(57)【要約】【課題】  新規のベクター、組成物、および、欠損UBE3Aによって特徴付けられる神経変性疾患の治療方法を提供する。【解決手段】  ユビキチンリガーゼのE6-APをコードするUBE3A遺伝子は、アンジェルマン症候群（AS）に関与することが分かっている。この遺伝子の特徴は、ニューロン特異的な母親性刷り込みである。AS症例の多くで母親由来のUBE3A遺伝子に変異又は欠失あり、その他に、片親性ダイソミーまたは母親由来遺伝子の異常なメチル化によるものがある。UBE3Aタンパク質コンストラクトを、細胞からの分泌と隣接神経細胞による取り込みとを可能にする付加配列とともに、作成した。このUBE3Aベクターは、ニューロンにE6-AP機能タンパク質を供給して疾患病状から救う、遺伝子治療に使用できる。【選択図】図１
2020528739.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写開始配列と、
前記転写開始配列の下流に配置されたUBE3A配列または相同配列と、
前記転写開始配列の下流に配置された分泌配列または相同配列と、
前記転写開始配列の下流に配置された細胞取り込み配列または相同配列、
を含む、UBE3Aベクター。
【請求項２】
前記転写開始配列が、サイトメガロウィルスチキンベータアクチンハイブリッドプロモーターまたはヒトユビキチンcプロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記転写開始配列の上流に配置されたサイトメガロウイルス最初期エンハンサー配列をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
ウッドチャック肝炎転写後調節エレメントをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
プラスミドをさらに含み、該プラスミドは、組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドであり、該組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドは、DNA組み込みエレメントを欠いていることを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項６】
前記組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドは、pTRプラスミドであることを特徴とする、請求項5に記載のベクター。
【請求項７】
前記分泌配列は、前記UBE3A配列の上流に配置されていることを特徴とする、請求項1に記載のベクター。
【請求項８】
前記細胞取り込み配列は、前記UBE3A配列の上流で前記分泌配列の下流に配置されていることを特徴とする、請求項1に記載のベクター。
【請求項９】
前記細胞取り込み配列は、ペネトラチン、R6W3、HIV TAT、HIV TATkまたはpVECであることを特徴とする、請求項1に記載のベクター。
【請求項１０】
前記分泌配列が、インスリン、GDNFまたはIgKであることを特徴とする、請求項1に記載のベクター。
【請求項１１】
神経変性疾患を治療する方法であって、
神経変性疾患を有する患者にUBE3Aベクターを投与するステップを含み、
該UBE3Aベクターが、
転写開始配列と、
前記転写開始配列の下流に配置されたUBE3A配列または相同配列と、
前記転写開始配列の下流に配置された分泌配列または相同配列と
前記転写開始配列の下流に配置された細胞取り込み配列または相同配列と、
を含む、方法。
【請求項１２】
前記転写開始配列が、サイトメガロウィルスチキンベータアクチンハイブリッドプロモーターまたはヒトユビキチンcプロモーターであることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞取り込み配列は、ペネトラチン、R6W3、HIV TAT、HIV TATkまたはpVECであることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１４】
前記分泌配列が、インスリン、GDNFまたはIgKであることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１５】
前記神経変性疾患がアンジェルマン症候群であることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１６】
前記UBE3Aベクターが、患者の脳内への注射によって患者に投与されることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１７】
UBE3Aベクターと、
薬学的に受容可能な担体と、
を含む、欠損UBE3Aによって特徴づけられる神経変性疾患の治療用の組成物。
【請求項１８】
前記薬学的に受容可能な担体がマンニトールであることを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
【請求項１９】
前記UBE3Aベクターが、
サイトメガロウィルスチキンベータアクチンハイブリッドプロモーターまたはヒトユビキチンcプロモーターである、転写開始配列と、
前記転写開始配列の下流に配置されたUBE3A配列または相同配列と、
前記転写開始配列の下流に配置された、インスリン、GDNFまたはIgKである、分泌配列または相同配列と、
前記転写開始配列の下流に配置された、ペネトラチン、R6W3、HIV TAT、HIV TATkまたはpVECである、細胞取り込み配列または相同配列と、
を含むことを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
【請求項２０】
前記神経変性疾患がアンジェルマン症候群であることを特徴とする、請求項17に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１７年６月２８日に出願された「アンジェルマン症候群の遺伝子治療法のための改変UBE3A遺伝子」と題する米国仮特許出願第６２／５２５，７８７号の非仮出願であり、その優先権を主張し、参照により、該出願の内容が本明細書中に組み込まれているものとする。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、アンジェルマン症候群の治療に関する。より詳しくは、本発明は、アンジェルマン症候群治療のための治療方法と治療用組成物を提供する。
【背景技術】
【０００３】
アンジェルマン症候群（AS）は、ニューロンに影響を及ぼす遺伝子疾患であり、出生数15,000に1人の割合で発症すると推定されている（非特許文献１）。ただし、おそらく誤診が原因で、実際にASと診断されている数は更に多い。
【０００４】
アンジェルマン症候群は、特に言語技能および運動技能に関する知的および発育的発達の遅滞および低下に現れる一連の機能障害である。特に、ASは、言語によるコミュニケーションがないか、または殆どなく、いくらかの非言語コミュニケーションと、運動失調、頻繁な笑いおよび微笑み、および、興奮性動作を含む傾向を有することによって定義される。
【０００５】
より進行した症例では、重度の精神遅滞、一般に３歳以前または３歳までに開始するコントロールが難しいことのある発作、頻繁な笑い（非特許文献2）、小脳髄症、異常脳波の原因となる。重症例では、患者は、言語の発達がないか、または、使用語数が５〜１０語に留まる場合がある。動作は一般にぎこちなく、歩行は、一般に、手を叩く動きを伴い、ぎこちない。患者は、特に人生の早期から一般にてんかんがあり、また、睡眠時無呼吸を患い、一般に、一度の睡眠時間が５時間にしかならない。社交性があり人との接触を望む。皮膚および眼の色素が殆どまたは全くない場合や、吸啜障害および嚥下障害、熱さに対する感受性、水への執着がある場合がある。UBE3A欠損マウスの研究により、長期シナプス可塑性の障害が示されている。現在、アンジェルマン症候群には治療方法がなく、治療は、緩和的である。例えば、てんかん発作の低減のために抗けいれん薬治療が用いられ、言語技能および運動技能の向上のために、言語療法および理学療法が用いられている。
【０００６】
UBE3A遺伝子は、ASに関与する遺伝子であり、ヒト刷り込み遺伝子の小さなファミリーの一つである点で独特である。UBE3Aは、15番染色体上にあり、E6AP C末端相同（HECT）タンパク質（E6関連タンパク質（E6AP））をコードする（非特許文献3）。UBE3Aは脳内において空間的に定義された母性刷り込みを受け、父親由来のコピーはDNAメチル化によって発現抑制される（非特許文献4）。このようにして、母親由来のコピーのみが活性化し、父親由来の染色体は、脳のその領域のニューロンのプロテオソームに殆どまたは全く作用しない。15番染色体の一部の不活性化、転座または欠失は、このため、機能の非代償性喪失を引き起こす。いくつかの研究により、E3-APタンパク質レベルの異常がアンジェルマン症候群患者の神経突起接触を変化させることが示唆されている（非特許文献5）。
【０００７】
アンジェルマン症候群の症例の大半（70％）は、UBE3A遺伝子を含む母親由来染色体の15q11-q13のおよそ4Mbの新たに発生した欠失によって起こるが（非特許文献6）、母親由来のコピーの異常なメチル化の結果、その発現を妨げること（非特許文献7、非特許文献8）、または、２コピーの父親由来遺伝子が遺伝される片親性ダイソミー（非特許文献9、非特許文献10）によっても起こり得る。残るAS症例は、母親由来染色体の様々なUBE3A変異を原因とするか、または、遺伝的原因なしに診断される（12-15UBE3Aは、E6関連タンパク質（E6-AP）ユビキチンリガーゼをコードする。E6-APはE3ユビキチンリガーゼの一つであり、このため、標的タンパク質に対する特異性を示す。標的タンパク質には、腫瘍抑制分子p53（非特許文献11）、酵母DNA修復タンパク質Rad23のヒトホモログ（非特許文献12）、E6-AP自体、および、最も新しく特定された標的であるArc（非特許文献13、非特許文献14）が含まれる。
【０００８】
軽症例は、ユビキチン経路のE6-APユビキチンリガーゼタンパク質をコードする、染色体15q11-13のUBE3A遺伝子の変異によると考えられ、より重症例は、15番染色体のより広範囲な欠失に起因すると考えられる。一般に、海馬および小脳におけるUBE3A遺伝子の喪失はアンジェルマン症候群の原因となるが、単一の機能喪失型変異もまた障害の原因となり得る。
【０００９】
解剖学的形態においては、マウスおよびヒトのASの脳に、正常な脳と比較して大きな変化は見られず、認知障害が、本来、発生上の問題ではなく生化学上の問題である可能性を示している（非特許文献15、非特許文献16）。エクソン2の無発現変異による母親由来UBE3A遺伝子の欠陥を有するアンジェルマン症候群マウスモデル（非特許文献15）が使用された。このモデルは、AS患者の特徴となる主要な表現型の再現能力が優れているために、AS研究分野において、信じられないほどの貢献をしてきた。例えば、ASマウスは、誘発性発作、乏しい運動協調性、海馬依存的な学習障害、海馬のLTP（長期増強）の欠陥を有する。ASマウスモデルの認知障害は、以前に、カルシウム／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII（CaMKII）のリン酸化状態の異常と関連することが示された（非特許文献17）。αCaMKIIの活性化Thr286部位と抑制Thr305部位の両方におけるリン酸化に有意な増加が見られ（全酵素レベルには変化なし）、全体的な活性低下の原因となっていた。また、シナプス後肥厚部の全CaMKII量の低下もあり、活性CaMKII量の低下を示していた。リン酸化を阻害するThr305部位の点変異のある変異マウスモデルをASマウスと交雑することにより、AS表現型が救われた。つまり、発作活性、運動協調性、海馬依存的な学習、およびLTPが野生型と同等のレベルまで回復した。従って、αCaMKIIの生後の発現は、ASマウスモデルの主要な表現型が、全体的発生障害ではなく生後の生化学的変化によるものであることを示唆している（非特許文献18）。
【００１０】
Ube3aの欠損は、ハンチントン病にも関与している（非特許文献19）。
【００１１】
Matentzoglueは、E6-APが、ホルモンシグナル伝達に関係する非E3活性を有することに注目した（特許文献1）。このため、アンジェルマン症候群、自閉症、てんかん、プラダー・ウィリー症候群、子宮頸癌、脆弱X症候群、およびレット症候群を含む、様々なE6-AP疾患の治療に、アンドロゲン、エストロゲン、グルココルチコイドのようなステロイドの投与が用いられた。Philpotは、トポイソメラーゼ阻害薬を使用して発現抑制された遺伝子を脱メチル化し、これによってUbe3Aの欠損を修正することを提案した（特許文献2）。しかし、当分野における研究および提案された治療法は、ステロイド使用の場合のように基礎疾患に対処していなかったり、または、脱メチル化化合物使用の場合のように自閉症等他の疾患につながる恐れがあったりした。従って、必要とされているのは、安全で効果的な方法で、UBE3A欠損疾患の根本的原因に対処できる治療法である。
