(57)【要約】  本発明は、ラージスケールの製造において細胞培養培地の容量を最小化するための方法としての灌流培養におけるオンラインバイオマス静電容量モニタリングの使用に関する。ある特定の実施形態では、バイオマス静電容量プローブが、生細胞密度を測定するために使用され、かつ、生細胞密度が、目標灌流速度を同定するために所定の一定の細胞特異的灌流速度と組み合わせて使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
灌流バイオリアクターの灌流速度を制御する方法であって、
ａ）バイオマス静電容量プローブを使用して培養において増殖している細胞の生細胞密度を測定すること、および
ｂ）前記生細胞密度を考慮して目標灌流速度を動的に調整すること
を含み、前記細胞が灌流の間に高細胞密度まで増殖する、
方法。
【請求項２】
細胞培養培地の灌流容量を最小化する方法であって、
ａ）バイオマス静電容量プローブを使用して培養において増殖している細胞の生細胞密度を測定すること、および
ｂ）前記生細胞密度を考慮して目標灌流速度を動的に調整すること
を含み、前記細胞が灌流の間に高細胞密度まで増殖する、
方法。
【請求項３】
前記生細胞密度が、前記目標灌流速度を決定するために一定の細胞特異的灌流速度と組み合わせて使用される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記一定の細胞特異的灌流速度が約０．０１〜０．１５ｎＬ／細胞／日である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記一定の細胞特異的灌流速度が約０．０２〜０．１０ｎＬ／細胞／日である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記一定の細胞特異的灌流速度が約０．０３ｎｌ／細胞／日である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記一定の細胞特異的灌流速度が約０．０４〜０．０５ｎｌ／細胞／日である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記一定の細胞特異的灌流速度が約０．０４ｎｌ／細胞／日である、請求項３〜５または７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記一定の細胞特異的灌流速度が約０．０８〜０．１０ｎＬ／細胞／日である、請求項３〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記一定の細胞特異的灌流速度が約０．１０ｎｌ／細胞／日である、請求項３〜５または９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
目標灌流流速の算出がバイオリアクター制御装置により行われる、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
灌流流速が、前記バイオリアクターにおける前記生細胞密度の測定後に目標灌流流速を達成するように増加される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
灌流流速が、前記バイオリアクターにおける前記生細胞密度の測定後に目標灌流流速を達成するように減少される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記生細胞密度が、目標細胞密度に到達する時点を測定するためにさらに使用される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記目標細胞密度が、＞３０×１０６細胞／ｍｌ、＞４０×１０６細胞／ｍｌ、＞５０×１０６細胞／ｍｌ、＞６０×１０６細胞／ｍｌ、または＞７０×１０６細胞／ｍｌである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記目標細胞密度が＞４０×１０６細胞／ｍｌである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
総灌流液量が測定される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
１日毎の灌流速度が測定される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
静電容量が測定される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が、前記目標細胞密度に到達した時に製造バイオリアクターに移される、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞が目的のポリペプチドを生成する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記目的のポリペプチドが抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞がＣＨＯ細胞である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記灌流バイオリアクターがＮ−１灌流バイオリアクターである、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記灌流バイオリアクターが交互タンジェンシャルフローシステムに取り付けられている、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記灌流バイオリアクターが、１日当たり約５未満、約４．５未満、約４未満、約３．５未満、約３．０未満、約２．５未満、約２未満、約１．５未満または１未満の容器容量の灌流培地を使用する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記灌流バイオリアクターが、前記生細胞密度を測定しないプロセスにより使用される灌流培地の総量の約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％のみを使用する、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記バイオマス静電容量プローブがＩＮＣＹＴＥプローブである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月１５日に出願された米国仮出願第６２／５５９，１４２号に対する優先権を主張し、該仮出願は参照することにより全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
灌流培養では、使用済みの培地を新鮮な培地と交換しながらバイオリアクターに細胞を保持するために細胞分離デバイスまたは濾過方法が利用される。灌流速度は、典型的には１日当たり１〜５バイオリアクター容量に設定され、２４時間を基準にして一定に維持される。灌流速度は、細胞のための充分な栄養分を確実にするために生細胞密度測定に基づいて増加され得る。この灌流速度は、頻繁にではなく１日毎を基準にしてのみ調整されるという事実に起因して、交換される培地の量は、細胞当たりを基準にして過少または過大に推定され得る。実際の細胞特異的灌流速度の過少推定は、栄養分の枯渇を結果としてもたらす可能性があり、したがって細胞増殖速度に影響し得る。細胞特異的灌流速度の過大推定は、培地中に提供される栄養分を完全に利用することなく高い培地灌流速度を結果としてもたらす。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
生成期の間の生細胞密度および灌流速度を測定したグループもある。Dowd et al., Cytotechnology 42: 35-45 (2003)。しかしながら、目標量を満たすように灌流速度を動的に調整し、それにより、高細胞密度灌流システムにおける栄養分のレベルを一定に保持しながら培地使用を低減させるための機構の必要性が当該技術分野において存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一実施形態では、本発明は、灌流バイオリアクターの灌流速度を制御する方法であって、ａ）バイオマス静電容量プローブを使用して培養（ｃｕｔｕｒｅ）において増殖している細胞の生細胞密度を測定すること、およびｂ）生細胞密度を考慮して目標灌流速度を動的に調整することを含み、細胞が灌流の間に高細胞密度まで増殖する、方法に関する。
【０００５】
一実施形態では、本発明は、細胞培養培地の灌流容量を最小化する方法であって、ａ）バイオマス静電容量プローブを使用して培養において増殖している細胞の生細胞密度を測定すること、およびｂ）生細胞密度を考慮して目標灌流速度を動的に調整することを含み、細胞が灌流の間に高細胞密度まで増殖する、方法に関する。
【０００６】
一部の実施形態では、生細胞密度は、目標灌流速度を決定するために一定の細胞特異的灌流速度と組み合わせて使用される。ある特定の実施形態では、一定の細胞特異的灌流速度は約０．０１〜０．１５ｎＬ／細胞／日である。特定の実施形態では、一定の細胞特異的灌流速度は約０．０２〜０．１０ｎＬ／細胞／日である。一実施形態では、一定の細胞特異的灌流速度は約０．０４ｎｌ／細胞／日である。複数の実施形態では、一定の細胞特異的灌流速度は約０．０３ｎｌ／細胞／日である。一部の実施形態では、一定の細胞特異的灌流速度は約０．０４〜０．０５ｎｌ／細胞／日である。ある特定の実施形態では、一定の細胞特異的灌流速度は約０．０４ｎｌ／細胞／日である。特定の実施形態では、一定の細胞特異的灌流速度は約０．０８〜０．１０ｎＬ／細胞／日である。複数の実施形態では、一定の細胞特異的灌流速度は約０．１０ｎｌ／細胞／日である。
【０００７】
一部の実施形態では、目標灌流流速の算出は、バイオリアクター制御装置により行われる。ある特定の実施形態では、灌流流速は、バイオリアクターにおける生細胞密度の測定後に目標灌流流速を達成するように増加される。他の実施形態では、灌流流速は、バイオリアクターにおける生細胞密度の測定後に目標灌流流速を達成するように減少される。
【０００８】
一部の実施形態では、生細胞密度は、目標細胞密度に到達した時点を測定するためにさらに使用される。ある特定の実施形態では、目標細胞密度は、＞３０×１０６細胞／ｍｌ、＞４０×１０６細胞／ｍｌ、＞５０×１０６細胞／ｍｌ、＞６０×１０６細胞／ｍｌ、または＞７０×１０６細胞／ｍｌである。特定の実施形態では、目標細胞密度は＞４０×１０６細胞／ｍｌである。
【０００９】
一部の実施形態では、総灌流液量が測定される。複数の実施形態では、１日毎の灌流速度が測定される。ある特定の実施形態では、静電容量が測定される。
【００１０】
