(57)【要約】  本発明は、(i)アミノ酸配列GNTFTSYVMHを有するVHCDR1、アミノ酸配列YINPYNDGTKYNEKFKGを有するVHCDR2、及びアミノ酸配列STARATPYFYAMDYを有するVHCDR3を含む重鎖可変ドメインと、(ii)アミノ酸配列KSSQSLLWSVNQNSYLSを有するVLCDR1、アミノ酸配列GASIRESを有するVLCDR2、及びアミノ酸配列QHNHGSFLPYTを有するVLCDR3を含む軽鎖可変ドメインとを含む、CEACAM6に結合する抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片に関する。本発明はまた、がんの治療、予防又は検出のための抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片を含む組成物、抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片の使用方法及び抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片を含むキットにも関する。
2020510631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(i)アミノ酸配列GNTFTSYVMH(配列番号3)を有するVHCDR1、アミノ酸配列YINPYNDGTKYNEKFKG(配列番号4)を有するVHCDR2、及びアミノ酸配列STARATPYFYAMDY(配列番号5)を有するVHCDR3を含む重鎖可変ドメインと、(ii)アミノ酸配列KSSQSLLWSVNQNSYLS(配列番号6)を有するVLCDR1、アミノ酸配列GASIRES(配列番号7)を有するVLCDR2、及びアミノ酸配列QHNHGSFLPYT(配列番号8)を有するVLCDR3を含む軽鎖可変ドメインとを含む抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項２】
(i)及び(ii)の重鎖及び軽鎖CDR領域と約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%同一な重鎖及び軽鎖CDR領域を含む、請求項1に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項３】
重鎖可変領域が、配列番号1に記載のアミノ酸配列SGPELVKPGASVKMSCKASGNTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSTARATPYFYAMDYWGQGTSVTVSSを含む、請求項1に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号1に記載のアミノ酸配列と約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項3に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項５】
軽鎖可変領域が、配列番号2に記載のアミノ酸配列DILMTQSPSSLAVTAGEKVTMRCKSSQSLLWSVNQNSYLSWYQLKQGQPPKLLLYGASIRESWVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVHVEDLAVYYCQHNHGSFLPYTFGGGTKLEIKを含む、請求項1に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号2に記載のアミノ酸配列と約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項5に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項７】
抗原結合タンパク質が、モノクローナル、組み換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体;キメラ抗原受容体(CAR)、単一可変ドメイン、ドメイン抗体、抗原結合断片、免疫学的に有効な断片、単鎖Fv、単鎖抗体、ヒンジ領域を欠く一価抗体、ミニボディ、ダイアボディ、並びにTandabs(商標)からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項８】
結合タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項7に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項９】
モノクローナル抗体がGR 6A04である、請求項8に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項8又は9に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
モノクローナル抗体がキメラである、請求項8又は9に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片が、CEACAM6に結合する、請求項1から11のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片が、CEACAM6上のグリカンに結合する、請求項12に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項１４】
抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片が、CEACAM6上のN-結合グリカンに結合する、請求項13に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項１５】
コンジュゲートした放射性同位体又は細胞毒素を含む、請求項1から14のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項１６】
抗体が、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、メルタンシン(DM-1)、サポリン、ゲムシタビン、イリノテカン、エトポシド、ビンブラスチン、ペメトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、白金製剤(例えば、シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン)、ビノレルビン、カペシタビン、ミトキサントロン、イクサベピロン、エリブリン、5-フルオロウラシル、トリフルリジン及びチピラシルからなる群から選択される細胞毒素とコンジュゲートされている、請求項15に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項１７】
抗原結合タンパク質又は抗原結合断片が、CEACAM6に結合した際に細胞中に内部移行する、請求項1から16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項１８】
抗原結合タンパク質又は抗原結合断片が、CEACAM6に結合した際に細胞中に内部移行しない、請求項1から16のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項１９】
抗原結合タンパク質又は抗原結合断片が、ゲフィチニブ耐性の肺がん細胞、非小細胞性肺がん細胞、乳がん細胞、結腸直腸がん細胞に選択的に結合する、請求項1から18のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【請求項２０】
生理学的に許容される担体、及び治療有効量の、請求項1から19のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片を含む組成物。
【請求項２１】
1つ又は複数のさらなる治療化合物を含む、請求項20に記載の組成物。
【請求項２２】
がんを治療又は予防するための医薬の製造における、請求項1から19のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質若しくはその抗原結合断片、又は請求項20若しくは請求項21に記載の組成物の使用。
【請求項２３】
がんが、ゲフィチニブ耐性の肺がん、非小細胞性肺がん、乳がん、胃がん、小腸がん、食道がん及び結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項22に記載の使用。
【請求項２４】
医薬が、1つ又は複数のさらなる活性医薬成分とともに投与される、請求項22又は請求項23に記載の使用。
【請求項２５】
医薬が、化学療法とともに投与される、請求項22又は請求項23に記載の使用。
【請求項２６】
1つ若しくは複数のさらなる活性医薬成分又は化学療法が、前記医薬と別々に、同時に又は逐次的に投与される、請求項24又は25に記載の使用。
【請求項２７】
対象においてがんを検出するための方法であって、前記対象から得られる試料を、請求項1から19のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片とin vitroで接触させるステップ;前記試料中の前記抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片の結合を検出するステップ;前記結合を対照試料中の結合レベルと相関させて、前記試料中の結合レベルを決定するステップを含み、前記対照試料と比較した前記試料中の結合レベルの増加が、がんであることを示す、方法。
【請求項２８】
がんに罹患しやすい対象を特定するための方法であって、前記対象から得られる試料を、請求項1から19のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片とin vitroで接触させるステップ;前記試料中の前記抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片の結合を検出するステップ;前記結合を対照試料中の結合レベルと相関させて、前記試料中の結合レベルを決定するステップを含み、前記対照試料と比較した前記試料中の結合レベルの増加が、前記対象ががんに罹患しやすいことを示す、方法。
【請求項２９】
対照試料が、同じ対象由来のものである、請求項27又は28に記載の方法。
【請求項３０】
対照試料が、異なる対象由来のものである、請求項27又は28に記載の方法。
【請求項３１】
抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片が、CEACAM6に結合する、請求項27から30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片が、検出可能な標識を含む、請求項27から31のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
検出可能な標識が、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識及び放射性核種標識からなる群から選択される、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
検出可能な標識が、ビオチン、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、FITC、PE及びCy色素からなる群から選択される、請求項32又は請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
