(57)【要約】  本発明は、生物学的流体試料中の低濃度の分析物を測定するための電気化学的バイオセンサーを提供する。バイオセンサーは、１つ以上の作業電極と、参照電極と、対向電極と、バイオカクテルとを備えている。バイオカクテルは、緩衝溶液中に１つ以上の酵素と１つ以上の酸化還元メディエーターとを含んでいる。本発明は、本発明の電気化学的バイオセンサーを用いて生物学的流体試料中の低濃度の分析物を測定する方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的流体中の１つ以上の分析物の濃度を測定する方法であって、
ａ）電気化学的バイオセンサー上に生物学的流体試料を置くことであって、前記電気化学的バイオセンサーが、
ｉ．支持部材基材と、
ｉｉ．前記支持部材基材（トランスデューサー）上に配置され、１つ以上の作業電極、対向電極、および参照電極を備える電気化学的セルと、
ｉｉｉ．前記電気化学的セル上に配置されたバイオカクテルであって、前記バイオカクテルが、
ａ．１つ以上のオキシダーゼ（ＯＸ）、ムタロターゼ（ＭＵＴ）、インベルターゼ（ＩＮＶ）、および１つ以上のペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）からなる群から選択される１つ以上の酵素触媒、ならびに
ｂ．Ｆｃ−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ３）２、Ｆｃ−（ＣＨ２ＯＨ）２、Ｆｃ−ＣＨ２ＯＨ、Ｆｃ−ＣＯＯＨ、およびＦｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２からなる群から選択される１つ以上のフェロセン酸化還元メディエーターを含む、バイオカクテルと、を備える、置くことと、
ｂ）電圧を前記電気化学的バイオセンサーへ印加することと、
ｃ）電流出力を測定することと、を含み、
前記電流出力が、前記生物学的流体中の前記分析物の前記濃度の関数である、方法。
【請求項２】
前記オキシダーゼが、バイオセンサーあたり４ＵＩ以下の量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ペルオキシダーゼが、バイオセンサーあたり１ＵＩ以下の量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ムタロターゼが、バイオセンサーあたり１６ＵＩ以下の量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記酸化還元メディエーターが、バイオセンサーあたり０．０３７ｍｇ以下の量で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記フェロセン酸化還元メディエーターが、Ｆｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
少なくとも１つのオキシダーゼが、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのペルオキシダーゼが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの酵素触媒が、ムタロターゼである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記分析物が、グルコースである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの酵素触媒が、インベルターゼである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記分析物が、スクロースである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
２つの分析物が測定される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記分析物が、グルコースおよびスクロースである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記バイオカクテルが、前記作業電極上のみに配置される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記電圧が、ポテンショスタットを用いて印加される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記電圧が、前記作業電極のうちの１つ以上へ印加される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記支持部材基材が、プラスチックフィルム、紙、およびセルロース基材からなる群から選択される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記支持部材基材が、ポリエチレンテレフタラート、ポリ塩化ビニル、ポリカルボナート、ポリプロピレン、およびポリエステルからなる群から選択されるプラスチックフィルムである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的流体が、唾液、汗、涙、または哺乳類動物によって分泌される他の流体である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の作業電極、対向電極、および参照電極が、前記支持部材基材上へと印刷によってメッキされる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記１つ以上の作業電極、対向電極、および参照電極が、前記支持部材基材上へとスクリーン印刷によってメッキされる、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
１つの電極が、前記対向電極および前記参照電極の両方である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
クロノアンペロメトリー、サイクリックボルタンメトリー、またはパルスボルタンメトリーによって操作可能な、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記クロノアンペロメトリーが、還元モードにおいて行われる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記参照電極が、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記作業電極および前記対向電極が、炭素／グラファイトである、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記生物学的流体中で測定されるグルコースおよび／またはスクロースの濃度が、０．００５〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物学的流体中で測定されるグルコースおよび／またはスクロースの濃度が、０．０２〜０．２５ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物学的流体中で測定されるグルコースおよび／またはスクロースの濃度が、０．２〜１．１ｍｍｏｌ／Ｌである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
生物学的流体試料中でグルコース濃度を測定するための電気化学的バイオセンサーであって、
ａ）支持部材基材と、
ｂ）前記支持部材基材（トランスデューサー）上に配置され、１つ以上の作業電極、対向電極、および参照電極を備える電気化学的セルと、
ｃ）前記電気化学的セル上に配置されたバイオカクテルであって、前記バイオカクテルが、
ｉ．グルコースオキシダーゼ、
ｉｉ．ムタロターゼ、
ｉｉｉ．ペルオキシダーゼ、ならびに
ｉｖ．Ｆｃ−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ３）２、Ｆｃ−（ＣＨ２ＯＨ）２、Ｆｃ−ＣＨ２ＯＨ、Ｆｃ−ＣＯＯＨ、およびＦｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２からなる群から選択される１つ以上のフェロセン酸化還元メディエーターを含む、バイオカクテルと、を備える、電気化学的バイオセンサー。
【請求項３２】
生物学的流体試料中のスクロースの濃度を測定するための電気化学的バイオセンサーであって、
ａ）支持部材基材と、
ｂ）前記支持部材基材（トランスデューサー）上に配置され、１つ以上の作業電極、対向電極、および参照電極を備える電気化学的セルと、
