(57)【要約】式（Ｉ）のポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）でグラフトされた分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）；式（ＩＩ）のポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）及びデカンでグラフトされた分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、又は式（ＩＩＩ）のポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）及びアルキル（Ｒ）でグラフトされた分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ） （式中：ｍが、１〜２０の範囲の整数であり；ｎが、１〜２０の範囲の整数であり；式（Ｉ）中、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：１〜１：２０の範囲であり；式（ＩＩ）中、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：１：１〜１：２０：２０の範囲であり；式（ＩＩＩ）中、Ｒが、直鎖状又は分枝鎖状、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ１５アルキルであり；ＰＥＩ−アルキル−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：１：１〜１：２０：２０の範囲である）を含む抗菌性ポリマー又はヒドロゲル及びその形成方法。式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の前記抗菌性ヒドロゲルでコートされた表面を有するデバイスも提供される。
2020514500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）のポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）でグラフトされた分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又は式（ＩＩ）のポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）及びデカンでグラフトされた分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
【化１】
2020514500.tif 000032
（式中：
ｍが、１〜２０の範囲の整数であり、
ｎが、１〜２０の範囲の整数であり、
式（Ｉ）中、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：１〜１：２０の範囲であり、
式（ＩＩ）中、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：１：１〜１：２０：２０の範囲である）
を含有する、抗菌性ポリマー又はヒドロゲル。
【請求項２】
式（Ｉ）中、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：５、１：１０、又は１：２０である、請求項１に記載の抗菌性ポリマー又はヒドロゲル。
【請求項３】
式（ＩＩ）中、ＰＥＩ−デカンのグラフト比が、１：１０である、請求項１に記載の抗菌性ポリマー又はヒドロゲル。
【請求項４】
式（ＩＩ）中、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：１０：１、１：１０：２、１：１０：４、１：１０：８、又は１：１０：１６である、請求項３に記載の抗菌性ポリマー又はヒドロゲル。
【請求項５】
ＰＥＩが、８００〜７５０ＫＤａの平均分子量を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗菌性ポリマー又はヒドロゲル。
【請求項６】
ＰＥＩが、８００、２５Ｋ、又は７５０ＫＤａの平均分子量を有する、請求項５に記載の抗菌性ポリマー又はヒドロゲル。
【請求項７】
請求項１に記載の式（Ｉ）の抗菌性ポリマーを形成するための方法において、
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を脱イオン水に溶解させて、ＰＥＩ溶液を形成する工程と、
アルカリ溶液を前記ＰＥＩ溶液に加えて、溶液混合物を形成する工程と、
クロロ官能化ポリエチレングリコールメタクリレート溶液を、前記溶液混合物に滴下して加えて、最終混合物を形成する工程と、
前記最終混合物を撹拌してから、前記最終混合物を透析する工程と、
前記最終混合物を凍結乾燥させて、式（Ｉ）の前記抗菌性ポリマーを得る工程とを備える、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の式（ＩＩ）の抗菌性ポリマーを形成するための方法において、
デカンでグラフトされたポリエチレンイミン（ＰＥＩ−デカン）を脱イオン水に溶解させて、ＰＥＩ−デカン溶液を形成する工程と、
アルカリ溶液を、前記ＰＥＩ−デカン溶液に加えて、溶液混合物を形成する工程と、
クロロ官能化ポリエチレングリコールメタクリレート溶液を、前記溶液混合物に滴下して加えて、最終混合物を形成する工程と、
前記最終混合物を撹拌してから、前記最終混合物を透析する工程と、
前記最終混合物を凍結乾燥させて、式（ＩＩ）の前記抗菌性ポリマーを得る工程とを備える、方法。
【請求項９】
請求項１に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルを形成するための方法において、
式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ポリマー、架橋剤、及びＵＶ開始剤を、脱イオン水に溶解させて、ヒドロゲル溶液を形成する工程と、
前記ヒドロゲル溶液に紫外線を照射して、前記抗菌性ヒドロゲルを形成する工程とを備える、方法。
【請求項１０】
請求項１に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルのコーティングを表面上に形成するための方法において、
式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ポリマー、架橋剤、及び任意選択的に、ＵＶ開始剤を、脱イオン水に溶解させて、ヒドロゲル溶液を形成する工程と、
前記表面に改質処理を施す工程と、
前記ヒドロゲル溶液を、前記改質された表面上に付着させる工程と、
前記ヒドロゲル溶液に紫外線を照射して、前記抗菌性ヒドロゲルのコーティングを形成する工程とを備える、方法。
【請求項１１】
前記改質処理が、プラズマ処理、オゾン処理、酸化鉄（ＩＩ）処理、又は前記表面上にフリーラジカルを生成する任意の他の処理を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルでコートされた表面を有するデバイス。
【請求項１３】
微生物を殺滅するための方法であって、請求項１に記載の式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ポリマー又はヒドロゲルを、前記微生物と接触させることを含む方法。
【請求項１４】
式（ＩＩＩ）のポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）及びアルキル（Ｒ）でグラフトされた分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
【化２】
2020514500.tif 000033
（式中：
ｍが、１〜２０の範囲の整数であり、
ｎが、１〜２０の範囲の整数であり、
Ｒが、直鎖状又は分枝鎖状、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ１５アルキルであり、
ＰＥＩ−アルキル−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：１：１〜１：２０：２０の範囲である）
を含有する、抗菌性ポリマー又はヒドロゲル。
【請求項１５】
請求項１４に記載の式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマーを形成するための方法において、
アルキルでグラフトされたポリエチレンイミン（ＰＥＩ−アルキル）を脱イオン水に溶解させて、ＰＥＩ−アルキル溶液を形成する工程と、
アルカリ溶液を、前記ＰＥＩ−アルキル溶液に加えて、溶液混合物を形成する工程と、
クロロ官能化ポリエチレングリコールメタクリレート溶液を、前記溶液混合物に滴下して加えて、最終混合物を形成する工程と、
前記最終混合物を撹拌してから、前記最終混合物を透析する工程と、
前記最終混合物を凍結乾燥させて、式（ＩＩＩ）の前記抗菌性ポリマーを得る工程とを備える、方法。
【請求項１６】
請求項１４に記載の式（ＩＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルを形成するための方法において、
式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマー、架橋剤、及びＵＶ開始剤を、脱イオン水に溶解させて、ヒドロゲル溶液を形成する工程と、
前記ヒドロゲル溶液に紫外線を照射して、前記抗菌性ヒドロゲルを形成する工程とを備える、方法。
【請求項１７】
請求項１４に記載の式（ＩＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルのコーティングを表面上に形成するための方法において、
式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマー、架橋剤、及び任意選択的に、ＵＶ開始剤を、脱イオン水に溶解させて、ヒドロゲル溶液を形成する工程と、
前記表面に改質処理を施す工程と、
前記ヒドロゲル溶液を、前記改質された表面上に付着させる工程と、
前記ヒドロゲル溶液に紫外線を照射して、前記抗菌性ヒドロゲルのコーティングを形成する工程とを備える、方法。
【請求項１８】
前記改質処理が、プラズマ処理、オゾン処理、酸化鉄（ＩＩ）処理、又は前記表面上にフリーラジカルを生成する任意の他の処理を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１４に記載の式（ＩＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルでコートされた表面を有するデバイス。
【請求項２０】
微生物を殺滅するための方法において、請求項１４に記載の式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマー又はヒドロゲルを、前記微生物と接触させる工程を備える、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
様々な実施形態は、一般に、抗菌性ポリマー及び抗菌性ヒドロゲル、特に、分枝鎖状ポリエチレンイミンから構成されるポリマー及びヒドロゲル、より具体的には、ポリエチレンイミン−グラフト−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｇｒａｆｔ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）又はポリエチレンイミン−グラフト−デカン−グラフト−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ：ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ−ｇｒａｆｔ−ｄｅｃａｎｅ−ｇｒａｆｔ−ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）から構成されるポリマー及びヒドロゲルに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒドロゲルは、それらの特性が意図される用途に合うように調整され得るため、抗菌性コーティングを作製するのに好適な材料であり得る。接触時に細菌を殺滅する抗菌性ヒドロゲルは、カチオン性ポリマーから合成され得る。
【０００３】
最近、ポリカチオン性ポリマーベースの表面抗菌性コーティングが開発された。全身性抗生物質及び抗菌剤を上回る表面抗菌性コーティングの重要な利点は、ポリカチオン性ポリマーをベースとする抗菌性コーティングが、（１）細菌の耐性がないこと、（２）固定化による持続的有効性を有し、拡散がないこと、（３）活性薬剤の固定化により毒性がないこと、ならびに（４）グラム陽性菌、グラム陰性菌及び真菌生物の両方に対する有効性を有することである。
【０００４】
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、弱塩基性、脂肪族、非毒性合成ポリマーである。その化学結合が、Ｃ−Ｃ及びＣ−Ｎからなるため、ＰＥＩは、高度の生体内安定性を有する。ＰＥＩ高分子における第一級、第二級、及び第三級アミノ基の存在のため、それは、ポリカチオンに変換され得、ポリカチオンは、遺伝子導入、酵素固定化、バイオセンサ、生体高分子の分離及び精製などの生物医学用途において広く使用されている。ＰＥＩは、ポリカチオン性ポリマーであるため、ＰＥＩベースのナノ粒子はまた、抗菌剤用に調製された。しかしながら、抗菌性コーティング用のヒドロゲルとしてのＰＥＩの使用に関する報告はない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本開示は、カチオン性ポリマー又はポリカチオン性ヒドロゲルと接触すると細菌の細胞外皮を破壊する（すなわち、細菌を殺滅する接触活性機構を含む）、カチオン性ポリマー（又はより具体的には、コポリマー）及び高度に微孔性のポリカチオン性ヒドロゲルに基づいている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の一態様によれば、式（Ｉ）のポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）でグラフトされた分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又は式（ＩＩ）のポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）及びデカンでグラフトされた分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
【０００７】
【化１】
2020514500.tif 000003
【０００８】
（式中：
ｍが、１〜２０の範囲の整数であり；
ｎが、１〜２０の範囲の整数であり；
式（Ｉ）中、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：１〜１：２０の範囲であり；
式（ＩＩ）中、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：１：１〜１：２０：２０の範囲である）
を含む抗菌性ポリマー又はヒドロゲルが提供される。
【０００９】
本開示の別の態様によれば、式（Ｉ）の抗菌性ポリマーを形成するための方法であって、
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を脱イオン水に溶解させて、ＰＥＩ溶液を形成すること；
アルカリ溶液をＰＥＩ溶液に加えて、溶液混合物を形成すること；
クロロ官能化ポリエチレングリコールメタクリレート溶液を、溶液混合物に滴下して加えて、最終混合物を形成すること；
最終混合物を撹拌してから、最終混合物を透析すること；及び
最終混合物を凍結乾燥させて、式（Ｉ）の抗菌性ポリマーを得ること
を含む方法が提供される。
【００１０】
本開示のさらに別の態様によれば、式（ＩＩ）の抗菌性ポリマーを形成するための方法であって、
デカンでグラフトされたポリエチレンイミン（ＰＥＩ−デカン）を脱イオン水に溶解させて、ＰＥＩ−デカン溶液を形成すること；
アルカリ溶液を、ＰＥＩ−デカン溶液に加えて、溶液混合物を形成すること；
クロロ官能化ポリエチレングリコールメタクリレート溶液を、溶液混合物に滴下して加えて、最終混合物を形成すること；
最終混合物を撹拌してから、最終混合物を透析すること；及び
最終混合物を凍結乾燥させて、式（ＩＩ）の抗菌性ポリマーを得ること
を含む方法が提供される。
【００１１】
本開示のさらなる態様によれば、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルを形成するための方法であって、
式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ポリマー、架橋剤、及びＵＶ開始剤を、脱イオン水に溶解させて、ヒドロゲル溶液を形成すること；及び
ヒドロゲル溶液に紫外線を照射して、抗菌性ヒドロゲルを形成すること
を含む方法が提供される。
【００１２】
本開示のさらに他の態様によれば、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルのコーティングを表面上に形成するための方法であって、
式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ポリマー、架橋剤、及び任意選択的に、ＵＶ開始剤を、脱イオン水に溶解させて、ヒドロゲル溶液を形成すること；
表面に改質処理を施すこと；
ヒドロゲル溶液を、改質された表面上に付着させること；及び
ヒドロゲル溶液に紫外線を照射して、抗菌性ヒドロゲルのコーティングを形成すること
を含む方法が提供される。
【００１３】
本開示の別の態様によれば、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルでコートされた表面を有するデバイスが提供される。
本開示のさらに別の態様によれば、微生物を殺滅するための方法であって、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ポリマー又はヒドロゲルを、微生物と接触させることを含む方法が提供される。
【００１４】
本開示のさらなる態様によれば、式（ＩＩＩ）のポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）及びアルキル（Ｒ）でグラフトされた分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
【００１５】
【化２】
2020514500.tif 000004
【００１６】
（式中：
ｍが、１〜２０の範囲の整数であり；
ｎが、１〜２０の範囲の整数であり；
Ｒが、直鎖状又は分枝鎖状、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ１５アルキルであり；
ＰＥＩ−アルキル−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：１：１〜１：２０：２０の範囲である）
を含む抗菌性ポリマー又はヒドロゲルが提供される。
【００１７】
本開示の別の態様によれば、式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマーを形成するための方法であって、
アルキルでグラフトされたポリエチレンイミン（ＰＥＩ−アルキル）を脱イオン水に溶解させて、ＰＥＩ−アルキル溶液を形成すること；
アルカリ溶液を、ＰＥＩ−アルキル溶液に加えて、溶液混合物を形成すること；
クロロ官能化ポリエチレングリコールメタクリレート溶液を、溶液混合物に滴下して加えて、最終混合物を形成すること；
最終混合物を撹拌してから、最終混合物を透析すること；及び
最終混合物を凍結乾燥させて、式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマーを得ること
を含む方法が提供される。
【００１８】
本開示のさらに別の態様によれば、式（ＩＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルを形成するための方法であって、
式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマー、架橋剤、及びＵＶ開始剤を、脱イオン水に溶解させて、ヒドロゲル溶液を形成すること；及び
ヒドロゲル溶液に紫外線を照射して、抗菌性ヒドロゲルを形成すること
を含む方法が提供される。
【００１９】
本開示の別のさらなる態様によれば、式（ＩＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルのコーティングを表面上に形成するための方法であって、
式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマー、架橋剤、及び任意選択的に、ＵＶ開始剤を、脱イオン水に溶解させて、ヒドロゲル溶液を形成すること；
表面に改質処理を施すこと；
ヒドロゲル溶液を、改質された表面上に付着させること；及び
ヒドロゲル溶液に紫外線を照射して、抗菌性ヒドロゲルのコーティングを形成すること
を含む方法が提供される。
【００２０】
本開示の別の態様によれば、式（ＩＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルでコートされた表面を有するデバイスが提供される。
本開示のさらに別の態様によれば、微生物を殺滅するための方法であって、式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマー又はヒドロゲルを、微生物と接触させることを含む方法が提供される。
【００２１】
図面中、類似の参照符号は、一般に、様々な図面を通して同じ部品を指す。図面は、必ずしも一定の縮尺で描かれておらず、その代わりに、一般に、様々な実施形態の原理を示すことに重点が置かれている。以下の説明において、本発明の様々な実施形態が、以下の図面を参照して説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】Ｄ２Ｏ中のＰＥＩ−デカンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図２】Ｄ２Ｏ中のＰＥＧＭＡでグラフトされたＰＥＩ−デカンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを示す。
