(57)【要約】  原形質膜およびエンドソームなどの種々の細胞区画で、Ｇαタンパク質サブユニットファミリー選択的な様式において、Ｇタンパク質活性化をモニタリングするためのシステムおよび方法が説明されている。これらのシステムおよび方法はまた、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）介在性、および非受容体グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）介在性Ｇタンパク質活性化のモニタリングを可能にしており、好適なエネルギー（ＢＲＥＴ）ドナーおよびアクセプタでタグ付けした、Ｇタンパク質の特異的エフェクタのＧタンパク質結合ドメインおよび細胞区画マーカの使用に基づいている。【選択図】図１Ａ
2020537531.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇαタンパク質サブユニットファミリー選択的様式でＧタンパク質活性化の調節を測定するためのシステムであって、前記システムが、
（ｉ）生物発光ドナー分子または蛍光アクセプタ分子でタグ付けされたＧαサブユニット相互作用ポリペプチド（ＧＡＳＩＰ）を含む第１の成分であって、
前記Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧｉである場合、前記ＧＡＳＩＰが、Ｇｉに特異的に結合するタンパク質のドメインを含み、
前記Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧｑである場合、前記ＧＡＳＩＰが、Ｇｑに特異的に結合するタンパク質のドメインを含み、
前記Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧ１２／１３である場合、前記ＧＡＳＩＰが、Ｇ１２／１３に特異的に結合するタンパク質のドメインを含む、第１の成分と、
（ｉｉ）生物発光ドナー分子または蛍光アクセプタ分子でタグ付けされた原形質膜（ＰＭ）標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分を含む第２の成分であって、
前記ＧＡＳＩＰが前記蛍光アクセプタ分子でタグ付けされている場合、前記ＰＭ標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分が、前記生物発光ドナー分子でタグ付けされており、前記ＧＡＳＩＰが前記生物発光ドナー分子でタグ付けされている場合、前記ＰＭ標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分が、前記蛍光アクセプタ分子でタグ付けされている、第２の成分と、を発現する細胞を含む、システム。
【請求項２】
Ｇｉに特異的に結合するタンパク質の前記ドメインが、Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインまたはＧタンパク質シグナル伝達調節因子（ＲＧＳ）タンパク質のドメインである、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記ＧＡＳＩＰが、Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインを含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
Ｒａｐ１ＧＡＰの前記Ｇタンパク質結合ドメインが、Ｒａｐ１ＧＡＰの残基１〜４４２（配列番号８）、または位置４３７、４３９および４４１のセリン残基のうちの１つ以上が突然変異したまたは非存在であるその変異体を含む、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
Ｒａｐ１ＧＡＰの前記Ｇタンパク質結合ドメインが、Ｒａｐ１ＧＡＰの残基１〜４２０または残基１〜４３６を含む、請求項４に記載のシステム。
【請求項６】
位置４３７、４３９、および４４１の３つのセリン残基すべてが変異している、請求項４に記載のシステム。
【請求項７】
前記セリン残基が、アラニンと置換されている、請求項４または６に記載のシステム。
【請求項８】
前記ＧＡＳＩＰが、ＲＧＳタンパク質のＧタンパク質結合ドメインを含む、請求項２に記載のシステム。
【請求項９】
前記ＲＧＳタンパク質が、ＲＧＳ１７、ＲＧＳ１９またはＲＧＳ２０である、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記Ｇタンパク質結合ドメインが、ＲＧＳ１７の残基６４〜２１０（配列番号１７）、ＲＧＳ１９の残基７０〜２１７（配列番号１８）、またはＲＧＳ２０の残基２４２〜３８８（配列番号１９）を含む、請求項９に記載のシステム。
【請求項１１】
Ｇｑに特異的に結合するタンパク質の前記ドメインが、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦまたはＧＲＫ２のＧタンパク質結合ドメインである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
前記ＧＡＳＩＰが、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインを含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦの前記Ｇタンパク質結合ドメインが、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦの残基２９５〜５０２（配列番号２５）を含む、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記ＧＡＳＩＰが、ＧＲＫ２のＧタンパク質結合ドメインを含む、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１５】
ＧＲＫ２の前記Ｇタンパク質結合ドメインが、ＧＲＫ２の残基３０〜２０３（配列番号２７）を含む、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
Ｇ１２／１３に特異的に結合するタンパク質の前記ドメインが、ＰＤＺＲｈｏＧＥＦまたはＰ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインである、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
前記ＧＡＳＩＰが、ＰＤＺＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインを含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
ＰＤＺＲｈｏＧＥＦの前記Ｇタンパク質結合ドメインが、ＰＤＺＲｈｏＧＥＦの残基２８１〜４８３（配列番号２１）を含む、請求項１７に記載のシステム。
【請求項１９】
前記ＧＡＳＩＰが、Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインを含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項２０】
Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦの前記Ｇタンパク質結合ドメインが、Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦの残基１〜２４４（配列番号２３）を含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記ＧＡＳＩＰが、前記生物発光ドナー分子でタグ付けされており、前記ＰＭ標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分が前記蛍光アクセプタ分子でタグ付けされている、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２２】
前記ＰＭ標的化部分が、ＰＭに局在するＰＭタンパク質またはその断片である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２３】
前記ＰＭタンパク質またはその断片が、（ａ）パルミトイル化、ミリストイル化、および／もしくはプレニル化シグナル配列ならびに／または（ｂ）多塩基配列を含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＧＣＭＳＣＫＣＶＬＳ（配列番号６０）、ＧＣＭＧＬＰＣＶＶＭ（配列番号６１）、ＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ（配列番号６２）、ＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号６３）、ＫＮＧＫＫＫＲＫＳＬＡＫＲＩＲＥＲＣＣＩＬ（配列番号４５）、ＣＭＳＣＫＣＣＩＬ（配列番号４）、またはＳＰＫＫＧＬＬＱＲＬＦＫＲＱＨＱＮＮＳＫＳ（配列番号５）を含む、請求項２２または２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号１）を含む、請求項２４に記載のシステム。
【請求項２６】
前記エンドソーム標的化部分が、エンドソームに局在するエンドソームタンパク質またはその断片である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２７】
前記エンドソームタンパク質またはその断片が、ＦＹＶＥドメインを含む、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記エンドソーム標的化部分が、ヒトエンドフィンのＦＹＶＥドメインを含む、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
前記エンドソーム標的化部分が、ヒトエンドフィンの残基７３９〜８０６（配列番号３９）を含む、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
前記ゴルジ標的化部分が、ゴルジに局在するゴルジタンパク質またはその断片である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３１】
前記ゴルジ標的化部分が、ゴルジに局在するｅＮＯＳ１またはその断片である、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
前記ゴルジ標的化部分が、ヒトｅＮＯＳ１の残基１〜７３（配列番号４６）を含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記第１の成分が、（ｉ）前記ＧＡＳＩＰと（ｉｉ）前記生物発光ドナー分子または蛍光アクセプタ分子との間にリンカーをさらに含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３４】
前記第２の成分が、（ｉ）前記ＰＭ標的化部分、エンドソーム標的化部分、またはゴルジ標的化部分と、（ｉｉ）前記生物発光ドナー分子または蛍光アクセプタ分子との間にリンカーをさらに含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３５】
前記リンカーが、５〜２５個のアミノ酸で連結されたペプチドである、請求項３３または３４に記載のシステム。
【請求項３６】
前記Ｇタンパク質を経てシグナル伝達する細胞表面受容体である第３の成分をさらに含む、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３７】
前記細胞表面受容体が、ＧＰＣＲ、ＲＴＫ、またはインテグリン受容体である、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
前記Ｇタンパク質活性化が、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）介在性Ｇタンパク質活性化である、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項３９】
組換えＧαサブユニットポリペプチドである第４の成分をさらに含む、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４０】
前記Ｇタンパク質活性化が、非受容体グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）介在性Ｇタンパク質活性化であり、前記組換えＧαサブユニットポリペプチドが、前記Ｇαサブユニットポリペプチドのカルボキシ（Ｃ）末端ドメインに少なくとも１つの突然変異を含み、前記Ｃ末端ドメインが、前記Ｇαサブユニットポリペプチドの最後の７個の残基に対応する、請求項３９に記載のシステム。
【請求項４１】
前記突然変異が、少なくとも最後の２個のＣ末端残基の欠失または置換である、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４２】
前記突然変異が、少なくとも最後の５個のＣ末端残基の欠失または置換である、請求項４１に記載のシステム。
【請求項４３】
前記突然変異が、前記Ｃ末端ドメインにおける保存されたロイシン残基の少なくとも１つの欠失または置換である、請求項４０に記載のシステム。
【請求項４４】
前記突然変異が、前記Ｃ末端ドメインにおける最後の保存されたロイシン残基の置換である、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
前記置換が、ロイシンからアスパラギン酸への、ロイシンからプロリンへの、またはロイシンからアルギニンへの置換である、請求項４４に記載のシステム。
【請求項４６】
前記ＧＥＦが、ＧＩＶ／Ｇｉｒｄｉｎであり、前記ＧＡＳＩＰが、請求項１〜７のいずれか１項において定義されるＲａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインを含む、請求項４０〜４５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４７】
前記ＧＥＦが、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）によって活性化される、請求項４６に記載のシステム。
【請求項４８】
前記生物発光ドナー分子が、ルシフェラーゼ、好ましくはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質（ｒＬｕｃ）である、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項４９】
前記蛍光アクセプタ分子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、好ましくはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ（ｒＧＦＰ）である、請求項１〜４８のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項５０】
請求項１〜４９のいずれか１項に記載のシステムの第１および／または第２の成分をコードする１つ以上の核酸。
【請求項５１】
請求項１〜４９のいずれか１項に記載のシステムの第１の成分をコードする第１の核酸と、請求項１〜４９のいずれか１項に記載のシステムの第２の成分をコードする第２の核酸と、を含む、請求項５０に記載の１つ以上の核酸。
【請求項５２】
請求項５０または５１に記載の１つ以上の核酸を含む、１つ以上のベクター。
【請求項５３】
請求項１〜４９のいずれか１項を定義するシステムの前記成分を発現する、宿主細胞。
【請求項５４】
薬剤が、関心対象のＧタンパク質の活性化を調節するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）請求項１〜４９のいずれか１項に記載のシステムを前記生物発光ドナー分子のための基質と接触させることと、
（ｂ）前記薬剤の存在下および非存在下で前記システム内のＢＲＥＴシグナルを測定することであって、
前記薬剤の非存在に対する前記薬剤の存在下での前記ＢＲＥＴシグナルの差は、前記薬剤が、関心対象の前記Ｇタンパク質の活性化を調節することを示す、測定することと、を含む、方法。
【請求項５５】
関心対象の前記Ｇタンパク質が、Ｇｉタンパク質サブユニットファミリーのものであり、前記ＧＡＳＩＰが、請求項１〜７のいずれか１項において定義されるＲａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記システムが、Ｇｉタンパク質サブユニットファミリーの組換えＧαサブユニットポリペプチドを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法が、複数のシステムを使用して実施され、前記システムの各々が、Ｇｉタンパク質サブユニットファミリーの異なる組換えＧαサブユニットポリペプチドを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
関心対象の前記Ｇタンパク質が、Ｇｑタンパク質サブユニットファミリーのものであり、前記ＧＡＳＩＰが、請求項１および１１〜１５のいずれか１項において定義されるＰ６３ＲｈｏＧＥＦまたはＧＲＫ２のＧタンパク質結合ドメインを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記システムが、Ｇｑタンパク質サブユニットファミリーの組換えＧαサブユニットポリペプチドを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記方法が、複数のシステムを使用して実施され、前記システムの各々が、Ｇｑタンパク質サブユニットファミリーの異なる組換えＧαサブユニットポリペプチドを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
関心対象の前記Ｇタンパク質が、Ｇ１２／１３タンパク質サブユニットファミリーのものであり、前記ＧＡＳＩＰが、請求項１および１６〜２０のいずれか１項において定義されるＰＤＺＲｈｏＧＥＦまたはＰ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６２】
前記システムが、Ｇ１２／１３タンパク質サブユニットファミリーの組換えＧαサブユニットポリペプチドを含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記方法が、複数のシステムを使用して実施され、前記システムの各々が、Ｇ１２／１３タンパク質サブユニットファミリーの異なる組換えＧαサブユニットポリペプチドを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
薬剤が、非受容体グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）介在性Ｇタンパク質活性化を調節するかどうかを決定するための方法であって、
（ａ）請求項４０〜４７のいずれか１項に記載のシステムを前記生物発光ドナー分子のための基質と接触させることと、
（ｂ）前記薬剤の存在下および非存在下で前記システム内のＢＲＥＴシグナルを測定することであって、
前記薬剤の非存在に対する前記薬剤の存在下での前記ＢＲＥＴシグナルの差は、前記薬剤が、非受容体ＧＥＦ介在性Ｇタンパク質活性化を調節することを示す、測定することと、を含む、方法。
【請求項６５】
前記ＢＲＥＴシグナルが、プレートリーダを使用して、または顕微鏡法によって測定される、請求項５４〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記基質が、コエレンテラジン基質である、請求項５４〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記コエレンテラジン基質が、メトキシｅ−コエレンテラジンである、請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される２０１７年１０月１８日出願の米国仮出願番号第６２／５７３，８５３号の利益を主張する。
【０００２】
本発明は、概して、細胞におけるＧタンパク質活性化のモニタリングに関する。
【背景技術】
【０００３】
ヘテロ三量体Ｇタンパク質は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）の標準的なシグナル伝達パートナであり、また、Ｇα相互作用小胞関連タンパク質（ＧＩＶ、Ｇｉｒｄｉｎとしても既知）を経て他の種類の受容体、特に受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）のシグナル伝達に関与することが既知である（Ｇｈｏｓｈ  Ｐ，２０１６，Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｓ．１０５：９９−１０７）。受容体の活性化は、Ｇα結合ＧＤＰのＧＴＰへの交換を惹起し、結果としてＧαおよびＧβ／γサブユニットの解離を促進するヘテロ三量体Ｇタンパク質の配座転位をもたらす。次に、ＧＴＰ結合Ｇαおよび遊離Ｇβ／γサブユニットは、特定のエフェクタを作動させるために利用可能である。
【０００４】
Ｇタンパク質は、Ｇαサブユニットの活性化後のシグナル伝達の結果に基づいてファミリーに分類される。Ｇｓファミリー（Ｇαｓ、Ｇαｏｌｆ）は、アデニリルシクラーゼ（ＡＣ）の直接的な活性化を経てｃＡＭＰの産生を強化する。逆に、Ｇｉファミリー（Ｇαｉ１、Ｇαｉ２、Ｇαｉ３、ＧαｏＡ、ＧαｏＢおよびＧαｚ）は、特定のＡＣを阻害することによって、ｃＡＭＰレベルを低減させる。Ｇｑファミリー（Ｇαｑ、Ｇα１１、Ｇα１４およびＧα１５）は、ホスホリパーゼＣβ（ＰＬＣβ）を活性化して二次メッセンジャーであるジアシルグリセロール（ＤＡＧ）およびイノシトール三リン酸（ＩＰ３）を生成し、これらがその後それぞれ、ＰＫＣの活性化および小胞体からのＣａ２＋放出を促進する。最後に、Ｇ１２／１３ファミリー（Ｇα１２およびＧα１３）は、ＬＡＲＧ、ｐ１１５、およびＴＲＩＯなどのＲｈｏ−ＧＥＦを制御し、したがって細胞骨格の再構築と連関した過程（例えば、走化性）に影響することが既知である。異なるファミリーに属するＧタンパク質の活性化後のシグナル伝達の明確な結果を考慮して、Ｇタンパク質ファミリー選択的様式でＧタンパク質の活性化を監視することができるシステムおよびアッセイは、例えば、種々のリガンドによる細胞表面受容体の活性化（例えば、所与のリガンドによって活性化されるシグナル伝達経路）をより良好に特徴づけ、Ｇタンパク質のより特異的なモジュレータを特定するために必要とされる。
【０００５】
細胞表面受容体の活性化は、主にリガンド結合に応答して原形質膜（ＰＭ）で発生するが、細胞表面受容体（例えば、ＧＰＣＲ、ＲＴＫ）のシグナル伝達は、エンドソームおよびゴルジを含む他の細胞区画において発生することが示されてきた。活性化の際、多くの細胞表面受容体がエンドソームに入り、エンドソーム内のリガンド−受容体複合体の輸送は、（リソソームおよびプロテアソームにおける）受容体の分解を経てシグナル伝達を終止させるかまたは、細胞表面へ戻る受容体の再利用を経てシグナル伝達を持続させるかのいずれかの機序を提供する。しかしながら、エンドソームにおいて受容体シグナル伝達を開始、持続、および終止させることができることも実証されてきた（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１０６  ｎｏ．４２，１７６１５−１７６２２、Ｔｓｖｅｔａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０（１１），ｐｐ．６６８９−６６９６、Ｖｉｌａｒｄａｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０，７００−７０６）。同様に、いくつかのＧタンパク質がゴルジと関係しており、ゴルジ（Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ．３３：１８９−２０３）および小胞体（ＥＲ）−ゴルジ界面（Ｂａｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５  Ｓｅｐ  １；３：１２８）で活性化されることがわかってきた。ＰＭならびにエンドソームおよびゴルジなどの他の区画の受容体から、異なるシグナルが発生することができ、結果として異なる生理学的応答をもたらし、異なる機序がこれらの区画の受容体のシグナル伝達を調節する。これらのシグナル伝達と調節の異なる機序は、（ＰＭよりもむしろ）他の細胞区画でのシグナル伝達の標的化に基づく新規療法の可能性を高め、したがって、異なる細胞区画でのＧタンパク質活性化を監視するシステムおよびアッセイが必要とされる。
【０００６】
米国特許第９，０２９，０９７号およびＷＯ／２０１６／０５８０９４は、Ｇタンパク質活性化を監視するためのＢＲＥＴ系バイオセンサを開示している。しかしながら、これらのバイオセンサは、Ｇタンパク質サブユニット（Ｇα、Ｇβ、および／またはＧγ）および／またはＧＰＣＲのうちの１つ以上のタグ付けを必要とし、このことは、これらのタンパク質の活性に影響することがある。また、これらのバイオセンサは、細胞内の包括的なＧタンパク質活性化を検出するが、異なる細胞区画でのおよびＧタンパク質ファミリー選択的様式におけるＧタンパク質活性化のモニタリングができない。
【０００７】
本明細書は、多くの文書を参照しており、その内容は全体として参照により本明細書に援用される。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、次の項目１〜６７を提供する。
１．Ｇαタンパク質サブユニットファミリー選択的様式でＧタンパク質活性化の調節を測定するためのシステムであって、該システムが、
（ｉ）生物発光ドナー分子または蛍光アクセプタ分子でタグ付けされたＧαサブユニット相互作用ポリペプチド（ＧＡＳＩＰ）を含む第１の成分であって、
該Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧｉである場合、該ＧＡＳＩＰが、Ｇｉに特異的に結合するタンパク質のドメインを含み、該Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧｑである場合、該ＧＡＳＩＰが、Ｇｑに特異的に結合するタンパク質のドメインを含み、該Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧ１２／１３である場合、該ＧＡＳＩＰが、Ｇ１２／１３に特異的に結合するタンパク質のドメインを含む、第１の成分と、
（ｉｉ）生物発光ドナー分子または蛍光アクセプタ分子でタグ付けされた原形質膜（ＰＭ）標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分を含む第２の成分であって、
該ＧＡＳＩＰが該蛍光アクセプタ分子でタグ付けされている場合、該ＰＭ標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分が、該生物発光ドナー分子でタグ付けされており、該ＧＡＳＩＰが前記生物発光ドナー分子でタグ付けされている場合、該ＰＭ標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分が、該蛍光アクセプタ分子でタグ付けされている、第２の成分と、を発現する細胞を含む、システム。
【０００９】
２．Ｇｉに特異的に結合するタンパク質の該ドメインが、Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインまたはＧタンパク質シグナル伝達調節因子（ＲＧＳ）タンパク質のドメインである、項目１のシステム。
【００１０】
３．該ＧＡＳＩＰが、Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインを含む、項目２のシステム。
