(57)【要約】  対象におけるミトコンドリア生合成を促進し、ミトコンドリア機能を改善するための組成物であって、前記組成物は、活性剤を備え、前記活性剤は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシンのアミノ酸と、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸とを含む組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象におけるミトコンドリア生合成を促進し、ミトコンドリア機能を改善するための組成物であって、前記組成物は、活性剤を備え、前記活性剤は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシンのアミノ酸と、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸とを含む組成物。
【請求項２】
クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の合計と、ロイシン、イソロイシン、バリンの分岐鎖アミノ酸にリシンおよびトレオニンを加えた合計との重量比が、０．０５〜０．３、好ましくは０．１〜０．２５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の総量と、前記ロイシン、イソロイシン、バリンの分岐鎖アミノ酸の総量との重量比が、０．１〜０．４、好ましくは０．１５〜０．３５である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
クエン酸と、リンゴ酸およびコハク酸の合計との重量比が、１．０〜４．０、好ましくは１．５〜２．５である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
クエン酸：リンゴ酸：コハク酸の重量比が、１０：１：１〜２：１．５：１．５、好ましくは７：１：１〜１．５：１：１、より好ましくは５：１：１〜３：１：１である、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記活性剤が、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、システインからなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸をさらに有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記活性剤が、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システインおよび任意にチロシンをさらに有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の総モル量と、メチオニン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびトリプトファンの総モル量との比が、１．３５より高い、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
クエン酸、コハク酸、リンゴ酸の３つの酸の総モル量と、リシンおよびトレオニンの総モル量との比が、０．１〜０．７、好ましくは０．１５〜０．５５である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
クエン酸の重量またはモル量が、リンゴ酸およびコハク酸の総重量またはモル量より多い、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ロイシンとクエン酸との重量比が、５〜１、好ましくは２．５０〜３．５０である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記活性剤がアルギニンを含まない、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、１種以上のビタミン類をさらに備え、前記ビタミン類は、好ましくはビタミンＢ群から選択され、より好ましくはビタミンＢ１および／またはビタミンＢ６を備える、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
医薬品で使用するための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
ミトコンドリア機能障害関連疾患の治療および／または予防に使用するための組成物であって、前記ミトコンドリア機能障害関連疾患が肥満である、請求項1から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書は、一般に、アミノ酸を備える組成物に関する。より具体的には、本明細書は、医薬品で使用するための、特にミトコンドリア機能障害に関連する疾患の治療に使用するための、アミノ酸を備える組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、細胞性オルガネラであり、その主な機能は、酸化的リン酸化、すなわち、グルコースまたは脂肪酸の代謝に由来するエネルギーがアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）に変換されるプロセスである。次いで、ＡＴＰを使用して、エネルギーを必要とするさまざまな生合成反応および他の代謝活動が促進される。
【０００３】
ミトコンドリア機能障害は、あらゆる組織に影響を及ぼす可能性があり、種々の組織が関与している程度に応じて、結果的に多種多様な症状を伴う。
【０００４】
ミトコンドリア機能障害から生じる疾患には、例えば、ミトコンドリア膜電位の機能不全に起因したミトコンドリアの膨潤、活性酸素種（ＲＯＳ）またはフリーラジカルの作用などによる酸化ストレスに起因した機能障害、遺伝子変異に起因した機能障害およびエネルギー産生のための酸化的リン酸化メカニズムの機能的欠陥に起因した疾患が含まれ得る。
【０００５】
ミトコンドリアは加齢とともに劣化し、呼吸活動を保てなくなり、それらのＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）に損傷を蓄積し、過剰量の活性酸素種（ＲＯＳ）を産生する。
【０００６】
最近のエビデンスは、アルツハイマー病、パーキンソン病およびハンチントン病などの主要な神経変性疾患ならびに慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に加えて、加齢に伴う代謝および心血管系疾患（アテローム性動脈硬化症）をはじめとするいくつかの疾患におけるミトコンドリア機能障害の関与を示す。
【０００７】
ミトコンドリア機能障害は、肥満ならびに２型糖尿病、高血圧、脂質異常症、心不全、腎疾患および骨粗鬆症をはじめとする関連疾患にも見られる。
【０００８】
注目すべきことに、骨格筋量および骨格強度の不随意の喪失に起因した高齢者の機能低下と自立喪失ならびにいわゆる虚弱症候群の主要な特徴の最も重要な原因の１つとして定義されるサルコペニアは、ミトコンドリア量およびミトコンドリア機能の減少に起因している。例えば悪液質をはじめとするほかの筋肉消耗疾患および筋肉消耗障害が知られている。悪液質または消耗症候群は、体重の意図しない減少、筋萎縮、疲労および脱力感として定義される。悪液質は、癌、エイズ、セリアック病、ＣＯＰＤ、多発性硬化症、関節リウマチ、うっ血性心不全、結核および神経性無食欲症の人に見られる。この状態を予防および／または治療するための薬物または栄養素は発見されていない。