複数の実施形態では、細胞は、目標細胞密度に到達した時に製造バイオリアクター（ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）に移される。ある特定の実施形態では、細胞は目的のポリペプチドを生成する。特定の実施形態では、目的のポリペプチドは抗体である。
【００１１】
複数の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。ある特定の実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。
【００１２】
一部の実施形態では、灌流バイオリアクターはＮ−１灌流バイオリアクターである。複数の実施形態では、灌流バイオリアクターは交互タンジェンシャルフローシステムに取り付けられる。
【００１３】
複数の実施形態では、灌流バイオリアクターでは、１日当たり約５未満、約４．５未満、約４未満、約３．５未満、約３．０未満、約２．５未満、約２未満、約１．５未満または１未満の容器容量の灌流培地が使用される。特定の実施形態では、灌流バイオリアクターでは、生細胞密度を測定しない方法により使用される灌流培地の総量の約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％のみが使用される。
【００１４】
複数の実施形態では、バイオマス静電容量プローブはＩＮＣＹＴＥプローブである。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＡＴＦ２灌流デバイスおよびバイオマス静電容量プローブを用いた５Ｌバイオリアクターの灌流速度の制御についての概略図。
【図２】ＡＴＦ６灌流デバイスおよびバイオマス静電容量プローブを用いた２００Ｌバイオリアクターの灌流速度の制御についての概略図。
【図３】図３Ａおよび図３Ｂ：オフライン生細胞密度に対する静電容量読取りの線形フィットに基づく生細胞密度のオンライン推定。異なるバイオリアクターランにしたがってデータポイントに印をしている。生細胞密度プロファイルに対する静電容量読取りの相関を記載する等式を２つの組換えＣＨＯ細胞株について（Ａ）および（Ｂ）において示す。細胞株Ａからの計７つのバイオリアクターランを使用してプロットＡにおけるデータを生成し、細胞株Ｂからの２つのランを使用してプロットＢにおけるデータを生成した。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂ：（Ａ）２つの異なる灌流モードを使用した経時的な培地利用速度。菱形：バイオ静電容量プローブ（ｂｉｏ−ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  ｐｒｏｂｅ）からのオンラインＶＣＤ読取りに基づいて動的に調整された灌流速度。丸：オフラインＶＣＤ測定に基づいて２４時間毎に調整された灌流速度。（Ｂ）５Ｌおよび２００Ｌ灌流バイオリアクターについての細胞密度プロファイル。細胞増殖速度は、灌流速度を制御する方法とは独立して同等である。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂ：（Ａ）Ｎ−１シードバイオリアクターにおける高いおよび低い細胞特異的灌流速度は、細胞株Ｃについて生細胞密度プロファイルの差異を結果としてもたらした。１４４時間および２１６時間時に細胞の一部分を製造バイオリアクターに接種し、細胞増殖を継続するために細胞を現行の容器に再播種した。（Ｂ）２つの異なる灌流速度におけるＮ−１バイオリアクターのグルコースレベル。より低い灌流速度は１４４時間時にグルコースの枯渇を結果としてもたらした。
【図６】図６Ａおよび図６Ｂ：生細胞密度に対する灌流速度の効果。灌流Ｎ−１シードバイオリアクターを使用して、６または１０×１０６細胞／ｍｌのいずれかにおいて製造容器に接種した。０．０４ｎＬ／細胞／日で作動させたＮ−１シードから接種された培養物は、０．０２ｎＬ／細胞／日で作動させたＮ−１シードと比較してより高いピークＶＣＤ（四角および三角の線）をもたらす。
【図７】図７Ａ〜７Ｆ：５Ｌおよび２００Ｌの両スケールにおいて細胞株Ｄにおいて実証されたオンライン静電容量値に基づく灌流速度の動的調整。この細胞株についての目標ＣＳＰＲは０．１０ｎＬ／細胞−日（ｎＬ／ｃｅｌｌ−ｄａｙ）に設定される。２００Ｌスケールにおける（Ａ）生細胞密度、静電容量（Ｂ）総灌流液量（ｃａｐａｃｉｔａｎｃｅ  （Ｂ）ｔｏｔａｌ  ｐｅｒｆｕｓａｔｅ）、１日毎の灌流速度、（Ｃ）細胞特異的灌流速度。５Ｌスケールにおける（Ｄ）生細胞密度、静電容量（Ｅ）総灌流液量、１日毎の灌流速度；（Ｆ）細胞特異的灌流速度。
【図８】図８Ａ〜８Ｃ：５Ｌスケールにおいて細胞株Ｃにおいて実証されたオンライン静電容量値に基づく灌流速度の動的調整。この細胞株についての目標ＣＳＰＲは０．０４ｎＬ／細胞−日に設定される。５Ｌスケールにおける（Ａ）生細胞密度、静電容量（Ｂ）総灌流液量、１日毎の灌流速度、（Ｃ）細胞特異的灌流速度。
【図９】図９Ａ〜９Ｃ：５Ｌスケールにおいて細胞株Ｅにおいて実証されたオンライン静電容量値に基づく灌流速度の動的調整。この細胞株についての目標ＣＳＰＲは０．０４ｎＬ／細胞−日に設定される。５Ｌスケールにおける（Ａ）生細胞密度、静電容量（Ｂ）総灌流液量、１日毎の灌流速度、（Ｃ）細胞特異的灌流速度。
【図１０】図１０：Ａ〜１０Ｆ（Ｆｉｇｕｒｅ  １０：Ａ−１０Ｆ）  ５Ｌスケールにおいて細胞株Ａにおいて実証されたオンライン静電容量値に基づく灌流速度の動的調整。０．０３ｎＬ／細胞−日の目標における（Ａ）ＶＣＤおよび静電容量、（Ｂ）総灌流液容量および１日毎の灌流速度、（Ｃ）細胞特異的灌流速度。０．０４ｎＬ／細胞−日の目標における（Ｄ）ＶＣＤおよび静電容量、（Ｅ）総灌流液容量および１日毎の灌流速度、（Ｆ）細胞特異的灌流速度。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
一般的用語および表現の定義
本開示がより容易に理解され得るように、ある特定の用語を最初に定義する。それ以外に本明細書において明示的に提供される場合を除き、本出願において使用される場合、以下の各用語は、以下に記載される意味を有する。追加の定義は、出願の全体を通じて示される。
【００１７】
「および／または」という用語は、本明細書において使用される場合、２つの指定される特徴または要素のそれぞれの、他方を伴うまたは伴わない特定の開示として解されるべきである。したがって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において使用される「および／または」という用語は、以下の態様：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）のそれぞれを包含することが意図される。
【００１８】
態様が「含む」という表現と共に本明細書において記載される場合は常に、「からなる」および／または「から本質的になる」の点で記載されるそれ以外は同様の態様もまた提供されることが理解される。
【００１９】
別段の定義がなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本開示が関する技術分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press；およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示において使用される用語の多くの全般的な辞典を当業者に提供する。
【００２０】
単位、接頭辞、および記号は、それらの国際単位系（ＳＩ）で承認された形態で表される。数値範囲は、範囲を定義する数を含む。本明細書において提供される見出しは、本開示の様々な態様の限定ではなく、本開示の様々な態様は、全体としての本明細書を参照することにより得られ得る。したがって、すぐ下において定義される用語は、全体として本明細書を参照することによってより充分に定義される。
【００２１】
選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢の１つ、両方、またはその任意の組合せのいずれかを意味することが理解されるべきである。本明細書において使用される場合、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、任意の記載または列挙される要素の「１つまたは複数」を指すことが理解されるべきである。
【００２２】
「約」または「本質的に含む」という用語は、当業者により決定されるような特定の値または組成についての許容される誤差範囲内の値または組成を指し、該誤差範囲は部分的に、値または組成が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの制限に依存する。例えば、「約」または「本質的に含む」は、当該技術分野における慣習にしたがって１または１以上の標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」または「本質的に含む」は、１０％または２０％までの範囲（すなわち、±１０％または±２０％）を意味することができる。例えば、約３ｍｇは、２．７ｍｇ〜３．３ｍｇ（１０％）または２．４ｍｇ〜３．６ｍｇ（２０％）の任意の数を含むことができる。さらには、特に生物学的なシステムまたはプロセスに関して、用語は、値の大きさの桁までまたは５倍までを意味することができる。特定の値または組成が本出願および特許請求の範囲において提供される場合、別段の言及がなければ、「約」または「本質的に含む」の意味は、その特定の値または組成について許容される誤差範囲内であることが想定されるべきである。
【００２３】
本明細書において記載される場合、任意の濃度範囲、パーセンテージ範囲、比範囲または整数範囲は、そうでないことを指し示さなければ、記載される範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その小数（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むことが理解されるべきである。
【００２４】
「細胞培養物」および「培養物」という用語は、細胞と培地との任意の組合せを含む。本発明の方法は、灌流細胞培養物および流加細胞培養物を想定するがこれらに限定されない。
【００２５】
本明細書において使用される場合、「灌流させる」、「灌流」および「灌流培養」という用語は交換可能に使用され、追加の新鮮な培地が培養物に提供され、使用済みの培地が培養物から除去される、細胞を培養する方法を指す。灌流は、培養物が播種された後に開始され、ある期間にわたり、所望により、連続的または断続的のいずれかで行うことができる。灌流の間に加えられる新鮮な培地は、典型的には、培養プロセスの間に枯渇した細胞用の栄養添加物を提供する。灌流はまた、細胞培養物からの細胞廃棄生成物および毒性副生成物の除去を可能とする。灌流は細胞の増殖期の間に行われるが、細胞を流加細胞培養物に移した後にも継続することができる。
