(57)【要約】  本発明では、既存の抗がん剤および抗がん治療の欠点を補完できる抗がん剤組成物およびその剤形を提供するものであり、アテロコラーゲン−［アプタマー−Ｘ］複合体を含む。前記式のＸは、抗がん活性を有する、薬物（Drug）、トキシン（Toxin）、オリゴヌクレオチド薬物（oligonucleotide drug）（siRNA、miRNA、アンチセンス（antisense）他）、タンパク質（antibody）、酵素（enzyme）、およびナノ粒子（Nanoparticles）からなる群より選択される一つ以上である。
2020514402.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物］複合体を含む薬物伝達および安定化複合体。
【請求項２】
前記薬物は、抗がん活性または抗炎症活性を有する物質であることを特徴とする、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記薬物は、薬物（Drug）、トキシン（Toxin）、オリゴヌクレオチド薬物類、タンパク質（antibody）、酵素（enzyme）、およびナノ粒子（Nanoparticles）からなる群より選択される一つ以上であることを特徴とする、請求項１または２に記載の複合体。
【請求項４】
前記複合体を含む請求項１に記載の薬物製剤。
【請求項５】
前記製剤は、局所用製剤であることを特徴とする、請求項４に記載の製剤。
【請求項６】
前記局所用製剤は、ゾル−ゲル型、パッチ型またはスカフォールド型を有することを特徴とする、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
薬物をアプタマーとコンジュゲートした後、アテロコラーゲンと複合体を作成することを特徴とするアプタマー−薬物コンジュゲートの安定化方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物伝達および安定化のための複合体並びにその製造方法に関し、より詳細には、アプタマー（aptamer）のターゲティング能力を活用するために、それに治療剤（治療効果のある）物質（Ｘ）をリンカー（linker）（Ｌ）を介して結合させたアプタマー−Ｌ−Ｘコンジュゲート［Aptamenr-Drug Conjugate］をさらに安定化して体内で長期間保護できる複合体および剤形、並びにその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
膵臓がんは、数十年間、明確な治療法が確立しておらず、生存率に大きな変化がない絶望的な癌である。その理由は、膵臓がんは、従来の化学抗がん剤や新しいタイプの免疫抗がん剤にも反応しない悪名高い癌であり、膵臓がんの典型的な特徴である腫瘍を取り囲む線維組織が免疫治療反応を妨げるためであると推定される。８５％の患者が末期になって発見し、再発の確率も高く、１日に１５人の新しい膵臓がん患者が発生し、１４人が命を落としている。
【０００３】
現在、膵臓がんに対する基本的な抗がん治療法は、ゲムシタビン（Gemcitabine）の単独療法である。現在のところは、どの抗がん治療を選択しても、局所進行性膵臓がんの場合は平均生存期間が８〜１２ヶ月、転移性膵臓がんの場合は３〜６ヶ月程度である。膵臓がんの治療としては、過去１２年間に渡ってゲムシタビンと数多くの薬剤との併合療法が行われていたが、単独療法に対する併合療法の利点は微々たるものである。しかし、現在でもゲムシタビンが主な役割を果たし、２〜３つの薬剤を用いる併合療法が行われている。ゲムシタビンに依存するしかないのか、または他の薬剤を用いて併合療法を施行すべきではないかという疑問が生じる。また、分子生物学的な発がん過程の究明に基づいて様々な標的治療剤が登場するとともに、さらに進展があったように見えたが、その効果は顕著ではないのが実状である。これらのことから、生物学的な標的治療剤および新しい細胞毒性治療剤の開発が、どの時期よりも切実に求められている。また、新たな薬剤の発見および併合療法を用いた臨床試験は、進行し続ける必要があり、激しい痛みと悪液質などを軽減するための治療法の開発も必要である。
【０００４】
乳がんは、アメリカやヨーロッパなどの先進国の女性がんの中で最も頻繁に発生する癌であり、４０歳から５５歳の間のアメリカ人女性の死亡原因第１位となっている。女性の９人に１人が人生のどこかのタイミングで乳がんを発症し、乳がん患者数も毎年約１５％ずつ増加している。１９９５年韓国では、女性がん患者の約１１．９％を乳がんが占めており、子宮頸がんと胃がんに次いで３番目に頻繁に発生した。また、胃がん、肝臓がん、子宮がん、肺がんに次いで５番目に死亡率が高いがんであり、その頻度が毎年増加する傾向にある。 
【０００５】
肝臓がんは、国内外で社会経済的に非常に重要な病気である。２０１２年を基準に、韓国で２番目に死亡率が高いがんは肝臓がんであり、１０万人当たり２２．５人が肝臓がんで死亡した。特に、韓国ではＢ型肝炎の有病率が高いため、肝臓がんの発生率が高いと知られている。また、肝臓がんは、がんの中で最も大きな社会経済的な損失を誘発することが知られ、効果的な治療剤の開発が急務となっている。現在までに開発された標準治療剤としてソラフェニブ（Sorafenip）があるが、経口用抗がん標的治療剤であり、様々な細胞物質を抑制することによって肝臓がんの治療に効果を示すことが証明された。しかし、このような治療剤は、治療効果があったとしても、生存期間の増加が２〜３ヶ月に過ぎないため限界がある。
【０００６】
食生活の欧米化に伴い急増している大腸がんの場合には、治療方法として手術や薬物療法が試みられている。抗腫瘍化合物である５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、大腸がんの治療における主な選択薬物であり、その使用は限界的に有効であることが証明された。５−ＦＵは、大腸がんの大きさを一時的に減少させることはできるが、患者の生存期間が実質的に延長されたか、または「治癒」されたこと（５年の軽減期を基準）を示す証拠はほとんどない。５−ＦＵを使用する化学療法が、病気が肝臓に転移した患者に使用されているが、そのケースの２５％またはそれ未満においてのみ一時的な改善が観察され、全体的な生存率には有意な影響がない。 
【０００７】
また、近年、特に韓国人に急激に増加している甲状腺がんの場合には、過剰手術が問題と提起されているのが実情である。
【０００８】
抗がん治療に使用される薬物は、深刻な副作用や毒性を示すものがほとんどであり、最近では、がんに関連する受容体に特異的に結合するアプタマーを開発し、単独で又は薬物と混合（combination）した状態で乳がんなどの様々ながんを治療するために臨床を進行中である。本発明者もＨｅｒ−２受容体に特異的に結合するアプタマーを既に開発し、米国特許登録ＵＳ９３０９５１５Ｂ２号公報（特許文献１）などに掲載した。
【０００９】
特に、このようなアプタマーは、抗がん効果のある物質（Ｘ）、例えば薬物（drug）や、トキシン（toxin）、オリゴヌクレオチド薬物（oligonucleotide drug）（siRNA、miRNA、antisense他）、タンパク質（antibody）、酵素（enzyme）、ナノ粒子などとコンジュゲートされる場合、アプタマーがターゲティング機能を有するので、これらの薬物などをターゲットのがん細胞まで移送（delivery）する機能を果たす。ところが、このアプタマー−Ｌ−Ｘコンジュゲート（アプタマー−薬物（drug）コンジュゲート）は、体内で不安定であるため、その機能を十分に発揮できない場合が多かった。 
【００１０】
関節炎治療剤などの他の薬物の場合も同様に、アプタマーとコンジュゲートする場合に体内で安定化させることができる技術が必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許登録ＵＳ９３０９５１５Ｂ２号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明は、既存の薬物および薬物治療の欠点を補完できる治療剤およびその剤形を提供することを目的とする。
【００１３】
本発明は、特に体内で不安定なアプタマー−Ｌ−Ｘコンジュゲート（アプタマー−薬物コンジュゲート）を安定化して優れた治療効果を示すようにすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明者らは、このアプタマー−Ｌ−Ｘコンジュゲート（例えば、アプタマー−薬物コンジュゲート）をアテロコラーゲンと複合体［アテロコラーゲン−（アプタマー−Ｌ−Ｘコンジュゲート）複合体（complex）］として製造して使用する場合に、アプタマー−Ｌ−Ｘコンジュゲートを体内で安定化してその効果を最大化できることを発見し、本発明を完成するに至った。すなわち、新しいアテロコラーゲン媒介の局部アプタマー−リンカー−薬物（アプタマー−Ｌ−Ｘ）伝達システム（Atelocollagen−mediated local Aptamenr−linker−Drug Conjugate delivery system）である。
【００１５】
つまり、本発明は、アテロコラーゲン−［アプタマー−Ｘ］複合体を含む薬物安定化複合体に関するものである。前記式中のＸは、薬物（drug）、トキシン（toxin）、オリゴヌクレオチド薬物類（siRNA、miRNA、antisense他）、タンパク質（antibody）、酵素（enzyme）、およびナノ粒子からなる群より選択される一つ以上である。
【発明の効果】
【００１６】
本発明の複合体は、体内で安定であり、抗がんをはじめとする優れた治療効果を示す。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の実施例のＡＳ１４１１およびドキソルビシン（Doxorubicin）の反応後のＡＳ１４１１−Ｄｏｘ 付加（AS1411-Dox Adduct）のＨＰＬＣ ＲＴである。