検出可能な標識が、フローサイトメトリー、組織切片、免疫蛍光法、免疫細胞化学法又は免疫組織化学法から選択されるアッセイにおいて検出される、請求項32から34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
がんが、ゲフィチニブ耐性の肺がん、非小細胞性肺がん、乳がん、胃がん、小腸がん、食道がん及び結腸直腸がんからなる群から選択される、請求項27から35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
請求項27から36のいずれか一項に記載の方法において使用するときのキットであって、使用説明書と一緒に、請求項1から19のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体があらゆる目的のために参照により本明細書に援用される、2016年10月10日に出願されたシンガポール出願番号第10201608481W号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
本発明は一般に、抗体に関する。特に、本発明は抗CEACAM6モノクローナル抗体及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
癌胎児性抗原関連細胞接着分子6(CEACAM6)は、癌胎児性抗原(CEA)ファミリーに属する。CEACAM6は、乳がん、膵癌、結腸癌及び非小細胞肺がんを含む様々ながんにおいて過剰発現されることが観察されている、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型細胞表面糖タンパク質である。CEACAM6は、腫瘍において癌遺伝子として働き、がん浸潤、転移、アノイキス耐性及び化学耐性を促進し、分化を阻害する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】WO 00/29004
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)
【非特許文献２】Ausubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987)
【非特許文献３】Holliger及びHudson、Nature Biotechnology、2005、Vol 23、No.9、1126〜1136
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現在までのところ、抗体療法のために又はがん治療用の抗体-薬物複合体として使用できる抗CEACAM6モノクローナル抗体の数は非常に限られている。そのため、抗体療法のために又はがん治療用の抗体-薬物複合体として使用できる、CEACAM6に対する新規な抗体を開発することが必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、(i)アミノ酸配列GNTFTSYVMH(配列番号3)を有するVHCDR1、アミノ酸配列YINPYNDGTKYNEKFKG(配列番号4)を有するVHCDR2及びアミノ酸配列STARATPYFYAMDY(配列番号5)を有するVHCDR3を含む重鎖可変ドメインと、(ii)アミノ酸配列KSSQSLLWSVNQNSYLS(配列番号6)を有するVLCDR1、アミノ酸配列GASIRES(配列番号7)を有するVLCDR2、及びアミノ酸配列QHNHGSFLPYT(配列番号8)を有するVLCDR3を含む軽鎖可変ドメインとを含む抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片が提供される。
【０００８】
別の態様では、生理学的に許容される担体、及び治療有効量の本明細書で開示されている抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片を含む組成物が提供される。
【０００９】
別の態様では、がんを治療又は予防するための医薬の製造における、本明細書で開示されている抗原結合タンパク質若しくはその抗原結合断片、又は本明細書で開示されている組成物の使用が提供される。
【００１０】
別の態様では、がんの治療又は予防において使用するための、本明細書で開示されている抗原結合タンパク質若しくはその抗原結合断片、又は本明細書で開示されている組成物が提供される。
【００１１】
別の態様では、がんを治療又は予防する方法であって、本明細書で開示されている抗原結合タンパク質若しくはその抗原結合断片、又は本明細書で開示されている組成物を、それを必要としている対象に投与するステップを含む方法が提供される。
【００１２】
別の態様では、対象においてがんを検出するための方法であって、対象から得られる試料を、本明細書で開示されている抗原結合タンパク質若しくはその抗原結合断片と、in vitroで接触させるステップ、試料中の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片の結合を検出するステップ、上記結合を対照試料中の結合レベルと相関させて、試料中の結合レベルを決定するステップを含み、対照試料と比較した試料中の結合レベルの増加が、がんであることを示す、方法が提供される。
【００１３】
別の態様では、がんに罹患しやすい対象を特定するための方法であって、対象から得られる試料を、本明細書で開示されている抗原結合タンパク質若しくはその抗原結合断片と、in vitroで接触させるステップ、試料中の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片の結合を検出するステップ、上記結合を対照試料中の結合レベルと相関させて、試料中の結合レベルを決定するステップを含み、対照試料と比較した試料中の結合レベルの増加が、対象ががんに罹患しやすいことを示す、方法が提供される。
【００１４】
一態様では、本明細書で開示されている方法において使用するときのキットであって、使用説明書と一緒に、本明細書で開示されている抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片を含むキットが提供される。
【００１５】
定義
以下は、本発明の記載を理解するのに役立ち得るいくつかの定義である。これらは一般的な定義として意図されており、本発明の範囲を決してそれらの用語だけに限定するべきではないが、以下の記載をよりよく理解するために述べられている。
【００１６】
本明細書において使用される「抗原結合タンパク質」という用語は、CEACAM6に結合できる抗体、抗体断片及び他のタンパク質構築物、例えばドメインなどを指す。
【００１７】
「抗体」という用語は、最も広い意味で本明細書において使用されて、免疫グロブリン様ドメインを有する分子を指し、モノクローナル、組み換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体;キメラ抗原受容体(CAR)、単一可変ドメイン、ドメイン抗体、抗原結合断片、免疫学的に有効な断片、単鎖Fv、ダイアボディ、Tandabs(商標)などを含む(代替の「抗体」フォーマットの概要については、Holliger及びHudson、Nature Biotechnology、2005、Vol 23、No.9、1126〜1136を参照されたい)。
【００１８】
「単一可変ドメイン」という語句は、異なる可変領域又はドメインとは独立して、抗原又はエピトープと特異的に結合する抗原結合タンパク質可変ドメイン(例えば、VH、VHH、VL)を指す。
【００１９】
「ドメイン抗体」又は「dAb」は、抗原に結合できる「単一可変ドメイン」と同じと考えることができる。単一可変ドメインは、ヒト抗体可変ドメインであってもよいが、げっ歯類動物(例えば、WO 00/29004に開示されている)、テンジクザメ及びラクダ科動物VHH dAbなどの他の種由来の単一抗体可変ドメインもまた含む。ラクダ科動物VHHは、天然に軽鎖がない重鎖抗体を産生する、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、及びグアナコを含む種に由来する、免疫グロブリン単一可変ドメインポリペプチドである。そのようなVHHドメインは、当技術分野において利用可能な標準的な技術に従ってヒト化されていてもよく、そのようなドメインは、「ドメイン抗体」であるとみなされる。本明細書で使用される場合、VHは、ラクダ科動物VHHドメインを含む。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、タンパク質の残りの部分とは独立した三次構造を有するフォールディングしたタンパク質構造を指す。一般に、ドメインは、タンパク質の別個の機能特性に関与しており、多くの場合、タンパク質の残部及び/又はドメインの機能を損なうことなく、付加、除去又は他のタンパク質に移動してもよい。「単一可変ドメイン」は、抗体可変ドメインの特徴的な配列を含むフォールディングしたポリペプチドドメインである。したがって単一可変ドメインは、完全な抗体可変ドメイン及び改変された可変ドメイン、例えば、1つ若しくは複数のループが、抗体可変ドメインに特徴的でない配列で置き換えられているもの、又はトランケートされた若しくはN若しくはC末端伸長部を含む抗体可変ドメイン、並びに完全長ドメインの少なくとも結合活性及び特異性を保持する可変ドメインのフォールディングした断片を含む。ドメインは、異なる可変領域又はドメインとは独立して、抗原又はエピトープに結合することができる。
【００２１】
抗原結合断片は、ドメインなどの非抗体タンパク質足場上に1つ又は複数のCDRを配置することによって提供されてもよい。ドメインはドメイン抗体であってもよく、又は天然リガンド以外のCEACAM6などの抗原に対する結合を可能にするためにタンパク質工学に供された、CTLA-4、リポカリン、SpA、Affibody、アビマー、GroEl、トランスフェリン、GroES及びフィブロネクチン/アドネクチンからなる群から選択される足場の誘導体であるドメインであってもよい。
【００２２】
抗原結合断片又は免疫学的に有効な断片は、部分的な重鎖又は軽鎖可変配列を含んでもよい。断片は、少なくとも5、6、8又は10アミノ酸長である。代替として、断片は少なくとも15、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも75、又は少なくとも100アミノ酸長である。
【００２３】
抗原結合タンパク質との関連で本明細書全体にわたって使用される「特異的に結合する」という用語は、抗原結合タンパク質が、CEACAM6に結合し、他の(例えば、無関係の)タンパク質には全く結合しないか又はわずかにしか結合しないことを意味する。しかしながら、この用語は、抗原結合タンパク質が、密接に関連する分子とも交差反応性でありうることを排除しない。本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、密接に関連する分子に結合するより少なくとも2、5、10、50、100、又は1000倍高い親和性で、CEACAM6に結合しうる。
【００２４】
