(57)【要約】心臓疾患を処置するための、心筋細胞と心外膜細胞とを含む方法および組成物が、本明細書において提供される。2020514362.tif 000012
2020514362.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト心筋細胞とインビトロで分化したヒト心外膜細胞またはそのようなヒト心外膜細胞の分化した子孫とを含む、移植用組成物。
【請求項２】
前記ヒト心筋細胞がインビトロで分化した細胞である、請求項1に記載の移植用組成物。
【請求項３】
前記心外膜細胞もしくはそれらの子孫、前記心筋細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞から分化した細胞である、請求項1または請求項2に記載の移植用組成物。
【請求項４】
前記心外膜細胞もしくはそれらの子孫、前記心筋細胞、またはその両方が、移植レシピエントにとって自己であるiPS細胞から分化した細胞である、請求項1〜3のいずれか一項に記載の移植用組成物。
【請求項５】
前記心外膜細胞がフィブロネクチンを発現する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の移植用組成物。
【請求項６】
ZVAD-FMK、Bcl-XL、シクロスポリンA、ピナシジル、およびIFG-1のうちの1つまたは複数をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の移植用組成物。
【請求項７】
前記心筋細胞が、前記心外膜細胞またはその子孫に対して約2:1の比率で存在する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の移植用組成物。
【請求項８】
前記心外膜細胞およびそれらの子孫を欠いている同様の組成物よりも少なくとも20%効率的に生着する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の移植用組成物。
【請求項９】
請求項1〜8のいずれか一項に記載の移植用組成物を含む、心臓送達装置。
【請求項１０】
ZVAD-FMK、Bcl-XL、シクロスポリンA、ピナシジル、およびIFG-1のうちの1つまたは複数を含む培養用培地中またはカクテル中の、インビトロで分化したヒト心外膜細胞または分化したその子孫と物理的に結合したヒト心筋細胞を含む組織粒子。
【請求項１１】
2〜2500個の細胞を含む、請求項10に記載の組織粒子。
【請求項１２】
心筋細胞と心外膜細胞または分化したその子孫の比率が約2:1である、請求項10に記載の組織粒子。
【請求項１３】
前記心外膜細胞、前記心筋細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞から分化した細胞である、請求項10〜12のいずれか一項に記載の組織粒子。
【請求項１４】
前記心筋細胞がインビトロで分化した細胞である、請求項10〜13のいずれか一項に記載の組織粒子。
【請求項１５】
前記心筋細胞、前記心外膜細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞からインビトロで分化した細胞である、請求項10〜14のいずれか一項に記載の組織粒子。
【請求項１６】
それを必要とする対象の心臓組織に、心筋細胞と混合された心外膜細胞を含む組成物を投与する段階を含む、心臓組織中への心筋細胞の生着を促進する方法。
【請求項１７】
前記対象が心筋梗塞症を患ったことがある、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
心筋細胞と混合された心外膜細胞を含む前記組成物が、請求項1〜8のいずれか一項に記載の移植用組成物であるか、または請求項10〜15のいずれか一項に記載の組織粒子を含む、請求項16に記載の方法。
【請求項１９】
それを必要とする対象の心臓組織に、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与する段階を含む、移植されたヒト心筋細胞の成熟表現型を促進する方法。
【請求項２０】
前記対象が心筋梗塞症を患ったことがある、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む前記組成物が、請求項1〜8のいずれか一項に記載の移植用組成物であるか、または請求項10〜15のいずれか一項に記載の組織粒子を含む、請求項19に記載の方法。
【請求項２２】
心筋細胞が心外膜細胞と混合されて移植された場合に、心筋細胞成熟度が、心筋細胞移植のみと比較して、筋節長の増加、心筋細胞の直径または長さの増加、トロポニンの心臓アイソフォームのcTnTの発現、およびコネキシン43発現のうちの1つまたは複数によって示される、請求項19〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
それを必要とする対象の心臓組織に、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与する段階を含む、心臓の心筋細胞移植体の部位における微小血管密度を増加させる方法。
【請求項２４】
前記対象が心筋梗塞症を患ったことがある、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む前記組成物が、請求項1〜8のいずれか一項に記載の移植用組成物であるか、または請求項10〜15のいずれか一項に記載の組織粒子を含む、請求項23または24に記載の方法。
【請求項２６】
微小血管密度またはそのマーカーが、心外膜細胞を欠いている心筋細胞移植体が投与された場合に見いだされるものと比較して少なくとも10%増加する、請求項23〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
微小血管密度が、CD31、VEカドヘリン、フォン・ヴィレブランド因子 (vWF) のうちの1つもしくは複数の発現によって、または血管内皮と優先的に結合するレクチンによる染色によって示される、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
それを必要とする対象の心臓組織に、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与する段階を含む、心臓組織における心筋細胞移植片サイズを増加させる方法。
【請求項２９】
前記対象が心筋梗塞症を患ったことがある、請求項28に記載の方法。
【請求項３０】
ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む前記組成物が、請求項1〜8のいずれか一項に記載の移植用組成物であるか、または請求項10〜15のいずれか一項に記載の組織粒子を含む、請求項28または29に記載の方法。
【請求項３１】
心筋細胞移植片サイズが、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与することにより、実質的に同じ数のヒト心筋細胞を含むがヒト心外膜細胞を欠いている組成物の投与と比較して少なくとも10%増加する、請求項28〜30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
インビトロで分化した心筋細胞を心外膜細胞、分化したその子孫、または心外膜細胞馴化培地の存在下で培養する段階を含む、インビトロで分化した心筋細胞の成熟度を促進する方法。
【請求項３３】
前記心筋細胞および前記心外膜細胞がヒトの細胞である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記心外膜細胞がインビトロで分化した細胞である、請求項32または33に記載の方法。
【請求項３５】
前記心外膜細胞、前記心筋細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞からインビトロで分化した細胞である、請求項32〜34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記心筋細胞成熟度が、人工組織 (engineered tissue)におけるまたは移植片における筋節長の増加、心筋細胞の直径または長さの増加、トロポニンの心臓アイソフォームのcTnTの発現、およびコネキシン43発現のうちの1つまたは複数によって示される、請求項32〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
心外膜細胞と混合された心筋細胞を含む移植用組成物を投与する段階を含む、移植された心筋細胞とレシピエント心筋細胞との間の電気的接続を促進する方法。
【請求項３８】
前記心筋細胞および前記心外膜細胞がヒトの細胞である、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
前記心筋細胞、前記心外膜細胞、またはその両方がインビトロで分化した細胞である、請求項37または38に記載の方法。
【請求項４０】
前記心外膜細胞、前記心筋細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞からインビトロで分化した細胞である、請求項37〜39のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
コネキシン43の発現が、心外膜細胞なしで投与され移植された心筋細胞におけるコネキシン43発現と比較して、心外膜細胞と混合されて投与され移植された心筋細胞において増大する、請求項37〜40のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
心外膜細胞または分化したその子孫と混合された心筋細胞を含む移植用組成物を投与する段階を含む、移植された心筋細胞の増殖を増大させる方法。
【請求項４３】
前記心筋細胞、前記心外膜細胞、またはその両方がインビトロで分化した細胞である、請求項42に記載の方法。
【請求項４４】
前記心筋細胞、前記心外膜細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞からインビトロで分化した細胞である、請求項42または43に記載の方法。
【請求項４５】
前記移植用組成物が、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物を含むか、または請求項10〜15のいずれか一項に記載の組織粒子を含む、請求項42〜44のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
それを必要とする対象の心臓組織に、請求項1〜8のいずれか一項に記載の組成物、または請求項10〜15のいずれか一項に記載の組織粒子を投与する段階を含む、心筋梗塞症を処置する方法。
【請求項４７】
移植された心筋細胞の生着、増殖、成熟度、または機能のうちの1つまたは複数が、実質的に同じ数の心筋細胞を含むが心外膜細胞を欠いている組成物の投与と比較して改善される、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
インビトロで分化したヒト心筋細胞の調製物を提供する段階；
インビトロで分化したヒト心外膜細胞の調製物を提供する段階；ならびに
ZVAD-FMK、Bcl-XL、シクロスポリンA、ピナシジル、およびIFG-1のうちの1つまたは複数を含む組成物中で該心筋細胞を該心外膜細胞と混合する段階
を含む、心筋細胞移植用組成物を作製する方法。
【請求項４９】
前記心筋細胞、前記心外膜細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞から分化した細胞である、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
前記心筋細胞と前記心外膜細胞が約2:1の比率で混合物中に存在する、請求項48または49に記載の方法。
【請求項５１】
移植の前に前記心外膜細胞および前記心筋細胞に熱ショックを与える段階をさらに含む、請求項48〜50のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
貯蔵用に凍結される前に前記心筋細胞に熱ショックを与え、かつ、該心筋細胞を解凍して、前記方法において用いられる心筋細胞の前記調製物を提供する、請求項48〜51のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
心筋細胞移植用組成物を作製するために前記心外膜細胞を使用しようとする前日に、該心外膜細胞に熱ショックを与える、請求項48〜52のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C. §119(e)の下で、2017年3月15日に出願された米国仮特許出願第62/471,737号の恩典を主張し、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
政府の支援
本発明は、米国立衛生研究所により付与された助成金第P01 HL094374号の下で、政府の支援を受けてなされたものである。政府は本発明においてある特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明の分野は、心筋に対する損傷および／または心不全を処置するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
収縮障害が原因の心不全の処置の大きな進歩にもかかわらず、治療アプローチは問題の原因の対処には至っておらず；哺乳動物の心臓の損傷は、再生不可能な収縮性心筋組織の不可逆的喪失を引き起こす。西暦2000年の変わり目に、心不全は、新たに発生した流行病として広く認識された。今日までに、米国だけで560万人の患者および世界中では2300万人の患者が心不全に罹患しており、診断されてから5年以内に50%が死亡している。現在の処置は、症状を改善することおよび疾患の自然な進行を遅らせることに限定されており、損傷後の収縮性心筋の喪失を補償することはできない。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書において、一部には、心筋に対する損傷後の機能的な心臓組織の生着およびそれに続く再生のための、心外膜細胞と心筋細胞とを含む方法および組成物が提供される。
【０００６】
したがって、本明細書において提供される1つの局面は、ヒト心筋細胞とインビトロで分化したヒト心外膜細胞またはそのようなヒト心外膜細胞の分化した子孫とを含む移植用組成物に関する。
【０００７】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の1つの態様において、移植用組成物は、インビトロで分化したヒト心筋細胞を含む。
【０００８】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心外膜細胞もしくはそれらの子孫、心筋細胞、またはその両方は、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞から分化した細胞である。
【０００９】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心外膜細胞もしくはそれらの子孫、心筋細胞、またはその両方は、移植レシピエントにとって自己であるiPS細胞から分化した細胞である。
【００１０】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心外膜細胞はフィブロネクチンを発現する。
【００１１】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、移植用組成物は、ZVAD-FMK、Bcl-XL、シクロスポリンA、ピナシジル、およびIFG-1のうちの1つまたは複数をさらに含む。
【００１２】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心筋細胞は、心外膜細胞またはその子孫に対して約2:1の比率で存在する。
【００１３】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、移植用組成物は、心外膜細胞およびそれらの子孫を欠いている同様の組成物よりも少なくとも20%効率的に生着する。
【００１４】
本明細書において提供される別の局面は、本明細書に記載されるかまたは実施例において実証される移植用組成物を含む心臓送達装置に関する。
【００１５】
別の局面において、ZVAD-FMK、Bcl-XL、シクロスポリンA、ピナシジル、およびIFG-1のうちの1つまたは複数を含む培養用培地中またはカクテル中の、インビトロで分化したヒト心外膜細胞または分化したその子孫と物理的に結合したヒト心筋細胞を含む組織粒子もまた、本明細書において提供される。
【００１６】
本明細書に記載されるこの局面およびすべての他の局面の1つの態様において、組織粒子は2〜2500個の細胞を含む。
【００１７】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心筋細胞と心外膜細胞または分化したその子孫の比率は約2:1である。
【００１８】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心外膜細胞、心筋細胞、またはその両方は、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞から分化した細胞である。
【００１９】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心筋細胞はインビトロで分化した細胞である。
【００２０】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心筋細胞、心外膜細胞、またはその両方は、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞からインビトロで分化した細胞である。
【００２１】
本明細書において提供される別の局面は、それを必要とする対象の心臓組織に、心筋細胞と混合された心外膜細胞を含む組成物を投与する段階を含む、心臓組織中への心筋細胞の生着を促進する方法に関する。
【００２２】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の1つの態様において、心筋梗塞症（すなわち、心筋梗塞）。
【００２３】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心筋細胞と混合された心外膜細胞を含む組成物は、移植用組成物であるか、または本明細書において提供される局面のいずれかに記載される組織粒子を含む。
【００２４】
本明細書において提供される別の局面は、それを必要とする対象の心臓組織に、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与する段階を含む、移植されたヒト心筋細胞の成熟表現型を促進する方法に関する。
【００２５】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の1つの態様において、対象は心筋梗塞症を患ったことがある。
【００２６】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物は、移植用組成物であるか、または本明細書に記載される局面のいずれかに記載される組織粒子を含む。
【００２７】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心筋細胞が心外膜細胞と混合されて移植された場合に、心筋細胞成熟度は、心筋細胞移植のみと比較して、筋節長の増加、心筋細胞の直径または長さの増加、トロポニンの心臓アイソフォームのcTnTの発現、およびコネキシン43発現のうちの1つまたは複数によって示される。
【００２８】
別の局面において、それを必要とする対象の心臓組織に、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与する段階を含む、心臓の心筋細胞移植体の部位における微小血管密度を増加させる方法もまた、本明細書において提供される。
【００２９】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の1つの態様において、対象は心筋梗塞症を患ったことがある。
【００３０】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物は、移植用組成物であるか、または本明細書に記載される組織粒子を含む。
【００３１】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、微小血管密度またはそのマーカーは、心外膜細胞を欠いている心筋細胞移植体が投与された場合に見いだされるものと比較して少なくとも10%増加する。
【００３２】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、微小血管密度は、CD31、VEカドヘリン、フォン・ヴィレブランド因子 (vWF) のうちの1つもしくは複数の発現によって、または血管内皮と優先的に結合するレクチンによる染色によって示される。
【００３３】
本明細書において提供される別の局面は、それを必要とする対象の心臓組織に、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与する段階を含む、心臓組織における心筋細胞移植片サイズを増加させる方法に関する。
【００３４】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の1つの態様において、対象は心筋梗塞症（すなわち、心筋梗塞）を患ったことがある。
【００３５】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物は、移植用組成物であるか、または本明細書に記載される組織粒子を含む。
【００３６】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心筋細胞移植片サイズは、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与することにより、実質的に同じ数のヒト心筋細胞を含むがヒト心外膜細胞を欠いている組成物の投与と比較して少なくとも10%増加する。
【００３７】
別の局面において、インビトロで分化した心筋細胞を心外膜細胞、分化したその子孫、または心外膜細胞馴化培地の存在下で培養する段階を含む、インビトロで分化した心筋細胞の成熟度を促進する方法もまた、本明細書において提供される。
【００３８】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の1つの態様において、心筋細胞および心外膜細胞はヒトの細胞である。
【００３９】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心外膜細胞はインビトロで分化した細胞である。
【００４０】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心外膜細胞、心筋細胞、またはその両方は、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞からインビトロで分化した細胞である。
【００４１】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心筋細胞成熟度は、人工組織 (engineered tissue)におけるまたは移植片における筋節長の増加、心筋細胞の直径または長さの増加、トロポニンの心臓アイソフォームの心筋トロポニンT (cTnT) の発現、およびコネキシン43発現のうちの1つまたは複数によって示される。
【００４２】
本明細書において提供される別の局面は、心外膜細胞と混合された心筋細胞を含む移植用組成物を投与する段階を含む、移植された心筋細胞とレシピエント心筋細胞との間の電気的接続を促進する方法に関する。
【００４３】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の1つの態様において、心筋細胞および心外膜細胞はヒトの細胞である。
【００４４】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心筋細胞、心外膜細胞、またはその両方はインビトロで分化した細胞である。
【００４５】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心外膜細胞、心筋細胞、またはその両方は、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞からインビトロで分化した細胞である。
【００４６】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、コネキシン43の発現は、心外膜細胞なしで投与され移植された心筋細胞におけるコネキシン43発現と比較して、心外膜細胞と混合されて投与され移植された心筋細胞において増大する。
【００４７】
別の局面において、心外膜細胞または分化したその子孫と混合された心筋細胞を含む移植用組成物を投与する段階を含む、移植された心筋細胞の増殖を増大させる方法もまた、本明細書において提供される。
【００４８】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心筋細胞、心外膜細胞、またはその両方はインビトロで分化した細胞である。
