(57)【要約】ナノポアを通る標的ポリマー分子の移動を制御するための方法において、クランプは、標的ポリマー分子長に沿った複数の連続するポリマーサブユニットに、可逆的に結合され、前記分子及びクランプは、前記ナノポアと流体連通するイオン溶液に配置される。一定の移動力が、前記クランプが、前記ナノポアの開口に当接し、前記標的ポリマー分子の前記ナノポアへのさらなる移動を停止するまで、前記標的ポリマー分子の前記ナノポアへの移動を誘導するために、前記ナノポアに適用される。次に、前記クランプを、前記標的ポリマー分子に沿って、ポリマーサブユニット１つだけ、前記ナノポアへの移動の方向と反対の方向にステップする制御パルス持続時間を有する、電圧制御パルス、及び／又は熱制御パルスが、前記ナノポアに適用される。前記クランプには、燃料は供給されない。
2020526750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノポアを通る標的ポリマー分子の移動を制御するための方法であって、
前記標的ポリマー分子は、標的ポリマー分子長に沿った連続する複数のポリマーサブユニットを含み、前記方法は、結合工程、配置工程、移動力適用工程、制御パルス適用工程及び制御パルス繰り返し適用工程を備え、
前記結合工程は、クランプを、前記標的ポリマー分子長に沿った複数の連続するポリマーサブユニットに、可逆的に結合する工程であって、
前記配置工程は、前記標的ポリマー分子及び可逆的に結合されたクランプを、前記ナノポアと流体連通するイオン溶液に配置する工程であって、
前記ナノポアは、前記クランプの外径よりも小さい開口径を有し、
前記移動力適用工程は、前記イオン溶液中の前記標的ポリマー分子の前記ナノポアへの移動を誘導するために、前記標的ポリマー分子上の前記クランプが、前記ナノポアの開口に当接し、前記標的ポリマー分子の前記ナノポアへのさらなる移動を停止するまで、前記ナノポアに一定の移動力を適用する工程であって、
前記制御パルス適用工程は、前記ナノポアにかかる電圧制御パルス及び前記ナノポアへの熱制御パルスのうち少なくとも１つを含む制御パルスを適用する工程であって、
前記制御パルスは、前記標的ポリマー分子を前記ナノポアにポリマーサブユニット１つ分だけさらにステップするために、前記クランプに燃料を供給せず、前記クランプを、前記標的ポリマー分子に沿って、ポリマーサブユニット１つ分だけ、前記ナノポアへの移動の方向と反対の方向にステップする制御パルス持続時間を有し、  制御パルス繰り返し適用工程は、前記標的ポリマー分子の連続する複数のポリマーサブユニットに、前記ナノポアを通って移動させるために、前記制御パルスを繰り返し適用する工程である、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記ナノポアに一定の移動力を適用する工程は、電気泳動力、静水圧、光学力、及び磁力のうちの少なくとも１つを適用する工程を含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、連続する複数のポリマーサブユニットに、前記ナノポアを通って移動させるために前記制御パルスを繰り返し適用する工程は、前記標的ポリマー分子の全長が、前記ナノポアを通って移動するまで前記制御パルスの適用を繰り返す工程を含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記ポリマーサブユニットが前記ナノポアを通って移動するとき、ポリマーサブユニット表す指標を取得する工程をさらに含む、方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法であって、前記適用された制御パルスは、追加のポリマーサブユニットの分、前記標的ポリマー分子の前記ナノポアへの移動を誘導するために、前記一定の移動力のために必要とされる時間の長さよりも短いパルス持続時間を有する、方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法であって、前記一定の移動力は、前記ナノポアにかかる電圧バイアスの適用によって加えられる静電力を含み、前記制御パルスは、前記ナノポアに適用される電圧バイアス振幅よりも大きい制御パルス振幅を有する電圧制御パルスを含む、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記制御パルスは、前記ナノポアに配置されたレーザーエネルギー吸収性材料にレーザーエネルギーを適用することによって、前記イオン溶液中の前記ナノポアへ生成される熱制御パルスを含む、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記適用された制御パルス持続時間は、約１ミリ秒以下である、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の方法であって、前記標的ポリマー分子の連続する複数のポリマーサブユニットが、前記ナノポアを通って移動する間に、前記ナノポアを通る電流を測定する工程をさらに含む、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の方法であって、前記クランプは、ヘリカーゼを含む、方法。
【請求項１１】
標的ポリマー分子を特徴づけるための方法であって、
前記標的ポリマー分子は標的ポリマー分子長に沿ったポリマーサブユニットを有し、前記方法は、結合工程、配置工程、移動力適用工程、制御パルス適用工程、指標取得工程、及び制御パルス繰り返し適用工程を備え、  前記結合工程は、クランプを、前記標的ポリマー分子長に沿った複数の連続するポリマーサブユニットに、可逆的に結合する工程であって、
前記配置工程は、前記標的ポリマー分子及び可逆的に結合されたクランプを、前記ナノポアと流体連通するイオン溶液に配置する工程であって、
前記ナノポアは、前記クランプの外径よりも小さい開口径を有し、
前記移動力適用工程は、前記イオン溶液中の前記標的ポリマー分子の前記ナノポアへの移動を誘導するために、前記標的ポリマー分子上の前記クランプが、前記ナノポアの開口に当接し、前記標的ポリマー分子の前記ナノポアへのさらなる移動を停止するまで、前記ナノポアに一定の移動力を適用する工程であって、
前記制御パルス適用工程は、前記ナノポアにかかる電圧制御パルス及び前記ナノポアへの熱制御パルスのうち少なくとも１つを含む制御パルスを適用する工程であって、
前記制御パルスは、前記標的ポリマー分子を前記ナノポアにポリマーサブユニット１つだけさらにステップするために、前記クランプに燃料を供給せず、前記クランプを、前記標的ポリマー分子に沿って、ポリマーサブユニット１つ以下ずつ、前記ナノポアへの移動の方向と反対の方向にステップし、制御パルス持続時間を有し、
前記指標取得工程は、前記ポリマーサブユニットが前記ナノポア内にあるとき、ポリマーサブユニットの特徴を表す指標を取得する工程であって、
制御パルス繰り返し適用工程は、前記ナノポアを通って移動する各ポリマーサブユニットの特徴を表す指標を取得しながら、前記標的ポリマー分子の連続する複数のポリマーサブユニットに、前記ナノポアを通ってイオン溶液に移動させるために、前記制御パルスを繰り返し適用する工程である、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の方法であって、前記ポリマーサブユニットが前記ナノポア内にあるとき、前記ナノポアを通る電流を測定することによって、ポリマーサブユニットの特徴を表す指標が取得される、方法。
【請求項１３】
請求項１１に記載の方法であって、前記ナノポアにおけるポリマーサブユニットの特徴を表す指標が取得されたあと、制御パルスの適用が繰り返される方法。
【請求項１４】
請求項１１に記載の方法であって、ポリマーサブユニットの特徴を表す指標を取得する工程は、前記ポリマーサブユニットをカウントする工程、及び前記ポリマーサブユニットを識別する工程のうち少なくとも１つを含む、方法。
【請求項１５】
請求項１１に記載の方法であって、前記標的ポリマー分子の全長が、前記ナノポアを通って移動するまで制御パルスの適用及びポリマーサブユニットの特徴を表す指標の取得が繰り返される、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、繰り返される制御パルスの適用を伴う連続するポリマーサブユニットの特徴を表す指標の取得は、前記標的ポリマー分子長に沿って配置されたポリマーサブユニットの数を決定する工程を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、繰り返される制御パルスの適用を伴う連続するポリマーサブユニットの特徴を表す指標の取得は、前記標的ポリマー分子長に沿って配置された同一のポリマーサブユニットの数を決定する工程を含む、方法。
【請求項１８】
請求項１１に記載の方法であって、前記一定の移動力は、前記ナノポアにかかる電圧バイアスの適用によって加えられる静電力を含み、前記制御パルスは、前記ナノポアに適用される電圧バイアス振幅よりも大きい制御パルス振幅を有する電圧制御パルスを含む、方法。
【請求項１９】
請求項１１に記載の方法であって、前記制御パルスは、前記イオン溶液中の前記ナノポアへ、前記ナノポアに配置されたレーザーエネルギー吸収性材料にレーザーエネルギーを適用することによって生成される熱制御パルスを含む、方法。
【請求項２０】
請求項１１に記載の方法であって、前記ナノポアに一定の移動力を適用する工程は、電気泳動力、静水圧、光学力、及び磁力のうちの少なくとも１つを適用する工程を含む、方法。
【請求項２１】
標的ポリマー分子を特徴づけるためのナノポアシステムであって、
前記標的ポリマー分子は、標的ポリマー分子長に沿った連続する複数のポリマーサブユニットを含み、前記システムは、第一の流体リザーバ及び第二の流体リザーバ、クランプ、回路、電圧パルス発生器、並びにコンピュータ制御装置を含み、
前記第一及び第二の流体リザーバは、前記第一の流体リザーバ及び前記第二の流体リザーバ間の唯一の流路を形成するナノポアによって、流体連通し、
前記クランプは、前記第一の流体リザーバ内に設けられ、
前記クランプは、前記ナノポアに当接し、前記第一の流体リザーバ内のイオン溶液中の前記標的ポリマー分子の連続する複数のポリマーサブユニットに可逆的に結合し、
前記回路は、前記標的ポリマー分子の前記ナノポアへの移動を誘導するために、前記第一リザーバ内の電極、前記第二リザーバ内の電極、及び、前記第一リザーバ及び前記第二リザーバ間の前記ナノポアに定電圧バイアスを適用するための電流増幅器を含み、
前記電圧パルス発生器は、前記第一リザーバ及び前記第二リザーバ間の前記ナノポアに電圧制御パルスを適用し、前記標的ポリマー分子の連続するポリマーサブユニットに沿ってポリマーサブユニット毎に前記ナノポアから離れる方向に前記クランプをステップするため、かつ、前記ポリマー分子をさらに前記ナノポアへとステップするために、前記回路に接続され、
前記システムは、前記クランプのための燃料及び前記クランプのための燃料源を含まず、
前記コンピュータ制御装置は、前記標的ポリマー分子の連続する複数のポリマーサブユニットが前記ナノポアを通ってステップする間、ナノポアを通るイオン電流の電気的な指標を収集するために前記回路に接続される、ナノポアシステム。
