(57)【要約】  本発明は、ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２および／またはＤ３の誘導体を含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２および／またはＤ３の誘導体からなるポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する、鎮痛剤として使用するため、疼痛治療において使用するため、慢性疼痛および／または神経障害性疼痛の治療において使用するため、および／または神経細胞発現性Ｎ型カルシウムチャネル（ＮＣＣ）を阻害するための組成物に関する。
2020502243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体を含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体からなるポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する、鎮痛剤として使用するための組成物。
【請求項２】
ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体を含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体からなるポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する、疼痛治療において使用するための組成物。
【請求項３】
ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体を含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体からなるポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する、慢性疼痛の治療において使用するための組成物。
【請求項４】
ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体を含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体からなるポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する、神経障害性疼痛の治療において使用するための組成物。
【請求項５】
ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体を含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体からなるポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する、神経細胞発現性Ｎ型カルシウムチャネル（ＮＣＣ）を阻害するための組成物。
【請求項６】
前記ペプチドが、実質的にＤ−エナンチオマーからなることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の組成物。
【請求項７】
体重１キロ当たり１マイクログラム〜１グラムの投与において使用するための、請求項１から５までのいずれか１項記載の組成物。
【請求項８】
経腸投与、経静脈投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与または経口投与、好ましくは経口投与用の、請求項１から５までのいずれか１項記載の組成物。
【請求項９】
Ｎ型ＮＣＣに対して、１ナノモーラー〜１ミリモーラーのＩＣ５０値を特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の組成物。
【請求項１０】
前記誘導体が、環化ペプチドまたはアミド化ペプチドであることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の組成物。
【請求項１１】
前記のＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体を含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体からなるポリマーが、さらなるアミノ酸、リンカー、スペーサ、官能基、および／または物質と結合していることを特徴とする、請求項１から５までのいずれか１項記載の組成物。
【請求項１２】
対照と比べて神経伝達物質の放出を低下させるための方法において、ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２および／またはＤ３の誘導体を含有するポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する、鎮痛剤として使用するための組成物を、Ｎ型ＮＣＣと接触させることを特徴とする、方法。
【請求項１３】
ＮＣＣを通るカルシウム流入が、対照と比べて低下することを特徴とする、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
対照と比べてＮ型ＮＣＣを阻害するための方法において、Ｎ型ＮＣＣを、ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２および／またはＤ３の誘導体を含有するポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する組成物と接触させることを特徴とする、方法。
【請求項１５】
Ｌ型ＮＣＣの機能が対照と比べて変化しない、請求項１２から１４までのいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２および／またはＤ３の誘導体を含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２および／またはＤ３の誘導体からなるポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する、鎮痛剤として使用するため、疼痛治療において使用するため、慢性疼痛および／または神経障害性疼痛の治療において使用するため、および／または神経細胞発現性（ｎｅｕｒｏｎａｌ）Ｎ型カルシウムチャネル（ＮＣＣ）を阻害するための組成物に関する。本発明は、さらに、対照と比べて神経伝達物質の放出を低下させるための方法、および前記で定義した組成物を使用しながらＮ型ＮＣＣを阻害するための方法に関する。
【０００２】
ドイツ疼痛研究会（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓｃｈｍｅｒｚｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ）の数字は、ドイツでは１２００万人を超える人が、長引く慢性疼痛および／または神経障害性疼痛に悩んでいることを裏付けている。神経障害性疼痛は、末梢神経系または中枢神経系における求心系の損傷または疾患後に生じる。薬物療法は、５０〜８０％の疼痛軽減率で可能であるが、たいてい無痛状態には至り得ない。すべての薬物オプションにおいて、およそ２０〜４０％の患者が治療に対して不十分にしか応答しないか（＜３０％の疼痛軽減、いわゆる非応答者）、または容認できない副作用に苦しむ。抗うつ薬（三環系／四環系抗うつ薬、選択的セロトニン／ノルアドレナリン再取り込み阻害薬）、長時間作用型オピオイド、神経細胞発現性ナトリウムチャネルに作用する抗てんかん薬（例えば、カルバマゼピン）、および局所治療薬（リドカインパッチ、高用量カプサイシンパッチ）の他に、神経細胞発現性カルシウムチャネルに作用する薬物療法、例えば、ガバペンチン、プレガバリン、およびジコノチド（Ｐｒｉａｌｔ（登録商標））が適用される。その際、ガバペンチンおよびプレガバリンは、Ｐ／Ｑ型カルシウムチャネル特異的阻害薬であり、ジコノチドは、承認された唯一のＮ型カルシウムチャネル特異的阻害薬である。ジコノチドは、２５個のアミノ酸からなる環状ペプチドであり、もともとはイモガイＣｏｎｕｓ  ｍａｇｕｓの毒からω−コノトキシンＭＶＩＩＡとして単離された。
