(57)【要約】本開示は、黄色ブドウ球菌感染症の予防および処置において有用な免疫原性組成物を提供する。特に、本開示は、多価オリゴペプチド、任意の順序で、単一のポリペプチドとして一緒に融合している２つ以上のブドウ球菌スーパー抗原（ＳＡｇ）タンパク質、または任意のその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む融合タンパク質を提供する。2020537488.tif 000009
2020537488.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４中のＬ４８Ｒ、Ｄ７０Ｒ、Ｙ９２Ａ、およびＨ２２５Ａ変異に対応する、野生型ＳＥＡに対する４つの変異を含む、弱毒化黄色ブドウ球菌由来スーパー抗原（ＳＡｇ）ＳＥＡトキソイド、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体であって、配列番号３を含むＳＥＡトキソイドよりもスーパー抗原活性が低くかつ／またはビルレンスが低いが、免疫原性を維持している、前記弱毒化黄色ブドウ球菌由来スーパー抗原（ＳＡｇ）ＳＥＡトキソイド、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体。
【請求項２】
配列番号４と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の弱毒化ＳＥＡトキソイド、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体。
【請求項３】
配列番号４を含む、請求項１に記載の弱毒化ＳＥＡトキソイド、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体。
【請求項４】
配列番号３を含むＳＥＡトキソイドのスーパー抗原活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、または１％未満を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の弱毒化ＳＥＡトキソイド、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体。
【請求項５】
任意の順序で配置された２つ以上の弱毒化黄色ブドウ球菌由来スーパー抗原（ＳＡｇ）トキソイド、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体からなる融合体を含む多価オリゴペプチドであって、該ＳＡｇトキソイド、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体が同じでも、または異なってもよく、かつ該ＳＡｇトキソイドの少なくとも１つが請求項１〜４のいずれか１項に記載のＳＥＡトキソイドである、前記多価オリゴペプチド。
【請求項６】
配列番号５を含むＳＡｇ融合タンパク質よりもスーパー抗原活性が低くかつ／またはビルレンスが低い、請求項５に記載のオリゴペプチド。
【請求項７】
配列番号５を含む前記ＳＡｇ融合タンパク質の免疫原性を維持している、請求項５または請求項６に記載のオリゴペプチド。
【請求項８】
配列番号５を含むＳＡｇ融合タンパク質のスーパー抗原活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、または１％未満を有する、請求項５〜７のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項９】
完全に弱毒化されている、請求項５〜８のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項１０】
３つ以上のＳＡｇトキソイド、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む、請求項５〜９のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項１１】
ブドウ球菌毒素性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）弱毒化トキソイド；ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）弱毒化トキソイド；またはその任意の組み合わせのうちの１つまたは複数を含む、請求項５〜１０のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項１２】
ＴＳＳＴ−１弱毒化トキソイドが、配列番号１中のＬ３０Ｒ、Ｄ２７Ａ、およびＩ４６Ａ変異に対応する、野生型ＴＳＳＴ−１に対する３つの変異、ならびに配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み；ＳＥＢ弱毒化トキソイドが、配列番号２中のＬ４５Ｒ、Ｙ８９Ａ、およびＹ９４Ａ変異に対応する、野生型ＳＥＢに対する３つの変異、ならびに配列番号２と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み；かつＳＥＡ弱毒化トキソイドが、配列番号４中のＬ４８Ｒ、Ｄ７０Ｒ、Ｙ９２Ａ、およびＨ２２５Ａ変異に対応する、野生型ＳＥＡに対する４つの変異、ならびに配列番号４と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載のオリゴペプチド。
【請求項１３】
ＴＳＳＴ−１トキソイドが配列番号１のアミノ酸配列を含み；ＳＥＢトキソイドが配列番号２のアミノ酸配列を含み；かつＳＥＡ弱毒化トキソイドが配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項１１または請求項１２に記載のオリゴペプチド。
【請求項１４】
前記２つ以上のＳＡｇトキソイド、またはその断片、バリアント、もしくは誘導体が、リンカーによってそれぞれ会合している、請求項５〜１３のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項１５】
前記リンカーが、グリシン、セリン、アラニン、およびその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１個、ただし５０個以下のアミノ酸を含む、請求項１４に記載のオリゴペプチド。
【請求項１６】
前記リンカーが（ＧＧＧＳ）ｎまたは（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、式中、ｎが１〜１０の整数である、請求項１５に記載のオリゴペプチド。
【請求項１７】
前記リンカーが（ＧＧＧＧＳ）ｎを含む、請求項１６に記載のオリゴペプチド。
【請求項１８】
ｎが３である、請求項１７に記載のオリゴペプチド。
【請求項１９】
配列番号６のアミノ酸配列を含む、請求項５〜１８のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項２０】
異種ポリペプチドをさらに含む、請求項５〜１９のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項２１】
前記異種ポリペプチドが、Ｈｉｓタグ、ユビキチンタグ、ＮｕｓＡタグ、キチン結合ドメイン、Ｂタグ、ＨＳＢタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、アビジン／ストレプトアビジン／Ｓｔｒｅｐタグ、ｔｒｐＥ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ＦＬＡＧ（商標）ペプチド、Ｓタグ、Ｔ７タグ、前記異種ポリペプチドのいずれかの断片、または前記異種ポリペプチドの２つ以上の組み合わせを含む、請求項２０に記載のオリゴペプチド。
【請求項２２】
前記異種ポリペプチドが、免疫原、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、その断片、またはその組み合わせを含む、請求項２０または請求項２１に記載のオリゴペプチド。
【請求項２３】
免疫原性炭水化物をさらに含む、請求項５〜２２のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項２４】
前記免疫原性炭水化物が糖である、請求項２３に記載のオリゴペプチド。
【請求項２５】
前記免疫原性炭水化物が莢膜多糖または表面多糖である、請求項２４に記載のオリゴペプチド。
【請求項２６】
前記免疫原性炭水化物が、莢膜多糖（ＣＰ）血清型５（ＣＰ５）、ＣＰ８、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）、ポリ−Ｎ−スクシニルグルコサミン（ＰＮＳＧ）、壁テイコ酸（ＷＴＡ）、リポテイコ酸（ＬＴＡ）、前記免疫原性炭水化物のいずれかの断片、および前記免疫原性炭水化物の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項２５に記載のオリゴペプチド。
【請求項２７】
前記免疫原性炭水化物が前記オリゴペプチドにコンジュゲートしている、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載のオリゴペプチド。
【請求項２８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の弱毒化ＳＥＡトキソイドポリペプチドまたは請求項５〜２７のいずれか１項に記載の多価オリゴペプチドをコードする核酸を含む、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２９】
配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３０】
異種核酸をさらに含む、請求項２８または請求項２９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３１】
前記異種核酸が、前記オリゴペプチドをコードする核酸と作動可能に会合しているプロモーターを含む、請求項３０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３２】
請求項２８〜３１のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３３】
プラスミドである、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
請求項３２または請求項３３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３５】
細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、または植物細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
前記細菌が大腸菌である、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
多価オリゴペプチドを生産する方法であって、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の宿主細胞を培養する工程と、該オリゴペプチドを回収する工程とを含む、前記方法。
【請求項３８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の弱毒化ＳＥＡトキソイド、請求項５〜２７のいずれか１項に記載のオリゴペプチド、またはそれらの任意の組み合わせと、担体とを含む、組成物。
【請求項３９】
アジュバントをさらに含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記アジュバントが、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、またはグルコピラノシルリピドＡベースのアジュバントである、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
追加の免疫原をさらに含む、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記追加の免疫原が細菌抗原である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記細菌抗原が、膜孔形成毒素、スーパー抗原、細胞表面タンパク質、前記細菌抗原のいずれかの断片、および前記細菌抗原の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
黄色ブドウ球菌に対する宿主免疫応答を誘導する方法であって、該免疫応答を必要とする対象に、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の組成物の有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項４５】
前記免疫応答が、先天応答、体液性応答、抗体応答、細胞応答、および前記免疫応答の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記免疫応答が抗体応答である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
対象においてブドウ球菌疾患または感染症を予防または処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項４８】
前記感染症が、皮膚、軟部組織、血液、または器官の限局性または全身性感染症であるか、または自己免疫性である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記疾患が呼吸器疾患である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記呼吸器疾患が肺炎である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記疾患が敗血症である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象が哺乳動物である、請求項４４〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記哺乳動物がウシまたはイヌである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記組成物を、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または経肺投与によって投与する、請求項４４〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
対象において黄色ブドウ球菌に対する宿主免疫応答を誘導する際に使用するための、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５７】
対象においてブドウ球菌疾患または感染症を予防または処置する際に使用するための、請求項３８〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の弱毒化ＳＥＡトキソイド、請求項５〜２７のいずれか１項に記載の多価オリゴペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを単離する工程と；前記トキソイド、オリゴペプチド、またはそれらの任意の組み合わせをアジュバントと組み合わせる工程とを含む、黄色ブドウ球菌感染症に対するワクチンを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる２０１７年７月２７日出願の米国特許仮出願第６２／５３７，７０６号の利益を請求する。
【０００２】
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる２０１５年１２月１８日出願の米国特許出願第１４／８９９，９９３号、現在の米国特許第９，８１５，８７２号に関する。
【０００３】
配列表の組み込み
３４，５０３バイト（ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）であり、「ＩＢＴ＿１７６９６５＿ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられたファイルを含む配列表は、１２の配列を含み、２０１８年７月１９日に作成されたものであり、本明細書と共に提出され、かつその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００４】
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所によってＡＩ１１１２０５の下に与えられた政府支援で成された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００５】
背景
黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＳＡ）は、皮膚および軟部組織感染（ＳＳＴＩ）から生命を脅かす敗血症および肺炎まで広範な感染症を引き起こすグラム陽性ヒト病原体である。これは、全世界で院内感染症および市中感染症の主な原因である（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．,２００９,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ、１５（２）：１５６−１６４（非特許文献1））。病態の範囲は、多くの病原性因子：スーパー抗原および膜孔形成毒素、コアグラーゼ、莢膜多糖、付着素、プロテアーゼ、補体不活性化エキソプロテイン、および他の自然応答調節物質（ｉｎｎａｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）を用いて免疫応答を免れるＳＡの多様な能力を反映している（Ｐｏｗｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ,２０１４,Ｊｏｕｒｎａｌ／ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ,１０（２）：ｅ１００３８７１（非特許文献2））。
【０００６】
１９６０年代に初めて出現して以来、メチシリン耐性ＳＡ（ＭＲＳＡ）は全世界の医療現場に蔓延している（Ｄｉｅｐ,ｅｔ  ａｌ．,２００６,Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ,１９３（１１）：１４９５−１５０３（非特許文献3））。１９９０年代からは、市中感染型ＭＲＳＡ株（ＣＡ−ＭＲＳＡ）が出現し、大きな世界的難題を提起している。（Ｂａｓｓｅｔｔｉ,ｅｔ  ａｌ．,２００９,Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ,３４  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ１５−１９（非特許文献4）；Ｂｒａｄｌｅｙ,２００５,Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ,２６（６）：６４３−６４９（非特許文献5）；Ｃｈａｍｂｅｒｓ,２００５,Ｎ．Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ,３５２（１４）：１４８５−１４８７．（非特許文献6））。したがって、黄色ブドウ球菌感染症用のワクチンおよび治療薬の開発に向けた努力は増大し続けている。
【０００７】
アルファヘモリジン（α毒素、Ｈｌａ）は、ＳＡ肺炎およびＳＳＴＩにおける主な病原性因子である（Ｂｕｂｅｃｋ  Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ,２００８,Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ,２０５（２）：２８７−２９４（非特許文献7）；Ｋｅｎｎｅｄｙ,ｅｔ  ａｌ．,２０１０,Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ,２０２（７）：１０５０−１０５８（非特許文献8））。最近、フェノール可溶性モジュリン（ＰＳＭ）として公知の短い細胞溶解性ペプチドが、黄色ブドウ球菌に対する主な防御ラインである好中球を溶解する重要な病原性因子として特定された（Ｗａｎｇ,ｅｔ  ａｌ．,２００７,Ｎａｔ  Ｍｅｄ,１３（１２）：１５１０−１５１４（非特許文献9））。ブドウ球菌の別の関連する短い細胞溶解性ペプチドは、黄色ブドウ球菌クオラムセンシング系（ａｇｒ）の重要なマーカーであるデルタヘモリジンまたはデルタ毒素（δ毒素）として公知である（Ｎｏｖｉｃｋ,ｅｔ  ａｌ．,１９９３,ＥＭＢＯ  Ｊ,１２（１０）：３９６７−３９７５（非特許文献10））。ＳＡ菌血症患者のコホートにおける最近の疫学研究は、敗血症の確率とＨｌａ、ＰＳＭ−α３、ならびにδ毒素に対する既存の抗体との間の逆相関を示している（Ａｄｈｉｋａｒｉ,ｅｔ  ａｌ．,２０１２,Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ,２０６（６）：９１５−９２３（非特許文献11））。