【００２６】
本明細書において使用される場合、「ＶＶＤ」という用語は、灌流速度により設定される値であり、１日当たりに交換する容器容量の容量を指す。
【００２７】
本明細書において使用される場合、「特異的灌流速度」（ＳＰＲ）という用語は、細胞密度に基づいて新鮮な培地が細胞培養物に提供され、使用済みの培地が除去される速度を指す。複数の実施形態では、ＳＰＲは一定の細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）である。複数の実施形態では、ＣＳＰＲは灌流速度／細胞密度に等しい。ある特定の実施形態では、ＳＰＲは、式１に記載される目標灌流速度または目標流速を算出するために使用される。複数の実施形態では、目標灌流速度は、バイオリアクターからポンプ排出される培地の量である。
【００２８】
ＳＰＲは、特定の宿主細胞の性質、細胞増殖速度、および生細胞密度を含む細胞密度が挙げられるがこれらに限定されない要因に基づいて、当業者により決定および／または調整され得る。例えば、典型的なＳＰＲは、約０．０１〜約１．０ｎＬ／細胞／日／の範囲内であり得る。一実施形態では、ＳＰＲは、約１．０、約０．９、約０．８、約０．７、約０．６、約０．５、約０．４、約０．３、約０．２、約０．１、約０．０９、約０．０８、約０．０７、約０．０６、約０．０５、約０．０４、約０．０３、約０．０２または約０．０１ｎＬ／細胞／日である。複数の実施形態では、ＳＰＲは約０．０５ｎＬ／細胞／日である。特定の実施形態では、ＳＰＲは約０．０４ｎＬ／細胞／日である。他の実施形態では、ＳＰＲは約０．０３ｎＬ／細胞／日である。さらに他の実施形態では、ＳＰＲは約０．０２ｎＬ／細胞／日である。一部の実施形態では、ＳＰＲは約０．１０ｎＬ／細胞／日である。複数の実施形態では、ＳＰＲは約０．０９ｎＬ／細胞／日である。複数の実施形態では、ＳＰＲは約０．０８ｎＬ／細胞／日である。ある特定の実施形態では、ＳＰＲは、約０．０１〜約０．２ｎＬ／細胞／日、約０．０１〜約０．１５ｎＬ／細胞／日、約０．０２〜約０．１０ｎＬ／細胞／日、約０．０２〜約０．０５ｎｌ／細胞／日、約０．０３〜約０．０５ｎｌ／細胞／日、または約０．０４〜約０．０５ｎｌ／細胞／日である。他の実施形態では、ＳＰＲは、約０．０５〜約０．１５ｎｌ／細胞／日、約０．０６〜約０．１５ｎｌ／細胞／日、０．０７〜約０．１５ｎｌ／細胞／日、０．０８〜約０．１５ｎｌ／細胞／日、０．０５〜約０．１４ｎｌ／細胞／日、０．０５〜約０．１３ｎｌ／細胞／日、０．０５〜約０．１２ｎｌ／細胞／日、０．０５〜約０．１１ｎｌ／細胞／日、０．０５〜約０．１０ｎｌ／細胞／日、０．０６〜約０．１２ｎｌ／細胞／日、または０．０８〜約０．１０ｎｌ／細胞／日である。
【００２９】
ＳＰＲは、ある期間にわたり一定のままであり得、または、それは、灌流の期間の経過にわたり変更（すなわち、増加または減少）され得る。例えば、ＳＰＲは、経時的に安定的な増加、経時的に段階的な様式での増加、経時的に安定的な減少、経時的に段階的な様式での減少、またはその任意の組合せをなされ得る。ある特定の実施形態では、ＳＰＲは、生細胞密度の測定後に調整される。灌流は、連続方式または断続方式で適用され得る。当業者は、細胞培養物のいくつかのパラメーターのモニタリングに基づいて、ＳＰＲの他に、灌流期間の開始および中止、ならびに灌流への任意の変更の適切なタイミングを決定することができる。
【００３０】
本明細書において使用される場合、「流加培養」という用語は、細胞培養物が新鮮な培地を添加される、すなわち、使用済みの培地が除去されずに細胞が新たな培地を「供給」（ｆｅｄ）される、細胞を培養する方法を指す。典型的には、「流加」培養プロセスはバイオリアクターで行われ、追加の成分（例えば、栄養添加物）は、培養プロセスの開始後の何らかの時点において培養物に加えられる。栄養分の制御された追加は、培養物の増殖速度に直接的に影響し、オーバーフローした代謝物の蓄積の回避を可能とする（例えば、Wlaschin, K. F. et al., "Fedbatch culture and dynamic nutrient feeding," Cell Culture Engineering, 101:43-74 (2006)およびLee, J. et al., "Control of fed-batch fermentations," Biotechnol. Adv., 17:29-48 (1999)を参照）。流加培養は、一般的に、何らかの時点において終了され、培地の細胞および／または成分は回収および適宜精製される。
【００３１】
本明細書において使用される場合、「接種」、「接種物」、および「播種する」という用語は、培養を開始させるため出発培地へ細胞を加えることを指す。
【００３２】
本明細書において使用される場合、「細胞密度」という用語は、所与の容量の培地の細胞の数を指す。細胞密度は、当該技術分野において公知の任意の技術によりモニターすることができ、該技術としては、培養物から試料を抽出し、市販の細胞計数デバイスを使用してまたはバイオリアクター自体（または培地および懸濁された細胞が通過し、次にバイオリアクターに戻されるループ）に導入された市販の好適なプローブを使用することにより、顕微鏡下で細胞を解析することが挙げられるがこれに限定されない。複数の実施形態では、バイオマス静電容量プローブにより静電容量が測定され、静電容量は細胞密度に相関する。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「超高細胞密度」および「高細胞密度」という用語は交換可能に使用され、Ｎ−１灌流バイオリアクターの少なくとも約４０×１０６細胞／ｍＬの細胞密度を指す。公知の細胞培養技術は、「第１臨界レベル」（ｆｉｒｓｔ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｌｅｖｅｌ）（すなわち、細胞培養物を灌流させ、おおよそ５００万〜４０００万細胞／ｍＬを得る前に、増加した濃度の廃棄物生成（例えば、細胞増殖阻害物質および毒性代謝物、例えば、乳酸塩、アンモニウムなど）により細胞生存能力が影響され得る、細胞周期の増殖期の間の時点）までの細胞の増殖を伴い得る。対照的に、本発明の方法にしたがって増殖する細胞は、高細胞密度に到達することができる。一部の実施形態では、本発明の細胞は、最低で約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、または１３０×１０６細胞／ｍＬより高い目標細胞密度まで増殖する。特定の実施形態では、本発明の細胞は、約６０×１０６細胞／ｍＬの目標細胞密度まで増殖する。他の実施形態では、本発明の細胞は、約４０×１０６細胞／ｍＬの目標細胞密度まで増殖する。高密度播種は、約５×１０６細胞／ｍｌ、約１０×１０６細胞／ｍｌ、約１５×１０６細胞／ｍｌ、約２０×１０６細胞／ｍｌ、または約２５×１０６細胞／ｍｌにおいて培養物を接種することを指す。ある特定の実施形態では、高密度播種は、約１０×１０６細胞／ｍｌにおいて培養物を接種することを指す。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「生細胞密度」または「ＶＣＤ」という用語は、所与の実験条件セット下での所与の容量の培地に存在する生細胞の数を指す。
【００３５】
本明細書において使用される場合、「細胞生存能力」という用語は、所与の条件セットまたは実験バリエーション下で生存する培養中の細胞の能力を指す。本明細書において使用される該用語はまた、特定の時点における培養物中の細胞（例えば、生細胞および死細胞）の総数に対するその時点における生細胞の割合を指す。
【００３６】
本明細書において使用される場合、細胞培養物の「増殖期」は、任意の時点における生細胞密度が任意の先行する時点におけるよりも高い時期を指す。
【００３７】
本明細書において使用される場合、細胞培養物の「生成期」は、細胞が顕著な量のタンパク質を生成し、該タンパク質が将来の加工のために蓄積される時期を指す。
【００３８】
本明細書において使用される場合、「細胞総数」（ｃｅｌｌ  ｉｎｔｅｇｒａｌ）という用語は、細胞増殖プロファイルの過程の間の全体的な生細胞数を指す。
【００３９】
本明細書において使用される場合、「力価」という用語は、細胞培養物により生成されるタンパク質の総量を、所与の量の培地容量で割ったものを指す。本質的に、「力価」という用語は濃度を指し、典型的には培地１リットル当たりのポリペプチドのミリグラム単位として表現される。本発明の方法は、当該技術分野において公知の他の細胞培養方法から生成されるポリペプチド生成物力価と比較してポリペプチド生成物力価を実質的に増加させる効果を有する。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「培地」、「細胞培養培地」および「培養培地」という用語は、その文法的変形を含めて、交換可能に使用され、細胞（例えば、動物または哺乳動物細胞）が培養中に増殖する栄養分溶解物を指す。細胞培養培地は、細胞のための生理化学、栄養、およびホルモン環境であり、典型的には以下からの少なくとも１つまたは複数の成分を含む：エネルギー供給源（例えば、グルコースなどの炭水化物の形態）；２０の基本的アミノ酸およびシステインを含む必須アミノ酸；典型的には低い濃度で必要とされるビタミンおよび／または他の有機化合物；脂質または遊離脂肪酸（例えば、リノレン酸）；ならびに微量元素（例えば、典型的には非常に低い濃度、通常マイクロモル濃度範囲で必要とされる無機化合物または天然に存在する元素）。培地は、固体、ゼラチン状、液体、気体または相と材料との混合物であってもよい。
【００４１】
本明細書において使用される場合、「細胞」という用語は、動物細胞、哺乳動物細胞、培養細胞、宿主細胞、組換え細胞、および組換え宿主細胞を指す。そのような細胞は、一般に、適切な栄養分および／または成長因子を含有する培地に置かれた場合に増殖および生存することができる哺乳動物組織から得られるまたは該組織に由来する細胞株である。本発明の方法において利用される細胞は、一般に、多量の特定のタンパク質を培養培地に発現および分泌することができる、または発現および分泌するように分子的に設計することができる、動物または哺乳動物細胞である。一実施形態では、細胞により生成されるタンパク質は、細胞にとって内因性または同種のものであり得る。あるいは、タンパク質は、細胞にとって異種、すなわち外来性であり得る。
【００４２】
本発明の方法において利用される細胞は、当該技術分野において公知または市販のものを含む、任意の種々の細胞培養培地で増殖および維持され得る。当業者は、細胞増殖、細胞生存能力、および／または特定の培養宿主細胞でのタンパク質生成を最大化するために選択される１つまたは複数の公知の細胞培養培地の使用を選択することができる。例示的な細胞培養培地としては、目的のタンパク質を発現することができる細胞を培養するために好適な任意の培地が挙げられる。一部の実施形態では、培地は化学的に明確な培地である。
