(57)【要約】  本発明は、アグリカンならびにＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３に結合するポリペプチドに、より特に、アグリカンに結合する免疫グロブリンならびにＡＤＡＭＴＳ５に結合する免疫グロブリンおよび／またはＭＭＰ１３に結合する免疫グロブリンを含むかまたは本質的にそれからなるポリペプチド（本明細書ではそれぞれ、「本発明のポリペプチド」および「本発明の免疫グロブリン」とも呼ばれる）に関する。本発明はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）などのかかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを含む構築物、ならびにかかる免疫グロブリンまたはポリペプチドをコードする核酸（本明細書では「本発明の核酸」とも呼ばれる）に；かかる免疫グロブリン、ポリペプチドおよび構築物を調製する方法に；かかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを発現するかまたは発現可能な宿主細胞に；かかる免疫グロブリン、ポリペプチド、構築物、核酸および／または宿主細胞を含む組成物、および特に医薬組成物に；特に、本明細書に記載の予防および／または治療目的などの予防および／または治療目的のための、免疫グロブリン、ポリペプチド、構築物、核酸、宿主細胞および／または組成物の使用に、関する。本発明の他の側面、態様、利点および用途は、本明細書のさらなる説明から明らかになるであろう。
2020523986.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下からなる群から選択される、ポリペプチド：
（ａ）少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドであって、ここで第１のＩＳＶＤはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に特異的に結合し、第２のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第３のＩＳＶＤを含む、前記ポリペプチド；
（ｂ）少なくとも２つのＩＳＶＤを含むポリペプチドであって、ここで第１のＩＳＶＤはトロンボスポンジンモチーフを有するＡディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）に特異的に結合し、第２のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第３のＩＳＶＤを含む、前記ポリペプチド；および
（ｃ）少なくとも３つのＩＳＶＤを含むポリペプチドであって、ここで第１のＩＳＶＤはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に特異的に結合し、第２のＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳに特異的に結合し、第３のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第４のＩＳＶＤを含む、前記ポリペプチド。
【請求項２】
第１のＩＳＶＤがＭＭＰに特異的に結合し、第２のＩＳＶＤがＡＤＡＭＴＳに特異的に結合し、第３のＩＳＶＤがアグリカンに特異的に結合し、第４のＩＳＶＤがアグリカンに特異的に結合する、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ＭＭＰがＭＭＰ１３である、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＭＭＰ１３に特異的に結合するＩＳＶＤが３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、請求項３に記載のポリペプチドであって、ここで
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号８；または
配列番号８と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号１０；または
配列番号１０と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号１２；または
配列番号１２と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である、
前記ポリペプチド。
【請求項５】
ＣＤＲ１が配列番号８であり、ＣＤＲ２が配列番号１０であり、ＣＤＲ３が配列番号１２である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
ＭＭＰ１３に特異的に結合するＩＳＶＤが、配列番号２を含むかまたはそれからなる、請求項４または５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
ＡＤＡＭＴＳがＡＤＡＭＴＳ５である、請求項１〜６のいずれかに一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤが、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、請求項７に記載のポリペプチドであって、ここで
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号１４［ＧＲＴＶＳＳＹＡＭＧ］または
配列番号１４と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号１６［ＧＩＳＲＳＡＥＲＴＹ］または
配列番号１６と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；
および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号１８［ＤＬＤＰＮＲＩＦＳＲＥＥＹＡＹ］または
配列番号１８と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である、
前記ポリペプチド。
【請求項９】
ＣＤＲ１が配列番号１４であり、ＣＤＲ２が配列番号１６であり、ＣＤＲ３が配列番号１８である、請求項８に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤが、配列番号３を含むかまたはそれからなる、請求項８または９に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤが、３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含む、請求項３に記載のポリペプチドであって、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号１９または
配列番号１９と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号２１または
配列番号２１と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号２３または
配列番号２３と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である、
前記ポリペプチド。
【請求項１２】
ＣＤＲ１が配列番号１９であり、ＣＤＲ２が配列番号２１であり、ＣＤＲ３が配列番号２３である、請求項１１に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤが、配列番号４を含むまたはそれからなる、請求項１１または１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
ＩＳＶＤが、リンカーを介して互いに連結している、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
リンカーが、配列番号２４〜４０からなる群から、好ましくは配列番号２８［９ＧＳ］または配列番号３５［３５ＧＳ］から選択される、請求項１４に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１に記載のポリペプチドであって、ここで第１のＩＳＶＤがＭＭＰ１３に特異的に結合し、第２のＩＳＶＤがＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、第３のＩＳＶＤがアグリカンに特異的に結合し、第４のＩＳＶＤがアグリカンに特異的に結合し、およびここで前記ポリペプチドは、好ましくは配列番号１もしくは６２を含むかまたはそれからなるか、または配列番号１もしくは６２と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドを含むかまたはそれからなる、前記ポリペプチド。
【請求項１７】
請求項１に記載のポリペプチドであって、ここで第１のＩＳＶＤがＭＭＰ１３に特異的に結合し、第２のＩＳＶＤがアグリカンに特異的に結合し、第３のＩＳＶＤがアグリカンに特異的に結合し、好ましくは配列番号５または６３を含むかまたはそれからなる、前記ポリペプチド。
【請求項１８】
請求項１に記載のポリペプチドであって、ここで第１のＩＳＶＤがＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、第２のＩＳＶＤがアグリカンに特異的に結合し、第３のＩＳＶＤがアグリカンに特異的に結合し、好ましくは配列番号６または６４を含むかまたはそれからなる、前記ポリペプチド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれかに一項に記載のポリペプチドであって、ここで、
（ｉ）ＭＭＰ１３に特異的に結合するＩＳＶＤが、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３から本質的になり；および／または
（ｉｉ）ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤが、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３から本質的になり；および／または
（ｉｉｉ）アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤが、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３から本質的になる、
前記ポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むか、または本質的にそれからなり、任意に１つ以上のペプチドリンカーを介して連結される１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位をさらに含む、構築物。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項２０に記載の構築物をコードする、核酸。
【請求項２２】
請求項２１に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２１に記載の核酸、または請求項２１に記載の発現ベクターを含む、宿主または宿主細胞。
【請求項２４】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチドまたは請求項１９に記載の構築物、または請求項２１に記載の核酸を含む、組成物。
【請求項２５】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチドを生産する方法であって、前記方法が、少なくとも以下のステップ：
ａ）適切な宿主細胞、宿主生物または適切な発現系において、請求項２１に記載の核酸を発現させること；任意にこれに続いて、
ｂ）請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチドを、単離および／または精製すること、
を含む、前記方法。
【請求項２６】
医薬組成物である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２７】
少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントをさらに含み、任意に１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
医薬として使用するための、請求項２６または２７に記載の組成物、請求項１〜１９のいずれかに一項に記載のポリペプチド、または請求項２０に記載の構築物。
【請求項２９】
関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎、アグリカノパチー、ＮＡＳＨ、慢性歯周炎および腹部大動脈瘤の、症状の予防または処置に使用するための、請求項２６または２７に記載の組成物、請求項１〜１９のいずれかに一項に記載のポリペプチド、または請求項２０に記載の構築物。
【請求項３０】
個体の疾患または障害の症状を予防または処置する方法であって、方法が、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２０に記載の構築物、または請求項２６もしくは２７に記載の組成物を、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎、アグリカノパチー、ＮＡＳＨ、慢性歯周炎および腹部大動脈瘤の症状を処置または予防するための有効量で、前記個体に投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．発明の分野
本発明は、アグリカンならびにＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３に結合するポリペプチドに、より特に、アグリカンに結合する免疫グロブリンならびにＡＤＡＭＴＳ５に結合する免疫グロブリンおよび／またはＭＭＰ１３に結合する免疫グロブリンを含むかまたは本質的にそれからなるポリペプチド（本明細書ではそれぞれ、「本発明の免疫グロブリン」および「本発明のポリペプチド」とも呼ばれる）に関する。本発明はまた、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）などのかかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを含む構築物、ならびにかかる免疫グロブリンまたはポリペプチドをコードする核酸（本明細書では「本発明の核酸」とも呼ばれる）に；かかる免疫グロブリン、ポリペプチドおよび構築物を調製する方法に；かかる免疫グロブリンまたはポリペプチドを発現するかまたは発現可能な宿主細胞に；かかる免疫グロブリン、ポリペプチド、構築物、核酸および／または宿主細胞を含む組成物、および特に医薬組成物に；特に、本明細書に記載の予防および／または治療目的などの予防および／または治療目的のための、免疫グロブリン、ポリペプチド、構築物、核酸、宿主細胞および／または組成物の使用に、関する。本発明の他の側面、態様、利点および用途は、本明細書のさらなる説明から明らかになるであろう。
【背景技術】
【０００２】
２．発明の背景
変形性関節症（ＯＡ）は、世界中に及ぶ廃疾の最も一般的な原因の１つである。３，０００万人のアメリカ人がこれに罹患しており、最も一般的な関節障害である。米国人口の２０％以上が、２０２５年までにこれに罹患すると予測されている。この疾患は全身性ではなく、通常は少数の関節に限定されている。しかし、この疾患はすべての関節で、ほとんどの場合は膝、股関節、手、肩、および脊椎で発生する。ＯＡは、慢性的な痛みと障害をもたらす関節軟骨（骨を覆う軟骨）の進行性の侵食によって特徴付けられる。最終的にこの疾患は、関節軟骨の完全な破壊、その下にある骨の硬化、骨棘形成などにつながり、すべて運動の喪失と痛みにつながる。変形性関節症は、関節症状、関節軟骨の欠損に起因する徴候、ならびに骨、腱、および筋肉などを含む隣接組織における変化の組合せを特徴とする、多様な状態群として定義できる。ＯＡの最も顕著な症状は痛みであり、これは多くの場合、患者が医療的援助を求める理由となる。ＯＡに治療法はなく、すなわち現在の処置はＯＡの関節の構造的劣化を抑制しない。疾患管理はせいぜい緩和的な処置に限られ、疾患の進行の根本的な原因にはほとんど対処できない。
【０００３】
構造的疾患の進行を抑制し、理想的には症状および／または機能を改善する薬物として定義できる、疾患修飾性抗変形性関節症薬（ＤＭＯＡＤ）が強く求められている。ＤＭＯＡＤは、高齢人口でのこの慢性疾患において長期間にわたって処方される可能性が高いため、複数の併存疾患および薬物間相互作用の可能性がある対象集団において、優れた安全性データが要求される。
疾患の開始は多因子性であり得るが、軟骨の破壊は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の制御されないタンパク質分解の結果であると考えられる。関節軟骨の最も豊富なＥＣＭ成分は、コラーゲン（主にコラーゲンＩＩ）およびプロテオグリカン、主にアグリカンである（Kiani et al. 2002 Cell Research 12:19-32）。
【０００４】
アグリカンは、軟骨に耐荷重性を与える水和ゲル構造を提供することにより、関節軟骨の適切な機能において重要である。アグリカンは、軟骨細胞によって発現される大きなマルチモジュラー分子（２３１７アミノ酸）である。そのコアタンパク質は、３つの球状ドメイン（Ｇ１、Ｇ２、およびＧ３）および、グリコサミノグリカン鎖の結合のためのＧ２とＧ３の間の大きな拡張領域で構成されている。この拡張領域は、２つのドメイン、すなわちケラタン硫酸鎖で置換されたドメイン（ＫＳドメイン）とコンドロイチン硫酸鎖で置換されたドメイン（ＣＳドメイン）で構成されている。ＣＳドメインには、１００〜１５０のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）鎖が結合している。アグリカンはヒアルロナンと大きな複合体を形成し、ここでは５０〜１００のアグリカン分子が、Ｇ１ドメインおよびリンクタンパク質を介して１つのヒアルロナン分子と相互作用する。水を吸収すると（ＧＡＧ含有量により）、これらの複合体は圧縮に抵抗する可逆的に変形可能なゲルを形成する。関節軟骨の構造、体液貯留および機能は、アグリカンのマトリックス含有量、および無傷のコアタンパク質に結合したコンドロイチン硫酸の量に関連している。構造的には、ＯＡはアグリカンの分解によって特徴付けられ、ドメインＧ３およびＧ２を徐々に放出し（軟骨の「収縮」をもたらす）、最終的にＧ１ドメインの放出とコラーゲンの分解を引き起こし、軟骨構造を不可逆的に破壊する。ＯＡ病因の最も重要なアグリカン切断部位は、配列ＴＥＧＥ３７３↓３７４ＡＲＧＳに位置する。この切断部位は、Ｇ１ドメインとＧ２ドメインの間にある、アグリカンの球間ドメイン（ＩＧＤ）に位置している。
３７４ＡＲＧＳネオエピトープを認識する抗体は、ＡＤＡＭＴＳ４であることが証明されたアグリカナーゼ１およびＡＤＡＭＴＳ５であるアグリカナーゼ２の発見につながった。その後、ＡＤＡＭＴＳ１、−８、−９、−１５、−２０を含む他の関連ＡＤＡＭＴＳ酵素が、アグリカナーゼ活性を有することが示された。様々な証拠が、ＡＤＡＭＴＳ５が変形性関節症の病因に関与する主要な酵素であることを示している。ヒト軟骨外植片および軟骨細胞において、ＡＤＡＭＴＳ５のノックダウンはアグリカン分解を減衰させ、この酵素がヒト組織に関与し得ることを示唆した。この酵素の発現は、インターロイキン１およびオンコスタチンＭなどのサイトカインによって増強され、組織内のアグリカンの分解を引き起こす。ＡＤＡＭＴＳ５によって生成されたアグリカン断片は、ＯＡ患者の滑液および血清から検出される（Germaschewski et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22:690-697）。
【０００５】
いくつかの製薬会社がＤＭＯＡＤを開発している。これらの化合物のいくつかは、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的であると主張されているが、他の化合物は別のＡＤＡＭＴＳメンバー、またはマトリックスメタロプロテイナーゼに対してさえも効果を有する。特にＭＭＰに対するこれらの交差阻害は、筋骨格症候群（ＭＳＳ）、すなわち広域スペクトル阻害剤によって引き起こされ関節痛、筋肉痛、関節硬直および腱炎を伴う副作用の、原因であると考えられている（Santamaria et al., 2015 Biochem J 471:391-401）。これらの副作用は、さらなる開発を中止する理由であった。Pfizerのアグリカナーゼ阻害剤ＡＧＧ−５２３は、ＯＡの第Ｉ相臨床試験で使用されたが、それ以上には進んでいない。他の低分子ＡＤＡＭＴＳ阻害剤も、潜在的なＤＭＯＡＤとしてさらなる臨床開発に参入していない（Bondeson et al., 2015 Drug Discovery 10:5-14）。Galapagos／ServierのＡＤＡＭＴＳ５阻害剤ＧＬＰＧ１９７２は最近、第I相試験を終了したが、その有効性は未定である。実際、ＤＭＯＡＤを具体的に調査した近年の多くの臨床試験にもかかわらず、これまでの所かかる処置は承認されていない（El Bakali et al., 2014 Future Medicinal Chemistry (Review) 6:1399）。ＡＤＡＭＴＳ５のスペーサードメインに向けられたRottapharmのモノクローナル抗体（ｍＡｂ）ＣＲＢ００１７の研究により、マウスにおいて、このｍＡｂの関節内投与によって、疾患の進行が用量依存的に有意に予防されたことが示された（Chiusaroli et al., 2013 Osteoarthritis Cartilage 21:1807）。しかし全身投与との比較は行われず、ｍＡｂが滑膜腔からどの程度漏出したかは評価されなかった。別の研究では、マウスにｍＡｂ １２Ｆ４を全身投与し、構造的疾患の改善と疼痛関連行動の軽減の両方が実証された（Miller et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22iii, S35）。しかし、ｍＡｂ １２Ｆ４をカニクイザルに１回投与すると、局所出血、用量依存性の平均動脈圧および心臓コンダクタンス異常（より具体的にはＥＣＧでのＳＴ上昇および心室性不整脈）が引き起こされ、心虚血が単回投与後８か月まで持続することが示された（Larkin et al., 2014 Osteoarthritis Cartilage 22iii, S483）。この場合においてもまた、ｍＡｂ １２Ｆ４のさらなる臨床開発は副作用のために中止された。
【０００６】
ＡＤＡＭＴＳ酵素の次に、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）もＯＡに関連する組織破壊に大きな役割を果たすことを実証する、説得力のある証拠が存在する。ＭＭＰは、細胞外マトリックスの分解および組織のリモデリングに関与する亜鉛依存性エンドペプチダーゼのファミリーである。約２８のＭＭＰファミリーメンバーがあり、これらは、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメリシン、膜型ＭＭＰ、マトリリシン、エナメリシンなどを含む様々なサブグループに分類できる。ＭＭＰ１、ＭＭＰ８、ＭＭＰ１３、およびＭＭＰ１８を含むコラゲナーゼは、三重らせん原線維コラーゲンを、特徴的な３／４および１／４断片に分解することできる。さらにＭＭＰ１４はまた、原線維コラーゲンを切断することも示されており、ＭＭＰ２もコラーゲン分解が可能であるという証拠がある。ＭＭＰは長い間、ＯＡの処置のための魅力的な治療標的として考えられてきた。しかし、関節炎の処置用に開発された広域スペクトルＭＭＰ阻害剤は、痛みを伴う関節硬化の副作用、すなわちＭＳＳのために、臨床試験で失敗した。
【０００７】
関節への治療的介入は、薬物を関節軟骨に標的化することが困難であるために、さらに妨げられている。関節軟骨は無血管および無リンパ組織であるため、従来の薬物送達経路（経口、静脈内、筋肉内）は、薬物の、受動拡散による滑膜毛細血管から軟骨への経滑膜移行に最終的に依存している。これは、医薬の関節内（ＩＡ）送達の開発を促進した。ＩＡ送達は受動拡散の問題を回避したが、治療用タンパク質のＩＡ送達は、関節空間からの急速なクリアランスと第一には軟骨内の保持不足により制限されている。注目すべきは、関節における薬物の滑膜滞留時間は、多くの場合２４時間未満である（Edwards 2011 Vet J 190:15-21；Larsen et al., 2008 J Pham Sci 97:4622-4654）。ほとんどのＩＡ注射された薬物の急速なクリアランスのため、有効な濃度を維持するには頻繁な注射が必要となる（Owen et al., 1994 Br J Clin Pharmacol 38:349-355）。しかし、頻繁なＩＡ注射は、痛みや不快感のために患者のコンプライアンスが困難になる可能性があり、関節感染症を引き起こすリスクがあるため、望ましくない。
効果的なＤＭＯＡＤの必要性が残されている。
【発明の概要】
【０００８】
３．発明の概要
本発明は、他の有利な特性に加えて、従来技術のアミノ酸配列および抗体と比較した場合に、改善された予防的、治療的および／または薬理学的特性（例えば、改善された調製の容易さ、良好な安定性、および／または商品のコスト削減）を有する、ＯＡに対するポリペプチドおよび構築物を提供することを目的とする。特に本発明は、関節内で長時間保持されながら、ＡＤＡＭＴＳおよび／またはＭＭＰ１３を阻害し、特にＡＤＡＭＴＳ５を阻害するポリペプチドを提供することを目的とする。
【０００９】
変形性関節症は均一には進行せず、病変の進行のペースは大きく変動する可能性があることを認識し―極端な場合には、変形性関節症は長い間安定したままであり得るが、一方他の患者においては、ＯＡは非常に急速に進行して数か月の内に軟骨の完全な破壊が完了する―、本発明者らは（ただし、理論に拘束されることなく）かかる様々な疾患進行のパターンは、様々なプロテアーゼの不均一な活性パターンによるものであると仮定した。
異なるファミリーおよび軟骨アンカー部分からの効果的なプロテアーゼ阻害剤を、創造的で従来にないスクリーニング、特性評価、および組み合わせ戦略によって特定した後、本発明者らは、様々な機能が結合した組み合わせを開発した。アグリカン（ＣＡＰ）に結合する軟骨アンカー部分、およびＡＤＡＭＴＳ５阻害剤またはＭＭＰ１３阻害剤のいずれかを含む、２つの二重特異性ポリペプチド、ならびに、ＡＤＡＭＴＳ５阻害剤、ＭＭＰ１３阻害剤、ＣＡＰ結合剤を含む三重特異性ポリペプチドを、操作した。
本発明のポリペプチドは、異なるＯＡ状態を表す様々なモデルシステムにおいて、ベンチマーク分子（WyethおよびPfizer）がそうでない場合であっても、有効性を維持することが実証された。
【００１０】
本発明者らはまた、２つの他の部分と組み合わせた場合でも有効性を維持するＣＡＰ結合剤を、同定および再設計することができた。また、本発明のポリペプチドのＣＡＰ部分により、関節での保持が増加することが実証された。
本発明のポリペプチドは、関節内で安定したままであることも実証された。
したがって、本発明のポリペプチドは、一方ではＯＡ患者に広く有用であり、他方では（ＩＡ）投与スケジュールの負担が軽減されるであろう。さらに、１つの分子内にさまざまな部分を組み合わせることにより、有効用量を増やすことができる。
したがって本発明は、以下からなる群から選択される、ポリペプチドに関する：（ａ）少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドであって、ここで第１のＩＳＶＤはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に特異的に結合し、第２のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第３のＩＳＶＤを含む、前記ポリペプチド；（ｂ）少なくとも２つのＩＳＶＤを含むポリペプチドであって、ここで第１のＩＳＶＤはトロンボスポンジンモチーフを有するＡディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）に特異的に結合し、第２のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第３のＩＳＶＤを含む、前記ポリペプチド；および（ｃ）少なくとも３つのＩＳＶＤを含むポリペプチドであって、ここで第１のＩＳＶＤはＭＭＰに特異的に結合し、第２のＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳに特異的に結合し、第３のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第４のＩＳＶＤを含む、前記ポリペプチド。
【００１１】
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、第１のＩＳＶＤはＭＭＰに特異的に結合し、第２のＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳに特異的に結合し、第３のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合し、第４のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合し、好ましくは前記ＭＭＰは、ＭＭＰ１３である。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のＩＳＶＤを提供し、前記ＩＳＶＤは、構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有し、式中、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３は本明細書で定義されるとおりであり、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４は、フレームワーク配列である。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、ＭＭＰ１３に特異的に結合するＩＳＶＤは４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、（ｉ）（ａ）ＣＤＲ１は、配列番号８；および（ｂ）配列番号８と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；（ｉｉ）（ｃ）ＣＤＲ２は、配列番号１０；および（ｄ）配列番号１０と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；および（ｉｉｉ）（ｅ）ＣＤＲ３は、配列番号１２；および（ｆ）配列番号１２と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；好ましくは、ここで、ＣＤＲ１は配列番号８であり、ＣＤＲ２は配列番号１０であり、ＣＤＲ３は配列番号１２であり；さらにより好ましくは、ここで、ＭＭＰ１３に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号２で表される。
【００１２】
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ＡＤＡＭＴＳはＡＤＡＭＴＳ５であり、好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、（ｉ）（ａ）ＣＤＲ１は配列番号１４［ＧＲＴＶＳＳＹＡＭＧ］；および（ｂ）配列番号１４と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；（ｉｉ）（ｃ）ＣＤＲ２は、配列番号１６［ＧＩＳＲＳＡＥＲＴＹ］；および（ｄ）配列番号１６と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；および（ｉｉｉ）（ｅ）ＣＤＲ３は、配列番号１８［ＤＬＤＰＮＲＩＦＳＲＥＥＹＡＹ］；および（ｆ）配列番号１８と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；さらに好ましくは、ここで、ＣＤＲ１は配列番号１４であり、ＣＤＲ２は配列番号１６であり、ＣＤＲ３は配列番号１８であり；さらにより好ましくは、ここで、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号３で表される。
【００１３】
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここでアグリカンに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで（ａ）ＣＤＲ１は、配列番号１９；および（ｂ）配列番号１９と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；（ｉｉ）（ｃ）ＣＤＲ２は、配列番号２１；および（ｄ）配列番号２１と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；および（ｉｉｉ）（ｅ）ＣＤＲ３は、配列番号２３；および（ｆ）配列番号２３と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；より好ましくは、ここで、ＣＤＲ１は配列番号１９であり、ＣＤＲ２は配列番号２１であり、ＣＤＲ３は配列番号２３であり；さらにより好ましくは、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、配列番号４で表される。
【００１４】
本発明のすべての側面の好ましい態様において、本明細書の上および下に略述されるように、本発明による免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）は、好ましくは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３からなるか、または本質的にそれらからなる。好ましいフレームワーク配列は、例えば以下の表Ａ−２に開示されており、本発明のＩＳＶＤに使用することができる。好ましくは、表Ａ−２に示されているＣＤＲは、同じＩＳＶＤ構築物のそれぞれのフレームワーク領域と一致している。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、前記ＩＳＶＤはリンカーを介して互いに連結され、好ましくは前記リンカーは、配列番号２４〜４０からなる群から、好ましくは配列番号２８［９ＧＳ］または配列番号３５［３５ＧＳ］から、選択される。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで第１のＩＳＶＤはＭＭＰ１３に特異的に結合し、第２のＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、第３のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合し、および第４のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合し、好ましくは、配列番号１または６２で表される。
【００１５】
