで開始となり、細胞が７つの透析濾過容量に洗浄されるまで継続する。透析濾過透過液は、２００ＬのＵＬＤＰ使い捨てバッグＴ１０３に送られる。透析濾過は、７つの血液量と等価の透過液が収集されるまで継続する。
【００８８】
細胞洗浄工程に用いる部品の例を下記表７に提供し、工程内試験の細胞洗浄に用いる部品の例を下記表８に提供する。
【００８９】
【表７】
2020533416.tif 000008
【００９０】
【表８】
2020533416.tif 000009
【００９１】
（細胞溶解）
図１０に示すように、赤血球は、遠心分離によって白血球及び血小板から分離され、浸透圧の急激な減少によって細胞が溶解したとき、赤血球からヘモグロビンが遊離する。洗浄された血液細胞は、１３，５００×ｇで作動する管状ボウル遠心分離機Ｃ２０１内に注入される。重質相に含まれた赤血球は、注射用水で２倍希釈され、スタティックミキサＭ２０１を介して２０ＬのＧＥ  Ｒｅａｄｙ  ＣｉｒｃｕｉｔフレキシブルバッグＴ２０２に送られる。Ｔ２０２が少なくとも１０Ｌの希釈全血で充填されると、１０００ｍＬ−分−１の流速で１００，０００ｋＤａの中空糸膜カートリッジＦ２０１を介した再循環が開始される。透過液は、２０ＬのＧＥ  Ｒｅａｄｙ  ＣｉｒｃｕｉｔフレキシブルバッグＴ２０３に送られる。Ｔ２０３に１５Ｌの透過液が蓄積されると、１０００ｍＬ−分−１の流速で３０，０００ｋＤａ膜Ｆ２０２を介した再循環が開始される。Ｆ２０２透過液は、廃棄物に送られる。１００，０００Ｄａ膜Ｆ２０１を介した透析濾過は、透過液中のヘモグロビン濃度が０．２ｍｇ／ｍＬ未満になるまで継続し、これは遊離したヘモグロビンの大半が抽出されたということを示す。これはおよそ２５〜３０Ｌの透析濾過容量に相当するおよそ１５〜２０の透析濾過容量に相当する。１００，０００Ｄａの濾過により細胞残骸物から分離したヘモグロビンは、３０，０００ｋＤａ膜に対する濾過によって濃縮される。１００，０００Ｄａステップ及び３０，０００Ｄａステップは、連続工程により実施される。ヘモグロビン濃度が９０〜１１０ｇ／Ｌの範囲内にあるとき、３０，０００Ｄａ濾過が停止する。
【００９２】
細胞溶解工程に用いる部品の例を下記表９に提供し、工程内試験の細胞溶解 に用いる部品の例を下記表１０に提供する。
【００９３】
【表９】
2020533416.tif 000010
【００９４】
【表１０】
2020533416.tif 000011
【００９５】
（ヘモグロビン溶液の脱酸素化）
ヘモグロビン溶液は、酸素を除去することで安定化され、図１１に示す工程を用いて中間体として保存のために濾過される。最初に、ヘモグロビン溶液は、７５ｐｓｉにおける窒素の対向流と共に、５００ｍｌ−分−１の流速で直列に整列された２つのＬｉｑｕｉｃｅｌｌ膜を介して注入される。溶存酸素数値が０．０２ｍｇ−ｍＬ−１未満になるまで脱酸素化を継続する。脱酸素化が十分達成されると、ヘモグロビン溶液は、０．３μＭ及び２つの０．２２μＭの深層フィルタを介して２０ＬのＧＥ  Ｒｅａｄｙ  ＣｉｒｃｕｉｔフレキシブルバッグＴ３０１に注入することで濾過される。濾過されたヘモグロビンは、さらなる処理の前に最大２週間保存できる。
【００９６】
ヘモグロビン濾過脱酸素化工程に用いる部品の例を下記表１１に提供し、工程内試験のヘモグロビン濾過脱酸素化に用いる部品の例を下記表１２に提供する。
【００９７】
【表１１】
2020533416.tif 000012
【００９８】
【表１２】
2020533416.tif 000013
【００９９】
（クロマトグラフィ）
クロマトグラフィを用いてヘモグロビン溶液をさらに精製し、非特異的血液細胞成分を減少させる（図１２に示す工程）。これは、７０±５ｃｍのベッド高さまでＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で満たされたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＸＫボロシリケートカラム（内径５ｃｍ×長さ１００ｃｍ）が装着されたＧＥ  Ａｋｔａ  Ｂｉｏｐｉｌｏｔクロマトグラフィシステムを用いて行われる。緩衝液は、注射用水を用いて製造し、パイロジェンの含有量がさらに減少するように、１０ｋＤａ膜を介して濾過する。緩衝液は、（１）緩衝液Ａ；酢酸を用いてｐＨ９．０±０．１に調整された２.４２ｇ−Ｌ−１トリス塩基、（２）緩衝液Ｂ；酢酸を用いてｐＨ７．０±０．１に調整された６．０５ｇ−Ｌ−１トリス塩基、及び（３）緩衝液Ｃ；酢酸を用いてｐＨ８．９±０．１に調整された２.４２ｇ−Ｌ−１トリス塩基及び５８．３８ｇ−Ｌ−１ＮａＣｌである。
【０１００】
クロマトグラフィの作業前に、新たに満たされたＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムを介して５回の完全な緩衝液サイクルを実行する。クロマトグラフィは１２５ｍＬ−分−１の流速で実施する。最初に、１３０±１０ｍｇ−ｍＬ−１ヘモグロビンを含有する１Ｌのヘモグロビン溶液をカラムにロードした後、同じ容量の緩衝液Ａ及び緩衝液Ｂを添加することで形成されるｐＨ勾配を生成する。カラムから溶出するタンパク質は、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって測定される。溶出液の吸光度が０．０５ＡＵ未満に低下すると、１００％の緩衝液Ｂで溶出してカラムｐＨが増加する。クロマトグラフィのこの部分を実行する間にヘモグロビンが溶出する。ヘモグロビン分画は、吸光度が０．４３ＡＵに達すると、２０ＬのＧＥ  Ｒｅａｄｙ  Ｃｉｒｃｕｉｔ使い捨てバッグＴ４０５に収集され、吸光度が０．０５ＡＵ未満に低下するとき終了する。ヘモグロビンの溶出後、３Ｌの緩衝液Ｃをカラムを介して注入して、しっかりと結合している成分を溶出させる。