本明細書全体にわたって使用される「中和する」という用語は、CEACAM6の生物学的活性が、in vitro又はin vivoで、抗原結合タンパク質の非存在下でのCEACAM6の活性と比較して、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の存在下で低減することを意味する。中和は、CEACAM6がその受容体に結合するのをブロックすること、CEACAM6がその受容体を活性化するのを阻止すること、CEACAM6若しくはその受容体を下方制御すること、又はエフェクター機能に影響を及ぼすことのうちの1つ又は複数に起因しうる。生物学的活性の低減又は阻害は、部分的又は全体的なものであってもよい。中和抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質の非存在下でのCEACAM6活性と比べて、CEACAM6の活性を少なくとも20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、82%、84%、86%、88%、90%、92%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は100%中和しうる。中和は、当業者に知られている又は本明細書に記載されている1つ又は複数のアッセイを使用して決定又は測定することができる。例えば、CEACAM6に結合する抗原結合タンパク質は、サンドイッチELISA、BIAcore(商標)、FMAT、FORTEbio、又は同様のin vitroアッセイにおいて評価することができる。
【００２５】
「CDR」は、抗原結合タンパク質の相補性決定領域アミノ酸配列と定義される。これらは、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の超可変領域である。免疫グロブリンの可変部分には、3つの重鎖及び3つの軽鎖CDR(又はCDR領域)が存在する。よって、本明細書で使用される「CDR」は、全ての3つの重鎖CDR、全ての3つの軽鎖CDR、全ての重鎖及び軽鎖CDR、又は少なくとも2つのCDRを指す。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、特定の遺伝子の転写を開始するDNAの領域を指すことを意図する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「がん性の」という用語は、がんに罹患していること又はがんに特徴的な異常を示すことに関する。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「生体試料」又は「試料」という用語は、患者から得られた、取り出された又は単離された、患者由来の組織又は細胞の試料を意味する。
【００２９】
本明細書で使用される「〜から得られた又は由来する」という用語は、包括的に使用されることを意味する。すなわち、生体試料から直接単離されるあらゆるヌクレオチド配列又はその試料に由来するあらゆるヌクレオチド配列を包含することが意図される。
【００３０】
本明細書に記載の方法は、新鮮な組織、凍結組織、パラフィン保存組織及び/又はエタノール保存組織の試料において使用するために好適である。試料は生体試料であってもよい。生体試料の非限定的な例としては、全血又はその構成成分(例えば、血漿、血清)、尿、唾液  リンパ液、胆汁液(bile fluid)、痰、涙液、脳脊髄液、気管支肺胞洗浄液、滑液、精液、がん性腹水(ascitic tumour fluid)、母乳及び膿が挙げられる。一実施態様では、核酸の試料は、血液、羊水又は頬側スミアから得られる。好ましい実施形態において、試料は全血試料である。
【００３１】
本明細書で企図される生体試料は、培養細胞に由来する試料、例えば、培養細胞から回収された培養培地又は細胞ペレットなどを含む、培養された生体材料を含む。したがって、生体試料は、全生物体(whole organism)又はその組織、細胞若しくは構成部分の部分集合から調製された溶解物、ホモジネート又は抽出物、又はその画分若しくは部分を指しうる。生体試料はまた、例えば、1つ若しくは複数の構成成分の精製、希釈、及び/又は遠心分離によって、使用前に改変されてもよい。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「検出可能な標識」又は「レポーター」という用語は、核酸に付着することができる検出可能なマーカー又はレポーター分子を指す。典型的な標識は、フルオロフォア、放射性同位体、リガンド、化学発光剤、金属ゾル及びコロイド、並びに酵素を含む。標識化するための方法及び様々な目的のために有用な標識を選択する際の手引きは、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)及びAusubelら、Current Protocols in Molecular Biology、Greene Publishing Associates and Wiley-Intersciences (1987)において論じられている。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「がんに罹患しやすい」又は「がんの易罹患性」という用語は、対象ががんを発症する見込みを指す。この用語は、対象が100%確実にがんを発症することを示すわけではない。そうではなく、「がんに罹患しやすい」という用語は、「がんに罹患しやす」くない個体と比較した場合に対象ががんを発症する確率が増加することを指す。
【００３４】
本明細書で使用される場合、製剤の構成成分の濃度に関連して「約」という用語は、典型的には、記載値の+/-5%、より典型的には記載値の+/-4%、より典型的には記載値の+/-3%、より典型的には、記載値の+/-2%、さらにより典型的には記載値の+/-1%、及びさらにより典型的には記載値の+/-0.5%を意味する。
【００３５】
本開示全体にわたって、ある特定の実施形態は、範囲形式で開示されうる。範囲形式での記載は、便宜上及び簡潔にするためだけのものであり、開示されている範囲のスコープに対する変更できない限定と解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、ある範囲の記載は、全ての可能な部分範囲並びにその範囲内の個々の数値を明確に開示していると考えるべきである。例えば、1から6までなどの範囲の記載は、1から3まで、1から4まで、1から5まで、2から4まで、2から6まで、3から6までなどの部分範囲並びにその範囲内の個々の数字、例えば、1、2、3、4、5、及び6を明確に開示していると考えるべきである。このことは、範囲の広さに関係なく当てはまる。
【００３６】
ある特定の実施形態は、本明細書において広く一般的に記載されることもある。一般的な開示に入るより狭い種及び亜属群のそれぞれもまた、本開示の一部を形成する。これには、削除された材料が本明細書に明確に記載されているかどうかにかかわらず、その属から任意の対象を排除するという条件又は否定的な限定を含む実施形態の一般的な記載が含まれる。
【００３７】
文脈上別段の解釈を要する又はそれと反対の明確な記述がある場合を除き、単数の整数、ステップ又は要素として本明細書に記載されている本発明の整数、ステップ、又は要素は、記載されている整数、ステップ又は要素の単数及び複数の形態の両方を、明らかに包含する。
【００３８】
「実質的に」という単語は、「完全に」を排除せず、例えばYを「実質的に含まない」組成物は、Yを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、「実質的に」という単語は、本発明の定義から省略してもよい。
【００３９】
本明細書において例示的に記載されている本発明は、本明細書で明確に開示されていない何らの1つ又は複数の要素、1つ又は複数の限定が存在しなくても、適切に実施されうる。よって、例えば、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「含有する(containing)」などの用語は、限定することなく広範囲に理解されるものとする。加えて、本明細書で用いる用語及び表現は、限定のためではなく説明のための用語として使用されており、そのような用語及び表現を使用する際に、示されている及び記述されている特徴の均等物又はその部分を除外する意図はないが、特許請求されている本発明の範囲内で様々な変更形態が可能であることが認識される。よって、好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって本発明を詳細に開示しているが、本明細書に開示されている本発明を具体化した変更形態及び変形形態を、当業者は実施可能であること、並びにそのような変更形態及び変形形態が本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。
【００４０】
本発明は、本明細書において広く一般的に記載されている。一般的な開示に入るより狭い種及び亜属群のそれぞれもまた、本発明の一部を形成する。これには、削除された材料が本明細書に明確に記載されているかどうかにかかわらず、その属から任意の対象を排除するという条件又は否定的な限定を含む本発明の一般的な記載が含まれる。
【００４１】
別の実施形態は、以下の特許請求の範囲及び非限定的な実施例の範囲内である。加えて、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群によって記載されている場合、当業者は、本発明がそれによってまた、マーカッシュ群の任意の個々の構成要素又は構成要素の下位群に関しても記載されていることを認識するであろう。
【００４２】
本発明は、非限定的な実施例及び添付の図面と併せて考察すれば、発明を実施するための形態を参照してよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】PC-9からゲフィチニブ耐性クローンを作製するための方法並びにモノクローナル抗体パネルの作製の免疫化及びハイブリドーマ融合に使用した細胞系を示すフローダイヤグラムである。
【図２Ａ】免疫GR系、CL75、CL86及びCL131におけるGR6A04のフローサイトメトリー結合を示す図である。ゲーティングは、各細胞系について陰性対照のM=2%で実施した。ヨウ化プロピジウム染色(FL-3)を行わない場合、mAb GR 6A04結合による固有の細胞毒性は示されない。
【図２Ｂ】親PC-9及び別のGR PC-9系におけるGR6A04のフローサイトメトリー結合を示す図である。ゲーティングは、各細胞系について陰性対照のM=2%で実施した。ヨウ化プロピジウム染色(FL-3)を行わない場合、mAb GR 6A04結合による固有の細胞毒性は示されない。
【図３Ａ】A)PC-9及び派生ゲフィチニブ耐性クローン、B)NSCLC系、C)HCC827及び派生ゲフィチニブ耐性クローン、D)乳がん系、E)結腸直腸がん系、並びにF)正常な細胞系を用いた、フローサイトメトリースクリーニングを示す図である。
【図３Ｂ】図3A参照。
【図３Ｃ】図3A参照。
【図３Ｄ】図3A参照。
【図３Ｅ】図3A参照。
【図３Ｆ】図3A参照。
【図４Ａ】GR 6A04モノクローナル抗体及びその派生体の特徴付けを示す図である。A)GR 6A04はマウスIgG1、κアイソタイプのものである。
【図４Ｂ】GR 6A04モノクローナル抗体及びその派生体の特徴付けを示す図である。B)CDRに下線を付けた可変重鎖及び軽鎖の翻訳された配列。
【図４Ｃ】GR 6A04モノクローナル抗体及びその派生体の特徴付けを示す図である。C)それぞれGR6A04-MMAE及びMG1.45を得るための、GR6A04及びIgG1アイソタイプ対照(MG1.45)のモノメチルアウリスタチンE(MMAE)への直接コンジュゲーション(DAR:薬物-抗体比)。フローサイトメトリー結合は、コンジュゲーション後に影響を受けない。
【図４Ｄ】GR 6A04モノクローナル抗体及びその派生体の特徴付けを示す図である。D)GR 6A04のためのヒトキメラモノクローナル抗体(Hu-GR6A04)。VH及びVL配列を、ヒト定常領域バックボーンを有する発現ベクター中にクローニングした。Hu-GR6A04を、発現用のCHO細胞中にクローニングした。クマシー染色により、予期されたタンパク質サイズが示され、フローサイトメトリー結合はGR6A04と同等であった。