【図３】コンタクトレンズ：（ａ）元のクリアラブ（Ｃｌｅａｒｌａｂ）Ａレンズ、（ｂ）ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：１）コートレンズ、（ｃ）ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：２）コートレンズ、（ｄ）ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：４）コートレンズ、（ｅ）ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：８）及び（ｆ）ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：１６）コートレンズの凍結乾燥された表面モルホロジーのＦＥＳＥＭ画像を示す。
【図４】寒天プレート視覚化によるコーティング抗菌アッセイを示す。細菌は、１時間にわたって試験される表面上でインキュベートし（対照のものは、コーティング表面なしである）、次に、ルリアブロス寒天培地に移し、１８時間にわたってインキュベータ中で、３７℃でさらにインキュベートした。
【図５】ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコートコンタクトレンズ（右）及び対照（左、コーティングなし）と接触させた細菌のモルホロジーを示す。
【図６】ヒト皮膚線維芽細胞におけるＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルのインビトロ生体適合性を示す。トランスウエル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）ＭＴＴ（左）は、両方のヒドロゲルについて９５％超の細胞生存を示し、これは、ヒドロゲルからの最小の浸出があったことを意味する。接触ＭＴＴ（右）は、両方のヒドロゲルについて８５％超の細胞生存を示し、これは、ヒドロゲルが、細胞と接触した状態でかなり適合性であったことを意味する。
【図７】ヒドロゲルの膨潤速度を示す。ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルは両方とも、非常に迅速に膨潤し、最初の時点（１０分）でそれらの最大膨潤の９０％超に達した。ヒドロゲルは、それらの乾燥質量の１１倍超の水を吸収することができた。これらの膨潤速度は、それらが、創傷被覆材に使用するのに非常に好適な材料であることを実証した。
【図８】対照及びＰＥＩ−ＰＥＧＭＡヒドロゲルで処理された場合の、ＭＲＳＡのインビボ細菌ＣＦＵを示す。約１０７ＣＦＵのＭＲＳＡが、３日間の処理後に対照において生存していたが、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡヒドロゲルで処理された場合、生存していなかった。これは、対照と比較してヒドロゲルによる細菌の７超のｌｏｇ減少又は細菌の９９．９９９９９％超の殺滅に相当する。
【図９】実験の０日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１４日目の創傷状態を示す。約６ｍｍの直径の創傷が、０日目に形成され、ＭＲＳＡに感染された。全ての日数で、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡヒドロゲル処理マウスの創傷が、対照マウスの創傷よりわずかに小さく、きれいであった。スケールバー＝５ｍｍ。矢印は、二次的創傷部位を示す。
【図１０】インビボ創傷感染症マウスモデルを示す。感染の２４時間後の処理モデル（ｎ＝６）における１日後の様々な処理創傷及び対照創傷における（Ａ）ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００、（Ｂ）ＣＲ−ＡＢ、（Ｃ）ＣＲ−ＰＡ及び（Ｄ）ＰＡ０１の細菌数。＊は、Ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示す。Ｅ）図Ａ〜Ｄからのｌｏｇ減少データをまとめた表。Ｆ）１日目、３日目、５日目、７日目の様々な処理創傷及び対照創傷（ｎ＝６）におけるＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００の細菌数。
【図１１】ＰＥＩ（２５Ｋ）−ＰＥＧＭＡシリーズ（ｎ＝３）についてのヒドロゲルのゾル含量を示す。８分のＵＶ時間を過ぎて、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡヒドロゲルは、ＰＥＧＭＡグラフト比に応じて約１１〜１７％の、プラトーになったゾル含量を有する。より高いＰＥＧＭＡグラフトは、より高い架橋が起こるためゾル含量を減少させた。
【図１２】ヒドロゲルにおける細菌のイメージングを示す。ａ）ＳＥＭを用いたＰＥＩ（２５Ｋ）−ＰＥＧＭＡ（１：５）ヒドロゲルの断面のモルホロジー。ｂ〜ｃ）ＳＥＭを用いた、ヒドロゲルにおける（ｂ）ＭＲＳＡ及び（ｃ）ＰＡ０１のモルホロジー。黒色の矢印は、細菌破片を表す。ｄ〜ｇ）ライブ／デッド（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ）アッセイを用いたＰＥＩ（２５Ｋ）−ＰＥＧＭＡ（１：５）ヒドロゲルにおける細菌の共焦点像。（ｄ）ＭＲＳＡ対照、（ｅ）ヒドロゲルにおけるＭＲＳＡ、（ｆ）ＰＡ０１対照及び（ｇ）ヒドロゲルにおけるＰＡ０１。緑色（ｄ、ｆ）は、生菌を表す一方、赤色（ｅ、ｇ）は、死菌を表す。
【図１３】ＦＥ−ＳＥＭを用いた、（Ａ）対照ＰＥＧＤＭＡヒドロゲル、対照ヒドロゲルにおける（Ｂ）ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００及び（Ｃ）ＰＡ０１の断面のモルホロジーを示す。ＦＥ−ＳＥＭを用いた、（Ｄ）ＰＥＩヒドロゲル、ＰＥＩヒドロゲルにおける（Ｅ）ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００及び（Ｆ）ＰＡ０１の断面のモルホロジー。ＦＥ−ＳＥＭを用いた、（Ｇ）ＰＤＰヒドロゲル、ＰＤＰヒドロゲルにおける（Ｈ）ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００及び（Ｉ）ＰＡ０１の断面のモルホロジー。差し込み図は、拡大されたモルホロジー（スケールバー＝１μｍ）を示す。矢印は、細菌破片を表す。
【図１４】ヒドロゲルの特徴を示す。Ａ）トランスウエル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）及び接触ＭＴＴアッセイ（ｎ＝３）を用いた、２４時間にわたってＰＥＩ及びＰＤＰヒドロゲルとともにインキュベートした場合のヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ：ｈｕｍａｎ  ｄｅｒｍａｌ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の細胞生存。Ｂ）参照目盛りを伴う、ＰＥＩ及びＰＤＰヒドロゲルの６ｍｍの円板の写真。Ｃ）ＰＥＩ及びＰＤＰヒドロゲル（ｎ＝３）の時間に対する膨潤比（最終質量／初期質量）。Ｄ）ライブ／デッド（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ）アッセイを用いた、ＰＥＩヒドロゲル表面における（ｉ）ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００及び（ｉｉ）ＰＡ０１の共焦点像。Ｅ）ライブ／デッド（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ）アッセイを用いた、対照（ＰＥＧＤＭＡ）ヒドロゲル表面における（ｉ）ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００及び（ｉｉ）ＰＡ０１の共焦点像。ヒドロゲルにおける細菌のインキュベーション時間は１時間である。緑色は、生菌を示す一方、赤色は、死菌を示す。
【図１５】０分、２分でのＰＥＩ及びＰＤＰヒドロゲルにおける水の接触角を示す。
【図１６】インビボ予防モデルのための全創傷治癒試験を示す。Ａ）感染の０＋時間後の処理モデルについてのｌｏｇ減少データをまとめた表。Ｂ）初期創傷サイズ（ｎ＝６）のパーセンテージとしての様々な日数における感染対照及びＰＥＩヒドロゲル処理創傷の創傷サイズ。Ｃ）様々な日数における感染対照及びＰＥＩヒドロゲル処理創傷の創傷写真。スケールバー＝５ｍｍ。黒色の矢印は、二次的感染部位を示す。Ｄ）３日目の感染対照の創傷及びＰＥＩヒドロゲル処理創傷における炎症の程度を示す創傷床の傍らの組織のＨ＆Ｅ染色。黒色の矢印は、暗色の点によって示される炎症部位を示す。スケールバー＝３００μｍ。Ｅ）ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００及びＰＡ０１感染マウス（ｎ＝６）を用いた、３日間の処理後の創傷におけるＣＤ１１ｂ＋細胞のパーセンテージ。ＣＤ１１ｂ＋細胞のパーセンテージは、皮膚の炎症の程度に正比例する。＊は、Ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を示す。
【図１７】細菌対照及びヒドロゲル上で処理された細菌において行われたライブ／デッド（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ）アッセイを示す。緑色（すなわち対照）は、生菌を示す一方、赤色（すなわちヒドロゲル）は、死菌を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下の詳細な説明は、本発明が実施され得る具体的な詳細及び実施形態を例示として示す添付の図面を示す。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施するのを可能にするのに十分に詳細に記載される。他の実施形態が、用いられてもよく、構造的、論理的、及び化学的な変更が、本発明の範囲から逸脱せずに行われ得る。様々な実施形態は、必ずしも相互に排他的ではなく、ある実施形態を、１つ又は複数の他の実施形態と組み合わせて、新たな実施形態を形成することができる。
【００２４】
ヒドロゲルは、高度に吸収性であり、かつ高い含水量を含む、高度に親水性のポリマー鎖の網目構造である。ヒドロゲルは、それらの膨潤能力及び構造を制御するために、共有結合的に又は非共有結合的に架橋された単一又は複数のモノマーから構成され得る。これらの膨潤能力、構造、強度及び含水量は、ｐＨ、温度、又はイオン強度によって影響され得る。
【００２５】
本開示は、抗菌活性を呈することが示される、カチオン性ポリマーで形成されるポリカチオン性ヒドロゲルに関する。ポリカチオン性ヒドロゲル又はカチオン性ポリマーは、抗菌能力を与えるために表面に固定化又は他の形でコートされ得る。固定化されたポリカチオン性ヒドロゲル又はカチオン性ポリマーの抗菌作用は、負荷電リン脂質と強く相互作用するそれらの能力に起因し得、それにより、静電相互作用が、標的細胞膜への最初の結合に影響を与えるのを可能にし、次に、ポリマーにおける疎水性部分が、細菌細胞膜の内側疎水性コアと相互作用して、完全性の破壊及びそれに続く細胞死をもたらす。したがって、表面電荷密度及び疎水性が、表面コーティングの抗菌活性に影響を与える主な要因である。イミノ基のｐＫａ値が、約１０〜１１であるため、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、生理環境溶液（ｐＨ約７．２）中で正荷電分子である。
【００２６】
特に、ＰＥＩ高分子の骨格上に第一級、第二級、及び第三級アミノ基を含有する分枝鎖状ＰＥＩが、本明細書において説明される。
したがって、本開示の一態様によれば、式（Ｉ）のポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）でグラフトされた分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）又は式（ＩＩ）のポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）及びデカンでグラフトされた分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
【００２７】
【化３】
2020514500.tif 000005
【００２８】
（式中：
ｍが、１〜２０の範囲の整数であり；
ｎが、１〜２０の範囲の整数であり；
式（Ｉ）中、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：１〜１：２０の範囲であり；
式（ＩＩ）中、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：１：１〜１：２０：２０の範囲である）
を含む抗菌性ポリマー又はヒドロゲルが提供される。
【００２９】
当業者は、式（Ｉ）中、分枝鎖状ＰＥＩが、ポリエチレングリコールメタクリレート含有部分でグラフトされた主鎖又は骨格中に１つの第三級アミノ基を含有する（本明細書においてＰＥＩ−ＰＥＧＭＡと表される）ことを容易に認識するであろう。カチオン性ＰＥＩは、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡがＵＶ重合性になることを可能にするようにＰＥＧＭＡでグラフトされた。ＰＥＧＭＡは、ＰＥＩに改質後特性を与えるだけでなく、哺乳類細胞との生体適合性も改善し得る。
【００３０】
式（Ｉ）中、グラフト比は、ＰＥＩ上にグラフトされたＰＥＧＭＡ部分の数（又は密度）を示す。ＰＥＧＭＡ部分の数は、１〜２０の範囲であり得る。言い換えると、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡのグラフト比は、１：１〜１：２０の範囲である。様々な実施形態において、１つのＰＥＩ上にグラフトされたＰＥＧＭＡ部分の数は、５、１０、あるいは２０であり得る。好ましい実施形態において、１つのＰＥＩ上にグラフトされたＰＥＧＭＡ部分の数は、５である。
【００３１】
式（ＩＩ）の抗菌性ポリマー又はヒドロゲルは、式（Ｉ）の拡張又は変形であり、ここで、式（Ｉ）について上述されるグラフトされたＰＥＧＭＡ部分に加えて、ＰＥＩ上にグラフトされたさらに別の部分がある。式（ＩＩ）中のこの他の部分は、アルキル基であってもよく、特に、デカンが、ＰＥＩ上にグラフトされる。
【００３２】
上述されるように、カチオン性ポリマー又はポリカチオン性ヒドロゲルの疎水性は、表面コーティングの抗菌活性に影響を与える１つの主な要因である。したがって、デカンなどのアルキル基が、疎水性を与えるように親水性ＰＥＩ上に意図的にグラフトされて、抗菌活性を改善する。本開示の範囲が、デカンであるアルキル基に限定されないことが、当業者によって理解され、認識されるべきである。例えば、Ｃ５〜Ｃ１５アルキル基が疎水性を与えて、抗菌活性を改善する限り、直鎖状又は分枝鎖状、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ１５アルキル基が、親水性ＰＥＩ上にグラフトされ得る。Ｃ４以下のアルキル基は、ＰＥＩ−アルキルを形成するために化学反応に関与するには低過ぎる沸点を有する。反応は、約８０℃で行われ得るため、これらのアルキル基は、反応に関与する代わりに単に還流され得る。また、それらは、過度に疎水性ではなく、抗菌特性の顕著な向上を有することはない。一方、Ｃ１６以上のアルキル基は、過度に疎水性であり、ポリマーの水への溶解度を大幅に低下させることがあり、ひいてはヒドロゲル溶液が、形成されないことがある。
【００３３】
式（ＩＩ）中、グラフト比は、ＰＥＩ上にグラフトされたデカン部分の数（又は密度）を示す。デカン部分の数は、１〜２０の範囲であり得る。言い換えると、ＰＥＩ−デカンのグラフト比は、１：１〜１：２０の範囲である。好ましい実施形態において、１つのＰＥＩ上にグラフトされたデカン部分の数は、１０である。
【００３４】
式（ＩＩ）中、グラフト比は、ＰＥＩ上にグラフトされたＰＥＧＭＡ部分の数（又は密度）をさらに示す。ＰＥＧＭＡ部分の数は、１〜２０の範囲であり得る。言い換えると、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡのグラフト比は、１：１〜１：２０の範囲である。様々な実施形態において、１つのＰＥＩ上にグラフトされたＰＥＧＭＡ部分の数は、１、２、４、８、あるいは１６であり得る。好ましい実施形態において、１つのＰＥＩ上にグラフトされたＰＥＧＭＡ部分の数は、１６である。
【００３５】
様々な実施形態において、抗菌性ポリマー又はヒドロゲルは、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ（１：５）、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ（１：１０）、又はＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ（１：２０）であり得、ここで、括弧内の数字は、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡの比率を示す。
【００３６】
様々な実施形態において、抗菌性ポリマー又はヒドロゲルは、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：１）、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：２）、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：４）、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：８）、又はＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：１６）であり得、ここで、括弧内の数字は、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡの比率を示す。
【００３７】
様々な実施形態において、ＰＥＩは、８００〜７５０ＫＤａの平均分子量を有する。例えば、ＰＥＩは、８００、２５Ｋ、又は７５０ＫＤａの平均分子量を有し得る。好ましい実施形態において、ＰＥＩは、２５ＫＤａの平均分子量を有し得る。
【００３８】
本開示の別の態様によれば、式（Ｉ）の抗菌性ポリマーを形成するための方法であって、
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を脱イオン水に溶解させて、ＰＥＩ溶液を形成すること；
アルカリ溶液をＰＥＩ溶液に加えて、溶液混合物を形成すること；
クロロ官能化ポリエチレングリコールメタクリレート溶液を、溶液混合物に滴下して加えて、最終混合物を形成すること；
最終混合物を撹拌してから、最終混合物を透析すること；及び
最終混合物を凍結乾燥させて、式（Ｉ）の抗菌性ポリマーを得ること
を含む方法が提供される。
【００３９】
本開示のさらに別の態様によれば、式（ＩＩ）の抗菌性ポリマーを形成するための方法であって、
デカンでグラフトされたポリエチレンイミン（ＰＥＩ−デカン）を脱イオン水に溶解させて、ＰＥＩ−デカン溶液を形成すること；
アルカリ溶液を、ＰＥＩ−デカン溶液に加えて、溶液混合物を形成すること；
クロロ官能化ポリエチレングリコールメタクリレート溶液を、溶液混合物に滴下して加えて、最終混合物を形成すること；
最終混合物を撹拌してから、最終混合物を透析すること；及び
最終混合物を凍結乾燥させて、式（ＩＩ）の抗菌性ポリマーを得ること
を含む方法が提供される。
【００４０】
本開示のさらなる態様によれば、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルを形成するための方法であって、
式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ポリマー、架橋剤、及びＵＶ開始剤を、脱イオン水に溶解させて、ヒドロゲル溶液を形成すること；及び
ヒドロゲル溶液に紫外線を照射して、抗菌性ヒドロゲルを形成すること
を含む方法が提供される。
【００４１】
本開示のさらに他の態様によれば、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルのコーティングを表面上に形成するための方法であって、
式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ポリマー、架橋剤、及び任意選択的に、ＵＶ開始剤を、脱イオン水に溶解させて、ヒドロゲル溶液を形成すること；
表面に改質処理を施すこと；
ヒドロゲル溶液を、改質された表面上に付着させること；及び
ヒドロゲル溶液に紫外線を照射して、抗菌性ヒドロゲルのコーティングを形成すること
を含む方法が提供される。
【００４２】
様々な実施形態において、改質処理は、プラズマ処理、オゾン処理、酸化鉄（ＩＩ）処理、又は表面上にフリーラジカルを生成する任意の他の処理を含み得る。特定の実施形態において、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルのコーティングを表面上に形成するための上記の方法におけるＵＶ開始剤の使用は、改質処理中に生成されるフリーラジカルが、抗菌性ヒドロゲルのコーティングを形成するためのその後の重合プロセスを助けるため、必要とされないことがある。
【００４３】
本開示の別の態様によれば、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルでコートされた表面を有するデバイスが提供される。
本開示のさらに別の態様によれば、微生物を殺滅するための方法であって、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ポリマー又はヒドロゲルを、微生物と接触させることを含む方法が提供される。
【００４４】
本開示のさらなる態様によれば、式（ＩＩＩ）のポリ（エチレングリコール）メタクリレート（ＰＥＧＭＡ）及びアルキル（Ｒ）でグラフトされた分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）
【００４５】