【０１０１】
カラムは、各クロマトグラフィの実行の間で０．２Ｎリン酸及び後続する２回の完全な緩衝液サイクルを用いて洗浄される。カラムは、２４時間以内に他の実行が開始されなければ、０．２Ｎリン酸で保存される。
【０１０２】
クロマトグラフィ工程に用いる部品の例を下記表１３に提供し、工程内試験のクロマトグラフィに用いる部品の例を下記表１４に提供する。
【０１０３】
【表１３】
2020533416.tif 000014
【０１０４】
【表１４】
2020533416.tif 000015
【０１０５】
（脱酸素化）
図１３Ａ及び図１３Ｂに示すように、精製ヘモグロビンを脱酸素化して安定性を増加させる。陰イオン交換クロマトグラフィのステップから精製された分画を３０，０００Ｄａの中空糸膜Ｆ５０３を介した濾過によって１１．０±１ｍｇ−ｍＬ−１に濃縮させる。所望のヘモグロビン濃度に達すると、精製ヘモグロビンは７５ｐｓｉにおける窒素の対向流と共に、５００ｍｌ−分−１の流速で直列に整列された２つのＬｉｑｕｉｃｅｌｌ膜Ｆ５０１、Ｆ５０２を通過して脱酸素化する。溶存酸素数値が０．０２ｍｇ／ｍＬ未満になるまで脱酸素化を継続する。
【０１０６】
その後、脱酸素化精製ヘモグロビンは、３０，０００Ｄａの中空糸膜Ｆ１１０を介して注入することで、６つの容量の保存緩衝液に対して透析濾過される。保存緩衝液の組成は、２．６３ｇ−Ｌ−１の三塩基性リン酸ナトリウム１２水和物、７．０ｇ−Ｌ−１の二塩基性リン酸ナトリウム７水和物、及び２．０ｇ−Ｌ−１のアセチルシステインである。緩衝液の交換が完了すると、溶液は０．５μＭ及び２つの０．２２μＭの深層フィルタを介して２０ＬのＧＥ  Ｒｅａｄｙ  Ｃｉｒｃｕｉｔ使い捨てバッグＴ５０１に注入することで濾過される。精製ヘモグロビンは、さらなる処理の前に室温（１７〜２３℃)で最大６０日間窒素グローブボックスに保存できる。
【０１０７】
脱酸素化工程に用いる部品の例を下記表１５に提供し、工程内試験の脱酸素化に用いる部品の例を下記表１６に提供する。
【０１０８】
【表１５】
2020533416.tif 000016
【０１０９】
【表１６】
2020533416.tif 000017
【０１１０】
（重合）
精製ヘモグロビンは、図１４に示す工程を用いてグルタルアルデヒドと架橋することで重合される。精製ヘモグロビン（４〜５Ｌ、１１０ｇ／Ｌ）は、窒素圧力下で保存タンクＴ５０１から２０Ｌの温度制御式ウェーブバッグＴ６０３に送られる。注射用水が精製ヘモグロビン移送ラインを介してＴ６０３に注入され、ヘモグロビン濃度が４０ｇ／Ｌに減少する。次いで、希釈ヘモグロビン溶液の温度を４２±２℃まで上昇させる。グルタルアルデヒド溶液は、温度制御式ウェーブバッグＴ６０２で６．２ｇ／Ｌの濃度で製造し、４２±２℃に加熱する。ヘモグロビンに対するグルタルアルデヒドの比がおよそ０．０２９：１になるまで、グルタルアルデヒド溶液を１０ｍＬ／分の速度でＴ６０３に注入する。グルタルアルデヒドは、再循環ループでスタティックミキサＭ６０１を介して添加され、ヘモグロビン溶液と迅速且つ均質に混合する。グルタルアルデヒドの添加が完了すると、反応混合物の温度は２２±２℃に冷却され、溶液は３０，０００Ｄａの中空糸膜Ｆ６０１を介した透析濾過によって８０±５ｇ／Ｌのヘモグロビン濃度に濃縮される。
【０１１１】
図１５で要約するように、グルタルアルデヒドとヘモグロビンの結合は、水素化ホウ素ナトリウムを用いた還元により安定化される。水素化ホウ素ナトリウムは、中性ｐＨの水溶液で分解され、分子状水素及びホウ酸ナトリウムを形成する。水素化ホウ素ナトリウムを安定化させて水素ガスの形成を制限するために、ホウ酸ナトリウム緩衝液を用いて、重合ヘモグロビンに対して透析濾過を実施する。ホウ酸塩緩衝液は、注射用水中に４．５８ｇ／Ｌのホウ酸ナトリウム１０水和物及び０．９１ｇ／Ｌの水酸化ナトリウムで構成される。パイロジェンの含有量を減少させるよう、緩衝液が１０，０００Ｄａ膜を介して濾過され、２０ＬのフレキシブルバッグＴ６０５に保存される。最初に、ホウ酸塩緩衝液は、２５０ｍＬ／分の流速で再循環ループを介してＴ６０３に注入される。同時に、重合ヘモグロビン溶液は、１，０００ｍＬ／分の流速で３０，０００Ｄａの中空糸膜を介して注入することで透析濾過される。ホウ酸の添加流速は、透析濾過の透過率であるおよそ２５０ｍＬ／分と同等に調整される。ホウ酸塩緩衝液による透析濾過は、重合ヘモグロビン溶液の３倍に該当する容量が添加されるまで継続する。
【０１１２】
水素化ホウ素ナトリウム溶液は、注射用水中に９．４５ｇ／Ｌの水素化ホウ素ナトリウム、４．５８ｇ／Ｌのホウ酸ナトリウム１０水和物、及び０．９１ｇ／Ｌの水酸化ナトリウムで構成される。この溶液は、パイロジェンの含有量を減少させるために、１０，０００Ｄａ膜を介して濾過され、２ＬのフレキシブルバッグＴ６０６に保存される。最初に、水素化ホウ素ナトリウム溶液（０．６Ｌ）は、７ｍＬ／分の流速で再循環ループを介してＴ６０３に注入され、Ｔ６０３の温度は２０±２℃に制御される。ホウ化水素反応は、重合ヘモグロビン溶液を連続して再循環させるとともに、全ての溶液を添加した後、６０分間継続する。
