(57)【要約】  本発明は、心筋損傷に罹患するリスクがあるか、心筋損傷に罹患した疑いがある、または心筋損傷に罹患している被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の心筋損傷を予防または治療するための方法に関する。本発明はさらに、被験者の心筋損傷およびその関連疾患を予防及び／または治療するための、プラスミノーゲンを含む薬物、薬物組成物、製品、キットに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
心筋損傷に罹患するリスクがあるか、心筋損傷に罹患した疑いがある、または心筋損傷に罹患している被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の心筋損傷を予防または治療するための方法。
【請求項２】
前記心筋損傷は、虚血、炎症、アレルギー反応、自己免疫、血栓、微小循環性障害、外傷、放射線損傷、糖質代謝障害、脂肪代謝障害による心筋損傷を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記心筋損傷は、心筋炎と、心膜炎と、高血圧と、アテローム性動脈硬化症と、冠状動脈心臓病と、狭心症と、心筋梗塞と、不整脈と、心不全と、ショックと、汎発性血管内凝固と、微小循環性障害と、糖尿病と、高脂血症と、動脈、静脈血栓と、脂肪塞栓と、虚血再灌流と、全身性硬化症と、全身性エリテマトーデスと、冠状動脈狭窄と、リウマチ性心臓病と、僧帽弁狭窄／閉鎖不全症と、大動脈弁狭窄／閉鎖不全症とからなる群より選ばれる疾患による心筋損傷である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記心筋損傷は、虚血性心臓疾患による心筋損傷である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記虚血性心臓疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、心不全、ショック、汎発性血管内凝固、微小循環性障害、虚血再灌流、冠状動脈狭窄、僧帽弁狭窄／閉鎖不全症、大動脈弁狭窄／閉鎖不全症である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記心筋損傷は、動脈、静脈血栓または脂肪塞栓による心筋損傷である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項７】
前記血栓または塞栓は、アテローム性動脈硬化によるものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
被験者に心筋組織を保護するために有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の心筋損傷を予防または治療するための方法。
【請求項９】
前記プラスミノーゲンは、心筋細胞損傷による心筋細胞アポトーシスを軽減する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記プラスミノーゲンは損傷心筋の修復を促進する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
前記プラスミノーゲンは損傷心筋の線維化を軽減する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記プラスミノーゲンは心筋機能の回復を促進する、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記プラスミノーゲンは、心筋損傷後の拡張及び心臓の代償性肥大を軽減する、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
被験者に心筋保護のために有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の脂質性心筋損傷を予防または治療するための方法。
【請求項１５】
前記プラスミノーゲンは心臓組織における脂質沈着を軽減する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記プラスミノーゲンは損傷心筋の修復を促進する、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記プラスミノーゲンは、損傷心筋組織の線維化を軽減する、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プラスミノーゲンは、損傷心筋細胞のアポトーシスを軽減する、請求項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記プラスミノーゲンは、心筋機能の回復を促進する、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記プラスミノーゲンは、心筋損傷後の拡張及び心臓の代償性肥大を軽減する、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記プラスミノーゲンは、血清のトリグリセリドを低下させることと、低密度リポタンパク質を低下させることと、超低密度リポタンパク質を低下させることと、血清のコレステロールを低下させることと、血清の高密度リポタンパク質を上昇させることとからなる群より選ばれる一つ以上によって血脂を軽減する、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
被験者に心筋保護のために有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の炎症性心筋損傷を予防または治療するための方法。
【請求項２３】
前記炎症は、被験者の自己免疫による炎症である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記炎症は、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、心筋炎、心膜炎である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記プラスミノーゲンは、損傷心筋の修復を促進する、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記プラスミノーゲンは、損傷心筋組織の線維化を軽減する、請求項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記プラスミノーゲンは、損傷心筋細胞のアポトーシスを軽減する、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記プラスミノーゲンは、心筋機能の回復を促進する、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記プラスミノーゲンは、心筋損傷後の拡張及び心臓の代償性肥大を軽減する、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
被験者に心筋保護のために有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者のアテローム性動脈硬化性心筋損傷を予防または治療するための方法。
【請求項３１】
前記心筋損傷は、被験者の冠状動脈心臓病によるものである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記プラスミノーゲンは、損傷心筋の修復を促進する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記プラスミノーゲンは、損傷心筋組織の線維化を軽減する、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記プラスミノーゲンは、損傷心筋細胞のアポトーシスを軽減する、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記プラスミノーゲンは、心筋機能の回復を促進する、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記プラスミノーゲンは、心筋損傷後の拡張及び心臓の代償性肥大を軽減する、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
被験者に心筋保護のために有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の糖尿病によって引き起こされるか糖尿病と合併した心筋損傷を予防または治療するための方法。
【請求項３８】
前記プラスミノーゲンは、損傷心筋の修復を促進する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記プラスミノーゲンは、損傷心筋組織の線維化を軽減する、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記プラスミノーゲンは、損傷心筋細胞のアポトーシスを軽減する、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記プラスミノーゲンは、心筋機能の回復を促進する、請求項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記プラスミノーゲンは、心筋損傷後の拡張及び心臓の代償性肥大を軽減する、請求項３７〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の脂質沈着による心筋損傷を予防または治療するための方法。
【請求項４４】
前記脂質沈着は、被験者の脂肪代謝異常または糖質代謝異常による高脂血症によるものである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の高脂血症によって引き起こされるまたは高脂血症に伴われる腎組織損傷を予防または治療するための方法。
【請求項４６】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の虚血再灌流性心筋組織損傷を予防または治療するための方法。
【請求項４７】
前記プラスミノーゲンは一種以上のその他の薬物または治療方法と併用することができる、請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記一種以上のその他の薬物は、高血圧の治療薬、糖尿病の治療薬、アテローム性動脈硬化症の治療薬、慢性糸球体腎炎の治療薬、慢性腎盂腎炎の治療薬、腎病症候群の治療薬、腎機能不全の治療薬、尿毒症の治療薬、腎移植の治療薬、脂肪肝の治療薬、肝硬変の治療薬、肥満症の治療薬を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記その他の薬物は、脂質低下薬、抗血小板薬、血圧降下薬、血管拡張薬、血糖降下薬、抗凝固薬、血栓溶解薬、肝臓保護薬、抗不整脈薬、強心薬、利尿薬、抗感染薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、炎症調節薬、抗腫瘍薬、ホルモン薬、チロキシンを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記薬物は、スタチン系、フィブラート系、ニコチン酸、コレスチラミン、クロフィブラート、益壽寧や血脂平や心脈楽のような不飽和脂肪酸、硫酸多糖類のような脂質低下薬；アスピリン、ペルサンチン、クロピドグレル、シロスタのような抗血小板薬；ヒドララジン、ニトログリセリンと硝酸イソソルビド、ニトロプルシドナトリウム、プラゾシンのようなα１受容体遮断薬、フェントラミンのようなα受容体遮断薬、サルブタモールのようなβ２受容体刺激薬、カプトプリル、エナラプリル、ニフェジピンやジルチアゼム、サルブタモール酸、ミノキシジル、プロスタグランジン、カルジオナトリンのような血管拡張薬；ウロキナーゼとストレプトキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化剤、単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化剤、ＴＮＫ−組織型プラスミノーゲン活性化剤のような血栓溶解薬；ヘパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、ビバリルジンのような抗凝固薬を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するものである、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２において、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を添加、削除及び／または置換したものであり、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、請求項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ−プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記プラスミノーゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである、請求項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記プラスミノーゲンは、ヒト由来の天然プラスミノーゲンである、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記被験者はヒトである、請求項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している、請求項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン。
【請求項６３】
薬学的に許容される担体及び請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンを含む薬物組成物。
【請求項６４】
（ｉ）請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンと、（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための手段（ｍｅａｎｓ）とを含む、予防性または治療性キット。
【請求項６５】
前記手段はシリンジまたはバイアルである、請求項６４に記載のキット。
【請求項６６】
請求項１〜４６のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するラベルまたはプロトコルをさらに含む、請求項６４または６５に記載のキット。
【請求項６７】
ラベルを含む容器と、
（ｉ）請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン、またはプラスミノーゲンを含む薬物組成物とを含む製品であって、
前記ラベルは、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する、製品。
【請求項６８】
その他の薬物を含む、もう一つ以上の部材または容器をさらに含む、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載のキット、または請求項６７に記載の製品。
【請求項６９】