【００４９】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心筋細胞、心外膜細胞、またはその両方は、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞からインビトロで分化した細胞である。
【００５０】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、移植用組成物は、請求項1〜8のいずれかに記載の組成物を含むか、または請求項10〜15のいずれかに記載の組織粒子を含む。
【００５１】
本明細書において提供される別の局面は、それを必要とする対象の心臓組織に、本明細書に記載される組成物または組織粒子を投与する段階を含む、心筋梗塞症を処置する方法に関する。
【００５２】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の1つの態様において、移植された心筋細胞の生着、増殖、成熟度、または機能のうちの1つまたは複数は、実質的に同じ数の心筋細胞を含むが心外膜細胞を欠いている組成物の投与と比較して改善される。
【００５３】
本明細書において提供される別の局面は、 (i) インビトロで分化したヒト心筋細胞の調製物を提供する段階；(ii) インビトロで分化したヒト心外膜細胞の調製物を提供する段階；ならびに (iii) ZVAD-FMK、Bcl-XL、シクロスポリンA、ピナシジル、およびIFG-1のうちの1つまたは複数を含む組成物中で心筋細胞を心外膜細胞と混合する段階を含む、心筋細胞移植用組成物を作製する方法に関する。
【００５４】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の1つの態様において、心筋細胞、心外膜細胞、またはその両方は、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞から分化した細胞である。
【００５５】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心筋細胞と心外膜細胞は約2:1の比率で混合物中に存在する。
【００５６】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、方法は、移植の前に心外膜細胞および心筋細胞に熱ショックを与える段階をさらに含む。
【００５７】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、貯蔵用に凍結される前に心筋細胞に熱ショックを与え、かつ、心筋細胞を解凍して、前記方法において用いられる心筋細胞の調製物を提供する。
【００５８】
本明細書において提供されるこの局面およびすべての他の局面の別の態様において、心筋細胞移植用組成物を作製するために心外膜細胞を使用しようとする前日に、心外膜細胞に熱ショックを与える。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】hESC由来心外膜細胞および心筋細胞を用いた3D-EHTの作製および成熟。（図1A）実験設計の模式図。心外膜細胞および心筋細胞をhESCから得て、3D-EHT中で共培養した。（図1B）心外膜マーカーBNC1およびWT1を発現する、hESCに由来する心外膜細胞。（図1C）フローサイトメトリーによる心外膜細胞および心筋細胞の純度。（図1D）hESC由来心外膜細胞および心筋細胞を用いた3D-EHTの模式図。（図1E〜1F）CMのみ、CM+hESC-MSC、CM+初代MSC、またはCM+hESC-心外膜細胞を含む3D-EHTの圧縮。スケールバー：2.5mm。（図1G、1H）3D-EHTの超微細構造および筋節組織化、ならびに筋節長の定量化。スケールバー：20μmm。平均値；エラーバーはSDを表す。両側p値は、多重比較のための事後補正を伴う一元配置ANOVAを用いて算出した。強調した弓型において、*P＜0.05および***P＜0.001。実験は、異なる日に少なくとも3回の生物学的反復で行った；実験群当たりn=9構築物。
【図２】hESC由来心外膜細胞は、3D-EHTの収縮性およびCa2+処理を促進する。（図2A）CMのみ、CM+hESC-MSC、CM+初代MSC、またはCM+hESC-心外膜細胞を含む3D-EHTの活動力発生。（図2B）CMのみ、CM+hESC-MSC、CM+初代MSC、またはCM+hESC-心外膜細胞を含む3D-EHTの受動力発生。（図2C）3D-EHTの代表的なCa2+トレース。（図2D）代表的なCa2+曲線の重ね合わせ。（図2E）Ca2+立ち上がり工程の勾配。平均値；エラーバーはSDを表す。点線は95%信頼区間を表す。両側p値は、多重比較のための事後補正を伴う一元配置ANOVAを用いて算出した。強調した弓型において、*P＜0.05および***P＜0.001。実験は、異なる日に少なくとも3回の生物学的反復で行った；実験群当たりn=9構築物。
【図３】hESC由来心外膜細胞と心筋細胞との同時移植は微小血管密度を増進する。（図3A）実験設計の模式図。（図3B）ピクロシリウスレッド-ファストグリーンで対比染色された代表的な梗塞ラット心臓切片。（図3C）心筋梗塞サイズの定量化。（図3D）脈管化について評価した領域の模式図。（図3E）心臓移植片における微小血管密度。（図3F）梗塞域における微小血管密度。（図3G）梗塞の非損傷境界域における微小血管密度。平均値；エラーバーはSDを表す。両側p値は、特に明記しない限り、多重比較のための事後補正を伴う一元配置ANOVAを用いて算出した。強調した弓型において、*P＜0.05および***P＜0.001。1カ月時点の組織学的解析について、合計でN=37。対照、EPI、CM、CM+EPI、n=動物9匹、10匹、8匹、および9匹。スケールバー：50μm。
【図４】hESC由来心外膜細胞は心臓再生を強化する。（図4A）hESC由来心外膜細胞および心筋細胞または心筋細胞単独のいずれかを受け取った動物における心臓移植片を示す、梗塞心臓の姉妹切片。スケールバー：2.5mm。（図4B）心臓移植片サイズの定量化。（図4C）心臓移植片は、ヒト特異的マーカーβ-MHCおよびα-アクチニンを発現する。スケールバー：c、50μm；c'およびc''、20μm。（図4D）筋節長の定量化。（図4E）心臓移植片におけるヒト心筋細胞の増殖指数。スケールバー：20μm。（図4F）増殖指数の定量化。（図4G）心臓移植片、および宿主組織との電気的統合。スケールバーは、gについては50μm、およびg'については20μm。平均値；エラーバーはSDを表す。両側p値は、特に明記しない限り、対応のないt検定を用いて算出した。強調した弓型において、*P＜0.05、**P＜0.01、および***P＜0.001。1カ月後の組織学的解析について、合計でN=37；対照、EPI、CM、CM+EPI、n=動物9匹、10匹、9匹、および9匹。1カ月後の機能解析について、合計でN=57；対照、EPI、CM、CM+EPI、n=動物14匹、15匹、14匹、および14匹。
【図５】心外膜細胞と心筋細胞の同時移植は心臓再生を促進する。（図5A）hESC由来心外膜細胞によって増強された心臓移植片の、梗塞後心室機能に及ぼす心エコー効果。短縮率値は、96時間のベースラインおよび1カ月の追跡について示される。（図5B）短縮率の差。（図5C）左室収縮末期径 (LVESD) は、96時間のベースラインおよび1カ月の追跡について示される。（図5D）LVEDSの差。（図5E）左室拡張末期径 (LVEDD) は、96時間のベースラインおよび1カ月の追跡について示される。（図5F）LVEDDの差。平均値；エラーバーはSDを表す。ベースラインと1カ月の追跡との間の群内の心臓機能の比較について、両側p値は、対応のあるt検定を用いて算出した。3群以上を比較する場合には、多重比較のための事後補正を伴う一元配置ANOVAを用いた。強調した弓型において、*P＜0.05、**P＜0.01、および***P＜0.001。1カ月後の機能解析について、合計でN=57；対照、EPI、CM、CM+EPI、n=動物14匹、15匹、14匹、および14匹。
【図６】hESC由来心外膜細胞は、化学的に定義された条件下でインビトロにおいて、心臓線維芽細胞へのEMTを起こす。（図6A）hESC-心外膜由来心臓線維芽細胞の誘導に関する模式図。（図6B）。hESC由来心外膜細胞における心外膜マーカー (WT1) および上皮マーカー（汎サイトケラチン）の存在、ならびに間葉系マーカービメンチンの非存在。（図6C）。化学的に定義された条件下における心臓繊維芽細胞への分化後の、線維芽細胞マーカー (DDR2) および間葉系マーカー（ビメンチン）の存在、ならびに上皮マーカー発現（汎サイトケラチン）の非存在。スケールバー：50μm。
【図７】hESC由来心外膜細胞は、3D-EHTにおいてEMTを起こし、hESC由来心筋細胞の電気的接続性を促進する。（図7A）構築物発生のそれぞれ7日後および14日後の上皮および間葉系マーカー発現。スケールバー 20μm。（図7B）3D-EHTにおけるEMTの定量化。（図7C）CX43発現によって実証される、CM単独またはCM+H9-MSCまたはCM+初代-MSCまたはCM+EPIを含む3D-EHTにおける電気的接続性。スケールバー 50μm。平均値；エラーバーはSDを表す。両側p値は、対応のない試料については対応のないt検定を用いて、および対応のある試料については対応あるt検定を用いて算出した。強調した弓型において、***P＜0.001。実験は、異なる日に少なくとも3回の生物学的反復で行った；実験群当たりn=9構築物。
【図８】hESC-心外膜細胞および心筋細胞を含む3D-EHTの機能的特徴決定。（図8A）3D-EHTにおけるフランク・スターリング機構の実験設定および評価。（図8B）Ca2+立ち上がり工程のそれぞれの時間。（図8C）Ca2+下降工程のそれぞれの時間。平均値；エラーバーはSDを表す。2群を比較する場合には、対応のないt検定を用いて両側p値を算出し、多重比較については、事後補正を伴う一元配置ANOVAを適用した。強調した弓型において、*P＜0.05および***P＜0.001。実験は、異なる日に少なくとも3回の生物学的反復で行った；実験群当たりn=9構築物。
【図９】hESC由来心外膜細胞は、哺乳動物梗塞において生着し、EMTを起こす。（図9A）予備試験のための実験設計の模式図。（図9B）検出可能な移植片を含む動物の数。（図9C）梗塞域におけるhESC由来のGFP陽性心外膜細胞の生着。動物は、MG+PSCの対照注射 (n=4)、2×106個 (n=4) または4×106個 (n=6) の心外膜細胞のいずれかを受け、それらを7日間追跡した。（図9D）心外膜細胞移植後の長期追跡。動物は、MG+PSCの対照注射 (n=4)、または6×106個 (n=4) の心外膜細胞のいずれかを受け、それらを1カ月間追跡した。（図9E）移植の7日後および28日後の、移植されたhESC由来心外膜細胞のEMT。（図9F）EMTの定量化。平均値；エラーバーはSDを表す。p値は、対応のない試料については対応のないt検定を用いて、および対応のある試料については対応あるt検定を用いて算出した。強調した弓型において、*P＜0.05および***P＜0.001。対照、2×106個、4×106個；対照、6×106個、n=動物4匹、4匹、4匹；4匹および6匹。
【図１０】移植の4週間後の、移植されたhESC由来心外膜細胞の運命。（図10A）移植された細胞は、ビメンチンおよび線維芽細胞マーカーS100A4を強く発現する。（図10B）hESC由来心外膜細胞は、梗塞域において冠脈管構造の壁中に組み込まれない（黄色の矢印）。（図10B'）心外膜細胞は、筋線維芽細胞表現型を示す平滑筋細胞マーカーSMA（白色の矢印）を発現することがほとんど見出されない。（図10C）移植された細胞は、パラフィン包埋ヒト胎児心臓（図10C'）を陽性対照として用いて、ヒトレクチンについて陰性である。（図10D）hESC由来心外膜細胞は、同一切片上の非梗塞ラット心筋（図10D'）を陽性対照として用いて、移植後に心筋細胞マーカー発現を示さない。スケールバー：20μm。
【図１１】心臓移植片、梗塞域、および境界域における冠動脈の存在。（図11A）壁細胞を含む成熟血管は、心外膜細胞を含む心臓移植片において検出されるが、心筋細胞のみを含む移植片において検出されない（黄色の矢印）。（図11B）冠動脈は、すべての研究群の梗塞域において存在する。（図11C）冠動脈は、すべての研究群の非損傷境界域において存在する。スケールバー：20μm。
【図１２】hESC由来心外膜細胞の有益な効果は長期間存在する。（図12A）心外膜および心臓移植片は、長期間存在したままである。スケールバー：20μm。（図12B）検出可能な移植片を含む動物の数。（図12C）細胞移植の3カ月後の梗塞サイズの定量化。（図12D）BrdU注射スケジュールの模式図。（図12E）3カ月時点の動物におけるBrdU取り込み。スケールバー：20μm。（図12F）増殖指数の定量化。平均値；エラーバーはSDを表す。両側p値は、多重比較のための事後補正を伴う一元配置ANOVAを用いて算出した。強調した弓型において、*P＜0.05、**P＜0.01、および***P＜0.001。3カ月後の組織学的解析について、合計でN=19；対照、EPI、CM、CM+EPI、n=動物4匹、5匹、5匹、および5匹。
【図１３】機能解析の検証。（図13A）機能解析前の観察者間一致度。2名の盲検研究者の独立した測定値間の平均差およびFSの差 (%) を示すブランド・アルトマンプロット。点線はすべての読み出しの平均差を示し、実線は測定値における許容偏差の先験合意限界を示す。動物6匹の各々を、それぞれ-1日目、4日目、および28日目に解析した（合計でn=18）。（図13B）すべての測定値について級内相関係数 (ICC) を示し、対応する95%CIを括弧内に示す。（図13C〜13D）ブランド・アルトマンプロットおよびICCによって実証される、解析の終了時における観察者間一致度。
【図１４】ヒトES由来心外膜細胞はまた、傍分泌様式で心筋細胞成熟を促進する。（図14A）Corning transwellプレートにおける、ヒトES由来心筋細胞および心外膜細胞を用いる傍分泌共培養アッセイ。（図14B）心外膜細胞は、心筋細胞の固有の拍動数を減少させる。（図14C）心外膜細胞は、心臓マーカー遺伝子の発現を促進する。これらのデータから、心外膜細胞を傍分泌アッセイにおいてインビトロで用いて、より成熟したhESC由来心筋細胞を作製することができることが実証される。
【図１５】心外膜駆動性心臓再生のメディエーターの調査。（図15A）RNA配列決定により、心外膜細胞および神経堤細胞のセクレトームが明らかになる。標的には、ネフロネクチン (NPNT)、ビトロネクチン (VTN)、およびフィブロネクチン (FNT) が含まれる。（図15B）神経堤細胞 + 心筋細胞と比較した、心外膜細胞 + 心筋細胞を用いた3D-EHTにおける活動力発生。（図15C）3D-EHTにおけるフィブロネクチン発現。発現は、心外膜細胞を含む構築物において高いが、ヒトES由来間葉系細胞およびまた初代間葉系細胞を含む構築物において低い。（図15D）追跡4週間後の、インビボにおける、胸腺欠損ラットの心臓移植片におけるフィブロネクチン発現の確認。これらのデータにより、hESC-Epiによるフィブロネクチン(FNT) 沈着が、心外膜細胞の有益な効果のうちのいくつかを媒介し得ることが示される。
【図１６】長期にわたって長続きするヒトES由来心外膜および心臓移植片ならびにフィブロネクチン発現。移植片はインビボにおいて移植の3カ月後まで持ちこたえ、心外膜細胞はフィブロネクチンを発現し続けた。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
詳細な説明
本明細書に記載される組成物および方法は、一部には、心筋の領域に投与された心筋細胞が、いくつかあるパラメータの中で特に移植片サイズおよび心臓機能尺度により評価して、心外膜細胞（例えば、インビトロで分化した心外膜細胞）の存在下においてより良好に生着するという発見に関する。実際に、損傷を受けた心臓組織に移植された場合に、心筋細胞は単独でおよび心外膜細胞は単独で有益な効果を及ぼし得るものの、2つの組み合わせは、生着および心臓移植片機能の多くの尺度に相乗効果を提供する。したがって、心筋損傷の処置および／または心不全の処置もしくは予防のための組成物もまた、本明細書において提供される。
【００６１】
定義
本明細書で用いられる場合、「ヒト幹細胞」という用語は、自己再生し少なくとも1つの細胞型に分化することができるヒト細胞を指す。「ヒト幹細胞」という用語は、ヒト幹細胞株、ヒト由来iPS細胞、ヒト胚性幹細胞、ヒト多能性細胞、ヒト複能性幹細胞、羊膜幹細胞、胎盤幹細胞、またはヒト成体幹細胞を包含する。
【００６２】
本明細書で用いられる場合、「心外膜細胞」という用語は、一部には、典型的に心臓の外側保護層として働き、心筋の成長および成熟のための因子を提供し得る、心外膜の上皮細胞を指す。本明細書に記載される心外膜細胞は、WT1および／またはTCF21を発現し、以下のマーカー：TBX18；BNC1；およびサイトケラチンのうちの1つまたは複数をさらに発現し得る。付加的な機能的心外膜細胞基準には、極性化上皮層の形成、ならびに（インビトロまたはインビボで）上皮間葉転換 (EMT) を起こして線維芽細胞（例えば、心臓線維芽細胞）および血管平滑筋系列を生成する能力が含まれるが、これらに限定されない。本用語が本明細書で用いられる場合の心外膜細胞（またはその集団）は、本明細書に記載されるように、心臓組織に同時投与された場合に心筋細胞の生着を促進することができる。
【００６３】
本明細書で用いられる場合、「インビトロで分化した心外膜細胞」という用語は、典型的にはヒト胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、初期中胚葉細胞、側板中胚葉細胞、または心臓前駆細胞などの前駆細胞から段階的分化により、培養において作製された心外膜細胞を指す。インビトロで分化した心外膜細胞は、そのような前駆細胞のいずれかから分化させることができるが、本明細書において例証されるヒト胚性幹細胞またはiPS細胞の心外膜細胞への段階的分化は、次の順序で起こる：hESC/hIPSC＞初期中胚葉＞側板中胚葉＞心外膜。加えて、インビトロで分化した心外膜細胞は、通常の心臓発生において心外膜細胞が通過するあらゆる前駆細胞型を経由する必要はない。1つの態様において、「インビトロで分化した心外膜細胞」という用語は、対象から得られた成人組織由来心外膜細胞（例えば、初代心外膜細胞）を除外する。
【００６４】
本明細書で用いられる場合、「EMT」または「上皮間葉転換」という用語は、上皮表現型を有する細胞の間葉表現型を有する細胞への転換を指す。上皮表現型には、上皮細胞マーカー（例えば、カドヘリン、サイトケラチン、ZO-1、ラミニン、デスモプラキン、MUC1等）の発現、および接着結合を介した高度の細胞間相互作用が含まれる。間葉表現型には、間葉系マーカー（例えば、ビメンチン、フィブロネクチン、twist、FSP-1 Snai1、Snai2）の発現、アメーバ状形態、細胞間結合の喪失、および細胞移動度の増加が含まれる。成体の心臓において、EMTは典型的には心筋に対する損傷に応答して起こる。上皮細胞は他の上皮細胞と多くの細胞間相互作用を有する傾向があるものの、間葉系細胞は移動性であり、かつ発生的に柔軟であり、このことは損傷した心筋組織を修復する上で特に有用である。
【００６５】
本明細書で用いられる場合、「心外膜細胞の分化した子孫」という用語は、心外膜細胞、特にEMTを起こして心外膜由来細胞 (EPDC) を生成した心外膜細胞の発生的に下流の、またはそれらから分化した細胞のいずれかを指す。分化した子孫のさらなる非限定的な例には、血管平滑筋細胞、心臓線維芽細胞、間質性線維芽細胞、間葉様細胞（例えば、心臓コロニー形成単位-線維芽細胞 (cCFU-F)）、およびおそらくは内皮細胞、心筋細胞、または心臓前駆細胞）が含まれる。したがって、「心外膜細胞の分化した子孫」は、本用語が本明細書で用いられる場合、心外膜細胞のいずれかの下流にある分化細胞のいずれかを指し、これには特に、例えば、血管平滑筋細胞、心臓線維芽細胞、間質性線維芽細胞、内皮細胞、周皮細胞、および心筋細胞が含まれる。心外膜細胞に由来する細胞は、インビボで心筋細胞と混合されて心臓組織に投入された場合に、心筋細胞の生着、増殖、および機能に対して、心外膜細胞によって提供される効果と同様のまたは同等の効果を提供するために使用することができることが、本明細書において明確に企図される。
【００６６】
本明細書で用いられる場合、マーカーについて陽性である細胞に言及する場合の「〜について陽性である」（例えば、ウィルムス腫瘍1 (WT1) 陽性心外膜細胞）という用語は、免疫蛍光顕微鏡または蛍光活性化細胞選別 (FACS) などのフローサイトメトリー法を用いて、細胞表面マーカー（例えば、WT1）が細胞上でバックグラウンドレベルを超えて検出可能であることを意味する。あるいは、「〜について陽性である」または「マーカーを発現する」という用語は、細胞表面マーカーまたは細胞内マーカー（所与の転写因子を含むが、これに限定されない）をコードするmRNAの発現が、RT-PCRを用いてバックグラウンドレベルを超えて検出可能であることを意味する。細胞表面マーカーまたは細胞内マーカーの発現レベルは、陰性対照（すなわち、マーカーを欠いていることが公知である細胞）から得られた、またはアイソタイプ対照（すなわち、関連する特異性を有さず、細胞タンパク質、脂質、または炭水化物に単に非特異的に結合する対照抗体）によって得られた発現レベルと比較することができる。したがって、マーカーを「発現する」（または「マーカーについて陽性である」）細胞は、そのマーカーの陰性対照について決定された発現レベルを超えて検出可能な発現レベルを有する。例えば、いくつかの態様において、本用語が本明細書で用いられる場合の心外膜細胞は、WT1および／またはTCF21について陽性であり、さらにTBX18、サイトケラチン、twist、またはsnailを含むがこれらに限定されない1つまたは複数のマーカーについても陽性であり得る。
【００６７】
本明細書で用いられる場合、マーカーについて陰性である細胞に言及する場合の「〜について陰性である」という用語（または「発現しない」という用語）は、免疫蛍光顕微鏡または蛍光活性化細胞選別 (FACS) などのフローサイトメトリー法を用いて、細胞表面マーカーを細胞上でバックグラウンドレベルを超えて検出できないことを意味する。あるいは、「陰性」または「発現しない」という用語は、細胞内マーカーまたは細胞表面マーカーのmRNAの発現を、RT-PCRを用いてバックグラウンドレベルを超えて検出できないことを意味する。細胞表面マーカーまたは細胞内マーカーの発現レベルは、陰性対照（すなわち、マーカーを欠いていることが公知である細胞）から得られた、またはアイソタイプ対照（すなわち、関連する特異性を有さず、細胞タンパク質、脂質、または炭水化物に単に非特異的に結合する対照抗体）によって得られた発現レベルと比較することができる。したがって、マーカーを「発現しない」細胞は、そのマーカーに関する陰性対照と類似しているように見える。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載される心外膜細胞は、間葉系幹細胞マーカーについて陰性である。
【００６８】
本明細書で用いられる「マーカー」という用語は、細胞の特徴および／または表現型を記載するために用いられる。マーカーは、関心対象の特徴を含む細胞を選択するために用いることができ、特定の細胞に応じて変化し得る。マーカーは特徴であり、特定の細胞型の細胞またはその細胞型によって発現される分子の、形態学的特徴、構造的特徴、機能的特徴、または生化学的（酵素的）特徴の如何を問わない。1つの局面において、そのようなマーカーはタンパク質である。そのようなタンパク質は、当技術分野において利用可能な抗体または他の結合分子のエピトープを保有し得る。しかしながら、マーカーは、細胞内または細胞上に見出される、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖類、核酸、ならびにステロイドを含むがこれらに限定されない任意の分子からなり得る。形態学的な特徴または形質の例には、形状、サイズ、および核対細胞質比が含まれるが、これらに限定されない。機能的な特徴または形質の例には、特定の物質に接着する能力、特定の色素を取り込むまたは排除する能力、特定の条件下で遊走する能力、および特定の系列に沿って分化する能力が含まれるが、これらに限定されない。マーカーは、当業者に利用可能な任意の方法によって検出することができる。マーカーはまた、形態学的特徴の非存在、またはタンパク質、脂質等の非存在であってもよい。マーカーは、ポリペプチドの存在および／または非存在の一連の特有の特徴と、他の形態学的または構造的特徴の組み合わせであってよい。1つの態様において、マーカーは細胞表面マーカーである。
【００６９】
いくつかの態様において、細胞表面マーカーの非存在を用いて、例えば心外膜細胞と別の系列の細胞（例えば、造血細胞または「血液形成」細胞）を区別することができる。心原性中胚葉細胞上に存在せず、造血性中胚葉細胞からの同定／選別を可能にする例示的な細胞表面マーカーには、KDR/CD34、SCL/TAL1、GATA1、RUNX1、HAND1、CDX1、WNT8a、およびWNT3aが含まれるが、これらに限定されない。逆に、造血性中胚葉細胞を除去するために用いることができる造血性中胚葉細胞上の例示的な細胞表面マーカーには、KDR/CD34、SCL/TAL1、GATA1、RUNX1、HAND1、CDX1、WNT8a、およびWNT3aが含まれるが、これらに限定されない。当業者は、細胞表面マーカーが、発生の特定の時点で、または特定の心臓前駆細胞型において存在してよく、細胞が細胞の拘束された系列のさらに下方へ分化するにつれて失われ得ることを認識するであろう。例えば、KDRは心原性中胚葉細胞において発現されるが、心臓前駆細胞への分化に際して失われる。したがって、細胞表面マーカーを、心外膜細胞に対する陽性選択戦略と組み合わせて用いることができ、また他の細胞（例えば、造血細胞）に対する陰性選択戦略と組み合わせて用いることもできる。
