(57)【要約】  本発明は、Ｇタンパク質共役受容体媒介症状に影響を及ぼす化合物を検出するための細胞および方法に関する。本発明はまた、薬物有害反応、自己免疫障害および掻痒症を治療する方法に関する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＸ３  Ｇタンパク質共役受容体媒介症状または障害を調節する薬剤をスクリーニングする方法であって、
ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＸ３  Ｇタンパク質共役受容体を発現する１つ以上の細胞を候補薬剤と接触させることと、
前記１つ以上の細胞の応答を検出することによって評価用の前記候補薬剤を選択して、前記Ｇタンパク質共役受容体媒介症状または障害を調節することとを含む方法。
【請求項２】
前記細胞の応答が、前記Ｇタンパク質共役受容体の活性化として検出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記候補薬剤が前記Ｇタンパク質共役受容体媒介症状または障害を調節するかどうかを決定することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＸ３  Ｇタンパク質共役受容体媒介症状が、薬物有害反応、自己免疫障害、多発性硬化症、疼痛、掻痒症、胆汁うっ滞性掻痒症、炎症障害、悪性形質転換、皮膚障害および創傷治癒から選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上の細胞が、免疫細胞、神経細胞および皮膚細胞から選択される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記１つ以上の細胞が樹状細胞を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の細胞がケラチノサイトを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記１つ以上の細胞が、後根神経節の一次感覚ニューロンを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記検出された応答が、細胞内カルシウムまたは活性化の増加であり、イノシトールリン酸検出によっても評価することができる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性化が、細胞内カルシウムの増加を特定することにより、またはイノシトールリン酸検出により検出される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
対象のＧタンパク質共役受容体媒介症状を治療する方法であって、
有効量のＭｒｇｐｒＸ３アンタゴニストおよび／またはＭｒｇｐｒＡ６アンタゴニストを前記対象に投与し、それにより前記Ｇタンパク質共役受容体媒介症状を治療することを含む方法。
【請求項１２】
前記Ｇタンパク質共役受容体媒介症状が、疼痛、掻痒症、胆汁うっ滞性掻痒症、炎症障害、悪性形質転換、皮膚障害および／または創傷治癒から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記アンタゴニストが、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの任意の組合せを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記アンタゴニストが小分子または核酸分子を含む、請求項１１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
対象のＧタンパク質共役受容体媒介症状を治療する方法であって、
有効量のＭｒｇｐｒＸ３アゴニストおよび／またはＭｒｇｐｒＡ６アゴニストを前記対象に投与し、それにより前記Ｇタンパク質共役受容体媒介症状を治療することを含む方法。
【請求項１６】
前記Ｇタンパク質共役受容体媒介症状が、掻痒症、胆汁うっ滞性掻痒症、炎症障害、および／または皮膚障害および／または創傷治癒から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アゴニストが、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの任意の組合せを含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アゴニストが小分子または核酸分子を含む、請求項１５から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
対象のＧタンパク質共役受容体媒介症状を治療する方法であって、
有効量のＭｒｇｐｒＸ４アンタゴニストおよび／またはＭｒｇｐｒＡ１アンタゴニストを前記対象に投与し、それにより前記Ｇタンパク質共役受容体媒介症状を治療することを含む方法。
【請求項２０】
前記Ｇタンパク質共役受容体媒介症状が、薬物有害反応、自己免疫障害、多発性硬化症、疼痛、掻痒症および胆汁うっ滞性掻痒症から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記アンタゴニストが、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの任意の組合せを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記アンタゴニストが小分子または核酸分子を含む、請求項１９から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
対象のＧタンパク質共役受容体媒介症状を治療する方法であって、
有効量のＭｒｇｐｒＸ４アゴニストおよび／またはＭｒｇｐｒＡ１アゴニストを前記対象に投与し、それにより前記Ｇタンパク質共役受容体媒介症状を治療することを含む方法。
【請求項２４】
前記Ｇタンパク質共役受容体媒介症状が、疼痛、掻痒症および胆汁うっ滞性掻痒症から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記アンタゴニストが、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの任意の組合せを含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記アゴニストが小分子または核酸分子を含む、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
化合物を投与することにより誘発される、対象の薬物有害反応の重症度を軽減する方法であって、
対象に前記化合物を投与することと、
ＭｒｇｐｒＡ１アンタゴニストおよび／またはＭｒｇｐｒＸ４アンタゴニストを前記対象に投与し、それにより前記対象の薬物有害反応の前記重症度を軽減することとを含む方法。
【請求項２８】
対象が化合物に対する薬物有害反応を発現するリスクが高いかどうかを決定する方法であって、
化合物に対する薬物有害反応を有するか、化合物に対する薬物有害反応を発現するリスクのある対象から試験試料を得ることと、
前記試験試料中の少なくとも１つのＧタンパク質共役受容体遺伝子の発現レベルを決定することと、
前記試験試料中の前記Ｇタンパク質共役受容体遺伝子の前記発現レベルと、参照試料中の前記Ｇタンパク質共役受容体遺伝子の発現レベルとを比較することと、
前記試験試料中の前記Ｇタンパク質共役受容体遺伝子の前記発現レベルが前記参照試料中の前記Ｇタンパク質共役受容体遺伝子の前記レベルと比較して差次的に発現している場合、前記対象に対する前記化合物の投与が薬物有害反応を誘発するであろうことを決定することとを含む方法。
【請求項２９】
前記Ｇタンパク質共役受容体遺伝子がＭｒｇｐｒＡ１またはＭｒｇｐｒＸ４である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＭｒｇｐｒＡ１またはＭｒｇｐｒＸ４が変異体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
有効量のＧタンパク質共役受容体アンタゴニストを含む、Ｇタンパク質共役受容体媒介症状または障害の治療のための医薬組成物。
【請求項３２】
前記Ｇタンパク質共役受容体アンタゴニストがＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＸ３アンタゴニストである、請求項３１に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記アンタゴニストが、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチド、小分子、核酸またはそれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項３１または３２に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
有効量のＧタンパク質共役受容体アゴニストを含む、Ｇタンパク質共役受容体媒介症状または障害の治療のための医薬組成物。
【請求項３５】
前記Ｇタンパク質共役受容体アンタゴニストがＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＸ３アゴニストである、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記アゴニストが、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチド、小分子、核酸またはそれらの任意の組合せを含む群から選択される、請求項３４または３５に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
１）請求項３１から３６のいずれか一項に記載の医薬組成物と、２）前記Ｇタンパク質共役受容体症状または障害を治療するための指示書とを含むキット。
【請求項３８】
前記指示書が、薬物有害反応、自己免疫障害、多発性硬化症、疼痛、掻痒症、胆汁うっ滞性掻痒症、炎症障害、悪性形質転換、皮膚障害および／または創傷治癒を治療するためのものである、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ３（ＭｒｇｐｒＸ３）またはＭｒｇｐｒＡ６を発現する組換え核酸を含む単離細胞。
【請求項４０】
前記組換え核酸がＭｒｇｐｒＸ３を発現する、請求項３９に記載の単離細胞。
【請求項４１】
前記組換え核酸がＭｒｇｐｒＡ６を発現する、請求項３９に記載の単離細胞。
【請求項４２】
ＭｒｇｐｒＸ３を発現する前記組換え核酸が１つ以上の変異を含む、請求項４０に記載の単離細胞。
【請求項４３】
前記１つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＸ３タンパク質を産生する、請求項４２に記載の単離細胞。
【請求項４４】
ＭｒｇｐｒＡ６を発現する前記組換え核酸が１つ以上の変異を含む、請求項４１に記載の単離細胞。
【請求項４５】
前記１つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＡ６タンパク質を産生する、請求項４４に記載の単離細胞。
【請求項４６】
前記単離細胞が、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、自然免疫細胞、幹細胞または細胞株を含む、請求項４１に記載の単離細胞。
【請求項４７】
ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ４（ＭｒｇｐｒＸ４）またはＭｒｇｐｒＡ１を発現する組換え核酸を含む単離細胞。
【請求項４８】
前記組換え核酸がＭｒｇｐｒＸ４を発現する、請求項４７に記載の単離細胞。
【請求項４９】
前記組換え核酸がＭｒｇｐｒＡ１を発現する、請求項４７に記載の単離細胞。
【請求項５０】
ＭｒｇｐｒＸ４を発現する前記組換え核酸が１つ以上の変異を含む、請求項４８に記載の単離細胞。
【請求項５１】
前記１つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＸ４タンパク質を産生する、請求項５０に記載の単離細胞。
【請求項５２】
ＭｒｇｐｒＡ１を発現する前記組換え核酸が１つ以上の変異を含む、請求項４９に記載の単離細胞。
【請求項５３】
前記１つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＡ１タンパク質を産生する、請求項５２に記載の単離細胞。
【請求項５４】
前記単離細胞が、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞、自然免疫細胞、幹細胞または細胞株を含む、請求項４７に記載の単離細胞。
【請求項５５】
ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６のアンタゴニストを同定する方法であって、
請求項３９に記載の単離細胞を、皮膚反応または上皮反応を誘発する化合物と接触させることと、
前記単離細胞を候補アンタゴニストと接触させることと、
ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の活性化を検出することとを含み、前記化合物の非存在下でのＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の前記活性化と比較してＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の活性化が低下していると、前記候補化合物がアンタゴニストであると決定される方法。
【請求項５６】
ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１のアンタゴニストを同定する方法であって、
請求項４７に記載の単離細胞を、薬物有害反応またはかゆみ反応を誘発する化合物と接触させることと、
前記単離細胞を候補アンタゴニストと接触させることと、
ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化を検出することとを含み、前記化合物の非存在下でのＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の前記活性化と比較してＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化が低下していると、前記候補化合物がアンタゴニストであると決定される方法。
【請求項５７】
ＭｒｇｐｒＸ３、ＭｒｇｐｒＸ４または他のＭｒｇｐｒメンバーの二重／多価アンタゴニストを同定する方法であって、
請求項３９から５４  ４９のいずれか一項に記載の単離細胞を、皮膚または上皮反応および薬物有害反応またはかゆみ反応を誘発する化合物と接触させることと、前記単離細胞を候補アンタゴニストと接触させることと、
ＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＸ３の活性化を検出することとを含み、前記化合物の非存在下でのＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＸ３の前記活性化と比較してＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＸ３の活性化が低下していると、前記候補化合物が多価アンタゴニストであると決定される方法。
【請求項５８】
ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６のアゴニストを同定する方法であって、
請求項３９から４６のいずれか一項に記載の単離細胞を、皮膚反応または上皮反応を誘発する化合物と接触させることと、
前記単離細胞を候補アゴニストと接触させることと、
ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の活性化を検出することとを含み、前記化合物の非存在下でのＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の前記活性化と比較してＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の活性化が増大していると、前記候補化合物がアンタゴニストであると決定される方法。
【請求項５９】
ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１のアゴニストを同定する方法であって、
請求項４７から５４のいずれか一項に記載の単離細胞を、薬物有害反応またはかゆみ反応を誘発する化合物と接触させることと、
前記単離細胞を候補アゴニストと接触させることと、
ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化を検出することとを含み、前記化合物の非存在下でのＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の前記活性化と比較してＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化が増大していると、前記候補化合物がアゴニストであると決定される方法。
【請求項６０】
ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ３（ＭｒｇｐｒＸ３）またはＭｒｇｐｒＡ６を発現する組換え核酸。
【請求項６１】
前記組換え核酸がＭｒｇｐｒＸ３を発現する、請求項６０に記載の組換え核酸。
【請求項６２】
前記組換え核酸がＭｒｇｐｒＡ６を発現する、請求項６０に記載の組換え核酸。
【請求項６３】
ＭｒｇｐｒＸ３を発現する前記組換え核酸が１つ以上の変異を含む、請求項６１に記載の組換え核酸。
【請求項６４】
前記１つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＸ３タンパク質を産生する、請求項６３に記載の組換え核酸。
【請求項６５】
ＭｒｇｐｒＡ６を発現する前記組換え核酸が１つ以上の変異を含む、請求項６２に記載の組換え核酸。
【請求項６６】
前記１つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＡ６タンパク質を産生する、請求項６５に記載の組換え核酸。
【請求項６７】
ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ４（ＭｒｇｐｒＸ４）またはＭｒｇｐｒＡ１を発現する組換え核酸。
【請求項６８】
前記組換え核酸がＭｒｇｐｒＸ４を発現する、請求項６７に記載の組換え核酸。
【請求項６９】
前記組換え核酸がＭｒｇｐｒＡ１を発現する、請求項６７に記載の組換え核酸。
【請求項７０】
ＭｒｇｐｒＸ４を発現する前記組換え核酸が１つ以上の変異を含む、請求項６８に記載の組換え核酸。
【請求項７１】
前記１つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＸ４タンパク質を産生する、請求項７０に記載の組換え核酸。
【請求項７２】
ＭｒｇｐｒＡ１を発現する前記組換え核酸が１つ以上の変異を含む、請求項６９に記載の組換え核酸。
【請求項７３】
前記１つ以上の変異が、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＡ１タンパク質を産生する、請求項７２に記載の組換え核酸。
【請求項７４】
ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ３（ＭｒｇｐｒＸ３）またはＭｒｇｐｒＡ６をコードする核酸配列を含むベクター。
【請求項７５】
前記核酸配列が、１つ以上の変異を含むＭｒｇｐｒＸ３核酸配列をコードする、請求項７４に記載のベクター。
【請求項７６】
前記核酸配列が、１つ以上の変異を含むＭｒｇｐｒＡ６核酸配列をコードする、請求項７４に記載のベクター。
【請求項７７】
ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ４（ＭｒｇｐｒＸ４）またはＭｒｇｐｒＡ１をコードする核酸配列を含むベクター。
【請求項７８】
前記核酸配列が、１つ以上の変異を含むＭｒｇｐｒＸ４核酸配列をコードする、請求項７７に記載のベクター。
【請求項７９】
前記核酸配列が、１つ以上の変異を含むＭｒｇｐｒＡ１核酸配列をコードする、請求項７７に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／５２０，８１２号明細書の優先権の利益を主張し、その内容全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＲ０１ＮＳ０５４７９１およびＭＨ１８５０１の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
慢性的なかゆみ（例えば、掻痒症）、炎症障害、自己免疫、皮膚障害および薬物有害反応を含むＧタンパク質共役受容体媒介障害は苦痛を引き起こす。Ｇタンパク質共役媒介障害の病態に関しては、多くのことが不明である。Ｇタンパク質共役受容体媒介障害の治療に対する必要性は満たされていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、新規Ｇタンパク質共役受容体であるヒトＭｒｇｐｒＸ４およびマウスＭｒｇｐｒＡ１の同定に部分的に基づく。ＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＡ１は、特定の種類の自然免疫細胞に発現し、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）を媒介し、自己免疫疾患に関与している可能性が高い。ＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＡ１は、ラモトリギンおよびアロプリノールなど、ＳＪＳを引き起こす多くの薬物によって活性化される。さらに、ＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＡ１は感覚ニューロンにも発現し、掻痒感および胆汁うっ滞性掻痒症に重要である。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＡ１はビリルビンの受容体である。本明細書に記載されるように、この発見以前には、ビリルビン受容体は同定されていなかった。いくつかの実施形態では、ヒトＭｒｇｐｒＸ４は、ＳＪＳ、多発性硬化症などの自己免疫疾患、胆汁うっ滞性掻痒症および他の慢性的なかゆみ症状の薬物標的である。本明細書に記載されるように、何らかの生物学的プロセスおよび疾患に果たすＭｒｇｐｒＸ４の役割は、この発見以前には完全に不明であった。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ４発現細胞ベースのアッセイ（ＭｒｇｐｒＸ４細胞株およびｃＤＮＡならびにＭｒｇｐｒＡ１変異マウス系統）を使用して、これらの反応を標的とする薬物をスクリーニングおよび試験する。本明細書に記載されるように、ＭｒｇｐｒＸ４発現細胞株は完全に新規であり、薬物スクリーニングのためのハイスループットスクリーニングに使用される。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ４の遮断は、ＳＪＳ、多発性硬化症などの自己免疫疾患、ならびに胆汁うっ滞性掻痒症および他の慢性的なかゆみ症状を治療するための新規の方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
好ましい態様では、１つ以上のＧタンパク質共役受容体媒介症状または障害を調節する薬剤をスクリーニングする方法が提供され、この方法は、（１）Ｇタンパク質共役受容体を発現する１つ以上の細胞を候補薬剤と接触させることと、（２）この１つ以上の細胞の応答を検出することによって評価用の候補薬剤を選択して、Ｇタンパク質共役受容体媒介症状または障害を調節することとを含む。好適には、細胞の応答は、Ｇタンパク質共役受容体の活性化として検出される。この方法は、候補薬剤がＧタンパク質共役受容体媒介症状または障害を調節するかどうかを決定することをさらに含み得る。
【０００６】
本発明はまた、ヒトＭｒｇｐｒＸ３およびそのマウスホモログＭｒｇｐｒＡ６が、後根神経節（ＤＲＧ）のケラチノサイト、上皮細胞および一次感覚ニューロンに発現するという発見に部分的に基づく。抗菌ペプチドのデフェンシンおよびカテリシジンがＭｒｇｐｒＸ３およびＭｒｇｐｒＡ６のアゴニストであることも発見された。デフェンシンおよびカテリシジンは、創傷治癒、慢性炎症、悪性形質転換、乾癬および皮膚炎などの皮膚疾患、気道障害、腸管および消化管の障害、疼痛ならびにかゆみなどの複数の疾患および症状に影響を及ぼす可能性がある。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ３およびＭｒｇｐｒＡ６を標的として、創傷治癒、慢性炎症、悪性形質転換、乾癬および皮膚炎などの皮膚疾患、気道障害、腸管および消化管の障害、疼痛ならびにかゆみを治療する。本明細書に記載されるように、何らかの生物学的プロセスおよび疾患に果たすＭｒｇｐｒＸ３の役割はこれまで不明であった。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ３発現細胞ベースのアッセイおよびＭｒｇｐｒＡ６変異マウスを使用して、これらの反応を標的とする薬物をスクリーニングおよび試験する。本明細書に記載されるように、ＭｒｇｐｒＸ３発現細胞株は新規であり、薬物スクリーニングのためのハイスループットスクリーニングに使用される。
【０００７】
本明細書では、ＭｒｇｐｒＸ３およびＭｒｇｐｒＸ４発現細胞ベースのアッセイを使用して、これらの受容体を標的とする薬物をスクリーニングする方法がさらに提供される。本発明はまた、薬物候補のハイスループットスクリーニングのためのＭｒｇｐｒＸ３およびＭｒｇｐｒＸ４発現細胞株を提供する。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ４を遮断して、薬物有害反応（例えば、ＳＪＳ）、胆汁うっ滞性掻痒症および他の慢性的なかゆみ症状ならびに自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）を治療する。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ３を遮断して、創傷治癒、慢性炎症、悪性形質転換、乾癬および皮膚炎などの皮膚疾患、気道および消化管障害、疼痛ならびにかゆみを治療する。
【０００８】
本発明はまた、ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ３（ＭｒｇｐｒＸ３）またはＭｒｇｐｒＸ４を発現する組換え核酸を含む単離細胞に部分的に基づく。例えば、組換え核酸はＭｒｇｐｒＸ３を発現する。あるいは、組換え核酸はＭｒｇｐｒＸ４を発現する。他の場合、ＭｒｇｐｒＸ３を発現する組換え核酸は、１つ以上の変異を含む。例えば、１つ以上の変異は、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＸ３タンパク質を産生する。あるいは、ＭｒｇｐｒＸ４を発現する組換え核酸は、１つ以上の変異を含む。例えば、１つ以上の変異は、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＸ４タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、細胞は免疫細胞、神経細胞および皮膚細胞から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は自然免疫細胞から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は細胞株から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物から得られる。いくつかの実施形態では、神経細胞は、後根神経節の一次感覚ニューロンからなる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は樹状細胞からなる。いくつかの実施形態では、ＭｒｐｇｒＸ４またはＭｒｐｇｒＡ１は、樹状細胞、および後根神経節の一次感覚ニューロンに発現する。いくつかの実施形態では、皮膚細胞はケラチノサイトである。
【０００９】
本発明はまた、ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ３（ＭｒｇｐｒＸ３）またはＭｒｇｐｒＸ４を発現する組換え核酸に部分的に基づく。例えば、組換え核酸は発現ベクターであり、ＭｒｇｐｒＸ３を発現する。あるいは、組換え核酸はＭｒｇｐｒＸ４を発現する。他の場合、ＭｒｇｐｒＸ３を発現する組換え核酸は、１つ以上の変異を含む。例えば、１つ以上の変異は、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＸ３タンパク質を産生する。あるいは、ＭｒｇｐｒＸ４を発現する組換え核酸は、１つ以上の変異を含む。例えば、１つ以上の変異は、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＸ４タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ３（ＭｒｇｐｒＸ３）またはＭｒｇｐｒＡ６をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上の変異を含むＭｒｇｐｒＸ３核酸配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上の変異を含むＭｒｇｐｒＡ６核酸配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ４（ＭｒｇｐｒＸ４）またはＭｒｇｐｒＡ１をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上の変異を含むＭｒｇｐｒＸ４核酸配列をコードする核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ベクターは、１つ以上の変異を含むＭｒｇｐｒＡ１核酸配列をコードする核酸配列を含む。
【００１０】
本明細書では、Ｇタンパク質共役受容体媒介症状または障害を調節する薬物をスクリーニングする方法であって、Ｇタンパク質共役受容体を発現する細胞を候補薬物と接触させることと、Ｇタンパク質共役受容体の活性化を検出することと、候補薬物がＧタンパク質共役受容体媒介症状または障害を調節するかどうかを決定することとを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体はＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＸ３から選択される。いくつかの実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体媒介症状は、薬物有害反応、自己免疫障害、多発性硬化症、疼痛、掻痒症、胆汁うっ滞性掻痒症、炎症障害、悪性形質転換、皮膚障害および創傷治癒から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は免疫細胞、神経細胞および皮膚細胞から選択される。いくつかの実施形態では、免疫細胞は自然免疫細胞から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は幹細胞から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は細胞株から選択される。いくつかの実施形態では、細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物から得られる。いくつかの実施形態では、神経細胞は、後根神経節の一次感覚ニューロンからなる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は樹状細胞からなる。いくつかの実施形態では、ＭｒｐｇｒＸ４またはＭｒｐｇｒＡ１は、樹状細胞、および後根神経節の一次感覚ニューロンに発現する。いくつかの実施形態では、皮膚細胞はケラチノサイトである。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性化は、細胞内カルシウムの増加を特定することによって検出される。
【００１１】
また、本明細書では、対象のＧタンパク質共役受容体媒介症状を治療する方法も提供され、この方法は、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６アンタゴニストを対象に投与し、それによりＧタンパク質共役受容体媒介症状を治療することを含む。いくつかの実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体媒介症状は、疼痛、掻痒症、胆汁うっ滞性掻痒症、炎症障害、悪性形質転換、皮膚障害および創傷治癒から選択される。
【００１２】
さらに、対象のＧタンパク質共役受容体媒介症状を治療する方法が提供され、この方法は、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６アゴニストを対象に投与し、それによりＧタンパク質共役受容体媒介症状を治療することを含む。いくつかの実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体媒介症状は、疼痛、掻痒症、胆汁うっ滞性掻痒症、炎症障害および皮膚障害（例えば、乾癬およびアトピー性皮膚炎）から選択される。
【００１３】
そのような方法のいくつかの実施形態では、アンタゴニストまたはアゴニストは、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、アンタゴニストまたはアゴニストは小分子を含む。いくつかの実施形態では、アンタゴニストまたはアゴニストは核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡもしくは短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、もしくはアンチセンスＲＮＡ、またはそれらの任意の部分を含む。そのような方法のいくつかの実施形態では、アンタゴニストまたはアゴニストは、対象に化合物を投与する前、それと同時またはその後に投与される。いくつかの実施形態では、アンタゴニストまたはアゴニストは、局所的に、経口的に、吸入により、または注射により投与される。
【００１４】
また、本明細書では、対象のＧタンパク質共役受容体媒介症状を治療する方法も提供され、この方法は、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１アンタゴニストを対象に投与し、それによりＧタンパク質共役受容体媒介症状を治療することを含む。そのような方法のいくつかの実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体媒介症状は、薬物有害反応、例えば、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）および中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）、自己免疫障害、多発性硬化症、疼痛、掻痒症ならびに胆汁うっ滞性掻痒症から選択される。
【００１５】
さらに、対象のＧタンパク質共役受容体媒介症状を治療する方法が提供され、この方法は、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１アゴニストを対象に投与し、それによりＧタンパク質共役受容体媒介症状を治療することを含む。そのような方法のいくつかの実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体媒介症状は、薬物有害反応、自己免疫障害、掻痒症および胆汁うっ滞性掻痒症から選択される。
【００１６】
そのような方法のいくつかの実施形態では、アンタゴニストまたはアゴニストは、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチドまたはそれらの任意の組合せを含む。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは小分子を含む。いくつかの実施形態では、アンタゴニストまたはアゴニストは核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡもしくは短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、もしくはアンチセンスＲＮＡ、またはそれらの任意の部分を含む。いくつかの実施形態では、アンタゴニストまたはアゴニストは、対象に化合物を投与する前、それと同時またはその後に投与される。そのような方法のいくつかの実施形態では、アンタゴニストまたはアゴニストは、局所的に、経口的に、吸入により、または注射により投与される。
【００１７】
また、本明細書では、化合物を投与することにより誘発される、対象の薬物有害反応の重症度を軽減する方法も提供され、この方法は、対象に化合物を投与することと、ＭｒｇｐｒＡ１またはＭｒｇｐｒＸ４アンタゴニストまたはアゴニストを対象に投与し、それにより対象の薬物有害反応の重症度を軽減することとを含む。
【００１８】
また、本明細書では、対象が化合物に対する薬物有害反応を発現するリスクが高いかどうかを決定する方法も提供され、この方法は、化合物に対する薬物有害反応を有するか、化合物に対する薬物有害反応を発現するリスクのある対象から試験試料を得ることと、試験試料中の少なくとも１つのＧタンパク質共役受容体遺伝子の発現レベルを決定することと、試験試料中のＧタンパク質共役受容体遺伝子の発現レベルと、参照試料中のＧタンパク質共役受容体遺伝子の発現レベルとを比較することと、試験試料中のＧタンパク質共役受容体遺伝子の発現レベルが参照試料中のＧタンパク質共役受容体遺伝子のレベルと比較して差次的に発現している場合、対象に対する化合物の投与が薬物有害反応を誘発するであろうことを決定することとを含む。いくつかの実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体遺伝子はＭｒｇｐｒＡ１またはＭｒｇｐｒＸ４である。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＡ１またはＭｒｇｐｒＸ４は変異体である。
【００１９】
また、本明細書では、Ｇタンパク質共役受容体媒介症状または障害の治療のための医薬組成物も提供され、組成物は、有効量のＧタンパク質共役受容体アンタゴニストまたはアゴニストを含む。いくつかの実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体アンタゴニストは、ＭｒｇｐｒＸ４もしくはＭｒｇｐｒＸ３アンタゴニスト、またはＭｒｇｐｒＸ３、ＭｒｇｐｒＸ４および他のＭｒｇｐｒメンバーの二重／多価アンタゴニストである。特定の他の実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体アゴニストは、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＸ３アゴニストである。いくつかの実施形態では、アンタゴニストまたはアゴニストは、抗体もしくはその断片、結合タンパク質、ポリペプチド、小分子、核酸またはそれらの任意の組合せを含む群から選択される。いくつかの実施形態では、アンタゴニストまたはアゴニストは、局所的に、経口的に、吸入により、または注射により投与される。いくつかの実施形態では、Ｇタンパク質共役受容体症状または障害は、薬物有害反応、自己免疫障害、多発性硬化症、疼痛、掻痒症、胆汁うっ滞性掻痒症、炎症障害、悪性形質転換、皮膚障害および創傷治癒から選択される。
【００２０】
さらに、１）本明細書に開示される医薬組成物と、２）Ｇタンパク質共役受容体症状または障害を治療するための指示書とを含むキットが提供される。医薬組成物は、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＸ３アンタゴニストなどのＧタンパク質共役受容体アンタゴニストの有効量を好適に含み得る。他の実施形態では、医薬組成物は、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＸ３アゴニストなどのＧタンパク質共役受容体アンタゴニストの有効量を好適に含み得る。指示書は、例えば、薬物有害反応、自己免疫障害、多発性硬化症、疼痛、掻痒症、胆汁うっ滞性掻痒症、炎症障害、悪性形質転換、皮膚障害および／または創傷治癒を治療するための医薬組成物の使用を開示するラベルまたはパッケージ挿入物であり得る。
【００２１】
また、本明細書では、ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ３（ＭｒｇｐｒＸ３）またはＭｒｇｐｒＡ６を発現する組換え核酸を含む単離細胞の組成物も提供される。いくつかの実施形態では、組換え核酸はＭｒｇｐｒＸ３を発現する。いくつかの実施形態では、組換え核酸はＭｒｇｐｒＡ６を発現する。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ３を発現する組換え核酸は、１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＸ３タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＡ６を発現する組換え核酸は、１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＡ６タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、単離細胞は、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を含む。
【００２２】
また、本明細書では、ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ４（ＭｒｇｐｒＸ４）またはＭｒｇｐｒＡ１を発現する組換え核酸を含む単離細胞の組成物も提供される。いくつかの実施形態では、組換え核酸はＭｒｇｐｒＸ４を発現する。いくつかの実施形態では、組換え核酸はＭｒｇｐｒＡ１を発現する。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ４を発現する組換え核酸は、１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＸ４タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＡ１を発現する組換え核酸は、１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、シグナル伝達経路を活性化することができないＭｒｇｐｒＡ１タンパク質を産生する。いくつかの実施形態では、単離細胞は、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞を含む。
【００２３】
また、本明細書では、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６のアンタゴニストを同定する方法であって、単離細胞（例えば、ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ３（ＭｒｇｐｒＸ３）またはＭｒｇｐｒＡ６を発現する組換え核酸を含む単離細胞）を偽アレルギー型反応を誘発する化合物と接触させることと、単離細胞を候補アンタゴニストと接触させることと、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の活性化を検出することとを含み、化合物の非存在下でのＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の活性化と比較してＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の活性化が低下していると、候補化合物がアンタゴニストであると決定される方法も提供される。
【００２４】
さらに、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６のアゴニストを同定する方法であって、単離細胞（例えば、ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ３（ＭｒｇｐｒＸ３）またはＭｒｇｐｒＡ６を発現する組換え核酸を含む単離細胞）を薬物有害反応を誘発する化合物と接触させることと、単離細胞を候補アゴニストと接触させることと、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の活性化を検出することとを含み、化合物の非存在下でのＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の活性化（すなわち対照）と比較してＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の活性化が増大していると、候補化合物がアゴニストであると決定される方法が提供される。好ましくは、候補アゴニストは、候補アゴニストの非存在下での試験アッセイ（対照）と比較して、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の活性化を少なくとも１、２、３、４または５パーセント増大させ、さらに好ましくは、候補アゴニストは、試験アッセイでは、候補アゴニストの非存在下での同じ試験アッセイ（対照）と比較して、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の活性化を少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０  ５０  ６０、７０、８０、９０または１００パーセント増大させる。候補アゴニストを評価するための好ましい試験アッセイには、以下の実施例９のアッセイが挙げられ、このアッセイでは、カルシウムイメージングまたはイノシトールリン酸検出により活性化を評価することができる。
【００２５】
また、本明細書では、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１のアンタゴニストを同定する方法であって、単離細胞（例えば、ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ４（ＭｒｇｐｒＸ４）またはＭｒｇｐｒＡ１を発現する組換え核酸を含む単離細胞）を薬物有害反応を誘発する化合物と接触させることと、単離細胞を候補アンタゴニストと接触させることと、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化を検出することとを含み、化合物の非存在下でのＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化（すなわち対照）と比較してＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化が低下していると、候補化合物がアンタゴニストであると決定される方法も提供される。好ましくは、候補アンタゴニストは、候補アンタゴニストの非存在下での試験アッセイ（対照）と比較して、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化を少なくとも１、２、３、４または５パーセント低下させ、さらに好ましくは、候補アンタゴニストは、試験アッセイでは、候補アンタゴニストの非存在下での同じ試験アッセイ（対照）と比較して、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化を少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０  ５０  ６０、７０、８０、９０または１００パーセント低下させる。候補アンタゴニストを評価するための好ましい試験アッセイには、以下の実施例９のアッセイが挙げられ、このアッセイでは、カルシウムイメージングにより活性化を評価することができる。活性化は、イノシトールリン酸検出によっても評価することができる。
【００２６】
さらに、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１のアゴニストを同定する方法であって、単離細胞（例えば、ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ４（ＭｒｇｐｒＸ４）またはＭｒｇｐｒＡ１を発現する組換え核酸を含む単離細胞）を薬物有害反応を誘発する化合物と接触させることと、単離細胞を候補アゴニストと接触させることと、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化を検出することとを含み、化合物の非存在下でのＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化（すなわち対照）と比較してＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化が増大していると、候補化合物がアゴニストであると決定される方法が提供される。好ましくは、候補アゴニストは、候補アゴニストの非存在下での試験アッセイ（対照）と比較して、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化を少なくとも１、２、３、４または５パーセント増大させ、さらに好ましくは、候補アゴニストは、試験アッセイでは、候補アゴニストの非存在下での同じ試験アッセイ（対照）と比較して、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化を少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０  ５０  ６０、７０、８０、９０または１００パーセント増大させる。候補アゴニストを評価するための好ましい試験アッセイには、以下の実施例９のアッセイが挙げられ、このアッセイでは、カルシウムイメージングまたはイノシトールリン酸検出により活性化を評価することができる。
