(57)【要約】  本発明は獣医寄生虫学およびワクチン学の分野に関し；より詳細には、本発明は、生エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）オーシストと薬学的に許容される担体とを含む組成物に関する。組成物は、それがＴＬＲ３アゴニストを含むことを特徴とする。組成物は、コクシジウム症に対する家禽用ワクチンの製造に使用されうる。該ワクチンは例えば１日齢のニワトリに粗噴霧として適用されうる。該ワクチン中のＴＬＲ３アゴニストはエイメリアオーシストの用量を最大４倍減少させうる一方で、ＴＬＲ３アゴニストを含有しないワクチンと同じレベルの、チャレンジに対する防御をもたらしうる。あるいは、ワクチンにおいてエイメリアオーシストの通常の用量を使用する場合、ＴＬＲ３アゴニストはより早い免疫開始を引き起こして、ワクチン接種の３週間後ではなく２週間後に既にチャレンジの際の腸病変スコアの有意な低下をもたらす。【選択図】図２
2020502204.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）オーシストと薬学的に許容される担体とを含む組成物であって、組成物が約０．３〜約５％ｗ／ｖのキサンタンガムとＴＬＲ３アゴニストとを含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２】
ＴＬＲ３アゴニストがポリＡ：Ｕであることを特徴とする、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
生エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）オーシストが胞子形成オーシストであることを特徴とする、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
生エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）オーシストが、エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）、エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）、エイメリア・ネカトリクス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメリア・ブルネッティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・プレコクス（Ｅ，ｐｒａｅｃｏｘ）、エイメリア・ミバティ（Ｅ．ｍｉｖａｔｉ）、エイメリア・ハガニ（Ｅ．ｈａｇａｎｉ）、エイメリア・メレアグリミティス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）１、エイメリア・メレアグリミティス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）２、エイメリア・アデノイデス（Ｅ．ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、エイメリア・ガロパボニス（Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ）およびエイメリア・ディスペルサ（Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ）からなる群から選択される１以上である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
組成物が約０．１〜約１．６％ｗ／ｖの金属塩を含むことを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
組成物が、薬学的に許容される着色剤を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
生エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）オーシストおよび薬学的に許容される担体を、ＴＬＲ３アゴニストと混合することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物の製造方法。
【請求項８】
コクシジウム症に対する家禽用ワクチンの製造のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【請求項９】
コクシジウム症に対する家禽用ワクチンとしての使用のための、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
ワクチンが、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物を含む、コクシジウム症に対する家禽用ワクチン。
【請求項１１】
ワクチンが、０．３〜１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含み、そして、２００〜４０００ｍＰａ．ｓの粘度を有する、請求項１０記載のワクチン。
【請求項１２】
コクシジウム症に対する家禽のワクチン接種方法であって、該方法が、請求項１０または１１に記載のワクチンを該家禽に投与することを含むことを特徴とする、ワクチン接種方法。
【請求項１３】
家禽および／またはその周囲に粗噴霧によりワクチンを投与することを含む、請求項１２に記載のワクチン接種方法。
【請求項１４】
家禽におけるエイメリア感染または関連疾患徴候の低減のための方法であって、該方法が、請求項１０または１１に記載のワクチンを該家禽に投与することを含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
経口経路によるトリの腸へのＴＬＲ３アゴニストの送達方法であって、ＴＬＲ３アゴニストがキサンタンガムと混合されることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は獣医寄生虫学およびワクチン学の分野に関し；より詳細には、本発明は、生きたエイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）オーシストと薬学的に許容される担体とを含む組成物、該組成物の製造方法、コクシジウム症に対する家禽用ワクチンにおける該組成物の医学的使用、ならびに該ワクチンの方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）はアピコンプレクサ門（Ｐｐｈｙｌｕｍ  Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）およびコクシジウム（Ｃｏｃｃｉｄｉａ）綱の原虫寄生虫であり、世界中で見出される。それは宿主に感染すると、コクシジウム症と称される腸疾患複合体を引き起こす。エイメリアは、複数の段階を含む複雑な生活環を有し、その幾つかは宿主外で生じる。エイメリア感染は胞子形成オーシストの摂取により生じ、生後１日目から生じうる。次にスポロゾイトが腸内で放出され、ついでこれは、腸上皮細胞に侵入することにより、宿主の腸の一部にコロニーを形成する。複製はメロゾイト段階の放出、および宿主の腸上皮細胞の破裂をもたらす。次にメロゾイトは他の上皮細胞に再感染し、これが４〜６日の更に最大４サイクルにわたって継続する。最後に性的段階が発達し、これは、糞便と共に放出されるオーシストを産生する。環境中での胞子形成の後、新たなサイクルが開始する（Ｓｈｉｒｌｅｙら，２００５，Ａｄｖ．ｉｎ  Ｐａｒａｓ．，ｖｏｌ．６０，ｐ．２８５）。
【０００３】
家禽におけるエイメリア感染の症状は、食欲不振から、腸炎および血性下痢、腸内の壊死組織の増加による臓器不全、更には死亡に至るまで、様々である。その結果、飼料要求率の低下、成長速度の低下、産卵の低下、および二次感染に対する感受性が生じる。これら全てが罹患鳥類に著しい不快感を与え、商業的養鳥業に深刻な経済的損害を与える。家禽コクシジウム症の概要に関しては、“Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（１０ｔｈ  ｅｄ．，２０１０，Ｃ．Ｍ．Ｋａｈｎ編，ＩＳＢＮ：０９１１９１０９３Ｘ）、またはＳｗａｙｎｅら編：“Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｏｆ  Ｐｏｕｌｔｒｙ”，１３ｔｈ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，Ａｍｅｓ，ＩＡ．，ＵＳＡのようなテキストを参照されたい。
【０００４】
エイメリア感染およびコクシジウム症の低減は、飼料を介して抗コクシジウム薬（コクシジウム抑制薬）を投与することによりもたらされうるが、耐性の発達および動物製品における残留薬物の存在が常に懸念される。したがって、家禽におけるエイメリア感染および関連疾患徴候は、好ましくは、ワクチン接種によって対処される。サブユニットまたは組換えＤＮＡに基づく有効なエイメリアワクチンが利用可能でないため、１以上のエイメリア種からの胞子形成オーシストを含む生ワクチンが家禽に最もよく使用されている。鳥類の腸におけるそれらの自然複製は、免疫系の体液性経路および細胞性経路の両方によって、強力な免疫を誘導する。一般に、ワクチン接種後約３週間で完全免疫に達する。鳥類を一生涯にわたって防御するには、若齢での１回の生オーシストのワクチン接種、およびその後時々生じる野生型追加感染による補助で十分である。
【０００５】
生ワクチンオーシストは野生型または弱毒化病原型のものでありうる。弱毒化エイメリアの特別なクラスは、いわゆる、早発株である。そのような弱毒化株は、より少数のオーシストの排出、および／またはワクチン接種された標的の腸への、より軽度な損傷を引き起こす。
【０００６】
エイメリアワクチンの有効性は通常、病原性エイメリア株によるチャレンジ感染後の感染および疾患に関する主要基準、すなわち、腸病変スコア、生体重増加およびオーシスト排出量を評価することにより決定される。エイメリアワクチンの有効性を評価するためのこれらの基準の妥当性を記載した論文としては、Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｃａｔｃｈｐｏｌｅ，（２０００，Ｖａｃｃｉｎｅ，ｖｏｌ．１８，ｐ．１１７８−１１８５）が挙げられる。
【０００７】
典型的には、鳥類用エイメリア生ワクチンは、幾つかのエイメリア種に由来する胞子形成オーシストを含む。なぜなら、免疫は種特異的だからである。また、異なるエイメリア種は、異なる種の家禽（例えば、ニワトリおよびシチメンチョウ）に感染する。家禽用の市販のコクシジウム症ワクチンの例としては、Ｃｏｃｃｉｖａｃ（商標）、Ｐａｒａｃｏｘ（商標）またはＦｏｒｔｅｇｒａ（商標）（全て、ＭＳＤ  Ａｎｉｍａｌ  Ｈｅａｌｔｈ）；Ｉｍｍｕｃｏｘ（商標）（Ｃｅｖａ）；およびＩｎｏｖｏｃｏｘ（商標）（Ｈｕｖｅｐｈａｒｍａ）が挙げられる。
【０００８】
一般に、そのようなワクチンは、コストを削減するために大量ワクチン接種の方法により、例えばトリもしくは飼料への噴霧または飲料水を介した方法により投与される。野外感染圧は生後１日目から存在するため、ワクチン接種は、好ましくは可能な限り若いトリに適用される。これは、雛が孵化したばかりで、開放状態のトレイ上に維持されているときに、孵化場における噴霧投与によって簡便に行われうる。この経路は、トリの体およびその直接的な周囲への送達をもたらす。ついで、トリは、小滴をついばみ、羽づくろいをする傾向にあるため、ワクチンは、経口経路、経鼻経路および／または眼経路によりトリによって摂取される。噴霧ワクチンの取り込みを改善するために、一般に、明るい色を加えることにより可視性が増強される。
【０００９】
欧州特許出願番号ＥＰ１５２０３０１２には、噴霧によりトリに送達されうるゲルに基づくエイメリアワクチンが記載されている。該ゲルは、キサンタンガムによりもたらされる約２００〜約４０００ｍＰａ．ｓの粘度を有する。キサンタンガムは擬塑性を有するため、標準的な噴霧ワクチン接種装置が使用されうる。このように、ゲルビーズは、トリによってついばまれるのに好都合なサイズで製造されうる。これは、それ以前のエイメリア噴霧ワクチンと比較して、向上したワクチン摂取および迅速な免疫生成をもたらす。
【００１０】
生エイメリアオーシストワクチンの商業的および大規模生産における主な欠点は、エイメリアオーシスト自体の生成である。現在のところ、エイメリアの全ての発生段階をインビトロで培養することが可能であるわけではないため、エイメリアオーシストはドナー家禽宿主において産生され、その糞便から単離される必要がある。ついで、エイメリアオーシストは精製され、胞子形成され、ワクチンへと製剤化される。また、有効な交差防御の欠如ゆえに、獣医学上重要な最大１４個の異なるエイメリア種がドナー鳥により産生される必要がありうる。
【００１１】
これは非常に面倒で厄介なワクチン製造方法であるため、現在の商業生産はこれらのワクチンに対する市場の需要を満たすことができない。したがって、経済的観点および倫理的観点の両方から、そのような入手困難な生エイメリアオーシストワクチンの有効性を最大にすることが必要とされている。
【００１２】
免疫応答はアジュバントの使用によって増幅されうる。これは単一分子または複合的組成物であることが可能であり、特異的または非特異的に標的の免疫反応を刺激しうる。典型的には、アジュバントは不活化ワクチンまたはサブユニットワクチンと共に適用される。なぜなら、これは、複製性微生物のワクチンでの極めて稀な例以外は、そのような免疫刺激の非存在下ではほとんど有効でないからである。
【００１３】
多数の可能なアジュバントのうち、免疫刺激性オリゴデオキシヌクレオチドが１つの選択肢である。最初の報告は、Ｋｒｉｅｇらによる細菌ＤＮＡに存在する非メチル化ＣｐＧモチーフの使用を記載している（１９９５，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３７４，ｐ．５４６）。その後の２０年間で、例えば侵入微生物のゲノム物質中に存在する保存構造モチーフ、いわゆる、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の認識による、微生物の侵入の感知および該侵入に対する応答のための方法として、根底メカニズムが明らかにされた。この目的のために、自然免疫系は、特異的パターン認識受容体例えばトール様受容体（ＴＬＲ）を用いる。