【００１１】
４．Ｒａｐ１ＧＡＰの該Ｇタンパク質結合ドメインが、Ｒａｐ１ＧＡＰの残基１〜４４２（配列番号８）、または位置４３７、４３９および４４１のセリン残基のうちの１つ以上が突然変異したまたは非存在であるその変異体を含む、項目３のシステム。
【００１２】
５．Ｒａｐ１ＧＡＰの該Ｇタンパク質結合ドメインが、Ｒａｐ１ＧＡＰの残基１〜４２０または残基１〜４３６を含む、項目４のシステム。
【００１３】
６．位置４３７、４３９、および４４１の３つのセリン残基すべてが変異している、項目４のシステム。
【００１４】
７．該セリン残基が、アラニンと置換されている、項目４または項目６のシステム。
【００１５】
８．該ＧＡＳＩＰが、ＲＧＳタンパク質のＧタンパク質結合ドメインを含む、項目２のシステム。
【００１６】
９．該ＲＧＳタンパク質が、ＲＧＳ１７、ＲＧＳ１９、またはＲＧＳ２０である、項目８のシステム。
【００１７】
１０．該Ｇタンパク質結合ドメインが、ＲＧＳ１７の残基６４〜２１０（配列番号１７）、ＲＧＳ１９の残基７０〜２１７（配列番号１８）、またはＲＧＳ２０の残基２４２〜３８８（配列番号１９）を含む、項目９のシステム。
【００１８】
１１．Ｇｑに特異的に結合するタンパク質の該ドメインが、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦまたはＧＲＫ２のＧタンパク質結合ドメインである、項目１のシステム。
【００１９】
１２．該ＧＡＳＩＰが、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインを含む、項目１１のシステム。
【００２０】
１３．Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦの該Ｇタンパク質結合ドメインが、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦの残基２９５〜５０２（配列番号２５）を含む、項目１２のシステム。
【００２１】
１４．該ＧＡＳＩＰが、ＧＲＫ２のＧタンパク質結合ドメインを含む、項目１１のシステム。
【００２２】
１５．ＧＲＫ２の該Ｇタンパク質結合ドメインが、ＧＲＫ２の残基３０〜２０３（配列番号２７）を含む、項目１４のシステム。
【００２３】
１６．Ｇ１２／１３に特異的に結合するタンパク質の該ドメインが、ＰＤＺＲｈｏＧＥＦまたはＰ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインである、項目１のシステム。
【００２４】
１７．該ＧＡＳＩＰが、ＰＤＺＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインを含む、項目１６のシステム。
【００２５】
１８．ＰＤＺＲｈｏＧＥＦの該Ｇタンパク質結合ドメインが、ＰＤＺＲｈｏＧＥＦの残基２８１〜４８３（配列番号２１）を含む、項目１７のシステム。
【００２６】
１９．該ＧＡＳＩＰが、Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインを含む、項目１６のシステム。
【００２７】
２０．Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦの該Ｇタンパク質結合ドメインが、Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦの残基１〜２４４（配列番号２３）を含む、項目１９のシステム。
【００２８】
２１．該ＧＡＳＩＰが、該生物発光ドナー分子でタグ付けされており、該ＰＭ標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分が該蛍光受容体分子でタグ付けされている、項目１〜２０のいずれか１つのシステム。
【００２９】
２２．該ＰＭ標的化部分が、ＰＭに局在するＰＭタンパク質またはその断片である、項目１〜２１のいずれか１つのシステム。
【００３０】
２３．該ＰＭタンパク質またはその断片が、（ａ）パルミトイル化、ミリストイル化、および／もしくはプレニル化シグナル配列ならびに／または（ｂ）多塩基配列を含む、項目２２のシステム。
【００３１】
２４．該ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＧＣＭＳＣＫＣＶＬＳ（配列番号６２）、ＧＣＭＧＬＰＣＶＶＭ（配列番号６３）、ＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ（配列番号６４）、ＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号６５）、ＫＮＧＫＫＫＲＫＳＬＡＫＲＩＲＥＲＣＣＩＬ（配列番号４５）、ＣＭＳＣＫＣＣＩＬ（配列番号４６）、またはＳＰＫＫＧＬＬＱＲＬＦＫＲＱＨＱＮＮＳＫＳ（配列番号４７）を含む、項目２２または項目２３のシステム。
【００３２】
２５．該ＰＭ標的化部分が、アミノ酸配列ＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号１）を含む、項目２４のシステム。
【００３３】
２６．該エンドソーム標的化部分が、エンドソームに局在するエンドソームタンパク質またはその断片である、項目１〜２１のいずれか１つのシステム。
【００３４】
２７．該エンドソームタンパク質またはその断片が、ＦＹＶＥドメインを含む、項目２６のシステム。
【００３５】
２８．該エンドソーム標的化部分が、ヒトエンドフィンのＦＹＶＥドメインを含む、項目２７のシステム。
【００３６】
２９．該エンドソーム標的化部分が、ヒトエンドフィンの残基７３９〜８０６を含む、項目２８のシステム。
【００３７】
３０．該ゴルジ標的化部分が、ゴルジに局在するゴルジタンパク質またはその断片である、項目１〜２１のいずれか１つのシステム。
【００３８】
３１．該ゴルジ標的化部分が、ゴルジに局在するｅＮＯＳ１またはその断片である、項目３０のシステム。
【００３９】
３２．該ゴルジ標的化部分が、ヒトｅＮＯＳ１の残基１〜７３（配列番号４８）を含む、項目３１のシステム。
【００４０】
３３．該第１の成分が、（ｉ）該ＧＡＳＩＰと（ｉｉ）該生物発光ドナー分子または蛍光アクセプタ分子との間にリンカーをさらに含む、項目１〜３２のいずれか１つのシステム。
【００４１】
３４．該第２の成分が、（ｉ）該ＰＭ標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分と、（ｉｉ）該生物発光ドナー分子または蛍光アクセプタ分子との間にリンカーをさらに含む、項目１〜３３のいずれか１つのシステム。
【００４２】
３５．該リンカーが、５〜２５個のアミノ酸で連結されたペプチドである、項目３３または項目３４のシステム。
【００４３】
３６．該Ｇタンパク質を経てシグナル伝達する細胞表面受容体である第３の成分をさらに含む、項目１〜３５のいずれか１つのシステム。
【００４４】
３７．該細胞表面受容体が、ＧＰＣＲ、ｒｔｋまたはインテグリン受容体である、項目３６のシステム。
【００４５】
３８．該Ｇタンパク質活性化が、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）介在性Ｇタンパク質活性化である、項目１〜３７のいずれか１つのシステム。
【００４６】
３９．組換えＧαサブユニットポリペプチドである第４の成分をさらに含む、項目１〜３８のいずれか１つのシステム。
【００４７】
４０．該Ｇタンパク質活性化が、非受容体グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）介在性Ｇタンパク質活性化であり、該組換えＧαサブユニットポリペプチドが、該Ｇαサブユニットポリペプチドのカルボキシ（Ｃ）末端ドメインに少なくとも１つの突然変異を含み、該Ｃ末端ドメインが、該Ｇαサブユニットポリペプチドの最後の７つの残基に対応する、項目３９のシステム。
【００４８】
４１．該突然変異が、少なくとも最後の２つのＣ末端残基の欠失または置換である、項目４０のシステム。
【００４９】
４２．該突然変異が、少なくとも最後の５つのＣ末端残基の欠失または置換である、項目４１のシステム。
【００５０】
４３．該突然変異が、該Ｃ末端ドメインにおける保存されたロイシン残基の少なくとも１つの欠失または置換である、項目４０のシステム。
【００５１】
４４．該突然変異が、該Ｃ末端ドメインにおける最後の保存されたロイシン残基の置換である、項目４３のシステム。
【００５２】
４５．該置換が、ロイシンからアスパラギン酸への、ロイシンからプロリンへの、またはロイシンからアルギニンへの置換である、項目４４のシステム。
【００５３】
４６．該ＧＥＦが、ＧＩＶ／Ｇｉｒｄｉｎであり、該ＧＡＳＩＰが項目１〜７のいずれか１つにおいて定義されるＲａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインを含む、項目４０〜４５のいずれか１つのシステム。
【００５４】
４７．該ＧＥＦが、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）によって活性化される、項目４６のシステム。
【００５５】
４８．該生物発光ドナー分子が、ルシフェラーゼ、好ましくはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼタンパク質（ｒＬｕｃ）である、項目１〜４７のいずれか１つのシステム。
【００５６】
４９．該蛍光アクセプタ分子が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、好ましくはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ（ｒＧＦＰ）である、項目１〜４８のいずれか１つのシステム。
【００５７】
５０．項目１〜４９のいずれか１つのシステムの第１および／または第２の成分をコードする１つ以上の核酸。
【００５８】
５１．項目１〜４９のいずれか１つのシステムの第１の成分をコードする第１の核酸と、項目１〜４９のいずれか１つのシステムの第２の成分をコードする第２の核酸と、を含む、項目５０の１つ以上の核酸。
【００５９】
５２．項目５０または項目５１の１つ以上の核酸を含む、１つ以上のベクター。
【００６０】
５３．項目１〜４９のいずれか１つを定義するシステムの前記成分を発現する、宿主細胞。
【００６１】
５４．薬剤が、関心対象のＧタンパク質の活性化を調節するかどうかを決定するための方法であって、（ａ）項目１〜４９のいずれか１つのシステムを該生物発光ドナー分子のための基質と接触させることと、（ｂ）該薬剤の存在下および非存在下でシステム内のＢＲＥＴシグナルを測定することであって、該薬剤が関心対象の該Ｇタンパク質の活性化を調節することを、該薬剤の非存在に対する該薬剤の存在下での該ＢＲＥＴシグナルの差が示す、測定することと、を含む、方法。
【００６２】
５５．関心対象の該Ｇタンパク質が、Ｇｉタンパク質サブユニットファミリーのものであり、該ＧＡＳＩＰが、項目１〜７のいずれか１つにおいて定義されるＲａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインを含む、項目５４の方法。
【００６３】
５６．システムが、Ｇｉタンパク質サブユニットファミリーの組換えＧαサブユニットポリペプチドを含む、項目４９の方法。
【００６４】
５７．方法が、複数のシステムを使用して実施され、該システムの各々が、Ｇｉタンパク質サブユニットファミリーの異なる組換えＧαサブユニットポリペプチドを含む、項目５６の方法。
【００６５】
５８．関心対象の該Ｇタンパク質が、Ｇｑタンパク質サブユニットファミリーのものであり、該ＧＡＳＩＰが、項目１および１１〜１５のいずれか１つにおいて定義されるＰ６３ＲｈｏＧＥＦまたはＧＲＫ２のＧタンパク質結合ドメインを含む、項目５４の方法。
【００６６】
５９．システムが、Ｇｑタンパク質サブユニットファミリーの組換えＧαサブユニットポリペプチドを含む、項目５８の方法。
【００６７】
６０．方法が、複数のシステムを使用して実施され、該システムの各々が、Ｇｑタンパク質サブユニットファミリーの異なる組換えＧαサブユニットポリペプチドを含む、項目５９の方法。
【００６８】
６１．関心対象の該Ｇタンパク質が、Ｇ１２／１３タンパク質サブユニットファミリーのものであり、該ＧＡＳＩＰが、項目１および１６〜２０のいずれか１つにおいて定義されるＰＤＺＲｈｏＧＥＦまたはＰ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインを含む、項目５４の方法。
【００６９】
６２．システムが、Ｇ１２／１３タンパク質サブユニットファミリーの組換えＧαサブユニットポリペプチドを含む、項目６１の方法。
【００７０】
６３．方法が、複数のシステムを使用して実施され、該システムの各々が、Ｇ１２／１３タンパク質サブユニットファミリーの異なる組換えＧαサブユニットポリペプチドを含む、項目６２の方法。
【００７１】
６４．薬剤が、非受容体グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）介在性Ｇタンパク質の活性化を調節するかどうかを決定するための方法であって、（ａ）項目４０〜４７のいずれか１つのシステムを該生物発光ドナー分子のための基質と接触させることと、（ｂ）該薬剤の存在下および非存在下でシステム内のＢＲＥＴシグナルを測定することであって、該薬剤が非受容体ＧＥＦ介在性Ｇタンパク質活性化を調節することを、該薬剤の非存在に対する該薬剤の存在下での該ＢＲＥＴシグナルの差が示す、測定することと、を含む、方法。
【００７２】
６５．ＢＲＥＴシグナルが、プレートリーダを使用して、または顕微鏡法によって測定される、項目５４〜６４のいずれか１つの方法。
【００７３】
６６．基質が、コエレンテラジン基質である、項目５４〜６５のいずれか１つの方法。
【００７４】
６７．コエレンテラジン基質が、メトキシｅ−コエレンテラジンである、項目６６の方法。
【００７５】
本発明の他の目的、利点、および特色は、添付の図面に関して例としてのみ与えられる、その具体的な実施形態の以下の非限定的な説明の読解の際により明らかとなることとなる。
【００７６】
添付図面：
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１Ａ】ＧＰＣＲ介在性直接的Ｇタンパク質活性化（上パネルｉ）またはグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）介在性Ｇタンパク質活性化（下パネルｉｉ）をモニタリングするエフェクタ系センサの原理を図示している。好適な生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）ドナーまたはアクセプタ（例えば、ｒＧＦＰ）でタグ付けされた、受容体、原形質膜（ＰＭ）マーカまたは初期エンドソーム（ＥＥ）マーカなどの細胞区画（または細胞内局在）マーカ、好適なＢＲＥＴドナーまたはアクセプタ（例えば、ＲｌｕｃＩＩ）でタグ付けされた特異的Ｇタンパク質エフェクタのＧα相互作用ドメインを発現している細胞は、アゴニストに曝露されて、共発現しているＧタンパク質を活性化する。パネルｉ）において、アゴニスト誘導性ＧＰＣＲ刺激は、Ｇタンパク質を直接活性化し、このことが、タグ付けされたエフェクタを細胞質から標識された膜へと動員する。パネルｉｉ）において、Ｇタンパク質の活性化は、ＲＴＫ（例えば、ＥＧＦＲ）またはインテグリンα−β複合体の活性化に続くＧＩＶ／ＧｉｒｄｉｎなどのＧＥＦの動員によって介在される。
【図１Ｂ】３種類のＧタンパク質エフェクタで得られた特異性の例を示す。Ｇｑ、Ｇｉ、およびＧ１２／１３ファミリーのメンバーと共役した受容体は、これらのＧタンパク質と共発現しており、ｒＧＦＰがＰＭマーカ（ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ、ＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ、配列番号１）に融合しており、Ｇタンパク質エフェクタがＲｌｕｃＩＩでタグ付けされていた。図１Ｂは、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩおよびｒＧＦＰ−ＣＡＡＸ（ＰＭマーカ）を使用した、血小板活性化因子（ＰＡＦ）／ＰＡＦＲ介在性Ｇタンパク質（Ｇｑ、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１２、ＧｏＡ、ＧｏＢ、Ｇｚ、Ｇｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３）活性化で得られた用量応答曲線（ＤＲＣ）を示す。偽応答は、内在性発現したＧｉ１タンパク質、ｉ２タンパク質およびｉ３タンパク質の活性化を表す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＰＤＺＲＧ−ＲｌｕｃＩＩおよびｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを使用して、Ｕ４６６１９／ＴＰαＲ介在性Ｇタンパク質（Ｇｑ、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１２、Ｇ１３、Ｇｚ）活性化で得られたＤＲＣを示す。偽応答は、内在性発現したＧ１２タンパク質およびＧ１３タンパク質の活性化を表す。
【図１Ｄ】図１Ｄおよび図１Ｅは、Ｐ６３ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩおよびｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを使用して、ＰＡＦ／ＰＡＦＲ介在性Ｇタンパク質（Ｇｑ、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１２、ＧｏＡ、ＧｏＢ、Ｇｚ、Ｇｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３）活性化（図１Ｄ）およびＵ４６６１９／ＴＰαＲ介在性Ｇタンパク質（Ｇｑ、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１５、Ｇ１２、Ｇ１３、Ｇｚ）の活性化（図１Ｅ）で得られたＤＲＣを示す。偽応答は、内在性発現したＧｑタンパク質およびＧ１１タンパク質の活性化を表す。
【図１Ｅ】（図１Ｄの説明を参照）
【図２Ａ】ＧｉファミリーのＧタンパク質の活性化をモニタリングするためのＲａｐ１ＧＡＰ系システムで検査された種々の構築物を図示する。第１の構築物は、ＢＲＥＴドナーであるＲｌｕｃ８をＣ末端にタグ付けしたＲａｐ１ＧＡＰの一部（残基１〜４４２）から構成されている。この構築物から、異なるリンカーを使用し、Ｒｌｕｃ８の代わりにＲｌｕｃＩＩを使用して、第２の構築物を得た。本実験の結果を図２Ｂ〜図２Ｚに図示する。リンカーＡ＝ＧＳＧＧＧＳＧＧＧＡ（配列番号６）およびリンカーＢ＝ＧＳＡＧＴＧＧＲＡＩＤＩＫＬＰＡＴ（配列番号７）。Ｒａｐ１ＧＡＰ  １〜４４２＝配列番号８、Ｒａｐ１ＧＡＰΔｃｔｅｒｍ（１〜４２０）＝配列番号１０、Ｒａｐ１ＧＡＰΔＳＳＳ＝配列番号９、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ＳＳ−ＡＡ＝配列番号１３、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ＳＳ−ＤＡ＝配列番号１４、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ＳＳ−ＡＤ＝配列番号１５、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ＳＳ−ＤＤ＝配列番号１６、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ＳＳＳ−ＡＡＡ＝配列番号１１、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ＳＳＳ−ＴＴＴ＝配列番号１２。
【図２Ｂ】３つの異なるＲａｐ１ＧＡＰ−Ｒｌｕｃ構築物、すなわち、Ｒａｐ１ＧＡＰ（１〜４４２）−Ｒｌｕｃ８（丸）、Ｒａｐ１ＧＡＰ（１〜４４２）−ＲｌｕｃＩＩ（三角）、およびＲａｐ１ＧＡＰ（ΔＣＴ）−ＲｌｕｃＩＩ（ひし形）を用いたＡＲ−Ｍ１００３９０（ＡＲＭ）刺激の際のＧｉ１（図２Ｂ）、Ｇｉ２（図２Ｃ）、ＧｏＡ（図２Ｄ）、およびＧｚ（図２Ｅ）のヒトＭｕオピオイド受容体（ｈＭＯＲ１）介在性活性化ＤＲＣを示す。
【図２Ｃ】（図２Ｂの説明を参照）
【図２Ｄ】（図２Ｂの説明を参照）
【図２Ｅ】（図２Ｂの説明を参照）
【図２Ｆ】ホルスコリン（三角）またはビヒクル（ＤＭＳＯ／タイロード、丸）の存在下でのＰＭにおけるｈＭＯＲ１／ＡＲＭ促進型Ｇｚ活性化を使用したＤＲＣを示しており、上昇ｃＡＭＰ産生およびタンパク質キナーゼＡの活性化を促進して、Ｒａｐ１ＧＡＰ（１〜４４２）−Ｒｌｕｃ８（図２Ｆ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ（１〜４４２）−ＲｌｕｃＩＩ（図２Ｇ）、またはＲＡＰ１ＧＡＰ（ΔＣＴ）−ＲｌｕｃＩＩ（図２Ｈ）を使用した異なるタンパク質のリン酸化をもたらす。
【図２Ｇ】（図２Ｆの説明を参照）
【図２Ｈ】（図２Ｆの説明を参照）
【図２Ｉ】Ｒａｐ１ＧＡＰ（１〜４４２）−ＲｌｕｃＩＩ（図２Ｉ）、切断型（残基１〜４３６）バージョンＲａｐ１ＧＡＰ（ΔＳＳＳ）−ＲｌｕｃＩＩ（図２Ｊ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳ−ＡＤ）−ＲｌｕｃＩＩ（図２Ｋ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳ−ＤＡ）−ＲｌｕｃＩＩ（図２Ｌ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳ−ＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩ（図２Ｍ）、またはＲａｐ１ＧＡＰ（ＳＳ−ＤＤ）−ＲｌｕｃＩＩ（図２Ｎ）を使用したホルスコリン（四角）またはビヒクル（丸）の存在下でのＰＭにおけるｈＭＯＲ１／ＡＲＭ促進型Ｇｉ２活性化を使用したＤＲＣを示している。
【図２Ｊ】（図２Ｉの説明を参照）
【図２Ｋ】（図２Ｉの説明を参照）
【図２Ｌ】（図２Ｉの説明を参照）
【図２Ｍ】（図２Ｉの説明を参照）
【図２Ｎ】（図２Ｉの説明を参照）
【図２Ｏ】Ｒａｐ１ＧＡＰ（１〜４４２）−ＲｌｕｃＩＩ（図２Ｏ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＴＴＴ）−ＲｌｕｃＩＩ（図２Ｐ）およびＲａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩ（図２Ｑ）を使用したホルスコリン（三角）またはビヒクル（丸）の存在下でのＰＭにおけるｈＭＯＲ１／ＡＲＭ促進型ＧｏＢ活性化を使用したＤＲＣを示す。
【図２Ｐ】（図２Ｏの説明を参照）
【図２Ｑ】（図２Ｏの説明を参照）
【図２Ｒ】Ｇｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３、ＧｏＡまたはＧｏＢの共発現を伴う、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩの原形質膜への転移を用いたドーパミンＤ４受容体（Ｄ４Ｒ）のドーパミン促進型刺激後のＧタンパク質活性化のＤＲＣを示している。
【図２Ｓ】リガンドＡ４１２，９９７、ドーパミン、Ｌ７４１，７４２およびＷａｙ−１００６３５によるドーパミン受容体Ｄ４Ｒ（図２Ｓ）、Ｄ１Ｒ（図２Ｔ）、Ｄ２Ｒ（図２Ｕ）、Ｄ３Ｒ（図２Ｕ）またはＤ１Ｒ（図２Ｗ）の刺激後のＧｚ活性化のＤＲＣを示す。
【図２Ｔ】（図２Ｓの説明を参照）
【図２Ｕ】（図２Ｓの説明を参照）
【図２Ｖ】（図２Ｓの説明を参照）
【図２Ｗ】（図２Ｓの説明を参照）
【図２Ｘ】本アッセイのＺ’値を図示するグラフであり、本アッセイの堅牢性を示している。ＨＥＫ２９３を、Ｄ４Ｒ、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸで、ＷＴ  Ｇｉ２（図２Ｘ）、ＷＴ  ＧｏＡ（図２Ｙ）、またはＷＴ  Ｇｚ（図２Ｚ）と一緒に同時トランスフェクトし、９６ウェルプレート内に播種し、１００ｎＭ  ドーパミン（三角）またはビヒクル（ＤＭＳＯ／タイロード、四角）で３７℃で６〜８分間刺激した。Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩのＰＭへの動員をＢＲＥＴ２において査定した。提示されたグラフでは、ＢＲＥＴ値をウェルごとに表す。
【図２Ｙ】（図２Ｘの説明を参照）
【図２Ｚ】（図２Ｘの説明を参照）
【図３Ａ】本明細書で説明する試験において使用するＧタンパク質シグナル伝達調節因子（ＲＧＳ）タンパク質のメンバーのＲＧＳドメインに基づいて、ＧｉファミリーのＧタンパク質の活性化をモニタリングするための他の構築物を図示する。ＲＧＳ１７のＲＧＳ（Ｇｉ結合）ドメイン（配列番号１７の残基６４〜２１０）と、ＲＧＳ１９（配列番号１８の残基７０〜２１７）と、ＲＧＳ２０（配列番号１９の残基２４２〜３８８）とを含む断片をＣ末端においてＢＲＥＴドナーＲｌｕｃＩＩでタグ付けしている。リンカーＢ’＝ＧＳＡＧＴＧＧＲＡＩＤＩＫＬＡＳＡＴ（配列番号２０）。
【図３Ｂ】ＲＧＳ（ＲＧＳ１７）−ＲｌｕｃＩＩ（図３Ｂ）、ＲＧＳ（ＲＧＳ１９）−ＲｌｕｃＩＩ（図３Ｃ）またはＲＧＳ（ＲＧＳ２０）−ＲｌｕｃＩＩ（図３Ｄ）のＰＭへの転移を使用した、ＧｏＡ、ＧｏＢ、Ｇｚ、Ｇｉ１、Ｇｉ２またはＧｉ３の共発現を伴うＤ４）のドーパミン促進型刺激後のＧタンパク質活性化のＤＲＣを示す。
【図３Ｃ】（図３Ｂの説明を参照）
【図３Ｄ】（図３Ｂの説明を参照）
【図４Ａ】本明細書に説明する試験において使用するＧ１２／１３ファミリーのＧタンパク質の活性化をモニタリングするためのＰＤＺＲｈｏＧＥＦ（ＰＤＺＲＧ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物を図示する。ＰＤＺＲｈｏＧＥＦのＧ１２／１３結合ドメイン（配列番号２１の残基２８１〜４８３）を含む断片をＣ末端においてＢＲＥＴドナーＲｌｕｃＩＩでタグ付けしている。リンカーＤ＝ＧＩＲＬＲＥＡＬＫＬＰＡＴ（配列番号２２）。
【図４Ｂ】トロンボキサン受容体（ＴＰαＲ）アゴニストＩ−ＢＯＰ（ＣＡＳ番号：１２８７１９−９０−４）による刺激後の、ＴＰαＲ、ＰＤＺＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸと、Ｇαなし（偽）、５ｎｇのＧα、２０ｎｇのＧαまたは１００ｎｇのＧαのいずれかとを共導入したＨＥＫ２９３細胞内でのＧ１２（図４Ｂ）およびＧ１３（図４Ｃ）のＤＲＣを示す。
【図４Ｃ】（図４Ｂの説明を参照）
【図４Ｄ】ＰＤＺＲＧ−ＲｌｕｃＩＩを使用したＰＭにおけるＧ１２（図４Ｄ）および１３（図４Ｅ）の活性化に及ぼすＴＰαＲリガンドのＤＲＣを示している。トロンボキサン受容体（ＴＰαＲ）、ＰＤＺＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを共導入したＨＥＫ２９３細胞を、既知の完全なアゴニスト（Ｕ４６６１９、Ｉ−ＢＯＰ、ＣＴＡ２）、部分アゴニスト（Ｕ５１６０５）、ならびにアンタゴニストＩ−ＳＡＰおよびＳＱ２９，５５８で刺激した。結果を正規化し、Ｉ−ＢＯＰ応答（ｎ＝４）の％±ＳＥＭとして提示した。
【図４Ｅ】（図４Ｄの説明を参照）
【図４Ｆ】ＰＤＺＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ構築物を使用したアッセイについてのＺ’値を図示するグラフである。ＨＥＫ２９３にＴＰαＲ、ＰＤＺＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸおよびＷＴ  Ｇ１２（図４Ｆ）またはＷＴ  Ｇ１３（図４Ｇ）を共導入し、９６ウェルプレート内に播種し、１００ｎＭのＴＰαＲアゴニストＵ４６６１９（三角）またはビヒクル（酢酸メチル／タイロード、四角）で３７℃で６〜８分間刺激した（三角形）。ＰＤＺＲＧ−ＲｌｕｃＩＩのＰＭへの動員を、ＢＲＥＴ２において査定した。提示したグラフにおいて、ＢＲＥＴ値はウェルごとに表す。