【図２】図２は、本発明の実施例のＡＳ１４１１−Ｄｏｘ 付加（AS1411-Dox Adduct）のＵＶ−可視光吸収スペクトルである。
【図３】図３は、本発明の実施例のＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲートである。
【図４】図４は、本発明の実施例のアテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（ゾル−ゲルタイプ）の写真である。
【図５】図５は、本発明の実施例のアテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（パッチタイプ）の写真である。
【図６】図６は、本発明の実施例のアテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（スカフォールド型（scaffold type））の電子顕微鏡写真である。
【図７ａ】図７は、Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲートおよびアテロコラーゲン−［Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（ゾル−ゲルタイプ）の生体内安定性を測定した写真（図７ａ）および結果のグラフ（図７ｂ）である。
【図７ｂ】図７は、Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲートおよびアテロコラーゲン−［Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（ゾル−ゲルタイプ）の生体内安定性を測定した写真（図７ａ）および結果のグラフ（図７ｂ）である。
【図８】図８は、本発明の実施例のアテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（パッチタイプ）の写真である。
【図９ａ】図９は、本発明の実施例のアテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（パッチタイプ）の生体内安定性試験の結果を示す写真である。
【図９ｂ】図９は、本発明の実施例のアテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（パッチタイプ）の生体内安定性試験の結果を示す写真である。
【図１０ａ】図１０は、本発明の実施例のアテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（スカフォールド型（scaffold type））の写真（図１０ａ）および電子顕微鏡写真（SEM IMAGE）（図１０ｂ）である。
【図１０ｂ】図１０は、本発明の実施例のアテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（スカフォールド型（scaffold type））の写真（図１０ａ）および電子顕微鏡写真（SEM IMAGE）（図１０ｂ）である。
【図１１】図１１は、本発明の実施例のアテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（スカフォールドタイプ）の生体内安定性を試験した写真である。
【図１２ａ】図１２は、アテロコラーゲン−［Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（スカフォールドタイプ）の写真（図１２ａ）および電子顕微鏡（SEM IMAGE）（図１２ｂ）である。
【図１２ｂ】図１２は、アテロコラーゲン−［Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（スカフォールドタイプ）の写真（図１２ａ）および電子顕微鏡（SEM IMAGE）（図１２ｂ）である。
【図１３】図１３は、ＡＳ１４１１、ＣＲＯ、ゲムシタビン（Gemcitabine）、ＡＳ１４１１−ＧｅｍコンジュゲートおよびＣＲＯ−Ｇｅｍコンジュゲートの膵臓がん細胞株に対する効能試験の結果を示すグラフである。
【図１４】図１４は、ＡＳ１４１１、ＣＲＯ、ゲムシタビン（Gemcitabine）、アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］およびアテロコラーゲン−［ＣＲＯ−Ｇｅｍコンジュゲート］の膵臓がん細胞株に対する効能試験の結果を示すグラフである。
【図１５】図１５は、ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ERBB2 aptamer-siRNA conjugate）およびｓｉＲＮＡの乳がん細胞株透過効能の比較結果である。
【図１６】図１６は、ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ERBB2 aptamer-siRNA conjugate）およびｓｉＲＮＡの乳がん細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ効能試験の結果である。
【図１７】図１７は、アテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２ ａｐｔａｍｅｒ−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA conjugate]Complex）の乳がん細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ効能試験の結果である。
【図１８】図１８は、ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加（AS1411-Dox adduct）とＣＲＯ−Ｄｏｘ付加（CRO-Dox adduct）の肝臓がん細胞株に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ効能試験の結果である。
【図１９】図１９は、アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Dox Adduct]Complex）の肝臓がんに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ効能試験の結果である。
【図２０】図２０は、ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート２．０ｍｇと０．５％アテロコラーゲン複合体を膵臓がんのマウスの腫瘍に注射器で直接注射した後の時間別腫瘍サイズを測定した結果である。
【図２１】図２１は、アテロコラーゲンのみを膵臓がんのマウスの腫瘍に注射器で直接注射した後の時間別腫瘍サイズを測定した結果である。
【図２２】図２２は、アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）の濃度別腫瘍サイズの変化を示すグラフである。
【図２３ａ】図２３は、摘出した腫瘍の大きさを比較した写真（図２３ａ）およびグラフ（図２３ｂ）である。
【図２３ｂ】図２３は、摘出した腫瘍の大きさを比較した写真（図２３ａ）およびグラフ（図２３ｂ）である。
【図２４】図２４は、アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（パッチタイプ）およびアテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（スカフォールドタイプ）を腫瘍周囲に移植した写真である。
【図２５ａ】図２５は、アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（パッチタイプ、Ａ）、アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（スカフォールドタイプ、Ｂ）、アテロコラーゲン−［ＣＲＯ−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（パッチタイプ、Ｃ）、アテロコラーゲン−［ＣＲＯ−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（スカフォールドタイプ、Ｄ）を腫瘍周囲に移植した後の時間別腫瘍サイズの変化を比較した写真（図２５ａ）およびグラフ（図２５ｂ）である。
【図２５ｂ】図２５は、アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（パッチタイプ、Ａ）、アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（スカフォールドタイプ、Ｂ）、アテロコラーゲン−［ＣＲＯ−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（パッチタイプ、Ｃ）、アテロコラーゲン−［ＣＲＯ−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（スカフォールドタイプ、Ｄ）を腫瘍周囲に移植した後の時間別腫瘍サイズの変化を比較した写真（図２５ａ）およびグラフ（図２５ｂ）である。
【図２６】図２６は、アテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）を乳がんのマウスに直接注入した後の時間別腫瘍サイズの変化を比較したグラフである。
【図２７】図２７は、摘出した腫瘍の大きさを比較した写真である。