【００１２】
NashとWeeberは、組み換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクターが、マウスモデルにおける遺伝子送達のための効果的な方法となり得ることを示した（特許文献3）。しかし、成功裏に形質導入されてタンパク質を発現するニューロンは少数しかなく、有効な治療に必要とされる程度にタンパク質を脳内に全体的に分布させることはできなかった。従って、必要とされているのは、Ube3aタンパク質の補給を脳全体に提供する治療法である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２７２４７２１号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１３／０３１７０１８号明細書
【特許文献３】国際公開第２０１６／１７９５８４号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Clayton-Smith, Clinical research on Angelman syndrome in the United Kingdom: observations on 82 affected individuals. Am J Med Genet. 1993 Apr 1;46(1):12-5
【非特許文献２】Nicholls, New insights reveal complex mechanisms involved in genomic imprinting. Am J Hum Genet. 1994 May;54(5):733-40
【非特許文献３】Kishino, et al., UBE3A/E6-AP mutations cause Angelman syndrome. Nat Gen. 1997 Jan 15.15(1):70-3
【非特許文献４】Albrecht, et al., Imprinted expression of the murine Angelman syndrome gene, Ube3a, in hippocampal and Purkinje neurons. Nat Genet. 1997 Sep;17(1):75-8
【非特許文献５】Tonazzini, et al., Impaired neurite contract guidance in ubuitin ligase E3a (Ube3a)-deficient hippocampal neurons on nanostructured substrates. Adv Healthc Mater. 2016 Apr;5(7):850-62
【非特許文献６】(Kaplan, et al., Clinical heterogeneity associated with deletions in the long arm of chromosome 15: report of 3 new cases and their possible significance. Am J Med Genet. 1987 Sep; 28(1):45-53
【非特許文献７】Buiting, et al., Inherited microdeletions in the Angelman and Prader-Willi syndromes define an imprinting centre on human chromosome 15. Nat Genet. 1995 Apr;9(4):395-400
【非特許文献８】Gabriel, et al., A transgene insertion creating a heritable chromosome deletion mouse model of Prader-Willi and Angelman syndrome. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1999 Aug;96(16):9258-63
【非特許文献９】Knoll, et al., Angelman and Prader-Willi syndromes share a common chromosome 15 deletion but differ in parental origin of the deletion. Am J Med Genet. 1989 Fed;32(2):285-90
【非特許文献１０】Malcolm, et al., Uniparental paternal disomy in Angelman’s syndrome. Lancet. 1991 Mar 23;337(8743):694-7
【非特許文献１１】Huibregtse, et al., A cellular protein mediates association of p53 with the E6 oncoprotein of human papillomavirus types 16 or18. EMBO J. 1991 Dec;10(13):4129-35
【非特許文献１２】Kumar, et al., Identification of HHR23A as a substrate for E6-associated protein-mediated ubiquitination. J Biol Chem. 1999 Jun 25;274(26):18785-92
【非特許文献１３】Nuber, et al., The ubiquitin-protein ligase E6-associated protein (E6-AP) serves as its own substrate. Eur J Biochem. 1998 Jun 15;254(3):643-9
【非特許文献１４】Greer, et al., The Angelman Syndrome protein Ube3A regulates synapse Development by ubiquitinating arc. Cell. 2010 Mar 5;140(5): 704-16
【非特許文献１５】Jiang, et al., Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 1998 Oct;21(4):799-811
【非特許文献１６】Davies, et al., Imprinted gene expression in the brain. Neurosci Biobehav Rev. 2005 May;29(3):421-430
【非特許文献１７】Weeber,et al  Derangements of hippocampal calcium/calmodulin-dependent protein kinase II in a mouse model for Angelman mental retardation syndrome. J Neurosci. 2003 Apr;23(7):2634-44
【非特許文献１８】Bayer, et al., Developmental expression of the CaM kinase II isoforms: ubiquitous γ- and δ-CaM kinase II are the early isoforms and most abundant in the developing nervous system. Brain Res Mol Brain Res. 1999 Jun 18;70(1):147-54
【非特許文献１９】Maheshwari, et al., Deficeincy of Ube3a in Huntington’s disease mice brain increases aggregate load and accelerates disease pathology. Hum Mol Genet. 2014 Dec 1;23(23):6235-45
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
重度の精神遅滞を特徴とするヒトの疾患の殆どが、脳の構造の異常と関連しているのに対し、ASには、巨視的な解剖学的変化は関連付けられていない。細胞からのUbe3aの分泌を可能にする細胞分泌配列と、隣接する神経細胞による取り込みを可能にする細胞取り込み配列を付加されて含むUbe3aタンパク質を作成した。これにより、ニューロンにE6-AP機能タンパク質を供給し、これにより、疾患病状から救う。
【００１６】
E6-AP分泌を促進する分泌シグナルと隣接する細胞内へのE6-AP再取り込みを促進する細胞透過性ペプチド（CPP）シグナルとを有する改変Ube3A遺伝子を含む、新規のプラスミドコンストラクトの有効性について調査した。これにより、ASのための遺伝子治療として、マウスの脳内に形質導入された際に、より全体的なE6-APの分布を可能とする。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
こうして、UBE3Aベクターを、転写開始配列と、該転写開始配列の下流に配置されたUBEコンストラクトとを用いて作成した。該UBEコンストラクトは、UBE3A配列、分泌配列、細胞取り込み配列から構成される。UBE3A配列の非限定的な例は、ハツカネズミ（mus musculus）UBE3A、ヒト（homo sapiens）UBE3A変異体1、変異体2または変異体3である。細胞取り込み配列の非限定的な例は、ペネトラチン、R6W3、HIV TAT、HIV TATkおよびpVECである。分泌配列の非限定的な例は、インスリン、GDNFおよびIgKである。
【００１８】
本発明の変形形態において、転写開始配列は、サイトメガロウイルスチキンベータアクチンハイブリッドプロモーターまたはヒトユビキチンcプロモーターである。本発明は、オプションとしてエンハンサー配列を含む。エンハンサー配列の非限定的な例は、転写開始配列の上流に配置されるサイトメガロウイルス最初期エンハンサー配列である。ベクターは、オプションとして、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメントも含む。
【００１９】
変形形態において、ベクターは、組み換えアデノ随伴ウイルス血清型２をベースとするプラスミドのようなプラスミドに挿入される。具体的変形形態において、組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドは、DNA組み込みエレメントを欠いている。組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドの非限定的な例は、pTRプラスミドである。
【００２０】
変形形態において、分泌配列は、UBE3A配列の上流に配置される。細胞取り込み配列は、UBE3A配列の上流で分泌配列の下流に配置されてもよい。
【００２１】
また、治療上有効な量のUBE3Aベクターを、上述のように、患者の脳に投与し、UBE3A欠損を修正することによって、アンジェルマン症候群およびハンチントン病のようなUBE3A欠損を特徴とする神経変性疾患の治療法も提供する。ベクターは、海馬内注射または脳室内注射のような脳内への注射によって投与されてもよい。ベクターは、例えば、両側に注射されてもよい。例示的な用量は、約5.55×1011ゲノム/g脳質量から約2.86×1012ゲノム/g脳質量の範囲とすることができる。
【００２２】
また、UBE3A欠損を特徴とする神経変性疾患の治療用組成物も提供する。組成物は、上述のようなUBE3Aベクターと、薬学的に受容可能な担体によって構成されてもよい。薬学的に受容可能な担体は、例えば、マンニトールのような、血液脳関門透過剤であってもよい。
【００２３】
本発明のより完全な理解のためには、添付図面とともに以下の詳細な説明を参照すべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図示のシグナルペプチドを含むGFPクローンで遺伝子導入されたHEK293細胞からの培地の抗GFPのドットブロットである。
【図２】本発明で使用されるマウスUBE3Aベクターコンストラクトのマップである。主要な遺伝子が示されている。
【図３】プラスミドで遺伝子導入されたHEK293細胞からのE6-APタンパク質の分泌を示すウェスタンブロットである。対照細胞を遺伝子導入された細胞の培地からの培地（cnt txn）、Ube3a遺伝子導入細胞からの培地（Ube3a txn）、および遺伝子導入されていない細胞からの培地（cnt untxn）を、アクリルアミドゲルおよび抗E6-AP抗体上に泳動させた。
【図４】E6-APタンパク質染色面積のパーセンテージを示すグラフである。非トランスジェニック（Ntg）対照マウスは、正常マウスの脳のUbe3a発現レベルを示している。アンジェルマン症候群（AS）マウスは、それらマウス（aka背景染色）の染色レベルを示している。ASマウスの側脳室へのAAV4-STUb注射は、ASマウスと比較したE6-APタンパク質染色レベルの上昇を示している。n=2。
