(57)【要約】  肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、インフルエンザ菌、チフス菌及び髄膜炎菌の莢膜多糖の精製の、改良された費用効果の高いかつ短縮された方法が開示される。この方法には、酵素処理のカクテル、接線流濾過、及びマルチモードクロマトグラフィ精製が含まれる。グラム陰性菌については、エンドトキシン除去方法はエンドトラップＨＤ樹脂に関与する。この短縮された方法は、ヒトワクチン調製における使用のためにＷＨＯ／ＥＰ／ＢＰが必要とする純度を達成し、従来の方法と比較して、簡単なステップ及びより高い収率を有した。この方法のステップは、実施するために費用と時間を要し、及び／又は商業的使用について健康被害を有する、例えば、アルコール、フェノールのような有機溶媒、及び超遠心分離の使用を避ける。また、開示された方法は、簡単で、効率的で、毒性がなく、スケールアップが容易で、環境に優しい。
2020526198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖の精製方法であって、
グラム陽性菌及び／又はグラム陰性菌の発酵回収物を提供する工程と、
デオキシコレートにより前記発酵回収物を清澄化する工程と、
清澄化した多糖を、第一の透析濾過により濃縮する工程と、
不純物を消化するために、第一の透析濾過をされた前記多糖を、酵素により処理する工程と、
酢酸により前記酵素を沈殿させる工程と、
前記多糖を第二の透析濾過により濃縮する工程と、
第二の透析濾過をされた前記多糖を、マルチモードクロマトグラフィ樹脂及び／又はエンドトキシン除去樹脂に通す工程と、
精製された前記多糖を回収する工程と
を含む、方法。
【請求項２】
前記多糖が、細菌細胞表面の多糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細菌細胞表面の多糖が、莢膜多糖及び／又は菌体外多糖を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記発酵回収物が、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、インフルエンザ菌、ネズミチフス菌及び／又は髄膜炎菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
清澄化後、約ｐＨ３．５〜５．０にｐＨ調整する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ｐＨ調整が、酸の添加を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記酸が、酢酸を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酵素が、ベンゾナーゼ、ムタノリシン／リゾチーム、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及び／又はプロテイナーゼＫの１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
酵素による処理が、複数の異なる酵素を連続的に、単独で、又は組み合わせて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記不純物が、タンパク質、核酸、細胞壁成分及び／又はペプチドグリカンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記マルチモードクロマトグラフィ樹脂に通すことが、フロースルーモード、接線流濾過モード、及び／又は濾過モードで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記マルチモードクロマトグラフィ樹脂に通すことが、接線流濾過モードで実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記発酵回収物が、グラム陰性菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
第一の透析濾過をされた多糖を接線流濾過に通すことをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記接線流濾過が、デオキシコレート／ＥＤＴＡ／Ｃａ−塩緩衝液を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記接線流濾過が、５０〜１００ｋＤａの膜に通すことをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記発酵回収物が、グラム陽性菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
