(57)【要約】  本開示は、従来の凍結乾燥器を使用してバイオ医薬品を保存するために、ＰＢＶプロトコルを実行するための方法に関する。記載されるのはまた、従来の凍結乾燥器を使用して無菌乾燥を達成するための、バイオ医薬品の分離を維持するためのステップである。追加の利益として、本発明は、クリーンルーム領域の外で処分される、従来の凍結乾燥器を使用してバイオ医薬品組成物の無菌乾燥を達成するための、適正製造基準（ＧＭＰ）に準拠する方法を提供する。最後に、患者への粘膜又は経皮送達に適したバイオ医薬品を保存するための方法及び製剤が開示される。
2020526225.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオ医薬品を保存するための方法であって、以下のステップを順に含む方法：
（ｉ）容器内に、水性の保存組成物であって、１種又は複数のバイオ医薬品を含む保存組成物を提供することと；
（ｉｉ）前記容器とその中の保存組成物を、凍結乾燥器の真空チャンバー内の温度制御された棚に置く（ここでは、前記温度制御された棚は、ある棚温度を提供するように適合され、且つ、前記真空チャンバーは、その中のある真空圧を提供するように適合される）ことと；
（ｉｉｉ）前記棚温度を０℃未満に低下させる、且つ前記真空圧を１．０トル未満に低下させ、それによって前記保存組成物を二相スラッシュ状態に転換させる（ここでは、前記保存組成物は、二相スラッシュ状態における氷晶を含む）ことと；
（ｉｖ）前記棚温度を０℃よりも高温に上昇させる、且つ前記真空圧を１．０トル未満に維持し、それによって前記保存組成物を機械的に安定なガラス質発泡体に転換させることと；
（ｖ）前記機械的に安定なガラス質発泡体のガラス転移温度を上昇させるために、前記棚温度を４０℃よりも高温に上昇させること。
【請求項２】
ステップ（ｉｖ）中に、前記凍結乾燥器の真空チャンバー内で、前記棚温度が２０℃よりも高温に上昇され、且つ前記真空圧が０．３トル未満に低下される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｉｖ）中に、第１の期間中、前記真空チャンバー内で、前記棚温度が２０℃よりも高温に上昇され、且つ前記真空圧が０．３トル未満に低下される、且つ、第１の期間後に、前記真空チャンバー内で、前記棚温度が３０℃よりも高温に上昇され、且つ前記真空圧が０．３トル未満に維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｖ）中に、前記棚温度が５０℃よりも高温に上昇される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記水性の保存組成物が、液体又はゲルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記保存組成物が、１種又は複数の非還元糖、１種又は複数の糖アルコール、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１種又は複数の非還元糖の少なくとも１つが、スクロース、トレハロース、ラフィノース、メチルグルコシド、及び２−デオキシグルコースからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記１種又は複数の糖アルコールの少なくとも１つが、マンニトール、イソマルト、ソルビトール、及びキシリトールからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記保存組成物が、１種又は複数の細胞凍結保護剤、１種又は複数の細胞外凍結保護剤、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１種又は複数の細胞凍結保護剤の少なくとも１つが、グリセロール、プロピレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、マンニトール、メチルグルコシド、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記１種又は複数の細胞外凍結保護剤の少なくとも１つが、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン、アルギニン、アラニン、リジン、システイン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、及びヒドロキシエチルデンプンからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記保存組成物が、１種又は複数の消泡剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記１種又は複数の消泡剤の少なくとも１つが、ポリプロピレングリコール及びエチレングリコールからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｉ）の前に、前記バイオ医薬品に前記１種又は複数の透過性の細胞凍結保護剤を負荷すること、それに続いて、負荷が行われたバイオ医薬品を保存溶液と混合して前記保存組成物を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記１種又は複数のバイオ医薬品が、細菌、ウイルス、タンパク質、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記１種又は複数のバイオ医薬品が、１種又は複数の細菌、１種又は複数のウイルス、及び１種又は複数のタンパク質の組み合わせを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記容器が、血清バイアル、プラスチックボトル、金属容器、又はトレーのうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記容器が、０．２５μｍ以下の孔径を有する多孔膜を含み、且つ、前記保存組成物が、前記多孔膜によって真空チャンバーの環境から隔てられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記容器が、滅菌パウチ内に密封される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ある体積の前記容器内に、複数の金属又はセラミックの球が提供される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｖ）に続いて、前記容器内で、その中に含有される金属又はセラミックの球を使用して、機械的に安定なガラス質発泡体を粉砕することをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記保存組成物が、１部の糖アルコールに対する少なくとも５部の二糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記保存組成物が、水溶性のアミノ酸又はその塩をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記水溶性のアミノ酸又はその塩が、アルギニン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、又はこれらの組み合わせを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
熱安定性のバイオ医薬品の無菌生成のための方法であって、以下のステップを含む方法：
ｉ．クリーンルームの第１の領域内で：
保存組成物であって、１種又は複数のバイオ医薬品を含む保存組成物を、容器内に入れることと；
前記容器の開口部を多孔膜で密封して、膜で密封された容器を形成する（ここでは、多孔膜は、０．２５ミクロン以下である穴径を含む）ことと；
前記膜で密封された容器を、滅菌した医療用滅菌パウチ内に入れ、この滅菌パウチを熱融着させることと；
ｉｉ．滅菌パウチとその中の膜で密封された容器を、クリーンルームの第１の領域から第２の領域に輸送することと（ここでは、この方法は、
前記滅菌パウチとその中の膜で密封された容器を、凍結乾燥器の真空チャンバー内の温度制御された棚に置くことと；
真空圧及び棚温度を調節して、乾燥プロトコル（ここでは、この乾燥プロトコルは、前記保存組成物を機械的に安定なガラス質発泡体に転換させることを含む）を実行することと
をさらに含む）；
ｉｉｉ．前記乾燥プロトコルを実行することに続いて、前記膜で密封された容器を前記滅菌パウチから取り出し、その後、前記膜で密封された容器をクリーンルームの第１の領域に戻すことと（ここでは、クリーンルームの第１の領域内で、この方法は、
前記容器内の機械的に安定なガラス質発泡体が、その後の保管中に外部の湿気から分離されたままであることを確実にするために、前記多孔膜を滅菌したカップと置き換える、又はフィルターを水が浸透できない滅菌したステッカーで覆うことと；
任意選択的に、前記容器内の機械的に安定なガラス質発泡体を、粉末に転換させることと
をさらに含む）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、バイオ医薬品に；より詳細には、従来の凍結乾燥器を使用してバイオ医薬品を保存するための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオ医薬品保存技術に関連する分野は、近年、進歩しており、２０１６年１０月１８日に発行された米国特許第９，４６９，８３５号に開示されている通りの「蒸発乾燥による保存(Preservation by Vaporization)（ＰＢＶ）」として公知のある種の優れた方法の出現と共に、著しい向上を達成している。
【０００３】
現在、従来の凍結乾燥器（フリーズドライヤー）は、ＰＢＶプロトコルを使用するバイオ医薬品及び他の組成物の保存を実行するためには設計されていない。
【０００４】
さらに、従来のフリーズドライプロトコルは、しばしば、バイオ医薬品組成物を、これらの組成物の活性に影響を与える傾向がある、極めて低い温度に曝露させる。
【０００５】
多くの研究室及び工業施設は、従来のフリーズドライヤーを所有しているので、バイオ医薬品組成物は、典型的には、より低い生成物の活性及び安定性をもたらす、従来のフリーズドライなどの時代遅れのプロトコルを使用して保存される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の凍結乾燥器を使用してバイオ医薬品を保存するための、改良された方法の必要性が存在する。
【０００７】
より詳細には、ＰＢＶ技術に従ってバイオ医薬品を保存するための、従来の凍結乾燥器の使用を組み込む、改良された方法の必要性が存在する。
【０００８】
さらに、これらの方法に従ってバイオ医薬品を保存する場合に、バイオ医薬品組成物の無菌分離を維持する必要性が存在する。
【０００９】
ＰＢＶプロトコルの実行中にバイオ医薬品組成物を保護するための、特別な保存製剤が必要とされることとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、従来の凍結乾燥器を使用してバイオ医薬品を保存するために、ＰＢＶプロトコルを実行するための方法に関する。
【００１１】
本開示はまた、従来の凍結乾燥器を使用して無菌乾燥を達成するための、バイオ医薬品の分離を維持するためのステップに関する。
【００１２】
さらに、本開示は、クリーンルーム領域の外で処分される、従来の凍結乾燥器を使用してバイオ医薬品組成物の無菌乾燥を達成するための、適正製造基準(good manufacturing practice)（ＧＭＰ）に準拠する方法に関する。
【００１３】
最後に、本開示は、患者への粘膜又は経皮送達に適した、周囲温度で安定な微粒子化されたバイオ医薬品の生成のための方法及び製剤に関する。
【００１４】
問題のこれらの及び他の解決策は、添付の説明、図面、及び特許請求の範囲を徹底的に見直すことで、当業者に理解されることとなる。
【発明の効果】
【００１５】
蒸発乾燥による保存(Preservation by Vaporization)は、バイオ医薬品保存技術の分野における好ましい技術である。なぜなら、このプロセスは、水のほとんどが保存組成物から除去されるステップである「一次乾燥」ステップとも呼ばれる最初の乾燥中に、比較的に穏やかな環境を実現するために、同時的な水の沸騰、氷晶の昇華、及び蒸発を利用するからである。この穏やかな環境は、損傷を受けやすいタンパク質、ウイルス、細菌、及び他の細胞性のものに対して特に優しく、周囲温度でのワクチン、血液、及びマイクロバイオーム成分の安定化のために適用される可能性がある。それに続く継続的な乾燥（「二次乾燥」としても知られる）は、保存組成物のガラス転移温度をわずかに上昇させ、その結果、機械的に安定な非晶質の乾燥ガラス質発泡体が得られ、ここでは、発泡体内に封入されたバイオ医薬品は、保護され、（ｉ）９０日を超える保管（「長期保管」）、及び（ｉｉ）時としてその後の再構成又は患者への送達のために保存される。開示した方法は、当業者が、従来の凍結乾燥器を使用する実行のために適合されたＰＢＶプロトコルに従ってバイオ医薬品を保存することを可能にする。したがって、ＰＢＶ技術を使用してバイオ医薬品組成物を保存するために、特殊化された装置は必要ではない。