【図４Ｇ】（図４Ｆの説明を参照）
【図５Ａ】本明細書で説明する試験において使用するＧ１２／１３ファミリーのＧタンパク質の活性化をモニタリングするためのＰ１１５ＲｈｏＧＥＦ（Ｐ１１５ＲＧ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物を図示する。Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧ１２／１３結合ドメイン（配列番号２３の残基１〜２４４）を含む断片をＣ末端においてＢＲＥＴドナーＲｌｕｃＩＩでタグ付けしているリンカーＣ＝ＲＬＫＬＰＡＴ（配列番号２４）。
【図５Ｂ】ＰＭにおけるＰ１１５ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩを用いたＧ１２（図５Ｂ）およびＧ１３（図５Ｃ）の活性化に及ぼすＴＰαＲリガンドのＤＲＣを示す。トロンボキサン受容体（ＴＰαＲ）、Ｐ１１５ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを共導入したＨＥＫ２９３細胞を、Ｕ４６６１９、Ｉ−ＢＯＰ、ＣＴＡ２、Ｕ５１６０５、Ｉ−ＳＡＰおよびＳＱ２９，５５８で刺激した。結果を正規化し、Ｉ−ＢＯＰ応答（ｎ＝４）の％±ＳＥＭとして提示した。
【図５Ｃ】（図５Ｂの説明を参照）
【図５Ｄ】ＰＤＺＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ構築物を使用したアッセイについてのＺ’値を図示するグラフである。ＨＥＫ２９３にＴＰαＲ、Ｐ１１５ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸおよびＷＴ  Ｇ１２（図５Ｄ）またはＷＴ  Ｇ１３（図５Ｅ）を共導入し、９６ウェルプレート内に播種し、１００ｎＭのＴＰαＲアゴニストＵ４６６１９（三角）またはビヒクル（酢酸メチル／タイロード、四角）で３７℃で６〜８分間刺激した。Ｐ１１５ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩのＰＭへの動員は、ＢＲＥＴ２で査定した。提示されたグラフにおいて、ＢＲＥＴ値はウェルごとに表す。
【図５Ｅ】（図５Ｄの説明を参照）
【図６Ａ】本明細書に説明する試験において使用するＧｑファミリー（Ｇｑ、Ｇ１１、Ｇ１４、Ｇ１５）のＧタンパク質の活性化をモニタリングするためのＰ６３ＲｈｏＧＥＦ（Ｐ６３ＲＧ）構築物を示している。Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦにおけるＧｑ結合ドメイン（配列番号２５の残基２９５〜５０２）を含む断片をＣ末端においてＢＲＥＴドナーＲｌｕｃＩＩでタグ付けしている。リンカーＥ＝ＡＳＧＳＡＧＴＧＧＲＡＩＤＩＫＬＰＡＴ（配列番号２６）。
【図６Ｂ】ＴＰαＲ、Ｐ６３ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸと、Ｇαなし（偽、内在性Ｇタンパク質から得られた応答）またはＴＰαＲアゴニストＵ４６６１９による刺激後の異なる量のＧαサブユニットのいずれかとを共導入したＨＥＫ２９３細胞におけるＰＭでのＧｑ（図６Ｂ）、Ｇ１１（図６Ｃ）、Ｇ１４（図６Ｄ）およびＧ１５（図６Ｅ）の活性化のＤＲＣを示している。
【図６Ｃ】（図６Ｂの説明を参照）
【図６Ｄ】（図６Ｂの説明を参照）
【図６Ｅ】（図６Ｂの説明を参照）
【図６Ｆ】ＴＰαＲ、Ｐ６３ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＦＹＶＥと、Ｇαなし（偽、内在性Ｇタンパク質から得られた応答）またはＴＰαＲアゴニストＵ４６６１９による刺激後の異なる量のＧαサブユニットのいずれかとを共導入したＨＥＫ２９３細胞における初期エンドソーム（ＥＥ）でのＧｑ（図６Ｆ）、Ｇ１１（図６Ｇ）、Ｇ１４（図６Ｈ）およびＧ１５（図６Ｉ）のＤＲＣを示す。
【図６Ｇ】（図６Ｆの説明を参照）
【図６Ｈ】（図６Ｆの説明を参照）
【図６Ｉ】（図６Ｆの説明を参照）
【図６Ｊ】図６Ｂ〜図６Ｅにおいて決定された最適条件下でのＰ６３ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩを使用したＰＭでのＧｑ（図６Ｊ）、Ｇ１１（図６Ｋ）、Ｇ１４（図６Ｌ）およびＧ１５（図６Ｍ）の活性化に及ぼすＴＰαＲリガンドのＤＲＣを示している。トロンボキサン受容体（ＴＰαＲ）、Ｐ６３ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸを共導入したＨＥＫ２９３細胞を、Ｕ４６６１９、Ｉ−ＢＯＰ、ＣＴＡ２、Ｕ５１６０５、Ｉ−ＳＡＰおよびＳＱ２９，５５８で刺激した。結果を正規化し、Ｉ−ＢＯＰ応答（ｎ＝３〜ｎ＝５）の％±ＳＥＭとして提示した。
【図６Ｋ】（図６Ｊの説明を参照）
【図６Ｌ】（図６Ｊの説明を参照）
【図６Ｍ】（図６Ｊの説明を参照）
【図６Ｎ】図６Ｆ〜図６Ｉにおいて決定された最適条件下でのＰ６３ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩを使用したＥＥでのＧｑ（図６Ｎ）、Ｇ１１（図６Ｏ）、Ｇ１４（図６Ｐ）およびＧ１５（図６Ｑ）の活性化に及ぼすＴＰαＲリガンドのＤＲＣを示している。トロンボキサン受容体（ＴＰαＲ）、Ｐ６３ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＦＹＶＥを共導入したＨＥＫ２９３細胞を、Ｕ４６６１９、Ｉ−ＢＯＰ、ＣＴＡ２、Ｕ５１６０５、Ｉ−ＳＡＰおよびＳＱ２９，５５８で刺激した。結果を正規化し、Ｉ−ＢＯＰ応答（ｎ＝３〜ｎ＝５）の％±ＳＥＭとして提示した。
【図６Ｏ】（図６Ｎの説明を参照）
【図６Ｐ】（図６Ｎの説明を参照）
【図６Ｑ】（図６Ｎの説明を参照）
【図６Ｒ】Ｐ６３ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ構築物を使用したアッセイについてのＺ’値を図示するグラフである。ＨＥＫ２９３にＴＰαＲ、Ｐ６３ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸおよびＷＴ  Ｇｑ（図６Ｒ）またはＷＴ  Ｇ１１（図６Ｓ）を共導入し、９６ウェルプレート内に播種し、１００ｎＭのＴＰαＲアゴニストＵ４６６１９（三角）またはビヒクル（酢酸メチル／タイロード、四角）で３７℃で６〜８分間刺激した。Ｐ６３ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩのＰＭへの動員は、ＢＲＥＴ２において査定した。提示したグラフにおいて、ＢＲＥＴ値はウェルごとに表す。
【図６Ｓ】（図６Ｒの説明を参照）
【図７Ａ】本明細書に説明する試験において使用するＧｑファミリーのＧタンパク質（Ｇｑ、Ｇ１１、Ｇ１４およびＧ１５）の活性化をモニタリングするための２つのＲＧＳ（ＧＲＫ２）構築物を示している。ＧＲＫ２のＧｑ結合ドメイン（ＲＧＳドメイン）（配列番号２７の残基３０〜２０３）を含む断片は、Ｎ末端ＲｌｕｃＩＩ−ＲＧＳ（ＧＲＫ２）またはＣ末端（ＲＧＳ（ＧＲＫ２）−ＲｌｕｃＩＩ）においてＢＲＥＴドナーＲｌｕｃＩＩでタグ付けされている。リンカーＢ’＝ＧＳＡＧＴＧＧＲＡＩＤＩＫＬＡＳＡＴ（配列番号２０）。
【図７Ｂ】ＲｌｕｃＩＩ−ＲＧＳ（ＧＲＫ２）を使用した２つのリガンド／受容体システム、すなわちＡｔ１ＡＲ／ＡＮＧＩＩ（図７Ｂ）およびＴＰαＲ／Ｕ４６６１９（図７Ｃ）におけるＰＭでのＧｑ、Ｇ１１、Ｇ１４およびＧ１５の活性化のＤＲＣを示す。
【図７Ｃ】（図７Ｂの説明を参照）
【図７Ｄ】ＲＧＳ（ＧＲＫ２）−ＲｌｕｃＩＩを使用して、２つのリガンド／受容体システム、すなわちＡｔ１ＡＲ／ＡＮＧＩＩ（図７Ｄ）およびＴＰαＲ／Ｕ４６６１９（図７Ｅ）におけるＰＭでのＧｑ、Ｇ１１、Ｇ１４およびＧ１５の活性化のＤＲＣを示す。
【図７Ｅ】（図７Ｄの説明を参照）
【図７Ｆ】ＲｌｕｃＩＩ−ＲＧＳ（ＧＲＫ２）構築物を使用したアッセイのＺ’値を図示するグラフである。ＨＥＫ２９３にＴＰαＲ、ＲｌｕｃＩＩ−ＲＧＳ（ＧＲＫ２）、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸおよびＷＴ  Ｇｑを共導入し、９６ウェルプレート内に播種し、１００ｎＭのＴＰαＲアゴニストＵ４６６１９（三角）またはビヒクル（酢酸メチル／タイロード、四角）で、３７℃で６〜８分間刺激した。ＲｌｕｃＩＩ−ＲＧＳ（ＧＲＫ２）のＰＭへの動員は、ＢＲＥＴ２において査定した。提示されたグラフにおいて、ＢＲＥＴ値はウェルごとに表す。
【図８Ａ】Ｇタンパク質のＧＥＦ介在性活性化、すなわちＧＰＣＲを介在させないＧタンパク質の活性化をモニタリングする能力について、本明細書に説明する試験において検査した変異型Ｇｉ２およびＧｏＢタンパク質を図示している。Ｇαｉ２Δ５＝配列番号２８、Ｇαｉ２Δ２＝配列番号２９、Ｇαｉ２Ｌ−２Ｇ＝配列番号３１、Ｇαｉ２Ｌ−２Ｐ＝配列番号３３、Ｇαｉ２Ｌ−２Ｒ＝配列番号３４、Ｇαｉ２Ｌ−２Ｄ＝配列番号３２、Ｇαｉ２Ｌ−７Ｇ＝配列番号３０、ＧαｏＢΔ５＝配列番号３６、ＧαｏＢＬ−２Ｇ＝配列番号３５。
【図８Ｂ】Ｇｉ２およびＧｏＢの欠失突然変異体、すなわちＧｉ２Δ２（図８Ｂおよび図８Ｃ）、Ｇｉ２Δ５（図８Ｄおよび図８Ｅ）およびＧｏＢΔ５（図８Ｆおよび図８Ｇ）の活性化のＤＲＣを示している。ＨＥＫ２９３に、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）（図８Ｂ、図８Ｄ、図８Ｆ）またはブラジキニン受容体（ＢＫＢ２Ｒ）（図８Ｃ、図８Ｅ、図８Ｇ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸおよびＷＴまたは変異型Ｇｉ２／ＧｏＢサブユニットのいずれかをコードする構築物を共導入した。
【図８Ｃ】（図８Ｂの説明を参照）
【図８Ｄ】（図８Ｂの説明を参照）
【図８Ｅ】（図８Ｂの説明を参照）
【図８Ｆ】（図８Ｂの説明を参照）
【図８Ｇ】（図８Ｂの説明を参照）
【図８Ｈ】Ｇｉ２およびＧｏＢのＬｅｕからＧｌｙへの突然変異体、すなわちＧｉ２  Ｌ−７Ｇ（図８Ｈおよび図８Ｉ）、Ｇｉ２  Ｌ−２Ｇ（図８Ｊおよび図８Ｋ）およびＧｏＢ  Ｌ−２Ｇの活性化のＤＲＣを示す（図８Ｌおよび図８Ｍ）。ＨＥＫ２９３に、ＥＧＦＲ（図８Ｈ、図８Ｊ、図８Ｌ）またはＢＫＢ２Ｒ（図８Ｉ、図８Ｋ、図８Ｍ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸと、ＷＴまたは変異型Ｇｉ２／ＧｏＢサブユニットとを共導入した。
【図８Ｉ】（図８Ｈの説明を参照）
【図８Ｊ】（図８Ｈの説明を参照）
【図８Ｋ】（図８Ｈの説明を参照）
【図８Ｌ】（図８Ｈの説明を参照）
【図８Ｍ】（図８Ｈの説明を参照）
【図８Ｎ】Ｇｉ２の位置−２突然変異体、すなわちＧｉ２  Ｌ−２Ｄ（図８Ｎおよび図８Ｏ）、Ｇｉ２  Ｌ−２Ｐ（図８Ｐおよび図８Ｑ）およびＧｉ２  Ｌ−２Ｒ（図８Ｒおよび図８Ｓ）の活性化のＤＲＣを示す。ＨＥＫ２９３に、ＥＧＦＲ（図８Ｎ、図８Ｐ、図８Ｒ）またはＢＫＢ２Ｒ（図８Ｏ、図８Ｑ、図８Ｓ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸおよびＷＴまたは変異型Ｇｉ２サブユニットのいずれかをコードする構築物を共導入した。
【図８Ｏ】（図８Ｎの説明を参照）
【図８Ｐ】（図８Ｎの説明を参照）
【図８Ｑ】（図８Ｎの説明を参照）
【図８Ｒ】（図８Ｎの説明を参照）
【図８Ｓ】（図８Ｎの説明を参照）
【図８Ｔ】Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩ構築物を使用して、Ｇタンパク質のＧＥＦ介在性活性化をモニタリングするアッセイについてのＺ’値を図示するグラフである。ＨＥＫ２９３にＥＧＦＲ、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸおよびＷＴ  Ｇｉ２（図８Ｔ）または突然変異体Ｇｉ２  Ｌ−２Ｐ（図８Ｕ）を共導入し、９６ウェルプレート内に播種し、１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（三角）またはビヒクル（タイロード、四角）で室温で２分間刺激した。Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩのＰＭへの動員をＢＲＥＴ２において査定した。提示したグラフにおいて、ＢＲＥＴ値はウェルごとに表す。
【図８Ｕ】（図８Ｔの説明を参照）
【図８Ｖ】Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩの構築物（丸）およびＲＧＳ（ＲＧＳ１７）−ＲｌｕｃＩＩ（三角）を用いてモニタリングする２つのＧＰＣＲ、すなわち図８Ｖのデルタオピオイド受容体（ＤＯＲ）および図８ＷのＤ２Ｒ、ならびにＲＴＫ（ＥＧＦＲ、図８Ｘ）によるＧｉ２活性化のＤＲＣを示している。ＨＥＫ２９３に、受容体（ＤＯＲ、Ｄ２ＲまたはＥＧＦＲ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩまたはＲＧＳ（ＲＧＳ１７）−ＲｌｕｃＩＩ、ｒＧＦＰ−ＣＡＡＸおよびＷＴ  Ｇｉ２をコードする構築物を共導入し、９６ウェルプレート内に播種し、示した用量で室温で、ＧＰＣＲアゴニストを用いて８分間（図８Ｖ、図８Ｗ）またはＥＧＦを用いて７分間（図８Ｘ）刺激した。Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩおよびＲＧＳ（ＲＧＳ１７）−ＲｌｕｃＩＩのＰＭへの動員をＢＲＥＴ２において査定した。提示するＤＲＣは、３つの独立した実験の代表である。
【図８Ｗ】（図８Ｖの説明を参照）
【図８Ｘ】（図８Ｖの説明を参照）
【図９Ａ】本明細書に説明する試験において使用するポリペプチドのアミノ酸配列を示している。
【図９Ｂ】（図９Ａの説明を参照）
【図９Ｃ】（図９Ａの説明を参照）
【図９Ｄ】（図９Ａの説明を参照）
【発明を実施するための形態】
【００７８】
本明細書で使用する遺伝学、分子生物学、生化学、および核酸の用語および記号は、当分野の標準的な学術書および文、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｂｏｏｋｓ，２００５）、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ（Ｓｄ），Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２０１２）、Ｓｔｒａｃｈａｎ  ａｎｄ  Ｒｅａｄ，Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）、Ｇａｉｔ，ｅｄｉｔｏｒ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８４）、およびこれらに類するものの用語および記号に従う。すべての用語は、関連技術において確立された該用語および記号の典型的な意味で理解されるべきである。
【００７９】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法上の対象の１つまたは１つ超（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用する。例として、「要素」は、１つの要素または１つ超の要素を意味する。本明細書全体で、文脈が特に必要としない限り、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、述べられたステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を含むことを意味するが、何らかの他のステップもしくは要素またはステップもしくは要素の群を除外するものではないことが理解されることになる。
【００８０】
本明細書で言及されるＧｅｎｂａｎｋ、ＲｅｆＳｅｑ、ＵｎｉＰｒｏｔ、ＮＣＢＩ、および／またはＥｎｓｅｍｂｌの受入番号（または何らかの他のデータベース）に対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列を含む情報は、参照により本明細書に援用される。
【００８１】
本明細書で説明するすべての方法は、本明細書で特に示さない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実施することができる。
【００８２】
本明細書で提供されるありとあらゆる例、または例示的な言葉（「例えば」、「など」）の使用は、本発明を単により良好に説明することを意図しており、特に主張しない限り、本発明の範囲を限定するものではない。
【００８３】
本明細書では、「約」という用語はその通常の意味を有する。「約」という用語は、値が、値を決定するために採用されるデバイスもしくは方法の誤差の固有の変動を含むこと、または列挙された値に近い値、例えば、列挙された値（または値の範囲）の１０％以内または５％以内の値を包含することを示すために使用する。
【００８４】
本明細書に開示する実施形態および特色のありとあらゆる組み合わせおよび部分的な組み合わせは、本発明に包含される。例えば、本明細書で特定した遺伝子のうちの２、３、４、５またはそれより多数の何らかの組み合わせの発現は、本明細書に説明する方法で使用することができる。
【００８５】
本開示は、Ｇタンパク質ファミリー選択的様式で、異なる細胞区画でのＧタンパク質活性化のモニタリングを可能にするシステムおよびアッセイに関する。これらのシステムとアッセイは、好適なエネルギー（すなわち、ＢＲＥＴ）のドナーおよびアクセプタでタグ付けしたＧタンパク質および細胞区画マーカの特定のエフェクタの使用に基づいている。これらのシステムおよびアッセイは、特定の細胞区画でのＧタンパク質活性化が、特定のＧタンパク質エフェクタの転移を評価のことによってＧタンパク質ファミリー選択的様式で間接的に検出されるので、Ｇタンパク質サブユニット（Ｇα、ＧβまたはＧγ）のうちのいずれかの改変（例えば、ＢＲＥＴドナーもしくはアクセプタまたは他の検出可能な標識によるタグ付け／融合）を有利に必要としない。本明細書に説明するシステムで得られた動的ウィンドウは、Ｇタンパク質活性化を評価する他のシステムで得られた動的ウィンドウよりも高く（例えば、米国特許第９，０２９，０９７号およびＷＯ／２０１６／０５８０９４）、このことは、高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）の応用（部分アゴニストの特定を含む）にとって重要である可能性があり、また、（Ｇタンパク質ファミリーレベルでの）内在性Ｇタンパク質が介在するシグナルの検出も可能にする。特異性は、Ｇｉファミリー（Ｇｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３、ＧｏＡ、ＧｏＢ、Ｇｚ）についてのＲａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメイン、Ｇｑファミリー（Ｇｑ、Ｇ１１、Ｇ１４およびＧ１５）についてのＰ６３ＲｈｏＧＥＦ（Ｐ６３ＲＧ）のＧタンパク質結合ドメイン、およびＧ１２／１３ファミリーについてのＰＤＺＲｈｏＧＥＦまたはＰ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインなど、関心対象のＧタンパク質サブユニット（複数可）に特異的なＧタンパク質エフェクタのＧタンパク質結合ドメインを用いることによって達成される。必要とされるとき、Ｇタンパク質サブユニットレベルでの特異性は、関心対象のＧタンパク質サブユニット（複数可）を試験対象の受容体と共発現させることによって達成することができる。
【００８６】
したがって、一態様において、本開示は、Ｇαタンパク質サブユニットファミリー選択的様式においてＧタンパク質活性化の調節を測定するためのシステムを提供し、該システムは以下を含む：
以下を発現する細胞：
（ｉ）生物発光ドナー分子または蛍光アクセプタ分子でタグ付けされたＧαサブユニット相互作用ポリペプチド（ＧＡＳＩＰ）を含む第１の成分であって、
該Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧｉである場合、該ＧＡＳＩＰが、Ｇｉに特異的に結合するタンパク質のドメインを含み、
該Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧｑである場合、該ＧＡＳＩＰが、Ｇｑに特異的に結合するタンパク質のドメインを含み、
該Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧ１２／１３である場合、該ＧＡＳＩＰが、Ｇ１２／１３に特異的に結合するタンパク質のドメインを含み、
該Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧｓである場合、該ＧＡＳＩＰが、Ｇｓに結合するタンパク質のドメインを含む、第１の成分、および
（ｉｉ）生物発光ドナー分子または蛍光アクセプタ分子でタグ付けされた原形質膜（ＰＭ）標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分を含む第２の成分であって、
該ＧＡＳＩＰが該蛍光アクセプタ分子でタグ付けされている場合、該ＰＭ標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分が、該生物発光ドナー分子でタグ付けされており、該ＧＡＳＩＰが該生物発光ドナー分子でタグ付けされている場合、該ＰＭ標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分が、該蛍光アクセプタ分子でタグ付けされている、第２の成分。
【００８７】
別の態様において、本開示は、Ｇαタンパク質サブユニットファミリー選択的様式でＧタンパク質活性化の調節を測定するためのシステムを提供し、該システムは以下を含む：
以下を発現する細胞：
（ｉ）生物発光ドナー分子または蛍光アクセプタ分子でタグ付けされたＧαサブユニット相互作用ポリペプチド（ＧＡＳＩＰ）を含む第１の成分であって、
該Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧｉである場合、該ＧＡＳＩＰが以下のＧタンパク質結合ドメイン、すなわちＲａｐ１ＧＡＰ、Ｇタンパク質シグナル調節（ＲＧＳ）タンパク質またはＴＮＦＡＩＰ８、好ましくはＲａｐ１ＧＡＰまたはＲＧＳタンパク質のＧタンパク質結合ドメインを含み、
該Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧｑである場合、該ＧＡＳＩＰが、ＲｈｏＧＥＦタンパク質（例えば、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦまたはＴＲＩＯ）、ＧＲＫ２、ＧＲＫ３、ＴＰＲ１（テトラトリコペプチド反復ドメイン１）またはＲＧＳタンパク質（例えば、ＲＧＳ２）のＧタンパク質結合ドメイン、好ましくはＰ６３ＲｈｏＧＥＦまたはＧＲＫ２／ＧＲＫ３のＧタンパク質結合ドメインを含み、
Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧ１２／１３である場合、該ＧＡＳＩＰがＲｈｏＧＥＦタンパク質のＧタンパク質結合ドメイン（ＰＤＺＲｈｏＧＥＦ、Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦまたはＬＡＲＧ）、ＪＮＫ相互作用ロイシンジッパータンパク質（ＪＬＰ）、カドヘリン、Ａｘｉｎ１、ＰＰ２Ａ、ＳＮＡＰ−アルファ、ポリシスチン１、ＲＧＳ１６、ＡＫＡＰ１１０またはＨＡＸ１（ＨＳ１関連タンパク質Ｘ１）、好ましくはＰＤＺＲｈｏＧＥＦまたはＰ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインを含み、
該Ｇαタンパク質サブユニットファミリーがＧＳ（ＧαＳ、ＸＬＧαＳ、Ｇαｏｌｆ）である場合、該ＧＡＳＩＰがＳＮＸ１３（ＲＧＳ−ＰＸ１）、ＡＸＩＮ１またはＴＰＲ１（テトラトリコペプチド反復ドメイン１）のＧタンパク質結合ドメインを含む、第１の成分、ならびに
（ｉｉ）生物発光ドナー分子または蛍光アクセプタ分子でタグ付けされた原形質膜（ＰＭ）標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分を含む第２の成分を含み、
ここで、該ＧＡＳＩＰが該蛍光アクセプタ分子でタグ付けされている場合、該ＰＭ標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分は該生物発光ドナー分子でタグ付けされ、該ＧＡＳＩＰが該生物発光ドナー分子でタグ付けされている場合、該細胞Ｍ標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分は、該蛍光アクセプタ分子でタグ付けされている。
【００８８】
生物発光ドナー分子（またはＢＲＥＴドナー）および蛍光アクセプタ分子（またはＢＲＥＴアクセプタ）は、生物発光ドナー分子の発光スペクトルが蛍光アクセプタ分子の吸収スペクトルと重複するように選択される。このような条件下では、生物発光ドナー分子によって送達される光エネルギーは、蛍光アクセプタ分子を励起することができる波長においてであり、すなわち、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）である。共鳴エネルギー移動（略してＲＥＴ）は、重複する発光／吸収スペクトルを有する２つの発色団間のエネルギー移動を説明する機序である。２つの発色団（「ドナー」および「アクセプタ」）が互いに短い距離（例えば、１０〜１００オングストローム）内にあり、該発色団の遷移双極子が適切に配向しているとき、ドナーの発色団はその励起状態エネルギーをアクセプタ発色団へと非放射性双極子間カップリングを経て移動させることができる。生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）は、ドナー生物発光分子（ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼなどの生物発光酵素）とアクセプタ蛍光分子（例えば、ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）との間のエネルギーの非放射性移動に基づいている。
【００８９】
本明細書で使用する場合、生物発光ドナー分子という用語は、好適な基質に及ぼす作用、または外部源によるそのものの励起のいずれかに続いて発光を生じることができる何らかの分子を指す。本開示で採用することができる多くの異なる生物発光ドナー分子がある。発光システムは、既知であり、細菌、原生動物、腔腸動物、軟体動物、魚、ヤスデ、ハエ、真菌、虫、甲殻類、および甲虫、特にＰｙｒｏｐｈｏｒｕｓ属のコメツキムシ、ならびにＰｈｏｔｉｎｕｓ属、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ属、およびＬｕｃｉｏｌａ属のホタルを含む多くの発光生物から単離されている。生物発光を示すさらなる生物は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／０２４８７８およびＷＯ９９／０４９０１９において列挙されている。実施形態において、生物発光ドナー分子はルシフェラーゼである。ルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質の例は、米国特許第５，２２９，２８５号、第５，２１９，７３７号、第５，８４３，７４６号、第５，１９６，５２４号、および第５，６７０，３５６号に開示されている。最も広く使用されているルシフェラーゼのうちの２つは、（ｉ）Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼおよび（ｉｉ）Ｆｉｒｅｆｌｙルシフェラーゼである。
【００９０】