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで第１のＩＳＶＤはＭＭＰ１３に特異的に結合し、第２のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合し、および第３のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合し、好ましくは、配列番号５または６３で表される、
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、第１のＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、第２のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合し、および第３のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合し、好ましくは、配列番号６または６４で表される。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドを含むか、または本質的にそれからなる構築物に関し、これはさらに、任意に１つ以上のペプチドリンカーを介して連結される、１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位を含む。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドまたは本明細書に記載の構築物をコードする、核酸に関する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載の核酸を含む、発現ベクターに関する。
【００１６】
一側面において、本発明は、本明細書に記載の核酸、または本明細書に記載の発現ベクターを含む、宿主または宿主細胞に関する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチド、本明細書に記載の構築物、または本明細書に記載の核酸を含む、組成物に関する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドを生産する方法に関し、前記方法は、少なくとも以下のステップを含む：ａ）適切な宿主細胞、宿主生物または適切な発現系において、本明細書に記載の核酸を発現させること；任意にこれに続いて、ｂ）本明細書に記載のポリペプチドを単離および／または精製すること。
一側面において、本発明は、医薬組成物である、本明細書に記載の組成物に関し、好ましくは前記組成物はさらに、少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントを含み、任意に１つ以上のさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または化合物を含む。
一側面において、本発明は、医薬として使用するための、本明細書に記載の組成物、本明細書に記載のポリペプチド、または本明細書に記載の構築物に関する。
【００１７】
一側面において、本発明は、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎、アグリカノパチー、ＮＡＳＨ、慢性歯周炎および腹部大動脈瘤の、症状の予防または処置に使用するための、本明細書に記載の組成物、本明細書に記載のポリペプチド、または本明細書に記載の構築物に関する。
一側面において、本発明は、個体の疾患または障害の症状を予防または処置する方法に関し、該方法は、本明細書に記載のポリペプチド、本明細書に記載の構築物、または本明細書に記載の組成物を、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎、アグリカノパチー、ＮＡＳＨ、慢性歯周炎および腹部大動脈瘤の症状を処置または予防するための有効量で、前記個体に投与することを含む。
【００１８】
ポリペプチドおよび組成物の他の側面、利点、用途および使用は、本明細書のさらなる開示から明らかになるであろう。本明細書の本文にわたりいくつかの文書が引用されている。ここに引用された各文書（すべての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、上記であっても下記であっても、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のすべては、本発明が先行発明によってかかる開示に先行する権利を与えられない、ということの承認として解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
４．図の凡例
【図１】図１は、ポリペプチド９４９（「C010100949」、配列番号１）による、FRETベースの酵素活性アッセイでの、種のＡＤＡＭＴＳ５の機能的阻害を示す図である。Ｖｉ：阻害された酵素反応の速度（進行曲線の傾き）；Ｖ０：阻害されていない反応の速度。各点は、技術的重複測定の平均を表す。エラーバー：技術的重複における標準偏差。このグラフは、３つの独立した実験の代表である。
【図２】図２は、ポリペプチド９４９による、FRETベースの酵素活性アッセイでの、ヒト、カニクイザルおよびラットＭＭＰ１３の機能的阻害を示す図である。左：ポリペプチド９４９（ＡＬＸ−１０１１）による種のｃｄＭＭＰ１３阻害。右：種の活性化ｐｒｏＭＭＰ１３の阻害（ポリペプチド９４９はC010100949と示す）。Ｖｉ：阻害された酵素反応の速度（進行曲線の傾き）；Ｖ０：阻害されていない反応の速度。Ｃｄ：触媒ドメイン；ｐｒｏ：活性化ｐｒｏ−ＭＭＰ１３。各点は、技術的重複測定の平均を表す。エラーバー：技術的重複における標準偏差。図は少なくとも２つの独立した実験の代表である。
【００２０】
【図３】図３は、ポリペプチド９４９（「ＮＢ９４９」）のウシ軟骨外植片アッセイにおける有効性を示す図である。有効性は、これらの条件下でＩＬ−１α刺激ＧＡＧ放出を完全に阻害する参照小分子アグリカナーゼ阻害剤（ＡＧＧ−５２３、Wyeth）と比較して計算され、これを１００％に設定し、非誘導の軟骨を０％に設定した。
【図４】図４は、ポリペプチド９４９のヒト軟骨外植片アッセイにおける有効性を示す図である。有効性は、これらの条件下でＩＬ−１α刺激ＧＡＧ放出を完全に阻害する参照小分子アグリカナーゼ阻害剤（ＡＧＧ−５２３、Wyeth）と比較して計算され、これを１００％に設定し、非誘導の軟骨を０％に設定した。
【図５】図５は、ウシ外植片アッセイにおける、ポリペプチドのＣＡＰ媒介性軟骨固定の効果を示す図である。
【００２１】
【図６】図６は、ポリペプチド９４９（「C010100949」または「MAC949」）が、共培養物からのＣ２Ｍ（Ｃｏｌ ＩＩ分解＝構造）およびＣ３Ｍ（Ｃｏｌ ＩＩＩ分解＝症状に関連）の放出を阻害することを示す図である。
【図７】図７は、軟骨の保持：異なる時点における、ラットの局所ナノボディ構築物濃度を示す図である。
【図８】図８は、異なる群における、内側脛骨の実質的な軟骨変性幅を示す図である。
【図９】図９は、内側脛骨軟骨変性幅を示す図である。
【図１０】図１０は、キャットウォークによる歩行分析を示す図である。
【図１１】図１１は、関節（右膝）あたり４００μｇのナノボディ構築物の単回関節内注射を受けた変形性関節症ラットおよび健康ラットにおけるポリペプチドの、初回投与後の時間（ｈ）に対する血清濃度（ｎｇ／ｍｌ単位の平均濃度）を示す図である。点は、健康な動物の個々の濃度を表す；三角形は、ＯＡ動物の個々の濃度を表す；および線は平均の濃度を表す。
【００２２】
５．詳細な説明
安全で効果的なＯＡ医薬品、特にＤＭＯＡＤの必要性が残されている。これらの医薬は、特に広く適用可能なフォーマットが意図される場合、様々な頻繁に対立する要件に適合する必要がある。かかるフォーマットは、好ましくは広範囲の患者に有用であるべきである。フォーマットは好ましくは安全であり、頻繁な投与による感染を誘発しない。加えてフォーマットは、好ましくは患者に優しく、例えば、便利な投与計画および投与経路、例えば全身投与を許容する。例えば、投与されると、フォーマットは循環から即座に除去されないことが好ましい。ただし、半減期を延長しても、好ましくは標的外の活性や副作用が生じたり、有効性が制限されるべきではない。
本発明は、これらの要件の少なくとも１つを実現する。
従来にはないスクリーニング、特性評価、および組み合わせ戦略に基づいて、本発明者らは驚くべきことに、免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）が、in vitro、ex vivoおよびin vivo実験で非常に良好に機能することを観察した。
【００２３】
さらに本発明者らは、ＩＳＶＤを再操作して、ＯＡの改善において比較薬よりもさらに優れた性能を発揮させることができた。また本発明のＩＳＶＤは、先行技術の化合物よりも有意に安全であることが実証された。
さらに本発明者らは、ＭＭＰ１３阻害剤、ＡＤＡＭＴＳ５阻害剤およびアグリカン結合剤を含む様々な機能性を組み合わせることにより、阻害剤のいずれかよりもさらに優れた効果が得られることを実証した。
本発明は、ＣＡＰ結合剤に結合した、ＡＤＡＭＴＳ、特にＡＤＡＭＴＳ５に拮抗するＩＳＶＤ、および／またはＭＭＰ、特にＭＭＰ１３に拮抗するＩＳＶＤの組み合わせであって、従来技術のアミノ酸配列および抗体と比較して、より安全なプロファイルを含む改善された予防的、治療的および／または薬理学的特性を有するものを提供することを意図する。
【００２４】
したがって、本発明は、以下からなる群から選択されるポリペプチドに関する：
（ａ）少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドであって、ここで第１のＩＳＶＤはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に特異的に結合し、第２のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第３のＩＳＶＤを含む、前記ポリペプチド；
（ｂ）少なくとも２つのＩＳＶＤを含むポリペプチドであって、ここで第１のＩＳＶＤはトロンボスポンジンモチーフを有するＡディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）に特異的に結合し、第２のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第３のＩＳＶＤを含む、前記ポリペプチド；および
（ｃ）少なくとも３つのＩＳＶＤを含むポリペプチドであって、ここで第１のＩＳＶＤはＭＭＰに特異的に結合し、第２のＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳに特異的に結合し、第３のＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合する、および任意にアグリカンに特異的に結合する第４のＩＳＶＤを含む、前記ポリペプチド。
【００２５】
別に示されているか定義されていない限り、使用されるすべての用語は、当業者には明白であろうこの分野でのそれらの通常の意味を有する。例えば、次のような標準的なハンドブックが参照される：Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2nd Ed.) Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)、F. Ausubel et al. (Current protocols in molecular biology, Green Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987)、Lewin (Genes II, John Wiley & Sons, New York, N.Y., 1985)、Old et al. (Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering (2nd edition) University of California Press, Berkeley, CA, 1981)；Roitt et al. (Immunology (6th Ed.) Mosby/Elsevier, Edinburgh, 2001)、Roitt et al. (Roitt’s Essential Immunology (10th Ed.) Blackwell Publishing, UK, 2001)、およびJaneway et al. (Immunobiology (6th Ed.) Garland Science Publishing/Churchill Livingstone, New York, 2005)、ならびに本明細書で引用する一般的な背景技術。
【００２６】
別に示されていない限り、特に詳細に説明されていないすべての方法、ステップ、技術、および操作は、それ自体既知の様式で実行でき、また実行されており、これは当業者には明らかであろう。例えば、本明細書で言及される標準ハンドブックおよび一般的な背景技術、ならびにそこに引用されているさらなる参考文献が再び参照され；また、例えば、以下のレビューも参照される：Presta (Adv. Drug Deliv. Rev. 58 (5-6): 640-56, 2006)、Levin and Weiss (Mol. Biosyst. 2(1): 49-57, 2006)、Irving et al. (J. Immunol. Methods 248(1-2): 31-45, 2001)、Schmitz et al. (Placenta 21 Suppl. A: S106-12, 2000)、Gonzales et al. (Tumour Biol. 26(1): 31-43, 2005)；これらは、親和性成熟などのタンパク質工学技術、および免疫グロブリンなどのタンパク質の特異性およびその他の望ましい特性を改善するためのその他の技術について、説明している。
【００２７】
本明細書で使用される場合、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の言及を含むことに留意すべきである。したがって例えば、１つの「試薬」への言及には、かかる異なる試薬の１つ以上が含まれ、「方法」への言及には、改変され得るかまたは本明細書に記載の方法で置換され得る、当業者に知られている同等のステップおよび方法への言及が含まれる。
特に明記しない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連のすべての要素を指すと理解されるべきである。当業者は、日常的な実験のみを使用して、本明細書に記載された本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または確認することができるであろう。かかる均等物は、本発明に含まれることが意図されている。
用語「および／または」は、本明細書で使用される場合は常に、「および」、「または」、および「前記用語によって接続される要素のすべてまたは任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
【００２８】
本明細書で使用される場合、用語「約」または「およそ」は、所与の値または範囲の２０％以内、好ましくは１５％以内、より好ましくは１０％以内、おとび最も好ましくは５％以内を意味する。
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通して、文脈が特に必要としない限り、「含む」という単語、および「含む」および「含むこと」などの変形は、述べられた整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを含むが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップのグループを除外しない、ということを意味する。本明細書で使用する場合、「含む（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」または「含む（including）」という用語で置き換えることができ、または場合によっては本明細書において、「有する」という用語を使用することもできる。
本明細書で使用される場合、用語「配列」（例えば、「免疫グロブリン配列」、「抗体配列」、「可変ドメイン配列」、「ＶＨＨ配列」または「タンパク質配列」などの用語）は、一般に、文脈がより限定された解釈を必要としない限り、関連するアミノ酸配列ならびにこれをコードする核酸またはヌクレオチド配列の両方を含むと理解されるべきである。
アミノ酸配列は、文脈に依存して、単一のアミノ酸または、２つ以上のアミノ酸の分岐していない配列を意味すると解釈される。ヌクレオチド配列は、３つ以上のヌクレオチドの非分岐配列を意味すると解釈される。
【００２９】
アミノ酸は、天然のタンパク質に一般的に見られるＬ−アミノ酸である。アミノ酸残基は、標準の３文字または１文字のアミノ酸コードに従って示される。例えば、WO 08/020079の４８頁表Ａ−２を参照されたい。Ｄ−アミノ酸を含むこれらのアミノ酸配列は、この定義に含まれることを意図しない。翻訳後修飾されたアミノ酸を含むアミノ酸配列は、この表Ａ−２に示されている記号および、例えばヒドロキシル化またはグリコシル化などの修飾位置を使用して、最初に翻訳されるアミノ酸配列として説明し得るが、しかしこれらの修飾は、アミノ酸配列に明示的に示されてはならない。配列修飾された結合、架橋およびエンドキャップ、非ペプチジル結合などとして発現できるペプチドまたはタンパク質はすべて、当技術分野で知られているように、この定義に含まれる。
【００３０】
用語「タンパク質」、「ペプチド」、「タンパク質／ペプチド」、および「ポリペプチド」は、本開示を通して交換可能に使用され、それぞれは本開示の目的に対して同じ意味を有する。各用語は、２つ以上のアミノ酸の直鎖でできた有機化合物を指す。化合物は、１０以上のアミノ酸、２５以上のアミノ酸；５０以上のアミノ酸；１００以上のアミノ酸、２００以上のアミノ酸、さらには３００以上のアミノ酸を有し得る。当業者は、以下を理解するであろう：すなわち、ポリペプチドは一般にタンパク質よりも少ないアミノ酸を含むが、しかしポリペプチドとタンパク質を区別するアミノ酸の数の、当技術分野で認識されているカットオフポイントは存在しないこと；ポリペプチドは、化学合成または組換え法により作成できること；および、タンパク質は一般に、当分野で 知られている組換え方法によりin vitroまたはin vivoで作製されること。慣例により、ポリペプチドの一次構造のアミド結合は、アミノ酸が書かれている順序の通りであり、ここでポリペプチドのアミン末端（Ｎ末端）は常に左側にあり、酸末端（Ｃ末端）は右側にある。
【００３１】
核酸またはアミノ酸配列が、「（本質的に）単離された（形態）（にある）」と見なされるのは、−例えば、それが得られた反応培地または培養培地と比較して−、上記ソースまたは培地と通常関連している少なくとも１つの別の成分から、例えば別の核酸、別のタンパク質／ポリペプチド、別の生物学的成分または高分子、または少なくとも１つの汚染物質、不純物または微量成分などから、分離された場合である。特に、核酸またはアミノ酸配列は、少なくとも２倍、特に少なくとも１０倍、より特に少なくとも１００倍、および最大１０００倍またはそれ以上まで精製されている場合に、「（本質的に）単離された」と見なされる。「（本質的に）単離された形態にある」核酸またはアミノ酸は、適切な技術を使用して、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動などの適切なクロマトグラフィー技術を使用して決定されるように、好ましくは本質的に均質である。
【００３２】
ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、それぞれ別のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を「含む」、または別のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列から「本質的になる」と言われる場合、これは、後者のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が、最初に言及されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列それぞれに組み込まれていることを意味し得るが、より一般的には、これは一般に、最初に言及されたヌクレオチド配列またはアミノ酸配列がその配列内に、後者の配列と同じヌクレオチド配列またはアミノ酸配列それぞれを有する、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基のストレッチそれぞれを含むことを意味し、最初に言及された配列が実際にどのように生成または取得されたか（例えば、本明細書に記載の任意の適切な方法による）には関係しない。非限定的な例により、本発明のポリペプチドが、免疫グロブリン単一可変ドメイン（「ＩＳＶＤ」）を含むと言われる場合、これは、前記免疫グロブリン単一可変ドメイン配列が、本発明のポリペプチドの配列に組み込まれたことを意味し得るが、より通常には、これは一般に、本発明のポリペプチドがどのように生成または取得されたかに関係なく、本発明のポリペプチドがその配列内に、免疫グロブリン単一可変ドメインの配列を含むことを意味する。また、核酸またはヌクレオチド配列が別のヌクレオチド配列を含むと言われる場合、最初に言及された核酸またはヌクレオチド配列は、これが発現産物（例えばポリペプチド）に発現されるときに、後者のヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列が前記発現産物の一部を形成している（言い換えると、後者のヌクレオチド配列は、最初に言及されたより大きな核酸またはヌクレオチド配列と同じリーディングフレームにある）。また、本発明の構築物がポリペプチドまたはＩＳＶＤを含むと言われる場合、これは、前記構築物が、前記ポリペプチドまたはＩＳＶＤをそれぞれ、少なくとも包含することを意味し得るが、より一般的には、これは、前記構築物が、前記ポリペプチドまたはＩＳＶＤに加えて、基、残基（例えばアミノ酸残基）、部分および／または結合単位を包含することを意味し、ここで前記ポリペプチドまたはＩＳＶＤが前記の基、残基（例えば、アミノ酸残基）、部分および／または結合単位にどのように接続されているかには関係せず、および前記構築物がどのように生成または取得されたかにも関係しない。
【００３３】
「本質的に〜からなる」とは、本発明で使用されるＩＳＶＤが、本発明のＩＳＶＤと全く同一であるか、または、本発明の次のようなＩＳＶＤに対応することを意味する：すなわち、限られた数のアミノ酸残基、例えば１〜２０アミノ酸残基など、例えば１〜１０のアミノ酸残基、好ましくは１〜６のアミノ酸残基、例えば１、２、３、４、５または６個のアミノ酸残基を、ＩＳＶＤのアミノ末端、カルボキシ末端、またはアミノ末端とカルボキシ末端の両方に付加されて有するＩＳＶＤ。
２つ以上のヌクレオチド配列を比較するために、第１ヌクレオチド配列と第２ヌクレオチド配列の間の「配列同一性」のパーセンテージは、次のように計算することができる：［第２ヌクレオチド配列内の対応する位置のヌクレオチドと同一の、第１ヌクレオチド配列内のヌクレオチドの数］を、［第１ヌクレオチド配列内のヌクレオチドの総数］で除算し、［１００％］を掛ける；ここで、第１ヌクレオチド配列と比較した、第２ヌクレオチド配列内のヌクレオチドの各欠失、挿入、置換または追加は、単一のヌクレオチド（位置）における違いと見なされる。代替的に、２つ以上のヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、NCBI Blast v2.0などの配列アラインメントのための既知のコンピューターアルゴリズムを使用して、標準設定を用いて計算され得る。配列同一性の程度を決定するための他のいくつかの技術、コンピューターアルゴリズムおよび設定は、例えば、WO 04/037999、EP 0967284、EP 1085089、WO 00/55318、WO 00/78972、WO 98/49185およびGB 2357768に記載されている。通常、上記で概説した計算方法に従って２つのヌクレオチド配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的で、最大数のヌクレオチドを有するヌクレオチド配列が「第１」ヌクレオチド配列とされ、他のヌクレオチド配列が「第２」ヌクレオチド配列とされる。
【００３４】
２つ以上のアミノ酸配列を比較するために、第１アミノ酸配列と第２アミノ酸配列の間の「配列同一性」のパーセンテージ（本明細書では「アミノ酸同一性」とも呼ばれる）は、次のように計算することができる：［第２アミノ酸配列内の対応する位置のアミノ酸残基と同一の、第１アミノ酸配列内のアミノ酸残基の数］を、［第１アミノ酸配列内のアミノ酸残基の総数］で除算し、［１００％］を掛ける；ここで、第１アミノ酸配列と比較した、第２アミノ酸配列内のアミノ酸残基の各欠失、挿入、置換または追加は、単一のアミノ酸残基（位置）における違い、すなわち本明細書で定義される「アミノ酸差異」と見なされる。代替的に、２つ以上のアミノ酸配列間の配列同一性の程度は、ヌクレオチド配列の配列同一性の程度を決定するための上記のような既知のコンピューターアルゴリズムを使用して、再度標準設定を用いて計算され得る。通常、上記で概説した計算方法に従って２つのアミノ酸配列間の「配列同一性」のパーセンテージを決定する目的で、最大数のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列が「第１」アミノ酸配列とされ、他のアミノ酸配列が「第２」アミノ酸配列とされる。
【００３５】
また、２つのアミノ酸配列間の配列同一性の程度を決定する際に、当業者はいわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮してもよく、これは一般的に、アミノ酸残基が類似の化学構造の別のアミノ酸残基で置換されるが、ポリペプチドの機能、活性または他の生物学的特性にほとんどまたは本質的に影響を与えないアミノ酸置換として説明することができる。かかる保存的アミノ酸置換は、当分野において、例えばWO 04/037999、GB 335768、WO 98/49185、WO 00/46383およびWO 01/09300からよく知られており；およびかかる置換の（好ましい）種類および／または組み合わせは、WO 04/037999ならびにWO 98/49185およびそこに引用されているさらなる参考文献からの関連する教示に基づいて選択され得る。
【００３６】
かかる保存的置換は、好ましくは、以下のグループ（ａ）〜（ｅ）内の１つのアミノ酸が、同じグループ内の別のアミノ酸残基で置換される置換である：（ａ）小さな脂肪族、非極性またはわずかに極性の残基：Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ；（ｂ）極性の負に帯電した残基およびそれらの（非帯電）アミド：Ａｓｐ、Ａｓｎ、ＧｌｕおよびＧｌｎ；（ｃ）極性の正に帯電した残基：Ｈｉｓ、Ａｒｇ、およびＬｙｓ；（ｄ）大きな脂肪族非極性残基：Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、ＶａｌおよびＣｙｓ；（ｅ）芳香族残基：Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ。特に好ましい保存的置換は、以下の通りである：Ａｌａを、ＧｌｙまたはＳｅｒへ；ＡｒｇをＬｙｓへ；Ａｓｎを、ＧｌｎまたはＨｉｓへ；ＡｓｐをＧｌｕへ；ＣｙｓをＳｅｒへ；ＧｌｎをＡｓｎへ；ＧｌｎをＡｓｐへ；Ｇｌｙを、ＡｌａまたはＰｒｏへ；Ｈｉｓを、ＡｓｎまたはＧｌｎへ；Ｉｌｅを、ＬｅｕまたはＶａｌへ；Ｌｅｕを、ＩｌｅまたはＶａｌへ；Ｌｙｓを、Ａｒｇ、Ｇｌｎ、またはＧｌｕへ；Ｍｅｔを、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、またはＩｌｅへ；Ｐｈｅを、Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、またはＴｙｒへ；ＳｅｒをＴｈｒへ；ＴｈｒをＳｅｒへ；ＴｒｐをＴｙｒへ；ＴｙｒをＴｒｐへ；および／またはＰｈｅを、Ｖａｌ、ＩｌｅまたはＬｅｕへ。
【００３７】
本明細書に記載のポリペプチドに適用される任意のアミノ酸置換はまた、Schulz et al. (“Principles of Protein Structure”, Springer-Verlag, 1978)によって開発された異なる種の相同タンパク質の間のアミノ酸変異の頻度の分析、Chou and Fasman (Biochemistry 13: 211, 1974; Adv. Enzymol., 47: 45-149, 1978)によって開発された構造形成可能性の分析、およびEisenberg et al. (Proc. Natl. Acad Sci. USA 81: 140-144, 1984)、Kyte and Doolittle (J. Molec. Biol. 157: 105-132, 1981)およびGoldman et al. (Ann. Rev. Biophys. Chem. 15: 321-353, 1986)によって開発されたタンパク質の疎水性パターンの分析に、基づいてもよい；これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ナノボディの一次、二次および三次構造に関する情報は、本明細書の説明および上記で引用した一般的な背景技術に記載されている。また、この目的のために、ラマからのＶＨＨドメインの結晶構造は、例えば、Desmyter et al. (Nature Structural Biology, 3: 803, 1996)、Spinelli et al. (Natural Structural Biology, 3: 752-757, 1996)およびDecanniere et al. (Structure, 7 (4): 361, 1999)により与えられている。従来のＶＨドメインにおいてＶＨ／ＶＬ界面を形成するいくつかのアミノ酸残基、およびこれらの位置での潜在的なラクダ化置換についてのさらなる情報は、上記の先行技術に見出すことができる。
【００３８】
アミノ酸配列および核酸配列は、それらがその全長にわたって１００％の配列同一性（本明細書で定義されるもの）を有する場合、「完全に同一」と言われる。
２つのアミノ酸配列を比較する場合、用語「アミノ酸差異（amino acid difference）」は、第２の配列と比較した、第１の配列の位置にある単一のアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を指す；２つのアミノ酸配列が、１つ、２つまたはそれ以上のかかるアミノ酸差異を含み得ることが理解されている。より具体的には、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドにおいて、用語「アミノ酸差異」は、（ｂ）、（ｄ）または（ｆ）で特定されるＣＤＲ配列の位置上の、それぞれ（ａ）、（ｃ）または（ｅ）のＣＤＲ配列と比較した、単一アミノ酸残基の挿入、欠失、または置換を指す。（ｂ）、（ｄ）および（ｆ）のＣＤＲ配列は、それぞれ（ａ）、（ｃ）または（ｅ）のＣＤＲ配列と比較して、１、２、３、４または最大５個のかかるアミノ酸差異を含み得ることが理解される。
【００３９】
「アミノ酸差異」は、任意の１、２、３、４または最大５個の置換、欠失または挿入、またはそれらの任意の組み合わせであることができ、これは、本発明のＩＳＶＤ、すなわち、本発明のポリペプチドなどの、本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤、本発明のＭＭＰ１３結合剤、および／または本発明のアグリカン結合剤の、特性を改善するか、または、本発明のＩＳＶＤ、すなわち、本発明のポリペプチドなどの、本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤、本発明のＭＭＰ１３結合剤、および／または本発明のアグリカン結合剤の所望の特性から、または所望の特性のバランスもしくは組み合わせから、少なくとも過度に低減のないものである。この点において、得られた本発明のポリペプチドは、１、２、３、４、または最大５個の置換、欠失、または挿入なしの１つ以上のＣＤＲ配列を含むポリペプチドと比較して、少なくとも、同じ、ほぼ同じ、またはより高い親和性で、アグリカンおよびＭＭＰ１３および／またはＡＤＡＭＴＳ５に結合すべきである。親和性は、当分野で 知られている任意の適切な方法により測定され得るが、好ましくは、実施例の節に記載の方法により測定される。
【００４０】
この点において、本明細書に示される（ｂ）、（ｄ）および／または（ｆ）によるＣＤＲのアミノ酸配列は、それ自体知られているかまたは実施例に記載されているような親和性成熟の１つ以上の技術を使用した親和性成熟を用いた、それぞれ（ａ）、（ｃ）および／または（ｅ）によるアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列であってよい。例えば、本発明のポリペプチドの発現に使用される宿主生物に応じて、かかる欠失および／または置換は、翻訳後修飾のための１つ以上の部位（１つ以上のグリコシル化部位など）が削除されるように設計され得、これは当業者の能力の範囲内であろう（実施例を参照）。
本明細書で使用される「ナノボディファミリー」、「ＶＨＨファミリー」または「ファミリー」とは、同一の長さを有するナノボディおよび／またはＶＨＨ配列のグループを指し（すなわち、それらはその配列内に同じ数のアミノ酸を有する）、そのうち、位置８と位置１０６（Kabat番号付けによる）の間のアミノ酸配列は、８９％以上のアミノ酸配列同一性を有する。
【００４１】
互換的に使用可能な用語「エピトープ」および「抗原決定基」とは高分子の一部を指し、例えば免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／または本発明のポリペプチドなどの、抗原結合分子によって、より具体的には前記分子の抗原結合部位によって認識される、ポリペプチドまたはタンパク質である。エピトープは、免疫グロブリンに対する最小結合部位を定義し、したがって免疫グロブリンの特異性の標的を表す。
エピトープを認識する抗原結合分子（免疫グロブリン、従来の抗体、免疫グロブリン単一可変ドメインおよび／または本発明のポリペプチドなど）の一部は、「パラトープ」と呼ばれる。
特定のエピトープ、抗原またはタンパク質（またはその少なくとも一部、断片またはエピトープ）に対して、「結合」または「特異的に結合」できるか、「親和性を有する」か、および／または「特異性を有する」アミノ酸配列（本発明の免疫グロブリン単一可変ドメイン、抗体、ポリペプチド、または一般にその抗原結合タンパク質またはポリペプチドまたは断片）は、前記エピトープ、抗原またはタンパク質に「対する」または「向けられる」と言われるか、またはかかるエピトープ、抗原またはタンパク質に関する「結合」分子であるか、または「抗」エピトープ、「抗」抗原または「抗」タンパク質（例えば、「抗」アグリカン、「抗」ＭＭＰ１３、および／または「抗」ＡＤＡＭＴＳ５）であると言われる。
【００４２】