【０００８】
スーパー抗原（ＳＡｇ）は、ブドウ球菌エンテロトキシン（ＳＥ）および毒素性ショック症候群毒素１（ＴＳＳＴ−１）から構成される発熱性毒素の大きなファミリーを構成する。抗原提示細胞によるタンパク質分解処理を受け、Ｔ細胞にＭＨＣ／ペプチド複合体として提示される従来の抗原とは対照的に、ＳＡｇはＭＨＣクラスＩＩと共にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を架橋し、最大３０％のＴ細胞を活性化して（Ｓｃｈｌｉｅｖｅｒｔ,１９９３,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ,１６７（５）：９９７−１００２（非特許文献12））、サイトカインおよびケモカインを大量に放出させ、細胞接着分子の発現ならびに活性化を強化し、Ｔ細胞増殖を増加させ、最終的に、Ｔ細胞アポトーシス／アネルギーを引き起こす。この一連の事象は、発疹、低血圧、発熱、および多系統機能不全によって特徴づけられる命を脅かす状態である毒素性ショック症候群（ＴＳＳ）へと達し得る（Ｂｏｈａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．,１９９０,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ,１７（４）：２５１−２７２（非特許文献13））。抗体はＴＳＳからの防御において重要な役割を果たしており、したがって、低応答性Ｔ細胞（Ｍａｈｌｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．,１９９６,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ,４５（１）：４２−４５（非特許文献14））および／またはＴ細胞依存性Ｂ細胞アポトーシス（Ｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．,１９９６,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、９３（１１）：５４２５−５４３０（非特許文献15））に起因して、問題を起こしている毒素に対して血清転換しない個体は、再発性の発作を経験する可能性が高い。さらに、低い非ＴＳＳ誘導濃度では、ＳＡｇは局所的で過剰な炎症応答の誘導によって黄色ブドウ球菌株のビルレンスに影響を及ぼす。
【０００９】
スーパー抗原を含む多価黄色ブドウ球菌ワクチンの開発における大きな難題は、２０種を超える異なるＳＡｇがあり、ほとんどのＳＡｇがプラスミドもしくは病原性アイランド（ブドウ球菌エンテロトキシンＫ（ＳＥＫ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＱ（ＳＥＱ））、溶原性ファージ（ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ））、またはＳＣＣｍｅｃブドウ球菌エンテロトキシンＨ（ＳＥＨ）のような抗生物質耐性カセットなどの可動遺伝因子上にあるので、臨床分離株におけるＳＡｇの存在に広範なばらつきがあるということである（Ｏｍｏｅ  ｅｔ  ａｌ．,２００２,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ,４０（３）：８５７−８６２（非特許文献16））。６０００を超える臨床分離株を含む大規模な文献レビューに基づき、最も広く現れるスーパー抗原（ＳＡｇ）は、毒素性ショック症候群毒素１（ＴＳＳＴ−１）およびブドウ球菌エンテロトキシンＣ（ＳＥＣ）、続いてＳＥＡ、ブドウ球菌エンテロトキシンＤ（ＳＥＤ）、およびブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）であると考えられる。さらに最近の研究は、主にＵＳＡ３００クローンが広まったために、ＳＥＫおよびＳＥＱの出現を示している（Ｐｒｏｆｔ  ａｎｄ  Ｆｒａｓｅｒ,２００３,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ,１３３（３）：２９９−３０６（非特許文献17））。多数のＳＡｇに対するモノクローナル抗体およびワクチン接種が、ＳＡ敗血症からマウスを部分的に防御することが見い出されている。無毒化ＳＡｇおよびサイトリシンの様々な組み合わせでの多価免疫化を用いる有意な防御がウサギの肺炎に対して報告されている（Ｓｐａｕｌｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．,２０１２、Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０（３４）：５０９９−１０９（非特許文献18）；Ｓａｌｇａｄｏ−Ｐａｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．,２０１４,Ｊ  Ｉｎｆｅｃ  Ｄｉｓ,２１０（５）：７８４−７９２（非特許文献19））。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．,２００９,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｎｆｅｃｔ、１５（２）：１５６−１６４
【非特許文献２】Ｐｏｗｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ,２０１４,Ｊｏｕｒｎａｌ／ＰＬＯＳ  Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ,１０（２）：ｅ１００３８７１
【非特許文献３】Ｄｉｅｐ,ｅｔ  ａｌ．,２００６,Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ,１９３（１１）：１４９５−１５０３
【非特許文献４】Ｂａｓｓｅｔｔｉ,ｅｔ  ａｌ．,２００９,Ｉｎｔ  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ,３４  Ｓｕｐｐｌ  １：Ｓ１５−１９
【非特許文献５】Ｂｒａｄｌｅｙ,２００５,Ｓｅｍｉｎ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ,２６（６）：６４３−６４９
【非特許文献６】Ｃｈａｍｂｅｒｓ,２００５,Ｎ．Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ,３５２（１４）：１４８５−１４８７
【非特許文献７】Ｂｕｂｅｃｋ  Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｅｗｉｎｄ,２００８,Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ,２０５（２）：２８７−２９４
【非特許文献８】Ｋｅｎｎｅｄｙ,ｅｔ  ａｌ．,２０１０,Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ,２０２（７）：１０５０−１０５８
【非特許文献９】Ｗａｎｇ,ｅｔ  ａｌ．,２００７,Ｎａｔ  Ｍｅｄ,１３（１２）：１５１０−１５１４
【非特許文献１０】Ｎｏｖｉｃｋ,ｅｔ  ａｌ．,１９９３,ＥＭＢＯ  Ｊ,１２（１０）：３９６７−３９７５
【非特許文献１１】Ａｄｈｉｋａｒｉ,ｅｔ  ａｌ．,２０１２,Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ,２０６（６）：９１５−９２３
【非特許文献１２】Ｓｃｈｌｉｅｖｅｒｔ,１９９３,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ,１６７（５）：９９７−１００２
【非特許文献１３】Ｂｏｈａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．,１９９０,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ,１７（４）：２５１−２７２
【非特許文献１４】Ｍａｈｌｋｎｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．,１９９６,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ,４５（１）：４２−４５
【非特許文献１５】Ｈｏｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．,１９９６,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ、９３（１１）：５４２５−５４３０
【非特許文献１６】Ｏｍｏｅ  ｅｔ  ａｌ．,２００２,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ,４０（３）：８５７−８６２
【非特許文献１７】Ｐｒｏｆｔ  ａｎｄ  Ｆｒａｓｅｒ,２００３,Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ,１３３（３）：２９９−３０６
【非特許文献１８】Ｓｐａｕｌｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．,２０１２、Ｖａｃｃｉｎｅ  ３０（３４）：５０９９−１０９
【非特許文献１９】Ｓａｌｇａｄｏ−Ｐａｂｏｎ  ｅｔ  ａｌ．,２０１４,Ｊ  Ｉｎｆｅｃ  Ｄｉｓ,２１０（５）：７８４−７９２
【発明の概要】
【００１１】
概要
一態様では、本開示は、野生型ＳＥＡに対する４つの変異を含み、その４つの変異が配列番号４中のＬ４８Ｒ、Ｄ７０Ｒ、Ｙ９２Ａ、およびＨ２２５Ａ変異に対応する、弱毒化黄色ブドウ球菌由来スーパー抗原（ＳＡｇ）ＳＥＡトキソイドまたはその免疫学的もしくは抗原的に活性な断片、バリアント、もしくは誘導体を提供する。ある特定の態様では、トキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、配列番号３を含むＳＥＡトキソイドよりもスーパー抗原活性が低くかつ／またはビルレンスが低いが、免疫原性を維持している。ある特定の態様では、弱毒化ＳＥＡトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、配列番号４と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、弱毒化ＳＥＡトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、配列番号４を含む。また、ある特定の態様では、弱毒化ＳＥＡトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、配列番号３を含むＳＥＡトキソイドのスーパー抗原の活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、または１％未満を有する。点変異（例えば「Ｌ４８Ｒ」）を記載するために本明細書において用いられる命名法は、異種発現に必要とされるＮ末端のメチオニンを含有しない野生型ＳＡｇタンパク質と比較しての命名法であることは理解されるであろう。
【００１２】
別の態様では、本開示はさらに、任意の順序で配置された、本明細書の他の箇所に記載されているとおりの２つ以上の弱毒化黄色ブドウ球菌由来スーパー抗原（ＳＡｇ）トキソイドまたはその免疫学的もしくは抗原的に活性な断片、バリアント、もしくは誘導体の融合体を含む多価オリゴペプチドであって、ＳＡｇトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体が同じでも、または異なってもよく、ＳＡｇトキソイドの少なくとも１つが本明細書の他の箇所に記載されているＳＥＡトキソイドである前記多価オリゴペプチドを提供する。ある特定の態様では、オリゴペプチドは、３つ以上のＳＡｇトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体の融合体を含む。ある特定の態様では、オリゴペプチドは、配列番号５を含むＳＡｇ融合タンパク質よりもスーパー抗原活性が低くかつ／またはビルレンスが低い。ある特定の態様では、オリゴペプチドは、配列番号５を含むＳＡｇ融合タンパク質の免疫原性を維持している。ある特定の態様では、オリゴペプチドは、配列番号５を含むＳＡｇ融合タンパク質のスーパー抗原活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、または１％未満を有する。また、ある特定の態様では、オリゴペプチドは、完全に弱毒化されている。
【００１３】
ある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、ブドウ球菌毒素性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）弱毒化トキソイド；ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）弱毒化トキソイド；またはその任意の組み合わせのうちの１つまたは複数を含む。ある特定の態様では、ＴＳＳＴ−１弱毒化トキソイドは、野生型ＴＳＳＴ−１に対する３つの変異を含み、その３つの変異は、配列番号１および配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列中のＬ３０Ｒ、Ｄ２７Ａ、およびＩ４６Ａ変異に対応する。ある特定の態様では、ＳＥＢ弱毒化トキソイドは、野生型ＳＥＢに対する３つの変異を含み、その３つの変異は、配列番号２および配列番号２と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列中のＬ４５Ｒ、Ｙ８９Ａ、およびＹ９４Ａ変異に対応する。ある特定の態様では、ＳＥＡ弱毒化トキソイドは、野生型ＳＥＡに対する４つの変異を含み、その４つの変異は、配列番号４および配列番号４と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列中のＬ４８Ｒ、Ｄ７０Ｒ、Ｙ９２Ａ、およびＨ２２５Ａ変異に対応する。ある特定の態様では、ＴＳＳＴ−１トキソイドは、アミノ酸配列の配列番号１を含む。ある特定の態様では、ＳＥＢトキソイドは、アミノ酸配列の配列番号２を含む。ある特定の態様では、ＳＥＡ弱毒化トキソイドは、アミノ酸配列の配列番号４を含む。ある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、アミノ酸配列の配列番号６を含む。
【００１４】
ある特定の態様では、本明細書の他の箇所に記載されている少なくとも２つのＳＡｇトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、リンカーによってそれぞれ会合されている。ある特定の態様では、リンカーは、グリシン、セリン、アラニン、およびその組み合わせからなる群から選択される少なくとも１個、ただし５０個以下のアミノ酸を含む。ある特定の態様では、リンカーは、（ＧＧＧＳ）ｎまたは（ＧＧＧＧＳ）ｎを含み、式中、ｎは１〜１０の整数である。ある特定の態様では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎを含む。ある特定の態様では、ｎは３である。
【００１５】
多価オリゴペプチドはさらに、異種ポリペプチドを含んでもよい。ある特定の態様では、異種ポリペプチドは、Ｈｉｓタグ、ユビキチンタグ、ＮｕｓＡタグ、キチン結合ドメイン、Ｂタグ、ＨＳＢタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、アビジン／ストレプトアビジン／Ｓｔｒｅｐタグ、ｔｒｐＥ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ｌａｃＺ（β−ガラクトシダーゼ）、ＦＬＡＧ（商標）ペプチド、Ｓタグ、Ｔ７タグ、異種ポリペプチドのいずれかの断片、または異種ポリペプチドの２つ以上の組み合わせを含む。ある特定の態様では、異種ポリペプチドは、免疫原、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、その断片、またはその組み合わせを含む。
【００１６】
多価オリゴペプチドはまたさらに、免疫原性炭水化物を含んでもよい。ある特定の態様では、免疫原性炭水化物は糖である。ある特定の態様では、免疫原性炭水化物は、莢膜多糖または表面多糖である。ある特定の態様では、免疫原性炭水化物は、莢膜多糖（ＣＰ）血清型５（ＣＰ５）、ＣＰ８、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）、ポリ−Ｎ−スクシニルグルコサミン（ＰＮＳＧ）、壁テイコ酸（ＷＴＡ）、リポテイコ酸（ＬＴＡ）、免疫原性炭水化物のいずれかの断片、および免疫原性炭水化物の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。ある特定の態様では、免疫原性炭水化物は、オリゴペプチドにコンジュゲートされている。
【００１７】
さらに、本明細書の他の箇所に記載されている弱毒化ＳＥＡトキソイドポリペプチドまたは本明細書の他の箇所に記載されている多価オリゴペプチドをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。ある特定の態様では、ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列の配列番号８を含む。ポリヌクレオチドはさらに、異種核酸を含んでもよい。ある特定の態様では、異種核酸は、オリゴペプチドをコードする核酸と作動可能に会合しているプロモーターを含む。また、ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。ある特定の態様では、ベクターはプラスミドである。また、ベクターを含む宿主細胞を提供する。ある特定の態様では、宿主細胞は、細菌、昆虫細胞、哺乳動物細胞、または植物細胞である。ある特定の態様では、細菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）である。
【００１８】
さらに、多価オリゴペプチドを生成する方法を提供する。ある特定の態様では、前記方法は、本明細書の他の箇所に記載されている宿主細胞を培養する工程と、オリゴペプチドを回収する工程とを含む。
【００１９】
さらに、本明細書の他の箇所に記載されている弱毒化ＳＥＡトキソイドもしくは多価オリゴペプチド、またはそれらの任意の組み合わせと担体とを含む治療用、免疫原性、および／または抗原性組成物などの組成物を提供する。組成物はさらに、アジュバントを含んでもよい。ある特定の態様では、アジュバントは、アラム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、またはグルコピラノシルリピドＡベースのアジュバントである。組成物はまたさらに、追加の免疫原を含んでもよい。ある特定の態様では、追加の免疫原は細菌抗原である。ある特定の態様では、細菌抗原は、膜孔形成毒素、スーパー抗原、細胞表面タンパク質、細菌抗原のいずれかの断片、および細菌抗原の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。
【００２０】
さらに、黄色ブドウ球菌に対する宿主免疫応答を誘導する方法を提供する。ある特定の態様では、前記方法は、免疫応答を必要とする対象に、有効量の、本明細書の他の箇所に記載されている免疫原性または抗原性組成物を投与することを含む。ある特定の態様では、免疫応答は、先天応答、体液性応答、抗体応答、細胞応答、および免疫応答の２つ以上の組み合わせからなる群から選択される。ある特定の態様では、免疫応答は、抗体応答である。
【００２１】
