(57)【要約】方法１００及び／又はシステム２００の実施形態、又は微生物と関連したシークエンシングを目的とするライブラリーの調製は、１つ又は複数の標的と関連する一連の固有分子識別子（ＵＭＩ）に基づく分子を調製すること；一連のシークエンシングに基づくプライマーを調製すること；一連のＵＭＩに基づく分子、及び１つ又は複数の標的と関連する１つ又は複数のサンプルに基づき、一連のタグ付けされた標的分子を生成すること；並びに／或いはタグ付けされた標的分子及び一連のシークエンシングに基づくプライマーに基づき、一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成することを含むことができる。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）のためにライブラリーを調製する方法であって、
一連の核酸標的と関連する一連の固有分子識別子（ＵＭＩ）に基づくプライマーを調製するステップであり、前記一連のＵＭＩに基づくプライマーのうちのＵＭＩに基づくプライマーそれぞれが、
一連のランダムな「Ｎ」塩基を含むＵＭＩ領域であり、ランダムな「Ｎ」塩基のそれぞれが、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基、及び「Ｃ」塩基のうちの任意の１つから選択される、ＵＭＩ領域と、
前記一連の核酸標的のうちの少なくとも１つの核酸標的と関連する標的関連の領域と
を含む、ステップ、
一連のシークエンシングに基づくプライマーを調製するステップであり、前記一連のシークエンシングに基づくプライマーのうちのシークエンシングに基づくプライマーそれぞれが、ＮＧＳと関連するアダプター領域を含む、ステップ、
前記一連のＵＭＩに基づくプライマー及び前記一連の核酸標的と関連する少なくとも１つのサンプルを用いた第１の増幅プロセスに基づき、一連のタグ付けされた標的分子を生成するステップ、及び
前記タグ付けされた標的分子及び前記一連のシークエンシングに基づくプライマーを用いた第２の増幅プロセスに基づき、一連のＮＧＳレディのタグ付けされた標的分子を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
前記一連のＵＭＩに基づくプライマーのうちのＵＭＩに基づくプライマーそれぞれが、前記標的関連の領域と関連する少なくとも１つの核酸標的に対して完全な相補性を有さないリンカー領域を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リンカー領域が、２１塩基よりも短い長さを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一連のＵＭＩに基づくプライマーのうちのＵＭＩに基づくプライマーそれぞれについて、前記リンカー領域が、前記ＵＭＩ領域と前記標的関連の領域の間に配置されている、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記一連のＵＭＩに基づくプライマーのうちのＵＭＩに基づくプライマーそれぞれが、ＮＧＳと関連する外部アダプター領域を更に含み、
前記一連のタグ付けされた標的分子が、外部アダプター領域を含み、
前記一連のＮＧＳレディのタグ付けされた標的分子を生成するステップが、前記タグ付けされた標的分子の前記外部アダプター領域において、前記一連のシークエンシングに基づくプライマーを、前記タグ付けされた標的分子と共にアニーリングすることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記一連のタグ付けされた標的分子を生成するステップが、前記一連のＵＭＩに基づくプライマーと、少なくとも１つの生体サンプルと、ＭｇＣｌ２、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、耐熱性核酸結合タンパク質、ベタイン、ホルムアミド、ｔｗｅｅｎ、ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ−４０、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のうちの少なくとも１つを含む一連のタグ付け促進分子とを用いて、第１の増幅プロセスを実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記耐熱性核酸結合タンパク質が、耐熱性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含み、前記一連のタグ付けされた標的分子を生成するステップが、一連のＵＭＩに基づくタンパク質と、少なくとも１つのサンプルと、ＭｇＣｌ２及び耐熱性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む一連のタグ付け促進分子とを用いて、第１の増幅プロセスを実施することを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記一連のタグ付けされた標的分子を生成するステップが、第１の増幅プロセスの生成物を用いて精製プロセスを実施して、第１の増幅プロセスの生成物から、前記一連のＵＭＩに基づくプライマーのうちのＵＭＩに基づくプライマーを取り除くことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第１の増幅プロセスが、第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスを含み、
第２の増幅プロセスが、第２のＰＣＲプロセスを含み、
前記一連のシークエンシングに基づくプライマーのうちのシークエンシングに基づくプライマーそれぞれが、ＮＧＳと関連する多重化を促進するように構成されたインデックス領域を更に含み、
前記一連のＮＧＳレディのタグ付けされた標的分子を生成するステップが、前記タグ付けされた標的分子及び前記一連のシークエンシングに基づくプライマーを用いた第２のＰＣＲプロセスに基づき、前記インデックス領域及びアダプター領域を、前記一連のタグ付けされた標的分子のうちのタグ付けされた標的分子に付加することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）のためにライブラリーを調製する方法であって、
一連のアンプリコン生成プライマー及び少なくとも１つのサンプルから得られた一連の核酸標的を用いた第１の増幅プロセスに基づき、一連の標的関連のアンプリコンを生成するステップ、
少なくとも１つのサンプルから得られた一連の全核酸を処理することに基づき、一連のメタゲノム関連の断片を生成するステップ、及び
前記一連の標的関連のアンプリコン、前記一連のメタゲノム関連の断片、及び一連のシークエンシングに基づくプライマーに基づき、一連のシークエンシングレディ標的分子を生成するステップであり、前記一連のシークエンシングレディ標的分子が、前記一連の核酸標的と関連する、ステップ
を含む、方法。
【請求項１１】
前記一連のアンプリコン生成プライマーが、
アンプリコン生成プライマーの第１のサブセットであって、第１のサブセットのアンプリコン生成プライマーそれぞれが、第１のアンプリコン関連のアダプター領域、及び前記一連の核酸標的のうちの少なくとも１つの核酸標的のフォワード配列と関連する第１の標的関連の領域を含む、サブセットと、
アンプリコン生成プライマーの第２のサブセットであって、第２のサブセットのアンプリコン生成プライマーそれぞれが、第２のアンプリコン関連のアダプター領域、及び前記一連の核酸標的のうちの少なくとも１つの核酸標的のリバース配列と関連する第２の標的関連の領域を含む、サブセットと
を含み、
前記一連の標的関連のアンプリコンを生成するステップが、アンプリコン生成プライマーの第１及び第２のサブセットを用いた増幅に基づき、前記一連の標的関連のアンプリコンを生成することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アンプリコン生成プライマーの第１のサブセットが、第１の固有分子識別子（ＵＭＩ）に基づくプライマーを含み、第１のＵＭＩに基づくプライマーのうちのＵＭＩに基づくプライマーそれぞれが、第１のアンプリコン関連アダプター領域、第１の標的関連の領域、及び第１のＵＭＩ領域を含み、
前記アンプリコン生成プライマーの第２のサブセットが、第２のＵＭＩに基づくプライマーを含み、第２のＵＭＩに基づくプライマーのうちのＵＭＩに基づくプライマーそれぞれが、第２のアンプリコン関連アダプター領域、第２の標的関連の領域、及び第２のＵＭＩ領域を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記一連のメタゲノム関連の断片を生成するステップが、ライゲーションプロセス及び増幅プロセスのうちの少なくとも１つに基づき、付加されたアダプターを含む前記一連のメタゲノム関連の断片を生成することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記一連のシークエンシングに基づくプライマーが、
ＮＧＳと関連するメタゲノム関連のアダプター領域、及び前記一連のメタゲノム関連の断片の付加されたアダプター
を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記一連のシークエンシングに基づくプライマーのそれぞれが、
ＮＧＳと関連する多重化を促進するように構成されたインデックス領域と、
ＮＧＳ、前記一連の標的関連のアンプリコン、及び前記一連のメタゲノム関連の断片と関連するアダプター領域と
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記一連のシークエンシングに基づくプライマーの前記アダプター領域が、ＮＧＳ、前記一連のメタゲノム関連の断片の付加されたアダプター、前記アンプリコン生成プライマーの第１のサブセットの第１のアンプリコン関連のアダプター領域、及び前記アンプリコン生成プライマーの第２のサブセットの第２のアンプリコン関連のアダプター領域と関連する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記一連のメタゲノム関連の断片を生成するステップが、
酵素的プロセス及び機械的プロセスのうちの少なくとも１つを用いて、前記一連の全核酸を処理することに基づき、断片を生成することと、
固有分子識別子（ＵＭＩ）に基づく分子を前記断片にライゲートすることに基づき、前記一連のメタゲノム関連の断片を生成することと
を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
前記一連のメタゲノム関連の断片を生成するステップが、断片化前に、前記一連の全核酸を前処理することを含み、前記一連の全核酸を前処理することが、
前記一連の全核酸に由来するｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること、
前記一連の全核酸の第１の核酸に対応する第１の配列を選択的に富化するために、第１の標的捕捉プロセスを実施すること、及び
前記一連の全核酸の第２の核酸に対応する第２の配列を選択的に除外するために、第２の標的捕捉プロセスを実施すること、
のうちの少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
前記一連のシークエンシングレディ標的分子に由来する微生物配列データセットに基づき、微生物群から特定の微生物を識別するステップを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
微生物と関連するシークエンシングを目的としてライブラリーを調製するための方法であって、
一連の核酸標的と関連する一連の固有分子識別子（ＵＭＩ）に基づく分子を調製するステップであり、前記一連のＵＭＩに基づく分子のうちのＵＭＩに基づく分子それぞれが、一連のランダムな「Ｎ」塩基を含むＵＭＩ領域を含み、ランダムな「Ｎ」塩基のそれぞれが、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基、及び「Ｃ」塩基のうちの任意の１つから選択される、ステップ、
一連のシークエンシングに基づくプライマーを調製するステップであり、前記一連のシークエンシングに基づくプライマーのうちのシークエンシングに基づくプライマーそれぞれが、シークエンシングを促進するように構成されている、ステップ、
前記一連のＵＭＩに基づく分子、及び前記一連の核酸標的と関連する少なくとも１つのサンプルに基づき、一連のタグ付けされた標的分子を生成するステップ、及び
前記一連のタグ付けされた標的分子、及び前記一連のシークエンシングに基づくプライマーを用いた増幅プロセスに基づき、一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成するステップ
を含む、方法。
【請求項２１】
前記一連のタグ付けされた標的分子を生成するステップが、
少なくとも１つのサンプル、及び前記一連の核酸標的の少なくとも１つの核酸標的と関連する標的関連の領域を含む一連のプライマーに基づき、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセスを実施することと、
前記一連のＵＭＩに基づく分子を、ＰＣＲプロセスの生成物にライゲートすることと
を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記一連のタグ付けされた標的分子を生成するステップが、
少なくとも１つのサンプルから核酸断片を生成することと、
前記一連のＵＭＩに基づく分子を前記核酸断片にライゲートすることと
を含む、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0002]本開示は、ゲノミクス及び分子生物学に一般的に関する。
【背景技術】
【０００２】
[0003]次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術（例として、ＮＧＳプラットフォーム）は、ＤＮＡ及び／又はその他の核酸のシークエンシングにおけるコストを低下させ、取得される情報の質を改善し、並びに／或いはシークエンシングプロセスのスケーラビリティを改善することができる。ＮＧＳ技術は、高深度の分析法を用いて、少数〜多数のＤＮＡ及び／又はその他の核酸サンプルのシークエンシングを促進することができ、それは、正確な標的ＤＮＡ配列及び／又はその他の適する配列の検出及び解読を可能にすることができる。異なる核酸の混合物（例として、異なるＤＮＡ核酸等）が同時に分析可能であるが、それは、複合的混合物（例として、微生物を含む複合的生態群集から抽出されるＤＮＡ及び／又はその他の核酸等）の組成分析、及び／又は保存された配列のプールからの稀なＤＮＡ配列バリアント（例として、大型の組織の少数の細胞における稀な突然変異の生成等）の分析を促進することができる。しかし、ＮＧＳ及び／又はその他のシークエンシングアプローチを目的として、シークエンシングライブラリーを構築する場合、様々なバイアス（例として、ＤＮＡ標的等の異なる標的について、標的間の比について等）を呼び込むおそれのあるライブラリー調製プロセス（例として、ＤＮＡ操作、増幅等）を含む可能性がある。更に、配列決定された読み取りの数は、ライブラリーの中又はオリジナルの混合品の中に存在する核酸分子（例として、ＤＮＡ分子）の直接的な割合を必ずしも表わしているわけではなく、それは絶対定量的データ（例として、分析されるオリジナルの生体サンプルの組成の正確な数又は見積り等）を生成する際に、困難をもたらすおそれがある。
