(57)【要約】  本発明は、対象のリンパ腫の治療方法に関し、より詳細には、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、及び非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療方法に関する。本方法は、対象に有効量のＣＤ８３結合タンパク質を投与することを含む。本発明はまた、対象のリンパ腫の診断及び評価方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のリンパ腫の治療方法であって、前記対象に有効量のＣＤ８３結合タンパク質を投与することを含む方法。
【請求項２】
前記リンパ腫がＨＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リンパ腫がＮＨＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＨＬがＭＣＬである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＮＨＬがＤＬＢＣＬである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＮＨＬがＦＬである、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＤ８３結合タンパク質が、
（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）であって、
（ｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列；又は
（ｉｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）
を含む重鎖可変領域と；
（ｂ）軽鎖可変領域であって、
（ｉｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２配列及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む抗原結合ドメインを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＤ８３結合タンパク質が、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２配列及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２配列及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と
を含む抗原結合ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＣＤ８３結合タンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む抗原結合ドメインを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＤ８３結合タンパク質が、
（ｉ）配列番号１０に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号１２に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｉｉ）配列番号１０に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号１３に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｉｉｉ）配列番号１０に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号１４に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｉｖ）配列番号１０に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号１５に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｖ）配列番号２１に示されるとおりの重鎖配列及び配列番号１６に示されるとおりの軽鎖配列；又は
（ｖｉ）配列番号２１に示されるとおりの重鎖配列及び配列番号１７に示されるとおりの軽鎖配列；又は
（ｖｉ）配列番号２１に示されるとおりの重鎖配列及び配列番号１８に示されるとおりの軽鎖配列；又は
（ｖｉｉ）配列番号２１に示されるとおりの重鎖配列及び配列番号１９に示されるとおりの軽鎖配列；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２１に示されるとおりの重鎖配列及び配列番号２０に示されるとおりの軽鎖配列；又は
（ｉｘ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２３に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｘ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２４に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｘｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２５に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｘｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２６に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２７に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２８に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２９に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号３０に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号３１に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号３２に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号３３に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号３４に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｖｉｘ）配列番号３５に示されるとおりの重鎖配列及び配列番号３６に示されるとおりの軽鎖配列
を含む抗原結合ドメインを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣＤ８３結合タンパク質が抗体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＤ８３結合タンパク質がモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＤ８３結合タンパク質が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ２、及びｓｃＦｖからなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記モノクローナル抗体が３Ｃ１２Ｃである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＣＤ８３結合タンパク質が部分にコンジュゲートされる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記部分が治療用又は診断用部分である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
リンパ腫の重症度又はステージの診断、又は評価方法であって、リンパ腫に罹患していない、又は既知の重症度のリンパ腫に罹患している対象のｓＣＤ８３レベルと比べた前記対象の血清中ｓＣＤ８３レベルを比較することを含む方法。
【請求項１８】
対象にリンパ腫治療が奏効するかどうかの決定方法であって、治療前、治療中及び／又は治療後の対象の血清中ｓＣＤ８３レベルを決定すること、及び治療中及び／又は治療後のｓＣＤ８３レベルを治療前のｓＣＤ８３レベルと比較することを含み、治療中及び／又は治療後のｓＣＤ８３レベルが治療前のｓＣＤ８３レベルと比べて減少すると、前記対象は治療が奏効する、方法。
【請求項１９】
前記リンパ腫がＨＬである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記リンパ腫がＮＨＬである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＨＬがＤＬＢＣＬである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＮＨＬがＭＣＬである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＤ８３結合タンパク質と、リンパ腫の治療への前記ＣＤ８３結合タンパク質の使用に関する説明書とを含む、対象のリンパ腫の治療用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、オーストラリア仮特許出願第２０１７９０３７２６号明細書からの優先権を主張し、この出願の全体は参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、対象のリンパ腫の治療方法に関し、より詳細には、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、並びにびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及びマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）などの非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
リンパ腫は、リンパ球から生じる一群の血液細胞腫瘍である。リンパ腫の主要な２つの種類は、ＨＬ及びＮＨＬである。
【０００４】
ＨＬは、ホジキン・リード−シュテルンベルク細胞（ＨＲＳ）によって引き起こされる血液系悪性腫瘍である。ＮＨＬには、ＨＬを除くあらゆるリンパ腫が含まれる。現在、ＨＬに罹患している患者は多剤化学療法及び放射線療法で治療される。現行のＨＬ療法は成功率が高いものの、２５％の患者は一次又は二次のいずれかの化学療法に対して難治性（ｒｅｆａｃｔｏｒｙ）になると疾患再発を経験し、特にかかる療法を忍容できない高齢患者において生存率は実質的に低く留まっている。ＮＨＬ療法はＨＬ療法よりも成功率が低い。ＮＨＬを有する約２人に１人がＤＬＢＣＬ形態のリンパ腫を有することになり、更なる５〜１０％がＭＣＬを有することになる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
特に高リスク特徴を有する患者において、リンパ腫の治療のための新規ターゲット療法がなおも必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の第１の態様は、対象のリンパ腫の治療方法を提供し、この方法は、対象に有効量のＣＤ８３結合タンパク質を投与することを含む。
【０００７】
本発明の代替的な第１の態様は、対象のリンパ腫の治療用医薬の製造におけるＣＤ８３結合タンパク質の使用；又は対象のリンパ腫の治療又は予防における使用のためのＣＤ８３結合タンパク質を提供する。
【０００８】
本発明の第２の態様は、対象のＨＬの治療方法を提供し、この方法は、対象に有効量のＣＤ８３結合タンパク質を投与することを含む。
【０００９】
本発明の代替的な第２の態様は、対象のＨＬの治療用医薬の製造におけるＣＤ８３結合タンパク質の使用；又は対象のＨＬの治療における使用のためのＣＤ８３結合タンパク質を提供する。
【００１０】
本発明の第３の態様は、対象のＮＨＬの治療方法を提供し、この方法は、対象に有効量のＣＤ８３結合タンパク質を投与することを含む。
【００１１】
本発明の代替的な第３の態様は、対象のＮＨＬの治療用医薬の製造におけるＣＤ８３結合タンパク質の使用；又は対象のＮＨＬの治療における使用のためのＣＤ８３結合タンパク質を提供する。
【００１２】
第４の態様は、対象のマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）の治療方法を提供し、この方法は、対象に有効量のＣＤ８３結合タンパク質を投与することを含む。
【００１３】
代替的な第４の態様は、対象のＭＣＬの治療用医薬の製造におけるＣＤ８３結合タンパク質の使用；又は対象のＭＣＬの治療における使用のためのＣＤ８３結合タンパク質を提供する。
【００１４】
第５の態様は、対象のびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）の治療方法を提供し、この方法は、対象に有効量のＣＤ８３結合タンパク質を投与することを含む。
【００１５】
代替的な第５の態様は、対象のＤＬＢＣＬの治療用医薬の製造におけるＣＤ８３結合タンパク質の使用；又は対象のＤＬＢＣＬの治療における使用のためのＣＤ８３結合タンパク質を提供する。
【００１６】
第６の態様は、対象のＤＬＢＣＬ、ＭＣＬ又はＨＬの治療方法を提供し、この方法は、対象に有効量のＣＤ８３抗体コンジュゲートを投与することを含む。
【００１７】
代替的な第６の態様は、対象のＤＬＢＣＬ、ＭＣＬ又はＨＬの治療用医薬の製造におけるＣＤ８３抗体コンジュゲートの使用；又は対象のＤＬＢＣＬ、ＭＣＬ又はＨＬの治療における使用のためのＣＤ８３抗体コンジュゲートを提供する。
【００１８】
第７の態様は、対象のＤＬＢＣＬ、ＭＣＬ又はＨＬの治療方法を提供し、この方法は、対象に有効量のＣＤ８３結合タンパク質（ｂｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を投与することを含み、ここでＣＤ８３結合タンパク質は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。
【００１９】
代替的な第７の態様は、対象のＤＬＢＣＬ、ＭＣＬ又はＨＬの治療用医薬の製造におけるＣＤ８３結合タンパク質の使用を提供し、ここでＣＤ８３結合タンパク質は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）であり；又は対象のＤＬＢＣＬ、ＭＣＬ又はＨＬの治療における使用のためのＣＤ８３結合タンパク質を提供し、ここでＣＤ８３結合タンパク質は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）である。
【００２０】
第８の態様は、対象のＤＬＢＣＬ、ＭＣＬ又はＨＬの治療方法を提供し、この方法は、有効量（ａｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）のＣＡＲ  Ｔ細胞を投与することを含み、ここでＣＡＲ  Ｔ細胞はＣＤ８３結合タンパク質を含む。
【００２１】
代替的な第８の態様は、対象のＤＬＢＣＬ、ＭＣＬ又はＨＬの治療用医薬の製造におけるＣＤ８３結合タンパク質を含むＣＡＲ  Ｔ細胞の使用；又は対象のＤＬＢＣＬ、ＭＣＬ又はＨＬの治療における使用のためのＣＤ８３結合タンパク質を含むＣＡＲ−Ｔ細胞を提供する。
【００２２】
本発明の第９の態様は、対象のリンパ腫の診断方法を提供し、この方法は、対象のリンパ球がＣＤ８３を発現するかどうかを決定することを含む。
【００２３】
第１０の態様は、対象のリンパ腫の重症度又はステージの評価方法を提供し、この方法は、対象の血清中の可溶性ＣＤ８３（ｓＣＤ８３）レベルを決定することを含む。
【００２４】
第１１の態様は、ＣＤ８３結合タンパク質と、リンパ腫の治療へのＣＤ８３結合タンパク質の使用に関する説明書とを含む、対象のリンパ腫の治療用キットを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＨＬ細胞株上にＣＤ８３が発現することを示す。図１（Ａ）は、それぞれ、ＨＢ１５ａ−ＦＩＴＣ、ＨＢ１５ｅ−ＦＩＴＣ又は３Ｃ１２Ｃ−ＦＩＴＣ抗ＣＤ８３  ｍＡｂで染色したＫＭ−Ｈ２、Ｌ４２８及びＨＤＬＭ−２リンパ腫細胞株上のＣＤ８３発現のフローサイトメトリーによる分析結果を示すヒストグラムである。灰色のヒストグラム、アイソタイプ対照；白抜きのヒストグラム、抗ＣＤ８３抗体。ＣＤ３０染色を陽性対照として使用した。これらのデータは、比較結果を含む３つの独立した実験を代表するものである。図１（Ｂ）は、ＫＭ−Ｈ２細胞上のＣＤ１５、ＣＤ２５、ＣＤ４０及びＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）発現のフローサイトメトリーによる分析結果を示すヒストグラムである。