【００１４】
ＴＬＲはＩ型膜貫通糖タンパク質であり、アゴニストリガンドの結合は、１型インターフェロンおよび炎症性サイトカイン（インターロイキンおよび腫瘍壊死因子アルファ）の発現をもたらす細胞シグナル伝達カスケードにつながる。加えて、これは二次的な後天性免疫応答の刺激のための基礎である（Ｋａｗａｉ  ＆  Ａｋｉｒａ，２０１０，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１１，ｐ．３７３）。
【００１５】
ニワトリにおいて、ＴＬＲアゴニストの使用は、アジュバントとして作用し種々の微生物、主にウイルスに対する免疫を刺激するその能力に関して研究されている（Ｓｔ．Ｐａｕｌら，２０１３，Ｖｅｔ  Ｉｍｍ．＆  Ｉｍｍ．ｐａｔｈｏｌ．，ｖｏｌ．１５２，ｐ．１９１−１９９；Ｇｕｐｔａら，２０１４，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ｖｏｌ．１３，ｐ．９０９−９２５）。しかし、結果は良く見ても変動的であり、際立って優れたＴＬＲアゴニストは１つもない。
【００１６】
鳥類と同様に哺乳類においても、ＴＬＲ３は、中間体である二本鎖ＲＮＡを感知することによりウイルス複製の検出に寄与している。これはＣｈｅｎら（２０１３，Ｖｅｔ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．４４，ｐ．８２）において概説されている。実際、合成ｄｓＲＮＡ、または類似体、例えばポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）またはポリアデニル−ポリウリジル酸（ポリＡ：Ｕ）の二量体ホモポリマーが、ＴＬＲ３アゴニストとして適用されうる。ポリＩ：ＣおよびポリＡ：Ｕは共に、種々の感染モデルにおいて、更には癌免疫学において、それらの効果に関して研究されている。例えば、ＥＰ３４４．８０８は組換えエイメリアタンパク質のコクシジウム症ワクチンを記載しており、ここで、ポリＩ：Ｃが潜在的アジュバントとして挙げられている。しかし、その例はフロイント完全アジュバントにおいて６５ｋＤａの抗原を使用しており、あるいは、それはワクシニアウイルスベクターから発現されている。
【００１７】
ＷＯ２０１５／０４２３６９は、エイメリア・マキシマ（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｍａｘｉｍａ）感染に対する防御のための、ポリＩ：Ｃとクロストリジウム・パーフリンジェンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）の組換え抗原とを含む油エマルジョンワクチンを記載している。
【００１８】
市販ワクチンであるＥｖａｌｏｎ（商標）（Ｈｉｐｒａ）は噴霧用の生エイメリアオーシストワクチンであり、これは、鉱油Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ（商標）を含有する油性懸濁液をアジュバントとして含む。
【００１９】
したがって、生エイメリアオーシストと共にＴＬＲ３アゴニストを使用することに関しては、当技術分野において記載も示唆もされていない。
【００２０】
Ｓｕｍｎｅｒｓら（２０１１，Ｅｘｐ．Ｐａｒａｓｉｔｏｌ．，ｖｏｌ．１２７，ｐ．７１４−７１８）は、エイメリア・プレコクス（Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ）の感染から生じる、ニワトリにおける幾つかのＴＬＲおよび抗微生物ペプチドの発現プロファイルの変化を調べた。結果は変動的であり、Ｃｈ  ＴＬＲ３に関しては矛盾していた。なぜなら、これは１つの実験においてはアップレギュレーションされていたが、より高い感染量が使用された別の実験においてはダウンレギュレーションされていたからである。Ｓｕｍｎｅｒは、ワクチン成分としてエイメリア・プレコクス（Ｅ．ｐｒａｅｃｏｘ）を含めることを示唆しているが、いずれかの特定の因子をアジュバントとして使用することを示唆していない。
【００２１】
したがって、先行技術における欠点を克服し、より有効なエイメリアワクチンを提供することによりこの分野における要求を満たすことが、本発明の目的である。
【発明の概要】
【００２２】
驚くべきことに、生（ｌｉｖｅ）エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）オーシストを含む組成物にキサンタンガムおよびＴＬＲ３アゴニストを加えることにより、この目的が達成可能であり、したがって、先行技術の欠点の１以上が克服されうることが判明した。ついで、この組成物は、コクシジウム症に対する家禽用ワクチンを製造するために使用されうる。該ワクチンは噴霧により投与可能であり、ついで家禽により摂取される。
【００２３】
得られたワクチンにおいて、ＴＬＲ３アゴニストはエイメリアオーシストの用量を最大４倍減少させうる一方で、ＴＬＲ３アゴニストを含有しないワクチンと同じレベルのチャレンジに対する防御をもたらしうる。あるいは、ワクチンにおいてエイメリアオーシストの通常の用量を使用する場合、ＴＬＲ３アゴニストはより早い免疫開始を引き起こし、ワクチン接種の３週間後ではなく２週間後に、既にチャレンジの際の腸病変スコアの有意な低下をもたらす。これらの効果は共に経済的に非常に重要である。
【００２４】
これは決して容易なことではなかった。なぜなら、本発明者らは、エイメリアワクチン接種をより有効に行うための方法を選択する際に、選択に迷ったからである。アジュバントの添加を選択することは、製剤自体、用量、方法または投与経路の改善などのような代替手段のうちの１つの選択肢に過ぎなかった。また、アジュバントは生ワクチンの一般的な成分ではない。更に、特に家禽における使用のために、考慮される多数の可能なアジュバントから適切かつ有効なアジュバントを選択する際に、ＰＡＭＰは最も有望な候補ではなかった。そして最後に、可能なＰＡＭＰから選択する際に、ＴＬＲアゴニストは多数の選択肢のうちの１つに過ぎず、ＴＬＲ３は、選択される多数のＴＬＲのうちの１つに過ぎず、証明された有効性の点で傑出したものでなかったことは確かである。
【００２５】
したがって、本発明者らは、ＴＬＲ３アゴニストがこのタイプのワクチンに非常に成功したことを見出して驚いた。例えば、生きた複製性寄生虫に対する免疫刺激に関する情報はなく、特に、腸管免疫のＴＬＲ３アゴニストによる刺激に関する情報はなかった。この刺激は、生複製性エイメリア寄生虫に有効であることが判明した。更に、ＴＬＲ３アゴニストが経口経路による摂取および腸管の通過の後に残存しうることは非常に予想外であった。
【００２６】
本発明者らは、これらの知見を説明しうるいずれの理論またはモデルによっても束縛されることを望まないが、本発明者らは、ＴＬＲ３アゴニストが複製性エイメリアに対する腸免疫応答を刺激しうると推測している。これは、おそらく、より早いおよび／またはより強力なワクチン接種応答をもたらすであろう。得られたワクチンにおいては、キサンタンガムは噴霧投与の際にワクチンからの小滴の形成を促進し、これらのゲル小滴の摂取の際に、キサンタンガムは腸への送達中のＴＬＲ３アゴニストの保護に関与しうる。
【００２７】
これも驚くべきことであった。なぜなら、アジュバントとしてＴＬＲ３アゴニストを使用した過去の研究は、これが経口経路によっては投与され得ないことを示していたからである。したがって、ワクチンアジュバントとしてＴＬＲ３アゴニストを使用することを検討した際にも、これが、関連作用部位、すなわち、トリの腸に、経口ワクチンと共に送達されうるのかどうか、またどのように送達されうるのかは示されていなかった。
【００２８】
実際、腸管内の状態は、胃の酸性環境と相まって、あらゆる形態のＲＮＡの急速な加水分解を促進するであろう。これは、ＲＮアーゼの存在によって、局所的に、および腸マイクロバイオームの細菌により分泌または放出された際の両方において、悪化されるに過ぎない。したがって、例えば本発明において使用されるような任意の裸ＲＮＡまたはＲＮＡ類似体は、要求される作用部位に到達する前であっても、即時分解される傾向にある。これはＺｈｏｕら（２００７，Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１７８，ｐ．４５４８−４５５６）においても記載されており、ＴＬＲ−３活性化から生じるｄｓＲＮＡの腹腔内投与後に観察された粘膜障害は、ｄｓＲＮＡの経口投与後には観察されなかったことを、彼らは見出した。
【００２９】
同様に、Ｌａｎｔｉｅｒら（２０１４，Ｊ．ｏｆ  Ｉｎｆ．Ｄｉｓ．，ｖｏｌ．２０９，ｐ．４５７−４６７）は、ポリＩ：Ｃの投与が、マウスにおいてクリプトスポリジウム・パルバム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）に対する防御を誘導するのを助けたことを記載している。しかし、経口投与は測定可能な応答を何ら示さなかったので、これは投与が腹腔内経路による場合のみであった。
【００３０】
ＺｈｏｕおよびＬａｎｔｉｅｒは共に、この効果がＲＮＡまたはその類似体の分解によるものであると示唆している。
【００３１】
したがって、本発明者らは、キサンタンガムを含む経口ワクチン中にＴＬＲ３アゴニストを配合することにより、該アゴニストの比較的低濃度のみの使用にもかかわらず、ＴＬＲ３アゴニストの免疫学的に活性な量をトリ標的の腸内の作用部位に送達するための方法を見出した。
【００３２】
よって、キサンタンガムとの組合せが、それが比較的低濃度で経口経路によって今や投与可能であり、家禽の経口エイメリアワクチン接種後に得られる防御応答の検出可能な臨床的な改善をトリの腸において尚ももたらしうるように、ｄｓＲＮＡの類似体を保護することが見出された。
【００３３】
したがって、１つの態様においては、本発明は、生エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）オーシストと薬学的に許容される担体とを含む組成物であって、組成物が約０．３〜約５％ｗ／ｖのキサンタンガムとＴＬＲ３アゴニストとを含むことを特徴とする、組成物に関する。
【００３４】
本発明の組成物は、コクシジウム症に対する家禽用ワクチンを製造するために使用されうる。コクシジウム症ワクチン、その製造およびその使用の詳細および好ましい態様は本明細書に後記に記載されている。
【００３５】
本明細書中で用いる「含む」（ならびに派生語、例えば「含む」、「含んで」および「含まれ」）なる語は、この語が用いられている本文、段落、特許請求の範囲などにより保護され又は包含される、本発明に関して考えられうる全ての要素および任意の可能な組合せを、そのような要素または組合せが明示的に列挙されていない場合であっても指し示すことを意図しており、そのような要素または組合せのいずれをも排除することを意図するものではない。
【００３６】
したがって、いずれかのそのような本文、段落、特許請求の範囲などはまた、「含む」（またはその派生語）なる語が「からなる」、「からなり」または「から本質的になる」のような語によって置換されている１以上の実施形態に関するものでありうる。
【００３７】
「オーシスト」は、エイメリア（Ｅｉｍｅｒｉａ）のようなアピコンプレクサ寄生虫の生活環段階の１つである周知の微生物である。
【００３８】
オーシストは、それが鳥類の腸内などのような適切な条件下でエイメリア複製周期を開始可能である場合、「生」（ｌｉｖｅ）である。
【００３９】
「エイメリア」（Ｅｉｍｅｒｉａ）は、アイメリア科に属する寄生虫として当技術分野においてよく知られている。これらの寄生虫およびそれらの誘発疾患は、よく知られているテキスト（前掲）に記載されている。エイメリアは、その分類群のメンバーの特徴的な特徴、例えば形態学的、ゲノム的および生化学的特性、ならびに生物学的特性、例えば生理学的、免疫学的または病理学的挙動を示す。
【００４０】
当技術分野において公知のとおり、特定の「種」としての微生物の分類はそのような特徴の組合せに基づいている。したがって、本発明はまた、例えば亜種、株、単離物、遺伝子型、変異体、亜型または亜群などとして、何らかの様態でそれから細分類されたエイメリアをも含む。
【００４１】
本発明のエイメリアは家禽の種において複製可能であり、例えばエイメリア種：エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ブルネッティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）、エイメリア・ミバティ（Ｅ．ｍｉｖａｔｉ）、エイメリア・ネカトリクス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメリア・プレコクス（Ｅ，ｐｒａｅｃｏｘ）、エイメリア・ハガニ（Ｅ．ｈａｇａｎｉ）、エイメリア・メレアグリミティス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）（１型または２型）、エイメリア・アデノイデス（Ｅ．ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、エイメリア・ガロパボニス（Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ）、エイメリア・ディスペルサ（Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ）、エイメリア・イノクア（Ｅ．ｉｎｎｏｃｕａ）、エイメリア・スブロツンダ（Ｅ．ｓｕｂｒｏｔｕｎｄａ）またはエイメリア・メレアグリディス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｄｉｓ）を含みうる。
【００４２】
