(57)【要約】ノイラミニダーゼＮａｎＢから改変されたシアル酸認識親和性試薬は、レクチン様特性及びシアル酸に対する明確な特異性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対応する野生型ＮａｎＢノイラミニダーゼタンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有する、触媒不活性ＮａｎＢノイラミニダーゼタンパク質又はその断片を含むシアル酸認識親和性試薬であって、前記変異は、
（ａ）前記ＮａｎＢタンパク質のノイラミニダーゼ活性を低減又は排除し、且つ
（ｂ）シアル酸結合親和性又は結合特異性に影響を及ぼし、
前記親和性試薬は、グリカンのシアル酸成分に結合する、シアル酸認識親和性試薬。
【請求項２】
前記ＮａｎＢ断片は、前記ＮａｎＢタンパク質の炭水化物結合性分子（ＣＢＭ）ドメイン及び前記ＮａｎＢタンパク質のグリコシルヒドロリアーゼ（ＧＨ）ドメインの少なくとも１つを含む、請求項１に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項３】
シアル酸に対してｐａｎ特異的である、請求項１又は２に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項４】
α２，３結合で隣接サッカリドモノマーに結合されたＮｅｕ５Ａｃ、α２，６結合で隣接サッカリドモノマーに結合されたＮｅｕ５Ａｃ及びα２，８結合で隣接サッカリドモノマーに結合されたＮｅｕ５Ａｃに結合する、請求項３に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項５】
Ｎｅｕ５Ａｃの少なくとも１つのバリアントに結合する、請求項３に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項６】
前記変異は、配列番号１又は配列番号４において表されるＹ６５３、Ｄ２７０及びＥ５４１からなる群から選択される部位におけるものである、請求項３に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項７】
前記変異は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮａｎＢ（配列番号１若しくは配列番号４）又はその断片或いは相同的ＮａｎＢ配列での対応する位置におけるものである、請求項６に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項８】
前記変異は、Ｙ６５３Ｆ、Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｎ、Ｅ５４１Ａ及びＥ５４１Ｑからなる群から選択される、請求項６に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項９】
前記変異は、Ｙ６５３Ｆである、請求項８に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項１０】
Ｓｉａ−ＰＳ１、Ｓｉａ−ＰＳ２、Ｓｉａ−ＰＳ３、Ｓｉａ−ＰＳ４及びＳｉａ−ＰＳ５からなる群から選択される、請求項８に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項１１】
Ｓｉａ−ＰＳ１である、請求項１０に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項１２】
対応する野生型ＮａｎＢノイラミニダーゼタンパク質と比較して複数のアミノ酸変異を有する、請求項１に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項１３】
前記複数の変異は、
（ａ）前記ＮａｎＢタンパク質の触媒活性を低減又は排除する少なくとも１つの第１変異、及び
（ｂ）結合親和性又は結合特異性に影響を及ぼす少なくとも１つの第２変異
を含む、請求項１２に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項１４】
α２，３結合で隣接サッカリドモノマーに結合されているＮｅｕ５Ａｃに対して特異的である、請求項１２に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項１５】
前記複数の変異は、配列番号１又は配列番号４において表されるＲ１９３、Ｄ２７０、Ａ５３８、Ｅ５４１、Ｐ６６０、Ｓ６７３、Ｄ３２７及びＮ６８３からなる群から選択される部位におけるものである、請求項１２に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項１６】
前記複数の変異は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮａｎＢ（配列番号１若しくは配列番号４）又はその断片或いは相同的ＮａｎＢ配列での対応する位置におけるものである、請求項１５に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項１７】
前記複数の変異は、Ｒ１９３Ａ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０Ｇ、Ｄ２７０Ｈ、Ｄ２７０Ｉ、Ａ５３８Ｖ、Ａ５３８Ｗ、Ａ５３８Ｆ、Ａ５３８Ｈ、Ａ５３８Ｍ、Ａ５３８Ｉ、Ｅ５４１Ｄ、Ｅ５４１Ａ、Ｅ５４１Ｉ、Ｅ５４１Ｓ、Ｐ６６０Ｑ、Ｓ６７３Ａ、Ｓ６７３Ｑ、Ｄ３２７Ｅ、Ｄ３２７Ｖ及びＮ６８３Ｓからなる群から選択される、請求項１５に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項１８】
前記複数の変異は、Ｒ１９３Ａ、Ｄ２７０Ｑ、Ａ５３８Ｖ及びＥ５４１Ｄを含む、請求項１７に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項１９】
Ｓｉａ−３Ｓ１、Ｓｉａ−３Ｓ２、Ｓｉａ−３Ｓ３、Ｓｉａ−３Ｓ５、Ｓｉａ−３Ｓ６、Ｓｉａ−３Ｓ７、Ｓｉａ−３Ｓ７＊、Ｓｉａ−３Ｓ８及びＳｉａ−３Ｓ９からなる群から選択される、請求項１７に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項２０】
Ｓｉａ−ＰＳ１である、請求項１９に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項２１】
前記グリカンは、グリコシル化生体分子の構成成分である、請求項１に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項２２】
前記グリコシル化生体分子は、糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、グリコリポタンパク質又はグリコリポペプチドを含む、請求項２１に記載のシアル酸認識親和性試薬。
【請求項２３】
第２成分に共有結合されている、請求項１に記載のシアル酸認識親和性試薬を含む第１成分を含むコンジュゲート。
【請求項２４】
前記第２成分は、タンパク質性成分である、請求項２３に記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
前記第２成分は、非タンパク質性成分である、請求項２３に記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
前記第２成分は、治療薬又は診断薬である、請求項２３に記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
請求項１に記載のシアル酸認識親和性試薬を含む融合タンパク質。
【請求項２８】
請求項１、２３又は２７のいずれか一項に記載のシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質を含む親和性マトリックス。
【請求項２９】
固体担体、表面、カラム、樹脂、ビーズ、マイクロアレイ、粒子及びナノ粒子からなる群から選択される、請求項２８に記載の親和性マトリックス。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか一項に記載のシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート、融合タンパク質又は親和性マトリックスと、使用説明書とを含むキット。
【請求項３１】
請求項１、２３又は２７のいずれか一項に記載のシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項３２】
請求項３１に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項３３】
発現ベクターである、請求項３２に記載のベクター。
【請求項３４】
請求項３２又は３３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３５】
細菌細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載のシアル酸認識親和性試薬若しくはコンジュゲート又は請求項２７に記載の融合タンパク質を製造する方法であって、宿主細胞において前記親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質を発現することを含む方法。
【請求項３７】
グリカンのシアル酸成分を検出する方法であって、生体試料又は実験試料を、請求項１、２３又は２７のいずれか一項に記載のシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質と、シアル酸への前記親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質の結合を可能にする条件下で接触させる工程と、前記シアル酸を検出する工程とを含む方法。
【請求項３８】
前記生体試料又は実験試料は、組換え抗体を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記グリカンは、バイオマーカーである、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記バイオマーカーは、癌バイオマーカーである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
シアル酸含有グリカンをエンリッチ、単離又は精製する方法であって、請求項１、２３又は２７のいずれか一項に記載のシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質を、シアル酸への前記親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質の結合を可能にする条件下で接触させて、エンリッチ、単離又は精製されたシアル酸含有グリカンをもたらすことを含む方法。
【請求項４２】
請求項１、２３又は２７のいずれか一項に記載のシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質を含む診断用又は治療用組成物。
【請求項４３】
前記シアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質は、検出可能に標識化される、請求項４２に記載の診断用又は治療用組成物。
【請求項４４】
検出可能な標識は、放射性標識、蛍光標識、リン光性標識、比色定量標識、酵素的標識、免疫学的標識、磁気標識、常磁性標識、反磁性標識又は電磁標識を含む、請求項４３に記載の診断用又は治療用組成物。
【請求項４５】
治療薬としての、請求項１、２３又は２７のいずれか一項に記載のシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質の使用。
【請求項４６】
診断薬としての、請求項１、２３又は２７のいずれか一項に記載のシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質の使用。
【請求項４７】
標的化薬物送達のための、請求項１、２３又は２７のいずれか一項に記載のシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質の使用。
【請求項４８】
生体試料又は実験試料中のシアル酸の存在又は量を検出するための、請求項１、２３又は２７のいずれか一項に記載のシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質の使用。
【請求項４９】
本明細書に記載される特徴の１つ又は複数を含む化合物、組成物又は方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれる２０１７年４月２４日出願の米国仮特許出願第６２／４８９，２４３号明細書の利益を主張する。
【０００２】
政府による財政的支援
本発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された譲与番号Ｒ４１ＧＭ１１３３５１の元で政府による支援を受けた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、２２キロバイトのサイズを有する「Ｓｅｑ−Ｌｉｓｔ−０２７４０２０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」という名称の２０１８年４月１６日に作成されたＡＳＣＩＩテキストファイルとして、米国特許商標庁にＥＦＳウェブを介して電子的に提出された配列表を含有する。配列表に含まれる情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
グリカンは、いくつかの固有の特性を有し、その開発は、疾患のバイオマーカーとして魅力的なものとなっている。細胞表面のその位置は、細胞の相互作用の最初の接触箇所となり、したがって正常な代謝プロセスの制御において重要である。それらは、病原体接着受容体としても機能する。糖タンパク質上に存在しないか又は正常状態において少量で存在するグリカン構造は、疾患状態においてその配列を増殖又は改変し得る。多くのグリカンの顕著な特徴は、末端シアル酸である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、新規なシアル酸認識親和性試薬を提供する。親和性試薬は、糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、オリゴ糖又は多糖などのグリコシル化生体分子上に存在するシアル酸（５−（アセチルアミノ）−３，５−ジデオキシ−Ｄ−グリセロ−α−Ｄ−ガラクト−非−２−ウロピラノソン酸、Ｎｅｕ５Ａｃ、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＮＡＮＡ及びＳｉａとも呼ばれる）を認識し、結合する。
【０００６】
本明細書において提供されるシアル酸認識親和性試薬は、シアリル化グリカンに対する親和性及び特異性を有する、改変Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）タイプのタンパク質である。Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、グリコセンサー（Ｇｌｙｃｏｓｅｎｓｏｒ）及び診断の登録商標（ｄ／ｂ／ａ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）Ｂｉｏ）である。本発明の改変シアル酸認識親和性試薬の実施形態としては、限定されないが、１）実施例Ｉに記載のリード候補Ｓｉａ−ＰＳ１を有する、結合（α２，３−、α２，６−及びα２，８−結合）とは無関係の、シアログリカンに対する広い特異性を有する、ｐａｎ特異的なシアル酸認識親和性試薬（本明細書においてＳｉａ−ＰＳ試薬と呼ばれる）；及び２）実施例ＩＩに記載のリード候補Ｓｉａ−３Ｓ１を有する、α２，６及びα２，８結合と比べてα２，３−結合シアログリカンに対して特異的なα２，３シアル酸認識親和性試薬（本明細書においてＳｉａ−３Ｓ試薬と呼ばれる）が挙げられる。これらの試薬は、非シアリル化グリカン又はペプチド主鎖に対して低い親和性を有するか又は親和性を有さない。
【０００７】