【図２８】図２８は、アテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（パッチタイプ、Ａ）、アテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（スカフォールドタイプ、Ｂ）、アテロコラーゲン−［Ｃｏｎｔｒｏｌ ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[Control ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（パッチタイプ、Ｃ）、アテロコラーゲン−［コントロール ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[Control ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（スカフォールドタイプ、Ｄ）を腫瘍周囲に移植した後の時間別腫瘍サイズの変化を比較したグラフである。
【図２９】図２９は、アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Dox Adduct]Complex）（ゾル−ゲルタイプ）およびアテロコラーゲン−［ＣＲＯ−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[CRO-Dox Adduct]Complex）（ゾル−ゲルタイプ）を肝臓がんのマウスに直接注入した後の時間別腫瘍サイズの変化を比較したグラフである。
【図３０】図３０は、摘出した腫瘍の大きさを比較した写真である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の薬物安定化複合体は、アテロコラーゲン−［アプタマー−Ｌ−Ｘコンジュゲート］複合体（Atelocollagen−［Aptamer−Drug Conjugate］Complex）からなる。ここで、前記Ｘは、抗がん、抗炎症などに治療効果のある物質（Ｘ）、例えば、薬物（Drug）や、トキシン（toxin）、ｓｉＲＮＡ、ペプチド、タンパク質薬物およびナノ物質などを示し、治療効果のある物質であれば、これらに限定されることなく様々な適用が可能である。
【００１９】
アプタマー−Ｌ−Ｘがコンジュゲート（アプタマー−薬物コンジュゲート）される場合には、アプタマーがターゲティング機能を有するので、これらの薬物などをターゲットのがん細胞や炎症部位などの目標部位まで移送（delivery）する機能を果たす。これにアテロコラーゲンを複合化すると、体内で安定化してさらに優れた治療効果を示す。
【００２０】
アテロコラーゲン、アプタマーおよび抗がん活性物質Ｘの量は、アプタマーの種類、患者の体重、治療対象となる腫瘍の大きさや皮膚からの距離などによって異なる場合があり、適宜調整できる。
【００２１】
本発明のアテロコラーゲン−［アプタマー−Ｌ−Ｘ］複合体（アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体）は、特定のアプタマーに限定されず、様々なアプタマーを使用してアテロコラーゲン−［アプタマー−Ｌ−Ｘコンジュゲート］複合体（Atelocollagen−［Aptamer−Drug Conjugate］Complex）として製造して使用することができ、複合体として製造する場合、アプタマーの安定性と抗がん効果の上昇を期待することができる。本発明の複合体は、アプタマーと抗がん活性物質の種類によって、膵臓がん、乳がん、肝臓がんをはじめとする各種がんの治療に有用である。関節炎治療剤などの他の治療剤にも適用可能なことは勿論である。
【００２２】
本発明の組成物は、様々な剤形で使用することができる。例えば、ゾル−ゲルタイプの注射剤として直接がんや関節炎の部位まで注入し、体温により固形化して薬物が徐々に放出される方式、またはパッチ、インプラントのような移植材などの形態にして貼り付ける方式も可能である。このため、がん手術前の腫瘍サイズの縮小、または手術後の残存癌細胞の除去にも、放射線治療などで発生する副作用および違和感なく特に有用に使用できる。
【実施例】
【００２３】
以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。 
【００２４】
実施例１．高濃度医療用アテロコラーゲン分散液の製造
高純度医療用アテロコラーゲンをＮａＯＡｃ／ＨＡｃ溶液（1.2g CH3COONa、27.5ml CH3COOH in 50ml）に３ｗｔ％で入れ、ｐＨ３．０に維持し、攪拌して完全に溶かした。この溶液をＴＦＦ（タンジェンシャルフロー・フィルトレーション（Tangential Flow Filtration））によりＰＢＳ溶液でダイアフィルトレーション（dia-filtration）して、ＰＢＳ溶液の医療用アテロコラーゲン分散液を製造した。
【００２５】
アプタマー−リンカー−薬物コンジュゲートの合成
実施例２．抗−ヌクレオリンＧＲＯアプタマー−リンカー−ゲムシタビンコンジュゲート（anti-Nucleolin GRO aptamer-linker-Gemcitabine Conjugate）［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］の合成
マレイミドカプロイル−（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ）−ゲムシタビン（Maleimidecarproyl-(Gly-Phe-Leu-Gly)-Gemcitabine）［ＭＣ−ＧＦＬＧ−ゲムシタビン（Gemcitabine）］に、ＨＳ−Ｃ６−tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg［ＨＳ−Ｃ６−Ｔ３−ＡＳ１４１１］を反応し、ゲムシタビン（Gemcitabine）−（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）−Ｍａｌ−Ｓ−Ｃ６−tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg［Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ３−ＡＳ１４１１，ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］を合成した。つまり、ＲＳＳ−Ｃ６−tttggtggtggtggttgtggtggtggtgg［ＲＳＳ−Ｃ６−Ｔ３−ＡＳ１４１］）をＤＴＴの存在下で約３時間還元反応した後、残っているＤＴＴをセントリコン（centricon）で除去し、ＳＢ１７緩衝液に交換した。少量のＤＭＳＯに溶かしたＭａｌ−ＧＰＬＧ−ゲムシタビン（Gemcitabine）を入れて一晩振とうさせた。逆相（Reverse-phase）ＨＰＬＣ（Waters-Xbridge OST C18 10×50mm、65、TEAE/ACN緩衝液）により精製し、ゲムシタビン（Gemcitabine）−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ３−ＡＳ１４１１［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］を得た。ＥＳＩ−ＭＳによりゲムシタビン（Gemcitabine）−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ３−ＡＳ１４１１［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］の分子量を確認した。Ｃ３３４Ｈ４２２Ｆ２Ｎ１１７Ｏ１９８Ｐ２９Ｓ［Ｃａｌ．ＭＷ＝１０２１１．９０ Ｏｂｓ．ＭＷ＝１０２１１．８７］
【００２６】
実施例３．抗−ヌクレオリン ＣＲＯアプタマー−リンカー−ゲムシタビンコンジュゲート（anti-Nucleolin CRO aptamer-linker-Gemcitabine Conjugate）［ＣＲＯ−Ｇｅｍコンジュゲート］の合成
マレイミドカプロイル−（Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ）−ゲムシタビン（Maleimidecarproyl-(Gly-Phe-Leu-Gly)-Gemcitabine）［ＭＣ−ＧＦＬＧ−ゲムシタビン（Gemcitabine）］に、ＨＳ−Ｃ６−tttcctcctcctccttctcctcctcctcc［ＨＳ−Ｃ６−Ｔ３−ＣＲＯ］を反応させて、ゲムシタビン（Gemcitabine）−（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ）−Ｍａｌ−Ｓ−Ｃ６−tttcctcctcctccttctcctcctcctcc［Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ３−ＣＲＯ、ＣＲＯ−Ｇｅｍコンジュゲート］を合成した。つまり、ＲＳＳ−Ｃ６−tttcctcctcctccttctcctcctcctcc［ＲＳＳ−Ｃ６−Ｔ３−ＣＲＯ］をＤＴＴの存在下で約３時間還元反応した後、残っているＤＴＴをセントリコン（centricon）で除去し、ＳＢ１７緩衝液に交換した。少量のＤＭＳＯに溶かしたＭａｌ−ＧＰＬＧ−ゲムシタビン（Gemcitabine）を入れて一晩振とうさせた。逆相（Reverse-phase）ＨＰＬＣ（Waters-Xbridge OST C18 10×50mm、65、TEAE/ACN緩衝液）により精製し、ゲムシタビン（Gemcitabine）−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ３−ＣＲＯ［ＣＲＯ−Ｇｅｍコンジュゲート］を得た。 ＥＳＩ−ＭＳによりＧｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ−（ＧＬＦＧ−ＭＣ−Ｓ−Ｃ６）−Ｔ３−ＣＲＯ［ＣＲＯ−Ｇｅｍコンジュゲート］の分子量を確認した。Ｃ３１７Ｈ４２２Ｆ２Ｎ８３Ｏ１９８Ｐ２９Ｓ［Ｃａｌ．ＭＷ＝９５３１．４９ Ｏｂｓ．ＭＷ＝９５３２，０９］