第一の透析濾過をされた多糖を接線流濾過に通すことをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記接線流濾過が、デオキシコレート／ＥＤＴＡ／Ｃａ−塩緩衝液を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記接線流濾過が、５０〜１００ｋＤａの膜に通すことをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
第二の透析をされた前記多糖が、エンドトキシン除去樹脂を通過する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記発酵回収物が、肺炎連鎖球菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記肺炎連鎖球菌が、血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４、３３Ｆ及び３５Ｂの１つ以上を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記発酵回収物が、Ｂ群連鎖球菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｂ群連鎖球菌が、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸの１つ以上を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記発酵回収物が、インフルエンザ菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記インフルエンザ菌が、血清型ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆの１つ以上を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記発酵回収物が、チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
前記チフス菌が、Ｖｉ−多糖を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記発酵回収物が、髄膜炎菌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記髄膜炎菌が、１つ以上の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、及びＷ−１３５を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１に記載の方法により精製された多糖。
【請求項３３】
請求項３２に記載の精製された多糖を組み込んだ又はそれに由来する免疫学的組成物。
【請求項３４】
アジュバントをさらに含む、請求項３３に記載の免疫学的組成物。
【請求項３５】
アジュバントを含まない、請求項３３に記載の免疫学的組成物。
【請求項３６】
請求項３３に記載の免疫学的組成物を投与することを含む、感染に対してヒトを治療する方法。
【請求項３７】
前記感染が、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、インフルエンザ菌、ネズミチフス菌及び／又は髄膜炎菌を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
多糖の精製方法であって、
肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、インフルエンザ菌、ネズミチフス菌及び／又は髄膜炎菌の発酵回収物を提供する工程と、
約３．５〜５．０のｐＨでデオキシコレートにより前記発酵回収物を清澄化する工程と、
清澄化した多糖を第一の透析濾過により濃縮する工程と、
不純物を除去するために、前記第一の透析濾過をされた多糖を、酵素により処理する工程と、
前記多糖が上清中に残るように、酢酸により酵素を沈殿させる工程と、
第二の透析濾過により上清の前記多糖を濃縮する工程と、
デオキシコレート／ＥＤＴＡ／Ｃａ−塩緩衝液を用いた接線流濾過により、前記第二の透析をされた多糖を、マルチモードクロマトグラフィ樹脂及び／又はエンドトキシン除去樹脂に通す工程と、