【化４】
2020514500.tif 000006
【００４６】
（式中：
ｍが、１〜２０の範囲の整数であり；
ｎが、１〜２０の範囲の整数であり；
Ｒが、直鎖状又は分枝鎖状、置換又は非置換Ｃ５〜Ｃ１５アルキルであり；
ＰＥＩ−アルキル−ＰＥＧＭＡのグラフト比が、１：１：１〜１：２０：２０の範囲である）
を含む抗菌性ポリマー又はヒドロゲルが提供される。
【００４７】
本開示の別の態様によれば、式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマーを形成するための方法であって、
アルキルでグラフトされたポリエチレンイミン（ＰＥＩ−アルキル）を脱イオン水に溶解させて、ＰＥＩ−アルキル溶液を形成すること；
アルカリ溶液を、ＰＥＩ−アルキル溶液に加えて、溶液混合物を形成すること；
クロロ官能化ポリエチレングリコールメタクリレート溶液を、溶液混合物に滴下して加えて、最終混合物を形成すること；
最終混合物を撹拌してから、最終混合物を透析すること；及び
最終混合物を凍結乾燥させて、式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマーを得ること
を含む方法が提供される。
【００４８】
本開示のさらに別の態様によれば、式（ＩＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルを形成するための方法であって、
式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマー、架橋剤、及びＵＶ開始剤を、脱イオン水に溶解させて、ヒドロゲル溶液を形成すること；及び
ヒドロゲル溶液に紫外線を照射して、抗菌性ヒドロゲルを形成すること
を含む方法が提供される。
【００４９】
本開示の別のさらなる態様によれば、式（ＩＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルのコーティングを表面上に形成するための方法であって、
式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマー、架橋剤、及び任意選択的に、ＵＶ開始剤を、脱イオン水に溶解させて、ヒドロゲル溶液を形成すること；
表面に改質処理を施すこと；
ヒドロゲル溶液を、改質された表面上に付着させること；及び
ヒドロゲル溶液に紫外線を照射して、抗菌性ヒドロゲルのコーティングを形成すること
を含む方法が提供される。
【００５０】
様々な実施形態において、改質処理は、プラズマ処理、オゾン処理、酸化鉄（ＩＩ）処理、又は表面上にフリーラジカルを生成する任意の他の処理を含み得る。
本開示の別の態様によれば、式（ＩＩＩ）の抗菌性ヒドロゲルでコートされた表面を有するデバイスが提供される。
【００５１】
本開示のさらに別の態様によれば、微生物を殺滅するための方法であって、式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマー又はヒドロゲルを、微生物と接触させることを含む方法が提供される。
【００５２】
明瞭さ及び簡潔さのために、式（Ｉ）又は式（ＩＩ）の抗菌性ポリマー又はヒドロゲルに関する上記の説明が、必要に応じて、式（ＩＩＩ）の抗菌性ポリマー又はヒドロゲルに適用され、本明細書において繰り返されないことが理解されるべきである。
【００５３】
本発明が、容易に理解され、実際に実行され得るために、特定の実施形態が、以下の非限定的な例によってここで説明される。
（実施例）
実施例１
この実施例では、コンタクトレンズ用の耐久性抗菌性ヒドロゲルコーティングが、アルキル化ポリエチレンイミン−グラフト−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ）のプラズマ処理とＵＶ光重合との組合せによって発生される。このように発生されたＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルコーティングは、グラム陰性菌及びグラム陽性菌ならびに真菌の両方に対して優れた広域スペクトル抗菌活性を示す。コーティングの殺滅％及びｌｏｇ減少は、それぞれ９９．９９％及び４．０より高い。
材料及び方法
材料
分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｍｎ＝１０４、Ｍｗ／Ｍｎ＝２．５）は、使用前に凍結乾燥させた。クロロ官能化ポリ（エチレングリコール）メタクリレート（Ｃｌ−ＰＥＧＭＡ）は、以下のように簡単に説明されるように合成した。１１．８ｍＬ（３５．３ｍｍｏｌ）のＰＥＧＭＡは、１００ｍＬのトルエンに最初に溶解させ、１１．２５ｍＬ（１４１．２ｍｍｏｌ）のクロロアセチルクロリドは、この溶液中に加え、次に、撹拌し、１２０℃で２４時間還流させた。反応の後、この溶液は、溶媒蒸発に供し、続いて、濃縮物は、溶解のために塩化メチレン（１００ｍＬ）とともに加えた。次に、炭酸カリウムを加え、混合物は、１０分間撹拌した。ろ過及びろ液の溶媒蒸発の後、生成物が得られた。
【００５４】
１−ブロモデカン、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、及びイソプロパノールは、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．）から購入し、入手したままの状態で使用した。無水エタノールは、ヴイダブリュアールＰｔｅ社（ＶＷＲ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ）（シンガポール）から購入し、さらに精製せずに使用した。
特性評価
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、３００ＭＨｚでブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）ＡＶ３００  ＮＭＲ分光計において２５℃で記録した。化学シフト（δ）は、テトラメチルシラン（ＴＭＳ：ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｓｉｌａｎｅ）の内部標準プロトンを参照して、百万分率（ｐｐｍ）で報告した。電界放射型走査電子顕微鏡法（ＦＥ−ＳＥＭ：ｆｉｅｌｄ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）観察は、ＪＳＭ−６７０１Ｆ（日本電子（ＪＥＯＬ）、日本）において保持した。
アルキル化ポリエチレンイミンの調製
様々なアルキル基を有するポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、１−ブロモデカン／ＰＥＩ供給比（スキーム１、表１）を変化させることによって、アルキル化反応によって調製した。
【００５５】
【化５】
2020514500.tif 000007
【００５６】
スキーム１．ＰＥＩ−デカン及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡの合成ストラテジー。ＰＥＧＭＡとデカン基のグラフト比により、すなわち、ｍ、ｎの数値により、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡをＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：ｎ：ｍ）と分類した。
【００５７】
【表１】
2020514500.tif 000008
【００５８】
ポリマー名の数値は、１−ブロモデカン対ＰＥＩの供給比を意味する。ＰＥＩ−デカン（１：１０）の調製のための典型的な手順は、以下のとおりであった：ＰＥＩ（２．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）は、５０ｍＬの無水エタノールに溶解させ、２４時間にわたって還流条件下で、０．４４２ｇの１−ブロモオクタン（２ｍｍｏｌ）でアルキル化した。生成されたＨＢｒは、さらに２４時間にわたって同じ条件下で、０．２ｇの水酸化ナトリウムで中和した。溶媒を除去した後、得られた残渣は、水に溶解させ、４日間にわたって蒸留水に対して透析した。得られた生成物は、２４時間にわたって凍結乾燥させて、ポリマーＰＥＩ−デカン（１：１０）を得た。様々なグラフト比を有する他のポリマーは、同様の手順によって調製し、詳細な特性評価結果が、図１に示された。ＰＥＩ−デカン（１０：１）についての１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ＝０．７５〜０．９６ｐｐｍ（デカン基中のＣＨ３）、δ＝０．９６〜１．６ｐｐｍ（デカン基中のＣＨ２）、δ＝２．１〜３．１８ｐｐｍ（ＰＥＩ中のＣＨ２）。
ＰＥＧＭＡでグラフトされたＰＥＩ−デカン（ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ）の調製
様々な比率のＰＥＧＭＡでグラフトされたＰＥＩ−デカンは、以下のように簡単に説明されるように実施した。簡潔にするために、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：４）は、例として記載される。１ｇのＰＥＩ−デカン（１：１０）は、１０ｍＬの脱イオン水に最初に溶解させ、次に、０．４ｍＬのＮａＯＨ溶液（１Ｍ）を加えた。次に、イソプロパノール（１ｍＬ）中のＣｌ−ＰＥＧＭＡ（０．１６ｇ）は、この溶液に滴下して加えた。混合物は、室温で撹拌しながら３時間にわたって反応させ、次に、透析（分子量カットオフ（ＭＷＣＯ：ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｃｕｔ−ｏｆｆ）１０３４４）に供した。最終生成物は、凍結乾燥によって得られた。
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ：Ｍｉｎｉｍｕｍ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）
ＭＩＣ（最小発育阻止濃度）は、抗菌性ポリマーの抗菌感受性について評価した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｋ１２）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ニューマン）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ０１）、及びＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）（ＡＴＣＣ１０２３１）などの細菌種は、ＭＩＣ試験に使用した。細菌は接種し、対数中期まで２００ｒｐｍで、連続的に振とうしながら３７℃で、５ｍＬのミューラー・ヒントンブロス（ＭＨＢ、フルカ（Ｆｌｕｋａ）、ＭＩＣ試験のための分析グレード）中で発達させた。次に、対数中期細菌培地は、抗菌感受性試験を行うための希釈細菌懸濁液の調製のために使用した。使用される抗菌性ポリマーの開始濃度は、１０００μｇ／ｍＬであった。次に、１２連続２倍希釈の抗菌性ポリマー溶液は、滅菌した９６ウェル平底マイクロリットルプレートの各ウェルにつき１００μＬのＭＨＢ中で作製した。ＭＨＢ中の抗菌剤の希釈は、１０００〜８μｇ／ｍＬの範囲を示した。その後、各ウェルに、光学密度０．０００２を有する１００μＬの希釈細菌懸濁液を接種し、各ウェルの最終接種材料は、５×１０５ＣＦＵ／ｍＬを示した（ここで、ＣＦＵは、コロニー形成単位を示す）。マイクロリットルプレートは、１８時間にわたって３７℃で、インキュベータ中でインキュベートした。６００ｎｍでバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）マイクロプレート分光光度計（ベンチマークプラス（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｐｌｕｓ））を用いて各ウェル中の懸濁液の光学密度（ＯＤ）を測定することによって、各ウェル中の微生物増殖を決定した。反復測定は、各細菌及び抗菌剤の濃度について行った。抗菌剤なしの陽性対照試料及び細菌懸濁液なしの陰性対照試料は、この実験に適用した。ＭＩＣは、１８時間のインキュベーション後に細菌の増殖を阻害するのに必要な抗菌剤の最低濃度として評価される。
コンタクトレンズにおけるＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡの表面コーティング
コンタクトレンズＡは、クリアラブ社（Ｃｌｅａｒｌａｂ  ｃｏｍｐａｎｙ）によって提供された。コンタクトレンズは、アルゴンプラズマ（マーチ（Ｍａｒｃｈ）ＰＸ−５００（商標）、条件は、１００Ｗ、５３．３３Ｐａ（４００ｍＴｏｒｒ）及び１２０秒であった）で最初に活性化し、次に、１５分間にわたって空気に曝して、表面過酸化物基を生成した。次に、前処理されたコンタクトレンズは、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１０重量％）及びＰＥＧＤＭＡ（５％）を含有する０．４９ｍＬの溶液に浸漬し、次に、１５分間にわたって紫外線（３６５ｎｍの波長及び１０ｍＷ  ｃｍ−２の強度で）によって照射した。ＵＶ照射後、試料は、取り出し、脱イオン水で洗浄して、グラフトされていない反応剤及び吸着されたホモポリマーを除去した。
ｑＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ表面コーティングの抗菌アッセイ
（１）細菌培地の調製
細菌の菌株は接種し、対数中期まで２００ｒｐｍで連続的に振とうしながら、３７℃で５ｍＬのＭＨＢ培地中で発達させた。１ｍＬの細菌懸濁液は、滅菌管中に加え、ＭＨＢ培地は、遠心分離によって除去した。細菌は、１ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ−１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ及び１０ｍＭのリン酸緩衝液からなる、ｐＨ７．２）で２回洗浄し、細菌懸濁液は、１ｍＬのＰＢＳを用いて調製した。
（２）コートされたコンタクトレンズにおける細菌の接種
コンタクトレンズは、抗菌性ポリマーでコートした。コーティングの後、コートされたコンタクトレンズは、脱イオン水で５回洗浄した。ＰＢＳ中の１０μＬの細菌懸濁液（５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）は、コートされたコンタクトレンズの表面上に分配し、それを組織培養プレート内に入れた。プレート中に試料を含まない細菌懸濁液は、対照として使用した。プレートは、９０％の相対湿度で、１時間にわたって３７℃でインキュベートした。
（３）細菌のプレート計数
２ｍＬのＰＢＳは、インキュベーション後に各組織培養プレートに加えた。９００μＬのＰＢＳは、２４ウェルプレートの各ウェルに挿入した。次に、一連の１０倍希釈の細菌懸濁液は調製し、プレートは、ルリアブロス（ＬＢ）寒天培地（寒天を含むＬＢブロス、シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で調製した。プレートは、１８時間にわたってインキュベータ中で、３７℃でインキュベートし、ＣＦＵを計数した。
【００５９】
結果が、以下のように評価される。
【００６０】
【数１】
2020514500.tif 000009
【００６１】
微生物モルホロジー試験
各病原体の１０μＬの接種材料（５×１０８ＣＦＵｍＬ−１）は、コンタクトレンズ表面上に塗布し、３７℃及び９０％以上の相対湿度で１時間インキュベートした後、４時間にわたってグルタルアルデヒド（４．０％、３ｍＬ）溶液で直ぐに固定した。フィルムは、エタノール水溶液を段階希釈（ｇｒａｄｅｄ  ｓｅｒｉｅｓ）（２０％〜１００％）で加えることによって脱水し、次に、窒素流れによって乾燥させた。コンタクトレンズ上の微生物は、ＦＥ−ＳＥＭによって観察した。
結果及び説明
合成
固定化されたカチオン性ポリマーの抗菌作用は、負荷電リン脂質と強く相互作用するそれらの能力に起因し得、それにより、静電相互作用が、標的細胞膜への最初の結合に影響を与えるのを可能にし、次に、ポリマーにおける疎水性部分が、細菌細胞膜の内側疎水性コアと相互作用して、完全性の破壊及びそれに続く細胞死をもたらす。したがって、表面電荷密度及び疎水性が、表面コーティングの抗菌活性に影響を与える主な要因である。イミノ基のｐＫａ値が、約１０〜１１であるため、ＰＥＩは、生理環境溶液（ｐＨ約７．２）中で正荷電分子である。
【００６２】
その抗菌特性をさらに改善するために、アルキル部分などの疎水性基が、ポリマー主鎖に導入される。ＰＥＩ骨格における１−ブロモデカンとアミノ基との間のアルキル化反応を行いながら、ブロモデカン／ＰＥＩの比率を変化させることによって、様々なデカン基でグラフトされたＰＥＩを調製した。１Ｈ  ＮＭＲは、ＰＥＩ−デカンを特性評価するのに使用した。図１に示されるように、ＰＥＩ及びデカン基のプロトンシグナルが、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルに見られる。デカンのプロトンの積分領域（約０．７〜０．９ｐｐｍ）に基づいて、さらに、グラフトされたデカン基の程度が、供給比の増加にしたがって増加することが分かり、これは、様々なデカン基を有する一連のＰＥＩ−デカンが得られたことを示す。
【００６３】
コンタクトレンズの表面上に安定したコーティングを形成するために、ＰＥＩ−デカンは、コンタクトレンズ上に共有結合的にグラフトされる必要がある。コンタクトレンズ表面におけるプラズマ処理と光重合との組合せが、コンタクトレンズ上に安定したコーティングを形成するための好適な手法であることが示される。光重合を起こすために、二重結合基が、ＰＥＩ−デカンに導入される必要がある。生体適合性を考慮に入れて、Ｃｌ−ＰＥＧＭＡとＰＥＩ−デカンのアミノ基との間のアルキル化反応によって、ＰＥＧＭＡをＰＥＩ−デカンに導入して、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡを形成した。
【００６４】
コーティング形成に対するＰＥＧＭＡ含量の影響を調べるために、様々な密度のＰＥＧＭＡ官能基を有するＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡを調製した。１Ｈ  ＮＭＲは、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡを特性評価するのに使用した。図２に示されるように、ＰＥＩ−デカン及びＰＥＧＭＡのシグナルが、特に、５．５８ｐｐｍ及び６．１４ｐｐｍにおける二重結合プロトンについて観察され、これは、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡが調製されたことを示す。それに加えて、グラフトされたＰＥＧＭＡの程度は、その供給比が増加するにつれて増加する。
コンタクトレンズにおけるコーティング形成
コーティングを形成するために、コンタクトレンズは、最初にアルゴンプラズマ処理に供して、コンタクトレンズの表面上に過酸化物基を生成した。これらの過酸化物基は、ＵＶ開始表面グラフト重合（スキーム２）における表面開始剤として使用した。
【００６５】
【化６】
2020514500.tif 000010
【００６６】
スキーム２．
ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡは、クリアラブ（Ｃｌｅａｒｌａｂ）コンタクトレンズ（Ａレンズ）上に表面コーティングを作製するのに使用した。コーティング形成を確認するために、ＦＥＳＥＭ観察が行われるが（図示せず）、これは、それが表面モルホロジーを特性評価するための典型的な技術であるためである。コートされていないコンタクトレンズは、平滑な表面を示す。しかしながら、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡでコートされたコンタクトレンズは、しわのある表面を示し、これは、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡの薄層が、コンタクトレンズの表面上に固定化されたことを示す。
【００６７】
一方、様々なＰＥＧＭＡ密度を有するポリマーによって形成されるコーティングを試験した。しわのあるコーティングは、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ中のＰＥＧＭＡの含量の増加とともにますます均一になることが分かる。ＰＥＧＭＡのグラフト度が４である場合、すなわち、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：４）である場合、均一なコーティングが観察される。ＰＥＧＭＡのグラフト度がさらに増加された場合、コーティングはコンパクトになり、これは、より高い架橋度に起因する。
【００６８】
水中のコーティングのモルホロジーをさらに観察するために、コートされたレンズは、液体窒素によって固定し、次に、凍結乾燥させた。オーブン中で乾燥された、コートされていないコンタクトレンズと同様に、コートされていないコンタクトレンズはまた、平滑な表面を示す（図３（ａ））。ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：１）によってコートされたコンタクトレンズについては、表面からブラシを形成するように鎖当たり１つのみのＰＥＧＭＡ基を有するようにポリマーを設計及び合成したため、表面はブラシ構造を示す（図３（ｂ））。ＰＥＧＭＡ含量の増加とともに、典型的な特徴である網目構造が明確に観察され（図３（ｃ〜ｆ））、これは、コーティングが、ポリマーの架橋から得られるヒドロゲルによって形成されたことを示唆する。ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：２）コーティングと比較して、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：４）の網目構造はより均一であり、これは、オーブンで乾燥された試料の結果によく一致する。コーティングの網目構造は、ＰＥＧＭＡ含量のさらなる増加にしたがって消失し得（例えば、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：８）及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：１６）コーティング（図３（ｅ〜ｆ）））、これは、架橋の増加によって引き起こされる。