ジコノチドは、きわめて激しい痛みに苦しみ、かつ別のすべての治療オプションが成果を示さない患者において適用される。Ｐｒｉａｌｔ（登録商標）の承認は、１２００名を超える患者を含めて行われた３つの第ＩＩＩ相臨床試験の結果に基づいている。すべての試験において、ジコノチドは、プラシーボと比べて疼痛、とりわけ、癌疾患またはＡＩＤＳがもたらす重度の治療抵抗性慢性疼痛を良好に軽減することができた。とりわけ、ジコノチドの追加的な髄腔内投与により、必要とされるオピオイド量を減らすことができた。モルヒネと比べてジコノチドは望ましくない作用をあまり引き起こさない。
ただし、ジコノチドの髄腔内（ｉ．ｔｈ．）投与は、生命を脅かしかねない潜在的な重症感染、例えば、髄膜炎のリスクをはらむ。カテーテルに沿って生物が侵入することに起因する髄膜炎または不注意による注入システムの汚染が、特に外部システムを使用した、医薬品の髄腔内投与に関する公知の合併症である。さらに、ジコノチドは、８８％の患者において、著しい中枢神経系副作用、例えば、めまい、吐き気、眼振、混乱、不安定歩行、記憶障害、霧視、頭痛、無力症、嘔吐、および意識朦朧を引き起こす。非常に手間がかかり、かつ危険を伴う投与方式および著しい副作用にもかかわらず、ジコノチドは、疼痛治療に使用されるが、なぜなら、ジコノチドは、例えば、腫瘍またはＡＩＤＳによって引き起こされる、モルヒネさえももはや緩和をもたらさない非常に激しい疼痛においても成果を示す、承認された唯一のＮ型カルシウムチャネル特異的阻害薬であるからである。
【０００３】
本発明の課題は、従来技術の欠点を克服することだった。特に、あまり副作用を有しておらず、それに応じて特異的かつ選択的にＮ型ＮＣＣを阻害し、Ｌ型ＮＣＣの機能には影響を及ぼさない組成物を提供することになる。提供される組成物は、簡単なやり方で、好ましくは経口投与により投与可能である。さらに、Ｎ型ＮＣＣチャネルの阻害は、持続的な疼痛非感受性および損傷を回避するためには、可逆性であるべきである。さらに、受容体生物の特異的代謝に左右されない投与を可能にするためには、ピコモーラー範囲を超えるＩＣ５０値が望ましい。ピコモーラー範囲またはそれ未満のＩＣ５０値では、有効成分のわずかな濃度変化がすでに大きな効果を示す。そのため、過少投与または過剰摂取が起こりやすく、それぞれ特異的代謝に依存する可能性があり、望ましくない副作用または長期的損傷をもたらしかねない。
さらなる課題は、血液脳関門の通過を保証する有効成分を含有する組成物を提供することだった。
さらなる課題は、その効果を標的部位であるＮ型ＮＣＣにおいて発揮する組成物の、安定した、経腸投与、経静脈投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与および／または経口投与を提供することだった。
【０００４】
この課題は、一実施形態において、ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体を含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体からなるポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する、鎮痛剤として使用するための組成物によって解決される。
【０００５】
本発明のさらなる主題は、ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体を含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体からなるポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する、疼痛治療において使用するための組成物である。
【０００６】
本発明の主題は、さらに、ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体を含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体からなるポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する、慢性疼痛および／または神経障害性疼痛の治療において使用するための組成物である。
【０００７】
本発明のもう１つの主題は、ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体を含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログとＲＤ２およびＤ３の誘導体からなるポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する、神経細胞発現性Ｎ型カルシウムチャネル（ＮＣＣ）を阻害するための組成物である。
【０００８】
本発明の一実施形態では、ペプチドが、実質的にＤ−アミノ酸からなる。本発明の趣旨では、用語「実質的にＤ−アミノ酸からなる」とは、本発明により使用すべきペプチドが、Ｄ−アミノ酸を少なくとも５０％、６０％、好ましくは７５％、８０、８１、８２、８３、８４％、特に好ましくは８５、８６、８７、８８、８９％、９０、９１、９２、９３、９４、９５％、特に９６％、９７％、９８％、９９％、１００％含有するか、またはＤ−アミノ酸からなることを意味する。
ジコノチドのようなＬ−エナンチオマーペプチドと比べて、Ｄ−ペプチド（イン・ビボ）は、プロテアーゼに対してはるかに耐性であり、それゆえ、消失半減期が長い経口投与の可能性を提供する。さらに、Ｄ−ペプチドは、たいていの場合は免疫原性でないか、またはわずかにしか免疫原性でない。
【０００９】
さらなる一実施形態は、体重１キロ当たり１マイクログラム〜１グラム、好ましくは１００μｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、特に好ましくは０．５〜５ｍｇ／ｋｇ体重の投与において使用するための、前記の組成物に関する。
【００１０】
一実施形態は、経腸投与、経静脈投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与または経口投与、好ましくは経口投与用の前記の組成物に関する。
【００１１】
有利には、前記の組成物が、Ｎ型ＮＣＣに対して、１ナノモーラー〜１ミリモーラー、好ましくは１０ｎＭ〜１００μＭ、特に好ましくは１００ｎＭ〜１０μＭ、特に１００ｎＭ〜１μＭというＩＣ５０値を示す。
【００１２】
本発明により使用すべき組成物は、一変形形態において、
ＡＮＫ１；（自由Ｎ末端、好ましくはアミド化Ｃ末端）：ｒｋｒｉｒｌｖｙｈｉｎｒ（配列番号８）、
ＡＮＫ２；（自由Ｎ末端、好ましくはアミド化Ｃ末端）：ｒｋｒｉｒｌ０６ｙｈｉｎｒ（配列番号９）、
ＡＮＫ３；（自由Ｎ末端、好ましくはアミド化Ｃ末端）：ｒｋｒｉｒｌ０６ｙｈｗｎｒ（配列番号１０）、
ＡＮＫ４；（自由Ｎ末端、好ましくはアミド化Ｃ末端）：ｒｋｒｉｒｌｖｙｈｗｎｒ（配列番号１１）、