【００４３】
さらに、細胞培養培地は、適宜、当業者に公知である、および実施されるように、必要または所望に応じて、適切な濃度または量の１つまたは複数の追加の成分を含むように添加がなされ得る。例示的な添加物としては、化学的遺伝子選択剤、ホルモンおよび他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子、血清、ソマトトロピン、下垂体抽出物、アプロチニン）；塩（例えば、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、および緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ（４−［２−ヒドロキシエチル（Ｈｙｄｒｏｘｅｔｈｙｌ）］−１−ピペラジン−エタンスルホン酸））；ヌクレオシドおよび塩基（例えば、アデノシン、チミジン、ヒポキサンチン）；タンパク質および加水分解生成物；抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）；細胞保護剤（例えば、プルロニックポリオール（ＰＬＵＲＯＮＩＣ．ＲＴＭ．  Ｆ６８））ならびに細胞外マトリックスタンパク質（例えば、フィブロネクチン）が挙げられるがこれらに限定されない。特定の細胞培養物の増殖および維持をサポートする添加物は、例えば、Barnes et al. (Cell, 22:649 (1980))；Mammalian Cell Culture, Mather, J. P., ed., Plenum Press, NY (1984)；および米国特許第５，７２１，１２１号明細書などに記載されるように、当業者により容易に決定され得る。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「バイオリアクター」という用語は、細胞培養物を増殖させるために使用される任意の装置、閉じた容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）または容器（ｖｅｓｓｅｌ）（例えば、発酵室）を指す。バイオリアクターは、細胞培養プロセスの間の様々なパラメーターの制御を可能とし、該パラメーターとしては、循環ループ流、ｐＨ、温度、過圧力および／または培地灌流速度が挙げられるがこれらに限定されない。バイオリアクターとしては、市販のバイオリアクター、古典的な発酵槽および細胞培養灌流システムの他に、使い捨てのバイオリアクターが挙げられる。
【００４５】
バイオリアクターは、本発明の方法にしたがって望ましいスケールで細胞を培養するために有用な任意のサイズであり得る。例えば、本発明の方法において用いられるバイオリアクターは、少なくとも約０．１、少なくとも約０．５、少なくとも約１、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、少なくとも約５０、少なくとも約５５、少なくとも約６０、少なくとも約６５、少なくとも約７０、少なくとも約７５、少なくとも約８０、８５、少なくとも約９０、少なくとも約９５、少なくとも約１００、少なくとも約１０５、少なくとも約１１０、少なくとも約１１５、少なくとも約１２０、少なくとも約１２５、少なくとも約１３０、少なくとも約１３５、少なくとも約１４０、少なくとも約１４５、少なくとも約１５０、少なくとも約１５５、少なくとも約１６０、少なくとも約１６５、少なくとも約１７０、少なくとも約１７５、少なくとも約１８０、少なくとも約１８５、少なくとも約１９０、少なくとも約１９５、少なくとも約２００、少なくとも約２０５、少なくとも約２１０、少なくとも約２１５、少なくとも約２２０、少なくとも約２２５、少なくとも約２３０、少なくとも約２３５、少なくとも約２４０、少なくとも約２４５、少なくとも約２５０、少なくとも約２５５、少なくとも約２６０、少なくとも約２６５、少なくとも約２７０、少なくとも約２７５、少なくとも約２８０、少なくとも約２８５、少なくとも約２９０、少なくとも約２９５、少なくとも約３００、少なくとも約３０５、少なくとも約３１０、少なくとも約３１５、少なくとも約３２０、少なくとも約３２５、少なくとも約３３０、少なくとも約３４０、少なくとも約３５０、少なくとも約３６０、少なくとも約３７０、少なくとも約３８０、少なくとも約３９０、少なくとも約４００、少なくとも約４１０、少なくとも約４２０、少なくとも約４３０、少なくとも約４４０、少なくとも約４５０、少なくとも約４６０、少なくとも約４７０、少なくとも約４８０、少なくとも約４９０、少なくとも約５００、少なくとも約５５０、少なくとも約１，０００、少なくとも約１，５００、少なくとも約２，０００、少なくとも約２，５００、少なくとも約３，０００、少なくとも約３，５００、少なくとも約４，０００、少なくとも約４，５００、少なくとも約５，０００、少なくとも約５，５００、少なくとも約６，０００、少なくとも約６，５００、少なくとも約７，０００、少なくとも約７，５００、少なくとも約８，０００、少なくとも約８，５００、少なくとも約９，０００、少なくとも約９，５００、少なくとも約１０，０００、少なくとも約１０，５００、少なくとも約１１，０００、少なくとも約１１，５００、少なくとも約１２，００００、少なくとも約１３，０００、少なくとも約１４，０００、少なくとも約１５，０００リットルまたはより大きい、または任意の中間の容量であってもよい。
【００４６】
本発明の方法は、１つまたは複数のバイオリアクターを用いることができる。例えば、一実施形態では、灌流細胞培養および流加細胞培養は、同じバイオリアクターで行われ得る。別の実施形態では、灌流細胞培養は、別個のバイオリアクターで行われ得る。別の実施形態では、灌流細胞培養物からの細胞は、１つまたは複数の流加バイオリアクターに移すことができる。
【００４７】
好適なバイオリアクターは、本発明の培養条件下で細胞培養物を保持するために好適であり、かつ細胞増殖および生存能力を助ける任意の材料から構成（すなわち、構築）され得る。例えば、本発明の方法において用いられるバイオリアクターは、ガラス、プラスチックまたは金属から作られたものであり得る。しかしながら、バイオリアクターを構成する材料は、ポリペプチド生成物の発現または安定性を阻害するべきではない。好適なバイオリアクターは当該技術分野において公知であり、市販されている。複数の実施形態では、バイオリアクターはＮ−１シードバイオリアクター（Ｎ−１バイオリアクター）である。
【００４８】
本発明の方法において使用される灌流バイオリアクターは、使い捨ての灌流バイオリアクターまたは任意の他の伝統的な灌流バイオリアクターであり得る。バイオリアクターは、適宜、任意の内部または外部の細胞保持デバイスを備えていてもよく、該デバイスとしては、スピンフィルター、タンジェンシャルフロー膜フィルター、ダイナミック膜、超音波セパレーター、重力セトラー、連続遠心分離機または音響細胞保持デバイス、精密濾過デバイス、限外濾過デバイスなどが挙げられるがこれらに限定されない。
【００４９】
複数の実施形態では、本発明の灌流バイオリアクターは、灌流プロセスの間高細胞密度および高細胞生存能力を得ることができるバイオリアクターである。ある特定の実施形態では、灌流バイオリアクターはＮ−１バイオリアクター（またはＮ−１シードバイオリアクター）である。
【００５０】
「バイオマス静電容量プローブ」は、他の能力の中でも特に、生細胞密度を測定することができるプローブを指す。バイオマス静電容量プローブは、培養物中の総生細胞を測定するために静電容量を使用する。生細胞は、交流電場においてコンデンサーとして作用する。バイオマス静電容量プローブは、これらの細胞からの電荷を測定し、それを報告することができる。
【００５１】
本発明の方法により包含される細胞培養物は、細胞種および培養条件のために適切な任意の温度において増殖し得る。一実施形態では、タンパク質生成を増進させるために約３０℃〜約３８℃の温度を使用することが望ましい。別の実施形態では、温度は、少なくとも約２５℃、少なくとも約２６℃、少なくとも約２７℃、少なくとも約２８℃、少なくとも約２９℃、少なくとも約３０℃、少なくとも約３１℃、少なくとも約３２℃、少なくとも約３３℃、少なくとも約３４℃、少なくとも約３５℃、少なくとも約３６℃、少なくとも約３７℃、少なくとも約３８℃、少なくとも約３９℃、少なくとも約４０℃、または少なくとも約４１℃である。培養の間の異なる時点において異なる温度を使用することもまた望ましいことがある。
【００５２】
灌流プロセス
先行する使用とは異なり、本明細書では、培地使用を低減させながら高細胞密度を達成するために、一定の細胞特異的灌流速度の調整が増殖期の間使用される。複数の実施形態では、本発明は、灌流培養プロセスの最適化を対象とする。特定の実施形態では、灌流プロセスは、Ｎ−１バイオリアクターで行われる。Ｎ−１バイオリアクターにおいて、細胞を製造バイオリアクターに移す前に灌流バイオリアクター中で強度の増殖期があり、Ｎ−１バイオリアクターで増殖する細胞は、高細胞密度まで増殖することができる。
【００５３】
ある特定の実施形態では、灌流バイオリアクターは、約１Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、２００Ｌ、３００Ｌ、または５００Ｌのバイオリアクターである。特定の実施形態では、灌流バイオリアクターは２００Ｌのバイオリアクターである。ある特定の実施形態では、灌流バイオリアクターは５Ｌのバイオリアクターである。
【００５４】
ある特定の実施形態では、本発明は、バイオリアクターに細胞を保持しながら培地を交換するために中空繊維フィルターと共に交互タンジェンシャルフロー（またはＡＴＦ）を使用する。特定の実施形態では、ＡＴＦシステムはＮ−１バイオリアクターに取り付けられている。ＡＴＦシステムにおいて、空気および真空系と連結されたダイアフラムポンプがバイオリアクター内容物（細胞および培地）を中空繊維フィルター中に引き込み、次に培養物をバイオリアクターに押し戻すと同時に浸透物（無細胞の培地）は中空繊維フィルターを通過する。中空繊維を通すこの交互タンジェンシャルフローの機構は、ダイアフラムポンプおよび外部の制御装置により駆動される。浸透物を連続的に引くために別個のポンプがＡＴＦデバイスに取り付けられており、これは灌流速度に等しい。別のポンプが、新鮮な培地を供給してバイオリアクターを目標容量に維持するためにバイオリアクターの入口に取り付けられている。
【００５５】
ある特定の実施形態では、灌流プロセスは、培養物の生細胞密度の測定により最適化される。特定の実施形態では、目標細胞特異的灌流速度または目標灌流もしくは浸透物流速を満たすように灌流速度を調整するために生細胞密度の測定が使用される。
【００５６】
