(57)【要約】  ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）またはＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）を治療、抑制または緩和するための治療による効果が見込まれる対象として特定または選択された対象において、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）やＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）などのＸ連鎖性疾患を治療、抑制または緩和するためのシステムおよび方法について記載する。本発明のシステムは、内在性ＷＡＳ遺伝子座の改変を目的として共送達できるように構成されたヌクレアーゼおよびドナーベクターコンストラクトを含む。
2020517270.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）のための核酸であって、
ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；
１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第２の配列；および
１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列
を含む核酸。
【請求項２】
前記ＷＡＳ遺伝子が、配列番号４に示される核酸配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
第２の配列が、配列番号１７に示される核酸配列を含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
前記１以上のヌクレアーゼ結合部位が、フォワードＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースＴＡＬＥＮ結合部位を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項５】
前記１以上のヌクレアーゼ結合部位が、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）結合部位である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項６】
１以上のエンハンサーエレメントをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項７】
相同性アーム配列をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項８】
プロモーターをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸。
【請求項９】
細胞におけるＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）の発現に対して相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進するためのベクターであって、
ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；
１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第２の配列；および
１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列
を含むベクター。
【請求項１０】
前記ＷＡＳ遺伝子が、配列番号４に示される核酸配列を含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
第２の配列が、配列番号１７に示される核酸配列を含む、請求項９または１０に記載のベクター。
【請求項１２】
前記１以上のヌクレアーゼ結合部位が、フォワードＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースＴＡＬＥＮ結合部位を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１３】
前記１以上のヌクレアーゼ結合部位が、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）結合部位である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１４】
１以上のエンハンサーエレメントをさらに含む、請求項９〜１３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１５】
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である、請求項９〜１４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１６】
自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項９〜１５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１７】
前記細胞がヒト細胞である、請求項９〜１６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１８】
前記細胞が初代細胞である、請求項９〜１７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１９】
前記細胞が自家細胞である、請求項９〜１８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２０】
前記細胞がＴ細胞である、請求項９〜１９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２１】
前記細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項９〜１９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２２】
前記細胞がＣＤ３４＋ＨＳＣである、請求項９〜１９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項２３】
細胞におけるＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）の発現に対して相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進するシステムであって、請求項９〜２２のいずれか１項に記載のベクターと、ヌクレアーゼをコードする核酸とを含むシステム。
【請求項２４】
前記ヌクレアーゼがＴＡＬＥＮヌクレアーゼである、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２５】
前記ヌクレアーゼがＣａｓヌクレアーゼである、請求項２３に記載のシステム。
【請求項２６】
前記ベクターおよび前記核酸が、前記細胞に共送達されるように構成されている、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２７】
前記細胞への共送達により、内在性のＷＡＳ遺伝子座が改変される、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記細胞が初代ヒト造血細胞である、請求項２３〜２７のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項２９】
ＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）を発現させるための細胞であって、
ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；
プロモーターをコードする第２の配列；
１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第３の配列；および
１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第４の配列
を含む核酸を含む細胞。
【請求項３０】
前記核酸がベクターに組み込まれている、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
前記ベクターがアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
前記ＡＡＶが自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である、請求項３１に記載の細胞。
【請求項３３】
ヒト細胞である、請求項２９〜３２のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３４】
初代細胞である、請求項２９〜３３のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３５】
自家細胞である、請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３６】
Ｔ細胞である、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３７】
造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３８】
ＣＤ３４＋ＨＳＣである、請求項２９〜３５のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項３９】
ＷＡＳ遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）の促進を必要とする対象において、ＷＡＳ遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進する方法であって、
請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の細胞または請求項９〜２２のいずれか１項に記載のベクターを前記対象に投与すること；および
ヌクレアーゼを前記対象に投与すること
を含む方法。
【請求項４０】
前記ヌクレアーゼがＴＡＬＥＮヌクレアーゼである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記ヌクレアーゼがＣａｓヌクレアーゼである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記ヌクレアーゼが、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に投与される、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が前記対象の細胞であり、該細胞が、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸または請求項９〜２２のいずれか１項に記載のベクターの導入により遺伝子改変されている、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
前記投与が養子細胞移入により行われる、請求項３９〜４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞がヒト細胞である、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞が初代細胞である、請求項３９〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が自家細胞である、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記細胞がＴ細胞である、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記細胞がＣＤ３４＋ＨＳＣである、請求項３９〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象が雄性の対象である、請求項３９〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象がウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）に罹患している、請求項３９〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
前記対象がＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）に罹患している、請求項３９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）および／もしくはＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、またはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、該疾患および／または該症状を治療、抑制または緩和する方法であって、
請求項２９〜３８のいずれか１項に記載の細胞もしくは請求項９〜２２のいずれか１項に記載のベクターを前記対象に投与すること；
ヌクレアーゼを前記対象に投与すること；
任意で、ＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴ、もしくはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の治療による効果が見込まれる対象として前記対象を同定すること；ならびに／または
任意で、前記対象において、ＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴの進行の改善もしくはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の改善を評価すること
を含む。
【請求項５５】
前記ヌクレアーゼがＴＡＬＥＮヌクレアーゼである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ヌクレアーゼが、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に投与される、請求項５４〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞が前記対象の細胞であり、該細胞が、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸または請求項９〜２２のいずれか１項に記載のベクターの導入により遺伝子改変されている、請求項５４〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記投与が養子細胞移入により行われる、請求項５４〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞がヒト細胞である、請求項５４〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が初代細胞である、請求項５４〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞が自家細胞である、請求項５４〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞がＴ細胞である、請求項５４〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記細胞が造血幹細胞（ＨＳＣ）である、請求項５４〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記細胞がＣＤ３４＋ＨＳＣである、請求項５４〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記対象が雄性の対象である、請求項５４〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
血小板減少症を改善する、請求項５４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
血小板数を増加させる、請求項５４〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年４月２１日に出願された米国仮出願第６２／４８８，２４９号の優先権の利益を主張するものである。この仮出願の開示内容は、参照により本明細書にその全体が明示的に援用される。
【０００２】
配列表の参照
本願は、電子形式の配列表とともに出願されている。この配列表は、２０１８年４月１９日に作成された２０１８−０４−１９  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ−ＳＣＲＩ．１４９ＷＯ．ｔｘｔという名称のファイルとして提供されており、該ファイルのサイズは１５８ｋｂである。この電子形式の配列表に記載の情報は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００３】
分野
本明細書に記載の実施形態は、全体として、初代ヒト造血幹細胞における遺伝子編集に関する。より詳細には、本明細書に記載の実施形態は、遺伝子の効率的な相同組換え修復が実施できるように構成された核酸およびベクター、ならびにＸ連鎖性劣性疾患などの遺伝的欠損を修復する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）は、ＷＡＳ遺伝子の変異に起因する遺伝性原発性免疫不全症であり、ＷＡＳ遺伝子は、アクチン細胞骨格を制御してシグナル伝達機能の変化および／または多系統の造血細胞の発生をもたらすタンパク質をコードする遺伝子である。ＷＡＳは、男性の約２５０，０００人に１人の割合で発症するＸ連鎖性劣性疾患である。この疾患の特徴としては、湿疹、血小板減少や免疫不全が挙げられる。ＷＡＳでは、ＷＡＳ遺伝子の変異により、変異または欠損したＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）が産生される。
【０００５】
Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）は、ＷＡＳに関連する遺伝性凝固障害である。ＸＬＴでは、正常または健康な個体より血中の血小板数が少なく、また血小板のサイズも小さいため、凝固過程に支障が生じ、主に循環器系に影響が現れる。ＸＬＴでは、ＷＡＳ遺伝子の変異により、ＷＡＳｐの産生量が減少したり、ＷＡＳｐ自体が産生されなかったり、あるいは変異したＷＡＳｐが産生される。
【０００６】
ＷＡＳｐは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるアクチン核化因子Ａｒｐ２／３複合体の活性化因子であり、造血細胞でのみ発現している。ＷＡＳｐは、白血球の細胞表面の受容体と細胞骨格とをつなぐ重要な因子として機能すると考えられている。
【０００７】
現在、ＷＡＳまたはＸＬＴを患う個体に対して行われている治療は対症療法が中心である。ＷＡＳまたはＸＬＴに適用可能な根治療法は同種幹細胞移植に限られている。ウイルスを用いた遺伝子置換も、現在実施中のいくつかの臨床試験において試されているが、ＷＡＳやＸＬＴの治療法の幅を広げる必要があることは明白である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
いくつかの実施形態は、自家造血幹細胞の内在性ＷＡＳ遺伝子座を正常に修正または修復する治療的方法に関する。いくつかの実施形態には、初代ヒト造血細胞のＷＡＳ遺伝子座を編集するよう構成された転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）および群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓを含む、組成物および方法が包含される。また、いくつかの実施形態は、初代ヒト造血細胞の内在性ＷＡＳ遺伝子座を改変するための、ヌクレアーゼとＡＡＶドナーの共送達に関する。
【０００９】
いくつかの実施形態は、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）のための核酸に関する。いくつかの実施形態において、前記核酸は、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列、１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第２の配列、および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＷＡＳ遺伝子は、配列番号４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の配列は、配列番号１７に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースＴＡＬＥＮ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）結合部位である。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、相同性アーム配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、プロモーターをコードする核酸配列をさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態は、細胞におけるＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）の発現に対して相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進するためのベクターに関する。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列、１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第２の配列、および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＷＡＳ遺伝子は、配列番号４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の配列は、配列番号１７に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースＴＡＬＥＮ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）結合部位である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、１以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。
【００１１】
いくつかの実施形態は、細胞におけるＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）の発現に対して相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進するシステムに関する。いくつかの実施形態において、前記システムは、ベクターと、ヌクレアーゼをコードする核酸とを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ベクターおよび前記核酸は、前記細胞に共送達されるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記細胞への共送達により、内在性のＷＡＳ遺伝子座が改変される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト造血細胞である。
【００１２】
いくつかの実施形態は、ＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）を発現させるための細胞に関する。いくつかの実施形態において、前記細胞は核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列、プロモーターをコードする第２の配列、１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第３の配列、および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第４の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸はベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。