有利には、本発明のシアル酸認識親和性試薬は、シアル酸に結合する抗体又はレクチンと比べて高い基質特異性を有する。基質特異性は、本明細書に記載のＳｉａ−ＰＳ親和性試薬及びＳｉａ−３Ｓ親和性試薬を比較することによって証明されるように調整可能である。基質特異性は、コンテクスト依存性である必要はなく、親和性試薬は、望ましい結合キネティクスを有すると導き出され得る。従来のように、本発明の親和性試薬は、単量体タンパク質として効率的に生成され得る。
【０００８】
一部の実施形態において、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮａｎＢ炭水化物処理酵素の構造的に誘導された遺伝子操作を用いて、変異の部位を同定し、シアル酸に対する向上した親和性を有する変異を選択し、それにより、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）として知られる、高い特異性の親和性試薬へとＮａｎＢが転化された。設計及び合成法は、一般に、それぞれが明示的に参照により組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／００４０４７４号明細書（「Ｇｌｙｃａｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｏｏｌｓ」）及び国際公開第２０１５／１６１２０１号パンフレット（米国特許出願第１５／３０４，７２５号明細書）に記述されており、更に具体的には以下の実施例Ｉ及びＩＩに記述されている。しかしながら、本発明は、本明細書で同定且つ記載される様々な且つ特定のシアル酸認識親和性試薬に関するため、かかる試薬の製造方法によって全く限定されないことを理解されたい。
【０００９】
本発明のシアル酸認識親和性試薬は、研究及び臨床的設定のいずれにおいても有用である。例えば、それは、グリコペプチド及び糖タンパク質の疾患関連シアル酸修飾の検出に有用である。親和性試薬は、グリカンベースの疾患マーカーの発見のための様々な用途だけでなく、遺伝子組換えで製造されたバイオ医薬品の品質管理分析でも捕捉試薬又は認識要素として用いられ得、その多くは、抗体などの糖タンパク質である。これらの試薬は、アフィニティークロマトグラフィーエンリッチメント、ウェスタンブロット又はＦＡＣＳに基づく検出などのプラットホームに適応することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ−Ｂ】肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮａｎＢの立体画像を示す。図１Ｂは、図１Ａから見て９０度回転している。これらの画像において、ＮａｎＢは、ＮａｎＢ活性部位に結合された球体として示される基質、２，７−アンヒドロ−Ｎｅｕ５Ａｃとの複合体で示される。Ｇｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２００８，５８２（２３−２４）：２２４８−３３５２。
【図２】Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）改変（ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）における重要な工程を略述するフローチャートを示す。
【図３Ａ】影付きの残基として左のパネルに示されるシアル酸と近位（≦４．５Å）の残基及び影付きの残基として右のパネルに示される３’ＳＬＮのＧａｌ／ＧｌｃＮＡｃ残基と近位の残基を有する、酵素に結合された３’シアリルラクトサミン（３’ＳＬＮ，棒）のモデルを示す。
【図３Ｂ】野生型肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮａｎＢ（ＰＤＢ  ＩＤ：２ｖｗ０）の配列ディスプレイを示す。６９７アミノ酸配列（配列番号１）を示し、注釈する。３つのドメインを２ｖｗ０Ａ０１、２ｖｗ０Ａ０２、２ｖｗ０Ａ０３と標識化する。画像は、ＰＤＢ  ＩＤ  ２ｖｗ０のＲＣＳＢ  ＰＤＢ（ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）からの画像である（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００８，３８４：４３６−４４９）。
【図３Ｃ】ＮａｎＡ（ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＶＶＺ；配列番号２）、ＮａｎＢ（ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＶＷ０；配列番号１）及びＮａｎＣ（ＰＤＢ  ＩＤ  ５Ｆ９Ｔ；配列番号３）のアミノ酸配列のアラインメントを示す。ＮａｎＢ及びＮａｎＣは、配列同一性５０％を有し、いずれもＮａｎＡと同一性２５％を共有する。「＊」は、完全に保存されていることを意味し；「：」は、類似性が高いアミノ酸の群間での保存を意味し；「．」は、類似性が低いアミノ酸の群間での保存を意味する。
【図３Ｄ】実施例ＩにおけるｐＥＴ２８ａ＋ベースのプラスミド（「ＮａｎＢ：ＡＡ３０−６９７（ｐＥＴ２８ａ）」）から発現されるＮａｎＢ断片（３０−６９７；配列番号４）と、野生型ＮａｎＢ（ＰＤＢ  ＩＤ  ２ＶＷ０；配列番号１）とのアラインメントを示す。野生型ＮａｎＢにおける残基１〜２９は、シグナル又はリーダー配列を表す。「＊」は、完全保存を意味し；「：」は、類似性が高いアミノ酸の群間での保存を意味し；「．」は、類似性が低いアミノ酸の群間での保存を意味する。
【図４】ＮａｎＢ及びＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）クローンの相対的酵素活性を示す。
【図５】固定化された３’ＳＬへのＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補の結合についてのバイオセンサーでのＢＬＩセンサーグラムを示す。
【図６−１】固定化オリゴ糖へのＳｉａ−ＰＳ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補（検体）の結合についてのＢＬＩセンサーグラムを示す。Ｌｓｐ＝ラクトース（シアル酸なし）、３’ＳＬ＝α２，３−シアリルラクトース、６’ＳＬ＝α２，６−シアリルラクトース、ＧＤ３＝末端α２，８−結合Ｎｅｕ５Ａｃ残基及び内部α２，３−結合Ｎｅｕ５Ａｃ残基を含有するＧＤ３オリゴ糖。例えば、Ｓｉａ−ＰＳ１検体は、定常状態ＫＤ（３’ＳＬ）＝０．５９μＭ、ＫＤ（６’ＳＬ）＝０．６９μＭ、ＫＤ（ＧＤ３）＝０．３０μＭを示す。
【図６−２】固定化オリゴ糖へのＳｉａ−ＰＳ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補（検体）の結合についてのＢＬＩセンサーグラムを示す。Ｌｓｐ＝ラクトース（シアル酸なし）、３’ＳＬ＝α２，３−シアリルラクトース、６’ＳＬ＝α２，６−シアリルラクトース、ＧＤ３＝末端α２，８−結合Ｎｅｕ５Ａｃ残基及び内部α２，３−結合Ｎｅｕ５Ａｃ残基を含有するＧＤ３オリゴ糖。例えば、Ｓｉａ−ＰＳ１検体は、定常状態ＫＤ（３’ＳＬ）＝０．５９μＭ、ＫＤ（６’ＳＬ）＝０．６９μＭ、ＫＤ（ＧＤ３）＝０．３０μＭを示す。
【図６−３】固定化オリゴ糖へのＳｉａ−ＰＳ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補（検体）の結合についてのＢＬＩセンサーグラムを示す。Ｌｓｐ＝ラクトース（シアル酸なし）、３’ＳＬ＝α２，３−シアリルラクトース、６’ＳＬ＝α２，６−シアリルラクトース、ＧＤ３＝末端α２，８−結合Ｎｅｕ５Ａｃ残基及び内部α２，３−結合Ｎｅｕ５Ａｃ残基を含有するＧＤ３オリゴ糖。例えば、Ｓｉａ−ＰＳ１検体は、定常状態ＫＤ（３’ＳＬ）＝０．５９μＭ、ＫＤ（６’ＳＬ）＝０．６９μＭ、ＫＤ（ＧＤ３）＝０．３０μＭを示す。
【図７Ａ−Ｃ】Ｓｉａ−ＰＳ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィー（ＬＡＣ）によるシアリル化及び非シアリル化タンパク質の分離を示す。精製Ｓｉａ−ＰＳ１試料（２ｍｇ）を１ｍＬセファロースカラムに化学的に結合させ、続いて検体をローディングした。競合的に溶離した後、次の検体の結合及び溶離のためにカラムを再生した。ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅクロマトグラフィーシステムで実験を行った。図７Ａは、非シアリル化糖タンパク質ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の素通り及び重ねられたクロマトグラムにおけるフェチュインの保持を示す。図７Ｂは、ＢＳＡ（非グリコシル化）とフェチュイン（シアリル化糖タンパク質）との混合物の分離を示す溶離プロファイルを示す。図７Ｃは、アシアロフェチュイン（脱シアル化フェチュイン）とフェチュインとの分離を示す溶離プロファイルを示す。
【図８Ａ−Ｂ】Ｓｉａ−ＰＳ１及び合成ネオ糖タンパク質のＬＡＣ溶離プロファイルを示す。図８Ａは、３’−シアリルラクトース−ＢＳＡのＳｉａ−ＰＳ１ＬＡＣ溶離プロファイルを示す。図８Ａは、６’−シアリルラクトース−ＢＳＡのＳｉａ−ＰＳ１ＬＡＣ溶離プロファイルを示す。検体（２００μｇ）のそれぞれを結合バッファー中でＬＡＣカラム上に適用し、洗浄し、重力流れ下で競合的に溶離した。使用されたＬＡＣカラムは、図７に記載のカラムと同じであった。回収された画分のタンパク質濃度は、２８０ｎｍでの分光光度吸収によって決定された。比較のために（図９を参照されたい）、ネオ糖タンパク質をそれぞれバッファー体積１ｍＬ中に２００μｇでローディングし、一般的な１ｍＬレクチンアフィニティーカラムに対する推奨に合わせた。それぞれの実験において、ローディングされた検体の量は、競合的溶離によってほぼ完全に回収された。
【図９Ａ−Ｂ】標準レクチンアフィニティーカラム及び合成ネオ糖タンパク質の溶離プロファイルを示し、図９Ａは、市販のＭＡＡカラムからの３’−シアリルラクトース−ＢＳＡ（２００μｇ）の溶離プロファイルを示す。図９Ｂは、市販のＳＮＡカラムからの６’−シアリルラクトース−ＢＳＡ（２００μｇ）の溶離プロファイルを示す。
【図１０Ａ−Ｃ】ＭＣＦ７無細胞抽出物（ＣＦＥ）からのシアロ−グリココンジュゲートのＳｉａ−ＰＳ１ＬＡＣエンリッチメントを示す。Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．［３６］に従って調製されたＣＦＥの試料（約５００μｇ）をＳｉａ−ＰＳ１  ＬＡＣカラムにローディングし（図７を参照されたい）、ローディングバッファー中でそれぞれ５０ｍＭの３’ＳＬと６’ＳＬの１：１混合物によって洗浄し、競合的に溶離した。図１０Ａは、結合工程での未結合タンパク質（素通りピーク；３１９μｇ）と、結合タンパク質（溶離ピーク；３０μｇ）との分離を示すＬＡＣプロファイルを示す。図１０Ｂは、ＣＦＥ（ローディング約１２５μｇ）及びＬＡＣ溶離画分（ローディング約７μｇ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１０Ｃは、ＬＡＣ溶離画分中の小分子のエンリッチメントを示すＭＡＬＤＩプロファイルを示す。ＭＡＬＤＩ実験に使用される質量分析計は、１５ｋＤを超えるサイズの分子を解明するほど十分に感度が高くないことに留意されたい。
【図１１】アレイ上のすべてのシアリル化グリカン（Ｎｅｕ５Ａｃ−グリカン）（Ｉ）及び多くの非ヒトＮｅｕ５Ｇｃ−Ｓｉａグリカン（ＩＩ）を特異的に認識する能力を示す、Ｓｉａ−ＰＳ１についての結果をスクリーニングするグリカンアレイを示す。
【図１２】エンリッチ化クローン配列のアミノ酸ｉｃｅＬｏｇｏを示す。野生型配列は、下部にわたって示される。５つのランダム化された位置の好ましいアミノ酸をグラフ表示で示す。Ｙ軸は、アミノ酸のそれぞれの検出のパーセンテージ（差異％）を示す。Ｄ２３７及びＳ６７３での野生型配列の優勢は、ｉｃｅＬｏｇｏによって無視され、したがってこれらの位置についてｉｃｅＬｏｇｏの上部でのブランクスペースである。
【図１３】野生型（ｗｔ）ＮａｎＢ、Ｒ１９３Ａ点変異体及びＳｉａ−３ＳＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補の酵素活性を示す。
【図１４Ａ−Ｂ】異なるバッファー条件下でのＳｉａ−３Ｓ１（検体）の、オリゴ糖（固定化リガンド）：３’ＳＬ＝α２，３−シアリルラクトース、６’ＳＬ＝α２，６−シアリルラクトースへの結合についてのＢＬＩセンサーグラムを示す。図１４Ａは、１０ｍＭ  ＥＰＰＳ、１０ｍＭ  ＮａＣｌで構成されるバッファー（ｐＨ７．５）を使用した、オリゴ糖へのＳｉａ−３Ｓ１（検体）の結合についてのＢＬＩセンサーグラムを示す。図１３Ｂは、１０ｍＭ  ＥＰＰＳ、２５ｍＭ  ＮａＣｌで構成されるバッファー（ｐＨ７．５）を使用した、オリゴ糖へのＳｉａ−３Ｓ１（検体）の結合についてのＢＬＩセンサーグラムを示す。
【図１５】Ｓｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣカラムに結合されたフェチュインの差次的溶離を示す。精製Ｓｉａ−３Ｓ１（２ｍｇ）を１ｍＬセファロースカラムに共有結合し、続いてフェチュイン１００μｇをローディングする。Ｓｉａ−３Ｓ１カラムに結合されたフェチュイン分子をローディングバッファー中の５０ｍＭ  ３’ＳＬ又は６’ＳＬ溶液で競合的に溶離した（保持体積１８ｍＬでのＡ２８０ＵＶスパイクは、装置ポンプによる人工産物である）。
【図１６Ａ】６’ＳＬ−ＢＳＡと比べて３’ＳＬ−ＢＳＡへの選択的な結合を実証するＳｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣクロマトグラフィーを示す。図１６Ａは、Ｓｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣカラムへローディングされた３’ＳＬ−ＢＳＡ１００μｇについての結果を示す。図１６Ｂは、Ｓｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣカラムへローディングされた６’ＳＬ−ＢＳＡ１００μｇについての結果を示す。１Ｍ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  ＥＰＰＳ（ｐＨ７．５）バッファーで再生（「ＮａＣｌ再生」）する前に、Ｓｉａ−３Ｓ１カラム上に結合されたシアリル化ＢＳＡ分子を５０ｍＭ  ３’ＳＬ又は６’ＳＬ溶液で競合的に溶離した。それぞれの条件下での素通り量は、約５μｇであった。
【図１６Ｂ】６’ＳＬ−ＢＳＡと比べて３’ＳＬ−ＢＳＡへの選択的な結合を実証するＳｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣクロマトグラフィーを示す。図１６Ａは、Ｓｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣカラムへローディングされた３’ＳＬ−ＢＳＡ１００μｇについての結果を示す。図１６Ｂは、Ｓｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣカラムへローディングされた６’ＳＬ−ＢＳＡ１００μｇについての結果を示す。１Ｍ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  ＥＰＰＳ（ｐＨ７．５）バッファーで再生（「ＮａＣｌ再生」）する前に、Ｓｉａ−３Ｓ１カラム上に結合されたシアリル化ＢＳＡ分子を５０ｍＭ  ３’ＳＬ又は６’ＳＬ溶液で競合的に溶離した。それぞれの条件下での素通り量は、約５μｇであった。
【図１７】１１０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する結合バッファーを使用して、Ｓｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣカラムが３’ＳＬ−ＢＳＡにのみ結合することを示す。３’ＳＬ−ＢＳＡ又は６’ＳＬ−ＢＳＡ５０μｇをＳｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣカラム上にローディングした。１Ｍ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  ＥＰＰＳバッファー（ｐＨ７．５）を使用して、Ｓｉａ−３Ｓ１カラムに結合されたシアリル化ＢＳＡ分子を溶離した。