【００１６】
ＰＢＶ技術を使用して保存されるバイオ医薬品組成物は、従来のフリーズドライ技術を使用して保存される同じ組成物と比較して、卓越した有効性をもたらす。従来のフリーズドライ技術を使用して受ける極端な温度が、これらの組成物のタンパク質エピトープ及び有用な成分を破壊する傾向があり、例えば、ＰＢＶによって保存される組成物よりも劣っている産生される生成物を与えることが考えられる。
【００１７】
限定はされないがワクチンなどのバイオ医薬品組成物のＧＭＰ生成は、本明細書に開示した方法を使用して実現することができる。つまり、この方法は、工業用途のための安定化のための、材料の、改良された、より効率的な、ＧＭＰに準拠する処理を提供する。
【００１８】
保存中にバイオ医薬品を保護する、また、材料の失透を防止する、ある種の保存製剤及びプロトコルを開示する。
【００１９】
他の好都合な効果は、本明細書を徹底的に見直すことで、当業者に認識されることとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】バイオ医薬品を保存するための方法を示す。
【図２】微粒子化及びそれに続く保管後のＰＢＶ  ＬＡＩＶの活性を試験する実験に関する結果チャートを示す。
【図３】本明細書に詳述される、ある実験と関連するＤＳＣプロットを示す。
【図４】本明細書に詳述される、別の実験と関連するＤＳＣプロットを示す。
【図５】本明細書に詳述される、別の実験と関連するＤＳＣプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
当業者が、本発明をその様々な態様及び実施形態において行う及び使用することができるように、限定ではなく例示の目的のために、ある種の好ましい実施形態の詳細及び説明を以下に提供する。しかし、これらの詳細及び説明は、ある種の好ましい実施形態の典型に過ぎず、明確に記載されない無数の他の実施形態は、本開示を徹底的に見直すことで、当業者に容易に理解されることとなる。したがって、本開示のいかなる読者も、特許請求の範囲による本発明の範囲を、こうした範囲が本明細書に記載及び例示された実施形態によって限定されることが意図されないものであると解釈するべきである。
【００２２】
これから、一般的実施形態において、バイオ医薬品を保存するための方法を開示する。この方法は、以下のステップを順に含む：
ステップ（ｉ）：容器内に、水性の保存組成物であって、１種又は複数のバイオ医薬品を含む保存組成物を提供すること；
ステップ（ｉｉ）：この容器とその中の保存組成物を、凍結乾燥器の真空チャンバー内の温度制御された棚に置く（ここでは、温度制御された棚は、ある棚温度を提供するように適合され、且つ、真空チャンバーは、その中のある真空圧を提供するように適合される）こと；
ステップ（ｉｉｉ）：棚温度を０℃未満に低下させる、且つ真空圧を１．０トル未満に低下させ、それによって保存組成物を二相スラッシュ状態に転換させる（ここでは、保存組成物は、二相スラッシュ状態における氷晶を含む）こと；
ステップ（ｉｖ）：棚温度を０℃よりも高温に上昇させる、且つ真空圧を１．０トル未満に維持し、それによって保存組成物を機械的に安定なガラス質発泡体に転換させること；及び
ステップ（ｖ）：機械的に安定なガラス質発泡体のガラス転移温度を上昇させるために、棚温度を４０℃よりも高温に上昇させること。
【００２３】
本明細書の目的では、用語「保存組成物」は、概して、−３０℃から＋４０℃までの周囲温度での長期保管、及びその後の再構成又は患者への送達の間、バイオ医薬品を保存するための組成物を意味する。保存組成物は、概して、１種又は複数の糖と１種又は複数のバイオ医薬品を含み、ここでは、バイオ医薬品は、１種又は複数の細菌、１種又は複数のウイルス、１種又は複数のタンパク質、又はこれらの組み合わせを含むことができる。保存組成物は、その初期状態では水性である、すなわち、１パーセントを超える若干の百分率組成の水を含む液体又はゲルである。この初期状態では、バイオ医薬品、糖、糖アルコール、及び他の成分などの様々な成分が選択され、共に混合される。しかし、「一次乾燥」としても知られるＰＢＶプロトコルの最初の乾燥ステップ中、水は、真空圧力下で、この水性の組成物から、同時的な沸騰、蒸発、及び昇華によって除去される。したがって、保存組成物は、一次乾燥後に、ほとんど水がなくなることとなり、概して、その中に固定されたバイオ医薬品と共に、非晶質の乾燥ガラス状マトリックス又は発泡体（本明細書では「機械的に安定なガラス質発泡体」）を包含することとなる。
【００２４】
したがって、さらに、本明細書の目的では、用語「機械的に安定なガラス質発泡体」は、ＰＢＶ一次乾燥後の保存組成物（ここでは、保存組成物は、実質的に水がなく、構造形態を維持するのに十分な機械的強度を有する非晶質の乾燥ガラス質発泡体を形成する）を意味する。具体的には、ＰＢＶ保存中、保存組成物の沸騰を開始するとすぐに、この組成物の内部で、気泡が核生成され、成長し、これは、このプロセスの初期に、移動する（安定していない）発泡体となり、やがて、脱水の結果としての組成物の粘性により、水蒸気の泡がさらに成長するのが妨げられ、一次乾燥の終わり間近に又は水のほとんどが蒸発される時に、気泡は組成物の内部で固定され、発泡体は、機械的に安定となる。
【００２５】
一実施形態では、ステップ（ｉｖ）中に、凍結乾燥器の真空チャンバー内で、棚温度が２０℃よりも高温に上昇され、且つ真空圧が０．３トル未満に低下される。
【００２６】
他の実施形態では、ステップ（ｉｖ）中に、第１の期間中、真空チャンバー内で、棚温度が２０℃よりも高温に上昇され、且つ真空圧が０．３トル未満に低下される、且つ、第１の期間後に、真空チャンバー内で、棚温度が３０℃よりも高温に上昇され、且つ真空圧が０．３トル未満に維持される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｖ）中に、棚温度が５０℃よりも高温に上昇される。
【００２８】
種々の実施形態では、（一次乾燥前の）水性の保存組成物が、液体又はゲルを含む。
【００２９】
ゲルは、保存溶液に含まれるポリマー間の、又はポリマーと他の分子又はイオン間の化学的架橋によって生成することができる。イオンは、カチオン、すなわちＣａ＋＋、又はアニオンを含むことができる。
【００３０】
ゲルは、別の架橋成分を含有する凍結された液滴の混合物の加温中の化学的架橋によって生成することができる。凍結された液滴は、低温パレット処理(cryo-palletization)、例えば、溶液を液体窒素（ＬＮ２）などの低温液体中で噴霧することを使用して生成することができる。
【００３１】
ゲルはまた、０℃未満でゲルに変わる保存組成物の冷却によって生成することもできる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、冷却中にゲルを形成することができるポリマー溶液の冷却は、低温ペレット化(cryo-pelletization)によって実施される。低温ペレット化は、冷却前に材料が多くの液滴に分散されるプロセスである。
【００３３】
多数の製剤が可能であるが、保存組成物は、概して、１種又は複数の非還元糖、１種又は複数の糖アルコール、又はこれらの組み合わせを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、前記１種又は複数の非還元糖の少なくとも１つは、スクロース、トレハロース、ラフィノース、メチルグルコシド、及び２−デオキシグルコースからなる群から選択される。しかし、当業者に公知の他の非還元糖も、同様に組み入れることができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、前記１種又は複数の糖アルコールの少なくとも１つは、マンニトール、イソマルト、ソルビトール、及びキシリトールからなる群から選択される。しかし、当業者に公知の他の非還元糖も、同様に組み入れることができる。
【００３６】
保存組成物は、１種又は複数の細胞凍結保護剤、１種又は複数の細胞外凍結保護剤、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、１種又は複数の細胞凍結保護剤の少なくとも１つは、グリセロール、プロピレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、マンニトール、メチルグルコシド、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、１種又は複数の細胞外凍結保護剤の少なくとも１つは、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン、アルギニン、アラニン、リジン、システイン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、及びヒドロキシエチルデンプンからなる群から選択される。
【００３９】
保存組成物は、１種又は複数の消泡剤をさらに含むことができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、１種又は複数の消泡剤の少なくとも１つは、ポリプロピレングリコール及びエチレングリコールからなる群から選択される。
【００４１】
ある種の実施形態では、この方法は、ステップ（ｉ）の前に、バイオ医薬品に１種又は複数の透過性の細胞凍結保護剤を負荷すること、それに続いて、負荷が行われたバイオ医薬品を保存溶液と混合して前記保存組成物を形成することをさらに含むことができる。
【００４２】
１種又は複数のバイオ医薬品は、細菌、ウイルス、タンパク質、又はこれらの組み合わせを含む。
【００４３】
一実施形態では、１種又は複数のバイオ医薬品は、１種又は複数の細菌、１種又は複数のウイルス、及び１種又は複数のタンパク質の組み合わせを含む。
【００４４】
種々の実施形態では、容器は、血清バイアル、プラスチックボトル、金属容器、又はトレーのうちの１つを含むことができる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、容器は、０．２５μｍ以下の孔径を有する多孔膜を含むことができ、且つ、保存組成物は、多孔膜によって真空チャンバーの環境から隔てることができる。多孔膜は、水溶液の滅菌のために使用される、いかなるフィルターも含むことができる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、容器はまた、滅菌パウチ内に密封される。
【００４７】
いくつかの実施形態では、容器は、保存組成物と共に、ある体積の容器の内に提供される、複数の金属又はセラミックの球を収めることができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、この方法は、機械的に安定なガラス質発泡体を粒子／粉末に転換するために、ステップ（ｖ）に続いて、前記容器内で、その中に含有される金属又はセラミックの球を使用して、機械的に安定なガラス質発泡体を粉砕すること（「ボールミル粉砕(ball-milling)」）をさらに含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、特に、バイオ医薬品が粘膜又は経皮送達を目的とする場合、保存組成物は、１部の糖アルコールに対する少なくとも５部の二糖を含むことができる。さらに、保存組成物は、水溶性のアミノ酸又はその塩をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、水溶性のアミノ酸又はその塩は、アルギニン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
【００５０】
別の態様では、熱安定性のバイオ医薬品の無菌生成のための方法が開示される。この方法は、以下のステップを含む：
【００５１】
クリーンルームの第１の領域内で：保存組成物であって、１種又は複数のバイオ医薬品を含む保存組成物を、容器内に入れることと；この容器の開口部を多孔膜で密封して、膜で密封された容器を形成する（ここでは、多孔膜は、０．２５ミクロン以下である穴径を含む）ことと；膜で密封されたこの容器を、滅菌した医療用滅菌パウチ内に入れ、この滅菌パウチを熱融着させることと；
【００５２】
滅菌パウチとその中の膜で密封された容器を、クリーンルームの第１の領域から第２の領域に輸送することと（ここでは、この方法は、滅菌パウチとその中の膜で密封された容器を、凍結乾燥器の真空チャンバー内の温度制御された棚に置くことと；真空圧及び棚温度を調節して、乾燥プロトコル（ここでは、この乾燥プロトコルは、保存組成物を機械的に安定なガラス質発泡体に転換させることを含む）を実行することとをさらに含む）；
【００５３】
