(57)【要約】【要約書】  固体状態のナノポアを移動するＤＮＡの速度の不要なばらつきを減らすために、ナノスケールの空洞によって１つの検知ナノポアから分離された超薄ナノ多孔性窒化ケイ素（ＮＰＮ）膜を使用して、移動する分子をナノスケールで事前に限局することを示す。包括的な実験結果は、このナノフィルターが存在することで、空洞の高さに依存するＤＮＡの大きさの範囲にわたって、検知細孔での通過時間の変動係数全体が最小値になることを示している。このような高度なナノポアデバイスを用いると、その直径と安定性に関係なく、通過時間分布の標準偏差が最小に抑えられる。また、これらの結果は、分子間および分子内での通過時間のばらつきが移動前のそのような分子のコンフォメーションエントロピーに依存することを示す最初の実験的な検証であり、固体状態のナノポアを通る輸送を制御するための実用的な戦略を提供する、【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノポアを通る標的分子の移動を制御するためのシステムであって、
基材上に設けられ、中に１つのナノポアを有する検知膜と、
前記検知膜の露出した上面に配置された１つ以上のスペーサと、
前記１つ以上のスペーサを覆うようにして、前記検知膜の前記上面に配置されたフィルター膜と、
流体を収容するように構成されるとともに、流体チャネルによって流体が行き来できる状態で互いに連結された２つのチャンバと、
２つの電極と、
を備え、
前記検知膜と、前記１つ以上のスペーサと、前記フィルター膜とが検知構造体を構成し、
前記フィルター膜には、その中に複数のナノポアが形成され、
前記検知構造体は、流体チャネルに挿入されることで、前記検知構造体に形成された前記ナノポアを通る以外に前記流体が前記２つのチャンバ間を通過できないようにし、
前記２つの電極は、２つのチャンバのそれぞれに１つずつ配置されるように、一つの電圧源に電気的に接続されるとともに、前記検知構造体に電位を加えるように構成された、
システム。
【請求項２】
前記フィルター膜は、前記標的分子の輪郭長とほぼ同じ距離だけ前記検知膜から離れている、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
前記フィルター膜に形成された前記複数のナノポアにおけるナノポアの平均サイズは、前記標的分子の前記回転半径の２倍未満である、請求項１に記載のシステム。
【請求項４】
前記フィルター膜は、電気抵抗が前記検知膜の電気抵抗よりも低くなるように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項５】
フィルター膜と前記検知膜との間には、前記標的分子が自由溶液中でコイル状をなしているときに、体積が前記標的分子の体積の１０００倍未満になるような空間が存在する、請求項１に記載のシステム。
【請求項６】
前記検知膜は誘電材料上に構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
前記検知膜は二次元材料上に構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
前記１つ以上のスペーサは、ある距離だけ前記検知膜から前記フィルター膜を離すように構成され、前記距離が前記標的分子の輪郭長より短くなるような大きさである、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
前記複数のナノポアは、前記フィルター膜と前記検知膜との間の距離の２倍に任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離を加えた値が前記標的分子の輪郭長よりも大きくなるような任意の２つのナノポア間の前記平均最近隣距離で、前記フィルター膜に形成されている、請求項８に記載のシステム。
【請求項１０】
前記複数のナノポアは、任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離が、標的分子が自由溶液中にあるときの前記標的分子の回転半径未満になるように、前記フィルター膜に形成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
前記フィルター膜は、電気抵抗を示すように構成され、前記検知膜は、前記フィルター膜の前記電気抵抗を前記検知膜の電気抵抗で割った商が０．０１未満になるような電気抵抗を示すように構成されている、請求項１に記載のシステム。
【請求項１２】
ナノポアを通る標的分子の移動を制御するための検知構造体であって、
１つのナノポアが形成された検知膜と、
前記検知膜の表面に配置された１つ以上のスペーサと、
前記１つ以上のスペーサを覆うようにして、前記検知膜の前記表面に配置されたフィルター膜と、を備え、
前記フィルター膜には複数のナノポアが形成され、
前記１つ以上のスペーサは、前記フィルター膜が、前記標的分子の輪郭長とほぼ同じ距離だけ前記検知膜から離れるような大きさである、検知構造体。
【請求項１３】
前記フィルター膜は、電気抵抗が前記検知膜の電気抵抗よりも低くなるように構成されている、請求項１２に記載の検知構造体。
【請求項１４】
フィルター膜と前記検知膜との間には、前記標的分子が自由溶液中でコイル状をなしているときに、体積が前記標的分子の体積の１０００倍未満になるような空間が存在する、請求項１２に記載の検知構造体
【請求項１５】
前記複数のナノポアは、前記フィルター膜と前記検知膜との間の距離の２倍に任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離を加えた値が前記標的分子の輪郭長よりも大きくなるような任意の２つのナノポア間の前記平均最近隣距離で、前記フィルター膜に形成されている、請求項１２に記載の検知構造体
【請求項１６】
前記複数のナノポアは、任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離が、標的分子が自由溶液中にあるときの前記標的分子の回転半径未満になるように、前記フィルター膜に形成されている、請求項１２に記載の検知構造体
【請求項１７】
前記フィルター膜は、電気抵抗を有するように構成され、前記検知膜は、前記フィルター膜の前記電気抵抗を前記検知膜の電気抵抗で割った商が０．０１未満になるような電気抵抗を有するように構成されている、請求項１２に記載の検知構造体
【請求項１８】
１つのナノポアが形成された検知膜を通る標的ポリマーの移動を制御するための方法であって、
複数のナノポアが形成されたフィルター膜が１つ以上のスペーサによって検知膜から離れた状態で前記検知膜上に配置された検知構造体を流体チャネル内に配置し、
