(57)【要約】  本発明は、多孔質生体模倣足場及びその作製方法を提供する。当該足場は、増強された細胞浸透のための傾斜孔径を有する当該足場は、足場内部への細胞浸透を促進することにより、そしてその固有の免疫調節効果のために、創傷再生に有用である。当該足場は、特定の組織の固有の層状構造を模倣することによって組織モデリング仕様を有する。
2020517382.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
足場であって、以下：
多孔質材料
を含み、前記多孔質材料は、植物タンパク質繊維を含み、前記植物タンパク質繊維は、第１の表面、第２の表面と、その間の厚さを有し；
ここで、前記第１の表面における平均孔径は、前記第２の表面における平均孔径よりも小さく；並びに
ここで、前記平均孔径は、前記第１の表面から前記第２の表面まで材料を通して漸増する、足場。
【請求項２】
前記植物タンパク質が、以下：大豆タンパク質単離物、小麦グルテン、コーンゼイン、及びエンドウタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の足場。
【請求項３】
前記繊維が、０．５μｍ〜５μｍの直径を有する、請求項１に記載の足場。
【請求項４】
前記足場が、５００μｍ〜２０００μｍの厚さを有する、請求項１に記載の足場。
【請求項５】
前記第１の表面の平均孔径が、１μｍ〜２０μｍの直径である、請求項１に記載の足場。
【請求項６】
前記第２の表面の平均孔径が、１０μｍ〜２００μｍである、請求項１に記載の足場。
【請求項７】
前記平均孔径の漸増が、線形である、請求項１に記載の足場。
【請求項８】
前記平均孔径の漸増が、非線形である、請求項１に記載の足場。
【請求項９】
前記足場が、細胞増殖を支持することができる、請求項１に記載の足場。
【請求項１０】
少なくとも１つの細胞をさらに含む、請求項１に記載の足場。
【請求項１１】
少なくとも１つの材料をさらに含む、請求項１に記載の足場であって、前記少なくとも１つの材料が、以下：フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、糖タンパク質、トロンボスポンジン、エラスチン、フィブリリン、ムコ多糖、糖脂質、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ビトロネクチン、ポリ−Ｄ−リジン、及び多糖類からなる群から選択される、足場。
【請求項１２】
少なくとも１つの材料をさらに含む、請求項１に記載の足場であって、前記少なくとも１つの材料が、以下、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、コポリマーポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリアニリン、及びポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）からなる群から選択される、足場。
【請求項１３】
傾斜多孔質足場（graded porous scaffold）を作製する方法であって、以下のステップ：
植物タンパク質溶液を犠牲材料（sacrificial material）溶液とともに電気処理し、前記植物タンパク質溶液及び犠牲材料は、同時にかつ別々に回転基板へと堆積されて、複合足場（composite scaffold）を形成し；
前記複合足場から犠牲材料を除去して、植物タンパク質足場を形成し；
前記植物タンパク質足場を水溶液で水和し；
前記植物タンパク質足場を凍結し；並びに
凍結した植物タンパク質足場を凍結乾燥して、傾斜多孔質足場を形成すること、
を含む、方法。
【請求項１４】
前記電気処理が、エレクトロスピニングである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＳＰＩ溶液が、１，１，１，３，３，３，−ヘキサフルオロ−２−プロパノール中に溶解したＳＰＩを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記犠牲材料が、水溶性材料を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
前記水溶性材料が、エタノール中に溶解したＰＥＯである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記水溶液が水である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】
前記凍結ステップが、−８０℃で２時間行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】
前記凍結乾燥ステップが、−６０℃かつ０．０８ｍｂａｒで行われる、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年４月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／４９０，１４８号の優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
慢性創傷ケアは、米国の医療制度と個人支払者の両方に多大な経済的負担を強いている。現在、非治癒/治癒困難な皮膚創傷に関する年間費用は約２５億ドルに達する（Witherel CE et al.、Wound Repair and Regeneration 24.3（2016）: 514-524）。しかしながら、全体のコストにも関わらず、痛みや瘢痕のない正常な生活を送るという患者のニーズはほとんど満たされていない。自家移植は、皮膚置換で実践される、より一般的な方法の一つであるが、罹患率、死亡率、及び移植に利用可能なドナー皮膚の面積に関するサイズ制限は依然として問題である。
【０００３】
代替治療法には、生物活性創傷ドレッシング、陰圧閉鎖療法（negative pressure wound therapy）（ＮＰＷＴ）、又は生物工学皮膚置換が挙げられる。創傷ドレッシングの適用は、効果的に創面の水分のバランスを取るが、組織の瘢痕化及び壊死を引き起こす可能性がある。ＮＰＷＴは、より速い肉芽組織形成及び創傷サイズの減少などの利点を提供し、これは最終的に、創傷組織を切断する必要性の減少をもたらす（Huang C et al.、Current problems in surgery 51.7（2014）: 301-331;Bruhin A et al.、International Journal of Surgery 12.10（2014）: 1105-1114;Li T et al.、Experimental and therapeutic medicine 11.3（2016）: 769-776）。しかしながら、NPWTは、いくつかの臨床的な注意点に関連する（Huang C et al.、Current problems in surgery 51.7（2014）: 301-331;Bruhin A et al.、International Journal of Surgery 12.10（2014）: 1105-1114;Orgill DP et al.、International wound journal 10.s1（2013）: 15-19）。最近のＦＤＡの警告によると、ＮＰＷＴは時により、出血及び感染を含む重度の合併症を引き起こすことがある。
【０００４】
動物モデルにおける生物工学足場の適用は、皮膚付属器の修復に役割を果たすようであり、これは他の２つの技術で治療される皮膚創傷では報告されていない（Har-el Y et al.、Wound Medicine 5（2014）: 9-15;Sundaramurthi D et al.、Polymer Reviews 54.2（2014）: 348-376）。皮膚付属器の再構築は、組織再生の開始、最終及び所望の段階の治癒プロセスを表す。長期にわたる炎症は、治癒組織のリモデリング及び再生に対する主要な障害である（Wang Z et al.、Biomaterials 35.22（2014）: 5700-5710;Mantovani A et al.、The Journal of pathology 229.2（2013）: 176-185;Badylak SF et al.、Tissue Engineering Part A 14.11（2008）: 1835-1842）。
【０００５】