乾燥プロトコルを実行することに続いて、膜で密封された容器を滅菌パウチから取り出し、その後、膜で密封されたこの容器をクリーンルームの第１の領域に戻すことと（ここでは、クリーンルームの第１の領域内で、この方法は、容器内の機械的に安定なガラス質発泡体が、その後の保管中に外部の湿気から分離されたままであることを確実にするために、多孔膜を滅菌したカップと置き換える、又はフィルターを水が浸透できない無菌のステッカーで覆うことと；任意選択的に、容器内の機械的に安定なガラス質発泡体を、粉末に転換させることとをさらに含む）。
【００５４】
クリーンルームは、典型的には、しばしばＡ、Ｂ、及びＣと呼ばれる３つの領域を含むように設計される。Ａは、クリーンルームの最初の、最大限に無菌の部分である。ＦＤＡ規則によれば、個人は、清潔な衣服及び  又は／及びカバーで覆われるならば、クリーンルームの領域Ａの外側（Ｂ及びＣ領域内）で、何らかの作業を行うこともできるし、存在することも可能である。個人は、最もクリーンな領域Ａに入ることは許されない。領域Ａ内へのボトル若しくは器具の送達のような小さな操作を実行する、又は容器を開け閉めする、又は類似のことのために、滅菌した手袋で覆われた手のみ、短期間、Ａ領域をＢ領域と隔てる線を越えることが許される。道具又はボトルは、領域Ａの中に移動する前に、領域Ａの外側の環境から隔てられるべきである。例えば、道具又はボトルは、領域Ａが無菌のままであることを確実にするために、滅菌したパウチ（これは、道具又はボトルを領域Ａに入れる前に取り除かれることとなる）に入れるべきである。
【００５５】
種々の実施形態では、乾燥発泡体は、沸騰中の蒸気泡の核生成及び成長の結果として生じ、液体の乾燥中に形成される泡の多い発泡体として現れる、又は気体包含物を含有する乾燥ヒドロゲルとして現れる可能性がある。
【００５６】
これらの及び他の実施形態は、以下の実験例に従って考案される及び裏付けられる：
【実施例】
【００５７】
実施例１：蒸発乾燥による保存（ＰＢＶ）
蒸発乾燥による保存（ＰＢＶ）は、周囲温度（ＡＴ）での脆弱なワクチン及び他のバイオ医薬品の安定化のための、比較的に新しい技術である。ＰＢＶ実行は、温度と真空圧力の同時制御を必要とする。これは、乾燥チャンバーを真空源に接触させることと、水の蒸発に由来する冷却に対処するために、乾燥を行う試料に熱を提供することによって行うことができた。熱源は、乾燥中に試料が置かれる加熱棚からの、電磁加熱又は従来の熱流である可能性がある。ＰＢＶプロセスを実行することができる真空乾燥装置の、多くのデザインが存在し得る。ＰＢＶはまた、従来の凍結乾燥器、例えば、フリーズドライプロトコルを使用する乾燥生物製剤の生成のために現在使用されているものを使用して実行することもできる。フリーズドライの実行は、典型的には、比較的に高い真空を使用することを必要とするので、従来の凍結乾燥器は、乾燥チャンバーの内部の圧力が１トルを超える又は場合によっては２トルを超える場合に真空圧力を自動的に制御するように作られていない。これにより、従来の凍結乾燥機を使用して自動的に実行することができるＰＢＶプロセスの範囲は限定される。しかし、本明細書の種々の実施形態では、周囲温度でバイオ医薬品を保存するために、従来の凍結乾燥器をどのようにして使用することができるかということ、また、操作者の関与を伴わないＰＢＶプロトコルの自動的な実行（これは、ＧＭＰ生成及びＦＤＡ認可並びに合衆国外の様々な規制機関の認可に必要とされることとなる）のために、乾燥プロトコルをどのようにしてプログラムすることができるかということが開示される。
【００５８】
ＰＢＶ技術によれば、一次乾燥は、部分的に凍結されたスラッシュ状態から実施されるべきである。したがって、ＰＢＶを実行するために、生物学的懸濁液と保存溶液（ＰＳ）との保存混合物（ＰＭ）を含めた試料、又は生物製剤とＰＳを含むヒドロゲルなどの、所与の保存組成物は、最初に部分的に凍結されるべきである。「凍結された」は、試料の内部に形成された氷晶が存在することを意味する。「部分的に凍結された」は、試料温度が、Ｔｇ’よりも少なくとも１０℃高いことを意味する。ここでは、Ｔｇ’は、保存組成物が、液相が残っておらず、結晶化された固体と非晶質固体（ガラス）を含む固体状態である温度よりも低い温度である。ＰＢＶと従来のフリーズドライとの間の、ある重要な違いは、一次フリーズドライ（又は凍結乾燥）中、試料の温度が、Ｔｇ’又はＴｇ’未満であるべきであることである。しかし、ＰＢＶ一次乾燥ステップ中の試料温度は、氷晶間の液相の存在を確実にするために、Ｔｇ’よりも少なくとも１０℃高い温度であるべきである。また、この液体が蒸発するだけでなく沸騰もすることを確実にするために、チャンバー内の真空圧力は、液体の上の平衡水蒸気圧よりも低い圧力であるべきである。ここでは、一般に認められている用語法と一致して、一次乾燥は、その間にサンプルがサンプル中の最初の水の量のおよそ９０％を失う、最初の乾燥ステップと定義される。
【００５９】
バイオ医薬品は、ＰＢＶ保存の前に、凍結及び乾燥の有害な影響からバイオ医薬品を保護するために設計された保存溶液（ＰＳ）と混合されるべきである。ＰＳの適切な選択は、保存の成功を確実にするために重要である。凍結温度が低いほど、ＰＳ中に従来の凍結保護剤を含むことが重要になる。細胞性のものの内部に浸透する細胞凍結保護剤と、細胞膜及びウイルス膜及びエンベロープを保護する細胞外凍結保護剤の両方を使用することが重要である。
【００６０】
実施例２：動物細胞の保存
ＣＴＶ−１は、ヒトＴ細胞白血病細胞株である。ＣＴＶ−１細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベータ内で成長させ、ＲＰＭＩ培地（８５〜９０％）及びを熱失活させたＦＢＳ（１０〜１５％）（ペニシリン−ストレプトマイシンを含む）中で浮遊状態で培養した。細胞は、４〜５日ごとに分割し、１Ｅ６細胞／ｍＬ位に維持した。次いで、細胞を収集し、遠心分離によって、およそ０．５−１Ｅ７細胞／ｍＬに濃縮した。
【００６１】
手順：５．５ｇの細胞培養物を、０．５ｍｌの５０％グリセロールと混合し、室温（ＲＴ）で３０分の間負荷を行った。負荷が行われた細胞を、２倍の体積の２種の保存溶液：３０％スクロース、１５％  ＭＡＧを含有するＰＳ１；及び３０％スクロース、１５％メチルグルコシド（ＭＡＧ）、及び５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含有するＰＳ２と混合することによって、２種の保存混合物（ＰＭ）を調製した。ＰＭを、５ｍｌ血清バイアル（バイアルあたり０．５ｍｌ）中に入れ、下に記載したＰＢＶプロトコルを使用して、フリーズドライヤーの内部で乾燥させた。
【００６２】
使用したＰＢＶプロトコルは、以下のステップを含んでいた：
棚温度を−１８℃に低下させ、−１８℃で１８分保つことによって前記ＰＭを部分的に凍結すること；
乾燥チャンバーの内部の真空圧力を０．１トルに低下させ、この圧力を５分間保って、ＰＭが凍結されていることを確実にすること；
棚温度を０℃に、真空圧力を０．９トルに上昇させ、この圧力及び棚温度を５０分間保つこと；
棚温度を１０℃に上昇させ、真空圧力を０．５トルに低下させ、この圧力及び棚温度を２２分間保つこと；
棚温度を１０℃に上昇させ、真空圧力を０．５トルに低下させ、この圧力及び棚温度を２２分間保つこと；
棚温度を２０℃に上昇させ、真空圧力を０．１トルに低下させ、この圧力及び棚温度を２２分間保つこと；
棚温度を３０℃に上昇させ、真空圧力を０．１トルに保ち、この圧力及び棚温度を２０時間保つこと；
棚温度を４０℃に上昇させ、真空圧力を０．１トルに保ち、この圧力及び棚温度を２０時間保つこと。
【００６３】
ＰＢＶサンプルを、保存後、０．５ｍｌのＲＰＭＩ培養培地で再構成し、さらに、ＲＰＭＩ培養培地で１：２希釈した。細胞生存率を、Tali（商標）Viability Kit-Dead Cell Red、ヨウ化プロピジウムの溶液を用いるInvitrogen Tali（商標）イメージベースサイトメーター(image-based cytometer)を使用して試験した。ヨウ化プロピジウムは、生細胞に対して不透過性であるが、死細胞（膜が損なわれた細胞）には侵入することとなり、核酸に結合すると赤色の蛍光を発する。このViability Kitには、測定のために使用されたプロトコルが含まれる：(https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10786.pdf)。Tali（商標）サイトメーターを使用して、ヨウ化プロピジウムプロトコルを用いて細胞の健康／生存率を観察し、生細胞／死細胞の割合を算出し、平均細胞サイズを測定した。この器具での測定は、４４０ＲＦＵに設定したヨウ化プロピジウム蛍光（ＰＩＦ）閾値と、４〜２０μｍに制限した平均細胞サイズカットオフを用いて行った。
【００６４】
結果：ＰＳ１を用いる乾燥後の細胞生存は、１０％未満であった；ＰＳ２を用いる乾燥後の細胞生存は、７５％を超えていた。このように、ＰＶＰは、保存中の細胞膜の保護を提供した。
【００６５】
実施例３：細菌細胞の保存
細菌細胞の懸濁液を、９％グリセロール（ＰＢＳ中）と、３：１で混合した。その後、この懸濁液を、２倍の体積の３種の保存溶液と混合することによって、３種のＰＭを調製した：
（ＰＳ１）：グルタミン酸７．８６％、スクロース１０％、マンニトール５％、ＮａＯＨ  ２％、及びＰＶＰ  ４．７６％（ｐＨ＝７に調整）；
（ＰＳ２）：グルタミン酸７．８６％、スクロース１０％、マンニトール５％、ＮａＯＨ  ２％（ｐＨ＝７に調整）；及び
（ＰＳ３）：グルタミン酸７．８６％、スクロース１０％、マンニトール５％、ＮａＯＨ  ２％、及びＰＥＧ  ４．７６％（ｐＨ＝７に調整）。
【００６６】
手順：ＰＭを、５ｍｌ血清バイアル（バイアルあたり０．５ｍｌ）中に入れ、下に記載したＰＢＶプロトコルを使用して、凍結乾燥器の内部で乾燥させた。
【００６７】
使用したＰＢＶプロトコルは、以下のステップを含んでいた：
棚温度を−１８℃に低下させ、−１８℃で１８分保つことによって前記ＰＭを部分的に凍結すること；
乾燥チャンバーの内部の真空圧力を０．１トルに低下させ、この圧力を５分間保って、ＰＭが凍結されていることを確実にすること；
棚温度を０℃に、真空圧力を０．９トルに上昇させ、この圧力及び棚温度を５０分間保つこと；
棚温度を１０℃に上昇させ、真空圧力を０．５トルに低下させ、この圧力及び棚温度を２２分間保つこと；
棚温度を１０℃に上昇させ、真空圧力を０．５トルに低下させ、この圧力及び棚温度を２２分間保つこと；
棚温度を２０℃に上昇させ、真空圧力を０．１トルに低下させ、この圧力及び棚温度を２２分間保つこと；
棚温度を３０℃に上昇させ、真空圧力を０．１トルに保ち、この圧力及び棚温度を２０時間保つこと。
【００６８】
結果：ＰＢＶ乾燥後、この材料を、保存後、０．５ｍｌのＰＢＳで再構成し、段階希釈後にＢＨＩ寒天上に塗抹した。プレートを、３７℃インキュベータで２４時間保管した。ＰＳ３を用いる場合の乾燥後の細菌の生存は、３０％未満であり；ＰＳ２を用いる、乾燥後の細菌生存は、６０％未満であり；ＰＳ１を用いる、乾燥後の細菌生存は、９０％超であった。したがって、ＰＶＰは、保存中の細菌に、さらなる保護を提供した。
【００６９】
実施例４：血清バイアルにおけるプロセスバリデーション及びスケールアップ乾燥
この研究は、ＰＢＶ乾燥プロセスの再現性を検証するために実施した。これらの実験では、モデルタンパク質として、ヒトアルブミンを使用した。２０ｍｇの組換え型ヒトアルブミン(Novozymes ALBiX)と、２６６ｍｇスクロースと、１３３ｍｇイソマルトとを含む２ｍｌの保存混合物を、２０ｍｌ血清バイアルに満たし、スチールトレーに乗せ、Virtisの凍結乾燥器（フリーズドライヤー）内の棚に置いた。トレーは、総数１２０本のバイアルで完全に埋め尽くされた。ＰＢＶ発泡体乾燥プロトコルは、−１５℃から３０℃の範囲の温度での１５００ミリトルでの３時間の一次乾燥と、５０℃での２０時間の二次乾燥から構成されていた。乾燥発泡体（機械的に安定なガラス質発泡体）の外観は、目に見える飛び跳ね(splashing)がなく、バイアルにわたって非常に均一に見えた。
【００７０】
ガラス転移温度（Ｔｇ）測定
目的：凍結乾燥器内の均一な乾燥条件について試験するために、乾燥トレーの様々な領域から採取されたＰＢＶアルブミンサンプルのＴｇを測定する。
【００７１】
実験手順：ＰＢＶアルブミンの５本のサンプルバイアルを、満杯の乾燥トレーの四隅から収集した（合計２０本のサンプルバイアル）。乾燥室内で、各バイアルからの乾燥材料を使用して、３種のＤＳＣサンプルパンを調製した。各サンプルは、およそ５ｍｇの手動で粉砕されたＰＢＶ発泡体を含有していた。サンプルパンに、オートサンプラーを備えたＤＳＣ  ８０００(Perkin Elmer,Massachusetts,USA)を実行させた。各パンを、２０℃／分の速度で−５０℃から８０℃まで走査し、Pyrisデータ分析ソフトウェアを使用してＴｇを算出した（以下の計算の例を参照のこと）。
【００７２】
結果：
【００７３】
【表１】
2020526225.tif 000003
【００７４】
水分活性測定
目的：凍結乾燥器内の均一な乾燥条件について試験するために、乾燥トレーの様々な領域から採取されたＰＢＶアルブミンサンプルからの水分活性（ａｗ）を測定する。
【００７５】