【請求項２２】
請求項２１に記載のナノポアシステムであって、前記ナノポアは、生体ナノポア含む、ナノポアシステム。
【請求項２３】
請求項２２に記載のナノポアシステムであって、前記ナノポアは、ＣｓｇＧナノポアを含む、ナノポアシステム。
【請求項２４】
請求項２２に記載のナノポアシステムであって、前記ナノポアは、脂質二重層中の生体ナノポアを含む、ナノポアシステム。
【請求項２５】
請求項２２に記載のナノポアシステムであって、前記ナノポアは、固体状の膜のナノポアを含む、ナノポアシステム。
【請求項２６】
請求項２５に記載のナノポアシステムであって、前記固体状の膜は、グラフェンを含む、ナノポアシステム。
【請求項２７】
請求項２１に記載のナノポアシステムであって、レーザー、光学系、及び材料要素をさらに含み、
前記レーザーは、レーザーパルスを生成するために、前記コンピュータ制御装置に接続され、
前記光学系は、前記レーザーに隣接して配置され、前記レーザーパルスが前記ナノポアを向くような方向に合わせられ、
前記材料要素は、前記ナノポアに配置され、各レーザーパルスの間、前記イオン溶液を加熱するため、前記レーザーパルスからのエネルギーを吸収する、ナノポアシステム。
【請求項２８】
標的ポリマー分子を特徴づけるためのナノポアシステムであって、
前記標的ポリマー分子は、標的ポリマー分子長に沿った連続する複数のポリマーサブユニットを含み、前記システムは、第一の流体リザーバ及び第二の流体リザーバ、クランプ、回路、レーザー、光学系、材料要素、並びにコンピュータ制御装置を含み、
前記第一及び第二の流体リザーバは、前記第一の流体リザーバ及び前記第二の流体リザーバ間の唯一の流路を形成するナノポアによって、流体連通し、
前記クランプは、前記第一の流体リザーバ内に設けられ、
前記クランプは、前記ナノポアに当接し、前記標的ポリマー分子の連続する複数のポリマーサブユニットに可逆的に結合し、
前記回路は、前記標的ポリマー分子の前記ナノポアへの移動を誘導するために、前記第一リザーバ内の電極、前記第二リザーバ内の電極、及び、前記第一リザーバ及び前記第二リザーバ間の前記ナノポアに定電圧バイアスを適用するための電流増幅器を含み、
前記レーザーは、レーザーパルスを生成するために、前記コンピュータ制御装置に接続され、
前記光学系は、前記レーザーに隣接して配置され、前記レーザーパルスが前記ナノポアを向くような方向に合わせられ、
前記材料要素は、前記ナノポアに配置され、各レーザーパルスの間、前記イオン溶液を加熱して、次に、前記標的ポリマー分子の連続するポリマーサブユニットに沿ってポリマーサブユニット毎に前記ナノポアから離れる方向に前記クランプをステップするため、かつ、前記ポリマー分子をさらに前記ナノポアへとステップするために、前記レーザーパルスからのエネルギーを吸収し、
前記システムは、前記クランプのための燃料及び前記クランプのための燃料源を含まず、
前記コンピュータ制御装置は、前記標的ポリマー分子の連続する複数のポリマーサブユニットが前記ナノポアを通ってステップする間、ナノポアを通るイオン電流の電気的な指標を収集するために前記回路に接続される、ナノポアシステム。
【請求項２９】
請求項２８に記載のナノポアシステムであって、前記材料要素は、金ナノ粒子及び銀ナノ粒子のうちの一つで構成されるナノ粒子を含む、ナノポアシステム。
【請求項３０】
請求項２９に記載のナノポアシステムであって、前記ナノ粒子は、前記クランプ及び前記ナノポアの少なくとも一つに結合される、ナノポアシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１７年６月２９日に出願された米国仮特許出願第62/526,823号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する声明
本発明は、ＮＩＨにより授与された契約番号R01HG003703に基づく政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
背景
本発明は、ナノポアを通るポリマーの移動によるポリマーの特徴付けに関し、より詳細には、ナノポアを通るポリマーステップの制御に関する。
【背景技術】
【０００４】
ポリマーとそのサブユニットは、ポリマーをステップさせて通過させる、ナノポアの電気伝導度における変化を測定することによって、特徴付けることができる。Deamer et al., Nat. Biotechnol., 34:518-524, 2016; Manrao et al., Nat. Biotechnol., 30:349-353, 2012; Akeson et al., Biophys. J., 77:3227-3233, 1999;及びCherf et al., Nat. Biotechnol., 30:344-348, 2012（これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ナノポアを使用して決定されたポリマーの特性には、濃度、例えば、試料溶液中の分子数、ポリマーの長さ、ポリマーの長さに沿ったモノマーユニットの数、並びに、連続するモノマーユニットの特定のシーケンスを含む、ポリマーやそのモノマーユニットの化学的及び物理的特性が含まれる。ナノポアに基づいた特徴付けの手法の一例において、研究対象のポリマーは、前述のナノポアと流体連通するシスリザーバ内のイオン溶液中に供給される。ポリマーは、ナノポアを通って、シスリザーバからトランスリザーバに移動され、その時間の間に、ナノポアの移動を検出することができ、ポリマーの特性が決定される。Kasianowicz et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 93:13770-13773, 1996（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、シス及びトランスリザーバ電極の間に定電圧バイアスを印加することにより生成される電界は、一般的に、ポリマーを駆動しナノポアを通過させるために使用されるが、例えば、Lu et al., Nano Lett.. 13:3048-3052, 2013及びKeyser et al., Nature Physics, 2:473-477, 2006（これらの両方が、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、代わりに他の力を使用することができ、静水圧、光学又は磁場の力、及びこれらの力の２つ以上の組み合わせを使用してポリマーを駆動してナノポアを通過させることができる。
【０００５】
望ましくないほど速い速度で自由に駆動されてナノポアを通ることを避け、ポリマーをゆっくりにする、又は遅らせるために、活性酵素をポリマーに結合するという概念が提案されており、例えば、Akesonの米国特許第7,625,706号に、Akesonの米国特許第7,238,485号に、Akesonの米国特許第7,947,454号に、Akesonの米国特許番号8,673,556号に、CherfのUS 20140051068に、MoyseyのUS 20140335512に、JayasingheのUS 20150031020に教示されている(これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。そのような活性酵素、例えば、ポリメラーゼ又はヘリカーゼは、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）等の化学基質に由来するエネルギーに依存して、ポリマーに沿って歩み、それに応じてポリマーを、ナノポアを通ってステップさせる。活性酵素のＡＴＰ依存性の動きにより、酵素のターンオーバー数、すなわち、酵素が単位時間あたりにそのポリマー基質に沿ってとる最大ステップ数に応じた速度で、ポリマーを駆動して、検知ナノポアを通過させることができる。しかし、バルク液相酵素の研究から導かれた他の概念と同様に、単一の酵素分子の各アクティブなステップ間の時間間隔が、酵素のターンオーバー数が前後するように確率論的に変化する場合でも、ターンオーバー数は、単一分子の活性の挙動にほとんど影響を与えないと判明した。
【０００６】
ナノポアでの、及びナノポアを通る単一分子の連続する各ステップ間の確率論的時間間隔（例えば、ナノポアを通るポリマーの隣接モノマーユニットのステップ間の確率論的時間間隔）は、大きな問題を引き起こす。なぜならば、これらの間隔中に、ナノポアの電気伝導度が測定及び評価されて、ナノポア内のポリマーとそのポリマーサブユニットを特徴付けるためである。これらの間隔の多くは、省略のエラーを引き起こすほど短い場合があるが、ところが、他の間隔は、実際には同一のモノマーユニットの連続が存在しないのに、同一のモノマーの連続として誤解されるほど長い場合もある。また、長さＸのホモポリマー領域（４つの同一モノマーのシーケンス）を長さＸ＋１、Ｘ＋２、...又はＸ＋ｎのホモポリマー領域と区別することもできない。
【０００７】
概要
本明細書で提供されるナノポアを通る標的ポリマー分子の移動を制御するための方法において、クランプは、前記標的ポリマー分子長に沿った複数の連続するポリマーサブユニットに、可逆的に結合する。前記標的ポリマー分子は、前記標的ポリマー分子長に沿った連続する複数のポリマーサブユニットを含む。前記標的ポリマー分子及び可逆的に結合されたクランプは、前記ナノポアと流体連通するイオン溶液に配置される。前記ナノポアは、前記クランプの外径よりも小さい開口径を有する。
【０００８】
前記イオン溶液中の前記標的ポリマー分子の前記ナノポアへの移動を誘導するために、前記標的ポリマー分子上の前記クランプが、前記ナノポアの開口に当接し、前記標的ポリマー分子の前記ナノポアへのさらなる移動を停止するまで、前記ナノポアに一定の移動力が適用される。次に、前記ナノポアにかかる電圧制御パルス及び前記ナノポアへの熱制御パルスのうち少なくとも１つの制御パルスが適用される。前記制御パルスは、前記クランプを、前記標的ポリマー分子に沿って、ポリマーサブユニット１つ分だけ、前記ナノポアへの移動の方向と反対の方向にステップさせる制御パルス持続時間を有する。前記クランプには、燃料は供給されない。前記クランプのステップによって、前記標的ポリマー分子は、さらに前記ナノポアに、しかし、ポリマーサブユニット１つ分だけ、ステップする。前記制御パルスは、前記標的ポリマー分子の連続する複数のポリマーサブユニットに前記ナノポアを通って移動させるために繰り返し適用される。
【０００９】
この移動制御方法は、標的分子を特徴づけるための方法を可能にし、前記ポリマーサブユニットが前記ナノポア内にあるとき、ポリマーサブユニットの特徴を表す指標が取得される。ここで、前記制御パルスは、前記ナノポアを通って移動する各ポリマーサブユニットの特徴を表す指標を取得しながら、前記標的ポリマー分子の連続する複数のポリマーサブユニットに、前記ナノポアを通って移動させるために、繰り返し適用される。
【００１０】