ＰＥＩ−デカンの抗菌活性
前述されるように、疎水性部分は、病原体膜の内側疎水性コア中に挿入して、細胞死をもたらすことによって、病原体を殺滅するのに重要な役割を果たす。したがって、抗菌活性は、ＰＥＩ骨格中への疎水性基の導入によって改善され得る。デカン基でグラフトされたＰＥＩの抗菌活性が改善されたかどうかを確認するために、ＭＩＣを調べた。ＭＩＣ値は、表１にまとめた。表１に示されるように、元のＰＥＩと比較して、細菌のＭＩＣは、デカン基の導入とともに低下し、ＰＥＩ−デカン（１：１０）は、全ての分子の中で最も低いＭＩＣを示した。しかしながら、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のＭＩＣは高いままであり、これは、ＰＥＩ及びＰＥＩ−デカンが、劣った抗真菌活性を示したことを示唆する。デカン基の導入はまた、それらの有効性を改善しなかった。これは、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）細胞と、溶液中のポリマーとの間の不十分な相互作用に起因し得る。したがって、ＭＩＣ結果に基づいて、ＰＥＩ−デカン（１：１０）は、さらなる試験又は最適化のための骨格材料として選択した。
ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡの抗菌活性
ＰＥＧＭＡがＰＥＩ−デカンの抗菌活性に影響を与え得るかどうかを決定するために、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡのＭＩＣを調べた。ＭＩＣが、ＰＥＧＭＡでグラフトした後に増加したことが分かった（表２）。
【００６９】
【表２】
2020514500.tif 000011
【００７０】
コンタクトレンズにおけるＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコーティング
ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコーティングが、コンタクトレンズ上に形成されたことが証明されたら、次に、コーティングが抗菌活性を示したかどうかを調べた。したがって、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡの抗菌活性は、細菌及び真菌に関して評価した。図４に示されるように、対照のものと比較して、コーティング上の病原体は観察されず、これは、細菌がコーティングと接触することによって殺滅されたことを示す。それに加えて、細菌及び真菌細胞数のｌｏｇ減少ならびに及び殺滅％を計算した。表３に列挙されるように、コーティングは、４を超える、細菌及び真菌の高いｌｏｇ減少を示し、殺滅％は、９９．９９％より高かった。結果は、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコーティングが、グラム陰性菌、グラム陽性菌及び真菌に対して非常に有効であり、かつ広域スペクトルであることを示した。ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコーティングの抗菌活性が、ＰＥＧＭＡグラフトによって影響されなかったことも分かった。
【００７１】
【表３】
2020514500.tif 000012
【００７２】
コーティング上の細菌についてのより直接的な情報を得るために、１時間にわたるインキュベーション後にコーティング上の細菌を視覚化するために、ＦＥＳＥＭ観察を行った。図５に示されるように、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコーティング上の病原体は、対照と比較して明らかな形態学的変化を示した。対照表面上の細菌の表面が、平滑で丸みを帯びているように見えた一方、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコーティング上の細菌は、しわのあるしなびた表面を示した。ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡが、正電荷及びデカン疎水性セグメントを有するカチオン性ポリマーであるため、これらの結果は予測され得る。ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡは、アニオン性表面及び疎水性細胞膜と有効に相互作用することができ、それによって、微生物細胞表面上に吸着し、細胞の外膜を乱し、細胞質の異常分布及び微生物への損傷をもたらすことによって、微生物を殺滅する。
結論
耐久性抗菌性ヒドロゲルコーティングを発生させるための骨格としてＰＥＩを選択した。疎水性デカン基によるＰＥＩの改質は、その抗菌特性を改善するために行った。最適化されたＰＥＩ−デカン（１：１０）は、グラム陰性菌及びグラム陽性菌ならびに真菌の両方に対して抗菌活性を示した。さらなる改質は、ＰＥＧＭＡでグラフトし、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡを形成することによって、ＰＥＩ−デカンに架橋可能な能力を与えるために行った。合成されたＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡは、プラズマ−ＵＶ方法によってコンタクトレンズ上にコーティングを作製するのに使用した。このＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコーティングは、優れた広域スペクトル抗菌活性を示し、殺滅％及びｌｏｇ減少はそれぞれ、９９．９９％及び４より高い。本明細書に示されるコーティングは、他の埋め込み物、例えばカテーテル上にコーティングを形成するための道を開く可能性がある。
実施例２
この実施例では、生物医学装置用の耐久性抗菌性ヒドロゲルコーティングは、ポリエチレンイミン−グラフト−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ）及びデカン基の添加によるそのアルキル化形態（ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ）のプラズマ処理とＵＶ光重合との組合せによって発生される。これらのＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコーティングは、グラム陰性菌及びグラム陽性菌ならびに真菌の両方に対して優れた広域スペクトル抗菌活性を示す。ヒドロゲルの殺滅％及びｌｏｇ減少はそれぞれ、９９．９９９９９％及び７．０より高い。ヒドロゲルは、インビトロでヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）に対して試験されるときに９５％超の細胞生存を有することが示されるため、ヒト細胞と生体適合性である。
材料及び方法
材料
分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｍｎ＝１０４、Ｍｗ／Ｍｎ＝２．５）は、使用前に凍結乾燥させた。１−ブロモデカン、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、イソプロパノール、ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、Ｍｎ＝３６０）及びイルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ、登録商標）２９５９は、シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏｒｐ．）から購入し、入手したままの状態で使用した。クロロアセチルクロリド、無水エタノール、トルエン及び塩化メチレンは、メルクＰｔｅ社（Ｍｅｒｃｋ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ）（シンガポール）から購入し、さらに精製せずに使用した。ポリ（エチレングリコール）（１０００）ジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ）は、ポリサイエンス社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）から購入した。
特性評価
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、３００ＭＨｚでブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）ＡＶ３００  ＮＭＲ分光計において２５℃で記録した。化学シフト（δ）は、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）の内部標準プロトンを参照して、ｐｐｍで報告した。ＦＥＳＥＭ観察は、ＪＳＭ−６７０１Ｆ（日本電子（ＪＥＯＬ）、日本）において保持した。細菌懸濁液及びＭＴＴの光学密度は、テカンインフィニット（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ）２００マイクロプレートリーダを用いて測定した。
クロロ官能化ポリエチレングリコールメタクリレート（Ｃｌ−ＰＥＧＭＡ）の調製
１１．８ｍＬ（３５．３ｍｍｏｌ）のＰＥＧＭＡは、１００ｍＬのトルエンに最初に溶解させ、１１．２５ｍＬ（１４１．２ｍｍｏｌ）のクロロアセチルクロリドは、この溶液中に加え、次に、撹拌し、１２０℃で２４時間還流させた。反応の後、この溶液は、溶媒蒸発に供し、続いて、濃縮物は、溶解のために塩化メチレン（１００ｍＬ）とともに加えた。次に、炭酸カリウムを加え、混合物は、１０分間撹拌した。ろ過及びろ液の溶媒蒸発の後、生成物が得られた。
ＰＥＧＭＡでグラフトされたポリエチレンイミン（ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ）の調製
ＰＥＩは、様々な比率のＰＥＧＭＡでグラフトし、このプロセスは、以下のように簡単に説明される。簡潔にするために、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ（１：５）は、例として記載される。１ｇのＰＥＩは、１０ｍＬの脱イオン水に最初に溶解させ、０．４ｍＬのＮａＯＨ溶液（１Ｍ）を加えた。次に、イソプロパノール（１ｍＬ）中のＣｌ−ＰＥＧＭＡ（０．２ｇ）は、この溶液に滴下して加えた。混合物は、室温で撹拌しながら３時間にわたって反応させ、次に、透析（ＭＷＣＯ  １０３４４）に供した。最終生成物は、凍結乾燥によって得られた。
アルキル化ポリエチレンイミンの調製
様々なアルキル基を有するＰＥＩは、１−ブロモデカン／ＰＥＩ供給比（スキーム１、表１）を変化させることによって、アルキル化反応によって調製した。
【００７３】
ポリマー名の数値は、１−ブロモデカン対ＰＥＩの供給比を意味する。ＰＥＩ−デカン（１：１０）の調製のための典型的な手順は、以下のとおりであった：ＰＥＩ（２．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）は、５０ｍＬの無水エタノールに溶解させ、２４時間にわたって還流条件下で、０．４４２ｇの１−ブロモオクタン（２ｍｍｏｌ）でアルキル化した。生成されたＨＢｒは、さらに２４時間にわたって同じ条件下で、０．２ｇの水酸化ナトリウムで中和した。溶媒を除去した後、得られた残渣は、水に溶解させ、４日間にわたって蒸留水に対して透析した。得られた生成物は、２４時間にわたって凍結乾燥させて、ポリマーＰＥＩ−デカン（１：１０）を得た。様々なグラフト比を有する他のポリマーは、同様の手順によって調製し、詳細な特性評価結果が、図１に示された。ＰＥＩ−デカン（１：１０）についての１Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ２Ｏ）：δ＝０．７５〜０．９６ｐｐｍ（デカン基中のＣＨ３）、δ＝０．９６〜１．６ｐｐｍ（デカン基中のＣＨ２）、δ＝２．１〜３．１８ｐｐｍ（ＰＥＩ中のＣＨ２）。
ＰＥＧＭＡでグラフトされたＰＥＩ−デカン（ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ）の調製
様々な比率のＰＥＧＭＡでグラフトされたＰＥＩ−デカンは、以下のように簡単に説明されるように実施した。簡潔にするために、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：４）は、例として記載される。１ｇのＰＥＩ−デカン（１：１０）は、１０ｍＬの脱イオン水に最初に溶解させ、次に、０．４ｍＬのＮａＯＨ溶液（１Ｍ）を加えた。次に、イソプロパノール（１ｍＬ）中のＣｌ−ＰＥＧＭＡ（０．１６ｇ）は、この溶液に滴下して加えた。混合物は、室温で撹拌しながら３時間にわたって反応させ、次に、透析（ＭＷＣＯ  １０３４４）に供した。最終生成物は、凍結乾燥によって得られた。
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）
ＭＩＣは、抗菌性ポリマーの抗菌感受性について評価した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（Ｋ１２）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ニューマン）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ０１）、及びＣ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）（ＡＴＣＣ１０２３１）などの細菌種は、ＭＩＣ試験に使用した。細菌は接種し、対数中期まで２００ｒｐｍで、連続的に振とうしながら３７℃で、５ｍＬのミューラー・ヒントンブロス（ＭＨＢ、フルカ（Ｆｌｕｋａ）、ＭＩＣ試験のための分析グレード）中で発達させた。次に、対数中期細菌培地は、抗菌感受性試験を行うための希釈細菌懸濁液の調製のために使用した。使用される抗菌性ポリマーの開始濃度は、１０００μｇ／ｍＬであった。次に、１２連続２倍希釈の抗菌性ポリマー溶液は、滅菌した９６ウェル平底マイクロリットルプレートの各ウェルにつき１００μＬのＭＨＢ中で作製した。ＭＨＢ中の抗菌剤の希釈は、１０００〜８μｇ／ｍＬの範囲を示した。その後、各ウェルに、光学密度０．０００２を有する１００μＬの希釈細菌懸濁液を接種し、各ウェルの最終接種材料は、５×１０５ＣＦＵ／ｍＬを示した。マイクロリットルプレートは、１８時間にわたって３７℃で、インキュベータ中でインキュベートした。６００ｎｍでバイオラッド（Ｂｉｏｒａｄ）マイクロプレート分光光度計（ベンチマークプラス（Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｐｌｕｓ））を用いて各ウェル中の懸濁液の光学密度を測定することによって、各ウェル中の微生物増殖を決定した。反復測定は、各細菌及び抗菌剤の濃度について行った。抗菌剤なしの陽性対照試料及び細菌懸濁液なしの陰性対照試料は、この実験に適用した。ＭＩＣは、１８時間のインキュベーション後に細菌の増殖を阻害するのに必要な抗菌剤の最低濃度として評価される。
ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルの形成
ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルは、前駆体ヒドロゲル溶液のＵＶ照射を用いて形成した。イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ）２９５９、ＵＶ開始剤は、エタノールに最初に溶解させて、１０％のストック溶液を作製した。ポリマー、架橋剤（ＰＥＧＤＭＡ）及びＵＶ開始剤（イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ）２９５９）を含有するヒドロゲル溶液を混合し、１．５ｍＬの微細管中で、脱イオン水に完全に溶解させた。０．５ｍＬのヒドロゲル溶液は、２４ウェルプレートのウェルに移した。次に、ヒドロゲル溶液は、架橋を起こしてヒドロゲルを形成するために１５分間にわたって紫外線（３６５ｎｍの波長及び１０ｍＷ  ｃｍ−２の強度で）を照射した。ヒドロゲルは、超音波処理しながらエタノール中で３回及び脱イオン水中で３回洗浄して、全ての未反応前駆体を除去した。
ヒドロゲルのインビトロ抗菌アッセイ
（Ｉ）細菌培地の調製
細菌の菌株は接種し、対数中期まで２２０ｒｐｍで連続的に振とうしながら、３７℃で４ｍＬのＭＨＢ培地中で分散させた。１ｍＬの細菌懸濁液は、滅菌微細管中に加え、ＭＨＢ培地は、遠心分離によって除去し、続いて上清をデカントした。細菌は、１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、最終細菌懸濁液は、１ｍＬのＰＢＳを用いて調製した。
（２）ヒドロゲルにおける細菌の接種
約１０７ＣＦＵを含有するＰＢＳ中の１０μＬの細菌懸濁液は、ヒドロゲルの表面上に接種し、それは、小さい組織培養ペトリ皿に入れた。次に、細菌懸濁液は、ヒドロゲルの表面全体を覆うように均一に塗布した。細菌を小さいペトリ皿上に直接接種することによって、対照を行った。ペトリ皿は、９０％の相対湿度で、２時間にわたって３７℃でインキュベートした。
（３）細菌数の計数
１ｍＬのＰＢＳは、インキュベーション後に各組織培養ペトリ皿に加えた。０．９ｍＬのＰＢＳは、２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。次に、細菌懸濁液の一連の１０倍希釈を行い、ＬＢ寒天（寒天を含むＬＢブロス、シグマ（Ｓｉｇｍａ））上で平板培養した。プレートは、１８時間にわたってインキュベータ中で、３７℃でインキュベートし、細菌コロニーを計数した。
【００７４】
ｌｏｇ減少及び殺滅％結果は、以下のように評価した。
【００７５】
【数２】
2020514500.tif 000013
【００７６】
ヒドロゲルのインビトロ生体適合性アッセイ
生体適合性試験は、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）を用いて行った。使用される細胞培養培地は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ：ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）及び１％の抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン）からなる完全ＤＭＥＭであった。
（Ｉ）トランスウエル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）ＭＴＴアッセイ
ＨＤＦ細胞は、各ウェル中５×１０４個の細胞の初期接種材料から２４ウェルプレート中で培養し、細胞接着のために２４時間にわたって３７℃で、ＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。約５ｍｍの直径のヒドロゲルは、切り取り、トランスウエル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）挿入物（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、１μｍの細孔）に入れてから、２４時間にわたって３７℃で、ＨＤＦ細胞とともにインキュベートした。次に、ヒドロゲルは、除去し、培養培地は、ＭＴＴ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）と取り換え、４時間にわたって３７℃でインキュベートして、生存細胞を染色した。ＭＴＴ溶液は、除去し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ：ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を加え、プレートは、１５分間にわたって１５０ｒｐｍで振とうした。細胞生存は、５７０ｎｍにおける各ウェルの吸光度によって測定し、１００％細胞生存対照として働く細胞のみの対照ウェルと比較した。
（２）接触ＭＴＴアッセイ
ＨＤＦ細胞は、各ウェル中１×１０４個の細胞の初期接種材料から９６ウェルプレート中で培養し、細胞接着のために２４時間にわたって３７℃で、ＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。約５ｍｍの直径のヒドロゲルは、切り取り、細胞培養物に浸漬し、２４時間にわたって３７℃でインキュベートした。次に、ヒドロゲルは、除去し、培養培地は、ＭＴＴ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）と取り換え、４時間にわたって３７℃でインキュベートして、生存細胞を染色した。ＭＴＩ溶液は、除去し、ＤＭＳＯを加え、プレートは、１５分間にわたって１５０ｒｐｍで振とうした。細胞生存は、５７０ｎｍにおける各ウェルの吸光度によって測定し、１００％細胞生存対照として働く細胞のみの対照ウェルと比較した。
【００７７】
結果は、以下のように評価した。
【００７８】
【数３】
2020514500.tif 000014
【００７９】
コンタクトレンズにおけるＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡの表面コーティング
コンタクトレンズＡは、クリアラブ社（Ｃｌｅａｒｌａｂ  ｃｏｍｐａｎｙ）によって提供された。コンタクトレンズは、アルゴンプラズマ（マーチ（Ｍａｒｃｈ）ＰＸ−５００（商標）、条件は、１００Ｗ、５３．３３Ｐａ（４００ｍＴｏｒｒ）及び１２０秒であった）で最初に活性化し、次に、１５分間にわたって空気に曝して、表面過酸化物基を生成した。次に、前処理されたコンタクトレンズは、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１０重量％）及びＰＥＧＤＭＡ（５％）を含有する０．４９ｍＬの溶液に浸漬し、次に、１５分間にわたって紫外線（３６５ｎｍの波長及び１０ｍＷ  ｃｍ−２の強度で）によって照射した。ＵＶ照射後、試料は、取り出し、脱イオン水で洗浄して、グラフトされていない反応剤及び吸着されたホモポリマーを除去した。
ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ表面コーティングの抗菌アッセイ
