(57)【要約】  本発明は、免疫刺激性核酸（ｎｕｃｌｅｉｄ  ａｃｉｄｓ）を封入する自己集合タンパク質ナノ粒子に関する。さらに、本発明は、ワクチン接種のためのかかるナノ粒子の使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）コイルドコイルオリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、コイルドコイルオリゴマー化ドメインＮＤ２並びにさらなる置換部分Ｘ１及びＹ１を含む連続鎖からなる式（Ｉ）
Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｙ１    （Ｉ）、
（式中、
ＮＤ１は、ｍ個のＮＤ１サブユニットのオリゴマー（ＮＤ１）ｍを含むコイルドコイルオリゴマー化ドメインであり、
ＮＤ２は、ｎ個のＮＤ２サブユニットのオリゴマー（ＮＤ２）ｎを含むコイルドコイルオリゴマー化ドメインであり、
ｍ及びｎは、それぞれ２と１０の間の数であり、ただし、ｍは、ｎと等しくなく且つｎの倍数でなく、ｎは、ｍの倍数でなく、
Ｌ１は、生理学的状態で全体として少なくとも＋２の正電荷を有するペプチドリンカーであり、
Ｘ１は、存在しないか、又はさらに置換されていてもよい、１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列であり、
Ｙ１は、存在しないか、又はさらに置換されていてもよい、１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である）
の複数の構築ブロックからなる自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）であって、
式（Ｉ）の複数の構築ブロックは、コイルドコイルオリゴマー化ドメインＮＤ３、リンカーＬ２、コイルドコイルオリゴマー化ドメインＮＤ４並びにさらなる置換部分Ｘ２及びＹ２を含む連続鎖からなる、式（ＩＩ）
Ｘ２−ＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４−Ｙ２    （ＩＩ）、
（式中
ＮＤ３は、ｙ個のＮＤ３サブユニットのオリゴマー（ＮＤ３）ｙを含むコイルドコイルオリゴマー化ドメインであり、
ＮＤ４は、ｚ個のＮＤ４サブユニットのオリゴマー（ＮＤ４）ｚを含むコイルドコイルオリゴマー化ドメインであり、
ｙ及びｚは、それぞれ２と１０の間の数であり、ただし、ｙは、ｚと等しくなく且つｚの倍数でなく、及びｚはｙの倍数でなく、
ＮＤ３はＮＤ１と同一であるか、又はＮＤ４はＮＤ２と同一であるか、又はＮＤ３及びＮＤ４の両方がそれぞれＮＤ１及びＮＤ２と同一であり、
Ｌ２は、生理学的状態で全体として少なくとも＋２の正電荷を有するペプチドリンカーであり、Ｘ２は、存在しないか、又はさらに置換されていてもよい、１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列であり
Ｙ２は、存在しないか、又はさらに置換されていてもよい、１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である）
の複数の構築ブロックと共集合していてもよい自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）、
（ｂ）免疫刺激性物質であって、前記免疫刺激性物質は核酸誘導体であり、前記核酸誘導体は、前記ＳＡＰＮに封入される、免疫刺激性物質
を含む、対象において免疫応答を誘導するための組成物。
【請求項２】
ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、少なくとも４アミノ酸からなり、生理学的状態で全体として少なくとも＋３の正電荷を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、配列番号４に示されるアミノ酸配列、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、配列番号１４に示されるアミノ酸配列及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
核酸誘導体は、グアニンが続くシトシンを含む一本鎖ＤＮＡであってシトシンヌクレオチドはメチル化されていない一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡウイルス由来の一本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡウイルス由来の二本鎖ＲＮＡ及びＲＮＡウイルス由来の二本鎖ＲＮＡを模倣する高分子複合体からなる群より選択される、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
核酸誘導体は、クラスＡ  ＣｐＧ  ＯＤＮ、クラスＢ  ＣｐＧ  ＯＤＮ及びクラスＣ  ＯＤＮからなる群より選択されるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
核酸誘導体は、配列番号１３、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８及び配列番号４９で示されるヌクレオチド酸配列からなる群より選択されるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
核酸誘導体は、イオン性相互作用によりＳＡＰＮと結合する、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
式（Ｉ）の複数の構築ブロックからなるＳＡＰＮのタンパク質鎖と核酸誘導体とのモル比は、約１対約０．６である、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、五量体コイルドコイル、四量体コイルドコイル、三量体コイルドコイル及び二量体コイルドコイルからなる群より選択されるコイルドコイルである、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
ＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、４ＰＮ８、４ＰＮＤ、４ＷＢＡ、３Ｖ２Ｎ、３Ｖ２Ｐ、３Ｖ２Ｑ、３Ｖ２Ｒ、４ＥＥＢ、４ＥＥＤ、３ＭＩＷ、１ＭＺ９、１ＦＢＭ、１ＶＤＦ、２ＧＵＶ、２ＨＹＮ、１ＺＬＬ及び１Ｔ８Ｚからなる群より選択される五量体コイルドコイルであるか、或いはＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、アミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなった、４ＰＮ８、４ＰＮＤ、４ＷＢＡ、３Ｖ２Ｎ、３Ｖ２Ｐ、３Ｖ２Ｑ、３Ｖ２Ｒ、４ＥＥＢ、４ＥＥＤ、３ＭＩＷ、１ＭＺ９、１ＦＢＭ、１ＶＤＦ、２ＧＵＶ、２ＨＹＮ、１ＺＬＬ及び１Ｔ８Ｚからなる群より選択される五量体コイルドコイルであり、各コイルドコイルは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリー番号付けにより示される、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
ＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、５Ｄ６０、５Ｄ５Ｙ、５ＡＬ６、４ＷＢ４、４ＢＨＶ、４Ｃ５Ｑ、４ＧＪＷ、４Ｈ７Ｒ、４Ｈ８Ｆ、４ＢＸＴ、４ＬＴＯ、４ＬＴＰ、４ＬＴＱ、４ＬＴＲ、３ＺＤＯ、３ＲＱＡ、３Ｒ４Ａ、３Ｒ４Ｈ、３ＴＳＩ、３Ｋ４Ｔ、３Ｆ６Ｎ、２Ｏ６Ｎ、２ＯＶＣ、２Ｏ１Ｊ、２Ｏ１Ｋ、２ＡＧ３、２ＣＣＥ、１ＹＢＫ、１Ｕ９Ｆ、１Ｕ９Ｇ、１Ｕ９Ｈ、１ＵＳＤ、１ＵＳＥ、１ＵＮＴ、１ＵＮＵ、１ＵＮＶ、１ＵＮＷ、１ＵＮＸ、１ＵＮＹ、１ＵＮＺ、１ＵＯ０、１ＵＯ１、１ＵＯ２、１ＵＯ３、１ＵＯ４、１ＵＯ５、１Ｗ５Ｉ、１Ｗ５Ｌ、１ＦＥ６、１Ｇ１Ｉ、１Ｇ１Ｊ、１ＥＺＪ、１ＲＨ４及び１ＧＣＬからなる群より選択される四量体コイルドコイルであるか、或いはＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、アミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなった、５Ｄ６０、５Ｄ５Ｙ、５ＡＬ６、４ＷＢ４、４ＢＨＶ、４Ｃ５Ｑ、４ＧＪＷ、４Ｈ７Ｒ、４Ｈ８Ｆ、４ＢＸＴ、４ＬＴＯ、４ＬＴＰ、４ＬＴＱ、４ＬＴＲ、３ＺＤＯ、３ＲＱＡ、３Ｒ４Ａ、３Ｒ４Ｈ、３ＴＳＩ、３Ｋ４Ｔ、３Ｆ６Ｎ、２Ｏ６Ｎ、２ＯＶＣ、２Ｏ１Ｊ、２Ｏ１Ｋ、２ＡＧ３、２ＣＣＥ、１ＹＢＫ、１Ｕ９Ｆ、１Ｕ９Ｇ、１Ｕ９Ｈ、１ＵＳＤ、１ＵＳＥ、１ＵＮＴ、１ＵＮＵ、１ＵＮＶ、１ＵＮＷ、１ＵＮＸ、１ＵＮＹ、１ＵＮＺ、１ＵＯ０、１ＵＯ１、１ＵＯ２、１ＵＯ３、１ＵＯ４、１ＵＯ５、１Ｗ５Ｉ、１Ｗ５Ｌ、１ＦＥ６、１Ｇ１Ｉ、１Ｇ１Ｊ、１ＥＺＪ、１ＲＨ４及び１ＧＣＬからなる群より選択される四量体コイルドコイルであり、各コイルドコイルは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリー番号付けにより示される、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、５ＴＯＨ、５ＴＯＩ、５Ｋ９２、５ＫＢ０、５ＫＢ１、５ＫＢ２、５ＫＫＶ、５ＥＦＭ、２Ｎ６４、５ＡＢＳ、５ＩＥＡ、５ＡＰＰ、５ＡＰＱ、５ＡＰＳ、５ＡＰＹ、５ＡＰＺ、５Ｄ５Ｚ、４ＹＰＣ、４ＹＶ３、４ＣＧＢ、４ＣＧＣ、４ＣＪＤ、４Ｒ０Ｒ、４ＵＷ０、４Ｐ６７、４ＯＸＭ、３Ｗ８Ｖ、３Ｗ９２、３Ｗ９３、４Ｉ２Ｌ、４Ｋ８Ｕ、４ＪＢＺ、３ＶＴＱ、４Ｌ１Ｒ、４ＪＤＯ、４Ｊ４Ａ、４Ｅ５２、３ＶＹＩ、３ＺＭＦ、３ＶＵ５、３ＶＵ６、２ＹＮＹ、２ＹＮＺ、２ＹＯ０、２ＹＯ１、２ＹＯ２、４Ｇ１Ａ、４ＧＩＦ、３ＴＱ２、４ＤＺＫ、４ＤＺＬ、４ＤＺＮ、３ＴＥ３、３Ｒ４８、３ＳＷＦ、３ＳＷＹ、３ＰＲ７、２ＹＫＯ、２ＹＫＰ、２ＹＫＱ、３ＮＴＮ、３ＰＰ５、３ＭＫＯ、３ＭＧＮ、３ＮＷＡ、３ＮＷＤ、３ＮＷＦ、３Ｌ３５、３Ｌ３６、３Ｌ３７、３Ｍ９Ｂ、３Ｍ９Ｄ、２Ｘ６Ｐ、３ＬＪＭ、３ＡＨＡ、３Ｈ７Ｘ、３Ｈ７Ｚ、３ＬＴ６、３ＬＴ７、３ＧＪＰ、２ＫＰ８、３ＫＰＥ、２ＷＰＲ、２ＷＰＳ、２ＷＰＹ、２ＷＰＺ、２ＷＱ０、２ＷＱ１、２ＷＱ２、２ＷＱ３、３ＨＦＣ、３ＨＦＥ、３ＨＲＮ、３ＨＲＯ、３Ｈ５Ｆ、３Ｈ５Ｇ、２ＷＧ５、２ＷＧ６、２Ｗ６Ｂ、２ＪＪＬ、２ＶＲＳ、３ＥＦＧ、３ＤＵＺ、２ＯＴ５、２Ｚ２Ｔ、２ＱＩＨ、３ＢＫ６、２Ｏ７Ｈ、２Ｒ３２、２ＪＧＯ、２Ｑ７Ｃ、２Ｑ３Ｉ、２Ｑ５Ｕ、２ＩＢＬ、１ＺＶ８、１ＺＶＢ、２ＦＸＰ、１ＷＴ６、２ＡＫＦ、１ＴＧＧ、１ＳＬＱ、１Ｓ９Ｚ、１ＰＷ９、１ＰＷＢ、１Ｍ７Ｌ、１ＧＺＬ、１ＫＹＣ、１ＫＦＭ、１ＫＦＮ、１ＩＪ０、１ＩＪ１、１ＩＪ２、１ＩＪ３、１ＨＱＪ、１ＱＵ１、１Ｂ０８、１ＣＺＱ、１ＣＵＮ、１ＳＶＦ、１ＣＥ０、１ＰＩＱ、１ＡＱ５、１ＡＶＹ、１ＨＴＮ、１ＡＡ０、１ＺＩＪ、１ＺＩＭ、１ＣＯＩ、１ＳＷＩ、１ＧＣＭ及び１ＨＵＰからなる群より選択される三量体コイルドコイルであるか、或いはＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、アミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなった、５ＴＯＨ、５ＴＯＩ、５Ｋ９２、５ＫＢ０、５ＫＢ１、５ＫＢ２、５ＫＫＶ、５ＥＦＭ、２Ｎ６４、５ＡＢＳ、５ＩＥＡ、５ＡＰＰ、５ＡＰＱ、５ＡＰＳ、５ＡＰＹ、５ＡＰＺ、５Ｄ５Ｚ、４ＹＰＣ、４ＹＶ３、４ＣＧＢ、４ＣＧＣ、４ＣＪＤ、４Ｒ０Ｒ、４ＵＷ０、４Ｐ６７、４ＯＸＭ、３Ｗ８Ｖ、３Ｗ９２、３Ｗ９３、４Ｉ２Ｌ、４Ｋ８Ｕ、４ＪＢＺ、３ＶＴＱ、４Ｌ１Ｒ、４ＪＤＯ、４Ｊ４Ａ、４Ｅ５２、３ＶＹＩ、３ＺＭＦ、３ＶＵ５、３ＶＵ６、２ＹＮＹ、２ＹＮＺ、２ＹＯ０、２ＹＯ１、２ＹＯ２、４Ｇ１Ａ、４ＧＩＦ、３ＴＱ２、４ＤＺＫ、４ＤＺＬ、４ＤＺＮ、３ＴＥ３、３Ｒ４８、３ＳＷＦ、３ＳＷＹ、３ＰＲ７、２ＹＫＯ、２ＹＫＰ、２ＹＫＱ、３ＮＴＮ、３ＰＰ５、３ＭＫＯ、３ＭＧＮ、３ＮＷＡ、３ＮＷＤ、３ＮＷＦ、３Ｌ３５、３Ｌ３６、３Ｌ３７、３Ｍ９Ｂ、３Ｍ９Ｄ、２Ｘ６Ｐ、３ＬＪＭ、３ＡＨＡ、３Ｈ７Ｘ、３Ｈ７Ｚ、３ＬＴ６、３ＬＴ７、３ＧＪＰ、２ＫＰ８、３ＫＰＥ、２ＷＰＲ、２ＷＰＳ、２ＷＰＹ、２ＷＰＺ、２ＷＱ０、２ＷＱ１、２ＷＱ２、２ＷＱ３、３ＨＦＣ、３ＨＦＥ、３ＨＲＮ、３ＨＲＯ、３Ｈ５Ｆ、３Ｈ５Ｇ、２ＷＧ５、２ＷＧ６、２Ｗ６Ｂ、２ＪＪＬ、２ＶＲＳ、３ＥＦＧ、３ＤＵＺ、２ＯＴ５、２Ｚ２Ｔ、２ＱＩＨ、３ＢＫ６、２Ｏ７Ｈ、２Ｒ３２、２ＪＧＯ、２Ｑ７Ｃ、２Ｑ３Ｉ、２Ｑ５Ｕ、２ＩＢＬ、１ＺＶ８、１ＺＶＢ、２ＦＸＰ、１ＷＴ６、２ＡＫＦ、１ＴＧＧ、１ＳＬＱ、１Ｓ９Ｚ、１ＰＷ９、１ＰＷＢ、１Ｍ７Ｌ、１ＧＺＬ、１ＫＹＣ、１ＫＦＭ、１ＫＦＮ、１ＩＪ０、１ＩＪ１、１ＩＪ２、１ＩＪ３、１ＨＱＪ、１ＱＵ１、１Ｂ０８、１ＣＺＱ、１ＣＵＮ、１ＳＶＦ、１ＣＥ０、１ＰＩＱ、１ＡＱ５、１ＡＶＹ、１ＨＴＮ、１ＡＡ０、１ＺＩＪ、１ＺＩＭ、１ＣＯＩ、１ＳＷＩ、１ＧＣＭ及び１ＨＵＰからなる群より選択される三量体コイルドコイルであり、各コイルドコイルは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリー番号付けにより示される、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、５Ｍ９７、５Ｍ９Ｅ、５ＦＩＹ、５Ｆ４Ｙ、５Ｄ３Ａ、５ＨＭＯ、５ＥＹＡ、５ＩＸ１、５ＩＸ２、５ＪＨＦ、５ＪＶＭ、５ＪＶＰ、５ＪＶＲ、５ＪＶＳ、５ＪＶＵ、５ＪＸ１、５ＦＣＮ、５ＨＨＥ、２Ｎ９Ｂ、４ＺＲＹ、４Ｚ６Ｙ、４ＹＴＯ、４ＺＩ３、５ＡＪＳ、５Ｆ３Ｋ、５Ｆ５Ｒ、５ＨＵＺ、５ＤＪＮ、５ＤＪＯ、５ＣＨＸ、５ＣＪ０、５ＣＪ１、５ＣＪ４、５Ｃ９Ｎ、５ＣＦＦ、４ＷＨＶ、３ＷＵＴ、３ＷＵＵ、３ＷＵＶ、４ＺＱＡ、４ＸＡ３、４ＸＡ４、４ＰＸＪ、４ＹＶＣ、４ＹＶＥ、５ＢＭＬ、５ＡＬ７、４ＷＯＴ、４ＣＧ４、５ＡＭＯ、４ＷＩＩ、４ＷＩＫ、４ＲＳＪ、４ＣＦＧ、４Ｒ３Ｑ、４ＷＩＤ、４ＣＫＧ、４ＣＫＨ、４ＮＳＷ、４Ｗ７Ｐ、４ＱＱ４、４ＯＪＫ、４ＴＬ１、４ＯＨ９、４ＬＰＺ、４Ｑ６２、４Ｌ２Ｗ、４Ｍ３Ｌ、４ＣＫＭ、４ＣＫＮ、４Ｎ６Ｊ、４ＬＴＢ、４ＬＲＺ、２ＭＡＪ、２ＭＡＫ、４ＮＡＤ、４ＨＷ０、４ＢＴ８、４ＢＴ９、４ＢＴＡ、４ＨＨＤ、４Ｍ８Ｍ、４Ｊ３Ｎ、４Ｌ６Ｑ、４Ｃ１Ａ、４Ｃ１Ｂ、４ＧＤＯ、４ＢＷＫ、４ＢＷＰ、４ＢＷＸ、４ＨＵ５、４ＨＵ６、４Ｌ９Ｕ、４Ｇ０Ｕ、４Ｇ０Ｖ、４Ｇ０Ｗ、４Ｌ３Ｉ、４Ｇ７９、４ＧＥＵ、４ＧＥＸ、４ＧＦＡ、４ＧＦＣ、４ＢＬ６、４ＪＭＲ、４ＪＮＨ、２ＹＭＹ、４ＨＡＮ、３ＶＭＹ、３ＶＭＺ、３ＶＮ０、４ＡＢＸ、３Ｗ０３、２ＬＷ９、４ＤＺＭ、４ＥＴＯ、３ＴＮＵ、３ＴＨＦ、４Ｅ８Ｕ、３ＶＭＸ、４Ｅ６１、３ＶＥＭ、３ＶＢＢ、４ＤＪＧ、３ＴＶ７、３ＳＴＱ、３Ｖ８Ｓ、３Ｑ８Ｔ、３Ｕ１Ｃ、３ＱＨ９、３ＡＺＤ、３ＯＮＸ、３ＯＫＱ、３ＱＸ３、３ＳＪＡ、３ＳＪＢ、３ＳＪＣ、２Ｌ２Ｌ、３ＱＦＬ、３ＱＫＴ、２ＸＶ５、２Ｙ３Ｗ、３Ｑ０Ｘ、３ＡＪＷ、３ＮＣＺ、３ＮＩ０、２ＸＵ６、３Ｍ９１、３ＮＭＤ、３ＬＬＬ、３ＬＸ７、３ＭＥ９、３ＭＥＵ、３ＭＥＶ、３ＡＢＨ、３ＡＣＯ、３ＩＡＯ、３ＨＬＳ、２ＷＭＭ、３Ａ６Ｍ、３Ａ７Ｏ、２ＷＶＲ、３ＩＣＸ、３ＩＤ５、３ＩＤ６、３ＨＮＷ、３Ｉ１Ｇ、２Ｋ６Ｓ、３ＧＨＧ、３Ｇ１Ｅ、２Ｗ６Ａ、２Ｖ５１、３ＥＲＲ、３Ｅ１Ｒ、２ＶＹ２、２ＺＲ２、２ＺＲ３、３ＣＬ３、３Ｄ９Ｖ、２Ｚ１７、２ＪＥＥ、３ＢＢＰ、３ＢＡＳ、３ＢＡＴ、２ＱＭ４、２Ｖ７１、２ＮＯ２、２ＰＯＮ、２Ｖ０Ｏ、２ＤＱ０、２ＤＱ３、２Ｑ２Ｆ、２ＮＲＮ、２Ｅ７Ｓ、２Ｈ９Ｖ、２ＦＸＭ、２ＨＪＤ、２ＧＺＤ、２ＧＺＨ、２ＦＶ４、２Ｆ２Ｕ、２ＥＵＬ、２ＥＳＭ、２ＥＴＫ、２ＥＴＲ、１ＺＸＡ、１ＹＩＢ、１ＹＩＧ、１ＸＳＸ、１ＲＦＹ、１Ｕ０Ｉ、１ＸＪＡ、１Ｔ３Ｊ、１Ｔ６Ｆ、１Ｒ７Ｊ、１ＵＩＩ、１ＰＬ５、１Ｓ１Ｃ、１Ｐ９Ｉ、１Ｒ４８、１ＵＲＵ、１ＯＶ９、１ＵＩＸ、１ＮＯ４、１ＮＹＨ、１ＭＶ４、１ＬＲ１、１Ｌ８Ｄ、１ＬＪ２、１ＫＱＬ、１ＧＸＫ、１ＧＸＬ、１ＧＫ６、１ＪＲ５、１ＧＭＪ、１ＪＡＤ、１ＪＣＨ、１ＪＢＧ、１ＪＴＨ、１ＪＹ２、１ＪＹ３、１ＩＣ２、１ＨＣＩ、１ＨＦ９、１ＨＢＷ、１ＦＸＫ、１Ｄ７Ｍ、１ＱＵＵ、１ＣＥ９、２Ａ９３、１ＢＭ９、１Ａ９３、１ＴＭＺ、２ＡＡＣ、１ＺＩＩ、１ＺＩＫ、１ＺＩＬ、２ＡＲＡ、２ＡＲＣ、１ＪＵＮ、１ＹＳＡ及び２ＺＴＡからなる群より選択される二量体コイルドコイルであるか、或いはＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、アミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなった、５Ｍ９７、５Ｍ９Ｅ、５ＦＩＹ、５Ｆ４Ｙ、５Ｄ３Ａ、５ＨＭＯ、５ＥＹＡ、５ＩＸ１、５ＩＸ２、５ＪＨＦ、５ＪＶＭ、５ＪＶＰ、５ＪＶＲ、５ＪＶＳ、５ＪＶＵ、５ＪＸ１、５ＦＣＮ、５ＨＨＥ、２Ｎ９Ｂ、４ＺＲＹ、４Ｚ６Ｙ、４ＹＴＯ、４ＺＩ３、５ＡＪＳ、５Ｆ３Ｋ、５Ｆ５Ｒ、５ＨＵＺ、５ＤＪＮ、５ＤＪＯ、５ＣＨＸ、５ＣＪ０、５ＣＪ１、５ＣＪ４、５Ｃ９Ｎ、５ＣＦＦ、４ＷＨＶ、３ＷＵＴ、３ＷＵＵ、３ＷＵＶ、４ＺＱＡ、４ＸＡ３、４ＸＡ４、４ＰＸＪ、４ＹＶＣ、４ＹＶＥ、５ＢＭＬ、５ＡＬ７、４ＷＯＴ、４ＣＧ４、５ＡＭＯ、４ＷＩＩ、４ＷＩＫ、４ＲＳＪ、４ＣＦＧ、４Ｒ３Ｑ、４ＷＩＤ、４ＣＫＧ、４ＣＫＨ、４ＮＳＷ、４Ｗ７Ｐ、４ＱＱ４、４ＯＪＫ、４ＴＬ１、４ＯＨ９、４ＬＰＺ、４Ｑ６２、４Ｌ２Ｗ、４Ｍ３Ｌ、４ＣＫＭ、４ＣＫＮ、４Ｎ６Ｊ、４ＬＴＢ、４ＬＲＺ、２ＭＡＪ、２ＭＡＫ、４ＮＡＤ、４ＨＷ０、４ＢＴ８、４ＢＴ９、４ＢＴＡ、４ＨＨＤ、４Ｍ８Ｍ、４Ｊ３Ｎ、４Ｌ６Ｑ、４Ｃ１Ａ、４Ｃ１Ｂ、４ＧＤＯ、４ＢＷＫ、４ＢＷＰ、４ＢＷＸ、４ＨＵ５、４ＨＵ６、４Ｌ９Ｕ、４Ｇ０Ｕ、４Ｇ０Ｖ、４Ｇ０Ｗ、４Ｌ３Ｉ、４Ｇ７９、４ＧＥＵ、４ＧＥＸ、４ＧＦＡ、４ＧＦＣ、４ＢＬ６、４ＪＭＲ、４ＪＮＨ、２ＹＭＹ、４ＨＡＮ、３ＶＭＹ、３ＶＭＺ、３ＶＮ０、４ＡＢＸ、３Ｗ０３、２ＬＷ９、４ＤＺＭ、４ＥＴＯ、３ＴＮＵ、３ＴＨＦ、４Ｅ８Ｕ、３ＶＭＸ、４Ｅ６１、３ＶＥＭ、３ＶＢＢ、４ＤＪＧ、３ＴＶ７、３ＳＴＱ、３Ｖ８Ｓ、３Ｑ８Ｔ、３Ｕ１Ｃ、３ＱＨ９、３ＡＺＤ、３ＯＮＸ、３ＯＫＱ、３ＱＸ３、３ＳＪＡ、３ＳＪＢ、３ＳＪＣ、２Ｌ２Ｌ、３ＱＦＬ、３ＱＫＴ、２ＸＶ５、２Ｙ３Ｗ、３Ｑ０Ｘ、３ＡＪＷ、３ＮＣＺ、３ＮＩ０、２ＸＵ６、３Ｍ９１、３ＮＭＤ、３ＬＬＬ、３ＬＸ７、３ＭＥ９、３ＭＥＵ、３ＭＥＶ、３ＡＢＨ、３ＡＣＯ、３ＩＡＯ、３ＨＬＳ、２ＷＭＭ、３Ａ６Ｍ、３Ａ７Ｏ、２ＷＶＲ、３ＩＣＸ、３ＩＤ５、３ＩＤ６、３ＨＮＷ、３Ｉ１Ｇ、２Ｋ６Ｓ、３ＧＨＧ、３Ｇ１Ｅ、２Ｗ６Ａ、２Ｖ５１、３ＥＲＲ、３Ｅ１Ｒ、２ＶＹ２、２ＺＲ２、２ＺＲ３、３ＣＬ３、３Ｄ９Ｖ、２Ｚ１７、２ＪＥＥ、３ＢＢＰ、３ＢＡＳ、３ＢＡＴ、２ＱＭ４、２Ｖ７１、２ＮＯ２、２ＰＯＮ、２Ｖ０Ｏ、２ＤＱ０、２ＤＱ３、２Ｑ２Ｆ、２ＮＲＮ、２Ｅ７Ｓ、２Ｈ９Ｖ、２ＦＸＭ、２ＨＪＤ、２ＧＺＤ、２ＧＺＨ、２ＦＶ４、２Ｆ２Ｕ、２ＥＵＬ、２ＥＳＭ、２ＥＴＫ、２ＥＴＲ、１ＺＸＡ、１ＹＩＢ、１ＹＩＧ、１ＸＳＸ、１ＲＦＹ、１Ｕ０Ｉ、１ＸＪＡ、１Ｔ３Ｊ、１Ｔ６Ｆ、１Ｒ７Ｊ、１ＵＩＩ、１ＰＬ５、１Ｓ１Ｃ、１Ｐ９Ｉ、１Ｒ４８、１ＵＲＵ、１ＯＶ９、１ＵＩＸ、１ＮＯ４、１ＮＹＨ、１ＭＶ４、１ＬＲ１、１Ｌ８Ｄ、１ＬＪ２、１ＫＱＬ、１ＧＸＫ、１ＧＸＬ、１ＧＫ６、１ＪＲ５、１ＧＭＪ、１ＪＡＤ、１ＪＣＨ、１ＪＢＧ、１ＪＴＨ、１ＪＹ２、１ＪＹ３、１ＩＣ２、１ＨＣＩ、１ＨＦ９、１ＨＢＷ、１ＦＸＫ、１Ｄ７Ｍ、１ＱＵＵ、１ＣＥ９、２Ａ９３、１ＢＭ９、１Ａ９３、１ＴＭＺ、２ＡＡＣ、１ＺＩＩ、１ＺＩＫ、１ＺＩＬ、２ＡＲＡ、２ＡＲＣ、１ＪＵＮ、１ＹＳＡ及び２ＺＴＡからなる群より選択される二量体コイルドコイルであり、各コイルドコイルは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリー番号付けにより示される、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
式（Ｉ）の複数の構築ブロックは、式（ＩＩ）の複数の構築ブロックと共集合し、式（Ｉ）の複数の構築ブロック及び式（ＩＩ）の複数の構築ブロックを含む共集合したＳＡＰＮは、約１から約１２の式（ＩＩ）の構築ブロックを含む連続鎖に対し約４８から約５９の式（Ｉ）の構築ブロックを含む連続鎖の共集合比率を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
ヒト又は非ヒト動物にワクチン接種する方法における使用のための、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物であって、方法は、かかるワクチン接種を必要とするヒト又は非ヒト動物に有効量の前記組成物を投与することを含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫刺激性核酸（ｎｕｃｌｅｉｄ  ａｃｉｄｓ）を封入する自己集合タンパク質ナノ粒子に関する。さらに、本発明は、ワクチン接種のためのかかるナノ粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣｐＧ−ＴＬＲ９
グアニンが続くシトシンを含む短い一本鎖合成ＤＮＡ分子は、ＣｐＧ オリゴデオキシヌクレオチド（又はＣｐＧ  ＯＤＮ）と呼ばれる。「ｐ」は、（二本鎖ＤＮＡにおけるＣＧベースペアリングとは対照的に）２個の連続するヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合を指し、一方、いくつかの合成ＯＤＮは、それらのｉｎ  ｖｉｖｏ安定性を増加させるため、代わりに改変されたホスホロチオエート骨格を有する。これらのＣｐＧモチーフのシトシンがメチル化されていない場合、それらは、免疫刺激性分子として作動し得る。脊椎動物のゲノムにおけるそれらの相対的な希少性（哺乳動物において、全てのＣｐＧペア中のシトシンの約７０％から８０％はメチル化されている）と対照的に微生物ゲノムにおいて豊富であるために、ＣｐＧモチーフは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と考えられる。ＣｐＧ ＰＡＭＰは、いわゆるパターン認識受容体であるＴｏｌｌ様受容体９（ＴＬＲ９）により認識される。ＴＬＲ９は、細菌及びウイルスのいずれからのＤＮＡも認識するｔｏｌｌ様受容体であり、一方、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、病原体由来ＲＮＡを認識する。ＴＬＲ９は、高等霊長類及びヒトにおける形質細胞様樹状細胞及びＢ細胞において構成的に発現され、従って、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド部位は、ヒトにおいてこれらの細胞上のＴＬＲ９により検出され得る。これは、細胞内感染を検出するため免疫系により用いられる。
