(57)【要約】本開示は、第二級アミン置換クマリン化合物、および蛍光標識としてのそれらの使用に関する。前記化合物は、核酸シークエンシングアプリケーションにおけるヌクレオチド用の蛍光標識として使用され得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物またはその塩：
【化１】
2020537630.tif 000029
式中、Ｘが、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＮＲｎであり、ここで、Ｒｎが、ＨまたはＣ１−６アルキルであり；
ＲおよびＲ１が、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり；
Ｒ２およびＲ４が、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであるか；あるいはＲ２およびＲ４の一方が、Ｒ３に結合して、任意に置換された複素環を形成し；
Ｒ３が、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ２−６アルキル、任意に置換されたＣ２−６アルケニル、任意に置換されたＣ２−６アルキニル、または任意に置換されたカルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであるか、あるいはＲ３が、Ｒ２またはＲ４に結合して、任意に置換された環を形成し；ここで、Ｒ１が−ＣＮの場合、Ｒ３はＣ１−６アルキルではなく；
各Ｒ５が、独立して、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり；および
ｍが、０、１、２、３、または４である。
【請求項２】
Ｒが、Ｈ、ハロ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２およびＲ４が、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり；Ｒ２およびＲ４のどちらも、Ｒ３に結合して任意に置換された複素環を形成しない、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が−ＳＯ３Ｈであり、かつ／またはＲ４が−ＳＯ３Ｈである、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
ＸがＯまたはＳである、請求項１〜４の何れかに記載の化合物。
【請求項６】
ＸがＮＲｎであり、ここで、ＲｎがＨまたはＣ１−６アルキルである、請求項１〜４の何れかに記載の化合物。
【請求項７】
（ａ）Ｒ３がＨであるか；または
（ｂ）Ｒ３がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはヘキシルであるか；または
（ｃ）Ｒ３がエチルである、請求項１〜６の何れかに記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ３が、置換されたＣ２−６アルキルである、請求項１〜６の何れかに記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ３が、−ＣＯ２Ｈで置換されたＣ２−６アルキルである、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ３が−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨであり、ここで、ｎが２、３、４、５または６である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ３が−（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｈであり、ここで、ｎが２、３、４、５または６である、請求項８に記載の化合物。
【請求項１２】
ｍが０、１、または２である、請求項１〜１１の何れかに記載の化合物。
【請求項１３】
各Ｒ５が、独立して、任意に置換されたＣ１−６アルキル、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、−ＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、または−ＳＯ２ＮＨ２である、請求項１〜１２の何れかに記載の化合物。
【請求項１４】
各Ｒ５が、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、または任意に置換されたＣ１−６アルキルである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ５が、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ２ＮＨ２で置換された、Ｃ２−６アルキルである、請求項１４に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｒ５が−（ＣＨ２）ｘＣＯＯＨであり、ここで、ｘが２、３、４、５または６である、請求項１５に記載の化合物。
【請求項１７】
Ｒ５が、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ２ＮＨ２である、請求項４に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｒ１が、Ｈ、ハロ、またはＣ１−６アルキルである、請求項１〜１６の何れかに記載の化合物。
【請求項１９】
Ｒ１が、ＨまたはＣｌである、請求項１８に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒが、Ｈ、ハロ、またはＣ１−６アルキルである、請求項１〜１９の何れかに記載の化合物。
【請求項２１】
Ｒ１が、ＨまたはＣｌである、請求項２０に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒが、Ｈ、ハロ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールである、請求項１〜２１の何れかに記載の化合物。
【請求項２３】
ＲがＨである、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ２が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、−ＣＯ２Ｈもしくは−ＳＯ３Ｈで任意に置換されたＣ１−４アルキル、または−ＳＯ３Ｈである、請求項１〜２３の何れかに記載の化合物。
【請求項２５】
Ｒ２が、Ｈまたは−ＳＯ３Ｈである、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
Ｒ２がＲ３に結合して、任意に置換された複素環、好ましくは１つ以上のアルキル基で任意に置換されたピロリジンまたはピペリジンを形成する、請求項１〜２３の何れかに記載の化合物。
【請求項２７】
Ｒ４が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、−ＣＯ２Ｈもしくは−ＳＯ３Ｈで任意に置換されたＣ１−４アルキル、または−ＳＯ３Ｈである、請求項１〜２５の何れかに記載の化合物。
【請求項２８】
Ｒ４がＲ３に結合して、任意に置換された複素環、好ましくは１つ以上のアルキル基で任意に置換されたピロリジンまたはピペリジンを形成する、請求項１〜２５の何れかに記載の化合物。
【請求項２９】
Ｘが、ＯまたはＳであり；ＲがＨであり；Ｒ１がＨであり；Ｒ３が−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨであり、ここで、ｎが２、３、４、５、または６であり；Ｒ５がＨ、−ＳＯ３Ｈ、または−ＳＯ２ＮＨ２であり；Ｒ２が、Ｈまたは−ＳＯ３Ｈであり；Ｒ４が、Ｈまたは−ＳＯ３Ｈである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３０】
Ｒ３が−（ＣＨ２）２ＣＯＯＨである、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３１】
Ｒ３が−（ＣＨ２）５ＣＯＯＨである、請求項２９に記載の化合物。
【請求項３２】
式（ＩＩ）の化合物およびその塩：
【化２】
2020537630.tif 000030
式中、
Ｘ’が、Ｏ、Ｓ、およびＮＲｐから選択され、ここで、Ｒｐが、ＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ６が、ＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ７が、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＯＨ、任意に置換されたＣ１−４アルキル、任意に置換されたＣ１−４アルケニル、任意に置換されたＣ２−４アルキニル、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、および任意に置換されたＣ１−４アルコキシであり；
Ｒ８およびＲ１０が、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、−ＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、任意に置換されたＣ１−６アルキル、任意に置換されたＣ１−６アルケニル、任意に置換されたＣ２−６アルキニル、または任意に置換されたＣ１−６アルコキシであるか；あるいは
Ｒ８およびＲ１０の一方が、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、−ＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、任意に置換されたＣ１−６アルキル、任意に置換されたＣ１−６アルケニル、任意に置換されたＣ２−６アルキニル、または任意に置換されたＣ１−６アルコキシであり、かつＲ８およびＲ１０の他方が、Ｒ９と一緒になって、任意に置換された４〜７員の複素環を形成し；
Ｒ９が、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−４アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＣＯＮ（Ｃ１−４アルキル）２、−ＣＮ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、または−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２で置換された、Ｃ２−６アルキルまたはＣ１−６アルキルであり；
各Ｒ１１が、独立して、ハロ、−ＣＮ、カルボキシ、アミノ、−ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、および任意に置換されたＣ１−６アルコキシであり；および
ｑが、０、１、または２である。
【請求項３３】
Ｘ’がＯであるか、またはＸ’がＳである、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
Ｘ’がＮＲｐであり、ここで、ＲｐがＨまたはＣ１−６アルキルである、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３５】
Ｒ６がＨであるか、またはＲ６がＣ１−４アルキルである、請求項３２〜３４の何れかに記載の化合物。
【請求項３６】
Ｒ７がＨであるか、またはＲ７が任意に置換されたＣ１−４アルキル、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、もしくは−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２である、請求項３２〜３５の何れかに記載の化合物。
【請求項３７】
Ｒ７が、−ＣＯ２Ｈで任意に置換されたＣ１−４アルキルである、請求項３６に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｒ８がＨであるか、またはＲ８が−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、もしくは−ＳＯ２ＮＨ２である、請求項３２〜３７の何れかに記載の化合物。
【請求項３９】
Ｒ１０がＨであるか、またはＲ１０が−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、もしくは−ＳＯ２ＮＨ２である、請求項３２〜３８の何れかに記載の化合物。
【請求項４０】
（ａ）Ｒ８がＨであり、かつＲ１０が−ＳＯ３Ｈであるか、あるいは（ｂ）Ｒ８が−ＳＯ３Ｈであり、かつＲ１０がＨである、請求項３２〜３７の何れかに記載の化合物。
【請求項４１】
Ｒ８およびＲ１０の一方が、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、任意に置換されたＣ１−６アルキル、任意に置換されたＣ１−６アルケニル、任意に置換されたＣ２−６アルキニル、または任意に置換されたＣ１−６アルコキシであり、かつＲ８およびＲ１０の他方が、Ｒ９と一緒になって、任意に置換された４〜７員の複素環を形成する、請求項３２〜３７の何れかに記載の化合物。
【請求項４２】
Ｒ９がＣ２−６アルキルであるか、またはＲ９が−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−４アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＣＯＮ（Ｃ１−４アルキル）２、−ＣＮ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）もしくは−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２で置換されたＣ１−６アルキルである、請求項３２〜４１の何れかに記載の化合物。
【請求項４３】
Ｒ９が−ＣＯ２Ｈで置換されたＣ１−６アルキルであり、好ましくはＲ９が−（ＣＨ２）ｙ−ＣＯ２Ｈであり、ここで、ｙが２、３、４、または５である、請求項４２に記載の化合物。
【請求項４４】
各Ｒ１１が、独立して、ハロ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、または任意に置換されたアルキルである、請求項３２〜４３の何れかに記載の化合物。
【請求項４５】
ｑが０、１、または２である、請求項３２〜４４の何れかに記載の化合物。
【請求項４６】
以下からなる群より選択される、化合物：
【化３】
2020537630.tif 000031
および、それらの塩。
【請求項４７】
前記化合物が、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに結合している、請求項１〜４６の何れかに記載の化合物。
【請求項４８】
請求項１〜４６の何れかに記載の化合物で標識された、標識ヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチド。
【請求項４９】
請求項１〜１１に記載の化合物が、式（Ｉ）中のＲ３または式（ＩＩ）中のＲ９を介して結合している、請求項４８に記載の標識ヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチド。
【請求項５０】
式（Ｉ）中のＲ３が−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨであり、ここでｎが２、３、４、５、もしくは６であるか、または式（ＩＩ）中のＲ９が−（ＣＨ２）ｙＣＯＯＨであり、ここでｙが２、３、４、５、もしくは６であり、
前記結合が、当該−ＣＯＯＨ基を用いてアミドを形成する、請求項４９に記載の標識ヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチド。
【請求項５１】
前記標識が、リンカー部分を介して、ピリミジン塩基のＣ５位または７−デアザプリン塩基のＣ７位に結合している、請求項４８〜５０の何れかに記載の標識ヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチド。
【請求項５２】
前記ヌクレオチドのリボース糖またはデオキシリボース糖に共有結合した３’ＯＨブロッキング基を更に含む、請求項４８〜５１の何れかに記載の標識ヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチド。
【請求項５３】
請求項４９〜５２の何れかに記載の第１の標識ヌクレオチド、
および第２の標識ヌクレオチドを含む、キット。
【請求項５４】
前記第２の標識ヌクレオチドが、前記第１の標識ヌクレオチドとは異なる化合物で標識されているか、または非標識である、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
前記第１の標識ヌクレオチドおよび前記第２の標識ヌクレオチドが、単一のレーザー波長を使用して励起可能である、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
第３のヌクレオチドおよび第４のヌクレオチドを更に含み、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド、および前記第４のヌクレオチドの各々が異なる化合物で標識されているか、または非標識であり、各標識が、他の標識と区別可能な異なる吸収極大を有する、請求項５３または５４に記載のキット。
【請求項５７】
４つのヌクレオチドを含み、前記４つのヌクレオチドの第１が請求項４８〜５２の何れかに記載の標識ヌクレオチドであり、前記４つのヌクレオチドの第２が第２の標識を有し、第３のヌクレオチドが第３の標識を有し、第４のヌクレオチドが非標識（ダーク）である、請求項５３に記載のキット。
【請求項５８】
４つのヌクレオチドを含み、前記４つのヌクレオチドの第１が請求項４８〜５２の何れかに記載の標識ヌクレオチドであり、前記４つのヌクレオチドの第２が第２の標識を有し、第３のヌクレオチドが２つの標識の混合物を有し、第４のヌクレオチドが非標識（ダーク）である、請求項５３に記載のキット。
【請求項５９】
シークエンシング、発現解析、ハイブリダイゼーション解析、遺伝子解析、ＲＮＡ解析、またはタンパク質結合アッセイにおける、請求項１〜４６の何れかに記載のヌクレオチド、請求項４８〜５２に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項５３〜５８の何れかに記載のキット、の使用。
【請求項６０】
自動化シークエンシング装置における請求項５９に記載の使用であって、前記自動化シークエンシング装置が、異なる波長で動作する２つのレーザーを含む、使用。
【請求項６１】
請求項４８〜５２の何れかに記載のヌクレオチドを、シークエンシングアッセイに組み込むことを含む、シークエンシング方法。
【請求項６２】
前記ヌクレオチドを検出することを更に含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記シークエンシングアッセイが自動化シークエンシング装置で実施され、前記自動化シークエンシング装置が異なる波長で動作する２つの光源を含む、請求項６１または６２に記載の方法。
【請求項６４】
本明細書に記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の、合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、第二級アミン置換クマリン化合物、および蛍光マーカーとしてのそれらの使用に関する。特に、前記化合物は、核酸シークエンシングアプリケーションにおけるヌクレオチド用の蛍光標識として使用され得る。
【背景技術】
【０００２】
この開示が関係する最新技術をより完全に説明するために、本出願ではいくつかの出版物および特許文書が参照される。これらの出版物および文書のそれぞれの開示は、参照により本明細書に援用される。
【０００３】