【００１３】
いくつかの実施形態は、ＷＡＳ遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）の促進を必要とする対象（例えば、ＸＬＴに罹患している対象などの、ＷＡＳ遺伝子のＨＤＲによる効果が見込まれる対象として同定または選択された対象）において、ＷＡＳ遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進する方法に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、ＷＡＳ遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）の促進を必要とする対象に、本明細書に記載の細胞または本明細書に記載のベクターを投与すること、およびヌクレアーゼを前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞は前記対象の細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、本明細書に記載の核酸または本明細書に記載のベクターの導入により遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入により行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性の対象である。いくつかの実施形態において、前記対象は、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）に罹患している対象として同定または選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記対象は、Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）に罹患している対象として同定または選択された対象である。
【００１４】
本明細書におけるいくつかの実施形態は、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）および／もしくはＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、またはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、該疾患および／または該症状を治療、抑制または緩和する方法に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、本明細書に記載の細胞もしくは本明細書に記載のベクターを前記対象に投与すること、ヌクレアーゼを前記対象に投与すること、任意で、ＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴ、もしくはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の治療による効果が見込まれる対象として前記対象を同定もしくは選択すること、ならびに／または任意で、前記対象において、ＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴの進行の改善もしくはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の改善を評価することを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞は前記対象の細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、本明細書に記載の核酸または本明細書に記載のベクターの導入により遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入により行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性の対象である。いくつかの実施形態において、前記方法は血小板減少症を改善する。いくつかの実施形態において、前記方法は血小板数を増加させる。いくつかの実施形態において、前記対象は、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）に罹患している対象として同定または選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記対象は、Ｘ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）に罹患している対象として同定または選択された対象である。
【００１５】
第１の態様において、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）のための核酸が提供され、該核酸は、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第２の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＷＡＳ遺伝子は、配列番号４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の配列は、配列番号１７に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースＴＡＬＥＮ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）結合部位である。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、相同性アーム配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、プロモーターをコードする核酸配列をさらに含む。
【００１６】
第２の態様において、細胞におけるＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）の発現に対して相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進するためのベクターが提供され、該ベクターは、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第２の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＷＡＳ遺伝子は、配列番号４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の配列は、配列番号１７に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースＴＡＬＥＮ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）結合部位である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、１以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。
【００１７】
第３の態様において、細胞におけるＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）の発現に対して相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進するシステムが提供され、該システムは、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載のベクターと、ヌクレアーゼをコードする核酸とを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ベクターおよび前記核酸は、前記細胞に共送達されるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記細胞への共送達により、内在性のＷＡＳ遺伝子座が改変される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト造血細胞である。
【００１８】
第４の態様において、ＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）を発現させるための細胞が提供され、該細胞は、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第３の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第４の配列を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、ベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。
【００１９】
第５の態様において、ＷＡＳ遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）の促進を必要とする対象において、ＷＡＳ遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進する方法が提供され、該方法は、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載の細胞またはベクターを前記対象に投与すること；およびヌクレアーゼを前記対象に投与することを含む。前記細胞は、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第３の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第４の配列を含む核酸を含む。前記ベクターは、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第２の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＷＡＳ遺伝子は、配列番号４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の配列は、配列番号１７に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースＴＡＬＥＮ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）結合部位である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、１以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。いくつかの実施形態において、前記核酸は、ベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞は前記対象の細胞であり、該細胞は、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載の核酸またはベクターの導入により遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入により行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性の対象である。いくつかの実施形態において、前記対象はウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）に罹患している。いくつかの実施形態において、前記対象はＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）に罹患している。
【００２０】
第６の態様において、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）および／もしくはＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、またはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、該疾患および／または該症状を治療、抑制または緩和する方法が提供され、該方法は、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載の細胞もしくはベクターを前記対象に投与すること；ヌクレアーゼを前記対象に投与すること；任意で、ＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴ、もしくはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の治療による効果が見込まれる対象として前記対象を同定すること；ならびに／または任意で、前記対象において、ＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴの進行の改善もしくはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の改善を評価することを含む。前記細胞は、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第３の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第４の配列を含む核酸を含む。前記ベクターは、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第２の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＷＡＳ遺伝子は、配列番号４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の配列は、配列番号１７に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースＴＡＬＥＮ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）結合部位である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、１以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。前記ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。前記ヌクレアーゼは、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に投与される。前記細胞は前記対象の細胞であり、該細胞は、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載の核酸またはベクターの導入により遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入により行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性の対象である。いくつかの実施形態において、前記方法は血小板減少症を改善する。いくつかの実施形態において、前記方法は血小板数を増加させる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ−１Ｂ】初代Ｔ細胞のＴＡＬＥＮおよびガイドＲＮＡの切断効率を評価した結果である。図１Ａは、ガイドとＴＡＬＥＮの注釈を付したＷＡＳ遺伝子座の模式図である。ヒトＷＡＳ遺伝子内におけるＷＡＳ  ＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥＮ＃１（Ｔ１）およびＴＡＬＥＮ＃２（Ｔ２））ならびにガイドＲＮＡ（Ｇ１、Ｇ２、Ｇ３およびＧ４）の切断部位の位置を示す。この模式図は原寸に比例して描写したものではない。図１Ｂは、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲガイドによるＷＡＳ遺伝子座の破壊率を示した図である。初代ヒトＴ細胞にＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（Ｔ１、Ｔ２）またはＣａｓ９  ｍＲＮＡ（ｇＲＮＡ（Ｇ１〜４）を発現するｓｃＡＡＶと共送達）をトランスフェクションした５日後にＴ７アッセイにより検出されたＮＨＥＪ（非相同末端連結）イベントの発生率を示す。Ｎ＝３は、それぞれ独立して実施した実験の回数を示す。ＴＡＬＥＮ＃１およびＧ１を選択し、以下の実験に使用した。
【００２２】
【図２Ａ−２Ｉ】ＴＡＬＥＮと合理的に設計されたＡＡＶドナーテンプレートとを用いた初代ヒトＴ細胞の編集を示した図である。図２Ａは、ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮを用いたターゲティングに使用されるＷＡＳ遺伝子座およびＡＡＶドナーテンプレートの模式図である。小さな四角は、ＴＡＬＥＮフォワード結合部位（Ｔ−ｆｏｒ）およびＴＡＬＥＮリバース結合部位（Ｔ−ｒｅｖ）を表す。相同性アームも示した。Ｘは、＃１２４４ベクターのＴＡＬＥＮによる切断を避けるためにＴＡＬＥＮの結合部位の上流に位置するＴが変異されていることを表す。＃１２６２ベクターは、エクソン１とリバースＴＡＬＥＮの結合部位との間の全領域が欠失したベクターである。図２Ｂは、初代Ｔ細胞のビーズ刺激で始まる遺伝子編集操作のタイムラインを示した図である。培養容量の２０％の濃度になるようにＡＡＶを添加した。図２Ｃおよび２Ｄは、ＨＤＲの指標となるＧＦＰ発現の経時変化（図２Ｃ）および細胞生存率の経時変化（図２Ｄ）を示した図である。図２Ｅは、細胞にＴＡＬＥＮをトランスフェクションし、ＭＮＤプロモーター駆動性の青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を有する、相同性アームを持たないＡＡＶベクターで形質導入を行った結果である。１５日目のＡＡＶベクターに由来する蛍光は、該ベクターがランダムに組込まれたことを示す指標である。１５日目のＡＡＶベクターに由来する蛍光は、該ベクターがランダムに組込まれたことを示す指標である。図２Ｆは、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡとＡＡＶドナーテンプレートの共送達後１５日目のＧＦＰ発現を示した代表的なＦＡＣＳプロットである。図２Ｇは、１５日目のＧＦＰ発現を示した別の代表的なＦＡＣＳプロットである。Ｎ＝３は、３名の異なるドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。図２Ｈは、相同性アームを持たないＡＡＶを用いた場合のヌクレアーゼの特異性を調べた結果である。初代Ｔ細胞にＴＡＬＥＮをトランスフェクションし、ＭＮＤプロモーター駆動性の青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を有する、相同性アームを持たないＡＡＶベクターで形質導入を行った。１５日目のＡＡＶベクターに由来する蛍光は、ランダムな組込みが行われたことを示す指標である。ｎ＝３は、３名の異なるドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。データは平均±ＳＥＭで示した。図２Ｉは、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡとＡＡＶドナーテンプレートの共送達後１５日目のＧＦＰ発現を示した代表的なＦＡＣＳプロットである。Ｎ＝３は、３名の異なるドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。
【００２３】
【図３Ａ−３Ｈ】ＣＲＩＳＰＲとＡＡＶドナーとを用いて行う初代ヒトＴ細胞の編集を示した図である。図３Ａは、初代Ｔ細胞のＷＡＳ遺伝子座のＣＲＩＳＰＲによる編集を模式的に示したものである。ｓｃＡＡＶガイドＲＮＡベクター（Ｇ）、ドナーテンプレートＤＴ（変異ＰＡＭ）、およびガイド配列とドナー配列の両方を含むＡＡＶベクター（ＤＴＧ）を模式的に示す。ＤＴテンプレート、ＤＴＧテンプレートのいずれも、ガイドによる切断を避けるためにＰＡＭ部位が変異されている。ｓｃＡＡＶガイドＲＮＡベクター（＃１１８９（Ｇ））、ドナーテンプレート（＃１２０１（変異ＰＡＭ））、およびガイド配列とドナー配列の両方を含むＡＡＶベクター（＃１２１５（ＤＴＧ））を模式的に示す。ＰＡＭ変異ドナーテンプレート、ＤＴＧ  ＡＡＶのいずれも、ガイドによる切断を避けるためにＰＡＭ部位が変異されている。図３Ｂおよび３Ｃは、％ＧＦＰ＋細胞の経時変化（図３Ｂ）および細胞生存率の経時変化（図３Ｃ）を示したグラフである。１０％および２０％は、それぞれ培養容量に対する＃１２１５  ＡＡＶの添加量（％）を示す。＃１２１５以外のＡＡＶにおいては、培養容量の１０％のＡＡＶを添加した。図３Ｄは、Ｃａｓ９、ガイドおよび相同性アームを持たないＭＮＤ．ＢＦＰベクターを送達した際のＢＦＰ発現を示したグラフである。２０％は、培養容量に対するＡＡＶの添加量（％）を示す。特に記載がない場合は、培養容量の１０％のＡＡＶを添加した。図３Ｅは、１５日目のＧＦＰ発現を示したＦＡＣＳプロットである。Ｎ＝３は、３名の異なるドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。図３Ｆは、ＧＦＰ発現の経時変化を示した棒グラフである。１５日目の％ＧＦＰを％ＨＲの指標とする。ｎ＝３は、３名の異なるドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。データは平均±ＳＥＭで示した。２０％は、培養容量に対する＃１２１５  ＡＡＶの添加量（％）を示す。＃１２１５以外のＡＡＶにおいては、培養容量の１０％のＡＡＶを添加した。１５日目の％ＧＦＰを％ＨＲの指標とする。ｎ＝３は、３名の異なるドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。データは平均±ＳＥＭで示した。図３Ｇは、相同性アームを持たないＡＡＶを用いた場合のヌクレアーゼの特異性を調べた結果である。棒グラフは、Ｃａｓ９、ガイドおよび相同性アームを持たないＭＮＤ．ＢＦＰベクターを送達した際のＢＦＰ発現を示す。ｎ＝３は、３名の異なるドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。データは平均±ＳＥＭで示した。図３Ｈは、１５日目のＧＦＰ発現を示した代表的なＦＡＣＳプロットである。
【００２４】
【図４Ａ−４Ｄ】ＴＡＬＥＮとＡＡＶを共送達して、成体由来の動員ＣＤ３４＋細胞の編集を行った結果である。図４Ａは、ヒト成体由来の動員ＣＤ３４＋細胞に対する遺伝子編集操作のタイムラインを示した図である。図４Ｂおよび４Ｃは、ＨＤＲの指標となるＧＦＰ発現の経時変化（図４Ｂ）および生存率の経時変化（図４Ｃ）を示した図である。図４Ｄは、５日目のＧＦＰ発現を示した代表的なＦＡＣＳプロットである。
【００２５】