【０００３】
ＲＮＡ
病原体由来ＲＮＡも、ｔｏｌｌ様受容体により認識される。ＴＬＲ３は、主に、二本鎖ＲＮＡのゲノムを運ぶウイルスからの二本鎖ＲＮＡ及びポリＩ：Ｃを認識し；ＴＬＲ７は、ＲＮＡウイルス由来の一本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ８は、低分子合成化合物、一本鎖ウイルスＲＮＡ及び貪食された細菌ＲＮＡを認識する。
【０００４】
ＴＬＲ３
最も一般的に使用される実験用ＴＬＲ３アゴニストは、ポリＩ：ポリＣ（ｐＩＣ）である。ｐＩＣは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を模倣する、巨大な合成高分子複合体である。ｐＩＣの調製物は、鎖長、溶解性、及び毒性を含む他の生物学的特性の分布が様々である。
【０００５】
実験的研究により、ＴＬＲ３は、がん細胞において、アポトーシスをもたらし得ることが示されている。さらに、ＭＤＡ５及びＲＩＧ−Ｉなどの、ｐＩＣにも結合する、他のｄｓＲＮＡ結合受容体が細胞質に存在し、がん細胞におけるアポトーシスに寄与する。アポトーシスを誘導し、同時に免疫系を活性化するＴＬＲ３の能力は、ｐＩＣなどのＴＬＲ３リガンドをがん治療のための魅力的な治療選択肢にする。
【０００６】
ＴＬＲ７及びＴＬＲ８
エンドソームに局在する場合、ＴＬＲ７及びＴＬＲ８は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を認識する。これは、マクロファージ又は樹状細胞などの免疫細胞により内部移行される、インフルエンザ、センダイ及びコクサッキーＢウイルスなどのｓｓＲＮＡウイルスのゲノムの共通する特徴である。ＴＬＲ７は、ＧＵリッチｓｓＲＮＡを認識することができるが、ｓｓＲＮＡにおいてＧＵリッチ配列の存在は、ＴＬＲ７を刺激するのに十分でない。イミキモドは、ＴＬＲ７と相互作用することにより、免疫応答調整剤として作用する処方薬である。イミキモドは、表在性基底細胞がん、性器疣贅及び日光角化症を治療するのに用いられる。レシキモド（Ｒ−８４８）及びガルジキモド（Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）は、イミキモドの誘導体である。
【発明の概要】
【０００７】
第一の態様において、本発明は、
（ａ）コイルドコイルオリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、コイルドコイルオリゴマー化ドメインＮＤ２並びにさらなる置換部分Ｘ１及びＹ１を含む連続鎖からなる、式（Ｉ）
Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｙ１    （Ｉ）
の複数の構築ブロックからなる自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）であって、ここで、
ＮＤ１は、ｍ個のＮＤ１サブユニットのオリゴマー（ＮＤ１）ｍを含むコイルドコイルオリゴマー化ドメインであり、
ＮＤ２は、ｎ個のＮＤ２サブユニットのオリゴマー（ＮＤ２）ｎを含むコイルドコイルオリゴマー化ドメインであり、
ｍ及びｎは、それぞれ２と１０の間の数であり、ただし、ｍは、ｎと等しくなく且つｎの倍数でなく、ｎは、ｍの倍数でなく、
Ｌ１は、生理学的状態で全体として少なくとも＋２の正電荷を有するペプチドリンカーであり、
Ｘ１は、存在しないか、又はさらに置換されていてもよい、１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列であり、
Ｙ１は、存在しないか、又はさらに置換されていてもよい、１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列であり、
ここで式（Ｉ）の複数の構築ブロックは、コイルドコイルオリゴマー化ドメインＮＤ３、リンカーＬ２、コイルドコイルオリゴマー化ドメインＮＤ４並びにさらなる置換部分Ｘ２及びＹ２を含む連続鎖からなる、式（ＩＩ）
Ｘ２−ＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４−Ｙ２    （ＩＩ）、
の複数の構築ブロックと共集合していてもよく、ここで
ＮＤ３は、ｙ個のＮＤ３サブユニットのオリゴマー（ＮＤ３）ｙを含むコイルドコイルオリゴマー化ドメインであり、
ＮＤ４は、ｚ個のＮＤ４サブユニットのオリゴマー（ＮＤ４）ｚを含むコイルドコイルオリゴマー化ドメインであり、
ｙ及びｚは、それぞれ２と１０の間の数であり、ただし、ｙは、ｚと等しくなく及びｚの倍数でなく、及びｚはｙの倍数でなく、ここで、
ＮＤ３はＮＤ１と同一であるか、又はＮＤ４はＮＤ２と同一であるか、又はＮＤ３及びＮＤ４の両方がそれぞれＮＤ１及びＮＤ２と同一であり、
Ｌ２は、生理学的状態で全体として少なくとも＋２の正電荷を有するペプチドリンカーであり、
Ｘ２は、存在しないか、又はさらに置換されていてもよい、１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列であり、
Ｙ２は、存在しないか、又はさらに置換されていてもよい、１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列であり、
（ｂ）免疫刺激性物質であって、前記免疫刺激性物質は核酸誘導体であり、前記核酸誘導体は、前記ＳＡＰＮに封入される、免疫刺激性物質
を含む対象において免疫応答を誘導するための組成物に関する。
【０００８】
第二の態様において、本発明は、ヒト又は非ヒト動物にワクチン接種する方法に関し、これは、かかるワクチン接種を必要とする対象に、本明細書に記載の組成物の有効量を投与することを含む。
【０００９】
第三の態様において、本発明は、ｉ）核酸誘導体を含む緩衝液にＳＡＰＮを加えること、及びｉｉ）通常のリフォールディングプロトコルを用いて、核酸誘導体の存在下でＳＡＰＮをリフォールディングすることを含む、本明細書に記載のＳＡＰＮを製造する方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】封入ＣｐＧナノ粒子の単量体の模式図。以下は、単量体の構築ブロックである：・  Ｘ１は、置換されていてもよい１から１０００のアミノ酸を含む、ペプチド又はタンパク質配列である。・  ＮＤ１は、ｍ個のＮＤ１サブユニットのオリゴマー（ＮＤ１）ｍを形成するコイルドコイルである。・  Ｌ１は、全体として＋３の正電荷を有するペプチドリンカーである。・  ＮＤ２は、ｎ個のＮＤ２サブユニットのオリゴマー（ＮＤ２）ｎを形成するコイルドコイルである。・  Ｙ１は、存在しないか、又はさらに置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である。
【図２】ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲの分子モデル。Ａ）ＴＬＲ５受容体及びＴＬＲ９受容体のそれらそれぞれのアゴニストとのＸ線結晶構造：ＴＬＲ５二量体は、２分子のフラジェリン（黄色及びマゼンタ）と相互作用し、ＴＬＲ９は、ＣｐＧと相互作用する。Ｂ）左：自己集合タンパク質の単量体構築ブロックは、ｈｉｓタグ（Ｘ１）五量体コイルドコイル（ＮＤ１）、二量体コイルドコイル（ＮＤ２）及びフラジェリンのＤ０及びＤ１ドメイン（Ｘ２）から構成される。２つのコイルドコイルオリゴマー化ドメインＮＤ１及びＮＤ２は、３の正電荷（Ｌ１）を有するリンカーにより接合されている。右：ＣｐＧ分子。Ｃ）６０のタンパク質鎖、及び中央の空洞封入された約３６のＣｐＧ分子を有する集合タンパク質ナノ粒子。より明確にするために、円の内側のタンパク質鎖（正電荷を示す）は、粒子の内側の（負に帯電した）ＣｐＧ分子を見えるようにするために示していない。パネルＡ）、Ｂ）及びＣ）において、全ての構造がサイズどおりに描かれているわけではないことに留意する。
【図３】ｐＰＥＰ−Ｔのベクターマップ。「ｐｒｏｍ」：プロモーター；「ｔｅｒｍ」：ターミネーター；「ｏｒｉ」：起点；「ｂｐ」：ベースペア；「ａｍｐ」：アンピシリン耐性遺伝子。
【図４Ａ】コンストラクトＤＥＤＤＬＩ−ＲＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。このコンストラクトは、４４．８ｋＤａの理論分子量を有する。Ａ）試料について２つの異なる濃度での発現レベル。ＵＩ  未誘導Ｉ  誘導
【図４Ｂ】コンストラクトＤＥＤＤＬＩ−ＲＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。このコンストラクトは、４４．８ｋＤａの理論分子量を有する。Ｂ）ＦＰＬＣからの溶出プロファイル。タンパク質は、１２０から１２２ｍＭイミダゾールで溶出する。
【図４Ｃ】コンストラクトＤＥＤＤＬＩ−ＲＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。このコンストラクトは、４４．８ｋＤａの理論分子量を有する。Ｃ）Ｎｉ−アフィニティー精製後の純度。第一レーン：Ｍｗマーカー；ＣＬ：透明溶解物；レーン３〜９：通過画分；レーン１５〜２０：溶出ピーク。
【図４Ｄ】コンストラクトＤＥＤＤＬＩ−ＲＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥ。このコンストラクトは、４４．８ｋＤａの理論分子量を有する。Ｄ）ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲとＮＨＳ−ニコチンのカップリング前（下）及び後（上）の質量分析。
【図５】コンストラクトＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ中への蛍光標識されたＯＤＮ１８２６Ｆの封入を伴う又は伴わない相対蛍光単位（ＲＦＵ）。封入比率の増加について、ＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６Ｆのみ（黒色カラム）、及びＳＡＰＮ  ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ中に封入されるＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６Ｆ（破線カラム）についてのＲＦＵ値。ＯＤＮ１８２６ＦのＤＮＡ鎖に対する、ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲのタンパク質鎖のモル比を示す。
【図６】コンストラクトＤＥＤＤＬＩ−ＲＲへの蛍光標識されたＯＤＮ１８２６Ｆの封入後の相対蛍光単位（ＲＦＵ）の差。封入比率の増加について、ＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６Ｆのみ（黒色ダイヤモンド）、及びＤＥＤＤＬＩ−ＲＲに封入されたＣｐＧ試料における遊離のＣｐＧに相当する差分（破線四角）についてのＲＦＵ値２つの曲線は、密接に重なり合っている。−    ＲＦＵにおける差分の値は、特定のＣｐＧ封入比率で封入されるＣｐＧを有するＤＥＤＤＬＩ−ＲＲからのシグナルから、１：０．６の封入比率でのシグナルを引いて計算される。−    「差分」の曲線（破線四角）の割合の値は、割合から０．６を引いて計算される。
【図７】ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲの透過型電子顕微鏡写真。組換えで発現させたタンパク質のリフォールディング及び共集合後、試料を炭素被覆グリッド上に吸着させ、２％酢酸ウラニルでネガティブ染色した。ナノ粒子は、実施例１に記載の配列番号１の配列を有する。上欄及び下欄のバーは、それぞれ、２００ｎｍ及び５００ｎｍを表す。
【図８】封入されるＯＤＮ１８２６を用いた及び用いない、ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲに対する免疫応答。それぞれ、１０μｇ及び３０μｇの２のタンパク質濃度での３つの注入モード（ＩＭ、ＩＮ及びＩＶ）、及びそれらの相当する抗体価。０．８５μｇ及び２．５６μｇのＣｐＧは、それぞれ「＋」又は「−」記号で示された、１０μｇ及び３０μｇ用量で封入された。抗体価を、ＢＳＡ−ニコチン、すなわち、ＢＳＡと共有結合的に結合したニコチンでコートしたプレートに対するＥＬＩＳＡ結合アッセイにより決定した。免疫付与において、封入されたＣｐＧ由来の試料において、抗体価における顕著な増加を観察することができる。
【図９】コンストラクトＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ、２ＲＲ及び３ＲＲ中に、蛍光標識されたＯＤＮ１８２６Ｆの封入を伴う又は伴わない、相対蛍光単位（ＲＦＵ）。ＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６Ｆのみ（ダイヤモンド）、及び封入比率を増加させるため、ＳＡＰＮ  ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ（四角）、２ＲＲ（三角）及び３ＲＲ（円）中に封入されたＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６ＦについてのＲＦＵ値。ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲのタンパク質鎖対ＯＤＮ１８２６ＦのＤＮＡ鎖のモル比を示す。    ＣｐＧのみ（すなわち、封入を伴わない）    ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ    ２ＲＲ    ３ＲＲ
【図１０】封入されたＯＤＮ１８２６を用いた及び用いない、ＬＩＶＥＬＩベースのコンストラクトに対する免疫応答。それぞれ、５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスの群を、封入されたＣｐＧを用いて（ＬＩＶＥＬＩ１−ＲＲ及びＬＩＶＥＬＩ２−ＲＲ）又は用いずに（ＬＩＶＥＬＩ１及びＬＩＶＥＬＩ２）、３０μｇタンパク質の用量で免疫した。ＬＩＶＥＬＩ１−ＲＲ及びＬＩＶＥＬＩ２−ＲＲの投与量において封入されるＣｐＧの量は、約２．５μｇである。筋肉内に、２週間ごとに３回注入した。封入されたＣｐＧ由来の試料において抗体価における顕著な増加を観察することができる。
【図１１】ＬＩＶＥＬＩ１、ＬＩＶＥＬＩ２、ＬＩＶＥＬＩ１−ＲＲ及びＬＩＶＥＬＩ２−ＲＲの透過型電子顕微鏡写真。組換えで発現させたタンパク質のリフォールディング及び共集合後、試料を炭素被覆グリッドに吸収させ、２％酢酸ウラニルを用いて、ネガティブ染色した。ナノ粒子は、Ａ）ＬＩＶＥＬＩ１、Ｂ）ＬＩＶＥＬＩ２、Ｃ）ＬＩＶＥＬＩ１−ＲＲ及びＤ）ＬＩＶＥＬＩ２−ＲＲに相当し、それぞれ、実施例１０において記載される、配列番号２０、配列番号２１、配列番号１８及び配列番号１９の配列を有する。全てのパネルにおいて、バーは、２００ｎｍを表す。
【図１２】コンストラクトＣＣ−ＲＲ中への、蛍光標識されたＯＤＮ１８２６Ｆの封入を伴う又は伴わない相対蛍光単位（ＲＦＵ）。ＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６Ｆのみ（黒色カラム）、及び封入比率を増加させるためＳＡＰＮ  ＣＣ−ＲＲ（破線カラム）中に封入されたＣｐＧ−ＯＤＮ１８２６ＦについてのＲＦＵ値。ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲのタンパク質鎖対ＯＤＮ１８２６ＦのＤＮＡ鎖のモル比を示す。
【図１３】ＣＣ−ＲＲ−ＮＮの分子モデル。Ａ）第一の自己集合タンパク質鎖の単量体構築ブロックは、ｈｉｓタグ及びＣｅｌＴＯＳ（Ｘ１）第一のコイルドコイルドメイン（ＮＤ１）、第二のコイルドコイルドメイン（ＮＤ２）及びＣｅｌＴＯＳ（Ｙ１）の第二の分子から構成され、ここで、２つのコイルドコイルドメインは３つの正電荷を有する（Ｌ１）短いペプチドリンカーによりにより接合している。Ｂ）第二の自己集合タンパク質鎖の単量体構築ブロックは、ｈｉｓタグ及びＣｅｌＴＯＳ（Ｘ２）第一のコイルドコイルドメイン（ＮＤ３）、第二のコイルドコイルドメイン（ＮＤ４）及びフラジェリンのＤ０及びＤ１ドメイン（Ｙ２）から構成され、ここで２つのコイルドコイルドメインは、３つの正電荷（Ｌ２）を有する短いペプチドリンカーにより接合している。 Ｃ）ＣｐＧ分子（パネルＡ及びＢのサイズに合わせて描かれてはいない）リフォールディングの間、共集合及び封入が同時に起こる。Ｄ）第一及び第二のタンパク質鎖５８：２の共集合比率で６０のタンパク質鎖、及び中央の空洞中に封入される約３６のＣｐＧ分子を有する、集合タンパク質ナノ粒子。より明確にするために、粒子の内側の（負に帯電した）ＣｐＧ分子を可視化させるよう、円の内側のタンパク質鎖（正電荷を表す）を示していない。Ｅ）封入されたＣｐＧを有する共集合したＳＡＰＮの透過型電子顕微鏡写真。バーは、１００ｎｍを表す。
【図１４】ＲＲ−ＳＳＩＥＦの透過型電子顕微鏡写真。組換えで発現させたタンパク質のリフォールディング後、試料を炭素被覆グリッド上に吸着させ、２％酢酸ウラニルでネガティブ染色した。ナノ粒子は、ＲＲ−ＳＳＩＥＦに相当し、封入されたＣｐＧ  ＯＤＮ１５８５（配列番号３９）を有し、実施例１２に記載された配列番号３４の配列を有する。バーは、２００ｎｍを表す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
発明の詳細な説明
本発明において、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ結合部位は、ＳＡＰＮに核酸を封入することを目標としてＳＡＰＮの構造に組み込まれるよう記載される。ＳＡＰＮは、例えば、Raman S.K. et al. Nanomed 2006, 2(2)： 95-102； Pimentel T. A., et al. Chem Biol Drug Des. 2009. 73(1)： 53-61； Indelicato, G., et al. Biophys J. 2016, 110(3)： 646-660； Karch, C. P., et al. Nanomedicine 2016, 13(1)： 241-251に記載されている。ＳＡＰＮは、ＷＯ２００４０７１４９３、ＷＯ２００９１０９４２８及びＷＯ２０１５１０４３５２にも記載されている。第一の態様において、本発明は：
（ａ）コイルドコイルオリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、コイルドコイルオリゴマー化ドメインＮＤ２並びにさらなる置換部分Ｘ１及びＹ１を含む連続鎖からなる、式（Ｉ）
Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｙ１    （Ｉ）、
の複数の構築ブロックからなる自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）であって、
ＮＤ１は、ｍ個のＮＤ１サブユニットのオリゴマー（ＮＤ１）ｍを含むコイルドコイルオリゴマー化ドメインであり、
ＮＤ２は、ｎ個のＮＤ２サブユニットのオリゴマー（ＮＤ２）ｎを含むコイルドコイルオリゴマー化ドメインであり、
ｍ及びｎは、それぞれ２と１０の間の数であり、ただし、ｍは、ｎと等しくなく且つｎの倍数でなく、ｎは、ｍの倍数でなく、
Ｌ１は、生理学的状態で全体として少なくとも＋２の正電荷を有するペプチドリンカーであり、
Ｘ１は、存在しないか、又はさらに置換されていてもよい、１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列であり、
Ｙ１は、存在しないか、又はさらに置換されていてもよい、１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列であり、
式（Ｉ）の複数の構築ブロックは、コイルドコイルオリゴマー化ドメインＮＤ３、リンカーＬ２、コイルドコイルオリゴマー化ドメインＮＤ４並びにさらなる置換部分Ｘ２及びＹ２を含む連続鎖からなる式（ＩＩ）
Ｘ２−ＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４−Ｙ２    （ＩＩ）、
の複数の構築ブロックと共集合していてもよく、
ＮＤ３は、ｙ個のＮＤ３サブユニットのオリゴマー（ＮＤ３）ｙを含むコイルドコイルオリゴマー化ドメインであり、
ＮＤ４は、ｚ個のＮＤ４サブユニットのオリゴマー（ＮＤ４）ｚを含むコイルドコイルオリゴマー化ドメインであり、
ｙ及びｚは、それぞれ２と１０の間の数であり、ただし、ｙは、ｚと等しくなく及びｚの倍数でなく、及びｚはｙの倍数でなく、ここで、ＮＤ３はＮＤ１と同一であるか、又はＮＤ４はＮＤ２と同一であるか、又はＮＤ３及びＮＤ４の両方がそれぞれＮＤ１及びＮＤ２と同一であり、
Ｌ２は、生理学的状態で全体として少なくとも＋２の正電荷を有するペプチドリンカーであり、
Ｘ２は、存在しないか、又はさらに置換されていてもよい、１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列であり、
Ｙ２は、存在しないか、又はさらに置換されていてもよい、１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチド若しくはタンパク質配列である、
自己集合タンパク質ナノ粒子、
（ｂ）免疫刺激性物質であって、前記免疫刺激性物質は核酸誘導体であり、前記核酸誘導体は、前記ＳＡＰＮに封入される、免疫刺激性物質
を含む、対象において免疫応答を誘導するための組成物に関する。
【００１２】
驚くべきことに、ＳＡＰＮの２つのオリゴマー化ドメインを接続するリンカーが正に帯電したアミノ酸（複数）のストレッチを含み、結果としてリンカーの全体的な電荷を少なくともプラス２にする場合、負に帯電した核酸がＳＡＰＮに封入され得ることが見いだされた。これは、好都合なことに正電荷を持つリンカーはＳＡＰＮの中央の空洞に向かっており、結果として中央の空洞の正に帯電した表面コーティングを、ウイルスのゲノム材料を封入するウイルスカプシドの正に帯電した空洞と同種にさせるためである。にもかかわらず、これは、Ｔ１二十面体対称性を有するＳＡＰＮのように、６０のタンパク質鎖がＳＡＰＮのために集合し、結果として、リンカーあたり少なくとも２の正電荷を用いて１２０もの正電荷が中央の空洞の相対的に小さなスペースに並んでおり、結果としてリフォールディングの間ＳＡＰＮの形成に対抗する著しい反発力につながることは予期されていなかった。