【０１１３】
安定化した重合ヘモグロビン溶液は、３０ｋＤａ限外濾過膜Ｆ６０１を介して１００±５ｇ／Ｌのヘモグロビン濃度に濃縮する。ホウ素含有成分（ホウ酸ナトリウム／水素化ホウ素ナトリウム）を除去し、透析濾過溶液Ａ（６．６７ｇ／Ｌの塩化ナトリウム、０．３０ｇ／Ｌの塩化カリウム、０．２０ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物、０．４４５ｇ／Ｌの水酸化ナトリウム、２．０２ｇ／ＬのＮ―アセチル―Ｌ―システイン、３．０７ｇ／Ｌの乳酸ナトリウム、ｐＨ＝４．９〜５．１）を用いて、３０ｋＤ限外濾過膜Ｆ６０１を介して重合ヘモグロビンを透析濾過することでｐＨを８．０〜８．４に減少させる。
【０１１４】
重合工程に用いる部品の例を下記表１７に提供し、試験内工程の重合に用いる部品の例を下記表１８に提供する。
【０１１５】
【表１７】
2020533416.tif 000018
【０１１６】
【表１８】
2020533416.tif 000019
【０１１７】
（滅菌濾過）
最終の重合ヘモグロビン溶液は、０．５μｍの深層フィルタＦ７０１、滅菌グレード０．２μｍの膜フィルタＦ７０２、及び２つ目の滅菌グレード０．２μｍの膜フィルタＦ７０３を介して、２０ＬのＧＥ  Ｒｅａｄｙ  ＣｉｒｃｕｉｔフレキシブルバッグＴ７０１に濾過される。大容量保有タンクは、使用するまで窒素下で保存される。滅菌濾過工程の概略図を図１６に示す。滅菌濾過工程に使用する部品の例を下記表１９に提供する。
【０１１８】
【表１９】
2020533416.tif 000020
【０１１９】
（実施例３）
製造及び精製工程のための装置及びアセンブリ
タンパク質（例えば、ヘモグロビン）精製工程は、分離システムの使用を含む（図１８）。この分離システムは、分離チャンバ（図１９Ａ〜図１９Ｂ）と、共に組み立てられ（図２１）、溶液（例えば、血液）からタンパク質を抽出するためのモジュールシステム（図２０）に設置可能なチューブセットアセンブリ（図２２）とを含む。タンパク質精製のための分離システムは、さらなる装置（図２３）を含むことができる。
【０１２０】
血液深層濾過は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ  ６０ＨＸの類似装置（図２４）を用いて行うことができる。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｌａｒｉｓｏｌｖｅ  ６０ＨＸまたはその類似装置は、血液深層濾過のために、アセンブリ（図２５）に連結できる。
【０１２１】
概略図（図２９）及び画像（図２８）の両方に重合アセンブリの例が示されている。このアセンブリにおいて、異なるグルタルアルデヒド／ｂＨＢの割合及びタイプのマニホールドを試験した。最適化されたマニホールドで再現性を評価するために、３回の重合反応を２日間行った。試験パラメータは、１試験当たり１８ｇの物質及びヘモグロビン（ｂＨＢ）１グラム当たり２９ｍｇのグルタルアルデヒドを用いた５月４日付１ロット、及び５月５日付２ロットを含む。図２８の試験装置は、３／１６インチの外径×４，６２５の長さのスタティックミキサ、過剰還流を回避するためにＹ字形の代わりにＴ字形のコネクタ、閉鎖型システム濃縮／透析濾過のための保持液チューブ上の弁、及び持続的なＮ２散布を有する。タンパク質（ヘモグロビン）の重合処理後のタンパク質架橋分布データを含むグラフ（図２７）及びチャート（図２６）を得た。
【０１２２】
図３５にタンパク質精製のためのクロマトグラフィシステムアセンブリの例を示す。Ｃ８００  ＱＥＸ（または等価物）クロマトグラフィシステムに対して、２つの相違する勾配最適化を行った。図３０〜図３１に、クロマトグラフィの最適化１データを含むグラフ、画像、及びチャートを示す。図３２〜図３３に、クロマトグラフィの最適化２データを含むグラフ、画像、及びチャートを示す。図３４に、Ｃ８００  ＱＥＸ（または等価物）クロマトグラフィシステムでＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬのＣＩＰの最適化のための流れ図を示す。一部のクロマトグラフィ処理の場合、４１２ｍｌのカラム（直径５ｃｍ）に１８０〜２２０ｍｇのヘモグロビン（ｂＨＢ）／ｍｌの樹脂をロードした。Ｃ５００  １７０５  Ａを処理するために、３回の実行を完了した。分画収集器を最初の実行に用い、緩衝液を持続的にＮ２散布した。分画収集器は、Ｎ２で膨張したアトモスバッグに覆われるように設計した。一部の場合、勾配方法は直径２，６ｃｍのカラム上で最適化された。
【０１２３】