【０００９】
したがって、世界的な肥満の流行および人口の高齢化を考えると、次の未来に最も多い患者は、サルコペニアの肥満老齢対象者である。
【００１０】
肥満ならびにインスリン抵抗性および２型糖尿病などの関連疾患は、今日では、１４億人を超える過体重の成人を伴う大きな健康問題である（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ．ＷＨＯ  Ｍｅｄｉａ  Ｃｅｎｔｒｅ）。その中で、約５億人が肥満であり、５歳未満の４，０００万人の子供が、現在、過体重または肥満に分類されている（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ．ＷＨＯ  Ｍｅｄｉａ  Ｃｅｎｔｒｅ）。
【００１１】
代謝の観点から、肥満が起こるのは、エネルギー摂取量がミトコンドリア機能の低下の結果としてエネルギー消費量（ＥＥ）を超えたときである；それゆえ、エネルギー摂取量を減らすことを目的とした食事介入のほかに、別のアプローチは、例えば運動によってエネルギー消費量を増加させることである。しかしながら、これは単純な作業ではなく、特に、肥満関連筋肉機能障害をしばしば示す肥満者に当てはまる（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００１２】
それゆえ、減量を達成し、この疾患の社会的および医学的影響を減らすことを目的とした新しい治療アプローチの必要性が高まっている。
【発明の概要】
【００１３】
本明細書は、ミトコンドリア機能の増加に、ひいては肥満および関連障害の治療において特に効果的な新しいアミノ酸ベースの組成物を提供することを目的とする。
【００１４】
本明細書によれば、上記の目的は、本開示の不可欠な部分を形成するものとして理解される特許請求の範囲において具体的に想起される主題のおかげで達成される。
【００１５】
本明細書の一実施形態は、対象におけるミトコンドリア生合成を促進し、ミトコンドリア機能を改善するための組成物を提供し、この組成物は、活性剤を備え、上記活性剤は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシンのアミノ酸と、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸とを含む。
【００１６】
１つ以上の実施形態では、組成物の活性剤は、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システインおよびチロシンからなる群から選択される１種以上のアミノ酸をさらに含む。
【００１７】
１つ以上の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、医薬品で使用され得る。
【００１８】
好ましい実施形態では、組成物は、ミトコンドリア機能障害関連疾患の治療および／または予防に使用されてもよく、上記疾患は肥満である。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
これから、添付の図面を参照しながら、例示のみを目的として本発明を説明する。
【００２０】
【図１】異なるアミノ酸ベースの組成物で４８時間（４８時間、２日間）処理したＨＬ−１心筋細胞内で定量ＰＣＲにより分析したミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）の含有量を示す。定量ＰＣＲは３回実行し、ＧＡＰＤＨのゲノムＤＮＡコーディングに対して正規化する（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）。未処理の細胞（ＣＴ）の値は１．０（＊ｐ＜０．０５  ｖｓ．未処理の細胞、♯ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＢＣＡＡｅｍおよびＢ２）とみなす。
【００２１】
【図２】アミノ酸ベースの組成物で２４時間（１日間）処理したＨＬ−１心筋細胞内で定量ＰＣＲにより分析したミトコンドリア生合成マーカー（Ｔｆａｍ、ＰＧＣ−１α、Ｃｙｔ  ｃ）のｍＲＮＡレベルを示す。定量ＰＣＲは３回実行し、ＧＡＰＤＨのゲノムＤＮＡコーディングに対して正規化する（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）。♯ｐ＜０．０５  ｖｓ．未処理の細胞、１．０で表される。♯ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＢＣＡＡｅｍ。
【００２２】
【図３】アミノ酸ベースの組成物で４８時間（２日間）処理したＨＬ−１心筋細胞内で定量ＰＣＲにより分析したミトコンドリア生合成マーカー（Ｔｆａｍ、ＰＧＣ−１α、Ｃｙｔ  ｃ）のｍＲＮＡレベルを示す。定量ＰＣＲは３回実行し、ＧＡＰＤＨに対して正規化する（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）。♯ｐ＜０．０５  ｖｓ．未処理の細胞、１．０で表される。♯ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＢＣＡＡｅｍ。
【００２３】
【図４】分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の異化を調節するタンパク質であるクルッペル様因子１５（ＫＦＬ１５）およびミトコンドリアマトリックス標的タンパク質ホスファターゼ２Ｃファミリーメンバー（ＰＰ２ＣＭ）のｍＲＮＡレベルを示す。ＰＰ２ＣＭおよびＫＦＬ１５は、アミノ酸ベースの組成物で２４時間（１日間）または４８時間（２日間）処理したＨＬ−１心筋細胞内で定量ＰＣＲにより分析した。定量ＰＣＲは３回実行し、ＧＡＰＤＨに対して正規化する（ｎ＝３、平均±ＳＥＭ）。＊ｐ＜０．０５  ｖｓ．未処理の細胞、１．０で表される。♯ｐ＜０．０５  ｖｓ．ＢＣＡＡｅｍおよびＢ２。
【００２４】
【図５】酸素消費速度（ＯＣＲ）の評価を示す。アミノ酸ベースの組成物またはＤＥＴＡ−ＮＯで４８時間処理したＨＬ−１心筋細胞の酸素消費量。＊＊＊＊ｐ＜０．００１  ｖｓ．未処理の細胞；＃＃＃＃ｐ＜０．００１  ｖｓ．ＢＣＡＡｅｍおよびＢ２。
【００２５】
【図６】４８時間（２日間）処理後の不死化褐色脂肪細胞（Ｓｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）でのＵＣＰ１発現を示す。ＣＴ：未処理のコントロール細胞。未処理の細胞（ＣＴ）の値は１．０とみなす。＊有意  ｖｓ．ＣＴ。＃有意ｖｓ．ＢＣＡＡｅｍ；ＲＴ−ＰＣＲは３回実行し、ＧＡＰＤＨに対して正規化する（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ）。
【００２６】
【図７】４８時間（２日間）処理後の不死化褐色脂肪細胞でのＰＧＣ−１α発現を示す。ＣＴ：未処理のコントロール細胞。未処理の細胞（ＣＴ）の値は１．０とみなす。＊有意  ｖｓ．ＣＴ。＃有意  ｖｓ．ＢＣＡＡｅｍ；ＲＴ−ＰＣＲは３回実行し、ＧＡＰＤＨに対して正規化する（ｎ＝３、平均値±ＳＥＭ）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
以下の説明では、実施形態の完全な理解を提供するために、多数の具体的な詳細が示される。実施形態は、１つ以上の具体的な詳細なしに、または他の方法、成分、材料などとともに実施することができる。他の例では、実施形態の態様を不明瞭にすることを避けるために、周知の構造、材料または動作は詳細に示されないか、または説明されない。