本発明に関する特定のエイメリアは、特定の種および属に現在割り当てられているかもしれないが、これは、新たな洞察が新たな又は異なる分類群への再分類をもたらすとやがて変化しうる分類学的分類であることが当業者に明らかであろう。しかし、これは微生物自体またはその抗原レパートリーを変化させずに、単にその科学的名称または分類のみを変化させるものであるため、そのような再分類された微生物は依然として本発明の範囲内にある。
【００４３】
本発明において使用されるエイメリア寄生虫は、種々の供給源から、例えば、種々の研究所、（寄託）機関もしくは（獣医科）大学から、または家禽舎から野外単離物として入手可能である。
【００４４】
「薬学的に許容される担体」は、高純度の、好ましくは無菌の水性液体、例えば水、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水である。該担体は、更に賦形剤、例えば安定化剤または保存剤を含みうる。
【００４５】
「キサンタンガム」は、よく知られている高分子量多糖、ＣＡＳ  ｎｒ．１１１３８−６６−２であり、例えば、ＣＰ  ＫｅｌｃｏからのＫｅｌｔｒｏｌ（商標）、Ｘａｎｔｕｒａｌ（商標）またはＫｅｌｚａｎ（商標）として、幾つかの品質および純度で、一般に商業的に入手可能である。キサンタンガムの詳細および特性は、例えば、Ｘａｎｔｈａｎ  ｂｏｏｋ’，８ｔｈ  ｅｄ．，２００８，ｃｐｋｅｌｃｏ．ｃｏｍに記載されている。
【００４６】
本発明に関しては、「約」は、数値がその表示値の上下で±２５％変動しうることを示す。
【００４７】
本発明に関しては、「％ｗ／ｖ」は体積当たりの重量パーセントを意味する。本発明のこの態様に関しては、それは本発明の組成物の体積に関するものである。
【００４８】
「ＴＬＲ３アゴニスト」は、ＴＬＲ３（トール様受容体、３型）を活性化しうる、すなわちＴＬＲシグナル伝達経路により媒介されるシグナル伝達事象を誘導しうる任意の化合物または物質である。この意味において、該アゴニストは、ＴＬＲ３に直接結合する結合部分またはリガンドであることが可能であり、あるいは、活性化は、内因性または外因性リガンドの生成を介した間接的なものでありうる。
【００４９】
ＴＬＲ３分子ならびにその活性化および生じる細胞カスケードは全て、当技術分野において記載されている。ＴＬＲ３アゴニストは、例えば、天然に存在する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、合成ｄｓＲＮＡおよび合成ｄｓＲＮＡ類似体である（例えば、Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕら，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  ｖｏｌ．４１３，ｐ．７３２−７３８を参照されたい）。適切なＴＬＲ３アゴニストは、それが他のいかなるＴＬＲをも実質的に活性化しないという点で選択的にＴＬＲ３を活性化しうる。
【００５０】
本発明のための適切なＴＬＲ３アゴニストの例としては、合成ｄｓＲＮＡ類似体、例えばポリＩ：ＣおよびポリＡ：Ｕ、または、変異体、例えばポリＩ：Ｃ  １２Ｕが挙げられる。合成ｄｓＲＮＡ類似体は、例えばホスホロチオアート修飾、ハロゲン化、アルキル化（例えば、エチルまたはメチル修飾）および／またはホスホジエステル修飾による修飾骨格を有しうる。
【００５１】
当技術分野においては、これらの類似体を示すために別の表記法も用いられており：例えば、ポリＩ：ＣはポリＩ・Ｃ、ポリ−ＩＣ、ポリＩ−ポリＣ、ポリＩ：ポリＣなどとしても表記される。これら全ては本発明の範囲内である。
【００５２】
記載されているとおり、キサンタンガムは、本発明の組成物から製造されうるワクチンが、大量ワクチン接種の方法、例えば噴霧によって有効に投与されることを可能にする。一例は、ＥＰ１５２０３０１２に記載されている、ゲルに基づく噴霧ワクチンである。そのようなワクチンを製造するために、組成物中のキサンタンガムの量は、意図されるワクチンを製造するために組成物が使用される比率に左右されるであろう。
【００５３】
ＥＰ１５２０３０１２に記載されているゲルに基づく噴霧ワクチンは、キサンタンガム約０．３〜約１．５％ｗ／ｖの量のキサンタンガムを含み、この場合の％ｗ／ｖは、ワクチンの体積当たりの重量パーセントを示す。
【００５４】
尚も簡便に処理されうるキサンタンガムの量の上限は、約５％ｗ／ｖである。したがって、本発明の組成物を約４倍まで希釈することを可能にするためには、組成物は（組成物の）０．３〜５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含みうる。
【００５５】
好ましくは、本発明の組成物は、例えばＥＰ１５２０３０１２に記載されているような、ゲルに基づく噴霧ワクチンの製造のためにほぼ実質的に使用されるべきである。その場合、組成物自体は（組成物の）約０．３〜約１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含む。
【００５６】
したがって、本発明の組成物の１つの実施形態においては、組成物は約０．３〜約１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含む。
【００５７】
１つの実施形態において、本発明の組成物は（組成物の）０．４〜１．２％ｗ／ｖのキサンタンガムを含む。好ましくは、組成物は０．５〜１％ｗ／ｖのキサンタンガム、０．５〜０．９％ｗ／ｖ、０．５〜０．８％ｗ／ｖ、または更には０．５〜０．７％ｗ／ｖのキサンタンガムを、好ましい順に含む。
【００５８】
１つの実施形態において、本発明の組成物は（組成物の）約０．６％ｗ／ｖのキサンタンガムを含む。
【００５９】
好ましくは、「約」はその値の上下の±２０％を意味し、より好ましくは、「約」はその値の上下の±１５、１２、１０、８、６、５、４、３、２％を意味し、または更には「約」はその値の上下の±１％を、好ましい順に意味する。
【００６０】
比較実験において、本発明の組成物から製造されたワクチンにおいて、ポリＡ：Ｕは、家禽、特にニワトリにおいてエイメリアに対する腸管免疫を刺激することにおいて、ポリＩ：Ｃより有効であったことを本発明者らは見出した。
【００６１】
したがって、本発明の組成物の１つの実施形態においては、ＴＬＲ３アゴニストはポリＡ：Ｕである。
【００６２】
ポリＩ：ＣまたはポリＡ：Ｕのような合成ｄｓＲＮＡ類似体は、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＣＡＳ  ｎｒ．２４９３６−３８−７の凍結乾燥ナトリウム塩として、ファインケミカルの供給業者から商業的に入手可能である。
【００６３】
本発明の組成物において使用されるＴＬＲ３アゴニストの量は、本明細書に記載されているコクシジウム症に対する家禽用ワクチンの製造に組成物が使用される比率、および標的家禽当たりに適用されるワクチンの量に関して決定される。
【００６４】
当業者に理解されるとおり、本発明の組成物またはその一部は、より濃縮された形態、例えば、２倍、３倍またはそれ以上に濃縮された形態で製造、販売または貯蔵されうる。ついで、濃縮物は、例えば本明細書に記載されているコクシジウム症に対する家禽用ワクチンの製造のために、更に、使用の前に希釈される。そのような状況においては、得られるワクチンにおけるＴＬＲ３アゴニストの好ましい量を達成するために、組成物はより多量のＴＬＲ３アゴニストを含みうる。
【００６５】
当業者は、例えば、腸病変スコアに基づくチャレンジに対する防御に関して、これらの量を最適化することが十分に可能である。
【００６６】
好ましくは、本発明の組成物は１ミリリットル当たり約５〜約１０００マイクログラムのＴＬＲ３アゴニストを含む。
【００６７】
この範囲は、ワクチン１ミリリットル当たり約５〜約２５０のＴＬＲ３アゴニストの量のワクチン中のＴＬＲ３アゴニストの量を得るために、ワクチンへの組成物の４倍までの希釈を可能にする。ワクチンをトリ１羽当たり約０．２ｍｌのワクチンで投与する場合、これは動物の用量当たり約１〜約５０マイクログラムのＴＬＲ３アゴニストを送達する。
【００６８】
したがって、本発明の組成物の１つの実施形態において、ＴＬＲ３アゴニストは組成物１ミリリットル当たり約５〜約１０００マイクログラムの量で存在する。
【００６９】
好ましくは、本発明の組成物は、コクシジウム症に対する家禽用ワクチンの製造のためにほぼ実質的に使用される。その場合、組成物自体は、組成物１ミリリットル当たり約５〜約２５０マイクログラムのＴＬＲ３アゴニストを含む。
【００７０】
「ほぼ実質的に」なる語は、本発明の組成物からのワクチンの製造において更に加えられる体積が全く無い又はごく僅か（例えば、ワクチンの体積の１０％未満）である状況を意味する。
【００７１】
したがって、好ましい実施形態において、本発明の組成物は、組成物１ミリリットル当たり５〜２５０マイクログラムのＴＬＲ３アゴニストを含む。
【００７２】
本発明において使用されるオーシストは、ドナー家禽動物において工業的規模で製造可能であり、これは、よく知られた技術、例えば塩浮遊による、それらの糞からの単離、ならびにそれに続く胞子形成および滅菌、ならびに最終的な光学顕微鏡による計数により行われうる。胞子形成は、例えば重クロム酸カリウムを使用して実施可能であり、そして、滅菌は、次亜塩素酸ナトリウムまたはベータプロピオラクトンを使用して実施可能である。これは全て、当技術分野においてよく知られている。
【００７３】
胞子形成は、家禽の腸における防御的感染の迅速な確立を保証する。
【００７４】
したがって、本発明の組成物の１つの実施形態において、生エイメリアオーシストは胞子形成オーシストである。
【００７５】
有効レベルの腸管免疫を誘導するためには、本発明の組成物から製造されうるワクチンにおける使用のために選択されるエイメリアオーシストは、例えば野生型または弱毒化のような特定のレベルの病原性のものでありうる。本発明に関しては、「病原性」は、エイメリアの病理を決定するエイメリアの態様、主として、その複製速度、感染したトリの腸にもたらされる損傷のレベル、成長速度に対する影響、および排出のレベル、集団における広がりを意味する。これら全ては、よく知られた方法およびパラメーター、例えば腸病変スコア、生体重増加およびオーシスト排出数を用いて評価されうる。
【００７６】
病変スコア化は、好ましくは、欧州薬局方モノグラフ２３２６に記載されているとおりに行われる。要するに、剖検においては、腸内のコクシジウム症の症状にスコアが割り当てられ、ここで、スコア０は肉眼的病変が存在しないことを意味し、スコア１〜４は腸壁の肥厚の重症度の増加、血液量の増加および正常糞便量の減少を意味する。病変スコア４においては、死亡の症例があった可能性がある。
【００７７】
当業者は、どの型の病原性のエイメリアをいつ適用するべきかを評価することが可能であり；例えば、高い野外感染圧の条件下では、弱毒化株の代わりに、より高い病原性のエイメリア株、例えば野生型株が、本発明の組成物から製造されるワクチンにおいて有利でありうる。
【００７８】
したがって、本発明の組成物の１つの実施形態において、生エイメリアオーシストの少なくとも１つはエイメリアの弱毒化株由来である。
【００７９】
「弱毒化エイメリア」は、より高い病原性の同じ種のエイメリアと比較してより軽い腸病変を引き起こす、および／またはワクチン接種動物の糞便におけるより少ないオーシスト排出をもたらすもの；例えば、少なくとも１０％低い腸病変スコアおよび／または少ないオーシスト排出、より好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％または更には少なくとも５０％低い腸病変スコアおよび／または少ないオーシスト排出をもたらすものとして定義される。
【００８０】
エイメリアの弱毒化はインビトロで達成可能であり、例えば、実験動物の継代および選択、または組換えＤＮＡ技術（これら全ては当技術分野においてよく知られている）により達成可能である。
【００８１】
弱毒化エイメリアの１つの形態は、早発性（ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ）であるエイメリアである。
【００８２】
したがって、本発明の組成物の好ましい実施形態において、弱毒化エイメリアの少なくとも１つは早発性である。
【００８３】
「早発性」であるエイメリア株は、それらの野生型対応物と比較してより少ない無性複製ラウンド数で、標的動物においてそれらの全生活環を完了する株である。例えば、同じ種の野生型株の場合の通常の４または５ラウンドではなく、３または４ラウンドである。これは弱毒化病原性をそれらに付与する。
【００８４】
本発明の組成物の１つの実施形態において、生エイメリアオーシストの少なくとも１つは、エイメリアの野生型株に由来する。
【００８５】
本発明に関して、「野生型」は、インビトロで弱毒化されておらず、早発性でないエイメリアを意味する。野生型株は、例えば、天然の感染家禽からまたはエイメリアに対してワクチン接種されていない家禽舎から単離されうる。
【００８６】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、弱毒化された生エイメリアオーシストおよび野生型病原性の生エイメリアオーシストを含む。
【００８７】
本発明の組成物はエイメリアの少なくとも１つの種のオーシストを含有する。好ましくは、組成物は、広範な免疫防御をもたらすワクチンの製造を可能にするために、複数の種のエイメリアオーシストを含む。更に、組成物は、より一層広範な免疫防御をもたらすために、特定のエイメリア種の２以上の株を含みうる。
【００８８】
本発明の組成物の１つの実施形態において、組成物は２以上の種の生エイメリアオーシストを含む。
【００８９】
本発明の組成物の好ましい実施形態において、組成物は、同じ種に由来する２以上の株の生エイメリアオーシストを含む。
【００９０】
本発明の組成物の好ましい実施形態において、組成物は２以上の種の生エイメリアオーシストを含み、そして、それらの種の少なくとも１つからのオーシストは、その種からの２以上の株の生エイメリアオーシストを含む。
【００９１】
本発明の組成物の好ましい実施形態において、組成物は同じ種からの２以上の株の生エイメリアオーシストを含み、ここで、それらの株の少なくとも１つは弱毒化されており、それは、それらの株の少なくとも１つは野生型病原性のものである。