図３７Ａ〜図３７Ｅは、タンパク質精製のための１０ＫＤａ透析濾過工程のチャート、グラフ、及び画像を示す。図３８Ａ〜図３８Ｃは、タンパク質精製のための１００ＫＤａ透析濾過工程の一連のチャート及びグラフを示す。画像（図３９）及び概略図（図４０）に、１００ＫＤａ透析濾過工程のためのアセンブリの例を示す。１００ＫＤａ透析濾過工程は、保持液、透過液、及び透析濾過緩衝液の一定のＮ２散布を含み；１０ｋＤａ膜により透析濾過された＜０，００５ＥＵｍｌにおける透析濾過Ｈ２Ｏ（ＭｉｌｌｉＱ  Ｈ２Ｏ）を用い；マグネット撹拌機を用いずに、保持液の均質性を改善するために、保持液チューブにスタティックミキサとＴ字形に嵌合することで、透析濾過緩衝液を添加することを含み；ゲル層の形成及びフラックスの減少を防止し、大規模なパイロット規模でブリッジするために、蠕動ポンプを用いた透過流動制御を含み；また、一時的な二量体ｂＨＢ形態の比率の増加を促進して、透析濾過の効率及び収率を向上させるよう、膜に入る前にフィードを４０℃の熱交換器に短時間で通過させることを含む。
【０１２４】
図４１は、中空糸洗浄工程の概略図を示す。この工程は、溶解前の抗凝固血液細胞に用いる。この工程は、赤血球を損傷することなく、ヘモグロビンをエンドトキシン及び他の脂質に露出させないよう、様々な方法で行う。図４２Ａ〜図４２Ｃは、血液洗浄及び溶解工程からのデータを示す一連の画像及びチャートである。
【０１２５】
図３６は、４℃で最大４週間保存できるタンパク質製造物Ｃ５００の保存を示す画像である。この製造物は、酸化活性が低いまたは全くないように、化学的に処理されていないものの、脱酸素化された中間体物質である。滅菌濾過は、材料の倉庫から使用可能な材料を引き出すことを可能とする寿命延長の利点がある。
【０１２６】
（実施例４）
変性ヘモグロビンタンパク質系酸素担体
本発明の開示によって製造した幾つかのロットの変性ヘモグロビンタンパク質系酸素担体を標準試験方法により分析した。ロットの結果を下記表２０〜２３に示す。
【０１２７】
【表２０】
2020533416.tif 000021
【０１２８】
【表２１】
2020533416.tif 000022
【０１２９】
【表２２】
2020533416.tif 000023
【０１３０】
【表２３】
2020533416.tif 000024
【０１３１】
（実施例５）
ｃＧＭＰ製造変性ヘモグロビンタンパク質系酸素担体
図４３を参照すると、商業的規模の製造施設が示されている。主要な製造スイートルーム１２７は、グレードＣ／ＩＳ０８規格を満たすように設計されている。このルームは、本発明による専用のイオン交換クロマトグラフィによりヘモグロビン溶液（即ち、水で希釈された原料物質）がさらに精製され得る主要処理室である。溶出液は、酸素を防いで微粒子への露出を防止するために、適切な容器に収集する。取り扱いや連結は、チューブ溶接機及び適切な密閉コンテナを介して行うので、室内環境への露出に対する全てのリスクを低減させる。材料は３０ｋＤのＴＦＦ膜を介して露出される。ＮａＣｌ緩衝溶液は、高純度のヘモグロビン溶液に添加され、疎水性ガス交換膜を介した脱酸素化を可能とする。
【０１３２】
ヘモグロビン溶液は、目標とするヘモグロビン濃度を達成するために、脱酸素剤を含有する保存緩衝液に濾過されて濃縮される。次いで、ヘモグロビン溶液は、さらに処理するまで（開放システム移動なし）、保存のために予め滅菌されたベッグに「０．２ミクロン濾過」される。このルームは、ヘモグロビンを重合し、反応液をクエンチングし、３０ｋＤ膜を用いて緩衝液を交換するための工程装備をさらに含む。また、重合システムにおける各容器は、閉鎖システムの疎水性気体交換膜を介して再循環され、工程に化学物質及び緩衝液を添加することで、システムに導入された任意の酸素を除去する。最終の重合ヘモグロビン製造物は、予め滅菌された容器に「０．２２ミクロン濾過」される。最終の製造物は、放出されるまで安全な場所で倉庫に保存でき、このようにして、委託された充填施設に輸送することができる。
【０１３３】
図４３をさらに参照すると、製造支援スイートルーム１３０は、グレードＤ／ＩＳ０９規格を満たすように設計されている。このルームは、工程に用いる緩衝液を剤形化することで、主要工程領域を支援する。緩衝液剤形に用いる化学物質は、粒子制御のために格納されたフードで秤量される。壁のポートを介して通過してアイリス弁で密封されるチューブを用いて、緩衝液が工程に供給される。また、これらのポートは、廃棄物の蓄積タンクに流動し得るよう、グレード未満の工程廃棄物液を廃棄物移送ヘッダに移送するのに用いる。
【０１３４】
薬学的に規定されたＳＯＰにより、ルームの清掃は、規定されたＳＯＰによって第４級アンモニウム「衛生化剤」により各作業日に行う。ルームは、毎月、殺胞子剤や環境モニタリングプログラムのエクスカーションに応じて清掃する。この工程は、予め滅菌された使い捨てシステムを用いて行う。閉鎖システム状態を保つために、システムにチューブ溶接された容器でサンプリングを行う。
【０１３５】
図４３に示すように、成分準備室１２８は、グレードＣの規格を満たすように設計されている。前記ルームは、滅菌工程で用いるためのアセンブリを準備するのに用いる。前記ルームは、リンス材用ＵＳＰ精製水と、必要に応じて成分の最終リンスを行うためのＷＦＩとを含む。前記ルームは、使用前後の無欠性試験を行うための無欠性試験機をさらに含む。
【０１３６】
また、図４３に示すように、ユーティリティルーム１２３は、設備機能を支援するためのユーティリティを含む。ここには、プラント蒸気ボイラ、空気圧縮機、窒素／アルゴンシステム、真空システム、ＵＳＰ給水システム、ＷＦＩ凝縮器を有する純水蒸気発生器、ＷＦＩシステム、及び廃液中和システムを含む。オートクレーブの機械側は、この空間からアクセスされている。廃棄物中和システムは、ｐＨ排出限界を順守し、正確な測定のための良好な流動を提供するために、バッチ式排出型である。