【００２７】
実施例４．抗−ヌクレオリン ＧＲＯアプタマー−ドキソルビシン付加（anti-Nucleolin GRO aptamer-Doxorubicin adduct）［ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加（AS1411-Dox adduct）］の合成
ＡＳ１４１１にドキソルビシン−ＨＣｌ（Doxorubicin-HCl）（アドリアマイシン−ＨＣｌ（Adramycin-HCl））を反応させて、ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加（AS1411-Dox adduct）を合成した。つまり、０．５ｍｌの緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．０）に２０ｕＭのＧＲＯ、１５０ｕＭのドキソルビシン−ＨＣｌ（Doxorubicin-HCl）、０．３７％ホルムアルデヒドを入れて１０℃で一晩振とうしながら反応を進行した。反応後、逆相（Reverse-phase）ＨＰＬＣ（Waters-Xbridge OST C18 10×50mm、0.1M TEAE/ACN緩衝液、260nm、490nm）により分離／精製した。分離精製した後、セントリコン（centricon）（ミリポア（Millipore）、MW3000 cut）を用いて濃縮および脱塩を行った。
ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加（AS1411-Dox adduct）は、ＨＰＬＣリテンションタイム（retention time）の確認とＵＶ−Ｖｉｓスペクトラ（spectra）、ＥＳＩ−ＭＳにより確認した（図１および図２）。
【００２８】
実施例５．ＣＲＯアプタマー−ドキソルビシン付加（CRO aptamer-Doxorubicin adduct）［ＣＲＯ−Ｄｏｘ付加（CRO-Dox adduct）］の合成
コントロールアプタマー（Control aptamer）にドキソルビシン−ＨＣｌ（Doxorubicin-HCl）（アドリアマイシン−ＨＣｌ（Adramycin-HCl））を反応してコントロール−Ｄｏｘ付加（control-Dox adduct）を合成した。つまり、０．５ｍｌの緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＥＤＴＡ；ｐＨ７．０）に２０ｕＭのコントロールアプタマー（Control aptamer）、１５０ｕＭのドキソルビシン−ＨＣｌ（Doxorubicin-HCl）、０．３７％ホルムアルデヒドを入れて１０℃で一晩振とうしながら反応を進行した。反応後、逆相（Reverse-phase）ＨＰＬＣ（Waters-Xbridge OST C18 10×50mm、0.1M TEAE/CAN緩衝液、260nm、490nm）により分離／精製した。分離精製した後、セントリコン（centricon）（ミリポア（Millipore）、MW3000 cut）を用いて濃縮および脱塩を行った。
ＣＲＯ−Ｄｏｘ付加（CRO-Dox adduct）は、ＨＰＬＣリテンションタイム（retention time）の確認とＵＶ−Ｖｉｓスペクトラ（spectra）、ＥＳＩ−ＭＳにより確認した。
【００２９】
実施例６．ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲートの合成
本発明者は、ＫＲ１０−１２７９５８４およびＵＳ９３０９５１５Ｂ２で出願したＥＲＢＢ２アプタマー［a6g66agag666gcc6gag6gcc6cgcaagggcg6aacaa、６＝ＮａｐｄＵ［５−（Ｎ−ナフチルカルボキシアミド）−２’−デオキシウリジン（5-(N-Naphthylcarboxyamide)-2´-deoxyuridine）］］からＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲートを合成した。細胞内でＢｃｌ−２を標的とするｓｉＲＮＡを末端部分にマレイミド基を有するように合成した。そしてＥＲＢＢ２アプタマーの末端には、チオール基で変形して合成した。チオール化したアプタマーとマレイミド−ｓｉＲＮＡを８ｍＭ スルフォ−ＳＭＰＢ（Sulfo-SMPB）とともに反応し、ＥＲＢＢ２アプタマーは、１０ｍＭ ＴＣＥＰが溶けているＰＢＳに３７℃、１時間反応して活性化した。そして、この２つの物質をセントリ-セップ（Centri-Sep）カラムで精製して準備し、２つの物質をよく混ぜた後、３７℃で２時間反応した。最後に、結合が完了した２つの物質をＰＡＧＥ精製し、ＵＶ分光光度計で定量した（図３）。
【００３０】
アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体の製造
実施例７．アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（ゾル−ゲルタイプ）組成物の製造
合成により製造したアプタマー−薬物（drug）コンジュゲートをＰＢＳに入れ、室温でミキサー（mixer）を用いて完全に溶かした。このようにして準備した試薬を高濃度アテロコラーゲン分散液と適正濃度０．５〜３．０％で混ぜて、室温でローテーターカフ（rotator cuff）装置を用いて３０分間混合液になるようにした。低い温度で液体状態（ゾル（Sol））であるアテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（ゾル−ゲルタイプ）は、生体内の腫瘍に直接注入時３７℃で固形化（ゲル（Gel））され、アプタマー−薬物コンジュゲート（ゾル−ゲルタイプ）を包んでいたアテロコラーゲンが徐々に溶けながら薬物が徐々に放出され、効果的な腫瘍治療剤として使用可能である（図４）。
１）膵臓がん：アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（Complex）（ゾル−ゲルタイプ）
２）乳がん：アテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Complex）（ゾル−ゲルタイプ）
３）肝臓がん：アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Dox Adduct]Complex）（ゾル−ゲルタイプ）
【００３１】
実施例８．アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体組成物の製造（パッチタイプ）
先に製造した高濃度コラーゲン分散液と合成されたアプタマー−薬物コンジュゲート（Aptamer-Drug Conjugate）をゾル−ゲルタイプと同様な方法により混合液を作成した。準備された混合液を４８ウエル細胞培養プレート（48 well cell culture Plate）に入れて拡散させて０．５ｍｍの均一な膜を形成した後、零下８０℃で凍結させた。凍結が完了した試料を−７０℃に維持された凍結乾燥機で３０時間凍結乾燥し、多孔性膜を製造した（図５）。
【００３２】
実施例９．アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体組成物の製造（スカフォールド（scaffold）タイプ）
生体適合性、生分解性天然高分子であるアテロコラーゲン分散液と合成されたアプタマー−薬物コンジュゲート（Aptamer-Drug Conjugate）を材料として、３次元構造を有するアテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（スカフォールドタイプ）を製造した。アテロコラーゲンが分解されて出てくるアプタマー−薬物コンジュゲートが、がん細胞に選択的に作用できるように結合した。製造には、３Ｄプロッター（3D plotter）にＳＦＦ（solid free−form fabrication）工程を適用し、製造方法としては、アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体混合溶液を精密ノズル（直径３００μｍ）が結合されたバレル（barrel）に注入し、３Ｄプロッター（3D plotter）を用いて、３７℃のプレート（Plate）に吐出圧力３００±５０ｋＰａ、フローティング速度５ｍｍ／ｓで固定して、３層（3 layer）の３次元アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（スキャナフォールドタイプ）を作製した。
【００３３】
また、格子構造の細胞担体を製造して空隙の効率を増加させ、アテロコラーゲンの様々な濃度（０．５、１．５、３．０ｗｔ％）で製造して、細胞担体の機械的強度や分解速度を調節できる３次元アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（スカフォールドタイプ）を製造した。アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（スカフォールドタイプ）細胞担体架橋には、ゲニピン（Genipin）を使用し、１％のゲニピン水溶液に２０℃の条件で２４時間架橋した（図６）。 
【００３４】
ｉｎ ｖｉｖｏ安定性の検証
実施例１０．アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体組成物の生体内安定性の実験（ゾル−ゲルタイプ）