【００２７】
本明細書では、対象に化合物を投与することにより化合物を投与することにより誘発される、対象のＧタンパク質共役受容体媒介症状の重症度を軽減する方法であって、ＭｒｇｐｒＸ４アンタゴニスト、ＭｒｇｐｒＸ３アンタゴニストまたはそれらの組合せを対象に投与し、それにより対象のＧタンパク質共役受容体媒介症状の重症度を軽減する方法が提供される。
【００２８】
さらに、対象に化合物を投与することにより化合物を投与することにより誘発される、対象のＧタンパク質共役受容体媒介症状の重症度を軽減する方法であって、ＭｒｇｐｒＸ４アゴニスト、ＭｒｇｐｒＸ３アゴニストまたはそれらの組合せを対象に投与し、それにより対象のＧタンパク質共役受容体媒介症状の重症度を軽減する方法が提供される。
【００２９】
また、対象に化合物を投与することにより化合物を投与することにより誘発される、対象の薬物有害反応の重症度を軽減する方法であって、ＭｒｇｐｒＸ４アンタゴニストを対象に投与し、それにより対象の薬物有害反応の重症度を軽減する方法が提供される。
【００３０】
また、対象の創傷治癒、慢性炎症、悪性形質転換、乾癬および皮膚炎などの皮膚疾患、気道および消化管障害、疼痛ならびにかゆみの重症度を軽減する方法であって、ＭｒｇｐｒＸ３アンタゴニストを対象に投与し、それにより対象の創傷治癒、慢性炎症、悪性形質転換、乾癬および皮膚炎などの皮膚疾患、気道および消化管障害、疼痛および／またはかゆみの重症度を軽減する方法が提供される。
【００３１】
また、対象の創傷治癒、慢性炎症、悪性形質転換、乾癬および皮膚炎などの皮膚疾患、気道および消化管障害、疼痛ならびにかゆみの重症度を軽減する方法であって、ＭｒｇｐｒＸ３アゴニストを対象に投与し、それにより対象の創傷治癒、慢性炎症、悪性形質転換、乾癬および皮膚炎などの皮膚疾患、気道および消化管障害、疼痛および／またはかゆみの重症度を軽減する方法が提供される。
【００３２】
例えば、本明細書に記載の方法は、Ｇタンパク質共役受容体媒介症状の重症度を少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％予防または軽減する。
【００３３】
対象は、好ましくは、そのような治療または予防を必要とする哺乳動物、例えば、偽アレルギー型反応またはそれに対する素因があると診断された対象である。哺乳動物は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ならびに、家畜または食用に育てられた動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリおよびヤギである。好ましい実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００３４】
阻害剤またはアンタゴニストもしくはアゴニストには、限定するものではないが、それらの特定の標的、または標的の天然リガンドと結合し、生物学的活性を調節する核酸、ペプチド、抗体または小分子が挙げられ得る。
【００３５】
場合によっては、アンタゴニストまたはアゴニストは小分子を含む。小分子とは、質量が２０００ダルトン未満の化合物である。小分子の分子量は、好ましくは１０００ダルトン未満、さらに好ましくは６００ダルトン未満であり、例えば、化合物は、５００ダルトン未満、４００ダルトン未満、３００ダルトン未満、２００ダルトン未満または１００ダルトン未満である。
【００３６】
小分子は有機または無機である。例示的な有機小分子には、限定するものではないが、脂肪族炭化水素、アルコール、アルデヒド、ケトン、有機酸、エステル、単糖および二糖、芳香族炭化水素、アミノ酸および脂質が挙げられる。例示的な無機小分子は、微量ミネラル、イオン、フリーラジカルおよび代謝産物を含む。あるいは、小分子は、酵素の結合ポケットを満たすために、断片、または小部分、またはそれよりも長いアミノ酸鎖からなるように合成的に改変することができる。典型的には、小分子は１キロダルトン未満である。
【００３７】
場合によっては、アンタゴニストまたはアゴニストは核酸分子を含む。例えば、リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）は、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４ポリペプチドの発現を阻害し、それによりＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性を阻害する。場合によっては、核酸は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡもしくは短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡもしくはマイクロＲＮＡまたはそれらの任意の部分を含む。しかし、当業者であれば、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４を阻害／拮抗または活性化／刺激する追加の核酸を容易に同定することができるであろう。
【００３８】
説明したように、アンタゴニストまたはアゴニストは、抗体、例えば、モノクローナルまたはポリクローナルＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４抗体であり得る。例えば、アンタゴニストとして使用され得るＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４抗体には、モノクローナルポリクローナル抗体、例えば、マウス、ウサギ、霊長類（例えば、サル）またはヒト化抗体（例えば、市販のＮｏｖｕｓ  ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌｓウサギポリクローナルＭｒｇｐｒＸ４抗体番号ＮＬＳ２４２９、ＡｂｃａｍのウサギポリクローナルＭｒｇｐｒＸ４抗体ｂ９７７８４、ＡｂｃａｍのウサギポリクローナルＭｒｇｒｐＸ４抗体ａｂ１８８７４０およびＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒの抗ＭｒｇｐｒＸ３ポリクローナル抗体ＰＡ５−３３９５）が挙げられる。上記の市販の抗体の断片を含め、そのようなモノクローナル抗体の断片はまた、好適なアンタゴニストまたはアゴニストであり得る。ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４．アンタゴニストまたはアゴニストとして使用するための好適かつ好ましい抗体断片は、本明細書に開示されるアッセイにより容易に同定することができる。好適な断片は、上記の市販の抗体などの対応する抗体と少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または９５の配列同一性を有する配列を含んでもよい。そのような断片は、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４．アンタゴニストまたはアゴニストとして使用される完全な薬剤であってよいか、別の配列または他の分子と共有結合して、例えば、抗体断片配列を含むか、上記の市販の抗体などの対応する抗体と同一の好適な配列を有する配列を含む融合分子を形成してもよい。
【００３９】
また、本明細書で説明されるように、小分子、ポリペプチド、抗体および抗体断片ならびに核酸を含む好適かつ好ましいＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＸ３アンタゴニストおよびアゴニストは、本明細書に開示されるアッセイにより容易に同定することができる、
アンタゴニストまたはアゴニストは、対象に化合物を投与する前、それと同時またはその後に投与される。
【００４０】
様々な投与経路が利用可能である。例えば、アンタゴニストまたはアゴニストは、局所的に、経口的に、吸入により、または注射により投与される。
【００４１】
アンタゴニストまたはアゴニストの有効量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜２５０ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、０．００１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ  ０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、７５ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ、１２５ｍｇ／ｋｇ、１５０ｍｇ／ｋｇ、１７５ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、２２５ｍｇ／ｋｇまたは２５０ｍｇ／ｋｇ体重である。最終的に、主治医または獣医が適切な量と投与レジメンとを決定する。
【００４２】
場合によっては、アンタゴニストまたはアゴニストは、少なくとも１日１回、少なくとも１週間に１回、または少なくとも１カ月に１回投与される。アンタゴニストまたはアゴニストは、好適には、１日、１週間、１カ月、２カ月、３カ月、６カ月、９カ月または１年の期間にわたって投与され得る。場合によっては、アンタゴニストは、連日、例えば、２４時間ごとに投与される。または、アンタゴニストは、連続的に、または１日に数回、例えば、１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、４時間ごと、５時間ごと、６時間ごと、７時間ごと、８時間ごと、９時間ごと、１０時間ごと、１１時間ごとまたは１２時間ごとに投与される。
【００４３】
化合物が薬物有害反応を誘発するかどうかを決定する方法は、本明細書に記載の単離細胞を候補化合物と接触させ、ＭｒｇｐｒＸ４の活性化を検出することにより行われ、ＭｒｇｐｒＸ４が活性化していると、候補化合物が薬物有害反応を誘発すると決定される。
【００４４】
例えば、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＡ６の活性化は、化合物の非存在下での細胞内カルシウムのレベルと比較して細胞内カルシウムの増加を特定することにより検出される。場合によっては、細胞内カルシウムのレベルは、少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％増加する。細胞内カルシウム濃度は、本明細書に記載の方法または当業者が利用可能な方法を利用して決定される。
【００４５】
例えば、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＡ１の活性化は、化合物の非存在下での細胞内カルシウムのレベルと比較して細胞内カルシウムの増加を特定することにより検出される。場合によっては、細胞内カルシウムのレベルは、少なくとも１％、例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％増加する。細胞内カルシウム濃度は、本明細書に記載の方法または当業者が利用可能な方法を利用して決定される。
【００４６】
ＭｒｇｐｒＸ４ポリペプチドの生物学的活性を打ち消すか、阻害するか、減少させるか、抑制することを確認するために、候補ＭｒｇｐｒＸ４アンタゴニストがスクリーニングされる。ＭｒｇｐｒＸ３ポリペプチドの生物学的活性を打ち消すか、阻害するか、減少させるか、抑制することを確認するために、候補ＭｒｇｐｒＸ３アンタゴニストがスクリーニングされる。
【００４７】
また、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＸ３のアンタゴニストを同定する方法であって、本明細書に記載の単離細胞を偽アレルギー型反応を誘発する化合物と接触させることと、本明細書に記載の単離細胞を候補アンタゴニストと接触させることと、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性化を検出することとを含み、候補アンタゴニストの非存在下でのＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性化と比較してＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性化が低下していると、候補化合物がアンタゴニストであると決定される方法も提供される。好ましくは、候補アンタゴニストは、候補アンタゴニストの非存在下での試験アッセイ（対照）と比較して、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性化を少なくとも１、２、３、４または５パーセント低下させ、さらに好ましくは、候補アンタゴニストは、試験アッセイでは、候補アンタゴニストの非存在下での同じ試験アッセイ（対照）と比較して、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性化を少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０  ５０  ６０、７０、８０、９０または１００パーセント低下させる。候補アンタゴニストを評価するための好ましい試験アッセイには、以下の実施例９のアッセイが挙げられ、このアッセイでは、カルシウムイメージングまたはイノシトールリン酸検出により活性化を評価することができる。
【００４８】
また、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＸ３のアゴニストを同定する方法であって、本明細書に記載の単離細胞（例えば、ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ３（ＭｒｇｐｒＸ３）またはＭｒｇｐｒＸ４を発現する組換え核酸を含む単離細胞）を偽アレルギー型反応を誘発する化合物と接触させることと、本明細書に記載の単離細胞を候補アゴニストと接触させることと、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性化を検出することとを含み、候補アゴニストの非存在下でのＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性化と比較してＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性化が増大していると、候補化合物がアゴニストであると決定される方法も提供される。好ましくは、選択された候補アゴニストは、候補アゴニストの非存在下での試験アッセイ（対照）と比較して、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性化を少なくとも１、２、３、４または５パーセント低下させ、さらに好ましくは、選択された候補アゴニストは、試験アッセイでは、候補アンタゴニストの非存在下での同じ試験アッセイ（対照）と比較して、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性化を少なくとも７、１０、１５、２０、２５、３０、４０  ５０  ６０、７０、８０、９０または１００パーセント低下させる。候補アゴニストを評価するための好ましい試験アッセイには、以下の実施例９のアッセイが挙げられ、このアッセイでは、カルシウムイメージングまたはイノシトールリン酸検出により活性化を評価することができる。
【００４９】
また、本明細書では、対象の自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）を治療する方法であって、自己免疫疾患に罹患しているか、自己免疫疾患を発症するリスクのある対象を特定することと、ＭｒｇｐｒＸ４アンタゴニストを含む有効量の組成物を対象に投与し、それにより対象の自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）を治療または予防することとを含む方法も提供される。
【００５０】
例示的な自己免疫疾患は、セリアック病、１型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデス（ＳＬＥまたはループス）からなる群から選択される。
【００５１】
また、本明細書では、対象の創傷治癒を治療する方法であって、創傷治癒を経験しているか、創傷治癒を経験するリスクのある対象を特定することと、ＭｒｇｐｒＸ３アンタゴニストを含む組成物の有効量を対象に投与し、それにより対象の創傷治癒を治療または支援することとを含む方法も提供される。
【００５２】
また、本明細書では、対象の皮膚障害を治療する方法であって、皮膚障害に罹患しているか、皮膚障害を発現するリスクのある対象を特定することと、ＭｒｇｐｒＸ３アンタゴニストを含む組成物の有効量を対象に投与し、それにより対象の皮膚障害を治療または予防することとを含む方法も提供される。
【００５３】
さらに、対象の皮膚障害を治療する方法であって、皮膚障害に罹患しているか、皮膚障害を発現するリスクのある対象を特定することと、ＭｒｇｐｒＸ３アゴニストを含む組成物の有効量を対象に投与し、それにより対象の皮膚障害を治療または予防することとを含む方法が提供される。
【００５４】
そのような方法により治療される例示的な皮膚障害には、乾癬、皮膚炎、皮膚潰瘍および癌腫（例えば、メラノーマ）が挙げられる。
【００５５】
また、本明細書では、対象の炎症（例えば、慢性炎症）を治療する方法であって、炎症に罹患しているか、炎症を発症するリスクのある対象を特定することと、ＭｒｇｐｒＸ３アンタゴニストを含む組成物の有効量を対象に投与し、それにより対象の炎症（例えば、慢性炎症）を治療または予防することとを含む方法も提供される。
【００５６】
炎症の例は、慢性炎症、虫垂炎、滑液包炎、大腸炎、膀胱炎、皮膚炎、静脈炎、反射性交感神経性ジストロフィー／複合性局所疼痛症候群（ｒｓｄ／ｃｒｐｓ）、鼻炎、腱炎、扁桃炎、尋常性ざ瘡、反応性気道障害、例えば、喘息および気道感染症、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、憩室炎、糸球体腎炎、化膿性汗腺炎、過敏症、上皮腸障害（ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）を含む腸障害、例えば、炎症性腸疾患、例えば、過敏性腸症候群および大腸炎、間質性膀胱炎、耳炎、骨盤内炎症性疾患、再灌流傷害、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植片拒絶ならびに血管炎からなる群から選択される。
【００５７】
また、本明細書では、対象の悪性形質転換（例えば、癌）を治療する方法であって、悪性形質転換に罹患しているか、悪性形質転換を発症するリスクのある対象を特定することと、ＭｒｇｐｒＸ３アンタゴニストを含む組成物の有効量を対象に投与し、それにより対象の悪性形質転換（例えば、癌）を治療または予防することとを含む方法も提供される。
【００５８】
例示的な癌は、癌腫、肉腫、腫瘍、固形腫瘍、血液癌、白血病、リンパ腫、皮膚癌、メラノーマ、乳癌、卵巣癌、子宮癌、前立腺癌、精巣癌、大腸癌、胃癌、腸癌、膀胱癌、肺癌、非小細胞肺癌、膵癌、腎細胞癌、腎癌、肝癌、肝細胞癌、脳癌、頭頸部癌、網膜癌、神経膠腫、脂肪腫、咽頭癌、甲状腺癌、神経芽細胞腫、子宮内膜癌、骨髄腫および食道癌からなる群から選択される。
【００５９】
本明細書に記載の組成物は、経口投与、静脈内投与、局所投与、非経口投与、腹腔内投与、筋肉内投与、脊髄内投与、病巣内投与、頭蓋内投与、鼻腔内投与、眼内投与、心臓内投与、硝子体内投与、骨内投与、脳内投与、動脈内投与、関節内投与、皮内投与、経皮投与、経粘膜投与、舌下投与、経腸投与、唇下投与（ｓｕｂｌａｂｉａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、吹送投与（ｉｎｓｕｆｆｌａｔｉｏｎ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、坐薬投与、吸入投与または皮下投与により投与される。
定義
【００６０】
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を当業者に提供する：Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；およびＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の用語は、別段の指定がない限り、以下でそれらに付与される意味を有する。
【００６１】
本明細書に記載の抗体およびその断片には、限定するものではないが、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ｄＡｂ（ドメイン抗体）、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ、ｓｃＦｖが挙げられる。抗体の断片は、そのそれぞれの抗体の免疫学的活性を有する。いくつかの実施形態では、抗体の断片は、１５００以下、１２５０以下、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、３００以下、２００以下のアミノ酸を含有する。例えば、タンパク質またはペプチド阻害剤は、１５００以下、１２５０以下、１０００以下、９００以下、８００以下、７００以下、６００以下、５００以下、４００以下、３００以下、２００以下、１００以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３０以下、２５以下、２０以下、１０以下のアミノ酸を含有する。例えば、本発明の核酸阻害剤は、４００以下、３００以下、２００以下、１５０以下、１００以下、９０以下、８０以下、７０以下、６０以下、５０以下、４０以下、３５以下、３０以下、２８以下、２６以下、２４以下、２２以下、２０以下、１８以下、１６以下、１４以下、１２以下、１０以下のヌクレオチドを含有する。
【００６２】
分子および細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２０１２）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，５ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  ２００２）；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）；Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）；およびＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９８）などの標準的な教科書に見出すことができる。本開示で言及される遺伝子操作のための試薬、クローニングベクターおよびキットは、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈおよびＣｌｏｎＴｅｃｈなどの商業ベンダーから入手可能である。
【００６３】
本明細書で使用される用語「抗体」（Ａｂ）には、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体断片が含まれる。用語「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、本明細書では「抗体」と区別なく使用される。
【００６４】
「単離抗体」とは、その自然環境の成分から分離および／または回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法によって決定される通り、抗体の９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニング・カップ・シークエネーターの使用によってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）還元または非還元条件下で、クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質性になるまで精製される。抗体の自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないことから、単離抗体は、組換え細胞内にインサイチュで抗体を含む。ただし、通常は、少なくとも１つの精製工程によって単離抗体が調製される。
【００６５】
基本的な四鎖抗体単位は、２つの同一の軽（Ｌ）鎖および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドに沿って５つの基本的なヘテロ四量体単位からなり、したがって、１０の抗原結合部位を含有するのに対して、分泌されたＩｇＡ抗体は、重合して、Ｊ鎖に沿って２〜５つの基本的な４鎖単位を含む多価集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合、４鎖単位は一般に約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖と連結しているのに対して、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結している。各ＨおよびＬ鎖はまた、規則的間隔の鎖間ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）、続いて、αおよびγ鎖のそれぞれについて３つの定常ドメイン（ＣＨ）、ならびにμおよびεアイソタイプについて４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）、続いて、もう一方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨと整列しており、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列している。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられている。ＶＨおよびＶＬの対合は、単一の抗原結合部位を一緒に形成する。様々なクラスの抗体の構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，ｐａｇｅ  ７１，ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。
【００６６】
任意の脊椎動物種由来のＬ鎖は、それらの定常ドメイン（ＣＬ）のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、それらの重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と指定された重鎖を有する５つのクラスの免疫グロブリン、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがある。γおよびαクラスは、ＣＨ配列および機能の比較的わずかな差に基づいてサブクラスにさらに分割され、例えば、ヒトは、下記のサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を発現する。
【００６７】
用語「可変」は、Ｖドメインの特定のセグメントでは、抗体間で配列が大幅に異なるという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を仲介し、その特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を定義する。ただし、可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸スパンにわたって均等に分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれ９〜１２アミノ酸長である「超可変領域」と呼ばれる極端な可変性の比較的短い領域によって分離された、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変のストレッチからなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは４つのＦＲをそれぞれ含み、この４つのＦＲは、βシート構造を接続し、場合によってはこのβシート構造の一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によって接続されたβシート構成を主に採用している。各鎖の超可変領域は、ＦＲによって、他の鎖由来の超可変領域とごく近接して一緒に保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照）。定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接関与していないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）での抗体の関与などの様々なエフェクター機能を示す。
【００６８】
本明細書で使用される用語「超可変領域」は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けした場合、ＶＬ内の残基約２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）程度、ならびにＶＨ内の約３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）程度；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））；および／または「超可変ループ」由来の残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付けシステムに従って番号付けした場合、ＶＬ内の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびにＶＨ内の２６〜３２（Ｈ１）、５２〜５６（Ｈ２）および９５〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；および／または「超可変ループ」／ＣＤＲ由来の残基（例えば、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従って番号付けした場合、ＶＬ内の残基２７〜３８（Ｌ１）、５６〜６５（Ｌ２）および１０５〜１２０（Ｌ３）、ならびにＶＨ内の２７〜３８（Ｈ１）、５６〜６５（Ｈ２）および１０５〜１２０（Ｈ３）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２０９−２１２（１９９９），Ｒｕｉｚ，Ｍ．ｅ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２１９−２２１（２０００））を含む。場合により、抗体は、ＡＨｏに従って番号付けした場合、下記の点、すなわち、ＶＬ内の２８、３６（Ｌ１）、６３、７４〜７５（Ｌ２）および１２３（Ｌ３）、ならびにＶＨ内の２８、３６（Ｈ１）、６３、７４〜７５（Ｈ２）および１２３（Ｈ３）のうちの１つ以上に対称的挿入を有する；Ｈｏｎｎｅｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｐｌｕｎｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０（２００１））。
【００６９】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量存在し得る可能な自然発生の変異を除き、同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、それらの特異性に加えて、他の抗体に汚染されずに合成され得るという点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ方法論によって調製され得るか、細菌、真核動物または植物細胞における組換えＤＮＡ法を使用して作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００７０】
モノクローナル抗体には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であるのに対して、鎖の残りが、別の種に由来するか別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに、それらが所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号明細書およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照）。また、ヒト抗体に由来する可変ドメイン抗原結合配列も提供される。したがって、本明細書の主要な目的のキメラ抗体には、１つ以上のヒト抗原結合配列（例えば、ＣＤＲ）を有し、非ヒト抗体に由来する１つ以上の配列、例えば、ＦＲまたはＣ領域配列を含む抗体が含まれる。さらに、本明細書の主要な目的のキメラ抗体には、１つの抗体クラスまたはサブクラスのヒト可変ドメイン抗原結合配列と、別の抗体クラスまたはサブクラスに由来する別の配列、例えば、ＦＲまたはＣ領域配列とを含むものが含まれる。本明細書の目的のキメラ抗体にはまた、本明細書に記載の配列に関連する、または非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）などの異なる種に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含むものも含まれる。キメラ抗体にはまた、霊長類化およびヒト化抗体も含まれる。
【００７１】
さらに、キメラ抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾は、抗体性能をさらに精緻化するために行われる。詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００７２】
「ヒト化抗体」とは、一般に、非ヒトである供給源からその中に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有するヒト抗体であると考えられる。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「インポート」残基と称され、「インポート」残基は典型的に、「インポート」可変ドメインから採取される。ヒト化は、従来、Ｗｉｎｔｅｒらの方法に準拠して（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））、ヒト抗体の対応する配列をインポート超可変領域配列に置換することにより行われる。したがって、そのような「ヒト化」抗体はキメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号明細書）であり、実質的にインタクトなヒト可変ドメイン未満が、非ヒト種由来の対応する配列によって置換されている。
【００７３】
「ヒト抗体」とは、ヒトによって自然に産生された抗体に存在する配列のみを含む抗体である。ただし、本明細書で使用される場合、ヒト抗体は、本明細書に記載される修飾および変異体配列を含む、自然発生のヒト抗体には見られない残基または修飾を含み得る。これらは典型的に、抗体性能をさらに精緻化または強化するために行われる。
【００７４】
「インタクト」抗体とは、抗原結合部位、ならびにＣＬおよび少なくとも重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であり得る。好ましくは、インタクト抗体は１つ以上のエフェクター機能を有する。
【００７５】
「抗体断片」は、インタクト抗体の一部、好ましくはインタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、ダイアボディ、線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］）、一本鎖抗体分子、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００７６】
抗体の「機能性断片またはアナログ」という語句は、完全長抗体と共通の定性的な生物学的活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能性断片またはアナログは、高親和性受容体ＦｃεＲＩと結合する能力を有することにより、そのような分子の能力を防止するか実質的に低減させるような方法で、ＩｇＥ免疫グロブリンと結合することができるものである。
【００７７】
抗体のパパイン分解は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一抗原結合断片と、残りの「Ｆｃ」断片とを産生し、名称は容易に結晶化する能力を反映している。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）に沿ったＬ鎖全体と、１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とからなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片にほぼ対応する単一の大きなＦ（ａｂ’）２断片を生成し、依然として抗原を架橋させることができる。Ｆａｂ’断片は、ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含む追加の少数の残基を有することにより、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’の呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は元来、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。
【００７８】
「Ｆｃ」断片は、ジスルフィドによって一緒に保持された両Ｈ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Ｆｃ領域の配列によって決定され、この領域は、特定の種類の細胞に見られるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
【００７９】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含有する最小の抗体断片である。この断片は、緊密で非共有結合的に会合した１つの重鎖可変領域ドメインおよび１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これらの２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（それぞれＨおよびＬ鎖に由来する３つのループ）が生じる。ただし、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、結合部位全体よりも低い親和性ではあるが、抗原を認識し結合する能力を有する。
【００８０】
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「一本鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインとの間にさらに含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  １９９５，ｉｎｆｒａを参照されたい。
【００８１】
用語「ダイアボディ」は、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間対合が実現されるように、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にショートリンカー（約５〜１０残基）を有するｓＦｖ断片（前段落を参照）を構築することによって、二価断片、すなわち、２つの抗原結合部位を有する断片をもたらすことによって調製される小さい抗体断片を指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨおよびＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「クロスオーバー」ｓＦｖ断片のヘテロ二量体である。ダイアボディについては、例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書、国際公開第９３／１１１６１号パンフレットおよびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）にさらに完全に記載されている。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「内在化する」抗体とは、哺乳動物細胞（例えば、細胞表面ポリペプチドまたは受容体）上の抗原との結合時に、細胞によって取り込まれる（すなわち、中に入る）抗体である。内在化抗体には、当然ながら、抗体断片、ヒトまたはキメラ抗体および抗体コンジュゲートが含まれる。特定の治療用途では、インビボでの内在化が企図される。内在化される抗体分子の数は、細胞、特に感染細胞を死滅させるか、その増殖を阻害するのに十分または妥当なものである。抗体または抗体コンジュゲートの効力に応じて、いくつかの例では、細胞への単一の抗体分子の取り込みは、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、特定の毒素は、抗体にコンジュゲートされた毒素の１分子の内在化が感染細胞を死滅させるのに十分であるように、死滅させるのに高度に強力である。
【００８３】
本明細書で使用される場合、抗体は、検出可能なレベルで、好ましくは、約１０４Ｍ−１以上、または約１０５Ｍ−１以上、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、または１０８Ｍ−１以上の親和定数Ｋａで抗原と反応する場合、「免疫特異性」、抗原「に対して特異的」または抗原と「特異的に結合する」と言われる。そのコグネイト抗原に対する抗体の親和性は、解離定数ＫＤとしても一般的に表現され、特定の実施形態では、ＨｕＭ２ｅ抗体は、１０−４Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下または１０−８Ｍ以下のＫＤで結合する場合、Ｍ２ｅと特異的に結合する。抗体の親和性は、従来の技術、例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５１：６６０（１９４９））によって記述されているものを使用して、容易に決定することができる。
【００８４】
その抗原、細胞または組織に対する抗体の結合特性は、一般に、例えば、免疫組織化学（ＩＨＣ）および／または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの免疫蛍光ベースのアッセイを含む免疫検出法を使用して決定および評価され得る。
【００８５】
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は、他の抗体からそれを区別するその抗体の生物学的特性のうちの１つ以上を有する抗体である。例えば、特定の実施形態では、指定された抗体の生物学的特性を有する抗体は、指定された抗体によって結合されているものと同じエピトープに結合し、および／または指定された抗体として共通のエフェクター機能を有する。
【００８６】
用語「アンタゴニスト抗体」は最も広い意味で使用され、それが特異的に結合するエピトープ、ポリペプチドまたは細胞の生物学的活性を部分的または完全に遮断、阻害または中和する抗体を含む。アンタゴニスト抗体を同定する方法は、候補アンタゴニスト抗体によって特異的に結合されているポリペプチドまたは細胞を候補アンタゴニスト抗体と接触させることと、そのポリペプチドまたは細胞に通常関連する１つ以上の生物学的活性の検出可能な変化を測定することとを含み得る。
【００８７】
抗体「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指し、抗体アイソタイプにより変動する。抗体エフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、貪食、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。
【００８８】
用語「抗原結合部位」または「結合部分」は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる、重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐するストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として知られる保存度の高いフランキングストレッチ間に挟まれる。したがって、用語「ＦＲ」は、免疫グロブリンの超可変領域の間、およびそれに隣接して自然に見られるアミノ酸配列を指す。抗体分子では、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、三次元空間に互いに対して配置されて、抗原結合表面を形成する。抗原結合表面は、結合抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と呼ばれる。
【００８９】
本明細書で使用される用語「エピトープ」には、免疫グロブリン、ｓｃＦｖまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することができる任意のタンパク質決定基が含まれる。エピトープ決定基は、アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な表面分子団からなり、特異的な三次元構造特性と特異的な電荷特性とを有する。例えば、ポリペプチドのＮ末端ペプチドまたはＣ末端ペプチド、タンパク質の線形または非線形ペプチド配列、ならびに第１の抗原のアミノ酸および第２の抗原のアミノ酸を含むエピトープに対して抗体を生じさせることができる。
【００９０】
本明細書で使用される用語「免疫細胞」には、一般に、骨髄「免疫細胞」内で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）（白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））が含まれ、例えば、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）および骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。いくつかの実施形態では、免疫細胞はキメラ抗原受容体を含む。本明細書で使用される用語「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」は、免疫細胞を活性化または刺激することができる細胞内シグナル伝達ドメインに融合した抗原結合ドメインを指し、特定の実施形態では、ＣＡＲは膜貫通ドメインも含む。
【００９１】
本明細書で使用される用語「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」は、免疫グロブリン分子と、その免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じる種類の非共有相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点から表現することができ、Ｋｄが小さいほど親和性が高くなる。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を使用して定量することができる。１つのそのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度の測定を伴い、それらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的パラメーターに依存する。したがって、濃度ならびに実際の会合および解離の速度の計算によって、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）および「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方を決定することができる。（Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：１８６−８７（１９９３））。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関係しないあらゆるパラメーターの取り消しを可能にし、解離定数Ｋｄに等しい。Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：４３９−４７３）。本発明の抗体は、放射性リガンド結合アッセイまたは当業者に公知の同様のアッセイなどのアッセイによって測定した際に、平衡結合定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、好ましくは≦１００ｎＭ、さらに好ましくは≦１０ｎＭ、さらに好ましくは≦１ｎＭ、最も好ましくは≦１００ｐＭ〜約１ｐＭである場合に、本明細書に記載の抗原またはエピトープ（例えば、ＣＴＬＡ、ＰＤ１、ＰＤＬ１、または他の免疫抑制タンパク質および／または腫瘍抗原）と特異的に結合すると言われている。
【００９２】