【０１３７】
図４３に示すように、倉庫室１１９は、製造工程で用いる材料を安全に保存するのに使用し、最終の大容量製品の保存のために追加確保されたルーム（ルーム１０２）と、流入するヘモグロビン溶液の保存のための冷蔵室（ルーム１２２）とを含む。流入する化学物質をＱＣ試験のための代表サンプルと共に購入できる。
【０１３８】
品質制御研究室１１８は、試験サンプルに対して進行中の作業を支援するために使用できる。まだ確認されていない大半の試験は、適切な委託試験研究室に委託することができる。
【０１３９】
（原料供給源）
工程の出発物質は、制御されたドナー群から収集した大量のウシヘモグロビンである。収集した赤血球は、接線流動濾過システムを経た透析濾過、または使い捨て可能な遠心分離機で遠心分離によって洗浄する。次いで、赤血球を浸透圧により溶解した後、ヘモグロビンを１００ｋＤのＴＦＦ膜を介して濾過させる。透過液を収集し、３０ｋＤのＴＦＦ膜を介して濃縮する。ヘモグロビンが目標の濃度になると、ヘモグロビン溶液をバッグに「０．２２ミクロン濾過」し、２〜８℃で保存する。
【０１４０】
（原産国）
全ての動物は米国産である。米国は、２００２年１月１１日に採択された欧州連合文書「牛海綿状脳症の地理的リスクに関する科学運営委員会の意見アップデート」において規定したＧＢＲレベルＩＩ国家である。ＧＢＲレベルＩＩは、「この国の家畜牛は、狂牛病（ＢＳＥ）病原体に感染している可能性は低いが、排除することはできない」ことを示す。
【０１４１】
（交差汚染のリスクを避けるための手順）
処理するためのウシ全血は、収集室の残りの処理領域と分離している専用の収集室で収集されるか、代案としては、制御された空間の屠畜場で収集される。承認された供給業者から入手した動物は、畜舎から血液収集領域に入られる。任意の収集が行われる全ての動物は、原産地や飼料状態を含む家畜群管理プログラムによる完全な文書を有する。動物は、出血や放血後、家畜群管理領域や屠畜施設でのさらなる処理のために、血液収集室から移される。
【０１４２】
（動物の隔離）
収集場または屠畜場に到着した個別に識別されたウシは、管理されている群から制御される。第１例において、標準家畜群管理プログラムにより、専用の血液収集領域に入る前に殆どが制御される。屠畜場の場合、ウシは、収集領域または屠殺台（ｓｔｕｎｎｉｎｇ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）に直結するシュート（ｃｈｕｔｅ）を経て入られる。血液収集施設は、指定施設において、一次放血施設（屠畜場の場合）または収集施設と分離されている。
【０１４３】
（血液収集）
各動物に関する証明書及び確認書は、各収集前に正確性及び安全性のために検証され、動物は、任意の疾病の兆候があるか検査される。血液収集は、閉鎖システムを用いて行う。動物（放血の場合）は固定され、一回の採取の場合、屠殺のために、非空気圧キャプティブボルト方法を使用し得る。屠畜場での収集には「ピッシング」と呼ばれる方法が用いられたことはなく、決して用いないであろう。屠畜場の場合、屠殺直後に、チェーンシャックルを後ひづめ周囲に配置し、動物は頭を下にしてつり上げられる。オーバーヘッドコンベヤシステムは、ラインに沿って動物の死体を収集台に移動させる。屠畜場での提供（ｄｏｎａｔｉｏｎ）の場合、皮の切開は、顎角から胸郭入り口まで行い、次いで、首の後部を包む弾性コードにより露出した頸静脈溝から皮を引く。
【０１４４】
血液は、大静脈近くの頸静脈に挿入されたステンレス鋼トロカールを用いた閉鎖方式で収集する。殺菌されたチューブは、殺菌されたトロカールを殺菌されたステンレス鋼容器またはプラスチックバッグに連結し、これらは、クエン酸ナトリウム抗凝固剤を用いて製造する。およそ１０〜１５リットルの血液をおよそ３０〜６０秒間収集する。血液を収集した後、トロカールを除去して容器を密封する。次いで、死体は、専用の監督収集施設から搬出した後、主要な屠畜処理場に搬入し、返還することができない。動物が２〜５リットルの制御された量で出血される動物管理施設である場合、滅菌済み抗凝固剤が充填されている収集バッグに血液を収集して提供する間、動物は拘束される。
【０１４５】
各収集容器は単一動物の血液を保有する。各収集容器の固有番号は、固有の動物の耳タグと共に記録して連携する。耳タグ番号は、さらに、包装工場を介してウシを追跡するのに用いる固有の屠殺場の動物番号と連携させる。その後、動物は、疾病や汚染を確認するために、ＵＳＤＡの熟練した検査官によって検査される。検査官は、ＵＳＤＡの熟練した獣医師によって監督される。何らかの理由でさらに検査するためにＵＳＤＡ職員が動物を保有している場合には、該当動物の血液は屠畜場で廃棄される。充填された収集容器は、施設から搬出し、氷と共にトラックに載せて分離施設に輸送する。管理されるドナー群の場合、同様の目録を作成し、バッグを収集し冷却して最初の処理施設に輸送する。
【０１４６】
（他の組織が収集した血液を汚染させる可能性）
他の組織による汚染の可能性は、閉鎖方法による血液収集や、管理されて文書化された手順のためによく訓練された作業者の採用により最小化される。屠畜の際、トロカールのブレードを血管に向かうように配置することで、気管及び食道を避ける。