【００３５】
【表１】
2020514402.tif 000003
【００３６】
Ｃｙ３で標識されたＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート（AS1411-Gem Conjugate）［Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート（Cy3-AS1411-Gem Conjugate）］およびアテロコラーゲン−［Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[Cy3-AS1411-Gem Conjugate]Complex）（ゾル−ゲルタイプ）を特定の濃度で、前記表に示すように準備した。前処理が完了したＣｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート（Cy3-AS1411-Gem Conjugate）およびアテロコラーゲン−［Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-［Cy3-AS1411-Gem Conjugate］Complex）（ゾル−ゲル型（Sol−Gel type））をヌードマウス（nude mouse）の皮下層に注射した後、日付別に蛍光の明るさの程度を測定する方法として、導入された部分にＣｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート（Cy3-AS1411-Gem Conjugate）がどれほど安定した状態で保たれるのかを観察した。そのために、蛍光測定装置のＩＶＩＳを用いて、３〜４日間隔で蛍光の程度を測定した。導出された結果を分析したところ、Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート（（Cy3-AS1411-Gem Conjugate））のみを動物に注入した場合、ほとんどが一日内に導入された部分から全身に広がって蛍光が消えることが確認できた。アテロコラーゲンと共に注入したアテロコラーゲン−［Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[Cy3-AS1411-Gem Conjugate]Complex）（ゾル−ゲルタイプ）の場合は、濃度が低い場合には、数日の間に徐々に広がることが観察された。そして、高濃度では、最長３５日後も少なくない量のＣｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート（（Cy3-AS1411-Gem Conjugate））が注入部位に存在することが確認された。したがってＣｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート（（Cy3-AS1411-Gem Conjugate））とアテロコラーゲンを複合体化（complex）した場合には、単独投与時よりも生体内で非常に安定して残っていることを確認した（図７ａおよび図７ｂ）。
【００３７】
実施例１１．アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（パッチタイプ）組成物の生体内安定性の実験
Ｃｙ３で標識されたＡＳ１４１１−Ｇｅｍ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ（ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート）［Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート（（Cy3-AS1411-Gem Conjugate））］およびアテロコラーゲン−［Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[Cy3-AS1411-Gem Conjugate]Complex）を凍結乾燥してシートに製作した。シートは５ｍｍと８ｍｍの大きさで０．５％、１．５％、３．０％の濃度のアテロコラーゲンを用いて製作した（図８）。
準備されたシートを、マウスの表皮層に移植して分解度を肉眼で確認した。０．５％と１％のシートは、５日内にすべて溶けて吸収されることが観察された。１．５％のシートは、５日経過時は一部残っていて、８日目にすべて溶けた。３．０％のシートは、８日経過後も完全に溶けずに維持されることが観察された（図９）。
【００３８】
実施例１２．アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（スカフォールドタイプ）組成物の生体内安定性の実験
アテロコラーゲンを３Ｄプラッター（3D plotter）を用いて、格子構造の３次元細胞担体として製作した。細胞担体は、５×５×２ｍｍ３、１０×１０×２ｍｍ３の大きさに０．５％、１．５％、３．０％の濃度のアテロコラーゲンを用いて製作し、生体内での分解速度を調節するために、１−エチル−（３−３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドヒドロクロリド（EDC、Sigma Chemical Co.，St．Louis、MO、USA）溶液で２４時間交差結合した。または生体適合性物質であるゲニピンを用いて架橋化した。このようにして得られた支持体は、超音波破砕機を使用して蒸留水で洗浄した後、−５０℃で再び冷凍乾燥処理を行った（図１０ａ、図１０ｂ）。
架橋化したスカフォールドを先に実施した方法と同様の方法で、マウスの表皮層に移植して経過を観察した。移植後８日が経過した時点でもほとんど分解されていないことが確認された。架橋化による分解速度の減少が顕著であることを確認した（図１１）。
Ｃｙ３−ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート（（Cy3-AS1411-Gem Conjugate））をこのスカフォールドに担持して電子顕微鏡で観察した（図１２）。
【００３９】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ効能の検証
実施例１３．アプタマー−薬物コンジュゲート（Aptamer-Drug Conjugate）の膵臓がんに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ効能
膵臓がん細胞株ＢｘＰＣ３、Ｍｉａｐａｃａ−２、Ｐａｎｃ−１、ｃａｐａｎ−１に対してＷＳＴ−１アッセイ（assay）を行った。膵臓がん細胞株でＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート（AS1411-Gem Conjugate）細胞阻害（cell inhibition）効能の検証をＷＳＴ−１アッセイ（assay）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。まず、抗がん剤が結合されていない裸の（naked）形態であるコントロールアプタマーＣＲＯ（control aptamer CRO）、および、がん細胞標的化機能を持っているＡＳ１４１１、そしてそれらにそれぞれ、膵臓がんに効果のある抗がん剤であるゲムシタビンが結合している形態のＣＲＯ−Ｇｅｍコンジュゲート（CRO-Gem Conjugate）およびＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート（AS1411-Gem Conjugate）を準備した（表２）。
【００４０】
【表２】
2020514402.tif 000004
【００４１】
Ｇｅｍ＝ゲムシタビン（gemcitabine）、ｎ＝１〜１０ 
【００４２】
ＷＳＴ−１アッセイにより細胞の細胞生存能力（cell viability）および増殖（proliferation）を比較したところ、ＡＳ１４１１アプタマーがコントロールアプタマー（control aptamer）であるＣＲＯよりも更に良い効果を示すことを確認し、既存の抗がん剤であるゲムシタビン単独処理の場合と比較しても優れた効能を示すことが確認された。
【００４３】
実験方法：
膵臓がん細胞株であるＢｘＰＣ３、Ｍｉａｐａｃａ−２、Ｐａｎｃ−１、ｃａｐａｎ−１（ATCC、RPMI+10％FBS）は、適正細胞濃度を決定するｃｅｌｌ ｔｅｓｔにより定められた細胞数（cell number）１〜２×１０４個／ウエル（well）を９６ウエルプレート（96 well Plate）に蒔種（seeding）した後、一日育てた。アプタマー（Aptamer）およびアプタマー−薬物コンジュゲート（Aptamer-Drug Conjugate）ＰＢＳに溶けており、０．１ｕＭで最大１００ｕＭの濃度で各ウエル（well）にすぐに処理した。処理された細胞（cell）は、５％ＣＯ２インキュベーター（incubator）で７２時間培養した後、ＷＳＴ−１アッセイ（assay）用試薬溶液（WST−1、Roche）を１０ｕｌずつ処理し、ＥＬＩＳＡリーダー（reader）機で４４０ｎｍでの吸光度を測定した（図１３）。
【００４４】
実施例１４．アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体の膵臓がんに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ効能