【図１８】Ｓｉａ−ＰＳ１、Ｓｉａ−ＰＳ４、Ｓｉａ−ＰＳ５及びＳｉａ−３Ｓ１は、対応するそのグリココンジュゲートに結合することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明のシアル酸認識親和性試薬は、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）と呼ばれ、その用語は、生物学的に重要なグリカン構造に対する特異性を有する、改変されたレクチン様酵素由来試薬の新規なクラスであると説明される。Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬は、親酵素から改変されているが、ほとんど又は全く酵素活性を有さず、レクチン様炭水化物結合性を有する。一部の実施形態において、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬は、その酵素から改変された内因性親酵素の特異性を維持する。他の実施形態において、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬の特性は、相同的グリカン構造又はモチーフに調整される。したがって、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬は、調整可能な特異性、調整可能な親和性及び製造の容易さなど、レクチン又は抗体のいずれかと比較していくつかの利点を有する。
【００１２】
本明細書に記載のシアル酸認識親和性試薬は、高い親和性を有するように改変されており、更に炭水化物処理酵素、ＮａｎＢに基づく基質特異性を保持することから、シアル酸認識レクチンに比べて多くの利点を提供する。一部の実施形態において、シアル酸認識親和性試薬の基質特異性は、ＮａｎＢと同じであり得る。一部の実施形態において、シアル酸認識親和性試薬の基質特異性は、ＮａｎＢよりも広いことができ、すなわち本明細書に記載のｐａｎ特異的なＳｉａ−ＰＳ親和性試薬と同様に拡張又は広げることができる。一部の実施形態において、シアル酸認識親和性試薬の基質特異性は、ＮａｎＢよりも狭いことができる（特異性の向上又は増加）。本明細書に記載のように、且つ米国特許出願公開第２０１２／００４０４７４号明細書（「Ｇｌｙｃａｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｏｏｌｓ」）及び国際公開第２０１５／１６１２０１号パンフレット（米国特許出願第１５／３０４，７２５号明細書）に記載のように、一般に構造的に誘導された遺伝子操作を用いて、シアル酸認識親和性が向上した修飾ＮａｎＢ分子の設計又は評価において、シアル酸の結合親和性及び特異性は、研究者又は臨床家の必要性に応じて独立して調整可能である。
【００１３】
ＮａｎＢシアリダーゼ
シアリダーゼ（ノイラミニダーゼ）は、種々のグリココンジュゲートの末端糖としてシアル酸、Ｃ９炭水化物を除去する。本発明では、新規なシアル酸認識親和性試薬を開発するために鋳型として、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮａｎＢシアリダーゼを用いる。肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮａｎＢの立体画像を図１に示す。パネルＢは、パネルＡから見て９０度回転される。これらの画像において、ＮａｎＢは、ＮａｎＢ活性部位に結合された球体として示される基質、２，７−アンヒドロ−Ｎｅｕ５Ａｃとの複合体で示される。Ｇｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．，２００８，５８２（２３−２４）：２２４８−３３５２。
【００１４】
ＣＢＭドメイン又はＣＢＭ４０ドメインとしても知られるＬ−ドメイン（レクチン様）は、炭水化物結合性分子（ＣＢＭ）を構成し、ＣＢＭ４０ファミリー内に分類されている。ノイラミニダーゼ活性を保有する、ＧＨ３３ドメインの、グリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインとしても知られる触媒Ｎ−ドメインも示される。短いリンカー（残基２２５〜２３０）がＬ−ドメイン及びＮ−ドメインを連結する。不規則なドメイン、Ｉ−ドメインも示される。配列番号１を参照すると、ＮａｎＢのドメインのおよその位置は、以下の通りに特徴付けることができる：シグナル／リーダー配列（残基１〜２９）、ＣＢＭ４０ドメイン（残基３０〜２２８）、触媒ドメイン（残基２２９〜３４５及び４５９〜６９７）及び不規則ドメイン（残基３４６〜４５８）。活性部位としては、古典的なシアリダーゼアルギニントリアッド、Ａｒｇ２４５、Ａｒｇ５５７及びＡｒｇ６１９並びにＴｙｒ６５３、Ｇｌｕ５４１及びＡｓｐ２７０（Ｇｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２００８，５８２（２３−２４）：２２４８−３３５２；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００８，３８４：４３６−４４９）が挙げられる。
【００１５】
ＮａｎＢ鋳型は、配列番号１であるか、又は配列番号１の切り詰め型であり得る。通常、シグナル配列は、鋳型に含まれず、したがって、有用なＮａｎＢ鋳型は、配列番号１のアミノ酸３０〜６９７によって例示される。
【００１６】
「シアル酸」という用語は、Ｃ９主鎖を有する酸性糖のファミリーを意味するために使用される場合が多い。哺乳動物細胞において見いだされる最も一般的なシアル酸は、Ｃ５位置でアセチル化されているＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ，又はＮＡＮＡ）である（式Ｉ）。
【化１】
2020517280.tif 000002
【００１７】
シアル酸構造の番号付けは、カルボキシレートの炭素で始まり、その鎖周囲に続く。アキシアル位置にカルボキシレートが配置される立体配置はαアノマーである（式ＩＩ）。
【化２】
2020517280.tif 000003
【００１８】
本発明において、「シアル酸」とは、一般に、実施例Ｉ及びＩＩに記載のＮｅｕ５Ａｃを意味するが、適切な文脈では、ノイラミン酸の他の誘導体、例えばＣ５位置でヒドロキシル化されている（例えば、ケトデオキシノノン酸、Ｋｄｎ）又はヒドロキシル化５−Ｎ−アセチル基（例えば、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、Ｎｅｕ５Ｇｃ）を有するか又はＮ−アシル化されていない（例えば、ノイラミン酸、Ｎｅｕ）変形体なども含み得る。Ｖａｒｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄｓ，Ｃｈ．１４  ｉｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００９）。シアル酸は、末端位置又は内部位置のいずれかでグリカン内に存在し得る。それらは、生物学的に関連性のあるＮ−グリカン、Ｏ−グリカン及びスフィンゴ糖脂質（ガングリオシド）の末端サッカリド成分として見られる。それらは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの側鎖をキャップすることも知られている。オリゴシアル酸又はポリシアル酸としても見出され得る。Ｖａｒｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄｓ，Ｃｈ．１４  ｉｎ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２００９）。シアル酸は、ムチン、糖タンパク質、グリコペプチド及び糖脂質、例えばスフィンゴ糖脂質及びグリコリポペプチドのオリゴ糖鎖の成分として存在し得る。一般に、シアル酸は、α−結合において他の単糖に結合する。
【００１９】
シアル酸認識
本発明のシアル酸認識親和性試薬は、オリゴ糖のシアル酸成分を認識する（すなわちシアル酸成分に結合する）。シアル酸は、いくつかの結合トポグラフィーのいずれかにおいてオリゴ糖の隣接モノマーに共有結合し得る。２つの結合コンフォメーション（α及びβ）が可能である一方、通常、隣接サッカリドへの結合は、αコンフォメーションにある。隣接モノマーの３位、６位又は８位など、隣接モノマー上の多くの位置のいずれかで結合が生じ得、その結果、α２，３結合、α２，６結合又はα２，８結合がそれぞれ形成される。シアル酸を含有するオリゴ糖は、二糖（２つのモノマー）又は三糖以上のオリゴ糖（３つ以上のモノマー）であり得る。有利には、オリゴ糖は、糖タンパク質、グリコペプチド又は糖脂質など、グリコシル化生体分子中に存在するグリカン構造の一部（すなわち構成成分）であり得る。
【００２０】
肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）からのＮａｎＢによって例示され、且つ配列番号１（リーダーペプチドを含む完全野生型アミノ酸配列；図３Ｃ）及び配列番号４（リーダーペプチドを含まないアミノ酸配列；図３Ｄ）に示されるように、本発明のシアル酸認識親和性試薬は、ＮａｎＢのアミノ酸配列に基づき、すなわちそのアミノ酸配列から改変される。例示的な変異部位を表１に示し、結合に重要であると指定される１つ又は複数の部位（例えば、Ｒ６１９、Ｗ６７４、Ｒ２４５、Ｒ６７６、Ｙ６５３、Ｓ６７５、Ｒ２６４、Ｈ２６９、Ｉ２４６、Ｉ３２６、Ｒ５５７及びＤ３２７）及び／又は「ｔｅｐｉｄ」として若しくは結合に弱く寄与するとして指定される１つ又は複数の部位（例えば、Ｅ５４１、Ｅ６６９、Ｓ６７３、Ｔ５３９、Ｌ６７９、Ｔ２６８、Ｐ４９２、Ｄ２７０、Ｙ６７１、Ａ５３８、Ｎ３５３、Ｎ３１６、Ｐ６６０及びＮ６８３）を含み得る。
【００２１】
改変された配列番号４であり、且つ実施例Ｉ及びＩに記載のＳｉａ−ＰＳ１、Ｓｉａ−ＰＳ２、Ｓｉａ−ＰＳ３、Ｓｉａ−ＰＳ４、Ｓｉａ−ＰＳ５、Ｓｉａ−３Ｓ１、Ｓｉａ−３Ｓ２、Ｓｉａ−３Ｓ３、Ｓｉａ−３Ｓ５、Ｓｉａ−３Ｓ６、Ｓｉａ−３Ｓ７、Ｓｉａ−３Ｓ７＊、Ｓｉａ−３Ｓ８、Ｓｉａ−３Ｓ９など、ＮａｎＢから改変された親和性試薬は、一部の実施形態において、更なる修飾を含み得ることを理解されたい。親和性試薬のドメイン構造全体がインタクトな状態のままであり、且つシアル酸へのｐａｎ特異的結合（Ｓｉａ−ＰＳ試薬の場合）又はＳｉａα２，３結合への特異的結合（Ｓｉａ−３Ｓ試薬の場合）が保存される限り、例えば、それらは、配列番号４の末端に切り詰め又は付加、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸の切り詰め又は付加及び／又は活性若しくは基質結合性に関与しない領域の保存的変異を含み得る。更に、シアル酸認識親和性試薬の一部の実施形態は、グリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインではなく、ＮａｎＢの炭水化物結合性分子（ＣＢＭ）ドメイン（例えば、配列番号１の３０〜約２２９の残基）を含有し得；シアル酸認識親和性試薬の他の実施形態は、ＮａｎＢの炭水化物結合性分子（ＣＢＭ）ドメインではなく、グリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメイン（例えば、配列番号１の２２９〜６９７の残基）を含有し得る。
【００２２】
ｐａｎ特異的なシアル酸認識親和性試薬
一実施形態において、シアル酸認識親和性試薬は、シアル酸のその認識（すなわちシアル酸への結合）においてｐａｎ特異的である。このｐａｎ特異的な親和性試薬は、Ｎｅｕ５Ａｃと隣接サッカリドとの結合立体配置と無関係にシアル酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を認識する。ｐａｎ特異的な親和性試薬により認識される結合立体配置としては、Ｓｉａα２，３−、α２，６−及びα２，８−結合が挙げられる。任意選択的に且つ有利には、Ｓｉａ−ＰＳ１の場合、ｐａｎ特異的なシアル酸認識親和性試薬は、９−Ｏアセチル化などのＮｅｕ５Ａｃの一般的な修飾及びシアル酸のＮ−グリコリル形の変形体も認識する。
【００２３】
本発明のｐａｎ特異的なシアル酸認識親和性試薬は、単点突然変異を有するＮａｎＢ断片（残基３０〜６９７；配列番号４）によって例示される。例示的な変異部位としては、Ｙ６５３、Ｄ２７０及びＥ５４１が挙げられる。注記されるＮａｎＢＧＨドメインにおいて単点突然変異をそれぞれが有する、例示的なｐａｎ特異的な親和性試薬が表２に示され、Ｓｉａ−ＰＳ１（Ｙ６５３Ｆ）、Ｓｉａ−ＰＳ２（Ｄ２７０Ａ）、Ｓｉａ−ＰＳ３（Ｄ２７０Ｎ）、Ｓｉａ−ＰＳ４（Ｅ５４１Ａ）及びＳｉａ−ＰＳ５（Ｅ５４１Ｑ）が挙げられる。意外なことに、これら単点突然変異は、二重の作用を有する。それらは、（Ｓｉａ−ＰＳ２及びＳｉａ−ＰＳ３）触媒活性を低減するか、又は（Ｓｉａ−ＰＳ１、Ｓｉａ−ＰＳ４及びＳｉａ−ＰＳ５）触媒活性を有効に除去し、且つシアル酸リガンド結合に対する特異性を広げる。更なるバリデーション研究のために本発明者らが選択するｐａｎ特異的なシアル酸認識親和性試薬は、活性部位残基Ｔｙｒ６５３においてＹ６５３Ｆを含有するＳｉａ−ＰＳ１であった。単一ヒドロキシル基の除去を伴うこの１つの変異は、ＮａｎＢの炭水化物結合性分子（ＣＢＭ）ドメインからのその距離にもかかわらず、酵素活性を除去するだけでなく、変異され、不活性化された酵素へのｐａｎ特異的な結合を驚くほど導く。
【００２４】
結合特異的なシアル酸認識親和性試薬
他の実施形態において、シアル酸認識親和性試薬は、単一シアル酸結合立体配置、すなわちα２，３−結合シアル酸に特異的である。これらの親和性試薬は、α２，３−結合における隣接サッカリドへのシアル酸結合を認識する（すなわち結合する）が、α２，６−結合又はα２，８−結合における隣接サッカリドへのシアル酸結合を認識しない。
【００２５】
本発明の結合特異的なシアル酸認識親和性試薬は、多重突然変異を有するＮａｎＢ断片（残基３０〜６９７；配列番号４）によって例示される。それと合わせて、その突然変異は、触媒活性を低減又は除去し、不活性化酵素の結合特異性をα２，３−結合シアル酸に特異的に変化させる（α２，６−結合シアル酸及びα２，８−結合シアル酸に対して）。例示的な変異部位としては、Ｒ１９３、Ｄ２７０、Ａ５３８、Ｅ５４１、Ｐ６６０、Ｓ６７３、Ｄ３２７及びＮ６８３が挙げられる。α２，３−結合シアル酸に対して高い特性を有する例示的なシアル酸認識親和性試薬を表４に示し、同定された変異部位を有する、以下：
Ｓｉａ−３Ｓ１  Ｒ１９３Ａ，Ｄ２７０Ｑ，Ａ５３８Ｖ，Ｅ５４１Ｄ
Ｓｉａ−３Ｓ２  Ｒ１９３Ａ，Ｄ２７０Ｇ，Ａ５３８Ｗ，Ｅ５４１Ｄ，Ｐ６６０Ｑ，Ｓ６７３Ａ
Ｓｉａ−３Ｓ３  Ｒ１９３Ａ，Ｄ２７０Ｇ，Ａ５３８Ｖ，Ｅ５４１Ｄ，Ｓ６７３Ａ
Ｓｉａ−３Ｓ５  Ｒ１９３Ａ，Ｄ３２７Ｅ，Ａ５３８Ｆ，Ｅ５４１Ａ
Ｓｉａ−３Ｓ６  Ｒ１９３Ａ，Ｄ２７０Ｇ，Ａ５３８Ｈ，Ｅ５４１Ａ，Ｎ６８３Ｓ
Ｓｉａ−３Ｓ７  Ｒ１９３Ａ，Ｄ２７０Ｈ，Ｄ４２７Ｙ，Ａ５３８Ｍ，Ｅ５４１Ａ，Ｌ６９０Ｆ
Ｓｉａ−３Ｓ７＊  Ｒ１９３Ａ，Ｄ２７０Ｈ，Ａ５３８Ｍ，Ｅ５４１Ａ
Ｓｉａ−３Ｓ８  Ｒ１９３Ａ，Ｄ２７０Ｉ，Ｄ３２７Ｖ，Ａ５３８Ｆ，Ｅ５４１Ｉ，Ｓ６７３Ｑ
Ｓｉａ−３Ｓ９  Ｒ１９３Ａ，Ｄ２７０Ｇ，Ａ５３８Ｉ，Ｅ５４１Ｓ，Ｓ６７３Ａ
が挙げられる。
【００２６】
Ｓｉａ−３Ｓ７＊は、突変変異Ｄ４２７Ｙ及びＬ６９０Ｆを含まないが、Ｓｉａ−３Ｓ７に基づく。これらの２つの欠損した突変変異は、結合特異性に影響を及ぼさないと予想される。
【００２７】
コンジュゲート
本発明は、シアル酸認識親和性試薬のコンジュゲートも含む。コンジュゲートは、タンパク質性成分又は非タンパク質性成分であり得る少なくとも第２成分に共有結合されるシアル酸認識親和性試薬を第１成分として含む。一部の実施形態において、タンパク質性成分を含むコンジュゲートは、既知の組換えＤＮＡ法を用いて融合タンパク質として合成することができる。一部の実施形態において、コンジュゲートは、シアル酸認識親和性試薬に化学的又は酵素的にコンジュゲートされるタンパク質性又は非タンパク質性成分を含む。
【００２８】
本発明のコンジュゲートの一例は、本明細書で薬物とも呼ばれる治療薬とコンジュゲートされたシアル酸認識親和性試薬を含む。シアル酸認識親和性試薬が抗体の代わりに使用されることを除いて、このコンジュゲートは、既知の抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）に類似している。シアル酸認識親和性試薬にコンジュゲートすることができる薬物としては、限定されないが、細胞毒、抗代謝産物、アルキル化剤、抗生物質及び有糸分裂阻害剤が挙げられる。
【００２９】