【０１４７】
動物が屠殺される頭蓋骨部位は、トロカール挿入部の位置から物理的に離れている（１メートル）。血液収集の間、動物を懸垂（ｓｕｓｐｅｎｄｅｄ）させる姿勢により、屠殺部位の任意の流液または骨の欠片が収集部位と接触し得ない。収集した血液は、脳、脊髄、目、回腸、リンパ節、近位結腸、脾臓、へんとう腺、硬膜、松果腺、胎盤、脳脊髄液、下垂体、副腎、遠位結腸、鼻粘膜、末梢神経、骨髄、肝臓、肺、膵臓と接触しない。また、任意の潜在的な汚染組織は、製造工場で血液の貯留過程中に除去することができ、血液は８００μのスクリーン、５０μのストレーナ及び６０μの深層フィルタによって順次濾過される。６０μ深層フィルタは、幅広い分布の孔径を有し、最大孔径が６０μまたはミクロンである。
【０１４８】
（水システム）
注射用水は、作業時に全ての内部表面を洗浄するために、スプレーボールを介して再循環する純蒸気を６５℃以上に保たれる２０００Ｌの保存タンクに凝縮させることで製造する。ホットループは、任意の直接的な使用時点を有しないものの、温度を２５℃に下げるために、熱交換器を介して再循環するコールドループを提供する。１つの使用時点は、緩衝液の製造時であり、他の使用時点は、オートクレーブで滅菌する前に最終リンスを行うための成分の準備時である。冷却ループは、規定時間の間、毎日夜間に熱水で消毒する。
【０１４９】
原料は、２〜８℃に保たれる精製ヘモグロビン溶液を除き、制御された室温で保存する。保存のために、ポリプロピレン、ポリカーボネート、シリコーンチューブ、Ｃ−ｆｌｅｘチューブ、及び超低密度ポリエチレンまたはその等価物で製造される不活性耐層を有するバッグなどの標準の使い捨て使用可能な製品接触物質を用いる。システムは、使用前に微粒子を除去し、処理前に漏出をテストするために洗浄する。衛生工程が必要な場合、システムは、規定時間の間、０．５ＭのＮａＯＨで洗浄する。次いで、ＮａＯＨをシステムの外に流し、処理前に保持液を中和させる。最終の製造物は、制御された室温で保存する。
【０１５０】
（ＨＶＡＣ及び空気の取り扱い）
ＨＶＡＣシステムは、冷却されたクリーンルームにＨＥＰＡフィルタで濾過された空気を提供して、湿度を相対湿度６０％未満に減少させ、作業者の便宜のために所望の温度に再加熱する。システムは、最も高い圧力の主要な処理領域と相違する類型のルームとの間で、０．０５インチの圧力カスケードを有する類型に適切且つ十分な換気率を有するよう設計されている。処理スイートは、エアロックで設計され、処理領域に与える影響を最小化すると共に、人と材料の移動を可能とする。ルームは、標準の運営手順により承認済みの衛生化剤で清掃する。生存可能な微粒子及び生存不可能な微粒子に対する環境モニタリングは、ルームのタイプによって周期的に行う。また、表面モニタリングは、標準の運営手順による規定位置で行う。
【０１５１】
（その他の実施形態）
本発明をその詳細な説明と共に説明したが、上述の説明は、添付の請求範囲の範疇によって規定される本発明の範疇を例示するためのものであり、これを制限するものではない。他の態様、長所、及び変更が下記の請求範囲の範疇内に存在する。
【０１５２】
本明細書に言及した特許及び学術文献は、当業者に利用可能な知識を確立する。本明細書で引用する全ての米国特許、及び公開または未公開の米国特許出願は参照として含まれる。本明細書で引用する全ての公開となった外国の特許及び特許出願は参照として含まれる。本明細書で引用する受託番号で表示されたＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩの提出物は、参考として含まれる。本明細書で引用する他の全ての公開となった参考文献、文書、原稿、及び学術文献は、参考として含まれる。
【０１５３】
本発明をその好ましい実施形態を参照して特別に示して説明したが、当業者は、添付の請求範囲によって含まれる本発明の範疇を逸脱することなく、形態及び細部事項における多様な変更が行われ得ることを理解するであろう。
【図１】
2020533416.tif 000025
【図２】
2020533416.tif 000026
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
2020533416.tif 000032
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020533416.tif 000035
【図１１】
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【図１２】
2020533416.tif 000037
【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
2020533416.tif 000041
【図１６】
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【図１７Ａ】
2020533416.tif 000043
【図１７Ｂ】
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【図１８】
2020533416.tif 000045
【図１９Ａ】
2020533416.tif 000046
【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