【００９２】
本発明の組成物の１つの実施形態において、生エイメリアオーシストは、エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）、エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）、エイメリア・ネカトリクス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメリア・ブルネッティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・プレコクス（Ｅ，ｐｒａｅｃｏｘ）、エイメリア・ミバティ（Ｅ．ｍｉｖａｔｉ）、エイメリア・ハガニ（Ｅ．ｈａｇａｎｉ）、エイメリア・メレアグリミティス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）１、エイメリア・メレアグリミティス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）２、エイメリア・アデノイデス（Ｅ．ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、エイメリア・ガロパボニス（Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ）およびエイメリア・ディスペルサ（Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ）からなる群から選択される１以上である。
【００９３】
エイメリアのこれらの異なる種は、当技術分野でよく知られた幾つかの方法で同定され、識別されうる。古典的な方法は、それらのオーシストのサイズおよび外観を光学顕微鏡検査により評価することによるものである。代替法は、例えば、血清学的マーカーまたはＰＣＲによる分類である。また、インビボで試験した場合、異なるエイメリア種はトリの腸管の異なる領域に特徴的にコロニーを形成する。
【００９４】
好ましい実施形態において、本発明の組成物は、既存の市販の生エイメリアオーシストワクチンに存在するのと同じエイメリア種からの生オーシストを含む。より好ましいのは、市販のエイメリアワクチンであるコクシバック（Ｃｏｃｃｉｖａｃ）、パラコックス（Ｐａｒａｃｏｘ）およびフォルテグラ（Ｆｏｒｔｅｇｒａ）の１以上におけるものと同じ種および株のオーシストである。
【００９５】
本発明の組成物の好ましい実施形態において、生エイメリアオーシストは、４つのエイメリア種、すなわち、エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）およびエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）に由来し、ここで、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）の２つの株が存在する。
【００９６】
本発明の組成物の好ましい実施形態において、生エイメリアオーシストは、４つのエイメリア種、すなわち、エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミバティ（Ｅ．ｍｉｖａｔｉ）およびエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）に由来し、ここで、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）の２つの株が存在する。
【００９７】
本発明の組成物の好ましい実施形態において、生エイメリアオーシストは、７つのエイメリア種、すなわち、エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・ブルネッティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）、エイメリア・ネカトリクス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメリア・プレコクス（Ｅ，ｐｒａｅｃｏｘ）およびエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）に由来し、ここで、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）の２つの株が存在する。
【００９８】
本発明の組成物の好ましい実施形態において、生エイメリアオーシストは、６つのエイメリア種、すなわち、エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・ブルネッティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミバティ（Ｅ．ｍｉｖａｔｉ）、エイメリア・ネカトリクス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）およびエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）に由来する。
【００９９】
本発明の組成物の好ましい実施形態において、生エイメリアオーシストは、４つのエイメリア種、すなわち、エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミバティ（Ｅ．ｍｉｖａｔｉ）およびエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）に由来し、ここで、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）の２つの株が存在する。
【０１００】
本発明の組成物の好ましい実施形態において、生エイメリアオーシストは、５つのエイメリア種、すなわち、エイメリア・アデノイデス（Ｅ．ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、エイメリア・ディスペルサ（Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ）、エイメリア・ガロパボニス（Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ）、エイメリア・メレアグリミティス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）１およびエイメリア・メレアグリミティス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）２に由来する。
【０１０１】
本発明の組成物において使用される生エイメリアオーシストの量は、コクシジウム症に対する家禽用ワクチンに組成物が含まれる比率、標的家禽当たりのワクチンの体積、および望ましいワクチン接種効力に基づいて、当業者によって容易に決定されうる。
【０１０２】
指標は、古くから利用可能である市販ワクチンにおいて使用されている生エイメリアオーシストの数でありうる。典型的には、使用されるオーシストの数は、エイメリアの種のそれぞれによって異なる。例えば、パラコックス（Ｐａｒａｃｏｘ）５は、動物の用量当たり、約５００個のエイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）のオーシスト、それぞれ約１００個および約２００個のエイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）のオーシスト、約１０００個のエイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）のオーシスト、および約５００個のエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）のオーシストを含む。
【０１０３】
本発明の組成物の製造において、その種々の成分は、例えば製造効率の観点から好都合な順序で組み合され得る。例えば、組成物の成分として使用される特定の溶液を滅菌することが有利であり；もちろん、そのような溶液は、その時点では、生オーシストを未だ含んでいないであろう。
【０１０４】
そのような滅菌は、種々の方法で、例えば化学的に、例えばベータ−プロプリオラクトンを使用して、または物理的に、例えば照射または精密濾過により行われうる。しかし、キサンタンガムを含む溶液の滅菌を加熱により行う場合には、ある量の金属塩の添加によってキサンタンガムを安定化させることが必要である。塩の非存在下では、熱処理は、所望の粘度を付与するキサンタンガムの能力を破壊するであろう。
【０１０５】
ＥＰ１５２０３０１２に記載されているとおり、塩の量は２つの様態で制限され；すなわち、下方の側では、それは（組成物の）約０．１％ｗ／ｖの金属塩に制限され、これは、最小量のキサンタンガムを滅菌するのに必要な最小量である。上方の側では、本発明の組成物から製造される意図されるワクチンの嗜好性により、塩の量は（該ワクチンの）約０．４％ｗ／ｖに制限される。この場合、対象家禽は喜んでワクチンを摂取すべきなので、風味が妥当である。
【０１０６】
事実上、これは、これらの限界を組合せて、本発明の組成物を最大４倍希釈することを可能にする場合、組成物は（組成物の）約０．１〜約１．６％ｗ／ｖの金属塩を含みうる。
【０１０７】
したがって、本発明の組成物の１つの実施形態において、組成物は約０．１〜約１．６％ｗ／ｖの金属塩を含む。
【０１０８】
好ましくは、本発明の組成物は、０．１〜１．２％ｗ／ｖの金属塩、より好ましくは、０．１〜０．８％、又は更には０．１〜０．４％ｗ／ｖ（組成物の）の金属塩をこの順序で含む。
【０１０９】
このように、キサンタンガムを含む本発明の組成物の一部は、ガムの粘度修飾特性を損なうことなく加熱滅菌されうる。本発明では、「加熱滅菌」は少なくとも１００℃で少なくとも１５分間のインキュベーションを含む。
【０１１０】
金属塩は、原則として任意の金属塩でありうるが、好ましくは、金属塩は１価または２価金属カチオンからの塩である。より好ましい、カチオンはアルカリ金属である。
【０１１１】
金属塩のアニオンは、好ましくは、ハロゲン、スルファート、ホスファート、ニトラートまたはアセタートであり、より好ましくは、クロリドである。
【０１１２】
より一層好ましくは、金属塩はアルカリ金属のハロゲン塩であり、より一層好ましくは、ナトリウムまたはカリウムのものであり、より一層好ましくは、金属塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【０１１３】
したがって、本発明の組成物の１つの実施形態において、金属塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【０１１４】
本発明の組成物から製造されるワクチンの摂取を刺激するために、着色剤が添加されうる。これは、そのように鮮やかに着色された小滴をついまんで摂取するという鳥類の自然な性向を刺激するであろう。したがって、本発明の組成物中に着色剤が配合されうる。もちろん、着色剤は、本発明の組成物の他の成分、特に生オーシストの生存性または安定性に悪影響を及ぼすべきではない。また、着色剤は、ワクチンの成分として薬学的に許容されるものであるべきである。
【０１１５】
したがって、本発明の組成物の１つの実施形態においては、組成物は、薬学的に許容される着色剤を含む。
【０１１６】
「薬学的に許容される着色剤」の例としては、例えば緑色（例えば、クロロフィル、Ｅ１４０）、赤色（例えば、カルミン、Ｅ１２０）または青色（例えば、ブリリアントブルー、ＦＤ＆ＣブルーＮｏ．１、Ｅ１３３）である。全て商業的に入手可能である。
【０１１７】
着色剤は、本発明の組成物中に、その組成物から製造されるワクチンを適切な度合で着色するのに適した量で存在する。本発明の組成物の４倍までの希釈を考慮して、組成物は（組成物の）約０．０５〜約４％ｗ／ｖの着色剤を含む。
【０１１８】
赤色（カルミン）着色剤は、エイメリアオーシストを含む、ゲルに基づく家禽用噴霧ワクチンの摂取を刺激するのに非常に有効であることが判明した。
【０１１９】
したがって、本発明の組成物の１つの実施形態において、薬学的に許容される着色剤はカルミンである。
【０１２０】
好ましい実施形態において、カルミンは、本発明の組成物中に（組成物の）０．１〜０．２％ｗ／ｖの量で存在する。
【０１２１】
本発明の組成物の１つの実施形態において、以下のものからなる群から選択される１以上または全ての条件が適用される：
・組成物は（組成物の）約０．３〜約１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含み；好ましくは、組成物は約０．６％ｗ／ｖのキサンタンガムを含む；
・ＴＬＲ３アゴニストは、ポリＩ：ＣまたはポリＡ：Ｕ、好ましくはポリＡ：Ｕである；
・ＴＬＲ３アゴニストは、組成物１ミリリットル当たり５〜１０００マイクログラムの量で存在し；好ましくは、組成物は１ミリリットル当たり５〜２５０マイクログラムのＴＬＲ３アゴニストを含む；
・生エイメリアオーシストは、胞子形成オーシストである；
・生エイメリアオーシストはエイメリアの弱毒化株に由来し、好ましくは、弱毒化エイメリアは早発性である；
・生エイメリアオーシストは、エイメリアの野生型株に由来する；
・組成物は、同じ種に由来する２以上の株の生エイメリアオーシストを含む；
・生エイメリアオーシストは、エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）、エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）、エイメリア・ネカトリクス（Ｅ．ｎｅｃａｔｒｉｘ）、エイメリア・ブルネッティ（Ｅ．ｂｒｕｎｅｔｔｉ）、エイメリア・プレコクス（Ｅ，ｐｒａｅｃｏｘ）、エイメリア・ミバティ（Ｅ．ｍｉｖａｔｉ）、エイメリア・ハガニ（Ｅ．ｈａｇａｎｉ）、エイメリア・メレアグリミティス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）１、エイメリア・メレアグリミティス（Ｅ．ｍｅｌｅａｇｒｉｍｉｔｉｓ）２、エイメリア・アデノイデス（Ｅ．ａｄｅｎｏｉｄｅｓ）、エイメリア・ガロパボニス（Ｅ．ｇａｌｌｏｐａｖｏｎｉｓ）およびエイメリア・ディスペルサ（Ｅ．ｄｉｓｐｅｒｓａ）からなる群から選択される１以上である；