改善された多孔質構造を有する足場のための技術が必要とされている。本発明はこの必要性を満たす。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
一態様では、本発明は、足場であって：多孔質材料を含み、当該多孔質材料は：大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）繊維を含み、当該ＳＰＩは、第１の表面、第２の表面、及びその間に厚さを含み；ここで、第１の表面における平均孔径は、第２の表面における平均孔径よりも小さく；並びに、ここで、平均孔径は、第１の表面から第２の表面まで材料を通して漸増する、足場に関する。
【０００７】
一実施形態では、植物タンパク質は、大豆タンパク質単離物、小麦グルテン、コーンゼイン、及びエンドウタンパク質からなる群から選択される。一実施形態では、繊維は、０．５μｍ〜５μｍの直径を有する。一実施形態では、足場は、５００μｍ〜２０００μｍの厚さを有する。一実施形態では、第１の表面の平均孔径は、１μｍ〜２０μｍの直径である。一実施形態では、第２の表面の平均孔径は、１０μｍ〜２００μｍである。一実施形態では、平均孔径の漸増は線形である。一実施形態では、平均孔径の漸増は非線形である。
【０００８】
一実施形態では、足場は、細胞増殖を支持することができる。一実施形態では、足場は、少なくとも１つの細胞をさらに含む。一実施形態では、足場は、少なくとも１つの材料をさらに含み、当該少なくとも１つの材料は、以下：フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、糖タンパク質、トロンボスポンジン、エラスチン、フィブリリン、ムコ多糖、糖脂質、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ケラチン硫酸、グリコサミノグリカン、ヒアルロン酸、プロテオグリカン、ビトロネクチン、ポリ−Ｄ−リジン、及び多糖類からなる群から選択される。一実施形態では、足場はさらに、ポリ（イプシロン−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、コポリマー  ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリアニリン、及びポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）からなる群から選択される少なくとも１つの材料を含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は、傾斜多孔質足場（graded porous scaffold）を作製する方法であって、以下のステップ：植物タンパク質溶液を犠牲材料（sacrificial material）溶液とともに電気処理し、植物タンパク質溶液及び犠牲材料は、同時に及び別々に回転基板へと堆積されて、複合足場を形成し；複合足場から犠牲材料を除去して、植物タンパク質足場を形成し；植物タンパク質足場を水溶液で水和し；植物タンパク質足場を凍結し；並びに、凍結した植物タンパク質足場を凍結乾燥して、傾斜多孔質足場を形成すること、を含む、方法に関する。
【００１０】
一実施形態では、電気処理は、エレクトロスピニングである。一実施形態では、ＳＰＩ溶液は、１，１，１，３，３，３，−ヘキサフルオロ−２−プロパノール中に溶解したＳＰＩを含む。一実施形態では、犠牲材料は、水溶性材料を含む。一実施形態では、水溶性材料は、エタノール中に溶解したＰＥＯである。一実施形態では、水溶液は水である。一実施形態では、凍結ステップは、−８０℃で２時間行われる。一実施形態では、凍結乾燥ステップは、−６０℃かつ０．０８ｍｂａｒで行われる。
【００１１】
以下の本発明の実施形態の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されることになる。しかしながら、本発明は、図面に示された実施形態の正確な配置及び手段に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１Ａから図１Ｃは、本発明の例示的な足場であって、可視化した水和前の赤色（ＤｉｌＣ１８）の大豆繊維、及び青色（ＤｉＯＣ１８）のＰＥＯ繊維（図１Ａ）、可視化した水和後の大豆繊維のみ（図１Ｂ）、並びに凍結乾燥後（図１Ｃ）を示す。
【図２】図２は、本願発明の足場を製造する例示的な方法を示す。
【図３】図３は、複合大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）及びポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）足場を製造するための実験セットアップを示す。
【図４】図４Ａ及び図４Ｂは、４０℃の水中で２４時間水和する前（図４Ａ）及び後（図４Ｂ）の実験的ＳＰＩ−ＰＥＯ足場を示す。ＤｉｌＣ１８で赤色染色されたＳＰＩ繊維、及びＤｉＯＣ１８で緑色染色された犠牲ＰＥＯ繊維。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、３０ｋＶの加速電圧で操作電子顕微鏡を用いて撮影した傾斜水和凍結（ＧＨＬ）足場（図５Ａ）対、規則的紡糸（regularly spun）ＳＰＩ足場（図５Ｂ）の断面図を示す。
【図６】図６Ａ及び図６Ｂは、播種７日後のＧＨＬ足場（図６Ａ）及び規則的紡糸ＳＰＩ足場（図６Ｂ）へのＨＤＦＢ細胞浸透を実証する実験の結果を示す。
【図７】図７Ａ及び図７Ｂは、播種２４時間後のＨＬ足場（図７Ａ）及び規則的紡糸ＳＰＩ足場（図７Ｂ）へのＲＡＷ２６４．７細胞浸透を示すＭＡＴＬＡＢを用いた３Ｄ再構成レーザー走査共焦点画像を示す。細胞核は青色、足場は緑色である。軸の単位はμｍである。
【図８Ａ】図８Ａ及び図８Ｂは、内層への細胞浸透を示すＨＬ足場（図８Ａ、矢印）、及び最小限の細胞浸透を示す規則的紡糸足場（図８Ｂ）についての手術７日後の汎マクロファージ（pan-macrophages）（Ｌ１）抗体でのＩＨＣ染色を示す。Ｔは組織であり、Ｓは足場である。点線は、足場−組織の境界を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ及び図８Ｂは、内層への細胞浸透を示すＨＬ足場（図８Ａ、矢印）、及び最小限の細胞浸透を示す規則的紡糸足場（図８Ｂ）についての手術７日後の汎マクロファージ（pan-macrophages）（Ｌ１）抗体でのＩＨＣ染色を示す。Ｔは組織であり、Ｓは足場である。点線は、足場−組織の境界を示す。
【図９】図９は、ＧＨＬ足場上への播種後３、７、及び１０日目の細胞の生存率を示すalamarBlueアッセイの結果を示す。
【図１０】図１０Ａから図１０Ｄは、ＧＨＬ足場（図１０Ａ）及び規則的紡糸ＳＰＩ（図１０Ｂ）上のヒト皮膚繊維芽細胞について、並びにＧＨＬ足場（図１０Ｃ）及び規則的紡糸ＳＰＩ（図１０Ｄ）上のＴＨＰ−１細胞についての播種後５日の細胞生存率の結果を示す。
【図１１】図１１は、湿潤及び乾燥条件下でのＧＨＬ足場の引張試験からの応力−ひずみ曲線を示す。
【図１２Ａ−Ｂ】図１２Ａから図１２Ｃは、ＧＨＬ足場と規則的紡糸ＳＰＩ足場との孔径を比較する。図１２Ａは、ＧＨＬ足場の断面図である。図１２Ｂは、規則的紡糸ＳＰＩ足場の断面図である。断面図は、走査電子顕微鏡を用いて撮影した。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＧＨＬ足場及び規則的紡糸ＳＰＩ足場の異なる領域における孔径の範囲を示すグラフである。ブラケットは、統計的に比較された２つの群を示す。この場合、中間部（Mid）が電界紡糸ＳＰＩと比較され、そして底部（Bottom）が電界紡糸ＳＰＩと比較される。二重アスタリスクは、０．０１以下のｐ値を示す。統計分析において、ｐ値は結果の有意性を決定する。０．０１未満のｐ値は、２つの群の比較が９９％の確実性で有意に異なることを示す。
【図１３】図１３は、ＧＨＬ足場及び規則的紡糸ＳＰＩ足場に対する身体の炎症反応を調査する実験の結果を示すグラフであり、斯かる炎症反応は、手術後３、７、及び１０日に汎マクロファージ細胞密度スコアによって測定された。単一のアスタリスクは、０．０５以下のｐ値を示す。０．０５未満のｐ値は、２つの群の比較が９５％の確実性で有意に異なることを示す。
【図１４】図１４は、本発明の例示的な傾斜足場が３層の異なる孔径を含むことを実証する実験の結果を示す。