実験手順：ＰＢＶアルブミンの５本のサンプルバイアルを、満杯の乾燥トレーの四隅から収集した（合計２０本のサンプルバイアル）。各バイアル中のＰＢＶ発泡体を、手動で粉末に粉砕した。各バイアルからのおよそ１５０ｍｇの粉末を、乾燥室に置かれたAqualab 4TE Dewpoint Water Activity Meter(Decagon Devices,Washington,USA)で試験した。
【００７６】
結果：
【００７７】
【表２】
2020526225.tif 000004
【００７８】
実施例５：０．２μｍ滅菌フィルター（膜）で、覆われ、且つチャンバー環境から隔てられた、１リットルプラスチックボトルの内部での乾燥。
先の実施例と同様に、ＰＭを調製し、１リットルのプラスチック容器に１５０ｇ／容器で満たした。ＰＭの調製後、各容器を、水溶液の滅菌のために使用される０．２μｍフィルターで覆った。
【００７９】
棚温度を−１８℃に低下させ、その後、真空圧力を０．１トル未満に低下させ、このプロセスの最後まで０．１トルと同等に保つ。次に、棚温度を３０℃に上昇させ、３０℃で２４時間保った。次いで、棚温度を４０℃に上昇させ、４０℃で２４時間保った。
【００８０】
実施例６：弱毒生インフルエンザワクチン（ＬＡＩＶ）の保存
凍結されたＬＡＩＶ株(A/17/Texas/2012/30(H3N2))の単一の高力価ストックを、蒸発乾燥による保存（ＰＢＶ）技術を使用して保存した。保存のために、ＬＡＩＶを解凍し、ｐＨ７を有する様々な保存溶液（ＰＳ）と１：１で混合して、保存混合物（ＰＭ）を形成した。ＰＭを、血清バイアルに分配し、４５℃及び５０℃の二次乾燥温度を用いるＰＢＶプロセスを使用して乾燥させた。ＣＤＣによって提供された改変されたＬＡＩＶ  ＴＣＩＤ５０アッセイプロトコルを使用して、様々なワクチン調製物の活性の試験を行った。
【００８１】
実験Ｆｌｕ−１：
実験Ｆｌｕ−１では、本発明者らは、以下を含む７種の異なるＰＳを使用した：
ＰＳ１：スクロース３０％、メチルグルコシド（ＭＡＧ）１０％、ゼラチン０．５％；
ＰＳ２：スクロース３０％、メチルグルコシド（ＭＡＧ）１１４０％、アルブミン０．５％；
ＰＳ３：スクロース３０％、マンニトール１０％；
ＰＳ４：スクロース３０％、マンニトール１０％、ゼラチン０．５％；
ＰＳ５：スクロース３０％、アセトグルコース１０％；
ＰＳ６：スクロース３０％、アセトグルコース１０％、ゼラチン０．５％；及び
ＰＳ７：スクロース３０％、ＭＡＧ  １０％．
【００８２】
残念ながら、ＰＳ６は、乾燥中に晶出し、その後、研究は行われなかった。本発明者らは、溶液ＰＳ６が過飽和し、ゼラチンが何らかの形でアセトグルコース結晶の核生成に影響を与えたという仮説を立てる。
【００８３】
結果：ＰＢＶ後、及びその後の室温（ＲＴ）での１．６年の保管後の乾燥させたワクチンの活性（ＴＣＩＤ５０／ｍｌのｌｏｇ１０）を、下の表に示す。
【００８４】
【表３】
2020526225.tif 000005
【００８５】
実験Ｆｌｕ−２：
実験Ｆｌｕ−２では、本発明者らは、より低い濃度のマンニトール（３３％スクロース＋７％マンニトール）を含有するＰＳと、５０℃の二次乾燥温度を使用した。
【００８６】
この実験は、本発明者らが本発明者らの固有のＴＣＩＤ５０プロトコルを最初に設定している及び最適化している期間中に実施し、この理由から、本発明者らは、ＲＴでの保管の５か月後、信頼できる定量測定が確立されて初めて、保存されたワクチンの活性を最初に測定した。ワクチン力価（２Ｅ７  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）は、ＰＢＶ乾燥及び５か月の室温保管後に凍結された対照に対するわずか０．６２対数の活性の低下を示した。この調製物からのサンプルを、下の微粒子化研究に使用した。
【００８７】
実験Ｆｌｕ−３
実験Ｆｌｕ−３では、本発明者らは、マンニトール濃度をさらに低下させ、且つより高い５０℃という二次乾燥温度を維持したもの（３５％スクロース＋５％マンニトール）を含めた、いくつかの新規製剤を調査した。
【００８８】
結果：室温（ＲＴ）及び３７℃での保管後のＦＬＵ−３製剤の活性（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を、下の表に示す。
【００８９】
【表４】
2020526225.tif 000006
【００９０】
結論：５０℃での二次乾燥ステップを含むプロセス下で３５％スクロースと５％マンニトール製剤を用いるＬＡＩＶのＰＢＶ乾燥は、熱安定性のＬＡＩＶの産生を可能にする。
【００９１】
実施例７：ボールミル粉砕技術を使用して、鼻腔送達に適した粒子範囲を有する乾燥粉末状の熱安定性のＬＡＩＶを製剤化する
ＰＢＶ乾燥プラセボ製剤のボールミル粉砕
最初に、本発明者らは、プラセボサンプルを使用して、ＰＢＶ製剤のボールミル粉砕を研究した。プラセボサンプルは、次の通りに調製及び評価した：
（ｉ）プラセボＰＭを調製するために、１００ｇの滅菌した細胞培養培地を、３３％スクロースと７％マンニトールを含む１００ｇのＰＳと混合した；
（ｉｉ）乾燥前に、ＰＭを、２０ｍＬ血清バイアルに分注した（２ｍＬ／バイアル）；
（ｉｉｉ）材料に、４５℃での１日の二次乾燥を伴う、初期の実験においてワクチンを乾燥させるために使用したのと同じＰＢＶプロトコルを施した；
（ｉｖ）乾燥後、ＰＢＶプラセボ発泡体を、最初に、滅菌したへらを用いて血清バイアルの内部で砕いて、このＰＢＶ発泡体を破壊し、粒径を数百ミクロンまで低下させた；
（ｖ）１５Ｈｚの振動数（本発明者らが以前に、約２０ミクロンの粒子を得るのに適した振動数であることを決定している）で、４５、７５、又は９０分の期間、LabWizz Laboratory-Scale Ball Millを使用して、それに続く微粒子化を実施した；
（ｖｉ）あらゆる凝集塊又はより大きい粒子を除去するために、粉末を、メッシュサイズ６３μｍの銅ふるいにかけた。ふるいを通過しなかったであろう粉末材料の部分を記録した。このサイズが、呼吸器送達のための乾燥ＬＡＩＶワクチンの調製における乾燥粉末増量剤として使用されるLactoHaleラクトース粉末をふるいにかけるために指定されることから、メッシュサイズは、６３μｍであることを選択した。本発明者らは、このメッシュを通過することができる粒子が、６３μｍよりも実質的に小さく、呼吸器送達に上手く適合されることも発見した；及び
（ｖｉｉ）粉末を、乾燥室の内部で鉱油に懸濁し、従来の顕微鏡観察を使用して評価した。
【００９２】
本発明者らは、呼吸器送達に適した粒径へのＰＢＶ発泡体のボールミル粉砕が、１５Ｈｚの揺動振動数と４５〜９０分の範囲の粉砕時間を使用して実現できることを発見した（下の表を参照のこと）。より短い粉砕時間は、より変動性の高い粒径をもたらし、６３μｍふるいを通過しない粒子の割合が増大する傾向がある。本発明者らは、１５Ｈｚの揺動振動数での７５分の粉砕が、呼吸器送達のための微粒子化されたワクチン粉末を生成するのに最適なプロトコルであることを結論付けた。
【００９３】
結果を図２に示す。
【００９４】
微粒子化及びその後の保管後のＰＢＶ  ＬＡＩＶの活性
研究のこの部分では、本発明者らは、３３％スクロースと７％マンニトールを含むＰＳを使用して実験Ｆｌｕ−２で生成されたワクチンに対する粉砕時間の影響を評価した。ワクチン微粒子化は、プラセボサンプルについて上に記載した通りに実施した。
【００９５】
結果：４５、７５、及び９０分間、１５Ｈｚで微粒子化され、それに続いて４℃、ＲＴ、及び３７℃で１．５か月保管された、乾燥ＰＢＶ  ＬＡＩＶ粉末の、ミリグラムあたりの活性（ＴＣＩＤ５０）を、下に示す。
【００９６】
【表５】
2020526225.tif 000007
【００９７】
ボールミル粉砕は、低い活性喪失をもたらし、微粒子化されたワクチンは、ＲＴで少なくとも１．５か月間、安定なままであった。しかし、本発明者らは、微粒子化されていないワクチン調製物と比較した、３７℃での保管中の微粒子化されたワクチン安定性の有意な低下を発見した。これは、過飽和したスクロース／マンニトールガラスからのマンニトール又はスクロースの結晶化に起因する可能性がある。この結晶化は、粉砕中に生じる割れの表面上のマンニトール結晶の核生成によって開始される可能性がある。
【００９８】
実施例８：ＰＢＶによって保存される弱毒生ロタウイルスワクチン（ＬＡＲＶ）に対する微粒子化の影響：
ＬＡＲＶワクチンを、３０％スクロースと１０％マンニトールを含むＰＳと１：１で混合し、ＰＢＶによって保存した。これまで論じたＦｌｕワクチンと同様に、粒径低下を、２つのステップ：手動粉砕、それに続く、Laarmann Labwizzの研究室サイズのボールミルを使用するボールミル粉砕（微粒子化）で実施した。最初に、室温で３か月間保管されていたバイアルを開け、バイアルの内部の乾燥発泡材料を、１５〜１８％の相対湿度を伴う乾燥室内で、へらを使用して手動で粉砕した。各バイアルから、およそ１２０ｍｇの手動で粉砕された発泡体が回収された。手動粉砕後の粒径は、典型的には、数百ミクロンであった。次に、手動で粉砕された発泡体を、それぞれ３×２ｍｍスチールボールを含有する２ｍＬの金属容器に入れた。この容器を、ボールミルの内部に入れ、３０分間、１５Ｈｚの速度で振動させて、粒子のサイズをおよそ５０ミクロンに低下させた。この粉末の一部を、４５℃で１日、真空中で乾燥させた。
【００９９】
本発明者らは、微粒子化、及びそれに続くＲＴでの５か月の保管後のウイルス活性の喪失が、非常に小さい（＜０．２対数）ことを発見した。しかし、３７℃での５か月の保管後、微粒子化されていない製剤については観察されなかった０．８対数の活性の喪失を受けた。この知見は、上述の微粒子化後のＰＢＶ  ｆｌｕワクチンの安定性の低下と相関する。
【０１００】
示差走査熱量計(Differential Scanning Calorimeter)を使用する、本発明者らのＴｇの測定は、微粒子化された試料における３７℃でのウイルス活性の低下が、分画の表面上に核生成する結晶からの糖の結晶化に関連する可能性があるという作業仮説を裏付けた。
【０１０１】
本発明者らは、３０％スクロースと１０％マンニトールを含むＰＳと共に調製された、ＰＢＶ製剤を調査した。各製剤について、本発明者らは、アルミニウムパンの内部に密閉封止した３つの独立した試料を調製した。微粒子化されていない製剤を用いると、いかなる予想外の結果も見られず、本発明者らは、第１の、第２、及び第３のＤＳＣ実行中に、−５０から８０℃までのＴｇを測定することができた。Ｒｏｔａ−１  ＰＭ４粉末（手で粉砕、微粒子化せず、３回実行）のＤＳＣ走査を示す、図３を参照のこと。
【０１０２】
しかし、微粒子化された粉末についてのみ、各サンプルパンの第１の実行は、観察可能なガラス転移挙動を有しており、その後、本発明者らは、加温中の結晶化に関連するＤＳＣ出力の急速な低下をはっきりと観察した。失透としても知られているこの現象はしばしば、低粘度により、ガラス状態の分画の表面上にしばしば形成される結晶の成長が止められていない場合に、ガラス転移温度を超えた準安定な過飽和混合物において観察される。図４は、乾燥微粒子化ＰＭ４製剤についてのＤＳＣ実行を示す。
【０１０３】
失透は、冷却中に結晶化されなかった、したがって、Ｔｇ未満で安定なガラスを形成する過飽和溶液における、不可逆的な動力学的結晶化プロセスである。結晶の核が、結晶が成長できる温度未満の温度で形成する、又は、結晶の核生成が、ガラス状態の割れの表面上でのみ起こる可能性があるので、典型的には、冷却中の結晶化は起こらない。Ｔｇよりも高温への加温中、溶液の粘度が低下する場合、より低い温度で形成する結晶核は、温度上昇と共に増大する速度で成長を始める−結晶化された状態の材料を不可逆的に転換させる。Ｔｇが高いほど、所与の加温速度に対して、失透が起こる温度が高くなる。
【０１０４】
本発明者らはまた、真空中で４５℃でさらに１日乾燥させた、微粒子化された乾燥製剤のサンプルにおけるＴｇを測定した。これらのサンプルにおいては、ガラス状態からの加温中の失透の影響は検出されなかった。４５℃での追加の乾燥後の乾燥微粒子化ＰＭ４製剤についてのＤＳＣ実行を、図５に示す。
【０１０５】
乾燥微粒子化製剤の追加の乾燥後、Ｔｇ測定値は、追加の乾燥ステップを有しない微粒子化された製剤について得られるもの（Ｔｇは、３０℃をわずかに超えていた）よりも有意に高かった（Ｔｇは、５０℃をわずかに超えていた）。これは、さらに乾燥させた粉末において失透が観察されなかった理由を説明する。
【０１０６】
失透は、すべてのガラス化混合物において必ずしも起こるわけではなく、混合物の組成に依存する。本発明者らの予備的な知見によれば、これは、ＭＡＧを含有する混合物と比較して、マンニトールを含有する混合物において、より顕著である。本明細書では、Ｔｇの上昇は、失透を低下又は排除することとなることが考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
産業上の利用可能性
主張される発明は、医薬品産業、特にワクチン産業に適用可能であるが、医薬品産業の他の部分も適用可能である。
参考文献
U.S.Patent No.9,469,835,issued October 18,2016.