前記検知構造体に電位を加えることによって前記検知構造体の前記ナノポアを介して標的ポリマーを駆動し、
前記検知膜の前記ナノポアを通る前記標的ポリマーの通過時間を測定することを含み、
前記検知膜と前記フィルター膜とを隔てる距離は、前記標的分子の輪郭長よりも短い、方法。
【請求項１９】
前記フィルター膜の複数のナノポアは、前記フィルター膜と前記検知膜との間の距離の２倍に２つのナノポア間の平均最近隣距離を加えた値が、前記標的分子の輪郭長よりも大きくなるような２つのナノポア間の前記平均最近隣距離で形成されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
１つのナノポアが形成された検知膜を通る標的ポリマーの移動を制御するための方法であって、
複数のナノポアが形成されたフィルター膜が１つ以上のスペーサによって検知膜から離れた状態で前記検知膜上に配置された検知構造体を流体チャネル内に配置し、
前記検知構造体に電位を加えることによって前記検知構造体の前記ナノポアを介して標的ポリマーを駆動し、
前記検知膜の前記ナノポアを通る前記標的ポリマーの通過時間を測定することを含み、
前記複数のナノポアは、任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離が、標的分子が自由溶液中にあるときの前記標的分子の回転半径未満になるように、前記フィルター膜に形成されている、方法。
【請求項２１】
複数のナノポアを有するフィルター膜と、検知ナノポアが１つ形成された検知膜とを含む、ナノデバイスの検知構造体への標的ポリマーの移動を制御するための方法であって、
前記検知構造体に電位を加えることによって前記検知構造体の前記検知ナノポアを介して標的ポリマーを駆動して、前記フィルター膜と前記検知膜との間に形成された空洞に入れ、
前記空洞に前記標的ポリマーをトラップし、
前記検知構造体に加える前記電位を反転することによって前記検知構造体の前記空洞から前記標的ポリマーを排出することを含む
前記フィルター膜と前記検知膜とを隔てる距離が前記標的ポリマーの捕捉半径よりも大きい、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願へのクロスリファレンス
本願は２０１７年４月２８日に出願された米国特許仮出願第６２／４９１，５７２号の優先権の利益を主張するものであり、上記出願の開示内容全体を本願に援用する。
【０００２】
本開示は、ナノポアデバイスおよびその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡなどのバイオポリマーが単独でナノポアを移動すると、分子輸送のダイナミクスが複雑になる。通過時の速度は、分子の細孔外にある部分のコンフォメーションと割合に依存するだけでなく、細孔壁や膜材料との一時的な相互作用や熱変動の影響も受けると考えられている。最終的には、分子間での速度変動と分子内での速度変動の両方が原因で、分子の動きが通過速度の分布の広さに影響されてしまうことに帰結する。このような通過時間の広がりがゆえ、時間から分子の位置を求める単純な変換が乱れてマッピングへの応用が複雑になり、荷電分子を大きさで振り分けるナノポアの機能が、従来のゲル電気泳動技術と比較して大幅に制限されてしまう。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
酵素を用いて細孔でＤＮＡを段階的に移動させる高水準の運動制御がいくらか功を奏し、長年にわたる集約的な研究は現在、生物学的ナノポアを利用した配列決定デバイスの形で成果をあげているが、固体状態のナノポアによって提供される潜在力の活用に大きな課題が残ったままになっている。
【０００５】
移動速度制御に関する実験では、大半の努力が、表面電荷密度をレーザー変調して電気浸透流を制御することを含む様々な手段、水性液体とイオン性液体の両方での適切な電解質の選択、粘度の調整、細孔とゲルとの接触または異なる膜材料の使用によって、ＤＮＡを減速させることに焦点をあてている。これらの方法では、様々な度合いでＤＮＡの移動速度を落とすことができるが、通過時間の分布が広がるという犠牲を払ってのことである。
【０００６】
通過時間の分布が広がる要因を検討した研究も、わずかに存在する。塩溶液に何を選択するかで、通過時間の分布の幅に大きく影響することがわかっている。シミュレーション研究によって、電場勾配が拡がるとポリマーの平衡状態が崩れ、平衡予測の結果よりも通過時間の分布が広くなることが実証された。移動前に長くなった分子は、抗力が増すことで通過時間が長くなり、移動終了に近づくにつれて加速する。
【０００７】
残念ながら、通過時間の大きなばらつきの原因となる主要なメカニズムは、ナノポアを移動前のＤＮＡ分子で利用可能な大きなコンフォメーションエントロピーであると考えられているが、ナノポア付近での幾何学形状を十分に制限できる装置の製造が複雑であるがゆえ、実験的な検証は依然として困難なままである。
【０００８】
このセクションでは、必ずしも先行技術ではない本開示に関する背景情報を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
このセクションは、開示の大ざっぱな概要を提示するものであり、その全範囲またはすべての特徴の包括的な開示ではない。
【００１０】
ナノポアを通る標的分子の移動を制御するためのシステムが提供される。このシステムには、検知構造体と、流体を収容するように構成されるとともに、流体チャネルによって流体が行き来できる状態で互いに連結された２つのチャンバであって、検知構造体が流体チャネルに挿入されることで、検知構造体に形成されたナノポアを通る以外に流体が２つのチャンバ間を通過できないように連結された２つのチャンバと、電圧源に電気的に接続されるとともに、検知構造体に電位を加えるように構成された、２つのチャンバのそれぞれに１つずつの２つの電極と、が含まれる。
【００１１】
基材上に検知膜が設けられ、検知膜には、ナノポアが1つ形成されている。検知膜は、誘電材料または二次元材料で構成されてもよい。検知膜の露出した上面に１つ以上のスペーサが配置されている。１つ以上のスペーサを覆うようにして、検知膜の上面にフィルター膜が配置され、それにより、検知膜、１つ以上のスペーサおよびフィルター膜が、検知構造体を形成する。フィルター膜には、複数のナノポアが形成されている。
【００１２】
いくつかの実施形態では、フィルター膜は、標的分子の輪郭長とほぼ同じ距離だけ検知膜から離れている。例えば、１つ以上のスペーサは、ある距離だけ検知膜からフィルター膜を離すように構成され、この距離が標的分子の輪郭長より短くなるような大きさである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、フィルター膜に形成された複数のナノポアにおけるナノポアの平均サイズは、標的分子の回転半径の２倍未満である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、フィルター膜は、電気抵抗が検知膜の電気抵抗よりも低くなるように構成されている。