親和性は、分子相互作用の強度または安定性を示す。親和性は通常、ＫＤ、または解離定数として与えられ、これはモル／リットル（またはＭ）の単位を有する。親和性は会合定数ＫＡとして表すこともでき、これは１／ＫＤに等しく、（モル／リットル）−１（またはＭ−１）の単位を有する。本明細書において、２つの分子間の相互作用の安定性は、主にそれらの相互作用のＫＤ値に関して表される。ＫＡ＝１／ＫＤの関係を考慮して、分子相互作用の強度をそのＫＤ値によって指定することを用いて、対応するＫＡ値を計算できることは、当業者には明らかである。ＫＤ値はまた、分子相互作用の強度を熱力学的意味でも特徴付けるが、これはＫＤ値が、結合の自由エネルギー（ＤＧ）の変化に、よく知られている関係ＤＧ＝ＲＴ．ｌｎ（ＫＤ）（等価的にＤＧ＝−ＲＴ．ｌｎ（ＫＡ））（式中、Ｒは気体定数、Ｔは絶対温度、ｌｎは自然対数を表す）によって関連するためである。
重要（例えば特異的）と考えられる生物学的相互作用のＫＤは、通常１０−１２Ｍ（０．００１ｎＭ）〜１０−５Ｍ（１００００ｎＭ）の範囲である。相互作用が強いほど、ＫＤは低くなる。
【００４３】
ＫＤは、ｋｏｆｆで表される複合体の解離速度定数と、ｋｏｎで表されるその会合速度との比として表すこともできる（したがってＫＤ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎおよびＫＡ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ）。オフレートｋｏｆｆの単位はｓ−１である（ｓは秒のＳＩ単位表記である）。オンレートｋｏｎの単位はＭ−１ｓ−１である。オンレートは、１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１の間で変化し、二分子相互作用の拡散律速会合速度定数に近づく。オフレートは、関係ｔ１／２＝ｌｎ（２）／ｋｏｆｆによって、特定の分子相互作用の半減期に関連している。オフレートは、１０−６ｓ−１（複数日数のｔ１／２を有する不可逆的な複合体に近い）〜１ｓ−１（ｔ１／２＝０．６９ｓ）の間で変化し得る。
ＩＳＶＤなどの抗原結合タンパク質の、抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば飽和結合アッセイおよび／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイを含む、それ自体既知の任意の適切な方法、および当技術分野でそれ自体知られているそれらの様々な変形、ならびに本明細書で言及される他の技術により、決定することができる。
【００４４】
２つの分子間の分子相互作用の親和性は、それ自体が既知の異なる技術によって測定でき、例えば、周知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）バイオセンサー技術などであり（例えば、Ober et al. 2001, Intern. Immunology 13: 1551-1559）ここで、一方の分子はバイオセンサーチップに固定され、もう一方の分子は、ｋｏｎ、ｋｏｆｆの測定、したがってＫＤ（またはＫＡ）値をもたらすフロー条件下で、固定された分子上を通過する。これは例えば、よく知られているBIACORE（登録商標）機器（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden）を使用して実行できる。Kinetic Exclusion Assay（KINEXA（登録商標）機器）（Drake et al. 2004, Analytical Biochemistry 328: 35-43）は、結合パートナーの標識なしで溶液中の結合イベントを測定し、複合体の解離を動力学的に除外することに基づいている。溶液内親和性分析はまた、自動化されたバイオ分析と迅速な試料ターンアラウンドのプラットフォームを提供するGYROLAB（登録商標）イムノアッセイシステム（Fraley et al. 2013, Bioanalysis 5: 1765-74）、またはＥＬＩＳＡを使用して実行することもできる。
【００４５】
また、測定プロセスが、例えばある分子のバイオセンサーのコーティングに関連するアーチファクトにより、意味された分子の固有の結合親和性に何らかの影響を与える場合、測定されたＫＤが見かけのＫＤに対応し得ることも当業者には明らかであろう。また、１つの分子が他の分子に対する複数の認識部位を含む場合、見かけのＫＤを測定してもよい。かかる状況において、測定された親和性は、２つの分子による相互作用の結合力の影響を受ける可能性がある。特に、ＫＤの正確な測定は非常に労働集約的である可能性があり、その結果、見かけ上のＫＤ値が、２つの分子の結合強度を評価するためにしばしば決定される。すべての測定が一貫した方法で行われる限り（例えば、アッセイ条件を変更しない限り）、見かけのＫＤ測定を真のＫＤの近似値として使用できるため、本書ではＫＤおよび見かけのＫＤは、同等の重要性または関連性で扱うべきである。
【００４６】
「特異性」という用語は、特定の抗原結合分子または抗原結合タンパク質（本発明のポリペプチドまたはＩＳＶＤなど）分子が結合できる、抗原または抗原決定基の異なる種類の数を指す。抗原結合タンパク質の特異性は、例えば、WO 08/020079（参照により本明細書に組み込まれる）の５３〜５６頁に記載されているように、親和性および／または結合力に基づいて決定することができ、ここには、抗原結合分子（本発明のポリペプチドまたはＩＳＶＤなど）と関連抗原の間の結合を測定するためのいくつかの好ましい技術も記載されている。典型的には、抗原結合タンパク質（本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなど）は、解離定数（ＫＤ）として１０−５〜１０−１２モル／リットル以下、好ましくは１０−７〜１０−１２モル／リットル以下、およびより好ましくは１０−８〜１０−１２モル／リットルで、それらの抗原に結合する（すなわち、会合定数（ＫＡ）として１０５〜１０１２リットル／モル以上、好ましくは１０７〜１０１２リットル／モル以上、およびより好ましくは１０８〜１０１２リットル／モル）。１０−４モル／リットルを超える任意のＫＤ値（または１０４リットル／モル未満の任意のＫＡ値）は、一般に、非特異的結合を示すと考えられる。好ましくは、本発明の一価ＩＳＶＤは、所望の抗原に、５００ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１０ｎＭ未満、例えば５００ｐＭ未満、例えば１０〜５ｐＭ以下などの親和性で、結合するであろう。WO 08/020079の５３〜５６頁の段落ｎ）も参照されたい。
【００４７】
ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドが、別の（第２）標的または抗原と比較して（第１）標的または抗原に「特異的」であると言われるのは、ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドが第１の抗原に、ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原に結合する場合の親和性よりも、（上記のように、およびＫＤ値、ＫＡ値、Ｋｏｆｆレートおよび／またはＫｏｎレートとして適切に表現されて）少なくとも１０倍、例えば少なくとも１００倍、好ましくは少なくとも１０００倍以上の親和性で結合する場合である。例えば、ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドは、第１の標的または抗原に、前記ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドが第２の標的または抗原に結合するＫＤよりも少なくとも１０分の１、例えば少なくとも１００分の１、および好ましくは少なくとも１０００分の１、またはさらに小さいＫＤ値で、結合し得る。好ましくは、ＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドが、第１の標的または抗原に対して、第２の標的または抗原と比較して「特異的」である場合、（本明細書で定義されるように）これは前記第１の標的または抗原には向けられるが、前記第２の標的または抗原には向けられない。
【００４８】
抗原結合タンパク質の抗原または抗原決定基への特異的結合は、例えば飽和結合アッセイおよび／または競合結合アッセイ、例えばラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）およびサンドイッチ競合アッセイなどを含む、それ自体既知の任意の適切な方法、および当技術分野で知られているそれらの異なる変形、ならびに本明細書で言及される他の技術により、決定することができる。
親和性を評価するために使用できる好ましいアプローチは、Friguet et al. 1985 (J. Immunol. Methods 77: 305-19)の２ステップＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）手順である。この方法は、液相結合平衡測定を確立し、プラスチックなどの支持体への１つの分子の吸着に関連する、起こりうるアーチファクトを回避する。当業者には明らかなように、解離定数は実際のまたは見かけの解離定数であってよい。解離定数を決定する方法は当業者には明らかであり、例えばWO 08/020079の５３〜５６頁に記載されている技術が含まれる。
【００４９】
最後に、多くの状況において、経験ある科学者はある参照分子に対する結合親和性を決定するのが便利であると判断し得ることに、注意すべきである。例えば、分子ＡとＢの間の結合強度を評価するために、例えばＢに結合することが知られており、かつ発蛍光団または発色団または他の化学成分で好適に標識されている、例えばＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ（蛍光活性化セルソーティング）または他のフォーマット（蛍光検出用の発蛍光団、光吸収検出用の発色団、ストレプトアビジン媒介ＥＬＩＳＡ検出用のビオチン）についてのビオチンなどで好適に標識されている、参照分子Ｃを使用し得る。通常、参照分子Ｃを固定濃度に維持し、Ａの濃度をＢの特定の濃度または量に対して変化させる。その結果、Ａの不在下でＣについて測定されたシグナルが半分になるところでのＡの濃度に対応する、ＩＣ５０値が得られる。参照分子のＫＤであるＫＤｒｅｆ、および参照分子の総濃度ｃｒｅｆが既知である場合、相互作用Ａ−Ｂの見かけのＫＤは、次の式から得られる：ＫＤ＝ＩＣ５０／（１＋ｃｒｅｆ／ＫＤｒｅｆ）。ｃｒｅｆ＜＜ＫＤｒｅｆ、ＫＤ≫ＩＣ５０であることに注意。ＩＣ５０の測定が、比較される結合剤について一貫した方法で行われる場合（例えば、ｃｒｅｆを固定するなど）、分子相互作用の強度または安定性の違いを、ＩＣ５０を比較することで評価でき、この測定は、このテキスト全体でＫＤまたは見かけのＫＤに等価であると判断される。
【００５０】
半数阻害濃度（ＩＣ５０）はまた、例えば薬理効果などの生物学的または生化学的機能を阻害することにおける、化合物の有効性の尺度でもある。この定量的尺度は、一定の生物学的プロセス（またはプロセスの成分、すなわち、酵素、細胞、細胞受容体、走化性、退形成、転移、侵襲性など）を半分に阻害するために必要な、ポリペプチドまたはＩＳＶＤ（ナノボディなど）の量を示す。言い換えれば、これは物質の最大半数（５０％）阻害濃度（ＩＣ）（５０％ＩＣ、またはＩＣ５０）である。ＩＣ５０値は、本発明のポリペプチドまたはＩＳＶＤ（例えばナノボディ）などの所定のアンタゴニストについて、アゴニストの最大生物学的応答の半分を阻害するために必要な濃度を決定することにより、計算することができる。薬物のＫＤは、用量反応曲線を作成し、本発明のポリペプチドまたはＩＳＶＤ（例えばナノボディ）などのアンタゴニストの異なる濃度が、アゴニスト活性を逆転させる効果を調べることにより、決定することができる。
【００５１】
半数効果濃度（ＥＣ５０）という用語は、指定された暴露時間の後、ベースラインと最大の中間の反応を引き起こす化合物の濃度を指す。本文脈において、これは、ポリペプチド、ＩＳＶＤ（例えばナノボディ）の効力の尺度として使用される。段階的用量反応曲線のＥＣ５０は、最大効果の５０％が観察される化合物の濃度を表す。濃度は、モル単位で表されることが好ましい。
生物学的システムにおいて、リガンド濃度のわずかな変化は、典型的には、Ｓ字関数に従った急速な応答の変化をもたらす。リガンド濃度の増加に伴う応答の増加が鈍化し始める変曲点が、ＥＣ５０である。これは、適合線の導出によって数学的に決定できる。推定のためにグラフに依存することは、ほとんどの場合に便利である。ＥＣ５０が実施例の節で提供されている場合、実験は、ＫＤを可能な限り正確に反映するように設計されている。すなわち、ＥＣ５０値はＫＤ値と見なされる。用語「平均ＫＤ」は、少なくとも１回、しかし好ましくは１回より多くの、例えば少なくとも２回の実験で得られた、平均ＫＤ値に関する。「平均」という用語は、数学用語の「平均」（データの合計をデータのアイテムの数で割ったもの）を指す。
【００５２】
これはまた、化合物の阻害（５０％阻害）の尺度であるＩＣ５０にも関連している。競合結合アッセイおよび機能的アンタゴニストアッセイの場合、ＩＣ５０は用量反応曲線の最も一般的な要約測度である。アゴニスト／刺激剤アッセイの場合、最も一般的な要約測度は、ＥＣ５０である。
阻害定数（Ｋｉ）は、阻害剤がどれだけ強力かを示す指標である；これは、半数阻害をもたらすのに必要な濃度である。実験条件に応じて変化するＩＣ５０とは異なり、Ｋｉは絶対値であり、しばしば薬物の阻害定数と呼ばれる。阻害定数Ｋｉは、次のCheng-Prusoff方程式を使用して計算できる：
【数１】
2020523986.tif 000003
式中、［Ｌ］はリガンドの固定濃度である。
【００５３】
本明細書で使用される、本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤの「効力」という用語は、その特定の効果が生じるのに必要な本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤの量の関数である。これは、本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤが、ＭＭＰ１３の活性を調節および／または部分的もしくは完全に阻害するか、および／またはＡＤＡＭＴＳ５の活性を調節および／または部分的もしくは完全に阻害する能力を指す。
特にこれは、前記ポリペプチドの、本明細書で定義されるＭＭＰ１３活性を低下させるか、または完全に阻害する能力を指す場合がある。したがってこれは、前記ポリペプチドのタンパク質分解を阻害する能力、例えばアグリカン、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＸ、コラーゲンＸＩＶおよびゼラチンなどの基質と結合する、プロテアーゼ活性、エンドペプチダーゼ活性を阻害する能力を指し得る。
【００５４】
特にこれは、前記ポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤの、本明細書で定義されるＡＤＡＭＴＳ５活性、および／または本明細書で定義されるＭＭＰ１３活性を、低下させるか、さらには完全に阻害する能力を指し得る。効力は、当技術分野で知られているか、または本明細書に記載されている任意の適切なアッセイによって測定され得る。本明細書で使用される「アグリカナーゼ活性」は、アグリカンのタンパク質分解的切断として定義される。
本発明のポリペプチドの「有効性」は、効果自体の最大強度を、飽和ポリペプチド濃度において測定する。有効性は、本発明のポリペプチドから達成可能な最大応答を示す。これは、ポリペプチドが所望の（治療）効果を生み出す能力を指す。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５に、例えばGyrolabまたはKinExAによって決定される場合、ＫＤとして１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１３Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、好ましくは最大で１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍもしくは１Ｅ−０９Ｍ未満、または１Ｅ−１０Ｍ未満、例えば５Ｅ−１１Ｍ、４Ｅ−１１Ｍ、３Ｅ−１１Ｍ、２Ｅ−１１Ｍ、１．７Ｅ−１１Ｍ、１Ｅ−１１Ｍなど、または５Ｅ−１２Ｍ、４Ｅ−１２Ｍ、３Ｅ−１２Ｍ、１Ｅ−１２Ｍなどで、結合する
【００５５】
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＭＭＰ１３に、例えばGyrolabまたはKinExAによって決定される場合、ＫＤとして１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１３Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、好ましくは最大で１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍもしくは１Ｅ−０９Ｍ未満、または１Ｅ−１０Ｍ未満、例えば５Ｅ−１１Ｍ、４Ｅ−１１Ｍ、３Ｅ−１１Ｍ、２Ｅ−１１Ｍ、１．７Ｅ−１１Ｍ、１Ｅ−１１Ｍなど、または５Ｅ−１２Ｍ、４Ｅ−１２Ｍ、３Ｅ−１２Ｍ、１Ｅ−１２Ｍなどで、結合する
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、アグリカンに、例えばGyrolabまたはKinExAによって決定される場合、ＫＤとして１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１３Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、好ましくは最大で１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍもしくは１Ｅ−０９Ｍ未満、または１Ｅ−１０Ｍ未満、例えば５Ｅ−１１Ｍ、４Ｅ−１１Ｍ、３Ｅ−１１Ｍ、２Ｅ−１１Ｍ、１．７Ｅ−１１Ｍ、１Ｅ−１１Ｍなど、または５Ｅ−１２Ｍ、４Ｅ−１２Ｍ、３Ｅ−１２Ｍ、１Ｅ−１２Ｍなどで、結合する
【００５６】
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えばＳＰＲにより決定される場合、オフレートとして５Ｅ−０４ｓ−１未満、例えば１Ｅ−０４ｓ−１または５Ｅ−０５ｓ−１未満、またはさらに１Ｅ−０５ｓ−１未満で、ＡＤＡＭＴＳ５に結合する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えばＳＰＲにより決定される場合、オフレートとして５Ｅ−０４ｓ−１未満、例えば１Ｅ−０４ｓ−１または５Ｅ−０５ｓ−１未満、またはさらに１Ｅ−０５ｓ−１未満で、ＭＭＰ１３に結合する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えばＳＰＲにより決定される場合、オフレートとして５Ｅ−０４ｓ−１未満、例えば１Ｅ−０４ｓ−１または５Ｅ−０５ｓ−１未満、またはさらに１Ｅ−０５ｓ−１未満で、アグリカンに結合する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えば結合ＥＬＩＳＡ（ＡＤＡＭＴＳ５活性の決定のため）、または競合ＥＬＩＳＡ、競合ＴＩＭＰ−２ ＥＬＩＳＡ、蛍光発生ペプチドアッセイ、蛍光発生コラーゲンアッセイ、もしくはコラーゲン分解アッセイ（ＭＭＰ１３活性の決定のため）によって決定される場合、ＥＣ５０として１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１１Ｍの間で、ＡＤＡＭＴＳ５活性および／またはＭＭＰ１３活性を調節する。
【００５７】
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えばヒトFRETアッセイまたはヒトAlphaLISA（ＡＤＡＭＴＳ５活性の決定のため）、または競合ＥＬＩＳＡ、競合ＴＩＭＰ−２ ＥＬＩＳＡ、蛍光発生ペプチドアッセイ、蛍光発生コラーゲンアッセイ、もしくはコラーゲン分解アッセイ（ＭＭＰ１３活性の決定のため）によって決定される場合、ＩＣ５０として１Ｅ−０７Ｍ〜１Ｅ−１２Ｍの間、例えば１Ｅ−０８Ｍ〜１Ｅ−１１Ｍの間で、ＡＤＡＭＴＳ５の活性および／またはＭＭＰ１３の活性を阻害する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、該ポリペプチドは、ＩＣ５０として最大１Ｅ−０７Ｍ、好ましくは１Ｅ−０８Ｍ、５Ｅ−０９Ｍ、または４Ｅ−９Ｍ、３Ｅ−９Ｍ、２Ｅ−９Ｍ、例えば１Ｅ−９Ｍなどで、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３の酵素活性を阻害する。
【００５８】
ＩＳＶＤまたはポリペプチドなどのアミノ酸配列が、２つの異なる抗原または抗原決定基（例えば、哺乳類の異なる種からのＡＤＡＭＴＳ５、例えばヒトＡＤＡＭＴＳ５、ウシＡＤＡＭＴＳ５、ラットＡＤＡＭＴＳ５、モルモットＡＤＡＭＴＳ５、マウスＡＤＡＭＴＳ５、またはカニクイザルＡＤＡＭＴＳ５、または例えば哺乳類の異なる種からのＭＭＰ１３、例えばヒトＭＭＰ１３、イヌＭＭＰ１３、ウシＭＭＰ１３、ラットＭＭＰ１３、ブタＭＭＰ１３、マウスＭＭＰ１３、ウサギＭＭＰ１３、カニクイザルＭＭＰ１３、または例えば哺乳類の異なる種からのアグリカン、たとえば、ヒトアグリカン、イヌアグリカン、ウシアグリカン、ラットアグリカン、ブタアグリカン、マウスアグリカン、ウサギアグリカン、カニクイザルアグリカン、および／またはアカゲザルアグリカン）に対して「交差反応性である」と言われるのは、これが、これらの異なる抗原または抗原決定基に特異的（本明細書で定義のように）である場合である。ＩＳＶＤまたはポリペプチドは、２つの異なる抗原に対する結合親和性が、２、５、１０、５０、１００倍またはそれ以上に異なる可能性があっても、これらの異なる抗原または抗原決定基に（本明細書で定義されるように）特異的であれば、交差反応性であると考えられることが理解されよう。
【００５９】
ＡＤＡＭＴＳ５は、ＡＤＡＭＴＳ１１、ＡＤＭＰ−２、またはアグリカナーゼ２とも呼ばれる。
ＡＤＡＭＴＳ５の関連する構造情報は、例えば、以下の表Ｂ−１に示すように、UniProtアクセッション番号に見出すことができる（表Ｂを参照）。
表Ｂ−１
【表１】
2020523986.tif 000004
【００６０】
「ヒトＡＤＡＭＴＳ５」とは、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＡＤＡＭＴＳ５を指す。一側面において、本発明のポリペプチドは、Human sapiens、Mus musculus、Cavia Porcellus、Bos taurus、Macaca mulattaおよび/またはRattus norvegicusからのＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、好ましくはヒトＡＤＡＭＴＳ５、好ましくは配列番号６７に特異的に結合する。
ＭＭＰ１３は、ＣＬＧ３またはコラゲナーゼ３、ＭＡＮＤＰ１、ＭＭＰ−１３、マトリックスメタロペプチダーゼ１３、またはＭＤＳＴとしても知られている。ＭＭＰ１３に関連する構造情報は、たとえば、以下の表Ｂ−２に示すように、UniProtアクセッション番号に見出すことができる（表Ｂを参照）。
表Ｂ−２
【表２】
2020523986.tif 000005
【００６１】
「ヒトＭＭＰ１３」とは、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＭＭＰ１３を指す。一側面において、本発明のポリペプチドは、Human sapiens、Mus musculus、Canis lupus、Bos taurus、Macaca mulatta、Rattus norvegicus、Gallus gallus、および／またはP.troglodytesからのＭＭＰ１３に特異的に結合し、好ましくはヒトＭＭＰ１３、好ましくは配列番号６６に特異的に結合する。
アグリカンは、アグリカン１、ＡＣＡＮ、ＡＧＣ１、ＡＧＣＡＮ、ＣＳＰＧＣＰ、ＭＳＫ１６、ＳＥＤＫ、軟骨特異的プロテオグリカンコアタンパク質（ＣＳＰＣＰ）またはコンドロイチン硫酸プロテオグリカン１（ＣＳＰＧ１）としても知られている。アグリカンは、ヒトにおいて、染色体Ｃｈｒ１５：ｑ２６．１に位置するＡＣＡＮ遺伝子によってコードされる。アグリカンに関連する構造情報は、たとえば、以下の表Ｂ−３に示すUniProtアクセッション番号に見出すことができる（表Ｂを参照）。
【００６２】
表Ｂ−３
【表３】
2020523986.tif 000006
「ヒトアグリカン」とは、配列番号６８のアミノ酸配列を含むアグリカンを指す。一側面において、本発明のポリペプチドは、Human sapiens、Mus musculus、Canis lupus、Bos taurus、Macaca mulatta、Rattus norvegicus、Gallus gallus、および／またはP.troglodytesからのアグリカンに特異的に結合し、好ましくはヒトアグリカン、好ましくは配列番号６８に特異的に結合する。
【００６３】
用語「（交差）ブロックする」、「（交差）ブロックされた」、「（交差）ブロッキング」、「競合的結合」、「（交差）競合する」、「（交差）競合すること」および「（交差）競合」は本明細書において互換的に使用され、免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは他の結合剤が、他の免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは結合剤の所定の標的への結合を妨害する能力を意味する。免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは他の結合剤が標的への別の結合を妨げることができる程度、したがって、本発明に従って交差ブロックすると言うことができるかどうかは、当技術分野で一般的な競合結合アッセイを使用して、例えば、精製されたＩＳＶＤを、競合ＥＬＩＳＡにおいてファージ上に提示されたＩＳＶＤに対してスクリーニングすることによる等で、決定することができる。特に適切な定量的交差ブロッキングアッセイには、ＥＬＩＳＡが含まれる。
標的（交差）ブロックに向けられた免疫グロブリン、抗体、ＩＳＶＤ、ポリペプチド、または他の結合剤が、本明細書で定義されるように（交差）ブロッキングが可能か、競合的に結合するか、または（交差）競合するかを決定するための他の方法は、例えば実施例の節で説明されているような、ＳＰＲベースの「サンドイッチアッセイ」によって評価することができる。他の適切な方法は、例えばXiao-Chi Jia et al. (Journal of Immunological Methods 288: 91-98, 2004)、Miller et al. (Journal of Immunological Methods 365: 118-125, 2011)に説明されている。
【００６４】
「ＡＤＡＭＴＳ５活性」および「ＡＤＡＭＴＳ５の活性」（これらの用語は、本明細書では互換的に使用される）には、限定はされないが、タンパク質分解などの酵素活性、例えばプロテアーゼ活性（プロテイナーゼまたはペプチダーゼ活性とも呼ばれる）、およびエンドペプチダーゼ活性、ならびに例えば基質の認識および／または結合などの、エキソサイトによる活性、例えばディスインテグリン様ドメイン、中央トロンボスポンジンＩ型様（ＴＳ）リピート、システインリッチドメイン、スペーサー領域および／または追加のＴＳモチーフによるもの、が含まれる。ＡＤＡＭＴＳ５活性には、ヒアルロナン結合コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＣＳＰＧ）細胞外タンパク質などの基質、例えばアグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、およびビグリカンなどの、結合および／またはタンパク質分解が含まれる。本明細書で使用される場合、タンパク質分解とは、タンパク質の、より小さなポリペプチドまたはアミノ酸への分解であって、ポリペプチド鎖においてアミノ酸を一緒に連結するペプチド結合の加水分解によるものである。
【００６５】
「ＭＭＰ１３活性」および「ＭＭＰ１３による活性」（これらの用語は本明細書では互換的に使用される）には、限定はされないが、一方ではプロテアーゼ活性（プロテイナーゼまたはペプチダーゼ活性とも呼ばれる）およびエンドペプチダーゼ活性などのタンパク質分解、および、例えばヘモペキシン様ドメインおよびペプチドグリカン結合ドメインによる、基質の結合が含まれる。ＭＭＰ１３活性には、アグリカン、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＸ、コラーゲンＸＩＶおよびゼラチンなどの基質の、結合および／またはタンパク質分解が含まれる。本明細書で使用される場合、タンパク質分解は、タンパク質の、より小さなポリペプチドまたはアミノ酸への分解であって、ポリペプチド鎖においてアミノ酸を一緒に連結するペプチド結合の加水分解によるものである。
【００６６】
本発明の文脈において、「調節すること」または「調節する」とは、一般に、適切なin vitro、細胞またはin vivoアッセイ（例えば、本明細書で言及されるものなど）を使用して測定される、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３による活性の変化を意味する。特に、「調節すること」または「調節する」とは、適切なin vitro、細胞またはin vivoアッセイ（例えば、本明細書で言及されるものなど）を使用して測定されるＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３の活性を、同じアッセイにおいて、同じ条件下であるが本発明のＩＳＶＤまたはポリペプチドが存在しない場合のＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３の活性と比較して、少なくとも１％、好ましくは少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または少なくとも２５％、例えば少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または９０％以上、低下または阻害するか、または活性を増加させることを意味し得る。
したがって、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３の活性を調節し、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３の活性を阻害する。
【００６７】
したがって、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５のプロテアーゼ活性を阻害する、例えばアグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、および／またはビグリカンなどの基質のタンパク質分解を阻害する。
したがって、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５の基質への結合、例えばアグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、および／またはビグリカンなどの基質への結合をブロックし、ここで前記基質は、好ましくはアグリカンである。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えばＥＬＩＳＡで決定される、ＡＤＡＭＴＳ５のアグリカンへの結合を、少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上、ブロックする。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５の活性に拮抗またはこれを阻害し、例えば（ｉ）プロテアーゼ活性、好ましくはアグリカン、バーシカン、ブレビカン、ニューロカン、デコリン、および／またはビグリカンなどの切断、好ましくはアグリカンの切断；好ましくは、ＡＤＡＭＴＳ５のアグリカナーゼ活性に、拮抗またはこれを阻害し；（ｉｉ）基質のＡＤＡＭＴＳ５への結合、例えばＡＤＡＭＴＳ５のエキソサイト例えばディスインテグリン様ドメイン、中央トロンボスポンジンＩ型様（ＴＳ）リピート、システインリッチドメイン、スペーサー領域または追加のＴＳモチーフなどへの結合に、拮抗またはこれを阻害する。
【００６８】
したがって、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＭＭＰ１３のプロテアーゼ活性を阻害する、例えば、アグリカン、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＸ、コラーゲンＸＩＶおよび／またはゼラチンなどの基質のタンパク質分解を阻害する。
したがって、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＭＭＰ１３の基質への結合をブロックする、例えば、アグリカン、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＸ、コラーゲンＸＩＶおよび／またはゼラチンなどの基質への結合をブロックし、ここで前記コラーゲンは、好ましくはコラーゲンＩＩである。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、例えばＥＬＩＳＡベースの競合アッセイで決定される、ＭＭＰ１３のコラーゲンおよび／またはアグリカンへの結合を、少なくとも２０％、例えば少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上、ブロックする（Howes et al. 2014 J. Biol. Chem. 289:24091-24101を参照）。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、該ポリペプチドは、ＭＭＰ１３の活性に拮抗またはこれを阻害し、例えば（ｉ）プロテアーゼ活性、好ましくはアグリカンおよび／またはコラーゲンの切断、ここで、前記コラーゲンは好ましくはコラーゲンＩＩである；（ｉｉ）コラーゲンのヘモペキシン様ドメインへの結合、に拮抗または阻害する。
【００６９】
一側面において、本発明は、明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで該ポリペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３のプロテアーゼ活性を、例えば競合アッセイまたは実施例の節に記載のような当技術分野で知られている任意の適切な方法で測定した場合に、好ましくは少なくとも５％、例えば１０％、２０％、３０％、４０％、５０％またはそれ以上、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％またはそれ以上、阻害する。
ＡＤＡＭ、ＡＤＡＭＴＳ、およびＭＭＰは、配列および全体の形状の両方で非常に類似している、アグリカンへの結合部位を共有し、例えばＡＤＡＭＴＳ４およびＡＤＡＭＴＳ５の触媒ドメインは高度の配列類似性を共有するが、本発明者らは、実施例の節で実証するように、標的特異的なＩＳＶＤを同定することができた。標的特異性はまた、広域スペクトル阻害剤によって引き起こされる副作用である筋骨格症候群を、回避するか、少なくとも制限する。
【００７０】