【図５Ａ−５Ｇ】ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡまたはＲＮＰとして調製したＣＲＩＳＰＲガイドと、ＡＡＶドナーとを共送達して、成体由来の動員ＣＤ３４＋細胞の編集を行った結果である。ＴＡＬＥＮまたはＲＮＰを用いた場合の、ヒトＣＤ３４＋細胞のＷＡＳ遺伝子座の破壊を示す。動員ヒトＣＤ３４＋細胞を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−３（６０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＳＣＧＭで４８時間培養した後、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてエレクトロポレーション法により、各ＴＡＬＥＮモノマー１μｇ、またはＣａｓ９タンパク質とシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とを１：１．２の比率で混合したリボ核タンパク複合体（ＲＮＰ）を導入した。使用したｓｇＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より購入したものであり、５’末端と３’末端の３つの末端部位のヌクレオチドが化学的に修飾されている。細胞を５日間培養した後、ゲノムＤＮＡを抽出した。ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮおよびガイドのそれぞれの切断部位の周辺領域を増幅し、ｐＪＥＴクローニングベクターにクローニングした。コロニーのシークエンシングを行い、挿入欠失の解析により切断部位における切断率（％）を定量した。Ｎ＝３は、３名のドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。図５Ａは、ＴＡＬＥＮまたはＲＮＰを用いた場合の、ヒトＣＤ３４＋細胞のＷＡＳ遺伝子座の破壊率を示した図である。動員ヒトＣＤ３４＋細胞を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−３（６０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＳＣＧＭで４８時間培養した後、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてエレクトロポレーション法により、各ＴＡＬＥＮモノマーｍＲＮＡ１μｇ、またはＣａｓ９タンパク質とシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とを１：１．２の比率で混合したリボ核タンパク複合体（ＲＮＰ）を導入した。使用したｓｇＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より購入したものであり、５’末端と３’末端の３つの末端部位のヌクレオチドが化学的に修飾されている。細胞を５日間培養した後、ゲノムＤＮＡを抽出した。ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮおよびガイドのそれぞれの切断部位の周辺領域を増幅し、ｐＪＥＴクローニングベクターにクローニングした。コロニーのシークエンシングを行い、挿入欠失の解析により切断部位における切断率（％）を定量した。Ｎ＝３は、３名のドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。図５Ｂは、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡまたはＲＮＰと、ＡＡＶドナーテンプレートとの共送達により、ＣＤ３４＋ＨＳＣのＷＡＳ遺伝子座をＨＤＲにより編集した結果である。図５Ｃは、編集後５日目の偽処理したＣＤ３４＋細胞、ＡＡＶで処理したＣＤ３４＋細胞、ＡＡＶ＋ＴＡＬＥＮで処理したＣＤ３４＋細胞（上段）またはＡＡＶ＋ＲＮＰで処理したＣＤ３４＋細胞（下段）のＧＦＰ発現を示したＦＡＣＳプロットである。図５Ｄは、編集した細胞の生存率を示した図である。棒グラフは、編集後２日目の偽処理した細胞および編集した細胞の生存率を示す。ＲＮＰはＮ＝８、ＴＡＬＥＮはｎ＝１２であり、４名を超える独立したドナー数を表す。図５Ｅは、ＴＡＬＥＮを用いて編集したＣＤ３４＋細胞のコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイの結果である。図５Ｆは、ＲＮＰを用いて編集したＣＤ３４＋細胞のＣＦＵアッセイの結果である。簡潔に述べると、編集した細胞または無処理の（偽処理した）細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４０３４培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に５００個ずつｎ＝２で播種し、３７℃で１２〜１４日間インキュベートした後、コロニーの形態とＧＦＰ発現に基づいてコロニーを計数した。ＣＦＵ−Ｅ：赤芽球コロニー形成単位、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球マクロファージ、Ｇ：顆粒球、ＧＥＭＭ：顆粒球、赤芽球、マクロファージ、巨核球、ＢＦＵ−Ｅ：赤芽球バースト形成細胞。ｎ＝３の実験および２名のドナー。データは平均±ＳＥＭで示した。図５Ｇは、ＨＤＲを評価するためのデジタル液滴ＰＣＲアッセイまたはフローサイトメトリー染色の結果である。
【００２６】
【図６Ａ−６Ｄ】ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ／ＲＮＰとＡＡＶドナーテンプレートの共送達によるＣＤ３４＋ＨＳＣのＷＡＳ遺伝子座の編集を行った結果である。図５と同様にヒト成体由来の動員ＣＤ３４＋細胞をＳＣＧＭ培地で培養した後、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてエレクトロポレーション法により、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡまたはＲＮＰ複合体を導入した。エレクトロポレーションの直後に、ドナーテンプレートを有するＡＡＶベクターを添加した。コントロールとして、無処理の細胞（偽処理）、およびヌクレアーゼのトランスフェクションは行わずにＡＡＶによる形質導入のみ行った細胞（ＡＡＶ）を用意した。図６Ａは、ＨＤＲの指標となる５日目の％ＧＦＰを示したグラフである。図６Ｂは、編集後２日目の編集した細胞の生存率を示した図である。ＴＡＬＥＮはＮ＝７、ＲＮＰはＮ＝３であり、独立したドナー数を表す。図６Ｃおよび６Ｄは、編集後１日目に、編集した細胞および偽処理した細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培地に播種してコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）アッセイを行った結果である。簡潔に述べると、それぞれの細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４０３４培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に５００個ずつｎ＝２で播種し、３７℃で１２〜１４日間インキュベートした後、コロニーの形態とＧＦＰ発現に基づいてコロニーを計数した。図６Ｃは、ＴＡＬＥＮを用いた実験のデータであり、図６Ｄは、ＲＮＰを用いた実験のデータである。ＣＦＵ−Ｅ：赤芽球コロニー形成単位、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球マクロファージ、Ｇ：顆粒球、ＧＥＭＭ：顆粒球、赤芽球、マクロファージ、巨核球、ＢＦＵ−Ｅ：赤芽球バースト形成細胞。
【００２７】
【図７Ａ−７Ｃ】編集したヒトＣＤ３４＋細胞の免疫不全ＮＳＧマウスへの生着実験の結果である。無処理のヒトＣＤ３４＋細胞、ＡＡＶで処理したヒトＣＤ３４＋細胞、およびＡＡＶとＲＮＰとで処理したヒトＣＤ３４＋細胞をそれぞれ２００万個ずつ、２５ｍｇ／ｋｇのブスルファンで前処置した免疫不全ＮＳＧマウスに注入した。移植後１０週目にマウスを屠殺し、ＢＭを採取した。図７Ａは、ヒトＣＤ４５マーカーの発現を指標として求めた、全個体における編集した細胞の生着率を示した図である。図７Ｂは、生着した細胞に占めるＧＦＰ＋細胞の割合（％）を示した図である。図７Ｃは、代表的なマウスのＦＡＣＳプロットである。
【００２８】
【図８】コドン最適化したヒトＷＡＳ遺伝子のｃＤＮＡを発現するＡＡＶベクターの構造である。プロモーターレスＧＦＰ（上段）またはプロモーターレスＷＡＳ  ｃＤＮＡ（下段）に、短いＷＰＲＥ（ＷＰＲＥ３と表記）とＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが続き、これら全体の両側に０．６ｋｂの相同性アームが配置されたＡＡＶベクターである。
【００２９】
【図９Ａ】ＮＳＧマウスに生着させるために用いる移入細胞の細胞生存率および％ＨＲを測定した代表的なデータである。ヒト成体由来の動員ＣＤ３４＋細胞の培養を、ＩＬ−３の代わりにＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍＬ）をＳＣＧＭ培地に添加した以外は上述の方法と同様にして行った。細胞に１μｇのＲＮＰ複合体をエレクトロポレーション法により導入し、ＡＡＶ（ＭＯＩ＝６２）を添加した。データは平均±ＳＥＭで示した。Ｎ＝５は、複数のドナーを用いて行った、独立した実験の回数を示す。
【００３０】
【図９Ｂ】移植後のＮＳＧマウスの骨髄における、編集した細胞の生着結果を示したデータである。６〜１０週齢のＮＳＧマウスに、リン酸緩衝生理食塩水で１：１希釈したＢＵＳＵＬＦＥＸ（Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ社）を２５ｍｇ／ｋｇまたは３５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射した。２４時間後、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した２×１０６個の偽処理した造血幹細胞または遺伝子編集した造血幹細胞（図５Ａと同様にして培養した）を、眼窩後方への注射により送達した。移植後１０〜１６週目に、マウスを安楽死させ、骨髄（ＢＭ）および脾臓を採取してヒト細胞の生着率を調べた。屠殺したマウスのＢＭ中のヒトＣＤ４５マーカーの発現を指標として求めた、各個体の編集した細胞の生着率をドットプロットで示す。各点は個々のマウスを示す。データは平均±ＳＥＭで示した。
【００３１】
【図９Ｃ】移植後１６週目のＮＳＧマウスの骨髄における、編集した細胞の生着結果を示したデータである。移植後１６週目にＮＳＧマウスの骨髄から採取した細胞の代表的なフロープロットを示す。左側は、無処理の細胞を移植したマウスから採取した骨髄のデータである。右側は、ＡＡＶ＋ＲＮＰで処理した細胞を移植したマウスから採取した骨髄のデータである。上段、左から右へ：ｈＣＤ４５：ｍＣＤ４５キメリズム、ヒトＣＤ４５でゲーティングしたＣＤ３３＋およびＣＤ１９＋染色。下段、左から右へ：ｈＣＤ４５＋細胞、ＣＤ３３＋細胞およびＣＤ１９＋細胞におけるＧＦＰ発現。
【００３２】
【図９Ｄ】移植後のマウスの脾臓における、編集した細胞の生着結果を示したデータである。屠殺したマウスの脾臓中のヒトＣＤ４５マーカーの発現を指標として求めた、１０〜１６週目の各個体における編集した細胞の生着率をグラフに示した。各点は個々のマウスを示す。データは平均±ＳＥＭで示した。
【００３３】
【図９Ｅ】ＮＳＧマウスの脾臓における、編集した細胞の生着結果を示したデータである。移植後１６週目にＮＳＧマウスの脾臓から採取した細胞の代表的なフロープロットを示す。左側は、無処理の細胞を移植したマウスから採取した脾臓のデータである。右側は、ＡＡＶ＋ＲＮＰで処理した細胞を移植したマウスから採取した脾臓のデータである。上段、左から右へ：ｈＣＤ４５：ｍＣＤ４５キメリズム、ヒトＣＤ４５でゲーティングしたＣＤ３３＋およびＣＤ１９＋染色。下段、左から右へ：ｈＣＤ４５＋細胞、ＣＤ３３＋細胞およびＣＤ１９＋細胞におけるＧＦＰ発現。
【図９Ｆ】ＮＳＧマウスにおけるＧＦＰ＋細胞の生着結果を示したデータである。１０〜１６週目に屠殺したＮＳＧマウスの骨髄と脾臓から回収されたｈＣＤ４５＋細胞中のＨＤＲ編集率（％ＧＦＰ＋）を示す。データは平均±ＳＥＭで示した。
【００３４】
【図１０Ａ】移植後１６週目のＮＳＧＷ４１マウスの骨髄における、編集した細胞の生着結果を示したデータである。右側は、ＡＡＶ＋ＲＮＰで処理した細胞を移植したマウスから採取した骨髄のデータである。上段、左から右へ：ｈＣＤ４５：ｍＣＤ４５キメリズム、ヒトＣＤ４５でゲーティングしたＣＤ３３＋およびＣＤ１９＋染色。下段、左から右へ：ｈＣＤ４５＋細胞、ＣＤ３３＋細胞およびＣＤ１９＋細胞におけるＧＦＰ発現。
【００３５】
【図１０Ｂ】移植後１６週目のＮＳＧＷ４１マウスの脾臓における、編集した細胞の生着結果を示したデータである。左側は、無処理の細胞を移植したマウスから採取した脾臓のデータである。右側は、ＡＡＶ＋ＲＮＰで処理した細胞を移植したマウスから採取した脾臓のデータである。上段、左から右へ：ｈＣＤ４５：ｍＣＤ４５キメリズム、ヒトＣＤ４５でゲーティングしたＣＤ３３＋およびＣＤ１９＋染色。下段、左から右へ：ｈＣＤ４５＋細胞、ＣＤ３３＋細胞およびＣＤ１９＋細胞におけるＧＦＰ発現。
【００３６】
【図１１Ａ】ＧＦＰまたはコドン最適化したＷＡＳ遺伝子のｃＤＮＡを内在性ＷＡＳプロモーター下で発現するＡＡＶベクターの構造である。プロモーターレスＧＦＰ（上段）またはプロモーターレスＷＡＳ  ｃＤＮＡ（下段）に、短いＷＰＲＥ（ＷＰＲＥ３と表記）とＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが続き、これら全体の両側に０．６ｋｂの相同性アームが配置されたＡＡＶベクターである。
【００３７】
【図１１Ｂ】ＷＡＳ標的化プロモーターレスＧＦＰコンストラクトの編集率を調べたデジタル液滴ＰＣＲのデータである。上述の方法と同様にして、インアウト液滴デジタルＰＣＲを行った。液滴の解析は、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により行った。すべての実験は雌性ドナーを対象に行った。ｄｄＰＣＲ率がＦＡＣＳによるＨＲ率の約半分であったことから、１つのＸ染色体のみを標的としていることが示唆される。ｎ＝３は、独立した実験を３回、３名のドナーで行ったことを示す。データは平均±ＳＥＭで示した。
【００３８】
【図１１Ｃ】ＷＡＳ標的化プロモーターレスｃｏＷＡＳ発現ＡＡＶベクターの編集率を調べたデジタル液滴ＰＣＲのデータである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下の詳細な説明において、添付の図面を参照する。添付の図面は、本明細書の一部を成すものである。別段の記載がない限り、図面中の類似の記号は、通常、類似の構成要素を示す。詳細な説明、図面および請求項に記載の実施形態は例示を目的としたものであり、本発明を何ら限定するものではない。また、本明細書に示される主題の趣旨または範囲から逸脱しない限り、その他の実施形態も可能であり、また、その他の変更も可能である。本明細書に概説され、図面に示された本開示の態様は、調整、置換、組み合わせ、分離などにより別の様々な構成とすることが可能であることは容易に理解されるであろう。これらの構成はすべて、本明細書において明示的に想定されるものである。
【００４０】
定義
別段の定めがない限り、本明細書で使用する技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の通常の技能を有する者によって一般に理解される意味を有するものとする。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９）を参照されたい。本発明の開示を目的として、以下の用語を下記の通り定義する。
【００４１】
本明細書において、「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、冠詞の文法上の目的語が１つまたは複数（例えば、少なくとも１つ）存在することを表すものとして使用される。一例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、１つの構成要素または複数の構成要素を意味する。
【００４２】
「約」は、特定の数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量または長さが、基準となる数量、レベル、値、数、頻度、パーセンテージ、寸法、大きさ、量、重量または長さに対して、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％の範囲で変動することを意味する。
【００４３】
本明細書において、請求項の移行句、本体部を問わず、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、オープンエンドの意味を有するものと解釈される。すなわち、これらの用語は、「少なくとも有する」または「少なくとも含んでいる」という表現と同義であると解釈される。「含む」という用語が方法に関わる文脈で用いられる場合は、当該方法が、明記された工程を少なくとも含み、さらに別の工程を含んでもよいことを意味する。また、「含む」という用語が化合物、組成物またはデバイスに関わる文脈で用いられる場合は、当該化合物、当該組成物または当該デバイスが、明記された特徴または構成要素を少なくとも含み、さらに別の特徴または構成要素を含んでもよいことを意味する。
【００４４】
本明細書に記載の「対象」または「患者」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、処置、観察または実験の対象となる動物が包含されるが、これに限定されない。「動物」には、変温脊椎動物、温血脊椎動物、および魚類、甲殻類、爬虫類などの無脊椎動物、特に哺乳動物が含まれる。「哺乳動物」には、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ウマ、およびサル、チンパンジー、類人猿などの霊長動物、特にヒトが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、対象はヒトである。
【００４５】
本明細書に開示されたいくつかの実施形態は、本発明を必要とする対象または患者の選択に関する。いくつかの実施形態において、疾患に伴う症状の治療、緩和、抑制、退行もしくは改善を必要とする患者、または根治治療を必要とする患者が選択される。いくつかの実施形態において、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）もしくはＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）の症状を有する患者、またはＷＡＳもしくはＸＬＴと診断された患者が選択される。このような本発明を必要とする対象または患者の同定または選択は、臨床的評価および／または診断的評価により実施することができる。
【００４６】
本明細書に記載の「治療」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、対象、特にＷＡＳまたはＸＬＴなどのＸ連鎖性疾患に罹患している対象に見られる疾患、障害または生理状態に応じてなされる処置が包含されるが、これに限定されない。治療の目的としては、症状の緩和または抑制；疾患、障害または病態の進行または悪化の遅延または抑止；疾患、障害または病態の根治；および疾患、障害または病態の緩解のうちの１以上が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、「治療」は、基礎疾患の治療、該疾患に伴う症状の治療の両方を表す。例えば、いくつかの実施形態において、治療により、疾患に伴う症状の軽減、緩和、改善もしくは消散および／または該疾患の根治が得られる。
【００４７】
本明細書に記載の「養子細胞療法」または「養子細胞移入」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、細胞、最も多いケースとしては免疫系由来細胞を患者自身または別のレシピエント（宿主）に戻し入れることにより、免疫的な機能および特性を宿主に移行するという処置が包含されるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、養子細胞療法または養子細胞移入は、対象のＷＡＳ遺伝子の相同組換え修復を促進させるための細胞の投与を含む。
【００４８】
本明細書において、「核酸」と「ポリヌクレオチド」という用語は同じ意味で用いられており、ホスホジエステル結合または修飾結合、例えば、ホスホトリエステル結合、ホスホロアミデート結合、シロキサン結合、カーボネート結合、カルボキシメチルエステル結合、アセトイミデート（ａｃｅｔａｍｉｄａｔｅ）結合、カルバメート結合、チオエーテル結合、架橋ホスホロアミデート結合、架橋メチレンホスホネート結合、架橋ホスホロアミデート結合、架橋ホスホロアミデート結合、架橋メチレンホスホネート結合、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、ホスホロジチオエート結合、架橋ホスホロチオエート結合、スルホン結合およびこのような結合の組み合わせなどで構成される任意の核酸を表す。また、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的には、生物体に存在する５つの塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基で構成される核酸も包含する。
【００４９】
本明細書に記載の「融合」または「融合した」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、第１の核酸の３’末端のコード配列と第２の核酸の５’末端のコード配列とがインフレームになるように第１の核酸と第２の核酸がリン酸ジエステル結合で連結されている状態が包含されるが、これに限定されない。さらに転じて、「融合」または「融合した」という用語は、第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとが第１のポリペプチドのＣ末端でペプチド結合により連結されている状態も表しうる。それゆえ、本明細書において、「融合した」核酸またはペプチド（あるいは核酸またはペプチドの「融合」）は、分子の形態を表すものであり、２つの分子を結合させるという行為を行うことを伴うものではない。例えば、第１の核酸と第２の核酸との融合により、（第１の核酸がコードする）第１のポリペプチド配列と（第２の核酸がコードする）第２のポリペプチド配列とが融合した１つのポリペプチドをコードすることができる。いくつかの実施形態において、融合した核酸を含む分子は融合核酸と称される。
【００５０】
本明細書に記載の「ベクター」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、宿主細胞に遺伝物質を伝達するために使用されるポリヌクレオチドコンストラクト、一般的には、プラスミドまたはウイルスが包含されるが、これらに限定されない。ベクターとしては、例えばウイルス、プラスミド、コスミドまたはファージが挙げられる。本明細書において、ベクターは、ＤＮＡで構成されていてもよく、ＲＮＡで構成されていてもよい。いくつかの実施形態において、ベクターはＤＮＡで構成されている。「発現ベクター」とは、適切な環境下に置かれた場合に、該ベクター内に組み込まれた１以上の遺伝子がコードするタンパク質の発現を誘導することができるベクターのことである。ベクターは自律複製能を有することが好ましい。一般に、発現ベクターは、転写プロモーター、遺伝子および転写ターミネーターを含む。遺伝子の発現は、通常、プロモーターの制御下に置かれており、遺伝子は該プロモーターと「作動可能に連結されている」と表現される。
【００５１】
本明細書に記載の「ＡＡＶシステム」または「ＡＡＶ発現システム」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、少なくとも１つの転写物をコードする核酸を発現させるために核酸が１以上のＡＡＶベクターに配置されているシステムが包含されるが、これに限定されない。本明細書において、「活性依存的発現」（およびこの用語を語根とする派生語）とは、目的の核酸を含む細胞の特定の活性の変化により、例えば細胞の脱分極により誘導される核酸の発現を表す。いくつかの実施形態において、細胞は神経細胞であり、刺激を受けて神経細胞が脱分極することにより、「活性依存的に」核酸の発現が誘導される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターは、配列番号５、６、７、８、９、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２１、２２、２３または２６に記載の配列を含む。
【００５２】
本明細書において、「作動可能に連結されている」という用語は、調節エレメントと遺伝子またはそのコード領域との接続を説明するために用いられる。一般に、遺伝子の発現は、例えば、以下に限定されないが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的調節エレメントおよびエンハンサーなどの１以上の調節エレメントの制御下に置かれている。遺伝子またはコード領域は、調節エレメントと「作動可能に連結されている」、「動作可能に連結されている」、または「作動可能な関係にある」と表現されるが、これは、遺伝子またはコード領域が調節エレメントによる制御または影響を受けていることを意味する。例えば、プロモーターによりコード配列の転写または発現が行われる場合は、プロモーターはコード配列と作動可能に連結されている。
【００５３】
本明細書に記載の「上流」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、ポリヌクレオチド上の位置を表す場合は５’位側、ポリペプチド上の位置を表す場合はＮ末端側が包含されるが、これらに限定されない。本明細書において、「下流」は、ヌクレオチド上の位置を表す場合は３’位側、ポリペプチド上の位置を表す場合はＣ末端側を意味する。