【００１５】
いくつかの実施形態では、フィルター膜と検知膜の間には、標的分子が自由溶液中でコイル状をなしているときに、体積が標的分子の体積の１０００倍未満になるような空間が存在する。
【００１６】
いくつかの実施形態において、複数のナノポアは、フィルター膜と検知膜との間の距離の２倍に任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離を加えた値が標的分子の輪郭長よりも大きくなるような任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離で、フィルター膜に形成されている。
【００１７】
いくつかの実施形態において、複数のナノポアは、任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離が、標的分子が自由溶液中にあるときの標的分子の回転半径未満になるように、フィルター膜に形成されている。
【００１８】
いくつかの実施形態では、フィルター膜は電気抵抗を示すように構成され、検知膜は、フィルター膜の電気抵抗を検知膜の電気抵抗で割った商が０．０１未満になるような電気抵抗を示すように構成されている。
【００１９】
一態様では、検知構造体を使用して、1つのナノポアが形成された検知膜を通る標的ポリマーの移動を制御することができる。この方法は、流体チャネル内に検知構造体を配置し、検知構造体に電位を加えることによって検知構造体のナノポアを介して標的ポリマーを駆動し、検知膜のナノポアを通る標的ポリマーの通過時間を測定することを含み、検知膜とフィルター膜とを隔てる距離は、標的分子の輪郭長よりも短い。
【００２０】
別の態様では、この方法は、流体チャネル内に検知構造体を配置し、検知構造体に電位を加えることによって検知構造体のナノポアを介して標的ポリマーを駆動し、検知膜のナノポアを通る標的ポリマーの通過時間を測定することを含み、複数のナノポアは、任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離が、任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離が、標的分子が自由溶液中にあるときの標的分子の回転半径未満になるように、フィルター膜に形成されている。
【００２１】
さらに別の態様では、この方法は、検知構造体に電位を加えることによって検知構造体の検知ナノポアを介して標的ポリマーを駆動して、フィルター膜と検知膜との間に形成された空洞に入れ、この空洞に標的ポリマーをトラップし、検知構造体に加える電位を反転することによって検知構造体の空洞から標的ポリマーを排出することを含み、フィルター膜と検知膜とを隔てる距離が標的ポリマーの捕捉半径よりも大きい。
【００２２】
適用可能なさらに別の領域が、本明細書で提供される説明から明らかになるであろう。この概要の説明および特定の例は、例示のみを目的とするものであり、本開示の範囲を限定するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本明細書で説明する図面は、選択された実施形態の例示のみを目的としており、すべての可能な実装ではなく、本開示の範囲を限定することは意図されていない。
【図１】図１は、分子をナノポアで移動させるシステムで使用するための改良された検知構造体の側面図である。
【図２】図２は、検知膜に配置された穴のあるスペーサを示す上面図である。
【図３Ａ】図３Ａは、フィルター膜の検知膜上への移動を示す側面図であり、両者の間にはスペーサによって隙間が維持されている。
【図３Ｂ】図３Ｂは、フィルター膜の検知膜上への移動を示す側面図であり、両者の間にはスペーサによって隙間が維持されている。
【図３Ｃ】図３Ｃは、フィルター膜の検知膜上への移動を示す側面図であり、両者の間にはスペーサによって隙間が維持されている。
【図４】図４は、ナノポアデバイスのセットアップ例の図である。
【図５Ａ】図５Ａは、ナノポアデバイス用の支持構造体の分解図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ナノポアデバイス用の支持構造体の分解図である。
【図６】図６は、内部の検知構造体を拡大して示した支持構造体の側断面図である。
【図７】図７Ａは、検知構造体を通過する長さの異なるポリマーを示す。図７Ｂは、検知構造体を通過する長さの異なるポリマーを示す。図７Ｃは、検知構造体を通過する長さの異なるポリマーを示す。図７Ｄは、それぞれのポリマーの通過時間分布を示す対応するグラフである。図７Ｅは、それぞれのポリマーの通過時間分布を示す対応するグラフである。図７Ｆは、それぞれのポリマーの通過時間分布を示す対応するグラフである。
【図８】図８は、ナノデバイスの寸法に関して非常に長いポリマーが、フィルター膜の２つ以上の細孔にまたがって検知細孔を貫通することによりデバイスを詰まらせることを示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、提案されたナノデバイスの平均通過時間を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９Ｂは、対照デバイスの平均通過時間を示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０Ａは、提案されたナノデバイスの通過時間の標準偏差を示すグラフである。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、対照デバイスの通過時間の標準偏差を示すグラフである。
【図１１Ａ】図１１Ａは、提案されたナノデバイスの通過時間の変動係数を示すグラフである。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、対照デバイスの通過時間の変動係数を示すグラフである。
【図１２】図１２Ａは、提案されたナノデバイスの細孔内の５００ｂｐのＤＮＡラダーを示すグラフである。図１２Ｂは、提案されたナノデバイスの細孔内の５００ｂｐのＤＮＡラダーを示すグラフである。図１２Ｃは、対照デバイスの細孔内の５００ｂｐのＤＮＡラダーを示すグラフである。
【図１３】図１３は、対照デバイスに関連する様々なナノデバイスの折り畳み率を示すグラフである。
【図１４】図１４Ａは、エントロピートラップとしての提案されたナノデバイスの動作の原理証明データを示すグラフである。図１４Ｂは、エントロピートラップとしての提案されたナノデバイスの動作の原理証明データを示すグラフである。