一側面において、本発明は、本発明のＩＳＶＤおよびポリペプチドなどのＡＤＡＭＴＳ５結合剤に関し、ここで該ＡＤＡＭＴＳ５結合剤は、ＡＤＡＭＴＳ４、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ１５、ＭＭＰ１および／またはＭＭＰ１４（膜型）に結合しない。好ましくは、本発明は、本明細書で定義されるポリペプチドに関し、ここでＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤは、ＡＤＡＭＴＳ４、ＭＭＰ１またはＭＭＰ１４に結合しない。
一側面において、本発明は、本発明のＩＳＶＤおよびポリペプチドなどのＭＭＰ１３結合剤に関し、ここで、該ＭＭＰ１３結合剤は、ＭＭＰ１および／またはＭＭＰ１４（膜型）に結合しない。好ましくは、本発明は、ＭＭＰ１３に結合する前記ＩＳＶＤが、ＭＭＰ１またはＭＭＰ１４に結合しない、本明細書で定義されるポリペプチドに関する。
特に明記しない限り、用語「免疫グロブリン」および「免疫グロブリン配列」は、本明細書において重鎖抗体または従来の４鎖抗体を指すために使用されるかどうかにかかわらず、フルサイズの抗体、その個々の鎖の両方、ならびにそのすべての部分、ドメインまたは断片（それぞれ、抗原結合ドメインまたは断片、例えばＶＨＨドメインまたはＶＨ／ＶＬドメインなどを含むが、これらに限定されない）を含む一般用語として使用される。
【００７１】
本明細書で使用される（ポリペプチドまたはタンパク質の）「ドメイン」という用語は、タンパク質の残りの部分とは無関係にその三次構造を保持する能力を有する、折り畳まれたタンパク質構造を指す。一般にドメインはタンパク質の個別の機能特性に関与しており、多くの場合、タンパク質および／またはドメインの残りの機能を失うことなく、他のタンパク質に追加、除去、または転送されることができる。
本明細書で使用される用語「免疫グロブリンドメイン」とは、抗体鎖の球状領域（例えば、従来の４鎖抗体または重鎖抗体の鎖など）、またはかかる球状領域から本質的になるポリペプチドを指す。免疫グロブリンドメインは、抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折り畳みを保持するという特徴があり、これは、２つのβシートに配置された約７つの逆平行β鎖の２層サンドイッチで構成され、任意に、保存されたジスルフィド結合によって安定化される。
【００７２】
本明細書で使用される用語「免疫グロブリン可変ドメイン」とは、４つの「フレームワーク領域」から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味し、これらは当技術分野および本明細書では、それぞれ「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」と呼ばれる；当該フレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」によって中断され、これらは当技術分野および本明細書の以下では、それぞれ「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」；および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」と呼ばれる。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造または配列は、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４のように示され得る。抗原結合部位を保有することにより、抗体に抗原に対する特異性を付与するのは、免疫グロブリン可変ドメインである。
【００７３】
用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（本明細書では「ＩＳＶＤ」または「ＩＳＶ」と略す）は、「単一可変ドメイン」と交換可能に使用され、これは、抗原結合部位が単一免疫グロブリンドメイン上にあり、かつ単一免疫グロブリンドメインによって形成されている分子を定義する。このため免疫グロブリン単一可変ドメインは、「従来の」免疫グロブリンまたはその断片とは別に設定され、ここで２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して、抗原結合部位を形成する。通常、従来の免疫グロブリンでは、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）が相互作用して、抗原結合部位を形成する。後者の場合、ＶＨとＶＬの両方の相補性決定領域（ＣＤＲ）が抗原結合部位に寄与する、すなわち、合計６つのＣＤＲが抗原結合部位の形成に関与する。
【００７４】
上記の定義を考慮して、従来の４鎖抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子など；当技術分野で既知）またはＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合ＦｖまたはｓｃＦｖ断片などのＦｖ断片、またはかかる従来の４鎖抗体に由来するダイアボディ（すべて当技術分野で知られている）の、抗原結合ドメインは、通常、免疫グロブリン単一可変ドメインと見なされないが、その理由は、これらの場合、抗原の各エピトープへの結合が、通常１つの（単一）免疫グロブリンドメインではなく、一対の（関連する）免疫グロブリンドメイン、例えば軽鎖および重鎖可変ドメインなどによって、すなわち、それぞれの抗原のエピトープに共同して結合する免疫グロブリンドメインのＶＨ−ＶＬペアによって、生じるからである。
対照的にＩＳＶＤは、追加の免疫グロブリン可変ドメインとペアリングすることなく、抗原のエピトープに特異的に結合することができる。ＩＳＶＤの結合部位は、単一のＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬドメインによって形成される。したがって、ＩＳＶＤの抗原結合部位は、３つ以下のＣＤＲによって形成される。
【００７５】
そのため、単一可変ドメインは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）またはその適切な断片；または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列またはＶＨＨ配列）またはその適切な断片であってよいが、ただし、単一の抗原結合単位（すなわち機能的抗原結合単位；これは単一の可変ドメインから本質的になり、単一の抗原結合ドメインが別の可変ドメインと相互作用して機能性抗原結合単位を形成する必要はない）を形成できる限りにおいてである。
本発明の一側面において、ＩＳＶＤは重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）である；より具体的には、ＩＳＶＤは、従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列であり得る。
【００７６】
例えば、ＩＳＶＤは、（単一）ドメイン抗体（または（単一）ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸）、「ｄＡｂ」またはｓｄＡｂ（またはｄＡｂとしての使用に適したアミノ酸）、またはナノボディ（本明細書で定義され、ＶＨＨを含むがこれに限定されない）；他の単一可変ドメイン、またはそのいずれかの適切な断片であってよい。
特に、ＩＳＶＤは、Nanobody（登録商標）（本明細書で定義）またはその適切な断片であり得る。［注：Nanobody（登録商標）、Nanobodies（登録商標）およびNanoclone（登録商標）は、Ablynx N.Vの登録商標である。］ナノボディの一般的な説明については、以下の詳細な説明、および本明細書で引用した先行技術、例えばWO 08/020079（１６頁）に記載されている。
【００７７】
ＶＨＨ、ＶＨＨドメイン、ＶＨＨ抗体断片、およびＶＨＨ抗体としても知られる「ＶＨＨドメイン」は、元々「重鎖抗体」の（すなわち、「軽鎖を欠く抗体」の；Hamers-Casterman et al. 1993 Nature 363: 446-448）抗原結合免疫グロブリン（可変）ドメインとして記述されてきた。用語「ＶＨＨドメイン」が選択されたのは、これらの可変ドメインを、従来の４本鎖抗体に存在する重鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＨドメイン」または「ＶＨドメイン」と呼ばれる）から、および従来の４本鎖抗体に存在する軽鎖可変ドメイン（本明細書では「ＶＬドメイン」または「ＶＬドメイン」と呼ばれる）から区別するためである。ＶＨＨおよびナノボディの詳細については、Muyldermans (Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001)のレビュー、および一般的な背景技術として言及されている以下の特許出願を参照する： Vrije Universiteit BrusselのWO 94/04678、WO 95/04079およびWO 96/34103；UnileverのWO 94/25591、WO 99/37681、WO 00/40968、WO 00/43507、WO 00/65057、WO 01/40310、WO 01/44301、EP 1134231およびWO 02/48193； Vlaams Instituut voor Biotechnologie (VIB)のWO 97/49805、WO 01/21817、WO 03/035694、WO 03/054016およびWO 03/055527；Algonomics N.V.およびAblynx N.V.のWO 03/050531；National Research Council of Canada によるWO 01/90190；Institute of AntibodiesによるWO 03/025020 (= EP 1433793)；ならびにAblynx N.V.によるWO 04/041867、WO 04/041862、WO 04/041865、WO 04/041863、WO 04/062551、WO 05/044858、WO 06/40153、WO 06/079372、WO 06/122786、WO 06/122787およびWO 06/122825、およびAblynx NVによるさらなる公開された特許出願。これらの出願で言及されたさらなる先行技術、特に国際出願WO 06/040153の４１〜４３頁の参考文献のリストも参照；そのリストおよび参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。これらの参考文献に記載されているように、ナノボディ（特にＶＨＨ配列および部分ヒト化ナノボディ）は、１つ以上のフレームワーク配列に１つ以上の「ホールマーク残基」が存在することによって、特に特徴付けられる。ナノボディのヒト化および／またはラクダ化、ならびに他の修飾、部分または断片、誘導体または「ナノボディ融合」、多価構築物（リンカー配列の非限定的な例を含む）、およびナノボディの半減期を延ばすための異なる修飾およびその調製を含む、ナノボディのさらなる説明は、例えばWO 08/101985およびWO 08/142164に見出すことができる。ナノボディのさらなる一般的な説明については、本明細書で引用される先行技術、例えばWO 08/020079（１６頁）の記載を参照する。
【００７８】
特に、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のアグリカン、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３結合剤に存在するフレームワーク配列は、本発明のアグリカン、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３結合剤がナノボディであるように、１つ以上のホールマーク残基を含んでもよい（例えば、WO 08/020079（表Ａ−３からＡ−８）に記載のように）。かかるフレームワーク配列（の適切な組み合わせ）のいくつかの好ましいが非限定的な例は、本明細書のさらなる開示から明らかになる（例えば、表Ａ−２を参照）。一般に、ナノボディ（特にＶＨＨ配列および部分的ヒト化ナノボディ）は、１つ以上のフレームワーク配列における１つ以上の「ホールマーク残基」の存在によって、特に特徴付けることができる（例えば、WO 08/020079、６１頁２４行目から９８頁３行目にさらに記載されているように）。本明細書で使用される場合、任意の配列番号の文脈における「によって表される」とは、前記配列番号「を含むかまたはそれからなる」と同等であり、好ましくは前記配列番号「からなる」と同等である。
【００７９】
より詳細には、本発明は、次の（一般的な）構造を有するアミノ酸配列である少なくとも１つの免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、アグリカン、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３結合剤を提供する：
ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
ここにおいてＦＲ１〜ＦＲ４はそれぞれフレームワーク領域１〜４を指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３はそれぞれ相補性決定領域１〜３を指し、および前記免疫グロブリン単一可変ドメインは：
ｉ）配列番号２、３または４（表Ａ−１を参照）のアミノ酸配列の少なくとも１つと、少なくとも８０％、より好ましくは９０％、さらにより好ましくは９５％のアミノ酸同一性を有し、ここでアミノ酸の同一性の程度を決定する目的で、ＣＤＲ配列を形成するアミノ酸残基は無視される。この点において表Ａ−２も参照し、この表は、配列番号２、３または４の免疫グロブリン単一可変ドメインのフレームワーク１配列（配列番号７）、フレームワーク２配列（配列番号９、１５および２０）、フレームワーク３配列（配列番号１１、１７および２２）を列挙する；または、
ｉｉ）表Ａ−２に示すフレームワーク配列の組み合わせ；
およびここで：
ｉｉｉ）好ましくは、Kabatの番号付けによる位置１１、３７、４４、４５、４７、８３、８４、１０３、１０４および１０８における１つ以上のアミノ酸残基は、例えばWO 08/020079の表Ａ−３から表Ａ−８に記載されているようなホールマーク残基から選択される。
【００８０】
本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のアグリカン、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３結合剤はまた、すべて「改良された免疫グロブリン可変ドメイン」と題された以下の同時係属米国仮出願に記載された特定の変異／アミノ酸残基を含み得る：２０１４年５月１６日出願のUS 61/994552；２０１４年６月１８日出願のUS 61/014,015；２０１４年８月２１日出願のUS 62/040,167；２０１４年９月８日出願のUS 62/047,560（すべてAblynx N.V.に割り当てられている）。
特に、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のアグリカン、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３結合剤は、以下を好適に含有し得る：（ｉ）位置１１２にＫまたはＱ；または（ｉｉ）位置１１のＶと組み合わせた、位置１１０のＫまたはＱ；または（ｉｉｉ）位置８９のＴ；または（ｉｖ）位置８９のＬおよび位置１１０のＫまたはＱ；または（ｖ）位置１１のＶおよび位置８９のＬ；または（ｉ）〜（ｖ）の適切な組み合わせ。
【００８１】
前記同時係属米国仮出願にも記載されているように、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のアグリカン、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３結合剤が、上記（ｉ）から（ｖ）の１つ（またはその適切な組み合わせ）に従った変異を含む場合：
−位置１１のアミノ酸残基は、好ましくはＬ、Ｖ、またはＫから選択される（およびＶが最も好ましい）；および／または
−位置１４のアミノ酸残基は、好ましくはＡまたはＰから適切に選択される；および／または
−位置４１のアミノ酸残基は、好ましくはＡまたはＰから適切に選択される；および／または
−位置８９のアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＶまたはＬから適切に選択される；および／または
−位置１０８のアミノ酸残基は、好ましくはＱまたはＬから適切に選択される；および／または
−位置１１０のアミノ酸残基は、好ましくはＴ、ＫまたはＱから適切に選択される；および／または
−位置１１２のアミノ酸残基は、好ましくはＳ、ＫまたはＱから適切に選択される。
【００８２】
前記同時係属米国仮出願で述べたように、前記の変異は、いわゆる「既存の抗体」の、本発明の免疫グロブリンおよび化合物への結合を防止または低減するのに有効である。この目的のために、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のアグリカン、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３結合剤はまた、（任意に前記変異と組み合わせて）Ｃ末端伸長（Ｘ）ｎを含み得る（式中、ｎは１から１０、好ましくは１から５、例えば１、２、３、４または５（および好ましくは１または２、例えば１）であり；および各Ｘは、独立して選択される（好ましくは天然に存在する）アミノ酸残基であり、好ましくはアラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）またはイソロイシン（Ｉ）からなる群から独立して選択される）、例えば、米国仮出願およびWO 12/175741を参照。特に、本発明のＩＳＶＤおよび／またはポリペプチドなどの本発明のアグリカン、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３結合剤は、タンパク質、ポリペプチドまたはこれらを含む他の化合物もしくは構築物のＣ末端を形成する場合、かかるＣ末端伸長を含み得る（例えば、前述の米国仮出願およびWO 12/175741を参照）。
【００８３】
本発明のアグリカン、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３結合剤は、任意の適切な様式で任意の適切な供給源に由来する免疫グロブリン、例えば免疫グロブリン単一可変ドメインであり得、例えば、天然に存在するＶＨＨ配列（すなわち、ラクダ科の適切な種由来）または、合成または半合成アミノ酸配列であって、「ヒト化」（本明細書で定義）ナノボディまたはＶＨＨ配列、「ラクダ化」（本明細書で定義）免疫グロブリン配列（および特にラクダ化重鎖可変ドメイン配列）を含むがこれらに限定されないもの、ならびに、親和性成熟（例えば、合成、ランダム、または天然の免疫グロブリン配列から開始）、ＣＤＲグラフト、ベニアリング、異なる免疫グロブリン配列由来の断片の組み合わせ、オーバーラッププライマーを使用したＰＣＲアセンブリ、および当業者に周知の免疫グロブリン配列を操作するための同様の技術などの手法によって得られたナノボディ；または、本明細書でさらに説明する前述のいずれかの適切な組み合わせであってよい。また、免疫グロブリンがＶＨＨ配列を含む場合、本明細書でさらに説明するように、前記免疫グロブリンを適切にヒト化して、本発明の１つ以上のさらなる（部分的または完全な）ヒト化免疫グロブリンを提供してもよい。同様に、免疫グロブリンが合成または半合成配列（部分的ヒト化配列など）を含む場合、前記免疫グロブリンを任意にさらに適切にヒト化して、再度、本明細書に記載されるように、再度、１つ以上のさらなる（部分的または完全な）本発明のヒト化免疫グロブリンを提供する。
【００８４】
「ドメイン抗体」は、「Ｄａｂ」、「Domain Antibodies」、および「dAbs」（「Domain Antibodies」および「dAbs」は、GlaxoSmithKlineグループの商標として使用されている）としても知られ、例えば以下に記載されている：EP 0368684、Ward et al. (Nature 341: 544-546, 1989)、Holt et al. (Tends in Biotechnology 21: 484-490, 2003)およびWO 03/002609ならびに例えばWO 04/068820、WO 06/030220、WO 06/003388；およびDomantis Ltdの他の公開特許出願。ドメイン抗体は本質的に、非ラクダ科哺乳類のＶＨまたはＶＬドメイン、特にヒト４鎖抗体に対応する。エピトープを単一の抗原結合ドメインとして、すなわちＶＬまたはＶＨドメインとそれぞれペアリングせずに結合するために、かかる抗原結合特性の特異的な選択が必要となり、例えばヒトの単一ＶＨまたはＶＬドメイン配列のライブラリを使用することによる。ドメイン抗体は、ＶＨＨと同様に約１３から約１６ｋＤａの分子量を有し、完全にヒト配列に由来する場合、例えばヒトにおける治療的使用のためにはヒト化を必要としない。
【００８５】
哺乳動物起源ではないために本発明の文脈ではあまり好ましくないが、単一可変ドメインは、ある種のサメに由来し得ることにも留意されたい（例えば、いわゆる「ＩｇＮＡＲドメイン」、例えばWO 05/18629を参照）。
本発明は特にＩＳＶＤに関し、ここで該ＩＳＶＤは、ＶＨＨ、ヒト化ＶＨＨおよびラクダ化ＶＨからなる群から選択される。
ＶＨＨドメインのアミノ酸残基の番号付けは、Kabat et al. ("Sequence of proteins of immunological interest", US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91)によるＶＨドメインの一般的な番号付けに従って、例えばRiechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)の図２に示されるように、ラクダのＶＨＨドメインに適用されたものと同様になされる；これらはすべて当技術分野で知られている。ＶＨドメインのアミノ酸残基に番号付けする代替方法は、同様の方法でＶＨＨドメインにも適用することができ、当技術分野で知られている。しかし、本明細書、特許請求の範囲、および図面では、特に明記しない限り、上記のようにＶＨＨドメインに適用されるKabatによる番号付けに従う。
【００８６】
ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインについて当技術分野で周知のように、各ＣＤＲにおけるアミノ酸残基の総数は変化する可能性があり、Kabatの番号付けにより示されるアミノ酸残基の総数に対応しない場合があることに、留意すべきである（すなわち、Kabat番号付けによる１つ以上の位置が実際の配列で占有されていないか、または実際の配列がKabat番号付けで許容されている数よりも多くのアミノ酸残基を含む場合がある）。これは一般に、Kabatによる番号付けは、実際の配列内のアミノ酸残基の実際の番号付けに対応する場合と対応しない場合があることを意味する。ＶＨドメインおよびＶＨＨドメインのアミノ酸残基の総数は、通常１１０〜１２０、多くの場合１１２〜１１５の範囲にあるだろう。しかし、より小さな配列およびより長い配列もまた、本書に記載の目的に適する可能性があることに注意すべきである。
【００８７】
ＣＤＲに関しては、当技術分野でよく知られているように、Kabatの定義（これは配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用されている）およびChothiaの定義（これは構造ループ領域の位置に基づいている）などの、ＶＨまたはＶＨＨ断片のＣＤＲを定義および説明するための複数の規則がある。例えば、ウエブサイトhttp://www.bioinf.org.uk/abs/を参照。本明細書および特許請求の範囲の目的のために、ＣＤＲは、最も好ましくはＡｂｍ定義に基づいて定義され（これは、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアに基づいている）、これはKabat定義とChothia定義の間の最適な妥協案であると考えられている（参照：http://www.bioinf.org.uk/abs/）。本明細書で使用する場合、ＦＲ１はアミノ酸残基を位置１〜２５に含み、ＣＤＲ１はアミノ酸残基を位置２６〜３５含み、ＦＲ２はアミノ酸を位置３６〜４９に含み、ＣＤＲ２はアミノ酸残基を位置５０〜５８に含み、ＦＲ３はアミノ酸残基を位置５９〜９４に含み、ＣＤＲ３はアミノ酸残基を位置９５〜１０２に含み、ＦＲ４はアミノ酸残基を位置１０３〜１１３に含む。
本発明の意味において、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」または「単一可変ドメイン」は、非ヒト源、好ましくはラクダ科動物、好ましくはラクダ科動物の重鎖抗体に由来するポリペプチドを含む。本明細書に記載されるように、それらはヒト化されてもよい。さらにこの用語は、非ラクダ科の供給源、例えばマウスまたはヒトであって、本明細書に記載されるように「ラクダ化」されたものに由来する、ポリペプチドを含む。
【００８８】
したがって、ドメイン抗体およびナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などのＩＳＶＤは、ヒト化の対象となる場合がある。特に、ナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などのヒト化ＩＳＶＤは、本明細書で一般的に定義されるＩＳＶＤであり得るが、ここで少なくとも１つのアミノ酸残基が（特に、フレームワーク残基の少なくとも１つに）存在し、これはヒト化置換（本明細書で定義のように）であるか、および／またはそれに対応する。潜在的に有用なヒト化置換は、天然に存在するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ以上の密接に関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することで確認でき、その後、こうして決定された1つ以上の潜在的に有用なヒト化置換（またはその組み合わせ）は、前記ＶＨＨ配列に導入され得（本明細書でさらに説明されるように、それ自体既知の任意の様式によって）、得られたヒト化ＶＨＨ配列は、標的に対する親和性、安定性、発現の容易さおよびレベル、および／またはその他の所望の特性について、試験され得る。このようにして、限られた程度の試行錯誤によって、他の適切なヒト化置換（またはその適切な組み合わせ）が、本明細書の開示に基づき当業者によって決定され得る。また、上記に基づいて、ナノボディ（ＶＨＨドメインを含む）などのＩＳＶＤ（のフレームワーク領域）は、部分的にヒト化または完全にヒト化されてもよい。
【００８９】
本発明の別の特に好ましいクラスのＩＳＶＤは、天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するが、ただし「ラクダ化」されているアミノ酸配列を有するＩＳＶＤを含み、ここで「ラクダ化」されているとは、すなわち従来の４本鎖抗体からの天然に存在するＶＨドメインのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸残基が、重鎖抗体のＶＨＨドメイン内の対応する位置にある１つ以上のアミノ酸残基で置換されることによる。これは、それ自体既知の様式で実行することができ、当業者には、例えば本明細書の説明に基づいて明らかであろう。かかる「ラクダ化」置換は、好ましくは、本明細書で定義されるように、ＶＨ−ＶＬ界面を形成するおよび／またはそこに存在するアミノ酸位置、および／または、いわゆるラクダ科のホールマーク残基に、挿入される（例えば、WO 94/04678およびDavies and Riechmann (1994 and 1996)も参照）。好ましくは、ラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメインを生成または設計するための出発材料または出発点として使用されるＶＨ配列は、好ましくは哺乳動物からのＶＨ配列、より好ましくはＶＨ３配列などのヒトのＶＨ配列である。しかし、本発明のかかるラクダ化免疫グロブリン単一可変ドメインは、それ自体既知の任意の適切な様式で得ることができ、したがって、天然のＶＨドメインを含むポリペプチドを出発材料として使用して得られたポリペプチドに厳密に限定されるのではないことに、留意されたい。以下を参照：Davies and Riechmann (FEBS 339: 285-290, 1994；Biotechnol. 13: 475-479, 1995；Prot. Eng. 9: 531-537, 1996)およびRiechmann and Muyldermans (J. Immunol. Methods 231: 25-38, 1999)。
【００９０】
例えば本明細書でさらに説明するように、「ヒト化」および「ラクダ化」は共に、次のように実施することができる：天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインそれぞれをコードするヌクレオチド配列を提供し、次いで、それ自体既知の様式で、前記ヌクレオチド配列中の１つ以上のコドンを変更して、新しいヌクレオチド配列がそれぞれ本発明の「ヒト化」または「ラクダ化」ＩＳＶＤをコードするようにすること。次いでこの核酸をそれ自体既知の様式で発現させて、本発明の所望のＩＳＶＤを提供することができる。代替的に、天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列それぞれに基づいて、本発明の所望のヒト化またはラクダ化ＩＳＶＤのアミノ酸配列をそれぞれ設計し、それ自体知られているペプチド合成の技術を使用してde novoで合成することができる。また、天然に存在するＶＨＨドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列それぞれに基づいて、本発明の所望のヒト化またはラクダ化ＩＳＶＤをそれぞれコードするヌクレオチド配列を設計し、次に、それ自体既知の核酸合成の技術を使用してde novoで合成することができ、その後、こうして得られた核酸をそれ自体既知の様式で発現させて、本発明の所望のＩＳＶＤを提供することができる。
【００９１】
ドメイン抗体およびナノボディ（ＶＨＨドメインおよびヒト化ＶＨＨドメインを含む）などのＩＳＶＤはまた、１つ以上のＣＤＲのアミノ酸配列に１つ以上の変更を導入することで親和性成熟させることができ、この変更は、それぞれの親分子と比較して、そのそれぞれの抗原について得られたＩＳＶＤに改善された親和性をもたらす。本発明の親和性成熟ＩＳＶＤ分子は、当技術分野で 知られている方法によって調製することができ、例えば以下に記載されている：Marks et al. (Biotechnology 10:779-783, 1992)、Barbas, et al. (Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91: 3809-3813, 1994)、Shier et al. (Gene 169: 147-155, 1995)、Yelton et al. (Immunol. 155: 1994-2004, 1995)、Jackson et al. (J. Immunol. 154: 3310-9, 1995)、Hawkins et al. (J. MoI. Biol. 226: 889 896, 1992)、Johnson and Hawkins (Affinity maturation of antibodies using phage display, Oxford University Press, 1996)。
【００９２】
ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ、ドメイン抗体またはナノボディなどのＩＳＶＤから開始して、ポリペプチドを設計／選択および／または調製するプロセスは、本明細書では前記ＩＳＶＤを「フォーマットする」とも呼ばれる；ポリペプチドの一部を作るＩＳＶＤは、「フォーマットされた」または「そのフォーマットの」ポリペプチドであると言われる。ＩＳＶＤがフォーマットされ得る方法の例およびかかるフォーマットの例は、本明細書の開示に基づいて当業者には明らかであろう；かかるフォーマットされた免疫グロブリン単一可変ドメインは、本発明のさらなる側面を形成する。
好ましいＣＤＲを、表Ａ−２に示す。
【００９３】
特に、本発明は本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＭＭＰ１３に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号８；および配列番号８と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号１０；および配列番号１０と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号１２；および配列番号１２と１、２、３または４個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である。
特に、本発明は本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＭＭＰ１３に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、ＣＤＲ１は配列番号８であり、ＣＤＲ２は配列番号１０であり、およびＣＤＲ３は配列番号１２である。
【００９４】
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号１４［ＧＲＴＶＳＳＹＡＭＧ］；および配列番号１４と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号１６［ＧＩＳＲＳＡＥＲＴＹ］；および配列番号１６と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号１８［ＤＬＤＰＮＲＩＦＳＲＥＥＹＡＹ］；および配列番号１８と１、２、３または４個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である。
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、ＣＤＲ１は配列番号１４であり、ＣＤＲ２は配列番号１６であり、およびＣＤＲ３は配列番号１８である。
【００９５】
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、
（ｉ）ＣＤＲ１は、配列番号１９；および配列番号１９と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；
（ｉｉ）ＣＤＲ２は、配列番号２１；および配列番号２１と１、２または３個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列であり；および
（ｉｉｉ）ＣＤＲ３は、配列番号２３；および配列番号２３と１、２、３または４個のアミノ酸差異を有するアミノ酸配列である。
特に、本発明は本明細書に記載のＩＳＶＤに関し、ここで前記ＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合し、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）から本質的になり、ここで、ＣＤＲ１は配列番号１９であり、ＣＤＲ２は配列番号２１であり、およびＣＤＲ３は配列番号２３である。
