(57)【要約】  一体化した標的を備えた顕微鏡スライドであって、顕微鏡スライド上に共在する黒色参照標的及び白色参照標的を有する、顕微鏡スライドを提供する。一体化した黒色標的及び白色標的を備えた顕微鏡スライドにより、種々のシステムにおけるデジタルイメージングにおいて、プロセス対照標的アレイ及び共在する組織を同時に使用して同様の結果が得られるように、照射レベルを設定することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イメージング用の一体化した黒色及び白色の参照体を備えた顕微鏡スライドであって、顕微鏡スライド上に共在する黒色参照標的及び白色参照標的を有する、顕微鏡スライド。
【請求項２】
前記黒色参照標的及び前記白色参照標的が、ＵＶによって反応開始する無水物によって触媒されたエポキシ塗料／インク基剤を含む材料から作られている、請求項１に記載の顕微鏡スライド。
【請求項３】
前記黒色参照標的の材料が、カーボンダスト、炭素化合物、又はそれらの混合物から選ばれる、請求項１に記載の顕微鏡スライド。
【請求項４】
前記カーボンダストが０．１ミクロン〜２ミクロンの粒径を有する、請求項３に記載の顕微鏡スライド。
【請求項５】
前記白色参照標的が、酸化物又は硫化塩状態のいずれかの元素周期表における「貧金属」から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の顕微鏡スライド。
【請求項６】
前記白色参照標的が、酸化チタン、酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム、硫酸バリウム、又はそれらの混合物から選ばれる、請求項５に記載の顕微鏡スライド。
【請求項７】
前記ＵＶによって反応開始する無水物によって触媒されたエポキシ塗料基剤が、メチルテトラヒドロフタル酸無水物とジフェニルヨードニウムヘキサフルオロヒ酸塩とで構成される、請求項２に記載の顕微鏡スライド。
【請求項８】
前記黒色参照標的及び前記白色参照標的が、組織切片又は遊離細胞と共在する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡スライド。
【請求項９】
前記黒色参照標的及び前記白色参照標的が、生体材料の染色剤に対して非反応性である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡スライド。
【請求項１０】
前記黒色参照標的及び前記白色参照標的が、抗原賦活化活動への曝露、緩衝剤、熱、及び時間に対して安定している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の顕微鏡スライド。
【請求項１１】
前記黒色参照標的及び前記白色参照標的が、ヒドロキシル化合物、アミン化合物、アミド化合物、ヒドラジド化合物、及び芳香族ベンゼン化合物に対して非反応性である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の顕微鏡スライド。
【請求項１２】
前記黒色参照標的及び前記白色参照標的を、スタンプ台、シリンジ、インクジェット等によって顕微鏡スライド上に印刷することができる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の顕微鏡スライド。
【請求項１３】
ＩＨＣ染色、ヘマトキシリンエオシン染色、尿標本Ｈ＆Ｅプラス特殊染色、及びパパニコロウ染色（ＰＡＰ）標本において、同じスライドのイメージングに対して照射強度及びコントラストを確立するための請求項１〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡スライドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１７年６月１５日付けで出願された米国仮特許出願第６２／５２０１７８号に対する優先権を主張するものであり、この仮出願の開示は、その全体が、引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００２】
本発明は、一体化した標的を備えた顕微鏡スライドに関する。本発明は、特に、一体化した黒色標的及び白色標的を備えた顕微鏡スライドに関する。本発明に開示の一体化した黒色標的及び白色標的を備えた顕微鏡スライドにより、種々のシステムにおけるデジタルイメージングにおいて、プロセス対照標的アレイ及び共在する組織を同時に使用して同様の結果が得られるように、照射レベルを設定することができる。
【背景技術】
【０００３】
従来の方法では、イメージングシステムは、照射光源の強度及びコントラストを調整することにより、標準的な白色標的及び黒色標的に対して較正を行っていた。標的は両方とも、表面仕上げにおいて非反射性である必要がある。ベースラインの白色参照体としては、ＭａｃＢｅｔｈ  ＰＣＭ  ＩＩでの使用のために確立されたような、プレスしたばかりの硫酸バリウムタブレットが利用できる。黒色参照体は、通常、反射光がイメージング装置に戻るのを防ぐボイドによって提供される。