蛍光標識を有する核酸の非放射性検出は、分子生物学における重要な技術である。組み換えＤＮＡ技術で用いられる多くの手順は、以前は、３２Ｐなどで放射性標識されたヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの使用に依存していた。放射性化合物は、核酸および他の目的の分子の高感度の検出を可能にする。しかしながら、費用、限られた貯蔵寿命、不十分な感度、そしてより重要なことである安全性への配慮など、放射性同位元素の使用には重大な制限がある。放射性標識の必要性を排除することは、安全リスクと、試薬廃棄などに関連する環境への影響およびコストとの双方を低減させる。非放射性蛍光検出に適した方法には、非限定的な例として、自動化ＤＮＡシークエンシング、ハイブリダイゼーション方法、ポリメラーゼ連鎖反応生成物のリアルタイム検出、およびイムノアッセイが含まれる。
【０００４】
多くのアプリケーションにとって、複数の空間的に重なり合う被検物の独立した検出を達成するために、複数のスペクトル的に区別可能な蛍光標識を使用することが望ましい。このような多重方法では、反応容器の数を減らして実験プロトコルを単純化し、特定用途向け試薬キットの製造を容易にし得る。マルチカラー自動化ＤＮＡシークエンシングシステムなどにおいて、多重蛍光検出は、単一の電気泳動レーンにおける複数のヌクレオチド塩基の分析を可能にし、それによってシングルカラーの方法よりもスループットを増加させ、レーン間の電気泳動移動度のばらつきに関連する不正確性を減少させる。
【０００５】
しかしながら、多重蛍光検出は問題を含む可能性があり、蛍光標識の選択を制約する多くの重要な因子がある。第一に、所定のアプリケーションにおいて、適切に分離された吸収および発光スペクトルを有する色素化合物を見つけることは困難であり得る。さらに、いくつかの蛍光色素が一緒に使用される場合、色素の吸収帯は通常広く分離されており、２つの色素であっても同等の蛍光励起効率を達成することは困難であるので、同時励起によって区別可能なスペクトル領域に蛍光シグナルを発生させることは困難であり得る。多くの励起方法は、レーザーなどの高出力光源を使用し、そのため、色素はこのようなレーザー励起に耐えるのに充分な光安定性を有しなければならない。分子生物学的方法において特に重要な最後の検討事項は、蛍光色素が、例えばＤＮＡ合成溶媒および試薬、緩衝液、ポリメラーゼ酵素、ならびにリガーゼ酵素などの試薬の化学的性質（ｒｅａｇｅｎｔ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｉｅｓ）と適合性でなければならないということである。
【０００６】
シークエンシング技術が進歩するにつれて、上記の制約の全てを満たし、特に固相シークエンシングなどのハイスループット分子法に適した、更なる蛍光色素化合物、それらの核酸コンジュゲート、および複数の色素セットに対する必要性が生じてきている。
【０００７】
適切な蛍光強度、形状、および蛍光の極大波長などの改良された蛍光特性を有する蛍光色素分子は、核酸シークエンシングの速度および精度を改良することができる。測定が水ベースの生物学的緩衝液中において高温で行われる場合、ほとんどの色素の蛍光強度はそのような条件では著しく低いので、強い蛍光シグナルは特に重要である。さらに、色素が結合している塩基の性質も、蛍光極大、蛍光強度、および他の分光学的な色素の特性に影響を与える。核酸塩基と蛍光色素の間の配列特異的相互作用は、蛍光色素の特定の設計によって調整することができる。蛍光色素の構造の最適化は、ヌクレオチドの取り込みの効率を改良し、シークエンシングエラーのレベルを低減し、核酸シークエンシングにおける試薬の使用量を削減し、それにより核酸シークエンシングのコストを低減することができる。
【０００８】
いくつかの光学的開発および技術的開発は、大幅に向上した画質をもたらしたが、最終的には低い光学分解能によって制限された。一般に、光学顕微鏡の光学分解能は、使用する光の波長の約半分の間隔の物体に制限される。したがって、実際には、かなり離れて（少なくとも２００〜３５０ｎｍ）配置されている物体のみが、光学顕微鏡によって解像され得た。画像の解像度を向上させ、単位表面積あたりの解像可能な物体の数を増加させる１つの方法は、より短い波長の励起光を使用することである。例えば、光の波長が同一の光学系を用いてΔλ〜１００ｎｍだけ短くされると、解像度が向上し（約Δ５０ｎｍ／（約１５％））、歪みの少ない画像が記録され、認識可能な領域の物体の密度が約３５％増加するであろう。
【０００９】
特定の核酸シークエンシング方法は、レーザー光を使用して、色素標識ヌクレオチドを励起および検出する。これらの装置は、６６０ｎｍで励起可能な適切な色素とともに、赤色レーザーなどのより長い波長の光を使用する。有用な解像度を維持しながら、より密に詰まった核酸シークエンシングクラスターを検出するために、より短波長の青色光源（４５０〜４６０ｎｍ）が使用され得る。この場合、光学分解能は、より長波長の赤色蛍光色素の発光波長ではなく、例えば５３２ｎｍの「グリーンレーザー」など、その次に最も長い波長の光源で励起可能な色素の発光によって制限されるであろう。したがって、シークエンシングアプリケーションにおいて蛍光検出で使用するための青色色素標識に対するニーズが存在する。
【００１０】
青色色素の化学と関連するレーザー技術は、例えば、ＤＶＤおよびＢｌｕ−ｒａｙディスク用の色素を生成するために改良されてきたが、これらの化合物はバイオラベルには適さず、バイオマーカーとして使用することができない。
【００１１】
残念ながら、ヌクレオチド標識に適した強力な蛍光を有する市販の青色色素は、依然として非常にまれである。本明細書に記載されているのは、青色光励起下における強い蛍光を有し、ヌクレオチド標識に適した新規蛍光化合物である。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、第二級アミン置換クマリン誘導体に関する。当該化合物は、特に核酸シークエンシングアプリケーションにおけるヌクレオチド標識のための蛍光標識として有用であり得る。いくつかの態様では、当該色素は４５０〜４６０ｎｍの波長で光を最適に吸収し、４５０〜４６０ｎｍの波長を有する青色波長励起源が使用される状況で特に有利である。青色波長の励起により、蛍光発光の波長が短くなるため、単位面積あたり、より高密度のフィーチャ（ｆｅａｔｕｒｅｓ）の検出および解像（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）が可能になる。このような色素がヌクレオチドとのコンジュゲートに使用されると、核酸シークエンシング方法の間に得られるシークエンシング読みとりデータ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｒｅａｄｓ）の長さ、強度、精度、およびクオリティーに改善が見られる。
【００１３】
第一の態様は、式（Ｉ）の化合物またはその塩である：
【化１】
2020537630.tif 000002
式中、Ｘが、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＮＲｎであり、ここで、Ｒｎが、ＨまたはＣ１−６アルキルであり；ＲおよびＲ１が、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり；Ｒ２およびＲ４が、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであるか；あるいはＲ２およびＲ４の一方が、Ｒ３に結合して、任意に置換された複素環を形成し；Ｒ３が、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ２−６アルキル、任意に置換されたＣ２−６アルケニル、任意に置換されたＣ２−６アルキニル、または任意に置換されたカルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであるか、あるいはＲ３が、Ｒ２またはＲ４に結合して、任意に置換された環を形成し；ここで、Ｒ１が−ＣＮの場合、Ｒ３はＣ１−６アルキルではなく；各Ｒ５が、独立して、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり；およびｍが、０、１、２、３、または４である。
【００１４】
いくつかの態様では、Ｒは−ＣＮではなく、Ｒが、Ｈ、ハロ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールである。
【００１５】
別の態様は、式（ＩＩ）の化合物およびその塩である：
【化２】
2020537630.tif 000003
式中、Ｘ’が、Ｏ、Ｓ、およびＮＲｐから選択され、ここで、Ｒｐが、ＨまたはＣ１−６アルキルであり；Ｒ６が、ＨまたはＣ１−４アルキルであり；Ｒ７が、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＯＨ、任意に置換されたＣ１−４アルキル、任意に置換されたＣ１−４アルケニル、任意に置換されたＣ２−４アルキニル、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、および任意に置換されたＣ１−４アルコキシであり；Ｒ８およびＲ１０が、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、−ＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、任意に置換されたＣ１−６アルキル、任意に置換されたＣ１−６アルケニル、任意に置換されたＣ２−６アルキニル、または任意に置換されたＣ１−６アルコキシであるか；あるいはＲ８およびＲ１０の一方が、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、−ＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、任意に置換されたＣ１−６アルキル、任意に置換されたＣ１−６アルケニル、任意に置換されたＣ２−６アルキニル、または任意に置換されたＣ１−６アルコキシであり、かつＲ８およびＲ１０の他方が、Ｒ９と一緒になって、任意に置換された４〜７員の複素環を形成し；Ｒ９が、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−４アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＣＯＮ（Ｃ１−４アルキル）２、−ＣＮ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、または−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２で置換された、Ｃ２−６アルキルまたはＣ１−６アルキルであり；各Ｒ１１が、独立して、ハロ、−ＣＮ、カルボキシ、アミノ、−ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、および任意に置換されたＣ１−６アルコキシであり；およびｑが、０、１、または２である。
【００１６】
別の態様では、本開示の化合物は、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、炭水化物、リガンド、粒子、細胞、半固体表面（例えば、ゲル）、または固体表面などの基質部分にコンジュゲートしている。コンジュゲーションは、カルボキシル基−ＣＯ２Ｈを介して行うことができ、当該カルボキシル基は、当技術分野で知られている方法を使用して、部分（ヌクレオチドなど）またはそれに結合したリンカー上のアミノ基またはヒドロキシル基と反応させて、アミドまたはエステルを形成することができる。
【００１７】
したがって、本開示のさらなる態様によれば、例えば、基質部分への共有結合を可能にするリンカー基を含む色素化合物が提供される。リンキング（Ｌｉｎｋｉｎｇ）は、Ｒ基のいずれかを含む、色素の任意の位置で実行され得る。リンキング（Ｌｉｎｋｉｎｇ）は、式（Ｉ）中のＲ３もしくはＲ５を介して、または式（ＩＩ）中のＲ９もしくはＲ１１を介して実行され得る。
【００１８】
更なる態様によれば、本開示は、以下の式によって定義されるヌクレオシド化合物またはヌクレオチド化合物を提供する：
Ｎ−Ｌ−Ｄｙｅ
式中、Ｎはヌクレオチドであり；Ｌは任意のリンカー部分であり；Ｄｙｅは、本開示による蛍光化合物である。したがって、本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、（ａ）式（Ｉ）または（ｂ）式（ＩＩ）の化合物で標識された部分、特にヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに関する。
【００１９】
更なる態様では、本開示は、本開示の色素化合物を使用したシークエンシング方法を提供する。
【００２０】
更なる態様によれば、本開示は、様々な免疫学的アッセイ、オリゴヌクレオチドもしくは核酸の標識、または合成によるＤＮＡシークエンシング（ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に使用され得る（遊離またはコンジュゲート形態の）色素化合物を含むキットも提供する。更に別の態様では、本開示は、自動化装置プラットフォームでの合成によるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）のサイクルに特に適した色素「セット」を含むキットを提供する。いくつかの態様では、当該キットは、少なくとも１つのヌクレオチドが本明細書に記載の標識ヌクレオチドである１つ以上のヌクレオチドを含む。
【００２１】
本開示の更なる態様は、第二級アミン置換クマリン色素およびそのような色素で標識されたヌクレオチドなどの部分を含む、本開示の化合物の化学的調製である。
【００２２】
更なる態様は、本明細書に記載の標識ヌクレオチドをシークエンシングアッセイのポリヌクレオチドに組み込むこと、および組み込まれた標識ヌクレオチドを検出することを含むシークエンシング方法である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ｉｌｌｕｍｉｎａの合成によるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；ＳＢＳ）ケミストリーを用いた、本明細書に記載される３つの青色色素についての仮想的なシークエンシング結果を示す散布図である（図１Ａ、図１Ｂ、および図１Ｃ）。４つのヌクレオチド上の色素は、実施例５に記載されているように、４つの異なるスペクトル分解領域として検出された。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本開示は、蛍光検出および合成によるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｂｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）の方法に特に適した第二級アミン置換クマリン化合物を提供する。本明細書に記載される実施形態は、式（Ｉ）の構造の色素およびそれらの誘導体に関する。
【００２５】
第一の態様によれば、本開示は式（Ｉ）の化合物またはその塩を提供する。
【００２６】
様々な置換基についての特定の制限を以下に示す。特段の指定がない限り、各々の単一の基は、任意の他の個々の制限と組み合わせることができる。
【００２７】
水ベースの溶液中における、バイオマーカーおよび特にそれらのバイオコンジュゲートの蛍光特性を改善するために、式（Ｉ）の化合物は以下の化合物である：
ｉ）Ｒ２が−ＳＯ３Ｈであり；かつ／または
ｉｉ）Ｒ４が−ＳＯ３Ｈであり；かつ／または
ｉｉｉ）Ｒ５が−ＳＯ３Ｈもしくは−ＳＯ２ＮＨ２である。
【００２８】
いくつかの態様では、ＸがＯまたはＳである。いくつかの態様では、ＸがＯである。いくつかの態様では、ＸがＳである。いくつかの態様では、ＸがＮＲｎであり、ここで、ＲｎがＨまたはＣ１−６アルキルであり、いくつかの態様では、ＲｎがＨである。
【００２９】
いくつかの態様では、Ｒ３がＨである。いくつかの態様では、Ｒ３がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはヘキシルである。他の態様では、Ｒ３がエチルである。他の態様では、Ｒ３が、置換されたＣ２−６アルキルである。他の態様では、Ｒ３が、−ＣＯ２Ｈで置換されたＣ２−６アルキルである。他の態様では、Ｒ３が、任意に置換されたＣ２−６アルケニルまたは任意に置換されたＣ２−６アルキニルである。いくつかの態様では、Ｒ３が、Ｒ２またはＲ４に結合して、任意に置換された環を形成する。
【００３０】
リンカーまたはヌクレオチドへの結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）がＲ３を介する場合、Ｒ３は、それに結合した官能基への結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）を可能にするのに十分な長さでなければならない。いくつかの態様では、Ｒ３は−ＣＨ２ＣＯＯＨまたは−ＣＨ２ＣＯＯ−ではない。
【００３１】
必要に応じて、Ｒ３が−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨであり、ここで、ｎが２〜６である。いくつかの態様では、ｎが２、３、４、５または６である。他の態様では、ｎが２または５である。いくつかの態様では、ｎが２である。いくつかの態様では、ｎが５である。
【００３２】
必要に応じて、Ｒ３が−（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｈであり、ここで、ｎが２〜６である。いくつかの態様では、ｎが２、３、４、５または６である。他の態様では、ｎが２または５である。いくつかの態様では、ｎが２である。いくつかの態様では、ｎが５である。
【００３３】
インドール部分のベンゼン環は、Ｒ５として示される置換基によって、１つ、２つ、３つ、または４つの位置で任意に置換される。ｍが０の場合、ベンゼン環は非置換である。ｍが１より大きい場合、各Ｒ５は同じでも異なっていてもよい。いくつかの態様では、ｍは０である。他の態様では、ｍは１である。他の態様では、ｍは２である。いくつかの態様では、ｍは１、２、または３であり、各Ｒ５は、独立して、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、−ＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、または−ＳＯ２ＮＨ２である。いくつかの態様では、Ｒ５が−（ＣＨ２）ｘＣＯＯＨであり、ここで、ｘが２〜６である。いくつかの態様では、ｘが２、３、４、５または６である。他の態様では、ｘが２または５である。いくつかの態様では、ｘが２である。いくつかの態様では、ｘが５である。
【００３４】
いくつかの態様では、Ｒ５が、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、または任意に置換されたＣ１−６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ５が、ハロ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、または−ＳＯ２ＮＨ２である。いくつかの態様では、Ｒ５が、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ２ＮＨ２で置換された、Ｃ２−６アルキルである。いくつかの態様では、各Ｒ５が、独立して、任意に置換されたＣ１−６アルキル、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、−ＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、または−ＳＯ２ＮＨ２である。
【００３５】
いくつかの態様では、Ｒ１がＨである。いくつかの態様では、Ｒ１がハロである。いくつかの態様では、Ｒ１がＣｌである。いくつかの態様では、Ｒ１がＣ１−６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ１がメチルである。
【００３６】
いくつかの態様では、ＲがＨである。いくつかの態様では、Ｒがハロである。いくつかの態様では、ＲがＣｌである。いくつかの態様では、ＲがＣ１−６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒがメチルである。いくつかの態様では、Ｒは−ＣＮではない。いくつかの態様では、Ｒが、Ｈ、ハロ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールである。
【００３７】
