(57)【要約】  本発明は、ＴＮＦαに結合し、改変ＦｃＲｎ結合を示す抗体に関する。本発明の抗体は、良好なエフェクター機能および／または薬物動態学的特性を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｐＨ６で５００ｎＭ未満の解離平衡定数（ＫＤ）を特徴とするヒトＦｃＲｎへの高親和性を有し、さらに、ｐＨ７．４で１０μＭより大きいＫＤを特徴とするヒトＦｃＲｎへの無親和性または低親和性を有する、ＴＮＦα結合ドメインおよびＦｃＲｎ結合部位を含む抗体であって、抗体のアミノ酸配列が、アミノ酸３８０Ａおよび４３４Ａを含む、抗体。
【請求項２】
前記抗体の前記アミノ酸配列が、アミノ酸３０７Ｔをさらに含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
インフリキシマブの親和性より大きいｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する親和性を有する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒトＦｃＲｎに対する前記高親和性が、３００ｎＭ未満の解離定数ＫＤを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
ヒトＴＮＦαに１００ｐＭ未満のＫＤで結合する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項６】
インフリキシマブより多くの量で、頂端側から側底側へ分極細胞単層を横切って輸送される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
前記分極細胞単層を横切って輸送される抗体の量が、前記分極細胞単層を横切って輸送される親免疫グロブリンの量の２倍より大きく、前記親免疫グロブリンが、前記抗体とは、前記親免疫グロブリンがアミノ酸３８０Ｅおよび４３４Ｎを含むという点のみで異なる、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
１０倍過剰量の競合免疫グロブリンの存在下で、インフリキシマブよりも大きなパーセンテージの抗体が頂端側から側底側へ分極細胞単層を横切って輸送され、前記パーセンテージが前記分極細胞単層を横切って輸送される免疫グロブリンの総質量を意味する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項９】
非フコシル化抗体である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸。
【請求項１１】
炎症状態の治療に使用するための請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記炎症状態が胃腸管の炎症性疾患である、請求項１１に記載の使用するための抗体。
【請求項１３】
前記治療が、有効量の前記抗体を経口投与することを含む、請求項１１に記載の使用するための抗体。
【請求項１４】
前記抗体が局所的に適用される、請求項１１または１２に記載の使用するための抗体。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項１６】
ＴＮＦαに対する抗体のトランスサイトーシスを改善する方法であって、前記抗体のアミノ酸配列中に置換Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａを導入することを含む、方法。
【請求項１７】
ＴＮＦαに対する抗体の血漿中半減期を延長する方法であって、前記抗体のアミノ酸配列中に置換Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａを導入することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善されたエフェクター機能および／または薬物動態学的特性を有する改変抗体に関する。この抗体は、種々の障害、特に炎症状態の治療的処置に有用である。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、この２０年にわたり、臨床医学における治療用の薬剤として重要性がますます増大している。長年にわたり、抗体の潜在的免疫原性を減らすように改善する努力に注力され、ヒト化あるいは完全ヒト抗体に繋がった。別の手法は、エフェクター機能を改善することにより抗体を最適化することを目指している。直接的効果は、抗体の可変抗原結合領域により媒介され、間接的効果は、定常Ｆｃ領域により媒介される。エフェクター機能を改善する努力は、主として、Ｆｃ領域の調節に対し集中的に行われている。さらに、治療抗体の血清半減期の改善が望ましく、これは、必要な抗体の量を減らし、治療間隔を延ばすことにより、患者の利便性を高め得る。
【０００３】
治療用途に対しては、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、いくつかの理由で好ましい選択のクラスとなっている；ＩｇＧは精製が容易で、保存時に比較的安定であり、静脈内投与可能であり、インビボで長い生物学的半減期を有し、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の活性化および種々のＦｃ受容体相互作用（抗体依存性細胞傷害；ＡＤＣＣ）を介したエフェクター細胞の動員などの一連の生物学的エフェクター機能に関与できる。５つの免疫グロブリンクラス中で、ＩｇＧは、ＩｇＧリサイクリング受容体の新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）との独特な相互作用に起因して、最長の生物学的半減期を示す。受容体の既知の機能の１つは、触媒分解からＩｇＧを救出することである。溶解したＦｃＲｎ−Ｆｃ共結晶構造体は、Ｆｃとの相互作用がＩｇＧヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ−３領域で起こることを示した。この相互作用は、厳密にｐＨ依存性方式であり、エンドソーム中、６．０〜６．５の酸性ｐＨで起こる。結合ＩｇＧ分子は、細胞表面に戻され、そこで、７．４の生理学的ｐＨで循環中に放出され、一方、複合体化していないＩｇＧ分子は、リソソーム分解に向かう運命にある。このリサイクルは、ＩｇＧの半減期延長の機序であり；従って、ＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用の調節は、ガンマ免疫グロブリンおよびＦｃ融合タンパク質の血清半減期の特異的制御を可能とする。
【０００４】
用途によっては、ＩｇＧの血清中滞留時間を延長するまたは短縮することが望ましい場合がある。治療用途に対しては、少ない用量およびより少ない回数の注射でよいので、より長い半減期が望ましい。半減期を延長するためのいくつかの手法が研究されてきており、それらには、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の使用、アルブミンまたはＦｃ融合タンパク質の生成、およびＦｃＲｎ−ＩｇＧ相互作用の強化が含まれる。ペグ化医薬品は、１９９０年以来既に医院に存在し、ペグ化は血液中の薬物滞留時間の延長のための確立された技術である。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）はまた、ｐＨ依存性相互作用を介してＦｃＲｎによりリサイクルされるので、安定性および半減期を向上させるいくつかのアルブミン融合タンパク質も作製された。さらに、アルブミンまたはアルブミン結合ドメインに融合した抗体フラグメントは、前臨床試験で血清中滞留時間の延長を実証した。Ｆｃ融合タンパク質の生成は、タンパク質またはペプチドに対し、無処理の抗体と類似の特性を与えるための別の方策である。
【０００５】
研究されているＦｃ領域の改変については、Ｓａｘｅｎａ（２０１６）Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７，Ａｒｔｉｃｌｅ  ５８０にまとめられている。種々のＦｃ変異は、国際公開第１９９８／０２３２８９Ａ１号、同第２０００／０４２０７２Ａ２号、同第２０１０／１０６１８０Ａ２号および同第２０１４／１０８１９８Ａ１号にさらに記載されている。
【０００６】
改善されたエフェクター機能および／または薬物動態学を有する抗体に対し、現在も継続したニーズがある。
【発明の概要】
【０００７】
本出願の発明者らは、抗体Ｆｃ領域中のある特定の変異が、ｐＨ６でのＦｃＲｎに対する抗体の親和性を高め、一方で、ｐＨ７．４での親和性は低いままであるということを見出した。変異を有する抗体は、薬物動態学的特性を改善した。さらに、本発明の好ましい抗体バリアントは、それらそれぞれの親野性型抗体よりも良好なＴ細胞増殖阻害作用を有する。
【０００８】
従って、本発明は、下記項目［１］〜［９１］で定義の主題に関する：
［１］ｐＨ６で５００ｎＭ未満の解離平衡定数（ＫＤ）を特徴とするヒトＦｃＲｎへの高親和性を有し、さらに、ｐＨ７．４で１μＭより大きいＫＤを特徴とするヒトＦｃＲｎへの低親和性を有する、ＴＮＦα結合ドメインおよびＦｃＲｎ結合部位を含む抗体であって、抗体のアミノ酸配列が、アミノ酸３８０Ａおよび４３４Ａを含む、抗体。
［２］抗体が、位置４３４でアスパラギンをアラニンで置換（Ｎ４３４Ａ）することにより得られる、項目［１］に記載の抗体。
［３］抗体が、位置３８０でグルタミン酸をアラニンで置換（Ｅ３８０Ａ）することにより得られる、項目［１］または［２］に記載の抗体。
［４］抗体のアミノ酸配列の位置３０７のアミノ酸がアラニンとは異なる、項目［１］〜［３］のいずれか１項に記載の抗体。
［５］抗体のアミノ酸配列が、アミノ酸３０７Ｔをさらに含む、項目［１］〜［４］のいずれか１項に記載の抗体。
［６］配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含む重鎖を含む、項目［１］〜［５］のいずれか１項に記載の抗体。
［７］インフリキシマブ（ＩＦＸ）の親和性より大きいｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する親和性を有する、項目［１］〜［６］のいずれか１項に記載の抗体
［８］ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する前記高親和性が、４００ｎＭ未満の解離定数ＫＤを特徴とする、項目［１］〜［７］のいずれか１項に記載の抗体。
［９］ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する前記高親和性が、３００ｎＭ未満の解離定数ＫＤを特徴とする、項目［１］〜［８］のいずれか１項に記載の抗体。
［１０］ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する前記高親和性が、２００ｎＭ未満の解離定数ＫＤを特徴とする、項目［１］〜［９］のいずれか１項に記載の抗体。
［１１］ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する前記高親和性が、１５０ｎＭ未満の解離定数ＫＤを特徴とする、項目［１］〜［１０］のいずれか１項に記載の抗体。
［１２］ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する前記高親和性が、５ｎＭ〜５００ｎＭ、または１０ｎＭ〜４００ｎＭ、または２５ｎＭ〜３００ｎＭ、または５０ｎＭ〜２００ｎＭ、または７５ｎＭ〜１５０ｎＭの範囲の解離定数ＫＤを特徴とする、項目［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の抗体。
［１３］ｐＨ６での高親和性を特徴付ける前記ＫＤが、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）により測定される、項目［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の抗体。
［１４］ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する前記低親和性が、１０μＭよりＫＤを特徴とする、項目［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の抗体。
［１５］ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する低親和性を特徴付ける前記ＫＤが、ＳＰＲにより測定される、項目［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の抗体。
［１６］ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する親和性が非常に低いため、ＫＤ値がＳＰＲにより測定できない、項目［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の抗体。
［１７］ヒトＴＮＦαに２００ｐＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の抗体。
［１８］ヒトＴＮＦαに１００ｐＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［１７］のいずれか１項に記載の抗体。