【０００３】
[0004]更に、ＮＧＳ技術及び／又はその他の適するシークエンシング技術は、アンプリコン関連のシークエンシング（例として、例えば生体サンプル中の１つ又は複数の微生物分類群を同定するなどための、単一又は少数の遺伝子領域と関連した分析等）、又はメタゲノム関連のシークエンシング（例として、例えば単一の遺伝子アンプリコンの分析とは異なり、ＤＮＡの群全体を含むような、生体サンプルの微生物群（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）及び／又はその他の適する生態群集と関連した分析等）に使用可能である。しかし、アンプリコン関連のシークエンシング又はメタゲノム関連のシークエンシングのそれぞれは、固有の長所及び欠点を個々に含む。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】方法の実施形態の変形形態のフローチャート表示を示す図である。
【図２】方法の実施形態の変形形態のフローチャート表示を示す図である。
【図３】方法の実施形態の変形形態のフローチャート表示を示す図である。
【図４】方法の実施形態の変形形態のフローチャート表示を示す図である。
【図５】方法の実施形態の変形形態のフローチャート表示を示す図である。
【図６】古典的なシークエンシングプライマー又は４Ｎ  ＵＭＩ領域を含むＵＭＩに基づくプライマーを用いて組み立てられた１６Ｓシークエンシングライブラリーについて、割り振られた読み取りを比較した具体的な例を示す図である。
【図７】４Ｎ  ＵＭＩ領域又は８Ｎ  ＵＭＩ領域を含むＵＭＩに基づくプライマーを用いて組み立てられた１６Ｓシークエンシングライブラリーについて、割り振られた読み取りを比較した具体的な例を示す図である。
【図８】８Ｎ  ＵＭＩ領域を含むＵＭＩに基づくプライマーを使用するＰＣＲプロセスにおいて、タグ付け促進分子を付加したときに、標的増幅が改善することの具体的な例を示す図である。
【図９Ａ】４Ｎ  ＵＭＩ領域、８Ｎ  ＵＭＩ領域、及びタグ付け促進分子を使用したときに、サンプル毎に割り振られたＵＭＩの合計数を比較した具体的な例を示す図である。
【図９Ｂ】４Ｎ  ＵＭＩ領域、８Ｎ  ＵＭＩ領域、及びタグ付け促進分子を使用したときに、サンプル毎に割り振られたＵＭＩの合計数を比較した具体的な例を示す図である。
【図１０Ａ】４Ｎ  ＵＭＩ領域、５Ｎ  ＵＭＩ領域、及びタグ付け促進分子を使用したときに、サンプル毎に割り振られたシークエンシング読み取りの合計数を比較した具体的な例を示す図である。
【図１０Ｂ】４Ｎ  ＵＭＩ領域、５Ｎ  ＵＭＩ領域、及びタグ付け促進分子を使用したときに、サンプル毎に割り振られたシークエンシング読み取りの合計数を比較した具体的な例を示す図である。
【図１１Ａ】４Ｎ  ＵＭＩ領域、８Ｎ  ＵＭＩ領域、及びタグ付け促進分子を使用したときに、サンプル毎に割り振られた固有のＵＭＩの割合（％）を比較した具体的な例を示す図である。
【図１１Ｂ】４Ｎ  ＵＭＩ領域、８Ｎ  ＵＭＩ領域、及びタグ付け促進分子を使用したときに、サンプル毎に割り振られた固有のＵＭＩの割合（％）を比較した具体的な例を示す図である。
【図１２】８Ｎ  ＵＭＩ領域を含むＵＭＩに基づくプライマーを用いた１６Ｓ増幅について、リンカー領域の効果の具体的な例を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００５】
[0017]下記の実施形態の説明は、本発明がこの実施形態に制限されるようには意図されず、むしろあらゆる当業者がそれを作成及び使用可能であるように意図される。
【０００６】
１．概要
[0018]図１及び図４に示すように、微生物と関連したシークエンシング（例として、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）等）を目的としてライブラリーを調製するための方法１００の実施形態は、１つ又は複数の標的（例として、一連の核酸標的；微生物と関連する標的等）と関連する一連の固有分子識別子（ＵＭＩ）に基づく分子（例として、ＵＭＩに基づくプライマー等）を調製すること（例として、決定すること、生成すること等）Ｓ１１０；一連のシークエンシングに基づくプライマー（例として、微生物と関連するシークエンシング、例えば次世代シークエンシング等を促進するように構成されている）を調製することＳ１２０；一連のＵＭＩに基づく分子、及び１つ又は複数の標的（例として、１つ又は複数の核酸標的と関連する核酸を含む１つ又は複数の生体サンプル等）と関連する１つ又は複数の生体サンプル（例として、少なくとも１つの生体サンプル）に基づき、一連のタグ付けされた標的分子を生成することＳ１３０；並びに／或いはタグ付けされた標的分子及び一連のシークエンシングに基づくプライマーに基づき、一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子（例として、ＮＧＳレディのタグ付けされた標的分子等）を生成することＳ１４０、を含むことができる。
【０００７】
[0019]具体的な例では、方法１００（例として、微生物と関連するＮＧＳ等）は、微生物と関連する一連の核酸標的と関連する一連のＵＭＩに基づくプライマー（例として、一連の核酸標的のうちの１つ又は複数の核酸標的の配列に対して相補的な遺伝子配列を含むＵＭＩに基づくプライマー等）であって、その一連のＵＭＩに基づくプライマーのうちのＵＭＩに基づくプライマーそれぞれが、一連のランダムな「Ｎ」塩基を含むＵＭＩ領域（但し、Ｎ塩基のそれぞれは「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基、及び「Ｃ」塩基のうちの任意の１つから選択される）、一連の核酸標的のうちの少なくとも１つの核酸標的と関連する標的関連領域（例として、少なくとも１つの核酸標的の配列に対して相補的な遺伝子配列を含む標的関連領域等）、リンカー領域（例として、ＵＭＩ領域と標的関連領域の間に配置されているリンカー領域等）、及び／又はアダプター領域（例として、シークエンシングレディ分子を調製するための後続する処理を促進するように構成された外部アダプター領域を含むアダプター領域等）を含む、上記一連のＵＭＩに基づくプライマーを調製することと、一連のシークエンシングに基づくプライマーであって、一連のシークエンシングに基づくプライマーのうちのシークエンシングに基づくプライマーそれぞれが、ＮＧＳと関連するアダプター領域（例として、１つ若しくは複数のＮＧＳ技術を用いてＮＧＳを促進するように構成されたシークエンシングアダプターを含み、及び／又はＵＭＩに基づくプライマーアダプター領域の外部アダプター領域と関連する外部アダプター領域を含むアダプター領域等）（例として、ＵＭＩに基づくプライマーのアダプター領域と異なる、類似した、若しくは同一のアダプター領域等）を含み、及び／又はインデックス領域（例として、異なるサンプルのコンビナトリアルなタグ付けを促進し、多重化を促進するためのシークエンシングインデックス領域等）を含む、上記一連のシークエンシングに基づくプライマーを調製することと、一連のＵＭＩに基づくプライマー及び一連の核酸標的と関連する少なくとも１つの生体サンプルを用いた第１の増幅プロセス（例として、第１のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロセス等）に基づき、一連のタグ付けされた標的分子を生成することと、並びにタグ付けされた標的分子及び一連のシークエンシングに基づくプライマーを用いた第２の増幅プロセス（例として、第２のＰＣＲプロセス等）に基づき、一連のＮＧＳレディのタグ付けされた標的分子を生成することとを含むことができる。
【０００８】
[0020]加えて、又は代替として、図２、図３、及び図５に示すように、方法１００の実施形態は、アンプリコン関連シークエンシング及び微生物と関連するメタゲノム関連シークエンシングと関連する統合型シークエンシングライブラリーを調製することＳ１５０を含むことができる。複数の実施形態では、方法１００（例として、統合型シークエンシングライブラリーを調製することを含む、方法１００の実施形態のいくつかの部分等）は、一連のアンプリコン生成プライマー（例としてＵＭＩに基づくプライマー等）、及び微生物と関連する少なくとも１つの生体サンプルに由来する一連の標的を用いた増幅プロセス（例として、第１のＰＣＲプロセス等）に基づき、一連の標的関連のアンプリコンを生成することＳ１５２；少なくとも１つの生体サンプルに由来する一連の全核酸を処理すること（例として、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること；標的捕捉プロセスを実施すること；断片化すること等）に基づき、微生物群（例として、微生物に対応する微生物群等）と関連する一連のメタゲノム関連の断片を生成することＳ１５４；並びに／或いは一連の標的関連のアンプリコン、一連のメタゲノム関連の断片、及び一連の配列決定に基づくプライマーに基づき（例として、第２の増幅プロセス、例えば標的関連のアンプリコン及び／又はメタゲノム関連の断片を用いた第２のＰＣＲプロセス等に基づき）、一連のシークエンシングレディ標的分子を生成することＳ１５８を含むことができる。
【０００９】
[0021]加えて、又は代替として、方法１００の実施形態は、１人又は複数のユーザー（例として、対象；ヒト；動物；患者；植物等）に由来する１つ又は複数の生体サンプル、例えば、１つ又は複数の腸の部位（例として、便サンプルに基づき分析されるような部位等）、皮膚の部位、鼻の部位、口の部位、生殖器の部位、及び／又はその他の適する生理学的な部位を含み得る、１つ又は複数の収集部位から収集された生体サンプル等を処理すること（例として、収集すること；方法１００の実施形態のいくつかの部分を促進するためのサンプル調製；方法１００の実施形態のいくつかの部分を実施すること等）と；微生物配列データセット（例として、方法１００の実施形態のいくつかの部分から生成されたシークエンシングライブラリーを用いたシークエンシングに基づき生成された微生物配列データセット；配列決定されたＵＭＩ領域、例えばシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子のＵＭＩ領域等と関連するバイオインフォマティク解析から生成された微生物配列データセット）に基づき、マイクロバイオーム特性（例として、微生物の組成特性；微生物の機能特性；診断及び／又は療法等に関連する微生物関連の状態と関連する特性等）を決定することと、を含むことができる。しかし、方法１００の実施形態は、任意の適するプロセスを加えて、又は代替として含むことができる。
【００１０】
[0022]方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、シークエンシング技術と関連するバイアス（例として、ＤＮＡライブラリー調製の従来のアプローチと関連したバイアス；１つ又は複数のオリジナルの生体サンプルに由来する個々の分子の当初の比に影響を及ぼすバイアス；ＮＧＳ技術と関連したバイアス等）を低下させ、核酸（例として、ＤＮＡ分子；１つ又は複数のオリジナルサンプル中の核酸等）及び／又はその他の適するコンポーネント（例として、サンプル中の定義されたコピー数の遺伝子について、ＵＭＩの割り振られた数に基づきシークエンシングデータの標準化を経たコンポーネント等）の定量分析（例として、絶対量の分析；分子、対立遺伝子、遺伝子バリアント、及び／又はその他のコンポーネントの絶対的な定量等）を改善し；ＲＮＡ転写の標準化と関連したプロセス（例として、ＲＮＡからＤＮＡへの変換後のプロセス等）を改善し；低頻度突然変異の検出を改善し；定量的な単一細胞ＲＮＡシークエンシングを改善し；免疫レパートリー細胞の定量的組成分析を改善し；並びに／或いは、例えば、シークエンシングライブラリーへの（例として、標的分子及び／又は配列決定されるその他の適する分子等への）ＵＭＩ（例としてＵＭＩに基づく分子、ＵＭＩに基づく分子のＵＭＩ領域等）のプロセシング（例として、その組み込み；その組み込みと関連する効率を改善すること；その組み込みと関連する汎用性を改善すること；その調製；その決定等）を改善することにより、シークエンシングを目的とするライブラリーの調製を改善すること等を通じて、シークエンシング技術と関連したその他の用途を改善するように機能することができる。具体的な例では、方法１００は、標的分子のタグ付け（例として、ＵＭＩ領域を用いたタグ付け等）及び増幅のために、第１及び第２のＰＣＲプロセス（例として、高効率２ステップＰＣＲアプローチ等）を実施することを含むことができる。具体的な例では、組み込まれたＵＭＩ領域は、例えば、ＮＧＳ技術、計算システム、及び／又はその他の適するコンポーネントを用いて、ＵＭＩ領域について、シークエンシング及び／又はバイオインフォマティクス分析を実施すること等を通じて、複合的混合物（例として、微生物群を含む複合的混合物等）中の個別の標的分子及び／又はその他の適する分子（例として、メタゲノム関連の断片等）のトラッキングを促進することができる。
【００１１】
[0023]加えて、又は代替として、方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、例えばアンプリコン関連のシークエンシング及びメタゲノム関連のシークエンシング（例として、ＮＧＳ技術及び／又はその他の適するシークエンシング技術を用いたシークエンシング等）を同時に実施すること（例として、それらを組み合わせること等）を促進して、例えば、アンプリコン関連のシークエンシング及びメタゲノム関連のシークエンシングの両方（例として、例えば標的遺伝子及び／又はその他の標的を含む微生物群内で大部分を占める生物の分析を可能にする際などにおけるアンプリコン関連のシークエンシングの長所；全コミュニティーＤＮＡに基づき微生物群の偏りのない分析を可能にする際などにおける、例えばマイクロバイオーム組成、マイクロバイオーム機能の両方、関連する多様性、及び／又はその他の適する特性に関連する微生物群の特徴付けを可能にする際などにおけるメタゲノム関連のシークエンシングの長所）の長所（例として、欠点と釣り合いを取ることができる；微生物群の多量に存在する微生物に偏った分析バイアスを低下させ、例えば標的の保存された領域、並びに例えば分類マーカー、例えば１６Ｓ  ｒＲＮＡ、ｒｐｏＢ、及び／又はその他のマーカー等に関連するなどしてその他の分類群から区別するための可変領域を含むプライマーデザインのために、標的の特徴付けの程度に関する要件を軽減する新たな長所を促進することができる）を生かすなどのために、統合型シークエンシングライブラリーの調製を可能にするように機能することができる。