本発明はまた、ポリペプチドおよび核酸断片がそれぞれ完全長のポリペプチドおよび核酸の所望の生物学的活性を示す（すなわち、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４に拮抗する）限り、そのポリペプチドおよび核酸断片を含む。ほぼあらゆる長さの核酸断片が使用される。例えば、本発明の多くの実装には、全長が約１０，０００、約５０００、約３０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の長さ（すべての中間の長さを含む）の例示的なポリヌクレオチドセグメントが含まれる。同様に、ほぼあらゆる長さのポリペプチド断片が使用される。例えば、本発明の多くの実装には、全長が約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００または約５０アミノ酸の長さ（すべての中間の長さを含む）の例示的なポリペプチドセグメントが含まれる。
【００９３】
ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは他の薬剤は精製および／または単離される。具体的には、本明細書で使用される場合、「単離」または「精製」された核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質は、組換え技術によって生成される場合、他の細胞材料もしくは培養培地を実質的に含まず、または化学的に合成された場合、化学的前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。精製された化合物は、対象化合物の少なくとも６０重量％（乾燥重量）である。好ましくは、調製物は、対象化合物の少なくとも７５重量％、さらに好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％である。例えば、精製された化合物は、重量で、所望の化合物の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９８％、９９％または１００％（ｗ／ｗ）のものである。純度は、任意の適切な標準法、例えばカラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィーまたは高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析によって測定される。精製または単離されたポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））には、その自然発生の状態では隣接する遺伝子または配列がない。精製または単離されたポリペプチドには、その自然発生の状態では隣接するアミノ酸または配列がない。「精製された」はまた、感染性または毒性物質を欠くなど、ヒト対象への投与に安全な無菌性の程度を定義する。
【００９４】
同様に、「実質的に純粋」とは、天然にそれに付随する成分から分離されたヌクレオチドまたはポリペプチドを意味する。典型的には、ヌクレオチドおよびポリペプチドは、それらが少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％またはさらには９９重量％であり、それらが自然に結合したタンパク質および自然発生の有機分子を含まない場合に、実質的に純粋である。
【００９５】
「単離された核酸」とは、核酸が由来する生物の自然発生のゲノム内では隣接する遺伝子がない核酸を意味する。この用語は、例えば、（ａ）自然発生のゲノムＤＮＡ分子の一部であるが、それが自然に発生する生物のゲノムでは分子のその一部に隣接する核酸配列の両方が隣接していないＤＮＡ、（ｂ）ベクター中に、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に、結果として生じる分子がいかなる自然発生のベクターともゲノムＤＮＡとも同一でないような方法で組み込まれた核酸、（ｃ）合成相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生された断片、または制限断片などの別個の分子、および（ｄ）雑種遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列を網羅する。本発明による単離された核酸分子には、合成により生成された分子、ならびに化学的に改変されたおよび／または骨格が改変された任意の核酸がさらに含まれる。例えば、単離された核酸は、精製されたｃＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドである。単離された核酸分子には、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子も含まれる。
【００９６】
用語「ベクター」は、複製および発現可能な細胞への導入のために異種核酸配列を挿入することができるキャリア核酸分子を指すために使用される。この用語はさらに、同じ目的に有用な特定の生物学的媒体、例えばウイルスベクターおよびファージを意味する。これらの感染性因子はともに異種核酸配列を導入することができる
【００９７】
「発現ベクター」は、宿主細胞内の特定のポリヌクレオチド配列の転写を可能にする一連の特定の核酸エレメントを有する、組換え的にまたは合成的に生成された核酸構築物である。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスゲノムまたは核酸断片の一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、転写され、プロモーターに作動可能に連結されるポリヌクレオチドを含む。この文脈では、「作動可能に連結された」とは、２つ以上の遺伝的エレメント、例えば、そのエレメントの適切な生物学的機能を可能にする相対位置に配置されたポリヌクレオチドコード配列およびプロモーター、例えば、コード配列の転写を誘導するプロモーターを意味する。本明細書では、用語「プロモーター」は、核酸の転写を誘導する核酸制御配列のアレイを指すために使用される。本明細書で使用される場合、プロモーターは、転写の開始部位近くの必要な核酸配列、例えば、ポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合、ＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターはまた、場合により、転写の開始部位から数千塩基対も離れて位置することができる遠位のエンハンサーエレメントまたはリプレッサーエレメントを含む。発現ベクターに存在し得る他のエレメントには、転写を増強するエレメント（例えば、エンハンサー）、および転写を終結するエレメント（例えば、ターミネーター）、ならびに発現ベクターから産生された組換えタンパク質に特定の結合親和性または抗原性を付与するエレメントが挙げられる。
【００９８】
「候補化合物」とは化学物質を意味し、それが自然発生するか、人工的に誘導されるかを問わない。候補化合物には、例えば、ペプチド、ポリペプチド、合成有機分子、天然有機分子、核酸分子、ペプチド核酸分子ならびにそれらの成分および誘導体が挙げられ得る。
【００９９】
用語「医薬組成物」は、少なくとも１つの治療的または生物学的に活性な薬剤を含有し、患者への投与に適した任意の組成物を意味する。これらの製剤はいずれも、当技術分野の周知かつ受け入れられている方法により調製することができる。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，２０００を参照されたい。
【０１００】
「Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）」とは、細胞外の分子を感知し、細胞内で、シグナル伝達経路、最終的には細胞応答を活性化するタンパク質受容体を意味する。ＧＰＣＲは、細胞膜を７回通過するため、７回膜貫通型受容体と呼ばれている。
【０１０１】
「アゴニスト」とは、受容体に結合し、受容体を活性化して生物学的応答を引き起こす化学物質を意味する。アゴニストが作用を引き起こすのに対して、「アンタゴニスト」はアゴニストの作用を遮断し、インバースアゴニストはアゴニストの作用とは反対の作用を引き起こす。本明細書で使用される用語「アンタゴニスト」および「阻害剤」は、その標的分子の生物学的活性を打ち消すか、阻害するか、減少させるか、抑制する任意の分子を指すために区別なく使用される。いくつかの実施形態では、アゴニストは、その標的分子（例えば、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＸ３）の生物学的活性を誘発または増加させる場合、「スーパーアゴニスト」である。いくつかの実施形態では、アンタゴニストは、その標的分子（例えば、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｇｐｒＸ３）の生物学的活性を打ち消すか、阻害するか、減少させるか、抑制する場合、「スーパーアンタゴニスト」である。好適なＭｒｇｐｒＸ３アンタゴニスト、ＭｒｇｐｒＸ４アンタゴニスト、ＭｒｇｐｒＸ３アゴニストおよび／またはＭｒｇｐｒＸ４アゴニストには、可溶性受容体、ペプチド阻害剤、小分子阻害剤、リガンド融合体および抗体が挙げられる。
【０１０２】
「野生型」または「ＷＴ」とは、自然界で発生する種の典型的な形態の表現型を意味する。あるいは、野生型は、非標準的な「変異」対立遺伝子によって生成されるものとは対照的に、遺伝子座での標準的な「正常」対立遺伝子の産物として概念化される。
【０１０３】
本明細書で使用される用語「投与する」は、例えば疾患または症状の治療を必要とする対象に、ＭｒｇｐｒＸ３もしくはＭｒｇｐｒＸ４アンタゴニストまたはＭｒｇｐｒＸ３もしくはＭｒｇｐｒＸ４アゴニストを移すか、送達するか、導入するか、輸送する任意の様式を指す。そのような様式には、限定するものではないが、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、鼻腔内および皮下投与が挙げられる。
【０１０４】
「ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４アンタゴニスト」とは、シグナル伝達経路を活性化するＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の能力を遮断、防止、軽減または変化させることができる任意の小分子、化合物、抗体、核酸分子もしくはポリペプチドまたはそれらの断片を意味する。
【０１０５】
「ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４アゴニスト」とは、シグナル伝達経路を活性化するＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の能力を増加、活性化または変化させることができる任意の小分子、化合物、抗体、核酸分子もしくはポリペプチドまたはそれらの断片を意味する。ＭｒｇｐｒＸ３アゴニストまたはＭｒｇｐｒＸ４アゴニストは、以下の実施例９など、本明細書に開示されたプロトコルにより同定することができる。
【０１０６】
「変化」とは、本明細書に記載されるものなど、当技術分野で知られている標準法によって検出される、ポリペプチド、例えばＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４の活性の変化（増加または減少）を意味する。本明細書で使用される場合、変化には、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の１０％以上の変化、好ましくは２５％の変化、さらに好ましくは４０％の変化、最も好ましくはポリペプチドの活性の５０％以上の変化が含まれる。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「変化」にはまた、遺伝子またはポリペプチドの発現レベルまたは活性の２倍以上の変化、例えば５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、５００倍、１０００倍以上の変化が含まれる。
【０１０８】
「改善する」とは、例えば、偽アレルギー型反応などの疾患の発症または進行を減少、抑制、減弱、低下、停止または安定化することを意味する。
【０１０９】
「増幅する」とは、分子のコピー数を増大することを意味する。一例では、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して核酸を増幅する。
【０１１０】
「結合」とは、分子に対して物理化学的親和性を有することを意味する。結合は、本発明の方法のいずれか、例えば、細胞上に発現した受容体を有する薬物／化合物によって測定される。
【０１１１】
本開示では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法でそれらに付与されている意味を有することができ、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することができ、用語「から本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」は、同様に米国特許法で付与されている意味を有し、これらの用語は非制限的であり、列挙されたもの以外のものの存在によって、列挙されたものの基本的特徴または新規の特徴が変化しない限り、列挙されたもの以外のものの存在も許容するが、従来技術の実施形態を除外する。
【０１１２】
「検出する」は、検出されるシグナル伝達経路のＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４活性化の有無または量を直接または間接的に同定することを指す。
【０１１３】
「有効量」とは、未治療の患者と比較して疾患の症状を改善するのに必要な量を意味する。疾患の治療的処置のために本発明を実施するために使用される活性化合物の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重および全体的な健康状態に応じて変動する。最終的に、主治医または獣医が適切な量と投与レジメンとを決定する。そのような量は「有効」量と呼ばれる。
【０１１４】
本明細書で使用される用語「治療する」および「治療」は、症状の重症度および／または頻度の低下をもたらす、症状および／またはそれらの根本原因を排除する、および／または損傷の改善または修復を促進するために、有害な症状、障害または疾患に苦しむ臨床的に症候性の個体に薬剤または製剤を投与することを指す。
【０１１５】
本明細書で提供される範囲は、範囲内のすべての値の略記であると理解される。例えば、１〜５０の範囲には、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０からなる群の任意の数、数の組合せ、または部分範囲、ならびに、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８および１．９などの前述の整数間のすべての介在する十進法の値が含まれると理解される。部分範囲に関しては、範囲のいずれかの終点から延びる「入れ子状の部分範囲」が具体的に意図されている。例えば、１〜５０の例示的な範囲の入れ子状の部分範囲は、一方の方向に１〜１０、１〜２０、１〜３０および１〜４０、または他方の方向に５０〜４０、５０〜３０、５０〜２０および５０〜１０を含み得る。
【０１１６】
「組換え」とは、複数の供給源からの遺伝物質を一緒にして、普通なら生物有機体には見られないであろう配列を作成するための遺伝子組換え（分子クローニングなど）の実験室的方法によって形成された核酸分子を意味する。
【０１１７】
「異種プロモーター」は、遺伝子または核酸配列が自然界で作動可能に連結されているプロモーターとは異なるプロモーターである。用語「作動可能に連結された」は、核酸発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、または転写因子結合部位のアレイなど）と第２の核酸配列との間の機能的連結を指し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に影響を及ぼす。本明細書で使用される「異種ポリヌクレオチド」または「異種遺伝子」は、特定の宿主細胞に対して外来の供給源に由来するもの、または同じ供給源に由来する場合、その元の形態から修飾されたものである。
【０１１８】
「低減させる」とは、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％または１００％の負の変化を意味する。
【０１１９】
「基準」とは、標準または対照条件を意味する。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、具体的に記載されない限り、または文脈から明らかでない限り、用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、単数または複数であると理解される。本明細書で使用される場合、具体的に記載されない限り、または文脈から明らかでない限り、用語「または」は包括的であると理解される。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、具体的に記載されない限り、または文脈から明らかでない限り、用語「約」は、当技術分野における一般公差の範囲内、例えば、平均の２標準偏差内であると理解される。約は、記載されている値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％または０．０１％以内であると理解することができる。文脈からそうでないことが明らかでない限り、本明細書に提供されるすべての数値は、用語「約」によって修飾されている。
【０１２２】
本発明の他の特徴および利点は、その好ましい実施形態の以下の説明から、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好適な方法および材料を以下に記載する。本明細書に引用するすべての公開外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用する受託番号によって示されるＧｅｎｂａｎｋおよびＮＣＢＩ寄託は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用する他のすべての公開参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、定義を包含する本明細書が優先するものとする。さらに、材料、方法および例は、例証的なものにすぎず、限定を意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１Ａ〜Ｅ。ラモトリギンがマウスＭｒｇｐｒａ１およびそのヒトオルソログＭＲＧＰＲＸ４に直接結合することを示す一連の図、グラフ、写真および顕微鏡写真である。図１Ａは、マウスおよびヒトＭｒｇｐｒ遺伝子を示すゲノム遺伝子座の図である。マウスＭｒｇｐｒａ３、Ｍｒｇｐｒｃ１１およびそれらのヒトオルソログＭＲＧＰＲＸ１は、後根神経節（ＤＲＧ）の感覚ニューロンに特異的に発現し、クロロキン（ＣＱ）およびＢＡＭ８−２２（ＢＡＭ）を含むかゆみ物質に応答してかゆみ受容体として機能する。マウスＭｒｇｐｒｂ２およびそのヒトオルソログＭＲＧＰＲＸ２は、肥満細胞に特異的に発現する塩基性分泌促進物質（例えば、化合物４８／８０およびＰＡＭＰ）の受容体であり、薬物誘発アナフィラキシー反応を媒介する。この試験では、ＭＲＧＰＲＸ４オルソログＭｒｇｐｒａ１が説明される。Ｓａａｌ１、Ｐｔｐｎ５およびＺｄｈｈｃ１３は、遺伝子座内の無関係な遺伝子である。図１Ｅは、ＬＴＧがＭｒｇｐｒａ１−ＧＦＰの内在化を誘導したことを示すグラフである。色素により標識したＬＴＧは、明るい赤色蛍光（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）を生成することができる。培地、色素を含む培地、ＬＴＧ、色素を含むＬＴＧにより、血清欠乏（＞４時間）Ｍｒｇｐｒａ１−ＧＦＰ細胞を３７°Ｃで１５分間処理した。染色により、色素を含むＬＴＧがＭｒｇｐｒａ１−ＧＦＰ細胞内に内在化されたことが示された。図１Ｃは、ＭＲＧＰＲＸ２／細胞膜クロマトグラフィー（ＣＭＣ）カラムおよびＭＲＧＰＲＸ４／ＣＭＣカラムでのＬＴＧの溶出プロファイルを示すグラフである。ＬＴＧはＭＲＧＰＲＸ２／ＣＭＣカラムに保持することができない。ＭＲＧＰＲＸ４／ＣＭＣカラムでのラモトリギンの保持時間１６．７分。図１Ｃおよび図１Ｄは、ＬＴＧのＭＲＧＰＲＸ４／ＣＭＣブレークスルー曲線（図１Ｃ）と、１／［ＬＲ］ｓ対１／［Ｌ］ｍをプロットすることにより達成される回帰曲線（図１Ｄ）とを示すグラフである。バー付きの各点は平均±標準誤差（ｎ＝５）を表す。図１Ｄでは、ラモトリギン濃度は、それぞれ２．０×１０−８、４．０×１０−８、８．０×１０−８、１．６×１０−７および３．２×１０−７ｍｏｌ  ｌ−１であった。ＫＤラモトリギン＝（４．１７±０．２４）×１０−７ｍｏｌ  ｌ−１。結果はいずれも３回を超えて繰り返された。
【図２】図２Ａ〜図２Ｆ。ＬＴＧは１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪ  ＷＴマウスではＳＪＳ様表現型を誘導することができるが、Ｍｒｇｐｒａ１  ＫＯマウスでは誘導することができないことを示す一連の図、写真、顕微鏡写真およびグラフである。図２Ａは、Ｍｒｇｐｒａ１のオープンリーディングフレームがＧＦＰに置換されたマウスを作製する方法を示す図である。図２Ｂは、ＬＴＧ  ５０ｍｇ／ｋｇ−１体重の経口摂取の７〜１０日後に、ＷＴマウスは、ＳＪＳに罹患した患者に見られる症状と同様に、それらの眼に粘膜分泌物およびそれらの足に水疱出血を発現したが、Ｍｒｇｐｒａ１  ＫＯマウスはこれらの症状を有しなかったことを示す写真である。図２Ｃおよび図２Ｅは、ＬＴＧによる処置の７日目に、生理食塩水により処置したＷＴマウスまたはＬＴＧにより処置したＫＯマウスではなく、ＷＴおよびＨＥＴ  Ｍｒｇｐｒａ１＋／ＧＦＰマウスが結膜分泌物を発現したことを示す写真およびグラフである。Ｈ＆Ｅ染色は、生理食塩水およびＫＯマウスではなくＷＴおよびＨＥＴマウスの表皮と結膜の局所組織との接合部付近の欠損、ならびに一部の炎症細胞浸潤を示した。また、ＷＴおよびＨＥＴマウスの結膜では、アポトーシス細胞マーカーＴＵＮＥＬの染色が増加したが（ＬＴＧ  ＷＴ：４０．４５±２．５８％、ＬＴＧ  ＨＥＴ：４０．３９±１．４５％）、生理食塩水およびＫＯマウスでは細胞死のこの増加は示されなかった（生理食塩水ＷＴ：７．０８±１．９９％、ＬＴＧ  ＫＯ：１３．５６±１．７４％）、（＊＊、ｐ＜０．０１）。図２ＤおよびＥは、ＬＴＧによる処置の９日目に、ＷＴおよびＨＥＴマウスの症状がさらに進行したことを示す写真およびグラフであり、生理食塩水およびＫＯマウスではなく、ＷＴおよびＨＥＴマウスでは、足に顕著な浮腫および水疱出血が示された（図２Ｄ）。Ｈ＆Ｅ染色では、生理食塩水およびＫＯマウスではなく、ＷＴおよびＨＥＴマウスの真皮に多数の赤血球および炎症細胞が浸潤していることが示された。図６Ａ〜図６Ｆでは、黒い破線の長方形内の組織が拡大されている。ＴＵＮＥＬアッセイにより、生理食塩水およびＫＯマウスではなく（生理食塩水ＷＴ：１０．５６±１．４５％、ＬＴＧ  ＫＯ：６．１０±１．６３％）、ＷＴおよびＨＥＴマウス（ＬＴＧ  ＷＴ：４８．７４±５．９４％、ＬＴＧ  ＨＥＴ：４５．９９±１．８４％）（＊＊、ｐ＜０．０１）では、多くの死んだ上皮細胞（緑色）が検出された。スケールバー、図６Ｆ、１００μｍ、図６Ｃ、図６Ｄ、５０μｍ。図２Ｆは、ＥＬＩＳＡの結果が、ＬＴＧにより処置された９日後の足の皮膚におけるグランザイムＢおよびＴＮＦ−α発現の定量を示すことを示すグラフである。＊＊、ｐ＜０．０１（１遺伝子型当たりｎ＝５）。
【図３】図３Ａ〜図３Ｆ。Ｍｒｇｐｒａ１が樹状細胞（ＤＣ）のサブセットに発現し、これらの樹状細胞がＳＪＳ表現型の形成に重要な役割を果たすことを示す一連のグラフ、写真、顕微鏡写真、ＦＡＣＳプロットおよび免疫ブロットである。図３Ａは、ＲＴ−ＰＣＲでは、Ｍｒｇｐｒａ１が、ＫＯマウスではなく、ＷＴマウスの脾臓、リンパ節にのみ発現することが示されたことを示す免疫ブロットである。図３Ｂは、フローサイトメトリーでは、ＧＦＰ＋細胞が樹状細胞のマーカーであるＣＤ１１ｃ＋およびＭＨＣＩＩ＋であったことが示されたことを示す細胞選別プロットである。図３Ｃおよび図３Ｄは、ＲＴ−ＰＣＲ（図３Ｃ）およびカルシウムイメージング（図３Ｄ）の検出のために、ＣＤ１１Ｃ＋およびＭＨＣＩＩ  ｈｉｇｈ細胞、ＣＤ１１ｃ−およびＭＨＣＩＩ−細胞、ＣＤ１１ｃ＋およびＭＨＣＩＩ  ｉｎｔ細胞、ＣＤ１１ｃ−およびＭＨＣＩＩ＋細胞がＷＴおよびＫＯマウスの脾臓から選別されたことを示す免疫ブロットおよび顕微鏡写真である。図３Ｃに示すように、ＲＴ−ＰＣＲは、ＷＴのＣＤ１１Ｃ＋およびＭＨＣＩＩ  ｈｉｇｈ細胞のみがＭｒｇｐｒａ１を発現することを示した。図３Ｄに示すように、カルシウムイメージングは、ＷＴマウスの脾臓から選別した４つの異なる細胞では、１０秒（ＬＴＧの添加前）、６０秒（ＬＴＧの添加後）、１８０秒（ＬＴＧを洗浄）の時点で反応を示した。黄色の矢印は、ＬＴＧが６０秒の時点でＣＤ１１Ｃ＋およびＭＨＣＩＩ  ｈｉｇｈ細胞の２つの細胞の［Ｃａ２＋］ｉの増加を誘発したことを示している。スケールバー、２５μｍ。右、代表的なイメージングトレース。各行は、固有の細胞からの応答である。ＣＤ１１Ｃ＋およびＭＨＣＩＩ  ｈｉｇｈ細胞のみがＬＴＧ（０．０５ｍｇ／Ｌ）に良好に応答した。図３Ｅは、カルシウムイメージングアッセイの定量を示すグラフである（１遺伝子型当たりｎ＝３、各実験について計数された細胞数が＞１００、＊＊、ｐ＜０．０１）。図３Ｆは、尾静脈注射によりＭｒｇｐｒａ１  ＫＯマウスに２５０万個の細胞を注射した、ＷＴまたはＫＯマウスから単離されたＭＨＣＩＩ＋およびＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（ＤＣ）を示す写真である（ｎ＝６、各群）。７日間のＬＴＧ摂取後（５０ｍｇ  ｋｇ−１体重）、結膜分泌物を形成するＷＴ  ＤＣをマウスに投与した。Ａ１ＫＯ  ＤＣを投与したマウスは、表現型を有しなかった。
【図４】図４Ａ〜図４Ｆ。ヒト樹状細胞がＭＲＧＰＲＸ４を発現し、ＬＴＧにより活性化され得ることを示す一連のグラフ、写真、顕微鏡写真および免疫ブロットである。図４Ａは、ヒト樹状細胞（ｈＤＣ）のＲＴ−ＰＣＲの結果がｈＤＣに発現したＭＲＧＰＲＸ４を示したことを示す免疫ブロットである。図４Ｂは、３７℃で１５分間、培地、色素を含む培地、ＬＴＧ（３μＭ）、色素を含むＬＴＧ（３μＭ）により処理したｈＤＣの免疫染色から得られた代表的な画像を示すグラフである。ＭＲＧＰＲＸ４（緑）を発現する細胞内にのみ内在化されたＬＴＧ（色素（赤）により標識）。スケールバー、１００μｍ。図４Ｃは、０．１ｍｇ／ＬのＬＴＧに曝露された（黒線により示された継続時間）ヒト樹状細胞（ｈＤＣ）から得られた、レシオメトリックＦｕｒａ−２イメージングによって測定された際の［Ｃａ２＋］ｉの変化を示す例示的なトレースを示すグラフである。各トレースは、単一の細胞から得られた応答である。図４Ｄは、対照ｓｉＲＮＡ（スクランブルｓｉＲＮＡ）およびＭＲＧＰＲＸ４  ｓｉＲＮＡ適用を受けた後、ＬＴＧにより処理されたｈＤＣからの応答細胞の割合を示す顕微鏡写真である。ヒトＤＣに、ＭＲＧＰＲＸ４に対するｓｉＲＮＡ、または対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。４８時間後、ＬＴＧにより細胞を処理し、カルシウムイメージングに供した。ｈＤＣの活性化は、ＭＲＧＰＲＸ４  ｓｉＲＮＡ処理細胞では、対照群と比較して有意に減少した。各群のデータは、平均±標準誤差として表した。ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔを用いて、統計比較の有意性を決定した（１遺伝子型当たりｎ＝４；１実験当たり計数された細胞数が＞１００。＊＊、ｐ＜０．０１）。図４Ｅは、ＳＪＳ患者および寛容性の人々から得られたＭＲＧＰＲＸ４遺伝子の分析を示し、この分析は、ＳＪＳ患者の方がＭＲＧＰＲＸ４  Ｇ／Ｇ変異が生じやすいことを示す。寛容性の人々のＧ／Ｇ変異の割合は７．１４％であるのに対して、ＳＪＳ患者では５０％である。
【図５】ＳＪＳ動物モデルの確立を示す一連の写真およびグラフである。１２９Ｓ１／ＳｖＩｍＪ  ＷＴマウスに、ラモトリギン（５０ｍｇ  ｋｇ−１体重）、オクスカルバゼピン（２００ｍｇ  ｋｇ−１体重）およびアロプリノール（１００ｍｇ  ｋｇ−１体重）など、ＳＪＳを誘発することができる薬物を２０日間連日強制経口投与した。７日目に、３群のマウスは眼に結膜分泌物を形成した。粘膜分泌物の最高発生率は、ＬＴＧによって誘発される（９３．３３％）。
【図６】図６Ａ〜図６Ｆ。ＬＴＧにより誘発された損傷を示す一連のグラフおよび顕微鏡写真である。図６Ａは、体重変化を示すグラフであり、これは、ＷＴおよびＨＥＴマウスがＬＴＧによる１０日間の処置後に体重を減少させるのに対して（ＷＴ：−３．８９±０．４７ｇ；ＨＥＴ：−４．４８±０．８９ｇ）、生理食塩水およびＫＯ群は体重を増加させる（生理食塩水ＷＴ：０．８４±０．３ｇ；ＫＯ：１．０７±０．６９ｇ）ことを示す。図６Ｂは、生存割合が、１４日間のＬＴＧによる処置後のマウスの生存率を示すことを示すグラフである。１４日目に、ＬＴＧ処置ＷＴおよびＨＥＴ群ではマウスの３０％のみが生存していたが、生理食塩水およびＫＯ群ではマウスは死亡しなかった。図６Ｃは、図２Ｄに示されたＷＴおよびＫＯの長方形内の、４０倍レンズを用いた顕微鏡下の皮下組織を示したＨ＆Ｅ染色を示す顕微鏡写真である。赤血球および炎症細胞は、ＷＴ真皮にのみ見ることができた。スケールバー、５０μｍ。図６Ｄは、９日間ＬＴＧにより処置されたマウスの眼瞼内のＣＤ８陽性細胞およびＣＤ３陽性細胞を示した免疫蛍光二重染色を示す顕微鏡写真である。スケールバー、５０μｍ。図６Ｅは、眼瞼内のＣＤ８陽性細胞およびＣＤ３陽性細胞の数を計数したことを示すグラフである（ナイーブＷＴ：３．６７±１．２、ＬＴＧ  ＷＴ：２５±８．３４、ＬＴＧ  ＨＥＴ：２５±２、ＬＴＧ  ＫＯ：５．６７±０．８８；＊＊、ｐ＜０．０１；１遺伝子型当たりｎ＝５）。図６Ｆは、ＬＴＧおよび生理食塩水により処置した後の９日目のマウスの足の皮膚におけるグランザイムＢのＩＨＣ染色を示す顕微鏡写真である。青い網掛けは、グランザイムＢの位置を示している。スケールバー、１００μｍ。
【図７】Ｂａｌｂ／ｃ  ＷＴおよびＲａｇ１（−／−）マウスがＬＴＧ（５０ｍｇ  ｋｇ−１体重）の経口摂取を２０日間受けたことを示す一連の写真である。写真は、７、９および２０日目のマウスの表現型を示している。７日目に、Ｂａｌｂ／ｃ  ＷＴの眼には粘膜分泌物の形成が認められた。９日目に、ＷＴマウスは足に水疱出血を発現した。２０日目に、ＷＴマウスの耳の皮膚は粗く肥厚して剥離したように見えた。
【図８】図８Ａ〜図８Ｃ。ＬＴＧ処置中のＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞の役割を示す一連の図、ＦＡＣＳプロットおよび写真である。図８Ａは、マウスＣＤ４およびＣＤ８に対するラットモノクローナル抗体を３回ｉ．ｐ．注射して、ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞を−２、０および３日目に枯渇させる、１２９Ｓ１  ＷＴマウスの処置スキームを示す図である。次いで、２回目の抗体投与後、１４日間ＬＴＧによりマウスを処置した。図８Ｂは、マウスにＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞がないことを確認するためのフローサイトメトリープロットである。７日目と１４日目に、フローサイトメトリー用にマウスから末梢血および脾臓の試料を採取した。図８Ｃは、ＬＴＧ処置を受けているマウスの写真である。９日目に、生理食塩水注射を受けたマウス（「ＷＴ」と標識された左パネル）は、眼に結膜分泌物と足に水疱出血とを発現したが、これらの表現型はＣＤ８またはＣＤ４  Ｔ細胞枯渇群では見られなかった。
【図９】図９Ａ〜図９Ｃ。Ｍｒｇｐｒａ１細胞がＣＤ１１ｃおよびＭＨＣ−ＩＩ陽性細胞であったことを示す一連のフローサイトメトリープロットおよび顕微鏡写真である。図９Ａは、Ｍｒｇｐｒａ１  ＫＯマウスが、ＧＦＰに置換された、Ｍｒｇｐｒａ１のオープンリーディングフレームであったことを示すフローサイトメトリープロットである。フローサイトメトリーを用いて、Ｍｒｇｐｒａ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウス由来のＧＦＰ＋細胞を特性評価した。ＣＤ４、ＣＤ８ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ３１７、ＣＤ３７０、Ｆ４／８０、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ、Ｌｙ６Ｃ、Ｌｙ６Ｇ、ＸＣＲ１、ＣＤ３およびＣＤ１１ｃなどの様々な抗体により、脾細胞およびリンパ節細胞を染色した。次いで、ＬＳＲ−ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により細胞を取得した。結果は、ＧＦＰ＋細胞がＣＤ１１ｃおよびＭＨＣ−ＩＩを高度に発現していたことを示した。図９Ｂは、免疫蛍光染色を示す顕微鏡写真であり、この免疫蛍光染色は、ＧＦＰ細胞がＡ１ＫＯマウス脾臓内のＣＤ３＋細胞ではなくＣＤ１１ｃ＋細胞であったことを示す。スケールバー、５０μｍ。図９Ｃは、リンパ節細胞のフローサイトメトリープロットであり、Ｍｒｇｐｒａ１  ＧＦＰ／ＧＦＰ細胞がＭＨＣ−ＩＩ＋およびＣＤ１１ｃ＋であったことを示している。
【図１０】異なる種類の脾細胞の選別を示す一連のＦＡＣＳプロットである。ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを使用して、ＣＤ１１ｃおよびＭＨＣ−ＩＩの発現に基づいて、免疫細胞集団をゲーティングおよび選別した。次いで、ＲＮＡ単離またはカルシウムイメージングのいずれかのために、選別された細胞を直ちに使用した。
【図１１】ＷＴおよびＡ１  ＫＯマウスの樹状細胞を注射したマウスの体重変化を示すグラフである。連日ＬＴＧによりＡ１  ＫＯマウスを処置した後、ＷＴおよびＡ１  ＫＯマウスの樹状細胞（ＤＣ）を１回注射した。７日目以降、ＷＴ  ＤＣを投与したマウスの体重は減少し、Ａ１  ＫＯ  ＤＣを投与したマウスの体重は増加した。
【図１２】ヒト樹状細胞におけるＭＲＧＰＲＸ４の発現を示す一連の顕微鏡写真である。ＤＡＰＩ（青）およびＭＲＧＰＲＸ４（緑）の免疫蛍光二重染色は、ヒト樹状細胞に発現したＭＲＧＰＲＸ４を示している。ＨＥＫ２９３およびＭＲＧＰＲＸ２−ＨＥＫ細胞を陰性対照として使用し、ＭＲＧＰＲＸ４−ＨＥＫ細胞を陽性対照として使用している。スケールバー、２００μｍ。
【図１３】図１３Ａ〜図１３Ｆ。胆汁うっ滞性掻痒症のモデルでは、ＭｒｇｐｒクラスターＫＯマウスの掻破が少ないことを示す一連のグラフである。図１３Ａは、ビヒクル（オリーブ油）または２５ｍｇ／ｋｇのＡＮＩＴを連日経口投与したマウスの結果を示すグラフである。５日目に、自発性のかゆみを評価した。試験チャンバー内でマウスを３０分間ビデオ録画し、掻破発作の回数を数えた。マウスはいずれも、８〜１２週齢の雄の同腹仔である。処置およびスコアリングを通して、遺伝子型に関する盲検試験を行った。ｎ＝６であったビヒクル処置クラスターＫＯを除いて、ｎ＝１０／処置および遺伝子型。図１３Ｂは、掻痒症を評価した後、心臓穿刺により血清を採取した際の結果を示すグラフである。ＪＨＵの動物病理学研究所で総ビリルビンを測定した。図１３Ｃは、処置後の肝臓重量の結果を示すグラフである。図１３Ｄは、血清胆汁酸値の結果を示すグラフである。対照はｎ＝４、ＷＴ処置はｎ＝１０、ＫＯ処置はｎ＝７。図１３Ｅは、血清オートタキシン活性の結果を示すグラフである。対照はｎ＝４、ＷＴ処置はｎ＝１２、ＫＯ処置はｎ＝８。図１３Ｆは、血清メトエンケファリン値の結果を示すグラフである。対照はｎ＝４、ＷＴ処置はｎ＝１９、クラスターＫＯ処置はｎ＝１０。
【図１４Ａ】クラスターＫＯマウスではなくＷＴマウスでは、ビリルビンがかゆみを引き起こすことを示す一連のグラフである。黒いバーはＷＴマウスである。赤いバーはクラスターＫＯマウスである。黄色のバーはＭｒｇｐｒＡ１単一遺伝子ノックアウトである。動物に起痒物質を注射した。注射後３０分にわたり、掻破発作の回数を評価した。この試験で使用したマウスは、８〜１２週齢の雄の同腹仔であった。スコアリング中の処置に関して盲検試験を行った。ＳＥＭによる平均を示した。図１６Ａは、５％ＤＭＳＯ（ｐＨ６．６〜７．０）を含有するビヒクル中のビリルビンを首筋に皮下注射したマウスの結果を示すグラフである。
【図１４Ｂ】５０μｌの生理食塩水中の１ｍｇ／ｋｇのモルヒネを首筋に注射したマウスの結果を示すグラフである。
【図１４Ｃ】５０μｌの生理食塩水中の１ｍｇ／ｋｇのＤＡＭＧＯを首筋に注射したマウスの結果を示すグラフである。
【図１４Ｄ】示された用量のビリルビンを頬に注射したマウスの結果を示すグラフである。
【図１４Ｅ】１．３ｍＭ  ＤＣＡを頬に注射したマウスの結果を示すグラフである。
【図１４Ｆ】４ｍＭ  ＬＰＡを頬に注射したマウスの結果を示すグラフである。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｄ。ビリルビンがＭｒｇｐｒ依存的に後根神経節ニューロンの集団を活性化することを示す一連のグラフである。図１５Ａは、ＷＴマウス由来のＤＲＧニューロンにＦｌｕｏ−４  ＡＭカルシウム色素を添加した場合の蛍光強度のトレースである。ニューロンにビヒクル（０．５％ＤＭＳＯ）を加えた。３０秒後、１分間洗浄した。５０μＭのビリルビンを加えた。陽性対照として５０ｍＭ  ＫＣｌを使用した。各トレースは単一のニューロンを表す。図１５Ｂは、１０秒の時点でビリルビンを適用した場合の蛍光強度のトレースである。１２０秒の時点で、浴液を３ｍＭ  ＥＧＴＡ浴液に置き換えた。この期間にビリルビンを再適用した。図１５Ｃは、ビヒクルまたは５０μＭビリルビンがＷＴおよびクラスターＫＯ  ＤＲＧニューロンの両方に適用された場合を示すグラフである。イメージング期間中に、ニューロンのピーク蛍光がベースラインよりも少なくとも５０％増加した場合、またはＫＣｌピークの５０％のレベルに達した場合、ニューロンを「活性化された」としてスコア付けした。さらに、ニューロンは、少なくとも２０秒間ベースラインを超えてシグナルを上昇させる必要があった。モーションアーティファクトは分析から除外した。少なくとも３匹のマウスにわたるニューロンの総数を集計して、割合を計算した。図１５Ｄは、「活性化された」としてスコア付けされたニューロンの直径を示すヒストグラムである。
【図１６】図１６Ａ〜図１６Ｃ。ビリルビン媒介掻痒症が非ヒスタミン作動性であることを示す一連のグラフである。図１６Ａは、ビリルビンを肥満細胞に適用した場合のヒスタミン放出（ピコグラム／細胞として示される）が対照と異ならなかったことを示すグラフである。図１６Ｂは、腹膜肥満細胞に対するビリルビンの浴適用がカルシウム流入を誘発することができなかった場合の蛍光強度のトレースである。図１６Ｃは、１ｍＭビリルビンをＷＴ動物に注射した際の結果の棒グラフである。黒いバーは、ビヒクルを注射した動物である。赤いバーは、Ｈ１Ｒ遮断薬であるセチリジン３０ｍｇ／ｋｇである。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｆ。ＭｒｇｐｒＡ１およびＭｒｇｐｒＸ４がビリルビンによりＧａｑ依存的に活性化されることを示す一連のグラフである。図１７Ａは、ＭｒｇｐｒＡ１を安定に発現するＨＥＫ細胞にＦｕｒａ−２カルシウム色素を添加した際の結果を示すグラフである。５０μＭのビリルビンを加えた。３０秒後、１分間洗浄し、細胞をベースラインに戻した。次いで、５０μＭのビリルビンを再び加えた。各トレースは単一のＨＥＫ細胞を表す。図１７Ｂは、Ｇａｑ遮断薬であるＵ７３１２２を利用した際の結果を示すグラフである。図１７Ｃは、Ｇａｑに対する機能を有しない、Ｕ７３１２２と密接に関連する類似体であるＵ７３３４３を利用した際の結果を示すグラフである。図１７Ｄは、ＭｒｇｐｒＸ４を安定に発現するＨＥＫ細胞を用いた以外は図１７Ａと同じ実験の結果を示すグラフである。５０μＭのビリルビンを１回適用した。各トレースは単一の細胞を表す。図１７Ｅは、図１７Ｂと同じであるがＸ４を用いた実験の結果を示すグラフである。図１９Ｆは、図１７Ｃと同じであるがＸ４を用いた実験の結果を示すグラフである。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃ。ＭｒｇｐｒＡ１およびＭｒｇｐｒＸ４が病態生理学的濃度でビリルビンに対するＥＣ５０を有することを示す一連のグラフである。ＭｒｇｐｒＡ１またはＭｒｇｐｒＸ４のいずれかを安定に発現するＨＥＫ細胞を使用してＥＣ５０を計算した。細胞にＦＬＩＰＲカルシウムイメージング色素を添加し、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ３マシン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して蛍光の変化を読み取った。ウェルを３連で操作し、各プレートから得られたあらゆる値を最も反応の良いウェルに正規化した。ビヒクルのみの添加は、いずれの細胞株でも蛍光の変化を引き起こさなかった。非トランスフェクト細胞は、蛍光にいくらかの変化を示したが、用量反応曲線は示さなかった（図示せず）。Ｘ軸は、修正された対数目盛を表す。図１８Ａは、ビリルビンに対するＭｒｇｐｒＡ１のＥＣ５０が約４９μＭであることを示すグラフである。図２０Ｂは、ビリルビンに対するＭｒｇｐｒＸ４のＥＣ５０が約３μＭであることを示すグラフである。図１８Ｃは、非トランスフェクトＨＥＫ細胞がＥＣ５０応答を示さなかったことを示すグラフである。
【図１９】図１９Ａ〜図１９Ｃ。ＭｒｇｐｒＡ１の活性化がかゆみをもたらすことを示す一連のグラフである。クラスターＫＯ動物ではなくＷＴ動物では、１ｍＭステルコビリン、１ｍＭヘマチンまたは１ｍＭ  ＦＭＲＦの注射が誘発された。３つの化合物はいずれもＭｒｇｐｒＡ１のアゴニストであり、他のＭｒｇｐｒのアゴニストではない。
【図２０】図２０Ａ〜図２０Ｃ。ＭＲＧＰＲＸ３がｈＢＤ３の新規ケラチノサイト受容体であることを示す一連のグラフである。図２０Ａは、ｈＢＤ３によるヒトＭｒｇｐｒＸ３の活性化を示す一連の代表的なＣａ２＋トレースである。図２０Ｂは、ｓｉＲＮＡによる、ヒト初代ケラチノサイト由来のＭＲＧＰＲＸ３の効果的なノックダウンを示すｑＰＣＲの結果のグラフである。対照としてＭＲＧＰＲＸ４を測定した。図２０Ｃは、ＭＲＧＰＲＸ３をノックダウンすると、ｈＢＤ３に対してＣａ２＋応答を生じたヒトケラチノサイトの割合が有意に減少したことを示すグラフである。
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｄ。マウスＭｒｇｐｒＡ６がヒトＭｒｇｐｒＸ３の推定ホモログであることを示す一連の免疫ブロット、グラフおよび図である。図２１Ａは、ＲＴ−ＰＣＲが精製マウスケラチノサイトにおけるＭｒｇｐｒＡ６、Ａ１２およびＢ３の高発現を明らかにしたことを示す免疫ブロットである。図２１Ｂは、ｍＢＤ１４によるマウスＭｒｇｐｒＡ６の活性化を示す一連の代表的なＣａ２＋トレースである。図２１Ｃは、ＭｒｇｐｒＢ３がｍＢＤ１４によって活性化されないことを示す代表的なトレースである（他のＭｒｇｐｒのデータは示されていない）。図２１Ｄは、マウスおよびヒトゲノム内のＭｒｇｐｒ遺伝子クラスターを示す概略図である。破線は対応するホモログを示す。
【図２２】ヘム代謝産物およびＭｒｇｐｒの分析結果を示す表である。ヘム代謝産物は構造的に関連している。複数のヘム代謝産物が、マウス受容体であるＭｒｇｐｒＡ１とヒト受容体であるＭｒｇｐｒＸ４とを活性化した。物質の用量を上に列挙し、活性化のおおよその割合を表に示す。
【図２３】図２３Ａ〜図２３Ｅ。ビリルビンが非ヒスタミン作動性のＭｒｇｐｒ依存性掻痒症を誘発したことを示す画像である。図２３Ａは、掻破発作がビリルビンの注射に関連していたことを示す棒グラフである。示された量のビリルビンを１００μＬの容量でマウスの首筋に注射した。青いバー（＋ＨＳＡ）は、１％のヒト血清アルブミンとプレインキュベートした６０μｇのビリルビン（１ｍＭの１００μＬ）を注射した動物を表す。ビヒクルｎ＝８；６μｇ  ｎ＝５、１８μｇ  ｎ＝１１、３０μｇ  ｎ＝１２、６０μｇ  ｎ＝７、＋ＨＳＡ  ｎ＝１２。図２３Ｂは、ビリルビン、ヒスタミンまたはクロロキンの注射に関連するかゆみ行動の時間経過を示す折れ線グラフである。掻破発作は５分間隔でビニングした。ビリルビンｎ＝１６、ヒスタミンｎ＝１３、クロロキンｎ＝１１。図２３Ｃは、ＷＴおよびクラスター−／−同腹仔マウスの首筋に６０μｇのビリルビンを注射した結果を示す棒グラフである。ＷＴ  ｎ＝８、クラスター−／−  ｎ＝１３。図２３Ｄは、ＷＴおよびクラスター−／−同腹仔マウスに注射された６０μｇ（１ｍＭの１００μＬ）の示された代謝産物の結果を示す棒グラフである。ヘミン（ＷＴ  ｎ＝１０、クラスター−／−  ｎ＝６）、ビリベルジン（ＷＴ  ｎ＝７、クラスター−／−  ｎ＝７）、ウロビリノーゲン（ＷＴ  ｎ＝１５、クラスターＫＯ  ｎ＝８）、ステルコビリン（ＷＴ  ｎ＝７、クラスター−／−  ｎ＝５）。図２３Ｅは、ヘム分解の経路の概略図である。各代謝産物の骨格式は、Ｂ３ＬＹＰ関数と６−３１Ｇ（ｄ）基底関数セットによって計算された際のそれらの最適な３Ｄ形状の上に描かれている。青とオレンジとは、ＤＦＴ計算から得られた各代謝産物のＨＯＭＯの軌道パリティを表す。図２３Ａ、図２３Ｃおよび図２３Ｄ−平均＋標準誤差を示す。各白丸は個々のマウスを表す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ。
【図２４】図２４Ａ〜図２４Ｎ。ビリルビンがマウスＭＲＧＰＲＡ１およびヒトＭＲＧＰＲＸ４を活性化したことを示すデータである。図２４Ａ〜図２４Ｅは、ＭＲＧＰＲＡ１またはＭＲＧＰＲＸ４を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞のＣａ２＋イメージングと変換された結合等温式とを示すデータである（図２４Ｆ〜図２４Ｊ）。図２４Ａ〜図２４Ｃおよび図２４Ｆ〜図２４Ｈは、黒いバーによって示される場所に加えられた５０μＭのビリルビンを示すデータである。１５秒後、１分間洗浄した。平均±９５％信頼区間（ＣＩ）を示す。ｎ＝１０。図２４Ａでは、黒いバーによって示されるように、洗浄後に３０μＭ  ＦＭＲＦを加えた。図２４Ｂ〜図２４Ｃおよび図２４Ｇ〜図２４Ｈでは、イメージング前に３０分間、１０μＭのＰＬＣ阻害剤Ｕ７３１２２または１０μＭのＧαｑ阻害剤ＹＭ２５４８９０のいずれかと細胞をプレインキュベートした。（図２４Ｄ）ＭＲＧＰＲＡ１、（図２４Ｉ）ＭＲＧＰＲＸ４および（図２４Ｍ）ＭＲＧＰＲＣ１１に対するビリルビン、抱合型ビリルビンおよびヘミンの濃度−Ｃａ２＋反応曲線、ならびに確立されたペプチドリガンドであるＭＲＧＰＲＣ１１に対するＢＡＭ８−２２の濃度−Ｃａ２＋反応曲線。データは、３連で実施した２〜３回の独立した反復の代表的な実験であり、平均±標準誤差として示す。ビリルビン、抱合型ビリルビンおよびヘミンから（図２４Ｅ）ＭＲＧＰＲＡ１、（図２４Ｊ）ＭＲＧＰＲＸ４および（図２４Ｎ）ＭＲＧＰＲＣ１１への変換された結合等温式、ならびにＢＡＭ８−２２からＭＲＧＰＲＣ１１への変換された結合等温式。データは、３つの独立した実験の平均であり、平均±標準誤差として示す。図２４Ｋは、部分精製されたＭＲＧＰＲＡ１、ＭＲＧＰＲＸ４およびＭＲＧＰＲＣ１１膜複合体のビリルビン刺激Ｇタンパク質活性の棒グラフを示す。［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合は、０．５％ＤＭＳＯまたは５０μＭビリルビンの存在下で測定した。平均±標準誤差を示す。＊＊、Ｐ＜０．０１；ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ。図２４Ｌは、ＷＴおよびＡ１−／−動物に対する６０μｇ（１ｍＭの１００μＬ）のビリルビンの注射から生じた掻破発作を示す棒グラフである。平均＋標準誤差を示す。白丸は個々のマウスを表す。ＷＴ  ｎ＝１０、Ａ１−／−ｎ＝１２、ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔによる＊、Ｐ＜０．０５。
【図２５】図２５Ａ〜図２５Ｉ。ビリルビンが感覚ニューロンをＭＲＧＰＲ依存的に活性化したことを示すデータを示す。図２５Ａは、内在性Ｍｒｇｐｒａ１遺伝子座（Ｍｒｇｐｒａ１ＧＦＰ）の制御下でのＧＦＰ発現を示す画像である。赤色は、ＰＬＡＰ発現が内在性Ｍｒｇｐｒｄ遺伝子座（ＭｒｇｐｒｄＰＬＡＰ）によって制御されている場所の抗ＰＬＡＰ抗体染色を示している。青色は、カルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）に対する抗体染色を示している。スケールバー＝５０μＭ。図２５Ｂは、ＷＴまたはＡ１−／−ＤＲＧニューロンのホール・セル・カレント・クランプ・レコーディング（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｃｕｒｒｅｎｔ−ｃｌａｍｐ  ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）を表す画像である。ＷＴ  ＤＲＧでは、ビリルビンは５０個の小径ニューロンのうち５個で活動電位を発生させた。Ａ１−／−ＤＲＧでは、ビリルビンは６０個の小径ニューロンのうち０個で活動電位を発生させた。フィッシャー直接確率法Ｐ＜０．０５。図２５Ｃは、５０μＭビリルビンおよび１ｍＭクロロキン（ＣＱ）の両方の添加に応答するＷＴ  ＤＲＧニューロンのホール・セル・カレント・クランプ・レコーディングを表す画像である。図２５Ｄは、ＷＴ  ＤＲＧニューロンのＣａ２＋イメージングを示すグラフである。１０秒のベースライン後、５０μＭビリルビンを加えた。２０秒後、３分間洗浄してから１ｍＭクロロキンを加えた。１５秒後、５０ｍＭ  ＫＣｌを加えた。平均＋９５％ＣＩを示す。ｎ＝１０ニューロン。黒いバーによって示されている場所に化合物を適用した。図２５Ｅは、ビヒクルまたは５０μＭビリルビンのいずれかを加えた際のＷＴ、Ａ１−／−およびクラスター−／−ＤＲＧのパーセント活性化を示す棒グラフである。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；カイ二乗検定。図２５Ｆは、ビヒクル、１ｍＭクロロキンまたは５０μＭビリルビンを用いたカルシウムイメージングにより評価した際のＴｇ（Ｍｒｇｐｒａ３−Ｃｒｅ）；ｌｓｌ−ｔｄＴｏｍａｔｏニューロンのパーセント活性化を示すグラフである。少なくとも３０秒間ΔＦ＞０．２の場合、ニューロンは活性化されたと考えた。図２５Ｇ〜図２５Ｈ、レンチウイルスによる模擬感染（ｎ＝１０）、またはＭｒｇｐｒａ１（ｎ＝６）、ＭＲＧＰＲＸ４（ｎ＝１０）もしくはＭＲＧＰＲＸ３（ｎ＝２０）をコードするレンチウイルスによる感染の４８時間後のクラスター−／−ＤＲＧニューロン（図２５Ｇ）および（図２５Ｈ）ＤＲＧニューロンのＣａ２＋イメージング。黒いバーによって示されている場合、５０μＭビリルビンを加えた。２０秒後、１分間洗浄してから５０ｍＭ  ＫＣｌを加えた。黒いバーによって示されている場所に化合物を適用した。平均±９５％ＣＩを示す。ｎ＝１０ニューロン。図２５Ｉは、ビリルビンによる、未感染、Ｍｒｇｐｒａ１感染、ＭＲＧＰＲＸ４感染およびＭＲＧＰＲＸ３感染クラスター−／−ニューロンのパーセント活性化を示すグラフである。＊＊＊、Ｐ＜０．００１。カイ二乗検定。