膵臓がん細胞株Ｍｉａｐａｃａ−２およびＭＣＦ−７に対してＷＳＴ−１アッセイ（assay）を行った。膵臓がん細胞株でアテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）の細胞阻害（cell inhibition）効能の検証をＷＳＴ−１アッセイ（assay）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。まず、抗がん剤が結合していない裸の（naked）形態であるコントロールアプタマー（control aptamer）ＣＲＯ、および、がん細胞標的化機能を持っているＡＳ１４１１、そしてそれらにそれぞれ、膵臓がんに効果のある抗がん剤であるゲムシタビンが結合している形態のアテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）およびアテロコラーゲン−［ＣＲＯ−Ｇｅｍ コンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[CRO-Gem Conjugate]Complex）を準備した。
【００４５】
ＷＳＴ−１アッセイ（assay）により細胞の細胞生存能力（cell viability）および増殖（proliferation）を比較したところ、アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）がアテロコラーゲン−［ＣＲＯ−Ｇｅｍコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[CRO-Gem Conjugate]Complex）よりも更に良い効果を示すことを確認し、既存の抗がん剤であるゲムシタビン（Gemcitabine）単独処理の場合と比較しても優れた効果を示すことが確認された。
【００４６】
実験方法：
膵臓がん細胞株であるＭｉａｐａｃａ−２およびＭＣＦ−７（ATCC、RPMI+10％FBS）は、適正細胞濃度を決定する細胞試験（cell test）により定められた細胞数（cell number）１〜２×１０４個／ウエル（well）を９６ウエルプレート（96 well Plate）に蒔種（seeding）した後、一日育てた。アプタマー（Aptamer）およびアテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[Aptamer-Drug Conjugate]Complex） ＰＢＳに溶けており、０．１ｕＭで最大１００ｕＭの濃度で各うえる（well）にすぐに処理した。処理された細胞（cell）は、５％ＣＯ２インキュベーター（incubator）で７２時間の間インキュベーション（incubation）させた後、ＷＳＴ−１アッセイ（assay）用試薬液（reagent solution）（WST−1、Roche）を１０μＬずつ処理し、ＥＬＩＳＡリーダー（reader）機で４４０ｎｍでの吸光度を測定した（図１４）。
【００４７】
実施例１５．ＥＲＢＢ２アプタマー−薬物コンジュゲート（ERBB2 Aptamer-Drug Conjugate）の乳がんに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ効能
乳がん標的細胞に対するターゲティングを確認するために、ｓｉＲＮＡにＣｙ３に変形されたＥＲＢＢ２アプタマー−リンカー−ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３（ERBB2 aptamer-linker-siRNA-Cy3）と、対照群であるｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３を製作した。ＥＲＢＢ２が過発現されたＭＣＦ７細胞ライン（cell line）にこの２つの合成物質を処理して蛍光顕微鏡で確認した。何の処理もしていないものとＣｙ３のみが結合しているｓｉＲＮＡ対照群の場合には、細胞が蛍光を示さないことが確認され、ＥＲＢＢ２アプタマー（ERBB2 aptamer）が結合しているものにおいてのみ蛍光を示すことが確認された。この結果から、アプタマーによる標的化によってｓｉＲＮＡが標的細胞に正確に伝達されることを確認することができる（図１５）。
【００４８】
そして、乳がん細胞株ＢＴ−４７４、ＭＣＦ−７に対してＷＳＴ−１アッセイを行った。乳がん細胞株細胞ライン（cell line）でＥＲＢＢ２アプタマーの細胞阻害（cell inhibition）効能の検証をＷＳＴ−１アッセイ（assay）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。活性効果のないコントロールＥＲＢＢ２アプタマー（control ERBB2 aptamer）と、がん細胞標的化機能を持っているＥＲＢＢ２標的アプタマーに、抗がん効果に優れた抗がん剤であるｓｉＲＮＡが結合しているＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ERBB２ aptamer-siRNA Conjugate）を乳がん細胞株に処理してＷＳＴ−１アッセイ（assay）を行った。細胞の細胞生存能力（cell viability）および増殖（proliferation）を比較したところ、ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ERBB２アプタマー-siRNA Conjugate）がＥＲＢＢ２アプタマーよりも更に良い効果を示すことを確認し、乳がん細胞株において優れた効能を示すことが確認された（図１６）。
【００４９】
実施例１６．アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体の乳がんに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ効能
乳がん細胞株ＢＴ−４７４とＭＣＦ−７細胞ライン（cell line）でアテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）の細胞阻害（cell inhibition）効能の検証をＷＳＴ−１アッセイ（assay）により行った。裸の（naked）ＥＲＢＢ２と活性効果のないＡｔｅｌｏｃｏｌｌａｇｅｎ−［ｃｏｎｔｒｏｌ ａｐｔａｍｅｒ−ｓｉＲＮＡ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ］Ｃｏｍｐｌｅｘ、そしてがん細胞標的化機能を持っているＥＲＢＢ２標的アプタマーに、抗がん効果に優れた抗がん剤であるｓｉＲＮＡが結合しているアテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）を乳がん細胞株に処理してＷＳＴ−１アッセイ（assay）を行った。細胞の細胞生存能力（cell viability）および増殖（proliferation）を比較したところ、ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート（ERBB２ aptamer-siRNA Conjugate）が対照群であるアテロコラーゲン−［コントロールアプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体アプタマー（Atelocollagen-[control aptamer-siRNA Conjugate]Complex aptamer）よりも優れた効能を示すことが確認された（図１７）。
【００５０】
実施例１７．ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加（AS1411-Dox Adduct）の肝臓がんに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ効能
前述の実験と同様の方法により肝臓がん細胞株ＨｅｐＧ２、Ｈｕｈ−７でアプタマー−薬物コンジュゲート（aptamer-drug conjugate）であるＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加（AS1411-Dox adduct）と、コントロールアプタマー（control aptamer）のコントロール−Ｄｏｘ付加（control-Dox adduct）をもって、細胞阻害（cell inhibition）効能の検証をＷＳＴ−１アッセイ（assay）によりｉｎ ｖｉｔｒｏで確認した。コントロール−Ｄｏｘ付加（control-Dox adduct）と比較したところ、ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加（AS1411-Dox adduct）が肝臓がん細胞株でにおいて優れた効能を示すことが確認され、組成物の活性能力を検証した（図１８）。
【００５１】
実施例１８．アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物コンジュゲート］複合体の肝臓がんに対するｉｎ ｖｉｔｒｏ効能
実施例１７と同様の方法で肝臓がん細胞株を準備し、抗がん効果のあるアテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Dox Adduct]Complex）、標的化機能のないアテロコラーゲン−［ＣＲＯ−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[CRO-Dox Adduct]Complex）、そしてアテロコラーゲン−Ｄｏｘ（Atelocollagen-Dox）を処理してＷＳＴ−１アッセイ（assay）で効能の検証を行った。予想通り、標的化機能のあるアテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Dox Adduct]Complex）が対照群であるアテロコラーゲン−［ＣＲＯ−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[CRO-Dox Adduct]Complex）と比較して優れた効能を示すことが観察された。コラーゲンとＤｏｘ単独投与時には、非選択的に細胞に透過による細胞阻害（cell inhibition）が観察された（図１９）。