複数の実施形態では、生細胞密度は、オンライン静電容量プローブとも呼ばれるバイオマス静電容量プローブを使用して測定される。バイオリアクターのオンラインでの細胞密度の予測の信頼性および正確性を有するバイオマス静電容量プローブを利用することにより、灌流速度は、目標灌流速度を一定して満たすように動的に調整され得、それにより、一定レベルの栄養分を提供しながら培地使用を低減することができる。ある特定の実施形態では、バイオマス静電容量プローブはＨａｍｉｌｔｏｎ  Ｉｎｃｙｔｅバイオマス静電容量プローブである。特定の実施形態では、バイオマス静電容量プローブはＩｎｃｙｔｅ  ＬＣである。他の実施形態では、バイオマス静電容量プローブはＩｎｃｙｔｅ  ＨＣである。Ｉｎｃｙｔｅはオンラインで誘電率を測定し、リアクターの生細胞に関する情報のみを提供する。Ｉｎｃｙｔｅにより提供される情報は、生細胞密度に相関させるために使用することができる。
【００５７】
ある特定の実施形態では、灌流速度は、生細胞密度の測定に基づいて動的に調整される。ある特定の実施形態では、目標灌流速度は、式１に見られるように、生細胞密度および一定の細胞特異的灌流速度を使用して算出される。複数の実施形態では、一定の細胞特異的灌流速度は、約０．０１〜約０．２ｎＬ／細胞／日、約０．０１〜約０．１５ｎＬ／細胞／日、約０．０２〜約０．１０ｎＬ／細胞／日、約０．０２〜約０．０５ｎｌ／細胞／日、または約０．０３〜約０．０５ｎｌ／細胞／日である。特定の実施形態では、一定の細胞特異的灌流速度は、約０．０１ｎＬ／細胞／日、約０．０２ｎＬ／細胞／日、約０．０３ｎＬ／細胞／日、約０．０４ｎＬ／細胞／日、約０．０５ｎｌ／細胞／日、約０．０６ｎＬ／細胞／日、約０．０７ｎＬ／細胞／日、約０．０８ｎＬ／細胞／日、約０．０９ｎＬ／細胞／日、約０．１０ｎＬ／細胞／日、約０．１１ｎＬ／細胞／日、約０．１２ｎＬ／細胞／日、約０．１３ｎＬ／細胞／日、約０．１４ｎＬ／細胞／日、または約０．１５ｎＬ／細胞／日である。ある特定の実施形態では、一定の細胞特異的灌流速度は約０．０４ｎＬ／細胞／日である。他の実施形態では、一定の細胞特異的灌流速度は約０．０３ｎＬ／細胞／日である。さらに他の実施形態では、一定の細胞特異的灌流速度は約０．０２ｎＬ／細胞／日である。特定の実施形態では、目標灌流速度は、バイオリアクター制御装置を使用して算出される。
【００５８】
ある特定の実施形態では、ＶＣＤの動的測定および目標灌流速度の使用の結果として、灌流リアクターは、１日当たり５容器容量未満の灌流培地を使用する。特定の実施形態では、灌流リアクターは、１日当たり約５未満、約４．５未満、約４未満、約３．５未満、約３．０未満、約２．５未満、約２未満、約１．５未満または１未満の容器容量の灌流培地を使用する。ある特定の実施形態では、ＶＣＤの動的測定および目標灌流速度の使用の結果として、灌流リアクターは、ＶＣＤを動的に測定しないプロセスにより使用される灌流培地の総量の約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％のみを使用する。
【００５９】
複数の実施形態では、バイオマス静電容量プローブは、バイオリアクターの細胞密度が目標細胞密度に到達し、製造バイオリアクターに移される臨界的な時点を決定するために使用される。一部の実施形態では、目標細胞密度は高細胞密度である。ある特定の実施形態では、目標細胞密度は、少なくとも約４０×１０６細胞／ｍｌ、約５０×１０６細胞／ｍｌ、約６０×１０６細胞／ｍｌ、約７０×１０６細胞／ｍｌ、約８０×１０６細胞／ｍｌ、約９０×１０６細胞／ｍｌ、または約１００×１０６細胞／ｍｌである。特定の実施形態では、目標細胞密度は少なくとも約６０×１０６細胞／ｍｌである。ある特定の実施形態では、目標細胞密度は約６０×１０６細胞／ｍｌより大きい。
【００６０】
複数の実施形態では、灌流バイオリアクターのｐＨは、約６．０〜約８．０、約６．５〜約７．５、約６．６〜約７．５、約６．７〜約７．５、約６．８〜約７．５、または約６．８〜約７．４に維持される。ある特定の実施形態では、灌流バイオリアクターのｐＨは、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．２、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９または約８．０に維持される。
【００６１】
特定の実施形態では、細胞は、目標細胞密度に到達したら、灌流バイオリアクターから製造バイオリアクターに移される。複数の実施形態では、細胞は、約２００Ｌ、５００Ｌ、１０００Ｌ、１５００Ｌ、２０００Ｌ、３０００Ｌまたはより大きい製造バイオリアクターである製造バイオリアクターに移される。ある特定の実施形態では、製造バイオリアクターは、より高い細胞密度において灌流培養物を接種される。複数の実施形態では、製造バイオリアクターは、約１×１０６細胞／ｍｌ、約２×１０６細胞／ｍｌ、約３×１０６細胞／ｍｌ、約４×１０６細胞／ｍｌ、約５×１０６細胞／ｍｌ、約６×１０６細胞／ｍｌ、約７×１０６細胞／ｍｌ、約８×１０６細胞／ｍｌ、約９×１０６細胞／ｍｌ、約１０×１０６細胞／ｍｌ、約１１×１０６細胞／ｍｌ、約１２×１０６細胞／ｍｌ、約１３×１０６細胞／ｍｌ、約１４×１０６細胞／ｍｌ、約１５×１０６細胞／ｍｌ、約２０×１０６細胞／ｍｌ、約３０×１０６細胞／ｍｌ、約４０×１０６細胞／ｍｌ、約５０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度、またはより高い細胞密度において接種される。特定の実施形態では、製造バイオリアクターは、約１０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度において接種される。特定の実施形態では、製造バイオリアクターは、約５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度において接種される。他の実施形態では、製造バイオリアクターは、約６×１０６細胞／ｍｌの細胞密度において接種される。
【００６２】
複数の実施形態では、バイオリアクターの温度は、約３４℃、約３４．５℃、約３５℃、約３５．５℃、約３６℃、約３６．５℃、約３７℃、約３７．５℃、約３８℃、約３８．５℃、または約３９℃に維持される。
【００６３】
一部の実施形態では、総灌流液量が測定される。複数の実施形態では、１日毎の灌流速度（バイオリアクター容量）が測定される。ある特定の実施形態では、静電容量が測定される。
【００６４】
ポリペプチド
宿主細胞で発現可能な任意のポリペプチドが本発明にしたがって製造され得る。ポリペプチドは、宿主細胞にとって内因性の遺伝子から、または遺伝子操作を通じて宿主細胞に導入された遺伝子から発現され得る。ポリペプチドは、天然に存在するものであってもよく、または代わりに、人類により設計もしくは選択された配列を有してもよい。設計されたポリペプチドは、個々に天然に存在する他のポリペプチドセグメントから組み立てられたものであってもよく、または天然に存在しない１つもしくは複数のセグメントを含んでもよい。
【００６５】
本発明にしたがって発現されることが望まれ得るポリペプチドは、多くの場合、目的の生物学的または化学的活性に基づいて選択される。例えば、本発明は、任意の薬学的または商業的に関連する酵素、受容体、抗体、ホルモン、調節因子、抗原、結合剤などを発現させるために用いられてもよい。
【００６６】
抗体
医薬的または他の商用の薬剤として現在使用または研究されている多数の抗体を考慮すれば、抗体の製造は本発明にしたがって目的とされる。抗体は、特定の抗原に特異的に結合する能力を有するタンパク質である。宿主細胞で発現され得る任意の抗体が本発明にしたがって使用されてもよい。一実施形態では、発現される抗体はモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。
【００６７】
別の実施形態では、抗体はキメラ抗体である。キメラ抗体は、１以上の生物に由来するアミノ酸断片を含有する。キメラ抗体分子は、例えば、マウス、ラット、または他の種の抗体からの抗原結合ドメインをヒト定常領域と共に含むことができる。キメラ抗体を作製するための様々なアプローチが記されてきた。例えば、Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 81, 6851 (1985)；Takeda et al., Nature 314, 452 (1985)、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、欧州特許出願公開第ＥＰ１７１４９６号明細書；欧州特許出願公開第０１７３４９４号明細書、英国特許第ＧＢ２１７７０９６Ｂ号明細書を参照されたい。
【００６８】
別の実施形態では、抗体は、例えば、リボソームディスプレイまたはファージディスプレイライブラリーの使用（例えば、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，２９１，１５９号明細書およびＫａｗａｓａｋｉ、米国特許第５，６５８，７５４号明細書を参照）、または、天然抗体遺伝子が不活性化されており、ヒト抗体遺伝子により機能的に置換されていると共に、天然の免疫系の他の成分が未変化で残されているゼノグラフィック（ｘｅｎｏｇｒａｐｈｉｃ）種の使用（例えば、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第６，６５７，１０３号明細書を参照）を通すことに由来するヒト抗体である。
【００６９】
５つのヒト免疫グロブリンクラスは、それらの重鎖組成に基づいて定義されており、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤと命名されている。ＩｇＧクラスおよびＩｇＡクラスの抗体は、サブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１およびＩｇＡ２にさらに分けられる。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ抗体における重鎖は、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３と称される３つの定常領域ドメインを有し、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体における重鎖は、４つの定常領域ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４を有する。
【００７０】
