(57)【要約】  本発明は、アルツハイマー病の危険性の予測に使用することができる一塩基多型（ＳＮＰ）に関する。ＳＮＰはｒｓ４０５５０９であり、ヒトゲノム地図ＧＲＣｈ３８．ｐ７に基づいて、第１９染色体、４４９０５５７９に位置する。本発明は、ｒｓ４０５５０９のＴアレルが、ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４の認知症の危険性をさらに増大させる役割を果たすことを示唆する。ＡＰＯＥ遺伝子型間の大脳皮質厚および海馬体積の比較の結果は、アジア人において、Ｅ４／Ｅ４の収縮がＥ３／Ｅ３より大きいことを示唆する。Ｅ４／Ｅ４遺伝子型を有するコーカサス人の中でｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ  遺伝子型を有する人々の大脳皮質は、より激しく萎縮している。したがって、本発明は、ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４とともにｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ多型の確認を可能にし、それにより、アルツハイマー病および／またはアルツハイマー病による認知症を診断するかまたは危険性予測するのに使用することができる。
2020510411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から単離された核酸を含む試料において軽度認知機能障害またはアルツハイマー病（ＡＤ）を示す遺伝的変異を検出することによって、軽度認知機能障害またはアルツハイマー病の診断をするかまたは危険性を予測するための方法であって、
（ａ）ＡＰＯＥ  Ｅ４アレルをコードする遺伝子から選択される遺伝子またはそれらの遺伝子産物中の遺伝的変異の有無を検出することができる試薬と前記試料を接触させる工程と、
（ｂ）ＡＰＯＥプロモーターのｒｓ４０５５０９  Ｔアレルをコードする遺伝子またはそれらの遺伝子産物から選択される遺伝的変異の有無を検出することができる試薬と前記試料を接触させる工程と
を含み、
ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４およびｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ遺伝的変異の存在が、前記対象が軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病を有する患者であること、または軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病の危険性を有することを示す、方法。
【請求項２】
ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４およびｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ遺伝的変異の有無を検出する方法が、前記対象から単離された前記試料から一本鎖形態の核酸を得、前記核酸を相補的プライマーセットと複合体を形成させ、次いで、前記複合体中の前記遺伝的変異の有無を解析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複合体中の前記ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４およびｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ遺伝的変異の有無を解析することが、ポリメラーゼ連鎖反応、ヌクレアーゼ消化、ハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、制限酵素断片多型分析、シークエンシング、プライマー伸長法もしくは一本鎖高次構造多型分析を使用して、またはそれらの組み合わせを使用して解析を実施することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸を増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸がゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記対象の大脳皮質厚の画像を得る工程