さらに、対象においてブドウ球菌疾患または感染症を予防または処置する方法を提供する。ある特定の態様では、前記方法は、それを必要とする対象に、本明細書の他の箇所に記載されている組成物を投与することを含む。ある特定の態様では、感染症は、皮膚、軟部組織、血液、または器官の限局性または全身性感染症であるか、または自己免疫性である。ある特定の態様では、疾患は、呼吸器疾患、例えば、肺炎である。ある特定の態様では、疾患は、敗血症である。
【００２２】
本明細書に開示の方法のいずれかにおける対象は、哺乳動物であってよい。ある特定の態様では、哺乳動物は、ヒトである。ある特定の態様では、哺乳動物は、ウシまたはイヌである。
【００２３】
本明細書に開示の方法のいずれかで投与するための組成物は、筋肉内注射、皮内注射、腹腔内注射、皮下注射、静脈内注射、経口投与、粘膜投与、鼻腔内投与、または経肺投与によって投与することができる。
【００２４】
さらに、対象において黄色ブドウ球菌に対する宿主免疫応答を誘導する際に使用するための組成物を提供する。さらに、対象においてブドウ球菌疾患または感染症を予防または処置する際に使用するための組成物を提供する。さらに、黄色ブドウ球菌感染症に対するワクチンを生産する方法を提供する。ある特定の態様では、前記方法は、本明細書の他の箇所に記載されている弱毒化ＳＥＡトキソイド、本明細書の他の箇所に記載されている多価オリゴペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを単離する工程と；トキソイド、オリゴペプチド、またはそれらの任意の組み合わせをアジュバントと組み合わせる工程とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ｒＴＢＡおよびｒＴＢＡ２２５構築物の図である。融合ペプチドのあり得る配置も示されている。リンカー：リンカーＧＧＧＧＳ（４ＧＳ）の３つの反復。
【図２】ｒＴＢＡの精製が示されている。（Ａ）ｒＴＢＡおよびｒＴＢＡ２２５を精製するためのプロセス。（Ｂ）ｒＴＢＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
【図３】マウスにおけるｒＴＢＡと、３種の個別のトキソイドからなるカクテルとの免疫原性の比較が示されている。Ａ）３つのＳＡｇについて１群あたり５匹の免疫化マウスからの貯留血清でＥＬＩＳＡおよび毒素中和アッセイ（ＴＮＡ）を行った。Ｂ）１０匹のマウスからなる群をＣｐＧまたはＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌのいずれか中で製剤化されたｒＴＢＡで３回免疫化し、免疫原性をＥＬＩＳＡおよびＴＮＡアッセイで決定した。示されているデータは、ＥＬＩＳＡ  ＥＣ５０およびＴＮＡ  ＮＴ５０値である。
【図４】ｒＴＢＡおよびｒＴＢＡ２２５安全性プロファイルが示されている。ＳＥＡ、ｒＴＢＡ、ＳＥＡＨ２２５Ａ、ｒＳＥＡ２２５、およびｒＴＢＡ２２５に対する、３人のドナーからのヒトＰＢＭＣの応答。
【図５】マウスにおけるｒＴＢＡ２２５と、ｒＴＢＡと、３種の個別のトキソイドからなるカクテルとの免疫原性の比較が示されている。ＳＥＡ、ＳＥＢおよびＴＳＳＴ−１について、１群あたり１０匹の免疫化マウスからの個別の血清でＥＬＩＳＡおよび毒素中和アッセイ（ＴＮＡ）を行った。示されているデータは、ＥＬＩＳＡ  ＥＣ５０（Ａ）およびＴＮＡ  ＮＴ５０値（Ｂ）である。他のスーパー抗原に対する交差中和を試験するためのＴＮＡも、免疫化マウスからの貯留血清で行った。示されているデータは、１：４０血清希釈での中和パーセンテージ（Ｃ）である。エラーバーは平均の標準誤差を表し、アステリスクは、マン−ホイットニーノンパラメトリック検定によって決定されたとおりの、ｒＴＢＡ２２５免疫化マウス血清とＳＡｇカクテル免疫化マウス血清との間の統計的相違度を示している。
【図６】ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌによるｒＴＳＳＴ−１（Ａ）およびｒＴＢＡ２２５（Ｂ）の吸着が示されている。タンパク質を単独で（左側のレーン）、または表示の比（タンパク質：Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ）でのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌと共に３０分間にわたって室温でインキュベートした。インキュベーション後に、試料を遠心して、吸着したタンパク質を沈殿させた。次いで、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に掛け、クーマシー染色によって可視化した。検出可能なタンパク質バンドが存在しないことは、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌへの結合を示している。
【図７】毒素暴露に対して、ｒＴＢＡ２２５がもたらす防御が示されている。１０匹のマウスからなる群に、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ中で製剤化された対照としてのＢＳＡまたはｒＴＢＡ２２５を３回ワクチン接種し、指定用量の野生型ＴＳＳＴ−１、ＳＥＡ、またはＳＥＡに暴露した。動物を５日間にわたって死亡率および罹患率についてモニターした。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
詳細な説明
Ｉ．定義
「ａ（１つの）」または「ａｎ（１つの）」実体という用語はその実体の１つまたは複数を指すことに注意すべきである；例えば、「ポリヌクレオチド（ａ  ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」は１つまたは複数のポリヌクレオチドを表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つもしくは複数の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において互換的に用いられ得る。
【００２７】
さらに、「および／または」は、本明細書において使用される場合、２つの指定された特徴または成分をそれぞれ、他方と共に、または他方を伴わずに明確に開示すると解釈される。したがって、「および／または」という用語は、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（のみ）、および「Ｂ」（のみ）を含むことが意図される。同様に、「および／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において用いられる場合、Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（のみ）；Ｂ（のみ）；ならびにＣ（のみ）をそれぞれ包含することが意図される。
【００２８】
別段に定義されていない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が関連する当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有する。例えば、Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｕｏ，Ｐｅｉ−Ｓｈｏｗ，２ｎｄ  ｅｄ．，２００２，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，１９９９，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＯｘｆｏｒｄ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｒｅｖｉｓｅｄ，２０００，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓは、本開示で使用される用語の多くの総合的な辞書を当業者に提供する。
【００２９】
単位、接頭辞、および記号は国際単位系（ＳＩ）に認められている形式で表示される。数値の範囲は、その範囲を規定している数字を含む。別段に示されていない限り、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向に書かれる。本明細書において提供される標題は、本明細書を全体として参照することによって持つことができる本開示の様々な態様または実施形態の限定ではない。したがって、すぐ下で定義される用語は、本明細書全体を参照することによってさらに詳細に定義される。
【００３０】
態様または実施形態が「を含む」という言葉を用いて説明されている場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」で説明される別段に類似の態様または実施形態も提供される。
【００３１】
アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ）によって推奨された一般に公知の三文字記号または一文字記号によって本明細書で言及される。同様に、ヌクレオチドは、一般に認められている一文字コードによって言及される。
【００３２】
「核酸」または「核酸断片」という用語は、ポリヌクレオチドまたは構築物に存在する、任意の１種または複数の核酸セグメント、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ断片を指す。本開示の２種以上の核酸が単一のポリヌクレオチド構築物、例えば、単一のプラスミドに存在してもよく、別々の（非同一の）ポリヌクレオチド構築物、例えば、別々のプラスミドに存在してもよい。さらに、任意の核酸または核酸断片が単一のポリペプチド、例えば、単一の抗原、サイトカイン、または調節ポリペプチドをコードしてもよいし、または複数種のポリペプチドをコードしてもよく、例えば、核酸が２種以上のポリペプチドをコードしてもよい。加えて、核酸がプロモーターまたは転写ターミネーターなどの調節エレメントをコードしてもよいし、または分泌シグナルペプチドまたは機能ドメインなどの、ポリペプチドまたはタンパク質の特殊なエレメントまたはモチーフをコードしてもよい。
【００３３】
「ポリヌクレオチド」という用語は、単数の核酸または核酸断片ならびに複数の核酸または核酸断片を包含することが意図され、ポリヌクレオチドを含む、単離分子または構築物、例えば、ウイルスゲノム（例えば、非感染性ウイルスゲノム）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、またはｐＤＮＡ誘導体（例えば、（Ｄａｒｑｕｅｔ，Ａ−Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：１３４１−１３４９，１９９７）に記載のミニサークル）を指す。ポリヌクレオチドは、直鎖型（例えば、ｍＲＮＡ）、環状型（例えば、プラスミド）、または分岐型、ならびに二本鎖型または一本鎖型で提供されてもよい。ポリヌクレオチドは従来型のホスホジエステル結合を含んでもよいし、または非従来型の結合（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）において見い出されるようなアミド結合などのアミド結合）を含んでもよい。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、単数の「ポリペプチド」ならびに複数の「ポリペプチド」を包含することが意図され、２つ以上のアミノ酸からなる任意の鎖を含む。したがって、本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ジペプチド」、「トリペプチド」、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、「アミノ酸配列」、「ペプチドサブユニット」、または２つ以上のアミノ酸からなる鎖に言及するために用いられる他の任意の用語は、（これらの用語がそれぞれ、より具体的な意味を有する場合であっても）「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」という用語は、これらの用語のうちのいずれかの代わりに、またはそれらと互換的に使用することができる。これらの用語は、翻訳後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、公知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質切断、または非天然アミノ酸による修飾を受けたポリペプチドをさらに含む。
【００３５】
本明細書で使用される場合の「多価オリゴペプチド」という用語は、任意の順序で１本のポリペプチドとして一緒に融合した２つ以上の弱毒化ブドウ球菌タンパク質、例えば、例えば、スーパー抗原（ＳＡｇ）トキソイドまたはその任意の断片、バリアント、もしくは誘導体を含む融合タンパク質を指す。オリゴペプチドは、本明細書の他の箇所に記載されているとおりの他の異種ペプチドを含んでもよい。本明細書において提供される多価オリゴペプチドに含めるための他のペプチドには、本明細書の他の箇所または両方ともその全体が参照によって本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１２／１０９１６７Ａ１およびＷＯ２０１３／０８２５５８Ａ１に記載されている様々な他のブドウ球菌トキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体が含まれる。
【００３６】
本開示によって提供されるトキソイドおよびトキソイドの融合体のオリゴペプチドの集まりは本明細書において、まとめて「多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイド」、または「多価オリゴペプチド、ＳＡｇトキソイド、またはそれらの任意の組み合わせ」と称される。これらの集合的な言及は、限定ではないが、本明細書において提供されるとおりのいずれか１つのトキソイドまたはオリゴペプチド、または本明細書において提供されるとおりの２つ、３つ、４つ、またはそれ以上のトキソイドまたはオリゴペプチドを含むことが意図されている。
【００３７】
「断片」、「誘導体」、または「バリアント」という用語は、本開示の多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドについて言及しているとき、供給源タンパク質の免疫原性または抗原性の少なくとも一部を保持している任意のポリペプチドを含む。本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇの断片には、タンパク質分解断片、欠失断片、または発現、精製、および／または動物への投与の間に溶解性の増加を示す断片が含まれる。本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇの断片には、対象に送達されたときに病原性または毒性の低下を示すタンパク質分解断片または欠失断片がさらに含まれる。ポリペプチド断片には、直鎖エピトープおよび三次元エピトープを含む供給源ポリペプチドの抗原性エピトープまたは免疫原性エピトープを含む任意のポリペプチド部分がさらに含まれる。
【００３８】
ポリペプチドの「エピトープ断片」は、エピトープを含有するポリペプチド部分である。「エピトープ断片」は１つまたは複数のエピトープに加えてアミノ酸配列を含有してもよいが、それらを含有する必要もない。
【００３９】
本明細書で使用される場合の「バリアント」という用語は、アミノ酸の置換、欠失、挿入、および／または改変により、列挙されたポリペプチドと異なるポリペプチドを指す。非天然バリアントは、当技術分野において公知の変異誘発法を用いて産生することができる。一部の態様では、バリアントポリペプチドは、同定された配列と３個のアミノ酸またはそれより少ないアミノ酸の置換、欠失、または付加だけ異なる。このようなバリアントは一般的に、ポリペプチド配列を改変し、例えば、本明細書に記載の代表的な手順を用いて、改変されたポリペプチドの抗原性または病原性を評価することによって同定することができる。一部の態様では、多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドのバリアントは、野生型複合体よりも毒性が低いタンパク質複合体を形成する。
【００４０】
本明細書に開示のポリペプチドバリアントは、同定されたポリペプチドと少なくとも約８５％、９０％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性を示す。バリアントポリペプチドは保存的または非保存的なアミノ酸の置換、欠失、または挿入を含んでもよい。バリアントは、本明細書の他の箇所に記載されている特定の変異を含む、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１５、２０、またはそれより多いアミノ酸置換を除いて様々な野生型ブドウ球菌タンパク質と同一の多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇを含んでもよく、その際、置換は複合体の毒性を対応する野生型タンパク質複合体よりも低くする。本明細書に記載の多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇの誘導体は、天然ポリペプチドには見い出されない追加の特徴を示すように変えられているポリペプチドである。例には融合タンパク質が含まれる。類似体は、別の型の本明細書に記載の多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドである。一例は、プロタンパク質の切断によって活性化されて、活性な成熟ポリペプチドを生じることができるプロタンパク質である。
【００４１】
バリアントはさらに、または代替的に他の改変を含有してもよく、それによって、例えば、ポリペプチドを、異種アミノ酸配列に、例えば、翻訳と同時に、または翻訳後にタンパク質移行を誘導する、タンパク質のＮ末端にあるシグナル（またはリーダー）配列に、コンジュゲートまたは結合、例えば融合することができる。また、ポリペプチドを、ポリペプチドの合成、精製、もしくは同定を容易にするために（例えば、６−Ｈｉｓ）、またはポリペプチドと固体支持体との結合を強化するためにリンカーもしくは他の配列にコンジュゲートすることができる、またはリンカーもしくは他の配列と結合させて生成することができる。例えば、ポリペプチドを免疫グロブリンＦｃ領域にコンジュゲートまたは結合することができる。また、ポリペプチドを、ポリペプチドに対する免疫応答を付与または調節する配列（例えば、Ｔ細胞エピトープ、Ｂ細胞エピトープ、サイトカイン、ケモカインなど）および／または抗原提示細胞もしくは他の免疫系細胞によるポリペプチドの取り込みおよび／または処理を強化する配列にコンジュゲートまたは結合することができる。また、ポリペプチドを、ブドウ球菌種および／または他の細菌および／または他のウイルスに由来する他のポリペプチド／エピトープにコンジュゲートまたは結合して、単独で、または様々なアジュバントとの組み合わせで他の病原性生物に対する防御免疫を誘発することができるハイブリッド免疫原性タンパク質を生成することができる。また、ポリペプチドを、これに限定されないが、アルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など、さらに大きな安定性を付与する、または半減期を改善する部分にコンジュゲートまたは結合することができる。また、ポリペプチドを、ブドウ球菌種および／または他の細菌および／または他のウイルスに由来する部分（例えば、免疫原性炭水化物、例えば、莢膜多糖または表面多糖）にコンジュゲートまたは結合して、単独で、または１種もしくは複数のアジュバントとの組み合わせで防御免疫を強化する、および／または防御免疫の作用を助けることができる改変された免疫原性タンパク質を生成することができる。ある特定の態様では、本明細書に記載のポリペプチドはさらに、免疫原性炭水化物を含む。一態様では、免疫原性炭水化物は糖である。
【００４２】
本明細書を通じて「糖」という用語は多糖またはオリゴ糖を示してもよく、その両方を含む。本開示の多糖は細菌から単離されてもよく、公知の方法によってサイズ変更されてもよい。例えば、全長多糖は「サイズ変更」されてもよい（例えば、それらのサイズは、酸加水分解処理、過酸化水素処理、ＥＭＵＬＳＩＦＬＥＸ（登録商標）によるサイズ変更、続く、オリゴ糖断片をもたらす過酸化水素処理または顕微溶液化などの様々な方法によって小さくされてもよい）。多糖試料中での粘度を低下させるために、および／またはコンジュゲートされた生成物の濾過性を改善するために、多糖をサイズ変更することができる。オリゴ糖は少数の反復単位（例えば、５〜３０反復単位）を有し、典型的には、加水分解多糖である。本開示の多糖は組換えにより生成されてもよい。