ｃ）前記電気化学的セル上に配置されたバイオカクテルであって、前記バイオカクテルが、
ｉ．グルコースオキシダーゼ、
ｉｉ．ムタロターゼ、
ｉｉｉ．インベルターゼ、
ｉｖ．ペルオキシダーゼ、ならびに
ｖ．Ｆｃ−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ３）２、Ｆｃ−（ＣＨ２ＯＨ）２、Ｆｃ−ＣＨ２ＯＨ、Ｆｃ−ＣＯＯＨ、およびＦｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２からなる群から選択される１つ以上のフェロセン酸化還元メディエーターを含む、バイオカクテルと、を備える、電気化学的バイオセンサー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書により援用される２０１７年６月７日出願の米国仮特許出願第６２／５１６，１９４号に対する優先権を特許請求する。
【０００２】
本発明は、生物学的流体中のグルコースおよびスクロースなどの分析物の濃度の測定のための電気化学的バイオセンサーに関する。本発明は、例えば、唾液、汗、および涙などの生物学的流体中で認められるような、低レベルの分析物を測定するのに適している。本発明の電気化学的センサーを用いて、分析物の濃度をカソードモードにおいて、他の酸化可能な種からの干渉を回避する電位で有利に測定することができる。本発明のバイオセンサーおよび方法は、種々の食品および農産物におけるグルコースおよびスクロースなどの低濃度の分析物を測定するのにも適している。
【背景技術】
【０００３】
検査ストリップは、血液試料中のグルコースを検査する技術分野において現に広範に使用されている。１つの共通の適用は、健常レベルを調整および維持するために糖尿病患者のレベルを頻繁に検査および監視する必要のある糖尿病患者に対してである。現行の診療には、検査目的のために針を用いて皮膚を常に穿刺して少量の血液を放出する必要性が包含されている。このことは、多くの理由のため不満足である。
【０００４】
より最近の開発において、グルコースモニターは、体内に植え込まれて、連続的な血液検査およびフィードバックを利用者に提供することができる。このアプローチは、一部には好まれているが、侵襲的な技術であり、固有の問題に関するそれ自体の共有を保持している。
【０００５】
血液よりもかなり低いグルコースレベルを含有する体液（例えば、唾液、涙、汗）が、検査試料として使用することができる検査があった場合、有利であろう。しかしながら、現行法では、血液と比較した時に非常に低レベルのグルコースの容易な検出が可能ではない。典型的な唾液および涙のグルコースレベルは、血中レベルの１／１００の程度にある。
【０００６】
血中の分析物、および、唾液等の体液中の低レベルの分析物、例えば、グルコースの検出のための検査方法および素子を開発するいくつかの試みがなされてきた。こうした試みには、ある範囲の素子が含まれる。
【０００７】
ＵＳ５，７７０は、金属化炭素基部と重層シリコーン含有の保護的なグルコースおよび／または乳酸の透過膜とを有する酵素電極を概して組み込んでいる固体状態の多用途電気化学的センサーを説明している。ここでは、電極における使用のためのペースト中へ酢酸セルロースを製剤することが説明されている。酸化還元メディエーターは一切用いられていない。
【０００８】
ＵＳ６，６２３，６９８は、検査チャネルと、検査チャネル内の再生可能なバイオセンサーの系とを備えたヘッドを有するバイオセンサー電気歯ブラシを開示している。該素子は、通例の唾液検査を実施するための使用することができる。酸化還元メディエーターは一切使用されていない。
【０００９】
ＵＳ２００１／００２３３２４は、唾液を刺激し、唾液を収集し、グルコース濃度を測定するための素子を説明している。好ましい実施形態は、検査ストリップの形態にある。該素子は、閾値タイプの指示フィルムと接触した吸収性マトリックスを含有している。該フィルムは、グルコースオキシダーゼと、グルコースペルオキシダーゼと、グルコースへ曝露されると、色彩を変化させる試薬とを含有している。酸化還元メディエーターは一切使用されていない。
【００１０】
ＵＳ２００８／０１７７１６６は、電流滴定グルコースセンサーストリップの系を開示している。該センサーストリップは、生物学的試料中のグルコースオキシダーゼによるグルコースの分解から生じる過酸化水素の検出のための白金フィルムを利用している。該センサーストリップは単一の酵素系であって、酸化還元メディエーターは一切使用されていない。
【００１１】
ＵＳ２０１４／０１９７０４２は、液体試料中のグルコース濃度を決定するための電気化学的センサーを説明している。該センサーは場合により、試料配置領域内で複数のセンサー要素に覆われている。該センサー要素は、単層のカーボンナノチューブ、グラファイト、グラフェン、カーボンナノファイバー、カーボンナノワイヤおよびこれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる。該センサー要素、またはセンサー要素がない場合、作業電極は、グルコースオキシダーゼを含有する被膜で機能を付与されている。該センサー要素または該作業電極は単一の酵素系であって、酸化還元メディエーターは一切使用されていない。
【００１２】
ＵＳ６，７６７，４４１は、生物学的流体中の種々の分析物の濃度を測定するための、少なくとも１つの酵素をペルオキシダーゼおよび酸化還元メディエーターと組み合わせた電気化学的センサーを開示している。フェロシアン化物が酸化還元メディエーターとして好ましい。参照電極には、作業電極（複数可）が適切に作動するために酸化還元メディエーターを搭載されていなければならない。電気化学的センサーは、干渉する種を酸化しないように、より低電圧で作動することができる。電気化学的センサーは、層状になった層から構成されており、導電性コンジット、およびカットアウトは、試料と電極との接触を可能にする。作業電極および参照電極は各々、別個の導電性コンジットと接触している。
【００１３】
グルコースおよびスクロースの検査のための別の用途は、食品および／または野菜の検査を包含している。１つの特定の適用は、ジャガイモに対してであり、伝統的なグルコース検査素子は、血中のより高いレベルと比較して、ジャガイモ中に存在する比較的低レベルのグルコースおよびスクロースを正確に検査するのに適合していない。グルコースおよびスクロースがアミノ酸（アスパラギン）と結合して、癌原性物質として特定されてきたアクリルアミド材料を生成することができるので、食品、特にジャガイモにおけるグルコースおよびスクロースのレベルを測定することはますます重要となってきた（Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｎｉｏｎ  Ｌ３０４／２４  ２１．１１．２０１７を参照されたい）。それゆえ、アクリルアミドの生成を最小限にするために、グルコースおよびスクロースのレベルの容易かつ正確な検出のための手段を有することは重要である。このことは、これらの材料についての政府の閾値と合致するための重要なツールでもあり得る（Ｃｒｅａｎｇａ  ａｎｄ  Ｅｌ  Ｍｕｒｒ．Ｄｉｓｐｏｓａｂｌｅ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｓｕｇａｒｓ  ｉｎ  ｐｏｔａｔｏｅｓ  ａｎｄ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｓｅｎｓｏｒ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．９，１−４（２０１１））。ＣｒｅａｎｇａおよびＥｌ  Ｍｕｒｒは、検査ストリップを利用した電気化学的な系を説明している。該検査ストリップは、グルコースオキシダーゼおよび西洋ワサビペルオキシダーゼの二重酵素系で機能を付与されており、酸化還元メディエーターを利用して、他の酸化種からの干渉を克服している。
【００１４】
今なお必要とされているものは、唾液、涙、および汗などの他の体液中のより低濃度の糖（例えば、グルコースおよびスクロース）を容易に検出するために使用することができる技術である。このことは、ヒトおよび他の動物における糖レベルを測定および監視するための容易で、無痛の、非侵襲的なアプローチを提供するであろう。
【発明の概要】
【００１５】
本発明は、生物学的流体試料中の低濃度の分析物を測定するための電気化学的バイオセンサーを提供する。本発明は、本発明の電気化学的バイオセンサーを用いて生物学的流体試料中の低濃度の分析物を測定するための方法も提供する。
【００１６】
詳細な態様において、本発明は、生物学的流体中の１つ以上の分析物の濃度を測定する方法であって、