別の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は、アミノ酸残基の大部分がヒト抗体に由来し、したがって被験者に送達された場合の任意の免疫反応の可能性が最小化されたキメラ抗体である。ヒト化抗体において、相補性決定領域のアミノ酸残基は、所望の抗原特異性または親和性を付与する非ヒト種からの残基により、少なくとも部分的に置換されている。そのような変性免疫グロブリン分子は、当該技術分野において公知のいくつもの技術（例えば、Teng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 80, 7308-7312 (1983)；Kozbor et al., Immunology Today, 4, 7279 (1983)；Olsson et al., Meth. Enzymol., 92, 3-16 (1982)）のいずれかにより作製することができ、ＰＣＴ国際公開第ＷＯ９２／０６１９３号パンフレットまたはＥＰ０２３９４００の教示にしたがって作製される（これらの全ては参照することにより本明細書に組み込まれる）。ヒト化抗体はまた、商用で製造されたものであり得る。さらなる参考文献については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)（これらの全ては参照することにより本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００７１】
さらに別の実施形態では、上記のモノクローナル、ポリクローナル、キメラ、またはヒト化抗体は、天然の任意の種における任意の抗体において天然に存在しないアミノ酸残基を含有してもよい。これらの外来残基は、例えば、新規のまたは改変された特異性、親和性またはエフェクター機能をモノクローナル、キメラまたはヒト化抗体に付与するために利用され得る。別の実施形態では、上記の抗体は、全身性の薬物療法用の薬物、例えば、毒素、低分子量細胞傷害性薬物、生物学的応答修飾剤、および放射性核種に共役されていてもよい（例えば、Kunz et al., Calicheamicin derivative-carrier conjugates、ＵＳ２００４００８２７６４  Ａ１を参照）。
【００７２】
細胞
細胞培養、およびポリペプチドの発現が可能な任意の哺乳動物細胞または細胞種を本発明にしたがって利用することができる。本発明にしたがって使用され得る哺乳動物細胞の非限定的な例としては、ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄腫株（ＮＳＯ／１、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞腫（ＰＥＲ．Ｃ６（ＣｒｕＣｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ））；ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎臓株（２９３細胞または懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞±ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳がん（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５  １）；ＴＲＩ細胞（Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒトヘパトーマ株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。特定の実施形態では、本発明は、ＣＨＯ細胞株の培養ならびにＣＨＯ細胞株からのポリペプチドおよびタンパク質の発現において使用される。
【００７３】
さらに、ポリペプチドまたはタンパク質を発現する任意の種々の市販および非市販のハイブリドーマ細胞株が本発明にしたがって利用されてもよい。当業者は、ハイブリドーマ細胞株は異なる栄養的必要性を有する可能性があることならびに／または最適な増殖およびポリペプチドもしくはタンパク質発現のために異なる培養条件を必要とする可能性があること、ならびに必要に応じて条件を改変できることを理解されよう。
【００７４】
上記のように、多くの事例において、細胞は、高レベルのタンパク質またはポリペプチドを生成するように選択または設計される。多くの場合、細胞は、例えば、目的のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする遺伝子の導入によりおよび／または目的のポリペプチドをコードする遺伝子（内因性であるのかまたは導入されたものであるのかによらない）の発現を調節する制御因子の導入により、高レベルのタンパク質を生成するように遺伝子操作される。
【００７５】
ある特定のポリペプチドは、細胞増殖、細胞生存能力または細胞の何らかの他の特徴に対して有害な効果を有することがあり、これは究極的には、何らかの方法で目的のポリペプチドまたはタンパク質の製造を制限する。特定のポリペプチドを発現するように設計された１つの特定の種類の細胞集団の中でさえ、細胞集団内にばらつきが存在し、それにより、ある特定の個々の細胞はより良好に増殖し、かつ／またはより多くの目的のポリペプチドを生成する。本発明のある特定の実施形態では、細胞株は、細胞を培養するために選択された特定の条件下での強力な増殖のために実施者により経験的に選択される。特定の実施形態では、特定のポリペプチドを発現するように設計された個々の細胞は、細胞増殖、最終細胞密度、細胞生存率、発現されるポリペプチドの力価またはこれらの任意の組合せまたは実施者により重要であるとみなされる任意の他の条件に基づいてラージスケールの製造のために選択される。
【００７６】
培地および培養条件
一部の実施形態では、哺乳動物宿主細胞は、目的のポリペプチド、本明細書において開示される任意のポリペプチドの製造を促進する条件下で培養される。基礎細胞培養培地配合物は当該技術分野において周知である。これらの基礎培養培地配合物に、当業者は、培養される宿主細胞の必要性に応じて、アミノ酸、塩、糖、ビタミン、ホルモン、成長因子、緩衝液、抗生物質、脂質、微量元素などの成分を加える。培養培地は、血清および／またはタンパク質を含有してもよく、または含有しなくてもよい。血清フリーおよび／または合成培養培地を含む様々な組織培養培地が細胞培養のために市販されている。組織培養培地は、本発明の目的のために、インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）細胞培養において動物細胞、および一部の実施形態では哺乳動物細胞の増殖のために好適な培地として組成が明確にされる。典型的には、組織培養培地は、緩衝液、塩、エネルギー供給源、アミノ酸、ビタミンおよび微量の必須元素を含有する。培養において、適切な真核細胞の増殖をサポートすることができる任意の培地を使用することができ、本発明は、培養中の真核細胞、特に哺乳動物細胞に広く応用可能であり、培地の選択は本発明にとってそれほど決定的なものではない。本発明において使用するために好適な組織培養培地は、例えばＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．）から入手可能である。例えば、以下の培地のいずれか１つまたは組合せを特に使用することができ、これらは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎまたはＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの他に、他の供給業者から入手することができる：ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＲＰＭＩ−１６４１培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地イーグル、Ｆ−１２Ｋ培地、ハムＦ１２培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、マッコイ５Ａ培地、ライボビッツＬ−１５培地、および血清フリー培地、例えばＥＸ−ＣＥＬＬ．ＴＭ．３００  Ｓｅｒｉｅｓ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅｎｅｘａ、Ｋａｎｓ．、ＵＳＡより入手可能）。血清フリーかつ／またはペプトンフリーの合成培地が使用される場合、培地は通常、アミノ酸および微量元素について高度に濃縮される。例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，１２２，４６９号明細書およびＫｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，６３３，１６２号明細書を参照されたい。
【００７７】
ある特定の実施形態では、細胞は、血清フリー、タンパク質フリー、成長因子フリー、かつ／またはペプトンフリーの培地で増殖させることができる。培地に適用される「血清フリー」という用語は、ウシ胎児血清などの血清を含有しない任意の哺乳動物細胞培養培地を含む。培地に適用される「インスリンフリー」という用語は、外因性インスリンが加えられていない任意の培地を含む。外因性は、この文脈において、細胞の培養自体により生成されたもの以外を意味する。培地に適用される「ＩＧＦ−１フリー」という用語は、外因性インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）およびアナログ（例えば、Ｓｏｕｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ、ＴｈｅｂａｒｔｏｎのＧｒｏＰｅｐＬｔｄ．から入手可能なＬｏｎｇＲ３、［Ａｌａ３１］、または［Ｌｅｕ２４］［Ａｌａ３１］ＩＧＦ−１アナログなど）のいずれも加えられていない任意の培地を含む。培地に適用される「成長因子フリー」という用語は、外因性成長因子（例えば、インスリン、ＩＧＦ−１）が加えられていない任意の培地を含む。培地に適用される「タンパク質フリー」という用語は、外因的に加えられたタンパク質、例えば、トランスフェリンおよびタンパク質成長因子ＩＧＦ−１およびインスリンなどを含まない培地を含む。タンパク質フリーの培地は、ペプトンを有してもよく、または有しなくてもよい。培地に適用される「ペプトンフリー」という用語は、外因性タンパク質加水分解生成物、例えば、動物および／または植物タンパク質加水分解生成物などが加えられていない任意の培地を含む。培地からのペプトンの除去は、ロット間のばらつきを低減させ、また濾過などの処理を増進させるという利点を有する。化学的に明確な培地は、あらゆる成分が明確にされており、かつ純粋な供給源、ある特定の実施形態では非動物供給源から得られた培地である。ある特定の実施形態では、培地は、化学的に明確でありかつ完全に血清およびタンパク質フリーである。
【００７８】