実施形態において、生物発光ドナー分子はＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（ｒＬｕｃ）である。本明細書で使用するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼという用語は、生物発光で使用する酸化酵素を指し、該酸化酵素は、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＲｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉなどのＲｅｎｉｌｌａ属の生物に由来する。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼには、Ｒｅｎｉｌｌａ生物由来の天然ルシフェラーゼ、またはその変異体、例えば、（アミノ酸配列に関して）天然型のＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）またはＲｌｕｃＩＩ、Ｒｌｕｃ３、緑色ウミシイタケルシフェラーゼもしくはＲｌｕｃ８などが含まれる。「ＲｌｕｃＩＩ」という用語は、以下のアミノ酸置換を含むＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼの突然変異型を指す：天然のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼに対するＡ５５Ｔ、Ｃ１２４Ａ、およびＭ１８５Ｖ。実施形態において、ＲｌｕｃＩＩは図９Ｃに示す配列を含む。「Ｒｌｕｃ８」という用語は、天然Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼと比較して、以下のアミノ酸置換を含むＲｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓルシフェラーゼの突然変異型を指す：Ａ５５Ｔ、Ｃ１２４Ａ、Ｓ１３０Ａ、Ｋ１３６Ｒ、Ａ１４３Ｍ、Ｍ１８５Ｖ、Ｍ２５３Ｌ、およびＳ２８７Ｌ。天然Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉルシフェラーゼのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＧ５４０９４．１に開示されている。
【００９１】
これらの酵素の天然および合成発光基質は、当技術分野で周知であり、市販されている。ルシフェラーゼ基質の例としては、ルシフェリン（例えば、Ｄ−ルシフェリンおよびその塩、Ｌａｔｉａルシフェリン、細菌ルシフェリン、Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅルシフェリンなど）、コエレンテラジン、コエレンテラジンｈ、コエレンテラジンｅ、コエレンテラジンｆ、コエレンテラジンｆｃｐ、コエレンテラジンｃｐ、コエレンテラジンｈｃｐ、コエレンテラジンｉ、コエレンテラジンｉｐ、コエレンテラジンｎ、コエレンテラジン４００ａ（ＤｅｅｐＢｌｕｅＣ（商標））、メトキシｅ−コエレンテラジン（ＮａｎｏＬｉｇｈｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）製Ｐｒｏｌｕｍｅ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ  Ｉ）、メトキシ−コエレンテラジン−メトキシ（ＮａｎｏＬｉｇｈｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）製Ｐｒｏｌｕｍｅ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ  ＩＩ）、メトキシ−コエレンテラジン−Ｆ（ＮａｎｏＬｉｇｈｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）製Ｐｒｏｌｕｍｅ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ  ＩＩＩ）、メトキシ−コエレンテラジン−ヨーダインヨウ素（ＮａｎｏＬｉｇｈｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）製Ｐｒｏｌｕｍｅ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ  ＩＶ）、メトキシ−ｖ−コエレンテラジン−メトキシ（ＮａｎｏＬｉｇｈｔＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）Ｐｒｏｌｕｍｅ（登録商標）Ｐｕｒｐｌｅ  Ｖ）、ＶｉｖｉＲｅｎ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）製）。生物発光ドナー分子の好適な基質は、生物発光タンパク質によって放射される光の所望の波長および／または強度に基づいて、当業者によって選択されることができる。実施形態において、ルシフェラーゼ基質はコエレンテラジンｈ、メトキシｅ−コエレンテラジンまたはコエレンテラジン４００Ａである。
【００９２】
本明細書で使用する場合、蛍光アクセプタ分子という用語は、生物発光ドナー分子の活性の結果として放出されるエネルギーを受け入れ、それを光エネルギーとして再放出することができる何らかの化合物を指す。代表的な蛍光アクセプタタンパク質には、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、緑色蛍光タンパク質の変異体（ＧＦＰ１０など）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、強化型ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、強化型ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＬＳＳ−ｍＯｒａｎｇｅ、ＬＳＳ−ｍＫａｔｅ、エメラルド、トパーズ、ＧＦＰｕｖ、不安定化型ｅｇｆｐ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化型ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化型ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰｌ、ポシロポリン、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ（ｒＧＦＰ）、モンスタＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質またはフィコビリタンパク質、またはこれらのうちのいずれかの１つの生物学的に活性のある変異体もしくは断片が含まれることができるが、それらに限定されない。最も頻繁に使用される生物発光のまたは蛍光体は、クラゲＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来のＧＦＰであり、多くの他の変異体（ＧＦＰ）は、例えば、突然変異誘発技術またはキメラタンパク質技術を得た。ＧＦＰは、ＧＦＰの発色団の特有の成分に基づいて分類され、各クラスは異なる励起波長および発光波長を有する：クラス１、中性フェノールとアニオン性フェノラートとからなる野生型混合物：クラス２、フェノラートアニオン：クラス３、中性フェノール：クラス４、ｓ電子系が積み重なったフェノラートアニオン：クラス５、インドール：クラス６、イミダゾール：およびクラス７、フェニル。
【００９３】
非タンパク質性の蛍光アクセプタ分子の例は、Ａｌｅｘａ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、蛍光色素、Ｂｏｄｉｐｙ  ｄｙｅ（商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｃｙ  ｄｙｅ（商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン（７−ヒドロキシクマリン）、蛍光ミクロスフェア、発光性ナノクリスタル、Ｍａｒｉｎａ  ｂｌｕｅ（商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｃａｓｃａｄｅ  ｂｌｕｅ（商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｃａｓｃａｄｅ  ｙｅｌｌｏｗ（商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｐａｃｉｆｉｃ  ｂｌｕｅ（商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｏｒｅｇｏｎ  ｇｒｅｅｎ（商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、テトラメチルローダミン、ローダミン、Ｔｅｘａｓ  ｒｅｄ（商標）（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、希土類元素キレート、またはこれらの何らかの組み合わせもしくは誘導体である。
【００９４】
他の代表的な蛍光アクセプタ分子には、ｓｇＧＦＰ、ｓｇＢＦＰ、ＢＦＰブルーシフトＧＦＰ（Ｙ６６Ｈ）、シアンＧＦＰ、ＤｓＲｅｄ、モノマーＲＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＣＦＰ、ＧＦＰ（Ｓ６５Ｔ）、ＧＦＰレッドシフト（ｒｓＧＦＰ）、非ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）、ＵＶ励起（ｗｔＧＦＰ）、ＧＦＰｕｖ、ＨｃＲｅｄ、ｒｓＧＦＰ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ  ＧＦＰ、ｓｇＢＦＰ（商標）、ｓｇＢＦＰ（商標）（スーパーグローＢＦＰ）、ｓｇＧＦＰ（商標）、ｓｇＧＦＰ（商標）（スーパーグローＧＦＰ）、イエローＧＦＰ、半導体ナノ粒子（例えば、ラマンナノ粒子）、１，５  ＩＡＥＤＡＮＳ；１，８−ＡＮＳ；４−メチルウンベリフェロン；５−カルボキシ−２，７−ジクロロフルオレセイン；５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）；５−カルボキシシナプトフルオレセイン；５−カルボキシテトラメチルローダミン（５−ＴＡＭＲＡ）；５−ＦＡＭ（５−カルボキシフルオレセイン）；５−ＨＡＴ（ヒドロキシトリプタミン）；５−ヒドロキシトリプタミン（ＨＡＴ）；５−ＲＯＸ（カルボキシ−Ｘ−ローダミン）；５−ＴＡＭＲＡ（５−カルボキシテトラメチルローダミン）；６−カルボキシローダミン６Ｇ；６−ＣＲ  ６Ｇ；６−ＪＯＥ；７−アミノ−４−メチルクマリン；７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）；７−ヒドロキシ−４−メチルクマリン；９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン；ＡＢＱ；アシッドフクシン；ＡＣＭＡ（９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン）；アクリジンオレンジ；アクリジンレッド；アクリジンイエロー；アクリフラビン；アクリフラビンフォイルゲンＳＩＴＳ  Ａ；エクオリン（発光タンパク質）；ＡＦＰ（自己蛍光タンパク質；Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５３２（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０（商標）；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（商標）；アリザリンコンプレクソン（Ａｌｉｚａｒｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘｏｎ）；アリザリンレッド；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；ＡＭＣ、ＡＭＣＡ−Ｓ；ＡＭＣＡ（アミノメチルクマリン）；ＡＭＣＡ−Ｘ；アミノアクチノマイシンＤ；アミノクマリン；アミノメチルクマリン（ＡＭＣＡ）；アニリンブルー；ステアリン酸アントロシル；ＡＰＣ（アロフィコシアニン）；ＡＰＣ−Ｃｙ７；ＡＰＴＲＡ−ＢＴＣ；ＡＰＴＳ；アストラゾンブリリアントレッド４Ｇ；アストラゾンオレンジＲ；アストラゾンレッド６Ｂ；アストラゾンイエロー７  ＧＬＬ；アタブリン；ＡＴＴＯ−ＴＡＧ（商標）ＣＢＱＣＡ；ＡＴＴＯ−ＴＡＧ（商標）ＦＱ；オーラミン；オーロホスフィンＧ；オーロホスフィン；ＢＡＯ９（ビスアミノフェニルオキサジアゾール）；ＢＣＥＣＦ（高ｐＨ）；ＢＣＥＣＦ（低ｐＨ）；硫酸ベルベリン；ベータラクタマーゼ；ビマン；ビスベンズアミド；ビスベンズイミド（ヘキ��ト）；ビス−ＢＴＣ；Ｂｌａｎｃｏｐｈｏｒ  ＦＦＧ；ＢｌａｎｃｏｐｈｏｒＳＶ；ＢＯＢＯ（商標）−ｌ；ＢＯＢＯ（商標）−３；Ｂｏｄｉｐｙ  ４９２／５１５；Ｂｏｄｉｐｙ  ４９３／５０３；Ｂｏｄｉｐｙ  ５００／５１０；Ｂｏｄｉｐｙ  ５０５／５１５；Ｂｏｄｉｐｙ  ５３０／５５０；Ｂｏｄｉｐｙ  ５４２／５６３；Ｂｏｄｉｐｙ  ５５８／５６８；Ｂｏｄｉｐｙ  ５６４／５７０；Ｂｏｄｉｐｙ  ５７６／５８９；Ｂｏｄｉｐｙ  ５８１／５９１；Ｂｏｄｉｐｙ  ６３０／６５０−Ｘ；Ｂｏｄｉｐｙ  ６５０／６６５−Ｘ；Ｂｏｄｉｐｙ  ６６５／６７６；Ｂｏｄｉｐｙ  Ｆｌ；Ｂｏｄｉｐｙ  ＦＬ  ＡＴＰ；Ｂｏｄｉｐｙ  Ｆｌ−セラミド；Ｂｏｄｉｐｙ  Ｒ６Ｇ  ＳＥ；Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＭＲ；Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＭＲ−Ｘ複合体；Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＭＲ−Ｘ，ＳＥ；Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＲ；Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＲ  ＡＴＰ；Ｂｏｄｉｐｙ  ＴＲ−Ｘ  ＳＥ；ＢＯ−ＰＲＯ（商標）−１；ＢＯ−ＰＲＯ（商標）−３；ブリリアントスルフォフラビンＦＦ；ＢＴＣ；ＢＴＣ−５Ｎ；カルセイン；カルセインブルー；カルシウムクリムゾン（商標）；カルシウムグリーン；カルシウムグリーン−１  Ｃａ２＋染料色素；カルシウムグリーン−２  Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−５Ｎ  Ｃａ２＋；カルシウムグリーン−Ｃ１８  Ｃａ２＋；カルシウムオレンジ；カルコフルオールホワイト；カルボキシ−Ｘ−ローダミン（５−ＲＯＸ）；Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ（商標）；カスケードイエロー；カテコールアミン；ＣＣＦ２（ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ）；ＣＦＤＡ；クロロフィル；クロモマイシンＡ；クロモマイシンＡ；ＣＬ−ＮＥＲＦ；ＣＭＦＤＡ；クマリンファロイジン；Ｃ−フィコシアニン；ＣＰＭメチルクマリン；ＣＴＣ；ＣＴＣホルマザン；Ｃｙ２（商標）；Ｃｙ３．１８；Ｃｙ３．５（商標）；Ｃｙ３（商標）；Ｃｙ５．１８；Ｃｙ５．５（商標）；Ｃｙ５（商標）；Ｃｙ７（商標）；環状ＡＭＰ蛍光センサ（ＦｉＣＲｈＲ）；ダブシル；ダンシル；ダンシルアミン；ダンシルカダベリン；塩化ダンシル；ダンシルＤＨＰＥ；フッ化ダンシル；ＤＡＰＩ；ダポキシル；ダポキシル２；ダポキシル３’ＤＣＦＤＡ；ＤＣＦＨ（ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート）；ＤＤＡＯ；ＤＨＲ（ジヒドロローダミン１２３）；ジ−４−ＡＮＥＰＰＳ；ジ−８−ＡＮＥＰＰＳ（比なし）；ＤｉＡ（４−ジ−１６−ＡＳＰ）；ジクロロジヒドロフルオレセインジアセタート（ＤＣＦＨ）；ＤｉＤ−親油性トレーサ；ＤｉＤ（ＤｉｌＣ１８（５））；ＤＩＤＳ；ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）；Ｄｉｌ（ＤｉｌＣ１８（３））；ジニトロフェノール；ＤｉＯ（ＤｉＯＣ１８（３））；ＤｉＲ；ＤｉＲ（ＤｉｌＣ１８（７））；ＤＭ−ＮＥＲＦ（高ｐＨ）；ＤＮＰ；ドーパミン；ＤＴＡＦ；ＤＹ−６３０−ＮＨＳ；ＤＹ−６３５−ＮＨＳ；ＥＬＦ９７；エオシン；エリスロシン；エリスロシンＩＴＣ；臭化エチジウム；エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）；ユークリシン；ＥｕｋｏＬｉｇｈｔ；塩化ユーロピウム（ＩＩＩ）；ＥＹＦＰ；ファーストブルー；ＦＤＡ；Ｆｅｕｌｇｅｎ（パラロサニリン）；ＦＩＦ（Ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）；ＦＩＴＣ；フラゾオレンジ；Ｆｌｕ���−３；Ｆｌｕｏ−４；フルオレセイン（ＦＩＴＣ）；フルオレセインジアセタート；フルオロエメラルド；フルオロゴールド（ヒドロキシスチルバミジン）；Ｆｌｕｏｒ−Ｒｕｂｙ；ＦｌｕｏｒＸ；ＦＭ１−４３（商標）；ＦＭ４−４６；Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ（商標）（高ｐＨ）；Ｆｕｒａ  Ｒｅｄ（商標）／Ｆｌｕｏ−３；Ｆｕｒａ−２；Ｆｕｒａ−２／ＢＣＥＣＦ；ジェナクリルブリリアントレッドＢ；ジェナクリルブリリアントイエロー１０ＧＦ；ジェナクリルピンク３Ｇ；ジェナクリルイエロー５ＧＦ；ＧｅｎｅＢｌａｚｅｒ（ＣＣＦ２）；グロキサリン酸；グラニュラーブルー；ヘマトポルフィリン；ヘキスト３３２５８；ヘキスト３３３４２；ヘキスト３４５８０；ＨＰＴＳ；ヒドロキシクマリン；ヒドロキシスチルバミジン（ＦｌｕｏｒｏＧｏｌｄ）；ヒドロキシトリプタミン；Ｉｎｄｏ−１、高カルシウム；Ｉｎｄｏ−１、低カルシウム；インドジカルボシアニン（ＤｉＤ）；インドトリカルボシアニン（ＤｉＲ）；Ｉｎｔｒａｗｈｉｔｅ  Ｃｆ；ＪＣ−１；ＪＯ−ＪＯ−１；ＪＯ−ＰＲＯ−１；ＬａｓｅｒＰｒｏ；ラウロダン；ＬＤＳ７５１（ＤＮＡ）；ＬＤＳ７５１（ＲＮＡ）；Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＰＡＦ；Ｌｅｕｃｏｐｈｏ  ＳＦ；Ｌｅｕｃｏｐｈｏｒ  ＷＳ；リサミンローダミン；リサミンローダミンＢ；カルセイン／エチジウムホモダイマー；ＬＯＬＯ−１；ＬＯ−ＰＲＯ−１；ルシファーイエロー；リソトラッカーブルー；リソトラッカーブルー−ホワイト；リソトラッカーグリーン；リソトラッカーブルーレッド；リソトラッカーイエロー；ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｂｌｕｅ；ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｇｒｅｅｎ；ＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ  Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ；マググリーン；マグダラレッド（フロキシンＢ）；マグフラレッド；マグフラ−２；マグフラ−５；Ｍａｇ−Ｉｎｄｏ−１；マグネシウムグリーン；マグネシウムオレンジ；マラカイトグリーン；マリーナブルー；マキシロンブリリアントフラビン１０ＧＦＦ；マキシロンブリリアントフラビン８  ＧＦＦ；メロシアニン；メトキシクマリン；Ｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＭ；ミトトラッカーオレンジ；ミトトラッカーレッド；ミトラマイシン；モノブロモビマン；モノブロモビマン（ｍＢＢｒ−ＧＳＨ）；モノクロロビマン；ＭＰＳ（メチルグリーンピロニンスチルベン）；ＮＢＤ；ＮＢＤアミン；ナイルレッド；ニトロベンゾオキサジドール；ノルアドレナリン；ニュークリアファストレッド；ニュークリアイエロー；ナイロンブリリアントラビンＥ８Ｇ；オレゴングリーン；オレゴングリーン４８８−Ｘ；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）４８８；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）５００；Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ（商標）５１４；パシフィックブルー；パラロサニリン（フェルゲン）；ＰＢＦＩ；ＰＥ−Ｃｙ５；ＰＥ−Ｃｙ７；ＰｅｒＣＰ；ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５；ＰＥ−ＴｅｘａｓＲｅｄ［Ｒｅｄ６１３］；フロキシンＢ（マグダラレッド）；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＡＲ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＢＫＬ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  Ｒｅｖ；Ｐｈｏｒｗｉｔｅ  ＲＰＡ；ホスフィン３Ｒ；ＰｈｏｔｏＲｅｓｉｓｔ；フィコエリトリンＢ［ＰＥ］；フィコエリトリンＲ［ＰＥ］；ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）；ＰＫＨ６７；ＰＭＩＡ；ポントクロームブルーブラック；ＰＯＰＯ−１；ＰＯＰＯ−３；ＰＯ−ＰＲＯ−１；ＰＯ−ＰＲＯ−３；プリムリン；プロシオンイエロー；プロピジウムイオディッド（ＰＩ）；ＰｙＭＰＯ；ピレン；ピロニン；ピロニンＢ；パイロザルブリリアントフラビン７ＧＦ；ＱＳＹ７；キナクリンマスタード；レッド６１３［ＰＥ−テキサスレッド］；レゾルフィン；ＲＨ４１４；Ｒｈｏｄ−２；ローダミン；ローダミン１１０；ローダミン１２３；ローダミン５  ＧＬＤ；ローダミン６Ｇ；ローダミンＢ；ローダミンＢ２００；ローダミンＢエキストラ；ローダミンＢＢ；ローダミンＢＧ；ローダミングリーン；ローダミンファリシジン；ローダミンファロイジン；ローダミンレッド；ローダミンＷＴ；ローズベンガル；Ｒ−フィコシアニン；Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）；Ｓ６５Ａ；Ｓ６５Ｃ；Ｓ６５Ｌ；Ｓ６５Ｔ；ＳＢＦＩ；セロトニン；セブロンブリリアントレッド２Ｂ；セブロンブリリアントレッド４Ｇ；セブロンブリリアントレッドＢ；セブロンオレンジ；セブロンイエローＬ；ＳＩＴＳ；ＳＩＴＳ（プリムリン）；ＳＩＴＳ（スチルベンイソチオスルホン酸）；ＳＮＡＦＬカルセイン；ＳＮＡＦＬ−１；ＳＮＡＦＬ−２；ＳＮＡＲＦカルセイン；ＳＮＡＲＦ１；ナトリウムグリーン；ＳｐｅｃｔｒｕｍＡｑｕａ；ＳｐｅｃｔｒｕｍＧｒｅｅｎ；ＳｐｅｃｔｒｕｍＯｒａｎｇｅ；スペクトルレッド；ＳＰＱ（６−メトキシ−Ｎ−（３−スルホプロピル）キノリニウム）；スチルベン；スルフォローダミンＢカンＣ；スルフォローダミンエキストラ；ＳＹＴＯ１１；ＳＹＴＯ１２；ＳＹＴＯ１３；ＳＹＴＯ１４；ＳＹＴＯ１５；ＳＹＴＯ１６；ＳＹＴＯ１７；ＳＹＴＯ１８；ＳＹＴＯ２０；ＳＹＴＯ２１；ＳＹＴＯ２２；ＳＹＴＯ２３；ＳＹＴＯ２４；ＳＹＴＯ２５；ＳＹＴＯ４０；ＳＹＴＯ４１；ＳＹＴＯ４２；ＳＹＴＯ４３；ＳＹＴＯ４４；ＳＹＴＯ４５；ＳＹＴＯ５９；ＳＹＴＯ６０；ＳＹＴＯ６１；ＳＹＴＯ６２；ＳＹＴＯ６３；ＳＹＴＯ６４；ＳＹＴＯ８０；ＳＹＴＯ８１；ＳＹＴＯ８２；ＳＹＴＯ８３；ＳＹＴＯ８４；ＳＹＴＯ８５；ＳＹＴＯＸブルー；ＳＹＴＯＸグリーン；ＳＹＴＯＸオレンジ；テトラサイクリン；テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）；
Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（商標）；Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘ（商標）複合体；チアジアカルボシアニン（ＤｉＳＣ３）；チアジンレッドＲ；チアゾールオレンジ；チオフラビン５；チオフラビンＳ；チオフラビンＴＣＮ；チオライト；チオゾールオレンジ；チノポールＣＢＳ（Ｃａｌｃｏｆｌｕｏｒ  Ｗｈｉｔｅ）；ＴＭＲ；ＴＯ−ＰＲＯ−１；ＴＯ−ＰＲＯ−３；ＴＯ−ＰＲＯ−５；ＴＯＴＯ−１；ＴＯＴＯ−３；ＴｒｉＣｏｌｏｒ（ＰＥ−Ｃｙ５）；ＴＲＩＴＣテトラメチルロダミンイソチオシアナート；トゥルーブルー；ＴｒｕＲｅｄ；ウルトラライト；ウラニンＢ；Ｕｖｉｔｅｘ  ＳＦＣ；ＷＷ７８１；Ｘ−ローダミン；ＸＲＩＴＣ；キシレンオレンジ；Ｙ６６Ｆ；Ｙ６６Ｈ；Ｙ６６Ｗ；ＹＯ−ＰＲＯ−１；ＹＯ−ＰＲＯ−３；ＹＯＹＯ−１；ＹＯＹＯ−３、ＳＹＢＲグリーン、およびチアゾールオレンジ（相互キレート色素）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９５】
実施形態において、蛍光アクセプタ分子は、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ（ｒＧＦＰ）である。「Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ」という用語は、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓまたはＲｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉなど、Ｒｅｎｉｌｌａ属の生物に由来する緑色蛍光タンパク質を指す。これには、Ｒｅｎｉｌｌａ生物由来の天然ＧＦＰまたはその変異体が含まれる。実施形態において、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰは、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓのＧＦＰであり、さらなる実施形態において、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＧＦＰの（アミノ酸配列に関する）天然型である。実施形態において、ｒＧＦＰは、図９Ｄに示す配列を含む。天然Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉ  ＧＦＰのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＡＧ５４０９８．１に開示されている。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼおよび／またはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰの核酸配列は、ヒト細胞内での発現のためにコドンを最適化することができる（すなわち、「ヒト化」であり、例えばＲｅｎｉｌｌａ  ｍｕｌｌｅｒｉ  ＧＦＰのヒト化版についてはＷＯ２００２／０５７４５１を参照されたい）。
【００９６】
ＢＲＥＴに好適な生物発光ドナーと蛍光アクセプタ分子の代表的な組み合わせ（ＢＲＥＴ対という）には、ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）／ＧＦＰ、Ｌｕｃ／Ｖｅｎｕｓ、Ｌｕｃ／Ｔｏｐａｚ、Ｌｕｃ／ＧＦＰ−１０、Ｌｕｃ／ＧＦＰ−２、Ｌｕｃ／ＹＦＰ、Ｌｕｃ／ｒＧＦＰ、およびこれらに類するものが含まれる。別の実施形態において、以下のＢＲＥＴ構成のうちの１つが、本明細書に説明するバイオセンサおよび方法において使用される：ＲｌｕｃＩＩ／ｃｏｅｌ−４００ａ／エンハンスドブルー（ＥＢ）ＦＰ２、ＲｌｕｃＩＩ／ｃｏｅｌ−４００ａ／スーパーシアン蛍光タンパク質（ＳＣＦＰ３Ａ）、ＲｌｕｃＩＩ／ｃｏｅｌ−４００ａ／ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ、ＲｌｕｃＩＩ／ｃｏｅｌ−４００ａ／ｒＧＦＰ、ＲｌｕｃＩＩ／ｃｏｅｌ−４００ａ／ｍＡｍｅｔｒｉｎｅ。
【００９７】