【図５】非トランスジェニックマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図６】非トランスジェニックマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像であり、脳室系（側脳室（LV）、第3脳室）を一層拡大して示している。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図７】注射を受けていないASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。
【図８】注射を受けていないASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像であり、脳室系（側脳室（LV）、第3脳室）を一層拡大して示している。
【図９】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。上衣細胞において発現が見られるが、脳室直近の実質においても染色が観察される（矢印で示されている）。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１０】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像であり、脳室系（側脳室（LV）、第3脳室）を一層拡大して示している。上衣細胞において発現が見られるが、脳室直近の実質においても染色が観察される（矢印で示されている）。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１１】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳室系（側脳室（LV））の高拡大画像である。上衣細胞において発現が見られるが、脳室直近の実質においても染色が観察される（矢印で示されている）。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１２】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳室系（第3脳室）の高拡大画像である。上衣細胞において発現が見られるが、脳室直近の実質においても染色が観察される（矢印で示されている）。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１３】GFPを遺伝子導入された非トランスジェニックマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-GFP注射で発現は観察されず、上衣細胞および脈絡叢細胞の形質導入だけを示している。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１４】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳の矢状断面である。
【図１５】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の側脳室（LV）の矢状断面である。
【図１６】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の第3脳室（3V）の矢状断面である。
【図１７】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の側脳室（LV）の内角の矢状断面である。
【図１８】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の側脳室（4V）の矢状断面である。
【図１９】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の第4脳室（LV）の矢状断面である。
【図２０】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す、脳室系の側脳室（LV）および（c）第3脳室（3V）を一層拡大した、脳の矢状断面である。
【図２１】本発明において使用されるヒトUBE3Aベクターコンストラクトのマップである。主要遺伝子が示されている。
【図２２】hSTUbコンストラクトで遺伝子導入されたHEK293細胞ライセートのウェスタンブロットである。タンパク質が、抗E6APで染色された。
【図２３】GDNFシグナルまたはインスリンシグナルを有するhSTUbコンストラクトで遺伝子導入されたHEK293細胞の抗E6APによるドットブロットであり、発現と分泌のためにインスリンシグナルが、よりよく作用していることを示している。
【図２４】抗HAタグ抗体を使用したインスリンシグナル分泌を裏付けるドットブロットである。
【図２５】（Ａ）は、GFPタンパク質のためのプラスミドコンストラクトを示す図である。（Ｂ）は、GFPタンパク質のためのゲル電気泳動結果の画像である。（Ｃ）は、GFPコンストラクトを使用した様々な分泌シグナルのためのドットブロットである。分泌シグナルを有するコンストラクトを、細胞培養物と各細胞培養物から得られた２つのクローンに形質導入し、クローンを培養して培地を収集した。
【図２６】（Ａ）は、E6-APタンパク質のためのプラスミドコンストラクトを示す図である。（Ｂ）は、E6-AP タンパク質のためのゲル電気泳動結果の画像である。（Ｃ）は、E6-AP コンストラクトを使用した様々な分泌シグナルのためのドットブロットである。分泌シグナルを有するコンストラクトを、細胞培養物と各細胞培養物から得られた２つのクローンに形質導入し、クローンを培養して培地を収集した。
【図２７】遺伝子導入されたHEK293細胞におけるニューロンによるタンパク質再取り込み誘導における細胞ペプチド取り込みシグナルの有効性を示すウェスタンブロットである。HEK293細胞の新しい細胞培養物に細胞ライセートを加え、インキュベート後のこれら細胞のE6-AP濃度を、ウェスタンブロットによって測定した。
【図２８】（A）は、興奮性シナプス後場電位を示すグラフである。Ube3Aバージョン1（hUbev1）、分泌シグナルおよびCPP TATkのコンストラクトを、rAAVベクターによって、ASのマウスモデルに形質導入した。マウス脳の長期増強を死後脳で電気生理的方法によって測定し、GFP遺伝子導入ASモデル対照マウスおよび野生型対照マウスと比較した。（B）は、興奮性シナプス後場電位を示すグラフである。Ube3Aバージョン1（hUbev1）、分泌シグナルおよびCPP TATkのコンストラクトを、rAAVベクターによって、ASのマウスモデルに形質導入した。マウス脳の長期増強を死後脳で電気生理的方法によって測定し、GFP遺伝子導入ASモデル対照マウスおよび野生型対照マウスと比較した。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本明細書において、文脈上明らかに他の意味を示す場合を除き、単数形（英語原文において“a”、 “an”、 “the”の付されたもの）は、複数の指示対象を含むものとする。従って、例えば、「ポリペプチド（a polypeptide）」)は、2つ以上のポリペプチドの混合物等を含む。
【００２６】
他の定義がなされない限り、本明細書において使用される技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって普通に理解されるのと同じ意味を有する。
本発明の実施または試験においては、本明細書に記載のものと同様または同等の方法および物を使用することができるが、本明細書に記載されているのは、候補となる好ましい方法および物の一部である。本明細書中で言及されている全ての公開物は、引用された公開物が関連する方法および／または物を開示および記載するために、参照により、その全てが援用される。矛盾がある場合、本明細書の開示は、援用された公開物の、いかなる開示よりも優先する。
【００２７】
範囲を含むpH、温度、時間、濃度および分子量のような数値指定は、必要に応じて1.0または0.1ずつ上下する近似値である。必ずしも明記されていなくても、全ての数値指定に先立って、「約」の語が付されていると解すべきである。また、必ずしも明記されていなくても、本明細書に記載された試薬は、単なる例示であり、本明細書で明記された試薬を当分野で知られている同等のもので置換可能であると解すべきである。
【００２８】
本明細書で使用される用語「含む、構成される（comprising）」は、製品、組成物および方法が、記載した成分またはステップを含むが、他を除外しないことを意味するものとする。「本質的に〜からなる（Consisting essentially of）」は、製品、組成物、方法を定義するために使用される場合、本質的な重要性を有する他の成分またはステップを除外することを意味するものとする。従って、本質的に列挙された成分からなる組成物は、微量の混入物質および薬学的に受容可能な担体を除外しない。「からなる（Consisting of）」は、微量要素より多い他の成分またはステップを除外することを意味するものとする。
【００２９】
本明細書および請求項において、文脈上明らかに他の意味を示す場合を除き、単数形（英語原文において“a”、 “an”、 “the”の付されたもの）は、複数の指示対象を含むものとする。例えば、「ベクター（a vector）」)は、複数のべクターも含む。
【００３０】
本明細書で使用される「約（about）」は、近似的であることや近いことを意味し、数値または数値範囲の記載である場合には、数値の±15％を意味する。
【００３１】
本明細書で使用される「アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター」は、「遺伝子治療における特定の機能のために操作され得るアデノ随伴ウイルスベクターを指す。例として、AAVは、rAAVと記される組み換えアデノ随伴ウイルスベクターであってよい。本明細書においては、使用されるものとしてAAV4が記載されているが、AAV9、AAV5、AAV1および AAV4を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られている任意の適するAAVを使用することができる。
【００３２】
「投与（administrationまたはadministering）」は、本発明の化合物が単独でまたは他の化合物との組み合わせで患者に送達されるプロセスを記述するために使用される。組成物は、特に、線条体内、海馬内、腹側被蓋領域（VTA）注射、大脳内、小脳内、髄内、黒質内、脳室内、嚢内、頭蓋内、脊髄および脳幹を含む実質内を含むがこれらに限定されない、脳を含む中枢神経系への注射、経口、非経口（静脈内および動脈内および他の適切な非経口経路をいう）、髄腔内、筋肉内、皮下、直腸、経鼻その他を含む、様々な方法で投与されてもよい。これら状態はそれぞれ、疾患または状態を治療するための本発明の化合物の他の投与ルートを使用して容易に治療してもよい。
【００３３】
本明細書で使用される「治療（treatment または treating）」は、症状の軽減、改善、除去および／または安定、並びに、特定の疾患の症状の進行の遅延のいずれをも指す。例えば、神経変性疾患の「治療」には、神経変性疾患に伴う１つまたは複数の症状の改善および／または除去、神経変性疾患の１つまたは複数の症状の縮小、神経変性疾患の症状の安定、並びに、神経変性疾患の１つまたは複数の症状の進行の遅延、のうちの任意の１つまたは複数を含むことができる。
【００３４】
本明細書で使用される  「予防（preventionまたはpreventing）」は、神経変性疾患の影響の停止、神経変性疾患の影響の縮小、神経変性疾患の発生率の低減、神経変性疾患の進行の低減、神経変性疾患の発症の遅延、神経変性疾患の発症までの時間の増大、神経変性疾患の進行のリスクの低減、のいずれをも指す。
【００３５】
本発明の医薬組成物は、薬学的に有用な組成物を調製する既知の方法によって調合可能である。さらに、本明細書で使用される「薬学的に受容可能な担体」という言葉は、任意の標準的な、薬学的に受容可能な担体を意味する。薬学的に受容可能な担体は、希釈剤、アジュバント、媒体、さらに、インプラント担体、および、不活性な無害の固体または液体の賦形剤、希釈剤、または、本発明の有効成分と反応しないカプセル化材料を含むことができる。例として、リン酸緩衝食塩水、生理食塩水、水、油／水乳濁液のような乳濁液を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、薬学的に受容可能な担体は、マンニトールを含むがこれに限定されない血液脳関門透過剤であってもよい。担体は、例えば、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、これらの適当な混合物および植物油を含有する、溶媒または分散媒質であってもよい。調合方法は、周知かつ当業者にとって容易に入手可能な多くの情報源に記載がある。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin EW [1995] Easton Pennsylvania, Mack Publishing Company, 19th ed.)には、本発明と組み合わせて使用可能な製剤方法が記載されている。