【００２８】
本明細書を通して「一実施形態」または「実施形態」という言及は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造または特性が少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通してさまざまな箇所における「一実施形態では」または「実施形態では」という語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造または特性は、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。本明細書に提供される見出しは、便宜上のものにすぎず、実施形態の範囲または意味を解釈するものではない。
【００２９】
１つ以上の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、活性剤を備え、この活性剤は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシンのアミノ酸と、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸の酸とを含む。
【００３０】
欧州登録特許第２１９６２０３号明細書に開示されているアミノ酸を備える組成物が、カロリー制限（ＣＲ）の利点を提供する代替的な解決策として哺乳類に投与された。そのようなベースのアミノ酸組成物（本開示では「ＢＣＡＡｅｍ」と呼ばれる）は、心筋と骨格筋の両方でミトコンドリア生合成の増加を導くことが示されている（Ｄ'Ａｎｔｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。これらの効果は、内皮型一酸化窒素合成酵素（ｅＮＯＳ）の発現と、それに伴う一酸化窒素（ＮＯ）の産生とにより媒介されていた（Ｄ'Ａｎｔｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００３１】
驚くべきことに、本出願の発明者は、特定の酸を、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニンおよびリシンの類似の組合せを備える組成物に加えることにより、細胞ミトコンドリア機能ひいては、エネルギー消費量（ＥＥ）の有意な増加を達成できることを見出した。
【００３２】
本出願の発明者は、中に含まれる酸に関して異なる多くの組成物を試験し、活性剤として、クエン酸、コハク酸およびリンゴ酸と、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニンおよびリシンとの組合せを備える組成物が上掲の目的のために非常に効果的であることを見出した。実際、上述の活性剤を備える組成物および更なる特定のアミノ酸を含む上述の活性剤を備える組成物（以下の表１にリストされている）は、ミトコンドリア生合成およびミトコンドリア機能を促進する点で、以前に試験されたアミノ酸ベースの組成物（ＢＣＡＡｍ）よりも有意に効果的である。
【００３３】
組成物は、心筋細胞株（ＨＬ−１）、すなわち、心機能の生体外モデル（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ）を表す細胞で試験した。これらの心筋細胞の分析から得られた結果を使用して、心不全の予防における新しい組成物の効力を検証することができる。
【００３４】
さらに、本明細書に開示される組成物は、褐色脂肪の生体外モデル（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｏｄｅｌ）である不死化褐色脂肪細胞で試験した。最近の発見では、ヒトにおける褐色脂肪細胞組織（ＢＡＴ）の発生が明らかにされている（Ｔｒａｙｈｕｒｎ，２０１６）。
【００３５】
主に脂肪（トリグリセリド）の形態でエネルギーを貯蔵する器官である白色脂肪組織（ＷＡＴ）とは異なり、褐色脂肪細胞組織（ＢＡＴ）は、食物からのエネルギーを利用して熱を生成（熱発生）することから、エネルギー消費量（ＥＥ）を高める。
【００３６】
このプロセスは、脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１；Ｃａｎｎｏｎ  ａｎｄ  Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄ，２００４）の発現および活性の増加によって、環境（すなわち、低温暴露）と栄養（食事）の両方の手がかりに応答して活性化される。
【００３７】
本出願で提供されるデータは、本明細書に開示される組成物のＵＣＰ１発現の増加における有効性を示し、したがって、この組成物の医薬品における有用性、特に、例えばインスリン抵抗性および２型糖尿病などの肥満および関連障害の治療における有用性が確認される。
【００３８】
１つ以上の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、活性剤を備え、上記活性剤は、クエン酸、コハク酸およびリンゴ酸を、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシンと組み合わせて含み、クエン酸、コハク酸およびリンゴ酸の総量と、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシンのアミノ酸の総量との重量比は、０．０５〜０．３、好ましくは０．１〜０．２５である。
【００３９】
１つ以上の実施形態では、活性剤は、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システイン、チロシンからなる群から選択される１種以上のアミノ酸をさらに備え得る。
【００４０】
更なる実施形態では、本明細書に開示される組成物の活性剤は、アスパラギン酸および／またはオルニチンＬ−アルファケトグルタル酸（ＯＫＧ）も含み得る。
【００４１】
一実施形態によれば、組成物は、活性剤を備え、この活性剤は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システインおよび任意にチロシン、ならびにクエン酸、コハク酸およびリンゴ酸からなる活性剤を含み、上記アミノ酸は、組成物に含まれる唯一のアミノ酸類である。
【００４２】
更なる実施形態では、組成物は、活性剤の重量に対して３５重量％〜６５重量％、好ましくは４２重量％〜５６重量％の量のイソロイシン、ロイシンおよびバリンのアミノ酸を含み得る。
【００４３】
１つ以上の実施形態では、ロイシンとクエン酸との重量比は、５〜１、好ましくは２．５〜３．５である。
【００４４】
更なる実施形態では、クエン酸の重量またはモル量は、リンゴ酸およびコハク酸のそれぞれの重量またはモル量よりも多い。好ましくは、クエン酸の重量またはモル量は、リンゴ酸にコハク酸を加えた総重量または総モル量よりも多い。更なる実施形態では、クエン酸と、リンゴ酸およびコハク酸の合計との重量比は、１．０〜４．０、好ましくは１．５〜２．５である。好ましい実施形態では、クエン酸：リンゴ酸：コハク酸の重量比は、１０：１：１〜２：１．５：１．５、好ましくは７：１：１〜１．５：１：１、より好ましくは５：１：１〜３：１：１である。
【００４５】
本開示のいくつかの実施形態によれば、好ましいイソロイシン：ロイシンのモル比は、０．２〜０．７の範囲、好ましくは０．３０〜０．６０の範囲であり、かつ／またはバリン：ロイシンの好ましい重量比は、０．２〜０．７０の範囲、好ましくは０．３０〜０．６５の範囲である。
【００４６】