実施形態において、生物発光ドナー分子は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼであり、蛍光アクセプタ分子は、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰである。
【００９８】
実施形態において、第２の成分はＰＭ標的化部分を含む。本明細書で使用する「原形質膜（ＰＭ）標的化部分」という用語は、生物発光ドナーまたは蛍光アクセプタ分子（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰまたはＲｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）をＰＭに動員または隔離することができる何らかの部分を指す。生物発光ドナーまたは蛍光アクセプタ分子はしたがって、原形質膜に認められる何らかのタンパク質（例えば、ＰＭに認められる受容体または何らかの他のタンパク質）またはその断片に融合することができる。このようなタンパク質の例はカベオリン１であり、これは多くの細胞型において認められるカベオラ（原形質膜の小さな（５０〜１００ｎｍ）陥入に対応する脂質ラフトの一種）の主成分である。ＣＡＶ１遺伝子の選択的スプライシングによって生成されたカベオリン１の２つのアイソフォーム、すなわちカベオリン１α（残基２〜１７８を含む）およびカベオリン１β（３２〜１７８配列に相当）が特定されている。このような部分の他の例としては、ミリストイル化、パルミトイル化およびプレニル化などのタンパク質への脂質付加／脂肪酸のアシル化のためのシグナル配列を含むペプチド／ポリペプチドと、多塩基性ドメインとが挙げられる。いくつかのタンパク質（例えば、Ｙｅｓ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ、Ｌｃｋ、Ｈｃｋ、Ｆｇｒ、Ｇαタンパク質、酸化窒素シンターゼ、ＡＤＰ−リボシル化因子（ＡＲＦ）、カルシウム結合タンパク質、およびＭＡＲＣＫＳなどの膜または細胞骨格結合構造タンパク質は、ミリストイル化、パルミトイル化およびプレニル化されることが既知であり（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．Ｍａｒ  ２０１０；３（１）：１９−３５、Ａｌｃａｒｔ−Ｒａｍｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）−Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８０８，Ｉｓｓｕｅ  １２，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  ２０１１，Ｐａｇｅｓ  ２９８１−２９９４を参照されたい）、したがって、これらのタンパク質のいずれかからのミリストイル化、パルミトイル化およびプレニル化（例えば、ゲラニルゲラニル化）シグナル配列は、バイオセンサにおいて使用することができる。実施形態において、ミリストイル化および／またはパルミトイル化配列は、Ｌｙｎキナーゼに由来する。
【００９９】
実施形態において、ＰＭ膜標的化部分は、ＣＡＡＸモチーフを含む（Ｃはシステイン残基であり、ＡＡは２つの脂肪族残基であり、Ｘは何らかのアミノ酸を表す。ＣＡＡＸモチーフは、翻訳後修飾を指示するＣ末端に特定のアミノ酸配列を持つタンパク質の基として定義される「ＣＡＡＸタンパク質」において認められる。ＣＡＡＸタンパク質には、プレラミンＡ、ラミンＢ１およびラミンＢ２などの核ラミン（中間径フィラメント）、Ｒａｓ、ならびにＲａｓ、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、およびＣｄｃ４２などの多数のＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）、いくつかのタンパク質キナーゼならびにホスファターゼなどを含む、広範な種々の分子を包含する（例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＭ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｒｅｓ．２００９；１（３）：３１２−３２５を参照されたい）。Ｃ末端の末端にＣＡＡＸモチーフまたはＣＡＡＸボックスを有するタンパク質は、典型的には、タンパク質が原形質膜または核膜に移動して異なる機能を発揮する前にプレニル化プロセスを必要とする。実施形態において、ＣＡＡＸボックスは、ヒトＲＡＳファミリータンパク質、例えば、ＨＲＡＳ、ＮＲＡＳ、Ｒａｌ−Ａ、ＫＲＡＳ４ＡまたはＫＲＡＳ４ｂに由来する。ＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ４ＡまたはＫＲＡＳ４ｂの最後のＣ末端残基（超可変領域またはＨＶＲという）を以下に示しており、推定最小原形質膜標的化領域は斜字であり、ＣＡＡＸボックスには下線を付している（例えば、Ａｈｅａｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １３：３９−５１，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１２を参照されたい）：ＨＲＡＳ：
【化１】
2020537531.tif 000003
（配列番号４１）、ＮＲＡＳ：
【化２】
2020537531.tif 000004
（配列番号４２）、ＫＲＡＳ４Ａ：
【化３】
2020537531.tif 000005
（配列番号４３）、ＫＲＡＳ４Ｂ：
【化４】
2020537531.tif 000006
（配列番号４４）、Ｒａｌ−Ａ／Ｒａｌ１：
【化５】
2020537531.tif 000007
（配列番号４５）。実施形態において、ＰＭ標的化部分は、アミノ酸配列ＧＣＭＳＣＫＣＶＬＳ（配列番号６０）、ＧＣＭＧＬＰＣＶＶＭ（配列番号６１）、ＣＶＫＩＫＫＣＩＩＭ（配列番号６２）、ＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号６３）、またはＫＮＧＫＫＫＲＫＳＬＡＫＲＩＲＥＲＣＣＩＬ（配列番号４５）を含み、好ましくはＰＭ標的化部分は、ＫＲＡＳ４Ｂからの配列ＧＫＫＫＫＫＫＳＫＴＫＣＶＩＭ（配列番号１）を含む。別の実施形態において、ＰＭ標的化部分は、ＨＲＡＳからの原形質膜標的化パルミトイル化配列と、Ｒａｌ−Ａ／Ｒａｌ１からのプレニル化シグナル配列とを含む（配列：ＣＭＳＣＫＣＣＩＬ、配列番号４）。
【０１００】
いくつかのタンパク質は、Ｒａｓ低分子量ＧＴＰアーゼ、ホスファターゼＰＴＥＮ、非受容体型チロシンキナーゼＳｒｃ、アクチン調節因子ＷＡＳＰおよびＭＡＲＣＫＳ、ならびにＧＲＫ５などのＧタンパク質共役型受容体キナーゼ（ＧＲＫ）など、ＰＭを標的とする非脂質の多塩基性ドメインも含有している。実施形態において、多塩基性ドメインは、ＧＲＫ５に由来し、配列ＳＰＫＫＧＬＬＱＲＬＦＫＲＱＨＱＮＮＳＫＳ（配列番号５）を含む。
【０１０１】
実施形態において、第２の成分は、エンドソーム標的化部分を含む。本明細書で使用する「エンドソーム標的化部分」という用語は、生物発光ドナーまたは蛍光アクセプタ分子をエンドソーム、例えば、初期エンドソームに動員または隔離することができる何らかの部分を指す。いくつかのエンドソーム標的化部分／マーカが当技術分野において既知であり、Ｒａｂファミリーのタンパク質（ＲＡＢ４、ＲＡＢ５、ＲＡＢ７、ＲＡＢ９およびＲＡＢ１１）、マンノース６リン酸受容体（Ｍ６ＰＲ）、カベオリン１および２、トランスフェリンおよびその受容体、クラスリン、ならびに初期エンドソーム自己抗原１（ＥＥＡ１）、ラベノシン５、受容体活性化用Ｓｍａｄアンカー（ＳＡＲＡ）、Ｖｐｓ２７ｐ、およびエンドフィン、などのＦＹＶＥドメインを含むタンパク質が含まれる。いくつかのマーカは、初期エンドソームにより特異的であり（例えば、ＲＡＢ４、トランスフェリンおよびその受容体、ならびにＦＹＶＥドメインを含むタンパク質）、他のものは、後期エンドソームにより特異的であり（例えば、ＲＡＢ７、ＲＡＢ９、およびＭ６ＰＲ）、他のものは再利用エンドソームにより特異的である（例えば、ＲＡＢ１１、ＲＡＢ４）。したがって、これらのタンパク質またはその好適な断片を生物発光ドナー分子（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｌｕｃ）または蛍光アクセプタ分子（例えば、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ）と融合させて、エンドソーム局在に連関／標的化することができる。
【０１０２】
実施形態において、エンドソーム標的化部分は、ＦＹＶＥドメインを含む。ＦＹＶＥドメインは、Ｎ末端のＷｘｘＤモチーフ、中央のＲＲ／ＫＨＨＣＲモチーフ、およびＣ末端のＲＶＣモチーフの３つの保存された要素によって定義される。ＦＹＶＥドメインを含有するヒトタンパク質の例としては、ＡＮＫＦＹ１、ＥＥＡ１  ＦＧＤ１、ＦＧＤ２、ＦＧＤ３、ＦＧＤ４、ＦＧＤ５、ＦＧＤ６、ＦＹＣＯ１、ＨＧＳ  ＭＴＭＲ３、ＭＴＭＲ４、ＰＩＫＦＹＶＥ、ＰＬＥＫＨＦ１、ＰＬＥＫＨＦ２、ＲＵＦＹ１、ＲＵＦＹ２、ＷＤＦ３、ＷＤＦＹ１、ＷＤＦＹ２、ＷＤＦＹ３、ＺＦＹＶＥ１、ＺＦＹＶＥ１６、ＺＦＹＶＥ１９、ＺＦＹＶＥ２０、ＺＦＹＶＥ２１、ＺＦＹＶＥ２６、ＺＦＹＶＥ２７、ＺＦＹＶＥ２８、およびＺＦＹＶＥ９（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ、ＦＹＶＥファミリー（ＰＦ０１３６３））が挙げられる。実施形態において、エンドソーム標的化部分は、ヒトＺＦＹＶＥ１６／エンドフィンのＦＹＶＥドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ７Ｚ３Ｔ８、配列番号３９）、例えば、残基約７４７〜８０５または残基約７３９〜８０６のヒトエンドフィンを含む。
【０１０３】
実施形態において、第２の成分はゴルジ標的化部分を含む。本明細書で使用する「ゴルジ標的化部分」という用語は、生物発光ドナーまたは蛍光アクセプタ分子をゴルジ装置に動員または隔離することができる何らかの部分を指す。いくつかのゴルジ標的化部分／マーカが当技術分野で既知であり、ｅＮＯＳ（例えば、そのＮ末端部分、Ｊ．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５（１９９６），ｐｐ．１３２７７−１３２８１）、ＧＭ１３０、ゴルジン−９７、５８Ｋタンパク質、トランスゴルジネットワーク膜タンパク質２（ＴＧＯＬＮ２）、ＴＧＮ４６、ＴＧＮ３８、マンノシダーゼ２、シンタキシン６、ＧＭ１３０（ＧＯＬＧＡ２）、ゴルジン−１６０、メンブリン（ＧＳ２７）、ＧＳ２８、コートマータンパク質、Ｒｂｅｔ１およびＲＣＡＳ１が含まれる。したがって、これらのタンパク質またはその好適な断片をＲｅｎｉｌｌａ  ＬｕｃまたはＲｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰに融合させて、ゴルジ装置局在化と連関させ／標的化することができる。実施形態において、ゴルジ標的化部分は、ヒトｅＮＯＳタンパク質（配列番号４６）のＮ末端部分、例えば、ヒトｅＮＯＳ１の残基１〜７３である。
【０１０４】
実施形態において、（ｉ）ＰＭ標的化部分、エンドソーム標的化部分またはゴルジ標的化部分と（ｉｉ）ＧＡＳＩＰとの間に直接的なタンパク質間相互作用はない。
【０１０５】
生物発光ドナーまたは蛍光アクセプタ分子は、標的化部分に対してＮ末端、内部またはＣ末端に融合していてもよい。実施形態において、ＰＭ標的化部分は、該生物発光ドナーまたは蛍光アクセプタ分子のＣ末端に融合している。実施形態において、ＰＭ標的化部分は、蛍光受容体分子、好ましくは蛍光アクセプタ分子のＣ末端に融合している。実施形態において、エンドソーム標的化部分は、該生物発光ドナーまたは蛍光アクセプタ分子のＣ末端に融合しており、さらなる実施形態においては、該蛍光アクセプタ分子のＣ末端に融合している。
【０１０６】
生物発光ドナーまたは蛍光アクセプタ分子は、ＧＡＳＩＰに対してＮ末端、内部、またはＣ末端に融合していてもよい。実施形態において、生物発光ドナーまたは蛍光アクセプタ分子は、ＧＡＳＩＰのＮ末端に融合している。別の実施形態において、生物発光ドナーまたは蛍光アクセプタ分子は、ＧＡＳＩＰのＣ末端に融合している。さらなる態様において、生物発光ドナー分子はＧＡＳＩＰ、好ましくはＧＡＳＩＰのＣ末端に融合している。
【０１０７】
「Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメイン」という用語は、ＧｉファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を有する、Ｒａｐ１  ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質１（Ｒａｐ１ＧＡＰ）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ４７７３６、配列番号４７）のドメインを含むポリペプチド、またはその変異体を指す。Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインは、Ｒａｐ１ＧＡＰのＮ末端部分に位置し、例えば、天然のＲａｐ１ＧＡＰから少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００残基を含む。Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインは、Ｇαサブユニットタンパク質への結合を無効にしない１つ以上の突然変異を含むことができる。実施形態において、Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインは、天然Ｒａｐ１ＧＡＰの残基１〜４２０もしくは１〜４３６、またはＧｉファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体を含む。別の実施形態において、Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインは、残基１〜４４２、またはＧｉファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体を含む。実施形態において、Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインは、生物発光ドナー分子のＮ末端に融合している。
【０１０８】
別の実施形態において、Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインは、キナーゼ活性化（例えば、タンパク質キナーゼＡ）などの下流シグナル伝達事象に対する感受性を低減させる突然変異を含む。キナーゼ活性化などの下流シグナル伝達事象に対する感度のこのような低減は、例えば、推定リン酸化部位のうちの１つ以上の突然変異（複数可）（例えば、欠失、置換）、例えば、天然Ｒａｐ１ＧＡＰの位置４３１、４３７、４３９および／または４４１のセリン残基の導入によって達成され得る。さらなる実施形態において、位置４３７、４３９および／または４４１のセリン残基のうちの１つ以上が、Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインにおいて変異しており、好ましくは位置４３７、４３９および／または４４１のセリン残基の少なくとも２つがＲａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインにおいて変異しており、より好ましくは位置４３７、４３９および４４１の３つのセリン残基すべてが変異している。さらなる実施形態において、突然変異は、例えば、アラニン残基などの、リン酸化されることができないアミノ酸による置換である。実施形態において、位置４３７、４３９、および４４１の３つのセリン残基はすべて、Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメイン内のアラニンによって置換されている。実施形態において、Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインは、図９Ａおよび図９Ｂに示す配列のうちの１つを含む。
【０１０９】
本明細書で使用する「Ｇタンパク質シグナル伝達調節因子（ＲＧＳ）タンパク質のＧタンパク質結合ドメイン」という用語は、ＲＧＳタンパク質、またはＧｉファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を有するその変異体のドメイン、を含むポリペプチドを指す。ＲＧＳタンパク質は、ＲＧＳボックスまたはＲＧＳドメイン（ＰＲＯＳＩＴＥ登録ＰＳ５０１３２）を含む２２のタンパク質（ＲＧＳ１〜ＲＧＳ２２）からなるファミリーである。ＲＧＳタンパク質のＧタンパク質結合ドメインは、ＲＧＳタンパク質からの少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０もしくは４００残基、またはＧｉファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体を含むことができる。実施形態において、ＧＡＳＩＰは、ＲＺ／ＡサブファミリーのＲＧＳタンパク質のＧタンパク質結合ドメイン、好ましくはＲＧＳ１７（ＲＧＳＺ２、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９ＵＧＣ６、配列番号１７）、ＲＧＳ１９（ＧＡＩＰ、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ４９７９５、配列番号１８）もしくはＲＧＳ２０（ＲＧＳＺ１、ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｏ７６０８１、配列番号１９）、またはＧｉファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を有するその変異体を含む。実施形態において、ＲＧＳ１７のＧタンパク質結合ドメインは、天然ＲＧＳ１７の残基８４〜２００またはＧｉファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を有するその変異体を含む。実施形態において、ＲＧＳ１７のＧタンパク質結合ドメインは、天然ＲＧＳ１７の残基６４〜２１０またはＧｉファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を有するその変異体を含む。実施形態において、ＲＧＳ１９のＧタンパク質結合ドメインは、天然ＲＧＳ１９の残基９０〜２０６またはＧｉファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を有するその変異体を含む。実施形態において、ＲＧＳ１９のＧタンパク質結合ドメインは、天然ＲＧＳ１９またはＧｉファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を有するその変異体の残基７０〜２１７を含む。実施形態において、ＲＧＳ２０のＧタンパク質結合ドメインは、天然ＲＧＳ２０の残基２６２〜３７８またはＧｉファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を有するその変異体を含む。実施形態において、ＲＧＳ２０のＧタンパク質結合ドメインは、天然ＲＧＳ２０の残基２４２〜３８８またはＧｉファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を有するその変異体を含む。実施形態において、ＲＧＳタンパク質のＧタンパク質結合ドメインは、生物発光ドナー分子のＮ末端に融合している。
【０１１０】
本明細書に説明するシステム／方法において使用することができるＧｉファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合するドメインを含む別のタンパク質は、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦα）誘導タンパク質８（ＴＮＦＡＩＰ８、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｏ９５３７９、配列番号４８）である。
【０１１１】
「Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメイン」という用語は、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦ（Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子２５）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ８６ＶＷ２、配列番号２５）のドメインを含むポリペプチド、またはＧｑファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を有するその変異体を指す。Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦのＣ末端部分に位置し、例えば、天然Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦまたはＧｑファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体からの少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００残基を含む。Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、Ｇαサブユニットタンパク質への結合を無効にしない１つ以上の突然変異を含むことができる。実施形態において、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、天然Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦの残基３４８〜４６６、またはＧｑファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体を含む。別の実施形態において、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、天然Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦの残基２９５〜５０２、またはＧｑファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体を含む。実施形態において、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、生物発光ドナー分子のＮ末端に融合している。
【０１１２】
「ＧＲＫ２のＧタンパク質結合ドメイン」という用語は、ＧＲＫ２（ベータアドレナリン受容体キナーゼ１）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｐ２５０９８、配列番号２７）のドメインを含むポリペプチド、またはＧｑファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を有するその変異体を指す。ＧＲＫ２のＧタンパク質結合ドメインは、ＧＲＫ２のＮ末端部分に位置し、例えば、天然ＧＲＫ２またはＧｑファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体からの少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００残基を含む。ＧＲＫ２のＧタンパク質結合ドメインは、Ｇαサブユニットタンパク質への結合を無効にしない１つ以上の突然変異を含むことができる。実施形態において、ＧＲＫ２のＧタンパク質結合ドメインは、天然ＧＲＫ２の残基５４〜１７５、またはＧｑファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体を含む。別の実施形態において、ＧＲＫ２のＧタンパク質結合ドメインは、天然ＧＲＫ２の残基３０〜２０３、またはＧｑファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体を含む。実施形態において、ＧＲＫ２のＧタンパク質結合ドメインは、生物発光ドナー分子のＣ末端に融合している。
【０１１３】
本明細書に説明するシステム／方法において使用することができるＧｑファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合するドメインを含む他のタンパク質には、ＧＲＫ３（例えば、残基約５４〜１７５）、ＰＬＣβタンパク質、ＲＧＳタンパク質（例えば、ＲＧＳ２、残基約８３〜１９９）、ＴＲＰ１および他のＲｈｏＧＥＦタンパク質（例えば、三重機能ドメインタンパク質、ＴＲＩＯ）が含まれる。先に定義したＧｑファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するこれらのドメインまたはその変異体を含むポリペプチドは、本明細書に説明するシステム／方法において使用することができる。
【０１１４】
「ＰＤＺＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメイン」という用語は、ＰＤＺＲｈｏＧＥＦ（Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子１１）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｏ１５０８５、配列番号２１）のドメインを含むポリペプチドまたはＧ１２／１３ファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を有するその変異体を指す。ＰＤＺＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、ＰＤＺＲｈｏＧＥＦの中央部に位置し、例えば、天然ＰＤＺＲｈｏＧＥＦから少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０もしくは４００残基、またはＧ１２／１３ファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体を指す。ＰＤＺＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、Ｇαサブユニットタンパク質への結合を無効にしない１つ以上の突然変異を含むことができる。実施形態において、ＰＤＺＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、天然ＰＤＺＲｈｏＧＥＦの残基３０６〜４８６、またはＧ１２／１３ファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体を含む。別の実施形態において、ＰＤＺＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、天然ＰＤＺＲｈｏＧＥＦの残基２８１〜４８３、またはＧ１２／１３ファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体を含む。実施形態において、ＰＤＺＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、生物発光ドナー分子のＮ末端に融合している。
【０１１５】
「Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメイン」という用語は、Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦ（Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子１）タンパク質（ＵｎｉＰｒｏｔ受入番号Ｑ９２８８８、配列番号２３）のドメインを含むポリペプチド、またはＧ１２／１３ファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を有するその変異体を指す。Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦのＮ末端部分に位置し、例えば、天然Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦまたはＧ１２／１３ファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体から少なくとも５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０または４００残基を含む。Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、Ｇαサブユニットタンパク質への結合を無効にしない１つ以上の突然変異を含む場合がある。実施形態において、Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、天然Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦの残基４１〜２３２、またはＧ１２／１３ファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体を含む。別の実施形態において、Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、天然のＰ１１５ＲｈｏＧＥＦの残基１〜２４４、またはＧ１２／１３ファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するその変異体を含む。実施形態において、Ｐ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインは、生物発光ドナー分子のＮ末端に融合している。
【０１１６】
本明細書に説明するシステム／方法において使用することができる、Ｇ１２／１３ファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合するドメインを含む他のタンパク質には、Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子１２（ＬＡＲＧ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｑ９ＮＺＮ５、配列番号４９）（例えば、残基約３６７〜５５８）、ＪＮＫ相互作用ロイシンジッパータンパク質（ＪＬＰ、Ｃ末端部分）カドヘリンタンパク質、ＡＸＩＮ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｏ１５１６９、配列番号５０、残基約８８〜２１２、Ｇ１２に対してより選択的）、ＰＰ２Ａ（Ｇ１２に対してより選択的）、アルファ可溶性ＮＳＦ付着タンパク質（ａｌｐｈａＳＮＡＰ、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ５４９２０、配列番号５１、Ｎ末端部分、Ｇ１２に対してより選択的）、ポリシスチン１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｐ９８１６１、配列番号５２、Ｇ１２に対してより選択的）、ＲＧＳ１６（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｏ１５４９２、配列番号５３、Ｎ末端部分、Ｇ１３に対してより選択的）、ＡＫＡＰ１１０（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｏ７５９６９、配列番号５４、Ｃ末端部分、Ｇ１３に対してより選択的）、ＨＳ１関連タンパク質Ｘ１（ＨＡＸ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｏ００１６５、配列番号５５、残基約１７６〜２４７、Ｇ１３に対してより選択的）。先に定義したＧ１２／１３ファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合する能力を保持するこれらのドメインまたはその変異体を含むポリペプチドは、本明細書に説明するシステム／方法において使用することができる。サブユニット（Ｇ１２またはＧ１３）のうちの１つに対してより選択的なドメインを使用することは、内在性のＧ１２またはＧ１３タンパク質の選択的活性化を評価するのに有用であり得る。
【０１１７】
ＧｓファミリーのＧαサブユニットタンパク質（複数可）に結合するドメインには、ＳＮＸ１３（ＲＧＳ−ＰＸ１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｑ９Ｙ５Ｗ８、配列番号５６、残基約３７３〜４９６）、ＡＸＩＮ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｏ１５１６９、配列番号５０、残基約８８〜２１１）またはＴＰＲ１（テトラトリコペプチド反復ドメイン１、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ受入番号Ｑ９９６１４、配列番号５７、Ｃ末端部分）。実施形態において、ＧｓファミリーのＧαサブユニットタンパク質は、膜に固定されたＸＬ（アルファ）サブユニットである。
【０１１８】
実施形態において、ＧＡＳＩＰの長さは、約５０、７５または１００アミノ酸から約５００、６００、７００または８００アミノ酸、例えば、約１００または１５０アミノ酸から約２００、２５０、３００、３５０、４００または５００アミノ酸である。
【０１１９】
実施形態において、ＧＡＳＩＰは、Ｒａｐ１ＧＡＰの完全長配列、ＲＧＳタンパク質（例えば、ＲＧＳ１７、１９または２０）、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦ、ＧＲＫ２、ＰＤＺＲｈｏＧＥＦまたはＰ１１５ＲｈｏＧＥＦを含まず、すなわち、ＧＡＳＩＰは、１つ以上の突然変異（置換、欠失など）を含む。実施形態において、ＧＡＳＩＰでは、ＰＭへの動員または固定に関与する残基またはドメイン、例えば、ミリストイル化、パルミトイル化および／またはプレニル化シグナル配列が欠如している。これらのタンパク質の切断型および／または変異型を使用すると、下流のシグナル伝達事象（例えば、キナーゼ活性化）の影響を最小限にし、および／またはＧタンパク質活性化の際にＧＡＳＩＰが異なる区画に適切に局在する（サイトゾル）および転移することを確保することができ、このことは、アッセイの信頼性および／または感度を改善する。
【０１２０】
実施形態において、本明細書に説明するシステムは、組換えＧαタンパク質サブユニットをさらに含む。本明細書で定義するＧαタンパク質サブユニットには、１７の異なる既知のアイソフォーム、これらのスプライシング変異体、および何らかの変異型Ｇαタンパク質、例えば、非選択的／無差別Ｇαをもたらすものが含まれるが、それらに限定されない。１つの非限定的な実施形態において、本明細書に説明するＧαタンパク質は、Ｇｑ、Ｇｓ、Ｇｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３、Ｇｔコーン、Ｇｔロッド、Ｇｔガスト、Ｇｚ、ＧｏＡ、ＧｏＢ、Ｇｏｌｆ、Ｇ１１、Ｇ１２、Ｇ１３、Ｇ１４、およびＧ１５／Ｇ１６（ＧＮＡ１５とも表記される）、これらのアイソフォームのスプライシング変異体、ならびにそれらの機能的変異体を含む天然の哺乳動物Ｇαタンパク質のうちのいずれかから選択される。実施形態において、組換えＧαタンパク質サブユニットは、Ｇｉファミリーのものであり、例えば、Ｇｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３、ＧｏＡ、ＧｏＢ、Ｇｔコーン、Ｇｔロッド、Ｇｇｕｓ、および／またはＧｚである。実施形態において、Ｇαタンパク質サブユニットは、Ｇｑファミリーのものであり、例えば、Ｇｑ、Ｇ１１、Ｇ１４および／またはＧ１５／１６）である。実施形態において、Ｇαタンパク質サブユニットは、Ｇ１２／１３ファミリーのものである。
【０１２１】
実施形態において、組換えＧαサブユニットポリペプチドは、ＧＰＣＲによる活性化を低下させるかまたは無効にする少なくとも１つの突然変異を含む。このような変異型Ｇαサブユニットポリペプチドは、非受容体グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）介在型Ｇタンパク質活性化、すなわち、ＧＰＣＲの関与を経て誘導されないＧタンパク質活性化を評価するのに有用であり得る。実施形態において、突然変異は、カルボキシ（Ｃ）末端ドメインにあり、好ましくは、該ＧαサブユニットポリペプチドのＣ末端にある最後の７残基のうちの１つ以上における突然変異である。実施形態において、突然変異は、Ｃ末端の最後の１、２、３、４、５、６または７残基の切断である。別の実施形態において、突然変異は、Ｃ末端の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはすべての残基の置換である。実施形態において、突然変異は、該Ｃ末端ドメインにおける保存されたロイシン残基のうちの少なくとも１つの欠失または置換、好ましくは該Ｃ末端ドメインにおける最後の保存されたロイシン残基（天然タンパク質の最後から２番目の残基）の欠失または置換である。さらなる実施形態において、突然変異は、最後に保存されたロイシン残基の置換、好ましくはアスパラギン酸（Ｄ）残基、プロリン（Ｐ）残基またはアルギニン（Ｒ）残基の置換である。実施形態において、変異型組換えＧαサブユニットポリペプチドは、Ｇｉファミリーのものであり、例えば、Ｇｉ２またはＧｏＢである。さらなる実施形態において、変異型組換えＧαサブユニットポリペプチドは、図９Ｂおよび図９Ｃに示す配列のうちの１つ、例えば、Ｇαｉ２Δ５（配列番号２８）、Ｇαｉ２Δ２（配列番号２９）、Ｇαｉ２Ｌ−２Ｇ（配列番号３１）、Ｇαｉ２Ｌ−２Ｐ（配列番号３３）、Ｇαｉ２Ｌ−２Ｒ（配列番号３４）、Ｇαｉ２Ｌ−２Ｄ（配列番号３２）、Ｇαｉ２Ｌ−７Ｇ（配列番号３０）、ＧαｏＢΔ５（配列番号３６）、またはＧαｏＢＬ−２Ｇ（配列番号３５）を含む。
【０１２２】
本明細書で使用する「組換え体」という用語は、組換え核酸分子、すなわち分子生物学／遺伝子工学の技術によって調製された核酸から発現するタンパク質分子、例えば、細胞（またはその継代）に、タンパク質（細胞によって天然に発現するタンパク質とは対照的）をコードする核酸（例えば、ベクター内に存在）を導入／形質導入した後に発現するタンパク質を指す。
【０１２３】
実施形態において、本明細書に説明するシステムは、細胞表面受容体をさらに含む。バイオセンサの細胞は、細胞表面受容体を天然に発現することができ、または細胞表面受容体は、組換え細胞表面受容体であってもよい（例えば、細胞は、細胞表面受容体をコードする核酸をすでに導入または形質転換されている）。本明細書で使用する「細胞表面受容体」という用語は、原形質膜に付着または埋没したタンパク質を指し、リガンドの結合の際にＧタンパク質の活性化を誘導する。Ｇタンパク質活性化を誘導する細胞表面受容体の例としては、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）、インテグリンが挙げられる。Ｇタンパク質の活性化は典型的には、リガンドによるＧＰＣＲの関与を経て生じるが、Ｇタンパク質の活性化はまた、ＧＩＶ（Ｇα相互作用小胞関連タンパク質、Ｇｉｒｄｉｎとしても知られる）、ＮＵＣＢ１（ヌクレオビンジン１、ｃａｌｎｕｃとしても知られる）、ＮＵＣＢ２およびＤＡＰＬＥ（振り乱し関連タンパク質（Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ−ａｓｓｏｃｉａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ））などの非受容体グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）を介して達成することができる。例えば、ＧＩＶ活性は、ＲＴＫ（例えば、ＥＧＦＲ）およびＧｉ活性のインテグリンα−β複合体調節と関係している。実施形態において、ＧＡＳＩＰは、Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインを含み、細胞表面受容体はＧＰＣＲまたはＲＴＫである。別の実施形態において、ＧＡＳＩＰは、ＲＧＳタンパク質、好ましくはＲＧＳ１７のＧタンパク質結合ドメインを含み、細胞表面受容体はＧＰＣＲである。
【０１２４】
「ＧＰＣＲ」とは、完全長の天然ＧＰＣＲ分子および突然変異型ＧＰＣＲ分子を指す。ＧＰＣＲのリストは、参照により本明細書に援用されるＦｏｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｒｅｖ．５７，２７９−２８８において付与されており、ＧＰＣＲの更新されたリストは、ＩＵＰＨＡＲ−ＤＢデータベースにおいて入手可能である（Ｈａｒｍａｒ  ＡＪ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）ＩＵＰＨＡＲ−ＤＢ：ｔｈｅ  ＩＵＰＨＡＲ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｉｏｎ  ｃｈａｎｎｅｌｓ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．７（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ６８０−Ｄ６８５、Ｓｈａｒｍａｎ  ＪＬ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１３）ＩＵＰＨＡＲ−ＤＢ：ｕｐｄａｔｅｄ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｆｅａｔｕｒｅｓ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４１（Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ）：Ｄ１０８３−８）。
【０１２５】
「ＲＴＫ」とは、完全長の天然ＲＴＫタンパク質および突然変異型ＲＴＫタンパク質を指す。ＲＴＫ（ＩＵＢＭＢ酵素命名法によるＥＣ２．７．１０．１）は、多くのポリペプチド成長因子、サイトカイン、およびホルモンのための細胞表面受容体であり、これらの受容体のキナーゼ活性の原因となる触媒ドメインを含む細胞内領域を特徴とし、受容体の自己リン酸化およびＲＴＫ基質のチロシンリン酸化を触媒する。ヒトには５８の既知のＲＴＫがあり、２０のサブファミリーに分布している（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０００，１９（４９）：５５４８−５７）。
【０１２６】
「インテグリン」とは、完全長の天然インテグリンタンパク質および突然変異インテグリンタンパク質を指す。インテグリンは、αおよびβと呼ばれる２つの非共有結合性膜貫通糖タンパク質サブユニットで構成されている。種々のヒトインテグリンヘテロダイマーは、９種類のβサブユニットと２４種類のαサブユニットから形成されている。脊椎動物において認められている代表的なインテグリンは、α１β１、α２β１、α３β１、α４β１、α５β１、α６β１、α７β１、αＬβ２、αＭβ２、αＩＩｂβ３、αＶβ１、αＶβ３、αＶβ５、αＶβ６、αＶβ８、およびα６β４が含まれる。
【０１２７】
本明細書で使用する「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」（または「突然変異体（ｍｕｔａｎｔ）」）という用語は、参照（例えば、天然）配列と少なくとも６０％の配列同一性を有している、その所望の活性、例えば、Ｇαサブユニットに結合するか、ＢＲＥＴのドナーもしくはアクセプタとして作用する能力を保持するタンパク質／ポリペプチドを指す。さらなる実施形態において、変異体は、参照（例えば、天然）配列と少なくとも６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％の類似性または同一性を有し、その所望の活性を保持する。「類似性」および「同一性」とは、２つのポリペプチド分子間の配列の類似性／同一性を指す。類似性または同一性は、整列した配列における各位置を比較することによって決定することができる。アミノ酸配列間の類似性または同一性の程度は、配列が共有する位置での一致するまたは同一のアミノ酸の数の関数である。類似性または同一性の比較のための配列の最適な整列は、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ  ２：４８２の局所相同性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性整列アルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似性方法についての検索、およびこれらのアルゴリズムの計算機実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡなど）などの種々のアルゴリズムを用いて行うことができる。配列の類似性または同一性は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（公表されているデフォルト設定を使用）に説明されているＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して決定することもできる。ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを経て入手することができる。
【０１２８】
複数の実施形態において、本明細書に説明する成分（融合分子）のドメインは、直接（例えば、ペプチド結合を経て）、または好適なリンカー部分、例えば、１つ以上のアミノ酸もしくは別の種類の化学リンカー（例えば、炭水化物リンカー、脂質リンカー、脂肪酸リンカー、ポリエーテルリンカー、ＰＥＧなどを介して「間接的に」共有結合することができる。実施形態において、１つ以上の追加のドメイン（複数可）は、先に定義したドメインの前（Ｎ末端）、間にまたは後に（Ｃ末端）挿入することができる。実施形態において、融合分子のドメインは、ペプチド結合を経て共有結合している。別の実施形態において、融合分子の成分の１つ以上は、ペプチドリンカーを経て連関している。一実施形態において、リンカーは、典型的には長さ２から３０のアミノ酸、例えば、約５から約２０〜２５のアミノ酸または約１０から約１５〜２０のアミノ酸の範囲のペプチドリンカーである。各リンカーの組成および長さは、可撓性および水溶性などの種々の特性に応じて選択することができる。例えば、ペプチドリンカーは、グリシンを含むがこれに限定されない比較的小さなアミノ酸残基を含んでもよい。小さなアミノ酸残基は、立体的な体積を減らし、ペプチドリンカーの柔軟性を高め得る。ペプチドリンカーは、セリンを含むがこれに限定されない極性アミノ酸も含み得る。極性アミノ酸残基は、ペプチドリンカーの水溶性を高め得る。さらに、Ｇｌｏｂｐｌｏｔ  ２．３（Ｌｉｎｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＧｌｏｂＰｌｏｔ：ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｇｌｏｂｕｌａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  ２００３−Ｖｏｌ．３１，Ｎｏ．１３，３７０１−８）などのプログラムは、無秩序と球状性、したがってまた可撓性の程度を決定するのを助けるために使用することができる。実施形態において、ペプチドリンカーは、以下の実施例および／または図面において開示するアミノ酸配列（配列番号６、７、２０、２２、２４および２６）のうちの１つ以上を含む。
【０１２９】
実施形態において、本システムは、本明細書で定義する種々の成分、すなわち第１および第２の成分、ならびに場合により組換えＧαタンパク質サブユニットおよび／または細胞表面受容体を発現する細胞をさらに含む。
【０１３０】
別の態様において、本開示は、本明細書で定義する先に定義の第１および／または第２の成分（複数可）をコードする１つのまたは複数の核酸を提供する。実施形態において、核酸（複数可）は、ベクター／プラスミド（または複数のベクター／プラスミド）内に、さらなる実施形態において、発現ベクター（複数可）／プラスミド（複数可）内に存在する。このようなベクターは、プロモータ、エンハンサおよび／または他の調節配列などの１つ以上の転写調節配列（複数可）に実施可能に連結した先に定義の第１および／または第２の成分（複数可）をコードする核酸（複数可）を含む。実施形態において、核酸は、第１および第２の成分をコードする（ポリシストロン性構築物）。
【０１３１】
「ベクター」という用語は、該ベクターに連結した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。好ましいベクターのうちの１つの種類は、エピソーム、すなわち染色体外複製が可能な核酸である。好ましいベクターは、該ベクターが連結している核酸の自律複製および／または自律発現が可能なものである。実施可能に連結された遺伝子の発現を指示することができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。本発明の組換え発現ベクターは、当業者に既知の、例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．において認められる標準的な技術によって構築することができる。ＤＮＡの断片をライゲートするための種々の戦略が利用可能であり、その選択はＤＮＡ断片の末端の性質に依存し、当業者によって容易に判断されることができる。本発明のベクターは、細菌および宿主細胞におけるベクターの増殖および選択を促進するための他の配列要素も含有することができる。さらに、本発明のベクターは、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位のためのヌクレオチド配列を含むことができる。選択可能なマーカおよびレポーター遺伝子などのコード配列は、当業者に周知である。
【０１３２】
本明細書で定義する核酸のうちの１つ以上を含む組換え発現ベクターは、定義された組換え発現ベクターからタンパク質コード領域を発現することができる生細胞を含み得る細胞（宿主細胞）内に導入されることができる。生細胞は、培養細胞および生きている生物内の細胞の両方を含むことができる。したがって、本発明はまた、本発明の組換え発現ベクターを含有する宿主細胞を提供する。「細胞」、「宿主細胞」、および「組換え宿主細胞」という用語は、本明細書で相互交換可能に使用される。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫も指す。突然変異または環境の影響により、ある特定の修飾が後続の世代において生じる可能性があるので、このような子孫は実際には親細胞と同一ではないことがあるが、本明細書で使用する用語の範囲内になおも含まれている。
【０１３３】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換または導入技術を介して細胞内に導入することができる。「形質転換」および「導入」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムによる共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在性導入、リポフェクション、電気穿孔法、マイクロインジェクションおよびウイルス介在性導入を含む、外来核酸を宿主細胞内に導入するための技術を指す。宿主細胞を形質転換または導入するのに好適な方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））、および他の実験マニュアルにおいて見出され得る。「転写調節配列／要素」は、開始シグナルおよび終結シグナル、エンハンサ、ならびにプロモータなどのＤＮＡ配列、スプライシングシグナル、実施可能に連結されたタンパク質コード配列の転写を誘導または制御するポリアデニル化シグナルを指す総称である。第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関連性にあるとき、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と「実施可能に連結されて」いる。例えば、プロモータがコード配列の転写または発現に影響する場合、プロモータはコード配列に実施可能に連結されている。概して、実施可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、必要な場合、リーディングフレーム内の２つのタンパク質コード領域を結合する。しかしながら、例えば、数キロ塩基ほどプロモータから分離されているとき、エンハンサは概して機能し、イントロン配列は可変長である可能性があるので、一部のポリヌクレオチド要素は実施可能に連結することはできるが、隣接していないことがある。
【０１３４】
別の態様において、本開示は、第１の成分をコードする第１の核酸と、第２の成分をコードする第２の核酸とを含む、または第１および第２の成分をコードする核酸を含む、キットを提供する。実施形態において、キットは、Ｇαタンパク質サブユニットをコードする核酸をさらに含む。別の実施形態において、キットは、細胞表面受容体をコードする核酸をさらに含む。
【０１３５】
別の態様において、本開示は、先に定義の第１および／または第２の成分（複数可）を含むかまたは発現する細胞を提供する。実施形態において、細胞は、先に定義の第１および／または第２の成分（複数可）をコードする核酸をすでに導入または形質転換している。実施形態において、細胞は、組換えＧαタンパク質サブユニットをさらに含むかまたは発現する。実施形態において、細胞は、組換え細胞表面受容体、例えば、ＧＰＣＲ、ＲＴＫまたはインテグリンをさらに含むかまたは発現する。
【０１３６】
本開示はさらに、例えば、当技術分野で周知の培養培地および試薬を使用して、本発明の第１および／または第２の成分（複数可）の発現のための、先に説明したものなどの組換え発現系、ベクターおよび細胞を提供する。細胞は、先に定義の第１および第２の成分（複数可）を発現することができる何らかの細胞であり得る。タンパク質の発現に好適な宿主細胞および方法は、当技術分野で周知である。先に定義の成分（複数可）を発現することができる何らかの細胞を使用することができる。例えば、哺乳動物細胞などの真核宿主細胞（例えば、マウス、ラットおよびハムスター細胞株などのげっ歯類細胞、ヒト細胞／細胞株）を使用することができる。別の実施形態において、先に記載の細胞は、ヒト細胞株、例えば、胚性腎細胞株（例えば、ＨＥＫ２９３細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞）である。
【０１３７】
別の態様において、本開示は、薬剤が関心対象のＧタンパク質の活性化を調節するかどうかを決定するための方法を提供し、該方法は以下を含む：
本明細書で定義するシステムを生物発光ドナー分子のための基質と接触させること、
該薬剤の存在下および非存在下でシステム内のＢＲＥＴシグナルを測定することであって、
該薬剤が関心対象の該Ｇタンパク質の活性化を調節することを、該薬剤の非存在に対する該薬剤の存在下での該ＢＲＥＴシグナルの差が示す、測定すること。
【０１３８】
実施形態において、薬剤はアゴニストであり、該ＢＲＥＴシグナルの差異は上昇である。
【０１３９】