ａ）電気化学的バイオセンサー上に生物学的流体試料を置くことであって、該電気化学的バイオセンサーが、
ｉ．支持部材基材と、
ｉｉ．該支持部材基材（トランスデューサー）上に配置され、１つ以上の作業電極、対向電極、および参照電極を備える電気化学的セルと、
ｉｉｉ．該電気化学的セル上に配置されたバイオカクテルであって、該バイオカクテルが、
ａ．１つ以上のオキシダーゼ（ＯＸ）、ムタロターゼ（ＭＵＴ）、インベルターゼ（ＩＮＶ）、および１つ以上のペルオキシダーゼ（ＰＯＸ）からなる群から選択される１つ以上の酵素触媒、ならびに
ｂ．Ｆｃ−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ３）２、Ｆｃ−（ＣＨ２ＯＨ）２、Ｆｃ−ＣＨ２ＯＨ、Ｆｃ−ＣＯＯＨ、およびＦｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２からなる群から選択される１つ以上のフェロセン酸化還元メディエーターを含む、バイオカクテルと、を備える、置くことと、
ｂ）電圧を該電気化学的バイオセンサーへ印加することと、
ｃ）電流出力を測定することと、を含み、
該電流出力が、該生物学的流体中の該分析物の該濃度の関数である、方法を提供する。
【００１７】
別の態様において、本発明は、生物学的流体試料中のグルコースの濃度を測定するための電気化学的バイオセンサーであって、
ａ）支持部材基材と、
ｂ）該支持部材基材（トランスデューサー）上に配置され、１つ以上の作業電極、対向電極、および参照電極を備える電気化学的セルと、
ｃ）該電気化学的セル上に配置されたバイオカクテルであって、該バイオカクテルが、
ｉ．グルコースオキシダーゼ、
ｉｉ．ムタロターゼ、
ｉｉｉ．ペルオキシダーゼ、ならびに
ｉｖ．Ｆｃ−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ３）２、Ｆｃ−（ＣＨ２ＯＨ）２、Ｆｃ−ＣＨ２ＯＨ、Ｆｃ−ＣＯＯＨ、およびＦｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２からなる群から選択される１つ以上のフェロセン酸化還元メディエーターを含む、バイオカクテルと、を備える電気化学的バイオセンサーを提供する。
【００１８】
さらに別の態様において、本発明は、生物学的流体試料中のスクロースの濃度を測定するための電気化学的バイオセンサーであって、
ａ）支持部材基材と、
ｂ）該支持部材基材（トランスデューサー）上に配置され、１つ以上の作業電極、対向電極、および参照電極を備える電気化学的セルと、
ｃ）該電気化学的セル上に配置されたバイオカクテルであって、該バイオカクテルが、
ｉ．グルコースオキシダーゼ、
ｉｉ．ムタロターゼ、
ｉｉｉ．インベルターゼ、
ｉｖ．ペルオキシダーゼ、ならびに
ｖ．Ｆｃ−ＣＨ２−Ｎ−（ＣＨ３）２、Ｆｃ−（ＣＨ２ＯＨ）２、Ｆｃ−ＣＨ２ＯＨ、Ｆｃ−ＣＯＯＨ、およびＦｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２からなる群から選択される１つ以上のフェロセン酸化還元メディエーターを含む、バイオカクテルと、を備える電気化学的バイオセンサーを提供する。
【００１９】
一実施形態において、バイオカクテルは、作業電極のうちの１つ以上の上のみに配置される。
【００２０】
ある特定の実施形態において、電圧は、作業電極のうちの１つ以上へ印加される。
【００２１】
ある特定の実施形態において、分析物は、グルコース、スクロース、またはグルコースおよびスクロースの両方である。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】第１の世代の電気化学的バイオセンサーにおいて生物学的流体試料中の分析物の濃度を測定するために電流を発生させた反応を示す。
【図２】第２の世代の電気化学的バイオセンサーにおいて生物学的流体試料中の分析物の濃度を測定するために電流を発生させた反応を示す。
【図３】生物学的流体試料中の分析物の濃度を測定するために電流を発生させるための酸化還元反応、および競合する複数の酸化還元反応を示す。
【図４】グルコースオキシダーゼの存在下でのフェロセン酸化還元メディエーターとグルコースとの間の酸化還元反応を示す。
【図５】グルコースオキシダーゼの存在下でのグルコースとの種々のフェロセン酸化還元メディエーター誘導体の酸化還元反応によって生じた電流を示す。
【図６】種々のフェロセン酸化還元メディエーター誘導体によって生じるサイクリックボルタンメトリー電流を示す。
【図７】グルコースオキシダーゼの存在下でのグルコースとの種々のフェロセン酸化還元メディエーター誘導体の酸化還元反応によって生じたサイクリックボルタンメトリー電流を示す。
【図８】グルコースオキシダーゼの存在下でのグルコースを用いたフェロセン誘導体間の酸化還元反応の電気化学的機序ＥＣ’を示す。
【図９】種々のフェロセン酸化還元メディエーター誘導体単独の、次いでグルコースおよびグルコースオキシダーゼの存在下での＋０．３Ｖ対Ａｇ／ＡｇＣｌで記録されたクロノアンペロメトリー曲線を示す。
【図１０】異なるフェロセン酸化還元メディエーター誘導体を用いて作動するバイオセンサーを用いたグルコース較正曲線を示す。
【図１１】使用する酸化還元メディエーターがＦｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２であるときのバイオセンサー上で起こる反応を示す。
【図１２】スクリーン印刷された電気化学的バイオセンサートランスデューサーの完全なカードを示す。
【図１３】電気化学的バイオセンサー基材上の３つの電極の印刷を示す。
【図１４】電気化学的バイオセンサー基材上の２つの電極の印刷を示す。
【図１５】唾液中での検査についての電流対時間のクロノアンペロメトリーグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
上述の一般的な説明および次の発明を実施するための形態は、例示的であって説明としてであるにすぎず、特許請求されたいかなる対象も制限されないことは理解されることになっている。
【００２４】
特に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書の全開示のいたるところで参照される特許、特許出願、公開された出願、ならびに刊行物、ウェブサイトおよび他の公表された材料はすべて、特に記載されていない限り、何らかの目的のためにそれらが全体として参照により援用される。
【００２５】
本発明は、生物学的流体中のグルコースおよびスクロースなどの分析物の濃度を測定する方法を提供する。本発明は、電気化学的セルを備える電気化学的バイオセンサー検査ストリップであって、該電気化学的セル（トランスデューサー）が１つ以上の作業電極と、参照電極と、対向電極とを備える、電気化学的バイオセンサー検査ストリップを提供する。１つ以上のオキシダーゼと、１つ以上のペルオキシダーゼと、他の酵素と、フェロセン酸化還元メディエーターとを含有するバイオカクテルが提供される。検査ストリップは、例えば、唾液、汗、および涙などの生物学的流体中に存在する低濃度のグルコースを検出するために特に有用である。
【００２６】
定義
本出願において、単数形の使用は、具体的に特に記載がない限り、複数形を含む。本明細書で使用する場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈が特に明確に示さない限り、複数形も含むよう企図されている。
【００２７】
本出願において、「または」の使用は、特に記載がない限り、「および／または」を意味する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「を含む」および／または「を含んでいる」という用語は、記載された特徴、整数、工程、操作、要素、および／または成分の存在を具現化するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、操作、要素、成分、および／またはそれらの群の存在または追加を除外しない。さらに、「を含む」、「を有している」、「を有する」、「を伴う」、「から構成された」、「を含んだ」という用語またはそれらの変化形が、発明を実施するための形態または特許請求の範囲のいずれかにおいて使用される範囲内で、これらのような用語は、「を含んでいる」という用語と類似の様式で含まれるよう企図されている。
【００２９】
本明細書で使用する場合、範囲および用語は、「約」特定の値または範囲として表すことができる。「約」は、実際の量も含むよう企図されている。このゆえに、「約５パーセント」は、「約５パーセント」および「５パーセント」も意味する。「約は、企図した適用または目的についての典型的な実験誤差内を意味する。
【００３０】