癌及び前癌症状並びに炎症及び免疫症状は、タンパク質グリコシル化パターンにおける変化と関連する場合が多いことから、抗癌、抗炎症、炎症誘発及び免疫調節薬がシアル酸認識親和性試薬へのコンジュゲーションに特に適している。例えば、治療又は診断用放射性薬剤をシアル酸認識親和性試薬に結合するか、又はシアル酸認識親和性試薬中に組み込み、癌グリコマーカーに標的化され得る「Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）薬物」コンジュゲートが得られる。一実施形態において、治療薬又は診断薬は、肺又は腸などの粘液内層（ｌｉｎｉｎｇ）又は粘液膜に標的化することができる。
【００３０】
同様に、標的化ウイルス性又は細菌性グリコシル化生体分子は、大きい治療的可能性を有するため、抗ウイルス薬及び抗菌薬も「Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）薬物」コンジュゲート中に組み込むのに特に適している。
【００３１】
本発明のコンジュゲートの他の例は、診断又は検出剤にコンジュゲートされたシアル酸認識親和性試薬を含む。診断又は検出剤としては、検出可能な標識、限定されないが、放射性、蛍光、リン光性、比色定量、酵素的、免疫学的、磁気、常磁性、反磁性又は電磁標識が挙げられる。シアル酸認識親和性試薬は、例えば、イムノアッセイによって直接検出することができるため、診断剤又は検出剤として機能させるためにシアル酸認識親和性試薬をコンジュゲートする必要はないことを理解されたい。
【００３２】
本発明のコンジュゲートの他の例としては、精製を容易にするために、マーカー配列、例えばヘキサ−ヒスチジン又は赤血球凝集素などのペプチドにコンジュゲートされたシアル酸認識親和性試薬が挙げられる。例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、ウシ血清アルブミン、ウシの膵臓トリプシン阻害剤又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光タンパク質に共有結合されたシアル酸認識親和性試薬を含む融合タンパク質が本発明に含まれる。
【００３３】
使用方法
そのレクチン様特性により、シアル酸認識親和性試薬の可能性のある多くの用途は、当業者に即座に明らかとなるであろう。本発明のシアル酸認識親和性試薬は、臨床又は研究設定において診断、治療、生物工学又は研究試薬として使用され得る。例えば、末端シアル酸などのグリカン構造の正常レベルの変化は、疾患状態のマーカーであり得る。したがって、疾患関連グリカンの発見及び利用における現在の制限を克服するために、高度に特異的な新規な試薬が望まれる。シアル酸認識親和性試薬を用いて、グリコペプチド、糖タンパク質及び糖脂質の新規な疾患関連シアル酸修飾を同定することができ、又は以前に同定された疾患関連シアル酸修飾を検出することができる。例えば、シアル酸認識親和性試薬は、シアルの検出並びに前立腺特異的な抗原（ＰＳＡ）及びインフルエンザウイルスと関連するマーカーの分析に有用である。
【００３４】
他の例として、試料エンリッチメントのための親和性マトリックス中で研究又は診断ツールとしてシアル酸認識親和性試薬を用いることができ、以下に更に記述されるように、質量分析に基づく既存の方法と組み合わせて結合情報を提供することができる。
【００３５】
シアル酸認識親和性試薬は、抗グリカン抗体又はレクチンを用いて実施され得るいずれかの方法において用いることができる。したがって、本発明のシアル酸認識親和性試薬は、診断、分析及び治療法などの多くの医療及び実験法において、抗グリカン抗体の代わりに有利に使用することができる。同様に、本発明のシアル酸認識親和性試薬は、多くの診断及び分析実験法においてレクチンの代わりに有利に使用することができる。例えば、シアル酸認識親和性試薬は、アフィニティークロマトグラフィーエンリッチメント又は組織学的研究、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳに基づく検出等と同様に捕捉試薬として用いられ得る。捕捉試薬又は認識エレメントとして、グリコプロファイリング分析と同様に、グリカンベースの疾患マーカーの発見に多様な用途において有用である（例えば、２０１４年１月２日公開の米国特許出願公開第２０１４／０００５０６９号明細書を参照されたい）。例えば、本発明のシアル酸認識試薬は、異なる特異性を有する、他のＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬及び／又はレクチン、抗体又は他の炭水化物結合性分子を含有する多成分マイクロアレイの一構成成分であり得る。
【００３６】
治療用途は、以下に更に詳細に構想され、説明される。例えば、シアル酸認識親和性試薬は、生物製剤の製造において品質管理のために、関連するシアル酸の検出に使用することができる。更に具体的には、合成又は保管中の品質管理における工程のように、治療抗体などの合成若しくは組換えで生成された糖タンパク質ベース又は糖脂質ベースの生物製剤の存在、非存在又は結合位置の検出に使用され得る。
【００３７】
診断及び分析法
シアル酸認識親和性試薬又はそのコンジュゲートを使用して、生体又は合成試料中のシアル酸含有グリカンを検出することができる。例えば、組織又は体液などの生体試料をシアル酸認識親和性試薬又はそのコンジュゲートと単独で又は他の分析用試薬と共に接触させて、生体試料中のグリコシル化及び／又はグリケーションのレベル又はタイプを検出し且つ／又は特徴付けることができる。特徴付けは、グリカンの構成成分サッカリドを同定すること、グリカンのサッカリド組成を決定すること、グリカン内の結合位置を決定すること、又はグリカンの立体化学を決定することを含み得る。他の例として、シアル酸認識親和性試薬又はそのコンジュゲートは、治療用生物製剤の合成、例えば治療抗体の合成における品質管理に使用され、グリコシル化のレベル又はタイプをモニターすることができる。２０１２年９月７日公開の国際公開第２０１２／１１８９２８号パンフレット及び２０１４年１月２日公開の米国特許出願公開第２０１４／０００５０６９号明細書を参照されたい。シアル酸認識親和性試薬又はそのコンジュゲートは、親和性試薬として又は親和性マトリックスの一部として用いられ得る。例えば、表面、カラム、樹脂、ビーズ、粒子若しくはナノ粒子などの固体担体に繋ぎ止められ、生体若しくは合成試料中又は生体若しくは合成試料からのシアル酸含有化合物を検出又はエンリッチする方法において使用することができる。繋がれたシアル酸認識親和性試薬は、合成グリコシル化化合物を単離及び／又は精製するために使用することもできる。
【００３８】
対象から採取された生体試料で診断を実施することができるが、生体内でも実施することができる。生体内用途では、シアル酸認識親和性試薬又はそのコンジュゲートは、対象に投与され、対象内のシアル酸認識親和性試薬の結合が検出される。好ましくは、コンジュゲートが対象に投与され、そのコンジュゲートは、生物医学的イメージングを容易にするために検出可能な標識を含む。適切なコンジュゲートの例としては、放射標識、常磁性標識又は反磁性標識にコンジュゲートされたシアル酸認識親和性試薬が挙げられる。
【００３９】
シアル酸認識親和性試薬を使用して、異常なグリコシル化の研究において生体試料を調べることができる。生体試料の例としては、限定されないが、いずれかの生物体液、組織又は臓器が挙げられる。生物体液の例としては、限定されないが、尿、血清、唾液、大脳髄液及び精液が挙げられる。他の実施形態において、シアル酸認識親和性試薬は、生物体液及び組織中の標的検体の存在又は量の検出に使用され得る。標的の例は、外因的に消費された種、例えば植物多糖、炭水化物ベースの薬物及び病原体であり、その表面は、多くの場合、固有の複合グリカンにおいて被覆されている。シアル酸認識親和性試薬は、新規なグリカンベースの化合物の創薬及びその生物活性の評価における用途も有する。
【００４０】
シアル酸認識親和性試薬は、異常なグリコシル化によって顕在化する疾患を診断及び／又は治療するために使用することができる。それを用いて、糖タンパク質、糖脂質及び／又は様々な炭水化物エピトープを含む特定の腫瘍抗原を検出することができる。これらの多くの腫瘍抗原は、腫瘍性疾患状態でアップレギュレートされることが判明している。腫瘍性疾患の発症及び進行を知らせ得る腫瘍抗原の例としては、限定されないが、結腸直腸、胃、膵臓癌、肺癌及び乳癌並びに発育中の胎児と関連する糖タンパク質である癌胎児抗原（ＣＥＡ）；膵臓癌の患者に見られる糖脂質中に存在する炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）又はシアリル化ルイス（Ｌｅｗｉｓ）Ａ抗原；及び乳癌と関連する炭水化物抗原１５−３（ＣＡ１５−３）が挙げられる。
【００４１】
抗原の存在によって必ずしも癌細胞への癌化が示されるわけではないが、ＣＥＡの場合と同様に、細胞でのその局在性によって暗示される。この理由から、高度に選択的且つ高い親和性の分析ツールが必要とされている。診断テストは、現在、糖タンパク質のペプチド部分又は糖脂質の糖部分に対して産生される場合が多い抗体に依存しているが、正確なエピトープのみが現在定義されている。グリカンが特徴付けられている実施例において、複数のグリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）が多くの場合に存在する（例えば、ＣＥＡ）。グリコフォーム間で区別することができる試薬を欠くと、グリコシル化におけるわずかな修飾が疾患状態、癌タイプ又は組織の局在化と相関する程度を決定することは、現在、不可能である。現時点で、これらの問題は、主にグリコフォームの混合物として調べられる単離された糖タンパク質のＭＳ分析によって解決することができる。通常、実施されているグリコフォームフォーカスの唯一のレベルは、レクチン（コンカナバリンＡ、（ＣｏｎＡ））アフィニティークロマトグラフィーを用いた高マンノース含有グリカンにおけるエンリッチメントである。より効率的な実験分析及び通常の臨床診断技術は、グリコフォーム特異的試薬の欠如によって厳しく制限されたままである。
【００４２】
シアル酸認識親和性試薬は、生体試料中の所定のいずれかの糖タンパク質に対して、存在する種々のグリコフォームの相対存在量を定量化する有用性を有し得る。本明細書で使用される「グリコフォーム」という用語は、特異的なグリカンが結合したタンパク質を意味する。糖タンパク質は、複数のグリコフォームを有し得る。更に具体的には、グリコフォームは、結合グリカンの数又はタイプに関してのみ異なるタンパク質のアイソフォームであり；アミノ酸配列は、様々なグリコフォームに関して同じである。糖タンパク質は、多くの場合、結合サッカリド又はオリゴ糖における改変を伴う多くの異なるグリコフォームを含む。有利には、シアル酸認識親和性試薬を使用して、シアル酸含有グリカンに関して生体試料をエンリッチすることができる。同様に、グリカンがそれに結合されたタンパク質表面上の特異的なグリコシル化部位を同定するために使用することができる。糖タンパク質のタンパク質分解による消化から、インタクトなグリコペプチドを分離するために使用することもできる。対象となる検体における試料のエンリッチメントは、グリコペプチド画分の更なる特徴付けにおいて大きい補助となる。特に、エンリッチメントは、ペプチド配列及びグリカン構造の同定を容易にし、それによりグリコシル化部位の、インタクトなタンパク質内での同定及びそれぞれのグリコシル化部位に存在する特定のグリカンの特徴付けが可能となる。
【００４３】
生物体液、組織、臓器又は生細胞におけるタンパク質の特異的なグリカン修飾のモニタリングにシアル酸認識親和性試薬を使用することができる。認識は、タンパク質の同一性に依存すると考えられず、シアル酸認識親和性試薬は、シアル酸を含むいずれかのタンパク質配列を認識することができると考えられ（シアル酸認識親和性試薬の特定の特異性と一致し、すなわちそれがｐａｎ特異的であろうと、特定の結合に対して特異的であろうと）、したがって特定のグリカン修飾の検出に非常に有用である。
【００４４】
更に他の実施形態において、シアル酸認識親和性試薬は、生体外又は生体内の染色細胞又は組織に使用することができる。
【００４５】
シアル酸認識親和性試薬を用いて、製薬又は研究産業で使用される組換え糖タンパク質の生成中に生じ得る、混合物中のグリカンのシアリル化をモニターすることができる。
【００４６】
前述の実施形態において、シアル酸認識親和性試薬は、染色又は色素で標識化することができ、対象の細胞、又は組織、又は糖タンパク質、又はグリコペプチド、又はオリゴ糖、又は多糖を含む生体試料に適用され得る。
【００４７】
本発明の他の態様は、分析用途でシアル酸認識親和性試薬を使用する方法を提供する。本発明のシアル酸認識親和性試薬は、シアル酸特異的な分析ツールとして使用することができる。グリカン特異的な分析ツールは、環境、発酵、食品及び医療分野などの多くの分野における検出方法としての潜在的な用途を有し、ヒト又は動物における生体外又は生体内での検出に用いることができる。例えば、本発明のシアル酸認識親和性試薬は、親和性試薬として又は組織染色の賦形剤として使用することができる。他の例としては、シアル酸含有グリカンについて生体試料をエンリッチするために、シアル酸認識親和性試薬を使用することができる。更に他の実施例において、シアル酸認識親和性試薬を使用して、糖タンパク質上の特異的なグリコシル化部位を決定することができる。
【００４８】
特定の実施形態において、シアル酸認識親和性試薬は、例えば、アフィニティークロマトグラフィーなどのアフィニティー分離の試薬として使用することができる。アフィニティークロマトグラフィーは、結合性タンパク質とグリカンとの間など、高度に特異的な生物学的相互作用に基づく生化学的混合物の分離方法である。本発明は、いずれかの特異的な設計又はクロマトグラフシステムに限定されない。一般に、シアル酸認識親和性試薬は、固体担体に共有結合されるか、そうでなければ固体担体に固定化され、固定相を構成する。特定の実施形態において、シアル酸認識親和性試薬で誘導体化される固定相をカラムクロマトグラフィーにおいて使用することができる。これらの実施形態において、固体固定相の粒子は、チューブの全内部容積を満たすために使用される（充填カラム）。代替方法としては、チューブ（開放管状カラム）の中間部分に生体試料（すなわち移動相）のための無制限開放経路が残されているチューブ壁内部上に又はそれに沿って固相粒子が濃縮される。他の実施形態において、誘導体化固定相は、バッチ式クロマトグラフィーに使用することができる。これらの実施形態において、固定相は、容器に添加され、生体試料と混合され得る。前述の実施例は、一般にアフィニティークロマトグラフィーに注目しているが、これらの原理は、他のアフィニティー精製プロトコルに容易に適用されることが理解される。
【００４９】
治療法
特定の実施形態において、本発明のシアル酸認識親和性試薬は、治療薬として使用することができ、又は活性治療薬の送達のために修飾することができる。本発明のシアル酸認識親和性試薬は、定義されたグリカン特異性を有し、治療薬の送達は、シアル酸認識親和性試薬によって認識されるグリカン構造を有する糖タンパク質又は糖脂質などの生体分子を示す細胞、組織又は臓器のみに標的化することができる。
【００５０】
したがって、標的化薬物送達などの多くの用途において治療法として用いられるシアル酸認識親和性試薬の可能性が存在する。シアル酸含有グリカンのレベル及び位置の変化は、癌などの多くに疾患と関連することが示されている。したがって、シアル酸認識親和性試薬は、癌研究の分野における直接的な用途を有すると期待され、特定の形態の癌を検出するための製品が開発される可能性がある。グライコミクスにおいて使用される試薬としての有用性を有することも期待され、シアル酸含有グリカンを含有する試料をエンリッチするためにそれを使用し得、これらの重要な炭水化物の検出及び分析が可能となる。シアル酸認識親和性試薬は、治療薬の標的送達の賦形剤として使用することができる。
【００５１】
シアル酸認識親和性試薬又はそのコンジュゲートは、感染症、疾患又は障害を治療又は予防するために対象に投与され得る。感染症は、例えば、ウイルス、細菌、寄生虫又は真菌感染症であり得る。疾患又は障害は、外来性の作用物質から生じるか、又は自己若しくは自己免疫のものであり得る。
【００５２】