【００７０】
細胞個体発生の文脈において、「分化する」または「分化すること」という用語は、「分化した細胞」がその前駆細胞よりも発生経路のさらに下方へと進行している細胞であることを示す相対的用語である。したがっていくつかの態様において、本用語が本明細書において定義される場合の幹細胞は、系列拘束前駆細胞（ヒト心臓前駆細胞または中間原始線条心原性中胚葉前駆細胞など）に分化することができ、次にこれは経路のさらに下方の他の種類の前駆細胞（組織特異的前駆細胞など、例えば心筋前駆細胞など）に分化することができ、次いでこれは、ある特定の組織型において特徴的役割を果たし、さらに増殖する能力を保持してもよいしまたは保持しなくてもよい最終段階分化細胞に分化することができる。幹細胞を心筋細胞および／または心外膜細胞にインビトロで分化させるための方法は、当技術分野で公知であり、および／または本明細書において以下に記載される。
【００７１】
本明細書で用いられる場合、「脱分化」または「再プログラム化」、または「逆分化」という用語は、それが由来する元の細胞よりもより多くの幹細胞表現型またはより少ない分化表現型を再発現する細胞を作製する過程を指す。例えば、複能性細胞を多能性細胞に脱分化させることができる。すなわち、脱分化は、全能性細胞から完全分化細胞に至る分化スペクトルに沿って、細胞を逆向きにシフトさせる。典型的に、細胞の分化表現型の逆転は、例えば幹細胞特異的mRNAおよび／またはタンパク質を発現させることによる、細胞の人為的操作を必要とする。再プログラム化は典型的に、インビボまたはインビトロで自然条件下では観察されない。
【００７２】
本明細書で用いられる場合、「体細胞」という用語は、生殖細胞、着床前胚に存在するかもしくはそれから得られる細胞、またはそのような細胞のインビトロでの増殖から生じる細胞以外の任意の細胞を指す。言い換えれば、体細胞は、生殖系列細胞とは対照的に、生物の身体を形成する任意の細胞を指す。精子および卵子、それらが作製された元の細胞（生殖母細胞）、ならびに未分化幹細胞を除いて、哺乳動物体中のあらゆる細胞型が体細胞である：内部器官、皮膚、骨、血液、および結合組織はすべて、実質的に体細胞で構成されている。いくつかの態様において、体細胞は、胚に存在しないかまたはそれから得られず、およびそのような細胞のインビトロでの増殖から生じない体細胞を意味する「非胚性体細胞」である。いくつかの態様において、体細胞は、胚もしくは胎児以外の生物に存在するかもしくはそれから得られる、またはそのような細胞のインビトロでの増殖から生じる細胞を意味する「成体体細胞」である。特に指示のない限り、分化細胞を再プログラム化するための方法（例えば、iPSCを作製するため）は、インビボおよびインビトロの両方で行うことができる（インビボでは、分化細胞が対象内に存在する場合に行われ、インビトロでは、培養で維持された単離された分化細胞を用いて行われる）。
【００７３】
本明細書で用いられる「単離された細胞」という用語は、その細胞が最初に見出された生物から取り出された細胞、またはそのような細胞の子孫を指す。任意にその細胞は、例えば他の細胞の存在下で、インビトロで培養されている。任意にその細胞はその後、第2の生物に導入されるか、またはそれ（もしくはそれが由来する元の細胞）が単離された元の生物に再導入される。
【００７４】
特定の細胞集団に関して、「実質的に純粋な」という用語は、全細胞集団を構成する細胞に関して、少なくとも約75%、好ましくは少なくとも約85%、より好ましくは少なくとも約90%、および最も好ましくは少なくとも約95%純粋である細胞の集団を指す。すなわち、心筋細胞および／または心外膜細胞の集団に関して、「実質的に純粋な」または「本質的に精製された」という用語は、それぞれ心筋細胞または心外膜細胞ではない細胞を約20%よりも少なく、より好ましくは約15%、10%、8%、7%よりも少なく、最も好ましくは約5%、4%、3%、2%、1%よりも少なく、または1%未満含む細胞の集団を指す。
【００７５】
「濃縮すること」または「濃縮された」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、ヒト心外膜細胞組成物および本明細書に記載される方法において用いるための細胞などの1つの種類の細胞の収率（割合）が、出発時の生体試料、培養物、または調製物におけるその種類の細胞の割合に対して、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、または少なくとも75%増加していることを意味する。
【００７６】
本明細書で用いられる「分離」または「選択」という用語は、異なる細胞型を1つまたは複数の集団へと単離すること、およびその単離された集団を、例えば特定の標的細胞が濃縮されている標的細胞集団として収集することを指す。選択は、それによって標的濃縮細胞集団が保持される陽性選択、またはそれによって非標的細胞型が廃棄される（それによって、残りの細胞集団において所望の標的細胞型を濃縮する）陰性選択を用いて行うことができる。
【００７７】
本明細書で用いられる「陽性選択」という用語は、関心対象の細胞を保持することによる所望の細胞型の選択を指す。いくつかの態様において、陽性選択は、関心対象の細胞の保持を助けるための作用物質の使用、例えば所望の細胞または標的細胞上の表面抗原に対して特異的結合親和性を有する抗体などの陽性選択物質の使用を伴う。いくつかの態様において、陽性選択は、陽性選択物質の非存在下で、例えば標的細胞型の陽性選択が、標的細胞型の細胞サイズ、密度、および／または形態のいずれかに基づく、例えば「タッチフリー」または閉鎖系で起こり得る。
【００７８】
本明細書で用いられる「陰性選択」という用語は、枯渇させるまたは廃棄するための望ましくない細胞または非標的細胞を選択し、それによって所望の標的細胞型を保持する（およびひいては濃縮する）ことを指す。いくつかの態様において、陰性選択は、廃棄するための望ましくない細胞の選択を助ける作用物質の使用、例えば不必要な細胞または非標的細胞上の表面抗原に対して特異的結合親和性を有するモノクローナル抗体などの陰性選択物質の使用を伴う。いくつかの態様において、陰性選択は陰性選択物質を伴わない。いくつかの態様において、陰性選択は、陰性選択物質の非存在下で、例えば廃棄されるべき望ましくない（非標的）細胞型の陰性選択が、望ましくない（非標的）細胞型の細胞サイズ、密度、および／または形態のいずれかに基づく、例えば「タッチフリー」または閉鎖系で起こり得る。
【００７９】
本明細書で用いられる場合、「物理的結合」という用語は、本明細書に記載される組成物中の心外膜細胞と心筋細胞の近接によって達成される細胞間接触を指す。細胞間接触は、細胞が、例えばギャップ結合、接着結合等を介した直接的な細胞間コミュニケーションを含むことを必要とせず、むしろ、細胞が、直接、または例えばマトリックスもしくは足場への一般的な付着によって付着していることを指す。例えば、例えば第1細胞上に発現されるが第2細胞上には発現されないマーカーとの結合による、第1細胞の特異的捕捉が、第1細胞および第2細胞の同時単離をもたらすのであれば、本用語が本明細書で用いられる場合の、第1細胞は第2細胞「と物理的に結合している」。1つの態様において、「物理的結合」という用語は、一方の細胞（例えば、心外膜細胞）によって分泌されたフィブロネクチンなどの因子が第2細胞（例えば、心筋細胞）の機能または生存に影響を及ぼし得る場合の、組成物中の心外膜細胞および心筋細胞を指す。
【００８０】
本明細書で用いられる場合、「組織粒子」は、互いに物理的に結合した少なくとも2つの異なる細胞型を含む、インビトロで培養された細胞組成物を指す。1つの態様において、組織粒子中の細胞には心筋細胞および心外膜細胞が含まれる。1つの態様において、組織粒子中の唯一の細胞は心筋細胞および心外膜細胞である。1つの態様において、組織粒子中の細胞は、インビトロで分化した心筋細胞および心外膜細胞である。組織粒子は、本用語が本明細書で用いられる場合の足場を含み得るが、必ずしもこれを含む必要はない。組織粒子は、少なくとも2個の細胞、すなわち2つの異なる細胞型の少なくとも1個ずつを含むが、例えば2〜2500個の細胞、例えば、少なくとも2個の細胞、少なくとも4個の細胞、少なくとも5個の細胞、少なくとも10個の細胞、少なくとも20個の細胞、少なくとも30個の細胞、少なくとも40個の細胞、少なくとも50個の細胞、少なくとも100個の細胞、少なくとも200個の細胞、少なくとも300個の細胞、少なくとも400個の細胞、少なくとも500個の細胞、少なくとも600個の細胞、少なくとも700個の細胞、少なくとも800個の細胞、少なくとも900個の細胞、少なくとも1000個の細胞、少なくとも1100個の細胞、少なくとも1200個の細胞、少なくとも1300個の細胞、少なくとも1400個の細胞、少なくとも1500個の細胞、少なくとも1600個の細胞、少なくとも1700個の細胞、少なくとも1800個の細胞、少なくとも1900個の細胞、少なくとも2000個の細胞、少なくとも2100個の細胞、少なくとも2200個の細胞、少なくとも2300個の細胞、少なくとも2400個の細胞、または少なくとも2500個の細胞を含み得る。1つの態様において、組織粒子は、2500個またはそれ未満の細胞、例えば、2400個またはそれ未満の細胞、2300個またはそれ未満の細胞、2200個またはそれ未満の細胞、2100個またはそれ未満の細胞、2000個またはそれ未満の細胞、1900個またはそれ未満の細胞、1800個またはそれ未満の細胞、1700個またはそれ未満の細胞、1600個またはそれ未満の細胞、1500個またはそれ未満の細胞、1400個またはそれ未満の細胞、1300個またはそれ未満の細胞、1200個またはそれ未満の細胞、1100個またはそれ未満の細胞、1000個またはそれ未満の細胞、900個またはそれ未満の細胞、800個またはそれ未満の細胞、700個またはそれ未満の細胞、600個またはそれ未満の細胞、500個またはそれ未満の細胞、400個またはそれ未満の細胞、300個またはそれ未満の細胞、200個またはそれ未満の細胞、100個またはそれ未満の細胞、50個またはそれ未満の細胞を含むが、少なくとも2個の細胞を含む。様々な態様において、組織粒子は、例えば、2〜100個の細胞、2〜500個の細胞、2〜1000個の細胞、2〜1500個の細胞、2〜2000個の細胞、2〜2400個の細胞、100〜200個の細胞、100〜500個の細胞、100〜1000個の細胞、100〜1500個の細胞、100〜2000個の細胞、100〜2500個の細胞、200〜400個の細胞、200〜500個の細胞、200〜1000個の細胞、200〜1500個の細胞、200〜2000個の細胞、200〜2500個の細胞、500〜1000個の細胞、500〜1500個の細胞、500〜2000個の細胞、または500〜2500個の細胞を含み得る。細胞数が差しつかえない場合、組織粒子中の細胞は、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:10；1:15、1:20、1:25、1:50、1:75、またはさらには1:100という様々な比率で存在し得る。
【００８１】
本明細書で用いられる場合、心筋細胞に適用される場合の「成熟表現型」という用語は、成体心筋細胞と類似の表現型を含み、かつ胎児心筋細胞の少なくとも1つの特徴を含まない細胞の表現型を指す。いくつかの態様において、心筋細胞の成熟度の増大を示すマーカーには、α-アクチニン、c-TnT、および／またはb-MHCの発現増大、異方性の増大、細胞整列の増大、細胞間のギャップ結合およびカドヘリンの異方性配置、T管形成の増大、ならびにカベオリン発現が含まれるが、これらに限定されず、この場合の増大とは、同じ心筋細胞の別の集団における、例えば同時投与された心外膜細胞がない場合の心筋細胞の集団に関する、そのマーカーに対する増大である。いくつかの態様において、成熟心筋細胞は、ssTnIのctTnIへの、N2BAのN2Bへの変換の増大、ならびに成体心臓組織において発現されるイオンチャネル（電位開口型K+チャネル、Na+チャネル、電位依存性Ca2+チャネル、環状ヌクレオチド依存性K+チャネル、およびその他のイオンチャネル）の発現の適切な増大または減少を有する。いくつかの態様において、成熟心筋細胞は、顕微鏡観察によって支援される収縮マッピングにより測定される単一細胞および多細胞レベルでの収縮の増大、収縮強度の増大を有する。いくつかの態様において、成熟心筋細胞は、細胞間電気伝導度の上昇、電気的活動電位が一点から別の点に伝播できるようにする、広い面積 (cm2) における2Dインビトロ培養物の合胞体性質の増大、波速度の上昇および興奮閾値の低下、Ca2+過渡電流の増大を有する。
【００８２】
本明細書で用いられる場合、「微小血管密度」という用語は、心臓の生着領域内の小血管の濃度を指す。1つの態様において、微小血管密度は、心臓の領域における、特に梗塞領域または移植された心筋を含む領域における、新たな血管／脈管構造（例えば、血管新生）の測定値である。
【００８３】
本明細書で用いられる場合、心筋細胞に言及する場合の「電気的接続」という用語は、細胞内イオンおよび他の低分子が一方の細胞から他方の細胞に移動することを可能にし（例えば、コネキシン43によって形成されるギャップ結合）、次に細胞間の電気信号の伝播（例えば、活動電位の伝播）を可能にする細胞間接続を指す。隣接する心筋細胞間の電気的接続の程度は、本明細書において「電気的接続性」または「電気接続性」とも称される。
【００８４】
本明細書で用いられる場合、「移植された心筋細胞の増殖を増大させること」という用語は、それらが心外膜細胞と共に移植されない場合の心筋細胞数の増加と比較した、心外膜細胞が移植用組成物中に含まれる場合に起こる心筋細胞数の増加を指す。
【００８５】
本明細書で用いられる場合、「足場」という用語は、細胞の接着および増殖に適した表面を提供する生体適合性材料を含む構造を指す。足場は、力学的な安定性および支持をさらに提供し得る。足場は、増殖細胞の集団がとる3次元の形状または形態に影響を及ぼすかまたはその範囲を定めるように、特定の形状または形態であってよい。そのような形状または形態には、フィルム（例えば、第3次元よりも実質的に大きい2次元を有する形態）、リボン、コード、シート、平坦な円板、円柱、球体、3次元の無定形形状等が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
本明細書で用いられる場合、「対象に植え込み可能」という用語は、植え込み時に宿主生物において認識可能な免疫応答を生じない任意の非生存（例えば、無細胞）植え込み可能構造を指す。したがって、植え込み可能構造は、例えば、刺激物質であってはならず、もしくは刺激物質を含んではならず、またはLPS等を含んではならない。
【００８７】
本明細書で用いられる場合、「生分解性」という用語は、生理的条件下で、例えば、送達された細胞またはインビボの細胞の細胞生存率に有害な影響を及ぼさない条件下で、足場が分解する能力を指す。そのような生分解性足場は、好ましくは、組成物が植え込まれている対象において全身性反応を引き起こし得る刺激物質もしくはアレルゲンではなく、またはそれらを含まない。いくつかの態様において、生分解性とは、足場が代謝され得る、および代謝物が生理的排出機構（例えば、尿、便、肝臓解毒等）によって対象から排除され得ることを意味する。
【００８８】
本明細書で用いられる場合、「処置すること」という用語は、状態、疾患、または障害の少なくとも1つの有害作用または症状を減少または軽減することを含む。例えば、「処置すること」および「処置」という用語は、対象が疾患の少なくとも1つの症状の減少または疾患の改善、例えば有益なまたは所望の臨床結果（例えば、心臓の梗塞領域における心臓機能の改善、心筋細胞の生着の改善等）を有するように、組成物の有効量、例えば、例えば心外膜細胞、心筋細胞等の集団を含む組成物の有効量を対象に投与することを指す。本開示の目的に関して、有益なまたは所望の臨床結果には、検出可能であるか検出不能であるかにかかわらず、1つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（例えば、悪化しない）、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的か完全かを問わない）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの態様において、処置することは、処置を受けない場合に予測される生存と比較した生存の延長を指し得る。したがって、当業者は、処置により疾患状態が改善され得るが、疾患が完全に治癒するわけではないことを認識する。いくつかの態様において、処置は予防を含み得る。しかしながら、代わりの態様において、処置は予防を含まない。
【００８９】
本明細書において言及される心臓障害、心臓疾患、または心臓損傷（例えば、心筋梗塞）の「処置」は、処置領域において心臓機能を向上させ、かつ／または心筋細胞の生着を増強し、かつ／または心筋細胞の移植体もしくは移植片の脈管化を増強し、そのようにして例えば心臓の機能を改善する治療的介入を指す。すなわち、心臓の「処置」は、心臓の機能（例えば、梗塞領域内の機能の向上）および／または本明細書に記載される組成物で処置された他の部位の機能に向けられる。例えば左室収縮末期径 (LVESD) を測定することにより評価して、心臓の機能を、そのような治療前のそのような機能と比較して、完全な機能までおよび完全な機能を含め、少なくとも10%、および好ましくは少なくとも20%、30%、40%、50%、75%、90%、100%、またはそれ以上、例えば、2倍、5倍、10倍、またはそれ以上改善する治療的アプローチは、有効な処置と見なされる。有効な処置は、有効な処置と見なされるために、心臓疾患もしくは障害を治癒する必要はなく、またはその基礎となる原因に直接影響を及ぼす必要もない。
【００９０】
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に釣り合って、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を引き起こすことなく、ヒトおよび動物の組織に接触して用いるのに適している化合物、材料、組成物、および／または剤形を指すために、本明細書において用いられる。
【００９１】
本明細書で用いられる場合、疾患、障害、またはその症状に関連して用いられる場合の「予防」または「予防すること」とは、個体が、疾患または障害、例えば一例としてではあるが心筋梗塞の後の心不全を発症する可能性の減少を指す。疾患または障害を発症する可能性は、例えば、疾患または障害に関する1つまたは複数の危険因子を有する個体が、同じ危険因子を有するが、本明細書に記載される処置を受けていない集団と比較して、統計学的に言って、障害を発症しない、またはそのような疾患もしくは障害を後になって発症するかもしくはより低い重症度で発症する場合に、減少する。疾患の症状を発症しないこと、または症状の発症が減少（例えば、その疾患もしくは障害に関する臨床的に許容されるスケールで少なくとも10%）もしくは遅延（例えば、数日、数週間、数カ月、もしくは数年）することは、有効な予防と見なされる。
【００９２】
本明細書で用いられる場合、「分化するように誘導される」という用語は、多能性または複能性幹細胞からより分化した細胞（例えば、心外膜細胞）の形成を助長する化学的／生物学的処置、物理的環境、または遺伝的修飾を指す。分化は、明確な細胞型特異的マーカーの出現によって、もしくは幹細胞特異的マーカーの喪失によって、またはその両方によって評価することができる。
【００９３】
「減少する」、「低下した」、「低下」、または「阻害する」という用語はすべて、特性、レベル、または他のパラメータが統計的に有意な量だけ減少するまたは少なくなることを意味するために、本明細書において用いられる。いくつかの態様において、「低下する」、「低下」または「減少する」または「阻害する」は典型的に、参照レベルと比較して少なくとも10%の減少を意味し、例えば、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約35%、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約50%、少なくとも約55%、少なくとも約60%、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90％、少なくとも約95%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、またはそれ以上の減少を含み得る。本明細書で用いられる場合、「低下」または「阻害」は、参照レベルと比較した場合の完全な阻害または低下を包含しない。「完全な阻害」とは、参照レベルと比較した場合の100%の阻害である。
【００９４】
「増加/増大した」、「増加/増大する」または「増強する」または「活性化する」という用語はすべて、特性、レベル、または他のパラメータが統計的に有意な量だけ増加することを一般に意味するために、本明細書において用いられ；疑義を避けるために付言すると、「増加/増大した」、「増加/増大する」または「増強する」または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10%の増加、例えば、参照レベルと比較して少なくとも約20%、もしくは少なくとも約30%、もしくは少なくとも約40%、もしくは少なくとも約50%、もしくは少なくとも約60%、もしくは少なくとも約70%、もしくは少なくとも約80%、もしくは少なくとも約90%の増加、もしくは最大で100%およびそれを含む増加、もしくは10〜100%の間の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、少なくとも約20倍の増加、少なくとも約50倍の増加、少なくとも約100倍の増加、少なくとも約1000倍の増加、もしくはそれ以上を意味する。
【００９５】
本明細書で用いられる場合、「含むこと」または「含む」という用語は、本発明に必須である組成物、方法、およびその各構成成分に関連して用いられるが、必須であるか否かにかかわらず、明記されていない要素の包含も受け入れる。
【００９６】
本明細書で用いられる場合、「本質的に〜からなる」という用語は、所与の態様に必要とされる要素を指す。本用語は、本発明のその態様の基本的でかつ新規なまたは機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない付加的な要素の存在を容認する。
【００９７】
「〜からなる」という用語は、本態様のその説明において列挙されていないいかなる要素も除外した、本明細書に記載される組成物、方法、およびその各構成成分を指す。
【００９８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、「1つの (a)」、「1つの (an)」および「その (the)」という単数形は、文脈が明確に他のことを示していない限り、複数の参照物も含む。したがって例えば、「その方法」への言及は、本明細書に記載され、かつ／または本開示を読むことによって当業者に明らかになるであろう種類の、1つまたは複数の方法および／または段階を含み、他の場合も同様である。
【００９９】
細胞調製
本明細書に記載される方法および組成物は、例えば、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞などの多能性幹細胞、またはそのような分化を可能にする他の幹細胞から、インビトロで分化した心筋細胞および心外膜細胞を使用することができる。心筋細胞および心外膜細胞を調製するために使用することができる様々な幹細胞を以下に記載する。
【０１００】
胚性幹細胞：幹細胞は、有糸分裂による細胞分裂を通して自身を再生する能力を保持し、より特殊化した細胞型に分化することができる細胞である。哺乳動物幹細胞の3つの大まかな種類には、胚盤胞において見出される胚性幹 (ES) 細胞、体細胞から再プログラム化された人工多能性幹細胞 (iPSC)、および成体組織において見出される成体幹細胞が含まれる。多能性幹細胞の他の供給源には、羊膜由来幹細胞または胎盤由来幹細胞が含まれ得る。発生中の胚において、幹細胞は、特殊化した胚組織のすべてに分化することができる。成体生物において、幹細胞および前駆細胞は、身体の修復システムとして働き、特殊化した細胞を補充しているが、同様に血液、皮膚、または腸組織などの再生器官の正常な代謝回転も維持している。多能性幹細胞は、3胚葉のいずれかに由来する細胞に分化することができる。
【０１０１】
本明細書に記載される方法および組成物に有用な心筋細胞および心外膜細胞は、数ある中でも、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞の両方から分化させることができる。1つの態様において、本明細書において提供される組成物および方法は、胚性幹細胞から分化したヒト心筋細胞および／または心外膜細胞を使用する。あるいは、いくつかの態様において、本明細書において提供される組成物および方法は、生存ヒト胚から採取された細胞から作製されたヒト心原性細胞および／または心外膜細胞の作製または使用を包含しない。
【０１０２】