【００９６】
特に、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記のＭＭＰ１３に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号２である。
特に、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記のＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号３である。
特に、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記のアグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤは、配列番号４である。
さらに好ましい態様において、本発明のアグリカン、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３結合剤は、少なくとも２つのＣＤＲ１配列、少なくとも２つのＣＤＲ２配列および少なくとも２つのＣＤＲ３配列を含み、各々は以下の表から独立して選択される：
【表４】
2020523986.tif 000007
【００９７】
前述のアグリカン、ＡＤＡＭＴＳ５、および／またはＭＭＰ１３結合剤において、配列の順序は好ましくはＣＤＲ１ａ−ＣＤＲ２ａ−ＣＤＲ３ａ−リンカー−ＣＤＲ１ｂ−ＣＤＲ２ｂ−ＣＤＲ３ｂであり、ここでリンカーは、ＣＤＲの第１のセット（ＣＤＲ１ａ−ＣＤＲ２ａ−ＣＤＲ３ａ）を第２のセット（ＣＤＲ１ｂ−ＣＤＲ２ｂ−ＣＤＲ３ｂ）に連結するのに適した、５アミノ酸より長いポリペプチドである。好ましくは、リンカーは、以下の表Ｃから選択され、最も好ましくは、配列番号３５のアミノ酸配列を有するリンカーである。より好ましい態様において、アグリカン、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３結合剤は、上記の表からの９つすべてのＣＤＲ配列を含み、ここで、ＣＤＲ配列とリンカーポリペプチドは次の順序である：ＣＤＲ１ａ−ＣＤＲ２ａ−ＣＤＲ３ａ−リンカー１−ＣＤＲ１ｂ−ＣＤＲ２ｂ−ＣＤＲ３ｂ−リンカー２−ＣＤＲ１ｃ−ＣＤＲ２ｃ−ＣＤＲ３ｃ、ここでリンカー１およびリンカー２はそれぞれ少なくとも５つのアミノ酸のポリペプチドであり、リンカー１およびリンカー２のポリペプチド配列は互いに同一であるか、または互いに同一ではない。好ましくは、リンカー１およびリンカー２は、それぞれ以下の表Ｃから互いに独立して選択され、最も好ましくは、リンカーの少なくとも１つ（好ましくは両方）は、配列番号３５によるアミノ酸配列を有する。
さらに好ましい態様において、本発明のアグリカン、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３結合剤は、好ましくは、少なくとも以下の表に列挙されたＣＤＲ配列を含む：
【表５】
2020523986.tif 000008
【００９８】
前述の態様において、ＣＤＲ配列の順序は、ＣＤＲ１ａ−ＣＤＲ２ａ−ＣＤＲ３ａ−リンカー１−ＣＤＲ１ｂ−ＣＤＲ２ｂ−ＣＤＲ３ｂ−リンカー２−ＣＤＲ１ｃ−ＣＤＲ２ｃ−ＣＤＲ３ｃ−リンカー３−ＣＤＲ１ｄ−ＣＤＲ２ｄ−ＣＤＲ３ｄであり得る；式中、リンカー１、リンカー２およびリンカー３は、それぞれ少なくとも５アミノ酸のポリペプチドであり、リンカー１、リンカー２およびリンカー３のポリペプチド配列は、互いに同一かまたは互いに同一ではない。好ましくは、リンカー１、リンカー２およびリンカー３は、以下の表Ｃから互いに独立して選択され、最も好ましくは、リンカーの少なくとも１つ（好ましくは３つすべて）が、配列番号３５のアミノ酸配列を有する。上記の２つの表の文脈で概説された好ましい態様において、ＣＤＲ配列は、本明細書の他の場所で説明されるフレームワーク配列を介して互いに連結され、好ましくは、表Ａ−２に開示されるフレームワーク配列が、この点で使用され得る。
【００９９】
限定することなく、本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインは、ポリペプチドの調製のための「ビルディングブロック」として使用でき、これは、ビルディングブロックとして機能することができる、１つ以上のさらなる免疫グロブリン単一可変ドメインを任意に含み得ることが、理解されるであろう。
当該技術は、変形性関節症などの関節の軟骨に影響を与える障害に対する、より効果的な治療を必要としている。関節内に投与された場合でも、罹患した軟骨を処置するためのほとんどの薬物の滞留時間は不十分である。理論に束縛されることなく、本発明者らは、本発明の構築物、ポリペプチドおよびＩＳＶＤなどの治療薬の有効性は、治療薬を、関節内に薬物を「固定」しその結果薬物の保持を増加させるが、治療薬の有効性は邪魔しない部分に結合することによって、調節できるとの仮説をたてた（この部分は、本明細書では「軟骨固定タンパク質」または「ＣＡＰ」とも呼ばれる）。この固定の概念は、薬物の有効性を調節するのみでなく、毒性と副作用を減らすことによって罹患した関節の操作上の特異性を調節することができ、それにより、可能性のある有用な薬物の数を増加させた。
【０１００】
臨床使用のための分子のフォーマットは、ＭＭＰ１３および／またはＡＤＡＭＴＳ５に結合する、ＩＳＶＤなどの１つまたは２つのビルディングブロック、およびかかる保持モードの作用を有する、ＩＳＶＤなどの１つ以上のビルディングブロック、および場合によってはさらなる部分を含むことが予想された。本発明において、かかるフォーマットは、ＭＭＰ１３および／またはＡＤＡＭＴＳ５結合と例えば抑制活性などの治療効果の両方、ならびに保持特性を保持することが実証されている。保持モードの作用を有する、ＩＳＶＤなどの１つ以上のビルディングブロックは、例えば以下のようなＭＭＰ１３および／またはＡＤＡＭＴＳ５が関与する疾患において保持効果を有する任意のビルディングブロックである（「ＣＡＰビルディングブロック」）：関節炎、変形性関節症、脊椎骨端異形成症、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、関節リウマチ、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチー。
「ＣＡＰビルディングブロック」は、他の例えば治療用のビルディングブロック、例えばＭＭＰ１３および／またはＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤなどを、例えば関節などの所望の部位に、誘導、固定、および／または保持するために使用され、ここで前記他の例えば治療用のビルディングブロックは、例えばＭＭＰ１３および／またはＡＤＡＭＴＳ５の結合および／または阻害などの、その効果を発揮する。
【０１０１】
再度、理論に束縛されることなく、本発明者らはさらに、アグリカンに結合するＩＳＶＤなどのアグリカン結合剤は、アグリカンが重度にグリコシル化され、関節の軟骨に影響を及ぼす様々な障害において分解されるにも関わらず、潜在的にかかるアンカーとして機能すると仮定した。さらに、薬剤が臨床に入る前に必要とされる様々な動物モデルでのコストおよび広範な試験を考慮すると、かかるアグリカン結合剤は、優先的に広い交差反応性を有するべきであり、例えば、アグリカン結合剤は、様々な種のアグリカンに結合すべきである。
様々な独創的な免疫化、スクリーニング、および特性評価方法を使用して、本発明者らは、関節内において延長された保持時間を可能にする、優れた選択性、安定性、および特異性を備えた様々なアグリカン結合剤を特定することができた。
一側面において本発明は、関節からの、組成物、ポリペプチドまたは構築物の流出を低減および／または阻害する方法に関し、前記方法は、本発明による少なくとも１つのポリペプチド、本発明による構築物、または本発明による組成物の薬学的活性量を、それを必要とする人へ投与することを含む。
【０１０２】
本発明において、用語「流出の低減および／または阻害」は、組成物、ポリペプチドまたは構築物の、関節内から外部への外向きの流れを低減および／または阻害することを意味する。好ましくは、流出は、関節内における前述の組成物、ポリペプチドまたは構築物の流出であって、同じ条件下であるが本発明のアグリカン結合剤、例えばアグリカンに結合するＩＳＶＤの存在なしの流出と比較して、少なくとも１０％、例えば少なくとも２０％、３０％、４０％、または５０％、またはそれ以上、例えば少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％をも、低減および／または阻害される。
ＭＭＰ１３および／またはＡＤＡＭＴＳ５が関与する疾患、例えば関節炎、変形性関節症、脊椎骨端異形成症、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、関節リウマチ、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーなどの次に、本発明のアグリカン結合剤はまた、軟骨に影響を与える様々な他の疾患、例えば、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、（例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離）、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎（本明細書では一般に「アグリカン関連疾患」と示される）にも使用できることが予想される。
【０１０３】
上記のＣＡＰビルディングブロック、例えばアグリカンに結合するＩＳＶＤは、好ましくは軟骨および／または半月板などの軟骨組織に結合する。好ましい側面において、ＣＡＰビルディングブロックは他の種に対して交差反応性であり、以下の１つ以上に特異的に結合する：ヒトアグリカン（配列番号６８）、イヌアグリカン、ウシアグリカン、ラットアグリカン；ブタアグリカン；マウスアグリカン、ウサギアグリカン；カニクイザルアグリカンおよび／またはアカゲザルアグリカン。アグリカンの関連構造情報は、例えば上の表Ｂ−３に示すように、（UniProt）アクセッション番号に記載されている。
好ましいＣＡＰビルディングブロックは、ＩＳＶＤ結合アグリカン、好ましくはヒトアグリカンであり、好ましくは表Ｂに示されるように配列番号６８で表される。
【０１０４】
したがって本発明は、少なくとも１つのＣＡＰビルディングブロックをさらに含む、本発明によるポリペプチドまたは構築物に関する。
したがって本発明は、好ましくは配列番号４で表されるＩＳＶＤから選択される、アグリカンに特異的に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤをさらに含む、本発明によるポリペプチドまたは構築物に関する。
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む、本明細書に記載のポリペプチドに関する。
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、同一でも異なっていてもよい。
【０１０５】
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合する少なくとも２つのＩＳＶＤを含む、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記少なくとも２つのＩＳＶＤのそれぞれは、配列番号４により表される。
一側面において、本発明は、アグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤを含む、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで、アグリカンに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、ヒトアグリカン［配列番号６８］に特異的に結合する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、アグリカンに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、ヒトアグリカン（配列番号６８）、イヌアグリカン、ウシアグリカン、ラットアグリカン、ブタアグリカン、マウスアグリカン、ウサギアグリカン、カニクイザルアグリカンおよび／またはアカゲザルのアグリカンに特異的に結合する。
【０１０６】
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここでアグリカンに特異的に結合する前記ＩＳＶＤは、好ましくは軟骨および／または半月板などの軟骨組織に結合する。
本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび構築物は、好ましくは安定であることが理解されるであろう。本発明のポリペプチド、構築物またはＩＳＶＤの安定性は、当業者に知られている日常的なアッセイにより測定することができる。典型的なアッセイには、（限定はされないが）ポリペプチド、構築物またはＩＳＶＤの活性が測定され、続いて滑液中で所望の期間インキュベートされ、その後活性が再度測定されるアッセイが含まれる。
一側面において、本発明は、滑液（ＳＦ）中３７℃で、少なくとも７日、例えば少なくとも１４日、２１日、１ヶ月、２ヶ月、または３ヶ月間も、安定性を有する、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは構築物に関する。
本発明の多価ポリペプチドまたは構築物中のＭＭＰ１３および／またはＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤなどの、治療用ビルディングブロックの望ましい活性は、当業者に知られている日常的なアッセイにより測定することができる。典型的なアッセイには（限定されないが）、実施例の節に詳述されているＧＡＧ放出アッセイが含まれる。
【０１０７】
本発明のポリペプチド（本明細書では「ナノボディ構築物」としても示される）は、以下からなる群から選択される：
（ａ）少なくとも２つの免疫グロブリン単一可変ドメイン（ＩＳＶＤ）を含むポリペプチドであって、アグリカンに特異的に結合する第１のＩＳＶＤおよびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）に特異的に結合する第２のＩＳＶＤを含む、前記ポリペプチド；
（ｂ）少なくとも２つのＩＳＶＤを含むポリペプチドであって、アグリカンに特異的に結合する第１のＩＳＶＤおよび、トロンボスポンジンモチーフを有するＡディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ（ＡＤＡＭＴＳ）に特異的に結合する２番目のＩＳＶＤを含む、前記ポリペプチド；および
（ｃ）少なくとも３つのＩＳＶＤを含むポリペプチドであって、アグリカンに特異的に結合する第１のＩＳＶＤ、ＡＤＡＭＴＳに特異的に結合する第２のＩＳＶＤ、およびＭＭＰに特異的に結合する第３のＩＳＶＤを含む、前記ポリペプチド。
本発明のポリペプチドにおいて、ＩＳＶＤは、直接連結されても、リンカーを介して連結されてもよい。さらにより好ましくは、本発明のポリペプチドは、Ｃ末端伸長を含む。本明細書で詳述するように、Ｃ末端伸長は、ヒト対象／患者のほとんどの試料中の既存の抗体／因子の結合を、本質的に防止／除去する。Ｃ末端伸長は、最後の（最もＣ末端に位置する）ＩＳＶＤの最後のアミノ酸残基（通常はセリン残基）のＣ末端に存在する。
【０１０８】
以下でさらに詳述するように、ＩＳＶＤは、ＶＨＨ、ＶＨまたはＶＬドメインに由来し得るが、しかしＩＳＶＤは、本発明のポリペプチドにおいてＶＨおよびＶＬドメインの相補的な対を形成しないように選択される。ナノボディ、ＶＨＨ、およびヒト化ＶＨＨは、軽鎖を有しない天然のラクダ抗体に由来するという点で珍しく、実際これらのドメインは、ラクダ科の軽鎖と会合して相補的なＶＨＨとＶＬの対を形成することができない。したがって、本発明のポリペプチドは、相補的ＩＳＶＤを含まず、および／または例えば相補的ＶＨ／ＶＬ対などの相補的ＩＳＶＤ対を形成しない。
一般に、単一のビルディングブロック、単一のＩＳＶＤまたは単一のナノボディを含むかまたは本質的にそれらからなるポリペプチドまたは構築物は、それぞれ「一価」ポリペプチドおよび「一価構築物」と呼ばれる。２つ以上のビルディングブロック（例えばＩＳＶＤなど）を含むポリペプチドまたは構築物は、「多価」ポリペプチドまたは構築物とも呼ばれ、かかるポリペプチドまたは構築物に存在するビルディングブロック／ＩＳＶＤは、本明細書において、「多価フォーマット」であると言及される。例えば、「二価」ポリペプチドは、リンカー配列を介して任意に連結された２つのＩＳＶＤを含み得るが、「三価」ポリペプチドは、２つのリンカー配列を介して任意に連結された３つのＩＳＶＤを含み得；一方、「四価」ポリペプチドは、３つのリンカー配列を介して任意に連結された４つのＩＳＶＤを含み得る、などである。
【０１０９】
多価ポリペプチドにおいて、２つ以上のＩＳＶＤは同一でも異なっていてもよく、同じ抗原または抗原決定基に対して（例えば、エピトープの同一部分またはエピトープの異なる部分に対して）向けられてもよく、または代替的に、異なる抗原または抗原決定基、またはそれらの任意の適切な組み合わせに向けられてもよく、例えば、アグリカンに向けられる。少なくとも２つのビルディングブロック（例えば、ＩＳＶＤなど）を含むポリペプチドおよび構築物であって、ここで少なくとも１つのビルディングブロックは第１の抗原（例えば、アグリカン）に向けられ、少なくとも１つのビルディングブロックは第２の抗原に向けられる（すなわちアグリカンとは異なる、例えば、ＡＤＡＭＴＳ５に向けられた）ものは、「多重特異性」ポリペプチドおよび構築物とも呼ばれ、かかるポリペプチドおよび構築物に存在するビルディングブロック（例えばＩＳＶＤなど）は、本明細書において「多重特異性フォーマット」とも呼ばれる。したがって、例えば、本発明の「二重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（すなわちＡＤＡＭＴＳ５）に向けられた少なくとも１つのＩＳＶＤ、および第２の抗原に向けられた（すなわちアグリカンとは異なる、例えば、ＡＤＡＭＴＳ５に向けられた）少なくとも１つのＩＳＶＤを含むポリペプチドであり、一方、本発明の「三重特異性」ポリペプチドは、第１の抗原（例えば、アグリカン）に向けられた少なくとも１つのＩＳＶＤ、第２の抗原に向けられた（すなわちアグリカンとは異なる、例えば、ＡＤＡＭＴＳ５に向けられた）少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤ、および少なくとも第３の抗原に向けられた（すなわち、アグリカンおよびＡＤＡＭＴＳ５の両方とは異なる、例えば、ＭＭＰに向けられた）少なくとも１つのさらなるＩＳＶＤを含むポリペプチドである、など。
【０１１０】
一側面において、本発明は、少なくとも２つのＩＳＶＤを含むポリペプチドに関し、ここで少なくとも１つのＩＳＶＤはＭＭＰ、好ましくはＭＭＰ１３に特異的に結合し、より好ましくは前記１つのＩＳＶＤは、配列番号２のアミノ酸配列によって表される。
一側面において、本発明は、少なくとも２つのＩＳＶＤを含むポリペプチドに関し、ここで少なくとも１つのＩＳＶＤは、ＡＤＡＭＴＳ、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合し、より好ましくは前記１つのＩＳＶＤは、配列番号３のアミノ酸配列によって表される。
一側面において、本発明は、少なくとも２つのＩＳＶＤを含むポリペプチドに関し、ここで少なくとも１つのＩＳＶＤはアグリカンに特異的に結合し、より好ましくは、前記１つのＩＳＶＤは、配列番号４のアミノ酸配列によって表される。
「多重パラトピック」ポリペプチドおよび「多重パラトピック」構築物、例えば「二重パラトピック」ポリペプチドまたは構築物および「三重パラトピック」ポリペプチドまたは構築物は、それぞれ異なるパラトープを有する２つ以上のビルディングブロックを含むか、本質的にそれらからなる。
【０１１１】
本発明の１つ以上のＩＳＶＤは、かかるポリペプチドまたは構築物中のビルディングブロックとして使用され、すべて本明細書に記載されるように、本発明の一価、多価または多重パラトピックポリペプチドまたは構築物を提供する。
したがって本発明は、例えば、本発明の２つ以上のＩＳＶＤを含むかまたは本質的にそれらからなる二価または三価ポリペプチドまたは構築物などの、多価ポリペプチドまたは多価構築物であるポリペプチドまたは構築物にも関する（１つ以上のＶＨＨドメインを含む多価および多重特異性ポリペプチドおよびそれらの調製については、Conrath et al. (J. Biol. Chem. 276: 7346-7350, 2001)、ならびに例えばWO96/34103、WO99/23221およびWO 2010/115998も参照）。
【０１１２】
別の側面において、本発明の多価ポリペプチドまたは構築物は、アグリカンに向けられたナノボディなどの第１のＩＳＶＤと、例えばＡＤＡＭＴＳ５またはＭＭＰ１３などの第２の抗原に向けられたナノボディなどの第２のＩＳＶＤとを含む、本発明の二重特異性ポリペプチドまたは構築物であり得、ここでナノボディなどの前記第１および第２のＩＳＶＤは、リンカー配列（本明細書で定義される）を介して任意に連結され得る；一方、本発明の多価ポリペプチドまたは構築物はまた、ＡＤＡＭＴＳ５に向けられたナノボディなどの第１のＩＳＶＤ、例えばアグリカンなどの第２の抗原に向けられたナノボディなどの第２のＩＳＶＤ、および例えばＭＭＰ１３などの第３の抗原に向けられたナノボディなどの第３のＩＳＶＤを含む、本発明の三重特異性ポリペプチドまたは構築物であってもよく、ここでナノボディなどの前記第１、第２および第３のＩＳＶＤは、１つ以上、特に２つのリンカー配列を介して、任意に連結されていてもよい。
本発明はさらに、ＡＤＡＭＴＳ５、好ましくはヒトＡＤＡＭＴＳ５に結合する少なくとも１つのＩＳＶＤ（またはその適切な断片）、およびアグリカンに結合するＩＳＶＤなどの追加の１つのＩＳＶＤを含むか、または（本質的に）それからなる、多価ポリペプチドに関する。
【０１１３】
本発明による特に好ましい二価、二重特異性ポリペプチドまたは構築物、および四価、三重特異性ポリペプチドまたは構築物は、本明細書に記載の実施例および表Ａ−１に示すものである（例えば、配列番号１、５、６、６２、６３および６４）。
本発明の多価ポリペプチドまたは構築物に存在する２つ以上のＩＳＶＤは、軽鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＬ配列）または重鎖可変ドメイン配列（例えば、ＶＨ配列）からなり得る；それらは、従来の４本鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列、または重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン配列で構成されていてもよい。好ましい側面において、それらは、ドメイン抗体（またはドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸）、単一ドメイン抗体（または単一ドメイン抗体としての使用に適したアミノ酸）、または「ｄＡｂ」（またはｄＡｂとしての使用に適したアミノ酸）、Nanobody（登録商標）（ＶＨＨを含むがこれに限定されない）、ヒト化ＶＨＨ配列、ラクダ化ＶＨ配列；または親和性成熟によって得られたＶＨＨ配列からなる。２つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインは、部分的または完全にヒト化されたナノボディまたは部分的または完全にヒト化されたＶＨＨからなることができる。
【０１１４】
特に好ましい側面において、本発明のポリペプチドまたは構築物は、４つ以上のＩＳＶＤを含むか、または本質的にそれからなり、このうち少なくとも２つのＩＳＶＤは、アグリカンに向けられている。アグリカンに向けられた前記少なくとも２つのＩＳＶＤは、同一でも異なっていてもよく、アグリカンの同じエピトープまたは異なるエピトープに向けられてもよく、同じエピトープビンまたは異なるエピトープビンに属することができ、および／または、アグリカンの同じドメインまたは異なるドメインに結合できることが、理解されるであろう。
相対的親和性は、ポリペプチド内のＩＳＶＤの位置に依存し得る。本発明のポリペプチドにおけるＩＳＶＤの順序（配向）は、当業者の必要性に従って選択され得ることが理解されるであろう。個々のＩＳＶＤの順序、およびポリペプチドがリンカーを含むかどうかは、設計選択の問題である。リンカーの有無にかかわらず、一部の配向は、他の配向と比較して優先される結合特性を提供し得る。例えば、本発明のポリペプチドにおける第１のＩＳＶＤ（例：ＩＳＶＤ１）および第２のＩＳＶＤ（例：ＩＳＶＤ２）の順序は、（Ｎ末端からＣ末端へ）：（ｉ）ＩＳＶＤ１（例：ナノボディ１）−［リンカー］−ＩＳＶＤ２（例：ナノボディ２）−［Ｃ末端伸長］；または（ｉｉ）ＩＳＶＤ２（例：ナノボディ２）−［リンカー］−ＩＳＶＤ１（例ナノボディ１）−［Ｃ末端伸長］；（ここで、角括弧内の部分、すなわちリンカーおよびＣ末端伸長は、任意である）。すべての配向が本発明に包含される。所望の結合特性を提供するＩＳＶＤの配向を含むポリペプチドは、例えば実施例の節で例示されるように、日常的なスクリーニングにより容易に同定され得る。
【０１１５】
好ましい順序において、アグリカンに結合するＩＳＶＤは、ポリペプチドのＣ末端側に位置する。特に好ましい順序は、Ｎ末端からＣ末端へ：ＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤ−［リンカー］−アグリカンに結合するＩＳＶＤ−［Ｃ末端延長］、または、ＭＭＰ１３に結合するＩＳＶＤ−［リンカー］−アグリカンに結合するＩＳＶＤ−［Ｃ末端伸長］、ここで角括弧内の部分は任意である。さらに特に好ましい順序は、Ｎ末端からＣ末端へ：ＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤ−［リンカー］−アグリカンに結合するＩＳＶＤ−［リンカー］−アグリカンに結合するＩＳＶＤ−［Ｃ末端伸長］、または、ＭＭＰ１３に結合するＩＳＶＤ−［リンカー］−アグリカンに結合するＩＳＶＤ−［リンカー］−アグリカンに結合するＩＳＶＤ−［Ｃ末端延長］、ここで角括弧内の部分は任意である。例えば、好ましい順序は、Ｎ末端からＣ末端へ：ＭＭＰ１３に結合するＩＳＶＤ−［リンカー］−ＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤ−［リンカー］−アグリカンに結合するＩＳＶＤ−［Ｃ末端伸長］、ここで角括弧内の部分は任意である。たとえば、特に好ましい順序は、Ｎ末端からＣ末端へ：ＭＭＰ１３に結合するＩＳＶＤ−［リンカー］−ＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤ−［リンカー］−アグリカンに結合するＩＳＶＤ−［リンカー］−アグリカンに結合するＩＳＶＤ−［Ｃ末端伸長］、ここで角括弧内の部分は任意である。
【０１１６】
さらなる側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１、５、６、６２、６３または６４のいずれかと少なくとも８０％、９０％、９５％または１００％の配列同一性を有する。
一側面において、本発明は、本明細書に記載のポリペプチドに関し、これは、配列番号１（ＡＬＸ−１０１１）、配列番号５（ＭＭＰ１３−ＣＡＰ−ＣＡＰ）、および配列番号６（ＡＴＳ５−ＣＡＰ−ＣＡＰ）、配列番号６２、配列番号６３および配列番号６４からなる群から選択される。
【０１１７】
本発明の特定の側面において、本発明の構築物またはポリペプチドは、それのない本発明の対応する構築物またはポリペプチドと比較して、増加した半減期を付与する部分を有し得る。本発明のかかる構築物およびポリペプチドのいくつかの好ましいが非限定的な例は、当業者には、本明細書のさらなる開示に基づいて明らかになり、これは例えば以下を含む：化学修飾されて半減期を増加させた（例えば、ペグ化による）、本発明のＩＳＶＤまたはポリペプチド；血清タンパク質（血清アルブミンなど）に結合するための少なくとも１つの追加の結合部位を含む、本発明のポリペプチドまたは構築物；または、本発明のアミノ酸配列の半減期を延長する少なくとも１つの部分（特に少なくとも１つのアミノ酸配列）に連結された、少なくとも１つの本発明のＩＳＶＤを含む本発明のポリペプチド。かかる半減期延長部分またはＩＳＶＤを含む本発明の構築物およびポリペプチドの例は、本明細書のさらなる開示に基づいて当業者に明らかになるであろう；例としては、限定はされないが、以下のポリペプチドである：本発明の１つ以上のＩＳＶＤが、１つ以上の血清タンパク質またはその断片（（ヒト）血清アルブミンまたはその適切な断片など）に好適に連結したポリペプチド、または、血清タンパク質に結合することができる１つ以上の結合単位に好適に連結したポリペプチド（血清タンパク質の例としては、例えば、ドメイン抗体、ドメイン抗体としての使用に適した免疫グロブリン単一可変ドメイン、単一ドメイン抗体、単一ドメイン抗体としての使用に適したＩＳＶＤ、ｄＡｂ、ｄＡｂとしての使用に適したＩＳＶＤ、または血清アルブミン（ヒト血清アルブミンなど）などの血清タンパク質に結合できるナノボディ、ＩｇＧなどの血清免疫グロブリン、またはトランスフェリンである；本明細書に記載のさらなる説明および参考文献を参照されたい）；本発明のアミノ酸配列がＦｃ部分（ヒトＦｃなど）またはその適切な部分もしくは断片に連結されているポリペプチド；または、本発明の１つ以上の免疫グロブリン単一可変ドメインが、血清タンパク質に結合することができる１つ以上の小タンパク質またはペプチドに適切に結合したポリペプチド、例えば、以下に記載のタンパク質およびペプチド：WO 91/01743、WO 01/45746、WO 02/076489、WO2008/068280、WO2009/127691およびPCT/EP2011/051559。
【０１１８】
一側面において、本発明は、本発明のポリペプチドおよび構築物を提供し、ここで前記構築物または前記ポリペプチドはさらに、血清タンパク質結合部分または血清タンパク質を含む。好ましくは、前記血清タンパク質結合部分は、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンに結合する。
一側面において、本発明は、血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含む、本明細書に記載のポリペプチドに関する。
一般に、半減期が増加した本発明の構築物またはポリペプチドは、好ましくは、対応する本発明の構築物またはポリペプチドそれ自体、すなわち半減期の増加をもたらす部分がない場合の半減期よりも長い、少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍または２０倍より長い、半減期を有する。例えば、半減期が増加した本発明の構築物またはポリペプチドは、対応する本発明の構築物またはポリペプチド自体と比較して、すなわち半減期の増加をもたらす部分がない場合と比較して、例えばヒトにおいて、半減期の増加が１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、またはさらに２４、４８または７２時間を超え得る。
【０１１９】
本発明の好ましい側面において、本発明の構築物および本発明のポリペプチドは、例えばヒトにおいて、対応する本発明の構築物またはポリペプチド自体、すなわち半減期の増加をもたらす部分がない場合と比較して、１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、さらには２４、４８または７２時間超増加した、血清半減期を有する。
本発明の別の好ましい側面において、本発明の構築物およびポリペプチドは、ヒトにおいて少なくとも約１２時間、好ましくは少なくとも２４時間、より好ましくは少なくとも４８時間、さらにより好ましくは少なくとも７２時間またはそれ以上の、血清半減期を示す。例えば、本発明の構築物またはポリペプチドは、血清半減期として、少なくとも５日（約５〜１０日など）、好ましくは少なくとも９日（約９〜１４日など）、より好ましくは少なくとも約１０日（約１０〜１５日など）、または少なくとも約１１日（約１１〜１６日など）、より好ましくは少なくとも約１２日（約１２〜１８日またはそれ以上など）、または１４日以上（約１４〜１９日など）を有し得る。
【０１２０】
本発明の特に好ましい側面において、本発明は、アグリカンに結合する１つ以上のビルディングブロック、およびＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３に結合する１つ以上のビルディングブロックに加えて、血清アルブミンに結合する少なくとも１つのビルディングブロック、例えば、本明細書に記載のヒト血清アルブミンなどの血清アルブミンに結合するＩＳＶＤを含む、本発明の構築物および本発明のポリペプチドを提供する。好ましくは、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤは、４つのフレームワーク領域（それぞれＦＲ１〜ＦＲ４）および３つの相補性決定領域（それぞれＣＤＲ１〜ＣＤＲ３）を含むか、または本質的にそれらからなり、ここでＣＤＲ１はＳＦＧＭＳであり、ＣＤＲ２はＳＩＳＧＳＧＳＤＴＬＹＡＤＳＶＫＧであり、およびＣＤＲ３はＧＧＳＬＳＲである。好ましくは、血清アルブミンに結合する前記ＩＳＶＤは、Ａｌｂ８、Ａｌｂ２３、Ａｌｂ１２９、Ａｌｂ１３２、Ａｌｂ１１、Ａｌｂ１１（Ｓ１１２Ｋ）−Ａ、Ａｌｂ８２、Ａｌｂ８２−Ａ、Ａｌｂ８２−ＡＡ、Ａｌｂ８２−ＡＡＡ、Ａｌｂ８２−Ｇ、Ａｌｂ８２−ＧＧ、Ａｌｂ８２−ＧＧＧ、Ａｌｂ９２またはＡｌｂ２２３からなる群から選択される（表Ｄを参照）。
一側面において、本発明は、血清タンパク質結合部分を含むポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで前記血清タンパク質結合部分は、非抗体ベースのポリペプチドである。
【０１２１】
一側面において、本発明は、少なくとも１つのＩＳＶＤまたはポリペプチド、および１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位を含む、本明細書に記載の構築物に関する。１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位は、好ましくは、以下：ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質に結合できる結合単位、Ｆｃ部分、および、血清タンパク質、さらなるアミノ酸残基、例えば毒素、標識、放射性化学物質などのタグまたは他の機能的部分に結合可能な、小タンパク質またはペプチド；からなる群から選択される。
一側面において、以下で言及されるように、本発明は、半減期延長を付与する部分を含むポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、前記部分はＰＥＧである。したがって本発明はまた、ＰＥＧを含む本発明の構築物またはポリペプチドに関する。
【０１２２】
さらなるアミノ酸残基は、本発明のポリペプチドの他の（生物学的）特性を変化させ、変更し、またはその他の影響を与えても与えなくてもよく、本発明のポリペプチドにさらなる機能を加えても加えなくてもよい。例えば、かかるアミノ酸残基は：
ａ）Ｎ末端Ｍｅｔ残基を、例えば異種宿主細胞または宿主生物での発現の結果として含むことができる；