【００４３】
黄色ブドウ球菌莢膜抗原は表面に結合し、抗原特異性が限定され、臨床分離株の間で高度に保存されている。一態様では、本開示の免疫原性炭水化物は黄色ブドウ球菌の莢膜多糖（ＣＰ）である。一態様では、莢膜糖は全長多糖でもよいが、しかしながら、他の態様では、莢膜糖は１つのオリゴ糖単位でもよいし、または反復オリゴ糖単位からなる天然の長さより短い糖鎖でもよい。ブドウ球菌分離株の血清型検査から、いくつかの推定莢膜血清型が明らかになっており、臨床感染からの分離株の中で５型および８型（ＣＰ５およびＣＰ８）が最も蔓延しており、それぞれ、ヒトから回収される分離株の約２５％および５０％を占めている（Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｊａｎｕａｒｙ  ２００４，ｐ．２１８−２３４，Ｖｏｌ．１７，Ｎｏ．１；Ｐｏｕｔｒｅｌ  ａｎｄ  Ｓｕｔｒａ，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９３  Ｆｅｂ；３１（２）：４６７−９）。同じ分離株が家禽、ウシ、ウマ、およびブタからも回収された（Ｔｏｌｌｅｒｓｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０００  Ａｕｇ；３８（８）：２９９８−３００３；Ｃｕｎｎｉｏｎ  ＫＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００１  Ｎｏｖ；６９（１１）：６７９６−８０３）。ＷｕおよびＰａｒｋ（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｐａｒｋ．１９７１．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１０８：８７４−８８４）によって以前に記載されたとおり、プロトタイプＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＢｅｃｋｅｒ株からそれぞれ精製された５型および８型莢膜多糖は互いに、およびＴ株によって作られた莢膜と構造がよく似ている。５型は構造（→４）−３−Ｏ−Ａｃ−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ−（１→４）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→）ｎを有し（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８７．Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３８：５６１−５６７；Ｍｏｒｅａｕ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９０．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．２０１：２８５−２９７）、８型は構造（→３）−４−Ｏ−Ａｃ−β−Ｄ−ＭａｎＮＡｃＡ−（１→３）−α−Ｌ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→３）−β−Ｄ−ＦｕｃＮＡｃ−（１→）ｎを有する（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，１９８４．Ｉｎｆｅｃｔ，Ｉｍｍｕｎ．４５：８７−９３）。５型および８型多糖は、糖間の結合およびマンノサミヌロン酸残基のＯ−アセチル化部位においてのみ異なるが、それでも、これらは血清学的に別個のものである。
【００４４】
無毒化組換え緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）エキソトキシンＡ担体とコンジュゲートした５型および８型ＣＰは、マウスモデルにおいて免疫原性および防御性が高いことが示され（Ａ  Ｆａｔｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９３  Ｍａｒｃｈ；６１（３）：１０２３−１０３２；Ａ  Ｆａｔｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９６  Ｍａｙ；６４（５）：１６５９−１６６５）、免疫化動物からのＣＰ５特異的抗体の受動伝達はマウスにおいて全身感染に対する防御を誘導し（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．１９９７  Ｏｃｔｏｂｅｒ；６５（１０）：４１４６−４１５１）、血清型５黄色ブドウ球菌に暴露されたラットにおいて心内膜炎に対する防御を誘導した（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２００２  Ｆｅｂ  １４；３４６（７）：４９１−６）。マウスにおいて黄色ブドウ球菌暴露に対して７５％の防御を提供する二価ＣＰ５・ＣＰ８コンジュゲートワクチン（ＳｔａｐｈＶＡＸ（登録商標），Ｎａｂｉ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）が開発された。このワクチンはヒトにおいて試験されている（Ｆａｔｔｏｍ  ＡＩ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ．２００４  Ｆｅｂ  １７；２２（７）：８８０−７；Ｍａｉｒａ−Ｌｉｔｒａｎ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００５  Ｏｃｔ；７３（１０）：６７５２−６２）。ある特定の態様では、本開示の組換えペプチドまたは多価オリゴペプチドは、免疫原性炭水化物（例えば、ＣＰ５、ＣＰ８、ＣＰ断片、またはその組み合わせ）と組み合わされる、またはそれにコンジュゲートされる。
【００４５】
両方とも黄色ブドウ球菌表面炭水化物であるポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）（ＭｃＫｅｎｎｅｙ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９９  Ｍａｙ  ２８；２８４（５４１９）：１５２３−７）またはポリ−Ｎ−スクシニルグルコサミン（ＰＮＳＧ）（Ｔｕｃｈｓｃｈｅｒｒ  ＬＰ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．２００８  Ｄｅｃ；７６（１２）：５７３８−４４．Ｅｐｕｂ  ２００８  Ｓｅｐ  ２２）での免疫化は、実験動物モデルにおいて黄色ブドウ球菌暴露に対する少なくとも部分的な防御をもたらすことが示されている。ＰＮＳＧは、生体材料へのコアグラーゼ陰性ブドウ球菌（ＣｏＮＳ）の付着を媒介するＳ．エピデルミデス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）莢膜多糖／付着素（ＰＳ／Ａ）の化学型として同定され、ＰＳ／Ａを発現するＣｏＮＳ株の莢膜として役立ち、防御抗体の標的である。ＰＮＳＧも黄色ブドウ球菌によって作られ、環境により調節され、インビボで発現する表面多糖であり、同様に防御免疫の標的として役立つ（ＭｃＫｅｎｎｅｙ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０００  Ｓｅｐｔ  ２９；８３（１−２）：３７−４４）。本開示のある特定の態様では、免疫原性炭水化物は、表面多糖、例えば、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）、ポリ−Ｎ−スクシニルグルコサミン（ＰＮＳＧ）、表面多糖断片、またはそれらの組み合わせである。
【００４６】
壁テイコ酸（ＷＴＡ）は、黄色ブドウ球菌株上に広範囲に発現する、目立つ多糖であり（Ｎｅｕｈａｕｓ，Ｆ．Ｃ．ａｎｄ  Ｊ．Ｂａｄｄｉｌｅｙ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｖ，２００３．６７（４）：６８６−７２３）、ＷＴＡに対する抗血清は単独で、および補体の存在下でオプソニン作用性死滅を誘導することが示されている（（Ｔｈａｋｋｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ，１９９８．６６（１１）：１８３−９）およびＦａｔｔｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第７，７５４，２２５号）。ＷＴＡはペプチドグリカンと連結し、細胞壁から突き出て、無莢膜（ｎｏｎ−ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ）株、例えば、米国における市中感染性ＭＲＳＡ（ＣＡ  ＭＲＳＡ）の大部分の症例の原因であるＵＳＡ３００では目立って露出している（Ｈｉｄｒｏｎ，Ａ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ，２００９．９（６）：３８４−９２）。
【００４７】
リポテイコ酸（ＬＴＡ）は、グラム陽性細菌、例えば、黄色ブドウ球菌の細胞壁の構成要素である。ＬＴＡは、非特異的に膜リン脂質を介して標的細胞に、または特異的にＣＤ１４およびＴｏｌｌ様受容体に結合し得る。標的に結合したＬＴＡは循環抗体と相互作用し、補体カスケードを活性化して受動免疫死滅現象を誘導することができる。これはまた、好中球およびマクロファージからの活性酸素種および活性窒素種、酸加水分解酵素、高カチオン性プロテイナーゼ、殺菌性カチオン性ペプチド、増殖因子、ならびに細胞傷害性サイトカインの放出も誘発し、これらは相乗作用して細胞損傷を増幅し得る。
【００４８】
ある特定の態様では、表面多糖は本開示のポリペプチドと組み合わされる、またはそれにコンジュゲートされる。ある特定の態様では、表面多糖は、例えば、ポリ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＰＮＡＧ）、ポリ−Ｎ−スクシニルグルコサミン（ＰＮＳＧ）、壁テイコ酸（ＷＴＡ）、リポテイコ酸（ＬＰＡ）、前記表面多糖のいずれかの断片、または前記表面多糖の２種以上の組み合わせである。
【００４９】
本明細書で使用される場合の「配列同一性」という用語は、２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係または２つ以上のポリペプチド配列間の関係を指す。ある配列にある位置が比較配列の対応する位置において同じ核酸塩基またはアミノ酸で占められている場合、その配列はその位置において「同一」だと言われる。「配列同一性」のパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸が両配列において生じている位置の数を決定して「同一の」位置の数を得ることによって計算される。次いで、「同一の」位置の数を比較ウィンドウにある位置の総数で割り、これに１００を掛けて「配列同一性」のパーセンテージを得る。「配列同一性」のパーセンテージは、比較ウィンドウおよび別の分離株に由来する相同ポリペプチドにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって決定される。比較のために配列を最適にアラインメントするために、比較ウィンドウにあるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、参照配列が一定に保たれている間に、ギャップと呼ばれる付加または欠失を含んでもよい。最適アラインメントは、ギャップがあっても、参照配列と比較配列との間で可能性のある最大数の「同一の」位置を生じるアラインメントである。２つの配列間の「配列同一性」のパーセンテージは、２００４年９月１日の時点で米国立バイオテクノロジー情報センターから入手可能なプログラム「ＢＬＡＳＴ２配列」バージョンを用いて決定することができ、このプログラムは、プログラムＢＬＡＳＴＮ（ヌクレオチド配列比較用）およびＢＬＡＳＴＰ（ポリペプチド配列比較用）を組み込んでおり、これらのプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０（１２）：５８７３−５８７７，１９９３）のアルゴリズムに基づいている。「ＢＬＡＳＴ２配列」を利用する場合、ワードサイズ（ｗｏｒｄ  ｓｉｚｅ）（３）、オープンギャップペナルティ（ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）（１１）、エクステンションギャップペナルティ（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）（１）、ギャップドロップオフ（ｇａｐ  ｄｒｏｐ−ｏｆｆ）（５０）、期待値（１０）、およびこれに限定されないがマトリックスオプション（ｍａｔｒｉｘ  ｏｐｔｉｏｎ）を含む他の任意の必要なパラメータには、２００４年９月１日の時点でデフォルトパラメータであったパラメータを使用することができる。
【００５０】
本明細書で使用される場合の「エピトープ」という用語は、動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトにおいて抗原活性または免疫原活性を有するポリペプチド部分を指す。本明細書で使用される場合の「免疫原性エピトープ」は、当技術分野において公知の任意の方法によって決定されるとおり、動物において免疫応答を誘発するタンパク質部分であると定義される。本明細書で使用される場合の「抗原性エピトープ」という用語は、当技術分野において周知の任意の方法によって決定されるとおり、抗体またはＴ細胞受容体がその抗原に免疫特異的に結合することができるタンパク質部分であると定義される。免疫特異的結合は非特異的結合を排除するが、必ずしも、他の抗原との交差反応性を排除するものではない。全ての免疫原性エピトープは抗原性であるが、抗原性エピトープは免疫原性である必要はない。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸部分である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ、またはＴＡＡ）はアミノ酸に翻訳されないが、コード領域の一部とみなされ得る。しかし、いずれのフランキング配列も、例えば、プロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーターなどはコード領域外にある。
【００５２】
「コドン最適化」という用語は、目的の対象の宿主の細胞における発現の増強のために、天然配列のうちの少なくとも１つのコドン、複数のコドン、またはかなりの数のコドンを宿主遺伝子内でさらに高い頻度で、または最も高い頻度で用いられるコドンで置換することによって核酸配列を改変することと、本明細書において定義される。様々な種が、ある特定のアミノ酸のある特定のコドンに特有のバイアスを示す。
【００５３】
「組成物」または「医薬組成物」という用語は、例えば、アジュバントまたは薬学的に許容される担体、賦形剤、もしくは希釈剤と共に、黄色ブドウ球菌感染症に既に罹患している個体または黄色ブドウ球菌感染に対する免疫化を必要とする個体に投与される、本開示の免疫原性ポリペプチドを含有する組成物を含んでもよい。
【００５４】
「薬学的に許容される」という用語は、適正な医学的判断の範囲内にあり、過度の毒性または他の合併症を引き起こすことなくヒトおよび動物の組織と接触させるのに適していて、妥当なベネフィット／リスク比に見合った組成物を指す。一部の態様では、本明細書に記載のポリペプチド、ポリヌクレオチド、組成物、およびワクチンは薬学的に許容される。
【００５５】
「有効量」は、単回投与または一連の投与の一部として個体に投与することが処置または予防に有効な量である。例えば、その投与が、例えば、感染性黄色ブドウ球菌に感染または暴露した後に決定された場合に、未処置個体と比べて、これに限定されないが、菌血症の軽減、毒血症の軽減、敗血症の軽減、症状の軽減、免疫応答の増大、免疫応答の調節、または回復までに必要な時間の短縮を含めて、黄色ブドウ球菌感染の発生率の低下をもたらした場合に、量は有効である。この量は、処置を受ける個体の健康状態および身体状態、処置を受ける個体の分類群（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、霊長類など）、個体の免疫系の応答能力、所望の処置または防御の程度、ワクチンの処方、医師による医学的状態の評価、ならびに他の関連要因に応じて変化する。有効量は、ルーチン的な試験によって決定することができる比較的広い範囲に該当すると予測される。典型的には、単回用量は、約１０μｇ〜１０ｍｇ／体重ｋｇの精製ポリペプチド、または同等量の本明細書に記載のとおりの組換えにより発現された多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドを提供するために十分な、改変されたキャリア生物もしくはウイルスまたはその断片もしくは残遺物の量である。「ペプチドワクチン」または「サブユニットワクチン」という用語は、動物に投与されたときに、ブドウ球菌（例えば、黄色ブドウ球菌）感染に対する免疫応答の刺激において有用な１種または複数の本明細書に記載のポリペプチドを含む組成物を指す。
【００５６】
「対象」という用語は、診断、予後、免疫化、または治療が望まれる任意の対象、特に、哺乳動物対象を意味する。哺乳動物対象には、これに限定されないが、ヒト、飼育動物、家畜、動物園の動物、例えば、クマ、スポーツ動物、ペット動物、例えば、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、クマ、雌ウシ；霊長類、例えば、類人猿、サル、オランウータン、およびチンパンジー；イヌ科動物、例えば、イヌおよびオオカミ；ネコ科動物、例えば、ネコ、ライオン、およびトラ；ウマ科動物、例えば、ウマ、ロバ、およびシマウマ；食用動物、例えば、ウシ、ブタ、およびヒツジ；有蹄類、例えば、シカおよびキリン；げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどが含まれる。一態様では、対象はヒト対象である。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」は、ブドウ球菌（例えば、黄色ブドウ球菌）疾患の症状を処置する、すなわち、予防する、治癒させる、遅らせる、もしくはその重症度を下げること、または一定の期間にわたって黄色ブドウ球菌が原因の疾患を悪化させないこと、あるいはその両方が望ましい個体を指す。
【００５８】
本明細書で使用される場合の「プライミング（ｐｒｉｍｉｎｇ）」または「プライマリ（ｐｒｉｍａｒｙ）」および「ブースト（ｂｏｏｓｔ）」または「ブースティング（ｂｏｏｓｔｉｎｇ）」という用語はそれぞれ、すなわち、これらの用語が免疫学において通常有する定義に従って、初回およびその後の免疫化を指す。しかしながら、例えば、プライミング成分およびブースティング成分が単一の製剤の中にある、ある特定の態様では、「プライム（ｐｒｉｍｅ）」組成物および「ブースト（ｂｏｏｓｔ）」組成物が両方とも同時に投与されるので、初回およびその後の免疫化は必要でない。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「スーパー抗原活性」は、多価オリゴペプチドまたはＳＡｇトキソイドの残留毒性の尺度であり、野生型ＳＡｇ毒素のスーパー抗原活性または別の基準ＳＡｇトキソイドもしくはＳＡｇトキソイド含有多価オリゴペプチドと比較して測定することができる。本開示の目的では、基準ポリペプチドと比較しての「スーパー抗原活性」の上昇または低下は、本明細書の他の箇所に記載されているとおりのインビトロ刺激アッセイにおいて、単離末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に対するＳＡｇ毒素、トキソイド、またはオリゴペプチドの活性を測定することによって決定することができる。
【００６０】
ＩＩ．スーパー抗原（ＳＡｇ）トキソイドおよび多価オリゴペプチド