［１９］ヒトＴＮＦαに５０ｐＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［１８］のいずれか１項に記載の抗体。
［２０］ヒトＴＮＦαに２５ｐＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［１９］のいずれか１項に記載の抗体。
［２１］ヒトＴＮＦαに１０ｐＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［２０］のいずれか１項に記載の抗体。
［２２］頂端側から側底側へ分極細胞単層を横切って輸送される、項目［１］〜［２１］のいずれか１項に記載の抗体。
［２３］配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含む対照抗体より多くの量で頂端側から側底側へ分極細胞単層を横切って輸送される、項目［１］〜［２２］のいずれか１項に記載の抗体。
［２４］インフリキシマブより多くの量で、頂端側から側底側へ分極細胞単層を横切って輸送される、項目［１］〜［２３］のいずれか１項に記載の抗体。
［２５］分極細胞単層を横切って輸送される抗体の量が、分極細胞単層を横切って輸送されるインフリキシマブの量の２倍より大きい、項目［２４］に記載の抗体。
［２６］前記量が、４時間以内に分極細胞単層を横切って輸送される抗体の質量を意味する、項目［２３］〜［２５］のいずれか１項に記載の抗体。
［２７］分極細胞単層を横切って輸送される抗体の量が、分極細胞単層を横切って輸送される親免疫グロブリンの量の２倍より大きく、前記親免疫グロブリンが、前記抗体とは、そのＦｃ領域が野生型アミノ酸のみを有するという点のみで異なる、項目［２２］〜［２６］のいずれか１項に記載の抗体。
［２８］分極細胞単層を横切って輸送される抗体の量が、分極細胞単層を横切って輸送される親免疫グロブリンの量の２倍より大きく、前記親免疫グロブリンが、前記抗体とは、前記親免疫グロブリンがアミノ酸３８０Ｅおよび４３４Ｎを含むという点のみで異なる、項目［２２］〜［２７］のいずれか１項に記載の抗体。
［２９］１０倍過剰の競合免疫グロブリンの存在下で、インフリキシマブよりも大きなパーセンテージの抗体が頂端側から側底側へ分極細胞単層を横切って輸送され、このパーセンテージが分極細胞単層を横切って輸送される免疫グロブリンの総質量を意味する、項目［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の抗体。
［３０］分極細胞単層を横切って輸送される抗体のパーセンテージが、分極細胞単層を横切って輸送される親免疫グロブリンのパーセンテージの２倍より大きく、前記親免疫グロブリンが、前記抗体とは、前記親免疫グロブリンのＦｃ領域が野生型アミノ酸のみを有するという点のみで異なる、項目［２９］に記載の抗体。
［３１］分極細胞単層を横切って輸送される抗体のパーセンテージが、分極細胞単層を横切って輸送される親免疫グロブリンのパーセンテージの２倍より大きく、前記親免疫グロブリンが、前記抗体とは、前記親免疫グロブリンがアミノ酸３８０Ｅおよび４３４Ｎを含むという点のみで異なる、項目［２９］または［３０］に記載の抗体。
［３２］前記分極細胞単層が分極Ｔ８４細胞の単層である、項目［２２］〜［３１］のいずれか１項に記載の抗体。
［３３］ＣＤ６４に１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［３２］のいずれか１項に記載の抗体。
［３４］ＣＤ３２ａ（Ｈ）に１０μＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［３３］のいずれか１項に記載の抗体。
［３５］ＣＤ３２ａ（Ｒ）に１０μＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［３４］のいずれか１項に記載の抗体。
［３６］ＣＤ３２ｂに１０μＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［３５］のいずれか１項に記載の抗体。
［３７］ＣＤ１６ａ（Ｖ）に１０００ｎＭ未満、好ましくは１００ｎＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［３６］のいずれか１項に記載の抗体。
［３８］ＣＤ１６ａ（Ｆ）に１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［３７］のいずれか１項に記載の抗体。
［３９］ＣＤ１６ｂ（ＮＡ２）に１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［３８］のいずれか１項に記載の抗体。
［４０］ヒトＣ１ｑに結合できる、項目［１］〜［３９］のいずれか１項に記載の抗体。
［４１］ウサギ補体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を有する、項目［１］〜［４０］のいずれか１項に記載の抗体。
［４２］抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有する、項目［１］〜［４１］のいずれか１項に記載の抗体。
［４３］ＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋マクロファージを誘導できる、項目［１］〜［４２］のいずれか１項に記載の抗体。
［４４］インフリキシマブ以上のレベルでＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋マクロファージを誘導できる、項目［１］〜［４３］のいずれか１項に記載の抗体。
［４５］Ｔ細胞増殖を抑制できる、項目［１］〜［４４］のいずれか１項に記載の抗体。
［４６］インフリキシマブ以上の程度でＴ細胞増殖を抑制できる、項目［１］〜［４５］のいずれか１項に記載の抗体。
［４７］非フコシル化抗体またはフコシル化が低減した抗体である、項目［１］〜［４６］のいずれか１項に記載の抗体。
［４８］（ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＬドメイン、および（ｉｉ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨドメインを含む、項目［１］〜［４７］のいずれか１項に記載の抗体。
［４９］配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、項目［１］〜［４８］のいずれか１項に記載の抗体。
［５０］配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含む、項目［１］〜［４９］のいずれか１項に記載の抗体。
［５１］前記抗体が、（ｉ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＬドメイン、および（ｉｉ）配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨドメインを含む、項目［１］〜［４７］のいずれか１項に記載の抗体。
［５２］配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む、項目［５１］に記載の抗体。
［５３］配列番号２３または配列番号２４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖および配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する重鎖を含む、項目［５１］または［５２］に記載の抗体。
［５４］前記抗体がヒトＴＮＦαに特異的に結合する、項目［１］〜［５３］のいずれか１項に記載の抗体。
［５５］前記抗体がＴＮＦβに有意に結合しない、項目［１］〜［５４］のいずれか１項に記載の抗体。
［５６］前記抗体が、
（ｉ）ヒトＴＮＦαに１２５ｐＭ未満の解離定数（ＫＤ）で結合する；
（ｉｉ）アカゲザルＴＮＦαおよびカニクイザルＴＮＦαと交差反応性である；
（ｉｉｉ）Ｌ９２９アッセイで測定して、インフリキシマブよりもより強力な効力を有する；および／または
（ｉｖ）少なくとも２の化学量論比（抗体：ＴＮＦαＴｒｉｍｅｒ）でヒトＴＮＦαＴｒｉｍｅｒに結合できる、項目［１］〜［５５］のいずれか１項に記載の抗体。
［５７］アカゲザル由来のＴＮＦαに１ｎＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［５６］のいずれか１項に記載の抗体。
［５８］カニクイザル由来のＴＮＦαに１ｎＭ未満のＫＤで結合する、項目［１］〜［５７］のいずれか１項に記載の抗体。
［５９］Ｌ９２９アッセイで決定されたインフリキシマブの効力（相対効力）に比べて、ＴＮＦα誘導アポトーシスを抑制する抗体の効力（相対効力）が３より高く、前記相対効力が、Ｌ９２９アッセイにおいて、インフリキシマブのＩＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）の、Ｌ９２９アッセイにおける抗体のＩＣ５０値（ｎｇ／ｍＬ）に対する比である、項目［１］〜［５８］のいずれか１項に記載の抗体。
［６０］示差走査蛍光定量法により決定されたｓｃＦｖフォーマットの抗体の可変ドメインの融解温度が少なくとも６５℃である、項目［１］〜［５９］のいずれか１項に記載の抗体。
［６１］示差走査蛍光定量法により決定されたｓｃＦｖフォーマットの抗体の可変ドメインの融解温度が少なくとも６８℃である、項目［１］〜［６０］のいずれか１項に記載の抗体。
［６２］示差走査蛍光定量法により測定される融解温度が少なくとも７０℃である、項目［１］〜［６１］のいずれか１項に記載の抗体。
［６３］ヒトＴＮＦαとＴＮＦ受容体Ｉ（ＴＮＦＲＩ）との間の相互作用を遮断できる、項目［１］〜［６２］のいずれか１項に記載の抗体。
［６４］ヒトＴＮＦαとＴＮＦ受容体ＩＩ（ＴＮＦＲＩＩ）との間の相互作用を遮断できる、項目［１］〜［６３］のいずれか１項に記載の抗体。
［６５］ＣＤ１４＋単球由来のインターロイキン−１βのＬＰＳ誘導分泌を抑制できる、項目［１］〜［６４］のいずれか１項に記載の抗体。
［６６］インターロイキン−１βのＬＰＳ誘導分泌を抑制するためのＩＣ５０値が１ｎＭ未満である、項目［６５］に記載の抗体。
［６７］モル基準で、インターロイキン−１βのＬＰＳ誘導分泌を抑制するためのＩＣ５０値が、アダリムマブのＩＣ５０値より低い、項目［６６］に記載の抗体。
［６８］ＣＤ１４＋単球由来のＴＮＦαのＬＰＳ誘導分泌を抑制できる、項目［１］〜［６７］のいずれか１項に記載の抗体。
［６９］ＴＮＦαのＬＰＳ誘導分泌を抑制するためのＩＣ５０値が１ｎＭ未満である、項目［６８］に記載の抗体。
［７０］モル基準で、ＴＮＦαのＬＰＳ誘導分泌を抑制するためのＩＣ５０値が、アダリムマブのＩＣ５０値より低い、項目［６９］に記載の抗体。
［７１］免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、好ましくはＩｇＧ１である、項目［１］〜［７０］のいずれか１項に記載の抗体。
［７２］項目［１］〜［７１］のいずれか１項に記載の抗体をコードする核酸。
［７３］項目［７２］の核酸を含むベクターまたはプラスミド。
［７４］項目［７２］の核酸、または項目［７３］のベクターもしくはプラスミドを含む細胞。
［７５］抗体をコードする核酸の発現を可能とする条件下で、項目［７４］に記載の細胞を培地中で培養すること、およびその抗体を細胞または培地から回収することを含む、項目［１］〜［７１］のいずれか１項に記載の抗体を作製する方法。
［７６］炎症性疾患またはＴＮＦα関連障害を治療する方法に使用するための項目［１］〜［７１］のいずれか１項で定義されている抗体。
［７７］前記炎症性疾患が、以下の「治療対象障害」のセクションに列挙される疾患および障害のリストから選択される、項目［７６］に記載の使用するための抗体。
［７８］前記炎症性疾患が、消化管の炎症性疾患である、項目［７６］に記載の使用するための抗体。
［７９］前記消化管の炎症性疾患が、炎症性腸疾患である、項目［７８］に記載の使用するための抗体。
［８０］前記消化管の炎症性疾患が、クローン病である、項目［７８］または［７９］に記載の使用するための抗体。
［８１］前記クローン病が、回腸、結腸、回腸結腸、および／または孤立性上部クローン病（ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｕｐｐｅｒ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ）（胃、十二指腸、および／または空腸）からなる群から選択され、非狭窄性／非浸透性、狭窄性、浸透性および肛門周囲疾患の挙動などを含み、局在化および上記のいずれかの疾患挙動の任意の組合せを可能とする、項目［８０］に記載の使用するための抗体。
［８２］前記消化管の炎症性疾患が、潰瘍性大腸炎である、項目［７８］または［７９］に記載の使用するための抗体。
［８３］前記潰瘍性大腸炎が、潰瘍性直腸炎、Ｓ状結腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、左側大腸炎、全大腸型潰瘍性大腸炎、および回腸嚢炎からなる群から選択される、項目［８２］に記載の使用するための抗体。
［８４］前記消化管の炎症性疾患が、顕微鏡的大腸炎である、項目［７８］または［７９］に記載の使用するための抗体。
［８５］前記炎症性疾患が、関節炎である、項目［７６］に記載の使用するための抗体。
［８６］前記炎症性疾患が、関節リウマチである、項目［７６］または［８５］に記載の使用するための抗体。