（１）細菌培地の調製
細菌の菌株は接種し、対数中期まで２２０ｒｐｍで連続的に振とうしながら、３７℃で４ｍＬのＭＨＢ培地中で分散させた。１ｍＬの細菌懸濁液は、滅菌微細管中に加え、ＭＨＢ培地は、遠心分離によって除去し、続いて上清をデカントした。細菌は、１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、最終細菌懸濁液は、１ｍＬのＰＢＳを用いて調製した。
（２）コートされたコンタクトレンズにおける細菌の接種
コンタクトレンズは、抗菌性ポリマーでコートした。コーティングの後、コートされたコンタクトレンズは、脱イオン水で５回洗浄した。ＰＢＳ中の１０μＬの細菌懸濁液（５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）は、コートされたコンタクトレンズの表面上に分配し、それを組織培養プレート内に入れた。プレート中に試料を含まない細菌懸濁液は、対照として使用した。プレートは、９０％の相対湿度で、１時間にわたって３７℃でインキュベートした。
（３）細菌のプレート計数
２ｍＬのＰＢＳは、インキュベーション後に各組織培養プレートに加えた。９００μＬのＰＢＳは、２４ウェルプレートの各ウェルに挿入した。次に、一連の１０倍希釈の細菌懸濁液は調製し、プレートは、ＬＢ寒天培地（寒天を含むＬＢブロス、シグマ（Ｓｉｇｍａ））中で調製した。プレートは、１８時間にわたってインキュベータ中で、３７℃でインキュベートし、ＣＦＵを計数した。
【００８０】
ｌｏｇ減少及び殺滅％結果は、実施例１に記載されるように評価した。
微生物モルホロジー試験
各病原体の１０μＬの接種材料（５×１０８ＣＦＵ／ｍＬ）は、コンタクトレンズ表面上に塗布し、３７℃及び９０％以上の相対湿度で１時間インキュベートした後、次に、４時間にわたってグルタルアルデヒド（４．０％、３ｍＬ）溶液で直ぐに固定した。フィルムは、エタノール水溶液を段階希釈（２０％〜１００％）で加えることによって脱水し、次に、窒素流れによって乾燥させた。コンタクトレンズ上の微生物は、ＦＥＳＥＭによって観察した。
耐摩擦性抗菌性コーティング用の配合物
使用者の指により加えられる通常の負荷によって生じる不具合に耐えるためにコーティング配合物を改善するために、架橋剤（ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート−ＰＥＧＤＡ−分子量−７００、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））及びモノマー（２−ヒドロキシエチルメタクリレート、９８％、分子量−１３０．１４、アクロスオーガニック（ＡＣＲＯＳ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ））は、抗菌性ポリマー、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡに加えた。配合物の組成は、以下のとおりである：表４。
【００８１】
【表４】
2020514500.tif 000015
【００８２】
コンタクトレンズは、２００Ｗ及び１４０ｃｃ／分のガス流量で２分間にわたってアルゴンプラズマで処理して、コンタクトレンズ上に化学的に反応性の官能基を形成した。処理の後、プラズマ処理されたコンタクトレンズは、１０分間にわたって空気に曝して、コンタクトレンズの表面上に過酸化物を形成した。次に、コンタクトレンズは、コーティング溶液に浸漬し、１０分間にわたって紫外線の照射を行って、コートされたコンタクトレンズを形成した。
インビボ創傷感染症マウスモデル
（１）ヒドロゲル創傷被覆材の調製
ヒドロゲルは、わずかな修正を伴い上述されるように形成した。５０μＬのヒドロゲル前駆体溶液は、９６ウェルプレートに加え、架橋を起こしてヒドロゲルを形成するために、１５分間にわたって紫外線（３６５ｒｕｎの波長及び１０ｍＷ  ｃｍ−２の強度で）を照射した。ヒドロゲルは、エタノール中で３回及び脱イオン水中で３回洗浄して、全ての未反応前駆体を除去した。次に、ヒドロゲルは、へらを用いてウェルから注意深くかき出し、市販の透明接着フィルム（オプサイトフレキシフィックス（Ｏｐｓｉｔｅ  Ｆｌｅｘｉｆｉｘ）、スミス・アンド・ネフュー（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｎｅｐｈｅｗ））上に設置した。
（２）創傷感染症マウスモデル
６週齢で約２０ｇの体重の雌スイスアルビノマウスは、マウスモデルにおいて使用した。マウスの創傷は、１日目に行った。腹腔内注射によってケタミン：キシラジン混合物を用いて、マウスに最初に麻酔をかけた。マウスの背部の毛は、きれいに剃った。次に、皮膚の約６ｍｍの直径の円形の切り取りは、鉗子及び切開はさみを用いてマウスの背部から切除して、傷を生成した。その後、２０μＬのＰＢＳ中のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＢＡＡ−４０（ＭＲＳＡ）の約１０７ＣＦＵは、創傷感染症を模倣するために、マウスの創傷皮膚上に接種した。次に、創傷被覆材は、感染したマウスの皮膚上に適用し、被覆材を毎日交換しながら、３日間観察した。対照マウスは、市販の透明の被覆材（オプサイトフレキシフィックス（Ｏｐｓｉｔｅ  Ｆｌｅｘｉｆｉｘ）、スミス・アンド・ネフュー（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｎｅｐｈｅｗ））のみで処理した一方、ヒドロゲル処理マウスは、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡヒドロゲル被覆材で処理した。５匹のマウスは、実験のために各群で使用した。
（３）創傷皮膚における細菌負荷の計数
４日目に、全てのマウスは、麻酔薬の過量摂取、続いて頸椎脱臼を用いた安楽死によって殺処分した。各創傷皮膚は、切除し、１５分間にわたる超音波処理、続いて５分間ボルテックスすることによって、１ｍＬのＰＢＳ中で均質化した。次に、細菌懸濁液の一連の１０倍希釈は、ＰＢＳ中で行い、ＬＢ寒天（寒天を含むＬＢブロス、シグマ（Ｓｉｇｍａ））上で平板培養した。プレートは、１８時間にわたってインキュベータ中で、３７℃でインキュベートし、細菌コロニーを計数した。
【００８３】
ｌｏｇ減少及び殺滅％結果は、以下のように評価した。
【００８４】
【数４】
2020514500.tif 000016
【００８５】
結果及び説明
合成
固定化されたカチオン性ポリマーの抗菌作用は、負荷電リン脂質と強く相互作用するそれらの能力に起因し得、それにより、静電相互作用が、標的細胞膜への最初の結合に影響を与えるのを可能にし、次に、ポリマーにおける疎水性部分が、細菌細胞膜の内側疎水性コアと相互作用して、完全性の破壊及びそれに続く細胞死をもたらす。したがって、表面電荷密度及び疎水性が、表面コーティングの抗菌活性に影響を与える主な要因である。イミノ基のｐＫａ値が、約１０〜１１であるため、ＰＥＩは、生理環境溶液（ｐＨ約７．２）中で正荷電分子である。
【００８６】
その抗菌特性をさらに改善するために、アルキル部分などの疎水性基が、ポリマー主鎖に導入される。ＰＥＩ骨格における１−ブロモデカンとアミノ基との間のアルキル化反応を行いながら、ブロモデカン／ＰＥＩの比率を変化させることによって、様々なデカン基でグラフトされたＰＥＩを調製した。１Ｈ  ＮＭＲは、ＰＥＩ−デカンを特性評価するのに使用した。図１に示されるように、ＰＥＩ及びデカン基のプロトンシグナルが、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルに見られる。デカンのプロトンの積分領域（約０．７〜０．９ｐｐｍ）に基づいて、さらに、グラフトされたデカン基の程度が、供給比の増加にしたがって増加することが分かり、これは、様々なデカン基を有する一連のＰＥＩ−デカンが得られたことを示す。
【００８７】
コンタクトレンズの表面上に安定したコーティングを形成するために、ＰＥＩ−デカンは、コンタクトレンズ上に共有結合的にグラフトされる必要がある。コンタクトレンズ表面におけるプラズマ処理と光重合との組合せが、コンタクトレンズ上に安定したコーティングを形成するための好適な手法であることが示される。光重合を起こすために、二重結合基が、ＰＥＩ−デカンに導入される必要がある。生体適合性を考慮に入れて、Ｃｌ−ＰＥＧＭＡとＰＥＩ−デカンのアミノ基との間のアルキル化反応によって、ＰＥＧＭＡをＰＥＩ−デカンに導入して、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡを形成した。
【００８８】
コーティング形成に対するＰＥＧＭＡ含量の影響を調べるために、様々な密度のＰＥＧＭＡ官能基を有するＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡを調製した。１Ｈ  ＮＭＲは、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡを特性評価するのに使用した。図２に示されるように、ＰＥＩ−デカン及びＰＥＧＭＡのシグナルが、特に、５．５８ｐｐｍ及び６．１４ｐｐｍにおける二重結合プロトンについて観察され、これは、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡが調製されたことを示す。それに加えて、グラフトされたＰＥＧＭＡの程度は、その供給比が増加するにつれて増加する。
パートＩ．コンタクトレンズコーティング
コンタクトレンズにおけるコーティング形成
コーティングを形成するために、コンタクトレンズは、最初にアルゴンプラズマ処理に供して、コンタクトレンズの表面上に過酸化物基を生成した。これらの過酸化物基は、ＵＶ開始表面グラフト重合（スキーム２）における表面開始剤として使用した。
【００８９】
ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡは、クリアラブ（Ｃｌｅａｒｌａｂ）コンタクトレンズ（Ａレンズ）上に表面コーティングを作製するのに使用した。コーティング形成を確認するために、ＦＥＳＥＭ観察が行われるが（図示せず）、これは、それが表面モルホロジーを特性評価するための典型的な技術であるためである。コートされていないコンタクトレンズは、平滑な表面を示す。しかしながら、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡでコートされたコンタクトレンズは、しわのある表面を示し、これは、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡの薄層が、コンタクトレンズの表面上に固定化されたことを示す。
【００９０】
一方、様々なＰＥＧＭＡ密度を有するポリマーによって形成されるコーティングを試験した。しわのあるコーティングは、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ中のＰＥＧＭＡの含量の増加とともにますます均一になることが分かる。ＰＥＧＭＡのグラフト度が４である場合、すなわち、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：４）である場合、均一なコーティングが観察される。ＰＥＧＭＡのグラフト度がさらに増加された場合、コーティングはコンパクトになり、これは、より高い架橋度に起因する。
【００９１】
水中のコーティングのモルホロジーをさらに観察するために、コートされたレンズは、液体窒素によって固定し、次に、凍結乾燥させた。オーブン中で乾燥された、コートされていないコンタクトレンズと同様に、コートされていないコンタクトレンズはまた、平滑な表面を示す（図３（ａ））。ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：１）によってコートされたコンタクトレンズについては、表面からブラシを形成するように鎖当たり１つのみのＰＥＧＭＡ基を有するようにポリマーを設計及び合成したため、表面はブラシ構造を示す（図３（ｂ））。ＰＥＧＭＡ含量の増加とともに、典型的な特徴である網目構造が明確に観察され（図３（ｃ〜ｆ））、これは、コーティングが、ポリマーの架橋から得られるヒドロゲルによって形成されたことを示唆する。ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：２）コーティングと比較して、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：４）の網目構造はより均一であり、これは、オーブンで乾燥された試料の結果によく一致する。コーティングの網目構造は、ＰＥＧＭＡ含量のさらなる増加にしたがって消失し得（例えば、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：８）及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：１６）コーティング（図３（ｅ〜ｆ）））、これは、架橋の増加によって引き起こされる。
ＰＥＩ−デカンの抗菌活性
前述されるように、疎水性部分は、病原体膜の内側疎水性コア中に挿入して、細胞死をもたらすことによって、病原体を殺滅するのに重要な役割を果たす。したがって、抗菌活性は、ＰＥＩ骨格中への疎水性基の導入によって改善され得る。デカン基でグラフトされたＰＥＩの抗菌活性が改善されたかどうかを確認するために、ＭＩＣを調べた。ＭＩＣ値は、表１にまとめた。表１に示されるように、元のＰＥＩと比較して、細菌のＭＩＣは、デカン基の導入とともに低下し、ＰＥＩ−デカン（１：１０）は、全ての分子の中で最も低いＭＩＣを示した。しかしながら、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）のＭＩＣは高いままであり、これは、ＰＥＩ及びＰＥＩ−デカンが、劣った抗真菌活性を示したことを示唆する。デカン基の導入はまた、それらの有効性を改善しなかった。これは、Ｃ．アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）細胞と、溶液中のポリマーとの間の不十分な相互作用に起因し得る。したがって、ＭＩＣ結果に基づいて、ＰＥＩ−デカン（１：１０）は、さらなる試験又は最適化のための骨格材料として選択した。
ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡの抗菌活性
ＰＥＧＭＡが、ＰＥＩ及びＰＥＩ−デカンの抗菌活性に影響を与え得るかどうかを調べるために、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡのＭＩＣを試験した。ＭＩＣが、ＰＥＧＭＡでグラフトした後に増加したことが分かった（表５）。
【００９２】
【表５】
2020514500.tif 000017
【００９３】
ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコーティングが、コンタクトレンズ上に形成されたことが証明されたら、次に、コーティングが抗菌活性を示したかどうかを調べた。したがって、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡの抗菌活性は、細菌及び真菌に関して評価した。図４に示されるように、対照と比較して、コーティング上の細菌は、観察することができず、これは、細菌が、コーティングと接触することで殺滅されたことを示す。それに加えて、細菌及び真菌細胞数のｌｏｇ減少ならびに殺滅％を計算した。表４に列挙されるように、コーティングは、４を超える、細菌及び真菌の高いｌｏｇ減少を示し、殺滅％は、９９．９９％より高かった。結果は、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコーティングが、グラム陰性菌、グラム陽性菌及び真菌に対して非常に有効であり、かつ広域スペクトルであることを示した。コーティングの抗菌活性は、ＰＥＧＭＡグラフトによって影響されなかったことも分かった。
【００９４】
コーティング上の細菌についてのより直接的な情報を得るために、１時間にわたるインキュベーション後にコーティング上の細菌を視覚化するために、ＦＥＳＥＭ観察を行った。図５に示されるように、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコーティング上の病原体は、対照と比較して明らかな形態学的変化を示す。対照表面上の細菌の表面は、平滑で丸みを帯びているように見える一方、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコーティング上の細菌は、しわのあるしなびた表面を示す。ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡが、正電荷及びデカン疎水性セグメントを有するカチオン性ポリマーであるため、これらの結果は予測され得る。ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡは、アニオン性表面及び疎水性細胞膜と有効に相互作用することができ、それによって、微生物細胞表面上に吸着し、細胞の外膜を乱し、細胞質の異常分布及び微生物への損傷をもたらすことによって、微生物を殺滅する。
耐摩擦性コーティング配合物Ａ及びＢ
使用者の指により加えられる通常の負荷によって生じる不具合に耐えるためにコーティング配合物を改善するために、架橋剤（ポリ（エチレングリコール）ジアクリレート−ＰＥＧＤＡ−分子量−７００、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））及びモノマー（２−ヒドロキシエチルメタクリレート、９８％、分子量−１３０．１４、アクロスオーガニック（ＡＣＲＯＳ  Ｏｒｇａｎｉｃｓ））は、抗菌性ポリマー、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡに加えた。
【００９５】
配合物Ａの組成が表３に示される。コンタクトレンズは、２００Ｗ及び１４０ｃｃ／分のガス流量で２分間にわたってアルゴンプラズマで処理して、コンタクトレンズ上に化学的に反応性の官能基を形成した。処理の後、プラズマ処理されたコンタクトレンズは、１０分間にわたって空気に曝して、コンタクトレンズの表面上に過酸化物を形成した。次に、コンタクトレンズは、コーティング溶液に浸漬し、１０分間にわたって紫外線の照射を行って、コートされたコンタクトレンズを形成した。コートされたコンタクトレンズの抗菌活性は、１×１０７ＣＦＵの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で試験した。対照群（コートされていないコンタクトレンズ）は、表面上に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌１．１７×１０７ＣＦＵを有することが観察された。配合物Ａでコートされたコンタクトレンズは、９９．９９９９９％超の殺滅率及び約７のｌｏｇ減少を有し、抗菌活性について有効であるようである。したがって、配合物中への架橋剤ＰＥＧＤＡ及びモノマーＨＥＭＡの組み込みも、抗菌活性について有効であり得ることが結論付けられ得る。
【００９６】
コートされたコンタクトレンズは、市販のコンタクトレンズのケースに入れられた標準的な市販のコンタクトレンズ消毒剤溶液に最初に浸漬した。次に、コンタクトレンズは、ケースから取り出し、製造業者の指示にしたがって１０秒間擦った。擦った後、コンタクトレンズは、新しい消毒溶液が入ったコンタクトレンズケースに入れ替えた。摩擦サイクルは、５回繰り返し、抗菌効果を評価した。５サイクルの摩擦後のコートされたコンタクトレンズの抗菌活性は、１×１０７ＣＦＵの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で試験した。対照群（コートされていないコンタクトレンズ）は、表面上に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌１．５５×１０７ＣＦＵを有することが観察された。表３に示される配合物でコートされたコンタクトレンズは、表面上に５×１０３ＣＦＵを有することが観察された。ｌｏｇ減少が７から３．４９へと減少したが、それは３．４９の良好なｌｏｇ減少を有するため、コーティング層は、摩擦中にコンタクトレンズの表面からの分解を有するようである。さらに、摩擦中、コーティング層の柔らかさが観察された。したがって、ＨＥＭＡの代わりに、トリメチルアクリルアミドプロピルアンモニウムクロリドを次の配合物Ｂに使用した。
【００９７】
コートされたコンタクトレンズの抗菌活性は、１×１０７ＣＦＵの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で試験した。対照群（コートされていないコンタクトレンズ）は、表面上に大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌８×１０６ＣＦＵを有することが観察された。配合物Ｂでコートされたコンタクトレンズは、９９．９９９９％超の殺滅率及び６．９０のｌｏｇ減少を有し、抗菌活性について有効であるようである。表３に示される配合物でコートされたコンタクトレンズについて、生存細胞は検出されなかった。これらの観察は、コンタクトレンズに対するＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ、ＰＥＧＤＡ（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリドの効果が、おそらく、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の付着の阻害であることを示唆する。図３は、様々な配合物でコートされたコンタクトレンズのＳＥＭ写真を示す。これらの写真により、ヒドロゲル多孔質網目構造がコンタクトレンズの表面上にあったことが確認される。
【００９８】