本開示は、ブドウ球菌スーパー抗原に由来し、本明細書では「トキソイド」と称される弱毒化ポリペプチドサブユニットを含む組換えオリゴペプチド融合タンパク質を提供する。ある特定の態様では、ＳＡｇトキソイドは、そのスーパー抗原活性、毒性、および／またはビルレンスを低下させるための１つまたは複数の変異によって弱毒化されているが、免疫原性は維持している。したがって、本開示は、配列番号４中のＬ４８Ｒ、Ｄ７０Ｒ、Ｙ９２Ａ、およびＨ２２５Ａ変異に対応する、野生型ＳＥＡに対する４つの変異を含む弱毒化黄色ブドウ球菌由来スーパー抗原（ＳＡｇ）ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）トキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体を提供する。ある特定の態様では、４つの指定の変異を有する弱毒化ＳＥＡトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、配列番号４と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、弱毒化ＳＥＡトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、配列番号４を含む、および／またはそれからなる。点変異（例えば「Ｌ４８Ｒ」）を記載するために本明細書において用いられる命名法は、異種発現に必要とされるＮ末端のメチオニンを含有しない野生型ＳＡｇタンパク質と比較しての命名法であることは理解されるであろう。
【００６１】
ある特定の態様では、４つの指定の変異を有するＳＥＡトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、低いスーパー抗原活性、低いビルレンスを有する、および／または野生型ＳＥＡ毒素よりも毒性が低い。ある特定の態様では、４つの指定の変異を有するＳＥＡトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、低いスーパー抗原活性、低いビルレンスを有する、および／または配列番号３（ＳＥＡＬ４８Ｒ／Ｄ７０Ｒ／Ｙ９２Ａ）を含むＳＥＡトキソイドよりも毒性が低い。ある特定の態様では、４つの指定の変異を有するＳＥＡトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、低いスーパー抗原活性、低い毒性を有する、および／または配列番号３からなるＳＥＡトキソイドよりもビルレンスが低い。
【００６２】
ある特定の態様では、４つの指定の変異を有する弱毒化ＳＥＡトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、野生型ＳＥＡ毒素のスーパー抗原活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、または１％未満を有する。ある特定の態様では、４つの指定の変異を有する弱毒化ＳＥＡトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、配列番号３を含むＳＥＡトキソイドのスーパー抗原活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、または１％未満を有する。ある特定の態様では、４つの指定の変異を有する弱毒化ＳＥＡトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、配列番号３からなるＳＥＡトキソイドのスーパー抗原活性の５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、または１％未満を有する。
【００６３】
本明細書に開示のとおりの配列番号４中のＬ４８Ｒ、Ｄ７０Ｒ、Ｙ９２Ａ、およびＨ２２５Ａ変異に対応する、野生型ＳＥＡに対する４つの変異を含む弱毒化ＳＥＡトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体のいずれかのある特定の態様では、免疫原性は、野生型ＳＥＡ毒素、配列番号３を含むＳＥＡトキソイド、および／または配列番号３からなるＳＥＡトキソイドと比較した場合に維持されている。ある特定の態様では、４つの指定の変異を含むＳＥＡトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体での免疫化は、野生型ＳＥＡ毒素に対する中和抗体を誘発する。
【００６４】
さらに、ある特定の態様では、本開示は、任意の順序で配置された２つ以上、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０またはそれ以上の黄色ブドウ球菌由来トキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体の融合体を含む多価オリゴペプチドを提供する。多価オリゴペプチドの２つ以上の黄色ブドウ球菌由来トキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体は、同じでも、または異なってもよい。
【００６５】
米国特許出願公開第２０１６／０１８５８２９Ａ１号（参照によって本明細書に組み込まれる）は、スーパー抗原の変異体、すなわち組換えＴＳＳＴ−１Ｌ３０Ｒ／Ｄ２７Ａ／Ｉ４６Ａ（配列番号１）、ＳＥＢＬ４５Ｒ／Ｙ８９Ａ／Ｙ９４Ａ（配列番号２）、およびＳＥＡＬ４８Ｒ／Ｄ７０Ｒ／Ｙ９２Ａ（配列番号３）の融合オリゴペプチドを含む簡易スーパー抗原（ＳＡｇ）トキソイドワクチンを記載している。この多価オリゴペプチドは本明細書では、ｒＴＢＡ（図１）と称され、アミノ酸配列の配列番号５を有する。ｒＴＢＡ構築物は、幅広い中和抗体を誘導することができた。この融合タンパク質は、３種の個別のトキソイドの単純な混合物と比較して、より良好な全抗体および中和応答を誘導したが、多少の残留スーパー抗原活性を維持した。
【００６６】
ｒＴＢＡに改良が加えられている多価オリゴペプチドを本明細書において提供する。ある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、配列番号５を含む、および／またはそれからなるＳＡｇ融合タンパク質と比べて低いスーパー抗原活性、毒性、および／またはビルレンスを有する２つ以上のＳＡｇトキソイドの融合タンパク質を含む。ある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、野生型ＳＥＡ毒素および／または配列番号５を含むＳＡｇ融合タンパク質のスーパー抗原活性、毒性、および／またはビルレンスの５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、または１％未満を有する（図４）。ある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、配列番号５を含む、および／またはそれからなるＳＡｇ融合タンパク質の免疫原性を維持する。ある特定の態様では、多価オリゴペプチドでの免疫化は、ＳＡｇ  ＴＳＳＴ−１毒素、ＳＡｇ  ＳＥＢ毒素、ＳＡｇ  ＳＥＡ毒素、またはそれらの任意の組み合わせに対する中和抗体を誘発する。ある特定の態様では、多価オリゴペプチドでの免疫化は、ＴＳＳＴ−１、ＳＥＢ、またはＳＥＡ以外のＳＡｇ毒素に対する中和抗体を誘発する。ある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、多価オリゴペプチドを構成する個別のＳＡｇトキソイドの等モルのカクテルよりも大きいおよび／または幅広い免疫原性を示す（図５）。ある特定の態様では、多価オリゴペプチドでの対象の免疫化は、野生型ＳＡｇ  ＴＳＳＴ−１毒素、野生型ＳＡｇ  ＳＥＢ毒素、および野生型ＳＡｇ  ＳＥＡ毒素の少なくとも１種以上に対する防御をもたらす（図７）。ある特定の態様では、多価オリゴペプチドまたはそのオリゴペプチドを含む組成物を、ブドウ球菌疾患または感染症を処置または予防するために使用することができる。
【００６７】
本開示のある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、限定ではないが、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＣ１〜３（ＳＥＣ１〜３）、ブドウ球菌エンテロトキシンＥ（ＳＥＥ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＨ（ＳＨＥ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＩ（ＳＥＩ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＫ（ＳＥＫ）、ブドウ球菌毒素性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）、連鎖球菌発熱外毒素Ｃ（ＳｐｅＣ）、ブドウ球菌エンテロトキシンＤ（ＳＥＤ）、連鎖球菌発熱外毒素Ａ（ＳｐｅＡ）のトキソイド誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、ブドウ球菌ＳＡｇトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体を任意の順序で含む。
【００６８】
ある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、ブドウ球菌毒素性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）トキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。ある特定の態様では、ＴＳＳＴ−１トキソイドは、弱毒化トキソイドＴＳＳＴ−１Ｌ３０Ｒ／Ｄ２７Ａ／Ｉ４６Ａ（配列番号１）、または配列番号１中のＬ３０Ｒ、Ｄ２７Ａ、およびＩ４６Ａ変異に対応する、野生型ＴＳＳＴ−１に対する３つの弱毒化変異ならびに配列番号１と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含むＴＳＳＴ−１トキソイドである。ある特定の態様では、オリゴペプチドは、ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）トキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。ある特定の態様では、ＳＥＢトキソイドは、弱毒化トキソイドＳＥＢＬ４５Ｒ／Ｙ８９Ａ／Ｙ９４Ａ（配列番号２）、または配列番号２中のＬ４５Ｒ、Ｙ８９Ａ、およびＹ９４Ａ変異に対応する、野生型ＳＥＢに対する３つの弱毒化変異ならびに配列番号２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含むＳＥＢトキソイドである。ある特定の態様では、オリゴペプチドは、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）トキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。ある特定の態様では、ＳＥＡトキソイドは、弱毒化トキソイドＳＥＡＬ４８Ｒ／Ｄ７０Ｒ／Ｙ９２Ａ／Ｈ２２５Ａ（配列番号４）、または配列番号４中のＬ４８Ｒ、Ｄ７０Ｒ、Ｙ９２Ａ、およびＨ２２５Ａ変異に対応する、野生型ＳＥＡに対する４つの弱毒化変異ならびに配列番号４と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含むＳＥＡトキソイドである。
【００６９】
ある特定の態様では、本明細書において提供されるとおりの多価オリゴペプチドは、本明細書の他の箇所に記載されているとおりのＳＥＡＬ４８Ｒ／Ｄ７０Ｒ／Ｙ９２Ａ／Ｈ２２５Ａ（配列番号４）中のＬ４８Ｒ、Ｄ７０Ｒ、Ｙ９２Ａ、およびＨ２２５Ａに対応する、野生型ＳＥＡに対する４つの変異を含む少なくとも１種のブドウ球菌エンテロトキシンＡ（ＳＥＡ）弱毒化トキソイドを含む。ある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、２つ以上または３つ以上のＳＡｇトキソイドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体を含む。ある特定の態様では、オリゴペプチドはさらに、本明細書の他の箇所に記載されているとおりのブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）弱毒化トキソイド、本明細書の他の箇所に記載されているとおりのブドウ球菌毒素性ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）弱毒化トキソイド、およびそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の態様では、ＴＳＳＴ−１トキソイドは、配列番号１中のＬ３０Ｒ、Ｄ２７Ａ、およびＩ４６Ａ変異に対応する、野生型ＴＳＳＴ−１に対する３つの変異ならびに配列番号１と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み；ＳＥＢトキソイドは、配列番号２中のＬ４５Ｒ、Ｙ８９Ａ、およびＹ９４Ａ変異に対応する、野生型ＳＥＢに対する３つの変異ならびに配列番号２と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含み；ＳＥＡ弱毒化トキソイドは、配列番号４のＳＥＡトキソイド中のＬ４８Ｒ、Ｄ７０Ｒ、Ｙ９２Ａ、およびＨ２２５Ａ変異に対応する、野生型ＳＥＡに対する４つの変異ならびに配列番号４と少なくとも９０％同一なアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、ＴＳＳＴ−１トキソイドは、アミノ酸配列の配列番号１を含み；ＳＥＢトキソイドは、配列番号２のアミノ酸配列を含み；かつＳＥＡ弱毒化トキソイドは、アミノ酸配列の配列番号４を含む。
【００７０】
ある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、ＳＡｇ弱毒化トキソイドＳＥＢＬ４５Ｒ／Ｙ８９Ａ／Ｙ９４Ａ（「Ｂ」）、ＳＥＡＬ４８Ｒ／Ｄ７０Ｒ／Ｙ９２Ａ／Ｈ２２５Ａ（「Ａ２２５」）、ＴＳＳＴ−１Ｌ３０Ｒ／Ｄ２７Ａ／Ｉ４６Ａ（「Ｔ」）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。ある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、少なくともＳＥＡＬ４８Ｒ／Ｄ７０Ｒ／Ｙ９２Ａ／Ｈ２２５Ａを含む。ある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、ＴＳＳＴ−１Ｌ３０Ｒ／Ｄ２７Ａ／Ｉ４６Ａ、ＳＥＢＬ４５Ｒ／Ｙ８９Ａ／Ｙ９４Ａ、およびＳＥＡＬ４８Ｒ／Ｄ７０Ｒ／Ｙ９２Ａ／Ｈ２２５Ａのその順序での融合体である「ＴＢＡ２２５」融合体（ｒＴＢＡ２２５；配列番号６）を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。または、オリゴペプチドは、ＳＥＢＬ４５Ｒ／Ｙ８９Ａ／Ｙ９４Ａ、ＳＥＡＬ４８Ｒ／Ｄ７０Ｒ／Ｙ９２Ａ／Ｈ２２５Ａ、およびＴＳＳＴ−１Ｌ３０Ｒ／Ｄ２７Ａ／Ｉ４６Ａのものに対応する弱毒化変異を有し、その際、オリゴペプチドは、配列番号６と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なアミノ酸配列を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。
【００７１】
上述のとおり、ある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、ｒＴＢＡ２２５（配列番号６）であり、これは、ＳＡｇ三重変異体ＴＳＳＴ−１Ｌ３０Ｒ／Ｄ２７Ａ／Ｉ４６Ａ（配列番号１）およびＳＥＢＬ４５Ｒ／Ｙ８９Ａ／Ｙ９４Ａ（配列番号２）およびＳＥＡ四重変異体ＳＥＡＬ４８Ｒ／Ｄ７０Ｒ／Ｙ９２Ａ／Ｈ２２５Ａ（配列番号４）の融合体である。ｒＴＢＡ２２５は、低いスーパー抗原活性を有しながらも、ｒＴＢＡ（配列番号５）の優れた免疫原性を維持している。上述のＳＡｇトキソイドの異なる順序を有する追加の可能な配置が図１に示されている。本開示では、ｒＴＢＡおよびｒＴＢＡ２２５をタグフリー精製するための方法も提供される。
【００７２】
ＳＡｇトキソイドを任意の順序で、リンカーを用いて、または用いずに一緒に連結することができ、それらは、同じでも、または異なってもよい。一部の態様では、多価オリゴペプチドに含まれるＳＡｇトキソイドは、相互に直接融合していてもよい。他の態様では、多価オリゴペプチドに含まれるＳＡｇトキソイドは、リンカーによって会合されていてもよい。可動性のある拡張したコンホメーションもしくはつなげられたエピトープと相互作用することができる二次構造をとる能力に基づいて、または融合ポリペプチドの全溶解度を高める能力に基づいて、またはつなげられたペプチド領域に影響を及ぼす静電効果もしくは水相互作用効果が無いことに基づいて、適切なリンカーを選択することができる。ある特定の態様では、リンカーは、ペプチドリンカーである。ある特定の態様では、本明細書において提供されるとおりの多価オリゴペプチドにおいて使用するためのペプチドリンカーは、少なくとも１個、ただし５０個以下のアミノ酸、例えば、可動性の鎖をもたらす小さなアミノ酸、例えば、グリシン、セリン、アラニン、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。ある特定の態様では、本明細書において提供されるとおりの多価オリゴペプチドにおいて使用するためのリンカーは、（ＧＧＧＳ）ｎまたは（ＧＧＧＧＳ）ｎを含んでもよく、式中、ｎは１〜１０の整数である。融合ペプチドｒＴＢＡ２２５（配列番号６）においてのようなある特定の態様では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎリンカーであり、式中、ｎ＝３である。
【００７３】
ある特定の態様では、多価オリゴペプチドは、アミノ酸配列の配列番号６を含む、それからなる、または本質的にそれからなる。
【００７４】
（表１）ＳＡｇおよび多価オリゴペプチドタンパク質配列
2020537488.tif 000003
2020537488.tif 000004
2020537488.tif 000005
【００７５】
別の態様では、本明細書で提供されるとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドを異種ポリペプチドに結合させることができる。これに限定されないが、安定化、分泌、または簡素化された精製を付与するＮ末端ペプチドまたはＣ末端ペプチド、例えば、ヘキサヒスチジンタグ、ユビキチンタグ、ＮｕｓＡタグ、キチン結合ドメイン、ｏｍｐＴ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ＤｓｂＡ、ＤｓｂＣ、ｃ−ｍｙｃ、ＫＳＩ、ポリアスパラギン酸、（Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ）ｎ、ポリフェニルアラニン、ポリシステイン、ポリアルギニン、Ｂタグ、ＨＳＢタグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、インフルエンザウイルス血球凝集素（ＨＡＩ）、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、ガラクトース結合タンパク質、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、連鎖球菌プロテインＧ、ブドウ球菌プロテインＡ、Ｔ７ｇｅｎｅ１０、アビジン／ストレプトアビジン／Ｓｔｒｅｐタグ複合体、ｔｒｐＥ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、ｌａｃＺ（βガラクトシダーゼ）、Ｈｉｓパッチチオレドキシン、チオレドキシン、ＦＬＡＧ（商標）ペプチド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｓタグ、またはＴ７タグを含む、様々な異種ポリペプチドを使用することができる。例えば、Ｓｔｅｖｅｎｓ、Ｒ．Ｃ．,Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ,８：Ｒ１７７−Ｒ１８５（２０００）を参照されたい。異種ポリペプチドはまた、宿主細胞からの本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドの輸送、移動、処理、および／または精製を容易にする任意のプレ配列および／またはプロ配列、あるいはこれに限定されないが、微生物病原体のＴ細胞エピトープまたは他の免疫原性タンパク質および／またはエピトープをコードする配列を含む任意の有用な免疫原性配列を含んでもよい。
【００７６】
一部の態様では、本明細書に記載のとおり、異種ポリペプチドに接続された多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドは、２つ以上のペプチド領域を含む配列をつなぐペプチドリンカー配列を含んでもよい。適切なペプチドリンカー配列は、可動性のある拡張したコンホメーションもしくはつなげられたエピトープと相互作用することができる二次構造をとる能力に基づいて、または融合ポリペプチドの全溶解度を高める能力に基づいて、またはつなげられたペプチド領域に影響を及ぼす静電効果もしくは水相互作用効果が無いことに基づいて、選択することができる。