をさらに含み、
前記大脳皮質厚の萎縮が、前記対象が軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病を有する患者であること、または軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病の危険性を有することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
大脳皮質厚の前記画像がＭＲ脳画像である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
神経心理学的検査、脳脊髄液（ＣＳＦ）検査、およびアミロイドＰＥＴ検査からなる検査の１つ以上を実施する工程
をさらに含む、請求項１、７および８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
軽度認知機能障害またはアルツハイマー病を診断または予測するためのキットであって、ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４遺伝的変異の有無を、ＡＰＯＥ  Ｅ４アレルをコードする遺伝子から選択される遺伝子またはそれらの遺伝子産物において検出し、ＡＰＯＥプロモーターのｒｓ４０５５０９  Ｔアレルをコードする遺伝子またはそれらの遺伝子産物から選択されるｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ遺伝的変異の有無をさらに検出する、キット。
【請求項１１】
前記ＡＰＯＥ  Ｅ４アレルおよび前記ＡＰＯＥプロモーターの前記ｒｓ４０５５０９  Ｔアレルに相補的なプライマーセット、ならびに
反応酵素
を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記遺伝的変異を解析するための解析方法が含まれる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
核酸を増幅するための方法が含まれる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
参照対照が含まれる、請求項１０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルツハイマー病を早期診断するための、およびアルツハイマー病の危険性を予測するための、一塩基多型に関する。さらに本発明は、一塩基多型を使用して、アルツハイマー病を早期診断するための、およびアルツハイマー病の危険性を予測するための方法に関する。本発明は、アルツハイマー型認知症に特異的な脳損傷を調べＭＲＩに基づく脳地図を作成するという課題を実施することによって得られた結果に基づき、これは、韓国のＭｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ＩＣＴ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  ＰｌａｎｎｉｎｇのＢｒａｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔプロジェクトの支援を受けている。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病は、認知低下および脳の老人斑を特徴とする進行性神経変性疾患である。アルツハイマー病は高齢者の認知症の最も一般的な原因であり、認知症の６０％〜８０％を占める（ＢａｒｎｅｓおよびＹａｆｆｅ、２０１１）。６５歳以上の高齢者の約１３％および８５歳以上の高齢者の約４５％がアルツハイマー病患者であると推定される。アルツハイマー病（ＡＤ）は、記憶喪失および他の認知障害だけでなく脳の構造変化も引き起こす複雑な神経変性疾患である（Ｂａｌｌａｒｄら、２０１１；Ｆｏｒｅｒｏら、２００６）。ＡＤ患者は、脳の後部帯状皮質（ＰＣＣ）、内側前頭前皮質および海馬におけるアミロイド斑の増大、ならびに海馬体積の低下を示す。さらに、患者は、ベータアミロイドレベルの低下ならびにＣＳＦ中のタウおよびｐ−タウのレベルの増大を示す（Ｊａｃｋ、２０１２；Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋｉら、２０１０）。