コートされたコンタクトレンズの抗菌活性は、１×１０７ＣＦＵの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で試験した。８×１０６ＣＦＵの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌が、コートされていないコンタクトレンズの表面上で検出された。５サイクルの摩擦後の表３に示される配合物でコートされたコンタクトレンズは、９９．９９９９％超の殺滅率及び６．９０のｌｏｇ減少を有し、同じ抗菌活性を維持するようである。５サイクルの摩擦後の表３に示される配合物でコートされたコンタクトレンズについて、生存細胞は検出されなかった。これらの観察は、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ、ＰＥＧＤＡ（３−アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリドが、指の負荷が加えられた官能化ポリマーの感受性の耐性を改善することを示唆する。図３は、表３に示される配合物でコートされたコンタクトレンズのＳＥＭ写真を示す。これらの写真により、ヒドロゲル層が、５サイクルの摩擦試験後にコンタクトレンズの表面上で安定していたことが確認される。
【００９９】
１０サイクルの摩擦後の抗菌コートされたコンタクトレンズは、細菌増殖を完全に阻害しながら、曝露後に生存大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の９９．９９９９％超の殺滅率及び６超のｌｏｇ減少をもたらした。コーティング材料のこの高い抗菌有効性は、コンタクトレンズの基材からのコーティングの破壊に耐えるこれらの材料の能力を反映している可能性が高い。３．９８×１０６ＣＦＵの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）が、コートされていないコンタクトレンズの表面上で観察され、１０サイクルの摩擦試験後のコートされたレンズについて、細菌が検出されなかったため、細菌のかなりの減少が、コートされたレンズについて達成された。さらに、１０サイクルの摩擦後のコートされたコンタクトレンズは、複雑な多孔質モルホロジーを有する表面をもたらした。１０サイクルの摩擦は、モルホロジー及びコーティングの付着を変化させなかった。
パートＩＩ：抗菌性創傷被覆材
ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルの架橋
ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルは両方とも、ＵＶ照射を用いて架橋されたが、これは、ＵＶ照射が、熱的及び化学的架橋と比較して、迅速でかつ効率的な方法であるためである。ゲル化プロセスに使用するためのモノマー及び架橋剤の様々な重量パーセンテージは、さらなる試験のための最良の配合物を選択するために調べた。ポリ（エチレングリコール）（１０００）ジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ）は、架橋剤として使用した。ヒドロゲルの配合物は、表６に示した。
【０１００】
【表６】
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【０１０１】
一般に、５〜１０％の重量パーセンテージのモノマー及び架橋剤は、ヒドロゲルを形成するのに使用した。配合物１及び２（５％のモノマー、５％のＰＥＧＤＭＡ）は、紫外線への曝露後にヒドロゲルを全く形成しなかった。配合物３（１０％のＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ、５％の架橋剤）は、非常に柔らかいヒドロゲルを形成し、それは、水への浸漬後に容易に分解した。配合物４（１０％のＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ、５％のＰＥＧＤＭＡ）は、良好なヒドロゲルを生成した。配合物５及び６（１０％のモノマー、１０％のＰＥＧＤＭＡ）は、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡの両方について最良のヒドロゲルを生成し、このヒドロゲルは、長期間にわたって水に浸漬したときに安定していた。他の配合物が、適切なヒドロゲルを形成せず、モノマー及び架橋剤の重量パーセンテージが、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡの両方について一致しているため、配合物５及び６は、さらなる試験のために選択した。
ヒドロゲルのインビトロ抗菌活性
ヒドロゲルは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＢＡＡ−４０（ＭＲＳＡ）に関して細菌の接触活性殺滅について試験した。ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルは両方とも、細菌の両方の菌株の非常に良好な細菌殺滅を示し、ヒドロゲルの表面上に接種された全ての細菌を殺滅した。対照は、１．１６×１０７ＣＦＵの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び１．３０×１０７ＣＦＵのＭＲＳＡからなっていたため、細菌のｌｏｇ減少は、両方のヒドロゲルについて、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）について７．０６及びＭＲＳＡについて７．１１であると計算され得る。したがって、両方の細菌の殺滅％は、両方のヒドロゲルについて９９．９９９９９％超であると決定された。
【０１０２】
表７は、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡヒドロゲル及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルとともにインキュベートされた場合の、ＰＡ０１、ＣＲ−ＰＡ、Ａ．バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）、ＣＲ−ＡＢ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＭＲＳＡのインビトロ細菌ｌｏｇ減少を示す。約１０７ＣＦＵの細菌が、２時間のインキュベーション後に対照において生存していたが、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルとともにインキュベートされた場合、生存していなかった。これは、対照と比較して、両方のヒドロゲルによる細菌の７超のｌｏｇ減少又は９９．９９９９９％超の細菌の殺滅に相当する。
【０１０３】
【表７】
2020514500.tif 000019
【０１０４】
表７は、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡでインキュベートした時のＰＡ０１，ＣＲ−ＰＡ，Ａ．バウマニ，ＣＲ−ＡＢ，大腸菌，肺炎桿菌，黄色ブドウ球菌，ＭＲＳＡのin vitroのバクテリアｌоｇ減少を示す。
【０１０５】
この結果は、両方のヒドロゲルが、接触モードで細菌を殺滅するのに非常に有効であったことを示した。ヒドロゲルが、ヒドロゲルの網目構造中の多くのカチオン性アミノ基からなるＰＥＩの高度な分岐性により全ての細菌を殺滅することができたことが仮定される。ヒドロゲル網目構造中のカチオン性基は、静電相互作用によって細菌を「吸引」し、その後、細菌細胞壁を破壊して、細菌を殺滅することができた。
ヒドロゲルのインビトロ生体適合性
ヒドロゲルは、ＨＤＦ細胞とのそれらの生体適合性について試験した。トランスウエル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）ＭＴＴアッセイは、ヒドロゲルの浸出の指標として使用したが、これは、ヒドロゲルが通常は毒性であり、細胞の生存を低下させるためである。接触ＭＴＴアッセイは、細胞とのヒドロゲルの接触適合性を決定するのに使用した。トランスウエル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）ＭＴＴについて、両方のヒドロゲル（ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ）は、ＨＤＦ細胞の９５％超の細胞生存を示した（図６）。これは、ヒドロゲルが、それらの内容物の多くの浸出を有さなかったことを意味し、ヒドロゲルが安定しており、適切に架橋されたことが結論付けられ得る。接触ＭＴＴについては、両方のヒドロゲルは、ＨＤＦ細胞の８５％超の細胞生存を示した。これは、ヒドロゲルが、細胞との接触時に適合性であり、細胞に対する接触毒性を誘発しないことを意味する。これらの結果は、ヒドロゲルが、ＨＤＦ細胞と非常に生体適合性であり、生物医学装置においてコーティングとして使用され得ることを証明した。
ヒドロゲルの膨潤速度
ヒドロゲルの膨潤速度は、膨潤の速度ならびにヒドロゲルが可能である膨潤の程度を決定するために試験した。ヒドロゲルは、時間ゼロの時点ならびに多量の水に浸漬した後の様々な時点で秤量した。ヒドロゲルは、ろ紙を用いて適切に乾燥させてから、それらの質量を測定した。特定の時点での膨潤比は、下式によって決定した。
【０１０６】
【数５】
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【０１０７】
次に、データは、図７に示されるように線グラフとしてプロットした。両方のヒドロゲルが非常に迅速に膨潤し、最初の時点であるわずか１０分後に最大膨潤に達することが分かる。ヒドロゲルは、水を非常に迅速に吸収し得るため、これは、ヒドロゲルの非常に優れた品質である。ヒドロゲルが迅速に膨潤することも重要であるが、これは、ヒドロゲルが創傷浸出液を迅速に吸収し、創傷部を湿潤状態に保つことができ、それが創傷治癒過程において重要であるためである。ヒドロゲルが、水を非常に迅速に引き付ける、ＰＥＩの多くのアミノ基による高いカチオン性電荷のため、非常に迅速に膨潤することができたことが仮定される。また、ヒドロゲルは、その元の質量の１０倍超まで膨潤することができた。
インビボ創傷感染症マウスモデル
細菌殺滅活性、インビトロ生体適合性及び膨潤速度の点でのＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルの間の多くの類似性により、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡヒドロゲルは、より少なくかつより簡単な合成工程を必要とするため、インビボ試験のために選択した。約１０７ＣＦＵのＭＲＳＡは、各マウスの創傷皮膚に接種した。細菌は、平板培養し、１．６０×１０７ＣＦＵのＭＲＳＡを含有することが決定された。次に、対照及びヒドロゲル被覆材は、マウスに適用し、３日間にわたって毎日交換した。４日目に、全てのマウスは、安楽死させ、創傷皮膚は、ＣＦＵ数について計数した。対照マウスにおけるＭＲＳＡの平均数は、１．９３×１０７ＣＦＵであることが決定され（図８）、これは、１日目に創傷皮膚において感染させた初期接種材料よりわずかに多かった。ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡヒドロゲル処理マウスにおけるＭＲＳＡの平均数は、平板培養後にゼロであることが決定された。これは、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡヒドロゲル被覆材が、対照被覆材と比較して７．２８桁生菌数を減少させることができたことを意味する。これは、９９．９９９９９％超のＭＲＳＡの有効な殺滅に相当する。インビボｌｏｇ減少結果は、インビトロ試験と同様であり、ここで、全ての細菌は、ヒドロゲルによって殺滅された。さらに、ヒドロゲル処理マウスの創傷は、３日後に対照マウスよりきれいであり、わずかに小さかった（図９）。
結論
ＰＥＩは、その高度な分岐性及び多くのカチオン性アミン基を含有することにより、抗菌性ヒドロゲルを発生させるための骨格として選択した。ＰＥＩは、ＰＥＧＭＡ基をグラフトすることによって改質され、架橋して、ヒドロゲルを形成することができた。疎水性デカン基によるＰＥＩのさらなるアルキル化は、その抗菌特性を改善するために行った。しかしながら、インビトロ抗菌試験では、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡヒドロゲルは、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルと同程度に良好に機能することができ、表面に接種された全ての細菌を殺滅した。両方のヒドロゲルのトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）及び接触ＭＴＴも、非常に類似しており、これは、ヒドロゲルが非常に生体適合性であり、生物医学用途に使用するのに好適であることを示唆する。合成されたＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡは、プラズマ−ＵＶ方法によってコンタクトレンズ上にコーティングを作製するのに使用した。このＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコーティングは、優れた広域スペクトル抗菌活性を示し、殺滅％及びｌｏｇ減少はそれぞれ、９９．９９％及び４より高い。創傷被覆材については、マウスモデル結果は、インビトロ結果と並行しており、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡヒドロゲルは、創傷皮膚に接種された細菌の全てを殺滅した。本明細書に示される抗菌性ヒドロゲルは、感染した創傷のための抗菌剤として使用するのに非常に有効であることが分かった。このヒドロゲルはまた、他の生物医学用途において検討される可能性があり得、例えば、多くの埋め込み物に関連する感染症に対処するためのヒドロゲルコーティングを形成する。
実施例３
この実施例では、創傷感染症を管理するための非浸出性のカチオン性ポリマーベースのヒドロゲルが、ポリエチレンイミン−グラフト−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ）のＵＶ光重合、続いて、エタノール及び水中での２時間の超音波処理によって、残留モノマーを除去することによって発生される。ＵＶ−可視光吸収試験は、２４時間にわたってヒドロゲルに浸漬した溶液（５ｍＬの水中１００ｍｇのヒドロゲル）からシグナルが検出されなかったため、非浸出性の結論を裏付けた一方、ピークが、１μｇ／ｍＬのヒドロゲルポリマーの低濃度でも２００ｎｍで観察され得る。
【０１０８】
ヒドロゲルの有効性を、市販の抗菌性創傷被覆材（アレビン（Ａｌｌｅｖｙｎ）Ａｇ及びアルジサイト（Ａｌｇｉｓｉｔｅ）Ａｇ、スミス・アンド・ネフュー（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｎｅｐｈｅｗ））と比較するためのバイオフィルム感染症モデルにおいて、ＰＥＩヒドロゲルが、４ｌｏｇ桁（９９．９９％超）のメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００）を殺滅することによってより良好に機能した一方、市販の抗菌性被覆材は、１ｌｏｇ桁（９０％超）だけ細菌数を減少させたに過ぎなかった。また、ヒドロゲルは、予防マウスモデルにおいて感染（１０７ＣＦＵ）全切除皮膚創傷におけるＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００の６＋桁（９９．９９９９％超）の殺滅及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ０１）の４＋桁（９９．９９％超）の殺滅を示した。ヒドロゲルはまた、非炎症性かつ非発熱性であり、感染したマウス皮膚における炎症細胞の数を、非感染創傷レベルまで有意に減少させる。ヒドロゲルは、インビトロでヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）に対して試験されるとき、９５％超の細胞生存を有することが示されるため、ヒト細胞と生体適合性である。ヒドロゲルはまた、非常に速い膨潤速度を有し、これは、ヒドロゲルが創傷浸出液を迅速に吸収し、創傷部を湿潤状態に保つため、創傷治療において重要である。ヒドロゲルのインビトロ及びインビボ機能特性は、罹患率及び死亡率の重要な原因である感染した創傷のための創傷被覆材としてのヒドロゲルの優位性を強調している。
材料及び方法
材料
分枝鎖状ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｍｗ＝８００、２５，０００及び７５０，０００）は、使用前に凍結乾燥させた。１−ブロモデカン、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、イソプロパノール、ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＧＭＡ、Ｍｎ＝３６０）及び２−ヒドロキシ−４’−（２−ヒドロキシエトキシ）−２−メチルプロピオフェノン（イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ）２９５９）は、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から購入し、入手したままの状態で使用した。クロロアセチルクロリド、無水エタノール、トルエン及び塩化メチレンは、メルクＰｔｅ社（Ｍｅｒｃｋ  Ｐｔｅ  Ｌｔｄ）（シンガポール）から購入し、さらに精製せずに使用した。ポリ（エチレングリコール）（１０００）ジメタクリレート（ＰＥＧＤＭＡ）は、ポリサイエンス社（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）から購入した。
特性評価
１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、３００ＭＨｚでブルカー（Ｂｒｕｋｅｒ）ＡＶ３００  ＮＭＲ分光計において２５℃で記録した。化学シフト（δ）は、テトラメチルシラン（ＴＭＳ）の内部標準プロトンを参照して、百万分率（ｐｐｍ）で報告した。細菌懸濁液及びＭＴＴアッセイの光学密度は、テカンインフィニット（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ）２００マイクロプレートリーダを用いて測定した。ゼータ電位読み取りは、マルバーンナノ−ＺＳ粒径分析計（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ−ＺＳ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒ）を用いて行った。ＳＥＭ画像は、日本電子（ＪＥＯＬ）ＪＳＭ−６７０１  ＦＥ−ＳＥＭを用いて撮影した。共焦点像は、ツァイス（ＺＥＩＳＳ）ＬＳＭ  ８００を用いて撮影した。ヒドロゲルの圧縮強度は、イントロン５５４３引張試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ  ５５４３  Ｔｅｎｓｉｌｅ  Ｍｅｔｅｒ）を用いて試験した。接触角は、ＦＴＡ２００接触角分析装置を用いて測定した。ＵＶ−可視光吸収は、サーモエボリューション（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）６００  ＢＢを用いて測定した。
クロロ官能化ポリエチレングリコールメタクリレート（Ｃｌ−ＰＥＧＭＡ）の調製
１１．８ｍＬ（３５．３ｍｍｏｌ）のポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＧＭＡ）は、１００ｍＬのトルエンに最初に溶解させ、１１．２５ｍＬ（１４１．２ｍｍｏｌ）のクロロアセチルクロリドは、この溶液中に加え、次に、撹拌し、１２０℃で２４時間還流させた。反応の後、この溶液は、溶媒蒸発に供し、続いて、濃縮物は、溶解のために塩化メチレン（１００ｍＬ）とともに加えた。次に、炭酸カリウムを加え、混合物は、１０分間撹拌した。ろ過及びろ液の溶媒蒸発の後、生成物が得られた。
ＰＥＧＭＡでグラフトされたポリエチレンイミン（ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ）の調製
分子量８００、２５，０００及び７５０，０００のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、様々な比率のＰＥＧＭＡでグラフトした（スキーム３）。
【０１０９】
【化７】
2020514500.tif 000021
【０１１０】
簡潔にするために、ＰＥＩ（２５Ｋ）−ＰＥＧＭＡ（１：５）は、例として記載される。１ｇのＰＥＩは、１０ｍＬの脱イオン水に最初に溶解させ、０．４ｍＬのＮａＯＨ溶液（１Ｍ）を加えた。次に、イソプロパノール（１ｍＬ）中のＣｌ−ＰＥＧＭＡ（０．２ｇ）は、この溶液に滴下して加えた。混合物は、室温で一定に撹拌しながら、３時間にわたって反応させ、次に、３日間にわたって透析（ＭＷＣＯ  １０３４４）に供した。最終生成物は、凍結乾燥によって得られた。
アルキル化ポリエチレンイミン（ＰＥＩ−デカン）の調製
デカン基を有するＰＥＩ（Ｍｗ＝２５，０００）は、実施例１に記載されるようにアルキル化反応によって調製した。ＰＥＩ（２．０ｇ、０．２ｍｍｏｌ）は、５０ｍＬの無水エタノールに溶解させ、２４時間にわたって８５℃で、還流条件下で、０．４４２ｇの１−ブロモデカン（２ｍｍｏｌ）でアルキル化した。生成されたＨＢｒは、さらに２４時間にわたって同じ条件下で、０．２ｇの水酸化ナトリウムで中和した。溶媒を除去した後、得られた残渣は、水に溶解させ、３日間にわたって蒸留水に対して透析した。得られた生成物は、２４時間にわたって凍結乾燥させて、ポリマーデカン−ＰＥＩを得た。
ＰＥＧＭＡでグラフトされたＰＥＩ−デカン（ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ）の調製
１ｇのＰＥＩ−デカンは、１０ｍＬの脱イオン水に最初に溶解させ、０．４ｍＬのＮａＯＨ溶液（１Ｍ）を加えた。次に、イソプロパノール（１ｍＬ）中のＣｌ−ＰＥＧＭＡ（０．６４ｇ）は、この溶液に滴下して加えた。混合物は、室温で撹拌しながら３時間にわたって反応させ、次に、３日間にわたって透析（ＭＷＣＯ  １０３４４）に供した。最終生成物は、凍結乾燥によって得られた。
ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルの形成
ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルは、前駆体ヒドロゲル溶液のＵＶ照射を用いて形成した。イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ）２９５９、ＵＶ開始剤は、エタノールに最初に溶解させて、１０％  ｗ／ｖのストック溶液を作製した。ポリマー、架橋剤（ＰＥＧＤＭＡ）及びＵＶ開始剤（イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ）２９５９）を含有するヒドロゲル溶液を混合し、１．５ｍＬの微細管中で、脱イオン水に完全に溶解させた。５０μＬのヒドロゲル溶液は、９６ウェルプレートの各ウェルに移した。次に、ヒドロゲル溶液は、架橋を起こしてヒドロゲルを形成するために１０分間にわたって紫外線（３６５ｎｍの波長及び１０ｍＷ／ｃｍ２の強度で）を照射した。ヒドロゲルは、超音波処理しながら、エタノール中で３回及び脱イオン水中で３回洗浄して、全ての未反応前駆体を除去した。ヒドロゲルの配合物が、表８に示される。１０％  ｗ／ｖのポリマー及びＰＥＧＤＭＡが、安定したヒドロゲルを形成するのに必要とされるようである。より低いパーセンテージのポリマー又はＰＥＧＤＭＡのいずれも、容易に分解する不安定なヒドロゲルをもたらし得る。
【０１１１】
【表８】
2020514500.tif 000022
【０１１２】
表８．ヒドロゲル組成物の配合。ＰＥＧＤＭＡ＝ポリエチレングリコールジメタクリレート
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）
ＭＩＣは、抗菌性ポリマーの抗菌有効性について評価した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＡＴＣＣ８７３９）、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＡＴＣＣ２７８５３）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＡＴＣＣ２９２１３）及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００）などの細菌種は、ＭＩＣ試験に使用した。細菌は接種し、対数中期まで２２０ｒｐｍで連続的に振とうしながら、３７℃で４ｍＬのミューラー・ヒントンブロス（ＭＨＢ、フルカ（Ｆｌｕｋａ）、ＭＩＣ試験のための分析グレード）中で分散させた。次に、対数中期細菌懸濁液は、抗菌試験を行うために、新鮮なＭＨＢ中で希釈した。使用される抗菌性ポリマーの開始濃度は、５１２μｇ／ｍＬであった。次に、１０連続２倍希釈の抗菌性ポリマー溶液は、滅菌した９６ウェル平底マイクロリットルプレートの各ウェルのために５０μＬのＭＨＢ中で作製した。ＭＨＢ中の抗菌剤の希釈は、５１２〜１μｇ／ｍＬの範囲を示した。その後、各ウェルに、０．０００２の光学密度を有する５０μＬの希釈細菌懸濁液を接種し、各ウェルの最終接種材料は、約５×１０５ＣＦＵ／ｍＬの細菌を含有していた。マイクロリットルプレートは、１８時間にわたって３７℃でインキュベートした。各ウェル中の微生物増殖は、６００ｎｍでマイクロプレート分光光度計（テカンインフィニット（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ）２００）を用いて各ウェル中の懸濁液の光学密度（ＯＤ）を測定することによって決定した。反復測定は、各細菌及び抗菌性ポリマーの濃度について行った。抗菌剤なしの陽性対照及び細菌懸濁液なしの陰性対照は、この実験に適用した。ＭＩＣは、１８時間のインキュベーション後に細菌の増殖を阻害するのに必要な抗菌性ポリマーの最低濃度として評価した。
ヒドロゲルのインビトロ抗菌アッセイ
（Ｉ）細菌培地の調製
細菌の菌株（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）８３７９、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）２９２１３、ＰＡ０１、ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００、肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）１３８８３及びＡ．バウマニ（Ａ．ｂａｕｍａｎｎｉｉ）１９６０６）は接種し、対数中期まで２２０ｒｐｍで連続的に振とうしながら、３７℃で４ｍＬのＭＨＢ培地中で分散させた。１ｍＬの細菌懸濁液は、滅菌微細管中に加え、ＭＨＢ培地は、遠心分離によって除去し、続いて上清をデカントした。細菌は、１ｍＬのＰＢＳで３回洗浄し、最終細菌懸濁液は、１ｍＬのＰＢＳを用いて調製した。
（ＩＩ）ヒドロゲルにおける細菌の接種
約１×１０７ＣＦＵを含有するＰＢＳ中の１０μＬの細菌懸濁液を、ヒドロゲルの表面上に接種し、それは、小さい組織培養ペトリ皿に入れた。次に、細菌懸濁液は、ヒドロゲルの表面全体を覆うように均一に塗布した。細菌を小さいペトリ皿上に直接接種することによって、対照を行った。ペトリ皿は、９０％の相対湿度で、１時間にわたって３７℃でインキュベートした。
（ＩＩＩ）細菌数の計数
１ｍＬのＰＢＳは、インキュベーション後に各組織培養ペトリ皿に加え、十分に洗浄した。ヒドロゲルは、ＰＢＳに浸漬し、ボルテックスして、細菌を解離させた。０．９ｍＬのＰＢＳは、２４ウェルプレートの各ウェルに加えた。次に、細菌懸濁液の一連の１０倍希釈を行い、ＬＢ寒天（寒天を含むＬＢブロス、シグマ（Ｓｉｇｍａ））上で平板培養した。プレートは、１８時間にわたってインキュベータ中で、３７℃でインキュベートし、細菌コロニーを計数した。
【０１１３】
ｌｏｇ減少及び殺滅％結果は、以下のように評価した。
【０１１４】
【数６】
2020514500.tif 000023
【０１１５】
ヒドロゲル−細菌の相互作用を視覚化するための走査電子顕微鏡法
ＰＢＳ中の細菌（ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００及びＰＡ０１、１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）の懸濁液を調製した後、ヒドロゲル上に接種し（１０μＬ、細菌数＝１×１０７ＣＦＵ）、その後、それらは、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、細菌は、少量のグルタルアルデヒド固定剤を滴下することによって、ヒドロゲル上に固定した。次に、ヒドロゲルは、一晩凍結乾燥させてから、薄片にし、日本電子（ＪＥＯＬ）ＪＳＭ−６７０１  ＦＥ−ＳＥＭを用いたＳＥＭイメージングに送った。細菌を含まないヒドロゲルをイメージングすることによって、対照を行った。
細菌生存及び膜透過を調べるためのライブ／デッド（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ）アッセイ
ライブ／デッド（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ）アッセイは、ＰＡ０１及びＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００を含むヒドロゲルを用いて行った。ＰＢＳ中の細菌（１×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）の懸濁液を調製した後、ヒドロゲル上に接種し（１０μＬ、細菌数＝１×１０７ＣＦＵ）、その後、それらは、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーションの後、ヒドロゲルは、室温で１５分間にわたってバックライト細菌生存キット（ＢａｃＬｉｇｈｔ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｋｉｔ）Ｌ１３１５２（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））で染色した。緑色ＳＹＴＯ  ９色素が、無傷の及び膜が損傷した細胞の両方に入る一方、赤色ヨウ化プロピジウム色素は、膜が損傷した細胞のみに入ることができ、その中で、それは、緑色ＳＹＴＯ色素を減少させる。次に、ヒドロゲルは、共焦点顕微鏡（ツァイス（ＺＥＩＳＳ）ＬＳＭ  ８００）を用いて、細菌を接種された表面においてイメージングした。生存細菌を染色することによって、対照を行った。
ヒドロゲルのゾル含量
ヒドロゲル前駆体溶液は、様々な時点（２、４、６、８、１０分）で紫外線を照射して、架橋させた。次に、ヒドロゲルは、一晩凍結乾燥させ、それらの乾燥質量について測定した。次に、ヒドロゲルは、上述されるように十分に洗浄し、再度、一晩凍結乾燥させてから、洗浄後のそれらの乾燥質量について測定した。ヒドロゲルのゾル含量は、以下のように式を用いて計算した。
【０１１６】
【数７】
2020514500.tif 000024
【０１１７】
ヒドロゲルの膨潤速度
ヒドロゲルは、以下の方法でそれらの膨潤速度について調べた。新たに作製されたヒドロゲルは、上述されるように洗浄し、凍結乾燥させた。完全に乾燥されたヒドロゲルの質量は、時間ゼロの時点で秤量した。次に、多量の脱イオン水をヒドロゲルに加えて、膨潤を誘発した。膨潤されたヒドロゲルの質量は、ろ紙を用いた乾燥の５、１０、１５、２０、２５及び３０分後の時点で取った。
【０１１８】
膨潤比は、以下のように式を用いて計算した。
【０１１９】
【数８】
2020514500.tif 000025
【０１２０】
圧縮試験
ヒドロゲルの機械的特性はまた、圧縮応力−歪み測定によって特性評価し、この測定は、イントロン５５４３シングルコラム試験システム（Ｉｎｓｔｒｏｎ  ５５４３  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）を用いて膨潤したゲルにおいて行った。直径６ｍｍ及び厚さ２ｍｍの、円柱状のゲル試料は、下側プレートに入れ、負荷細胞に連結された上側プレートによって、０．１ｍｍ／分の歪み速度で圧縮した。測定当たり４つに平行な試料を実施し、得られた値は、平均し、グラフにプロットした。
ヒドロゲルの表面ゼータ電位
ヒドロゲルは、マルバーンナノ−ＺＳ粒径分析計（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏ−ＺＳ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｓｉｚｅｒ）を用いてそれらの表面ゼータ電位について特性評価した。簡潔に述べると、ヒドロゲルは、乳鉢及び乳棒を用いて破砕し、一晩凍結乾燥させた。次に、乾燥されたヒドロゲルは、再度破砕して、粉末形態にし、水中に分散させた。次に、分散体は、ゼータ電位測定に送った。
ヒドロゲル浸出試験
ヒドロゲルは、上述されるように十分に洗浄してから、それらの浸出性について試験した。次に、洗浄されたヒドロゲルは、２４時間にわたって５ｍＬの脱イオン水に浸漬してから、サーモエボリューション（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）６００  ＢＢ  ＵＶ−可視光分光光度計を用いて溶液のＵＶ−可視光吸収を測定した。１００、１０及び１μｇ／ｍＬの濃度で、それぞれのポリマーのＵＶ−可視光吸収を測定することによって、対照を行った。測定される波長は、１９０〜４００ｎｍであった。
インビボ創傷感染症マウスモデル
（Ｉ）創傷実験及びＦＡＣ分析
約７〜８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを使用した。実験を開始させる前の２週間、動物の背中を除毛することによって、各マウスの毛包周期を同期させた。マウスに麻酔をかけ、除毛し、背面皮膚及びその下の皮筋層に、２つの直径６ｍｍの十分な厚さの切除創傷を負わせた。次に、２０μＬのＰＢＳ中の、１×１０７の指示される細菌（ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００及びＰＡ０１）は、創傷に局所的に接種し、１０分間静置して、感染を促した。ヒドロゲルは、創傷に適用し、テガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）（３Ｍ）透明被覆材で固定した。非処理の感染創傷及び非感染創傷を対照として用いた。負傷の４８時間後、５ｍｍの周辺領域を含む創傷を切除した。創傷試料からの単一細胞懸濁液は、製造業者のプロトコル（ミルテニーバイオテク（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ））にしたがって、ジェントルマックス組織分散装置（ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ）を用いて得た。細胞は、ＣＤ１１ｂ及びＬｙ６Ｇ（バイオレジェンド（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄｓ））で免疫標識し、フローサイトメトリーは、アキュリ（Ａｃｃｕｒｉ）Ｃ６フローサイトメータ（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて行った。データ分析は、フロージョ（Ｆｌｏｗｊｏ）ソフトウェアバージョン７．６．５（ツリースター（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ））を用いて行った。平均パーセンテージ値（ｎ＝４〜６）は、各処理についてプロットした（±ＳＥＭ）。両側スチューデントのｔ検定は、比較のために使用した。全ての動物試験は、南洋理工大学（Ｎａｎｙａｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）の実験動物管理使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）の規制にしたがって、承認され、行われた。
（ＩＩ）創傷皮膚における細菌負荷の計数
負傷の４８時間後、５ｍｍの周辺領域を含む創傷を切除した。各創傷は、１ｍＬのＰＢＳ中で均質化して、細菌（ｎ＝４）を解離させた。次に、細菌懸濁液の一連の１０倍希釈は、ＰＢＳ中で行い、ＬＢ寒天（寒天を含むＬＢブロス、シグマ（Ｓｉｇｍａ））上で平板培養した。プレートは、１８時間にわたって３７℃でインキュベートし、細菌コロニーを計数した。
【０１２１】
ｌｏｇ減少及び殺滅％結果は、プロットし、以下のように評価した。
【０１２２】
【数９】
2020514500.tif 000026
【０１２３】
（ＩＩＩ）市販の銀被覆材との比較
創傷及び感染は、期間にわずかな相違がある以外は上記と同じ手順によって行った。細菌に感染させた後、マウスは、処理なしで２４時間放置して、バイオフィルム感染症を促し、その後、２４時間にわたってそれらのそれぞれの処理剤で処理した。使用される市販の抗菌性創傷被覆材は、アレビン（Ａｌｌｅｖｙｎ）Ａｇ及びアルジサイト（Ａｌｇｉｓｉｔｅ）Ａｇ（両方ともスミス・アンド・ネフュー（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｎｅｐｈｅｗ）製）であった。次に、５ｍｍの周辺領域を含む創傷を切除した。各創傷は、１ｍＬのＰＢＳ中で均質化して、細菌（ｎ＝６）を解離させた。次に、細菌懸濁液の一連の１０倍希釈は、ＰＢＳ中で行い、ＬＢ寒天（寒天を含むＬＢブロス、シグマ（Ｓｉｇｍａ））上で平板培養した。プレートは、１８時間にわたって３７℃でインキュベートし、細菌コロニーを計数した。
【０１２４】
ｌｏｇ減少及び殺滅％結果は、プロットし、以下のように評価した。
【０１２５】
【数１０】
2020514500.tif 000027
【０１２６】
（ＩＶ）全創傷治癒試験
ＰＥＩヒドロゲル及びＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００細菌は、この試験のために選択した。０日目、マウスに創傷を負わせ、細菌に感染させた。創傷及び感染の手順は、上記と同じである。非処理の創傷は、テガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）で固定した一方、処理創傷は、ＰＥＩヒドロゲルを適用してから、テガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ）で固定した。創傷の写真は、０日目、１日目、３日目、５日目、７日目、９日目、１２日目、１４日目に撮影し、その時点で、新鮮なヒドロゲルへの交換も行った。同じ時点で、マウスは、安楽死させ、殺処分し、マウスの創傷は、細菌計数（ｎ＝４）のために採取した。各時点での細菌数及び創傷サイズを決定した。創傷サイズは、以下のように式を用いて計算した。
【０１２７】
【数１１】
2020514500.tif 000028
【０１２８】
ヒドロゲルのインビトロ生体適合性アッセイ
生体適合性試験は、ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ−Ａｄ−Ｄｅｒ線維芽細胞、ＣＣ２５１１、ロンザ（Ｌｏｎｚａ））を用いて行った。使用される細胞培養培地は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）及び１％の抗生物質（ペニシリン−ストレプトマイシン）からなる完全ＤＭＥＭであった。
（Ｉ）トランスウエル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）ＭＴＴアッセイ
ＨＤＦ細胞は、各ウェル中５×１０４個の細胞の初期接種材料から２４ウェルプレート中で培養し、細胞接着のために２４時間にわたって３７℃で、ＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。ヒドロゲルの５ｍｍの円板は、切り取り、トランスウエル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）挿入物（ファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）、１μｍの細孔）に入れてから、２４時間にわたって３７℃で、ＨＤＦ細胞とともにインキュベートした。次に、ヒドロゲルは、除去し、培養培地は、ＭＴＴ溶液（ＤＭＥＭ中１ｍｇ／ｍＬ）と取り換え、４時間にわたって３７℃でインキュベートして、生存細胞を染色した。ＭＴＴ溶液は、除去し、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を加え、プレートは、１５分間にわたって１５０ｒｐｍで振とうした。細胞生存は、５７０ｎｍにおける各ウェルの吸光度によって測定し、１００％細胞生存対照として働く細胞のみの対照ウェルと比較した。
（ＩＩ）接触ＭＴＴアッセイ
ＨＤＦ細胞は、各ウェル中１×１０４個の細胞の初期接種材料から９６ウェルプレート中で培養し、細胞接着のために２４時間にわたって３７℃で、ＣＯ２インキュベータ中でインキュベートした。ヒドロゲルの約３ｍｍの円板は、切り取り、細胞培養物に浸漬し、２４時間にわたって３７℃でインキュベートした。次に、ヒドロゲルは、除去し、培養培地は、ＭＴＴ溶液（ＤＭＥＭ中１ｍｇ／ｍＬ）と取り換え、４時間にわたって３７℃でインキュベートして、生存細胞を染色した。ＭＴＴ溶液は、除去し、ＤＭＳＯを加え、プレートは、１５分間にわたって１５０ｒｐｍで振とうした。細胞生存は、５７０ｎｍにおける各ウェルの吸光度によって測定し、１００％細胞生存対照として働く細胞のみの対照ウェルと比較した。
【０１２９】
結果は、以下のように評価した。
【０１３０】
【数１２】
2020514500.tif 000029
【０１３１】
結果及び説明
この実施例では、誘導体ＰＥＩコポリマーの２つのファミリー、特に、ポリエチレンイミン−グラフト−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ）及びポリエチレンイミン−グラフト−デカン−グラフト−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡ）は、合成し、次に、架橋剤（ポリエチレングリコールジメタクリレート、ＰＥＧＤＭＡ）と配合し、ＵＶ重合して、微孔性カチオン性ヒドロゲルにした。カチオン性ＰＥＩは、ＰＥＧＭＡでグラフトして、ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡがＵＶ重合性になるようにした。ＰＥＧＭＡは、ＰＥＩにおける改質後特性を与えただけでなく、哺乳類細胞との生体適合性も改善し得る。ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡによるヒドロゲルに対する疎水性の影響も試験した。最適化されたヒドロゲルは、様々なＥＳＫＡＰＥ細菌の７桁超のインビトロｌｏｇ減少を達成した（表９）。
【０１３２】
【表９】
2020514500.tif 000030
【０１３３】
表９．６種類の株のバクテリアに対する、異なるバージョンのＰＥＩヒドロゲルのIn vitroでのＬｏｇ減少。＊は、１８時間のプレーティング後にペトリ皿上にバクテリアコロニーが観察されないことを示す。
【０１３４】
創傷感染症について臨床的に関連する、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００）及び緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）（ＰＡ０１）に対する予防創傷感染症マウスモデルのインビボｌｏｇ減少はそれぞれ、６及び４超であり（図１０）、これは、ヒドロゲルが、優れた広域スペクトルインビボ抗菌活性を有することを示す。さらに、ＰＥＩヒドロゲルで処理されたマウスは、感染した対照マウスより、皮膚におけるより少ない炎症を示した。さらに、ヒドロゲルは、いかなる浸出性成分も、現在の抗菌性創傷被覆材に一般的に使用されている銀も含有していなかった。本発明の技術は、ヒドロゲルと接触する細菌の細胞外皮を破壊する高度に微孔性のカチオン性ヒドロゲルに基づいている。
【０１３５】