【００７７】
一部の態様では、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドが単離される。「単離」ポリペプチドは、その天然環境から取り出されているポリペプチドである。「単離（された）」という用語は、いずれの特定の精製レベルも意味しない。非天然宿主細胞内で発現され、組換えにより産生された本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇは、本開示の目的では単離されたとみなされ、濾過、クロマトグラフィー、遠心分離などによる技法を含む任意の適切な技法によって分離された、分画された、または部分的もしくは実質的に精製されたポリペプチドも同様である。
【００７８】
本明細書で提供されるとおり、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇの産生は、本開示のポリペプチドを作動可能にコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養し、ポリペプチドを回収することによって達成することができる。このような宿主細胞を培養し、ポリヌクレオチドを発現させるための条件の決定は一般的に、宿主細胞および発現系に特異的であり、当業者の知識の範囲内である。同様に、本開示のポリペプチドを回収するための適切な方法は当業者に公知であり、これに限定されないが、クロマトグラフィー、濾過、沈殿、または遠心分離が含まれる。
【００７９】
ＩＩＩ．ポリヌクレオチド
本開示では、本明細書の他の箇所に記載されているとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドをコードする核酸を含む単離ポリヌクレオチドも提供する。ある特定の態様では、本明細書で提供されるとおりの単離ポリヌクレオチドはさらに、本明細書の他の箇所に記載されているとおりのプロモーター、オペレーター、または転写ターミネーターなどの非コード領域を含む。一部の態様では、本開示は本明細書に記載のとおりのポリヌクレオチドに関し、異種核酸をさらに含む。異種核酸は、一部の態様では、本明細書に記載のとおりのポリペプチドと融合した異種ポリペプチドをコードしてもよい。例えば、本明細書に記載のとおりの単離ポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載のとおりのポリペプチドと融合した異種ポリペプチドをコードする追加のコード領域、またはこれに限定されないが、選択マーカー、追加の免疫原、免疫エンハンサーなどの本明細書に記載のとおりのポリペプチドとは別の異種ポリペプチドをコードするコード領域を含んでもよい。
【００８０】
本明細書に記載のポリヌクレオチドを含む発現構築物、ベクター、および／または宿主細胞も提供する。単離ポリヌクレオチドの一例は、ベクター内に含まれる組換えポリヌクレオチドである。ある特定の態様では、ベクターは、発現ベクターである。単離ポリヌクレオチドのさらなる例には、異種宿主細胞内に維持されている組換えポリヌクレオチド、または溶解状態にある（部分的もしくは実質的に）精製されたポリヌクレオチドが含まれる。本開示のある特定の態様では、ポリヌクレオチドは「組換え」である。本開示による単離ポリヌクレオチドまたは核酸はさらに、合成により作製されたこのような分子を含む。本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの純度の相対的な程度は周知の方法によって容易に決定される。
【００８１】
本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇをコードする遺伝子操作されたポリヌクレオチドも本開示の範囲内に含まれる。本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇをコードする核酸の改変は、当業者によって、例えば、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発または新規核酸合成によって容易に達成することができる。
【００８２】
一部の態様は、本明細書の他の箇所に記載されているとおりの多価オリゴペプチドＳＡｇトキソイドをコードする核酸を含み、ポリペプチドをコードするコード領域がコドン最適化されている、単離ポリヌクレオチドを開示する。当業者であれば理解するとおり、様々な核酸コード領域が、遺伝コードの重複のために同じポリペプチドをコードする。任意のポリペプチド鎖のアミノ酸をコードするコドンを含むヌクレオチド配列に偏りがあると、コード領域の配列中にばらつきが生じる。各コドンは３つのヌクレオチドからなり、ＤＮＡを含むヌクレオチドは４つの特定の塩基に限定されるので、６４の起こり得るヌクレオチドの組み合わせがあり、このうちの６１がアミノ酸をコードする（残り３つのコドンはシグナル終結翻訳をコードする）。どのコドンがどのアミノ酸をコードするかを示す「遺伝コード」は、本明細書において表２として転載されている。結果として、多くのアミノ酸が１つより多いコドンによって指定されている。例えば、アミノ酸アラニンおよびプロリンは４種のトリプレットによってコードされ、セリンおよびアルギニンは６種のトリプレットによってコードされる一方で、トリプトファンおよびメチオニンは１種だけのトリプレットによってコードされる。この縮重によって、ＤＮＡによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列が変化することなくＤＮＡ塩基組成が広範囲にわたって変化することが可能になる。
【００８３】
（表２）標準的な遺伝コード
2020537488.tif 000006
【００８４】
使用されるコドンに関わらず、本開示に従ってポリペプチドをコードするあらゆるポリヌクレオチドが本開示の範囲内に該当すると認められるべきである。
【００８５】
多くの生物が、成長しているポリペプチド鎖の中に、特定のアミノ酸の挿入をコードする特定のコドンが用いられるバイアスを示す。生物間のコドン使用頻度の差であるコドン優先またはコドンバイアスは遺伝コード縮重によって与えられ、多くの生物間で詳細に記録されている。
【００８６】
翻訳選択、ＧＣ組成、鎖特異的変異バイアス、アミノ酸保存、タンパク質ハイドロパシー、転写選択、およびＲＮＡ安定性さえ含む種々の要因がコドン使用頻度優先に寄与すると提唱されている。コドン使用頻度を決定する要因の１つは、ゲノムＧＣ組成を形作る変異バイアスである。この要因は、極端な塩基組成を有するゲノム：高ＧＣ含有量を有する種（例えば、グラム陽性細菌）において最も重要である。変異バイアスはコドン使用頻度の遺伝子間差だけでなく、同じゲノム内のコドン使用頻度バイアスも担っている（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ  Ｍ，Ｃｕｒｒ．Ｉｓｓｕｅｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３（４）：９１−９７，２００１）。
【００８７】
コドンバイアスは多くの場合に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関し、その結果として、特に、翻訳されているコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられている。細胞内における選択されたｔＲＮＡの数が圧倒的に多いことは一般的に、ペプチド合成においてコドンが最も高い頻度で用いられることを反映している。したがって、所与の生物において遺伝子が最適に発現するように、コドン最適化に基づいて遺伝子を合わせることができる。
【００８８】
本開示は、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドをコードするコドン最適化コード領域を含むポリヌクレオチドを提供する。コドン使用頻度は、所与の原核または真核生物宿主細胞において最適化発現するように合わせられる。ある特定の態様では、コドン使用頻度は、大腸菌において最適化発現するように合わせられる。
【００８９】
例えば、配列番号７は、ｒＴＢＡ融合タンパク質をコードする大腸菌発現に最適化されたヌクレオチド配列コドンである：
2020537488.tif 000007
【００９０】
例えば、配列番号８は、ｒＴＢＡ２２５融合タンパク質をコードする大腸菌発現に最適化されたヌクレオチド配列コドンである：
2020537488.tif 000008
【００９１】
コドン最適化ポリヌクレオチドは、所与の種の遺伝子における使用に好ましいコドンをＤＮＡ配列に組み込むことによって調製される。本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドをコードするコドン最適化コード領域を含むポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド発現構築物、ベクター、宿主細胞も提供する。
【００９２】
多種多様な動物、植物、および微生物種に利用可能な多数の遺伝子配列があれば、コドン使用頻度の相対頻度を計算することが可能である。コドン使用頻度表は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／（２０１１年１０月１２日に訪れた）において入手可能な「コドン使用頻度データベース（Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ）」において容易に入手することができ、これらの表を多様に適合させることができる（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００」  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２，２０００）。
【００９３】
入手可能な表を利用することによって、当業者であれば、任意の所与のポリペプチド配列に頻度を適用し、所望のポリペプチドをコードするが、所与の種に最適なコドンを使用するコドン最適化コード領域の核酸断片を作製することができる。当業者に周知の標準的かつルーチン的な分子生物学的操作を用いて、前記の方法のいずれかによって設計されたコドン最適化コード領域を合成する多数の選択肢が利用可能である。加えて、遺伝子合成は容易に商業利用することができる。
【００９４】
ＩＶ．ベクターおよび発現系
さらに、本明細書で提供されるとおりのポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。本明細書で使用される場合の「ベクター」という用語は、例えば、異なる遺伝子環境間で輸送するために、または宿主細胞内で発現させるために、所望の配列を例えば、制限およびライゲーションによって挿入することができる多数の任意の核酸を指す。核酸ベクターはＤＮＡでも、またはＲＮＡでもよい。ベクターには、これに限定されないが、プラスミド、ファージ、ファージミド、細菌ゲノム、およびウイルスゲノムが含まれる。クローニングベクターは、宿主細胞内で複製することができ、かつ決定可能な様式でベクターを切断することができ、新たな組換えベクターが宿主細胞内で複製能力を保持するように所望のＤＮＡ配列をライゲートすることができる１つまたは複数のエンドヌクレアーゼ制限部位によってさらに特徴付けられるベクターである。プラスミドの場合、所望の配列の複製は、プラスミドのコピー数が宿主細菌内で増えるときに多数回でも行われてもよいし、または宿主が有糸分裂により複製する前に１つの宿主あたり１回だけ行われてもよい。ファージの場合、複製は溶菌期（ｌｙｔｉｃ  ｐｈａｓｅ）の間に能動的に行われてもよいし、または溶原期（ｌｙｓｏｇｅｎｉｃ  ｐｈａｓｅ）の間に受動的に行われてもよい。ある特定のベクターは、導入された宿主細胞内で自己複製することができる。他のベクターは宿主細胞に導入されたら宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。
【００９５】
適切な宿主と共に使用することができる多種多様な任意の適切なクローニングベクターが当技術分野において公知であり、市販されている。本明細書で使用される場合、「プラスミド」という用語は、遺伝物質が染色体外にあり、場合によっては自己複製する、遺伝物質（すなわち、核酸）で作られた環状二本鎖構築物を指す。本明細書に記載のポリヌクレオチドは環状プラスミド内にあってもよいし、または直線化プラスミド内にあってもよいし、または他の任意の種類のベクター内にあってもよい。ヌクレオチド配列をベクター、例えば、発現ベクターに挿入し、形質転換またはトランスフェクションによって適切な宿主細胞に導入し、発現に適した条件下で培養するための手順は一般的に、当技術分野において公知である。
【００９６】
本開示はさらに、本明細書の他の箇所に記載されているとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。ある特定の態様では、ベクターは、適切な宿主細胞内で、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドを発現することができる発現ベクターである。「発現ベクター」という用語は、本明細書に記載のポリペプチドを発現することができるベクターを指す。すなわち、ベクター配列は、これに限定されないが、プロモーター、オペレーター、転写終結部位、リボソーム結合部位などを含む、ポリペプチドの転写および翻訳を制御する制御配列を含有する。「発現」という用語は、コード配列によってコードされる産物の生物学的生産を指す。ほとんどの場合、コード配列を含むＤＮＡ配列は転写されてメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を形成する。次いで、メッセンジャーＲＮＡは翻訳されて、関連する生物学的活性を有するポリペプチド産物を形成する。また、発現プロセスは、イントロンを除去するスプライシング、および／またはポリペプチド産物の翻訳後処理などの転写ＲＮＡ産物へのさらなる処理工程を伴ってもよい。
【００９７】
ベクター−宿主システムには、これに限定されないが、インビボ、例えば、動物における、またはインビトロ、例えば、細菌もしくは細胞培養のいずれかにおける、細菌、哺乳動物、酵母、昆虫、または植物細胞システムなどのシステムが含まれる。適切な宿主の選択は、本明細書における教示から当業者の範囲内であると考えられる。ある特定の態様では、宿主細胞は、細菌、および昆虫細胞、哺乳動物細胞、または植物細胞である。ある特定の態様では、細菌は、大腸菌である。
【００９８】
宿主細胞は、本開示のベクターで遺伝子操作（感染、形質導入、形質転換、またはトランスフェクション）される。したがって、本開示の一局面は、本明細書に記載のとおりのポリヌクレオチドを含有するベクターを含む宿主細胞に関する。操作された宿主細胞を、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、またはポリヌクレオチドの増幅のために適切に改変された従来の栄養培地中で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に用いられた培養条件であり、当業者に明らかであろう。本明細書で使用される場合の「トランスフェクトする」という用語は、真核細胞がそのゲノムに、プラスミドの形をしたＤＮＡを含むが、これに限定されない単離ＤＮＡを受け入れ、組み込むように誘導される任意の手順を指す。本明細書で使用される場合の「形質転換する」という用語は、真核細胞がそのゲノムに、これに限定されないがプラスミドの形態のＤＮＡを含む単離ＤＮＡを受け入れ、組み込むように誘導される任意の手順を指す。
【００９９】
細菌宿主−発現ベクターシステムには、これに限定されないが、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡで形質転換された原核生物（例えば、大腸菌）が含まれる。一部の態様では、大腸菌と共に用いられるプラスミドは、ＩＰＴＧ誘導を介してＬａｃＩタンパク質によって調節されるＴ７プロモーター駆動システムを使用する。多数の適切なベクターが当業者に公知であり、市販されている。例として次の細菌ベクター：ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＥＴ２８、ｐＢＡＤ、ｐＴｒｃＨＩＳ、ｐＢＲ３２２、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、ｐＱＥ−９（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ｐｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐｂｓｋｓ、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２４３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＢＲ３２２、ｐＰＳ１０、ＲＳＦ１０１０、ｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；ｐＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ｐＬｅｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびｐＵＣプラスミド誘導体が提供される。
【０１００】
適切な発現ベクターは、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドをコードする挿入ヌクレオチド配列に作動可能につなげることができる制御配列を含有する。本明細書で使用される場合、「制御配列」という用語は、宿主細胞による、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドをコードする挿入配列の転写に必要な、または転写の助けとなるヌクレオチド配列、および／または結果として生じた転写物から所望の多価オリゴペプチド、および／またはＳＡｇトキソイドへの宿主細胞による翻訳に必要な、または翻訳の助けとなるヌクレオチド配列を意味する。制御配列には、これに限定されないが、５’配列、例えば、オペレーター、プロモーターおよびリボソーム結合配列ならびに３’配列、例えば、ポリアデニル化シグナルまたは転写ターミネーターが含まれる。制御配列は、エンハンサー配列または上流アクチベーター配列を含んでもよい。
【０１０１】
一般的に、細菌ベクターは、宿主細胞の形質転換を可能にする複製起点および選択マーカー、例えば、大腸菌のアンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン耐性遺伝子、および下流構造配列の転写を誘導する高発現遺伝子由来プロモーターを含む。適切なプロモーターには、これに限定されないが、Ｔ７プロモーター、ラムダ（λ）プロモーター、Ｔ５プロモーター、およびｌａｃプロモーター、または解糖酵素、例えば、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、酸性ホスファターゼ、もしくは熱ショックタンパク質、もしくは誘導性プロモーター様カドミウム（ｐｃａｄ）、およびβラクタマーゼ（ｐｂｌａ）をコードするオペロンに由来するプロモーターが含まれる。
【０１０２】
発現ベクターが選択されたら、本明細書に記載のとおりのポリヌクレオチドをプロモーターの下流に、例えば、ポリリンカー領域にクローニングすることができる。ベクターで適切な細菌株を形質転換し、ＤＮＡを標準的な技法を用いて調製する。ポリヌクレオチド、さらにはベクターに含まれる他の全てのエレメントの方向およびＤＮＡ配列を、制限酵素マッピング、ＤＮＡ配列分析、および／またはＰＣＲ分析を用いて確認する。正しいプラスミドを有する細菌細胞を細胞バンクとして保管することができる。
【０１０３】
Ｖ．免疫原性および医薬組成物
さらに、有効量の本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドまたは本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する組成物、例えば、免疫原性組成物および医薬組成物を開示する。本明細書に記載のとおりの組成物はさらに、例えば、多価ワクチンとして、追加の免疫原性成分、ならびに担体、賦形剤、またはアジュバントを含んでもよい。
【０１０４】