ｂ）合成時に宿主細胞からのポリペプチドの分泌を指示するシグナル配列またはリーダー配列を、形成し得る（例えば、本発明のポリペプチドを発現するために使用する宿主細胞に応じて、本発明のポリペプチドのプレ、プロまたはプレプロ形態を提供するため）。適切な分泌リーダーペプチドは、当業者には明らかであり、本明細書でさらに説明されているとおりであってよい。通常、かかるリーダー配列はポリペプチドのＮ末端に連結されるが、ただし最も広い意味での本発明はこれに限定されない；
【０１２３】
ｃ）「タグ」、すなわち例えばポリペプチドの精製を可能にするまたは促進するアミノ酸配列または残基を、例えば前記配列または残基に向けられた親和性技術を使用して、形成し得る。その後、前記配列または残基を除去して（例えば、化学的または酵素的切断により）、ポリペプチドを提供することができる（この目的のために、タグは、切断可能なリンカー配列を介してアミノ酸配列またはポリペプチド配列に任意に連結するか、切断可能なモチーフを含むことができる）。かかる残基のいくつかの好ましいが非限定的な例は、複数のヒスチジン残基、グルタチオン残基、およびＡＡＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＮＧＡＡなどのｍｙｃタグである；
ｄ）官能化された、および／または官能基の結合部位として機能することができる、１つ以上のアミノ酸残基であってもよい。適切なアミノ酸残基および官能基は当業者には明らかであり、本発明のポリペプチドの誘導体について本明細書で言及されるアミノ酸残基および官能基が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１２４】
本発明にさらに包含されるのは、本発明のポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤを含む構築物であり、これらはさらに他の機能的部分、例えば毒素、標識、放射性化学物質などを含む。
他の基、残基、部分または結合単位は、例えば化学基、残基、部分であってよく、これらは例えば、それ自体で生物学的および／または薬理学的に活性であってもなくてもよい。例えば、限定されないが、かかる基は、本発明のポリペプチドまたは構築物の「誘導体」を提供するために、本発明の１つ以上のＩＳＶＤまたはポリペプチドに連結され得る。
したがって本発明は、その最も広い意味で、本発明の構築物および／またはポリペプチドの誘導体である、構築物および／またはポリペプチドも含む。かかる誘導体は一般に、本発明の構築物および／またはポリペプチド、および／または本発明のポリペプチドを形成する１つ以上のアミノ酸残基の、修飾によって、および特に化学的および／または生物学的（例えば酵素的）修飾によって、得ることができる。
【０１２５】
かかる修飾の例、ならびにかかる様式で修飾可能なポリペプチド配列内のアミノ酸残基の例（すなわち、タンパク質骨格上であるか、好ましくは側鎖上）、かかる修飾に使用できる方法および技術、およびかかる修飾の潜在的な使用および利点は、当業者には明らかであろう（Zangi et al., Nat Biotechnol 31(10):898-907, 2013も参照）。
例えば、かかる修飾は、１つ以上の（官能）基、残基または部分の、本発明のポリペプチド内またはこれの上への導入（例えば、共有結合によるかまたは他の適切な様式による）、および特に、本発明の構築物および／またはポリペプチドに１つ以上の所望の特性または機能性を付与する、１つ以上の（官能）基、残基または部分の導入を、含み得る。かかる官能基の例は、当業者には明らかであろう。
【０１２６】
例えば、かかる修飾は、本発明の構築物またはポリペプチドの半減期、溶解度および／または吸収を増加させ、本発明の構築物またはポリペプチドの免疫原性および／または毒性を低減し、本発明の構築物またはポリペプチドの望ましくない副作用を排除または減弱し、および／または本発明の構築物またはポリペプチドに他の有利な特性を付与しおよび／または望ましくない特性を低減する、１つ以上の機能的部分の；または前述の２つ以上の任意の組み合わせの、導入（例えば、共有結合によるか、または他の適切な様式による）を含み得る。かかる機能的部分およびそれらを導入するための技術の例は、当業者には明らかであり、一般に、本明細書の上記で引用した一般的な背景技術で言及されるすべての機能的部分および技術、ならびに医薬品タンパク質の修飾のための、それ自体既知の機能的部分および技術を含むことができる；および特に、抗体または抗体断片（ＳｃＦｖおよび単一ドメイン抗体を含む）の修飾については、例えばRemington (Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1980)を参照されたい。かかる機能的部分は、例えば、本発明のポリペプチドに直接（例えば共有結合で）、または任意に適切なリンカーまたはスペーサーを介して、連結することができ、これは再度、当業者には明らかであろう。
【０１２７】
１つの具体例は、本発明のポリペプチドまたは構築物が化学的に修飾されてその半減期が増加した（例えば、ペグ化により）、本発明の誘導体ポリペプチドまたは構築物である。これは、医薬タンパク質の半減期の延長および／または免疫原性の低下に、最も広く使用されている手法の１つであり、好適な薬学的に許容し得るポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはその誘導体（メトキシポリ（エチレングリコール）またはｍＰＥＧ）などの結合を含む。一般に、任意の適切な形態のペグ化、例えば抗体および抗体断片（（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖを含むがこれらに限定されない）に対して当技術分野で使用されるペグ化などを、使用することができる；例えば、以下を参照：Chapman (Nat. Biotechnol. 54: 531-545, 2002)、Veronese and Harris (Adv. Drug Deliv. Rev. 54: 453-456, 2003)、Harris and Chess (Nat. Rev. Drug. Discov. 2: 214-221, 2003)およびWO 04/060965。タンパク質のペグ化のための様々な試薬も市販されており、例えばNektar Therapeutics, USAからである。
【０１２８】
好ましくは、特にシステイン残基を介した部位特異的ペグ化が使用される（例えば、Yang et al. (Protein Engineering 16: 761-770, 2003を参照）。例えばこの目的のために、ＰＥＧを、本発明のポリペプチドに天然に存在するシステイン残基に結合させることができ、本発明の構築物またはポリペプチドは、ＰＥＧの結合のために１つ以上のシステイン残基を適切に導入するように修飾され得、または、ＰＥＧの結合のための１つ以上のシステイン残基を含むアミノ酸配列が、本発明の構築物またはポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に融合されてもよく、これらはすべて、当業者にそれ自体既知のタンパク質工学の技術を使用するものである。
好ましくは、本発明の構築物またはポリペプチドについては、５０００を超える分子量、例えば１０，０００超および２００，０００未満、例えば１００，０００未満；例えば、２０，０００〜８０，０００の範囲の分子量を有するＰＥＧが使用される。
【０１２９】
別の、通常はあまり好ましくない修飾は、Ｎ結合またはＯ結合グリコシル化を、本発明のポリペプチドの発現に使用される宿主細胞に応じて、通常は同時翻訳および／または翻訳後の修飾の一部として含む。
さらに別の修飾は、本発明のポリペプチドまたは構築物の意図する使用に応じた、１つ以上の検出可能な標識または他のシグナル生成基もしくは部分の導入を含み得る。それらを結合、使用および検出するための適切な標識および技術は、当業者には明らかであり、例えば、以下を含むがこれに限定はされない：蛍光標識（例えばフルオレセイン、イソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルデヒド（phthaldehyde）、およびフルオレスカミンおよび１５２Ｅｕなどの蛍光金属、またはランタニド系のその他の金属など）、リン光標識、化学発光標識または生物発光標識（例えばルミナール、イソルミノール、セロマティック（theromatic）アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、シュウ酸エステル、ジオキセタンまたはＧＦＰおよびそのアナログ）、放射性同位体（例えば３Ｈ、１２５Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ、１４Ｃ、５１Ｃｒ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、および７５Ｓｅなど）、金属、金属キレート、または金属カチオン（例えば金属カチオン、例：９９ｍＴｃ、１２３Ｉ、１１１Ｉｎ、１３１Ｉ、９７Ｒｕ、６７Ｃｕ、６７Ｇａ、および６８Ｇａ、またはin vivo、in vitroもしくはin situ診断およびイメージングでの使用に特に適した他の金属または金属カチオン、例えば（１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、１６２Ｄｙ、５２Ｃｒおよび５６Ｆｅ））、ならびに発色団および酵素（例えばリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−Ｖ−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ビオチナビジンペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−ＶＩ−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼおよびアセチルコリンエステラーゼ）。他の適切な標識は当業者には明らかであり、例えば、ＮＭＲまたはＥＳＲ分光法を使用して検出可能な部分を含む。
【０１３０】
本発明のかかる標識ポリペプチドおよび構築物は、例えば、in vitro、in vivoまたはin situアッセイ（それ自体既知の免疫アッセイ、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡおよび他の「サンドイッチアッセイ」等を含む）のために、ならびにin vivoの診断およびイメージングを目的として、特定の標識の選択に応じて使用され得る。
当業者には明らかであるように、別の修飾は、例えば上記の金属または金属カチオンの１つをキレート化するためのキレート基の導入を伴い得る。適切なキレート基には、例えば限定するものではないが、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）またはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が含まれる。
【０１３１】
さらに別の修飾は、ビオチン−（ストレプト）アビジン結合ペアなどの特定の結合ペアの一部である、機能的部分の導入を含んでもよい。かかる機能的部分を使用して、本発明のポリペプチドを、結合ペアの他の半分に結合する別のタンパク質、ポリペプチドまたは化学化合物に、例えば結合ペアの形成により連結することができる。例えば、本発明の構築物またはポリペプチドをビオチンにコンジュゲートさせ、アビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートした別のタンパク質、ポリペプチド、化合物または担体に連結することができる。例えば、本発明のかかるコンジュゲート構築物またはポリペプチドは、レポーターとして、例えば、検出可能なシグナル発生剤がアビジンまたはストレプトアビジンにコンジュゲートされる診断システムにおいて、使用され得る。かかる結合ペアは、例えば本発明の構築物またはポリペプチドを、薬学的目的に適した担体を含む担体に結合するために使用することもできる。１つの非限定的な例は、Cao and Suresh (Journal of Drug Targeting 8: 257, 2000)に記述されたリポソーム製剤である。かかる結合ペアはまた、治療的に活性な薬剤を本発明のポリペプチドに連結するために使用され得る。
【０１３２】
他の可能性のある化学的および酵素的修飾は、当業者には明らかであろう。かかる修飾はまた、研究目的（例えば、機能−活性の関係を研究するため）で導入することもできる。例えばLundblad and Bradshaw (Biotechnol. Appl. Biochem. 26: 143-151, 1997)を参照する。
好ましくは、構築物、ポリペプチドおよび／または誘導体は、アグリカンおよびＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３に、本明細書で定義される親和性（本明細書でさらに説明されるように、ＫＤ値（実際または見かけの値）、ＫＡ値（実際または見かけの値）、ｋｏｎレートまたはオンレート、および／またはｋｏｆｆまたはオフレート、あるいは代替的にＩＣ５０値として、適切に測定および／または表示される）で結合する（本発明のポリペプチドについて定義されるように）。
本発明のかかる構築物および／またはポリペプチドならびにその誘導体はまた、本質的に単離された形態（本明細書で定義される）であってもよい。
【０１３３】
一側面において、本発明は、本発明のＩＳＶＤまたは本発明のポリペプチドを含むかまたは本質的にそれからなり、さらに、任意に１つ以上のペプチドリンカーを介して連結されている１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位を含む、本発明の構築物に関する。
一側面において、本発明は、１つ以上の他の基、残基、部分または結合単位が、ポリエチレングリコール分子、血清タンパク質またはその断片、血清タンパク質に結合可能な結合単位、Ｆｃ部分、および血清タンパク質に結合可能な小タンパク質またはペプチドからなる群から選択される、本発明の構築物に関する。
【０１３４】
本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物において、例えばＩＳＶＤなどの２つ以上のビルディングブロック、および任意に１つ以上の他の基、薬物、薬剤、残基、部分、または結合単位は、互いに直接連結されてもよく（例えば、WO 99/23221に記載されているように）、および／または１つ以上の適切なスペーサーまたはリンカーを介して互いに連結されてもよく、またはそれらの任意の組み合わせである。多価および多重特異性ポリペプチドでの使用に適したスペーサーまたはリンカーは、当業者には明らかであり、一般に、アミノ酸配列を連結するために当技術分野で使用される任意のリンカーまたはスペーサーであり得る。好ましくは、前記リンカーまたはスペーサーは、薬学的使用を目的とする構築物、タンパク質またはポリペプチドの構築における使用に適している。
【０１３５】
例えば本発明のポリペプチドは、三価、三重特異性ポリペプチドであって、例えば、アグリカンに結合するＩＳＶＤなどの１つのビルディングブロック、ＡＤＡＭＴＳ５に結合するＩＳＶＤ、およびＭＭＰ１３に結合する第３のＩＳＶＤなどの潜在的に別のビルディングブロックを含む、前記ポリペプチドであってもよく、ここでＩＳＶＤなどの前記第１、第２および第３のビルディングブロックは、１つ以上、特に２つのリンカー配列を介して、任意に連結されてもよい。また本発明は、本発明の構築物またはポリペプチドであって、アグリカンに結合する第１のＩＳＶＤ、および場合によりアグリカンに結合する第２のＩＳＶＤ、および／または場合により第３のＩＳＶＤ ＡＤＡＭＴＳ５および／または場合によりＭＭＰ１３に結合する第４のＩＳＶＤを含む、前記構築物またはポリペプチドを提供し、ここで前記第１のＩＳＶＤおよび／または場合により前記第２のＩＳＶＤおよび／または場合により前記第３のＩＳＶＤおよび／または場合により前記第４のＩＳＶＤは、リンカー、特に３つのリンカーを介して、連結される。
【０１３６】
いくつかの特に好ましいリンカーには、抗体断片または抗体ドメインを連結するために当技術分野で使用されるリンカーが含まれる。これらには、上記の一般的な背景技術で言及されたリンカー、ならびに例えばダイアボディまたはＳｃＦｖ断片を構築するために当技術分野で使用されるリンカーが含まれる（この点についてはしかし、ダイアボディおよびＳｃＦｖ断片において、使用されるリンカー配列は、適切なＶＨおよびＶＬドメインが一緒になって完全な抗原結合部位を形成することを可能にする長さ、ある程度の柔軟性、および他の特性を有するべきであり、本発明のポリペプチドで使用されるリンカーの長さまたは柔軟性に特に制限はなく、これは、ナノボディなどの各ＩＳＶＤが、それ自体で完全な抗原結合部位を形成するからである）。
【０１３７】
例えばリンカーは、適切なアミノ酸配列であってよく、特に１〜５０個、好ましくは１〜３０個、例えば１〜１０個のアミノ酸残基のアミノ酸配列であり得る。かかるアミノ酸配列のいくつかの好ましい例には、例えば（ｇｌｙｘｓｅｒｙ）２タイプのｇｌｙ−ｓｅｒリンカー、例えばWO 99/42077に記載されている（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３または（ｇｌｙ３ｓｅｒ２）３など、および、本明細書に記載のAblynxによる出願に記載されているＧＳ３０、ＧＳ１５、ＧＳ９およびＧＳ７リンカー（例えばWO 06/040153およびWO 06/122825を参照）、ならびにヒンジ様領域、例えば天然に存在する重鎖抗体または類似の配列のヒンジ領域など（WO 94/04678に記載されている）が含まれる。好ましいリンカーを、表Ｃに示す。
いくつかの他の特に好ましいリンカーは、ＧＳ９（WO 06/122825の配列番号８４も参照）およびＧＳ３５、ならびにポリアラニン（ＡＡＡなど）、およびリンカーＧＳ３０（WO 06/122825の配列番号８５も参照）である。
他の適切なリンカーは一般に、有機化合物またはポリマー、特に医薬用途のタンパク質での使用に適したものを含む。例えばポリ（エチレングリコール）部分は、抗体ドメインを連結するために使用されている；例えばWO 04/081026を参照。
【０１３８】
使用されるリンカーの長さ、柔軟性の程度、および／または他の特性（ただし通常は、ＳｃＦｖ断片で使用されるリンカーの場合ほど重要ではない）が、本発明のポリペプチドなどの本発明の最終構築物の、ケモカインまたは１つ以上の他の抗原に対する親和性、特異性または結合力を含む特性（これらに限定はされない）にいくらかの影響を及ぼし得ることは、本発明の範囲に包含される。本明細書の開示に基づいて、当業者は、本発明のポリペプチドなどの本発明の特定の構築物で使用する最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された日常的実験の後に決定することができるであろう。
例えば、アグリカンおよび別の標的、例えばＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３に向けられた、ビルディングブロック、ＩＳＶＤまたはナノボディを含む本発明の多価ポリペプチドにおいて、リンカーの長さおよび柔軟性は、ポリペプチド中の本発明のＩＳＶＤなどの各ビルディングブロックが、その同族の標的、例えば各標的の抗原決定基に結合することを可能にするようなものであることが好ましい。再び、本明細書の開示に基づいて、当業者は、本発明のポリペプチドなどの本発明の特定の構築物で使用するための最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された日常的実験の後に決定することができるであろう。
【０１３９】
さらに本発明の範囲内であるのは、使用されるリンカーが、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に、１つ以上の他の好ましい特性または機能性を付与し、および／または誘導体の形成および／または官能基の結合のための１つ以上の部位を提供することである（例えば、本発明のＩＳＶＤの誘導体について本明細書に記載のように）。例えば、１つ以上の荷電アミノ酸残基を含むリンカーは改善された親水性を提供できるが、小さなエピトープまたはタグを形成するかまたは含むリンカーは、検出、識別、および／または精製の目的で使用することができる。再び、本明細書の開示に基づいて、当業者は、本発明の特定のポリペプチドで使用するための最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された日常的実験の後に決定することができるであろう。
【０１４０】
最後に、本発明のポリペプチドなどの構築物に２つ以上のリンカーが使用される場合、これらのリンカーは同一でも異なっていてもよい。再び、本明細書の開示に基づいて、当業者は、本発明の特定の構築物またはポリペプチドで使用する最適なリンカーを、任意にいくつかの限定された日常的実験の後に決定することができるであろう。
通常、発現および生産を容易にするために、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物は、線状ポリペプチドである。しかし本発明は、その最も広い意味でこれに限定されない。例えば、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物が３つ以上のビルディングブロック、ＩＳＶＤまたはナノボディを含む場合、３つ以上の「アーム」を有するリンカーの使用によりそれらを連結することが可能であり、それぞれの「アーム」は、ビルディングブロック、ＩＳＶＤまたはナノボディに連結されて「星形」の構築物を提供する。通常はあまり好ましくはないが、円形の構築物を使用することも可能である。
【０１４１】
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、前記ＩＳＶＤは互いに直接連結されるか、またはリンカーを介して連結される。
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、第１のＩＳＶＤおよび／または第２のＩＳＶＤおよび／またはおそらく血清アルブミンに結合するＩＳＶＤが、リンカーを介して連結されている。
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで、前記リンカーは、９ＧＳ、３５ＧＳ、３Ａ、５ＧＳ、７ＧＳ、１０ＧＳ、１５ＧＳ、１８ＧＳ、２０ＧＳ、２５ＧＳ、３０ＧＳ、ｐｏｌｙ−Ａ、８ＧＳ、４０ＧＳ、Ｇ１ヒンジ、９ＧＳ−Ｇ１ヒンジ、ラマ上部の長いヒンジ領域、およびＧ３ヒンジ、のリンカーからなる群から選択され、例えば表Ｃ（配列番号２８、３５、２４〜２７、２９〜３４および３６〜４０）に示されている。
【０１４２】
したがって本発明は、本発明のポリペプチドなどの本発明の構築物に関し、ここで前記ポリペプチドは、配列番号６２〜６４、１、５および６からなる群から選択される。
本発明はさらに、本明細書に記載の構築物、ポリペプチド、ＩＳＶＤ、核酸、宿主細胞、および組成物を調製する方法に関する。
本発明の多価ポリペプチドは一般に、少なくとも本発明のＩＳＶＤおよび／または一価ポリペプチドを、場合により１つ以上の適切なリンカーを介して、１つ以上のさらなるＩＳＶＤに適切に連結するステップを含む方法によって調製することができ、こうして本発明の多価ポリペプチドを提供する。本発明のポリペプチドはまた、少なくとも、本発明のポリペプチドをコードする核酸を提供するステップ、前記核酸を適切な方法で発現するステップ、および発現された本発明のポリペプチドを回収するステップを含む方法によっても、調製することができる。かかる方法は、それ自体既知の様式で実行することができ、これは当業者には、例えば本明細書でさらに説明する方法および技術に基づいて、明らかであろう。
【０１４３】
本発明の多価ポリペプチドを調製する方法は、少なくとも、本発明の２つ以上のＩＳＶＤおよび例えば１つ以上のリンカーを、適切な様式で一緒に連結するステップを含んでもよい。本発明のＩＳＶＤ（およびリンカー）は、当技術分野で知られており本明細書でさらに説明する任意の方法により、結合することができる。好ましい技術には、本発明のＩＳＶＤ（およびリンカー）をコードする核酸配列を連結して、多価ポリペプチドを発現する遺伝子構築物を調製することが含まれる。アミノ酸または核酸を連結する技術は当業者には明らかであり、標準的なハンドブック、例えば上記のSambrook et al.およびAusubel et al.など、ならびに以下の実施例を再び参照する。
【０１４４】
したがって、本発明は、本発明の多価ポリペプチドの調製における、本発明のＩＳＶＤの使用にも関する。多価ポリペプチドを調製する方法は、本発明のＩＳＶＤを、任意に１つ以上のリンカーを介して、少なくとも１つのさらなる本発明のＩＳＶＤに連結することを含む。次いで、本発明のＩＳＶＤは、２つ（例えば、二価ポリペプチド中）、３つ（例えば、三価ポリペプチド中）、４つ（例えば、四価中）、またはそれ以上（例えば、多価ポリペプチド中）のビルディングブロックを含む多価ポリペプチドを提供および／または調製する際の、結合ドメインまたはビルディングブロックとして使用される。これに関して、本発明のＩＳＶＤは、２、３、４またはそれ以上のビルディングブロックを含む本発明の二価、三価または四価などの多価ポリペプチドを提供および／または調製する際の、結合ドメインまたは結合単位として、使用することができる。
【０１４５】
したがって、本発明はまた、本発明のＩＳＶＤポリペプチド（本明細書に記載）の、多価ポリペプチドの調製における使用にも関する。多価ポリペプチドの調製方法は、本発明のＩＳＶＤの、任意に１つ以上のリンカーを介した、少なくとも１つのさらなる本発明のＩＳＶＤへの連結を含む。
本発明のポリペプチドおよび核酸は、本明細書のさらなる説明から当業者に明らかなように、それ自体既知の様式で調製することができる。例えば、本発明のポリペプチドは、抗体の調製、特に抗体断片（（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ断片を含むがこれらに限定されない）の調製のための、それ自体既知の任意の様式で調製することができる。ポリペプチドおよび核酸を調製するためのいくつかの好ましいが非限定的な方法には、本明細書に記載の方法および技術が含まれる。
【０１４６】
本発明のポリペプチドを生産する方法は、以下のステップを含み得る：本発明の前記ポリペプチドをコードする核酸（本明細書では「本発明の核酸」とも呼ばれる）の、適切な宿主細胞または宿主生物（本明細書では「本発明の宿主」とも呼ばれる）における、または別の適切な発現系における発現；続いて任意に、こうして得られた本発明のポリペプチドを、単離および／または精製すること。
特に、かかる方法は、以下のステップを含んでもよい：本発明の宿主を、本発明の宿主が本発明の少なくとも１つのポリペプチドを発現および／または生産するような条件下で、培養および／または維持すること；続いて任意に、こうして得られた本発明のポリペプチドを単離および／または精製すること。
【０１４７】
したがって本発明はまた、本発明のポリペプチド、ＩＳＶＤまたは構築物をコードする核酸またはヌクレオチド配列（「本発明の核酸」とも呼ばれる）にも関する。
本発明の核酸は、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡの形態であり得る。本発明の一態様によれば、本発明の核酸は、本明細書で定義されるように、本質的に単離されている。本発明の核酸はまた、発現ベクターなどのベクター、例えばプラスミド、コスミドまたはＹＡＣ（これもまた本質的に単離された形態であり得る）の形態であっても、その中に存在しても、および／またはベクターの一部であってもよい。したがって本発明はまた、本発明の核酸またはヌクレオチド配列を含む、発現ベクターにも関する。
【０１４８】
本発明の核酸は、本明細書に記載の本発明のポリペプチドに関する情報に基づいて、それ自体既知の様式で調製または取得でき、および／または適切な天然源から単離できる。また、当業者には明らかであるように、本発明の核酸を調製するために、いくつかのヌクレオチド配列、例えば本発明のＩＳＶＤをコードする少なくとも２つの核酸、および例えば１つ以上のリンカーをコードする核酸などを、適切な様式で一緒に連結することができる。本発明の核酸を生成するための技術は当業者には明らかであり、例えば、限定はされないが、以下を含み得る：自動化されたＤＮＡ合成；部位特異的変異誘発；２つ以上の天然に存在する配列および／または合成配列（またはその２つ以上の部分）の組み合わせること、切断された発現産物の発現をもたらす変異の導入；１つ以上の制限部位の導入（例えば、適切な制限酵素を使用して、容易に消化および／またはライゲートできるカセットおよび／または領域を作成するため）、および／または１つ以上の「不一致」プライマーを使用した、ＰＣＲ反応による変異の導入。これらおよび他の技術は当業者には明らかであり、再度、標準的なハンドブック、例えば上記のSambrook et al.およびAusubel et al.など、ならびに以下の実施例を参照する。
【０１４９】
好ましいが非限定的な態様において、本発明の遺伝子構築物は以下を含む：
ａ）本発明の少なくとも１つの核酸；
ｂ）１つ以上の調節要素に動作可能に接続されている、例えばプロモーター、および任意に適切なターミネーター；および任意にまた
ｃ）それ自体知られている、遺伝子構築物の１つ以上のさらなる要素；
ここで、用語「調節要素」、「プロモーター」、「ターミネーター」、および「動作可能に接続された」は、当技術分野における通常の意味を有する。
本発明の遺伝子構築物は一般に、本発明のヌクレオチド配列を、例えば上記のSambrook et al.およびAusubel et al.など一般的なハンドブックに記載された技術を使用して、上記の１つ以上のさらなる要素に適切に連結することにより提供され得る。
【０１５０】
本発明の核酸および／または本発明の遺伝子構築物は、宿主細胞または宿主生物を形質転換するために、すなわち、本発明のポリペプチドの発現および／または生産のために、使用され得る。適切な宿主または宿主細胞は当業者には明らかであり、例えば、任意の適切な真菌、原核生物または真核生物の細胞または細胞株、または任意の適切な真菌、原核生物または（非ヒト）真核生物ならびに、抗体および抗体断片（（単一）ドメイン抗体およびＳｃＦｖ断片を含むがこれらに限定されない）の発現および生産についてそれ自体既知の宿主細胞または（非ヒト）宿主であることができ、これらは当業者には明らかであろう。上記で引用された一般的な背景技術、ならびに例えば以下も参照される：WO 94/29457；WO 96/34103；WO 99/42077；Frenken et al. (Res Immunol. 149: 589-99, 1998)；Riechmann and Muyldermans (1999)上記；van der Linden (J. Biotechnol. 80: 261-70, 2000)；Joosten et al. (Microb. Cell Fact. 2: 1, 2003)；Joosten et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol. 66: 384-92, 2005)；および、本明細書に引用されているさらなる参考文献。さらに本発明のポリペプチドは、無細胞発現系で発現および／または生産することもでき、かかる系の適切な例は当業者には明らかであろう。本発明の宿主または宿主細胞を形質転換するための適切な技術は、当業者には明らかであり、意図される宿主細胞／宿主生物および使用される遺伝子構築物に依存し得る。再度、上記のハンドブックおよび特許出願を参照する。形質転換された宿主細胞（安定な細胞株の形態であり得る）または宿主生物（安定な変異体系統または株の形態であり得る）は、本発明のさらなる側面を形成する。したがって本発明は、本発明による核酸、または本発明による発現ベクターを含む、宿主または宿主細胞に関する。好ましくは、これらの宿主細胞または宿主生物は、本発明のポリペプチド（および宿主生物の場合：その少なくとも１つの細胞、部分、組織または臓器において）を発現するか、（少なくとも）（例えば、適切な条件下で）発現可能なものである。本発明はまた、本発明の宿主細胞または宿主生物のさらなる世代、後代および／または子孫を含み、これらは例えば、細胞分裂または有性生殖または無性生殖により得ることができる。
【０１５１】
本発明のポリペプチドの発現を生成／取得するために、形質転換された宿主細胞または形質転換された宿主生物は、一般に、本発明の（望ましい）ポリペプチドが発現／生産されるような条件において、保たれる、維持される、および／または培養され得る。適切な条件は当業者には明らかであり、通常、使用される宿主細胞／宿主生物、ならびに本発明の（関連する）ヌクレオチド配列の発現を制御する調節要素に依存する。再度、本発明の遺伝子構築物に関する段落で上述した、ハンドブックおよび特許出願を参照する。
【０１５２】
次いで、本発明のポリペプチドの単離は、宿主細胞／宿主生物および／または前記宿主細胞もしくは宿主生物が培養された培地から、それ自体既知のタンパク質の単離および／または精製技術、例えば（分取）クロマトグラフィーおよび／または電気泳動技術、示差沈殿技術、親和性技術（例えば、本発明のポリペプチドと融合した特定の切断可能なアミノ酸配列を使用）および／または分取免疫学的技術（すなわち、単離されるポリペプチドに対する抗体を使用）を用いて、行うことができる。
一側面において、本発明は、少なくとも以下のステップを含む、本発明による構築物、ポリペプチドまたはＩＳＶＤを生産する方法に関する：（ａ）適切な宿主細胞または宿主生物または別の適切な発現系において、本発明による核酸配列を発現するステップ；これに続いて任意に（ｂ）本発明による構築物、ポリペプチドまたはＩＳＶＤを単離および／または精製するステップ。
一側面において、本発明は、本発明による構築物、ポリペプチド、ＩＳＶＤまたは核酸を含む、組成物に関する。
【０１５３】
上記のように、安全で効果的なＯＡ医薬品の必要性が残されている。第一に、本発明者らは、非常に効果的な軟骨固定タンパク質、すなわちアグリカンに結合するＩＳＶＤを同定し、これは、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３にも結合する分子を操作するためのビルディングブロックとして使用された。得られた分子は、対象において増加した保持を有し、活性を保持しつつ全身投与することができた。本発明者らはその後、ＡＤＡＭＴＳ５阻害剤とＭＭＰ１３阻害剤の両方の組み合わせが、いずれかの標的を単独で阻害するよりも、ＯＡを改善するのにより効果的であることを実証した。さらに、本発明のポリペプチドおよび構築物は、先行技術の化合物よりも顕著に効果的であることも実証した。
したがって本発明は、先行技術のアミノ酸配列および抗体と比較して、より安全なプロファイルを含む、改善された予防的、治療的および／または薬理学的特性を有する組成物、構築物および／またはポリペプチドを提供する。
【０１５４】
一側面において、本発明は、例えばＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３活性が関与する個体の疾患または障害を処置または予防する方法に関し、この方法は、本発明による組成物、ポリペプチドおよび／または構築物を、前記疾患または障害（の症状）を処置または予防するための有効量で、前記個体に投与することを含む。
一側面において、本発明は、医薬として使用するための、本発明による組成物、本発明によるポリペプチド、および／または本発明による構築物に関する。