ＡＮＫ５；（自由Ｎ末端、好ましくはアミド化Ｃ末端）：ｒｋｒｖｒｌｖｙｈｋｋｒ（配列番号１２）、
ＡＮＫ６；（自由Ｎ末端、好ましくはアミド化Ｃ末端）：ｒｋｒｉｒｌｖｔｋｋｋｒ（配列番号１３）、
ＡＮＫ７；（自由Ｎ末端、好ましくはアミド化Ｃ末端）：ｒｋｒｖｒｌ０２ｔｈｉｋｒ（配列番号１４）、
ＡＮＫ１５；（自由Ｎ末端、好ましくはアミド化Ｃ末端）：ｒｐｒｖｒｌ０６ｙｈｗｎｒ（配列番号１５）、
ＡＮＫ１６；（自由Ｎ末端、好ましくはアミド化Ｃ末端）：ｒｋｒ０７ｒｌｖｔｋｒｎｒ（配列番号１６）、
ＡＮＫ１７；（自由Ｎ末端、好ましくはアミド化Ｃ末端）：ｒｋｒｉｒｌ０６ｙｈｉｋｒ（配列番号１７）、
ＡＮＫ１８；（自由Ｎ末端、好ましくはアミド化Ｃ末端）：ｒｐｒ０７ｒｌｈｔｋｋｋｒ（配列番号１８）、
０２：４−フルオロ−フェニルアラニン（Ｄ）０６：フェニルグリシン（Ｄ）０７：Ｄ−ホモアルギニン
からなるか、もしくはそれらを含有する群から選択されるペプチドを含有するか、またはそれらのペプチドからなる。
【００１３】
一別法では、本発明により使用すべき、かつ前記のペプチドの誘導体が、環化ペプチドまたはアミド化ペプチドである。
本発明により使用すべきペプチドは、本発明のさらなる一形態では、自由Ｃ末端において、自由Ｎ末端と互いに共有結合しており、その場合、それに応じて環化して存在する。同じく、閉環によって、有利には、自由Ｃ末端のカルボキシル基がもはや存在しなくなる。ペプチドは、有利には、例えば、縮合反応を介して、例えば、最初のアミノ酸と最後のアミノ酸との共有結合により直鎖状分子の環化が起こっているアミノ酸配列を有する。例えば、別のアミノ酸を互いに結合させるというやり方で、当然ながら、環化のさらなる可能性が存在する。単に模範的に、２番目のアミノ酸と最後のアミノ酸との結合を挙げておく。あらゆる起こり得る別の結合が、同じく考えられる。ペプチドの最初のアミノ酸と最後のアミノ酸とを互いに結合させる場合、有利には、ペプチド鎖（アミノ酸配列）内に開放末端が存在しなくなる。この措置は、さらに、環化後にもはや区別できない同一のアミノ酸配列を生み出す直鎖状アミノ酸配列を有するすべてのペプチドが、この趣旨で同一であることをもたらす。
例：公知のペプチドＤ３の直鎖状アミノ酸配列は、ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒである（配列番号２）。Ｎ末端アミノ基とＣ末端カルボキシル基との間のアミド結合によって結合された、相応する環化ペプチド「ｃＤ３」は、配列ｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒｒ、ｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒｒｐ、ｔｒｌｈｔｈｒｎｒｒｐｒ、ｒｌｈｔｈｒｎｒｒｐｒｔ、ｌｈｔｈｒｎｒｒｐｒｔｒ、ｈｔｈｒｎｒｒｐｒｔｒｌ、ｔｈｒｎｒｒｐｒｔｒｌｈ、ｈｒｎｒｒｐｒｔｒｌｈｔ、ｒｎｒｒｐｒｔｒｌｈｔｈ、ｎｒｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒ、またはｒｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎの環化ペプチドともはや区別できない。これらの配列のそれぞれから、引き続きｃＤ３を同じく誘導できる。
ＲＤ２：ｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒ（配列番号１）の状況は、配列ｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒｐ、ｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒｐｔ、ｈｔｈｎｒｒｒｒｒｐｔｌ、ｔｈｎｒｒｒｒｒｐｔｌｈ、ｈｎｒｒｒｒｒｐｔｌｈｔ、ｎｒｒｒｒｒｐｔｌｈｔｈ、ｒｒｒｒｒｐｔｌｈｔｈｎ、ｒｒｒｒｐｔｌｈｔｈｎｒ、ｒｒｒｐｔｌｈｔｈｎｒｒ、ｒｒｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒ、ｒｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒの環化ペプチドおよび名称「ｃＲＤ２」を伴いつつ類似である。環化ペプチドの製造は、従来技術であり、例えば、独国特許出願公開第１０２００５０４９５３７号明細書（ＤＥ  １０  ２００５０４９５３７  Ａ１）に記載される方法により行うことができる。
ペプチドの最初のアミノ酸と最後のアミノ酸とによる環化が、有利には、細胞、動物、または人間における、例えば、アミノペプチダーゼおよびカルボキシペプチダーゼによるペプチド分解活性の頻繁な攻撃部位（Ａｎｇｒｉｆｆｓｐｕｎｋｔ）である、ペプチド鎖の「開放」末端をもはや存在させなくする。
【００１４】
本発明により使用すべきペプチドは、本発明のさらなる一形態では、自由Ｃ末端においてアミド化されており、それゆえ、カルボキシル基の代わりに酸アミド基が存在する。つまり、カルボキシル基（−ＣＯＯＨ基）の代わりに酸アミド基（−ＣＯＮＨ２基）がＣ末端に配置されている。したがって、ペプチドは、特に有利に、自由Ｃ末端においてアミド化されている。それによると、より親和的に標的分子に結合でき、かつ簡単なやり方で入手できる、過剰負電荷を伴わないペプチドが存在するというさらなる課題が、特に有利に解決される。
本発明の一別法では、カルボキシル基の代わりに、ＣＯＨ、ＣＯＣｌ、ＣＯＢｒ、ＣＯＮＨ−アルキル残基、ＣＯＮＨ−アルキルアミン残基（正味正電荷）からなる基が存在し、ただし、これに限定されることはない。
【００１５】
さらに、本発明により使用すべきペプチドは、一形態において、本来の配列に対して、Ｎ末端および／またはＣ末端においてそれぞれ１つまたは２つのアミノ酸だけ、それぞれ延長されているか、または短縮されている。一別法は、１つまたは２つのアミノ酸が付加的な末端を有する一方で、別の末端は１つまたは２つ少ないアミノ酸を有する。ペプチドは、好ましくは、本来の配列に対して、Ｃ末端において、アミノ酸ｒｌｈｔの基から選択される１つのアミノ酸の分、好ましくはｒの分だけ延長される。
【００１６】
好ましい誘導体は、環化（ｃｙｃｌ−）ペプチド、アミド化ペプチド、および／またはＣ末端において１つのアミノ酸の分、好ましくはアルギニンのｒの分だけ延長されたペプチド配列、特にＤ３ｒ  ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒｒ（配列番号５）、および環化Ｄ３ｒである。さらなる好ましい誘導体は、環化ＲＤ２、およびそれぞれ直鎖状のアミド化された型、および／またはＣ末端において１つのアミノ酸の分、好ましくはアルギニンのｒの分だけ延長されたペプチド配列ＲＤ２ｒ  ｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒｒ（配列番号１９）である。本発明の主題は、それゆえ、ペプチドＲＤ２ｒ  ｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒｒ（配列番号１９）でもあり、Ｃ末端において１つのアミノ酸の分、好ましくはｒの分だけ延長された、ＲＤ２に基づく１３−ｍｅｒである。アミド化および／または環化された型ｃＲＤ２ｒ（ｃＲＤ２に類似）も、本発明の主題である。さらなる主題は、医学において、ないしは医薬品として使用するための、好ましくは疼痛の治療において、ないしは疼痛、特に慢性疼痛および神経障害性疼痛の療法において使用するための、ペプチドＲＤ２ｒならびにアミド化および／または環化された型、好ましくはｃＲＤ２ｒである。本発明により使用すべきさらなるペプチドは、ＲＤ２ＲＤ２、ｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒ（配列番号３）ＲＤ２Ｄ３  ｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒ（配列番号４）、ｃｙｃｌ−ＲＤ２ＲＤ２、ｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒｐｔｌｈｔｈｎｒｒｒｒｒ、ｃｙｃｌ−Ｄ３ｒ、ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒｒ、Ｄ３ｐ、ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒｐ（配列番号６）およびｃｙｃｌ−Ｄ３ｐ、ならびにＤ３ａ、ｒｐｒｔｒｌｈｔｈｒｎｒａ（配列番号７）およびｃｙｃｌ−Ｄ３ａである。