本開示の各所で、部分および百分率はすべて、重量によるもの（総重量に基づく重量％または質量％）であって、温度はすべて、特に示さない限り、℃である。
【００３１】
本明細書で使用する場合、「バイオセンサー」、「グルコースセンサー」という用語、およびこれらに類するものは、相互交換可能に使用することができ、生物学的流体中で測定するのがグルコース、スクロース、フルクトース、または他の分析物にかかわらず、本発明のバイオセンサーを指す。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「アノードモード」および「酸化モード」という用語は、電位（正の電位または負の電位のいずれか対基準）が参照電極と比較して作業電極に印加されるときに測定される正の電流を指す。アノードモードまたは酸化モードにおいて、電子は、試薬（例えば、酸化還元メディエーター）から作業電極へと移動する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「カソードモード」および「還元モード」という用語は、電位（正の電位または負の電位のいずれか対基準）が参照電極と比較して作業電極へ印加されるときに測定される負の電流を指す。カソードモードまたは還元モードにおいて、電子は、作業電極から試薬（例えば、酸化還元メディエーター）へと移動する。
【００３４】
電気化学的バイオセンサーおよびその使用
現在のところ、大部分のグルコース電気化学的バイオセンサーは、クロノアンペロメトリーモードにおけるアノード検出に基づいており、該バイオセンサーの選択性は、作業電極へ印加される電位で検出可能である干渉種にかなり非常に依存している。干渉種には、酸素、アセトアミノフェン、アスコルビン酸、およびこれらに類するものが含まれる。さらに、多くの酸化された酸化還元メディエーターは、該酸化還元メディエーターにおけるおよび該酸化還元メディエーターの電気化学的検出に干渉することができる。
【００３５】
電気化学的バイオセンサーは、作業電極、参照電極、および対向電極という３つの電極を典型的に備えている。監視されている酸化還元反応は、作業電極の表面で生じる。作業電極の表面は、生物認識要素（例えば、本発明のバイオカクテル）を備えている。参照電極は、定常かつ周知の電位を有する。参照電極はしばしば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極である。電気化学的バイオセンサー法における「印加された電位」は、参照電極の標準電位と比較した、例えば、ポテンショスタットなどによって作業電極へ印加された電位の差を指す。したがって、本発明者らが、正の（アノードまたは酸化）電位というとき、作業電極へ印加される電位は、参照電極における電位よりも高いことを意味する（すなわち、この差は、０Ｖよりも大きな正の数である）。本発明者らが、負の（カソードまたは還元）電位というとき、作業電極へ印加される電位は、参照電極における標準電位よりも低いことを意味する（すなわち、この差は、０Ｖよりも小さな負の数である）。対向電極は、電流の吸込み点である。対向電極は、参照電極による電流閾値を防止する。いくつかの場合において、参照電極および対向電極は、同じ電極であってもよい。
【００３６】
グルコース電気化学的バイオセンサーの第１の世代のうちの１つは、酸素の存在下でグルコースをグルコノラクトンへと転換し、バイオセンサーの作業電極の表面上で検出および定量される過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を発生させるために、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）酵素を使用した。Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して作業電極で印加されるおよそ＋０．６Ｖの電位が、生成されるＨ２Ｏ２の量を定量するのに必要であった。測定されるＨ２Ｏ２の量は、試料中に存在するグルコースの量に等しい（図１を参照されたい）。しかしながら、ほとんどの生化学的化合物（例えば、酵素）は、電子を作業電極と容易に交換してはいない。酸化還元メディエーターを用いた第２世代の電気化学的バイオセンサーを、これから述べるとおり開発した。
【００３７】
第２世代は、酸化還元メディエーターを、ＧＯｘと、作業電位の低下を許容し、グルコース試料中に存在する他の生成物の干渉のうちのいくつかを回避する電極表面との間の連係として使用した。安定した還元型および酸化型（例えば、フェロセン誘導体）において存在することができる酸化還元メディエーターは、電極と酸化還元酵素との間で電子を移動させるのを支援することができる。フェロセン誘導体（ＦｃＲ）はおそらく、電気化学的グルコースバイオセンサーにおいて使用される最も一般的な媒質である（図２を参照されたい）。ほとんどの生化学的化合物（例えば、酵素）は、電子を作業電極と容易に交換することがない。還元型または酸化型の安定した形態で存在することができる酸化還元メディエーターは、電極と酸化還元酵素との間で電子を交換するのを支援することができる。この単一の酵素系において、酸化型の酸化還元メディエーターＦｃＲ＋は、ＧＯｘの存在下でグルコースと反応して、還元型ＦｃＲを生成する（図４を参照されたい）。ＦｃＲが、アノード電位を有する作業電極と接触しているとき（すなわち、酸化モード）、ＦｃＲは電子を電極へ喪失し（すなわち、電子を移動させ）、酸化型のＦｃＲ＋へと転換し戻される。このＦｃＲから電極への電子の移動によって生じる電流は、試料中のグルコースの濃度に比例する。しかしながら、酸素、グルコース、およびＧＯｘが同時に存在すると、グルコン酸を発生させることによるグルコースの正確な測定に影響し、したがって、グルコースの濃度を低減させる。この反応の干渉は、溶液中に存在する酸素の干渉と同じくらい多くのグルコースを消費し、したがって、低濃度のグルコースを測定することは困難となる。ＧＯｘの存在下でのグルコースと酸素および水との反応によって生成されるＨ２Ｏ２は、電子の電極への移動に干渉することがあり、測定される電流およびグルコース濃度の正確性におそらく影響する。また、アノード（酸化）モードにおける正の電位でなおも作動しているので、試料中に存在するかもしれない他の酸化可能な種からの何らかの干渉がなおもあることがある
【００３８】
酸素およびわずかな濃度のグルコースの存在下で、ＧＯｘなどの酵素はＨ２Ｏ２を発生させる。Ｈ２Ｏ２およびペルオキシダーゼ（例えば、西洋ワサビ根ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））の存在下で、ＦｃＲは、対応するフェリシニウム誘導体（ＦｃＲ＋）へと迅速に酸化される。カソード（還元）電位が作業電極へ印加されると、ＦｃＲ＋は電子を電極から拾い上げ（すなわち、電子は電極からＦｃＲ＋へと移動し）、還元される（すなわち、ＦｃＲ形態へと還元される）。しかしながら、多くのフェロセンは、図４に示すように、ＧＯｘの存在下でグルコースとの反応によっても還元される。
【００３９】
したがって、ＧＯｘの存在下での酸化型フェロセンとグルコースの反応で還元型のフェロセンを生成すると、作業電極からの電子の移動によって酸化型フェロセンの還元に干渉する。結果として生じる電流はそれゆえ、試料中のグルコースの濃度を正確に反映していない可能性がある。生成されたＦｃＲ＋が干渉反応に関与していない場合、電気化学的還元による該ＦｃＲ＋の測定は、溶液中のグルコースの濃度を決定する。アノードの電気化学的検出（酸化）からカソードモード（還元）へと逆転することの重要性は、検査されることになっている実際の試料の溶液中で非常にしばしばである多くの酸化可能な生成物の干渉を回避することである。
【００４０】
このような系に関する動態研究は、異なるＦｃＲとの競合反応が電気化学的検出中のグルコースおよびＧＯｘの存在下で起こる可能性があることを示してきた（図３を参照されたい）。これらの反応は、電気化学的信号に影響する。このような干渉は、低濃度のグルコース（例えば、０．０２ｍＭ未満のレベル）を伴う試料を測定するときに特に有害である。
【００４１】
フェリシニウム誘導体（ＦｃＲ＋）の干渉問題を解決するために、いくつかのフェリシニウム誘導体の動態研究を行うことが必要となってきた。２つの方法を採用した。
【００４２】