・組成物は２以上の種の生エイメリアオーシストを含み、それらの種の少なくとも１つは、その種からの２以上の株の生エイメリアオーシストを含み、ここで、好ましくは、それらの株の少なくとも１つは弱毒化されており、そして、それらの株の少なくとも１つは野生型である；
・組成物は、（組成物の）約０．１〜約１．６％ｗ／ｖの金属塩を含み；好ましくは、組成物は約０．１〜約０．４％ｗ／ｖの金属塩を含む；
・金属塩は塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである；
・組成物は薬学的に許容される着色剤を含み；好ましくは、薬学的に許容される着色剤はカルミンである；そして
・薬学的に許容される着色剤は、（組成物の）０．０５〜４％ｗ／ｖの量で組成物中に存在する。
【０１２２】
本発明の組成物の好ましい実施形態において、ＴＬＲ３アゴニストはポリＡ：Ｕであり；ＴＬＲ３アゴニストは、組成物１ミリリットル当たり５〜１０００マイクログラムの量で存在し；生エイメリアオーシストは胞子形成オーシストであり；オーシストは、エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）およびエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）であり；エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）のオーシストは２つの株に由来し；組成物は、（組成物の）約０．１〜約１．６％ｗ／ｖの金属塩を含み；金属塩は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムであり；組成物は、（組成物の）０．０５〜４％ｗ／ｖの量の薬学的に許容される着色剤を含み；そして、薬学的に許容される着色剤はカルミンである。
【０１２３】
前記のような種々の選択肢および好ましい態様を適用することにより、当業者は本発明の組成物を製造することが可能である。
【０１２４】
したがって、更なる態様において、本発明は、生エイメリアオーシストおよび薬学的に許容される担体をＴＬＲ３アゴニストと混合することを含む、本発明の組成物の製造方法に関する。
【０１２５】
そのような混合を行うための方法は当技術分野においてよく知られており、簡便または実施可能である任意の規模で適用されうる。例えば、ＴＬＲ３アゴニストが粉末として得られた場合、これは、生エイメリアオーシストと薬学的に許容される担体とを含有する溶液中に直接的に溶解可能である。あるいは、ＴＬＲ３アゴニストはそれ自体の溶液中に存在することが可能であり、ついでそれは液体形態で添加されうる。
【０１２６】
記載されているとおり、本発明の組成物は、通常の生エイメリアオーシストワクチンより有効にコクシジウム症に対する家禽用ワクチンの製造に使用されうる。
【０１２７】
したがって、更なる態様において、本発明は、コクシジウム症に対する家禽用ワクチンの製造のための、本発明の組成物の使用に関する。
【０１２８】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンの詳細および好ましい態様は、後記に記載されている。
【０１２９】
本発明の使用における、コクシジウム症に対する家禽用ワクチンの「製造」は、当業者によく知られ容易に適用可能な方法を用いて行われうる。例えば、生エイメリアオーシストおよび薬学的に許容される担体およびＴＬＲ３アゴニストを含む本発明の組成物を混合し、所望により、他の賦形剤を添加することが可能であり、そして、得られたワクチンは、適切なサイズの容器内に分注され、包装される。
【０１３０】
製造工程の種々の段階は、適切な試験によりモニターされ、例えば、オーシストまたは任意の他の添加抗原の質および量に関する免疫学的試験、無菌性（勿論、生オーシスト以外）および異物の非存在に関する微生物学的試験、生物学的および化学的安定性に関する試験、ならびに最終的にはワクチンの有効性および安全性を判定するためのインビトロまたはインビボ実験によりモニターされる。これら全ては当業者によく知られており、薬局方のような政府規制、ならびに“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ”（２０００，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔ，ＵＳＡ，ＩＳＢＮ：６８３３０６４７２）および“Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｏｌｏｇｙ”（Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｅｔら編，１９９７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，ＩＳＢＮ  ０４４４８１９６８１）のようなハンドブックにおいて定められている。
【０１３１】
コクシジウム症に対する家禽用ワクチンの製造はまた、本発明の組成物またはその一部が多少なりとも濃縮された形態で使用される実施形態を含む。例えば、エイメリアオーシストから製造されるワクチン中に該オーシストが存在すると意図される数より遥かに多い数において該オーシストが存在する形態で、該オーシストが製造され使用前に保存されうる。また、組成物の他の部分は、キサンタンガム、金属塩および／または着色剤を含む溶液のような濃縮形態で、製造され保存されうる。製造工程中に好都合となる任意の様態で、これらのいずれか１つが残りのもののいずれか１つのための希釈剤として使用されうる。当業者は、得られるワクチン中の活性物質または賦形剤の所望の最終量または濃度を得るために適用される希釈係数を計算することが十分に可能である。
【０１３２】
記載されているとおり、本発明の組成物を使用して製造されうるワクチンは通常の生エイメリアオーシストワクチンより有効である。これはＴＬＲ３アゴニストの添加により達成される。
【０１３３】
したがって、もう１つの態様において、本発明は、コクシジウム症に対する家禽用ワクチンとしての使用のための、本発明の組成物に関する。
【０１３４】
また、もう１つの態様において、本発明は、本発明の組成物を含むコクシジウム症に対する家禽用ワクチンに関する。
【０１３５】
「ワクチン」は、医学的効果を有する組成物であることがよく知られている。ワクチンは、免疫学的に活性な成分と薬学的に許容される担体とを含む。「免疫学的に活性な成分」は１以上の抗原分子であり、この場合は、標的家禽の免疫系により認識され防御免疫応答を誘導する生エイメリアオーシストである。該応答は、標的の先天性免疫系からおよび／または後天性免疫系から生じることが可能であり、そして、細胞性および／または体液性のものでありうる。
【０１３６】
ワクチンは、一般に、例えば寄生虫負荷を低減することまたは宿主動物における寄生虫の複製期間を短縮することにより、感染のレベルまたは度合を低減するのに有効である。
【０１３７】
また、あるいはおそらくその結果として、ワクチンは、一般に、そのような感染または複製によりあるいはその感染または複製に対する動物の応答により、引き起こされうる疾患の（臨床）症状を軽減または改善するのに有効である。
【０１３８】
コクシジウム症に対する本発明のワクチンの効果は、エイメリアによる感染、および／または、そのような感染もしくは複製に関連したコクシジウム症の１以上の徴候の、家禽における予防または軽減である。この場合、そのような（臨床的）徴候としては、腸病変スコア、生体重増加およびオーシスト排出量である。
【０１３９】
このようなコクシジウム症ワクチンは、口語的には、エイメリア「に対する」またはコクシジウム症「に対する」ワクチン、あるいは「エイメリアワクチン」とも称されうる。
【０１４０】
本発明のコクシジウム症ワクチンの詳細および好ましい態様は後記に記載されている。
【０１４１】
「家禽」は、農業関連の鳥類、例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ヤマウズラ、クジャク、ウズラ、ハト、キジ、ホロホロチョウまたはダチョウを意味する。好ましくは、家禽はニワトリ、シチメンチョウ、アヒルまたはガチョウである。より好ましくは、家禽はニワトリまたはシチメンチョウである。最も好ましくは、家禽はニワトリである。
【０１４２】
標的家禽は任意のタイプのものであることが可能であり、例えば、レイヤー（産卵ニワトリ）、ブリーダー、ブロイラー、組合せ品種、またはそのような品種のいずれかの親系統でありうる。好ましい家禽のタイプはブロイラーである。
【０１４３】
「コクシジウム症」は、エイメリアのようなコクシジウム寄生虫により引き起こされる腸疾患複合体としてよく知られている。
【０１４４】
１つの実施形態において、コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンは、ワクチン１ミリリットル当たり約５〜約２５０マイクログラムのＴＬＲ３アゴニストを含む。
【０１４５】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンは、本発明の組成物に関して本明細書に記載されている実施形態（好ましいもの又はそうでないもの）のいずれか、または本発明の組成物のそれらの実施形態の２以上の任意の組合せを含む形態で提供されうる。
【０１４６】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンは、ＥＰ１５２０３０１２に記載されている、ゲルに基づく噴霧ワクチンとして適用された場合に最も有効である。したがって、該ワクチンはキサンタンガムを含み、これは、最も容易に摂取される小滴の形成を助け、そして、鳥類の腸へのＴＬＲ３アゴニストの送達を助ける。
【０１４７】
本発明のワクチンを噴霧する際に形成されるゲル小滴の好ましいサイズは、直径約１〜約４ｍｍである。それを達成するためには、ワクチンは約２００〜約４０００ｍＰａ．ｓの比較的高い粘度を有する必要がある。この粘度は、本発明のワクチン中にキサンタンガムを約０．３〜約１．５％ｗ／ｖの量で配合することにより達成可能であり、この場合の「ｗ／ｖ」はワクチンの体積に関するものである。
【０１４８】
したがって、コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンの１つの実施形態において、ワクチンは０．３〜１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含み、そして、２００〜４０００ｍＰａ．ｓの粘度を有する。
【０１４９】
本発明のための「粘度」は、回転スピンドル技術を用いて決定されるべきであり、それにより、サンプルは、一定温度で平衡化された際に測定される。特には、粘度測定は、Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ（商標）回転粘度計を製造業者の説明に従い使用して行われる。測定は、１００ｒｐｍで回転するＬＶ４型スピンドルを使用し、そして、サンプルは水浴中２５℃で平衡化される。
【０１５０】
１つの実施形態において、コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンは、経口ワクチンである。
【０１５１】
「経口」なる語は、口腔を経由する摂取の方法を意味する。本発明の場合、これは、鳥類がワクチンのゲル小滴をついばみ、それらを飲み込むことを意味する。
【０１５２】
前記のとおり、本発明のワクチンは、キサンタンガムを含む組成物の一部の滅菌を含む異なる方法で本発明の組成物から製造されうる。そのような滅菌は異なる方法で達成され；キサンタンガムを含有する溶液を加熱により滅菌する場合、キサンタンガムは金属塩の添加により保護される必要がある。本明細書にも記載されているとおり、使用される金属塩の量には上限および下限がある。
【０１５３】
したがって、本発明のワクチンが加熱により滅菌されたキサンタンガムの溶液から製造された場合、ワクチンは（ワクチンの）約０．１〜約０．４％ｗ／ｖの金属塩を含有する。
【０１５４】
したがって、コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンの１つの実施形態において、ワクチンは０．１〜０．４％ｗ／ｖの金属塩を含む。
【０１５５】
好ましくは、金属塩は、塩化ナトリウムまたは塩化カリウムである。
【０１５６】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンにおいては、用量当たりのエイメリアオーシストの厳密な量はそれほど重要ではなく、なぜなら、該オーシストは容易に複製し、宿主の腸においてコロニーを形成するからである。ワクチン用量は、そのような増殖性感染を開始させるのに十分であることが必要とされるに過ぎない。より高い接種用量は、宿主における最適なコロニー形成に達するのにかかる時間をほとんど短縮せず、そして、非常に高い用量は経済的理由から魅力的ではない。加えて、高すぎるワクチンオーシスト用量は、それ自体で何らかの病状を引き起こしうる。明らかに、低すぎる用量はエイメリア感染をおそらく確立しうるものの、免疫の適切な開始のために非常に長時間を要しうる。
【０１５７】
したがって、好ましい接種用量は、動物用量当たり約１０〜約１×１０５個の、エイメリアの種の胞子形成オーシスト、より好ましくは、用量あたり１００〜１×１０４個のオーシスト、１００〜５０００個、または更には１００〜１０００個のオーシスト／動物用量であり、その順に好ましい。
【０１５８】
当業者に明らかなとおり、生エイメリアオーシストの最適ワクチン用量は、例えば、標的動物種ならびに使用されるエイメリア株の種および病原性に左右され、したがって、１つの混合ワクチンにおける種々のエイメリア種の間で異なりうる。
【０１５９】
本発明のコクシジウム症ワクチンに使用されるエイメリアオーシストを定量する方法は当技術分野においてよく知られている。