本明細書で提供されるとおりの組成物は、公知の方法に従って製剤化することができる。適切な調製方法は、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ（１９９５）に記載されている。組成物は、これに限定されないが、水溶液、エマルジョン、ゲル、懸濁液、凍結乾燥型、または当技術分野において公知の他の任意の形を含む、様々な形をとってよい。加えて、組成物は、例えば、希釈剤、結合剤、安定剤、および防腐剤を含む、薬学的に許容される添加剤を含有してもよい。製剤化したら、本開示の組成物を対象に直接投与することができる。処置を受ける対象は動物でもよく、特に、ヒト対象を処置することができる。
【０１０５】
本開示の組成物と共に使用することができる担体は当技術分野において周知であり、それには、限定ではないが、例えば、チログロブリン、アルブミン、例えば、ヒト血清アルブミン、破傷風トキソイド、およびポリアミノ酸、例えば、ポリＬ−リジン、ポリＬ−グルタミン酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質などが含まれる。様々な水性担体、例えば、水、緩衝水、０．８％食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などを使用することができる。組成物は従来の周知の滅菌法によって滅菌されてもよいし、または滅菌濾過されてもよい。得られた組成物は、使用のためにそのままで、または凍結乾燥されて包装されてもよく、凍結乾燥された調製物は投与の前に滅菌溶液と混合される。組成物は、生理条件に近づけるための薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調節剤および緩衝剤、張性調節剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどを含有してもよい。
【０１０６】
本明細書で提供されるとおりのある特定の組成物はさらに、例えば、免疫原に対する免疫応答を増強する、保持する、局在させる、または調節するために免疫原性組成物に添加される物質である１種または複数のアジュバントを含む。「アジュバント」という用語は、（１）ある特定の抗原に対する免疫応答を変える、もしくは高める、または（２）薬理学的作用物質の効果を高める、もしくは助ける能力を有する任意の物質を指す。ポリペプチドの発現、抗原性、または免疫原性を高めることができるあらゆる化合物が潜在的アジュバントである。本明細書で使用される場合の「免疫原性担体」という用語は、第２のポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体の免疫原性を増強する、第１の部分、例えば、ポリペプチドまたはその断片、バリアント、もしくは誘導体を指す。
【０１０７】
非常に多様な物質が、様々な機構を介してアジュバント活性を有すると示されてきた。例えば、体液性免疫の増大は典型的には、抗原に対して産生される抗体の力価の大幅な増加によって明らかにされ、Ｔ細胞活性の増加は典型的には、細胞増殖または細胞傷害性またはサイトカイン分泌の増大で現れる。アジュバントはまた、例えば、主として体液性応答すなわちＴｈ２応答を主として細胞性応答すなわちＴｈ１応答に変えることによって免疫応答を変える、または調節することができる。所与の抗原に対する免疫応答は、当業者に周知の、および／または本明細書の他の箇所に記載の様々なイムノアッセイによって試験することができる。
【０１０８】
多数のアジュバントが当業者に熟知されており、非常に多くの参考文献に記載されている。本明細書に記載の組成物において使用することができるアジュバントには、これに限定されないが、不活性担体、例えば、アラム、ベントナイト、ラテックス、およびアクリル粒子；不完全フロイントアジュバント、完全フロイントアジュバント；アルミニウムベースの塩、例えば、水酸化アルミニウム；Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ａｌ（ＯＨ３））；リン酸アルミニウム（ＡｌＰＯ４）；カルシウムベースの塩；シリカ；任意のＴＬＲ生物学的リガンド（複数可）；ＩＤＣ−１００１（ＧＬＡ−ＳＥ；グルコピラノシル脂質アジュバント安定エマルジョンとしても公知）（Ｃｏｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１０．５（１０）：ｐ．ｅ１３６７７；Ｃｏｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２０１１．６（１）：ｐ．ｅ１６３３３）；ＣｐＧ（Ｍｕｌｌｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，２００８．３（８）：ｐ．ｅ２９４０）、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。ある特定の態様では、アジュバントは、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌを含む。アジュバントの量、製剤化方法、および投与方法、全てのパラメータは十分に、当業者が行う範囲内である。
【０１０９】
一部の態様では、本開示の組成物はさらに、例えば、製剤を安定化する、製剤をある特定の組織、例えば、リンパ系組織に標的化する、またはポリペプチド組成物の半減期を延ばすのに役立ち得る、リポソームまたは他の微粒子担体を含む。このような微粒子担体には、エマルジョン、発泡体、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散液、ラメラ層、ｉｓｃｏｍなどが含まれる。これらの調製物では、本明細書に記載のポリペプチドはリポソームまたは他の粒子の一部として組み込まれてもよいか、またはリポソームと併せて送達されてもよい。本開示による使用のためのリポソームは、一般的に、中性および負の電荷をもつリン脂質ならびにコレステロールなどのステロールを含む標準的な小胞形成脂質から形成され得る。リポソームまたは他の粒子懸濁液ならびに本明細書に記載のとおりのポリペプチドを含む組成物は、特に、投与手法、送達されるポリペプチド、および処置を受ける疾患の段階に応じて変化する用量で、静脈内、局所、表面などで投与することができる。
【０１１０】
固体組成物では、例えば、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどを含む従来の無毒の固体担体を使用することができる。経口投与では、一般的に用いられる賦形剤のいずれか、例えば、以前に列挙された担体、および一般的に１０〜９５％の活性成分、すなわち、本明細書に記載のとおりのポリペプチド、多くの場合、２５％〜７５％の濃度の本明細書に記載のとおりのポリペプチドを組み込むことによって、薬学的に許容される無毒の組成物が形成される。
【０１１１】
エアロゾル投与または粘膜投与では、本明細書に記載のとおりのポリペプチドは、超微粒子の形で、任意選択で、界面活性剤ならびに噴射剤および／または粘膜付着剤、例えば、キトサンと共に供給することができる。ある特定の態様では、界面活性剤は薬学的に許容され、一部の態様では、噴射剤に可溶性である。このような薬剤の代表は、６〜２２個の炭素原子を含有する脂肪酸、例えば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸（ｏｌｅｓｔｅｒｉｃ  ａｃｉｄ）、およびオレイン酸と、脂肪族多価アルコールまたはその環式無水物とのエステルまたは部分エステルである。混合エステル、例えば、混合または天然グリセリドを使用することができる。界面活性剤は、組成物の０．１重量％〜２０重量％、一部の態様では０．２５〜５重量％を構成してもよい。通常、組成物の残りは噴射剤であるが、噴射剤が必要なく、それに応じて他のパーセンテージが調節されるアトマイザーを使用してもよい。一部の態様では、免疫原性ポリペプチドを空気力学的に軽い粒子、例えば、米国特許第６，９４２，８６８号または米国特許出願公開第２００５／０００８６３３号に記載の粒子の中に組み込むことができる。担体、例えば、鼻腔内送達ではレシチンも含めることができる。
【０１１２】
本開示はまた、本開示による組成物を生産する方法に関する。一部の態様では、組成物を生産する方法は、（ａ）本開示によるポリペプチドを単離する工程と；（ｂ）単離ポリペプチドにアジュバント、担体、および／または賦形剤を添加する工程とを含む。一部の態様は、ポリペプチドを他のブドウ球菌抗原と組み合わせることをさらに開示する。
【０１１３】
一部の態様は、多価ワクチンを含む。本開示の多価ワクチンは、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイド、または多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドをコードするポリヌクレオチド、ならびに１種または複数の追加の免疫原性成分を含み得る。このような成分は、同じ感染因子、例えば、黄色ブドウ球菌の、または他のブドウ球菌に由来する追加の免疫原でもよいし、または効果的に、都合よく、または経済的に一緒に投与することができる他の感染因子に由来する免疫原でもよい。ある特定の態様では、複数の細菌ビルレンス決定子を標的とすることができる広範囲の毒素に基づく多価ワクチンを作製するために、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドを他の毒素または他の病原性成分に基づくワクチンと組み合わせることができる。他の態様では、単鎖の多価ワクチンを作製し、複数の抗原に対する免疫応答を誘導するために、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドを、他の免疫原性の、生物学的に有意な、または防御的なエピトープを含有するポリペプチドと融合することができる。また別の態様では、Ｔ細胞免疫を誘導するために、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドを１種または複数のＴ細胞エピトープに融合することができる。
【０１１４】
ＶＩ．処置／予防の方法およびレジメン
対象におけるブドウ球菌属感染症、例えば、黄色ブドウ球菌感染症を処置もしくは予防する方法またはブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に起因する疾患を処置もしくは予防する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイド、またはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含む本明細書に記載のとおりの組成物を投与することを含む前記方法も提供する。ある特定の態様では、対象は、動物、例えば、脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば、ヒトである。一部の態様は、黄色ブドウ球菌株に対する免疫応答を誘導する方法であって、免疫応答を必要とする対象に、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイド、またはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含む有効量の組成物を投与することを含む前記方法を含む。
【０１１５】
一部の態様では、予防的に、例えば、ブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌への潜在的もしくは実際の曝露の前に、またはブドウ球菌属関連症状に罹患する前に、健常な動物においてブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に対する免疫を確立または増強し、したがって、疾患を予防する、症状を緩和する、症状を軽減する、または疾患症状の重症度を下げるための予防ワクチンとして、対象には、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイド、またはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含む組成物が投与される。一態様では、疾患は呼吸器疾患、例えば、肺炎である。処置または予防される他の疾患または状態には、これに限定されないが、菌血症、敗血症、皮膚感染症、創傷感染症、心内膜炎、骨感染症および関節感染症、骨髄炎、および／または髄膜炎が含まれる。本明細書に記載のとおりの１つまたは複数の組成物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞はまた、動物の免疫系をさらに刺激し、したがって、曝露に関連した症状を軽減または排除するように、ブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に既に曝露されている対象、またはブドウ球菌属関連症状に既に罹患している対象を処置するために使用することができる。本明細書で定義するとおりの「動物の処置」は、動物における黄色ブドウ球菌症状を予防する、治癒させる、遅らせる、またはその重症度を下げるための、および／または一定の期間にわたってブドウ球菌属の症状を悪化させないための本開示の１つまたは複数の組成物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞の使用を指す。本明細書に記載のとおりの任意の組成物、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞が、ブドウ球菌感染に対する完全な防御を提供すること、または全てのブドウ球菌属関連症状を完全に治癒させるもしくは排除することは、必要とされない。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「治療的免疫および／または予防的免疫を必要とする対象」は、ブドウ球菌属関連症状を処置する、すなわち、予防する、治癒させる、遅らせる、またはその重症度を下げることが望ましい、または一定の期間にわたってブドウ球菌属関連症状を悪化させないことが望ましい対象を指す。本明細書で使用される場合、「免疫応答を必要とする対象」は、Ｓブドウ球菌関連疾患に対する免疫応答（複数可）が望まれる対象を指す。
【０１１７】
本明細書に記載の免疫原性組成物、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドを含む医薬組成物を用いた処置は適切に、他の処置とは別々に、またはそれと併せて行うことができる。
【０１１８】
治療適用において、本開示の組成物、ポリペプチド、またはポリヌクレオチドは、多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイドに対して効果的な自然体液性および／または細胞性応答を誘発して、症状もしくは合併症を治癒させる、またはそれを少なくとも部分的に抑えるために十分な量で、患者に投与される。
【０１１９】
これを達成するために十分な量が、「治療的有効用量」または「単位用量」と定義される。この使用に有効な量は、例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの組成、投与手法、処置を受けている疾患のステージおよび重症度、患者の体重および全身の健康状態、ならびに処方医の判断に依存することとなる。一部の態様では、プライミング投与の後に、ある期間にわたるブースティング投与が続く。
【０１２０】
一部の態様では一般的に、ヒトでは、（治療的投与または予防的投与のための）初回免疫化が投与され、続いて、患者血液中の抗体またはＴリンパ球応答を測定することによって、患者の応答および状態に応じて数週間から数ヶ月にわたってブースティングレジメンに従って同じ用量範囲のブースティング投与量が投与される。
【０１２１】
本明細書に記載のとおりのポリペプチドおよび組成物は一般的に、重篤な病態、すなわち、生命を脅かすか、または潜在的に生命を脅かす状況において使用することができる。このような場合、異物の最小化およびポリペプチドの比較的無毒な性質を考慮して、かなり過剰な量のこれらのポリペプチド組成物を投与することが可能であり、処置を行っている医師が望ましいと感じることがあり得る。
【０１２２】
治療的使用の場合、投与は、黄色ブドウ球菌感染または危険因子の最初の徴候で開始することができる。ある特定の態様では、初回投与の後に、例えば、症状が実質的に軽減するまで、その後、ある期間にわってブースティング投与を続ける。頻繁な感染では、負荷投与、続いて、ブースティング投与が必要となり得る。
【０１２３】
ある特定の態様では、本明細書に記載のとおりの組成物は、本明細書に記載の方法によって対象に送達され、それによって、効果的な免疫応答および／または効果的な治療的免疫応答もしくは予防的免疫応答を達成する。ブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に対する免疫応答、および／またはブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に対する予防的もしくは治療的有効な免疫応答を、このような応答を必要とする動物においてもたらすために十分な量での、所望の組織への所望のポリペプチドの送達および／または発現が得られる限り、任意の投与様式を使用することができる。開示の方法では、本明細書に記載の組成物は、粘膜送達、経皮送達、皮下注射、静脈内注射、経口投与、経肺投与、筋肉内（ｉ．ｍ．）投与によって、または腹腔内注射によって投与することができる。他の適切な投与経路には、これに限定されないが、気管内、経皮、眼内、鼻腔内、吸入、腔内、管内（例えば、膵臓内）、および実質内（すなわち、任意の組織内）投与が含まれる。経皮送達には、これに限定されないが、皮内（例えば、真皮もしくは表皮への投与）、経皮（例えば、経皮）、および経粘膜（すなわち、皮膚もしくは粘膜組織の中へ、またはそれを通過）が含まれる。腔内投与には、これに限定されないが、口腔、膣腔、直腸腔、鼻腔、腹腔、または腸腔（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｃａｖｉｔｙ）への投与、さらには、くも髄腔内（すなわち、脊柱管内）投与、室内（すなわち、脳室内または心室内）投与、動脈内（すなわち、心房内）投与、およびくも膜下（すなわち、脳のくも膜下腔内）投与が含まれる。
【０１２４】
ブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に対する免疫応答、および／またはブドウ球菌属、例えば、黄色ブドウ球菌に対する予防的もしくは治療的有効な免疫応答を、このような応答を必要とする動物においてもたらすために十分な量での所望のポリペプチドの送達および／または発現が得られる限り、任意の投与様式を使用することができる。本明細書に記載のとおりの投与は、例えば、針注射（ｎｅｅｄｌｅ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、または当技術分野において公知の他の送達もしくは装置によるものでよい。
【０１２５】
一部の態様では、本明細書に記載のとおりの多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイド、またはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含む組成物は、ブドウ球菌属感染、例えば、黄色ブドウ球菌感染から動物を防御するために十分な抗体応答または細胞性免疫応答を刺激する。他の態様では、本明細書に記載の多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイド、またはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含む組成物は、体液性および細胞性応答を両方とも刺激し、これらの組み合わせはブドウ球菌属感染、例えば、黄色ブドウ球菌感染から動物を防御するために十分である。一部の態様では、本明細書に記載の多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイド、またはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含む組成物は、自然免疫、抗体免疫、および／または細胞性免疫応答をさらに刺激する。
【０１２６】
一部の態様では、本明細書に記載の多価オリゴペプチドおよび／またはＳＡｇトキソイド、またはそれをコードするポリヌクレオチド、ベクター、もしくは宿主細胞を含む組成物は、黄色ブドウ球菌に対する抗体応答を誘導することができる。ある特定の態様では、Ｔ細胞応答（例えば、Ｔ細胞エピトープ）を誘導する成分が、主として抗体応答を誘導する本明細書に記載のとおりのポリペプチドなどの成分と組み合わされる。