前記その他の薬物は、脂質低下薬、抗血小板薬、血圧降下薬、血管拡張薬、血糖降下薬、抗凝固薬、血栓溶解薬、肝臓保護薬、抗不整脈薬、強心薬、利尿薬、抗感染薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、炎症調節薬、抗腫瘍薬、ホルモン薬、チロキシンからなる群より選ばれる、請求項６８に記載のキットまたは製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心臓病変の治療、特に各原因による心筋損傷、心臓機能障害の治療に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
心臓病変はよく見られる一種類の疾患であり、冠状動脈アテローム性硬化症、冠状動脈心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、心不全、心膜炎などを含む。心臓病変を引き起こす要素は多くて互いに影響し合い、例えば、糖尿病は脂肪代謝障害のため高脂血症、アテローム性動脈硬化症を引き起こすことができ、さらに高脂血症とアテローム性動脈硬化症は糖尿病を厳重化させる。この互いに影響する関係において、アテローム性動脈硬化症は多くの心脳血管疾患の共通の病理的基礎であり、心血管系疾患の中で最もよく見られる疾患でもあり、人の健康に深刻な危害を及ぼす。アテローム性動脈硬化症の発生発展は、脂質の侵入、血小板の活性化、血栓の形成、内膜損傷、炎症性反応、酸化ストレス、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）活性化、選択的基質代謝、及び血管再建などを含む。アテローム性動脈硬化症のみについていえば、何の症状も感じられない。体内のある重要な器官とつながっている動脈が塞がれた後しか、この疾患が発見されることができない。これは、該器官における動脈が塞がれて引き起こされる症状が目立つからである。例えば、心臓の供血動脈の部分は塞がれると、狭心症が感じられるが、完全にふさがれると、心臓病を引き起こす可能性がある（塞がれた動脈により供血される心臓組織が死亡した）。
【０００３】
糖尿病も心臓病変を引き起こす潜在的要素の一つである。糖尿病患者において、最終糖化産物（ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ，ＡＧＥｓ）は、アテローム性動脈硬化症病変の発生及び発展を促進することができる。ＡＧＥｓは動脈壁内のグルコースとタンパク質およびリポタンパク質との非酵素糖化反応産物であり、対応する受容体と結合した後下記のメカニズムによりアテローム性動脈硬化症を加速することができる。長期高血糖はＡＧＥｓの生成を増加させることができ、ＡＧＥｓはタンパク質、核酸および脂質を修飾して活性酸素種の生成を増加させ、酸化ストレスを増強でき、ＡＧＥｓは好中球と酸素ラジカルの生成を増加させるとともに好中球ＮＡＤＰＨ酸化酵素の活性を増加させ、血管の酸化すとれるを促進し、糖尿病患者の心血管疾患の発生率を高めることができる。糖尿病により引き起こされる長期的高血糖状態は、深刻な糖尿病合併症を引き起こすことができ、その中には、糖尿病心筋症などが含まれている。
【０００４】
一方で、脂質代謝障害はよく糖尿病と合併して発生するので、糖尿病は「糖脂病」ともいわれる。糖尿病の発症メカニズムは、Ｂ細胞の機能障害およびインスリンの抵抗に相関し、慢性高血糖として表れるが、糖代謝障害はよく脂質代謝障害と合併している。糖尿病の脂質代謝障害はすでに心血管疾患の独立した危険因子となっており、主に高トリグリセリド血症、低レベルのＨＤＬ、及びＬＤＬ濃度の増加として表れている。研究によると、糖尿病患者の心血管疾患の発病率と死亡率は非糖尿病患者より明らかに高く、糖尿病はすでに心血管疾患の独立した危険要素となっている。
【０００５】
研究によると、糖尿病患者の心血管疾患の発病率と死亡率は非糖尿病患者より明らかに高く、糖尿病はすでに心血管疾患の独立の危険要素となっている［３］。前記心血管疾患の中で、アテローム性動脈硬化症の発症率は高く、糖尿病と合併することが多い。
【０００６】
糖尿病患者のアテローム性動脈硬化症の発生は様々な要素と関係しているが、血漿脂質レベルの異常は最も主要な要素である。近年来、腎臓病と脂質代謝障害との関係はますます注目されてきており、慢性進行性腎損傷に脂質代謝異常が伴われ、高脂血症は腎損傷を促進し厳重化させ、糸球体損傷に介在する他、尿細管間質損傷においても寄与する。
【０００７】
脂質代謝障害と糖尿病腎症との間は一定の相関性があることは、臨床研究により実証された。糖尿病患者には脂質代謝障害があり、上昇した脂質は糸球体基底膜に沈着して基底膜の細胞増殖と細胞外間質の生成を刺激する。早くとも１９３６年に、ＫｉｍｍｅｌｓｔｉｅｌとＷｉｌｓｏｎは糖尿病腎症患者の腎動脈、糸球体および腎尿細管内に大量の脂質沈着を見つけた［７］。脂質代謝異常による糸球体と腎尿細管間質線維化は、腎機能の進行性損傷を引き起こす要因の一つである［８］。脂質代謝障害は人体に心臓病変の発生率を増加させ、例えば、脂肪肝の危害の一つとして、高血圧、冠状動脈性心臓病を誘発したり厳重化させたりして、心筋梗塞を引き起こして急死に至る。
【０００８】
本発明の研究により明らかなように、プラスミノーゲンは心臓病変を標的にして治療することができ、心臓病の治療に全く新しい構想を提供した。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は下記項に係る。
【００１０】
一つの局面において、本発明は、項１．心筋損傷に罹患するリスクがあるか、心筋損傷に罹患した疑いがある、または心筋損傷に罹患している被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の心筋損傷を予防または治療するための方法に係る。
【００１１】
項２．前記心筋損傷は、虚血、炎症、アレルギー反応、自己免疫、血栓、微小循環性障害、外傷、放射線損傷、糖質代謝障害、脂肪代謝障害による心筋損傷を含む、項１に記載の方法。
【００１２】
項３．前記心筋損傷は、心筋炎と、心膜炎と、高血圧と、アテローム性動脈硬化症と、冠状動脈心臓病と、狭心症と、心筋梗塞と、不整脈と、心不全と、ショックと、汎発性血管内凝固と、微小循環性障害と、糖尿病と、高脂血症と、動脈、静脈血栓と、脂肪塞栓と、虚血再灌流と、全身性硬化症と、全身性エリテマトーデスと、冠状動脈狭窄と、リウマチ性心臓病と、僧帽弁狭窄／閉鎖不全症と、大動脈弁狭窄／閉鎖不全症とからなる群より選ばれる疾患による心筋損傷である、項１または２に記載の方法。
【００１３】
項４．前記心筋損傷は、虚血性心臓疾患による心筋損傷である、項１または２に記載の方法。
【００１４】
項５．前記虚血性心臓疾患は、アテローム性動脈硬化症、冠状動脈心臓病、狭心症、心筋梗塞、不整脈、心不全、ショック、汎発性血管内凝固、微小循環性障害、虚血再灌流、冠状動脈狭窄、僧帽弁狭窄／閉鎖不全症、大動脈弁狭窄／閉鎖不全症である、項４に記載の方法。
【００１５】
項６．前記心筋損傷は、動脈、静脈血栓または脂肪塞栓による心筋損傷である、項１または２に記載の方法。
【００１６】
項７．前記血栓または塞栓は、アテローム性動脈硬化によるものである、項６に記載の方法。
【００１７】
もう一つの局面において、本発明は、項８．被験者に心筋組織を保護するために有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の心筋損傷を予防または治療するための方法に係る。
【００１８】
項９．前記プラスミノーゲンは、心筋細胞損傷による心筋細胞アポトーシスを軽減する、項８に記載の方法。
【００１９】
項１０．前記プラスミノーゲンは損傷心筋の修復を促進する、項８または９に記載の方法。
【００２０】
項１１．前記プラスミノーゲンは損傷心筋の線維化を軽減する、項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【００２１】
項１２．前記プラスミノーゲンは心筋機能の回復を促進する、項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【００２２】
項１３．前記プラスミノーゲンは、心筋損傷後の拡張及び心臓の代償性肥大を軽減する、項８〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【００２３】
もう一つの局面において、本発明は、項１４．被験者に心筋保護のために有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の脂質性心筋損傷を予防または治療するための方法に係る。
【００２４】
項１５．前記プラスミノーゲンは心臓組織における脂質沈着を軽減する、項１４に記載の方法。
【００２５】
項１６．前記プラスミノーゲンは損傷心筋の修復を促進する、項１４または１５に記載の方法。
【００２６】
項１７．前記プラスミノーゲンは、損傷心筋組織の線維化を軽減する、項１４〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【００２７】
項１８．前記プラスミノーゲンは、損傷心筋細胞のアポトーシスを軽減する、項１４〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【００２８】
項１９．前記プラスミノーゲンは、心筋機能の回復を促進する、項１４〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【００２９】
項２０．前記プラスミノーゲンは、心筋損傷後の拡張及び心臓の代償性肥大を軽減する、項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【００３０】
項２１．前記プラスミノーゲンは、血清のトリグリセリドを低下させることと、低密度リポタンパク質を低下させることと、超低密度リポタンパク質を低下させることと、血清のコレステロールを低下させることと、血清の高密度リポタンパク質を上昇させることとからなる群より選ばれる一つ以上によって血脂を軽減する、項１４〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００３１】
もう一つの局面において、本発明は、項２２．被験者に心筋保護のために有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の炎症性心筋損傷を予防または治療するための方法に係る。
【００３２】
項２３．前記炎症は、被験者の自己免疫による炎症である、項２２に記載の方法。
【００３３】
項２４．前記炎症は、全身性エリテマトーデス、全身性硬化症、心筋炎、心膜炎である、項２３に記載の方法。
【００３４】
項２５．前記プラスミノーゲンは、損傷心筋の修復を促進する、項２２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【００３５】
項２６．前記プラスミノーゲンは、損傷心筋組織の線維化を軽減する、項２２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【００３６】
項２７．前記プラスミノーゲンは、損傷心筋細胞のアポトーシスを軽減する、項２２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【００３７】
項２８．前記プラスミノーゲンは、心筋機能の回復を促進する、項２２〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【００３８】
項２９．前記プラスミノーゲンは、心筋損傷後の拡張及び心臓の代償性肥大を軽減する、項２２〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【００３９】
もう一つの局面において、本発明は、項３０．被験者に心筋保護のために有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者のアテローム性動脈硬化性心筋損傷を予防または治療するための方法に係る。
【００４０】
項３１．前記心筋損傷は、被験者の冠状動脈心臓病によるものである、項３０に記載の方法。
【００４１】
項３２．前記プラスミノーゲンは、損傷心筋の修復を促進する、項３１に記載の方法。
【００４２】
項３３．前記プラスミノーゲンは、損傷心筋組織の線維化を軽減する、項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【００４３】
項３４．前記プラスミノーゲンは、損傷心筋細胞のアポトーシスを軽減する、項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【００４４】
項３５．前記プラスミノーゲンは、心筋機能の回復を促進する、項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【００４５】
項３６．前記プラスミノーゲンは、心筋損傷後の拡張及び心臓の代償性肥大を軽減する、項３０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【００４６】
もう一つの局面において、本発明は、項３７．被験者に心筋保護のために有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の糖尿病によって引き起こされるか糖尿病と合併した心筋損傷を予防または治療するための方法に係る。
【００４７】
項３８．前記プラスミノーゲンは、損傷心筋の修復を促進する、項３７に記載の方法。
【００４８】
項３９．前記プラスミノーゲンは、損傷心筋組織の線維化を軽減する、項３７または３８に記載の方法。
【００４９】
項４０．前記プラスミノーゲンは、損傷心筋細胞のアポトーシスを軽減する、項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【００５０】
項４１．前記プラスミノーゲンは、心筋機能の回復を促進する、項３７〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【００５１】
項４２．前記プラスミノーゲンは、心筋損傷後の拡張及び心臓の代償性肥大を軽減する、項３７〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【００５２】
もう一つの局面において、本発明は、項４３．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の脂質沈着による心筋損傷を予防または治療するための方法に係る。
【００５３】
項４４．前記脂質沈着は、被験者の脂肪代謝異常または糖質代謝異常による高脂血症によるものである、項４３に記載の方法。
【００５４】
もう一つの局面において、本発明は、項４５．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の高脂血症によって引き起こされるまたは高脂血症に伴われる腎組織損傷を予防または治療するための方法に係る。
【００５５】
もう一つの局面において、本発明は、項４６．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の虚血再灌流性心筋組織損傷を予防または治療するための方法に係る。
【００５６】
項４７．前記プラスミノーゲンは一種以上のその他の薬物または治療手段と併用することができる、項１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【００５７】
項４８．前記一種以上のその他の薬物は、高血圧の治療薬、糖尿病の治療薬、アテローム性動脈硬化症の治療薬、慢性糸球体腎炎の治療薬、慢性腎盂腎炎の治療薬、腎病症候群の治療薬、腎機能不全の治療薬、尿毒症の治療薬、腎移植の治療薬、脂肪肝の治療薬、肝硬変の治療薬、肥満症の治療薬を含む、項４７に記載の方法。
【００５８】
項４９．前記その他の薬物は、脂質低下薬、抗血小板薬、血圧降下薬、血管拡張薬、血糖降下薬、抗凝固薬、血栓溶解薬、肝臓保護薬、抗不整脈薬、強心薬、利尿薬、抗感染薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、炎症調節薬、抗腫瘍薬、ホルモン薬、チロキシンを含む、項４８に記載の方法。