【０００３】
アルツハイマー型認知症の治療剤は開発中であるが、注目すべき治療剤は現在まで存在していない。したがって、アルツハイマー型認知症の早期診断および早期予測に関する必要性は高い。アルツハイマー型認知症の診断技術としては、神経心理学的検査、ＭＲＩ脳イメージング検査、専門家の意見による臨床診断、脳脊髄液およびフロルベタベンに基づくアミロイドＰＥＴによる病理検査などが挙げられる。臨床診断は、認知症または軽度認知機能障害の発症を診断することができるが、それらを他の脳疾患と区別することが困難である場合があり得る。臨床診断は、症状が発生した後でしか診断が可能でないことから、早期診断の目的には適切ではない。脳脊髄液検査は、定量分析、例えばベータアミロイドタンパク質およびタウタンパク質の分析を介して実施され、したがって、これは、認知症に対する信頼できる診断尺度である。しかし、侵襲的な脳脊髄液採取の理由から、対象はこの検査に非常に抵抗する。アミロイドＰＥＴによる病理検査は信頼できるが、費用がかかる。ＭＲＩ脳イメージングの場合は、認知症と関連する脳損傷、例えば、大脳皮質の萎縮および海馬の萎縮を調べるための、および早期診断のための技術が開発中であるが、診断が早い時点で行われないということが現在知られている。さらに、血液を介する認知症の診断技術の開発が活発に進行中である。しかし、実験のための集団の規模および正確性に対する制限があり、したがって、信頼性の検証が臨床的使用について必要とされる。
【０００４】
遺伝因子では、アミロイド前駆体タンパク質、プレセニリン−１およびプレセニリン−２が、家族歴が理由の早発性のアルツハイマー病についての主な因子である（Ｂｌｅｎｎｏｗら、２００６；ＨａｒｄｙおよびＳｅｌｋｏｅ、２００２）。ＡＰＯＥでは、ｅ４アレルが遅発性の孤発性アルツハイマー病の最も強い危険因子である（Ｂｕ、２００９；Ｃｏｒｄｅｒら、１９９３；ＨｕａｎｇおよびＭｕｃｋｅ、２０１２）。ＡＰＯＥ遺伝子は、世界的観点から見ると、それぞれ８．４％、７７．９％、および１３．７％の頻度で、３つの多型、ｅ２、ｅ３、およびｅ４を有する（Ｆａｒｒｅｒら、１９９７）。アルツハイマー病におけるｅ４の頻度は約４０％に劇的に増加する（Ｆａｒｒｅｒら、１９９７）。ＡＰＯＥは第１９染色体の長腕（１９ｑ１３．２）に位置する。ＡＰＯＥは３つのアレル、すなわち、ｅ２、ｅ３、およびｅ４を有し、これらは、アミノ酸位置１１２（Ｃｙｓ／Ａｒｇ）および１５８（Ａｒｇ／Ｃｙｓ）の変化により形成され、３つのアレルの組み合わせにより、６つの遺伝子型（Ｅ２／Ｅ２、Ｅ２／Ｅ３、Ｅ３／Ｅ３、Ｅ２／Ｅ４、Ｅ３／Ｅ４、Ｅ４／Ｅ４）多型が存在する。これらの中で、ＡＰＯＥ  ｅ４は、ＡＤ患者の５０％以上で通常見出される。しかし、ＡＰＯＥ  ｅ４は認知的に正常な対照の１５％未満でしか見出されない（Ｗａｒｄら、２０１２）。以前の研究によって、ＡＰＯＥ  ｅ４がＡＤの発症時期を５〜１５年短くし得ることが報告された（Ｃｏｒｄｅｒら、１９９３；Ｇｏｍｅｚ−Ｔｏｒｔｏｓａら、２００７）。さらに、認知低下に対するＡＰＯＥ  ｅ４の影響が報告された。しかし、いくつかの研究によって、ＡＰＯＥ  ｅ４は認知能力を低下させることが報告され、その一方で、他の研究によって、ＡＰＯＥ  ｅ４は認知能力の低下に影響を与えないことが報告され、さらに他の研究の結果によって、ＡＰＯＥ  ｅ４は認知能力をゆっくりと低下させることが示唆された（ＡｎｓｔｅｙおよびＣｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ、２０００；Ｂｅａｕｄｒｅａｕら、２０１３；Ｃａｓｅｌｌｉら、２００９；Ｃｒａｆｔら、１９９８；Ｄｅａｒｙら、２００２；Ｊｏｒｍら、２００７；Ｋｌｅｉｍａｎら、２００６；Ｍａｙｅｕｘら、２００１；Ｖａｎ  Ｇｅｒｖｅｎら、２０１２）。議論を要するそのような結果にもかかわらず、ＡＰＯＥ  ｅ４ホモ接合体を有する健常個体は海馬体積の低下を示し、一方で、健常な高齢者群において、ＡＰＯＥ  ｅ４ヘテロ接合体を有する健常個体は、ｅ４を保有しない対象と違いを示さなかった（Ｃｒｉｖｅｌｌｏら、２０１０；Ｆａｒｌｏｗら、２００４；Ｌｅｍａｉｔｒｅら、２００５）。