更なる実施形態では、トレオニン：ロイシンのモル比は、０．１０〜０．９０の範囲、好ましくは０．２０〜０．７０の範囲であり、かつ／またはリシン：ロイシンの重量比は、０．２０〜１．００の範囲、好ましくは０．４０〜０．９０の範囲にある。
【００４７】
好ましい実施形態では、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の総モル量と、メチオニン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびトリプトファンの総モル量との比は、１．３５よりも高い。
【００４８】
１つ以上の実施形態では、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の合計と、ロイシン、イソロイシン、バリンの分岐鎖アミノ酸の合計との重量比は、０．１〜０．４、好ましくは０．１５〜０．３５である。
【００４９】
更なる実施形態では、ロイシン、イソロイシン、バリンの分岐鎖アミノ酸にトレオニンおよびリシンを加えた総重量は、３つの酸（クエン酸、リンゴ酸、コハク酸）の総重量よりも多い。好ましくは、単一の酸（クエン酸、コハク酸またはリンゴ酸）の重量は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニンおよびリシンの単一アミノ酸のそれぞれの重量よりも少ない。
【００５０】
好ましい実施形態では、クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の合計と、ロイシン、イソロイシン、バリンの分岐鎖アミノ酸にリシンおよびトレオニンを加えた合計との重量比は、０．０５〜０．３０、好ましくは０．１０〜０．２５である。
【００５１】
更なる実施形態では、リシンおよびトレオニンの総モル量は、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸の３つの酸の総モル量よりも多い。好ましくは、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸の３つの酸の総モル量と、リシンおよびトレオニンの総モル量との比は、０．１０〜０．７０、好ましくは０．１５〜０．５５である。
【００５２】
１つ以上の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、ビタミン類をさらに備え、このビタミン類は、好ましくは、ビタミンＢ１および／またはビタミンＢ６などのビタミンＢ群から選択される。
【００５３】
本開示の更なる実施形態では、組成物は、炭水化物、添加剤および／または香味物質を含み得る。
【００５４】
さらに、特に本開示による組成物、具体的には活性剤を調製する場合、アミノ酸であるアルギニンは、好ましくは回避される。
【００５５】
加えて、本明細書に開示される組成物により好ましくは除外される更なるアミノ酸は、セリン、プロリン、アラニンである。
【００５６】
そのようなアミノ酸は、組成物内のある濃度または化学量論比では、逆効果または有害でさえあり得る。
【００５７】
本明細書に開示されるアミノ酸は、それぞれの薬学的に許容される誘導体、すなわち塩で置き換えられ得る。
【００５８】
以下で明らかになるように、本開示による組成物の投与は、ミトコンドリア生合成およびミトコンドリア機能の促進に特に有効である。
【００５９】
好ましい実施形態では、開示される組成物は、ミトコンドリア機能障害関連疾患の治療および／または予防において使用され得、上記疾患は肥満である。
【００６０】
更なる実施形態では、開示される組成物は、ミトコンドリア機能障害関連疾患の治療および／または予防に使用され得、上記疾患は、好ましくはインスリン抵抗性と２型糖尿病とから選択される肥満関連疾患である。
【００６１】
更なる実施形態によれば、アミノ酸組成物は、例えばタンパク質、ビタミン類、炭水化物、天然および人工の甘味料ならびに／または香味物質のような薬学的に許容される賦形剤を備え得る。好ましい実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、ホエータンパク質、マルトデキストリン、フルクトース、カゼイン酸カルシウム、魚油、クエン酸またはその塩、スクラロース、スクロースエステル、ビタミンＤ３、ビタミンＢ群から選択され得る。
【００６２】
経口使用の場合、本明細書に記載の組成物は、錠剤、カプセル、顆粒、ゲル、ゲル化可能な粉末、粉末の形態をとり得る。
【００６３】
組成物により提供されるさまざまなアミノ酸の量および比に関する更なる仕様は、添付の特許請求の範囲に含まれ、本発明に関して本明細書に提供される技術的教示の不可欠な部分を形成する。
【００６４】
［実施例］
表１は、ＨＬ−１細胞および以下に開示される不死化褐色脂肪細胞で試験した異なるアミノ酸ベースの組成物を示す。
【００６５】
具体的には、ＢＣＡＡｅｍ組成物は、欧州登録特許第２１９６２０３号明細書に開示されている組成物である。
【００６６】
「Ｂ２」と呼ばれる組成物は、活性剤として、ＢＣＡＡｅｍ組成物のアミノ酸と同様のアミノ酸の組合せを有するが、さらにクエン酸を含む。そのような組成物は、ビタミンＢ１およびＢ６も含む。
【００６７】
アルファ５（α５）、アルファ６（α６）、アルファ７（α７）と呼ばれる組成物は、アミノ酸およびクエン酸、コハク酸およびリンゴ酸を含む活性剤を備える。さらに、アルファ７組成物の活性剤は、ＯＫＧ（オルニチンＬ−αケトグルタル酸）およびアミノ酸のアスパラギン酸（Ｌ−アスパラギン酸）も備える。
表１
【表１】
2020528402.tif 000002
【００６８】
上記の表１の組成物は、０．８メッシュですべての成分を篩分けすることにより最初に調製することができる。予備混合物を得るために、各成分（総量の１０重量％未満の量）をＬ−リシン塩酸塩の一部と一緒にポリエチレン袋にとり、組成物全体の重量の１０％を得る。次いで、バッグを５分間手で振る。次いで、予備混合物を残りの成分と一緒にミキサー（Ｐｌａｎｅｔａｒｉａ）に入れ、１２０ｒｐｍで１５分間混合して均一な最終組成物を得る。
【００６９】
表１にリストされる組成物をＨＬ−１心筋細胞および不死化褐色脂肪細胞に投与し、ミトコンドリア機能を以下に開示するように評価した。
【００７０】
［方法］
［細胞および処理］
［ＨＬ−１心筋細胞］
ＨＬ−１心筋細胞（Ｗ．Ｃ．Ｃｌａｙｃｏｍｂ，Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｓｃｈｏｏｌからの寄贈品）をフィブロネクチン／ゼラチンコーティングフラスコに播種し、Ｃｌａｙｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８に開示されているように、１００μＭのノルエピネフリン（３０ｍＭのＬ−アスコルビン酸［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］に溶解した１０ｍＭのノルエピネフリン［Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ］ストック溶液から）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１０％ＦＢＳ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加したＣｌａｙｃｏｍｂ培地（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で７０％〜８０％コンフルエントに増殖した。
【００７１】
細胞を、表１に示される１％（ｗ／ｖ）の組成物（Ｃｌａｙｃｏｍｂ培地に溶解）で２４時間または４８時間処理した。
【００７２】