【図２６】図２６Ａ〜図２６Ｉ。Ｍｒｇｐｒａ１−／−、クラスター−／−およびＢＶＲ−／−動物がいずれも胆汁うっ滞性掻痒症の減少を示したことを示す画像である。図２６Ａは、ＷＴ、クラスター−／−およびＡ１−／−群間のビヒクルおよびＡＮＩＴ処置マウスの掻破発作を示す棒グラフである。３０分にわたり発作を評価した。ビヒクルコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１５、クラスター−／−  ｎ＝６、Ａ１−／−  ｎ＝６。ＡＮＩＴコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝２０、クラスター−／−  ｎ＝１４、Ａ１−／−  ｎ＝１４。図２６Ｂは、ＷＴおよびＢＶＲ−／−群間のビヒクルおよびＡＮＩＴ処置動物の掻破発作を示す棒グラフである。３０分にわたり発作を評価した。ビヒクルコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝５およびＢＶＲ−／−  ｎ＝８。ＡＮＩＴコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝２１およびＢＶＲ−／−  ｎ＝２０。図２６Ｃは、ＷＴおよびクラスター−／−ＡＮＩＴ処置動物およびビヒクル処置動物から得られた血漿ビリルビン値（ｍｇ／ｄＬ）を示す棒グラフである。ビヒクルコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝９、クラスター−／−  ｎ＝５。ＡＮＩＴコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１０、クラスター−／−  ｎ＝８。図２６Ｄは、ＷＴ  ＡＮＩＴ処置動物の掻破発作を示す棒グラフである。ビヒクルまたは１ｍｇ／ｋｇ  ＱＷＦのいずれかを腹腔内送達した。ビヒクルｎ＝８、ＱＷＦ  ｎ＝９。図２６Ｅは、ＷＴおよびＢＶＲ−／−動物由来のビヒクルまたはＡＮＩＴ処置血漿を注射したＷＴマウスの掻破発作を示す棒グラフである。ビヒクル血漿コホートの場合：ｎ＝７。胆汁うっ滞性ＡＮＩＴ処置血漿の場合：ＷＴ  ｎ＝１０およびＢＶＲ−／−  ｎ＝８。図２６Ｆは、高ビリルビン血症血漿が採取された患者の特徴を説明する表である。図２６Ｇは、高ビリルビン血症患者血漿を注射したＷＴまたはＡ１−／−マウスの掻破発作を示す棒グラフである。患者１血漿注射の場合、ＷＴ  ｎ＝７、Ａ１−／−  ｎ＝９。患者２血漿注射の場合、ＷＴ  ｎ＝８、Ａ１−／−  ｎ＝５。患者３血漿注射の場合、ＷＴ  ｎ＝７、Ａ１−／−  ｎ＝８。患者４血漿注射の場合、ＷＴ  ｎ＝６、Ａ１−／−  ｎ＝８。図２６Ｈは、未処置（ＮＴ）対照ヒト血漿、ＦｅＣｌ３処置対照ヒト血漿、ＮＴ胆汁うっ滞患者１血漿（（図２６Ｇ）の患者１  ＷＴデータのコピー）またはＦｅＣｌ３処置患者１血漿のいずれかを注射したマウスの掻破発作を示す棒グラフである。対照血漿の場合、ＮＴ  ｎ＝６およびＦｅＣｌ３  ｎ＝５。患者１血漿の場合、ＮＴ  ｎ＝７およびＦｅＣｌ３  ｎ＝７。図２６Ｉは、正常ウサギＩｇＧ処置患者１血漿または抗ビリルビンＩｇＧ処置患者１血漿のいずれかを注射したマウスの掻破発作を示す棒グラフである。正常ＩｇＧ  ｎ＝５、抗ビリルビンｎ＝７。図２６Ａ〜図２６Ｉ、平均＋標準誤差を示す。白丸は個々のデータ点を表す。ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔによる＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１。
【図２７】図２７Ａ〜図２７Ｆ。ビリルビンが非ヒスタミン作動性掻痒症を誘発したが、疼痛を誘発しなかったことを示すデータを示す。図２７Ａは、ビリルビンの頬への注射に関連する掻破発作を示す棒グラフを示す。示された量のビリルビンを１０μｌの容量で注射し、３０分にわたり掻破発作の回数を評価した。ビヒクルｎ＝６、１．８μｇ  ｎ＝５、３μｇ  ｎ＝４、６μｇ  ｎ＝５、６μｇ（−／−）ｎ＝６。図２７Ｂは、頬への６μｇのビリルビン注射に関連する拭い行動を示す棒グラフを示す。注射後１０分にわたり拭い行動を評価した。ビヒクルｎ＝５、ビリルビンｎ＝７。図２７Ｃは、足への６μｇのビリルビン注射に関連する舐め時間を示す棒グラフを示す。注射後１０分にわたり舐め行動を評価した。１条件当たりｎ＝３。図２７Ｄは、Ｈ１遮断薬がビリルビン誘発性掻痒症を阻害しなかったことを示す棒グラフを示す。首筋にビリルビンを注射する３０分前に、ビヒクルまたは３０ｍｇ／ｋｇセチリジンのいずれかを腹腔内投与した。注射後３０分にわたり掻破発作を評価した。ビヒクルｎ＝１０、セチリジンｎ＝５。図２７Ｅは、１００μＭビリルビンに応答して放出された肥満細胞ヒスタミンを示す棒グラフである。化合物４８／８０に対するビヒクルｎ＝４、化合物４８／８０（１０μｇ／ｍＬ）ｎ＝４、ビヒクルｎ＝６、ビリルビンｎ＝８。図２７Ｆは、マウス腹膜肥満細胞のＣａ２＋イメージングを示すグラフである。１０秒のベースラインの後、１００μＭビリルビンを加えた。１５秒後、１分間洗浄してから１０μｇ／ｍＬの化合物４８／８０を加えた。黒いバーによって示されている場合、薬物を適用した。平均±９５％ＣＩを示す。ｎ＝２６。図２７Ａ〜図２７Ｃおよび図２７Ｄ〜図２７Ｅ、平均＋標準誤差を示す。白丸は独立したデータ点を表す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ。ｎ．ｓ．、有意ではない。
【図２８】図２８Ａ〜図２８Ｆ。ビリルビンが他のＭＲＧＰＲを活性化しなかったことを示すデータである。図２８Ａは、マウスおよびヒトのＭｒｐｇｒ遺伝子座の画像描写であり、先に公開された機能的に相同な対が黒で強調表示されている。図２８Ｂ〜図２８Ｆは、（図２８Ｂ）ＭＲＧＰＲＡ３、（図２８Ｃ）ＭＲＧＰＲＣ１１、（図２８Ｄ）ＭＲＧＰＲＤ、（図２８Ｅ）ＭＲＧＰＲＸ１または（図２８Ｆ）ＭＲＧＰＲＸ２を一時的に発現するＨＥＫ２９３細胞のＣａ２＋イメージングを示すグラフである。黒いバーによって示されている場所に５０μＭビリルビンを加えた。１５秒後、１分間洗浄した。洗浄後、黒いバーによって示されているように、（図２８ｂ）１ｍＭクロロキン、（図２８ｃ）３μＭ  ＢＡＭ８−２２、（図２８ｄ）１ｍＭ  β−アラニン、（図２８Ｅ）３μＭ  ＢＡＭ８−２２または（図２８Ｆ）１０μｇ／ｍＬの化合物４８／８０を加えた。平均±９５％ＣＩを示す。ｎ＝１０。
【図２９】図２９Ａ〜図２９Ｃ。ＭＲＧＰＲＡ１のＣＲＩＳＰＲ欠失のデータを示す。図２９Ａは、ＷＴおよびＡ１−／−ゲノム配列の比較を示す概略図である。ダッシュにより示される２塩基対（ｂｐ）欠失の位置。番号はＭＲＧＰＲＡ１オープンリーディングフレームに対応している。図２９Ｂは、２ｂｐ欠失の配列決定データを示す。図２９Ｃは、開始コドンから始まるＭＲＧＰＲＡ１−／−のオープンリーディングフレームの翻訳の概略図を示す。２ｂｐ欠失によりフレームシフトが発生し、これにより、赤いアスタリスク（右端）によってマークされた早期終結が発生した。
【図３０】図３０Ａおよび図３０Ｂ。ビリルビンがクロロキンと同様の径感覚（ｄｉａｍｅｔｅｒ  ｓｅｎｓｏｒｙ）の集団を活性化したことを示す画像を示す。図３０Ａは、ビリルビンおよび／またはクロロキン（ビリルビン単独＝７、クロロキン＝４０、重複＝１３）のいずれかによって活性化された全ニューロンを示すベン図である。図３０Ｂは、ビリルビン活性化ニューロン神経細胞体の直径のヒストグラムである。
【図３１】図３１Ａ〜図３１Ｋ。肝損傷の病理学的マーカーの血漿中濃度が、ＷＴ、クラスター−／−、Ａ１−／−およびＢＶＲ−／−動物間で異ならないことを示すグラフである。図３１Ａは、ビヒクルおよびＡＮＩＴ処置動物間の血漿アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）値を示すグラフである。ビヒクルコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１０、クラスター−／−  ｎ＝４、Ａ１−／−  ｎ＝４、ＢＶＲ−／−  ｎ＝６。ＡＮＩＴコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１７、クラスター−／−  ｎ＝６、Ａ１−／−  ｎ＝５、ＢＶＲ−／−  ｎ＝１５。図３１Ｂは、ビヒクルおよびＡＮＩＴ処置動物間の血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）値を示すグラフである。ビヒクルコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１０、クラスター−／−  ｎ＝４、Ａ１−／−  ｎ＝４、ＢＶＲ−／−  ｎ＝９。ＡＮＩＴコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１２、クラスター−／−  ｎ＝６、Ａ１−／−  ｎ＝５、ＢＶＲ−／−  ｎ＝１７。図３１Ｃは、ビヒクルおよびＡＮＩＴ処置動物間のアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）値を示すグラフである。ビヒクルコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１０、クラスター−／−  ｎ＝４、Ａ１−／−  ｎ＝４、ＢＶＲ−／−  ｎ＝６。ＡＮＩＴコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１５、クラスター−／−  ｎ＝６、Ａ１−／−  ｎ＝５、ＢＶＲ−／−  ｎ＝１７。図３１Ｄは、ビヒクルおよびＡＮＩＴ処置動物間のγグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）値を示すグラフである。ビヒクルコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１０、クラスター−／−  ｎ＝４、ＢＶＲ−／−  ｎ＝６。ＡＮＩＴコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１７、クラスター−／−  ｎ＝６、ＢＶＲ−／−  ｎ＝１５。図３１Ｅは、ＡＮＩＴ処置動物およびビヒクル処置動物から得られた血漿胆汁酸値（μＭ）を示すグラフである。ビヒクルコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝４、クラスター−／−  ｎ＝５、ＢＶＲ−／−  ｎ＝５。ＡＮＩＴコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１０、クラスター−／−  ｎ＝７、ＢＶＲ−／−  ｎ＝１４。図３１Ｆは、ビヒクルおよびＡＮＩＴ処置動物から得られた血漿間のメトエンケファリン値を示すグラフである。ビヒクルコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝４、クラスター−／−およびＢＶＲ−／−  ｎ＝５。ＡＮＩＴコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１９、クラスター−／−  ｎ＝１０、ＢＶＲ−／−  ｎ＝１１。図３１Ｇは、ビヒクルおよびＡＮＩＴ処置動物から得られた血漿間のオートタキシン活性を示すグラフである。ビヒクルコホートの場合：ＷＴおよびＢＶＲ−／−  ｎ＝４、クラスター−／−  ｎ＝５。ＡＮＩＴコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１２、クラスター−／−  ｎ＝８、ＢＶＲ−／−  ｎ＝１０。図３１Ｈは、頬に注射された１０μＬの１．３ｍＭデオキシコール酸（ＤＣＡ）に応答した掻破発作を示すグラフである。ＷＴ  ｎ＝９、クラスター−／−  ｎ＝９。図３１Ｉは、頬に注射された１０μＬの４ｍＭリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）に応答した掻破発作を示すグラフである。ＷＴ  ｎ＝６、クラスター−／−ｎ  ＝６。図３１Ｊは、ＷＴ  ｎ＝７、クラスター−／−  ｎ＝８を示すグラフである。図３１Ｋは、背中に注射された２５μｇのＤＡＭＧＯ（容量５０μＬ）に応答した掻破発作を示すグラフである。ＷＴ  ｎ＝５、クラスター−／−  ｎ＝５。図３１Ａ〜図３１Ｊは、示された平均±標準誤差を示す。白丸は独立したデータ点を表す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ。ｎ．ｓ．、有意ではない。
【図３２】図３２Ａ〜図３２Ｆ。ＢＶＲ−／−およびＡ１−／−動物がインタクトなかゆみ回路を有することを示すデータである。図３２Ａは、ＷＴおよびＢＶＲ−／−マウスの全脳から得られたＢＬＶＲＡ転写物の定量的ＰＣＲ分析を示す棒グラフである。図３２Ｂは、Ｃ１８カラムを介して分離され、４５０ｎｍでの吸光度により分析された、ＷＴおよびＢＶＲ−／−マウスから得られた血漿のＨＰＬＣ分析の代表的なクロマトグラムである。図３２Ｃは、過剰のビリルビンを添加した、ＷＴマウスから得られた血漿のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図３２Ｄは、ＷＴおよびＢＶＲ−／−動物の血漿の総ビリルビン値を示す棒グラフである。ＷＴ  ｎ＝７、ＢＶＲ−／−  ｎ＝６。図３２Ｅは、１５０μｇ（１０ｍＭの５０μＬ）のクロロキンに応答した掻破発作を示す棒グラフである。クロロキン注射後、３０分にわたり掻破発作を評価した。ＷＴ  ｎ＝９、ＢＶＲ−／−  ｎ＝５、Ａ１−／−  ｎ＝６。図３２Ｆは、６０μｇ（１ｍＭの１００μＬ）のビリルビンに応答した掻破発作を示す棒グラフである。ビリルビン注射後、３０分にわたり掻破発作を評価した。ＷＴ  ｎ＝８、ＢＶＲ−／−  ｎ＝９。図３２Ｄ〜図３２Ｆは、示された平均＋標準誤差を示す。白丸は独立したデータ点を表す。スチューデントのｔ検定による＊＊、Ｐ＜０．０１。ｎ．ｓ．、有意ではない。
【図３３】図３３Ａおよび図３３Ｂ。Ａ１−／−およびＢＶＲ−／−動物では、シクロスポリンＡ処置に関連するかゆみが減少したことを示すグラフを示す。図３３Ａは、ビヒクルおよびシクロスポリンＡ処置ＷＴおよびＡ１−／−動物の掻破発作を示す棒グラフである。ビヒクルコホートの場合：いずれもｎ＝５。シクロスポリンＡコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１０およびＡ１−／−  ｎ＝８。図３３Ｂは、ビヒクルおよびシクロスポリンＡ処置ＷＴおよびＢＶＲ−／−動物の掻破発作を示す棒グラフである。３０分にわたり掻破発作を評価した。ビヒクルコホートの場合：ｎ＝５。シクロスポリンＡコホートの場合：ＷＴ  ｎ＝１１およびＢＶＲ−／−  ｎ＝７。図３３Ａおよび図３３Ｂは、示された平均＋標準誤差を示す。白丸は個々のデータ点を表す。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔ。ｎ．ｓ．、有意ではない。
【図３４】図３４Ａ〜図３４Ｇ。ＱＷＦ処置が胆汁うっ滞性肝損傷の重症度に影響を及ぼさないことを示すグラフを示す。図３４Ａは、ＭＲＧＰＲＡ１発現ＨＥＫ細胞内のビリルビン誘発Ｃａ２＋シグナルの濃度反応曲線のグラフである。２００μＭビリルビンは、示された用量のＱＷＦと競合して維持された。平均±標準誤差を示す。ｎ＝３は２連で反復する。図３４Ｂ〜図３４Ｃは、ビヒクルまたは１ｍｇ／ｋｇのＱＷＦのいずれかと同時注射された（図３４Ｂ）６０μｇ（１ｍＭの１００ｍＬ）のビリルビンまたは（図３４Ｃ）１５０μｇのクロロキンの掻破発作の棒グラフを示す。注射後、３０分にわたり掻破発作の回数を評価した。ビリルビンの場合：ビヒクルｎ＝７、ＱＷＦ  ｎ＝８。クロロキンの場合：ビヒクルｎ＝４、ＱＷＦ  ｎ＝７。平均＋標準誤差を示す。ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔによる＊、Ｐ＜０．０５。ｄ〜ｇ、ＡＮＩＴ肝損傷を受けたビヒクルおよびＱＷＦ投与ＷＴ動物の血漿（図３４Ｄ）ビリルビン、（図３４Ｅ）ＡＳＴ、（図３４Ｆ）ＡＬＴおよび（図３４Ｇ）ＡＬＰ値。図３４Ｄ〜図３４Ｇは示された平均±標準誤差を示す。白丸は独立したデータ点を表す。ｎ．ｓ．、ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔにより有意ではない。
【図３５】図３５Ａおよび図３５Ｂ。血漿ビリルビンのＦｅＣｌ３および抗ビリルビン抗体の枯渇を示すデータを示す。図３５Ａは、１００μＭビリベルジン＋１００μＭビリルビン標準および処置血漿試料の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示している。４０５ｎｍで吸光度を測定した。図３５Ｂは、未処置、ＦｅＣｌ３、正常ウサギＩｇＧおよびビリルビン抗体処置試料中の血漿ビリルビンの定量の棒グラフを示す。点は技術的複製を表す。平均±標準誤差を示す。＊＊、Ｐ＜０．０１；ｎ．ｓ．、双方向ＡＮＯＶＡとそれに続く事後テューキー検定により有意ではない。
【発明を実施するための形態】
【０１２４】
本発明は、新規Ｇタンパク質共役受容体であるヒトＭｒｇｐｒＸ４およびマウスＭｒｇｐｒＡ１の同定に少なくとも部分的に基づく。ＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＡ１は、特定の種類の自然免疫細胞に発現し、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）を媒介し、自己免疫疾患に関与している可能性が高い。ＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＡ１は、ラモトリギンおよびアロプリノールなど、ＳＪＳを引き起こす多くの薬物によって活性化される。さらに、ＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＡ１は感覚ニューロンにも発現し、掻痒感および胆汁うっ滞性掻痒症に重要である。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＡ１はビリルビンの受容体である。本明細書に記載されるように、この発見以前には、ビリルビン受容体は同定されていなかった。いくつかの実施形態では、ヒトＭｒｇｐｒＸ４は、ＳＪＳ、多発性硬化症などの自己免疫疾患、胆汁うっ滞性掻痒症および他の慢性的なかゆみ症状の薬物標的である。本明細書に記載されるように、何らかの生物学的プロセスおよび疾患に果たすＭｒｇｐｒＸ４の役割は、この発見以前には完全に不明であった。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ４発現細胞ベースのアッセイ（ＭｒｇｐｒＸ４細胞株およびｃＤＮＡならびにＭｒｇｐｒＡ１変異マウス系統）を使用して、これらの反応を標的とする薬物をスクリーニングおよび試験する。本明細書に記載されるように、ＭｒｇｐｒＸ４発現細胞株は完全に新規であり、薬物スクリーニングのためのハイスループットスクリーニングに使用される。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ４の遮断は、ＳＪＳ、多発性硬化症などの自己免疫疾患、ならびに胆汁うっ滞性掻痒症および他の慢性的なかゆみ症状を治療するための新規の方法である。
【０１２５】
本発明はまた、ヒトＭｒｇｐｒＸ３およびそのマウスホモログＭｒｇｐｒＡ６が、後根神経節（ＤＲＧ）のケラチノサイト、上皮細胞および一次感覚ニューロンに発現するという発見に少なくとも部分的に基づく。抗菌ペプチドのデフェンシンおよびカテリシジンがＭｒｇｐｒＸ３およびＭｒｇｐｒＡ６のアゴニストであることも発見された。デフェンシンおよびカテリシジンは、創傷治癒、慢性炎症、悪性形質転換、乾癬および皮膚炎などの皮膚疾患、気道および消化管障害、疼痛ならびにかゆみなどの複数の疾患および症状に影響を及ぼす可能性がある。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ３およびＭｒｇｐｒＡ６を標的として、創傷治癒、慢性炎症、悪性形質転換、乾癬および皮膚炎などの皮膚疾患、気道および消化管障害、疼痛ならびにかゆみを治療する。本明細書に記載されるように、何らかの生物学的プロセスおよび疾患に果たすＭｒｇｐｒＸ３の役割はこれまで不明であった。いくつかの実施形態では、ＭｒｇｐｒＸ３発現細胞ベースのアッセイおよびＭｒｇｐｒＡ６変異マウスを使用して、これらの反応を標的とする薬物をスクリーニングおよび試験する。本明細書に記載されるように、ＭｒｇｐｒＸ３発現細胞株は新規であり、薬物スクリーニングのためのハイスループットスクリーニングに使用される。本発明は、化合物がＧタンパク質共役受容体媒介症状に影響を及ぼすかどうかを決定する方法、および対象のＧタンパク質共役受容体媒介症状の重症度を軽減する方法を特徴とする。本発明は、薬物有害反応および自己免疫障害に密接に関連している樹状細胞と呼ばれるある種の免疫細胞に排他的に発現するＧタンパク質共役受容体、すなわち、ヒトのＭｒｇｐｒＸ４およびマウスのＭｒｇｐｒＡ１の発見に少なくとも部分的に基づく。
【０１２６】
本明細書に記載される発明以前には、薬物有害反応および自己免疫障害に果たすＭｒｇｐｒＸ４／ＭｒｇｐｒＡ１の役割は完全に不明であった。本明細書には、ＭｒｇｐｒＸ４／ＭｒｇｐｒＡ１発現細胞ベースのアッセイを使用して、薬物有害反応または自己免疫障害を誘発する薬物をスクリーニングし、これらの反応を遮断するか生じるＭｒｇｐｒＸ４のアンタゴニストをスクリーニングすることが記載されている。
【０１２７】
本発明の単離細胞は、カルシウムベースのスクリーニングアッセイでの受容体活性化の容易な視覚化を可能にするヒトＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ＭｒｇｐｒＸ４またはマウスＧＰＣＲ  ＭｒｇｐｒＡ１を発現する。これらの細胞株は、ＭｒｇｐｒＸ４アゴニストおよびアンタゴニストの活性について、ＦＤＡ承認薬および開発中の薬物のスクリーニングを可能にする。
【０１２８】
薬物スクリーニングのための細胞ベースのアッセイにこれらの細胞を用いると、陽性結果（すなわち、例えばカルシウム放出によって測定される細胞株の活性化）では、薬物が樹状細胞を通常活性化し、患者に有害反応を引き起こす可能性があることが示されるであろう。開発中の薬物のスクリーニングによって副作用プロファイルが予測され得、現在使用されている薬物のスクリーニングによって、これらの薬物の有害作用の原因が特定され得、アンタゴニストのスクリーニングによって、薬物有害反応を誘発する薬物と同時に投与することができ、細胞（例えば、樹状細胞および一次感覚ニューロン）の活性化を阻害するが、それらの意図された用途を妨げない新たな治療薬がもたらされ得る。
【０１２９】
本明細書には、この受容体を活性化するか、この受容体に拮抗するＦＤＡ承認薬および研究用化合物のスクリーニングに使用される細胞株が記載される。これらは、薬物がアレルギー型反応を誘発するかどうかを決定するのに有用であり、これらの反応を遮断するアンタゴニストを開発するためのスクリーニングにも有用である。
【０１３０】
薬物有害反応による樹状細胞および一次感覚ニューロンの活性化を試験するためのマウスモデルの導入、ならびに薬物有害反応を減少させるための治療標的としてのＭｒｇｐｒＸ４の同定について以下に詳述する。
【０１３１】
本明細書に記載されるように、新規Ｇタンパク質共役受容体、ヒトＭｒｇｐｒＸ４およびマウスＭｒｇｐｒＡ１が同定される。ＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＡ１は、特定の種類の自然免疫細胞に発現し、スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）を媒介し、自己免疫疾患に関与している可能性が高い。ＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＡ１は、ラモトリギンおよびアロプリノールなど、ＳＪＳを引き起こす多くの薬物によって活性化される。さらに、ＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＡ１は感覚ニューロンにも発現し、掻痒感および胆汁うっ滞性掻痒症に重要である。ＭｒｇｐｒＸ４およびＭｒｇｐｒＡ１はビリルビンの受容体である。この発見以前には、ビリルビン受容体は同定されていなかった。したがって、ヒトＭｒｇｐｒＸ４は必須の薬物標的である。本明細書に記載されるように、生物学的プロセスおよび疾患に果たすＭｒｇｐｒＸ４の役割は、この発見まで完全に不明である。したがって、ＭｒｇｐｒＸ４発現細胞ベースのアッセイ（ＭｒｇｐｒＸ４細胞株およびｃＤＮＡ、ならびにＭｒｇｐｒＡ１変異マウス系統）を使用して、これらの反応を標的とする薬物をスクリーニングおよび試験することは完全に新規である。ＭｒｇｐｒＸ４発現細胞株は完全に新規であり、薬物スクリーニングのためのハイスループットスクリーニングに不可欠である。ＭｒｇｐｒＸ４の遮断は、ＳＪＳ、自己免疫疾患（多発性硬化症など）および胆汁うっ滞性掻痒症（および他の慢性的なかゆみ症状）を治療するための新規の方法であり得る。
【０１３２】
本明細書に記載されるように、ヒトのＭｒｇｐｒＸ３およびマウスのＭｒｇｐｒＡ６を標的として、創傷治癒、慢性炎症、悪性形質転換、皮膚疾患（例えば、乾癬および皮膚炎）、気道および消化管障害、疼痛ならびにかゆみを治療することができる。本明細書に記載されるように、生物学的プロセスおよび疾患に果たすＭｒｇｐｒＸ３の役割は、本開示以前には不明であった。したがって、ＭｒｇｐｒＸ３発現細胞ベースのアッセイおよびＭｒｇｐｒＡ６変異マウスを使用して、これらの反応を標的とする薬物をスクリーニングおよび試験することも新規である。ＭｒｇｐｒＸ３発現細胞株は新規であり、薬物スクリーニングのためのハイスループットスクリーニングに不可欠である。
【０１３３】
ＭｒｇｐｒＸ４／ＭｒｇｐｒＡ１
Ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ４は、ヒトではＭＲＧＰＲＸ４遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＭＡＳ１発癌遺伝子は、アンジオテンシンＩＩ代謝産物であるアンジオテンシン−（１−７）に結合するＧタンパク質共役受容体である。ＭＡＳ１受容体は、アンジオテンシン−（１−７）に結合することによって活性化されると、アンジオテンシンＩＩ活性化アンジオテンシン受容体の多くの作用に拮抗する。ＭＡＳ１受容体アゴニストは、血圧の低下など、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストと同様の治療効果を有する。
【０１３４】
薬物有害反応（ＡＤＲ）は、意図しないかつ望ましくない重大な薬物安全上の懸念であり、全入院の約６％および入院費用の９％を占め、米国だけで年間最大３０１億ドルもの費用がかかっている（Ｚａｌｅｗｓｋａ−Ｊａｎｏｗｓｋａ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ３７，１６５−１８１（２０１７）；Ｓｕｌｔａｎａ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ４，Ｓ７３−７７（２０１３））。最も重篤なＡＤＲの１つであるスティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）および中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）は、大量のケラチノサイト細胞死による水疱病変、粘膜破壊および発疹／剥離を特徴とし、死亡率は最大３０％に及ぶ致死的な重症の皮膚ＡＤＲ（ｃＡＤＲ）である（Ｄｏｗｎｅｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ６６，９９５−１００３（２０１２）；Ｌｅｅ，Ｈ．Ｙ．＆Ｃｈｕｎｇ，Ｗ．Ｈ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３，３３０−３３６（２０１３））。不適切な免疫介在性細胞毒性（ｉｍｍｕｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）の関与が示されているが（Ｄｏｗｎｅｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ６６，９９５−１００３（２０１２））、薬物がＳＪＳ／ＴＥＮをトリガーする方法の分子および細胞機構は大部分が不明である。本明細書で説明するように、眼粘膜損傷および足水疱出血を伴う新規薬物誘発ＳＪＳマウスモデルが確立された。いくつかの実施形態では、いくつかのＳＪＳ／ＴＥＮ原因薬物は、マウスのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）Ｍｒｇｐｒａ１と、そのヒト機能的オルソログＭＲＧＰＲＸ４とを直接活性化することができる。Ｍｒｇｐｒａ１ノックアウト動物では、薬物誘発ＳＪＳ様表現型は消失する。さらに、本明細書に記載されるように、Ｍｒｇｐｒａ１およびＭＲＧＰＲＸ４はともに、細胞毒性につながる適応免疫応答を開始するのに不可欠なプロフェッショナル抗原提示細胞である樹状細胞のサブセットに発現する。最後に、ｃＡＤＲ患者では、ＭＲＧＰＲＸ４遺伝子に、薬物に対する受容体の感受性を増大させる変異が同定されている。これらの発見は、これらの薬物がどのように重篤な副作用を誘発し得るかに関する新たな分子機構を明らかにし、ＡＤＲの潜在的な予防および治療的処置の新たな道を開く。
【０１３５】
軽度な形態のＴＥＮであるＳＪＳは、１９２２年にＡｌｂｅｒｔ  Ｍ．ＳｔｅｖｅｎｓおよびＦｒａｎｋ  Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎによって最初に記述された（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ａ．Ｍ．＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｆ．Ｃ．，Ａｍ  Ｊ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ  ２４，５２６−５３３（１９２２））。それ以来、ＳＪＳ／ＴＥＮの認知度は、その死亡率および罹患率のために医療分野で増大している。ＳＪＳ／ＴＥＮの病因としていくつかの種類の感染および悪性疾患が関与しているが、ＳＪＳ／ＴＥＮの主な原因は薬物の有害作用である（Ｈｅｎｇ，Ｙ．Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １７３，１２５０−１２５４（２０１５））。抗てんかん薬（例えば、ラモトリギン、カルバマゼピン）、抗痛風薬（例えば、アロプリノール）、特定のクラスの抗生物質および非ステロイド性抗炎症薬を含む１００超の臨床的に使用されている薬物がＳＪＳ／ＴＥＮと関連しており、これは主要な薬物安全上の懸念であり、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により綿密に監視されている（Ｓｃｈｏｔｌａｎｄ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９４，８４−９２，（２０１６））。原因薬物によって誘発される免疫学的反応は、ＳＪＳ／ＴＥＮの病因の根底にある機構と考えられている。原因薬物の相互作用、抗原提示細胞上のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）、およびＴ細胞上のＴ細胞受容体を含むいくつかのモデルが提案されているが（Ａｄａｍ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７１，７０１−７０７（２０１１）；Ｃｈｕｎｇ，Ｗ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ４３，７５８−７６６（２０１６））、薬物がどのようにＳＪＳ／ＴＥＮを誘発するかに関する分子および細胞機構は、少なくとも部分的には、良好かつ単純な動物モデルの欠如のために、依然として解明されていない。
【０１３６】
スティーブンス・ジョンソン症候群
スティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）は、重度の皮膚反応の一種である。中毒性表皮壊死症（ＴＥＮ）とともに一連の疾患を形成し、ＳＪＳは比較的軽度である。初期症状には、発熱およびインフルエンザ様症状が挙げられる。数日後、皮膚に水疱ができ、皮がむけ始め、痛みを伴う皮膚のむけた領域が形成される。口腔などの粘膜も典型的に侵される。合併症には、脱水症状、敗血症、肺炎および多臓器不全が挙げられる。
【０１３７】
最も一般的な原因は、ラモトリギン、カルバマゼピン、アロプリノール、スルホンアミド抗生物質およびネビラピンなどの特定の薬物である。その他の原因には、肺炎マイコプラズマおよびサイトメガロウイルスなどの感染症が挙げられる場合もあるが、原因が不明のままである場合もある。危険因子には、ＨＩＶ／ＡＩＤＳおよび全身性エリテマトーデスが挙げられる。診断は、皮膚の１０％未満が侵されていることに基づく。皮膚の３０％超が侵されている場合はＴＥＮとして知られており、ＴＥＮは１０〜３０％が侵される中間形態である。多形性紅斑（ＥＭ）は一般に別の症状と考えられる。
【０１３８】
治療は典型的には、熱傷病棟または集中治療室内などの病院内で行われる。処置には、原因の停止、鎮痛薬、抗ヒスタミン剤、抗生物質、静脈用免疫グロブリンまたはコルチコステロイドが挙げられ得る。ＳＪＳは、ＴＥＮとともに、年間１００〜２００万人に影響を及ぼす。ＳＪＳは、男性では女性の２倍見られる。典型的な発症は３０歳未満である。皮膚は通常２〜３週間で再生するが、完全な回復には数カ月かかる場合がある。
【０１３９】
ＳＪＳはウイルス感染および悪性腫瘍によって引き起こされる場合があるが、主な原因は薬物である。主な原因は、抗生物質、特にサルファ剤の使用であると思われる。１００〜２００種類の薬物がＳＪＳに関連付けられ得る。個々の症例について、特定の薬物とＳＪＳとの関連を確立するための信頼できる試験は存在しない。原因の薬物の決定は、薬物の最初の使用から皮膚反応の開始までの時間間隔に基づく。薬物の因果関係を評価するための公表されたアルゴリズム（ＡＬＤＥＮ）は、原因となる薬物を特定するための構造化された支援を提供する。
【０１４０】
ＳＪＳは、バンコマイシン、アロプリノール、バルプロエート、レボフロキサシン、ジクロフェナク、エトラビリン、イソトレチノイン、フルコナゾール、バルデコキシブ、シタグリプチン、オセルタミビル、ペニシリン、バルビツレート、スルホンアミド、フェニトイン、アジスロマイシン、オクスカルバゼピン、ゾニサミド、モダフィニル、ラモトリギン、ネビラピン、ピリメタミン、イブプロフェン、エトスクシミド、カルバマゼピン、ブプロピオン、テラプレビルおよびナイスタチンなどの薬物の有害作用によって引き起こされる場合がある。
【０１４１】
ＳＪＳ、多形性紅斑および中毒性表皮壊死症に至ることが従来知られている薬物には、スルホンアミド抗生物質、ペニシリン抗生物質、セフィキシム（抗生物質）、バルビツレート（鎮静剤）、ラモトリギン、フェニトイン（例えば、ディランチン）（抗痙攣薬）およびトリメトプリムが挙げられる。ラモトリギンとバルプロ酸ナトリウムとを併用すると、ＳＪＳのリスクが高まる。
【０１４２】
非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）は、成人のＳＪＳのまれな原因である。高齢患者、女性、および治療を開始した患者ではリスクは高くなる。典型的には、薬物誘発ＳＪＳの症状は、投薬開始から１週間以内に発生する。ＮＳＡＩＤｓと同様に、パラセタモール（アセトアミノフェン）もＳＪＳのまれな症例を引き起こしている。全身性エリテマトーデスまたはＨＩＶ感染症患者は、薬物誘発ＳＪＳに罹患しやすい。
【０１４３】
自己免疫疾患
自己免疫疾患は、正常な身体部分に対する異常な免疫応答から生じる症状である。少なくとも８０種類の自己免疫疾患が存在する。ほぼすべての身体部分が関与する可能性がある。一般的な症状には、微熱および疲労感が挙げられる。症状は多くの場合現れたり消えたりする。
【０１４４】
原因は一般に不明である。ループスなどの自己免疫疾患の中には家族性のものもあり、特定の症例は感染または他の環境要因によって引き起こされる場合がある。いくつかの一般的な自己免疫疾患には、セリアック病、１型糖尿病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデスが挙げられる。診断を決定するのは難しい場合がある。
【０１４５】
症状の種類および重症度によって治療が決まる。非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）および免疫抑制剤が使用されることが多い。静脈用免疫グロブリンも時に使用されることがある。治療は通常症状を改善するが、典型的には疾患を治癒させることはない。
【０１４６】
米国では約２４００万人（７％）の人々が自己免疫疾患に罹患している。一般的に女性は男性よりも罹患しやすい。多くの場合、自己免疫疾患は成人期に発症する。最初の自己免疫疾患は１９００年代初頭に記述された。
【０１４７】
ヒト免疫系は、典型的には、自己抗原と反応可能なＴ細胞およびＢ細胞の両方を産生するが、これらの自己反応性細胞は、通常、免疫系内で活性化する前に死滅させられるか、免疫不応答状態に置かれるか（過剰な活性化のために免疫系内のそれらの役割からサイレントに排除される）、調節性細胞によって免疫系内でのそれらの役割から排除される。これらの機構のうちのいずれかが機能しなくなると、免疫系内で機能するようになる自己反応性細胞の貯蔵庫を有することが可能になる。自己反応性Ｔ細胞の産生を妨げる機構は、Ｔ細胞が成熟した免疫細胞に発達する際に胸腺内で起こる負の選択過程によって起こる。
【０１４８】
カンピロバクター・ジェジュニなどの一部の感染症は、宿主自身の自己分子に類似する（ただし同一ではない）抗原を有する。この場合、Ｃ．ジェジュニに対する正常な免疫応答により、骨格筋上の受容体との反応性も低い抗体が産生され得る（すなわち、重症筋無力症）。自己免疫疾患の根底にある病態生理の主要な理解は、自己免疫疾患間の遺伝的共有の程度を同定したゲノムワイド関連スキャンの適用であった。
【０１４９】
一方、自己免疫とは、それに起因する損傷または病態の有無にかかわらず、自己反応性免疫応答（例えば、自己抗体、自己反応性Ｔ細胞）の存在である。これは、特定の臓器に限定されることもあれば（例えば、自己免疫性甲状腺炎）、異なる部位の特定の組織に及ぶこともある（例えば、肺および腎臓の両方の基底膜に影響を及ぼし得るグッドパスチャー病）。
【０１５０】
多発性硬化症
多発性硬化症（ＭＳ）は、脳および脊髄の神経細胞の絶縁被覆が損傷している脱髄疾患である。この損傷は、神経系の一部の伝達能力を混乱させ、身体的、精神的、時に精神医学的な問題を含む様々な徴候および症状をもたらす。特定の症状には、複視、片目失明、筋力低下、感覚障害または協調障害が挙げられ得る。ＭＳにはいくつかの形態があり、新たな症状は、単独の発作で生じるか（再発型）、経時的に蓄積する（進行型）。発作の合間に、症状が完全に消えることがある。しかし、特に疾患が進行するにつれて、永続的な神経学的問題が残ることが多い。
【０１５１】
原因は明らかではないが、根本的な機序は免疫系による破壊またはミエリン産生細胞の障害のいずれかであると考えられている。これに対して提案されている原因には、遺伝的特質、およびウイルス感染によって引き起こされるものなどの環境要因が挙げられる。ＭＳは通常、提示された徴候および症状、ならびに裏付けとなる医学的検査の結果に基づいて診断される。
【０１５２】
多発性硬化症の治療法は分かっていない。治療では、発作後の機能を改善し、新たな発作を予防しようと試みられる。ＭＳの治療に使用される薬物は、適度に効果的であるが、副作用を有し、忍容性が低い場合がある。理学療法は、人々が身体を機能させるのに役立ち得る。多くの人々は、証拠の欠如にもかかわらず、代替治療を追求している。長期的な転帰を予測するのは困難であり、女性、若年で発症した患者、再発性の経過をたどる患者、および最初に発作をほとんど経験しなかった患者の方が転帰が良好なことが多い。平均余命は平均して、罹患していない集団の平均余命よりも５〜１０年短い。
【０１５３】
多発性硬化症は、中枢神経系に影響を及ぼす最も一般的な自己免疫障害である。２０１５年には、世界中で約２３０万人が罹患し、その割合は様々な地域内および様々な集団間で大きく変動する。２０１５年には約１８，９００人がＭＳにより死亡し、１９９０年の１２，０００人から増加した。この疾患は通常２０歳から５０歳の間に発症し、女性では男性の２倍見られる。多発性硬化症という名称は、脳および脊髄の白質に発生する多数の瘢痕（強膜−プラークまたは病変としてさらによく知られる）を指す。
【０１５４】
胆汁うっ滞性掻痒症
かゆみ（掻痒症とも呼ばれる）は、掻きたいという欲求また反射を引き起こす感覚である。感覚体験の１つにかゆみを分類しようとする多くの試みはうまくいっていない。現代の科学では、かゆみには疼痛と多くの類似点があることが示されており、いずれも不快な感覚体験であるが、行動反応パターンは異なる。疼痛は引っ込め反射を起こし、かゆみは掻破反射を起こす。かゆみおよび疼痛に対する後根神経節の一次感覚ニューロンの無髄神経線維はいずれも皮膚に由来する。しかし、それらの情報は、同じ神経束と脊髄視床路とを使用する２つの異なる系で中央に伝達される。
【０１５５】
胆汁うっ滞性掻痒症は、ほぼすべての肝疾患に起因する掻痒感であるが、最も一般的に関連する病態は、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、閉塞性総胆管結石症、胆管癌、胆汁うっ滞（薬剤性掻痒症も参照）、ならびにＣ型慢性肝炎ウイルス感染および他の形態のウイルス性肝炎である。
【０１５６】
胆汁うっ滞とは、「胆汁の流れが遅くなったり止まったりすること」を意味し、肝臓（胆汁を生成する）、胆嚢（胆汁を貯蔵する）または胆道（胆管としても知られ、胆汁が肝臓および胆嚢から小腸に入ることを可能にする導管）の様々な疾患によって引き起こされ得る。これが起こると、通常は胆汁中に排泄される抱合型ビリルビンおよび老廃物が逆流して血流に戻る。これは、主に抱合型高ビリルビン血症および黄疸を引き起こす。肝臓は胆汁を抱合して水溶性にし、胆汁はすでに肝臓によって処理されているため、閉塞のために胆汁が血液中に逆流すると、血液中の抱合型ビリルビンの濃度が高くなる。これは、血清アルブミンに結合する水不溶性の形態である主に非抱合型高ビリルビン血症とは対照的である。肝臓は、ビリルビンを抱合する機会がなく、（大量溶血または無効赤血球生成などでは）非抱合型ビリルビンが過剰に生成されるか、抱合型ビリルビンが少なすぎる（ジルベール病またはクリグラー・ナジャー症候群）ために起こることがある。非抱合型高ビリルビン血症は、典型的には、掻痒症を引き起こさない。
【０１５７】
皮膚に沈着する胆汁酸塩が掻痒症（かゆみ）の原因であると考えられているが、血流中のビリルビン値と掻痒症の重症度との間には強い相関は見られない。しかし、胆汁酸塩キレート剤を投与された患者ではいくらかの軽減が報告され、完全な肝細胞不全を有する（したがって、これらの物質を最初から生成することができない）患者は掻痒症を有しない。これは、肝臓によって生成される物質が掻痒症に何らかの役割を果たしているに違いないことを示唆している。
【０１５８】
慢性的なかゆみ、または掻痒症は、多くの苦痛を引き起こす（Ｈａｌｖｏｒｓｅｎ  ＪＡ，ｅｔ  ａｌ．Ａｃｔａ  Ｄｅｒｍ  Ｖｅｎｅｒｅｏｌ  ９２：５４３−６（２０１２））。臨床的に意味のある慢性的なかゆみは広範囲の病態に起因する（Ｉｋｏｍａ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ７：５３５−４７（２００６））。１つの主な原因が胆汁うっ滞である。胆汁うっ滞は、胆汁分泌能の障害に起因し、胆管の解剖学的閉塞および肝不全を含む多数の病態に起因して起こり得る（Ｂｅｒｇａｓａ  ＮＶ．Ｐｒｕｒｉｔｕｓ  ｏｆ  Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ．Ｉｎ  Ｉｔｃｈ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｅｄ．Ｅ  Ｃａｒｓｔｅｎｓ，Ｔ  Ａｋｉｙａｍａ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（ＦＬ）．Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ．（２０１４））。胆汁うっ滞から生じる掻痒症は非ヒスタミン作動性であり、根底にある疾患の病態の解消により解消する（Ｂｅｒｇａｓａ  ＮＶ．Ｐｒｕｒｉｔｕｓ  ｏｆ  Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ．Ｉｎ  Ｉｔｃｈ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｅｄ．Ｅ  Ｃａｒｓｔｅｎｓ，Ｔ  Ａｋｉｙａｍａ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（ＦＬ）．Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ．（２０１４））。胆汁うっ滞性掻痒症は、胆汁中に存在する起痒物質に起因すると仮定されている。現在、内因性オピオイド、胆汁酸（ＢＡ）およびリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）が、胆汁うっ滞性掻痒症を媒介すると提案されている３つの主要な候補である。
【０１５９】
胆汁うっ滞性動物モデルおよび患者の血清ではともに、内因性オピオイドがアップレギュレートされている（Ｓｗａｉｎ  ＭＧ，ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０３：６３０−５（１９９２）；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＲ，Ｌｏｓｏｗｓｋｙ  ＭＳ．ＢＭＪ  ２９７：１５０１−４−２９（１９８８）；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＲ，Ｌｏｓｏｗｓｋｙ  ＭＳ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ８：５３−９（１９８９）；Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＲ，Ｌｏｓｏｗｓｋｙ  ＭＳ．Ｇｕｔ  ３０：１３９２−５（１９８９））。小規模の臨床試験では、オピオイドアンタゴニストのナロキソンおよびナルメフェンが胆汁うっ滞性のかゆみの制御に効果的であることが実証された（Ｂｅｒｇａｓａ  ＮＶ．Ａｍ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ９３：１２０９−１０（１９９８）；Ｂｅｒｇａｓａ  ＮＶ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７：６７９−８４（１９９８）；Ｂｅｒｇａｓａ  ＮＶ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０２：５４４−９（１９９２）；Ｓｗａｉｎ  ＭＧ，ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０３：６３０−５（１９９２））。胆汁うっ滞患者の血清では、コレステロールのステロイド代謝産物であるＢＡも上昇するが、それらの値は患者から報告された掻痒感の強さと相関しない（Ｂｅｒｇａｓａ  ＮＶ．Ｐｒｕｒｉｔｕｓ  ｏｆ  Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ．Ｉｎ  Ｉｔｃｈ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｅｄ．Ｅ  Ｃａｒｓｔｅｎｓ，Ｔ  Ａｋｉｙａｍａ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（ＦＬ）．Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ．（２０１４））。一連のヒト臨床試験では、ＢＡ結合樹脂が掻痒症の軽減に有効であることが実証された（Ｄａｔｔａ  ＤＶ，Ｓｈｅｒｌｏｃｋ  Ｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ５０：３２３−３２（１９６６）；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌ．ＥＡＳＬ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ：ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｃ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ５１：２３７−６７（２００９））。ただし、これらの結論には異議が唱えられている（Ｋｒｅｍｅｒ  ＡＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３９：１００８−１８，（２０１０）；Ｋｕｉｐｅｒ  ＥＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５２：１３３４−４０（２０１０））。２０１３年には、胆汁酸受容体であるＴＧＲ５が、かゆみをプログラムする感覚ニューロンの亜集団で同定された（Ａｌｅｍｉ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２３：１５１３−３０（２０１３））。最後に、胆汁うっ滞患者の血清では、リゾホスファチジルコリンをＬＰＡに変換する酵素であるオートタキシンがアップレギュレートされる（Ｋｒｅｍｅｒ  ＡＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３９：１００８−１８，（２０１０））。この上昇は、掻痒症を報告する患者にのみ発生する（Ｋｒｅｍｅｒ  ＡＥ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５６：１３９１−４００（２０１２））。