【００５４】
本明細書に記載の「コンストラクト」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、１つまたは複数の特定のヌクレオチド配列を発現させるために作製された組換え核酸、または、他の組換えヌクレオチド配列の構築に使用される組換え核酸が包含されるが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書において、「プロモーター」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を促し、遺伝子の転写を誘導するヌクレオチド配列である。一般に、プロモーターは、遺伝子の５’非コード領域（遺伝子の転写開始点付近）に位置する。プロモーター内の転写開始に関わる配列エレメントには、多くの場合、コンセンサスヌクレオチド配列が存在するという特徴がある。プロモーターの例としては、微生物、酵母、植物、ウイルスおよび哺乳動物（ヒトを含む）のプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。プロモーターは、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターおよび／または構成性プロモーターのいずれであってもよい。誘導性プロモーターは、温度変化などの培養条件の何らかの変化を受けて、制御下にあるＤＮＡの転写レベルが増大するよう誘導する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のプロモーターは、Ｕ６プロモーターまたはＭＮＤプロモーターであってもよい。
【００５６】
本明細書において、「エンハンサー」という用語は、転写開始点に対する距離または方向性に関係なく転写効率を調節できる調節エレメントの１つを表す。
【００５７】
本明細書に記載の「変異体」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、元のポリヌクレオチド（またはポリペプチド）と実質的に類似した配列を有するポリヌクレオチド（またはポリペプチド）が包含されるが、これに限定されない。ポリヌクレオチドの場合、変異体は、元のポリヌクレオチドの５’末端、３’末端および／または内部の１以上の位置に１以上のヌクレオチドの欠失、置換、付加を有しうるポリヌクレオチドである。変異体と元のポリヌクレオチドの配列間の類似性および／または相違性は、当技術分野で知られている慣用の手法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）およびハイブリダイゼーション法を用いて検出することができる。また、変異ポリヌクレオチドには、例えば、部位特異的突然変異導入により作製された変異ポリヌクレオチドなどの合成的に創出されるポリヌクレオチドも包含される。一般に、ＤＮＡ（これに限定されない）などのポリヌクレオチドの変異体と元のポリヌクレオチドとの配列同一性は、当業者に公知の配列アラインメントプログラムで決定される配列同一性として、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上、またはこれらの数値のいずれか２つを上下限値とする範囲内の数値でありうる。ポリペプチドの場合、変異体は、元のポリペプチドの１以上のアミノ酸の欠失、置換または付加を有しうる。変異体と元のポリペプチドの配列間の類似性および／または相違性は、当技術分野で知られている慣用の手法、例えば、ウェスタンブロットを用いて検出することができる。一般に、ポリペプチドの変異体と元のポリペプチドとの配列同一性は、当業者に公知の配列アラインメントプログラムで決定される配列同一性として、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上、またはこれらの数値のいずれか２つを上下限値とする範囲内の数値でありうる。
【００５８】
本明細書に記載の「トランスフェクション」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、宿主細胞と本明細書に記載の組換えＡＡＶベクターとを接触させることなどによって該宿主細胞に核酸を導入することが包含されるが、これに限定されない。本明細書において「一過性トランスフェクション」は、トランスフェクション後に宿主細胞のゲノムに外来核酸が通常組み込まれないような方法を利用して、１つまたは複数の外来核酸を宿主細胞に導入することを指す。いくつかの実施形態において、前記核酸はＲＮＡである。いくつかの実施形態において、前記核酸はＤＮＡである。いくつかの実施形態において、前記核酸がＲＮＡである場合、該ＲＮＡは、一過性にトランスフェクションされた細胞のゲノムに通常組み込まれることはない。いくつかの実施形態において、前記核酸がＤＮＡである場合、該ＤＮＡは、一過性にトランスフェクションされた細胞のゲノムに組み込まれることがある。
【００５９】
本明細書に記載の「宿主細胞」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、本発明の実施形態に記載のＣａｓ９  ｍＲＮＡ／ＡＡＶガイドＲＮＡが導入される細胞、および本明細書に記載のシステムとともに提供される細胞が包含されるが、これらに限定されない。宿主細胞は、原核細胞であってもよく、真核細胞であってもよい。原核細胞である宿主細胞としては、大腸菌、窒素固定細菌、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・アルバス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｌｂｕｓ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・チューリゲンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、マイコプラズマ、およびシアノバクテリアが挙げられるが、これらに限定されない。真核細胞である宿主細胞としては、原生動物細胞、真菌細胞、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞、両生類細胞、鳥類細胞および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも１つの標的遺伝子を編集するシステムであって、該細胞が真核細胞であることを特徴とするシステムが提供される。いくつかの実施形態において、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は形質転換細胞ではない。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代リンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、初代リンパ球、ＣＤ３４＋幹細胞、肝細胞、心筋細胞、神経細胞、グリア細胞、筋細胞または腸細胞である。
【００６０】
本明細書に記載の「Ｔ細胞前駆細胞」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、胸腺へ移動してＴ細胞前駆細胞となることができる、Ｔ細胞受容体を発現していないリンパ球前駆細胞が包含されるが、これに限定されない。すべてのＴ細胞は、骨髄中の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞由来の造血前駆細胞（リンパ球系前駆細胞）は、胸腺に定着して細胞分裂により増殖し、未成熟な胸腺細胞の大集団を形成する。ごく初期の胸腺細胞はＣＤ４もＣＤ８も発現せず、したがって、ダブルネガティブ（ＣＤ４−ＣＤ８−）細胞に分類される。これらはその発生が進むにつれてダブルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）胸腺細胞となり、最終的にシングルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８−またはＣＤ４−ＣＤ８＋）胸腺細胞に成熟して、その後、胸腺から末梢組織へ移出される。
【００６１】
本明細書に記載の「造血幹細胞」または「ＨＳＣ」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、マクロファージ、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞などの骨髄系細胞、およびリンパ系細胞（たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）に分化することができる前駆細胞が包含されるが、これらに限定されない。ＨＳＣは３種の幹細胞を含む異種細胞集団であり、これら３種の幹細胞は血液中のリンパ系子孫細胞と骨髄系子孫細胞の割合（Ｌ／Ｍ）によって区別される。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される細胞はＨＳＣ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代リンパ球またはＣＤ３４＋幹細胞である。
【００６２】
本明細書において、「自家」は、（移植する）幹細胞のドナーとレシピエントとが同じであることを表し、例えば、患者または対象が幹細胞の提供者であることを表す。
【００６３】
本明細書に記載の「初代ヒト細胞」は、その由来臓器の組織または血球から直接培養される細胞を表す。初代ヒト細胞は、不死化細胞株よりｉｎ  ｖｉｖｏにおける複製能が優れている。いくつかの実施形態において、本明細書において提供される細胞は初代ヒト細胞である。
【００６４】
本明細書に記載の「共送達」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏを問わず、２つ以上の別個の化学物質が送達されることが包含されるが、これに限定されない。共送達には、別個の剤が同時に送達されること；別個の剤が混合物として同時に送達されること；および１つの剤が送達された後に、別の剤または別の複数の剤が送達されることが含まれる。いずれの場合も、共送達される剤が共同で働くことが意図される。いくつかの実施形態において、共送達には、例えば、目的のｍＲＮＡとＡＡＶベクターとの送達が含まれる。
【００６５】
本明細書に記載の「エンドヌクレアーゼ」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、ポリヌクレオチド鎖のホスホジエステル結合を切断する酵素が包含されるが、これに限定されない。前記ポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡの二本鎖ハイブリッド、合成ＤＮＡ（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ以外の塩基を含むもの）のいずれであってもよい。エンドヌクレアーゼは、対称的な位置でポリヌクレオチドを切断して「平滑」末端を生じるものや、少しずれた位置でポリヌクレオチドを切断して突出末端を生じるものがあり、この突出部位は「粘着末端」とも呼ばれる。本明細書に記載の方法および組成物は、エンドヌクレアーゼにより生じた切断部位に対して使用してもよい。本明細書に記載のシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ（ＭｅｇａＴＡＬなど）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９などのエンドヌクレアーゼをコードする核酸；またはＣａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ＭｅｇａＴＡＬなどのエンドヌクレアーゼの特定のドメインもしくは１以上の部分を含む融合タンパク質をコードする核酸をさらに提供することができる。ただし、これらの例には限定されず、その他のエンドヌクレアーゼ、その他のエンドヌクレアーゼを含む前記システムおよび方法の実施形態、これらの例示的な実施形態を変更または改良したものは、過度な実験を行うことなく実施することができる。
【００６６】
本明細書に記載の「転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、ヌクレアーゼドメインに融合したＴＡＬエフェクタードメインを含むヌクレアーゼが包含されるが、これに限定されない。ＴＡＬエフェクターのＤＮＡ結合ドメインは、所望の標的と結合するように遺伝子操作によって作製し、ヌクレアーゼドメイン（例えば、Ｆｏｋｌヌクレアーゼドメインなど）と融合させてもよい。このような方法により、ＴＡＬエフェクタードメインとヌクレアーゼの融合タンパク質を作製することができる。本明細書に記載の方法およびシステムは、ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼにより生じた切断部位に対して使用してもよい。本明細書で提供されるシステムの実施形態のいくつかにおいて、該システムは、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼ、またはＴＡＬＥＮヌクレアーゼをコードするベクターもしくは核酸をさらに含んでいてもよい。本明細書で提供される方法の実施形態のいくつかにおいて、該方法は、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼなどのヌクレアーゼを提供することをさらに含んでいてもよい。
【００６７】
ＣＲＩＳＰＲ（群生性等間隔短回文反復配列）は、短い反復塩基配列を含む原核生物のＤＮＡセグメントである。各反復配列の後ろには、過去に遭遇した細菌ウイルスやプラスミドに由来する短いセグメントが「スペーサーＤＮＡ」として組み込まれている。
【００６８】
Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）などの微生物が持つ獲得免疫機構であるＣＲＩＳＰＲに関連するＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である。化膿レンサ球菌は、Ｃａｓ９を利用して、侵入してきたバクテリオファージＤＮＡやプラスミドＤＮＡなどの外来性ＤＮＡを記憶し、同じ外来性ＤＮＡが再侵入してくると、それを解読して切断する。Ｃａｓ９は、外来性ＤＮＡを巻き戻して、ガイドＲＮＡに存在する２０ｂｐのスペーサー領域との相補性を確認することによって、外来性ＤＮＡを解読する。ＤＮＡ基質がガイドＲＮＡと相補的であれば、Ｃａｓ９は侵入してきたＤＮＡを切断する。
【００６９】
本明細書で述べるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、遺伝子編集（特定の遺伝子配列の付加、破壊または変更）や遺伝子制御に使用されている。Ｃａｓ９タンパク質またはその誘導体もしくは断片と適切なガイドＲＮＡを細胞に送達することによって、生物体のゲノムを所望の位置で切断することができる。ＣＲＩＳＰＲを用いて、特定の集団全体のゲノムを変更することができるＲＮＡ誘導型遺伝子を構築することが可能である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムの基本的なコンポーネントは、標的遺伝子、ガイドＲＮＡおよびＣａｓ９エンドヌクレアーゼまたはその誘導体もしくは断片を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して遺伝子編集を行う際の重要な点の１つとして、様々な種類の細胞にガイドＲＮＡを効率よく送達できるシステムが必要であることが挙げられる。このようなシステムは、例えば、核酸としてインビトロで作製されたガイドＲＮＡ（インビトロ転写または化学合成により作製されたガイドＲＮＡ）を送達することを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ガイドＲＮＡをコードする核酸は、２’Ｏ−メチル塩基などの修飾塩基の組み込みによりヌクレアーゼ耐性が付与されている核酸である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムでは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはその誘導体もしくは機能性断片をコードするポリヌクレオチド（たとえば、Ｃａｓ９含有ｍＲＮＡベクターに含まれる２０残基長の核酸配列）に、所望の長さのポリ（Ｔ）テールまたはポリ（Ａ）テールが付加されており、このポリヌクレオチドは本明細書に記載の教示に従って調製されるが、このようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、例えば、１以上の修飾塩基（例えば本明細書に記載の１以上の修飾塩基）を含むガイドＲＮＡとともに提供される。
【００７０】
本明細書に記載の実施形態に有用なガイドＲＮＡの例として、本明細書に記載の修飾塩基を１以上含むものが挙げられる。いくつかの実施形態において、前記修飾ガイドＲＮＡは、配列番号１０に示される配列を含む。さらに、本発明において、ガイドＲＮＡを発現するための重要なシステムではＡＡＶベクターを使用しているが、これは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが、広範囲な初代細胞への形質導入に用いることができるためである。ＡＡＶベクターは、感染症を引き起こさず、ゲノムにも組み込まれないことが知られている。したがって、ＡＡＶベクターは、安全かつ有効に使用できるという利点がある。
【００７１】
「と相補的な」という用語は、相補配列が元のポリヌクレオチド配列全体またはその１以上の部分と相同であることを意味する。具体的に説明するならば、ヌクレオチド配列「ＣＡＴ」は、元の配列「ＣＡＴ」と一致しており、元の配列「ＧＴＡ」と相補的である。
【００７２】
本明細書に記載の「相同組換え修復（ＨＤＲ）」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、ＤＮＡの二本鎖切断（ＤＳＢ）の修復時などに細胞内で行われるＤＮＡ修復が包含されるが、これに限定されない。ＨＤＲには、ヌクレオチド配列の相同性が必要であり、ドナーポリヌクレオチドを利用してＤＳＢ（例えば、標的ＤＮＡ配列内のＤＳＢ）が生じた配列の修復が行われる。ドナーポリヌクレオチドが修復に適したテンプレートとして機能するためには、一般にＤＳＢの両側の配列と配列相同性を有する必要がある。ＨＤＲにより、例えば、ドナーポリヌクレオチドからＤＮＡ標的配列へ遺伝子情報が伝達される。ドナーポリヌクレオチド配列がＤＮＡ標的配列と異なる場合は、ＨＤＲにより、ＤＮＡ標的配列が変更（例えば、挿入、欠失、変異）され、ドナーポリヌクレオチド全体または一部がＤＮＡ標的配列に組み込まれる。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチド全体、ドナーポリヌクレオチドの一部、またはドナーポリヌクレオチドのコピーが、ＤＮＡ標的配列部位に組み込まれる。
【００７３】
本明細書に記載の「ガイド」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、ヌクレアーゼを部位特異的に標的核酸配列に誘導する任意のポリヌクレオチドが包含されるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、前記ガイドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの組み合わせを含む。
【００７４】
「ゲノム領域」とは、宿主細胞のゲノムを構成する染色体のセグメントであって、標的核酸配列部位の両側に存在するセグメント、また該標的部位の一部を含むセグメントのことである。ドナーポリヌクレオチドの相同性アームは、対応するゲノム領域との間で相同組換えが起こるよう十分な相同性を有する。いくつかの実施形態において、ドナーポリヌクレオチドの相同性アームは、標的部位を挟んで両側に隣接して存在するゲノム領域と顕著な配列相同性を有する。また、標的部位から離れた位置にあるゲノム領域と十分な相同性を有するような相同性アームを設計することも可能である。
【００７５】
本明細書に記載の「非相同末端連結（ＮＨＥＪ）」とは、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、ドナーポリヌクレオチドを必要とせずに、切断部位の末端同士を直接連結することによりＤＮＡ中のＤＳＢが修復されることが包含されるが、これに限定されない。ＮＨＥＪは、修復テンプレートを使用せずにＤＮＡの修復を行うことができる、細胞に備わったＤＮＡ修復経路である。ドナーポリヌクレオチドを使用せずに行われるＮＨＥＪでは、多くの場合、ＤＳＢが生じた部位にヌクレオチドのランダムな挿入や欠失が起こる。
【００７６】
本明細書において、「切断部位」は、第１のポリペプチドとシスの位置関係にある第２のポリペプチドの分離を媒介する配列を意味する。したがって、簡潔に言えば、本明細書において、「切断」、「切断部位」などの用語は、１つのポリヌクレオチドによりコードされる、シスの位置関係にある任意の２つのポリペプチドの分離を意味する。したがって、「切断」および「切断部位」は、タンパク質分解部位およびタンパク質分解を意味するということもできるが、それに限られるものではなく、例えばリボソームスキッピングなどのポリペプチドの分離を媒介するその他のメカニズムを意味し得るものである。
【００７７】
本明細書において、「標識」という用語は、検出可能な分子を表す。好適な標識の例として、ポリペプチドが挙げられる。それゆえ、本明細書において、「標識核酸」は、標識をコードする核酸を意味する。いくつかの実施形態において、ＡＡＶベクターシステムは標識ポリヌクレオチドを含む。したがって、いくつかの実施形態において、プロモーター（ＭＮＤプロモーターなど）が標識ポリヌクレオチドと動作可能に連結されており、それによって本明細書に記載のＡＡＶベクターがレポーターを含むように構成されている。本明細書の実施形態において好適な標識としては、例えば、Ａｅｑｕｏｒｉａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ  ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ  ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  ＧＦＰ、Ｒｅｎｉｌｌａ  ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ  ＧＦＰなどの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、および橙色蛍光タンパク質（ＯＦＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。その他のレポーター遺伝子としては、ネオマイシン、ホスホロトランスフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、ルシフェラーゼ、β−グルクロニダーゼ、アミノグリコシド、ホスホトランスフェラーゼ、ハイグロマイシンＢ、キサンチングアニンホスホリボシル（トランスフェラーゼ）、ルシフェラーゼ（例えば、ウミシイタケ、ホタルなどのルシフェラーゼ）、ＤＨＦＲ／メトトレキサート、β−ガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ｔｕｒｂｏ、およびｔａｇＲＦＰ、ならびにこれらのレポーター遺伝子のいずれかの核標的型が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、例えば活性化した（アクティブな）細胞での標識の産生が所望される場合は、目的のポリペプチド自体に標識が含まれる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるＡＡＶコンストラクトは、Ｕ６プロモーター駆動性ガイドＲＮＡカセット、ＭＮＤプロモーター駆動性ＧＦＰカセットのいずれか、またはその両方を含み、ＭＮＤプロモーター駆動性ＧＦＰカセットにより、ＡＡＶの形質導入効率をトラッキングすることができる。
【００７８】
本明細書に記載の「遺伝子発現」という用語は、本明細書に照らして解釈される一般的かつ通常の意味を有しており、例えば、遺伝子産物の生合成が包含されるが、これに限定されない。例えば、構造遺伝子の場合、遺伝子発現は、構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写、およびｍＲＮＡから１以上のポリペプチドへの翻訳を含む。
【００７９】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合により連結されたアミノ酸残基で構成されるポリマーであり、天然由来のものおよび合成されたものを含む。１０アミノ酸残基未満のポリペプチドは、一般に「ペプチド」と呼ばれる。ポリペプチドはタンパク質と見なすこともできる。