【００２４】
対応する参照番号は、図面のいくつかの図を通して対応する部分を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
次に、添付の図面を参照して、例示的な実施形態をより完全に説明する。
【００２６】
図１に、分子をナノポアで移動させるシステムで使用するための改良された検知構造体１０を示す。検知構造体１０は主に、検知膜１４の露出した上面にフィルター膜１２を配置して構成されている。検知膜１４の上面に１つ以上のスペーサ１３を配置し、このスペーサ１３によってフィルター膜１２を検知膜１４から離しておくと好ましい。フィルター膜を検知膜から離す距離は、標的分子（例えば、モノマーまたはポリマーなど）の輪郭長とほぼ同じであると好ましい。１つ以上のスペーサ１３は、フィルター膜１２と検知膜１４との間に空洞を形成するのに役立つ。この空洞は、典型的には、体積が、自由溶液中でコイル状になっているときの標的分子の体積の１０００倍未満の空洞である。構造的に支持するために、膜を基材１５に設ける。
【００２７】
例示的な実施形態では、検知膜１４は窒化ケイ素などの誘電材料で構成されたものであると好ましい。低圧化学蒸着（ＬＰＣＶＤ）を使用して、窒化ケイ素の薄膜（例えば、５〜１００ｎｍなど）を基材（例えば、シリコンウェハなど）上に堆積させることができる。検知膜１４は、グラフェンや遷移金属ジカルコゲニドなどの二次元材料または多層金属／誘電体構造を含む他の誘電材料もしくは非誘電材料で構成されたものであってもよい。
【００２８】
スペーサ１３は、検知膜１４の露出した上面に形成される。例示的な実施形態では、スペーサ１３は、プラズマ強化ＣＶＤ（ＰＥＣＶＤ）または他の堆積技術を使用して、二酸化ケイ素の層（例えば、５０〜１０００ｎｍなど）を窒化ケイ素上に堆積させることによって形成される。その後、二酸化ケイ素層にフォトレジストをパターニングし、選択的にエッチングして（例えば、ドライＲＩＥまたはウェットＨＦを使用）、フィルター膜１２と検知膜１４とを離した状態に維持する一助となる検知膜１４上のスペーサ１３に、１つ以上の穴（すなわち、グリッド）を形成する。例示的な実施形態では、スペーサ１３は、図２から最も良くわかるように、複数の穴１１が配列されたフィルムである。別の実施形態では、スペーサは、検知膜の上面に並んで設けられた複数のピラーで構成されてもよい。スペーサおよびそれらの製造のための他の配置も、本開示によって考えられる。
【００２９】
検知膜を露出させるために、基材の反対側に凹部１７も設けられている。同様に、基材にフォトレジストをパターニングした後にエッチングを施して、基材１５に凹部１７を形成してもよい。例示的な実施形態では、凹部１７は、ウェハの反対側に配置されるスペーサ１３の中心と整列されている。凹部１７を設けるのはスペーサ１３の形成前であっても形成後であってもよいが、フィルター膜１２を検知膜１４に移動する前であると好ましいことが、容易に理解される。
【００３０】
フィルター膜１２も、窒化ケイ素などの誘電材料で構成される。例示的な実施形態では、フィルター膜１２は、基材１５上に支持されてもよい薄膜（例えば、１〜１００ナノメートル台など）である。フィルター膜１２は、１〜１００ナノメートルの範囲で孔径を調整可能な複数のナノポア１９（本明細書では、ナノフィルター細孔とも称する）を含む。ナノフィルター細孔は、平均サイズが標的分子の回転半径の２倍未満であると好ましい。一実施形態では、例としてのフィルター膜１２が、ニューヨーク州ウェストヘンリエッタのＳｉＭＰｏｒｅ，Ｉｎｃ．から市販されている。そのようなフィルター膜の製造については、全体を本明細書に援用するＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０５１３１６号のＰＣＴ特許出願にさらに説明されている。他の実施形態では、フィルター膜１２は、気相逐次浸透合成または他の原子層堆積法を使用して製造される。フィルター膜の他の製造方法も本開示によって考えられる。
【００３１】
フィルター膜１２を検知膜１４に密着させることにより、スペーサ１３を覆って検知膜１４上にフィルター膜１２を堆積させることができる。一例では、ファンデルワールス力を利用して、検知膜１４上にフィルター膜１２を移動させることができる。図３Ａおよび図３Ｂを参照すると、図３Ａに見られるように、膜同士を近接（例えば、数ミクロン）させる。場合によっては、膜同士を接触させてもよい。表面を親水性にするために、各要素を（例えば、コロナ処理などによって）クリーニングしてもよい。
【００３２】
図３Ｂでは、冷たい水蒸気３１の流れがフィルター膜１２に向けられ、２つの膜の間にある空洞に入り込む。膜の間にある水は、自然に蒸発する。表面張力がゆえ２つの膜が引っ張られ、膜同士が接触すると、膜は互いに張り付く。最後に、フィルター膜１２を支持している基材を機械的に取り除く。図３Ｃに見られるように、フィルター膜１２は基材１５から引き剥がされ、スペーサ１３の上に残っている。検知構造体を完成させるには、例えば、フィルター膜１２の縁に沿ってポリジメチルシロキサンを塗布し、フィルター膜１２を適所に密着させることで、フィルター膜１２を検知膜１４に固定すればよい。作製したばかりの検知構造体１０を、摂氏８０度でベーキングすることによって硬化させてもよい。
【００３３】
あるいは、フィルター膜１２に向けられた圧縮ガス（例えば、窒素または圧縮空気などの）の流れを利用して、フィルター膜１２を移動させることができる。このガスが、スペーサ１３に向かってフィルター膜１２をそらせ、ひとたび膜同士が接触すれば、（例えばファンデルワールス力によって）２つの膜同士が張り付くように、接触を作り出す。２つの材料の結合を促進するために、接触前に空気または酸素プラズマでそれぞれの表面を活性化することが可能である。また、ポリジメチルシロキサンまたは他の何らかの接着剤を塗布する方法に代えて、ジグで圧縮しながら検知構造体１０を高温で熱アニールしてフィルター膜１２をスペーサ１３に熱接着することで、フィルター膜から基材を剥がす必要性をなくすことができる。以上、特定の移動方法について言及したが、検知膜上にフィルター膜を堆積させる他の方法も本開示によって考えられる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、検知膜１４は、検知構造体１０の製造中に形成される検知細孔１８を含む。例えば、検知細孔は、基材上に窒化ケイ素を堆積後、電子線穿孔またはイオンビーム穿孔によって形成することができる。他の実施形態では、検知膜１４の検知細孔１８は、以下でさらに説明するように、ナノデバイスの文脈で制御された破壊プロセスを使用して形成したものであってもよい。検知細孔を形成するための他の技術も考えられる。同様に、他の製造方法を使用して検知構造体１０を形成できることが容易に理解される。