【０００４】
この白色標的は、或る種の金属酸化物であり、その酸化物表面が保護されていない場合には、エオシンへの曝露により染色する可能性がある。炭素化合物を含む黒色標的は印刷することができるが、第１表面反射が若干あるため、完全な黒色とはならない。しかしながら、生体材料によって起こり得るいずれの染色に対しても、十分黒色である。
【０００５】
数多くのイメージングシステムでは、イメージング対象物の導入前に、照射レベルを設定するのに使用する白色参照標的及び黒色ボイド参照標的を取り入れる。スライドのダイナミックレンジは、最大レンジでも、理想値の５０％未満である。
【０００６】
時間の経過及び異なる染色経験に対してスライド間で同じ結果が得られたり、得られなかったりすることは、顕微鏡スライドのイメージングベースライン処理における重大な不利点である。
【０００７】
そこで、本発明は、スライド自体に黒色参照標的及び白色参照標的を一体化することを目的とする。その結果、イメージング参照体はスライドの一部となり、異なるイメージングシステム間で近似した結果を確保することができる。
【発明の概要】
【０００８】
概して、本発明の一態様においては、一体化した黒色標的及び白色標的を備えた顕微鏡スライドが開示されており、この顕微鏡スライドにより、種々のシステムにおけるデジタルイメージングにおいて、プロセス対照標的アレイ及び共在する組織切片を同時に使用して同様の結果が得られるように、照射レベルを設定することができることが確実になる。
【０００９】
本発明の他の態様においては、上記白色標的は、完全な白色ではなく、スライド上で最も白い物体を表するものであることが開示されている。
【００１０】
本発明の更に他の態様においては、上記黒色標的は、カメラのダイナミックレンジを設定するものであることが開示されている。
【００１１】
本発明の更に他の態様においては、共在する標的は、顕微鏡スライドに組み込まれ、染色特定標的及び組織切片自体を評価することのできる客観的数値を提供することが開示されている。
【発明の効果】
【００１２】
ａ．一体化した黒色標的及び白色標的が、顕微鏡スライド上で組織切片又は遊離細胞と共在している。
ｂ．一体化した黒色標的及び白色標的が、生体材料の染色剤に対して非反応性である。
ｃ．一体化した黒色標的及び白色標的が、抗原賦活化活動への曝露、緩衝剤、熱、時間、その他の環境因子に対して安定している。
ｄ．一体化した黒色標的及び白色標的が、ヒドロキシル化合物、アミン化合物、アミド化合物、ヒドラジド化合物、及び芳香族ベンゼン化合物に対して非反応性である。黒色標的／白色標的は、例示した末端基と反応することのできる染色試薬に曝露される。これにより、標的が染色しないようにするには、−ＣＨ３又は−Ｃ＝Ｏ等の末端基は本質的に不活性でなければならない。大抵、染色は、例示した末端基に特異的に結合するよう設計された特定の染色試薬によって起こる。例えば、エオシンＹは、金属酸化物に結合する。
【００１３】
添付の図面及び以下の記載において、本発明の他の態様が開示される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ヘマトキシリンエオシンＹ染色剤に対して反応性の化学標的と同一直線上に黒色イメージング標的及び白色イメージング標的を含む、Ｈ＆Ｅ用のスライドの画像である。黒色標的が右側にあり、白色標的が右側の上にある。同一スライドに対して３枚の画像を示す。左側が、組織切片適用前のスライドの画像であり、中央が、３つの組織切片を適用した画像であり、右側が、染色後のスライドの画像である。灰色で示す領域は、標的上のパラフィンシールド又はホルムアルデヒドに固定された捕捉組織切片を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、本開示の一部をなす本発明の以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解され得る。本発明は、本明細書で記載されるか、及び／又は、示される特定の装置、方法、条件、又はパラメータに限定されるものではなく、本明細書で使用される専門用語は単なる例であり、特許請求する発明の限定を意図するものではないと理解されるべきである。また、添付の特許請求の範囲を含む明細書で使用される数量を特定していない単数形（'a', 'an', and 'the'）は、複数形を含み、特定の数値に対する言及は、内容により明確に異なることが指示されない場合は、少なくともその特定の数値を含むものである。本明細書中、他の実施形態において表現されている場合は、範囲は、「約（about）」又は「およそ（approximately）」他の特定値からと表現してもよい。また、特段の指示がない限り、本明細書で言及する寸法及び材料特性は、限定的なものではなく例示であり、好適に実用できるサンプル実施形態をより理解するためのものであり、言及した値を外れる変形形態も、特定の用途によって本発明の範囲に含まれ得ると理解されるべきである。