【０１６０】
内因性オピオイド、ＢＡおよびＬＰＡは、いずれも非ヒスタミン作動性かゆみの例である。胆汁うっ滞患者は、紅斑または腫脹などのヒスタミン放出の古典的な徴候を示さない（Ｂｅｒｇａｓａ  ＮＶ．Ｐｒｕｒｉｔｕｓ  ｏｆ  Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ．Ｉｎ  Ｉｔｃｈ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｅｄ．Ｅ  Ｃａｒｓｔｅｎｓ，Ｔ  Ａｋｉｙａｍａ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（ＦＬ）．Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ．（２０１４））。さらに、抗ヒスタミン薬は胆汁うっ滞性掻痒症の治療には効果がなく、症状の臨床的改善を報告する患者はごくわずかである（Ｂｅｒｇａｓａ  ＮＶ．Ｃｌｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  １２：３８５−４０６（２００８）；Ｂｅｒｇａｓａ  ＮＶ．Ｐｒｕｒｉｔｕｓ  ｏｆ  Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ．Ｉｎ  Ｉｔｃｈ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｅｄ．Ｅ  Ｃａｒｓｔｅｎｓ，Ｔ  Ａｋｉｙａｍａ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（ＦＬ）．Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ．（２０１４））。
【０１６１】
胆汁うっ滞およびビリルビン
胆汁うっ滞は、多くの場合、黄疸、皮膚および眼の黄変をもたらす。黄疸は、皮膚に沈着するビリルビン値の上昇のために発生する。ビリルビンはヘムの下流代謝産物である。細胞では、ヘムはヘムオキシゲナーゼ１（ＨＭＯＸ１）によってビリベルジンに分解され、次いでこれがビリベルジンリダクターゼ（ＢＶＲ）によってビリルビンに還元される。ビリルビンは極めて親油性であり、細胞膜を通過することができると考えられている。血中では、ビリルビンはアルブミンに結合している。肝臓では、ＵＧＴ１Ａ＊２８がビリルビンをグルクロン酸に抱合させて水溶性化合物を形成する。抱合型ビリルビンおよび非抱合型ビリルビンの両方が胆汁中に排泄される。ヒトの健康に関しては、ビリルビンは心血管保護効果のある生理的抗酸化物質であると考えられている（Ｂｕｌｍｅｒ  ＡＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ５２：１９３−２０５（２０１３）；Ｖｉｔｅｋ  Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １６０：４４９−５６（２００２））。
【０１６２】
Ｍｒｇｐｒおよび非ヒスタミン作動性かゆみ
Ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体（Ｍｒｇｐｒ）は、起痒性リガンドの受容体として、およびかゆみをプログラムするニューロンの分子マーカーとして、非ヒスタミン作動性かゆみに関与している（Ｌｉｕ  Ｑ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３２：１４５３２−７（２０１２）；Ｌｉｕ  Ｑ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １３９：１３５３−６５（２００９））。マウスでは、２７を超えるＭｒｇｐｒが発現するが、既知の生理学的リガンドを有するのはそのうちのごくわずかである（ＭｃＮｅｉｌ  Ｂ，Ｄｏｎｇ  Ｘ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｂｕｌｌ  ２８：１００−１０（２０１２））。ヒトでは、４つのＭｒｇｐｒ（ＭｒｇｐｒＸ１〜Ｘ４）が発現する。ＭｒｇｐｒＸ１、Ｘ３およびＸ４は、ヒトＤＲＧおよび三叉神経節（ＴＧ）に特異的に発現していることが特定されているが、ＭｒｇｐｒＸ２はヒト肥満細胞に認められている（Ｆｌｅｇｅｌ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０：ｅ０１２８９５１（２０１５）；Ｇｏｓｗａｍｉ  ＳＣ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｐａｉｎ  １０：４４（２０１４）；Ｌｅｍｂｏ  ＰＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ５：２０１−９（２００２）；ＭｃＮｅｉｌ  ＢＤ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１９：２３７−４１（２０１５））。
【０１６３】
ＭｒｇｐｒＸ３／ＭｒｇｐｒＡ６
ｍａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体メンバーＸ３は、ヒトではＭＲＧＰＲＸ３遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＭＡＳ１発癌遺伝子は、アンジオテンシンＩＩ代謝産物であるアンジオテンシン−（１−７）に結合するＧタンパク質共役受容体である。ＭＡＳ１受容体は、アンジオテンシン−（１−７）に結合することによって活性化されると、アンジオテンシンＩＩ活性化アンジオテンシン受容体の多くの作用に拮抗する。ＭＡＳ１受容体アゴニストは、血圧の低下など、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストと同様の治療効果を有する。
【０１６４】
ヒトＭｒｇｐｒＸ３およびそのマウスホモログＭｒｇｐｒＡ６は、後根神経節（ＤＲＧ）のケラチノサイトおよび一次感覚ニューロンに発現する。さらに重要なことに、抗菌ペプチドのデフェンシンおよびカテリシジンは、ＭｒｇｐｒＸ３およびＭｒｇｐｒＡ６のアゴニストである。デフェンシンおよびカテリシジンは、創傷治癒、慢性炎症、悪性形質転換、乾癬および皮膚炎などの皮膚疾患、気道および消化管障害、疼痛ならびにかゆみなどの複数の疾患および症状に影響を及ぼす可能性がある。ＭｒｇｐｒＸ３およびＭｒｇｐｒＡ６を標的として、創傷治癒、慢性炎症、悪性形質転換、乾癬および皮膚炎などの皮膚疾患、気道および消化管障害、疼痛ならびにかゆみを治療することができる。本明細書に記載されるように、生物学的プロセスおよび疾患に果たすＭｒｇｐｒＸ３の役割は、本開示以前には不明である。したがって、ＭｒｇｐｒＸ３発現細胞ベースのアッセイおよびＭｒｇｐｒＡ６変異マウスを使用して、これらの反応を標的とする薬物をスクリーニングおよび試験することも新規である。ＭｒｇｐｒＸ３発現細胞株は新規であり、薬物スクリーニングのためのハイスループットスクリーニングに不可欠である。
【０１６５】
損傷と病原体の侵入とは、損傷した組織の回復を目的とした一連の炎症反応および修復反応を引き起こす。また、反復刺激と慢性炎症とが癌の強力な危険因子であることも長い間指摘されている。したがって、創傷治癒プロセスの完全な理解は、様々な癌腫の原因、ひいてはそれらの予防のための重要な洞察をもたらす。このプロセス中に放出される多数の宿主防御分子の中には、デフェンシンと呼ばれる抗菌ペプチド（ＡＭＰ）の大きなファミリーがある。これらのＡＭＰは、病原体を直接死滅させることに加えて、炎症反応の複数の段階で様々な種類の細胞に無数の免疫調節効果を及ぼすため、特に興味深い。特に、ヒトβ−デフェンシンｈＢＤ３は、上皮細胞の遊走および増殖を刺激することにより創傷治癒を支援することが示されている。本明細書に記載されるように、新規Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）、ＭＲＧＰＲＸ３は、ヒトケラチノサイトおよび他の上皮細胞型でのデフェンシン受容体である。本明細書に記載されるように、リガンド相同性および発現プロファイリングは、ヒトＭＲＧＰＲＸ３のマウスホモログとしてのマウス遺伝子ＭｒｇｐｒＡ６を示し、これらの受容体の生理学的および細胞生物学的機能がインビトロおよびインビボの両方で検討される。
【０１６６】
皮膚は最大の免疫器官であり、感染に対する第一線の防御器官である。損傷および病原体の侵入時に、炎症性カスケードが保護反応として迅速に引き起こされる（Ｐａｓｐａｒａｋｉｓ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４，２８９−３０１（２０１４）；Ｓｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｊ．＆Ｃｌａｒｋ，Ｒ．Ａ．Ｆ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４１，７３８−７４６（１９９９））。局所的な皮膚炎症は、古代ローマ人記録されているように「熱および疼痛を伴う発赤および腫脹」によって特徴付けられ（Ｏｗｅｎ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，２０１３））、複数の細胞型および多数の分子メディエーターが関与する。この複雑なプロセスは、免疫、神経、血管および上皮系の協調作用を伴い、我々の生存に不可欠である。
【０１６７】
ヒトβデフェンシンｈＢＤ３は、ケラチノサイトの遊走と創傷治癒とを促進する。デフェンシンは、抗菌ペプチド（ＡＭＰ）の大きなファミリーである。これらのカチオン性ペプチドは、組織の損傷および感染の直後に上皮細胞および免疫細胞によって産生され、広範囲の病原体を死滅させることができる（Ｐａｚｇｉｅｒ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．Ｃ．６３，１２９４−１３１３（２００６）；Ａｍｉｄ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １０，１−１３（２００９））。直接的な死滅に加えて、デフェンシンは多くの免疫調節機能も発揮する。ヒトβデフェンシン３（ｈＢＤ３）は、様々な免疫細胞（Ｇａｎｚ，Ｔ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３，７１０−７２０（２００３）；Ｒｏｈｒｌ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４，６６８８−６６９４（２０１０））、肥満細胞脱顆粒（Ｂｅｆｕｓ，Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３，９４７−９５３（１９９９）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１，３４５−３５２（２０１３））に対する走化性活性を含む広範囲な機能を示し、創傷治癒を支援することが示された（Ｈｉｒｓｃｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１１，２２０−２２８（２００９）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０，５５８３−５５８９（２００３）；Ａａｒｂｉｏｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０，１９３−２０１（２００４）；Ｏｔｔｅ，Ｊ．−Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，２２８６−２２９７（２００８））。培養初代ヒトケラチノサイトを対象とした実験では、ｈＢＤ３がケラチノサイトの遊走および増殖を促進することができることが示された（Ｎｉｙｏｎｓａｂａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２７，５９４−６０４（２０１６））。感染した糖尿病創傷に適用した場合、ｈＢＤ３は細菌負荷を顕著に低下させ、再上皮化と創傷閉鎖とを促進した。ケラチノサイトに対するｈＢＤ３の効果は百日咳毒素によって遮断される場合があり、受容体がＧＰＣＲであることを示している（Ｎｉｙｏｎｓａｂａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２７，５９４−６０４（２０１６））。
【０１６８】
ヒトケラチノサイトにおけるｈＢＤ３の主要な受容体としてのＭＲＧＰＲＸ３。ＭＲＧＰＲＸ３は、ＧＰＣＲのＭａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体（Ｍｒｇｐｒ）ファミリーに属する。本明細書に記載されるように、過去１０年間の研究により、感覚ニューロンおよび免疫細胞でのこれらの受容体の多様な発現パターンおよび機能が明らかにされた（Ｌｉｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  １３９，１３５３−１３６５（２００９）；Ｈａｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６，１７４−１８２（２０１３）；ＭｃＮｅｉｌ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１９，２３７−２４１（２０１５））。４つのヒトＭＲＧＰＲＸのうち、ＭＲＧＰＲＸ３はケラチノサイトを含む上皮細胞に高度に発現するが、その他はＤＲＧニューロン、肥満細胞または他の免疫細胞型に特異的である（Ｈｒｕｚ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００８，４２０７４７（２００８）；Ｋｉａｔｓｕｒａｙａｎｏｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｄｅｒｍｓｃｉ．（２０１６．０５．００６））。ユニバーサルプロモーターを用いた過剰発現ヒトＭＲＧＰＲＸ３は、ラットではケラチノサイト過剰増殖を誘発した（Ｋａｉｓｈｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３０，６５３−６５７（２００５））。本明細書に記載されるように、初代ヒトケラチノサイトを対象としたＣａ２＋イメージングおよびノックダウン実験では、細胞がｈＢＤ３に応答するためにＭＲＧＰＲＸ３が必要であることが示される。発現分析とリガンド相同性とは、さらにＭＲＧＰＲＸ３のマウスホモログとしてのマウス遺伝子ＭｒｇｐｒＡ６を示し、これらの受容体のインビボ研究の機会を開いた。
【０１６９】
創傷治癒
損傷のない皮膚では、表皮（表面層）と真皮（深層）とが外部環境に対する保護バリアを形成する。バリアが破られると、生化学的事象の組織化されたカスケードが開始されて損傷を修復する。このプロセスは、予測可能な段階、すなわち、血液凝固（止血）、炎症、組織増殖（増殖）および組織再構築（成熟）に分けられる。血液凝固は、別の段階ではなく、炎症段階の一部であると考えられる場合がある。
【０１７０】
止血（血液凝固）は、創傷治癒プロセスの初期に始まる。損傷の最初の数分以内に、血液中の血小板が損傷部位に付着し始める。これにより血小板が活性化され、いくつかのことが生じる。血小板は、凝固に適した無定形な形状に変化し、化学信号を放出して凝固を促進する。これはフィブリンの活性化をもたらし、フィブリンはメッシュを形成し、血小板を互いに結合する「接着剤」として機能する。これにより、血管の裂け目を塞ぐのに役立つ血栓が形成され、それ以上の出血が遅くなり予防される。
【０１７１】
炎症の段階では、細菌および他の病原体または残骸とともに、損傷した細胞および死細胞が取り除かれる。これは、白血球が残骸を飲み込むことによって残骸を「食べる」貪食のプロセスを通して起こる。血小板由来の増殖因子が創傷に放出され、これにより、増殖段階で細胞の遊走および分裂が引き起こされる。
【０１７２】
増殖（新たな組織の増殖）段階では、血管新生、コラーゲン沈着、肉芽組織形成、上皮化および創傷収縮が生じる。血管新生では、血管内皮細胞が新たな血管を形成する。線維増殖および肉芽組織形成では、線維芽細胞が増殖し、コラーゲンとフィブロネクチンとを排出することにより、新たな暫定的な細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を形成する。同時に、表皮の再上皮化が起こり、そこでは上皮細胞が増殖して創傷床の上に「一面に広がり」、新たな組織を覆う。創傷収縮では、筋線維芽細胞が、平滑筋細胞の場合と同様の機構を用いて創傷端を把持し収縮することにより創傷の大きさを減少させる。細胞の役割がほぼ完了すると、不要な細胞はアポトーシスを起こす。
【０１７３】
成熟および再構築中、張力線に沿ってコラーゲンが再配列され、不要になった細胞はプログラム細胞死すなわちアポトーシスによって除去される。創傷治癒プロセスは複雑であるだけでなく、脆弱でもあり、治癒していない慢性創傷の形成につながる中断または失敗の影響を受けやすい。非治癒慢性創傷に寄与する因子は、糖尿病、静脈疾患または動脈疾患、感染症、および老年期の代謝欠損である。
【０１７４】
樹状細胞
樹状細胞（ＤＣ）は、哺乳動物の免疫系の抗原提示細胞（アクセサリー細胞としても知られる）である。樹状細胞の主な機能は、抗原物質を処理し、それを細胞表面で免疫系のＴ細胞に提示することである。樹状細胞は、自然免疫系と適応免疫系との間のメッセンジャーとして機能する。樹状細胞は、皮膚（ランゲルハンス細胞と呼ばれる特殊な樹状細胞型がある）ならびに鼻、肺、胃および腸の内層など、外部環境と接触している組織に存在する。樹状細胞はまた、血液中に未成熟な状態で見出され得る。樹状細胞は活性化されると、リンパ節に遊走し、そこでＴ細胞およびＢ細胞と相互作用して適応免疫応答を開始および形成する。未成熟樹状細胞は、樹状突起ではなく大きな細胞質の「ベール」を有するため、ベール細胞とも呼ばれる。
【０１７５】
後根神経節
後根神経節（または脊髄神経節）（後根神経節（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ  ｒｏｏｔ  ｇａｎｇｌｉｏｎ）としても知られる）は、脊髄神経の後根にある神経細胞体（神経節）の集団である。後根神経節には感覚ニューロン（求心性）の細胞体が含まれる。感覚ニューロンは、求心性ニューロンとしても知られ、それらの受容体を介して特定の種類の刺激を活動電位または段階的電位に変換するニューロンである。このプロセスは感覚伝達と呼ばれる。感覚ニューロンの細胞体は、脊髄の背側神経節（ｄｏｒｓａｌ  ｇａｎｇｌｉａ）に位置している。一次感覚ニューロンは、受容器で始まり、多くの場合中枢神経系の核内にある二次感覚ニューロンとのシナプスで終わる求心路の最初のものである。
【０１７６】
この感覚情報は、求心性神経または感覚神経の求心性神経線維に沿って、脊髄を介して脳に伝わる。刺激は、体外の外受容器から（例えば、光および音）、または体内の内受容器から（例えば、血圧、または体位の感覚）発生し得る。異なる種類の感覚ニューロンは、異なる種類の刺激に応答する異なる感覚受容器を有する。
【０１７７】
後根神経節ニューロンの軸索は求心性神経として知られている。末梢神経系では、求心性神経とは、中枢神経系（すなわち、脳および脊髄）に感覚情報を中継する軸索を指す。ニューロンは、３つの部分、すなわち、情報を受け取り、それを神経細胞体に中継する樹状突起、ニューロンの細胞体である神経細胞体、および神経細胞体から情報を中継する軸索からなる。ニューロンでは、樹状突起がミエリンによって覆われている場合であっても、樹状突起はシナプスで別のニューロンの軸索から情報を受け取り、軸索は次のニューロンの樹状突起に情報を送る。
【０１７８】
プロトン感知性Ｇタンパク質共役受容体は、後根神経節感覚ニューロンによって発現され、酸誘発侵害受容（ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｏｎ）に何らかの役割を果たす可能性がある。いくつかの実施形態では、後根神経節の一次感覚ニューロンのＧタンパク質共役受容体（例えば、ＭｒｇｐｒＸ４またはＭｒｐｇｒＡ１）は、疼痛およびかゆみなどの感覚を媒介する。
【０１７９】
後根神経節ニューロンの神経終末は、機械的、熱的、化学的および有害な刺激によって活性化される様々な感覚受容器を有する。閾値の高いチャネルは侵害受容に何らかの役割を果たす可能性がある。脊髄の背側神経終末放電のシナプス前調節は、侵害受容と疼痛伝達とを制御することができる特定の種類のＧＡＢＡＡ受容体を介して起こり得る。
【０１８０】
ＨＥＫ２９３細胞
ヒト胎児由来腎臓２９３細胞は、多くの場合、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ−２９３、２９３細胞、またはあまり正確ではないがＨＥＫ細胞とも呼ばれ、組織培養で増殖させた（流産したヒト胚由来の）ヒト胎児由来腎臓細胞に元来由来するか死産動物に元来由来する特定の細胞株である。ＨＥＫ２９３細胞は、非常に容易に増殖し、非常にトランスフェクトしやすく、細胞生物学研究では長年にわたって広く使用されてきた。ＨＥＫ２９３細胞は、バイオテクノロジー産業により、遺伝子療法のための治療用タンパク質およびウイルスを産生するためにも使用される。本明細書には、ＭｒｇｐｒＸ３またはＭｒｇｐｒＸ４のいずれかを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞が記載される。
【０１８１】
医薬組成物
特定の実施形態では、本発明は、本発明で使用される薬剤を含む医薬組成物を提供する。薬剤は、好適に製剤化され、そのような送達のために認識されている任意の手段によって対象、または細胞の環境に導入され得る。
【０１８２】
そのような組成物は、典型的に、薬剤および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される用語「薬学的に許容される担体」には、薬学的投与に適合する生理食塩水、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などが含まれる。補助的な活性化合物も組成物に組み込むことができる。
【０１８３】
医薬組成物は、その意図された投与経路に適合するように製剤化される。投与経路の例には、非経口、例えば、静脈内、皮内、皮下、経口（例えば、吸入）、経皮（局所）、経粘膜、および直腸投与が挙げられる。非経口、皮内または皮下投与に使用される溶液または懸濁液には、以下の成分、すなわち、滅菌希釈剤、例えば、注射用水、生理食塩水、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗細菌剤、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミン四酢酸；緩衝液、例えば、アセテート、シトレートまたはホスフェート、および張度調整剤、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースが挙げられ得る。ｐＨは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムにより調整することができる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器または複数回投与バイアルに封入することができる。
【０１８４】
注射用途に適した医薬組成物には、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液、および滅菌注射液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与の場合、好適な担体には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州パーシッパニー）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。いずれの場合も、組成物は無菌でなければならず、容易な注射の可能性が存在する程度に流動性であるべきである。組成物は、製造および保管の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。例えば、レシチンなどの被覆の使用によって、分散液の場合は必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。様々な抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって、微生物の作用の防止を達成することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、多価アルコール、例えば、マニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物に含めることによって、注射用組成物の長期吸収をもたらすことができる。
【０１８５】
必要に応じて上に列挙した成分のうちの１つまたは組合せとともに、選択された溶媒に必要な量の活性化合物を組み込み、続いて濾過滅菌することによって、滅菌注射液を調製することができる。一般に、基本的な分散媒、および上に列挙したものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み込むことによって分散液が調製される。滅菌注射液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は真空乾燥および凍結乾燥であり、これにより、その事前に滅菌濾過された溶液から活性成分および任意の追加の所望の成分の粉末がもたらされる。
【０１８６】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。経口治療投与の目的のために、活性化合物を賦形剤と混合し、錠剤、トローチまたはカプセル、例えばゼラチンカプセルの形で使用することができる。経口組成物は、口腔洗浄薬として使用するための液体担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合する結合剤、および／またはアジュバント材料を組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の成分、または同様の性質の化合物のいずれか、すなわち、結合剤、例えば、微結晶セルロース、トラガカントゴムもしくはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース；崩壊剤、例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌもしくはコーンスターチ；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくはＳｔｅｒｏｔｅｓ；流動促進剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えば、スクロースもしくはサッカリン；または香味料、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチルもしくはオレンジ風味を含有することができる。
【０１８７】
本発明の組成物は、ナノ粒子製剤として製剤化することもできる。本発明の化合物は、即時放出、遅延放出、調節放出、持続放出、パルス放出および／または制御放出用途のために投与することができる。本発明の医薬組成物は、体積当たり０．０１〜９９重量％の活性物質を含有してもよい。吸入による投与の場合、化合物は、好適な噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含む加圧容器もしくはディスペンサー、またはネブライザーからエアゾールスプレーの形で送達される。そのような方法には、米国特許第６，４６８，７９８号明細書に記載されているものが挙げられる。
【０１８８】
全身投与は、経粘膜または経皮手段によるものでもあり得る。経粘膜または経皮投与の場合、浸透する障壁に適した浸透剤が製剤に使用される。そのような浸透剤は一般に当技術分野で知られており、例えば、経粘膜投与の場合、洗浄剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐薬の使用によって達成することができる。経皮投与の場合、活性化合物は、当技術分野で一般に知られているように、軟膏、膏薬、ゲルまたはクリームに製剤化される。化合物は、坐薬（例えば、カカオバターおよび他のグリセリドなどの従来の坐薬基剤を含む）、または直腸送達用の保持浣腸の形で調製することもできる。
【０１８９】
一実施形態では、活性化合物は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤など、身体からの急速な排出から化合物を保護する担体とともに調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤は、標準的な技術を使用して調製することができる。また、材料は、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体により感染細胞を標的としたリポソームを含む）も、薬学的に許容される担体として使用することができる。これらは、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号明細書に記載されているように、当業者に知られている方法に従って調製することができる。
【０１９０】
このような化合物の毒性および治療効果は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に対して治療上有効な用量）を決定するための、細胞培養または実験動物を対象とした標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物を使用してもよいが、非感染細胞に対する潜在的な損傷を最小限に抑え、それによって副作用を低減するために、罹患組織の部位に対してそのような化合物を標的化する送達システムを設計するのに注意を払うべきである。
【０１９１】
細胞培養アッセイおよび動物試験から得られたデータは、ヒトに使用するための投与量の範囲を策定する際に使用することができる。そのような化合物の投与量は、毒性をほとんどまたはまったく伴わず、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、使用される剤形および利用される投与経路に応じてこの範囲内で変動してもよい。本発明の方法に使用される化合物について、細胞培養アッセイから治療有効用量を最初に推定することができる。細胞培養で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の半最大阻害を達成する試験化合物の濃度）を含む循環血漿中濃度範囲を達成するために、動物モデルに対してある用量が製剤化されてもよい。このような情報を使用して、ヒトに対して有用な用量をさらに正確に決定することができる。血漿中の濃度は、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定されてもよい。
【０１９２】
本明細書で定義されるように、薬剤の治療有効量（すなわち、有効投与量）は、選択された薬剤に依存する。例えば、約１ｐｇ〜１０００ｍｇの範囲の薬剤の単回投与量が投与されてもよい。いくつかの実施形態では、１０、３０、１００もしくは１０００ｐｇ、または１０、３０、１００もしくは１０００ｎｇ、または１０、３０、１００もしくは１０００μｇ、または１０、３０、１００もしくは１０００ｍｇが投与されてもよい。いくつかの実施形態では、１〜５ｇの組成物を投与することができる。
【０１９３】
本発明の化合物の治療有効量は、当技術分野で知られている方法により決定することができる。使用される薬剤および選択された製剤／医薬製剤に依存することに加えて、本発明の医薬組成物の治療有効量は、患者の年齢および全体的な生理学的状態ならびに投与経路に依存する。特定の実施形態では、治療用量は、一般に、約１０〜２０００ｍｇ／日、好ましくは約３０〜１５００ｍｇ／日である。例えば、５０〜５００ｍｇ／日、５０〜３００ｍｇ／日、１００〜２００ｍｇ／日を含む他の範囲が使用されてもよい。
【０１９４】
投与は、１日１回、１日２回、またはさらに頻繁であってよく、疾患または障害の維持期には、例えば、１日１回または１日２回ではなく、２日または３日に１回に減らしてもよい。用量および投与頻度は、当業者に公知の急性期の少なくとも１つ以上、さらに好ましくは２つ以上の臨床徴候の減少または欠如を伴う寛解期の維持を裏付ける臨床徴候に依存する。当業者であれば、限定するものではないが、疾患または障害の重症度、以前の治療、対象の全体的な健康状態および／または年齢、および存在する他の疾患を含む特定の因子が、対象を効果的に治療するために必要な投与量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。さらに、治療有効量の薬剤による対象の治療は、単回治療を含むことができるか、場合により、一連の治療を含むことができる。
【０１９５】
細胞の環境に薬剤を導入する方法は、細胞の種類とその環境の構成とに依存することを理解することができる。好適な量の薬剤を導入しなければならず、これらの量は標準法を使用して経験的に決定することができる。細胞の環境での個々の薬剤の例示的な有効濃度は、５００ミリモル以下、５０ミリモル以下、１０ミリモル以下、１ミリモル以下、５００ナノモル以下、５０ナノモル以下、１０ナノモル以下であってよいか、１ナノモル以下の濃度が使用され得る組成物であってもよい。
【０１９６】
医薬組成物は、投与のための指示書とともにキット、容器、パックまたはディスペンサーに含めることができる。
【０１９７】
以下の実施例は、本発明のアッセイ、スクリーニングおよび治療方法を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するように記載されており、本発明者がその発明としてみなすものの範囲を限定することを意図しない。
【実施例】
【０１９８】
実施例１：実施例２〜１１の材料および方法
以下の材料および方法を使用した。
【０１９９】
動物
野生型１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪ、野生型ＢＡＬＢ／ｃＪ、およびＢＡＬＢ／ｃ遺伝的バックグラウンドにおけるＲａｇ１−／−（Ｃ．１２９Ｓ７（Ｂ６）−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ／Ｊ）をジャクソン研究所から購入し、ジョンズ・ホプキンス大学医学部において特定病原体不在条件下で交配および飼育した。１２時間の昼夜サイクルで動物を維持し、オートクレーブ処理された飼料と濾過水とを自由に摂取させた。他の実験にはいずれも８〜１０週齢の動物を使用した。ジョンズ・ホプキンス大学医学部の動物実験委員会によって承認されたプロトコルの下で全動物を管理した。ＷＴおよび変異体試料ならびに動物に対する同等の処理を含む全実験が、条件を知らない実験者によって行われた。
【０２００】
カルシウムカルシウムイメージング用の薬物調製
ラモトリギン（ＬＴＧ）、アロプリノール、カルバマゼピンおよびオクスカルバゼピン（いずれもＳｉｇｍａ製）を実験当日に新たに調製した。まずジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）にこれらの薬物を溶解し、次いで使用前にカルシウムイメージング緩衝液で少なくとも１００００倍に希釈した。対応する図の説明文に、各実験の薬物の最終濃度を示した。
【０２０１】
ＨＥＫ２９３細胞の培養およびトランスフェクション
ＨＥＫ２９３ヒト胎児由来腎臓細胞（ＡＴＣＣ）を３７°Ｃの増殖培地（１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ  ｍｌ−１ペニシリンおよび１００ｍｇ  ｍｌ−１ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ）中で培養した。Ｍｒｇｐｒ発現細胞を生成するために、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ｍｒｇｐｒ遺伝子（ｐＬＸ３０４ベクターにクローニングおよび挿入したＭＲＧＰＲＸ４および変異ＭＲＧＰＲＸ４を除く）をコードするｃＤＮＡを挿入したｐｃＤＮＡ３．１哺乳動物発現プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に一時的にトランスフェクトした。Ｍｒｇｐｒａ１−ＧＦＰ、Ｍｒｇｐｒｃ１１−ＧＦＰおよびＭＲＧＰＲＸ４−ＧＦＰを発現する安定な細胞株は、前述のように生成した（２４）。要約すると、プラスミド内のＭｒｇｐｒタンパク質のＣ末端に融合したＧＦＰをコードするｃＤＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中のゼオシンまたはブラストサイジンにより、トランスフェクトした細胞を選択した。クローニングした各細胞を安定な細胞株としてさらに選択し、受容体−ＧＦＰ融合タンパク質の膜局在を確認した。
【０２０２】
ＨＥＫ２９３細胞に対するカルシウムイメージング
最初の実験では、１００μｇ／ｍｌのポリ−Ｄ−リジンで被覆したガラスカバースリップ上にＨＥＫ２９３細胞を播種し、Ｍｒｇｐｒ遺伝子を含有するベクターを一時的にトランスフェクトし、培養の２４〜４８時間後、３７°Ｃの暗所で３０分間、プルロニックＦ−１２７分散剤（０．１％、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）とともにＦｕｒａ２−アセトメトキシエステルカルシウムインジケーター（０．５μＭ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を細胞に添加し、次いで、カルシウムイメージング緩衝液（ＣＩＢ；ＮａＣｌ  １２５ｍＭ、ＫＣｌ  ３ｍＭ、ＣａＣｌ２  ２．５ｍＭ、ＭｇＣｌ２  ０．６ｍＭ、ＨＥＰＥＳ  １０ｍＭ、グルコース２０ｍＭ、ＮａＨＣＯ３  １．２ｍＭ、スクロース２０ｍＭ、ＮａＯＨによりｐＨ７．４にしたもの）で洗浄した。Ｆｕｒａ  ２添加細胞に薬物を加え、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの励起波長を使用して細胞内遊離カルシウムを測定し、顕微鏡ベースのイメージングシステム（Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ＴＥ２００）を用いて５２０ｎｍで発光を測定した。３４０／３８０ｎｍ励起での発光蛍光比の変化を１秒間隔で継続的にモニターした。その後、Ｍｒｇｐｒａ１−ＧＦＰ、Ｍｒｇｐｒｃ１１−ＧＦＰおよびＭＲＧＰＲＸ４−ＧＦＰ安定細胞株を使用して実験を行って、一過性発現細胞から得られた観察結果を確認した。
【０２０３】
ＥＣ５０の決定
Ｍｒｇｐｒａ１または野生型および変異体ＭＲＧＰＲＸ４が安定に発現したＨＥＫ細胞を、９６ウェルプレート上の１００μｌの培養培地に一晩播種した。翌日、培地をＦＬＩＰＲカルシウム５アッセイキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）製の色素添加溶液に置き換え、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを加えたもの（ｐＨ７．４）で希釈した。３７°Ｃで１時間インキュベートした後、細胞を室温で暗所で１０分間回復させた後、Ｆｌｅｘｓｔａｔｉｏｎ−３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）で細胞内カルシウム動員アッセイを行った。試験した薬物は、３倍濃度のＨＢＳＳ／ＨＥＰＥＳ溶液中で調製した。製造業者の仕様に従って、１８０秒間の同時データ収集でウェルをイメージングし、イメージング開始後２０秒で５０μｌの薬物を加えた。少なくとも３つの独立したウェルで物質を試験し、シグナルを平均化した。最大シグナル（薬物により刺激した後に得られる）から最小シグナル（薬物を加える前の基礎レベルで）を差し引くことにより応答を決定した。用量反応曲線は、ＳｏｆｔＭａｘ（登録商標）Ｐｒｏ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって最高応答（１００％）に正規化された相対蛍光シグナル（％）としてプロットした。その試験でその物質に対する正規化されたピーク応答の５０％の応答を与える物質の濃度としてＥＣ５０（半最大有効濃度）を決定した。
【０２０４】
薬物標識および内在化アッセイ
赤色蛍光色素によって薬物を標識するために、１μｇのＬＴＧを最初に５０μｌのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、さらに４５０μｌの反応緩衝液（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０）で希釈して、７．８ｍＭの濃度のＬＴＧを得た。次いで、１０ｍｇ  ｍｌ−１のＤＭＦに溶解した５０μｌのＴｅｘａｓ−ｒｅｄ−コンジュゲートスルホニルクロリド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｔ１９０５）をＬＴＧ溶液にゆっくりと加えた。反応物を連続的に撹拌しながら４℃で１時間インキュベートした。次いで、その後の使用のために混合物を細胞培養培地に希釈した。Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ色素によって標識したＬＴＧは、励起／発光極大約５９５／６１５ｎｍを有する明るい赤色蛍光を生成することができる。Ｍｒｇｐｒａ１−ＧＦＰ、Ｍｒｇｐｒｃ１１−ＧＦＰまたはＭＲＧＰＲＸ４−ＧＦＰ融合タンパク質を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で増殖させた。血清飢餓の４〜６時間後、細胞を培地、色素のみ、非標識ＬＴＧまたはＴｅｘａｓ−Ｒｅｄ標識ＬＴＧのいずれかで３７°Ｃで１５または６０分間処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドにより固定した。倍率４００倍の共焦点蛍光顕微鏡下で（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００）、Ｍｒｇｐｒ−ＧＦＰまたは薬物の細胞内局在を視覚化した。
【０２０５】
ＬＴＧ結合能
ポンプ、脱ガス器、オートサンプラー、カラムオーブンおよびダイオードアレイ検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、京都、日本）からなるＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−２０１０Ａ装置を用いて、ＣＭＣ分析を行った。Ｌａｂ−ｓｏｌｕｔｉｏｎプログラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）によってデータを取得した。移動相は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；５ｍＭ、ｐＨ７．４）からなり、０．２ｍｌ／分の流速で送液した。標準薬を別個にメタノールに溶解することにより、ラモトリギンのストック溶液（１００μＭ）を調製した。ストック溶液を移動相で希釈することにより、様々な濃度の標準溶液を調製した。ＭＲＧＰＲＸ２／ＣＭＣおよびＭＲＧＰＲＸ４／ＣＭＣカラムを以下のように調製した。要約すると、ＭＲＧＰＲＸ４発現ＨＥＫ２９３細胞（１×１０８）を採取し、遠心分離した（１０００ｇ、１０分、４°Ｃ）。４℃で１０分間１０００ｇで遠心分離することにより、細胞を生理食塩水（ｐＨ＝７．４）で洗浄した。３０分間Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍＭ、ｐＨ＝７．４）中で超音波により細胞を溶解し、４℃で１０分間１０００ｇで２回遠心分離した。次いで、回収した上清を４℃で２０分間１２０００ｇで遠心分離し、ペレットを５ｍｌの氷冷生理食塩水に再懸濁した。シリカ（４５ｍｇ）を１０５°Ｃで３０分間活性化した。４℃で一晩撹拌しながら、真空下で活性化シリカを用いて、細胞膜懸濁液をホモジナイズ／吸着した。次いで、細胞膜固定相を蒸留水で洗浄し、湿式充填法（１０ＭＰａ、５分）を用いてカラムに充填し、ＣＭＣカラムを得た。
【０２０６】
ＭＲＧＰＲＸ４／ＣＭＣ系によって、以下のようにラモトリギンのＫＤ値を決定した。各化合物の標準溶液を別個に移動相に加え、それぞれ２．０×１０−８、４．０×１０−８、８．０×１０−８、１．６×１０−７および３．２×１０−７モルの濃度範囲の一連の新たな移動相を得た。各化合物の異なる濃度を有するこの移動相を、勾配プログラムの下で０．２ｍｌ  ｍｉｎ−１の流速でＭＲＧＰＲＸ４／ＣＭＣカラムを通して別個にポンプで送液し、異なる濃度を有する化合物のブレークスルー曲線を記録した。式４に従って、［ＬＲ］ｓ対［Ｌ］ｍの逆数値の対応するグラフを得た。さらに、切片と勾配の比を計算することによりＫＤを決定することができ、切片の逆数から［Ｒ］ｓを得た。
【０２０７】
Ｍｒｇｐｒａ１ノックアウト−ｅＧＦＰノックインマウスの作製
ＳＪＳ／ＴＥＮマウスモデル
８〜１０週齢の雄マウスに、生理食塩水に懸濁した原因薬物（ＬＴＧ、アロプリノール、オクスカルバゼピン）、または生理食塩水のいずれかを強制経口投与した。投与量は、示されている動物の体重のｍｇ／ｋｇに基づくものとした（例えば、ＬＴＧ  ５０ｍｇ  ｋｇ−１体重）。皮膚、眼および粘膜、生存率、体重、身体的および肉眼的外観（特に眼、粘膜および皮膚に対して）を連日監視した。
【０２０８】
組織学的分析および免疫染色
ペントバルビタールにより動物を深く麻酔し、２０ｍｌの０．１Ｍ冷ＰＢＳ（ｐＨ７．４）に続いて２５ｍｌの冷４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を経心臓的に灌流した。足の皮膚、眼瞼、脾臓、リンパ節を切除し、４％ＰＦＡ中で２時間超かけて後固定し、２０％に続いて３０％スクロース溶液中で４°Ｃで各２４時間凍結保護した。組織試料を最適切断温度（ＯＣＴ）で包埋し、凍結してから２０μｍ切片に連続的に切断し、スライド上に置いた。製造業者の指示（ＶｉｔｒｏＶｉｅｗ（商標）Ｈ＆Ｅ染色キット）に従って、標準手順を使用してヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行った。アポトーシス細胞の量を定量するために、Ａｐｏ‐ＢｒｄＵ  ＤＮＡ断片化アッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）のプロトコルに従って、核酸の末端を標識することによってアポトーシス細胞から生じるＤＮＡ断片化を検出する方法である末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイを行った。組織内の全細胞数を推定するために、ヨウ化プロピジウムにより核を残らず染色した。倍率２００倍の共焦点蛍光顕微鏡下で（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ  ７００）デジタル写真を撮影した。ＴＵＮＥＬ陽性核の数を計数し、皮膚の表皮層で観察された総核の数に対する割合として報告した。
【０２０９】
グランザイムＢ免疫染色のために、スライドを０．３％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ＰＢＳ溶液で洗浄し、ブロッキング溶液（１０％正常ヤギ血清）中で１時間インキュベートし、次いで、ブロッキング溶液中、抗マウスグランザイムＢビオチン（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローン１６Ｇ６）の１：５００希釈液とともに室温で３０分間インキュベートし、企業のマニュアルとしてＡＢＣキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＴＭＢ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して発色させた。
【０２１０】
免疫蛍光染色のために、スライドを洗浄し、１０％正常ヤギ血清でブロックし、次いで、ブロッキング溶液で希釈した以下の一次抗体、すなわち、ニワトリ抗ＧＦＰ（１：５００、Ａｖｅｓ  Ｌａｂｓ）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４ハムスター抗マウスＣＤ１１ｃ（１：５００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、クローンＮ４１８）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ６４７ラット抗マウスＣＤ３（１：５００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、１７Ａ２）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４抗マウスＣＤ８ａ（１：５００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、５３−６．７）とともに４°Ｃで一晩インキュベートした。０．３％Ｔｒｉｔｏｎ溶液でスライドを洗浄した。ＧＦＰ染色のために、続いて、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ４８８ヤギ抗ニワトリＩｇＹ（１：１０００  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中でスライドを室温で２時間インキュベートした。次いで、スライドをＰＢＳで洗浄してから、イメージング用の退色防止溶液により封入した。
