(57)【要約】  本発明は、ニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）に由来する新規ペプチド、および特に様々な疾患、特にうつ病の治療におけるそれらの使用に関する。
2020502995.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４の配列（ＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬ）のペプチドＰＥ（１３〜２７）、配列番号５の配列（ＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷ）のペプチドＰＥ（１４〜２５）、ビオチン化された配列番号３の配列に対応するビオチン化ペプチドＰＥ（２２〜２８）、配列番号６の配列（ＰＩＧＶＳＷＧＬＲ）のペプチドＰＩ−ＰＥ（２２〜２８）、ビオチン化された配列番号６の配列に対応するビオチン化ペプチドＰＩ−ＰＥ（２２〜２８）、２２位のグリシンがアラニンで置換された配列番号３の配列に対応する配列番号７の配列（ＡＶＳＷＧＬＲ）のペプチドＧ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）、ビオチン化された配列番号７の配列に対応するビオチン化ペプチドＧ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）、Ｎ末端にダンシル酸化学基が付加された配列番号３の配列に対応するペプチドダンシル−ＰＥ（２２〜２８）、及びＣ末端にＯ−メチルとＯ−エチルがそれぞれ付加された配列番号３の配列に対応するペプチドＯ−メチル−ＰＥ（２２〜２８）およびＯ−エチル−ＰＥ（２２〜２８）から選択されるニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）のプロペプチド（ＰＥ）由来のペプチド。
【請求項２】
配列番号４の配列（ＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬ）のペプチドＰＥ（１３〜２７）、配列番号５の配列（ＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷ）のペプチドＰＥ（１４〜２５）、配列番号６の配列（ＰＩＧＶＳＷＧＬＲ）のペプチドＰＩ−ＰＥ（２２〜２８）、ビオチン化された配列番号６の配列に対応するビオチン化ペプチドＰＩ−ＰＥ（２２〜２８）、２２位のグリシンがアラニンで置換された配列番号３の配列に対応する配列番号７の配列（ＡＶＳＷＧＬＲ）のペプチドＧ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）、ビオチン化された配列番号７の配列に対応するビオチン化ペプチドＧ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）、から成るペプチドをコードする核酸配列。
【請求項３】
請求項２に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項４】
請求項１に記載のペプチドおよび／または請求項２に記載の核酸配列および／または請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
−  請求項２に記載の核酸で宿主細胞をトランスフェクトする工程、または請求項３に記載のベクターで宿主細胞を形質転換する工程；
−  前記ペプチドの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養する工程；及び
−  前記ペプチドを回収する工程
を含む、請求項２に規定されたペプチドの製造方法。
【請求項６】
医薬として使用するための請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
前記医薬が抗うつ薬である、請求項６に記載の使用のためのペプチド。
【請求項８】
うつ病の治療に使用するための、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
糖尿病または癌の治療に使用するための、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
てんかんまたは卒中に対する神経保護に使用するための請求項１に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）に由来する短いペプチド、および様々な病状（糖尿病、癌、てんかん、卒中、神経変性病理など）、特に精神病理学、特に例えば脳卒中の後など、うつ病を患っているまたはうつ病を患ったことがある患者の治療におけるその使用に関する。本発明は、特に、医薬品、例えば抗うつ薬の製造のためのこれらのペプチドの使用に関する。
【０００２】
本発明は製薬産業の分野、特に様々な病状（糖尿病、癌、卒中、てんかん、精神疾患、神経変性病など）の治療に使用される医薬の開発の分野に用途がある。
【０００３】
以下の説明では、大括弧（［］）内の参考文献は、テキストの末尾に表示される参考文献のリストを表す。
【背景技術】
【０００４】
うつ病は公衆衛生上の大きな問題である。最新の研究では、うつ病の有病率が高いことが確認されている。一生の間に、女性の２０％、男性の１０％がうつ病のエピソードを経験したことがある。そのような数字は明らかに印象的である。フランスのような国々では、年間１２０００人の死亡にあたる、うつ病の主要な合併症、自殺を見ると、その数字はもっと大きくなる［２］。
【０００５】
うつ病は非常に一般的でしばしば衰弱させる病気である。それは先進国の人口の最大２０％に影響を及ぼしている。その起源は多様で様々である。この病理は、精神、ならびに患者の行動および生理学に影響を及ぼすものである。うつ病の治療法も複数あり、使用される薬の作用機序は明確に確立されてはいない。