一実施形態において、シアル酸認識親和性試薬は、治療的又は予防的効果が達成されるように、対象内に存在するシアル酸含有グリカンに結合するように投与される。シアル酸含有グリカンは、対象によって産生される内因性生体分子であるか、又は病原体によって産生される外来性生体分子であり得る。一実施形態において、シアル酸認識親和性試薬は、内因性生体分子、例えば対象の癌、前癌症状又は免疫障害と関連する生体分子に結合する。他の実施形態において、シアル酸認識親和性試薬は、宿主細胞に対する病原体の結合を防ぎ；他の実施形態において、シアル酸認識親和性試薬は、宿主細胞内への病原体のインターナリゼーションを防ぐ。
【００５３】
他の実施形態において、シアル酸認識親和性試薬のコンジュゲートは、対象に投与され、コンジュゲートは、上記に例示される治療薬を含む。治療薬は、抗生剤、例えば微生物病原体を標的とする薬剤であり得る。治療薬は、自己又は自己免疫疾患を標的とする薬剤、例えば細胞毒などの抗癌剤又は免疫活性剤であり得る。部位特異的送達に使用され得る治療薬の例としては、限定されないが、種々の化学療法剤、抗生剤及び抗ウイルス剤、毒素、ラジオアイソトープ、サイトカイン等が挙げられる。
【００５４】
治療用途のシアル酸認識親和性試薬又はそのコンジュゲートは、適切な動物モデルシステムにおいて、例えばラット、マウス、サル又はウサギにおいて毒性に関して試験され得る。ウイルス感染を治療又は予防するシアル酸認識親和性試薬又はそのコンジュゲートの有用性は、ウイルス複製を阻害するか、ウイルス伝染を阻害するか、又はウイルス感染に伴う症状を治療又は予防するその能力を評価することによって推定され得る。同様に、細菌性感染を治療又は予防するシアル酸認識親和性試薬又はそのコンジュゲートの有用性は、細菌複製を阻害するか、又は細菌性感染に伴う症状を治療又は予防するその能力を評価することによって推定され得る。癌治療における有用性は、癌細胞の増殖又は拡散転移を阻害するか、血管形成を阻害するか、又は細胞死を引き起こすシアル酸認識親和性試薬又はそのコンジュゲートの能力を評価することによって推定され得る。
【００５５】
製造方法
本発明のシアル酸認識親和性試薬は、遺伝子操作技術を用いて宿主細胞において発現され得る。「細胞」という用語は、生物細胞のいずれかのタイプを含むことが意図される。宿主細胞は、真核細胞又は原核細胞であり得る。好ましくは、宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞であるが、原生生物又は酵母などの単細胞真核生物も宿主細胞として有用である。好ましい宿主細胞は、微生物細胞、好ましくは細菌細胞若しくは酵母細胞などの単細胞微生物の細胞である。細菌及び／又は微生物細胞に対する上記の優先にもかかわらず、シアル酸認識親和性試薬は、動物、植物、昆虫、酵母、原生動物、細菌又は古細菌の細胞において、制限されることなく発現され得ることを理解されたい。本発明のシアル酸認識親和性試薬を発現するように改変することができる微生物細胞の例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に加えて、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、サルモネラ菌属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ザイモモナス属（Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ロドコッカス属（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、アルカリゲネス属（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、アルスロバクター属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、ブレビバクテリウム属（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ属（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）及びサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）のメンバーを含む多様な細菌及び酵母が挙げられる。好ましい微生物細胞としては、限定されないが、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、アルカリゲネス・ユートロフス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ  ｅｕｔｒｏｐｈｕｓ）、ロドコッカス・エリスポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）、パエニバシラス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、エンテロコッカス・ガリナラム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｉｕｍ）及びエンテロコッカスフェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）が挙げられる。
【００５６】
本発明のシアル酸認識親和性試薬を発現するように遺伝子操作された細胞は、「宿主」細胞、「組換え」細胞、「遺伝子操作」細胞又は単に「改変」細胞と呼ばれ得る。これらの且つ同様の用途は、区別なく使用される。遺伝子操作細胞は、共に天然に見出されない遺伝物質を１つにまとめるように標準分子クローニング技術によって作成された、ヌクレオチドの１つ又は複数の人工配列を含有する。組換えＤＮＡ分子の構築で使用されるＤＮＡ配列は、いずれかの種に由来し得る。例えば、植物ＤＮＡは、細菌ＤＮＡに連結し得、又はヒトＤＮＡは、真菌ＤＮＡと連結し得る。代わりに、天然に存在しないＤＮＡ配列がＤＮＡの化学合成又はＤＮＡの定方向突然変異により作成され得、組換え分子に組み込まれ得る。組換えＤＮＡの発現から生じるタンパク質は、組換えタンパク質と呼ばれることが多い。組換えの例は、以下に更に詳細に記述され、細胞内に外来性ポリヌクレオチド（他の細胞種から得られた）を挿入すること、合成ポリヌクレオチドを細胞内に挿入すること、又は細胞内にポリヌクレオチドを再配置若しくは再配列することを含み得る。組換えのいずれかの形態は、遺伝子操作であると考えることができ、したがってあらゆる組換え細胞も遺伝子操作細胞であると考えられ得る。
【００５７】
当業者によって理解されるように、本発明のシアル酸認識親和性試薬などのタンパク質の発現は、多くの分子生物学技術によって達成することができる。例えば、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの１つ又は複数のコピーを宿主細胞に導入することによって発現を達成することができる。目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、内因性であるか、又は宿主細胞に対して異種性であり得る。好ましくは、ポリヌクレオチドは、ベクターを用いて細胞内に導入されるが、裸のＤＮＡも使用され得る。ポリヌクレオチドは、環状又は直鎖状、一本鎖又は二本鎖であり得、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそのいずれかの修飾若しくは組み合わせであることができる。ベクターは、細胞内に遺伝物質を導入するためにビヒクルとして使用され得る分子であることができる。ベクターの例としては、限定されないが、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド及び人工染色体が挙げられる。微生物にヌクレオチド配列を導入する分子生物学技術の例としては、限定されないが、トランスフェクション、電気穿孔法、形質導入及び形質転換が挙げられる。これらの方法は、技術分野でよく知られている。標的細胞へのベクターの挿入は、通常、細菌細胞について形質転換及び真核細胞についてトランスフェクションと呼ばれるが、ウイルスベクターの挿入は、形質導入と呼ばれることが多い。本発明の目的では、形質転換、トランスフェクション及び形質導入という用語は、本明細書において区別なく使用される。ベクターの使用によって細胞内に伝達されているポリヌクレオチドは、導入遺伝子と呼ばれることが多い。
【００５８】
好ましくは、ベクターは、発現ベクターである。「発現ベクター」又は「発現構築物」は、標的細胞に特異的なポリヌクレオチドを導入するために使用されるいずれかのベクターであり、発現ベクターが細胞内に入ると、ポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質が細胞の転写及び翻訳機構によって産生される。通常、発現ベクターは、目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結された調節配列を含む。調節配列は、当業者に一般に知られており、例えば複製開始点、プロモーター配列及び／又はエンハンサー配列を含み得る。目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、染色体外に存在し得、或いは宿主細胞染色体ＤＮＡに組み込まれ得る。
【００５９】
染色体外ＤＮＡは、ミトコンドリア（大部分の真核生物における）などの細胞小器官並びに葉緑体及びプラスチド（植物における）に含有され得る。より一般的には、染色体外ＤＮＡは、ＤＮＡがそのベクター上で宿主細胞に導入されるベクター内に維持される。多くの場合、タンパク質の発現を最大限にするために、高いコピー数のベクターを選択することが有益であり得る。任意選択的に、ベクターは、選択マーカーを更に含有し得る。ベクターが標的細胞内に存在することを確認するために、特定の選択マーカーを使用し得る。他の選択マーカーを使用して、ベクター及び／又は導入遺伝子が宿主細胞染色体ＤＮＡに組み込まれたかを更に確認し得る。選択マーカーの使用は、当技術分野では一般的であり、当業者であれば、選択マーカーの多くの使用を理解且つ認識するであろう。任意選択的に、ベクターは、レポーター遺伝子を更に含有し得る。レポーター遺伝子を使用して、ベクターが標的細胞内で発現しているかを確認し得、更にベクターからの発現をモニターするために使用し得る。レポーター遺伝子の使用は、当技術分野では一般的であり、当業者であれば、レポーター遺伝子の多くの使用を理解且つ認識するであろう。
【００６０】
本発明のシアル酸認識親和性試薬は、本明細書に記載の遺伝子操作細胞から単離し、任意選択的に精製することができる。例えば、好気性又は嫌気性発酵プロセス中に細胞から又は培地から直接、それを単離することができる。公知の方法を用いて、単離及び／又は精製を達成することができる。
【００６１】
シアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート、融合タンパク質又は特許請求の範囲のいずれかの親和性マトリックスと、使用説明書とを含むキットも本発明によって提供される。
【００６２】
例証的な実施形態
実施形態１．対応する野生型ＮａｎＢノイラミニダーゼタンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸変異を有する、触媒不活性なＮａｎＢノイラミニダーゼタンパク質又はその断片を含むシアル酸認識親和性試薬であって、その変異は、
（ａ）ＮａｎＢタンパク質のノイラミニダーゼ活性を低減又は除去し、且つ
（ｂ）シアル酸結合親和性又は結合特異性に影響し、
前記親和性試薬は、グリカンのシアル酸成分に結合する、シアル酸認識親和性試薬。
【００６３】
実施形態２．ＮａｎＢ断片は、ＮａｎＢタンパク質の炭水化物結合性分子（ＣＢＭ）ドメイン及びＮａｎＢタンパク質のグリコシルヒドロラーゼ（ＧＨ）ドメインの少なくとも１つを含む、実施形態１のシアル酸認識親和性試薬。
【００６４】
実施形態３．シアル酸に対してｐａｎ特異的である、実施形態１又は２のシアル酸認識親和性試薬。
【００６５】
実施形態４．α２，３結合で隣接サッカリドモノマーに結合されたＮｅｕ５Ａｃ、α２，６結合で隣接サッカリドモノマーに結合されたＮｅｕ５Ａｃ及びα２，８結合で隣接サッカリドモノマーに結合されたＮｅｕ５Ａｃに結合する、実施例３のシアル酸認識親和性試薬。
【００６６】
実施形態５．Ｎｅｕ５Ａｃの少なくとも１つのバリアントに結合する、実施形態３又は４のシアル酸認識親和性試薬。
【００６７】
実施形態６．変異は、配列番号１又は配列番号４に表されるＹ６５３、Ｄ２７０及びＥ５４１からなる群から選択される部位におけるものである、実施例３〜５のいずれかのシアル酸認識親和性試薬。
【００６８】
実施形態７．変異は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮａｎＢ（配列番号１若しくは配列番号４）又はその断片或いは相同的ＮａｎＢ配列での対応する位置におけるものである、実施例６のシアル酸認識親和性試薬。
【００６９】
実施形態８．変異は、Ｙ６５３Ｆ、Ｄ２７０Ａ、Ｄ２７０Ｎ、Ｅ５４１Ａ及びＥ５４１Ｑからなる群から選択される、実施形態６又は７のシアル酸認識親和性試薬。
【００７０】
実施形態９．変異は、Ｙ６５３Ｆである、実施例８のシアル酸認識親和性試薬。
【００７１】
実施形態１０．Ｓｉａ−ＰＳ１、Ｓｉａ−ＰＳ２、Ｓｉａ−ＰＳ３、Ｓｉａ−ＰＳ４及びＳｉａ−ＰＳ５からなる群から選択される、実施形態８のシアル酸認識親和性試薬。
【００７２】
実施形態１１．Ｓｉａ−ＰＳ１である、実施形態１０のシアル酸認識親和性試薬。
【００７３】
実施形態１２．対応する野生型ＮａｎＢノイラミニダーゼタンパク質と比べて複数のアミノ酸変異を有する、実施例１又は２のシアル酸認識親和性試薬。
【００７４】
実施形態１３．前記複数の変異は、
（ａ）ＮａｎＢタンパク質の触媒活性を低減又は除去する少なくとも１つの第１変異、及び
（ｂ）結合親和性又は結合特異性に影響を及ぼす少なくとも１つの第２変異
を含む、実施例１２のシアル酸認識親和性試薬。
【００７５】
実施形態１４．α２，３結合で隣接サッカリドモノマーに結合されているＮｅｕ５Ａｃに特異的である、実施形態１２又は１３のシアル酸認識親和性試薬。
【００７６】
実施形態１５．複数の変異は、配列番号１又は配列番号４において表されるＲ１９３、Ｄ２７０、Ａ５３８、Ｅ５４１、Ｐ６６０、Ｓ６７３、Ｄ３２７及びＮ６８３からなる群から選択される部位におけるものである、実施形態１２〜１４のいずれかのシアル酸認識親和性試薬。
【００７７】
実施形態１６．複数の変異は、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＮａｎＢ（配列番号１若しくは配列番号４）又はその断片或いは相同的ＮａｎＢ配列での対応する位置におけるものである、実施例１５のシアル酸認識親和性試薬。
【００７８】
実施形態１７．複数の変異は、Ｒ１９３Ａ、Ｄ２７０Ｑ、Ｄ２７０Ｇ、Ｄ２７０Ｈ、Ｄ２７０Ｉ、Ａ５３８Ｖ、Ａ５３８Ｗ、Ａ５３８Ｆ、Ａ５３８Ｈ、Ａ５３８Ｍ、Ａ５３８Ｉ、Ｅ５４１Ｄ、Ｅ５４１Ａ、Ｅ５４１Ｉ、Ｅ５４１Ｓ、Ｐ６６０Ｑ、Ｓ６７３Ａ、Ｓ６７３Ｑ、Ｄ３２７Ｅ、Ｄ３２７Ｖ及びＮ６８３Ｓからなる群から選択される、実施形態１５又は１６のシアル酸認識親和性試薬。
【００７９】
実施形態１８．複数の変異は、Ｒ１９３Ａ、Ｄ２７０Ｑ、Ａ５３８Ｖ及びＥ５４１Ｄを含む、実施形態１７のシアル酸認識親和性試薬。
【００８０】
実施形態１９．Ｓｉａ−３Ｓ１、Ｓｉａ−３Ｓ２、Ｓｉａ−３Ｓ３、Ｓｉａ−３Ｓ５、Ｓｉａ−３Ｓ６、Ｓｉａ−３Ｓ７、Ｓｉａ−３Ｓ７＊、Ｓｉａ−３Ｓ８及びＳｉａ−３Ｓ９からなる群から選択される、実施形態１７のシアル酸認識親和性試薬。
【００８１】
実施形態２０．Ｓｉａ−ＰＳ１である、実施形態１９のシアル酸認識親和性試薬。
【００８２】
実施形態２１．グリカンは、グリコシル化生体分子の構成成分である、実施形態１〜２０のいずれかのシアル酸認識親和性試薬。
【００８３】
実施形態２２．グリコシル化生体分子は、糖タンパク質、グリコペプチド、糖脂質、グリコリポタンパク質又はグリコリポペプチドを含む、実施形態２１のシアル酸認識親和性試薬。
【００８４】
実施形態２３．第２成分に共有結合されている、実施形態１〜２２のいずれかのシアル酸認識親和性試薬を含む第１成分を含むコンジュゲート。
【００８５】
実施形態２４．第２成分は、タンパク質性成分である、実施形態２３のコンジュゲート。
【００８６】
実施形態２５．第２成分は、非タンパク質性成分である、実施形態２３のコンジュゲート。
【００８７】
実施形態２６．第２成分は、治療薬又は診断薬である、実施形態２３〜２５のいずれかのコンジュゲート。