【００１７】
「ホモログ配列」または「ホモログ」とは、本発明の趣旨において、アミノ酸配列が、前記のモノマーアミノ酸配列の１つと、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の同一性を有することを意味する。用語「同一性」の代わりに、本明細書中では、用語「ホモログ」または「ホモロジー」を同じ意味で使用する。２つの核酸配列間またはポリペプチド配列間の同一性は、Ｓｍｉｔｈ，  Ｔ．  Ｆ．およびＷａｔｅｒｍａｎ，  Ｍ．  Ｓ（Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．  ２：  ４８２〜４８９ページ（１９８１年））のアルゴリズムに基づくプログラムＢＥＳＴＦＩＴを用いた比較により、次のアミノ酸用パラメータ、つまりＧａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：８およびＧａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：２、ならびに次の核酸用パラメータ、つまりＧａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：５０およびＧａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：３を調整して計算する。好ましくは、２つの核酸配列間またはポリペプチド配列間の同一性は、それぞれ配列全長にわたる核酸配列／ポリペプチド度配列の同一性によって定義し、それは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，  Ｓ．  Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，  Ｃ．  Ｄ．（Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：  ４４３〜４５３ページ）のアルゴリズムに基づくプログラムＧＡＰを用いた比較により、次のアミノ酸用パラメータ、つまりＧａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：８およびＧａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：２、ならびに次の核酸用パラメータ、つまりＧａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：５０およびＧａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ：３を調整して計算する。
２つのアミノ酸配列は、本発明の趣旨において、それらが同一アミノ酸配列を有する場合に同一である。
【００１８】
一別法では、ホモロジーないしは同一性を、該当するペプチドのそれぞれ全長にわたって特定する。別の一別法では、比較、それゆえ、同一性ないしはホモロジーの特定を、単に部分領域を介して行う。
この別法においても、本発明により使用すべきペプチドは、少なくとも２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％のホモロジーを有する。
【００１９】
本発明のさらなる一実施形態では、組成物が、ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、ならびにＲＤ２およびＤ３の誘導体、もしくはさらなる前記のペプチドを含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、ならびにＲＤ２およびＤ３の誘導体、もしくはさらなる前記のペプチドからなるポリマーを含有するか、あるいはそれらのポリマーからなる。本発明により使用すべきポリマーは、前記のモノマーペプチドを２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上含有する。
好ましくは、ＲＤ２Ｄ３、Ｄ３ＲＤ２、Ｄ３Ｄ３、およびＲＤ２ＲＤ２、もしくはホモログ、もしくはそれらの誘導体からなるか、またはＲＤ２Ｄ３、Ｄ３ＲＤ２、Ｄ３Ｄ３、およびＲＤ２ＲＤ２、もしくはホモログ、もしくはそれらの誘導体を含有する群から選択された二量体を使用する。
前記の配列の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、またはそれ以上のあらゆる任意の組み合わせも、直鎖型または環化型でポリマーを形成できる。ポリマーは、例えば、化学合成ないしはペプチド合成を介して製造され得る。
本発明の一変形形態では、ペプチドが、特に前記のように、直鎖状に互いに結合していてもよい。別の一変形形態では、ペプチドが互いに分岐状に結合していて本発明によるポリマーとなる。分岐ポリマーは、本発明によると、モノマーが互いに共有結合または非共有結合しているデンドリマーであり得る。別法として、ペプチドが、プラットフォーム分子（例えば、ＰＥＧまたは糖）と結合していることも可能であり、その結果、分岐ポリマーを形成することができる。
【００２０】
モノマーペプチドは、ヘッドトゥーヘッド、テールトゥーテール、またはヘッドトゥーテールに、付加的なリンカーを伴うか、または伴わずに直鎖状に結合しており、一別法では、全体として、付加的なリンカー（例えば、１つまたは複数のアミノ酸）を伴うか、または伴わずに、残っている２つの末端の共有結合により環化している。
【００２１】
本発明の一実施形態では、本発明により使用すべきペプチドが、さらなるアミノ酸、リンカー、スペーサ、および／または官能基と共有結合している。
本発明の一別法では、それらのさらなるアミノ酸、リンカー、スペーサ、および／または官能基によって、ペプチドの特性が変化しない。さらなる一別法では、さらなるアミノ酸、リンカー、スペーサ、および／または官能基が、ペプチドの特性の変化を引き起こす。そのような一実施形態では、Ｎ型ＮＣＣに関して、本発明によるポリマーの選択性および／または親和性が高まる。
【００２２】
リンカーとは、共有結合によってペプチドに結合している１つまたは複数の分子と理解され、ただし、それらのリンカー同士も、共有結合によって結合していてもよい。
官能基とは、ペプチドに共有結合している分子と理解される。一変形形態では、官能基がビオチン基を含有する。それにより、ストレプトアビジンへの強力な共有結合が可能になる。
本発明の一実施形態では、ペプチドがいわゆるスペーサを含有する。スペーサとは、共有結合を介してペプチドに結合しており、かつ特定の物理的特性および／または化学的特性を有する分子と理解され、それらの特性によってペプチドの特性が変化する。一実施形態では、親水性または疎水性のスペーサ、好ましくは親水性のスペーサを使用する。親水性のスペーサは、ポリエチレングリコール、糖、グリセリン、ポリ−Ｌ−リジン、またはベータアラニンから形成される分子群から選択される。