【００５９】
項５０．前記薬物は、スタチン系、フィブラート系、ニコチン酸、コレスチラミン、クロフィブラート、益壽寧や血脂平や心脈楽のような不飽和脂肪酸、硫酸多糖類（Poly Saccharide Sulphate、Alginic Sodium Diester）のような脂質低下薬；アスピリン、ペルサンチン、クロピドグレル、シロスタのような抗血小板薬；ヒドララジン、ニトログリセリンと硝酸イソソルビド、ニトロプルシドナトリウム、プラゾシンのようなα１受容体遮断薬、フェントラミンのようなα受容体遮断薬、サルブタモールのようなβ２受容体刺激薬、カプトプリル、エナラプリル、ニフェジピンやジルチアゼム、サルブタモール酸、ミノキシジル、プロスタグランジン、カルジオナトリンのような血管拡張薬；ウロキナーゼとストレプトキナーゼ、組織型プラスミノーゲン活性化剤、単鎖ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化剤、ＴＮＫ−組織型プラスミノーゲン活性化剤のような血栓溶解薬；ヘパリン、エノキサパリン、ナドロパリン、ビバリルジンのような抗凝固薬を含む、項４９に記載の方法。
【００６０】
項５１．前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するものである、項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【００６１】
項５２．前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２において、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を添加、削除及び／または置換したものであり、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、項１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【００６２】
項５３．前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【００６３】
項５４．前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ−プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である、項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【００６４】
項５５．前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【００６５】
項５６．前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【００６６】
項５７．前記プラスミノーゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである、項１〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【００６７】
項５８．前記プラスミノーゲンは、ヒト由来の天然プラスミノーゲンである、項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【００６８】
項５９．前記被験者はヒトである、項１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【００６９】
項６０．前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している、項１〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【００７０】
項６１．前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である、項６０に記載の方法。
【００７１】
もう一つの局面において、本発明は、項６２．項１〜６１のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンに係る。
【００７２】
もう一つの局面において、本発明は、項６３．薬学的に許容される担体及び項１〜６１のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンを含む薬物組成物に係る。
【００７３】
もう一つの局面において、本発明は、項６４．（ｉ）項１〜６１のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンと、（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための手段（ｍｅａｎｓ）とを含む、予防性または治療性キットに係る。
【００７４】
項６５．前記手段はシリンジまたはバイアルである、項６４に記載のキット。
【００７５】
項６６．項１〜４６のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するラベルまたはプロトコルをさらに含む、項６４または６５に記載のキット。
【００７６】
もう一つの局面において、本発明は、項６７．ラベルを含む容器と、
（ｉ）項１〜６１のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン、またはプラスミノーゲンを含む薬物組成物とを含む製品であって、
前記ラベルは、項１〜６１のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する、製品に係る。
【００７７】
項６８．その他の薬物を含む、もう一つ以上の部材または容器をさらに含む、項６４〜６６のいずれか１項に記載のキット、または項６７に記載の製品。
【００７８】
項６９．前記その他の薬物は、脂質低下薬、抗血小板薬、血圧降下薬、血管拡張薬、血糖降下薬、抗凝固薬、血栓溶解薬、肝臓保護薬、抗不整脈薬、強心薬、利尿薬、抗感染薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、炎症調節薬、抗腫瘍薬、ホルモン薬、チロキシンからなる群より選ばれる、項６８に記載のキットまたは製品。
【００７９】
本発明はさらに、項１〜６１のいずれか１項に記載の方法を実施するためのプラスミノーゲンの用途に係る。
【００８０】
本発明はさらに、項１〜６１のいずれか１項に記載の方法に用いられる薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。
【００８１】
一部の実施形態において、前記キットまたは製品は、その他の薬物を含む、もう一つ以上の部材または容器をさらに含む。一部の実施形態において、前記その他の薬物は、脂質低下薬、抗血小板薬、血圧降下薬、血管拡張薬、血糖降下薬、抗凝固薬、血栓溶解薬、肝臓保護薬、抗不整脈薬、強心薬、利尿薬、抗感染薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、炎症調節薬、抗腫瘍薬、ホルモン薬、チロキシンからなる群より選ばれる。
前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは全身または局所投与により投与され、好ましくは、静脈内、筋肉内、皮下という経路により投与される。前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは適切なポリペプチド担体または安定化剤と組み合わせて投与する。前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは毎日０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜６００ｍｇ／ｋｇ、０．１〜４００ｍｇ／ｋｇ、１〜２００ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１〜２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１〜８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１〜６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１〜４００ｍｇ／ｃｍ２、１〜２００ｍｇ／ｃｍ２、１〜１００ｍｇ／ｃｍ２、１０〜１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは少なくとも毎日投与する。
【００８２】
本発明は、本発明に係る実施形態どうしの技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、且つこれらの組み合わせた技術構成は前記実施形態が単独且つ明確に開示されているように、本出願で明確に開示されている。また、本発明はさらに各実施形態及び要素のすべてのサブの組み合わせを明確にカバーし、この組み合わせた技術構成は本明細書中において明確に開示されている。
[発明の詳細な説明]
【００８３】
プラスミンはプラスミノゲン活性化系（ＰＡ系）の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の幾つかの成分を加水分解することができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテアーゼ（ｐｒｏ−ＭＭＰ）を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のＰＡ：組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）をタンパク質加水分解することで形成されるものである。プラスミノゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはＰＡ系の調節は主にＰＡの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。ＰＡ系成分の合成は異なる要素によって厳密な制御を受け、例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、この他に、プラスミンとＰＡｓの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα２−抗プラスミン（α２−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）である。ＰＡｓの活性は、ｕＰＡとｔＰＡのプラスミノーゲン活性剤阻害剤−１（ＰＡＩ−１）に同時に阻害され、ｕＰＡを主に阻害するプラスミノーゲン活性剤阻害剤−２（ＰＡＩ−２）によって調節される。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるｕＰＡ特異性細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）がある。
【００８４】
プラスミノゲンは単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的な由来である。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する：グルタミン酸−プラスミノゲン（Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン−プラスミノゲン（Ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌されかつ分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ−末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸−プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸−プラスミノゲンはＬｙｓ７６−Ｌｙｓ７７においてリジン−プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸−プラスミノゲンと比較して、リジン−プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０−Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡ  またはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって接続された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの相同性三環を含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅｓであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のＫｒｉｎｇｌｅｓはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２−ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたのは３８ｋＤａのフィブリンプラスミノゲンフラグメントであり、ｋｒｉｎｇｌｅｌ−４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントはアンジオスタチン（Angiostatin）と命名され、幾つかのプロテアーゼ加水分解プラスミノゲンから生成される。
【００８５】
プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理学的血栓の形成を予防するキーポイントである。プラスミンはさらにＥＣＭの幾つかの成分に対する基質特異性を有し、これらはラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含み、これはプラスミンがＥＣＭ再建において重要な作用を有することを示している。間接的に、プラスミンはさらにいくつかのプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりＥＣＭのその他の成分を分解し、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９を含む。そのため、以下のように提唱する人がいる。プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子である可能性がある。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する。体外において、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。
【００８６】
「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解する。
【００８７】
「プラスミノーゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドのヒト由来の天然プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列４）は計算によれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９０ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノーゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ  Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１−５）を含む。ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ１９を含み、ＰＡｐは残基Ｇｌｕ２０−Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３−Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４−Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５−Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７−Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１−Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１−Ａｒｇ８０４を含む。
【００８８】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは天然のフルサイズのプラスミノーゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）。該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。体内において、さらにＧｌｕ−プラスミノーゲンの第７６−７７位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ−プラスミノーゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。δ−プラスミノーゲン（δ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノーゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２−Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず、δ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノーゲン（Ｍｉｎｉ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドＧｌｕ−プラスミノーゲン配列を含まないＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノーゲン（Ｍｉｃｒｏ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１−Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許の配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。
【００８９】
本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノーゲン」と「フィブリンプラスミノーゲン」、「繊維タンパクプラスミノーゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
【００９０】
本願において、プラスミノーゲンの「欠乏」とは、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より低く、被験者の正常な生理学的機能に影響を及ぼすのに十分に低いことをいう。プラスミノーゲンの「欠乏」の意味は、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より明らかに低く、活性または発現が極微量であり、外部供給によってのみ正常な生理学的機能を維持できることである。
【００９１】
当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノーゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノーゲン及びプラスミンをカバーするものである。
【００９２】
循環プロセスにおいて、プラスミノーゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノーゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解させ、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノーゲンのＰＡｐドメインはプラスミノーゲンを非活性閉鎖コンフォメーションにする重要なエピトープであり、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノーゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、以下を含む：組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び血液凝固因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などである。
【００９３】
「プラスミノーゲン活性フラグメント」とはプラスミノーゲンタンパク質において、基質中のターゲット配列と結合してタンパク質加水分解機能を発揮できる活性フラグメントである。本発明はプラスミノーゲンの技術構成に係り、プラスミノーゲン活性フラグメントでプラスミノーゲンの代替とする技術構成を含む。本発明に記載のプラスミノーゲン活性フラグメントはプラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むタンパク質であり、好ましくは、本発明に記載のプラスミノーゲン活性フラグメントは配列１４、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含むものである。そのため、本発明に記載のプラスミノーゲンは該プラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つ依然として該プラスミノーゲン活性を有するタンパク質を含む。
【００９４】
現在、血液中のプラスミノーゲン及びその活性測定方法は以下を含む：組織フィブリンプラスミノーゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ−ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ−ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノーゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン−抗プラスミン複合体に対する測定（ＰＡＰ）。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象(被験者)の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のプラスミノーゲンはＳＫの作用下においてプラスミンとなり、後者は発光基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノーゲンの活性と正比例の関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のフィブリンプラスミノーゲン活性に対して測定を行うことができる。
【００９５】
「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは異なる種どうしのホモログであり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含む。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノーゲンはヒト由来の天然プラスミノーゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノーゲン活性を有するプラスミノーゲンオルソログを含む。
【００９６】
「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、塩基性、疎水性など）のアミノ酸でペアレントタンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性の塩基性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％〜９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素を含み、、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然またはペアレントタンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
【００９７】
「分離された」プラスミノーゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノーゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノーゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になる精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノーゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造することができ、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノーゲンを含む。
【００９８】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するか有しない）を含む融合物；等々である。
【００９９】
参照ポリペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要に応じてギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は配列をアライメントするための適切なパラメータを決めることができ、比較対象の配列のフルサイズに対して最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ−２により得られるものである。
【０１００】
ＡＬＩＧＮ−２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、所定のアミノ酸配列Ａの所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、と、またはについてのあるアミノ酸配列と同一性を有する又は含む所定のアミノ酸配列Ａともいう）は以下のように計算される：  
分数Ｘ／Ｙ×１００
【０１０１】
そのうちＸは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２において該プログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。特に断りのない限り、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムによって得られるものである。
【０１０２】
本文において使用されているように、用語の「治療」及び「処理」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状を完全または一部予防すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む：（ａ）疾患が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況であること；（ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害すること；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状を減退させること。
【０１０３】
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。
【０１０４】
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノーゲンの量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノーゲン、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
【０１０５】
本発明のプラスミノーゲンの調製
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４ページ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ  Ａ．２００６Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．６：３−１０及びＣａｍａｒｅｒｏ  ＪＡら  ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンと単一のＮ保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と接続する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
【０１０６】
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノーゲンを生産する。例えば、プラスミノーゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に接続させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーターシステムとすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノーゲンの収集及び精製に適した条件下において宿主を維持する。
【０１０７】
適切な発現ベクターは通常宿主体内において附加体または宿主染色体ＤＮＡの整合部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、インビトロで所望のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
【０１０８】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は目的抗体をコードするポリヌクレオチドをクローンする原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と相容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β−ラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージλ由来のプロモーターシステムである。プロモーターは一般的に発現を制御し、必要に応じて遺伝子配列を制御する場合に、転写及び翻訳を起動するために、さらにリボソームの結合位置配列を有してもよい。
【０１０９】
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えばサッカロミセス（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母プロモーターはアルコール脱水素酵素、イソチトクロムＣ、及びマルトースとガラクトースの利用のための酵素のプロモーターを含む。
【０１１０】