【０００６】
世界保健機関（ＷＨＯ）は、単極性うつ病が２０２０年までに身体障害の２番目に主要な原因になると予測している。うつ病の個人的および家族的苦しみには、この病状の重要な社会的重みが加わる。うつ病はすでに労働停止の主な原因の１つであり、年間３００億ユーロを超える経済的負担がある。医療専門家、特にＳＳＲＩ（選択的セロトニン再取り込み阻害薬）およびＳＮＲＩ（セロトニンノルアドレナリン再取り込み阻害薬）に利用可能な治療用手段にもかかわらず、うつ病人口の３０％は治療を受けていない。さらに、抗うつ剤の作用時間は３〜６週間のオーダーであり、そして副作用はしばしば重大である。
【０００７】
一般に、うつ病患者の１５％が自殺により死亡すると推定されている。ほとんどの患者で、うつ病は遺伝的素因とストレスや感情的外傷などの環境要因との相互作用によるものである［３］。この疾患は一般的であり、抗うつ薬（ＡＤ）市場は巨大である（少なくとも年間１００億ユーロ）。
【０００８】
それにもかかわらず、これらの抗うつ剤は約７０％の症例で患者の状態を改善するが、それらは患者の３０〜４０％でのみ疾患の完全な寛解をもたらす。さらに、治療を受けた被験者のほぼ３分の１が既存の治療に抵抗性を示している。このような事態により、うつ病のメカニズムを考慮に入れることができる新しい治療法を検討することがますます必要になっている［３］。
【０００９】
医療専門家に利用可能にされた治療用兵器庫において、アミトリプチリンおよびイミプラミンを含む三環式抗うつ剤（ＴＣＡ）が最初に発見され、続いてフェルネジンおよびパルギリンのような不可逆的かつ非選択的なモノアミンオキシダーゼ阻害剤（ＭＡＯＩ）が発見された。有害な影響、特にＴＣＡの心毒性（特に過剰摂取の場合）およびＭＡＯＩの高血圧の危機（消化性チラミンとの相互作用、有名な「チーズ効果」）は、同一の治療効果であるがより良い容認性を有する新しい分子に向かって研究を進めている。
【００１０】
選択性の概念は、ノルアドレナリン（ＮＡ）またはセロトニン（５−ヒドロキシトリプタミンまたは５ＨＴ）の再取り込みに特異的な阻害剤で出現した。第ＩＩＩフェーズ臨床試験では、これらの新しい分子が第一世代の抗うつ薬と同等の有効性と、特に過量投与の場合のより優れた安全性を提供することが実証されている。
【００１１】
特異的セロトニン再取り込み阻害剤（ＳＳＲＩ）および特異的ノルアドレナリン再取り込み阻害剤（ＳＮＲＩ）は現在最も広く使用されている分子である［４〜５］。したがって、ＡＤは、モノアミン作動系の伝達を促進することと最も頻繁に関連している。
【００１２】
セロトニン、ノルアドレナリンおよびドーパミンは明らかに関係しているが、現在ではＡＤによって生じるモノアミンレベルの変化およびそれらから生じる適応過程、特にそれらの受容体のいくつかの感受性の変化はそれ自体では説明できないことが認められている。
【００１３】
抗うつ薬の作用機序。
したがって、ＡＤを得るのに必要な３〜６週間の時間をモノアミンのシナプスレベルの増加と相関させることは困難であり、これは製品の最初の投与と同時に起こる。半世紀近く、うつ病の病因とその治療法に関する仮説の数は増え続けている。
【００１４】
例えば、高濃度のグルココルチコイドは、一般に、ＢＤＮＦ（脳由来神経栄養因子）合成の減少、グルタミン酸の過剰分泌、および/またはグルコース摂取の減少による海馬の負の気分効果、ならびに構造変化に関連している［６］。
【００１５】
これらの観察によると、グルココルチコイド合成阻害薬およびグルココルチコイド受容体拮抗薬はＡＤ様の効果を発揮する［７］。
【００１６】
サブスタンスＰ受容体、特にＮＫ１、またはＣＲＦ受容体（コルチコトロピン放出因子）に作用する拮抗薬、ならびにＮＭＤＡ受容体拮抗薬は、ある程度の成功を収めて開発されている［８〜１０］。
【００１７】
ストレスの多い状況やうつ病のモデルで行われた最近の様々な研究は、主要なうつ病性障害の病因に神経新生を関与させている［１１〜１３］。電気ショックを含む全ての慢性的なＡＤ治療は、海馬の顆粒層のニューロンの起源で前駆細胞の増殖を刺激することが示されている。
【００１８】
ＡＤは、ＣＲＥＢ、Ｂｃ１２、またはＭＡＰキナーゼなどの細胞の生存および増殖に関与する様々な因子の発現を調節することも知られている。しかしながら、気分障害の病態生理学におけるこれらの新形成ニューロンの機能的重要性は物議を醸している［１４］。
【００１９】
これらすべての適応症は、うつ病がその病態生理学が多因子性である複雑な疾患であり、その結果、そのような病状の治療が依然として課題であることを実証している。
【００２０】
４０年以上にわたり、うつ病および有効な薬物の開発に関する研究は、モノアミン作動性仮説によって支配されてきた。モノアミン作動性神経伝達物質（セロトニン、ノルアドレナリンおよびドーパミン）は明らかに関係しているが、うつ病の病態生理学およびＡＤの作用機序に関する仮説の数は進化し続けている。
【００２１】
今日使用されているＡＤ薬は、口渇、かすみ目、腸機能障害（下痢または便秘）など、さまざまな副作用を引き起こしている。多くの副作用は一過性（吐き気など）であるが、中には（性的影響など）一貫しているように見え、長期的な治療順守に影響を与える可能性がある。これが、うつ病において新たに同定された受容体またはチャネルに作用する新しい分子の探索が非常に重要である理由である。
【００２２】
いくつかのタンパク質、受容体およびチャンネルは、うつ病の分子メカニズムに関係しているとされてきた。これは、ニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）（特にソルチリンとも呼ばれる）の場合であり、マウスでの不活性化は基礎カリウムチャネルＴＲＥＫ−１について無効化されたマウスで観察されるのと同様のうつ病耐性の表現型を生じる。
【００２３】