【００２３】
ペプチドは、一別法において、さらなる物質と結合している。
その物質は、一変形形態では、ドイツ薬事法第２条ないしは第４条（１９）（２０１２年９月現在）に準拠して定義される医薬品または有効成分である。一別法では、有効成分は、薬用有効成分として使用される治療活性物質である。
別の一変形形態では、その物質は、有効成分の放出制御（Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍとも呼ばれる）用の担体であり、その目標は、一方では、有効成分の、身体からの迅速な排出を阻止することである。たいていの慣用の有効成分は大部分が小さいため、短時間しか血液循環内にとどまらないが、なぜなら、そのサイズに基づいて腎閾値を下回るため、血液から分離され、再び排出されるからである。他方では、その担体系により、有効成分が特定の器官または細胞の近くへと特異的に輸送され、そこで制御型に放出される。
【００２４】
その物質は、さらなる一変形形態では、ペプチドの作用を強化する物質である。一別法では、そのような化合物が、アミノピラゾールおよび／またはアミノピラゾール誘導体である。本発明の趣旨でのアミノピラゾール誘導体は、３−アミノピラゾール−５−カルボン酸または３−ニトロピラゾール−５−カルボン酸、ならびに複素環ＣＨ基が−ＣＲ−または−Ｎ−または−Ｏ−または−Ｓ−で置換されたすべての誘導体、ならびにそれらから誘導された、すべてのペプチド性の二量体、三量体または四量体であり、好ましくはアミノピラゾール三量体である。さらなる一別法では、ペプチドの可溶性および／または血液脳関門の通過を改善する化合物である。
【００２５】
物質は、ペプチドと結合しており、ただし、その結合は、共有結合であるか、または共有結合ではない。その場合、結合は、水素結合、親水性相互作用、疎水性相互作用、静電相互作用ないしは親水性結合、疎水性結合、静電結合、および／または立体的固定化を介して起こる。
【００２６】
本発明のさらなる主題は、対照と比べて神経伝達物質の放出を低下させるための方法において、ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２および／またはＤ３の誘導体を含有するか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２および／またはＤ３の誘導体からなるポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する、鎮痛剤として使用するための組成物をＮ型ＮＣＣと接触させることを特徴とする方法である。
【００２７】
特に、ＮＣＣを通るカルシウム流入が、対照と比べて、本発明の方法により低下する。
【００２８】
さらに、対照と比べてＮ型ＮＣＣを阻害するための方法において、Ｎ型ＮＣＣを、ＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体からなるか、またはＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２もしくはＤ３の誘導体を含有する群から選択されるペプチド、ならびにＲＤ２、Ｄ３、少なくとも５０％の同一性を有するホモログ、およびＲＤ２および／またはＤ３の誘導体を含有するポリマーからなるか、あるいはそれらのペプチドならびにポリマーを含有する組成物と接触させることを特徴とする方法も、本発明の主題である。
【００２９】
本発明の趣旨では、「接触させる」とは、本発明により使用すべきペプチドとＮ型ＮＣＣとの間の相互作用、特に物理的および／または化学的な相互作用、例えば、配位結合または水素結合の形成を可能にする条件が存在することを意味する。
【００３０】
対照の選択は、実験手法のルーチン的な部分である。対照としては、一別法における被検査生物と同一である生物を使用する。被検査生物を、本発明による組成物で処理する、ないしは非常に広い意味では接触させるのに対して、対照にはこの方法を行わない。本発明によると、生物という用語は、生物の一部、組織、組織サンプル、個々の細胞、または細胞培養、細胞の一部、例えば、好ましくはＮ型またはＬ型のＮＣＣチャネルを含有する膜、または人工膜、例えば、好ましくはＮ型および／またはＬ型の神経細胞発現性カルシウムチャネルを含有する脂質二重膜も含む。対照も被検査生物も、前記のリストから選択される。異なる一別法では、対照は、臨床試験の基準に従って定義されている。
【００３１】
本発明の趣旨では、阻害するとは、本発明により使用すべき組成物による、好ましくはＮ型の神経細胞発現性カルシウムチャネル活性の、対照に対する低下を意味する。対照は、本発明によると、この組成物と接触させない。その代わりに、対照を、公知の阻害剤と接触させることも可能である。
公知の阻害剤の適用を、本発明により使用すべき組成物の適用と比較して、当業者は同じく、本発明による組成物の有効性に関する結論を探し出せる。
【００３２】
本発明の一実施形態では、ＩＣ５０値に相応する濃度ないしはＩＣ５０値と等しい濃度において阻害を特定する。
本発明により使用すべき組成物は、Ｎ型ＮＣＣを、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、好ましくは３０％、特に好ましくは４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、特に９０％または１００％阻害する。
一実施形態では、本発明により、いわゆるパッチクランプ技術を利用して阻害を特定する。その際、カルシウムチャネルを通るイオン電流を、様々な電圧において測定する。したがって、神経細胞発現性カルシウムチャネルの阻害は、イオン電流の低下により特定される。一別法では、イオン電流が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、好ましくは３０％、３５％、特に好ましくは４０、４２、４４、４６、４８、５０％、５２、５４、５６、５８、６０％、７０％、８０％、特に９０％または１００％だけ低下する。好ましくは、ＩＣ５０値に等しいペプチド濃度において低下を特定する。一実施形態では、１５０ｎＭという濃度の、本発明により使用すべき組成物と、該当するチャネルとを接触させる際に、パッチクランプ測定を行う。
【００３３】
本発明による方法は、Ｌ型ＮＣＣの機能を、対照と比べて変化させないことを特徴とする。言い換えると、Ｌ型ＮＣＣを通るカルシウム流入は、対照と比べて変化しない。本発明により使用すべきペプチドは、特異的および／または選択的にＮ型ＮＣＣに作用する。
【００３４】
コノトキシンの代用品としての、本発明により使用すべきペプチドの使用も、本発明の主題である。
つまり、ＮＣＣ、ないしはＮＣＣを含有する膜、またはＮＣＣを含有する同様の起源の接触を、イン・ビトロ（エクス・ビボ）で行うことができる。
【００３５】
本発明はさらに、被治療個体に対して、経腸投与、経静脈投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与または経口投与、好ましくは経口投与により、１μｇ〜１ｇ／ｋｇ体重の濃度において本発明により使用すべきペプチドを投与する、慢性疼痛および／または神経障害性疼痛の治療、つまり疼痛緩和のための治療に関する。
【００３６】