サイクリックボルタンメトリーとは、作業電極における電位が時間に対して線状に傾斜し、設定電位に到達した後、作業電極の電位が反対方向に傾斜して出発電位に戻る、電位動的（ｐｏｔｅｎｔｉｏｄｙｎａｍｉｃ）方法である。作業電極の電流は、印加電圧に対してプロットされる。クロノアンペロメトリーとは、特にアノードモードにおけるグルコース測定のための、電気化学的検出を用いた多くのバイオセンサーの基本的な技術である。クロノアンペロメトリーとは、酸化還元反応が生じる電位まで何も起こっていない領域から作業電極の電位が階段状となり、一定期間保持される電位ステップ法である。電流は、時間に対して測定される。電位ステップ法とは、パルスボルタンメトリーの技術のための基本でもある。パルスボルタンメトリーにおいて、種々の程度の複数のステップの組み合わせが適用され、電流は、電流電圧応答を構築するために時間どおりに記録される。
【００４３】
好ましくは、クロノアンペロメトリーは、生物学的流体試料中の分析物の濃度を測定するために使用される。クロノアンペロメトリーとは、作業電極の電位が固定された電気化学的技術であり、結果として生じるファラデー電流（ｉ）は、時間（ｔ１／２）の関数として監視される（図１５を参照されたい）。ファラデー電流は、Ｃｏｔｔｒｅｌｌの式ｉ＝ｋ．ｉ．ｔ１／２において説明されるとおり減衰する。
【００４４】
１つの方法において、いくつかのＦｃＲ＋の溶液を白金電極対飽和カロメル電極（ＳＣＥ）上での＋０．５Ｖでの対応するＦｃＲの調製用電気合成酸化によって調製した。ＦｃＲ＋のこれらの溶液の各々をグルコースおよびＧＯｘの溶液と接触させて、先に示されるとおり反応に関与するかどうかをみた。
【００４５】
グルコースおよびＧＯｘを、ＦｃＲ＋誘導体を含有する溶液へ添加すると、ＧＯｘの存在下でグルコースと反応するＦｃＲ＋を、（図４に示すように）還元し、回転中の（＋０．５Ｖの）白金電極を用いる酸化によって分析を開始して、ＦｃＲが発生するかどうかを検出する。すなわち、還元型ＦｃＲから白金電極への電子の移動によって発生する電流を測定する。酸化電流が高ければ、干渉はより重要な因子となる可能性があり、対応するフェロセンは、バイオセンサーのための良好な酸化還元メディエーターとはならないかもしれない。図５は、５つの異なるフェロセンメディエーターについての動態を示しており、そのうちの４つは、異なる速度で、干渉が発生する反応を生じ、グルコース濃度の正確なカソード測定ができない。ＧＯｘの存在下でグルコースと反応しない唯一のフェロセンメディエーターは、［Ｆｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２］＋誘導体である。したがって、［Ｆｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２］＋は、カソードモードにおける低濃度のグルコースの測定のための理想的なメディエーターであり得る。
【００４６】
使用する第２の方法は、サイクリックボルタンメトリーおよびクロノアンペロメトリーを用いる分析電気化学の研究に基づいている。これら２つの技術を用いて取得された曲線によって、フェロセン誘導体がカソードモードにおける良好なメディエーターとして機能することができるかどうかの決定が比較的短時間で可能となる。図６は、−０．１５Ｖで出発して＋０．４Ｖまでの非常に低速の走査（５ｍＶ／秒）を用いた、低濃度での４つのフェロセンの重層されたサイクリックボルタンメトリー曲線を示す。曲線は、４つの生成物については反応が逆転可能であることを示している（ＦｃＲ←−→ＦｃＲ＋＋１ｅ−）。
【００４７】
図７は、図６におけるのと同じ速度で同じ濃度のフェロセンを用いているが、ＧＯｘおよびグルコースの存在下での走査を示している。この場合、単一の誘導体Ｆｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２は、ＧＯｘおよびグルコースの存在によって影響されていない。その他の３つのフェロセンは、異なって挙動しており、酸化ピークの電流の増大、および還元ピークの電流の消失となっている。この種類の電気化学的機序は、ＥＣ’と呼ばれ、図８に示されている。この機序は、グルコース測定のための第２の世代のアノードバイオセンサーを基にしており、カソードモードを用いた場合、本発明の方法と干渉する。誘導体Ｆｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２のみが機序ＥＣ’に従って反応せず、それゆえ、ＧＯｘの存在下でグルコースからいかなる干渉もなく作動しており、バイオセンサーがカソードモードにおける低濃度のグルコース（および他の分析物）を測定することができる新たなかつ独特なメディエーターとなっている。
【００４８】
図９は、＋０．３ＶでＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して、グルコースオキシダーゼ、グルコース、ならびにそれぞれ２つのメディエーターＦｃ−（ＣＨ２ＯＨ）２およびＦｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２の各々の非存在下、次いで存在下で、サイクリックボルタンメトリーと同じ条件下で記録したクロノアンペロメトリー曲線を示す。さらに、Ｆｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２がＥＣ’反応を受けず、それゆえ、理想的な酸化還元メディエーターであることがわかる。
【００４９】
使用する方法または技術が何であれ、Ｆｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２は、現在のところ、カソードモードにおける低いグルコース濃度を測定するための特別なメディエーターである。このことによって、低いグルコース濃度の測定結果を特にひずませる酸化可能な干渉生成物を回避することができる。図１０は、異なるメディエーターで作動するバイオセンサーを用いたグルコース較正曲線を示す。図１０でわかるように、Ｆｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２についての濃度応答曲線は、直線的であり、十分に定義された急こう配の傾斜が付いており、試料中のグルコースの濃度による電流には明確な差がある。図１１は、Ｆｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２をメディエーターとして用いるバイオセンサー上で起こる反応を示す。
【００５０】
これらの結果に基づいて、好ましい実施形態において、本発明の電気化学的バイオセンサーは、多重酵素系（すなわち、２つ以上の酵素）における酸化還元メディエーターとしてＦｃ−（ＣＨ２−ＣＯ２Ｈ）２を備えている。本発明の電気化学的バイオセンサーは、負の電位（Ａｇ／ＡｇＣｌ参照電極に対して０Ｖ未満）の還元モードにおけるクロノアンペロメトリーによって作動し、低濃度のグルコースを、例えば、グルコースをほとんどまたはまったく含有していないと疑われている試料の分析において測定することができる。このような生物学的流体試料には、唾液、汗、涙、および他の生物学的流体が含まれる。
【００５１】
クロノアンペロメトリーを用いて、本発明の電気化学的バイオセンサーは、非常に低濃度のグルコースを、例えば、０．００５ｍｍｏｌ／Ｌ〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌの範囲で測定することができる。例えば、本発明の電気化学的バイオセンサーは、唾液（０．０２ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、涙（０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ〜０．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、または汗（０．２７７ｍｍｏｌ／Ｌ〜１．１１ｍｍｏｌ／Ｌ）中に典型的に存在する低レベルのグルコースを測定することができる。
【００５２】
大部分の健常個体については、空腹時正常血糖値は、４．０ｍｍｏｌ／Ｌ〜６．０ｍｍｏｌ／Ｌ（７２ｍｇ／ｄＬ〜１０８ｍｇ／ｄＬ）であり、食後２時間で最大７．８ｍｍｏｌ／Ｌ（１４０ｍｇ／ｄＬ）となる。糖尿病患者については、血糖値標的は、食前の１型または２型糖尿病患者について４．０ｍｍｏｌ／Ｌ〜７．０ｍｍｏｌ／Ｌであり、食後の１型糖尿病患者については９．０ｍｍｏｌ／Ｌ未満であり、食後の２型糖尿病患者については８．５ｍｍｏｌ／Ｌ未満である。
【００５３】
グルコース測定のために現に利用可能なモニター／バイオセンサーの製造元は、２０ｍｇ／ｄＬ〜６００ｍｇ／ｄＬ（１．１ｍｍｏｌ／Ｌ〜３３．３ｍｍｏｌ／Ｌ）の範囲を特許請求している。しかしながら、唾液、涙、および汗におけるグルコースの生理学的範囲は、非常に低い（上述を参照されたい）。それゆえ、現に利用可能なグルコースモニターは、このような生理学的流体中のグルコースレベルを測定するのに適していない。
【００５４】
本発明の電気化学的バイオセンサーは、グルコースに加えて、例えば、スクロースなど、ある範囲の分析物を測定するのに適している。