精製された前記多糖を回収する工程と
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願への参照＞
本出願は、２０１７年７月５日に出願された米国仮出願第６２／５２８，６８３号に対する優先権を主張するものであり、該仮出願の全体は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
＜背景＞
＜１．発明の分野＞
本発明は、細菌多糖の効果的な精製のための方法及び組成物を対象とする。方法は効率的で、費用対効果が高く、規模の拡大が可能であり、共役型ワクチンをはじめとするワクチンの調製のための不純物の除去を含む。
【背景技術】
【０００３】
＜２．背景の記述＞
精製されたＣＰＳ(莢膜多糖）は、ワクチン、特にＣＰＳが由来する細菌が生じる感染に対して有効なワクチンの製造に用いられる。従来の方法では、細菌は工業用バイオリアクター、及び所定の又は所望の純度要件まで精製したＣＰＳ中で培養される。ワクチン生産のための細菌ＣＰＳの伝統的な精製処理は、エタノール及びフェノールのような溶媒、並びにカチオン性浄化剤によるいくつかの選択的沈殿ステップに基づいている。
【０００４】
インフルエンザ菌（Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、髄膜炎菌（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｂ群連鎖球菌（Ｇｒｏｕｐ  Ｂ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、及び肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）は、乳児及び免疫不全の成人における髄膜炎、肺炎及び菌血症の最も一般的な病原体の一部である。莢膜多糖（ＣＰＳ）は宿主の免疫系に対する防御機構として作用し、それらをこれらの細菌の病原性の主要因子とする。これらの微生物に由来する多糖をベースとするワクチンは、成人集団に有効である。多糖ワクチンの免疫原性特性については、いくつかの研究がある。精製処理は、収量を最大限にし、処理コストを最小限に抑えながら、所望の仕様の生成物を得ることを目的としている。従来の手順の最終精製ステップは、生産効率と汚染物質の除去との間に代償がある一連の精製ステップを含む。ＣＰＳの精製における汚染物は、例えば、タンパク質、核酸、顔料及び不要な多糖、例えば、グラム陽性菌については細胞壁多糖又はグラム陰性菌についてはリポ多糖（ＬＰＳ）である。
【０００５】
ＣＰＳの従来の精製処理は、エタノールによる濃縮／精製及び／又はアニオン性浄化剤による選択的沈殿、フェノールによる及びグラム陰性菌についてはＬＰＳを排除するための超遠心法によるタンパク質抽出の一般的な方法に続く。
【０００６】
例えば、髄膜炎菌からの多糖の従来の精製には、カチオン性浄化剤セタブロンによる沈殿、沈殿物の１Ｍ  ＣａＣｌ２への再懸濁、エタノールによる２回の沈殿、フェノールによる３回の抽出段階による徐蛋白、透析及びさらなるエタノール沈殿が含まれる。ＬＰＳは、超遠心法によりＣＰＳから分離される。
【０００７】
肺炎連鎖球菌のＣＰＳのための従来の精製処理は、デオキシコレート浄化剤による全細胞溶解、濃縮／透析濾過、エタノール沈殿の４段階、フェノール処理及び活性炭による徐蛋白を含む。
【０００８】
インフルエンザ菌のＰＲＰの従来の精製処理は、フェノール、ホルムアルデヒド又はチメロサールによる細胞の不活性化、及び遠心分離による培養ブロスの分離から始まる。次いで、清澄された上清を５０〜１００ｋＤａカットオフ膜による接線流限外濾過によって濃縮し、カチオン性浄化剤セタブロン及び塩化カルシウムで可溶化した複合体ＰＲＰ−セタブロンで沈殿させた後、数回のエタノール沈殿及びフェノールでの抽出による除蛋白及びさらなるエタノール沈殿を行う。リポ多糖は超遠心法によりＰＲＰから分離される。
【０００９】