いくつかの態様では、Ｒ２がＨである。いくつかの態様では、Ｒ２が任意に置換されたアルキルである。いくつかの態様では、Ｒ２が、−ＣＯ２Ｈまたは−ＳＯ３Ｈで任意に置換されたＣ１−４アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ２が、−ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ２がＲ３に結合して、任意に置換された複素環、例えば１つ以上のアルキル基で任意に置換されたピロリジンまたはピペリジンを形成する。いくつかの態様では、Ｒ２が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、−ＣＯ２Ｈもしくは−ＳＯ３Ｈで任意に置換されたＣ１−４アルキル、または−ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ２が、Ｈまたは−ＳＯ３Ｈである。
【００３８】
いくつかの態様では、Ｒ４がＨである。いくつかの態様では、Ｒ４が任意に置換されたアルキルである。いくつかの態様では、Ｒ４が、−ＣＯ２Ｈまたは−ＳＯ３Ｈで任意に置換されたＣ１−４アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ４が、−ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ４がＲ３に結合して、任意に置換された複素環、例えば１つ以上のアルキル基で任意に置換されたピロリジンまたはピペリジンを形成する。
【００３９】
式（Ｉ）の化合物の特定の例は、Ｘが、ＯまたはＳであり；ＲがＨであり；Ｒ１がＨであり；Ｒ３が−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨであり、ここで、ｎが２〜６であり；Ｒ５がＨ、−ＳＯ３Ｈ、または−ＳＯ２ＮＨ２であり；Ｒ２が、Ｈまたは−ＳＯ３Ｈであり；Ｒ４が、Ｈまたは−ＳＯ３Ｈである場合を含む。
【００４０】
式（Ｉ）の化合物の特定の例は、Ｘが、ＯまたはＳであり；ＲがＨであり；Ｒ１がＨであり；Ｒ３が−（ＣＨ２）２ＣＯＯＨであり；Ｒ５がＨ、−ＳＯ３Ｈ、または−ＳＯ２ＮＨ２であり；Ｒ２が、Ｈまたは−ＳＯ３Ｈであり；Ｒ４が、Ｈまたは−ＳＯ３Ｈである場合を含む。
【００４１】
式（Ｉ）の化合物の特定の例は、Ｘが、ＯまたはＳであり；ＲがＨであり；Ｒ１がＨであり；Ｒ３が−（ＣＨ２）５ＣＯＯＨであり；Ｒ５がＨ、−ＳＯ３Ｈ、または−ＳＯ２ＮＨ２であり；Ｒ２が、Ｈまたは−ＳＯ３Ｈであり；Ｒ４が、Ｈまたは−ＳＯ３Ｈである場合を含む。
【００４２】
式（ＩＩ）のいくつかの態様では、Ｘ’がＯである。いくつかの態様では、Ｘ’がＳである。いくつかの態様では、Ｘ’がＮＲｐであり、ここで、Ｒｐが、ＨまたはＣ１−６アルキルである。いくつかの態様では、Ｘ’がＮＲｐであり、ここで、ＲｐがＨである。
【００４３】
いくつかの態様では、Ｒ６がＨである。いくつかの態様では、Ｒ６がＣ１−４アルキルである。
【００４４】
いくつかの態様では、Ｒ７がＨである。いくつかの態様では、Ｒ７が任意に置換されたＣ１−４アルキル、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、または−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２である。いくつかの態様では、Ｒ７が、−ＣＯ２Ｈで任意に置換されたＣ１−４アルキルである。
【００４５】
いくつかの態様では、Ｒ８がＨである。いくつかの態様では、Ｒ８が−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、または−ＳＯ２ＮＨ２である。いくつかの態様では、Ｒ８が−ＳＯ３Ｈである。
【００４６】
いくつかの態様では、Ｒ１０がＨである。いくつかの態様では、Ｒ１０が−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ２ＮＨ２である。いくつかの態様では、Ｒ１０が−ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ８がＨであり、かつＲ１０が−ＳＯ３Ｈである。いくつかの態様では、Ｒ８が−ＳＯ３Ｈであり、かつＲ１０がＨである。
【００４７】
いくつかの態様では、Ｒ８およびＲ１０の一方が、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、任意に置換されたＣ１−６アルキル、任意に置換されたＣ１−６アルケニル、任意に置換されたＣ２−６アルキニル、または任意に置換されたＣ１−６アルコキシであり、かつＲ８およびＲ１０の他方が、Ｒ９と一緒になって、任意に置換された４〜７員の複素環を形成する。
【００４８】
いくつかの態様では、Ｒ９がＣ２−６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ９が−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−４アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＣＯＮ（Ｃ１−４アルキル）２、−ＣＮ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）もしくは−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２で置換されたＣ１−６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ９が−ＣＯ２Ｈで置換されたＣ１−６アルキルである。いくつかの態様では、Ｒ９が−（ＣＨ２）ｙ−ＣＯ２Ｈであり、ここで、ｙが２、３、４、または５である。
【００４９】
いくつかの態様では、各Ｒ１１が、独立して、ハロ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、または任意に置換されたアルキルである。他の態様では、各Ｒ１１が、独立して、ハロ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、または−ＳＯ２ＮＨ２である。
【００５０】
いくつかの態様では、ｑが０である。他の態様では、ｑが１である。更に他の態様では、ｑが２である。
【００５１】
第二級アミン置換クマリン色素の具体例は以下を含む：
【化３】
2020537630.tif 000004
および、それらの塩。
【００５２】
特に有用な化合物は、本明細書に記載の色素で標識されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドである。前記標識ヌクレオチドまたは標識ヌクレオチドオリゴヌクレオチドは、アルキル−カルボキシ基を介してクマリン分子の窒素原子に結合して、アルキル−アミドを形成する標識を有し得る。前記標識ヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチドは、リンカー部分を介して、ピリミジン塩基のＣ５位または７−デアザプリン塩基のＣ７位に結合した標識を有し得る。
【００５３】
前記標識ヌクレオチドまたは標識ヌクレオチドオリゴヌクレオチドはまた、前記ヌクレオチドのリボース糖またはデオキシリボース糖に共有結合したブロッキング基を有し得る。前記ブロッキング基は、前記リボース糖またはデオキシリボースの糖の任意の位置に結合させることができる。特定の実施形態では、前記ブロッキング基は、前記ヌクレオチドの前記リボース糖またはデオキシリボース糖の３’ＯＨ位にある。
【００５４】
本明細書では、２つ以上のヌクレオチドを含むキットであって、少なくとも１つのヌクレオチドが本開示の化合物で標識されたヌクレオチドである、キットが提供される。前記キットは、２つ以上の標識ヌクレオチドを含み得る。前記ヌクレオチドは、２つ以上の蛍光標識で標識され得る。前記標識の２つ以上は、単一の励起源を使用して励起され得、当該単一の励起源はレーザーであり得る。例えば、スペクトルの重複領域での励起により両方の標識が蛍光を発するように、前記２つ以上の標識の励起帯は、少なくとも部分的に重複し得る。特定の実施形態では、前記２つ以上の標識からの発光は、スペクトルの異なる領域で発生し、前記発光を光学的に区別することによって、前記標識の少なくとも１つの存在を決定することができる。
【００５５】
前記キットは、４つの標識ヌクレオチドを含み得、４つのヌクレオチドの第１が本明細書に開示される化合物で標識される。そのようなキットでは、前記４つのヌクレオチドの各々は、他の３つのヌクレオチドの標識と同じまたは異なる化合物で標識され得る。したがって、前記化合物の１つ以上は、当該化合物が他の化合物と区別可能であるように、異なる吸収極大および／または発光極大を有し得る。例えば、各化合物は、前記化合物のそれそれが他の３つの化合物と区別可能であるように、異なる吸収極大および／または発光極大を有し得る。極大以外の吸収スペクトルおよび／または発光スペクトルの部分が異なる可能性があり、これらの違いを利用して前記化合物を区別できることが理解されよう。前記キットは、前記化合物の２つ以上が異なる吸収極大を有するものであってもよい。本発明の化合物は、典型的には５００ｎｍ未満の領域において光を吸収する。
【００５６】
本明細書に記載されている化合物、ヌクレオチド、またはキットは、生物学的システム（例えば、そのプロセスまたは構成要素を含む）を検出、測定、または特定するために使用され得る。前記化合物、ヌクレオチドまたはキットを使用することができる例示的な技術は、シークエンシング、発現解析、ハイブリダイゼーション解析、遺伝子解析、ＲＮＡ解析、細胞アッセイ（例えば、細胞結合解析または細胞機能解析）、またはタンパク質アッセイ（例えば、タンパク質結合アッセイまたはタンパク質活性アッセイ）を含む。前記使用は、特定の技術を実施するための自動化装置、例えば、自動化シークエンシング装置における使用であり得る。前記自動化シークエンシング装置が異なる波長で動作する２つの光源を含み得る。
【００５７】
本明細書では、本開示の化合物の合成方法が開示される。本開示による色素は、様々な異なる適切な出発材料から合成され得る。クマリン色素を調製する方法は、当技術分野で周知である。
【００５８】
（定義）
本明細書で使用されている節の見出しは、単に編成目的のためにすぎず、記載されている主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００５９】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、明示的かつ明確に１つの指示対象に限定されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。本教示の精神または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の様々な実施形態に対して様々な修正および変更を行うことができることは、当業者には明らかであろう。したがって、本明細書で説明される様々な実施形態は、添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内で他の修正および変形を包含することが意図されている。
【００６０】
別段の定めがない限り、本明細書で使用されている全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、ならびに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含んでいた（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の語形の使用は限定的なものではない。用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、ならびに「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｓ）」、および「有していた（ｈａｄ）」などの他の語形の使用は限定的なものではない。本明細書で使用される場合、請求項の移行句であろうと本体部であろうと、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非限定的意味を有するものと解釈されるべきである。すなわち、上記の用語は、「少なくとも有する」または「少なくとも含む」という句と同義的に解釈されるべきである。例えば、方法との関連で使用されている場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、方法が少なくとも列挙された工程を含むが、追加の工程を含み得ることを意味する。化合物、組成物、または装置との関連で使用されている場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、化合物、組成物、または装置が少なくとも列挙された特徴または構成要素を含むが、追加の特徴または構成要素も含み得ることを意味する。
【００６１】
本明細書で使用される場合、用語「共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ａｔｔａｃｈｅｄ）」または「共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｂｏｎｄｅｄ）」は、原子間の電子対の共有を特徴とする化学結合の形成を指す。例えば、共有結合ポリマーコーティングは、他の手段、例えば、接着または静電相互作用による表面への付着と比較して、基質の官能化表面と化学結合を形成するポリマーコーティングを指す。表面に共有結合しているポリマーは、共有結合以外の手段によっても結合し得ることが理解されよう。
【００６２】
本明細書で使用される用語「ハロゲン」または「ハロ」は、元素周期表の第７列の放射線安定原子のうちのいずれか一つ、例えばフッ素、塩素、臭素、またはヨウ素を意味し、フッ素および塩素が好ましい。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、完全に飽和している（すなわち、二重結合または三重結合を含まない）直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を指す。アルキル基は、１〜２０個の炭素原子を有し得る（「１〜２０」などの数値範囲は、本明細書中に記載されているときはいつでも、所定の範囲の各整数を指す；「１〜２０個の炭素原子」は、１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など、２０個以下の炭素原子からなり得ることを意味するが、本定義は、数値範囲が指定されていない場合の用語「アルキル」の記載も包含する）。アルキル基は、１〜９個の炭素原子を有する中サイズのアルキルでもあり得る。アルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキルでもあり得る。アルキル基は、「Ｃ１−４アルキル」または同様の表記として示され得る。ただの例示として、「Ｃ１−６アルキル」は、アルキル鎖中に１〜６個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチルからなる群から選択される。典型的なアルキル基として、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ターシャリーブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられるが、これらに決して限定されるものではない。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、式−ＯＲを指し、ここで、Ｒは上記に定義されているアルキルであり、例えば、「Ｃ１−９アルコキシ」として、限定はされないが、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、１−メチルエトキシ（イソプロポキシ）、ｎ−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、およびｔｅｒｔ−ブトキシなどが挙げられる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、１以上の二重結合を含む直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を指す。アルケニル基は、２〜２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルケニル」の記載も包含する。アルケニル基は、２〜９個の炭素原子を有する中サイズのアルケニルでもあり得る。アルケニル基は、２〜６個の炭素原子を有する低級アルケニルでもあり得る。アルケニル基は、「Ｃ２−６アルケニル」または同様の表記として示され得る。ただの例示として、「Ｃ２−６アルケニル」は、アルケニル鎖中に２〜６個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルケニル鎖は、エテニル、プロペン−１−イル、プロペン−２−イル、プロペン−３−イル、ブテン−１−イル、ブテン−２−イル、ブテン−３−イル、ブテン−４−イル、１−メチル−プロペン−１−イル、２−メチル−プロペン−１−イル、１−エチル−エテン−１−イル、２−メチル−プロペン−３−イル、ブタ−１，３−ジエニル、ブタ−１，２，−ジエニル、およびブタ−１，２−ジエン−４−イルからなる群から選択される。典型的なアルケニル基として、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、およびヘキセニルなどが挙げられるが、これらに決して限定されるものではない。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、１以上の三重結合を含む直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を指す。アルキニル基は、２〜２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アルキニル」の記載も包含する。アルキル基は、２〜９個の炭素原子を有する中サイズのアルキニルでもあり得る。アルキニル基は、２〜６個の炭素原子を有する低級アルキニルでもあり得る。アルキニル基は、「Ｃ２−６アルキニル」または同様の表記として示され得る。ただの例示として、「Ｃ２−６アルキニル」は、アルキニル鎖中に２〜６個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルキニル鎖は、エチニル、プロピン−１−イル、プロピン−２−イル、ブチン−１−イル、ブチン−３−イル、ブチン−４−イル、および２−ブチニルからなる群から選択される。典型的なアルキニル基として、エチニル、プロピニル、ブチニル、ペンチニル、およびヘキシニルなどが挙げられるが、これらに決して限定されるものではない。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」は、主鎖中に１以上のヘテロ原子、すなわち、炭素以外の元素、例えば、限定はされないが、窒素、酸素、および硫黄を含有する直鎖状または分岐状の炭化水素鎖を指す。ヘテロアルキル基は、１〜２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロアルキル」の記載も包含する。ヘテロアルキル基は、１〜９個の炭素原子を有する中サイズのヘテロアルキルでもあり得る。ヘテロアルキル基は、１〜６個の炭素原子を有する低級ヘテロアルキルでもあり得る。ヘテロアルキル基は、「Ｃ１−６ヘテロアルキル」または同様の表記として示され得る。ヘテロアルキル基は、１以上のヘテロ原子を含有し得る。ただの例示として、「Ｃ４−６ヘテロアルキル」は、ヘテロアルキル鎖中に４〜６個の炭素原子があり、さらに骨格鎖中に１個以上のヘテロ原子があることを示す。
【００６８】