【図５】GR 6A04抗原の特徴付けを示す図である。A)実施したウェスタンブロットは、55〜90kDaのスメアとして抗原を示した。抗原スメアは、β-メルカプトエタノール(還元剤)による処理の後、減少した。B)GR 6A04結合は、PNGアーゼ感受性である。抗原に対するGR 6A04の結合は、PNGアーゼ処理(レーン3)により分子量の低下を伴って消失し、抗原からNグリカンを除去するのに成功したことを示す。抗アクチン結合は、PNGアーゼ処理による影響を受けない。言い換えると、GR 6A04結合は、抗原のNグリコシル化に依存している。
【図６】A)GR 6A04を用いた免疫沈降を示す図である。四角で囲んだ部分を質量分析用に切り取った。B)切り取った領域の質量分析により、カラム対照レーンの同じ領域中に認められる非特異的なヒットを除去した後、上位5つの推定抗原が同定された。結果は、推定抗原が全体のスコアに基づいて構成され、これは全タンパク質カバー率及び認められるユニークペプチドの数と相関することを示した。次いで、標的に対する市販の抗体を用いたプルダウン及びGR 6A04を用いた免疫沈降産物のクロスプローブ(cross-probe)によって抗原同一性を確認し、逆の場合も同様にした。GRP78を交差IPによって試験し、GR 6A04の予想される抗原として除外した。
【図７Ａ】GR 6A04の推定抗原としてのCEACAM6の検証を示す図である。A)市販の抗CEACAM6を用いて、交差免疫沈降を実施した。市販の抗CEACAM6及びGR 6A04の両方が、その対応物によってプルダウンされた抗原を認識した。
【図７Ｂ】GR 6A04の推定抗原としてのCEACAM6の検証を示す図である。B)CEACAM6のsiRNAノックダウンを実施した。結果は、PC-9細胞におけるCEACAM6発現のノックダウンがウェスタンブロット及びフローサイトメトリーで観察されるGR 6A04結合を減少させたことを示した。
【図８】がん細胞株におけるGR 6A04の免疫組織学的検査を示す図である。A)PC-9細胞ペレット上のFFPEは、GR 6A04の膜結合及びサイトゾル局在化の両方を示す。B)2連の核(duplicate cores)にわたるImmunoMembraneによってスコアリングした、FFPE細胞系アレイスクリーニング。
【図９】腫瘍組織におけるGR 6A04の免疫組織学的検査を示す図である。正常組織と腫瘍組織のミックス、複数の臓器(MNT241)を使用した組織試料(Pantomics TMAs)上のFFPE、及びImmunoMembraneによるスコアリング。
【図１０Ａ】腫瘍組織におけるGR 6A04の免疫組織学的検査を示す図である。腫瘍組織、複数の臓器(MTU481)におけるFFPE。
【図１０Ｂ】図10A参照。
【図１０Ｃ】図10A参照。
【図１０Ｄ】図10A参照。
【図１１Ａ１】腫瘍組織におけるGR 6A04の免疫組織学的検査を示す図である。A)腫瘍組織、複数の臓器(MTU951)におけるFFPE及び染色された核の概要。
【図１１Ａ２】図11A1参照。
【図１１Ａ３】図11A1参照。
【図１１Ｂ】腫瘍組織におけるGR 6A04の免疫組織学的検査を示す図である。B)2つの正常な核;食道及び肺における2+染色(偽陽性スコア)。
【図１１Ｃ１】腫瘍組織におけるGR 6A04の免疫組織学的検査を示す図である。C)複数の臓器でのがんにおける代表的な陽性スコアリング。
【図１１Ｃ２】図11C1参照。
【図１２Ａ】NSCLC組織試料におけるGR 6A04の免疫組織学的検査を示す図である。隣接正常を伴う肺腫瘍TMA(LC 1001 2a)における染色は、4/27の扁平上皮及び9/18の腺癌で陽性染色を示し、対になった隣接正常組織では陰性染色を示す。
【図１２Ｂ】図12A参照。
【図１３】アレイLC1001 2aによる核画像を示す図である。
【図１４Ａ】試験した正常組織(MNO961)の93/96で陰性染色を示す図である。管壁(ductal lining)(核の縁部)及び/又は壊死組織においては、非特異的な染色が一般に見られる。
【図１４Ｂ】図14A参照。
【図１５Ａ】GR 6A04と市販の抗CEACAM6抗体との比較を示す図である。A)GR6A04は、ツニカマイシン(N-グリコシル化阻害剤)及びPNGアーゼ消化により影響を受けたが、市販の抗CEACAM6には影響を受けなかった(クローン9A6)。
【図１５Ｂ】GR 6A04と市販の抗CEACAM6抗体との比較を示す図である。B)mAb結合におけるグリコシル化の役割の差異はまた、免疫組織化学法における特異性の差異にもつながる。細胞系アレイは1つのさらなる核のスコアが陽性であった(四角で囲んだ)。
【図１６Ａ】結合プロファイルの差異はまた、MNO961(マルチ正常TMA)でも観察されたことを示す図である。この場合、市販の抗CEACAM6はより高い染色強度でより多くの非特異的結合を有する。特に、全ての3つの正常な肺及び2つの正常な脾臓の核のスコアは陽性であった。
【図１６Ｂ】図16A参照。
【図１７Ａ】A549細胞のソーティングを示す図である。A)A549肺腺癌細胞系は、GR6A04の不均一な結合及び15〜30%陽性結合テールを示した。
【図１７Ｂ】A549細胞のソーティングを示す図である。B)Dynabeads Pan Ms-IgGビーズを使用したGR6A04によるA549細胞のソーティング、続いてDNアーゼビーズ放出によりP0でGR6A04+割合の濃縮が示されたが、その後の通過で結合の減少が観察された(A549親細胞からのソーティングの1回目(陽性画分))。
【図１７Ｃ】A549細胞のソーティングを示す図である。C)複数回のソーティングにより安定な特異な系が確立された。D)作製したA549-GR6A04+単細胞(SC)クローンは、GR6A04結合の均一性の改善を示した。
【図１７Ｄ】図17C参照。
【図１７Ｅ】A549-GR6A04+単細胞(SC)クローン間の形態の差異を示す図である。
【図１８】ソートされた集団の特徴付けを示す図である。EGFRはA549-GR6A04+細胞において下方制御され、CEACAM1はA549-GR6A04+細胞において上方制御された。
【図１９Ａ】A549肺腺癌の異種移植片モデル;A549-GR6A04+及びA549親を使用した、GR6A04のin vivoでの機能を示す図である。A)A549-GR6A04+細胞は腫瘍形成能を増加させた。
【図１９Ｂ】A549肺腺癌の異種移植片モデル;A549-GR6A04+及びA549親を使用した、GR6A04のin vivoでの機能を示す図である。B)A549親、及び異種移植片においてA549親をGR6A04+細胞に関して選択した終了点でのGR6A04結合の保持(20%から>70%)。
【図２０】GR 6A04の抗原が馴化培地中に浸出されることを示す図である。培地を、培養細胞で5日間馴化させ、既知の体積を膜上に2連でブロットし、Hu-GR6A04でプローブした。結果は、A549親細胞及びGR6A04(-)細胞より高い抗原レベルが、GR 6A04(+)細胞の馴化培地において見出されうることを示した。
【図２１】GR 6A04の抗体薬物コンジュゲートの特徴付けを示す図である。A)Mab-ZAP Antibody Internalization Kitを、概念実証として使用した。毒素と連結された抗マウス二次抗体を使用して、GR 6A04をサポリンと間接的にコンジュゲートした。B)GR 6A04はPC-9細胞中に内部移行した。4℃で20分間、GR 6A04、10μg/mLのプレインキュベーションを実施した。複数の時点で細胞を固定化し、抗Ms AlexaFluor 488でプローブした。画像は40×で撮影した。結果は、GR 6A04が、T=0minで細胞辺縁/膜上にリングとして(実線の矢印)、及びT=120minでリング(実線の矢印)として、また細胞内にも(破線の矢印)、局在化していることを示した。
【図２２】GR6A04-MMAE(毒素の直接コンジュゲーション)のin vitroでの機能を示す図であり、用量応答曲線によりPC-9に対して19.58nMのEC50;A549-GR6A04+細胞に対して3.33nMのEC50が推定される。
【図２３】GR 6A04の抗体依存性細胞傷害を示す図である。FcγRのためのルシフェラーゼレポーター及び陽性ADCC対照としてのセツキシマブを用いて、Promea ADCCキットを使用した。PC-9のEC50:39.6nM;A549-GR6A04+のEC50:1.33nM。
【図２４】異種移植片モデルにおけるADCとしてのGR 6A04概念実証を示す図である。使用した条件は、GR6A04-MMAE;MG1.45-MMAEアイソタイプ対照(ctrl);バッファー対照;GR6A04(非コンジュゲート);Hu-GR6A04(非コンジュゲート)であった。処理レジメンは、10mg/kg(約200ug/マウス)並びにD0、D4及びD8での3回投与(腫瘍サイズ>150mm3で開始)であった。結果は、GR6A04-MMAEで処理した異種移植片は腫瘍増殖をほとんど示さず、このことによりADCとしての優れたin vivoでの機能が実証されることを示唆した。非コンジュゲートGR6A04及びHu-GR6A04で処理した異種移植片は、バッファー対照と比較してより遅い増殖を示し、このことは、ADCC機序を介したいくらかのin vivoでの腫瘍増殖阻害を示唆した。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
第1の態様では、(i)アミノ酸配列GNTFTSYVMH(配列番号3)を有するVHCDR1、アミノ酸配列YINPYNDGTKYNEKFKG(配列番号4)を有するVHCDR2及びアミノ酸配列STARATPYFYAMDY(配列番号5)を有するVHCDR3を含む重鎖可変ドメインと、(ii)アミノ酸配列KSSQSLLWSVNQNSYLS(配列番号6)を有するVLCDR1、アミノ酸配列GASIRES(配列番号7)を有するVLCDR2、及びアミノ酸配列QHNHGSFLPYT(配列番号8)を有するVLCDR3を含む軽鎖可変ドメインとを含む抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片が提供される。
【００４５】
抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片は、(i)及び(ii)の重鎖及び軽鎖CDR領域と約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%同一な重鎖及び軽鎖CDR領域を含みうる。
【００４６】
一実施態様では、重鎖可変領域は、配列番号1に記載のアミノ酸配列SGPELVKPGASVKMSCKASGNTFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCARSTARATPYFYAMDYWGQGTSVTVSSを含む。あるいは、重鎖可変領域は、配列番号1に記載のアミノ酸配列と約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%の同一性を有するアミノ酸配列を含みうる。
【００４７】
一実施態様では、軽鎖可変領域は、配列番号2に記載のアミノ酸配列DILMTQSPSSLAVTAGEKVTMRCKSSQSLLWSVNQNSYLSWYQLKQGQPPKLLLYGASIRESWVPDRFTGSGSGTDFTLTISNVHVEDLAVYYCQHNHGSFLPYTFGGGTKLEIKを含む。あるいは、抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片は、配列番号2に記載のアミノ酸配列と約80%、約85%、約90%、約95%、約96%、約97%、約98%又は約99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含みうる。
【００４８】