したがって、本発明は、本発明により使用すべきペプチドを、当業者には公知の慣用の方法を利用して、医薬製剤に混合する方法にも関する。したがって、医薬製剤中での前記のペプチドの使用も、本発明の主題である。したがって、本発明により使用すべき前記のペプチドを含有する医薬製剤も同じく、本発明の主題である。
さらに、本発明の主題は、鎮痛剤、疼痛治療において使用する医薬品、および／または慢性疼痛および神経障害性疼痛の治療薬を製造するための、請求項１からの組成物の使用である。
【００３７】
本発明のさらなる主題は、神経細胞発現性Ｎ型カルシウムチャネルＮＣＣを阻害するための、請求項１に基づく組成物の使用である。
【００３８】
本発明による方法においては、さらなる、前記のペプチド、誘導体、およびホモログも使用できる。
【００３９】
さらなる例は、前記のペプチドのどれを用いても行える。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１Ａ】１５０ｍＭのＲＤ２を含有する組成物との接触前および接触後に、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの保持電位の、４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされる、ＣａＶ２．２チャネルが仲介する電流強度の代表的記録を示す図。
【図１Ｂ】−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの５秒ごとの連続パルスの最中に、代表的細胞において記録された阻害の時間推移を示す図。
【図１Ｃ】ＣａＶ２．２を発現する細胞の、ＲＤ２の存在下および不在下での平均的な電流強度−電圧関係（ｎ＝７）を示す図。
【図１Ｄ】図Ｃと同じ細胞を対象に、電圧プロットに対してプロットした活性化チャネル画分（活性化曲線）を示す図。
【図２Ａ】１５０ｍＭのＲＤ２を含有する組成物との接触前および接触後に、−９０ｍＶ〜＋１０ｍＶの保持電位の、４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされる、ＣａＶ１．２チャネルが仲介する電流強度の代表的記録を示す図。
【図２Ｂ】１５０ｎＭのＲＤ２による灌流の際の電流強度を示す図。
【図２Ｃ】イオン電流の遮断を示す図。
【図２Ｄ】ＣａＶ１．２チャネルの活性化の電圧依存性を示す図。
【図３】ＲＤ２が、ＣａＶ２．２チャネルおよびＣａＶ１．２チャネルにより仲介されるイオン電流を遮断する能力の検査結果を示す図。
【図４Ａ】１５０ｍＭのＤ３を含有する組成物との接触前および接触後に、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの保持電位の、４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされる、ＣａＶ２．２チャネルが仲介する電流強度の代表的記録を示す図。
【図４Ｂ】−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの５秒ごとの連続パルスの最中の電流強度の記録を示す図。
【図４Ｃ】５４％までのイオン電流の低下を示す電流−電圧プロット（Ｉ−Ｖ）を示す図。
【図４Ｄ】Ｄ３による細孔遮断機構を推定させる図。
【図５】Ｄ３がＣａＶ２．２チャネルを遮断することを示す図。
【図６】ＣａＶ２．２チャネルおよびＣａＶ１．２チャネルに及ぼすｃＤ３ｒおよびｃＲＤ２ｒの作用を示す図。
【図７Ａ】ＣａＶ２．２チャネルによって仲介される代表的なイオン電流放電が、１５０ｎＭのｃＤ３ｒへの曝露前および曝露後に、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされたこと（左図）、および−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの５秒ごとの連続パルスの最中の、代表的細胞における遮断の時間推移（右図）を示す図。
【図７Ｂ】ＣａＶ２．２発現細胞の、ｃＤ３ｒの存在下および不在下での平均的な電流強度−電圧関係（ｎ＝８）ならびに活性化チャネル画分対電圧（活性化曲線）を示す図。
【図７Ｃ】ＣａＶ２．１チャネルによって仲介される代表的なイオン電流放電が、１５０ｎＭのｃＤ３ｒへの曝露前および曝露後に、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされたこと（左図）、および−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの５秒ごとの連続パルスの最中の、代表的細胞における遮断の時間推移（右図）を示す図。
【図７Ｄ】ＣａＶ２．１発現細胞の、ｃＤ３ｒの存在下および不在下での平均的な電流強度−電圧関係（ｎ＝８）ならびに活性化曲線（ｎ＝７）を示す図。
【図８Ａ】ＣａＶ２．２チャネルによって仲介される代表的なイオン電流放電が、１５０ｎＭのｃＲＤ２ｒへの曝露前および曝露後に、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされたこと（左図）、および−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの５秒ごとの連続パルスの最中の、代表的細胞における遮断の時間推移（右図）を示す図。
【図８Ｂ】ＣａＶ２．２発現細胞の、ｃＲＤ２ｒの存在下および不在下での平均的な電流強度−電圧関係（ｎ＝７）ならびに活性化チャネル画分対電圧（活性化曲線）を示す図。
【図８Ｃ】ＣａＶ２．１チャネルによって仲介される代表的なイオン電流放電が、１５０ｎＭのｃＲＤ２ｒへの曝露前および曝露後に、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされたこと（左図）、および−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの５秒ごとの連続パルスの最中の、代表的細胞における遮断の時間推移（右図）を示す図。
【図８Ｄ】ＣａＶ２．１発現細胞の、ｃＲＤ２ｒの存在下および不在下での平均的な電流強度−電圧関係（ｎ＝８）および活性化曲線（ｎ＝６）を示す図。
【００４１】
例：
１．ＲＤ２（Ｃ末端アミド化）
Ａ．タンパク質コンストラクト：
電位依存性カルシウムチャネルの２つの異なるａｌｐｈａ１細孔形成ユニット（ＣａＶａｌｐｈａ１）のコーディング領域を、蛍光タンパク質とインフレーム（Ｃ末端融合）で、次のように融合させた：イエウサギ由来ユニットＣａＶ１．２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ１５３８１）をＹＦＰと融合させ（ＣａＶ１．２−ＹＦＰ）、ヒトユニットＣａＶ２．２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ００９７５−１）をＧＦＰと融合させた（ＣａＶ２．２−ＧＦＰ）。ベータサブユニットＣａＶｂｅｔａ２ｅ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ８ＶＧＣ３−２）をｍＲＦＰに（ＣａＶｂｅｔａ２ｅ−ｍＲＦＰ）、およびＣａＶｂｅｔａ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ００３０５．２）をｍＣｈｅｒｒｙに結合させた（ＣａＶｂｅｔａ４−ｍＣｈｅｒｒｙ）。
【００４２】
Ｂ：細胞のトランスフェクション：