胚性幹細胞およびそれらの回収のための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Trounson A O (Reprod Fertil Dev (2001) 13: 523)、Roach M L (Methods Mol Biol (2002) 185: 1)、およびSmith A G (Annu Rev Cell Dev Biol (2001) 17:435) に記載されている。「胚性幹細胞」という用語は、胚性胚盤胞の内部細胞塊の多能性幹細胞を指すために用いられる（例えば、米国特許第5843780号、同第6200806号を参照されたい）。そのような細胞は、体細胞核移入に由来する胚盤胞の内部細胞塊からも同様に得ることができる（例えば、米国特許第5945577号、同第5994619号、同第6235970号を参照されたい）。胚性幹細胞の識別的特徴は、胚性幹細胞表現型を規定する。したがって、ある細胞が、その細胞を他の細胞と区別することができるような胚性幹細胞の特有の特徴の1つまたは複数を有する場合、その細胞は胚性幹細胞の表現型を有する。例示的な識別的な胚性幹細胞の特徴には、非限定的に、遺伝子発現プロファイル、増殖能、分化能、核型、特定の培養条件に対する応答性、および同等のものが含まれる。
【０１０３】
胚供給源に由来する細胞には、幹細胞バンクまたは他の公認の保管施設から得られた胚性幹細胞または幹細胞株が含まれ得る。幹細胞株を生成する他の手段には、胚盤胞を形成する前の初期胚（およそ8細胞期）からの割球細胞の使用を含む方法が含まれる。そのような技法は、生殖補助クリニックで日常的に行われている着床前遺伝子診断技法に相当する。単一の割球細胞を、確立されたES細胞株と共培養し、次いでそれらから分離すると、完全にコンピテントなES細胞株を形成する。
【０１０４】
胚性幹細胞は、それらが特定の分化系列に拘束されていない場合、未分化であると見なされる。そのような細胞は、それらを胚または成体起源の分化した細胞と区別する形態学的特徴を示す。未分化の胚性幹 (ES) 細胞は、当業者によって容易に認識され、典型的に2次元の顕微鏡像において高い核／細胞質比および顕著な核小体を有する細胞のコロニーとして出現する。いくつかの態様において、本明細書に記載されるヒト心筋細胞および／または心外膜細胞は、胚性幹細胞または胚起源の任意の他の細胞に由来しない。
【０１０５】
成体幹細胞は、出生後もしくは新生児期後の生物の組織または成体生物に由来する幹細胞である。成体幹細胞は、胚性幹細胞と比較してそれが発現するかまたは発現しないマーカーの点だけでなく、後成的な差、例えばDNAメチル化パターンの差の存在によっても、構造的に胚性幹細胞とは異なる。
【０１０６】
人工多能性幹細胞 (iPSC)
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法および組成物は、人工多能性幹細胞からインビトロで分化した心筋細胞および／または心外膜細胞を利用する。本明細書に記載される組成物のための心筋細胞および／または心外膜細胞を作製するためにiPSCを使用することの利点は、その細胞が、所望のヒト心筋細胞および／または心外膜細胞を投与しようとする対象と同じ対象に由来し得る点である。すなわち、体細胞を対象から得て、人工多能性幹細胞に再プログラム化し、次いでヒト心筋細胞および／または心外膜細胞に再分化させて対象に投与することができる（例えば、自己細胞）。心筋細胞および／または心外膜細胞（もしくはそれらの分化した子孫）は本質的に自己供給源に由来するため、生着拒絶またはアレルギー反応のリスクは、別の対象または対象群からの細胞を用いる場合と比較して減少する。いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物に有用な心筋細胞および／または心外膜細胞は、非自己供給源に由来する。加えて、iPSCを用いることで、胚供給源から得られた細胞の必要がなくなる。したがって、1つの態様において、本明細書に記載される組成物および方法において用いるための心外膜細胞または心筋細胞を作製するために用いられる幹細胞は、胚性幹細胞ではない。
【０１０７】
分化は一般的に生理的状況下で不可逆的であるが、最近、体細胞を人工多能性幹細胞に再プログラム化するためのいくつかの方法が開発されている。例示的な方法は当業者に公知であり、本明細書において以下に簡潔に説明する。
【０１０８】
再プログラム化は、分化した細胞（例えば、体細胞）の分化状態を変化または逆転させる過程である。言い換えれば、再プログラム化は、細胞の分化をより未分化なまたはより原始的な種類の細胞へと逆向きに駆動する過程である。多くの初代培養細胞を培養下に置くと、完全に分化した特徴の一部が失われ得ることに留意されたい。しかしながら、分化した細胞という用語に含まれるそのような細胞の単純な培養によって、これらの細胞が非分化細胞（例えば、未分化細胞）または多能性細胞になるわけではない。分化細胞の多能性への移行は、分化細胞を培養下に置いた場合に分化特徴の部分的喪失をもたらす刺激を超える再プログラム化刺激を必要とする。再プログラム化された細胞はまた、一般的に培養において限られた回数だけ分裂する能力を有する初代細胞の親と比較して、成長能を失うことなく長期間継代できるという特徴を有する。
【０１０９】
再プログラム化しようとする細胞は、再プログラム化の前に、部分的に分化していてもよいか、または最終分化していてもよい。いくつかの態様において、再プログラム化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の、多能性状態または複能性状態への完全な逆転を包含する。いくつかの態様において、再プログラム化は、分化細胞（例えば、体細胞）の分化状態の、未分化細胞（例えば、胚様細胞）への完全なまたは部分的な逆転を包含する。再プログラム化は細胞による特定の遺伝子の発現を引き起こすことができ、その発現が再プログラム化にさらに寄与する。本明細書に記載されるある特定の態様において、分化細胞（例えば、体細胞）の再プログラム化により、分化細胞は、自己再生し、全3つの生殖細胞系列の細胞に分化する能力を有する未分化状態をとる。結果として得られた細胞は、「再プログラム化細胞」または「人工多能性幹細胞（iPSCもしくはiPS細胞）」と称される。
【０１１０】
体細胞（例えば、生殖系列細胞を除外した身体の任意の細胞；線維芽細胞等）から多能性幹細胞を作製するために用いられる特定のアプローチまたは方法は、特許請求される本発明にとって重要ではない。したがって、体細胞を多能性表現型に再プログラム化するいかなる方法も、本明細書に記載される方法において用いるのに適している。
【０１１１】
iPS細胞は、最終分化した体細胞および成体幹細胞もしくは体性幹細胞から作製することができ、またはそれらに由来し得る。すなわち、非多能性の前駆細胞を、再プログラム化によって多能性または複能性にすることができる。
【０１１２】
出発細胞の集団に由来する再プログラム化の効率（すなわち、再プログラム化された細胞の数）は、Shi, Y., et al (2008) Cell-Stem Cell 2:525-528、Huangfu, D., et al (2008) Nature Biotechnology 26(7):795-797、およびMarson, A., et al (2008) Cell-Stem Cell 3:132-135によって示されるように、様々な低分子の添加によって向上させることができる。再プログラム化効率を向上させる作用物質のいくつかの非限定的な例には、数ある中でも、可溶性Wnt、Wnt馴化培地、BIX-01294（G9aヒストンメチルトランスフェラーゼ）、PD0325901（MEK阻害剤）、DNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストン脱アセチル化酵素 (HDAC) 阻害剤、バルプロ酸、5'-アザシチジン、デキサメタゾン、スベロイルアニリド、ヒドロキサム酸 (SAHA)、ビタミンC、およびトリコスタチン (TSA) が含まれる。
【０１１３】
本明細書に記載される方法と共に用いるための多能性幹細胞の誘導を確認するために、単離されたクローンを幹細胞マーカーの発現に関して試験することができる。体細胞由来の細胞におけるそのような発現により、細胞は人工多能性幹細胞であると同定される。幹細胞マーカーは、SSEA3、SSEA4、CD9、Nanog、Fbx15、Ecat1、Esg1、Eras、Gdf3、Fgf4、Cripto、Dax1、Zpf296、Slc2a3、Rex1、Utf1、およびNat1を含む非制限的な群より選択され得る。1つの態様において、Oct4またはNanogを発現する細胞は、多能性であると同定される。そのようなマーカーの発現を検出するための方法には、例えば、RT-PCR、およびウェスタンブロットまたはフローサイトメトリー解析などのコードされるポリペプチドの存在を検出する免疫学的方法が含まれ得る。いくつかの態様において、検出はRT-PCRを伴うのみならず、タンパク質マーカーの検出も含む。細胞内マーカーはRT-PCRによって最も良好に同定され得るが、細胞表面マーカーは例えば免疫細胞化学的検査によって容易に同定される。
【０１１４】
単離された細胞の多能性幹細胞特性は、iPSCが3胚葉の各々の細胞に分化する能力を評価する試験によって確認することができる。一例として、ヌードマウスにおけるテラトーマ形成を用いて、単離されたクローンの多能性特性を評価することができる。細胞をヌードマウスに導入し、その細胞から生じた腫瘍に関して組織学的検査および／または免疫組織化学的検査を行う。3胚葉すべてからの細胞を含む腫瘍が成長すれば、例えば細胞が多能性幹細胞であることがさらに示される。
【０１１５】
疾患の治療的処置において用いるべきヒト心筋細胞および／または心外膜細胞の作製に再プログラム化細胞が用いられる場合、処置される患者から単離された体細胞を用いることが望ましいが、その必要はない。例えば、疾患に関係する体細胞、および疾患の治療的処置に関与する体細胞、ならびに同等のものを用いることができる。いくつかの態様において、再プログラム化細胞およびそれらが由来するまたは作製された元の体細胞を含む不均一な集団から再プログラム化細胞を選択するための方法は、任意の公知の手段によって行うことができる。例えば、選択マーカー遺伝子などの薬物耐性遺伝子または同等のものを用いて、選択マーカーを指標として用いて再プログラム化細胞を単離することができる。
【０１１６】
本明細書において開示される再プログラム化体細胞は、アルカリホスファターゼ (AP)；ABCG2；ステージ特異的胚抗原-1 (SSEA-1)；SSEA-3；SSEA-4；TRA-1-60；TRA-1-81；Tra-2-49/6E；ERas/ECAT5、E-カドヘリン；β-III-チューブリン；α-平滑筋アクチン (α-SMA)；線維芽細胞増殖因子4 (Fgf4）、Cripto、Dax1；ジンクフィンガータンパク質296 (Zfp296)；N-アセチルトランスフェラーゼ-1 (Nat1)；（ES細胞関連転写物1 (ECAT1)；ESG1/DPPA5/ECAT2；ECAT3；ECAT6；ECAT7；ECAT8；ECAT9；ECAT10；ECAT15-1；ECAT15-2；Fthl17；Sal14；未分化胚細胞転写因子 (Utf1)；Rex1；p53；G3PDH；TERTを含むテロメラーゼ；サイレントX染色体遺伝子；Dnmt3a；Dnmt3b；TRIM28；F-ボックス含有タンパク質15 (Fbx15)；Nanog/ECAT4；Oct3/4；Sox2；Klf4；c-Myc；Esrrb；TDGF1；GABRB3；Zfp42、FoxD3；GDF3；CYP25A1；発生多能性関連2 (DPPA2)；T細胞リンパ腫切断点1 (Tcl1)；DPPA3/Stella；DPPA4；多能性に関する他の一般的マーカー等を含む、任意の数の多能性細胞マーカーを発現し得る。他のマーカーには、Dnmt3L；Sox15；Stat3；Grb2；β-カテニン、およびBmi1が含まれ得る。そのような細胞はまた、人工多能性幹細胞が由来する元の体細胞に特徴的であるマーカーの下方制御を特徴とし得る。
【０１１７】
インビトロ分化
本明細書に記載される方法および組成物は、インビトロで分化した心筋細胞および心外膜細胞を使用することができる。ESCまたはIPSCからいずれかの細胞型を分化させるための方法は、当技術分野において公知である。例えば、心筋細胞の分化を記載しているLaFlamme et al., Nature Biotech 25:1015-1024 (2007)、ならびに心外膜細胞の分化を記載しているWitty et al., Nature Biotech. 32:1026-1035 (2014) およびIyer et al., Development 142:1528-1541 (2015) を参照されたい。これらのアプローチでは様々な因子および条件を用いて、それらの各々の細胞型をもたらす分化プログラムを活性化し導く。それらに関係する経路および一部の因子については、以下で考察する。
【０１１８】
典型的に、ESCまたはIPSCの心外膜細胞への段階的分化は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞から始まり、これが初期中胚葉細胞に分化し、次いで側部中胚葉細胞表現型を通して心外膜細胞に分化する。
【０１１９】
ある特定の態様において、ESCまたはiPSCの心筋細胞への段階的分化は、以下の順序で進行する：ESCまたはiPSC＞心原性中胚葉＞心臓前駆細胞＞心筋細胞（例えば、その内容が全体として参照により本明細書に組み入れられるUS 2017024086を参照されたい）。
【０１２０】
当業者によって認識されるように、心外膜細胞および／または心筋細胞のインビトロ分化は、心外膜細胞または心筋細胞の表現型的および形態学的特徴を有する細胞という最終結果をもたらすが、インビトロ分化の分化段階は、胚で自然に起こる分化と同じである必要はない。すなわち、心外膜細胞または心筋細胞への分化中には、そのような細胞を生成するために利用される段階的分化アプローチは、胚形成中に同定されているあらゆる前駆細胞型を通過する必要はなく、胚形成中に起こるある特定の発生段階を本質的に「飛ばす」ことができることが、本明細書において明確に企図される。
【０１２１】
TGF-βシグナル伝達経路の調節：いくつかの態様においては、多能性細胞の心外膜細胞、または場合によっては心筋細胞への特定の分化段階を促進するために、1つまたは複数のTGF-βアゴニスト（例えば、アクチビンA）が用いられる。心外膜細胞に関して、TGF-βシグナル伝達はまた、心外膜細胞の上皮間葉細胞転換を促進し得る。そのような態様において、TGF-βシグナル伝達に特異的な活性化剤は、TGF-βポリペプチドもしくはその活性断片、TGF-βポリペプチドもしくはその活性断片を含む融合タンパク質、TGF-β受容体に対するアゴニスト抗体、またはTGF-β受容体の低分子アゴニストであってよい。
【０１２２】
いくつかの態様において、例えばヒト胚性幹細胞またはiPS細胞から心筋細胞を分化させる際に、本明細書に記載される方法において用いられるTGF-βアゴニスト（例えば、アクチビンA）の用量は、50ng/mL〜100ng/mL、75 ng/mL〜125 ng/mL、50〜200 ng/mL、50〜500 ng/mL、100 ng/mL〜1000 ng/mL、100 ng/mL〜750 ng/mL、100 ng/mL〜500 ng/mL、100 ng/mL〜400 ng/mL、100 ng/mL〜300 ng/mL、100 ng/mL〜200 ng/mL、90 ng/mL〜150 ng/mL、または80 ng/mL〜120 ng/mLである。
【０１２３】
いくつかの態様において、TGF-βアゴニスト（例えば、アクチビンA）の用量は、例えば、少なくとも25 ng/mL、少なくとも50 ng/mL、少なくとも75 ng/mL、少なくとも80 ng/mL、少なくとも85 ng/mL、少なくとも90 ng/mL、少なくとも95 ng/mL、少なくとも99 ng/mL、少なくとも100 ng/mL、少なくとも105 ng/mL、少なくとも110 ng/mL、少なくとも120 ng/mL、少なくとも150 ng/mL、またはそれ以上である。
【０１２４】
BMP受容体経路の活性化：いくつかの態様においては、本明細書に記載される組成物および方法において用いるための心外膜細胞および／または心筋細胞の分化において、BMPアゴニストが用いられる。ある特定の態様においては、(i) ヒト多能性幹細胞の初期中胚葉細胞への、(ii) 初期中胚葉細胞の側板中胚葉細胞への、および／または (iii) 側板中胚葉細胞の心外膜細胞への分化段階において、BMP4が用いられる。
【０１２５】
1つの態様においては、多能性細胞の特定の分化段階を促進するために、1つまたは複数のBMPアゴニストが用いられる。そのような態様において、BMPシグナル伝達に特異的な活性化剤は、BMPポリペプチドもしくはその活性断片、BMPポリペプチドもしくはその活性断片を含む融合タンパク質、BMP受容体に対するアゴニスト抗体、またはBMP受容体の低分子アゴニストであってよい。1つの態様において、本明細書に記載される方法と共に用いられるBMPはBMP4である。
【０１２６】
いくつかの態様において、BMP4の用量は、例えば、少なくとも5 ng/mL、少なくとも10 ng/mL、少なくとも25 ng/mL、少なくとも30 ng/mL、少なくとも40 ng/mL、少なくとも50 ng/mL、少なくとも60 ng/mL、少なくとも70 ng/mL、少なくとも75 ng/mL、少なくとも80 ng/mL、少なくとも85 ng/mL、少なくとも90 ng/mL、少なくとも95 ng/mL、少なくとも99 ng/mL、少なくとも100 ng/mL、少なくとも105 ng/mL、少なくとも110 ng/mL、少なくとも120 ng/mL、少なくとも150 ng/mL、少なくとも175 ng/mL、少なくとも200 ng/mL、少なくとも225 ng/mL、またはそれ以上である。
【０１２７】
ある特定の態様において、BMP4の用量は、5〜200 ng/mL、5〜150 ng/mL、5〜100 ng/mL、5〜75 ng/mL、5〜50 ng/mL、5〜15 ng/mL、25〜50 ng/mL、25〜75 ng/mL、25〜100 ng/mL、40〜60 ng/mL、45〜55 ng/mL、50〜100 ng/mL、50〜150 ng/mL、50〜200 ng/mL、150〜200 ng/mL、100〜200 ng/mL、75〜200 ng/mLの範囲内、またはそれらの間の任意の範囲内である。
【０１２８】
FGF活性化：いくつかの態様においては、(i) ヒト多能性幹細胞（例えば、hESCもしくはhIPSC）の初期中胚葉細胞への分化を誘導するため、または (ii) 初期中胚葉細胞の側板中胚葉細胞への分化を誘導するための分化段階において、FGF2が用いられる。これらの細胞は次いで、例えば心不全の処置または予防のための、本明細書に記載される方法および組成物に有用な心筋細胞および／または心外膜細胞を生成するために、さらに分化させることができる。
【０１２９】
いくつかの態様において、FGF2に有用な投与量範囲は、1〜30 ng/mL、例えば、1〜25 ng/mL、1〜20 ng/mL、1〜15 ng/mL、1〜10 ng/mL、1〜5 ng/mL、1.5〜30 ng/mL、2〜30 ng/mL、5〜30 ng/mL、10〜30 ng/mL、15〜25 ng/mL、15〜30 ng/mL、20〜30 ng/mL、25〜30 ng/mL、8〜12 ng/mL、9〜15g/mL、9〜11 ng/mL、8〜20 ng/mL、またはそれらの間の任意の範囲である。
【０１３０】
いくつかの態様において、FGF2の用量は、例えば、少なくとも1 ng/mL、少なくとも2 ng/mL、少なくとも3 ng/mL、少なくとも4 ng/mL、少なくとも5 ng/mL、少なくとも6 ng/mL、少なくとも7 ng/mL、少なくとも8 ng/mL、少なくとも9 ng/mL、少なくとも10 ng/mL、少なくとも12 ng/mL、少なくとも14 ng/mL、少なくとも15 ng/mL、少なくとも16 ng/mL、少なくとも18 ng/mL、少なくとも20 ng/mL、少なくとも22 ng/mL、少なくとも24 ng/mL、少なくとも25 ng/mL、またはそれ以上である。
【０１３１】
Wntアンタゴニスト：細胞をWntアンタゴニストと接触させることによって中胚葉細胞を心臓系列に指向させるための方法が、本明細書において提供される。Wntアンタゴニストのいくつかの非限定的な例には、Wnt経路阻害剤V（(E)-4-(2,6-ジフルオロスチリル)-N,N-ジメチルアニリンとしても公知である）、IWR-1 endo、IWP-2、CCT036477、XAV-939（タンキラーゼ阻害剤）、および配列t-Boc-NH-Met-Asp-Gly-Cys-Glu-Leu-C02Hを含むペプチドが含まれる。
【０１３２】
いくつかの態様において、Wntアンタゴニスト（例えば、XAV-939）に有用な投与量範囲は、0.5〜5μM、0.5〜4μM、0.5〜3μM、0.5〜2μM、0.5〜1μM、4〜5μM、3〜5μM、2〜5μM、1〜μM、0.5〜2μM、0.75〜2μM、0.9μM〜2μM、またはそれらの間の任意の範囲である。
【０１３３】
いくつかの態様において、Wntアンタゴニストの用量は、例えば、少なくとも20 ng/mL、少なくとも30 ng/mL、少なくとも40 ng/mL、少なくとも50 ng/mL、少なくとも60 ng/mL、少なくとも70 ng/mL、少なくとも80 ng/mL、少なくとも90 ng/mL、少なくとも100 ng/mL、少なくとも110 ng/mL、少なくとも120 ng/mL、少なくとも130 ng/mL、少なくとも140 ng/mL、少なくとも150 ng/mL、少なくとも160 ng/mL、少なくとも170 ng/mL、少なくとも180 ng/mL、少なくとも190 ng/mL、少なくとも200 ng/mL、またはそれ以上である。
【０１３４】
Wntアゴニスト：いくつかの態様において、本明細書に記載される方法および組成物に有用な心外膜細胞は、一部に側板中胚葉細胞をWntアゴニスト（例えば、Wnt3a）で処理する段階を含むプロトコールを用いて作製することができる。Wntアゴニストには、Wntペプチド、低分子、ペプチド模倣物等が含まれ得る。ある特定の態様において、Wntアゴニストは、2-アミノ-4-[3,4-(メチレンジオキシ)ベンジル-アミノ]-6-(3-メトキシフェニル)ピリミジン、WAY-316606、（ヘテロ）アリールピリミジン、IQ1、QS11、SB-216763、またはジクロロ酢酸 (DCA) である。Wntアゴニストはまた、数ある中でも、Sigma-Aldrich、ApexBio、Santa Cruz Biotechnology、Cayman Chemicalsなどの供給元から商業的に入手することができる。1つの態様において、WntアゴニストはWnt3Aである。
【０１３５】
いくつかの態様において、Wnt3Aの用量は、少なくとも10 ng/mL、少なくとも15 ng/mL、少なくとも20 ng/mL、少なくとも25 ng/mL、少なくとも30 ng/mL、少なくとも40 ng/mL、少なくとも50 ng/mL、少なくとも60 ng/mL、またはそれ以上である。
【０１３６】
PI3-K阻害剤：いくつかの態様において、本明細書に記載される組成物および方法に有用な心外膜細胞または心筋細胞の生成は、初期中胚葉細胞の生成を通過する。例えば、一部にhESCまたはhIPSCをPI3K阻害剤（例えば、Ly294002）と接触させる段階を含むプロトコールを用いて、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞を初期中胚葉細胞に分化させることができる。
【０１３７】
例示的なPI3K阻害剤には、ワートマニン、デメトキシビリジン、LY294002、イデラリシブ、コパンリシブ、ペリフォシン、ブパリシブ、デュベリシブ、アルペリシブ、ウンブラリシブ、コパンリシブ、PX-866、ダクトリシブ、CUDC-997、ME-401、IPI-549、SF-1126、RP6530、INK1117、ピクチリシブ、XL147、XL765、パロミド529、GSK1059615、ZSTK474、PWT33596、IC87114、TG100-115、CAL263、RP6503、PI-103、GNE-477、およびAEZS-136が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で用いられるPI3K阻害剤は、胚性細胞またはiPS細胞の心外膜細胞への分化過程の初期においてであり、PI3K活性はより後期の分化段階においても必要である可能性があるため、そのような分化段階のためにはLy29947002などの可逆的PI3Kを選択することが好ましいと考えられる。
【０１３８】
いくつかの態様において、Ly294002の投与量範囲は、1〜25μM、1〜20μM、1〜15μM、1〜2μM、5〜15μM、5〜20μM、5〜25μM、20〜25μM、10〜25μM、8〜12μM、8〜15μM、9μM〜11μM、またはそれらの間の任意の範囲である。
【０１３９】
レチノイン酸：いくつかの態様において、インビトロで分化した心外膜細胞の生成は、本用語が本明細書で用いられる場合、一部には側部中胚葉細胞をレチノイン酸またはその誘導体と接触させることによって行われる。いくつかの態様において、レチノイン酸の投与量範囲は、1〜10μM、1〜7.5μM、1〜5μM、1〜2μM、7.5〜10μM、5〜10μM、3〜10μM、2〜8μM、3〜7μM、3〜6μM、3〜5μM、またはそれらの間の任意の範囲内である。
【０１４０】
心臓前駆細胞の心筋細胞および／または心外膜細胞への分化のモニタリング