一実施態様では、抗原結合タンパク質が、モノクローナル、組み換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、二重特異性及びヘテロコンジュゲート抗体;キメラ抗原受容体(CAR)、単一可変ドメイン、ドメイン抗体、抗原結合断片、免疫学的に有効な断片、単鎖Fv、単鎖抗体、ヒンジ領域を欠く一価抗体、ミニボディ、ダイアボディ、並びにTandabs(商標)からなる群から選択される、請求項1から6のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片。
【００４９】
一実施態様では、抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片は、モノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、GR 6A04であってもよい。一実施態様では、モノクローナル抗体は、ヒト化されていてもよい。あるいは、モノクローナル抗体は、キメラであってもよい。
【００５０】
一実施態様では、抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片は、CEACAM6に結合しうる。一実施態様では、抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片は、CEACAM6上のグリカンに結合しうる。本明細書に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片は、CEACAM6上のN-結合グリカンに結合しうる。
【００５１】
別の実施態様では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片は、それとコンジュゲートした放射性同位体又は細胞毒素を含みうる。抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片は、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、メルタンシン(DM-1)、サポリン、ゲムシタビン、イリノテカン、エトポシド、ビンブラスチン、ペメトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、白金製剤(例えば、シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン)、ビノレルビン、カペシタビン、ミトキサントロン、イクサベピロン、エリブリン、5-フルオロウラシル、トリフルリジン及びチピラシルからなる群から選択される細胞毒素とコンジュゲートしていてもよい。
【００５２】
一実施態様では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質又は抗原結合断片は、CEACAM6に結合した際に細胞中に内部移行する。
【００５３】
別の実施態様では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質又は抗原結合断片は、CEACAM6に結合した際に細胞中に内部移行しなくてもよい。
【００５４】
一実施態様では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質又は抗原結合断片は、ゲフィチニブ耐性の肺がん細胞、非小細胞性肺がん細胞、乳がん細胞及び/又は結腸直腸がん細胞に選択的に結合しうる。
【００５５】
別の態様では、生理学的に許容される担体、及び治療有効量の本明細書に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片を含む組成物が提供される。一実施態様では、本明細書で開示されている組成物は、1つ又は複数のさらなる治療化合物を含んでもよい。
【００５６】
薬学的組成物及び製剤中の本明細書に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片の割合は当然ながら様々であってよく、例えば、好都合には、投薬単位の重量の約2%〜約90%、約5%〜約80%、約10%〜約75%、約15%〜約65%;約20%〜約60%、約25%〜約50%、約30%〜約45%、又は約35%〜約45%の範囲でありうる。治療上有用な組成物中の化合物の量は、好適な投薬量が得られるようなものである。
【００５７】
「生理学的に許容される担体」という用語は、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などを含むことが意図されている。薬学的に活性な物質のためにそのような媒体及び薬剤を使用することは、当技術分野においてよく知られている。任意の従来の媒体又は薬剤がその化合物と不適合性でない限り、治療用組成物並びに治療及び予防方法においてそれらを使用することが企図される。補助的な活性化合物もまた、本発明による組成物中に組み込んでもよい。投与を容易にするため及び投薬量を均一にするために、非経口組成物を単位剤形で製剤化することは特に有利である。
【００５８】
本明細書で使用される「単位剤形」は、治療される個体のために単位投薬量として適した物理的に分離した単位を指し、所定量の化合物を含有する各単位は、必要とされる医薬担体と共同して所望の治療効果をもたらすように計算される。化合物は、許容できる投薬単位において好適な薬学的に許容される担体とともに有効量で、好都合に及び効果的に投与するために製剤化することができる。補助的な活性成分を含有する組成物の場合、投薬量は、前記成分の通常の用量及び投与方法を参照することにより決定される。
【００５９】
組成物は、好都合には、注射、例えば、皮下、静脈内などによって投与することができる。組成物はまた、非経口的に又は腹腔内に投与してもよい。一実施態様では、化合物は、注射によって投与されうる。注射液の場合、担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど)、好適なそれらの混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒とすることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合には必要とされる粒径の維持によって及び界面活性剤の使用によって、維持することができる。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤及び/又は抗真菌剤を含むことによって達成することができる。好適な薬剤は、当業者によく知られており、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ベンジルアルコール、アスコルビン酸、チメロサールなどを含む。多くの場合、組成物中に等張化剤、例えば、糖、多価アルコール、例えばマンニトール、ソルビトールなど、及び塩化ナトリウムを含むことが好ましい可能性がある。注射用組成物の持続的な吸収は、組成物中に吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによってもたらすことができる。
【００６０】
無菌注射液は、必要に応じて上記に列挙した成分の1つ又は組み合わせとともに、適切な溶媒中に必要量の類似体を組み込み、続いて濾過滅菌することによって調製することができる。一般に、分散液は、基礎分散媒及び上記に列挙されているものの中の必要とされる他の成分を含有する無菌ビヒクル中に類似体を組み込むことによって調製される。
【００６１】
通常の保管及び使用条件下で、医薬製剤は、微生物の増殖を阻止するための防腐剤を含有してもよい。好ましくは、薬学的組成物は、酸加水分解を最小限にするための好適な緩衝剤をさらに含みうる。好適な緩衝剤は、当業者によく知られており、リン酸塩、クエン酸塩、炭酸塩及びそれらの混合物を含むがこれらに限定されない。
【００６２】
本発明による薬学的組成物の単回又は複数回投与を行ってもよい。当業者は、通常の実験によって、本発明の化合物及び/又は組成物の有効な非毒性の投薬量レベル並びに化合物及び組成物を適用できる疾患及び/又は感染を治療するのに好適であろう投与パターンを決定することができるであろう。
【００６３】
さらに、最適な治療クール、例えば、規定の日数にわたって1日当たり投与される本発明の化合物又は組成物の用量数などは、従来の治療クール決定試験を使用して確かめることができることが当業者には明らかなはずである。
【００６４】
一般に、24時間当たりの有効投薬量は、体重1kg当たり約0.0001mg〜約1000mg、好適には、体重1kg当たり約0.001mg〜約750mg、体重1kg当たり約0.01mg〜約500mg、体重1kg当たり約0.1mg〜約500mg、体重1kg当たり約0.1mg〜約250mg、又は体重1kg当たり約1.0mg〜約250mgの範囲でありうる。より好適には、24時間当たりの有効投薬量は、体重1kg当たり約1.0mg〜約200mg、体重1kg当たり約1.0mg〜約100mg、体重1kg当たり約1.0mg〜約50mg、体重1kg当たり約1.0mg〜約25mg、体重1kg当たり約5.0mg〜約50mg、体重1kg当たり約5.0mg〜約20mg、又は体重1kg当たり約5.0mg〜約15mgの範囲でありうる。
【００６５】
あるいは、有効投薬量は、約500mg/m2までであってもよい。例えば、一般に、有効投薬量は、約25〜約500mg/m2、約25〜約350mg/m2、約25〜約300mg/m2、約25〜約250mg/m2、約50〜約250mg/m2、及び約75〜約150mg/m2の範囲であることが予期される。
【００６６】
別の態様では、がんを治療又は予防するための医薬の製造における、本明細書で開示されている抗原結合タンパク質若しくはその抗原結合断片、又は本明細書で開示されている組成物の使用が提供される。
【００６７】
一実施態様では、がんは、ゲフィチニブ耐性の肺がん、非小細胞性肺がん、乳がん、胃がん、小腸がん、食道がん及び結腸直腸がんからなる群から選択されうる。
【００６８】
一部の実施形態では、医薬は、1つ又は複数のさらなる活性医薬成分とともに投与されてもよい。あるいは、医薬は、化学療法とともに投与されてもよい。さらなる活性医薬成分又は化学療法は、別々に、同時に又は逐次的に投与されてもよい。
【００６９】
別の態様では、対象においてがんを検出するための方法であって、対象から得られる試料を、本明細書で開示されている抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片と、in vitroで接触させるステップ、試料中の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片の結合を検出するステップ、上記結合を対照試料中の結合レベルと相関させて、試料中の結合レベルを決定するステップを含み、対照試料と比較した試料中の結合レベルの増加が、がんであることを示す、方法が提供される。
【００７０】
別の態様では、がんに罹患しやすい対象を特定するための方法であって、対象から得られる試料を、本明細書で開示されている抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片と、in vitroで接触させるステップ、試料中の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片の結合を検出するステップ、上記結合を対照試料中の結合レベルと相関させて、試料中の結合レベルを決定するステップを含み、対照試料と比較した試料中の結合レベルの増加が、対象ががんに罹患しやすいことを示す、方法が提供される。
【００７１】
一実施態様では、対照試料は、同じ対象由来のものである。あるいは、対照試料は、異なる対象由来のものであってもよい。
【００７２】