さらに、ＡＰＯＥ  ｅ４は、健常な高齢者において、軽度認知機能障害のアルツハイマー病への転換に関与することが示された（Ｗａｎｇら、２０１１）。ｅ４アレルの危険性は、人種群の間で変動することが報告されている（Ｂｒａｉｎｅｒｄ、２０１３；Ｆａｒｒｅｒら、１９９７；Ｈｅｕｎら、２０１０；ＨｓｉｕｎｇおよびＳａｄｏｖｎｉｃｋ、２００７；Ｈｓｉｕｎｇら、２００４；Ｒｏｓｅ、２００５）。しかし、ＡＰＯＥ  ｅ４に基づいて予測が行われる場合でさえも、認知症に対する遺伝的影響の程度の２０％以内でしか説明することができない。したがって、アルツハイマー病に対するｅ４媒介性の危険性および可能な誘導因子は、依然として不明なままである。その一方で、韓国特許第１０−１３３５０２１号は、アルツハイマー病または軽度認知機能障害を有する患者とＡＰＯＥ  ｒｓ４０５５０９のＴ／Ｇヘテロ接合性との間の関連を記載している。
【０００５】
したがって、本発明者らはＡＰＯＥ  Ｅ４の遺伝的変異を研究しただけでなく、認知症に対するＡＰＯＥ  Ｅ４の危険性に影響を及ぼし得る、ＡＰＯＥ遺伝子周辺の遺伝的変異も研究した。さらに、ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体の場合では、本発明者らは、認知症に対する危険性の人種差が存在することを確認し、その原因を解析することを目的とした。その結果、驚くべきことに本発明者らは、ＡＰＯＥプロモーターに位置する一塩基多型が、ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４ホモ接合体の認知症に対する危険性の人種差を説明するだけでなく、大脳皮質厚がアレルに応じて変動することを確認した。さらに、本発明者らは、大脳皮質厚および海馬体積を解析することによって、脳構造に対するＡＰＯＥ多型の影響を確認した。
【発明の開示】
【技術的問題】
【０００６】
本発明の一目的は、アルツハイマー病および／またはアルツハイマー病に起因する認知症に対する危険性を予測するための一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝的変異を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、一塩基多型（ＳＮＰ）遺伝的変異を検出することによってアルツハイマー病および／またはアルツハイマー病に起因する認知症に対する危険性を予測するための方法を提供することである。
【問題に対する解決策】
【０００８】
本発明は、アルツハイマー病および／またはアルツハイマーに起因する認知症に対する危険性を予測するのに使用することができる一塩基多型（ＳＮＰ）を提供する。より具体的には、ＳＮＰは、ヒトゲノム地図のＧＲＣｈ３８．ｐ７バージョンに基づくと、第１９染色体上の４４９０５５７９に位置するｒｓ４０５５０９であり、そのアレルはＴおよびＧである。このＳＮＰは、マイナーアレル頻度（ＭＡＦ）の人種差を示した。
【０００９】
本発明の一態様では、本発明は、対象から単離された試料、例えば、細胞、組織、血液または体液からゲノムＤＮＡを単離および精製し、ＡＰＯＥプロモーターのｒｓ４０５５０９一塩基多型およびＡＰＯＥ遺伝子型を解析および特定することによって、認知症に対する危険性を予測する。
【００１０】
本発明の別の態様では、ＡＰＯＥイプシロン遺伝的変異（ｒｓ４２９３５８およびｒｓ７４１２）ならびにｒｓ４０５５０９遺伝的変異を使用するアルツハイマー型認知症の予測についての情報を提供するための方法が提供される。
【００１１】
本発明のさらに別の態様では、対象から単離された核酸を含む試料において軽度認知機能障害またはアルツハイマー病を示す遺伝的変異を検出することによって、軽度認知機能障害またはアルツハイマー病（ＡＤ）の診断をするかまたは危険性を予測するための方法であって、（ａ）ＡＰＯＥ  Ｅ４アレルをコードする遺伝子から選択される遺伝子またはそれらの遺伝子産物中の遺伝的変異の有無を検出することができる試薬と試料を接触させる工程と、（ｂ）ＡＰＯＥプロモーターのｒｓ４０５５０９  Ｔアレルをコードする遺伝子またはそれらの遺伝子産物から選択される遺伝的変異の有無を検出することができる試薬と試料を接触させる工程とを含み、ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４およびｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ遺伝的変異の存在が、対象が軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病を有する患者であること、または軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病の高い危険性を有することを示す方法が提供される。