【０１２７】
さらに、対象における黄色ブドウ球菌感染に対する防御的免疫応答および／または治療的免疫応答をもたらす、増強する、または調節するための方法であって、治療的免疫および／または予防的免疫を必要とする対象に、本明細書に記載のとおりの組成物の１つまたは複数を投与することを含む前記方法を開示する。
【０１２８】
本明細書に記載のとおりの組成物は、投与されている動物の生活環の間のいずれの時点でも、動物に投与することができる。ヒトでは、他のワクチンが投与されている間に、例えば、本明細書の他の箇所に記載されているとおりの多価ワクチンとして投与されている間に、本明細書に記載のとおりの組成物の投与を、多くの場合に有利に行うことができる。
【０１２９】
さらに、本明細書に記載のとおりの組成物は、任意の所望の免疫化または投与レジメンにおいて；例えば、単回投与において、または別法では年１回のワクチン接種などの定期ワクチン接種制度の一部として、または同じもしくは異なるポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの投与の前後に本開示の組成物もしくはポリペプチドもしくはポリヌクレオチドが投与されるプライム−ブーストレジメンにおいてのように使用することができる。最近の研究から、プライム−ブーストプロトコルは多くの場合に、ワクチンを投与する適切な方法であることが示されている。プライム−ブーストプロトコルでは、１つまたは複数の本明細書に記載のとおりの組成物を「プライム−ブースト」レジメンにおいて使用することができる。「プライム−ブースト」レジメンの一例は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｙａｎｇ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：７９９−８０３，２００２に見い出すことができる。
【０１３０】
処置を受ける感染症には、これに限定されないが、皮膚、軟部組織、血液、もしくは器官の限局性もしくは全身感染症、または自己免疫疾患が含まれる。処置または予防される特定の疾患または状態には、これに限定されないが、呼吸器疾患、例えば、肺炎、敗血症、皮膚感染症、創傷感染症、心内膜炎、骨および関節感染症、骨髄炎、および／または髄膜炎が含まれる。
【０１３１】
黄色ブドウ球菌感染の多数の動物モデルが当技術分野において公知であり、過度の実験を伴わずに本明細書に開示の方法と共に使用することができる。例えば、抗微生物剤の試験のためには、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）肺炎ハムスターモデルが記載されている（Ｖｅｒｇｈｅｓｅ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ．３４：４９７−５０３（１９８８），Ｋｅｐｈａｒｔ  ＰＡ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２１：３３−９，（１９８８））。さらに、成人における黄色ブドウ球菌誘発性肺炎のモデルである免疫適格性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスが記載されており、これは、ヒト患者における肺炎の臨床的および病理学的特徴をかなり模倣する（Ｂｕｂｅｃｋ−Ｗａｒｄｅｎｂｕｒｇ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．７５：１０４０−４（２００７））。加えて、ＭｃＥｌｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（ＭｃＥｌｒｏｙ  ＭＣ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．６７：５５４１−４（１９９９））に記載のとおり、黄色ブドウ球菌肺炎のラットモデルにおいて、ビルレンスが試験されている。最後に、新療法を評価するための標準化された、かつ再現性のあるＭＲＳＡ誘発性敗血症性肺炎モデルがヒツジにおいて確立されている（Ｅｎｋｈｂａａｔａｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｃｋ．２９（５）：６４２−９（２００８））。
【０１３２】
本開示の実施では、別段に示されていない限り、当技術分野の技能の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、および免疫学の従来法が用いられることとなる。このような技法は文献内で十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：（１９８９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，（１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，（１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８７）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．）；Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ（１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ，Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，（１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，（１９８６）；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ（１９８９）を参照されたい。
【０１３３】
免疫学の一般原則を示した標準的な参考図書には、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋｌｅｉｎ，Ｊ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ  Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８２）；Ｒｏｉｔｔ，Ｉ．，Ｂｒｏｓｔｏｆｆ，Ｊ．ａｎｄ  Ｍａｌｅ  Ｄ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｍｏｓｂｙ（２００１）；Ａｂｂａｓ  Ａ．，Ａｂｕｌ，Ａ．ａｎｄ  Ｌｉｃｈｔｍａｎ，Ａ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄ．５，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（２００５）；およびＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）が含まれる。
【実施例】
【０１３４】
本開示の幅および範囲は、前記のいずれの例示的な態様によっても限定されてはならず、以下の特許請求の範囲およびその均等物にのみ従って定義されなければならない。
【０１３５】
実施例１：ブドウ球菌スーパー抗原トキソイドのｒＴＢＡ２２５三重融合体
ｒＳＥＢの安全性は、第Ｉ相治験を含めて広範に評価されているが、ｒＳＥＡおよびｒＴＳＳＴ−１の安全性は、広範には研究されていない。加えて、３種のスーパー抗原トキソイドの融合体が残留スーパー抗原活性を激化させるかどうかを評価するために、ｒＴＢＡに対する健康人ドナーからのＰＢＭＣの応答を、スーパー抗原活性についての読み出しとしてＩＦＮγ放出を使用して評価した（「ＰＢＭＣ刺激アッセイ」）。
【０１３６】
ＰＢＭＣ刺激アッセイでは、ＰＢＭＣを培養培地中で、９６ウェルプレートの個々のウェル内で、様々な濃度の野生型ＴＳＳＴ−１またはｒＴＢＡなどのトキソイドと共に３７℃および５％ＣＯ２で加湿インキュベーター内でインキュベートした。４８時間の培養後に、プレートを５分間にわたって遠心し、上清を除去した。各ウェル中のＩＦＮγ濃度を、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＥＬＩＳＡキットを製造者指示に従って使用して測定した。誘導されたＩＦＮγの濃度を毒素またはトキソイドの濃度に対してプロットして、ＥＣ５０（５０パーセント有効濃度）を各作用物質について決定した。
【０１３７】
低度、中程度、および高度レスポンダーとして特徴づけられた３人のドナーを用いた。図４に示されているとおり、高濃度では、ｒＴＢＡは、低度レスポンダーで低レベルのＩＦＮ−γ誘導、中程度レスポンダーで中レベル、および高度レスポンダーで高レベルを示したが、これらの応答は、野生型スーパー抗原に対する同じドナーの応答よりもかなり低かった。
【０１３８】
これらの実験は、ｒＴＢＡが多少の残留スーパー抗原活性を維持することを示唆した。さらなる分析が、この活性がｒＳＥＡＬ４８Ｒ／Ｄ７０Ｒ／Ｙ９２Ａの残留活性による一方で、ｒＴＳＳＴＬ３０Ｒ／Ｄ２７Ａ／Ｉ４６Ａは全く不活性であったことを示した。したがって、追加の変異を、ｒＴＢＡのｒＳＥＡ部分に導入した。以前の報告は、ＭＨＣクラスＩＩでのＨ２２５（ＳＥＡ−Ｈ２２５Ａ）結合部位の変異が、Ｔ細胞を刺激するＳＥＡの能力を低下させることを示唆した（Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１８２（３）：７１１−７２０；Ｋｏｚｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊｏｕｒｎａｌ／Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３（２）：１８７−１９６）。変異をＨ２２５Ａ位で、ＷＴ  ＳＥＡ、ｒＳＥＡＬ４８Ｒ／Ｄ７０Ｒ／Ｙ９２Ａ、さらにはｒＴＢＡに導入した。新たな変異体は本明細書では、それぞれＳＥＡＨ２２５Ａ（配列番号１１）、ｒＳＥＡＶａｘ２２５（ＳＥＡＬ４８Ｒ／Ｄ７０Ｒ／Ｙ９２Ａ／Ｈ２２５Ａとも）（配列番号４）、およびｒＴＢＡ２２５（配列番号６）と称され、これらをＰＢＭＣ刺激アッセイで試験した。野生型ＳＥＡ（ＳＥＡＨ２２５Ａ）への単一のＨ２２５Ａ変異の導入は、毒素を弱毒化したが、有意なレベルの残留毒性を残した（図４）。しかしながら、Ｈ２２５ＡとＬ４８Ｒ／Ｄ７０Ｒ／Ｙ９２Ａ変異との組み合わせ（ｒＳＥＡＶａｘ２２５）は、低度および中程度レスポンダー細胞では全く不活性であり、かなりの高濃度で高度レスポンダー細胞でほんのわずかに活性なだけであった（図４）。同様に、ｒＴＢＡが残留毒性を示した一方で、ｒＴＢＡ２２５は、ｒＳＥＡＶａｘ２２５よりもさらに、完全に弱毒化された。これらのデータは、これらの４つの変異がｒＴＢＡおよびｒＳＥＡＶａｘの完全な弱毒化には必要であったことを示している（図４）。
【０１３９】
実施例２：スーパー抗原変異体の融合タンパク質を生成およびタグフリー精製するための方法
トキソイドｒＴＢＡ（配列番号５）およびｒＴＢＡ２２５（配列番号６）の融合体をコードする遺伝子をコドン最適化し、合成し、ｐＥＴ２４ａ（＋）発現ベクターにクローニングし、かつＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌細胞に形質転換した。一晩培養をカナマイシン含有ルリアブロス中で、対数中期培養（６００ｎｍで約０．５ＯＤ）まで展開し、その時点で細胞を約２５℃に冷却し、０．３ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、続いて、２５℃で一晩培養した。翌日、細菌細胞を採取し、秤量し、細胞溶解バッファー（２０ｍＭトリスｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）中に懸濁した。リゾチームを添加し（１ｍｇ／ｍＬ）、細胞を３７℃で３０分間インキュベートした。部分的に溶解させた細胞を音波処理した。細菌細胞溶解を分光光度的に確認した。細胞溶解産物を０．５Ｍ  ＮａＣｌに調整し、常に混合しながら核酸をポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の添加によって沈澱させた。ＰＥＩペレットを遠心によって除去し、トキソイドを含有する上清を硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）沈殿に掛けた。（ＮＨ４）２ＳＯ４ペレットを遠心によって回収し、−８０℃で貯蔵した。
【０１４０】
図２Ａに示されているとおり、次のクロマトグラフィーステップを行った。（ＮＨ４）２ＳＯ４ペレットを再懸濁させ、捕捉カラム平衡化バッファーに脱塩し、澄明にし、Ｐｏｒｏｓ  ５０ＨＳカラムでのクロマトグラフィーに掛けた。カラムを平衡化させ、負荷し、洗浄し、ｐＨ６．５のリン酸バッファー中２５から１，０００ｍＭまでのＮａＣｌの４０カラム体積（ＣＶ）の勾配を用いて溶離した。カラム画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、トキソイド含有画分を決定した。貯留物質を次のカラム平衡化バッファーに透析し、ＢｉｏＲａｄ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（ＨＴＰ）Ｔｙｐｅ  Ｉカラムでクロマトグラフィーに掛けた。カラムを平衡化し、負荷し、洗浄し、かつｐＨ６．８のリン酸バッファー中５０〜１，０００ｍＭのＮａＣｌの４０ＣＶの勾配を用いて溶離した。画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析して、トキソイドを検出した（図２Ｂ）。貯留ＨＴＰ画分を適切な貯蔵バッファーに透析し、滅菌濾過し、分取し、−８０℃で凍結させた。
【０１４１】
実施例３：融合構築物ｒＴＢＡの免疫原性
５匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、１４日間の間隔で３回、Ｓｉｇｍａ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＳ）アジュバントと一緒にｒＴＢＡまたは３種のトキソイドのカクテルのいずれかで免疫化した。これらのマウスからの３５日目の血清を全抗体ＥＬＩＳＡおよび毒素中和（ＴＮＡ）力価について試験した。
【０１４２】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を健常なヒトドナーのヘパリン化血液から、Ｆｉｃｏｌｌ勾配遠心分離によって単離した。単離ＰＢＭＣを、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＲＰＭＩ１６４０中に再懸濁させ、細胞を洗浄し、トリパンブルー排除によって計数し、２×１０６細胞／ｍｌに調整した。この＞９５％の生存率を有する細胞懸濁液７５μｌ（１．５×１０５細胞）を、固定濃度のスーパー抗原と混合された、ワクチン接種された動物からの片対数希釈血清３７．５μｌを含有する９６ウェル平底プレートのウェルに２連で添加した。毒素のみを含む培地を含有するウェルを対照として使用した。培養物を３７℃で、５％ＣＯ２−９５％空気の雰囲気下で４８時間にわたってインキュベートした。細胞を１６００ｘｇで１０分間にわたって遠心し、培養上清を採取し、ＩＦＮγ産生を、製造者プロトコルに従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）によって評価した。プレートを４５０ｎｍで、ＶｅｒｓａＭａｘプレートリーダーを使用して読み取り、データをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  Ｅｘｃｅｌ  ２００７に移して解析した。中和抗体の非存在下で毒素で刺激された細胞は陽性対照として役立ち、０％ＩＦＮγ阻害と判断された。したがって、免疫血清の存在下でのＩＦＮγ産生の阻害は、陽性対照と試料との間の差として計算された。中和作用物質（ヒトモノクローナル抗体）でのＩＣ５０値は、４パラメーターロジスティックモデル（式２０５、ＸＬＦｉｔ  ｖ５．２）を使用して決定した。
【０１４３】
ｒＴＢＡは、３種のトキソイドのカクテルと比較して、ＳＥＢおよびＴＳＳＴ−１へのかなり高い合計ＩｇＧ結合力価、さらには、高い毒素中和（ＴＮＡ）力価を誘導した（図３Ａ）。したがって、３種のトキソイドを１つの分子に融合することは、ワクチンをシンプルにするだけでなく、免疫原性も強化する。
【０１４４】
ＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌまたはＣｐＧ中で製剤化されたｒＴＢＡの免疫原性も比較した。図３Ｂに示されているとおり、両方のアジュバントが、３種すべての毒素に対して非常に高く均等な力価を誘導し、抗体応答の規模は、ＳＡＳアジュバントで達成されるものよりも高かった。２種のアジュバントは、ＳＥＢおよびＴＳＳＴ−１に対する中和抗体の誘導に関しては同等であったが、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌは、ＳＥＡに対して、より強い中和応答を誘導した。
【０１４５】
実施例４：融合構築物ｒＴＢＡ２２５の免疫原性
ｒＴＢＡ２２５の免疫原性をＢａｌｂ／ｃマウスにおいて、ｒＴＢＡと比較して試験して、追加の変異が免疫原性に影響を及ぼすかどうかを決定した。マウスを３回、２０μｇのＳＡｇカクテル（等モル量のそれぞれ個別のトキソイド）、ｒＴＢＡ、またはｒＴＢＡ２２５のいずれかで、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと共に免疫化した。３回目の免疫化の後に、マウス血清を結合および中和力価のために、ＥＬＩＳＡおよび毒素中和アッセイ（ＴＮＡ）によって抗原ＳＥＡ、ＳＥＢおよびＴＳＳＴ−１について試験した。図５に示されているとおり、融合構築物をワクチン接種されたマウスは、３種すべてのスーパー抗原に対して強い合計抗体応答（図５Ａ）および中和抗体応答を有した（図５Ｂ）。これらのデータは、変異の追加が融合ワクチンの免疫原性を低下させなかったことを示している。さらに、図５Ｃに示されているとおり、融合タンパク質ｒＴＢＡ２２５は、前記抗原に含まれないスーパー抗原に対する中和活性を誘導することができる。
【０１４６】
Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ中で製剤化されたＳＡｇトキソイドカクテルは、ＴＳＳＴ−１に対するいずれの抗体応答も誘導することができないが、非常に対照的に、融合タンパク質のｒＴＢＡおよびｒＴＢＡ２２５は強いＴＳＳＴ−１応答を誘導することが観察された（図５Ａの左のパネル）。これらのデータは、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌと共に製剤化するときには、強い免疫応答を誘導するにはＴＳＳＴ−１の融合が必要であったことを示している。合わせたデータは、これが、ＴＳＳＴ−１は単独ではＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌに吸着することができないが、融合タンパク質としてであれば、抗原はＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌに吸着し、したがって、強い抗体応答を誘導し得るためであることを示した。（図６）。
【０１４７】
実施例５：ＳＥＡ、ＳＥＢ、およびＴＳＳＴ−１での毒素暴露に対するｒＴＢＡ２２５ワクチンの防御効力
Ｂａｌｂ／ｃマウスを２０μｇのｒＴＢＡ２２５で３回、アジュバントとしてのＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌと共に免疫化し、続いて、４０μｇ／マウスのＬＰＳによって増強された腹腔内致死量のＳＥＡ（１０μｇ／マウス）、ＳＥＢ（３．３１５μｇ／マウス）またはＴＳＳＴ−１（１０μｇ／マウス）に暴露することによって、ＳＡｇ毒素暴露に対するｒＴＢＡ２２５の防御効力を評価した。マウスの体重および健康スコアを暴露後の５日間にわたってモニターした。図７に示されているとおり、ｒＴＢＡ２２５での免疫化は、ＳＥＢおよびＴＳＳＴ−１暴露に対する１００％の防御ならびにＳＥＡ暴露に対する９０％の防御をもたらした。これらのデータは、それぞれの毒素への暴露に対するｒＴＢＡ２２５の防御効力を実証した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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