【００８８】
実施形態２７．実施形態１〜２２のいずれかのシアル酸認識親和性試薬を含む融合タンパク質。
【００８９】
実施形態２８．実施形態１〜２７のいずれかのシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質を含む親和性マトリックス。
【００９０】
実施形態２９．固体担体、表面、カラム、樹脂、ビーズ、マイクロアレイ、粒子及びナノ粒子からなる群から選択される、実施形態２８の親和性マトリックス。
【００９１】
実施形態３０．実施形態１〜２９のいずれかのシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート、融合タンパク質又は親和性マトリックスと、使用説明書とを含むキット。
【００９２】
実施形態３１．実施形態１〜２４のいずれかのシアル酸認識親和性試薬若しくはコンジュゲート又は実施形態２７の融合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
【００９３】
実施形態３２．実施形態３１のポリヌクレオチドを含むベクター。
【００９４】
実施形態３３．発現ベクターである、実施形態３２のベクター。
【００９５】
実施形態３４．実施形態３２又は３３のベクターを含む宿主細胞。
【００９６】
実施形態３５．細菌細胞である、実施形態３４の宿主細胞。
【００９７】
実施形態３６．実施形態１〜２４のいずれかのシアル酸認識親和性試薬若しくはコンジュゲート又は実施形態２７の融合タンパク質を製造する方法であって、宿主細胞において親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質を発現させることを含む方法。
【００９８】
実施形態３７．グリカンのシアル酸成分を検出する方法であって、生体試料又は実験試料を、実施形態１〜２７のいずれかのシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質と、シアル酸への親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質の結合を可能にする条件下で接触させる工程と、シアル酸を検出する工程とを含む方法。
【００９９】
実施形態３８．生体試料又は実験試料は、組換え抗体を含む、実施形態３７の方法。
【０１００】
実施形態３９．グリカンは、バイオマーカーである、実施形態３７の方法。
【０１０１】
実施形態４０．バイオマーカーは、癌バイオマーカーである、実施形態３９の方法。
【０１０２】
実施形態４１．シアル酸含有グリカンをエンリッチ、単離又は精製する方法であって、実施形態１〜２７のいずれかのシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質を、シアル酸への親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質の結合を可能にする条件下で接触させて、エンリッチ、単離又は精製されたシアル酸含有グリカンをもたらすことを含む方法。
【０１０３】
実施形態４２．実施形態１〜２７のいずれかのシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質を含む診断用又は治療用組成物。
【０１０４】
実施形態４３．シアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質は、検出可能に標識化される、実施形態４２の診断用又は治療用組成物。
【０１０５】
実施形態４４．検出可能な標識は、放射性標識、蛍光標識、リン光性標識、比色定量標識、酵素的標識、免疫学的標識、磁気標識、常磁性標識、反磁性標識又は電磁標識を含む、実施形態４３の診断用又は治療用組成物。
【０１０６】
実施形態４５．治療薬としての、実施形態１〜２７のいずれかのシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質の使用。
【０１０７】
実施形態４６．診断薬としての、実施形態１〜２７のいずれかのシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質の使用。
【０１０８】
実施形態４７．標的化薬物送達のための、実施形態１〜２７のいずれかのシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質の使用。
【０１０９】
実施形態４８．生体試料又は実験試料中のシアル酸の存在又は量を検出するための、実施形態１〜２７のいずれかのシアル酸認識親和性試薬、コンジュゲート又は融合タンパク質の使用。
【０１１０】
実施形態４９．本明細書に記載される特徴の１つ又は複数を含む化合物、組成物又は方法。
【０１１１】
本発明は、以下の実施例によって例証される。本明細書に記載の本発明の範囲及び趣旨に従い、特定の実施例、材料、量及び手順は、広く解釈されるべきであることを理解されたい。
【実施例】
【０１１２】
実施例Ｉ．ｐａｎ特異的なシアル酸試薬
導入
現在、複数のレクチン（一般にセイヨウニワトコ（Ｓ．Ｎｉｇｒａ）、イヌエンジュ（Ｍ．ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）及びコムギ胚芽）は、シアリル化グリカンをエンリッチするために連続レクチンアフィニティークロマトグラフィーを利用しなければならない［２］。これらのレクチン（特にＷＧＡ及びＭＡＬ）は、非シアリル化グリカンとの交叉反応性を示すため［３，４］、その使用では、無関係の成分を捕捉するリスクがある。Ｓｉａ−ＰＳ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）（ＰＳ＝ｐａｎ特異的）は、隣接サッカリドへの末端Ｎｅｕ５Ａｃ（Ｓｉａα２，３−、α２，６−及びα２，８−）結合にかかわらず、一般的なシアロ−グリココンジュゲートの検出及びエンリッチメントに関して開発途上にある。本発明者らの知る限りでは、これは、シアル酸（Ｓｉａ、ノイラミン酸、Ｎｅｕ５Ａｃ）に対してｐａｎ特異的な第１試薬であり、それ自体がシアログリカンバイオマーカーの検出及びグライコミクスのエンリッチメントを有意に高める可能性を有する。
【０１１３】
方法
図２に示すフローチャートは、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補をスクリーニングし、最適化し、選択するための、実施例Ｉ及びＩＩで用いられる方法を図示している。可能性のあるＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補の特異性及び親和性は、最適なクローンの選択を可能にするように設計された、構造的に誘導される部位特異的及び／又は部位飽和変異誘発によって評価される。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて、グリカン及び糖タンパク質に結合するための結合キネティクス及び親和性が決定される。アフィニティークロマトグラフィーは、カラムフォーマットにＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補を固定化することによって実施され、シアリル化グリカン及びシアログリカン及びグリココンジュゲートを分画するその能力が評価される。すべての有望なＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補が、６００を超えるＯ−及びＮ−結合グリカンを現在含有するＣＦＧにおいてグリカンアレイに対してスクリーニングされる。
【０１１４】
結果及び結論
酵素−リガンド複合体の計算シミュレーションからＳｉａ−ＰＳ１特異性が予測された。
ＮａｎＢは、シアリル化グリカン基質を認識する、十分に特徴付けられた酵素である。その配列及び更なる特徴は、文献［９］において以前に記述されている。計算シミュレーション［１０］を用いて、基質親和性最適化のための突然変異誘発に適している可能性が高い、ＮａｎＢにおける残基を同定した。図３Ａに示す３Ｄモデルは、ＧＬＹＣＡＭ−Ｗｅｂ（ｗｗｗ．ｇｌｙｃａｍ．ｏｒｇ）のオンラインツールを使用して構築された。
【０１１５】
リガンドのアラインメント後、酵素−リガンド複合体を完全溶媒和分子（ＭＤ）シミュレーション［１１−１３］にかけ、続いて分子力学一般化ボルン表面近似（ＭＭ−ＧＢＳＡ）法［１２，１４］を用いて、平均相互エネルギーを計算した。３’−シアリルラクトサミン（Ｎｅｕ５Ａｃα２、３Ｇａｌβ１、４ＧｌｃβＮＡｃ又は３’ＳＬＮ）に結合された選択アミノ酸のＮａｎＢ自由エネルギーのリストについては、表１を参照されたい。シミュレーション解析から、Ｓｉａ−ＰＳ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）がシアリル化グリカンに対して有意な親和性を示し、非シアリル化グリカンに対して測定可能な親和性を示さないはずであることが示されている。生成されたＳｉａ−ＰＳ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）を表２に示し、それによって突然変異誘発部位配列同一性も同定される。表３は、これらのＳｉａ−ＰＳ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬の様々な物理的及び化学的性質を示す。
【０１１６】
【表１】
2020517280.tif 000004
【０１１７】
【表２】
2020517280.tif 000005
【０１１８】
【表３】
2020517280.tif 000006
【０１１９】
Ｓｉａ−ＰＳＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、酵素活性を有さないか又は減弱された酵素活性を有する。
ｗｔ  ＮａｎＢ酵素及びその変異体のノイラミニダーゼ活性を、ｐＮＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを比色定量用基質として用いて測定した。図４に示すように、野生型酵素と比較して、Ｓｉａ−ＰＳ３は、１９％活性であり、Ｓｉａ−ＰＳ２は、９％活性であり、その他は、不活性であった。したがって、Ｓｉａ−ＰＳ１、Ｓｉａ−ＰＳ４及びＳｉａ−ＰＳ５は、適切なＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補である。
【０１２０】
Ｓｉａ−ＰＳ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬は、固有の標的親和性を有する。
Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補とシアル酸リガンドとの定常状態結合定数は、ＢＬＩによって測定された。Ｓｉａ−ＰＳ４が、３’ＳＬに対するμＭ以下のＫＤ値を有する最高結合応答を有し、Ｓｉａ−ＰＳ２、残留ノイラミニダーゼ活性を有する候補は、より高いＫＤ値を有する最も低い結合応答を有することが図５から示された。６’−シアリルラクトース（Ｎｅｕ５Ａｃα２、６Ｇａｌβ１、４Ｇｌｃβ又は６’ＳＬ）への５つの候補の結合により、低い結合応答ではあるが、同様のＫＤ値が得られた（図６）。注目すべきことに、３’ＳＬ又は６’ＳＬに対するＳｉａ−ＰＳ１、Ｓｉａ−ＰＳ４及びＳｉａ−ＰＳ５の親和性は、レクチンＭＡＬに対して報告された値と同等であるか又はそれより優れているＭＡＬ（ＫＤ約１〜３μＭ［１６，１７］）及びＳＮＡ（０．６〜０．９μＭ［１６］）。
【０１２１】
Ｓｉａ−ＰＳ１は、結合と無関係にＮｅｕ５Ａｃを検出する。
更なるＢＬＩ測定から、Ｓｉａ−ＰＳ１、Ｓｉａ−ＰＳ２、Ｓｉａ−ＰＳ３、Ｓｉａ−ＰＳ４及びＳｉａ−ＰＳ５が、３’ＳＬ、６’ＳＬ及びガングリオシドＧＤ３のオリゴ糖（Ｎｅｕ５Ａｃα２、８Ｎｅｕ５Ａｃα２、３Ｇａｌβ１、４Ｇｌｃβ）のそれぞれに存在するＮｅｕ５Ａｃα２，３−、α２，６−及びα２，８−結合を認識することが確認された。結合親和性は、オリゴ糖のそれぞれに関してμＭ又はμＭ以下である（図６）。
【０１２２】
Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィー
本発明者らが開発しているＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）の一般的な適用は、バイオマーカーのエンリッチメントのための複合試料のアフィニティークロマトグラフィーを用いたものである。Ｓｉａ−ＰＳ１についての低ＫＤ値及びオフ速度（ｋｏｆｆ＝０．００８ｓ−１）により、アフィニティークロマトグラフィーのマトリックスとして理想的となる。実際に、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィー（ＬＡＣ）において、セファロースカラムに結合されたＳｉａ−ＰＳ１は、非シアリル化糖タンパク質ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）を全く保持しなかった。そのすべてが素通りであった。対照的に、シアリル化フェチュインは、カラムに保持され、溶離された（図７Ａ）。１：１混合物中において、カラムは、シアリル化フェチュインを捕捉するのに対して、非シアリル化ＢＳＡ又は脱シアル酸アシアロフェチュインは、検体のローディング工程においてカラムを素通りした（図７Ｂ及び７Ｃ）。
【０１２３】
Ｓｉａ−ＰＳ１は、３’−シアリル化及び６’−シアリル化糖タンパク質の両方に特異的に結合する。
ＢＬＩデータ（図６）の他に、本発明者らは、合成シアリル化糖タンパク質（ネオ糖タンパク質）、３’−シアリルラクトース−ＢＳＡ（３’ＳＬ−ＢＳＡ）及び６’−シアリルラクトース−ＢＳＡ（６’ＳＬ−ＢＳＡ）を検体として使用してＬＡＣを行った。Ｓｉａ−ＰＳ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）カラムは、ネオ糖タンパク質のそれぞれを捕捉することができ、続いて３’ＳＬ及び６’Ｓによってそれぞれ溶離された（図８）。
【０１２４】
Ｓｉａ−ＰＳ１は、シアロ−グリココンジュゲートのエンリッチメント試薬としてレクチンよりも優れている。
比較のために、ＭＡＡ（３’Ｓｉａ特異的として知られる）及びＳＮＡ（６’Ｓｉａ特異的として知られる）の市販のアフィニティーカラム（１ｍＬ）に、ローディングバッファー１ｍＬ中に検体２００μｇの推奨ローディングレベルにおいて３’ＳＬ−ＢＳＡ及び６’ＳＬ−ＢＳＡをそれぞれローディングした。図９で明らかであるように、それぞれのカラムがネオグリココンジュゲートの一部を保持すると同時に、かなりの量が素通り画分中に確認された。製造元の技術的データに従って、レクチンカラムの結合能力は、ローディングされる糖タンパク質２００μｇをはるかに超える。更に、溶離ピークは、Ｓｉａ−ＰＳ１  ＬＡＣから溶離されるよりもはるかに広い。多くの因子、例えばレクチンカラムの質又は固定化レクチンとネオグリココンジュゲート検体との不適合性又は製造元の推奨溶離剤が結果に影響を及ぼしているが、これらの実験から、シアロ−グリココンジュゲートのエンリッチメント試薬としてＳｉａ−ＰＳ１が優れていることが示されている。
【０１２５】
Ｓｉａ−ＰＳ１は、ＭＣＦ７無細胞抽出物からシアロ−グリココンジュゲートをエンリッチする。
Ｓｉａ−ＰＳ１  ＬＡＣの適用は、ＭＣＦ７無細胞抽出物からのシアロ−グリココンジュゲートのエンリッチメントに応用されている［１８］。図１０に示すように、ＭＣＦ７抽出物における総タンパク質の約１０％がＳｉａ−ＰＳ１  ＬＡＣカラムに親和性であり、競合的試薬３’ＳＬ及び６’ＳＬによって溶離することができた。本発明者らは、ＭＣＦ７タンパク質約１．５ｍｇを、カラムを通して４℃で一晩循環させることによって結合効率を高めることができ、タンパク質２０７μｇ又は１３．８％の溶離ピークが得られた。既知のグリコシル化データベース並びにＳｉａ−ＰＳ１  ＬＡＣエンリッチ化タンパク質の同一性及び相対存在量の比較により、バイオマーカー発見試薬としてのＳｉａ−ＰＳ１の特異性及び有効性が更に実証されるであろうと予想される。
【０１２６】
グリカンアレイスクリーニングから、シアログリカンに対するＳｉａ−ＰＳ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）特異性が確認される。