【００３６】
本明細書で使用される「動物」は、動物界または後生動物に分類される多細胞の真核生物を意味する。この用語は、哺乳動物を含むが、これに限定されない。非限定的例示として、齧歯動物、哺乳動物、水生哺乳動物、犬および猫のような飼育動物、羊、豚、牛、馬のような家畜、および人間を含む。ここで、「動物」（英語で“animal”または複数の“animals”）の用語が使用される場合、当該用語は任意の複数の動物にも適用されることが意図されている。
【００３７】
本明細書で使用される「保存的置換」の用語は、アミノ酸を、同様の性質（例えば、酸性、塩基性、正または負荷電、極性または非極性）を有する他のアミノ酸で置換することを指す。以下の６つのグループに含まれるアミノ酸は、それぞれ、互いに保存的置換となる。１）アラニン（A）、セリン（S）、トレオニン（T）；２）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；３）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；４）アルギニン（R）、リジン（K）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；および６）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）。
【００３８】
本明細書で使用される「保存的変異」は、アミノ酸をコードする際に何ら変更を生じさせない、ヌクレオチドの置換、つまり、縮合コドン内での重複する配列への変化、または、保存的置換を生じさせる置換のことを言う。コドンの重複性の例を表１および２に示す。
【００３９】
【表１】
2020528739.tif 000003
【００４０】
【表２】
2020528739.tif 000004
つまり、表２によれば、コドンUUAへの保存的変異は、UUG、CUU、CUC、CUAおよびCUGを含む。
【００４１】
本明細書で使用される「相同」の用語は、対象配列に対して少なくとも80％の配列相同性、好ましくは、少なくとも90％の配列相同性、より好ましくは、少なくとも95％の配列相同性を有するヌクレオチド配列、さらに好ましくは、少なくとも98％の配列相同性を有するヌクレオチド配列を意味する。ヌクレオチド配列の変形形態は、ヌクレオチド配列内の保存的変異、つまり、表２に示されるような同じアミノ酸をコードするトリプレットコード内の変異であってもよい。
【００４２】
本明細書で使用される「治療上の有効量」の用語は、アンジェルマン症候群または他のUBE3A関連疾患またはその１つ以上の症状の改善をもたらすか、アンジェルマン症候群または他のUBE3A関連疾患の進行を妨げるか、またはアンジェルマン症候群または他のUBE3A関連疾患の退行を引き起こすために十分な、治療（例えば治療薬または治療ベクター）の量を意味する。本発明によれば、適切な１回の用量サイズとは、適切な期間にわたって、１回または複数回投与された場合に、患者の症状を予防または緩和（低減または除去）することのできる用量である。当業者であれば、哺乳動物のサイズおよび投与経路に基づき、全身投与のための適切な１回の用量サイズを容易に決定できる。
【００４３】
治療的または予防的効果を得るための本発明の化合物および組成物の用量は、当技術分野で周知のように、患者の状況によって決定される。本発明における患者の用量決定は、本発明の化合物若しくは組成物の個々の若しくは単位用量を通して、または、化合物若しくは組成物の組み合わされた若しくは予めパッケージされた若しくは予め調合された用量によって実施されることができる。平均的な40gのマウスは、0.416gの重さの脳を持ち、160gのマウスは、1.02gの重さの脳を持ち、250gのマウスは、1.802gの重さの脳を持っている。平均的なヒトの脳は1508gの重さがあり、これを、本明細書に記載する治療を実施するのに必要なまたは有用な治療量を指示するために、使用可能である。
【００４４】
用量の非限定的な例は、5.55×1011ゲノム/g脳質量、5.75×1011ゲノム/g脳質量、5.8×1011ゲノム/g脳質量、5.9×1011ゲノム/g脳質量、6.0×1011ゲノム/g脳質量、 6.1×1011ゲノム/g脳質量、6.2×1011ゲノム/g脳質量、6.3×1011ゲノム/g脳質量、6.4×1011 ゲノム/g脳質量、6.5×1011ゲノム/g脳質量、6.6×1011ゲノム/g脳質量、6.7×1011ゲノム/g脳質量、6.8×1011ゲノム/g脳質量、6.9×1011 ゲノム/g脳質量、7.0×1011ゲノム/g脳質量、7.1×1011ゲノム/g脳質量、7.2×1011ゲノム/g脳質量、7.3×1011ゲノム/g脳質量、 7.4×1011ゲノム/g脳質量、7.5×1011ゲノム/g脳質量、7.6×1011ゲノム/g脳質量、7.7×1011 ゲノム/g脳質量、7.8×1011ゲノム/g脳質量、7.9 × 1011ゲノム/g脳質量、8.0×1011ゲノム/g脳質量、8.1×1011ゲノム/g脳質量、8.2×1011ゲノム/g脳質量、8.3×1011ゲノム/g脳質量、8.4×1011ゲノム/g脳質量、8.5×1011ゲノム/g脳質量、8.6×1011ゲノム/g脳質量、 8.7×1011ゲノム/g脳質量、8.8×1011ゲノム/g脳質量、8.9×1011ゲノム/g脳質量、9.0×1011 ゲノム/g脳質量、9.1×1011ゲノム/g脳質量、9.2×1011ゲノム/g脳質量、9.3×1011ゲノム/g脳質量、9.4×1011ゲノム/g脳質量、9.5×1011ゲノム/g脳質量、9.6×1011ゲノム/g脳質量、9.7×1011ゲノム/g脳質量、9.80×1011ゲノム/g脳質量、1.0×1012ゲノム/g脳質量、1.1×1012ゲノム/g脳質量、1.2×1012ゲノム/g脳質量、1.3×1012ゲノム/g脳質量、1.4×1012 ゲノム/g脳質量、1.5×1012ゲノム/g脳質量、1.6×1012ゲノム/g脳質量、1.7×1012ゲノム/g脳質量、1.8×1012ゲノム/g脳質量、1.9×1012ゲノム/g脳質量、2.0×1012ゲノム/g脳質量、2.1×1012ゲノム/g脳質量、2.2×1012ゲノム/g脳質量、2.3×1012ゲノム/g脳質量、2.40 ×1012ゲノム/g脳質量、2.5×1012ゲノム/g脳質量、2.6×1012ゲノム/g脳質量、2.7×1012ゲノム/g脳質量、2.75×1012ゲノム/g脳質量、2.8×1012ゲノム/g脳質量、または2.86×1012ゲノム/g脳質量を含むが、これらに限定されない。
【００４５】
本発明で使用される組成物は、個別に、または、１つまたは複数の神経変性疾患、特にUBE3A欠損疾患のための他の治療と組み合わせて、または、同時に、投与することができる。
【００４６】
本明細書で使用される「患者」は、本発明の組成物による予防的治療を含む治療の対象となる動物、好ましくは人間を記述するために使用される。
【００４７】
本明細書で使用される「神経変性疾患（neurodegenerative disorderまたはneurodegenerative disease）」は、神経細胞の死または機能不全が障害の原因に関与する、任意の異常な身体的または精神的挙動または経験を指す。さらに、本明細書で使用される「神経変性疾患」の用語は、UBE3A欠損に関連する「神経変性疾患」を指す。例として、神経変性疾患は、アンジェルマン症候群、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、自閉症スペクトラム障害、てんかん、多発性硬化症、プラダー・ウィリー症候群、脆弱Ｘ症候群、レット症候群およびピック病を含む。
【００４８】
本明細書で使用される「UBE3A欠損（UBE3A deficiency）」は、UBE3A遺伝子の変異または欠失を指す。
【００４９】
本明細書で使用される「正常（normal）」または「対照（control）」の用語は、アンジェルマン症候群または他の何らかの神経変性疾患または他の何らかのUBE3A欠損神経疾患を有さないと評価された試料または細胞または患者を指す。
【００５０】
一般的に、UBE3Aベクターは、転写開始配列、および、転写開始配列の下流に配置されたUBEコンストラクトを用いて形成された。UBEコンストラクトは、UBE3A配列、分泌配列および細胞取り込み配列で形成される。UBE3A配列の非限定的な例は、配列番号4、配列番号9、配列番号14、配列番号15、配列番号17、配列番号10のcDNA、配列番号16のcDNA、または、相同配列である。DNA配列の変形形態は、表1および2に示すようなDNAトリプレットコードの保存的変異を含む。具体的な変形形態において、UBE3A配列は、ハツカネズミUBE3A、ヒトUBE3A変異体1、変異体2、または変異体3である。
【００５１】
分泌配列の非限定的な例は、配列番号2、配列番号5、配列番号11、配列番号12、配列番号3のcDNA、配列番号7のcDNA、配列番号18のcDNA、配列番号19のcDNA、または、上述の保存的変異を含むDNA配列の変形形態を含む相同配列である。
【００５２】
細胞取り込み配列の非限定的な例は、配列番号6、配列番号8のcDNA、配列番号13のcDNA、配列番号20のcDNA、配列番号21のcDNA、配列番号22のcDNA、または相同配列である。DNA配列の変形形態は、上述の保存的変異を含む。
【００５３】
本発明の具体的変形形態において、分泌配列は、UBE3A配列の上流に配置され、より具体的には、オプションとしてUBE3A配列の上流で分泌配列の下流に配置される。他の可能な取り込みタンパク質として、ペネトラチン、TATk、pVEC、トランスポータン、MPG、Pep-1、ポリアルギニン、MAPおよびR6W3を含む。
【００５４】
本発明の変形形態において、転写開始配列は、サイトメガロウイルスチキンベータアクチンハイブリッドプロモーターまたはヒトユビキチンcプロモーターである。本発明は、オプションとしてエンハンサー配列を含む。エンハンサー配列の非限定的な例は、転写開始配列の上流に配置されるサイトメガロウイルス最初期エンハンサー配列である。ベクターは、オプションとして、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメントも含む。列挙されたプロモーター、エンハンサー配列および転写後調節エレメントは、当該分野において周知である。（Garg S. et al., The hybrid cytomegalovirus enhancer/chicken beta-actin promotor along with woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element enhances the protective efficacy of DNA vaccines, J. Immunol., July 1, 2004; 173(1):550-558; Higashimoto, T. et al., The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors, September 2007; 14(17):1298-304; Cooper, A.R. et al., Rescue of splicing-mediated intron loss maximizes expression in lentiviral vectors containing the human ubiquitin C promoter, Nucleic Acids Res., January 2015; 43(1):682-90）
【００５５】
変形形態において、ベクターは、組み換えアデノ随伴ウイルス血清型２をベースとするプラスミドのようなプラスミドに挿入される。具体的変形形態において、組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドは、DNA組み込みエレメントを欠いている。組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドの非限定的な例は、pTRプラスミドである。
【００５６】
UBE3Aベクターの合成方法は、転写開始配列を有する骨格プラスミドへの、UBE3Aコンストラクトの挿入を含む。ＴBE3Aコンストラクトは、上述のように、UBE3A配列、分泌配列、および細胞取り込み配列で構成される。例えば、Ube3a遺伝子をクローニングし、3′DNA配列（他の2つのペプチド配列を伴うN末端）、シグナルペプチド配列およびHIV TAT配列にインフレーム融合し、それらを、AS患者の脳および脊髄における分泌E6-APタンパク質発現のために、組み換えアデノ随伴ウイルスベクターにクローンニングした。オプションとして、骨格プラスミドを少なくとも1つのエンドヌクレアーゼで切断することによってUBEコンストラクトを挿入し、骨格プラスミドの切断端にUBE3Aコンストラクトを結合させた。