一部の実施形態では、特定の培養される宿主細胞において細胞増殖、細胞生存能力、および／または組換えポリペプチドの製造を最大化するように開発された多くの個別化された培地配合物の１つが利用される。本明細書において記載される方法では、市販の細胞培養培地または特定の細胞株の使用のために個々に配合された細胞培養培地を組み合わせて使用してもよい。例えば、ポリペプチドの製造の増加をサポートし得る濃縮培地は、２つまたはそれより多くの商用の培地などの混合物、例えば、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、またはさらには１：１５までまたはより高い比などで合わせたＤＭＥＭおよびハムＦ１  ２培地などを含んでもよい。代替的または追加的に、培地は、アミノ酸またはペプトンなどの栄養分の添加により濃縮されてもよく、かつ／または、培地（または以下に記載される例外を除くその成分のほとんど）は、その通常の推奨される濃度より高い濃度、例えば、２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、またはさらにより高い濃度において使用されてもよい。本明細書において使用される場合、「１Ｘ」は標準的な濃度を意味し、「２Ｘ」は標準的な濃度の２倍を意味する、などである。これらの任意の実施形態において、塩などの容量オスモル濃度に実質的に影響し得る培地成分は、培地の容量オスモル濃度が許容範囲外となるようには濃度を増加させることができない。したがって、培地は、例えば、１Ｘでのみ存在することができる塩を除いて、全ての成分に関して８Ｘであってもよい。濃縮培地は、血清フリーかつ／またはタンパク質フリーであってもよい。さらに、培地は、例えば、ビタミン、アミノ酸、および代謝前駆体などの枯渇を来す可能性がある培地成分を補充するために、培養物が維持される時間の間、定期的に添加がなされてもよい。当該技術分野において公知のように、異なる培地および温度は、異なる細胞株に対していくぶん異なる効果を有することがあり、同じ培地および温度が全ての細胞株にとって好適でないことがある。
【００７９】
哺乳動物細胞のための好適な培養条件は当該技術分野において公知である。例えば、Animal cell culture: A Practical Approach, D. Rickwood, ed., Oxford university press, New York (1992)を参照されたい。哺乳動物細胞は、懸濁状態でまたは固体基材に結合させて培養されてもよい。さらには、哺乳動物細胞は、例えば、流動床バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター、ローラーボトル、シェークフラスコ、または撹拌槽バイオリアクターで、マイクロキャリアありまたはなしで培養されてもよく、バッチ、フェドバッチ、連続、半連続、または灌流モードで作動されてもよい。
【００８０】
培養条件のモニタリング
本発明のある特定の実施形態では、実施者は、増殖する細胞培養物の特定の条件を定期的にモニターすることが有益または必要であると見出すことがある。細胞培養条件のモニタリングは、細胞培養物が最適以下のレベルにおいて組換えポリペプチドもしくはタンパク質を生成しているかどうかまたは培養物が最適以下の生成期に入ろうとしているかどうかを実施者が決定することを可能とする。ある特定の細胞培養条件をモニターするために、分析用の培養物の小アリコートを取り出すことが必要である。当業者は、そのような取出しは細胞培養に汚染を導入する可能性があり、そのような汚染のリスクを最小化するために適切な注意がなされることを理解するであろう。
【００８１】
非限定的な例として、温度、ｐＨ、細胞密度、細胞生存能力、総生細胞密度、乳酸塩レベル、アンモニウムレベル、容量オスモル濃度、または発現されたポリペプチドもしくはタンパク質の力価をモニターすることが有益または必要なことがある。当業者がこれらの条件を測定することを可能とする多数の技術が当該技術分野において周知である。例えば、細胞密度は、血球計、コールターカウンター、または細胞密度検査（ＣＥＤＥＸ）を使用して測定され得る。生細胞密度は、トリパンブルーを用いて培養物試料を染色することにより決定されてもよい。死細胞のみがトリパンブルーを取り込むので、生細胞密度は、細胞の総数を数え、染料を取り込んだ細胞の数を細胞の総数で割り、逆数を取ることにより決定され得る。細胞生存能力はまた、バイオマス静電容量プローブを使用して測定され得る。ＨＰＬＣ、ＵＰＬＣ、ＮＯＶＡ  ＦｌｅｘまたはＣｅｄｅｘ  Ｂｉｏは、乳酸塩、アンモニウムまたは発現されたポリペプチドもしくはタンパク質のレベルを決定するために使用され得る。あるいは、発現されたポリペプチドまたはタンパク質のレベルは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシー染色、ウエスタンブロッティング、ブラッドフォードアッセイ、ローリーアッセイ、ビウレットアッセイ、およびＵＶ吸光度などの標準的な分子生物学技術により決定され得る。リン酸化およびグリコシル化を含む、発現されたポリペプチドまたはタンパク質の翻訳後修飾をモニターすることもまた有益または必要なことがある。
【実施例】
【００８２】
以下の実施例は、以下の目的でＮ−１バイオリアクターにおいて適用したバイオマス静電容量プローブの使用を記載する：
１．オンラインでＶＣＤ（生細胞密度）を測定する。ＶＣＤおよび一定の細胞特異的灌流速度（０．０２〜０．１０ｎＬ／細胞／日）を利用して、バイオリアクターからポンプ排出される培地の量を決定した（これを目標灌流または浸透物流速と称する）。この算出はバイオリアクター制御装置により行う。別個のフローセンサーにより流速を測定し、灌流ポンプ流速を増加または減少させて目標流速を達成した。
２．より多くのデータ点を用いてオンラインでＶＣＤを測定することにより製造容器に接種すべき臨界的な時点をより高い程度の正確性をもって推定する。この臨界的な時点において、充分な細胞が、Ｎ−１灌流バイオリアクターから外に移して、より高い細胞密度（＞５Ｅ６細胞／ｍｌ）で製造バイオリアクター容器に接種するために準備済みとなった。
【００８３】
以下の実験は、５Ｌおよび２００ＬのバイオリアクタースケールにおいてＮ−１シードバイオリアクターに適用されたこの方法を記載する。
【００８４】
細胞株および細胞培養培地
ＢＭＳ所有の細胞培養培地（Ｂ６）および異なるＩｇＧ抗体を発現する５種の所有の組換えＣＨＯ細胞株をこれらの実験において使用した。細胞培養培地は化学的に明確かつ完全に血清およびタンパク質フリーである。組換えＩｇＧ産生ＣＨＯ細胞を２５０ｍＬ、１Ｌおよび３Ｌのシェークフラスコの懸濁培養で維持した。ＣＯ２シェーカーインキュベーター（Ｋｕｈｎｅｒ）を３６．５℃、１５０ｒｐｍ、５％のＣＯ２濃度でのインキュベーションのために使用した。
【００８５】
ベンチスケールバイオリアクターおよび培養条件
Ｎ−１シードおよび流加製造の両方のためのベンチスケールリアクター培養を５Ｌの撹拌槽リアクター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で実行した。５Ｌリアクターの全ては、２つの４５°間隔の３枚刃の羽根車、ｐＨ、ＤＯおよびバイオマス静電容量プローブを備えていた。Ｎ−１シードにおいて、培養物を、３６．５℃の温度において１〜２×１０６細胞／ｍｌの範囲内の３Ｌシェークフラスコ培養物から接種した。５Ｌバイオリアクターの作動容量は３Ｌであった。ｐＨを１Ｍの炭酸ナトリウムの添加およびＣＯ２ガスのスパージングにより６．８〜７．４の範囲内に制御した。羽根車の撹拌を２４０ｒｐｍに設定し、０．５ｍｍのドリル開けしたホールスパージャーを通じた純粋酸素のスパージングによりエアレーションを提供した。溶解酸素をカスケード酸素スパージングを介して４０％のレベルに維持した。酸素スパージングが０．５ｌｐｍの最大スパージ速度に到達した時に、追加の酸素スパージを１０μｍのスパージャーを通じて導いた。消泡剤（ＥＸ−ＣＥＬＬ消泡剤、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をバイオリアクターに加えて、泡レベルを制御した。細胞密度を１日毎のオフライン測定（Ｖｉ−ｃｅｌｌ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によりおよび／またはオンライン静電容量プローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を介して測定した。１日毎のオフライン試料をまた、ｐｈｏｘ機器（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を介してｐＨ、溶解酸素およびｐＣＯ２についてモニターし、グルコース、乳酸塩プロファイルをＣｅｄｅｘ  Ｂｉｏ  ＨＴ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定した。
【００８６】
流加製造バイオリアクターにおいて、細胞を６×１０６または１０×１０６細胞／ｍｌのいずれかの細胞密度において５Ｌ製造容器からの灌流Ｎ−１シード培養物から接種した。化学的に明確な培地のボーラス供給を０〜２日目に開始して製造容器に加えた。供給の量は、３〜６％の初期作動容量で変動する。撹拌およびスパージャー制御戦略は、上記のＮ−１シードバイオリアクターに類似する。細胞密度、代謝物プロファイルを上記と同じ方法を使用して測定した。追加の１０  ｍｌの上清試料もまた流加製造バイオリアクターから得た。１０００ｇで５分間の遠心分離後、無細胞試料を−８０℃で凍結した後、ＵＰＬＣ法によりＩｇＧ力価の測定を行った。
【００８７】
２００Ｌのバイオリアクターおよび５００Ｌの製造バイオリアクター
Ｎ−１シードおよび流加製造のためのベンチスケールリアクター培養をそれぞれ２００Ｌおよび５００Ｌの単回使用バイオリアクター（ＳＵＢ）バッグ（ＧＥ  Ｘｃｅｌｌｅｒｅｘ）で実行した。ＳＵＢは、底部に取り付けた磁気駆動の羽根車、およびｐＨ、ＤＯ、バイオマス静電容量プローブを備えていた。Ｎ−１シードにおいて、培養物を、３６．５℃の温度において１〜２×１０６細胞／ｍｌの範囲内で１つまたは複数の５０Ｌ  Ｗａｖｅバッグから接種した。２００Ｌ  ＳＵＢの作動容量は１３０〜２００Ｌであった。ｐＨを１Ｍの炭酸ナトリウムの添加およびＣＯ２ガスのスパージングにより６．８〜７．４の範囲内に制御した。羽根車の撹拌を８０〜１１０ｒｐｍに設定し、１ｍｍディスクのスパージャーを通じた純粋酸素のスパージングによりエアレーションを提供した。溶解酸素をカスケード酸素スパージングを介して４０％のレベルに維持した。消泡剤（ＥＸ−ＣＥＬＬ消泡剤、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をバイオリアクターに加えて、泡レベルを制御した。細胞密度を１日毎のオフライン測定（Ｖｉ−ｃｅｌｌ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）によりおよび／またはオンライン静電容量プローブ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）を介して測定した。１日毎のオフライン試料をまた、ｐｈｏｘ機器（Ｎｏｖａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を介してｐＨ、溶解酸素およびｐＣＯ２についてモニターし、グルコース、乳酸塩プロファイルをＣｅｄｅｘ  Ｂｉｏ  ＨＴ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定した。