多能性幹細胞（例えば、中胚葉細胞、中間線条原始 (mid-streak primitive) 中胚葉細胞、ES細胞、またはiPSC）を分化または再分化させることにより作製された心外膜細胞または心筋細胞が、本明細書において提供される。そのような方法は、本明細書の実施例の項において例証される。当業者によって認識されるように、本明細書に記載されるインビトロで分化したヒト心筋細胞またはインビトロで分化した心外膜細胞は、造血細胞もしくは造血性細胞、血管内皮細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞のマーカーを欠いている。本明細書に記載される方法の1つの態様においては、胚性幹細胞またはiPSCから、例えば完全に分化した心筋細胞または心外膜細胞までのスペクトルに沿った分化の程度を判定するために、1つまたは複数の細胞表面マーカーが用いられる。
【０１４１】
細胞表面マーカー、特に幹細胞表面マーカーは、細胞の分化または脱分化状態を同定するために、本明細書に記載される方法および組成物と共に有用である。心外膜細胞および心筋細胞は両方とも共通の心臓前駆細胞マーカーを共有するため、そのような初期心臓マーカー（例えば、Isl1+、SlK-1+、Nkx2.5+）を用いて心臓系列への拘束を判定することができるが、より後期の分化マーカーを用いて、心外膜細胞と心筋細胞を区別することもできる（例えば、WT1+、TBX18+などの前駆心外膜マーカー、またはWT1+、TBX18+、ALDH1A2+などの心外膜マーカー）。例えば、例えば細胞表面マーカーとの結合のために抗体を用いて、または細胞内マーカーについてはPCRにより、細胞表面マーカーおよび細胞内マーカーの両方を検出することができる。
【０１４２】
いくつかの態様においては、所与のマーカーまたはマーカーのセットに特異的な抗体または類似の作用物質を用いて、蛍光活性化細胞選別 (FACS）、パニング法、磁気粒子選択、粒子選別機選択、ならびに密度分離（Xu et al. (2002) Circ. Res. 91:501；U.S.S.N. 20030022367）および他の物理的特性に基づく分離（Doevendans et al. (2000) J. Mol. Cell. Cardiol. 32:839-851）を含む当業者に公知の他の方法を使用して、所望の細胞を分離および単離することができる。例えば線維芽細胞マーカー、上皮細胞マーカー等の、望ましくないマーカーまたは特徴を有する細胞を選択および除去する段階を含む陰性選択を行うことができる。
【０１４３】
未分化ES細胞は、未分化細胞の存在を検出するためのマーカーとして使用され得る遺伝子を発現する。例示的なES細胞マーカーには、ステージ特異的胚抗原 (SSEA)-3、SSEA-4、TRA-I-60、TRA-1-81、アルカリホスファターゼ、または例えば、それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられるU.S.S.N. 2003/0224411；もしくはBhattacharya (2004) Blood 103(8):2956-64に記載されているものが含まれる。心臓前駆細胞上に発現される例示的なマーカーには、TMEM88、GATA4、ISL1、MYL4、およびNKX2-5が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４４】
心筋細胞上に発現される例示的なマーカーには、NKX2-5、MYH6、MYL7、TBX5、ATP2a2、RYR2、およびcTnTが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４５】
いくつかの態様において、所望の細胞（例えば、インビトロで分化した心外膜細胞）は、濃縮された細胞集団であり；すなわち、細胞集団中のインビトロで分化したヒト心外膜細胞の百分率（例えば、細胞のパーセント）は、集団中の細胞の総数の少なくとも10%である。例えば、濃縮集団は少なくとも15%の最終的な心外膜細胞を含み、集団の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも99%、またはさらには100%が、インビトロで分化したヒト心外膜細胞を含む。いくつかの態様において、細胞集団は、少なくとも100個の細胞、少なくとも500個の細胞、少なくとも1000個の細胞、少なくとも1×104個の細胞、少なくとも1×105個の細胞、少なくとも1×106個の細胞、少なくとも1×107個の細胞、少なくとも1×108個の細胞、少なくとも1×109個の細胞、少なくとも1×1010個の細胞、少なくとも1×1011個の細胞、少なくとも1×1012個の細胞、少なくとも1×1013個の細胞、少なくとも1×1014個の細胞、少なくとも1×1015個の細胞、またはそれ以上を含む。
【０１４６】
足場組成物
1つの局面において、本明細書に記載される心筋細胞および／または心外膜細胞は、細胞を支持する足場を提供する調製物と混合することができ、または該調製物内もしくは該調製物上で成長させることができる。そのような足場は、例えば植え込み後に細胞を所与の位置に固定する上で物理的利点を提供し得ると共に、例えば、さらなる成熟、または例えば細胞が確立されるまでの表現型の維持のための細胞外合図を提供する上で生化学的利点を提供し得る。
【０１４７】
足場材料として使用され得るポリマー粒子を合成するために、生体適合性の合成、天然、および半合成ポリマーを用いることができる。一般的に、本明細書に記載される方法の実践に関して、植え込み前に心筋細胞および／もしくは心外膜細胞をポリマーから単離することができるように、または足場が対象内で経時的に分解し除去の必要がないように、足場は生分解することが好ましい。したがって、1つの態様において、足場は、心筋細胞および／もしくは心外膜細胞の成長、および／またはそれを必要とする対象への送達のための一時的構造を提供する。いくつかの態様においては、足場によって、ヒト細胞が、それを必要とする対象への移植または投与に適した形状で成長することが可能となり、それによって植え込み前に足場を除去することが可能となり、足場自体によって惹起される拒絶反応またはアレルギー反応のリスクが減少する。
【０１４８】
使用され得るポリマーの例には天然および合成ポリマーが含まれるが、再現性および徐放性速度論のためには合成ポリマーが好ましい。使用され得る合成ポリマーには、生分解性ポリマー、例えば、ポリ(乳酸) (PLA)、ポリ(グリコール酸) (PGA）、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド) (PLGA)、および他のポリヒドロキシ酸、ポリ(カプロラクトン)、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ならびに生分解性ポリウレタンなど；非生分解性ポリマー、例えば、ポリアクリル酸、エチレン-酢酸ビニルポリマー、ならびに他のアシル置換酢酸セルロースおよびその誘導体など；ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ(ビニルイミダゾール)、クロロスルホン化ポリオレフィン、およびポリエチレンオキシドが含まれる。生分解性の天然ポリマーの例には、タンパク質、例えば、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、シルク、合成ポリアミノ酸、およびプロラミンなど；多糖類、例えば、アルギン酸、ヘパリンなど；ならびに他の天然に存在する生分解性の糖単位のポリマーが含まれる。代わりに、上述のポリマーの組み合わせを用いることができる。1つの局面においては、一般的に細胞外マトリックス中に見出されない天然ポリマーを用いることができる。
【０１４９】
PLA、PGA、およびPLA/PGAコポリマーは、生分解性足場を形成するのに特に有用である。PLAポリマーは通常、乳酸の環状エステルから調製される。L(+)型およびD(-)型の乳酸の両方、ならびにD(-)乳酸とL(+)乳酸の光学的に不活性なDL-乳酸混合物を用いて、PLAポリマーを調製することができる。ポリ乳酸を調製する方法は、特許文献において十分に文書化されている。その教示が参照により本明細書に組み入れられる以下の米国特許は、適切なポリ乳酸、その特性およびその調製を詳細に記載している：Doroughに対する米国特許第1,995,970号 ；Schneider に対する米国特許第2,703,316号；Salzbergに対する米国特許第2,758,987号；Zeileに対する米国特許第2,951,828号；Higginsに対する米国特許第2,676,945号；およびTrehuに対する米国特許第2,683,136号；第3,531,561号。
【０１５０】
PGAは、グリコール酸（ヒドロキシ酢酸）のホモポリマーである。グリコール酸のポリ(グリコール酸)への変換の際には、グリコール酸を最初にそれ自体と反応させて環状エステルグリコリドを形成し、これを熱および触媒の存在下で高分子量の直鎖ポリマーに変換させる。PGAポリマーおよびその特性は、Cyanamid Research Develops World's First Synthetic Absorbable Suture」, Chemistry and Industry, 905 (1970) においてより詳細に記載されている。
【０１５１】
繊維は、融解紡糸、押し出し、鋳造、またはポリマー加工分野において周知の他の技法によって形成され得る。好ましい溶媒は、植え込み前に足場を除去するために用いるのであれば、加工によって完全に除去されるか、または加工後に残存する量で生体適合性である溶媒である。
【０１５２】
マトリックスにおいて用いるためのポリマーは、細胞のその後の成長および増殖に適切な支持を提供するのに必要な力学的および生化学的パラメータを満たすべきである。ポリマーは、Instronテスターを用いて引張強度などの力学的特性に関して、ゲル浸透クロマトグラフィー (GPC) によってポリマーの分子量に関して、示差走査熱量測定 (DSC) によってガラス転移温度に関して、および赤外 (IR) 分光法によって結合構造に関して特徴決定することができる。
【０１５３】
足場は、任意の所望の形状のものであってよく、本明細書に記載される方法に有用である広範囲の幾何学的形状を含み得る。形状の非制限的なリストには、例えば、数ある中でも、パッチ、中空粒子、チューブ、シート、円柱、球体、および繊維が含まれる。足場の形状またはサイズは、細胞成長、細胞分化、細胞増殖、または任意の他の細胞過程を実質的に妨害してはならず、また足場は、例えばアポトーシスもしくは壊死によって細胞死を誘導してはならない。加えて、細胞生存率が損なわれないように、集団中の細胞に周囲の培地からの栄養素が送達されるための適切な表面積が、足場の形状によって可能になることを確実にするよう注意するべきである。当業者の所望に応じて、足場の多孔性を変化させることもできる。
【０１５４】
いくつかの態様において、ポリマーへの細胞の付着は、基底膜構成成分、フィブロネクチン、寒天、アガロース、ゼラチン、アラビアゴム、I型、II型、III型、IV型、およびV型コラーゲン、ラミニン、グリコサミノグリカン、ポリビニルアルコール、それらの混合物、ならびに細胞培養または組織工学の当業者に公知の他の親水性材料およびペプチド付着材料などの化合物でポリマーをコーティングすることによって向上させる。ポリマー足場をコーティングするための材料の例には、ポリビニルアルコールおよびコラーゲンが含まれる。当業者によって認識されるように、Matrigel（商標）はヒト対象への投与には適しておらず、したがって本明細書に記載される組成物はMatrigel（商標）を含まない。
【０１５５】
いくつかの態様においては、足場に生物活性分子／因子を添加することが望ましいと考えられる。種々の生物活性分子を、本明細書に記載されるマトリックスを用いて送達することができる。
【０１５６】
1つの態様において、生物活性因子には増殖因子が含まれる。増殖因子の例には、血小板由来増殖因子 (PDGF)、トランスフォーミング増殖因子αまたはβ (TGFβ)、骨形成タンパク質4 (BMP4)、線維芽細胞増殖因子7 (FGF7)、線維芽細胞増殖因子10 (FGF10)、上皮増殖因子 (EGF/TGFα)、血管内皮増殖因子 (VEGF) が含まれ、それらのうちのいくつかはまた血管新生因子でもある。
【０１５７】
これらの因子は、当業者に公知であり、かつ、市販されているかまたは文献に記載されている。生物活性分子をマトリックスに組み入れ、マトリックスの拡散および／もしくは分解によって経時的に放出させることができ、またはそれらを細胞懸濁液で懸濁することができる。
【０１５８】
心臓疾患および／または心臓損傷の処置
心臓は、3つの主要な組織層：心内膜、心筋、および心外膜で構成されている。心外膜は心臓のもっとも外側の上皮層であり、冠動脈血管平滑筋細胞の形成を担っている。心筋に対する急性損傷（例えば、心筋梗塞）に応答して、心外膜はより胎児型へと再活性化され得、かつ／または心外膜細胞は上皮間葉転換 (EMT) を起こし得る。心臓損傷、心臓疾患／障害の処置、ならびに／または同時投与された心筋細胞の脈管化および生着の促進における心外膜細胞およびその使用（例えば、心筋細胞との同時投与）が、本明細書において提供される。
【０１５９】
本明細書において提供される方法および組成物は、心筋細胞および／または心外膜細胞（例えば、ヒト心筋細胞およびヒト心外膜細胞）の治療有効量に関する。したがって、いくつかの態様において、(i) 心臓損傷の梗塞域を修復するため、(ii) 心臓虚血もしくは損傷後の回復を促進するため、および／または (iii) 組織修復および／もしくは組織工学を促進するために、心筋細胞の治療有効量が心外膜細胞と共に対象に同時投与される。
【０１６０】
したがって、それを必要とする対象において心臓損傷または心臓疾患もしくは障害を処置および予防するための方法が、本明細書において提供される。本明細書に記載される方法は、心臓の構造および／または機能に対する病的損傷をもたらすような多くの心臓疾患またはそれらの症状を処置するため、改善するため、予防するため、またはその進行を遅らせるために用いることができる。「心臓疾患」、「心臓障害」、および「心臓損傷」という用語は、本明細書において互換的に用いられ、例えば梗塞域中への心筋細胞の機能的生着および脈管化を含む、心臓に関連した状態および／または障害を指す。
【０１６１】
そのような心臓疾患または心臓関連疾患には、心筋梗塞、心不全、心筋症、先天性心臓欠陥（例えば、緻密化障害型心筋症）、肥大型心筋症、拡張型心筋症、心筋炎、心不全、および心肥大が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６２】
本明細書で用いられる場合、「投与すること」、「導入すること」、および「移植すること」という用語は、所望の効果が生じるように、損傷部位または修復部位などの所望の部位において導入細胞の少なくとも部分的局在をもたらす方法または経路によって、細胞、例えば本明細書に記載される心筋細胞および／または心外膜細胞を対象に留置するという文脈において互換的に用いられる。細胞、例えば心外膜細胞またはそれらの分化した子孫（例えば、心臓繊維芽細胞等）および心筋細胞は、心臓に直接植え込むことができ、またはその代わりに対象内の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができ、その位置において、植え込まれた細胞もしくは細胞の構成成分の少なくとも一部は生存したままである。対象への投与後の心外膜細胞の生存期間は、数時間、例えば24時間と短いものから、数日、数年と長いもの、すなわち長期生着であってよい。当業者が認識するように、心筋細胞は、心筋細胞死を含む急性損傷から心臓が治癒し得る程度まで増殖しないため、心筋細胞の長期生着は望ましい。他の態様において、細胞は、腹腔内または静脈内経路などの間接的全身投与経路によって投与することができる。
【０１６３】
予防的に提供される場合、例えば、以前の心筋梗塞または左室不全に起因する心不全、うっ血性心不全等の心臓障害の任意の症状に先立って、心筋細胞および／または心外膜細胞を対象に投与することができる。したがって、心筋細胞および／または心外膜細胞の集団の予防的投与は、本明細書において開示されるように、心臓心不全障害または不適応性心臓リモデリングを予防するのに役立つ。
【０１６４】
本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、本明細書に記載される方法に従って投与される細胞の集団は、1例または複数例のドナーから得られた同種異系細胞またはそれらを含む。本明細書で用いられる場合、「同種異系」は、1つまたは複数の遺伝子座における遺伝子が同一ではない、同じ種の1例または複数例の異なるドナーから得られた、またはそれらに由来する（例えば、それらから分化した）心筋細胞および／または心外膜細胞を指す。例えば、対象に投与される心筋細胞および／または心外膜細胞は、1例もしくは複数例の非血縁ドナー対象から、または1例もしくは複数例の非同一同胞から得られた臍帯血に由来し得る。いくつかの態様においては、遺伝的に同一の動物からまたは一卵性双生児から得られたような同系細胞集団を用いることができる。この局面の他の態様において、心筋細胞および／または心外膜細胞は自己細胞であり；すなわち細胞は対象から得られもしくは単離され（またはそれに由来し）、同じ対象に投与され、すなわちドナーとレシピエントは同一である。
【０１６５】
薬学的に許容される担体
本明細書に記載される、ヒト心筋細胞および／または心外膜細胞を対象に投与する方法は、そのような細胞を含む治療組成物の使用を伴う。治療組成物は、活性成分としてその中に溶解または分散された細胞組成物および任意に本明細書に記載される少なくとも1つの付加的な生物活性剤と共に、生理的に認容される担体を含有する。好ましい態様において、治療組成物は、治療目的で哺乳動物またはヒト患者に投与された場合に、そのように所望されない限り、実質的に免疫原性ではない。本明細書で用いられる場合、「薬学的に許容される」、「生理的に認容される」という用語、およびその文法上の変化形は、それらが組成物、担体、希釈剤、および試薬を指す場合、互換的に用いられ、その材料が、悪心、めまい、胃の不調、移植体拒絶、アレルギー反応、および同等のものなどの望ましくない生理的影響を生じることなく、哺乳動物にまたは哺乳動物に対して投与できることを表す。薬学的に許容される担体は、そのように所望されない限り、それと混合される作用物質に対する免疫応答の発生を促進しない。その中に溶解または分散された活性成分を含有する組成物の調製は、当技術分野において十分に理解されており、製剤に基づいて制限される必要はない。典型的に、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとしての注射剤として調製されるが、使用前に液体中で溶液または懸濁液とするのに適した固体形態も同様に調製することができる。
【０１６６】
一般的に、本明細書に記載される心筋細胞および／または心外膜細胞を含む組成物は、細胞が薬学的に許容される担体と混合されている懸濁液製剤として投与される。当業者は、細胞組成物において用いられるべき薬学的に許容される担体が、対象に送達されるべき細胞の生存率を実質的に妨害する量の緩衝剤、化合物、凍結保護剤、保存剤、または他の作用物質を含まないことを認識するであろう。細胞を含む製剤は、例えば、細胞膜の完全性を維持できるようにする浸透圧緩衝剤、および任意に、投与に際して細胞生存率を維持するかまたは生着を増強するための栄養素を含み得る。そのような製剤および懸濁液は、当業者に公知であり、かつ／または日常的な実験を用いて、本明細書に記載されるヒト心臓前駆細胞と共に用いるために適合させることができる。
【０１６７】
細胞組成物はまた、乳化手順が細胞生存率に悪影響を及ぼさない限り、乳化するかまたはリポソーム組成物として提示することができる。細胞および任意の他の活性成分を、薬学的に許容され、かつ活性成分と適合性である賦形剤と、本明細書に記載される治療法において用いるのに適した量で混合することができる。
【０１６８】
生理的に認容される担体は、当技術分野において周知である。例示的な液体担体は、活性成分および水に加えて材料を含有しない、または生理的pH値のリン酸ナトリウムなどの緩衝液、生理食塩水、もしくはリン酸緩衝生理食塩水などのその両方を含有する滅菌水溶液である。なおさらに、水性担体は、複数の緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含有し得る。液体組成物はまた、水に加えておよび水を除外して液相を含有し得る。そのような付加的な液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および水-油乳剤である。特定の障害または状態の処置において有効である、本明細書に記載される細胞組成物において用いられる活性化合物の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技法によって決定することができる。
【０１６９】
投与および有効性
それを必要とする対象に心筋細胞および／または心外膜細胞を投与する段階を含む、心臓疾患、心臓障害、または心臓損傷を処置するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様においては、予測される心臓障害、例えば心筋損傷後の心不全を予防するための方法および組成物が、本明細書において提供される。
【０１７０】
測定されるまたは測定可能なパラメータには、疾患の臨床的に検出可能なマーカー、例えば、臨床または生物学的マーカーのレベルの上昇または低下、ならびに疾患または障害の症状またはマーカーの臨床的に許容されるスケールに関連したパラメータが含まれる。しかしながら、本明細書において開示される組成物および製剤の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されることが理解されるであろう。必要とされる正確な量は、処置される疾患の種類などの要因に応じて変化する。
【０１７１】
本明細書で用いられる「有効量」という用語は、心臓損傷または心臓疾患もしくは障害を含むがこれらに限定されない疾患または障害の少なくとも1つまたは複数の症状を軽減するために必要な、心筋細胞および／または心外膜細胞の集団の量を指す。「有効量」は、所望の効果を提供するため、例えば、心筋梗塞の後の梗塞域を有する対象を処置するため、心筋細胞の生着を改善するため、心臓損傷後の心不全の発症を予防するため、移植片の脈管化を増強するため等の、組成物の十分量に関連する。「治療有効量」という用語はしたがって、心臓疾患もしくは障害を有するか、またはそれらのリスクがある対象などの典型的な対象に投与された場合に、特定の効果を促進するのに十分である、ヒト心筋細胞および／もしくは心外膜細胞または組成物のそのような細胞の量を指す。本明細書において用いられる有効量にはまた、疾患の症状の発生を防ぐもしくは遅延させる、疾患症状の経過を変化させる（例えば、疾患の症状の進行を遅らせる、がこれに限定されない）、または疾患の症状を逆転させるのに十分な量が含まれる。いかなる所与の場合に関しても、適切な「有効量」は、日常的な実験を用いて当業者によって決定され得ることが理解される。
【０１７２】
いくつかの態様において、対象は、本明細書に記載される方法による細胞の投与の前に、心筋に影響を及ぼす疾患または障害を有すると最初に診断される。いくつかの態様において、対象は、細胞の投与の前に、心臓疾患（例えば、心筋損傷後の心不全）または心臓障害を発症するリスクがあると最初に診断される。
【０１７３】
本明細書に記載される様々な局面において用いるために、ヒト心筋細胞および／または心外膜細胞の有効量は、少なくとも1×103個、少なくとも1×104個、少なくとも1×105個、少なくとも5×105個、少なくとも1×106個、少なくとも2×106個、少なくとも3×106個、少なくとも4×106個、少なくとも5×106個、少なくとも6×106個、少なくとも7×106個、少なくとも8×106個、少なくとも9×106個、少なくとも1×107個、少なくとも1.1×107個、少なくとも1.2×107個、少なくとも1.3×107個、少なくとも1.4×107個、少なくとも1.5×107個、少なくとも1.6×107個、少なくとも1.7×107個、少なくとも1.8×107個、少なくとも1.9×107個、少なくとも2×107個、少なくとも3×107個、少なくとも4×107個、少なくとも5×107個、少なくとも6×107個、少なくとも7×107個、少なくとも8×107個、少なくとも9×107個、少なくとも1×108個、少なくとも2×108個、少なくとも5×108個、少なくとも7×108個、少なくとも1×109個、少なくとも2×109個、少なくとも3×109個、少なくとも4×109個、少なくとも5×109個、またはそれ以上の心筋細胞および／または心外膜細胞を含む。
【０１７４】
1つの態様において、心筋細胞と心外膜細胞の比率 (CM:EPI) は2:1である。他の態様において、心筋細胞と心外膜細胞の比率は、1:1、1.5:1、2.25:1、2.5:1、2.75:1、3:1、3.5:1、4:1、5:1、7.5:1、10:1、15:1、20:1、1:1.5、1:2、1:2.25、1:2.5、1: 2.75、1:3、1:3.5、1:4、1:5、1:7.5、1:10、1:15、1:20、または任意の治療的に有効な比率である。当業者は、（例えば、所与の損傷サイズのための）心筋細胞と心外膜細胞の所望の比率（例えば、最適比率）が、生着サイズ、機能的生着、LVESDまたはLVEDDの好ましい変化等などのパラメータを評価することにより、動物試験またはヒト臨床治験を通して決定され得ることを認識するであろう。
【０１７５】