およそ６４のグリカン構造を有するシアログリカンマイクロアレイ上で濃度２００μｇ／ｍＬにおいて、ビオチン標識標Ｓｉａ−ＰＳ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試料を用いて、グリカンアレイスクリーニングを実施した［１９］。ストレプトアビジン−Ｃｙ３を用いて第２の検出を達成し、実験を上述のように行った。特異性データ（図１１）から、α２，３、α２，６などのアレイ上のＮｅｕ５Ａｃのすべての結合バリアントだけでなく、９−Ｏアセチル化などのＮｅｕ５Ａｃの一般的な修飾への結合も確認される。更に、一部の９−Ｏ−アセチル化構造を除いて、シアル酸のＮ−グリコリル形態（Ｎｅｕ５Ｇｃ，Ｇｃ−Ｓｉａ）のすべてのバリアントが検出された。非シアル酸末端ガラクトース構造に関してシグナルは確認されず、シアル酸に対するＳｉａ−ＰＳ１の特異性が再確認された。
【０１２７】
Ｓｉａ−ＰＳ１、Ｓｉａ−ＰＳ４及びＳｉａ−ＰＳ５をプローブとして用いたウェスタンブロット
アシアロフェチュイン、フェチュイン、ＢＳＡ、３’ＳＬ−ＢＳＡ又は６’ＳＬ−ＢＳＡの試料（それぞれ１μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動させた。ゲルは、ニトロセルロース膜に移動し、ブロックされた。それぞれ１μＭのＳｉａ−Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）をブロットと共にインキュベートし、末端シアル酸に対してプローブした。洗浄後、抗Ｐｏｌｙ  Ｈｉｓ−ＨＲＰコンジュゲートをブロットと共にインキュベートし、Ｓｉａ−ＰＳ１のＮ末端ヘキサ−ヒスチジン標識化を検出した。ブロットを洗浄し、化学発光基質で展開した。画像（図１８）は、Ｓｉａ−ＰＳ１、Ｓｉａ−ＰＳ４及びＳｉａ−ＰＳ５がシアリル化タンパク質フェチュイン、３’ＳＬ−ＢＳＡ及び６’ＳＬ−ＢＳＡに結合するが、非シアリル化タンパク質アシアロフェチュイン及びＢＳＡに結合しないことを示す。比較のために、ＳｉａαＳｉａα２，３結合及びＳｉａα２，６結合のそれぞれに対して特異的であることが知られている市販のビオチン標識標レクチンＭＡＬＩＩ及びＳＮＡがプローブとして使用された。ＨＲＰストレプトアビジンが二次検出試薬として使用された。レクチンは、その非同族ＢＳＡネオ糖タンパク質に結合しなかった。このことから、Ｓｉａ−ＰＳ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、市販のレクチンと異なり、ｐａｎ特異的であることが実証されている。
【０１２８】
概要
１）計算論モデリングは、触媒不活性なｐａｎ特異的なシアル酸Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬へのｗｔ  ＮａｎＢ親酵素の転化に関連する構造的洞察を提供する。
２）すべてのｐａｎ特異的なＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補は、ｗｔ親酵素に対して有意に減少した触媒活性又は未検出の触媒活性を有する。注目すべきことに、リード候補Ｓｉａ−ＰＳ１は、触媒不活性である。
３）Ｓｉａ−ＰＳ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬は、固有の親和性を有し、Ｓｉａ−ＰＳ１は、最も高い親和性を有する。
４）Ｓｉａ−ＰＳ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、３’ＳＬ、６’ＳＬ及びＧＤ３グリカン（Ｎｅｕ５Ａｃα２、８Ｎｅｕ５Ａｃα２、３Ｇａｌβ１、４Ｇｌｃ）中に存在するＳｉａα２，３−、α２，６−及びα２，８−結合に対してｐａｎ特異的であり、３つのすべての標的グリカン構造に対してμＭ以下の親和性を有する。
５）Ｓｉａ−ＰＳ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、フェチュイン：アシアロフェチュイン及びフェチュイン：ＢＳＡの５０：５０混合物からフェチュインをエンリッチするための機能性捕捉試薬である。
６）Ｓｉａ−ＰＳ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、３’−シアリルラクトース−ＢＳＡと６’−シアリルラクトース−ＢＳＡグリココンジュゲートの両方をエンリッチするための機能性捕捉試薬である。
７）Ｓｉａ−ＰＳ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、レクチンＭＡＡ及びＳＮＡと比べて、シアロ−グリココンジュゲートをエンリッチするための優れた捕捉試薬である。
８）Ｓｉａ−ＰＳ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、複合ＭＣＦ７乳癌細胞抽出物からシアロ−グリココンジュゲートをエンリッチするための機能性捕捉試薬である。
９）Ｓｉａ−ＰＳ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、シアリル化グリカンへの結合を示し、グリカンアレイスクリーンにより、非シアル酸末端ガラクトース保有グリカンへの結合は確認されない。
【０１２９】
実施例ＩＩ．α２，３−結合シアル酸に対して特異的な試薬
導入
イヌエンジュ（Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）レクチン白血球凝集素（ＭＡＬ）及び赤血球凝集素（ＭＡＨ）は、末端グリカン配列Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβに対して特異的であると広く考えられている。更に注目すべきことに、市販のＭａａｃｋｉａレクチンは、多くの場合、混合物として販売され、複数の名称を有し（ＭＡＡ、ＭＡＬＩ、ＭＡＬＩＩ等）、且つある範囲の既報告の特異性を有する［５］。その特異性を完全に定義するために、これらのレクチンは、最近、機能グライコミクスコンソーシアム（Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｍｉｃｓ）においてグリカンアレイに対してスクリーニングされており、Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ配列に結合しないが、他の炭水化物において末端のグリカン、例えば３Ｓ−Ｇａｌβ、３Ｓ−ＧａｌＮＡｃβ、Ｎｅｕ５Ｇｃα２，３Ｇａｌβｂ、Ｎｅｕ５Ａｃα２，８Ｎｅｕ５Ｇｃａ、及びＮｅｕ５Ｇｃα２，８Ｎｅｕ５Ｇｃα（ＭＡＬ）、及び３Ｓ−Ｇａｌβ、ＫＤＮα２，３Ｇａｌβに等しく結合することができ、Ｎｅｕ５Ｇｃα（ＭＡＨ）に結合しないことが確認された。末端３Ｓ−Ｇａｌβ［６］及びＮｅｕ５Ｇｃα［７］修飾がいずれも癌に対して可能性のあるマーカーであると仮定すると、正常なＮｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ配列を他の配列と区別する能力が重要である。更に、特定の糖タンパク質における正常な「α２，３」配列の存在は、前立腺特異的な抗原（ＰＳＡ）の場合と同様に疾患と相関し得る［８］。この報告において、本発明者らは、α２，３−シアル酸特異的なＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬、Ｓｉａ−３Ｓ１の開発を例示する。更に、本発明者らは、Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）アフィニティークロマトグラフィー適用のための捕捉試薬としてのその可能性を実証する。
【０１３０】
方法
その方法は、実施例Ｉに記載の通りである。
【０１３１】
結果及び結論
ライブラリーの構築
非計算的に誘導される定方向進化を用いて（図２、実施例Ｉ）、６’ＳＬと比べて３’ＳＬに対して様々な特異性を有する複数のＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補が同定された。骨格としてＷＴＮａｎＢ酵素を用いて、３つの異なる酵母表面ディスプレイライブラリーを作成した［１］（表１）。具体的には、酵母細胞表面上にＡｇａ−２ｐの融合タンパク質としてＮａｎＢ酵素を発現させた。これらの酵母ライブラリーは、表１に示すように対象となる位置での部位飽和変異誘発を用いて作成された。ライブラリー１は、ＮａｎＢ  ＧＨ３３ドメイン（残基２３０〜６９７）を含む。ライブラリー２は、ＮａｎＢ  ＣＢＭ及びＧＨ３３ドメイン（残基３０〜６９７）を含む。ライブラリー３は、Ｒ１９３Ａ変異を有するライブラリー２と同じカバレッジを含む。ライブラリー２及び３は、いずれも３’ＳＬグリカン標的に対してバイオパニングされた。ラウンド３、６及び９からのクローンを配列決定して、エンリッチされたクローンを同定した。タンパク質発現、精製及び特徴付けのために、ライブラリー３からのエンリッチ酵母クローンを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターにクローニングした。ライブラリー２のクローンも配列決定されており、同様の手法で解析される。ライブラリー３から選択される候補のアミノ酸ｉｃｅＬｏｇｏの表示は、図１２に示され、それぞれのライブラリー変異誘発残基において様々なアミノ酸の頻度を示す。これらの候補すべてが、表４で同定されるライブラリー変異に加えて、アルギニン１９３残基乃至アラニン変異（Ｒ１９３Ａ）を含有する。この変異は、ＮａｎＢの炭水化物結合性分子に位置し、ｗｔ  ＮａｎＢの８８％の酵素活性を有する（図１３）。本発明者らは、以前に、Ｒ１９３ＡがＳｉａ−ＰＳ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）に導入された場合、シアロ−グリココンジュゲートの減弱された結合を確認した。総合すると、選択前にＳｉａ−３Ｓ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）ライブラリーにＲ１９３Ａ変異を導入することにより、候補酵素活性にほとんど影響を及ぼさず、ｐａｎ特異的なシアル酸の結合が減弱されるはずである。これにより、定方向進化を介して、３’ＳＬに優先的に結合する候補のエンリッチメントが高められるであろう。
【０１３２】
これらのＳｉａ−３Ｓ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補は、ＢＬＩによって特徴付けられており、２，３−結合シアル酸グリカンのエンリッチメントのための捕捉試薬としてのその有用性が現在評価されている。これらのＳｉａ−３Ｓ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）の一部のリストは、その変異と共に表４に含まれる。これらの変異体のアミノ配列は、表４に示すアミノ酸部位で修飾された図３Ｄの野生型配列番号４によって表される。これらの候補試薬の物理的及び化学的性質を表５に示す。
【０１３３】
【表４】
2020517280.tif 000007
【０１３４】
Ｓｉａ−３Ｓ７は、変異Ｄ４２７Ｙ及びＬ６９０Ｆを更に有するが、これらは、変異に対して選択される部位中になく（表１に基づく）、むしろクローニングの人工産物である。
【０１３５】
【表５】
2020517280.tif 000008
【０１３６】
Ｓｉａ−３Ｓ１と指定される有望なリードＬｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補のデータを以下に示す。
【０１３７】
Ｓｉａ−３Ｓ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、検出可能な酵素活性を有さない。
本発明者らは、同定されたＳｉａ−３Ｓ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補がノイラミニダーゼ活性を示すかどうかを評価するために、ｗｔ  ＮａｎＢ及びＲ１９３Ａ点変異体に対してこれらの候補をスクリーニングした。比色定量用基質ｐＮＰ−Ｎｅｕ５Ａｃを使用して、活性を測定した。図１３に示すように、野生型酵素と比較して、Ｓｉａ−３Ｓ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）候補に関して上記のバックグラウンドで活性を測定することができなかった。したがって、すべてのＳｉａ−３Ｓ  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）試薬が適切な候補である。
【０１３８】
Ｓｉａ−３Ｓ１は、６’ＳＬに比べて３’ＳＬに対して特異的である。
酵素的に不活性であるＳｉａ−３Ｓ１は、明確な条件下において高い３’ＳＬ親和性を有する。図１４は、２つの異なる結合バッファーにおいて３’ＳＬ及び６’ＳＬそれぞれへのそのＢＬＩ結合キネティクスを示す。
【０１３９】
Ｓｉａ−３Ｓ１は、フェチュインを保持し、且つ３’ＳＬを用いて競合的に溶離される。
フェチュイン、３’−結合及び６’−結合シアル酸残基の両方を有する、高度にシアリル化された糖タンパク質で予備的なＳｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣを実施し、続いて３’ＳＬ又は６’ＳＬのいずれかで競合的に溶離した。図１５に示すように、Ｓｉａ−３Ｓ１カラムに結合されたフェチュイン約８５μｇのうち、１００％が３’ＳＬによって競合的に溶離され、５０％のみが６’ＳＬによって溶離された。これらの結果から、Ｓｉａ−３Ｓ１の３’−結合の優先が強く示されている。
【０１４０】
Ｓｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣカラムに結合された３’ＳＬ−ＢＳＡは、３’ＳＬによって競合的に溶離されるが、６’ＳＬによって競合的に溶離されない。
５０ｍＭ  ３’ＳＬ又は６’ＳＬで溶離する前に３’ＳＬ−ＢＳＡ  １００μｇ（図１６Ａ）又は６’ＳＬ−ＢＳＡ  １００μｇ（図１６Ｂ）をＳｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣカラムに注入した。図１６Ａにおいて、３’ＳＬは、予め結合された３’ＳＬ−ＢＳＡ  ９０μｇを溶離することができる。５０ｍＭ  ６’ＳＬを用いて結合３’ＳＬ−ＢＳＡを溶離する試みで小さい溶離ピークが生じ、ＮａＣｌ再生工程中に３’ＳＬ−ＢＳＡの大部分が溶離される。６’ＳＬ−ＢＳＡ  １００μｇがＳｉａ−３Ｓ１カラムに結合された場合（図１６Ｂ）、５０ｍＭ  ３’ＳＬ及び６’ＳＬのいずれも６’ＳＬ−ＢＳＡ  ４５μｇを溶離する。総合すれば、これらの結果から、Ｓｉａ−３Ｓ１は、６’ＳＬ−ＢＳＡと比べて３’ＳＬ−ＢＳＡに選択的に結合していることが実証される。１．５ｍＬ〜１０ｍＬの保持体積からの狭いピーク及び広いピークによって示されるように、６’ＳＬ−ＢＳＡの残りの量は、素通り画分中にある。
【０１４１】
Ｓｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣを用いた、６’ＳＬ−ＢＳＡと比較される３’ＳＬ−ＢＳＡの分離
図１７で例証されるように、１１０ｍＭ  ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ  ＥＰＰＳ（ｐＨ７．５）結合バッファー中の３’ＳＬ−ＢＳＡ又は６’ＳＬ−ＢＳＡ  ５０μｇをＳｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣカラムに注入した。これらの条件下において、６’ＳＬ−ＢＳＡ  ５０μｇのすべてが素通り画分中で検出されたのに対して、３’ＳＬ−ＢＳＡ  ５μｇのみは、カラムに結合しなかった。続いて、１Ｍ  ＮａＣｌを含む１０ｍＭ  ＥＰＰＳ（ｐＨ７．５）バッファーを使用して、結合３’ＳＬ−ＢＳＡを溶離した。１Ｍ  ＮａＣｌを含む同じＥＰＰＳバッファーを使用して、６’ＳＬ−ＢＳＡ溶離を検出することができなかった。これらの結果から、結合バッファー中のＮａＣｌ濃度を調節することにより、Ｓｉａ−３Ｓ１  ＬＡＣカラムへの３’ＳＬ−ＢＳＡの結合が生じ得るのに対して、６’ＳＬ−ＢＳＡの結合が生じ得ないことが示唆されている。
【０１４２】
Ｓｉａ−３Ｓ１を用いたウェスタンブロット