【図２】ＨＬ患者及びかなりの割合のＤＬＢＣＬ患者においてＨＲＳ細胞上にＣＤ８３が発現することを示す。図２（Ａ）は、抗ＣＤ８３及び抗ＣＤ３０抗体によるＨＬのパラフィン包埋リンパ節生検試料の染色を示す顕微鏡像（倍率×２００）である（濃い部分）。一つの代表的な試料が示される。図２（Ｂ）は、抗ＣＤ２０、抗ＣＤ８３及び抗ＣＤ３抗体によるびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）患者のパラフィン包埋リンパ節生検試料の染色を示す顕微鏡像である（濃い領域）（倍率×２００）。図２（Ｃ）は、ＨＬ患者（ｎ＝３５）のＨＲＳ細胞におけるＣＤ８３発現レベルの分析結果を示す円グラフである。高発現：＞９０％のＨＲＳ細胞でＣＤ８３陽性；中程度：ＨＲＳ細胞で１０〜９０％のＣＤ８３＋；低発現：ＨＲＳ細胞で１０％のＣＤ８３＋。図２（Ｄ）は、強拡大（倍率×２００）での図２（Ｃ）に関する各発現群の一つの代表的な試料の画像である。矢印は、ＣＤ８３を発現するＨＲＳ細胞を示す。
【図３】ＨＲＳからＴ細胞へのＣＤ８３分子のトロゴサイトーシスを示す。図３（Ａ）は、健常ドナーＰＢＭＣ由来のＴ細胞をＫＭ−Ｈ２細胞と１：５の比で４時間共培養した後のＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ８３発現のパーセンテージを示すグラフである。ＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣＤ８３発現はフローサイトメトリーによって分析し、データは５つの実験からのものだった。図３（Ｂ）は、Ｔ細胞及びＫＭ−Ｈ２細胞をトランズウェル有り又は無しで４時間共培養した後のＣＤ３＋  Ｔ細胞上のＣＤ８３発現を示すプロットである。Ｔ細胞上のＣＤ８３発現はフローサイトメトリーによって分析し、３つの代表的な実験のうちの１つを示す。図３（Ｃ）は、ＫＭ−Ｈ２細胞をＣｅｌｌＶｕｅ  Ｃｌａｒｅｔで標識し、精製ＣＤ３＋Ｔ細胞と５：１の比で４時間共培養した後のＣＤ３＋Ｔ細胞上のＣｅｌｌＶｕｅ  Ｃｌａｒｅｔ（Ｃｌａｒｅｔ）発現を示すプロットである。Ｔ細胞上のＣｅｌｌＶｕｅ  Ｃｌａｒｅｔ発現はフローサイトメトリーによって分析した。データは３つの実験を代表するもの。図３（Ｄ）は、ＫＭ−Ｈ２細胞と４時間共培養したＣＤ８３＋のトロゴサイトーシスを受けたＴ細胞上のＰＤ−１（ＣＤ２７９）発現レベルを示すグラフである。発現はフローサイトメトリーによって決定した（ｎ＝４）。一元配置ＡＮＯＶＡ分析のｐ値を示す。図３（Ｅ）は、ＫＭ−Ｈ２細胞と４時間共培養した後のトロゴサイトーシスを受けたＣＤ４＋Ｔ又はＣＤ８＋Ｔ細胞上のＰＤ−１発現レベルを示すグラフである。発現はフローサイトメトリーによって分析した（ｎ＝４）。一元配置ＡＮＯＶＡ分析のｐ値を示す。図３（Ｆ）は、フローサイトメトリーを用いたＴ細胞上のＰＤ−１発現の分析から得られた代表的なプロットである。
【図４】ＨＬ細胞が分泌する可溶性ＣＤ８３（ｓＣＤ８３）によってＴ細胞増殖が阻害され（ｉｎｈｂｉｔｉｅｄ）、３Ｃ１２Ｃを加えることによりｓＣＤ８３活性が消失することを示す。図４（Ａ）は、ＫＭ−Ｈ２、Ｌ４２８細胞株からの上清（ＳＮ）及びＨＬ患者からの診断用血清中にＥＬＩＳＡによって検出されたｓＣＤ８３の濃度を示すグラフである。マン・ホイットニーｔ検定のｐ値を示した。図４（Ｂ）は、ＣＦＳＥで標識し、且つＫＭ−Ｈ２の２５％ＳＮ又は＋３Ｃ１２Ｃ（抗ＣＤ８３  ｍＡｂ）（５μｇ／ｍｌ）の存在下においてＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズ（３：１）で５日間刺激した精製Ｔ細胞についての増殖指数（ＰＩ）を示すグラフである。細胞はフローサイトメトリーによって分析し、全ＣＤ３＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞についてＦｌｏｗ  Ｊｏを使用して増殖指数（ＰＩ）を計算した（ｎ＝６）。一元配置ＡＮＯＶＡ分析のｐ値を示す。図４（Ｃ）は、ＣＤ２／ＣＤ３ＣＤ２８マイクロビーズで刺激したＣＦＳＥ標識ヒトＴ細胞に種々の容積（ｖ／ｖ）のＫＭ−Ｈ２上清を加えたときのフローサイトメトリー分析の結果を示すヒストグラムである。５日目にＴ細胞を収集し、ＣＦＳＥをフローサイトメトリーによって分析した。増殖の指標としてＰＩ及び分裂指数（ＤＩ）を計算した。３つの同様の実験のうちの１つからの代表的なデータを示す。図４（Ｄ）は、ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズで刺激し、次に２５％（ｖ／ｖ）ＫＭ−Ｈ２  ＳＮ中で抗体３Ｃ１２Ｃ（５及び１０μｇ／ｍｌ）有り又は無しで培養したＣＦＳＥ標識Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すヒストグラムである。５日目にＴ細胞増殖を分析した。図４（Ｅ）は、ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズで刺激し、次に種々の濃度の３Ｃ１２Ｃのみと培養したＣＦＳＥ標識Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示すヒストグラムである。３Ｃ１２Ｃ単独は、ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８マイクロビーズによる刺激後もＣＦＳＥ標識Ｔ細胞の増殖に効果を及ぼさなかった。
【図５】ＨＬ患者における化学療法中のｓＣＤ８３の経時変化を示す。図５は、ＥＬＩＳＡによって調べた、異なる化学療法サイクル中の６人のＨＬ患者の血清中ｓＣＤ８３レベルを示すグラフである。矢印は、いつＰＥＴスキャンを実施したかを示し、完全奏効（ＣＲ）、部分奏効（ＰＲ）又は疾患進行（ＰＤ）の結果が注記される。
【図６】３Ｃ１２Ｃ及び３Ｃ１２Ｃ−モノメチル−アウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）がインビトロでＨＬ細胞株を死滅させることを示す。図６（Ａ）は、カルセイン−ＡＭで標識した標的細胞ＫＭ−Ｈ２又はＬ４２８をエフェクター細胞（ヒトＰＢＭＣ）と２５：１のＥ：Ｔ比で０μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌの漸増３Ｃ１２Ｃ濃度で３７℃において３時間共培養したときの細胞傷害パーセンテージを示すグラフである。上清を収集して、遊離カルセインの蛍光読み取り（励起４８５ｎｍ、発光５３８ｎｍ）を行った。ＡＤＣＣ活性を計算した（ｎ＝３）。図６（Ｂ）は、ＫＭ−Ｈ２又はＨＬ−６０細胞を種々の濃度の３Ｃ１２Ｃ−ＭＭＡＥと３日間培養した後の生細胞数を示すグラフである。フローサイトメトリーでの７ＡＡＤ染色による生細胞。半数阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。
【図７】３Ｃ１２Ｃが非ヒト霊長類においてＢ細胞を減少させたことを示す。０、７、１４及び２１日目に５匹の非ヒト霊長類に３Ｃ１２Ｃ（１、５、１０、１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝４）又はヒトＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１）を注射した。２８日目、３Ｃ１２Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）及び対照で治療した動物からリンパ節生検を採取した。図７（Ａ）は、５匹の動物のＰＢＭＣからのフローサイトメトリーによるＣＤ１９＋Ｂ細胞数を示すグラフである。破線は、０日目における基準細胞数を示す。＊は、当該動物においてＷＢＣが極めて高かった１時点を示す。図７（Ｂ）は、パラフィン包埋リンパ節生検試料上の抗ヒトＣＤ２０  ｍＡｂで染色された細胞を示す画像である。１０ｍｇ／ｋｇの３Ｃ１２Ｃ又はヒトＩｇＧの投与を受けた動物からの画像が示され、前者はＢ細胞の減少を示している。
【図８】ＣＤ８３及びＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅した後のＨＬ細胞株ｍＲＮＡの電気泳動結果を示す画像である。
【図９】ＫＭ−Ｈ２細胞と共培養したＴ細胞からのＴｒｅｇ細胞を示す。精製Ｔ細胞をＫＭ−Ｈ２細胞と１：５の比で４時間共培養し、ＣＤ８３＋Ｔ細胞中のＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏｗＴｒｅｇ細胞の割合をフローサイトメトリーによって分析した。Ｔ細胞のみの培養条件を対照として使用した。３つの実験中１つのデータがＴｒｅｇ細胞の増加を示さない。
【図１０】ＨＬ株の上清中のＩＬ−１０レベルを示すグラフである。ＫＭ−Ｈ２、Ｌ４２８及びＨＤＬＭ２の上清を回収し、ＣＢＡ  ＩＬ−１０ビーズアッセイでＩＬ−１０レベルを計測した。低いレベルが実証された。ＰＨＡ活性化Ｔ細胞の上清を陽性対照として使用した。
【図１１】ＨＬ６０株上のＣＤ８３発現を示すグラフである。ＨＬ６０上のＣＤ８３発現をマウス抗ヒトＣＤ８３  ｍＡｂ  ＨＢ１５ａ、ＨＢ１５ｅ又はヒト抗ヒトＣＤ８３  ｍＡｂ  ３Ｃ１２Ｃでフローサイトメトリーによって分析した。灰色に塗り潰したヒストグラムはＣＤ８３抗体のアイソタイプ対照であった。
【図１２】３Ｃ１２Ｃが非ヒト霊長類において安全であることを示すグラフである。０、７、１４及び２１日目に５匹の非ヒト霊長類（ヒヒ）に３Ｃ１２Ｃ（１［ＴＡ１］、５［ＴＡ２］、１０［ＴＡ３］、１０［ＴＡ４］ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝４）又はヒトＩｇＧ（１０［ＣＴＲ］ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝１）を注射した。血球数（赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＢＣ）及び血小板）、肝機能（ＡＬＰ、ＡＳＴレベル）及び腎機能（クレアチニンレベル）の分析のため、血液及び血清試料を採取した。１０ｍｇ／ｋｇの３Ｃ１２Ｃ又はヒトＩｇＧの投与を受ける動物のデータを示す。ＴＡ１＝１ｍｇ／ｋｇの投与を受ける動物、ＴＡ２＝５ｍｇ／ｋｇの投与を受ける動物、ＴＡ３＝１０ｍｇ／ｋｇの投与を受ける動物、ＴＡ４＝１０ｍｇ／ｋｇの投与を受ける動物、ＣＴＲ＝１０ｍｇ／ｋｇのヒトＩｇＧの投与を受ける対照動物。
【図１３】患者からのＭＣＬ及びＦＬにおけるＣＤ８３発現を示す顕微鏡像である。ＭＣＬ患者及び濾胞性リンパ腫（ＦＬ）患者からのパラフィン包埋リンパ節生検試料でのＣＤ８３発現（濃い範囲）の顕微鏡像（倍率×２００）。
【図１４】３Ｃ１２Ｃ−ＭＭＡＥがＤＬＢＣＬ及びＭＣＬ細胞株を死滅させることを示す。ＤＬＢＣＬ株ＫＡＲＰＡＳＳ−１１０６Ｐ又はＭＣＬ株Ｍｉｎｏ細胞を種々の濃度の３Ｃ１２Ｃ−ＭＭＡＥと７２時間インキュベートし、次にフローサイトメトリーによって生細胞をカウントした。ＫＭ−Ｋ２細胞を対照として使用した。半数阻害濃度（ＩＣ５０）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本開示は、対象のリンパ腫の治療方法に関する。
【００２７】
リンパ腫は、リンパ球から生じる一群の血液細胞腫瘍である。リンパ腫はＨＬ又はＮＨＬであり得る。
【００２８】
一実施形態において、リンパ腫はＨＬである。ホジキンリンパ腫は、ホジキン・リード−シュテルンベルク細胞（ＨＲＳ細胞）の存在によって特徴付けられるリンパ腫である。ＨＲＳ細胞は、典型的には、顕著な核小体及びＣＤ４５−、ＣＤ３０＋、ＣＤ１５＋＋／−免疫表現型を有する大型二核細胞として特定される。ＨＲＳ細胞の典型的な特徴には、大きいサイズ（２０〜５０マイクロメートル）、多量、両染性、細かい顆粒状の／均一な細胞質；好酸球性核小体及び厚い核膜（核膜の近くにクロマチンが分布している）を各々が有する２つの鏡像状の核（フクロウの目）が含まれる。
【００２９】
別の実施形態において、リンパ腫はＮＨＬである。ＮＨＬは、ＨＲＳ細胞が関わらないリンパ腫である。
【００３０】
一実施形態において、ＮＨＬはＭＣＬである。マントル細胞リンパ腫は、正常な胚中心濾胞を取り囲むマントルゾーン内のＣＤ５陽性抗原ナイーブプレ胚中心Ｂ細胞に起因した、Ｂ細胞リンパ腫の亜型である。マントル細胞リンパ腫細胞は、概してサイクリンＤ１を過剰発現する。
【００３１】
一実施形態において、ＮＨＬはびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）である。
【００３２】
別の実施形態において、ＮＨＬ亜型は、ＣＤ８３陽性染色細胞株からの濾胞性リンパ腫（ＦＬ）である。典型的には、濾胞性リンパ腫は、ＣＤ８３陽性（ｐｏｓｔｉｖｅ）染色で且つ細胞膜上に誘導されたＲＮＡタンパク質を含む細胞株からのものである。
【００３３】
リンパ腫の治療方法は、対象に有効量のＣＤ８３結合タンパク質を投与することを含む。
【００３４】
ＣＤ８３は１回膜貫通Ｉ型膜タンパク質であり、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ８３の異なるアイソフォームをコードする３つのヒト転写変異体が特定されている。限定でなく、命名する目的で、配列番号１（ＮＰ＿００４２２４．１；アイソフォームａ）、配列番号２（ＮＰ＿００１０３５３７０．１；アイソフォームｂ）及び配列番号３（ＮＰ＿００１２３８８３０．１；アイソフォームｃ）にヒトＣＤ８３（ｈＣＤ８３）アイソフォームのアミノ酸配列を示す。従って、一例において、ヒトＣＤ８３のアミノ酸配列は、配列番号１、２、又は３に示されるとおりのアミノ酸配列を含む。ＣＤ８３の相同体は、チンパンジー（Ｐａｎ  ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ）（ＸＰ＿５１８２４８．２）、アカゲザル（Ｍａｃａｃａ  ｍｕｌａｔｔａ）（ＸＰ＿００１０９３５９１．１）、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）（ＸＰ＿８５２６４７．１）、ウシ（Ｂｏｓ  Ｔａｕｒｕｓ）（ＮＰ＿００１０４００５５．１）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）（ＮＰ＿０３３９８６．１）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）（ＮＰ＿００１１０１８８０．１）及びニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）（ＸＰ＿４１８９２９．１）に見出すことができる。
【００３５】
ＣＤ８３は活性化樹状細胞（ＤＣ）のマーカーであり、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、マクロファージ、好中球等にもまた発現する。膜結合型のＣＤ８３と、可溶性型のＣＤ８３（ｓＣＤ８３）とがある。
【００３６】
ＣＤ８３結合タンパク質
ＣＤ８３結合タンパク質は、ＣＤ８３への特異的結合能を有するタンパク質である。用語「ＣＤ８３結合タンパク質」には、ＣＤ８３への特異的結合能を有する単一のポリペプチド鎖（即ち、ペプチド結合によってつながった一続きの連続アミノ酸）、又は共有結合的若しくは非共有結合的に互いにつながった一続きのポリペプチド鎖（即ち、ポリペプチド複合体又はタンパク質）が含まれる。例えば、一続きのポリペプチド鎖は、好適な化学結合又はジスルフィド結合を用いて共有結合的につながっていてもよい。非共有結合的な結合の例には、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、及び疎水性相互作用が含まれる。
【００３７】
ＣＤ８３結合タンパク質は、典型的には抗原結合ドメインを含む。「抗原結合ドメイン」は、抗体のなかで抗原への特異的結合能を有する領域である。ＣＤ８３結合タンパク質の抗原結合ドメインはＣＤ８３に特異的に結合する。抗原結合ドメインは、典型的には、抗体の重鎖可変領域の相補性決定領域（ＣＤＲ）１、２及び／又は３、及び／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含む。より典型的には、抗原結合ドメインは、抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３、及び軽鎖可変領域のＣＤＲ１、２及び３を含む。なおもより典型的には、抗原結合ドメインは、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）、及び／又は軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。抗原結合ドメインは抗体全体のコンテクストでなくてもよく、例えばそれは単離されていても（例えばドメイン抗体）又は別の形態（例えばｓｃＦｖ）であってもよい。