Pushkar,N.S.and V.L.Bronshtein.1988.The mechanism of ice formation on rewarming of the frozen cryoprotectant solutions.Proc.Ukrainian Acad.Sci.10:68-70.
【図１】
2020526225.tif 000008
【図２】
2020526225.tif 000009
【図３】
2020526225.tif 000010
【図４】
2020526225.tif 000011
【図５】
2020526225.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月12日(2020.3.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体材料を保存するための方法であって、
（ｉ）容器内に、水性の保存組成物であって、１種又は複数の生体材料を含む保存組成物を提供することと；
（ｉｉ）前記容器とその中の保存組成物を、凍結乾燥器の真空チャンバー内の温度制御された棚に置く（ここでは、前記温度制御された棚は、ある棚温度を提供するように適合され、且つ、前記真空チャンバーは、その中のある真空圧を提供するように適合される）ことと；
（ｉｉｉ）部分的凍結プロトコルであって、
前記棚温度を０℃未満に低下させる、且つ前記保存組成物の温度をＴｇ’よりも高温に維持し、それによって前記保存組成物を二相スラッシュ状態に転換させる（ここでは、前記保存組成物は、二相スラッシュ状態における氷晶及び水性液相を含む）こと
を含む部分的凍結プロトコルを実行することと；
（ｉｖ）一次乾燥プロトコルであって、
前記棚温度を０℃よりも高温に上昇させる、且つ前記真空圧を１．０トル未満に維持し、それによって前記二相スラッシュ状態における前記保存組成物からの水を沸騰させて、機械的に安定なガラス質発泡体を形成させることと
を含む前記一次乾燥プロトコルを実行することと；
（ｖ）二次乾燥プロトコルであって、
前記機械的に安定なガラス質発泡体のガラス転移温度を上昇させるために、前記棚温度を４０℃よりも高温に上昇させること
を含む前記二次乾燥プロトコルを実行すること
を順に含む方法。
【請求項２】
ステップ（ｉｖ）中に、第１の期間中、前記真空チャンバー内で、前記棚温度が２０℃よりも高温に上昇され、且つ前記真空圧が０．３トル未満に低下される、且つ、第１の期間後に、前記真空チャンバー内で、前記棚温度が３０℃よりも高温に上昇され、且つ前記真空圧が０．３トル未満に維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記水性の保存組成物が、液体又はゲルを含む、請求項１又は２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記保存組成物が、１種又は複数の非還元糖、１種又は複数の糖アルコール、又はこれらの組み合わせを含み、且つ前記１種又は複数の非還元糖の少なくとも１つが、スクロース、トレハロース、ラフィノース、メチルグルコシド、及び２−デオキシグルコースからなる群から選択され、且つ、前記１種又は複数の糖アルコールの少なくとも１つが、マンニトール、イソマルト、ソルビトール、及びキシリトールからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記保存組成物が、１種又は複数の細胞凍結保護剤、１種又は複数の細胞外凍結保護剤、又はこれらの組み合わせを含み、且つ、前記１種又は複数の細胞凍結保護剤の少なくとも１つが、グリセロール、プロピレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、マンニトール、メチルグルコシド、及びポリエチレングリコールからなる群から選択され、且つ、前記１種又は複数の細胞外凍結保護剤の少なくとも１つが、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン、アルギニン、アラニン、リジン、システイン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、及びヒドロキシエチルデンプンからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記保存組成物が、１種又は複数の消泡剤を含み、且つ、前記１種又は複数の消泡剤の少なくとも１つが、ポリプロピレングリコール及びエチレングリコールからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｉ）の前に、前記生体材料に前記１種又は複数の透過性の細胞凍結保護剤を負荷すること、それに続いて、負荷が行われた生体材料を保存溶液と混合して前記保存組成物を形成することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記１種又は複数の生体材料が、細菌、ウイルス、及びタンパク質、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記容器が、血清バイアル、プラスチックボトル、金属容器、又はトレーのうちの１つである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記容器が、０．２５μｍ以下の孔径を有する多孔膜を含み、且つ、前記保存組成物が、前記多孔膜によって真空チャンバーの環境から隔てられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記容器が、滅菌パウチ内に密封される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ある体積の前記容器内に、複数の金属又はセラミックの球が提供される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｖ）に続いて、前記容器内で、その中に含有される金属又はセラミックの球を使用して、機械的に安定なガラス質発泡体を粉砕することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記保存組成物が、１部の糖アルコールに対する少なくとも５部の二糖を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記保存組成物が、水溶性のアミノ酸又はその塩をさらに含み、且つ前記水溶性のアミノ酸又はその塩が、アルギニン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、又はこれらの組み合わせを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、生体材料に；より詳細には、従来の凍結乾燥器を使用して生体材料を保存するための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体材料保存技術に関連する分野は、近年、進歩しており、２０１６年１０月１８日に発行された米国特許第９，４６９，８３５号に開示されている通りの「蒸発乾燥による保存(Preservation by Vaporization)（ＰＢＶ）」として公知のある種の優れた方法の出現と共に、著しい向上を達成している。
【０００３】
現在、従来の凍結乾燥器（フリーズドライヤー）は、ＰＢＶプロトコルを使用する生体材料及び他の組成物の保存を実行するためには設計されていない。
【０００４】
さらに、従来のフリーズドライプロトコルは、しばしば、生体材料組成物を、これらの組成物の活性に影響を与える傾向がある、極めて低い温度に曝露させる。
【０００５】
多くの研究室及び工業施設は、従来のフリーズドライヤーを所有しているので、生体材料組成物は、典型的には、より低い生成物の活性及び安定性をもたらす、従来のフリーズドライなどの時代遅れのプロトコルを使用して保存される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従来の凍結乾燥器を使用して生体材料を保存するための、改良された方法の必要性が存在する。
【０００７】
より詳細には、ＰＢＶ技術に従って生体材料を保存するための、従来の凍結乾燥器の使用を組み込む、改良された方法の必要性が存在する。
【０００８】
さらに、これらの方法に従って生体材料を保存する場合に、生体材料組成物の無菌分離を維持する必要性が存在する。
【０００９】
ＰＢＶプロトコルの実行中に生体材料組成物を保護するための、特別な保存製剤が必要とされることとなる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本開示は、従来の凍結乾燥器を使用して生体材料を保存するために、ＰＢＶプロトコルを実行するための方法に関する。
【００１１】
本開示はまた、従来の凍結乾燥器を使用して無菌乾燥を達成するための、生体材料の分離を維持するためのステップに関する。
【００１２】
さらに、本開示は、クリーンルーム領域の外で処分される、従来の凍結乾燥器を使用して生体材料組成物の無菌乾燥を達成するための、適正製造基準(good manufacturing practice)（ＧＭＰ）に準拠する方法に関する。
【００１３】
最後に、本開示は、患者への粘膜又は経皮送達に適した、周囲温度で安定な微粒子化された生体材料の生成のための方法及び製剤に関する。
【００１４】
問題のこれらの及び他の解決策は、添付の説明、図面、及び特許請求の範囲を徹底的に見直すことで、当業者に理解されることとなる。
【発明の効果】
【００１５】
蒸発乾燥による保存(Preservation by Vaporization)は、生体材料保存技術の分野における好ましい技術である。なぜなら、このプロセスは、水のほとんどが保存組成物から除去されるステップである「一次乾燥」ステップとも呼ばれる最初の乾燥中に、比較的に穏やかな環境を実現するために、同時的な水の沸騰、氷晶の昇華、及び蒸発を利用するからである。この穏やかな環境は、損傷を受けやすいタンパク質、ウイルス、細菌、及び他の細胞性のものに対して特に優しく、周囲温度でのワクチン、血液、及びマイクロバイオーム成分の安定化のために適用される可能性がある。それに続く継続的な乾燥（「二次乾燥」としても知られる）は、保存組成物のガラス転移温度をわずかに上昇させ、その結果、機械的に安定な非晶質の乾燥ガラス質発泡体が得られ、ここでは、発泡体内に封入された生体材料は、保護され、（ｉ）９０日を超える保管（「長期保管」）、及び（ｉｉ）時としてその後の再構成又は患者への送達のために保存される。開示した方法は、当業者が、従来の凍結乾燥器を使用する実行のために適合されたＰＢＶプロトコルに従って生体材料を保存することを可能にする。したがって、ＰＢＶ技術を使用して生体材料組成物を保存するために、特殊化された装置は必要ではない。
【００１６】
ＰＢＶ技術を使用して保存される生体材料組成物は、従来のフリーズドライ技術を使用して保存される同じ組成物と比較して、卓越した有効性をもたらす。従来のフリーズドライ技術を使用して受ける極端な温度が、これらの組成物のタンパク質エピトープ及び有用な成分を破壊する傾向があり、例えば、ＰＢＶによって保存される組成物よりも劣っている産生される生成物を与えることが考えられる。
【００１７】
限定はされないがワクチンなどの生体材料組成物のＧＭＰ生成は、本明細書に開示した方法を使用して実現することができる。つまり、この方法は、工業用途のための安定化のための、材料の、改良された、より効率的な、ＧＭＰに準拠する処理を提供する。
【００１８】
保存中に生体材料を保護する、また、材料の失透を防止する、ある種の保存製剤及びプロトコルを開示する。
【００１９】
他の好都合な効果は、本明細書を徹底的に見直すことで、当業者に認識されることとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】生体材料を保存するための方法を示す。
【図２】微粒子化及びそれに続く保管後のＰＢＶ  ＬＡＩＶの活性を試験する実験に関する結果チャートを示す。
【図３】本明細書に詳述される、ある実験と関連するＤＳＣプロットを示す。
【図４】本明細書に詳述される、別の実験と関連するＤＳＣプロットを示す。
【図５】本明細書に詳述される、別の実験と関連するＤＳＣプロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