アシアロフェチュイン、フェチュイン、ＢＳＡ、３’ＳＬ−ＢＳＡ又は６’ＳＬ−ＢＳＡの試料（それぞれ１μｇ）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させた。ゲルは、ニトロセルロース膜に移動し、ブロックされた。１μＭ  Ｓｉａ−３Ｓ１をブロットと共にインキュベートし、Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌに対してプローブした。洗浄後、抗Ｐｏｌｙ  Ｈｉｓ−ＨＲＰコンジュゲートをブロットと共にインキュベートし、Ｓｉａ−３Ｓ１のＮ末端ヘキサ−ヒスチジン標識化を検出した。ブロットを洗浄し、化学発光基質で展開した。画像（図１８）は、Ｓｉａ−３Ｓ１が、α２，３−結合シアリル化を有するタンパク質のみ：フェチュイン及び３’ＳＬ−ＢＳＡに結合することを示す。（アシアロフェチュインのかすかなバンドは、市販のアシアロフェチュイン中の微量のフェチュインによるものであり得る。）それは、ＢＳＡに結合せず、有意に６’ＳＬ−ＢＳＡに結合しない。これは、「Ｓｉａα２，３特異的」ＭＡＬＩＩレクチンと対照的であり、フェチュインの非常にかすかなバンドを除いて結合を示さない。３’ＳＬ−ＢＳＡのバンドは、予想されるであろうが、全く確認されなかった。
【０１４３】
概要
１）Ｓｉａ−３Ｓ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、６’ＳＬと比べて、３’ＳＬに対して優先的な親和性を有する。
２）Ｓｉａ−３Ｓ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）は、２，３−結合シアロ糖タンパク質のエンリッチメントのための機能性捕捉試薬であり；競合的溶離試薬として競合的溶離のために３’ＳＬを用いた場合、６’ＳＬよりも多くのフェチュインが溶離された。
３）明確なＮａＣｌ濃度を有するバッファーを使用して、ＬＡＣ上のＳｉａ−３Ｓ１  Ｌｅｃｔｅｎｚ（登録商標）への６’ＳＬ結合が除去される。
４）ウェスタンブロット法により、Ｓｉａ−３Ｓ１は、市販のＭＡＬＩＩよりもかなり優れた、α２，３−結合シアル酸グリココンジュゲートに特異的な分子プローブであると実証される。
【０１４４】
ＲＥＦＥＲＥＮＣＥＳ  ＣＩＴＥＤ
１．Ｃｈａｏ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＨｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００６．１（２）：ｐ．７５５−７６８．
２．Ｚｈａｏ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｅｒｕｍ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｅｃｔｉｎ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｅｒｕｍ．Ｊ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ，２００６．５（７）：ｐ．１７９２−８０２．
３．Ｂａｉ，Ｘ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ３−Ｏ−ｓｕｌｆａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｌａｃｔｏｓｅ  ｉｎ  Ａｓｎ−ｌｉｎｋｅｄ  ｇｌｙｃａｎｓ  ａｎｄ  Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  ｌｅｃｔｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｎｅｗ  ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００１．１１（８）：ｐ．６２１−３２．
４．Ｎｉｃｈｏｌｌｓ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅＨｕｍａｎ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒＨｕｍａｎ  ａｎｄ  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ，２００７．８：ｐ．７３．
５．Ｇｅｉｓｌｅｒ，Ｃ．ａｎｄ  Ｄ．Ｌ．Ｊａｒｖｉｓ，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｇｌｙｃｏａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  ｌｅｃｔｉｎｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａ  ｃｌｅａｒ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１．２１（８）：ｐ．９８８−９３．
６．Ｚｈｅｎｇ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｒｕｍ  ３’−ｓｕｌｆｏ−Ｌｅａ  ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ，２００９．４０５（１−２）：ｐ．１１９−２６．
７．Ｓａｍｒａｊ，Ａ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎＨｕｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｆｒｏｎｔ  Ｏｎｃｏｌ，２０１４．４：ｐ．３３．
８．Ｔａｊｉｒｉ，Ｍ．，Ｃ．Ｏｈｙａｍａ，ａｎｄ  Ｙ．Ｗａｄａ，Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｆｒｅｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｄ  ｆｏｒｍｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  ｉｎ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｐｌａｓｍａ：ａ  ｇｌｙｃｏｐｅｐｔｉｄｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２００８．１８（１）：ｐ．２−８．
９．Ｇｕｔ，Ｈ．，Ｓ．Ｊ．Ｋｉｎｇ，ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｗａｌｓｈ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ｎｅｕｒａｍｉｎｉｄａｓｅ  Ｂ：Ａｎ  ｉｎｔｒａｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｒａｎｓ−ｓｉａｌｉｄａｓｅ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，２００８．５８２（２３−２４）：ｐ．３３４８−５２．
１０．Ｆｏｒｄ，Ｍ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，ＭＤ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｇａｌｅｃｔｉｎ−１  Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  Ｒｅｖｅａｌ  ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２００３．５３：ｐ．２２９−２４０．
１１．Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｏ−ＧｌｃＮＡｃａｓｅ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｏｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３．
１２．Ｋａｄｉｒｖｅｌｒａｊ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ  ｓｑｕａｍｏｓｕｓ  Ｌｅｃｔｉｎ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｎｅｕ５Ａｃα２−６Ｇａｌβ１−４ＧｌｃＮＡｃＨｕｍａｎ−ｔｙｐｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１．２１（７）：ｐ．９７３−９８４．
１３．Ｗｏｏｄｓ，Ｒ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍ．Ｂ．Ｔｅｓｓｉｅｒ，Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｇｌｙｃｏｓｃｉｅｎｃｅ：Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓｐａｔｉａｌ  ａｎｄ  Ｔｅｍｐｏｒａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃａｎｓ  ａｎｄ  Ｇｌｙｃａｎ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２０１０．２０：ｐ．５７５−５８３．
１４．Ｈａｄｄｅｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆｒｅｅ  ｅｎｅｒｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０１５．１２７３：ｐ．４３１−６５．
１５．Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ  Ｅ．，Ｈ．Ｃ．，Ｇａｔｔｉｋｅｒ  Ａ．，Ｄｕｖａｕｄ  Ｓ．，Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｍ．Ｒ．，Ａｐｐｅｌ  Ｒ．Ｄ．，Ｂａｉｒｏｃｈ  Ａ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｔｏｏｌｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  Ｓｅｒｖｅｒ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ＰｒｏｔｏｃｏｌｓＨａｎｄｂｏｏｋ  Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ，Ｅｄｉｔｏｒ．２００５，ＣｏｐｙｒｉｇｈｔＨｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ．ｐ．５７１−６０７．
１６．Ｈａｓｅｌｅｙ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｃ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｏｆ  ｌｅｃｔｉｎｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ．Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９９９．２７４（２）：ｐ．２０３−１０．
１７．Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｙ．Ｋｏｎａｍｉ，ａｎｄ  Ｔ．Ｉｒｉｍｕｒａ，Ｓｉａｌｉｃ  ａｃｉｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ  ｏｆ  Ｍａａｃｋｉａ  ａｍｕｒｅｎｓｉｓ  ｌｅｃｔｉｎｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９７．１２１（４）：ｐ．７５６−６１．
１８．Ｌｅｅ，Ｌ．Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｌｙｓａｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｎａｔｉｖｅ  ｍｕｌｔｉ−ｌｅｃｔｉｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｊ  Ｓｅｐ  Ｓｃｉ，２０１２．３５（１８）：ｐ．２４４５−５２．
１９．Ｐａｄｌｅｒ−Ｋａｒａｖａｎｉ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｏｓｓ−ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉａｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｎ  Ｔｗｏ  Ｎｏｖｅｌ  Ｓｉａｌｏｇｌｙｃａｎ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１２．２８７（２７）：ｐ．２２５９３−２２６０８．
【０１４５】
本明細書に記載のすべての特許、特許出願及び出版物並びに電子的に入手可能な資料（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおけるヌクレオチド配列登録及び例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢにおけるアミノ酸配列登録並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑにおける注釈付きコード領域からの翻訳）の完全な開示内容が参照により組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれる本出願の開示内容と、いずれかの文書の開示内容との間に不一致が存在する場合、本出願の開示内容が優先すべきである。上記の詳細な説明及び実施例は、単に理解を容易にするために示されている。そこから不必要な限定が理解されるべきではない。本発明は、特許請求の範囲によって定義される本発明内に包含される、当業者に明らかな変形形態に関して示され、且つ記述される厳密な詳細に限定されない。
【０１４６】
標題は、すべて読者の便宜上記載され、且つ指定がない限り、標題に続く文章の意味を限定するために使用されるべきではない。
【図１Ａ−Ｂ】
2020517280.tif 000009
【図２】
2020517280.tif 000010
【図３Ａ】
2020517280.tif 000011
【図３Ｂ】
2020517280.tif 000012
【図３Ｃ】
2020517280.tif 000013
【図３Ｄ】
2020517280.tif 000014
【図４】
2020517280.tif 000015
【図５】
2020517280.tif 000016
【図６−１】
2020517280.tif 000017
【図６−２】
2020517280.tif 000018
【図６−３】
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【図７Ａ−Ｃ】
2020517280.tif 000020
【図８Ａ−Ｂ】
2020517280.tif 000021
【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０Ａ−Ｃ】
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【図１１】
2020517280.tif 000024
【図１２】
2020517280.tif 000025
【図１３】
2020517280.tif 000026
【図１４Ａ−Ｂ】
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【図１５】
2020517280.tif 000028
【図１６Ａ】
2020517280.tif 000029
【図１６Ｂ】
2020517280.tif 000030
【図１７】
2020517280.tif 000031
【図１８】
2020517280.tif 000032
【配列表】
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【国際調査報告】
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2020517280.tif 000034
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