本明細書で提供される標的ポリマー分子を特徴づけるためのナノポアシステムは、第一の流体リザーバ及び第二の流体リザーバを含み、前記第一及び第二の流体リザーバは、前記第一の流体リザーバ及び前記第二の流体リザーバ間の唯一の流路を形成するナノポアによって、流体連通する。前記クランプは、前記第一の流体リザーバ内に設けられる。前記クランプは、前記ナノポアに当接し、前記第一の流体リザーバ内のイオン溶液中の前記標的ポリマー分子の連続する複数のポリマーサブユニットに可逆的に結合する。前記標的ポリマー分子は、前記標的ポリマー分子長に沿った連続する複数のポリマーサブユニットを含む。
【００１１】
回路が提供され、前記回路は、前記標的ポリマー分子の前記ナノポアへの移動を誘導するために、前記第一リザーバ内の電極、前記第二リザーバ内の電極、及び、前記第一リザーバ及び前記第二リザーバ間の前記ナノポアに定電圧バイアスを適用するための電流増幅器を含む。電圧パルス発生器は、前記第一リザーバ及び前記第二リザーバ間の前記ナノポアに電圧制御パルスを適用し、前記標的ポリマー分子の連続するポリマーサブユニットに沿ってポリマーサブユニット毎に前記ナノポアから離れる方向に前記クランプをステップするため、かつ、前記ポリマー分子をさらに前記ナノポアへとステップするために、前記回路に接続される。前記システムは、前記クランプのための燃料及び前記クランプのための燃料源を含まない。コンピュータ制御装置は、前記標的ポリマー分子の連続する複数のポリマーサブユニットが前記ナノポアを通ってステップする間、ナノポアを通るイオン電流の電気的な指標を収集するために前記回路に接続される。
【００１２】
さらに本明細書で提供される標的ポリマー分子を特徴づけるためのナノポアシステムは、第一の流体リザーバ及び第二の流体リザーバを含み、前記第一の流体リザーバ及び前記第二の流体リザーバは、前記第一の流体リザーバ及び前記第二の流体リザーバ間の唯一の流路を形成するナノポアによって、流体連通する。クランプが、前記第一の流体リザーバ内に設けられる。前記クランプは、前記ナノポアに当接し、前記標的ポリマー分子の連続する複数のポリマーサブユニットに可逆的に結合する。前記標的ポリマー分子は、前記標的ポリマー分子長に沿った連続する複数のポリマーサブユニットを含む。
【００１３】
回路が提供され、前記回路は、前記標的ポリマー分子の前記ナノポアへの移動を誘導するために、前記第一リザーバ内の電極、前記第二リザーバ内の電極、並びに、前記第一リザーバ及び前記第二リザーバ間の前記ナノポアに定電圧バイアスを適用するための電流増幅器を含む。レーザーは、レーザーパルスを生成するために、前記コンピュータ制御装置に接続され、光学系は、前記レーザーに隣接して配置され、前記レーザーパルスが前記ナノポアを向くような方向に合わせられる。前記レーザーパルスからのエネルギーを吸収する材料要素は、前記ナノポアに配置され、各レーザーパルスの間、前記イオン溶液を加熱して、次に、前記標的ポリマー分子の連続するポリマーサブユニットに沿ってポリマーサブユニット毎に前記ナノポアから離れる方向に前記クランプをステップし、かつ、前記ポリマー分子をさらに前記ナノポアへとステップする。前記システムは、前記クランプのための燃料及び前記クランプのための燃料源を含まない。コンピュータ制御装置は、前記標的ポリマー分子の連続する複数のポリマーサブユニットが前記ナノポアを通ってステップする間、ナノポアを通るイオン電流の電気的な指標を収集するために前記回路に接続される。
【００１４】
本明細書で提供される前記ナノポアシステム及び方法論は、ナノポアを通る標的ポリマー分子の移動の決定論的制御を可能とし、標的ポリマー分子の特徴付けにおいて、対応する優れた程度の制御を可能にする。本開示のこれら及び他の態様及び実施形態は、以下及び添付の図面ならびに特許請求の範囲に記載されている。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ−１Ｃ】図１Ａ、図１Ｂ及び図１Ｃは、生体膜内の生体ナノポアを通る、クランプ連結式ポリマー分子の決定論的ステップの３段階の模式図である。
【図１Ｄ−１Ｆ】図１Ｄ、図１Ｅ及び図１Ｆは、固体状の膜のナノポアを通る、クランプ連結式ポリマー分子の決定論的ステップの３段階の模式図である。
【図２】図２は、ナノポアを通りトランスリザーバへの決定論的なステップのために、シスリザーバに提供されたクランプ連結式ポリマー分子を含むナノポアシステムの摸式図である。
【図３】図３は、ナノポアを通る、クランプ連結式ポリマー分子の決定論的ステップを実行するための方法論の工程のフローチャートである。
【図４Ａ−４Ｄ】図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ及び図４Ｄは、図３のフローチャートの方法論のステップを実行する際に測定されるナノポア電流又は印加される制御パルス電圧のプロットである。
【図５】図５は、ナノポアを通る、クランプ連結式ポリマーの決定論的ステップにおける電圧制御パルスの印加を実施するための、ナノポアシステム及び関連する電子機器の摸式図である。
【図６】図６は、制御パルス電圧印加電子機器を含むナノポアシステムの電気回路モデルである。
【図７】図７は、図５のシステムの低ノイズ電圧パルス発生器の模式的なブロック図である。
【図８】図８は、ナノポアを通る、クランプ連結式ポリマーの決定論的ステップにおける熱制御パルスの適用を実施するためのナノポアシステムと関連するコンポーネントの摸式図である。
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ、図９Ｂは、それぞれ、図８のナノポアシステムに吸収性材料を提供するための、クランプに結合された金ナノ粒子（ＮＰ）及びナノポアに結合された金ナノ粒子（ＮＰ）の摸式図である。
【図１０】図１０は、ポリメラーゼ合成の摸式図である。
【図１１】図１１は、ＡＴＰ駆動ポリマーステップとＡＴＰなしの電圧バイアス駆動ポリマーステップの条件について、検知されたモノマーに隣接する周辺の５核酸塩基についての関数として測定されたナノポア電流のプロットであり、どちらもＴ４ヘリカーゼポリマークランプを使用し、プロットの上に示されているＤＮＡシーケンスは、横軸の下に表示される一連のオーパーラッピングする５量体として読み取られる。
【図１２】図１２は、ポリマークランプとしてＴ４相ヘリカーゼを使用し、２ｍＭのＡＤＰＮＰを使用し、ＡＴＰアナログを使用しない場合の、ポリマー全長の移動の測定された持続時間中央値のプロットであり、垂直のキャップされたラインは、いくつかの同一のポリマーがナノポアを完全に通るための持続時間の範囲を示す。
【図１３】図１３は、４つの異なる温度に対する、印加されたバイアス駆動電圧の関数としてのモノマーステップ持続時間の中央値のプロットであり、Ｔ４相のヘリカーゼクランプ連結式ＤＮＡ分子を使用した。
【図１４Ａ−１４Ｃ】図１４Ａ、図１４Ｂ及び図１４Ｃは、ナノポア内のポリマー分子のブラウン運動に打ち勝つために印加されたバイアス駆動電圧による、ポリマー分子制御の模式図である。
【図１５Ａ−１５Ｂ】図１５Ａ及び図１５Ｂは、１６０ｍＶのバイアス駆動電圧を使用する実験的ナノポアシステムについて、時間の関数として測定されたナノポア電流及び印加された電圧制御パルス振幅のプロットである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
詳細な説明
本明細書では、図２のようなナノポアシステム内のナノポアを通る標的ポリマー分子の、確率的ステップではなく、決定論的ステップの構造、システム、及び対応する方法論のすべてが提供される。一実施形態において、この構造、システム、及び方法論は、正確に決定論的な運動によって、ナノポアを通る、標的ポリマー分子の直線的に接続された連続するモノマー残基を駆動操作し、それによって、同一のモノマーユニットの繰り返しシーケンスがナノポアを通って移動するのにかかる時間により、ナノポアを通過して移動した同一のモノマーの、正確な数を特定する。具体的には、ナノポアを通過する各モノマーのステップ間の時間間隔が既知の定数ｋであるとき、つまり、本明細書で可能にされるように、ステップが決定論的である場合、同一のモノマーユニットの繰り返しシーケンスがナノポアを横断するのにかかる合計時間を、間隔定数ｋで割ると、ナノポアを横断した同一モノマーの正確な数が特定される。
【００１７】
図１Ａ〜１Ｃに示すように、本明細書では、決定論的に進むクランプ１０の構造が提供され、クランプは、ＤＮＡ鎖等の標的ポリマー分子１４、又は分子長に沿ったポリマーサブユニットを有する他の適切なポリマー分子に沿って、例えば１〜２０個のモノマーのグループなどの複数のモノマー１２に、可逆的にクランプするか、可逆的に結合する。図１Ａ〜図１Ｃに示されるように、クランプ１０の外径１６は、ナノポア２０を通って延在する開口又はチャネルの直径１８よりも大きい。
【００１８】
本明細書で使用される「ポリマー分子」という用語は、生体分子、例えば、生体ポリマー核酸分子デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）等のポリヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等の合成核酸、並びに、タンパク質、糖ポリマー、その他の生体分子を指すものとする。したがって、以下の説明は、特定の実施に限定することを意図したものではない。ポリヌクレオチド等のこれらの分子の例に関連する詳細は、ポリマー分子の特徴付けのための実施形態の範囲で、本明細書で提供される原理を説明するために、提供される。
【００１９】
図２の断面図も参照すると、このクランプ連結式分子構造は、ポリマー分子を特徴付けるナノポアシステム２５で使用することができる。ナノポアシステムは一般に、ナノポア２０が配置された、膜等の構造２６を含み、これらのいずれか又は両方は、実質上生体的なものか、又は固体状のものとできる。ナノポアが配置された膜又は他の構造２６は、必要に応じて、例えば、支持構造２８によって端部で支持することができる。構造２６及び支持構造２８は、トランスリザーバ３２からシスリザーバ３０を分離するように配置され、ナノポアは２つのリザーバ間の唯一の流体経路を提供する。シス及びトランスリザーバは、イオン液体溶液を含み、シスリザーバは、ナノポア２０を通ってトランスリザーバに移動する標的分子１４を含む。ナノポアを通って移動するシスリザーバ内の標的分子１４はそれぞれ、複数のポリマーサブユニット上の分子長に沿った部位に配置された可逆クランプ１０を有し、標的分子クランプ複合体を形成する。そのような標的分子クランプ複合体の溶液は、例えば、米国特許出願公開第20140335512号においてMoyseyにより記載される、従来の方法で製造することができ、これは参照により、その全体が本明細書に組み込まれる。ナノポアを通る移動による標的分子の分析のために、標的分子クランプ複合体がシスリザーバに提供される。
【００２０】