一実施態様では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片は、検出可能な標識を含みうる。検出可能な標識は、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識及び放射性核種標識からなる群から選択することができる。
【００７３】
一実施態様では、検出可能な標識は、ビオチン、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、FITC、PE及びCy色素からなる群から選択することができる。検出可能な標識は、フローサイトメトリー、組織切片、免疫蛍光法、免疫細胞化学法又は免疫組織化学法から選択されるアッセイにおいて検出することができる。
【００７４】
一態様では、本明細書に記載の方法において使用するときのキットであって、使用説明書と一緒に、本明細書に記載の抗原結合タンパク質又はその抗原結合断片を含むキットが提供される。
【００７５】
本明細書において例示的に記載されている本発明は、本明細書で明確に開示されていない何らの1つ又は複数の要素、1つ又は複数の限定が存在しなくても、適切に実施されうる。よって、例えば、「含む(comprising)」、「含む(including)」、「含有する(containing)」などの用語は、限定することなく広範囲に理解されるものとする。加えて、本明細書で用いる用語及び表現は、限定のためではなく説明のための用語として使用されており、そのような用語及び表現を使用する際に、示されている及び記述されている特徴の均等物又はその部分を除外する意図はないが、特許請求されている本発明の範囲内で様々な変更形態が可能であることが認識される。よって、好ましい実施形態及び任意選択の特徴によって本発明を詳細に開示しているが、本明細書に開示されている本発明を具体化した変更形態及び変形形態を、当業者は実施可能であること、並びにそのような変更形態及び変形形態が本発明の範囲内にあるとみなされることが理解されるべきである。
【００７６】
本発明は、本明細書において広く一般的に記載されている。一般的な開示に入るより狭い種及び亜属群のそれぞれもまた、本発明の一部を形成する。これには、削除された材料が本明細書に明確に記載されているかどうかにかかわらず、その属から任意の対象を排除するという条件又は否定的な限定を含む本発明の一般的な記載が含まれる。
【００７７】
別の実施形態は、以下の特許請求の範囲及び非限定的な実施例の範囲内である。加えて、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群によって記載されている場合、当業者は、本発明はそれによってまた、マーカッシュ群の任意の個々の構成要素又は構成要素の下位群に関しても記載されていることを認識するであろう。
【実施例】
【００７８】
本発明の非限定的な実施例及び比較例を、具体的な実施例を参照することによってより詳細にさらに記述するが、これは本発明の範囲を限定するものとは決して解釈されるべきではない。
【００７９】
材料及び方法
【００８０】
ゲフィチニブ耐性細胞系の培養及び作製
【００８１】
PC-9を、10%ウシ胎児血清(HyClone GE Healthscience、South America)を添加したRPMI(Invitrogen、USA)中で培養した。獲得ゲフィチニブ耐性を有するPC-9クローンを得るために、PC-9培養物を、2nMから出発し、その後の各継代で徐々に増加させて最終濃度6.4μMとした、漸増する濃度のゲフィチニブ(Selleckchem、USA)に曝露させた。GRクローンであるCL75、CL86及びCL131をその後、6.4μMゲフィチニブ中に維持した。
【００８２】
A549を、10%のFBS及び20mMのL-グルタミン(Invitrogen、USA)を添加したDMEM(Invitrogen、USA)中で培養した。A549はゲフィチニブに対する初期耐性を有しており、IC50は10μMより高い。
【００８３】
GR mAbパネルの作製
【００８４】
PC-9 GR系であるCL75、CL86及びCL131の免疫化は、フロイント完全アジュバントと1:1で再懸濁した5E6細胞を用いて行った。初回免疫化では第1週〜第3週にそれぞれ単一の系だけを用いて1週間に1回免疫化を行い、その後の免疫化では第4週〜第5週に全ての3つの系を混合した懸濁液を用いた。5週間後、マウスを屠殺し、製造業者の指示に従ってSTEMCELL Technologies ClonaCell(商標)-HYキットを使用してSp2/0マウス骨髄腫系と融合させるためにB細胞を回収した。単一のハイブリドーマクローンを96ウェル中に採取し、フローサイトメトリーによるスクリーニングのために培養上清を回収した。
【００８５】
フローサイトメトリー
【００８６】
トリプシンを使用して単一細胞懸濁液として細胞を回収した。1試料当たり1E5細胞を使用し、100μlのmAb培養上清とともに30分間インキュベートした。次いで細胞をPBS中の1%ウシ血清アルブミンで洗浄し、100μlのヤギ抗マウス抗体フルオレセインイソチオシアネート(FITC)コンジュゲート(1:500、DAKO、Denmark)とともに4℃で15分間、暗所でさらにインキュベートした。細胞を再び洗浄し、Guava(登録商標)easyCyte 8HT Benchtop Flow Cytometer(Merck Millipore、USA)で分析するために200μLの1%BSA/PBS中に再懸濁した。細胞間結合のインターロゲーションのために、4%PFA/PBS(Affymetrix、USA)とともに室温で10分間、細胞を固定化し、PBS中で洗浄し、0.1%トリトン/PBSで5分間、室温で透過処理した後、mAb上清/一次抗体とともにインキュベーションを続けた。ヨウ化プロピジウムで染色するために、フローサイトメーターによる分析の直前に、PIを5ug/mLの最終濃度で添加し5分間おいた。
【００８７】
ウェスタンブロット及び免疫沈降
【００８８】
Membrane Protein Extraction Kit(BioVision、USA)を使用して、PC-9細胞ペレットから膜タンパク質を抽出した。簡潔に述べると、1mLのHomogenize Buffer中に5E7細胞の細胞ペレットを再懸濁し、ダウンスホモジナイザー中で細胞膜を破壊した。これをエッペンドルフチューブ中に移し、700×gで10分間4℃で遠心分離にかけて細胞デブリを除去した。上清を新しいエッペンドルフチューブに移し、12,000×gで30分間4℃で遠心分離にかけて膜をペレット化した。最後に、プロテアーゼ阻害剤(Pierce ThermoScientific、USA)を含有する500μlの1×Cell Lysis Buffer (Cell Signaling Technology、USA)中に膜を再懸濁した。15,000×g、4℃で5分間の遠心分離によって膜タンパク質溶液を清澄化して、不溶性タンパク質を除去した。Pierce 660nM Protein Assay Reagentを使用して、タンパク質を定量した。
【００８９】
免疫沈降(IP)は、自動化されたPhynexus MEA system(Phynexus Inc.、USA)を使用して行った。5ulの樹脂層を入れたProtein G PhyTipカラム上に、GR6A04を捕捉した。次いでカラムをPBSで洗浄して結合していないタンパク質を除去し、PC-9膜タンパク質抽出物を導入して、カラム上に捕捉されているGR6A04に結合させた。次いでカラムを、Wash Buffer II(140mM NaCl、pH7.4)で洗浄した後、Elution Buffer(200mM NaH2PO4/140mM NaCl pH2.5)を用いて低pHで溶出し、1M Tris-Cl pH9.0で直ちに中和した。その後、IP産物をウェスタンブロットによる分析に供する。
【００９０】
最終濃度1%のSDSを含有するタンパク質ローディング色素中で95℃で5分間加熱することによって、PC-9膜タンパク質抽出物又はIP産物を変性させた。次いで試料をプレキャストグラジエントゲル(NuPAGE 4〜12%グラジエントゲル、Invitrogen)中にロードし、MOPS Running Buffer(NuPAGE Invitrogen、USA)を流したSDS-PAGEで分離させた。ゲル電気泳動後、分離したタンパク質を、DI水中に20%メタノール、10%Tris-Glycineを含有するトランスファーバッファー中で110Vの定電圧で90分間、ポリフッ化ビニリデン(PVDF)膜(BioRad、USA)上に移した。
【００９１】
次いで膜を、PBS/0.1%Tween-20(PBS-T)中で調製した5%乳で、室温で30分間ブロックした。次いで膜をPBS-T中で洗浄し、続いて、2ug/mLのGR6A04を4℃で2.5%乳中で終夜インキュベーションした。その後、膜をPBS-T中で洗浄した後、ヤギ抗マウス二次抗体ホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート(1:10000、Dako)とともに室温で1時間インキュベーションした。PBS-Tで最後に洗浄した後、HRPコンジュゲート二次抗体の結合をECL検出(GE Healthcare、Sweden)で可視化した。
【００９２】
クマシーブルー染色及び質量分析法
【００９３】
IP産物について並行したゲルを流し、これを、10%酢酸、50%メタノール及び40%水中に0.1%クマシーブルーR250を含有するクマシーブルー染色溶液で室温で1時間染色した。次いで染色溶液を除去し、10%酢酸、50%メタノール及び40%水を含有する脱染色溶液で交換した。ゲルのバックグラウンドがほぼ透明になるまで、脱染色溶液を新鮮な溶液と交換する。次いで脱染色されたゲルを水中で再水和する。次いでこのゲルを、IP産物のウェスタンブロットと比較して、ゲル上の抗原バンドの位置を決定する。次いでこの領域を、LC-MS分析用に切り取る。
【００９４】
グリコシル化試験
【００９５】
PNGアーゼ消化を、製造業者のプロトコール(New England Biolabs)に従って行った。簡潔に述べると、20μgのPC-9膜タンパク質抽出物をまず、1×糖タンパク質Denaturing Buffer中で95℃で10分間、変性させた。その後、1×G7 Reaction Buffer及び10% NP-40を添加し、PNGアーゼFとともに37℃で1時間、インキュベートした。その後、消化したタンパク質を上述した通りウェスタンブロッティングで分析した。
【００９６】
細胞培養中のタンパク質のN-グリコシル化の阻害もまた、培養培地中に1μMツニカマイシン(Sigma Aldrich、USA)を添加することにより達成した。PC-9細胞を、6ウェル組織培養プレート(place)中に1E5細胞で播種し、ツニカマイシン又はDMSOを添加(spike)した培養培地中で3日間、コンフルエントまで増殖させた。次いで細胞を、フローサイトメトリー及びウェスタンブロッティングによる分析のために回収した。
【００９７】
免疫組織化学染色
【００９８】
FFPE組織を含有するTMAスライドをまず、オーブン中で60℃で30分間加熱して、溶媒を除去した。次いでスライドを脱脂し、Histoclear(2×)、100%エタノール(2×)、95%エタノール、70%エタノール、及び最後にDI水中に順次浸漬することによって再水和した。
【００９９】
10mM Tris Base、1mM EDTA、0.05%Tween20を含有する溶液(pH9.0)中で熱誘導性エピトープ回復を行い、95℃で20分間、加熱した。次いで抗原回復溶液及びスライドを含む容器を取り出し、さらに20分間、室温まで冷ました。次いでスライドをDI水中で洗浄した。次いで、スライドを3%H2O2とともにPBS中で30分間、室温でインキュベーションすることによって、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックした。スライドをDI水中で洗浄し、続いてPBS中10%正常ヤギ血清で30分間ブロッキング工程を行った。