［８７］前記方法が、対象に抗体を経口投与することを含む、項目［７６］〜［８６］のいずれか１項に記載の使用するための抗体。
［８８］前記方法が、抗体を局所適用することを含む、項目［７６］〜［８７］のいずれか１項に記載の使用するための抗体。
［８９］項目［１］〜［７１］のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬組成物。
［９０］ＴＮＦαに対する抗体のトランスサイトーシスを改善する方法であって、抗体のアミノ酸配列中に置換Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａを導入することを含む、方法。
［９１］ＴＮＦαに対する抗体の血漿中半減期を延長する方法であって、抗体のアミノ酸配列中に置換Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａを導入することを含む、方法。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】Ｌ９２９アッセイにおける抗ＴＮＦα抗体バリアントのヒトＴＮＦαを中和する効力。ＴＮＦα抗体特異的ＴＰ抗体および基準インフリキシマブの用量反応曲線が示されている。
【図２】分極Ｔ８４細胞を横切る抗ＴＮＦα  ＩｇＧバリアントの輸送。添加４時間後の頂端側から基底外側リザーバーへの抗ＴＮＦα抗体バリアントおよびＩＦＸの量。ｎｇ／ｃｍ２として表される。エラーバーは、２〜４つの個別の単分子膜のＳＤを示す。
【図３】過剰量の骨髄腫ＩｇＧの存在下での分極Ｔ８４細胞を横切る抗ＴＮＦα  ＩｇＧバリアントの輸送。１０倍過剰量のヒト骨髄腫ＩｇＧの存在下の、添加４時間後の頂端側から基底外側リザーバーへ輸送された抗ＴＮＦα抗体  ＩＦＸおよび抗体バリアントの量。ｎｇ／ｃｍ２として表される。エラーバーは、３〜４つの個別の単分子膜のＳＤを示す。
【図４】ＡＤＣＣ活性。抗ＴＮＦα抗体バリアントおよび野生型抗体によるＡＤＣＣの誘導。
【図５】ヒトＣ１ｑへの結合。ＩＦＸおよび抗ＴＮＦα抗体バリアントのヒトＣ１ｑへの結合。各濃度は、２回繰り返してアッセイされた。エラーバーはＳＤを示す。
【図６】ＩＦＸと比較した各化合物によるＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋マクロファージの誘導。独立した４種の実験をまとめたデータ。バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図７】ＩＦＸと比較した各化合物によるＴ細胞増殖の抑制。独立した３種の実験をまとめたデータ。バーは平均を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図８】部位特異的変異誘発の模式表現。
【図９】抗ＴＮＦα抗体バリアントのＮ２９７に結合した主要なＮ−グリカン型の模式図。試験した抗ＴＮＦα抗体のパネル中で優位を占める２つのＮ−グリカンプロファイルは、４ＧｌｃＮａｃ−１Ｆｕｃ−３Ｍａｎおよび４ＧｌｃＮａｃ−１Ｆｕｃ−３Ｍａｎ−１Ｇａｌであり、一方、２ＦＦの存在下で生成されたＩｇＧバリアントに対しては、フコースを欠くものを除いて、同じ二分岐構造が発生した。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本発明は、ＴＮＦαに結合でき、ＦｃＲｎ結合部位を含む抗体に関する。本出願によれば、抗体は、ｐＨ６でＦｃＲｎ、好ましくはヒトＦｃＲｎに結合できる場合には、ＦｃＲｎ結合部位を含む。ｐＨ６でのＦｃＲｎへの結合は、例えば、本出願の実施例４に記載のように、ＳＰＲにより測定できる。ｐＨ６で、抗体のＦｃＲｎへの結合がＳＰＲにより検出できる場合には、このような抗体はＦｃＲｎ結合部位を有する。本発明の抗体は、５００ｎＭ未満の解離平衡定数（ＫＤ）を特徴とする、ｐＨ６でヒトＦｃＲｎに対する高親和性を有する。抗体は、１μＭより大きいＫＤを特徴とする、ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対し低親和性をさらに有する。抗体のアミノ酸配列は、位置３８０および位置４３４（ＥＵナンバリング）にアミノ酸アラニンを含む。
【００１１】
本明細書全体を通して、可変ドメイン（ほぼ、軽鎖の残基１〜１０７および重鎖の残基１〜１１３）中の残基を参照する場合、Ｋａｂａｔナンバリングシステムが通常使用される（Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基を参照する場合、「ＥＵナンバリングシステム」または「ＥＵインデックス」が通常使用される（例えば、ＫａｂａｔらのＳｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）（参照により本明細書に明示的に組み込まれる）で報告されたＥＵインデックス）。特に断りのない限り、抗体の可変ドメイン中の残基番号への参照は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる残基ナンバリングを意味する。特に断りのない限り、抗体の定常ドメイン中の残基番号への参照は、ＥＵナンバリングシステム（例えば、国際公開第２００６／０７３９４１号を参照されたい）による残基ナンバリングを意味する。
【００１２】
抗体
本出願の場合、用語の「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤクラス（またはその任意のサブクラス）に属する、その全ての従来から既知の抗体およびそれらの機能性断片を含むタンパク質として定義される「免疫グロブリン」（Ｉｇ）の同義語として用いられる。本発明の場合、抗体／免疫グロブリンの「機能性断片」は、抗原結合断片、またはこのような親抗体の１つまたは複数の特性を本質的に維持する親抗体の他の誘導体として定義される。抗体／免疫グロブリンの「抗原結合断片」または「抗原結合ドメイン」は、抗原結合領域を保持する断片（例えば、ＩｇＧの可変領域）として定義される。抗体の「抗原結合領域」は、典型的には抗体の１つまたは複数の超可変領域、すなわち、ＣＤＲ−１、−２および／または−３領域に見出される。本発明の抗体は、二官能性または多官能性構築物の一部であってもよい。
【００１３】
好ましくは、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で使用される場合、用語の「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術により産生される抗体に限定されない。用語の「モノクローナル抗体」は、それが産生される方法ではなく、任意の真核生物、原核生物またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を意味する。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージ提示技術、またはこれらの組み合わせの使用など、当技術分野で公知の多種多様な技術を用いて作製できる（Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｎ．Ｙ．）。
【００１４】
ヒトにおける抗ＴＮＦα抗体のインビボ使用に関する実施形態を含む他の実施形態では、キメラ抗体、霊長類化抗体、ヒト化抗体、またはヒト抗体を使用できる。好ましい実施形態では、抗体はヒト抗体またはヒト化抗体であり、より好ましくはモノクローナルヒト抗体またはモノクローナルヒト化抗体である。
【００１５】
別の特定の実施形態では、本発明の抗体は免疫グロブリン、好ましくは免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）である。本発明のＩｇＧのサブクラスは、限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４が挙げられる。好ましくは、本発明のＩｇＧは、サブクラス１、２または４、すなわち、それぞれ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ４分子である。最も好ましくは、本発明のＩｇＧはサブクラス１、すなわち、ＩｇＧ１分子である。
【００１６】
ＴＮＦα結合ドメイン
本発明の抗体のＴＮＦα結合ドメインは、特に限定されない。それは、ＴＮＦαに結合できる任意の抗体由来であり得る。
【００１７】
好ましくは、本発明の抗体は、ＴＮＦαに特異的に結合する。本明細書で使用される場合、抗体が、ヒトＴＮＦαと１つまたは複数の参照分子とを識別できる場合、抗体は、ヒトＴＮＦαを「特異的に認識する」またはヒトＴＮＦαに「特異的に結合する」。好ましくは、参照分子の各々への結合に対するＩＣ５０値は、ＴＮＦαへの結合に対するＩＣ５０値よりも少なくとも１，０００倍大きい。最も一般的な形態（および定義された参照が記載されていない場合）では、「特異的結合」とは、例えば、当技術分野で既知の特異性アッセイ法により測定して、ヒトＴＮＦαと非関連生体分子とを区別する抗体の能力を意味する。このような方法には、限定されないが、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ試験が含まれる。例えば、標準的なＥＬＩＳＡアッセイを実施できる。通常、結合特異性の決定は、単一の参照生体分子ではなく、ミルクパウダー、ＢＳＡ、トランスフェリンなどの約３〜５種の非関連生体分子のセットを使用することにより行われる。一実施形態では、特異的結合は、ヒトＴＮＦαとヒトＴＮＦβとを区別する抗体の能力を意味する。
【００１８】
本発明の抗体は、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。ＶＬドメインは、ＣＤＲ１領域（ＣＤＲＬ１）、ＣＤＲ２領域（ＣＤＲＬ２）、ＣＤＲ３領域（ＣＤＲＬ３）、およびフレームワーク領域を含む。ＶＨドメインは、ＣＤＲ１領域（ＣＤＲＨ１）、ＣＤＲ２領域（ＣＤＲＨ２）、ＣＤＲ３領域（ＣＤＲＨ３）、およびフレームワーク領域を含む。
【００１９】
用語の「ＣＤＲ」は、主に抗原結合に寄与する抗体の可変ドメイン内の６つの高頻度可変領域の内の１つを意味する。６つのＣＤＲの最も一般的に使用される定義の１つは、Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら（１９９１）（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ．ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２）により提供された。本明細書で使用される場合、ＫａｂａｔのＣＤＲの定義は、軽鎖可変ドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、またはＬ１、Ｌ２、Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメインのＣＤＲ２およびＣＤＲ３（ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、またはＨ２、Ｈ３）のみに適用される。しかし、本明細書で使用される場合、重鎖可変ドメインのＣＤＲ１（ＣＤＲＨ１またはＨ１）は、以下の残基（Ｋａｂａｔナンバリング）により定義される：それは、位置２６で始まり、位置３６の前で終わる。
【００２０】
本発明の一実施形態では、本発明の抗体は、出願時の国際出願：ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２１８、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２４６、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２３７およびＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２２７のいずれか１件に開示の抗ＴＮＦα抗体である。本発明のさらに別の実施形態では、抗体は、出願時の国際出願：ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２１８、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２４６、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２３７およびＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２２７で開示のアミノ酸配列を有する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメインを有する抗ＴＮＦα抗体である。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態では、抗体は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２１８、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２４６、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２３７またはＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２２７で開示のアミノ酸配列を有する１つまたは複数のＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインおよび／または重鎖可変ドメインを有する抗ＴＮＦα抗体である。