一実施形態において、シスリザーバ３０とトランスリザーバ３２に、電極３４、３６がそれぞれ含まれ、その間に定バイアス電圧３８を印加することができる。シス及びトランスリザーバ電極３４、３６間に、このような電圧バイアスを印加することにより生成される電界は、従来の方法で、シスリザーバ内の荷電された分子を、ナノポアを通って、トランスリザーバに駆動するために使用できる。しかし、他の移動力を代わりに使用できることが認識されるべきである。したがって、本明細書のステップ制御の方法論の説明では、「電圧バイアス」又はＶｄｒｉｖｅという用語を使用するが、静水圧、光場、又は磁場、及び2つ以上の場の組み合わせを含む他の力を、ポリマーを駆動してナノポアを通過させるために使用することもできる。以降、「定電圧駆動バイアス」又はＶｄｒｉｖｅという用語が本明細書で使用される場合、これらの場の1つ又は複数のいずれかが代替され得ることを理解されたい。ナノポアを通る分子移動の電気泳動駆動のさらなる詳細及び例は、2003年9月30日に発行されたBrantonらの米国特許第6,627,067号「Molecular and Atomic Scale Evaluation of Biopolymers」に記載されており、これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
ここで、本明細書で可能となる方法論を参照すると、図１Ａに示すように、可逆的に結合されたクランプ１０を含む調査中の標的ポリマー分子１４がナノポア２０に示されている。図１Ｂに示すように、シス及びトランスリザーバの間に電圧バイアスＶｄｒｉｖｅが印加され、図２のように、標的ポリマー１４の、ナノポア２０への移動を促進する状態が供される。図１Ａに示すように、標的ポリマー１４がナノポアに移動し、図１Ｂに示すように、クランプ１０が、内径１８がクランプの外径１６よりも小さいナノポア２０の領域４０に当接すると、移動は自動的に停止する。この状態下において、ポリマー１４の１つのポリマーサブユニット４２、例えば１つのモノマーは、ナノポア内の部位を占め、好ましい実施形態では、ナノポア２０の高感度の狭い領域４４の部位を占める。結果として、サブユニット４２がナノポア内の適切な部位、例えば、ナノポアの高感度領域に留まる限り、サブユニット４２の電気的及び体積的特性は、この状態のナノポアのシスからトランスへの導電性を支配する。したがって、ナノポアの導電率に関連するナノポアシステムのパラメータを検知、検出、測定、又はその他の方法で決定することにより、この状態下のサブユニット４２を特徴付ける指標が得られる。
【００２２】
サブユニット４２を特徴付ける指標が決定された後、図１Ｃに示されるように、例えば、電圧制御パルスＶｐｕｌｓｅ及び／又は熱制御パルスＨｐｕｌｓｅとして提供される制御パルスが、ナノポアにかかるバイアス駆動電圧Ｖｄｒｉｖｅに加えて提供される。制御パルスは、矢印４４で示される方向に、ナノポア２０から離れポリマー１４に沿ってクランプ１０をステップさせる。クランプ１０は、具体的には制御可能に駆動され、ポリマーに沿って１つのポリマーサブユニットをステップさせ、次の連続するグループ１２のポリマーサブユニットに可逆的に結合する。結果として、ナノポアにあったサブユニット４２が今はトランスリザーバ内の溶液に移動し、次のサブユニット４６がナノポアのシスからトランスへの導電性を支配する。ポリマーに沿ってナノポアから離れるクランプの決定論的なステップに関するこのプロセスが続いて、ポリマー分子が１サブユニットずつステップしてナノポアに入り通過する。１つのポリマーサブユニットから次のポリマーサブユニットへのクランプのステップの燃料となるエネルギーは供給されない。具体的には、化学燃料も生化学燃料もクランプに供給されない。制御パルスの印加によってのみ、クランプが１つのポリマーサブユニットから次のポリマーサブユニットにステップする。
【００２３】
図１Ａ〜１Ｃは、図中で単純な円として表されているサブユニットの直線状のシークエンスを有する標的ポリマー分子１４を示している。この表現は、単に説明を明確にするために提供される。シスリザーバにロードされる標的ポリマー分子は、ｓｓＤＮＡのように一本鎖でも、ｄｓＤＮＡのように二本鎖であってもよい。いずれの場合も、クランプは、一本鎖のポリマー分子の領域上の部位に配置される。したがって、二本鎖標的ポリマー分子には、二本鎖標的分子の一本鎖領域に沿った箇所にクランプを配置することができるように、一本鎖領域が設けられ、この一本鎖領域に従来の方法でクランプを配置することができる。
【００２４】
図１Ａ−１Ｃの状態は、膜３５における生体ナノポア２０として提供される一実施形態について示されており、膜は、生体的又は有機的であってもよく、例えば脂質二重層、テトラエーテル脂質、又はトリブロック共重合体とすることができる。例えば、ナノポアは、八量体タンパク質チャネルであるマイコバクテリウムスメグマチスポーリンＡ（ＭｓｐＡ）として提供され、９量体タンパク質チャネルである細菌性ポリンＣｓｇＧとして提供されるか、又はこれらの変異体、又はＭｏｙｓｅｙによって米国特許第9,617,591号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で教示されているような、その他のチャネルとして提供することができる。選択された生体ナノポアは、例えば、ジフィタノイルホスファチジルコリン膜（ｄｉＰｈＰＣ）、テトラエーテル脂質、トリブロック共重合体、又は形成された固体状の膜等の固体状の構造で配置される。そのような固体状の膜は、例えば、１つ又は複数のグラフェン層、ＳｉＮｘ、又は他の固体状の支持体として提供することができ、ここで、イオンはこれらを通り抜けることはできないが、これらには、前述の生体ナノポアのいずれかを、シスからトランスへのイオンの流れを妨げる（但し、ナノポア自体のチャネルの通過を除く）ような方法で、配置することができる。
【００２５】
図１Ａ−１Ｃに示されているナノポアでのポリマーの捕捉とステップの状態は、図１Ｄ−１Ｆにも示されているが、固体状のナノポアシステムの一実施形態である。図１Ｄ−１Ｅに示すように、シス及びトランスリザーバの間に定電圧バイアスＶｄｒｉｖｅが印加され、図２のように、ナノポアの部位２０で、クランプ１０を含む標的ポリマー１４の捕捉を促進する状態が供される。ここで、ナノポア２０は、固体状の膜３７に配置された開口、穴、チャネル、又はその他の開口である。膜は、上述の任意の適切な固体状の材料、例えば、グラフェン又は他の原子レベルに薄い材料、又は窒化物、酸化物、又は組み合わせの材料層等のマイクロエレクトロニクス材料として形成することができる。次に、固体状の膜は、図２の膜２６及び支持構造２８のように、マイクロ電子基板等の支持構造によって支持され得る。明確にするために、図２のシステム２５は膜２６の開口であるナノポア２０とともに示されているが、図２のナノポアシステム２５のために、生体的、有機的、及び固体状のナノポアと膜の任意の適切な組み合わせを使用でき、意図されることを認識されたい。
【００２６】
定バイアス電圧により、標的ポリマー１４がナノポアを通って移動するため、図１Ｅに示すように、クランプ１０がナノポア２０に当接すると、移動は自動的に停止する。ナノポアの直径１８は、図１Ｄに示すように、クランプの外径１６より小さい。この状態下では、標的ポリマー１４の１つのサブユニット４２、例えば１つのモノマーが、ナノポアの最も感度の高い領域を占有する。結果として、サブユニット４２の電気的及び体積特性は、モノマーサブユニット４２がナノポア内に留まっている限り、この状態でのナノポアのシスからトランスへの導電性を支配する。結果として、ナノポアの導電率に関連するナノポアシステムのパラメータを検知、検出、測定、又はその他の方法で決定することにより、この状態の下でのサブユニット４２に関連する、特徴を表す指標が得られる。
【００２７】
サブユニット４２の特徴を示す指標が決定された後、図１Ｆに示されるように、制御パルスが、例えば、電圧制御パルスＶｐｕｌｓｅ及び／又は熱制御パルスＨｐｕｌｓｅとして、バイアス駆動電圧Ｖｄｒｉｖｅと組み合わせて提供され、クランプ１０が標的ポリマー１４に沿ってナノポア２０から離れ、矢印４４で示される方向にステップする。クランプ１０は、具体的には、１つのモノマーサブユニットだけポリマーに沿ってステップし、次にポリマーサブユニットの次のグループに結合するように駆動される。結果として、ナノポアのサブユニット４２がトランスリザーバに移動し、次のサブユニット４６がナノポアのシスからトランスへの導電性を支配する。標的ポリマーに沿ったクランプの決定論的なステップに関するこのプロセスが続いて、ポリマー分子が１サブユニットずつステップしてナノポアに入り通過する。
【００２８】
図３は、図１Ａ−Ｃ及び図１Ｄ−Ｆに示す状態を実施するための方法の工程のフローチャートであり、図４Ａ−４Ｄは、方法の各工程の条件を示す、測定電気信号のプロットである。方法論５０では、ナノポアシステムを組み立て、シスリザーバに配置されたクランプが連結された標的ポリマー分子による方法を開始５２した後、最初のステップ５４において、定バイアス駆動電圧Ｖｄｒｉｖｅがシス及びトランスリザーバ間に印可される。次のステップ５６で、標的ポリマーがナノポアで捕捉されたかどうかが判定５６される。図４Ａは、ナノポアについて測定された時間の関数としての電流のプロットであり、ナノポアで標的ポリマーが捕捉されると、ナノポアを通る測定される電流は、開孔電流レベルから、ナノポアでのポリマー分子捕獲を示すより低いレベルまで、劇的に減少することを示す。ポリマーがナノポアで捕捉されていないと判定された場合、定電圧バイアスが維持され、ポリマーがナノポアで捕捉されたことが確認されるまで判定が維持される。
【００２９】
次のステップ５８では、バイアス電圧に加えて、電圧制御パルス及び熱制御パルス等の制御パルスが、シス及びトランスリザーバの間に印加される。一実施形態において、ここでは電圧制御パルスについて、図４Ｂのプロットに示すように、電圧パルスがナノポアに印加される。次に、図４Ｃのプロットに示すように、ナノポアにかかる合計電圧には、定バイアス電圧とパルス電圧の和が含まれる。各パルスのタイミングと持続時間は、手動で制御するか、連続的に繰り返すパルスを供することができる自動システムによって、制御できる。バイアス電圧とパルス電圧の極性はナノポアに対して同じであるため、バイアス電圧と電圧パルスの合計は加算的であり、与えられたポリマー電荷に対して、ナノポアを通ってポリマーを駆動する方向に向けられる。
【００３０】
次のステップ６０では、印可された制御パルスに応答して、標的ポリマーがナノポアを通ってステップしているかどうかが判定される。図４Ｄのプロットは、電流測定により、標的ポリマーが、単一の電圧パルスに応答して、１つのポリマーサブユニットの単一ステップをとることを決定できることを示す例を示している。ポリマーが単一の電圧パルスに応答して、又は単一の熱パルスに応答して単一のステップをとっていないと判定された場合、パルスの大きさ及び／又は持続時間が増加する。ポリマーが、１つの印加パルスに応答して、１つのポリマーサブユニットずつナノポアを通ってステップしていることが示されると、次のステップで、ナノポア検知部位でのポリマーサブユニットの特性を反映した、いくつかの代表的な指標が取得される。例えば、図３に示すように、このステップ６２では、ナノポアを通る測定電流を取得し、必要に応じて記録して、ポリマーが制御パルスに応答してナノポアを通って進む際のポリマーサブユニットの特性を反映することができる。
【００３１】