【００３５】
図４から図６は、ナノポアデバイス４０の例示的なセットアップを示す。ナノデバイス４０は主に、様々な流体通路が形成された支持構造体４１で構成される。この例では、支持構造体４１は、流体チャネル４３によって流体が行き来できる少なくとも２つのチャンバ４２を含む。２つのチャンバ４２と流体チャネル４３には、イオンを含む流体が入っている。一例では、流体は塩化カリウム水溶液である。別の例では、流体は塩化リチウムのエタノール溶液などの非水性溶媒である。着目する分析物に応じて、流体の組成が変わる可能性があることは、容易に理解される。
【００３６】
検知構造体１０は、流体チャネル４３に挿入される。これによって、流体は、検知構造体１０に形成されたナノポアを通る以外、２つのチャンバ間を流れることができなくなる。本例では、支持構造体４１は、別々に設けられて互いに噛み合う２つの要素で形成されている。検知構造体１０は、２つの別々要素の一方または両方に形成された凹部に嵌まる。検知構造体１０が、２つのシリコーンガスケット４４の間にあってもよい。支持構造体４１に検知構造体１０を収める他の構成および支持構造体４１自体の他の構成も、本開示によって考えられる。
【００３７】
ナノデバイスのチャンバ４３には、２つの電極４６が１つずつ挿入される。これらの電極は、電圧源４９に電気的に接続され、ナノデバイス４０内に配置された検知構造体１０に電位を加えるように構成されている。電圧源４９は、コントローラ４８により制御される。一実施形態では、コントローラは、パーソナルコンピュータまたは別のタイプのコンピューティングデバイスに電気的に接続されたデータ取得回路により実装される。いくつかの実施形態では、データ取得回路は、支持構造体の２つのチャンバ間を流れる電流を測定するように構成されてもよい。他の実施形態では、支持構造体４１および／またはシステム全体を接地したファラデーケージ４７に配置して、電気ノイズから隔離することができる。このように、このセットアップは、ナノポアセンシング分野で生体分子検出に一般に使用されるものと同様である。
【００３８】
上述したように、制御された破壊プロセスを使用して、検知膜に検知細孔を形成することができる。この場合、検知構造体１０がナノポアデバイス４０の支持構造体４１内にあるときに検知膜で値が０．１ボルト／ナノメートルを超える電場を誘導する電位が得られるように、検知膜に電位が加えられる。検知膜を構成する材料の制御された破壊により、検知膜にナノポアが１つ形成される。検知膜に電位が加えられている間、検知膜での漏れ電流がモニターされる。検知膜の漏れ電流の急激な増加によって、ナノポアの形成が判断される。漏れ電流の急激な増加が検出されたら、膜の電位を消失させる。制御された破壊プロセスに関するさらに詳細については、全体を本明細書に援用する米国特許出願公開第２０１５／０１０８００８号に見いだすことができる。
【００３９】
上記のナノデバイスには、様々な用途が想定される。例えば、ナノデバイス４０の一方のチャンバから他方のチャンバまで、検知構造体１０を通ってＤＮＡまたは他の荷電分子などの分析物の混合物を流すことができる。ほとんどの用途では、フィルター膜１２側から分析物を入れるが、用途によっては（すなわち、エントロピーケージ）検知膜１４側から分析物を入れてもよい。動作時、分析物は、わずかな電圧（例えば１ボルトまで）に駆動されて、電気泳動でシステム内を移動する。
【００４０】
例示的な実施形態では、ナノデバイスおよびその検知構造体の寸法を、用途に合わせて調整することができる。ナノデバイスの寸法は、次のように定義される。
ｈ：検知膜とナノフィルターとの間の垂直距離
ｘ：ナノフィルターの任意の２つの細孔間の平均最近隣距離
Ｌ：研究対象のポリマーの輪郭長
Ｙ：スペーサ材料の穴の直径
Ｌ＜ｈであるポリマーを、短いポリマーとする。短いポリマーは、検知細孔への捕捉前に隙間に完全に入るはずであり、その際、一部が緩むことになる。それでもまだナノデバイスはこれらのポリマーを通すが、検知細孔を通る移動動態にはほとんど影響しない。
【００４１】
ｈ＜Ｌ＜３（ｘ／２＋ｈ）を満たすポリマーを、中くらいのポリマーとする。中くらいのポリマーは、ナノデバイスがサイジングの用途に最も有用な長さの範囲を表している。ここでのポリマーは通常、２つのナノフィルター細孔を貫通しても検知細孔に詰まることはないが、移動動態はフィルター膜の影響を強く受ける。
【００４２】
Ｌ＞３（ｘ／２＋ｈ）を満たすポリマーを、長いポリマーとする。長いポリマーは、２つのナノフィルター細孔を貫通する際に両端が検知細孔に入り、一定の電場を加えた際に貼り付いて、遅かれ早かれ検知細孔に詰まる。実際に使われるナノフィルター細孔はわずかであるため、実際の最近隣細孔距離ｘが特定のデバイスでの平均とは異なる場合がある。そのため、上記のポリマー長の範囲は、たいていの場合に有効な推定値にすぎない。デバイスによっては、中くらいのポリマーと長いポリマーとの間の境でわずかに値が異なる場合があるが、平均して、これはかなりうまく機能する。Ｙは、可撓性のナノフィルター層が検知膜に接触するのを防ぐことができる程度に小さくなければならない点でのみ制約されるが、電場線を空洞内でよりよく集束させることによってポリマーを伸張させる一層大きな電場勾配を達成するために、Ｙを小さくすることも考えられる。
【００４３】
要するに、ポリマーが上で定義した中くらいの長さのときに、ナノデバイスは閉塞せずにポリマーを伸長するのに最もうまく機能する。着目するポリマーが中くらいの範囲になるように、ナノデバイスの寸法を調整する必要がある。
【００４４】
本開示の一態様では、特定の用途に合わせてナノデバイス４０を適切に構成することにより、通過時間分布特性を制御する。本明細書では、短いポリマーは、検知細孔に捕捉されたまま２つのナノフィルター細孔１９を貫通するには短すぎるポリマーと定義される。図７Ａおよび図７Ｄを参照すると、短いポリマーでは、通過時間の分布がほぼ対数正規分布となる。ポリマーが長くなると、図７Ｂおよび図７Ｅに示すように、通過時間の長いテールが現れる。図７Ｃおよび図７Ｆでは、より長いポリマーが検知細孔１８に捕捉されたまま２つのナノフィルター孔１９を貫通している。これらの長めのポリマーは、２つのナノフィルター細孔を貫通できるだけでなく、長さ方向の一部がナノフィルター膜に沿って平らになって摩擦や固着の可能性を高めるとともに、通過時間の分布における長いテールを大幅に大きくすることができる。ナノフィルターの２つ以上の細孔を貫通するとともに両端が同時に検知細孔内に入っていられるだけの長さのポリマーでは、詰まりのモードを予測可能である。このモードでは、ポリマーの両端が２つのナノフィルター細孔を貫通したまま検知細孔に捕捉され、それによってセンサーが詰まる。これは、所定のスペーサ形状に対して、ナノデバイス４０で確実に研究することができるポリマーの長さの上限となる。