これらの期間の終わりに、ｍＲＮＡおよびＤＮＡを細胞から抽出するか、または細胞を使用して酸素消費量を評価した。コントロール細胞はＣｌａｙｃｏｍｂ培地のみで処理した。
【００７３】
［不死化褐色脂肪細胞］
不死化褐色脂肪細胞を、Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｓｅａｌｅ教授（ペンシルベニア大学、フィラデルフィア、米国）から購入した。
【００７４】
これらはＳＶ４０不死化ＢＡＴ由来細胞株であり、適切な刺激プロトコルにより、成熟した褐色脂肪細胞に分化することができる。
【００７５】
細胞を、１０％ＦＢＳを含むＦ１２／ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社によるＧｉｂｃｏ）で分化のために定期的に維持し、コンフルエントな細胞を、１０％ＦＢＳ＋０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン、１２５ｎＭのインドメタシン、１μＭのデキサメタゾン、２０ｎＭのインスリン、１ｎＭのＴ３を含む培地で処理した。
【００７６】
４８時間後、細胞を、１０％ＦＢＳ、２０ｎＭのインスリンおよび１ｎＭのＴ３を含む培地に切り替えた。
【００７７】
予備実験により、この培地との６〜７日間のインキュベーションがＵＣＰ１および他の褐色脂肪細胞マーカーの発現を誘導するのに十分であることが確認された。特に、褐色脂肪細胞分化のマーカーである１４０ｋＤａのＰＲ（ＰＲＤ１−ＢＦ１−ＲＩＺ１相同）ドメイン含有タンパク質であるＰＲＤＭ１６の発現（Ｓｅａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）が、分化細胞で増加したため、６日後、Ｆ１２／ＤＭＥＭに溶解した表１に示される１％（ｗ／ｖ）の異なる組成物（ＢＣＡＡｅｍ、Ｂ２、α５）で細胞を処理した。コントロール細胞には培地のみを与えた。次いで、４８時間後、細胞を採取し、遺伝子発現解析のためにＲＮＡを抽出した。
【００７８】
［遺伝子発現およびミトコンドリア生合成法］
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、ＨＬ−１心筋細胞および不死化褐色脂肪細胞から総ＲＮＡを単離した；Ｄ'Ａｎｔｏｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）に記載されているように、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、１マイクログラムの総ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。
【００７９】
遺伝子相対レベルを２−ＤＤＣＴとして計算し、ＤＤＣＴは、内部コントロールとしてＧＡＰＤＨを使用して、いずれかの処理のＤＣＴと未治療群のＤＣＴとの差に対応していた。Ｄｅｌｔａ−Ｄｅｌｔａ−ＣＴ（ＤＤＣＴ）アルゴリズムは、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）実験で相対的な遺伝子発現を判定する近似法である（Ｌｉｖａｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ，２００１を参照）。
【００８０】
プライマー（以下の表２に報告されている配列）は、Ｂｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ２．６ソフトウェア（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用して設計した。グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）の発現に伴って値を正規化した。
表２
【表２】
2020528402.tif 000003
【００８１】
アニーリングのＴａ温度（℃）；アクセッション番号ＧＡＰＤＨ：ＮＭ＿００８０８４．３；アクセッション番号Ｃｙｔ  ｃ：ＮＭ＿００７８０８；アクセッション番号ＰＧＣ−１α：ＡＦ０４９３３０；アクセッション番号Ｔｆａｍ：ＮＭ＿００９３６０．４；アクセッション番号ＫＦＬ１５：ＮＭ＿０２３１８４．４；アクセッション番号ＰＰ２ＣＭ：ＮＭ＿１７５５２３．４；Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓミトコンドリア、完全ゲノム：ＮＣ＿００５０８９．１；ｇＤＮＡ（ＧＡＰＤＨ）：ＮＣ＿００００７２．６；１２ＳミトコンドリアｒＲＮＡのプライマーコード（ＮＣ＿００５０９８．１）。ＧＡＰＤＨを使用して、ミトコンドリアＤＮＡを正規化した。
【００８２】
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）分析のために、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）で総ＤＮＡを抽出した。
【００８３】
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）遺伝子に特異的なプライマーを使用してｍｔＤＮＡを増幅し、ＧＡＰＤＨ遺伝子ＤＮＡの増幅によりゲノムＤＮＡに正規化した。Ｂｅａｃｏｎ  Ｄｅｓｉｇｎｅｒ  ２．６ソフトウェア（Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カリフォルニア州パロアルト）を使用して設計されたプライマーを、ｇＤＮＡについて表２に示す。
【００８４】
［統計分析］
すべての遺伝子発現データについて、両側のペアサンプルｔ検定（ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ  ｐａｉｒｅｄ−ｓａｍｐｌｅ  ｔ  ｔｅｓｔ）を使用して、コントロール細胞と処理細胞の値を比較した。ｐ値＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。
【００８５】
［酸素消費量］
表１に示される組成物で処理した１ｍｌの量のＨＬ−１心筋細胞を、ハンクス平衡塩溶液（Ｓｉｇｍａ）に再懸濁し、遠沈してペレット細胞にした。多数のＨＬ−１細胞にはまた、一酸化窒素（ＮＯ）ドナー、特に、ポジティブコントロールとして、ＤＥＴＡ−ＮＯ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミラノ、イタリア国）とも呼ばれるジエチレントリアミン−ＮＯを添加した。
【００８６】
次いで、細胞を呼吸緩衝液（０．３Ｍマンニトール、１０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＫ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）に３．０×１０６／ｍｌの密度で再懸濁した。
【００８７】
チャートレコーダーに接続されたクラーク型酸素電極（Ｒａｎｋ  Ｂｒｏｔｈｅｒｓ  Ｌｔｄ．）を備える気密容器内で、サンプルを３７℃で分析した。
【００８８】
酸素電極は、培養培地中の酸素濃度を３７℃で２００μｍｏｌ／ｌと仮定して較正した。
【００８９】
約１０分間の連続混合で酸素消費量を評価した。次いで、トレースレコーダーの勾配を使用して酸素消費量を計算した。酸素含有量は、細胞の量に応じて異なり得る。したがって、細胞含有量と直接相関するタンパク質含有量は、細胞サンプルの酸素消費量を正規化するために使用した。タンパク質含有量は、ビシンコニン酸タンパク質（ＢＣＡ）アッセイを使用して決定した。
【００９０】
［結果］