莢膜多糖からタンパク質及び細胞壁Ｃ−多糖のような他の不純物の除去を対象とする複数の精製手順が現在利用可能である。例えば、米国特許第４，２４２，５０１号は、肺炎球菌莢膜多糖の精製を対象とし、微生物莢膜多糖からのタンパク質及び他の不純物（Ｃ−多糖）の除去方法に関する。１５７２  ＭＵＭ／２０１０。米国特許第５，７１４，３５４号、同第５，８４７，１１２号、及び同第４，２４２，５０１号はそれぞれ、肺炎球菌多糖からの精製処理を対象とする。国際公開第ＷＯ２００６／０８２５２７号は、カチオン性浄化剤による沈殿を伴うＢ群連鎖球菌の莢膜多糖の精製処理に関する。国際公開第ＷＯ２００８／０４５８５２号は、加熱及び低ｐＨ沈殿処理を使用した肺炎球菌多糖の精製処理に関する。国際公開第ＷＯ２０１２／１２７４８５号は、肺炎球菌多糖の精製のためのアルコール及びＣＴＡＢを含まない方法に関する。ＣＰＳ精製に関する他の刊行物としては、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｐｓｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  １９Ａ」Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２１（７）、７３４−７３８、２０１１；「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｐｓｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｔｙｐｅ  １４  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６７（２）、９６９−９７１、２０１１年２月が挙げられる。
【００１０】
従来のＣＰＳ精製処理は長く、複雑であり、高度に訓練された個人を必要とし、複数の費用のかかる供給品及び組成物を利用する。さらに、間違えるリスクは大きく、間違いがしばしば発生し、時間及び資源の両方において処理が非常に非効率になっている。したがって、効率的で効果的な多糖精製手順が依然として必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第４，２４２，５０１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，７１４，３５４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８４７，１１２号明細書
【特許文献４】米国特許第４，２４２，５０１号明細書
【特許文献５】国際公開第２００６／０８２５２７号
【特許文献６】国際公開第２００８／０４５８５２号
【特許文献７】国際公開第２０１２／１２７４８５号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｐｓｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｓｅｒｏｔｙｐｅ  １９Ａ」Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，  ２１（７）、７３４−７３８、２０１１
【非特許文献２】「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｐｓｕｌａｒ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  Ｔｙｐｅ  １４  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ」、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６７（２）、９６９−９７１、２０１１年２月
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、現在の戦略及び設計に関連する課題及び欠点を克服し、多糖を精製するための新しい組成物及び手順を提供する。
【００１４】
本発明の一実施形態は、グラム陽性及び／又はグラム陰性菌の発酵回収物を提供することを含む、細菌細胞表面の多糖を精製する方法を対象とする。発酵回収物は、好ましくは、ｐＨ３．５〜５．０のような酸性ｐＨにおいて、デオキシコレート又は機能的に類似したもので、清澄化される。清澄化された多糖は、好ましくは透析濾過によって濃縮され、ペプチドグリカン及び／又は他の細胞膜構造に付着し得る宿主細胞タンパク質、核酸、及び細胞壁多糖などの不純物を除去するための酵素で処理される。酵素は好ましくは酢酸で沈殿させられ、酵素処理した多糖を透析濾過により濃縮し、フロースルーモード、接線流濾過、及び／又はＣＡＰＴＯ（商標）Ａｄｈｅｒｅ樹脂による濾過でマルチモードクロマトグラフィ樹脂に通される。好ましくは、細菌細胞表面の多糖は、莢膜多糖及び／又は菌体外多糖を含む。好ましくは、細菌の回収物は、肺炎連鎖球菌、Ｂ群連鎖球菌、インフルエンザ菌、ネズミチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）又は髄膜炎菌を含む。好ましくは、清澄化に続いて、酢酸を用いて酸性ｐＨ３．５〜５に、又は２Ｍ酢酸を用いてｐＨ３．５未満又はｐＨ４．５未満にｐＨを調整する。