【０１６０】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンの動物用量当たりの体積は、意図される適用経路に応じて最適化され、例えば、噴霧ワクチン接種の場合、用量はトリ１羽当たり約１０μｌ〜約１ｍｌでありうる。好ましくは、噴霧ワクチンの体積はトリ１羽当たり０．１〜０．５ｍｌ、より好ましくは、トリ１羽当たり０．１〜０．３ｍｌである。
【０１６１】
最も好ましくは、噴霧ワクチンの体積はトリ１羽当たり約０．２ｍｌである。
【０１６２】
あるいは、ワクチンは、飼料への噴霧によりまたは飲料水への液体として投与されうる。これらの場合には、トリ１羽当たりの用量は、摂取される飼料の量または飲まれる水の量に合わせて最適化されうる。これは当業者の能力の範囲内である。
【０１６３】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンの動物用量当たりのエイメリアオーシストの免疫学的に有効な量がどのくらいであるかを決定することにより種々の投与経路に最適な体積および用量を見出すことは、当業者の通常の能力の範囲内に十分に含まれる。これは、例えば、ワクチン接種後またはチャレンジ感染後の免疫学的応答をモニターすることにより実施可能であり、例えば、標的の疾患徴候および臨床スコア（最も重要なのは腸病変スコア）をモニターすることにより実施可能である。他の基準は、生体重増加、血清学的パラメータまたはオーシスト排出量を決定するための病原体の再単離でありうる。これらの結果は、例えば、模擬ワクチン接種動物において見られるワクチン接種−チャレンジ応答と比較されうる。
【０１６４】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンのための標的家禽の年齢、体重、性別、免疫学的状態および他のパラメータは決定的に重要ではないが、健常標的家禽にワクチン接種することおよび病原性エイメリアによる初期感染（の影響）を予防するために、可能な限り早期にワクチン接種することが好ましい。
【０１６５】
したがって、コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンは、好ましくは、孵化日、すなわち、１日齢で投与される。
【０１６６】
好ましい場合には、家禽は、後年、ブースターワクチン接種を受けうる。
【０１６７】
当業者に理解されるとおり、コクシジウム症に対する本発明のワクチンを受けることになる家禽のための薬用飼料の使用は、注意して適用されるべきである。計画されたワクチン接種の時期の前後には、トリは、抗コクシジウム薬を含有する飼料を摂取すべきではなく、あるいは、少なくともワクチン中のエイメリアオーシストが感受性である抗コクシジウム薬を含有する飼料を摂取すべきではない。
【０１６８】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンを混合ワクチンとして処方することは、非常に効率的であり、なぜなら、このようにして複数の免疫薬が一度に投与可能であり、これは標的鳥類に対する不快感を低減し、人件費を減少させるからである。本発明のワクチンに基づく混合ワクチンは、もう１つの免疫学的に活性な化合物を更に含む。原則として、これは任意の生もしくは死滅微生物またはその一部であることが可能であり、この場合、生エイメリアオーシストの安定性および複製能が維持される必要がある。また、追加的な免疫活性成分は、摂取されるワクチンに適合し、そして、該ワクチンにおいて有効でなければならない。
【０１６９】
追加的な免疫学的に活性な化合物は、抗原、免疫増強物質および／またはワクチンでありうる。あるいは、本発明のワクチン自体がワクチンに添加されうる。
【０１７０】
本発明のためのそのような混合ワクチンの製造方法は、当業者の通常の能力の範囲内である。
【０１７１】
したがって、１つの実施形態においては、コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンは、ワクチンが１以上の追加的な免疫活性成分（類）を含むことを特徴とする。
【０１７２】
１つの実施形態においては、コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンは、家禽に対して病原性である微生物に由来する少なくとも１つの追加的抗原を含む混合ワクチンである。追加的抗原は、生微生物、生弱毒化もしくは死滅微生物またはそれらの一部でありうる。
【０１７３】
好ましくは、家禽に対して病原性である微生物に由来する追加的抗原は、以下のものからなる群から選択される１以上である：
・ウイルス：伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、アデノウイルス、産卵低下症候群ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）（すなわち、ガンボロウイルス）、ニワトリ貧血症ウイルス、トリ脳脊髄炎ウイルス、鶏痘ウイルス、シチメンチョウ鼻気管炎ウイルス（ＴＲＴ）、アヒルペストウイルス（アヒルウイルス腸炎）、ハトポックスウイルス、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、トリ白血病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、トリニューモウイルス、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）およびレオウイルス；
・細菌：大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、オルニトバクテリウム・リノトラケアレ（Ｏｒｎｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒｈｉｎｏｔｒａｃｈｅａｌｅ）、ヘモフィリス・パラガリナルム（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｐａｒａｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、エリジペロスリックス・ルジオパシエ（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌａｓ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）およびクロストリジウム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）；
・寄生虫：ヒストモナス（Ｈｉｓｔｏｍｏｎａｓ）、イソスポラ（Ｉｓｏｓｐｏｒａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）およびデルマニッスス（Ｄｅｒｍａｎｙｓｓｕｓ）；ならびに
・真菌：アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）。
【０１７４】
より好ましい追加的抗原は、ＩＢＶ、ＮＤＶ、ＩＢＤＶ、ＩＬＴＶ、ＴＲＴ、ＡＩＶ、ＭＤＶ、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）およびサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）からなる群から選択される１以上である。
【０１７５】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用のワクチンは、医薬成分、例えば抗生物質、ホルモンおよび／または抗炎症薬と有利に組合されうる。抗コクシジウム化合物の使用さえも可能であるが、ただし、ワクチンにおけるエイメリアオーシストがその特定の薬物に対して感受性であってはならない。
【０１７６】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンは、本発明で使用される生エイメリアオーシストの生存能および質を支援することにより標的家禽の腸における増殖性複製およびコロニー形成の確立を促進する１以上の成分を含有しうる。
【０１７７】
１つの実施形態において、添加剤は、製剤化、保存、取り扱い、投与または摂取中の本発明のエイメリアオーシストの量および質を安定化させるための安定剤である。また、適切な保存剤、例えばチメロサール、メルチオラート、フェノール化合物またはゲンタマイシンも添加されうる。
【０１７８】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンは、予防的処置または治療的処置またはその両方として使用され、なぜなら、それは、病原性エイメリアによる感染の確立および進行の両方を妨げるからである。
【０１７９】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンの投与状況、例えば飼養場の状態または標的家禽種に応じて、ワクチンを更に最適化することが有利でありうる。これは十分に当業者の能力の範囲内であり、一般に、ワクチン接種の有効性または安全性の微調整を含む。これは、使用されるエイメリア株の選択、ワクチンの用量、量、投与頻度または投与経路の適合、あるいはワクチンの他の成分（例えば、安定化剤、担体、希釈剤など）の適合または添加により行われうる。
【０１８０】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンの好ましい実施形態において、ＴＬＲ３アゴニストは、ポリＡ：Ｕであり；ＴＬＲ３アゴニストは、ワクチン１ミリリットル当たり５〜２５０マイクログラムの量で存在し；生エイメリアオーシストは、胞子形成オーシストであり；該オーシストは、エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）およびエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）であり；エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）のオーシストは、２つの株に由来し；ワクチンは、（ワクチンの）約０．３〜約１．５％ｗ／ｖのキサンタンガムを含み；ワクチンは、約２００〜約４０００ｍＰａ．ｓの粘度を有し；そして、組成物は、カルミンを（ワクチンの）０．１〜０．２％ｗ／ｖの量で含む。
【０１８１】
もう１つの態様において、本発明は、コクシジウム症に対する家禽のワクチン接種方法であって、該方法が、コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンを該家禽に投与することを含むことを特徴とする、ワクチン接種方法に関する。
【０１８２】
前記のとおり、コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンは、好ましくは、ワクチンが摂取されて病原性エイメリアに対する有効な免疫化がもたらされるように、大量投与の方法により投与される。
【０１８３】
コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンの大量投与の好ましい方法は、鳥類への噴霧によるものである。これは、水性媒体を使用する粗噴霧（ｃｏａｒｓｅ  ｓｐｒａｙ）として実施可能であり、ここで、生じる小滴は、一般に直径５０μｍを超えるサイズのものである。
【０１８４】
そのような粗噴霧は、例えば、孵化トレイにおける１日齢のニワトリを免疫化する場合には孵化場噴霧器を使用して適用可能であり、あるいは、床飼い状態の年長の鳥類を免疫化する場合には背負い型噴霧器を使用して適用可能である。噴霧されたワクチンは、羽または床から鳥類によって素早く摂取される。
【０１８５】
したがって、本発明のコクシジウム症に対する家禽のワクチン接種方法の１つの実施形態において、該方法は、家禽および／またはその周囲への粗噴霧によるワクチンの投与を含む。
【０１８６】
ワクチンが「家禽に」噴霧されるという指示は、ワクチンの全部または大部分が鳥類の体に到達することを要しない。むしろ、これは、体の特定の部分が特異的に標的化される必要がないことを示している。キサンタンガムを配合すると、ワクチン小滴はやや粘性になり、粗噴霧として投与されると、鳥類の羽に或る程度付着する傾向にある。しかし、ワクチンの一部は鳥類の体に降下せずまたは滞留せず、鳥類が飼育されている容器の底または床に終着する。これで十分であり、というのも、鳥類はそのような小滴をすぐについばみ始めそれを摂取するからである。
【０１８７】
粗噴霧による本発明のコクシジウム症に対する家禽のワクチン接種方法の好ましい実施形態において、ワクチン小滴は直径約１〜約４ｍｍのサイズのものである。
【０１８８】
標準的な噴霧ワクチン接種装置が使用可能であり、そして、使用されるノズルおよび圧力のような適切な条件を選択することにより、当業者は、そのようなサイズの小滴を簡便に得ることが可能である。キサンタンガムの擬塑性ゆえに、加圧の増加または特別な高圧噴霧ニップルの使用は必要とされない。
【０１８９】
本発明の方法による標的家禽へのワクチン接種のための投与計画は、ワクチンの処方および動物飼育の実用的態様に適合する様態の、単回または複数回投与でありうる。
【０１９０】
好ましくは、本発明によるコクシジウム症に対する家禽のワクチン接種方法のための計画（レジメン）は、動物に対するストレスを低減し人件費を削減するために、標的家禽が受けうる他のワクチンの既存ワクチン接種スケジュールに統合される。これらの他のワクチンは、それらの登録用途に適合する様態で、同時、並行的または逐次的に投与されうる。
【０１９１】
したがって、本発明によるコクシジウム症に対する家禽のワクチン接種方法の１つの実施形態においては、ワクチンは別の家禽ワクチンと組合せて投与される。
【０１９２】
本発明によるコクシジウム症に対する家禽のワクチン接種のこれらの方法は、エイメリアによる感染に対しておよび／またはそのような感染に関連した疾患の（臨床的）徴候に対して家禽を防御するのに非常に有効である。特に、これは家禽の罹患および不快感を予防し、そして、商業的養鳥業に対する重大な経済的損失を防ぐ。
【０１９３】