【図１５】図１５は、規則的紡糸ＳＰＩ足場と、傾斜多孔質繊維（ＧＰＦ）足場の大細孔（large pore）領域とにおけるヒト皮膚繊維芽細胞、ＴＨＰ−１単球、及びＲＡＷ  ２６４．７マクロファージの付着及び増殖を比較する実験の結果を示す。細胞核はＤＡＰＩで青色に染色され；アクチンフィラメントはファロイジンで緑色に染色された。
【図１６】図１６は、ＧＰＦ足場の大細孔領域が、皮膚繊維芽細胞の異なる浸透を支持することを実証する実験の結果を示す。規則的紡糸ＳＰＩ足場及びＧＰＦ足場の小細孔で培養された皮膚繊維芽細胞及びＲＡＷ  ２６４．７マクロファージが、比較のために提供される。細胞核はＤＡＰＩで青色に染色され；アクチンフィラメントはファロイジンで緑色に染色された。
【図１７】図１７は、ＧＰＦ足場の大きな孔径が、培養２日目という早さでＴＨＰ−１マクロファージのプロヒーリング（pro-healing）表現型への極性化（polarization）を促進することを実証する実験の結果を示す。規則的紡糸ＳＰＩ足場及びＧＰ足場の小細孔領域で培養されたＴＨＰ−１マクロファージが、比較のために提供される。Ｍ２／Ｍ１スコアは、Ｍ１遺伝子（ＴＮＦα、ＩＬ６）の発現レベルの合計をＭ２遺伝子（ＭＲＣ１、ＣＣＬ１７）の発現レベルの合計で割ったものとして定義される。
【図１８】図１８は、規則的紡糸ＳＰＩ足場で処置した創傷と、非処置創面とが比較される例示的なＧＰＦ足場を用いた創傷処置の結果を示す。手術後７日のプロヒーリング（Ｍ２）及び炎症誘発性（pro-inflammatory）（Ｍ１）抗体の茶色での免疫組織化学染色。スケールバーは２５０μｍ、インセットで１００μｍである。
【図１９】図１９は、創傷に移植されたＧＰＦ足場が、マクロファージのプロヒーリング表現型への極性化を促進することを実証する実験の結果を示す。創傷に移植された規則的紡糸ＳＰＩ足場及び非処置創傷におけるマクロファージが比較のために提供される。Ｍ２／Ｍ１スコアは、抗ＭＲＣ１で免疫染色されたマクロファージの数の平均を、抗ｉＮＯＳで免疫染色されたマクロファージの数の平均で割ったものとして定義され、それぞれサンプリングエリアに対して正規化された。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
本発明は、多孔質生体模倣足場及びその作製方法を提供する。当該足場は、増強された細胞浸透のための傾斜孔径を有する。当該足場は、特定の組織の固有の層状構造を模倣することにより、創傷再生及び組織モデリングに役立つ。
【００１４】
定義
本発明の図面及び説明は、本願発明の明確な理解に関連する要素を例示するために簡略化され、明確性の目的で、典型的に当該技術分野で見られる他の多くの要素は排除されていることを理解されたい。当業者は、他の要素及び／又はステップが、本発明の実施に望ましい、及び／又は必要とされることを理解するであろう。しかしながら、そのような要素及びステップは当該技術分野で良く知られているため、並びにそれらは本願発明のより良い理解を促進しないため、そのような要素及びステップの議論は本明細書では提供されない。本明細書の開示は、当業者によって知られているそのような要素及び方法に対するそのような全ての変形及び修正に関する。
【００１５】
他で定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似又は同等の任意の方法及び材料が、本願発明の実施又は試験に使用されてもよいが、例示的な方法及び材料が記載される。
【００１６】
本明細書で使用される場合、以下の用語のそれぞれはこの章でそれに関連する意味を有する。
【００１７】
冠詞「a」及び「an」は、１つの又は１つを超える（すなわち、少なくとも１つの）冠詞の文法的対象を指すために使用される。例として、「要素（an element）」とは、１つの要素又は複数の要素を意味する。
【００１８】
「約」は、本明細書において、測定可能な値、例えば量、一時的な持続期間などを指す際に使用される場合、指定された値からの±２０％、±１０％、±５％、±１％、及び±０．１％の変動を包含することを意味し、それは、そのような変数が適切であるためである。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「生体適合性」は、哺乳動物に移植された場合に、哺乳動物に有害反応を引き起こさない任意の材料を指す。生体適合性材料は、個体に導入された場合、その個体に対して毒性又は有害でなく、またそれは哺乳動物における材料の免疫学的拒絶を誘導しない。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「培養」は、栄養培地中又は栄養培地上での細胞、例えば組織細胞の培養又は成長を指す。細胞又は組織培養の当業者に良く知られているように、細胞培養は一般に、ヒト又は他の動物から細胞又は組織を除去し、それを酵素で処理することによって分離し、そして得られた細胞の懸濁液をペトリ皿の底部のような平坦な表面に広げることによって開始される。細胞は一般に、ペトリ皿のプラスチック又はガラスに細胞を付着させる糖タンパク質様物質を生成することによって、「単層」と呼ばれる細胞の薄い層を形成する。次に、細胞増殖に適した栄養素を含む培養培地の層を、単層の上に配置し、培養物をインキュベートして、細胞の増殖を促進する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「細胞外マトリックス組成物」は、可溶性及び不溶性画分の両方又はそれらの任意の部分を含む。不溶性画分は、支持体又は足場に堆積している分泌されたＥＣＭタンパク質及び生物学的成分を含む。可溶性画分は、細胞が培養された培養培地、並びに細胞が活性剤（複数）を分泌した培養培地への言及を含み、かつ、足場に堆積していないタンパク質及び生物学的成分を含む。両方の画分は収集され、任意によりさらに処理され、そして、本明細書に記載の様々な用途で個別に又は組み合わせて使用することができる。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「移植片（graft）」は、典型的には欠損を置換、修正、又は克服するために、個体に移植される細胞、組織、器官、又は生体材料を指す。移植片はさらに足場を含んでもよい。組織又は器官は、同じ個体に由来する細胞からなり得る;この移植片は、本明細書において以下の互換可能な用語で呼ばれる:「自家移植片（autograft）」、「自家移植片（autologous transplant）」、「自家移植片（autologous implant）」及び「自家移植片（autologous graft）」。同じ種の遺伝的に異なる個体からの細胞を含む移植片は、本明細書において以下の互換可能な用語で呼ばれる:「同種異系移植片（allograft）」、「同種異系移植片（allogeneic transplant）」、「同種異系移植片（allogeneic implant）」及び「同種異系移植片（allogeneic graft）」。個体からその個体の一卵性双生児への移植片は、「同系移植片（isograft）」、「同系移植片（syngeneic transplant）」、「同系移植片（syngeneic implant）」又は「同系移植片（syngeneic graft）」と呼ばれる。「異種移植片（xenograft）」、「異種移植片（xenogeneic transplant）」又は「異種移植片（xenogeneic implant）」は、１つの個体から異なる種の別の個体への移植片を指す。用語「患者」、「対象」、「個体」などは、本明細書で互換的に使用され、そして、本明細書に記載された方法に適した任意の動物、又はインビトロ又はインサイチュ（in situ）に関わらずその動物の細胞を指す。特定の非限定的な実施形態では、患者、対象又は個体は、ヒトである。
【００２３】