【００１２】
[0024]具体的な例では、方法１００は、（例として、機能関連遺伝子、例えば抗生物質遺伝子、病毒性遺伝子、ヒト遺伝マーカー等のメタゲノム検出を可能にする；複数のＲＮＡ生物、例えばウイルス等の検出を可能にする；生体サンプルに由来するｍＲＮＡを通じて宿主及び微生物の転写遺伝子の検出を可能にするなどのために）、統合型アンプリコン（例として、分類関連遺伝子、例えば１６Ｓ、１８Ｓ、ＩＴＳ等について）、及びメタゲノムＤＮＡライブラリーを生成することを含むことができる。具体的な例では、方法１００は、幅広い標的核酸（例として、ＤＮＡ）ライブラリーを生成することを含むことができる。
【００１３】
[0025]加えて、又は代替として、方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、例えば、標準的なゲノム又は公知のゲノムに基づき、機能関連分析を実施する（例として、マイクロバイオームの機能的な特質等を決定する）付加的又は代替的な方式で、１つ又は複数の生体サンプル中の生物を対象とする狙いを定めた分類プロファイリング（及び／又はその他の適する組成関連分析）に関するデータ（例として、微生物配列データ等）の提供を促進し、並びに生物の遺伝子機能プロファイリング（及び／又はその他の適する機能関連分析）に関するデータ（例として、微生物配列データ等）の提供（例として、メタゲノム関連アプローチ、例えばメタゲノム関連のシークエンシング等を通じて）を促進するように機能することができる。
【００１４】
[0026]加えて、又は代替として、方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、微生物関連の検出（例として、サンプルの生物の分類検出、並びに同一サンプル中に存在する又は発現される遺伝子の検出；保存された分類遺伝子を有する生物の狙いを定めた方式での検出、並びに／或いは１つ又は複数の生体サンプル中のすでに特徴付けられた、又はいまだ特徴付けられていないＤＮＡを有するその他の真核生物、原核生物、ウイルス生物、及び／又はその他の適する微生物を偏りなく検出すること；例えば補完性の富化に基づくプロトコール等、例えば特異的な標的若しくは１６Ｓ、１８Ｓ、ＩＴＳのような領域の増幅、或いはメタゲノム及び／又はメタトランスクリプトミックシークエンシングにおいて偏りがない任意のその他の部位特異的方式に基づく技術等による新規、未知、及び／又は未確認の潜在的核酸標的の検出；偏りのない方式での、例えば抗生物質耐性、病原性因子分子マーカー等と関連する公知の又は同定済みの核酸標的、及び目的とするその他の適する標的の、例えば補完性の富化に基づくプロトコール等による検出）を促進するように機能することができる。但し、方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、任意の適する機能性を含むことができる。
【００１５】
[0027]方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、ＮＧＳ（例として、ＮＧＳ技術）と関連するライブラリー調製を容易にするのが好ましい。ＮＧＳは、ハイスループットシークエンシング（例として、ハイスループットシークエンシング技術；超並列シグネチャーシークエンシング、ポロニーシークエンシング、４５４パイロシークエンシング、イルミナシークエンシング、ＳＯＬｉＤシークエンシング、イオントレント半導体シークエンシング、ＤＮＡナノボールシークエンシング、ヘリスコープ単一分子シークエンシング、単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ）シークエンシング、ナノポアＤＮＡシークエンシング等を通じて促進される）、任意の世代番号のシークエンシング技術（例として、第２世代のシークエンシング技術、第３世代のシークエンシング技術、第４世代のシークエンシング技術等）、アンプリコン関連のシークエンシング（例として、標的化アンプリコンシークエンシング）、メタゲノム関連のシークエンシング（例として、メタトランスクリプトミックシークエンシング、メタゲノミックシークエンシング等）、逐次合成シークエンシング、トンネル電流シークエンシング、ハイブリダイゼーションによるシークエンシング、マススペクトロメトリーシークエンシング、顕微鏡に基づく技術、及び／又は任意の適するＮＧＳ技術のうちの任意の１つ又は複数を含むことができる。
【００１６】
[0028]加えて、又は代替として、方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、ライブラリー調製、及び／又はキャピラリーシークエンシング、サンガーシークエンシング（例として、マイクロ流体サンガーシークエンシング等）、パイロシークエンシング、ナノポアシークエンシング（オックスフォードナノポアシークエンシング等）のうちの任意の１つ又は複数、及び／又は任意の適するシークエンシング技術により促進される任意のその他の適する種類のシークエンシングを含み得る、任意の適するシークエンシング（例として、任意の適するシークエンシング技術等）と関連したその他の適するプロセスを促進することができる。
【００１７】
[0029]方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、１つ又は複数の微生物関連の状態について特徴付け及び／又は治療を促進するために（例として、シークエンシングライブラリーのシークエンシングに由来する微生物配列データセット等に基づき）、シークエンシングライブラリーの調製を改善することができるが、該微生物に関連した状態として、疾患、症状、原因（例として、トリガー等）、障害、関連するリスク（例として、傾向スコア等）、関連する重症度、行動（例として、カフェイン消費、習慣、食事等）、及び／又は微生物関連の状態と関連する任意のその他の適する側面のうちの１つ又は複数を挙げることができる。微生物関連の状態として、１つ又は複数の疾患関連の状態を挙げることができ、疾患関連の状態として、胃腸関連の状態（例として、過敏性腸症候群、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、セリアック病、クローン病、腹部膨満、痔疾患、便秘、逆流、血便、下痢等）；アレルギー関連の状態（例として、小麦、グルテン、乳製品、ダイズ、ピーナッツ、甲殻類、ツリーナッツ、卵等と関連するアレルギー及び／又は不耐性）；皮膚関連の状態（例として、ざ瘡、皮膚筋炎、湿疹、酒さ、皮膚乾燥、乾癬、ふけ、光線過敏症等）；歩行運動関連の状態（例として、痛風、リウマチ性関節炎、骨関節炎、反応性関節炎、多発性硬化症、パーキンソン病等）；がん関連の状態（例として、リンパ腫；白血病；芽細胞腫；胚細胞腫瘍；癌腫；肉腫；乳がん；前立腺がん；基底細胞がん；皮膚がん；結腸がん；肺がん；任意の適する生理学的領域と関連したがんの状態等）、心血管系関連の状態（例として、冠状動脈性心疾患、炎症性心疾患、心臓弁膜心疾患、肥満、脳卒中等）、貧血状態（例として、サラセミア；鎌状赤血球；悪性；ファンコーニ；溶血性；再生不良性；鉄欠乏症等）、神経学関連の状態（例として、ＡＤＨＤ、ＡＤＤ、不安、アスペルガー症候群、自閉症、慢性疲労症候群、鬱病等）、自己免疫関連の状態（例として、スプルー、ＡＩＤＳ、シェーグレン、狼瘡等）、内分泌関連の状態（例として、肥満、グレーヴス病、橋本甲状腺炎、代謝性疾患、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病等）、ライム病の状態、コミュニケーション関連の状態、睡眠関連の状態、代謝関連の状態、体重関連の状態、疼痛関連の状態、遺伝子関連の状態、慢性疾患、及び／又は任意のその他の適する種類の疾患関連の状態のうちの任意の１つ又は複数を挙げることができる。加えて、又は代替として、微生物関連の状態として、カフェインの消費、アルコールの消費、その他の食品の消費、栄養補助食品の消費、プロバイオティック関連の行動（例として、消費、忌避等）、その他の摂食行動、習慣的行動（例として、喫煙；運動条件、例えば低、中程度、及び／又は極度の運動条件等）、閉経、その他の生物学的プロセス、社会的行動、その他の行動、及び／又は任意のその他の適する人間行動状態のうちの任意の１つ又は複数を含み得る、１つ又は複数の人間行動状態を挙げることができる。状態は、任意の適する表現型と関連し得る（例として、ヒト、動物、植物、菌体について測定可能な表現型等）。
【００１８】
[0030]方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、例えば単一のユーザーから得られた１つ又は複数の生体サンプルからシークエンシングライブラリーを調製するために、方法１００の実施形態のいくつかの部分を実施すること等に関連して、単一のユーザーから得られた１つ又は複数の生体サンプルについて実施可能である。加えて、又は代替として、実施形態は、一連のユーザーが、任意の適する種類の特性について（例として、微生物関連の状態、人口統計学的特性行動、マイクロバイオーム組成及び／又は機能等に関連して）、任意のその他の対象と類似した、及び／又はそれと異なる対象を含み得る場合、一連のユーザー（例として、ユーザーを含む、ユーザーを除く対象の集団等）から得られた生体サンプルについて実施可能；ユーザーのサブグループ（例として、方法１００の実施形態のいくつかの部分に影響を及ぼす特性等の特性を共有するサブグループ）について実施可能；植物、動物、微生物（例として、環境微生物群等に由来する）、及び／又は任意のその他の適する実態について実施可能である。従って、一連のユーザー（例として、対象の集団、一連の対象、ユーザーのサブグループ等）に由来する情報は、後続するユーザーに対して追加の知見を提供するのに使用可能である（例として、方法１００の実施形態のいくつかの部分を実施する際に使用される実験パラメーター等に関連して）。１つの変形形態では、一連の生体サンプルの集合は、例えば異なる種類のユーザーについて、アンプリコン関連の特性及びメタゲノム関連の特性を比較する（例として、アンプリコン関連の特性及びメタゲノム関連の特性が、アンプリコン関連のシークエンシング及びメタゲノム関連のシークエンシングを同時に行うための統合型シークエンシングライブラリーに由来する微生物配列データセットに基づき決定可能である場合等）などのために、例えば、異なる人口統計学（例として、性別、年齢、結婚歴、民族性、国籍、社会経済的状況、性的指向等）、異なる微生物関連の状態（例として、健康及び疾患状態；異なる遺伝的素因等）、異なる生活状況（例として、独り住まい、ペットとの同居、重要な他者との同居、子供との同居等）、異なる食習慣（例として、雑食性、ベジタリアン、菜食主義者、糖消費、酸の消費、カフェインの消費等）、異なる行動性向（例として、身体活動のレベル、薬剤使用、アルコール摂取等）、異なる運動レベル（例として、所定の期間内に移動する距離と関連する）、及び／又は任意のその他の適する特性（例として、マイクロバイオーム組成及び／又は機能に影響を及ぼす、それと相関関係を有する、及び／又はさもなければそれと関連する特性等）のうちの１つ又は複数に該当するユーザー等を含む、多種多様なユーザーと関連し、そしてそれについて処理され得る。いくつかの例では、ユーザーの数が増加するに従い、方法１００の実施形態のいくつかの部分で実施されるプロセスの予知力も、例えば様々なユーザーをそのマイクロバイオームに基づき特徴付けることに関連して（例として、ユーザーにおける異なるサンプル採取部位に関連して）増加し得る。但し、方法１００及び／又はシステム２００の実施形態のいくつかの部分は、任意の適する１つの実体又は複数の実体について、任意の適する方式で実施可能及び／又は構成可能である。
【００１９】
[0031]本明細書に記載されているデータ（例として、増幅プロセス、例えばＰＣＲプロセス等と関連するデータ；ＵＭＩ関連のタグ付けと関連するデータ；シークエンシングと関連するデータ、例えばシークエンシング読み取り、微生物配列データセット、及び／又はその他の適するシークエンシングデータ等；マイクロバイオームの特質；ユーザーデータ；補足的データ；微生物関連の状態と関連するデータ等）は、データが収集されたときを示す時間的な指標（例として、サンプルが収集されたときを示す時間的な指標等）、決定されたときを示す時間的な指標（例として、サンプル処理操作が開始し、完了したときを示す時間的な指標等）、移送されたとき、受け取られたとき、及び／又はさもなければ処理されたときを示す時間的な指標；データにより記載される内容に対して文脈を提供する時間的な指標；時間的な指標の変化（例として、サンプル処理操作のアウトプットの経時的変化、例えばＰＣＲサイクル全体にわたる生成物の変化等）；及び／又は時間と関連する任意のその他の適する指標のうちの１つ又は複数を含め、任意の適する時間的な指標（例として、秒、分、時、日、週等）と関連し得る。本明細書に記載されている分子及び／又は任意の適する生体成分は、任意の適するサイズ（例として、配列の長さ等）を含むことができる。
【００２０】
[0032]加えて、又は代替として、パラメーター、メトリクス、インプット、アウトプット、及び／又はその他の適するデータは、スコア、個々の数値、数値の集合、二進値、相対的数値、分類、信頼水準、識別子、スペクトルに沿った数値、及び／又は任意のその他の適する種類の数値のうちの任意の１つ又は複数を含む数値タイプと関連し得る。本明細書に記載されている任意の適する種類のデータ、コンポーネント（例として、生体成分）、生成物（例として、サンプル処理操作等の）は、インプット（例として、異なるサンプル処理操作；モデル；混合物；シークエンシング技術等に対する）として使用可能、アウトプット（例として、異なるモデル；モジュール；サンプル処理操作の生成物等）として生成可能、及び／又は方法１００及び／又はシステム２００と関連する任意の適するコンポーネントについて、任意の適する方式で操作可能である。
【００２１】
[0033]本明細書に記載されている方法１００及び／又はプロセスの実施形態の１つ若しくは複数の事例及び／又は部分、は、トリガーイベント（例として、方法１００の実施形態の一部分の実施）との時間的な関係において（例として、それと実質的に同時に、それに応答して、それに連続して、それに先立ち、それに後続して等）、並びに／或いは任意のその他の適する順序で任意の適する時間及び頻度において、システム２００、コンポーネント、及び／又は本明細書に記載されている実体の１つ又は複数の事例によって、及び／又はそれらを使用して、非同期的に（例として、連続して）、同時に（例として、多重式；方法１００の実施形態のいくつかの部分において複数のサンプルを処理すること；シークエンシング分析及び／又は方法１００の実施形態のいくつかの部分と関連したパラレルデータ処理等）実施可能である。
【００２２】