【００８８】
流加製造バイオリアクターにおいて、細胞を６×１０６または１０×１０６細胞／ｍｌのいずれかの細胞密度において２００Ｌ製造容器からの灌流Ｎ−１シード培養物から接種した。化学的に明確な培地のボーラス供給を０〜２日目に開始して製造容器に加えた。供給の量は、３〜６％の初期作動容量で変動する。細胞密度、代謝物プロファイルを上記と同じ方法を使用して測定した。１０ｍｌの上清試料もまた流加製造バイオリアクターから得た。１０００ｇで５分間の遠心分離後、無細胞試料を−８０℃で凍結した後、ＵＰＬＣ法によりＩｇＧ力価の測定を行った。
【００８９】
ベンチスケールバイオリアクターのＡＴＦ２における灌流速度の制御
細胞を１〜１．５×１０６細胞／ｍｌにおいて５Ｌバイオリアクターに接種し、バッチモードで開始した後、細胞密度が３〜８×１０６細胞／ｍｌの範囲に到達した時に灌流操作に切り替えた。ＡＴＦ６システムを使用して灌流を作動させ、デバイスは、ポリエーテルスルホンまたはポリスルホン０．２ｕｍ中空繊維フィルターを細胞保持デバイスとして含む。ＡＴＦ制御装置をＡＴＦシステムの底部半球に接続し、ダイアフラムポンプ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）を介してＡＴＦ流速を制御した。ＡＴＦ６中空繊維フィルターの他のパラメーターを表１に記載する。２つの蠕動運動ポンプをバイオリアクターに取り付け、１つはバイオリアクターへの培地入口を制御し、第２のポンプは、灌流速度と同等であるＡＴＦからの浸透物を制御する（図１を参照）。
【００９０】
浸透物ポンプ速度をＦｉｎｅｓｓｅ制御装置の出力により制御して目標流速を維持した。この目標流速は、ＣＳＰＲ、作動容量およびバイオマス静電容量プローブにより測定したオンラインＶＣＤプロファイルを用いて式１により決定した。一定のバイオリアクター作動容量を維持するために、容器重量をスケールによってモニターし、培地入口蠕動運動ポンプにより新鮮な培地をバイオリアクターに供給して一定の重量を維持する。＞４０×１０６細胞／ｍｌの目標生細胞密度に到達するまでこの灌流操作を継続した後、高密度で製造容器に移した。
【００９１】
対照として、浸透物ポンプ速度をまた、以下の設定に基づく指定された灌流速度に手動で設定した：細胞密度が３００万〜８００万に到達した時に、灌流速度を１容量のリアクターの作動容量に設定し、必要に応じて灌流速度を１日毎に増加させて、培養物がオフラインＶＣＤ値に基づいて０．０４ｎＬ／細胞／日の灌流速度を維持することを確実にした。
式１：
【００９２】
【数１】
2020533983.tif 000002
（式中、オンラインＶＣＤ＝細胞係数×バイオ静電容量読取り、細胞係数は、バイオ静電容量読取り（ｐＦ）に対するオフラインＶＣＤの相関に由来する。
【００９３】
ＡＴＦ６および２００Ｌバイオリアクターにおける灌流速度の制御
細胞を２００Ｌバイオリアクターに接種し、細胞密度が３〜８×１０６細胞／ｍｌに到達するまでバッチモードで作動させ、該細胞密度に到達した時に灌流操作を開始した。ＡＴＦ６システムは、ポリエーテルスルホンまたはポリスルホン０．２ｕｍ中空繊維フィルターを細胞保持デバイス（ステンレス鋼または単回使用のいずれか）として含んだ。ＡＴＦ制御装置をＡＴＦシステムの底部半球に接続して、ダイアフラムポンプ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）を介してＡＴＦ流速を制御した。ＡＴＦ２中空繊維フィルターの他のパラメーターは表１に記載される通りであった。２つの蠕動運動ポンプをバイオリアクターに取り付け、１つはバイオリアクターへの培地入口を制御し、他方は、ＡＴＦからの浸透物を制御する（図２を参照）。浸透物ラインもまたフローセンサー（ｌｅｖｉｆｌｏｗ）に接続して、浸透物ポンプの流速を測定および制御した。ライン中の培地を別個の蠕動運動ポンプに接続し、ＳＵＢの上部ポートへの供給を行った。
【００９４】
浸透物流速は灌流速度と同等であり、フローセンサー（Ｌｅｖｉｆｌｏｗ）により検証された流速設定点に基づいてＸｃｅｌｌｅｒｅｘ制御装置により制御した。目標流速は式１に基づいた。Ｌｅｖｉｆｌｏｗセンサーによりポンプの下流の浸透物流速を測定し、式１により決定された目標化された流速に向けて浸透物蠕動運動ポンプを駆動する。一定のバイオリアクター作動容量を維持するために、容器重量をロードによってモニターし、培地入口ラインにおいて蠕動運動ポンプを通じて細胞培地を供給して一定の重量を維持する。＞４０×１０６細胞／ｍｌの目標生細胞密度に到達するまで灌流操作を継続した後、高密度で製造容器に移した。
【００９５】
【表１】
2020533983.tif 000003
【００９６】
図３は、バイオマス静電容量読取りに対する生細胞密度の相関を示す。相関は、０．９５より高いＲ二乗値を有して線形である。静電容量に対する相関ＶＣＤにおける傾きを式１に記載される細胞係数として使用する。それゆえ、この静電容量シグナルを使用してＡＴＦについての灌流速度または浸透物流速を決定する。図３に示すように、２種の細胞株（細胞株ＡおよびＢ）は、異なるＩｇＧエンティティを生成し、異なる細胞係数式をもたらす。
【００９７】
図４は、細胞株Ａについての２つの異なる灌流モードで作動させたＮ−１バイオリアクターの培地利用速度を示す。バイオ静電容量読取りに基づく灌流速度の動的制御は、ベンチスケール５Ｌおよびパイロットプラントスケール２００Ｌの菱形プロットとして強調される。１日毎の灌流速度変化に基づく灌流速度を丸プロットにより表す。データは、全体として約３０％少ない培地をこの方法において使用したが、類似の細胞密度増殖速度を有するプロセスをもたらしたことを示す。したがって、灌流速度の動的制御が５Ｌの他に２００Ｌの両スケールにおいて実証された。
【００９８】
オンラインＶＣＤ読取りに基づいて灌流速度を動的に制御する方法を使用して、異なる細胞特異的灌流速度の試験およびＮ−１シード増殖に対する影響力の試験も行った。図５において、２つの異なる細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）を細胞株Ｃについて試験した。０．０２ｎＬ／細胞−日の、より低いＣＳＰＲにおいて、細胞増殖は１２０時間後に低減され、より低い最終ＶＣＤが１４４時間時に達成された。０．０２ｎＬ／細胞−日のＣＳＰＲはまた１４４時間時において、より低いグルコース濃度およびほぼ枯渇を結果としてもたらす。したがって、この方法を使用して、Ｎ−１灌流プロセスのための最適なＣＳＰＲ灌流速度を決定することができる。
【００９９】
上記の灌流Ｎ−１シードをその後にそれぞれ６および１０×１０６細胞／ｍｌの細胞密度において高シード密度流加製造バイオリアクターに接種した。Ｎ−１シードにおけるＣＳＰＲ速度にかかわらず、全てのバイオリアクターは類似のレベルの最終力価に到達した。０．０４ｎＬ／細胞／日の、より高いＣＳＰＲ速度においてシードから接種したバイオリアクターは４日目に、より高いピークＶＣＤを達成した。
【０１００】
Ｎ−１シードステージにおける目標細胞特異的灌流速度（ＣＳＰＲ）の選択は、細胞株およびそれが培養される増殖培地に依存する。ＢＭＳにより自社開発された標準シード拡大増殖培地を使用して、細胞株Ｄは、２７〜２８時間の倍加時間を達成するために０．０８〜０．１０ｎＬ／細胞−日のＣＳＰＲを必要とし、５日目に６４Ｅ６細胞／ｍｌの細胞密度に到達した（図７）。これは、５Ｌおよび２００Ｌの両バイオリアクターにおいて実証された。この細胞株について、約９バイオリアクター容量の増殖培地をこのＮ−１シードステージにおいて使用した。
【０１０１】
同じ増殖培地を使用する異なる研究において、細胞株Ｃは、２４．０時間の倍加時間を達成するために０．０４〜０．０５ｎＬ／細胞−日のＣＳＰＲのみを必要とし、６日目に６４．６Ｅ６細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達した（図８）。細胞株Ｃについて、約４バイオリアクター容量の増殖培地をＮ−１シードステージにおいて使用した。０．０４〜０．０５ｎＬ／細胞−日の同じＣＳＰＲにおいて、細胞株Ｅは、２４．６時間の倍加時間を達成し、６日目に５２．７Ｅ６細胞／ｍｌの最終細胞密度に到達した（図９）。細胞株Ａにおいて、０．０３および０．０４ｎＬ／細胞−日の２つの異なるＣＳＰＲ速度を評価した。異なるＣＳＰＲは細胞増殖速度に影響しなかったが、０．０３ｎＬ／細胞−日の、より低いＣＳＰＲにおいて灌流を制御することは、総灌流液容量を２０％低減させた（図１０）。
【０１０２】
物品のコストを低下させ、かつＮ−１シードステージにおいて利用される培地の容量を最小化するために、＞５０Ｅ６細胞／ｍｌの最終ＶＣＤを達成するために必要とされる最低のＣＳＰＲが好ましい。しかしながら、低すぎる設定のＣＳＰＲはまた、図５（細胞株Ｃ）に示すように、増殖速度に影響する可能性があり、かつ栄養分の枯渇を結果としてもたらす。ＣＳＰＲは経験的に設定され、増殖培地の種類に応じて変更され得る。
【０１０３】
本明細書において参照される全ての刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、ならびにポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列の両方を含むアクセッション番号／データベースの配列は、各個々の刊行物、特許、特許出願、インターネットサイト、またはアクセッション番号／データベースの配列が参照することにより組み込まれることを具体的かつ個々に指し示されたのと同じ程度まで全ての目的のために全体が本明細書において参照することにより本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020533983.tif 000004
【図２】
2020533983.tif 000005
【図３】
2020533983.tif 000006
【図４】
2020533983.tif 000007
【図５】
2020533983.tif 000008
【図６】
2020533983.tif 000009
【図７】
2020533983.tif 000010
【図８】
2020533983.tif 000011
【図９】
2020533983.tif 000012
【図１０】
2020533983.tif 000013
【国際調査報告】
2020533983.tif 000014
2020533983.tif 000015
2020533983.tif 000016