ナノデバイス４０の検知膜での標的ポリマーの移動を改善するための方法を説明する。出発点として、上記のように検知構造体をナノデバイスの流体チャネルに配置する。検知構造体に電位を加えることにより、検知構造体のナノポアを介して標的ポリマーを駆動する。次に、検知膜のナノポアを通過する標的ポリマーの通過時間を測定する。注目すべきは、１つ以上のスペーサが、フィルター膜を検知膜から離すように構成され、その距離が標的分子の輪郭長よりも短くなるような大きさになっていることである。場合によっては、フィルター膜に形成された複数のナノポアも、ポリマーが詰まりにくくなるように構成されている。例えば、フィルター膜の寸法は、次のように設計される。
【数１】
2020517968.tif 000002
【００４５】
これは十分な境界であり、ある程度の緩みを前提としている。より確固たる境界は２ｈ＋ｘ＞Ｌである。すなわち、フィルター膜の複数のナノポアは、任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離が、フィルター膜と検知膜との間の距離の２倍に任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離を加えたものが標的分子の輪郭長より大きくなるようなものである。
【００４６】
ナノデバイス４０で有効に研究できる範囲のポリマーの場合、フィルター膜１２によって、通過時間の標準偏差を抑え、図９から図１１に見られるように通過時間分布の解像度を最大にすることができる。この効果は、フィルター膜を通過する際のＤＮＡの伸長と伸張によって生じる。ナノフィルター細孔はコイル状のまま通過するには小さすぎるため、フィルターを通過するためには、コイルをほどいて伸長する必要がある。ひとたび一端が２つの膜の間の空間に入ると、電場勾配が生じる。これは、ポリマーの先端（検知細孔に最も近い）がポリマーの残りの部分よりも強い引っ張り力を受けることを意味する。この伸張のメカニズムは、フィルター膜なしでも生じる。しかし、フィルター膜との接触による摩擦と相まって、ポリマーはより伸張し、捕捉前にポリマーが取り得るコンフォメーションの数が少なくなる。ポリマーがフィルターを通過するには線状に伸張する必要があるため、フィルター膜によってポリマーの通過時に想定可能なコンフォメーションの数を制限し、つど極めて一貫した移動動態を得ることができる。
【００４７】
対照デバイスには依然として電場勾配が存在するが、検知細孔の直径の２乗に比例する物理的な広がりがあることから、小さな細孔の場合には特に、フィルター膜が存在しない場合よりも伸張が不完全になる。このように、フィルター膜を用いることで、検知細孔の大きさや大きさの安定性への依存がなくなり、全ての細孔が、たとえ小さな細孔であっても、着目する分析物の通過を検知する極めて一貫したセンサーになる。フィルター膜は、本質的に、センサーが検知細孔に近づくにつれてポリマーを最大限に伸張させるメカニズムである。
【００４８】
例示的な実施形態では、フィルター膜の細孔はランダムに分布している。ナノフィルター細孔がランダムに分布している事実がゆえ、上述した区分を作るポリマーの長さは、検知細孔付近にあるナノフィルター細孔の局所的な分布に応じてデバイスごとに若干異なる場合がある。それにもかかわらず、どの長さがどの区分になるかを予測することが可能である。他の実施形態では、どの長さがどの区分になるかを予測できるように、フィルター膜の細孔のパターンと位置を制御することができる。
【００４９】
他の例では、詰まりを利用して、ポリマーが検知細孔内にある時間を延ばすことができる。この用途では、着目するポリマーが長い範囲になるように、ナノデバイスの寸法を調整する必要がある。詰まったポリマーについては、例えば、詰まっている間にＤＣ電場にＡＣ電場を重ねることにより、制御可能な状態で移動させることができる。ポリマーが細孔内にある時間を延ばすことで、ポリマーの長さに沿った特徴のより正確なマッピングおよび／または検出目的でより低帯域幅の電子機器の使用が可能になる。
【００５０】
ナノデバイス４０の別の用途に、ナノポアサイズ分光法がある。ナノフィルターを使用すると通過時間の標準偏差が最小になるため（図９および図１０参照）、これを活用し、ＤＮＡフラグメントが混じった集団を区別するためのＤＮＡサイズ分解能を向上させることができる。ここでの重要な改善は、過去、通常のナノポアではＤＮＡを長さで区別する際に約１０００ｂｐの解像度しか達成できず、細孔が厳密に正しい大きさでも約４００ｂｐの解像度（具体的には、１００ｂｐと５００ｂｐとを区別）を達成できただけであるが、提案されたナノデバイス４０は、検知細孔がＬｉＣｌ塩で不安定な場合であっても、検知細孔の大きさを問わず短いポリマーから中程度のポリマー長の範囲で５００ｂｐの解像度を実現できる点にある。ＫＣｌ溶液などでＤＮＡの電荷をシールドするためにＫ＋など異なるカチオン種を使用すると、より良い性能（例：約１００ｂｐ）が期待される。フィルター膜がないと、分布は検知細孔の大きさに極めて依存するため、デバイスの信頼性が低下して故障しやすくなるが、フィルター膜を適所に設けることで、この依存性がなくなり、サイズ分光法の信頼性が高くなる。
【００５１】
本開示の別の態様では、提案された検知構造体を、分子が折り畳まれた状態での移動を抑制するように構成することもできる。この態様でも、検知構造体は、上述したようなナノデバイスの流体チャネルに配置される。検知構造体に電位を加えることによって検知構造体のナノポアを介して標的ポリマーが駆動され、検知膜のナノポアを通る標的ポリマーの通過時間が測定される。この場合、任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離は、折り畳みを抑制するために特定の方法で構成される。具体的には、任意の２つのナノポア間の平均最近隣距離が、標的分子が自由用液中にあるときの標的分子の回転半径未満になるように、複数のナノポアがフィルター膜に形成されている。
【００５２】
実験データから、この折り畳みを抑制するアプローチを確認する。ＤＮＡの単一ファイルの通過がタイプ１のイベント、ＤＮＡが中央で折り畳まれ、完全に折り畳まれた状態で移動するイベントがタイプ２のイベントになるように定義し、折り畳まれた状態でイベントが開始される、部分的に折り畳まれたイベントがタイプ２１のイベントになるように定義する。折り畳み率は、折り畳まれた状態で費やされた時間ｔ２と、合計通過時間と折り畳まれた時間との和ｔｔｏｔａｌ＋ｔ２との比として次のように定義される。