【００８０】
「タンパク質」は、１以上のポリペプチド鎖を含む巨大分子である。タンパク質は、糖鎖基などの非ペプチド成分をさらに含んでいてもよい。タンパク質への糖鎖やその他の非ペプチド性置換基の付加は、該タンパク質を産生する細胞によって行われてもよく、付加される糖鎖やその他の非ペプチド性置換基の種類は細胞の種類によって異なる。本明細書において、タンパク質は、そのアミノ酸主鎖構造の観点から定義されるものであり、糖鎖基などの置換基は特に規定されないが、このような置換基がタンパク質中に含まれていてもよい。いくつかの実施形態において、細胞の少なくとも１つの標的遺伝子を編集するシステムが提供され、該システムは、ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡをコードする第１の核酸配列；Ｃａｓ９タンパク質をコードする第２の核酸配列；第１のアデノウイルスタンパク質をコードする第３の核酸配列；および第２のアデノウイルスタンパク質をコードする第４の核酸配列を含み、前記ＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡが、細胞における少なくとも１つの標的遺伝子と相補的であること、ならびに第１の核酸配列がベクターに含まれていることを特徴とする。いくつかの実施形態において、前記ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、配列番号３、５、６、７または８で示される配列である。いくつかの実施形態において、前記ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、配列番号３１、３２、３３または３４で示される配列である。
【００８１】
Ｘ連鎖性疾患
本明細書におけるいくつかの実施形態は、Ｘ連鎖性疾患の治療、緩和、抑制または改善に関する。いくつかの実施形態において、前記疾患はウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）である。ＷＡＳは、出生した男児の約２５０，０００人に１人の割合で発症する重篤なＸ連鎖性遺伝病である。ＷＡＳはＷＡＳ遺伝子の変異が原因で起こる。ＷＡＳの特徴としては、リンパ球機能異常による日和見ウイルスおよび日和見細菌による感染症、小型の血小板が認められる血小板減少、湿疹、ならびに自己免疫障害や悪性腫瘍のリスクの増加が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記疾患はＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）である。ＸＬＴもＷＡＳ遺伝子の変異を起因とする疾患であり、主に血小板減少や出血が現れる。
【００８２】
造血細胞移植（ＨＣＴ）は、ＷＡＳの根治治療が可能な唯一の方法として広く実施されている。全体的に見れば、ここ２０年間で移植細胞生着率は、移植治療の向上、ドナーマッチングおよび早期治療に伴い増加している。しかし、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合するドナーが見つからない患者（特に高齢の対象）では依然十分な結果が得られていない。また、混合キメリズムを有する患者は、自己免疫疾患のリスクが高くなる一方、脊髄のキメリズムの低い患者は、血小板減少が持続する可能性がある。さらに、ＨＣＴに関連する罹患を抑えるための最適な前処置法や、前処置後の遅発性の影響もいまだ不明である。
【００８３】
適合するドナーを見つけるという難題やＨＣＴに伴うその他の重大な合併症から、代替治療としてＷＡＳの遺伝子治療（ＧＴ）法の開発が進められている。ガンマレトロウイルス（ＲＶ）ベクターまたは自己不活性化レンチウイルス（ＬＶ）ベクターを用いたウイルスベクターを組込む先駆的なＧＴ試験がヨーロッパで実施されている。Ｂｏｚｔｕｇらは、まず、ＲＶ  ＧＴを受けた２名の患者について報告した（Ｂｏｚｔｕｇら，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２０１０，３６３（２０），１９１８−１９２７；この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いずれの患者も、感染症の頻度および重症度が低下し、出血エピソードおよび自己免疫性症状が消失した。その後の造血幹細胞遺伝子治療を用いた後続試験として、合計１０名の患者に対して治療が行われた。９名の患者で免疫の再構築に成功し、９名の対象のうち８名の血小板数は８００，０００個／μＬを超える値であった（Ｂｒａｕｎら，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ，２０１４，１２（６），２２７；この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。しかし、特筆すべき点は、７名の患者で、白血病に至る、挿入突然変異を伴う重篤な有害事象が認められたことである。
【００８４】
このような有害事象を受けて、ＷＡＳ遺伝子付近に存在する天然のプロモーターの制御下にあるＷＡＳ  ｃＤＮＡをコードする自己不活性化ＬＶ（ＳＩＮ−ＬＶ）が開発された。このＬＶを用いた試験はヨーロッパと米国で開始された。Ａｉｕｔｉらは、イタリアで行った３名の患者の初期の治療結果について報告した（Ａｉｕｔｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４１，６１４８；この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。３名の患者すべてで遺伝子改変された細胞が長期にわたって生着していることが確認され、末梢血液細胞全体の２５〜５０％を占めていた。ベクターを含む造血細胞でのＷＡＳｐの発現は、Ｔ細胞中の内在性のＷＡＳｐ発現レベルと同程度であった。一連の免疫異常が正常に戻った。血小板減少症は改善したものの、ＷＡＳ  ＲＶ試験の結果とは異なり、血小板数は正常値には戻らなかった。また、ＲＶ試験とは異なり、クローン解析の結果、３年を超えてもクローン性増殖の所見は認められなかった。
【００８５】
フランス／英国のグループは、同じＬＶを用いて、ＧＴを受けた７名のＷＡＳ患者の転帰を報告した（Ａｂｉｎａら，ＪＡＭＡ，２０１５，３１３，１５５０−１５６３；この文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。Ａｉｕｔｉらのデータと同様、血小板減少症は改善されたものの、血小板数は正常値には戻らなかった。要約すると、これまでのＷＡＳ  ＬＶ試験において、多系統の造血細胞で持続的なウイルスの検出とＷＡＳｐ発現が確認されており、また臨床的な改善も部分的に認められている。しかし、ＬＶ治療では、血小板減少症の回復には至らない。さらに、免疫処置や感染攻撃に対する長期の反応と自己免疫疾患のリスクに関してはまだ確認されていない。
【００８６】
したがって、本明細書において、内在性のプロモーターおよびエンハンサーの制御下にある完全なＷＡＳ  ｃＤＮＡを造血幹細胞（ＨＳＣ）に導入するシステムおよび方法を提供する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムおよび方法により、ＷＡＳおよびＸＬＴにおける免疫不全および機能不全の回復、ならびに根治治療が可能になる。上述したように、ウイルスを利用する遺伝子治療を用いたＷＡＳ遺伝子置換は、当該疾患を部分的に治すという目的では実施されているものの、ウイルスベクターを用いる現行の方法は、悪性腫瘍（ガンマレトロウイルスベクターを用いた場合）のリスクの増加を招いたり、最も顕著なところでは、血小板減少症が治癒しないなど、造血障害をすべて回復させることはできないのが現状である。しかし、本明細書で提供される、内在性のＷＡＳ遺伝子を遺伝子編集するシステムおよび方法により、疾患の長期回復率が向上する。
【００８７】
したがって、本明細書に記載のシステムおよび方法は、他に類を見ない、ＷＡＳおよびＸＬＴの治療の機会を提供する。例えば、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、遺伝子産物、例えば、ＷＡＳ遺伝子座における遺伝子産物を編集することに関する。いくつかの実施形態において、編集した遺伝子産物は、内在性のプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントの制御下に置かれたままである。いくつかの実施形態において、前記編集は、細胞（造血幹細胞など）内で高効率で行われる。したがって、本明細書において、高効率の編集が可能なシステムおよび方法が提供される。また、編集した細胞を生着させるシステムおよび方法も提供される。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法およびシステムは、自家幹細胞の使用を含む。同種ドナーの幹細胞の骨髄移植による従来の治療とは異なり、本明細書に記載のＷＡＳ遺伝子編集は自家幹細胞を用いる。したがって、移植に伴う主要な問題およびリスクの１つである、移植片対宿主病のリスクはない。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法およびシステムは、遺伝子発現を制御するために内因性遺伝子プロモーター／エンハンサーを用いる。従来の治療法で用いられるウイルス遺伝子置換療法とは異なり、本明細書に記載の遺伝子編集システムおよび遺伝子編集方法は、遺伝子発現を制御するための内因性遺伝子プロモーター／エンハンサーを用いるため、関連するあらゆる細胞系統において内在性のＷＡＳｐ発現レベルを達成することができる。また、遺伝子編集は、ウイルスベクターによる突然変異誘発リスクを排除する。このリスクは、いずれの遺伝子置換法も抱えている問題であり、実際ガンマレトロウイルスベクターによる治療を受けたほぼすべてのＷＡＳ患者で重篤な有害事象の１つとして確認されている。また、遺伝子編集は、現行のＬＶベクター療法と比較して、ＷＡＳタンパク質をより適切なレベルで発現させることができる。公開されているＷＡＳ  ＬＶ療法の試験では、ＷＡＳ最小プロモーターを含むベクターを使用しており、細胞種によっては部分的な機能回復が認められたものもあったが、血小板産生は回復しなかった。その理由として、最小プロモーターが血小板前駆細胞では強力に作用しなかったことが原因である可能性が最も高いと思われる。
【００８８】
さらに、現行の治療法（移植およびＬＶ遺伝子治療）ではいずれも、前処置法が用いられている。編集したＨＳＣの生着率を臨床的に意義のあるレベルにするためには、遺伝子編集においても前処置が必要である。いくつかの実施形態において、編集した細胞の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％もしくは７０％、またはこれらの数値のいずれか２つを上下限値とする範囲内の生着率が達成されれば、臨床上有効である。いくつかの実施形態において、トレオサルファン／フルダラビンによる前処置が用いられる。
【００８９】
本明細書におけるいくつかの実施形態は、ＡＡＶによる新規のＨＤＲ修復テンプレートの送達と併用される、ＴＡＬＥＮプラットフォームまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９プラットフォームをベースとする特有のヌクレアーゼ試薬に関する。いくつかの実施形態において、ヌクレアーゼとＡＡＶベクターとを組み合わせることにより、ヒトＴ細胞およびＣＤ３４＋ＨＳＣのＷＡＳ遺伝子座におけるＨＤＲ率が向上し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでも、免疫不全マウスで生着した後のｉｎ  ｖｉｖｏでも持続的な遺伝子発現が得られる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法およびシステムにより、コントロール対象またはＷＡＳもしくはＸＬＴに罹患している対象の自家細胞のＷＡＳ遺伝子座に、修正したｃＤＮＡを導入することが可能であり、それにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて機能遺伝子産物の系列特異的および発生特異的な制御が可能になる。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法およびシステムにより、宿主ゲノムに対する有害事象を伴うことなく、細胞系統に適した治療的なＷＡＳｐの発現が長期にわたって持続的に得られる。
【００９０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムおよび方法は、ＷＡＳ遺伝子座への治療用カセットの標的組込みにより突然変異導入のリスクを最小限に抑えることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムは、相同組換え修復によりＷＡＳの第１のエクソンに発現カセットを組込むためのＡＡＶドナーテンプレートを含む。また本明細書において、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を含む、ＷＡＳ遺伝子座を標的とするヌクレアーゼプラットフォームが提供される。
【００９１】
いくつかの実施形態は、成体由来の動員ＣＤ３４＋細胞を用いて、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡリボ核タンパク複合体（ＲＮＰ）のいずれかと、プロモーター駆動性蛍光マーカーを標的組込みするためのＡＡＶドナーとを共送達する方法に関する。いくつかの実施形態において、本明細書で提供される方法により、複数のドナーで効果的な相同組換え修復率が得られ、ＴＡＬＥＮでは、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくはそれ以上、またはこれらの数値のいずれか２つを上下限値とする範囲の効率で、ＲＮＰでは、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％もしくはそれ以上、またはこれらの数値のいずれか２つを上下限値とする範囲の効率で、相同組換え修復が達成される。いくつかの実施形態において、ＲＮＰ／ＡＡＶ共送達を用いた場合に、最も高い細胞生存率が得られる。いくつかの実施形態において、編集したＨＳＣは、コロニー形成単位アッセイにおいて多系統に分化できる能力を保持する細胞である。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるシステムにより、免疫不全マウスにおいて長期にわたる生着と分化能が提供される。いくつかの実施形態において、ＷＡＳ  ｃＤＮＡを有するＡＡＶベクターにより、ＷＡＳ欠損細胞での発現が回復する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のシステムおよび方法は、患者の前記疾患または該疾患に伴う症状の治療的な修正がなされる。
【００９２】
相同組換え修復
相同組換え修復（ＨＤＲ）は、相同性を有する核酸（例えば姉妹染色分体または外来核酸）を用いて、ＤＮＡの損傷を修復する過程である。正常細胞において、ＨＤＲは、一般に、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖ＤＮＡの安定化、ＤＮＡクロスオーバー中間体の形成、クロスオーバー中間体の分解、および連結などの一連の工程を伴う。本明細書に記載されているように、ＨＤＲを利用して、ゲノム中の標的配列を変更して変異を正常に修正する（例えば、修復または編集する）ことができる。特定の理論に縛られることを望むものではないが、ドナーテンプレートまたはテンプレート核酸を用いることにより、ＨＤＲによる標的配列の変更が起こると考えられる。例えば、ドナーテンプレートまたはテンプレート核酸により、標的部位を変更することができる。
【００９３】
本明細書におけるいくつかの実施形態は、疾患に関わる遺伝子の相同組換え修復方法および該遺伝子の相同組換え修復システムに関する。いくつかの実施形態において、前記遺伝子はＷＡＳ遺伝子である。いくつかの実施形態において、前記方法は、ヒト造血細胞のＷＡＳ遺伝子のＨＤＲを含む。いくつかの実施形態において、前記疾患はＸ連鎖性疾患である。いくつかの実施形態において、前記疾患はＷＡＳである。いくつかの実施形態において、前記疾患はＸＬＴである。いくつかの実施形態において、前記方法およびシステムは、ＷＡＳ遺伝子の、ヌクレアーゼを用いるＨＤＲを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼを用いるＨＤＲは、ＴＡＬＥＮをベースとするヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼを用いるＨＤＲは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓをベースとするヌクレアーゼを含む。
【００９４】
ＴＡＬＥＮ
転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターＤＮＡ修飾酵素（ＴＡＬＥＮ）は、特定のＤＮＡ配列を切断するよう作製することができる制限酵素である。ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬエフェクタードメインとＤＮＡ切断ドメインとを融合することにより作製される。
【００９５】
いくつかの実施形態において、ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮを用いたターゲティングに使用されるＷＡＳ遺伝子座は、ＡＡＶドナーと共送達される。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮフォワード配列は、配列番号２７または配列番号２９で示される配列である。いくつかの実施形態において、ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮリバース配列は、配列番号２８または配列番号３０で示される配列である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ＭＮＤプロモーターの制御下にあるＧＦＰカセットを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ＭＮＤプロモーター駆動性ＧＦＰカセットの両側に１ｋｂの相同性アームを有する（配列番号３５）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ＴＡＬＥＮによる切断を避けるために１以上のヌクレオチド変異を含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド変異は、ＴＡＬＥＮ結合部位の上流に位置するＴの変異である（配列番号３６）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、エクソン１とリバースＴＡＬＥＮ結合部位との間の全領域が欠失している（配列番号３７）。
【００９７】
本明細書におけるいくつかの実施形態は、目的遺伝子のＨＤＲに使用するＴＡＬＥＮヌクレアーゼに関する。いくつかの実施形態において、ＴＡＬＥＮは目的遺伝子のＴＡＬＥＮ結合部位に結合する。いくつかの実施形態において、目的遺伝子はＷＡＳ遺伝子（配列番号４）である。いくつかの実施形態において、ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮは天然のＷＡＳ配列（配列番号４）に結合する。ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮを用いたターゲティングに使用されるＷＡＳ遺伝子座は、５’から３’に向かって下記の要素を含む。上流相同性アーム（配列番号１１）；エクソン１（ガイドＲＮＡを含む）（配列番号１９）；Ｔ−ｆｏｒ（ＴＡＬＥＮフォワード結合部位；配列番号１５）；切断部位（配列番号１７）；Ｔ−ｒｅｖ（ＴＡＬＥＮリバース結合部位；配列番号１６）；エクソン２（配列番号１８）；および下流相同性アーム（配列番号１２、１３、または１４）。
【００９８】
いくつかの実施形態において、ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮを用いたターゲティングに使用されるＷＡＳ遺伝子座は、ＡＡＶドナーと共送達される。いくつかの実施形態において、ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮフォワード配列は、配列番号１または配列番号２４で示される配列である。いくつかの実施形態において、ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮリバース配列は、配列番号２または配列番号２５で示される配列である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ＭＮＤプロモーターの制御下にあるＧＦＰカセットを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ＭＮＤプロモーター駆動性ＧＦＰカセットの両側に１ｋｂの相同性アームを有する（配列番号５）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ＴＡＬＥＮによる切断を避けるために１以上のヌクレオチド変異を含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド変異は、ＴＡＬＥＮ結合部位の上流に位置するＴの変異である（配列番号６）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、エクソン１とリバースＴＡＬＥＮ結合部位との間の全領域が欠失している（配列番号７）。
【００９９】
いくつかの実施形態において、ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮフォワード配列は、配列番号２７または配列番号２９で示される配列である。いくつかの実施形態において、ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮリバース配列は、配列番号２８または配列番号３０で示される配列である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ＭＮＤプロモーターの制御下にあるＧＦＰカセットを含む。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ＭＮＤプロモーター駆動性ＧＦＰカセットの両側に１ｋｂの相同性アームを有する（配列番号３５）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ＴＡＬＥＮによる切断を避けるために１以上のヌクレオチド変異を含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド変異は、ＴＡＬＥＮ結合部位の上流に位置するＴの変異である（配列番号３６）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、エクソン１とリバースＴＡＬＥＮ結合部位との間の全領域が欠失している（配列番号３７）。
【０１００】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ
本明細書における実施形態のいくつかは、目的遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）に使用されるＣａｓヌクレアーゼに関する。いくつかの実施形態において、前記ＣａｓヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼである。Ｃａｓ９は、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）などの微生物が持つ獲得免疫機構であるＣＲＩＳＰＲ（群生性等間隔短回文反復配列）に関連するＲＮＡ誘導型ＤＮＡエンドヌクレアーゼ酵素である。化膿レンサ球菌は、Ｃａｓ９を利用して、侵入してきたバクテリオファージＤＮＡやプラスミドＤＮＡなどの外来性ＤＮＡを記憶し、同じ外来性ＤＮＡが再侵入してくると、それを解読して切断する。Ｃａｓ９は、外来性ＤＮＡを巻き戻して、ガイドＲＮＡに存在する２０ｂｐのスペーサー領域と相補的かどうかを確認することによって、外来性ＤＮＡを解読する。ＤＮＡ基質がガイドＲＮＡと相補的であれば、Ｃａｓ９は侵入してきたＤＮＡを切断する。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、シングルガイドＲＮＡとともに複合体を形成し、リボ核タンパク複合体（ＲＮＰ）として送達される。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列は配列番号３で示される配列である。いくつかの実施形態において、ＲＮＰはＡＡＶドナーと共送達される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ＭＮＤプロモーターの制御下にあるＧＦＰカセットを含み、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位は欠失している（配列番号５）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、Ｕ６プロモーター駆動性のガイドＲＮＡカセットを含む（配列番号８）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ドナー配列とガイド配列の両方を含む（配列番号９）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ガイド配列を含むｓｃＡＡＶドナーであって、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３で示される配列を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、Ｃａｓヌクレアーゼは、シングルガイドＲＮＡとともに複合体を形成し、リボ核タンパク複合体（ＲＮＰ）として送達される。いくつかの実施形態において、ＣＲＩＳＰＲガイド配列は、配列番号３１、３２、３３または３４で示される配列である。いくつかの実施形態において、ＲＮＰはＡＡＶドナーと共送達される。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ＭＮＤプロモーターの制御下にあるＧＦＰカセットを含み、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）部位は欠失している（配列番号９）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、Ｕ６プロモーター駆動性のガイドＲＮＡカセットを含む（配列番号３８）。いくつかの実施形態において、ＡＡＶドナーは、ドナー配列とガイド配列の両方を含む（配列番号３９）。
【０１０３】
細胞
本明細書におけるいくつかの実施形態は、細胞の内在性ＷＡＳ遺伝子座を改変するための、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼやＣａｓヌクレアーゼなどのヌクレアーゼと、ＡＡＶドナーテンプレートとの共送達に関する。いくつかの実施形態において、前記細胞は哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はリンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞は形質転換細胞ではない。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代リンパ球である。いくつかの実施形態において、前記細胞はリンパ球前駆細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト造血細胞である。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、前記細胞は、細胞の内在性のＷＡＳ遺伝子座を改変するための、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼやＣａｓヌクレアーゼなどのヌクレアーゼと、ＡＡＶドナーとの共送達により形質転換される。いくつかの実施形態において、細胞のＷＡＳ遺伝子を編集する方法が提供され、該方法は、該細胞の少なくとも１つの標的遺伝子と相補的な、ＴＡＬＥＮガイドＲＮＡやＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡなどのガイドＲＮＡをコードする第１の核酸配列を含む第１のベクターを細胞に導入すること；およびＴＡＬＥＮヌクレアーゼやＣａｓヌクレアーゼなどのヌクレアーゼ、またはその誘導体もしくは断片をコードする第２の核酸配列を前記細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法により作製された細胞が提供される。
【０１０５】
ＷＡＳまたはＸＬＴの治療、抑制または改善を必要とする対象におけるＷＡＳまたはＸＬＴを治療、抑制または改善するための方法
本明細書におけるいくつかの実施形態は、ＷＡＳ遺伝子のＨＤＲの促進を必要とする対象において、ＷＡＳ遺伝子のＨＤＲを促進する方法に関する。いくつかの実施形態において、前記方法は、ＷＡＳ遺伝子のＨＤＲの促進を必要とする対象を選択または同定することを含む。ＷＡＳ遺伝子のＨＤＲの促進を必要とする対象として選択または同定される対象は、ＷＡＳもしくはＸＬＴなどのＸ連鎖性疾患の症状を呈する対象、またはＷＡＳもしくはＸＬＴなどＸ連鎖性疾患と診断された対象である。このような判定は、臨床的にまたは診断検査により行うことができる。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、前記方法は、ＷＡＳ遺伝子のＨＤＲの促進を必要とする対象に対して、処理した細胞を用いた養子細胞療法または養子細胞移入を行うことを含む。いくつかの実施形態において、養子細胞療法または養子細胞移入は、対象のＷＡＳ遺伝子の相同組換え修復を促進するために細胞を投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、ＷＡＳ遺伝子のＨＤＲの促進を必要とする対象から細胞を採取することを含む。いくつかの実施形態において、ＷＡＳ遺伝子のＨＤＲの促進を必要とする対象から採取する細胞は初代ヒト造血細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は、細胞の内在性のＷＡＳ遺伝子座を改変するための、ＴＡＬＥＮヌクレアーゼやＣａｓヌクレアーゼなどのヌクレアーゼと、ＡＡＶドナーとの共送達により形質転換される。いくつかの実施形態において、前記方法は前記形質転換細胞を増殖させることを含む。いくつかの実施形態において、前記方法は、細胞内のＷＡＳ遺伝子座が改変された形質転換細胞を選択することを含む。いくつかの実施形態において、前記形質転換細胞は患者に投与される。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、患者への前記形質転換細胞の投与は、該患者への自家細胞の投与を含む。いくつかの実施形態において、患者への前記形質転換細胞の投与は、ＷＡＳおよび／またはＸＬＴの症状を治療、抑制または緩和する。いくつかの実施形態において、患者への前記形質転換細胞の投与は、ＷＡＳおよび／またはＸＬＴを治療する。いくつかの実施形態において、前記方法は血小板減少症を改善する。いくつかの実施形態において、前記方法は血小板数を増大させる。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、処理した細胞は特定の量で患者に投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞の投与量は、１×１０４個、２×１０４個、３×１０４個、４×１０４個、５×１０４個、６×１０４個、７×１０４個、８×１０４個、９×１０４個、１×１０５個、２×１０５個、３×１０５個、４×１０５個、５×１０５個、６×１０５個、７×１０５個、８×１０５個、９×１０５個、１×１０６個、２×１０６個、３×１０６個、４×１０６個、５×１０６個、６×１０６個、７×１０６個、８×１０６個、９×１０６個、１×１０７個、２×１０７個、３×１０７個、４×１０７個、５×１０７個、６×１０７個、７×１０７個、８×１０７個、９×１０７個、１×１０８個、２×１０８個、３×１０８個、４×１０８個、５×１０８個、６×１０８個、７×１０８個、８×１０８個、９×１０８個、１×１０９個もしくはそれ以上、またはこれらの数値のいずれか２つを上下限値とする範囲内である。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、処理した細胞の対象への投与は、目的の障害の症状または該障害を治療するために用いられる別の治療法との組み合せた併用療法として行われる。いくつかの実施形態において、別の治療法としては、免疫グロブリン療法、抗生物質療法、コルチコステロイド療法または輸血療法が挙げられる。
【０１１０】
医薬組成物および投与
本明細書で提供されるシステムまたは方法で調製された細胞は、ＷＡＳ遺伝子座の標的の相同組換え修復を目的として、かつ治療的または予防的な使用を目的として、例えばＷＡＳまたはＸＬＴなどのＸ連鎖性疾患を治療、抑制または緩和することを目的として、患者に直接投与することができる。いくつかの実施形態において、前記細胞は、本明細書で提供されるシステムにより調製される。いくつかの実施形態において、前記細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の組成物は、ＷＡＳもしくはＸＬＴなどのＸ連鎖性疾患を治療、阻止、緩和もしくは抑制する方法、またはＷＡＳもしくはＸＬＴなどのＸ連鎖性疾患に関わる病状もしくは症状を緩和する方法において使用することができる。
【０１１１】
前記細胞を含む前記組成物は、適切な任意の方法で投与され、また、いくつかの実施形態においては、薬学的に許容される担体とともに投与される。当業者であれば、前記細胞を含む前記組成物に応じて好適な投与方法を利用することができ、そのような投与方法に熟知しているであろう。また、前記組成物の種類によっては、２つ以上の投与経路を使用できる場合もあるが、いずれかの経路が別の経路よりも即時性および有効性に優れている場合が多い。
【０１１２】
薬学的に許容される担体は、投与される個々の組成物およびその組成物のそれぞれの投与方法などに応じて選択される。したがって、医薬組成物の好適な剤形として、幅広い種類の製剤が挙げられる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓを参照されたい）。
【０１１３】
静脈内経路、筋肉内経路、皮内経路、皮下経路などの非経口投与に適した製剤としては、水性または非水性の滅菌等張注射液剤が挙げられ、該注射液剤は、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、投与対象のレシピエントの血液と等張にするための溶質を含んでいてもよい。さらに、水性または非水性の滅菌懸濁剤も例として挙げることができ、該滅菌懸濁剤は、懸濁化剤、可溶化剤、粘稠化剤、安定剤および保存剤を含んでいてもよい。本明細書に開示された組成物は、例えば、点滴静注投与、経口投与、局所投与、腹腔内投与、膀胱内投与または髄腔内投与することができる。前記組成物の製剤は、アンプルやバイアルなどの、単一用量または複数用量の密閉容器に入れて提供することができる。注射用の液剤および懸濁剤は、上記した種類の滅菌された散剤、顆粒剤および錠剤から調製することもできる。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、非経口投与経路、皮下投与経路、関節腔内投与経路、気管支内投与経路、腹腔内投与経路、関節包内投与経路、軟骨内投与経路、腔内投与経路、体腔内投与経路、小脳内投与経路、脳室内投与経路、結腸内投与経路、頸管内投与経路、胃内投与経路、肝内投与経路、心筋内投与経路、骨内投与経路、骨盤内投与経路、心膜内投与経路、腹膜内投与経路、胸膜内投与経路、前立腺内投与経路、肺内投与経路、直腸内投与経路、腎内投与経路、網膜内投与経路、脊髄内投与経路、滑液包投与経路、胸腔内投与経路、子宮内投与経路、膀胱内投与経路、病巣内投与経路、ボーラス投与、経膣投与経路、直腸投与経路、頬側投与経路、舌下投与経路、鼻腔内投与経路または経皮投与経路の１以上が企図される。いくつかの実施形態において、投与される組成物は、上記の１以上の経路による送達に適した剤形に製剤化することができる。
【実施例】
【０１１５】
さらなる実施形態
以下の実施例において、さらなる実施形態をより詳細に開示するが、これらの実施例は特許請求の範囲を何ら限定するものではない。以下の実施例では、特異性の高いゲノム編集ツールを示し、治療薬のためのＷＡＳ遺伝子座の部位特異的改変の基礎を提供する。
【０１１６】
実施形態１
初代Ｔ細胞におけるＴＡＬＥＮの切断効率
この実施形態は、本明細書に記載のシステムの切断効率を評価する方法を示す。
【０１１７】
候補となるガイドＲＮＡ（Ｃａｓ９  ｍＲＮＡとともに自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）として送達）またはＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを調製し、Ｔ細胞を用いて評価した。図１Ａに、ヒトＷＡＳ遺伝子におけるＷＡＳ  ＴＡＬＥＮ（ＴＡＬＥＮ＃１およびＴＡＬＥＮ＃２）ならびにＧ１、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４と表記したガイドＲＮＡの位置を示す。
【０１１８】
初代ヒトＴ細胞を、ＩＬ−２（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ）を添加したＴ細胞増殖培地で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で４８時間刺激した。ビーズを除去し、一晩細胞を休ませた後、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてエレクトロポレーション法によりＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（各ＲＮＡモノマー１μｇ）の送達または１μｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡとガイドＲＮＡを有するｓｃＡＡＶとの共送達を行った。細胞を５日以上培養した後、ゲノムＤＮＡを抽出した。切断部位の周辺領域を増幅し、ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物をＴ７エンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ）でインキュベートした後、ゲル上で解析し、Ｌｉｃｏｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅソフトウェアを用いて破壊率（％）を定量した。
【０１１９】
図１Ｂに、初代ヒトＴ細胞にＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（Ｔ１、Ｔ２）またはＣａｓ９  ｍＲＮＡ(ｇＲＮＡ（Ｇ１〜Ｇ４）を発現するｓｃＡＡＶと共送達)をトランスフェクションした５日後にＴ７アッセイで検出された非相同末端連結（ＮＨＥＪ）イベントのパーセンテージを示す。ｎ＝２は、独立で実施した実験の回数を示す。以降の実施例ではＴＡＬＥＮ  Ｔ１およびガイドＧ１を使用した。
【０１２０】
初代ヒトＴ細胞を、ＩＬ−２（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ）を添加したＴ細胞増殖培地で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で４８時間刺激した。ビーズを除去し、一晩細胞を休ませた後、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてエレクトロポレーション法によりＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ（各ＲＮＡモノマー１μｇ）の送達または１μｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡとガイドＲＮＡを有するｓｃＡＡＶの共送達を行った。細胞を５日以上培養した後、ゲノムＤＮＡを抽出した。切断部位の周辺領域を増幅し、ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。２００ｎｇの精製ＰＣＲ産物をＴ７エンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ）でインキュベートした後、ゲル上で解析し、Ｌｉｃｏｒ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅソフトウェアを用いて破壊率（％）を定量した。以降の図面に示す実験ではＴＡＬＥＮ  Ｔ１およびガイドＧ１を使用した。
【０１２１】
実施形態２
ＴＡＬＥＮとＡＡＶの共送達によるヒト初代Ｔ細胞の編集
この実施形態は、本明細書のいくつかの実施形態に記載されている、ＴＡＬＥＮとＡＡＶとを用いた初代Ｔ細胞の編集方法を示す。
【０１２２】
実施例１に記載のＴＡＬＥＮ  Ｔ１およびガイドＧ１を用いて、図２Ａに示すＷＡＳ遺伝子を調製した。図２Ａに、ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮを用いたターゲティングに使用されるＷＡＳ遺伝子座およびＡＡＶドナーテンプレートを示す。ＷＡＳ遺伝子座には、Ｔ−ｆ（ＴＡＬＥＮフォワード）およびＴ−ｒ（ＴＡＬＥＮリバース）で表されるＴＡＬＥＮ結合部位が示されている。相同性アームも示されている。３種類のＡＡＶベクターを、ベクター＃１２０１、＃１２４４および＃１２６２と表記する。ＡＡＶベクター＃１２０１は、ＭＮＤプロモーター駆動性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）カセットの両側に１ｋｂの相同性アームを有する。ＡＡＶベクター＃１２４４は、ＴＡＬＥＮによる切断を避けるために（Ｘで表される）１組のヌクレオチド変異を有する。ＡＡＶベクター＃１２６２は、エクソン１とリバースＴＡＬＥＮ結合部位との間の全領域が欠失したベクターである。
【０１２３】
図２Ａに示される赤色の小さな四角は、ＴＡＬＥＮフォワード結合部位（Ｔ−ｆｏｒ）およびＴＡＬＥＮリバース結合部位（Ｔ−ｒｅｖ）を表す。相同性アームは白色で示されている。ＤＴ  ＡＡＶベクターは、ＭＮＤプロモーター駆動性緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）カセットの両側に１ｋｂの相同性アームを有する。ＤＴＭ  ＡＡＶドナーは、ＴＡＬＥＮによる切断を避けるために（Ｘで表される）１組のヌクレオチド変異を有する。ＤＴ−Ｄベクターは、エクソン１とリバースＴＡＬＥＮ結合部位との間の全領域が欠失したベクターである。
【０１２４】
図２Ｂに、実験方法のタイムスケールを示す。初代ヒトＴ細胞を、ＩＬ−２（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ）を添加したＴ細胞増殖培地で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で４８時間刺激した。初代ヒトＴ細胞を、ＩＬ−２（５０ｎｇ／ｍＬ）、ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ）を添加したＴ細胞増殖培地で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）で４８時間刺激した。ビーズを除去し、一晩細胞を休ませた後、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてエレクトロポレーション法によりヌクレアーゼＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡを送達した。トランスフェクションの２〜４時間後に、ＡＡＶドナーを、培養容量の２０％の濃度になるように添加した。２日目、８日目および１５日目に、細胞のＧＦＰ発現を調べた。１５日目のＧＦＰは、相同組換え修復（ＨＤＲ）が行われたことを示す指標である。図２Ｃに、各種条件（＋／−  ｍＲＮＡおよび各種ＡＡＶベクター）下における２日目、８日目および１５日目の％ＧＦＰを示す。初代ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞を培養し、ビーズで刺激した。次いで、細胞にＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡをトランスフェクションし、２時間後、培養容量の２０％の濃度になるようにＡＡＶドナーを添加した。２日目、８日目および１５日目に、細胞のＧＦＰ発現を調べた。１５日目のＧＦＰ発現は、相同組換え修復（ＨＤＲ）が行われたことを示す指標である。ｎ＝３は、３名の異なるドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。データは平均±ＳＥＭで示した。１５日目のＧＦＰ発現は、相同組換え修復（ＨＤＲ）が行われたことを示す指標である。ｎ＝３は、３名の異なるドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。データは平均±ＳＥＭで示した。図２Ｄに、各条件下での細胞生存率を示す。図２Ｅに、相同性アームを持たないＡＡＶを用いた場合のヌクレアーゼの特異性を調べた結果を示す。初代Ｔ細胞にＴＡＬＥＮをトランスフェクションし、ＭＮＤプロモーター駆動性の青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を有する、相同性アームを持たないＡＡＶベクターで形質導入を行った。１５日目のＡＡＶベクターに由来する蛍光は、ランダムな組込みが行われたことを示す指標である。ｎ＝３は、３名の異なるドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。データは平均±ＳＥＭで示した。図２Ｆに、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡとＡＡＶドナーテンプレートの共送達後１５日目のＧＦＰ発現を示した代表的なＦＡＣＳプロットを示す。図２Ｇに、１５日目のＧＦＰ発現を示した別の代表的なＦＡＣＳプロットを示す。Ｎ＝３は、３名の異なるドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。図２Ｈに、相同性アームを持たないＡＡＶを用いた場合のヌクレアーゼの特異性を調べた結果を示す。初代Ｔ細胞にＴＡＬＥＮをトランスフェクションし、ＭＮＤプロモーター駆動性の青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を有する、相同性アームを持たないＡＡＶベクターで形質導入を行った。１５日目のＡＡＶベク��ーに由来する蛍光は、ランダムな組込みが行われたことを示す指標である。ｎ＝３は、３名の異なるドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。データは平均±ＳＥＭで示した。図２Ｉに、１５日目のＧＦＰ発現を示した代表的なＦＡＣＳプロットを示す。ｎ＝３は、３名の異なるドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。
【０１２５】
実施形態３
ＣＲＩＳＰＲとＡＡＶの共送達によるヒト初代Ｔ細胞の編集
この実施形態は、本明細書のいくつかの実施形態に記載されている、ＣＲＩＳＰＲとＡＡＶとを用いた初代Ｔ細胞の編集方法を示す。
【０１２６】
図３Ａに、ｓｃＡＡＶガイドＲＮＡベクター（＃１１８９）、ドナーテンプレート（＃１２０１）、およびガイド配列とドナー配列の両方を含むＡＡＶベクター（＃１２１５）を示す。＃１２０１  ＡＡＶおよび＃１２１５  ＡＡＶのいずれも、ガイドによる切断を避けるためにＰＡＭ部位が変異されている。
【０１２７】
実施例１と同様に初代ヒトＣＤ３  Ｔ細胞を培養し、１μｇのＣａｓ９  ｍＲＮＡをトランスフェクションした後、ベクター＃１１８９および＃１２０１、または＃１２１５  ＡＡＶベクターを用いて形質導入を行った。図３Ｂに、各条件下における２日目、８日目および１５日目の％ＧＦＰを示し、図３Ｃに、各条件下における２日目、８日目および１５日目の細胞生存率を示す。１０％および２０％は、それぞれ培養容量に対する＃１２１５  ＡＡＶの添加量（％）を示す。＃１２１５以外のＡＡＶにおいては、培養容量の１０％のＡＡＶを添加した。図３Ｄに、Ｃａｓ９、ガイドおよび相同性アームを持たないＭＮＤ．ＢＦＰベクターを送達した際のＢＦＰ発現を示す。図３Ｅに、１５日目のＧＦＰ発現を示した代表的なＦＡＣＳプロットを示す。Ｎ＝３は、３名のドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。図３Ｆに、２日目、８日目および１５日目の％ＧＦＰを示す。図３Ｇに、Ｃａｓ９、ガイドおよび相同性アームを持たないＭＮＤ．ＢＦＰベクターを送達した際のＢＦＰ発現を示す。図３Ｈに、１５日目のＧＦＰ発現を示した代表的なＦＡＣＳプロットを示す。Ｎ＝３は、３名のドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。