[0034]加えて、又は代替として、方法１００及び／又はシステム２００の実施形態のいくつかの部分は、２０１６年８月１８日出願の米国特許出願第１５／２４０，９１９号、２０１７年７月１３日出願の米国特許出願第１５／６４９，４９７号、２０１７年１１月６日出願の米国仮特許出願第６２／５８２，１９１号、２０１７年１１月１３日出願の米国特許出願第１５／８１１，５４４号、及び２０１８年９月１８日出願の米国特許出願第１５／７０７，９０７号（これらの各号は本明細書において参照によりそのまま組み込まれている）に記載されている事項を促進し（例として、方法１００及び／又はシステム２００の実施形態のいくつかの部分のアウトプットが、その後インプットとして使用可能な場合等）、改善し、それらと連携して使用され（例として、連続して、並行して等）、それらを使用し（例として、方法１００の及び／又はシステム２００の実施形態のいくつかの部分に対するインプット等として）、それらと任意の適する時間的関連性を有し、それらを増強し、修正し、含むことが可能であり、及び／又はさもなければそれらと関連することができる。
【００２３】
[0035]但し、方法１００及び／又はシステム２００は、任意の適する方式で構成可能である。
【００２４】
２．１  ＵＭＩに基づく分子の調製
[0036]方法１００の実施形態は、１つ又は複数の標的（例として、一連の核酸標的；微生物と関連する標的等）と関連する一連のＵＭＩに基づく分子（例として、ＵＭＩに基づくプライマー等）を調製すること（例として、決定すること、生成すること等）Ｓ１１０を含むことが可能であり、それは、１つ又は複数の標的のタグ付け（例としてＵＭＩに基づく分子；ＵＭＩ領域；アダプター領域；リンカー領域；インデックス領域等を用いて）、その増幅、及び／又はその他の適する処理を促進するのに使用される分子を調製するように機能することができる。
【００２５】
[0037]標的（例として、目的とする標的；公知又は同定済みの標的；未知又はこれまでに同定されていない標的等）は、バイオマーカー；遺伝子（例として、遺伝子発現マーカー等）；配列領域（例として、遺伝子配列；遺伝子を識別する配列、染色体、微生物関連の状態、保存された配列、突然変異、多形性；アミノ酸配列；ヌクレオチド配列等）；核酸（例として、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、コスミドＤＮＡ、ファージミドＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ＲＮＡから得られたｃＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡ等）；細胞；小分子；タンパク質；ペプチド；１つ若しくは複数の微生物関連の状態と関連する標的（例として、１つ又は複数の微生物関連の状態と関連する診断、予後、予測、及び／又は治療について情報提供する標的等）；微生物組成と関連する標的（例として、サンプル中に存在する微生物の分類学的分類を示唆する標的；任意の適する分類群の微生物の存在、存在量、及び／又は不存在を示すマーカー等）、及び／又は微生物の機能（例として、微生物と関連する機能的な特質を示唆する標的等）；脂質；全核酸；全微生物；代謝物；炭水化物；及び／又は任意の適する種類の標的のうちの任意の１つ若しくは複数を含むことができる。方法１００の実施形態のいくつかの部分は、シークエンシング（例として、ＮＧＳ）の改善及び／又は任意の適する標的の分析の改善（例として、ＵＭＩの使用等を通じて）を促進する標的を用いてライブラリー調製を促進することができる。
【００２６】
[0038]ＵＭＩに基づく分子は、１つ又は複数の標的（例として、微生物関連の核酸標的等）と関連する（例として、１つ又は複数の標的（例として、核酸標的等）の１つ又は複数の配列領域に対して相補的な１つ又は複数の配列領域を含む；それを標的とする；それと共に増幅可能な；それと共に処理可能な；それをタグ付けすることができる標的関連の領域等を含め）のが好ましいが、しかし任意の適するコンポーネントと加えて、又は代替として関連することができる。ＵＭＩに基づく分子は、ＵＭＩに基づくプライマー（例として、１つ又は複数の増幅プロセス、例えば１つ又は複数のＰＣＲプロセス等で使用される）を含むのが好ましいが、しかし任意の適する目的のために、任意の適する種類のＵＭＩに基づく分子を加えて、又は代替として含むことができる。
【００２７】
[0039]ＵＭＩに基づく分子（及び／又はその他の適する分子、例えば本明細書に記載されているプライマー及び／又はその他の分子等）は、１つ又は複数のＵＭＩ領域を含むのが好ましい（例として、ＵＭＩに基づく分子が単一のＵＭＩ領域を含むことができる場合；ＵＭＩに基づく分子が複数のＵＭＩ領域を含むことができる場合等）。一例では、ＵＭＩ領域は、一連のランダムな「Ｎ」塩基（例として、Ｎデオキシヌクレオチド塩基）を含むＵＭＩ領域を含むことができ、但し各ランダムな「Ｎ」塩基は、「Ａ」塩基、「Ｇ」塩基、「Ｔ」塩基、及び「Ｃ」塩基のうちの任意の１つから選択される。「Ｎ」塩基は、連続的（例として、「Ｎ」塩基の強さ等）であり得る、分離し得る（例として、定義された塩基により；任意の適する配列領域により）、及び／又はＵＭＩに基づく分子の任意の適する位置に配置されていてもよい。ＵＭＩ領域は、任意の適する配列長さ（例として、少なくとも２つの「Ｎ」塩基；２１個よりも少ない「Ｎ」塩基；任意の適する数の「Ｎ」塩基等）を含むことができる。例えばより長いＵＭＩ領域が、より大きな数のランダムな塩基の組み合わせ、及びより大きな一連の固有の識別子（例として、種類の数がより大きな標的が区別される分析に使用される；多数のテンプレート及び／又は遺伝子変異体を含むサンプルを分析するのに使用される等）に貢献できる場合等において、ＵＭＩ領域の配列長さは、処理される（例として、定量化される、区別される等）標的の量及び／又は種類に基づき決定可能である。一例では、ＵＭＩ領域は、４Ｎ  ＵＭＩ領域（例として、４個の「Ｎ」塩基を含むＵＭＩ領域等）を含むことができる。具体的な例では、ＵＭＩ領域は、例えば１つ又は複数のタグ付け促進分子、例えばＭｇＣｌ２、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、耐熱性核酸結合タンパク質（例として、極めて耐熱性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質等）等、及び／又はその他の適するコンポーネントのうちの１つ又は複数を添加することで、例えば１６Ｓ遺伝子の増幅プロセス等を実施するための８ＮのＵＭＩ領域を含むことができる。但し、ＵＭＩ領域は、任意の適する方式で構成され得る。
【００２８】
[0040]ＵＭＩに基づく分子（及び／又はその他の適する分子、例えば本明細書に記載されているプライマー及び／又はその他の分子等）は、１つ又は複数の標的関連の領域を含むのが好ましい。標的関連の領域は、配列領域（例として、遺伝子配列等）を含むのが好ましいが、しかし任意の適する種類のコンポーネント（例として、標的と関連した任意の適するコンポーネント、例えば標的と結合可能な、それとカップリング可能な、それと連結可能な、それに影響を及ぼす、その情報を提供する、それを修正する、及び／又はそれと任意の適する関連性を有するコンポーネント等）を、加えて、又は代替として含むことができる。標的関連の領域は、１つ又は複数の標的（例として、核酸標的の配列領域；核酸標的のその他の適するコンポーネント等）と関連する（例として、それに対して配列相補性を有する；それを標的とする；それと共に増幅可能である；それと共に処理可能である）のが好ましい。一例では、標的関連の領域は、相補的な標的ＤＮＡ配列（例として、核酸標的の）とアニーリング可能なＤＮＡ配列を含むことができる。標的関連の領域は、ポリメラーゼ（例として、ＤＮＡポリメラーゼ）が核酸標的及び／又はその他の適するコンポーネントをコピー及び増幅するのを可能にするのが好ましいが、しかし標的関連の領域は、任意の適する機能性を含むことができる。標的関連の領域は、任意の適する長さ（例として、少なくとも１５塩基の長さ；任意の適する数の塩基等）を含むことができる。或いは、ＵＭＩに基づく分子は、標的関連の領域を除外することができる。但し、標的関連の領域（及び／又はその他の適する分子）は、任意の適する方式で構成可能である。
【００２９】
[0041]ＵＭＩに基づく分子（及び／又はその他の適する分子、例えば本明細書に記載されているプライマー及び／又はその他の分子等）は、１つ又は複数のリンカー領域を含むことができる。リンカー領域は、１つ又は複数の核酸標的（例として、標的関連の領域と関連した核酸標的等）に対して完全な相補性を有さない（例として、相補性なし、部分的に相補性である等）のが好ましい。リンカー領域は、任意の適する長さを含むことができる（例として、リンカー領域が、例えば一連のＵＭＩに基づくプライマーのうちのＵＭＩに基づくプライマーそれぞれについて２１塩基よりも短い長さを含む場合、任意の適する数の塩基の長さ等）。リンカー領域は、ＵＭＩ領域と標的関連の領域の間に配置されるのが好ましいが（例として、ＵＭＩ配列領域と標的関連の配列領域を分離する等）、しかし例えばＵＭＩに基づく分子のそれぞれについて（例として、一連のＵＭＩに基づくプライマーのうちのＵＭＩに基づくプライマーそれぞれについて）、リンカー領域がＵＭＩに基づく分子のＵＭＩ領域と標的関連の領域の間に配置される場合等においては、任意の適する位置（例として、任意の適する配列位置等）に配置可能である。具体的な例では、ＵＭＩに基づく分子は、標的関連の領域（例として、アニーリング領域）とＵＭＩ領域の間に配置されている７塩基の長さを含むリンカー領域を含むことができるが、その場合、ＵＭＩに基づく分子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ゲノム由来の１６Ｓのセグメントを増幅する際に使用可能であり、リンカー領域の存在は、１６Ｓ増幅効率を改善することができる（例として、８Ｎ  ＵＭＩ領域を含み、リンカー領域を除外するＵＭＩに基づくプライマーを使用したときに、１６Ｓ領域の増幅がより小規模である場合等）。或いは、ＵＭＩに基づく分子（及び／又はその他の適する分子）は、リンカー領域を除外することができる。但し、リンカー領域は、任意の適する方式で構成可能である。
【００３０】
[0042]ＵＭＩに基づく分子（及び／又はその他の適する分子、例えば本明細書に記載されているプライマー及び／又はその他の分子等）は、１つ又は複数のアダプター領域を含むことができる。アダプター領域は、外部アダプター領域を含むのが好ましく（例として、アダプター領域が１つ又は複数の外部アダプター領域等を含むことができる場合）、かかる領域は、シークエンシングライブラリー調製を促進するように構成された（例として、ＮＧＳライブラリーの構築及びシークエンシングを促進するように構成された）配列領域（例として、配列等）を含むのが好ましいが、しかし外部アダプター領域は、シークエンシングを促進するための任意の適するコンポーネントを加えて、又は代替として含むことができる。外部アダプター領域は、任意の適する長さ（例として、配列長さ；任意の適する数の塩基等）及び／又は任意の適する配列領域（例として、任意の適する塩基の組み合わせ等）を含むことができるが、それらはシークエンシングの種類（例として、使用されるシークエンシング技術の種類等）に基づき決定可能である。或いは、ＵＭＩに基づく分子（及び／又はその他の適する分子）は、アダプター領域を除外することができる。但し、アダプター領域は、任意の適する方式で構成可能である。
【００３１】
[0043]具体的な例では、ＵＭＩに基づく分子（例として、ＵＭＩに基づくプライマー）は、「５’−外部アダプター−固有分子識別子−リンカー−標的ＤＮＡ配列−３’」を備えるコンフィギュレーションを含むことができるが、しかしＵＭＩに基づく分子は、任意の適するコンフィギュレーションを含むことができる。
【００３２】
[0044]ＵＭＩに基づく分子は、任意の適するサイズ（例として、任意の適する配列長さ等）を含むことができ、並びに任意の適する数及び／又は種類のＵＭＩに基づく分子は、方法１００の実施形態のいくつかの部分において調製可能及び／又は使用可能である。
【００３３】
[0045]ＵＭＩに基づく分子を調製することは、方法１００の実施形態の任意の適する部分の前及び／又は後において（例として、一連のシークエンシングに基づくプライマーを調製する前又は後；タグ付けされた標的分子の生成前又は期間中；タグ付けされた標的分子を反復生成するためのタグ付けされた標的分子の生成後等）、及び／又は任意の適する時間及び頻度において実施可能である。
【００３４】
[0046]但し、ＵＭＩに基づく分子を調製することは任意の適する方式で実施可能である。
【００３５】
２．２  シークエンシングに基づくプライマーの調製
[0047]方法１００の実施形態は、一連のシークエンシングに基づくプライマーを調製することＳ１２０を含むことができるが、それは、例えば微生物と関連したシークエンシングを改善することに関連するなどして、シークエンシングレディ（例として、ＮＧＳレディ）分子の生成を促進するのに使用されるプライマーを調製するように機能することができる。
【００３６】
[0048]シークエンシングに基づくプライマー（及び／又は本明細書に記載されているその他の適する分子）は、１つ又は複数のアダプター領域を含むのが好ましい。シークエンシングに基づくプライマーのアダプター領域は、１つ又は複数のシークエンシングアダプター領域を含むのが好ましく、かかる領域は、ＮＧＳを促進する配列領域を含むのが好ましいが（例として、シークエンシングを実施するために１つ又は複数のＮＧＳ技術により必要とされる配列領域；使用されるＮＧＳ技術の種類に基づき決定される配列領域；ＮＧＳ技術を促進する等）、しかしシークエンシングアダプター領域は、任意の適する方式で構成可能である。加えて、又は代替として、任意の適するアダプター領域は、シークエンシングアダプター領域を含むことができる。シークエンシングに基づくプライマーのアダプター領域は、１つ又は複数の外部アダプター領域（例として、その他のアダプター領域、例えばＵＭＩに基づく分子のアダプター領域等の外部アダプター領域と同一の、それと類似した、異なる、それに対して相補的な領域）を含むのが好ましいが、しかし任意の適するアダプター領域は、１つ又は複数の外部アダプター領域を含むことができる。シークエンシングに基づくプライマーのアダプター領域は、１つ又は複数のインデックス領域（例として、シークエンシングインデックス領域等）を含むのが好ましく、かかる領域は、異なるサンプル（及び／又はサンプルのコンポーネント、配列決定されるコンポーネント）の多重化、コンビナトリアルなタグ付け、並びに／或いはＮＧＳ及び／又はその他のシークエンシングと関連するその他の適する機能性を促進するように構成されるのが好ましい。インデックス領域は、定義されたバーコード配列を含むのが好ましいが（例として、少なくとも２塩基且つ１１塩基よりも短い長さを含む；任意の適する塩基数の長さを含む等）、しかし任意の適する長さを含む任意の適するコンポーネントを加えて、又は代替として含むことができる。具体的な例において、シークエンシングに基づくプライマーは、「５’−シークエンシングアダプター−シークエンシングインデックス−外部アダプター−３’」を備えるコンフィギュレーションを含むことができる。アダプター領域は、外部アダプター領域から分離した、それと隣接した、及び／又はさもなければそれに対して配置されているシークエンシングアダプター領域を含むことができるが、しかし任意の適する領域は、その他の領域、及び／又は任意の適する位置に対して任意の適する位置を含むことができる。加えて、又は代替として、シークエンシングに基づくプライマーは、任意の適する領域（例として、プライマーと関連して本明細書に記載されている領域等）及び／又はその他の適するコンポーネントを含むことができる。但し、シークエンシングに基づくプライマーは、任意の適する方式で構成可能である。