【００５７】
ベクターは、その後、オプションとして、抗生物質耐性遺伝子を有する増幅宿主に挿入し、抗生物質耐性遺伝子に応じた抗生物質選択に晒した。増幅宿主は、その後、抗生物質選択を含む培地中で増殖させ、増殖した増幅宿主を回収した。その後、ベクターを、増幅宿主から単離した。本発明の具体的な変形形態において、抗生物質耐性遺伝子は、対応するアンピシリンを抗生物質選択として有する、アンピシリン耐性遺伝子である。
【００５８】
好ましい実施形態において、UBE3Aベクターは、UBE3Aバージョン1遺伝子（配列番号9）を構成するためのヒトUBE3A遺伝子からクローニングされたcDNAから構成された。UBE3Aバージョン1遺伝子（配列番号9）は、GDNF、インスリンまたはIgKのような分泌シグナリングペプチドをコードする遺伝子と融合された。好ましい実施形態においては、GDNFが用いられる。コンストラクトは、CMV チキンベータアクチンハイブリッドプロモータ（好ましい）またはヒトユビキチンcプロモーターのもとで、hSTUbベクターに挿入された。発現レベルを上昇させるために、ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（WPRE）が存在する。
【００５９】
UBE3A分泌シグナルコンストラクトは、その後、HIV TATまたはHIV TATk（好ましい）のような細胞取り込みペプチド（細胞透過ペプチドまたはCPP）に結合される。ヒトUBE3Aベクターは、その後、実施例２に記載されたヒートショック法を使用してE. coliのような増幅宿主に形質転換する。形質転換されたE. coliは、ベクターを選択し、多量のベクターを集めるため、アンピシリンを含有するブロス内で増殖させた。その後、治療上有効な量のベクターを、アンジェルマン症候群またはUBE3A欠損を有する他の神経変性疾患の治療のための遺伝子治療として、患者に投与することができる。    ベクターは、海馬内または脳室内への、場合によっては両側への注射によって投与されてもよい。治療のための用量は、約5.55×1011ゲノム/g脳質量から約2.86×1012ゲノム/g脳質量の範囲とすることができる。
【実施例１】
【００６０】
（分泌シグナルの有効性）
分泌シグナルの有効性を試験するために、GFP（配列番号1）（XM 013480425.1）を、ヒトインスリン、GDNF（配列番号2）（AB675653.1）またはIgKシグナルペプチドとインフレームにクローニングした。
【００６１】
2020528739.tif 000005
が、
ＧＤＮＦに基づく分泌タンパク質；
ATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTCTGCCTGGTGCTGCTCCACACCGCGTCCGCC（配列番号2）（XM 017009337.2）と、融合された。これは、
MKLWDVVAVCLVLLHTASA (配列番号3) (AAC98782.1)をコードする。
【００６２】
コンストラクトをpTRプラスミドに挿入し、HEK293細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）に遺伝子導入した。HEK293細胞は、37℃、5％ CO2で、10％ FBSおよび1％ Pen/Strepを含むダルベッコ変法必須培地（DMEM）中で培養し、80％コンフルエンスで継代培養した。
【００６３】
ベクター（6ウェルプレート中に2μg/ウェル）は、PEI遺伝子導入法を用いて細胞に遺伝子導入した。細胞は、遺伝子導入の2日前に、6ウェルプレート中で、DMEM培地で、ウェル当たり0.5×106細胞で継代培養した。培地は、遺伝子導入前夜に交換した。エンドドキシンフリーなdH2Oを約80℃に加熱し、ポリエチレンイミン（Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, MO）を溶解した。溶液を約25℃まで冷まし、水酸化ナトリウムを使用して溶液を中和した。各遺伝子導入ウェルに対し、AAV4−STUbベクターまたは陰性対照（培地のみ）を、200μL毎に2μgで、無血清DMEMに加え、各ウェルに対し、1μg/μLのポリエチレンイミン9μLを混合物に加えた。遺伝子導入混合物を室温で15分インキュベートし、その後、細胞の各ウェルに、ウェル毎に210μLずつ加え、48時間インキュベートした。
【００６４】
各培養ウェルから培地を集め、先細ピペットを使用して、ニトロセルロースメンブレンに2μL滴下した。試料が乾いた後、メンブレンに5％ BSA in TBS-Tを適用し、室温で30分から1時間インキュベートしてメンブレンをブロックし、その後、メンブレンをニワトリ抗GFP（5 μg/mL, Abcam PLC, Cambridge, UK; #ab13970）in BSA/TBS-Tとともに室温で30分インキュベートした。メンブレンを、TBS-Tで３回（各回5分）洗浄した。メンブレンを、HRPとコンジュゲートした抗ニワトリHRPコンジュゲート2次抗体（Southern Biotechnology, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA; #6100-05, 1/3000）とともに室温で30分インキュベートし、その後、メンブレンをTBS-Tで３回（1回15分）洗浄し、引き続き、それぞれ5分で洗浄した。メンブレンを室温でTBSを用いて5分間洗浄し、発光試薬（Millipore, Merck KGaA, Darmstadt, DE; #WBKLS0100）とともに1分インキュベートした。図１に示すように、メンブレンをGEアマシャム イメージャー 600（General Electric, Fairfield, CA）に記録した。
【００６５】
図１に示されるように、遺伝子導入されていない対照細胞と比較して観察すると、3つの分泌シグナルは全て、細胞からのGFP標識タンパク質放出を引き起こした。3つの分泌コンストラクトのうち、IgKコンストラクトが最も高い分泌レベルを示したが、GDNFクローン2コンストラクトも同様に高いGFP標識タンパク質の分泌を示した。
【実施例２】
【００６６】
（マウスUBE3Aベクターコンストラクト）
pTRプラスミドを用いてマウスUBE3Aベクターコンストラクトを作成した。マウス（Mus musculus）UBE3A遺伝子は、cDNAから作成した（U82122.1）；
2020528739.tif 000006
2020528739.tif 000007
【００６７】
cDNAをサブクローニングし、配列した。マウスUBE3A遺伝子（配列番号4）を、分泌シグナリングペプチドGDNFをコードするDNA配列（配列番号5）と細胞取り込みペプチドＨＩＶ TAT配列（配列番号6）に融合した。分泌シグナリングペプチドは、DNA配列；
ATG GCC CTG TTG GTG CAC TTC CTA CCC CTG CTG GCC CTG CTT GCC CTC TGG GAG CCC AAA CCC ACC CAG GCT TTT GTC （配列番号 5） （NM 008386.4）
を有し、タンパク質配列；
MALLVHFLPLLALLALWEPKPTQAFV（配列番号7）（NP 032412.3）
をコードし、一方、HIV TAT配列は；
TAC GGC AGA AAG AAG AGG AGG CAG AGA AGG AGA (配列番号6)
であり、タンパク質配列；
YGRKKRRQRRR (配列番号8)（AIW51918.1）
をコードする。
【００６８】
配列番号5および配列番号6と融合された配列番号4のコンストラクト配列をpTRプラスミドに挿入した。 Age I および Xho Iエンドヌクレアーゼを用いてプラスミドを切断し、リガーゼを用いてコンストラクト配列を連結した。ベクターは、図2に示すように、AAV血清型2の末端反復、CMVチキンベータアクチンハイブリッドプロモーターおよびWPREを含む。組み換えプラスミドはRepおよびCap配列を欠き、宿主DNAへのプラスミドの組み込みが制限されている。
【００６９】
ベクター（AAV4-STUbベクター）は、その後、大腸菌（E. coli, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA; SURE2 cells）に形質転換された。簡略に説明すると、細胞を氷上で平衡化し、1pgから500ngのベクターをE. coliに加え、そのまま1分間インキュベートした。BioRad Gene Pulserを使用し、0.1cmキュベット内で、細胞を電気穿孔した（1.7V, 200オーム）。E. coliは、その後、培地内で60分間培養した後、アンピシリン（50 μg/mL）を含む、ATCC培地1065（American Type Culture Collection, Manassas, VA）のような寒天培地に蒔いた。多量のベクターを集めるため、アンピシリンを含有するブロス内で、E. coliを増殖させた。
【実施例３】
【００７０】
（マウスUBE3Aベクターコンストラクトのインビトロ試験）
実施例2で作成されたコンストラクトのマウスベクターの特性を、HEK293細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）内で試験した。HEK293細胞は、37℃、5％ CO2で、10％ FBSおよび1％ Pen/Strepを含むダルベッコ変法必須培地（DMEM）中で培養し、80％コンフルエンスで継代培養した。
【００７１】
ベクター（6ウェルプレート中に2μg/ウェル）を、PEI遺伝子導入法を用いて細胞に遺伝子導入した。細胞は、遺伝子導入の2日前に、6ウェルプレート中で、DMEM培地で、ウェル当たり0.5×106細胞で継代培養した。培地は、遺伝子導入前夜に交換した。エンドドキシンフリーなdH2Oを約80℃に加熱し、ポリエチレンイミン（Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, MO）を溶解した。溶液をそのまま約25℃まで冷まし、水酸化ナトリウムを使用して溶液を中和した。各遺伝子導入ウェルに対し、AAV4-STUbベクターまたは陰性対照（培地のみ）を、200μL毎に2μgで、無血清DMEMに加え、各ウェルに対し、1μg/μlのポリエチレンイミン9μlを混合物に加えた。遺伝子導入混合物を室温で15分インキュベートし、細胞の各ウェルに、ウェル毎に210μLずつ加え、48時間インキュベートした。
【００７２】
AAV4-STUbベクター遺伝子導入細胞、培地のみ遺伝子導入対照細胞、遺伝子導入されていない対照細胞から培地を集めた。培地をウェスタンブロットで泳動させ、ヒトおよびマウスE6-APに対して反応性を示す、ウサギ抗E6-AP抗体（A300-351A, Bethyl Labs, Montgomery, TX）、0.4 μg/mlで染色した。ウサギコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（Southern Biotechnology, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA）と2次コンジュゲートを行った。デンシオメトリー法で結果を判定すると、図３に示されるように、AAV4-STUbで遺伝子導入されたHEK293細胞が培地中にE6-APタンパク質を分泌することが示された。
【実施例４】
【００７３】
（マウスUBE3Aベクターコンストラクトのインビボ試験）
母親由来UBE3AとGABARB3に欠失のあるマウスを交雑することにより、トランスジェニックマウスを作成した。（Jiang, et al., Mutation of the Angelman ubiquitin ligase in mice causes increased cytoplasmic p53 and deficits of contextual learning and long-term potentiation. Neuron. 1998 Oct;21(4):799-811; Gustin, et al., Tissue-specific variation of Ube3a protein expression in rodents and in a mouse model of Angelman syndrome. Neurobiol Dis. 2010 Sep;39(3):283-91）; Heck, et al., Analysis of cerebellar function in Ube3a-deficient mice reveals novel genotype-specific behaviors. Hum Mol Genet. 2008 Jul 15;17(14):2181-9）。マウスを12時間の昼光サイクルで飼育し、餌と水を自由に与えた。月齢3か月のマウスをベクターで治療した。
【００７４】