ここで、危険性を予測するための方法は、対象から単離された核酸を増幅することによって実施されてもよく、核酸はゲノムＤＮＡまたはＲＮＡであってもよい。
【００１２】
本発明のさらになお別の態様では、方法は、対象の大脳皮質厚について、画像、例えば、磁気共鳴（ＭＲ）脳画像を得る工程をさらに含み、大脳皮質厚の萎縮は、対象が軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病を有する患者であること、または軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病の高い危険性を有することを示し得る。
【００１３】
本発明のさらになお別の態様では、方法は、神経心理学的検査、脳脊髄液（ＣＳＦ）検査、およびアミロイドＰＥＴ検査からなる検査の１つ以上を実施する工程をさらに含んでもよい。
【００１４】
本発明の一態様では、遺伝的変異の有無を検出する方法は、対象から単離された試料から得られた一本鎖形態の核酸が相補的プライマーセットと複合体を形成するように供され、次いで、複合体において遺伝的変異の有無が解析される方法である。複合体中の遺伝的変異の有無は、ポリメラーゼ連鎖反応、ヌクレアーゼ消化、ハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、制限酵素断片多型分析、シークエンシング、プライマー伸長法もしくは一本鎖高次構造多型分析を使用して、またはそれらの組み合わせを使用して解析されてもよい。
【００１５】
本発明のさらになお別の態様では、軽度認知機能障害またはアルツハイマー病を診断または予測するためのキットが提供され、キットは、ＡＰＯＥ  Ｅ４アレルをコードする遺伝子から選択される遺伝子またはそれらの遺伝子産物中の遺伝的変異の有無を検出することができ、キットは、ＡＰＯＥプロモーターのｒｓ４０５５０９  Ｔアレルをコードする遺伝子またはそれらの遺伝子産物をさらに含んでもよい。したがって、本発明の一態様では、キットは、ＡＰＯＥの一塩基多型ＡＰＯＥ  Ｅ４およびＡＰＯＥプロモーターの一塩基多型ｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ、Ｔ／Ｇ、およびＧＧに相補的なプライマーセット、ならびに反応酵素を含むキットであってもよい。
【００１６】
本発明において遺伝子産物は、遺伝子の発現によって生じる産物であり、ＲＮＡ、例えば、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ、ポリペプチドならびにタンパク質を含むと理解される。
【００１７】
本発明の別の態様では、キットは、遺伝的変異を解析するための解析方法、核酸を増幅するための方法、または参照対照を含むキットであってもよい。
【００１８】
本発明のさらに別の態様では、ＡＰＯＥ  Ｅ４アレルをコードする遺伝子から選択される遺伝子またはそれらの遺伝子産物中の遺伝的変異の有無を検出することができる相補的プライマーセットが提供され、ｒｓ４０５５０９  Ｔアレルをコードする遺伝子またはそれらの遺伝子産物が一緒に提供されてもよい。したがって、本発明の一態様では、プライマーセットは、ＡＰＯＥの一塩基多型ＡＰＯＥ  Ｅ４ならびにＡＰＯＥプロモーターの一塩基多型ｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ、Ｔ／Ｇ、およびＧＧに相補的なプライマーセットであってもよい。
【００１９】
本発明の別の態様では、プライマーセットは、標識、例えば、放射性同位体、フルオロフォアまたは化学誘導体が結合しているプライマーセットであってもよい。
【発明の有利な効果】
【００２０】