【００５２】
ｉｎ ｖｉｖｏ効能の検証
実施例１９．アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍ コンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）（ゾル−ゲル型（Sol-Gel type））の膵臓がん動物モデルの効能の検証
動物モデルの作成：６週齢Ｂａｌｂ／ｃヌード雌マウス（nude female mouse）を用いて、腫瘍ｉｎ ｖｉｖｏモデルを作成した。実験に使用されたマウスの平均体重は、２０ｇであった。ヒトに由来する膵臓細胞株であるｃａｐａｎ−１細胞をＡＴＣＣ社から購入して増殖させた。増殖されたｃａｐａｎ−１細胞を５×１０７細胞数分の量でマウスに皮下注射して腫瘍を形成した。注射後２〜３週間毎日観察して腫瘍の成長を肉眼で確認し、キャリパー（caliper）を使用して腫瘍の大きさを測定した。
複合体の効能の検証：腫瘍が適当な大きさに成長した後、前記表３に示すようなアテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍ コンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）（ゾル−ゲル型（Sol-Gel type））をマウスの腫瘍部位に注射器で直接注入した（表３）。
【００５３】
【表３】
2020514402.tif 000005
【００５４】
そして、アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍ コンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）（ゾル−ゲル型（Sol-Gel type））の抗がん効果を測定するために、一定期間、腫瘍のサイズ変化と移植体の重量変化を観察した（図２０および図２１）。
【００５５】
対照群の０．５％アテロコラーゲンのみを注入した場合と比較したところ、優れたがん抑制効能を示し、濃度が高いほど効果が増加することを観察した（図２２）。 
【００５６】
複合体の移植後３０日が経過した時点で各グループの腫瘍を摘出した。その後、各々の重量を測定し、写真を撮影して実際の腫瘍サイズを比較した（図２３）。
【００５７】
実施例２０．アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍ コンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）（パッチ型（patch type））およびアテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍ コンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）（スカフォールド型（scaffold type））の膵臓がん動物モデルの効能の検証 
【００５８】
【表４】
2020514402.tif 000006
【００５９】
実施例１９の方法で腫瘍動物モデルを作成し、実施例８および９の方法で製造したアテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍ コンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）（パッチ型（patch type））およびアテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍ コンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）（スカフォールド型（scaffold type））を腫瘍周囲に移植した（図２４）。
【００６０】
移植されたアテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍ コンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）（パッチ型（patch type））およびアテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍ コンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）（スカフォールド型（scaffold type））の抗がん効果を測定するために、一定期間、腫瘍のサイズ変化と移植体の重量変化を観察した。アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍ コンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）（スカフォールド型（scaffold type））がアテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｇｅｍ コンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Gem Conjugate]Complex）（パッチ型（patch type））よりも更に良い抗がん効果を示すことを確認した（図２５）。 
【００６１】
実施例２１．アテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（Sol−Gel type）の乳がん動物モデルの効能の検証
動物モデルの作成：６週齢Ｂａｌｂ／ｃヌード雌マウス（nude female mouse）を用いて、腫瘍ｉｎ ｖｉｖｏモデルを作成した。実験に使用されたマウスの平均体重は、２０ｇであった。ヒトに由来する乳がん細胞株であるＢＴ−４７４細胞をＡＴＣＣ社から購入して増殖させた。増殖されたＢＴ−４７４細胞を１×１０７細胞数分の量でマウスに皮下注射して腫瘍を形成した。注射後２〜３週間毎日観察して腫瘍の成長を肉眼で確認し、キャリパー（caliper）を使用して腫瘍の大きさを測定した。 
【００６２】
【表５】
2020514402.tif 000007
【００６３】
アテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（ゾル−ゲルタイプ）の効能の検証：腫瘍が適当な大きさに成長した後、前記表４に示すようなアテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（ゾル−ゲルタイプ）をマウスの腫瘍部位に注射器で直接注入した。そして、アテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（ゾル−ゲル型（Sol−Gel type））の抗がん効果を測定するために、一定期間、腫瘍のサイズ変化と移植体の重量変化を観察した。対照群の０．５％アテロコラーゲンのみを注入した場合と比較したところ、優れたがん抑制効能を示すことを観察した（図２６）。
【００６４】
アテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（ゾル−ゲルタイプ）の注入後３０日が経過した時点で各グループの腫瘍を摘出した。その後、写真を撮影して実際の腫瘍サイズを比較した（図２７）。 
【００６５】
実施例２２．アテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（パッチタイプ）およびアテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（スカフォールドタイプ）の乳がん動物モデルの効能の検証
実施例２１の方法で腫瘍動物モデルを作成し、実施例７および８の方法で製造したアテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（パッチタイプ）、およびアテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（スカフォールドタイプ）を腫瘍周囲に移植した。
移植されたアテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（パッチタイプ）、およびアテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（スカフォールド型（scaffold type））の抗がん効果を測定するために、一定期間、腫瘍のサイズ変化と移植体の重量変化を観察した。アテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（スカフォールドタイプ）がアテロコラーゲン−［ＥＲＢＢ２アプタマー−ｓｉＲＮＡコンジュゲート］複合体（Atelocollagen-[ERBB2 aptamer-siRNA Conjugate]Complex）（パッチタイプ）よりも更に良い抗がん効果を示すことを確認した（図２８）。
【００６６】
実施例２３．アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Dox adduct]Complex）（ゾル−ゲル型（Sol-Gel type））の肝臓がん動物モデルの効能の検証
動物モデルの作成：６週齢Ｂａｌｂ／ｃヌード雌マウス（nude female mouse）を用いて、腫瘍ｉｎ ｖｉｖｏモデルを作成した。実験に使用されたマウスの平均体重は、２０ｇであった。ヒトに由来する肝臓がん細胞株であるＨｕｈ−７細胞をＡＴＣＣ社から購入して増殖させた。増殖されたＨｕｈ−７細胞を５×１０６細胞数分の量でマウスに皮下注射して腫瘍を形成した。注射後２〜３週間毎日観察して腫瘍の成長を肉眼で確認し、キャリパー（caliper）を使用して腫瘍の大きさを測定した。