最後のステップ６４では、例えば、ナノポア電流が開孔電流に戻ったかどうかを判定することにより、ナノポアがオープンになったかどうかが判定される。そうでない場合、ポリマーシークエンスを記録するステップ６２が継続される。ナノポアがオープンであると判定された場合、ステップ５４が再び実行され、ナノポアでの標的ポリマー分子の捕捉を待ちながら、ナノポアに定バイアス電圧のみが印加される。
【００３２】
方法論５０では、ナノポア電流を測定するステップを実施して、ナノポア内のポリマーサブユニットのさまざまな特性を示す指標の範囲を取得することができる。一般的に、ポリマーサブユニットの特性を示す指標の取得は、例えば、ナノポア内のポリマーサブユニットの存在の検出として、連続する複数のサブユニット内のポリマーサブユニットをカウントすることとして、連続する複数のサブユニット内の同一のサブユニットの数を識別することとして、ポリマーサブユニットを識別することとして、サブユニットの化学的側面、又はサブユニットの他の特徴的な指標を決定することとして、実施することができる。ポリマー分子全体に沿ったサブユニットの連続シーケンスは、この方法で特徴付けられ、ポリマー分子シーケンス全体の数と識別情報を提供する。
【００３３】
この制御されたステップ方法は、任意の適切な電子制御システムで実施することができる。図５は、電圧制御パルスである制御パルスを用いて図３の方法論を実施するためのシステム７５が配置されている一実施形態の概略図である。システム７５では、電極３４、３６がシス及びトランスリザーバに設けられ、低ノイズ電圧パルス発生器７０及び電流増幅器７２に接続されている。電流増幅器７２は、シス及びトランスリザーバの間に定バイアス電圧Ｖｄｒｉｖｅを印加するように制御される。パルス発生器７０は、制御コンピュータ７４からの制御信号によってトリガーされると、電極３４、３６間に印加されるバイアス電圧Ｖｄｒｉｖｅに追加される電圧制御パルスＶｐｕｌｓｅを生成する。電流増幅器７２は、ナノポア電流のアナログ出力測定値を提供し、これは、アナログデジタル変換器７６によってデジタル化され、記録のためにコンピュータ７４に提供される。シス及びトランスリザーバ、ナノポア、電流増幅器、Ａ／Ｄコンバーター、パルス発生器、コンピュータによって形成された回路により、ナノポアを通るイオン電流を示す回路内の電流を測定することができる。
【００３４】
システムは、必要に応じて、適切な方法で、例えば熱電ヒーター／クーラー等を用いて、温度制御可能なものとすることができる。システムのどの要素も、クランプにエネルギーを供給してポリマー分子に沿ったクランプのステップに燃料を供給せず、エネルギー源はシステムに含まれない。上記で説明したように、電圧制御パルスのみが、クランプをポリマー分子に沿ってステップさせる。
【００３５】
このシステム７５は、図６に示すように、電気回路モデル８０で電気的にモデル化することができる。膜内のナノポアは、細孔抵抗と膜容量を生じさせる。図７は、図５の低ノイズ電圧パルス発生器７０の一実施形態の概略図である。低ノイズパルス発生器には、制御パルス間の持続時間、並びに、電圧制御パルスの持続時間及び振幅を決定する制御要素が含まれる。この実施形態は、電圧制御パルスの正確な生成を可能にするために、特に好ましい可能性がある。特に、好ましい実施形態では、図７に示すように、静電容量補償、＋Ｖｐｕｌｓｅ及び−Ｖｐｕｌｓｅが生成され、これは電圧フォロワー−インバーターによって提供され、静電容量に起因する「オーバーシュート」を低減させる。電圧パルス間の時間間隔が、例えばナノポアのデータ出力を最大化するために最小の間隔に設定されている場合、「オーバーシュート」の持続時間によって、ナノポアを通る実際の電流を測定することが不可能になる可能性がある。
【００３６】
図８は、図３の方法論を熱制御パルスである制御パルスで実施するためにナノポアシステム８５を配置した一実施形態の概略図である。システム８５では、電極３４、３６がシス及びトランスリザーバに設けられ、電流増幅器７２に接続されている。電流増幅器７２は、シス及びトランスリザーバの間に定バイアス電圧Ｖｄｒｉｖｅを供する。熱の制御パルスは、コンピュータ７４からの制御により生成され、レーザー８２及び光学系８４にトリガーパルス制御信号を提供する。ここで、レーザー８２及び光学系８４は、レーザーエネルギー８６のパルスが、レーザーエネルギー８６を吸収する材料が配置された膜のナノポアの部位に向くように、配置される。以下に説明するように、吸収性材料によるレーザーエネルギーの吸収により、ナノポアの近くの温度上昇のパルスが発生する。電流増幅器７２は、ナノポア電流のアナログ出力測定値を提供し、これはアナログデジタル変換器７６によってデジタル化され、図５の電圧パルス制御システムの方法で記録するためにコンピュータ７４に提供される。そのシステムと同様に、ここでのシステム８５は、必要に応じて、任意の適切な方法で、例えば熱電ヒーター／クーラー等を用いて、温度制御することができる。
【００３７】
図９Ａ−９Ｂは、図８のシステム８５のナノポアの部位に、吸収性材料を提供するための実施形態を示す。図９Ａに示される第１の実施形態では、金、銀、又は他の適切なナノ粒子（ＮＰ）等の吸収体粒子９０が供され、分子リンカー９２によってクランプ１０に付いている。図９Ｂに示されるさらなる実施形態では、金ＮＰ等の吸収体粒子９０は、分子リンカー９２によってナノポア２０に付いている。
【００３８】
これら２つの実施形態のいずれにおいても、レーザー光による粒子、好ましくは金ＮＰの照射は、その波長が、金粒子へのプラズモン共鳴効果を利用するものであり、ナノポア付近の溶液の急速な局所加熱で特に効果的である。金ナノ粒子の高度に閉じ込められた表面プラズモン共鳴効果により、粒子による光の吸収が高められるため、ナノ粒子に入射する可視レーザー光は、粒子温度及び隣接する溶液温度の急速かつ大幅な上昇を引き起こす。この温度上昇は、ナノポアのイオン伝導度の変化から推定することができる。例えば、３００ｍＷのビームエネルギーで動作する５３２ｎｍ波長のレーザーは、金のナノスケールの直径の粒子とＮＰの近接の周囲領域の温度を、室温から、約２０℃から約５０℃だけ、ナノ秒で簡単に上昇させることができる。加熱される体積は数ヨクトリットル（ｙｏｃｔｏｌｉｔｅｒ）と小さいため、この小さな体積は、周囲の溶液の体積の温度に急速に戻る可能性がある。これは、熱エネルギーが、その体積が通常少なくとも１６桁は大きい周囲の溶液に急速に放散されるためである。
【００３９】
さらなる実施形態において、図５の制御システム７５は、図８の制御システム８５と組み合わされて、電圧及び熱制御パルスの組み合わせを可能にする。ナノポアに金ＮＰ等の吸収体を配置すると、上記の方法での決定論的なモノマーの動きに、電圧と熱の両方のパルスが使用される。各電圧及び熱パルスのタイミングと持続時間は、手動又は自動システムのいずれかで、熱パルス制御と電圧パルス制御の調整により、個別に制御することができる。
【００４０】
ナノポアシステムで使用されるクランプ１０の詳細に着目すると、図１Ａ−１Ｃに示すクランプは、任意の適切な構成及び配置をとることができ、それによって、クランプは、ナノポアを通って移動する標的ポリマーの複数のポリマーサブユニット、又は他の一般の分子のサブユニットに対して、可逆的にクランプするか又は可逆的に結合できる。クランプは、他のシステムでは酵素又は生化学的な燃料依存モーターとして機能する分子である可能性はあるが、本明細書においては、用語「クランプ」は、任意の生体分子又は非生体アセンブリを指す。すなわち、ポリマーに可逆的に結合し、生化学的燃料依存の作用の代わりに、電圧制御パルス、Ｖｐｕｌｓｅ及び／又は熱制御パルスＨｐｕｌｓｅの印加・適用により、ポリマー長にわたって単一の連続したモノマーステップで、ステップ又は移動するように、決定論的に駆動させることができる、固体状アセンブリである。クランプには、標的ポリマー分子のポリマーサブユニットのシーケンスに沿ってステップさせるために、化学物質又は他の燃料は供給されない。
【００４１】
一実施形態において、クランプは、Ｔ４ファージヘリカーゼ酵素等のヘリカーゼである。他の実施形態において、Ｔ４ファージヘリカーゼ酵素の変異体を含む他の酵素、及び核酸ポリマーに結合する他のタンパク質、及び生化学的又は無機化学的複合体も、クランプとして使用できる。
【００４２】
このようなクランプと上記の制御システムにより、ここで提供されるポリマーステップ方法論は、クランプを使用することにより、酵素活性分子の確率的移動を回避する。ここで、クランプは、ＡＴＰ、又は、化学的若しくは生化学的燃料の投入を必要とせず、代わりに、電圧制御パルスＶｐｕｌｓｅ、及び／又は熱制御パルスＨｐｕｌｓｅ並びに定電圧バイアスＶｄｒｉｖｅの重ね合わせによって、決定論的に駆動される。結果として、標的ポリマーのモノマーの直線的なシークエンスが、正確にタイミングを合わせたステップ運動でナノポアを通って移動する方法が、ここに提供される。２つの特徴が、特にこの方法論を可能にする。
【００４３】
第一に、ナノポアを通ってポリマーの確率的運動を制御するために使用されてきたヘリカーゼやポリメラーゼ等の酵素ための生化学的燃料配置とは異なり、ここでの方法論は、決定論的に駆動されるクランプが、クランプを標的ポリマーのモノマーサブユニットに沿って運動させるための化学エネルギー源を使用しないことを要求する。その代わりに、本明細書では、電圧制御パルスＶｐｕｌｓｅ及び／又は熱制御パルスＨｐｕｌｓｅが、定駆動電圧バイアスＶｄｒｉｖｅと共に、制御可能に適用され、ポリマー結合クランプを非常に簡単に解放するか、又は緩め、それによって、クランプが１モノマーステップ分だけポリマーに沿ってスライドし、図１Ｃに示すように、ポリマーが駆動され、モノマーが１つだけナノポアを通ってステップするようになる。したがって、図１Ｃのように、クランプが標的ポリマーに対して移動する場合を除き、結合されたクランプは、クランプがなければ、ポリマーの全長を急速に駆動してナノポアを通るであろう駆動力によって標的ポリマーが駆動されてナノポアを通ることを防ぐか、又は失速させる。実際には、クランプはクロックラチェットホイールのつめの機能を果たし、バイアス電圧Ｖｄｒｉｖｅはラチェットホイールを推進するスプリング又はモーターとして機能する。
【００４４】
第二に、電圧制御パルス及び／又は熱制御パルスは、好ましくは持続時間がナノ秒からマイクロ秒、例えば１ミリ秒以下であり、クランプコンポーネントが、パルス毎にポリマーに沿って１モノマーユニットを「スライド」させることにより、標的ポリマー鎖を、ナノポアを通過させ、ステップさせる。定電圧バイアスＶｄｒｉｖｅは、連続的に作用して、ナノポアを通るポリマーを電気泳動又は駆動する。ここで、結合されたクランプは、その直径がナノポアより大きい場合移動できない。そのため、ポリマーは、クランプコンポーネントが可逆的に、しかし決定論的にスライドして、次にポリマーの別の複数のモノマーユニットに可逆的に再クランプするときに、ナノポアを通って、１モノマーユニットずつ決定論的にステップする。
【００４５】