【０２１１】
マウスＴＮＦ−αおよびグランザイムＢの測定
連日の薬物投与後９日目に、ＳＪＳ／ＴＥＮモデルマウスの足の皮膚を採取した。組織を秤量し、Ｂｉｏ−Ｇｅｎ  Ｐｒｏ２００ホモジナイザー（Ｐｒｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を含有する冷ＰＢＳ中でホモジナイズした。次いで、ホモジネートを１０，０００ｇ、４°Ｃで１０分間遠心分離した。上清を使用して、Ｄｕｏｓｅｔ（登録商標）ＥＬＩＳＡ開発システムキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用してＴＮＦ−αの値とグランザイムＢの値とを測定した。各試料を最小３連ウェルでアッセイし、ｐｇ  ｍｌ−１  ｍｇ−１組織としてサイトカイン濃度を報告した。
【０２１２】
ＧＦＰ＋細胞の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
Ｍｒｇｐｒａ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウス由来のＧＦＰ＋細胞を特性評価するために、それらの脾臓およびリンパ節を小片に切断し、１ｍｇ  ｍｌ−１コラゲナーゼＤ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および３０μｇ  ｍｌ−１  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中で３７°Ｃで３０分間消化した。次いで、消化した組織を７０μｍメッシュのナイロン細胞濾過器（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）を通して濾過して、単一細胞懸濁液を生成した。脾細胞懸濁液中の汚染赤血球を、室温で５分間、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）中で溶解した。残りの細胞をＰＢＳで２回洗浄し、氷上で３０分間、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ａｑｕａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）により染色した。次いで、細胞を洗浄し、ＦＡＣＳ染色緩衝液（２％加熱不活性化ＦＢＳを含む１倍ＰＢＳ）に再懸濁し、抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２  Ｆｃ  Ｂｌｏｃｋ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により非特異的結合を１０分間ブロックした後、ＣＤ４（クローンＲＭ４−５）、ＣＤ８ａ（５３−６．７）、ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、ＣＤ４５（３０−Ｆ１１）、ＣＤ３１７（９２７）、ＣＤ３７０（ＤＮＧＲ１、７Ｈ１１）、Ｆ４／８０（ＢＭ８）、Ｉ−Ａ／Ｉ−Ｅ（Ｍ５／１１４．１５．２）、Ｌｙ６Ｃ（ＨＫ１．４）、Ｌｙ６Ｇ（１Ａ８）、ＸＣＲ１（ＺＥＴ、いずれもＢｉｏｌｅｇｅｎｄ製）、ＣＤ３（１４５−２Ｃ１１）およびＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を認識する抗体を含む蛍光色素コンジュゲート表面マーカー染色抗体の可変パネルとともに氷上で３０分間インキュベートした。次いで、染色された試料をいずれも染色緩衝液で２回洗浄し、ＬＳＲ−ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で細胞の取得を行った。あらゆるフローサイトメトリーデータを分析し、図１１Ａ〜図１１Ｃに示すようにゲーティングし、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ，ＬＬＣ）を用いてプロットした。Ｍｒｇｐｒａ１＋／＋野生型（ＧＦＰなし）マウス由来の脾細胞およびリンパ節細胞を使用して、ＧＦＰ陰性領域のゲートを設定した。必要に応じて、「蛍光マイナス１」対照を他の表面染色に使用した。
【０２１３】
ＲＮＡ調製およびカルシウムイメージングのためのマウス免疫細胞選別
ＣＤ１１ｃおよびＭＨＣ−ＩＩ発現に基づいて脾細胞の様々な細胞タイプを選別するために、マウス脾細胞の単一細胞懸濁液を上記のように調製した。次いで、製造業者のプロトコルによって示唆されているように、いくつかの改変を加えて、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＣＤ１１ｃ  Ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎキット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＣＤ１１ｃ＋細胞を濃縮した。要約すると、マウスＦｃＲブロッカーにより非特異的結合について細胞懸濁液をブロックし、次いでＣＤ１１ｃに対するフィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗体により染色し、続いてＰＥおよび磁気ナノ粒子を認識した四量体抗体複合体とともにインキュベートした。次いで、免疫磁気分離からＰＥ標識細胞を一度回収した。反復磁気分離を行わずに、ＡＰＣ−Ｃｙ７コンジュゲート抗マウスＩ−Ａ／Ｉ−Ｅ（クローンＭ５／１１４．１５．２）抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）により、濃縮されたＣＤ１１ｃ＋細胞を染色した。ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを用いるＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩｕソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）上で、図１２に示すようなＣＤ１１ｃおよびＭＨＣ−ＩＩの発現に基づいて、細胞集団をゲーティングおよび選別した。次いで、Ｍｒｇｐｒａ１発現を確認するためのＲＮＡ単離、またはカルシウムイメージング（ＨＥＫ細胞について記載されているように）のいずれかのために、選別された細胞を直ちに使用した。
【０２１４】
ＲＮＡ単離および定量的ＲＴ−ＰＣＲ
様々な臓器から得られたマウス組織試料をホモジナイズし、製造業者のマニュアルに従って、ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＲＮｅａｓｙ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔのいずれかを用いてそれらのＲＮＡを抽出した。ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、単離されたマウス細胞または培養ヒト樹状細胞からＲＮＡを抽出した。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）汚染を最小限に抑えるために、ｇＤＮＡ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｏｒカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを精製し、カラム上でＤＮａｓｅ  Ｉにより１５分間処理した。製造業者の指示に従って、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、ｏｉｌｇｏ−ｄＴおよびランダムプライマーにより、組織から得られた５００ナノグラムの全ＲＮＡ、または細胞から得られた３０ナノグラムの全ＲＮＡを相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写した。ｇＤＮＡの汚染を確認するために、逆転写酵素を使用しない陰性対照反応を行った。次いで、０．５ＬのＴａｑｍａｎ特異的プライマー／プローブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ；Ｍｒｇｐｒａ１用のＭｍ０１７０３２６１；Ａｃｔｂ用のＭｍ０４３９４０３６；ＭＲＧＰＲＸ４用のｈｓ００６０７７７９；ＡＣＴＢ用のＨｓ０１０６０６６５）、７．５ＬのＴａｑｍａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）および５ＬのＤＥＰＣ処理水を用いて、２ＬのＤＮＡから定量的ＰＣＲアッセイを行った。ＰＣＲ反応は、以下の熱プロファイル、すなわち、５０°Ｃで２分間、９５°Ｃで１０分間、次いで、４５サイクルの９５°Ｃ（１５秒）に続いて６０°Ｃ（１分）により行った。２％アガロースゲル電気泳動によりＰＣＲ産物を視覚化した。
【０２１５】
ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞のインビボ枯渇
ＣＤ４／ＣＤ８  Ｔリンパ球のインビボ枯渇に、マウスＣＤ４（ＢｉｏＸＣｅｌｌ、クローンＧＫ１．５）およびＣＤ８（ＢｉｏＸＣｅｌｌ、クローン２．４３）に対するラットモノクローナル抗体を使用した。−２、０および３日目に、雄の野生型１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪマウスに、２００μｇのＣＤ４またはＣＤ８抗体を腹腔内注射した。同様のプロトコルにより、ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照抗体（ＢｉｏＸＣｅｌｌ）を用いて対照群を処置した。全マウスに、０日目から１日１回、ＬＴＧ（５０ｍｇ  ｋｇ−１体重）を強制経口投与した。７日目に、脾臓および末梢血のフローサイトメトリー分析により、枯渇の効果を評価した。この枯渇スキームにより、それぞれ、ＣＤ４枯渇マウスの脾臓および末梢血のＣＤ４＋細胞が約９８．４％および８９．９％減少したのに対し、ＣＤ８枯渇マウスの脾臓および末梢血のＣＤ８＋細胞が９９．１％および９７．６％減少した（図１０）。
【０２１６】
樹状細胞の養子移入
ナイーブな１２９Ｓ１  ＷＴマウスまたはＭｒｇｐｒａ１−／−マウスから得られた脾臓を無菌的に除去し、製造業者のマニュアルに従って、マウスＰａｎ樹状細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いてＤＣを単離した。要約すると、上記のようにコラゲナーゼＤ／ＤＮａｓｅ  Ｉ消化によって、脾臓由来の単一細胞懸濁液を生成した。次いで、非樹状細胞に対するビオチンコンジュゲート抗体のカクテル、続いて抗ビオチン磁気マイクロビーズを細胞懸濁液に加えた。ＬＳカラムを使用して、ビーズ標識非樹状細胞から樹状細胞を分離した。ＬＴＧ（５０ｍｇ／ｋｇ−１体重）の連日投与を開始する前日に、ナイーブな雄のＭｒｇｐｒａ１ノックアウトマウスに、２００μｌのハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁した、ＷＴマウスまたはＫＯマウスから新たに単離した樹状細胞を静脈内（尾静脈）注射した（２ｘ１０６細胞／マウス）。
【０２１７】
ヒト末梢血樹状細胞の培養
Ｌｏｎｚａ（ｃｃ−２７０１）およびＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（７００４１）から、４例の異なるドナー由来のヒト末梢血樹状細胞を購入した。未成熟樹状細胞として細胞を維持するために、細胞を解凍し、加湿した３７°Ｃ  ５％ＣＯ２インキュベーター内で、１０％ＦＢＳ、５０ｎｇ  ｍｌ−１のＩＬ−４および５０ｎｇ  ｍｌ−１のＧＭ−ＣＳＦを補充したＲＰＭＩ１６４０培地中で培養した。これらの樹状細胞に関する実験はいずれも、細胞が死滅する前の７日以内に完了した。
【０２１８】
ヒトＤＣのｓｉＲＮＡトランスフェクション
ＭＲＧＰＲＸ４に対するＯＮ−ＴＡＲＧＥＴ＋ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、樹状細胞でのＭＲＧＰＲＸ４の発現をダウンレギュレートした。培養開始後３日目に、ヒト樹状細胞を培地で洗浄し、回収し、室温で１０分間２００ｇで遠心分離した。次いで、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）溶液に細胞を再懸濁し、ヒト樹状細胞Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（登録商標）キットのプロトコルに従ってＮｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ（商標）２ｂデバイス（Ｌｏｎｚａ）を使用して、ＭＲＧＰＲＸ４  ｓｉＲＮＡまたは非標的化対照ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクション後、５００μｌの添加培養培地を試料に静かに加え、４８時間インキュベートする。次いで、カルシウムイメージングおよび内在化アッセイに細胞を使用した。
【０２１９】
ヒトＤＣの内在化
カバースリップにヒト樹状細胞を播種し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地中で５日間培養した。４〜６時間の血清飢餓の後、培地、色素のみ、非コンジュゲートＬＴＧまたはＴｅｘａｓ  ＲｅｄコンジュゲートＬＴＧ（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄは、上述のようにＬＴＧにコンジュゲートした）を用いて、３７°Ｃの暗所で細胞を１５分間処理した。ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドにより細胞を固定し、ＰＢＳで洗浄した。次いで、固定した細胞をブロッキング溶液（１０％正常ヤギ血清）中で一時間ブロックしてから、ウサギ抗ＭＲＧＰＲＸ４（１０ｕｇ  ｍｌ−１、Ａｂｃａｍ、ａｂ１８８７４０）中で４°Ｃで一晩インキュベートした。続いて、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ溶液で細胞を洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ４８４コンジュゲートヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で室温で２時間インキュベートした。カバースリップをＰＢＳで洗浄し、ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含む退色防止封入剤により封入した。
【０２２０】
患者および試料
本試験は、国立台湾大学病院（ＮＴＵＨ−ＲＥＣ番号：２０１５１２１３３４ＲＩＮＣ）の研究倫理委員会によって承認され、ヘルシンキ宣言の原則に従って実施された。黄斑丘疹性発疹（ＭＰＥ）、好酸球増加と全身症状を伴う薬物反応（ＤＲＥＳＳ）、およびスティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）を含む、ラモトリギンに対する重篤な有害皮膚反応（ｃＡＤＲ）の症例は、皮膚科専門医によって評価および診断された。ラモトリギン耐性の症例は、２カ月超のラモトリギンの使用歴のある神経科クリニックから募集したが、関連する皮膚有害反応は報告されなかった。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は、前述のように末梢血から分離した（２５）。血液試料を同量のＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ溶液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）と混合し、６００ｇで４０分間さらに遠心分離した。−８０℃でＰＢＭＣを保存した。
【０２２１】
逆転写およびＭＲＧＰＲＸ４配列決定
Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ヒトＰＢＭＣ由来の全ＲＮＡを抽出した。ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  ＲＴ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ１６９１）を使用してＲＮＡの逆転写を行った。ＭＲＧＰＲＸ４順方向プライマー５’−ＣＡＧＡＧＡＴＧＡＴＡＣＡＧＣＴＧＧＴＧ−３’（配列番号１）およびＭＲＧＰＲＸ４逆方向プライマー５’−ＧＡＣＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＴＣＴＧＡＣＧ−３’（配列番号２）を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件：９４°Ｃで３分、および９４°Ｃで３０秒の３０サイクル、５２°Ｃで３０秒、ならびに７２°Ｃで３０秒。順方向プライマーおよび逆方向プライマーの両方を用いて配列決定を行った。
【０２２２】
実施例２：薬物有害反応（ＡＤＲ）に関与するＧタンパク質共役受容体としてのＭＲＧＰＲＸ４の同定
本明細書に記載されるように、薬物誘発アナフィラキシー様反応（図１Ａ）に不可欠な肥満細胞特異的受容体Ｍｒｇｐｒｂ２／ＭＲＧＰＲＸ２（ＭＡＳ関連Ｇタンパク質共役受容体（Ｍｒｇｐｒ）サブファミリーのメンバー）が先に同定された（参照により本明細書に組み込まれる（１０））。Ｍｒｇｐｒがスティーブンス・ジョンソン症候群（ＳＪＳ）などの他の種類のＡＤＲに関与しているかどうかを決定するために、ＨＥＫ２９３細胞に個々に発現したＭｒｇｐｒに対して、ＳＪＳを引き起こす薬物であるラモトリギンをスクリーニングした。Ｃａ２＋イメージングアッセイを使用して、マウスＭｒｇｐｒａ１およびヒトＭＲＧＰＲＸ４のみが、ラモトリギン（ＬＴＧ）およびオクスカルバゼピンなどのいくつかのＳＪＳ関連薬物によって特異的に活性化されることを決定した。ヒトＭＲＧＰＲＸ４に対するＬＴＧのＥＣ５０は約２００μＭであり、これは臨床で使用される用量範囲内である（１１、１２）。マウスＭｒｇｐｒＡ１に対するＬＴＧのＥＣ５０は約３０μＭである。
【０２２３】
リガンドと受容体との物理的相互作用を評価するために、ＭＲＧＰＲＸ４を発現するＨＥＫ２９３細胞膜をカラムに固定し、カラムを介したＬＴＧの溶出をモニターする細胞膜クロマトグラフィー（ＣＭＣ）実験を行った。このアフィニティークロマトグラフィー技術を使用して、ＬＴＧは、ＭＲＧＰＲＸ２／ＣＭＣカラムでは保持することができないのに対して（図１Ｂ）、４１７±２４ｎＭ（ＦＩＧ１Ｂ〜Ｄ）の結合ＫｄでＭＲＧＰＲＸ４／ＣＭＣカラムに保持することができることが決定された。次いで、ほとんどのＧＰＣＲはリガンド‐受容体相互作用に続いて細胞表面から細胞内区画に内在化されるため（１３）、この薬物がＭｒｇｐｒａ１およびＭＲＧＰＲＸ４の内在化を誘導することができるかどうかを決定した。この問題を評価するために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とＭｒｇｐｒａ１またはＭＲＧＰＲＸ４受容体のいずれかの融合タンパク質を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞を使用し、ＬＴＧとＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ蛍光色素とをコンジュゲートさせた。ＬＴＧによって細胞を刺激すると、Ｍｒｇｐｒａ１−ＧＦＰおよびＭＲＧＰＲＸ４−ＧＦＰ受容体の内在化を誘導することができるが、受容体はアゴニストを伴わずほとんど細胞膜上に残った（図１Ｅ）。Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識ＬＴＧを使用すると、ＧＦＰ標識受容体とともに細胞への薬物の取り込みが観察された（図１Ｅ）。ＬＴＧは、Ｍｒｇｐｒｃ１１−ＧＦＰの内在化を誘導せず、この受容体を発現する細胞に吸収されなかった（データは示していない）。まとめると、これらは、ＬＴＧがＭｒｇｐｒａ１およびＭＲＧＰＲＸ４に特異的に結合し、活性化し得ることを強く示唆した。
【０２２４】
実施例３：ＭＲＧＰＲＸ４を介した薬物有害反応のマウスモデルの作製
ＳＪＳを引き起こす薬物であるラモトリギンにＭｒｇｐｒａ１が結合することができることを知り、そのインビボでの役割を検討した。ＳＪＳ／ＴＥＮのマウスモデルを開発するために、野生型（ＷＴ）１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪマウスに５０ｍｇ  ｋｇ−１体重の用量でＬＴＧを連日強制経口投与した。このＬＴＧの用量は臨床で推奨されている量よりも高かったが、ヒトが発症したＳＪＳではＬＴＧの過剰投与範囲内であった（１４）。薬物治療の７〜１０日後、ほぼすべてのマウスでは体重が減少し、眼の粘膜分泌物および足の水疱出血を含むＳＪＳ／ＴＥＮ様症状が示され、１４日目までの死亡率は６０％であった（図２Ｂ、図６Ａ、図６Ｂ）。この表現型の発現は、抗原曝露後数日から数週間を要するヒト患者の薬物誘発性過敏症に似ている（１５）。高用量のオクスカルバゼピンおよびアロプリノールを含む他のＳＪＳ原因薬物も、この系統のマウスに対して、比較的低い発生率で、足の異常を伴わず、眼症状を誘発することができる（図５）。特に、高用量ＬＴＧの連日の経口投与は１２９Ｓ１およびＢＡＬＢ／ｃ系統（図８）に対してのみＳＪＳ様の特徴を誘発することができることが分かったが、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは耐性であるようである。これは、この薬物に反応したマウス系統のかなりの変動を示唆する。このため、１２９Ｓ１／ＳｖｌｍＪバックグラウンド上でＭｒｇｐｒａ１のオープンリーディングフレームがＧＦＰに置換されたＭｒｇｐｒａ１ノックアウトマウス（Ｍｒｇｐｒａ１ＧＦＰ／ＧＦＰ、ＫＯマウス）を作製した（図２Ａ）。同じＬＴＧ処置に曝露すると、Ｍｒｇｐｒａ１ヘテロ接合マウス（Ｍｒｇｐｒａ１ＧＦＰ／＋、ＨＥＴマウス）はＷＴマウスと同様の表現型を発現したが、ＭｒｇｐｒＡ１  ＫＯマウスには死亡も体重減少も見られず、ＳＪＳ様症状を発現しなかった（図２Ｃ、Ｄおよび図６Ａ、図６Ｂ）。結膜および後足切片の組織学的染色により、ＬＴＧ処置ＫＯマウスまたは生理食塩水処置対照動物ではなく、ＬＴＧ処置ＷＴおよびＨＥＴマウスの組織のみの明らかな表皮壊死および炎症細胞浸潤が明らかにされた（図２Ｃ、図２Ｄ）。
【０２２５】
実施例４：ＳＪＳマウスモデルに対する病態生理の検討
ＳＪＳ／ＴＥＮ患者の組織病理学的検査では、表皮に広範囲なケラチノサイトアポトーシスが示される（１６、１７）。この病態生理は、いくつかのサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−６など）の上昇とともに、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞から放出される細胞傷害性分子（例えば、グランザイムＢ、グラニュリシン、Ｆａｓリガンド）によって媒介されることが提案されている（１７〜２１）。次いで、本明細書に記載のマウスモデルに対して、これらの特性を検討した。ヒトＳＪＳ患者と一致して、ＬＴＧを強制経口投与したＭｒｇｐｒａ１  ＷＴおよびＨＥＴマウスの皮膚では、上皮アポトーシス細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞の数が有意に増加するとともに、グランザイムＢおよびＴＮＦ−αの上昇が認められた（図２Ｃ、図２Ｄ、図２Ｅ、図２Ｆ、図６Ｄ、図６Ｅおよび図６Ｆ）。ただし、Ｍｒｇｐｒａ１  ＫＯマウスは、薬物曝露後に細胞毒性の徴候を示さない。ＣＤ８＋Ｔ細胞とそのメディエーターとが、本明細書に記載のマウスモデルのＳＪＳ様表現型の発現に必要であるかどうかを確認するために、Ｒａｇ１−／−マウス（機能性ＴおよびＢリンパ球を含有しない）およびＣＤ８枯渇動物（抗体枯渇を介して枯渇させている）を利用した。ＬＴＧに曝露した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞の数がゼロであるか少ないこれらのマウスでは、表現型は発現しなかった（図７、図８）。これらのデータはいずれも、１）本明細書に記載の動物モデルでは、ＣＤ８＋Ｔ細胞がＳＪＳの発症に必要であり、２）Ｍｒｇｐｒａ１がこの免疫応答を開始するために不可欠であり得ることを示唆している。
【０２２６】
実施例５：ＭＲＧＰＲＡ１の樹状細胞発現
ＳＪＳの発症に果たすＭｒｇｐｒａ１の役割を示唆するデータを用いて、この受容体の発現部位を決定した。逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）では、Ｍｒｇｐｒａ１がリンパ節および脾臓に主に発現したことが示された（図３Ａ）。次いで、Ｍｒｇｐｒａ１遺伝子をＧＦＰ（Ｍｒｇｐｒａ１ＧＦＰ／ＧＦＰ）に置換することによって作製されたＭｒｇｐｒａ１  ＫＯマウスをレポーターマウスとして使用して、Ｍｒｇｐｒａ１発現細胞を同定した。Ｍｒｇｐｒａ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウスから得られた脾細胞およびリンパ節細胞のフローサイトメトリー分析では、小さな顕著なＧＦＰ＋集団の存在が明らかにされた（図３Ｂおよび図９Ａ）。その後の特性評価では、ＧＦＰ＋細胞が、従来の樹状細胞マーカー（インテグリンＣＤ１１ｃおよびクラスＩＩ主要組織適合抗原（ＭＨＣ−ＩＩ）の両方の高発現）を伴うが、他の細胞タイプのマーカーは伴わない造血細胞（ＣＤ４５＋）の特徴を示したことが示された（図３Ｂおよび図９Ｂ）。これらのマウスから得られた脾臓組織切片の免疫染色では、不規則な形状および樹状突起様のＧＦＰ＋細胞がＣＤ１１ｃ＋とともに同定されたが、ＣＤ３＋（Ｔ細胞のマーカー）は同定されなかった（図９Ｃ）。Ｍｒｇｐｒａ１が樹状細胞で発現および機能することをさらに検証するために、ＣＤ１１ｃおよびＭＨＣ−ＩＩ：ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈ（主に樹状細胞）、ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩｉｎｔ（主にマクロファージ）、ＣＤ１１ｃ−ＭＨＣ−ＩＩ＋（主にＢ細胞）およびＣＤ１１ｃ−ＭＨＣ−ＩＩ−（主にＴ細胞）の発現に基づいて、Ｍｒｇｐｒａ１＋／＋およびＭｒｇｐｒａ１ＧＦＰ／ＧＦＰマウスから得られた脾細胞を４つの集団に分類した（図１０に示すゲーティング戦略）。ＲＴ−ＰＣＲ分析により、ＷＴ動物のＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈ集団でのみＭｒｇｐｒａ１の発現が決定された（図３Ｃ）。Ｍｒｇｐｒａ１ＧＦＰ／ＧＦＰノックアウトマウスから得られたＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈ細胞にはＭｒｇｐｒａ１は存在しない。機能的には、ＷＴ  ＣＤ１１ｃ＋ＭＨＣ−ＩＩｈｉｇｈ細胞のサブセット（約５％）のみがＣａ２＋イメージングアッセイを使用してＬＴＧに応答し、このＬＴＧ誘導活性化はＫＯ細胞で有意に減少した（図３Ｄ、図３Ｅ）。これらデータはいずれも、Ｍｒｇｐｒａ１が樹状細胞のサブセットで特異的に発現し、他の免疫細胞では発現しないことを示唆している。続いて、これらのＭｒｇｐｒａ１発現樹状細胞がインビボでの薬物誘発ＳＪＳ／ＴＥＮ症状の発現に必要であるかどうかを検討するために、Ｍｒｇｐｒａ１＋／＋マウスから得られた樹状細胞を単離し、Ｍｒｇｐｒａ１  ＫＯ動物に養子移入した。薬物曝露の７〜１０日後、ＷＴ樹状細胞を受け取ったＭｒｇｐｒａ１  ＫＯ動物では体重が減少し、その６４％がＳＪＳ様の眼症状を発現したが、ＫＯ樹状細胞を受け取った対照動物では体重減少も表現型も観察されなかった（図３Ｆおよび図１１）。ただし、ＷＴ樹状細胞を注射した動物に見られたこれらの表現型は３〜４日しか続かず、１２日目以降は消失した。これは、樹状細胞の活性化およびリンパ球との相互作用後の樹状細胞の寿命が短いためと考えられる（２２）。これらの観察結果は、樹状細胞でのＭｒ���ｐｒａ１の同定と、ＳＪＳ／ＴＥＮの病因の誘発および維持に果たすその役割とを強く裏付けている。
【０２２７】
実施例６：ＳＪＳに果たすヒトＭＲＧＰＲＸ４の役割
本明細書に記載のＣａ２＋イメージングデータによれば、ヒトＭＲＧＰＲＸ４は、マウスＭｒｇｐｒａ１と同様のＳＪＳ原因薬物に応答した（図３Ｃ）。このため、ＭＲＧＰＲＸ４がヒトのＳＪＳ／ＴＥＮの発症に関与している可能性を検討した。最初に、ヒトＣＤ１１ｃ＋樹状細胞では、ＲＴ−ＰＣＲによるＭＲＧＰＲＸ４転写物および免疫染色によるＭＲＧＰＲＸ４タンパク質がともに検出された（図４Ａおよび図１２）。次に、ＬＴＧはＭＲＧＰＲＸ４依存的にヒト樹状細胞を活性化することができる。Ｃａ２＋イメージング試験では、マウス樹状細胞と同様に、約５％のヒト樹状細胞がＬＴＧによって活性化された（図４Ｂ、図４Ｃ）。短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いたＭＲＧＰＲＸ４ノックダウン樹状細胞では、ＬＴＧに応答した活性化細胞数が有意に少ないことが示された（図４Ｃ）。また、ＭＲＧＰＲＸ４発現樹状細胞のみが、それらの細胞質区画にＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ標識ＬＴＧを内在化することができた（図４Ｄ）。ｃＡＤＲの発生率に関連するＭＲＧＰＲＸ４遺伝子の変異を同定した。ＬＴＧに対するｃＡＤＲを有する患者６例と耐性症例２８例とを試験に登録した。ｃＡＤＲには、ＳＪＳ、ＤＲＥＳＳおよびＭＰＥが含まれる。大部分のＬＴＧ耐性症例は、ＭＲＧＰＲＸ４の４９５番目のヌクレオチド（受託番号＿０５４０３２．３、ｒｓ２４６８７７４、４９５位）でヘテロ接合Ｇ／Ｔ対立遺伝子を示した。タンパク質レベルでｐ．Ａｓｎ２５Ｌｙｓのミスセンス変異体につながる同じ遺伝子座でホモ接合Ｇ／Ｇ対立遺伝子の有意に高い有病率があった。２８例の耐性患者のうち２例（７．１％）がホモ接合Ｇ／Ｇ対立遺伝子を有し、６例のｃＡＤＲ患者のうち３例がホモ接合対立遺伝子を有した（５０％）（図４Ｅ）。まとめると、これらの結果は、ＭＲＧＰＲＸ４がＭｒｇｐｒａ１のヒトホモログであり、ヒトのＳＪＳを媒介することを示唆している。
【０２２８】
特定の薬物がどのようにして薬物特異的Ｔ細胞による細胞毒性を引き起こすことができるのか、長い間謎とされてきた。本明細書に記載される発見は、これらの薬物が、Ｔ細胞活性化のための抗原の捕捉、処理および提示に特化した最も効率的な抗原提示細胞である樹状細胞上のＭＲＧＰＲＸ４／Ｍｒｇｐｒａ１受容体と相互作用することができることを示す最初の例である（２３）。ただし、Ｔ細胞への抗原提示をもたらすために樹状細胞内で内在化された薬物が結果的にどのように処理されるかに関する機構は、さらに検討を必要とする。ＭＲＧＰＲＸ４受容体と反応する可能性のある薬物のスクリーニング、受容体アンタゴニストのスクリーニング、および薬物摂取前の患者のＭＲＧＰＲＸ４変異のスクリーニングは、ｃＡＤＲのリスクを軽減するのに有益であり得る。
【０２２９】
実施例１〜６の参考文献を以下に列挙する
１  Ｚａｌｅｗｓｋａ−Ｊａｎｏｗｓｋａ，Ａ．，Ｓｐｉｅｗａｋ，Ｒ．＆Ｋｏｗａｌｓｋｉ，Ｍ．Ｌ．Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  ３７，１６５−１８１，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉａｃ．２０１６．０８．００６（２０１７）．
２  Ｓｕｌｔａｎａ，Ｊ．，Ｃｕｔｒｏｎｅｏ，Ｐ．＆Ｔｒｉｆｉｒｏ，Ｇ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ  ４，Ｓ７３−７７，ｄｏｉ：１０．４１０３／０９７６−５００Ｘ．１２０９５７（２０１３）．
３  Ｄｏｗｎｅｙ，Ａ．，Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｃ．，Ｈａｒｕｎ，Ｎ．＆Ｃｏｏｐｅｒ，Ａ．Ｔｏｘｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｃｒｏｌｙｓｉｓ：ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ．Ｊ  Ａｍ  Ａｃａｄ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ６６，９９５−１００３，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊａａｄ．２０１１．０９．０２９（２０１２）．
４  Ｌｅｅ，Ｈ．Ｙ．＆Ｃｈｕｎｇ，Ｗ．Ｈ．Ｔｏｘｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｃｒｏｌｙｓｉｓ：ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ｉｎ  ｒｅｖｉｅｗ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３，３３０−３３６，ｄｏｉ：１０．１０９７／ＡＣＩ．０ｂ０１３ｅ３２８３６３０ｃｃ２（２０１３）．
５  Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ａ．Ｍ．＆Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｆ．Ｃ．Ａ  ｎｅｗ  ｅｒｕｐｔｉｖｅ  ｆｅｖｅｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｏｐｈｔｈａｌｍｉａ：Ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｃａｓｅｓ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ  ２４，５２６−５３３（１９２２）．
６  Ｈｅｎｇ，Ｙ．Ｋ．，Ｌｅｅ，Ｈ．Ｙ．＆Ｒｏｕｊｅａｕ，Ｊ．Ｃ．Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｃｒｏｌｙｓｉｓ：６０  ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｅｒｒｏｒｓ  ａｎｄ  ａｄｖａｎｃｅｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １７３，１２５０−１２５４，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｂｊｄ．１３９８９（２０１５）．
７  Ｓｃｈｏｔｌａｎｄ，Ｐ．，Ｂｏｊｕｎｇａ，Ｎ．，Ｚｉｅｎ，Ａ．，Ｔｒａｍｅ，Ｍ．Ｎ．＆Ｌｅｓｋｏ，Ｌ．Ｊ．Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｄｒｕｇ  ｓａｆｅｔｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ９４，８４−９２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｅｊｐｓ．２０１６．０６．００９（２０１６）．
８  Ａｄａｍ，Ｊ．，Ｐｉｃｈｌｅｒ，Ｗ．Ｊ．＆Ｙｅｒｌｙ，Ｄ．Ｄｅｌａｙｅｄ  ｄｒｕｇ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ：ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７１，７０１−７０７，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２１２５．２０１０．０３７６４．ｘ（２０１１）．
９  Ｃｈｕｎｇ，Ｗ．Ｈ．，Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｗ．＆Ｄａｏ，Ｒ．Ｌ．Ｓｅｖｅｒｅ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  ４３，７５８−７６６，ｄｏｉ：１０．１１１１／１３４６−８１３８．１３４３０（２０１６）．
１０  ＭｃＮｅｉｌ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｓｔ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｓｅｕｄｏ−ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１９，２３７−２４１，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４０２２（２０１５）．
１１  Ｂｉｔｏｎ，Ｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｌａｍｏｔｒｉｇｉｎｅ  ｉｎ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  ２，１００９−１０１８，ｄｏｉ：１０．１５１７／１７４２５２５５．２．６．１００９（２００６）．
１２  Ｋｈａｎｎａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２０１２  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｇｏｕｔ．Ｐａｒｔ  １：ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｎｏｎｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｈｙｐｅｒｕｒｉｃｅｍｉａ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｃａｒｅ  Ｒｅｓ（Ｈｏｂｏｋｅｎ）６４，１４３１−１４４６，ｄｏｉ：１０．１００２／ａｃｒ．２１７７２（２０１２）．
１３  Ｐａｖｌｏｓ，Ｎ．Ｊ．＆Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｐ．Ａ．ＧＰＣＲ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｌｏｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔ  ｏｆ  Ｉｔ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２８，２１３−２２６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｔｅｍ．２０１６．１０．００７（２０１７）．
１４  Ａｌａｂｉ，Ａ．，Ｔｏｄｄ，Ａ．，Ｈｕｓｂａｎｄ，Ａ．＆Ｒｅｉｌｌｙ，Ｊ．Ｓａｆｅｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｏｆ  ｌａｍｏｔｒｉｇｉｎｅ  ｉｎ  ｏｖｅｒｄｏｓｅ．Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６，３６９−３８１，ｄｏｉ：１０．１１７７／２０４５１２５３１６６５６７０７（２０１６）．
１５  Ｐｉｃｈｌｅｒ，Ｗ．Ｊ．Ｄｅｌａｙｅｄ  ｄｒｕｇ  ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １３９，６８３−６９３（２００３）．
１６  Ｐａｕｌ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｓ  ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｃｒｏｌｙｓｉｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １３４，７１０−７１４（１９９６）．
１７  Ｃｈｕｎｇ，Ｗ．Ｈ．＆Ｈｕｎｇ，Ｓ．Ｉ．Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ．Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｃｉ  ６６，１９０−１９６，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｊｄｅｒｍｓｃｉ．２０１２．０４．００２（２０１２）．
１８  Ｐｏｓａｄａｓ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｌａｙｅｄ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｄｒｕｇｓ  ｓｈｏｗ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｐｅｒｆｏｒｉｎ，ｇｒａｎｚｙｍｅ  Ｂ，ａｎｄ  Ｆａｓ−Ｌ  ｔｏ  ｂｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｅｖｅｒｉｔｙ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０９，１５５−１６１（２００２）．
１９  Ｎａｓｓｉｆ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｃｒｏｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １２３，８５０−８５５，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．００２２−２０２Ｘ．２００４．２３４３９．ｘ（２００４）．
２０  Ｃａｐｒｏｎｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｏｆ  ｅｒｙｔｈｅｍａ  ｍｕｌｔｉｆｏｒｍｅ  ａｎｄ  Ｓｔｅｖｅｎｓ−Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ／ｔｏｘｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｃｒｏｌｙｓｉｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １５５，７２２−７２８，ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊ．１３６５−２１３３．２００６．０７３９８．ｘ（２００６）．
２１  Ｖｉａｒｄ−Ｌｅｖｅｕｇｌｅ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．ＴＮＦ−ａｌｐｈａ  ａｎｄ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  ａｒｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｉｎｄｕｃｅｒｓ  ｏｆ  Ｆａｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｉｎ  ｔｏｘｉｃ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｎｅｃｒｏｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  １３３，４８９−４９８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｊｉｄ．２０１２．３３０（２０１３）．
２２  Ｃｈｅｎ，Ｍ．，Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｓｈａｂｉｅｒ，Ｚ．＆Ｗａｎｇ，Ｊ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｆｅｓｐａｎ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｅｔｓ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４４，２５５８−２５６５，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２００６．１２．０２０（２００７）．
２３  Ｇｕｅｒｍｏｎｐｒｅｚ，Ｐ．，Ｖａｌｌａｄｅａｕ，Ｊ．，Ｚｉｔｖｏｇｅｌ，Ｌ．，Ｔｈｅｒｙ，Ｃ．＆Ａｍｉｇｏｒｅｎａ，Ｓ．Ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０，６２１−６６７，ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ．ｉｍｍｕｎｏｌ．２０．１００３０１．０６４８２８（２００２）．
２４  Ｈａｎ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｒｐｈａｎ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ＭｒｇＡ１  ａｎｄ  ＭｒｇＣ１１  ａｒｅ  ｄｉｓｔｉｎｃｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ＲＦ−ａｍｉｄｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｇａｌｐｈａ  ｑ／１１  ｐａｔｈｗａｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９，１４７４０−１４７４５，ｄｏｉ：１０．１０７３／ｐｎａｓ．１９２５６５７９９（２００２）．
２５  Ｃｈｅｎ，Ｙ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  −−ａ  ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ７０，５６８−５７５，ｄｏｉ：１０．１１１１／ａｌｌ．１２６０２（２０１５）．
【０２３０】
実施例７：胆汁うっ滞性掻痒症のモデルではＭｒｇｐｒクラスターＫＯマウスの掻破が少ない
マウスＭｒｇｐｒ遺伝子座は、２７個のインタクトなＭｒｇｐｒオープンリーディングフレームを含有する。マウスに発現した多くのＭｒｇｐｒは、同様の配列を有する（１０；２０）。Ｍｒｇｐｒメンバー間で起こり得る補償を回避するために、一群のＭｒｇｐｒを遺伝的に欠失させる（クラスターＫＯ）クラスター欠失戦略を追求した。クラスターＫＯマウスは、１２個のインタクトなＭｒｇｐｒ  ＯＲＦを含有する８４５ｋｂのＤＮＡを欠失している（２２）。
【０２３１】
α−ナフチルイソチオシアネート（ＡＮＩＴ）を投与すると、胆汁うっ滞性損傷および掻痒症が生じる。ＡＮＩＴは、未知の機構を介して胆管上皮細胞を選択的に損傷することにより、肝内胆汁うっ滞を引き起こす（８）。ＡＮＩＴ処置は、ＷＴおよびクラスターＫＯ動物の両方に対して自発性のかゆみの増加をもたらした（図１３Ａ）。クラスターＫＯマウスでは、ＷＴ同腹仔よりも掻破が有意に少なく、発作が約４６％減少したことが示された（図１３Ａ）。ＷＴおよびクラスターＫＯの両ビヒクル処置動物は、本質的に自発性のかゆみを示さなかった（図１３Ａ）。肝臓重量、直接ビリルビン値、総ビリルビン値および肝臓酵素などの胆汁うっ滞性損傷の指標はいずれも、対照の状態と比較して処置群の状態では有意な上昇を示した（図１３Ｂ、図１３Ｃ）。これらの指標の中で、ＷＴ処置群の状態とクラスターＫＯ処置群の状態との間に差はなく、胆汁うっ滞性損傷の重症度がＷＴとクラスターＫＯ動物とで同等であることが示された。これに基づいて、処置の相違はかゆみの相違を説明するものとはならない。さらに、胆汁酸、メトエンケファリンおよびオートタキシン（胆汁うっ滞性掻痒症に何らかの役割を果たすと仮定される３つの物質）のうち、ＡＮＩＴ処置動物では胆汁酸のみが上昇し、メトエンケファリンまたはオートタキシンの有意な上昇は認められなかった（図１３Ｄ〜図１３Ｆ）。胆汁酸の値は、ＷＴ処置群の状態とクラスターＫＯ処置群の状態との間で差がなかった（図１３Ｄ）。
【０２３２】
実施例８：ビリルビンはＭｒｇｐｒＡ１に依存するかゆみを引き起こす
ＡＮＩＴ処置は多くの病理学的変化をもたらす。通常、血清中に微量に存在する胆汁成分がアップレギュレートされる。さらに、ＡＮＩＴは肝細胞損傷を引き起こし、これにより、生物学的恒常性にさらに混乱がもたらされる。これらの変化により、クラスターＫＯ動物に見られる胆汁うっ滞性のかゆみの減少を説明することができる多くの仮説が存在する。これに対処するために、ＷＴおよびクラスターＫＯ同腹仔の両方に、胆汁うっ滞性掻痒症に関与すると仮定された多数の胆汁成分を注射した。注射後、急性のかゆみを評価した。これらの注射から、以前に発表されていない現象である起痒物質としてビリルビンを同定した。ＷＴマウスは、ビリルビンの注射に反応して、頬または背中のいずれかを掻破する（図１４Ａ、図１４Ｄ）。この掻破反応は用量依存的であり、比較的低用量であれば動物は掻破しない（図１４Ａ）。注目すべきことに、ビリルビンの注射は、クラスターＫＯ動物のかゆみを誘発することができなかった（図１４Ａ）。ビリルビンはヒスタミン放出アッセイおよびカルシウムイメージングの両方で肥満細胞を活性化することができなかったため、ビリルビン媒介掻痒症は本質的にヒスタミン作動性であるとは考えられなかった（図１５Ａ、図１５Ｂ）。さらに、Ｈ１受容体遮断薬は行動を阻害しなかった（図１５Ｃ）。胆汁うっ滞性掻痒症の３つの提案されたメディエーターの代表的なメンバーである他の起痒物質、ＤＡＭＧＯ、モルヒネ、ＬＰＡおよびＤＣＡの注射はいずれも、ＷＴおよびクラスターＫＯ動物の両方に対して同等のかゆみ反応を誘発した（図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｅ、図１４Ｆ）。これに基づいて、クラスターＫＯ動物の胆汁うっ滞性掻痒症の減少の機序は、クラスター内のＭｒｇｐｒに対するビリルビンの活性低下に起因するものであった。