【００３８】
「抗体」は、抗体のＦｖ領域内に含まれる抗原結合ドメインによって１つ又は少数の密接に関連する抗原（例えば、ＣＤ８３）に特異的に結合する能力を有するタンパク質を指す。抗体は、４本鎖抗体（例えば、２本の軽（Ｌ）鎖及び２本の重（Ｈ）鎖）、組換え、又は修飾抗体（例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ＣＤＲグラフト化抗体、霊長類化抗体、脱免疫化抗体、シンヒューマナイズド（ｓｙｎｈｕｍａｎｉｚｅｄ）抗体、ハーフ抗体、及び二重特異性抗体）を含む。抗体は概して定常ドメインを含み、これは、定常領域又は定常断片又は結晶化可能断片（Ｆｃ）となるように配列され得る。抗体の例示的形態は、その基本単位として４本鎖構造を含む。完全長抗体は、共有結合的につながった２本の重鎖（各約５０〜７０ｋＤａ）と、２本の軽鎖（各約２３ｋＤａ）とを含む。軽鎖は概して可変領域（存在する場合）と定常ドメインとを含み、哺乳類ではκ軽鎖又はλ軽鎖のいずれかである。重鎖は概して可変領域と、ヒンジ領域によって別の１つ又は複数の定常ドメインにつながった１つ又は２つの定常ドメインとを含む。哺乳類の重鎖は、以下のタイプα、δ、ε、γ、又はμのうちの一つである。各軽鎖もまた、重鎖のうちの一方に共有結合的につながっている。例えば、２本の重鎖並びに重鎖及び軽鎖は、鎖間ジスルフィド結合によって、及び非共有結合性相互作用によって一体に保持される。鎖間ジスルフィド結合の数は異なる種類の抗体間で変わり得る。各鎖はＮ末端可変領域（各々が約１１０アミノ酸長であるＶＨ又はＶＬ）と、Ｃ末端における１つ以上の定常ドメインとを有する。軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ、これは約１１０アミノ酸長である）は、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１、これは３３０〜４４０アミノ酸長である）と整列してジスルフィド結合している。軽鎖可変領域は重鎖の可変領域と整列している。抗体重鎖は２つ以上の更なるＣＨドメイン（ＣＨ２、ＣＨ３など）を含んでもよく、ＣＨ１及びＣＨ２定常ドメイン間にヒンジ領域を含んでもよい。抗体は任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）又はサブクラスであってもよい。一例において、抗体はネズミ科動物（マウス又はラット）抗体又は霊長類（ヒトなど）抗体である。様々な実施形態において、抗体は、ヒト化、シンヒューマナイズド（ｓｙｎｈｕｍａｎｉｚｅｄ）、キメラ、ＣＤＲグラフト化又は脱免疫化である。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「可変領域」は、抗原への特異的結合能を有し、且つ相補性決定領域（ＣＤＲ）、即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びにフレームワーク領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む本明細書に定義するとおりの抗体の軽鎖及び／又は重鎖の一部分を指す。例えば、可変領域は、３つ又は４つのＦＲ（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び任意選択でＦＲ４）を３つのＣＤＲと共に含む。ＶＨは重鎖の可変領域を指す。ＶＬは軽鎖の可変領域を指す。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、用語「相補性決定領域」（即ち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、その存在が特異的抗原結合に寄与する大きな要因である抗体可変領域中のアミノ酸残基を指す。各可変領域ドメイン（ＶＨ又はＶＬ）は、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と特定される３つのＣＤＲ領域を有する。一例において、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７  ａｎｄ  １９９１（本明細書では「Ｋａｂａｔ付番方式」とも称される）に従い定義される。別の例において、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられるアミノ酸位置は、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｏｔｈｉａ  Ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  Ｓｃｈｅｍｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｕｋ）に従い定義される。Ｋａｂａｔの付番方式によれば、ＶＨ  ＦＲ及びＣＤＲは以下のとおり位置する：残基１〜３０（ＦＲ１）、３１〜３５（ＣＤＲ１）、３６〜４９（ＦＲ２）、５０〜６５（ＣＤＲ２）、６６〜９４（ＦＲ３）、９５〜１０２（ＣＤＲ３）及び１０３〜１１３（ＦＲ４）。Ｋａｂａｔの付番方式によれば、ＶＬ  ＦＲ及びＣＤＲは以下のとおり位置する：残基１〜２３（ＦＲ１）、２４〜３４（ＣＤＲ１）、３５〜４９（ＦＲ２）、５０〜５６（ＣＤＲ２）、５７〜８８（ＦＲ３）、８９〜９７（ＣＤＲ３）及び９８〜１０７（ＦＲ４）。本開示は、Ｋａｂａｔ付番方式により定義されるとおりのＦＲ及びＣＤＲに限定されず、標準的な付番方式又はＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７，１９８７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３，１９８９；及び／又はＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８，１９９７のもの；Ｈｏｎｎｅｇｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐｌｕｅｋｔｈｕｎ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０，２００１の付番方式；又はＧｉｕｄｉｃｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２０６−２１１  １９９７に考察されるＩＭＧＴ方式を含め、あらゆる付番方式を含む。一例において、ＣＤＲはＫａｂａｔ付番方式に従い定義される。
【００４１】
「フレームワーク領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変領域残基である。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、用語「Ｆｖ」は、複数のポリペプチドを含むか、それとも単一のポリペプチドを含むかに関わらず、ＶＬ及びＶＨが会合して、抗原への特異的結合能を有する抗原結合ドメインを有する複合体を形成する任意のタンパク質を指す。抗原結合ドメインを形成するＶＨ及びＶＬは、単一のポリペプチド鎖にあってもよく、又は異なるポリペプチド鎖にあってもよい。更に、本開示のＦｖ（並びに本開示の任意のタンパク質）は、同じ抗原に結合しても又はしなくてもよい複数の抗原結合ドメインを有し得る。この用語は、抗体に直接由来する断片並びに組換え手段を用いて作製された、かかる断片に対応するタンパク質を包含すると理解されるものとする。例示的Ｆｖ含有ポリペプチド又はタンパク質としては、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ若しくはそれより高次の複合体、又は定常領域若しくはそのドメイン、例えばＣＨ２若しくはＣＨ３ドメインにつながった前述のいずれか、例えばミニボディが、ＣＡＲ  Ｔ細胞コンストラクトのような他のタンパク質を含め、挙げられる。
【００４３】
「Ｆａｂ断片」は免疫グロブリンの一価抗原結合断片からなり、全抗体を酵素パパインで消化することにより作製されてもよく、インタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなる断片が生じ、又は組換え手段を用いて作製されてもよい。
【００４４】
抗体の「Ｆａｂ’断片」は、全抗体のペプシン処理と、続く還元によって得られてもよく、インタクトな軽鎖とＶＨ及び単一の定常ドメインを含む重鎖の一部分とからなる分子が生じる。このように処理される抗体１つにつき２つのＦａｂ’断片が得られる。Ｆａｂ’断片はまた、組換え手段によって作製されてもよい。
【００４５】
抗体の「Ｆ（ａｂ’）２断片」は、２つのジスルフィド結合によって一体に保持された２つのＦａｂ’断片の二量体からなり、全抗体分子を酵素ペプシンで処理し、続く還元は行わないことによって得られる。
【００４６】
「Ｆａｂ２」断片は、例えばロイシンジッパー又はＣＨ３ドメインを用いてつながった２つのＦａｂ断片を含む組換え断片である。
【００４７】
「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とが好適な可動性ポリペプチドリンカーによって共有結合的につながった、抗体の可変領域断片（Ｆｖ）を含む組換え分子である。
【００４８】
本明細書で使用されるとき、ＣＤ８３結合タンパク質又はその抗原結合ドメインと抗原との相互作用に関する用語「結合」は、その相互作用が抗原上の特定の構造（例えば、抗原決定基又はエピトープ）の存在に依存することを意味する。例えば、抗体は、タンパク質全般というよりむしろ、特異的タンパク質構造を認識してそれに結合する。抗体がエピトープ「Ａ」に結合する場合、標識された「Ａ」と抗体とを含む反応物中において、エピトープ「Ａ」（又は遊離した、非標識の「Ａ」）を含む分子が存在すれば、抗体に結合する標識された「Ａ」の量が減少することになる。
【００４９】
特定の抗原「に特異的に結合する」又は「特異的にそれに結合する」タンパク質は、それが別の抗原と反応し又は会合するのと比べて、特定の抗原とより高頻度に、より急速に、より長い持続期間で及び／又はより高い親和性で反応し又は会合するタンパク質である。例えば、ＣＤ８３に特異的に結合するタンパク質は、それが他の抗原に結合するのと比べてより高い親和性、アビディティで、より急速に、及び／又はより長い持続期間でＣＤ８３と結合する。一例において、ある抗原へのＣＤ８３結合タンパク質の「特異的結合」とは、タンパク質がその抗原に対し、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下など、例えば２０ｎＭ以下、１５ｎＭ以下又は１０ｎＭ以下又は５ｎＭ以下又は１ｎＭ以下又は５００ｐＭ以下又は４００ｐＭ以下又は３００ｐＭ以下又は２００ｐＭ以下又は１００ｐＭ以下などの平衡定数（ＫＤ）で結合することを意味する。
【００５０】
本明細書で使用されるとき、用語「エピトープ」（同義語「抗原決定基」）は、抗体の抗原結合ドメインを含むタンパク質が結合する抗原中の一領域を意味する。この用語は、必ずしもタンパク質が接触する具体的な残基又は構造に限定されるわけではない。例えば、この用語には、タンパク質が接触するアミノ酸にわたる領域及び／又はこの領域外の少なくとも５〜１０又は２〜５又は１〜３アミノ酸が含まれる。一部の例において、エピトープは線状の一続きのアミノ酸である。エピトープはまた、抗原が折り畳まれると互いに近くに位置するようになる一続きの不連続なアミノ酸、即ち「立体エピトープ」も含み得る。当業者はまた、用語「エピトープ」がペプチド又はポリペプチドに限定されないことも認識しているであろう。例えば、用語「エピトープ」には、糖側鎖、ホスホリル側鎖、又はスルホニル側鎖など、分子の化学的に活性な表面基が含まれ、及び、特定の例では、特定の三次元構造特性、及び／又は特定の電荷特性を有し得る。エピトープ又はそれを含むペプチド若しくはポリペプチドは、動物に投与して、そのエピトープに対する抗体を産生させることができる。
【００５１】
本方法は、対象が忍容できる、且つＣＤ８３に高親和性を有する任意のＣＤ８３結合タンパク質を用い得る。本発明の方法における使用に好適なＣＤ８３結合タンパク質は、抗体又は抗原結合ドメインを含む（例えば抗体の可変領域を含む）タンパク質のライブラリをスクリーニングしてＣＤ８３結合タンパク質を同定することにより同定し得る。ＣＤ８３に特異的に結合する抗原結合ドメインを含むタンパク質のライブラリのスクリーニング方法については、例えば、国際公開第２０１４／１１７２２０号パンフレット、及び国際公開第２０１６／０６１６１７号パンフレットに記載されている。
【００５２】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は抗体である。
【００５３】
一実施形態において、抗体はポリクローナル抗体である。ポリクローナル抗体は、当該技術分野において公知の方法を用いて調製し得る。ポリクローナル抗体は、哺乳類において、例えば、哺乳類の免疫化に使用される抗原性組成物の１回以上の注射により産生させることができる。典型的には、抗原性組成物は複数回の静脈内、皮下又は腹腔内注射によって投与される。免疫化プロトコルは当業者が容易に選択し得る。ポリクローナル抗体の免疫化及び単離方法については、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｃｈａｐｔｅｒ  ５に記載されている。
【００５４】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質はモノクローナル抗体又はその抗原結合断片である。モノクローナル抗体は当該技術分野において公知の方法を用いて調製されてもよく、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ｂｙ  Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ，１９８８，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ５−７に記載されている。モノクローナル抗体は、例えば、マウス、ハムスター、又は他の適切な宿主動物を抗原で免疫して、その抗原に特異的に結合するだろう抗体を産生する又は産生することのできるリンパ球を誘発することにより調製されてもよい。抗原は、典型的には、国際公開第２０１６／０６１６１７号パンフレットに記載されるものなど、例えばＣＤ８３タンパク質を含む抗原性組成物を投与することにより投与されることになる。概して、ヒト由来の細胞が所望される場合には末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が使用されるか、又は非ヒト哺乳類供給源が所望される場合には脾臓細胞若しくはリンパ節細胞が使用されるかのいずれかである。次にこのリンパ球がポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して不死化細胞株と融合され、ハイブリドーマ細胞が形成される。不死化細胞株は、通常、形質転換哺乳類細胞、特にげっ歯類、ウシ及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウス骨髄腫細胞株が利用される。ハイブリドーマ細胞は、融合しなかった不死化細胞の成長又は生存を阻害する１つ以上の物質を好ましくは含有する好適な培養培地中で培養されてもよい。例えば、親細胞に酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）が欠損している場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的にはヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含むことになり（「ＨＡＴ培地」）、これらの物質がＨＧＰＲＴ欠損細胞の成長を防止する。
【００５５】
ＣＤ８３タンパク質に対する抗体の初期産生後、抗体を配列決定し、続いて組換え技術により調製してヒト化抗体などのキメラ抗体を作製することができる。マウス抗体及び抗体断片のキメラ化は当業者に公知である。キメラ化モノクローナル抗体に由来する抗体成分を使用すると、マウス配列の免疫原性に伴う潜在的問題が減少する。
【００５６】