最近のＳＴＡＲ＊Ｄ（うつ病を緩和するための連続治療法）研究［１５］は、ヒトの抗うつ反応に関与する遺伝子としてＴＲＥＫ−１を薬理学的に同定した。この研究はまた、ヒトにおける研究のための候補遺伝子の同定における抗うつ治療の探索のための動物モデルの有用性を示唆している。したがって、ＴＲＥＫ−１チャネル遮断薬は抗うつ薬のデザインの分野における新しい概念を表している。
【００２４】
今日までに、ＴＲＥＫ−１チャネルと効果的に相互作用する分子が同定されている。これはプロペプチド（ＰＥ）：ＱＤＲＬＤＡＰＰＰＰＡＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬＲＡＡＡＡＧＧＡＦＰＲＧＧＲＷＲＲ（配列番号１）と呼ばれる４４アミノ酸のペプチドであり、成熟と同時に、同じ受容体のリガンドとなるニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）のフリンによって放出される。興味深いことに、このプロペプチドはまたＴＲＥＫ−１チャンネルの活性を遮断することができることが示された。スパジン（ＹＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＳＷＧＬＲ、配列番号２）と呼ばれる前記プロペプチド由来の１７アミノ酸の一部が受容体に対する全ての結合活性を保有することが示されている［１６］。最近、スパジンがＴＲＥＫ−１チャンネルを特異的に遮断することが示された。うつ病のげっ歯類モデルでは、心臓および血糖インデックスレベルで、このチャンネルおよび他のカリウムチャンネルの他の機能に副作用を引き起こすことなく、抗うつ薬として作用している［１７］。最近、シナプス形成の調節におけるスパジンの役割が確認された［１８］。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Wong, M. & Licinic, J. Research and treatment approaches to depression. Nat Rev Neurosci. 2, 343-351 (2001)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
したがって、うつ病の治療に使用できる新しい分子、より効果的で、より耐容性があり、そしてより速い作用を有する分子が本当に必要とされている。
【００２７】
本発明はまさにその必要性に応えそして従来技術の不利益を解決するという役割を有する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
この目的のために、本発明者らは、スパジンの分解から生じるより小さなペプチドも抗うつ剤の役割を有することができるかどうかを調査し、そして予期せずに、変性されたまたはされていないプロペプチド（ＰＥ）から誘導される新規の活性ペプチド、特に配列番号４の配列（ＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＳＷＧＬ）のペプチド（１３〜２７）及び配列番号５の配列（ＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷ）のペプチド（１４〜２５）を同定した。これらはスパジンの分解生成物に対応し、抗うつ薬の性質を保持している。
【００２９】
さらに、やはりプロペプチドに由来する配列番号３の配列（ＧＶＳＷＧＬＲ）のＰＥ（２２〜２８）ペプチドを、他のペプチド：ビオチン化ペプチドＰＥ（２２〜２８）、配列番号６の配列（ＰＩＧＶＳＷＧＬＲ）のペプチドＰＩ−ＰＡ（２２〜２８）、ビオチン化ペプチドＰＩ−ＰＡ（２２〜２８）、２２位のグリシンがアラニンで置換された配列番号３の配列に対応する配列番号７の配列（ＡＶＳＷＧＬＲ）のペプチドＧ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）、ビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）ペプチド、Ｎ末端にダンシル酸化学基が付加された配列番号３の配列に対応するダンシル−ＰＥ（２２〜２８）ペプチド、Ｃ末端にＯ−メチルとＯ−エチルがそれぞれ付加された配列番号３の配列に対応するペプチドＯ−メチル−ＰＥ（２２〜２８）およびＯ−エチル−ＰＥ（２２〜２８）ペプチドの設計のための基本ペプチドとして使用した。
【００３０】
これらのＰＥ（２２〜２８）類似体（以後、スパジン類似体と呼ぶ）は、行動試験（強制泳動試験、学習性無力試験）によって測定されるように、マウスにおいて有意な抗うつ剤（ＡＤ）作用を示し、そして迅速かつより効率的に神経発生およびシナプス形成を誘導する。これらのスパジン類似体の生理学的標的はスパジンのそれらと同じであるので、それらの作用機序はスパジンのそれらと非常に類似している。これらのスパジン類似体は、ＴＲＥＫ−１チャネルの阻害によって、スパジン自体よりも優れた親和性（×３３３）で作用する（スパジン類似体では０．１２ｎＭ、スパジンでは４０ｎＭ）。より優れた親和性とより小さいサイズのスパジン類似体を考えると、これらのペプチドの主な利点は、投与される製品の量の減少であり、潜在的に関連する副作用（毒性、腫瘍形成性など）の減少をもたらす。そして第二に、製造コストならびに既知の投与経路（ｉｃｖ、ｉｖ、ｉｐおよび経口）の利用可能性の減少をもたらす。従来の抗うつ薬では２１日ではなく４日で、スパジンが急速な効果を発揮することが以前に示されている。したがって、迅速に入手可能でありかつ迅速に生物から除去される短いペプチドの使用は、副作用のない有効な治療用製品の保証を表す。これは公衆衛生において非常に重要である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