いくつかの態様において、心筋細胞と心外膜細胞とを含む組成物は、そのような心筋細胞が単独で投与された場合の生着よりも少なくとも20%高い効率で、心臓における細胞の生着を可能にし；他の態様において、そのような効率は、心筋細胞が単独で投与された場合の生着の効率よりも少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、またはそれ以上高い。
【０１７６】
いくつかの態様において、組み合わせて投与された（例えば、同時投与された）場合の心筋細胞および心外膜細胞の治療有効量は、心外膜細胞を欠いて実質的に同じ数の心筋細胞が投与された場合よりも、少なくとも10%（例えば、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、またはそれ以上）の心筋細胞移植片のサイズの増加を参照する。1つの態様において、心筋細胞および／または心外膜細胞はヒト細胞である。
【０１７７】
いくつかの態様において、心筋細胞および心外膜細胞の治療有効量は、心筋細胞が心外膜細胞の非存在下で投与された場合に見いだされる微小血管密度またはその（例えば、脈管化の）マーカーと比較して、少なくとも20%、（例えば、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも100倍、またはそれ以上）の微小血管密度またはそのマーカーの増大を参照する。微小血管密度の例示的なマーカーには、CD31、VEカドヘリン、フォン・ヴィレブランド因子 (vWF) を含むがこれらに限定されない1つもしくは複数のマーカーの発現増大、または血管内皮と優先的に結合するレクチン（例えば、SNA-I、MAA、AIA、VAA I〜III、WGA、および／もしくはLEA）による染色が含まれる。
【０１７８】
心筋細胞および／または心外膜細胞は、1例もしくは複数例のドナーに由来してよく、または自己供給源から得られ得る。本明細書に記載される局面のいくつかの態様において、心筋細胞および／または心外膜細胞は、それを必要とする対象に投与する前に培養で増大される。
【０１７９】
本明細書に記載される方法において用いるための例示的な投与様式には、注射、心臓内送達、全身投与、および植え込み（足場材料を伴うまたは伴わない）が含まれるが、これらに限定されない。「注射」には、非限定的に、心臓内、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、腹腔内、および皮下が含まれる。
【０１８０】
いくつかの態様において、心筋細胞および／または心外膜細胞の治療有効量は、開心術中の投与または無傷胸部を通した心臓内注射を含むがこれらに限定されない心臓への直接注射を用いて投与される。これらの方法のいくつかの局面において、心筋細胞および／または心外膜細胞の治療有効量は、腹腔内または静脈内経路などの全身経路を用いて投与される。これらの方法の他の局面において、心筋細胞および／または心外膜細胞の治療有効量は、全身または腹腔内投与を用いて投与される。これらの方法は、心臓疾患もしくは障害を有するか、またはそれらを有するリスクがあるヒト対象の治療的および予防的処置を特に目的としている。本明細書に記載されるヒト心筋細胞および／または心外膜細胞は、対象において有効な処置をもたらす任意の適切な経路によって、任意の心臓疾患または障害を有する対象に投与することができる。本明細書に記載される局面のいくつかの態様においては、細胞を投与する前に、心臓障害を有する対象が最初に選択される。
【０１８１】
いくつかの態様において、心筋細胞および／または心外膜細胞の有効量は、心臓内投与または送達によって対象に投与される。本明細書において定義される場合、「心臓内」投与または送達は、心筋細胞および／または心外膜細胞の集団が、直接心臓注射、心筋内注射、梗塞域内注射、手術中（例えば、心臓バイパス手術、心臓ミニポンプまたはペースメーカーの植え込み中、等）の注射を含むがこれらに限定されない、これらの細胞と対象の心筋との直接接触をもたらす方法で投与される、すべての投与経路を指す。いくつかのそのような態様において、細胞は心筋（例えば、心筋細胞）内に、または心房および／もしくは心室の腔内に注射される。いくつかの態様において、細胞の心臓内送達には、細胞が、例えば細胞懸濁液として、心臓の所望の領域への単回注射または頻回「ミニ」注射を介して、手術を受けている対象に投与される投与方法が含まれる。
【０１８２】
いくつかの態様において、心筋細胞および／または心外膜細胞の有効量は、静脈内投与などの全身投与によって対象に投与される。
【０１８３】
「全身投与」、「全身に投与される」、「末梢投与」、および「末梢に投与される」という語句は、心筋細胞および／または心外膜細胞の集団が、心臓などの標的部位、組織、または器官に直接投与されるのではなく、その代わりに対象の循環系に入るような投与を指すために、本明細書において用いられる。
【０１８４】
製剤の選択は、用いられる特定の組成物ならびに投与されるべき心筋細胞および／または心外膜細胞の数に依存し；そのような製剤は、当業者によって調整され得る。しかしながら、一例として、組成物が薬学的に許容される担体中の心筋細胞および／または心外膜細胞である場合、組成物は、溶液1 mL当たりに有効濃度の細胞の、適切な緩衝液（例えば、生理食塩水緩衝液）中の細胞の懸濁液であってよい。製剤はまた、細胞の生存率を維持するための細胞栄養素、単純な糖（例えば、浸透圧を調節するため）、または他の構成成分を含み得る。あるいは、製剤は生分解性足場などの足場を含み得る。
【０１８５】
いくつかの態様においては、対象の処置に役立つ付加的な剤を、記載される心筋細胞および／または心外膜細胞による処置の前または後に投与することができる。そのような付加的な剤を用いて、前駆細胞を投与するための標的組織を調製することができる。あるいは、付加的な剤を心筋細胞および／または心外膜細胞の後に投与して、投与された細胞の心臓中または他の所望の投与部位中への生着および成長を支持することができる。いくつかの態様において、付加的な剤はVEGFまたはPDGFなどの増殖因子を含む。他の例示的な剤を用いて、心筋細胞が生着している間の心臓への負担を軽減することができる（β遮断薬、血圧を下げるための薬物等）。
【０１８６】
処置の有効性は、熟練の臨床医によって判定され得る。しかしながら、疾患、例えば、心臓疾患、心不全、心臓損傷、および／または心臓障害の症状、または他の臨床的に許容される症状もしくはマーカーのいずれか1つまたはすべてが、本明細書に記載されるヒト心筋細胞および／または心外膜細胞を含む組成物による処置後に例えば少なくとも10％減少するのであれば、処置は、本用語が本明細書で用いられる場合の「有効な処置」と見なされる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書に記載される。
【０１８７】
心臓疾患もしくは心臓障害または心臓損傷の指標には、機能的指標またはパラメータ、例えば、一回拍出量、心拍数、左室駆出率、心拍数、心拍リズム、血圧、心臓容積、逆流等、および生化学的指標、例えば、数ある中でも血清乳酸脱水素酵素または血清トロポニンなどの心臓損傷のマーカーの減少などが含まれる。一例として、心筋虚血および再灌流は心臓機能の低下に関連している。虚血性心臓イベントを患ったことがある対象および／または再灌流療法を受けたことがある対象は、虚血および／または再灌流の前と比較して心臓機能が低下している。心臓機能の尺度には、例えば駆出率および短縮率が含まれる。駆出率は、心拍ごとに心室から送り出される血液の割合である。駆出率という用語は、右心室および左心室の両方に適用される。LVEFは左室駆出率 (LVEF) を指す。短縮率は、拡張末期径と収縮末期径との差を拡張末期径で除したものを指す。
【０１８８】
心臓機能パラメータを評価するために使用され得る臨床検査の非限定的な例には、心エコー検査（ドップラー血流イメージングを伴うかもしくは伴わない）、心電図 (EKG)、運動負荷検査、ホルターモニタリング、またはβ-ナトリウム利尿ペプチドの測定が含まれる。
【０１８９】
必要であればまたは望ましければ、心臓損傷または心臓疾患の動物モデルを用いて、本明細書に記載される特定の組成物の有効性を計測することができる。例えば、単離された実用的ウサギもしくはラット心臓モデル、またはイヌもしくはブタのいずれかにおける冠動脈結紮モデルを用いることができる。心臓機能の動物モデルは、梗塞域、冠動脈灌流、電気伝導、左室拡張末期圧、左室駆出率、心拍数、血圧、肥大の程度、拡張期弛緩機能、心拍出量、心拍変動、および心室壁の厚さ等をモニターするのに有用である。
【０１９０】
いくつかの態様において、本明細書に記載される心筋細胞および／または心外膜細胞を含む組成物は、再灌流の開始後、例えば心筋梗塞の後、少なくとも6時間で送達される。虚血発作およびその後の再灌流の間、心臓の微小環境または梗塞域の微小環境は、心臓に投与された心筋細胞および／または心外膜細胞の生着を可能にするにはあまりにも「適さない」と考えられる。したがって、いくつかの態様においては、そのような組成物を、再灌流の開始後、少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも18時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、少なくとも48時間、少なくとも60時間、少なくとも72時間、少なくとも84時間、少なくとも96時間、少なくとも5日、少なくとも6日、少なくとも7日、少なくとも8日、少なくとも9日、少なくとも10日、またはそれ以上で投与することが好ましい。いくつかの態様においては、本明細書に記載される心筋細胞および／または心外膜細胞を含む組成物を、心筋梗塞の後の任意の期間（例えば、少なくとも1カ月、少なくとも6カ月、少なくとも1年、少なくとも2年、少なくとも5年、少なくとも10年、少なくとも20年、少なくとも30年、またはそれ以上）後に、心臓の梗塞域、梗塞域周囲、虚血域、ペナンブラ、または境界域に投与することができるが、当業者によって認識されるように、梗塞後の長期の時間間隔後の生着の成功は、瘢痕組織沈着の量、瘢痕組織の密度、梗塞域のサイズ、梗塞域の周囲の脈管化の程度等を含むがこれらに限定されない多くの要因に依存する。したがって、心筋細胞および／または心外膜細胞を含む組成物の投与によるより早い介入は、例えば梗塞後の1カ月またはそれ以上後の投与よりも効果的であり得る。
【０１９１】
本明細書に記載される心筋細胞および／または心外膜細胞を含む組成物は、梗塞域、梗塞域周囲、虚血域、ペナンブラ、境界域、壁菲薄化の領域、緻密化障害の領域、または不適応性心臓リモデリングのリスクがある領域を含むがこれらに限定されない、心臓の任意の所望の領域に投与することができる。
【０１９２】
スクリーニングアッセイ
本明細書に記載される心筋細胞と心外膜細胞とを含む組成物は、生物活性剤の毒性、またはその代わりに心筋細胞の生存率、心筋細胞の成熟、心筋細胞の電気伝導度等に及ぼす生物活性剤の有効性を判定するためのスクリーニングアッセイにおいて用いることができる。例えば心筋細胞と心外膜細胞の共培養を用いることで、単に心筋細胞を単独で培養するよりも、無傷の心臓の組織をより厳密に模倣する。特に、成体心筋細胞は、再生せず、それ故インビトロで増大することができないため、培養するのは難しい。したがって、インビトロにおけるヒト幹細胞の心臓前駆細胞への分化、および心筋細胞と心外膜細胞の共培養を用いるそれらのその後の成熟は、疾患を処置するための生物活性剤をスクリーニングするため、または種々の剤の細胞毒性をモニターするための心外膜細胞および心筋細胞を生成する上で特に有用である。
【０１９３】
いくつかの態様において、心筋細胞と心外膜細胞の共培養物は、3次元細胞培養物を構成するか、または本明細書の実施例に記載されるように組織構築物に成型される。
【０１９４】
いくつかの態様においては、共培養されたヒト心筋細胞および心外膜細胞を、特定のインビトロアッセイを開発するための方法、アッセイ、システム、およびキットにおいて用いることができる。薬物スクリーニングおよび毒性試験に関するそのようなアッセイは、それらがヒト起源であり、細胞株の不死化を必要とせず、正常なヒト細胞の生理学をあまり反映しない死体からの組織を必要としないため、既存のアッセイに勝る利点を有する。例えば、本明細書に記載される方法、アッセイ、システム、およびキットを用いて、心筋細胞の成熟（例えば、筋節長を測定することによって評価される）、細胞生存率、心筋細胞の電気伝導度（例えば、一致したまたはほぼ一致した形態学的拍動；コネキシン43の発現；電極で刺激された場合の活動電位の伝播）等を促進し得る剤を同定および／または試験することができる。加えて、またはその代わりに、該方法、アッセイ、システム、およびキットを用いて、心臓疾患もしくは障害を処置する上で有用な、または心臓損傷（例えば、心肥大、心不全等）を予防／処置するのに有用な剤を同定および／または試験することができる。
【０１９５】
したがって、(a) ヒト心筋細胞と心外膜細胞の共培養物を、試験化合物と接触させる段階、および (b) 細胞または所望の細胞パラメータに及ぼす化合物の任意の効果を判定する段階を含む、生物学的活性に関して試験化合物をスクリーニングするための方法が、本明細書において提供される。細胞に及ぼす効果は、レポーター分子を用いて直接または間接的に観察可能な効果であってよい。
【０１９６】
本明細書で用いられる場合、「生物学的活性」または「生物活性」という用語は、試験化合物が生体試料に影響を及ぼす能力を指す。生物学的活性には、非限定的に、生物学的アッセイにおける刺激、阻害、調節、毒性、または致死反応の誘発が含まれ得る。例えば、生物学的活性は、化合物が酵素の効果を調節する能力、受容体を遮断する能力、受容体を刺激する能力、1つもしくは複数の遺伝子の発現レベルを調節する能力、細胞増殖を調節する能力、細胞分裂を調節する能力、細胞代謝を調節する能力、細胞形態を調節する能力、またはそれらの組み合わせを指し得る。場合によっては、生物学的活性は、試験化合物が生体試料において毒性効果を生じる能力を指し得る。
【０１９７】
先に考察したように、インビトロで得られた心筋細胞および／または心外膜細胞の特定の系列は、疾患（例えば、心臓疾患）の表現型および／または遺伝子型である系列であってよい。
【０１９８】
本明細書で用いられる場合、「試験化合物」または「候補作用物質」という用語は、細胞に効果を及ぼすそれらの能力に関してスクリーニングされる予定の作用物質または作用物質の収集物（例えば、化合物）を指す。試験化合物には、化学的化合物、化学的化合物の混合物、例えば、多糖類、有機または無機低分子（例えば、2000ダルトン未満、1000ダルトン未満、1500ダルトン未満、1000ダルトン未満、または500ダルトン未満の分子量を有する分子）、生体高分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ペプチド類似体、ならびにそれらの類似体および誘導体、ペプチド模倣体、核酸、核酸類似体および誘導体、細菌、植物、真菌、または動物細胞もしくは組織などの生物学的材料から作製された抽出物、天然または合成組成物を含む、多種多様な異なる化合物が含まれ得る。
【０１９９】
実施される特定の態様に応じて、試験化合物を、溶液中に遊離した状態で提供することができ、または担体もしくは固体支持体、例えばビーズに付着させることができる。試験化合物を固定化するために、多くの適切な固体支持体を用いることができる。適切な固体支持体の例には、アガロース、セルロース、デキストラン（すなわち、セファデックス、セファロースとして市販されている）、カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール (PEG)、濾紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、ポリアミンメチルビニルエーテルマレイン酸コポリマー、ガラスビーズ、アミノ酸コポリマー、エチレン-マレイン酸コポリマー、ナイロン、シルク等が含まれる。加えて、本明細書に記載される方法に関して、試験化合物は個々にまたはグループでスクリーニングすることができる。グループスクリーニングは、有効な試験化合物のヒット率が、所与のグループに関して複数の陽性結果を期待できないほど低いと予測される場合に、特に有用である。
【０２００】
多くの低分子ライブラリーが当技術分野において公知であり、市販されている。これらの低分子ライブラリーを、本明細書に記載されるスクリーニング法を用いてスクリーニングすることができる。化学物質ライブラリーまたは化合物ライブラリーは、特定の効果に関して候補作用物質をスクリーニングするために、本明細書に記載される方法と共に用いることができる、保管化学物質の収集物である。化学物質ライブラリーはまた、各化合物の化学構造、純度、量、および生理化学的特徴に関する情報を含む。化合物ライブラリーは、数ある中でも、例えば、Enzo Life Sciences、Aurora Fine Chemicals、Exclusive Chemistry Ltd.、ChemDiv、ChemBridge、TimTec Inc.、AsisChem、およびPrinceton Biomolecular Researchから商業的に入手することができる。
【０２０１】
非限定的に、前記化合物は、適切な期間にわたって、対照と比較して細胞に対して効果を発揮し得る任意の濃度で試験することができる。いくつかの態様において、化合物は、約0.01nM〜約100mM、約0.1nM〜約500μM、約0.1μM〜約20μM、約0.1μM〜約10μM、または約0.1μM〜約5μMの範囲の濃度で試験される。
【０２０２】
化合物スクリーニングアッセイを、ハイスループットスクリーニングにおいて使用することができる。ハイスループットスクリーニングは、化合物のライブラリーを所与の活性に関して試験する過程である。ハイスループットスクリーニングは、多数の化合物を迅速にかつ並行してスクリーニングすることを追求する。例えば、マイクロタイタープレートおよび自動アッセイ機器を用いて、1つの研究所が、1日に100,000件もの多くのアッセイを並行して行うことができる。
【０２０３】
本明細書に記載される化合物スクリーニングアッセイは、細胞またはレポーター機能の複数の測定（例えば、複数のパラメータの測定、および／またはアッセイの過程の複数の時点における1つもしくは複数のパラメータの測定）を伴い得る。複数回測定することで、試験化合物とのインキュベーション期間にわたって生物学的活性を追跡することが可能になり得る。1つの態様において、レポーター機能は、異なるインキュベーション時間における試験化合物の効果をモニターできるように、複数の時点で測定される。
【０２０４】
スクリーニングアッセイの後に、同定された試験化合物が、意図される使用にとって望ましい特性を有するかどうかかをさらに同定するためのアッセイを引き続き行うことができる。例えば、スクリーニングアッセイの後に、生物学的利用能、毒性、または薬物動態のいずれかの測定からなる群より選択される第2のアッセイを行うことができるが、これらの方法に限定されるわけではない。
【０２０５】
キット
本明細書に記載される技術の別の局面は、心臓疾患もしくは障害を処置するためのキット、候補作用物質をスクリーニングするためのキット、および／または心筋細胞と心外膜細胞を共培養するためのキットに関する。本明細書に記載されるキットの1つまたは複数に含まれ得るキットの構成成分が、本明細書に記載される。
【０２０６】
本明細書において開示される技術の別の局面は、本明細書において開示される方法に従って心筋細胞または心外膜細胞を生成するためのキットに関する。
【０２０７】
いくつかの態様において、本明細書に記載される構成成分は、単独で提供され得るか、またはキットとして任意の組み合わせで提供され得る。キットは、本明細書に記載される構成成分、例えば、本明細書に記載される化合物、例えばヒト幹細胞を心筋細胞または心外膜細胞に分化させるための化合物または化合物もしくは試薬のカクテルを含む組成物を含む。そのようなキットは任意に、心臓前駆細胞マーカーもしくは心臓細胞マーカーまたはそれらのセットの検出を可能にする1つまたは複数の作用物質を含み得る。加えて、キットは任意に情報資料を含む。
【０２０８】
いくつかの態様において、キット中の化合物は、いくつかの態様においてキットの他の構成成分を実質的に含まない防水または気密容器中に提供され得る。例えば、シグナル伝達経路または分化経路調節化合物は、複数の容器中に供給され得、例えばそれは、例えば1回、2回、3回、またはそれ以上といった所定数の分化反応に十分な試薬を有する容器中に供給され得る。本明細書に記載される1つまたは複数の化合物は、任意の形態、例えば、液体、乾燥、または凍結乾燥形態で提供され得る。本明細書に記載される化合物は、実質的に純粋および／または無菌であることが好ましい。本明細書に記載される1つまたは複数のシグナル伝達経路調節化合物が液体溶液中に提供される場合、液体溶液は好ましくは水溶液であり、滅菌水溶液が好ましい。本明細書に記載される化合物が乾燥形態で提供される場合、再構成は一般的に、適切な溶媒の添加による。溶媒、例えば滅菌水または緩衝液は、任意にキット中に提供され得る。
【０２０９】
前記情報資料は、本明細書に記載される方法、および／または本明細書に記載される方法のための本明細書に記載される化合物の使用に関する、説明、指示、販売、または他の資料であってよい。キットの情報資料は、その形態に限定されない。1つの態様において、情報資料は、化合物の生成、化合物の分子量、濃度、有効期限、バッチ、または生成場所の情報、およびその他に関する情報を含み得る。1つの態様において、情報資料は、化合物を使用または投与するための方法に関する。
【０２１０】
1つの態様において、情報資料は、心臓損傷または心臓疾患もしくは障害の処置をもたらすのに適した様式で、例えば、適切な用量、剤形、または投与様式（例えば、本明細書に記載される用量、剤形、または投与様式）で、本明細書に記載されるヒト心筋細胞および／または心外膜細胞を投するための説明書を含み得る。別の態様において、情報資料は、ヒト幹細胞をヒト心筋細胞または心外膜細胞に分化させるための説明書を含み得る。あるいは、情報資料は、心臓疾患または障害を処置するための候補作用物質をスクリーニングするための説明書を含み得る。
【０２１１】
本明細書に記載される化合物に加えて、キットの組成物は、溶媒もしくは緩衝液、安定剤、保存剤、および／または、例えば幹細胞を分化させるため（例えば、インビトロで）もしくは本明細書に記載される状態もしくは障害を処置するための付加的な作用物質などの他の成分を含み得る。あるいは、他の成分をキット中に含めることができるが、本明細書に記載される細胞またはシグナル伝達経路もしくは分化経路調節化合物とは異なる組成物中または容器中に含めることができる。そのような態様において、キットは、本明細書に記載される化合物と他の成分を混合するため、または本明細書に記載される化合物を他の成分と共に用いるための説明書、例えば使用または投与の前に2つの作用物質を組み合わせることに関する説明書を含み得る。
【０２１２】
前記キットは、ヒト心臓前駆細胞、ES細胞、iPS細胞、心筋細胞、心外膜細胞、造血細胞、血管内皮細胞等のマーカーを検出するための構成成分を含み得る。加えて、キットは、細胞マーカーと結合する1つもしくは複数の抗体、またはRT-PCRもしくはPCR反応、例えば半定量的もしくは定量的なRT-PCRもしくはPCR反応のためのプライマーを含み得る。そのような構成成分は、心臓細胞特異的マーカーの活性化、またはES細胞、iPSC、もしくは成体幹細胞マーカーの喪失を評価するために用いることができる。検出試薬が抗体である場合、それは乾燥調製物中に、例えば凍結乾燥されて供給され得るか、または溶液中に供給され得る。抗体または他の検出試薬は、標識、例えば、検出に用いるための放射性標識、蛍光標識（例えば、GFP）、または比色標識に連結させることができる。検出試薬がプライマーである場合、それは乾燥調製物中に、例えば凍結乾燥されて供給され得るか、または溶液中に供給され得る。
【０２１３】
前記キットはまた、HDAC阻害剤（例えば、バルプロ酸）またはDNAメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、5azaC）などの、人工多能性幹細胞の生成の効率を向上させるための1つまたは複数の試薬を含み得る。
【０２１４】
1つの態様において、キットは、心臓中胚葉作製のための細胞または組織培地を含む。1つの態様において、培地はアクチビンAおよびBMP4を含む。
【０２１５】
前記キットは典型的に、その様々な要素が、1つのパッケージ、例えばファイバーベースの、例えばボール紙またはポリマーの、例えば発泡スチロール箱に含まれて提供される。包材は内部と外部の温度差を維持するように構成され得、例えばそれは、予め選択された温度で予め選択された期間にわたって試薬を維持するための遮蔽特性を提供し得る。
【０２１６】
本発明は、以下の番号付き項目のいずれかにおいて記載される通りであり得る。
1. ヒト心筋細胞とインビトロで分化したヒト心外膜細胞またはそのようなヒト心外膜細胞の分化した子孫とを含む、移植用組成物。
2. 前記ヒト心筋細胞がインビトロで分化した細胞である、項目1に記載の移植用組成物。
3. 前記心外膜細胞もしくはそれらの子孫、前記心筋細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞から分化した細胞である、項目1または項目2に記載の移植用組成物。
4. 前記心外膜細胞もしくはそれらの子孫、前記心筋細胞、またはその両方が、移植レシピエントにとって自己であるiPS細胞から分化した細胞である、項目1〜3のいずれかに記載の移植用組成物。
5. 前記心外膜細胞がフィブロネクチンを発現する、項目1〜4のいずれかに記載の移植用組成物。