本明細書で使用される場合「成長因子」は、以下を含むがこれらに限定されない非限定的な因子が意図される：成長ホルモン、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン３、インターロイキン６、インターロイキン７、マクロファージコロニー刺激因子、ｃ−ｋｉｔリガンド／幹細胞因子、オステオプロテジェリンリガンド、インスリン、インスリン様成長因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、神経成長因子、毛様体神経栄養因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ−ベータ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、及び骨形成タンパク質であって、ピコグラム／ｍｌ〜ミリグラム／ｍｌレベルの濃度のもの。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「ポリマー」はコポリマーを含む。「コポリマー」は、１つを超えるポリマー前駆体から形成されるポリマーである。ポリマーは、本明細書で使用される場合、溶媒に可溶性であり、かつ貧溶媒（antisolvent）に不溶性であるポリマーを含む。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「足場（scaffold）」は、生体適合性材料を含む構造を指し、当該生体適合性材料は、細胞の付着及び増殖に適した表面を提供する。足場はさらに、機械的安定性及び支持を提供することができる。足場は、増殖する細胞の集団によって想定される三次元形状又は形態に影響与えるかその範囲を定めるように、特定の形状又は形態であってもよい。そのような形状又は形態は、これらに限定されるものではないが、フィルム（例えば三次元よりも実質的に大きな二次元を有する形態）、リボン、コード、シート、フラットディスク、シリンダー、球体、３次元無定形などを含む。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「組織工学」は、組織の置換又は再構築に使用するためにエクスビボで組織を生成するプロセスを指す。組織工学は、「再生医療」の一例であり、これは、生物工学材料及び技術とともに、細胞、遺伝子又は他の生物学的構成要素を組み込むことによる、組織及び器官の修復または置換に対するアプローチを含む。
【００２７】
本明細書で使用される場合、用語「組織移植」及び「組織再構築」はいずれも、肺欠損又は軟組織欠損などの組織欠損を治療又は軽減するために移植片を個体に移植することを指す。
【００２８】
「移植片（Transplant）」は、移植されることになる生体適合性格子（lattice）又はドナー組織、器官又は細胞を指す。移植片の例としては、これらに限定されるものではないが、皮膚細胞又は組織、骨髄、並びに固形臓器、例えば心臓、膵臓、腎臓、肺及び肝臓が挙げられる。
【００２９】
本開示を通して、本発明の様々な態様が範囲形式で提示される。範囲形式での説明は、単に便宜上及び簡潔にするためのものであることが理解されるべきであり、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限として解釈されるべきではない。従って、範囲の説明は、全ての可能な部分範囲、並びにその範囲内の個別の数値を具体的に開示したとみなされるべきである。例えば、１〜６のような範囲の説明は、部分範囲、例えば１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６、及び当該範囲内の個別の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、６、並びにその間の任意の全体的及び部分的増分を開示したとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関わらず適用される。
【００３０】
足場
本発明は、細胞浸潤を促進する傾斜孔径を有する繊維足場を提供する。足場は、皮膚又は骨などの固有の段階的構造を有する組織のエンジニアリングに役立つ。勾配−多孔質（gradient-porous）構造は、これら組織の細胞外マトリックスの天然の生体構造を模倣し、他の多孔質足場と比較して、足場へのより自然な、異方性の細胞浸透、並びに構築物内での改善された細胞の運動性及び移動を可能にする。足場全体の細孔のサイズ分布は、多様な細胞タイプの分離と配置を増強する。例えば、皮膚繊維芽細胞及び角化細胞は、それぞれの天然組織の固有の層状構造を緊密に模倣する一で足場に配置され得る。また、細孔は、生理活性分子、栄養因子、及び老廃物の効率的な輸送を可能にする。
【００３１】
ここで、図１Ａから図１Ｃを参照すると、例示的な足場１０が示されている。足場１０は、植物タンパク質繊維を含む多孔質材料である。植物タンパク質は、任意の好適な植物、例えば大豆タンパク質単離物、小麦グルテン、コーンゼイン、エンドウタンパク質などに由来し得る。足場１０は、第１の表面１２、第２の表面１４と、その間の厚さを有するように形成され、ここで、表面１２は第１の平均孔径を備え、かつ表面１４は第２の孔径を備える。ＳＰＩ繊維は、任意の好適な平均直径、例えば０．５μｍ〜５μｍを有し得る。一実施形態では、表面１２の第１の平均孔径は、表面１４の第２の平均孔径よりも大きい。別の実施形態では、表面１４の第２の平均孔径は、表面１２の第１の平均孔径よりも大きい。より小さな平均孔径を有する表面についての平均孔径は、１μｍ〜２０μｍであるか、又は一実施形態では、１μｍ〜１０μｍであり得る。より大きな平均孔径を有する表面についての平均孔径は、１０μｍ〜１０００μｍであるか、又は一実施形態では、１０μｍ〜２００μｍであり得る。平均孔径は、足場１０を通じて、より小さな平均孔径を有する表面から、より大きな平均孔径を有する表面まで、徐々に増加する。様々な実施形態では、平均孔径の変化は、線形又は非線形であり得る。様々な実施形態では、複数の足場１０を組み合わせて、動的平均孔径を有する多成分足場を形成することができる。例えば、２つの足場１０は、鏡面勾配配向（mirrored gradient orientation）を有する表面対表面で融合されて、外表面から足場内部に向かって増加又は減少する平均孔径を有する、より厚い足場を形成することができる。他の例では、２つの足場１０は、同じ勾配配向を有する表面対表面で融合されて、表面対表面の界面で大細孔と小細孔との間の急激な遷移を有する、より厚い足場を形成することができる。
【００３２】
特定の実施形態では、足場１０の構造は、多孔度に関して説明することができる。例えば、第１の表面１２は、第１の多孔度を有することができ、かつ表面１４は第２の多孔度を有することができ、ここで、第１の多孔度は第２の多孔度よりも高く、又は第２の多孔度は第１の多孔度よりも高い。より低い多孔度を有する表面の多孔度は、１％〜５０％であり得る。より高い多孔度を有する表面の多孔度は、５０％〜９９％であり得る。足場１０の多孔度は、より低い多孔度を有する表面からより高い多孔度を有する表面まで徐々に増加する。多孔度の変化は、線形又は非線形であり得る。
【００３３】
特定の実施形態では、足場１０の構造は、細孔の数、又は細孔数に関して説明することができる。例えば、第１の表面１２は第１の細孔数を有することができ、表面１４は第２の細孔数を有することができる、ここで、第１の細孔数は第２の細孔数よりも多く、又は第２の細孔数は第１の細孔数よりも多い。足場１０の細孔数は、より少ない細孔数を有する表面からより多い細孔数を有する表面へと徐々に増加する。細孔数の変化は線形又は非線形であり得る。
【００３４】
足場１０は、任意の好適な形状を有し得る。いくつかの実施形態では、足場１０は、実質的に平面、例えばシートの形態である。他の実施形態では、足場１０は、三次元構造、例えばチューブ又は球体に成形することができる。足場１０は、任意の好適な厚さ、例えば１００μｍ未満又は数ミリメートル程度の厚さを有し得る。一実施形態では、生体模倣足場の厚さは、５００μｍ〜５０００μｍであり、又は別の実施形態では、５００μｍ〜２０００μｍである。足場１０は任意の幾何学形状を有し得る。様々な実施形態では、足場１０は、任意の好適な形状に合わせてトリミング又はサイズ調整することができる。
【００３５】
様々な実施形態では、足場１０は、大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）を含み、宿主体内における免疫応答を軽減し、組織のリモデリングを進める炎症プロセスを低減又は短縮する。用語「大豆タンパク質単離物」は、本明細書で使用される場合、大豆タンパク質産業での従来の意味で使用される。例えば、大豆タンパク質単離物は、無水ベースで少なくとも９０％の大豆タンパク質のタンパク質含有量を有する大豆材料である。「単離された大豆タンパク質」は、当該技術分野で使用される場合、本明細書で使用され、かつ当該技術分野で使用される「大豆タンパク質単離物」と同じ意味を有する。大豆タンパク質単離物は、大豆から形成され、この形成は、子葉から大豆の外皮及び胚芽を取り除き、子葉をフレーキング（flaking）又は粉砕し、そしてフレーキング又は粉砕した子葉から油を除去し、子葉繊維及び脂質から子葉の大豆タンパク質及び炭水化物を分離し、その後炭水化物から大豆タンパク質を分離することによって行われる。特定の実施形態では、得られた材料をエタノールで洗浄して、何割かのイソフラボノイドを除去する。一実施形態では、大豆ベースの組成物は、大豆タンパク質と大豆子葉繊維とを含む繊維材料を含む。繊維材料は一般に、脱脂大豆タンパク質材料及び大豆子葉繊維を含む。繊維材料は、大豆タンパク質材料及び大豆子葉繊維を押し出すことにより生成される。