［ＨＬ−１心筋細胞ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）］
ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）は、ミトコンドリア質量への影響を検証するために、異なるアミノ酸組成物で処理した細胞内で最初に評価した。
【００９１】
図１に示されるように、α５組成物で処理したＨＬ−１心筋細胞は、コントロール細胞（ＣＴ）、Ｂ２処理細胞、および非常に興味深いことにＢＣＡＡｅｍ組成物で処理した細胞内で評価したｍｔＤＮＡに対してｍｔＤＮＡの最も有意な増加を示した。
【００９２】
［ＨＬ−１心筋細胞ＰＧＣ−１α、ＴｆａｍおよびＣｙｔ  ｃ］
異なるアミノ酸組成物の効果は、ミトコンドリア生合成でも試験した。具体的には、以下のマーカーのＨＬ−１心筋細胞による発現を評価した：
−  ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベーター１−アルファ（ＰＧＣ−１α）、ミトコンドリア生合成の主要制御節因子、
−  ミトコンドリアＤＮＡ転写因子Ａ（Ｔｆａｍ）、ｍｔＤＮＡ複製を調節するｍｔＤＮＡ転写因子、
−  シトクロム複合体（Ｃｙｔ  ｃ）、呼吸複合体タンパク質。
【００９３】
ＢＣＡＡｅｍ組成物、Ｂ２組成物（すなわちＢＣＡＡｅｍ組成物に類似するが、クエン酸も含む組成物）、α５（すなわちアミノ酸以外の活性剤としてクエン酸、コハク酸、リンゴ酸の酸も備える組成物）の投与後に得られた結果の比較により、α５組成物がＨＬ−１心筋細胞内で上記マーカーの発現を促進するのに最も効果的であることを示した。
【００９４】
さらに、経時変化効果が観察された：３つのカルボン酸と一緒に表１にリストされるアミノ酸を備えるα５組成物を４８時間添加した後、実際に、増加は基底値よりもさらに顕著であった。
【００９５】
この増加は、２４時間処理と比較した場合のＴｆａｍのＢＣＡＡｅｍ組成物の値（図２）ならびに４８時間処理後のＰＧＣ−１αおよびＣｙｔ  ｃの値（図３）に対しても統計的に有意であった。
【００９６】
［ＨＬ−１心筋細胞ＫＦＬ１５およびＰＰ２ＣＭ］
クリュッペル様因子１５（ＫＦＬ１５）およびミトコンドリアマトリックス標的タンパク質ホスファターゼ２Ｃファミリーメンバー（ＰＰ２ＣＭ）は、分岐鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の異化を調節するタンパク質である。
【００９７】
ＢＣＡＡ異化の最初のステップは３つのＢＣＡＡに共通しており、ミトコンドリア酵素ＢＣＡＡアミノトランスフェラーゼ（ＢＣＡＴ）および分岐鎖α−ケト酸デヒドロゲナーゼ複合体（ＢＣＫＤＣ）が必要である。
【００９８】
分解の最初で完全に可逆的なステップでは、ミトコンドリアＢＣＡＴは、アミノ基をＢＣＡＡからα−ケトグルタル酸に転移させ、対応する分岐鎖α−ケト酸（ＢＣＫＡ）およびグルタミン酸を形成する。
【００９９】
その後、ＢＣＫＤＣは、ＢＣＫＡのカルボキシル基の脱炭酸を触媒し、対応する分岐鎖アシルＣｏＡエステルを形成する。
【０１００】
この反応は不可逆的であるため、ＢＣＡＡを劣化させる。
【０１０１】
ＢＣＫＤＣ活性は、ＮＡＤＨ、α−ケトイソカプロン酸および分岐鎖アシルＣｏＡエステルによる最終産物のアロステリック阻害により調節される。
【０１０２】
ＢＣＫＤＣ活性は、その調節サブユニットＥ１ａのリン酸化状態により決定される。
【０１０３】
ＢＣＡＡレベルが低い場合、Ｅ１ａは、ＢＣＫＤキナーゼにより過剰リン酸化され、ＢＣＫＤＣ活性の阻害と遊離ＢＣＡＡの保存につながる。
【０１０４】
ＢＣＡＡレベルが高い場合、Ｅ１ａは、ミトコンドリア内のＰＰ２Ｃ（ＰＰ２ＣＭ）と呼ばれるミトコンドリア標的２Ｃ型Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質ホスファターゼまたはタンパク質ホスファターゼ、Ｍｇ２＋／Ｍｎ２＋依存性１Ｋ（ＰＰＭ１Ｋ）により脱リン酸化され、ＢＣＫＤＣの活性化および総ＢＣＡＡの減少につながる（Ｂｉｆａｒｉ  ａｎｄ  Ｎｉｓｏｌｉ，２０１６）。
【０１０５】
さらに、ＫＬＦ１５は、心臓内でのＢＣＡＴ、ＢＣＫＤＣおよびＰＰ２ＣＭ遺伝子発現を増加させることがわかった（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０１０６】
ＰＰ２ＣＭおよびＫＦＬ１５のｍＲＮＡレベルの評価により、α５組成物がＨＬ−１心筋細胞内の基底値を超えてＰＰ２ＣＭおよびＫＬＦ１５のｍＲＮＡレベルを増加させることが示された。この増加は、ＢＣＡＡｅｍ組成物に対してさえも有意であった（図４）。
【０１０７】
これらの結果は、活性剤を備える組成物であって、この活性剤が、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシンと、クエン酸、コハク酸およびリンゴ酸とを含む組成物が、ミトコンドリア機能の促進に非常に効果的であり、代謝的に活性な細胞内のＢＣＡＡｅｍ組成物に対してさえも、ミトコンドリア生合成をより効率的に活性化することを示す。
【０１０８】
［ＨＬ−１心筋細胞の酸素消費量（ＯＣＲ）］
異なる組成物を添加したＨＬ−１細胞の酸素消費量を試験した。ポジティブコントロールとしてジエチレントリアミン−ＮＯ（ＤＥＴＡ−ＮＯ）を添加した細胞も試験した。細胞の酸素消費量の増加に及ぼすＤＥＴＡ−ＮＯの効果は明らかにされている（Ｎｉｓｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＮＯは、褐色脂肪細胞ならびに３Ｔ３−Ｌ１、Ｕ９３７およびＨｅＬａ細胞などの多種多様な細胞でミトコンドリア生合成を引き起こすことがわかった。一酸化窒素のこの効果は、環状グアノシン３'，５'−一リン酸（ｃＧＭＰ）に依存し、ミトコンドリア生合成の主要調節因子であるＰＧＣ−１αの誘導により媒介された（Ｎｉｓｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。
【０１０９】
４８時間のＤＥＴＡ−ＮＯ処理の後、予期していたとおり、酸素消費量の増加が観察された。
【０１１０】
最も注目すべきことに、ＨＬ−１細胞にα５組成物を４８時間添加した場合、酸素消費量の著しい増加量が観察され、したがって、ミトコンドリア活性の上昇が示されたことがわかる（図５）。
【０１１１】
この増加は、Ｂ２およびＢＣＡＡｅｍ組成物の投与後に観察される増加よりも有意に高い。
【０１１２】
［不死化褐色脂肪細胞内でのＵＣＰ１発現］
図６に示されるように、開示される組成物での４８時間の処理は、程度は異なるものの、不死化褐色脂肪細胞内でのＵＣＰ１発現を増加させた。
【０１１３】
異なる混合物の中で、α５が未処理の細胞に対してＵＣＰ１発現を誘導するのに最も効果的であった（ｐ＝０．０４  ｖｓ．ＣＴ）；α５はまた、ＢＣＡＡｅｍ混合物と比較した場合、ＵＣＰ１  ｍＲＮＡをより効率的に増加させた（ｐ＝０．０５）。
【０１１４】
［不死化褐色脂肪細胞内でのＰＧＣ−１α発現］
ＵＣＰ１データによると、α５混合物は、ＰＧＣ−１αの発現も有意に増加させ（ｐ＝０．０１）、したがって、ミトコンドリア生合成の活性化におけるこの組成物の能力が確認される（図７）。注目すべきことに、α５はまた、ＰＧＣ−１α発現の増加の点で、ＢＣＡＡｅｍ組成物よりも効果的であった。
【０１１５】
まとめると、これらの結果は、活性剤を備える組成物であって、この活性剤が、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシン、クエン酸、コハク酸およびリンゴ酸の組合せを含む組成物が、ミトコンドリア生合成、ミトコンドリア機能およびＢＣＡＡ異化の促進の点で有意により活性が高いことを示す。