したがって、本発明の目的は、配列番号４の配列（ＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷＧＬ）のペプチドＰＥ（１３〜２７）、配列番号５の配列（ＬＰＲＷＳＧＰＩＧＶＳＷ）のペプチドＰＥ（１４〜２５）、ビオチン化された配列番号３の配列に対応するビオチン化ペプチドＰＥ（２２〜２８）、配列番号６の配列（ＰＩＧＶＳＷＧＬＲ）のペプチドＰＩ−ＰＥ（２２〜２８）、ビオチン化された配列番号６の配列に対応するビオチン化ペプチドＰＩ−ＰＥ（２２〜２８）、２２位のグリシンがアラニンで置換された配列番号３の配列に対応する配列番号７の配列（ＡＶＳＷＧＬＲ）のペプチドＧ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）、ビオチン化された配列番号７の配列に対応するビオチン化ペプチドＧ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）、Ｎ末端にダンシル酸化学基が付加された配列番号３の配列に対応するペプチドダンシル−ＰＥ（２２〜２８）、及びＣ末端にＯ−メチルとＯ−エチル化学基がそれぞれ付加された配列番号３の配列に対応するペプチドＯ−メチル−ＰＥ（２２〜２８）およびＯ−エチル−ＰＥ（２２〜２８）から選択されるニューロテンシン受容体３（ＮＴＳＲ３）のプロペプチド（ＰＥ）由来のペプチドである。
【００３２】
本発明はまた、本発明のペプチドをコードする核酸配列に関する。この配列は、本発明のペプチドまたはそのフラグメントもしくは誘導体をトランスフェクションにより製造するために好ましく使用可能である。これは、例えば、ソルチリンＳＯＲＴ１のメッセンジャーＲＮＡについてのＧｅｎＢａｎｋ登録番号の配列：マウスにおけるＮＭ＿０１９９７２、ヒトにおいて：ＮＭ＿００２９５９である。
【００３３】
本発明はまた、本発明による核酸配列を含むベクターに関する。それは、遺伝子組換え技術を介して前記細胞により本発明のペプチドを製造する目的で宿主細胞を形質転換するための任意の適切なベクターであり得る。ベクターは、例えば、ｐＩＲＥＳおよびｐＩＲＥＳ２およびそれらの誘導体、ｐｃＤＮＡ３およびその誘導体、ｐＧＥＸおよびその誘導体を含む群から選択されるベクターから得ることができる。
【００３４】
本発明はまた、本発明によるペプチドおよび／または本発明による核酸配列および／または本発明によるベクターを含む宿主細胞に関する。宿主細胞は、形質転換されそして本発明の前記ペプチドまたはそのフラグメントもしくは誘導体を製造するのに適した任意の細胞であり得る。それは、例えば、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３およびその由来、Ｎ１Ｅ１１５および関連細胞であり得る。
【００３５】
したがって、本発明はまた、以下の工程を含む、本発明によるペプチドの製造方法に関する：
−  宿主細胞を本発明による核酸でトランスフェクトすること、または本発明のベクターで宿主細胞を形質転換する工程；
−  本発明によるペプチドの発現を可能にする条件下で前記宿主細胞を培養する工程；及び
−  前記ペプチドを回収する工程。
【００３６】
本発明のペプチドを製造するために使用され得るトランスフェクションおよび形質転換技術は、当業者に公知のもの、例えば、Alloui A.ら、EMBO J. 2006［１９］に記載されているものである。
【００３７】
本発明によれば、小さいサイズの本発明のペプチドを考えると、ペプチドの好ましい製造方法は、例えば固相での化学合成である。当業者に知られている任意の技術を使用することができる。例えば、ペプチドは、Krieger D.Eら、Proc Nat Acad Sci USA 1976年［２０］の固相技術に従って合成することができる。
【００３８】
本発明のペプチドは、新しいクラスの抗うつ剤および新しいうつ病治療戦略の確立において新しい道を開く。
【００３９】
本発明の目的はまた、医薬として、特に抗うつ剤として使用するための本発明によるペプチドである。
【００４０】
本発明の目的はまた、糖尿病、癌、卒中、神経変性病理、精神病理、特にうつ病、例えば卒中後うつ病のような種々の病状の治療に使用するための本発明によるペプチドである。いくつかの実験的事実によって裏付けられているＴＲＥＫ−１チャネルは、β−ＴＣ３細胞などのβ−膵臓細胞の表面に存在する。さらに、スパジン（ＹＡＰＬＰＲＷＳＧＰＩＧＳＷＧＬＲ、配列番号２）は、高血糖症に対してインスリン分泌をさらに増加させることが示されている（Hivelin C.ら、J Diabetes Res.2016）［２７］。さらに、βＴＣ３細胞上で、本発明者らは、配列番号３：ＧＶＳＷＧＬＲの配列のペプチドＰＥ（２２〜２８）がアラキドン酸（ａａ）感受性カリウム電流を遮断することを実証した。スパジン、ペプチドＰＥ（２２〜２８）、および本発明のペプチドが同じ生理学的標的を有する限り、これらのペプチドは低血糖分子と見なすこともできる。さらに、ＴＲＥＫ−１チャネルはＬＮＣａＰ細胞（前立腺癌）などの癌細胞の表面にも存在している。ＬＮＣａＰ細胞において、本発明者らは、ＰＥ（２２〜２８）ペプチドがアラキドン酸（ａａ）感受性カリウム電流を遮断し、そしてそれらの増殖を阻害することを実証した。ペプチドＰＥ（２２〜２８）および本発明のペプチドは同じ生理学的標的を有するので、それらは抗癌活性を有するとも考えられ得る。本発明によるペプチドの使用はまた、卒中に対する神経保護またはてんかんにおいても想定され得る。
【００４１】
Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）を除いて、上で定義された本発明のペプチドは、新しいタイプの抗うつ剤を構成する天然物である。それらは、うつ病の治療に現在使用されている薬物の全ての望ましくない副作用を回避することを可能にする。従来技術で使用されている薬物の副作用はそれらの化学的性質から由来する。これらの先行技術の薬物は、細胞膜を受動的に通過する性質をしばしば持ち、細胞内エフェクターとの非特異的相互作用をもたらす分子である。本発明のペプチドの性質はこの問題を回避することを可能にする。
【００４２】