【００３６】
様々な実施形態では、足場は、様々なタンパク質（例えば、コラーゲン）又は化合物、例えば治療剤を共有結合するための１つ又は複数の官能基で修飾することができる。足場に連結され得る治療剤としては、これらに限定されるものではないが、鎮痛薬、麻酔薬、抗真菌薬、抗生物質、抗炎症薬、駆虫薬、解毒剤、制吐薬、抗ヒスタミン薬、抗がん薬、抗高血圧薬、抗マラリア薬、抗菌薬、抗精神病薬、解熱薬、消毒薬、抗関節炎薬、抗結核薬、鎮咳薬、抗ウイルス薬、心臓作用薬、下剤、化学療法剤、着色又は蛍光イメージング剤、コルチコイド（例えばステロイド）、抗うつ薬、抑制薬、診断補助薬、利尿薬、酵素、去痰薬、ホルモン、睡眠薬、ミネラル、栄養補助食品、副交感神経刺激薬、カリウム補助食品、放射線増感剤、放射性同位元素、蛍光ナノ粒子、例えばナノダイヤモンド、鎮静剤、スルホンアミド、刺激剤、交感神経刺激薬、精神安定剤、尿路抗感染薬、血管収縮薬、血管拡張薬、ビタミン、キサンチン誘導体などが挙げられる。治療剤はまた、他の小有機分子、天然に単離された実体又はそのアナログ、有機金属剤、キレート化金属又は金属塩、ペプチドベースの薬物、あるいは、ペプチド又は非ペプチド受容体標的化または結合剤であってもよい。足場への治療剤の結合は、プロテアーゼ感受性リンカー又は他の生分解性結合を介していてもよいことが企図される。生体模倣足場に組み込まれてもよい分子は、これらに限定されるものではないが、ビタミン及び他の栄養補助剤；糖タンパク質（例えば、コラーゲン）；フィブロネクチン；ペプチド及びタンパク質；炭水化物（単純及び／又は複合体の両方）；プロテオグリカン；抗原；オリゴヌクレオチド（センス及び／又はアンチセンスＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）；抗体（例えば、感染因子、腫瘍、薬物又はホルモンに対する）；並びに遺伝子治療試薬を含む。
【００３７】
様々な実施形態では、足場はさらに、１つ又は複数の多糖類を含むことができ、斯かる多糖類には、好適な粘度、分子量、及び他の所望の特性を有するグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）又はグルコサミノグリカンが含まれる。用語「グリコサミノグリカン」は、任意のグリカン（すなわち、多糖類）を包含することが意図され、斯かる任意のグリカンは、１つが常にアミノ糖である二糖類の繰り返し単位を有する非分岐多糖鎖を含む。クラスとしてのこれら化合物は、高い負電荷を有し、強い親水性であり、一般的にムコ多糖と呼ばれる。多糖類のこのグループは、ヘパリン、へパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸、及びヒアルロン酸を含む。これらＧＡＧは、主として細胞表面上及び細胞外マトリックスに見られる。用語「グルコサミノグリカン」はまた、主として単糖誘導体を含む任意のグリカン（すなわち多糖類）を包含することを意図し、斯かる単糖誘導体において、アルコール性ヒドロキシル基は、アミノ基又は他の官能基、例えばサルフェート又はホスフェートによって置換されている。グルコサミノグリカンの例はポリ−Ｎ−アセチルグルコサミノグリカンであり、これは一般的にキトサンと呼ばれる。本発明において有用であり得る例示的な多糖類としては、デキストラン、ヘパラン、ヘパリン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、アガロース、カラギーナン、アミロペクチン、アミロース、グリコーゲン、デンプン、セルロース、キチン、キトサン、及び様々な硫酸化多糖類、例えばヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、デルマタン硫酸、又はケラタン硫酸が挙げられる。
【００３８】
様々な実施形態では、足場はさらに、１つ又は複数の細胞外マトリックス材料及び／又は天然に存在する細胞外マトリックス材料のブレンドを含むことができ、斯かる材料には、これらに限定されるものではないが、コラーゲン、フィブリン、フィブリノーゲン、トロンビン、エラスチン、ラミニン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリン、及びケラタン硫酸、プロテオグリカン、及びこれらの組み合わせが含まれる。有益であり得るいくつかのコラーゲンは、これらに限定されるものではないが、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩ、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ、ＸＩ、ＸＩＩ、ＸＩＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶ、ＸＶＩ、ＸＶＩＩ、ＸＶＩＩＩ、及びＸＩＸ型コラーゲンを含む。これらタンパク質は、天然型及び変性型を含むがこれらに限定されない任意の形態であり得る。足場はさらに、１つ又は複数の炭水化物、例えばキチン、キトサン、アルギン酸、並びにアルギン酸塩、例えばアルギン酸カルシウム及びアルギン酸ナトリウムを含み得る。これら材料は、植物製品、ヒト若しくは他の生物、又は細胞から単離されるか、あるいは合成によって製造され得る。また、単独又は組み合わせでの組織の粗抽出物、細胞外マトリックス材料、又は非天然組織の抽出物が企図される。細胞、組織、器官、及び腫瘍を含むが、これらに限定されない、生物学的材料の抽出物も含まれ得る。
【００３９】
様々な実施形態では、足場はさらに、１つ又は複数の合成材料を含み得る。合成材料は好ましくは、インビボ又はインビトロでの適用に生物学的に適合する。そのようなポリマーは、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：ポリ（ウレタン）、ポリ（シロキサン）又はシリコーン、ポリ（エチレン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリル酸）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ナイロン、ポリアミド、ポリ無水物、ポリ（エチレン−コ−ビニルアルコール）（ＥＶＯＨ）、ポリカプロラクトン、ポリ（酢酸ビニル）（ＰＶＡ）、ポリビニル水酸化物、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）及びポリオルトエステル又は開発され得る任意の他の類似の合成ポリマーであって、生物学的に適合性のもの。カチオン性部分を有するポリマー、例えばポリ（アリルアミン）、ポリ（エチレンイミン）、ポリ（リジン）、及びポリ（アルギニン）を使用することもできる。ポリマーは任意の分子構造を有してもよく、斯かる分子構造は、これらに限定されるものではないが、線形、分岐、グラフト、ブロック、星形、くし形、及びデンドリマー構造を含む。
【００４０】