本発明によれば、孤発性アルツハイマー型認知症についての予測的遺伝的変異として、ＡＰＯＥ遺伝子型、特にＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４に加えて、遺伝的変異ｒｓ４０５５０９を調べることによって、アルツハイマー型認知症の危険性をより正確に診断することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ＡＰＯＥ  ｅ４／４の危険性を調節する多型候補をスクリーニングするためのストラテジーを図示する（図１Ａ）。図１Ｂは、ＡＰＯＥの遺伝子構造を概略的に図示する。ｒｓ４４９６４７（−４９１  Ａ／Ｔ）、ｒｓ４０５５０９（−２１９  Ｔ／Ｇ）、ｒｓ４４０４４６（＋１１３  Ｇ／Ｃ）、ｒｓ４２９３５８およびｒｓ７４１２のＳＮＰをパネルＢに示した。図１Ｃは、東アジア人、コーカサス人およびアフリカ人系統からの全ケース調節された対象（whole case-regulated subjects）またはｅ４ホモ接合体に関して、ｒｓ４０５５０９、ｒｓ４４９６４７、ｒｓ４４０４４６について遺伝子型頻度の分布を評価することにより得られた結果を図示する。ここで、遺伝子型頻度は、各ケースおよび対照における平均頻度として計算した。
【図２】図２は、東アジア人およびコーカサス人における皮質厚の減少を示す地図を図示する（図２Ａ）。一般線形モデルを適用し、固定因子としてＡＰＯＥ  ｅ４／４およびｅ３／３を、ならびに共変量として年齢、性別および場の強度を使用することによって、皮質厚のポイントごとの違いを推定した。数は統計的差異（ｐ＜０．０５）を表す。黒丸は内側嗅内および海馬傍回領域内の脳萎縮を表し、赤丸は楔前部領域内の脳萎縮を表す（図２Ａ）。内側側頭皮質（内側嗅内および海馬傍回領域）内（図２Ｂ）ならびに楔前部内（図２Ｃ）の平均皮質厚を、東アジア人およびコーカサス人におけるＡＰＯＥ遺伝子型に応じて比較した。データはｅ３／３に対して正規化し、９５％信頼区間を有するエラーバーとともに％として表した。棒グラフは、東アジア人およびコーカサス人におけるＡＰＯＥ遺伝子型間で海馬体積を比較することによって得られた結果である（図２Ｄ）。
【図３】図３は、ｒｓ４０５５０９  Ｔ−アレルがＡＰＯＥタンパク質の発現を低下させることを図示する。ヒト血清を抗ＡＰＯＥおよび抗トランスフェリン（ＴＦ）とともにウエスタンブロッティングにかけて、ＡＰＯＥタンパク質のｒｓ４０５５０９依存的血清発現を調べる（図３Ａ）。ＡＰＯＥ  ｅ３／３ホモ接合体におけるｒｓ４０５５０９（Ｇ／Ｇ、Ｇ／ＴおよびＴ／Ｔ）遺伝子型について血清試料を選択する。棒グラフはＡＰＯＥ発現の相対強度を示す（図３Ｂ）。参照としてＧＧ遺伝子型を使用した。正規化された対照としてトランスフェリン（ＴＦ）を使用した。データは平均±ＳＥＭである（＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１）。
【図４】図４は、ＡＰＯＥ  ｅ４／４媒介性アルツハイマー病の発症に対するアジア人の感受性を図示する。アルツハイマー病については、ｅ３／３を参照してＡＰＯＥ  ｅ４／４のオッズ比を異なる人種群の間で比較した。棒グラフは、臨床診断に基づいたアルツハイマー病に対する（図４Ａ）、および神経病理学的に特定された系列に対する（図４Ｂ）、ｅ４／４のオッズ比を表す。＊データセットは、ロジスティック回帰によって解析し、†は以前の研究結果の引用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
本発明において、本発明者らは、大規模な研究を通して、異なる人種群の間でＡＰＯＥ  ｅ４媒介性ＡＤに対する感受性を解析した。その結果、ｅ４ホモ接合体は、コーカサス人およびアフリカ人系統と比較して、東アジア人においてアルツハイマー病にかかりやすかった。さらに、本発明者らは、神経病理学的にアルツハイマー病と診断された患者および対照に対する関連研究によって、そのような人種差を確認した。少数の以前の研究によって、様々な集団における異なるＡＰＯＥ  ｅ４アレル分布が報告されている（Ｆａｒｒｅｒら、１９９７；Ｓｉｎｇｈら、２００６）。ｅ４アレルの頻度はアフリカ、ヨーロッパおよびアジアの順番に高く、これは、アルツハイマー病に対するｅ４の危険性の順番と逆である。
【００２３】