6. ZVAD-FMK、Bcl-XL、シクロスポリンA、ピナシジル、およびIFG-1のうちの1つまたは複数をさらに含む、項目1〜5のいずれかに記載の移植用組成物。
7. 前記心筋細胞が、前記心外膜細胞またはその子孫に対して約2:1の比率で存在する、項目1〜6のいずれかに記載の移植用組成物。
8. 前記心外膜細胞およびそれらの子孫を欠いている同様の組成物よりも少なくとも20%効率的に生着する、項目1〜7のいずれかに記載の移植用組成物。
9. 項目1〜8のいずれかに記載の移植用組成物を含む、心臓送達装置。
10. ZVAD-FMK、Bcl-XL、シクロスポリンA、ピナシジル、およびIFG-1のうちの1つまたは複数を含む培養用培地中またはカクテル中の、インビトロで分化したヒト心外膜細胞または分化したその子孫と物理的に結合したヒト心筋細胞を含む組織粒子。
11. 2〜2500個の細胞を含む、項目10に記載の組織粒子。
12. 心筋細胞と心外膜細胞または分化したその子孫の比率が約2:1である、項目10に記載の組織粒子。
13. 前記心外膜細胞、前記心筋細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞から分化した細胞である、項目10〜12のいずれかに記載の組織粒子。
14. 前記心筋細胞がインビトロで分化した細胞である、項目10〜13のいずれかに記載の組織粒子。
15. 前記心筋細胞、前記心外膜細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞からインビトロで分化した細胞である、項目10〜14のいずれかに記載の組織粒子。
16. それを必要とする対象の心臓組織に、心筋細胞と混合された心外膜細胞を含む組成物を投与する段階を含む、心臓組織中への心筋細胞の生着を促進する方法。
17. 前記対象が心筋梗塞症を患ったことがある、項目16に記載の方法。
18. 心筋細胞と混合された心外膜細胞を含む前記組成物が、項目1〜8のいずれかに記載の移植用組成物であるか、または項目10〜15のいずれかに記載の組織粒子を含む、項目16に記載の方法。
19. それを必要とする対象の心臓組織に、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与する段階を含む、移植されたヒト心筋細胞の成熟表現型を促進する方法。
20. 前記対象が心筋梗塞症を患ったことがある、項目19に記載の方法。
21. ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む前記組成物が、項目1〜8のいずれかに記載の移植用組成物であるか、または項目10〜15のいずれかに記載の組織粒子を含む、項目19に記載の方法。
22. 心筋細胞が心外膜細胞と混合されて移植された場合に、心筋細胞成熟度が、心筋細胞移植のみと比較して、筋節長の増加、心筋細胞の直径または長さの増加、トロポニンの心臓アイソフォームのcTnTの発現、およびコネキシン43発現のうちの1つまたは複数によって示される、項目19〜21のいずれかに記載の方法。
23. それを必要とする対象の心臓組織に、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与する段階を含む、心臓の心筋細胞移植体の部位における微小血管密度を増加させる方法。
24. 前記対象が心筋梗塞症を患ったことがある、項目23に記載の方法。
25. ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む前記組成物が、項目1〜8のいずれかに記載の移植用組成物であるか、または項目10〜15のいずれかに記載の組織粒子を含む、項目23または24に記載の方法。
26. 微小血管密度またはそのマーカーが、心外膜細胞を欠いている心筋細胞移植体が投与された場合に見いだされるものと比較して少なくとも10%増加する、項目23〜25のいずれかに記載の方法。
27. 微小血管密度が、CD31、VEカドヘリン、フォン・ヴィレブランド因子 (vWF) のうちの1つもしくは複数の発現によって、または血管内皮と優先的に結合するレクチンによる染色によって示される、項目23〜26のいずれかに記載の方法。
28. それを必要とする対象の心臓組織に、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与する段階を含む、心臓組織における心筋細胞移植片サイズを増加させる方法。
29. 前記対象が心筋梗塞症を患ったことがある、項目28に記載の方法。
30. ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む前記組成物が、項目1〜8のいずれかに記載の移植用組成物であるか、または項目10〜15のいずれかに記載の組織粒子を含む、項目28または29に記載の方法。
31. 心筋細胞移植片サイズが、ヒト心外膜細胞と混合されたヒト心筋細胞を含む組成物を投与することにより、実質的に同じ数のヒト心筋細胞を含むがヒト心外膜細胞を欠いている組成物の投与と比較して少なくとも10%増加する、項目28〜30のいずれかに記載の方法。
32. インビトロで分化した心筋細胞を心外膜細胞、分化したその子孫、または心外膜細胞馴化培地の存在下で培養する段階を含む、インビトロで分化した心筋細胞の成熟度を促進する方法。
33. 前記心筋細胞および前記心外膜細胞がヒトの細胞である、項目32に記載の方法。
34. 前記心外膜細胞がインビトロで分化した細胞である、項目32または33に記載の方法。
35. 前記心外膜細胞、前記心筋細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞からインビトロで分化した細胞である、項目32〜34のいずれかに記載の方法。
36. 前記心筋細胞成熟度が、人工組織 (engineered tissue)におけるまたは移植片における筋節長の増加、心筋細胞の直径または長さの増加、トロポニンの心臓アイソフォームのcTnTの発現、およびコネキシン43発現のうちの1つまたは複数によって示される、項目32〜35のいずれかに記載の方法。
37. 心外膜細胞と混合された心筋細胞を含む移植用組成物を投与する段階を含む、移植された心筋細胞とレシピエント心筋細胞との間の電気的接続を促進する方法。
38. 前記心筋細胞および前記心外膜細胞がヒトの細胞である、項目37に記載の方法。
39. 前記心筋細胞、前記心外膜細胞、またはその両方がインビトロで分化した細胞である、項目37または38に記載の方法。
40. 前記心外膜細胞、前記心筋細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞からインビトロで分化した細胞である、項目37〜39のいずれかに記載の方法。
41. コネキシン43の発現が、心外膜細胞なしで投与され移植された心筋細胞におけるコネキシン43発現と比較して、心外膜細胞と混合されて投与され移植された心筋細胞において増大する、項目37〜40のいずれかに記載の方法。
42. 心外膜細胞または分化したその子孫と混合された心筋細胞を含む移植用組成物を投与する段階を含む、移植された心筋細胞の増殖を増大させる方法。
43. 前記心筋細胞、前記心外膜細胞、またはその両方がインビトロで分化した細胞である、項目42に記載の方法。
44. 前記心筋細胞、前記心外膜細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞からインビトロで分化した細胞である、項目42または43に記載の方法。
45. 前記移植用組成物が、項目1〜8のいずれかに記載の組成物を含むか、または項目10〜15のいずれかに記載の組織粒子を含む、項目42〜44のいずれかに記載の方法。
46. それを必要とする対象の心臓組織に、項目1〜8のいずれかに記載の組成物、または項目10〜15のいずれかに記載の組織粒子を投与する段階を含む、心筋梗塞症を処置する方法。
47. 移植された心筋細胞の生着、増殖、成熟度、または機能のうちの1つまたは複数が、実質的に同じ数の心筋細胞を含むが心外膜細胞を欠いている組成物の投与と比較して改善される、項目46に記載の方法。
48. インビトロで分化したヒト心筋細胞の調製物を提供する段階；インビトロで分化したヒト心外膜細胞の調製物を提供する段階；ならびにZVAD-FMK、Bcl-XL、シクロスポリンA、ピナシジル、およびIFG-1のうちの1つまたは複数を含む組成物中で該心筋細胞を該心外膜細胞と混合する段階を含む、心筋細胞移植用組成物を作製する方法。
49. 前記心筋細胞、前記心外膜細胞、またはその両方が、胚性幹細胞からまたは人工多能性幹細胞から分化した細胞である、項目48に記載の方法。
50. 前記心筋細胞と前記心外膜細胞が約2:1の比率で混合物中に存在する、項目48または49に記載の方法。
51. 移植の前に前記心外膜細胞および前記心筋細胞に熱ショックを与える段階をさらに含む、項目48〜50のいずれかに記載の方法。
52. 貯蔵用に凍結される前に前記心筋細胞に熱ショックを与え、かつ、該心筋細胞を解凍して、前記方法において用いられる心筋細胞の前記調製物を提供する、項目48〜51のいずれかに記載の方法。
53. 心筋細胞移植用組成物を作製するために前記心外膜細胞を使用しようとする前日に、該心外膜細胞に熱ショックを与える、項目48〜52のいずれかに記載の方法。
【実施例】
【０２１７】
概要
hESC由来心外膜をインビトロで3D-人工心臓組織 (engineered heart tissue: EHT) において試験して、心筋細胞の成熟に及ぼすその誘導効果を調べ、次いで直接注射した心外膜細胞の再生能を心筋梗塞のラットモデルにおいて評価した。ヒト胚性幹細胞 (hESC) 由来の心筋細胞によって、梗塞心臓を修復する試みは前進した。しかしながら、細胞の未熟性、細胞生存および増殖速度が最適以下であることなどの制限が、治療的心臓修復に対する障害としていまだ残っている。これらの課題の克服を目指して、hESC由来心外膜細胞を本研究において使用する。そのような細胞は、胚心臓発生中のその中心的役割が認められる。
【０２１８】
本研究で示されるように、心外膜細胞は、3D-EHTにおいて心筋細胞の成熟および機能を促進した。インビボにおける心外膜細胞と心筋細胞の同時移植は、単独の心筋細胞もしくは心外膜細胞またはビヒクルのいずれかを受け取った対照と比較して、より大きな心臓移植片サイズ、より優れた宿主組織リモデリング、およびより高い心臓機能をもたらした。心外膜細胞が心臓の移植片サイズおよび機能を促進する能力により、それらの細胞は心筋梗塞の後の心臓再生のための有望な補助療法となり、心臓成熟の長年にわたるジレンマにおけるそれらの使用が促される。
【０２１９】
実施例1：ヒト胚性幹細胞由来心外膜細胞は心筋細胞駆動性の心臓再生を増大させる
収縮障害による心不全の処置の大きな進歩にもかかわらず、治療アプローチは問題の原因の対処には至っておらず；哺乳動物の心臓の損傷は、再生不可能な収縮性心筋組織の不可逆的喪失を引き起こす。西暦2000年の変わり目に、心不全は、新たに発生した流行病として広く認識された (1)。今日までに、米国だけで560万人の患者および世界中では2300万人の患者が心不全に罹患しており、診断されてから5年以内に50%が死亡している (2, 3)。現在の処置は、症状を改善することおよび疾患の自然な進行を遅らせることに限定されており、損傷後の収縮性心筋の喪失を補償することはできない。
【０２２０】
再生医療は、幹細胞由来の心血管細胞および組織を用いて完全な収縮機能を回復させることにより、心不全を効果的に処置する鍵を握っていると考えられる。すべての幹細胞型のうち、ヒト胚性幹細胞 (hESC) は、化学的に定義された条件下で心筋細胞 (4〜6)、内皮細胞 (7, 8)、平滑筋細胞 (9)、およびより最近ではまた心外膜細胞 (10, 11) を確実に生じて、心血管組織を形成する最も大きな可能性を有する。さらに、hESC由来心筋細胞は、梗塞性の齧歯類心臓を再筋肉化するために首尾よく使用され、電気的統合をもたらし、かつ心臓機能を保持した (6, 12)。この技術の臨床適用性は非ヒト霊長類モデルにおいても実証されており、ヒト多能性幹細胞 (hPSC) 由来心筋細胞の移植によって、梗塞心臓の実質的な再構成が生じた (13, 14)。
【０２２１】
哺乳動物心臓を再生する試みはいくらか前進したものの、移植細胞の相対的未熟性、移植片保持、細胞増殖、および移植片サイズが最適以下であることなどの障害が依然として残っている。現在のところ、hPSC由来心筋細胞は、妊娠初期胚において見出される心筋細胞とせいぜい似ている程度であり、移植後の機能的利点を制限し得る (15)。今日まで、hESC由来心筋細胞の成熟度およびインビボにおける移植後のそれらの生存を促進する支持的細胞型に対して、ほとんど注意が向けられていない。
【０２２２】
初期の哺乳動物心臓発生において、心外膜は心血管前駆細胞供給源として中心的役割を果たし、心筋細胞の発生のための栄養支援を提供する。冠動脈平滑筋細胞を生じるため、心外膜は機能的な冠脈管構造の形成に必須である (16, 17)。さらに、心外膜由来細胞は、心臓の増殖、圧縮、および成熟にとって最重要である (1820)。胚心臓発生におけるその栄養的な役割を考慮すると、心外膜細胞は、インビトロでhESCベースの3D-ETHにおいて、およびインビボでそれらをhESC由来心筋細胞と同時移植することにより、心筋細胞の成熟および収縮性を促進し得ると仮定された。
【０２２３】
本明細書において提供されるデータは、hESC由来心外膜が、心筋細胞の成熟、増殖、および収縮を通じて、インビトロにおける3D-ETHおよびインビボにおける心臓移植片の発生を促進したことを示す。hESC由来心外膜細胞は、内因性新生血管発生を増大させ、そのようにして適さない環境においてhESC由来心筋細胞のための好ましい適所を作成した。重要な発生段階を再現することで、心外膜は心筋細胞機能を増大させ、そのため再生医療における有望な補助療法となる。
【０２２４】
hESC由来心外膜細胞は3D-EHTにおいて心筋細胞の成熟を促進する
hESC由来のGFP遺伝子導入心外膜細胞および野生型 (WT) 心筋細胞を、以前に記載された通りに作製した (6, 10)。心外膜細胞および心筋細胞はいずれも、高純度（94〜97%）で作製された。次いで細胞をコラーゲンベースの3D-EHT中に組み込み、それらを受動的ストレス下で14日間発生させた後、組織学的および機能評価に供した（図1A〜1D)。心外膜細胞の機能性は、最初に、化学的に定義された条件下でのインビトロにおけるそれらの心臓線維芽細胞への分化によって実証された。心外膜細胞は、インビトロでのそれらの誘導後に、心外膜マーカーおよび上皮マーカー（すなわち、WT1および汎サイトケラチン）を発現したが、間葉系マーカーを発現しなかった。心臓線維芽細胞分化プロトコールの終了時に、それらは線維芽細胞マーカーおよび間葉系マーカー、DDR2およびビメンチンを発現したが、その上皮特性を失い、上皮間葉転換の成功が示された（図6A〜6C）。3D-EHTにおける心外膜細胞の効力を評価するため、その細胞を、心筋細胞単独、または心筋細胞およびhESC由来間葉系細胞、または心筋細胞および初代間葉系細胞型を含む、組成物と比較した。心外膜細胞および初代間葉系細胞の両方が、組織リモデリングおよび圧縮に最も強い効果を及ぼしたのに対して、高純度の心筋細胞を単独で含む組織は、圧縮の完全な欠如を示した（図1E、1F）。組織中にある場合、hESC由来心外膜細胞は、それらの発生の7日後と14日後の構築物を比較して、ビメンチンの発現増大および汎サイトケラチンの減少によってわかるように（図7A〜7B）、EMTを起こす。心筋細胞成熟度の状態を判定するために、組織切片を筋節タンパク質について染色し、筋節長を定量化した。hESC由来心外膜細胞は、初代MSC、hESC由来MSC、またはCM単独と比較して、心筋細胞の成熟と相関する筋節長に最も強い効果を及ぼした（図1G〜1H）。さらに、hESC由来心外膜細胞を含む構築物は、他の群と比較して、心筋細胞間の電気的接続性のマーカーであるコネキシン43の最も高い染色を構成した（図7C）。まとめると、これらのデータから、hESC由来心外膜細胞が3D-EHTにおいて初期の胚心臓発生の重要な段階を再現し、心筋細胞の成熟を増大させることが示される。
【０２２５】
3D-EHTにおけるhESC由来心外膜の機能的効果
組織学的に観察されたhESC由来心外膜細胞の有益な効果がまた、心収縮性の増大にも変換されるかどうかを次に試験した。EHT構築物を、長さ制御装置および力変換器を備えたミオグラフに移した（図8A）。CMと、hESC-MSCまたは初代MSCまたはhESC-Epiのいずれかとを含む構築物は、フランク・スターリング関係を示した。高純度のCMが単独で、効率的な組織リモデリング、心筋細胞の成熟、または電気的接続性をもたらさないという組織学的知見と一致して、CMを単独で含む3D-EHTにおいて、協調した収縮も測定可能な力発生も認められなかった。hESC由来心外膜細胞を含む構築物は、初代MSCおよびhESC-MSCと比較して、ひずみ増大に伴う活動力発生の最大の増大を構成し、ひずみレジメンの各段階において最も大きな活動力を生じた（図7A）。それと同時に、hESC-Epiを含む3D-EHTは、初代MSCまたはhESC-MSCと比較して最小の受動力を生じ、これは、梗塞における移植後の拡張期により良い弛緩を示し得る、より適合した組織に相当する（図7B）。構築物のCa2+処理を評価した場合、hESC-Epiおよび初代MSCを含む構築物は、最も高い生理学的シグナルを構成した。hESC-MSCを含む構築物が、不規則でかつ幅広いCa2+波を示したのに対して、CMのみを含む構築物では、協調したCa2+波は全く検出不可能であった。むしろ、CMのみの群では、単一の非接続心筋細胞の非協調的な収縮が認められた（図2C〜2D）。心外膜細胞を含む構築物はまた、初代MSCと比較して、Ca2+立ち上がりのより急な勾配およびより短いCa2+立ち上がり工程時間を構成した（図2E；図8B〜8C）。まとめると、これらのデータから、hESC由来心外膜細胞が3D-EHTの機能的成熟を促進することが示され、インビボにおけるその使用が促される。
【０２２６】
（表１）心筋梗塞および細胞生着の後の動物の死亡
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【０２２７】
心筋梗塞における生着および運命
hESC由来心外膜細胞の機能的特性をインビボで評価するため、心外膜細胞が胸腺欠損ラットの梗塞域において移植を切り抜けて生存し、生着するかどうかを最初に調べた。動物は、左前下行領域における60分間の虚血の4日後に、2×106個 (n=4) もしくは4×106個 (n=4) の心外膜細胞、またはビヒクルのみ (n=4) の心筋内注射のいずれかを受けた。移植された心外膜細胞は、移植後7日目に、GFPおよびヒトミトコンドリアに対する抗体を用いて容易に検出された。4×106個の細胞用量が、すべての動物の間で頑強な移植片を生じたのに対して、2×106個の細胞という用量は、実質的により小さな移植片、および検出可能な移植片のない動物1匹をもたらした（図9A〜9C）。第2の研究では、長期生着を評価し、動物は、6×106個の心外膜細胞の注射 (n=6) または対照注射 (n=4) のいずれかを受けた。移植の4週間後に、梗塞域において頑強な移植片がなお検出可能であった（図9D）。移植後7日目の移植された心外膜細胞の上皮マーカーおよび間葉系マーカーの発現を、28日目の発現と比較したところ、7日後にはEMTは進行中であるが不完全であり、28日後には、移植されたすべての細胞がビメンチンを発現し、汎サイトケラチンの検出可能な発現がほぼなく、EMTが最終的に完全であることが見出された（図9E〜9F）。移植された心外膜細胞の運命を評価した場合、移植後28日の細胞は、ビメンチンおよび線維芽細胞表現型を示唆するS100A4について強く陽性であることが見出された。筋線維芽細胞表現型に対応して、ごく少数の発現したSMAが認められたが既存血管の壁への有意な組込みは認められなかった（図10A〜10B）。移植された細胞は、心臓マーカーα-アクチニンおよび内皮マーカーヒトレクチンについて陰性であった（図10C〜10D）。まとめると、これらのデータから、hESC由来心外膜細胞が、移植後28日の梗塞域において頑強な移植片を形成し、線維芽細胞表現型へのEMTを起こすことが示される。
【０２２８】
微小血管密度に及ぼす効果
hESC由来心外膜細胞が、胚心臓形成において見られるものと類似の栄養効果を示すかどうかを評価するため、同時移植研究を実施した。動物は、5×106個のhESC由来心外膜細胞、または10×106個のhESC由来心筋細胞、またはその両方の組み合わせ（5×106個のhESC由来心外膜細胞および10×106個の心筋細胞）、またはビヒクル対照の注射のいずれかを受けた（図3A）。移植の4週間後に、群の間で梗塞サイズに違いがないことが見出され、梗塞瘢痕治癒に及ぼす効果は除外された（図3B〜3C）。細胞移植が宿主の血管動員に影響を及ぼしたかどうかを評価するため、心臓移植片において微小血管密度を定量化し、梗塞域および非損傷境界域においても定量化した（図3D）。微小血管密度は、心外膜細胞と心筋細胞を同時移植された動物の心臓移植片において有意に増加していた。さらに、血管の管腔を灌流し、赤血球が容易に検出可能であった（図3E）。梗塞域および梗塞の非損傷境界域における微小血管動員の増大が認められ、EPI+CMで最も高く、次にCM、次いでEPIであり、最後がビヒクル対照であった（図3F〜3G）。検出された新生血管の成熟度の問題に対処するため、関心対象の3つの指定された領域を、平滑筋細胞で被覆された動脈の存在についてスクリーニングした。壁細胞を含む血管は、すべての群の梗塞域および境界域において大量に存在した。しかしながら、心臓移植片内のそれらの存在を評価した場合、平滑筋細胞で被覆された動脈はEPI+CM群では認められたが、CM単独の群では認められず、血管成熟に及ぼす心外膜の効果が示された（図11A〜11C）。要約すると、hESC由来心外膜細胞は、おそらくは部分的に血管動員の増大を通して、適さない環境において心臓移植片のための好ましい適所を作成する。
【０２２９】
同時移植は心臓移植片のサイズおよび特性を促進する
次いで、心臓移植片に及ぼす心外膜細胞の効果を評価した。インビトロにおける心筋細胞およびインビボにおける心臓移植片に及ぼす心外膜細胞の栄養効果を考慮して、これが心臓移植片サイズに影響を及ぼすかどうかを最初に調べた。心臓移植片は、ヒトミトコンドリアおよびα-アクチニンまたはβ-MHCに対する抗体を用いて容易に同定された（すなわち、α-アクチンおよびβ-MHCの両方を発現した）。心筋細胞が心外膜細胞と同時移植された場合に、心臓移植片は、心筋細胞単独と比較して実質的により大きいことが見出された（図4A〜4C）。インビトロにおける心筋細胞成熟に及ぼす心外膜の効果を考慮して、心臓移植片の超微細構造を評価した。インビトロにおけるこれらの知見と一致して、心外膜細胞と同時移植された心筋細胞は、単独で移植されたものよりも長い筋節長を示し、これはより成熟した表現型を意味する（図4D）。心外膜細胞が移植片内の心筋細胞の増殖に影響を及ぼすかどうかに取り組むため、組織を、合成ヌクレオシドBrdUおよびヒト特異的心臓マーカーβ-MHCに対する抗体で染色した。β-MHC陽性細胞の増殖指数は、hESC由来心外膜細胞と心筋細胞の組み合わせを受け取った動物において、心筋細胞単独と比較してより高かった（図4E〜4F）。
【０２３０】
心臓移植片が宿主の心筋と電気的に接続しているかどうかに取り組むため、β-MHC、α-アクチニン、および電気的ギャップ結合タンパク質コネキシン43に対する抗体で組織を染色した。すべての動物にわたっていくつかの領域において、隣接するヒト心筋とラット心筋との間のコネキシン43発現によって実証される潜在的な電気的統合性が見られた（図4G）。結論として、hESC由来心外膜細胞は、心臓移植片サイズ、ならびに成熟および増殖などの特性を促進し、レシピエントの心筋との電気的統合を改善し得る。
【０２３１】
同時移植は心臓機能を促進する
全体的な宿主心臓機能に及ぼす心臓移植片の機能的効果を評価するため、すべての動物に対して、梗塞前、細胞注射の直前、および28日間の追跡後に、心臓超音波を実施した。それらの注射前の値と比較して、ビヒクル対照群は注射後に短縮率の低下を示したのに対して、心外膜のみの群はこの過程を遅らせると考えられた。CMのみの群は心臓機能を保持し、さらなる機能悪化を防いだのに対して、CM+EPI群は機能の増大をもたらした（図5A〜5B；表2）。左室拡張は、梗塞後にすべての群において増大した。
【０２３２】
（表２）組織学的パラメータおよび心エコーパラメータ
2020514362.tif 000004
略語：EPI、心外膜細胞；CM、心筋細胞；LV、左心室；LVEDD、左室拡張末期径；LVESD、左室収縮末期径。
#、対をなす96 hr時点に対してp＜0.05で有意に異なる。##、対をなす96 hr時点に対してp＜0.01で有意に異なる。###、対をなす96 hr時点に対してp＜0.001で有意に異なる。*、同じ時点のEPI+CMとのp＜0.05での有意差。**、同じ時点のEPI+CMとのp＜0.01での有意差。***、同じ時点のEPI+CMとのp＜0.001での有意差。
【０２３３】
注射前の値と注射後の値を比較すると、左室収縮末期径 (LVESD) は、CM+EPI群において安定したままであり、CMのみの群において増加しており、続いてEPIおよびビヒクル対照群においてより大きく増加していた。CM+EPI群におけるLVESDの変化は、ビヒクル対照群における変化よりも有意に小さかったが、CMのみの群またはEPI群に対する差は統計的有意性に達しなかった（図5C〜5D）。左室拡張末期径 (LVEDD) に関して、ANOVAにより全体的な群の差が示唆されたが、事後検定によってこれは確証されなかった（図5E〜5F）。まとめると、これらのデータから、hESC由来心外膜細胞と心筋細胞との同時移植は、心筋細胞単独の移植と比較して心臓機能のより大きな増大をもたらしたことが示される。