別の側面において、本発明は、少なくともＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３関連疾患、例えばＯＡなどの、予防および／または処置のための医薬組成物の調製における、および／または本明細書に記載の処置方法の１つ以上で使用するための、本発明の組成物、ポリペプチドおよび／または構築物の使用に関する。
【０１５５】
本発明はまた、本発明の組成物、ポリペプチドおよび／または構築物の使用であって、ＡＤＡＭＴＳの活性を調節すること、好ましくはＡＤＡＭＴＳ５の活性を阻害することにより、予防および／または処置できる少なくとも１つの疾患または障害の、予防および／または処置のための医薬組成物の調製における、前記使用に関する。
本発明は、本発明による組成物、ポリペプチドおよび／または構築物の使用であって、ＭＭＰの活性を調節し好ましくはＭＭＰ１３の活性を阻害することにより予防および／または処置することができる少なくとも１つの疾患または障害の、予防および／または処置のための医薬組成物の調製における、前記使用にも関する。
本発明はまた、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチド、組成物および／または構築物の使用であって、本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチド、組成物および／または構築物を患者に投与することにより予防および／または処置することができる少なくとも１つの疾患、障害または状態の予防および／または処置のための医薬組成物の調製における、前記使用に関する。
【０１５６】
本発明はさらに、少なくともＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３関連疾患の予防および／または処置に使用するための、本発明のＩＳＶＤ、組成物、ポリペプチド、および／もしくは構築物、またはそれを含む医薬組成物に関する。
本発明のＡＤＡＭＴＳ５結合剤は、軟骨に影響を与える様々な疾患において、例えば関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎およびアグリカノパチーおよび非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）（本明細書では一般的に「ＡＤＡＭＴＳ５関連疾患」として示される）、好ましくはＯＡにおいて、使用可能であることが予想される。
【０１５７】
本発明のＭＭＰ１３結合剤は、軟骨に影響を与える様々な疾患において、例えば関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎、アグリカノパチー、慢性歯周炎および腹部大動脈瘤（本明細書では一般的に「ＭＭＰ１３関連疾患」として示される）、好ましくはＯＡにおいて、使用可能であることが予想される。
【０１５８】
一側面において、本発明は、ＡＤＡＭＴＳ５関連疾患および／またはＭＭＰ１３関連疾患の症状を処置または予防するのに使用するための、本発明による組成物、ＩＳＶＤ、ポリペプチドおよび／または構築物に関し、前記疾患としては例えば、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎、アグリカノパチー、ＮＡＳＨ、慢性歯周炎および腹部大動脈瘤、好ましくはＯＡである。
一側面において、本発明は、関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、再発性多発性軟骨炎、ＮＡＳＨ、慢性歯周炎および腹部大動脈瘤、好ましくはＯＡを予防または処置するための方法に関し、ここで前記方法は、それを必要とする対象に、少なくとも本発明による組成物、免疫グロブリン、ポリペプチド、または構築物の薬学的活性量を投与することを含む。
【０１５９】
一側面において、本発明は、本発明によるＩＳＶＤ、ポリペプチド、組成物および／または構築物の使用であって、疾病または疾患、例えば関節症および軟骨異栄養症、関節炎、例えば変形性関節症、関節リウマチ、痛風性関節炎、乾癬性関節炎、外傷性裂傷または剥離、軟骨形成不全、肋軟骨炎、脊椎骨端異形成症、椎間板ヘルニア、腰部椎間板変性疾患、変性関節疾患、および再発性多発性軟骨炎、離断性骨軟骨炎、アグリカノパチー、ＮＡＳＨ、慢性歯周炎および腹部大動脈瘤、好ましくはＯＡを処置または予防するための医薬組成物の調製における、前記使用に関する。
また、アグリカンに結合することにより、本発明のＩＳＶＤ、構築物および／またはポリペプチドは、セリンプロテアーゼファミリーのメンバー、カテプシン、例えばＭＭＰ２０などのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ１３以外のＭＭＰ）だけではなく、アグリカンの分解におけるＡＤＡＭＴＳ４（アグリカナーゼ１）および／またはＡＤＡＭＴＳ１１の活性を、低下または阻害し得ることが期待される。
【０１６０】
本発明の文脈において、用語「予防および／または処置」は、疾患の予防および／または処置を含むだけでなく、一般に以下も含む：疾患の発症の予防、疾患の進行の遅延または逆転、疾患の予防または遅延、疾患に関連する１つ以上の症状の発症の予防または遅延、疾患に関連する１つ以上の症状の軽減および／または緩和、疾患の重症度および／または持続期間および／またはそれに関連する症状の低減、および／または疾患の重症度および／またはそれに関連する任意の症状のさらなる増加の予防、疾患によって引き起こされる任意の生理学的損傷の予防、軽減、または逆転、および処置される患者に有益な一般的に任意の薬理作用。
【０１６１】
投与計画は、担当医および臨床的要因によって決定される。医療分野でよく知られているように、任意の一患者への投与量は、例えば患者のサイズ、体重、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、使用されるポリペプチド（抗体を含む）の活性、投与の時間と経路、一般的な健康状態、および他の療法または処置との組み合わせを含む、多くの要因に依存する。タンパク質性の薬学的活性物質は、１用量あたり１ｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の量で存在し得る；しかしながら、この例示的な範囲を下回るかまたは上回る用量も想定される。計画が持続注入の場合、１分間に体重１キログラムあたり１ｐｇ〜１００ｍｇの範囲であり得る。
【０１６２】
本発明のＩＳＶＤ、ポリペプチドまたは構築物は、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３の活性を、当技術分野で周知の方法によりアッセイされる場合に、少なくとも約５０％、好ましくは７５％、より好ましくは９０％、９５％または最大９９％、および最も好ましくは約１００％（本質的に完全に）阻害および／または中和するために、例えば、０．０１、０．１、０．５、１、２、５、１０、２０または５０ｐｇ／ｍｌの濃度で使用され得る。
一般に処置計画は、本発明の１つ以上のポリペプチドおよび／もしくは構築物、またはそれを含む１つ以上の組成物の、１以上の薬学的有効量または用量での投与を含む。投与されるべき特定の量または用量は、臨床医により、再度上記の要因に基づいて決定することができる。本発明の組成物、構築物、および／またはポリペプチドの有用な用量は、それらのin vitro活性と動物モデルにおけるin vivo活性とを比較することにより決定することができる。マウスおよび他の動物での有効用量をヒトに外挿する方法は、当技術分野で知られている；例えば、US 4,938,949を参照。
【０１６３】
一般に、処置される特定の疾患、障害または状態、使用される特定の本発明のポリペプチドおよび／または構築物の効力、特定の投与経路および使用される特定の医薬製剤または組成物に応じて、臨床医は適切な投与計画を決定できるであろう。
本発明の組成物、構築物、および／またはポリペプチドの、処置における使用に必要とされる量は、選択された特定の組成物、ポリペプチド、および／または構築物だけでなく、投与経路、処置される状態の性質、患者の年齢および状態によっても異なり、最終的には担当医または臨床医の裁量に委ねられる。また、本発明の組成物、構築物、および／またはポリペプチドの用量は、標的細胞、組織、または臓器に応じて変化する。
【０１６４】
所望の用量は、単回用量で、または、−より好ましくはないが−適切な間隔で投与される分割用量として、例えば、１日あたり２、３、４またはそれ以上のサブ用量として便利に提示され得る。サブ用量自体は、例えば、いくつかの別個の大まかに間隔を空けた複数の投与にさらに分割されてもよい。
投与計画には、長期にわたる毎日の処置が含まれ得る。「長期」とは、少なくとも２週間、好ましくは数週間、数ヶ月、または数年の期間を意味する。この用量範囲の必要な修正は、本明細書の教示および通常の実験のみを使用して、当業者により決定され得る。Remington’s Pharmaceutical Sciences (Martin, E.W., ed. 4), Mack Publishing Co., Easton, PAを参照。投与量は、任意の合併症の場合には、個々の医師が調整することもできる。組成物、ポリペプチドおよび構築物は非常に安定であり、長期間有効であることが示されている。
【０１６５】
通常、上記の方法において、本発明の組成物、ポリペプチドおよび／または構築物が使用される。しかしながら、本発明の２つ以上の組成物、ポリペプチドおよび／または構築物を組み合わせて、例えば配列番号５と６、配列番号６３と６４、配列番号５と６４、または配列番号６３と６を組み合わせて使用することは、本発明の範囲内である。
本発明の組成物、ポリペプチドおよび／または構築物は、１つ以上のさらなる薬学的に活性な化合物または成分と組み合わせて、すなわち、併用治療計画として使用することができ、これは、相乗効果をもたらすことも、そうでない場合もある。
医薬組成物はまた、少なくとも１つのさらなる活性剤、例えば１つ以上のさらなる抗体またはその抗原結合断片、ペプチド、タンパク質、核酸、有機および無機分子を含み得る。
【０１６６】
再度、臨床医は、かかるさらなる化合物または成分、ならびに適切な併用処置計画を、上記の要因と自身の専門家の判断に基づき、選択することができる。
特に、本発明の組成物、ポリペプチドおよび／または構築物は、本明細書に引用される疾患、障害および状態の予防および／または処置に使用されるかまたは使用できる、他の薬学的に活性な化合物または成分と、組み合わせて使用することができ、その結果、相乗効果が得られる場合も得られない場合もある。かかる化合物および成分の例、ならびにそれらを投与するための経路、方法および医薬製剤または組成物は、臨床医には明らかであろう。
【０１６７】
２つ以上の物質または成分、たとえば、ＡＤＡＭＴＳ５を阻害するＩＳＶＤを含むポリペプチドおよびＭＭＰ１３を阻害するＩＳＶＤを含む別のポリペプチド（を含む組成物）などの物質または成分が、併用処置計画の一部として、例えば配列番号５と６、配列番号６３と６４、配列番号５と６４、または配列番号６３と６の組み合わせで使用される場合、それらは同じ投与経路または異なる投与経路を介して、本質的に同時にまたは異なる時間に投与され得る（例えば、本質的に同時に、連続的に、または交互の方式に従って）。物質または成分を同じ投与経路を介して同時に投与する場合、それらは、当業者には明らかなように、異なる医薬製剤もしくは組成物、または組み合わせた医薬製剤または組成物の一部として、投与することができる。
【０１６８】
また、２つ以上の活性物質または成分を併用処置計画の一部として使用する場合、例えば、ＡＤＡＭＴＳ５を阻害するＩＳＶＤを含むポリペプチドおよびＭＭＰ１３を阻害するＩＳＶＤを含む別のポリペプチド（を含む組成物）を使用する場合、物質または成分の各々は、化合物または成分をそれ自体で使用する場合に使用するのと同じ量で、同じ計画に従って投与してもよく、かかる併用は、相乗効果をもたらすこともあり、もたらさないこともある。しかし、２つ以上の活性物質または成分の組み合わせ使用が相乗効果をもたらす場合、投与する物質または成分の１つ、それ以上、またはすべての量を減らすことも可能であり、なおかつ所望の治療効果を達成する。これは例えば、通常の量で使用する場合に、１つ以上の物質または成分の使用に関連する任意の望ましくない副作用を、回避、制限、または軽減するのに役立ち得て、なおかつ所望の医薬または治療効果が得られる。
【０１６９】
本発明に従って使用される処置計画の有効性は、臨床医には明らかであるように、関与する疾患、障害または状態について、それ自体既知の任意の様式で決定しおよび／または従うことができる。臨床医はまた、必要に応じておよびケースバイケースで特定の処置計画を変更または修正して、望ましい治療効果を達成し、望ましくない副作用を回避、制限、または軽減することができ、および／または、一方では望ましい治療効果を達成し、他方では望ましくない副作用を回避、制限、または軽減することの間の適切なバランスを達成する。
【０１７０】
一般に処置計画は、所望の治療効果が達成されるまで、および／または所望の治療効果が維持される限り、続けられるであろう。再度、これは臨床医が決定できる。
したがって、さらなる側面において、本発明は、本発明の少なくとも１つの構築物、または本発明の少なくとも１つのポリペプチド、および少なくとも１つの適切な担体、希釈剤または賦形剤（すなわち、医薬用途に適した）、および任意に１つ以上のさらなる活性物質を含む、医薬組成物に関する。特定の側面において、本発明は、少なくとも１つの本発明による組成物、構築物、またはポリペプチドを含む医薬組成物に、好ましくは配列番号１と６２、配列番号５と６、配列番号６３と６４、配列番号５と６４、または配列番号６３と６の少なくとも１つ、および少なくとも１つの適切な担体、希釈剤または賦形剤（すなわち、医薬用途に適したもの）、および任意に１つ以上のさらなる活性物質を含む、医薬組成物に関する。
【０１７１】
処置される対象は、任意の温血動物であってもよいが、特に哺乳動物、より具体的にはヒトである。獣医用途においては、処置される対象に、商業目的で飼育されているかペットとして飼われている任意の動物が含まれる。当業者には明らかであるように、処置される対象は、特に、本明細書で言及される疾患、障害および状態に苦しんでいるか、またはそのリスクのある人である。したがって、本発明の好ましい側面において、本発明のポリペプチドを含む医薬組成物は、医学または診断において使用するためのものである。好ましくは、医薬組成物は、ヒト医学で使用するためのものであるが、獣医学的目的で使用することもできる。
【０１７２】
再度、かかる医薬組成物において、本発明の１つ以上の組成物、ポリペプチドおよび／もしくは構築物、またはそれをコードするヌクレオチド、および／またはそれを含む医薬組成物は、１つ以上の他の活性成分、例えば本明細書に記載されているものと、適切に組み合わせることができる。
本発明はまた、in vitro（例えば、in vitroまたは細胞アッセイ）またはin vivo（例えば、単一細胞または多細胞生物、および特に哺乳動物、より具体的にはヒト、例えば本発明の疾患、障害または状態のリスクがあるか、またはこれに罹患しているヒト）のいずれかで使用するための組成物（例えば、限定されることなく、本明細書にさらに記載の医薬組成物または製剤など）にも関する。
【０１７３】
特に明記しない限り、処置への言及には、確立された症状の処置および予防的処置の両方が含まれることを理解されたい。
一般に、医薬用途では、本発明の組成物、構築物、ポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤは、少なくとも１つの本発明の構築物、ポリペプチドおよび／またはＩＳＶＤおよび、少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバント、ならびに任意に１つ以上の薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含む、医薬製剤または組成物として製剤化することができる。非限定的な例として、かかる製剤は、経口投与のため、非経口投与のため（例えば関節内、静脈内、筋肉内または皮下注射または静脈内注入など）、局所投与のため、吸入による投与のために、皮膚パッチ、インプラント、座薬などに適した形態であることができ、ここで非経口投与が好ましい。かかる適切な投与形態−これは投与の様式に応じて固体、半固体または液体であり得る−およびその調製に使用するための方法および担体は、当業者には明らかであり、本明細書でさらに説明される。かかる医薬製剤または組成物は、一般に、本明細書において「医薬組成物」と呼ばれる。
【０１７４】
例示的な賦形剤として、崩壊剤、結合剤、充填剤、および潤滑剤が言及され得る。崩壊剤の例には、寒天、アルギン、炭酸カルシウム、セルロース、コロイド二酸化ケイ素、ゴム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、メチルセルロース、およびデンプンが含まれる。結合剤の例には、微結晶セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、およびポリビニルピロリドンが含まれる。充填剤の例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、三塩基性硫酸カルシウム、カルボキシメチルセルロースカルシウム、セルロース、デキストリン、デキストロース、フルクトース、ラクチトール、ラクトース、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルチトール、マルトデキストリン、マルトース、ソルビトール、デンプン、スクロース、糖、およびキシリトールが含まれる。潤滑剤の例には、寒天、オレイン酸エチル、ラウリン酸エチル、グリセリン、パルミトステアリン酸グリセリル、硬化植物油、酸化マグネシウム、ステアリン酸塩、マンニトール、ポロキサマー、グリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリルナトリウム、ソルビトール、およびタルクが含まれる。通常の安定剤、防腐剤、湿潤剤および乳化剤、粘稠性改善剤、風味改善剤、浸透圧を変化させる塩、緩衝物質、可溶化剤、希釈剤、皮膚軟化剤、着色剤、およびマスキング剤、および抗酸化剤が、医薬品アジュバントとして考慮される。
【０１７５】
適切な担体には、限定はされないが、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、タルク、糖、ラクトース、ペクチン、デキストリン、デンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、低融点ワックス、ココアバター、水、アルコール、ポリオール、グリセロール、植物油などが含まれる。
一般に、本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤは、それ自体既知の任意の適切な様式で、製剤化および投与することができる。例えば、上記で引用された一般的な背景技術（および特にWO 04/041862、WO 04/041863、WO 04/041865、WO 04/041867およびWO 08/020079）、ならびに標準のハンドブック、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Company, USA (1990)、Remington, the Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams and Wilkins (2005)；またはthe Handbook of Therapeutic Antibodies (S. Dubel, Ed.), Wiley, Weinheim, 2007（例えば、２５２〜２５５頁参照）を参照。
【０１７６】
特定の側面において、本発明は、少なくとも本発明による組成物、構築物、ポリペプチド、ＩＳＶＤまたは核酸を含み、さらに少なくとも１つの薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤および／またはアジュバントを含み、任意に１つ以上のさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または構築物を含む、医薬組成物に関する。
本発明の組成物、構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤは、従来の抗体および抗体断片（ＳｃＦｖおよびダイアボディを含む）および他の薬学的に活性なタンパク質についてのそれ自体既知の任意の様式で、製剤化および投与され得る。かかる製剤およびそれを調製する方法は、当業者には明らかであり、例えば、非経口投与（例えば、関節内、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、管腔内、動脈内、脊髄内、鼻腔内または気管支内投与）、またさらに局所（すなわち、経皮または皮内）投与に好ましく適している製剤を含む。
【０１７７】
非経口投与のための製剤は、例えば、注入または注射に適した滅菌溶液、懸濁液、分散液または乳液であり得る。かかる製剤に適した担体または希釈剤には、例えば、限定はされないが、WO 08/020079の１４３頁に記載されているものが含まれる。通常、水溶液または懸濁液が好ましい。
本発明の組成物、構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤはまた、遺伝子治療から知られている送達方法を用いて投与することもでき、例えば、その遺伝子治療送達方法に関して参照により組み込まれる米国特許第5,399,346号を参照されたい。遺伝子治療の送達方法を使用して、本発明の構築物、ポリペプチド、および／またはＩＳＶＤをコードする遺伝子でトランスフェクトされた一次細胞は、特定の臓器、組織、移植片、腫瘍、または細胞を標的とする組織特異的プロモーターでさらにトランスフェクトされ得、さらに、細胞内局在発現のためのシグナルおよび安定化配列でトランスフェクトされ得る。
【０１７８】
本発明のさらなる側面によれば、本発明の組成物、構築物および／またはポリペプチドは、in vivoおよびin vitroでのさらなる用途に使用され得る。例えば本発明の組成物、構築物および／またはポリペプチドは、診断目的のために、例えば、ＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３の存在を検出および／または定量化するため、および／またはＡＤＡＭＴＳ５および／またはＭＭＰ１３を精製するために設計されたアッセイにおいて、使用され得る。組成物、ポリペプチドおよび／または構築物はまた、毒性学、安全性、および投与量の研究を実施するために、特定の疾患の動物モデルで試験され得る。
最後に本発明は、本発明による少なくとも１つの組成物、ポリペプチドまたは構築物、前記成分をコードする少なくとも１つの核酸配列、本発明のベクターまたはベクターシステム、および／または本発明による宿主細胞を含む、キットに関する。キットは、異なる形態、例えば診断キットとして提供され得ることが企図される。
【０１７９】
本発明を、以下の非限定的な好ましい側面、実施例および図によりさらに説明する。
本出願を通して引用されるすべての参考文献（文献参照、発行済み特許、公開特許出願、および同時係属中の特許出願を含む）の全内容は、特に上記で参照された教示に関して、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。
配列は、明細書の本文および、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５による別個の配列リストに記載されている。特定の番号で指定された配列は、明細書本文と別個の配列リストにおいて同一であるべきである。例として、配列番号１は、明細書本文と別個の配列リストの両方で、同じ配列を定義すべきである。
【０１８０】
配列は、明細書の本文および、ＷＩＰＯ標準ＳＴ．２５による別個の配列リストに記載されている。特定の番号で指定された配列は、明細書本文と別個の配列リストにおいて同一であるべきである。例として、配列番号１は、明細書本文と別個の配列リストの両方で、同じ配列を定義すべきである。明細書本文と別個の配列リストの配列定義の間に矛盾がある場合（例えば、明細書本文の配列番号１が誤って、別個の配列リストの配列番号２に対応する場合）、本出願における特定の配列への言及、特に特定の態様における言及は、別個の配列リストへの言及ではなく、本出願の本文中の配列への言及として理解されるべきである。言い換えれば、明細書本文と別個の配列リストとの間の、配列定義／指定の矛盾は、別個の配列リストを、明細書、実施例、図、および特許請求の範囲を含む出願の本文に開示されている配列およびそれらの指定に修正することにより、解決される。
【実施例】
【０１８１】
６．例
発明者らは、理論に拘束されることなく、ＡＤＡＭＴＳ５とＭＭＰ１３の両方を阻害することが以下の点で潜在的により効果的であると仮定した：
（１）より広範囲のＯＡ誘導性かつ持続性のプロテアーゼが阻害される；
（２）患者を異なるグループに分ける必要なしに、より広範囲の患者を標的にすることができる；および
（３）より広範囲の病気の発症を処置することができる。
患者への優しさのために、阻害剤は関節内で長期間保持され活性であることが好ましい。
したがって、本発明者らは、ＭＭＰ１３に特異的に結合するＩＳＶＤ、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤ、およびアグリカンに特異的に結合するＩＳＶＤの単離および特性評価に着手した。その後、ＩＳＶＤをさまざまなフォーマットで組み合わせ、さまざまなin vitro、ex vivo、およびin vivoモデルで試験した。
【０１８２】
例１  ＭＭＰ１３ ＩＳＶＤ
１．１  抗ＭＭＰ１３ ＩＳＶＤ ６２Ｃ０２
１０Ｅ７より多くのクローンをスクリーニングした後、ＭＭＰ１３に特異的なＩＳＶＤ ６２Ｃ０２を、蛍光発生ペプチドアッセイ、コラーゲン分解アッセイ、蛍光発生コラーゲンアッセイで同定した。
簡潔に言えば、ヒト、カニクイザル、ラット、イヌおよびウシのＭＭＰ１３蛍光発生ペプチドアッセイ、ならびにヒトＭＭＰ１およびＭＭＰ１４蛍光発生ペプチドアッセイの設定は次のとおりである。活性化されたＭＭＰを、蛍光発生ペプチド基質Ｍｃａ−ＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ２（R&DSystems #ES001）およびペリプラズム抽出物の１／５希釈液または精製ナノボディ／陽性対照の希釈系列（総容量＝アッセイバッファー：５０ｍＭのTris、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％Tween20中、２０μｌ）を用いて、３７℃で２時間インキュベートした。蛍光の線形の増加（ｖ０−１５〜４５分間のインキュベーション）を酵素活性の尺度として使用し、阻害％を、式：１００−１００（試験ナノボディの存在下でのｖ０／陰性対照ナノボディ（Cablys）の存在下でのｖ０）により計算した。
【０１８３】
コラーゲン分解アッセイの設定の概要は次のとおりである。２５０ｎｇ／ｍｌの免疫グレードのヒトコラーゲンＩＩ（Chondrex #20052）を、５ｎＭの活性化ＭＭＰと共に、１００μｌのアッセイバッファー（５０ｍＭのTris−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％Tween-20）中でインキュベートした。３５℃で１．５時間のインキュベーションの後、反応物をＥＤＴＡ（３０ｍＭのストックを１０μｌ）で中和した。ＭＭＰ１３で切断されたコラーゲンは、エラスターゼを用いて３８℃で２０分間さらに分解して、分解したコラーゲンＩＩの再アニーリングを回避した（ＩＩ型コラーゲン検出キット（Chondrex #6009）で提供される１／３希釈ストック１０μｌ）。残されたそのままのコラーゲンは、ＥＬＩＳＡ（ＩＩ型コラーゲン検出キット（Chondrex #6009）で提供される試薬）を介して検出した。
蛍光発生コラーゲンアッセイの設定は、基本的に次のとおりである：ウシ皮膚からの１００μｇ／ｍｌのＤＱ(登録商標)Ｉ型コラーゲン（フルオレセインコンジュゲート、Molecular Probes #D-12060 lot 1149062）を、１０ｎＭの活性化ＭＭＰ１３および精製ナノボディ／陽性対照の希釈系列と共に、４０μｌアッセイバッファー（５０ｍＭのTris−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．０１％Tween-20）中、３７℃で２時間インキュベートした。蛍光の線形の増加（ｖ０−１５〜４５分間のインキュベーション）を酵素活性の尺度として使用し、阻害％を、式：１００−１００（試験ナノボディの存在下でのｖ０／陰性対照ナノボディ（Cablys）の存在下でのｖ０）により計算した。
【０１８４】
ＩＳＶＤ ６２Ｃ０２をさらに特徴付けるために、このＩＳＶＤをベクターｐＡＸ１２９に再クローン化し、大腸菌に形質転換し、標準プロトコルに従って発現および精製した（例：Maussang et al. 2013 J Biol Chem 288: 29562-72）。その後、このＩＳＶＤをさまざまな機能的in vitroアッセイに供した。非選択的ＭＭＰ阻害剤であるＴＩＭＰ−２は、これらのアッセイの陽性対照として使用した。陽性比較物として、小分子薬MSC2392891Aを使用した。酵素アッセイにおける効力の概要を、表１．１に示す。
表１．１．
【表６】
2020523986.tif 000009
結論として、ＩＳＶＤ ６２Ｃ０２は、比較薬であるMSC2392891Aと比較して、すべてのアッセイで優れた性能を発揮した。
【０１８５】
１．２  抗ＭＭＰ１３ ＩＳＶＤ ６２Ｃ０２は選択的である
ＭＭＰ１３に対するＩＳＶＤ ６２Ｃ０２の選択性を決定するために、ＭＭＰ１およびＭＭＰ１４の蛍光発生ペプチドアッセイを使用した。ＭＭＰ１およびＭＭＰ１４は、密接に関連する２つのＭＭＰファミリーメンバーである。これらのアッセイでは、ＴＩＭＰ−２を陽性対照として使用した。例１．１で説明したものと同様の設定を使用した。
ＩＳＶＤ ６２Ｃ０２は高度に選択的であり、ＭＭＰ１またはＭＭＰ１４阻害を示さないことが実証された（データは示さず）。
【０１８６】
例２  ＡＤＡＭＴＳ５ ＩＳＶＤ
２．１  抗ＡＤＡＭＴＳ５ ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３
この場合においても、ＡＤＡＭＴＳ５に特異的に結合するＩＳＶＤ ０２Ｆ０３を識別するために、１０Ｅ７を超えるクローンをスクリーニングした。ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３は、ＡＤＡＭＴＳ５媒介性のアグリカンの切断の阻害について、FRETベースアッセイおよびAlphaLISAアッセイを介してさらに特性評価した。
簡潔に言えば、ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３のペリプラズム抽出物を、組換えヒトＡＤＡＭＴＳ５への結合について、結合ＥＬＩＳＡにより試験した。次に、ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３は、FRETベースのヒトＡＤＡＭＴＳ５酵素アッセイにおいて、ＡＤＡＭＴＳ５媒介性のアグリカンの切断を防止できることが確認された。FRETベースのアッセイの次に、AlphaLISA（Perkin Elmer, Waltham, MA, US）ベースのヒトＡＤＡＭＴＳ５アッセイを、基質としてビオチン化４３マーアグリカンオリゴペプチドを用いて実施した。この基質のＡＤＡＭＴＳ５切断により、ビオチン化ＡＲＧＳＶネオエピトープ産物が放出され、これは、ストレプトアビジン−AlphaScreenドナービーズおよび抗マウスＩｇＧ被覆AlphaLISAアクセプタービーズで捕捉されたα−ネオエピトープ（「ＡＲＧＳＶ」）抗体により検出することができ、レーザー励起時に発光AlphaScreen信号の生成がもたらされる。
ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３がＡＤＡＭＴＳ５媒介性の基質の切断を防止する能力を判断するために、シグナルの減少をＩＳＶＤ ０２Ｆ０３濃度の関数として分析し、ＩＣ５０値を計算した。ＡＤＡＭＴＳ４活性とＡＤＡＭＴＳ５活性の両方を阻害する小分子MSC2310852Aを、陽性対照として使用した。
【０１８７】
結果を表２．１．１にまとめる。
表２．１．１  ヒトFRETおよびAlphaLISA酵素アッセイにおけるＩＳＶＤ ０２Ｆ０３および参照化合物についてのＡＤＡＭＴＳ５の効力（ＩＣ５０）および阻害％
【表７】
2020523986.tif 000010
ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３は、二価のｍＡｂ １２Ｆ４とは同等であるが、小分子MSC2310852Aよりも優れた効力を示した。
【０１８８】
さらにＩＳＶＤ ０２Ｆ０３を、軟骨の分解をブロックする能力について、ex vivoアッセイでさらに評価した；このアッセイでは、生化学アッセイと比較して、生理学的条件により近い条件で基質が提示される。簡潔に言えば、ウシの軟骨外植片（直径４ｍｍ）を牛の膝関節から新たに調製し、ＩＬ−１αの存在下で９６ウェルプレートでインキュベートして、軟骨の分解を誘発した。軟骨／アグリカン分解の測度として、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の放出を、メタクロマジー性色素(異染性色素)１，９ジメチルメチレンブルー（６３３ｎｍでの発光）による５日間のインキュベーション（３７℃、７．５％ＣＯ２）後に上清において検出した。コンドロイチン硫酸は、アッセイ標準として含めた。有効性は、ＩＬ−１α誘導対照を用いて、化合物なし（０％）およびMSC2310852Aの存在下（１００％の効果）において定義した。
結果を表２．１．２にまとめる。
表２．１．２  ウシ外植片アッセイにおけるＩＳＶＤ ０２Ｆ０３のＩＣ５０値
【表８】
2020523986.tif 000011
【０１８９】
このex vivoアッセイでは、ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３は２価のｍＡｂ １２Ｆ４よりも優れた効力を示した；すなわち、ＩＣ５０は約５０倍低い。
種の交差反応性は、初めにＳＰＲベースのオフレート分析により、Biacore T100機器で評価した。ポリペプチドは、ヒト、カニクイザル（「cyno」）、モルモット、マウス、およびウシＡＤＡＭＴＳ５への結合について試験した。この目的のために、組換えＡＤＡＭＴＳ５を、ＥＤＣおよびＮＨＳを使用したアミンカップリングによりＣＭ５チップ上に固定化した。精製したＩＳＶＤ ０２Ｆ０３を１００ｎＭの濃度で２分間注入し、４５μｌ／分の流量で１５分間解離させた。個々のＡＤＡＭＴＳ５のオフレートは、ＢＩＡ評価ソフトウェアを使用して、１：１相互作用モデル（ラングミュアモデル）を個々の解離曲線に適合させることにより決定した。参照として、ヒトＡＤＡＭＴＳ５のオフレートを各実験で決定した。
【０１９０】
結果を表２．１．３にまとめる。
表２．１．３  ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３の種交差反応性データの概要
【表９】
2020523986.tif 000012
ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３は、ヒト、カニクイザル、モルモット、およびウシのＡＤＡＭＴＳ５と同等のオフレート（交差反応性）を示した。
【０１９１】
２．２  ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３の選択性