ＡＰＯＥ  ｅ４プロモーターが嗅内皮質、海馬傍回皮質および楔前部の皮質厚の減少を促進することが報告されている（Ｄｏｎｉｘら、２０１０；Ｆｏｌｅｙら、２０１６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２０１１）。認知的に正常な対象における別の研究によって、ｅ４を有する個体も皮質厚の減少があることが示唆された（Ｆｏｕｑｕｅｔら、２０１４）。さらに、ｅ４アレルを有する個体は、記憶機能に重要な役割を果たす海馬における重度の萎縮、および記憶障害を示した（Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｓら、２０１１）。本発明では、本発明者らは、東アジア人とコーカサス人の両方において、ＡＰＯＥ  ｅ３ホモ接合体と比較して、ＡＰＯＥ  ｅ４ホモ接合体が、嗅内皮質、海馬傍回皮質および楔前部領域における皮質厚の激しい減少ならびに海馬の萎縮と関連することを発見し、この結果は以前の研究と矛盾がなかった（Ｄｏｎｉｘら、２０１０；Ｆｏｌｅｙら、２０１６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、２０１１）。驚くべきことに、ｅ４／４対象で観察されたこれらの皮質および海馬の萎縮は、コーカサス人よりも東アジア人で重度であることが確認された。本発明は、ＡＰＯＥ  ｅ４／４を有する東アジア人は、コーカサス人と比較して、アルツハイマー病ならびに脳における皮質厚の減少および海馬の萎縮に対する危険性が高いことを示唆する。
【００２４】
本発明者らは、集団間のｅ４／４媒介性ＡＤに対する危険性の違いは、遺伝的背景、特に、ＡＰＯＥ遺伝子周辺の多型の人種差のためであると仮定した。ＡＰＯＥ  ｅ４はアルツハイマー病と関連する唯一のＡＰＯＥ多型ではない。ＡＰＯＥプロモーターおよびイントロン領域内の多型が、ＡＤの発症に対するＡＰＯＥ  ｅ４の影響を調節することが報告されている（Ｂｅｒｔｒａｍら、２００７；Ｌａｍｂｅｒｔら、２００２；Ｌａｍｂｅｒｔら、１９９８ｂ；Ｌｅｓｃａｉら、２０１１）。プロモーター中の２つのＳＮＰ（ｒｓ４４９６４７およびｒｓ４０５５０９）ならびにイントロン中の１つのＳＮＰ（ｒｓ４４０４４６）は、アルツハイマー病に対するＡＰＯＥイプシロン変異の影響を調節することが評価された。−４９１ＡＡおよび２１９ＴＴ遺伝子型がＡＰＯＥイプシロン遺伝子型とは無関係にＡＤの危険性を増大させることが報告されている（Ｌａｍｂｅｒｔら、２００２；Ｌａｍｂｅｒｔら、１９９８ａ；Ｌａｍｂｅｒｔら、１９９８ｂ；Ｌｉｍｏｎ−Ｓｚｔｅｎｃｅｌら、２０１６；Ｗａｎｇら、２０００）。さらに、ｒｓ４０５５０９が、認知能力への影響においてＡＰＯＥ  ｅ４と相乗作用を有することが報告されている（Ｍａら、２０１６）。本発明者らは、これらのＳＮＰが、異なる人種集団において異なるアレル頻度を示すことを解析した。本発明者らは、これらのＳＮＰの中のｒｓ４０５５０９の場合、韓国人および日本人を含めた東アジア人が、コーカサス人およびアフリカ人系統と比較して、全集団とｅ４ホモ接合体保有群の両方において、高頻度のｒｓ４０５５０９−Ｔ（これはリスクアレルである）を保有することを確認した。このことは、ｅ４ホモ接合体が、他の人種群と比較して、東アジア人においてアルツハイマー病の高い危険性を有することを支持する。同様に、コーカサス人は、アフリカ人系統と比較してｒｓ４０５５０９−Ｔに対して高いアレル頻度を有すること、およびコーカサス人は、アフリカ人系統と比較して高いｅ４／４ホモ接合体オッズ比も有することが確認された。
【００２５】
いくつかの神経イメージング研究によって、脳萎縮に対するＡＰＯＥ  ｅ４ホモ接合体の影響が報告されているが、ＡＰＯＥプロモーター多型の影響は、まだはっきりとは解明されていない。以前の研究によって、中国人集団の非認知症関連の老化過程において、ヒトの脳に対するＡＰＯＥプロモーター領域中のｒｓ４０５５０９多型の影響が報告されている。ＡＰＯＥ  ｅ４とともにｒｓ４０５５０９−ＴＴを有する個体が、ｒｓ４０５５０９  Ｇ−アレルを有する個体と比較して、年齢依存的に皮質厚の萎縮を示すことが発見された（Ｃｈｅｎら、２０１５ａ）。本発明者らは、ｒｓ４０５５０９−ＴＴ遺伝子型を有する個体が、ｅ４ホモ接合体の中で、Ｇ−アレルを有する個体と比較して、アルツハイマー病と非常に関連しており、皮質厚および海馬体積の激しい萎縮を引き起こすことを発見した。特に、このパターンの皮質厚の減少は、内側側頭皮質（嗅内および海馬傍回領域）ならびに楔前部で観察され、海馬傍回領域の萎縮は以前の研究（Ｃｈｅｎら、２０１５ａ）と類似している。本発明者らは、ＡＰＯＥ  ｅ４ホモ接合体およびｒｓ４０５５０９−ＴＴを有する個体で、嗅内皮質、海馬傍回皮質および楔前部領域における皮質厚の激しい減少ならびに海馬の萎縮を確認した。本発明では、本発明者らは、アルツハイマー病およびｅ４／４媒介性脳萎縮の危険性の人種差は、ｒｓ４０５５０９多型の人種多様性のためであることを確認した。