微生物以外に、哺乳動物細胞（例えば体外細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明のプラスミノーゲンの発現および生成に用いることができる（例えば目的抗−Ｔａｕ抗体をコードするポリヌクレオチド）。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマを含む。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報位置、例えばリボソームの結合サイト、ＲＮＡの切断サイト、ポリアデノシン酸化サイト、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなどの派生のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。
【０１１１】
一旦合成（化学または組み換え的に）されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノーゲンを精製することができる。該プラスミノーゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％〜９０％の純度で、少なくとも約９０％〜９５％の純度で、または９８％〜９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、目的抗体以外の大分子などである。
【０１１２】
薬物配合剤
所望の純度のプラスミノーゲンと必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；ｍ-クレゾール）；低分子量ポリペプチド（少なくとも１０個の残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛−タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましくは凍結乾燥された抗−ＶＥＧＦ抗体配合剤であり、ＷＯ  ９７／０４８０１に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。
【０１１３】
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、血圧降下薬、抗不整脈薬、糖尿病治療薬等である。
【０１１４】
本発明のプラスミノーゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に内包ことができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたは粗エマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０１１５】
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノーゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌濾過膜で濾過することで容易に実現できる。
【０１１６】
本発明のプラスミノーゲンは緩衝製剤を調製できる。緩衝製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過マトリックスを含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。緩衝基質の実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ（ビニールアルコール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン−ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｖｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン−酢酸エチル及び乳酸−ヒドロキシ酢酸は、持続的に分子を１００日間以上放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。
【０１１７】
投与及び使用量
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈）、筋肉内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。
【０１１８】
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。
【０１１９】
医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノーゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１−５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってに従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量のスケジュール表は連続数日１−１０ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において治療効果及び安全性はリアルタイムに評価すべきである。
【０１２０】
製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、糖尿病によって引き起こされる心血管疾患及びその関連疾患を治療するための本発明のプラスミノーゲンまたはプラスミンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはプロトコルを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン／プラスミンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の前記糖尿病によって引き起こされる心血管疾患及びその関連疾患の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１】図１は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の血清中の心筋トロポニン含有量の検出結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群の心筋トロポニンＩの濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的にとても有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病末期のマウスの心筋損傷の修復を有意に促進できることを示している。
【図２】図２はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の心臓臓器係数（心係数）の統計結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの心臓臓器係数は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低い。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの心臓損傷による心臓の代償性肥大を改善できることを示している。
【図３】図３はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の大動脈洞のオイルレッドＯ染色の代表的写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの大動脈洞における脂肪沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンが大動脈洞における脂肪沈着を改善できることを示している。
【図４】図４はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の大動脈弁のＨＥ染色の代表的写真を示すものである。ＡとＣは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、ＢとＤはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの大動脈弁におけるプラーク沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少なく、しかも大動脈弁の融合程度では前者は後者より小さい。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症モデルマウスの大動脈弁損傷を改善できることを示している。
【図５】図５はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の心臓のＩｇＭ免疫染色の代表的写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの心臓ＩｇＭの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症による心臓損傷の回復を促進できることを示している。
【図６】図６はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の大動脈洞のシリウスレッド染色の代表的写真を示すものである。Ａ、Ｃは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂ、Ｄはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群の大動脈洞の血管内壁におけるコラーゲン沈着（矢印に表記される）の面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに小さい。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症モデルマウスの大動脈洞の線維化レベルを軽減することができることを示している。
【図７】図７はプラスミノーゲンを２０日投与した後の３％コレステロール高脂血症モデルマウスの心臓リスク指数の計算結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群のＣＲＩは溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的にとても有意である。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスに心臓疾患が発症するリスクを効果的に低めることができることを示している。
【図８】図８は１６週齢の高脂血症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の大動脈洞のオイルレッドＯ染色の観察結果を示すものである。ＡとＣは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、ＢとＤはプラスミノーゲン投与群であり、Ｅは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの大動脈洞における脂肪沈着は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの大動脈洞における脂肪沈着を改善できることを示している。
【図９】図９は１６週齢の高脂血症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の大動脈洞のＨＥ染色の代表的写真を示すものである。ＡとＣは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、ＢとＤはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群の大動脈管壁には泡沫細胞沈着が見えられ（矢印に示される）、プラークの沈着が深刻である；プラスミノーゲン投与群の大動脈管壁には軽度の泡沫細胞沈着のみが見えられ、しかも内膜下には明らかなアテローム性プラーク沈着が見えられず、プラスミノーゲン投与群の大動脈の損傷が軽い。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの大動脈洞内壁の、脂質沈着による損傷を改善できることを示している。
【図１０】図１０は１６週齢の高脂血症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の心臓フィブリンの免疫組織化学染色の写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの心臓フィブリンの陽性発現は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが高脂血症による心臓損傷を減少させることができることを示している。
【図１１】図１１は１６週齢の高脂血症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の心臓のＩｇＭ免疫染色の代表的写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの心臓ＩｇＭの陽性発現は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンが高脂血症による心臓損傷を軽減できることを示している。
【図１２】図１２は１６週齢の高脂血症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の心臓のシリウスレッド染色の代表的写真である。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスのコラーゲンの沈着は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの心臓線維化を軽減できることを示している。
【図１３】図１３は１６週齢の高脂血症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の血清の心筋トロポニンの検出結果を示すものである。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群の血清の心筋トロポニン濃度はプラスミノーゲン投与群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが高脂血症による心臓損傷を修復できることを示している。
【図１４】図１４は２６週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の心室のオイルレッドＯ染色の代表的写真である。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの心室における脂質沈着（矢印に示される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心室における脂質沈着を減少させ、心室損傷の修復を促進することができることを示している。
【図１５】図１５は１６週齢の高脂血症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の大動脈洞のシリウスレッド染色の代表的写真である。ＡとＣは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、ＢとＤはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群の大動脈洞の血管内壁におけるコラーゲンの沈着（矢印に示される）面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに小さい。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの大動脈洞の線維化レベルを低減できることを示している。