したがって、もう１つの態様において、本発明は、家禽におけるエイメリア感染または関連疾患徴候の低減のための方法であって、該方法が、コクシジウム症に対する本発明の家禽用ワクチンを該家禽に投与することを含むことを特徴とする方法に関する。
【０１９４】
ｄｓＲＮＡの類似体をキサンタンガムと組合せることによる、比較的低濃度で今や経口経路により投与可能となる一方で、トリの腸内で尚も免疫誘導して、家禽の経口エイメリアワクチン接種後に得られる防御的応答に対する検出可能な臨床的改善をもたらすような、ｄｓＲＮＡの類似体の保護の驚くべき効果の点で、本発明は、経口送達中のＴＬＲ３アゴニストの保護のための方法に関する。
【０１９５】
したがって、もう１つの態様において、本発明は、経口経路によるトリの腸へのＴＬＲ３アゴニストの送達方法であって、ＴＬＲ３アゴニストをキサンタンガムと混合することを特徴とする方法に関する。
【０１９６】
ＴＬＲ３アゴニストは、それ自体が薬学的効果を有する可能性があり、および／または別の化合物の免疫学的もしくは薬学的効果をアジュバント化（補助）することにおいて（も）機能しうる。
【０１９７】
好ましくは、ＴＬＲ３アゴニストと混合するためのキサンタンガムは、本明細書に記載されている態様ならびにそれらの種々の実施形態および好ましい態様の１以上に記載されているとおりである。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】図１は、実施例１に記載されているワクチン接種−チャレンジ実験の結果を示す。パネルＡ〜Ｇは、それぞれ群１〜７に関するワクチン接種−チャレンジ処置後の病変スコアを示す。横軸は病変スコア数０〜４を表し、縦軸は、その群内でその病変スコアを示すトリの百分率を表す。これらの群に関しては、ｎ＝３０である。
【図２】実施例２のワクチン接種−チャレンジ実験から得られた病変スコアの結果である。パネルＡ〜Ｅは、それぞれ群１〜５の結果を表す。用いられている軸は図１の場合と同じである。これらの群に関しては、ｎ＝２０である。
【０１９９】
次に、以下の非限定的な実施例により、本発明を更に詳細に説明することとする。
【０２００】
実施例
１．エイメリアワクチンの有効性に対するＴＬＲ３アゴニストの効果；より早い免疫開始
１．１．実験の概要
この実験は、ＴＬＲ３アゴニストの添加によるＰａｒａｃｏｘ（商標）８ワクチンの免疫の開始に対する効果を試験した。ＴＬＲ３アゴニストに関する用量滴定を行った。結果を、Ｐａｒａｃｏｘ  ８のみでワクチン接種したトリと直接比較した。
【０２０１】
２１０羽の１日齢のトリを３０羽のトリの７つの群に分けた。群１〜５の全てのトリに、０．１％カルミンを含有する０．６％キサンタンガムで希釈されたＰａｒａｃｏｘワクチンを、０．５ｍｌワクチンの経口強制飼養によりワクチン接種した。群１〜４は、異なる量のＴＬＲ３アゴニストの投与を受けた。群５のトリはＰａｒａｃｏｘ  ８のみでワクチン接種され、群６および７のトリは、ワクチン接種されなかった（表１を参照されたい）。ワクチン接種後（ＰＶ）１４日間、全てのトリを別々の檻において、それらの群において飼育した。コクシジウム症感染をモニターするために、第７、１４および１９日に、対照トリ（群６および７）から糞便サンプルを採取した。チャレンジ前の第１３日ＰＶに、全てのトリを番号札で一意（ユニーク）に識別し、ついで第１４日ＰＶに、群１〜６の各トリをエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）野生型の１５，０００個のオーシストでチャレンジした。このチャレンジ日は、通常のＰａｒａｃｏｘワクチン接種が完全防御に達するには時期尚早だったが、それは免疫の開始における何らかの増強の検出を可能にした。
【０２０２】
チャレンジ後第５日に、全てのチャレンジされたトリおよび群７のトリを安楽死させ、エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）感染に関連した病変に関して死後検査した。エイメリア属種の感染に関連していた可能性のあるあらゆる臨床徴候に関して、試験の全期間にわたり、トリを毎日観察した。
【表１】
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【０２０３】
１．２．材料および方法
Ｐａｒａｃｏｘ  ８ワクチンの市販バッチを使用し、これを再懸濁して０．５ｍｌ当たり１回の全用量を得た。７５ｍＭ  ＮａＣｌ中に１．２％キサンタンガム溶液を含有し（すなわち０．４４％ｗ／ｖ）、０．２％ｗ／ｖのカルミン（Ｅ１２０）を含有する希釈液の２倍濃縮ストックで、該ワクチンを１：１希釈した。該希釈ストックを、１１５℃で３０分間オートクレーブ処理することにより滅菌した。
【０２０４】
Ｐａｒａｃｏｘ  ８ワクチン希釈液を安全キャビネット内で調製した。各群につき１００ｍｌのワクチン（２００用量を含有する）を調製し；該ワクチンの２つの１０００用量の薬袋（ｓａｃｈｅｔ）を振盪し、オーシストの再懸濁を確実にするために１分間激しくマッサージした。薬袋の内容物を適切な容器内でプールした。各ワクチンに関して、２１ｍｌの純粋なプール化Ｐａｒａｃｏｘ  ８ワクチンを滅菌ガラスＤｕｒａｎ（デュラン）ボトル（群番号で適切に標識されている）に添加した。１０ｍｇ／ｍｌのＴＬＲ３アゴニストストック溶液を迅速に解凍し、ついで適切な体積のアゴニストおよび水を該ワクチンに添加し、十分に混合した。次に、５０ｍｌの２倍希釈ストックを（群に応じて）各Ｄｕｒａｎボトルに添加した。ついで、使用前に少なくとも１０分間振盪することにより、全ての製剤を完全に混合した。
【０２０５】
ワクチンサンプルにおいては、群１〜４は１０ｍｇ／ｍｌの量のＴＬＲ３アゴニストストックの投与を受けて、意図されたアゴニストの量に達した；群１：１００μｌ、群２：２００μｌなど；これら全ての体積は、２９ｍｌまでの滅菌水で補充された。
【０２０６】
ＴＬＲ３アゴニスト：
使用したＴＬＲ３アゴニストは、ポリＡ：Ｕ、二本鎖標準ホモポリマー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。それを凍結乾燥ナトリウム塩から１０ｍｇ／ｍｌストック溶液に溶解し、使用するまで−７０℃で保存した。
【０２０７】
チャレンジ材料：
チャレンジ材料は、使用するまで２〜８℃で保存されたエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）野生型無菌胞子形成オーシストのバッチであった。チャレンジ材料中のオーシストの濃度を、改良型フックス（Ｆｕｃｈｓ）−ローゼンタール（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）計数板を使用して決定した。これから希釈を行って、チャレンジ用量０．５ｍｌ当たり１５．０００個のオーシストを得た。
【０２０８】
試験動物：
実験動物は、ワクチン接種時に１日齢の、混合された性別のローマン（Ｌｏｈｍａｎｎ）ＳＰＦニワトリであった。トリを個々の檻内で３０個の群にランダムに配置した。
【０２０９】
ワクチン接種後第１３日に、トリに個別に迅速タグを付けた。
【０２１０】
トリに、経口強制飼養により、トリ１羽当たり０．５ｍｌの適切なワクチン調製物を投与することにより、ワクチン接種した。
【０２１１】
ニワトリを、経口強制飼養により、それぞれ０．５ｍｌのエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）野生型調製物で、全て、お互いから１時間以内にチャレンジした。
【０２１２】
実験全体にわたって、コクシジウム感染の臨床徴候、例えば下痢または血便、意気消沈または食欲不振に関して、全てトリを毎日観察した。特別な所見は観察されなかった。実験に無関係な原因により、３羽のニワトリが死亡し；１羽は１群、２羽は２群のものであった。
【０２１３】
チャレンジ後第５日に、全てのトリを安楽死させ、剖検に送った。死後、各群からの全てのトリを、エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）に関連した腸病変に関して検査した。
【０２１４】
ワクチンまたはチャレンジの摂取を確認する目的で、ワクチン接種後第７、１４および１９日に、対照トリ（群６および７）の檻の床から糞便採集を行った。各サンプルを檻内のゴミから採取し、サンプルは約１０〜２０グラムであり、檻全体を代表するものであり、例えば、檻の四隅および中央から採取され；サンプルは新鮮であり、可能な限り最少量のゴミを含有していた。各サンプルを二重包装し、ラベルを付け、処理するまで２〜８℃で保存した。オーシストは、標準的な慣例に従い検出され、その数を、修飾マクマスター（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＭｃＭａｓｔｅｒ）計数技術を用いて計算した。
【０２１５】
１．３．結果
エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）に関連した腸病変スコアを、剖検により、チャレンジ後第５日に決定した。対照群６および７を除き、処置群に関して盲検的に病変評価を行った。群１〜７に関する病変スコアの結果が図１のそれぞれパネルＡ〜Ｇに、あるスコアを示す動物の％として要約されている。偶発的な死亡を除き、これらのグループでは、ｎ＝３０である。
【０２１６】
病変スコアの結果は対照群に関しては予想通りであり；チャレンジされていない群７のトリは、全て０の病変スコアを有し、一方、ワクチン接種されずにチャレンジされた群６のトリは３または４の高いスコアを有し、これはナイーブなトリの病変スコアプロファイルに類似していた。
【０２１７】
群５（Ｐａｒａｃｏｘ  ８ワクチンのみ）のトリは、スコア範囲の上限に加重されたスコアを有していた。それらのトリはワクチン接種後第１４日にチャレンジされたが、このワクチンは通常は部分的な防御しかもたらさないので、これは予想外ではなかった。しかし、これは、ＴＬＲ３アゴニストの添加の結果として免疫のより早い開始が生じたかどうかを観察することを容易にした。
【０２１８】
低用量のＴＬＲ３アゴニスト（それぞれ５または１０μｇ／トリ）が投与された群１および２のトリは全範囲の病変スコアを示し、より低い病変スコアの比率の明らかな増加を示した。より高い２用量レベルのＴＬＲ３アゴニスト（それぞれ２０または４０μｇ／トリ）がトリに投与された群３および４においては、Ｐａｒａｃｏｘ  ８のみでワクチン接種されたトリ（グループ５）と比較して病変スコアプロファイルはそれほど変わらなかった。
【０２１９】
糞便収集物は、採取された糞便サンプルのいずれにおいてもオーシストが検出されないことを示した。これは、群７のトリが研究全体を通して未感染のままであることを示した。群６に関しても、最終収集物においてオーシストは検出されなかったが、これはおそらくこれらのトリの重篤な疾患に関連しており、正常な糞便形成を妨げるそれらの腸病変スコアにより実証されたとおりであった。
【０２２０】
１．４．結論
試験した全てのＴＬＲ３アゴニスト量のうち、動物当たり５または１０μｇの低用量が投与されたトリは最良の病変スコア結果を示し、より広い範囲のスコアおよびより低い病変スコアへの明らかな傾向を示した。これは、より早い免疫開始の誘導の説得力のある証拠である。
【０２２１】
この実験においては、動物当たりより多量のＴＬＲ３アゴニストは、明らかな免疫学的増強を示さなかった。これは、ＴＬＲ３アゴニストの用量効果における最適プロファイルが存在することを示している可能性がある。しかし、別のワクチン接種−チャレンジ実験（実施例２）においては、動物当たりより高用量のＴＬＲ３アゴニストは、Ｐａｒａｃｏｘ  ８ワクチンのみの群と比較して明らかな利益を示した。
【０２２２】
２．エイメリアワクチンの有効性に対するＴＬＲ３アゴニストの効果；より早い免疫開始２
実施例１に記載されているものとほぼ同じ設定および手順を用いる実験において、トリ当たり１０または２０マイクログラムの量のＴＬＲ３アゴニストを、免疫開始における増強に対する効果に関して試験した。
【０２２３】
表２に示されている処置を受けた２０羽のニワトリの群を用いた。
【表２】
2020502204.tif 000004
【０２２４】
２．１．結果
この実験の病変スコアの結果は、群１〜５に関して、図２のそれぞれパネルＡ〜Ｅに示されている。
【０２２５】
結果は対照群に関しては予想通りであり；ワクチン接種されておらず、チャレンジされていない群５のトリは、全て０の病変スコアを有し、一方、ワクチン接種されておらず、チャレンジされたトリは３または４の高いスコアを有し、このことは、これらがチャレンジに対する防御を有さないことを示した。チャレンジの重篤さは、実施例１において適用されたものより僅かに低いようであった。
【０２２６】
Ｐａｒａｃｏｘ  ８ワクチンのみの投与を受けた群３のトリは或る範囲のスコアを有していたが、スコア範囲の上限に加重されていた。実施例１の場合と同様に、これは、ワクチン接種後のチャレンジの日（２週間）が早かったため、予想通りのことであった。
【０２２７】
処置群１および２は広範な病変スコアプロファイルを有し、より低い病変スコアの比率がワクチン群３のトリより高く、このことは、ワクチンが誘導した免疫の開始に関して、ＴＬＲ３アゴニストがワクチンの免疫を増強したことを示している。
【０２２８】
この実験では、免疫の早期開始の誘導において、より多量のＴＬＲ３アゴニスト（２０μｇ／トリ）がより少量（１０μｇ／トリ）の場合より有効であるようであった。
【０２２９】
３．エイメリアワクチンの有効性に対するＴＬＲ３アゴニストの効果；用量当たりのオーシストの減少
生エイメリアオーシストのワクチン接種の有効性に対するＴＬＲ３アゴニストの効果を試験するために、更なる実験を行った。この実験においては、ワクチンの用量に対するＴＬＲ３アゴニストの効果を評価するために、幾つかの大きな群を処置した。設定および特性は、以下の点を除き、実施例１および２の実験の場合と本質的に同じであり：ニワトリは市販の産卵ニワトリの種類のものであり：使用したワクチンはＰａｒａｃｏｘ（商標）５であり、トリ当たりのＴＬＲ３アゴニストの用量は７．５μｇに固定し、ワクチン接種は０．２ｍｌ／トリで粗噴霧により投与し、そして、チャレンジは、ワクチン接種後第２１日に４つの別々の株を使用して行った。
【０２３０】
３．１．実験の概要