【００１３】
ＳＡＰＮにおける核酸のこの封入にＳＡＰＮと核酸との特別な化学的付着を必要としないことは注目に値する。核酸の封入は、リフォールディング前のリフォールディング緩衝液への核酸の添加、及びその後、通常のリフォールディングプロトコルを用いて核酸の存在下で.ＳＡＰＮをリフォールディングした時に起こる。
【００１４】
ＳＡＰＮに封入され得る具体的な核酸は、免疫賦活性特性を含み得る。例えば、免疫付与プロトコルの間、封入されるＣｐＧを有するＳＡＰＮを用いると、全体として免疫応答が著しく増加する。従って、本発明のＳＡＰＮは、免疫応答を増加させ、結果としてＳＡＰＮベースのワクチンの免疫原性を効率良く増加させる、洗練された方法を提供する。
【００１５】
単量体構築ブロック
ペプチド（又はポリペプチド又はタンパク質）は、アミド結合により共有結合しているアミノ酸鎖又は配列である。ペプチドは、天然、改変された天然、部分的合成又は完全合成であってもよい。改変された天然、部分的合成又は完全合成は、天然に生じないことを意味すると理解される。用語、アミノ酸は、２０の必須天然α−Ｌ−アミノ酸から選択される天然に存在するアミノ酸、α−Ｄ−アミノ酸、６−アミノヘキサン酸、ノルロイシン、ホモシステイン若しくは類似のものなどの合成アミノ酸、並びにリン酸化セリン若しくはリン酸化チロシン又はｎ−オクタノイル−セリンなどの他の改変物、又は類似のものなどの、何らかの方法で電荷などの特定の特性を変更された天然に存在するアミノ酸のいずれもを包含する。アミノ酸の誘導体は、例えば、アミド結合を形成するアミノ基が、アルキル化され、又は側鎖アミノ基、ヒドロキシル基若しくはチオ基がアルキル化又はアシル化され、又は側鎖カルボキシ基がアミド化またはエステル化される、アミノ酸である。好ましくは、本発明のペプチド又はタンパク質は、２０の必須天然α−Ｌ−アミノ酸から選択されるアミノ酸を含む。
【００１６】
大まかな近似では、ペプチドは、それらのサイズに基づいて、タンパク質と区別することができる。すなわち、およそ、５０アミノ酸鎖又はそれ未満は、ペプチドであると考えることができ、一方、より長い鎖は、タンパク質であると考えることができる。従って、本明細書中に用いられる用語「ペプチド」は、５０アミノ酸又はそれ未満のアミノ酸鎖、好ましくは、２から５０アミノ酸のアミノ酸鎖を指し、本明細書中に用いられる用語、「タンパク質」は、５０より多いアミノ酸のアミノ酸鎖、好ましくは５１から１００００アミノ酸のアミノ酸鎖を指す。ジペプチドは、最も短いペプチドであり、単一のペプチド結合により接合している２アミノ酸からなる。同様に、トリペプチドは、３アミノ酸からなり、テトラペプチドは、４アミノ酸からなる、などである。ポリペプチドは、長く、連続し、かつ非分岐のペプチド鎖である。文献において、ペプチドをタンパク質と区別するサイズの境界は、いささか薄弱である。アミロイドベータなどの長い「ペプチド」をタンパク質と考え、反対に、インスリンなどのより小さなタンパク質をペプチドと呼ぶこともある。
【００１７】
本発明によるオリゴマー化ドメインは、コイルドコイルである。コイルドコイルは、主に３および４残基離れた疎水性残基の連続したパターンを有するタンパク質配列であり、それは、以下により詳細に説明するように、集合して多量体ヘリックスバンドルを形成する。
【００１８】
式（Ｉ）の単量体構築ブロックの構成要素ＮＤ１、ＮＤ２、Ｘ１及びＹ１、及び／又は式（ＩＩ）の単量体構築ブロックの構成要素（ＮＤ３、ＮＤ４、Ｘ２及びＹ２）は、任意で、標的化実体（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｅｎｔｉｔｙ）、又はナノ粒子のアジュバント特性を強化する置換部分によりさらに置換され得る。置換されるとは、単量体構築ブロック上の１つの化学基を、単量体構築ブロックと共有結合した置換部分を生じる別の化学基により、置き換えることを意味する。かかる置換部分は、免疫刺激性核酸、好ましくは、デオキシイノシンを含むオリゴデオキシヌクレオチド、デオキシウリジンを含むオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド、核酸分子を含む、ＣｐＧ、イミキモド、レシキモド、ガルジキモド（Ｇａｒｄｉｑｕｉｍｏｄ）、イノシン及びシチジン、又は類似のものであり得る。置換部分として考えられる特定の標的化実体は、ＥＲ標的シグナル、すなわち、小胞体（ＥＲ）へのタンパク質又はペプチドの輸送を誘導するシグナルペプチドである。
【００１９】
好ましい実施態様において、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の構築ブロックは、置換部分Ｘ１又は置換部分Ｙ１又は置換部分Ｘ２又は置換部分Ｙ２のいずれかを含む。
【００２０】
別の好ましい実施態様において、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の構築ブロックは、置換部分Ｘ１及びＹ１、又は置換部分Ｘ２及びＹ２を含む。従って、最も好ましい実施態様において、置換部分Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１又はＹ２は、例えば、Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｙ１として又はＸ２−ＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４−Ｙ２として、といった、タンパク質鎖の通常、一端での、好ましくは両端での伸張（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）を表し、組み合わさった単一の連続したタンパク質配列を作る、ペプチド又はタンパク質置換部分である。好都合なことに、かかる単一の連続したタンパク質鎖は、組換えタンパク質発現系において、１の単一分子として発現され得る。互いを独立に形成する（independently form each other）置換部分Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２及びＹ２は、１から１０００アミノ酸を含むペプチド又はタンパク質配列であり、好ましくは、Ｂ細胞エピトープとして又はフラジェリン若しくはＷＯ２０１５１０４３５２に記載のその４つのドメインのサブセットとして用いられ免疫応答を増強する、完全にフォールディングしたタンパク質又はタンパク質ドメインに相当する配列である。
【００２１】
フラジェリンは、４つのドメインＤ０、Ｄ１、Ｄ２及びＤ３から構成される分子構造を有する。タンパク質鎖は、Ｄ０ドメインにおけるＮ末端から始まり、他のドメインＤ１、Ｄ２及びＤ３を介して大きなループを分子の先端まで走り、ここで、それは、回転し、Ｄ３、Ｄ２及びＤ１を介して戻り、Ｄ０ドメインにおけるそのＣ末端をＮ末端の極めて近くに持って行く。フラジェリンは、自然免疫系の活性化の２つのモードを有する。第一のモードは、主に、そのＤ１ドメイン（Yoon et al., loc. cit.）の高度に保存された部分を介する、ＴＬＲ５受容体との結合による。活性化の別のモードは、主に、そのＤ０ドメインの高度に保存されたＣ末部分を介した、インフラマソームとの相互作用による（Lightfield K.L. et al., Nat Immunol. 2008, 9：1171−8）。
【００２２】
従って、好ましい実施態様において、置換部分Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２及びＹ２の少なくとも１つは、全長フラジェリン、例えば、全長サルモネラ・チフィリウムフラジェリン又は２若しくは３のドメインのみを含むフラジェリン、好ましくは少なくともＴＬＲ５結合ドメインＤ１を含むフラジェリン、より好ましくは、Ｄ０及びＤ１ドメインを含むフラジェリン、特に配列番号６に示されるフラジェリンである。欠けているドメイン（単数又は複数）は、残りのフラジェリン配列の２つの末端をつなぐ、１から２０アミノ酸の柔軟なリンカーセグメントにより置換されていてもよく、あるいは、それらは、完全にフォールディングしたタンパク質抗原により置き換えられていても良い。好ましい実施態様において、柔軟なリンカーは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を含む。柔軟なリンカー領域は、抗原の共有結合的カップリングに適切な付着部分を含んでいてもよい。従って、フラジェリンのＤ２及びＤ３ドメインを欠くフラジェリン誘導体コンストラクトは、Ｄ１及びＤ２ドメインのインターフェイスで、単にタンパク質鎖を接続することにより、作製することができる。同様に、Ｎ末端及びＣ末端を有するタンパク質抗原がＤ１及びＤ２間のインターフェイスでＮ末端及びＣ末端を接続させることができる場合に、先端ドメイン（Ｄ３、又はＤ２及びＤ３を一緒に、のいずれか）は、タンパク質抗原と置き換えることができる。先端ドメインＤ２及びＤ３は、抗原分子の共有結合的カップリングに適した残基を有するペプチド配列で置き換えることもできる。
【００２３】
別の好ましい実施態様において、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２及びＹ２は、互いに独立に、一続きの、１又はそれより多いＣＤ４又はＣＤ８エピトープのストリングも含んでもよい。別の好ましい実施態様において、Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２及びＹ２は、互いに独立に、これらのタイプの免疫学的関連ペプチド及びタンパク質配列の１以上の組み合わせを含んでもよい。
【００２４】
オリゴマーを形成する傾向とは、かかるタンパク質が、条件に応じてオリゴマーを形成することができること、例えば、変性条件下でそれらは単量体であるが、生理学的状態でそれらは例えば、二量体、三量体、四量体又は五量体を形成し得ることを意味する。事前に定義された条件下でそれらは１つの単一のオリゴマー化状態をとり、それは、ナノ粒子形成に必要である。しかしながら、それらのオリゴマー化状態は、例えば、塩濃度が減少する際に三量体から二量体に（Burkhard P. et al., Protein Science 2000, 9：2294-2301）又はｐＨを減少させると五量体から単量体にといった、条件を変化する際に変化し得る。
【００２５】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）に記載の構築ブロック構造は、ウイルスカプシドタンパク質と明確に区別される。ウイルスカプシドは、６０又はその倍数のオリゴマーを形成する１の単一タンパク質、例えば肝炎ウイルスＢ粒子（ＥＰ１  ２６２  ５５５、ＥＰ０  ２０１  ４１６）、又は共集合してウイルスカプシド構造を形成する１より多いタンパク質のいずれかから構成される。それは、ウイルスのタイプに応じて、二十面体とは別の他の形状にも採用することができる（Fender P. et al., Nature Biotechnology 1997, 15：52-56）。本発明のＳＡＰＮは、（ａ）ウイルスカプシドタンパク質以外から構築され、且つ（ｂ）ナノ粒子の中央における空洞は、全ウイルスゲノムのＤＮＡ／ＲＮＡを収容するには小さすぎるため、ウイルス様粒子とも明確に区別される。
【００２６】
タンパク質オリゴマー化ドメインは、よく知られている（Burkhard P. et al., Trends Cell Biol 2001, 11：82-88）。本発明において、オリゴマー化ドメインは、コイルドコイルドメインである。コイルドコイルは、通常、７アミノ酸（ヘプタッドリピート）又は１１アミノ酸（ウンデカッドリピート）の配列中に、主として３および４残基離れた疎水性残基の連続したパターンを有するタンパク質配列であり、それは、集合（フォールディング）して多量体ヘリックスバンドルを形成する。３及び４残基間隔が多少不規則に分布した配列を有するコイルドコイルもまた考えられる。疎水性残基は、特に疎水性アミノ酸Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びＴｒｐである。主に疎水性とは、残基の少なくとも５０％が言及した疎水性アミノ酸から選択されなければならないことを意味する。
【００２７】
ヘプタッドリピート及びコイルドコイル
例えば、好ましい式（Ｉ）及び／又は（ＩＩ）の単量体構築ブロックにおいて、ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及び／又はＮＤ４は、ヘプタッドリピート又はウンデカッドリピート、より好ましくは、ヘプタッドリピート、特に式
［ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）］Ｘ    （ＩＩＩａ）、
［ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）］Ｘ    （ＩＩＩｂ）、
［ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）］Ｘ    （ＩＩＩｃ）、
［ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）］Ｘ    （ＩＩＩｄ）、
［ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）］Ｘ    （ＩＩＩｅ）、
［ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）］Ｘ    （ＩＩＩｆ）、
［ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）］Ｘ    （ＩＩＩｇ）、
のいずれかのタンパク質を含み、
ここで、ａａは、アミノ酸又はそれらの誘導体を意味し、ａａ（ａ）、ａａ（ｂ）、ａａ（ｃ）、ａａ（ｄ）、ａａ（ｅ）、ａａ（ｆ）及びａａ（ｇ）は、同一の若しくは異なるアミノ酸又はそれらの誘導体、好ましくはａａ（ａ）及びａａ（ｄ）は、同一の若しくは異なる疎水性アミノ酸又はそれらの誘導体であり；且つｘは２から２０の間の数、好ましくは３から１０の間の数である。
【００２８】
ヘプタッドは、式ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）（ＩＩＩａ）又は式（ＩＩＩｂ）から（ＩＩＩｇ）のその並べ替えのいずれかのヘプタペプチドである。
【００２９】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）の単量体構築ブロックであって、タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及び／又はＮＤ４が
（１）式（ＩＩＩａ）から（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質であって、ｘは３であり且つａａ（ａ）及びａａ（ｄ）は、これらの６アミノ酸について表１からのスコアの合計が少なくとも１４であるように２０の天然α−Ｌ−アミノ酸から選択され、且つかかるタンパク質は、最大１７のさらなるヘプタッドを含む、タンパク質；又は
（２）式（ＩＩＩａ）から（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質であって、ｘは３でありａａ（ａ）及びａａ（ｄ）は、これらの６アミノ酸について表１からのスコアの合計が少なくとも１２であるように２０の天然α−Ｌ−アミノ酸から選択され、ただし、１のアミノ酸ａａ（ａ）は、隣接するヘプタッドのアミノ酸ａａ（ｄ）又はａａ（ｇ）にヘリックス間塩架橋を形成することができる荷電アミノ酸であるか、あるいは、１のアミノ酸ａａ（ｄ）は、隣接するヘプタッドのアミノ酸ａａ（ａ）又はａａ（ｅ）にヘリックス間塩架橋を形成することができる荷電アミノ酸であり、かかるタンパク質は最大２のさらなるヘプタッドを含む、タンパク質
を含む、単量体構築ブロックが好ましい。隣接するヘプタッドのアミノ酸にヘリックス間塩架橋を形成することができる荷電アミノ酸は、例えば、他のアミノ酸がＬｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓである場合に、Ａｓｐ又はＧｌｕであり、あるいはその逆である。
【００３０】
表１：嗜好性（コイルドコイル傾向）の決定のためのアミノ酸のスコア
2020510650.tif 000002
【００３１】
タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及び／又はＮＤ４が、以下の好ましいタンパク質から選択されるタンパク質を含む、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の単量体構築ブロックもまた好ましい：
（１１）ａａ（ａ）は、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ及びＭｅｔ及びそれらの誘導体から選択され、且つ
ａａ（ｄ）は、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ及びＩｌｅ及びそれらの誘導体から選択される、
式（ＩＩＩａ）から（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質。
（１２）１つのａａ（ａ）は、Ａｓｎであり、且つ他のａａ（ａ）は、Ａｓｎ、Ｉｌｅ及びＬｅｕから選択され、且つａａ（ｄ）はＬｅｕである、式（ＩＩＩａ）から（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質。かかるタンパク質は、通常、二量体化ドメインである。
（１３）ａａ（ａ）及びａａ（ｄ）は、いずれもＬｅｕであるか、又はいずれもＩｌｅである、式（ＩＩＩａ）から（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質。かかるタンパク質は、通常、三量体化ドメインである。
（１４）ａａ（ａ）及びａａ（ｄ）は、いずれもＴｒｐである、式（ＩＩＩａ）から（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質。かかるタンパク質は、通常、五量体化ドメインである。
（１５）ａａ（ａ）及びａａ（ｄ）はいずれもＰｈｅである、式（ＩＩＩａ）から（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質。かかるタンパク質は、通常、四量体化ドメインである。
（１６）ａａ（ａ）及びａａ（ｄ）は、いずれも、Ｔｒｐ又はＰｈｅのいずれかである、式（ＩＩＩａ）から（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質。かかるタンパク質は、通常、五量体化ドメインである。
（１７）ａａ（ａ）は、Ｌｅｕ又はＩｌｅのいずれかであり、且つ１つのａａ（ｄ）は、Ｇｌｎであり、且つ他のａａ（ｄ）はＧｌｎ、Ｌｅｕ及びＭｅｔから選択される、式（ＩＩＩａ）から（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質。かかるタンパク質は、五量体化ドメインになる可能性を有する。
他の好ましいタンパク質は、上文で定義したタンパク質（１）、（２）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）  （１６）及び（１７）であって、さらに、（１８）少なくとも１つのａａ（ｇ）は、Ａｓｐ及びＧｌｕから選択され、続くヘプタッドにおいてａａ（ｅ）はＬｙｓ、Ａｒｇ又はＨｉｓであり；且つ／又は
（１９）少なくとも１つのａａ（ｇ）はＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓから選択され、且つ続くヘプタッドにおいてａａ（ｅ）はＡｓｐ又はＧｌｕであり、且つ／又は
（２０）少なくとも１のａａ（ａからｇ）は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓから選択され、配列において３又は４アミノ酸離れたａａ（ａからｇ）はＡｓｐ又はＧｌｕである。かかるアミノ酸ａａ（ａからｇ）のペアは、例えばａａ（ｂ）及びａａ（ｅ）又はａａ（ｆ）である。
【００３２】
ＰＣＯＩＬＳ（http：//toolkit.tuebingen.mpg.de/pcoils； Gruber M. et al., J. Struct. Biol. 2006, 155(2)： 140-5）又はＭＵＬＴＩＣＯＩＬ（http：//groups.csail.mit.edu/cb/multicoil/cgi−bin/multicoil.cgi）などのコイルドコイル予測プログラムは、コイルドコイル形成タンパク質配列を予測することができる。従って、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の単量体構築ブロックにおいて、ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及び／又はＮＤ４は、コイルドコイル予測プログラムＰＣＯＩＬＳにより１４、２１又は２８のウィンドウ・サイズの少なくとも１つを用い、その全てのアミノ酸について０．９より高い確率でコイルドコイルを形成すると予測される少なくとも２のヘプタッドリピートの長さの配列を含むタンパク質を含む。
【００３３】
より好ましい式（Ｉ）又は（ＩＩ）の単量体構築ブロックにおいて、ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及び／又はＮＤ４は、１４、２１又は２８のウィンドウ・サイズの少なくとも１つを用いてコイルドコイル予測プログラムＰＣＯＩＬＳにより、その全てのアミノ酸について０．９より高い確率でコイルドコイルを形成すると予測される、３ヘプタッドリピートの長さの少なくとも１の配列を含むタンパク質を含む。
【００３４】
別のより好ましい式（Ｉ）又は（ＩＩ）の単量体構築ブロックにおいて、ＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及び／又はＮＤ４は、１４、２１又は２８のウィンドウ・サイズの少なくとも１つを用いてコイルドコイル予測プログラムＰＣＯＩＬＳにより、その全てのアミノ酸について０．９より高い確率でコイルドコイルを形成すると予測される、少なくとも２つの別々の、２ヘプタッドリピートの長さの配列を含むタンパク質を含む。