【０１００】
次いでスライドを、ブロッキング溶液中5ug/mLのGR6A04とともに4℃で終夜インキュベートした。次いでスライドを洗浄し、HRP(DAKO、USA)とコンジュゲートしたポリマーベースの抗マウス二次抗体とともに室温で30分間インキュベートし、推奨されているDAB色素原基質溶液で2分間発色させ、ギルヘマトキシリン溶液で対比染色した。
【０１０１】
続いて、染色されたスライドを、50%エタノール、70%エタノール、90%エタノール、100%エタノール(2×)及びHistoclear(2×)中に浸漬することによって脱水した後、カバーガラスを載せた。次いでスライドを、Zeiss AxioScan Digital Slide Scannerを用いて画像化した。
【０１０２】
A549細胞系からのGR6A04結合集団の濃縮
【０１０３】
A549親肺腺癌系からのGR6A04-及びGR6A04+亜集団の濃縮には、製造業者の指示に従って、CELLection(商標)Pan Mouse IgG Kit(ThermoScientific、USA)を使用した。簡潔に述べると、トリプシンを用いてA549細胞を回収して単一細胞溶液を得た。10μg/1E7細胞のGR6A04とともに、4℃で30分間、細胞をインキュベートした。次いで細胞を300×gで3分間遠心分離にかけて、結合していないGR6A04を除去した後、キット推奨に従ってDynabeadsとともにこれをインキュベートした。次いで細胞-ビーズ懸濁液をマグネットラックに付け、分離させた。上清をGR6A04-集団として回収し、一方、結合したビーズ及び細胞をGR6A04+集団として回収した。両方の画分を洗浄し、マグネットラックに3回供した。最後に、結合したビーズ及び細胞をDNアーゼIとともにインキュベートして、Dynabeadsから細胞を放出させた。細胞を、フラスコ1つ当たり2.5E6細胞の密度でT75組織培養フラスコ中に播種した。
【０１０４】
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害(ADCC)アッセイ
【０１０５】
ADCC活性は、レポーターバイオアッセイ(Promega;ADCC Reporter Bioassay、#G7010)を使用して測定した。ADCCバイオアッセイを、製造業者のプロトコールに従って行った。簡潔に述べると、PC-9及びA549細胞を、低4%IgG血清(Promega;#G711A)培地中、96ウェル透明底黒色組織培養プレート(Corning;#3904)において1ウェル当たり5,000細胞で播種し、終夜付着及び拡大させた。Hu-GR6A04の連続希釈物を3連のウェルで、37℃、5%CO2で約15分間インキュベートした。インキュベーション後、改変されたエフェクター細胞を、1ウェル当たり約150,000細胞でウェルに添加した。6時間後、Bio-Glo(商標)Luciferase Assay Substrate (Promega;#G719A及び#G720A)をウェルに添加し、Infinite(登録商標)200マイクロプレートリーダー(Tecan)を使用して発光を測定した。
【０１０６】
増殖  -  CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability(CTG)アッセイ
【０１０７】
黒色コート96ウェルプレート(Grenier Bio-one、UK)に1ウェル当たり1000〜5000細胞の密度範囲(使用される細胞タイプに応じて)及び1ウェル当たり90uLで、細胞を播種した。次いでプレートを、37℃で24時間、5%CO2の加湿空気中でインキュベートした。24時間後、10μLのmAb又はバッファーを各ウェルに添加し、再びプレートを37℃で5%CO2の加湿空気中に置いた。mAb又はバッファー添加の4日後、100uLのCTG基質(Promega、Wisconsin、USA)を各ウェルに添加した。次いでプレートを激しく振とうしながら10分間、暗所に置いた。その後、Tecan I-対照(Tecan、Switzerland)を使用して、試料の細胞生存性を定量した。
【０１０８】
抗体薬物コンジュゲート(ADC)
【０１０９】
GR6A04及び市販のマウスIgG1アイソタイプ抗体(BioLegendのClone MG1.45)を、それぞれ3.0及び3.3のDARで、MMAE毒素(Moradec、San Diego、USA)と直接コンジュゲートした。コンジュゲートされたmAbについての用量応答曲線を、0〜4.5μg/mlの連続希釈範囲を用いたCTGアッセイにより確立した。以前に記載されたように、細胞の細胞生存性は処理後4日目に測定した。
【０１１０】
in vivo異種移植片モデル
【０１１１】
NCrヌードマウスにおいてA549-GR6A04+細胞を使用して、異種移植片モデルを確立した。DMEM基本培地中の5E6細胞を、1:1の比率でMatrigelと混合し、200μlの体積で皮下注射した。腫瘍を形成させ、150mm3を超えるサイズにした後、これらをそれぞれ5匹のマウスからなる5つの群に無作為化した。これらの群を以下の通りmAbで処置した:(1)バッファー対照;(2)GR6A04-MMAE;(3)Hu-GR6A04;(4)GR6A04;(5)MG1.45-MMAEアイソタイプ対照。100μlの全体積で尾静脈注射によってmAbを注射した。各用量は、適用できる場合、200μg(10mg/kgと同等)であり、処置は合計で3回の投与を4日ごとに行った(0、4及び8日目)。腫瘍サイズを50日間にわたって監視した。
【０１１２】
結果及び考察
【０１１３】
GR耐性mAbパネルの作製
【０１１４】
GR6A04は、上皮成長因子(EGFR)の小分子阻害剤であるゲフィチニブに対する獲得耐性を有するPC-9肺腺癌に対して作製されたモノクローナル抗体(mAb)パネルの一部と同定された。ゲフィチニブ耐性(GR)PC-9クローンは、6.4μMのゲフィチニブ濃度で安定な系が得られるまで漸増する濃度のゲフィチニブ中で培養することによって作製された。これを、この化合物による治療を受けている肺がん患者において観察されるゲフィチニブに対する獲得耐性の代用物として使用した。
【０１１５】
半循環プロトコールにおいて、Balb/cマウスでの免疫化のために、3つのゲフィチニブ耐性PC-9クローン(CL75、CL86及びCL131)を使用した(図1)。6週目にマウスを屠殺し、STEMCELL Technologies ClonaCell(商標)-HYを使用してB細胞をSp2/0マウス骨髄腫細胞と融合し、mAb産生ハイブリドーマクローンを得た。このGRパネル由来のmAbを、免疫系に対する結合に関してフローサイトメトリーによってスクリーニングし、そのうちのGR6A04を、このパネルの結合リード候補のうちの1つとして同定した。
【０１１６】
フローサイトメトリーによる細胞系におけるGR6A04結合
【０１１７】
GR6A04は、免疫化に使用した3つのPC-9ゲフィチニブ耐性クローンに対する強い反応性(>50%)を示し、陽性結合パーセントは二次のみの対照において2%でゲーティングしたFL-1チャネルから決定した(図2)。細胞をmAb単独とともにインキュベートした場合、FL-3チャネルでのヨウ化プロピジウム染色もまた、明らかな細胞傷害を示さなかった。GR6A04結合を、ゲフィチニブ感受性親PC-9細胞系、及び免疫化において使用していない別のGR PC-9クローンにおいてもまた試験し、両方の系で同様に強い結合が認められた。このフローサイトメトリー結合データは、図3Aにまとめている。
【０１１８】
GR6A04のフローサイトメトリー結合を他のNSCLC系においても試験し、試験した4つの系のうちの2つにおいて部分的な結合が認められた(A549及びCalu-3)。別の肺腺癌系であるHCC827のGRクローンもまた、ゲフィチニブ濃度を漸増させて培養することによって得た。6つのこれらのGR HCC827クローンのうちの2つに関して、GR6A04結合が観察された。加えて、他のがん指標における結合はまた、試験した13の乳がん系のうちの3つ、及び2つの結腸直腸がん系のうちの1つにおいてもGR6A04反応性を示した。異なるがん指標におけるGR6A04結合は、図3B〜Eにまとめている。
【０１１９】
重要なことに、図3Fにまとめているように、同じ染色方法を使用して、線維芽細胞、内皮及び上皮細胞、並びに初代末梢血単核細胞(PBMC)を含む様々な正常な細胞系を用いて試験した場合、正常な細胞の細胞表面におけるGR6A04の結合は無視できる程度(<8%)であることがわかった。
【０１２０】
要約すると、GR6A04のフローサイトメトリー結合特性は、a)フローサイトメトリーに基づいて、GR6A04は、PC-9及びそれらの派生ゲフィチニブ耐性クローンの細胞表面に結合する、b)GR6A04は他のNSCLC、乳及び結腸直腸がん系に対する反応性を示す、及びc)試験した正常な細胞系に対する交差反応性はない、である。
【０１２１】
GR6A04 mAb及び派生体の特徴付け
【０１２２】
GR6A04 mAbのアイソタイプは、図4AのPierce(商標)Rapid Antibody Isotyping Kitによって決定して、マウスIgG1サブタイプであると決定された。可変重鎖(VH)及び軽鎖(VL)アミノ酸配列は、マウス免疫グロブリン用の縮重プライマーを使用して、図4Bの通り決定した。AKTA avantシステムとともにCaptureSelect(商標)IgG-Fc(ms)Affinity Matrixを使用して、ハイブリドーマ培養上清からGR6A04を精製した。
【０１２３】
GR6A04の2つの派生体を作製し、特徴付けを行った:モノメチルアウリスタチンE(MMAE)との抗体薬物コンジュゲート(GR6A04-MMAE)、並びにヒトIg定常領域バックボーン中にVH及びVLをクローニングしたヒトキメラmAb(Hu-GR6A04)。
【０１２４】
GR6A04-MMAEは、3.0の薬物対抗体比(DAR)でMMAEとコンジュゲートし、同時に、市販のマウスIgG1抗体(BiolegendのクローンMG1-45)を同じ化学反応を使用して3.3のDARでコンジュゲートした(図4C)。PC-9及びA549細胞におけるGR6A04-MMAEの結合はフローサイトメトリーによって試験され、非コンジュゲートGR6A04と同等であることがわかったが、MG1-45-MMAEの、これらの2つの系における結合は無視できる程度のものであると決定された。
【０１２５】
Hu-GR6A04をCHO細胞において発現させ、GR6A04と同じ系を使用して培養上清から抗体を精製した。精製Hu-GR6A04は、SDS-PAGEのクマシーブルー染色から正確なタンパク質サイズを調べ、還元レーンにおいてそれぞれ50kDa及び25kDaの予期されたサイズに重鎖及び軽鎖、並びに非還元レーンにおいて150kDaにインタクトなIgGであった。同様に、PC-9及びA549におけるHu-GR6A04の結合は、図4Eに示すフローサイトメトリーにおいてGR6A04と同等であった。
【０１２６】
GR6A04はN-グリコシル化CEACAM6に結合する
【０１２７】
PC-9細胞溶解物のウェスタンブロッティングは、GR6A04を用いて免疫ブロットし、図5に示される非還元レーン上に55〜90kDaの間のスメアが認められることがわかった。抗原結合強度はまた、還元条件下でより弱かった。加えて、N-結合グリカンを除去するためのPNGアーゼによる細胞溶解物の処理は抗原バンドに対するGR6A04の結合も消失させ、抗体認識部位におけるN-グリコシル化の重要性を示した。
【０１２８】