さらに、カリウムチャネルＴＲＥＫ−１に対する本発明のペプチドの直接的な作用は、従来の抗うつ剤の作用時間、しばしば長い時間を十分に短縮することができた。
【００４３】
当然のことながら、添付の図面を参照しながら非限定的に与えられる以下の実施例を読めば、当業者には他の利点が明らかになり得る。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】図１は、電気生理学的実験によりインビトロで測定された、スパジンおよびペプチドＰＥ（２２〜２８）の活性と比較した、ＴＲＥＫ−１チャネルの活性に対する本発明のスパジン類似体の作用を示す。
【図２】図２は、スパジンおよびペプチドＰＥ（２２〜２８）の活性と比較した、電気生理学的実験によりインビトロで測定された、ＴＲＥＫ−１チャネルの活性に対するスパジン類似体Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）およびビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）の作用を示す。
【図３】図３は、強制泳動試験（ＦＳＴ）を受けたマウスにおいてインビボで測定された、本発明によるスパジン類似体の抗うつ活性を、スパジンおよびペプチドＰＥ（２２〜２８）のそれと比較して示す。
【図４】図４は、スパジンおよびペプチドＰＥ（２２〜２８）のそれと比較した、学習無力試験（ＬＨＴ）を受けたマウスのｉｎ  ｖｉｖｏで測定した、スパジン類似体Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）およびビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）の抗うつ活性を示す。
【図５】図５は、ペプチドＰＥ（２２〜２８）のそれと比較した、スパジン類似体Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）およびビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）の神経発生に対する作用の免疫組織化学的研究を示す。
【図６】図６は、ペプチドＰＥ（２２〜２８）（Ａ）と比較した、スパジン類似体Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）およびビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）（それぞれＢおよびＣ）の作用の研究を示す。各ペプチドについてのＰＳＤ−９５のシナプス形成ヒストグラムが（Ｄ）である。
【図７】図７は、電気生理学的実験によって同様にインビトロで測定された、膵臓細胞βＴＣ３（Ａ）および癌性細胞ＬＮＣａＰ（Ｂ）において発現されたＴＲＥＫ−１チャネルの活性に対するペプチドＰＥ（２２〜２８）の作用を示す。 並びにＬＮＣａＰ癌細胞の増殖についての結果が（Ｃ）である。
【実施例】
【００４５】
実施例１：ＴＲＥＫ−１チャネル活性に対するスパジンアナログの作用
スパジン類似体およびスパジンの効果を測定するすべての実験は、ＴＲＥＫ−１チャネル、ｈＴＲＥＫ−１／ＨＥＫ２９３で安定的にトランスフェクトされたβＴＣ３またはＬＮＣａＰまたはＨＥＫ２９３細胞に対して行われた。ｈＴＲＥＫ−１／ＨＥＫ２９３細胞株は研究室で調製された［２１］。これらの細胞はまたレポーター遺伝子：それらの可視化を可能にするＥ−グリーン蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を発現する。
【００４６】
これらの細胞を、使用する２４〜７２時間前に、直径３５ｍｍの２０，０００細胞／皿の密度で播種した。
【００４７】
ＨＥＫ２９３細胞をＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）／１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＩＣＮ）／１％ストレプトマイシン＋ペニシリン混合物（Ｇｉｂｃｏ）／１％グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ）／０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ）中で５％ＣＯ２の存在下で３７℃で培養した。
【００４８】
βＴＣ３細胞を、２．５％ＦＣＳ、５０μＭベータ−メルカプトエタノール、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５０μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび１％ストレプトマイシン＋ペニシリン混合物を補充したＲＰＭＩ １６４０培地中、３７℃で５％ＣＯ２の存在下で培養した。
【００４９】
ＬＮＣａＰ細胞をＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）／１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＩＣＮ）／１％ストレプトマイシン＋ペニシリン混合物（Ｇｉｂｃｏ）／１％グルタマックス（Ｇｉｂｃｏ）／５％ＣＯ２の存在下で３７℃で培養した。１日目に、ｈＴＲＥＫ−１／ＨＥＫ２９３またはβＴＣ３またはＬＮＣａＰ細胞を、２ｍｌの培地を含有する直径３５ｍｍ皿あたり２０，０００細胞で播種した。２日目から４日目まで、細胞を電気生理学的方法で測定した。
【００５０】
全ての測定は室温、すなわち２１〜２２℃で行われた。 ｈＴＲＥＫ−１／ＨＥＫ２９３細胞は、４８０ｎｍでの励起後にＥＧＦＰによって放出された蛍光によって同定された。
【００５１】