マウス抗体からの可変ドメインは、当該技術分野において公知の、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｅｄｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ，ｖｏｌｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００１に記載されている従来技術を用いてクローニングされてもよい。一般に、マウス抗体の可変軽鎖及び可変重鎖配列は、ＲＴ−ＰＣＲ、５’−ＲＡＣＥ、及びｃＤＮＡライブラリスクリーニングなど、種々の分子クローニング手順によって入手することができる。キメラ抗体とは、一つの種に由来する抗体、典型的にはマウス抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含めた可変領域を含む一方で、抗体分子の定常ドメインがヒトなどの別の種に由来する抗体タンパク質である。
【００５７】
一部の実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質はヒト化抗体である。ヒト化抗体とは、一つの種由来の抗体；例えばマウス抗体からのＣＤＲがマウス抗体の重鎖及び軽鎖可変鎖からヒト重鎖及び軽鎖可変ドメイン（例えば、フレームワーク領域配列）に移されている形態のキメラ抗体である。抗体分子の定常ドメインはヒト抗体のものに由来する。
【００５８】
ＣＤ８３結合タンパク質は、そのもので、キメラ抗体であってもよい。本明細書に記載される方法に用いられるキメラ抗体は、ＣＤ８３タンパク質に特異的に結合するマウスｍＡｂの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、典型的にはフレームワーク領域（ＦＲ）とを含む。このキメラ抗体はヒト抗体の軽鎖及び重鎖定常領域を含み得る。キメラ化モノクローナル抗体に由来する抗体成分を使用すると、マウス定常領域の免疫原性に伴う潜在的問題が減少する。マウス抗体及び抗体断片のヒト化は当業者に公知であり、例えば、米国特許第５２２５５３９号明細書；米国特許第６０５４２９７号明細書；及び米国特許第７５６６７７１号明細書に記載されている。例えば、ヒト化モノクローナル抗体は、マウス相補性決定領域をマウス免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖可変鎖からヒト可変ドメインに移し、次に、マウス対応物のフレームワーク領域内においてヒト残基を置換することにより作製されてもよい。ヒト定常領域配列に加えてヒトフレームワーク領域配列を使用すると、ＨＡＭＡ反応が引き起こされる可能性が更に減少する。抗体は、種々の十分に確立された技法によって血清及びハイブリドーマ培養物から単離し、精製することができる。かかる単離技法には、プロテインＡセファロースによるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、及びイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．７．１−２．７．１２  ａｎｄ  ｐａｇｅｓ  ２．９．１−２．９．３を参照のこと。また、Ｂａｉｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ），”  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ  ７９−１０４（Ｔｈｅ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９２）も参照のこと。
【００５９】
一部の実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は完全にヒト化されたモノクローナル抗体である。一方で、ヒト化抗体は、一つの種由来の抗体；例えばマウス抗体からのＣＤＲがマウス抗体の重鎖及び軽鎖可変鎖からヒト重鎖及び軽鎖可変ドメイン（例えば、フレームワーク領域配列）に移されている形態のキメラ抗体である。抗体分子の定常ドメインはヒト抗体のものに由来する。
【００６０】
ＣＤ８３を標的とする抗体は、当業者に周知の種々の技法によって特徴付けることができる。例えば、抗体がＣＤ８３に特異的に結合する能力は、例えば、間接的酵素イムノアッセイ、フローサイトメトリー分析、ＥＬＩＳＡ又はウエスタンブロット分析を用いて確認することができる。
【００６１】
ＣＤ８３結合タンパク質は、典型的には抗体の重鎖及び／又は軽鎖の可変領域を含み、それがＣＤ８３に特異的に結合する。可変重鎖及び／又は軽鎖の一部分は、Ｆｖ断片など、別個のポリペプチド鎖上にあってもよく、又は単一のポリペプチド鎖上にあって、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって結び付けられていてもよい（「ｓｃＦｖタンパク質」）。一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は抗体の抗原結合断片である。抗体の抗原結合断片は、抗体の抗原結合ドメインを含む。抗原結合断片の例には、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓＦｖ、ｓｃＦｖなどが含まれる。典型的には、抗原結合断片は可変重鎖及び／又は可変軽鎖のＣＤＲ１、２及び／又は３領域を含む。より典型的には、抗原結合断片は可変重鎖及び／又は可変軽鎖のＣＤＲ１、２及び３領域を含む。なおもより典型的には、抗原結合断片は可変重鎖のＣＤＲ１、２及び３領域並びに可変軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。特異的エピトープを認識する抗原結合断片は、公知の技法によって作成することができる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、例えば、抗体分子のペプシン消化によって作製することができる。これら及び他の方法が、例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．８．１−２．８．１０  ａｎｄ  ２．１０．−２．１０．４によって記載されている。或いは、所望の特異性を有するＦａｂ’断片の迅速且つ容易な同定を可能にするため、Ｆａｂ’発現ライブラリを構築することができる。
【００６２】
一部の実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）である。単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）はＶＬドメインとＶＨドメインとを含む。ＶＬ及びＶＨドメインは典型的にはペプチドリンカー（Ｌ）によって共有結合的につながり、折り畳まれて抗原結合部位を形成する。ＶＨ及びＶＬ領域は互いに直接つなぎ合わされ得るが、当業者は、これらの領域が、１アミノ酸以上からなるペプチドリンカーによって隔てられてもよいことを理解するであろう。ペプチドリンカー及びその使用については当該技術分野において公知である。概してペプチドリンカーには、領域をつなぎ合わせること又はＶＨとＶＬとの間に幾らかの最小距離若しくは他の空間的関係を保つこと以外に特別な生物学的活性はないであろう。しかしながら、ペプチドリンカーの構成アミノ酸が、折り畳み、正味電荷、又は疎水性など、分子の何らかの特性に影響を及ぼすように選択されてもよい。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体は、任意選択で、５０アミノ酸長以下、概して４０アミノ酸長以下、好ましくは３０アミノ酸長以下、及びより好ましくは２０アミノ酸長以下のペプチドリンカーを含む。
【００６３】
ｓｃＦｖ抗体の作製方法は当該技術分野において公知であり、例えば、米国特許第５２６０２０３号明細書に記載されている。例えば、免疫動物由来のＢ細胞からのｍＲＮＡ、又はヒトドナーのパネルから精製したＢリンパ球から得られるｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを調製する。このｃＤＮＡを、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域に特異的なプライマーを使用して増幅する。ＰＣＲ産物を精製し、核酸配列をつなぎ合わせる。リンカーペプチドが所望される場合、そのペプチドをコードする核酸配列を重鎖核酸配列と軽鎖核酸配列との間に挿入する。ｓｃＦｖをコードする核酸をベクターに挿入し、適切な宿主細胞において発現させる。所望の抗原に特異的に結合するｓｃＦｖは、典型的にはファージディスプレイライブラリのパニングによって見つけ出される。パニングは幾つかの方法のうちのいずれでも実施することができる。パニングは、好都合には、その表面上に所望の抗原を発現する細胞を使用するか、又は所望の抗原でコーティングされた固体表面を使用して実施することができる。好都合には、表面は磁気ビーズであってもよい。未結合のファージを固体表面から洗い流し、結合したファージを溶出させる。
【００６４】
他の抗原結合断片の調製方法が当該技術分野において公知である。例えば、抗原結合断片はまた、完全長抗体のタンパク質分解性加水分解によるか、又は断片をコードするＤＮＡの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくは別の宿主における発現によって調製することもできる。抗体断片は、従来の方法による完全長抗体のペプシン又はパパイン消化によって入手することができる。例えば、抗体断片は、抗体をペプシンで酵素的に切断することにより作製してもよく、Ｆ（ａｂ’）２と呼ばれる約１００Ｋｄ断片を提供することができる。この断片は、チオール還元剤、及び任意選択でジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基のブロック基を使用して更に切断してもよく、約５０Ｋｄ  Ｆａｂ’一価断片を作製することができる。或いは、パパインを使用した酵素的切断により、２つの一価Ｆａｂ断片及びＦｃ断片が直接作製される。
【００６５】
重鎖の分離による一価軽鎖−重鎖断片の形成、断片の更なる切断、又は他の酵素的、化学的若しくは遺伝学的技法など、抗体を切断する他の方法もまた、インタクトな抗体によって認識されるエピトープにその断片が結合する限り用いられてよい。
【００６６】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は二重特異性抗体である。二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有する又は同じ抗原上の２つのエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル、好ましくはヒト又はヒト化抗体である。
【００６７】
一部の実施形態において、二重特異性抗体は二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーである。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は、人工的二重特異性モノクローナル抗体の一クラスである。ＢｉＴＥは、異なる抗体の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、又は４つの異なる遺伝子からのアミノ酸配列を単一のペプチド鎖上に典型的に含む融合タンパク質である。ｓｃＦｖのうちの一方は腫瘍抗原（例えば本明細書に記載されるＣＤ８３標的）に結合し、他方は概して、ＣＤ３受容体を介してＴ細胞などのエフェクター細胞に結合する。二重特異性抗体の調製方法については、例えば、Ｌａｓｚｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４  Ｊａｎ  ２３；１２３（４）：５５４−５６１；Ｌｏｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ（２０００），９５：２０９８−１０３に記載されている。
【００６８】
別の実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ  Ｔ細胞）に対するキメラ抗原受容体である。この点で、ｓｃＦｖなど、抗原結合ドメインを含むポリペプチドをコードする核酸をシグナル伝達分子と併せて使用してＴ細胞を形質導入することにより、ＣＡＲ  Ｔ細胞を作製することができる。ＣＡＲ  Ｔ細胞に発現する抗原結合ドメインは、非ＭＨＣ拘束的に抗原を認識することができる。従って、例えば本明細書に記載される抗ＣＤ８３抗体の抗原結合ドメインをコードするｓｃＦｖがＴ細胞の表面上に発現すると、リンパ腫細胞上のＣＤ８３のターゲティングにおいて有効となり得る。ＣＡＲ  Ｔ細胞の調製方法は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｓｈａｎｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ，２５  Ｊｕｎｅ  ２０１５  Ｖｏｌｕｍｅ  １２５，Ｎｏ．２６：４０１７−４０２３；Ｏ’Ｈｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ；１００（３）：３３６−３４４に記載されている。
【００６９】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質はヒトモノクローナル抗体であってもよい。ヒトモノクローナル抗体はヒト免疫系からの遺伝子を有するトランスジェニックマウスを免疫することにより作成してもよく、又はファージヒトｓｃＦｖライブラリから誘導してもよい。例えば、再配列されていないヒト重鎖及び軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウスを免疫してヒトモノクローナル抗体を作製してもよい。ヒト抗体を作製するためのトランスジェニックマウスの例は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５９３−５９７；Ｔｏｍｉｚｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）ＰＮＡＳ  ９７：７２２−７２７に記載されている。
【００７０】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は完全ヒト抗体である。かかる抗体は、ヒトｓｃＦｖから作製して、ヒト抗体の定常ドメインを有する抗体に再フォーマット化してもよい。例えば、ヒトドナーのパネルから精製したＢリンパ球から得られるｍＲＮＡを使用して、本明細書に記載されるとおりのヒトｓｃＦｖを作製し得る。ヒト抗体は、ｓｃＦｖ配列に含まれる重鎖及び軽鎖可変領域に重鎖及び軽鎖定常領域を加えることにより調製してもよい。
【００７１】
本明細書に記載される抗体を使用して、同じエピトープ、又は重複するエピトープに結合する他のＣＤ８３結合タンパク質、例えば抗体などを、そのエピトープに対する交差競合を評価することにより単離してもよい。本明細書に記載される抗体又は抗原結合断片との交差競合は、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ分析など、当該技術分野において公知の方法を用いて評価することができる。
【００７２】
本発明の方法における使用に好適なＣＤ８３結合タンパク質の例としては、抗ＣＤ８３抗体ＨＢ１５ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｕｌｔｅｒから入手可能）、ＨＢ１５ｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）、国際公開第２０１４／１１７２２０号パンフレットに記載されるとおりのモノクローナル抗体３Ｃ１２、３Ｃ１２Ｂ、３Ｃ１２Ｃ、３Ｃ１２Ｄ及び３Ｃ１２Ｅ、及び国際公開第２０１６／０６１６１７号パンフレットに記載されるとおりのモノクローナル抗体１Ｆ７、又はその誘導体が挙げられる。
【００７３】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列；又は
（ｉｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）
を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【００７４】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は、
（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）であって、
（ｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列；又は
（ｉｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）
を含む重鎖可変領域と；
（ｂ）軽鎖可変領域（ＶＬ）であって、