用語「芳香族」は、共役パイ電子系を有する環または環系を指し、炭素環式芳香族基（例えば、フェニル）および複素環式芳香族基（例えば、ピリジン）の両方を含む。当該用語は、環系全体が芳香族であるという条件の下に、単環式または縮合環多環式（すなわち、隣接する原子の対を共有する環）基を含む。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「アリール」は、環骨格中に炭素のみを含有する芳香環または環系（すなわち、２つの隣接する炭素原子を共有する２以上の縮合環）を指す。アリールが環系である場合、当該系中の全ての環は芳香族である。アリール基は、６〜１８個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「アリール」の記載も包含する。いくつかの実施形態において、アリール基は、６〜１０個の炭素原子を有する。アリール基は、「Ｃ６−１０アルキル」、「Ｃ６またはＣ１０アリール」、または同様の表記として示され得る。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アズレニル、およびアントラセニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
「アラルキル」または「アリールアルキル」は、アルキレン基を介して置換基として結合しているアリール基であり、例えば「Ｃ７−１４アラルキル」などとしては、限定はされないが、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、およびナフチルアルキルが挙げられる。いくつかの場合において、アルキレン基は、低級アルキレン基（すなわち、Ｃ１−６アルキレン基）である。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、環骨格中に１以上のヘテロ原子、すなわち、炭素以外の元素、例えば、限定はされないが、窒素、酸素、および硫黄を含有する芳香環または環系（すなわち、２つの隣接する原子を共有する２以上の縮合環）を指す。ヘテロアリールが環系である場合、当該系中の全ての環は芳香族である。ヘテロアリール基は、５〜１８の環員数（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含む環骨格を構成する原子の数）を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロアリール」の記載も包含する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、５〜１０の環員数または５〜７の環員数を有する。ヘテロアリール基は、「５〜７員のヘテロアリール」、「５〜１０員のヘテロアリール」、または同様の表記として示され得る。ヘテロアリール環の例として、限定はされないが、フリル、チエニル、フタラジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノリニル、イソキノリニル（ｉｓｏｑｕｉｎｌｉｎｙｌ）、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イソインドリル、およびベンゾチエニルが挙げられる。
【００７２】
「ヘテロアラルキル」または「ヘテロアリールアルキル」は、アルキレン基を介して置換基として結合しているヘテロアリール基である。例としては、２−チエニルメチル、３−チエニルメチル、フリルメチル、チエニルエチル、ピロリルアルキル、ピリジルアルキル、イソオキサゾリルアルキル、およびイミダゾリルアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合において、アルキレン基は、低級アルキレン基（すなわち、Ｃ１−６アルキレン基）である。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「カルボシクリル」は、環系骨格中に炭素原子のみを含有する非芳香族環式環または環系を意味する。カルボシクリルが環系である場合、２以上の環が、縮合、架橋、またはスピロ結合様式で共に結合していてもよい。カルボシクリルは、環系中の少なくとも１つの環が芳香族ではないという条件の下に、任意の飽和度を有し得る。したがって、カルボシクリルには、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルが含まれる。カルボシクリル基は、３〜２０個の炭素原子を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「カルボシクリル」の記載も包含する。カルボシクリル基は、３〜１０個の炭素原子を有する中サイズのカルボシクリルでもあり得る。カルボシクリル基は、３〜６個の炭素原子を有するカルボシクリルでもあり得る。カルボシクリル基は、「Ｃ３−６カルボシクリル」または同様の表記として示され得る。カルボシクリル環の例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，３−ジヒドロ−インデン、ビシクロ［２．２．２］オクタニル、アダマンチル、およびスピロ［４．４］ノナニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」は、完全飽和カルボシクリル環または環系を意味する。例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロヘキシルが挙げられる。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル」は、環骨格中に１以上のヘテロ原子を含有する非芳香族環式環または環系を意味する。ヘテロシクリルは、縮合、架橋、またはスピロ結合様式で共に結合していてもよい。ヘテロシクリルは、環系中の少なくとも１つの環が芳香族ではないという条件の下に、任意の飽和度を有し得る。ヘテロ原子は、環系中の非芳香族環または芳香族環のいずれに存在していてもよい。ヘテロシクリル基は、３〜２０の環員数（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含む環骨格を構成する原子の数）を有し得るが、本定義は、数値範囲が指定されていない用語「ヘテロシクリル」の記載も包含する。ヘテロシクリル基は、３〜１０の環員数を有する中サイズのヘテロシクリルでもあり得る。ヘテロシクリル基は、３〜６の環員数を有するヘテロシクリルでもあり得る。ヘテロシクリル基は、「３〜６員のヘテロシクリル」または同様の表記として示され得る。好ましい６員の単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、１〜３のＯ、Ｎ、またはＳから選択され、好ましい５員の単環式ヘテロシクリルでは、ヘテロ原子は、Ｏ、Ｎ、またはＳから選択される１〜２のヘテロ原子から選択される。ヘテロシクリル環の例として、限定はされないが、アゼピニル、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジオキソラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、オキシラニル、オキセパニル、チエパニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ジオキソピペラジニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピロリジオニル（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｏｎｙｌ）、４−ピペリドニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、１，３−ジオキシニル、１，３−ジオキサニル、１，４−ジオキシニル、１，４−ジオキサニル、１，３−オキサチアニル、１，４−オキサチイニル、１，４−オキサチアニル、２Ｈ−１，２−オキサジニル、トリオキサニル、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジニル、１，３−ジオキソリル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオリル、１，３−ジチオラニル、イソオキサゾリニル、イソオキサゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリジノニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、１，３−オキサチオラニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロ−１，４−チアジニル、チアモルホリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンズイミダゾリジニル、およびテトラヒドロキノリンが挙げられる。
【００７６】
「Ｏ−カルボキシ」基は、「−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７カルボシクリル、Ｃ６−１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００７７】
「Ｃ−カルボキシ」基は、「−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７カルボシクリル、Ｃ６−１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。非限定的な例として、カルボキシル（すなわち、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ）が挙げられる。
【００７８】
「スルホニル」基は、「−ＳＯ２Ｒ」基を指し、ここで、Ｒは、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７カルボシクリル、Ｃ６−１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００７９】
「スルフィノ」基は、「−Ｓ（＝Ｏ）ＯＨ」基を指す。
【００８０】
「Ｓ−スルホンアミド」基は、「−ＳＯ２ＮＲＡＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７カルボシクリル、Ｃ６−１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００８１】
「Ｎ−スルホンアミド」基は、「−Ｎ（ＲＡ）ＳＯ２ＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７カルボシクリル、Ｃ６−１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００８２】
「Ｃ−アミド」基は、「−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＡＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７カルボシクリル、Ｃ６−１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００８３】
「Ｎ−アミド」基は、「−Ｎ（ＲＡ）Ｃ（＝Ｏ）ＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７カルボシクリル、Ｃ６−１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。
【００８４】
「アミノ」基は、「−ＮＲＡＲＢ」基を指し、ここで、ＲＡおよびＲＢは、それぞれ独立して、本明細書で定義されている、水素、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６アルケニル、Ｃ２−６アルキニル、Ｃ３−７カルボシクリル、Ｃ６−１０アリール、５〜１０員ヘテロアリール、および３〜１０員ヘテロシクリルから選択される。非限定的な例として、遊離アミノ（すなわち−ＮＨ２）が挙げられる。
【００８５】
「アミノアルキル」基は、アルキレン基を介して結合しているアミノ基を指す。
【００８６】
「アルコキシアルキル」基は、アルキレン基を介して結合しているアルコキシ基を指し、例えば、「Ｃ２−８アルコキシアルキル」などである。
【００８７】
本明細書で使用される場合、置換基は、１個以上の水素原子が他の原子または基で交換されている非置換型親基に由来する。特段の定めがない限り、基を「置換型」と見なす場合、当該基が、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルケニル、Ｃ１〜Ｃ６アルキニル、Ｃ１〜Ｃ６ヘテロアルキル、（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで任意に置換された）Ｃ３〜Ｃ７カルボシクリル、（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで任意に置換された）Ｃ３〜Ｃ７−カルボシクリル−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで任意に置換された）３〜１０員ヘテロシクリル、（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで任意に置換された）３〜１０員ヘテロシクリル−Ｃ１〜Ｃ６−アルキル、（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで任意に置換された）アリール、（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで任意に置換された）アリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで任意に置換された）５〜１０員ヘテロアリール、（ハロ、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１〜Ｃ６ハロアルコキシで任意に置換された）５〜１０員ヘテロアリール（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ハロ、−ＣＮ、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ、Ｃ１〜Ｃ６アルコキシ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（すなわち、エーテル）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル（例えば、−ＣＦ３）、ハロ（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ（例えば、−ＯＣＦ３）、Ｃ１〜Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、アミノ（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、ニトロ、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、アシル、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニル、−ＳＯ３Ｈ、スルフィノ、−ＯＳＯ２Ｃ１−４アルキル、およびオキソ（＝Ｏ）から独立して選択される１つ以上の置換基で置換されていることを意味する。基が「任意に置換された」と記載されている場合は常に、当該基は上記の置換基で置換されていることができる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、置換アルキル基、置換アルケニル基、または置換アルキニル基は、ハロ、−ＣＮ、ＳＯ３−、ＳＲａ、ＯＲａ、ＮＲｂＲｃ、オキソ、ＣＯＮＲｂＲｃ、ＣＯＯＨ、およびＣＯＯＲｂからなる群から選択される１つ以上の置換基で置換されており、Ｒａ、ＲｂおよびＲｃは、それぞれ独立して、Ｈ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、および置換アリールから選択される。
【００８９】
本明細書に記載の化合物は、いくつかのメソメリー型として表すことができる。単一の構造が描かれる場合、関連するメソメリー型のいずれかが意図される。本明細書に記載のクマリン化合物は、単一の構造によって表されているが、関連するメソメリー型のいずれかとして等しく示すことができる。式（Ｉ）について、例示的なメソメリー構造を以下に示す：
【化４】
2020537630.tif 000005
本明細書に記載の化合物の単一のメソメリー型が示される各場合において、代替のメソメリー型も同様に企図される。
【００９０】
当業者には理解されるように、本明細書に記載の化合物は、イオン化された形態、例えば、−ＣＯ２−または−ＳＯ３−で存在し得る。化合物が正または負に帯電した置換基、例えばＳＯ３−を含む場合、当該化合物が全体として中性であるように、当該化合物は、負または正に帯電した対イオンも含み得る。他の態様では、化合物は塩の形態で存在する場合があり、対イオンは共役酸または共役塩基によって提供される。
【００９１】
特定のラジカル命名法は、文脈に応じて、モノラジカルまたはジラジカルのいずれかを含み得ることを理解されたい。例えば、置換基が分子の残部への２つの結合点を必要とする場合、当該置換基はジラジカルであると理解される。例えば、２つの結合点を必要とするアルキルとして識別される置換基には、−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２−などのジラジカルが含まれる。他のラジカル命名法は、ラジカルが「アルキレン」または「アルケニレン」などのジラジカルであることを明確に示している。
【００９２】
２つの「隣接する」Ｒ基が「それらが結合している原子と共に」環を形成すると記載されている場合、原子、介在結合、および２つのＲ基の集合単位が、記載の環であることを意味する。例えば、以下の構造：
【化５】
2020537630.tif 000006
が存在し、Ｒ１およびＲ２が、水素およびアルキルからなる群から選択されるものとして定義されるか、またはＲ１およびＲ２が、それらが結合している原子と共にアリールまたはカルボシクリルを形成する場合、Ｒ１およびＲ２が水素またはアルキルから選択され得ること、またはその代わりに、部分構造が構造：
【化６】
2020537630.tif 000007
を有し、Ａが、描かれている二重結合を含むアリール環またはカルボシクリルであることを意味する。
【００９３】
（標識ヌクレオチド）
本開示の一態様によれば、基質部分への結合に適した色素化合物、特に基質部分への結合を可能にするリンカー基を含む色素化合物が提供される。基質部分は、本開示の蛍光色素をコンジュゲートすることができる実質的にあらゆる分子または物質であり得、非限定的な例としては、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、リガンド、粒子、固体表面、有機および無機ポリマー、染色体、核、生細胞、ならびにそれらの組み合わせまたは集合体が含まれ得る。疎水性引力、イオン性引力、および共有結合を含む様々な手段によって、当該色素を任意のリンカーによりコンジュゲートすることができる。いくつかの態様では、当該色素は共有結合によって基質にコンジュゲートしている。より具体的には、当該共有結合は、リンカー基による。いくつかの場合において、このような標識ヌクレオチドは、「修飾ヌクレオチド」とも呼ばれる。
【００９４】
本開示は、本明細書に記載の色素の１つ以上で標識された、ヌクレオシドおよびヌクレオチド（修飾ヌクレオチド）のコンジュゲートを更に提供する。標識ヌクレオシドおよび標識ヌクレオチドは、非限定的な例として、ＰＣＲ増幅、等温増幅、固相増幅、ポリヌクレオチドシークエンシング（例、固相シークエンシング）、ニックトランスレーション反応などにおける酵素合成により形成されたポリヌクレオチドの標識に有用である。
【００９５】
生体分子への結合は、式（Ｉ）の化合物のＲ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、またはＸ位を介し得る。いくつかの態様では、結合は式（Ｉ）のＲ３基またはＲ５基を介する。式（II）の場合、結合はＲ６−１１またはＸ’のどの位置でも可能である。いくつかの実施形態では、置換基は、−ＣＯ２Ｈまたはカルボキシル基の活性化型で置換されたアルキルなどの置換アルキル（例えば、アミドまたはエステル）であり、それらは、生体分子のアミノ基またはヒドロキシル基への結合に使用され得る。一実施形態では、式（Ｉ）のＲ基、Ｒ１基、Ｒ２基、Ｒ３基、Ｒ４基、Ｒ５基もしくはＸ基、または式（ＩＩ）のＲ６−１１基もしくはＸ’基は、更なるアミド／ペプチド結合の形成に最適な活性化エステル残基またはアミド残基を含み得る。本明細書で使用される用語「活性化エステル」は、穏やかな条件下で、例えばアミノ基を含む化合物と反応することができるカルボキシ基誘導体を指す。活性化エステルの非限定的な例としては、ｐ−ニトロフェニル、ペンタフルオロフェニル、およびスクシンイミドエステルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