全細胞パッチクランプ法を用いてＴＲＥＫ−１チャネル活性を測定した。使用した装置はＲＫ４００パッチクランプ増幅器（Ａｘｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、米国）である。 １．３〜８ＭΩ抵抗パッチピペットをホウケイ酸ガラスキャピラリーから調製し、そして１５５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、５ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ ｐＨ７．２の溶液で満たした。
【００５２】
細胞培養培地を、１０ｍＭテトラエチルアンモニウムクロリド、３ｍＭ ４−アミノピリジンを含有する１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ ｐＨ７．４の溶液と交換した。細胞にこの溶液を連続的に注入した。測定された細胞の膜の静止電位は−８０ｍＶに設定された。
【００５３】
電圧変化は、連続的なランプ（−１００から＋６０ｍＶへ）または１０ｍＶの電位ジャンプ（−１００から＋６０ｍＶへの１ジャンプ当たり１．５秒）のいずれかによって得られた。得られたデータをＰｃｌａｍｐソフトウェアで分析した。
【００５４】
図１および２に記載の電流は０ｍＶで得た。表された図１および２の結果は平均値±標準偏差である。図２のＩＣ５０値は、シグモイド関数を用いて実験データをプロットすることによって得られた。
【００５５】
次いで、チャネル活性を、上記のように全細胞構成において「パッチクランプ」技術によって測定した。
【００５６】
０ｍＶで測定された本発明の全てのスパジン類似体およびスパジンのＴＲＥＫ−１チャネル活性の阻害を図１に示す。これは、ペプチドＰＥ（１４〜２５）、ＰＥ（２２〜２５）を除く全てのスパジン類似体を示す。およびＰＥ（２２〜２７）は、スパジン（ＰＥ（１２〜２８））と同程度にＴＲＥＫ−１チャネルの活性を遮断することができる。
【００５７】
０ｍＶで測定されたＴＲＥＫ−１チャネル活性阻害の用量反応曲線は、類似体Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）またはビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）またはスパジンの存在下で行われた。これらの曲線を図２に示す。これは、ペプチドＧ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）およびビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）について、それぞれ０．１２ｎＭおよび０．１３ｎＭの半減濃度（ＩＣ５０）を示し、およびスパジンについては４０ｎＭの半減濃度（ＩＣ５０）を示す。
【００５８】
全ての結果は、ほとんどのスパジン類似体が、スパジンよりも優れた親和性（×３３３）で、そしていくつかの類似体については、ペプチドＰＥ（２２〜２８）と同等の親和性でＴＲＥＫ−１チャネルを遮断できることを示す。
【００５９】
図７Ａに記載のβＴＣ３細胞に印加された電圧［Ｉ＝ｆ（Ｖ）］の関数として測定された電流強度は、スパジンがβＴＣ３細胞上に発現されかつアラキドン酸（ａａ）で以前に活性化されたＴＲＥＫ−１チャネルを遮断することができることを示す。本発明のスパジンおよびペプチドは同じ生理学的標的を有し、したがってこれらのペプチドは血糖降下分子と見なすことができる。
【００６０】
図７Ｂに記載されたＬＮＣａＰ細胞に印加された電圧［Ｉ＝ｆ（Ｖ）］の関数として測定された電流強度は、ペプチドＰＥ（２２〜２８）が、ＬＮＣａＰ細胞上に発現され、以前にアラキドン酸（ａａ）で活性化したＴＲＥＫ−１チャネルを遮断することができることを示す。さらに、ペプチドＰＥ（２２〜２８）の存在下または非存在下で２４または４８時間後に培養中の細胞を計数した後に得られたＬＮＣａＰ細胞の増殖は、ペプチドＰＥ（２２〜２８）が阻害することができることを示す。細胞増殖ペプチドＰＥ（２２〜２８）および本発明のペプチドは同じ生理学的標的を有し、したがってこれらのペプチドも抗癌活性を有すると見なすことができる。
【００６１】
実施例２：挙動試験
強制泳動試験（ＦＳＴ）
物質の抗うつ活性を決定するために古典的行動試験が開発された（Nestier E.J. et al、2002、Cryan J. and Holmes A.、2005）［２２〜２３］。本発明のスパジン類似体の効果を、本発明のスパジン類似体が溶解されている食塩水の効果およびスパジンの効果と比較した。使用したマウス系統は、Ｃ５７ＢＩ／６Ｊ系統であった。
【００６２】
食塩水、スパジン類似体およびスパジンを１００μｌのボーラスで１００μｇ／ｋｇの用量で腹腔内（ＩＰ）にマウスに投与した。
【００６３】
実験は、試験物質の投与から３０分後に、マウスを直径１５ｃｍ、高さ３０ｃｍ、１１ｃｍの水を含有する２２℃の容器に６分間浸し、最後の４分の間の無動時間を測定することからなる。
【００６４】
これらの試験の結果を図３に示す：ＦＳＴ試験、値±ＳＥＭを対照条件（生理食塩水）と統計的に比較した。***Ｐ＜０．００１、（「ＡＮＯＶＡ」試験＝分散分析の試験）。
【００６５】
結果は、ＴＲＥＫ−１チャネルの作用を阻害することができるスパジン類似体が、マウスへのそれらのＩＰ注射後の強制水泳試験において有効であることを示している。他方、ＴＲＥＫ−１チャネルを阻害するのに有効ではないペプチドＰＥ（２２〜２７）もまた、強制泳動試験における不動時間を短縮するのには無効である。
【００６６】
学習無力試験（ＬＨＴ）
学習した甘受または学習した無力感は、動物に甘受状態を誘導するための電気ショックの反復投与に基づくモデルである。確かに、避けられない電気ショックを受けた動物はそれらを受けることを甘受し、逃げようとしないことが示されている（SeligmanおよびBeagley、ラットJ Comp Physiol Psychol 88、534-541、1975）［２４］。
【００６７】