【００５５】
好ましい実施形態において、本発明の電気化学的セルは、支持基材上へと電極をスクリーン印刷することによって調製される（実施例１および実施例２を参照されたい）。しかしながら、フレキソ印刷、グラビア印刷、リソグラフィー印刷、デジタル印刷などの他の印刷技術も可能である。好ましい支持部材基材は、プラスチックフィルム（例えば、ポリブチレンテレフタラート（ＰＢＴ）、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリカルボナート、ポリカルボナート配合ポリエステル、ポリプロピレンなど）、ならびに紙およびセルロースの基材である。本発明の電気化学的セルは、好ましくは３つの電極を備えている。ＷＥ、すなわち作業電極（炭素）、ＣＥ、すなわち対向電極（炭素）、およびＲＥ、すなわち参照電極（Ａｇ／ＡｇＣｌ）である（実施例１を参照されたい）。異なる形状、大きさ、および材料を使用することができる。
【００５６】
炭素に加えて、作業電極および対向電極は、何らかの他の適切な材料でつくられてもよい。作業電極および参照電極が作られる材料は、伝導性であり、化学的に安定していなければならない。適切な材料には、炭素（例えば、グラファイト、グラフェン）、白金、金、ケイ素化合物、およびこれらに類するものが含まれるが、それらに限定されない。参照電極は、既知の安定した電位の物質でつくられていなければならない。参照電極に適した材料には、銀／塩化銀（Ａｇ／ＡｇＣｌ）、およびこれらに類するものが含まれるが、それらに限定されない。
【００５７】
異なる構成も使用してもよい。例えば、構成は、炭素対向電極によって、およびＡｇ／ＡｇＣｌ参照電極によって取り囲まれた環状の炭素作業電極からなり得る（実施例１を参照されたい）。構成はまた、２つの電極のみであってもよい。２電極構成において、作業電極は、対向電極としても機能する参照電極によって取り囲まれ得るか、または対面してい得る（実施例２を参照されたい）。多重バイオセンサー（トランスデューサー）は、基材カード上に印刷されている。バイオセンサーは、バイオカクテルのメッキ後にダイスカットされる。
【００５８】
各グルコース電気化学的バイオセンサーの表面は好ましくは、関心対象の分析物を検出および定量するのに必要な成分を含有するバイオカクテルをメッキすることによって改質される。バイオカクテルは典型的には、１つ以上の酵素、および１つ以上の酸化還元メディエーターを、約６．５〜約７．５のｐＨを有する緩衝溶液中に含んでいる。例えば、グルコースのためのバイオカクテルは、１，１’−フェロセン二酢酸（すなわち、Ｆｃ−（ＣＨ２Ｏ２Ｈ）２）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、ムタロターゼ（ＭＵＴ）およびリン酸カリウム塩などの緩衝溶液（ここで、緩衝溶液は、約７のｐＨを有する）を含んでいてもよい。酢酸ナトリウム緩衝液、（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸、ナトリウム緩衝液、クエン酸緩衝液、およびこれらに類するものなどだがそれらに限定されない他の緩衝液を使用することができる。ｐＨ７で、グルコースは、２つの環状ヘミアセタール形態（６３．６％のβ−Ｄ−グルコースおよび３６．４％のα−Ｄ−グルコース）で溶液中に存在する。グルコースオキシダーゼは、β−Ｄ−グルコースとのみ反応してＤ−グルクノ−１，５−ラクトンとなり、次いで、グルコン酸へと加水分解する。ムタロターゼとは、α−Ｄ−グルコースをβ−Ｄ−グルコースへと転換する酵素であり、反応全体を加速させ、電気化学的電流の信号を増大させる。スクロースの測定について、グルコースの場合と同じ成分を使用し、好ましくは、インベルターゼ（ＩＮＶ）を添加する。インベルターゼとは、スクロースからフルクトースおよびグルコースへの加水分解（分解）を触媒する酵素である。発生したグルコースは次に、グルコースバイオセンサーで測定することができる。
【００５９】
バイオカクテルは典型的には、約１００ＵＩ／ｍＬ〜約２０００ＵＩ／ｍＬの量でＧＯｘを含む。好ましくは、バイオカクテルは、約２００ＵＩ／ｍＬ〜約１０００ＵＩ／ｍＬのＧＯｘを含む。例えば、バイオカクテルは、約１００ＵＩ／ｍＬ〜約１５００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約１０００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約２００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約２０００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約１５００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約１０００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬ、または約５００ＵＩ／ｍＬ〜約２０００ＵＩ／ｍＬ、または約５００ＵＩ／ｍＬ〜約１５００ＵＩ／ｍＬ、または約５００ＵＩ／ｍＬ〜約１０００ＵＩ／ｍＬ、または約１０００ＵＩ／ｍＬ〜約２０００ＵＩ／ｍＬ、または約１０００ＵＩ／ｍＬ〜約１５００ＵＩ／ｍＬ、または約１５００ＵＩ／ｍＬ〜約２０００ＵＩ／ｍＬの量でＧＯｘを含んでもよい。
【００６０】
バイオカクテルは典型的には、約２０ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬのＨＲＰを含む。好ましくは、バイオカクテルは、約５０ＵＩ／ｍＬ〜約３００ＵＩ／ｍＬのＨＲＰを含む。例えば、バイオカクテルは、約２０ＵＩ／ｍＬ〜約４００ＵＩ／ｍＬ、または約２０ＵＩ／ｍＬ〜約３００ＵＩ／ｍＬ、または約２０ＵＩ／ｍＬ〜約２００ＵＩ／ｍＬ、または約２０ＵＩ／ｍＬ〜約１００ＵＩ／ｍＬ、または約２０ＵＩ／ｍＬ〜約５０ＵＩ／ｍＬ、または約５０ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬ、または約５０ＵＩ／ｍＬ〜約４００ＵＩ／ｍＬ、または約５０ＵＩ／ｍＬ〜約３００ＵＩ／ｍＬ、または約５０ＵＩ／ｍＬ〜約２００ＵＩ／ｍＬ、または約５０ＵＩ／ｍＬ〜約１００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約４００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約３００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約２００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約４００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約３００ＵＩ／ｍＬ、または約３００ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬ、または約３００ＵＩ／ｍＬ〜約４００ＵＩ／ｍＬ、または約４００ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬの量でＨＲＰを含んでもよい。
【００６１】
バイオカクテルは典型的には、約２００ＵＩ／ｍＬ〜約２０００ＵＩ／ｍＬのＭＵＴを含む。好ましくは、バイオカクテルは、約４００ＵＩ／ｍＬ〜約１６００ＵＩ／ｍＬのＭＵＴを含む。例えば、バイオカクテルは、約１００ＵＩ／ｍＬ〜約１５００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約１０００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約２００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約２０００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約１５００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約１０００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬ、または約５００ＵＩ／ｍＬ〜約２０００ＵＩ／ｍＬ、または約５００ＵＩ／ｍＬ〜約１５００ＵＩ／ｍＬ、または約５００ＵＩ／ｍＬ〜約１０００ＵＩ／ｍＬ、または約１０００ＵＩ／ｍＬ〜約２０００ＵＩ／ｍＬ、または約１０００ＵＩ／ｍＬ〜約１５００ＵＩ／ｍＬ、または約１５００ＵＩ／ｍＬ〜約２０００ＵＩ／ｍＬの量でＭＵＴを含んでもよい。