いくつかの実施形態において、色素化合物は、核酸塩基を介してオリゴヌクレオチドまたはヌクレオチドに共有結合していてもよい。例えば、標識ヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチドは、リンカー部分を介してピリミジン塩基のＣ５位、または７−デアザプリン塩基のＣ７位に結合した標識を有し得る。標識ヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース糖またはデオキシリボース糖に共有結合している３’−ＯＨブロッキング基も有し得る。
【００９７】
本明細書に記載される新規蛍光色素の特に有用なアプリケーションは、生体分子、例えばヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの標識化である。本出願のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の新規蛍光化合物で標識されたヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに関する。
【００９８】
（リンカー）
本明細書に開示されている色素化合物は、置換基位置の一つに、当該化合物の基質または別の分子への共有結合のための反応性リンカー基を含み得る。反応性リンカー基は、結合（例えば、共有結合または非共有結合）、特には共有結合を形成することができる部分である。特定の実施形態において、リンカーは、切断可能なリンカーであり得る。用語「切断可能なリンカー」の使用は、リンカー全体を除去する必要があることを暗示することを意図したものではない。切断後にリンカーの一部が色素および／または基質部分に結合したままであることを確実にするリンカー上の位置に切断部位を配置することができる。切断可能なリンカーは、非限定的な例として、求電子的に切断可能なリンカー、求核的に切断可能なリンカー、光により切断可能なリンカー、還元条件下で切断可能（例えば、ジスルフィドまたはアジド含有リンカー）、酸化的条件下で切断可能、セーフティー−キャッチリンカーの使用により切断可能、および除去機構により切断可能であり得る。色素化合物を基質部分に結合させるための切断可能なリンカーの使用は、標識を必要に応じて検出後に除去し、ダウンストリーム工程でのいかなる干渉シグナルをも回避することを確実にできるようにする。
【００９９】
有用なリンカー基は、（参照により本明細書に援用される）ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００４／０１８４９３に見出すことができ、その例には、水溶性ホスフィンまたは水溶性遷移金属触媒を使用して切断され得るリンカーが含まれ、当該水溶性遷移金属触媒は遷移金属および少なくとも部分的に水溶性の配位子から形成される。水溶液中では、後者は、少なくとも部分的に水溶性の遷移金属錯体を形成する。そのような切断可能なリンカーを使用して、ヌクレオチドの塩基を、本明細書に記載の色素などの標識に接続することができる。
【０１００】
特定のリンカーには、以下の式の部分を含むものなど、（参照により本明細書に援用される）ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００４／０１８４９３に開示されているものが含まれる：
【化７】
2020537630.tif 000008
（式中、ＸはＯ、Ｓ、ＮＨおよびＮＱを含む群から選択され、ＱはＣ１〜１０の置換または非置換のアルキル基であり、ＹはＯ、Ｓ、ＮＨおよびＮ（アリル）を含む群から選択され、Ｔは水素またはＣ１〜Ｃ１０の置換もしくは非置換のアルキル基であり、＊は、当該部分がヌクレオチドまたはヌクレオシドの残部に接続されている場所を示す）。いくつかの態様では、リンカーは、ヌクレオチドの塩基を、例えば本明細書に記載の色素化合物などの標識に接続する。
【０１０１】
特定の実施形態では、蛍光色素（フルオロホア）とグアニン塩基との間のリンカーの長さは、例えば、ポリエチレングリコールスペーサー基を導入することにより変えることができ、それにより、当分野で公知の他の結合を介してグアニン塩基に結合している同じフルオロホアと比較して、蛍光強度を増加させることができる。例示的なリンカーおよびそれらの特性は、（参照により本明細書に援用される）ＰＣＴ国際公開ＷＯ２００７０２０４５７に記載されている。リンカーの設計、特にリンカーの長さの増大は、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドに取り込まれたときに、グアノシンヌクレオチドのグアニン塩基に結合したフルオロホアの明るさの改良を可能にする。したがって、ＷＯ２００７／０２０４５７に記載されるように、色素がグアニン含有ヌクレオチドに結合した蛍光色素標識の検出を必要とする任意の分析方法において使用するためのものである場合、リンカーが式−（（ＣＨ２）２Ｏ）ｎ−のスペーサー基を含むと有利であり、ここで、ｎは、２〜５０の整数である。
【０１０２】
ヌクレオシドおよびヌクレオチドは、糖または核酸塩基上の部位で標識されていてもよい。当技術分野で知られているように、「ヌクレオチド」は、窒素塩基、糖、および１つ以上のリン酸基からなる。ＲＮＡでは、糖はリボースであり、ＤＮＡでは、糖はデオキシリボース、すなわちリボースに存在する１つのヒドロキシル基を欠く糖である。窒素塩基は、プリンまたはピリミジンの誘導体である。プリンはアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）であり、ピリミジンはシトシン（Ｃ）および、チミン（Ｔ）またはＲＮＡではウラシル（Ｕ）である。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合している。ヌクレオチドはヌクレオシドのリン酸エステルでもあり、エステル化は糖のＣ−３またはＣ−５に結合したヒドロキシル基で起こる。ヌクレオチドは、通常、モノホスフェート、ジホスフェートまたはトリホスフェートである。
【０１０３】
「ヌクレオシド」は、ヌクレオチドと構造的に類似しているが、リン酸部分を欠いている。ヌクレオシド類似体の一例は、標識が塩基に結合しており、糖分子に結合したリン酸基がないものである。
【０１０４】
塩基は通常プリンまたはピリミジンと呼ばれるが、当業者は、ワトソン−クリック塩基対合を経るというヌクレオチドまたはヌクレオシドの性質を変えない誘導体および類似体が利用可能であることを理解するであろう。「誘導体」または「類似体」は、そのコア構造が親化合物のコア構造と同じであるか、または近似しているが、例えば異なる、または追加の側鎖基などの化学的または物理的修飾を有する化合物または分子を意味し、そのため、誘導体ヌクレオチドまたはヌクレオシドを他の分子に連結させることが可能である。例えば、塩基はデアザプリンであり得る。特定の実施形態では、誘導体は当然ワトソン−クリック対合を経ることができる。「誘導体」および「類似体」は、例えば、修飾塩基部分および／または修飾糖部分を有する合成ヌクレオチドまたはヌクレオシド誘導体も含む。このような誘導体および類似体は、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｎａｌｏｇｓ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎ，  １９８０）およびＵｈｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３−５８４，  １９９０で論じられている。ヌクレオチド類似体は、修飾ホスホジエステル結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、アルキル−ホスホネート、ホスホラニリデート、ホスホルアミデート結合なども含むことができる。
【０１０５】
色素は、例えばリンカーを介して、核酸塩基上の任意の位置に結合させ得る。特定の実施形態では、得られた類似体について、ワトソン−クリック塩基対合が依然として実行され得る。特定の核酸塩基標識部位は、ピリミジン塩基のＣ５位または７−デアザプリン塩基のＣ７位を含む。上記のように、リンカー基を用いて、色素をヌクレオシドまたはヌクレオチドに共有結合させ得る。
【０１０６】
特定の実施形態において、標識ヌクレオシドまたは標識ヌクレオチドは、酵素的に取り込み可能かつ酵素的に伸長可能であり得る。したがって、リンカー部分は、核酸複製酵素によるヌクレオチドの全体的な結合および認識を化合物が著しく妨害しないように、ヌクレオチドを化合物に結合させるのに充分な長さであり得る。したがって、リンカーは、スペーサー単位も含むことができる。スペーサーは、例えば、切断部位または標識からヌクレオチド塩基を離れさせる。
【０１０７】
本明細書に記載の色素で標識されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは、式：
【化８】
2020537630.tif 000009
を有し得、式中、Ｄｙｅは、色素化合物であり、Ｂは、核酸塩基、例えばウラシル、チミン、シトシン、アデニン、グアニンなどであり、Ｌは、存在してもしなくてもよい任意のリンカー基である。Ｒ’は、Ｈ、モノホスフェート、ジホスフェート、トリホスフェート、チオホスフェート、リン酸エステル類似体、反応性リン含有基に結合した−Ｏ−、またはブロッキング基により保護された−Ｏ−であることができる。Ｒ”は、Ｈ、ＯＨ、ホスホルアミダイト、または３’−ＯＨブロッキング基であることができ、Ｒ”’は、ＨまたはＯＨであり、Ｒ”がホスホルアミダイトである場合、Ｒ’は、自動合成条件下でのその後のモノマーカップリングを可能にする酸切断可能なヒドロキシル保護基である。
【０１０８】
特定の実施形態では、ブロッキング基は、色素化合物とは別個であり、独立している、すなわち、色素化合物に結合していない。あるいは、色素は、３’−ＯＨブロッキング基の全部または一部を含み得る。したがって、Ｒ”は、色素化合物を含んでも含まなくてもよい３’−ＯＨブロッキング基であることができる。
【０１０９】
更に別の代替的な実施形態では、ペントース糖の３’炭素上にブロッキング基は存在せず、塩基に結合した色素（または色素およびリンカーの構築物）は、例えば、更なるヌクレオチドの取り込みに対するブロックとして作用するのに充分なサイズまたは構造であることができる。したがって、色素が糖の３’位に結合しているかどうかにかかわらず、ブロックは、立体障害によるものあることができるか、またはサイズ、電荷、および構造の組み合わせによるものであることができる。
【０１１０】
更に別の代替的な実施形態では、ブロッキング基は、ペントース糖の２’炭素または４’炭素上に存在し、更なるヌクレオチドの取り込みに対するブロックとして作用するのに充分なサイズまたは構造であることができる。
【０１１１】
ブロッキング基の使用は、修飾ヌクレオチドが取り込まれたときに伸長を停止することなどによって、重合を制御することを可能にする。ブロッキング効果が、例えば非限定的な例として化学的条件の変更により、または化学的ブロックの除去により、可逆的である場合、伸長を特定の時点で停止させ、その後続けさせることができる。
【０１１２】
別の特定の実施形態では、３’−ＯＨブロッキング基は、参照により本明細書に援用されるＷＯ２００４／０１８４９７およびＷＯ２０１４／１３９５９６に開示される部分を含む。例えば、ブロッキング基は、アジドメチル（−ＣＨ２Ｎ３）もしくは置換型アジドメチル（例えば、−ＣＨ（ＣＨＦ２）Ｎ３もしくはＣＨ（ＣＨ２Ｆ）Ｎ３）、またはアリルであり得る。
【０１１３】
特定の実施形態において、（色素とヌクレオチドの間の）リンカーおよびブロッキング基は、両方とも存在し、別個の部分である。特定の実施形態では、リンカーおよびブロッキング基は、実質的に同様の条件下で両方とも切断可能である。したがって、色素化合物とブロッキング基の両方を除去するために単一の処理のみが必要とされるので、脱保護工程およびデブロッキング工程は、より効率的であり得る。しかしながら、いくつかの実施形態では、リンカーおよびブロッキング基は、同様の条件下で切断可能である必要はなく、その代わり個別の条件下で個別に切断可能である。
【０１１４】
本開示は、色素化合物を取り込んでいるポリヌクレオチドも包含する。このようなポリヌクレオチドは、ホスホジエステル結合で結合したデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドからそれぞれなるＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。本明細書に記載の少なくとも１つの修飾ヌクレオチド（例えば、色素化合物で標識された）と組み合わせて、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の標識ヌクレオチド以外の天然ヌクレオチド、非天然（または修飾）ヌクレオチド、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。本開示によるポリヌクレオチドは、非天然骨格結合および／または非ヌクレオチド化学修飾も含み得る。１以上の標識ヌクレオチドを含むリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの混合物からなるキメラ構造体も企図されている。
【０１１５】
本明細書に記載の標識ヌクレオチドの非限定的な例は、以下を含む：
【化９】
2020537630.tif 000010
ここで、Ｌはリンカーを表し、Ｒは上述した糖残基を表す。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、非限定的な例示的な蛍光色素コンジュゲートを以下に示す：
【化１０−１】
2020537630.tif 000011
【化１０−２】
2020537630.tif 000012
【０１１７】
（キット）
本開示はまた、色素で標識された、修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオチドを含むキットを提供する。そのようなキットは、一般に、少なくとも１つの更なる構成要素とともに、本明細書に記載の色素で標識された少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオシドを含む。更なる構成要素は、本明細書に記載の方法または以下の実施例セクションで特定される1つ以上の構成要素であり得る。本開示のキットに組み合わせることができる構成要素のいくつかの非限定的な例を以下に記載する。
【０１１８】
特定の実施形態では、キットは、本明細書に記載の色素で標識された少なくとも１つの修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオシドを、修飾または非修飾のヌクレオチドまたはヌクレオシドとともに含むことができる。例えば、本開示による色素で標識された修飾ヌクレオチドは、非標識ヌクレオチドもしくは天然ヌクレオチド、および／または蛍光標識ヌクレオチドもしくはそれらの任意の組み合わせと組み合わせて供給され得る。したがって、キットは、本開示による色素で標識された修飾ヌクレオチド、および先行技術の色素化合物などの他の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドの組み合わせは、別々の個別の構成要素（例えば、容器またはチューブごとに１つのヌクレオチドタイプ）、またはヌクレオチド混合物（例えば、同じ容器またはチューブ内で混合された２つ以上のヌクレオチド）として提供され得る。
【０１１９】
キットが色素化合物で標識された複数の、特に２つの、または３つの、またはより特には４つの修飾ヌクレオチドを含む場合、異なるヌクレオチドは、異なる色素化合物で標識されていてもよく、または１つはダーク（ｄａｒｋ）であり、色素化合物を有しなくてもよい。異なるヌクレオチドが異なる色素化合物で標識されている場合、前記色素化合物がスペクトル的に区別可能な蛍光色素であることがキットの特徴である。本明細書で使用される場合、用語「スペクトル的に区別可能な蛍光色素」は、１つのサンプル中に２以上の蛍光色素が存在する場合、蛍光検出装置（例えば、市販のキャピラリーベースのＤＮＡシークエンシングプラットフォーム）が区別できる波長で蛍光エネルギーを発する蛍光色素を指す。蛍光色素化合物で標識された２つの修飾ヌクレオチドがキットの形態で供給される場合、スペクトル的に区別可能な蛍光色素を、同じ波長で、例えば同じレーザーなどによって、励起することができることがいくつかの実施形態の特徴である。蛍光色素化合物で標識された４つの修飾ヌクレオチドがキットの形態で供給される場合、スペクトル的に区別可能な蛍光色素のうちの２つを、両方とも、１つの波長で励起することができ、他の２つのスペクトル的に区別可能な色素を、両方とも、別の波長で励起することができることがいくつかの実施形態の特徴である。具体的な励起波長は、４８８ｎｍおよび５３２ｎｍである。
【０１２０】
一実施形態において、キットは、本開示の化合物で標識された修飾ヌクレオチドおよび第２の色素で標識された第２の修飾ヌクレオチドを含み、色素は１０ｎｍ以上、具体的には２０ｎｍ〜５０ｎｍの吸収極大の差を有する。より具体的には、２つの色素化合物は１５〜４０ｎｍの間のストークスシフトを有し、「ストークスシフト」は、ピーク吸収波長とピーク発光波長の間の距離である。
【０１２１】
さらなる実施形態では、キットは、蛍光色素で標識された２つの他の修飾ヌクレオチドをさらに含むことができ、当該色素は５３２ｎｍの同じレーザーによって励起される。色素は、少なくとも１０ｎｍ、特に２０ｎｍ〜５０ｎｍの吸収極大の差を有する。より具体的には、２つの色素化合物は、２０〜４０ｎｍのストークスシフトを有し得る。本開示の色素とスペクトル的に区別可能であり、上記の基準を満たす特定の色素は、米国特許第５，２６８，４８６号（例えば、Ｃｙ３）もしくはＷＯ０２２６８９１（Ａｌｅｘａ５３２；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ａ２０１０６）に記載されているポリメチン類似体、または米国特許第６，９２４，３７２号に開示されている非対称ポリメチンであり、これらの各々は参照により本明細書に援用される。代替的な色素は、ローダミン類似体、例えば、テトラメチルローダミンおよびその類似体を含む。
【０１２２】
代替的実施形態において、本開示のキットは、同じ塩基が２つの異なる化合物で標識されているヌクレオチドを含み得る。第１のヌクレオチドは、本開示のの化合物で標識されていることがあり得る。第２のヌクレオチドは、スペクトル的に異なる化合物、例えば６００ｎｍ未満の波長で吸収する「緑色」色素で標識されていることがあり得る。第３のヌクレオチドは、本開示の化合物とスペクトル的に異なる化合物との混合物として標識されていることがあり得、第４のヌクレオチドは「ダーク」であり、標識を含まないことがあり得る。したがって、簡単に言えば、ヌクレオチド１〜４は、「青色」、「緑色」、「青色／緑色」、およびダークで標識されていることがあり得る。機器類をさらに単純化するために、単一のレーザーで励起される２つの色素で４つのヌクレオチドを標識することができ、したがって、ヌクレオチド１〜４の標識は、「青色１」、「青色２」、「青色１／青色２」、およびダークであり得る。
【０１２３】
ヌクレオチドは、本開示の２つの色素を含み得る。キットは、本開示の色素で標識された２つ以上のヌクレオチドを含み得る。キットは、５２０ｎｍ〜５６０ｎｍの領域で吸収する色素で標識されたヌクレオチドを更に含む。キットは、非標識ヌクレオチドを更に含み得る。
【０１２４】
本明細書では、異なる色素化合物で標識された異なるヌクレオチドを有する構成に関してキットを例示しているが、キットは同じ色素化合物を有する２、３、４または５以上の異なるヌクレオチドを含むことができることが理解されよう。
【０１２５】
特定の実施形態では、キットは、ポリヌクレオチドへの修飾ヌクレオチドの取り込みを触媒することができるポリメラーゼ酵素を含み得る。そのようなキットに含まれる他の成分には、緩衝液などが含まれ得る。本開示の色素で標識された修飾ヌクレオチド、および異なるヌクレオチドの混合物を含む他のヌクレオチド成分は、使用前に希釈される濃縮形態でキット中に提供され得る。このような実施形態では、適切な希釈緩衝液も含まれ得る。ここでも、本明細書に記載の方法で特定された１つ以上の構成要素を、本開示のキットに含めることができる。