一実施形態では、足場はさらに、１つ又は複数の天然又は合成薬、例えば非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、抗生物質、例えばペニシリンを含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、天然ペプチド、例えばグリシル−アルギニル−グリシル−アスパルチル−セリン（ＧＲＧＤＳ）、アルギニルグリシルアスパラギン酸（ＲＧＤ）、及びアメロゲニンを含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、タンパク質、例えばキトサン及びシルクを含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、スクロース、フルクトース、セルロース、又はマンニトールを含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、細胞外マトリックスタンパク質、例えばフィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、及びヴィクサパチン（vixapatin）（ＶＰ１２）を含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、ディスインテグリン（disintegrins）、例えばＶＬＯ４を含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、脱細胞化組織又は脱塩（demineralized）組織を含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、合成ペプチド、例えばエムドゲイン（emdogain）を含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、栄養素、例えばウシ血清アルブミンを含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、ビタミン、例えばビタミンＢ２、ビタミンＡｄ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、及びビタミンＫを含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、核酸、例えばｍＲＮＡ及びＤＮＡを含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、天然又は合成ステロイド及びホルモン、例えばデキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、エストロゲン、及びその誘導体を含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、成長因子、例えば繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、及び上皮成長因子（ＥＧＦ）を含むことができる。一実施形態では、足場はさらに、送達ビヒクル、例えばナノ粒子、微小粒子、リポソーム、ウイルス及び非ウイルストランスフェクション系を含むことができる。
【００４１】
一実施形態では、足場は無細胞で提供される。別の実施形態では、足場は、人工組織コンストラクトを形成するために、１つ又は複数の細胞集団を予め播種して設けられている。人工組織コンストラクトは、細胞集団が患者自身の組織に由来する自家であっても、あるいは細胞集団が患者と同じ種内の別の対象に由来する同種異系であってもよい。人工器官コンストラクトはまた、異なる細胞集団が対象とは異なる哺乳動物種に由来する異種であってもよい。例えば、細胞は、哺乳動物、例えばヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、及びヒツジの器官に由来してもよい。
【００４２】
細胞は、例えば生体からの生検及び死体からの臓器全体の回復を含む多くの供給源から単離することができる。単離された細胞は好ましくは、レシピエントとなることが意図される対象からの生検によって得られる自家細胞である。生検は、生検針を使用して取得することができ、急速作用針は手順を迅速かつ簡単にする。
【００４３】
細胞は、当業者に既知の技法を用いて単離することができる。例えば、組織は、機械的に分解し、並びに／あるいは消化酵素及び／又はキレート剤で処理することができ、斯かる処理は隣接細胞間の結合を弱め、大幅な細胞破壊無しに組織を個々の細胞の懸濁液に分散することを可能にする。酵素的解離は、組織を細かく刻み、いくつかの消化酵素を単独で又は組み合わせて刻んだ組織を処理することによって達成される。消化酵素には、これらに限定されるものではないが、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、及び／又はヒアルロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼ及びディスパーゼが含まれる。機械的破壊はまた、組織の表面の削り、グラインダー、ブレンダー、篩、ホモジナイザー、圧力セル、又は超音波処理器の使用を含むがこれらに限定されない多くの方法によって達成される。
【００４４】
組織が個々の細胞の懸濁液まで小さくなると、懸濁液は、細胞要素が得られる部分集団に分画され得る。これはまた、細胞分離のための標準技術を用いて達成することができ、斯かる技術は、これらに限定されるものではないが、特定の細胞タイプのクローニング及び選抜、不要な細胞の選択的破壊（ネガティブ選抜）、混合集団での細胞凝集能の違いに基づく分離、凍結融解手順、混合集団における細胞の異なる付着特性、濾過、従来の遠心分離及びゾーン遠心分離、遠心溶出法（centrifugal elutriation）（対流遠心分離（counterstreaming centrifugation））、単位重力分離、向流分配、電気泳動及び蛍光活性化セルソーティングを含む。
【００４５】
例えば、ドナーが疾患、例えば癌又は所望の組織への他の腫瘍の転移を有する場合に、細胞分画が望ましい場合もある。細胞集団は、正常な非癌性細胞から悪性細胞又は他の腫瘍細胞を分離するためにソートされ得る。１つ又は複数のソート技術から単離された正常な非癌性細胞は、次に組織再構築に使用することができる。
【００４６】
単離された細胞を、インビトロで培養して、生体模倣足場に播種するために利用可能な細胞数を増加してもよい。組織拒絶を防ぐために、同種異形細胞の使用、より好ましくは自家細胞の使用が好ましい。しかしながら、人工器官の移植後に対象において免疫応答が生じた場合、対象は、拒絶の可能性を減らすために、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン又はＦＫ５０６で治療され得る。特定の実施形態では、キメラ細胞、又はトランスジェニック動物からの細胞が、生体適合性足場上に播種され得る。
【００４７】
単離された細胞は、遺伝物質でコーティングする前にトランスフェクトされ得る。有用な遺伝物質は、例えば、宿主の免疫応答を低減又は排除することができる遺伝子配列であり得る。例えば、細胞表面抗原、例えばクラスＩ及びクラスＩＩ組織適合性抗原の発現が抑制され得る。これは、移植された細胞の宿主による拒絶の可能性を低下させ得る。さらに、遺伝子導入のためにトランスフェクションを使用することもできる。
【００４８】
単離された細胞は、正常であるか、あるいは追加の又は正常な機能を提供するために遺伝的に操作されていてもよい。レトロウイルスベクター、ポリエチレングリコール、又は当業者に既知の他の方法を用いて細胞を遺伝的に操作するための方法が使用され得る。これらには、細胞において核酸を輸送及び発現する発現ベクターを用いるものが含まれる。（Goeddel;Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185、Academic Press、San Diego、Calif.（1990）参照）。ベクターＤＮＡは、従来の形質転換又はトランスフェクション技術によって原核生物又は細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための好適な方法は、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual、3nd Edition、Cold Spring Harbor Laboratory press（2001））、及び他の実験教科書に見出すことができる。
【００４９】
足場上への細胞の播種は標準的な方法に従って行うことができる。例えば、組織修復に使用するためのポリマー基板上への細胞の播種が報告されている（例えば、Atala, A.et al.、J. Urol.148（2 Pt 2）: 658-62（1992）;Atala, A., et al. J. Urol.150（2 Pt 2）: 608-12（1993）参照）。培養で増殖した細胞をトリプシン処理して細胞を分離し、分離した細胞を足場上に播種してもよい。あるいは、細胞培養から得られた細胞を細胞層として培養プレートから採取し、細胞を事前に分離することなく、細胞層を足場上に直接播種してもよい。
【００５０】
一実施形態では、１００万〜５０００万細胞の範囲が培地に懸濁され、足場の表面の各平方センチメートルに適用される。足場は、細胞が付着するまでの期間、例えば３７℃、５％ＣＯ2のような標準的な培養条件下でインキュベートされる。しかしながら、足場上に播種される細胞の密度は異なってもよいことが理解されよう。例えば、より高い細胞密度は、播種された細胞によってより高い組織再生を促進するが、より低い密度は、宿主から移植片へと浸潤する細胞によって組織の比較的高い再生を可能にし得る。他の播種技術も、マトリックス又は足場及び細胞に応じて使用することができる。例えば、細胞は、真空濾過によってマトリックス又は足場に適用されてもよい。細胞タイプの選択、及び足場上への細胞の播種は、本明細書の教示に照らして当業者にとって日常的なものであろう。