【図１６】図１６はブレオマイシンにより誘発された全身性硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを２１日投与した後の心臓シリウスレッド染色の代表的写真である。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。研究の結果、ブレオマイシンにより誘発された全身性硬化症モデルマウスにおいて、溶媒ＰＢＳ投与対照群の心臓コラーゲンの沈着（矢印に表記される）程度がプラスミノーゲン投与群より高いことは示されている。これは、プラスミノーゲンがブレオマイシンにより誘発される心臓線維化を効果的に減少させることができることを示している。
【図１７】図１７は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の心臓のマッソン（ｍａｓｓоｎ）染色の観察結果である。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群の心筋繊維間に青色の増殖したコラーゲン繊維（矢印に表記される）が見えられ、軽度の心筋線維化が呈されている。プラスミノーゲン投与群の心筋繊維間に少量の水色の増殖したコラーゲン繊維が見えられ、対照群と比べ、心筋線維化は明らかに軽減されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心臓の線維化を改善することができることを示している。
【図１８】図１８は１７〜１８週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の心臓のシリウスレッド染色の代表的写真である。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスのコラーゲン繊維の沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ないことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心臓線維化を減少させることができることを示している。
【図１９】図１９は２６〜２７週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の心臓のシリウスレッド染色の代表的写真である。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスのコラーゲン繊維の沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ないことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心臓線維化を弱めることができることを示している。
【図２０】図２０はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の心室のオイルレッドＯ染色の代表的写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの心室における脂肪沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化モデルマウスの心室における脂肪沈着を改善し、脂質沈着による心室損傷の修復を促進することができることを示している。
【図２１】図２１はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の心臓のシリウスレッド染色の代表的写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群のコラーゲン沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの心臓線維化を軽減することができることを示している。
【発明を実施するための形態】
【０１２２】
[実施例]
[実施例１]
実施例１は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心筋損傷に対する保護作用に関するものである。
糖尿病には通常心血管アテローム性動脈硬化症が伴われる［１，２］。心血管アテローム性動脈硬化症は、心筋細胞の虚血損傷を引き起こし得る。心筋トロポニンＩ（Ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ，ＣＴＮＩ）は、心筋損傷の重要なマーカーであり、その血清における濃度は、心筋損傷の程度を反映することができる［３］。本実験は、心筋トロポニンＩを検出することでプラスミノーゲンが心筋損傷に対する修復作用を観察する。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス２８匹を取ってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で１２匹とプラスミノーゲン投与群で１６匹とした。実験開示当日を０日として体重を測って群に分け、群分けした次の日からプラスミノーゲンまたはＰＢＳを投与してその日を１日目とし、連続して３１日間投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３２日目に眼球を摘出して採血し、３５００ｒ／分で１５〜２０分間遠心分離して上澄み液を取り、心筋トロポニンＩの濃度測定を行った。その結果、プラスミノーゲン投与群の心筋トロポニンＩの濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的にとても有意である（図１）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心筋損傷の修復を有意に促進できることを示している。
【０１２３】
[実施例２]
実施例２は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの心臓の代償性肥大を改善することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４，５］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。投与期間は３０日間であり、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。投与した３１日目に体重を測ってマウスを殺処分し、心臓を取って重量を測って、心係数を計算した。心係数（％）＝心臓重量／体重×１００。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの心係数は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２）より明らかに低い。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの心臓損傷による心臓の代償性肥大を軽減できることを示している。
【０１２４】
[実施例３]
実施例３は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの大動脈洞における脂質沈着を改善することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４，５］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、３１日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。それぞれ１５％、３０％スクロース中において４℃で終夜沈めさせ、ＯＣＴで包埋処理を行い、凍結切片の厚みは８μｍであり、オイルレッドＯで１５分間染色し、７５％アルコールで５秒間分別し、そしてヘマトキシリンで３０秒間核を染色し、グリセリンゼラチンに封入させた。切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図３Ｂ）マウスの大動脈洞における脂肪沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３Ａ）より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症の大動脈洞における脂質沈着を改善できることを示している。
【０１２５】
[実施例４]
実施例４は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの大動脈洞損傷を改善することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４，５］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。３１日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。大動脈洞の組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水してヘマトキシリン及びエオシンで染色（ＨＥ染色）させ、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入させ、切片を光学顕微鏡下で４０倍（図４Ａ、４Ｂ）、２００倍（図４Ｃ、４Ｄ）にて観察した。
染色の結果、プラスミノーゲン投与群（図４Ｂ、４Ｄ）マウスの大動脈洞における脂質プラーク沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図４Ａ、４Ｃ）より明らかに少なく、しかも大動脈弁の融合程度では前者は後者より小さい。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症における大動脈弁膜の損傷を改善できることを示している。
【０１２６】
[実施例５]
実施例５は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの心臓損傷を改善することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４，５］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。３１日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせてから１回水洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ヤギ抗マウスＩｇＭ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。ＩｇＭ抗体は、アポトーシス細胞及び壊死細胞の排除において重要な役割を果たし、損傷した組織器官の局所ＩｇＭ抗体のレベルは、損傷の程度と正比例に相関している［６，７］。よって、検出した組織器官の局所ＩｇＭ抗体のレベルは該組織器官の損傷状況を反映することができる。実験の結果、プラスミノーゲン投与群マウス（図５Ｂ）の心臓ＩｇＭ陽性発現は、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図５Ａ）より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥマウスの心筋損傷を明らかに改善できることを示している。
【０１２７】
[実施例６]
実施例６は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの心臓線維化レベルを低減することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４，５］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。３１日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから１回水で洗い、０．１％シリウスレッド飽和ピクリン酸で３０分間染色した後、流水で２分間流し、ヘマトキシリンで１分間染色してから流水で流し、１％塩酸エタノールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
シリウスレッド染色は、コラーゲンを長期的に染色することができ、病理学的切片の特殊染色法として、シリウスレッド染色はコラーゲン組織を特異的に表示することができる。
染色の結果、プラスミノーゲン投与群（図６Ｂ）の心臓動脈洞のアテローム性硬化部分のコラーゲン沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図６Ａ）より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの心臓組織におけるコラーゲンの沈着を低減し、心臓の線維化を低減できることを示している。
【０１２８】
[実施例７]
実施例７は、プラスミノーゲンが３％コレステロール高脂血症モデルマウスの心臓発症リスクを低めることに関するものである。
９週齢のオスＣ５７マウス１６匹に３％コレステロール高脂肪食（南通トロフィー）を４週間給餌して高脂血症を誘発し［８，９］、このモデルを３％コレステロール高脂血症モデルとし、モデル化後のマウスに引き続き３％コレステロール高脂肪食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取し、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）を測定し、モデルマウスを総コレステロール濃度と体重によってランダムに二つの群に分け、各群で８匹ずつとした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。２０日目に投与した後、マウスを１６時間禁食し、２１日目に眼窩静脈叢から５０μＬ採血して遠心分離して上澄み液を取り、総コレステロール検出キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ａ１１１−１）を用いて総コレステロール含有量を測定した。高密度リポタンパク質コレストロール検出キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ａ１１２−１）を用いて高密度リポタンパク質コレストロール含有量を測定した。
心臓リスク指数（ｃａｒｄｉａｃ  ｒｉｓｋ  ｉｎｄｅｘ，ＣＲＩ）は、血脂障害によって心臓疾患が誘発されるリスクを評価するためのものである［１０］。
心臓リスク指数＝Ｔ−ＣＨＯ／ＨＤＬ−Ｃ。
その結果、プラスミノーゲン投与群のＣＲＩは溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに小さく、しかもその差が統計学的にとても有意である（図７）。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの心臓疾患の発症リスクを効果的に低めることができることを示している。
【０１２９】
[実施例８]
実施例８は、プラスミノーゲンが１６週齢の高脂血症モデルマウスの大動脈洞における脂質沈着を低減することに関するものである。