好ましい実施形態では、単一の電圧制御パルスＶｐｕｌｓｅ及び／又は熱制御パルスＨｐｕｌｓｅの持続時間は、ポリマーからクランプを瞬間的に解放するのに必要とされる時間より長くならないように調整され、定バイアス電圧Ｖｄｒｉｖｅは、クランプが、図１Ｃで上向きの矢印で示す方向に、ポリマーに沿って１モノマーステップ分スライドし、次の連続するモノマーユニット又はモノマーユニットのグループに結合するように、ポリマーを駆動し、ナノポアを通過させる。これにより、ポリマーの次の連続するモノマーユニットがナノポアを占有し、好ましくはナノポアの最も狭い領域を占有し、ここは最も感度が高く、そのため、ナノポアの導電性は、この次の連続するモノマー又はモノマーのグループの電気的及び体積的特性によって支配される。したがって、これらの一連の電圧及び／又は熱制御パルスは、クロックシステムのつめを開放する（ｐａｗｌ−ｒｅｌｅａｓｅ）メカニズムの方法で機能する。これにより、一連の電圧及び／又は熱制御パルスは、ナノポアを通って駆動される標的ポリマーの全長をステップさせる。
【００４６】
クランプが、分子クランプ酵素として実施され、ＡＴＰ又は他の生化学燃料を利用してポリマーに沿ってターンオーバーし、ステップする可能性のある場合でも、ＡＴＰ又は化学エネルギー源は、ここの方法論では供給されず、クランプは、ＶｐｕｌｓｅやＨｐｕｌｓｅを用いた、電圧と熱制御パルスによってのみ、そのポリマー基質に沿ってスライドさせられることに注意されたい。正確なタイミングの電圧制御パルスＶｐｕｌｓｅ及び／又は熱制御パルスＨｐｕｌｓｅによってクランプがポリマーに沿って駆動されるため、ナノポアを通るポリマーの段階的な運動は決定論的である。
【００４７】
デオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）駆動ポリメラーゼ及びＡＴＰ依存性ヘリカーゼは共に、シーケンスのため、ナノポアを通って確率論的にＤＮＡをステップするために使用されている。これら及び他の化学的に駆動される酵素の両方のステップ速度は、機械的な力によって加速、減速、又は停止させられることさえあることが知られている。また、ＡＴＰ又はｄＮＴＰの存在下では、ヘリカーゼやポリメラーゼ等の核酸ステップ酵素は、機械的に加速又は減速しても、いくつかのモノマーをスキップ又はジャンプすることなく、モノマーごとにポリマー基質モノマーに沿ってステップすることが知られている。例えば、図１Ａ−Ｃに示されているクランプ１０がヘリカーゼであり、ＡＴＰの存在下で図１Ｃの上向きの矢印で示される方向にポリマー基質に沿って標準的にステップする場合、ポリマーをシスリザーバからナノポアを通ってトランスリザーバに駆動する電圧バイアスが増加するにつれて、このステップはより速くなる（しかし、スキップせずにモノマーごとにステップする）。これは、Ｍｏｙｓｅｙが米国特許第９，６１７，５９１号において教示している（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４８】
反対に、図１０を参照すると、クランプがプロセッシブポリメラーゼ８５の場合、ポリマーをシスからトランスに駆動する電圧バイアスの電気泳動力がより大きくなるにつれて、ｄＮＴＰの存在下で矢印８６の方向にポリマーに沿ってのポリメラーゼのステップは、ポリマーがナノポアからよりゆっくりとステップし、出て行く傾向になる（しかし、ポリマーモノマーを、スキップせずにモノマーごとにステップする）。このことは、Lieberman et al., J. Am. Chem. Soc., 132:17961-17972, 2010（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において説明される。最後に、通常ＡＴＰを消費して反時計回りにステップするＦ１−ＡＴＰａｓｅが、純粋に機械的な力によって時計回りに駆動されるとＡＴＰを合成するという事実は、タンパク質マシンの、ある特定のポイントで働く機械的な力が、触媒サイトで化学反応を駆動できることを明確に示す。これらの例は、適切に加えられた機械的な力は、酵素の通常の立体構造変化を破損も破壊もしないことを示す。さらに、これらの例は、純粋に機械的な力が、標準的な化学エネルギー駆動の立体構造変化を「遅延」、「促進」、又はさらに「駆動」することができるという明確な証拠を提供する。
【００４９】
ＡＴＰの存在下で、機械的な力が酵素の立体構造の変化を「促進」、「遅延」、又は「置換」できるという事実によって、本明細書で提供される構造によって対処される、次の疑問が提起される。ＡＴＰが存在しない場合、つまり燃料が存在しない場合、純粋に機械的な力だけでポリマーステップ酵素に立体構造の変化が生じ、それによって、ＡＴＰに依存性のステップと同じ特徴を有する、モノマーごとの精度で、ポリマーに沿ってスライドし得るであろうか？ＡＴＰの加水分解に由来する化学エネルギーを使用する場合、ヘリカーゼ等の酵素は、立体構造変化を受け、それによって、ヘリカーゼを正確にポリマーに沿ったステップごとに１核酸塩基分だけ進める。仮に、単独で作用する機械的な力が、単に各ステップで酵素クランプを押して不定の数の核酸塩基をランダムにスライドさせるような場合は、ナノポアによって検知された核酸塩基のシーケンスは、ポリマー内の核酸塩基の実際のシーケンスを報告できない。なぜならば、ナノポアによる連続する各核酸塩基の識別は、連続する各ステップ間の時間間隔中で生じるためである。
【００５０】
ここで図１１のプロットを参照すると、本明細書の発明者は、ＡＴＰによって可能になる方法で、しかし完全にＡＴＰ不在下で、つまり、クランプに供給される燃料なしで、適用された力が酵素クランプを押して、正確に、ステップごとに１核酸塩基分だけを進めることができることを発見した。図１１のプロットは、ＤＮＡ鎖の各ステップでナノポアの最も狭い領域を占めるモノマーに近接する５核酸塩基周辺によるナノポアの電流遮断を示す。ＤＮＡのシークエンスは、水平軸に示されているように、一連のオーバーラップする５量体として読み取られる。
【００５１】
図１１のプロットに示すように、Ｖｄｒｉｖｅ＝１６０ｍＶの印加電圧バイアスに対する、電圧バイアス駆動ＤＮＡ鎖（円）の各ステップのナノポアを流れる電流は（そのような電流測定値の誤差限界の範囲内で）、ＡＴＰ駆動鎖（四角）の各ステップの電流測定値と同じである。これは、機械的に強制された運動が、ＡＴＰ燃料による力と同様に、ＤＮＡ鎖等のポリマーを、ナノポアを通して１ヌクレオチドだけ前進させることができ、ＡＴＰを使用せずにそのようにできることを示す。したがって、電圧強制運動は、ナノポアを通って、標的ポリマー分子を忠実に移動させることができ、よって、ナノポアを通るポリマーの運動が、例えばＡＴＰ燃料よる、ヘリカーゼ酵素によって制御されるときと同じ、一連の電流レベルを可能にする。これは、十分な大きさの純粋に機械的な力により、標準的にはＡＴＰ依存性酵素であるものがクランプとして機能し、ＡＴＰの非存在下で、電圧及び／又は熱制御によって駆動され、ＡＴＰ依存性ＤＮＡモーター酵素が行うのと同様に、モノマーごとのステップ精度で、ＤＮＡ鎖の長さに沿って移動できることを明確に示す。
【００５２】
図１１のプロットは、通常の、ＡＴＰ駆動Ｔ４ヘリカーゼの５'から３'のステップと、ＡＴＰの非存在下でクランプとして機能する機械駆動のＴ４ヘリカーゼの５'から３'を示し、Ｔ４ヘリカーゼはまた、ＤＮＡ鎖に沿って逆方向、つまり３'から５'に機械的に駆動されている。実際、Mulkidjanianらによって観測されたこと(Mulkidjanian et al., Nat. Rev. Microbiol., 5:892-899, ２００７，これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を考慮すれば、Ｆ１−ＡＴＰａｓｅを使用して、ＡＴＰを加水分解する代わりに、逆に機械的な力によって駆動しＡＴＰを合成できる。ＡＴＰ依存性核酸ステップモーター酵素をＤＮＡに沿った標準の５'−ｔｏ−３'又は３'−ｔｏ−５'の移動方向と逆方向に駆動することにより、ＡＴＰを消費するのではなく生成できることが理解される。これは、Ito et al., Nature, 427:465-468, 2004,（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。結果として、本明細書で提供されるさらなる実施形態では、バイアス駆動電圧並びに電圧制御パルス及び／又は熱制御パルスを使用して、ポリマー分子長に沿って２つの可能な方向のいずれかにクランプを移動できる。
【００５３】
制御パルスのために本明細書で提供される方法論には、バイアス駆動電圧、Ｖｄｒｉｖｅ、及び追加の電圧制御パルスＶｐｕｌｓｅの非常に短い間隔、及び／又は、熱制御パルスＨｐｕｌｓｅにおけるより高い温度での短い間隔の組み合わせが関連するため、より高い電圧バイアスとより高い温度がステップ速度にどのように影響するかの理解がここに提供される。これらの条件の実験結果は、パルシングのない条件の電圧及び温度パラメータについて作成され、ＤＮＡ鎖上のクランプの例としてＴ４−ヘリカーゼを再度使用した。図１２のプロット、ＡＴＰ非存在を参照すると、固定されたクランプを備えたＤＮＡポリマーが一定のシスからトランスへのバイアスによってナノポアを通って駆動される場合、ナノポアを通りポリマーの全長をステップするのにかかる時間の中央値は、ナノポアにかかる電圧バイアスＶｄｒｉｖｅが増加するにつれて短くなる。図１３も参照すると、結果として、各モノマーステップ間の時間間隔の中央値（ここではステップ持続時間中央値と称する）は、Ｔ４ヘリカーゼクランプを備え、図１２のプロットのデータを表す条件についてのものであり、電圧バイアスＶｄｒｉｖｅが増加するにつれて短くなる。図１３のプロットのステップ持続時間中央値データは、図１２のデータについてのものであり、図１２に示される、全分子移動の測定された持続時間を、移動した分子の全長を構成する既知のモノマーの数で除することによって決定された。
【００５４】
他のいくつかの要因が、各ステップ間の時間間隔又はステップ持続時間中央値に影響を与える可能性がある。例えば、ＡＴＰの非加水分解性類似体である５'−（β、γ−イミド）三リン酸（ＡＤＰＮＰ）の低濃度の添加により、図１１のプロットで表される条件のように、多くの同一のポリマーがナノポアを通ってステップするとき、ナノポアを完全に通過する持続時間の範囲が大幅に短縮される。ステップ持続時間中央値に影響を与える可能性のある他の要因には、例えば、３'から５'方向又は５'から３'方向等の、クランプを介するポリマーの移動方向、及び、クランプのアミノ酸組成の変化、又はクランプコンポーネント間のジスルフィドリンクの形成、又は他の構造が含まれる。
【００５５】
再び図１３を参照すると、図１３のプロットデータに示されているように、クランプとその近接周囲の温度が、ステップ持続時間中央値に特に顕著な影響を与えることがわかる。例えば、Ｔ４ファージヘリカーゼをクランプとして使用すると、温度を室温より低くすると、ステップ持続時間中央値が大幅に長くなり、温度を２５°Ｃから３７°Ｃに上げるとステップ持続時間中央値が３倍以上短くなることが観察される。電圧の上昇も温度の上昇も、観察されたＤＮＡポリマーの長さに沿って、クランプがモノマーごとにステップする精度を変えることはなかった。
【００５６】
電圧制御パルスと熱制御パルスの実施形態に着目すると、本方法論のナノポアシステムの特徴、クランプコンポーネント、並びに電圧及び／又は熱パルスの持続時間と振幅は、互いに一体に選択され、ナノポア検知及びナノポアシーケンスの方法論に精通している人々に知られている他の一般的に使用されるナノポア検知の特徴と一体に選択されることが理解される。一実施形態において、決定論的なステップを生成する制御パルスを実施するための手順は次のとおりである。