【０１２６】
（シークエンシング方法）
本開示の色素化合物を含む修飾ヌクレオチド（またはヌクレオシド）は、単独でも、またはより大きな分子構造もしくはコンジュゲートに組み込まれているか、もしくはこれらと会合していても、ヌクレオチドまたはヌクレオシドに結合した蛍光標識の検出を含む方法などの任意の分析方法に使用され得る。この文脈において、「ポリヌクレオチドに組み込まれる」という用語は、５’リン酸が、それ自体がより長いポリヌクレオチド鎖の一部を形成し得る第２の（修飾または未修飾）ヌクレオチドの３’ヒドロキシル基に、ホスホジエステル結合で結合することを意味することができる。本明細書に記載の修飾ヌクレオチドの３’末端は、さらなる（修飾または非修飾）ヌクレオチドの５’リン酸にホスホジエステル結合で結合してもしなくてもよい。したがって、非限定的な一実施形態では、本開示は、ポリヌクレオチドに取り込まれた修飾ヌクレオチドを検出する方法を提供し、当該方法は、（ａ）本開示の１以上の修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチドに取り込むことと、（ｂ）前記修飾ヌクレオチドに結合した色素化合物からの蛍光シグナルを検出することにより、ポリヌクレオチドに取り込まれた修飾ヌクレオチドを検出すること、を含む。
【０１２７】
この方法は、以下を含むことができる：本開示による１つ以上の修飾ヌクレオチドがポリヌクレオチドに組み込まれる、合成工程（ａ）、および、ポリヌクレオチドに組み込まれた１つ以上の修飾ヌクレオチドが、それらの蛍光を検出または定量的に測定することにより検出される、検出工程（ｂ）。
【０１２８】
本出願のいくつかの実施形態は、（ａ）本明細書に記載の１以上の標識ヌクレオチドをポリヌクレオチドに取り込むことと、（ｂ）前記修飾ヌクレオチドに結合した新規の蛍光色素からの蛍光シグナルを検出することにより、ポリヌクレオチドに取り込まれた標識ヌクレオチドを検出することとを含むシークエンシング方法に関する。
【０１２９】
一実施形態において、１以上の修飾ヌクレオチドは、合成工程においてポリメラーゼ酵素の作用によってポリヌクレオチドに取り込まれる。しかしながら、修飾ヌクレオチドをポリヌクレオチドに加える（ｊｏｉｎｉｎｇ）他の方法、例えば化学的オリゴヌクレオチド合成、または標識オリゴヌクレオチドと非標識オリゴヌクレオチドとのライゲーションなどを使用することができる。したがって、ヌクレオチドおよびポリヌクレオチドに関して使用される場合、「取り込む」という用語は、化学的方法および酵素的方法によるポリヌクレオチド合成を包含することができる。
【０１３０】
特定の実施形態では、合成工程が実施され、場合により、合成工程は、本開示の蛍光標識修飾ヌクレオチドを含む反応混合物とともに鋳型ポリヌクレオチド鎖をインキュベートすることを含み得る。ポリメラーゼはまた、鋳型ポリヌクレオチド鎖にアニールされたポリヌクレオチド鎖上の遊離３’ヒドロキシル基と、修飾ヌクレオチド上の５’リン酸基との間のホスホジエステル結合の形成を可能にする条件下で提供され得る。したがって、合成工程は、鋳型鎖へのヌクレオチドの相補的な塩基対合によって指示されるポリヌクレオチド鎖の形成を含むことができる。
【０１３１】
当該方法の全ての実施形態において、標識ヌクレオチドが取り込まれているポリヌクレオチド鎖を鋳型鎖にアニールさせる間に、または２つの鎖を分離する変性工程の後に、検出工程を実施し得る。さらなる工程、例えば化学的もしくは酵素的反応工程または精製工程が、合成工程と検出工程との間に含まれ得る。特に、標識ヌクレオチドを取り込んでいる標的鎖を、単離または精製し、次いでさらに処理するか、またはその後の分析に使用し得る。例として、合成工程において本明細書に記載の修飾ヌクレオチドで標識された標的ポリヌクレオチドを、その後、標識プローブまたはプライマーとして使用し得る。他の実施形態において、本明細書に記載される合成工程の生成物を、さらなる反応工程に付してもよく、所望により、これらの後続工程の生成物を精製または単離する。
【０１３２】
合成工程の好適な条件は、標準的な分子生物学的技術に精通している者に周知であろう。一実施形態において、合成工程は、好適なポリメラーゼ酵素の存在下で鋳型鎖に相補的な伸長標的鎖を形成する、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドを含むヌクレオチド前駆体を使用する標準的プライマー伸長反応に類似し得る。他の実施形態において、合成工程は、それ自体、標的および鋳型ポリヌクレオチド鎖のコピー由来のアニーリングした相補鎖からなる標識二本鎖増幅産物を産生する増幅反応の一部を形成し得る。他の例示的な合成工程としては、ニックトランスレーション、鎖置換型重合、ランダムプライムドＤＮＡラベリングなどが挙げられる。合成工程に特に有用なポリメラーゼ酵素は、本明細書に記載の修飾ヌクレオチドの取り込みを触媒することができるものである。様々な天然ポリメラーゼまたは修飾ポリメラーゼを使用することができる。例として、熱安定性ポリメラーゼは、熱サイクル条件を使用して実行される合成反応に使用することができるが、熱安定性ポリメラーゼは、等温プライマー伸長反応には望ましくない場合がある。本開示に係る修飾ヌクレオチドを取り込むことができる適切な熱安定性ポリメラーゼには、ＷＯ２００５／０２４０１０またはＷＯ０６１２０４３３に記載されているものが含まれ、これらはそれぞれ参照により本明細書に援用される。３７℃などの低温で行われる合成反応では、ポリメラーゼ酵素は、必ずしも熱安定性ポリメラーゼである必要はなく、したがって、ポリメラーゼの選択は、反応温度、ｐＨ、鎖置換活性などの多数の要因に依存するであろう。
【０１３３】
特定の非限定的な実施形態において、本開示は、核酸シークエンシング、再シークエンシング、全ゲノムシークエンシング、一塩基多型スコアリング、本明細書に記載の色素セットで標識された修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオシドの、ポリヌクレオチドに取り込まれた際の検出を伴う他のアプリケーションを包含する。蛍光色素を含む修飾ヌクレオチドで標識されたポリヌクレオチドの使用の恩恵を受ける様々な他のアプリケーションのいずれも、本明細書に記載の色素を有する修飾ヌクレオチドまたは修飾ヌクレオシドを使用することができる。
【０１３４】
特定の実施形態において、本開示は、ポリヌクレオチド合成によるシークエンシング反応（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）における、本開示による色素化合物を含む修飾ヌクレオチドの使用を提供する。合成によるシークエンシング（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）は、通常、配列決定される鋳型核酸に相補的な伸長ポリヌクレオチド鎖を形成するために、ポリメラーゼまたはリガーゼを使用して、５’から３’の方向に１つ以上のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを伸長しているポリヌクレオチド鎖に順次付加することを伴う。１つ以上の付加されたヌクレオチド中に存在する塩基の同一性は、検出工程または「画像化」工程において決定され得る。付加された塩基の同一性は、各ヌクレオチド取り込み工程の後に決定され得る。次いで、鋳型の配列は、従来のワトソン−クリック塩基対合規則を使用して推測され得る。一塩基の同一性の決定のための本明細書に記載の色素で標識された修飾ヌクレオチドの使用は、例えば一塩基多型のスコアリングにおいて有用であり得、このような一塩基伸長反応は、本出願の範囲内である。
【０１３５】
本開示の一実施形態において、鋳型ポリヌクレオチドの配列は、取り込まれたヌクレオチドに結合した蛍光標識の検出により、配列決定される鋳型ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖への１以上のヌクレオチドの取り込みを検出することによって決定される。鋳型ポリヌクレオチドのシークエンシングは、好適な（または、ヘアピンの一部としてプライマーを含むヘアピン構築物として作製された）プライマーでプライミングされ得、新生鎖は、ポリメラーゼ触媒反応において、プライマーの３’末端へのヌクレオチドの付加により段階的様式で伸長される。
【０１３６】
特定の実施形態では、異なるヌクレオチド三リン酸（Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣ）の各々は、特有のフルオロホアで標識されていてもよく、制御されない重合を防ぐために３’位にブロッキング基も含む。あるいは、４つのヌクレオチドのうちの１つは、非標識（ダーク）であり得る。ポリメラーゼ酵素は、鋳型ポリヌクレオチドに相補的な新生鎖にヌクレオチドを取り込ませ、ブロッキング基は、ヌクレオチドのさらなる取り込みを防ぐ。取り込まれていないヌクレオチドを洗い流し、取り込まれた各ヌクレオチドからの蛍光シグナルを、レーザー励起を用いる電荷結合素子および好適な発光フィルターなどの好適な手段によって、光学的に「読み取る」ことができる。次いで、３’ブロッキング基および蛍光色素化合物を（同時にまたは逐次的に）除去（脱保護）して、さらなるヌクレオチドの取り込みのために新生鎖を露出させることができる。典型的には、取り込まれたヌクレオチドの同一性は、各取り込み工程の後に決定されるであろうが、これは、絶対に必須というわけではない。同様に、（参照により本明細書に援用される）米国特許第５，３０２，５０９号は、固体支持体上に固定化されたポリヌクレオチドをシークエンシングする方法を開示している。
【０１３７】
当該方法は、上に例示したように、ＤＮＡポリメラーゼの存在下での、固定化ポリヌクレオチドに相補的な伸長鎖への蛍光標識された３’−ブロック化ヌクレオチドＡ、Ｇ、Ｃ、およびＴの取り込みを利用している。ポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに相補的な塩基を取り込むが、３’−ブロッキング基により、さらなる付加は防止される。次いで、取り込まれたヌクレオチドの標識を決定し、化学的切断によってブロッキング基を除去して、さらなる重合を起こさせることができる。合成によるシークエンシング反応で配列決定される核酸鋳型は、配列決定することが望まれる任意のポリヌクレオチドであり得る。シークエンシング反応用の核酸鋳型は、典型的には、シークエンシング反応においてさらなるヌクレオチドを付加するためのプライマーまたは開始点として機能する遊離３’ヒドロキシル基を有する二本鎖領域を含むであろう。配列決定される鋳型の領域は、相補鎖上のこの遊離３’ヒドロキシル基をオーバーハングするであろう。配列決定される鋳型のオーバーハング領域は、一本鎖であり得るが、シークエンシング反応の開始のために遊離３’ＯＨ基を与えるように、配列決定される鋳型鎖に相補的な鎖上に「ニックが存在する」という条件の下に、二本鎖であることができる。このような実施形態では、シークエンシングは、鎖置換により進行し得る。特定の実施形態において、遊離３’ヒドロキシル基を有するプライマーを、配列決定される鋳型の一本鎖領域にハイブリダイズする別個の成分（例えば、短いオリゴヌクレオチド）として添加し得る。あるいは、配列決定されるプライマーおよび鋳型鎖はそれぞれ、例えばヘアピンループ構造などの分子内二重鎖を形成することができる部分的に自己相補的な核酸鎖の一部を形成し得る。ヘアピンポリヌクレオチドおよびそれらを固体支持体に結合させ得る方法は、ＰＣＴ国際公開ＷＯ０１５７２４８およびＷＯ２００５／０４７３０１に開示されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に援用される。ヌクレオチドが伸長中のプライマーに連続的に付加され得、結果として、５’から３’方向のポリヌクレオチド鎖の合成が起こる。付加された塩基の性質を、必須ではないが特に各ヌクレオチド付加の後に、決定し、それにより、核酸鋳型についての配列情報を与え得る。したがって、ヌクレオチドの５’リン酸基とのホスホジエステル結合の形成を介して、ヌクレオチドを核酸鎖の遊離３’ヒドロキシル基に結合させることによって、ヌクレオチドは核酸鎖（またはポリヌクレオチド）に取り込まれる。
【０１３８】
配列決定される核酸鋳型は、ＤＮＡもしくはＲＮＡ、またはさらにはデオキシヌクレオチドおよびリボヌクレオチドからなるハイブリッド分子であり得る。核酸鋳型は、シークエンシング反応における鋳型のコピーを妨げないという条件の下に、天然および／または非天然のヌクレオチドならびに天然または非天然の骨格結合を含み得る。
【０１３９】
特定の実施形態において、配列決定される核酸鋳型を、当分野において公知の好適な連結方法によって、例えば共有結合によって、固体支持体に結合し得る。特定の実施形態において、鋳型ポリヌクレオチドを、固体支持体（例えば、シリカ系支持体）に直接結合し得る。しかしながら、本開示の他の実施形態において、固体支持体の表面を、鋳型ポリヌクレオチドの直接的な共有結合を可能にするように、またはそれ自体が非共有結合的に固体支持体に結合し得るヒドロゲルもしくは高分子電解質多層により鋳型ポリヌクレオチドを固定化するように、修飾し得る。
【０１４０】
ポリヌクレオチドがシリカ系支持体に直接結合しているアレイには、例えば、（参照により本明細書に援用される）ＷＯ００００６７７０に開示されているものがあり、このアレイでは、ポリヌクレオチドは、ガラス上のペンダントエポキシド基とポリヌクレオチド上の内部アミノ基との反応によって、ガラス支持体上に固定化されている。さらに、ポリヌクレオチドは、例えば（参照により本明細書に援用される）Ｗ０２００５／０４７３０１に記載のように、硫黄系求核剤と固体支持体との反応により固体支持体に結合させることができる。固体支持鋳型ポリヌクレオチドのさらに他の例には、例えば、Ｗ０００／３１１４８、Ｗ００１／０１１４３、Ｗ００２／１２５６６、Ｗ００３／０１４３９２、米国特許第６，４６５，１７８号、およびＷ０００／５３８１２に記載されるように、鋳型ポリヌクレオチドが、シリカ系または他の固体支持体上に支持されたヒドロゲルに結合している場合があり、これらのそれぞれは参照により本明細書に援用される。
【０１４１】
鋳型ポリヌクレオチドが固定化され得る具体的な表面は、ポリアクリルアミドヒドロゲルである。ポリアクリルアミドヒドロゲルは、上記で引用した参考文献および参照により本明細書に援用されるＷＯ２００５／０６５８１４に記載されている。使用され得る具体的なヒドロゲルには、ＷＯ２００５／０６５８１４および米国公開第２０１４／００７９９２３号に記載されているものが含まれる。一実施形態において、ヒドロゲルは、ＰＡＺＡＭ（ポリ（Ｎ−（５−アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド−コ−アクリルアミド））である。
【０１４２】
ＤＮＡ鋳型分子は、例えば、（参照により本明細書に援用される）米国特許第６，１７２，２１８号に記載されているように、ビーズまたは微粒子に付着させることができる。ビーズまたは微粒子への付着は、シークエンシングアプリケーションに有用であり得る。各ビーズが異なるＤＮＡ配列を含有するビーズライブラリを調製することができる。例示的なライブラリおよびその作製方法は、Ｎａｔｕｒｅ，４３７，３７６−３８０頁（２００５年）；Ｓｃｉｅｎｃｅ，３０９，５７４１，１７２８−１７３２頁（２００５年）に記載されており、それぞれ参照により本明細書に援用される。本明細書に記載のヌクレオチドを使用した、このようなビーズのアレイのシークエンシングは、本開示の範囲内である。
【０１４３】
配列決定される鋳型は、固体支持体上の「アレイ」の一部を形成し得、この場合、アレイは任意の利便性のある形態をとり得る。したがって、本開示の方法は、単一分子アレイ、クラスターアレイ、およびビーズアレイを含む、あらゆる種類の高密度アレイに適用可能である。本開示の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、固体支持体上における核酸分子の固定化によって形成されたものを含むがこれらに限定されない、実質的にあらゆる種類のアレイ上の鋳型のシークエンシングに使用され得る。
【０１４４】
しかしながら、本開示の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、クラスターアレイのシークエンシングの文脈において特に有利である。クラスターアレイにおいて、アレイ上の別個の領域（しばしばサイトまたはフィーチャーと呼ばれる）は、複数のポリヌクレオチド鋳型分子を含む。一般に、複数のポリヌクレオチド分子は、光学的手段によって個別に分離可能（ｒｅｓｏｌｖａｂｌｅ）ではなく、その代わりにアンサンブルとして検出される。アレイの形成方法に応じて、アレイ上の各サイトは、１つの個別のポリヌクレオチド分子の複数コピー（例えば、このサイトは、特定の一本鎖または二本鎖の核酸種に対して均一である）、または少数の異なるポリヌクレオチド分子の複数コピー（例えば、２つの異なる核酸種の複数コピー）さえも含み得る。核酸分子のクラスターアレイは、当分野において公知の技術を使用して作製され得る。例として、それぞれ参照により本明細書に援用されるＷＯ９８／４４１５１およびＷＯ００／１８９５７は、固定化された核酸分子のクラスターまたは「コロニー」からなるアレイを形成するために、鋳型および増幅産物の両方が固体支持体上に固定化されたままとなる、核酸の増幅方法を記載している。これらの方法に従って作製されたクラスターアレイ上に存在する核酸分子は、本開示の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドを使用したシークエンシングの好適な鋳型である。
【０１４５】
本開示の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、単一分子アレイ上の鋳型のシークエンシングにおいても有用である。本明細書で使用される用語「単一分子アレイ」または「ＳＭＡ」は、固体支持体上に配置（または配列）されたポリヌクレオチド分子の集団を指し、任意の１つのポリヌクレオチドと集団の他の全てとの間隔は、個々のポリヌクレオチド分子を個別に解像する（ｒｅｓｏｌｖｅ）ことが可能であるようになっている。したがって、いくつかの実施形態では、固体支持体の表面上に固定化された標的核酸分子は、光学的手段によって解像可能であり得る。これは、それぞれが1つのポリヌクレオチドを表す1つ以上の別個のシグナルが、使用される特定のイメージングデバイスの解像可能（ｒｅｓｏｌｖａｂｌｅ）な領域内で発生することを意味する。
【０１４６】
単一分子検出は、アレイ上の隣接するポリヌクレオチド分子間の間隔が、１００ｎｍ以上、より具体的には２５０ｎｍ以上、さらにより具体的には３００ｎｍ以上、なおいっそう具体的には３５０ｎｍ以上である場合に達成され得る。したがって、各分子は個々に解像可能であり、単一分子の蛍光点として検出可能であり、前記単一分子の蛍光点からの蛍光も単一段階のフォトブリーチングを示す。
【０１４７】
用語「個々に解像」および「個々の解像」は、視覚化したときに、アレイ上の１つの分子をその隣接分子と区別することが可能であることを明示するために本明細書において使用される。アレイ上の個々の分子間の間隔は、ある程度、個々の分子を解像するために使用される具体的な技術によって決められるであろう。単一分子アレイの一般的特徴は、それぞれ参照により本明細書に援用されるＰＣＴ国際公開ＷＯ００／０６７７０およびＷＯ０１／５７２４８を参照することによって理解されよう。本開示の修飾ヌクレオチドの一つの使用は、合成によるシークエンシング反応（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ）におけるものであるが、当該標識ヌクレオチドの有用性は、そのような方法に限定されない。実際、当該ヌクレオチドは、ポリヌクレオチドに取り込まれたヌクレオチドに結合した蛍光標識の検出を必要とするあらゆるシークエンシング方法において、有利に使用され得る。
【０１４８】
特に、本開示の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、自動化蛍光シークエンシングプロトコル、特にサンガーと共同研究者の鎖停止配列決定法に基づく蛍光色素−ターミネーターサイクルシークエンシングに使用され得る。そのような方法は、通常、プライマー伸長シークエンシング反応において蛍光標識ジデオキシヌクレオチドを取り込むために、酵素およびサイクルシークエンシングを使用する。いわゆるサンガーシークエンシング方法、および関連プロトコル（サンガー型）は、標識ジデオキシヌクレオチドを用いるランダム化鎖停止を利用する。