【００６２】
バイオカクテルは典型的には、約２０ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬのＩＮＶを含む。好ましくは、バイオカクテルは、約５０ＵＩ／ｍＬ〜約３００ＵＩ／ｍＬのＩＮＶを含む。例えば、バイオカクテルは、約２０ＵＩ／ｍＬ〜約４００ＵＩ／ｍＬ、または約２０ＵＩ／ｍＬ〜約３００ＵＩ／ｍＬ、または約２０ＵＩ／ｍＬ〜約２００ＵＩ／ｍＬ、または約２０ＵＩ／ｍＬ〜約１００ＵＩ／ｍＬ、または約２０ＵＩ／ｍＬ〜約５０ＵＩ／ｍＬ、または約５０ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬ、または約５０ＵＩ／ｍＬ〜約４００ＵＩ／ｍＬ、または約５０ＵＩ／ｍＬ〜約３００ＵＩ／ｍＬ、または約５０ＵＩ／ｍＬ〜約２００ＵＩ／ｍＬ、または約５０ＵＩ／ｍＬ〜約１００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約４００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約３００ＵＩ／ｍＬ、または約１００ＵＩ／ｍＬ〜約２００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約４００ＵＩ／ｍＬ、または約２００ＵＩ／ｍＬ〜約３００ＵＩ／ｍＬ、または約３００ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬ、または約３００ＵＩ／ｍＬ〜約４００ＵＩ／ｍＬ、または約４００ＵＩ／ｍＬ〜約５００ＵＩ／ｍＬの量でＩＮＶを含んでもよい。
【００６３】
バイオカクテルは典型的には、約０．０１モル／Ｌ〜約０．２モル／Ｌの酸化還元メディエーターを含む。好ましくは、バイオカクテルは、約０．０２５モル／Ｌ〜約０．１モル／Ｌの酸化還元メディエーターを含む。例えば、バイオカクテルは、約０．０１モル／Ｌ〜約０．１５モル／Ｌ、または約０．０１モル／Ｌ〜約０．１０モル／Ｌ、または約０．０１モル／Ｌ〜約０．０５モル／Ｌ、または約０．０１モル／Ｌ〜約０．０２５モル／Ｌ、または約０．０２５モル／Ｌ〜約０．２モル／Ｌ、または約０．０２５モル／Ｌ〜約０．１５モル／Ｌ、または約０．０２５モル／Ｌ〜約０．１モル／Ｌ、または約０．０２５モル／Ｌ〜約０．０５モル／Ｌ、または約０．０５モル／Ｌ〜約０．２モル／Ｌ、または約０．０５モル／Ｌ〜約０．１５モル／Ｌ、または約０．０５モル／Ｌ〜約０．１モル／Ｌ、または約０．１モル／Ｌ〜約０．２モル／Ｌ、または約０．１モル／Ｌ〜約０．１５モル／Ｌ、または約０．１５モル／Ｌ〜約０．２モル／Ｌの量で酸化還元メディエーターを含んでもよい。
【００６４】
成分の量は典型的には、使用する酵素の活性、トランスデューサーの大きさ、電気化学的バイオセンサーにメッキされることになるカクテルの容積により、また測定されることになっている分析物を含有している液体（すなわち、生物学的試料または実験試料）の容積、および測定時間にもよる。
【００６５】
バイオカクテルは好ましくは、高精度のピペットを用いて少量をピペット操作することによって作業電極上へとメッキされる。典型的には、バイオカクテルは、約５μＬ〜約５０μＬの容積でメッキされる。好ましくは、バイオカクテルは、約４０μＬの容積でメッキされる。例えば、バイオカクテルは、約５μＬ〜約４５μＬ、または約５μＬ〜約４０μＬ、または約５μＬ〜約３５μＬ、または約５μＬ〜約３０μＬ、または約５μＬ〜約２５μＬ、または約５μＬ〜約２０μＬ、または約５μＬ〜約１５μＬ、または約５μＬ〜約１０μＬ、または約１０μＬ〜約５０μＬ、または約１０μＬ〜約４５μＬ、または約１０μＬ〜約４０μＬ、または約１０μＬ〜約３５μＬ、または約１０μＬ〜約３０μＬ、または約１０μＬ〜約２５μＬ、または約１０μＬ〜約２０μＬ、または約１０μＬ〜約１５μＬ、または約１５μＬ〜約５０、または約１５μＬ〜約４５μＬ、または約１５μＬ〜約４０μＬ、または約１５μＬ〜約３５μＬ、または約１５μＬ〜約３０μＬ、または約１５μＬ〜約２５μＬ、または約１５μＬ〜約２０μＬ、または約２０μＬ〜約５０μＬ、または約２０μＬ〜約４５μＬ、または約２０μＬ〜約４０μＬ、または約２０μＬ〜約３５μＬ、または約２０μＬ〜約３０μＬ、または約２０μＬ〜約２５μＬ、または約２５μＬ〜約５０μＬ、または約２５μＬ〜約４５μＬ、または約２５μＬ〜約４０μＬ、または約２５μＬ〜約３５μＬ、または約２５μＬ〜約３０μＬ、または約３０μＬ〜約５０μＬ、または約３０μＬ〜約４５μＬ、または約３０μＬ〜約４０μＬ、または約３０μＬ〜約３５μＬ、または約３５μＬ〜約５０μＬ、または約３５μＬ〜約４５μＬ、または約３５μＬ〜約４０μＬ、または約４０μＬ〜約５０μＬ、または約４０μＬ〜約４５μＬ、または約４５μＬ〜約５０μＬの量でメッキされてもよい。
【００６６】
ピペットは、自動ピペット操作機であることができる。例えば、バイオカクテルは、Ｉｎｎｏｖａｄｙｎｅ  Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＳ−２を用いて作業電極の表面上へとピペット操作することができる。Ｉｎｎｏｖａｄｙｎｅ  Ｎａｎｏｄｒｏｐは、広範な範囲の液体を吸引および分配し、幅広い範囲の応用およびデータ操作を可能にするソフトウェアシステムを特徴とする。Ｉｎｎｏｖａｄｙｎｅ  Ｎａｎｏｄｒｏｐは、非接触型の分配および高い動的範囲という利点で、高精度のピペット操作を提供する。Ｉｎｎｏｖａｄｙｎｅ  Ｎａｎｏｄｒｏｐは、トランスデューサーの表面上の正確な選択された場所において、正確な量のバイオカクテル溶液を迅速に分配するのに非常に十分に適している。少数のバイオセンサーの製造のために、マイクロピペットを用いてバイオカクテルをメッキすることは可能である。
【００６７】
メッキ後、バイオカクテルをトランスデューサー上で乾燥させる。バイオセンサー上でのバイオカクテルの乾燥は典型的には、凍結乾燥器（室温で使用）の中で行われる。バイオカクテルがメッキされたトランスデューサーを、傍にシリカゲル（乾燥剤）を添えて凍結乾燥器の中に入れる。低真空をポンプによって凍結乾燥器の中で創出し、次にバイオセンサーを真空下で約１２〜約１５時間チャンバー内で放置する。
【００６８】
ある特定の実施形態において、印刷した電極上に絶縁体誘電性ポリマーを（例えば、スクリーン印刷を介して）塗布する。典型的には、誘電性ポリマーは、非極性ポリマーである。しかしながら、あまり有効ではないが、極性ポリマーも使用することができる。非極性誘電性ポリマーには、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、およびポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）などのフルオロポリマー、ならびにこれらに類するものが含まれるが、それらに限定されない。極性誘電性ポリマーには、ポリ（メチルメタクリラート）（ＰＭＭＡ）、ポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）、ポリアミド（例えば、ナイロン）、ポリカルボナート（ＰＣ）、およびこれらに類するものが含まれるが、それらに限定されない。
【００６９】
トランスデューサー上で乾燥した製品を、医薬等級の生体適合性のオープンメッシュ繊維（例えば、ＳＥＦＡＲ  Ｃｏｍｐａｎｙ製）によって保護する。オープンメッシュ繊維は、単一フィラメント糸を用いて紡績されている。糸は典型的には、ポリエステル（例えば、ポリエチレンテレフタラート（ＰＥＴ））またはポリアミド（例えば、ナイロン）から構成される。センサーは、ダイスカッター（例えば、Ｇｌｏｂａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ．製）を用いて切断される。センサーを切断した直後に、センサーを湿気から保護するバイアル内に入れる。
【００７０】
本発明の使い捨て可能な電流滴定バイオセンサーは、カソードモードで非常に少量のグルコースまたはスクロースを信頼可能に測定することができ、これは、生物学的試料中の多くの他の酸化可能な分子による干渉を防止する。これらのバイオセンサーは、使用するのが容易で、高感度、および広範な線形範囲を有し、使用期限が好ましくは１年を超える。類似のバイオセンサーの使用は、非常に少量の糖（例えば、０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ未満、品種による）を含有するジャガイモ塊茎汁中でグルコースおよびスクロースを測定するために実証されてきた。本発明の方法は、生物学的流体（例えば、唾液、涙、および汗）まで使用の分野を拡大する。これらのバイオセンサーの使用は、種々の利用のために糖レベルを監視する必要のあるヒトおよび／または他の哺乳類動物、例えば、糖尿病患者にとって特に有益であろう。