（ｉ）配列番号１２、１３、１１、１４、又は１５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも９０％同一の配列；又は
（ｉｉ）配列番号１２、１３、１１、１４、又は１５に示されるアミノ酸配列のいずれか１つの３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）；又は
（ｉｉｉ）配列番号４０に示されるとおりのコンセンサス配列、又は
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、又はＣＤＲ３のアミノ酸配列が、配列番号３７、３８、又は３９に示されるコンセンサス配列である３つのＣＤＲ
を含む軽鎖可変領域と
を含む。
【００７５】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は、
（ａ）重鎖可変領域（ＶＨ）であって、
（ｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列；又は
（ｉｉ）配列番号１０に示されるアミノ酸配列の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）
を含む重鎖可変領域と；
（ｂ）軽鎖可変領域であって、
（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２配列及び配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列
を含む軽鎖可変領域と
を含む抗原結合ドメインを含む。
【００７６】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は、
（ａ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列、配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２配列及び配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域と；
（ｂ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１配列、配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２配列及び配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域と
を含む抗原結合ドメインを含む。
【００７７】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む抗原結合ドメインを含む。
【００７８】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は、国際公開第２０１４／１１７２２０号パンフレットに記載されるとおりのモノクローナル抗体３Ｃ１２Ｃである。
【００７９】
様々な他の実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は、
（ｉ）配列番号１０に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号１２に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｉｉ）配列番号１０に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号１３に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｉｉｉ）配列番号１０に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号１４に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｉｖ）配列番号１０に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号１５に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｖ）配列番号２１に示されるとおりの重鎖配列及び配列番号１６に示されるとおりの軽鎖配列；又は
（ｖｉ）配列番号２１に示されるとおりの重鎖配列及び配列番号１７に示されるとおりの軽鎖配列；又は
（ｖｉ）配列番号２１に示されるとおりの重鎖配列及び配列番号１８に示されるとおりの軽鎖配列；又は
（ｖｉｉ）配列番号２１に示されるとおりの重鎖配列及び配列番号１９に示されるとおりの軽鎖配列；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２１に示されるとおりの重鎖配列及び配列番号２０に示されるとおりの軽鎖配列；又は
（ｉｘ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２３に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｘ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２４に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｘｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２５に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｘｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２６に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２７に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２８に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号２９に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号３０に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号３１に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号３２に示されるとおりのＶＬ配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号３３に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｖｉｉｉ）配列番号２２に示されるとおりのＶＨ配列及び配列番号３４に示されるとおりのＶＬ配列；又は
（ｖｉｘ）配列番号３５に示されるとおりの重鎖配列及び配列番号３６に示されるとおりの軽鎖配列
を含む抗原結合ドメインを含む。
【００８０】
一態様において、対象のリンパ腫の治療方法が提供され、この方法は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む有効量のＣＤ８３結合タンパク質を投与すること含む。
【００８１】
別の態様は、対象のＨＬの治療方法を提供し、この方法は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む有効量のＣＤ８３結合タンパク質を投与することを含む。
【００８２】
別の態様は、対象のマントル細胞リンパ腫の治療方法を提供し、この方法は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む有効量のＣＤ８３結合タンパク質を投与することを含む。
【００８３】
別の態様は、対象のＤＬＢＣＬの治療方法を提供し、この方法は、配列番号１０のアミノ酸配列を含む可変重鎖と、配列番号１１のアミノ酸配列を含む可変軽鎖とを含む有効量のＣＤ８３結合タンパク質を投与することを含む。
【００８４】
本明細書に記載される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするヌクレオチド配列の例は、配列番号４１〜５９に示される。
【００８５】
配列表の概要を以下に示す：
【００８６】
【表１】
2020533384.tif 000002
【００８７】
【表２】
2020533384.tif 000003
【００８８】
実施例に更に記載されるとおり、本発明者らはまた、抗ヒトＣＤ８３モノクローナル抗体及びその毒素コンジュゲートの死滅効果も分析し、非ヒト霊長類トライアルにおいてその安全性も試験した。
【００８９】
エフェクター機能
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質はエフェクター機能を誘導し得る。
【００９０】
本明細書に記載されるとおり、「エフェクター機能」は、抗体が結合する細胞の死滅を生じさせる抗体の生物学的活性（例えば、Ｆｃ領域に結合する細胞又はタンパク質によって媒介される）を指す。抗体によって誘導されるエフェクター機能の例としては、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）；及びＢ細胞活性化が挙げられる。
【００９１】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」又は「ＡＤＣＣ」は、抗体が結合した標的細胞が、結合した抗体のＦｃ領域を認識するＦｃ受容体を有するエフェクター細胞（例えば、ナチュラルキラー（「ＮＫ」）細胞、好中球及び／又はマクロファージ）によって溶解することを指す。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するため、インビトロＡＤＣＣアッセイを実施してもよい。かかるアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（「ＰＢＭＣ」）及びＮＫ細胞が含まれる
【００９２】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は、細胞の表面上にあるＣＤ８３に対し、それがＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣなどのエフェクター機能を誘導できるような方法で結合する。
【００９３】
別の実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は、抗体の重鎖の特異的アミノ酸の改変によるか、又は抗体重鎖の糖鎖部分の改変により、エフェクター機能の誘導が向上するように操作されている。
【００９４】
エフェクター機能の決定方法は当該技術分野において公知であり、例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３，１９８６及びＢｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１，１９８７；米国特許第７３１７０９１号明細書；Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３，１９９６に記載されている）。免疫グロブリンによって誘導されるＡＤＣＣレベルを評価するための他のアッセイには、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．ＣＡ、ＵＳＡ）又はＣｙｔｏＴｏｘ  ９６（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ、ＵＳＡ）が含まれる。
【００９５】
イムノコンジュゲート
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質はイムノコンジュゲートである。本明細書で使用されるとき、イムノコンジュゲートは、治療用部分及び／又は診断用部分などの部分にコンジュゲートした抗体又はその抗原結合断片である。
【００９６】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は、治療用部分を含むイムノコンジュゲートである。治療用部分は、疾患の治療において有用な化合物、分子又は原子である。治療用部分の例としては、薬物、例えば細胞傷害剤、例えば、化学療法剤；アポトーシス促進剤；放射性同位体；免疫毒素が挙げられる。細胞傷害剤は、細胞にとって有害な化合物である。細胞傷害剤（ｃｙｔｏｘｏｔｏｘｉｃ  ａｇｅｎｔ）の例としては、ドキソルビシン、シクロホスファミド、メトトレキサート、ムスチン、ビンクリスチン、プロカルバジン（ｐｒｏｃａｒｂｚｉｎｅ）、プレドニゾロン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ダカルバジン、シクロホスファミド、プロカルバジン、パクリタキセル、イリノテカン、ゲムシタビン、フルオロウラシル、シタラビン、オゾガマイシン、アドリアマイシン、エトポシド、メルファラン、マイトマイシンＣ、クロラムイル（ｃｈｌｏｒａｍｕｉｌ）、ダウノルビシンが挙げられる。放射性同位体の例としては、リン−３２、銅−６７、ヒ素−７７、ロジウム−１０５、パラジウム−１０９、銀−１１１、スズ−１２２１、ヨウ素−１２５、ヨウ素−１３１、ホルミウム−１６６、ルテチウム−１７７、レニウム−１８６、イリジウム−１９４、金−１９９、アスタチン−２１１、イットリウム−９０、及びビスマス−２１２が挙げられる。免疫毒素の例は、例えば、Ｗａｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｂｌｏｏｄ，１２３：２４７０−２４７７に記載され、例えば、ジフテリア毒素Ａ、リシンｄｇＡ、緑膿菌外毒素Ａ、グロニン（ｇｌｏｎｉｎ）、リポソーム、粒子又は実際には任意の毒素送達が挙げられる。
【００９７】
一実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は、診断用部分を含むイムノコンジュゲートである。診断用部分は、抗体又は抗原結合断片のその標的抗原への結合の検出に有用な化合物、分子又は原子である。診断用部分は、放射性核種又は非放射性核種、造影剤（磁気共鳴画像法、コンピュータ断層撮影法又は超音波法用のものなど）を含むことができる。診断用部分には、例えば、放射性同位体、色素（ビオチン−ストレプトアビジン複合体を含むものなど）、造影剤、蛍光化合物又は分子及び磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）又は陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）スキャニング用の促進剤（例えば、常磁性イオン）が含まれる。一実施形態において、診断用部分は、放射性同位体、磁気共鳴画像法に用いられる促進剤、及び蛍光化合物からなる群から選択される。抗体成分に放射性金属又は常磁性イオンを負荷するためには、イオン結合用の多数のキレート基を結合させるための長いテールを有する試薬とそれを反応させる必要があり得る。かかるテールは、ポリマー、例えば、ポリリジン、多糖、又はその他、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＮＥＴＡ、ポルフィリン類、ポリアミン類、クラウンエーテル類、ビス−チオセミカルバゾン類、ポリオキシム類、及び本目的上有用であることが公知の同様の基など、キレート基を結合させることのできるペンダント基を有する誘導体化された又は誘導体化可能な鎖であってもよい。キレートは、標準的なケミストリーを用いて抗体とカップリングされる。キレートは通常、免疫反応性の損失を最小限に抑え且つ凝集及び／又は内部架橋結合を最小限に抑えつつ分子との結合の形成を可能にする基によって抗体につながる。
【００９８】
治療用及び診断用部分を抗体又は抗原結合断片とコンジュゲートする方法は、当該技術分野において公知である。
【００９９】
本明細書に記載されるＣＤ８３結合タンパク質は、典型的には対象への投与用の医薬組成物として製剤化される。典型的には、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体と共に製剤化されたＣＤ８３結合タンパク質を含む。「薬学的に許容可能な担体」とは、それが組成物中の他の成分と適合性を有し、且つ対象にとって有害でないことを意味する。本組成物は、以下に記載するとおりの他の治療剤を含有してもよく、医薬製剤の技術分野において周知のものなどの技法に従い、例えば、従来の液体媒体又は希釈剤、並びに所望の投与方法に適切な種類の医薬添加剤（例えば、賦形剤、結合剤、保存剤、安定剤、香料等）を利用することにより製剤化されてもよい（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ  Ｅｄ．，２００５，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓを参照のこと）。