好ましくは、酵素は、ベンゾナーゼ、ムタノリシン／リゾチーム、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ及びプロテイナーゼＫからなる群から選択される。好ましくは、酵素処理は、単独又は組み合わせのいずれかで連続的に行われる。好ましくは、発酵回収物はグラム陰性菌を含み、酵素処理及び透析濾過された多糖は、デオキシコレート／ＥＤＴＡ／Ｃａ−塩緩衝液を用いた接線流濾過を通過する。好ましくは、接線流濾過は、多糖を５０〜１００ｋＤａの膜に通すことを含む。好ましくは、発酵回収物はグラム陽性菌を含み、酵素処理及び透析濾過された多糖は、ＣＡＰＴＯ（商標）  Ａｄｈｅｒｅ樹脂を用いたマルチモードクロマトグラフィを通過する。好ましくは、発酵回収物はグラム陰性菌を含み、さらに、樹脂クロマトグラフィ、より具体的にはフロースルーモードでのＥｎｄｏＴｒａｐ  ＨＤ樹脂を用いたエンドトキシンの除去を含む。好ましくは、発酵回収物は、１つ以上の血清型１、２、３、４、５、６Ａ、６Ｂ、７Ｆ、８、９Ｖ、９Ｎ、１０Ａ、１１Ａ、１２Ｆ、１４、１５Ｂ、１７Ｆ、１８Ｃ、１９Ａ、１９Ｆ、２０、２２Ｆ、２３Ｆ、２４、３３Ｆ及び３５Ｂ、又はワクチン調製に使用される別の血清型を含む肺炎連鎖球菌を含む。好ましくは、発酵回収物は、血清型Ｉａ、Ｉｂ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ及びＩＸの１つ以上を含むＢ群連鎖球菌を含む。好ましくは、発酵回収物は、亜系ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ及びｆ血清型を含むインフルエンザ菌を含む。好ましくは、発酵回収物は、Ｖｉ−多糖を含むチフス菌を含む。好ましくは、発酵回収物は、１つ以上の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｘ、Ｙ、及びＷ−１３５を含む髄膜炎菌を含む。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、本明細書に記載の本発明の方法によって精製された多糖を含む。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、本発明の精製多糖を組み込んだ、又は本発明の精製多糖に由来するワクチンのような免疫学的組成物を含む。本開示に従って調製されたワクチンは、アジュバントを含んでいても含んでいなくてもよい。
【００１７】
本発明の他の実施形態及び利点は、以下に続く本明細書の一部に記載されており、部分的には、本明細書から明白であり得るか、又は本発明の実践から習得することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】精製戦略−１を用いた、多糖が細胞壁多糖（ＣＷＰＳ）を含まないことを示す精製多糖の１Ｈ  ＮＭＲ分析。肺炎連鎖球菌３型多糖、サイズが低下した多糖、ＳＥＣ―ＨＰＬＣ−による＜５０ｋＤａの分子サイズ分布（３．２ＰＰＭで未検出のＣ−多糖）。
【図２】精製戦略−１を用いた、多糖が細胞壁多糖（ＣＷＰＳ）を含まないことを示す精製多糖の１Ｈ  ＮＭＲ分析。肺炎連鎖球菌１型多糖−サイズが低下した多糖、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ−による＜５０ｋＤａの分子サイズ分布（３．２ＰＰＭで未検出のＣ−多糖）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜本発明の記述＞
液体からの固体の分離は、これらの細菌に対するワクチンの製造に使用される精製されたＣＰＳ中での連続遠心分離に基づく。液体からの固体の分離は、防爆設備での連続遠心分離に基づく。
【００２０】
従来の手順のエタノール沈殿、フェノールの使用、及び超遠心ステップを排除するＣＰＳ精製法が驚くべきことに開発された。本開示の方法は、例えば３０〜１００ｋＤａのような所望の分子量カットオフ値を有する膜を用いた限外濾過ステップを含み、酵素消化及び好ましくは３０〜１００ｋＤａのカットオフ膜を用いた接線流濾過（ＴＦＦ）によって残留タンパク質及び核酸を除去する。得られた精製ＣＰＳは、７０％を超える収率を有し、総ＣＰＳに関して１％以下のタンパク質及び1％以下の核酸を含む。精製ＣＰＳは、タンパク質分解酵素活性を有さず、必要な品質試験に合格する。
【００２１】
本発明の一般的な利点は、多糖を精製すると同時に、簡単で、効率的で、商業的に拡大可能なステップによって非常に短時間で不純物を除去し、それによって、関連するＷＨＯ仕様及び他の品質基準を満たすか、又は超える高品質多糖を生成する、細菌細胞表面の莢膜多糖（ＣＰＳ）の精製のための迅速で、効率的かつ効果的な方法を提供することを含む。