この装置は、スライドドアによって分離された２つの区画と、電気パルスが供給される金属グリッドからなる床とを備えている。学習された無力感のプロトコルは、動物のコンディショニング段階とテスト段階の2つの段階に分けられる。
【００６８】
条件付けは４日間にわたって行われ、その間にマウスは１時間０．３ｍＡの回避不可能な３６０回の電気ショックを受けた（ドア、２つの区画を分離し、閉じている）。衝撃は２秒間続き、各衝撃の間に８秒間の間隔を置いた。このコンディショニングステップは、動物に無力感という現象をもたらす。
【００６９】
試験当日、マウスを同じ区画に入れたが、ショックを回避する可能性がある。テストは３０試行を数えた。ショックの施行中、２つの区画を隔てる扉が開き、動物が逃げることができた。動物がコンパートメントを変えると、試験は終了し、そしてショックは止まる。マウスがコンパートメントを変えなければ、ショックは２４秒後に止まり、テストは終了する。この試験により、動物の逃避潜時を記録することが可能になった。次に、３０のテストを５でグループ化し、平均逃避時間を計算した。
【００７０】
分子であるＧ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）およびビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）または食塩水を、調整の３０分前に、食塩水中で調製した１０−６Ｍ溶液１００μＬのボーラスの形態で注射する。
【００７１】
図４に示された結果は、以前に記載されたのと同じ条件下でマウスに投与されたペプチドＧ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）およびビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）が、ペプチドＰＥ（２２〜２８）と同等の方法で学習した甘受試験における逃避潜時を短縮できることを示す。
【００７２】
実施例３：神経発生およびシナプス形成に対するスパジンアナログの作用
免疫組織化学による神経発生の研究
ＢｒｄＵ（５−ブロモ−２’−デオキシウリジン）は、チミジンに類似の合成ヌクレオシドである。分裂中の細胞のＳ期（間期中の染色体複製）中のＤＮＡ複製中に取り込まれる。 ＢｒｄＵの注射は、免疫学的標識によって分析されるべき組織の分割における細胞を視覚化することを可能にする。本研究では、マウスの海馬神経発生を、スパジンまたは異なる類似体での治療後に評価した。
【００７３】
行動試験の後、Beauquis、J.ら（Eur J Neurosci 23、1539-1546、2007）［２５］の改良プロトコルに従って、マウスに１２０ｍｇ／ｋｇの最終濃度でＢｒｄＵを腹腔内注射した。２時間間隔で１０ｍｇ／ｍｌの３００μｌの４回注射を行った。注射の２４時間後、マウスをペントバルビタール（１００ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した後、心臓内に灌流した。心臓内灌流の間、生理食塩水を投与してマウスの体から全ての血液を除去し、次いで４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を灌流して臓器を固定した。４％ＰＦＡ中での固定後もまた一晩行った。マウスの脳をビブラトーム（Ｌｅｉｃａ）で切断したところ、４０μｍの浮遊前頭切片が得られた。免疫学的反応のために選択された切片は、ブレグマ３．３から５．３の範囲のものであった。 ８つの切片を規則的な間隔で選択し、海馬全体を覆うことができるようにしながら、一方の脳から他方の脳へと均質に保った。
【００７４】
免疫学的反応は、抗ＢｒｄＵ一次抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、１／８０００）を脳切片と共に4℃で一晩インキュベートすることによって行った。次いで脳切片をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、二次抗体（ビオチン化ヤギ抗マウス抗体、Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、１／４００）と共に２時間インキュベートした。免疫学的反応を増幅するために、アビジン／ビオチン／ペルオキシダーゼ複合体（ＡＢＣ Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ Ｋｉｔ、Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中で１時間インキュベートした。最後に、ニッケルの溶液、３−３’ジアミノベンジジンの溶液およびＨ２Ｏ２を含むペルオキシダーゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて明らかにした。
【００７５】
次に切片をスライドに載せ、エンテランで固定した。海馬の歯状回のＢｒｄＵ陽性細胞を各脳の両方の半球で計数した。次いで、８つの切片で得られた細胞数を４０倍して、海馬全体の増殖細胞の総数を説明した。
【００７６】
図５に示す結果は、ペプチドＧ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）およびビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）が、わずか４日間の治療後に神経新生の増加を誘導することができることを示している。これらの増加は、未修飾ペプチドＰＥについて同じ条件下で得られた増加よりも大きい（２２〜２８）。
【００７７】
シナプス形成