マウスをイソフルランで麻酔し、定位固定装置（51725D Digital Just for Mice Stereotaxic Instrument, Stoelting, Wood Dale, IL）に置いた。頭蓋の中央部を矢状に切開し、開口を広げるために周囲の皮膚を押し広げた。左右の海馬の位置を特定するために、以下の座標を用いた：AP 22.7mm、L 62.7mm、およびV 23.0mm。マウスは、10 mLハミルトンシリンジによって、各半球内に、20％マンニトール10μL中の濃度1×1012ゲノム/mL (N=2)のAAV4-STUb粒子または媒体（20％マンニトール10μL）のいずれかの、両側海馬内注射を受けた。傷は、生理食塩水で洗浄し、ベットボンド（NC9286393 Fisher Scientific, Pittsburgh, PA）で閉じた。対照動物には、注射を受けていないASマウスと、同腹の野生型マウスが含まれていた（n=2）。マウスは、清潔な、温かいヒーターの上に載せた空のケージ内で回復させ、屠殺するまで単独で飼育した。実験期間を通して、マウスの観察を行った。
【００７５】
治療後30日時点で、販売されている安楽死溶液のSomnasol（登録商標）（0.22 ml/kg）を腹腔内に注射して、マウスを安楽死させた。マウスを安楽死させた後、CSFを回収し、マウスをPBSで灌流し、脳を取り出した。脳は、ショ糖溶液中で凍結保護するに先立って、4％パラホルムアルデヒド溶液内で1晩固定した。ミクロトームで、脳を、25μmの薄片にした。
【００７６】
殆どの組み換え型アデノ随伴ウイルスベクターの研究では、ベクターを直接実質に注射するため、一般的に、細胞の形質導入が限られている（Li, et al., Intra-ventricular infusion of rAAV-1-EGFP resulted in transduction in multiple regions of adult rat brain: a comparative study with rAAV2 and rAAV5 vectors. Brain Res. 2006 Nov 29;1122(1):1-9）。しかし、分泌シグナルリング配列とTAT配列をUbe3Aタンパク質に付加することにより、遺伝子導入された細胞からのHECTタンパク質（すなわちUBE3A）の分泌と近接ニューロンによるペプチドの取り込みが可能となり、離れた部位への注射を、全脳内の別の部位のためのタンパク質供給源として作用させることができる。
【００７７】
屠殺したマウスの脳をミクロトームでスライスし、抗E6-AP抗体（A300-351A, Bethyl Labs, Montgomery, TX）とビオチン標識抗ウサギ2次抗体（Vector Labs #AB-1000）を用いて、E6-APタンパク質の染色を行った。染色は、ABC（Vector Labs）とDAB反応で完成された。切片をZeiss Axio Scan顕微鏡に乗せてスキャンした。染色面積のパーセンテージを、IAE-NearCYTE画像解析ソフトウェア（University of Pittsburgh Starzl Transplant Institute, Pittsburgh, PA）で定量した。
【００７８】
非トランスジェニック（Ntg）対照マウスは、正常マウスの脳のUBE3a発現レベルを示し、図４に示すように約40％であった。これと比較して、アンジェルマン症候群マウス（AS）は、約25％のUbe3aタンパク質染色レベルを示している。ASマウスの側脳室へのAAV4-STUbベクターの挿入は、ベクターがE6-APのレベルを約30〜35％まで増加させたことを示している。
【００７９】
脳スライスの免疫組織化学解析は、非トランスジェニックマウスが、領域特異的染色を伴う比較的高いレベルのE6-APを有していることを示している（図５および図６参照）。アンジェルマン症候群モデルマウスでは、E6-APの染色パターンは類似しているが、E6-APレベルは予想通り極端に減少している（図７および図８参照）。アンジェルマン症候群モデルマウスへのマウスUBE3Aベクター投与は、非トランスジェニックマウスのレベルまでではないものの、E6-APレベルを上昇させた（図９およ図１０参照）。側脳室の詳細な分析により、UBE3Aベクターの注射により、上衣細胞によるベクター取り込みが起こったことが示されている（図１１参照）。しかし、上衣細胞によるUBE3Aベクター取り込みとE6-AP発現に加えて、図の矢印で示されるように、実質内の近接する細胞も、染色されてE6-AP陽性を示している。さらに、図１２に示されるように、染色は、3d脳室のような、さらに距離の離れた場所にも見られた。このことは、E6-APが遺伝子導入された細胞によって分泌され、近接する細胞によって順調に取り込まれていたことを示し、コンストラクトがE6-APの導入に使用できること、および、アンジェルマン症候群のようなE6-AP発現に関連する全体的な脳の欠陥を治療するための治療用材料として、E6-APコンストラクトを使用できることを裏付けている。図13に示されるように、AAV4-GFPベクターを使用した対照治療においては、対照タンパク質の取り込みを示さず、上衣細胞および脈絡叢細胞の形質導入だけであった。
【００８０】
アンジェルマン症候群モデルマウスの冠状断面の詳細な解析により、UBE3Aコンストラクトの投与が、側脳室内および側脳室周辺のE6-APのレベルを上昇させることが確認された（図１４〜図２０参照）。
【実施例５】
【００８１】
（ヒトUBE3Aベクターコンストラクト）
pTRプラスミドを用いて、ヒトベクターコンストラクトを作成した。ヒトUBE3A遺伝子は、cDNAから作成し、（AH005553.1）；
2020528739.tif 000008
2020528739.tif 000009
2020528739.tif 000010
2020528739.tif 000011
2020528739.tif 000012
2020528739.tif 000013
これは；
2020528739.tif 000014
2020528739.tif 000015
をコードする。
【００８２】
cDNAをサブクローニングし、配列した。UBE3Aバージョン1遺伝子（hUBEv1）（配列番号9）を、
GDNFに基づく；
ATGAAGTTATGGGATGTCGTGGCTGTCTGCCTGGTGCTGCTCCACACCGCGTCCGCC（配列番号2）、
インスリンタンパク質からの；
ATGGCCCTGTGGATGCGCCTCCTGCCCCTGCTGGCGCTGCTGGCCCTCTGGGGACCTGACCCAGCCGCAGCC（配列番号11）（AH002844.2）、
またはIgKからの；
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT（配列番号12）（NG 000834.1）の、分泌シグナリングペプチドをコードする3つの遺伝子の1つに融合した。
【００８３】
コンストラクトを、CMVチキンベータアクチンハイブリッドプロモーターまたはヒトユビキチンcプロモーターのもとで、hSTUbベクターに挿入した。ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（WPRE）が存在し、発現レベルを上昇させる。
【００８４】
UBE3A分泌シグナルコンストラクトを、次に、
HIV TAT配列；
YGRKKRRQRRR（配列番号8）、または
HIV TATk配列；
YARKAARQARA（配列番号13）、
のいずれかの細胞取り込みペプチド（細胞透過性ペプチド）に結合させた。
【００８５】
図21に示すヒトUBE3Aベクターを、その後、実施例２に記載のヒートショック法を使用してE. coliに形質転換した。形質転換されたE. coliを、ベクターを選択し多量のベクターを回収するために、アンピシリン含有ブロス内で増殖させた。
【００８６】
UBE3Aの他の配列として、以下に示す変異体1、2または3が含まれる。
【００８７】
ヒトUBE3A変異体1；
2020528739.tif 000016
2020528739.tif 000017
2020528739.tif 000018
【００８８】
ヒトUBE3A変異体2；
2020528739.tif 000019
2020528739.tif 000020
2020528739.tif 000021
タンパク質；
2020528739.tif 000022
2020528739.tif 000023
をコードする。
【００８９】
ヒトUBE3A変異体3；
2020528739.tif 000024
2020528739.tif 000025
【実施例６】
【００９０】
（ヒトUBE3Aベクターコンストラクトのインビトロ試験）
ヒトベクターの特性を、10％ FBSおよび1％ Pen/Strepを含むDMEM中で、37℃、5％ CO2で培養し、80％コンフルエンスで継代培養されたHEK293細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）内で試験した。
【００９１】
ベクター（6ウェルプレート中に2μg/ウェル）を、PEI遺伝子導入法を用いて細胞に遺伝子導入した。細胞は、遺伝子導入の2日前に、6ウェルプレート中で、DMEM培地で、ウェル当たり0.5×106細胞で継代培養した。培地は、遺伝子導入前夜に交換した。エンドドキシンフリーなdH2Oを約80℃に加熱し、ポリエチレンイミン（Sigma-Aldrich Co. LLC, St. Louis, MO）を溶解した。溶液をそのまま約25℃まで冷まし、水酸化ナトリウムを使用して溶液を中和した。各遺伝子導入ウェルに対し、AAV4−STUbベクターまたは陰性対照（培地のみ）を、200μL毎に2μgで、無血清DMEMに加え、各ウェルに対し、1μg/μlのポリエチレンイミン9μlを混合物に加えた。遺伝子導入混合物を室温で15分インキュベートし、細胞の各ウェルに、ウェル毎に210μlずつ加え、48時間インキュベートした。細胞をプレートからかきとることによって、細胞と培地を回収した。その後、培地と細胞を5000×gで5分間遠心分離した。
【００９２】
抽出物のウェスタンブロットのために、細胞ペレットを50μLの低浸透圧緩衝液内に再懸濁し、凍結／解凍を3回繰り返すことによって細胞を溶解した。15μLのライセート（可溶化液）をLamelli試料緩衝液とともに加熱し、BioRad 4〜20％ アクリルアミドゲル上で泳動させた。トランスブロットを使用して、ニトロセルロースメンブレンに転写した。5％ミルクでブロットをブロックし、抗E6AP抗体を使用してタンパク質を検出した。
【００９３】
図22に示されるように、コンストラクトで遺伝子導入された細胞は、UBE3A遺伝子、すなわちE6-APを発現している。さらに、様々な分泌シグナルへの遺伝子の付加は、分泌シグナルペプチドに応じて、様々な結果を示した。例えば、図23に示されるように、GDNF分泌シグナルに基づくコンストラクトを使用した遺伝子導入は、より低い発現を示し、遺伝子導入細胞からの検出可能な分泌は示されなかった。インスリン分泌シグナルの使用は、細胞内のコンストラクトの高い発現とともに、遺伝子導入細胞からの中程度のE6AP分泌を引き起こした。インスリンシグナル分泌の結果は、図24に示されるように、HA標識コンストラクトを使用して確認された。
【実施例７】
【００９４】
（分泌ペプチドの有効性）
ニューロンによるタンパク質の細胞外分泌促進に対する分泌ペプチドの有効性を、図25（A）および図26（A）に示すような、様々な分泌シグナル、GFPまたはヒトUbe3Aバージョン1（hUbev1）遺伝子、および、CPP TATkを含むプラスミドコンストラクトを作成することによって、測定した。GFPは、インビボ試験のためのレポーター遺伝子として使用するため、また、将来のAS研究においてhUbev1に対する対照とするために作られた。この実験で試験された分泌シグナルは、GDNF分泌シグナル、ヒトインスリン分泌シグナル、および、IgK分泌シグナルであった。分泌シグナルのアミノ酸配列は、以下の通りである。
インスリン：MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAA (配列番号18) (CAA08766.1)
GDNF: MKLWDVVAVCLVLLHTASA (配列番号3)
IgK: METDTLLLWVLLLWVPGSTG (配列番号19) (AAH80787.1)
【００９５】
様々な分泌シグナルを含むプラスミドコンストラクトを作成し、各プラスミドに対して遺伝子挿入が成功したことを確認するためにゲル電気泳動法を行った。図25（B）および図26（B）に示されるように、GFPおよびhUbev1は、いずれも、プラスミド内への組み込みが成功していた。プラスミドコンストラクトをHEK293細胞に遺伝子導入し、培地中のGFP濃度をドットブロットによって測定することにより、ニューロンによるペプチド分泌誘導に対する、選択された分泌シグナルの有効性を、測定した。培地からの抽出物を回収し、Xμlをニトロセルロース紙に載せ、その後、免疫染色を行った。。図25（C）および図26（C）に示されるように、結果は、インスリンシグナルが、中程度の細胞外タンパク質レベル、IgKおよびGDNFシグナルが、強から高の細胞外タンパク質レベルであった。従って、各シグナルは、ニューロンにおけるペプチド分泌の誘導に有効であり、hUbev1/GDNFシグナル含有プラスミドは、E6-APの分泌誘導に、特に有効であった。