【００２２】
本発明の一実施形態は、多糖の精製方法を対象とする。この方法は、多糖を大幅に短縮された時間で精製する、新規で、迅速で、費用効果の高い、かつ規模の拡大が可能な方法を記載する。選択された菌株を発酵槽内で最適化した培養培地上で培養し、発酵回収物の遠心分離を行い、細胞残屑を除去した後、分子量カットオフ膜を用いるＴＦＦにより方法が進行する。本発明の方法は、多糖を調製する新規かつ迅速な方法を提供するなど、先行技術を上回るいくつかの利点を示す。この方法は、総ステップ数を減少させ、単一のクロマトグラフィスクリーニングを必要とするので、費用効果が高い。追加の利点は、この方法が完全に規模の拡大が可能であることである。
【００２３】
大部分の任意の多糖の精製は、本開示の方法に従って行うことができるが、特に、好ましい方法は、ワクチン生産のための髄膜炎菌、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌ｂ型、ネズミチフス菌、及びＢ群連鎖球菌に由来する多糖の精製を含む。本方法は、細菌の発酵回収物又は他の多糖源を提供し、デオキシコレートにより発酵回収物を、例えば約３．５〜５．０のｐＨで清澄化し、第一の透析濾過による清澄化多糖の濃縮及び不純物を除去するための第一の透析濾過された多糖の酵素による処理、多糖が上清中に残るように酢酸による酵素の沈殿、第二の透析濾過による上清の多糖の濃縮、マルチモードクロマトグラフィ樹脂及び／又はデオキシコレート／ＥＤＴＡ／Ｃａ−塩緩衝液による接線流濾過によるエンドトキシン除去樹脂に第二の透析濾過された多糖を通し、並びに精製された多糖の回収を含む。
【００２４】
本開示の方法は、エタノール、フェノール、及び浄化剤沈殿物の必要性及び使用を排除し、代わりに、連続的な溶菌酵素処理に続いて限外濾過を行い、望ましい場合には、疎水性相互作用クロマトグラフィ又は混合モードイオン交換樹脂クロマトグラフィによるさらなる精製を含む。
【００２５】
ヌクレアーゼであるベンゾナーゼは、残存するゲノムＤＮＡ及びＲＮＡを加水分解し、得られた低分子量オリゴヌクレオチドは、第二のＴＦＵＦにおいて膜を通して濾過される。ペプチドグリカン及びペプチドグリカンに付着した細胞壁多糖（ＣＷＰＳ又はＢ群炭水化物）は、ムタノリシン／チゾチーム／Ｂ−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ酵素（活性単位比：１：１：０．１）カクテル組み合わせにより分解及び／又はサイズ低下する。タンパク質及びＬＰＳは、酵素処理及びＴＦＵＦ  ３０〜１００ｋＤａによる第二の濃縮／透析濾過後に除去される。グラム陰性菌については、ＬＰＳの除去は、浄化剤及びキレート剤、好ましくはＤＯＣ／ＥＤＴＡの存在下でＴＦＵＦを用いて行うことが好ましい。浄化剤デオキシコレート、ＤＯＣは、脂質部分の脂肪酸の疎水性相互作用を破壊し、凝集体を解き、３０〜１００ｋＤａの膜中で自由に濾過することができるＬＰＳの低分子量モノマーを生成する。
【００２６】
本発明の精製方法は、部分的には、分子サイズに基づく。最初のＴＦＵＦでは、カットオフされた細孔よりも小さいサイズの分子が除去され、その大部分は培養培地から除去される。酵素が汚染物質、タンパク質、核酸のサイズを低下させた後、第二のＴＦＵＦがそれらの除去を行う。ＬＰＳに由来する低分子量モノマーは、浄化剤及びキレート剤の存在下で限外濾過される。
【００２７】
本発明の方法は、アルコール、フェノール、又はカチオン性浄化剤を使用する従来の方法で必要とされる複数の沈殿ステップを排除し、代わりに、酵素処理及び／又は限外濾過を含み、要求された又は所望の純度で最終生成物を得る。
【００２８】
超遠心分離法と比較して、酵素処理と接線限外濾過の組み合わせはスケールアップがより容易で、はるかに安価である。接線流用の膜は所定の位置で洗浄され、（例えば使い捨て膜を使用して）繰り返し使用できるように保管される。本開示の方法は、商業開発のために容易にスケールアップされる、簡単で、効率的で、環境に優しい方法を提供する。
【実施例】
【００２９】
以下の実施例は本発明の実施形態を例示するが、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。
【００３０】
［実施例１］
＜細菌の培養＞
細菌の培養は、各菌株に適した培地及び条件を含む５〜１０Ｌの発酵槽で行った。バイオリアクターの全ブロスを０．１５％デオキシコレートで沈殿させ、デカントし、遠心分離した。接線精密濾過法により培養ブロスから細胞を分離した。肺炎連鎖球菌及び追加の菌株についても、ＣＰＳ精製には細胞を含まない精密濾液を用いた。