【００６７】
【表６】
2020514402.tif 000008
【００６８】
アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Dox adduct]Complex）（ゾル−ゲル型（Sol-Gel type））の効能の検証：
腫瘍が適当な大きさに成長した後、前記表５に示すようなアテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Dox adduct]Complex）（ゾル−ゲル型（Sol−Gel type）を注射器でマウスの腫瘍に直接注入した。そして、複合体の抗がん効果を測定するために、一定期間、腫瘍のサイズ変化と移植体の重量変化を観察した。対照群の０．５％アテロコラーゲンのみを注入した場合と、活性のないアテロコラーゲン−［ＣＲＯ−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[CRO-Dox adduct]Complex）（ゾル−ゲル型（Sol-Gel type））と比較したところ、アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Dox adduct]Complex）（ゾル−ゲル型（Sol-Gel type））が優れたがん抑制効果を示すことが観察された（図２９）。
【００６９】
アテロコラーゲン−［ＡＳ１４１１−Ｄｏｘ付加］複合体（Atelocollagen-[AS1411-Dox adduct]Complex）（ゾル−ゲル型（Sol−Gel type））の移植後３０日が経過した時点で各グループの腫瘍を摘出した。その後、写真を撮影して実際の腫瘍サイズを比較した（図３０）。
【産業上の利用可能性】
【００７０】
本発明の複合体は、体内で安定であり、抗がん治療剤、抗炎症治療剤に適用可能である。
【図１】
2020514402.tif 000009
【図２】
2020514402.tif 000010
【図３】
2020514402.tif 000011
【図４】
2020514402.tif 000012
【図５】
2020514402.tif 000013
【図６】
2020514402.tif 000014
【図７ａ】
2020514402.tif 000015
【図７ｂ】
2020514402.tif 000016
【図８】
2020514402.tif 000017
【図９ａ】
2020514402.tif 000018
【図９ｂ】
2020514402.tif 000019
【図１０ａ】
2020514402.tif 000020
【図１０ｂ】
2020514402.tif 000021
【図１１】
2020514402.tif 000022
【図１２ａ】
2020514402.tif 000023
【図１２ｂ】
2020514402.tif 000024
【図１３】
2020514402.tif 000025
【図１４】
2020514402.tif 000026
【図１５】
2020514402.tif 000027
【図１６】
2020514402.tif 000028
【図１７】
2020514402.tif 000029
【図１８】
2020514402.tif 000030
【図１９】
2020514402.tif 000031
【図２０】
2020514402.tif 000032
【図２１】
2020514402.tif 000033
【図２２】
2020514402.tif 000034
【図２３ａ】
2020514402.tif 000035
【図２３ｂ】
2020514402.tif 000036
【図２４】
2020514402.tif 000037
【図２５ａ】
2020514402.tif 000038
【図２５ｂ】
2020514402.tif 000039
【図２６】
2020514402.tif 000040
【図２７】
2020514402.tif 000041
【図２８】
2020514402.tif 000042
【図２９】
2020514402.tif 000043
【図３０】
2020514402.tif 000044
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月27日(2019.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アプタマーおよび前記アプタマーに結合した薬物からなるアプタマー−薬物コンジュゲートをアテロコラーゲン分散液に混合して得られたアテロコラーゲン−［アプタマー−薬物］複合体を含み、
前記アプタマーは、配列番号１の配列からなるＡＳ１４１１、配列番号２の配列からなるＣＲＯおよび化学式１で表されるＥＲＢＢ２からなる群より選択される一つであり、前記薬物は、ゲムシタビン、ドキソルビシンおよびｓｉＲＮＡからなる群より選択される一つである薬物伝達体。
【化１】
2020514402.tif 000045
（前記６は、ＮａｐｄＵ（５−（Ｎナフチルカルボキシアミド）−２'−デオキシウリジン）である。）
【請求項２】
前記アテロコラーゲン分散液は、アテロコラーゲンＮａＯＡｃ／ＨＡｃ溶液をＴＦＦ（タンジェンシャルフロー・フィルトレーション）によりＰＢＳ溶液でダイアフィルトレーションして得られたものである、請求項１に記載の薬物伝達体。
【請求項３】
前記アプタマー−薬物コンジュゲートは、ＰＢＳ分散液の状態でアテロコラーゲンＰＢＳ分散液と混合して得られたものである、請求項１に記載の薬物伝達体。
【請求項４】
前記複合体は、固形化されてアプタマー−薬物コンジュゲートを包んでいるアテロコラーゲンが体温により溶けるゾル−ゲル型である、請求項３に記載の薬物伝達体。
【請求項５】
前記複合体は、ゾル型の複合体を細胞培養プレートに入れて拡散させて膜を形成し、これを凍結乾燥した多孔性膜状である、請求項３に記載の薬物伝達体。
【請求項６】
前記複合体は、ゾル型の複合体をノズルが結合されたバレルに注入し、３Ｄプラッターを用いてプレートに吐出して得られたスカフォールド型である、請求項３に記載の薬物伝達体。
【請求項７】
前記アプタマー−薬物コンジュゲートは、ＡＳ１４１１とゲムシタビンのコンジュゲートである、請求項１に記載の薬物伝達体。
【請求項８】
前記アプタマー−薬物コンジュゲートは、ゲムシタビン−（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−マレイミドカプロイル−Ｓ−（ＣＨ２）６）−ｔｔｔ−ＡＳ１４１１、ゲムシタビン−（Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−マレイミドカプロイル−Ｓ−（ＣＨ２）６）−ｔｔｔ−ＣＲＯ、ＡＳ１４１１−ドキソルビシン付加、ＣＲＯ−ドキソルビシン付加またはＥＲＢＢ２−ｓｉＲＮＡコンジュゲートである、請求項１に記載の薬物伝達体。
【請求項９】
請求項１に記載の薬物伝達体を含む抗がん組成物。
【請求項１０】
前記抗がん組成物は、がん手術前の患者に投与して腫瘍の大きさを縮小するためのものである、請求項９に記載の抗がん組成物。
【請求項１１】
前記抗がん組成物は、がん手術後の患者に投与して残存がん細胞を除去するためのものである、請求項９に記載の抗がん組成物。
【請求項１２】
前記がんは、膵臓がん、乳がんまたは肝臓がんである、請求項９に記載の抗がん組成物。
【請求項１３】
前記アプタマー−薬物コンジュゲートは、ＡＳ１４１１とゲムシタビンのコンジュゲートである、請求項９に記載の抗がん組成物 。
【請求項１４】
アプタマー−薬物コンジュゲート分散液をアテロコラーゲン分散液と混合して、アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物］複合体を得るステップを含み、
前記アプタマーは、配列番号１の配列からなるＡＳ１４１１、配列番号２の配列からなるＣＲＯおよび化学式１で表されるＥＲＢＢ２からなる群より選択される一つであり、前記薬物は、ゲムシタビン、ドキソルビシンおよびＢｃｌ−２をターゲットとするｓｉＲＮＡからなる群より選択される一つである薬物伝達体の製造方法。
【化２】
2020514402.tif 000046
（前記６は、ＮａｐｄＵ（５−（Ｎナフチルカルボキシアミド）−２'−デオキシウリジン）である。）
【請求項１５】
アテロコラーゲンＮａＯＡｃ／ＨＡｃ溶液をＴＦＦ（タンジェンシャルフロー・フィルトレーション）によりＰＢＳ溶液でダイアフィルトレーションして前記アテロコラーゲン分散液を得るステップをさらに含む、請求項１４に記載の薬物伝達体の製造方法。
【請求項１６】
前記アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物］複合体の分散液を細胞培養プレートに入れて拡散させて膜を形成し、凍結乾燥して多孔性膜を得るステップをさらに含む、請求項１４に記載の薬物伝達体の製造方法。
【請求項１７】
前記アテロコラーゲン−［アプタマー−薬物］複合体の分散液をノズルが結合されたバレルに注入し、３Ｄプラッターでプレートに吐出して得られたスカフォールド型を得るステップをさらに含む、請求項１４に記載の薬物伝達体の製造方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020514402000001.app
【国際調査報告】
2020514402.tif 000047
2020514402.tif 000048
2020514402.tif 000049
2020514402.tif 000050