【００５１】
一実施形態では、足場に細胞の１つの集団を播種して、人工組織コンストラクトを形成する。別の実施形態では、足場は、２つの面に２つの異なる細胞集団で播種される。これは、足場の１つの面に第１の播種し、次いで他の面に播種することによって行われる。例えば、足場は、片側を上にして配置され、播種され得る。次に、足場は、第２の面が上になるように再配置され得る。次に、第２の面は第２の細胞集団で播種され得る。あるいは、足場の両面が同時に播種されてもよい。例えば、２つの細胞チャンバは、足場の両面（すなわち、サンドイッチ）に配置されてもよい。２つのチャンバは、異なる細胞集団で充填されて、足場の両面に同時に播種することができる。サンドイッチされた足場は、両方の細胞集団が均等に付着する機会を与えるために、回転又は反転し得る。
【００５２】
別の実施形態では、２つの別個の足場に異なる細胞集団を播種することができる。播種後に、２つの足場は結合されて、２つの面に２つの異なる細胞集団を有する単一の足場を形成し得る。足場の相互の結合は、標準的な手順、例えばフィブリン接着剤、液体コポリマー、縫合糸などを用いて行うことができる。
【００５３】
本願発明の足場上での細胞増殖を促進するために、足場は、１つ又は複数の細胞接着増強剤でコーティングされ得る。これらの剤は、コラーゲン、ラミニン、及びフィブロネクチンを含むが、これらに限定されない。足場はまた、足場上で培養された細胞を含み、標的組織代替物を形成し得る。代替では、他の細胞が、本願発明の足場上で培養され得る。
【００５４】
作製方法
本発明はまた、本願発明の足場を作製する方法に関する。当該方法は、電気処理することと、電気処理された足場を水和し、浸漬したコンストラクトを凍結し、それを凍結乾燥する処理後プロセスとを組み合わせる。この方法は、水和及び凍結乾燥された足場を生成し、これは犠牲材料と組み合わせて、本願発明の独自の傾斜多孔質足場を生成する。
【００５５】
ここで、図２を参照すると、傾斜多孔質足場を作製する例示的な方法１００が示される。方法１００は、ステップ１１０で始まり、当該ステップでは、植物タンパク質溶液を犠牲材料とともに電気処理して、複合足場を形成する。植物タンパク質溶液及び犠牲材料は、同じ回転基板上に、同時に、さらには別々に、電気的に堆積されることに留意することが重要である。特定の実施形態では、植物タンパク質溶液及び犠牲材料は、植物タンパク質溶液及び犠牲材料堆積の軌跡が互いに９０度に配向されるように堆積される。ステップ１２０では、犠牲材料は複合足場から除去されて、植物タンパク質足場を残す。ステップ１３０では、植物タンパク質足場は水溶液で水和される。ステップ１４０では、植物タンパク質足場は水溶液から取り出した後に凍結される。ステップ１５０では、凍結した植物タンパク質足場は凍結乾燥され、傾斜多孔質足場を形成する。凍結乾燥は−６０℃及び０．０８ｍｂａｒで行われる。
【００５６】
ＳＰＩ溶液は任意の好適な方法で調製することができる。例えば、ＳＰＩ溶液は、１，１，１，３，３，３，−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＰ）溶液中に溶解したＳＰＩを含み得る。いくつかの実施形態では、ＳＰＩ溶液は、一定量の犠牲材料を含むことができる。一実施形態では、ＳＰＩ溶液は、ＨＦＰに溶解した７％（ｗ／ｖ）のＳＰＩ及び０．０５％（ｗ／ｖ）ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を含む。
【００５７】
犠牲材料溶液は任意の好適な方法で調製することができる。特定の実施形態では、犠牲材料は、ステップ１２０及びステップ１３０が同時に行われるように水溶性である（犠牲繊維は水和ステップ中に除去される）。一実施形態では、犠牲材料は、９０％エタノールに溶解した３％（ｗ／ｖ）ＰＥＯを含む。他の実施形態では、犠牲材料は、ポリエチレンオキシド、ポリビニルアルコール、又はデキストランを含むことができる。
【００５８】
一実施形態では、電気処理は、エレクトロスピニングである。ＳＰＩ溶液及び犠牲材料溶液が同時紡糸される条件は、任意の好適な範囲、例えば本明細書に開示された範囲内で行われる。例えば、エレクトロスピニングプロセスが使用される電界は、約５〜約５０ｋＶ、より好ましくは約１０〜約３０ｋＶの範囲であり得る。スピナレット（spinneret）へのスピニング溶液の送り速度（feed rate）は、約０．１〜約３ｍＬ／時間、より好ましくは約０．５〜約１．５ｍＬ／時間の範囲内であり得る。スピナレットは、個別に又は両方、１つ又は複数の追加のエアジェットで補充され得る。スピナレットは、回転基板から同じ距離であるか、それらは、ＳＰＩ溶液及び犠牲材料溶液について異なる距離であり得る。
【００５９】
回転基板が典型的には、通常ドリルチャックを介して、モーターに機械的に結合されたマンドレルを含むことを当業者は理解するであろう。様々な実施形態では、モーターは、約１毎分回転数（revolution per minute）（ｒｐｍ）〜約４０，０００ｒｐｍの速度でマンドレルを回転させる。１つの例示的な実施形態では、モーター回転速度は約１０００ｒｐｍ〜約４０００ｒｐｍである。別の例示的な実施形態では、モーター回転速度は約１ｒｐｍ〜約３００ｒｐｍである。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ＳＰＩ溶液、犠牲溶液、又はその両方はさらに付加的なポリマーを含んでもよい。ポリマーの非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：ポリウレタン、ポリシロキサン又はシリコーン、ポリエチレン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリメチルメタクリレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド、ポリエチレン−コ−酢酸ビニル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリメタクリル酸、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリスチレン、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリカーボネートなど。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ＳＰＩ溶液、犠牲溶液、又はその両方はさらに付加的な治療薬を含んでもよい。治療薬の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：麻酔薬、抗アレルギー薬、抗ヒスタミン薬、かゆみ止め薬、筋弛緩薬、鎮痛薬、解熱薬、ビタミン、抗菌薬、防腐剤、消毒薬、殺菌剤、外部寄生虫駆除薬（ectoparasiticides）、駆虫薬、アルカロイド、塩、イオン、抗炎症薬、創傷治癒剤、植物抽出物、成長因子、ポリカーボネート、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分、例えばＥＣＭタンパク質、皮膚軟化剤、抗菌剤又は抗ウイルス剤、精神安定剤、鎮咳剤、ナノ粒子、例えば銀イオン、細胞、例えば幹細胞、上皮細胞、内皮細胞など。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ＳＰＩ溶液、犠牲溶液、又はその両方はさらに付加的な動物又は植物タンパク質を含んでもよい。非限定的な例としては、以下のものが挙げられる：ゼラチン、マトリゲル、ケラチン、コラーゲン、エラスチン、フィブリン、ヒアルロン酸、グリコサミノグリカン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、キトサン、及び大豆キトサン。
【００６３】
本発明のキット
本発明はキットも含み、斯かるキットは、本発明の方法内で有用な成分と、例えば足場を使用する方法を説明する指示資料とを含む。キットは、本発明の方法を実施するのに有用な成分及び材料を含んでもよい。例えば、キットは、ＳＰＩ及び犠牲材料のスピニング溶液を含んでもよい。特定の実施形態では、キットは、予め形成された足場を含んでもよい。他の実施形態では、キットはさらに、細胞培養及び外科用器具を含む。