本発明の別の好ましい実施形態では、抗体は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２１８の請求項２、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２４６の請求項２、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２３７の請求項２またはＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２２７の請求項２で開示のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインを有する抗ＴＮＦα抗体である。本発明のさらに別の好ましい実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２１８の請求項４、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２４６の請求項５および６、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２３７の請求項５および６、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２２７の請求項４、およびこれらの組み合わせによる重鎖可変ドメインアミノ酸配列および／または軽鎖可変ドメインアミノ酸配列を含む抗ＴＮＦα抗体からなる群より選択される。国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２１８、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２４６、ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２３７およびＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５６２２７のそれぞれの開示は、その全体が本明細書に組み込まれる。それらは、本出願の一部を形成する。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明の抗体は、（ｉ）配列番号３で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＬドメイン、および（ｉｉ）配列番号６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨドメインを含む。
【００２３】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む。別のより好ましい実施形態では、抗体は、配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。最も好ましくは、本発明の抗体は、（ｉ）配列番号９で示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、および（ｉｉ）配列番号１０で示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。
【００２４】
別の特定の実施形態では、本発明の抗体は、（ｉ）配列番号１４で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号１５で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号１６で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＬドメイン、および（ｉｉ）配列番号１７で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ１領域、配列番号１８で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ２領域、および配列番号１９で示されるアミノ酸配列を有するＣＤＲ３領域を含むＶＨドメインを含む。
【００２５】
より好ましい実施形態では、本発明の抗体は、配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインを含む。別のより好ましい実施形態では、抗体は、配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。最も好ましくは、本発明の抗体は、（ｉ）配列番号２０で示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメイン、および（ｉｉ）配列番号２１または配列番号２２で示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。
【００２６】
本発明の抗体は、ヒトＴＮＦαに対して高い親和性を有する。用語の「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を意味する。通常、本発明の抗体は、ＢＩＡＣＯＲＥ装置で表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して測定して、約２ｘ１０−１０Ｍ未満、好ましくは１．５ｘ１０−１０Ｍ未満、好ましくは１．２５ｘ１０−１０Ｍ未満、より好ましくは１ｘ１０−１０Ｍ未満、最も好ましくは７．５ｘ１０−１１Ｍ未満、あるいは５ｘ１０−１１Ｍ未満の解離平衡定数（ＫＤ）でヒトＴＮＦαに結合する。特に、ＫＤの測定は、実施例１に記載のように実施される。
【００２７】
ＦｃＲｎに対する親和性に影響を与える改変
本発明の抗体は、本明細書で定義の少なくとも１個の「アミノ酸改変」のために、野性型抗体の天然配列とは異なるアミノ酸配列を含む。少なくとも１個のアミノ酸改変は、ヒトＦｃＲｎに対する抗体の親和性に影響を与える。通常、少なくとも１個のアミノ酸改変は、ｐＨ６で、ヒトＦｃＲｎに対する抗体の親和性を高める。一実施形態では、少なくとも１個のアミノ酸改変は、ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する抗体の親和性を高め、ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する親和性を実質的に変えない。好ましくは、改変抗体は、野性型抗体または親抗体のアミノ酸配列に比べて、少なくとも１個のアミノ酸置換、例えば、約１〜約１０個のアミノ酸置換、および好ましくは、約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。好ましくは、少なくとも１個のアミノ酸改変は、抗体のＦｃＲｎ結合部位内にある。抗体は、抗体のＦｃＲｎ結合部位の外側に、１個または複数のアミノ酸改変を有し得、これは、例えば、構造変化によりＦｃＲｎ結合に影響を及ぼす。アミノ酸改変は、それ自体既知の方法により、例えば、“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｃｈａｍｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，２０１２，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３１（ＩＳＢＮ  ９７８−１−６１７７９−９７３−０）に記載の部位特異的変異誘発により生成できる。
【００２８】
本発明の抗体は、位置３８０および位置４３４（ＥＵナンバリング）にアミノ酸アラニンを含む。これは、本明細書では、「３８０Ａ」および「４３４Ａ」と呼ばれる。非改変ヒトＩｇＧ抗体の位置３８０の天然のアミノ酸は、グルタミン酸（Ｅ）である。非改変ヒトＩｇＧ抗体の位置４３４の天然のアミノ酸は、アスパラギン（Ｎ）である。従って、本発明の抗体は、変異Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａを抗体中に導入することにより得ることができる。好ましくは、本発明の抗体は、位置３８０でグルタミン酸のアラニンによる置換、および位置４３４のアスパラギンのアラニンによる置換により、得ることができる、または得られる。
【００２９】
Ｆｃドメインの残りのアミノ酸配列は、典型的なヒトＩｇＧの天然のアミノ酸配列と同じであり得る。しかし、抗体が次に示す改変の後でも、ＴＮＦα結合活性、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎ結合活性および１つまたは複数のエフェクター機能を有する限りにおいて、抗体のアミノ酸配列が、天然の抗体のＦｃ領域の天然のアミノ酸配列に対して、１個または複数の変異または置換を含むことは可能である。
【００３０】
好ましい実施形態では、ヒンジ領域を含む本発明の抗体のＦｃ領域は、配列番号１３で示されるアミノ酸配列を含むまたはそれからなる。
【００３１】
一実施形態では、本発明の抗体の重鎖は、配列番号１１で示されるアミノ酸配列を有する。好ましくは、この抗体は、配列番号１で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖をさらに含む。
【００３２】
別の実施形態では、本発明の抗体の重鎖は、配列番号１２で示されるアミノ酸配列を有する。好ましくは、この抗体は、配列番号２３または配列番号２４で示されるアミノ酸配列を有する軽鎖をさらに含む。
【００３３】
本発明の好ましい態様では、本発明の抗体は、非フコシル化抗体またはフコシル化が低減した抗体である。
【００３４】
本明細書で使用される場合、用語の「フコシル化の低減した抗体」は、抗体のＮ−グリカンの９０％未満がフコシル化されている抗体を意味する。フコシル化のパーセンテージを測定する方法は、当技術分野において既知である。好ましくは、フコシル化のパーセンテージは、本出願の実施例１０に記載のように測定される。
【００３５】
一実施形態では、抗体のＮ−グリカンの７５％未満、または５０％未満、または２５％未満がフコシル化されている。最も好ましくは、抗体のＮ−グリカンの１０％未満がフコシル化されている。特定の実施形態では、本発明の抗体のＮ−グリカンは、フコースを何ら含まない。
【００３６】
好ましくは、抗体のＮ２９７（ＥＵナンバリング）のＮ−グリカンの９０％未満がフコシル化されている。別の実施形態では、抗体のＮ２９７（ＥＵナンバリング）位置のＮ−グリカンの７５％未満、または５０％未満、または２５％未満がフコシル化されている。最も好ましくは、抗体のＮ２９７（ＥＵナンバリング）のＮ−グリカンの１０％未満がフコシル化されている。
【００３７】
別の実施形態では、抗体のＮ２９７位置のＮ−グリカンは、フコースを何ら含まない。
【００３８】
非フコシル化（ａｆｕｃｏｓｙｌａｔｅｄ）抗体と呼ばれることもある、非フコシル化抗体は、各種方法により作製できる。例えば、ＣＨＯ細胞中のα１，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）およびＧＤＰ−マンノース４，６−デヒドラターゼ（ＧＭＤ）に対する遺伝子の相乗的ノックダウンを用いて、完全に非フコシル化され、ＡＤＣＣ強化されたモノクローナル抗体バリアントを産生できる（例えば、Ｉｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａ  ら（２００７）ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７，８４を参照されたい）。α１，６−フコシルトランスフェラーゼの触媒的コアをコードする領域中のＦＵＴ８遺伝子を切断し、それにより、ＣＨＯ細胞中の対応する酵素機能を破壊するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を用いる方法を使用して、コアフコースを完全に欠くモノクローナル抗体を産生できる（例えば、Ｍａｌｐｈｅｔｔｅｓら（２０１０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１０６，７７４−７８３を参照されたい）。
【００３９】
フコシル化の低減した抗体は、２−デオキシ−２−フルオロ−２−フコースなどのデコイ基質を培地へ添加し、ＩｇＧ−Ｆｃグリカン中へのフコースの取り込みを減らすことにより作製できる（例えば、Ｄｅｋｋｅｒら（２０１６）Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ６：３６９６４を参照されたい）。
【００４０】
別の実施形態では、本発明の抗体は、高いシアル酸含量を有する。シアル化の増加は、例えば、シチジン一リン酸−シアル酸シンターゼ（ＣＭＰ−ＳＡＳ）、シチジン一リン酸−シアル酸トランスポーター（ＣＭＰ−ＳＡＴ）、および２，３−シアル酸転移酵素の同時遺伝子導入により達成できる（例えば、Ｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１，１０１９−１０２８を参照されたい）。
【００４１】
ＦｃＲｎに対する親和性
ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する本発明の抗体の親和性は高い。ｐＨ６での抗体のヒトＦｃＲｎに対する高親和性結合は、５００ｎＭ未満のＫＤ値を特徴とする。好ましくは、ｐＨ６での高親和性結合のＫＤ値は、４００ｎＭ未満、または３００ｎＭ未満、または２００ｎＭ未満である。例えば、ｐＨ６での親和性を特徴付けるＫＤ値は、５〜５００ｎＭ、または１０〜４００ｎＭ、または２５〜３００ｎＭ、または５０〜２００ｎＭ、または１００〜１５０ｎＭの範囲であり得る。
【００４２】
好ましい実施形態では、ｐＨ６でのヒトＦｃＲｎに対する本発明の抗体の親和性は、ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対するインフリキシマブの親和性よりも大きい。
【００４３】
本発明の抗体のヒトＦｃＲｎに対する親和性は、好ましくは、例えば、本出願の実施例４に記載のような表面プラズモン（ｐｌａｓｍａ）共鳴法（ＳＰＲ）により測定される。
【００４４】
本発明の抗体は通常、ｐＨ７．４でヒトＦｃＲｎに対する低い親和性を有する。低い親和性は、１μＭより大きいＫＤ値により特徴付けられる。好ましくは、ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する低い親和性は、２μＭより大きい、または５μＭより大きい、または１０μＭより大きいＫＤ値により特徴付けられる。
【００４５】
特定の実施形態では、ｐＨ７．４での低い親和性は、ＫＤ値がＳＰＲにより測定できないほど低い。
【００４６】
特定の実施形態では、（ｉ）ｐＨ７．４でのヒトＦｃＲｎに対する本発明の抗体の結合のＫＤの、（ｉｉ）ｐＨ６．０でのヒトＦｃＲｎに対する結合のＫＤに対する比率は、少なくとも５０である。好ましくは、この比率は、少なくとも１００、または少なくとも１５０、または少なくとも２００である。
【００４７】
抗体の機能特性
本発明の抗体は、頂端側から側底側へ分極細胞単層を横切って効率的に輸送される。通常、分極細胞単層を横切る輸送は、インフリキシマブの場合よりも大きい量であり、インフリキシマブの抗体の量は、分極細胞単層の質量／ｃｍ２を意味する。分極細胞単層を横切って輸送されるインフリキシマブの量に対して、分極細胞単層を横切って輸送される抗体の量は、少なくとも１１０％、好ましくは少なくとも１２０％、より好ましくは少なくとも１３０％、または少なくとも１４０％、または少なくとも１５０％である（輸送されたインフリキシマブの量を１００％とする）。
【００４８】
さらに、抗体は、過剰な競合免疫グロブリンの存在下で、頂端側から側底側へ分極細胞単層を横切って、特異的に輸送される。これは、本明細書では、特異的輸送と呼ばれる。
【００４９】
分極細胞単層を横切って輸送される免疫グロブリンの総質量のパーセンテージは、１０倍過剰の競合免疫グロブリンの存在下で、頂端側から側底側へ分極細胞単層を横切って輸送されるインフリキシマブのパーセンテージよりも大きい。１０倍過剰量の無関係の免疫グロブリンの存在下での分極細胞単層を横切って輸送される本発明の抗体のパーセンテージは、１０倍過剰量の無関係の免疫グロブリンの存在下での分極細胞単層を横切って輸送されるインフリキシマブのパーセンテージに対して、少なくとも１２０％、または少なくとも１３０％、または少なくとも１４０％、または少なくとも１５０％である（インフリキシマブの量を１００％とする）。
【００５０】
好ましくは、分極細胞単層は、分極Ｔ８４細胞の単層である。トランスサイトーシスの輸送アッセイ模倣プロセスは、本出願の実施例５に記載のように実施できる。
【００５１】
本発明の抗体は、ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ（Ｈ）、ＣＤ３２ａ（Ｒ）、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１６ａ（Ｖ）、ＣＤ１６ａ（Ｆ）およびＣＤ１６ｂ（ＮＡ２）に結合する。
【００５２】
本発明の抗体は通常、ＣＤ６４に１００ｎＭ未満、好ましくは１０ｎＭ未満のＫＤで結合する。
【００５３】
本発明の抗体は通常、ＣＤ３２ａ（Ｈ）に１０μＭ未満のＫＤで結合する。
【００５４】
本発明の抗体は通常、ＣＤ３２ａ（Ｒ）に１０μＭ未満のＫＤで結合する。
【００５５】
本発明の抗体は通常、ＣＤ３２ｂに１０μＭ未満のＫＤで結合する。
【００５６】
本発明の抗体は通常、ＣＤ１６ａ（Ｖ）に、例えば、１μＭ未満、好ましくは５００ｎＭ未満、より好ましくは１００ｎＭ未満のＫＤで結合する。
【００５７】
本発明の抗体は通常、ＣＤ１６ａ（Ｆ）に、例えば、１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満のＫＤで結合する。
【００５８】
本発明の抗体は通常、ＣＤ１６ｂ（ＮＡ２）に、例えば、１０μＭ未満、好ましくは１μＭ未満のＫＤで結合する。
【００５９】
本発明の抗体は、ヒトＣ１ｑにさらに結合する。好ましくは、本発明の抗体のヒトＣ１ｑに対するこの結合の強度は、ヒトＣ１ｑに対するインフリキシマブの結合と少なくとも同等の強度である。
【００６０】
本発明の抗体は、ウサギ補体の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をさらに有する。
【００６１】
本発明の抗体は、さらに、ＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋マクロファージを誘導できる。誘導のレベルは、好ましくは、インフリキシマブのレベルと同等、それと同じ、またはそれより大きい。
【００６２】
本発明の抗体は、さらに、Ｔ細胞増殖を抑制できる。Ｔ細胞増殖抑制の程度は、好ましくは、インフリキシマブのレベルと同等、それと同じ、またはそれより大きい。
【００６３】
医薬組成物および治療
疾患の治療は、いずれかの臨床段階または症状のなんらかの形態の疾患を有すると既に診断された患者の治療；疾患の症状もしくは兆候の発症、または進展、または憎悪、または悪化の遅延；および／または疾患の重症度の予防および／または軽減、を包含する。
【００６４】
抗ＴＮＦα抗体が投与される「対象」または「患者」は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）などの哺乳動物、または霊長類（例えば、サルまたはヒト）であり得る。特定の態様では、ヒトは小児患者である。他の態様では、ヒトは成人患者である。
【００６５】
抗ＴＮＦα抗体、および必要に応じ、１種または複数の追加の治療薬、例えば、以下に記載の第２の治療薬を含む組成物が本明細書で記載される。組成物は通常、薬学的に許容可能な担体を含む無菌の医薬組成物の一部として供給される。この組成物は、（患者に投与する所望の方法に応じて）任意の好適な形態であり得る。
【００６６】
抗ＴＮＦα抗体は、経口、経皮、皮下、鼻腔内、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、局所に（ｔｏｐｉｃａｌｌｙ）または局所に（ｌｏｃａｌｌｙ）、例えば、経粘膜などの様々な経路によって、患者に投与できる。任意の所定の場合の投与のための最も好適な経路は、特定の抗体、対象、および疾患の性質および重症度、ならびに対象の身体的状態に依存するであろう。通常、抗ＴＮＦα抗体は静脈内に投与であろう。
【００６７】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は経口投与される。投与が経口経路によるものである場合、抗体は、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１である。
【００６８】
典型的な実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜２０ｍｇ／ｋｇ体重の静脈内投与を可能にするのに十分な濃度で医薬組成物中に存在する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法での使用に好適な抗体の濃度としては、限定されないが、０．５ｍｇ／ｋｇ、０．７５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、２．５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、９ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１１ｍｇ／ｋｇ、１２ｍｇ／ｋｇ、１３ｍｇ／ｋｇ、１４ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、１６ｍｇ／ｋｇ、１７ｍｇ／ｋｇ、１８ｍｇ／ｋｇ、１９ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、または、例えば１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｍｇ／ｋｇ、もしくは１０ｍｇ／ｋｇ〜１８ｍｇ／ｋｇなどのいずれかの前述の値の間の範囲の濃度が挙げられる。
【００６９】
抗ＴＮＦα抗体の有効用量は、単回（例えば、ボーラス）投与、複数回投与または連続投与当たり約０．００１〜約７５０ｍｇ／ｋｇの範囲であるか、または単回（例えば、ボーラス）投与、複数回投与または連続投与当たり０．０１〜５０００μｇ／ｍＬの血清濃度を達成するための範囲であるか、または治療される状態、投与経路、ならびに対象の年齢、体重、および状態に応じて、任意の有効な範囲またはその中の値であり得る。経口投与の場合には、血清中濃度は、非常に低いか、あるいは検出限界未満であり得る。特定の実施形態では、各用量は、約０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重または約３ｍｇ／ｋｇ体重〜約３０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり得る。抗体は、水溶液として処方し得る。
【００７０】
特に好ましい実施形態では、本発明の抗体は経口投与される。投与が経口経路によるものである場合、抗体は、好ましくはＩｇＧ、最も好ましくはＩｇＧ１である。抗体が経口投与される場合、抗体の一日量は通常、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜約２５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１５ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．１６ｍｇ／ｋｇ体重〜約５ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．２ｍｇ／ｋｇ体重〜約２ｍｇ／ｋｇ体重、または約０．２ｍｇ／ｋｇ体重〜約１ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。通常、好都合な投与量は、１〜２００ｍｇ／日、好ましくは５〜１００ｍｇ／日または１０〜５０ｍｇ／日の投与量である。
【００７１】
医薬組成物は、用量当たり所定量の抗ＴＮＦα抗体を含有する単位投与形態で簡便に提供できる。このような単位は、０．５ｍｇ〜５ｇ、例えば、限定されないが、１ｍｇ、１０ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、４０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、３００ｍｇ、４００ｍｇ、５００ｍｇ、７５０ｍｇ、１０００ｍｇ、または前述の値の任意の２つの間の任意の範囲、例えば、１０ｍｇ〜１０００ｍｇ、２０ｍｇ〜５０ｍｇ、または３０ｍｇ〜３００ｍｇを含み得る。薬学的に許容可能な担体は、例えば、治療される状態または投与経路に応じて、多種多様な形態をとることができる。
【００７２】
抗ＴＮＦα抗体の有効投与量、総投与回数および治療期間の長さの決定は、十分に当業者の能力の範囲内であり、また標準用量漸増試験を用いて決定できる。
【００７３】
本明細書に記載の方法に好適な抗ＴＮＦα抗体の治療用配合物は、所望の純度を有する抗体を、当該技術分野で通常使用される任意の薬学的に許容可能な担体、賦形剤または安定化剤（本明細書では、それらのすべてを「担体」と称する）、すなわち、緩衝剤、安定化剤、防腐剤、等張剤、非イオン性界面活性剤、抗酸化剤、および他の種々添加物などと混合することによって、凍結乾燥配合物または水溶液として保存するために調製できる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｏｓｏｌ，ｅｄ．１９８０）を参照されたい。このような添加剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して無毒でなければならない。
【００７４】
緩衝剤は、生理学的条件に近い範囲のｐＨを維持するのに役立つ。これらは、約２ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度で存在できる。好適な緩衝剤は、有機、無機両方の酸およびその塩、例えば、クエン酸緩衝剤（例えば、クエン酸一ナトリウム−クエン酸二ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸三ナトリウム混合物、クエン酸−クエン酸一ナトリウム混合物など）、クエン酸−リン酸緩衝液、コハク酸緩衝剤（例えば、コハク酸−コハク酸一ナトリウム混合物、コハク酸−水酸化ナトリウム混合物、コハク酸−コハク酸二ナトリウム混合物など）、酒石酸緩衝剤（例えば、酒石酸−酒石酸ナトリウム混合物、酒石酸−酒石酸カリウム混合物、酒石酸−水酸化ナトリウム混合物など）、フマル酸緩衝剤（例えば、フマル酸−フマル酸一ナトリウム混合物、フマル酸−フマル酸二ナトリウム混合物、フマル酸一ナトリウム−フマル酸二ナトリウム混合物など）、グルコン酸緩衝剤（例えば、グルコン酸−グルコン酸ナトリウム混合物、グルコン酸−水酸化ナトリウム混合物、グルコン酸−グルコン酸カリウム混合物など）、シュウ酸緩衝剤（例えば、シュウ酸−シュウ酸ナトリウム混合物、シュウ酸−水酸化ナトリウム混合物、シュウ酸−シュウ酸カリウム混合物など）、乳酸緩衝剤（例えば、乳酸−乳酸ナトリウム混合物、乳酸−水酸化ナトリウム混合物、乳酸−乳酸カリウム混合物など）および酢酸緩衝剤（例えば、酢酸−酢酸ナトリウム混合物、酢酸−水酸化ナトリウム混合物など）などを含む。さらに、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、およびトリスなどのトリメチルアミン塩を使用できる。