実施形態において、関心対象のＧタンパク質は、Ｇｉタンパク質サブユニットファミリーのものであり、ＧＡＳＩＰは、本明細書に定義するＲａｐ１ＧＡＰタンパク質またはＲＧＳタンパク質のＧタンパク質結合ドメインを含む。実施形態において、先に記載の方法において使用するシステムは、Ｇｉタンパク質サブユニットファミリーの組換えＧαサブユニットポリペプチド、すなわち、組換えＧｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３、ＧｏＡ、ＧｏＢ、またはＧｚサブユニットポリペプチドを含む。所与の検査薬のプロファイルまたは特質を特定するために（すなわち、検査薬によって活性化する特定のＧｉタンパク質サブユニット（複数可）を特定するために）、先に記載の方法は、複数（すなわち、２つ以上）のシステムを使用して実施することができ、各システムは、異なるＧｉタンパク質サブユニットを含み、例えば、第１のシステムは組換えＧｉ１を含み、第２のシステムは組換えＧｉ２を含み、第３のシステムは組換えＧｉ３を含む、などである。
【０１４０】
別の実施形態において、関心対象のＧタンパク質は、Ｇｑタンパク質サブユニットファミリーのものであり、ＧＡＳＩＰは、本明細書で定義するＰ６３ＲｈｏＧＥＦまたはＧＲＫ２のＧタンパク質結合ドメインを含む。実施形態において、先に記載の方法において使用するシステムは、Ｇｑタンパク質サブユニットファミリーの組換えＧαサブユニットポリペプチド、すなわち、組換えＧｑ、Ｇ１１、Ｇ１４またはＧ１５サブユニットポリペプチドを含む。所与の検査薬のプロファイルまたは特質を特定するために（すなわち、検査薬によって活性化する特定のＧｑタンパク質サブユニット（複数可）を特定するために）、先に記載の方法は、複数（すなわち、２つ以上）のシステムを使用して実施することができ、各システムは、異なるＧｑタンパク質サブユニットを含み、例えば、第１のシステムは組換えＧｑを含み、第２のシステムは組換えＧ１１を含み、第３のシステムは組換えＧ１４を含む、などである。
【０１４１】
別の実施形態において、関心対象のＧタンパク質は、Ｇ１２／１３タンパク質サブユニットファミリーのものであり、ＧＡＳＩＰは、本明細書で定義するＰＤＺＲｈｏＧＥＦまたはＰ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインを含む。実施形態において、上述の方法において使用するシステムは、Ｇ１２／１３タンパク質サブユニットファミリーの組換えＧαサブユニットポリペプチド、すなわち組換えＧｑ、Ｇ１２またはＧ１３サブユニットポリペプチドを含む。所与の検査薬のプロファイルまたは特質を特定するために（すなわち、検査薬によって活性化する特定のＧ１２／１３タンパク質サブユニット（複数可）を特定するために）、先に記載の方法は、複数（すなわち、２つ以上）のシステムを使用して実施することができ、各システムは、異なるＧ１２／１３タンパク質サブユニットを含み、例えば、第１のシステムは組換えＧ１２を含み、第２のシステムは組換えＧ１３を含む。
【０１４２】
別の態様において、本開示は、薬剤が非受容体グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）介在性Ｇタンパク質活性化を調節するかどうかを決定するための方法を提供し、該方法は以下を含む：
本明細書に定義するシステムを生物発光ドナー分子のための基質と接触させること、
該薬剤の存在下および非存在下でシステム内のＢＲＥＴシグナルを測定することであって、該システムは、ＧＰＣＲによる活性化を低下させるかまたは無効にする少なくとも１つの突然変異を含む組換えＧαサブユニットポリペプチドを含み、
該薬剤が非受容体ＧＥＦ介在性Ｇタンパク質活性化を調節することを、該薬剤の非存在に対する該薬剤の存在下での該ＢＲＥＴシグナルの差が示す、測定すること。
【０１４３】
実施形態において、薬剤はアゴニストであり、該ＢＲＥＴシグナルの差は上昇（またはより高いＢＲＥＴシグナル）である。
【０１４４】
別の実施形態において、薬剤はアンタゴニストであり、該ＢＲＥＴシグナルにおける差は低下（またはより低いＢＲＥＴシグナル）である。実施形態において、薬剤がアンタゴニストであるかどうかを特定するために、システムを既知のアゴニストと接触させ、薬剤の存在下で既知のアゴニストにより誘導されるＢＲＥＴシグナルの低下は、薬剤がアンタゴニストであることを示す。
【０１４５】
別の態様において、本開示は、薬剤がＧＰＣＲ介在性Ｇタンパク質活性化またはＲＴＫ／ＧＥＦ介在性Ｇタンパク質活性化を誘導するかどうかを決定する方法を提供し、この方法は以下を含む：
ＧＡＳＩＰがＲａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメイン、好ましくは先に定義したとおり、下流のシグナル伝達事象（例えば、キナーゼの活性化）に対する感度を低減させる突然変異を含む、より好ましくは、位置４３７、４３９および／または４４１のセリン残基のうちの１つ以上での突然変異を含む（例えば、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ））、Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインを含む第１のバイオセンサを使用して、薬剤の存在下でＢＲＥＴシグナルを測定すること、
先に定義したように、ＧＡＳＩＰがＲＧＳタンパク質、好ましくはＲＧＳ１７のＧタンパク質結合ドメインを含む第２のバイオセンサを使用して、薬剤の存在下でＢＲＥＴシグナルを測定することであって、
第２のバイオセンサにおける薬剤の存在下でのＢＲＥＴシグナルの上昇を伴わない、第１のバイオセンサにおける薬剤の存在下でのＢＲＥＴシグナルの上昇（例えば、用量依存的上昇）は、薬剤がＲＴＫ／ＧＥＦ介在性Ｇタンパク質活性化を誘導することを示し、第１および第２のバイオセンサにおける薬剤の存在下でのＢＲＥＴシグナルの上昇（例えば、用量依存的上昇）は、薬剤がＧＰＣＲ介在性Ｇタンパク質活性化を誘導することを示す、測定すること。
【０１４６】
「化合物」、「薬剤」、「検査化合物」または「検査薬」という用語は、合成または天然の化合物のライブラリーを含む何らかの数の源から得られることができる、本明細書に説明するシステム／アッセイによってスクリーニングすることができる何らかの分子（例えば、薬物候補）を指す。例えば、数多くの手段は、無作為化オリゴヌクレオチドの発現を含む、広範な種々の有機化合物および生体分子の無作為で指向性のある合成のために利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物および動物の抽出物の形態の天然の化合物のライブラリーが入手可能であるか、または容易に製造される。さらに、天然のまたは合成で製造したライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的および生化学的手段を経て容易に改質される。
【０１４７】
実施形態において、本明細書で使用する「上昇したシグナル」または「より高いシグナル」は、検査薬の非存在下で測定された参照シグナルと比較して少なくとも１０、２０、３０、４０、４５または５０％高いシグナルを指す。別の実施形態において、「より高いシグナル」は、例えば、複数の試料において得られた結果を合わせることによって、検査薬の非存在に対する存在下で測定されたシグナルにおける統計的有意差（好適な統計分析を用いて決定）を示すことによって決定される。異なるデータセット間の有意差を決定するための統計分析（ＡＮＯＶＡ、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定、カイ二乗など）は、当技術分野で既知であり、このような分析は、好適なコンピュータープログラムを使用して実施することができる。
【０１４８】
陽性対照および陰性対照は、本明細書に説明する方法／アッセイにおいて使用することができる。統計的に有意な結果を得るために、対照試料および検査試料を複数回実施することがある。
【０１４９】
実施形態において、先に記載の方法は、高処理量法（高処理量スクリーニング（ＨＴＳ））である。本明細書で使用する「高処理量スクリーニング」（ＨＴＳ）という用語は、標的分子に対する結合活性または生物活性について多数の化合物（数百、数千）を迅速かつ並行してスクリーニングすることができる方法を指す。このようなＨＴＳ法は、典型的には、いくつかのウェル、例えば、３８４、１５３６、または３４５６個のウェルを有するマイクロタイタープレートにおいて実施される。ＨＴＳについては、読み出しシグナルが高い感度、精度、再現性で検出されるべきであることは重要である。方法がＨＴＳに好適であるかまたはＨＴＳと互換性があるかを判断する１つの方法は、以下の例で説明するように、Ｚ因子の測定による。理想的には、Ｚ因子は、少なくとも０．５（０．５〜１）、好ましくは少なくとも０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、または０．８であるべきである。
【０１５０】
ＢＲＥＴシグナルを測定する方法および装置は、当技術分野で周知である。ＢＲＥＴシグナルは、例えば、ＢＲＥＴアクセプタシグナルの強度（光強度）を決定することによって、および／またはＢＲＥＴドナーによって放出されるシグナルもしくは光の強度に対するＢＲＥＴアクセプタによって放射されるシグナルまたは光の強度の比（ＢＲＥＴ比）を算出することによって、測定することができる。ＢＲＥＴシグナルは、ＢＲＥＴドナーおよび／またはＢＲＥＴアクセプタの発光を検出するために好適なフィルタセットを備えたマイクロプレートリーダまたは顕微鏡を使用して測定することができる。
【０１５１】
本明細書に説明するシステムおよび方法は、ＨＴＳで使用して、例えば、Ｇタンパク質の活性化を（ＧＰＣＲまたはＧタンパク質を経てシグナル伝達する他の受容体を経て）調節する上で活発であり、したがって、潜在的な薬剤候補である、またはＧタンパク質の阻害もしくは刺激が有益であろうＧタンパク質シグナル伝達が関与する障害を処置する上での使用のための、化合物を特定することができる。本明細書に説明するシステムおよび方法はまた、リガンドプロファイリングを実施するために、例えば、ＧＰＣＲまたはＧタンパク質を経てシグナル伝達する他の受容体のリガンドによって調節される経路を決定するために、使用することが使用することができる。
【０１５２】
本明細書に説明するシステムおよび方法は、化合物ライブラリーのスクリーニングに使用して、薬物開発のための潜在的な候補を特定することができる。本明細書に説明するシステムを化合物と接触させたときのＢＲＥＴシグナル比の変化は、薬物または薬学的に活性である化合物を特定し、細胞経路に及ぼす該化合物の効果を特定することができる。また、本明細書に説明するシステムおよび方法はまた、薬物候補の薬用量依存性の決定に使用することができる。
【０１５３】
電気機械式プレートリーダを使用して、シグナル比の変化を検出することができる。このようなプレートリーダは、本発明のシステムを使用したＨＴＳ、薬剤候補スクリーニング、および薬物用量依存性試験のために使用することができる。本発明を実施する上で使用することができるプレートリーダの例としては、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ装置を含む、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）によって提供されるプレートリーダのＦｕｓｉｏｎ（商標）ファミリーが挙げられる。ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（商標）ＨＴＳモデルもまた、本明細書で説明する方法を実行する上で採用され得る。
【実施例】
【０１５４】
発明を実施するための形態
本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに詳細に説明する。
【０１５５】
実施例１：材料および方法
材料。アンギオテンシンＩＩ（ＡｎｇＩＩ；［Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ］、配列番号５８）、ホルコリン、ドーパミン、およびポリオルニチンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製であり、ｕ４６６１９、Ｉ−ＢＯＰ、ＣＴＡ２、Ｕ５１６０５、Ｉ−ＳＡＰ、ＳＱ２９５５８は、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（登録商標）（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）製であった。ヒトＥＧＦは、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ研究所製であった。カリジン（［Ｌｙｓ０］−ブラジキニン）はＥｕｒｏｇｅｎｔｅｃ製であった。ＷＡＹ−１００６３５、Ａ  ４１２９９７、Ｌ  ７４１７４２、ＳＮＣ−８０、およびＡＲ−Ｍ１００３９０は、Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｅ）製であった。血小板活性化因子（ＰＡＦ−Ｃ１６）は、Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．製であった。サケ精子ＤＮＡ、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清、子ウシ血清、ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（登録商標）、および他の細胞培養試薬は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から、およびＷｉｓｅｎｔ  Ｉｎｃ．から購入した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）２５ｋＤａ（線状）はＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．製であった。Ｐｒｏｌｕｍｅ  Ｐｕｒｐｌｅ  ＩはＮａｎｏｌｉｇｈｔ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製であった。制限酵素、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、およびＧｉｂｓｏｎアセンブリミックスは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｌｔｄから入手した。白色の９６ウェルポリスチレン細胞培養マイクロプレート（固体底）（ＣｅｌｌＳｔａｒ  ６５５  ０８３）は、Ｇｒｅｉｎｅｒ製であった。
【０１５６】
プラスミドおよび構築物。原形質膜マーカｒＧＰＦ−ＣＡＡＸおよび初期エンドソームマーカｒＧＦＰ−ＦＹＶＥ構築物は、すでに説明した（Ｎａｍｋｕｎｇ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．２０１６；Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ．７：１２１７８）。ＴＰα受容体構築物、すべてのＧαサブユニット、Ｇβ１サブユニット、およびＧγ１サブユニットをコードするプラスミドは、ｃｄｎａ．ｏｒｇ製である。シグナルペプチドＭＤＳＫＧＳＳＱＫＧＳＲＬＬＬＬＬＶＶＳＮＬＬＬＣＱＧＶＶＳ（配列番号５９）を持つヒト受容体Ｄ４Ｒ、Ａｔ１ＡＲおよびＭｕオピオイド受容体（ｈＭＯＲ１）のコード配列（ｃｄｓ）を配列最適化し、ＧｅｎｅＡＲＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で合成し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のｐＣＤＮＡ３．１（＋）におけるＧｉｂｓｏｎアセンブリ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によってサブクローン化し、ｈＭＯＲ１をｐＬＶＸ  ＩＲＥＳ  ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡ）においてサブクローン化した。ヒトＥＧＦＲをコードする構築物は、Ｙｏｓｅｆ  Ｙａｒｄｅｎ博士によって提供された（Ｔｚａｈａｒ  Ｅ．ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６（１０）：５２７６−５２８７）。ブラジキニンＢ２受容体（ＢＫＢ２Ｒ）ｃｄおよびＲＡＰＧＡＰ（１−４４２）−Ｒｌｕｃ８構築物（図９Ａおよび図９Ｂを参照されたい）は、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）のＴｏｐｇｅｎｅｔｅｃｈで配列最適化、合成、およびサブクローン化し、ペプチドリンカーＧＳＧＧＧＳＧＧＧＡ（配列番号６）は、ＲａｐＧＡＰ（１−４４２）とＲｌｕｃ８との間に存在する（図２Ａを参照されたい）。ＲａｐＧＡＰのＲｌｕｃＩＩタグ付き版（１〜４４２）、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ΔＣＴ（１〜４２０）、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ΔＳＳＳ（１〜４３６）、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ＳＳＳ−ＡＡＡ（１〜４４２；Ｓ４３７Ａ／Ｓ４３９Ａ／Ｓ４４１Ａ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ＳＳＳ−ＴＴＴ（１〜４４２；Ｓ４３７Ｔ／Ｓ４３９Ｔ／Ｓ４４１Ｔ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ＳＳ−ＡＡ（１〜４４２；Ｓ４３７Ａ／Ｓ４４１Ａ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ＳＳ−ＤＡ（１〜４４２；Ｓ４３７Ａ／Ｓ４４１Ａ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ＳＳ−ＡＤ（１〜４４２；Ｓ４３７Ａ／Ｓ４４１Ｄ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ  ＳＳ−ＤＤ（１〜４４２；Ｓ４３７Ａ／Ｓ４４１Ａ）をコードする以下の構築物を、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）ＲａｐＧＡＰ（１−４４２）−Ｒｌｕｃ８からのＰＣＲ増幅によって行い、ｐＣＤＮＡ３．１  Ｈｙｇｒｏ（＋）ＧＦＰ１０−ＲｌｕｃＩＩにおけるＧｉｂｓｏｎアセンブリによってサブクローン化し、ＧＦＰ１０を、Ｒａｐ１ＧＡＰの異なる変異体のコード配列と置き換えた（図２Ａ、図９Ａおよび図９Ｂを参照されたい）。ペプチドリンカー：ＧＳＡＧＴＧＧＲＡＩＤＩＫＬＰＡＴ（配列番号７）はＲＡＰＧＡＰとＲｌｕｃＩＩとの間に存在する（図２Ａを参照されたい）。ＲｌｕｃＩＩでタグ付けしたヒトＲＧＳ１７（残基：６４〜２１０）のＲＧＳ結合ドメインをコードする構築物を、ｐＣＤＮＡ  ３．１  ＨＡ−ＲＧＳ１７（ｃＤＮＡ．ｏｒｇ製）からのＰＣＲ増幅によって行い、ｐＣＤＮＡ３．１  Ｈｙｇｒｏ（＋）ＧＦＰ１０−ＲｌｕｃＩＩにおけるＧｉ���ｓｏｎアセンブリによってサブクローン化し、ＧＦＰ１０をＲＧＳ（ＲＧＳ１７  ６４−２１０）のｃｄで置き換えた（図３Ａおよび図９Ｄを参照されたい）。ＲｌｕｃＩＩでタグ付けしたヒトＲＧＳ１９（残基：７０〜２１７）のＲＧＳ結合ドメインをコードする構築物を、ｐＣＤＮＡ  ３．１  ＨＡ−ＲＧＳ１９（ｃＤＮＡ．ｏｒｇ製）からのＰＣＲ増幅によって行い、ｐＣＤＮＡ３．１  Ｈｙｇｒｏ（＋）ＧＦＰ１０−ＲｌｕｃＩＩにおけるＧｉｂｓｏｎアセンブリによってサブクローン化し、ＧＦＰ１０をＲＧＳ１９（７０−２１７）のコード配列に置き換えた（図３Ａおよび図９Ｄを参照されたい）。ＲｌｕｃＩＩでタグ付けしたヒトＲＧＳ２０  ｖａｒ１（残基：２４２〜３８８）のＲＧＳ結合ドメインをコードする構築物を、ｐＣＤＮＡ  ３．１  ＨＡ−ＲＧＳ２０  ｖａｒ１（ｃＤＮＡ．ｏｒｇ製）からのＰＣＲ増幅によって行い、ｐＣＤＮＡ３．１  Ｈｙｇｒｏ（＋）ＧＦＰ１０−ＲｌｕｃＩＩにおけるＧｉｂｓｏｎアセンブリによってサブクローン化し、ＧＦＰ１０をＲＧＳ（ＲＧＳ２０  ２４２−３８８）のコード配列に置き換えた（図３Ａおよび図９Ｄを参照されたい）。ペプチドリンカー：ＧＳＡＧＴＧＧＲＡＩＤＩＫＬＡＳＡＴ（配列番号２０）は、Ｒａｐ１ＧＡＰとＲｌｕｃＩＩの間に存在する（図３Ａを参照されたい）。ＲｌｕｃＩＩでタグ付けしたヒトＰＤＺＲｈｏＧＥＦ（残基：２８１〜４８３）およびＰ１１５ＲｈｏＧＥＦ（残基：１〜２４４）のＧ１２／１３結合ドメインをコードする構築物を、ＩＭＡＧＥクローン（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からのＰＣＲ増幅によって行い、ｐＣＤＮＡ３．１  Ｈｙｇｒｏ（＋）ＧＦＰ１０−ＲｌｕｃＩＩのＧｉｂｓｏｎアセンブリによってサブクローン化し、ＧＦＰ１０を置き換えた（図４Ａ、図５Ａ、および図９Ｄを参照されたい）。ペプチドリンカー：ＧＩＬＲＥＡＬＫＬＰＡＴ（配列番号２２）およびＲＬＫＬＰＡＴ（配列番号２４）は、ＲｌｕｃＩＩとＰＤＺＲｈｏＧＥＦおよびＰ１１５ＲｈｏＧＥＦのＧ１２／１３結合ドメインとの間にそれぞれ存在する（図４Ａおよび図５Ａを参照されたい）。ＲｌｕｃＩＩでタグ付けしたヒトＰ６３ＲｈｏＧＥＦ（残基：２９５〜５０２）のＧｑ結合ドメインをコードする構築物を、ＩＭＡＧＥクローン（ＯｐｅｎＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から行い、ｐＣＤＮＡ３．１  Ｈｙｇｒｏ（＋）ＧＦＰ１０−ＲｌｕｃＩＩのＧｉｂｓｏｎアセンブリによってサブクローン化し、ＧＦＰ１０を置き換えた（図６Ａおよび図９Ｂを参照されたい）。ペプチドリンカー：ＡＳＧＳＡＧＴＧＧＲＡＩＤＩＫＬＰＡＴ（配列番号２６）は、Ｇｑ結合ドメインとＲｌｕｃＩＩの間に存在する（図６Ａを参照されたい）。ＲｌｕｃＩＩでタグ付けしたヒトＧＲＫ２のＲＧＳドメイン（残基：３０〜２０３）をコードする構築物を、ｐｃＤＮＡ３．１Ｚ−ＧＲＫ２−ＧＦＰ１０からのＰＣＲ増幅によって行い、ｐＣＤＮＡ３．１  Ｈｙｇｒｏ（＋）ＧＦＰ１０−ＲｌｕｃＩＩおよびｐＣＤＮＡ３．１（＋）ＲｌｕｃＩＩ−ＧＦＰ１０ｓｔ２のＧｉｂｓｏｎアセンブリによってサブクローン化し、ＧＦＰ１０を置き換え、それぞれＲＧＳ（ＧＲＫ２）−ＲｌｕｃＩＩおよびＲｌｕｃＩＩ−ＲＧＳ（ＧＲＫ２）を創出した（図７Ａ��よび図９Ｂを参照されたい）。ペプチドリンカー：ＧＳＡＧＴＧＧＲＡＩＤＩＫＬＡＳＡＴ（配列番号２０）は、両方の構築物においてＲＧＳ（ＧＲＫ２）ドメインとＲｌｕｃＩＩとの間に存在する（図７Ａを参照されたい）。Ｇαｉ２およびＧαｏＢ突然変異体をコードする構築物：Ｇαｉ２  Δ５（＝１〜３５０）、Ｇαｉ２  Δ２（＝１−３５３）、Ｇαｉ２  Ｌ−７Ｇ（＝Ｌ３５４Ｇ）、Ｇαｉ２  Ｌ−２Ｇ（＝Ｌ３５４Ｇ）、Ｇαｉ２  Ｌ−２Ｄ（＝Ｌ３５４Ｄ）、Ｇαｉ２  Ｌ−２Ｐ（＝Ｌ３５４Ｐ）、Ｇαｉ２  Ｌ−２Ｒ（＝Ｌ３５４Ｒ）、ＧαｏＢ  Ｌ−２Ｇ（＝Ｌ３５３Ｇ）、ＧαｏＢ  Δ５（＝１〜３４９）を、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）ＧＮＡｉ２およびｐＣＤＮＡ３．１（＋）ＧＮＡｏＢ（ｃｄｎａ．ｏｒｇ製）からのＰＣＲ増幅ならびにｐＣＤＮＡ３．１  Ｚｅｏ（＋）におけるＧｉｂｓｏｎアセンブリによるサブクローン化によって創出した。
【０１５７】
細胞培養および一過性トランスフェクション。ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を、１０％ウシ胎児血清、１００単位／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃で維持した。ＨＥＫ２９３ＳＬ細胞を、５％ウシ胎児血清および２０μｇ／ｍｌゲンタマイシンを補充したＤＭＥＭ中で培養した。細胞は、５％ＣＯ２および９０％湿度において３７°Ｃで成長させた。
【０１５８】
ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）を使用したトランスフェクション：実験の２日前に、ＨＥＫ２９３細胞をカルシウムもマグネシウムも含有していないＰＢＳで洗浄し、剥離し、トランスフェクション剤としてＰＥＩを（３対１のＰＥＩ：ＤＮＡの比で）使用して、表示のプラスミドでトランスフェクトした。次いで、細胞を、ウェルあたり３５，０００個の細胞密度でポリ−Ｌ−オルニチン臭化水素酸塩で前処理をしたまたはしていない９６ウェルプレート内に直接播種した。Ｓｐａｒｋ  １０Ｍリーダにおいて読み取られるすべての実験は、未処理のプレートを使用して実行した。
【０１５９】
ＢＲＥＴ測定。トランスフェクションの４８時間後、予め加温しておいたタイロード緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５．６ｍＭ  Ｄ−グルコース、０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３７ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）で細胞を２回洗浄した後、示すとおり、種々の濃度のリガンドで、室温（ＲＴ）または３７℃のいずれかで刺激した。細胞透過性基質であるコエレンテラジンパープルＩを少なくとも６分間（３７°Ｃ）から１０分間（ＲＴ）、タイロード緩衝液中で１μＭの終濃度で添加した後、ＢＲＥＴ測定した。測定は、Ｓｐａｒｋ  １０Ｍリーダ（Ｔｅｃａｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ；ドナー：３６０ｎｍ／３８０ｎｍおよびアクセプタ：５０５ｎｍ／５７０ｎｍ）、ＬＢ  ９４１  マルチモードプレートリーダ（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ドナー：４００／４７０ｎｍおよびアクセプタ：５１５／５２０ｎｍフィルタ）またはＳｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏ（Ｂｉｏｔｅｋ：（ドナー：４００／４８０ｎｍ、アクセプタ：５１５／５３０ｎｍ）のいずれかで行った。ＢＲＥＴシグナルは、ｒＧＦＰ（アクセプタ）によって放射される光の強度とＲｌｕｃＩＩ（ドナー）によって放射される光の強度の比を計算することによって決定した。すべてのＢＲＥＴ測定は、Ｔｒｉｓｔａｒリーダにおいて３７°Ｃで（図１〜図２Ｍおよび図２Ｒ〜図７Ｆ）、Ｓｐａｒｋ  １０ＭリーダにおいてＲＴで（図２Ｎ〜図２Ｑおよび図８Ｂ〜図８Ｓ）、またはＳｙｎｅｒｇｙ  ＮｅｏにおいてＲＴで（図８Ｔ〜図８Ｘ）実施した。
【０１６０】
Ｚ’値の決定。Ｚ’値の値は、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ．１９９９；４（２）：６７−７３）によって説明されたとおり計算した。０．４を超えるＺ’値を、堅牢なアッセイと見なす。
【０１６１】
データ解析。ＥＣ５０値の推定は、ＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）Ｐｒｉｓｍ曲線あてはめプログラムを使用して計算した。本試験全体を通じて提示された曲線は、最適なあてはめを表し、また、このＧｒａｐｈＰａｄ（登録商標）Ｐｒｉｓｍプログラムを使用して作成した。
【０１６２】
実施例２：Ｇタンパク質ファミリー選択的様式においてＧタンパク質活性化をモニタリングするためのシステムおよびアッセイの生成および特異性