【０２３３】
この行動データを裏付けて、解離ＤＲＧニューロンに対するビリルビンの浴適用はカルシウムの一過性の増加を誘発した（ＦＩＧ１６Ａ）。ビリルビン誘発カルシウムフラックスは、細胞外カルシウムの存在に依存していた（図１６Ｂ）。５０μＭビリルビンは、総ＤＲＧの４〜６パーセントを活性化した（図１６Ｃ）。重要なことに、ビヒクル対照と比較して、クラスターＫＯ  ＤＲＧは、ビリルビンに応答して活性化されるニューロンの数の増加を示さなかった（図１５Ｃ）。活性化されたニューロンの平均直径は２０．６μｍであった［１９．２、２１．７］（図１６Ｄ）。大きさに基づいて、小径の侵害受容ニューロンとしてこれらのニューロンを分類した（図１６Ｄ）（１９；２５）。
【０２３４】
クラスターＫＯ動物では、１２個のインタクトなＭｒｇｐｒ  ＯＲＦが欠失している。ビリルビン関連掻痒症の媒介に関与しているものを決定するために、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞に、クラスター内の各Ｍｒｇｐｒを連続的にトランスフェクトした。カルシウムイメージングを使用して、ビリルビンの存在下でカルシウムをフラックスした細胞集団を同定するために、これらのトランスフェクトされた細胞に対してビリルビンを試験した。非トランスフェクトＨＥＫ細胞はビリルビンに応答せず、クラスター内のあらゆるＭｒｇｐｒのうち、ＭｒｇｐｒＡ１を発現する細胞のみがビリルビンに応答して陽性シグナルを示し、ＥＣ５０は約４９μＭであった（図１７Ａ、図１８Ａ）。Ｕ７３１２２はカルシウム流入を遮断し、一過性のカルシウムの増加はＧαｑ媒介性であることが示唆された（図１７Ｂ、図１７Ｃ）。ＭｒｇｐｒＡ１単一遺伝子ＫＯ動物はビリルビン注射時に掻破しなかったため、行動からカルシウムイメージング分析を確認した（図１４Ａ）。受容体のマウスＭｒｇｐｒＡファミリーのメンバーは、ヒトＭｒｇｐｒＸファミリーのメンバーと最も密接に関連している。いずれかのヒト受容体がビリルビンに応答したかどうかを決定するために、４つのヒトＭｒｇｐｒ  Ｘ１〜Ｘ４のそれぞれを安定に発現するＨＥＫ細胞株をスクリーニングした。これらの４つのうち、ＭｒｇｐｒＸ４のみがビリルビンに対する陽性反応を示し、ＥＣ５０は２μＭであった（図１７Ｄ、図１８Ｂ）。ここでも、カルシウムシグナルはＧαｑ媒介性であった（図１７Ｅ、図１７Ｆ）。
【０２３５】
実施例９：追加のヘム代謝産物はＭｒｇｐｒＡ１およびＸ４を活性化する
ヘム代謝産物は構造的に非常に似ている。これに基づいて、追加のヘム代謝産物がＭｒｇｐｒＡ１およびＸ４に対して活性を有することが予測され得る。実際、カルシウムイメージングにより評価されるように、複数のヘム代謝産物はこれらの受容体を活性化し、関連受容体Ａ３およびＸ１は活性化しなかった（表１、図２２）。ヘム代謝産物は構造的に関連している。複数のヘム代謝産物は、マウス受容体であるＭｒｇｐｒＡ１とヒト受容体であるＭｒｇｐｒＸ４とを活性化した。物質の用量を上に列挙し、活性化のおおよその割合を表に示す。いくつかの同定されたＭｒｇｐｒＡ１アゴニストをＷＴマウスに注射することによって、このカルシウムイメージングを検証した。ヘマチンおよびステルコビリンなど、ＭｒｇｐｒＡ１に対する活性を有する他のヘム代謝産物はいずれも、クラスターＫＯ動物では見られなかったかゆみをＷＴ動物では誘発した。さらに、構造的に異なるアゴニストであるＦＭＲＦによるＭｒｇｐｒＡ１の活性化が、かゆみを引き起こした。これに基づいて、ＭｒｇｐｒＡ１の活性化はかゆみを誘発するのに十分であった。カルシウムイメージングによって確立された機能的相同性に基づいて、ヒトでのＭｒｇｐｒＸ４の活性化はかゆみを引き起こす。
【０２３６】
実施例７〜９の参考文献を以下に列挙する
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４．Ｂｅｒｇａｓａ  ＮＶ．２０１４．Ｐｒｕｒｉｔｕｓ  ｏｆ  Ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ．Ｉｎ  Ｉｔｃｈ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｅｄ．Ｅ  Ｃａｒｓｔｅｎｓ，Ｔ  Ａｋｉｙａｍａ．Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ（ＦＬ）．Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ．
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６．Ｂｅｒｇａｓａ  ＮＶ，Ｔａｌｂｏｔ  ＴＬ，Ａｌｌｉｎｇ  ＤＷ，Ｓｃｈｍｉｔｔ  ＪＭ，Ｗａｌｋｅｒ  ＥＣ，ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｎａｌｏｘｏｎｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｕｒｉｔｕｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０２：５４４−９．
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１３．Ｇｏｓｗａｍｉ  ＳＣ，Ｔｈｉｅｒｒｙ−Ｍｉｅｇ  Ｄ，Ｔｈｉｅｒｒｙ−Ｍｉｅｇ  Ｊ，Ｍｉｓｈｒａ  Ｓ，Ｈｏｏｎ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｉｔｃｈ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ａｎｄ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂ  ａｎｄ  ｇａｓｔｒｉｎ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｉｎ  ｄｏｒｓａｌ  ｒｏｏｔ  ａｎｄ  ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ  ｇａｎｇｌｉａ，ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ．Ｍｏｌ  Ｐａｉｎ  １０：４４．
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１８．Ｋｕｉｐｅｒ  ＥＭ，ｖａｎ  Ｅｒｐｅｃｕｍ  ＫＪ，Ｂｅｕｅｒｓ  Ｕ，Ｈａｎｓｅｎ  ＢＥ，Ｔｈｉｏ  ＨＢ，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｔ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｎｔ  ｃｏｌｅｓｅｖｅｌａｍ  ｉｓ  ｎｏｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｃ  ｐｒｕｒｉｔｕｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｄｏｕｂｌｅ−ｂｌｉｎｄ，ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ，ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５２：１３３４−４０．
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２１．Ｌｉｕ  Ｑ，Ｓｉｋａｎｄ  Ｐ，Ｍａ  Ｃ，Ｔａｎｇ  Ｚ，Ｈａｎ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｉｔｃｈ  ｅｖｏｋｅｄ  ｂｙ  ｂｅｔａ−ａｌａｎｉｎｅ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  ３２：１４５３２−７．
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２３．ＭｃＮｅｉｌ  Ｂ，Ｄｏｎｇ  Ｘ．２０１２．Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｉｔｃｈ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｂｕｌｌ  ２８：１００−１０．
２４．ＭｃＮｅｉｌ  ＢＤ，Ｐｕｎｄｉｒ  Ｐ，Ｍｅｅｋｅｒ  Ｓ，Ｈａｎ  Ｌ，Ｕｎｄｅｍ  ＢＪ，ｅｔ  ａｌ．２０１５．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｓｔ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｓｅｕｄｏ−ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１９：２３７−４１．
２５．Ｒｏｓｓ  ＳＥ．２０１１．Ｐａｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｃｈ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒａｌ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ  ｏｆ  ａｖｅｒｓｉｖｅ  ｓｏｍａｔｏｓｅｎｓａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ  ２１：８８０−７．
２６．Ｓｗａｉｎ  ＭＧ，Ｒｏｔｈｍａｎ  ＲＢ，Ｘｕ  Ｈ，Ｖｅｒｇａｌｌａ  Ｊ，Ｂｅｒｇａｓａ  ＮＶ，Ｊｏｎｅｓ  ＥＡ．１９９２．Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｏｐｉｏｉｄｓ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １０３：６３０−５．
２７．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＲ，Ｌｏｓｏｗｓｋｙ  ＭＳ．１９８８．Ｏｐｉｏｉｄ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ．ＢＭＪ  ２９７：１５０１−４．
２８．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＲ，Ｌｏｓｏｗｓｋｙ  ＭＳ．１９８９．Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｉｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｌｅ  ａｎｄ  ｕｒｉｎｅ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ８：５３−９．
２９．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ  ＪＲ，Ｌｏｓｏｗｓｋｙ  ＭＳ．１９８９．Ｐｌａｓｍａ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇｕｔ  ３０：１３９２−５．
３０．Ｖｉｔｅｋ  Ｌ，Ｊｉｒｓａ  Ｍ，Ｂｒｏｄａｎｏｖａ  Ｍ，Ｋａｌａｂ  Ｍ，Ｍａｒｅｃｅｋ  Ｚ，ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ａｎｄ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ．Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  １６０：４４９−５６．
【０２３７】
実施例１０：ＭＲＧＰＲＸ３はヒトケラチノサイトに発現し、ｈＢＤ３に対するそれらの応答に必要である
図２０Ａに示すように、ＭＲＧＰＲＸ３を発現するＨＥＫ細胞は、合成ヒトβ−デフェンシン３（ｈＢＤ３）に対して強いＣａ２＋応答を生じた。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、初代ヒトケラチノサイトでのＭＲＧＰＲＸ３の発現を分析し、遺伝子が中間レベルで発現していることを確認した。ＭＲＧＰＲＸ３に対するｓｉＲＮＡは、別のファミリーメンバーＭＲＧＰＲＸ４に影響を及ぼすことなく、この受容体の発現を効果的に減少させた（図２０Ｂ）。ＭＲＧＰＲＸ３をノックダウンすると、ｈＢＤ３に応答するケラチノサイトの割合が８０％超から２０％未満に顕著に減少し、ＭＲＧＰＲＸ３が、細胞がリガンドを感知し応答するために必要であることが示された。
【０２３８】
実施例１１：マウスＭｒｇｐｒＡ６は、ヒトＭＲＧＰＲＸ３の推定ホモログである
ＭｒｇｐｒＡ６はケラチノサイトに発現する。
ヒトＭＲＧＰＲＸ３のマウスホモログの同定を行った。Ｍｒｇｐｒ遺伝子クラスターは進化の過程で大きく拡大し、ヒトでは４つのＭＲＧＰＲＸに対して２０を超える受容体がコードされていた（図２１Ｃ）。第１の工程は、マウス上皮からケラチノサイトを単離し、Ｍｒｇｐｒ遺伝子のいずれが強く発現しているかを決定することであった。ＲＴ−ＰＣＲでは、ＭｒｇｐｒＡ６、Ａ１２およびＢ３の３つの遺伝子のみがマウスケラチノサイトに強く発現していることが明らかにされた。ＭｒｇｐｒＡ１、Ａ４およびＢ６は弱い発現を示した（図２１Ａ）。
【０２３９】
ＭｒｇｐｒＡ６は、ｈＢＤ３の唯一のマウスマウスホモログであるｍＢＤ１４に応答する。
ＭｒｇｐｒＸ３はオーファン受容体であり、ｈＢＤ３はその最初に同定されたアゴニストである。ｈＢＤ３のよく保存されたマウスホモログであるマウスβ−デフェンシン−１４（ｍＢＤ１４）を使用して、ｈＭｒｇｐｒＸ３のマウスホモログをさらに探索した。マウスケラチノサイトに発現を示した受容体の中で（図２１Ａ）、ＭｒｇｐｒＡ６はｍＢＤ１４によって強く活性化された唯一の受容体であったが、ＭｒｇｐｒＡ１、Ａ４、Ａ１２、Ｂ３およびＢ６は反応を示さなかった（図２１Ｂ）。
【０２４０】
ＭｒｇｐｒＡ６  ＫＯマウスおよびＭｒｇｐｒＡ６−ｃｒｅ  ＢＡＣマウスを作製した。これらのマウス系統は、インビボでの創傷閉鎖アッセイおよび他の皮膚疾患モデルにとって独自かつ重要である。野生型および変異動物から単離されたケラチノサイトは、ｍＢＤ１４に対するそれらの応答のための、およびＭｒｇｐｒＡ６受容体の下流の細胞内シグナル伝達経路をさらに検討するための重要な細胞ベースのアッセイである。同様に、ＭｒｇｐｒＸ３ノックダウンまたは変異発現を伴うヒトケラチノサイトは、皮膚疾患モデルでＭｒｇｐｒＸ３を試験するヒト細胞ベースのアッセイに不可欠である。ＭｒｇｐｒＸ３機能に関与する他の潜在的な皮膚疾患には、乾癬、皮膚炎、慢性皮膚潰瘍および癌腫が挙げられる。さらに、ｈＢＤ３および他のデフェンシンはまた気道および腸に防御を提供するため、ＭｒｇｐｒＸ３の疾患適応は皮膚系から粘膜系に拡大することができる。したがって、ＭｒｇｐｒＸ３およびＭｒｇｐｒＡ６を標的とすると、創傷治癒、慢性炎症、悪性形質転換、乾癬および皮膚炎などの皮膚疾患、気道および消化管障害、疼痛ならびにかゆみを治療する可能性がある。
【０２４１】
実施例１０〜１１の参考文献を以下に列挙する
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７．Ｒｏｈｒｌ，Ｊ．，Ｙａｎｇ，Ｄ．，Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｊ．Ｊ．＆Ｈｅｈｌｇａｎｓ，Ｔ．Ｈｕｍａｎ  β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ２  ａｎｄ  ３  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｍｏｕｓｅ  Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＣＣＲ２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８４，６６８８−６６９４（２０１０）．
８．Ｂｅｆｕｓ，Ａ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌｓ：Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ａｃｔｉｏｎ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３，９４７−９５３（１９９９）．
９．Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．β−Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  Ａｃｔｉｖａｔｅ  Ｈｕｍａｎ  Ｍａｓｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｖｉａ  Ｍａｓ−Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｇｅｎｅ  Ｘ２．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９１，３４５−３５２（２０１３）．
１０．Ｈｉｒｓｃｈ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｄｅｆｅｎｓｉｎ−３  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｗｏｕｎｄｓ．Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１１，２２０−２２８（２００９）．
１１．Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｏ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｗｏｕｎｄ  Ｈｅａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ／Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ，ａ  Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｃｏｍｍｏｎ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０，５５８３−５５８９（２００３）．
１２．Ａａｒｂｉｏｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｌｕｎｇ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｗｏｕｎｄ  Ｃｌｏｓｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｕｃｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０，１９３−２０１（２００４）．
１３．Ｏｔｔｅ，Ｊ．−Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ  ｄｅｆｅｎｓｉｎ  ２  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４，２２８６−２２９７（２００８）．
１４．Ｎｉｙｏｎｓａｂａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｅｔａ−Ｄｅｆｅｎｓｉｎｓ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ．Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２７，５９４−６０４（２０１６）．
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１６．Ｈａｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｉｔｃｈ．Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  １６，１７４−１８２（２０１３）．
１７．ＭｃＮｅｉｌ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｓｔ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｓｅｕｄｏ−ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１９，２３７−２４１（２０１５）．
１８．Ｈｒｕｚ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ  Ｖ３：Ａ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｍｅｔａ−Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ．Ａｄｖ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００８，４２０７４７（２００８）．
１９．Ｋｉａｔｓｕｒａｙａｎｏｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ（ＡＧ）−３０／５Ｃ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  ｔｏ  ｐｒｏｄｕｃｅ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ／ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｏ  ｍｉｇｒａｔｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅ  ｖｉａ  ＭｒｇＸ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．Ｊ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｓｃｉ．ｄｏｉ：ｈｔｔｐ：／／ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｊｄｅｒｍｓｃｉ．２０１６．０５．００６
２０．Ｋａｉｓｈｏ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒａｔｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ＭｒｇＸ３  ｇｅｎｅ  ｓｈｏｗ  ｃａｔａｒａｃｔｓ  ａｎｄ  ａｎ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｓｋｉｎ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．３３０，６５３−６５７（２００５）．
【０２４２】
実施例１２：実施例１２〜１７の材料および方法
以下の材料および方法を使用した。
【０２４３】
動物の世話および使用
実験はいずれも、ジョンズ・ホプキンス大学医学部の動物実験委員会によって承認されたプロトコルに従って実施した。
【０２４４】
ヒト血漿の分離
ジョンズ・ホプキンス大学医学部の治験審査委員会（試験番号：ＩＲＢ００１５４６５０）によって承認されたプロトコルの下で、高ビリルビン血症、特に胆汁うっ滞に罹患した患者から得られた血漿を分離した。全血をＰＡＸｇｅｎｅチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ  ７６１１１５）に収集し、３００ｇで５分間遠心分離した。次いで、血漿を収集し、アリコートし、実験まで−２０℃で保存した。正常な対照ヒト血漿は、Ｓｉｇｍａ（Ｐ９５２３）から購入した。
【０２４５】
分子および調製
以下の分子を使用した：ビリルビンＩＸα（Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。α−ナフチルイソチオシアネート（ＡＮＩＴ、Ｓｉｇｍａ）、ビリベルジン（Ｓｉｇｍａ）、クロロキン（Ｓｉｇｍａ）、化合物４８／８０（Ｓｉｇｍａ）、シクロスポリンＡ（Ｓｉｇｍａ）、ヘミン（Ｓｉｇｍａ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ、Ｓｉｇｍａ）、ＢＡＭ８−２２（Ｓｉｇｍａ）、ＢＯＣ−ＧＬＮ−Ｄ−（ホルミル）ＴＲＰ−ＰＨＥ−ベンジルエステル（ＱＷＦ、Ｓｉｇｍａ）、ビリルビンジタウレート（Ｌｅｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。セチリジン（Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ステルコビリン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウロビリノーゲン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、コレラ毒素（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｕ７３１２２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＹＭ−２５４８９０（Ｗａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、百日咳毒素（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、フィブロネクチン（Ｓｉｇｍａ）、Ｆｌｕｏ  ４−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）およびＦｕｒａ  ２−ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）。
【０２４６】
ビリルビンは酸化と光分解とを非常に受けやすい。したがって、ＤＭＳＯまたは０．１Ｍ  ＮａＯＨ中で各実験の直前にビリルビンを新たに調製し、次いで、暗所で維持した。カルシウムイメージング分析では、使用の数秒前にカルシウムイメージング緩衝液にビリルビンを希釈した。適用可能な全試験溶液中のＤＭＳＯの最終濃度は０．５％未満であった。ＡＮＩＴとシクロスポリンＡとをオリーブ油に溶解し、必要に応じて新たに調製した。ウロビリノーゲンとステルコビリンとをリン酸緩衝食塩水に溶解し、ｐＨ７．４に調整した後、必要になるまで−２０°Ｃで１００μｌのアリコート中で保存した。他の薬物はいずれも、１００μｌ〜１，０００μｌのアリコートとして調製し、−２０°Ｃで保存してから４°Ｃで解凍した。凍結／解凍サイクルは可能な限り回避した。
【０２４７】
行動試験
あらゆる適用可能な行動試験を行い、遺伝子型を知らない実験者が分析した。使用したマウスはいずれも、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊバックグラウンドで作製したか、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに少なくとも１０世代戻し交配した８〜１２週齢の雄（２０〜３０ｇ）であった。かゆみ行動実験はいずれも午前８時から午後１２時までの間に行った。実験の前日に、試験チャンバーに動物を３０分間入れた後、５分間の休憩を挟んで一連の３回の模擬注射を行った。実験当日、注射の１０分前に、動物を最初に試験チャンバーに順応させた。首筋または頬に掻痒性化合物を皮下注射し、掻破行動を３０分間観察した。注射部位の領域に向けられたいずれかの後足による連続的な掻破運動として掻破発作を定義した。頬注射モデルでは、片方の前足によって注射部位をなでる動きとして拭い行動を定義した。顔または頬に対する両前足の使用は毛づくろい行動と解釈した。３０分間の観察期間にわたって５分間隔で掻破発作の回数を数えることにより、掻破行動を定量した。１０分間の観察期間にわたって２分間隔で拭い行動を定量した。Ｈ１Ｒ遮断では、ビリルビン注射の３０分前に、３０ｍｇ／ｋｇの塩酸セチリジン（ｐＨ７．４）を腹腔内投与した。舐め行動は、数秒にわたり定量し、身体のいずれかの他の部分の舐め行動に先行も後続もしなかった、注射部位の後足足指または足蹠の舐め行動として識別した。
【０２４８】
ノックインおよびノックアウトマウスの作製
前述のように、Ｍｒｇｐｒ−クラスターΔ−／−マウス、Ｍｒｇｐｒａ１ＧＦＰマウス、およびＭｒｇｐｒｄＰＬＡＰを作製した４、２１、４４。前述のように、Ｔｇ（Ｍｒｇｐｒａ３−Ｃｒｅ）マウスを作製した２４。ジャクソン研究所からＬｓｌ−ｔｄＴｏｍａｔｏマウス（Ａｉ９、００７９０９）を購入した。ガイドＲＮＡ配列：ＴＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＣＡＧＧＧ（配列番号３）を使用して、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに対してＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用してＭｒｇｐｒａ１−／−マウスを作製した。Ｂｌｖｒａ−／−マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６ＪバックグラウンドでＯｚｇｅｎｅ（オーストラリア）で作製された。
【０２４９】
カルシウムイメージングおよび分析
カルシウムイメージング緩衝液（ＣＩＢ；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１．２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭグルコースおよび２０ｍＭスクロース（ｐＨ７．４および２９０〜３００ｍＯｓｍ））中で細胞を画像化した。細胞内の変化［Ｃａ２＋］（［Ｃａ２＋］ｉ）をモニターするために、イメージングの直前にＣＩＢ中で３７°Ｃの暗所で３０分間、細胞にＦｕｒａ  ２‐ＡＭ（ＨＥＫ２９３細胞）またはＦｌｕｏ  ４−ＡＭ（ＤＲＧニューロンおよびマスト細胞）を添加した。Ｆｕｒａ  ２−ＡＭでは、３４０ｎｍおよび３８０ｎｍの両方の励起から５１０ｎｍでの発光をモニターした。Ｆｌｕｏ  ４−ＡＭでは、４８８ｎｍでの励起から５２０ｎｍでの発光をモニターした。細胞内［Ｃａ２＋］が、ベースラインと比較して５０％、または５０ｍＭ  ＫＣｌの添加中にアッセイした［Ｃａ２＋］ｉ変化と比較して５０％上昇した場合に、細胞は応答しているものとして識別した（ニューロンのみ）。損傷、剥離、高ベースラインおよび運動活性化細胞は分析から除外した。
【０２５０】
ＨＥＫ２９３細胞
最初のスクリーニングでは、多種多様なＧＰＣＲをホスホリパーゼＣ３０に非選択的に結合させる独自のＧαタンパク質であるマウスＧタンパク質αサブユニットＧα１５を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、ポリ−Ｄ−リジンで被覆したカバースリップ上に播種し、目的のＭＲＧＲＰＲをコードする構築物を一時的にトランスフェクトした。１２〜２４時間後、細胞にＦｕｒａ  ２−ＡＭを添加した。特に明記しない限り、ベースライン期間が確立された後、約３０秒間、イメージングチャンバーに化合物を灌流した。次いで、５秒間隔でさらに６０秒間応答をモニターした。
【０２５１】
ＤＲＧニューロン
解離の２４時間後（自然遺伝子型）または解離の４８時間後（ウイルス形質導入）に、Ｆｌｕｏ−４  ＡＭとともにＤＲＧをインキュベートした。特に明記しない限り、細胞を２０秒間画像化して、化合物を加える前にベースラインを確立した。３０秒後、２分間洗浄してから別の物質を加えた。各イメージング試験の最後に、陽性対照として５０ｍＭ  ＫＣｌを加えた。割合を計算するのに含めた細胞はいずれも、ＫＣｌを加えると、ベースラインと比較して、［Ｃａ２＋］ｉの少なくとも５０％の増加を示した。
【０２５２】
肥満細胞
肥満細胞を記載のように精製し、３０ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチンでコーティングしたガラスカバースリップ上に播種し、３７℃で２時間回復させた。次いで、細胞にＦｌｕｏ−４  ＡＭを添加した。
【０２５３】
ＥＣ５０およびＩＣ５０の決定
ＭＲＧＰＲＡ１、ＭＲＧＰＲＸ４およびＭＲＧＰＲＣ１１のいずれかを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を、１０，０００細胞／ウェルでポリ−Ｄ−リジン被覆９６ウェルプレートに播種した。細胞にＦｕｒａ  ２−ＡＭを添加し、２回洗浄し、ＣＩＢ中で維持した。ヘム代謝産物を薄明かりでＤＭＳＯに新たに溶解し、次いで、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌから構成される緩衝液（ｐＨ８．８）に希釈した。各実験の前にｐＨの潜在的変化を評価した。３連で、２〜４回反復して実施した用量反応からＥＣ５０値を決定した。ビリルビンに対するＱＷＦによる潜在的な拮抗作用を決定するために、アゴニストの適用前に、ＣＩＢ中で１分間、様々な用量のＱＷＦによって細胞を処理した。
【０２５４】
マウス腹膜肥満細胞の精製およびカルシウムイメージング
ＣＯ２吸入により、８〜１２週齢の成体雄マウスを殺処分した。使用前に合計２５ｍＬの肥満細胞解離培地（ＭＣＤＭ；３％ウシ胎児血清および１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳを含むＨＢＳＳ、ｐＨ７．２）を氷上で冷却し、２回の連続腹膜洗浄を行った。洗浄液を合わせて、２００ｇで遠心した。２ｍＬのＭＣＤＭにペレットを再懸濁し、４ｍｌの等張性７０％Ｐｅｒｃｏｌｌ懸濁液（２．８ｍｌのＰｅｒｃｏｌｌ、３２０ｍｌの１０％ＨＢＳＳ、４０ｍｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、８３０ｍｌのＭＣＤＭ）上に重層し、４°Ｃで５００ｇで２０分間遠心した。肥満細胞をペレットに回収した。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２５ｎｇ／ｍＬの組換えマウス幹細胞因子（Ｓｉｇｍａ）を含むＤＭＥＭに肥満細胞を再懸濁した。
【０２５５】
マウス腹膜肥満細胞ヒスタミン放出アッセイ
肥満細胞を記載のように精製し、３７°Ｃで２時間回復させた。次いで、３００細胞／ウェルで、２０ｍｇ／ｍＬのフィブロネクチンで被覆した９６ウェルプレートに細胞を播種した。アッセイ前に、３７℃で４５分間プレートをインキュベートした。アッセイのために、試験化合物をいずれもＣＩＢで希釈した。化合物添加の５分後、上清を吸引し、製造業者の指示に従ってＨＴＲＦヒスタミンアッセイキット（Ｃｉｓｂｉｏ  Ａｓｓａｙｓ）を用いてヒスタミン値が測定されるまで−８０℃で凍結した。
【０２５６】
ＤＲＧの解離および培養
冷ＤＨ１０培地（９０％ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）／Ｆ−１２、１０％ＦＢＳ、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ））中に、あらゆる脊髄部位由来のＤＲＧニューロンを収集した。ディスパーゼ（５ｍｇ／ｍｌ）／コラゲナーゼＩ型（１ｍｇ／ｍｌ）酵素混合物を用いて、ＤＲＧを３７°Ｃで４５分間消化した。粉砕後、３００ｇで細胞を遠心し、ＤＨ１０に再懸濁してから、ポリ−Ｄ−リジン（０．５ｍｇ／ｍｌ）およびラミニン（１０μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で被覆したガラスカバースリップに播種した。５０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦを補充したＤＨ１０を用いて、３７°ＣでＤＲＧを培養した。
【０２５７】
ＤＲＧウイルス形質導入
ｐｓＰＡＸ２およびｐＭＤ２．Ｇを使用して、ＭＲＧＰＲの様々なｃＤＮＡをコードするレンチウイルスを生成した。１００，０００ｇで４時間遠心分離することによりウイルスをペレット化し、ＤＨ１０培地で２回穏やかに洗浄し、ＤＨ１０に懸濁した。ＤＲＧの単離および培養の１日後、ＤＲＧを２４時間一晩レンチウイルスに感染させた。翌朝、５０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦを補充した新鮮なＤＨ１０に培地を完全に置き換えた。感染の２４時間後、カルシウムイメージングのために細胞を処理した。
【０２５８】
ＤＲＧの電気生理
３〜５週齢のマウス由来のＤＲＧニューロンを記載のように収集した。１〜３日間培養した後、ＮａＯＨによりｐＨ７．４に調整した、１４４  ＮａＣｌ、２．５  ＫＣｌ、２  ＣａＣｌ２、０．５  ＭｇＣｌ２、５  ＨＥＰＥＳおよび１０グルコース（ｍＭ単位）を含有する細胞外溶液とともにＤＲＧニューロンをチャンバーに移した。チップ抵抗３〜５ＭΩのホウケイ酸毛細管ガラス電極（Ｓｕｔｔｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を用いて、約２３°Ｃでホール・セル・カレント・クランプ・レコーディングを行った。内部溶液には８０  Ｋ−アセテート、３０  ＫＣｌ、４０  ＨＥＰＥＳおよび１  ＣａＣｌ２（ｍＭ単位）を含有させ、水酸化カリウム（ＫＯＨ）によりｐＨ７．４に調整した。パッチクランプのために直径１５〜２５μｍの小径ニューロンを選択した。Ａｘｏｐａｔｃｈ  ７００Ｂ増幅器とｐＣｌａｍｐ９．２ソフトウェアパッケージ（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）を備えたＤｉｇｉｄａｔａ  １３２２Ａデジタイザーを使用してデータを取得した。２０秒間灌流することにより１ｍＭのクロロキン（ＣＱ）を加え、新たに生成した５０μＭのビリルビンをピペットにより加えた。各細胞の記録の最後に、５０ｍＭ  ＫＣｌを含有する溶液を適用した。ＫＣｌを加えた後に活動電位を発生させることができるニューロンのみが、正常であり、データ分析に含めるのに適切であると考えられた。
【０２５９】
マイクロスケール熱泳動結合アッセイ
ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  ｍｏｎｏｌｉｔｈ  ＮＴ．１１５機器を使用したマイクロスケール熱泳動によって、様々なリガンドに対するＭＲＧＰＲＡ１、ＭＲＧＰＲＸ４およびＭＲＧＰＲＣ１１の結合等温式を決定した２７。結合緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ８．８））中で、室温で５分間、１０μＭの目的のＧＦＰタグ付き受容体とともにリガンドをプレインキュベートした。受容体を安定に発現する細胞から、膜画分として受容体を粗精製した４５。薄明かりで０．１Ｍ  ＮａＯＨにヘム代謝産物を新たに溶解し、次いで、アッセイ緩衝液に希釈した。凍結乾燥したＢＡＭ８−２２を結合緩衝液に溶解した。受容体とのインキュベーションの前に、各リガンドのｐＨを評価した。ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ製のＮＴ．１１５  Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓに試料を添加した。２０％ＬＥＤ電力および１５％ＭＳＴ電力を使用して、マイクロスケール熱泳動実験を行った。３つの独立した実験から得られたデータを用いて、質量作用の法則を使用してＫＤを計算した。ビリルビンと受容体との間の結合は純粋に熱泳動的に評価したのに対して、ＢＡＭ８−２２とＭＲＧＰＲＣ１１との間の結合はＴ−Ｊｕｍｐによって評価した。初期蛍光に著しい偏差のある試料は除外した。
【０２６０】
［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ結合
前述のように、ＧＴＰの放射性標識された非加水分解性形態である［３５Ｓ］グアノシン−５’−（γ−チオ）トリホスフェート（［３５Ｓ］ＧＴＰγＳ）の結合を測定することによって、ＭＲＧＰＲの活性化を決定した４５。要約すると、１０μＭのＧＤＰを補充した１７５μＬのアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  ８０）に１０μｇの粗膜画分を希釈し、室温で５分間インキュベートした。次いで、５０μＭビリルビンを補充した最終容量１９９μＬのアッセイ緩衝液中でさらに１分間膜をインキュベートした。次いで、１０ｎＭ［３５Ｓ］ＧＴＰγＳを加えて試料を２００μＬにした。穏やかに撹拌しながら、試料を４℃で２時間インキュベートした。ＧＦ／Ｂフィルター上への急速濾過により実験を終了し、洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２および５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４））で３回洗浄した。次いで、フィルターをシンチレーションカクテルに浸漬し、計数した。１０μＭの非標識ＧＴＰγＳとの競合によって非特異的結合を決定した。ＧＴＰγＳ結合アッセイは、２回の独立した実験として３連で行った。
【０２６１】
免疫組織化学
成体マウス（５〜６週齢）をペントバルビタールにより麻酔し、２０ｍＬの冷０．１Ｍ  ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、続いて２５ｍＬの冷固定剤（０．１Ｍ  ＰＢＳ中の４％ホルムアルデヒド（ｖ／ｖ）および１４％飽和ピクリン酸（ｖ／ｖ））を灌流した。灌流したマウスからＤＲＧを切除し、４℃の４％パラホルムアルデヒド中に１時間かけて後固定した。２０％スクロース（ｗ／ｖ）中で組織を２４時間超かけて凍結保護してから、最適切断温度化合物（ＯＣＴ）に包埋し、クライオスタットを用いて切片にした。スライド上で切片を３７°Ｃで１時間乾燥させ、４％パラホルムアルデヒドにより２１〜２３°Ｃで１０分間固定した。ブロッキング溶液（１０％正常ヤギ血清（ｖ／ｖ）、ＰＢＳ中０．２％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ｖ／ｖ）、ｐＨ７．４）中でスライドを２１〜２３°Ｃで１時間プレインキュベートし、次いで、一次抗体とともに４°Ｃで一晩インキュベートした。二次抗体のインキュベーションを２１〜２３℃で２時間行った。一次抗体については、ＣＧＲＰ（Ｔ−４２３９、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ、１：１，０００）に対してウサギ抗体、ＧＦＰ（Ａ−１１１２２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、１：１，０００）に対してウサギ抗体とした。二次抗体については、ウサギに対するヤギ抗体（Ａ１１０１１、Ａｌｅｘａ  ５６８コンジュゲート；Ａ１１００８、Ａｌｅｘａ  ４８８コンジュゲート；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）をブロッキング溶液で１：５００に希釈して使用した。
【０２６２】
ＧＦＰタグ付きＭＲＧＰＲを安定に発現する細胞の生成
先に記載された報告では、ＧＦＰタグ付きＭＲＧＰＲＡ３、ＭＲＧＰＲＣ１１、ＭＲＧＰＲＤ、ＭＲＧＰＲＸ１およびＭＲＧＰＲＸ２を発現するＨＥＫ２９３安定細胞株が生成された２１、２３、４６。要約すると、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００を使用して、ＨＥＫ細胞に目的の受容体を含有するプラスミドをトランスフェクトした。３日後、０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を使用して細胞を選択した。３週間後、モノクローナルコロニーを樹立し、各々の最高発現クローンを同定した。この試験では、Ｍｒｇｐｒａ１およびＭＲＧＰＲＸ４をｐＥＧＦＰ−Ｎ１に挿入し、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を使用してＭＲＧＰＲ陽性細胞を３週間かけて選択し、その後、ＦＡＣＳによりＧＦＰ陽性細胞を選別し、モノクローナル的に拡大した。試験のために、ＧＦＰ蛍光によって測定された際に、同様のレベルのＭＲＧＰＲＡ１およびＭＲＧＰＲＸ４を発現する２つの系統を選択した。
【０２６３】
高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
分析用ＬＣ‐１８カラム、２５ｃｍ×４．６ｍｍ（Ｘｔｅｒｒａ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いたＨＰＬＣにより、血漿ビリルビンを検出した。移動相（６０％メタノール／４０％水（ｖ／ｖ）（ｐＨ５．２）（溶媒Ａ）および１００％メタノール（溶媒Ｂ）中の０．１Ｍ酢酸アンモニウム）の勾配でビリルビンを溶出した。ビリルビンは以下のように溶出した：０〜１４分：１００％Ａ〜１００％Ｂの直線勾配；１４〜１９分：１００％Ａ〜１００％Ｂの直線勾配；１９〜２４分：１００％Ａでのイソクラティック溶出。ビリルビンは約１４〜１５分の保持時間を示し、４５０ｎｍで吸光度を測定することにより検出された。内部標準として試料に１０μＭビリルビンを加えることにより、血漿ビリルビンに対応するピークを確認した。
【０２６４】
胆汁うっ滞のマウスモデルおよび試料収集
１−ナフチルイソチオシアネート（ＡＮＩＴ；Ｓｉｇｍａ）をオリーブ油（Ｓｉｇｍａ）に可溶化した。動物に２５ｍｇ／ｋｇのＡＮＩＴを５日間連日経口投与した。５日目に、かゆみ行動のために動物を順応させた。６日目に、動物を試験チャンバーに入れ、１時間ビデオ録画した。１時間にわたり、後足のいずれかによる連続的な掻破運動として定義される掻破発作の回数を数え、５分間隔でビニングした。かゆみ行動を評価した後、動物にペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）を投与した。心臓穿刺により血液を採取し、ヘパリン処理したチューブに入れた（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。遠心分離後、血漿を収集し、アリコートし、分析まで−２０℃で保存した。Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ製の蛍光測定キットにより胆汁酸値を評価した。適用可能な場合には、その後、マウスを組織学的検査に進めた。
【０２６５】
組織学的検査
ＡＮＩＴ誘発胆汁うっ滞の組織学的評価のために、動物に冷ＰＢＳ、続いて４％ＰＦＡ（ｗ／ｖ）を経心臓的に灌流した。肝臓を切除し、４％ＰＦＡ中に一晩かけて後固定し、１０〜３０％スクロース（ｗ／ｖ）の勾配により凍結保存した。肝臓をＯＣＴに包埋し、クライオスタットを用いて切片にした。切片を室温で１時間乾燥させた後、ヘマトキシリンにより染色し、エオシンにより対比染色し、リンスし、次いで脱水した。
【０２６６】
量子力学的計算
Ｓｐａｒｔａｎ  １６を用いてＤＦＴ計算を行い、ｗｘＭａｃＭｏｌＰｌｔを用いてモデル化した。６−３１Ｇ（ｄ）基底関数セットを用いたＤＦＴ−Ｈａｒｔｒｅｅ  ＦｏｃｋハイブリッドＢ３ＬＹＰ理論を使用して、形状の最適化とシングルポイントエネルギー計算とを行った。気相２９８  Ｋの基底状態でエネルギーを計算した。
【０２６７】
血漿ビリルビン枯渇
ＦｅＣｌ３によるビリベルジンＩＸα／ビリベルジンＸＩＩＩαへの選択的酸化によって、または免疫沈降によって血漿ビリルビンを枯渇させた。ＦｅＣｌ３は、２０％ＦｅＣｌ３の０．１Ｎ  ＨＣｌ／メタノール溶液として調製した。３７°Ｃで１０分間、最終濃度１．５％ＦｅＣｌ３で血漿とともにＦｅＣｌ３をフラックスした。ＦｅＣｌ３は穏やかな酸化剤であるが、ビリルビンがビリベルジンに酸化される酸化還元電位を示す４７。また、正常ウサギＩｇＧ、またはタンパク質Ａ／Ｇビーズに結合した抗ビリルビン抗体（前述のように生成された１０）５μｇとともに血漿を２５°Ｃで１時間インキュベートすることによってビリルビンを免疫沈降させた。ビリルビン枯渇を定量するために、１００％メタノールを用いて試料からビリルビンを抽出し、ＨＰＬＣおよびＵＶ可視分光分析に供した。吸光度を０ＯＤのベースラインに調整し、クロマトグラフィーのピーク下面積を積分することによってビリルビンを定量した。
【０２６８】
データ分析
特に明記しない限り、群のデータは平均±標準誤差として表した。Ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔｓ、フィッシャー直接確率法およびカイ二乗検定を使用して統計的比較の有意性を決定し、Ｐ＜０．０５で有意差があると解釈した。統計的検出力分析を使用してサンプルサイズを正当化し、分散はＦ検定により決定したように全処置群間で類似していると決定した。成功した手順および／または処置を受けたサンプルまたは動物は分析から除外しなかった。行動実験はいずれも、遺伝子型および処置の両方を考慮し、ブロックした方法でデザインした。
【０２６９】
実施例１３：ビリルビンは非ヒスタミン作動性のＭｒｇｐｒ依存性掻痒症を誘発した
かゆみは、臨床的には掻痒症として知られており、皮膚と粘膜表面とを支配する後根神経節の一次感覚ニューロンによって知覚される５〜８。ヒスタミン介在性のかゆみには効果的な治療選択肢が存在するが、黄疸関連掻痒症などの非ヒスタミン作動性疾患の治療は比較的困難である２。黄疸、すなわち皮膚、強膜および粘膜の黄変は、黄色の代謝産物であるビリルビンが異常に蓄積した結果である。
【０２７０】
ビリルビンは、複雑な生理学的および病態生理学的特性を有する。生理学的および軽度の濃度上昇（０．２〜２．７ｍｇ／ｄＬ、３．４〜４６．２μＭ）では、ビリルビンは抗酸化物質９として作用し、神経保護物質１０でも心保護物質１１でもある。しかし、皮膚黄疸（ビリルビン＞５ｍｇ／ｄＬ、＞８５．５μＭ）に見られるような高値は掻痒症と関連しており、この相関は紀元前２世紀にはすでに医師によって最初に報告されている１。
【０２７１】