【０１００】
ＣＤ８３結合タンパク質を含む医薬組成物は、典型的には滅菌注射用水性懸濁液の形態である。この懸濁液は、公知の技術に従い製剤化されてもよく、水性懸濁液の製造に好適な賦形剤との混合物中に活性物質を含有し得る。かかる賦形剤としては、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム及びアカシアゴムを挙げることができ；分散剤又は湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えばレシチン、又はアルキレンオキシドと脂肪酸、例えばステアリン酸ポリオキシエチレンとの縮合生成物、又はエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコール、例えばヘプタデカエチレンオキシセタノールとの縮合生成物、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール由来の部分エステル、例えばポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートとの縮合生成物、又はエチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトール無水物由来の部分エステル、例えばポリエチレンソルビタンモノオレエートとの縮合生成物であってもよい。水性懸濁液はまた、１つ以上の保存剤、例えば、エチル、又はｎ−プロピル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸、１つ以上の着色剤、１つ以上の香味剤、及び１つ以上の甘味剤、例えばスクロース又はサッカリンなどを含有してもよい。
【０１０１】
滅菌注射用製剤はまた、例えば１，３−ブタンジオール中の溶液としての、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤又は溶媒中にある滅菌注射用溶液又は懸濁液であってもよい。利用し得る許容可能な媒体及び溶媒の中には、水、リンゲル溶液及び等張食塩水があり得る。加えて、滅菌固定油が、従来、溶媒又は懸濁媒として利用される。本目的上、合成モノグリセリド又はジグリセリドを含め、任意の無刺激固定油を用いることができる。加えて、注射用製剤の調製においては、オレイン酸などの脂肪酸に用途が見出される。
【０１０２】
医薬組成物は、任意の好適な手段により、典型的には、皮下、静脈内、筋肉内、皮内（経皮）、又は大槽内注射若しくは注入技法によるなど、非経口的に（例えば、滅菌注射用水性溶液又は懸濁液として）；非毒性の薬学的に許容可能な媒体又は希釈剤を含有する投薬量単位製剤で投与されてもよい。ＣＤ８３結合タンパク質は、例えば、即効型放出又は徐放性放出に好適な形態で投与されてもよい。即効型放出又は徐放性放出は、化合物を含む好適な医薬組成物の使用によるか、又は特に徐放性放出の場合、皮下インプラント又は浸透圧ポンプなどの装置の使用によって実現し得る。
【０１０３】
対象への投与用の医薬組成物は、好都合には投薬量単位形態で提供されてもよく、薬学の技術分野において周知の方法のいずれによって調製されてもよい。一般に、医薬組成物は、化合物を液体担体と均一且つ均質に合体させることにより調製される。医薬組成物中には、活性化合物は、疾患の過程又は状態に対する所望の効果を生じさせるのに十分な量で含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「組成物」は、指定量の指定成分を含む生成物、並びに指定量の指定成分の組み合わせから直接又は間接的にもたらされる任意の生成物を包含することが意図される。
【０１０４】
概して、用語「治療する」は、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を達成するため対象、組織又は細胞に影響を及ぼすことを意味し、（ａ）疾患に罹り易い素因があり得るが、まだそれに罹っているとは診断されていない対象において疾患の発生を予防すること；（ｂ）疾患を抑制すること、即ち、その発症を止めること；又は（ｃ）疾患の効果を軽減又は緩和すること、即ち、疾患の効果の退縮を生じさせることが含まれる。一実施形態において、治療は、レシピエント対象の悪性リンパ球数が減少する結果を実現する。
【０１０５】
用語「対象」は、本方法による治療が必要な疾患を有する任意の動物を指す。ヒトなどの霊長類に加え、種々の他の哺乳類が本発明の方法を用いて治療され得る。例えば、限定はされないが、雌ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、モルモット、ラット又は他のウシ亜科動物、ヒツジ科動物、ウマ科動物、イヌ科動物、ネコ科動物、げっ歯類又はネズミ科動物種を含めた哺乳類が治療され得る。
【０１０６】
用語「有効量」は、研究者、獣医師、医師又は他の臨床家が求める組織、全身、動物又はヒトの生物学的又は医学的応答を誘発するであろうＣＤ８３結合タンパク質の量を指す。
【０１０７】
リンパ腫の治療又は予防において、適切な投薬量レベルは概して約０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ患者体重／用量であり得る。好ましくは、投薬量レベルは約０．１〜約２５ｍｇ／ｋｇ／用量；より好ましくは約０．５〜約１０ｍｇ／ｋｇ／用量であり得る。好適な投薬量レベルは約０．０１〜２５ｍｇ／ｋｇ／用量、約０．０５〜１０ｍｇ／ｋｇ／用量、又は約０．１〜５ｍｇ／ｋｇ／用量であってもよい。この範囲内で、投薬量は０．０５〜０．５、０．５〜５又は５〜５ｍｇ／ｋｇ／用量であってもよい。投薬量は１回又は複数回投与されてもよい。
【０１０８】
任意の特定の患者に対する投薬量の具体的な用量レベル及び頻度は異なることもあり、利用する具体的な化合物の活性、当該化合物の代謝安定性及び作用時間、年齢、体重、全般的な健康、性別、食事、投与方法及び時間、排泄速度、薬物併用、詳細な病態の重症度、及び加療中の宿主を含め、種々の要因に依存し得ることは理解されるであろう。
【０１０９】
一部の例では用量漸増レジームが用いられ、ここでは最初にＣＤ８３結合タンパク質又は他の活性成分が後続用量で用いられるよりも低用量で投与される。この投薬量レジームは、対象が当初から有害事象を患っている場合に有用である。
【０１１０】
治療が十分に奏効しない対象の場合、１週間に複数の用量が投与されてもよい。或いは、又は加えて、増量した用量が投与されてもよい。
【０１１１】
１つ以上のＣＤ８３結合タンパク質は、単独でも、又は別の薬物若しくは薬剤との併用でも（その前、それと同時、又はその後に）、適切な経路によって対象に投与することができる。例えば、本開示のＣＤ８３結合タンパク質は、リンパ腫の治療に典型的に使用される１つ以上の化学療法剤など、１つ以上の薬剤と例えば併用して投与することができる。リンパ腫の治療に好適な化学療法剤の例としては、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン、ダカルバジン（ｄｅｃａｒｂａｚｉｎｅ）、エトポシド、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジン、カルムスチン、エトポシド、シタラビン、メルファラン、クロラムブシル、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｂｅ）、シスプラチン、又はこれらの組み合わせが挙げられる。リンパ腫の治療用の化学療法剤併用としては、ＡＢＶＤ（ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン及びダカルバジン）、ＣｈｌＶＰＰ（クロラムブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン及びプレドニゾン）、ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、シタラビン、及びシスプラチン）、ＢＥＡＭ（カルムスチン、エトポシド、シタラビン、及びメルファラン）、ＢＥＡＣＯＰＰ（ブレオマイシン、エトポシド、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジン、及びプレドニゾロン）が挙げられる。
【０１１２】
一部の実施形態において、ＣＤ８３結合タンパク質は、リンパ腫の治療に有効であり得る１つ以上の他の結合タンパク質と併用して投与されてもよい。例えば、ＣＤ８３結合タンパク質は、抗ＰＤ１及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体など、ＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１結合タンパク質と併用して（その前、それと同時、又はその後に）投与されてもよい。抗ＰＤ１又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体の例は当該技術分野において公知であり、例えば、ニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ペンブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ）及びアテゾリズマブ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。
【０１１３】
診断及び評価
本ＣＤ８３結合タンパク質は、リンパ腫の診断又は評価に使用し得る。
【０１１４】
一態様において、本発明は、対象のリンパ腫の診断方法を提供し、この方法は、対象の血清中ｓＣＤ８３レベルを決定することを含む。リンパ腫に罹患している対象の血清中ｓＣＤ８３レベルは、リンパ腫に罹患していない対象のＣＤ８３レベルと比べて上昇している。
【０１１５】
別の態様は、リンパ腫の重症度又はステージの診断、又は評価方法を提供し、この方法は、対象の血清中ｓＣＤ８３レベルを決定すること、及びリンパ腫に罹患していない、又は既知の重症度のリンパ腫に罹患している対象のｓＣＤ８３レベルと比べた対象の血清中ｓＣＤ８３レベルを比較することを含む。
【０１１６】
更なる態様は、対象にリンパ腫治療が奏効するかどうかの決定方法を提供し、この方法は、治療前、治療中及び／又は治療後の対象の血清中ｓＣＤ８３レベルを決定すること、及び治療中及び／又は治療後のｓＣＤ８３レベルを治療前のｓＣＤ８３レベルと比較することを含み、治療前のｓＣＤ８３レベルと比べて治療中及び／又は治療後のｓＣＤ８３レベルが減少すると、対象は治療が奏効する。
【０１１７】
実施例に記載されるとおり：
−ＣＤ８３抗体はＨＬリンパ節生検試料中の腫瘍細胞に結合する；
−ＨＬ患者の血清は分泌型ＣＤ８３（ｓＣＤ８３）を含有する；及び
−患者の血清中ｓＣＤ８３レベルは臨床奏効に対応する。
【０１１８】
本発明者らは、患者の血清中の分泌型ＣＤ８３レベルがリンパ腫の重症度に相関することを見出した。実施例に記載されるとおり、ホジキンリンパ腫に罹患している対象は、リンパ腫に罹患していない対象と比較してｓＣＤ８３レベルの上昇を呈する。更に、ホジキンリンパ腫に罹患している対象は、リンパ腫を低減するための化学療法治療前には、その血清中ｓＣＤ８３レベルが治療後のｓＣＤ８３血清レベルと比較して高く、血清ｓＣＤ８３の減少が疾患重症度と相関することが指摘される。
【０１１９】
以下のアッセイは、本開示のＣＤ８３結合タンパク質、例えば、本明細書で考察するとおりの検出可能標識にコンジュゲートしたＣＤ８３結合タンパク質を伴い実施することができる。本明細書に記載されるアッセイによるＣＤ８３の検出は、病態の診断又は予後判定に有用である。
【０１２０】
イムノアッセイは、対象の病態を診断し、又は試料中のＣＤ８３を検出するための例示的アッセイフォーマットである。本開示は、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光結合免疫吸着アッセイ（ＦＬＩＳＡ）、競合アッセイ、ラジオイムノアッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、フロースルーイムノアッセイ、電気化学発光アッセイ、比濁法ベースのアッセイ、濁度測定ベースのアッセイ、及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）ベースのアッセイを含め、任意の形態のイムノアッセイを企図する。
【０１２１】
好適なイムノアッセイの一形態は、例えばＥＬＩＳＡである。
【０１２２】
一形態では、かかるアッセイは、例えばポリスチレン又はポリカーボネートマイクロウェル又はディップスティック、膜、又はガラス支持体（例えばスライドグラス）などの固体マトリックス上にＣＤ８３結合タンパク質を固定化することを含む。次に試験試料をＣＤ８３結合タンパク質と直接接触させて、試料中のＣＤ８３を結合させ又は捕捉する。洗浄して試料中の任意の未結合のタンパク質を除去した後、ＣＤ８３に個別的なエピトープで結合するタンパク質を、捕捉されたＣＤ８３と直接接触させる。この検出用タンパク質は、概して、例えばＥＬＩＳＡの場合には酵素（例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ））、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）又はβ−ガラクトシダーゼ）など、検出可能なレポーター分子で標識される。或いは、検出用タンパク質に結合する第２の標識タンパク質を使用することができる。洗浄して任意の未結合のタンパク質を除去した後、ＥＬＩＳＡの場合には基質、例えば過酸化水素、ＴＭＢ、又はトルイジン、又は５−ブロモ−４−クロロ−３−インドール−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ｘ−ｇａｌ）などを加えることにより、検出可能なレポーター分子を検出する。当然ながら、固定化した（捕捉）タンパク質と検出用タンパク質とは、逆にして使用してもよい。
【０１２３】
次に、既知の分量のマーカーを使用して作成した標準曲線を用いて、又は対照試料との比較により、試料中の抗原のレベルを決定する。
【０１２４】
上記に記載されるアッセイは、検出の基礎として化学発光又は電気化学発光を使用するように容易に修正される。
【０１２５】
当業者には明らかなとおり、本開示の実施においては、免疫吸着アッセイに基づく他の検出方法が有用である。例えば、検出用放射標識、又は検出用金標識（例えば、コロイド金）、又は検出用リポソーム、例えば封入ＮＡＤ＋を用いる前掲の記載に基づく免疫吸着法又はアクリジニウム結合免疫吸着アッセイ。本開示の一部の例において、ＣＤ８３レベルは、表面プラズモン共鳴検出器又はバイオルミノメトリー（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）、フロースルー装置、例えば、米国特許第７２０５１５９号明細書に記載されるとおりのもの、マイクロ又はナノイムノアッセイ装置（例えば、米国特許第７２７１００７号明細書に記載されるとおり）、ラテラルフロー装置（例えば、米国特許出願公開第２００４０２２８７６１号明細書又は米国特許出願公開第２００４０２６５９２６号明細書に記載されるとおり）、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ、例えば、米国特許第４５９３０８９号明細書又は米国特許第４７５１１９０号明細書に記載されるとおり）、又は免疫比濁アッセイ（例えば、米国特許第５５７１７２８号明細書又は米国特許第６２４８５９７号明細書に記載されるとおり）を用いて決定される。
【０１２６】
リンパ腫の診断又は評価方法は、リンパ腫を治療するステップを更に含み得る。一実施形態において、リンパ腫は、本明細書に記載されるリンパ腫の治療方法を用いて治療される。
【０１２７】
また本明細書には、典型的にはリンパ腫の治療又は診断に関する説明書を含む、本明細書に記載されるＣＤ８３結合タンパク質を含むキットも開示される。一実施形態において、キットはＣＤ８３結合タンパク質を１つ以上の容器内に含む。別の実施形態において、本キットは、本明細書に記載されるＣＤ８３結合タンパク質を１つ以上の容器内に含み、及びリンパ腫の治療に有用な１つ以上の他の治療剤を含む。別の実施形態において、本キットは、本明細書に記載されるＣＤ８３結合タンパク質を１つ以上の容器内に含み、及び１つ以上の他の診断用部分を含む。
【０１２８】