１１２５羽の１日齢のニワトリを、１２５羽の動物の９つの群に分け；１つの群はワクチン未接種のままであり、残りの８つの群は、ＴＬＲ３アゴニストの存在下または非存在下、種々の用量のＰａｒａｃｏｘ  ５ワクチンの投与を受けた、表３を参照されたい。ワクチンはキサンタンガムを含有し、標準的な孵化場噴霧器を使用して粗噴霧として適用された。
【０２３１】
ワクチン接種後第２１日に、各処置群からの８０羽のトリを４つのチャレンジタイプのうちの１つに割り当て、種チャレンジ亜群当たり２０羽のトリを残した。合計７２０羽のトリに４つのエイメリア種チャレンジのうちの１つの０．５ｍｌの経口強制飼養を行った。対照群１からの５羽のトリをチャレンジせずに残し、それらの元の檻において飼育して第２８日ｐ．ｖ．にベースライン剖検評価に付した。
【０２３２】
全てのトリを、チャレンジタイプに割り当てられる前に、第２０日ｐ．ｖ．に個別に秤量し、剖検前に、第２８日ｐ．ｖ．に、生体重増加を測定するために再び秤量した。大部分の糞便サンプルは、オーシスト排出量の測定のために、全ての檻から第２１日〜第２５日および第２５日〜第２８日ｐ．ｖ．に採取された。エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）およびエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）のチャレンジタイプに関しては、チャレンジ処置群当たり１０羽のトリを腸病変の評価のために剖検に付した。エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）は疾病特徴的腸病変を引き起こさないため、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）でチャレンジされた群１（対照）からの１０羽のトリを、チャレンジの取り込みを確認するために寄生虫状態に関する剖検に付した。
【０２３３】
３．２．材料および方法
試験動物：
Ｈｙｌｉｎｅ（商標）の褐色の市販の産卵ニワトリである。雄であり、個別に番号で標識された。全てのニワトリは、ワクチン接種日に１日齢であった。トリは、気候管理され制御された条件下、適切な檻において経木の床敷上で飼育された。飼料には薬物添加されなかった。
【０２３４】
試験全体を通じてニワトリを綿密にモニターし；ワクチン接種後第１週に、処置に無関係な原因で７羽のトリが死亡し、これらは異なる群からのものであった。
【表３】
2020502204.tif 000005
【０２３５】
ワクチン：
合計１１．０００用量のＰａｒａｃｏｘ  ５の薬袋を徹底的に振盪し、水中でそれぞれ希釈された種々の群に分け、意図される場合にはＴＬＲ３アゴニストと混合し、そして、全てのワクチンを記載されているとおりにキサンタンガム（１．２％）、ＮａＣｌ（７５ｍＭ）およびカルミン（０．２％）を含有する希釈液の無菌２×ストックと１：１で混合した。
【０２３６】
群８および９の「全」用量ワクチン中のオーシストの量は、用量当たり、以下のとおりであった：エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）：５００；エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）ＣＰ株：２００；エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）ＭＦＰ株：１００；エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）：１０００；およびエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）：５００オーシスト。
【０２３７】
使用したＴＬＲ３アゴニストは、トリ１羽当たり７．５μｇの用量のポリＡ：Ｕであった。
【０２３８】
Ｓｐｒａｙｃｏｘ（商標）ＩＩ装置を製造業者の説明に従い使用して、粗噴霧としてワクチンを投与した；使用前に体積および圧力の設定を較正した；使用前にワクチンを十分に振とうした；ワクチンの投与は最低用量から最高用量へと行い、アゴニストを含まない群の後、アゴニストを含む群に行い、中間において水洗を行った。ワクチン体積は、トリ１００羽当たり２０ｍｌに設定された。ワクチン接種したら、トリを、ワクチン接種されたトレイにおいて十分に明るく暖かい場所で少なくとも３０分間維持した後、収容檻に移した。
【０２３９】
チャレンジ材料：
全てのチャレンジ材料は、以下の４つの異なる種からの胞子形成オーシストの液体懸濁液であった：エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）（Ｅａ）、エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）（Ｅｔ）、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）（Ｅｍｉｔ）またはエイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）（Ｅｍａｘ）。意図されるオーシスト数を、それぞれ、以下のとおりに、改良型フックス（Ｆｕｃｈｓ）−ローゼンタール（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）計数板を使用して決定した：Ｅａ：１ｍｌ中の１×１０６／トリ；Ｅｔ：０．５ｍｌ中の３×１０４／トリ；Ｅｍｉｔ：１ｍｌ中の３×１０５／トリ；Ｅｍａｘ：０．５ｍｌ中の１×１０４／トリ。
【０２４０】
チャレンジ材料を経口強制飼養により個別に投与した。
【０２４１】
剖検および病変スコア：
オーシストの計数または病変のスコア化を行う者は、処置に関する情報から盲検化された。病変のスコア化は、チャレンジ種（Ｅａ、ＥｔおよびＥｍａｘ）のそれぞれに特有の標準的な基準を用いた。
【０２４２】
３．３．結果
ワクチンおよびチャレンジの実施：
群１のトリの糞便サンプルはチャレンジ前のオーシスト数に関して陰性のままであり、このことは、群１がチャレンジ前にコクシジウムを有していなかったことを示している。ワクチン接種群２〜９から採取された糞便サンプルのオーシスト数は第１１日ｐ．ｖ．から全て陽性であり、このことは、ワクチン接種オーシストの複製が全てのワクチン接種群で成功したことを示している。
【０２４３】
チャレンジ実施は、チャレンジ後第３日から剖検まで観察されたコクシジウム症の臨床症状に関しても成功した。第２８日ｐ．ｖ．の剖検時に、エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）およびエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）でチャレンジされたトリは、０を超える腸病変スコアを有し、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）でチャレンジされた対照トリの腸擦過の全てはオーシストに関して陽性であり、このことは、チャレンジが有効であったことを証明している。
【０２４４】
生体重増加：
種々のチャレンジ亜群に関するワクチン接種後第２０日から第２８日までの平均生体重増加（単位はグラム）の結果を、表４に示す。それらの種々の亜群のサイズは動物２０羽であった。
【０２４５】
エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）に関しては、１／２０希釈液（群２）以外の全てのワクチン希釈液が、ワクチン未接種対照群と比較して有意に良好（ｐ＜０．０１）な平均生体重増加を示し、１／２０希釈液（群２）は有意に低い平均体重増加を示した。しかし、これはＴＬＲ３アゴニストの存在下で劇的に回復した。
【０２４６】
その他のチャレンジ種［エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）またはエイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）］の１つの投与を受けたワクチン接種亜群のトリのうち、ほとんどは、それらのワクチン未接種チャレンジ群と比較して有意に良好な平均体重増加を示した。しかし、ワクチン希釈またはＴＬＲ３アゴニストの存在の効果は検出できなかった。
【０２４７】
適用されたワクチン用量は、希釈されたサンプルにおいてさえも、体重増加に対する効果を観察することができないほど高い用量のオーシストを尚も含有していたと考えられる。反復実験において、より高いワクチン希釈物が使用されるであろう。
【表４】
2020502204.tif 000006
【０２４８】
腸病変スコア：
チャレンジタイプおよび処置群ごとの平均腸病変スコアの結果を表５に表す。これらの群においては、ｎ＝２０であった。
【０２４９】
エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）でチャレンジされたワクチン未接種対照トリの僅か５０％が、２を超える病変スコアを示した。
【０２５０】
ワクチン接種されチャレンジされたトリは、それらの病変スコアの分布において有意差を示さなかった。エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）でチャレンジされたワクチン未接種対照トリの８０％が、２を超える病変スコアを示した。ワクチン希釈またはＴＬＲ３アゴニストの存在と無関係に、ワクチン未接種トリと比較して（全て、ｐ値＜０．０３）、全てのワクチン接種トリ（群２〜９）の病変分布において有意（ｐ＜０．０５）差が認められた。エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）でチャレンジされたワクチン未接種対照トリの９０％が、２を超える病変スコアを示した。ＴＬＲ３アゴニストの非存在下の標準的なワクチン（群８）に関しては、２を超える病変スコアを示したトリの割合は６０％に減少したが、全体的な分布の変化は統計的に有意ではなかった（ｐ＝０．０７）。しかし、１／４希釈されたワクチンに関しては、病変スコアの分布における有意な減少が認められた（群６；ｐ＝０．００１）。より高いワクチン希釈度においては（１／１０、群２、および１／２０、群４）、トリの７０％が、２を超える病変スコアを示し、その分布は、ワクチン未接種チャレンジ対照群と有意には異ならなかった。ＴＬＲ３アゴニストの存在は、２を超える病変スコアを示すトリの割合を、それぞれ２０％（群５、１／１０用量）および５０％（群３、１／２０用量）に減少させて、群５に関しては対照群と統計的に有意に異なる（ｐ＝０．００３）病変スコア分布、および群３に関しては統計的にほぼ有意である（ｐ＝０．０５０９）病変スコア分布をもたらした。
【０２５１】
３．４．考察および結論
第２０日ｐ．ｖ．の各チャレンジタイプに関して、対照群とワクチン接種処置群の間でトリの体重に有意差は認められなかった。ワクチン未接種対照（群１）からの糞便サンプルは、群１がチャレンジ前にコクシジウムを有さないままであることを証明した。ワクチン接種処置群２〜９から採取された糞便サンプルからのオーシスト数は、第１１日ｐ．ｖ．から、全て陽性であり、このことは、ワクチン接種オーシストの取り込みおよび再利用が全ワクチン接種群で成功したことを示している。使用したチャレンジ材料の再計算は、チャレンジ用量が標的の±２％以内であることを示した。
【０２５２】
第２８日ｐ．ｖ．の剖検においては、エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）およびエイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）でチャレンジされたワクチン未接種対照トリは、それぞれ５０％、８０％および９０％のトリにおいて、２を超える腸病変スコアを示した。また、エイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）でチャレンジされた対照トリの全ての腸擦過はオーシストに関して陽性であった。
【０２５３】
エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）でのチャレンジの後で得られた病変スコアは比較的軽度であったが、ワクチン未接種対照群においては高レベルのオーシスト排出量および体重増加に対する有意な影響が見られ、したがって、このことは、全てのチャレンジが有効であったことを証明している。ワクチン希釈は、チャレンジ種および測定されているパラメータに応じて、有効性に対する様々な影響を示した。１／２０までのワクチンの希釈は、エイメリア・マクシマ（Ｅ．ｍａｘｉｍａ）またはエイメリア・ミティス（Ｅ．ｍｉｔｉｓ）に関して調べられた有効性パラメータのいずれにも影響を及ぼさず、このことは、これらの抗原がＰａｒａｃｏｘ  ５製剤中で有意に過剰であることを示している。これとは対照的に、エイメリア・テネラ（Ｅ．ｔｅｎｅｌｌａ）に関しては、病変スコアおよびオーシスト排出量の両方の減少の点での防御レベルの減少が、１／１０以上のワクチン希釈度で観察された。エイメリア・アセルブリナ（Ｅ．ａｃｅｒｖｕｌｉｎａ）に関しても同様に、ワクチンを１／２０に希釈した場合、体重増加の減少に対する防御は観察されなかった。腸病変は、決定的な結果を示すには軽度すぎた。ワクチン希釈ゆえに防御の低下が観察された全ての場合において、ワクチン製剤中にＴＬＲ３アゴニストを配合することは有益であった。
【０２５４】
全体として、これらの結果は、ワクチン製剤中にＴＬＲ３アゴニストを配合することが、チャレンジに対する同レベルの防御をもたらす一方で、より低い抗原用量でワクチン効力を最大４倍まで増強しうることを証明している。
【表５】
2020502204.tif 000007
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【国際調査報告】
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2020502204.tif 000013
2020502204.tif 000014
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