【０１４９】
したがって、本開示は、３’位および２’位の両方にヒドロキシル基を欠くジデオキシヌクレオチドである色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドも包含し、そのような修飾ジデオキシヌクレオチドは、サンガー型シークエンシング方法などにおける使用に好適である。
【０１５０】
修飾ジデオキシヌクレオチドを使用することにより達成される同じ効果は、３’−ＯＨブロッキング基を有する修飾ヌクレオチドを使用することによっても達成され得る（両方とも後続のヌクレオチドの取り込みを防ぐ）ので、３’ブロッキング基を組み込んだ本開示の色素化合物で標識された修飾ヌクレオチドは、サンガー法および関連するプロトコルでも有用であり得ることが認識されよう。３’ブロッキング基を有する本開示によるヌクレオチドがサンガー型シークエンシング方法で使用される場合、本開示の標識ヌクレオチドが組み込まれる各場合において、ヌクレオチドを続いて組み込む必要はなく、したがってヌクレオチドから標識を除去する必要はないので、当該ヌクレオチドに結合した色素化合物または検出可能な標識は、切断可能なリンカーを介して接続される必要がないことが理解されよう。
【実施例】
【０１５１】
追加の実施形態を、特許請求の範囲を限定することを決して意図するものではない以下の実施例において、さらに詳細に開示する。
【０１５２】
追加の実施形態を、特許請求の範囲を限定することを決して意図するものではない以下の実施例において、さらに詳細に開示する。表２は、実施例で開示されている新規のクマリン蛍光色素のスペクトル特性をまとめたものである。表３は、本明細書に開示される新規の色素で標識された様々なヌクレオチドの構造およびスペクトル特性をまとめたものである。
【０１５３】
（実施例１−１−１）
７−（５−カルボキシペンチル）アミノ−３−（ベンゾチアゾール−２−イル）クマリン
【化１１】
2020537630.tif 000013
【０１５４】
３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−フルオロ−クマリン誘導体（ＦＣ−１、０．４ｇ、１．３４５ｍｍｏｌ、１当量）および６−アミノヘキサン酸（ＡＣ−Ｃ５、０．２５ｇ、１．９０６ｍｍｏｌ、１．４１７当量）を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、３ｍＬ）に添加した。添加が完了した後、混合物を室温で数分間撹拌し、次いで、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミン（ＤＩＰＥＡ、０．２５ｇ、２ｍｍｏｌ、２当量）をこの混合物に添加した。反応混合物を１２０℃で３時間撹拌した。室温で１時間静置した後、黄色の半固体反応混合物を水（５ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引ろ過により収集した。収量０．３６ｇ（６５．５％）。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４０８．４７。検出されたｍ／ｚ：（＋）４０９（Ｍ＋１）＋；（−），４０７（Ｍ−１）−。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１２．０３（ｍ，２Ｈ）、９．００（ｓ，１Ｈ）、８．１２（ｄ，Ｊ＝７．９Ｈｚ，１Ｈ）、７．９９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、６．７３（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．１Ｈｚ，１Ｈ）、６．５４（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）、３．１８（ｑ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，２Ｈ）、２．２３（ｔ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）、１．５７（ｄｐ，Ｊ＝１４．７，７．２Ｈｚ，４Ｈ）、１．３９（ｄｑ，Ｊ＝９．２，４．５，３．５Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１５５】
（実施例１−１−２）
７−（５−カルボキシペンチル）アミノ−３−（ベンズイミダゾール−２−イル）クマリン
【化１２】
2020537630.tif 000014
【０１５６】
３−（ベンズイミダゾール−２−イル）−７−フルオロ−クマリン（ＦＣ−２、０．２８ｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）および６−アミノヘキサン酸（ＡＣ−Ｃ５、０．１３ｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２ｍＬ）に添加した。得られた混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．２５ｇ、２ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。反応混合物を温度１３０℃で４時間撹拌した。６−アミノヘキサン酸（ＡＣ−１、０．１３ｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）およびＤＩＰＥＡ（０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ、２当量）の追加部分を反応混合物に加え、１３０℃で５時間加熱を続けた。室温で１時間静置した後、淡黄色の反応混合物を水（５ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引ろ過により収集した。収量０．２６ｇ（６８．５％）。生成物の純度、構造、および組成は、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、およびＬＣＭＳによって確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３９１．１５。検出されたｍ／ｚ：（＋）３９２（Ｍ＋１）＋；（−）３９０（Ｍ−１）−，７８１（２Ｍ−１）−。
【０１５７】
（実施例１−１−３）
７−（２−カルボキシエチル）アミノ−３−（ベンゾチアゾール−２−イル）クマリン
【０１５８】
＜工程Ａ＞
７−［２−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）エチル］アミノ−３−（ベンゾチアゾール−２−イル）クマリン
【化１３】
2020537630.tif 000015
【０１５９】
３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−フルオロ−クマリン（ＦＣ−１、０．３ｇ、１．０１ｍｍｏｌ、１当量）およびｔ−ブチル３−アミノプロピオン酸塩酸塩（ＡＣ−Ｃ２、０．２ｇ、１．１ｍｍｏｌ、１．０９当量）を無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、２ｍＬ）に添加して、得られた混合物を室温で数分間撹拌した後、ＤＩＰＥＡ（０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。得られた反応混合物を温度１００℃で２時間撹拌した。室温で１時間静置した後、黄色の反応混合物を水（７ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引ろ過により収集した。収量０．３８ｇ（６９％）。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４２２．１３。検出されたｍ／ｚ：（＋）４２３（Ｍ＋１）＋；（−），４２１（Ｍ−１）−。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：９．２８（ｓ，１Ｈ）、９．０１（ｓ，１Ｈ）、８．２７−８．１６（ｍ，１Ｈ）、８．１０（ｔｔ，Ｊ＝８．３，０．９Ｈｚ，２Ｈ）、８．０５−７．９２（ｍ，１Ｈ）、７．７２（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．６６−７．５５（ｍ，１Ｈ）、７．５１（ｄｄｄｄ，Ｊ＝１１．４，８．２，７．１，１．３Ｈｚ，２Ｈ）、７．４６−７．３２（ｍ，２Ｈ）、６．７４（ｄｄ，Ｊ＝８．７，２．１Ｈｚ，１Ｈ）、６．５８（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ）、３．４１（ｑ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，２Ｈ）、２．５５（ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，２Ｈ）、１．４１（ｓ，９Ｈ）。
【０１６０】
＜工程Ｂ＞
【化１４】
2020537630.tif 000016
【０１６１】
７−［２−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）エチル］アミノ−３−（ベンゾチアゾール−２−イル）クマリン（Ｉ−１−３ｔＢｕ、０．２ｇ、０．４７３ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液をトリフルオロ酢酸（０．５ｍＬ）で処理し、得られた混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣を水（１０ｍＬ）で粉砕した。得られた沈殿物を吸引ろ過により収集した。収量０．１５ｇ（８６％）。純度、構造、および組成は、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、およびＬＣＭＳによって確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３６６．３９。検出されたｍ／ｚ：（＋）３６７（Ｍ＋１）＋；（−），３６５（Ｍ−１）−。
【０１６２】
（実施例１−１−４）
７−（３−カルボキシプロピル）アミノ−３−（ベンゾチアゾール−２−イル）クマリン
【０１６３】
＜工程Ａ＞
７−［３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）プロピル］アミノ−３−（ベンゾチアゾール−２−イル）クマリン
【化１５】
2020537630.tif 000017
【０１６４】
３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−フルオロ−クマリン（ＦＣ−１、０．６ｇ、２．０２ｍｍｏｌ、１当量）およびｔ−ブチル４−アミノブタノ酸塩酸塩（ＡＣ−Ｃ３、０．５ｇ、２．５６ｍｍｏｌ、１．２７当量）を、無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５ｍＬ）に添加した。添加が完了した後、混合物を室温で数分間撹拌してから、ＤＩＰＥＡ（０．６５ｇ、５ｍｍｏｌ、４当量）を添加した。反応混合物を１００℃の温度で３時間撹拌した。室温で１時間静置した後、黄色の半固体反応混合物を水（１０ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引ろ過により収集した。収量０．７ｇ（７９％）。純度、構造、および組成は、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、およびＬＣＭＳによって確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４３６．５３。検出されたｍ／ｚ：（＋）４３７（Ｍ＋１）＋；（−），４３５（Ｍ−１）−。
【０１６５】
＜工程Ｂ＞
【化１６】
2020537630.tif 000018
【０１６６】
７−［３−（ｔ−ブチルオキシカルボニル）プロピル］アミノ−３−（ベンゾチアゾール−２−イル）クマリン（Ｉ−１−４ｔＢｕ、０．７ｇ、１．６０４ｍｍｏｌ）の無水ジクロロメタン（２５ｍＬ）溶液をトリフルオロ酢酸（１ｍＬ）で処理し、反応混合物を室温で２４時間撹拌した。溶媒を留去し、残渣を水（１０ｍＬ）で粉砕した。得られた沈殿物を吸引ろ過により収集した。収量０．５９ｇ（９７％）。純度、構造、および組成は、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、およびＬＣＭＳによって確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値３６６．３９。検出されたｍ／ｚ：３８１（Ｍ＋１）＋；（−），３７９（Ｍ−１）−。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１２．１７（ｓ，１Ｈ）、９．０１（ｓ，１Ｈ）、８．１２（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．９９（ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ，１Ｈ）、７．７１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ）、７．４８−７．３０（ｍ，２Ｈ）、６．７３（ｄｄ，Ｊ＝８．８，２．１Ｈｚ，１Ｈ）、６．５７（ｄ，Ｊ＝２．１Ｈｚ，１Ｈ）、３．２１（ｑ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，２Ｈ）、２．３６（ｄ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）、１．８０（ｐ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，２Ｈ）。
【０１６７】
（実施例１−１−５）
７−（５−カルボキシペンチル）アミノ−３−（５−クロロ−ベンゾオキサゾール−２−イル）クマリン
【化１７】
2020537630.tif 000019
【０１６８】
３−（５−クロロ−ベンゾオキサゾール−２−イル）−７−フルオロ−クマリン（ＦＣ−３、０．３２ｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）および６−アミノヘキサン酸（ＡＣ−Ｃ５、０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ、２当量）を、丸底フラスコ内の無水ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、５ｍＬ）に添加した。添加が完了した後、混合物を室温で数分間撹拌し、次いでＤＩＰＥＡ（０．５２ｇ、４ｍｍｏｌ、２当量）を添加した。反応混合物を温度１３５℃で７時間撹拌した。６−アミノヘキサン酸（ＡＣ−１、０．１３ｇ、１ｍｍｏｌ、１当量）およびＤＩＰＥＡ（０．２６ｇ、２ｍｍｏｌ、２当量）の追加部分を添加し、１３５℃で５時間加熱を続けた。室温で１時間静置した後、淡黄色の反応混合物を水（１５ｍＬ）で希釈し、一晩撹拌した。得られた沈殿物を吸引ろ過により収集した。収量０．０９ｇ（２１％）。生成物の純度、構造、および組成は、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、およびＬＣＭＳによって確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４２６．１０。検出されたｍ／ｚ：（＋）４２７（Ｍ＋１）＋；（−）４２５（Ｍ−１）−，８５１（２Ｍ−１）−。
【０１６９】
（実施例２）
７−（５−カルボキシペンチル）アミノ−３−（ベンゾチアゾール−２−イル）クマリン−６−スルホン酸（２Ａ）および７−（５−カルボキシペンチル）アミノ−３−（ベンゾチアゾール−２−イル）クマリン−８−スルホン酸（２Ｂ）
【化１８】
2020537630.tif 000020
【０１７０】
化合物Ｉ−１−１（０．１ｇ、０．２４５ｍｍｏｌ）を、ドライアイス／アセトン浴で冷却した２０％発煙硫酸（１ｍＬ）に撹拌しながら少量ずつ加えた。添加が完了した後、混合物を０℃で１時間撹拌し、室温に温め、次いで室温で２時間撹拌した。溶液を無水エーテル（２５ｍＬ）に注いだ。室温で１時間静置した後、得られた沈殿物を吸引ろ過により収集した。収量７８ｍｇ（６５％）。１Ｈ  ＮＭＲ（ｄ６−ＤＭＳＯ）は、少量（約４％）の化合物２Ｂとともに、化合物２Ａを示した。
【０１７１】
＜実施例２Ａ＞
ナトリウム塩
【化１９】
2020537630.tif 000021
【０１７２】
上記の沈殿物を水（２ｍＬ）に再懸濁し、５Ｍ  ＮａＯＨ溶液を添加して懸濁液のｐＨを約５に調整した。得られた混合物を１０ｍＬのメタノールに注ぎ、懸濁液をろ過した。ろ液を蒸発乾固させて、色素をナトリウム塩（Ｉ−２Ａ−Ｎａ）として得た。純度、構造、および組成は、ＨＰＬＣ、ＮＭＲ、およびＬＣＭＳによって確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値４８８．０７。検出されたｍ／ｚ：（＋）４８９（Ｍ＋１）＋；（−）２４３（Ｍ−１）２−，４８７（Ｍ−１）−。
【０１７３】
＜２Ａおよび２Ｂのトリエチルアンモニウム塩の調製＞
【０１７４】
化合物Ｉ−１−１（０．４１ｇ、１ｍｍｏｌ）を、ドライアイス／アセトン浴で冷却した２０％発煙硫酸（５ｍＬ）に撹拌しながら少量ずつ添加した。添加が完了した後、混合物を０℃で１時間撹拌し、室温に温め、次いで室温で２時間撹拌した。この溶液を無水エーテル（５０ｍＬ）に注いだ。室温で１時間静置した後、有機溶媒層をデカントし、半固体の底層をアセトニトリル−水（１：１、１０ｍＬ）に溶解した。２Ｍ  ＴＥＡＢ水溶液を添加して、溶液のｐＨを約７．０に調整した。得られた溶液を２０μｍナイロンフィルターでろ過し、異性体を分取ＨＰＬＣで分離した。異性体の溶液を真空で濃縮し、次いで水（２０μＬ）に再溶解し、溶媒を真空で除去して乾燥させ、色素をトリエチルアンモニウム塩として得た。純度および組成は、ＨＰＬＣおよびＬＣＭＳによって確認した。
【０１７５】
（実施例３）
７−（５−カルボキシペンチル）アミノ−３−［５−スルホナート（ベンゾチアゾール−２−イル）−クマリン−６−スルホン酸トリエチルアンモニウム塩
【化２０】
2020537630.tif 000022
【０１７６】
化合物Ｉ−１−１（０．０８ｇ、０．２ｍｍｏｌ）を、ドライアイス／アセトン浴で冷却した２０％発煙硫酸（２ｍＬ）に撹拌しながら少量ずつ添加した。添加が完了した後、混合物を０℃で１時間撹拌し、室温に温め、その後７０℃で２時間撹拌した。次に、混合物を室温で一晩撹拌した。この溶液を無水エーテル（３０ｍＬ）に注いだ。室温で１時間撹拌した後、得られた沈殿物を吸引ろ過により収集した。収量４３ｍｇ（３８％）。
【０１７７】
沈殿物を水（２ｍＬ）に再懸濁し、２Ｍ  ＴＥＡＢ水溶液を添加して懸濁液のｐＨを約７．５に調整した。得られた混合物を２０μｍナイロンフィルターでろ過し、分取ＨＰＬＣで精製した。色素画分を真空で濃縮し、次いで水（２０μＬ）に再溶解し、溶媒を真空で除去して乾燥させ、色素をビス−トリエチルアンモニウム塩として得た。純度および組成は、ＨＰＬＣおよびＬＣＭＳによって確認した。ＭＳ（ＤＵＩＳ）：ＭＷ計算値５６８．０３。検出されたｍ／ｚ：（＋）５６９（Ｍ＋１）＋。
【０１７８】
例示的な色素溶液の蛍光強度を、同じスペクトル領域の市販の色素と比較した。結果が表２に示され、蛍光ベースの分析アプリケーションについての例示的な色素の顕著なアドバンテージを実証している。
【０１７９】
【表１】
2020537630.tif 000023
【０１８０】
（実施例４）
新規蛍光色素を有する、充分に機能的なヌクレオチドコンジュゲートの合成の一般的な手順
以下のアデニンの例示的なスキームに従って、適切な試薬で色素（Ｄｙｅ）のカルボキシル基を活性化した後：
【化２１】
2020537630.tif 000024
本明細書に開示されるクマリン蛍光色素を、適切なアミノ置換アデニン（Ａ）およびシトシン（Ｃ）ヌクレオチド誘導体Ａ−ＬＮ３−ＮＨ２またはＣ−ＬＮ３−ＮＨ２に結合（ｃｏｕｐｌｅｄ）させた：
【化２２】
2020537630.tif 000025
アデニン結合（ａｄｅｎｉｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）の一般的な生成物が以下に示される：