ＣａＶａｌｐｈａ１サブユニットの正常機能および表面発現は、ＣａＶｂｅｔａサブユニットへの会合を必要とするため、ｔｓＡ２０１細胞を、ＣａＶ１．２−ＹＦＰとＣａＶｂｅｔａ２ｅ−ｍＲＦＰ、またはＣａＶ２．２−ＧＦＰとＣａＶｂｅｔａ４−ｍＣｈｅｒｒｙとのいずれか一方により、一過性に共トランスフェクションした。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行い、トランスフェクションに成功した細胞を、蛍光シグナルによって同定した。電気生理学的な放電（Ａｂｌｅｉｔｕｎｇ）を、トランスフェクションから２４〜４８時間後に行った。
【００４３】
Ｃ．電気生理学：
イオン電流を、Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｃｈ  Ｃｌａｍｐ技術を用いて、ＰａｔｃｈＭａｓｔｅｒソフトウェアが実装されたＥＰＣ−１０アンプ（ＨＥＫＡ、Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ）により測定した。バリウムを担体として使用した。Ｓｕｔｔｅｒ  Ｐ−１０００プラー（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて、０．９〜２ＭΩの抵抗を有するホウケイ酸ガラスピペットを引き伸ばし、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  ＭＦ−８３０マイクロフォージを用いて、先端部の表面をヒートポリッシュした。外部測定溶液として１４０ｍＭのＴＥＡ−ＭｅＳＯ３、１０ｍＭのＢａＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を使用し、内部測定溶液として１３５ｍＭのＣｓ−ＭｅＳＯ３、１０ｍＭのＥＧＴＡ，５ｍＭのＣｓＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのＭｇＡＴＰ、０．４ｍＭのＮａ２ＧＴＰおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を使用した。データ解析は、ソフトウェアＦｉｔＭａｓｔｅｒ（ＨＥＫＡ）、Ｏｒｉｇｉｎ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）およびＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）の組み合わせを使用して行った。すべてのデータは、平均値±ＳＥＭとして示す。イオン電流は、Ｐ／４プロトコルを使用して補正した（リーク電流の除去）。
ＲＤ２の薬理効果を検査するために、細胞を剥離し、被検物質を含有するか、または含有しない灌流中へと移した。被検物質の一定濃度を保証するために、一定の灌流下に観察を行った。ＲＤ２を、１ｍＭという最終濃度でＤＭＳＯ中に溶解し、使用直前に、外部測定溶液中において１５０ｎＭに溶解した。対照実験は、公知のＣａＶ１．２およびＣａＶ２．２のカルシウムチャネル拮抗薬、ニモジピン（１０μＭ）およびオメガコノトキシン（１ｎＭ）を用いて行った。
【００４４】
Ｄ．結果：
ＣａＶ２．２が仲介するイオン電流へのＲＤ２の作用：
ＣａＶ２．２は、シナプス前神経終末に局在し、シナプス中心部（ｚｅｎｔｒａｌｅ  Ｓｙｎａｐｓｅ）での神経伝達を仲介する。ＣａＶ２．２仲介イオン電流を、ＣａＶ２．２／ＣａＶｂｅｔａ４を発現するｔｓＡ２０１細胞から記録した。ＲＤ２（１５０ｎＭ）を含有する外部測定溶液による細胞の灌流は、イオン電流の著しい低下をもたらしたが、外部測定溶液単独を用いると低下は起こらなかった（図１Ａ、Ｂ；Ａ：１５０ｍＭのＲＤ２を含有する組成物との接触前および接触後に、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの保持電位の、４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされる、ＣａＶ２．２チャネルが仲介する電流強度の代表的記録。Ｂ：−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの５秒ごとの連続パルスの最中に、代表的細胞において記録された阻害の時間推移）。電流−電圧プロット（Ｉ−Ｖ）は、検査したすべての電圧において、５５％までのイオン電流の低下を示した（図１Ｃ：ＣａＶ２．２を発現する細胞の、ＲＤ２の存在下および不在下での平均的な電流強度−電圧関係（ｎ＝７））。イオン電流の遮断には、チャネルの電圧依存性活性化の変化が付随しなかったことから、ＲＤ２による細孔遮断機構を推定させる（図１Ｄ：図Ｃと同じ細胞を対象に、電圧プロットに対してプロットした活性化チャネル画分（活性化曲線）。対照として。したがって、チャネルの機能または機構の変化は起こらないが、なぜなら、曲線が互いに重なっており、ずれていないからである）。イオン電流が、１ｎＭのＣａＶ２．２拮抗薬オメガコノトキシンの投与後に中断されたことは、そのイオン電流が、ＣａＶ２．２チャネルにより仲介されたことを裏付ける（図１Ａの挿入図）。
【００４５】
ＣａＶ１．２が仲介するイオン電流へのＲＤ２の作用：
ＣａＶ１．２は、主に心臓で発現しているＬ型カルシウムチャネルであり、心筋細胞の電気的活性化を筋フィラメント収縮と連関させる。イオン電流を、ＣａＶ１．２とＣａＶｂｅｔａ２ｅとを共発現する細胞から記録すると、１５０ｎＭのＲＤ２への曝露後にほぼ不変のままだった（図２Ａ：１５０ｍＭのＲＤ２を含有する組成物との接触前および接触後に、−９０ｍＶ〜＋１０ｍＶの保持電位の、４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされる、ＣａＶ１．２チャネルが仲介する電流強度の代表的記録。図２Ｂ：１５０ｎＭのＲＤ２による灌流の際に電流強度の変化なし）。それに対して、公知のＣａＶ１．２チャネル拮抗薬である、１０μＭのニモジピンによる灌流は、イオン電流のほぼ完全な遮断をもたらした。つまり、ＣａＶ１．２チャネルの活性化の電圧依存性は、ＲＤ２の存在によって影響されなかった（図２Ｃおよび２Ｄ）。
【００４６】
Ｅ：結論
ＲＤ２が、ＣａＶ２．２チャネルおよびＣａＶ１．２チャネルにより仲介されるイオン電流を遮断する能力を、１５０ｎＭの濃度において検査した。その検査は、ＣａＶ２．２チャネルおよびＣａＶ１．２チャネルを発現するｔｓＡ２０１細胞において、Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｃｈ  Ｃｌａｍｐ技術を使用して行った。ＲＤ２は、ＣａＶ２．２チャネルを遮断するのに対して、ＣａＶ１．２チャネルは、検査した濃度では、ＲＤ２に対して非感受性である（図３）。
【００４７】
２．Ｄ３（Ｃ末端アミド化）
Ａ．タンパク質コンストラクト：
電位依存性カルシウムチャネルＣａＶ２．２のヒトａｌｐｈａ１細孔形成ユニット（ＣａＶａｌｐｈａ１）（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｑ００９７５−１）のコーディング領域を、ＧＦＰと融合させてＣａＶ２．２−ＧＦＰとした。ベータサブユニットＣａＶｂｅｔａ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｏ００３０５．２）を、ｍＣｈｅｒｒｙに融合してＣａＶｂｅｔａ４−ｍＣｈｅｒｒｙとした。
【００４８】
Ｂ：細胞のトランスフェクション：
ＣａＶａｌｐｈａ１サブユニットの正常機能および表面発現は、ＣａＶｂｅｔａサブユニットへの会合を必要とするため、ｔｓＡ２０１細胞を、ＣａＶ２．２−ＧＦＰとＣａＶｂｅｔａ４−ｍＣｈｅｒｒｙとにより、一過性に共トランスフェクションした。トランスフェクションは、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００ＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて行い、トランスフェクションに成功した細胞を、蛍光シグナルによって同定した。電気生理学的な放電を、トランスフェクションから２４〜４８時間後に行った。