【０１１６】
ＢＣＡＡ、トレオニンおよびリシン、ならびにクエン酸、コハク酸およびリンゴ酸を備える有効成分を提供する組成物のアルファ６（α６）およびアルファ７（α７）は、同様の利点を達成すると考えられる。
【０１１７】
注目すべきことに、アセチルＣｏＡに加えて、混合物に富むＢＣＡＡの異化が、スクシニルＣｏＡを提供する。この後者は、スクシニル−ＣｏＡシンテターゼ反応を活性化し得、これによりまたコハク酸デヒドロゲナーゼの後続反応の基質としてコハク酸が産生する。
【０１１８】
それゆえ、コハク酸をＢＣＡＡとともに混合物に提供すると、コハク酸デヒドロゲナーゼ反応も促進され、したがって、サイクルがさらに促進されることになる。注目すべきことに、コハク酸デヒドロゲナーゼは、ＦＡＤＨ２を直接提供することから、ミトコンドリアの電子伝達鎖（複合体ＩＩ）の一部でもある。それゆえ、コハク酸によるその刺激は、ミトコンドリアの酸化還元キャリアを直接活性化し、膜電位を増加させ、したがって、プロトン勾配、酸素消費およびＡＴＰ合成を高める。
【０１１９】
同時に、リンゴ酸サプリメントは、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ反応を活性化し、ＮＡＤＨレベルを増加させ得る；これはまた、コハク酸由来ＦＡＤＨ２と同じ方法で、複合体Ｉの基質を提供し、ひいてはＡＴＰレベルを増加させる。一方で、リンゴ酸は、リンゴ酸アスパラギン酸シャトルの活性を刺激し得る。これは、ミトコンドリア内への細胞質ゾルＮＡＤＨの侵入も助長し（さもなければミトコンドリア膜を透過できない）、したがって、ミトコンドリアの酸化に利用できるようになる。これにより、ミトコンドリアの活性および酸素消費量がさらに増加する。
【０１２０】
さらに、炭水化物または脂肪の分解から得られるエネルギーは、ミトコンドリアの酸化的リン酸化のプロセスにより得られる。ＴＣＡ（トリカルボン酸）サイクルによるグルコースおよび脂肪酸の異化は、ＮＡＤＨおよびＦＡＤＨ２分子を提供する。次いで、ＮＡＤＨおよびＦＡＤＨ２からの電子が、ミトコンドリア内膜のタンパク質複合体を介して酸素分子に移動し、このプロセスにより、ミトコンドリア膜を横切るプロトン勾配が生成される。プロトンは、ＡＴＰシンターゼ複合体を介してミトコンドリア内に再進入し、ＡＴＰシンターゼ複合体は、勾配からのエネルギーを使用してアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）を合成する。このようにして、電子輸送はＡＴＰ合成にカップリングされる。
【０１２１】
一方で、ＵＣＰ１は、低温栄養または過剰栄養後にＢＡＴ内で活性化されるミトコンドリア膜貫通タンパク質であり、ミトコンドリアの内膜を横切るプロトン勾配を消散させ、これにより酸化的リン酸化の脱共役が生じる。プロトン勾配に由来するエネルギーはＡＴＰ合成に利用できなくなり、ＵＣＰ１はＡＴＰを形成しないため、プロトン勾配からのエネルギーは熱として解放される。
【０１２２】
ミトコンドリアの生合成と数の増加は、上述の刺激に応答してＢＡＴ内で発生する熱発生プログラムの基礎もなし、このプロセスで重要な役割を果たすのは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマコアクチベーター１−アルファ（ＰＧＣ−１α）、ＵＣＰ１とミトコンドリアの生合成に関与するほかの因子の両方の発現を調節することができる低温誘導性転写コアクチベーターである（Ｓｃａｒｐｕｌｌａ，２０１１）。その結果、ＵＣＰ１活性の刺激およびＢＡＴ内での熱産生は、肥満を逆転させるための潜在的な治療アプローチとなり得、この組織の活性を刺激する薬剤および／または栄養戦略を調べることに大きな関心が存在する。
【０１２３】
また、今日では、ＷＡＴおよびＢＡＴのほかに、３番目のタイプの脂肪が一部のＷＡＴデポで認識され、「ベージュ」または「ブライト」脂肪として説明されていることも注目に値する。ＢＡＴ内で熱発生を引き起こす同じ刺激に応答して、この組織は、ＵＣＰ１などの熱産生タンパク質の発現を高め、典型的な褐色脂肪マーカーも誘導することにより「褐色化」のプロセスを経て、その結果、エネルギー消費量が高まることになる（ＥＥ，Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。それゆえ、これらの発見は、代謝的に不活性な器官としてのＷＡＴの一般的な見解に挑戦し、より可塑性で「薬用の」標的組織の仮説を強化し、したがって、ブライト脂肪を抗肥満治療または栄養によるアプローチの別の潜在的な標的にする。
【０１２４】
全体として、これらの結果は、本明細書に開示される組成物が、ミトコンドリア生合成およびミトコンドリア機能、ＨＬ−１心筋細胞内でのＢＣＡＡ異化作用を増加させ、褐色脂肪細胞マーカー発現を促進できることを示す。
【０１２５】
上記から、本開示による組成物が、ヒトおよび動物における不十分なミトコンドリア機能により区別される病的状態の治療にどのように有用であるかが明らかになる。
【０１２６】
［参考文献］
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【０１３０】
Ｌｉｖａｋ  ＫＪ，Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ  ＴＤ．Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ２（−Ｄｅｌｔａ  Ｄｅｌｔａ  Ｃ（Ｔ））Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２５：４０２−４０８，  ２００１．
【０１３１】
Ｎｉｓｏｌｉ  Ｅ，Ｃｌｅｍｅｎｔｉ  Ｅ，Ｐａｏｌｕｃｃｉ  Ｃ，Ｃｏｚｚｉ  Ｖ，Ｔｏｎｅｌｌｏ  Ｃ，Ｓｃｉｏｒａｔｉ  Ｃ，Ｂｒａｃａｌｅ  Ｒ，Ｖａｌｅｒｉｏ  Ａ，Ｆｒａｎｃｏｌｉｎｉ  Ｍ，Ｍｏｎｃａｄａ  Ｓ，Ｃａｒｒｕｂａ  ＭＯ．Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｓ：  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ：２９９（５６０８）：８９６−９，２００３．
【０１３２】
Ｎｉｓｏｌｉ  Ｅ，Ｔｏｎｅｌｌｏ  Ｃ，Ｃａｒｄｉｌｅ  Ａ，Ｃｏｚｚｉ  Ｖ，Ｂｒａｃａｌｅ  Ｒ，Ｔｅｄｅｓｃｏ  Ｌ，Ｆａｌｃｏｎｅ  Ｓ，  Ｖａｌｅｒｉｏ  Ａ，Ｃａｎｔｏｎｉ  Ｏ，Ｃｌｅｍｅｎｔｉ  Ｅ，Ｍｏｎｃａｄａ  Ｓ，Ｃａｒｒｕｂａ  ＭＯ．Ｃａｌｏｒｉｅ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅＮＯＳ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：３１４−３１７，２００５．
【０１３３】
Ｓｅａｌｅ  Ｐ，Ｋａｊｉｍｕｒａ  Ｓ，Ｙａｎｇ  Ｗ，Ｃｈｉｎ  Ｓ，Ｒｏｈａｓ  ＬＭ，Ｕｌｄｒｙ  Ｍ，Ｔａｖｅｒｎｉｅｒ  Ｇ，Ｌａｎｇｉｎ  Ｄ，Ｓｐｉｅｇｅｌｍａｎ  ＢＭ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｂｒｏｗｎ  ｆａｔ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＰＲＤＭ１６．Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂ．６：３８−５４，２００７
【０１３４】