2020533416.tif 000049
【図２２】
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【図２３Ａ】
2020533416.tif 000051
【図２３Ｂ】
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【図２４】
2020533416.tif 000053
【図２５】
2020533416.tif 000054
【図２６】
2020533416.tif 000055
【図２７】
2020533416.tif 000056
【図２８】
2020533416.tif 000057
【図２９】
2020533416.tif 000058
【図３０】
2020533416.tif 000059
【図３１】
2020533416.tif 000060
【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
2020533416.tif 000064
【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３７Ｅ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４３】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年1月18日(2019.1.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＰＤ抗凝固剤を含有する滅菌コンテナを用いてウシ血液を収集するステップと、
前記収集した血液を透析濾過によって洗浄するステップと、
前記ウシ赤血球を溶解してヘモグロビン溶液を製造するステップと、
酸素を除去することにより、前記ヘモグロビン溶液を安定化させて、脱酸素化ヘモグロビン溶液を製造するステップと、
前記脱酸素化ヘモグロビン溶液を濾過するステップと、
前記脱酸素化ヘモグロビン溶液を精製して非特異的血液細胞成分を減少させるステップであって、前記精製は、クロマトグラフィーにより達成され、精製ヘモグロビン溶液を製造するステップと、
約３０，０００Ｄａの中空糸膜を介した濾過によって脱酸素化することで、前記精製ヘモグロビン溶液を安定化させて所望のヘモグロビン濃度を達成するステップであって、前記精製ヘモグロビンは、多数の膜を通過して脱酸素化されるステップと、
３０，０００Ｄａの中空糸膜を介して注入して保存緩衝液に対して透析濾過することで、前記脱酸素化精製ヘモグロビン溶液を濾過するステップと、
グルタルアルデヒドと架橋して前記精製脱酸素化ヘモグロビンを重合するステップと、
水素化ホウ素ナトリウムを用いる還元によって前記重合精製脱酸素化ヘモグロビンを安定化させるステップであって、前記重合ヘモグロビンの透析濾過を介して前記安定化された重合精製脱酸素化ヘモグロビンは、最終の重合ヘモグロビン溶液を製造するステップと、
前記最終の重合ヘモグロビン溶液を濾過するステップと、を含む、
エンドトキシンフリーヘモグロビン系薬物物質の製造方法。
【請求項２】
前記最終の重合ヘモグロビン溶液は、０．５μｍの深層フィルタ、滅菌グレードの０．２μｍの膜フィルタ、及び少なくとも１つのさらなる２つ目の滅菌グレードの０．２μｍの膜フィルタを介して濾過される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ウシ赤血球の溶解は、細胞溶解をもたらす浸透圧の急速な減少及び１００ｋＤａ膜と３０ｋＤａ膜を介した連続の透析濾過によるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヘモグロビン溶液を脱酸素化するステップは、溶存酸素数値が０．０２ ｍｇ−ｍＬ-1未満になるまで、７５ｐｓｉにおける窒素の対向流と共に、５００ｍｌ−分-1の流速で直列に整列された２つのＬｉｑｕｉｃｅｌｌ膜を介して、前記ヘモグロビン溶液を注入するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記クロマトグラフィシステムは、７０±５ｃｍのベッド高さまでＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で満たされたＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＸＫボロシリケートカラム（内径５ｃｍ×長さ１００ｃｍ）が装着されたＧＥ  Ａｋｔａ  Ｂｉｏｐｉｌｏｔクロマトグラフィシステムを用いる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記クロマトグラフィシステムの緩衝液は、注射用水を用いて製造し、パイロジェンの含有量がさらに減少するように、１０ｋＤａ膜を介して濾過し、前記緩衝液は、（１）緩衝液Ａ；酢酸を用いてｐＨ９．０±０．１に調整された２.４２ｇ−Ｌ-1トリス塩基、（２）緩衝液Ｂ；酢酸を用いてｐＨ７．０±０．１に調整された６．０５ｇ−Ｌ-1トリス塩基、及び（３）緩衝液Ｃ；酢酸を用いてｐＨ８．９±０．１に調整された２.４２ｇ−Ｌ-1トリス塩基及び５８．