黄疸と掻痒症との間の長期にわたる関連にもかかわらず１２、ビリルビンそれ自体は起痒物質としてこれまでに研究されていない。ビリルビンが掻痒症を直接誘発するかどうかを決定するために、マウスの首筋にビリルビンを皮内注射した。ビリルビンの病態生理学的濃度は、注射部位で用量依存的に掻破を刺激した（図２３Ａ）。ビリルビンに高親和性で結合するヒト血清アルブミンとビリルビンをプレインキュベートすると１３〜１５、誘発される掻破が減少した（図２３Ａ）。ビリルビン誘発掻破の時間経過は、２つのよく特徴付けられた起痒物質、ヒスタミンおよびクロロキンのそれを反映していた（図２３Ｂ）。
【０２７２】
ビリルビンが疼痛ではなくかゆみを誘発したことを確認するために、マウスの頬にビリルビンを注射したが、この注射部位では、かゆみ刺激と疼痛刺激とを行動的に区別することができる１６。首筋と同様に、頬にビリルビンを注射すると、用量依存的な掻破が誘発された（図２７Ａ）。ビリルビンは拭い行動も舐め行動も誘発せず、疼痛ではなくかゆみが選択的に刺激されたことが示された（図２７Ｂ〜図２７Ｃ）。
【０２７３】
マウスに同様の構造の代謝産物を注射して、ビリルビンの掻痒活性の特異性を決定した（図２３Ｄ）。ビリルビンに対して直接上位の２つの代謝産物であるヘミンおよびビリベルジンは、テトラピロールであるにもかかわらず掻破を誘発しなかった（図２３Ｄ）。ヘミン、ビリベルジンおよびビリルビンは、それらの間にわずかな原子的および電子的相違を示したにすぎなかったが、それらの物理化学的特性および構造は大幅に異なっていた（図２３Ｅ）。
【０２７４】
これらの差をさらによく理解するために、密度汎関数理論（ＤＦＴ）計算を行い１７〜２０、続いてシングルポイントエネルギー計算を行って、各代謝産物の最適形状を解明した。ヘムおよびビリベルジンとは異なり、ビリルビンの４つのピロールは伸びており、いずれもが同じ平面にあるわけではない（図２３Ｅ）。ＤＦＴ計算により、ビリルビンの下流にある２つの細菌代謝産物であるウロビリノーゲンおよびステルコビリンでは同様の伸長配座が採用されていることが明らかにされた。ウロビリノーゲンおよびステルコビリンはともに掻破行動を刺激することができ（図２３Ｄ）、ビリルビンのピロールの伸長配座がその掻痒活性に重要であり得ることが示された。
【０２７５】
黄疸関連掻痒症患者には、抗ヒスタミン剤の効果がほとんどない３。これらの臨床所見と一致して、ヒスタミン受容体１遮断薬セチリジン（３０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）は、ビリルビンを注射したマウスの掻破行動を抑制することができなかった（図２７Ｄ）。さらに、ビリルビンは、カルシウム応答を誘発することも、腹膜肥満細胞から相当量のヒスタミン放出を誘発することもなかった（図２７Ｅ〜図２７Ｆ）。
【０２７６】
受容体のＭａｓ関連Ｇタンパク質共役受容体（Ｍｒｇｐｒ）ファミリーは、非ヒスタミン作動性掻痒症の主要なメディエーターである２１〜２４。Ｍｒｇｐｒがビリルビン誘発性掻痒症を媒介するかどうかを試験するために、１２のＭｒｇｐｒ遺伝子のクラスターを欠くマウス（クラスター−／−）にビリルビンを注射した２１（図２８Ａ）。クラスター−／−動物では、野生型（ＷＴ）マウスよりも掻破が約７５％少なく、クラスター内の１２のＭｒｇｐｒのうちの１つ以上がビリルビン誘発性掻痒症を媒介することが示された（図２３Ａ）。
【０２７７】
実施例１４：ビリルビンはマウスＭＲＧＰＲＡ１およびヒトＭＲＧＰＲＸ４を活性化した
原因となるＭｒｇｐｒを特定するために、クラスター−／−マウスでは欠失させた１２のＭｒｇｐｒの各々をヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞に個別に発現させ、ビリルビンの適用時に細胞内カルシウムの変化をモニターした。陽性のリガンド‐受容体相互作用時にカルシウム応答が確実に観察されるようにするために、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）を介してカルシウムシグナル伝達にＧＰＣＲを結合するＧαタンパク質であるマウスＧタンパク質αサブユニットＧα１５を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を使用した。
【０２７８】
１２のマウス受容体のうち、ＭＲＧＰＲＡ１を発現するＨＥＫ細胞のみがビリルビンの適用時にカルシウム応答を示した（ＥＣ５０は１４５．９μＭ［９６、２２０］）（図２４Ａおよび図２４Ｃ）。ビリルビンに応答した同じ細胞が、ＭＲＧＰＲＡ１アゴニストであるＦＭＲＦにも応答した４。ビリルビンがＭＲＧＰＲＡ１で細胞シグナル伝達を開始することを確実にするために、ＧＰＣＲシグナル伝達の阻害剤であるＰＬＣ阻害剤Ｕ７３１２２またはＧαｑ阻害剤ＹＭ−２５４８９０を用いてＭＲＧＰＲＡ１発現細胞を前処理した。両化合物は、ビリルビン誘発カルシウム応答を無効にした（図２４Ｂ〜図２４Ｃ）。
【０２７９】
ビリルビン自体に加えて、黄疸に関連するかゆみでは、グルクロン酸抱合ビリルビンがアップレギュレートされることが多い。同様のビリルビン誘導体がＭＲＧＰＲＡ１を活性化することができるかどうかを評価した。実際、ジタウレートビリルビン（抱合型ビリルビン）は、ＭＲＧＰＲＡ１発現細胞を活性化した（図２４Ｄ）。最初の挙動の所見と一致して、ヘミンはＭＲＧＰＲＡ１を活性化することができなかった（図２４Ｄ）。スクリーニングされた１２個のうちの他のＭｒｇｐｒはビリルビンに応答しなかった（図２４Ｍ、図２８Ｂ〜図２８Ｆ）。
【０２８０】
マウスＭｒｇｐｒａファミリーは、ヒトＭＲＧＰＲＸファミリーに配列相同性が最も近い（図２８Ａ〜図２８Ｆ）４、２５、２６。４つのヒトＭＲＧＰＲＸ受容体のうち、ＭＲＧＰＲＸ４発現細胞のみがビリルビンに応答した（ＥＣ５０は６１．９μＭ［４４、８７］）（図２４Ｆおよび図２４Ｉ）。Ｕ７３１２２およびＹＭ−２５４８９０は、ＭＲＧＰＲＡ１と同様に、ＭＲＧＰＲＸ４発現細胞のビリルビン誘発カルシウム応答を阻害した（図２４Ｇ〜図２４Ｈ）。抱合型ビリルビンもＭＲＧＰＲＸ４を活性化したが、ヘミンは効果を有しなかった（図２４Ｉ）。
【０２８１】
同定された受容体にビリルビンが直接結合することを確認するために、ビリルビンの存在下および非存在下で受容体の熱泳動をアッセイした。分子の熱泳動は、サイズ、電荷および溶媒和などの物理的パラメーターの影響を受けるため、分子間の相互作用を評価するために使用することができる２７。この手法を使用して、ビリルビンが、９２．９±１５μＭのＫＤでＭＲＧＰＲＡ１に、および５４．４±１３μＭのＫＤでＭＲＧＰＲＸ４に結合することが決定された（図２４Ｅおよび図２４Ｊ）。ビリルビンは、ＢＡＭ８−２２受容体ＭＲＧＰＲＣ１１に対する親和性をほとんどまたはまったく示さなかった（図２４Ｎ）。カルシウムイメージングによりＭＲＧＰＲＡ１またはＭＲＧＰＲＸ４を活性化しなかったヘミンも（図２４Ｄおよび図２４Ｉ）、ＭＲＧＰＲＡ１またはＭＲＧＰＲＸ４に結合しなかった（図２４Ｅおよび図２４Ｊ）。抱合型ビリルビンはＭＲＧＰＲＡ１およびＭＲＧＰＲＸ４の両方に結合したが、ビリルビンと比較して親和性は低かった（図２４Ｅおよび図２４Ｊ）。ビリルビンが結合時にＭＲＧＰＲＡ１およびＭＲＧＰＲＸ４を活性化することを確認するために、ＧＰＣＲシグナル伝達の最初の事象の１つであるグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）からグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）への交換を測定した。ビリルビンは、ＭＲＧＰＲＡ１膜複合およびＭＲＧＰＲＸ４膜複合体に対するＧＴＰ結合を増加させたが、ＭＲＧＰＲＣ１１へのＧＴＰ結合は増加させなかった（図２４Ｋ）。ビリルビンがインビボでＭＲＧＰＲＡ１を活性化してかゆみを誘発することを確認するために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用してＭｒｇｐｒａ１（Ａ１−／−）ノックアウトマウス系統を作製した２８（図２９Ａ〜図２９Ｃ）。Ａ１−／−動物では、ビリルビン注射時にＷＴマウスよりも掻破が有意に少なかった（図２４Ｌ）。
【０２８２】
実施例１５：ビリルビンはＭＲＧＰＲ依存的に感覚ニューロンを活性化した
これまでの試験では、ＭＲＧＰＲＡ１およびＭＲＧＰＲＸ４の両方が後根神経節（ＤＲＧ）内の感覚ニューロンのサブセットに発現することが実証されている４、２５、２９。６週齢の成体マウスは、わずかな割合の感覚ニューロンにＭＲＧＰＲＡ１を発現する。（図２５Ａ）。５０μＭビリルビンの適用により、小径（＜３０μｍ）ＷＴ  ＤＲＧ感覚ニューロン（５０のうち５）に強力な活動電位が誘発された。しかし、ビリルビンは、Ａ１−／−ニューロンでは活動電位を誘発することができなかった（６０のうち０）（図２５Ｂ）。感覚ニューロンでのＭＲＧＰＲＡ１の発現は、かゆみ感覚ニューロンの典型であるＭＲＧＰＲＡ３発現と重複している（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。電気生理およびＣａ２＋イメージングの両方によって決定されるように、ビリルビン応答性ニューロンは、ＭＲＧＰＲＡ３のリガンドである１ｍＭクロロキンにも応答するニューロンと部分的に重複した（Ｑｉｎ  Ｌｉｕ，Ｄｏｎｇ，Ｃｅｌｌ  ２００９）（図２５Ｃ、図３０Ａ）。ビリルビン感受性ニューロンは、かゆみ感覚ニューロンに特徴的な直径である２０．４±１．３μｍの平均細胞体直径を有した（図３０Ｂ）。ＷＴ  ＤＲＧニューロンの約５％が５０μＭビリルビンの適用に応答したが、クラスター−／−またはＡ１−／−ＤＲＧ由来の感覚ニューロンはほとんど応答しなかった（図２５Ｄ〜図２５Ｅ）。
【０２８３】
ビリルビンが推定ＭＲＧＰＲＡ３陽性かゆみニューロンを活性化することを確認するために、ＭＲＧＰＲＡ３陽性ニューロンで蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏを発現するＴｇ（Ｍｒｇｐｒａ３−Ｃｒｅ）；ｌｓｌ−ｔｄＴｏｍａｔｏマウスから単離したＤＲＧニューロンに対してカルシウムイメージングを行った。５０μＭビリルビンは、かなりの割合のｔｄＴｏｍａｔｏ陽性ニューロンを活性化した（図２５Ｆ）。
【０２８４】
次に、ＭＲＧＰＲＡ１またはＭＲＧＰＲＸ４のいずれかの発現がニューロンをビリルビンに感受性にするのに十分であるかどうかを決定した。この問題に対処するために、クラスター−／−ＤＲＧに、Ｍｒｇｐｒａ１、ＭＲＧＰＲＸ４またはＭＲＧＰＲＸ３のいずれかを保有するレンチウイルスを感染させた。ビリルビンは、Ｍｒｇｐｒａ１形質導入クラスター−／−ＤＲＧの１４％およびＭＲＧＰＲＸ４形質導入クラスター−／−ＤＲＧの３２％を活性化した（図２５Ｇ〜図２５Ｉ）。対照遺伝子ＭＲＧＰＲＸ３に感染させたクラスター−／−ＤＲＧはビリルビンに応答しなかった。
【０２８５】
次に、インビボでのビリルビンの慢性的な上昇がＭｒｇｐｒ依存性掻痒症を刺激することができるかどうかを検討した。この問題に対処するために、α−ナフチルイソチオシアネート（ＡＮＩＴ）をマウスに投与して、肝内胆汁うっ滞、または胆汁の流れの遅延もしくは停止を誘発した３０。胆汁はビリルビンを排泄する主な手段であり、胆汁うっ滞患者では、血中のビリルビンおよび他の起痒性物質の値が上昇する。ＷＴ、クラスター−／−およびＡ１−／−動物を２５ｍｇ／ｋｇのＡＮＩＴにより５日間処置してから、自発性のかゆみを評価した。ＷＴ、クラスター−／−およびＡ１−／−動物は、肝組織像、ならびに血漿ビリルビン、胆汁酸、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）およびγグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）の相対的増加によって決定されるように、胆汁うっ滞性損傷の同等の重症度を示した（図３１Ａ〜図３１Ｄ）。
【０２８６】
実施例１６：Ｍｒｇｐｒａ１−／−、クラスター−／−およびＢＶＲ−／−動物は胆汁うっ滞性掻痒症の減少を示した。
ビヒクル処置と比較して、ＡＮＩＴ処置では、全動物の掻痒症が有意に増加した（図Ａ）。しかし、クラスター−／−およびＡ１−／−マウスはＷＴマウスよりも著しく掻破が少なく（図２６Ａ）、ＭＲＧＰＲＡ１が胆汁うっ滞性掻痒症の成分を媒介したことが示唆された。ヒトでは、胆汁酸、内因性オピオイドおよびＬＰＡが胆汁うっ滞性血清中で増加することが多く、掻痒症を媒介することが示されている３１〜３４。ＡＮＩＴ処置動物の血清は胆汁酸の上昇を示したが（図３１Ｅ）、内因性オピオイドペプチドであるメトエンケファリン３５、３６もＬＰＡ産生酵素オートタキシンも上昇しなかった（図３１Ｆ〜図３１Ｇ）。
【０２８７】
一部の他の胆汁うっ滞性起痒物質ではなく、ビリルビンはもはやＭＲＧＰＲＡ１依存性のかゆみを刺激することができないことから、クラスター−／−およびＡ１−／−マウスではＡＮＩＴによる掻破が少なかったことを確認するため、ＷＴおよびクラスター−／−に胆汁酸、オピエートおよびＬＰＡを注射した。他の胆汁うっ滞性起痒物質はいずれも、ＷＴおよびクラスター−／−動物で同等のかゆみを誘発したため、Ｍｒｇｐｒ依存性ではない（図３１Ｈ〜図３１Ｋ）。したがって、ＭＲＧＰＲＡ１は黄疸による掻痒症を特異的に媒介するため、クラスター−／−およびＡ１−／−マウスではＡＮＩＴによる掻破が少なかった。
【０２８８】
ビリルビンがＭＲＧＰＲＡ１と相互作用して胆汁うっ滞のかゆみを刺激することをさらに実証するために、ビリルビンの生合成酵素であるビリベルジンリダクターゼ（ＢＶＲ−／−）３７を欠くマウスを作製した（図２３Ｅ、図３２Ａ）。ＢＶＲを欠くマウスでは、血漿中のビリルビンは検出可能な値ではなかった（図３２Ｂ〜図３２Ｄ）。ＡＮＩＴにより処置した場合、ＢＶＲ−／−マウスではＷＴマウスよりも掻破が有意に少なかった（図２６Ｂ）。胆汁酸、ＡＬＰ、ＡＳＴ、ＡＬＴおよびＧＧＴの血漿中濃度は、処置されたＢＶＲ−／−動物とＷＴ対照との間で区別することができなかった（図３１Ａ〜図３１Ｄ）。ＢＶＲ−／−マウスにクロロキンまたは外因性ビリルビンを注射すると正常に掻破したことから（図３２Ｅ〜図３２Ｆ）、ＡＮＩＴに対する応答低下は異常なかゆみ回路によるものではない。
【０２８９】
胆汁うっ滞性掻痒症に観察された差がＡＮＩＴに特異的なものではなかったことを確認するために、ＷＴ、Ａ１−／−およびＢＶＲ−／−マウスに肝毒素シクロスポリンＡを投与した３８。５０ｍｇ／ｋｇのシクロスポリンＡまたはビヒクルによりマウスを８日間処置してから、自発性のかゆみを評価した（図３３Ａおよび図３３Ｂ）。シクロスポリンＡはＷＴ動物に対して自発性のかゆみを誘発したが、Ａ１−／−およびＢＶＲ−／−マウスでは再びＷＴマウスよりも掻破が有意に少なかった（図３３Ａおよび図３３Ｂ）。
【０２９０】
ＭＲＧＰＲの薬理学的拮抗作用が胆汁うっ滞性のかゆみを軽減することができるかどうかを評価した。近年、３−アミノ酸ペプチド、ＱＷＦがＭＲＧＰＲＡ１アンタゴニストとして同定された３９。ＱＷＦは、ＭＲＧＰＲＡ１発現細胞のビリルビン関連カルシウムシグナル伝達を無効にし、ＩＣ５０は２．９μＭであった［１、５］（図３４Ａ）。インビトロでのその薬理作用を反映して、ビリルビンとともに注射された０．２５ｍｇ／ｋｇのＱＷＦは、ビリルビンに関連した掻痒症を有意に軽減した（図３４Ｂ）。ＱＷＦによる拮抗作用は、クロロキン−ＭＲＧＰＲＡ３に関連するかゆみを減弱させなかったため、ビリルビンに特異的であった（図３４Ｃ）。
【０２９１】
ＭＲＧＰＲＡ１アンタゴニストＱＷＦがインビボで胆汁うっ滞性掻痒症を軽減することができるかどうかを評価した。前述のようにＷＴ動物にＡＮＩＴを投与したが、行動分析の３０分前にビヒクルまたは１ｍｇ／ｋｇのＱＷＦのいずれかをマウスに腹腔内注射した。ＱＷＦにより処置したマウスでは、ビヒクルにより処置した動物よりも掻破が有意に少なかった（図２６Ｄ）。ＱＷＦ処置は総ビリルビン、ＡＳＴ、ＡＬＴまたはＡＬＰの血漿中濃度を変化させず、ＱＷＦ処置が、根底にある肝臓の病態を変化させなかったことが示唆された（図３４Ｄ〜図３４Ｇ）。
【０２９２】
胆道ドレナージは、胆汁うっ滞性掻痒症の最も効果的な治療法である４０。この観察に基づいて、胆汁うっ滞性動物から分離された血漿が掻痒症を誘発し得ることが予測された。実際、胆汁うっ滞を有するＷＴ動物から得られた血漿は、ナイーブＷＴ動物に注射するとかゆみを誘発した（図２６Ｅ）。ビリルビンを欠くＢＶＲ−／−マウスから分離された胆汁うっ滞性血漿（図３２Ｂ〜図３２Ｄ）は、ＷＴ胆汁うっ滞性血漿よりも有意に少ない掻破を誘発した（図２６Ｅ）。ＡＬＰ、ＡＳＴおよびＡＬＴの値は、ＷＴ胆汁うっ滞性血漿とＢＶＲ−／−胆汁うっ滞性血漿との間で区別がすることができず（図３１Ａ〜図３１Ｄ）、元のＷＴおよびＢＶＲ−／−マウスと同等の肝障害が示唆された。代わりに、ＢＶＲ−／−血漿はビリルビンを欠いているため、掻痒症が減少する可能性がある。
【０２９３】
高ビリルビン血症（図２６Ｆ）をもたらす様々な症状に罹患した患者４例の血漿を分離した。４例の患者の血漿はいずれもＷＴ動物に対してかゆみを誘発した（図２６Ｇ）。各患者の血漿は、Ａ１−／−動物に注射した場合、掻痒症をそれほど誘発しなかった（図２６Ｇ）。胆汁うっ滞性血漿からビリルビンを除去することが治療に効果的であり得るかどうかを評価するために、選択的酸化または抗ビリルビン抗体によってビリルビンを枯渇させた後、その掻痒能力を再評価した。ＨＰＬＣおよびＵＶ−可視微分分光法の両方により、ビリルビンの除去を検証した（図３５Ａ〜図３５Ｂ）。ＦｅＣｌ３またはビリルビン抗体により処置した後の患者＃１の血漿をＷＴマウスに注射したところ、未処置血漿および正常ＩｇＧ処置患者血漿と比較して掻痒症が少なかった（図２６Ｈ〜図２６Ｉ）。
【０２９４】
実施例１７
様々な病態により黄疸、ビリルビンの蓄積による皮膚の黄変が生じる。黄疸を有する患者は、一般に、激しい非ヒスタミン作動性のかゆみを経験すると報告されている１〜３。この関連にもかかわらず、ビリルビン自体の起痒能力は検討されておらず、ビリルビン受容体も同定されていない。本明細書では、ビリルビンの病態生理学的レベルが末梢かゆみ感覚ニューロンを刺激し、一次感覚ニューロンに発現するＧタンパク質共役受容体のファミリーであるＭｒｇｐｒを介して掻痒症を誘発することが実証された４。ビリルビンは、これまで特徴付けられていなかった２つのＭｒｇｐｒ、マウスＭＲＧＰＲＡ１およびヒトＭＲＧＰＲＸ４に結合し活性化する。病理学的高ビリルビン血症の２つのマウスモデルでは、ビリルビン産生酵素であるＭｒｇｐｒａ１またはＢＶＲのいずれかの遺伝子欠失がかゆみを減弱することが示された。同様に、高ビリルビン血症患者から分離した血漿は野生型動物に対してかゆみを誘発したが、Ｍｒｇｐｒａ１−／−動物には誘発しなかった。ビリルビンを除去すると、患者血漿の起痒能力が低下した。これらのデータに基づいて、ＭＲＧＰＲを標的とすることは黄疸に関連するかゆみを軽減するための有望な戦略である
【０２９５】
今日まで、ビリルビンの細胞表面受容体は分かっていない。本明細書の結果は、ビリルビンがＭＲＧＰＲに結合し活性化することにより掻痒症を誘発する可能性が高いことから、疾患の不活性なバイオマーカーとして不適切に見落とされ得ることを実証した。
【０２９６】
胆汁うっ滞性掻痒症に罹患する患者がいずれも黄疸を示すわけではなく、ビリルビンが胆汁うっ滞性掻痒症に罹患したこれらの患者に存在するいくつかの起痒物質のうちの１つである可能性が高いことが示唆される。他の原因となる起痒物質には胆汁酸、内因性オピオイドおよびＬＰＡが挙げられる可能性が高く、これらは非Ｍｒｇｐｒ機構を介して作用し得る（図３１Ｈ〜図３Ｋ）。さらに、黄疸を有する患者がいずれもかゆみを経験するわけではない。例えば、ビリルビントランスポーターＡＢＣＣ２の変異が関与する常染色体劣性遺伝障害であるデュビン・ジョンソン症候群患者では、血清抱合型ビリルビンが増加しているが、掻痒症の訴えがあるのはまれである４１。これらの患者と、黄疸を有する他の患者とが掻痒症を経験しないことがある理由はいくつかある。ビリルビンは血清アルブミンに強く結合される親油性分子であるため、血清中の総ビリルビン値と組織内の値との間に不一致が存在する可能性が高い。特に、胆汁うっ滞性掻痒症の最良の予測指標の１つは、血清ビリルビンおよびアルブミンの両値を使用するＭａｙｏリスクスコアである１２。さらに、これらの非掻痒性の黄疸障害の血清ビリルビンは、掻痒性の黄疸の血清ビリルビン値よりも有意に低い４１。原発性胆汁性胆管炎患者では、総ビリルビンの典型的な血清値がデュビン・ジョンソン症候群患者よりも約２〜３倍高く、非掻痒性の黄疸を有する患者が掻痒症を誘発するのに十分な値のビリルビンを有しない可能性が高いことを示唆している４１。さらに、孤発性高ビリルビン血症患者では、ほとんどのビリルビンがアルブミンおよび他の血清タンパク質に結合している可能性が高いため、ビリルビンが皮膚に侵入したり、感覚神経に存在する受容体と相互作用したりすることはできない１３、４２、４３。これらの問題にもかかわらず、結果は、ＭＲＧＰＲＸ４を遮断することにより黄疸関連掻痒症患者に緩和を提供し得ることを示唆した。
【０２９７】
実施例１２〜１７の参考文献を以下に列挙する
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９．Ｂａｒａｎａｎｏ，Ｄ．Ｅ．，Ｒａｏ，Ｍ．，Ｆｅｒｒｉｓ，Ｃ．Ｄ．＆Ｓｎｙｄｅｒ，Ｓ．Ｈ．Ｂｉｌｉｖｅｒｄｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ：Ａ  ｍａｊｏｒ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ  ｃｙｔｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９，１６０９３−１６０９８（２００２）．
１０．Ｄｏｒｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ，ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−２，ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｉｎｊｕｒｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６，２４４５−２４５０（１９９９）．
１１．Ｃｌａｒｋ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｍｅ  ｏｘｙｇｅｎａｓｅ−１−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｐｏｓｔｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｈｅａｒｔ  Ｃｉｒｃ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７８，Ｈ６４３−Ｈ６５１（２０００）．
１２．Ｔａｌｗａｌｋａｒ，Ｊ．Ａ．，Ｓｏｕｔｏ，Ｅ．，Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ，Ｒ．Ａ．＆Ｌｉｎｄｏｒ，Ｋ．Ｄ．Ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｐｒｕｒｉｔｕｓ  ｉｎ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｂｉｌｉａｒｙ  ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ．Ｃｌｉｎ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１，２９７−３０２（２００３）．
１３．Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｊ．＆Ｂｒｏｄｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａｌｂｕｍｉｎ−ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５８，６３１９−６３２６（１９８３）．
１４．Ｂｒｅａｖｅｎ，Ｇ．Ｈ．，Ｄ’Ａｌｂｉｓ，Ａ．＆Ｇｒａｔｚｅｒ，Ｗ．Ｂ．Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３３，５００−５０９（１９７３）．
１５．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｗ．Ｃ．，Ｄｉａｍｏｎｄ，Ｉ．＆Ｄｅｘｔｒａｚｅ，Ｐ．Ｔｈｅ  ａｌｂｕｍｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｕｎｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｉｎ  ｓｅｒｕｍ．Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．８，２５４−２６０（１９７５）．
１６．Ｓｈｉｍａｄａ，Ｓ．Ｇ．＆ＬａＭｏｔｔｅ，Ｒ．Ｈ．Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｔｃｈ  ａｎｄ  ｐａｉｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ．Ｐａｉｎ  １３９，６８１−６８７（２００８）．
１７．Ｈｏｈｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．＆Ｋｏｈｎ，Ｗ．Ｉｎｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｇａｓ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂ  １３６，Ｂ８６４−＋（１９６４）．
１８．Ｋｏｈｎ，Ｗ．＆Ｓｈａｍ，Ｌ．Ｊ．Ｓｅｌｆ−Ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ  Ｅｑｕａｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  ａｎｄ  Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  Ｅｆｆｅｃｔｓ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  １４０，１１３３−＆（１９６５）．
１９．Ｂｅｃｋｅ，Ａ．Ｄ．Ｄｅｎｓｉｔｙ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｔｈｅｒｍｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ．３．ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｅｘａｃｔ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ９８，５６４８−５６５２（１９９３）．
２０．Ｓｔｅｐｈｅｎｓ，Ｐ．Ｊ．，Ｄｅｖｌｉｎ，Ｆ．Ｊ．，Ｃｈａｂａｌｏｗｓｋｉ，Ｃ．Ｆ．＆Ｆｒｉｓｃｈ，Ｍ．Ｊ．Ａｂ−Ｉｎｉｔｉｏ  Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖｉｂｒａｔｉｏｎａｌ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｉｒｃｕｌａｒ−Ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｕｓｉｎｇ  Ｄｅｎｓｉｔｙ−Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｃｅ−Ｆｉｅｌｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９８，１１６２３−１１６２７（１９９４）．
２１．Ｌｉｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｙ  Ｎｅｕｒｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＧＰＣＲ  Ｍｒｇｐｒｓ  Ａｒｅ  Ｉｔｃｈ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  Ｍｅｄｉａｔｉｎｇ  Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｒｕｒｉｔｕｓ．Ｃｅｌｌ  １３９，１３５３−１３６５（２００９）．
２２．Ｓｉｋａｎｄ，Ｐ．，Ｄｏｎｇ，Ｘ．＆ＬａＭｏｔｔｅ，Ｒ．Ｈ．ＢＡＭ８−２２  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｓ  ｉｔｃｈ  ａｎｄ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｉｖｅ  ｓｅｎｓａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｈｉｓｔａｍｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３１，７５６３−７５６７（２０１１）．
２３．Ｌｉｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｉｔｃｈ  ｅｖｏｋｅｄ  ｂｙ  β−ａｌａｎｉｎｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ３２，１４５３２−１４５３７（２０１２）．
２４．Ｈａｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｃｉｃｅｐｔｏｒｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｉｔｃｈ．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１６，１７４−１８２（２０１２）．
２５．Ｌｅｍｂｏ，Ｐ．Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ  Ａ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ａ  ｎｅｗ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎ−−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＧＰＣＲｓ．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５，２０１−２０９（２００２）．
２６．Ｚｈａｎｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＭＲＧ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍａｃａｑｕｅ，ｍｏｕｓｅ，ａｎｄ  ｈｕｍａｎ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１３３，１８７−１９７（２００５）．
２７．Ｄｕｈｒ，Ｓ．＆Ｂｒａｕｎ，Ｄ．Ｗｈｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｍｏｖｅ  ａｌｏｎｇ  ａ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３，１９６７８−１９６８２（２００６）．
２８．Ｊｉｎｅｋ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  Ｄｕａｌ−ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，８１６−８２１（２０１２）．
２９．Ｆｌｅｇｅｌ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｒｉｇｅｍｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｄｏｒｓａｌ  Ｒｏｏｔ  Ｇａｎｇｌｉａ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｆｏｃｕｓ  ｏｎ  Ｃｈｅｍｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０，ｅ０１２８９５１（２０１５）．
３０．Ｅｌｉａｋｉｍ，Ｍ．，Ｅｉｓｎｅｒ，Ｍ．＆Ｕｎｇａｒ，Ｈ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｉｎｔｒａｈｅｐａｔｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｊａｕｎｄｉｃｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｇｅｓｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｌｐｈａｎａｐｈｔｈｙｌ−ｉｓｏ−ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ．Ｂｕｌｌ  Ｒｅｓ  Ｃｏｕｎｃ  Ｉｓｒ  Ｓｅｃｔ  Ｅ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ８Ｅ，７−１７（１９５９）．
３１．Ｋｒｅｍｅｒ，Ａ．Ｅ．，Ｍａｒｔｅｎｓ，Ｊ．，Ｋｕｌｉｋ，Ｗ．＆Ｒｕｅｆｆ，Ｆ．Ｌｙｓｏｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｃ  ｐｒｕｒｉｔｕｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２０１０）．ｄｏｉ：１０．１０５３／ｊ．ｇａｓｔｒｏ．２０１０．０５．００９
３２．Ａｌｅｍｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ＴＧＲ５  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｔｃｈ  ａｎｄ  ａｎａｌｇｅｓｉａ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１２３，１５１３−１５３０（２０１３）．
３３．Ｂｅｒｇａｓａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｎａｌｏｘｏｎｅ  ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｕｒｉｔｕｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ．ＹＧＡＳＴ  １０２，５４４−５４９（１９９２）．
３４．Ｂｅｒｇａｓａ，Ｎ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｎａｌｍｅｆｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｕｒｉｔｕｓ  ｏｆ  ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２７，６７９−６８４（１９９８）．
３５．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｒ．＆Ｌｏｓｏｗｓｋｙ，Ｍ．Ｓ．Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ  ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ｉｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｂｉｌｅ  ａｎｄ  ｕｒｉｎｅ．Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．８，５３−５９（１９８９）．
３６．Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．Ｒ．＆Ｌｏｓｏｗｓｋｙ，Ｍ．Ｓ．Ｐｌａｓｍａ  ｌｅｕｃｉｎｅ  ｅｎｋｅｐｈａｌｉｎ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｇｕｔ  ３０，１３９２−１３９５（１９８９）．
３７．Ｋｕｔｔｙ，Ｒ．Ｋ．＆Ｍａｉｎｅｓ，Ｍ．Ｄ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｌｉｖｅｒｄｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｒａｔ  ｌｉｖｅｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６，３９５６−３９６２（１９８１）．
３８．Ｌａｕｐａｃｉｓ，Ａ．，Ｋｅｏｗｎ，Ｐ．Ａ．，Ｕｌａｎ，Ｒ．Ａ．，Ｓｉｎｃｌａｉｒ，Ｎ．Ｒ．＆Ｓｔｉｌｌｅｒ，Ｃ．Ｒ．Ｈｙｐｅｒｂｉｌｉｒｕｂｉｎａｅｍｉａ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ  Ａ  ｌｅｖｅｌｓ．Ｌａｎｃｅｔ  ２，１４２６−１４２７（１９８１）．
３９．Ａｚｉｍｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｄｕａｌ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｋｉｎｉｎ−１  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｎ  Ｍａｓ−ｒｅｌａｔｅｄ  ＧＰＣＲｓ．ＪＣＩ  Ｉｎｓｉｇｈｔ  １，ｅ８９３６２（２０１６）．
４０．Ｈｅｇａｄｅ，Ｖ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｎａｓｏｂｉｌｉａｒｙ  ｄｒａｉｎａｇｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｃｈｏｌｅｓｔａｔｉｃ  ｐｒｕｒｉｔｕｓ：ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｓｔｕｄｙ．Ａｌｉｍｅｎｔ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．４３，２９４−３０２（２０１６）．
４１．Ｌｅｖｉｔｔ，Ｄ．Ｇ．＆Ｌｅｖｉｔｔ，Ｍ．Ｄ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅ  ｆｏｒ  ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  ７，３０７−３２８（２０１４）．
４２．Ｋｏｚａｋｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ｄｅｌｔａ−ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｊａｕｎｄｉｃｅ．Ｊ．Ｓｕｒｇ．Ｒｅｓ．７９，６１−６５（１９９８）．
４３．Ｋａｌｉｒ，Ｔ．，Ｃａｔａｎｅｓｅ，Ｇ．Ｓ．＆Ｃｌｅｊａｎ，Ｓ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｕｔｉｌｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｌｔａ  Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎ．Ｌａｂ  Ｍｅｄ  ２１，１５９−１６２（１９９０）．
４４．Ｌｉｕ，Ｑ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｒａｒｅ  ｓｕｂｓｅｔ  ｏｆ  ｕｎｍｙｅｌｉｎａｔｅｄ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｍａｙ  ｄｅｔｅｃｔ  ｇｅｎｔｌｅ  ｔｏｕｃｈ．Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１０，９４６−９４８（２００７）．
４５．Ｖａｓａｖｄａ，Ｃ．，Ｚａｃｃｏｒ，Ｎ．Ｗ．，Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｐ．Ｃ．，Ｓｕｍｎｅｒ，Ｃ．Ｊ．＆Ｓｎｙｄｅｒ，Ｓ．Ｈ．Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｖｉａ  Ｒａｄｉｏ−ｌａｂｅｌｅｄ  ＧＴＰ  Ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ（２０１７）．ｄｏｉ：１０．３７９１／５５５６１
４６．ＭｃＮｅｉｌ，Ｂ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｍａｓｔ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｆｏｒ  ｐｓｅｕｄｏ−ａｌｌｅｒｇｉｃ  ｄｒｕｇ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ５１９，２３７−２４１（２０１５）．
４７．Ｄｏｌｐｈｉｎ，Ｄ．Ｔｈｅ  Ｐｏｒｐｈｙｒｉｎｓ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐａｒｔ  Ａ−Ｂ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒ，１９７８）．
【０２９８】
実施例１８：ＭｒｇｐｒＸ４インバースアゴニストおよびアンタゴニスト
製造業者のワンステッププロトコルによって説明されているように、３８４ウェルのホモジニアス時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ  ＩＰ−Ｏｎｅ（登録商標）、ＣｉｓＢｉｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｂａｇｎｏｌｓ／Ｃｅｚｅ、フランス、カタログ番号６２ＩＰＡＰＥＪ）を使用して、細胞内イノシトールリン酸値を決定した。要約すると、組換えヒトＭｒｇｐｒＸ４を安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を採取し、フェノールレッド不含ＯｐｔｉＭＥＭ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中に懸濁し、１５，０００細胞／ウェルで１０μＬ／ウェルの容量で、３８４ウェルアッセイプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｐｒｏｘｉｐｌａｔｅ−Ｐｌｕｓ（登録商標）カタログ番号６００８２８０）中に播種した。次いで、加湿ＣＯ２インキュベーター内でこれらの細胞プレートを３７℃で一晩インキュベートした。試験化合物をＤＭＳＯに溶解し、アッセイ緩衝液（Ｔｒｉｓ．ＨＣｌ  ４０ｍＭ、ＮａＣｌ  ３００ｍＭ、ＬｉＣｌ  ３５０ｍＭ、ｐＨ８）でさらに希釈し、細胞に加えた（２μＬ添加、最終アッセイ濃度は典型的には１０μＭ）。この構成では、アッセイはアゴニストおよびインバースアゴニストを検出することができる。アンタゴニストの検出のために、試験化合物を加えた後、ビリルビンを加えた（２μＬ添加、最終アッセイ濃度１００μＭ）。次いで、アッセイ形式（アゴニスト／インバースアゴニスト対アンタゴニスト）とは関係なく、プレートを３７℃で１時間インキュベートし、続いて室温で３０分間インキュベートした。次いで、溶解／検出試薬（６ｕＬ／ウェル）を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした後、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）またはＢＭＧ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒ（登録商標）などのＨＴＲＦ互換リーダーにより読み取る。
【０２９９】
ＭｒｇｐｒＸ４受容体に対する代表的な化合物のインバースアゴニストおよびアンタゴニスト活性を以下の表１に示す。上記で開示された技術を用いて、市販の小分子ライブラリーをスクリーニングすることにより、表１の化合物を同定した。ＭｒｇｐｒＸ４インバースアゴニスト活性に関して、「＋＋＋＋」は、ベースラインよりも少なくとも３標準偏差低い活性を示し、「＋＋＋」は、ベースラインよりも２標準偏差から３標準偏差未満低い活性を示す。ＭｒｇｐｒＸ４アンタゴニスト活性に関して、「＋＋＋＋」は、少なくとも８５％のビリルビン誘発シグナルの遮断を示し、「＋＋＋」は、７０％から８５％未満のビリルビン誘発シグナルの遮断を示す。
【０３００】
【表１】
2020523992.tif 000003
【０３０１】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示するものであり、限定するものではない。他の態様、利点および修正は、添付の特許請求の範囲内に入る。
【０３０２】
本明細書で言及される特許および科学文献は、当業者が利用可能な知識を確立するものである。本明細書に引用するすべての米国特許および公開または未公開の米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書に引用するすべての公開外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用する受託番号によって示されたＧｅｎｂａｎｋおよびＮＣＢＩ寄託は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用する他のすべての公開参考文献、文書、原稿および科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３０３】
本発明をその好ましい実施形態を参照して特に示し、説明してきたが、添付の特許請求の範囲に包含される本発明の範囲から逸脱することなく、その中の形態および詳細に様々な変更を加えることができることを当業者であれば理解するであろう。
【図１Ａ】
2020523992.tif 000004
【図１Ｂ】
2020523992.tif 000005
【図１Ｃ】
2020523992.tif 000006
【図１Ｄ】
2020523992.tif 000007
【図１Ｅ】
2020523992.tif 000008
【図２Ａ】
2020523992.tif 000009
【図２Ｂ】
2020523992.tif 000010
【図２Ｃ】
2020523992.tif 000011
【図２Ｄ】
2020523992.tif 000012
【図２Ｅ】
2020523992.tif 000013
【図２Ｆ】
2020523992.tif 000014
【図３Ａ】
2020523992.tif 000015
【図３Ｂ】
2020523992.tif 000016
【図３Ｃ】
2020523992.tif 000017
【図３Ｄ】
2020523992.tif 000018
【図３Ｅ】
2020523992.tif 000019
【図３Ｆ】
2020523992.tif 000020
【図４Ａ】
2020523992.tif 000021
【図４Ｂ】
2020523992.tif 000022
【図４Ｃ】
2020523992.tif 000023
【図４Ｄ】
2020523992.tif 000024
【図４Ｅ】
2020523992.tif 000025
【図５】
2020523992.tif 000026
【図６Ａ】
2020523992.tif 000027
【図６Ｂ】
2020523992.tif 000028
【図６Ｃ】
2020523992.tif 000029
【図６Ｄ】
2020523992.tif 000030
【図６Ｅ】
2020523992.tif 000031
【図６Ｆ】
2020523992.tif 000032
【図７】
2020523992.tif 000033
【図８Ａ】
2020523992.tif 000034
【図８Ｂ】
2020523992.tif 000035
【図８Ｃ】
2020523992.tif 000036
【図９Ａ】
2020523992.tif 000037
【図９Ｂ】
2020523992.tif 000038
【図９Ｃ】
2020523992.tif 000039
【図１０】
2020523992.tif 000040
【図１１】
2020523992.tif 000041
【図１２】
2020523992.tif 000042
【図１３Ａ】
2020523992.tif 000043
【図１３Ｂ】
2020523992.tif 000044
【図１３Ｃ】
2020523992.tif 000045
【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１４Ｆ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１７Ｆ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ−１】
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【図２３Ｅ−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２７Ｅ】
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【図２７Ｆ】
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【図２８−１】
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【図２８−２】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３２−１】
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【図３２−２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2020523992.tif 000121
2020523992.tif 000122
2020523992.tif 000123