【００３７】
[0049]シークエンシングに基づくプライマーを調製することは、方法１００の実施形態の任意の適する部分の前及び／又は後（例として、一連のＵＭＩに基づく分子を調製する前又は後、タグ付けされた標的分子を生成する前又は後等）、並びに／或いは任意の適する時間及び頻度において実施可能である。但し、一連のシークエンシングに基づくプライマーを調製することは、任意の適する方式で実施可能である。
【００３８】
２．３  タグ付けされた標的分子の生成
[0050]方法１００の実施形態は、一連のＵＭＩに基づく分子、及び１つ又は複数の標的と関連する１つ又は複数の生体サンプル（例として、１つ又は複数の標的を含む生体サンプル；１つ又は複数の標的が存在しない生体サンプル等）に基づき、一連のタグ付けされた標的分子を生成することＳ１３０を含むことができるが、それは、下流サンプル処理及び／又はバイオインフォマティクス解析を促進して微生物関連の特性を決定するためのタグ付けされた標的を取得するように機能することができる。
【００３９】
[0051]タグ付けされた標的分子は、１つ又は複数のＵＭＩに基づく分子でタグ付けされた（例として、それと連結した；それと接続した；それと結びついた）標的（例として、標的を含むコンポーネント、例えば全核酸及び／又は標的配列領域を含む核酸断片等）を含むのが好ましいが、しかし１つ又は複数の標的と関連しており、任意の適する分子でタグ付けされた任意の適するコンポーネントを加えて、又は代替として含むことができる。一連のタグ付けされた標的分子を生成することは、一連のＵＭＩに基づく分子（例として、ＵＭＩに基づくプライマー等）、及び１つ又は複数の生体サンプル（例として、一連のＵＭＩに基づく分子及び／又は一連のＵＭＩに基づく分子のコンポーネントを含む、１つ又は複数の生体サンプルのタグ付けコンポーネント等）に基づく（例として、それを使用する；それを用いて処理する；それを用いて増幅プロセスを実施する）のが好ましいが、しかし任意の適するコンポーネントに加えて、又は代替として基づくことができる。
【００４０】
[0052]一連のタグ付けされた標的分子を生成することは、１つ又は複数の増幅プロセスに基づく（例として、それを含む；それからのアウトプットを使用する）のが好ましい。増幅プロセス（例として、一連のタグ付けされた標的分子を生成することと関連する；方法１００の実施形態の任意の適する部分と関連する）は、１つ又は複数のＰＣＲプロセス（例として、固相ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、ｎａｎｏＰＣＲ、ネステッドＰＣＲ、ホットスタートＰＣＲ等）を含むのが好ましいが、しかしヘリカーゼ依存性の増幅法（ＨＤＡ）、ループ媒介式の等温増幅法（ＬＡＭＰ）、自己持続式の配列複製（３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅法（ＮＡＳＢＡ）、ストランド変位増幅法（ＳＤＡ）、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）のうちの１つ若しくは複数、及び／又は任意のその他の適する増幅プロセスを加えて、又は代替として含むことができる。具体的な例では、ＰＣＲプロセスを実施することは、例えばＤＮＡポリメラーゼ（例として、０．０２〜０．０８ユニット／μＬ以内のＤＮＡポリメラーゼ；任意の適する濃度を有する）の使用に付加して、一連のＵＭＩに基づくプライマー（例として、２０〜２０００ｎＭ以内の濃度を有する；任意の適する濃度を有する）を使用して、サーマルサイクラー内でのＰＣＲにより、１つ又は複数の標的ＤＮＡ配列を増幅することを含むことができる。具体的な例では、ＰＣＲプロセスを実施することは、２又は３サイクル以内のＰＣＲを実施することを含むことができる（例として、ＵＭＩ領域及び外部アダプター領域に隣接する各標的分子の単一のコピーを生成するため；１つ又は複数のタグ付け促進分子を用いたＰＣＲプロセスの実施等）。但し、任意の適するＰＣＲプロセス及び／又はその他の増幅プロセスを実施すること（例として、一連のタグ付けされた標的分子を生成することに関連して；方法１００の実施形態の任意の適する部分に関連して）は、任意の適する方式で実施可能である。
【００４１】
[0053]一連のタグ付けされた標的分子を生成することは、１つ又は複数のタグ付け促進分子（例として、タグ付けと関連する効率及び／又は汎用性を改善するのに使用可能である；例えば効率等に関連して、増幅プロセスを改善するのに使用可能であるＵＭＩに基づく分子の核酸標的への組み込み等）に、加えて、又は代替として基づく（例として、それを使用する；それを用いて処理する；それを用いて増幅プロセスを実施する）ことができる。タグ付け促進分子は、ＭｇＣｌ２、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、耐熱性核酸結合タンパク質、ベタイン、ホルムアミド、ｔｗｅｅｎ、ｔｒｉｔｏｎ、ＮＰ−４０、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、有機及び／又は無機のエンハンサーエレメント、化合物、塩、小分子、生体分子のうちの任意の１つ又は複数、並びに／或いはタグ付けを促進するように構成された任意のその他の適する分子を含むことができる。
【００４２】
[0054]一例では、一連のタグ付けされた標的分子を生成することは、一連のＵＭＩに基づくプライマーと、少なくとも１つの生体サンプルと、ＭｇＣｌ２、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、及び耐熱性核酸結合タンパク質のうちの少なくとも１つを含む一連のタグ付け促進分子とを用いた第１の増幅プロセスを実施することを含むことができる。具体的な例では、一連のタグ付けされた標的分子を生成することが、一連のＵＭＩに基づくタンパク質と、少なくとも１つの生体サンプルと、ＭｇＣｌ２及び耐熱性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む一連のタグ付け促進分子とを用いた第１の増幅プロセスを実施することを含み得る場合、耐熱性核酸結合タンパク質は、耐熱性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含むことができる。
【００４３】
[0055]一例では、耐熱性核酸結合タンパク質は、極めて耐熱性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例として、超好熱性微生物から単離された；高温において、例えば増幅プロセスに認められる温度等において限界期間インキュベートした後でも活性を温存する能力を有する）を含むことができる。
【００４４】
[0056]具体的な例では、例えば一連のタグ付け促進分子を使用することで、１つ又は複数の生体サンプルのコンポーネントを伴うＵＭＩに基づくプライマーの組み込みを改善することができる場合、ＰＣＲプロセスを実施することは、ＭｇＣｌ２と耐熱性核酸結合タンパク質（例として、極めて耐熱性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質）とを含む一連のタグ付け促進分子、５Ｎ  ＵＭＩ領域を含む一連のＵＭＩに基づくプライマー、及び１つ又は複数の生体サンプルに基づく（例として、それらを使用する）ことができる。ＰＣＲプロセスを実施することは、サーマルサイクラー（例として、従来のサーマルサイクラー）、及び／又はＰＣＲプロセスを促進するための任意のその他の適するシステムを用いて（例として、そこにおいて、それと関連して）実施することができる。
【００４５】
[0057]タグ付けされた標的分子を生成すること（及び／又は任意の適する分子をタグ付けすること）は、任意の適する時間及び頻度で実施可能である（例として、シークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成する前；例えば反復した生成物の生成アプローチにおいては、シークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成する期間中又はその後、）。
【００４６】
[0058]１つの変形形態では、一連のタグ付けされた標的分子を生成することは、例えばＵＭＩに基づく分子を用いて１つ又は複数の標的、例えば核酸標的等（及び／又は１つ若しくは複数の生体サンプルのその他の適するコンポーネント等）をタグ付けするなどために、１つ若しくは複数の断片化プロセス、ライゲーションプロセス、及び／又はその他の適するプロセスを実施すること（例として、ＰＣＲに基づくプロセスに付加又は代替して）を含むことができる。一例では、一連のタグ付けされた標的分子を生成することは、１つ又は複数の生体サンプルを用いて、酵素的プロセス及び機械的プロセス（例として、酵素的及び／又は機械的断片化等）のうちの少なくとも１つに基づき断片を生成すること（例として、１つ又は複数の核酸標的、例えば目的とする標的に対応する標的配列等を含む断片を生成する；１つ又は複数の生体サンプルから断片を生成するなどのために）；並びにＵＭＩに基づく分子及び断片についてライゲーションプロセス（例として、リガーゼ酵素を用いた平滑末端ライゲーション等）を実施すること（例として、ＵＭＩに基づく分子を断片にライゲートすること等）を、例えば標的分子（例として、標的ＮＤＡ；シークエンシングライブラリーを構築するため等）を増幅する前などにおいて含み得る。一例では、一連のタグ付けされた標的分子を生成することは、少なくとも１つの生体サンプルから核酸断片を生成すること；及び一連のＵＭＩに基づく分子を核酸断片にライゲートすることを含むことができる。一例では、１つ又は複数の断片化プロセス及び／又はライゲーションプロセスを実施することは、すべての利用可能な分子（例として、溶液内の）の無差別的なタグ付けを引き起こすことができるが、一方、一例では、ＰＣＲプロセス（例として、本明細書に記載されているＰＣＲプロセス等）を用いて一連のタグ付けされた標的分子を生成することは、ＵＭＩのタグ付けにおいて特異的標的化（例として、標的ＤＮＡ配列の）を促進することができる。ＵＭＩのタグ付けで使用されるライゲーションプロセスは、タグ付けされた標的分子を生成して断片化プロセスを実施するために、ＰＣＲプロセスで使用されるＵＭＩに基づく分子の種類と同一の、それと類似した、又は異なるＵＭＩに基づく分子を使用する（例として、生成した断片及び／又はその他の分子等をタグ付けするために）ことができる。具体的な例では、ＵＭＩ領域を含むＤＮＡアダプター（例として、「外部アダプター−固有分子識別子−リンカー−標的ＤＮＡ配列」を備えるコンフィギュレーション等を含む）を含むＵＭＩに基づく分子はライゲート可能である。加えて、又は代替として、追加のコンポーネント（例として、領域等）が、ライゲーションプロセスの前、期間中、及び／又はその後に付加可能である（例として、例えば「５’−シークエンシングアダプター−シークエンシングインデックス−外部アダプター−３’」等を備えるコンフィギュレーションを含むプライマーの使用等により、追加の領域を、例えばＰＣＲプロセス等を通じて付加すること）。但し、１つ又は複数の断片化プロセス及び／又はライゲーションプロセスを実施することは任意の適する方式で実施可能である。
【００４７】
[0059]１つの変形形態では、一連のタグ付けされた標的分子を生成することは、少なくとも１つのＰＣＲプロセス及び少なくとも１つのライゲーションプロセスの組み合わせ（例として、連続的な組み合わせ；パラレルな組み合わせ等）を含むことができる。例えば、一連のタグ付けされた標的分子を生成することは、例えばＰＣＲ効率及び標的の増幅を増加させるなどのために、一連のプライマー（例として、１つ又は複数の標的関連の領域、リンカー領域、及び／又は任意のその他の適するコンポーネント等を含む）を用いたＰＣＲプロセスを実施すること；並びに、例えばＵＭＩに基づく分子をＰＣＲプロセスの生成物（例として、増幅された核酸標的等）に付加するなどのために、１つ又は複数のＵＭＩに基づく分子（例として、１つ又は複数のＵＭＩ領域、アダプター領域、及び／又はその他の適するコンポーネント等を含む）とのライゲーションプロセスを実施することを含むことができる。一例では、一連のタグ付けされた標的分子を生成することは、少なくとも１つの生体サンプル及び一連の標的のうちの少なくとも１つの標的と関連する標的関連の領域を含む一連のプライマーに基づき、ＰＣＲプロセスを実施すること；並びに一連のＵＭＩに基づく分子をＰＣＲプロセスの生成物にライゲートすることを含むことができる。具体的な例では、１つ又は複数のＵＭＩに基づく分子を用いてライゲーションプロセスを実施することは、相同性に基づく１つ又は複数のライゲーションプロセスを実施すること、並びにＤＮＡの一方のストランドを標的分解するためのエキソヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、リガーゼ、及び／又はその他の適するコンポーネントを使用することを含むことができる。具体的な例では、ＵＭＩに基づく分子は、アダプター領域（例として、外部アダプターを含む）、ＵＭＩ領域、少なくとも１つのＰＣＲプロセスにより生成される１つ若しくは複数のアンプリコンの５’末端と相同である、３’末端側の任意の長さの領域、及び／又はライゲーションプロセスを促進する任意のその他の適する領域を含むオリゴヌクレオチドを含むことができる。但し、少なくとも１つのＰＣＲプロセス及び少なくとも１つのライゲーションプロセスを組み合わせて実施することは、任意の適する方式で実施可能である。
【００４８】