ＡＤＡＭＴＳ５に対するＩＳＶＤ ０２Ｆ０３の選択性を確認するために、ＭＭＰ１、ＭＭＰ１４、およびＡＤＡＭＴＳ４の酵素活性の阻害を、それぞれの酵素を使用したFRETベースのアッセイおよびヒトＡＤＡＭＴＳ４AlphaLISAを介して評価した。
活性化されたヒトＭＭＰ１またはＭＭＰ１４を、室温で３０分間、１０μｌのＩＳＶＤ ０２Ｆ０３の希釈系列とともにインキュベートした。インキュベーション後、２０μｌの５μＭまたは２．５μＭ蛍光発生ペプチド基質（Ｍｃａ−ＰＬＧＬ−Ｄｐａ−ＡＲ−ＮＨ２蛍光発生ＭＭＰ基質（R&D Systems cat #ES001））をそれぞれ添加した。ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３の、ＭＭＰ１およびＭＭＰ１４媒介性の切断を防ぐ能力を、Tecan Infinite M1000プレートリーダーで３７℃で２時間、毎分監視した。
【０１９２】
天然の阻害剤ＴＩＭＰ２とＴＩＭＰ３がＭＭＰ１とＭＭＰ１４の活性を阻害したのに対し、ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３は阻害を示さなかった（データは示さず）。
ヒトＡＤＡＭＴＳ４の阻害を評価するために、ヒトＡＤＡＭＴＳ５AlphaLISAと同様のアッセイを、本質的に例２．１に記載されているようにして、ただしヒトＡＤＡＭＴＳ４（R&D Systems, Minneapolis, US; cat #4307-AD）を使用して実施した。ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３の基質の、ヒトＡＤＡＭＴＳ４媒介性の切断を防ぐ能力を決定するために、シグナルの減少をＩＳＶＤ ０２Ｆ０３濃度の関数で分析し、ＩＣ５０値を計算した。
小分子MSC2310852AはヒトＡＤＡＭＴＳ４活性を阻害したが、ＩＳＶＤ ０２Ｆ０３またはｍＡｂ １２Ｆ４は阻害活性を示さなかった（データは示さず）。モノクローナル抗体ｍＡｂ １２Ｆ４（Ｈ４Ｌ０）は、WO 2011/002968においてＡＤＡＭＴＳ４よりも選択的であると記載された。
【０１９３】
例３  アグリカンＩＳＶＤ
３．１  抗アグリカンＩＳＶＤ １１４Ｆ０８
アグリカン特異的ＩＳＶＤ １１４Ｆ０８を、大規模なスクリーニングキャンペーンの後に単離および特性評価した。ラマを、組換えヒトアグリカン（Ｇ１−ＩＧＤ−Ｇ２ドメイン、R&D Systems #1220-PG）で免疫化し、特異的で高い血清力価を与えた。しかし、単離されたナノボディのごく一部のみが、アグリカンのＧ１ドメインへの結合と幅広い種の交差反応性を示すという２つの要件を満たした。困難な試みの後、本質的に同様の特性を示すさまざまなファミリーが同定された（ＣＤＲでの配列変異については表３．１Ａ〜表３．１Ｃを参照）。最終的に、ＩＳＶＤ １１４Ｆ０８（「C0101PMP114F08」）がさらなる特性評価のために選択された。
【０１９４】
ドメインマッピングと種の交差反応性データの概要を、表３．１．１に示す。
表３．１．１
【表１０】
2020523986.tif 000013
一次スクリーニング、ＥＬＩＳＡによる結合の初期評価、オフレートおよび種交差反応性の決定の後、ＩＳＶＤ １１４Ｆ０８をさらに特性評価した。
【０１９５】
ＩＳＶＤ １１４Ｆ０８のファミリーメンバーのＣＤＲにおける配列の変動性を、以下の表３．１Ａ、３．１Ｂ、および３．１Ｃに示す。クローン１１４Ｆ０８のＣＤＲのアミノ酸配列を参照として使用し、これに対して他のすべてのファミリーメンバーのＣＤＲを比較した（ＣＤＲ１はKabat位置２６から始まり、ＣＤＲ２はKabat位置５０から始まり、ＣＤＲ３はKabat位置９５から始まる）。
表３．１Ａ
【表１１】
2020523986.tif 000014
＊１つのクローンにおいて最大２個のＣＤＲ１変異
表３．１Ｂ
【表１２】
2020523986.tif 000015
＊１つのクローンにおいて最大５個のＣＤＲ２変異
表３．１Ｃ
【表１３】
2020523986.tif 000016
＊１つのクローンにおいて最大２個のＣＤＲ３変異
【０１９６】
３．２  ex vivoウシ軟骨での保持
軟骨での保持を評価するための確立されたアッセイがないため、本発明者らは、ウシ軟骨を使用するex vivo軟骨保持アッセイを開発した。
ＩＳＶＤ １１４Ｆ０８を含むポリペプチドが軟骨において長期間保持される能力を、軟骨への比較的短い暴露（関節内注射の際に予想される）の後に決定した。アッセイは通常、ナノボディ試料あたり４つの軟骨ディスクを使用して実行した；２枚のディスクを、ポリペプチドのインキュベーション直後（ｔ０）に分析して、結合したポリペプチドの初期量を決定した；２枚のディスクを洗浄後に分析した（ｔ１〜５日）。保持の程度は、ｔ１〜５日とｔ０で検出されたポリペプチドの量の比率として定義した。この比率の決定は、ウェスタンブロットの目視検査で０〜６のスコアを与えることにより実施し、ここで０は保持なし、６は完全保持である。２つの不活性なＩＳＶＤ ＡＬＢ２６で構成されるダミー構築物C0101030（「３０」）は、結合を示さなかった。
【０１９７】
結果の要約を表３．２に示す。
表３．２：ＡＬＢ２６フォーマットされた抗アグリカンＩＳＶＤ １１４Ｆ０８の軟骨保持。＊スコアは、１〜４の独立したex vivoウシ軟骨保持アッセイの、０〜６のスケールでの平均である：０は保持なし、および６は完全保持である。
【表１４】
2020523986.tif 000017
ＩＳＶＤ １１４Ｆ０８を含むポリペプチドは、軟骨に非常によく保持されていることが判明した（スコア５〜６）。これには、ＩＳＶＤ １１４Ｆ０８の１つおよび２つの結合ユニットの両方を含む構築物が含まれていた。
【０１９８】
３．３  結合特性−ＥＬＩＳＡ
ex vivoのウシ軟骨での保持データに基づいて、ＩＳＶＤ １１４Ｆ０８を、ヒト、カニクイザル、ラット、イヌ、およびウシのアグリカンからの組換えＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２領域上でのＥＬＩＳＡでさらに特性評価し、その種交差反応性を決定し（例３．１も参照）、および、組換えヒトニューロカンおよびブレビカンについて特性評価して、その選択性を決定した。決定されたＥＣ５０値を表３．３に示す。
表３．３  ＡＬＢ２６フォーマットの抗アグリカンＩＳＶＤ １１４Ｆ０８のＥＬＩＳＡによる特性評価。
【表１５】
2020523986.tif 000018
【０１９９】
３．４  組織特異性
本発明のポリペプチドは、in vitroでアグリカンに、およびex vivoで軟骨に特異的に結合することが、上記で実証された。加えてこれらのポリペプチドはまた、関節の他の組織には結合しないかまたは結合が少ないが、関節の軟骨に結合することが好ましい。
ＩＳＶＤ １１４Ｆ０８を含むポリペプチドの、滑膜、腱、および筋外膜への結合は、ex vivo軟骨結合アッセイと同じ設定を使用して評価した。ポリペプチド放出およびウェスタンブロット分析を、ポリペプチドとのＯＮインキュベーション後、組織の短時間の洗浄（３０分）の後に実施した。
【０２００】
結果を表３．４にまとめる。
表３．４：組織の特異性。ＡＬＢ２６フォーマットの抗アグリカンＩＳＶＤ １１４Ｆ０８の、関節軟骨、滑膜、腱、および筋外膜への結合。スコアは０〜６のスケールで、０は結合なし、６は観察された最大結合である。
【表１６】
2020523986.tif 000019
この結果は、ＩＳＶＤ １１４Ｆ０８の１つまたは２つの結合単位を含むポリペプチドが、関節に見られる他の組織よりも軟骨への優先的な結合を示すことを示している。
【０２０１】
３．５  ウシ滑液でのナノボディ安定性
患者の利便性および安全性を含むさまざまな理由から、ポリペプチドが滑膜中でより長期間安定であることが好ましい。
したがって、ＩＳＶＤ １１４Ｆ０８を含むポリペプチドの滑液（ＳＦ）での安定性を、ポリペプチドのウシＳＦ中での３７℃で最大７日間のインキュベーションにより評価した。
結果を表３．５にまとめる。
表３．５：ＩＳＶＤ １１４Ｆ０８を含むポリペプチドのウシＳＦにおける安定性。
【表１７】
2020523986.tif 000020
構築物のいずれの分解も検出できなかった。
【０２０２】
例４  ポリペプチド
ポリペプチド７５４を、３５ＧＳリンカー（Ｍ−Ｃ−Ｃ）を使用して、抗ＭＭＰ１３ ＩＳＶＤ ６２Ｃ０２と２つの抗アグリカンＩＳＶＤ １１４Ｆ０８を遺伝的に連結することにより、操作した。ポリペプチド７５４−９はポリペプチド７５４と類似であったが、ここでは９ＧＳリンカーを使用する。得られたアミノ酸配列を、それぞれ配列番号５および６３として表Ａ−１に示す。
ポリペプチド９５４を、３５ＧＳリンカー（Ａ−Ｃ−Ｃ）を使用して、抗ＡＤＡＭＴＳ５ ＩＳＶＤ ２Ｆ０３と２つの抗アグリカンＩＳＶＤ １１４Ｆ０８を遺伝的に連結することにより、操作した。ポリペプチド９５４−９（「９７３」を参照）はポリペプチド９５４と類似であったが、ここでは９ＧＳリンカーを使用する。得られたアミノ酸配列を、それぞれ配列番号６および６４として表Ａ−１に示す。
ポリペプチド９４９は、３５ＧＳリンカー（Ｍ−Ａ−Ｃ−Ｃ）を使用して、抗ＭＭＰ１３ ＩＳＶＤ ６２Ｃ０２、抗ＡＤＡＭＴＳ５ ＩＳＶＤ ２Ｆ０３、および２つの抗アグリカンＩＳＶＤ １１４Ｆ０８を遺伝的に連結することにより、操作した。ポリペプチド９４９−９はポリペプチド９４９と類似であったが、ここでは９ＧＳリンカーを使用する。得られたアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１および６２として表Ａ−１に示す。
【０２０３】
例５  ポリペプチドの、異なる種のＡＤＡＭＴＳ５、ＭＭＰ１３およびアグリカンに対する親和性
５．１  ポリペプチド９４９の、ヒト、カニクイザル、ラットのＡＤＡＭＴＳ５に対する親和性
ポリペプチド９４９の、ヒト、カニクイザル、およびラットＡＤＡＭＴＳ５に対する溶液中の親和性を、KinExAを使用して決定した。２０ｐＭの固定濃度（最終濃度）のポリペプチド９４９を、ヒト、カニクイザルまたはラットＡＤＡＭＴＳ５の１６ポイント１／２．２連続希釈用量反応曲線に対して、２４時間平衡化した；各時点は２０ｎＭで開始し、最終時点はブランク（＝ＡＤＡＭＴＳ５なし）である。すべての希釈液は、試料バッファー（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋０．０２％ＮａＮ３）中で調製した。アグリカンの干渉を試験するために、選択された実験において、組換えアグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２をこのプレインキュベーションに２ｎＭの濃度で添加した（＝ポリペプチド９４９のＫＤの１００倍以上、下記参照）。
【０２０４】
その後、プレインキュベートした混合物（ＡＤＡＭＴＳ５ ＤＲＣ＋２０ｐＭポリペプチド９４９±アグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２）を、KinExAのオートサンプラーを介して、ヒトＡＤＡＭＴＳ５コンジュゲートポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）ビーズを充填したカラムに注入し、ビーズ上の遊離ナノボディ構築物を捕捉した。捕捉されたナノボディ構築物を、ポリペプチド９４９を認識するAlexa Fluor（ＡＦ）６４７標識抗ナノボディツールを使用して検出した。遊離ナノボディ構築物の％を、ＡＤＡＭＴＳ５濃度の関数としてプロットし、KinExAのＰｒｏソフトウェアｖ３．６．５を使用してフィットさせて、ＫＤを決定した。
表５．１に示した結果は、ポリペプチド９４９のヒトＡＤＡＭＴＳ５に対する親和性が、Ｇ１−ＩＧＤ−Ｇ２の非存在下で３２．６９ｐＭ、アグリカンの存在下で２６．５６ｐＭであることを示す。ＫＤ値でのＣＩの重複に基づいて、アグリカンの存在は、ＡＤＡＭＴＳ５に対するポリペプチド９４９の親和性を妨げない。カニクイザルとラットＡＤＡＭＴＳ５に対する親和性は、それぞれ２４．３５ｐＭと２５．１７ｐＭであり、両方のＫＤ値がヒトＫＤのＣＩ内にあるため、ポリペプチド９４９の両方の種に対する結合交差反応性を示す。
表５．１：ポリペプチド９４９の、アグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２の非存在下または存在下でのヒトＡＤＡＭＴＳ５に対する親和性、およびカニクイザルとラットＡＤＡＭＴＳ５に対する親和性
【表１８】
2020523986.tif 000021
【０２０５】
５．２  ポリペプチド９４９によるヒト、カニクイザルおよびラットのＡＤＡＭＴＳ５の機能的阻害
C010100949によるヒト、カニクイザル、およびラットのＡＤＡＭＴＳ５の機能的阻害を、FRETベースの動態アッセイを使用して研究した。このアッセイは、FRETアッセイバッファー（MilliQ中、５０ｍＭのHEPES、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２＊２Ｈ２０、５％グリセロール、０．１％CHAPS）を使用して実施した。１０ｎＭの固定濃度（最終濃度）のそれぞれの種のＡＤＡＭＴＳ５を混合し、５０ｎＭ（最終濃度）から始まる、ポリペプチド９４９の１１ポイント（１２番目＝ブランク）１／１．７連続希釈ＤＲＣを用いて平衡化した。次に、３０μＭ（最終濃度）の種特異的蛍光発生ＡＤＡＭＴＳ５基質を追加した。この基質、消光剤（２，４−ジニトロフェニル、Ｄｎｐ）および蛍光色素（アミノ安息香酸、Ａｂｚ）で標識されたアグリカンペプチドは、ＡＤＡＭＴＳ５によって酵素的に切断され、結果として生じる蛍光（励起波長３４０ｎｍ／発光波長４３０ｎｍ）を、１分ごとに２時間、Tecan F200マイクロプレートリーダーを使用して動力学的に測定した。得られた進行曲線（反応時間の関数での蛍光シグナル）は、GraphPad Prismソフトウェアを使用して、各進行曲線の線形部分を直線（Ｙ＝勾配＊Ｘ＋Ｙ切片）に適合することにより分析した。得られた勾配または反応速度（ｖｉ）は、すべてのブランク試料の平均勾配（非阻害反応速度、ｖ０）に対して正規化し、ポリペプチド９４９濃度の関数としてプロットし、非対称５パラメーターロジスティックス（５ＰＬ）曲線近似に適合させて、阻害曲線を取得する。
結果を図１に要約する；これは、結果の代表的な図解である。結果は、ポリペプチド９４９（「C010100949」）による、すべての試験種からのＡＤＡＭＴＳ５の酵素活性の用量依存的かつ完全な阻害を示し、これらはすべて、ナノボディ構築物によって完全に機能的に阻害されることを実証する。
【０２０６】
５．３  ポリペプチド９４９の、ヒト、カニクイザルおよびラットのＭＭＰ１３に対する親和性
ポリペプチド９４９の、異なる種からのＭＭＰ１３に対する機能的活性および酵素阻害定数（ＫＩ）を、FRETベースの動態アッセイを使用して研究した。すべての希釈は、アッセイバッファー（５０ｍＭのTris（ｐＨ７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２＊２Ｈ２０、０．０１％Tween20）中で実施した。９μＭ（最終濃度）から始まる、ポリペプチド９４９の１／３連続希釈１１ポイント（１２番目＝ブランク）ＤＲＣを、０．２ｎＭの一定濃度の種触媒ドメイン（ｃｄ）ＭＭＰ１３またはそれぞれの種の０．２〜２０ｎＭの活性化ｐｒｏ−ＭＭＰ１３（名目濃度）で平衡化した。次に、２２μＭ（最終濃度）の一定濃度の蛍光発生ＭＭＰ基質を、すべてのウェルに加えた。このコラーゲンベースの基質は、一般的なＭＭＰ切断配列であるプロリン−ロイシン−グリシン−ロイシン（ＰＬＧＬ）を含み、蛍光色素Ｍｃａおよび消光剤Ｄｐａで標識されている。活性酵素（ナノボディ構築物に結合されていない）は基質を切断することができ、蛍光色素の放出をもたらし、蛍光シグナル（励起波長３２０ｎｍ／発光波長４０５ｎｍ）をもたらすが、一方、中和された（ナノボディ構築物に結合した）酵素はそうではない。基質添加後１分以内に開始し、Tecan F200プレートリーダーを使用して、蛍光を、合計１２０サイクル（２時間）の間毎分動力学的に測定した。
【０２０７】
得られた進行曲線（反応時間の関数での蛍光シグナル）は、GraphPad Prismソフトウェアを使用して、各進行曲線の線形部分を直線（Ｙ＝勾配＊Ｘ＋Ｙ切片）に適合することにより分析した。得られた勾配または反応速度（ｖｉ）は、すべてのブランク試料の平均勾配（非阻害反応速度、ｖ０）に対して正規化し、ポリペプチド９４９濃度の関数としてプロットし、非対称５パラメーターロジスティクス（５ＰＬ）曲線に適合させて、阻害曲線を取得する。
これらのアッセイ条件において、得られたＩＣ５０値は阻害定数ＫＩに等しい。
定量分析の結果を、表５．３にまとめる。２〜６回の独立した実験を相互作用ごとに繰り返した。６回の独立した反復実験に基づいて、ポリペプチド９４９のヒトｃｄＭＭＰ１３に対する阻害定数は、２７．８６ｎＭ（９５％ＣＩ：２５．６７〜３０．２３ｎＭ）であると決定された。独立して繰り返された３回の実験に基づいて、活性化ヒトｐｒｏ−ＭＭＰ１３のＫＩは、２．９２ｎＭ（９５％ＣＩ：０．６１〜１４．０２ｎＭ）と決定された。カニクイザルとラットＭＭＰ１３に対するＫＩ値は、触媒ドメインおよび活性化されたｐｒｏ−ＭＭＰ１３の両方についてのヒトＫＩに強く対応しており、ポリペプチド９４９の、カニクイザルとラットＭＭＰ１３に対する交差反応性を示す。
【０２０８】
表５．３  ポリペプチド９４９の、ヒト、カニクイザル、ラットのＭＭＰ１３触媒ドメインおよび活性化ｐｒｏ−ＭＭＰ１３に対する親和性測定結果の概要。平均ＫＩ値と９５％信頼区間（ＣＩ）は、グローバル平均値の推定により計算した。Ｃｄ：触媒ドメイン；ｐｒｏ：活性化されたｐｒｏ−ＭＭＰ１３；ＣＶ：変動係数。
【表１９】
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ポリペプチド９４９による、ヒト、カニクイザル、ラットのｃｄＭＭＰ１３および活性化されたｐｒｏ−ＭＭＰ１３の機能的阻害を、ＫＩを測定するために実施した実験で同時に評価した（上記参照）。図２は、結果を図示したものである。これらの結果は、ナノボディ構築物９４９による、すべての試験種のｃｄＭＭＰ１３およびｐｒｏ−ＭＭＰ１３の酵素活性の用量依存的かつ完全な機能的阻害を示す。
【０２０９】
５．４  ポリペプチド９４９の、ヒト、カニクイザルおよびラットのアグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２に対する親和性
ポリペプチド９４９の、ヒト、カニクイザル、およびラットの組換えアグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２に対する親和性測定を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して、ProteOn XPR36相互作用アレイ機器（BioRad, serial n° 670BR6176）で実施した。簡潔に述べると、組換えアグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２（「リガンド」）を、１０ｍＭ酢酸、ｐＨ４．５中、１０μｇ／ｍＬの濃度、および１００μＬ／分の流量でアミンカップリングすることにより、ＧＬＣセンサーチップ（Biorad cat#176-5011）のリガンドレーンに固定し、４００レゾナンスユニット（resonance unit）（ＲＵ）の固定レベルを目指した。ポリペプチド９４９（「C010100949」、「分析物」）を、４５μＬ／分の連続流下でセンサーチップの分析レーンに沿って２分間、ランニングバッファーとして１ｘＨＢＳ−Ｐ＋ｐＨ７．４（GE Healthcare cat#R-1006-71）中のさまざまな濃度（０．５−１−２−４−６−１０ｎＭ）で注入した。解離時間は１０分であった。各試料を注入した後、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５で表面を再生した。アグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２とポリペプチド９４９の相互作用は、ポリペプチド９４９のアグリカンへの結合によるチップ上の質量変化の結果として生じる屈折率（refractory index）の増加として検出した。この屈折率の変化により反射光の強度と角度が変化し、これはリアルタイムで定量的に測定され、センサーグラムにレスポンスユニット（response unit）（ＲＵ）対時間としてプロットされる。速度定数は、ProteOn Manager 3.1.0バージョン3.1.0.6ソフトウェアおよび「速度ラングミュアｋａ／ｋｄ同時」モデルを使用して、得られたセンサーグラムから計算した。
【０２１０】
結果を表５．４にまとめる。２〜４回の独立した繰り返し実験に基づいて、ポリペプチド９４９の、捕捉されたアグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２に対する平均結合親和性（ＫＤ）は、ヒト、カニクイザル、ラットでそれぞれ１４．０ｐＭ、１６．０ｐＭ、１６．６ｐＭと決定された。
ポリペプチド９４９のＣＡＰビルディングブロックの作用機序（ＭｏＡ）は、ＳＰＲベースの親和性決定に直接反映されるアグリカン結合のみに依存するため、ＣＡＰビルディングブロックのさらなる機能分析は関係しない。これらのＳＰＲデータから、ポリペプチド９４９は、カニクイザルとラットアグリカンの両方に対して完全な交差反応性を示し、ヒトとの親和性の違いはないと結論付けることができる。
表５．４  ９４９のヒト、カニクイザル、ラットのアグリカンＧ１−ＩＧＤ−Ｇ２に対する親和性測定の結果の概要。平均ＫＤ値および９５％信頼区間（ＣＩ）を、グローバル平均値の推定により計算した。Ｎ：独立した実験の数；ＫＤ：解離定数；ＮＣ：計算されず；（＊）カニクイザルの場合、２回の独立した実験で同一の１６．０ｐＭの結果が得られ、ProteOnソフトウェアによってＫＤに関する標準エラー情報が提供されないために、ＣＩは計算できなかった。
【表２０】
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【０２１１】
例６  ウシ外植片モデルにおけるex vivo軟骨分解の阻害
ポリペプチド９４９（Ｍ−Ａ−Ｃ−Ｃ：６２Ｃ０２−２Ｆ０３−１１４Ｆ０８−１１４Ｆ０８）を、ウシ軟骨外植片アッセイにおいて、軟骨分解の阻害について試験した。
簡潔に言えば、ポリペプチドを、ＩＬ−１αで５日間培養してＯＡ様の軟骨分解プロセスを誘導したウシ軟骨外植片とインキュベートした。５日以内に主にアグリカンの分解が起こるが、コラーゲンの分解は約２週間後、すなわちここで記載される実験の終了後にのみ発生する。実験の最後に、分解した軟骨から培養上清に放出されたＧＡＧ（主にアグリカンに由来する）を定量化した。ポリペプチドによるＧＡＧ放出の阻害の有効性は、これらの条件下でＩＬ−１α刺激によるＧＡＧ放出を完全に阻害した参照小分子阻害剤と比較して、計算した。
結果を図３に示す。
ポリペプチド９４９（図中のＮＢ９４９）は、ウシ軟骨の分解を、用量依存的に完全に阻害することがわかる。
【０２１２】
例７  ヒト外植片モデルにおけるex vivo軟骨分解の阻害
ポリペプチド９４９（Ｍ−Ａ−Ｃ−Ｃ：６２Ｃ０２−２Ｆ０３−１１４Ｆ０８−１１４Ｆ０８）を、ヒト軟骨外植片アッセイにおいて、軟骨分解の阻害について試験した。簡潔に言えば、ポリペプチドを、ＩＬ−１β＋オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）で７日間培養したヒト軟骨外植片とインキュベートした。７日以内に主にアグリカンの分解が起こるが、コラーゲンの分解は約２週間後、すなわちここで記載される実験の終了後にのみ発生する。実験の最後に、分解した軟骨から培養上清に放出されたＧＡＧ（主にアグリカンに由来する）を定量化した。ＩＣ５０は、最大のＧＡＧ損失の測定値として、陰性対照レベル（＝追加刺激なしの外植片からのＧＡＧ放出）およびＩＬ−１β＋ＯＳＭレベルに基づいて計算した。ＧＡＧは、個々の外植片の軟骨１ｍｇあたりのＧＡＧ放出（μｇ）として示される。
結果を図４に示す。
データは、ナノボディ構築物が、用量依存的にヒトＯＡ軟骨からのＧＡＧ放出を阻害することを示し、計算されたＩＣ５０は０．０３７２４μＭである。
【０２１３】
例８  ＣＡＰは、軟骨分解を阻害するポリペプチドの有効性をex vivoで拡大する
ポリペプチドを軟骨に固定するように機能するＣＡＰ部分の効果を評価するために、上記の外植片アッセイを、軟骨外植片のポリペプチドとのインキュベーションステップ（１ｈ）に続き洗浄ステップを含むように修正した（図５、上部パネルを参照）。洗浄ステップの後、ＩＬ−１αを添加することにより軟骨の分解が開始された。さらに７日間インキュベートした後、培養上清へのＧＡＧ放出を定量化した。対照として、ＣＡＰ結合部分（配列番号６５）を含まないＡＤＡＭＴＳ５阻害ポリペプチド５８１が含まれた。
結果を図５に示す。
この実験は、対照ポリペプチド５８１、すなわちＣＡＰ結合部分を含まないポリペプチドが、ＡＤＡＭＴＳ５を阻害する効果をほとんど示さなかったことを示す。これは、洗浄ステップが省略されたアッセイとは非常に対照的である。一方、ポリペプチド９４９は、大規模な洗浄を行った後でも効果があった。現在のアッセイ条件下において、ＧＡＰ放出がＭＭＰ１３ではなくＡＤＡＭＴＳ５によって駆動されることを考えると、この結果は、ＣＡＰ結合部分が実際にポリペプチドを軟骨に固定するように機能し、ＣＡＰ結合部分がＡＤＡＭＴＳ５ ＩＳＶＤの有効性に影響しないことを、強く示す。
【０２１４】
例９  ポリペプチド９４９のウシ軟骨滑膜共培養システムにおける効果
ＯＡには軟骨のみが関与するのではないことを知るため、ポリペプチド９４９をまた、滑膜（滑膜）および関節軟骨からの外植片で構成されるウシモデルで試験した。簡単に言えば、軟骨外植片と滑膜の比率１／１で、培地を定期的に交換しながら２８日間共培養した。毎週、Ｃ２Ｍ（Ｃｏｌ ＩＩ分解）およびＣ３Ｍ（Ｃｏｌ ＩＩＩ分解）を共培養の上清で測定した。
結果（ＡＵＣ＝曲線下面積として）を図６に示す。
データは、軟骨外植片と滑膜との共インキュベーションが、Ｃ２Ｍ（左グラフ）とＣ３Ｍ（右グラフ）の放出を誘導することを示す。ポリペプチド９４９を３つの異なる濃度（１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ）でインキュベートした。ポリペプチド９４９の効果は、参照分子Wyeth（MSC2310852A-1）と比較して評価した。データは、例示的なポリペプチド９４９および参照化合物が、Ｃ２ＭおよびＣ３Ｍ放出を強く阻害することを示している。
【０２１５】
例１０  軟骨保持試験
in vivoでのナノボディ構築物の保持を決定するために、例示的なポリペプチド９４９を使用してラット軟骨保持研究を設計した。ポリペプチド９４９は４つのビルディングブロックを有するため（ＭＡＣＣ）、ポリペプチド７５４および９５４はそれぞれ２つのアグリカン結合剤および１つの標的特異的ＩＳＶＤを有して、基本的に同様に動作する。
ＥＬＩＳＡベースのリガンド結合アッセイは、ラットの軟骨の局所ナノボディ構築物濃度を定量化するために開発し、リガンド結合アッセイ（ＭＳＤプラットフォーム）は、循環中のナノボディ構築物を定量化するために開発した。
結果を図７に示す。
結論として、例示的なポリペプチド９４９は、ＩＡ投与後１１２日までin vivoで軟骨に保持され、全身濃度（低ｐｇ／ｍｌ範囲）は、健康なラットにおいて最初のサンプリング時点（ＩＡ注射後２時間）でのみ検出可能であり、一方その後の時点（１４日以上）ではポリペプチドを検出できなかった。
したがって、抗アグリカンＩＳＶＤ １１４Ｆ０８を含む構築物は安定であり、in vivoモデルで保持される。
【０２１６】
例１１  ラットin vivoＭＭＴのＤＭＯＡＤ試験１
ポリペプチド７５４（Ｍ−Ｃ−Ｃ；「ナノボディ７５４」）、ポリペプチド９５４（Ａ−Ｃ−Ｃ；「ナノボディ９５４」）およびポリペプチド９４９（Ｍ−Ａ−Ｃ−Ｃ、「ナノボディ９４９」）のin vivoでの有効性を実証するために、ラットで外科的に誘発された内側半月板断裂（Tear）（ＭＭＴ）モデルを使用した。簡潔に言えば、ラットの片膝を手術して、ＯＡ様の症状を引き起こした。処置は、手術後３日目にＩＡ注射により開始した。以下の用量を、手術後３日目に動物に投与した：ビヒクル（バッファー）、ポリペプチド７５４（３００μｇ／ラット）、ポリペプチド９４９（４、４０または４００μｇ／ラット）およびポリペプチド９５４（３００μｇ／ラット）。術後４２日目に組織病理学を実施した。内側脛骨軟骨変性幅および内側脛骨総軟骨変性幅、ならびに軟骨変性の減少率を決定した。群当たり２０匹の動物を使用した。
内側脛骨軟骨変性幅の結果を図８に示す。
【０２１７】
結果は、内側脛骨軟骨幅が、すべてのナノボディ構築物によって、ビヒクルと比較して４２日後に実質的に減少したことを示す。これらの結果はさらに、以下を示唆する：
（ａ）ＣＡＰ部分は、構築物の活性に悪影響を与えない；
（ｂ）ＣＡＰ部分は、構築物の保持を可能にする；
（ｃ）すべての構築物は、軟骨の幅にプラスの効果を有する；および
（ｄ）ＡＤＡＭＴＳ５阻害剤とＭＭＰ１３阻害剤の組み合わせは、ポリペプチドによって例示されるように、全体として最大の効果を示す。
【０２１８】
例１２  確認的ラットin vivoＭＭＴのＤＭＯＡＤ試験２
例１１（ＤＭＯＡＤ試験１）に記載のin vivo有効性試験を、異なる投与計画で基本的に繰り返した。さらに、ＤＭＯＡＤ試験１では、術後３日目に軽度のＯＡのみが存在した。したがってポリペプチドは、ＭＭＴモデルではＯＡのより進行した段階で評価し、一方処置は、手術の７日後に開始した。簡潔に述べると、内側脛骨軟骨変性幅は術後４２日目に測定した。再度、ポリペプチド９４９を使用して、ＡＤＡＭＴＳ５とＭＭＰ１３阻害剤の複合効果を実証した。
群ごとに２０匹の動物で構成される最初の一連の実験では、各群は術後７日間にＩＡ注射（４００μｇ、８００μｇ、ビヒクル）を１回受けた。処置の終了時に、４００μｇのポリペプチド９４９を投与した群は内側脛骨軟骨変性幅が２１％減少したが、８００μｇの群は１６％の減少を示した（図９参照）。これらの結果は、構築物の有効性を確認する。
群ごとに２０匹の動物で構成される２回目の一連の実験では、各群は術後７日目と１０日目に２回のＩＡ注射（２００μｇ、４００μｇ、８００μｇ、ビヒクル）を受けた。処置の終了時に、２００μｇのポリペプチド９４９を投与した群では脛骨幅が１４％減少し、８００μｇ群では３１％減少し、一方４００μｇ群では３５％減少した（図９）。
【０２１９】
例１３  in vivoでの症候性の利益
ポリペプチドの症候性の利益を提供する能力を評価するために、ラットの外科的ＯＡモデルを使用した。簡潔に言えば、ラットをＡＣＬｔおよびｔＭｘ手術で処置して、０日目にＯＡを誘導した。ＡＣＬｔおよびｔＭｘ外科的モデル（内側半月板切除で拡大された前十字靭帯切除）において、構築物を、異なる濃度（１００μｇ、４００μｇ、および１０００μｇ）で１週目および８週目にＩＡ投与した。ラットの１つの群は、抗神経成長因子（ＮＧＦ）ｍＡｂであるタネズマブ（Pfizer）でＩＡ処置し、これは、本試験での症状緩和の陽性対照として含まれた。２、５、９、および１３週目に、歩行分析（CatWalk上）による症候性利益、および関節の直径の減少を決定した。
結果を図１０に示す。
ポリペプチドによる関節内処置は、最大４３％の症候性の利益をもたらした。
【０２２０】
例１４  健康なラットおよび変形性関節症のラットにおけるＣＡＰ結合剤の保持は、in vivoで類似する
健康なラットにおける軟骨保持試験の例１０において、本発明のポリペプチドが関節内（Ｉ．Ａ．）注射後１１２日まで軟骨で測定可能であることが示された。軟骨組成物は、全身循環における軟骨の結合および吸収に影響を与える可能性があるため、本発明のポリペプチドの薬物動態を、罹患した変形性関節症ラットと健康なラットにおいて、ポリペプチドの血清レベルをin vivoで時間とともに追跡することにより比較した。
本発明のＣＡＰ結合剤に融合したＡＤＡＭＴＳ５阻害剤のin vivo効力を実証するために、ラットで外科的に誘発された内側半月板断裂（ＭＭＴ）モデルを使用した。簡単に述べると、抗ＡＤＡＭＴＳ５ナノボディを、ＣＡＰ結合剤（ナノボディ構築物C010100954またはナノボディ構築物９５４として示される）に結合させた。ラットの片膝を手術して、ＯＡ様の症状を引き起こした。処置は、手術後３日目にＩＡ注射により開始した。組織病理学を術後４２日目に実施した。中間および最終血清試料を、探索的バイオマーカー分析のために採取した。内側および全体の実質的軟骨変性の幅、ならびに軟骨変性の減少率を決定した。群当たり２０匹の動物を使用した。
特に、ラットで外科的に誘発された内側半月板断裂（ＭＭＴ）モデルを、例１０に記載されているように使用したが、いくつかの修正を加えた。簡潔に言えば、本発明のポリペプチドを、抗ＭＭＰ１３ ＩＳＶおよび抗ＡＤＡＭＴＳ５ ＩＳＶ（「９４９」、「０９４９」または「C010100949」ナノボディと呼ぶ）に結合した。ラットの片膝を手術して、ＯＡ様の症状を引き起こした（ＯＡ群）。各処置群（健康およびＯＡ）は１５匹の動物で構成され、４００μｇ／３０μｌのナノボディの単一のＩ．Ａ．注射が、７日目（健康）または術後７日目（ＭＭＴ）に与えられた。血清試料を麻酔ラットから以下の時点で収集した：０日目、および７日目（０時間＝投与前試料）、８日目（処置後２４時間までの異なる時間）、９日目（処置後４８時間）、ｄ１０（処置後３日）、ｄ１４（処置後７日）、ｄ２１（処置後１４日）およびｄ４２（処置後３５日）。収集した血清試料を、電気化学発光（ＥＣＬ）ベースの総ＰＫアッセイ形式でのポリペプチド濃度の決定に使用し、続いてノンコンパートメント解析を行った。
健康なラットとＯＡラットの血清中のポリペプチドの保持を、図１１に示す。
結果は、健康なラットとＯＡラットのポリペプチドの血清濃度に明らかな違いが見られないことを示す。したがってこれらの結果は、軟骨の分解が本発明のポリペプチドの薬物動態に影響を及ぼさないことを支持する。
【０２２１】
表Ａ−１：本発明のポリペプチドの名称と簡単な説明（「ＩＤ」）、配列番号（「ＳＥＱ」）およびアミノ酸配列
【表２１−１】
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【表２１−２】
2020523986.tif 000025
【０２２２】
表Ｂ：その他のアミノ酸配列：名称と簡単な説明（「ＩＤ」）、配列番号（「ＳＥＱ」）およびアミノ酸配列（「配列」）
【表２２】
2020523986.tif 000026
【０２２３】
表Ｃ：様々なリンカー配列（「ＩＤ」は、本明細書で使用される配列番号を指す）
【表２３】
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【０２２４】
表Ａ−２：ＣＤＲおよびフレームワークの配列、および式Ｉで提供される好ましい組み合わせ、すなわちＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４（以下の用語：「ＩＤ」は所定の配列番号を指す）
【表２４】
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【０２２５】
表Ｄ：ＣＤＲ配列を含む、血清アルブミン結合ＩＳＶＤ配列（「ＩＤ」は本明細書で使用される配列番号を指す）
【表２５】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
2020523986.tif 000032
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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