当業者が、本発明をその様々な態様及び実施形態において行う及び使用することができるように、限定ではなく例示の目的のために、ある種の好ましい実施形態の詳細及び説明を以下に提供する。しかし、これらの詳細及び説明は、ある種の好ましい実施形態の典型に過ぎず、明確に記載されない無数の他の実施形態は、本開示を徹底的に見直すことで、当業者に容易に理解されることとなる。したがって、本開示のいかなる読者も、特許請求の範囲による本発明の範囲を、こうした範囲が本明細書に記載及び例示された実施形態によって限定されることが意図されないものであると解釈するべきである。
【００２２】
これから、一般的実施形態において、生体材料を保存するための方法を開示する。この方法は、以下のステップを順に含む：
ステップ（ｉ）：容器内に、水性の保存組成物であって、１種又は複数の生体材料を含む保存組成物を提供すること；
ステップ（ｉｉ）：この容器とその中の保存組成物を、凍結乾燥器の真空チャンバー内の温度制御された棚に置く（ここでは、温度制御された棚は、ある棚温度を提供するように適合され、且つ、真空チャンバーは、その中のある真空圧を提供するように適合される）こと；
ステップ（ｉｉｉ）：棚温度を０℃未満に低下させる、且つ真空圧を１．０トル未満に低下させ、それによって保存組成物を二相スラッシュ状態に転換させる（ここでは、保存組成物は、二相スラッシュ状態における氷晶を含む）こと；
ステップ（ｉｖ）：棚温度を０℃よりも高温に上昇させる、且つ真空圧を１．０トル未満に維持し、それによって保存組成物を機械的に安定なガラス質発泡体に転換させること；及び
ステップ（ｖ）：機械的に安定なガラス質発泡体のガラス転移温度を上昇させるために、棚温度を４０℃よりも高温に上昇させること。
【００２３】
本明細書の目的では、用語「保存組成物」は、概して、−３０℃から＋４０℃までの周囲温度での長期保管、及びその後の再構成又は患者への送達の間、生体材料を保存するための組成物を意味する。保存組成物は、概して、１種又は複数の糖と１種又は複数の生体材料を含み、ここでは、生体材料は、１種又は複数の細菌、１種又は複数のウイルス、１種又は複数のタンパク質、又はこれらの組み合わせを含むことができる。保存組成物は、その初期状態では水性である、すなわち、１パーセントを超える若干の百分率組成の水を含む液体又はゲルである。この初期状態では、生体材料、糖、糖アルコール、及び他の成分などの様々な成分が選択され、共に混合される。しかし、「一次乾燥」としても知られるＰＢＶプロトコルの最初の乾燥ステップ中、水は、真空圧力下で、この水性の組成物から、同時的な沸騰、蒸発、及び昇華によって除去される。したがって、保存組成物は、一次乾燥後に、ほとんど水がなくなることとなり、概して、その中に固定された生体材料と共に、非晶質の乾燥ガラス状マトリックス又は発泡体（本明細書では「機械的に安定なガラス質発泡体」）を包含することとなる。
【００２４】
したがって、さらに、本明細書の目的では、用語「機械的に安定なガラス質発泡体」は、ＰＢＶ一次乾燥後の保存組成物（ここでは、保存組成物は、実質的に水がなく、構造形態を維持するのに十分な機械的強度を有する非晶質の乾燥ガラス質発泡体を形成する）を意味する。具体的には、ＰＢＶ保存中、保存組成物の沸騰を開始するとすぐに、この組成物の内部で、気泡が核生成され、成長し、これは、このプロセスの初期に、移動する（安定していない）発泡体となり、やがて、脱水の結果としての組成物の粘性により、水蒸気の泡がさらに成長するのが妨げられ、一次乾燥の終わり間近に又は水のほとんどが蒸発される時に、気泡は組成物の内部で固定され、発泡体は、機械的に安定となる。
【００２５】
一実施形態では、ステップ（ｉｖ）中に、凍結乾燥器の真空チャンバー内で、棚温度が２０℃よりも高温に上昇され、且つ真空圧が０．３トル未満に低下される。
【００２６】
他の実施形態では、ステップ（ｉｖ）中に、第１の期間中、真空チャンバー内で、棚温度が２０℃よりも高温に上昇され、且つ真空圧が０．３トル未満に低下される、且つ、第１の期間後に、真空チャンバー内で、棚温度が３０℃よりも高温に上昇され、且つ真空圧が０．３トル未満に維持される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｖ）中に、棚温度が５０℃よりも高温に上昇される。
【００２８】
種々の実施形態では、（一次乾燥前の）水性の保存組成物が、液体又はゲルを含む。
【００２９】
ゲルは、保存溶液に含まれるポリマー間の、又はポリマーと他の分子又はイオン間の化学的架橋によって生成することができる。イオンは、カチオン、すなわちＣａ＋＋、又はアニオンを含むことができる。
【００３０】
ゲルは、別の架橋成分を含有する凍結された液滴の混合物の加温中の化学的架橋によって生成することができる。凍結された液滴は、低温パレット処理(cryo-palletization)、例えば、溶液を液体窒素（ＬＮ２）などの低温液体中で噴霧することを使用して生成することができる。
【００３１】
ゲルはまた、０℃未満でゲルに変わる保存組成物の冷却によって生成することもできる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、冷却中にゲルを形成することができるポリマー溶液の冷却は、低温ペレット化(cryo-pelletization)によって実施される。低温ペレット化は、冷却前に材料が多くの液滴に分散されるプロセスである。
【００３３】
多数の製剤が可能であるが、保存組成物は、概して、１種又は複数の非還元糖、１種又は複数の糖アルコール、又はこれらの組み合わせを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、前記１種又は複数の非還元糖の少なくとも１つは、スクロース、トレハロース、ラフィノース、メチルグルコシド、及び２−デオキシグルコースからなる群から選択される。しかし、当業者に公知の他の非還元糖も、同様に組み入れることができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、前記１種又は複数の糖アルコールの少なくとも１つは、マンニトール、イソマルト、ソルビトール、及びキシリトールからなる群から選択される。しかし、当業者に公知の他の非還元糖も、同様に組み入れることができる。
【００３６】
保存組成物は、１種又は複数の細胞凍結保護剤、１種又は複数の細胞外凍結保護剤、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、１種又は複数の細胞凍結保護剤の少なくとも１つは、グリセロール、プロピレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、マンニトール、メチルグルコシド、及びポリエチレングリコールからなる群から選択される。
【００３８】
いくつかの実施形態では、１種又は複数の細胞外凍結保護剤の少なくとも１つは、グルタミン酸、グリシン、プロリン、セリン、トレオニン、バリン、アルギニン、アラニン、リジン、システイン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、及びヒドロキシエチルデンプンからなる群から選択される。
【００３９】
保存組成物は、１種又は複数の消泡剤をさらに含むことができる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、１種又は複数の消泡剤の少なくとも１つは、ポリプロピレングリコール及びエチレングリコールからなる群から選択される。
【００４１】
ある種の実施形態では、この方法は、ステップ（ｉ）の前に、生体材料に１種又は複数の透過性の細胞凍結保護剤を負荷すること、それに続いて、負荷が行われた生体材料を保存溶液と混合して前記保存組成物を形成することをさらに含むことができる。
【００４２】
１種又は複数の生体材料は、細菌、ウイルス、タンパク質、又はこれらの組み合わせを含む。
【００４３】
一実施形態では、１種又は複数の生体材料は、１種又は複数の細菌、１種又は複数のウイルス、及び１種又は複数のタンパク質の組み合わせを含む。
【００４４】
種々の実施形態では、容器は、血清バイアル、プラスチックボトル、金属容器、又はトレーのうちの１つを含むことができる。
【００４５】
いくつかの実施形態では、容器は、０．２５μｍ以下の孔径を有する多孔膜を含むことができ、且つ、保存組成物は、多孔膜によって真空チャンバーの環境から隔てることができる。多孔膜は、水溶液の滅菌のために使用される、いかなるフィルターも含むことができる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、容器はまた、滅菌パウチ内に密封される。
【００４７】
いくつかの実施形態では、容器は、保存組成物と共に、ある体積の容器の内に提供される、複数の金属又はセラミックの球を収めることができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、この方法は、機械的に安定なガラス質発泡体を粒子／粉末に転換するために、ステップ（ｖ）に続いて、前記容器内で、その中に含有される金属又はセラミックの球を使用して、機械的に安定なガラス質発泡体を粉砕すること（「ボールミル粉砕(ball-milling)」）をさらに含む。
【００４９】
いくつかの実施形態では、特に、生体材料が粘膜又は経皮送達を目的とする場合、保存組成物は、１部の糖アルコールに対する少なくとも５部の二糖を含むことができる。さらに、保存組成物は、水溶性のアミノ酸又はその塩をさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、水溶性のアミノ酸又はその塩は、アルギニン、グルタミン酸、グリシン、プロリン、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
【００５０】
別の態様では、熱安定性の生体材料の無菌生成のための方法が開示される。この方法は、以下のステップを含む：
【００５１】
クリーンルームの第１の領域内で：保存組成物であって、１種又は複数の生体材料を含む保存組成物を、容器内に入れることと；この容器の開口部を多孔膜で密封して、膜で密封された容器を形成する（ここでは、多孔膜は、０．２５ミクロン以下である穴径を含む）ことと；膜で密封されたこの容器を、滅菌した医療用滅菌パウチ内に入れ、この滅菌パウチを熱融着させることと；
【００５２】
滅菌パウチとその中の膜で密封された容器を、クリーンルームの第１の領域から第２の領域に輸送することと（ここでは、この方法は、滅菌パウチとその中の膜で密封された容器を、凍結乾燥器の真空チャンバー内の温度制御された棚に置くことと；真空圧及び棚温度を調節して、乾燥プロトコル（ここでは、この乾燥プロトコルは、保存組成物を機械的に安定なガラス質発泡体に転換させることを含む）を実行することとをさらに含む）；
【００５３】
乾燥プロトコルを実行することに続いて、膜で密封された容器を滅菌パウチから取り出し、その後、膜で密封されたこの容器をクリーンルームの第１の領域に戻すことと（ここでは、クリーンルームの第１の領域内で、この方法は、容器内の機械的に安定なガラス質発泡体が、その後の保管中に外部の湿気から分離されたままであることを確実にするために、多孔膜を滅菌したカップと置き換える、又はフィルターを水が浸透できない無菌のステッカーで覆うことと；任意選択的に、容器内の機械的に安定なガラス質発泡体を、粉末に転換させることとをさらに含む）。
【００５４】
クリーンルームは、典型的には、しばしばＡ、Ｂ、及びＣと呼ばれる３つの領域を含むように設計される。Ａは、クリーンルームの最初の、最大限に無菌の部分である。ＦＤＡ規則によれば、個人は、清潔な衣服及び  又は／及びカバーで覆われるならば、クリーンルームの領域Ａの外側（Ｂ及びＣ領域内）で、何らかの作業を行うこともできるし、存在することも可能である。個人は、最もクリーンな領域Ａに入ることは許されない。領域Ａ内へのボトル若しくは器具の送達のような小さな操作を実行する、又は容器を開け閉めする、又は類似のことのために、滅菌した手袋で覆われた手のみ、短期間、Ａ領域をＢ領域と隔てる線を越えることが許される。道具又はボトルは、領域Ａの中に移動する前に、領域Ａの外側の環境から隔てられるべきである。例えば、道具又はボトルは、領域Ａが無菌のままであることを確実にするために、滅菌したパウチ（これは、道具又はボトルを領域Ａに入れる前に取り除かれることとなる）に入れるべきである。
【００５５】
種々の実施形態では、乾燥発泡体は、沸騰中の蒸気泡の核生成及び成長の結果として生じ、液体の乾燥中に形成される泡の多い発泡体として現れる、又は気体包含物を含有する乾燥ヒドロゲルとして現れる可能性がある。
【００５６】
これらの及び他の実施形態は、以下の実験例に従って考案される及び裏付けられる：