【００３１】
＜濃縮／デフィルトレーション（ｄｅｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）＞
細胞を含まないＣＰＳを３０〜１００ｋＤａの接線流限外濾過（ＴＦＵＦ）膜により１〜２０倍に濃縮した。この濃縮物を緩衝液で生物濾過した。
【００３２】
＜酵素処理及び濃縮／透析濾過＞
ナイセリア又は連鎖球菌に由来する可溶性ＣＰＳ画分のｐＨをｐＨ７に調整した。組換え酵素を連続的に添加した：ベンゾナーゼ（２ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び２０ｍＭ  ＮａＣｌを含むＴｒｉｓ―ＨＣｌ  ５０ｍＭ）；ムタノリシン／リゾチーム（１：１）；β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ；及びプロテイナーゼKをそれらの間の２〜４時間間隔で添加し、５０〜１００ｒｐｍでアルカリ性ｐＨ（ｐＨ８．８〜１０．５）下で３７℃〜５６℃で１２〜２４時間インキュベートした。酵素分解及び浄化剤処理から生じる低分子量汚染物質を、３０〜１００ｋＤａカットオフの第二のＴＦＵＦ膜によって除去した。精製ＣＰＳを０．２μｍの膜で無菌濾過し、マイナス２０℃で保存した。
【００３３】
多糖の精製には２つの異なる精製戦略を用いた。グラム陽性菌多糖の精製処理には一般的に一つの精製方法（精製戦略−１）を用い、グラム陰性菌多糖の精製処理には一つの精製方法（精製戦略−２）を用いた。
【００３４】
＜精製戦略−１（グラム陽性菌の場合）＞
ベンゾナーゼ、ムタリノシン／リゾチームの組み合わせ、β−Ｄ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、プロテイナーゼＫを含む酵素カクテルに続く接線流濾過（ＴＦＦ）、最終的にはマルチモードアニオン交換体ＣＡＰＴＯ（商標）  Ａｄｈｅｒｅ樹脂クロマトグラフィ(プロセススケールでのモノクローナル抗体のポストプロテインＡ精製用に設計されたマルチモード媒体樹脂）を用いた多糖精製。
【００３５】
肺炎連鎖球菌及びＢ群連鎖球菌血清型のいずれかに由来する複数の血清型多糖を精製した。精製したすべての多糖は、多糖純度に関するＷＨＯ／若しくはＢＰ／の基準又はＥＰ基準を満たすか、又は上回った。さらなる純度は、残留タンパク質、核酸及びエンドトキシンマルチモードクロマトグラフィステップに対する重量によって達成された。また、精製ステップ中に使用した残留酵素を除去するために、マルチモードクロマトグラフィを使用した。
【００３６】
＜細胞分離、接線限外濾過による濃縮＞
細菌の培養後、発酵液を０．１５％デオキシコレートで不活性化（ｐＨを４．５〜５に調整）し、デカンティング後遠心分離して細胞を除去し、０．９％生理食塩水、続いてＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて５０ＫＤａ〜１００ＫＤａのＰＥＳ膜を使用して細胞を含まない清澄化されたブロスを濃縮し透析濾過した。
【００３７】
＜酵素処理及び接線限外濾過による第二の濃縮＞
多糖溶液のｐＨをｐＨ７．０からｐＨ９〜９．５に上げ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加え、４２℃で、５０〜７５ｒｐｍで１５分間インキュベートした。酵素ベンゾナーゼを加え、ＰＳ溶液１ｍｌ当たり１０〜２０単位を加え、１〜２時間インキュベートした。その後、溶液１ｍｌ当たり５０単位でムタノリシン／リゾチーム（１：１）の酵素の組み合わせを加え、１〜２時間インキュベートした。酵素β−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニダーゼを多糖溶液１００ｍｌ当たり１単位で加えた。プロテイナーゼＫを加え、ｐＨ９．５〜１０．５で、５６℃で２〜４時間インキュベートした。全酵素反応を６〜８時間以内に完了させた。使用した酵素はすべて組換え酵素であった。
【００３８】
酵素処理後、酢酸（２Ｍ）を用いて溶液のｐＨを３．５〜４．５に低下させ、沈殿物を深層濾過により除去し、多糖溶液のｐＨをｐＨ７．０に調整した。清澄化された多糖溶液を０．９％生理食塩水、続いて５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．４〜７．６）を用いて５０ｋＤａ〜１００ｋＤａのＰＥＳ膜で濃縮し、透析濾過した。
【００３９】
＜ＣＡＰＴＯ（商標）  Ａｄｈｅｒｅ樹脂を使用したカラムクロマトグラフィ＞