【００３５】
ＲＣＳＢ構造データベース
既知のコイルドコイル配列は、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（http：//www.rcsb.org）などのデータバンクから取得し得る。
【００３６】
五量体コイルドコイル
五量体コイルドコイルは、「コイルド」又は「ジッパー」についてのテキスト検索と組み合わせて、「タンパク質対称性は環状Ｃ５である」との弁別子（discriminator）を用いた、生物学的集合における対称性についての検索によりＲＣＳＢデータベース（http：//www.rcsb.org/pdb/）から取得することができる。適切なエントリーのリストは、４ＰＮ８、４ＰＮＤ、４ＷＢＡ、３Ｖ２Ｎ、３Ｖ２Ｐ、３Ｖ２Ｑ、３Ｖ２Ｒ、４ＥＥＢ、４ＥＥＤ、３ＭＩＷ、１ＭＺ９、１ＦＢＭ、１ＶＤＦ、２ＧＵＶ、２ＨＹＮ、１ＺＬＬ、１Ｔ８Ｚを含む。
【００３７】
四量体、三量体及び二量体コイルドコイル
同様に、それぞれ、「コイルド」又は「ジッパー」についてのテキスト検索と組み合わせて、四量体コイルドコイルは、「タンパク質対称性は「環状Ｃ４」である」を用いて取得することができ、三量体コイルドコイルは、「タンパク質対称性は「環状Ｃ３」である」を用いて取得することができ、及び二量体コイルドコイルは、「タンパク質対称性は「環状Ｃ２」である」を用いて取得することができる。
【００３８】
四量体コイルドコイルについて、これは、以下の適切なエントリーを生じる：  ５Ｄ６０、５Ｄ５Ｙ、５ＡＬ６、４ＷＢ４、４ＢＨＶ、４Ｃ５Ｑ、４ＧＪＷ、４Ｈ７Ｒ、４Ｈ８Ｆ、４ＢＸＴ、４ＬＴＯ、４ＬＴＰ、４ＬＴＱ、４ＬＴＲ、３ＺＤＯ、３ＲＱＡ、３Ｒ４Ａ、３Ｒ４Ｈ、３ＴＳＩ、３Ｋ４Ｔ、３Ｆ６Ｎ、２Ｏ６Ｎ、２ＯＶＣ、２Ｏ１Ｊ、２Ｏ１Ｋ、２ＡＧ３、２ＣＣＥ、１ＹＢＫ、１Ｕ９Ｆ、１Ｕ９Ｇ、１Ｕ９Ｈ、１ＵＳＤ、１ＵＳＥ、１ＵＮＴ、１ＵＮＵ、１ＵＮＶ、１ＵＮＷ、１ＵＮＸ、１ＵＮＹ、１ＵＮＺ、１ＵＯ０、１ＵＯ１、１ＵＯ２、１ＵＯ３、１ＵＯ４、１ＵＯ５、１Ｗ５Ｉ、１Ｗ５Ｌ、１ＦＥ６、１Ｇ１Ｉ、１Ｇ１Ｊ、１ＥＺＪ、１ＲＨ４、１ＧＣＬ。
三量体コイルドコイルについて、これは、以下の適切なエントリーを生じる：  ５ＴＯＨ、５ＴＯＩ、５Ｋ９２、５ＫＢ０、５ＫＢ１、５ＫＢ２、５ＫＫＶ、５ＥＦＭ、２Ｎ６４、５ＡＢＳ、５ＩＥＡ、５ＡＰＰ、５ＡＰＱ、５ＡＰＳ、５ＡＰＹ、５ＡＰＺ、５Ｄ５Ｚ、４ＹＰＣ、４ＹＶ３、４ＣＧＢ、４ＣＧＣ、４ＣＪＤ、４Ｒ０Ｒ、４ＵＷ０、４Ｐ６７、４ＯＸＭ、３Ｗ８Ｖ、３Ｗ９２、３Ｗ９３、４Ｉ２Ｌ、４Ｋ８Ｕ、４ＪＢＺ、３ＶＴＱ、４Ｌ１Ｒ、４ＪＤＯ、４Ｊ４Ａ、４Ｅ５２、３ＶＹＩ、３ＺＭＦ、３ＶＵ５、３ＶＵ６、２ＹＮＹ、２ＹＮＺ、２ＹＯ０、２ＹＯ１、２ＹＯ２、４Ｇ１Ａ、４ＧＩＦ、３ＴＱ２、４ＤＺＫ、４ＤＺＬ、４ＤＺＮ、３ＴＥ３、３Ｒ４８、３ＳＷＦ、３ＳＷＹ、３ＰＲ７、２ＹＫＯ、２ＹＫＰ、２ＹＫＱ、３ＮＴＮ、３ＰＰ５、３ＭＫＯ、３ＭＧＮ、３ＮＷＡ、３ＮＷＤ、３ＮＷＦ、３Ｌ３５、３Ｌ３６、３Ｌ３７、３Ｍ９Ｂ、３Ｍ９Ｄ、２Ｘ６Ｐ、３ＬＪＭ、３ＡＨＡ、３Ｈ７Ｘ、３Ｈ７Ｚ、３ＬＴ６、３ＬＴ７、３ＧＪＰ、２ＫＰ８、３ＫＰＥ、２ＷＰＲ、２ＷＰＳ、２ＷＰＹ、２ＷＰＺ、２ＷＱ０、２ＷＱ１、２ＷＱ２、２ＷＱ３、３ＨＦＣ、３ＨＦＥ、３ＨＲＮ、３ＨＲＯ、３Ｈ５Ｆ、３Ｈ５Ｇ、２ＷＧ５、２ＷＧ６、２Ｗ６Ｂ、２ＪＪＬ、２ＶＲＳ、３ＥＦＧ、３ＤＵＺ、２ＯＴ５、２Ｚ２Ｔ、２ＱＩＨ、３ＢＫ６、２Ｏ７Ｈ、２Ｒ３２、２ＪＧＯ、２Ｑ７Ｃ、２Ｑ３Ｉ、２Ｑ５Ｕ、２ＩＢＬ、１ＺＶ８、１ＺＶＢ、２ＦＸＰ、１ＷＴ６、２ＡＫＦ、１ＴＧＧ、１ＳＬＱ、１Ｓ９Ｚ、１ＰＷ９、１ＰＷＢ、１Ｍ７Ｌ、１ＧＺＬ、１ＫＹＣ、１ＫＦＭ、１ＫＦＮ、１ＩＪ０、１ＩＪ１、１ＩＪ２、１ＩＪ３、１ＨＱＪ、１ＱＵ１、１Ｂ０８、１ＣＺＱ、１ＣＵＮ、１ＳＶＦ、１ＣＥ０、１ＰＩＱ、１ＡＱ５、１ＡＶＹ、１ＨＴＮ、１ＡＡ０、１ＺＩＪ、１ＺＩＭ、１ＣＯＩ、１ＳＷＩ、１ＧＣＭ、１ＨＵＰ。
【００３９】
二量体コイルドコイルについて、これは、以下の適切なエントリーを生じる：５Ｍ９７、５Ｍ９Ｅ、５ＦＩＹ、５Ｆ４Ｙ、５Ｄ３Ａ、５ＨＭＯ、５ＥＹＡ、５ＩＸ１、５ＩＸ２、５ＪＨＦ、５ＪＶＭ、５ＪＶＰ、５ＪＶＲ、５ＪＶＳ、５ＪＶＵ、５ＪＸ１、５ＦＣＮ、５ＨＨＥ、２Ｎ９Ｂ、４ＺＲＹ、４Ｚ６Ｙ、４ＹＴＯ、４ＺＩ３、５ＡＪＳ、５Ｆ３Ｋ、５Ｆ５Ｒ、５ＨＵＺ、５ＤＪＮ、５ＤＪＯ、５ＣＨＸ、５ＣＪ０、５ＣＪ１、５ＣＪ４、５Ｃ９Ｎ、５ＣＦＦ、４ＷＨＶ、３ＷＵＴ、３ＷＵＵ、３ＷＵＶ、４ＺＱＡ、４ＸＡ３、４ＸＡ４、４ＰＸＪ、４ＹＶＣ、４ＹＶＥ、５ＢＭＬ、５ＡＬ７、４ＷＯＴ、４ＣＧ４、５ＡＭＯ、４ＷＩＩ、４ＷＩＫ、４ＲＳＪ、４ＣＦＧ、４Ｒ３Ｑ、４ＷＩＤ、４ＣＫＧ、４ＣＫＨ、４ＮＳＷ、４Ｗ７Ｐ、４ＱＱ４、４ＯＪＫ、４ＴＬ１、４ＯＨ９、４ＬＰＺ、４Ｑ６２、４Ｌ２Ｗ、４Ｍ３Ｌ、４ＣＫＭ、４ＣＫＮ、４Ｎ６Ｊ、４ＬＴＢ、４ＬＲＺ、２ＭＡＪ、２ＭＡＫ、４ＮＡＤ、４ＨＷ０、４ＢＴ８、４ＢＴ９、４ＢＴＡ、４ＨＨＤ、４Ｍ８Ｍ、４Ｊ３Ｎ、４Ｌ６Ｑ、４Ｃ１Ａ、４Ｃ１Ｂ、４ＧＤＯ、４ＢＷＫ、４ＢＷＰ、４ＢＷＸ、４ＨＵ５、４ＨＵ６、４Ｌ９Ｕ、４Ｇ０Ｕ、４Ｇ０Ｖ、４Ｇ０Ｗ、４Ｌ３Ｉ、４Ｇ７９、４ＧＥＵ、４ＧＥＸ、４ＧＦＡ、４ＧＦＣ、４ＢＬ６、４ＪＭＲ、４ＪＮＨ、２ＹＭＹ、４ＨＡＮ、３ＶＭＹ、３ＶＭＺ、３ＶＮ０、４ＡＢＸ、３Ｗ０３、２ＬＷ９、４ＤＺＭ、４ＥＴＯ、３ＴＮＵ、３ＴＨＦ、４Ｅ８Ｕ、３ＶＭＸ、４Ｅ６１、３ＶＥＭ、３ＶＢＢ、４ＤＪＧ、３ＴＶ７、３ＳＴＱ、３Ｖ８Ｓ、３Ｑ８Ｔ、３Ｕ１Ｃ、３ＱＨ９、３ＡＺＤ、３ＯＮＸ、３ＯＫＱ、３ＱＸ３、３ＳＪＡ、３ＳＪＢ、３ＳＪＣ、２Ｌ２Ｌ、３ＱＦＬ、３ＱＫＴ、２ＸＶ５、２Ｙ３Ｗ、３Ｑ０Ｘ、３ＡＪＷ、３ＮＣＺ、３ＮＩ０、２ＸＵ６、３Ｍ９１、３ＮＭＤ、３ＬＬＬ、３ＬＸ７、３ＭＥ９、３ＭＥＵ、３ＭＥＶ、３ＡＢＨ、３ＡＣＯ、３ＩＡＯ、３ＨＬＳ、２ＷＭＭ、３Ａ６Ｍ、３Ａ７Ｏ、２ＷＶＲ、３ＩＣＸ、３ＩＤ５、３ＩＤ６、３ＨＮＷ、３Ｉ１Ｇ、２Ｋ６Ｓ、３ＧＨＧ、３Ｇ１Ｅ、２Ｗ６Ａ、２Ｖ５１、３ＥＲＲ、３Ｅ１Ｒ、２ＶＹ２、２ＺＲ２、２ＺＲ３、３ＣＬ３、３Ｄ９Ｖ、２Ｚ１７、２ＪＥＥ、３ＢＢＰ、３ＢＡＳ、３ＢＡＴ、２ＱＭ４、２Ｖ７１、２ＮＯ２、２ＰＯＮ、２Ｖ０Ｏ、２ＤＱ０、２ＤＱ３、２Ｑ２Ｆ、２ＮＲＮ、２Ｅ７Ｓ、２Ｈ９Ｖ、２ＦＸＭ、２ＨＪＤ、２ＧＺＤ、２ＧＺＨ、２ＦＶ４、２Ｆ２Ｕ、２ＥＵＬ、２ＥＳＭ、２ＥＴＫ、２ＥＴＲ、１ＺＸＡ、１ＹＩＢ、１ＹＩＧ、１ＸＳＸ、１ＲＦＹ、１Ｕ０Ｉ、１ＸＪＡ、１Ｔ３Ｊ、１Ｔ６Ｆ、１Ｒ７Ｊ、１ＵＩＩ、１ＰＬ５、１Ｓ１Ｃ、１Ｐ９Ｉ、１Ｒ４８、１ＵＲＵ、１ＯＶ９、１ＵＩＸ、１ＮＯ４、１ＮＹＨ、１ＭＶ４、１ＬＲ１、１Ｌ８Ｄ、１ＬＪ２、１ＫＱＬ、１ＧＸＫ、１ＧＸＬ、１ＧＫ６、１ＪＲ５、１ＧＭＪ、１ＪＡＤ、１ＪＣＨ、１ＪＢＧ、１ＪＴＨ、１ＪＹ２、１ＪＹ３、１ＩＣ２、１ＨＣＩ、１ＨＦ９、１ＨＢＷ、１ＦＸＫ、１Ｄ７Ｍ、１ＱＵＵ、１ＣＥ９、２Ａ９３、１ＢＭ９、１Ａ９３、１ＴＭＺ、２ＡＡＣ、１ＺＩＩ、１ＺＩＫ、１ＺＩＬ、２ＡＲＡ、２ＡＲＣ、１ＪＵＮ、１ＹＳＡ、２ＺＴＡ。しかしながら、周期的な二回対称性を有する二量体コイルドコイルは、平行コイルドコイル及び逆平行コイルドコイルを選択するため、この二量体構造のリストは逆平行コイルドコイルをも含む。構造の外観検査により、逆平行二量体コイルドコイルと平行コイルドコイルとを容易に区別することができる。
【００４０】
五量体、四量体、三量体及び二量体コイルドコイルについてのそれらのエントリーのいくつはさらなるタンパク質ドメインを含むものもあるが、外観検査時に、それらのさらなるドメインは容易に検出し取り除くことができる。
【００４１】
代替のウェブサイトとして、http：//coiledcoils.chm.bris.ac.uk/ccplus/search/periodic_table/は、二量体、三量体、四量体及び五量体（２ＧＵＶなど）コイルドコイルからのコイルドコイル構造の周期表を提供する。
【００４２】
これらの五量体、四量体、三量体及び二量体コイルドコイルドメインのアミノ酸改変も想定される。かかる改変は、例えば、位置ａａ（ｅ）、ａａ（ｇ）、ａａ（ｂ）、ａａ（ｃ）又はａａ（ｆ）での、好ましくはａａ（ｂ）、ａａ（ｃ）又はａａ（ｆ）の位置での、最も好ましくはａａ（ｆ）の位置での、オリゴマーの外側の非コア残基（ａａ（ａ）及びａａ（ｄ））であるアミノ酸の置換であってもよい。可能性のある改変は、これらのオリゴマーをより可溶性にするための、荷電残基への置換である。これらのドメインのより短いコンストラクトも想定される。
【００４３】
他のアミノ酸改変は、例えば、オリゴマーを安定化する目的のための、コア位置（ａａ（ａ）及びａａ（ｄ））でのアミノ酸の置換であってもよく、すなわち、あまり好ましくないコア残基をより好ましい残基と置き換えることによるものであってもよく、すなわち、原則として、表１により、より低いコイルドコイル傾向を有するコア位置での残基は、それらがコイルドコイルのオリゴマー化状態を変化させない場合、より高いコイルドコイル傾向を有する残基と置き換えることができる。
【００４４】
本明細書中使用される用語、「アミノ酸改変」は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、及び／又は欠失を含む。本明細書中「アミノ酸置換（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」又は「置換」は、親ポリペプチド配列における、特定の位置でのアミノ酸の別のアミノ酸への置き換えを意味する。例えば、置換Ｒ９４Ｋは、位置９４のアルギニンがリジンに置き換えたバリアントポリペプチドを指す。本明細書における目的のため、複数の置換は典型的にはスラッシュで区切られる。例えば、Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖは、置換Ｒ９４Ｋ及びＬ７８Ｖを含むダブルバリアントを指す。本明細書中に用いられる「アミノ酸挿入」又は「挿入」は、親ポリペプチド配列における、特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、インサート９４は、位置９４での挿入を指定する。本明細書中に用いられる「アミノ酸欠失」又は「欠失」は、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４−は、位置９４でのアルギニンの欠失を指定する。
【００４５】
本明細書に記載のアミノ酸改変を含むペプチド又はタンパク質は、親（改変されていない）ペプチド又はタンパク質と、好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは、少なくとも約９５％、特に９９％のアミノ酸配列同一性を持つであろう。好ましくは、アミノ酸改変は、保存的改変である。
【００４６】
本明細書中に用いられる、用語「保存的改変」又は「保存的配列改変」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特性に著しく影響を及ぼすものでなく又は抗体の結合特性を変更するものでない、アミノ酸改変を指すことを意図する。かかる保存的改変は、アミノ酸置換、挿入及び欠失を含む。改変は、部位特異的変異生成及びＰＣＲ媒介性変異生成などの当該技術分野で知られた標準的技術により、本発明のタンパク質に導入され得る。
【００４７】
保存的アミノ酸置換とは、それにおいてアミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（例、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例、アスパラギン酸、グルタミン酸）、極性無電荷側鎖（例、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。
【００４８】
特定のコイルドコイル
実施例に記載される、コイルドコイル配列及び単量体構築ブロックは、最も好ましい。
【００４９】
リンカー
リンカーは、第一のオリゴマー化ドメインの最後のコア残基（ａａ（ａ）又はａａ（ｄ）のいずれか）から、第二のコイルドコイルオリゴマー化ドメインの最初のコア残基（ａａ（ａ）又はａａ（ｄ）のいずれか）に、２つのコイルドコイルオリゴマー化ドメインを接続する。
【００５０】
ペプチドリンカーＬ１及び／又はＬ２は、通常、３から５０個のアミノ酸を有する、好ましくは３から１０個のアミノ酸を有する、より好ましくは、４から９個のアミノ酸を有するペプチド鎖から構成される。好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、少なくとも２アミノ酸、少なくとも４アミノ酸、少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、又は少なくとも１０アミノ酸からなる。より好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、少なくとも４アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、又は少なくとも９アミノ酸からなる。さらにより好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、少なくとも４アミノ酸からなる。
【００５１】
さらに好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、２アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、又は１０アミノ酸からなる。より好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、４アミノ酸、７アミノ酸、又は９アミノ酸からなる。さらにより好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、４アミノ酸からなる。
【００５２】
特定の実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、配列番号４に示されるアミノ酸配列、配列番号１２に示されるアミノ酸配列、配列番号１４に示されるアミノ酸配列及び配列番号１５に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号４に示されるアミノ酸配列及び配列番号１２に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含み、より好ましくは、配列番号４に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５３】
ペプチドリンカーＬ１及び／又はＬ２は、互いに独立に、通常、生理学的状態で、２の及び１０、好ましくは３から７の正電荷を含む。生理学的状態は、水性溶液中、ｐＨ６．５から８．５で、好ましくは約７．０から７．６のｐＨでの状態に相当する。好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、少なくとも２の正電荷、少なくとも３の正電荷、少なくとも４の正電荷、少なくとも５の正電荷、少なくとも６の正電荷、少なくとも７の正電荷、少なくとも８の正電荷、少なくとも９の正電荷、又は少なくとも１０の正電荷を含む。より好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、少なくとも３の正電荷、少なくとも５の正電荷、又は少なくとも７の正電荷を含む。さらにより好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、少なくとも３の正電荷を含む。
【００５４】
さらに好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、２の正電荷、３の正電荷、４の正電荷、５の正電荷、６の正電荷、７の正電荷、８の正電荷、９の正電荷、又は１０の正電荷を含む。より好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、３の正電荷、５の正電荷、又は７の正電荷を含む。さらにより好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、３の正電荷を含む。
【００５５】
好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、ＲＲＧＲ（配列番号４）又はＫＫＧＫ（配列番号１２）などの少なくとも１のグリシン残基を含む。
【００５６】
好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及び／又はペプチドリンカーＬ２は、互いに独立に、少なくとも４アミノ酸からなり、生理学的状態で全体として少なくとも＋３の正電荷を有する。
【００５７】
好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１及びペプチドリンカーＬ２は同一である。
【００５８】
核酸誘導体
本明細書中に用いられる用語、核酸誘導体は、一本鎖ＤＮＡを含む。シトシンヌクレオチドがメチル化されておらずグアニンが続くシトシン、ＲＮＡウイルス由来の一本鎖ＲＮＡ、ＲＮＡウイルス由来の二本鎖ＲＮＡ及びＲＮＡウイルス由来の二本鎖ＲＮＡを模倣する高分子複合体を含む。
【００５９】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を模倣する高分子複合体は、例えば、ポリＩ：ポリＣ（ｐＩＣ）であり、それは、好ましい。ｐＩＣは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を模倣する巨大な合成高分子複合体である。ｐＩＣの調製物は、鎖長、溶解性及び毒性を含む他の生物学的特性の分布が様々である。
【００６０】
グアニンが続くシトシンを含む一本鎖ＤＮＡであってシトシンヌクレオチドがメチル化されていない一本鎖ＤＮＡは、通常、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である。合成分子であるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）は、典型的なリン酸ジエステル骨格の代わりに、完全にまたは部分的にホスホロチオエート骨格を有し、任意で５’エンド、３’エンドにポリＧのテイルを有するという点で、天然微生物ＤＮＡとは異なる。ポリＧテイルは、高分子量集合体をもたらし細胞への取り込みを増強する分子間テトラドを形成し、ホスホロチオエートを有する改変は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＤＮａｓｅなどのヌクレアーゼによる分解からＯＤＮを保護する。
【００６１】
多くの異なる配列は、ＣｐＧ二量体の数と位置、並びにＣｐＧ二量体に隣接する正確な塩基配列が異なるＴＬＲ９を刺激することを示されてきた。それは、ＣｐＧ  ＯＤＮの５つの非公式クラス又はカテゴリーに分類され得る。これらのクラスは、それらの配列、二次構造及びヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）への効果に基づき、クラスＡ（タイプＤ）、クラスＢ（タイプＫ）、クラスＣ、クラスＰ及びクラスＳと呼ばれる。
【００６２】
クラスＡ  ＯＤＮは、大量のタイプＩインターフェロン、最も重要なものであるＩＦＮαの産生を刺激し、形質細胞様樹状細胞の成熟を誘導するという点で、クラスＢ  ＯＤＮと明確に異なる。クラスＡ  ＯＤＮは、間接的なサイトカインシグナリングを介したＮＫ細胞の強力な活性化剤でもある。他方、クラスＢ  ＯＤＮは、ヒト単球及びＢ細胞成熟の強力な刺激剤である。それらは、形質細胞様樹状細胞の成熟も刺激し、それらは、クラスＡ  ＯＤＮよりも少ない範囲でこれを行う。それらは、非常に少ない量のＩＦＮαも刺激する。
【００６３】
クラスＡ
ＯＤＮ２２１６は、クラスＡ  ＣｐＧ  ＯＤＮであり、ヒトＴＬＲ９に最適なリガンドである。それは、配列５’−ｇｇＧＧＧＡＣＧＡ：ＴＣＧＴＣｇｇｇｇｇｇ−３’（配列番号４３）を有する２０ｍｅｒである。大文字に示される塩基は、リン酸ジエステルであり、小文字に示される塩基は、ヌクレアーゼ耐性ホスホロチオエートである。パリンドロームに下線を引いた。ＯＤＮ２３３６は、ヒトＴＬＲ９について嗜好性を有する、別のＡ−クラスＣｐＧ  ＯＤＮである。それは、配列５’−ｇｇｇＧＡＣＧＡＣ：ＧＴＣＧＴＧｇｇｇｇｇｇ−３’（配列番号４４）を有する２１ｍｅｒである。
【００６４】
クラスＢ
ＯＤＮ  １８２６は、マウスＴＬＲ９に特異的なクラスＢ  ＣｐＧ  ＯＤＮである。それは、配列５’−ｔｃｃａｔｇａｃｇｔｔｃｃｔｇａｃｇｔｔ−３’（配列番号１３）を有する２０ｍｅｒである。全ての塩基は、ヌクレアーゼ耐性のホスホロチオエート類である。ＯＤＮ２００６は、クラスＢ  ＣｐＧ  ＯＤＮであり、ヒトＴＬＲ９の最適なリガンドである。それは、配列５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ−３’（配列番号４２）を有する２４ｍｅｒである。ＯＤＮ  ＢＷ００６は、さらなるタイプＢ  ＣｐＧ  ＯＤＮであり、ヒトＧＴＣＧＴＴにおける、最適なモチーフの２倍を含む。それは、配列５’−ｔｃｇａｃｇｔｔｃｇｔｃｇｔｔｃｇｔｃｇｔｔｃ−３’（配列番号４５）を有する２３ｍｅｒである。別のタイプＢ  ＣｐＧは、ＯＤＮ  Ｄ−ＳＬ０１である。それは、多様な脊椎動物種、すなわち、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ及びイヌにおけるＴＬＲ９アゴニストであり、配列５’−ｔｃｇｃｇａｃｇｔｔｃｇｃｃｃｇａｃｇｔｔｃｇｇｔａ−３’（配列番号４９）（２６ｍｅｒ）を有する。
【００６５】
クラスＣ