【実施例】
【００５７】
実施例１：蒸発乾燥による保存（ＰＢＶ）
蒸発乾燥による保存（ＰＢＶ）は、周囲温度（ＡＴ）での脆弱なワクチン及び他の生体材料の安定化のための、比較的に新しい技術である。ＰＢＶ実行は、温度と真空圧力の同時制御を必要とする。これは、乾燥チャンバーを真空源に接触させることと、水の蒸発に由来する冷却に対処するために、乾燥を行う試料に熱を提供することによって行うことができた。熱源は、乾燥中に試料が置かれる加熱棚からの、電磁加熱又は従来の熱流である可能性がある。ＰＢＶプロセスを実行することができる真空乾燥装置の、多くのデザインが存在し得る。ＰＢＶはまた、従来の凍結乾燥器、例えば、フリーズドライプロトコルを使用する乾燥生物製剤の生成のために現在使用されているものを使用して実行することもできる。フリーズドライの実行は、典型的には、比較的に高い真空を使用することを必要とするので、従来の凍結乾燥器は、乾燥チャンバーの内部の圧力が１トルを超える又は場合によっては２トルを超える場合に真空圧力を自動的に制御するように作られていない。これにより、従来の凍結乾燥機を使用して自動的に実行することができるＰＢＶプロセスの範囲は限定される。しかし、本明細書の種々の実施形態では、周囲温度で生体材料を保存するために、従来の凍結乾燥器をどのようにして使用することができるかということ、また、操作者の関与を伴わないＰＢＶプロトコルの自動的な実行（これは、ＧＭＰ生成及びＦＤＡ認可並びに合衆国外の様々な規制機関の認可に必要とされることとなる）のために、乾燥プロトコルをどのようにしてプログラムすることができるかということが開示される。
【００５８】
ＰＢＶ技術によれば、一次乾燥は、部分的に凍結されたスラッシュ状態から実施されるべきである。したがって、ＰＢＶを実行するために、生物学的懸濁液と保存溶液（ＰＳ）との保存混合物（ＰＭ）を含めた試料、又は生物製剤とＰＳを含むヒドロゲルなどの、所与の保存組成物は、最初に部分的に凍結されるべきである。「凍結された」は、試料の内部に形成された氷晶が存在することを意味する。「部分的に凍結された」は、試料温度が、Ｔｇ’よりも少なくとも１０℃高いことを意味する。ここでは、Ｔｇ’は、保存組成物が、液相が残っておらず、結晶化された固体と非晶質固体（ガラス）を含む固体状態である温度よりも低い温度である。ＰＢＶと従来のフリーズドライとの間の、ある重要な違いは、一次フリーズドライ（又は凍結乾燥）中、試料の温度が、Ｔｇ’又はＴｇ’未満であるべきであることである。しかし、ＰＢＶ一次乾燥ステップ中の試料温度は、氷晶間の液相の存在を確実にするために、Ｔｇ’よりも少なくとも１０℃高い温度であるべきである。また、この液体が蒸発するだけでなく沸騰もすることを確実にするために、チャンバー内の真空圧力は、液体の上の平衡水蒸気圧よりも低い圧力であるべきである。ここでは、一般に認められている用語法と一致して、一次乾燥は、その間にサンプルがサンプル中の最初の水の量のおよそ９０％を失う、最初の乾燥ステップと定義される。
【００５９】
生体材料は、ＰＢＶ保存の前に、凍結及び乾燥の有害な影響から生体材料を保護するために設計された保存溶液（ＰＳ）と混合されるべきである。ＰＳの適切な選択は、保存の成功を確実にするために重要である。凍結温度が低いほど、ＰＳ中に従来の凍結保護剤を含むことが重要になる。細胞性のものの内部に浸透する細胞凍結保護剤と、細胞膜及びウイルス膜及びエンベロープを保護する細胞外凍結保護剤の両方を使用することが重要である。
【００６０】
実施例２：動物細胞の保存
ＣＴＶ−１は、ヒトＴ細胞白血病細胞株である。ＣＴＶ−１細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベータ内で成長させ、ＲＰＭＩ培地（８５〜９０％）及びを熱失活させたＦＢＳ（１０〜１５％）（ペニシリン−ストレプトマイシンを含む）中で浮遊状態で培養した。細胞は、４〜５日ごとに分割し、１Ｅ６細胞／ｍＬ位に維持した。次いで、細胞を収集し、遠心分離によって、およそ０．５−１Ｅ７細胞／ｍＬに濃縮した。
【００６１】
手順：５．５ｇの細胞培養物を、０．５ｍｌの５０％グリセロールと混合し、室温（ＲＴ）で３０分の間負荷を行った。負荷が行われた細胞を、２倍の体積の２種の保存溶液：３０％スクロース、１５％  ＭＡＧを含有するＰＳ１；及び３０％スクロース、１５％メチルグルコシド（ＭＡＧ）、及び５％ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含有するＰＳ２と混合することによって、２種の保存混合物（ＰＭ）を調製した。ＰＭを、５ｍｌ血清バイアル（バイアルあたり０．５ｍｌ）中に入れ、下に記載したＰＢＶプロトコルを使用して、フリーズドライヤーの内部で乾燥させた。
【００６２】
使用したＰＢＶプロトコルは、以下のステップを含んでいた：
棚温度を−１８℃に低下させ、−１８℃で１８分保つことによって前記ＰＭを部分的に凍結すること；
乾燥チャンバーの内部の真空圧力を０．１トルに低下させ、この圧力を５分間保って、ＰＭが凍結されていることを確実にすること；
棚温度を０℃に、真空圧力を０．９トルに上昇させ、この圧力及び棚温度を５０分間保つこと；
棚温度を１０℃に上昇させ、真空圧力を０．５トルに低下させ、この圧力及び棚温度を２２分間保つこと；
棚温度を１０℃に上昇させ、真空圧力を０．５トルに低下させ、この圧力及び棚温度を２２分間保つこと；
棚温度を２０℃に上昇させ、真空圧力を０．１トルに低下させ、この圧力及び棚温度を２２分間保つこと；
棚温度を３０℃に上昇させ、真空圧力を０．１トルに保ち、この圧力及び棚温度を２０時間保つこと；
棚温度を４０℃に上昇させ、真空圧力を０．１トルに保ち、この圧力及び棚温度を２０時間保つこと。
【００６３】
ＰＢＶサンプルを、保存後、０．５ｍｌのＲＰＭＩ培養培地で再構成し、さらに、ＲＰＭＩ培養培地で１：２希釈した。細胞生存率を、Tali（商標）Viability Kit-Dead Cell Red、ヨウ化プロピジウムの溶液を用いるInvitrogen Tali（商標）イメージベースサイトメーター(image-based cytometer)を使用して試験した。ヨウ化プロピジウムは、生細胞に対して不透過性であるが、死細胞（膜が損なわれた細胞）には侵入することとなり、核酸に結合すると赤色の蛍光を発する。このViability Kitには、測定のために使用されたプロトコルが含まれる：(https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/mp10786.pdf)。Tali（商標）サイトメーターを使用して、ヨウ化プロピジウムプロトコルを用いて細胞の健康／生存率を観察し、生細胞／死細胞の割合を算出し、平均細胞サイズを測定した。この器具での測定は、４４０ＲＦＵに設定したヨウ化プロピジウム蛍光（ＰＩＦ）閾値と、４〜２０μｍに制限した平均細胞サイズカットオフを用いて行った。
【００６４】
結果：ＰＳ１を用いる乾燥後の細胞生存は、１０％未満であった；ＰＳ２を用いる乾燥後の細胞生存は、７５％を超えていた。このように、ＰＶＰは、保存中の細胞膜の保護を提供した。
【００６５】
実施例３：細菌細胞の保存
細菌細胞の懸濁液を、９％グリセロール（ＰＢＳ中）と、３：１で混合した。その後、この懸濁液を、２倍の体積の３種の保存溶液と混合することによって、３種のＰＭを調製した：
（ＰＳ１）：グルタミン酸７．８６％、スクロース１０％、マンニトール５％、ＮａＯＨ  ２％、及びＰＶＰ  ４．７６％（ｐＨ＝７に調整）；
（ＰＳ２）：グルタミン酸７．８６％、スクロース１０％、マンニトール５％、ＮａＯＨ  ２％（ｐＨ＝７に調整）；及び
（ＰＳ３）：グルタミン酸７．８６％、スクロース１０％、マンニトール５％、ＮａＯＨ  ２％、及びＰＥＧ  ４．７６％（ｐＨ＝７に調整）。
【００６６】
手順：ＰＭを、５ｍｌ血清バイアル（バイアルあたり０．５ｍｌ）中に入れ、下に記載したＰＢＶプロトコルを使用して、凍結乾燥器の内部で乾燥させた。
【００６７】
使用したＰＢＶプロトコルは、以下のステップを含んでいた：
棚温度を−１８℃に低下させ、−１８℃で１８分保つことによって前記ＰＭを部分的に凍結すること；
乾燥チャンバーの内部の真空圧力を０．１トルに低下させ、この圧力を５分間保って、ＰＭが凍結されていることを確実にすること；
棚温度を０℃に、真空圧力を０．９トルに上昇させ、この圧力及び棚温度を５０分間保つこと；
棚温度を１０℃に上昇させ、真空圧力を０．５トルに低下させ、この圧力及び棚温度を２２分間保つこと；
棚温度を１０℃に上昇させ、真空圧力を０．５トルに低下させ、この圧力及び棚温度を２２分間保つこと；
棚温度を２０℃に上昇させ、真空圧力を０．１トルに低下させ、この圧力及び棚温度を２２分間保つこと；
棚温度を３０℃に上昇させ、真空圧力を０．１トルに保ち、この圧力及び棚温度を２０時間保つこと。
【００６８】
結果：ＰＢＶ乾燥後、この材料を、保存後、０．５ｍｌのＰＢＳで再構成し、段階希釈後にＢＨＩ寒天上に塗抹した。プレートを、３７℃インキュベータで２４時間保管した。ＰＳ３を用いる場合の乾燥後の細菌の生存は、３０％未満であり；ＰＳ２を用いる、乾燥後の細菌生存は、６０％未満であり；ＰＳ１を用いる、乾燥後の細菌生存は、９０％超であった。したがって、ＰＶＰは、保存中の細菌に、さらなる保護を提供した。
【００６９】
実施例４：血清バイアルにおけるプロセスバリデーション及びスケールアップ乾燥
この研究は、ＰＢＶ乾燥プロセスの再現性を検証するために実施した。これらの実験では、モデルタンパク質として、ヒトアルブミンを使用した。２０ｍｇの組換え型ヒトアルブミン(Novozymes ALBiX)と、２６６ｍｇスクロースと、１３３ｍｇイソマルトとを含む２ｍｌの保存混合物を、２０ｍｌ血清バイアルに満たし、スチールトレーに乗せ、Virtisの凍結乾燥器（フリーズドライヤー）内の棚に置いた。トレーは、総数１２０本のバイアルで完全に埋め尽くされた。ＰＢＶ発泡体乾燥プロトコルは、−１５℃から３０℃の範囲の温度での１５００ミリトルでの３時間の一次乾燥と、５０℃での２０時間の二次乾燥から構成されていた。乾燥発泡体（機械的に安定なガラス質発泡体）の外観は、目に見える飛び跳ね(splashing)がなく、バイアルにわたって非常に均一に見えた。
【００７０】
ガラス転移温度（Ｔｇ）測定
目的：凍結乾燥器内の均一な乾燥条件について試験するために、乾燥トレーの様々な領域から採取されたＰＢＶアルブミンサンプルのＴｇを測定する。
【００７１】
実験手順：ＰＢＶアルブミンの５本のサンプルバイアルを、満杯の乾燥トレーの四隅から収集した（合計２０本のサンプルバイアル）。乾燥室内で、各バイアルからの乾燥材料を使用して、３種のＤＳＣサンプルパンを調製した。各サンプルは、およそ５ｍｇの手動で粉砕されたＰＢＶ発泡体を含有していた。サンプルパンに、オートサンプラーを備えたＤＳＣ  ８０００(Perkin Elmer,Massachusetts,USA)を実行させた。各パンを、２０℃／分の速度で−５０℃から８０℃まで走査し、Pyrisデータ分析ソフトウェアを使用してＴｇを算出した（以下の計算の例を参照のこと）。
【００７２】
結果：
【００７３】
【表１】
2020526225.tif 000013
【００７４】
水分活性測定
目的：凍結乾燥器内の均一な乾燥条件について試験するために、乾燥トレーの様々な領域から採取されたＰＢＶアルブミンサンプルからの水分活性（ａｗ）を測定する。
【００７５】
実験手順：ＰＢＶアルブミンの５本のサンプルバイアルを、満杯の乾燥トレーの四隅から収集した（合計２０本のサンプルバイアル）。各バイアル中のＰＢＶ発泡体を、手動で粉末に粉砕した。各バイアルからのおよそ１５０ｍｇの粉末を、乾燥室に置かれたAqualab 4TE Dewpoint Water Activity Meter(Decagon Devices,Washington,USA)で試験した。
【００７６】
結果：
【００７７】
【表２】
2020526225.tif 000014
【００７８】
実施例５：０．２μｍ滅菌フィルター（膜）で、覆われ、且つチャンバー環境から隔てられた、１リットルプラスチックボトルの内部での乾燥。
先の実施例と同様に、ＰＭを調製し、１リットルのプラスチック容器に１５０ｇ／容器で満たした。ＰＭの調製後、各容器を、水溶液の滅菌のために使用される０．２μｍフィルターで覆った。
【００７９】
棚温度を−１８℃に低下させ、その後、真空圧力を０．１トル未満に低下させ、このプロセスの最後まで０．１トルと同等に保つ。次に、棚温度を３０℃に上昇させ、３０℃で２４時間保った。次いで、棚温度を４０℃に上昇させ、４０℃で２４時間保った。
【００８０】
実施例６：弱毒生インフルエンザワクチン（ＬＡＩＶ）の保存