【数２】
2020517968.tif 000003
【００５３】
これは、ＤＮＡ骨格に沿った折り畳みの部分的な位置の代わりに使用可能である。タイプ１のイベントではｆ＝０、タイプ２のイベントではｆ＝０．５であり、部分的に折り畳まれたタイプ２１のイベントはその間にある。各タイプの例が、図１３の挿入図に見られる。
引き続き図１３を参照すると、研究対象とした８つのナノデバイスのうち２つが、検知細孔は折り畳まれた状態での移動を可能にするのに十分な大きさであるにもかかわらず、折り畳まれた状態での移動をほぼ完全に抑制したことに注意されたい。しかし、残りの６つのナノデバイスは、対照デバイス（すなわち、フィルター膜なし）と同様の挙動を示した。それぞれのデバイスで研究対象とした全てのＤＮＡ長で折り畳み抑制が発生した（または発生しなかった）ため、折り畳みを抑制する要因となるのはフィルター膜の静的な性質のはずであるが、これは必ずしも全てのナノデバイスに存在するとは限らない。その理由として最も可能性があるのは、ナノフィルターの細孔の大きさと位置がランダムに分布していることである。
【００５４】
ＤＮＡは堅いポリマーであるため、折り畳んでナノポアに入れるには相当な力が必要である。フィルター膜のインピーダンスが低いことから、電圧の大半が検知細孔で降下して電圧の降下がわずかしかなく、フィルター膜に存在する力は小さい。電場は検知細孔から離れるにつれて検知細孔からの半径方向距離の２乗で減衰するため、検知細孔からの隙間の高さとほぼ等しい横方向距離の範囲内にあるナノフィルター細孔だけが、実際にＤＮＡを通過させられるだけの十分な電圧降下となる。考慮対象とした多孔度については、アクティブにＤＮＡを通過させるナノフィルター細孔が８つ未満であることを意味する。検知細孔に近い全てのナノフィルター細孔が非常に小さい場合（すなわち、二本鎖ＤＮＡの持続長または約３０ｎｍよりも小さいと定義される場合）、折り畳まれた構成でＤＮＡをフィルターに通すには力が不十分であろう。ＤＮＡが膜の間にある時間は、完全に緩むには不十分であるため、フィルターを通過する際に折り畳まれていない状態だと、検知細孔も折り畳まれていない状態で通過することになりやすい。この場合、ナノフィルター細孔を小さく（＜３０ｎｍ）することで、フィルター膜が最適化される。
【００５５】
あるいは、ナノフィルターを通過するＤＮＡ分子が両端からほぼ常に両方の細孔に同時に捕捉されるほど検知細孔に最も近い２つのナノフィルター細孔が接近してしまったら、実際に移動させる前にナノフィルター細孔を線形化して選択する必要がある（すなわち、図７Ｃに示すような状況）。このプロセスでは、ＤＮＡが線状になり、折り畳まれていない状態での捕捉が促進される傾向にある。なぜなら、ポリマーが、検知細孔を通って移動する前に引っ張り力に抗って伸びるためである。この場合、細孔間の平均距離が膜間の隙間の高さよりも短くなるような非常に高い多孔性を持つことでフィルター膜が最適化され、ナノフィルター細孔が必ずしもポリマーの持続長よりも小さくなくても、折り畳みの抑制が可能になる。
【００５６】
このシナリオでは、折り畳みを抑制するにはｘ＜＜Ｌ（例えば、ｘ＜Ｌ／５）が必要であるため、ポリマーは２つのナノフィルター細孔を貫通する可能性が非常に高く、ｈ＞Ｌ／２が必要であるため、ポリマーは両端が同時に検知細孔に入るほど長くはない。繰り返すが、Ｙは、可撓性のフィルター膜が検知膜に接触するのを防ぐことができる程度に小さくなければならない点でのみ制約される。例えば、１０００ｂｐのｄｓＤＮＡ（３４０ｎｍ）の折り畳みを抑制するには、ｘ＜６８ｎｍおよびｈ＞１７０ｎｍが必要であろう。使用するナノフィルター特性（厚さ５０ｎｍ）に対して、Ｙ＝１０００ｎｍも同様に機能するであろう。上述したように、他の寸法を制限することができる。
【００５７】
標的ポリマーの移動を制御する別の方法に、検知構造体の検知膜とフィルター膜との間に形成された空洞への出入りがある。検知構造体に電位を加えることにより、標的ポリマーを空洞に押し込むことができる。例えば、ＤＮＡが検知細孔側から捕捉されて膜間の隙間に引き込まれるようにナノデバイス４０を逆に動作させると、エントロピートラップとして機能する。ナノフィルターと検知膜との間の隙間ではＤＮＡに加わる力が小さいため、ＤＮＡは、ナノフィルターが適所に配置されていない場合よりも長くそこにトラップされやすい。従って、標的ポリマーが空洞にトラップされる。このトラップ時間を最大にするには、膜間の隙間ｈを少なくとも検知細孔の捕捉半径と同じ大きな隙間にすることが重要である（通常１００〜１０００ナノメートル台）。これによって、ナノフィルターでの電圧降下が拡散をなくすには不十分になり、トラップ時間が非常に長くなるはずである。捕捉半径を正確に推定するのは困難であるが、通常は１００〜１０００ｎｍ台であるため、ｄｓＤＮＡでの要件はｈ＞１０００ｎｍおよびｄ＜３０ｎｍであると言える。その後、検知構造体に加える電位を反転させることにより、標的ポリマーが空洞から排出される。このデバイスの違いは、隙間におさまれば、どのような長さのポリマーであっても動作できることである。
【００５８】
トラップ時間を最大にするための別の調整パラメーターは、非常に小さなナノフィルター細孔（例えば、＜３０ｎｍ）を使用することであり、これによって、移動に対するエントロピー障壁が大きくなる。多孔度を高める方法でも、ナノフィルターでの電場が低下し、それによって脱出がより困難になる。通常、ナノフィルター細孔の大きさと多孔度との間には相互作用があり、トラップ時間を最大にするために、これらのパラメーターを一緒に調整する必要がある。トラップの用途で最も重要なパラメーターは、ナノフィルター膜の活性領域の電気抵抗と検知細孔の電気抵抗との比である。エントロピートラップ用途の場合、この値を極めて小さくしておく必要がある。例えば、検知膜の電気抵抗に対するフィルター膜の電気抵抗の比は、０．０１未満であるのが好ましい。
【００５９】
図１４に、エントロピートラップとしてのこれらのデバイスの動作に関する原理データの証明を示す。この図は、トラップされる分子のローディングとその後の回収を示している。ナノケージには、ナノスケールリアクターとしての用途があろう。この用途では、検知細孔を介してトラップにＤＮＡがロードされ、ＤＮＡはそこで、ナノフィルターを通って膜間の空間内まで自由に拡散できる程度に小さく、システムのナノフィルター側に存在するいくつかの小分子と相互作用する。その後、電圧を逆にして反応生成物を取り戻し、研究することができる。
【００６０】
別の可能な用途として、隙間内を局所的に高濃度にするために低濃度サンプルを高電圧で膜間の隙間に捕捉した上で、より詳細な研究のために、電圧を反転して下げ、低電圧で再捕捉するコンセントレータがある。
【００６１】