図１Ａ〜図１Ｅは、Ｇタンパク質エフェクタからのＧαサブユニット相互作用ポリペプチド（ＧＡＳＩＰ）の転移に基づく、異なる細胞区画でのＧタンパク質ファミリー選択的様式におけるＧタンパク質活性化をモニタリングするためのシステムおよびアッセイの生成および特異性を示す。図１Ａは、ｉ）ＧＰＣＲ介在性の直接的なＧタンパク質活性化における、およびｉｉ）グアニン−ヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）介在性Ｇタンパク質活性化をモニタリングするためのエフェクタ系センサの原理を示している。受容体、ｒＧＦＰでタグ付けされた細胞内局在ドメイン（例えば、原形質膜（ＰＭ）についてのまたは初期エンドソーム（ＥＥ）についての）、ＢＲＥＴドナー（例えば、ＲｌｕｃＩＩ）でタグ付けした特定のエフェクタのＧα相互作用ドメインを発現する細胞を、共発現したＧタンパク質を活性化するためにアゴニストへ曝露する。ｉ）において、アゴニスト誘導性ＧＰＣＲ刺激は、Ｇタンパク質を直接活性化し、このことがタグ付けしたエフェクタを細胞質からｒＧＦＰ標識膜へと動員する。ｉｉ）において、Ｇタンパク質の活性化は、ＲＴＫ（例えば、ＥＧＦＲ）またはインテグリンα−β複合体の活性化に続くＧＩＶ／ＧｉｒｄｉｎなどのＧＥＦの動員から介在される。Ｇタンパク質サブユニットは、活性化をモニタリングするために修飾する必要がなく、Ｇαタンパク質サブユニットを試験対象の受容体と共発現させることによって、ならびにＧｉファミリー（Ｇｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３、ＧｏＡ、ＧｏＢ、Ｇｚ）に対するＲａｐ１ＧＡＰ（図１Ｂ）の、Ｇｑファミリー（Ｇｑ、Ｇ１１、Ｇ１４、およびＧ１５）に対するＰ６３ＲｈｏＧＥＦ（Ｐ６３ＲＧ）（図１Ｃ）の、およびＧ１２／１３ファミリーに対するＰＤＺＲｈｏＧＥＦ（ＰＤＺＲＧ）（図１Ｄおよび図１Ｅ）のＧタンパク質結合ドメインなどのＧタンパク質の各ファミリーに特異的なＧＡＳＩＰを使用することによって達成される。Ｒａｐ１ＧＡＰのＧタンパク質結合ドメインを使用したとき、Ｇｉファミリーのメンバーのみが、偽条件（内在的に発現したＧｉ１、ｉ２およびｉ３タンパク質の活性化）よりも大きな応答を示し（図１Ｂ）、ＰＤＺＲＧを使用したとき、Ｇ１２／１３ファミリーのメンバーのみが、偽条件（内在的に発現したＧ１２およびＧ１３タンパク質の活性化）よりも大きな応答を示し（図１Ｃ）、Ｐ６３ＲＧを使用したとき、Ｇｑファミリーのメンバーのみが、内在的に発現したＧｑおよびＧ１１タンパク質）の偽条件の活性化よりも大きな応答を示し（図１Ｄおよび図１Ｅ）、したがって、アッセイの特異性を確認した。
【０１６３】
実施例３：ＧｉファミリーのＧタンパク質の活性化をモニタリングするためのシステムおよびアッセイ
図２Ａ〜図２Ｚは、ＧｉファミリーのＧタンパク質（Ｇｉ１、ｉ２、ｉ３、ｏＡ、ｏＢ、ｚ）の活性化をモニタリングするためのＲａｐ１ＧＡＰ系ＢＲＥＴセンサの最適化と使用を示している。検査した種々の構築物を図２Ａに示している。図２Ｂ〜図２Ｅに提示する結果は、検査した２つのＢＲＥＴドナー（Ｒｌｕｃ８およびＲｌｕｃＩＩ）を使用して検出可能なＢＲＥＴシグナルが得られたことを示している。図２Ｆおよび図２Ｇに提示する結果は、細胞を（上昇ｃＡＭＰ産生、および異なるタンパク質のリン酸化をもたらすタンパク質キナーゼＡの活性化を促進する）ホルスコリンで前処理したときに測定したより低い反応によって証明されるように、Ｒａｐ１ＧＡＰ（１〜４４２）構築物がリン酸化に感度があることを実証しており、このことは本アッセイに影響し得る。Ｃ末端切断変異体（１〜４２０および１〜４３６）およびＳｅｒからＡｌａおよびＳｅｒからＡｓｐへの置換の組み合わせを含む異なる突然変異体を推定リン酸化部位（Ｓｅｒ  ４３７、４３９、および４４１の残基）で作製し、生成し、検査した。ＲＡＰ１ＧＡＰのＣ末端切断変異体（ΔＣＴ）はホルスコリンの作用に対して非感受性であったが、このより短い断片（Ｒａｐ１ＧＡＰ  １〜４２０）のウィンドウはＲａｐ１ＧＡＰ（１〜４４２）のウィンドウよりも有意に低い（図２Ｈ）。検査した他の突然変異体のうち、ホルスコリンの影響をなおも受けた突然変異体は、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳ−ＡＤ）、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＴＴＴ）、およびＲａｐ１ＧＡＰ（ＳＳ−ＡＡ）のみであり、後者はＲａｐ１ＧＡＰ（１〜４４２）−ＲｌｕｃＩＩに匹敵する動的ウィンドウを示した（図２Ｊ〜図２Ｑ）。Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）は、以下で説明する他の実験に使用した。
【０１６４】
ドーパミン促進刺激の際のドーパミンＤ４受容体（Ｄ４Ｒ）のＧタンパク質プロファイリングは、原形質膜へのＲａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩ転移で得られ、各Ｇタンパク質（Ｇｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３、ＧｏＡ、およびＧｏＢ）は、明確な薬理学的特徴を持つ用量応答曲線を示した（図２Ｒ）。Ｇｚ活性化を使用して、５つのドーパミン受容体上のいくつかのドーパミン受容体リガンド（Ａ４１２  ９９７、ドーパミン、Ｌ７４１  ７４２、およびＷａｙ−１００６３５）をプロファイルし、結果を図２Ｓ〜図２Ｗに示す。ドーパミンはすべての受容体を活性化することが示され（ＥＣ５０：Ｄ１Ｒ＝３８０ｎＭ、Ｄ２Ｒ＝２．６ｎＭ、Ｄ３Ｒ＝０．５０ｎＭ、Ｄ４Ｒ＝０．１１ｎＭ、Ｄ５Ｒ＝５１ｎＭ）、既知のＤ４ＲアンタゴニストＬ７４１，７４２はアゴニストもドーパミン受容体のうちのいずれに関する逆特性も示さなかった。ＷＡＹ−１００６３５はＤ４Ｒでのみアゴニスト特性を示した（ＥＣ５０＝０．８３）が、Ａ４１２，９９７はＤ３Ｒ（ＥＣ５０＝２８１ｎＭ）およびＤ４Ｒ（ＥＣ５０＝０．０４ｎＭ）の両方を活性化したが、Ｄ１Ｒ、Ｄ２ＲまたはＤ５Ｒは活性化しなかった。図２Ｘ〜図２Ｚに描かれた結果は、Ｇｉ２、ＧｏＡおよびＧｚ活性化についてＺ’値がそれぞれ０．８１２、０．７０３、および０．６０７と査定され、アッセイが堅牢であり、かつ高処理量スクリーニング（ＨＴＳ）と互換性があることを示している。
【０１６５】
図３Ａ〜図３Ｄは、ＲＧＳ１７、１９、および２０などのＧタンパク質シグナル伝達調節因子（ＲＧＳ）タンパク質のメンバーのＲＧＳドメインを、Ｇタンパク質活性化をモニタリングするためのＲａｐ１ＧＡＰの代替として使用することができることを示す。ＲＧＳ１７（残基６４〜２１０）、ＲＧＳ１９（残基７０〜２１７）、およびＲＧＳ２０（残基２４２〜３８８）タンパク質のＲＧＳドメインに基づくＲｌｕｃＩＩタグのついた構築物を図３Ａに提示する。これらのタンパク質のＧα結合ＲＧＳドメインのみを使用すると、Ｇタンパク質の活性化の際にサイトゾルの局在化と異なる区画への転移が可能になり、全長タンパク質に存在する他のドメインまたはこれらのタンパク質のＮ末端部分に存在するパルミトイル化部位の影響をまったく受けない。ＲＧＳ（ＲＧＳ１７）−ＲｌｕｃＩＩ（図３Ｂ）、ＲＧＳ（ＲＧＳ１９）−ＲｌｕｃＩＩ（図３Ｃ）およびＲＧＳ（ＲＧＳ２０）−ＲｌｕｃＩＩ（図３Ｄ）で得られた用量応答曲線は、ＰＭでのＧｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３、ＧｏＡ、ＧｏＢ、およびＧｚのＤ４Ｒ／ドーパミン介在性活性化について提示されている。３つのＲＧＳ構築物で類似の結果（カップリングおよびＥＣ５０）が得られ、これらのＲＧＳ系構築物を使用してＧｉおよびＧｏの活性化をモニタリングすることができることを確認した。本結果は、Ｒａｐ１ＧＡＰ系構築物で得られた結果と類似していたが、Ｇｚの共発現は偽条件と区別可能なシグナルをもたらさず、Ｒａｐ１ＧＡＰ系構築物に対するＲＧＳ系構築物を用いたＧｉ３についての動的ウィンドウはより小さかった。
【０１６６】
実施例４：Ｇ１２／１３ファミリーのＧタンパク質の活性化をモニタリングするためのシステムおよびアッセイ。
Ｇ１２／１３ファミリーのＧタンパク質の活性化をモニタリングするためのＰＤＺＲｈｏＧＥＦ系ＢＲＥＴシステムの最適化および使用を、図４Ａ〜図４Ｇに説明している。Ｇ１２／１３結合ドメイン（残基２８１〜４８３、ＰＤＺＲＧ）を含むＰＤＺＲｈｏＧＥＦの断片を、ＢＲＥＴドナーＲｌｕｃＩＩでＣ末端にタグ付けした（図４Ａ）。Ｇ１２および１３の活性化を測定するための動的ウィンドウは、Ｇαサブユニットの発現レベルに直接依存することが示されたが、発現のレベルは、異なる量のＧ１２および１３で得られた匹敵するＬｏｇＥＣ５０値から明らかなように、Ｇ１２および１３のＩ−ＢＯＰ／ＴＰαＲ介在性活性化についての効力に影響しなかった（図４Ｂおよび図４Ｃ）。ＰＤＺＲＧ−ＲｌｕｃＩＩを使用して、ＰＭでのＧ１２およびＧ１３の活性化に関するＴＰαＲリガンドをプロファイルした。既知の完全なアゴニスト（Ｕ４６６１９、Ｉ−ＢＯＰ、ＣＴＡ２）、１つの部分アゴニスト（Ｕ５１６０５）、ならびにアンタゴニストＩ−ＳＡＰおよびＳＱ  ２９，５５８で細胞を刺激した。図４Ｄおよび図４Ｅに示した結果は、ＳＱ  ２９，５５８がＴＰαＲアゴニストとして作用していないことを示している。既知の活性／特性と一致して、Ｕ４６６１９、Ｉ−ＢＯＰおよびＣＴＡ２はＧ１２および１３の活性化に及ぼす完全なアゴニストであり、Ｇ１２／１３の活性化をモニタリングするアッセイの妥当性を確認している。興味深いことに、Ｕ５１６０５およびＩ−ＳＡＰは、偏向したリガンドとして作用することが示された。Ｕ５１６０５は、Ｇ１２（最大の４０％）の活性化に対する部分アゴニスト、およびＧ１３（最大の９３％）の活性化に対するほぼ完全なアゴニストであることが実証された。対照的に、Ｉ−ＳＡＰ刺激は、本アッセイにおいて有意なＧ１２活性化を誘導し損ねているが（図４Ｄ）、Ｇ１３に対しては部分アゴニスト活性（最大の５３％）が検出された（図４Ｅ）。最後に、Ｇ１２活性化に対して０．６４５、Ｇ１３活性化に対して０．８１２と査定されたＺ’値が得られ（図４Ｆおよび図４Ｇ）、本アッセイも堅牢であり、Ｇ１２／Ｇ１３調節に基づく高処理量スクリーニングの適用と互換性があることを示した。
【０１６７】
Ｇ１２／１３ファミリーのＧタンパク質の活性化をモニタリングするためのＰ１１５ＲｈｏＧＥＦ系ＢＲＥＴシステムの最適化および使用は、図５Ａ〜図５Ｅに説明する。Ｇ１２／１３結合ドメイン（残基１〜２４４、Ｐ１１５ＲＧ）を含むＰ１１５ＲｈｏＧＥＦの断片を、ＢＲＥＴドナーＲｌｕｃＩＩでＣ末端にタグ付けした（図５Ａ）。Ｐ１１５ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩを使用して、ＰＭでのＧ１２およびＧ１３の活性化に関するＴＰαＲリガンドをプロファイルした。細胞を、Ｕ４６６１９、Ｉ−ＢＯＰ、ＣＴＡ２、Ｕ５１６０５、Ｉ−ＳＡＰ、およびＳＱ  ２９，５５８で刺激した。図５Ｂおよび図５Ｃに示す結果は、ＰＤＺＲＧ−ＲｌｕｃＩＩで得られた結果と一致しており、ＳＱ  ２９，５５８がＴＰαＲアゴニストとして作用しておらず、Ｕ４６６１９、Ｉ−ＢＯＰおよびＣＴＡ２がＧ１２および１３活性化に対する完全なアゴニストであることを示しており、Ｕ５１６０５およびＩ−ＳＡＰが、偏向したリガンドとして作用することが示された。Ｕ５１６０５はＧ１２（最大の１４％）およびＧ１３（最大の６０％）の活性化に対する部分アゴニストであることが実証されましたのに対し、Ｉ−ＳＡＰ刺激はＧ１３（最大の１９％）に対する部分アゴニストであり、Ｇ１２活性化の際には中性であると実証された。最後に、Ｇ１２活性化で０．７０３、Ｇ１３活性化で０．７４３と査定されたＺ’値が得られ（図５Ｄおよび図５Ｅ）、このアッセイも堅牢で、Ｇ１２／Ｇ１３調節に基づく高処理量スクリーニング適用と互換性があることを示した。
【０１６８】
実施例５：ＧｑファミリーのＧタンパク質の活性化をモニタリングするためのシステムおよびアッセイ。
ＧｑファミリーのＧタンパク質（Ｇｑ、Ｇ１１、Ｇ１４、およびＧ１５）の活性化をモニタリングするためのＰ６３ＲｈｏＧＥＦ系ＢＲＥＴシステムの最適化および使用を、図６Ａ〜図６Ｓで説明している。Ｇｑ結合ドメインを含むＰ６３ＲｈｏＧＥＦの断片（残基２９５〜５０２、Ｐ６３ＲＧ）を、Ｃ末端においてＢＲＥＴドナーＲｌｕｃＩＩでタグ付けした（図６Ａ）。完全長のＰ６３ＲｈｏＧＥＦタンパク質は、そのＮ末端によってＰＭと会合している。ＰＤＺＲＧ−ＲｌｕｃＩＩおよびＰ１１５ＲＧ−ＲｌｕｃＩＩと同様に、Ｐ６３ＲｈｏＧＥＦのＧタンパク質結合ドメインのみを含む断片を使用すると、Ｇタンパク質活性化の際にサイトゾルの局在化および異なる区画への転移が可能になる。異なる膜マーカ（ＰＭの場合はｒＧＦＰ−ＣＡＡＸおよびＥＥの場合はｒＧＦＰ−ＦＹＶＥ）を使用して、ＰＭおよび初期エンドソーム（ＥＥ）でＧタンパク質活性をモニタリングするための最適化を図６Ｂ〜図６Ｅ（ＰＭ）および図６Ｆ〜図６Ｉ（ＥＥ）において提示する。偽は、組換えＧαをトランスフェクトしていない細胞における内在性Ｇタンパク質から得た応答を表す。Ｇｑファミリーのメンバーの活性化を測定するための動的ウィンドウは、Ｇαサブユニットの発現レベルに依存していることが示された。Ｇｑについては図６Ｂに、Ｇ１４については図６Ｄに提示するように、Ｇαがさらに共トランスフェクトされると、動的ウィンドウが上昇する。Ｇ１５については（図６Ｅ）、Ｇα１５をコードする同時トランスフェクトした構築物の５ｎｇで効果はすでに最大であり、それより多量のトランスフェクションでは有意な効果はなかった。Ｇ１１については（図６Ｃ）、トランスフェクトされたＤＮＡのレベルを、５ｎｇを超えて上げると、動的ウィンドウの低下をもたらすことが示された。ＥＥでのＧタンパク質活性のモニタリングについて類似の結果が得られた（図６Ｆ〜図６Ｉ）。
【０１６９】
最適化された条件を使用して、ＰＭ（図６Ｊ〜図６Ｍ）およびＥＥ（図６Ｎ〜図６Ｑ）でのＴＰαＲリガンドＵ４６６１９、Ｉ−ＢＯＰ、ＣＴＡ２、Ｕ５１６０５、Ｉ−ＳＡＰおよびＳＱ  ２９，５５８をプロファイルした。図６Ｊ〜図６Ｍに示すように、Ｕ４６６１９、Ｉ−ＢＯＰおよびＣＴＡ２は、Ｇｑ（図６Ｊ）、Ｇ１４（図６Ｋ）、Ｇ１１（図６Ｌ）およびＧ１５（図６Ｍ）に対する完全なアゴニストであり、Ｕ５１６０５は、部分アゴニストであり（Ｇｑの場合、Ｉ−ＢＯＰ最大応答の３２％、Ｇ１４の場合２５％、Ｇ１１の場合２４％、およびＧ１５の場合１０％）、Ｉ−ＳＡＰ（Ｇｑで７％のみ）およびＳＱ  ２９，５５８は、ＰＭでの４つのＧタンパク質すべての有意な活性化を誘導し損ねている。ＥＥでのＧタンパク質の活性をモニタリングしたときに、類似の結果（効力および有効性）が得られた（図６Ｎ〜図６Ｑ）。Ｕ５１６０５の場合、より高い有効性がＥＥで、Ｇｑ（Ｉ−ＢＯＰ最大応答の７１％）、Ｇ１１（６１％）およびＧ１４（７５％）について観察されたが、Ｇ１５については応答がなかった。最後に、ＰＭでのＧｑおよびＧ１１の活性化についてそれぞれ０．８４０および０．８７９と査定されたＺ’値が得られ（図６Ｒおよび図６Ｓ）、本アッセイも堅牢であり、Ｇｑ調節に基づく高処理量スクリーニング適用と互換性があることを示した。
【０１７０】
ＧｑファミリーのＧタンパク質（Ｇｑ、Ｇ１１、Ｇ１４、およびＧ１５）の活性化をモニタリングするためのＧＲＫ２系ＢＲＥＴシステムの最適化および使用を図７Ａ〜図７Ｆにおいて説明する。２つのＲＧＳ（ＧＲＫ２）構築物を提示している。Ｇｑ結合ドメイン（ＲＧＳドメイン）（残基３０〜２０３、ＲＧＳ（ＧＲＫ２））を含むＧＲＫ２の断片を、Ｎ末端（ＲｌｕｃＩＩ−ＲＧＳ（ＧＲＫ２））またはＣ末端（ＲＧＳ（ＧＲＫ２）−ＲｌｕｃＩＩ）でＢＲＥＴドナーであるＲｌｕｃＩＩでタグ付けした。完全長ＧＲＫ２タンパク質は、ＰＭへの動員を調節するプレクストリン（ＰＨ）ドメインおよびＧβγ相互作用ドメインを有する。ＧＲＫ２のＧｑ結合ＲＧＳドメインのみを使用すると、例えば、他の非Ｇｑ  Ｇタンパク質の活性化を経て調節され得るＰＩＰ２または遊離Ｇβγサブユニットレベルの影響を受けずに、Ｇｑタンパク質の活性化の際にサイトゾルの局在化と異なる区画への転移が有利に可能になる。図７Ｂおよび図７Ｃにおいて、ＲｌｕｃＩＩ−ＲＧＳ（ＧＲＫ２）で得られた用量応答曲線は、ＰＭでのＧｑ、Ｇ１１、Ｇ１４およびＧ１５の活性化について、２つのＧｑ共役型受容体、すなわちアンギオテンシンＩＩで刺激したＡＴ１ＡＲ（図７Ｂ）およびＵ４６６１９で刺激したＴＰαＲ（図７Ｃ）によって提示した。図７Ｄおよび図７Ｅにおいて示すように、ＲｌｕｃＩＩ−ＲＧＳ（ＧＲＫ２）に対して概して動的ウィンドウが低いにもかかわらず、ＲＧＳ（ＧＲＫ２）−ＲｌｕｃＩＩで類似の結果（カップリングおよびＥＣ５０）が得られた。０．７８５と査定されたＺ’値は、１００ｎＭのＵ４６６１９によるＴＰαＲの活性化後のＰＭへのＲｌｕｃＩＩ−ＲＧＳ（ＧＲＫ２）の動員を査定するときに得られ、本アッセイが堅牢であり、Ｇｑ調節に基づく高処理量スクリーニング適用で互換性があることを確認した。
【０１７１】
実施例６：非受容体グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）によるＧタンパク質の活性化をモニタリングするためのシステムおよびアッセイ。
Ｇタンパク質の活性化は、ＧＩＶ（Ｇα相互作用小胞関連タンパク質、Ｇｉｒｄｉｎとしても既知）、ＮＵＣＢ１（ヌクレオビンジン１、ｃａｌｎｕｃとしても既知）、ＮＵＣＢ２、およびＤＡＰＬＥ（振り乱し関連タンパク質）などの非受容体グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）を介して達成することができる。ＧＩＶ／Ｇｉｒｄｉｎ活性は、ＲＴＫ（例えば、ＥＧＦＲ）およびＧｉ活性のインテグリン調節と関係している。ＤＡＰＬＥは、ｗｎｔ／Ｆｒｉｚｚｌｅ受容体（ＧＰＣＲ）を経たｒａｃおよびＧｉの活性化と関係している。ＷＴ  Ｇｉタンパク質のＧＥＦ介在性活性化は、Ｒａｐ１Ｇａｐ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩを使用するシステム／アッセイなど、本明細書に説明するＧｉファミリーのＧタンパク質の活性化をモニタリングするためのシステム／アッセイを使用してモニタリングすることができる。しかしながら、ＧＰＣＲがＥＧＦＲおよびＩＧＦＲなどのＲＴＫをトランス活性化することが示されてきたので、ＨＴＳ適用およびリガンドプロファイリング試験についてＧタンパク質のＧＰＣＲとＧＥＦ介在性活性化との間を区別することができることは有用であり得る。この目的を達成するために、Ｃ末端突然変異を有する突然変異型Ｇαｉ２タンパク質の群（図８Ａ）を設計し、検査した。ＷＴおよび突然変異体Ｇｉ２のＥＧＦＲ介在性活性化を、用量応答曲線においてＧＰＣＲ（ＢＫＢ２Ｒ）応答と比較した。Ｇαｉ２の最後の２つの残基（図８Ｂ、図８Ｃ）またはＧαｉ２（図８Ｄ、図８Ｅ）およびＧαｏＢ（図８Ｆ、８Ｇ）の最後の５つの残基を欠失させることは、Ｇｉ２およびＧｏＢのＥＧＦＲ介在性活性化を維持しながら、ＧＰＣＲ介在性Ｇタンパク質活性化を防ぐのに十分であった。Ｇｉ２については、ＥＧＦＲを共発現する細胞のＷＴ  Ｇタンパク質と比較して、両方の欠失により基礎活性が変化した。２つの保存されたロイシン残基（位置−７および位置−２）で置換を行い、ＥＧＦＲと類似の基礎活性をもたらすが、ＧＰＣＲ活性化の際に依然として不活性である突然変異体との類似の基礎活性をもたらすであろう残基を特定した。Ｌ−７Ｇ突然変異体は、ＥＧＦＲを含むＷＴとは異なる基礎活性を示した（図８Ｈ、８Ｉ）。Ｇαｉ２のＬ−２Ｇ突然変異体を用いた結果は、ＥＧＦＲを用いたＷＴと類似の基礎活性を示したが、ＢＫＢ２Ｒを用いた場合とは異なる基礎活性を示した（図８Ｊ、図８Ｋ）。ＧαｏＢＬ−２Ｇ突然変異体については、基礎活性は両方の受容体についてのＷＴタンパク質と類似していた（図８Ｌ、図８Ｍ）。追加のＬ−２突然変異体Ｇαｉ２タンパク質を検査した（Ｌ−２Ｄ、Ｌ−２ＰおよびＬ−２Ｒ）。Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩのＰＭへのアゴニスト誘導性転移で測定されるように、該追加のＬ−２変異体Ｇａｉ２の動的ウィンドウは、ＷＴタンパク質を用いて測定した場合よりも小さく、基礎活性の違いは、Ｇαｉ２タンパク質の欠失またはＬ−２Ｇ突然変異体に対して非常により近かった（図８Ｎ〜図８Ｓ）。ＷＴ  Ｇαｉ２で０．７０（図８Ｔ）およびＬ−２ＰＧαｉ２突然変異体で０．７３（図８Ｕ）と査定されたＺ’値が得られ、このことは、突然変異体およびＷＴ  Ｇタンパク質の両方を用いた非ＧＰＣＲ介在性Ｇタンパク質活性化をモニタリングするための堅牢なアッセイを示す。図８Ｖ〜図８Ｘは、Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩを使用してＧＰＣＲ（ＳＮＣ８０介在性ＤＯＲ活性化による図８Ｖ、および図８ＷにおいてはＤ２Ｒのキンピロール介在性活性化）およびＧＥＦ介在性Ｇタンパク質活性化（ＥＧＦＲ刺激経由、図８Ｘ）をモニタリングすることができることを示すのに対し、ＲＧＳ（ＲＧＳ１７）−ＲｌｕｃＩＩ系センサは、アゴニストＥＧＦの濃度の漸増の存在下で、ＢＲＥＴシグナルにおける有意な上昇がないので、ＧＰＣＲ介在性活性化をモニタリングするだけであることを示している。ＧＰＣＲの活性化はＲＴＫのトランス活性化につながる可能性があるので、これらの結果は、ＷＴＧα／ＲＧＳ（ＲＧＳ１７）−ＲｌｕｃＩＩおよび突然変異体Ｇα／Ｒａｐ１ＧＡＰ（ＳＳＳ−ＡＡＡ）−ＲｌｕｃＩＩを使用して、ＧＰＣＲ介在性Ｇタンパク質活性化をＲＴＫ／ＧＥＦ介在性Ｇタンパク質活性化と区別することができたという証拠を提供する。
【０１７２】
本発明は、先にその具体的な実施形態によって説明されたが、添付の特許請求の範囲において定義するような本発明の趣旨および性質から逸脱することなく、改変することができる。特許請求の範囲において、「を含んでいる」という用語は、「を含むが、これ（ら）に限定されない」という句と実質的に等価の、無制限の用語として使用される。「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形には、文脈からそうでないことが明確に示されていない限り、対応する複数の参照が含まれる。
【図１Ａ】
2020537531.tif 000008
【図１Ｂ】
2020537531.tif 000009
【図１Ｃ】
2020537531.tif 000010
【図１Ｄ】
2020537531.tif 000011
【図１Ｅ】
2020537531.tif 000012
【図２Ａ】
2020537531.tif 000013
【図２Ｂ】
2020537531.tif 000014
【図２Ｃ】
2020537531.tif 000015
【図２Ｄ】
2020537531.tif 000016
【図２Ｅ】
2020537531.tif 000017
【図２Ｆ】
2020537531.tif 000018
【図２Ｇ】
2020537531.tif 000019
【図２Ｈ】
2020537531.tif 000020
【図２Ｉ】
2020537531.tif 000021
【図２Ｊ】
2020537531.tif 000022
【図２Ｋ】
2020537531.tif 000023
【図２Ｌ】
2020537531.tif 000024
【図２Ｍ】
2020537531.tif 000025
【図２Ｎ】
2020537531.tif 000026
【図２Ｏ】
2020537531.tif 000027
【図２Ｐ】
2020537531.tif 000028
【図２Ｑ】
2020537531.tif 000029
【図２Ｒ】
2020537531.tif 000030
【図２Ｓ】
2020537531.tif 000031
【図２Ｔ】
2020537531.tif 000032
【図２Ｕ】
2020537531.tif 000033
【図２Ｖ】
2020537531.tif 000034
【図２Ｗ】
2020537531.tif 000035
【図２Ｘ】
2020537531.tif 000036
【図２Ｙ】
2020537531.tif 000037
【図２Ｚ】
2020537531.tif 000038
【図３Ａ】
2020537531.tif 000039
【図３Ｂ】
2020537531.tif 000040
【図３Ｃ】
2020537531.tif 000041
【図３Ｄ】
2020537531.tif 000042
【図４Ａ】
2020537531.tif 000043
【図４Ｂ】
2020537531.tif 000044
【図４Ｃ】
2020537531.tif 000045
【図４Ｄ】
2020537531.tif 000046
【図４Ｅ】
2020537531.tif 000047
【図４Ｆ】
2020537531.tif 000048
【図４Ｇ】
2020537531.tif 000049
【図５Ａ】
2020537531.tif 000050
【図５Ｂ】
2020537531.tif 000051
【図５Ｃ】
2020537531.tif 000052
【図５Ｄ】
2020537531.tif 000053
【図５Ｅ】
2020537531.tif 000054
【図６Ａ】
2020537531.tif 000055
【図６Ｂ】
2020537531.tif 000056
【図６Ｃ】
2020537531.tif 000057
【図６Ｄ】
2020537531.tif 000058
【図６Ｅ】
2020537531.tif 000059
【図６Ｆ】
2020537531.tif 000060
【図６Ｇ】
2020537531.tif 000061
【図６Ｈ】
2020537531.tif 000062
【図６Ｉ】
2020537531.tif 000063
【図６Ｊ】
2020537531.tif 000064
【図６Ｋ】
2020537531.tif 000065
【図６Ｌ】
2020537531.tif 000066
【図６Ｍ】
2020537531.tif 000067
【図６Ｎ】
2020537531.tif 000068
【図６Ｏ】
2020537531.tif 000069
【図６Ｐ】
2020537531.tif 000070
【図６Ｑ】
2020537531.tif 000071
【図６Ｒ】
2020537531.tif 000072
【図６Ｓ】
2020537531.tif 000073
【図７Ａ】
2020537531.tif 000074
【図７Ｂ】
2020537531.tif 000075
【図７Ｃ】
2020537531.tif 000076
【図７Ｄ】
2020537531.tif 000077
【図７Ｅ】
2020537531.tif 000078
【図７Ｆ】
2020537531.tif 000079
【図８Ａ】
2020537531.tif 000080
【図８Ｂ】
2020537531.tif 000081
【図８Ｃ】
2020537531.tif 000082
【図８Ｄ】
2020537531.tif 000083
【図８Ｅ】
2020537531.tif 000084
【図８Ｆ】
2020537531.tif 000085
【図８Ｇ】
2020537531.tif 000086
【図８Ｈ】
2020537531.tif 000087
【図８Ｉ】
2020537531.tif 000088
【図８Ｊ】
2020537531.tif 000089
【図８Ｋ】
2020537531.tif 000090
【図８Ｌ】
2020537531.tif 000091
【図８Ｍ】
2020537531.tif 000092
【図８Ｎ】
2020537531.tif 000093
【図８Ｏ】
2020537531.tif 000094
【図８Ｐ】
2020537531.tif 000095
【図８Ｑ】
2020537531.tif 000096
【図８Ｒ】
2020537531.tif 000097
【図８Ｓ】
2020537531.tif 000098
【図８Ｔ】
2020537531.tif 000099
【図８Ｕ】
2020537531.tif 000100
【図８Ｖ】
2020537531.tif 000101
【図８Ｗ】
2020537531.tif 000102
【図８Ｘ】
2020537531.tif 000103
【図９Ａ】
2020537531.tif 000104
【図９Ｂ】
2020537531.tif 000105
【図９Ｃ】
2020537531.tif 000106
【図９Ｄ】
2020537531.tif 000107
【配列表】
2020537531000001.app
【国際調査報告】
2020537531.tif 000108
2020537531.tif 000109