凍結されたＬＡＩＶ株(A/17/Texas/2012/30(H3N2))の単一の高力価ストックを、蒸発乾燥による保存（ＰＢＶ）技術を使用して保存した。保存のために、ＬＡＩＶを解凍し、ｐＨ７を有する様々な保存溶液（ＰＳ）と１：１で混合して、保存混合物（ＰＭ）を形成した。ＰＭを、血清バイアルに分配し、４５℃及び５０℃の二次乾燥温度を用いるＰＢＶプロセスを使用して乾燥させた。ＣＤＣによって提供された改変されたＬＡＩＶ  ＴＣＩＤ５０アッセイプロトコルを使用して、様々なワクチン調製物の活性の試験を行った。
【００８１】
実験Ｆｌｕ−１：
実験Ｆｌｕ−１では、本発明者らは、以下を含む７種の異なるＰＳを使用した：
ＰＳ１：スクロース３０％、メチルグルコシド（ＭＡＧ）１０％、ゼラチン０．５％；
ＰＳ２：スクロース３０％、メチルグルコシド（ＭＡＧ）１１４０％、アルブミン０．５％；
ＰＳ３：スクロース３０％、マンニトール１０％；
ＰＳ４：スクロース３０％、マンニトール１０％、ゼラチン０．５％；
ＰＳ５：スクロース３０％、アセトグルコース１０％；
ＰＳ６：スクロース３０％、アセトグルコース１０％、ゼラチン０．５％；及び
ＰＳ７：スクロース３０％、ＭＡＧ  １０％．
【００８２】
残念ながら、ＰＳ６は、乾燥中に晶出し、その後、研究は行われなかった。本発明者らは、溶液ＰＳ６が過飽和し、ゼラチンが何らかの形でアセトグルコース結晶の核生成に影響を与えたという仮説を立てる。
【００８３】
結果：ＰＢＶ後、及びその後の室温（ＲＴ）での１．６年の保管後の乾燥させたワクチンの活性（ＴＣＩＤ５０／ｍｌのｌｏｇ１０）を、下の表に示す。
【００８４】
【表３】
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【００８５】
実験Ｆｌｕ−２：
実験Ｆｌｕ−２では、本発明者らは、より低い濃度のマンニトール（３３％スクロース＋７％マンニトール）を含有するＰＳと、５０℃の二次乾燥温度を使用した。
【００８６】
この実験は、本発明者らが本発明者らの固有のＴＣＩＤ５０プロトコルを最初に設定している及び最適化している期間中に実施し、この理由から、本発明者らは、ＲＴでの保管の５か月後、信頼できる定量測定が確立されて初めて、保存されたワクチンの活性を最初に測定した。ワクチン力価（２Ｅ７  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）は、ＰＢＶ乾燥及び５か月の室温保管後に凍結された対照に対するわずか０．６２対数の活性の低下を示した。この調製物からのサンプルを、下の微粒子化研究に使用した。
【００８７】
実験Ｆｌｕ−３
実験Ｆｌｕ−３では、本発明者らは、マンニトール濃度をさらに低下させ、且つより高い５０℃という二次乾燥温度を維持したもの（３５％スクロース＋５％マンニトール）を含めた、いくつかの新規製剤を調査した。
【００８８】
結果：室温（ＲＴ）及び３７℃での保管後のＦＬＵ−３製剤の活性（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）を、下の表に示す。
【００８９】
【表４】
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【００９０】
結論：５０℃での二次乾燥ステップを含むプロセス下で３５％スクロースと５％マンニトール製剤を用いるＬＡＩＶのＰＢＶ乾燥は、熱安定性のＬＡＩＶの産生を可能にする。
【００９１】
実施例７：ボールミル粉砕技術を使用して、鼻腔送達に適した粒子範囲を有する乾燥粉末状の熱安定性のＬＡＩＶを製剤化する
ＰＢＶ乾燥プラセボ製剤のボールミル粉砕
最初に、本発明者らは、プラセボサンプルを使用して、ＰＢＶ製剤のボールミル粉砕を研究した。プラセボサンプルは、次の通りに調製及び評価した：
（ｉ）プラセボＰＭを調製するために、１００ｇの滅菌した細胞培養培地を、３３％スクロースと７％マンニトールを含む１００ｇのＰＳと混合した；
（ｉｉ）乾燥前に、ＰＭを、２０ｍＬ血清バイアルに分注した（２ｍＬ／バイアル）；
（ｉｉｉ）材料に、４５℃での１日の二次乾燥を伴う、初期の実験においてワクチンを乾燥させるために使用したのと同じＰＢＶプロトコルを施した；
（ｉｖ）乾燥後、ＰＢＶプラセボ発泡体を、最初に、滅菌したへらを用いて血清バイアルの内部で砕いて、このＰＢＶ発泡体を破壊し、粒径を数百ミクロンまで低下させた；
（ｖ）１５Ｈｚの振動数（本発明者らが以前に、約２０ミクロンの粒子を得るのに適した振動数であることを決定している）で、４５、７５、又は９０分の期間、LabWizz Laboratory-Scale Ball Millを使用して、それに続く微粒子化を実施した；
（ｖｉ）あらゆる凝集塊又はより大きい粒子を除去するために、粉末を、メッシュサイズ６３μｍの銅ふるいにかけた。ふるいを通過しなかったであろう粉末材料の部分を記録した。このサイズが、呼吸器送達のための乾燥ＬＡＩＶワクチンの調製における乾燥粉末増量剤として使用されるLactoHaleラクトース粉末をふるいにかけるために指定されることから、メッシュサイズは、６３μｍであることを選択した。本発明者らは、このメッシュを通過することができる粒子が、６３μｍよりも実質的に小さく、呼吸器送達に上手く適合されることも発見した；及び
（ｖｉｉ）粉末を、乾燥室の内部で鉱油に懸濁し、従来の顕微鏡観察を使用して評価した。
【００９２】
本発明者らは、呼吸器送達に適した粒径へのＰＢＶ発泡体のボールミル粉砕が、１５Ｈｚの揺動振動数と４５〜９０分の範囲の粉砕時間を使用して実現できることを発見した（下の表を参照のこと）。より短い粉砕時間は、より変動性の高い粒径をもたらし、６３μｍふるいを通過しない粒子の割合が増大する傾向がある。本発明者らは、１５Ｈｚの揺動振動数での７５分の粉砕が、呼吸器送達のための微粒子化されたワクチン粉末を生成するのに最適なプロトコルであることを結論付けた。
【００９３】
結果を図２に示す。
【００９４】
微粒子化及びその後の保管後のＰＢＶ  ＬＡＩＶの活性
研究のこの部分では、本発明者らは、３３％スクロースと７％マンニトールを含むＰＳを使用して実験Ｆｌｕ−２で生成されたワクチンに対する粉砕時間の影響を評価した。ワクチン微粒子化は、プラセボサンプルについて上に記載した通りに実施した。
【００９５】
結果：４５、７５、及び９０分間、１５Ｈｚで微粒子化され、それに続いて４℃、ＲＴ、及び３７℃で１．５か月保管された、乾燥ＰＢＶ  ＬＡＩＶ粉末の、ミリグラムあたりの活性（ＴＣＩＤ５０）を、下に示す。
【００９６】
【表５】
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【００９７】
ボールミル粉砕は、低い活性喪失をもたらし、微粒子化されたワクチンは、ＲＴで少なくとも１．５か月間、安定なままであった。しかし、本発明者らは、微粒子化されていないワクチン調製物と比較した、３７℃での保管中の微粒子化されたワクチン安定性の有意な低下を発見した。これは、過飽和したスクロース／マンニトールガラスからのマンニトール又はスクロースの結晶化に起因する可能性がある。この結晶化は、粉砕中に生じる割れの表面上のマンニトール結晶の核生成によって開始される可能性がある。
【００９８】
実施例８：ＰＢＶによって保存される弱毒生ロタウイルスワクチン（ＬＡＲＶ）に対する微粒子化の影響：
ＬＡＲＶワクチンを、３０％スクロースと１０％マンニトールを含むＰＳと１：１で混合し、ＰＢＶによって保存した。これまで論じたＦｌｕワクチンと同様に、粒径低下を、２つのステップ：手動粉砕、それに続く、Laarmann Labwizzの研究室サイズのボールミルを使用するボールミル粉砕（微粒子化）で実施した。最初に、室温で３か月間保管されていたバイアルを開け、バイアルの内部の乾燥発泡材料を、１５〜１８％の相対湿度を伴う乾燥室内で、へらを使用して手動で粉砕した。各バイアルから、およそ１２０ｍｇの手動で粉砕された発泡体が回収された。手動粉砕後の粒径は、典型的には、数百ミクロンであった。次に、手動で粉砕された発泡体を、それぞれ３×２ｍｍスチールボールを含有する２ｍＬの金属容器に入れた。この容器を、ボールミルの内部に入れ、３０分間、１５Ｈｚの速度で振動させて、粒子のサイズをおよそ５０ミクロンに低下させた。この粉末の一部を、４５℃で１日、真空中で乾燥させた。
【００９９】
本発明者らは、微粒子化、及びそれに続くＲＴでの５か月の保管後のウイルス活性の喪失が、非常に小さい（＜０．２対数）ことを発見した。しかし、３７℃での５か月の保管後、微粒子化されていない製剤については観察されなかった０．８対数の活性の喪失を受けた。この知見は、上述の微粒子化後のＰＢＶ  ｆｌｕワクチンの安定性の低下と相関する。
【０１００】
示差走査熱量計(Differential Scanning Calorimeter)を使用する、本発明者らのＴｇの測定は、微粒子化された試料における３７℃でのウイルス活性の低下が、分画の表面上に核生成する結晶からの糖の結晶化に関連する可能性があるという作業仮説を裏付けた。
【０１０１】
本発明者らは、３０％スクロースと１０％マンニトールを含むＰＳと共に調製された、ＰＢＶ製剤を調査した。各製剤について、本発明者らは、アルミニウムパンの内部に密閉封止した３つの独立した試料を調製した。微粒子化されていない製剤を用いると、いかなる予想外の結果も見られず、本発明者らは、第１の、第２、及び第３のＤＳＣ実行中に、−５０から８０℃までのＴｇを測定することができた。Ｒｏｔａ−１  ＰＭ４粉末（手で粉砕、微粒子化せず、３回実行）のＤＳＣ走査を示す、図３を参照のこと。
【０１０２】
しかし、微粒子化された粉末についてのみ、各サンプルパンの第１の実行は、観察可能なガラス転移挙動を有しており、その後、本発明者らは、加温中の結晶化に関連するＤＳＣ出力の急速な低下をはっきりと観察した。失透としても知られているこの現象はしばしば、低粘度により、ガラス状態の分画の表面上にしばしば形成される結晶の成長が止められていない場合に、ガラス転移温度を超えた準安定な過飽和混合物において観察される。図４は、乾燥微粒子化ＰＭ４製剤についてのＤＳＣ実行を示す。
【０１０３】
失透は、冷却中に結晶化されなかった、したがって、Ｔｇ未満で安定なガラスを形成する過飽和溶液における、不可逆的な動力学的結晶化プロセスである。結晶の核が、結晶が成長できる温度未満の温度で形成する、又は、結晶の核生成が、ガラス状態の割れの表面上でのみ起こる可能性があるので、典型的には、冷却中の結晶化は起こらない。Ｔｇよりも高温への加温中、溶液の粘度が低下する場合、より低い温度で形成する結晶核は、温度上昇と共に増大する速度で成長を始める−結晶化された状態の材料を不可逆的に転換させる。Ｔｇが高いほど、所与の加温速度に対して、失透が起こる温度が高くなる。
【０１０４】
本発明者らはまた、真空中で４５℃でさらに１日乾燥させた、微粒子化された乾燥製剤のサンプルにおけるＴｇを測定した。これらのサンプルにおいては、ガラス状態からの加温中の失透の影響は検出されなかった。４５℃での追加の乾燥後の乾燥微粒子化ＰＭ４製剤についてのＤＳＣ実行を、図５に示す。
【０１０５】
乾燥微粒子化製剤の追加の乾燥後、Ｔｇ測定値は、追加の乾燥ステップを有しない微粒子化された製剤について得られるもの（Ｔｇは、３０℃をわずかに超えていた）よりも有意に高かった（Ｔｇは、５０℃をわずかに超えていた）。これは、さらに乾燥させた粉末において失透が観察されなかった理由を説明する。
【０１０６】
失透は、すべてのガラス化混合物において必ずしも起こるわけではなく、混合物の組成に依存する。本発明者らの予備的な知見によれば、これは、ＭＡＧを含有する混合物と比較して、マンニトールを含有する混合物において、より顕著である。本明細書では、Ｔｇの上昇は、失透を低下又は排除することとなることが考えられる。
【産業上の利用可能性】
【０１０７】
主張される発明は、医薬品産業、特にワクチン産業に適用可能であるが、医薬品産業の他の部分も適用可能である。
参考文献
U.S.Patent No.9,469,835,issued October 18,2016.
Pushkar,N.S.and V.L.Bronshtein.1988.The mechanism of ice formation on rewarming of the frozen cryoprotectant solutions.Proc.Ukrainian Acad.Sci.10:68-70.
【国際調査報告】
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2020526225.tif 000019
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