【００６４】
一実施形態では、キットは創傷治療用である。例えば、キットは、小、中、大、及び特大のような予め設定されたサイズを有する足場を含んでもよく、ここで、オペレータは、創傷に合うよう適切にサイズ調整した足場を有する適切なキットを選択することができる。キットはさらに、包帯、抗生物質、又は創傷再生を促進する他の薬物を含んでもよい。
【００６５】
いくつかの実施形態では、キットはさらに、組成物の総重量で約０．００５％〜２．０％の保存剤に入れられた足場を含んでもよい。保存剤は、環境中での汚染物質に曝露した場合に腐敗を防ぐために使用される。本発明に従って有用な保存剤の例としては、これらに限定されるものではないが、ベンジルアルコール、ソルビン酸、パラベン、イミド尿素（imidurea）、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される保存剤が挙げられる。一実施形態では、保存剤は、約０．５％〜２．０％のベンジルアルコールと０．０５％〜０．５％のソルビン酸との組み合わせである。
【００６６】
特定の実施形態では、キットは、指示資料を含む。指示資料は、出版物、記録、図表、又は本明細書に記載のデバイス又はインプラントキットの有用性を伝えるために使用できる他の任意の表現媒体を含み得る。本発明のキットの指示資料は、例えば、所望の手順に必要であり得る１つ又は複数の機器を含むパッケージに貼り付けられていてもよい。あるいは、指示資料は、パッケージとは別に出荷されるか、又は通信ネットワーク、例えばインターネットを介して電子的にアクセス可能であってもよい。
【実施例】
【００６７】
実験例
本発明は、以下の実験例を参照することによってさらに詳細に説明される。これらの例は、例示の目的のためのみに提供され、特に指定がない限り限定的であることを意図しない。したがって、本発明は、決して以下の例に限定されるものと解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供された教示の結果として明らかになるありとあらゆる変形を包含すると解釈されるべきである。
【００６８】
さらなる説明なしに、当業者は、前述の説明及び以下の例示的な例を使用して、本発明の化合物を作製及び利用し、特許請求の範囲に記載の方法を実施することができると考えられる。それゆえ、以下の実施例は、本願発明の例示的な実施形態を具体的に指摘するものであり、決して本開示の残りを限定するものと解釈されるべきではない。
【００６９】
実施例１：傾斜水和凍結乾燥（ＧＨＬ）足場
本研究の目標は、足場の深部への細胞浸透を可能にするのに十分大きな細孔を有する繊維足場を開発することであり、これは、マクロファージの組織リモデリングＭ２表現型への切り替えを開始／促進し、したがって再生創傷治癒を促進することが報告されている（Garg K et al.、Biomaterials 34.18（2013）: 4439-4451;Wang Z et al.、Biomaterials 35.22（2014）: 5700-5710;Sussman EM et al.、Annals of biomedical engineering 42.7（2014）: 1508-1516）。
【００７０】
繊維足場の主成分は精製された大豆タンパク質単離物（ＳＰＩ）であり、これは、インビトロでの細胞の付着、拡散及び増殖を可能にすることが示されている系列的な（paradigmatic）生体適合性生体材料である（Lin L et al.、Journal of tissue engineering and regenerative medicine 7.12（2013）: 994-1008）。足場の犠牲成分はポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）であり、これは容易に入手可能かつ水に可溶性の安価なポリマー化合物である。スピニング溶液については、７％（ｗ／ｖ）のＳＰＩ＋０．０５％（ｗ／ｖ）のポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を１，１，１，３，３，３，−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＰ）に溶解し、ＰＥＯスピニング溶液については、３％（ｗ／ｖ）ＰＥＯを９０％エタノールに溶解した。２つの成分を共電界紡糸（co-electrospun）し、得られた足場を後処理した。水和ステップ中、ＰＥＯを除去し；凍結ステップにより、傾斜多孔性が得られる。
【００７１】
具体的には、共紡糸システムは、いずれも１３ｋＶの高電圧静電場に接続された別々のＳＰＩ及びＰＥＯスピナレットを提供した。ＰＥＯスピナレットを、１ｂａｒの圧力で作動する追加のエアジェットに接続した。繊維を収集するために垂直回転マンドレルを使用した。２つのノズルを、互いに９０度で、かつマンドレルに垂直に配置した（図３）。この配置により、ＰＥＯの大きな繊維（〜２０μｍの直径）とＳＰＩの小さな繊維（〜１．２μｍの直径）とを含む繊維足場が作成される。複合ＳＰＩ／ＰＥＯ足場から犠牲繊維を除去するために、足場を水（４０℃）に一晩浸漬した（図４Ａ、図４Ｂ）。次に、浸漬した足場を−８０℃に２時間移した。凍結した試料を、−６０℃及び０．０８ｍｂａｒで一晩凍結乾燥した。得られたＧＨＬ足場及び規則的紡糸ＳＰＩの断面図をそれぞれ図５Ａ及び図５Ｂに示す。規則的紡糸ＳＰＩ足場については、７％（ｗ／ｖ）のＳＰＩ＋０．０５％（ｗ／ｖ）のポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）を１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＰ）に溶解し、静止した長方形のアルミニウムターゲット上に紡糸した。１３ｋＶの高電圧静電場で、１５ｃｍのアルミニウムターゲット距離へのスピナレットを用いて、エレクトロスピニングを行った。
【００７２】
インビトロ細胞研究は、規則的電界紡糸ＳＰＩ足場と比較して、本発明者らの新たに開発した足場の浸透性における有意な改善を明らかにした（図６Ａ、図６Ｂ、図７Ａ、図７Ｂ）。Sprague Dawleyラットを用いた動物研究を行って、ＧＨＬ足場の炎症反応の影響と、従来の電界紡糸ＳＰＩ足場により誘発される炎症反応とを比較した。下背部の右側と左側にそれぞれ１つずつ、２つの皮下ポーチ（subcutaneous pouches）を作成し、正方形の１０ｍｍ×１０ｍｍの足場をそれぞれに挿入した。１つはＧＨＬ足場であり、もう一つは従来紡糸のＳＰＩ対照であった。動物を手術の３、７、及び１０日後に安楽死させ、足場を取り巻く組織を採取して、組織学用に調製した。
【００７３】
足場を取り巻くコラーゲン性カプセルに隣接する領域に存在する全てのマクロファージを識別する汎マクロファージ抗体による組織の染色により、術後１０日の対照ＳＰＩ群と比較して、ＧＨＬ足場を標的とするマクロファージの数が有意に少ないことが明らかとなった（図８Ａ、図８Ｂ）。
【００７４】
本明細書で引用されるありとあらゆる特許、特許出願、及び刊行物の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本願は、特定の実施形態を参照して開示されたが、本発明の他の実施形態及び変形が、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、このような全ての実施形態及び等価な変形を含むと解釈されることを意図している。
【図１Ａ−１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−４Ｂ】
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【図５Ａ−５Ｂ】
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【図６Ａ−６Ｂ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ−１０Ｄ】
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【図１１】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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