【００７１】
唾液中のグルコースまたはスクロースなどの分析物を測定するために、口腔を水で２回または３回すすぎ、およそ１分間待って、次に小さな清潔な容器内へと吐出することが推奨される。少量の唾液（例えば、約４０μＬ）を、ポテンショスタットへ接続したバイオセンサー上に置く。クロノアンペロメトリー測定（例えば、０〜２０秒間）を行う。結果として生じる電流は、特定のアルゴリズムを用いることによって、分析物の濃度を提供する。
【００７２】
涙中のグルコースまたはスクロースなどの分析物を測定するために、小さな清潔な容器内へと涙滴を収集する。少量（例えば、約４０μＬ）をピペット操作し、ポテンショスタットへ接続したバイオセンサー上に置く。クロノアンペロメトリー測定（例えば、０〜２０秒間）を行う。結果として生じる電流は、特定のアルゴリズムを用いることによって、分析物の濃度を提供する。
【００７３】
ある特定の実施形態において、本発明の電気化学的バイオセンサーおよび方法は、種々の食品および農産物中のグルコースおよびスクロースなど、低濃度の分析物を測定するのに適している。このような食品および農産物には、ジャガイモ、コーヒー、パンなどが含まれるが、これらに限定されない。近年、種々の食品および農産物中で反応してアクリルアミドを生成するグルコースおよびスクロースについての懸念がある。アクリルアミドは癌原性物質である。それゆえ、異なる食品を検査して、特に食品が高温で加熱されるとき、アクリルアミドの生成をもたらし得るグルコースおよびスクロースの濃度をどれが有するのかを決定することは有利であろう。
【実施例】
【００７４】
次の実施例は、本発明の具体的な態様を説明するものであって、その範囲をいかなる点においても限定するよう企図されるものではなく、そのように解釈されるべきではない。次の実施例は、好ましい実施形態を説明するが、当業者は、本発明の範囲および趣旨を伴う他の実施形態も使用することができることは理解することになる。
【００７５】
電極を印刷する方法
支持部材基材をポリブチレンテレフタラート樹脂（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ製のＶａｌｏｘ  ＦＲ−１）から調製した。基材は厚さ５００μｍとし、３００ｍｍ×２３５ｍｍの寸法のカードへと切断した。使用前に、基材を１１０℃で１時間硬化させた。完全なカードのＶａｌｏｘ基材は、１６０スクリーン印刷したトランスデューサーを有している（図１２を参照されたい）。
【００７６】
電極を個別の層の中で、第１の印刷層、第２の印刷層、およびいくつかの実施形態においては第３の印刷層を用いてスクリーン印刷した。スクリーン印刷をＤＥＫ  ＨＯＲＩＺＯＮ印刷機を用いて行った。各印刷工程の後、ペーストを箱型のオーブンの中で乾燥させた。Ａｇ／ＡｇＣｌペーストおよび炭素／グラファイトペーストについての乾燥条件は、６０℃で３０分間とした。ペーストは、１３０℃で１０分間乾燥させることもできた。誘電性ポリマーについての乾燥条件は、８０℃、３０分間とした。誘電性ポリマーは、１３０℃で１０分間乾燥させることもできた。
【００７７】
これらの例において、トランスデューサーの寸法は、１３．２ｍｍ×２７．６ｍｍとし、直径６ｍｍの環状作業電極を備えていた。トランスデューサーが企図された使用条件によって、他の寸法も使用され得ることは理解されることになっている。
【００７８】
バイオカクテル
バイオカクテルは、測定されることになっている分析物の選択的検出および定量を可能にする成分の混合物を含有する溶液である。決定された量のバイオカクテルをトランスデューサーの表面上にメッキした後、低温乾燥工程とした。
【００７９】
グルコースバイオセンサーのためのバイオカクテル
グルコース測定のためのバイオカクテルは、７．０〜７．５のｐＨを有するリン酸緩衝溶液とした。酵素および酸化還元メディエーターをリン酸緩衝溶液中へと混合した。カクテルは、８００ＵＩ／ｍＬの酵素グルコースオキシダーゼ（ＧＯｘ）、１６００ＵＩ／ｍＬの酵素ムタロターゼ（ＭＵＴ）、２００ＵＩ／ｍＬの酵素西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、および０．０２５モル／Ｌの酸化還元メディエーター１，１’−フェロセン二酢酸（すなわち、Ｆｃ−（ＣＨ２Ｏ２Ｈ）２）を含んでいた。
【００８０】
スクロースバイオセンサーのためのバイオカクテル
スクロース測定のためのバイオカクテルは、グルコースバイオカクテルのものと同じであり、これに２００ＵＩ／ｍＬのインベルターゼ（ＩＮＶ）を添加した。
【００８１】
バイオカクテルのメッキ
バイオカクテルを（スクリーン印刷したトランスデューサーの上の）電気化学的セルの作業電極上にメッキした。バイオカクテルを５μＬの容積で、広範な範囲の液体を吸引および分配し、幅広い範囲の応用およびデータ操作を可能にするソフトウェアシステムを特徴とするＩｎｎｏｖａｄｙｎｅ  Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＳ−２を用いて塗布した。
【００８２】
実施例１．３つの電極でできた電気化学的セル（トランスデューサー）。
３つの電極を備える電気化学的セルを製造した。電極は、炭素でできた作業電極（ＷＥ）、および炭素でできた対向電極（ＣＥ）、およびＡｇ／ＡｇＣｌでできた参照電極（ＲＥ）とした。支持基材は、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ製のＶａｌｏｘ−ＦＲ１とした。図１３は、実施例１の電気化学的セルの印刷された層を示す。
【００８３】
第１のスクリーン印刷したＡｇ／ＡｇＣｌペーストの層を基材に塗布した（図１３、第１の箱）。Ａｇ／ＡｇＣｌ層は、参照電極として作用し、接続子を備えた３つの電極の電気的接触を確実にして、ポテンショスタットと連通させる。
【００８４】
第２のスクリーン印刷した炭素／グラファイトペーストの層は、環状作業電極、および周囲の対向電極を形成する（図１３、第２の箱）。
【００８５】
第３のスクリーン印刷した絶縁体誘電性ポリマーの層を塗布して、電気化学的セルの幾何形状を制限し、電極を互いに単離した（図１３、第３の箱）。
【００８６】
最終的な電気化学的セルの構成を図１３の第４の箱に示す。
【００８７】
実施例２．２つの電極でできた電気化学的セル（トランスデューサー）。
２つの電極を備える電気化学的セルを調製した。電極は、炭素ＷＥおよび二重カウンターおよびＡｇ／ＡｇＣｌでできた参照電極（ＣＥ／ＲＥ）とした。図１４は、実施例２の電気化学的セルを示す。
【００８８】
基材（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ製のＶａｌｏｘ−ＦＲ１）上の第１のスクリーン印刷したＡｇ／ＡｇＣｌペーストの層（図１４、第５の箱）は、参照電極および対向電極として同時に作用し、両方の電極とポテンショスタットとの電気的な接触を確実にする。
【００８９】
第２のスクリーン印刷した炭素／グラファイトの層（図１４、第６の箱）は、ＷＥおよびポテンショスタットへのその接続子を形成する。
【００９０】
第３のスクリーン印刷した絶縁体誘電性ポリマーの層（図１４、第７の箱）は、電気化学的セルの幾何形状を制限し、電極を互いに単離する。
【００９１】
最終的な電気化学的セルを図１４の第８の箱に示す。
【００９２】
実施例３．試料中のグルコース濃度の測定。
本研究における唾液分析のための検査を、本特許において説明したバイオセンサーを用いて実施した。この検査を、空腹時の対象によって午前中に実施した。
【００９３】
対象は、自分の口腔を水で２回すすぎ、その後すぐに嚥下することなく、小さな清潔な容器内に自分の唾液を吐出した。４０μＬの唾液を、電位を参照Ａｇ／ＡｇＣｌに対して０Ｖに固定したポテンショスタットへ接続したバイオセンサーの表面上に置いた。次に、クロノアンペロメトリーを開始し、電流曲線を時間の関数として秒で記録した（図１５を参照されたい）。５秒間測定した電流によって、較正曲線を用いてグルコース濃度を決定することができる（例えば、図１０の線状曲線（ａ）を参照されたい）。
【００９４】
本発明は、その好ましい実施形態を含め、詳細に説明されてきた。しかしながら、当業者が、本開示の考慮の際に、本発明の範囲および趣旨の内に収まる本発明の変法および／または改良をすることができることは認識されることになる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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