[0060]一連のタグ付けされた標的分子を生成すること（及び／又は方法１００の実施形態の好適な部分）は、１つ又は複数の精製プロセスを実施することを含むことができる（例として、任意の適するコンポーネントを精製するために；任意の適するコンポーネントを取り除くために）。一例では、一連のタグ付けされた標的分子を生成することは、第１の増幅プロセスの生成物を用いて精製プロセスを実施して、第１の増幅プロセスの生成物から、一連のＵＭＩに基づくプライマーのうちのいくつかのＵＭＩに基づくプライマーを取り除く（及び／又はその他の適するコンポーネント等を取り除く）ことを含むことができる。一例では、方法１００は、本明細書に記載されている増幅プロセス（例として、タグ付けされた標的分子生成物のプールを生成するのに使用されるＰＣＲプロセス等）から得られる生成物を用いて精製プロセスを実施すること、例えば第１の一連のＵＭＩに基づくプライマーについて実施されるＰＣＲに基づく増幅プロセスから得られた生成物を精製すること等を含むことができる。精製プロセスは、シリカに基づくＤＮＡ結合ミニカラム、可逆的固相固定化法（ＳＰＲＩ）マグネットビーズ（例として、アップスケーリング及び自動化等のため）、生体サンプルからの核酸の沈殿（例として、アルコールに基づく沈殿法を使用する）、液体−液体に基づく精製技術（例として、フェノール−クロロホルム抽出）、クロマトグラフィーに基づく精製技術（例として、カラム吸着）、核酸と結合するように構成され、そして溶出環境の存在下（例として、溶出溶液を有する、ｐＨシフトを起こさせる、温度シフトを起こさせる等）で核酸を放出するように構成された、結合部分に結合した粒子（例として、マグネットビーズ、浮揚性のビーズ、サイズ分布を有するビーズ、超音波に応答性のビーズ等）の使用を伴う精製技術、及び／又は任意の適する精製プロセスのうちの任意の１つ若しくは複数を含むことができる。具体的な例では、マグネットビーズは、例えばＤＮＡとカルボキシルコーティングビーズとの静電相互作用等により、ＰＣＲプロセスの生成物についてその少量の精製を可能にすることができる。具体的な例では（例として、その代替例等として）、マグネットビーズを用いて精製プロセスを実施することは、ビーズ体積に対するサンプル体積の比として１：１．２〜１：０．６を使用することを含むことができる（例として、小型のＤＮＡ分子とビーズとの相互作用が好ましくなく、そして不特定の生成物（サイズが、１００ｂｐ以下があるのが好ましい）が取り除かれる場合等）。具体的な例では（例として、その代替例等として）、マグネットビーズを用いて精製プロセスを実施することは、例えば任意の適するＰＣＲプロセスに由来する取得生成物、例えばＵＭＩに基づく分子（例として、ＤＮＡプライマー、；サンプルの分子をタグ付けしなかったＵＭＩに基づく分子等）、及び／又はその他の好適なコンポーネント（例として、第１のＰＣＲ由来の）を選択的に分解するなどために添加される、５〜１００ユニットのエキソヌクレアーゼＩ、及び／又は任意のその他の一本鎖ＤＮＡ分解酵素を使用することを含むことができる。具体的な例では、マグネットビーズを用いて精製プロセスを実施することは、例えばＰＣＲテンプレートＤＮＡを分解するなどのために、１〜１００ユニットのＤｐｎＩ制限酵素の添加によってプロセスを補助することを含むことができる。具体的な例では、酵素処理及び／又はその他の適するプロセスの両者の組み合わせは、ＰＣＲ生成物クリーンアップアプローチに付加又は代替して使用可能である。加えて、又は代替として、精製プロセスは、任意の適する方式で実施可能である（例として、方法１００の実施形態の任意の適する部分等に関連して）。
【００４９】
[0061]但し、タグ付けされた標的分子を生成することは、任意の適する方式で実施可能である。
【００５０】
２．４  シークエンシングレディのタグ付けされた標的分子の生成
[0062]方法１００の実施形態は、一連のタグ付けされた標的分子及び一連のシークエンシングに基づくプライマーに基づき、一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子（例として、ＮＧＳレディのタグ付けされた標的分子等）を生成することＳ１４０を含むことができるが、それは、シークエンシング（例として、ＮＧＳ等）を目的とする調製のために、標的分子（例として、タグ付けされた標的分子）を処理するように機能することができる。
【００５１】
[0063]シークエンシングを目的とする分子の調製は、シークエンシングを目的としてタグ付けされた標的分子を調製することを含むのが好ましいが（例として、１つ若しくは複数のアダプター領域、及び／又はより多くのインデックス領域を付加すること等により）、しかしシークエンシングを目的として任意の適する分子を調製することを加えて、又は代替として含むことができる。
【００５２】
[0064]一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成することは、一連のタグ付けされた標的分子及び一連のシークエンシングに基づくプライマーに基づく（例として、それを使用する；それを用いて処理する；それを用いて増幅プロセスを実施する等）ことが好ましいが（例として、シークエンシングに基づくプライマーを一連のタグ付けされた標的分子と共に組み込むため；シークエンシングに基づくプライマーの領域を一連のタグ付けされた標的分子に付加するために）、しかし任意の適するコンポーネントに加えて、又は代替として基づくことができる。一例では、一連のタグ付けされた標的分子（例として、ＵＭＩに基づくプライマーに基づき生成される）が外部アダプター領域を含む場合、及び一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子（例として、ＮＧＳレディのタグ付けされた標的分子等）を生成することが、一連のシークエンシングに基づくプライマー（例として、外部アダプター領域、例えば相補的な外部アダプター領域等を含むアダプター領域を含む）を、タグ付けされた標的分子の外部アダプター領域において、タグ付けされた標的分子と共にアニーリングすることを含む場合、一連のＵＭＩに基づくプライマーのうちのＵＭＩに基づくプライマーそれぞれ（例として、一連のタグ付けされた標的分子を生成するのに使用される）は、ＮＧＳと関連する外部アダプター領域を含むことができる。一例では、一連のシークエンシングに基づくプライマーのうちのシークエンシングに基づくプライマーそれぞれが、アダプター領域（例として、シークエンシング、例えばＮＧＳ等と関連する領域等）、及びＮＧＳと関連する多重化を促進するように構成されたインデックス領域を含む場合、並びに一連のＮＧＳ読み取りのタグ付けされた標的分子を生成することが、タグ付けされた標的分子及び一連のシークエンシングに基づくプライマーを用いた第２のＰＣＲプロセスに基づき、インデックス領域及びアダプター領域を、一連のタグ付けされた標的分子のうちのタグ付けされた標的分子に付加することを含む場合、方法１００は、第１のＰＣＲプロセスを含む第１の増幅プロセスに基づき、一連のタグ付けされた標的分子を生成すること；タグ付けされた標的分子及び一連のシークエンシングに基づくプライマーを用いた第２のＰＣＲプロセスを含む第２の増幅プロセスに基づき、一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子（例として、ＮＧＳレディのタグ付けされた標的分子）を生成することを含むことができる。具体的な例では、ＰＣＲプロセスを実施すること（例として、一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成するための第２のＰＣＲ法）は、２４〜４５サイクル以内のＰＣＲにおいて、１μＬ当たり０．０２〜０．０８ユニット以内のＤＮＡポリメラーゼを使用することを含むことができる。具体的な例では、ＰＣＲプロセス（例として、第２のＰＣＲプロセス等）を実施すれば、一連のタグ付けされた標的分子（例として、第１のＰＣＲプロセスの実施に由来する生成物等）の生成から高純度のＤＮＡ生成物を増幅することが可能となり、シークエンシング（例として、ＮＧＳ；少なくとも１ｐＭ等）に適するレベルまで、核���標的（例として、標的分子）のＤＮＡ濃度を高めることができる。具体的な例では、一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成することは、１つ又は複数のアダプター領域、インデックス領域（例として、多重化を促進するための）、及び／又はその他の適する領域を、タグ付けされた標的分子及び／又はその他の適するコンポーネントに付加することを含むことができる。具体的な例では、一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成することは、「５’−シークエンシングアダプター−シークエンシングインデックス−外部アダプター−３’」を備えるコンフィギュレーションを含む一連のシークエンシングに基づくプライマーに由来する領域を付加することを含むことができる。
【００５３】
[0065]一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成すること（及び／又は方法１００の実施形態の適する部分）は、１つ又は複数の補足的増幅プロセス（例として、タグ付けされた標的分子及び／又は任意のその他の適するコンポーネント等の濃度を増加させるように機能することができる）を実施することを、加えて、又は代替として含むことができる。一例では、方法１００は、例えば一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成するのに使用されるＰＣＲプロセス（例として、第２のＰＣＲプロセス等）により付加されたシークエンシングアダプター領域においてアニーリングするプライマーに基づき（例として、それを使用して、それと共に）、補足的ＰＣＲプロセス（例として、タグ付けされた標的分子を生成することが第１のＰＣＲプロセスを実施することを含み、一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成することが第２のＰＣＲプロセスを実施することを含む場合には、第３のＰＣＲプロセス等）を実施することを含むことができる。具体的な例では、補足的ＰＣＲプロセスを実施することは、限界条件（例として、１ｐＭ未満の濃度等）を満たす濃度（例として、生成物の濃度；一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成することから得られた生成物の濃度；第２のＰＣＲプロセスから得られた生成物等）に基づくことができる。
【００５４】
[0066]但し、一連のシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成することは、任意の適する方式で実施可能である。
【００５５】
２．５  統合型シークエンシングライブラリーの調製
[0067]加えて、又は代替として、図２、図３、及び図５に示すように、方法１００の実施形態は、アンプリコン関連のシークエンシング及び微生物と関連するメタゲノム関連のシークエンシングと関連した統合型シークエンシングライブラリーを調製することＳ１５０を含むことができ、それは、アンプリコン関連のシークエンシング及びメタゲノム関連のシークエンシングの両者と関連した統合型シークエンシング技術を促進するように機能することができる。一例では、方法１００の実施形態のいくつかの部分は、一連のシークエンシングレディ標的分子に由来する微生物配列データセットに基づく（例として、一連のシークエンシングレディ標的分子についてそのシークエンシングに基づく）微生物群から、特定の微生物を識別すること（並びに／或いはマイクロバイオーム組成、機能、及び／又は適する微生物関連の側面に関連して、適するマイクロバイオームの特徴付けを実施すること）（例として、１つ又は複数の微生物分類群の存在量、その存在、その不存在を決定すること等）を含むことができる。
【００５６】
[0068]統合型配列ライブラリーは、アンプリコン関連のシークエンシング（例として、アンプリコンを含むコンポーネント；処理されたアンプリコン、例えばシークエンシングを目的として調製するために、例えばメタゲノム関連のコンポーネントに関連して処理されたアンプリコン等、例えばアンプリコン関連のコンポーネントとメタゲノムコンポーネントの間の濃度比をバランスさせることに関連して処理されたアンプリコン等、例えばタグ付けされたアンプリコン等；アンプリコンの生成及び／又は処理と関連するアウトプット等）、及びメタゲノム関連のシークエンシング（全核酸の断片を含むコンポーネント；例えばシークエンシングを促進するなどために処理された断片、例えばアンプリコン関連のコンポーネントに関連して処理された断片等；タグ付けされた断片；全核酸それ自体等）と関連したコンポーネント（例として、配列決定可能なコンポーネント、標的、タグ付けされた分子、全核酸の断片、アンプリコン関連のコンポーネント、メタゲノム関連のコンポーネント等）を含むのが好ましいが、しかし任意の適するコンポーネントを加えて、又は代替として含むことができる。
【００５７】
[0069]アンプリコンは、ＰＣＲプロセスから得られた増幅産物（例として、１つ又は複数の標的、例えば核酸標的等を含む生成物）を含むのが好ましいが、しかし増幅プロセスと関連した任意の適する生成物を加えて、又は代替として含むことができる。アンプリコン関連のシークエンシングは、例えば生体サンプル中の１つ又は複数の微生物分類群を同定するなどのために、単一又は少数の標的（例として、遺伝子領域）の分析と関連するシークエンシングを含むのが好ましいが、しかしアンプリコンと関連する任意の適するシークエンシンを加えて、又は代替として含むことができる。メタゲノム関連のシークエンシングは、例えば単一の遺伝子アンプリコンの分析とは対照的に、ＤＮＡの全コミュニティーを含む等、微生物群及び／又はその他の適する生態群集（例として、１つ又は複数の生体サンプル中に存在する）の分析と関連したシークエンシングを含むのが好ましいが、しかし微生物群（例として、組成関連の分析；機能関連の分析等に関連する）、生態群集、微生物の群、及び／又はメタゲノム関連の側面と関連する任意の適するシークエンシングを加えて、又は代替として含むことができる。
【００５８】
[0070]統合型シークエンシングライブラリーを調製するいくつかの部分は、方法１００の実施形態のいくつかの部分と任意の適する関連性（例として、時間的な関連性、例えば前、後、期間中、連続的、並列的等；インプットとして使用される及び／又はアウトプットとして生成されるコンポーネントに関する関連性等）を有しながら実施可能である。
【００５９】
[0071]変形形態では、１つ又は複数の統合型シークエンシングライブラリーを調製するいくつかの部分は、標的分子をタグ付けすることＳ１３０、に関連して記載される任意の適するプロセス（及び／又は類似のプロセス）、及び／又は方法１００の実施形態の適する部分を含むことができる。
【００６０】
[0072]但し、統合型シークエンシングライブラリーを調製することは、任意の適する方式で実施可能である。
【００６１】
２．５．標的関連のアンプリコンの生成
[0073]方法１００の実施形態（例として、統合型シークエンシングライブラリーを調製することを含む、方法１００の実施形態のいくつかの部分等）は、微生物と関連する少なくとも１つの生体サンプルから、一連のアンプリコン生成プライマー及び一連の標的（例として、核酸標的等）を用いた増幅プロセスに基づき、一連の標的関連のアンプリコンを生成することＳ１５２を含むことができ、それは、アンプリコン関連のシークエンシングを促進するアンプリコンを生成するように機能することができる。
【００６２】