ＰＥＩ−ＰＥＧＭＡコポリマーシリーズについては、ＰＥＩ対ＰＥＧＭＡのモル比は、２５Ｋの分子量（Ｍｗ）を有するＰＥＩを用いて、１：５から、１：１０及び１：２０まで変化し；ｘモルのＰＥＩ対ｙモルのＰＥＧＭＡの様々なモル比を有する５つのＰＥＩ（Ｍｗ）−ＰＥＧＭＡ（ｘ：ｙ）コポリマーを作製した：（１）ＰＥＩ（２５Ｋ）−ＰＥＧＭＡ（１：５）；（２）ＰＥＩ（２５Ｋ）−ＰＥＧＭＡ（１：１０）；（３）ＰＥＩ（２５Ｋ）−ＰＥＧＭＡ（１：２０）；（４）ＰＥＩ（８００）−ＰＥＧＭＡ（１：５）；及び（５）ＰＥＩ（７５０Ｋ）−ＰＥＧＭＡ（１：５）。ＰＥＩ（２５Ｋ）−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：１６）のデカン誘導体は、疎水性の影響を試験するために作製した。１Ｈ  ＮＭＲ（図示せず）は、組成を確認するために使用した。５．５８ｐｐｍ及び６．１４ｐｐｍにおける二重線は、メタクリレート基中のプロトンに起因し、これは、ＰＥＧＭＡが、ＰＥＩ及びデカン−ＰＥＩ上に首尾よくグラフトして、それぞれＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡを形成したことを示す。約０．７〜０．９ｐｐｍにおけるプロトンは、デカンに起因し、これは、ＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡが首尾よく作製されたことを示す。
【０１３６】
グラム陰性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ならびにグラム陽性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００）に対する様々なＰＥＩ−ＰＥＧＭＡ及びＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡコポリマー溶液の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を測定し（表１０）、それらは、一般に同様であり、グラム陰性菌について６４〜５１２μｇ／ｍＬ及びグラム陽性菌について３２〜６４μｇ／ｍＬの範囲であり、これは、中程度の効力を示す。ＰＥＩ上への様々な比率のＰＥＧＭＡ及びデカンのグラフトは、それらの溶液形態でＭＩＣにあまり影響を与えなかった。
【０１３７】
【表１０】
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【０１３８】
表１０．生ＰＥＩポリマー及び修飾したＰＥＩヒドロゲルポリマーの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）。単位はすべてμｇ／ｍＬ。
ヒドロゲルは、水中の少ないパーセント（０．１％）の光開始剤（イルガキュア（Ｉｒｇａｃｕｒｅ）２９５９）とともに１０％の架橋剤（ＰＥＧＤＭＡ）を含む１０％のポリマーの最適化された配合物から作製した。ＵＶ照射後、この溶液は、固化して、良好な機械的完全性を有するヒドロゲルになる。ゾル含量データ（図１２）は、ヒドロゲルが８分の時点で最小ゾル含量に達したため、１０分のＵＶ曝露が、ヒドロゲルを架橋させるのに十分であったことを示した。
【０１３９】
ヒドロゲルは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、ならびに多くのＥＳＫＡＰＥ細菌の実験室株のそれらの接触活性インビトロ殺滅について試験した。細菌は、１時間にわたってヒドロゲルの表面に接種し、次に、細菌の生存を決定するために平板培養した。ＰＥＩ（２５Ｋ）−ＰＥＧＭＡ（１：５）、ＰＥＩ（７５０Ｋ）−ＰＥＧＭＡ（１：５）及びＰＥＩ（２５Ｋ）−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：１６）ヒドロゲルは、全ての細菌を殺滅したため、より有効であり、これは、より高いＭｗ  ＰＥＩ及び架橋剤のより低い割合が、殺菌特性を向上させることを示す。細菌のインビトロｌｏｇ減少は、ＰＥＩ（２５Ｋ）−ＰＥＧＭＡ（１：５）、ＰＥＩ（７５０Ｋ）−ＰＥＧＭＡ（１：５）及びＰＥＩ（２５Ｋ）−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：１６）ヒドロゲルについて、ＭＲＳＡについて７．５２及びＰＡ０１について７．３１であった。それらはまた、試験される細菌の他の菌株について７超のｌｏｇ減少を達成した。この結果は、より高いＭｗ  ＰＥＩヒドロゲルが、ヒドロゲルの網目構造中の多くのカチオン性アミノ基からなるＰＥＩの高度な分岐性のため、接触モードにおいて細菌を殺滅するのに非常に有効であったことを示した。ヒドロゲル網目構造中のカチオン性基は、静電相互作用によって細菌を「吸引」し、その後、細菌細胞壁を破壊して、細菌を殺滅することができた。ＰＥＩ（８００）−ＰＥＧＭＡ（１：５）ヒドロゲルは、ＥＳＫＡＰＥ菌株について１桁未満の減少を有する、細菌の最も低いｌｏｇ減少を達成した。
【０１４０】
走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）及びライブ／デッド（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ）アッセイはまた、結果をさらに調べ、実証するために、ヒドロゲル及び細菌において行った。図１２から、ＰＥＩ（２５Ｋ）−ＰＥＧＭＡ（１：５）ヒドロゲルが、１０μｍより大きい細孔を有する微孔性構造を有することが分かる。細菌が接種される場合、細菌は全て、ヒドロゲルの壁に吸引され、細菌破片が、ヒドロゲルに付着するのが見られ、細菌の溶解により、それらの細胞内含有物が放出されることを示す。同じことがＭＲＳＡ及びＰＡ０１の両方について観察された。細菌が、ヒドロゲルに接種され、ライブ／デッド（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ）色素で染色される場合（図１７）、ヒドロゲルに接種された全ての細菌が赤色に染色され、これは、赤色色素ヨウ化プロピジウムが、細菌細胞質に入ったことを意味する。ヨウ化プロピジウムは、透過性膜のみに入ることができるため、細菌は全て死亡しており、それらの膜が破壊されたことが示される。対照は、全て緑色に染色された細菌を有し、これは、細菌が全て生存していることを示す。結果は、ＭＲＳＡ及びＰＡ０１の両方について一致していた。疎水性ＰＥＩ（２５Ｋ）−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：１６）ヒドロゲルは、わずかに異なる構造を有するが、殺滅の機構は、他のヒドロゲルと同じである（図１３）。
【０１４１】
ヒドロゲルは、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）とのそれらの生体適合性について試験した。トランスウエル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）ＭＴＴアッセイは、ヒドロゲルの毒性浸出含量の指標として使用したが、これは、ヒドロゲルが細胞の生存を低下させるためである。接触ＭＴＴアッセイは、細胞とのヒドロゲルの接触生体適合性を決定するのに使用した。トランスウエル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）ＭＴＴについては、ＨＤＦ細胞の細胞生存は、ほぼ１００％であり、これは、ヒドロゲルが毒性浸出性でないことを意味する。接触ＭＴＴについては、ＨＤＦ細胞の細胞生存は、９０％超であり、これは、ヒドロゲルが、細胞との接触時に比較的生体適合性であり、細胞に対する接触毒性をあまり誘発しないことを意味する。これらの結果は、ヒドロゲルが、ヒト皮膚に見られるＨＤＦ細胞と非常に生体適合性であり、より重要なことには、毒性浸出性にならず、ひいては創傷被覆材における抗菌剤の形態として使用するのに好適であることを証明した。
【０１４２】
２つの最良のヒドロゲル配合物は、さらなる特性評価のために選択し、１つはＰＥＩ−ＰＥＧＭＡヒドロゲルであり、１つはＰＥＩ−デカン−ＰＥＧＭＡヒドロゲルであった。ＰＥＩ（２５Ｋ）−ＰＥＧＭＡ（１：５）及びＰＥＩ（２５Ｋ）−デカン−ＰＥＧＭＡ（１：１０：１６）ヒドロゲルは、それらの優れたインビトロ抗菌活性及びＰＥＩの同様のＭｗのために選択した。以下の段落において、それらはそれぞれ、ＰＥＩ及びＰＤＰヒドロゲルと示される。ヒドロゲルの膨潤速度は、膨潤の速度ならびにヒドロゲルが可能な膨潤の程度を決定するために試験した。ヒドロゲルは、一晩凍結乾燥させ、時間ゼロの時点ならびに多量の水に浸漬した後の様々な時点（０分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分）で秤量した。ヒドロゲルは、ろ紙を用いて適切に乾燥させてから、それらの質量を測定した。
【０１４３】
特定の時点での膨潤比は、方法の節において見られる式によって決定した。次に、データは、図１４に示されるように線グラフとしてプロットした。結果は、ヒドロゲルが非常に迅速に膨潤し、１０分後に９０％超の膨潤に達し、１５分後に最大膨潤に達したことを示した。ヒドロゲルは、水を非常に迅速に吸収し得るため、これは、ヒドロゲルの非常に優れた品質である。ヒドロゲルが迅速に膨潤することも重要であるが、これは、ヒドロゲルが創傷浸出液を迅速に吸収し、創傷部を湿潤状態に保つことができ、それが創傷治癒過程において重要であるためである。ヒドロゲルが、ＰＥＩの多くのアミノ基に起因する高いカチオン性電荷、及びその結果としての、水を非常に迅速に引き付ける高い親水性のため、非常に迅速に膨潤することができたことが仮定される。また、ヒドロゲルのより大きい細孔は、水が迅速に入るのを可能にする。ヒドロゲルは、それらの表面ゼータ電位について測定し、それらは、それらの表面上により高いカチオン性電荷を示した。ＰＥＩヒドロゲルは、特に、その表面上に＋６４．５ｍＶの電荷を有しており、これは、疎水性ＰＤＰヒドロゲルにおける表面電荷（＋５４．７ｍＶ）よりわずかに高かった。この高い正電荷は、ヒドロゲルが、その表面上に負荷電細菌を引き付けてから、接触によってそれらを殺滅するのを可能にする。また、ヒドロゲルは、破壊されずに５０％超の圧縮に耐え得るため、良好な圧縮強度を有する。
【０１４４】
接触角測定（図１５）は、水の接触角が、０分（ＰＤＰでは５０．５７°、ＰＥＩでは２１．８２°）及び２分（ＰＤＰでは３０．６４°、ＰＥＩでは１１．４２°）の両方の時点でＰＤＰヒドロゲルについてはるかに高かったため、ＰＤＰヒドロゲルが、ＰＥＩヒドロゲルより極めて疎水性であることを示した。
【０１４５】
ヒドロゲル浸漬溶液の吸光度を測定することによって両方のヒドロゲルにおいて行われた浸出実験は、ヒドロゲルが浸出成分を有さないことを示したが、これは、１００、１０及び１μｇ／ｍＬで測定した場合、２００ｎｍで吸光度ピークを有するそれらの未加工（ｒａｗ）ポリマーと対照的に、ヒドロゲルが、吸光度を示さなかったためである（図１４）。
【０１４６】
ＰＥＩ及びＰＤＰヒドロゲルは、それらの優れたインビトロ抗菌活性及び生体適合性のため、感染した皮膚創傷のマウスモデルを用いて試験した。ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００及びＰＡ０１は、インビボ試験に使用した。細菌のこれらの２つの菌株は、創傷感染症において臨床的に関連しており、多くの現行の抗生物質に対して耐性であるため、それらを試験することは、非常に重要である。約１×１０７ＣＦＵの細菌は、マウスの創傷皮膚のそれぞれに接種した。細菌は、平板培養し、３．７３×１０７ＣＦＵのＭＲＳＡ及び１．２２×１０７ＣＦＵのＰＡ０１を含有すると計数された。それらは、対照（テガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ））、ＰＥＩ及びＰＤＰヒドロゲルで処理した。２日目に、全てのマウスは、安楽死させ、創傷皮膚組織は、ＦＡＣＳのために解離させ、細菌負荷数のために均質化した。ＦＡＣＳ分析は、ＣＤ１１ｂ＋シグナルのパーセンテージが、細菌の両方の菌株について、非感染対照と比較した際に、ＰＥＩヒドロゲル処理された皮膚について有意でなかったことを示した。興味深いことに、ＰＤＰヒドロゲル処理された皮膚は、ＣＤ１１ｂ＋シグナルの増加を示し、これは、ＭＲＳＡ及びＰＡ０１の両方について、感染した対照皮膚の値と同等であった（図１０）。ＣＤ１１ｂ＋は、白血球に特異的な受容体であるため、それは、マクロファージ及び顆粒球のためのマーカーと見なされる。これらは、炎症を引き起こす免疫応答細胞である。したがって、ＰＥＩヒドロゲルは、細菌を殺滅することができると同時に、皮膚の炎症を軽減することができた一方、ＰＤＰヒドロゲルは、前者のみを行うことができた。
【０１４７】
対照創傷におけるＭＲＳＡ及びＰＡ０１の平均数はそれぞれ、１．６０×１０９ＣＦＵ及び２．２３×１０８であると決定され、これは、０日目に創傷に接種された最初の数より約１〜２桁多かった。ヒドロゲル処理創傷におけるＭＲＳＡの平均数は、ＰＥＩ及びＰＤＰヒドロゲルについてそれぞれ３．１７×１０２及び２．６６×１０２であり、ＰＡ０１について３．８３×１０３及び１．７８×１０４であった。これは、ヒドロゲル被覆材が、ＭＲＳＡについて６ｌｏｇ桁超及びＰＡ０１について４ｌｏｇ桁超だけ、生菌数を減少させることができたことを意味する。これは、９９．９９９９％超のＭＲＳＡ及び９９．９９％超のＰＡ０１の有効な殺滅に相当していた。ヒドロゲルは、驚くほど機能し、感染モデルにおいて細菌の大部分を実質的に根絶し、ＰＥＩヒドロゲルは、感染したマウス皮膚における炎症レベルさえ軽減した。インビボ時間殺滅実験も、ヒドロゲルが細菌を殺滅する速度を定量するために行った。ヒドロゲルが、１時間程度の速さで９９．９９％超の細菌を殺滅することができたことが分かった。
【０１４８】
バイオフィルム細菌の細菌殺滅は、臨床環境におけるヒドロゲル被覆材の有効性の指標として、市販の創傷被覆材と比較した。マウス創傷は、２４時間にわたってＭＲＳＡ及びＰＡ０１に感染させて、バイオフィルム感染症を促してから、さらに２４時間にわたってそれぞれの被覆材で処理した。使用される市販の抗菌性創傷被覆材は、被覆材中に抗菌剤として銀を含有する、アレビン（Ａｌｌｅｖｙｎ、登録商標）Ａｇ及びアルジサイト（Ａｌｇｉｓｉｔｅ、登録商標）Ａｇ（両方ともスミス・アンド・ネフュー（Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｎｅｐｈｅｗ）製）であった。対照創傷の細菌数は、実験の最後に約１桁増加した。アレビン（Ａｌｌｅｖｙｎ、登録商標）Ａｇ及びアルジサイト（Ａｌｇｉｓｉｔｅ、登録商標）Ａｇは両方とも、ＭＲＳＡについて１ｌｏｇ桁及びＰＡ０１について１〜２ｌｏｇ桁だけ細菌数を減少させた一方、ＰＥＩヒドロゲル処理創傷は、ＭＲＳＡ及びＰＡ０１の両方について４ｌｏｇ桁の細菌減少を有していた（図１０）。ＰＥＩヒドロゲルが、試験される２つの市販の抗菌性創傷被覆材より良好なインビボ細菌バイオフィルム殺滅を有することが証明される。
【０１４９】
２週間の長さの創傷治癒試験は、皮膚創傷の治癒速度に対するヒドロゲルの影響を調べるために、マウスにおいて行った。ＰＥＩヒドロゲルは、その優れたインビボ抗菌有効性ならびに非炎症性のためにこの試験のために選択し、非処理の対照（テガダーム（Ｔｅｇａｄｅｒｍ））と比較し、ＭＲＳＡ  ＵＳＡ３００は、この実験に使用した。全ての日数の時点で、ＰＥＩヒドロゲル処理創傷の治癒速度は、初期サイズのパーセンテージにおける創傷サイズがより小さいため、対照創傷より速かった（図１６）。さらに、はるかに多い膿が対照創傷において観察され得るため、ＰＥＩヒドロゲル処理創傷は、対照創傷よりきれいであった。さらに、二次的創傷部位が、対照創傷において見られ、皮膚領域の近くへの感染の広がりによって引き起こされる可能性が最も高い。７日目の６つの異なる対照とＰＥＩヒドロゲル処理創傷との間の比較（図示せず）は、６つのうち５つの対照創傷が、二次的創傷部位を有する一方、ＰＥＩヒドロゲル処理創傷のいずれも、二次的創傷部位を有さないことを示した。ＰＥＩヒドロゲルで処理された場合、ＭＲＳＡは、３日後に完全に全滅した一方、対照創傷における細菌は、マウスの免疫系によってゆっくりと殺滅され、１４日後にかなりの量が依然として残っている。
【０１５０】
固定化されたカチオン性ポリマーの抗菌作用は、負荷電リン脂質と強く相互作用するそれらの能力に起因し得、それにより、静電相互作用が、標的細胞膜への最初の結合に影響を与えるのを可能にし、次に、ポリマーにおける疎水性部分が、細菌細胞膜の内側疎水性コアと相互作用して、完全性の破壊及びそれに続く細胞死をもたらす。したがって、表面電荷密度及び疎水性が、表面コーティングの抗菌活性に影響を与える主な要因である。イミノ基のｐＫａ値が、約１０〜１１であるため、ＰＥＩは、生理環境溶液（ｐＨ約７．２）中で正荷電分子である。
【０１５１】
その抗菌特性をさらに改善するために、アルキル部分などの疎水性基が、ポリマー主鎖に導入される。アルキル化及び非アルキル化ＰＥＩ、ならびに様々な分子量を有するＰＥＩを用いたＰＥＩヒドロゲルの抗菌活性を調べた。非アルキル化ＰＥＩヒドロゲルは、アルキル化形態と同等に十分に機能し、アルキル化形態と異なり、皮膚の炎症を誘発しない。また、それは、その疎水性同等物と比較して、より高い機械的強度、より大きい細孔径、より高い膨潤及びその親水性による哺乳類細胞とのより高い生体適合性のようなより優れた特性を有する。インビボ創傷感染症モデルにおいて市販の抗菌性創傷被覆材（アレビン（Ａｌｌｅｖｙｎ、登録商標）Ａｇ及びアルジサイト（Ａｌｇｉｓｉｔｅ、登録商標）Ａｇ）と比較した際、それは、市販のものについての１〜２ｌｏｇ桁と比較して、試験される細菌（ＭＲＳＡ及びＰＡ０１）の４ｌｏｇ桁の殺滅によって、市販のものより機能が優れている。ＰＥＩヒドロゲルによる処理はまた、感染した創傷の近くに二次的創傷部位さえ有する、膿でいっぱいの対照創傷と異なり、膿があまりないきれいな創傷を保った。したがって、本発明のヒドロゲル技術は、感染に関連する創傷への潜在的な処理として生物医学分野において有望である。
結論
ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、その高度な分岐性及び多くのカチオン性アミン基を含有することにより、抗菌性ヒドロゲルを発生させるための骨格として選択した。ＰＥＩは、ＰＥＧＭＡ基をグラフトすることによって改質し、架橋して、ヒドロゲルを形成することができた。疎水性デカン基によるＰＥＩのさらなるアルキル化は、その抗菌特性を改善するために行った。しかしながら、インビトロ抗菌試験では、ＰＥＩヒドロゲルは、ＰＤＰヒドロゲルと同程度に良好に機能することができ、表面に接種された全ての細菌を殺滅した。両方のヒドロゲルのトランスウェル及び接触ＭＴＴはまた、非常に類似しており、これは、ヒドロゲルが、非常に生体適合性であり、創傷被覆材において使用するのに好適であることを示唆する。マウスモデルは、ヒドロゲルが、創傷表面におけるほとんどの細菌を根絶することができ、創傷治癒さえ助けることを証明した。本明細書に示される抗菌性ヒドロゲルは、感染した創傷のための抗菌剤として使用するのに非常に有効であることが分かった。この技術は、身体に有害でかつ発癌性であり得る、多くの抗菌性創傷被覆材において一般的に見られる銀の使用を回避するため、多くの市販の製品に対して有利である。臨床環境において使用するのに本発明のヒドロゲル技術の他の多くの利点がある。記載されるように、ヒドロゲルは、２工程合成及び高速のＵＶ重合プロセスのみを必要とする。ヒドロゲルは、創傷浸出液を管理するのに良好な、高くかつ迅速な膨潤を有し、透明であり、したがって、被覆材を取り外さずに創傷状態を見ることができる。また、ヒドロゲルは、安定しており、処理の際に破壊されず、又は分解せず、処理が完了したときにきれいな創傷を保つ。このヒドロゲルはまた、他の生物医学用途において検討される可能性があり得、例えば、多くの埋め込み物に関連する感染症に対処するためのヒドロゲルコーティングを形成する。
【０１５２】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語に続く全てのものを含むがそれらに限定されないことを意味する。したがって、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語の使用は、列挙された要素が、必要又は必須であるが、他の要素が任意であり、存在してもしなくてもよいことを示す。
【０１５３】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句に続く全てのものを含み、それらに限定されることを意味する。したがって、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句は、列挙された要素が、必要又は必須であり、他の要素が存在してはならないことを示す。
【０１５４】
本明細書に説明的に記載される本発明は、本明細書に特に開示されていない、いかなる１つ又は複数の要素、１つ又は複数の限定がなくても、好適に実施され得る。したがって、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、広く及び限定なしで読まれるべきである。さらに、本明細書において用いられる用語及び表現は、限定の用語ではなく、説明の用語として使用されており、このような用語及び表現の使用には、示され記載される特徴のいかなる均等物又はその部分も除外する意図はなく、権利請求される本発明の範囲内で様々な変更が可能であることが認識される。したがって、本発明が、好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、ここで実施され、本明細書に開示される本発明の変更及び変形は、当業者によって行うことができ、このような変更及び変形は、本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０１５５】
温度及び期間などについての所与の数値に関する「約」とは、指定される値の１０％以内の数値を含むことを意味する。
本発明は、本明細書において広範にかつ一般に記載されている。一般的開示に含まれるより狭い種及び亜属の群のそれぞれも、本発明の一部を成す。これは、除外される材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、任意の主題を属から除外するという条件又は消極的限定付きで、本発明の一般的記載を含む。
【０１５６】
他の実施形態が、以下の特許請求の範囲及び非限定的な実施例に含まれる。さらに、本発明の特徴又は態様が、マーカッシュグループに関して記載される場合、本発明はまた、マーカッシュグループの任意の個別の要素又は要素のサブグループに関して記載されていることを当業者は認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１２ｇ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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