【０１２８】
実施例２および３から、Ｔ７エンドヌクレアーゼアッセイにより、ＴＡＬＥＮシステムおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを用いることにより、それぞれ８５％および７３％の頻度で達成されることが分かった。また、これらの実施例により、ヌクレアーゼとＡＡＶドナーテンプレートの共送達により、Ｔ細胞で７０％の相同組換え修復（ＨＤＲ）が行われることも分かった。
【０１２９】
実施形態４
ＴＡＬＥＮとＡＡＶの共送達による成体由来の動員ＣＤ３４＋細胞の編集
この実施形態は、本明細書のいくつかの実施形態に記載されている、ＴＡＬＥＮとＡＡＶの共送達による成体由来の動員ＣＤ３４＋細胞の編集方法を示す。
【０１３０】
実施例２と同様に、ＣＤ３４＋細胞にＴＡＬＥＮとＡＡＶとをトランスフェクションした。図４Ａに、実験条件のタイムラインを示す。２日目、５日目および８日目にフローサイトメトリーで細胞の解析を行った。図４Ｂに、２日目および５日目の％ＧＦＰを示し、図４Ｃに細胞生存率を示す。図４Ｄに、５日目のＧＦＰ発現を示した代表的なＦＡＣＳプロットを示す。
【０１３１】
この実施形態から、ヒト成体由来の動員ＣＤ３４＋細胞へのＴＡＬＥＮとＡＡＶの共送達によりＨＤＲが誘導されることが分かる。
【０１３２】
実施形態５
ＴＡＬＥＮによるオフターゲット（非標的）切断
この実施形態は、ＴＡＬＥＮにより生じる可能性があるオフターゲット（非標的）切断部位を示す。
【０１３３】
Ｔ細胞にフォワードＷＡＳ  ＴＡＬＥＮおよびリバースＷＡＳ  ＴＡＬＥＮをそれぞれ１μｇずつトランスフェクションした。トランスフェクションの５日後、ゲノムＤＮＡを抽出し、内在性のＷＡＳ遺伝子座と、予測されるオフターゲットの遺伝子座を増幅し、コロニーのシークエンスを行った。オフターゲットはＰｒｏｇｎｏｓソフトウェアを用いて予測した。下表１に示すように、Ｐｒｏｇｎｏｓソフトウェアによって同定したＴＡＬＥＮにより生じる可能性があるオフターゲット切断部位を増幅してシークエンスを行ったところ、予測された遺伝子座のいずれにおいてもオフターゲット切断は認められなかった。
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【０１３４】
実施形態６
ＴＡＬＥＮまたはＲＮＰを用いたヒトＣＤ３４＋細胞のＷＡＳ遺伝子座の破壊
この実施形態は、ＴＡＬＥＮまたはリボ核タンパク複合体（ＲＮＰ）を用いたヒトＣＤ３４＋細胞の破壊を示す。
【０１３５】
動員ヒトＣＤ３４＋細胞を、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ−３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−３（６０ｎｇ／ｍＬ）を添加した幹細胞増殖培地（ＳＣＧＭ）で４８時間培養した後、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてエレクトロポレーション法により、各ＴＡＬＥＮモノマー１μｇ、またはＣａｓ９タンパク質とシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とを１：１．２の比率で混合したリボ核タンパク複合体（ＲＮＰ）を導入した。使用したｓｇＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より購入したものであり、５’末端と３’末端の３つの末端部位のヌクレオチドが化学的に修飾されている。細胞を５日間培養した後、ゲノムＤＮＡを抽出した。ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮおよびガイドのそれぞれの切断部位の周辺領域を増幅し、ｐＪＥＴクローニングベクターにクローニングした。コロニーのシークエンシングを行い、挿入欠失の解析により切断部位における切断率（％）を定量した。図５Ａに、ＴＡＬＥＮとＲＮＰのそれぞれを用いた場合の、ＣＤ３４＋細胞のＷＡＳ遺伝子座における切断率（％）を示す。Ｎ＝３は、３名のドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。
【０１３６】
図５Ａに示すように、ヒト成体由来の動員ＣＤ３４＋細胞を、ＴＰＯ、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３Ｌ（１００ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ−３（６０ｎｇ／ｍＬ）を添加したＳＣＧＭで４８時間培養した後、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてエレクトロポレーション法により、各ＴＡＬＥＮモノマー１μｇ、またはＣａｓ９タンパク質とシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とを１：１．２の比率で混合したリボ核タンパク複合体（ＲＮＰ）を導入した。使用したｓｇＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ  ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社より購入したものであり、５’末端と３’末端の３つの末端部位のヌクレオチドが化学的に修飾されている。細胞を５日間培養した後、ゲノムＤＮＡを抽出した。ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮおよびガイドのそれぞれの切断部位の周辺領域を増幅し、ｐＪＥＴクローニングベクターにクローニングした。コロニーのシークエンシングを行い、挿入欠失の解析により切断部位における切断率（％）を定量した。Ｎ＝３は、３名のドナーから採取した細胞を用いて行った、独立した実験の回数を示す。
【０１３７】
図５Ｂに示すように、図５Ａと同様にヒト成体由来の動員ＣＤ３４＋細胞をＳＣＧＭ培地で培養した後、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてエレクトロポレーション法により、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡまたはＲＮＰ複合体（２μｇ）を導入した。エレクトロポレーションの直後に、ドナーテンプレートを有するＡＡＶベクター（ＭＯＩ：６２〜３００）を添加した。コントロールとして、無処理の細胞（偽処理）、およびヌクレアーゼのトランスフェクションは行わずにＡＡＶによる形質導入のみ行った細胞（ＡＡＶ）を用意した。ＨＤＲの指標となる５日目の％ＧＦＰを棒グラフに示す。ＲＮＰはｎ＝８、ＴＡＬＥＮはｎ＝１５であり、４名を超えるドナー数を表す。
【０１３８】
図５Ｃに、編集後５日目の、偽処理したＣＤ３４＋細胞、ＡＡＶで処理したＣＤ３４＋細胞、ＡＡＶ＋ＴＡＬＥＮで処理したＣＤ３４＋細胞（上段）またはＡＡＶ＋ＲＮＰで処理したＣＤ３４＋細胞（下段）のＧＦＰ発現を示したＦＡＣＳプロットを示す。
【０１３９】
図５Ｄに、編集後２日目の、偽処理した細胞および編集した細胞の生存率を示した棒グラフを示す。ＲＮＰはＮ＝８、ＴＡＬＥＮはｎ＝１２であり、４名を超える独立したドナー数を表す。
【０１４０】
図５Ｅに、ＴＡＬＥＮを用いて編集したＣＤ３４＋細胞のＣＦＵアッセイの結果を示す。編集後１日目に、ＴＡＬＥＮを用いて編集した細胞および偽処理した細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培地に播種してコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）アッセイを行った。簡潔に述べると、それぞれの細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４０３４培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に５００個ずつｎ＝２で播種し、３７℃で１２〜１４日間インキュベートした後、コロニーの形態とＧＦＰ発現に基づいてコロニーを計数した。ＣＦＵ−Ｅ：赤芽球コロニー形成単位、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球マクロファージ、Ｇ：顆粒球、ＧＥＭＭ：顆粒球、赤芽球、マクロファージ、巨核球、ＢＦＵ−Ｅ：赤芽球バースト形成細胞。ｎ＝３の独立したドナー。データは平均±ＳＥＭで示した。
【０１４１】
図５Ｆに、ＲＮＰを用いて編集したＣＤ３４＋細胞のＣＦＵアッセイの結果を示す。編集後１日目に、ＲＮＰを用いて編集した細胞および偽処理した細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培地に播種してコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）アッセイを行った。簡潔に述べると、それぞれの細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４０３４培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に５００個ずつｎ＝２で播種し、３７℃で１２〜１４日間インキュベートした後、コロニーの形態とＧＦＰ発現に基づいてコロニーを計数した。ＣＦＵ−Ｅ：赤芽球コロニー形成単位、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球マクロファージ、Ｇ：顆粒球、ＧＥＭＭ：顆粒球、赤芽球、マクロファージ、巨核球、ＢＦＵ−Ｅ：赤芽球バースト形成細胞。ｎ＝３の実験および２名のドナー。データは平均±ＳＥＭで示した。
【０１４２】
図５Ｇに、ＨＤＲを評価するためのデジタル液滴ＰＣＲアッセイの結果を示す。造血幹細胞・前駆細胞（ＨＳＰＣ）からゲノムＤＮＡをＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ＆Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離した。編集率を評価するために、ＡＡＶインサート内で結合するフォワードプライマーと、相同領域外のＷＡＳ遺伝子座で結合するリバースプライマーとを用いて、「インアウト」液滴デジタルＰＣＲを行った。ＡｃｔＢ遺伝子をコントロールとして、同サイズのコントロール増幅産物を得た。反応はすべて２回ずつ行った。ＰＣＲ反応は、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて液滴に分割して行った。増幅は、ＵＴＰ非含有のプローブ用ｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）、９００ｎＭのプライマー、２５０ｎＭのプローブ、５０ｎｇのゲノムＤＮＡおよび１％ＤＭＳＯを用いて行った。液滴の解析は、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により行った。データは平均±ＳＥＭで示した。
【０１４３】
実施形態７
ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡ／ＲＮＰとＡＡＶの共送達によるＣＤ３４＋ＨＳＣのＷＡＳ遺伝子座の編集
この実施形態は、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡまたはＲＮＰとＡＡＶドナーテンプレートとの共送達によるＣＤ３４＋造血幹細胞のＷＡＳ遺伝子座の編集を示す。
【０１４４】
実施例６と同様にヒト成体由来の動員ＣＤ３４＋細胞をＳＣＧＭ培地で培養した後、Ｎｅｏｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いてエレクトロポレーション法により、ＴＡＬＥＮ  ｍＲＮＡまたはＲＮＰ複合体を導入した。エレクトロポレーションの直後に、ドナーテンプレートを有するＡＡＶベクターを添加した。コントロールとして、無処理の細胞（偽処理）、およびヌクレアーゼのトランスフェクションは行わずにＡＡＶによる形質導入のみ行った細胞（ＡＡＶ）を用意した。図６Ａに、ＨＤＲの指標となる５日目の％ＧＦＰを示す。図６Ｂに、編集後２日目の編集した細胞の生存率を示す。ＴＡＬＥＮはＮ＝７、ＲＮＰはＮ＝３であり、独立したドナー数を表す。編集後１日目に、編集した細胞および偽処理した細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ培地に播種してコロニー形成ユニット（ＣＦＵ）アッセイを行った。簡潔に述べると、それぞれの細胞をＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４０３４培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）に５００個ずつｎ＝２で播種し、３７℃で１２〜１４日間インキュベートした後、コロニーの形態とＧＦＰ発現に基づいてコロニーを計数した。図６Ｃに、ＴＡＬＥＮのデータを示し、図６Ｄに、ＲＮＰのデータを示す。ＣＦＵ−Ｅ：赤芽球コロニー形成単位、Ｍ：マクロファージ、ＧＭ：顆粒球マクロファージ、Ｇ：顆粒球、ＧＥＭＭ：顆粒球、赤芽球、マクロファージ、巨核球、ＢＦＵ−Ｅ：赤芽球バースト形成細胞。
【０１４５】
実施形態８
編集したヒトＣＤ３４＋細胞の免疫不全ＮＳＧマウスへの生着
この実施形態は、編集した細胞の免疫不全マウスにおける使用を示す。
【０１４６】
無処理のヒトＣＤ３４＋細胞、ＡＡＶで処理したヒトＣＤ３４＋細胞、およびＡＡＶとＲＮＰとで処理したヒトＣＤ３４＋細胞をそれぞれ２００万個ずつ、２５ｍｇ／ｋｇのブスルファンで前処置した非肥満糖尿病（ＮＯＤ）の重症複合型免疫不全（ｓｃｉｄ）ガンマ（ＮＳＧ）マウスに注入した。移植後１０週目にマウスを屠殺し、骨髄を採取した。図７Ａに、ヒトＣＤ４５マーカーの発現を指標として求めた、全個体における編集した細胞の生着率を示す。図７Ｂに、生着した細胞に占めるＧＦＰ＋細胞の割合（％）を示す。図７Ｃに、代表的なマウスのＦＡＣＳプロットを示す。
【０１４７】
実施形態９
生着のための細胞の％ＨＲ
図９Ａに、ＮＳＧマウスに生着させるために用いる移入細胞の細胞生存率および％ＨＲを示す。ヒト成体由来の動員ＣＤ３４＋細胞の培養を、ＩＬ−３の代わりにＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍＬ）をＳＣＧＭ培地に添加した以外は上述の方法と同様にして行った。細胞に１μｇのＲＮＰ複合体をエレクトロポレーション法により導入し、ＡＡＶ（ＭＯＩ＝６２）を添加した。データは平均±ＳＥＭで示した。Ｎ＝５は、独立で実施した実験の回数を示す。図９Ｂに、移植後のＮＳＧマウスの骨髄における、編集した細胞の生着結果を示す。６〜１０週齢のＮＳＧマウスに、リン酸緩衝生理食塩水で１：１希釈したＢＵＳＵＬＦＥＸ（Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ社）を２５ｍｇ／ｋｇまたは３５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射した。２４時間後、リン酸緩衝生理食塩水に懸濁した２×１０６個の偽処理した造血幹細胞または遺伝子編集した造血幹細胞（図９Ａと同様にして培養した）を、眼窩後方への注射により送達した。移植後１０〜１６週目に、マウスを安楽死させ、骨髄（ＢＭ）および脾臓を採取してヒト細胞の生着率を調べた。屠殺したマウスのＢＭ中のヒトＣＤ４５マーカーの発現を指標として求めた、各個体の編集した細胞の生着率をドットプロットで示す。各点は個々のマウスを示す。データは平均±ＳＥＭで示した。図９Ｃに、移植後１６週目のＮＳＧマウスの骨髄における、編集した細胞の生着結果を示す。細胞移植後１６週目にＮＳＧマウスの骨髄から採取した細胞の代表的なフロープロットを示す。左側は、無処理の細胞を移植したマウスから採取した骨髄のデータである。右側は、ＡＡＶ＋ＲＮＰで処理した細胞を移植したマウスから採取した骨髄のデータである。上段、左から右へ：ｈＣＤ４５：ｍＣＤ４５キメリズム、ヒトＣＤ４５でゲーティングしたＣＤ３３＋およびＣＤ１９＋染色。下段、左から右へ：ｈＣＤ４５＋細胞、ＣＤ３３＋細胞およびＣＤ１９＋細胞におけるＧＦＰ発現。図９Ｄに、移植後のマウスの脾臓における、編集した細胞の生着率を示す。屠殺したマウスの脾臓中のヒトＣＤ４５マーカーの発現を指標として求めた、１０〜１６週目の各個体における編集した細胞の生着率をグラフに示した。各点は個々のマウスを示す。図９Ｅに、ＮＳＧマウスの脾臓における、編集した細胞の生着結果を示す。細胞移植後１６週目にＮＳＧマウスの脾臓から採取した細胞の代表的なフロープロットである。左側は、無処理の細胞を移植したマウスから採取した脾臓のデータである。右側は、ＡＡＶ＋ＲＮＰで処理した細胞を移植したマウスから採取した脾臓のデータである。上段、左から右へ：ｈＣＤ４５：ｍＣＤ４５キメリズム、ヒトＣＤ４５でゲーティングしたＣＤ３３＋およびＣＤ１９＋染色。下段、左から右へ：ｈＣＤ４５＋細胞、ＣＤ３３＋細胞およびＣＤ１９＋細胞におけるＧＦＰ発現。図９Ｆに、ＮＳＧマウスにおけるＧＦＰ＋細胞の生着率を示す。１０〜１６週目に屠殺したＮＳＧマウスの骨髄と脾臓から回収されたｈＣＤ４５＋細胞中のＨＤＲ編集率（％ＧＦＰ＋）を示す。グラフ上のデータは平均±ＳＥＭで示した。
【０１４８】
実施形態１０
編集した細胞のＮＳＧＷ４１マウスへの生着
図１０Ａに、ＮＳＧＷ４１マウスの骨髄における、編集した細胞の生着結果を示す。細胞移植後１６週目にＮＳＧＷ４１マウスの骨髄から採取した細胞の代表的なフロープロットである。左側は、無処理の細胞を移植したマウスから採取した骨髄のデータである。右側は、ＡＡＶ＋ＲＮＰで処理した細胞を移植したマウスから採取した骨髄のデータである。上段、左から右へ：ｈＣＤ４５：ｍＣＤ４５キメリズム、ヒトＣＤ４５でゲーティングしたＣＤ３３＋およびＣＤ１９＋染色。下段、左から右へ：ｈＣＤ４５＋細胞、ＣＤ３３＋細胞およびＣＤ１９＋細胞におけるＧＦＰ発現。
【０１４９】
図１０Ｂに、ＮＳＧＷ４１マウスの脾臓における、編集した細胞の生着結果を示す。細胞移植後１６週目にＮＳＧＷ４１マウスの脾臓から採取した細胞の代表的なフロープロットである。左側は、無処理の細胞を移植したマウスから採取した脾臓のデータである。右側は、ＡＡＶ＋ＲＮＰで処理した細胞を移植したマウスから採取した脾臓のデータである。上段、左から右へ：ｈＣＤ４５：ｍＣＤ４５キメリズム、ヒトＣＤ４５でゲーティングしたＣＤ３３＋およびＣＤ１９＋染色。下段、左から右へ：ｈＣＤ４５＋細胞、ＣＤ３３＋細胞およびＣＤ１９＋細胞におけるＧＦＰ発現。
【０１５０】
実施形態１１
編集した細胞のＮＳＧＷ４１マウスへの生着
図１１Ａに、ＧＦＰのｃＤＮＡまたはコドン最適化したＷＡＳ遺伝子のｃＤＮＡを内在性プロモーター下で発現するＡＡＶベクターの構造を示す。プロモーターレスＧＦＰ（上段）またはプロモーターレスＷＡＳ  ｃＤＮＡ（下段）に、短いＷＰＲＥ（ＷＰＲＥ３と表記）とＳＶ４０ポリアデニル化シグナルが続き、これら全体の両側に０．６ｋｂの相同性アームが配置されたＡＡＶベクターである。図１１Ｂに、ＷＡＳ標的化プロモーターレスＧＦＰコンストラクトの編集率を調べたデジタル液滴ＰＣＲの結果を示す。上述の方法と同様にして、インアウト液滴デジタルＰＣＲを行った。液滴の解析は、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）により行った。すべての実験は雌性ドナーを対象に行った。ｄｄＰＣＲ率がＦＡＣＳによるＨＲ率の約半分であったことから、１つのＸ染色体のみを標的としていることが示唆される。ｎ＝３は、独立した実験を３回、３名のドナーで行ったことを示す。データは平均±ＳＥＭで示した。図１１Ｃに、ＷＡＳ標的化プロモーターレスｃｏＷＡＳ発現ＡＡＶベクターの編集率を調べたデジタル液滴ＰＣＲの結果を示す。
【０１５１】
さらなる実施形態
本開示のさらなる態様は、以下の番号を付した実施形態で実施される。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）のための核酸が提供され、該核酸は、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第２の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＷＡＳ遺伝子は、配列番号４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の配列は、配列番号１７に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースＴＡＬＥＮ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）結合部位である。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、相同性アーム配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、プロモーターをコードする核酸配列をさらに含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、細胞におけるＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）の発現に対して相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進するためのベクターが提供され、該ベクターは、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第２の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＷＡＳ遺伝子は、配列番号４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の配列は、配列番号１７に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースＴＡＬＥＮ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）結合部位である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、１以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、細胞におけるＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）の発現に対して相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進するシステムが提供され、該システムは、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載のベクターと、ヌクレアーゼをコードする核酸とを含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第２の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ＷＡＳ遺伝子は、配列番号４に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第２の配列は、配列番号１７に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースＴＡＬＥＮ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）結合部位である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、１以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。前記システムのいくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。前記システムのいくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＣａｓヌクレアーゼである。前記システムのいくつかの実施形態において、前記ベクターおよび前記核酸は、前記細胞に共送達されるように構成されている。前記システムのいくつかの実施形態において、前記細胞への共送達により、内在性のＷＡＳ遺伝子座が改変される。前記システムのいくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト造血細胞である。