[0074]一連の標的関連のアンプリコンを生成することは、例えば一連のアンプリコン生成プライマーを使用するなどして、ＰＣＲプロセス（例として、方法１００のいくつかの実施形態において、統合型シークエンシングライブラリーを調製するための３ステップＰＣＲ法の第１のＰＣＲプロセス等）に基づく（例として、それを含む；それを使用する；それを用いて処理する等）のが好ましいが、しかし、任意の適する増幅プロセスに加えて、又は代替として基づくことができる。アンプリコン生成プライマーは、１つ又は複数のアダプター領域（例として、例えば後続するＰＣＲプロセスを促進する際に、例えば方法１００の実施形態のいくつかの部分の後続するプロセスにおいて、例えば標的とすること、例えば後続プライマーが結合すること等を促進するための、標的関連のアンプリコンと関連するアダプター領域）、及び１つ又は複数の標的関連の領域（例として、１つ若しくは複数の標的との結合、アニーリング、及び／又はその他の適するカップリングを促進するなどのために）を含むのが好ましい。一例では、例えば一連の標的関連のアンプリコンを生成することが、アンプリコン生成プライマーの第１及び第２のサブセットを用いた増幅法（例として、ＰＣＲプロセス等）に基づき、一連の標的関連のアンプリコンを生成することを含むなどの場合、一連のアンプリコン生成プライマーは、アンプリコン生成プライマーの第１のサブセット（第１のサブセットの各アンプリコン生成プライマーは、第１のアンプリコン関連のアダプター領域、及び一連の核酸標的の少なくとも１つの核酸標的のフォワード配列と関連する第１の標的関連の領域を含む）；及びアンプリコン生成プライマーの第２のサブセット（第２のサブセットの各アンプリコン生成プライマーは、第２のアンプリコン関連のアダプター領域及び一連の核酸標的の少なくとも１つの核酸標的のリバース配列と関連する第２の標的関連の領域を含む）を含むことができる。具体的な例では、一連のアンプリコン生成プライマーは、第１のプライマー型に対応し、及び「５’−アダプターＡ１−標的ＤＮＡ配列−フォワード−３’」を備えるコンフィギュレーションを含む第１のプライマーを含み；第２のプライマー型に対応し、及び「５’−アダプターＡ２−標的ＤＮＡ配列−リバース−３’」を備えるコンフィギュレーションを含む第２のプライマーを含むことができるが、但し「標的ＤＮＡ配列」は、１つ又は複数の核酸標的（例として、目的とする遺伝子セグメント等）の増幅を可能にする任意のシークエンシングを含むことができ、「アダプターＡ１」及び「アダプターＡ２」は、例えば方法１００の実施形態の後続する部分等（例として、例えばシークエンシングレディ標的分子を生成すること等に関連する；例えばシークエンシングレディ分子を生成すること等に関連する、後続するＰＣＲプロセス）において、プライマー及び／又はその他の適する分子の結合を可能にする、アンプリコン関連のアダプター領域を含むことができる。具体的な例では、アンプリコン生成プライマーは、外部アダプター領域を含むアダプター領域を（例として、シークエンシングに基づくプライマー、例えばシークエンシングに基づくプライマーのアダプター領域等とのアニーリング、結合、及び／又はその他の適する会合を促進するなどために）含むことができる。但し、アンプリコン生成プライマーは、任意の適するコンポーネントを含むことができ、また任意の適する方式で構成可能である。
【００６３】
[0075]１つの変形形態では、一連の標的関連のアンプリコンを生成することは、１つ又は複数の標的をタグ付けすること（例として、増幅プロセス等を通じて）、例えば１つ又は複数のＵＭＩに基づく分子（例として、ＵＭＩ領域及び／又はＵＭＩに基づく分子のその他の領域等）を用いて１つ又は複数の標的をタグ付けすること等を含むことができる。一例では、一連のアンプリコン生成プライマーは、ＵＭＩに基づくプライマー（例として、対応する増幅プロセスで使用される）を含むことができる。具体的な例では、一連のアンプリコン生成プライマーは、アンプリコン生成プライマーの第１及び第２のサブセットを含むことができるが、その場合、アンプリコン生成プライマーの第１のサブセットは、第１のＵＭＩに基づくプライマーを含むことができ、第１のＵＭＩに基づくプライマーのうちのＵＭＩに基づくプライマーそれぞれは、第１のアンプリコン関連のアダプター領域、第１の標的関連の領域、及び第１のＵＭＩ領域を含み；アンプリコン生成プライマーの第２のサブセットは、第２のＵＭＩに基づくプライマーを含むことができ、第２のＵＭＩに基づくプライマーのうちのＵＭＩに基づくプライマーそれぞれは、第２のアンプリコン関連のアダプター領域、第２の標的関連の領域、及び第２のＵＭＩ領域を含む。但し、標的関連のアンプリコンを生成することに関連して、ＵＭＩに基づく分子及び／又はＵＭＩ領域を用いて、１つ若しくは複数の標的（例として、核酸標的等）をタグ付けすること、及び／又は任意の適するプロセスを実施することは、任意の適する方式で実施可能である。
【００６４】
[0076]アンプリコンは、任意の適するサイズ（例として、任意の適する配列長さ等）を含むことができ、また任意の適する数及び／又は種類の標的及び／又はその他の適するコンポーネントの増幅から生成可能である。但し、一連の標的関連のアンプリコンを生成することは、任意の適する方式で実施可能である。
【００６５】
２．５．Ｂ  メタゲノム関連の断片の生成
[0077]方法１００の実施形態（例として、統合型シークエンシングライブラリーを調製することを含む、方法１００の実施形態のいくつかの部分等）は、１つ又は複数の生体サンプルから一連の全核酸を処理することに基づき、微生物群と関連する一連のメタゲノム関連の断片（例として、メタゲノム関連の核酸断片等）を生成することＳ１５４を含むことができ、それは、メタゲノム関連のシークエンシングを促進する断片を生成するように機能することができる。
【００６６】
[0078]メタゲノム関連の断片は、全核酸の生の断片（例として、１つ又は複数の生体サンプルの全核酸において断片化プロセスを実施したときの生成物等）、全核酸の処理された断片（例として、１つ又は複数のアダプター領域、ＵＭＩに基づく分子、任意の適する領域、及び／又は任意の適するコンポーネント；前処理された全核酸及び／又はその他の適するコンポーネントの断片；精製された断片等でタグ付けされた、及び／又はそれらを含む断片）、及び／又は全核酸の任意の適する断片、及び／又は１つ若しくは複数の生体サンプルのその他の適するコンポーネントを含むことができる。
【００６７】
[0079]メタゲノム関連の断片は、１つ又は複数の微生物群と関連するのが好ましい。微生物群は、複数の分類群（例として、界、門、綱、目、科、属、種、亜種、系、及び／又は任意のその他の適する微生物の群等を含む分類群）に由来する微生物（例として、共通する生存空間、例えばユーザーの生理学的領域等、例えばユーザーのサンプル収集部位等を共有する）を含むのが好ましいが、しかし単一の分類群に由来する微生物のみを代替的に含むことができる。加えて、又は代替として、微生物群は、微生物間の相互作用、微生物間相互作用の生成物、微生物間の関連性、微生物及び／又は微生物群と関連した機能的な特質（例として、機能的プロファイル等）、微生物及び／又は微生物群と関連した組成的な特質（例として、分類プロファイル等）、並びに／或いは微生物及び／又は微生物群と関連した任意のその他の適するコンポーネント及び／又は特質を含むことができる。
【００６８】
[0080]一連のメタゲノム関連の断片を生成することは、一連の全核酸を処理することに基づくのが好ましいが、しかし任意の適するコンポーネント（例として、核酸断片、標的、例えば核酸標的等、その他の適するコンポーネント等）を処理することに加えて、又は代替として基づくことができる。
【００６９】
[0081]一連のメタゲノム関連の断片を生成すること（例として、一連の全核酸を処理すること）は、一連の全核酸に由来する全核酸（例として、１つ又は複数の生体サンプルから得られた一連の全核酸のすべて又はサブセット等）を用いて、１つ又は複数の断片化プロセス（例として、それを断片化すること；その断片を生成すること等）を実施することを含むのが好ましいが、しかしメタゲノム関連の断片生成を促進するための任意の適するプロセスを加えて、又は代替として含むことができる。１つ又は複数の断片化プロセスを実施すること（例として、一連のメタゲノム関連の断片を生成することに関連して；方法１００の実施形態の任意の適する部分に関連するなどして）は、酵素的プロセス（例として、定義された配列を、切断された核酸、例えば切断されたＤＮＡ等の１つ又は複数の末端部に付加するために、トランスポサーゼタイプの酵素を使用するなどして）、機械的プロセス（例として、全核酸について、その取得されたＤＮＡ断片を末端修復すること、並びにＵＭＩに基づく分子及び／又はその他の適するタグ付け分子を、修復されたＤＮＡ末端部にライゲートすること）、及び／又は任意の適する種類の断片化プロセスのうちの任意の１つ若しくは複数を含むことができる。断片化プロセスのアウトプット（例として、全核酸の断片）に付加される領域（例として、配列）は、例えば方法１００の実施形態の後続する部分等（例として、後続するＰＣＲプロセス；例えばシークエンシングレディ標的分子を生成することに関連するなどして）において、アダプター領域（例として、メタゲノム関連の断片生成アダプター領域等）、例えばプライマー及び／又はその他の適する分子の結合を可能にするアダプター領域等を含むことができる。但し、１つ又は複数の断片化プロセスを実施すること（例として、１つ又は複数の酵素的プロセス；１つ又は複数の機械的プロセス等）、並びに／或いはアダプター領域及び／又はその他の適するコンポーネント（例として、領域等）を付加することは、任意の適する方式で実施可能である。
【００７０】
[0082]変形形態では、一連のメタゲノム関連の断片を生成することは、１つ又は複数の断片（例として、全核酸の断片等）、並びに／或いはメタゲノム関連の断片及び／又は全核酸と関連するその他の適するコンポーネントをタグ付けすること、例えば１つ又は複数のＵＭＩに基づく分子及び／又はその他の適するコンポーネント（例として、シークエンシングに基づくプライマーを用いた後続処理を促進するためのアダプター領域、例えばシークエンシングに基づくプライマーとアニールするためのアダプター領域等）を用いてタグ付けすること等を含むことができる。一例では、一連のメタゲノム関連の断片を生成することは、酵素的プロセス及び機械的プロセスのうちの少なくとも１つを用いて、一連の全核酸を処理することに基づき断片を生成すること；並びにＵＭＩに基づく分子を断片とライゲートすることに基づき、一連のメタゲノム関連の断片を生成することを含むことができる。一例では、一連のメタゲノム関連の断片を生成することは、アダプター領域（例として、外部アダプター領域、メタゲノム関連のアダプター領域等）、ＵＭＩ領域、及び／又は任意のその他の適するコンポーネントを断片（例として、全核酸の断片等）に付加するために、増幅プロセス（例として、ＰＣＲプロセス）を実施することを含むことができる。但し、１つ又は複数の断片をタグ付けすることは、任意の適する方式で（例として、増幅プロセス、例えばＰＣＲプロセス等を通じて）実施可能である。
【００７１】
[0083]一連のメタゲノム関連の断片を生成することは、一連の全核酸を前処理することを加えて、又は代替として含むことができる（例として、１つ又は複数の断片化プロセスを実施する前；断片化プロセスを反復して実施しながら等）。前処理すること（例として、一連の全核酸；任意の適するコンポーネントを）は、核酸を変換すること（例として、ｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること）、標的捕捉プロセスを実施すること（例として、富化プロセス、除外プロセス等）のうちの任意の１つ又は複数を含むことができ、精製プロセス、補足的な増幅プロセスを実施し、及び／又は任意の適する前処理プロセスを実施することができる。一例では、一連のメタゲノム関連の断片を生成することは、一連の全核酸を前処理すること（例として、断片化前等において）を含むことができ、その場合、一連の全核酸を前処理することは、一連の全核酸から得られたｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換すること、一連の全核酸の第１の核酸に対応する第１の配列を選択的に富化するために、第１の標的捕捉プロセスを実施すること、及び一連の全核酸の第２の核酸に対応する第２の配列を選択的に除外する（例として、枯渇させるなど）ために、第２の標的捕捉プロセスを実施することのうちの少なくとも１つを含む。核酸を変換することは、標的遺伝子及び／又はその他の標的（例として、１つ又は複数の生体サンプル中の核酸標的）についてその発現の検出を促進するのに、並びに／或いはウイルスの存在及び／又はウイルスのその他の適する特性（例として、ＲＮＡに基づくゲノムを有するウイルス等）を検出するのに使用可能である。一例では、前処理することは、断片化前に、逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）により（例として、ＲＴ−ＰＣＲが、例えばサンプル中のすべて若しくは実質的にすべてのｍＲＮＡを逆転写するなどのためにランダムプライマーを使用して、又は目的とするｍＲＮＡを標的とするプライマーを使用して実施可能である場合等）、並びに／或いは例えば断片化プロセス及び統合型シークエンシングライブラリーへの組み入れを促進するなどのためのその他の適する形質転換プロセスにより、全核酸中のｍＲＮＡをｃＤＮＡに変換することを含むことができる。標的捕捉プロセスを実施することは、例えば標的捕捉プロセスが、オリゴヌクレオチドに基づくプロセスを含み得るなどの場合において（例として、オリゴヌクレオチドが、標的核酸、例えば標的ＤＮＡ断片等の中の配列とハイブリダイズすることができる場合、ビーズサービスに固定化された、又はそれに連結したオリゴヌクレオチドを使用するなどして）、標的配列に対応する核酸を富化若しくは除去すること、及び／又は適する種類の標的を富化若しくは除去すること（例として、枯渇させること）（例として、断片化プロセス前等において）を含むことができる。但し、一連の全核酸を前処理することは、全核酸及び／又はその他の適するコンポーネントを断片化することに付加して及び／又は代替して、方法１００の実施形態において、及び／又は任意の適する方式で、一連のメタゲノム関連の断片を生成することの任意の適する部分に付加して及び／又は代替して実施可能である。
【００７２】
[0084]但し、メタゲノム関連の断片を生成することは、任意の適する方式で実施可能である。
【００７３】
２．５．Ｃ  シークエンシングレディ標的分子の生成
[0085]方法１００の実施形態（例として、統合型シークエンシングライブラリーを調製することを含む、方法１００の実施形態のいくつかの部分等）は、一連の標的関連のアンプリコン、一連のメタゲノム関連の断片（例として、メタゲノム関連の核酸断片等）、及び一連のシークエンシングに基づくプライマーに基づき、一連のシークエンシングレディ（例として、ＮＧＳレディ）標的分子（例として、１つ又は複数の標的、例えば核酸標的等と関連する）を生成することＳ１５８を含むことができ、それは、シークエンシング（例として、ＮＧＳ；同時に行われるアンプリコン関連のシークエンシング及びメタゲノム関連のシークエンシングを含むシークエンシング等）を目的として調製するために、１つ又は複数の標的関連のアンプリコン及び／又はメタゲノム関連の断片、及び／又はその他の適する混合物（例として、アンプリコン関連のコンポーネント及びメタゲノム関連のコンポーネントからなる混合物等）を処理するように機能することができる。