PC-9細胞溶解物に対するGR6A04を用いた免疫沈降(IP)により抗原を濃縮し、これを切り取り、質量分析による同定に送った(図6A)。タンパク質リストは、タンパク質カバー率及び認められるユニークペプチドの数に基づく、かつカラム対照のタンパク質リストと比較した、全体のスコアによって構成した。上位5つの推定抗原を図6B中の表に記載し、市販の抗CEACAM6抗体(Santa Cruz/AbcamのClone 9A6)を用いた交差IP(図7A)、及びPC-9細胞におけるCEACAM6の一過性siRNAノックダウン(図7B)によって確認した。
【０１２９】
GR6A04の抗原標的はCEACAM6であり、それによってNグリカンは抗体抗原認識にとって重要であると結論付けることができる。
【０１３０】
患者FFPE組織試料におけるGR6A04結合
【０１３１】
GR6A04はフローサイトメトリーにおいて様々ながん指標に特異的であり、かつ正常な細胞に結合しないことが立証されたため、本発明者らは、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織マイクロアレイ(TMA)でのがん患者組織試料におけるGR6A04の結合の測定を続行した。市販のFFPE TMAを、Pantomicsから入手した。
【０１３２】
FFPE試料のためのGR6A04の結合条件を、FFPE細胞系ペレットを用いて最適化し、pH9抗原回復ステップで5ug/mLであると決定した。GR6A04は、PC-9細胞の膜及びサイトゾルの両方に局在化していることが観察された。他のがん細胞系におけるGR6A04の結合プロファイルにも広げるために、より大きい範囲のがん指標を含むFFPE細胞系アレイにおいて免疫組織化学(IHC)染色を行った。GR6A04は、胃、肺、結腸直腸及び膵臓がん細胞系において反応性であることがわかった(図8)。
【０１３３】
臓器由来の広いアレイのがん組織試料を含む様々なFFPE TMAにおけるIHC染色も行った。オープンソースソフトウェア:ImmunoMembraneを用いて、GR6A04染色をスコアリングした。陽性に染色された(2+及び3+)組織核の大半において、結合は細胞膜に局在化していた。壊死領域において、いくらかの非特異的な染色も観察された。マルチ腫瘍TMAにおけるIHC染色は、細胞系スクリーニングにおいて観察されたことを支持し、それによって本発明者らは、肺がんに加えて、GR6A04は、これらだけに限らないが胃腸(GI)及び乳がんにも非常に反応性であることを認めた(図9〜11)。NSCLCのフォーカスアレイにおいて、GR6A04は、TMAで示されている扁平上皮がん核の15%で、及び肺腺癌核の50%で陽性に染色された。重要なことに、隣接する正常組織は全く陽性染色されておらず、がん組織に対するGR6A04特異性を示した(図12及び13)。
【０１３４】
加えて、同じ染色プロトコール及びスコアリングシステムを使用して、GR6A04をFFPE正常組織に対して試験した。35の異なる解剖学的部位を含むFDA推奨のTMAを使用した(MNO961)(図14)。存在する96の核のうち93においてGR6A04の染色は観察されなかったが、3つの結腸核のうち2つ、及び3つの前立腺核のうちの1つは弱い陽性であった(2+)。拡大した画像から、これらの場合の染色は主に細胞内又は壊死領域中であったことに留意するべきである。
【０１３５】
したがって、GR6A04は、患者組織試料において広範囲の異なるがん指標に対する特異性を示し、正常組織タイプにおける染色は無視できる程度であり、本発明者らの前述のフローサイトメトリー及び細胞ベースのスクリーニングによる結合プロファイルを支持する。
【０１３６】
グリカン認識部位のためのGR6A04の特異性増加
【０１３７】
より先行する検証に使用された市販の抗CEACAM6抗体は、CEACAM6のグリコシル化の変化に感受性でない(すなわち認識部位がグリカン依存性でない)ものである。このことは図15Aにおいて示されており、この場合、GR6A04とは異なって、PNGアーゼ及びツニカマイシン処理の後に結合強度は変化しないままであった。
【０１３８】
FFPE細胞系マイクロアレイにおいて2つの抗CEACAM6(GR6A04及び市販)を比較した場合、染色プロファイルはおおむね類似しているものの、市販抗体はHCC827において1つのさらなる染色核を有し、BxPC3(膵臓がん系)はまたより強度の細胞内染色も示した(図15B)。
【０１３９】
市販の抗CEACAM6のこの明らかな非特異性は、正常組織を用いたTMA(MNO961)においても観察され、GR6A04では3つの核だけだったこととは対照的に95の核のうち11が陽性に染色された。重要なことに、全ての3つの肺正常組織、及び2つの脾臓正常組織は細胞膜上に染色を示した(図16)。
【０１４０】
染色プロファイルの差異は、特にCEACAM6上のNグリカンから生じる、CEACAM6上のエピトープ結合部位の差異に起因すると考えることができる。このことにより、CEACAM6タンパク質単独に対する結合に加えてより一層の特異性が可能となり、これが、正常組織に対する非特異的結合を減少させる。このことは、GR6A04が治療法のために開発される場合にさらなるレベルの安全性をもたらすため、重要である。
【０１４１】
GR6A04+ A549亜集団の特徴
【０１４２】
肺腺癌細胞系であるA549は、GR6A04に対して不均一に結合するため、がんにおけるグリコシル化CEACAM6発現の役割を調べるための良好な生物学的モデルであり、ほんの少数の15〜30%のGR6A04+集団を有する(図17A)。CELLection(商標)Pan Mouse IgG Kitを用いて磁気ソーティングを使用することによって、GR6A04-及びGR6A04+の両方を濃縮できた。しかし培養での継代が増えるとともに、GR6A04結合の減少が観察されたことに留意しなければならない。複数回の連続的なソーティングによりこれは軽減され、GR6A04+では7回の単離の後及びGR6A04-細胞では5回の後、安定な特異な系が得られ、その後それぞれをA549-GR6A04+及びA549-GR6A04-と称した(図17B及びC)。加えて、A549-GR6A04+培養から、GR6A04の強い均一な結合を示す単一細胞クローンを単離した(D5、D7及びS4クローン)。これらはクローン間で異なる細胞形態を有することが観察された(図17D及びE)。特に、D5クローンは円形形態の高密度クラスターを示し、D7は紡錘体形状の細胞を示し、S4は接着非依存的増殖とともにSCLC様形態を示した。
【０１４３】
これらの亜集団において、また親系においても、EGFR及びCEACAM1の発現をフローサイトメトリーによって測定した。A549-GR6A04-細胞及び親A549におけるこれらの2つのマーカーの発現は同様であったものの、A549-GR6A04+細胞はEGFRの発現がはるかに少なく(MFIが25%減少)、CEACAM1結合の増加も観察された(図18)。
【０１４４】
GR6A04発現は、in vivoでの腫瘍形成能に影響を及ぼすこともわかった。ヌードマウスでのA549異種移植片モデルにおいて、同じ初期細胞数を皮下注射したが、A549-GR6A04+細胞は、A549親細胞より大きい異種移植片を形成した(図19A)。50日間の試験の終了時に異種移植片を切り離したとき、異種移植片中のA549親細胞から得たGR6A04の割合が、注射の時点でのおよそ20%から50日目までに70%超まで増加したこともまた認められた(図19B)。
【０１４５】
GR6A04が肺がんの血清バイオマーカーとしての潜在的用途を有しうるかどうかを確かめるために、A549亜集団の馴化培地を膜にスポットし、GR6A04で免疫ブロットした。抗原はA549-GR6A04+及びA549親細胞培養の馴化培地において検出可能であったが、A549-GR6A04-培養においては検出不能であり、強度はスポットした培地の体積に比例する(図20)。結果は、GR6A04が患者血清試料における抗原定量に使用できることを示す。
【０１４６】
in vitro及びin vivoでの機能的アッセイ
【０１４７】
前の節においてGR6A04の特異性及びがん生物学におけるその考えられる役割を確認したので、この節は主として、がん治療薬としてのmAbの機能に注目する。抗体-薬物複合体(ADC)としての機能についての初期試験として、毒素とコンジュゲートした抗マウス抗体を使用して、GR6A04をサポリン(リボソーム不活性化タンパク質)と間接的にコンジュゲートした。PC-9感受性親系、及びCL75 GRクローンの両方においてそれぞれ43%及び28%、細胞増殖が阻害された(図21A)。GR6A04は、37℃で120分以内に内部移行できることも観察され、mAbは、結合後0分で細胞辺縁に局在化しており、その後120分で細胞の細胞質内(破線の矢印)に分布しているのが認められた。しかしながら、細胞の一部は120分でmAbを内部移行しておらず、mAbは表面上(実線の矢印)に依然として局在化していた(図21B)。
【０１４８】
よりロバストなアッセイのために、続いてGR6A04をMMAEと直接コンジュゲートした(図4C)。用量応答曲線を、PC-9及びA549結合細胞、並びにH1299非結合細胞において実施した(図22)。EC50は、PC-9細胞では19.8nM、及びA549-GR6A04+細胞では3.33nMであると確定された。GR6A04-MMAEは、非結合細胞、H1299及びA549-GR6A04-集団に関して細胞増殖に影響を及ぼさず、GR6A04結合細胞だけに対する特異性を示した。
【０１４９】
GR6A04は、ヒトIgG定常バックボーンとのキメラmAbとしても開発した(図4D)。FcγR結合のためのルシフェラーゼレポーターを有するPromega ADCCキットを使用して、抗体依存性細胞傷害(ADCC)に関してHu-GR6A04を試験した(図23)。PC-9及びA549-GR6A04+での用量応答曲線を実施し、EC50は、それぞれ39.6nM及び1.33nMであると確定された。
【０１５０】
したがって、GR6A04は、ADCC活性を有する裸のヒトキメラmAbとして、及びMMAEとコンジュゲートしたADCとしての、2つの肺がん細胞系、PC-9(ゲフィチニブ感受性)及びA549(ゲフィチニブ耐性)におけるin vitroでの機能を実証した。
【０１５１】
最後に、皮下異種移植片モデルにおいてA549-GR6A04+細胞を使用して、in vivoでの機能を試験した(図24)。腫瘍が150mm3に達したときにGR6A04及びそれらの派生体による処置を開始し、4日ごとの3回投与にわたって10mg/kgで静脈内mAb注射した。両方の裸のmAb、Gr6A04及びHu-GR6A04がバッファー対照で腫瘍増殖の抑制を示し、ADCC機序に起因すると考えられた。重要なことに、GR6A04-MMAEは腫瘍サイズを管理するのに極めて有効であり、45日間の試験全体にわたって腫瘍増殖はほとんどなかった(1/2未満)。したがって、GR6A04は、in vitroでの結果と一致して、ゲフィチニブ耐性A549異種移植片モデルで良好なin vivoでの機能を実証した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ１】
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【図１１Ａ２】
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【図１１Ａ３】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ１】
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【図１１Ｃ２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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