【００７５】
本発明の医薬組成物は、少なくとも１種の塩、例えば、塩化ナトリウムをさらに含み得る。塩濃度は、好ましくは、１００ｍＭ〜２００ｍＭの範囲、例えば、約１５０ｍＭである。
【００７６】
防腐剤は、微生物増殖を遅らせるために添加することができ、０．２％〜１％（ｗ／ｖ）の範囲の量で添加できる。好適な防腐剤としては、フェノール、ベンジルアルコール、メタクレゾール、メチルパラベン、プロピルパラベン、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、ベンザルコニウムハロゲン化物（例えば、塩化物、臭化物およびヨウ化物）、塩化ヘキサメトニウム、およびメチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノールなどが挙げられる。場合により「安定剤」として知られる等張剤は、液体組成物の等張性を確実にするために添加することができ、多価糖アルコール、好ましくはグリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール、およびマンニトールなどの３価以上の糖アルコールが挙げられる。安定化剤は、増量剤から、治療薬を可溶化する添加剤、または変性もしくは容器壁への付着を防ぐのに役立つ添加剤まで、さまざまな機能となり得る賦形剤の幅広いカテゴリーを指す。典型的な安定剤は、多価糖アルコール（上記に列挙）；アルギニン、リジン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、オルニチン、Ｌ−ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸；ラクトース、トレハロース、スタキオース、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、リビトール、ミオイニシトール、ガラクチトール、グリセロールなどの有機糖または糖アルコール（イノシトールなどのシクリトール）：ポリエチレングリコール；アミノ酸ポリマー；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、α−モノチオグリセロールおよびチオ硫酸ナトリウムなどの硫黄含有還元剤；低分子量ポリペプチド（例えば、１０残基以下のペプチド）、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；キシロース、マンノース、フルクトース、グルコースなどの単糖類；ラクトース、マルトース、スクロースなどの二糖類；ラフィノースなどの三糖類；およびデキストランなどの多糖類などであり得る。安定化剤は、活性タンパク質１重量部当たり０．１〜１０，０００重量の範囲で存在し得る。
【００７７】
非イオン性界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）または合成洗剤（ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ）（「湿潤剤」としても知られている）を添加して、治療薬の可溶化を助けるとともに、撹拌誘発凝集から治療用タンパク質を保護することができ、また、タンパク質の変性を引き起こすことなく、応力が加えられた剪断面に配合物を曝露可能とする。適切な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、８０、など）、ポロクサマー（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒ）（１８４、１８８など）、プルロン酸ポリオール、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ツイーン（登録商標）−２０、ツイーン（登録商標）−８０、など）が挙げられる。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌの範囲、または約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在できる。
【００７８】
追加の種々の賦形剤としては、増量剤（例えばデンプン）、キレート剤（例えばＥＤＴＡ）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ）、プロテアーゼ阻害剤、および共溶媒が挙げられる。
【００７９】
本明細書の配合物はまた、抗ＴＮＦα抗体に加えて、第２の治療薬を含み得る。好適な第２の治療薬の例を以下に示す。
【００８０】
投与スケジュールは、疾患のタイプ、疾患の重症度、および抗ＴＮＦα抗体に対する患者の感受性などの多くの臨床因子に応じて、月１回から毎日まで変化し得る。特定の実施形態では、抗ＴＮＦα抗体は、毎日１回、週に２回、週に３回、隔日、５日ごと、週１回、１０日ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごともしくは月１回、または、上記の値の任意の２つの間の任意の範囲内、例えば、４日ごとから月１回、１０日ごとから２週間ごと、もしくは週に２〜３回など、で投与される。
【００８１】
投与される抗ＴＮＦα抗体の投薬量は、特定の抗体、対象、ならびに疾患の性質および重症度、対象の健康状態、治療法（例えば、第２の治療薬が使用されるか否か）、および選択された投与経路によって、異なり、適切な投薬量は、当業者によって、容易に決定され得る。
【００８２】
当業者であれば、抗ＴＮＦα抗体の個々の投薬量の最適な量および間隔は、治療される状態の性質および程度、投与形態、投与経路、および投与部位、ならびに治療される特定の対象の年齢および状態により決定され、医師が、使用する適切な投薬量を最終的に決定することは分かるであろう。この投薬は、必要な回数繰り返すことができる。副作用が発現する場合、投与の量および／または頻度は、通常の臨床診療に従って、変更または減少させることができる。
【００８３】
治療対象障害
本発明は、本明細書で定義される抗体を対象に投与することを含む、対象におけるヒトＴＮＦα関連疾患を治療または予防する方法に関する。用語「ＴＮＦα関連障害」または「ＴＮＦα関連疾患」は、ＴＮＦαの関与を必要とする症状または疾患状態の障害、発症、進行または持続のいずれかを意味する。例示的なＴＮＦα関連障害には、限定されないが、炎症の慢性および／または自己免疫状態全般、免疫媒介性の炎症性疾患全般、炎症性ＣＮＳ疾患、眼、関節、肌、粘膜、中枢神経系、消化管、尿路、または肺に影響を及ぼす炎症性疾患、ブドウ膜炎の状態全般、網膜炎、ＨＬＡ−Ｂ２７＋ブドウ膜炎、ベーチェット病、ドライアイ症候群、緑内障、シェーグレン症候群、真性糖尿病（糖尿病性神経障害を含む）、インスリン抵抗性、関節炎の状態全般、リウマチ性関節炎、変形性関節症、反応性関節炎およびライター症候群、若年性関節炎、強直性脊椎炎、多発性硬化症、ギランバレー症候群、重症筋無力症、筋萎縮性側索硬化症、サルコイドーシス、糸球体腎炎、慢性腎臓病、膀胱炎、乾癬（乾癬性関節炎を含む）、化膿性汗腺炎、皮下脂肪組織炎、壊疽性膿皮症、ＳＡＰＨＯ症候群（滑膜炎、座瘡、膿疱症、骨化過剰症および骨炎）、座瘡、スイート症候群、天疱瘡、クローン病（腸外症状を含む）、潰瘍性大腸炎、気管支喘息、過敏性肺炎、総合アレルギー、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、ウェゲナー肉芽腫症、川崎症候群、巨細胞性動脈炎、チャーグ−ストラウス血管炎、結節性多発動脈炎、火傷、移植片対宿主病、宿主対移植片反応、臓器移植または骨髄移植後の拒絶エピソード、血管炎の全身および局所状態全般、全身性及び皮膚性エリテマトーデス、多発性筋炎および皮膚筋炎、強皮症、子癇前症、急性および慢性膵炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、眼の手術後（例えば、白内障（眼球レンズ置換）または緑内障手術）などの手術後の炎症、関節手術（関節鏡視下手術を含む）、関節関連構造（例えば、靭帯）での手術、口腔および／または歯科手術、低侵襲性心血管手順（例えば、ＰＴＣＡ、アテレクトミー、ステント配置）、腹腔鏡下および／または内視鏡内腹腔内および婦人科的処置、内視鏡泌尿器科処置（例えば、前立腺手術、尿管鏡検査、膀胱鏡検査、間質性膀胱炎）、または、手術前後の炎症（予防）全般、水疱性皮膚炎、好中球性皮膚炎、毒性表皮壊死症、膿疱性皮膚炎、脳マラリア、溶血性尿毒症症候群、同種移植片拒絶反応、中耳炎、ヘビ咬傷、結節性紅斑、骨髄異形成症候群、原発性硬化性胆管炎、血清陰性脊椎関節症、自己免疫性溶血性貧血、口腔顔面肉芽腫症、増殖性化膿性口内炎、アフタ性口内炎、地図状舌、移動性口内炎、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、ベル麻痺、クロイツフェルト・ヤコブ病、ならびに神経変性状態全般が挙げられる。
【００８４】
癌関連骨溶解、癌関連炎症、癌関連疼痛、癌関連悪液質、骨転移、ＴＮＦαの中枢作用または末梢作用に起因するかどうか、およびそれらが炎症に分類されるかどうかにかかわらず急性および慢性型の痛み、侵害受容性または神経障害性型の痛み、坐骨神経痛、腰痛、手根管症候群、複合性局所疼痛症候群（ＣＲＰＳ）、痛風、ヘルペス後神経痛、線維筋痛、局所疼痛状態、転移性腫瘍に起因する慢性疼痛症候群、月経困難症。
【００８５】
治療される特定の障害としては、関節炎の状態全般、リウマチ性関節炎、変形性関節炎、反応性関節炎、若年性関節炎、乾癬性関節炎などの乾癬、クローン病などの炎症性腸疾患、直腸炎などの潰瘍性大腸炎、Ｓ状結腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、左側大腸炎、広範な大腸炎および全結腸炎、未確定大腸炎、コラーゲンおよびリンパ球性大腸炎などの顕微鏡的大腸炎、結合組織疾患における大腸炎、転流性大腸炎、憩室疾患の大腸炎、好酸球性大腸炎、および回腸嚢炎が挙げられる。
【００８６】
最も好ましくは、本発明の抗体は、炎症性腸疾患、特にクローン病、潰瘍性大腸炎、または顕微鏡的大腸炎を治療するために使用される。クローン病は、非狭窄性／非浸透性、狭窄性、浸透性および肛門周囲疾患の挙動などを含む、回腸、結腸、回腸結腸、または孤立性上部クローン病（胃、十二指腸、および／または空腸）であり得、上記のいずれかの局在化および疾患の挙動の任意の組合せが可能である。潰瘍性大腸炎は、潰瘍性直腸炎、直腸Ｓ状結腸炎、左側大腸炎、全大腸型潰瘍性大腸炎、および回腸嚢炎であり得る。
【００８７】
併用療法および他の態様
好ましくは、抗ＴＮＦα抗体で治療されている患者は、別の従来の薬剤でも治療される。例えば、炎症性腸疾患患者、特に中等度から重度の疾患を有する場合には通常、メサラジンもしくはその誘導体、またはプロドラッグ、ブデソニド、またはプレドニゾロンなどのコルチコステロイド（経口または静脈内）、免疫抑制剤、例えば、アザチオプリン／６−メルカプトプリン（６−ＭＰ）もしくはメトトレキセート、シクロスポリンもしくはタクロリムスでも治療される。患者に同時投与できる他の薬物には、他の抗ＴＮＦα抗体（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、エタネルセプト、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ）、インテグリン拮抗薬（例えば、ナタリズマブ、ベドリズマブ）、抗ＩＬ−２３抗体（例えば、ＭＥＤＩ２０７０）、抗β７抗体（例えば、エトロリズマブ）、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路のＪＡＫ阻害剤（例えば、トファシチニブ）などが挙げられる。患者に同時投与できるさらなる薬剤としては、安定で、より長期の寛解を維持するために、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン／６−ＭＰまたはメトトレキセートまたは経口シクロスポリン）が挙げられる。本発明のさらに別の態様は、炎症を減少させるための本明細書の上記で定義されている抗ＴＮＦα抗体の使用である。
【００８８】
本発明のさらに別の態様は、炎症状態に罹患している患者の炎症の減少に使用するための、本明細書の上記で定義されている抗ＴＮＦα抗体である。
【００８９】
本発明のさらなる態様は、炎症状態を治療する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書の上記で定義されている抗ＴＮＦα抗体の有効量を投与することを含む方法である。炎症状態は、好ましくは上記の状態のうちの１つである。
【００９０】