６週齢のオスＣ５７マウス１１匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌して高脂血症を誘発し［８，９］、このモデルを１６週齢高脂血症モデルとした。モデル化後のマウスに引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で６匹とプラスミノーゲン投与群で５匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、３１日目にマウスを殺処分して心臓組織を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。それぞれ１５％、３０％スクロース中において４℃で終夜沈めさせ、ＯＣＴで包埋処理を行い、大動脈洞の凍結切片の厚みは８μｍであり、オイルレッドＯで１５分間染色し、７５％アルコールで５秒間分別し、そしてヘマトキシリンで３０秒間核を染色し、グリセリンゼラチンに封入させた。切片を光学顕微鏡下で４０倍（図８Ａ、８Ｂ）、２００倍（図８Ｃ、８Ｄ）にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図８Ｂ、８Ｄ）マウスの大動脈洞における脂肪沈着は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図８Ａ、８Ｃ）より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（図８Ｅ）。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの大動脈洞における脂質沈着を低減できることを示している。
【０１３０】
[実施例９]
実施例９は、プラスミノーゲンが１６週齢の高脂血症モデルマウスの大動脈洞損傷を改善することに関するものである。
６週齢のオスＣ５７マウス１１匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌して高脂血症を誘発し［８，９］、このモデルを１６週齢高脂血症モデルとした。モデル化後のマウスに引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で６匹とプラスミノーゲン投与群で５匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、３１日目にマウスを殺処分して心臓組織を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。大動脈洞の組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水してヘマトキシリン及びエオシンで染色（ＨＥ染色）させ、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入させ、切片を光学顕微鏡下で４０倍（図９Ａ、９Ｂ）、２００倍（図９Ｃ、９Ｄ）にて観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図９Ａ、９Ｃ）の大動脈洞内壁には泡沫細胞沈着があり（矢印に示される）、プラークの沈着が深刻である；プラスミノーゲン投与群（図９Ｂ、９Ｄ）の大動脈洞内壁には軽度の泡沫細胞沈着のみが見えられ、しかも内膜下には明らかなアテローム性プラーク沈着が見えられず、プラスミノーゲン投与群の大動脈洞内壁の損傷が軽い。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの大動脈洞内壁の損傷を改善できることを示している。
【０１３１】
[実施例１０]
実施例１０は、プラスミノーゲンが１６週齢の高脂血症モデルマウスの心臓フィブリンの発現を低減することに関するものである。
６週齢のオスＣ５７マウス１１匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌して高脂血症を誘発し［８，９］、このモデルを１６週齢高脂血症モデルとした。モデル化後のマウスに引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で６匹とプラスミノーゲン投与群で５匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、３１日目にマウスを殺処分して心臓組織を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから１回水洗った。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。ウサギ抗マウスフィブリン抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
フィブリノーゲンはフィブリンの前駆体であり、組織に損傷が存在する状況下において、生体の損傷に対する応答反応として、フィブリノーゲンはフィブリンに加水分解されて損傷部位に沈着する［１１，１２］。そのため、損傷局所のフィブリンのレベルを損傷程度の一つのマーカーとすることができる。
免疫組織化学染色の結果、プラスミノーゲン投与群マウス（図１０Ｂ）の心臓フィブリンの陽性発現は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１０Ａ）より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（図１０Ｃ）。これは、プラスミノーゲンが高脂血症による心筋損傷を減少させることができることを示している。
【０１３２】
[実施例１１]
実施例１１は、プラスミノーゲンが１６週齢の高脂血症モデルマウスの心筋損傷を効果的に保護することに関するものである。
６週齢のオスＣ５７マウス１１匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌して高脂血症を誘発し［８，９］、このモデルを１６週齢高脂血症モデルとした。モデル化後のマウスに引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で６匹とプラスミノーゲン投与群で５匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、３１日目にマウスを殺処分して心臓組織を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから１回水洗った。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲んだ。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗マウスＩｇＭ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで核を３０秒染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ＩｇＭ抗体は、アポトーシス細胞及び壊死細胞の排除において重要な役割を果たし、損傷した組織器官の局所ＩｇＭ抗体のレベルは、損傷の程度と正比例に相関している［６，７］。よって、検出した組織器官の局所ＩｇＭ抗体のレベルは該組織器官の損傷程度を反映することができる。
免疫染色の結果、プラスミノーゲン投与群マウス（図１１Ｂ）の心臓ＩｇＭ陽性発現は、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１１Ａ）より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデル動物の心臓損傷を減少させることができることを示している。
【０１３３】
[実施例１２]
実施例１２は、プラスミノーゲンが１６週齢の高脂血症モデルマウスの心臓線維化を軽減することに関するものである。
６週齢のオスＣ５７マウス１１匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌して高脂血症を誘発し［８，９］、このモデルを１６週齢高脂血症モデルとした。モデル化後のマウスに引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で６匹とプラスミノーゲン投与群で５匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、３１日目にマウスを殺処分して心臓組織を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから１回水で洗い、０．１％シリウスレッド飽和ピクリン酸で３０分間染色した後、流水で２分間流し、ヘマトキシリンで１分間染色してから流水で流し、１％塩酸エタノールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
シリウスレッド染色は、コラーゲンを長期的に染色することができ、病理学的切片の特殊染色法として、シリウスレッド染色はコラーゲン組織を特異的に表示することができる。
染色の結果、プラスミノーゲン投与群（図１２Ｂ）のコラーゲン沈着は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１２Ａ）より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの心臓組織におけるコラーゲンの沈着を低減し、心筋の線維化を軽減できることを示している。
【０１３４】
[実施例１３]
実施例１３は、プラスミノーゲンが１６週齢の高脂血症モデルマウスの心筋損傷を修復することに関するものである。
６週齢のオスＣ５７マウス１１匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌して高脂血症を誘発し［８，９］、このモデルを１６週齢高脂血症モデルとした。モデル化後のマウスに引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で６匹とプラスミノーゲン投与群で５匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、３０日目に投与した後マウスを禁食し、マウスを１６時間禁食し、３１日目に眼球を摘出して採血し、遠心分離して上澄み液を取り、心筋トロポニン（Ｃａｒｄｉａｃ  ｔｒｏｐｏｎｉｎ  Ｉ，ＣＴＮＩ）検出キット（南京建成）を用いて血清における心筋トロポニン濃度を測定した。
心筋トロポニンＩは、心筋損傷の重要なマーカーであり、その血清における濃度は、心筋損傷の程度を反映することができる［３］。
測定した結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群の血清における心筋トロポニン濃度はプラスミノーゲン投与群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（図１３）。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの心臓損傷を有意に改善できることを示している。
【０１３５】
[実施例１４]
実施例１４は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心室における脂質沈着を低減することに関するものである。
２６週齢のオスｄｂ／ｄｂマウス９匹を取ってランダムに群分けし、プラスミノーゲン投与群で４匹と溶媒ＰＢＳ投与対照群で５匹とした。プラスミノーゲン投与群マウスに２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。それぞれ１５％、３０％スクロース中において４℃で終夜沈めさせ、ＯＣＴで包埋処理を行い、凍結切片の厚みは８μｍであり、オイルレッドＯで１５分間染色し、７５％アルコールで５秒間分別し、そしてヘマトキシリンで３０秒間核を染色し、グリセリンゼラチンに封入させた。切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウス（図１４Ｂ）の心室における脂質沈着（矢印に示される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１４Ａ）より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心室における脂肪の沈着を低減し、心室損傷の修復を促進できることを示している。
【０１３６】
[実施例１５]
実施例１５は、プラスミノーゲンが１６週齢の高脂血症モデルマウスの大動脈洞線維化を軽減することに関するものである。
６週齢のオスＣ５７マウス１１匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌して高脂血症を誘発し［８，９］、このモデルを１６週齢高脂血症モデルとした。モデル化後のマウスに引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で６匹とプラスミノーゲン投与群で５匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、３１日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。大動脈洞の組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから１回水で洗い、０．１％シリウスレッド飽和ピクリン酸で３０分間染色した後、流水で２分間流し、ヘマトキシリンで１分間染色してから流水で流し、１％塩酸エタノールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で４０倍（図１５Ａ、１５Ｂ）、２００倍（図１５Ｃ、１５Ｄ）にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図１５Ｂ、１５Ｄ）の大動脈洞血管内壁におけるコラーゲン沈着（矢印に示される）の面積は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１５Ａ、１５Ｃ）より明らかに小さい。これは、プラスミノーゲンが高脂血症モデルマウスの大動脈洞の線維化レベルを軽減できることを示している。
【０１３７】
[実施例１６]
実施例１６は、プラスミノーゲンが全身性硬化症モデルマウスの心臓線維化を減少させることに関するものである。
１２週齢のＣ５７オスマウス１０匹を取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群５匹ずつとした。実験開始当日を０日目として体重をはかって群分けし、１日目からモデルを構築して投薬し、０．１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でブレオマイシンを皮下注射して全身性硬化症を誘発させ［１３］、当日からプラスミノーゲンまたはＰＢＳを投与し、２１日間連続して投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。２２日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４時間固定を行った。固定後の心臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて１回水で洗い、０．１％シリウスレッド飽和ピクリン酸で３０分間染色した後、流水で２分間流し、ヘマトキシリンで１分間染色してから流水で流し、１％塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、ブレオマイシンにより誘発された全身性硬化症モデルマウスにおいて、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１６Ａ）の心臓コラーゲン沈着がプラスミノーゲン投与群（図１６Ｂ）より高いことは観察された。これは、プラスミノーゲンがブレオマイシンにより誘発された心臓線維化を効果的に減少させることができることを示している。
【０１３８】
[実施例１７]