【００５７】
１）最初のステップでは、定バイアス駆動電圧、Ｖｄｒｉｖｅ及びナノポアシステムの他のすべての条件を設定して、ステップ持続時間中央値ができるだけ長く、短時間のステップの頻度ができるだけ低くなるようにする。これは、例えば、バイアス駆動電圧Ｖｄｒｉｖｅを約２０ｍＶから約１４０ｍＶの間の電圧に設定し、リザーバの溶媒を約１０℃から約１５℃の間の温度に維持することによって実現される。約１２０ｍＶ以下のバイアス駆動電圧Ｖｄｒｉｖｅを用いることにより、より長いステップ持続時間中央値を達成できる可能性があるが、約１２０ｍＶ未満のバイアスでは、連続するモノマーユニットがナノポアの検知開口領域の外側に拡散する可能性のある間の持続時間の経過を最適に防止できない可能性があることが理解される。これは、Lu et al., Biophys. J., 109:1439-1445, 2015,（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）において説明される。以下で説明するように、このような条件は、ポリマーの異なるサブユニットを区別するナノポアの能力を低下させ得る。結果として、好ましい実施形態において、バイアス実施電圧Ｖｄｒｉｖｅは少なくとも約１２０ｍＶであり、好ましい実施形態では、約１２０ｍＶ〜約１４０ｍＶである。
【００５８】
２）次のステップでは、電圧制御パルスＶｐｕｌｓｅ又は熱制御パルスＨｐｕｌｓｅ又はＶｐｕｌｓｅとＨｐｕｌｓｅの同時の制御パルスの周波数を設定する。これらの周波数は、パルス間の時間の長さが、バイアス駆動電圧Ｖｄｒｉｖｅを印加するだけで、パルスがない場合に発生すると測定される最短持続時間のステップの長さよりも大幅に短くなるように設定する。パルス間の時間の長さは、パルスがない場合に観察される最短持続時間のステップの長さよりも十分に短いことが好ましいが、パルス間の時間の長さは、ナノポアシステムの電子機器が各パルス間でナノポアを流れるイオン電流を正確に評価できるように、十分に長いことが好ましい。パルス間の時間の長さが、パルスが存在しない場合に観察される最短持続時間の長さよりも十分に短い場合、バイアス電圧だけでクランプが確率論的にステップするように駆動される確率が、非常に小さくなることが保証される。したがって、結果として、実質的にすべてのクランプステップは、電圧制御パルスＶｐｕｌｓｅ及び／又は熱制御パルスＨｐｕｌｓｅの意図的な印加によるものであり、ナノポアを通るポリマーのステップ移動は、決定論的であり、制御され、かつ、反復可能であることが保証される。
【００５９】
言い換えると、標的ポリマーが、決定論的なステップ様の運動でナノポアを通って確実に前進するように、各電圧制御パルス及び／又は熱制御パルスの持続時間は、バイアス駆動電圧Ｖｄｒｉｖｅが、ポリマーを駆動してナノポアを通ってポリマーを１モノマーユニットだけ前進させるのにかかる時間の長さより少なくするために、クランプがポリマーのモノマーユニットに結合する標準的な力に打ち勝つように選択される
【００６０】
ナノポアシステムで実施される選択された調査、調査される標的ポリマーの詳細、及びクランプコンポーネントと適切なナノポアの可用性に応じて、本明細書において、いくつかの実施形態が提供される。以下の２つの実施形態は、ナノポア検知とナノポアシーケンスの技術分野の当業者が本明細書で提供されるシステムの適切な特徴をどのように選択できるかと、それらのパラメータ及びナノポア検知のその他の一般的に使用される特徴を設定して、それらが互いに機能するように連携する方法を示す。実施形態にはＤＮＡが使用され、他の直線的に接続された荷電ポリマー、すなわち、連続的なモノマー残基、例えば、ＲＮＡ、タンパク質、及び上記の分子等が、ポリマーに可逆的に結合された適切なクランプコンポーネントとともに、同様に調査される。
【００６１】
本明細書で提供される様々な実施形態において、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）又は二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）は標的ポリマー分子である。いずれの実施形態においても、ナノポアは、標的ポリマーの１本の鎖のみが通過するが、結合されたクランプコンポーネントを有する、この１本の鎖が通過できない制限開口を有し、構成される。容易に入手可能なナノポアの中で、タンパク質等の有機ナノポア、又は膜の開口等の無機固体状のナノポアのいずれかで、いずれの場合も、クランプの直径よりも小さいが、約１ｎｍよりも大きいチャネル開口径を有するものが、多くの実施形態に対して好ましい。
【００６２】
ナノポアシステムのナノポア、膜、及び支持構造の製造、配置、及び構成は、任意の適切な方法で実現でき、例えば、Moyseyの米国特許第9,617,591号、Golovchenkoの米国特許第7,468,271号、Lieberの米国特許第8,698,481号、 GarajのUS 20120234679、Lieberの米国特許第9,702,849号、 Russoの米国特許第9,611,140号、 Golovchenkoの米国特許第9,815,082号、 及びXieのUS20160231307に記載されているような方法で実現することができ、これらのそのすべてが参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
標的ポリマーの長さに沿ってモノマーをカウントするための例示的パラメータに関する実施形態この例示的な実施形態では、脂質二重層から形成されたナノポア膜が特定されている。例えば、支持構造体の開口を横切って延在するｄｉＰｈＰＣ脂質二重層を使用することができ、支持構造体の開口は約１０ミクロンから約２０ミクロンの間の直径を有する。適切なナノポア、例えば、ＣｓｇＧナノポアをここで使用することができる。ｄｉＰｈＰＣ脂質二重層膜は、約３００ｍＶを超える一定又は長時間の電圧バイアスで破壊する可能性があることが知られているため、ここでは定バイアス電圧として、比較的低いバイアス駆動電圧、例えばＶｄｒｉｖｅ＝１２０ｍＶが適切であり、上記のように、この比較的低いバイアス電圧が、各連続するモノマーユニットがナノポアの最も感度が高い検知開口の外側で費やす時間の長さを最適に減少しない場合でも、電圧制御パルス中及び電圧制御パルス間の両方で維持される。
【００６４】
この駆動電圧が選択された状態で、次に標的ポリマーがｄｉＰｈＰＣのＣｓｇＧナノポアを通って決定論的なステップ様の動きで確実に前進するように、各電圧制御パルス及び／又は熱制御パルスの振幅と持続時間は、１２０ｍＶのバイアス駆動電圧Ｖｄｒｉｖｅが、ポリマーを駆動してナノポアを通ってポリマーを１モノマーユニットだけ前進させるのにかかる時間の長さより少なくするために、クランプが標的ポリマーのモノマーユニットに結合する標準的な力に打ち勝つように選択される。各電圧制御パルス及び／又は熱制御パルスの振幅と持続時間はまた、膜が破壊したり破損したりしないように選択される。一般的に、ほとんどの実施形態では、電圧制御パルスは一定ではないため、電圧制御パルスの振幅は一定の駆動電圧の振幅よりも大きくなる。
【００６５】
比較的壊れやすいｄｉＰｈＰＣ膜は、約１８０ｍＶより大きい一定の電圧バイアスによって破壊する可能性があるが、最大約５００ｍＶの大きさの電圧を印加する短い、〜１マイクロ秒のパルスには耐えることができる。したがって、この例では、ＡＴＰの非存在下でクランプコンポーネントをポリマーのモノマーユニットに結合する力に簡単に打ち勝つために使用される電圧制御パルス及び／又は熱制御パルスは、持続時間が約１マイクロ秒より短く、約５００ｍＶ未満の電圧を有するよう特定される。
【００６６】
この実施形態では、クランプは、ＤＮＡの一本鎖に結合する高度にプロセッシブな幅広いＤＮＡ酵素のいずれかとして実施することができる。例えば、ヘリカーゼやポリメラーゼ等のトランスロカーゼは、クランピングコンポーネントとして使用できる。ヘリカーゼの中でも、他の領域はｄｓＤＮＡである不対一本鎖領域に結合する多くが利用可能である。これらは、von Hippel et al., Cell, 104:177-190, 2001,（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）によって説明される。
【００６７】
本明細書のこの実施形態及び様々な実施形態では、ＤＮＡポリマーに付けられたいくつかのクランプではなく、１つのクランプのみを使用することが好ましい可能性がある。結果として、不対一本鎖ＤＮＡ領域に結合するヘリカーゼは、特によく適したクランプである。なぜならば、分子生物学の分野の当業者は、例えば、ｓｓＤＮＡの大部分を一時的にｄｓＤＮＡに変換することにより、複数のヘリカーゼがｓｓＤＮＡサンプルに結合するのを防ぐ方法を理解しているためである。
【００６８】
Ｔ４  Ｄｄａヘリカーゼ等のＳＦ１ファミリーヘリカーゼは、これと多くの実施形態に好ましいクランプ選択であり得る。なぜならば、ｓｓＤＮＡの５'から３'に沿ったＴ４  Ｄｄａヘリカーゼの移動のモードが高解像度で研究されており、これらのヘリカーゼが結合したＤＮＡと作る約１２−１４アミノ酸の接触のほとんどは、ＤＮＡの糖リン酸骨格と接触していることは明らかであるためである。これらは、Saikrishnan et al., Cell, 137:849-859, 2009,（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される。結果として、ＳＦ１ファミリーヘリカーゼは、それが結合するＤＮＡ鎖で遭遇するすべての核酸塩基配列に等しく良好に結合することが本明細書で理解される。
【００６９】
さらに、このファミリーのトランスロカーゼのメンバーは多くの生物に見られ、ＡＴＰの非存在下でＤＮＡに沿って結合ヘリカーゼをスライドさせるのに必要な力は、ＳＦ１ファミリーヘリカーゼが精製される生物によって大きく異なる。例えば、そのＤＮＡへの結合が、約１８０ｍＶ未満の定バイアス電圧によっては負かされないが、そのＤＮＡ鎖への結合が、約２００ｍＶを超える電圧パルスであって、任意で熱パルスと連携され、両方とも約５００μｓ未満の継続期間間の持続するものによって負かされる可能性があるクランプが好ましい場合がある。
【００７０】
電圧制御パルスとともに、又は電圧制御パルスの代わりに熱制御パルスを印加するために、多くの実施形態で、少なくとも約３００ｍＷのビームエネルギーで動作する５３２ｎｍ波長のレーザーを使用できる。このレーザーは、上記で説明したように、１つ又は複数の金、銀、又はその他の光吸収ナノ粒子が結合されたクランプの近接周囲のイオン溶液約１０ヨクトリットル未満の体積の温度を上昇させる。媒体の一定のバックグラウンド温度は、この実施形態では約１５℃のバイアス温度に保持されることが好ましく、その後、電圧制御パルスと時間的に一致するように放射されるレーザー光によって約５０℃に上昇される。
【００７１】