【０２３４】
これらの効果が長期間存在するかどうかを調べるため、動物の一部を3カ月間追跡した。細胞移植の3カ月後に、hESC由来心外膜細胞およびhESC由来心筋細胞は、抗ヒトミトコンドリア染色により確認して、梗塞域になお存在した（図12A〜12B）。28日目の追跡と一致して、移植後84日目において、4つの試験群の間で梗塞サイズに差は見出されなかった（図12C）。さらに、増殖指数を評価した場合、心外膜細胞を含む心臓移植片は、心筋細胞を単独で受け取った動物と比較して、より高いBrdU取り込みの有意でない傾向を構成した（図12D〜12F）。要約すると、この研究は、3カ月時の機能差を検出するための検出力はなかったものの、hESC由来細胞の移植片は長期間持続した。移植片の持続を考慮すると、機能差がこの時点においても持続することが、本明細書において明確に企図される。
【０２３５】
hESC由来心外膜細胞が、インビトロおよびインビボにおいてhESC由来心筋細胞の成熟および機能を増大させ、胚心臓発生におけるその機能的役割を再現することが、本明細書において実証される。以前の研究により、hESC由来心筋細胞が哺乳動物の梗塞を再筋肉化し、心臓機能を保持し得ることが実証された (6)。それと同時に、胚心臓発生の詳細な理解によって心外膜の栄養的な役割が強調され、一方では、hPSCを用いるインビトロ研究により、この必須の胚組織の化学的に定義された誘導が可能となった (10, 11)。これらの発生上の洞察を利用することは、hESC由来心筋細胞移植のための補助療法を提供することによって、現在の心臓再生戦略を最適化するのに役立ち得る。
【０２３６】
本明細書において提供されるデータは、hESC由来心外膜細胞と心筋細胞の共培養が、3D-EHTの圧縮ならびに構造的および機能的成熟をもたらすことを示す。より具体的には、hESC由来心外膜が、力発生およびCa2+処理の点でhESC由来MSCおよび初代MSCの両方を打ち負かすことが本明細書において実証され、その胚独自性の機能的役割が確証される。心外膜細胞の機能的効力は、心筋細胞に関して構造的完全性および機能の向上によって恩恵を受ける現在の組織工学戦略に広く適用可能であることが判明し得る (25)。
【０２３７】
発生におけるその重要な役割に関連して、心外膜はまた、心臓損傷後に再活性化され増殖性となる。成体哺乳動物心臓において、損傷に対する心外膜細応答は、心臓損傷後の成体心筋組織の不十分な再生能によって明らかなように、心臓修復をもたらすには不十分である。対照的に、新生仔マウスおよびゼブラフィッシュの心臓は心臓再生の能力があり、心外膜はこの過程において決定的な役割を果たす (26, 27)。したがって、外因性hESC由来心外膜の胚の独自性または状態は、機能的関連性があると考えられる。これに関連して、胚性心臓線維芽細胞が、心肥大を引き起こすその成体対応物よりも多くの心筋細胞増殖を誘導し、胚起源が再生に有益であり得るというさらなる証拠が提供された (20)。本明細書におけるデータは、梗塞における移植に際して、心外膜が主に心臓線維芽細胞を生じることを示し、これは、損傷心筋における線維芽細胞の心外膜起源を確証する以前の研究と一致する (28, 29）。さらに、hESC由来心外膜によって誘導される、移植された心筋細胞の増殖およびそれらのその後の成熟の増大によって、移植された心外膜がインビボにおいてその胚の役割を再現することがさらに確証される。実際に、hESCに由来するほぼすべての細胞型が未成熟または胎児表現型を示すという知見と一致した、移植の時点におけるhESC-心外膜の不完全な成熟は、移植されたhESC-心筋細胞の最適な支持にとって有益であり得る。
【０２３８】
心外膜細胞はしたがって、より良好に血管形成もされた、より大きな心臓移植片の形成を可能にする。適さない梗塞後環境は高い細胞死および低い生着率をもたらし、これが心臓再生の努力における長年の複雑さを構成するため、上記のことは特に興味深い。最終的に、優れた移植片の完全性およびサイズはまた、心筋細胞単独と比較した心臓機能の増大に変換される。
【０２３９】
観察された効果は、どのような機構によってそれらが起こるのかという問題を提起する。理論によって縛られることは望まないが、1つの直接的説明は、心外膜細胞が、同時移植された心筋細胞に対して増殖促進および生存促進効果を発揮し、より大きな移植片をもたらし、それがさらなる力を生じるというものである。さらに、観察された宿主新生血管の動員の増大がこれらの効果と結びつき、細胞生存をさらに改善し得る。ニューレグリンおよび一酸化窒素などの内皮細胞分泌因子が、損傷時に心臓細胞死を減少させることが示された (30, 31)。加えて、血管供給は、最適な移植片機能および長期にわたるその維持にとって重要である。
【０２４０】
理論によって縛られることは望まないが、心臓移植片の生存および成熟に利益をもたらし得る別の因子は、心外膜細胞による細胞外マトリックスの供給である。ゼブラフィッシュにおいて、心外膜細胞によるフィブロネクチンの分泌が心臓再生に必要であることが実証された (32)。これらの知見と一致して、成体線維芽細胞ではなく胚線維芽細胞による、フィブロネクチン、コラーゲン、およびヘパリン結合EGF様増殖因子の組織化された分泌が、心筋細胞増殖をもたらすことが実証された (20)。したがって、理論によって縛られることは望まないが、hESC由来心外膜細胞によって規定されたマトリックスが、成熟した梗塞後心筋細胞には存在しない発生の合図を示し、適さない環境において有利な適所を提供する可能性が高い。
【０２４１】
心血管再生医療は実質的に進歩したが、ある特定の制限がいまだ残っている。先駆的努力によって、左室収縮機能の救済またはさらには増大を伴って、梗塞を起こした齧歯類および非ヒト霊長類の心臓を再筋肉化するのに十分な心筋細胞生存が可能になった (6, 13, 14)。それにもかかわらず、hPSC由来心筋細胞移植は、低い増殖率、細胞未熟性、移植片サイズによって妨げられる。本研究におけるデータにより、hESC由来心外膜細胞が、心筋細胞の増殖、成熟度、移植片サイズ、および最終的に心臓機能を促進することによって、これらの制限を克服するための進歩を決定的に速める有望なツールであることが示される。これらの知見の裏付けとして、ヒト初代心外膜細胞が、ビヒクル対照と比較して心臓機能を促進すること、および心血管前駆細胞と心外膜細胞との同時移植が、単独療法の効果を上回る相乗効果を発揮することが実証されている (33, 34)。これらの結果から多細胞療法の有益な効果が示唆されたが、著者らは群のいずれにおいても移植片を検出しておらず、見られた効果が事実上は単に傍分泌であったことが示唆された。同様に、心外膜IGF-1充填フィブリンパッチに加えた、内皮細胞、平滑筋細胞、および心筋細胞の同時移植は、心筋梗塞のブタモデルにおいて収縮心臓機能に対する相乗効果を示した (35)。対照的に、心臓および心外膜の両方の、本明細書に記載される実験において観察された移植片は、移植の3カ月後まで検出可能であり、長期にわたって恩恵が長続きすることおよび永続化する可能性が高いことの証拠が提供された。
【０２４２】
hESC由来心外膜細胞は、細胞移植および組織工学戦略を含む再生心血管医療を前進させるための有望なツールである。
【０２４３】
方法
hESC由来心外膜細胞およびhESC由来心筋細胞の調製。心外膜細胞は、以前に記載された通りにGFP遺伝子導入hESCから分化させた (10)。簡潔に説明すると、hESC（H9、WiCell、Madison）を、アクチビン-A（10 ng/ml、R&D Systems）およびFGF2（12 ng/ml、R&D Systems）を含有する化学的に定義された培地 (CDM-BSA) 中で維持した。化学的に定義された培地は、IMDM（250 ml、Life Technologies）、Ham's F12（250 ml、Life Technologies）、Pen/Strep（5 ml、Life Technologies）、インスリン（350μl、Roche）、トランスフェリン（250μl、Roche）、化学的に定義された100×脂質濃縮物（5 ml、Life Technologies）、およびモノチオグリセロール（20μl、Sigma）からなった。側部中胚葉への分化は、ポリビニルアルコール（PVA、1 mg/ml、Sigma）を含有するCDM-PVA中で、以前に記載された通りに実施した (14)。簡潔に説明すると、初期中胚葉分化は、CDM-PVA、FGF2 (20 ng/ml)、LY294002（10μM、Sigma）、およびBMP4（10 ng/ml、R&D）の組み合わせを用いて開始して、1.5日間行った。次いで、側部中胚葉分化は、CDM-PVA、FGF2 (20 ng/ml) およびBMP4 (50 ng/ml) 中で開始して、3.5日間行った。心外膜分化を誘導するために、細胞を2.5×104個／cm2の播種密度でCDM-PVA、Wnt3a（25ng/ml、R&D）、BMP4 (50ng/ml)、およびRA（4μM、Sigma）中に単一細胞として再懸濁して10日間置き、分化の途中で培地を交換した。hESCから間葉系幹細胞を誘導するために、コロニーを継代し、FGF (12 ng/ml) およびSB (10μM) を含有するCDM-PVA中に再懸濁し、ゲル-MEFコーティングプレートに30コロニー／cm2の密度で播種した。細胞を酵素的に分散させ、FGFおよびSBを含有するCDM-PVA中で4回継代した後、長期維持のために、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM-F12中でもう一度分割した。初代間葉系幹細胞も同様に、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM-F12中で維持した。
【０２４４】
心筋細胞は、以前に記載された通りにABCX法でhESCから作製した (36, 37)。簡潔に説明すると、hESC（RUES2、雌性株、Rockefeller University、NIH登録番号0013）を、bFGF（4ng/ml、Peprotech）を含有するフィーダー不含照射マウス胚線維芽細胞 (iMEF) 馴化培地中で維持した。Chiron 99021（1μM、Cayman Chemical）およびROCK阻害剤 (Y27632) を含む馴化培地で、細胞をMatrigel（商標）(BD) コーティングプレート上に単一細胞として播種した（1×105個／cm2）。翌日（0日目）、培地を吸引し、アクチビンA (100ng/ml) を含有する、B27 (Invitrogen) を補充したRPMI培地を細胞に供給し、18時間置いた。1日目に、培地を吸引し、RPMI培地+B27は48時間BMP4 (5ng/ml) およびChiron 99021 (1μM) を含有した。3日目に、培地を吸引し、Xav 939（1μM、Torcis）を含有するRPMI培地+B27と置換した。5日目に、培地をRPMI培地+B27と置換した。7日目に、培地を、インスリン (Invitrogen) と共にB27を含有するRPMIと置換し、結果としてプロトコールが終了するまで一日おきに置換した。
【０２４５】
21日目に心筋細胞を凍結させ、全研究に同じバッチを使用した。フローサイトメトリーを、BD FACSCanto II（Beckton Dickinson、San Jose, CA）においてcTnT抗体（Thermo、MS-295-P）を用いて解凍細胞に対して行い、FACSDivaソフトウェア (BD Biosciences) を用いて解析し、97.1%±0.5の純度が明らかになった（cTnT+、図1、パネルC）。
【０２４６】
細胞移植の前日に心外膜細胞に熱ショックを与え、凍結前に心筋細胞に熱ショックを与え、いずれも42.5℃で30分間の熱ショックであった。細胞移植の当日に、心外膜細胞および心筋細胞を酵素的に分散させ、計数し、ラット当たり100μl容積のMatrigel（商標）中および生存促進カクテル (PSC) 中に再懸濁した。PSCは、50% (vol/vol) Matrigel（商標）、ならびにZVAD-FMK（100μM、Calbiochem）、Bcl-XL（50nM、Calbiochem）、シクロスポリンA（200 nM、Wako Pure Chemicals）、ピナシジル（50μ、Sigma）、およびIGF-1（100ng/ml、Peprotech）からなった。細胞調製物は、ビヒクル対照としてのMatrigel（商標）+PSC、またはMatrigel（商標）／PSC中の5×106個の心外膜細胞、または10×106個の心筋細胞、または5×106個の心外膜細胞と10×106個の心筋細胞の組み合わせのいずれかを含んだ。
【０２４７】
定期的にすべての細胞においてマイコプラズマスクリーニングを行い、陰性であることが見出された。
【０２４８】
3D-EHTの作製および機能評価。組織構築物を成型するために、ポリジメチルシロキサン (PDMS)（PDMS、Sylgard 184；Dow Corning、Midland, MI）を用いてウェルを製作した。PDMSリンカーと基材を1:10の質量比で混合し、3×8×2 mmの寸法で、かつ各末端から1.5mmの位置に配置された直径1 mmの柱を含む4つのウェルを特徴とする、レーザーでエッチングされたアクリル製ネガ鋳型に注いだ。PDMSを65℃で一晩焼き、ネガから取り出し、次いでオートクレーブした。組織を成型する前に、PDMSウェルを5%プルロニック酸F127溶液（Sigma、P2443）で1時間処理した。
【０２４９】
構築物研究に用いられた心筋細胞は、分化の21日目に凍結させ、培養下で5日間与えて回復させた。構築物成型の間に、心筋細胞および心外膜細胞をトリプシン処理し、10×RPMI-1640培地 (Sigma)、NaOH、Geltrex（商標）（Invitrogen、A1413202）、コラーゲンIラットタンパク質（Gibco Life Technologies、A1048301）、および水を含有するコラーゲンゲル中で混合した。細胞-ゲル溶液をPDMSウェルに分注し、37℃で30分間凝固させた。次いで構築物に7 mlのRPMI培地+B27+インスリンを一日おきに供給し、自発的な収縮が7日以内に観察された。構築物はすべて14日間培養し、4% PFAで固定し、30%スクロースで4℃にて一晩処理し、最終的に凍結包埋して切片を作製した。
【０２５０】
Ca2+処理を評価するため、14日齢の構築物をfluo-4, AM（Invitrogen、Molecular Probes）と共に37℃で20分間インキュベートした。蛍光顕微鏡 (Nikon Eclipse TS100) に取り付けられたSony Handycam（商標）(Vixia HFS20) を用いて、ビデオを撮影した。続いてビデオをフレームに変換し、取り込み、Image Jソフトウェアを用いて解析した。
【０２５１】
構築物の力測定は、以前に記載された通りに、培養下での2週間後に行った (38)。簡潔に説明すると、構築物をPDMSウェルから取り出し、力変換器（Aurora Scientific、モデル400A）と長さ制御装置（Aurora Scientific、モデル312B）の間に懸濁した。フランク・スターリング関係を評価するために、構築物を、37℃に維持されたHEPES緩衝Tyrode溶液中に浸しながら、それらの静止長からさらなる25%ひずみまで6段階で伸ばした。力のトレースを、最初は電気刺激なしで記録し、続いて5Vおよび50msパルス幅における1、1.5、2、および3 Hzで記録した。受動張力および活動力のトレースを記録し、カスタマイズされたLabViewおよびMATLABソフトウェアを用いて解析した。
【０２５２】
心筋梗塞および細胞移植。研究はすべて、ワシントン大学動物実験委員会 (University of Washington Animal Care and Use Committee)（IACUC；プロトコール番号2225-04）によって承認され、実験動物の人道的管理と使用に関する米国NIHの規範 (US NIH Policy on Humane Care and Use of Laboratory Animals) に従って行った。研究設計は、2つの実現可能性研究および1つの確定研究を含んだ。第1の研究は、hESC由来心外膜細胞の急性の生存および運命を評価するように設計された。動物は、2×106個 (n=4) もしくは4×106個 (n=4) の心外膜細胞、またはビヒクル対照注射 (n=4) のいずれかを受けた。第2の実現可能性研究は、心外膜細胞の長期生存およびそれらの機能を評価するように設計され、動物は、6×106個の心外膜細胞 (n=6) またはビヒクル対照注射 (n=4) のいずれかを無作為に受けた。確定研究は、心筋細胞に及ぼす心外膜の栄養効果を評価するために行った。確定研究設計は、以下の4つの研究群を含んだ：5×106個の心外膜細胞 (n=15)、10×106個の心筋細胞 (n=14)、5×106個の心外膜細胞+10×106個の心筋細胞 (n=14)、またはビヒクル対照 (n=13)。
【０２５３】
細胞移植のためのプロトコールは、以前に詳述されている (6, 39)。簡潔に説明すると、雄性胸腺欠損Sprague Daleyラット (Charles River) に、68.2 mg/kgケタミンおよび4.4 mg/kgキシラジンの腹腔内注射により麻酔をかけ、挿管し、室内気および補給酸素による人工呼吸を行った。20分後、ケタミンおよびキシラジンの第2用量を投与した。直腸温度プローブに接続された加熱パッド上に動物を置き、これによって37℃での体温の維持を確実にした。続いて開胸術を実施し、心臓の前面を露出させ、冠動脈左前下行枝 (LAD) を可視化した。LADを結果的に60分間結紮し、その後結紮を除去し、動物を再灌流し、胸部を無菌的に縫合した。心筋梗塞の4日後に、動物にイソフルランで麻酔をかけた後、心筋内細胞移植のための2回目の開胸術を行った。続いて動物を処置群のうちの1つに無作為に割り当て、細胞を梗塞域に注射した。続いて胸部を縫合し、手術後に動物をモニターした。
【０２５４】
移植片保持を最適化するため、動物は、手術の前日から手術後7日目まで、5 mg/kgシクロスポリンAの皮下注射を受けた。細胞移植片における細胞増殖を評価するため、細胞注射後1、4、7、および14日目に、動物に50 mg/kg BrdUを注射した。3カ月間追跡する動物のコホートは、研究が終了する24時間前に、1回のBrdU注射をさらに受けた。
【０２５５】
心エコー検査。動物はすべて、心筋梗塞の前のベースライン時、梗塞の4日後、および細胞移植の28日後に心エコー検査を受けた。動物の一部を維持し、移植後84日目に画像化した。簡潔に説明すると、動物に吸入イソフルラン (Novaplus) で軽く麻酔をかけ、10S (10MHz) 小児用プローブを用いて経胸壁心エコー検査 (GE Vivid 7) によってスキャンした。得られた評価項目は、短縮率 (%)、左室拡張期径 (LVEDD)、および左室収縮期径 (LVESD) を含んだ。LVDDおよびLVESDは、ミリメートル (mm) で表された。画像は匿名化され、最初の読み取り者が盲検様式で測定を行った。検証目的のために、全データセットの解析前および最後に、独立した研究者が画像の試料セットを盲検様式で解析して、測定値の一貫性を保証した。これら2つの試験のそれぞれのブランド・アルトマンプロットおよび級内相関係数を図13に示す。
【０２５６】
免疫細胞化学的検査および免疫組織化学的検査。免疫細胞化学的検査のため、細胞を4%パラホルムアルデヒド (PFA) 中で固定し、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 中の0.5% Triton X100で透過処理し、3% BSA/PBS中で室温にて45分間ブロッキングした。一次抗体インキュベーションを4℃で一晩行った。翌日、細胞を洗浄し、Alexa-Fluor結合二次抗体と共に室温 (RT) で45分間インキュベートした後、核を可視化するために49,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) で10分間染色した。免疫組織化学的検査 (IHC) のため、死後心臓を摘出し、記載されている通りに調製した (39)。簡潔に説明すると、心臓をPBS中で洗浄し、飽和KCl中で20分間維持し、続いて4% PFA中で固定し、パラフィン切片 (5 mm) を作製した。IHC染色のため、スライドを脱パラフィンし、熱媒介性抗原回復を15分間行い、0.3 % Triton X-100を含有する5% BSA/PBSでRTにて1時間ブロッキングした。次に、スライドを一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートし、翌日に蛍光二次抗体を室温で60分間適用した。免疫細胞化学的検査および免疫組織化学的検査に用いられたすべての抗体を、表3において詳述する。
【０２５７】
（表３）ICCおよびIHCのために用いられた一次抗体
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【０２５８】
梗塞および移植片の定量化。梗塞サイズを評価するため、スライドをピクロシリウスレッド／ファストグリーン染色液で染色した。続いて、梗塞切片においてピクロシリウスレッド陽性領域を定量化し、各切片において左室領域に対して正規化した。心臓移植片サイズの定量化のため、スライドをヒト心臓移植片サイズを定量化するためのヒトミトコンドリア抗体 (Novus) およびα-アクチニン (Abcam) で一晩染色し、その後Alexa Fluor-488ロバ抗ウサギ二次抗体およびAlexa Fluor-568ヤギ抗マウス二次抗体 (Invitrogen) と共に1時間インキュベートした。次いで、対応する移植片サイズを梗塞領域のサイズに対して正規化した。検出可能な移植片を示さなかった、CMのみの研究群における動物1匹を除いて、すべての動物を解析に使用した。Nikon TiE倒立広視野蛍光高分解能顕微鏡 (Inverted Widefield Fluorescence High-Resolution Microscope) において、画像を取得した。心外膜移植片を評価するために、抗GFP (Novus) および抗ヒトミトコンドリア (Novus) 抗体を使用した。移植された心外膜細胞の上皮間葉転換を調べるために、スライドを、GFP (Novus)、ビメンチン (Dako)、および広域サイトケラチン (Dako) に対する抗体で染色した。心外膜細胞の運命を判定するために、スライドを、ヒトミトコンドリア (Novus)、および心筋細胞（α-アクチニン (Abcam)）、内皮細胞（ヒトレクチン（ハリエニシダ (Ulex europaeus)、Vector））、平滑筋細胞（平滑筋α-アクチン (Dako)）、または線維芽細胞 (S100A4 (Abcam)) に対する抗体で同時染色した。心臓移植片を検出するために、ヒトミトコンドリアおよびα-アクチンまたはβ-MHC (Developmental Studies Hybridoma Bank) に対する抗体を使用した。微小血管密度を評価するために、スライドをCD31/PECAM (Novus) およびβ-MHC (Developmental Studies Hybridoma Bank) または cTnI (Abcam) のいずれかで染色した。心臓移植片、梗塞域、および非損傷境界域における微小血管密度を定量化するために、管腔の数を計数し、それぞれ心臓移植片サイズの領域、心筋梗塞症の領域、または非損傷心筋の領域に対して正規化した。画像はすべて、ZENソフトウェアを用いてZeiss LSM700顕微鏡において、動物ごとに技術的反復を行って取得し、続いてImage Jソフトウェアを用いて解析した。
【０２５９】
（表４）級内相関係値（括弧内は95%信頼区間）
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【０２６０】
統計。インビトロ研究はすべて、3回の生物学的反復（独立実験）として行い、そのそれぞれは技術的反復で行った。インビボデータはすべて、各時点について評価された動物の数を具体的に述べている。値の正規分布は、適切な場合には、ダゴスティーノ & ピアソンのオムニバス正規性検定を用いて確認した。試料間の分散は、ブラウン・フォーサイス検定を用いて検定した。統計検定は、2群の比較については対応のないt検定を用いて行い、対応のある2群の比較については対応のあるt検定を用いて行った。複数群の比較については、群の分散が等しい場合には、事後テューキー検定を伴う一元配置ANOVAを使用し、分散が等しくない群については、多重比較のためのダンの補正を伴うクラスカル・ウォリス検定を適用した。両側有意性を測定して、p値0.05を統計的に有意であると見なした。解析はすべて、盲検様式でGraphPad Prismソフトウェアを用いて行った。結果はすべて、特に明記しない限り平均値±SDとして表す。
【０２６１】
すべてのインビボ実験について、群のサイズは以前の研究の分散に基づいて推定した。正式な統計的方法を標本サイズの計算に適用しなかった。無作為化の正式な方法は使用しなかったものの、動物は、処置に関して盲検化されたテクニシャンによって無作為に選択された。すべての組織学的検査スライドおよびすべての機能データの解析は、盲検様式で行われた。死亡が、さらなる組織学的解析および機能解析に関する唯一の除外基準であった。
【０２６２】
参照文献：
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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