実施例１７は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの心臓線維化を改善することに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス１０匹を取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群５匹ずつとした。実験開始当日を０日目として体重を測ってから群分けし、１日目からプラスミノーゲンまたはＰＢＳを投与し、３１日間連続して投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを投与した。プラスミノーゲンを３１日間投与した後にマウスを殺処分して心臓組織を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４時間固定を行った。固定後の心臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは４μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから重クロム酸カリウム溶液に終夜置いた。鉄ヘマトキシリンで３〜５分間染色して流水で流した。１％塩酸アルコールで分別させてアンモニア水で１秒処理してから水で洗った。ポンソー酸性マゼンタ溶液にて８分間染色し、水中で素早く濯いだ。１％リンモリブデン酸水溶液で約２分間処理し、アニリンブルー溶液にて６分間複染色した。１％氷酢酸で約１分間濯いだ。無水エタノールで脱水させてキシレンで透徹にしてから封入し、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
糖尿病の最も一般的な合併症は結合組織の過剰な蓄積（病理的線維化）であり、心筋間質の線維化は糖尿病の心筋病変の特徴性病理的変化であるかもしれない［１４，１５］。
マッソン（Ｍａｓｓｏｎ）染色は組織の線維化を示すことができる。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１７Ａ）の心筋繊維間に青色の増殖したコラーゲン繊維（矢印に表記される）が見えられ、軽度の心筋線維化が呈されている。プラスミノーゲン投与群（図１７Ｂ）の心筋繊維間に少量の水色の増殖したコラーゲン繊維が見えられ、対照群と比べ、心筋線維化は明らかに軽減されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの心臓の線維化を改善することができることを示している。
【０１３９】
[実施例１８]
実施例１８は、プラスミノーゲンが１７〜１８週齢の糖尿病マウスの心臓のコラーゲン沈着を減少させることに関するものである。
１７〜１８週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス８匹を取り、ランダムに二つの群に分け、それぞれ溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で、各群４匹ずつとした。実験開始当日を０日目として体重をはかって群分けし、１日目からプラスミノーゲンまたはＰＢＳを投与し、３５日間連続して投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを投与した。プラスミノーゲンを３５日間投与した後にマウスを殺処分して心臓組織を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４時間固定を行った。固定後の心臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて１回水で洗い、０．１％シリウスレッド飽和ピクリン酸で３０分間染色した後、流水で２分間流し、ヘマトキシリンで１分間染色してから流水で流し、１％塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図１８Ｂ）マウスのコラーゲン繊維の沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１８Ａ）より明らかに少ないことは示されている。これは、プラスミノーゲンが心臓組織のコラーゲン沈着を減少させることができることを示し、プラスミノーゲンが心臓組織のコラーゲン沈着を減少させることにより、比較的に若い（１７〜１８週齢）糖尿病マウスの心臓組織の線維化を減少させることができることを示唆している。
【０１４０】
[実施例１９]
実施例１９は、プラスミノーゲンが２６〜２７週齢の糖尿病マウスの心臓のコラーゲン沈着を減少させることに関するものである。
２６〜２７週齢のｄｂ／ｄｂオスマウス９匹を取り、ランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹とプラスミノーゲン投与群に４匹とした。実験開始当日を０日目として体重をはかって群分けし、１日目からプラスミノーゲンまたはＰＢＳを投与し、３５日間連続して投与した。プラスミノーゲン投与群マウスに２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを投与した。プラスミノーゲンを３５日間投与した後にマウスを殺処分して心臓組織を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４時間固定を行った。固定後の心臓をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから１回水で洗い、０．１％シリウスレッドで６０分間染色した後、流水で流し、ヘマトキシリンで１分間染色してから流水で流し、１％塩酸アルコールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に封入させ、光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図１９Ｂ）マウスのコラーゲン繊維の沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１９Ａ）より明らかに少ないことは示されている。これは、プラスミノーゲンが心臓組織のコラーゲン沈着を減少させることができることを示し、プラスミノーゲンが心臓組織のコラーゲン沈着を減少させることにより、比較的に老齢（２６〜２７週齢）糖尿病マウスの心臓組織の線維化を減少させることができることを示唆している。
【０１４１】
[実施例２０]
実施例２０は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの心室における脂質沈着を改善することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４，５］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、３１日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。それぞれ１５％、３０％スクロース中において４℃で終夜沈めさせ、ＯＣＴで包埋処理を行い、心室の凍結切片の厚みは８μｍであり、オイルレッドＯで１５分間染色し、７５％アルコールで５秒間分別し、そしてヘマトキシリンで３０秒間核を染色し、グリセリンゼラチンに封入させた。切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図２０Ｂ）の心室における脂肪沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２０Ａ）より明らかに少なく、しかもその差は統計学的に有意である（図２０Ｃ）。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの心室における脂質沈着を改善し、脂質沈着による心室損傷の修復を促進できることを示している。
【０１４２】
[実施例２１]
実施例２１は、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症マウスの心臓線維化レベルを低減することに関するものである。
６週齢のオスＡｐｏＥマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症モデルを誘発した［４，５］。モデル化後の各マウスから、投薬の３日前に５０μＬの血液を採取して総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）含有量を測定し、モデルマウスをＴ−ＣＨＯ含有量によってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、投与期間中に引き続き高脂肪高コレステロール食を与えた。３１日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。固定後の組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水してから１回水で洗い、０．１％シリウスレッド飽和ピクリン酸で３０分間染色した後、流水で２分間流し、ヘマトキシリンで１分間染色してから流水で流し、１％塩酸エタノールで分別させてアンモニア水でブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に中性ゴムに封入させ、光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
シリウスレッド染色は、コラーゲンを長期的に染色することができ、病理学的切片の特殊染色法として、シリウスレッド染色はコラーゲン組織を特異的に表示することができる。
染色の結果、プラスミノーゲン投与群（図２１Ｂ）のコラーゲン沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２１Ａ）より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症モデルマウスの心臓組織におけるコラーゲンの沈着を低減し、心筋の線維化を軽減できることを示している。
参考文献：
[1] Sun Mi Hwang,Jin Sook Kim,Yun Jung Lee et al. Anti-Diabetic Atherosclerosis Effect of Prunella vulgaris in db/db Mice with Type 2 Diabetes. The American Journal of Chinese Medicine, Vol. 40, No. 5, 937-951.
[2] Hardy, D.S., D.M. Hoelscher, C. Aragaki et al.Association of glycemic index and glycemic load with risk of incident coronary heart disease among Whites and African Americans with and without type 2 diabetes: the atherosclerosis risk in communities study. Ann. Epidemiol. 20: 610-616, 2010. 
[3] R. Langhorn and J.L. Willesen. Cardiac Troponins in Dogs and Cats. J Vet Intern Med 2016;30:36-50.
[4] Yutaka Nakashima, Andrew S. Plump, Elaine W. Raines et al. Arterioscler Thromb. 1994 Jan;14(1):133-40.
[5] Yvonne Nitschke , Gabriele Weissen-Plenz , Robert Terkeltaub et al. Npp1 promotes atherosclerosis in ApoE knockout mice. J. Cell. Mol. Med. Vol 15, No 11, 2011 pp. 2273-2283.
[6] Zhang M, Takahashi K, Alicot EM, Vorup-Jensen T, Kessler B, et al. (2006) Activation of the lectin pathway by natural IgM in a model of ischemia/reperfusion injury. J Immunol 177: 4727-4734.
[7] Kim SJ, Gershov D, Ma X, Brot N, Elkon KB (2002) I-PLA2 Activation during Apoptosis Promotes the Exposure of Membrane Lysophosphatidylcholine Leading to Binding by Natural Immunoglobulin M Antibodies and Complement.
[8] Dominika Nackiewicz, Paromita Dey, Barbara Szczerba et al. Inhibitor of differentiation 3, a transcription factor regulates hyperlipidemia associated kidney disease. Nephron Exp Nephrol. 2014 ; 126(3): 141-147.
[9] Ming Gu1, Yu Zhang., Shengjie Fan et al. Extracts of Rhizoma Polygonati Odorati Prevent High-Fat Diet-Induced Metabolic Disorders in C57BL/6 Mice. PLoS ONE 8(11): e81724.
[10] Hao W, Friedman A (2014) The LDL-HDL Profile Determines the Risk of Atherosclerosis: A Mathematical Model. PLoS ONE 9(3): e90497
[11] Siobhan M. Craige, PhD, Shashi Kant et al. Endothelial NADPH oxidase 4 protects ApoE-/- mice from atherosclerotic lesions. Free Radic Biol Med. 2015 December ; 89: 1-7.
[12]Dimitrios Davalos , Katerina Akassoglou. Fibrinogen as a key regulator of inflammation in disease.Seminars in Immunopathology,2012. 34(1):43-62.
[13] Yosuke Kanno, En Shu, Hiroyuki Kanoh et al. The Antifibrotic Effect of a2AP Neutralization in Systemic Sclerosis Dermal Fibroblasts and Mouse Models of Systemic Sclerosis. J Invest Dermatol. 2016 Apr;136(4):762-9.
[14] Ashish Aneja,  W.H. Wilson Tang,  Sameer Bansilal et al. Diabetic Cardiomyopathy: Insights into Pathogenesis, Diagnostic Challenges, and Therapeutic Options. Am J Med. 2008 Sep;121(9):748-57.
[15]SamuelCS1, HewitsonTD, ZhangYetal.Relaxin ameliorates fibrosis in experimental diabetc cardiomyopathy. Endocrinology. 2008 Jul;149(7):3286-93.
【図１】
2020502155.tif 000002
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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