本明細書全体を通じて、特に具体的に明記されない限り又は文脈上特に必要がない限り、単一のステップ、組成物、ステップ群又は組成物群への言及は、それらのステップ、組成物、ステップ群又は組成物群の１つ及び複数（即ち１つ以上）を包含すると解釈されるものとする。従って、本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数の態様を含む。例えば、「ａ」への言及は単一並びに２つ以上を含む；「ａｎ」への言及は単一並びに２つ以上を含む；「ｔｈｅ」への言及は単一並びに２つ以上を含むなどである。
【０１２９】
本明細書全体を通じて、表現言語又は必然的な含意に起因して文脈上特に必要がある場合を除き、語句「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は包含的な意味で使用され、即ち記載される特徴の存在を指定するが、本発明の様々な実施形態における更なる特徴の存在又は追加を除外しない。
【０１３０】
本明細書に記載される本開示の各例は、特に具体的に明記されない限り、適宜修正してあらゆる他の例に適用されるものとする。
【０１３１】
当業者は、本明細書の開示が具体的に記載されるもの以外にも変形例及び改良例を受け入れる余地があることを理解するであろう。本開示はかかる変形例及び改良例を全て包含することが理解されるべきである。本開示はまた、本明細書において言及又は指示される全てのステップ、特徴、組成物及び化合物を個別に又はまとめて包含し、及び前記ステップ又は特徴の任意の一部及び全ての組み合わせ又は任意の２つ以上も包含する。
【０１３２】
本開示は、あくまでも例示を意図するに過ぎない本明細書に記載される具体的な例によって範囲が限定されることはない。機能的に均等な生成物、組成物及び方法は、明確に本明細書に記載されるとおりの本開示の範囲内にある。
【実施例】
【０１３３】
材料及び方法
リンパ腫組織切片及び血漿試料
ヘルシンキ宣言に準拠するシドニー地域保健地区（Ｓｙｄｎｅｙ  Ｌｏｃａｌ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄｉｓｔｒｉｃｔ：ＳＬＨＤ）ヒト研究倫理委員会（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ：ＨＲＥＣ）による承認後、３５人のＨＬ、２０人のＤＬＢＣＬ及び２１人のＭＣＬ患者から初期診断時に入手したアーカイブパラフィン包埋リンパ節生検を分析した。３５人のＨＬ患者が、ＷＨＯ／ＲＥＡＬ分類に基づく結節硬化型、混合細胞型、リンパ球豊富型古典的、不特定古典的又は結節性リンパ球優位型ＨＬの組織学的診断を有した（Ｓｗｅｒｄｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１６；１２７（２０）：２３７５−２３９０）。６人のＨＬ及び３人のＤＬＢＣＬ患者から診断時及び化学療法中に採取した血漿試料がＳＬＨＤ  ＨＲＥＣによって承認された。ＨＬ患者において２〜３サイクルの治療後に陽電子放射断層撮影法（ＰＥＴ）スキャンを実施した。ＭＣＬ細胞株Ｍｉｎｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ３０００（商標））はＡＴＣＣから購入した。ＤＬＢＣＬ株Ｋａｒｐａｓｓ−１１０６ｐはＣｅｌｌｂａｎｋ  Ａｕｓｔｒａｌｉａから購入した。
【０１３４】
ヒト血液細胞及び細胞株培養
ＳＬＨＤ  ＨＲＥＣの承認を得て、健常ドナー（ＨＤ）から静脈血を採取した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ−ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で遠心することによりヒトＰＢＭＣを単離した。供給業者の説明に従いＥａｓｙＳｅｐヒトＴ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＢＭＣからＴ細胞を単離した。本試験に使用した細胞株はＨＬ細胞株ＫＭ−Ｈ２、Ｌ４２８及びＨＤＬＭ−２であった（Ｖｏｌｋｅｒ  Ｄｉｅｈｌ教授、ケルン大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃｏｌｏｇｎｅ）、独国から供与いただいた）。ＨＬ−６０細胞株はＣｈｒｉｓｔｃｈｕｒｃｈ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｇｒｏｕｐから入手した。実験全体を通じて細胞培養には、１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ  ｇｌｕｔａＭＡＸ（商標）、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０μＭ  β−メルカプトエタノールを含有する完全ＲＰＭＩ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した。
【０１３５】
フローサイトメトリー
以下の抗体を使用した：ＣＤ３−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（ＡＦ）７００、ＣＤ４−フィコエリトリン（ＰＥ）−ＣＦ５９４、ＣＤ１５−バイオレット（Ｖ）４５０、ＣＤ１９−Ｖ４５０、ＣＤ２０−Ｖ４２１、ＣＤ３０−ＰＥ、ＣＤ４０−ＰＥ−Ｃｙ７、ＣＤ２７９（ＰＤ−１）−ブリリアントバイオレット（ＢＶ）７８６、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）−ＰＥ−Ｃｙ７（全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）、ＣＤ２５−ＢＶ４２１及びＣＤ１０７−ＰＥ−Ｃｙ７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）。マウス抗ヒトＣＤ８３モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＨＢ１５ａ−イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）はＢｅｃｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｕｌｔｅｒから入手し、ＨＢ１５ｅ−ＦＩＴＣはＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。３Ｃ１２Ｃは、ファージディスプレイライブラリから選択された、且つ軽鎖シャッフリングによって親和性が向上するように更に操作されているヒトＩｇＧ１抗ヒトＣＤ８３  ｍＡｂである（国際公開第２０１４／１１７２２０号パンフレットに記載される）。アイソタイプ対照抗体には、マウスＩｇＧ１κ−ＦＩＴＣ、マウスＩｇＧ２ｂ−ＦＩＴＣ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）及びヒトＩｇＧ１κ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）が含まれた。データはＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で収集し、ＦｌｏｗＪｏ  Ｖ９＆１０ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析した。
【０１３６】
免疫蛍光染色
リジンコート顕微鏡スライド上のＫＭ−Ｈ２、Ｌ４２８又はＨＤＬＭ−２細胞（１０５細胞）をサイトスピンした。細胞をアセトンによって−２０℃で一晩、固定及び透過処理した。この後、ＰＢＳ／１％ＢＳＡで再水和し、１０％ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でブロックした。細胞を一次抗体：ＨＢ１５ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＨＢ１５ｅ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）又は３Ｃ１２Ｃ抗ＣＤ８３抗体で染色し、続いてヤギ抗マウスＩｇＧ−ＡＦ６４７（ＨＢ１５ａ、ＨＢ１５ｅについて）又はヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＡＦ４８８（３Ｃ１２Ｃについて）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。核を４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール二塩酸塩（ＤＡＰＩ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。レーザー走査共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＳＰ８）を使用して細胞を視覚化し、Ｉｍａｇｅ  Ｊ（国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ））を用いて合成画像を生成した。
【０１３７】
免疫組織化学
非ヒト霊長類又はＨＬ、ＭＣＬ若しくはＢＬＢＣＬ患者からのヒトリンパ節のホルマリン固定パラフィン包埋生検組織の３μｍ切片に対して免疫組織化学二重染色を実施した。使用した一次抗体は、マウス抗ヒトＣＤ２０（Ｄａｋｏ）、ＣＤ８３  ｍＡｂ（Ｆ５、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＣＤ３０（Ｄａｋｏ）であり、染色はＬｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ  ＩＩＩ自動染色装置（Ｌｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）による視覚化のためＢｏｎｄポリマー精製検出（Ｂｏｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）キットを使用して実施した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＰＰ７１カメラを備えたＯｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１顕微鏡でＯｌｙｍｐｕｓ  ｌａｂＳｅｎｓソフトウェア（Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して画像を撮影した。
【０１３８】
トロゴサイトーシス分析
ＫＭ−Ｈ２細胞をヒトＰＢＭＣからの精製ＣＤ３＋Ｔ細胞と共に１：５の比で４時間培養した。Ｔ細胞上のＣＤ８３発現をフローサイトメトリーによってＨＢ１５ａ  ｍＡｂを使用して分析した。蛍光イメージングのため、ＫＭ−Ｈ２細胞をＣｅｌｌＶｕｅ  Ｃｌａｒｅｔ  Ｆａｒ  Ｒｅｄ蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識し、ＣＤ３＋Ｔ細胞と５：１の比で４時間共培養した。次に細胞をビオチン化マウス抗ヒトＣＤ３  ｍＡｂ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐｄａｖｉｄｉｎ）−ＡＦ４８８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した。一部の実験では、０．４μｍトランズウェルインサート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を使用して培養中にＴ細胞をＫＭ−Ｈ２細胞と分離した。４時間培養した後、Ｔ細胞上のＣＤ８３発現をフローサイトメトリーによって分析した。
【０１３９】
Ｔ細胞増殖分析
ヒトＰＢＭＣから単離したＴ細胞を５ｎＭカルボキシフルオレセインＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で標識し、ＫＭ−Ｈ２細胞からの上清の存在下に抗ＣＤ２／ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ細胞活性化／拡大キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で５日間刺激した。細胞をＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でフローサイトメトリーによって分析した。増殖指数（ＰＩ）及び分裂指数（ＤＩ）をＦｌｏｗＪｏ  Ｖ９（ＴｒｅｅＳｔａｒ）で分析した。
【０１４０】
ｓＣＤ８３及びＩＬ−１０分析
ＫＭ−Ｈ２、Ｌ４２８の培養上清又はＨＬ患者の血清中のヒトｓＣＤ８３を製造者の指示に従いＥＬＩＳＡ（３．９ｐｇ／ｍｌの検出限界を有する）によって分析した（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ）。簡潔に言えば、供給されたＣＤ８３捕捉ｍＡｂで９６ウェルプレートを一晩コーティングした。培養上清、患者血漿又は組換えＣＤ８３−Ｆｃ標準（ｓＣＤ８３  ＥＬＩＳＡキットから）を２時間インキュベートし、マウス抗ヒトＣＤ８３−ＨＲＰ及びテトラメチルベンジジン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）基質溶液を使用して、これをマイクロプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で４５０ｎＭで読み取ってｓＣＤ８３を検出した。細胞株上清中のＩＬ−１０レベルをサイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって分析した。
【０１４１】
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイ
ＫＭ−Ｈ２、Ｌ４２８又はＨＤＬＭ−２細胞を標的細胞として使用して、２５μＭカルセイン−ＡＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって３７℃で３０分間標識し、ヒトＰＢＭＣをエフェクター細胞として使用した。２５：１のＥ：Ｔ比のエフェクター細胞及び標的細胞（５×１０３／ウェル）を様々な濃度の３Ｃ１２Ｃ又は対照抗ＣＤ２０抗体、リツキシマブ（Ｒｏｃｈｅ）と共にトリプリケートで３７℃で３時間コインキュベートした。上清を回収し、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して遊離カルセインを計測した（励起４８５ｎｍ、発光５３８ｎｍ）。式：特異的溶解パーセンテージ＝［Ｅ／Ｔ（試料）−Ｅ／Ｔ（自然発生）］／［Ｔ（全体）−Ｔ（自然発生）］×１００［ここで、Ｔ（自然発生）＝標的のみ、Ｅ／Ｔ（自然発生）＝エフェクター＋標的、Ｔ（全体）＝標的＋溶解］を用いて具体的な細胞溶解パーセンテージを計算した。
【０１４２】
モノメチルアウリスタチンＥとの３Ｃ１２Ｃコンジュゲーション（３Ｃ１２Ｃ−ＭＭＡＥ）及びＣＤ８３＋細胞株に対する細胞傷害性
３Ｃ１２Ｃ−ＭＭＡＥを作製するため、ブレンツキシマブベドチンと同様の方法を用いて２８、部分的に還元された３Ｃ１２ＣにコンジュゲートするためのリソソームカテプシンＢ切断性自己犠牲性（ｓｅｌｆ−ｅｍｏｌａｔｉｖｅ）ジペプチド（ＶａｌＣｉｔ）マレイミドリンカーをアウリスタチンＥから調製した。様々な濃度のコンジュゲートをＣＤ８３＋リンパ腫細胞又はＣＤ８３−（特異性のため）ＨＬ−６０細胞株と３日間インキュベートすることにより、ＨＬ細胞に対する３Ｃ１２Ｃ−ＭＭＡＥの細胞傷害活性をインビトロで分析した。７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７ＡＡＤ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）染色によってフローサイトメトリーを用いて生存能を評価した。
【０１４３】
ＰＣＲ分析
ＴＲＩｚｏｌ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でＲＮＡを抽出し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ第１鎖合成キット及びランダムヘキサマープライマー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者のプロトコルに従い用いて１００ｎｇ  ＲＮＡからｃＤＮＡを転写した。指定の免疫集団からのｃＤＮＡを、ヒトＣＤ８３エクソン２フォワードプライマー５’−ＡＧＧＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＧＴＣＴＣＣ−３’及びエクソン５リバースプライマー５’−ＡＡＧＡＴＡＣＴＣＴＧＴＡＧＣＣＧＴＧＣＡＡＡＣ−３’を使用してＰＣＲ増幅した。ＧＡＰＤＨハウスキーピング遺伝子に対するプライマー５’−ＡＴＧＧＧＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＣＧＧＡ−３’（フォワード）及び５’−ＡＧＧＧＧＣＣＡＴＣＣＡＣＡＧＴＣＴＴＣＴＧ−３’（リバース）を内因性対照として使用した。２％アガロース（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）ゲル上で増幅断片を分離した。