ＯＤＮ２３９５は、ヒト及びマウスＴＬＲ９に特異的なＣｐＧ  ＯＤＮクラスＣである。Ｃ−クラス  ＣｐＧ  ＯＤＮとして、それは、完全なホスホロチオエート骨格及びパリンドロームモチーフを含むＣｐＧを含む。Ｃ−クラスＣｐＧ  ＯＤＮは、ｐＤＣからの強力なＩＦＮ−α産生及びＢ細胞刺激を誘導する。それは、配列５’−ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｃｇｇｃｇｃ：ｇｃｇｃｃｇ−３’（配列番号４６）を有する２２ｍｅｒである。全ての塩基は、ホスホロチオエートであり、パリンドロームに下線を引いた。ＯＤＮ  Ｍ３６２は、ヒト及びマウスＴＬＲ９に特異的な、別のＣｐＧ  ＯＤＮ  クラスＣである。それは、配列５’−ｔｃｇｔｃｇｔｃｇｔｔｃ：ｇａａｃｇａｃｇｔｔｇａｔ−３’（配列番号４７）を有する２５ｍｅｒである。別のタイプＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮは、ＯＤＮ  Ｄ−ＳＬ０３である。それは、多様な脊椎動物種、すなわち、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ及びイヌにおける、ＴＬＲ９アゴニストである。ＯＤＮ  Ｄ−ＳＬ０３は、ダブルステムループ、ホスホロチオエート骨格、及び各ループにおいてＡＡＣＧＴＴモチーフ及びＴＴＣＧＡＡモチーフを有する２つのパリンドロームから構成される。ＯＤＮ  Ｄ−ＳＬ０３は、おそらくパリンドローム配列の存在により、ロバストなＩＦＮ−αの誘導剤である。Ｄ−ＳＬ０３は、多様な脊椎動物種、すなわち、マウス、ラット、ウサギ、イヌ及びブタから得られるＰＢＭＣ／脾細胞並びにヒトＢ細胞、ＮＫ細胞及び単核細胞を強く活性化することが示されている。ＯＤＮ  Ｄ−ＳＬ０３は、確立された乳がんを有するマウスにおいて抗腫瘍活性を実証する。それは、配列５−ｔｃｇｃｇａａｃｇｔｔｃｇｃｃｇｃｇｔｔｃｇａａｃｇｃｇｇ−３’（配列番号４８）を有する２９ｍｅｒである。
【００６６】
好ましい実施態様において、核酸誘導体は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である。好ましい実施態様において、核酸誘導体は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）であって、ＣｐＧモチーフにおける、少なくとも１のヌクレオチド、好ましくは少なくとも１のシトシンヌクレオチドはメチル化されていない、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である。好ましい実施態様において、核酸誘導体は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）であって、ＣｐＧモチーフにおける、１〜１０の、好ましくは２〜８の、より好ましくは、２〜５のシトシンヌクレオチドはメチル化されていない、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である。
【００６７】
さらにより好ましい実施態様において、核酸誘導体は、クラスＡ  ＣｐＧ  ＯＤＮ、クラスＢ  ＣｐＧ  ＯＤＮ及びクラスＣ  ＣｐＧ  ＯＤＮからなる群より選択されるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である。特定の好ましい実施態様において、核酸誘導体は、配列番号１３、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８及び配列番号４９で示されるヌクレオチド酸配列からなる群より選択されるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）であり、特に、核酸誘導体は、配列番号１３で示されるヌクレオチド酸配列及び配列番号３９で示されるヌクレオチド酸配列からなる群より選択されるＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ  ＯＤＮ）である。
【００６８】
本発明による組成物において、核酸誘導体は、ＳＡＰＮと共有結合的に結合していない、すなわち、核酸誘導体は、イオン性相互作用によりＳＡＰＮと結合している。通常、核酸誘導体は、イオン性相互作用により、ペプチドリンカーＬ１及び／又はＬ２と結合している。
【００６９】
自己集合タンパク質ナノ粒子：ＬＣＭユニット
ＳＡＰＮは、任意で式（ＩＩ）の単量体構築ブロックと共集合した式（Ｉ）の単量体構築ブロックから形成される。かかる構築ブロックが集合する場合、それらは、いわゆる「ＬＣＭユニット」を形成するであろう。かかるＬＣＭユニットへと集合するであろう単量体構築ブロックの数は、最小公倍数（ＬＣＭ）により定義されるであろう。従って、例えば、単量体構築ブロックのオリゴマー化ドメインが五量体（ＮＤ１）５（ｍ＝５）及び三量体（ＮＤ２）３（ｎ＝５）を形成する場合、１５の単量体が、ＬＣＭユニットを形成するであろう。リンカーセグメントＬ１及びＬ２が適切な長さを有する場合、このＬＣＭユニットは、球状タンパク質ナノ粒子の形で集合しても良い。ＳＡＰＮは、１のみ又は１より多いＬＣＭユニット（表２）の集合により形成されてもよい。かかるＳＡＰＮは、トポロジー的に閉じた構造を表す。
【００７０】
正多面体
５つの正多面体、四面体、立方体、八面体、十二面体及び二十面体が存在する。それらは、異なる内部の回転対称要素を有する。四面体は、２回及び２つの３回軸を有し、立方体及び八面体は、２回、３回及び４回回転対称軸を有し、十二面体及び二十面体は、２回、３回及び５回回転対称軸を有する。立方体においてこれらの軸の空間的配向は八面体と全く同じであり、且つ十二面体及び二十面体においてこれらの軸の互いに対する空間的配向は全く同じである。従って、本発明のＳＡＰＮの目的のために、十二面体及び二十面体は、同一であると考えることができる。十二面体／二十面体は、６０の同一の３次元構築ブロック（表１）から構築される。これらの構築ブロックは、多面体の非対称ユニット（ＡＵ）である。それらは角錐であり、角錐のエッジは、回転対称軸の１つに相当し、従って、これらのＡＵはそれらのエッジで２回、３回及び５回対称性要素を運ぶであろう。これらの対称性要素がタンパク質オリゴマー化ドメインから生じる場合、かかるＡＵは、上記単量体構築ブロックから構築される。ＡＵの対称軸の２つに沿って、２つのオリゴマー化ドメインＮＤ１及びＮＤ２又はＮＤ３及びＮＤ４を並べることで十分である。これらの２つのオリゴマー化ドメインが安定なオリゴマーを形成する場合、第三の対称軸に沿った対称性インターフェイスは自動的に生じるであろうし、且つこのインターフェイスに沿った相互作用、例えば、疎水性、親水性相互作用又はイオン性相互作用、又はジスルフィド架橋などの共有結合を最適化することにより、安定化してもよい。
【００７１】
好ましい実施態様において、式（Ｉ）又は（ＩＩ）のオリゴマー化ドメインＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及びＮＤ４の少なくとも１つ、好ましくはＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、二量体、三量体、四量体及び／又は五量体ドメイン、より好ましくは、二量体、四量体及び／又は五量体ドメイン、さらにより好ましくは、二量体及び／又は五量体ドメインを含む。
【００７２】
より好ましい実施態様において、式（Ｉ）又は（ＩＩ）のオリゴマー化ドメインＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及び／又はＮＤ４の１つ、より好ましくは、ＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、４ＰＮ８、４ＰＮＤ、４ＷＢＡ、３Ｖ２Ｎ、３Ｖ２Ｐ、３Ｖ２Ｑ、３Ｖ２Ｒ、４ＥＥＢ、４ＥＥＤ、３ＭＩＷ、１ＭＺ９、１ＦＢＭ、１ＶＤＦ、２ＧＵＶ、２ＨＹＮ、１ＺＬＬ及び１Ｔ８Ｚからなる群より選択される五量体コイルドコイルを含むか、又は４ＰＮ８、４ＰＮＤ、４ＷＢＡ、３Ｖ２Ｎ、３Ｖ２Ｐ、３Ｖ２Ｑ、３Ｖ２Ｒ、４ＥＥＢ、４ＥＥＤ、３ＭＩＷ、１ＭＺ９、１ＦＢＭ、１ＶＤＦ、２ＧＵＶ、２ＨＹＮ、１ＺＬＬ及び１Ｔ８Ｚからなる群より選択される五量体コイルドコイルであって、アミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなった五量体コイルドコイルを含み、各コイルドコイルは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリー番号付けにより示される。さらにより好ましくは、ＮＤ１は、トリプトファン−ジッパー五量体化ドメイン（ｐｄｂ−ｅｎｔｒｙ：１Ｔ８Ｚ）、又はアミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなったトリプトファン−ジッパー五量体化ドメイン（ｐｄｂ−ｅｎｔｒｙ：１Ｔ８Ｚ）、特に配列番号３又は配列番号２５を含む五量体コイルドコイル）又はアミノ酸改変を有する及び／又はいずれかの末端又は両端が短くなった配列番号３又は配列番号２５を含む五量体コイルドコイルからなる群より選択される五量体コイルドコイルである。
【００７３】
別のより好ましい実施態様において、式（Ｉ）又は（ＩＩ）のオリゴマー化ドメインＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及びＮＤ４の少なくとも１つ、より好ましくは、ＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、四量体コイルドコイル５Ｄ６０、５Ｄ５Ｙ、５ＡＬ６、４ＷＢ４、４ＢＨＶ、４Ｃ５Ｑ、４ＧＪＷ、４Ｈ７Ｒ、４Ｈ８Ｆ、４ＢＸＴ、４ＬＴＯ、４ＬＴＰ、４ＬＴＱ、４ＬＴＲ、３ＺＤＯ、３ＲＱＡ、３Ｒ４Ａ、３Ｒ４Ｈ、３ＴＳＩ、３Ｋ４Ｔ、３Ｆ６Ｎ、２Ｏ６Ｎ、２ＯＶＣ、２Ｏ１Ｊ、２Ｏ１Ｋ、２ＡＧ３、２ＣＣＥ、１ＹＢＫ、１Ｕ９Ｆ、１Ｕ９Ｇ、１Ｕ９Ｈ、１ＵＳＤ、１ＵＳＥ、１ＵＮＴ、１ＵＮＵ、１ＵＮＶ、１ＵＮＷ、１ＵＮＸ、１ＵＮＹ、１ＵＮＺ、１ＵＯ０、１ＵＯ１、１ＵＯ２、１ＵＯ３、１ＵＯ４、１ＵＯ５、１Ｗ５Ｉ、１Ｗ５Ｌ、１ＦＥ６、１Ｇ１Ｉ、１Ｇ１Ｊ、１ＥＺＪ、１ＲＨ４、１ＧＣＬからなる群より選択される四量体コイルドコイル、又はアミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなった５Ｄ６０、５Ｄ５Ｙ、５ＡＬ６、４ＷＢ４、４ＢＨＶ、４Ｃ５Ｑ、４ＧＪＷ、４Ｈ７Ｒ、４Ｈ８Ｆ、４ＢＸＴ、４ＬＴＯ、４ＬＴＰ、４ＬＴＱ、４ＬＴＲ、３ＺＤＯ、３ＲＱＡ、３Ｒ４Ａ、３Ｒ４Ｈ、３ＴＳＩ、３Ｋ４Ｔ、３Ｆ６Ｎ、２Ｏ６Ｎ、２ＯＶＣ、２Ｏ１Ｊ、２Ｏ１Ｋ、２ＡＧ３、２ＣＣＥ、１ＹＢＫ、１Ｕ９Ｆ、１Ｕ９Ｇ、１Ｕ９Ｈ、１ＵＳＤ、１ＵＳＥ、１ＵＮＴ、１ＵＮＵ、１ＵＮＶ、１ＵＮＷ、１ＵＮＸ、１ＵＮＹ、１ＵＮＺ、１ＵＯ０、１ＵＯ１、１ＵＯ２、１ＵＯ３、１ＵＯ４、１ＵＯ５、１Ｗ５Ｉ、１Ｗ５Ｌ、１ＦＥ６、１Ｇ１Ｉ、１Ｇ１Ｊ、１ＥＺＪ、１ＲＨ４、１ＧＣＬからなる群より選択される四量体コイルドコイルを含む。各コイルドコイルは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリー番号付けにより示される。
【００７４】
最も好ましい実施態様において、四量体コイルドコイルは、テトラブラキオン（ｔｅｔｒａｂｒａｃｈｉｏｎ）（ｐｄｂ−エントリーコード１ＦＥ６）由来であるか、又は四量体コイルドコイルは、アミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなったテトラブラキオン（ｔｅｔｒａｂｒａｃｈｉｏｎ）（ｐｄｂ−エントリーコード１ＦＥ６）由来であって、各ＳＨＢは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｐエントリー番号付けにより示されるものである。
【００７５】
別のより好ましい実施態様において、式（Ｉ）又は（ＩＩ）のオリゴマー化ドメインＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及びＮＤ４の１つは、より好ましくは、ＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、三量体コイルドコイル５ＴＯＨ、５ＴＯＩ、５Ｋ９２、５ＫＢ０、５ＫＢ１、５ＫＢ２、５ＫＫＶ、５ＥＦＭ、２Ｎ６４、５ＡＢＳ、５ＩＥＡ、５ＡＰＰ、５ＡＰＱ、５ＡＰＳ、５ＡＰＹ、５ＡＰＺ、５Ｄ５Ｚ、４ＹＰＣ、４ＹＶ３、４ＣＧＢ、４ＣＧＣ、４ＣＪＤ、４Ｒ０Ｒ、４ＵＷ０、４Ｐ６７、４ＯＸＭ、３Ｗ８Ｖ、３Ｗ９２、３Ｗ９３、４Ｉ２Ｌ、４Ｋ８Ｕ、４ＪＢＺ、３ＶＴＱ、４Ｌ１Ｒ、４ＪＤＯ、４Ｊ４Ａ、４Ｅ５２、３ＶＹＩ、３ＺＭＦ、３ＶＵ５、３ＶＵ６、２ＹＮＹ、２ＹＮＺ、２ＹＯ０、２ＹＯ１、２ＹＯ２、４Ｇ１Ａ、４ＧＩＦ、３ＴＱ２、４ＤＺＫ、４ＤＺＬ、４ＤＺＮ、３ＴＥ３、３Ｒ４８、３ＳＷＦ、３ＳＷＹ、３ＰＲ７、２ＹＫＯ、２ＹＫＰ、２ＹＫＱ、３ＮＴＮ、３ＰＰ５、３ＭＫＯ、３ＭＧＮ、３ＮＷＡ、３ＮＷＤ、３ＮＷＦ、３Ｌ３５、３Ｌ３６、３Ｌ３７、３Ｍ９Ｂ、３Ｍ９Ｄ、２Ｘ６Ｐ、３ＬＪＭ、３ＡＨＡ、３Ｈ７Ｘ、３Ｈ７Ｚ、３ＬＴ６、３ＬＴ７、３ＧＪＰ、２ＫＰ８、３ＫＰＥ、２ＷＰＲ、２ＷＰＳ、２ＷＰＹ、２ＷＰＺ、２ＷＱ０、２ＷＱ１、２ＷＱ２、２ＷＱ３、３ＨＦＣ、３ＨＦＥ、３ＨＲＮ、３ＨＲＯ、３Ｈ５Ｆ、３Ｈ５Ｇ、２ＷＧ５、２ＷＧ６、２Ｗ６Ｂ、２ＪＪＬ、２ＶＲＳ、３ＥＦＧ、３ＤＵＺ、２ＯＴ５、２Ｚ２Ｔ、２ＱＩＨ、３ＢＫ６、２Ｏ７Ｈ、２Ｒ３２、２ＪＧＯ、２Ｑ７Ｃ、２Ｑ３Ｉ、２Ｑ５Ｕ、２ＩＢＬ、１ＺＶ８、１ＺＶＢ、２ＦＸＰ、１ＷＴ６、２ＡＫＦ、１ＴＧＧ、１ＳＬＱ、１Ｓ９Ｚ、１ＰＷ９、１ＰＷＢ、１Ｍ７Ｌ、１ＧＺＬ、１ＫＹＣ、１ＫＦＭ、１ＫＦＮ、１ＩＪ０、１ＩＪ１、１ＩＪ２、１ＩＪ３、１ＨＱＪ、１ＱＵ１、１Ｂ０８、１ＣＺＱ、１ＣＵＮ、１ＳＶＦ、１ＣＥ０、１ＰＩＱ、１ＡＱ５、１ＡＶＹ、１ＨＴＮ、１ＡＡ０、１ＺＩＪ、１ＺＩＭ、１ＣＯＩ、１ＳＷＩ、１ＧＣＭ、１ＨＵＰからなる群より選択される三量体コイルドコイル、又はアミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなった５ＴＯＨ、５ＴＯＩ、５Ｋ９２、５ＫＢ０、５ＫＢ１、５ＫＢ２、５ＫＫＶ、５ＥＦＭ、２Ｎ６４、５ＡＢＳ、５ＩＥＡ、５ＡＰＰ、５ＡＰＱ、５ＡＰＳ、５ＡＰＹ、５ＡＰＺ、５Ｄ５Ｚ、４ＹＰＣ、４ＹＶ３、４ＣＧＢ、４ＣＧＣ、４ＣＪＤ、４Ｒ０Ｒ、４ＵＷ０、４Ｐ６７、４ＯＸＭ、３Ｗ８Ｖ、３Ｗ９２、３Ｗ９３、４Ｉ２Ｌ、４Ｋ８Ｕ、４ＪＢＺ、３ＶＴＱ、４Ｌ１Ｒ、４ＪＤＯ、４Ｊ４Ａ、４Ｅ５２、３ＶＹＩ、３ＺＭＦ、３ＶＵ５、３ＶＵ６、２ＹＮＹ、２ＹＮＺ、２ＹＯ０、２ＹＯ１、２ＹＯ２、４Ｇ１Ａ、４ＧＩＦ、３ＴＱ２、４ＤＺＫ、４ＤＺＬ、４ＤＺＮ、３ＴＥ３、３Ｒ４８、３ＳＷＦ、３ＳＷＹ、３ＰＲ７、２ＹＫＯ、２ＹＫＰ、２ＹＫＱ、３ＮＴＮ、３ＰＰ５、３ＭＫＯ、３ＭＧＮ、３ＮＷＡ、３ＮＷＤ、３ＮＷＦ、３Ｌ３５、３Ｌ３６、３Ｌ３７、３Ｍ９Ｂ、３Ｍ９Ｄ、２Ｘ６Ｐ、３ＬＪＭ、３ＡＨＡ、３Ｈ７Ｘ、３Ｈ７Ｚ、３ＬＴ６、３ＬＴ７、３ＧＪＰ、２ＫＰ８、３ＫＰＥ、２ＷＰＲ、２ＷＰＳ、２ＷＰＹ、２ＷＰＺ、２ＷＱ０、２ＷＱ１、２ＷＱ２、２ＷＱ３、３ＨＦＣ、３ＨＦＥ、３ＨＲＮ、３ＨＲＯ、３Ｈ５Ｆ、３Ｈ５Ｇ、２ＷＧ５、２ＷＧ６、２Ｗ６Ｂ、２ＪＪＬ、２ＶＲＳ、３ＥＦＧ、３ＤＵＺ、２ＯＴ５、２Ｚ２Ｔ、２ＱＩＨ、３ＢＫ６、２Ｏ７Ｈ、２Ｒ３２、２ＪＧＯ、２Ｑ７Ｃ、２Ｑ３Ｉ、２Ｑ５Ｕ、２ＩＢＬ、１ＺＶ８、１ＺＶＢ、２ＦＸＰ、１ＷＴ６、２ＡＫＦ、１ＴＧＧ、１ＳＬＱ、１Ｓ９Ｚ、１ＰＷ９、１ＰＷＢ、１Ｍ７Ｌ、１ＧＺＬ、１ＫＹＣ、１ＫＦＭ、１ＫＦＮ、１ＩＪ０、１ＩＪ１、１ＩＪ２、１ＩＪ３、１ＨＱＪ、１ＱＵ１、１Ｂ０８、１ＣＺＱ、１ＣＵＮ、１ＳＶＦ、１ＣＥ０、１ＰＩＱ、１ＡＱ５、１ＡＶＹ、１ＨＴＮ、１ＡＡ０、１ＺＩＪ、１ＺＩＭ、１ＣＯＩ、１ＳＷＩ、１ＧＣＭ、１ＨＵＰからなる群より選択される三量体コイルドコイルを含み、ここで、各コイルドコイルは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリー番号付けにより示される。
【００７６】
別のより好ましい実施態様において、式（Ｉ）又は（ＩＩ）のオリゴマー化ドメインＮＤ１、ＮＤ２、ＮＤ３及びＮＤ４の１つは、より好ましくは、ＮＤ１及び／又はＮＤ３又はＮＤ２及び／又はＮＤ４のいずれかは、二量体コイルドコイル５Ｍ９７、５Ｍ９Ｅ、５ＦＩＹ、５Ｆ４Ｙ、５Ｄ３Ａ、５ＨＭＯ、５ＥＹＡ、５ＩＸ１、５ＩＸ２、５ＪＨＦ、５ＪＶＭ、５ＪＶＰ、５ＪＶＲ、５ＪＶＳ、５ＪＶＵ、５ＪＸ１、５ＦＣＮ、５ＨＨＥ、２Ｎ９Ｂ、４ＺＲＹ、４Ｚ６Ｙ、４ＹＴＯ、４ＺＩ３、５ＡＪＳ、５Ｆ３Ｋ、５Ｆ５Ｒ、５ＨＵＺ、５ＤＪＮ、５ＤＪＯ、５ＣＨＸ、５ＣＪ０、５ＣＪ１、５ＣＪ４、５Ｃ９Ｎ、５ＣＦＦ、４ＷＨＶ、３ＷＵＴ、３ＷＵＵ、３ＷＵＶ、４ＺＱＡ、４ＸＡ３、４ＸＡ４、４ＰＸＪ、４ＹＶＣ、４ＹＶＥ、５ＢＭＬ、５ＡＬ７、４ＷＯＴ、４ＣＧ４、５ＡＭＯ、４ＷＩＩ、４ＷＩＫ、４ＲＳＪ、４ＣＦＧ、４Ｒ３Ｑ、４ＷＩＤ、４ＣＫＧ、４ＣＫＨ、４ＮＳＷ、４Ｗ７Ｐ、４ＱＱ４、４ＯＪＫ、４ＴＬ１、４ＯＨ９、４ＬＰＺ、４Ｑ６２、４Ｌ２Ｗ、４Ｍ３Ｌ、４ＣＫＭ、４ＣＫＮ、４Ｎ６Ｊ、４ＬＴＢ、４ＬＲＺ、２ＭＡＪ、２ＭＡＫ、４ＮＡＤ、４ＨＷ０、４ＢＴ８、４ＢＴ９、４ＢＴＡ、４ＨＨＤ、４Ｍ８Ｍ、４Ｊ３Ｎ、４Ｌ６Ｑ、４Ｃ１Ａ、４Ｃ１Ｂ、４ＧＤＯ、４ＢＷＫ、４ＢＷＰ、４ＢＷＸ、４ＨＵ５、４ＨＵ６、４Ｌ９Ｕ、４Ｇ０Ｕ、４Ｇ０Ｖ、４Ｇ０Ｗ、４Ｌ３Ｉ、４Ｇ７９、４ＧＥＵ、４ＧＥＸ、４ＧＦＡ、４ＧＦＣ、４ＢＬ６、４ＪＭＲ、４ＪＮＨ、２ＹＭＹ、４ＨＡＮ、３ＶＭＹ、３ＶＭＺ、３ＶＮ０、４ＡＢＸ、３Ｗ０３、２ＬＷ９、４ＤＺＭ、４ＥＴＯ、３ＴＮＵ、３ＴＨＦ、４Ｅ８Ｕ、３ＶＭＸ、４Ｅ６１、３ＶＥＭ、３ＶＢＢ、４ＤＪＧ、３ＴＶ７、３ＳＴＱ、３Ｖ８Ｓ、３Ｑ８Ｔ、３Ｕ１Ｃ、３ＱＨ９、３ＡＺＤ、３ＯＮＸ、３ＯＫＱ、３ＱＸ３、３ＳＪＡ、３ＳＪＢ、３ＳＪＣ、２Ｌ２Ｌ、３ＱＦＬ、３ＱＫＴ、２ＸＶ５、２Ｙ３Ｗ、３Ｑ０Ｘ、３ＡＪＷ、３ＮＣＺ、３ＮＩ０、２ＸＵ６、３Ｍ９１、３ＮＭＤ、３ＬＬＬ、３ＬＸ７、３ＭＥ９、３ＭＥＵ、３ＭＥＶ、３ＡＢＨ、３ＡＣＯ、３ＩＡＯ、３ＨＬＳ、２ＷＭＭ、３Ａ６Ｍ、３Ａ７Ｏ、２ＷＶＲ、３ＩＣＸ、３ＩＤ５、３ＩＤ６、３ＨＮＷ、３Ｉ１Ｇ、２Ｋ６Ｓ、３ＧＨＧ、３Ｇ１Ｅ、２Ｗ６Ａ、２Ｖ５１、３ＥＲＲ、３Ｅ１Ｒ、２ＶＹ２、２ＺＲ２、２ＺＲ３、３ＣＬ３、３Ｄ９Ｖ、２Ｚ１７、２ＪＥＥ、３ＢＢＰ、３ＢＡＳ、３ＢＡＴ、２ＱＭ４、２Ｖ７１、２ＮＯ２、２ＰＯＮ、２Ｖ０Ｏ、２ＤＱ０、２ＤＱ３、２Ｑ２Ｆ、２ＮＲＮ、２Ｅ７Ｓ、２Ｈ９Ｖ、２ＦＸＭ、２ＨＪＤ、２ＧＺＤ、２ＧＺＨ、２ＦＶ４、２Ｆ２Ｕ、２ＥＵＬ、２ＥＳＭ、２ＥＴＫ、２ＥＴＲ、１ＺＸＡ、１ＹＩＢ、１ＹＩＧ、１ＸＳＸ、１ＲＦＹ、１Ｕ０Ｉ、１ＸＪＡ、１Ｔ３Ｊ、１Ｔ６Ｆ、１Ｒ７Ｊ、１ＵＩＩ、１ＰＬ５、１Ｓ１Ｃ、１Ｐ９Ｉ、１Ｒ４８、１ＵＲＵ、１ＯＶ９、１ＵＩＸ、１ＮＯ４、１ＮＹＨ、１ＭＶ４、１ＬＲ１、１Ｌ８Ｄ、１ＬＪ２、１ＫＱＬ、１ＧＸＫ、１ＧＸＬ、１ＧＫ６、１ＪＲ５、１ＧＭＪ、１ＪＡＤ、１ＪＣＨ、１ＪＢＧ、１ＪＴＨ、１ＪＹ２、１ＪＹ３、１ＩＣ２、１ＨＣＩ、１ＨＦ９、１ＨＢＷ、１ＦＸＫ、１Ｄ７Ｍ、１ＱＵＵ、１ＣＥ９、２Ａ９３、１ＢＭ９、１Ａ９３、１ＴＭＺ、２ＡＡＣ、１ＺＩＩ、１ＺＩＫ、１ＺＩＬ、２ＡＲＡ、２ＡＲＣ、１ＪＵＮ、１ＹＳＡ、２ＺＴＡからなる群より選択される二量体コイルドコイル、又はアミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなった５Ｍ９７、５Ｍ９Ｅ、５ＦＩＹ、５Ｆ４Ｙ、５Ｄ３Ａ、５ＨＭＯ、５ＥＹＡ、５ＩＸ１、５ＩＸ２、５ＪＨＦ、５ＪＶＭ、５ＪＶＰ、５ＪＶＲ、５ＪＶＳ、５ＪＶＵ、５ＪＸ１、５ＦＣＮ、５ＨＨＥ、２Ｎ９Ｂ、４ＺＲＹ、４Ｚ６Ｙ、４ＹＴＯ、４ＺＩ３、５ＡＪＳ、５Ｆ３Ｋ、５Ｆ５Ｒ、５ＨＵＺ、５ＤＪＮ、５ＤＪＯ、５ＣＨＸ、５ＣＪ０、５ＣＪ１、５ＣＪ４、５Ｃ９Ｎ、５ＣＦＦ、４ＷＨＶ、３ＷＵＴ、３ＷＵＵ、３ＷＵＶ、４ＺＱＡ、４ＸＡ３、４ＸＡ４、４ＰＸＪ、４ＹＶＣ、４ＹＶＥ、５ＢＭＬ、５ＡＬ７、４ＷＯＴ、４ＣＧ４、５ＡＭＯ、４ＷＩＩ、４ＷＩＫ、４ＲＳＪ、４ＣＦＧ、４Ｒ３Ｑ、４ＷＩＤ、４ＣＫＧ、４ＣＫＨ、４ＮＳＷ、４Ｗ７Ｐ、４ＱＱ４、４ＯＪＫ、４ＴＬ１、４ＯＨ９、４ＬＰＺ、４Ｑ６２、４Ｌ２Ｗ、４Ｍ３Ｌ、４ＣＫＭ、４ＣＫＮ、４Ｎ６Ｊ、４ＬＴＢ、４ＬＲＺ、２ＭＡＪ、２ＭＡＫ、４ＮＡＤ、４ＨＷ０、４ＢＴ８、４ＢＴ９、４ＢＴＡ、４ＨＨＤ、４Ｍ８Ｍ、４Ｊ３Ｎ、４Ｌ６Ｑ、４Ｃ１Ａ、４Ｃ１Ｂ、４ＧＤＯ、４ＢＷＫ、４ＢＷＰ、４ＢＷＸ、４ＨＵ５、４ＨＵ６、４Ｌ９Ｕ、４Ｇ０Ｕ、４Ｇ０Ｖ、４Ｇ０Ｗ、４Ｌ３Ｉ、４Ｇ７９、４ＧＥＵ、４ＧＥＸ、４ＧＦＡ、４ＧＦＣ、４ＢＬ６、４ＪＭＲ、４ＪＮＨ、２ＹＭＹ、４ＨＡＮ、３ＶＭＹ、３ＶＭＺ、３ＶＮ０、４ＡＢＸ、３Ｗ０３、２ＬＷ９、４ＤＺＭ、４ＥＴＯ、３ＴＮＵ、３ＴＨＦ、４Ｅ８Ｕ、３ＶＭＸ、４Ｅ６１、３ＶＥＭ、３ＶＢＢ、４ＤＪＧ、３ＴＶ７、３ＳＴＱ、３Ｖ８Ｓ、３Ｑ８Ｔ、３Ｕ１Ｃ、３ＱＨ９、３ＡＺＤ、３ＯＮＸ、３ＯＫＱ、３ＱＸ３、３ＳＪＡ、３ＳＪＢ、３ＳＪＣ、２Ｌ２Ｌ、３ＱＦＬ、３ＱＫＴ、２ＸＶ５、２Ｙ３Ｗ、３Ｑ０Ｘ、３ＡＪＷ、３ＮＣＺ、３ＮＩ０、２ＸＵ６、３Ｍ９１、３ＮＭＤ、３ＬＬＬ、３ＬＸ７、３ＭＥ９、３ＭＥＵ、３ＭＥＶ、３ＡＢＨ、３ＡＣＯ、３ＩＡＯ、３ＨＬＳ、２ＷＭＭ、３Ａ６Ｍ、３Ａ７Ｏ、２ＷＶＲ、３ＩＣＸ、３ＩＤ５、３ＩＤ６、３ＨＮＷ、３Ｉ１Ｇ、２Ｋ６Ｓ、３ＧＨＧ、３Ｇ１Ｅ、２Ｗ６Ａ、２Ｖ５１、３ＥＲＲ、３Ｅ１Ｒ、２ＶＹ２、２ＺＲ２、２ＺＲ３、３ＣＬ３、３Ｄ９Ｖ、２Ｚ１７、２ＪＥＥ、３ＢＢＰ、３ＢＡＳ、３ＢＡＴ、２ＱＭ４、２Ｖ７１、２ＮＯ２、２ＰＯＮ、２Ｖ０Ｏ、２ＤＱ０、２ＤＱ３、２Ｑ２Ｆ、２ＮＲＮ、２Ｅ７Ｓ、２Ｈ９Ｖ、２ＦＸＭ、２ＨＪＤ、２ＧＺＤ、２ＧＺＨ、２ＦＶ４、２Ｆ２Ｕ、２ＥＵＬ、２ＥＳＭ、２ＥＴＫ、２ＥＴＲ、１ＺＸＡ、１ＹＩＢ、１ＹＩＧ、１ＸＳＸ、１ＲＦＹ、１Ｕ０Ｉ、１ＸＪＡ、１Ｔ３Ｊ、１Ｔ６Ｆ、１Ｒ７Ｊ、１ＵＩＩ、１ＰＬ５、１Ｓ１Ｃ、１Ｐ９Ｉ、１Ｒ４８、１ＵＲＵ、１ＯＶ９、１ＵＩＸ、１ＮＯ４、１ＮＹＨ、１ＭＶ４、１ＬＲ１、１Ｌ８Ｄ、１ＬＪ２、１ＫＱＬ、１ＧＸＫ、１ＧＸＬ、１ＧＫ６、１ＪＲ５、１ＧＭＪ、１ＪＡＤ、１ＪＣＨ、１ＪＢＧ、１ＪＴＨ、１ＪＹ２、１ＪＹ３、１ＩＣ２、１ＨＣＩ、１ＨＦ９、１ＨＢＷ、１ＦＸＫ、１Ｄ７Ｍ、１ＱＵＵ、１ＣＥ９、２Ａ９３、１ＢＭ９、１Ａ９３、１ＴＭＺ、２ＡＡＣ、１ＺＩＩ、１ＺＩＫ、１ＺＩＬ、２ＡＲＡ、２ＡＲＣ、１ＪＵＮ、１ＹＳＡ、２ＺＴＡからなる群より選択される二量体コイルドコイルを含み、ここで、各コイルドコイルは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリー番号付けにより示される。
【００７７】