【０１５５】
いくつかの実施形態において、ＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）を発現させるための細胞が提供され、該細胞は、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第３の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第４の配列を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸はベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、ＷＡＳ遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）の促進を必要とする対象において、ＷＡＳ遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進する方法が提供され、該方法は、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載の細胞または本明細書のいずれか１つの実施形態に記載のベクターを前記対象に投与すること；およびヌクレアーゼを前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞は前記対象の細胞であり、該細胞は、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載の核酸または本明細書のいずれか１つの実施形態に記載のベクターの導入により遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入により行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性の対象である。いくつかの実施形態において、前記対象はウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）に罹患している。いくつかの実施形態において、前記対象はＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）に罹患している。
【０１５７】
いくつかの実施形態において、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）および／もしくはＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、またはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、該疾患および／または該症状を治療、抑制または緩和する方法が提供され、該方法は、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載の細胞もしくは本明細書のいずれか１つの実施形態に記載のベクターを前記対象に投与すること；ヌクレアーゼを前記対象に投与すること；任意で、ＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴ、もしくはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の治療による効果が見込まれる対象として前記対象を同定すること；ならびに／または任意で、前記対象において、ＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴの進行の改善もしくはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の改善を評価することを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞は前記対象の細胞であり、該細胞は、本明細書の実施形態１〜８のいずれか１つに記載の核酸または本明細書のいずれか１つの実施形態に記載のベクターの導入により遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入により行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性の対象である。いくつかの実施形態において、前記方法は血小板減少症を改善する。いくつかの実施形態において、前記方法は血小板数を増加させる。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）のための核酸が提供され、該核酸は、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第２の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースＴＡＬＥＮ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）結合部位である。いくつかの実施形態において、前記核酸は、１以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、相同性アーム配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記核酸は、プロモーターをコードする核酸配列をさらに含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態において、細胞におけるＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）の発現に対して相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進するためのベクターが提供され、該ベクターは、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第２の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第３の配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、フォワードＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）結合部位およびリバースＴＡＬＥＮ結合部位を含む。いくつかの実施形態において、前記１以上のヌクレアーゼ結合部位は、群生性等間隔短回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質９（Ｃａｓ９）結合部位である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、１以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、細胞におけるＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）の発現に対して相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進するシステムが提供され、該システムは、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載のベクターと、ヌクレアーゼをコードする核酸とを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ベクターおよび前記核酸は、前記細胞に共送達されるように構成されている。いくつかの実施形態において、前記細胞への共送達により、内在性のＷＡＳ遺伝子座が改変される。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代ヒト造血細胞である。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、ＷＡＳタンパク質（ＷＡＳｐ）を発現させるための細胞が提供され、該細胞は、ＷＡＳ遺伝子をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；１以上のガイドＲＮＡ切断部位をコードする第３の配列；および１以上のヌクレアーゼ結合部位をコードする第４の配列を含む核酸を含む。いくつかの実施形態において、前記核酸はベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、前記ベクターはアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記ＡＡＶは自己相補型ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、ＷＡＳ遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）の促進を必要とする対象において、ＷＡＳ遺伝子の相同組換え修復（ＨＤＲ）を促進する方法が提供され、該方法は、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載の細胞またはベクターを前記対象に投与すること；およびヌクレアーゼを前記対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＣａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞は前記対象の細胞であり、該細胞は、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載の核酸またはベクターの導入により遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入により行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性の対象である。いくつかの実施形態において、前記対象はウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）に罹患している。いくつかの実施形態において、前記対象はＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）に罹患している。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、ウィスコット・アルドリッチ症候群（ＷＡＳ）および／もしくはＸ連鎖性血小板減少症（ＸＬＴ）、またはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、該疾患および／または該症状を治療、抑制または緩和する方法が提供され、該方法は、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載の細胞もしくはベクターを前記対象に投与すること；ヌクレアーゼを前記対象に投与すること；任意で、ＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴ、もしくはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の治療による効果が見込まれる対象として前記対象を同定すること；ならびに／または任意で、前記対象において、ＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴの進行の改善もしくはＷＡＳおよび／もしくはＸＬＴに伴う症状の改善を評価することを含む。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＴＡＬＥＮヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼである。いくつかの実施形態において、前記ヌクレアーゼは、前記細胞または前記ベクターとともに前記対象に投与される。いくつかの実施形態において、前記細胞は前記対象の細胞であり、該細胞は、本明細書のいずれか１つの実施形態に記載の核酸またはベクターの導入により遺伝子改変されている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入により行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は初代細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は自家細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＴ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞（ＨＳＣ）である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋ＨＳＣである。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性の対象である。いくつかの実施形態において、前記方法は血小板減少症を改善する。いくつかの実施形態において、前記方法は血小板数を増加させる。
【０１６４】
本明細書中、例示的な実施形態を示す記載、具体例およびデータは、単に例示を目的として提示されているものであり、本開示の様々な実施形態を限定することを意図しているものではない。本明細書中の記載およびデータに基づき、本開示の範囲を逸脱することなく様々な変更および変形が可能であることは当業者には明らかである。したがって、そのような変更および変形も、本開示の様々な実施形態の一部とみなされる。
別表Ｉ
配列識別番号、識別説明および配列
配列番号１  ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮフォワード
2020517270.tif 000004
2020517270.tif 000005
配列番号２  ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮリバース
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配列番号３  ＣＲＩＳＰＲガイド配列
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配列番号４  ＷＡＳ遺伝子配列
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配列番号５  ＡＡＶ＃１２０１
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配列番号６  ＡＡＶ＃１２４４
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配列番号７  ＡＡＶ＃１２６２
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配列番号８  ＡＡＶ＃１１８９
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配列番号９  ＡＡＶ＃１２１５
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配列番号１０  完全長の化学的に修飾されたガイド＃１の配列
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配列番号１１  上流相同性アーム（＃１２０１、＃１２６２、＃１２４４で共通）
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配列番号１２  ＃１２０１の下流相同性アーム
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配列番号１３  ＃１２４４の下流相同性アーム
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配列番号１４  ＃１２６２の下流相同性アーム
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配列番号１５  ゲノム上のＷＡＳ  ＴＡＬＥＮ結合部位（フォワードＴＡＬＥＮ）
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配列番号１６  ゲノム上のＷＡＳ  ＴＡＬＥＮ結合部位（リバースＴＡＬＥＮ）
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配列番号１７  ＴＡＬＥＮ切断部位（スペーサー配列）
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配列番号１８  ＷＡＳエクソン２
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配列番号１９  ＷＡＳエクソン１配列
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配列番号２０  ｐＷＮＹ．２ｘＮＬＳ．Ｃａｓ９．ｍＣｈｅｒｒｙ
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配列番号２１  １１９０  ｓｃＡＡＶ．Ｕ６．ガイドＲＮＡ２
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配列番号２２  ＃１１９１  ｓｃＡＡＶ．Ｕ６．ガイドＲＮＡ３
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配列番号２３  ＃１１９２  ｓｃＡＡＶ．Ｕ６．ガイドＲＮＡ４
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配列番号２４  ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮ＃２フォワード
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配列番号２５  ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮ＃２リバース
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配列番号２６  ＃１３８０  ＡＡＶ．ＷＡＳＡＴＧｃｏＷＡＳ．ＷＰＲＥ３．ｐＡ
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配列番号２７  ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮ＃１フォワードＲＶＤ配列
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配列番号２８  ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮ＃１リバースＲＶＤ配列
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配列番号２９  ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮ＃２フォワードＲＶＤ配列
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配列番号３０  ＷＡＳ  ＴＡＬＥＮ＃２リバースＲＶＤ配列
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配列番号３１  ＷＡＳ  ガイド＃１配列
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配列番号３２  ＷＡＳ  ガイド＃２配列
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配列番号３３  ＷＡＳ  ガイド＃３配列
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配列番号３４  ＷＡＳ  ガイド＃４配列
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配列番号３５  ｐＡＡＶ．ＤＴ（＃１２０１）
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配列番号３６  ｐＡＡＶ．ＤＴ−Ｍ（＃１２４４）
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配列番号３７  ｐＡＡＶ．ＤＴ−Ｄ（＃１２６２）
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配列番号３８  ｐｓｃＡＡＶ．Ｇ（＃１１８９）
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配列番号３９  ｐＡＡＶ．ＤＴＧ（＃１２１５）
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配列番号４０  ｐＡＡＶ．ＡＴＧ．ＧＦＰ（＃１３７４）
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配列番号４１  ｐＡＡＶ．ＡＴＧ．ｃｏＷＡＳ（＃１３８０）
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2020517270.tif 000094
【図１Ａ】
2020517270.tif 000095
【図１Ｂ】
2020517270.tif 000096
【図２Ａ】
2020517270.tif 000097
【図２Ｂ】
2020517270.tif 000098
【図２Ｃ】
2020517270.tif 000099
【図２Ｄ】
2020517270.tif 000100
【図２Ｅ】
2020517270.tif 000101
【図２Ｆ】
2020517270.tif 000102
【図２Ｇ】
2020517270.tif 000103
【図２Ｈ】
2020517270.tif 000104
【図２Ｉ】
2020517270.tif 000105
【図３Ａ】
2020517270.tif 000106
【図３Ｂ】
2020517270.tif 000107
【図３Ｃ】
2020517270.tif 000108
【図３Ｄ】
2020517270.tif 000109
【図３Ｅ】
2020517270.tif 000110
【図３Ｆ】
2020517270.tif 000111
【図３Ｇ】
2020517270.tif 000112
【図３Ｈ】
2020517270.tif 000113
【図４Ａ】
2020517270.tif 000114
【図４Ｂ】
2020517270.tif 000115
【図４Ｃ】
2020517270.tif 000116
【図４Ｄ】
2020517270.tif 000117
【図５Ａ】
2020517270.tif 000118
【図５Ｂ】
2020517270.tif 000119
【図５Ｃ】
2020517270.tif 000120
【図５Ｄ】
2020517270.tif 000121
【図５Ｅ】
2020517270.tif 000122
【図５Ｆ】
2020517270.tif 000123
【図５Ｇ】
2020517270.tif 000124
【図６Ａ】
2020517270.tif 000125
【図６Ｂ】
2020517270.tif 000126
【図６Ｃ】
2020517270.tif 000127
【図６Ｄ】
2020517270.tif 000128
【図７Ａ】
2020517270.tif 000129
【図７Ｂ】
2020517270.tif 000130
【図７Ｃ】
2020517270.tif 000131
【図８】
2020517270.tif 000132
【図９Ａ】
2020517270.tif 000133
【図９Ｂ】
2020517270.tif 000134
【図９Ｃ】
2020517270.tif 000135
【図９Ｄ】
2020517270.tif 000136
【図９Ｅ】
2020517270.tif 000137
【図９Ｆ】
2020517270.tif 000138
【図１０Ａ】
2020517270.tif 000139
【図１０Ｂ】
2020517270.tif 000140
【図１１Ａ】
2020517270.tif 000141
【図１１Ｂ】
2020517270.tif 000142
【図１１Ｃ】
2020517270.tif 000143
【配列表】
2020517270000001.app
【国際調査報告】
2020517270.tif 000144
2020517270.tif 000145