【０１４４】
非ヒト霊長類における３Ｃ１２Ｃトライアル
ＳＬＨＤ動物研究倫理委員会が５匹の非ヒト霊長類（パピオ・ハマドリアス（Ｐａｐｉｏ  Ｈａｍａｄｒｙａｓ）ヒヒ）の試験を承認し、これらの非ヒト霊長類が０、７、１４及び２１日目に静脈内ヒト−ＩｇＧ（Ｉｎｔｒａｇａｍ、ＣＳＬ）（１０ｍｇ／ｋｇ）又は３Ｃ１２Ｃ  ｍＡｂ（１、５、１０、１０ｍｇ／ｋｇ）の投与を受けた。血球計算は、ＣＥＬＬ−ＤＹＮ  Ｓａｐｐｈｉｒｅ自動血球計算機（Ａｂｂｏｔｔ）を使用して実施した。ＤＣ、Ｔ及びＢ細胞を含めた免疫細胞集団に関してＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ２０フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＰＢＭＣを分析した。５６日目までＣｏｂａｓ  ８０００（Ｒｏｃｈｅ）を使用して週１回採取した血清試料中のＡＬＰ、ＡＳＴ及びクレアチニン（Ｃｒ）を計測することにより肝腎機能を評価した。２８日目、免疫組織染色のため３Ｃ１２Ｃ（１０ｍｇ／ｋｇ）又はヒトＩｇＧ（１０ｍｇ／ｋｇ）で治療した動物からリンパ節を採取した。
【０１４５】
統計的分析
統計的分析は、Ｐｒｉｓｍ  ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して実施した。特に指定されない限り、平均値の標準誤差を示す。記載されるとおり、マン・ホイットニーｔ検定又は多重比較のためのリーンハウス・ガイザー補正を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用した。ｐ＜０．０５の差を有意と見なした。
【０１４６】
結果
１．ＨＬ細胞株及びＨＬ患者のリンパ節生検におけるＨＲＳ上にＣＤ８３が発現する
マウス抗ヒト抗体ＨＢ１５ａ、ＨＢ１５ｅ及び潜在的候補である治療用ヒト抗ヒトＣＤ８３抗体３Ｃ１２Ｃを使用してＣＤ８３の発現を分析した。それぞれ、ＨＢ１５ａ−ＦＩＴＣ、ＨＢ１５ｅ−ＦＩＴＣ又は３Ｃ１２Ｃ−ＦＩＴＣ抗ＣＤ８３  ｍＡｂで染色したＫＭ−Ｈ２、Ｌ４２８及びＨＤＬＭ−２リンパ腫細胞株に関してＣＤ８３の発現をフローサイトメトリーによって分析した。ＫＭ−Ｈ２細胞は、全ての抗体で染色される細胞表面ＣＤ８３を最も多く発現し、一方、Ｌ４２８及びＨＤＬＭ−２株はＣＤ８３をそれほど発現しなかった。３つの株全てがＣＤ３０を発現した（図１Ａ）。ＣＤ１５、ＣＤ２５、ＣＤ４０及びＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）がＫＭ−Ｈ２細胞上に発現した（図１Ｂ）。このデータは、ＫＭ−Ｈ２細胞に対する共焦点ＣＤ８３染色及び３つのＨＬ株におけるＲＴ−ＰＣＲによるＣＤ８３  ｍＲＮＡ転写物の検出によって確認された（図８）。
【０１４７】
次に、３５人のＨＬ患者のパラフィン包埋リンパ節生検に関してＣＤ８３発現を分析した。ＨＲＳ細胞はＣＤ３０＋と同定された（図２Ａ）。注目すべきことに、ＨＬ患者の８／３５例（２２．９％）の生検がＨＲＳ細胞上にＣＤ８３を高度に発現し（＞９０％陽性）、２１／２６例（６０％）が中程度に発現し（１０〜９０％陽性）及び６／３５例（１７．１％）はＣＤ８３発現が低度であった（＜１０％陽性）（図２Ｃ）。亜型分析では、結節硬化型（ＮＳ）ＨＬにおけるＨＲＳ細胞の８１％がＣＤ８３高発現又は中程度であり、混合細胞型（ＭＣ）ＨＬでは８５．７％がＣＤ８３高発現又は中程度であったことが示された。ほとんど（９０％）のステージＩ〜ＩＩ  ＨＬがＣＤ８３高発現又は中程度であり、ステージＩＩＩ〜ＩＶにおける６１．５％のＨＬがＣＤ８３高発現又は中程度であった。
【０１４８】
ＭＣＬ及びＤＬＢＣＬ患者のパラフィン包埋リンパ節生検に関してもまた、ＣＤ８３発現を分析した。ＤＬＢＣＬ患者の生検はＣＤ８３及びＣＤ２０の高度な発現を示し、ＣＤ３は低度であった（図２Ｂ）。マントル細胞リンパ腫患者の生検もまた、ＣＤ８３の高度な発現を示した（図１３）。
【０１４９】
ＣＤ８３はＨＬ細胞からＴ細胞へのトロゴサイトーシスを受ける
本発明者らは以前、ＣＤ８３がトロゴサイトーシスによってＤＣの膜からＴ細胞へと移行可能であることを見出した（Ｊｕ  Ｘ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１６；１９７（１２）：４６１３−４６２５）。ＨＬ細胞株とＴ細胞との間にも同様のトロゴサイトーシスが起こることが観察された。これらの２つの細胞型を４時間共培養すると、Ｔ細胞上でＣＤ８３表面発現が５〜１２％に増加し（図３Ａ；ｐ＝０．００４）、一方、ＫＭ−Ｈ２細胞が存在しない場合にＴ細胞上にＣＤ８３は検出されなかった。更に、培養中に０．４μｍトランズウェルフィルタによってＴ細胞とＫＭ−Ｈ２細胞とを分けると、トロゴサイトーシスが妨げられた（図３Ｂ）。トロゴサイトーシスが膜移行に関わったことを確かめるため、ＫＭ−Ｈ２細胞を蛍光色素（ＣｅｌｌＶｕｅ  Ｃｌａｒｅｔ）で標識し、ＣＤ３＋Ｔ細胞と共培養した。ＫＭ−Ｈ２細胞からＴ細胞への細胞膜移行がフローサイトメトリー（図３Ｃ）及び共焦点顕微鏡法によって確認された。ＫＭＨ２細胞とＴ細胞との４時間以内の共培養中に、ＣＤ４＋Ｔ細胞とＣＤ８＋Ｔ細胞との比に差は生じなかった。しかしながら、ＣＤ８３＋Ｔ細胞は、ＣＤ８３−Ｔ細胞（ｐ＝０．０４８）及びＫＭ−Ｈ２なしで培養したＴ細胞（ｐ＝０．００５）と比べてＰＤ−１を有意に高度に発現した（図３Ｄ）。ＰＤ−１の増加は、トロゴサイトーシスを受けていないＣＤ８３−Ｔ細胞と比べてトロゴサイトーシスを受けたＣＤ８３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞で有意に高かった（ｐ＝０．０４９）。対照的に、ＣＤ８３＋Ｔ細胞とＣＤ８３−ＣＤ８＋Ｔ細胞との間にＰＤ−１発現の差は認められなかったが（ｐ＝０．１８５）、ＫＭ−Ｈ２と共培養したＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞は両方ともに、単独で培養したＴ細胞よりもＰＤ−１発現が高かった（図３Ｅ、図３Ｆ）。ＣＤ８３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞は、トロゴサイトーシスを受けていないＣＤ４＋Ｔ細胞と同じＴｒｅｇ割合を有した（図９）。
【０１５０】
ＨＬ細胞株からの上清はＴ細胞増殖を阻害する
ＫＭ−Ｈ２（４６０．６±１１．８ｐｇ／ｍｌ）及びＬ４２８（２００．８±５３．２ｐｇ／ｍｌ）の上清には高度のｓＣＤ８３が見られ、これはその高度な表面ＣＤ８３と一致した（図４Ａ）。ＨＬ患者は診断時の血清ｓＣＤ８３（３６０．５±５４．８２ｐｇ／ｍｌ、ｎ＝１０）が健常ドナー（ＨＤ）（５２．６±９．５ｐｇ／ｍｌ．図４Ａ）と比べて有意に高かった。興味深いことに、３つ全てのＨＬ細胞株の上清で、極めて低いＩＬ−１０レベルしか存在しなかった（図１０）。
【０１５１】
次に本発明者らは、ＫＭ−Ｈ２細胞上清がＴ細胞機能に及ぼす効果を試験した。ｓＣＤ８３を含有するＫＭ−Ｈ２上清はＴ細胞増殖を用量依存的に阻害した（図４Ｂ〜図４Ｅ）。ＫＭ−Ｈ２上清によってはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖のみが阻害され（ｐ＝０．０９）、ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖は阻害されないように見えた（ｐ＝０．７３２）（図４Ｂ）。抗ＣＤ８３抗体、３Ｃ１２Ｃの投与は、ＫＭ−Ｈ２上清の阻害効果を部分的に消失させた（図４Ｂ、図４Ｃ及び図４Ｄ）。３Ｃ１２Ｃ単独はＴ細胞増殖に何ら効果を及ぼさなかった（図４Ｅ）。
【０１５２】
正常レベルに減少したＨＬ患者血清ｓＣＤ８３はＰＥＴスキャンによる完全又は部分奏効と相関した
本発明者らは、６患者について、逐次化学療法の間のＨＬ患者における循環ｓＣＤ８３の変化をモニタした。全ての患者が３〜６サイクルの化学療法を受け、ＰＥＴスキャンにより５人は完全奏効（ＣＲ）が得られ、１人の患者は部分奏効（ＰＲ）が得られた（図５）。患者＃１及び２において血清ｓＣＤ８３は低下し、ＰＥＴスキャンによって実証される化学療法に対するＣＲを患者が得たときには正常レベルに戻った。患者＃３及び６では、ＰＥＴスキャンがＣＲを示したときにも血清ｓＣＤ８３レベルはなお高かったが、もう１サイクルの更なる化学療法の後に正常化した。患者＃４はＰＥＴスキャンによってサイクル５より前にＰＲを示したが、しかしながらサイクル＃５の間は血清ｓＣＤ８３レベルが低下し始めたのみで、サイクル６で正常範囲に達し、同時にＣＲが得られた。患者＃５におけるＰＥＴスキャンはサイクル２の後に疾患進行（ＰＤ）を示したが、更なる２サイクルの化学療法後に、対応するｓＣＤ８３が正常値に減少したときＰＲを示した。
【０１５３】
３Ｃ１２ＣはＡＤＣＣによってＨＬ細胞株を死滅させる
３つのＨＬ株：ＫＭ−Ｈ２、Ｌ４２８及びＨＤＬＭ−２に対して抗ＣＤ８３  ｍＡｂ、３Ｃ１２ＣのＡＤＣＣ活性を試験した。３Ｃ１２ＣはＫＭ−Ｈ２及びＬ４２８を効率的に死滅させたが、ＨＤＬＭ−２はこれに対して比較的抵抗性であった（図６Ａ）。治療上の適用可能性を更に調べるため、本発明者らは３Ｃ１２Ｃ毒素コンジュゲート（３Ｃ１２Ｃ−ＭＭＡＥ）を作成した。インビトロで、３Ｃ１２Ｃ−ＭＭＡＥはＣＤ８３−ＨＬ−６０細胞と比べてＣＤ８３＋ＫＭ−Ｈ２細胞をより効率的に死滅させた（図６Ｂ）。
【０１５４】
３Ｃ１２Ｃの投与はマウス及び非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において安全である
本発明者らは非ヒト霊長類で３Ｃ１２Ｃの用量漸増試験を実施した。５匹のヒヒに３Ｃ１２Ｃを静脈内注射した（０、７、１４、及び２１日目に１、５、１０ｍｇ／ｋｇ）。注射後８４日間のフォローアップの間に有害臨床事象は記録されなかった。本発明者らは血球数及び生化学を毎週評価し、フローサイトメトリー又は免疫組織学によって種々の免疫細胞集団をモニタした。３Ｃ１２Ｃの投与は血球数（ＷＢＣ、ＲＢＣ、及び血小板）、肝機能（ＡＬＰ及びＡＳＴ）又は腎機能（クレアチニン）に影響を及ぼさなかった（図１２）。総Ｔ細胞数、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞比は全て、８４日目まで正常値のままであった（データは示さず）。しかしながら、他のＣＤ８３＋標的細胞（活性化ＤＣ及び活性化Ｂ細胞）が減少した点で３Ｃ１２Ｃ有効性のエビデンスがあった。３Ｃ１２Ｃをマウスに静脈内投与すると、フローサイトメトリーによって決定したとき、血液及びリンパ節Ｂ細胞の減少が生じた（図７Ａ）。加えて、３Ｃ１２Ｃ治療動物（１０ｍｇ／ｋｇ）においては、対照ヒトＩｇＧ動物（１０ｍｇ／ｋｇ；図７Ｂ）と比較してリンパ節におけるＢ細胞面積が減少した。
【０１５５】
ＭＣＬ及びＦＬ  ＣＤ８３染色
ＭＣＬの抗ＣＤ８３抗体染色は、強い拡散性の膜及び細胞質染色を示す。加えて、まさにＤＬＢＣＬと同じように、強い点状の染色がある（図１３［ＭＣＬ］）。５２．２％のＭＣＬ生検試料がＣＤ８３を高度又は中程度に発現した（ｎ＝２１）。ＦＬは濾胞の周囲及びその内部に反応性Ｂ細胞の抗ＣＤ８３染色を示す。ＦＬの拡散性の染色はない（図１３［ＦＬ］）。
【０１５６】
３Ｃ１２Ｃ−ＭＭＡＥはＤＬＢＣＬ及びＭＣＬ細胞株を死滅させる
３Ｃ１２Ｃ−ＭＭＡＥコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｆｇａｔｅｓ）がＤＬＢＣＬ及びＭＣＬ細胞株に及ぼす効果を決定するため、ＤＬＢＣＬ株ＫＡＲＰＡＳＳ−１１０６Ｐ又はＭＣＬ株Ｍｉｎｏ細胞を種々の濃度の３Ｃ１２Ｃ−ＭＭＡＥと７２時間インキュベートし、フローサイトメトリーによって生細胞をカウントした。ＫＭ−Ｋ２細胞を対照として使用した。細胞株Ｍｉｎｏ、ＫＭ−Ｈ２及びＫａｒｌａｓｓｓの各々についての漸増抗体（ａｎｔｉｂｏｄｔ）コンジュゲート濃度による生細胞数のプロットを半数阻害濃度（ＩＣ５０）の計算値と共に図１４に示す。ＨＬ株ＫＭ−Ｈ２と同様に、７２時間の培養後にＤＬＢＣＬ及びＭＣＬ株は３Ｃ１２Ｃ−ＭＭＡＥによって有効に死滅した（図１４）。
【０１５７】
要約：
・ＨＬ細胞株並びに一次ＨＬ、ＤＬＢＣＬ及びＭＣＬ組織上でのＣＤ８３の高発現は、ＣＤ８３が良好な治療標的であることを示している。
・ＨＬ腫瘍細胞はＣＤ８３を発現し、一部の周囲Ｔ細胞が腫瘍細胞から表面ＣＤ８３分子を獲得することができる。ＣＤ８３＋Ｔ細胞の８０％が、共抑制分子、例えばＰＤ−１の高発現を伴うＣＤ４＋  Ｔ細胞であった。ＨＬ患者における浸潤性Ｔリンパ球は抗原に対して低応答性である。ＰＤ−１及びＰＤ−１リガンド相互作用がホジキンリンパ腫の免疫抑制性微小環境に寄与する。インビトロでＫＭ−Ｈ２からＴ細胞に移行したＣＤ８３は、特にＣＤ８３高発現患者におけるＬＮ生検試料のリンパ球上のＣＤ８３発現の知見と一致している。かかるＣＤ８３＋  Ｔ細胞は枯渇性又はアポトーシス性となる可能性があり（ＰＤ−１高として）、これはＫＭ−Ｈ２細胞がＣＤ８３を介して免疫監視から逃れる別の機構であり得る。これは、ＰＤ−１阻害薬と併用したＣＤ８３標的療法が恐らくは臨床奏効を更に亢進させるであろうことを示している。
・ＨＬ細胞の上清（ＳＮ）はＴ細胞増殖を阻害し（ＫＭ−Ｈ２のＳＮはＴｒｅｇを誘導しない、データは示さず）、ＨＬ細胞はｓＣＤ８３をＳＮ中に高度に分泌し、ｓＣＤ８３は健常ドナーと比べてＨＬ患者血清中により高度に検出された；３Ｃ１２Ｃは、ｓＣＤ８３に結合することによりかかる阻害を部分的に消失させる。ＳＮからのｓＣＤ８３は、かかる阻害効果において主要な役割を果たすが、ＩＬ−１０にはそのような役割はない。３Ｃ１２ＣはインビトロでＴｒｅｇの阻害機能に何ら効果を及ぼさなかったが、３Ｃ１２Ｃは一過性のＴｒｅｇを誘導する可能性があり（ＮＨＰトライアルデータによる）、それが非活性化ＤＣからの間接的なＴｒｅｇ誘導効果であってもよく、３Ｃ１２Ｃはインビトロ及びインビボで活性化ＤＣを除去する。対照的に、ＰＤ−１阻害薬（ニボルマブ）はＣＤ８＋Ｔ細胞のＴｒｅｇ抑制機能を直接制限し、ニボルマブの投与を受けたマウスではＣＤ８／Ｔｒｅｇ及びＣＤ４  Ｔｅｆｆ／Ｔｒｅｇの比が増加した。
・ＳＮからの他のサイトカイン又は可溶性因子、例えばｓＣＤ３０もまた、阻害効果に寄与する可能性がある。８５ｋＤａ可溶性形態のＣＤ３０分子（ｓＣＤ３０）は、インビトロ及びインビボでＣＤ３０＋細胞によって放出されることが示されている。活性化Ｔ細胞、特にＣＤ４＋  Ｔ細胞もまたｓＣＤ３０を分泌した。
・ＨＬ患者におけるｓＣＤ８３レベルは疾患状態及び治療奏効と相関した。従って、ｓＣＤ８３レベルは診断用及び予後判定用バイオマーカーとなり得る。
・抗ＣＤ８３抗体、３Ｃ１２Ｃ（及びＣＤ８３ｍＡｂ薬物複合体）はインビトロでＨＲＳ細胞、ＤＬＢＣＬ及びＭＣＬ細胞を死滅させる。ＮＨＰトライアルでは、ヒト抗ＣＤ８３  ｍＡｂ  ３Ｃ１２Ｃは安全で、血球数、肝腎機能に対する副作用はなく、この有効性及び安全性プロファイルにより、ＣＤ８３抗体はＨＬに対する有効な治療用抗体の別の候補となる。
【図１−１】
2020533384.tif 000004
【図１−２】
2020533384.tif 000005
【図２−１】
2020533384.tif 000006
【図２−２】
2020533384.tif 000007
【図３−１】
2020533384.tif 000008
【図３−２】
2020533384.tif 000009
【図３−３】
2020533384.tif 000010
【図４−１】
2020533384.tif 000011
【図４−２】
2020533384.tif 000012
【図４−３】
2020533384.tif 000013
【図５−１】
2020533384.tif 000014
【図５−２】
2020533384.tif 000015
【図６】
2020533384.tif 000016
【図７−１】
2020533384.tif 000017
【図７−２】
2020533384.tif 000018
【図８】
2020533384.tif 000019
【図９】
2020533384.tif 000020
【図１０】
2020533384.tif 000021
【図１１】
2020533384.tif 000022
【図１２−１】
2020533384.tif 000023
【図１２−２】
2020533384.tif 000024
【図１２−３】
2020533384.tif 000025
【図１３】
2020533384.tif 000026
【図１４】
2020533384.tif 000027
【配列表】
2020533384000001.app
【国際調査報告】
2020533384.tif 000028
2020533384.tif 000029
2020533384.tif 000030