【００７４】
[0086]シークエンシングレディ標的分子は、１つ又は複数の標的（例として、アンプリコンと関連する）、及び微生物群（例として、標的が全核酸を含み；標的が複数の分類群の微生物と関連する場合、メタゲノム関連の断片と関連する）と関連するのが好ましいが、しかし微生物群とは独立している１つ若しくは複数の標的；１つ若しくは複数の標的とは独立している微生物群；及び／又は任意のその他の適する目的とする標的と加えて、又は代替として関連することができる。シークエンシングレディ標的分子を生成することは、一連の標的関連のアンプリコン、一連のメタゲノム関連の断片、及び一連のシークエンシングに基づくプライマーを用いた増幅プロセス（例として、標的関連のアンプリコンを生成することが、第１のＰＣＲプロセスを含む第１の増幅プロセスを含み得る場合、第２のＰＣＲプロセスを含む第２の増幅プロセス等）に基づく（例として、それを含む）のが好ましい。ＰＣＲプロセスは、限定されたサイクル（例として、限界量よりも少ない）を含むのが好ましいが、しかし任意の適するサイクル数を含むことができる。増幅プロセスを実施することは、１つ若しくは複数のアダプター領域及び／又は１つ若しくは複数のインデックス領域（例として、増幅プロセスを経た）を、コンポーネント（例として、混合物）、例えば標的関連のアンプリコン及び／又はメタゲノム関連の断片を含むコンポーネント等に付加することを含むのが好ましいが、しかしアダプター領域、インデックス領域、及び／又はその他の適する領域は、任意の適する方式（例として、ライゲーションプロセス等）で付加可能である。一例では、シークエンシングに基づくプライマーは、シークエンシング（例として、ＮＧＳ等）と関連する多重化を促進するように構成されたインデックス領域（例として、シークエンシングインデックス領域等を含む）、及びシークエンシング（例として、ＮＧＳ等）と関連するアダプター領域、及び１つ若しくは複数のプライマー及び／又はアダプター領域（例として、シークエンシングに基づくプライマーが、標的関連のアンプリコンのアダプター領域、及び／又はメタゲノム関連の断片のアダプター領域；及び／又はその他の適するコンポーネントに対して相補的、アニーリング可能、及び／又はさもなければそれらと関連するアダプター領域を含み得る場合、標的関連のアンプリコン、例えばプライマーのアダプター領域等を生成する際に使用されるプライマー；標的関連のアンプリコンのアダプター領域；メタゲノム関連の断片のアダプター領域等）を含むことができる。具体的な例では、シークエンシングに基づくプライマーは、「５’−シークエンシングアダプター−シークエンシングインデックス−外部アダプター−３’」を備えるコンフィギュレーションを含むことができる。１つの変形形態では、シークエンシングに基づくプライマーは、標的関連のアンプリコン、及び／又はメタゲノム関連の断片、及び／又はその他の適するコンポーネント（例として、標的関連のアンプリコン及びメタゲノム関連の断片を含む混合物に含まれる）のアダプター領域（例として、アンプリコン関連のアダプター領域；メタゲノム関連のアダプター領域；アンプリコン生成アダプター領域；メタゲノム関連の断片生成アダプター領域等）とアニーリングするように構成された領域（例として、アダプター領域等）を含むことができる。一例では、シークエンシングに基づくプライマーは、アンプリコン生成アダプター領域、及び／又はその他の適するアダプター領域（例として、メタゲノム関連の断片のメタゲノム関連アダプター領域等）とアニーリングするように構成された領域を含むことができる。加えて、又は代替として、Ｓ１５８と関連するシークエンシングに基づくプライマーは、Ｓ１４０と関連するシークエンシングに基づくプライマーと同一である、類似する、又はそれとは異なる可能性がある。但し、シークエンシングに基づくプライマーは、任意の適する方式で構成可能であり、またシークエンシングレディ標的分子を生成することに関連して増幅プロセスを実施すること（例として、ＰＣＲプロセス）は、任意の適する方式で実施可能である。
【００７５】
[0087]変形形態では、シークエンシングレディ標的分子を生成することは、１つ若しくは複数の前処理プロセス及び／又は事後処理プロセスを実施することを含むことができる。一例では、シークエンシングレディ標的分子を生成することは、標的関連のアンプリコン、メタゲノム関連の断片、及び一連のシークエンシングに基づくプライマーを用いたＰＣＲプロセスを実施すること；並びに洗浄すること、サイズ選択すること、補足的な増幅プロセスを実施すること、精製すること、富化すること、除去すること、及び／又はＰＣＲプロセスの生成物を用いて任意の適するプロセスを実施することを含むことができる（例として、任意の適するシークエンシング技術に適するシークエンシングレディ標的分子を調製するなどのために）。
【００７６】
[0088]変形形態では、標的関連のアンプリコン、メタゲノム関連の断片、及び／又はシークエンシングに基づくプライマーに基づき、一連のシークエンシングレディ標的分子を生成することは、シークエンシングレディのタグ付けされた標的分子を生成することＳ１４０（例として、タグ付けされた標的分子及び／又はシークエンシングに基づくプライマー等に基づく）に関連して記載されている任意の適するプロセス（及び／又は類似のプロセス）を含むことができる。但し、シークエンシングレディ標的分子を生成することは、任意の適する方式で実施可能である。
【００７７】
３．実施例
[0089]一例では、方法１００の実施形態のいくつかの部分は、細菌１６Ｓリボソーム遺伝子を標的とするシークエンシングライブラリーを生成するために実施可能である。シークエンシングライブラリーを生成することは、反比例して混合可能である２つの細菌ＤＮＡプールの定義された混合品を含むＤＮＡテンプレートの使用を含むことができる（例として、図６に示す通り）。プールの各メンバーに割り振られたシークエンシング読み取りの数を比較すれば、同等数の読み取りが、ＵＭＩ除外プライマー（例として、ＵＭＩ領域を有さないプライマー等）及びＵＭＩに基づくプライマーについて、各条件において、検出された微生物毎に取得可能であることが明らかとなり得る。
【００７８】
[0090]一例では、例えばタグ付けの効率が「Ｎ」塩基の数と逆数相関の関係を有し得る場合などで、例えば特定の適用例において（例として、図７に示す通り）、「Ｎ」塩基の数が４Ｎから８Ｎに増加したとき（及び／又は一般的に増加したとき）に、割り振られるシークエンシング読み取りの数が減少し得る場合などでは、４Ｎ  ＵＭＩ領域又は８Ｎ  ＵＭＩ領域を含むＵＭＩに基づくプライマーがシークエンシングライブラリーを生成するのに適用可能である。一例では、タグ付け促進分子が、タグ付け効率（例として、タグ付けされた標的分子を生成するＰＣＲプロセスと関連する効率等）を改善するために付加可能である。具体的な例では、図８に示すように、ＭｇＣｌ２、ＤＭＳＯ、及び／又は極めて耐熱性の一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質を含む一連のタグ付け促進分子を、８Ｎ  ＵＭＩ領域を含むＵＭＩに基づくプライマーを使用するＰＣＲプロセスに付加すれば、増幅及び／又はタグ付け効率を改善することができる（例として、図８に示すように、大腸菌ゲノムＤＮＡの単一ＤＮＡテンプレートを使用する１６Ｓ遺伝子の増幅は、アガロースゲル電気泳動により分析されるように、ある範囲のＤＮＡインプットについて改善し得る）。具体的な例では、図９Ａ〜９Ｂに示すように、４Ｎ  ＵＭＩ領域又は８Ｎ  ＵＭＩ領域を含むＵＭＩに基づくプライマーを使用するＰＣＲプロセスのためにタグ付け促進分子を付加すれば、タグ付け効率を改善することができる（例として、より多数の異なるＵＭＩタグ等）。具体的な例では、図１０Ａ〜１０Ｂに示すように、４Ｎ  ＵＭＩ領域又は５Ｎ  ＵＭＩ領域を含むＵＭＩに基づくプライマーを使用するＰＣＲプロセスのためにタグ付け促進分子を付加すれば（例として、図１０Ａ〜１０Ｂに示す通り）、読み取り数の増加を引き起こすことができ（例として、微生物群標準サンプル等について）、例えば、具体的な例では（例として、図１１Ａ〜１１Ｂに示す通り）、標的配列の３０％が固有のＵＭＩを示し得る。但し、タグ付け促進分子を付加すれば、任意の適する程度の改善を付与することができる。
【００７９】
[0091]一例では、１つ又は複数のリンカー領域（例として、ＵＭＩ領域と標的関連の領域を分離する）を含むＵＭＩに基づく分子を使用すれば、プライマーを用いた増幅効率を改善することができる（例として、より長い「Ｎ」長さのＵＭＩ領域が使用される場合等）。具体的な例では、図１２に示すように、１６Ｓ領域の増幅は、ＵＭＩ領域と標的関連の領域を分離する７塩基長のリンカー領域を含むＵＭＩに基づくプライマーの使用を通じて改善し得る。
【００８０】
[0092]一例では、方法１００の実施形態のいくつかの部分は、ヒト便生体サンプルに由来する統合型シークエンシングライブラリーを調製することを含むことができるが、しかし統合型配列ライブラリーは、任意の適する生体サンプル（例として、任意の適するユーザー由来；任意の適する採取部位由来）から加えて、又は代替として調製可能である。具体的な例では、統合型配列ライブラリーは、単一ユーザー由来の便サンプルから構築可能であり；複数回（例として、数百回等）のシークエンシング操作から得られたサンプルについて細菌分類群分析を行えば、統計的に有意な再現性のある相違（例として、頑健性及び一貫性等を示唆する）を明らかにすることができる。具体的な例では、統合型シークエンシングライブラリーは、アンプリコン重視のアプローチのみを使用したときには、統合型シークエンシングライブラリーのアンプリコン関連のコンポーネントにおいて提示されるすべての種（及び／又はその他の適する分類群）の組み入れを示す結果をもたらす可能性があり、そして細菌分類群の提示がより高いにもかかわらず過少提示されることが明らかとなる（例として、テネリクテス・フィラム（Ｔｅｎｅｒｉｃｕｔｅｓ  ｐｈｙｌｕｍ）等）。具体的な例では、統合型シークエンシングライブラリーを調製することと関連するプロセスは、所与の微生物（例として、１６Ｓ領域、１８Ｓ領域、ＩＴＳ等を含む及び／又はそれらに基づく）の有無を識別するアンプリコン関連のプロセスを使用することにより、並びに目的とする核酸標的（例として、抗生物質耐性遺伝子、病原性因子、分泌系等）及び／又はその他の適する標的を同定するメタゲノム関連のプロセスを使用することにより、異なる微生物及び目的とする特定の核酸標的を同定するのに使用可能である。
【００８１】
[0093]いくつかの例では、方法１００及び／又はシステム２００は、従来のアプローチに対して改善を付与することができる。方法１００及び／又はシステム２００の具体的な例は、少なくとも従来のアプローチと関連した課題に対して技術的に定着した解決策を付与することができる。いくつかの例では、技術は、実体（例として、生体サンプル、標的、例えば核酸標的等、プライマー、ＵＭＩに基づく分子、ユーザー等）を異なる状態又は物に変換することができる。具体的な例では、核酸標的は、例えばシークエンシングを改善する（例として、バイアスの低減、分析法の改善、例えば定量化の改善等と関連して）ように構成されたシークエンシングレディ標的分子、及び／又はシークエンシングレディのタグ付けされた標的分子に変換可能である。具体的な例では、例えば１つ又は複数の微生物関連の状態と関連した診断及び／又は治療の改善を促進し、これにより１人又は複数のユーザーを変換するなどのために、改善したシークエンシングライブラリーを調製して、改善したマイクロバイオームの特徴付けを実現することができる。但し、いくつかの例では、技術は任意の適する方式で実体を変換することができる。
【００８２】
[0094]いくつかの例では、技術は、少なくともシークエンシングライブラリーの調製、サンプルの処理、ゲノミクス、分子生物学、微生物学、診断、治療薬、デジタル医療、モデリング、及び／又はその他の適する技術分野のうちのいくつかの技術分野を改善することができる。但し、具体的な例では、技術は、例えば方法１００及び／又はシステム２００の実施形態のいくつかの部分を実施すること等により、任意のその他の適する改善を提供し得る。
【００８３】
[0095]方法１００及び／又はシステム２００の実施形態は、任意の変法（例として、実施形態、変形形態、実施例、具体例、図面等）を含む様々なシステムコンポーネント及び様々な方法プロセスについて、あらゆる組み合わせ及び置換を含むことができ、方法１００の実施形態のいくつかの部分及び／又は本明細書に記載されているプロセスは、システム２００及び／又は本明細書に記載されているその他の実体の１つ若しくは複数の事例、要素、コンポーネント、及び／又はその他の側面により、並びに／或いはそれらを使用して、非同期的に（例として、連続して）、同時に（例として、並行して）、又は任意のその他の適する順序で実施可能である。
【００８４】
[0096]本明細書に記載されている変法（例として、実施形態、変形形態、実施例、具体例、図面等）のいずれも、及び／又は本明細書に記載されている変法のいずれの部分も、加えて、又は代替として統合可能、集約可能、除外可能、使用可能、連続的に実施可能、並行して実施可能であり、及び／又はさもなければ適用可能である。
【００８５】
[0097]方法１００及び／又はシステム２００の実施形態いくつかの部分は、コンピューター読み取り可能な指示を保管するコンピューター読み取り可能な媒体を受け入れるように構成された機械として、少なくとも一部について具体化可能及び／又は実施可能である。指示は、システムと共に組み込み可能なコンピューター実行可能なコンポーネントにより実行可能である。コンピューター読み取り可能な媒体は、任意の適するコンピューター読み取り可能な媒体、例えばＲＡＭ、ＲＯＭ、フラッシュメモリー、ＥＥＰＲＯＭ、光デバイス（ＣＤ又はＤＶＤ）、ハードドライブ、フロッピードライブ等、又は任意の適するデバイスに保管可能である。コンピューター実行可能なコンポーネントは、一般的又は特別仕様のプロセッサーであり得るが、しかし任意の適する専用のハードウェア又はハードウェア／ファームウェア組み合わせデバイスが、指示を代替的又は付加的に実行することができる。
【００８６】
[0098]これまでの詳細な説明から、並びに図面及び特許請求の範囲から当業者は認識するように、特許請求の範囲において定義される範囲から逸脱せずに、方法１００、システム２００の実施形態、及び／又は変法に対して修正及び変更を加えることができる。
【００８７】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、２０１７年６月２０日出願の米国仮特許出願第６２／５２２，２９３号、及び２０１７年１１月６日出願の米国仮特許出願第６２／５８２，１６２号の利益を主張し、その各号は本明細書において参照によりそのまま組み込まれている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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