好ましい実施態様において、Ｘ１は、Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列、配列番号２９に示されるＨｉｓタグを含むアミノ酸配列、Ｈｉｓタグ及びマラリア原虫オオキネート及びスポロゾイトの細胞横断タンパク質（ＣｅｌＴＯＳ）を含むアミノ酸配列、Ｈｉｓタグ及び配列番号３０に示されるマラリア原虫オオキネート及びスポロゾイトの細胞横断タンパク質（ＣｅｌＴＯＳ）を含むアミノ酸配列、配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号２９に示されるアミノ酸配列、配列番号２４に示されるアミノ酸配列、並びに配列番号２、配列番号３０、配列番号２９又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列であってアミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなったアミノ酸配列からなる群より選択される。より好ましくは、Ｘ１は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号２９に示されるアミノ酸配列、配列番号２４に示されるアミノ酸配列、並びに、配列番号２、配列番号２９又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列であってアミノ酸配列がアミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなったアミノ酸配列からなる群より選択される。
【００７８】
好ましい実施態様において、Ｘ２は、Ｈｉｓタグを含むアミノ酸配列、配列番号２９に示されるＨｉｓタグを含むアミノ酸配列、Ｈｉｓタグ及びマラリア原虫オオキネート及びスポロゾイトの細胞横断タンパク質（ＣｅｌＴＯＳ）を含むアミノ酸配列、Ｈｉｓタグ及び配列番号３０に示されるマラリア原虫オオキネート及びスポロゾイトの細胞横断タンパク質（ＣｅｌＴＯＳ）を含むアミノ酸配列、配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号２９に示されるアミノ酸配列、配列番号２４に示されるアミノ酸配列、及び配列番号２、配列番号３０、配列番号２９又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列であってアミノ酸配列はアミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなったアミノ酸配列からなる群より選択される。より好ましくは、Ｘ１は、配列番号２に示されるアミノ酸配列、配列番号２９に示されるアミノ酸配列、配列番号２４に示されるアミノ酸配列、及び配列番号２、配列番号２９又は配列番号２４に示されるアミノ酸配列であってアミノ酸配列はアミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなったアミノ酸配列からなる群より選択される。
好ましい実施態様において、Ｙ１は、マラリア原虫オオキネート及びスポロゾイトの細胞横断タンパク質（ＣｅｌＴＯＳ）を含むアミノ酸配列、配列番号２７に示されるアミノ酸配列及び配列番号２７に示されるアミノ酸配列であってアミノ酸配列はアミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなったアミノ酸配列からなる群より選択される。
【００７９】
好ましい実施態様において、Ｙ２は、フラジェリンのＤ０及びＤ１ドメインを含むアミノ酸配列、配列番号２８又は配列番号６に示されるアミノ酸配列、又は配列番号２８又は配列番号６に示されるアミノ酸配列であってアミノ酸配列はアミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなった配列番号２８又は配列番号６に示されるアミノ酸配列である。
【００８０】
好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ１は、少なくとも３アミノ酸からなり、且つ式（Ｉ）の構築ブロックのＸ１、ＮＤ１、ＮＤ２及びＹ１の、少なくとも１、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも３、さらにより好ましくは全てが、配列番号２又は配列番号２４に示されるＸ１；配列番号３又は配列番号２５に示されるＮＤ１； 配列番号５又は配列番号２６に示されるＮＤ２；及び配列番号６又は配列番号２７に示されるＹ１からなる群より選択され、或いは、ペプチドリンカーＬ１は、少なくとも３アミノ酸からなり、且つ式（Ｉ）の構築ブロックのＸ１、ＮＤ１、ＮＤ２及びＹ１の少なくとも１、好ましくは少なくとも２、より好ましくは少なくとも３、さらにより好ましくは全てが、配列番号２又は配列番号２４に示されるＸ１；配列番号３又は配列番号２５に示されるＮＤ１；配列番号５又は配列番号２６に示されるＮＤ２；及び配列番号６又は配列番号２７に示されるＹ１からなる群より選択され、ここで配列番号２、配列番号２４、配列番号３、配列番号２５、配列番号５、配列番号２６、配列番号６又は配列番号２７の少なくとも１は、アミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなっている。
好ましい実施態様において、ペプチドリンカーＬ２は、少なくとも３アミノ酸からなり、且つ式（Ｉ）の構築ブロックの、Ｘ２、ＮＤ３、ＮＤ４及びＹ２の少なくとも１、好ましくは、少なくとも２、より好ましくは、少なくとも３、さらにより好ましくは全ては、配列番号２４に示されるＸ２；配列番号２５に示されるＮＤ３；配列番号２６に示されるＮＤ４；及び配列番号２８に示されるＹ２からなる群より選択され、或いは、ペプチドリンカーＬ２は、少なくとも３アミノ酸からなり、且つ式（Ｉ）の構築ブロックの、Ｘ２、ＮＤ３、ＮＤ４及びＹ２の少なくとも１、好ましくは少なくとも２、より好ましくは、少なくとも３、さらにより好ましくは全ては、配列番号２４に示されるＸ２；配列番号２５に示されるＮＤ３；配列番号２６に示されるＮＤ４；及び配列番号２８に示されるＹ２であって、配列番号２４；配列番号２５；配列番号２６又は配列番号２８の少なくとも１つは、アミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなったものからなる群より選択される。
【００８１】
好ましい実施態様において、式（Ｉ）の構築ブロックは、配列番号１に示されるアミノ酸配列、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、配列番号１７に示されるアミノ酸配列、配列番号１８に示されるアミノ酸配列、配列番号１９に示されるアミノ酸配列、配列番号２２に示されるアミノ酸配列及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸の連続鎖を含むか、又は式（Ｉ）の構築ブロックは、配列番号１に示されるアミノ酸配列、配列番号１６に示されるアミノ酸配列、配列番号１７に示されるアミノ酸配列、配列番号１８に示されるアミノ酸配列、配列番号１９に示されるアミノ酸配列、配列番号２２に示されるアミノ酸配列及び配列番号３４に示されるアミノ酸配列であって、少なくとも１の、配列番号１６；配列番号１７；配列番号１８、配列番号１９、配列番号２２又は配列番号３４は、アミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなったアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸の連続鎖を含む。
【００８２】
好ましい実施態様において、式（ＩＩ）の構築ブロックは、配列番号２３に示されるアミノ酸の連続鎖を含むか、又は式（ＩＩ）の構築ブロックは、 配列番号２３に示されるアミノ酸であって、 配列番号２３に示されるアミノ酸が、アミノ酸改変を含む及び／又は片方若しくは両方の端で短くなったアミノ酸の連続鎖を含む。
【００８３】
好ましい実施態様において、式（Ｉ）の複数の構築ブロック、式（ＩＩ）の複数の構築ブロック又は式（Ｉ）及び式（ＩＩ）の複数の共集合した構築ブロックからなるＳＡＰＮのタンパク質鎖、より好ましくは、式（Ｉ）の複数の構築ブロックからなるＳＡＰＮのタンパク質鎖の、核酸誘導体に対するモル比は、約１対約０．４から０．８、好ましくは約１対約０．６である。
【００８４】
好ましい実施態様において、組成物は、式（ＩＩ）の複数の構築ブロックと共集合した 式（Ｉ）の複数の構築ブロックからなるＳＡＰＮを含む。
【００８５】
好ましい実施態様において、式（Ｉ）の複数の構築ブロック及び式（ＩＩ）の複数の構築ブロックを含む共集合したＳＡＰＮ、より好ましくは、本明細書に記載のフラジェリンを含む、式（Ｉ）の複数の構築ブロック及び式（ＩＩ）の複数の構築ブロックを含む共集合したＳＡＰＮは、約１２から約１の式（ＩＩ）の構築ブロックを含む連続鎖に対し、約４８から約５９の式（Ｉ）の構築ブロックを含む連続鎖、より好ましくは、約５から約２の式（ＩＩ）の構築ブロックを含む連続鎖に対し、約５５から約５８の式（Ｉ）の構築ブロックを含む連続鎖、例えば、約５の式（ＩＩ）の構築ブロックを含む連続鎖に対し約５５の式（Ｉ）の構築ブロックを含む連続鎖、約４の式（ＩＩ）の構築ブロックを含む連続鎖に対し約５６の式（Ｉ）の構築ブロックを含む連続鎖、約３の式（ＩＩ）の構築ブロックを含む連続鎖に対し約５７の式（Ｉ）の構築ブロックを含む連続鎖、又は約２の式（ＩＩ）の構築ブロックを含む連続鎖に対し約５８の式（Ｉ）の構築ブロックを含む連続鎖、さらにより好ましくは、約２の式（ＩＩ）の構築ブロックを含む連続鎖に対し約５８の式（Ｉ）の構築ブロックを含む連続鎖の共集合比率を有する。
【００８６】
正多面体対称性を有する自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）への集合
規則的な形状（十二面体、二十面体、八面体、立方体及び四面体）を有する自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）を作製するために、１より多いＬＣＭユニットが必要である。例えば、三量体及び五量体オリゴマー化ドメインを含む単量体から二十面体を形成するためには、それぞれ１５の単量体構築ブロックから構成される、４つのＬＣＭユニットが必要であり、すなわち、規則的な形状を有するタンパク質ナノ粒子は、６０の単量体構築ブロックから構成されるであろう。対応する多面体を形成するのに必要とされる、２のオリゴマー化ドメインのオリゴマー化状態及びＬＣＭユニットの数の組み合わせを、表２に示した。
【００８７】
表２：正多面体の形成においてオリゴマー化状態の可能な組み合わせ
2020510650.tif 000003
ＬＣＭユニットが、さらに集合して、１より多いＬＣＭユニットから構成される正多面体を形成するであろうかどうかは、２つのオリゴマー化ドメインＮＤ１及びＮＤ２並びに２つのオリゴマー化ドメインＮＤ３及びＮＤ４のそれぞれの互いに対する幾何学的配置に依存し、特に２つのオリゴマー化ドメインの回転対称軸間の角度に依存する。これは、主に、ｉ）ナノ粒子における、隣接するドメイン間の相互作用、ｉｉ）リンカーセグメントＬ１及びＬ２の長さ、ｉｉｉ）個々のオリゴマー化ドメインの形状により制御される。ＬＣＭユニットにおいて、この角度は、正多面体の配置と比較して、より大きい。正多面体とは対照的に、この角度は、単量体構築ブロックにおいて同一ではない。
【００８８】
２つのオリゴマー化ドメイン間の角度が十分に小さい（二十面体対称性を有する正多面体においてよりもさらに小さい）場合、その時、多数（数百）のタンパク質鎖はタンパク質ナノ粒子に集合することができる。三量体−五量体構造を有するＳＡＰＮの生物物理学的及び数学的分析については、最近報告された（Indelicato, G., et al. Biophys J 2016, 110(3)： 646-660）。
【００８９】
好ましくは、ＳＡＰＮ上のループ構造に提示される抗原は、（ａ）がん細胞に対する免疫応答を誘導するのに適するタンパク質又はペプチド；（ｂ）感染性疾患に対する免疫応答を誘導するのに適するタンパク質又はペプチド；（ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するのに適するタンパク質又はペプチド；（ｄ）ヒト疾患の治療のための免疫応答を誘導するのに適するタンパク質又はペプチドからなる群より選択される。
【００９０】
かかるタンパク質又はペプチドを含むＳＡＰＮは、ヒトにおいて又は家畜及び愛玩動物において免疫応答を誘導するのに適していてもよい。
【００９１】
さらなる態様において、本発明は、上で定義した式（Ｉ）又は（ＩＩ）の単量体構築ブロックに関する。
【００９２】
別の態様において、本発明は、ワクチンとして適する本明細書に記載のタンパク質ナノ粒子を含む組成物、例えば、ワクチンとしての使用のための本明細書に記載のタンパク質ナノ粒子を含む組成物に関する。好ましいワクチン組成物は、水性緩衝液中にタンパク質ナノ粒子を含み、かつ例えば、糖由来添加剤（グリセロール、トレハロース、スクロースなど）又はアミノ酸由来添加剤（アルギニン、プロリン、グルタメートなど）又は陰イオン性、陽イオン性、非イオン性又は双性イオン界面活性剤（コレート、デオキシコレート、ｔｗｅｅｎなど）又は溶液のイオン強度を調節するためのあらゆる種類の塩（ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２など）をさらに含み得る。
【００９３】
別の態様において、本発明は、ヒト又は非ヒト動物にワクチン接種する方法に関する、かかるワクチン接種を必要とする対象に、本明細書中すでに記載した組成物の有効量を投与することを含む。かかるワクチン接種を必要とする対象は、通常、ヒト又は非ヒト動物である。
【００９４】
本明細書中すでに記載した、ヒト又は非ヒト動物にワクチン接種する方法における使用のための組成物であって、方法は、かかるワクチン接種を必要とするヒト又は非ヒト動物に有効量の前記組成物を投与することを含む、組成物も提供される。
【００９５】
ヒト又は非ヒト動物にワクチン接種するための医薬の製造のための、本明細書中すでに記載した組成物の使用も提供される。
【００９６】
ヒト又は非ヒト動物にワクチン接種するための、本明細書中すでに記載した組成物の使用も提供される。
【００９７】
用語「個体」「対象」又は「患者」は、本明細書中で交換可能に用いられる。ある特定の態様において、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、霊長類（ヒト及び非ヒト霊長類を含む）を含むがこれらに限定されない。好ましい実施態様において、対象はヒトである。さらなる態様において、本発明は、ｉ）核酸誘導体を含む緩衝液にＳＡＰＮを加えること及びｉｉ）通常のリフォールディングプロトコルを用いて、核酸誘導体の存在下でＳＡＰＮをリフォールディングすることを含む、本明細書に記載のＳＡＰＮを製造する方法に関する。
【００９８】
ＣｐＧ−ＳＡＰＮ（ＣｐＧを封入する自己集合タンパク質ナノ粒子）の設計
本発明によるＣｐＧ−ＳＡＰＮの特定の例としては、以下のコンストラクト「ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ」、（配列ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷＲＲＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号１）を有する式（Ｉ）に相当する）が挙げられる。
【００９９】
これは、以下の部分構造：
Ｘ１：ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳ（配列番号２）
ＮＤ１：ＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷ（配列番号３）
Ｌ１：ＲＲＧＲ（配列番号４）
ＮＤ２：ＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡＥＬＥＲＲＬＥＥＬ（配列番号５）
Ｙ１：ＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦ  ＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号６）
から構成されるコンストラクトである。
【０１００】
精製を容易にするために、ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲは、式（Ｉ）：
ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳ（配列番号２）
に定義される配列Ｘ１から始まり、それは、ニッケルアフィニティー精製ためのＨｉｓタグと、さらなるサブクローニングのための、ＤＮＡレベルの制限部位（ＮｃｏＩ及びＢａｍＨＩ）に含む。
【０１０１】
ＮＤ１について、五量体化ドメインを選択した（ｍ＝５）。具体的な五量体コイルドコイルは、ｐｄｂ−ｅｎｔｒｙ  １Ｔ８Ｚを有する、トリプトファン−ジッパー五量体化ドメイン（Liu, J., et al. Proc Natl Acad Sci USA 2004, 101(46)： 16156-16161）の新規な改変物である。
【０１０２】
オリジナルのトリプトファン−ジッパー五量体化ドメインは、配列
ＳＳＮＡＫＷＤＱＷＳＳＤＷＱＴＷＮＡＫＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＫＤＤＷＡＲＷＮＱＲＷＤＮＷＡＴ（配列番号７）を有する。
【０１０３】
ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲに用いられる五量体化ドメインの改変されたコイルドコイル配列は、位置１３で始まり、位置４９で終わり、及びＣ末端に配列バリエーション（ＮＱＲＷ（配列番号３７）の代わりにＲＡＴＷ（配列番号３６））と、溶解性の目的で、コイルドコイルの非コアであるが、オリジナルの配列（配列番号８）にあるようなコア位置でのトリプトファン残基のヘプタッドリピートパターンを保つ、いくつかの電荷改変とを含む。また、２つのリジン残基は、五量体コイルドコイルへのハプテン分子のカップリングを避けるため、アルギニン残基に変更される。ａａ（ａ）及びａａ（ｄ）位置でのコイルドコイルコア残基を太字で示し、下線を引いた。
【０１０４】
2020510650.tif 000004
その後、この配列は、配列ＲＲＧＲ（配列番号４）を有する短いリンカーＬ１により伸張し、コイルドコイル配列ＮＤ２と接続する。Ｌ１は、ナノ粒子の２つのコイルドコイル部分の間に柔軟な残基Ｇ（グリシン）を含む。それは、負に帯電した封入される核酸とのイオン性相互作用を提供する、３つの正に帯電したアルギニンアミノ酸を含む。
【０１０５】
Ｌ１の後に、以下の配列：
2020510650.tif 000005
を有する、第二のコイルドコイルドメインＮＤ２が続く。
【０１０６】
それは、アスパラギン残基が占める３つのコアａａ（ａ）位置を有する二量体コイルドコイルを形成することを目的としている、新規に設計されたコイルドコイルであり、それは、二量体コイルドコイル形成を好む。位置ａａ（ａ）及びａａ（ｄ）でコイルドコイルコア残基は、太字で示され、及び強調される。それは、それ自体に、配列ＩＤ  ＢＡＡ０１４４９．１を有するインフルエンザＡウイルスのマトリックスタンパク質１の残基１７３から１８１に相当する、プロミスキャス（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）ＣＤ４／ＣＤ８エピトープ  ＩＲＨＥＮＲＭＶＬ（配列番号８）（Parida R. et al., Vaccine 2007, 25：7530-7539）を含むパンＤＲ結合ＣＤ４エピトープストリングＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡ（配列番号７）を含む。
【０１０７】
セグメントＹ１は、以下の配列：
ＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮ  ＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号６）
を有する。
【０１０８】
それは、ＸｍａＩ制限部位を内部に含む配列ＡＲＧ、及びそれに続くフラジェリンの断片を含み、且つ表面露出しないリジン側鎖がアルギニンに変異するが、配列ＤＧＤＫＧＤＤＫ（配列番号９）を有するフラジェリンのＤ０及びＤ１ドメインを接続するループ中で４つのリジン残基がニコチン、ヘロイン、コカイン又はその同等物などの共有結合的にカップリングハプテン分子の目的のために組み込まれるように、さらに改変されたサルモネラ・ティフィムリウム フラジェリン（米国特許８，４２０，１０２にあるような）のＤ０及びＤ１ドメインから構成される。このループは、表面露出している。
【０１０９】
配列
ＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧ  ＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫ（配列番号１０）
【０１１０】
それにおいて残基２０、４２、５９、１３６及び１６１をリジンからアルギニンに変異させている一方、残基１７２はトレオニンからグルタミンに変異させてＤＮＡレベルでＭｆｅＩ制限部位を挿入している、べん毛生合成タンパク質ＦｌｉＣのＰ０６１７５．２の残基１から１８０に相当する。
【０１１１】
配列
ＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号１１）
それにおいて残基４０９をリジンからアルギニンに変異させているＰ０６１７５．２の残基４０３から４９３に相当する。それは、変異Ｔ４１９Ａ、Ｔ４４６Ｓ及びＳ４４７Ｅも含む。
【０１１２】
Ｔ＝１二十面体対称性と仮定し、単量体形及び二十面体形において、ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ単量体のモデルを図２に示す。ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲのＥＭ画像を図７に示す。
【実施例】
【０１１３】
実施例
以下の実施例は、本発明をさらに説明するために有用であるが、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【０１１４】
実施例１−ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲの分子クローニング
ナノ粒子コンストラクトをコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学の手順を用いて調製した。タンパク質配列ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ
ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷＲＲＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号１２）
をコードするＤＮＡを含むプラスミドを、ｐＰＥＰ−Ｔ（図３）の塩基性ＳＡＰＮ発現コンストラクトのＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位へのクローニングにより構築した。ワクチン免疫原は、ニコチンの活性化型であるＮＨＳ−ニコチンを用いて、リジン残基へのキャリヤとエピトープニコチンを共有結合的に付着させることにより作製した。
【０１１５】
構造Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｙ１を有するこのコンストラクトの配列は、詳細に上述した。簡潔に、このコンストラクトは、配列ＲＲＧＲ（配列番号４）を有するリンカーＬ１により、二量体の新規に設計されたコイルドコイル（ＮＤ２）と結合し、五量体コイルドコイルの最後のコア位置と二量体コイルドコイルの最初のコア位置との間に３つの正電荷を含む、五量体コイルドコイルトリプトファンジッパー（ＮＤ１）から構成される。Ｎ末端で配列Ｘ１は、Ｈｉｓタグ及び３つのハプテン／ニコチン結合部位（リジン）を含む一方、配列Ｙ１は、サルモネラ・ティフィムリウム フラジェリンの断片を含み、改変されたフラジェリンのＤ０及びＤ１ドメインから構成される。
【０１１６】
実施例２−発現
プラスミドはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｔｕｎｅｒ（ＤＥ３）細胞を形質転換させ、それをＨｙｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ中、抗生物質アンピシリンの存在下で増殖させた（図４Ａ）。前培養物を２８℃で増殖させた。翌日、前培養物の１：５００希釈物を、発現１Ｌ培養物に植菌し、細胞を５Ｌエルレンマイヤーフラスコ中で振とうさせながら、約０．８〜０．９のＯＤ６００に到達するまで３７℃で増殖させた。その後、細胞培養物をＩＰＴＧ（１ｍＭの最終濃度）を用いて誘導した。誘導後、培養物を振とう下、３７℃で３時間、増殖させた。その後、細胞を４，０００ｘ ｇで１５分間の遠心分離により収集した。細胞のペレットを−２０℃で保存した。ペレットを氷上で融解させ、ｐＨ８．０で６ＭグアニジンＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭイミダゾールからなる溶解バッファーに懸濁した。
【０１１７】
実施例３−精製
以下の精製緩衝液を用いた：
１．高リン酸溶解バッファー：６ＭグアニジンＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭイミダゾール  ｐＨ８．０
２．低リン酸洗浄バッファー：６ＭグアニジンＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ８．０
３．エンドトキシン除去のための洗浄緩衝液：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、６０％（ｖ／ｖ）イソプロパノール
４．溶出緩衝液：様々な濃度のイミダゾールと共に、低リン酸緩衝液６ＭグアニジンＨＣｌ、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ８．０
【０１１８】
細胞ペレットのグラムあたり、５から１０ｍＬ体積の溶解バッファー（６Ｍ  ＧｕＨＣｌ、３００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭイミダゾール  ｐＨ８．０）を用いた。２５ｍＬの溶解バッファーを３分間、氷上で超音波処理した。溶解物を、１５Ｋｒｐｍで４５分間の遠心分離を用いて透明にした。遠心分離後、透明溶解物を０．４５μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いてろ過し、２＊５ｍＬ  Ｈｉｓ−ｔｒａｐ  ＨＰアフィニティーカラムで精製した。
【０１１９】
第一に、タンパク質をカラムに結合させ、続いて以下のスキームに従い洗浄工程を行った：
１．高リン酸溶解バッファーを用いてカラムを平衡化すること
２．ろ過した透明溶解物（ＣＬ）のカラムへの結合
３．高リン酸溶解バッファー（５カラム体積）を用いた洗浄１
４．低リン酸緩衝液（５カラム体積）を用いた洗浄２
５．１０ｍＭＴｒｉｓ  ｐＨ８．０（１０カラム体積）中６０％イソプロパノールを用いた洗浄３
６．低リン酸緩衝液（１５カラム体積）を用いた洗浄４
【０１２０】
工程３を行い、核酸断片を除去し、エンドトキシンを除去するためには工程５を用いた。
【０１２１】
その後、１２０から１３２ｍＭに増加するイミダゾールのイミダゾール濃度を用いた段階的溶出を以下のスキームに従い行った（図４Ｂ）：
１．低リン酸緩衝液（５カラム体積）を用いたカラム洗浄
２．２０ｍＭイミダゾール（２カラム体積−フラクションサイズ３ｍＬ）を用いた溶出
３．１２２ｍＭイミダゾール（２カラム体積−フラクションサイズ３ｍＬ）を用いた溶出
４．１２４ｍＭイミダゾール（２カラム体積−フラクションサイズ３ｍＬ）を用いた溶出
５．１２６ｍＭイミダゾール（２カラム体積−フラクションサイズ３ｍＬ）を用いた溶出
６．１２８ｍＭイミダゾール（２カラム体積−フラクションサイズ３ｍＬ）を用いた溶出
７．１３０ｍＭイミダゾール（２カラム体積−フラクションサイズ３ｍＬ）を用いた溶出
８．１３２ｍＭイミダゾール（２カラム体積−フラクションサイズ３ｍＬ）を用いた溶出
９．２５０ｍＭイミダゾール（４カラム体積−フラクションサイズ６ｍＬ）を用いた溶出
１０．低リン酸緩衝液（１０カラム体積）を用いたカラム洗浄
精製したＤＥＤＤＬＩ−ＲＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥを（図４Ｃ）に示し、これは純粋なタンパク質の高収率を示す。
【０１２２】
実施例４−ニコチンのカップリング
ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ及びＬＩＶＥＬＩ１−ＲＲの第一のプールされた溶出フラクションは、５ｍＭ  ＥＤＴＡと少なくとも１時間インキュベーションし、浸出した金属イオンを除去した。続いてプールされた溶出フラクションの接線流ろ過を用いて、６Ｍグアニジン塩酸塩、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．２、１５０ｍＭ  ＮａＣｌからなるカップリング緩衝液に対し、透析を行った。透析には、スペクトラ−ポア６−８ｋＤａカットオフ膜を用いた。
【０１２３】
１１．０３ｍｇ／ｍＬの濃度でのＤＥＤＤＬＩ−ＲＲの１２ｍｇを、１０９０μＬの体積に相当するカップリングに用いた。タンパク質対ＮＨＳ−ニコチンのモル比は１：５０であった。従って、この比について以下の量のタンパク質及びＮＨＳ−ニコチンが用いられた：
ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ：０．２６７μモル（１２ｍｇ）
エナンチオピュアなＮＨＳ−ニコチン：１３．３５μモル
【０１２４】
カップリング反応を、マグネチックスターラーを使用して撹拌しながら、暗所で（すなわち、アルミホイルで覆って）、室温で３時間行った。カップリング反応後、試料をＰＤ  ｍｉｎｉｔｒａｐ  Ｇ−２５充填カラムに通過させカップリングしていないＮＨＳ−ニコチンを除去し、８Ｍ  尿素、２０ｍＭＴｒｉｓ  ｐＨ８．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ及び１０％トレハロース（図４Ｄ）からなるプレ−リフォールディング緩衝液に緩衝液交換をした。カップリング前及び後のコンストラクトの分子量を、タンパク質鎖あたり平均８．９ニコチン分子、すなわち、８つ全てのリジン側鎖及びＮ末端アミンがほとんど完全にＮＨＳ−ニコチンとカップリングしている（図４Ｄ）に相当する、それぞれ、４４５２７．３１及び４６８３８．５５Ｄａであると決定した。
【０１２５】
実施例５−リフォールディング
免疫付与実験のためのＣｐＧ又は封入研究のための蛍光標識されたＣｐＧのいずれかを含む、最終リフォールディング緩衝液を調製した。
2020510650.tif 000006
を有するマウス特異的ＣｐＧ（１８２６）であって、それにおいてＤＮＡ骨格における塩基はホスホロチオエート結合（記号＊により示す）により接続されている、配列。ＣｐＧ１８２６の分子量は６３６２．７ｇ／ｍｏｌである。フルオレセイン標識ＣｐＧ ＯＤＮ１８２６Ｆは、６８９９．７ｇ／ｍｏｌの分子量を有する。ＯＤＮ１８２６は、クラスＢ ＣｐＧ配列であり、２つの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを含み、それらは太字で強調表示されている。クラスＢ ＣｐＧは、迅速な分解を防ぐ完全なホスホロチオエート骨格内に、１又はそれより多いＣｐＧジヌクレオチドを含む。それらは、Ｂ細胞を強く活性化するがＩＦＮ−α分泌を弱く刺激する。
【０１２６】
哺乳動物ＤＮＡと比較して、これらの非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドは、２０倍の頻度で細菌ＤＮＡにおいて存在する。このマウス特異的ＯＤＮ１８２６配列におけるこれらのモチーフは、マウスＴｏｌｌ様受容体９により認識され、その後、強力な免疫刺激性効果を引き起こす。
【０１２７】
迅速なリフォールディング後、最終タンパク質濃度は、タンパク質、０．３１ナノモルに相当する、０．０５ｍｇ／ｍＬである。封入実験のため、タンパク質対ＣｐＧの異なるモル比を調製した。異なる最終リフォールディング緩衝液のため、次の量のＣｐＧを調製した：ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ：ＯＤＮ１８２６Ｆの１：０．２、１：０．３、１：０．４５、１：０．６、１：０．７５、１：１、１：１．５及び１：２の割合に相当する、０．０６、０．０９、０．１４、０．１８６、０．２３３、０．０３１、０．４５１及び０．６２ナノモル。
【０１２８】
その後、プレ−リフォールディング緩衝液中のタンパク質を、異なる量のＯＤＮ１８２６を含む、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％トレハロースを含む、最終リフォールディング緩衝液に滴下希釈した。迅速なリフォールディング工程は以下のように行われた：ＣｐＧを含む最終リフォールディング緩衝液を絶えず撹拌し続けた。タンパク質ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲを（ＣｐＧを有する）最終リフォールディング緩衝液に滴下し、リフォールディング工程を開始した。タンパク質を加えた後、絶えず攪拌しながらリフォールディング工程を５分間継続させた。
【０１２９】
実施例６−封入
迅速なリフォールディング後、ろ過の前に、全相対蛍光単位（ＲＦＵ）を測定した。その後、３００μＬのＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ：ＯＤＮ１８２６Ｆの全量を用いて、タンパク質を２．５倍濃縮する（すなわち、保持液を３００μＬから約１２０μＬに減少させた）ことにより第一のろ過工程を実行した。遊離のＣｐＧは通過するが封入されたＣｐＧを有するかもしれない集合ＳＡＰＮは保持されることを可能とする、１００ｋＤａカットオフ遠心フィルターを用いてろ過工程を実行した。第一のろ過工程後、通過画分及び保持液のＲＦＵを測定した。
【０１３０】
2020510650.tif 000007
表３：封入後の蛍光
【０１３１】
蛍光クエンチングのため、蛍光測定値のシグナル（ＲＦＵ）は濃度について極めて非線形であることに注意することは重要である。従って、成功した封入は、カラム「通過画分」フラクションにおいて最も良く観察することができる。ＣｐＧがＳＡＰＮに封入される場合、それは、その後、フィルターを通過しないであろうし、「通過画分」においてシグナルを与えないであろう。最大１：０．６の封入比率まで、ＳＡＰＮ（ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ：ＯＤＮ１８２６Ｆ）を有する試料の「通過画分」における検出可能な蛍光はほとんどないが、ＳＡＰＮを有しない試料（ＯＤＮ１８２６Ｆのみ）においては、より低い封入比率１：０．３、１：０．４５及び１：０．６に相当するこれらの濃度で蛍光強度の急速な増加があった（図５）。より高い比においては、ＳＡＰＮが全ての蛍光（すなわち、ＣｐＧ）を保持することができず、従って、蛍光シグナルは、ＳＡＰＮを含む試料の「通過画分」において著しく増加する（ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ：ＯＤＮ１８２６Ｆ）。これは、ＳＡＰＮが、タンパク質鎖のモル比の０．６倍に相当するＣｐＧの量を封入することができ、すなわち、６０のタンパク質鎖を有するＳＡＰＮのＴ１二十面体対称性を仮定すると、おおよそ、ナノ粒子あたり合計３６のＣｐＧ分子が封入されることを意味する。
【０１３２】
６８９９．７ｇ／ｍｏｌの分子量を有する、ＮａＣｌ緩衝液中でのＤＮＡの１．８ｇ／ｃｍ３の密度を仮定すると、３６分子のＯＤＮ１８２６Ｆは、直径７．６ｎｍを有する球体を占める。ＳＡＰＮのコンピューターモデルに基づいた中央の空洞の体積と非常によく一致している。
【０１３３】
ＳＡＰＮに封入され得るよりも多くのＣｐＧが添加される場合、その後、さらなるＣｐＧは、膜を通過し、通過画分において蛍光強度の増加をもたらすであろう。非封入ＣｐＧによる、通過画分における蛍光強度のこの増加は、相当するＣｐＧ濃度での、ＣｐＧのみ試料から測定されるシグナルとよく相関する（図６）。従って、ＳＡＰＮを含む試料において非封入ＣｐＧから検出されるシグナルは、ＣｐＧのみ試料からのシグナルとよく類似しており、濃度依存曲線はほとんど重なり合っている（図６）。
【０１３４】
実施例７−電子顕微鏡法
ＯＤＮ１８２６を有する封入ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲの透過型電子顕微鏡分析は、非常によい、非凝集ナノ粒子形成（図７）を示す。
【０１３５】
実施例８−マウス免疫付与実験
免疫付与実験のため、モル比１：０．６のＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ：ＯＤＮ１８２６を用いた。迅速なリフォールディング後、封入されるＣｐＧを有する、リフォールディングさせたＤＥＤＤＬＩ−ＲＲを含む溶液を透析し、ろ過した。試料をその後、１００ｋＤａカットオフ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。滅菌フードにおいて、０．２μｍシリンジフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて最終滅菌ろ過ステップを行った。各５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスの群を１０μｇ及び３０μｇの２つの異なる投与量で、封入されたＣｐＧを有する又は有しないタンパク質を免疫した。それらの投与量におけるＣｐＧの量は、それぞれ０．８５μｇ及び２．５６μｇである。２週間ごとに３回の注入を、筋肉内（ＩＭ）、鼻腔内（ＩＮ）及び静脈内（ＩＶ）注入の３つの異なる免疫付与プロトコルについて行った。免疫原のＳＡＰＮ中にＣｐＧが封入される場合に、３回の免疫付与プロトコルのそれぞれについて、抗体価の著しい増加を観察することができる（表３、図８）。
−  ＩＭ免疫付与について、１０μｇ投与量  免疫付与では、ＣｐＧを有する場合も有していない場合も、抗体価の観点から同一の強さの免疫応答を示すが、３０μｇの投与量については、ＣｐＧを有しない試料と比較して、封入されたＣｐＧを有する試料について２３６％の増加を観察することができる。
−  ＩＮ免疫付与については、封入されるＣｐＧは、タンパク質１０μｇ（ＣｐＧの０．８５μｇに相当する）のより低い投与量ですでに免疫応答を１６１％増加させている。３０μｇタンパク質投与量（２．５６μｇ  ＣｐＧ）について、増加は３１９％である。
−  ＩＭ免疫付与に対する免疫応答は一般に最も強いが、ＣｐＧのインフルエンザは、タンパク質１０μｇ及び３０μｇ（ＣｐＧ０．８５μｇ及び２．５６μｇ）の、低い投与量及び高い投与量について１８％及び８７％の増加を伴い、より穏やかである。
【０１３６】
表３：ＣｐＧ封入を伴う及び伴わない、免疫応答
2020510650.tif 000008
【０１３７】
実施例９−異なる長さのリンカーＬ１及びリンカーＬ１の全体としての電荷の試験
より長いリンカーＬ１を有し、全体としてプラス３の電荷を有するＤＥＤＤＬＩ−ＲＲよりも多くの正電荷を運ぶＳＡＰＮは、より効率良く負に帯電した核酸を封入するであろう、すなわち、それらは核酸のより大きな積載量を運ぶことができるであろうことが予測される。この仮定を試験するため、それぞれＲＲＧＲＲＧＲ（配列番号１４）及びＲＲＧＲＲＧＲＲＧＲ（配列番号１５）のリンカーＬ１を有する２つの新しい粒子を設計した。第一のコンストラクト（２ＲＲとも呼ばれる）のリンカーＬ１の長さは、５の正電荷（アルギニン）を有する７アミノ酸であり、一方、第二のコンストラクト（３ＲＲとも呼ばれる）は、合計で７の正電荷（アルギニン）を有する９アミノ酸長のリンカーＬ１を有した。
【０１３８】
改変されたリンカーの理論的根拠は、リンカーＬ１の長さを増加させることにより２つのオリゴマー化ドメインＮＤ１及びＮＤ２をさらに離れさせることができ、従って、積み荷を積むためのスペースをより多く与える、中央の空洞のサイズを増加させる。リンカーにさらなる電荷を加えることにより、最大積載量として負に帯電した核酸とタンパク質との間で電荷をより良く釣り合わせることが可能になる。
【０１３９】
リフォールディング挙動は、タンパク質鎖の全体としての電荷に大きく依存し、従って粒子そのものの全体としての電荷に大きく依存するため、２ＲＲ及び３ＲＲのリンカーＬ１におけるさらなる正電荷は、五量体ＮＤ１の始まりの直前のＸ１の端での負に帯電したグルタミン酸の挿入により補い、及び３ＲＲについては五量体ＮＤ１のＣ末端近くのアルギニン残基を負に帯電したアスパラギン酸へ変更することにより補った。これは、２ＲＲ及び３ＲＲのタンパク質鎖の全体としての電荷を、ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲの全体としての電荷と同一である、−７に保つ。２ＲＲ及び３ＲＲの配列は、その結果、それぞれ、
ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳＥＥＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷＲＲＧＲＲＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号１６）
及び
ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳＥＥＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＤＡＴＷＲＲＧＲＲＧＲＲＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号１７）
である。２ＲＲ及び３ＲＲの計算された分子量は、それぞれ、４５４３１．９３Ｄａ及びＭｗ４５７６０．２６Ｄａである。
【０１４０】
２つのコンストラクトを、実施例１、２及び３のとおり、クローニングし、発現させ及び精製した。ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲと比較してわずかに異なる分子量を説明するため、わずかに変更された、封入比率に用いられるタンパク質量を用い、ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲについて実施例５に記載のように、リフォールディング及び付随する封入を行った。
【０１４１】
図９による驚くべき発見は、２ＲＲ及び３ＲＲの、より長く且つより正に帯電したリンカーは、より多くのＣｐＧを封入させることはできなかったことである。ＣｐＧのみ試料と比較して、通過画分へフィルターを通過せず上清中に保持されるＣｐＧが依然として非常に明確に存在するが、それはＤＥＤＤＬＩ−ＲＲの封入効率よりもやや少ない。
【０１４２】
実施例１０−ＴＬＲ５バックグラウンド免疫刺激を用いない、ＴＬＲ９活性化の試験
コンストラクトＤＥＤＤＬＩ−ＲＲにおいて、フラジェリン分子のＤ０／Ｄ１ドメインは、ＴＬＲ５を活性化して、強力な免疫応答を誘導する。これは、ＴＬＲ９に結合するＣｐＧからの免疫応答を覆うであろう。主にＴＬＲ９活性化から生じる、免疫応答を試験するため、ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲにおけるＴＬＲ５相互作用部位を改変し、受容体との相互作用を無効にさせた。ＴＬＲ５／フラジェリン相互作用部位でのアルギニン残基（Yoon S.I. et al., Science 2012, 335：859-64）をリジンに変異させた。また、フラジェリンのＣ末端のインフラマソーム相互作用部位をに変異させ、インフラマソームとの相互作用を妨害した（Lightfield K.L. et al., Nat Immunol. 2008, 9：1171-8）。２つのタンパク質配列の名称は、ＬＩＶＥＬＩ１−ＲＲ及びＬＩＶＥＬＩ２−ＲＲであり、対応する配列は、ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷＲＲＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＫＶＫＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＫＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＡＡＡＡＲ（配列番号１８）
及び
ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷＲＲＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＫＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＫＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＫＶＫＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＫＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＫＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＡＡＡＡＲ（配列番号１９）
である。
【０１４３】
コンストラクトＬＩＶＥＬＩ１−ＲＲにおいて、コンストラクトＤＥＤＤＬＩ−ＲＲのアルギニン残基２０６、２０８及び３２２をリジンに変異させ、ＬＩＶＥＬＩ２−ＲＲにおいて、ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲのアルギニン残基１３５、１７４、２５１及び３１０もリジンに変化させた。リジン残基の第一級アミンでハプテンニコチンをカップリングすることにより、フラジェリン及びＴＬＲ５間のインターフェイスでバルキーな基が挿入され、従って、複合体形成を阻害し、従って、ｔｏｌｌ−様受容体ベースの免疫刺激を阻害する。コンストラクトＬＩＶＥＬＩ１−ＲＲ及びＬＩＶＥＬＩ２−ＲＲのいずれにおいても、フラジェリンのＤ０ドメインのインフラマソーム相互作用部位は改変されてＤＥＤＤＬＩ−ＲＲ（ＬＳＬＬ）の残基３９０から３９３が４つのアラニン（ＡＡＡＡ）（配列番号４０）に置き換えられている。この改変は、２つのコンストラクトＬＩＶＥＬＩ１−ＲＲ及びＬＩＶＥＬＩ２−ＲＲのインフラマソーム活性化を阻害するであろう（Lightfield K.L. et al., Nat Immunol. 2008, 9：1171-8）。
【０１４４】
正に帯電したリンカーを有するコンストラクトについて、封入されるＣｐＧを伴わないリフォールディングは上手くいかないため、コンストラクトのペアを調製した。それにおいて正に帯電したリンカーＲＲＧＲ（配列番号４）が配列ＭＧＧＲ（配列番号４１）と置き換えられており、従って、リンカーＬ１において、３つの正電荷のうち２つが除かれている。ＬＩＶＥＬＩ１及びＬＩＶＥＬＩ２と名付けられたそれらのコンストラクトを封入されるＣｐＧを伴わない免疫付与に用い、それらは、全体として配列
ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷＭＧＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＫＶＫＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＫＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＡＡＡＡＲ（配列番号２０）
及び
ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷＭＧＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＫＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＫＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＫＶＫＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＫＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＫＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＡＡＡＡＲ（配列番号２１）
を有した。
【０１４５】
コンストラクトＬＩＶＥＬＩ１／ＬＩＶＥＬＩ１−ＲＲ及びＬＩＶＥＬＩ２／ＬＩＶＥＬＩ２−ＲＲの２つのペアを、実施例１、２及び３のとおりクローニングし、発現させ、精製した。ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲについて実施例５に記載のように、リフォールディング及び付随する封入を、ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲと比較してわずかに異なる分子量を説明するために、わずかに改変された封入比率に用いたタンパク質量を用いて行った。免疫付与実験のため、１：０．６のタンパク質：ＯＤＮ１８２６のモル比を用いた。迅速なリフォールディング後、封入されたＣｐＧを有するリフォールディングさせたナノ粒子を含む溶液を透析し、ろ過した。その後、試料を１００ｋＤａカットオフ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。滅菌フードにおいて、０．２μｍシリンジフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて最終滅菌ろ過ステップを行った。
【０１４６】
各５匹のＢａｌｂ／Ｃマウスの群を、（ＬＩＶＥＬＩ１−ＲＲ及びＬＩＶＥＬＩ２−ＲＲ）を用いて又は封入されたＣｐＧ（ＬＩＶＥＬＩ１及びＬＩＶＥＬＩ２）を用いずに、３０μｇタンパク質の投与量を用いて免疫した。ＬＩＶＥＬＩ１−ＲＲ及びＬＩＶＥＬＩ２−ＲＲ投与量における封入されたＣｐＧの量は、約２．５μｇである。免疫付与プロトコルにおいて、２週間差で各３回の筋肉内注入を行った。免疫原のＳＡＰＮにＣｐＧは封入される場合、免疫原のいずれのペアについても抗体価の著しい増加を観察することができる（図１０）。ＬＩＶＥＬＩ１及びＬＩＶＥＬＩ２免疫原についてＯＤＮ１８２６を用いない抗体価はそれぞれ、５７６．３及び３６７．６であったが、一方、ＬＩＶＥＬＩ１−ＲＲ及びＬＩＶＥＬＩ２−ＲＲに封入されたＣｐＧは、抗体価を、およそ２０倍の増加に相当する、それぞれ、１０９５８．０及び７６１８．４に増加させた。
【０１４７】
実施例１１−フラジェリンを含むタンパク質鎖（ＣＣ−ＲＲ）との共集合によるマラリアワクチン
本発明によるＣｐＧ−ＳＡＰＮのさらなる例は、以下のコンストラクト「ＣＣ−ＲＲ」であり、それにおいて、
式（Ｉ）について、配列、
ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＴＦＲＧＮＮＧＨＮＳＳＳＳＬＹＮＧＳＱＦＩＥＱＬＮＮＳＦＴＳＡＦＬＥＳＱＳＭＮＫＩＧＤＤＬＡＥＴＩＳＮＥＬＶＳＶＬＱＫＮＳＰＴＦＬＥＳＳＦＤＩＫＳＥＶＫＫＨＡＫＳＭＬＫＥＬＩＫＶＧＬＰＳＦＥＮＬＶＡＥＮＶＫＰＰＫＶＤＰＡＴＹＧＩＩＶＰＶＬＴＳＬＦＮＫＶＥＴＡＶＧＡＫＶＳＤＥＩＷＮＹＮＳＰＤＶＳＥＳＥＥＳＬＳＤＤＦＦＤＡＳＧＳＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＳＧＳＷＥＲＷＮＡＫＷＤＥＷＲＮＤＱＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＹＷＴＬＴＷＲＲＧＲＬＹＳＲＬＡＲＩＥＲＲＶＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＡＲＲＬＥＡＬＩＤＹＮＫＡＡＬＳＫＦＫＥＤＡＲＧＴＦＲＧＮＮＧＨＮＳＳＳＳＬＹＮＧＳＱＦＩＥＱＬＮＮＳＦＴＳＡＦＬＥＳＱＳＭＮＫＩＧＤＤＬＡＥＴＩＳＮＥＬＶＳＶＬＱＫＮＳＰＴＦＬＥＳＳＦＤＩＫＳＥＶＫＫＨＡＫＳＭＬＫＥＬＩＫＶＧＬＰＳＦＥＮＬＶＡＥＮＶＫＰＰＫＶＤＰＡＴＹＧＩＩＶＰＶＬＴＳＬＦＮＫＶＥＴＡＶＧＡＫＶＳＤＥＩＷＮＹＮＳＰＤＶＳＥＳＥＥＳＬＳＤＤＦＦＤ  （配列番号２２）
及び
式（ＩＩ）について、配列、ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＴＦＲＧＮＮＧＨＮＳＳＳＳＬＹＮＧＳＱＦＩＥＱＬＮＮＳＦＴＳＡＦＬＥＳＱＳＭＮＫＩＧＤＤＬＡＥＴＩＳＮＥＬＶＳＶＬＱＫＮＳＰＴＦＬＥＳＳＦＤＩＫＳＥＶＫＫＨＡＫＳＭＬＫＥＬＩＫＶＧＬＰＳＦＥＮＬＶＡＥＮＶＫＰＰＫＶＤＰＡＴＹＧＩＩＶＰＶＬＴＳＬＦＮＫＶＥＴＡＶＧＡＫＶＳＤＥＩＷＮＹＮＳＰＤＶＳＥＳＥＥＳＬＳＤＤＦＦＤＡＳＧＳＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＳＧＳＷＥＲＷＮＡＫＷＤＥＷＲＮＤＱＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＹＷＴＬＴＷＲＲＧＲＬＹＳＲＬＡＲＩＥＲＲＶＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＡＲＲＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号２３）
を有する式（Ｉ）及び（ＩＩ）に相当する２つの異なるタンパク質鎖が共集合する。
第一のコンストラクトは、以下の部分構造
Ｘ１：  ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＴＦＲＧＮＮＧＨＮＳＳＳＳＬＹＮＧＳＱＦＩＥＱＬＮＮＳＦＴＳＡＦＬＥＳＱＳＭＮＫＩＧ  ＤＤＬＡＥＴＩＳＮＥＬＶＳＶＬＱＫＮＳＰＴＦＬＥＳＳＦＤＩＫＳＥＶＫＫＨＡＫＳＭＬＫＥＬＩＫＶＧＬＰＳＦＥＮＬＶＡＥＮＶＫＰＰＫＶＤＰＡＴＹＧＩＩＶＰＶＬＴＳＬＦＮＫＶＥＴＡＶＧＡＫＶＳＤＥＩＷＮＹＮＳＰＤＶＳＥＳＥＥＳＬＳＤＤＦＦＤＡＳＧＳＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＳＧＳ（配列番号２４）
ＮＤ１：  ＷＥＲＷＮＡＫＷＤＥＷＲＮＤＱＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＹＷＴＬＴＷ（配列番号２５）
Ｌ１：  ＲＲＧＲ（配列番号４）
ＮＤ２：  ＬＹＳＲＬＡＲＩＥＲＲＶＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＡＲＲＬ（配列番号２６）
Ｙ１：  ＥＡＬＩＤＹＮＫＡＡＬＳＫＦＫＥＤＡＲＧＴＦＲＧＮＮＧＨＮＳＳＳＳＬＹＮＧＳＱＦＩＥＱＬＮＮＳＦＴＳＡＦＬＥＳＱＳ  ＭＮＫＩＧＤＤＬＡＥＴＩＳＮＥＬＶＳＶＬＱＫＮＳＰＴＦＬＥＳＳＦＤＩＫＳＥＶＫＫＨＡＫＳＭＬＫＥＬＩＫＶＧＬＰＳＦＥＮＬＶＡＥＮＶＫＰＰＫＶＤＰＡＴＹＧＩＩＶＰＶＬＴＳＬＦＮＫＶＥＴＡＶＧＡＫＶＳＤＥＩＷＮＹＮＳＰＤＶＳＥＳＥＥＳＬＳＤＤＦＦＤ（配列番号２７）
を有する式Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｙ１（Ｉ）に相当する。
【０１４８】
第二のコンストラクトは、
以下の部分構造
Ｘ２：ＭＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＴＦＲＧＮＮＧＨＮＳＳＳＳＬＹＮＧＳＱＦＩＥＱＬＮＮＳＦＴＳＡＦＬＥＳＱＳＭＮＫＩＧ  ＤＤＬＡＥＴＩＳＮＥＬＶＳＶＬＱＫＮＳＰＴＦＬＥＳＳＦＤＩＫＳＥＶＫＫＨＡＫＳＭＬＫＥＬＩＫＶＧＬＰＳＦＥＮＬＶＡＥＮＶＫＰＰＫＶＤＰＡＴＹＧＩＩＶＰＶＬＴＳＬＦＮＫＶＥＴＡＶＧＡＫＶＳＤＥＩＷＮＹＮＳＰＤＶＳＥＳＥＥＳＬＳＤＤＦＦＤＡＳＧＳＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＳＧＳ（配列番号２４）
ＮＤ３：ＷＥＲＷＮＡＫＷＤＥＷＲＮＤＱＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＹＷＴＬＴＷ（配列番号２５）
Ｌ２：ＲＲＧＲ（配列番号４）
ＮＤ４：ＬＹＳＲＬＡＲＩＥＲＲＶＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＡＲＲＬ（配列番号２６）
Ｙ２：ＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧ  ＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号２８）
を有する、式Ｘ２−ＮＤ３−Ｌ２−ＮＤ４−Ｙ２（ＩＩ）に相当する。
特に、これらのコンストラクトにおける異なる断片は以下のとおりである：
Ｘ１は、制限部位ＮｃｏＩ、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩをコードするペプチド配列（ＭＧ、ＡＳＧＳ及びＳＧＳ）に挟まれそれにより区切られた、Ｈｉｓタグ（ＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨ）（配列番号２９）、それに続くマラリアの抗原ＣｅｌＴＯＳ（ＴＦＲＧＮＮＧＨＮＳＳＳＳＬＹＮＧＳＱＦＩＥＱＬＮＮＳＦＴＳＡＦＬＥＳＱＳＭＮＫＩＧＤＤＬＡＥＴＩＳＮＥＬＶＳＶＬＱＫＮＳＰＴＦＬＥＳＳＦＤＩＫＳＥＶＫＫＨＡＫＳＭＬＫＥＬＩＫＶＧＬＰＳＦＥＮＬＶＡＥＮＶＫＰＰＫＶＤＰＡＴＹＧＩＩＶＰＶＬＴＳＬＦＮＫＶＥＴＡＶＧＡＫＶＳＤＥＩＷＮＹＮＳＰＤＶＳＥＳＥＥＳＬＳＤＤＦＦＤ）（配列番号３０）及びパン−ＤＲ結合エピトープＰＡＤＲＥ（ＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡ）（配列番号３１）を含む。
【０１４９】
ＮＤ１はいくつかの電荷改変を有する、トリプトファンジッパー（Liu J et al., Proc Natl Acad Sci U S A 2004; 101(46)：16156-61、ｐｄｂ−ｅｎｔｒｙ  １Ｔ８Ｚ、配列番号７）由来の五量体コイルドコイルである。それは、配列番号３を有するＤＥＤＤＬＩ−ＲＲのＮＤ１ドメインと類似する。
【０１５０】
Ｌ１は、ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲにおける配列ＲＲＧＲ及び配列番号４を有するものと同一のリンカーである。
【０１５１】
ＮＤ２は、配列ＩＤ ＢＡＡ０１４４９．１を有するインフルエンザＡウイルスのマトリックスタンパク質１の残基１７３から１８１に相当するプロミスキャスＣＤ４／ＣＤ８エピトープＩＲＨＥＮＲＭＶＬ（配列番号８）（Parida R. et al., Vaccine 2007, 25：7530-7539）も含むコンストラクトＤＥＤＤＬＩ−ＲＲにおけるＮＤ２（配列番号５）とよく類似する配列を有するコイルドコイルドメインである。
【０１５２】
Ｙ１は、リンパ球性脈絡髄膜炎マンマレナウイルスの糖タンパク質由来のＣＤ４エピトープを含む配列から始まり、ＬＩＤＹＮＫＡＡＬＳＫＦＫＥＤ（配列番号３２）その後、ＤＮＡレベルで制限部位ＸｈｏＩ及びＸｍａＩをコードするペプチド配列（ＬＥ及びＡＲＧ）に挟まれそれにより区切られたマラリア抗原ＣｅｌＴＯＳ（ＴＦＲＧＮＮＧＨＮＳＳＳＳＬＹＮＧＳＱＦＩＥＱＬＮＮＳＦＴＳＡＦＬＥＳＱＳＭＮＫＩＧＤＤＬＡＥＴＩＳＮＥＬＶＳＶＬＱＫＮＳＰＴＦＬＥＳＳＦＤＩＫＳＥＶＫＫＨＡＫＳＭＬＫＥＬＩＫＶＧＬＰＳＦＥＮＬＶＡＥＮＶＫＰＰＫＶＤＰＡＴＹＧＩＩＶＰＶＬＴＳＬＦＮＫＶＥＴＡＶＧＡＫＶＳＤＥＩＷＮＹＮＳＰＤＶＳＥＳＥＥＳＬＳＤＤＦＦＤ）（配列番号３０）の第二のコピーが続く。ＸｈｏＩ制限部位は、断片ＮＤ２と共有される。
【０１５３】
第一のコンストラクトと第二のコンストラクトとの唯一の違いは、部分構造Ｙ１及びＹ２における違いであり、すなわち、他の断片は、２つのコンストラクト間で同一であり、それは、Ｘ１はＸ２と等しく、ＮＤ１はＮＤ３と等しく、Ｌ１はＬ２と等しく及びＮＤ２はＮＤ４と等しいことを意味する。従って、２つのコンストラクトのコイルドコイルオリゴマー化ドメインは同一であるため、２つのコンストラクトは、共集合することができる。これは、特許ＷＯ２０１５／１０４３５２Ａ１に記載されている概念であり、それにおいて、フラジェリンを含むタンパク質鎖はタンパク質鎖を運ぶＢ細胞エピトープと共集合する。
【０１５４】
第二のコンストラクトのＹ２は、第一のコンストラクトのＹ１と対照的に、フラジェリンのＤ０及びＤ１ドメインを含む。それは、ＮＤ４のコイルドコイルをもう少し伸張させるフラジェリン配列前の小さなαヘリックスセグメント（ＥＲＲＬＥＥＬ）（配列番号３３）から始まる。Ｙ２は、ＸｈｏＩ制限部位が断片ＮＤ４と共有されながら制限部位ＸｈｏＩ及びＸｍａＩをコードするペプチド配列（ＬＥ及びＡＲＧ）に挟まれそれにより区切られる。
【０１５５】
２つのコンストラクトの共集合物は、両方のコイルドコイルにＢ細胞エピトープＣｅｌＴＯＳを提示するＳＡＰＮを形成するが、少数のフラジェリン分子は、第一のコンストラクトと第二のコンストラクトとの共集合比率に応じて、ＳＡＰＮに組み込まれている。正に帯電したリンカーＬ１及びＬ２は、再び、ＳＡＰＮの中央の空洞に位置し、従って、負に帯電したＣｐＧとのイオン性相互作用可能にする。再び、ＣｐＧ ＯＤＮ１８２６は、リフォールディングの間にＳＡＰＮに封入される。
【０１５６】
実施例１、２及び３のとおり、２つのコンストラクトをクローニングし、発現させ、精製した。ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲと比較して異なる分子量を説明するために、１：０．６（タンパク質：ＣｐＧ）の同一の封入比率について用いるタンパク質量を変更して、ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲについて実施例５に記載のようにリフォールディング及び付随する封入を行った。ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲコンストラクトと同様に、封入効率は、上記蛍光ろ過実験における保持率から明らかなように、タンパク質鎖対ＣｐＧ ＯＤＮ１８２６Ｆ分子の割合について約１：０．６である。ＣＣ−ＲＲは、最大１：０．６の共集合比率で蛍光ＯＤＮ１８２６Ｆ分子を保持することができる（図１２）。
【０１５７】
ＳＡＰＮの分子構造を記載する図、共集合／封入手順の工程並びに第一の及び第二のタンパク質鎖の５８：２の共集合比率についてのＥＭ顕微鏡写真を図１３に示した。
【０１５８】
実施例１２−ＣＤ４及びＣＤ８エピトープを有するＨＳＶマウス免疫原「ＲＲ−ＳＳＩＥＦ」
ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲコンストラクト（実施例１）について、ＲＲ−ＳＳＩＥＦをコードするＤＮＡは、標準的な分子生物学の手順を用いて調製した。タンパク質配列ＲＲ−ＳＳＩＥＦ
ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷＲＲＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＥＥＬＲＲＬＬＱＬＩＲＨＥＮＲＭＶＬＱＦＶＲＡＬＳＭＱＮＡＥＬＥＲＲＬＥＥＬＡＲＧＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＳＳＩＥＦＡＲＬＱＦＤＤＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号３４）
をコードするＤＮＡを含むプラスミドは、ｐＰＥＰ−Ｔの塩基性ＳＡＰＮ発現コンストラクトのＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位へのクローニングにより構築した（図３）。
【０１５９】
構造Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｙ１を有するこのコンストラクトの配列は、詳細に上述したＤＥＤＤＬＩ−ＲＲの１つに類似する。簡潔に、このコンストラクトは、五量体コイルドコイルの最後のコア位置及び二量体コイルドコイルの最初のコア位置の間に３つの正電荷を含む配列ＲＲＧＲを有するリンカーＬ１により、新規に設計された二量体コイルドコイル（ＮＤ２）と結合した五量体コイルドコイルトリプトファンジッパー（ＮＤ１）から構成される。配列Ｘ１は、Ｎ末端にＨｉｓタグを含み、配列Ｙ１は、改変されたフラジェリンのＤ０及びＤ１ドメインから構成される、サルモネラ・ティフィムリウムフラジェリンの断片を含む。フラジェリンのＤ０及びＤ１ドメインを接続するペプチド配列は、ＭｆｅＩ及びＰｓｔＩの制限部位の間に、配列ＱＬＮＶＱＱＡＫＦＶＡＡＷＴＬＫＡＡＡＳＳＩＥＦＡＲＬＱＦＤＤＴＥＮＰＬＱ（配列番号３５）を有する。これは、ヒトアルファヘルペスウイルス２のエンベロープ糖タンパク質Ｂのマウス特異的（ハプロタイプＨ−２ｋ）ＣＤ８エピトープＳＳＩＥＦＡＲＬと、パン−ＤＲ結合ＣＤ４エピトープＰＡＤＲＥを含む断片を接続する。ＭＨＣ−Ｉ分子を有する複合体中でのこのペプチドの結晶構造は、エントリーコード１Ｔ０Ｍで、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎデータベースに寄託した。
【０１６０】
Ｔｈ１免疫応答を誘導するために、クラスＢ  ＯＤＮ１８２６の代わりに、クラスＡ  ＣｐＧ  ＯＤＮ１５８５を用いた。ＯＤＮ１５８５は、リン酸ジエステル結合を表す大文字の塩基を有し、小文字の塩基は、塩基間のホスホロチオエート結合を含む、配列５’−ｇｇＧＧＴＣＡＡＣＧＴＴＧＡｇｇｇｇｇｇ−３’（配列番号：３９）を有する。
【０１６１】
実施例１、２及び３において、コンストラクトＲＲ−ＳＳＩＥＦをクローニングし、発現させ、精製した。ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲと比較してわずかに異なるＲＲ−ＳＳＩＥＦの分子量、及びＯＤＮ１８２６に対しＯＤＮ１５８５の異なる分子量を説明するために、封入比率のために用いられるタンパク質量をわずかに変更して、ＤＥＤＤＬＩ−ＲＲについて実施例５に記載するように、リフォールディング及び付随する封入を行った。免疫付与実験のため、モル比１：０．６のタンパク質：ＯＤＮ１５８５を用いた。迅速なリフォールディング後、封入されるＣｐＧを有するリフォールディングさせたナノ粒子を含む溶液を透析し、ろ過した。その後、試料を１００ｋＤａカットオフ遠心フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて濃縮した。滅菌フードにおいて、０．２μｍシリンジフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて最終滅菌ろ過ステップを行った。封入されたＯＤＮ１５８５とＲＲ−ＳＳＩＥＦの透過型電子顕微鏡分析は、非常によく、非凝集ナノ粒子形成（図１４）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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