本発明のさらなる態様は、炎症状態を防止する方法であって、それを必要とする患者に、本明細書の上記で定義されている抗ＴＮＦα抗体の有効量を投与することを含む方法である。炎症状態は、好ましくは上記の状態のうちの１つである。
【００９１】
本発明のさらに別の態様は、ＴＮＦαに対する抗体のトランスサイトーシスを改善する方法であって、改善されたトランスサイトーシスを有する改変抗体を得るために、抗体のアミノ酸配列中に置換Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａを導入することを含む、方法である。改変抗体は、好ましくは、本明細書で前述の抗体である。
【００９２】
本発明のさらに別の態様は、ＴＮＦαに対する抗体の血漿中半減期を延長する方法であって、延長された血漿中半減期を有する改変抗体を得るために、抗体のアミノ酸配列中に置換Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａを導入することを含む、方法である。改変抗体は、好ましくは、本明細書で前述の抗体である。血漿中半減期は、非改変抗体（すなわち、置換Ｅ３８０ＡおよびＮ４３４Ａ変異を欠く親抗体）の血漿中半減期に対して、少なくとも１０％、または少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％延長され得る。
【表１】
2020534000.tif 000002
【００９３】
実施例
抗体バリアント
抗ＴＮＦα抗体のいくつかのバリアントを、抗体アミノ酸配列のＦｃ領域中に置換を導入することにより生成した。確立された方法の部位特異的変異誘発により変異を導入した。要するに、変異をＰＣＲにより導入した。順方向プライマーを目的の変異を含むように設計し、同時に、逆方向プライマーを、２つのプライマーの５’末端が背中合わせに（しかし、重なり合わないで）アニーリングされるように設計した（図８）。ＰＣＲを２５サイクル実施した（９８℃で１０秒、６４℃で３０秒、７２℃で３分）。ＰＣＲ産物をアガロースゲルに供する前に、非変異導入したＰＣＲテンプレートをＰＣＲ産物のプールから制限酵素ＤｐｎＩを用いて取り除いた。ＰＣＲ産物のゲル精製後、平滑末端を連結して環状化プラスミドを得て、これをコンピテント大腸菌細胞中に形質転換した。一晩インキュベーション後、いくつかのコロニーを採取し、プラスミドＤＮＡを単離し、配列決定して、変異が組み込まれたことを確認した。
【００９４】
０．１５ｍＭのデコイ基質２−デオキシ−２−フルオロ−２−フコースの添加により、非フコシル化バリアントを生成した（Ｄｅｋｋｅｒｓら（２０１６）Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ６：３６９６４）。以下の実施例１０に示すように、これにより、ＩｇＧ−Ｆｃグリカン中のフコースの組み込みを有意に低減させた。
【表２】
2020534000.tif 000003
【００９５】
実施例１．ＴＮＦαに対する親和性
方法：
ＴＮＦαに対する親和性をＢｉａｃｏｒｅにより測定した。標準的なアミン固定化Ｂｉａｃｏｒｅ手順を用いてＣＭ５チップを作製した。ＣＭ５チップの挿入時に、システムをプライミングし、その後、ＢＩＡ正規化溶液（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｋｉｔ  ２）で正規化した。チップをＰＢＳ−Ｔランニング緩衝液と共にシステムに加え；固定化の前に、チップ表面を５０ｍＭのＮａＯＨの３回の注入によりプライミングした。プロテインＡをチップ表面上に固定した。このために、タンパク質をｐＨ４．５で１０ｍＭの酢酸緩衝液中で５μｇ／ｍＬに希釈し、注入して、全て４つのフローセル中で約１０００ＲＵの結合応答を生成した。全てのチップフローセルから非共有結合物質を除去するために、５０ｍＭのＮａＯＨによる３回の１５秒間の洗浄を実施した。プロテインＡチップ上の、フローセル２および４中で抗体が捕捉され、フローセル１および３は、基準値の減算のために使用した。試行抗体をＰＢＳ−Ｔ中で１０ｎＭに希釈し、２．５〜７．５ｕＬを注入して、１２０ＲＵの捕捉抗体を得た。供給業者の指示に従い、分析物ＴＮＦαを水中で５００μｇ／ｍＬで作製し、ランニング緩衝液リン酸緩衝食塩水ツイーン−２０（ＰＢＳ−Ｔ）中でさらに希釈した。単一サイクル動力学を用いて、定常状態親和性を推定した。各単一サイクルの解析サイクルに対し、５種の分析物濃度の滴定液をリガンド上に注入した後、複合体の解離を測定した。グリシンｐＨ１．７を用いて表面を再生した。二重基準法を採用し、リガンド結合捕捉表面（ｆｃ２および４）のデータをリガンドが捕捉されていない基準表面（それぞれ、ｆｃ１および３）から差し引いた。緩衝液のブランク注入を３〜４サイクル毎に実施した後、分析物注入サイクルから差し引いて、リガンド捕捉表面中の小さい変化を補正した。各分析実行の開始と終了時の分析物の反復注入を用いて、試料分解、または装置性能の変化を調べた。全ての分析を２５℃で実施し、実験の実施中、試料ラックを１０℃でインキュベートした。各実験を少なくとも３回実施した。１対１結合モデルを用いて、得られた動的データに当てはめた。
【００９６】
結果：
全ての抗体は、ＴＮＦαに対し類似の結合動力学を示し、いずれの導入された改変も、抗原結合領域中の大きな変化をもたらさなかった。
【表３】
2020534000.tif 000004
【００９７】
実施例２．効力
方法：
Ｌ９２９細胞を、段階希釈の抗ＴＮＦα抗体バリアントの存在下、０．２５ｎｇ／ｍＬのＴＮＦαおよび１μｇ／ウェルのアクチノマイシンＤと共にインキュベートした。３７℃／５％ＣＯ２下で２０時間のインキュベーション後、増殖性応答をＭＴＳ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムおよび電子カップリング試薬（フェナジンエトスルフェート、ＰＥＳ）を用いて測定した。ＭＴＳは、代謝的に活性細胞中に存在する脱水素酵素によりホルマザン生成物に変換された。４９２ｎｍの吸光度で測定したホルマザン生成物の量は、培養物中の生存細胞の数に正比例した。
【００９８】
結果：
結果を、図１に示す。抗ＴＮＦα抗体のＦｃ領域中への変異の導入は、効力に影響を与えなかった。
【００９９】
実施例３．Ｆｃγ受容体（ＣＤ６４、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ）に対する親和性
方法：
ＦｃγＲに対する親和性をＢｉａｃｏｒｅにより測定した。標準的なアミン固定化Ｂｉａｃｏｒｅ手順を用いてＣＭ５チップを作製した。ＣＭ５チップの挿入時に、システムをプライミングし、その後、ＢＩＡ正規化溶液（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  Ｋｉｔ  ２）で正規化した。チップをＰＢＳ−Ｔランニング緩衝液と共にシステムに加え；固定化の前に、チップ表面を５０ｍＭのＮａＯＨの３回の注入によりプライミングした。Ｈｉｓタグ捕捉システムを用いて、ＦｃγＲをチップ表面上に固定した。Ｂｉａｃｏｒｅキット説明書に従って抗Ｈｉｓタグチップを作製し、４つ全てのフローセル上に約１２０００ＲＵの抗体が堆積した。全てのチップフローセルから非共有結合物質を除去するために、１０ｍＭのグリシン：ｐＨ１．５による３回の３０秒間の洗浄を実施した。Ｆｃγ受容体をＰＢＳ−Ｔ中で、０．５〜２μｇ／ｍＬの範囲に希釈し、２．５〜５．０μＬをチップ上に注入し、６０〜２００ＲＵのレベルの捕捉を生成した。分析の前に、抗体をＰＢＳ−Ｔ中に希釈した。単一サイクル動力学を用いて、定常状態親和性を推定した。各単一サイクルの解析サイクルに対し、５種の抗体濃度の滴定液をＦｃγＲリガンド上に注入した後、複合体の解離を測定した。推奨溶液の、１０ｍＭのグリシンｐＨ１．５を用いて、抗Ｈｉｓ捕捉表面用として表面を再生した。二重基準法を採用し、リガンド結合捕捉表面（ｆｃ２および４）のデータをリガンドが捕捉されていない基準表面（それぞれ、ｆｃ１および３）から差し引いた。緩衝液のブランク注入を抗体用量設定サイクル毎に実施した後、分析物注入サイクルから差し引いて、リガンド捕捉表面中の小さい変化を補正した。全ての分析を２５℃で実施し、実験の実施中、試料ラックを１０℃でインキュベートした。各実験を少なくとも３回実施した。
【０１００】
結果：
ＣＤ６４に対する結合は、遺伝子改変抗ＴＮＦα抗体の影響を受けなかった。変異の導入は、ＣＤ３２ａ（Ｈ）、ＣＤ３２ａ（Ｒ）およびＣＤ３２ｂに対する親和性に影響を与えなかった。しかし、抗体Ａｂ−ＡＡ−２ＦＦは、ＣＤ１６ａ（Ｖ）に対する親和性の４．７倍の増加を示した。特に、非フコシル化抗体Ａｂ−ＡＡ−２ＦＦは、低親和性ＣＤ１６ａ受容体およびＣＤ１６ｂに対する結合も改善した。
【表４】
2020534000.tif 000005
【表５】
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【０１０１】
実施例４．ＦｃＲｎに対する親和性
方法：
製造業者により記載されているように、アミンカップリング化学を使って抗ＴＮＦα  ＩｇＧ１抗体（約５００共鳴単位（ＲＵ））と結合したＣＭ５センサーチップを用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００装置でＳＰＲを実施した。アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中の２．０ｕｇ／ｍＬのそれぞれのタンパク質を注入することにより、カップリングを実施した。ＨＢＳ−Ｐ緩衝液ｐＨ７．４（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％の界面活性剤Ｐ２０）またはリン酸緩衝液ｐＨ６．０（６７ｎＭのリン酸緩衝液、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．００５％のツイーン２０）をランニング緩衝液および希釈緩衝液として用いた。単量体Ｈｉｓタグ付きヒトＦｃＲｎ（ｈＦＣＲｎ）の滴定量（１０００〜３１．２ｎＭ）を、ｐＨ７．４またはｐＨ６．０で固定化抗体上に注入することにより結合動力学を決定した。全てのＳＰＲ実験を２５℃、流速４０ｕｌ／分で実施した。結合データをゼロ調節し、基準セル値を減算した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（バージョン４．１）により提供されたラングミュア１：１リガンド結合モデルを用いて、結合動力学を決定した。
【０１０２】
結果：
結果は、野性型抗体Ａｂ−ｗｔは、厳密にｐＨ依存的にｈＦｃＲｎに結合することを示した。遺伝子改変抗体バリアントは、ｐＨ６．０でＦｃＲｎに対するより高い親和性を有するが、それらのｐＨ依存性を保持し、ｐＨ７．４では、受容体に結合しなかった。全ての抗体バリアントは、野生型ＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含有するインフリキシマブに比べて、ＦｃＲｎに対し改善された結合を示した。
【表６】
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【０１０３】
実施例５．トランスサイトーシス
方法：
０．４μｍサイズのコラーゲンコートポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）膜を備えたトランスウェルフィルター（１．１２ｃｍ２）を完全増殖培地中で一晩インキュベートし、続けて、ウェル当たり１．０ｘ１０６個のＴ８４細胞を播種した。Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＥＲＳ−２ボルト−オームメーターを用いて、経上皮電気抵抗値（ＴＥＥＲ）を毎日監視した。培養物を４〜５日間増殖させた後、約１０００〜１３００Ωｘｃｍ２のＴＥＥＲ値を有するコンフルエンスに達した。実験の前に、単層をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で１時間にわたり欠乏させた。その後、４００ｎＭの抗体バリアントまたはＩＦＸ単独を、または無関係の特異性を有する４０００ｎＭのヒト骨髄腫ＩｇＧと一緒に、頂端トランスウェルチャンバーに加えた。添加の０および４時間後に、基底外側リザーバーから試料を収集した。基底外側リザーバー中の抗体濃度をＥＬＩＳＡで測定した。手短に説明すると、９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを組換えＴＮＦαまたはヤギ由来の抗ヒトＦｃ特異的抗体（両方ともＰＢＳ中で１μｇ／ｍｌに希釈）で一晩コートした。その後、プレートを４％脱脂乳含有ＰＢＳを用いて室温で２時間ブロッキングし、続けて、０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳで４回洗浄した。トランスサイトーシス実験中に収集した試料をウェルに加え、室温で２時間インキュベートした後、上記のように洗浄した。アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）標識ヤギ由来抗ヒトＦｃ特異的抗体を用いて、捕捉抗体バリアント、ＩＦＸまたは総ＩｇＧを検出した。１００μｌのＡＬＰ−基質の添加により結合を可視化し、４０５ｎｍ吸収スペクトルを記録した。輸送された抗体バリアント、ＩＦＸおよび総ＩｇＧの量を、それぞれ個別の抗体バリアントの検量線から計算した。
【０１０４】
分極ヒト上皮細胞を横切る抗体バリアントのトランスサイトーシス
結果：