３８ｇ−Ｌ-1ＮａＣｌからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記脱酸素化ヘモグロビン溶液は、前記溶液を約４２±２℃に上昇させて重合し、グルタルアルデヒド溶液は、温度制御式ウェーブバッグＴ６０２で６．２ｇ／Ｌの濃度に製造し、約４２±２℃に加熱し、前記グルタルアルデヒド溶液は、前記ヘモグロビンに対する前記グルタルアルデヒドの比がおよそ０．０２９：１になるまで、１０ｍＬ／分の速度で前記温度制御式ウェーブバッグに注入する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記グルタルアルデヒドは、再循環ループでスタティックミキサを介して添加され、ヘモグロビンと迅速且つ均質に混合され、前記反応混合物の温度が約２２±２℃に冷却される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記反応混合物は、３０，０００Ｄａの中空糸膜Ｆ６０１を介した透析濾過により約８０±５ｇ／Ｌのヘモグロビン濃度に濃縮される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記水素化ホウ素ナトリウム溶液は、注射用水中に９．４５ｇ／Ｌの水素化ホウ素ナトリウム、４．５８ｇ／Ｌのホウ酸ナトリウム１０水和物、及び０．９１ｇ／Ｌの水酸化ナトリウムで構成され、前記水素化ホウ素ナトリウム溶液は、パイロジェンの含有量が減少するように、１０，０００Ｄａ膜を介して濾過される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記収集した血液の洗浄は、約２８０ｍＬ−分-1でクエン酸ナトリウム溶液を注入すると共に、クエン酸血液を０．６μＭ及び０．４μＭの連続の深層濾過膜を介して約２００ｍＬ−分-1でバッグに注入し、約１Ｌ−分-1で０．２μＭの中空糸膜を介して再循環させ、約３００ｍｌ−分-1で前記クエン酸ナトリウム溶液を注入して前記フレキシブルバッグに透析濾過することにより行われる請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ヘモグロビン溶液を脱酸素化するステップは、０．３μＭ及び少なくとも１つの０．２２μＭの深層フィルタを介して前記濾過されたヘモグロビン溶液を注入するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記水素化ホウ素ナトリウム溶液は、約２０±２℃の制御された温度で７ｍＬ／分の流速で再循環ループを介して前記温度制御式ウェーブバッグに注入され、次いで、前記重合ヘモグロビン溶液の連続的な再循環と共に、全ての溶液が添加された後、６０分間反応を継続する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記精製重合ヘモグロビン溶液は、３０ｋＤ限外濾過膜を介して１００±５ｇ／Ｌのヘモグロビン濃度にさらに濃縮する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＣＰＤ抗凝固剤を含有する滅菌コンテナを用いてウシ血液を収集するステップと、
前記収集した血液を透析濾過によって洗浄するステップと、
前記ウシ赤血球を溶解してヘモグロビン溶液を製造するステップと、
酸素を除去することにより、前記ヘモグロビン溶液を安定化させて、脱酸素化ヘモグロビン溶液を製造するステップと、
前記脱酸素化ヘモグロビン溶液を濾過するステップと、
前記脱酸素化ヘモグロビン溶液を精製して、精製ヘモグロビン溶液を製造するステップと、
前記精製ヘモグロビン溶液を濾過によって脱酸素化することで安定化させて、所望のヘモグロビン濃度を達成するステップと、
保存緩衝液に対して透析濾過することで前記脱酸素化精製ヘモグロビン溶液を濾過するステップと、
グルタルアルデヒドとの架橋によって前記精製脱酸素化ヘモグロビンを重合させるステップと、
水素化ホウ素ナトリウムを用いて前記重合精製脱酸素化ヘモグロビンを安定化させるステップと、
最終の重合ヘモグロビン溶液を製造するステップと、
前記最終の重合ヘモグロビン溶液を濾過するステップと、を含む、
エンドトキシンフリーヘモグロビン溶液の製造方法。
【請求項１６】
前記脱酸素化ヘモグロビン溶液の精製は、クロマトグラフィにより達成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記精製ヘモグロビン溶液の安定化は、約３０，０００Ｄａの中空糸膜を介した濾過及び少なくとも１つのＬｉｑｕｉｃｅｌｌ膜の通過による脱酸素化をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記脱酸素化精製ヘモグロビン溶液の濾過は、３０，０００Ｄａの中空糸膜を介して注入して保存緩衝液に対して透析濾過することにより達成される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
水素化ホウ素ナトリウムを用いた前記重合精製脱酸素化ヘモグロビンの安定化は、前記重合ヘモグロビンの透析濾過をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【国際調査報告】
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