【００４９】
Ｃ．電気生理学：
イオン電流を、Ｗｈｏｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｐａｔｃｈ  Ｃｌａｍｐ技術を用いて、ＰａｔｃｈＭａｓｔｅｒソフトウェアが実装されたＥＰＣ−１０アンプ（ＨＥＫＡ、Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ）により測定した。バリウムを担体として使用した。Ｓｕｔｔｅｒ  Ｐ−１０００プラー（Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ）を用いて、０．９〜２ＭΩの抵抗を有するホウケイ酸ガラスピペットを引き伸ばし、Ｎａｒｉｓｈｉｇｅ  ＭＦ−８３０マイクロフォージを用いて、先端部の表面をヒートポリッシュした。外部測定溶液として１４０ｍＭのＴＥＡ−ＭｅＳＯ３、１０ｍＭのＢａＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を使用し、内部測定溶液として１３５ｍＭのＣｓ−ＭｅＳＯ３、１０ｍＭのＥＧＴＡ，５ｍＭのＣｓＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、４ｍＭのＭｇＡＴＰ、０．４ｍＭのＮａ２ＧＴＰおよび１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）を使用した。データ解析は、ソフトウェアＦｉｔＭａｓｔｅｒ（ＨＥＫＡ）、Ｏｒｉｇｉｎ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ）およびＥｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ）の組み合わせを使用して行った。すべてのデータは、平均値±ＳＥＭとして示す。イオン電流は、Ｐ／４プロトコルを使用して補正した（リーク電流の除去）。
【００５０】
Ｄ３の薬理効果を検査するために、細胞を剥離し、被検物質を含有するか、または含有しない灌流中へと移した。被検物質の一定濃度を保証するために、一定の灌流下に観察を行った。Ｄ３を、１ｍＭという最終濃度でＤＭＳＯ中に溶解し、使用直前に、外部測定溶液中において１５０ｎＭに溶解した。対照実験は、公知のＣａＶ２．２カルシウムチャネル拮抗薬であるオメガコノトキシン（１ｎＭ）を用いて行った。
【００５１】
Ｄ．結果：
ＣａＶ２．２が仲介するイオン電流へのＤ３の作用：
ＣａＶ２．２仲介イオン電流を、ＣａＶ２．２／ＣａＶｂｅｔａ４を発現するｔｓＡ２０１細胞から記録した。Ｄ３（１５０ｎＭ）を含有する外部測定溶液による細胞の灌流は、イオン電流の著しい低下をもたらしたが、外部測定溶液単独を用いると低下は起こらなかった（図４Ａ、Ｂ；Ａ：１５０ｍＭのＤ３を含有する組成物との接触前および接触後に、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの保持電位の、４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされる、ＣａＶ２．２チャネルが仲介する電流強度の代表的記録。４Ｂ：Ｄ３が誘導した阻害は、外部リンガー溶液による再灌流後に可逆である。−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの５秒ごとの連続パルスの最中に電流強度を記録した）。電流−電圧プロット（Ｉ−Ｖ）は、検査したすべての電圧において、５４％までのイオン電流の低下を示した（図４Ｃ）。イオン電流の遮断には、チャネルの電圧依存性活性化の変化が付随しなかったことから、Ｄ３による細孔遮断機構を推定させる（図４Ｄ）。イオン電流が、１ｎＭのＣａＶ２．２拮抗薬オメガコノトキシンの投与後に中断されたことは、そのイオン電流が、ＣａＶ２．２チャネルにより仲介されたことを裏付ける（図４Ａの挿入図）。
【００５２】
Ｅ．結論
Ｄ３は、ＣａＶ２．２チャネルを遮断する（図５）。
【００５３】
３．ｃＤ３（環化Ｄ３）およびｃＲＤ２（環化ＲＤ２）
例１および２に類似して実験を行った。
【００５４】
ＣａＶ２．２チャネルおよびＣａＶ１．２チャネルに及ぼすｃＤ３ｒおよびｃＲＤ２ｒの作用のまとめ（図６）
２つの棒グラフは、ＣａＶ２．２に関しては＋２０ｍＶにおいて、ＣａＶ１．２に関しては＋１０ｍＶにおいて、電流強度−電圧グラフから読み取った平均イオン電流をまとめる。＊＊ｐ≦０．０１。
【００５５】
ＣａＶ２．２チャネルおよびＣａＶ１．２チャネルに及ぼすｃＤ３ｒの作用（図７）
ＣａＶ２．２チャネルによって仲介される代表的なイオン電流放電が、１５０ｎＭのｃＤ３ｒへの曝露前および曝露後に、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされた（７Ａの左図）。７Ａの右図は、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの５秒ごとの連続パルスの最中の、代表的細胞における遮断の時間推移を示す。７Ｂ、ＣａＶ２．２発現細胞の、ｃＤ３ｒの存在下および不在下での平均的な電流強度−電圧関係（ｎ＝８）ならびに活性化チャネル画分対電圧（活性化曲線）。７Ｃ、ＣａＶ２．１チャネルによって仲介される代表的なイオン電流放電が、１５０ｎＭのｃＤ３ｒへの曝露前および曝露後に、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされた（７Ｃの左図）。７Ｃの右図は、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの５秒ごとの連続パルスの最中の、代表的細胞における遮断の時間推移を示す。７Ｄ、ＣａＶ２．１発現細胞の、ｃＤ３ｒの存在下および不在下での平均的な電流強度−電圧関係（ｎ＝８）ならびに活性化曲線（ｎ＝７）。
【００５６】
ＣａＶ２．２チャネルおよびＣａＶ１．２チャネルに及ぼすｃＲＤ２ｒの作用（図８）
８Ａ、ＣａＶ２．２チャネルによって仲介される代表的なイオン電流放電が、１５０ｎＭのｃＲＤ２ｒへの曝露前および曝露後に、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされた（８Ａの左図）。８Ａの右図は、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの５秒ごとの連続パルスの最中の、代表的細胞における遮断の時間推移を示す。８Ｂ、ＣａＶ２．２発現細胞の、ｃＲＤ２ｒの存在下および不在下での平均的な電流強度−電圧関係（ｎ＝７）ならびに活性化チャネル画分対電圧（活性化曲線）。８Ｃ、ＣａＶ２．１チャネルによって仲介される代表的なイオン電流放電が、１５０ｎＭのｃＲＤ２ｒへの曝露前および曝露後に、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの４０ｍｓのパルスの最中に引き起こされた（左図）。８Ｃの右図は、−９０ｍＶ〜＋２０ｍＶの５秒ごとの連続パルスの最中の、代表的細胞における遮断の時間推移を示す。８Ｄ、ＣａＶ２．１発現細胞の、ｃＲＤ２ｒの存在下および不在下での平均的な電流強度−電圧関係（ｎ＝８）および活性化曲線（ｎ＝６）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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