【化２３】
2020537630.tif 000026
ｆｆＡ−ＬＮ３−Ｄｙｅは、ＬＮ３リンカーを有し、本明細書に開示されているクマリン色素で標識された充分に機能化されたＡヌクレオチドを指す。各構造中のＲ基は、コンジュゲーション後のクマリン色素部分を指す。
【０１８１】
色素（１０μｍｏｌ）を５ｍＬ丸底フラスコに入れて乾燥させ、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、１ｍＬ）に溶解させた後、溶媒を真空で留去する。この手順を２回繰り返す。乾燥した色素を室温で無水Ｎ、Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ、０．２ｍＬ）に溶解させる。Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラメチル−Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ、１．５当量、１５μｍｏｌ、４．５ｍｇ）を色素溶液に添加し、ＤＩＰＥＡ（３当量、３０μｍｏｌ、３．８ｍｇ、５．２μＬ）をマイクロピペットでこの溶液に加える。反応フラスコを窒素ガス下で密閉する。反応の進行は、ＴＬＣ（溶出液、アセトニトリル−水１：９）およびＨＰＬＣによって監視される。その間、適切なアミノ置換ヌクレオチド誘導体（Ａ−ＬＮ３−ＮＨ２、２０ｍＭ、１．５当量、１５μｍｏｌ、０．７５ｍＬ）の溶液を真空中で濃縮し、水（２０μＬ）に再溶解する。ＤＭＡ中の活性化色素の溶液を、Ｎ−ＬＮ３−ＮＨ２の溶液が入っているフラスコに移す。トリエチルアミン（１μＬ）とともに、ＤＩＰＥＡ（３当量、３０μｍｏｌ、３．８ｍｇ、５．２μＬ）をさらに加える。結合（ｃｏｕｐｌｉｎｇ）の進行は、ＴＬＣ、ＨＰＬＣ、およびＬＣＭＳによって１時間ごとに監視される。反応が完了したら、重炭酸トリエチルアミン緩衝液（ＴＥＡＢ、０．０５Ｍ、約３ｍＬ）をピペットで反応混合物に加える。完全に機能化されたヌクレオチドの初期精製は、クエンチした反応混合物をＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ（登録商標）カラムに通して、残っている未反応色素の大部分を除去することにより行われる。例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘは、空の２５ｇ  Ｂｉｏｔａｇｅカートリッジ、溶媒システムＴＥＡＢ／ＭｅＣＮに注がれる。Ｓｅｐｈａｄｅｘカラムからの溶液は真空中で濃縮される。残留物は、２０μｍナイロンフィルターでろ過する前に、最小量の水およびアセトニトリルに再溶解される。ろ過した溶液は分取ＨＰＬＣで精製される。調製した化合物の組成は、ＬＣＭＳで確認した。
【０１８２】
【表２】
2020537630.tif 000027
【０１８３】
本明細書に開示される色素で標識されたヌクレオチドの溶液中における蛍光強度と、同じスペクトル領域の市販の色素（ＡｔｔｏＴｅｃ社製Ａｔｔｏ４６５）で標識されたヌクレオチドの適切なデータとの比較は、蛍光ベースの分析アプリケーションで使用する生体分子の標識についての、本明細書に記載の色素のアドバンテージを実証する。
【０１８４】
（実施例５）
シークエンシング解析
本明細書に開示される色素に基づくｆｆＡは、合成によるシークエンシングケミストリー（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用いたＩｌｌｕｍｉｎａシークエンサーでのシークエンシングにおいて使用され、図１Ａ、図１Ｂ、および図１Ｃのイメージはそれらの有用性を実証している。スキャン温度２２℃、暴露時間：青５００ｍｓ、緑５００ｍｓ；ＳＦＡフローセル。以下の図の括弧内の数字は、新規の青色ｆｆＡと緑色Ａ（ｇｒｅｅｎＡ）との比率を示している。Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＴヌクレオチドは、以下のように標識された：Ａ：Ｅｘ  ２Ａ（図１Ａ）、Ｅｘ  Ｉ−１−３（図１Ｂ）、およびＥｘ  Ｉ−１−１（図１Ｃ）；Ｃ：ＮＲ４４０；Ｇ：ダーク（Ｄａｒｋ）；およびＴ：ＡＦ５５０ＰＯＰＯＳ０。
【化２４】
2020537630.tif 000028
【図１】
2020537630.tif 000032
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月14日(2020.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物またはその塩：
【化１】
2020537630.tif 000033
式中、Ｘが、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、またはＮＲｎであり、ここで、Ｒｎが、ＨまたはＣ１−６アルキルであり；
ＲおよびＲ１が、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり；
Ｒ２およびＲ４が、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであるか；あるいはＲ２およびＲ４の一方が、Ｒ３に結合して、任意に置換された複素環を形成し；
Ｒ３が、Ｈ、Ｃ１−６アルキル、置換されたＣ２−６アルキル、任意に置換されたＣ２−６アルケニル、任意に置換されたＣ２−６アルキニル、または任意に置換されたカルボシクリル、ヘテロシクリル、アリール、もしくはヘテロアリールであるか、あるいはＲ３が、Ｒ２またはＲ４に結合して、任意に置換された環を形成し；ここで、Ｒ１が−ＣＮの場合、Ｒ３はＣ１−６アルキルではなく；
各Ｒ５が、独立して、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり；および
ｍが、０、１、２、３、または４である。
【請求項２】
Ｒが、Ｈ、ハロ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ２およびＲ４が、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールであり；Ｒ２およびＲ４のどちらも、Ｒ３に結合して任意に置換された複素環を形成しない、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
Ｒ２が−ＳＯ３Ｈであり、かつ／またはＲ４が−ＳＯ３Ｈである、請求項２に記載の化合物。
【請求項５】
（ａ）ＸがＯまたはＳであるか、あるいは
（ｂ）ＸがＮＲｎであり、ここで、ＲｎがＨまたはＣ１−６アルキルである、請求項１〜４の何れかに記載の化合物であって、
任意に、
（ａ）Ｒ３がＨであるか；または（ｂ）Ｒ３がメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、またはヘキシルであるか；または（ｃ）Ｒ３がエチルであるか、あるいは
Ｒ３が、置換されたＣ２−６アルキルであって、
更に任意に、
（ａ）Ｒ３が、−ＣＯ２Ｈで置換されたＣ２−６アルキルであるか、または
（ｂ）Ｒ３が−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨであり、ここで、ｎが２、３、４、５または６であるか、または
（ｃ）Ｒ３が−（ＣＨ２）ｎＳＯ３Ｈであり、ここで、ｎが２、３、４、５または６である、化合物。
【請求項６】
ｍが０、１、または２である；および
各Ｒ５が、独立して、任意に置換されたＣ１−６アルキル、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、−ＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、または−ＳＯ２ＮＨ２である；
のうち少なくとも一方を満たす請求項１〜５の何れかに記載の化合物であって、
任意に、各Ｒ５が、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、または任意に置換されたＣ１−６アルキルであって、
任意に、Ｒ５が、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ２ＮＨ２で置換された、Ｃ２−６アルキルであって、
任意に、Ｒ５が−（ＣＨ２）ｘＣＯＯＨであり、ここで、ｘが２、３、４、５または６である、化合物。
【請求項７】
Ｒ５が、−ＳＯ３Ｈまたは−ＳＯ２ＮＨ２である、請求項４に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ１が、Ｈ、ハロ、またはＣ１−６アルキルである請求項１〜６の何れかに記載の化合物であって、任意に、Ｒ１がＨまたはＣｌである、化合物。
【請求項９】
Ｒが、Ｈ、ハロ、またはＣ１−６アルキルである請求項１〜８の何れかに記載の化合物であって、任意に、Ｒ１がＨまたはＣｌである、化合物。
【請求項１０】
Ｒが、Ｈ、ハロ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、−ＮＯ２、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたアミノアルキル、任意に置換されたカルボシクリル、任意に置換されたヘテロシクリル、任意に置換されたアリール、または任意に置換されたヘテロアリールである請求項１〜９の何れかに記載の化合物であって、
任意に、ＲがＨである、化合物。
【請求項１１】
ａ）Ｒ２が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、−ＣＯ２Ｈもしくは−ＳＯ３Ｈで任意に置換されたＣ１−４アルキル、または−ＳＯ３Ｈであって、任意に、Ｒ２がＨまたは−ＳＯ３Ｈであるか、あるいは
ｂ）Ｒ２がＲ３に結合して、任意に置換された複素環、好ましくは１つ以上のアルキル基で任意に置換されたピロリジンまたはピペリジンを形成する、請求項１〜１０の何れかに記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ４が、Ｈ、任意に置換されたアルキル、−ＣＯ２Ｈもしくは−ＳＯ３Ｈで任意に置換されたＣ１−４アルキル、または−ＳＯ３Ｈであるか、あるいは
Ｒ４がＲ３に結合して、任意に置換された複素環、好ましくは１つ以上のアルキル基で任意に置換されたピロリジンまたはピペリジンを形成する、請求項１〜１１の何れかに記載の化合物。
【請求項１３】
Ｘが、ＯまたはＳであり；ＲがＨであり；Ｒ１がＨであり；Ｒ３が−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨであり、ここで、ｎが２、３、４、５、または６であり；Ｒ５がＨ、−ＳＯ３Ｈ、または−ＳＯ２ＮＨ２であり；Ｒ２が、Ｈまたは−ＳＯ３Ｈであり；Ｒ４が、Ｈまたは−ＳＯ３Ｈである請求項１に記載の化合物であって、
任意に、ａ）Ｒ３が−（ＣＨ２）２ＣＯＯＨであるか、またはｂ）Ｒ３が−（ＣＨ２）５ＣＯＯＨである、化合物。
【請求項１４】
式（ＩＩ）の化合物およびその塩：
【化２】
2020537630.tif 000034
式中、
Ｘ’が、Ｏ、Ｓ、およびＮＲｐから選択され、ここで、Ｒｐが、ＨまたはＣ１−６アルキルであり；
Ｒ６が、ＨまたはＣ１−４アルキルであり；
Ｒ７が、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＯＨ、任意に置換されたＣ１−４アルキル、任意に置換されたＣ１−４アルケニル、任意に置換されたＣ２−４アルキニル、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、および任意に置換されたＣ１−４アルコキシであり；
Ｒ８およびＲ１０が、それぞれ独立して、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、−ＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、任意に置換されたＣ１−６アルキル、任意に置換されたＣ１−６アルケニル、任意に置換されたＣ２−６アルキニル、または任意に置換されたＣ１−６アルコキシであるか；あるいは
Ｒ８およびＲ１０の一方が、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、−ＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、任意に置換されたＣ１−６アルキル、任意に置換されたＣ１−６アルケニル、任意に置換されたＣ２−６アルキニル、または任意に置換されたＣ１−６アルコキシであり、かつＲ８およびＲ１０の他方が、Ｒ９と一緒になって、任意に置換された４〜７員の複素環を形成し；
Ｒ９が、−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−４アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＣＯＮ（Ｃ１−４アルキル）２、−ＣＮ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、または−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２で置換された、Ｃ２−６アルキルまたはＣ１−６アルキルであり；
各Ｒ１１が、独立して、ハロ、−ＣＮ、カルボキシ、アミノ、−ＯＨ、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、ニトロ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、および任意に置換されたＣ１−６アルコキシであり；および
ｑが、０、１、または２である。
【請求項１５】
以下の（ｉ）〜（ｘ）のうち少なくとも１つを満たす、請求項１４に記載の化合物：
（ｉ）Ｘ’がＯまたはＸ’がＳであるか、あるいはＸ’がＮＲｐであり、ここで、ＲｐがＨまたはＣ１−６アルキルである；
（ｉｉ）Ｒ６がＨであるか、またはＲ６がＣ１−４アルキルである；
（ｉｉｉ）Ｒ７がＨであるか、またはＲ７が任意に置換されたＣ１−４アルキル、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、もしくは−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２であって、任意に、Ｒ７が−ＣＯ２Ｈで任意に置換されたＣ１−４アルキルである；
（ｉｖ）Ｒ８がＨであるか、またはＲ８が−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、もしくは−ＳＯ２ＮＨ２である；
（ｖ）Ｒ１０がＨであるか、またはＲ１０が−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、もしくは−ＳＯ２ＮＨ２である；
（ｖｉ）（ａ）Ｒ８がＨであり、かつＲ１０が−ＳＯ３Ｈであるか、あるいは（ｂ）Ｒ８が−ＳＯ３Ｈであり、かつＲ１０がＨである；
（ｖｉｉ）Ｒ８およびＲ１０の一方が、Ｈ、ハロ、−ＣＮ、−ＣＯ２Ｈ、アミノ、-ＯＨ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、任意に置換されたＣ１−６アルキル、任意に置換されたＣ１−６アルケニル、任意に置換されたＣ２−６アルキニル、または任意に置換されたＣ１−６アルコキシであり、かつＲ８およびＲ１０の他方が、Ｒ９と一緒になって、任意に置換された４〜７員の複素環を形成する；
（ｖｉｉｉ）Ｒ９がＣ２−６アルキルであるか、またはＲ９が−ＣＯ２Ｈ、−ＣＯ２Ｃ１−４アルキル、−ＣＯＮＨ２、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＣＯＮ（Ｃ１−４アルキル）２、−ＣＮ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）もしくは−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２で置換されたＣ１−６アルキルであって、
任意に、Ｒ９が−ＣＯ２Ｈで置換されたＣ１−６アルキルであり、好ましくはＲ９が−（ＣＨ２）ｙ−ＣＯ２Ｈであり、ここで、ｙが２、３、４、または５である；
（ｉｘ）各Ｒ１１が、独立して、ハロ、−ＣＯ２Ｈ、−ＳＯ３Ｈ、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−４アルキル）、−ＳＯ２Ｎ（Ｃ１−４アルキル）２、または任意に置換されたアルキルである；
（ｘ）ｑが０、１、または２である。
【請求項１６】
以下からなる群より選択される、化合物：
【化３】
2020537630.tif 000035
および、それらの塩。
【請求項１７】
前記化合物が、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに結合している、請求項１〜１６の何れかに記載の化合物。
【請求項１８】
請求項１〜１６の何れかに記載の化合物で標識された、標識ヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
以下の（Ａ）〜（Ｃ）のうち少なくとも１つを任意に満たす、請求項１８に記載の標識ヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチド：
（Ａ）請求項１〜５の何れかに記載の化合物が、式（Ｉ）中のＲ３または式（ＩＩ）中のＲ９を介して結合していて、任意に、更に、式（Ｉ）中のＲ３が−（ＣＨ２）ｎＣＯＯＨ（ｎは２、３、４、５、または６）であるかまたは式（ＩＩ）中のＲ９が−（ＣＨ２）ｙＣＯＯＨ（ｙは２、３、４、５、または６）であって、且つ、前記結合が当該−ＣＯＯＨ基を用いてアミドを形成する；
（Ｂ）前記標識が、リンカー部分を介して、ピリミジン塩基のＣ５位または７−デアザプリン塩基のＣ７位に結合している；
（Ｃ）前記ヌクレオチドのリボース糖またはデオキシリボース糖に共有結合した３’ＯＨブロッキング基を更に含む。
【請求項２０】
請求項１９に記載の第１の標識ヌクレオチド、および第２の標識ヌクレオチドを含むキットであって、
任意に、
（ｉ）前記第２の標識ヌクレオチドが、前記第１の標識ヌクレオチドとは異なる化合物で標識されているかまたは非標識であって、任意に、前記第１の標識ヌクレオチドおよび前記第２の標識ヌクレオチドが、単一のレーザー波長を使用して励起可能であり、かつ／または
（ｉｉ）前記キットは第３のヌクレオチドおよび第４のヌクレオチドを更に含み、前記第２のヌクレオチド、前記第３のヌクレオチド、および前記第４のヌクレオチドの各々が異なる化合物で標識されているかまたは非標識であり、各標識が、他の標識と区別可能な異なる吸収極大を有し、または
（ｉｉｉ）前記キットは４つのヌクレオチドを含み、前記４つのヌクレオチドの第１が請求項１８または１９に記載の標識ヌクレオチドであり、前記４つのヌクレオチドの第２が第２の標識を有し、第３のヌクレオチドが第３の標識を有し、第４のヌクレオチドが非標識（ダーク）であり、または
（ｉｖ）前記キットは４つのヌクレオチドを含み、前記４つのヌクレオチドの第１が請求項１８または１９に記載の標識ヌクレオチドであり、前記４つのヌクレオチドの第２が第２の標識を有し、第３のヌクレオチドが２つの標識の混合物を有し、第４のヌクレオチドが非標識（ダーク）である、キット。
【請求項２１】
シークエンシング、発現解析、ハイブリダイゼーション解析、遺伝子解析、ＲＮＡ解析、またはタンパク質結合アッセイにおける、請求項１〜１６の何れかに記載のヌクレオチド、請求項１８または１９に記載のオリゴヌクレオチド、または請求項２０に記載のキット、の使用。
【請求項２２】
自動化シークエンシング装置における請求項２１に記載の使用であって、前記自動化シークエンシング装置が、異なる波長で動作する２つのレーザーを含む、使用。
【請求項２３】
請求項１８または１９に記載のヌクレオチドを、シークエンシングアッセイに組み込むことを含むシークエンシング方法であって、
任意に、前記ヌクレオチドを検出することを更に含み、
任意に、前記シークエンシングアッセイが自動化シークエンシング装置で実施され、前記自動化シークエンシング装置が異なる波長で動作する２つの光源を含む、シークエンシング方法。
【請求項２４】
本明細書に記載の式（Ｉ）または式（ＩＩ）の化合物の、合成方法。
【国際調査報告】
2020537630.tif 000036
2020537630.tif 000037
2020537630.tif 000038
2020537630.tif 000039