多糖の最終精製はＣＡＰＴＯ（商標）  Ａｄｈｅｒｅ樹脂クロマトグラフィを用いた単純フロースルーモードで達成し、最終的にｐＨ７．４〜７．６で５０ｍＭリン酸ナトリウム＋１．０Ｍ  ＮａＣｌを用いて溶出した。結果を表１及び図１に示す。
【００４０】
【表１】
2020526198.tif 000003
【００４１】
＜精製戦略−２（グラム陰性菌の場合）＞
ベンゾナーゼ、プロテイナーゼＫを含む酵素カクテル、それに続く接線流濾過（ＴＦＦ）、及びマルチモードアニオン交換体ＣＡＰＴＯ（商標）  Ａｄｈｅｒｅ樹脂クロマトグラフィ及び／又はＥＮＤＯＴＲＡＰ（Ｒ）−ＨＤ樹脂によるＬＰＳ除去を用いた多糖精製
【００４２】
インフルエンザ菌、髄膜炎菌、ネズミチフス菌血清型のいずれかに由来する複数の血清型多糖を精製した。精製したすべての多糖は、多糖純度に関するＷＨＯ／若しくはＢＰ／の基準又はＥＰ基準を満たすか、又は上回った。エンドトキシン除去ステップを用いて、残留エンドトキシンを除去した。精製ステップ中に使用した残留酵素を除去するために、マルチモードクロマトグラフィを任意にした。
【００４３】
＜細胞分離、接線限外濾過による濃縮＞
細菌の培養後、発酵液を０．１５％デオキシコレート又は０．６％ホルムアルデヒドによって不活性化した。細胞をデカンティング及び／又は遠心分離のいずれかによって除去し、細胞を含まない清澄化されたブロスを、０．９％生理食塩水、続いてＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．０）を用いて、５０ｋＤａ〜１００ｋＤａのＰＥＳ膜を使用して濃縮し、透析濾過した。
【００４４】
＜酵素処理、接線限外濾過による第二の濃縮＞
多糖溶液のｐＨを７．０から８．５〜８．８に上げ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を加え、３７℃で、５０〜７５ｒｐｍで１５分間インキュベートした。酵素ベンゾナーゼをＰＳ溶液１ｍｌ当たり１０〜２０単位で添加し、溶液を１〜２時間インキュベートした。プロテイナーゼＫを添加し、ｐＨ  ９．５〜１０．５で、４５℃で２〜４時間インキュベートした。全酵素反応を６〜８時間以内に完了させた。使用したすべての酵素は組換え酵素であった。
【００４５】
酵素処理後、酢酸（２Ｍ）を用いて溶液のｐＨを３．５〜４．５に低下させた。沈殿物を深層濾過で除去し、多糖溶液のｐＨをｐＨ７．０に調整した。清澄化された多糖溶液を０．２％  ＤＯＣ及び１〜２ｍＭ  ＥＤＴＡ、続いて５０ｍＭ  リン酸Ｎａ塩緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ６．０〜６．４）を用いて５０ｋＤａ〜１００ｋＤａのＰＥＳ膜で濃縮し、透析濾過して、エンドトキシン不純物を減少させた。
【００４６】
＜Ｅｎｄｏｔｒａｐ  ＨＤ樹脂を用いたエンドトキシン除去＞
多糖溶液中の残留エンドトキシンは、ＥＮＤＯＴＲＡＰ（Ｒ）−ＨＤ樹脂（エンドトキシン除去樹脂、Ｈｙｇｌｏｓ  ＧｍｂＨ、ドイツ）を用いて単純フロースルーモードで除去した。使用する緩衝液は、ｐＨ６．４〜７．４の１００〜２００ｍＭのＴＲＩＳ又はＨＥＰＥＳのいずれかであり、ＮａＣｌは５０〜８０ｍＭである。緩衝液中に存在するカルシウムイオン及びＥＤＴＡもエンドトキシンの除去を高めた。再生後、数回ＥＮＤＯＴＲＡＰ（Ｒ）−ＨＤ樹脂を使用することができる。
【００４７】
＜ＣＡＰＴＯ（商標）  Ａｄｈｅｒｅ樹脂を使用したカラムクロマトグラフィ＞
多糖の精製はＣＡＰＴＯ（商標）  Ａｄｈｅｒｅ樹脂クロマトグラフィを用いた単純フロースルーモードで達成し、ｐＨ  ７．４〜７．６で５０ｍＭリン酸ナトリウム＋１．０Ｍ  ＮａＣｌを用いて溶出した。残留酵素活性が観察された場合、及びまたＥＮＤＯＴＲＡＰ（Ｒ）−ＨＤ樹脂からの漏出が観察された場合にも、このクロマトグラフィステップは任意とした。結果を表２及び図２に示す。
【００４８】
【表２】
2020526198.tif 000004
【００４９】
本発明の他の実施形態及び使用は、本発明の明細書の検討及び本明細書に開示された実践から当業者に明白であろう。すべての刊行物、米国及び外国特許及び特許出願をはじめとする、本明細書に引用されたすべての参考文献は、参照により具体的かつ完全に援用される。明細書及び実施例は例示的とのみみなされることが意図され、本発明の真の範囲及び精神は次の特許請求の範囲によって示される。さらに、「含む」という用語は、「からなる」及び「本質的にからなる」という用語を含む。
【図１】
2020526198.tif 000005
【図２】
2020526198.tif 000006
【国際調査報告】
2020526198.tif 000007