電圧及び／又は熱制御パルス間の時間の長さは、所望の精度レベルでのモノマー識別に必要とされる最短の時間よりも長いが、バイアス電圧Ｖｄｒｉｖｅの条件下でのクランプ１モノマーユニットのスライドのための特徴を示す最短時間よりも短い。このスライドのための最短の測定時間は、選択された特定のヘリカーゼによって異なる。例えば、ＡＴＰがなく、クランプとして好ましいＴ４  Ｄｄａヘリカーゼを用いた場合、Ｖｄｒｉｖｅ＝１２０ｍＶでは、１秒未満のステップ間の持続時間が非常にまれであることがわかる。したがって、電圧制御パルス間の間隔は、１００ミリ秒以下に設定することができ、これは、簡単に実施できる条件である。これは、駆動電圧による検出されないスライドを回避し、これによって、ナノポアを通って標的ＤＮＡポリマーの全長を駆動するように適用されるパルスのカウント数が、ポリマー長内のモノマーサブユニットの数、すなわち核酸塩基の数と、等しくなる。
【００７２】
標的ポリマー長に沿った、化学的事項及びモノマーシークエンスを決定するための例示的なパラメータに関する実施形態さらなる実施形態において、ナノポアシステム、クランプ、及び制御パルスは、標的ポリマーの化学的性質及び標的ポリマーに沿ったモノマーサブユニットのシークエンスの決定を可能にするために選択される。この実施形態は、上記のように、その核酸塩基がポリマーのモノマーサブユニットである標的ポリマー分子ＤＮＡを考慮している。ここではモノマーサブユニットに関するより詳細な情報が求められるため、ナノポアを通ってポリマーを駆動するためのバイアス電圧は、前述の実施形態のバイアス電圧よりも大きい、必要があり、これは、そうしなければ詳細な情報を劣化させてしまうブラウン運動の影響を最小限に抑えるためである。結果として、この実施形態の主題であるパラメータのいくつか、及びナノポア検知の他の一般的に使用される特徴のパラメータは、前の実施形態とは異なる。
【００７３】
この実施形態は、前の実施形態のバイアス駆動電圧よりも大きいバイアス駆動電圧Ｖｄｒｉｖｅを必要とし、したがって、Ｖｄｒｉｖｅ＋Ｖｐｕｌｓｅの合成電圧の振幅は、相応して前の実施形態の振幅よりも大きいため、前の実施形態で使用されたものよりもより壊れにくく、より強固である膜がここでは好ましい。適切な膜には、グラフェン膜、窒化ケイ素膜、又は他の適切な固体状の膜等の固体状の膜、又は両親媒性トリブロック共重合体膜が含まれ、Zhao et al., Science, 279: 548-552, 1998（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、ポリ（ジメチルシロキサン）−ブロック−ポリ（２メチルオキサゾリン）−ポリ（ジメチルシロキサン）又はミコール酸膜等があり、Langford et al., J. Lipid Res., 52: 272-277, 2011,（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、それらはすべて、diPhPC脂質二重層よりも、より強固なイオン不透過性膜を形成できる。
【００７４】
支持構造体において、比較的小さな開口、例えば直径２０ミクロン未満の支持構造体開口にわたり延在する膜もまた、好ましい。従来の１０ミクロン直径〜５０ミクロン直径の支持構造体の開口にわたって形成される膜よりも、顕著に強固であるためである。選択された直径、例えば直径が１ｎｍを超える、又は直径が約２ｎｍを超えないナノポアは、膜を通ってまっすぐ貫通し、例えば、グラフェン膜等の膜を貫通することができる。又は、ＣｓｇＧポーリンの変異体等の生体ナノポアは、膜に提供される、好ましいタンパク質ナノポアである。これらのいずれも、Howorkaにより、US20180148481（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるように、α−ヘモリシンよりもＤＮＡ核酸塩基間をより容易に区別することができる。
【００７５】
ここで、約１４０ｍＶから約２５０ｍＶのバイアス駆動電圧Ｖｄｒｉｖｅは、ブラウン運動を最小限に抑え、連続する各モノマーユニットがナノポアの最も感度が高い狭い開口であって、高電気抵抗領域の外部で費やす時間を最小限に抑えることにより、各イオン電流測定に寄与するモノマーの数を最小限に抑えることが好ましい。この状態は、約１２０ｍＶの駆動電圧の例に関し、図１４Ａ〜１４Ｃを参照して理解することができる。ナノポア２０に１２０ｍＶの駆動電圧３８が印加されると、１つのモノマーユニット４２がナノポアの高感度部位４４に配置され、図１４Ｂに示されるように、ブラウン運動によりモノマーユニットが高感度部位から一瞬の間追い出される可能性がある。１２５ｍＶを超える、より大きいバイアス駆動電圧を印加すると、図１４Ｃに示すように、サブユニット４２がより迅速に高感度部位に戻り、それによってモノマーの識別が改善される。したがって、約１２０ｍＶを超える比較的高いバイアス駆動電圧を使用するか、ブラウン運動に対抗する可変電圧を使用することが好ましい場合がある。
【００７６】
この実施形態において熱パルスを加えるために、例えば、少なくとも約３００ｍＷのビームエネルギーで動作する５３２ｎｍ波長レーザーを使用し、上記の方法で、クランプ又はナノポアに結合した金ナノ粒子を有する、クランプの近接周囲のイオン溶液の約１０ヨクトリットル未満の体積の温度を上昇させることができる。溶液の一定のバックグラウンド温度は、約１０℃に保持されることが好ましく、レーザー光によって約５０℃に上昇される。レーザー光は電圧制御パルスと一致するように上記の方法で制御される。
【００７７】
約１０ミクロン未満の支持構造体開口径にわたって、ここで選択された比較的強固な膜を用いると、約５００ｍＶを超える定電圧バイアスが膜を破壊する可能性がある。しかし、最大で約１マイクロ秒及び約３マイクロ秒の間のパルス持続時間を有し、約９００ｍＶ未満の大きさの電圧制御パルスは、許容される。したがって、ＡＴＰの非存在下で、クランプコンポーネントをポリマーのモノマーユニットに結合する力に簡単に打ち勝つために使用される電圧制御パルスは、ここでは、持続時間が約３マイクロ秒より短く、電圧の大きさが約９００ｍＶより小さいことが好ましい。
【００７８】
ここでの実施形態では、ＳＦ１ファミリーヘリカーゼが好ましい。なぜならば、トランスロカーゼのこのファミリーのメンバーは多くの生物に見られ、ＡＴＰの非存在下でＤＮＡに沿って結合したヘリカーゼをスライドさせるのに必要な力は、ＳＦ１ファミリーヘリカーゼが精製される生物によって大きく異なるためである。この例に関しては、そのＤＮＡ鎖への結合は約５００ｎｓ未満の制御パルス持続時間と約９００ｍＶ未満の大きさによって負かされる可能性があるが、そのＤＮＡへの結合は約５００ｍＶ未満のバイアス駆動電圧によっては負かされないクランプが好ましい場合がある。
【００７９】
前の実施形態と同様に、制御パルス間の持続時間は、ここでは、所望の精度レベルでのモノマーの識別に必要とされる最短時間よりも長いが、バイアス駆動電圧のみの条件下でのクランプのスライドに関する特徴を示すと知られる最短時間よりも短くなるように選択される。このスライドの最短測定時間は、選択された特定のヘリカーゼによって異なる。ＡＴＰ非存在で、クランプとして好ましいＳＦ１ファミリーヘリカーゼを使用すると、スライド間の平均時間は約１００ミリ秒を超え、指数関数的に減少し、そのためＶｄｒｉｖｅ＝３００ｍＶのバイアス駆動電圧のみの条件下での、ある核酸塩基から次の核酸塩基へのスライドは、約１５ｍｓのスパンでは、非常にまれにしか発生しない。したがって、電圧制御パルスの間隔を、簡単に実施される持続時間で発生するように、例えば約５ミリ秒から約１０ミリ秒の間に設定することによって、確率論的スライディングが最小限に抑えられ、ＤＮＡシーケンス内の連続する各核酸塩基が、ナノポアでのその現在のシグネチャによって確実に検出及び識別されるように、決定論的なステップを提供する。
【００８０】
実験例ＭｓｐＡナノポアが、ジフィタノイルホスファチジルコリン膜に供され、図２に示すように、ナノポアシステムに配置された。Ｄｄａヘリカーゼクランプを備えたＤＮＡを、ｐＨ８．０の１ＭのＫＣｌ、２５ｍＭのリン酸緩衝液、２ｍＭのＡＤＰＮＰ、２ｍＭのＭｇＣｌ２のイオン溶液中で、シスリザーバシステムにロードした。溶液を３７℃に保持した。ナノポアにかかるバイアス駆動電圧は１６０ｍＶであった。電圧制御パルスは、図５の電圧パルス制御システムと図３の制御方法を使用して適用された。最初の実験では、電圧制御パルスの持続時間は５００マイクロ秒で、２番目の実験では、電圧制御パルスの持続時間は１ミリ秒であった。両方の実験で、電圧制御パルスの振幅は３００ｍＶであった。ナノポア電流を測定し、２ｋＨｚでフィルタリングした。
【００８１】
図１５Ａ及び１５Ｂは、電圧制御パルスが印加されたときの時間の関数として測定されたナノポア電流のプロットであり、ナノポアにかかる印加電圧を時間の関数として示し、５００マイクロ秒の持続時間の電圧制御パルスと１ミリ秒の電圧制御パルスの、それぞれに関する。測定されたナノポアイオン電流は上の線として表示され、軸はプロットの左側にあり、印加電圧パルスは下の線として表示され、その軸ラベルはプロットの右側にある。両方のデータのプロットに示されているように、ナノポアを通るイオン電流において測定された変化は、印加された電圧制御パルスＶｐｕｌｓｅと時間的に一致した。これは、１つの単一印加電圧制御パルスＶｐｕｌｓｅに応答して、ヘリカーゼクランプがＤＮＡ鎖長に沿って１つのモノマーのステップしたことを示す。図１５Ｂのプロットにおいて、印加されたパルスに示される容量性電流スパイクのオーバーシュートは、１ミリ秒という比較的長い持続時間の電圧制御パルス中の電子機器による不適切な補償の結果である。
【００８２】
この説明、本明細書で提供される実施形態、及び実験例により、ナノポアシステム、クランプ制御、及び本明細書で提供され方法論により、標的ポリマー分子のナノポアを通る移動の、確率論的ステップではなく、決定論的なステップが達成されること、及び、それがナノポアを有する標的ポリマーの直線的に接続された連続的なポリマーサブユニットの特徴付けを可能にすることが実証された。これにより、これまで困難であった標的ポリマーの正確な評価が可能になる。
【００８３】
本明細書において、好ましい実施形態を詳細に説明したが、本発明の趣旨から逸脱することなく、様々な修正、追加、置換等を行うことができることは、当業者には明らかであり、したがって、これらは、添付の特許請求の範囲で定義される発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるであろう。
【図１Ａ−１Ｃ】
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【図１Ｄ−１Ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ−９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ−１４Ｃ】
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【図１５Ａ−１５Ｂ】
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【国際調査報告】
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