フィルター膜は通常、フィルターとして機能する。これらのナノフィルターは、球状の分子に対して非常にはっきりとサイズ排除ができる一方で、自由溶液サイズがナノフィルター細孔よりも大きい場合でも、線形ポリマーを通過させる。これは、検知細孔を詰まらせる多種多様な生体分子を含有する実世界のサンプル（血液など）をクリーンアップするためのフィルターとして使用できる。着目する標的のみを通過させつつ、全てのバックグラウンド分子を除外するために、ナノフィルター細孔の大きさを調整することができる。ここで必要なのは、ナノフィルター細孔が、フィルター処理が必要な最小粒子（ｄ＜ｆ）を排除できるほどに十分に小さく、研究対象となる標的ポリマーは短いものから中程度の長さのものであるという点であって、ｆはフィルター処理が必要な最小粒子の直径である。したがって、ナノポアフィルターの寸法は、用途とサンプル内の予想される分子の大きさによって異なる。
【００６２】
ナノフィルターと検知細孔との間の隙間にある流体は必然的に静止し、流れがないため、ナノフィルター膜の上に横流が存在する場合でも、ナノフィルターを使用して検知細孔と接触する流体の剪断のない領域を作成できる。検知細孔の位置で剪断流が発生しないため、これによって検知細孔によるポリマーの高い捕捉率が可能になるとともに、新たな分析物を細孔の近くに移動しやすくする目的で、ナノフィルター上で流れを利用することも可能になる。
【００６３】
上述した実施形態の説明は、例示および説明の目的で提供された。網羅的であること、または開示を制限することは意図されていない。特定の実施形態の個々の要素または特徴は、通常はその特定の実施形態に限定されないが、適用可能な場合には入れ替え可能であり、具体的に図示または説明がなくても選択された実施形態で使用できる。同じことが多くの点で異なる場合もある。そのような変形は、本開示からの逸脱とみなされるべきではなく、そのようなすべての改変も本開示の範囲内に含まれることが意図されている。
【００６４】
本明細書で使用する用語は、特定の例示的な実施形態のみを説明するためのものであり、限定することを意図するものではない。本明細書で使用する場合、単数形は、文脈から複数形を含まないことが明らかに示されていない限り、複数形も含むことを意図している場合がある。「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ」は包括的であるため、表記の特徴、整数、工程、動作、要素および／または構成要素の存在を示すが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、動作、要素、構成要素および／またはそれらの群の存在または追加を排除しない。本明細書に記載の方法の工程、プロセスおよび動作は、特に性能の順序として特定されない限り、言及または図示された特定の順序で性能が発揮される必要があると解釈されるべきではない。また、追加の工程または代わりの工程を使用できることを理解されたい。
【００６５】
要素または層が別の要素または層「の上にある」、「に嵌まっている」、「と接続されている」、「の上に配置されている」または「と連結されている」という場合、直接的に他の要素または層の上にある、他の要素または層に嵌まっている、他の要素または層と接続されている、他の要素または層の上に配置されている、他の要素または層と連結されていてもよいし、介在する要素または層が存在してもよい。対照的に、要素または層が別の要素または層「のすぐ上にある」、「に直接嵌まっている」、「と直接接続されている」または「と直接連結されている」という場合、介在する要素または層は存在しない場合がある。要素間の関係を説明するために用いた他の単語も、同様に解釈する必要がある（例：「間に」と「直接間に」、「隣接する」と「直接隣接する」など）。本明細書で使用する場合、「および／または」という用語は、そこで列挙された１つ以上の項目のありとあらゆる組み合わせを含む。
【００６６】
本明細書では、第１、第２、第３などの用語を使用して様々な要素、構成要素、領域、層および／またはセクションを説明する場合があるが、これらの要素、構成要素、領域、層および／またはセクションは、これらの用語に限定されるべきではない。これらの用語は、１つの要素、構成要素、領域、層またはセクションを別の領域、層またはセクションから区別するためにのみ使用できるものである。本明細書で使用する「第１」、「第２」などの用語および他の数値用語は、文脈により明確に示されない限り、順序または順番を意味しない。したがって、以下で説明する第１の要素、構成要素、領域、層またはセクションは、例示的な実施形態の教示から逸脱することなく、第２の要素、構成要素、領域、層またはセクションと呼ぶことができる。
【００６７】
「内側」、「外側」、「真下」、「下」、「より下」、「上」、「より上」などの空間的に相対的な用語は、本明細書では、説明を簡単にするために、図示したような１つの要素または特徴と他の要素または特徴との関係を説明するのに使用される場合がある。空間的に相対的な用語は、図示した向きに加えて、使用中または操作中のデバイスの別の向きを包含することを意図している場合がある。例えば、図のデバイスを裏返すと、他の要素または特徴の「下」または「真下」にある要素は、他の要素または特徴の「上」に配置される。したがって、「下」という用語の例には、上と下の両方の向きが含まれる。デバイスは、別の方法で方向付けられ（９０度または他の方向で）、それに応じて本明細書で使用される空間的に相対的な記述子が解釈されてもよい。
【図１】
2020517968.tif 000004
【図２】
2020517968.tif 000005
【図３Ａ】
2020517968.tif 000006
【図３Ｂ】
2020517968.tif 000007
【図３Ｃ】
2020517968.tif 000008
【図４】
2020517968.tif 000009
【図５Ａ】
2020517968.tif 000010
【図５Ｂ】
2020517968.tif 000011
【図６】
2020517968.tif 000012
【図７】
2020517968.tif 000013
【図８】
2020517968.tif 000014
【図９Ａ−９Ｂ】
2020517968.tif 000015
【図１０Ａ】
2020517968.tif 000016
【図１０Ｂ】
2020517968.tif 000017
【図１１Ａ】
2020517968.tif 000018
【図１１Ｂ】
2020517968.tif 000019
【図１２】
2020517968.tif 000020
【図１３】
2020517968.tif 000021
【図１４】
2020517968.tif 000022
【国際調査報告】
2020517968.tif 000023