Ｓｏｎｇ  ＮＪ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｉｃ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｉｃ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１７  Ｊｕｌ  ７；４９（７）：ｅ３５３．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｅｍｍ．２０１７．７０．Ｒｅｖｉｅｗ．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２８６８４８６４．
【０１３５】
Ｓｕｎ  Ｈ，Ｏｌｓｏｎ  ＫＣ，Ｇａｏ  Ｃ，Ｐｒｏｓｄｏｃｉｍｏ  ＤＡ，Ｚｈｏｕ  Ｍ，Ｗａｎｇ  Ｚ，Ｊｅｙａｒａｊ  Ｄ，Ｙｏｕｎ  ＪＹ，Ｒｅｎ  Ｓ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｒａｕ  ＣＤ，Ｓｈａｈ  Ｓ，Ｉｌｋａｙｅｖａ  Ｏ，Ｇｕｉ  ＷＪ，Ｗｉｌｌｉａｍ  ＮＳ，Ｗｙｎｎ  ＲＭ，Ｎｅｗｇａｒｄ  ＣＢ，Ｃａｉ  Ｈ，Ｘｉａｏ  Ｘ，Ｃｈｕａｎｇ  ＤＴ，Ｓｃｈｕｌｚｅ  ＰＣ，Ｌｙｎｃｈ  Ｃ，Ｊａｉｎ  ＭＫ，Ｗａｎｇ  Ｙ．Ｃａｔａｂｏｌｉｃ  Ｄｅｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｂｒａｎｃｈｅｄ−Ｃｈａｉｎ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １３３：２０３８−２０４９，２０１６．
【０１３６】
Ｓｃａｒｐｕｌｌａ  ＲＣ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ＰＧＣ−１  ｆａｍｉｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｎｅｔｗｏｒｋ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１１；１８１３（７）：１２６９−７８
【０１３７】
Ｔｒａｙｈｕｒｎ  Ｐ．Ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ  Ｂｒｏｗｎ  Ａｄｉｐｏｓｅ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ．２０１６；６５（５）：１１５８−６０．
【０１３８】
Ｗｅｌｌｓ  ＧＤ，  Ｎｏｓｅｗｏｒｔｈｙ  ＭＤ，  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｊ，Ｔａｒｎｏｐｏｌｓｋｉ  Ｍ，Ｔｅｉｎ  Ｉ．Ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｃａｎ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ．２００８；３５  （１）：３１−４０．Ｒｅｖｉｅｗ
【０１３９】
Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｖｅｒｗｅｉｇｈｔ．ＷＨＯ  Ｍｅｄｉａ  Ｃｅｎｔｒｅ．Ｕｐｄａｔｅｄ  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１４．Ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｆｒｏｍ  ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｍｅｄｉａｃｅｎｔｒｅ／ｆａｃｔｓｈｅｅｔｓ／ｆｓ３１１／ｅｎ／．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月4日(2020.2.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肥満の治療および／または予防に使用するための組成物であって、前記組成物は、活性剤を備え、前記活性剤は、ロイシン、イソロイシン、バリン、トレオニン、リシンのアミノ酸と、クエン酸、コハク酸、リンゴ酸とを含む組成物。
【請求項２】
クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の合計と、ロイシン、イソロイシン、バリンの分岐鎖アミノ酸にリシンおよびトレオニンを加えた合計との重量比が、０．０５〜０．３、好ましくは０．１〜０．２５である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の総量と、前記ロイシン、イソロイシン、バリンの分岐鎖アミノ酸の総量との重量比が、０．１〜０．４、好ましくは０．１５〜０．３５である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
クエン酸と、リンゴ酸およびコハク酸の合計との重量比が、１．０〜４．０、好ましくは１．５〜２．５である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
クエン酸：リンゴ酸：コハク酸の重量比が、１０：１：１〜２：１．５：１．５、好ましくは７：１：１〜１．５：１：１、より好ましくは５：１：１〜３：１：１である、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記活性剤が、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、チロシン、システインからなる群から選択される少なくとも１のアミノ酸をさらに有する、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記活性剤が、ヒスチジン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、システインおよび任意にチロシンをさらに有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
クエン酸、リンゴ酸、コハク酸の総モル量と、メチオニン、フェニルアラニン、ヒスチジンおよびトリプトファンの総モル量との比が、１．３５より高い、請求項６または７に記載の組成物。
【請求項９】
クエン酸、コハク酸、リンゴ酸の３つの酸の総モル量と、リシンおよびトレオニンの総モル量との比が、０．１〜０．７、好ましくは０．１５〜０．５５である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
クエン酸の重量またはモル量が、リンゴ酸およびコハク酸の総重量またはモル量より多い、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ロイシンとクエン酸との重量比が、５〜１、好ましくは２．５０〜３．５０である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記活性剤がアルギニンを含まない、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、１種以上のビタミン類をさらに備え、前記ビタミン類は、好ましくはビタミンＢ群から選択され、より好ましくはビタミンＢ１および／またはビタミンＢ６を備える、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物を調製する方法。
【国際調査報告】
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