【００１６】
本発明は、その適用において、以下の記載において明示する構造の詳細及び構成要素の配列に限定されるものではない。本発明においては、他の実施形態が可能であり、種々の方法で実施又は実行することができる。また、本明細書で使用の用語及び専門用語は、説明を目的として使用されており、限定的に解釈されるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「伴う（involving）」、及びこれらの変化形の使用は、追加の項目を含む。
【００１７】
以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に言及する。
【００１８】
歴史的には、参照対照スライドの結果は、黒色参照標的及び白色参照標的を含まないため、完全に主観的なものである。これらの標的は、密度に一貫性がなく、単一の染色試薬に対して特有の反応性を有する。参照対照スライドは、最善の状態でも既知の抗原部位を含有する部分を含有するソーセージ状構造（sausage）を有するものであり、抗原濃度はわからないため、染色したスライドによってできることは、あらゆる試薬が、抗原の存在を示すのに十分なレベルで働いているのが分かる程度である。ＩＨＣ処理したスライドの場合には、抗原賦活化、一次染色試薬、及び二次染色試薬の累積的な産物として結果が得られるため、客観的な測定ができない。そのため、参照対照スライドは、単にあらゆる試薬が働いているという或る種の安堵感を使用者に提供するに過ぎない。
【００１９】
染色した生体材料を含む顕微鏡スライドのデジタルイメージングは、染色した材料のプレスクリーニング、及び可能性としては、染色した材料の完全な診断決定を行うことへと発展しつつある。一般的には、イメージングシステムにおいては、デジタル画像が白色限度と黒色限度とのいずれにおいても圧縮されないように、照射光レベルを調整する必要がある。従来の解決法では、標識が位置するとされる場所に黒色標的及び白色標的を置いている。これは、スライドが示すことのできる極値を白色標的及び黒色標的が示しているということを前提としている。しかしながら、その際、組織切片の染色によって、実現できるよりも、黒色は遥かに黒く、白色は遥かに白くなるようにデジタルスケールにおいて圧縮される。
【００２０】
本発明の好ましい一実施形態においては、組織切片又は遊離細胞付着物と共在する標準対照参照標的を組み込んだ顕微鏡スライドが開示される。参照標的及び組織切片は、組織捕捉と染色したスライドのカバースリッピングとの間の処理過程を記録する。
【００２１】
他の実施形態においては、顕微鏡スライドの標的アレイ中に、共在する黒色参照標的及び白色参照標的が存在する。黒色参照標的及び白色参照標的は、もう片方の標的及び組織切片と同じように、試薬への曝露及び処理を受けた。
【００２２】
他の実施形態においては、黒色参照標的及び白色参照標的によって、動作範囲が広がるようにイメージングシステムの照射レベルを変えることができる。生体材料の種類によって、処理過程を大幅に変えることができる。
【００２３】
他の実施形態においては、種々の処理経路は、免疫組織化学的染色（ＩＨＣ）、ヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）プラス特殊染色、尿標本Ｈ＆Ｅプラス特殊染色、及び５種類の色素を含む３つの溶液からなるパパニコロウ染色（ＰＡＰ）標本に分類され得るが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
一般的に、純粋な黒色付着標的は、定義上全光を吸収しなければならないため、製造するのが難しい。伝統的な解決法は、単に、反射が戻り得ないように光路を曲げるボイドを提供することである。黒色標的は最善の状態でも多少の反射性を有するが、スライド上にはそこまで黒いものは他にないので、通常それで十分である。
【００２５】
他の実施形態においては、両方の標的、すなわち、黒色標的及び白色標的は、スライドを処理するのに使用されるいずれも試薬にも非反応性の印刷塗料付着物又は印刷インク付着物である。白色標的は理想的な状態では完全な白色を有する。しかしながら、黒色から白色までの中間を過ぎるようになる染色された生体材料の有用性は、限りなく低い。よって、白色は、完全な白色から５％〜１０％外れるが、それでも有用な値であり得る。主な要件は、白色標的が、太陽光に曝露されなければ時間の経過に対して安定な金属酸化物組成物又は金属硫酸塩組成物からなることである。酸化アルミニウム及び酸化チタンは、その要件に非常に合致する。
【００２６】