遺伝子改変抗ＴＮＦα抗体バリアントの、細胞単層を横切るトランスサイトーシスの試験を行い、別のヒトＩｇＧ１抗ＴＮＦα抗体としてＩＦＸと比較した。この結果は図２に示されている。ＩＦＸに比べて、ｗｔ  Ｆｃ領域を有するＩｇＧ１抗体、Ａｂ−ＡＡは、約１．８倍高い効率で輸送された。Ａｂ−ＡＡの輸送に類似の有意な増加が、非フコシル化バージョンのＡｂ−ＡＡ−２ＦＦに対しても同様に観察された。
【０１０５】
競合ＩｇＧの存在下での分極ヒト上皮細胞を横切る抗体バリアントのトランスサイトーシス
結果：
抗ＴＮＦα抗体バリアントを添加４時間後に１０倍過剰量のヒト骨髄腫ＩｇＧと共にインキュベートした場合、頂端側から基底外側リザーバーへ分極Ｔ８４細胞単層を横切って輸送された免疫グロブリンの合計量は、全ての抗体で同等であった。しかし、ｐＨ６．０でのＦｃＲｎへの増加した親和性は、無関係の特異性を有する過剰の競合ヒトＩｇＧの存在下でも、有意により高いパーセンテージの特異的抗ＴＮＦαの細胞単層を横切る輸送をもたらした。この結果は図３に示されている。
【０１０６】
実施例６．ＡＤＣＣ
方法：
ＰｒｏｍｅｇａのＡＤＣＣレポーターバイオアッセイコアキットを使用した。手短に説明すると、ｍＴＮＦα  ＣＨＯ−Ｋ１標的細胞を１ｘ１０５／ｍＬで白色（透明底）組織培養皿に、ウェル当たり１００μＬを播種した。プレートを３７℃／５％ＣＯ２下、一晩インキュベートした。２日目に、９５μＬのアッセイ媒体を取り出し、２５μＬの３ｘ１０６／ｍＬの遺伝子改変ジャーカットエフェクター細胞と置換した。その後、プレートを３７℃／５％ＣＯ２下で、６時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに近づくと、ＢｉｏＧｌｏ（商標）試薬を作製した。プレートを室温で、１０〜２０分間平衡化した後、ウェル当たり７５μＬのＢｉｏＧｌｏ（商標）試薬を加えた。インキュベーションの５〜１０分後、暗所で発光を測定した。４−ＰＬモデルを用いて、データに当てはめた。
【０１０７】
結果：
結果（図４参照）は、全ての抗ＴＮＦα抗体がＡＤＣＣを誘導したが、強度は異なっていた。野生型抗体Ａｂ−ｗｔに比較して、Ａｂ−ＡＡは、類似のＡＤＣＣ活性を示したが、非フコシル化抗体バリアントＡｂ−ＡＡ−２ＦＦは、有意に改善されたＡＤＣＣを有した。
【０１０８】
実施例７．Ｃ１ｑ結合
方法：
ウェルをＰＢＳ中で１μｇ／ｍＬに希釈したヒトＴＮＦαでコートした９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレートを用いてＥＬＩＳＡを実施した。４℃で一晩インキュベーションした後、プレートを４％脱脂乳含有ＰＢＳを用いて１時間ブロッキングし、０．０５％ツイーン２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔ）で４回洗浄した。その後、滴定量の抗ＴＮＦα  ＩｇＧ抗体をＰＢＳ−Ｔ中で希釈し、添加して、室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−Ｔを用いて洗浄後、ヒトＣ１ｑ（０．５μｇ／ｍＬ）を０．１Ｍのベロナール緩衝液（０．２５ｍＭのＣａＣｌ２および０．８ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．２）中で希釈し、ウェルに添加し、１時間インキュベートした。続けて、ウェルを上述のように洗浄後、ＰＢＳ−Ｔ中で１：５０００に希釈したウサギ抗ヒトＣ１ｑをウェルに加え、１時間インキュベートした。洗浄後、ＰＢＳ−Ｔ中で１：５０００に希釈したロバ由来のＨＲＰ標識抗ウサギＩｇＧを添加した。続けて、ウェルを洗浄し、１００μＬの３，３’、５，５’−テトラメチルベンジジン基質を各ウェルに加えた。Ｓｕｎｒｉｓｅ分光光度計を用いて、６２０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１０９】
結果：
抗ＴＮＦα抗体バリアントは、ヒトＣ１ｑが加えられる前に、ヒトＴＮＦαに捕捉された。結果（図５参照）は、抗体はＣ１ｑに結合したが、結合強度はそれぞれ異なっていた。最強から最低までの結合の序列は次の通りであった：
Ａｂ−ＡＡ＝ＩＦＸ＞Ａｂ−ＡＡ−２ＦＦ。
【０１１０】
実施例８．制御性マクロファージの誘導
方法：
健康なバフィーコートから末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。フィコール密度勾配遠心分離により細胞を単離した。２人の個別のドナーの細胞を等しい数で混合し、混合物の２ｘ１０５細胞を９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルの合計体積で播種した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２下で、４８時間インキュベートした。４８時間後、抗ＴＮＦα抗体バリアントまたはＩＦＸを、最終濃度１０μｇ／ｍＬに達するまで加えた。各化合物を５または６回反復して加えた。最終体積は、１５０μＬ／ウェルであった。ヒト血清ＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｉ５１５４）を対照として用いた。化合物の添加後、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を３７℃／５％ＣＯ２下で、さらに４日間培養した。後で、プレートをＰＢＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ）を用いて洗浄し、５０μＬ／ウェルのＰＢＳ／ＥＤＴＡと共に、室温で２０分間インキュベートした。プレートを遠心分離し、液体を飛散させた。抗体をＰＢＳ／ＥＤＴＡ（抗ＣＤ１４−ＰＥ、抗ＣＤ２０６−ＡＰＣ、両方１：１０に希釈）で希釈した。細胞を５０μＬの抗体溶液に再懸濁し、室温で２０分間インキュベートした。後で、細胞をＰＢＳ／ＥＤＴＡで洗浄し、５０μＬのＰＢＳ／ＥＤＴＡに再懸濁した。染色した試料をＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを用いて、ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａで分析した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いて分析を実施した。
【０１１１】
結果：
制御性マクロファージの誘導を４種の独立したＭＬＲで分析し、全ての実験で成功した（ＩｇＧ対照に対しＩＦＸを比較）。結果を、図６に示す。ＩＦＸによる誘導のレベルは、各実験が個体間変動を有する異なるドナーを使って実施されたという事実のために、実験間で異なり得る。全ての試験抗ＴＮＦα抗体バリアントは、ＣＤ１４＋ＣＤ２０６＋制御性マクロファージを誘導し、化合物間で僅かな変動があった。Ａｂ−ＡＡ−２ＦＦは、ＩＦＸより有意に多くの制御性マクロファージを誘導した。
【０１１２】
実施例９．Ｔ細胞増殖の阻害
方法：
健康なバフィーコートからＰＢＭＣを単離した。フィコール密度勾配遠心分離により細胞を単離した。２人の個別のドナーの細胞を等しい数で混合し、混合物の２ｘ１０５細胞を９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェルの合計体積で播種した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２下で、４８時間インキュベートした。４８時間後、抗ＴＮＦα抗体バリアントまたはＩＦＸを、最終濃度１０μｇ／ｍＬに達するまで加えた。各化合物を５または６回反復して加えた。最終体積は、１５０μＬ／ウェルであった。ヒト血清ＩｇＧ１（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｉ５１５４）を対照として用いた。化合物の添加後、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を３７℃／５％ＣＯ２下で、さらに２日間培養した。後で、トリチウム標識チミジン（３Ｈ  チミジン、０．５マイクロキュリー／ウェル）を培養物に加えた。培養物を３７℃／５％ＣＯ２下で、１８時間さらにインキュベートした。Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔ９６セルハーベスターを用いて試料を回収し、単一検出器を備えたＭｉｃｒｏｂｅｔａ  ＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＣｏｕｎｔｅｒを用いて分析した。試料を１０秒間／ウェルで計数し、分当たりのカウント数（ｃｐｍ）に変換した。
【０１１３】
結果：
Ｔ細胞増殖の阻害を３種の独立したＭＬＲで測定し、陽性対照としてのＩＦＸが抑制を誘導した場合に成功と定義した。個別の実験でのＩＦＸによる抑制のレベルは、おそらく制御性マクロファージ誘導の変動性により、異なる可能性がある。各実験では、抗ＴＮＦα抗体バリアントのＴ細胞増殖を抑制する可能性を陽性対照ＩＦＸに対して計算した。抗体Ａｂ−ＡＡ−２ＦＦは、ＩＦＸに比べて抑制を有意に高めることを示し、一方、Ａｂ−ＡＡは、ＩＦＸより有意に少ないＴ細胞増殖の抑制を示した（図７参照）。
【０１１４】
実施例１０．Ｎ−グリカンの分析
方法：
５０μｌの各ＩｇＧバリアント（１ｍｇ／ｍｌ）を１３，０００ｘｇで１０分間遠心沈降させた後、１００μｌの５０ｍＭの重炭酸アンモニウム（ｐＨ７．８）中に溶解した１μｇのトリプシンを加えて、３７℃で一晩インキュベートした。遠心装置で１３，０００ｘｇで１０分間遠心沈降させ、通過画分をエッペンドルフチューブに移し、ＳｐｅｅｄＶａｃ（Ｈｅｔｏ  Ｍａｘｉ  ｄｒｙ）中で乾燥させた。乾燥試料を２０μｌの１％ギ酸中に溶解し、３０秒間超音波処理して、１６，１００ｘｇで１０分間遠心分離した。その後、各試料を新しいバイアルに移し、タンパク分解性ペプチドの逆相（Ｃ１８）ナノオンライン液体クロマトグラフィー−タンデム型質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００  ＵＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いて実施した。５μｌのペプチド溶液を抽出カラムに注入し、バックフラッシュモードで、抽出カラムから分析カラムにペプチドを溶出した。移動相は、アセトニトリルおよび質量分析グレード水（両方共０．１％のギ酸を含有）から構成された。クロマトグラフ分離は、０．３μｌ／分の流速で、６０分間の水中３〜５０％のアセトニトリルからのバイナリ勾配法を用いて行った。ＬＣシステムをナノエレクトロスプレーイオン源を介してＱ  ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極オービトラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に連結した。ペプチド試料を、２０の正規化衝突エネルギーを用いて高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）フラグメント化法で分析し、ｍ／ｚ  ３００〜２０００の質量範囲で１つのオービトラップサーベイスキャンを取得し、続けて、オービトラップ中の１０個の最強イオンのＭＳ／ＭＳを取得した。
【０１１５】
データ解析をＸｃａｌｉｂｕｒ  ｖ２．０で実施した。全てのＮ−グリコペプチドのＭＳ／ＭＳスペクトルをオキソニウムイオンサーチにより抽出した；２０４．０８６（Ｎ−アセチルヘキソサミン）および３６６．１３８８（Ｎ−アセチルヘキソサミン−ヘキソース）。２０の正規化衝突エネルギー有するＨＣＤフラグメント化を用いることにより、ＩｇＧのグリカン構造およびペプチド質量が検出された。標的グリコールペプチド（ＩｇＧ１のＥＥＱＹＮＳＴＹＲ）の抽出イオンクロマトグラムは、１０ｐｐｍの精度で抽出され、対応するＭＳ／ＭＳスペクトルは、マニュアルで検証された。３５の正規化衝突エネルギーを有するＨＣＤフラグメント化を用いて、ペプチド配列を検出し、ペプチド質量が正確なペプチド配列に対応していたことを検証した。全ての抽出したグリコールペプチドの曲線下面積を計算し、各グリコフォームのパーセンテージ比率を決定した。
【０１１６】
結果：
Ａｂ−ＡＡの場合、２種のＮ−グリカン型、すなわち、４ＧｌｃＮａｃ−１Ｆｕｃ−３Ｍａｎおよび４ＧｌｃＮａｃ−１Ｆｕｃ−３Ｍａｎ−１Ｇａｌが優位を占め、総Ｎ−グリカンプールの９０％超に相当する。優位を占める両方のＮ−グリカン型は、コアフコースを含有していた。Ａｂ−ＡＡ（Ａｂ−ＡＡ−２ＦＦ）の「非フコシル化」バージョンを生成するために、デコイ基質２−デオキシ−２−フルオロ−１−フコース（２ＦＦ）を用いた。この抗体のＭＳマッピングにより、この戦略が、フコースの組み込みを成功裏に大きく低減させ、９０％超から１０％未満までのフコース含量の低下が検出されたことが明らかとなった。処理後の優位を占めるＮ−グリカン型は、これらの構造がフコースを欠くこと以外は、２ＦＦの非存在下で生成されたバリアントと同じであった（図９も参照）。
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020534000.tif 000015
【図８】
2020534000.tif 000016
【図９】
2020534000.tif 000017
【配列表】
2020534000000001.app
【国際調査報告】
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2020534000.tif 000019