【実施例８】
【００９６】
（細胞透過ペプチドの有効性）
分泌シグナル（GDNF）、hUbev1遺伝子、および、以下に示す様々なCPPシグナルを含むプラスミドコンストラクトを作成し、これらをHEK293細胞に遺伝子導入することによって、ニューロンによるタンパク質の再取り込み誘導に対する、選択されたCPPシグナルの有効性を、測定した。
ペネトラチン：RQIKIWFQNRRMKWKK （配列番号20）
TATk: YARKAARQARA （配列番号12）
R6W3: RRWWRRWRR （配列番号 21）
pVEC： LLIILRRRIRKQAHAHSK （配列番号 22）
【００９７】
これらの細胞の細胞ライセートを採取し、HEK293細胞の新しい細胞培養物に加え、インキュベート後のこれら細胞のE6-AP濃度を、ウェスタンブロットによって測定した。CPPシグナルのペネトラチン、TATk、R6RWおよびpVECに関する、取り込みの結果が、図27に示されている。
【実施例９】
【００９８】
（マウスモデルにおける、ヒトUBE3Aベクターコンストラクトのインビボ試験）
分泌および再取り込みシグナルを含むように改変されたUbe3A遺伝子が、ASに関連する認知障害を改善させる能力を維持していることを確認するために、ヒトUbe3Aバージョン1（hUbev1）、分泌シグナル、および、CPP TATkを含むプラスミドコンストラクト（hSTUb）を、rAAVベクターによって、ASのマウスモデルに形質導入した。マウス脳の長期増強を死後脳で電気生理的方法によって測定し、GFP遺伝子導入ASモデル対照マウスおよび野生型対照マウスと比較した。図28（A）および図28（B）に示されるように、測定結果は、hSTUbプラスミドが、LTP欠陥の救済に成功したことを示している。
【実施例１０】
【００９９】
（マウスモデルにおける遺伝子治療としてのヒトUBE3Aベクターコンストラクト）
ASの遺伝子治療に使用するため、ニューロン内のE6-APのより全体的な分布を促進する能力に関して、分泌能力とCPPシグナルペプチドの分析を行った。マウスモデルにおける、hSTUbプラスミドによるLTPの救済は、UBE3A遺伝子が、分泌およびCPPシグナル追加後に、ASの認知障害の治療における有効性を維持していることを示し、遺伝子治療におけるコンストラクトの可能性を支持している。GDNFシグナルは、そのプラスミドコンストラクトが、形質導入後に培地中に最も多くのE6-APの分泌を見せていることによって示されるように、この提案される治療法に使用するための最適なシグナルと考えられる。細胞に細胞ライセートを適用後の、CPPシグナルによる測定可能なE6-AP再取り込み誘導の失敗は、ライセート中のE6-AP濃度が不十分であった等、いくつかの要因によると考えられる。
【実施例１１】
【０１００】
（予測的な、人遺伝子治療）
あるヒトの小児は、１２か月頃から明らかになる重度の発達遅延を呈している。その小児は、その後、発語の欠如、発作、筋緊張低下、運動失調および小頭症を呈している。小児は、動きがぎこちなく、歩行が操り人形のようで、笑いの発作を伴う異常に楽しそうな態度を示す。小児は、突出した頤、異常に満面の笑み、および窪んだ眼によって特徴づけられる、顔面形成異常を有する。小児は、アンジェルマン症候群と診断されている。その小児は、脳の左右の海馬半球に両側注射される治療上有効な量のUBE3Aベクターで治療を受けている。治療後、症状の改善が見られ、発作の減少、筋緊張の増加、筋肉の動きの協調の増加、発語の改善がある。
【０１０１】
UBE3Aベクターは、ヒトUBE3A遺伝子からクローニングされたcDNAから形成されている。UBE3Aバージョン1遺伝子（配列番号9）を、分泌シグナリングペプチドをコードする遺伝子（インスリンまたはIgKの使用も可能であるが、この場合はGDNF）に融合する。このコンストラクトを、CMVチキンベータアクチンハイブリッドプロモーターまたはヒトユビキチンcプロモーターのもとで、hSTUbベクターに挿入する。ウッドチャック肝炎転写後調節エレメント（WPRE）が存在し、発現レベルを増加させている。
【０１０２】
このUBE3A分泌シグナルコンストラクトを、HIV TATまたはHIV TATkのような細胞取り込みペプチド（細胞透過ペプチドまたはCPP）に結合させる。次に、このヒトUBE3Aベクターを、実施例２に記載したヒートショック法を用いて、E. coli内に形質転換する。形質転換されたE. coliは、ベクターを選択し、多量のベクターを集めるため、アンピシリンを含有するブロス内で増殖させた。
【０１０３】
以上の明細書において、開示された全ての文書、行為または情報は、その文書、行為、情報またはその任意の組み合わせが、優先日において、公に入手可能であったか、公知であったか、当該分野における一般的知識の一部であったか、または何らかの問題解決に関連することが知られていたことを認めるものではない。
【０１０４】
以上で引用された全ての公開物の開示は、各公開物が個々に参照により組み込まれたのと同程度に、個々に、完全に、参照により明示的に本明細書中に組み込まれる。
【０１０５】
UBE3A欠損の治療法の具体的実施形態について記載、例示を行ってきたが、本発明の広範な精神と原理から逸脱することなしに、変形および改変を行い得ることは、当業者にとって明らかである。以下の請求項が、ここに記載された本発明の一般的および具体的特徴の全て、および、言語上、範囲に含まれる可能性のある、本発明の範囲の記述を全て、網羅することを意図することも、理解されるべきである。
【図１】
2020528739.tif 000026
【図２】
2020528739.tif 000027
【図３】
2020528739.tif 000028
【図４】
2020528739.tif 000029
【図５】
2020528739.tif 000030
【図６】
2020528739.tif 000031
【図７】
2020528739.tif 000032
【図８】
2020528739.tif 000033
【図９】
2020528739.tif 000034
【図１０】
2020528739.tif 000035
【図１１】
2020528739.tif 000036
【図１２】
2020528739.tif 000037
【図１３】
2020528739.tif 000038
【図１４】
2020528739.tif 000039
【図１５】
2020528739.tif 000040
【図１６】
2020528739.tif 000041
【図１７】
2020528739.tif 000042
【図１８】
2020528739.tif 000043
【図１９】
2020528739.tif 000044
【図２０】
2020528739.tif 000045
【図２１】
2020528739.tif 000046
【図２２】
2020528739.tif 000047
【図２３】
2020528739.tif 000048
【図２４】
2020528739.tif 000049
【図２５Ａ】
2020528739.tif 000050
【図２５Ｂ】
2020528739.tif 000051
【図２５Ｃ】
2020528739.tif 000052
【図２６Ａ】
2020528739.tif 000053
【図２６Ｂ】
2020528739.tif 000054
【図２６Ｃ】
2020528739.tif 000055
【図２７】
2020528739.tif 000056
【図２８Ａ】
2020528739.tif 000057
【図２８Ｂ】
2020528739.tif 000058
【配列表】
2020528739000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月9日(2020.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
UBE3A遺伝子は、ASに関与する遺伝子であり、ヒト刷り込み遺伝子の小さなファミリーの一つである点で独特である。UBE3Aは、15番染色体上にあり、E6AP C末端相同（HECT）タンパク質（E6関連タンパク質（E6AP））をコードする（非特許文献3）。UBE3Aは脳内において空間的に定義された母性刷り込みを受け、父親由来のコピーはDNAメチル化によって発現抑制される（非特許文献4）。このようにして、母親由来のコピーのみが活性化し、父親由来の染色体は、脳のその領域のニューロンのプロテアソームに殆どまたは全く作用しない。15番染色体の一部の不活性化、転座または欠失は、このため、機能の非代償性喪失を引き起こす。いくつかの研究により、E6-APタンパク質レベルの異常がアンジェルマン症候群患者の神経突起接触を変化させることが示唆されている（非特許文献5）。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
【図１】図示のシグナルペプチドを含むGFPクローンで遺伝子導入されたHEK293細胞からの培地の抗GFPのドットブロットである。
【図２】本発明で使用されるマウスUBE3Aベクターコンストラクトのマップである。主要な遺伝子が示されている。
【図３】プラスミドで遺伝子導入されたHEK293細胞からのE6-APタンパク質の分泌を示すウェスタンブロットである。対照細胞を遺伝子導入された細胞の培地からの培地（cnt txn）、Ube3a遺伝子導入細胞からの培地（Ube3a txn）、および遺伝子導入されていない細胞からの培地（cnt untxn）を、アクリルアミドゲルおよび抗E6-AP抗体上に泳動させた。
【図４】E6-APタンパク質染色面積のパーセンテージを示すグラフである。非トランスジェニック（Ntg）対照マウスは、正常マウスの脳のUbe3a発現レベルを示している。アンジェルマン症候群（AS）マウスは、それらマウス（aka背景染色）の染色レベルを示している。ASマウスの側脳室へのAAV4-STUb注射は、ASマウスと比較したE6-APタンパク質染色レベルの上昇を示している。n=2。
【図５】非トランスジェニックマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図６】非トランスジェニックマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像であり、脳室系（側脳室（LV）、第3脳室）を一層拡大して示している。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図７】注射を受けていないASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。
【図８】注射を受けていないASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像であり、脳室系（側脳室（LV）、第3脳室）を一層拡大して示している。
【図９】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。上衣細胞において発現が見られるが、脳室直近の実質においても染色が観察される。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１０】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像であり、脳室系（側脳室（LV）、第3脳室）を一層拡大して示している。上衣細胞において発現が見られるが、脳室直近の実質においても染色が観察される。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１１】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳室系（側脳室（LV））の高拡大画像である。上衣細胞において発現が見られるが、脳室直近の実質においても染色が観察される（矢印で示されている）。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１２】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳室系（第3脳室）の高拡大画像である。上衣細胞において発現が見られるが、脳室直近の実質においても染色が観察される。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１３】GFPを遺伝子導入された非トランスジェニックマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-GFP注射で発現は観察されず、上衣細胞および脈絡叢細胞の形質導入だけを示している。GFP（緑色蛍光タンパク質）は、分泌されない細胞質タンパク質である。これは、Ube3aが上衣細胞から放出されて実質内に取り込まれていることを示唆している。
【図１４】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳の冠状断面である。