他の実施形態においては、上述の問題に対する好ましい解決法を開示する。黒色標的及び白色標的は、いずれも、公称３６５ｎｍでの直接ＵＶ光曝露により触媒された無水物系エポキシ塗料基剤に基づいている。無水物触媒は、メチルテトラヒドロフタル酸無水物とジフェニルヨードニウムヘキサフルオロヒ酸塩とからなる。ＵＶによって反応開始することに加えて、エポキシを触媒して架橋させるよう機能するのに、無水物は熱付加を必要とする。ＵＶによって反応開始する好ましい無水物及びその仲間を載せているが、無水物製造業者を探せば他の可能な解決法を見つけることができる。そのような塗料／インクは必要に応じて構成することができるが、使用する印刷方法に最適化された市販成分であることが多い。塗料／インクの製造は、顔料粒子とエポキシバインダーとの間の濡れ性を良好にするのが困難であることに対処しなければならない。無水物系塗料（粘度が低い場合にはインクとも呼ばれる）では、可使時間が数ヶ月の期間になるよう、無水物をエポキシと混合することが多い。粘度を低下させることは、塗料産業に関連する既知の知識であり、エポキシ混合物を適用する表面及び使用する印刷方法によって配合物は変わる。熱で反応が引き起こされる無水物−エポキシ塗料／インクは一般的に使用されているが、反応を開始するのに必要な熱によって、塗料／インクと共在し得る生体材料（タンパク質、ペプチド、及び化学的標的）がダメージを受ける可能性がある。
【００２７】
他の実施形態においては、無水物触媒は、非特異的染色をサポートするアミノ−シラン系触媒で見られる未反応のアミンを除去する。遊離アミン末端基は、生体材料及び特定の染色剤の両方を捕捉することができ、実際に捕捉するものである。詳細には、無水物触媒は、スライド処理試薬、特に染色試薬による白色標的の望ましくない染色という問題に取り組んでいる。塗料／インクの表面上の遊離アミン末端基としては、一次抗体及び二次染色試薬の両方を捕捉することができ、これにより染色される。これにより、スライド上に一体化した白色標的を有することの価値を無しにする。
【００２８】
他の実施形態においては、黒色顔料としては、直径２ミクロン未満のカーボンダストを使用するが、白色としては、酸化アルミニウムビーズ又は酸化チタンビーズを使用する。酸化チタンは、この用途において好ましい金属酸化物である。
【００２９】
他の実施形態においては、エポキシインク／塗料配合物を作製する際、種々の短鎖アルコール、長鎖アルコール、及び界面活性剤により粘度及び乾燥時間を調整することは既知である。界面活性剤の選択により、これらのスライドが受け得る範囲の染色剤及び試薬に対してインク／塗料を反応性のままにすることができる。好ましい配合物は、界面活性剤を全く避けたものである。
【００３０】
他の実施形態においては、標的の印刷は、スタンプ台又はシリンジによって行うことができるが、標的付着物のより良好な特徴であるサイズへの調整をサポートすることから、シリンジが好ましい方法である。
【００３１】
他の実施形態においては、上述の白色標的は、無水物で触媒されたエポキシの範囲内の金属酸化物顔料からなる。他の実施形態においては、上述の黒色標的は、ＵＶによって反応開始する無水物によって触媒されたエポキシの範囲内のカーボン顔料からなる。他の実施形態においては、無水物触媒は、直接ＵＶ光曝露によってＵＶによって反応開始する。ＵＶによって反応開始する無水物触媒を使用することの主要な利点は、無水物−エポキシ反応を開始するのに必要な熱が、生体材料（タンパク質、ペプチド、及び化学的標的）がダメージを受けることなく耐えることのできるものを上回ることである。より重要なことは、染色試薬と反応し得るあらゆる遊離アミンを除去することである。
【実施例】
【００３２】
実施例１
一直線になった標的を含むＨ＆Ｅ用スライドの画像を図１に示す。これらの標的は、端で黒色顔料標的及び白色顔料標的によって境界されている。顔料標的は、特定の染色標的から離れて印刷されている。黒色標的／白色標的は、改良分注ポンプを使用して印刷される。分注ポンプは、スライド表面へと保持された中空チューブを降りるエポキシ混合物に対して吐出吸引（spit and suck）サイクルを適用している。吐出吸引サイクルに続いてプリントヘッドが上がると、付着物がドットとして残る。化学的標的の残部は、他のステーションにおいて印刷され、スライドはＵＶ曝露トンネルを通過し、無水物触媒を反応開始してエポキシを硬化する。
【００３３】
エポキシプラス無水物は、市販の予混合物である。均一性を確保するため、エポキシ混合物は撹拌され、その後脱ガスされる。塗料／インクは、顔料を既に混ぜた状態で購入される。このような塗料／インクは、多数の販売会社から市販されているが、あらゆるケースにおいて、配合物はその販売会社所有のものであり、販売会社ごとに異なるだろう。販売会社が供給する推奨の希釈剤を用いて、必要に応じて粘度を調整する。白色顔料は、特定の染色剤とのほとんどの化学相互作用を回避する硫酸バリウムである。これは、エオシンＹと反応し得る二酸化チタン又は酸化アルミニウムと対照的である。
【図１】
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【国際調査報告】
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