妊娠した雌Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウス（２０〜２５ｇ、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ、Ｓｔ Ｂｅｒｔｈｅｖｉｎ、フランス）を、３０％酸素および７０％亜酸化窒素と混合した２％イソフルランの吸入によって麻酔し、次いで屠殺した。胚（Ｅ１４）を取り出し、大脳皮質を１％グルコースを含有するＰＢＳ中で解剖した。ニューロンは、Brewer and Torricelli、2007［２６］に記載されているように、大脳皮質から機械的解離によって調製した。解離したニューロンをポリ−Ｌ−リジン処理プレートに分配し、３７℃で２％Ｂ２７（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｉｌｌｋｉｒｃｈ、フランス）および５０μｇ ／ ｍｌゲンタマイシン（Ｓｉｇｍａ、フランス）を含有する神経基礎培地中で最大１０日間培養した。 ５％ＣＯ２下での温度。
【００７８】
スパジンＧ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）およびビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）の類似体は、Ｃｏｖａｌａｂ（Ｖｉｌｌｅｕｒｂａｎｎｅ、フランス）によって合成された。
【００７９】
１４日目の段階（Ｅ１４）でＣ５７Ｂ１６／Ｊマウス胚（Ｊａｎｖｉｅｒ）の新皮質から単離した皮質ニューロン培養物を、１μＭの各スパジン類似体と共にインキュベートした。インキュベーションは、１４０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣｌ、１．８ｍＭのＣａＣｌ ２、３．６ｍＭのＭｇＣｌ ２、および０．１％のＢＳＡを含有するｐＨ７．４のイーグルス−Ｔｒｉｓ−ＨＥＰＥＳ緩衝液中で行った。
【００８０】
ペプチドＧ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）およびビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）で様々な期間（０、５、８、２４および３６時間）処理した皮質ニューロンをＬａｅｍｍｌｉ緩衝液中でホモジナイズし、以下を使用して分析した。１０％ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル。次いで、分離したタンパク質をゲルからニトロセルロース膜（ＶＷＲ、Ｆｏｎｔｅｎａｙ−ｓｏｕｓ−Ｂｏｉｓ、フランス）に移し、5％スキムミルクまたは５％ＢＳＡのＰＢＳ溶液で室温で30分間ブロッキングした。膜をＰＳＤ−９５タンパク質（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、非標識、Ｍｏｎｔｉｇｎｙ−ｌｅ−Ｂｒｅｔｏｎｎｅｕｘ、フランス）に対する抗体と４℃で一晩インキュベートした。 β−アクチン含有量は、抽出後、１／５０００希釈の抗β−アクチン抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚマウスモノクローナル抗体、１／５０００希釈）を用いて決定した。 ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ ０．１％中で４回洗浄した後、ＨＲＰ結合抗マウスおよび抗ウサギ二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｒｓａｙ、フランス、１／１００００）を室温で１時間インキュベートする。タンパク質は、ＬＡＳ−３０００イメージングシステム（富士通、デュッセルドルフ、ドイツ）を用いてＥＣＬ  Ｐｌｕｓ検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で検出した。各標識バンドの相対強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｗａｙｎｅ  Ｒａｓｂａｎｄ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、米国メリーランド州ベセスダ）を使用して濃度測定スキャニングによって分析した。示されるように、タンパク質活性化を全βアクチンを用いて正規化した。
【００８１】
図６に示す結果は、スパジン類似体がシナプス形成を急速に増加させたことを示している。スパジン類似体Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）またはビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）（１μＭ）で処置した皮質ニューロンは、２４時間後およびより重要なことには３６後に観察可能なＰＳＤ−９５シナプスタンパク質発現の増加を示す。時間です。最初の５時間の間のわずかな減少を除いて、スパジン類似体での処置は３６時間までＰＳＤ−９５の発現を連続的に増加させることに留意されたい（図６Ｄ）。これらの増加は、未修飾ペプチドＰＥについて同じ条件下で得られた増加よりも大きい（２２〜２８）。これらの結果は、スパジン類似体Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）またはビオチン化Ｇ／Ａ−ＰＥ（２２〜２８）がペプチドＰＥ（２２〜２８）よりも強力に神経新生を増加させるがシナプス形成もより強力に増加することを示す。大部分の新形成細胞の成熟は、成熟ニューロンを生成することである。
【００８２】
［参考文献］
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2020502995.tif 000004
2020502995.tif 000005
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2020502995000001.app
【国際調査報告】
2020502995.tif 000013
2020502995.tif 000014
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