【図１５】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の側脳室（LV）の冠状断面である。
【図１６】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の第3脳室（3V）の冠状断面である。
【図１７】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の側脳室（LV）の内角の冠状断面である。
【図１８】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の側脳室（LV）の冠状断面である。
【図１９】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す脳内の第4脳室（4V）の冠状断面である。
【図２０】側脳室内にAAV4-STUbを注射されたASマウスにおける抗E6-AP染色の顕微鏡画像である。AAV4-STUb送達後のUbe3a発現を示す、脳室系の側脳室（LV）および（c）第3脳室（3V）を一層拡大した、脳の冠状断面である。
【図２１】本発明において使用されるヒトUBE3Aベクターコンストラクトのマップである。主要遺伝子が示されている。
【図２２】hSTUbコンストラクトで遺伝子導入されたHEK293細胞ライセートのウェスタンブロットである。タンパク質が、抗E6APで染色された。
【図２３】GDNFシグナルまたはインスリンシグナルを有するhSTUbコンストラクトで遺伝子導入されたHEK293細胞の抗E6APによるドットブロットであり、発現と分泌のためにインスリンシグナルが、よりよく作用していることを示している。
【図２４】抗HAタグ抗体を使用したインスリンシグナル分泌を裏付けるドットブロットである。
【図２５】（Ａ）は、GFPタンパク質のためのプラスミドコンストラクトを示す図である。（Ｂ）は、GFPタンパク質のためのゲル電気泳動結果の画像である。（Ｃ）は、GFPコンストラクトを使用した様々な分泌シグナルのためのドットブロットである。分泌シグナルを有するコンストラクトを、細胞培養物と各細胞培養物から得られた２つのクローンに形質導入し、クローンを培養して培地を収集した。
【図２６】（Ａ）は、E6-APタンパク質のためのプラスミドコンストラクトを示す図である。（Ｂ）は、E6-AP タンパク質のためのゲル電気泳動結果の画像である。（Ｃ）は、E6-AP コンストラクトを使用した様々な分泌シグナルのためのドットブロットである。分泌シグナルを有するコンストラクトを、細胞培養物と各細胞培養物から得られた２つのクローンに形質導入し、クローンを培養して培地を収集した。
【図２７】遺伝子導入されたHEK293細胞におけるニューロンによるタンパク質再取り込み誘導における細胞ペプチド取り込みシグナルの有効性を示すウェスタンブロットである。HEK293細胞の新しい細胞培養物に細胞ライセートを加え、インキュベート後のこれら細胞のE6-AP濃度を、ウェスタンブロットによって測定した。
【図２８】（A）は、興奮性シナプス後場電位を示すグラフである。Ube3Aバージョン1（hUbev1）、分泌シグナルおよびCPP TATkのコンストラクトを、rAAVベクターによって、ASのマウスモデルに形質導入した。マウス脳の長期増強を死後脳で電気生理的方法によって測定し、GFP遺伝子導入ASモデル対照マウスおよび野生型対照マウスと比較した。（B）は、興奮性シナプス後場電位を示すグラフである。Ube3Aバージョン1（hUbev1）、分泌シグナルおよびCPP TATkのコンストラクトを、rAAVベクターによって、ASのマウスモデルに形質導入した。マウス脳の長期増強を死後脳で電気生理的方法によって測定し、GFP遺伝子導入ASモデル対照マウスおよび野生型対照マウスと比較した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５１】
分泌配列の非限定的な例は、配列番号2、配列番号5、配列番号11、配列番号12、配列番号3のcDNA、配列番号6のcDNA、配列番号18のcDNA、配列番号19のcDNA、または、上述の保存的変異を含むDNA配列の変形形態を含む相同配列である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
細胞取り込み配列の非限定的な例は、配列番号7、配列番号8のcDNA、配列番号13のcDNA、配列番号20のcDNA、配列番号21のcDNA、配列番号22のcDNA、または相同配列である。DNA配列の変形形態は、上述の保存的変異を含む。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５３】
本発明の具体的変形形態において、分泌配列は、UBE3A配列の上流に配置され、より具体的には、オプションとして細胞取り込み配列は、UBE3A配列の上流で分泌配列の下流に配置される。他の可能な取り込みタンパク質として、ペネトラチン、TATk、pVEC、トランスポータン、MPG、Pep-1、ポリアルギニン、MAPおよびR6W3を含む。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
UBE3Aベクターの合成方法は、転写開始配列を有する骨格プラスミドへの、UBE3Aコンストラクトの挿入を含む。UBE3Aコンストラクトは、上述のように、UBE3A配列、分泌配列、および細胞取り込み配列で構成される。例えば、Ube3a遺伝子をクローニングし、3′DNA配列（他の2つのペプチド配列を伴うN末端）、シグナルペプチド配列およびHIV TAT配列にインフレーム融合し、それらを、AS患者の脳および脊髄における分泌E6-APタンパク質発現のために、組み換えアデノ随伴ウイルスベクターにクローンニングした。オプションとして、骨格プラスミドを少なくとも1つのエンドヌクレアーゼで切断することによってUBEコンストラクトを挿入し、骨格プラスミドの切断端にUBE3Aコンストラクトを結合させた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
cDNAをサブクローニングし、配列した。マウスUBE3A遺伝子（配列番号4）を、分泌シグナリングペプチドGDNFをコードするDNA配列（配列番号5）と細胞取り込みペプチドＨＩＶ TAT配列（配列番号7）に融合した。分泌シグナリングペプチドは、DNA配列；
ATG GCC CTG TTG GTG CAC TTC CTA CCC CTG CTG GCC CTG CTT GCC CTC TGG GAG CCC AAA CCC ACC CAG GCT TTT GTC（配列番号 5） （NM 008386.4）
を有し、タンパク質配列；
MALLVHFLPLLALLALWEPKPTQAFV（配列番号6）（NP 032412.3）
をコードし、一方、HIV TAT配列は；
TAC GGC AGA AAG AAG AGG AGG CAG AGA AGG AGA (配列番号7)
であり、タンパク質配列；
YGRKKRRQRRR (配列番号8)（AIW51918.1）
をコードする。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７２】
AAV4-STUbベクター遺伝子導入細胞、培地のみ遺伝子導入対照細胞、遺伝子導入されていない対照細胞から培地を集めた。培地をウェスタンブロットで泳動させ、ヒトおよびマウスE6-APに対して反応性を示す、ウサギ抗E6-AP抗体（A300-351A, Bethyl Labs, Montgomery, TX）、0.4μg/mlで染色した。ウサギコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼ（Southern Biotechnology, Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA）と2次コンジュゲートを行った。デンシトメトリー法で結果を判定すると、図３に示されるように、AAV4-STUbで遺伝子導入されたHEK293細胞が培地中にE6-APタンパク質を分泌することが示された。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
様々な分泌シグナルを含むプラスミドコンストラクトを作成し、各プラスミドに対して遺伝子挿入が成功したことを確認するためにゲル電気泳動法を行った。図25（B）および図26（B）に示されるように、GFPおよびhUbev1は、いずれも、プラスミド内への組み込みが成功していた。プラスミドコンストラクトをHEK293細胞に遺伝子導入し、培地中のGFP濃度をドットブロットによって測定することにより、ニューロンによるペプチド分泌誘導に対する、選択された分泌シグナルの有効性を、測定した。培地からの抽出物を回収し、200μlまたは400μlをニトロセルロース紙に載せ、その後、免疫染色を行った。。図25（C）および図26（C）に示されるように、結果は、インスリンシグナルが、中程度の細胞外タンパク質レベル、IgKおよびGDNFシグナルが、強から高の細胞外タンパク質レベルであった。従って、各シグナルは、ニューロンにおけるペプチド分泌の誘導に有効であり、hUbev1/GDNFシグナル含有プラスミドは、E6-APの分泌誘導に、特に有効であった。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
（細胞透過ペプチドの有効性）
分泌シグナル（GDNF）、hUbev1遺伝子、および、以下に示す様々なCPPシグナルを含むプラスミドコンストラクトを作成し、これらをHEK293細胞に遺伝子導入することによって、ニューロンによるタンパク質の再取り込み誘導に対する、選択されたCPPシグナルの有効性を、測定した。
ペネトラチン：RQIKIWFQNRRMKWKK（配列番号20）
TATk: YARKAARQARA（配列番号13）
R6W3: RRWWRRWRR（配列番号 21）
pVEC：LLIILRRRIRKQAHAHSK（配列番号 22）
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月27日(2020.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
転写開始配列と、
前記転写開始配列の下流に配置されたUBE3A配列または相同配列と、
前記転写開始配列の下流に配置された分泌配列または相同配列と、
前記転写開始配列の下流に配置された、ペネトラチン、R6W3またはpVECである、細胞取り込み配列または相同配列、
を含む、UBE3Aベクター。
【請求項２】
前記転写開始配列が、サイトメガロウィルスチキンベータアクチンハイブリッドプロモーターまたはヒトユビキチンcプロモーターであることを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記転写開始配列の上流に配置されたサイトメガロウイルス最初期エンハンサー配列をさらに含むことを特徴とする、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
ウッドチャック肝炎転写後調節エレメントをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
プラスミドをさらに含み、該プラスミドは、組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドであり、該組み換えアデノ随伴ウイルス血清型2をベースとするプラスミドは、DNA組み込みエレメントを欠いていることを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項６】
前記分泌配列は、前記UBE3A配列の上流に配置されていることを特徴とする、請求項1に記載のベクター。
【請求項７】
前記細胞取り込み配列は、前記UBE3A配列の上流で前記分泌配列の下流に配置されていることを特徴とする、請求項1に記載のベクター。
【請求項８】
前記分泌配列が、インスリン、GDNFまたはIgKであることを特徴とする、請求項1に記載のベクター。
【請求項９】
請求項１に記載のUBE3Aベクターと、
薬学的に受容可能な担体と、
を含む、欠損UBE3Aによって特徴づけられる神経変性疾患の治療用の組成物。
【請求項１０】
前記神経変性疾患がアンジェルマン症候群であることを特徴とする、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
前記UBE3A配列が、配列番号9、配列番号14、配列番号15、配列番号17、配列番号10のcDNA、配列番号16のcDNA、または相同配列であることを特徴とする、請求項１に記載のベクター。
【請求項１２】
神経系の疾患、障害、または、疾患若しくは障害の症候群を治療するための医薬を製造するための、請求項1乃至11のいずれかの組成物の使用であり、前記疾患または障害が、欠損UBE3Aによって特徴づけられる神経変性疾患である、使用。
【請求項１３】
前記神経系の疾患または障害がアンジェルマン症候群であることを特徴とする、請求項12に記載の使用。
【国際調査報告】
2020528739.tif 000059