【００２６】
さらに、本発明者らは、ｒｓ４０５５０９−ＴＴが、ヒトの脳および血清においてＡＰＯＥの発現低下を誘導することを実証した。ｒｓ４０５５０９  ＴまたはＧアレルにおけるアレル置換を使用するレポーター遺伝子アッセイにおいて、本発明者らは、プロモーター中にｒｓ４０５５０９−Ｔアレルを有するＡＰＯＥ遺伝子はあまり発現していないことを実証し、これは、ｒｓ４０５５０９−Ｔを含有する危険性はＡＰＯＥタンパク質の減少のためであることを示唆する。
【００２７】
上記のように、本発明者らは、東アジア人におけるＡＰＯＥ  ｅ４ホモ接合体は、コーカサス人およびアフリカ人系統よりもアルツハイマー病にかかりやすいことを確認した。人種群の間のＡＰＯＥプロモーター多型の異なるアレル頻度は、ＡＰＯＥ  ｅ４を有する個体に対して、アルツハイマー病の発症を差別的に起こしやすくするであろう。ＡＰＯＥタンパク質レベルの調節とのｒｓ４０５５０９の関連性を考慮すると、ｒｓ４０５５０９−ＴＴを有するｅ４  ＡＰＯＥ個体におけるＡＰＯＥレベルの低下が、アルツハイマー病の危険性の増大を誘導することが示唆される。
【発明の形態】
【００２８】
以下に、本発明を例により記載する。以下の例は例示目的のみであり、本発明の範囲はそれらに限定されない。
【００２９】
材料および方法
（１）試料およびデータ
本発明では、完全長ゲノム情報、ＭＲＩ脳画像情報および臨床診断情報を利用した。認知症コホートにおける２，０７５人の研究対象（主にＣｈｏｓｕｎ大学病院および他の協力病院から；正常対象の平均年齢：７３．４５±５．３０（平均±ＳＤ）、アルツハイマー病患者の平均年齢：７１．６５±５．６５（平均±ＳＤ）、正常対象の女性の割合：６２．４％、アルツハイマー病患者の女性の割合：６１．５％）については、完全長ゲノムの情報は血液を使用して獲得し、脳画像情報は各研究対象のＭＲＩスキャン（３Ｔ  ＭＲＩ、Ｓｋｙｒａ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって獲得した。各研究対象は、認知症の診断に必要である神経心理学的検査（Ｋ−ＭＭＳＥおよびＳｅｏｕｌ  Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  Ｂａｔｔｅｒｙ（ＳＮＳＢ））を受けた。その結果、正常、軽度認知機能障害または認知症の診断は、認知症クリニックの専門医によって行われた。診断結果によって、１，１４５人の対象が正常であり、９３０人の対象が認知症の患者であることが示された。さらに、韓国、光州広域市のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ（ＮＲＣＤ）のデータベースを使用した。本発明のすべての実験および研究のプロトコールは、Ｃｈｏｓｕｎ大学病院の役員会によって承認された。すべての志願者および患者の親族は、実験に参加する前に準備された同意書を提出した。東アジア人の対象は、２，３０９人の認知的に正常な個体および１，８８６人のＡＤ患者からなっていた。コーカサス人のゲノムは、Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＡＤＮＩ；ｈｔｔｐ：／／ａｄｎｉ．ｌｏｎｉ．ｕｓｃ．ｅｄｕ／）データベースから獲得し、コーカサス人の脳画像もＡＤＮＩデータベースから得た。コーカサス人は、５１５人の正常対象および３２０人のＡＤ患者からなっていた。
【００３０】
ＡＤの臨床診断は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ／Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ）のＡＤ評価基準に従って行った（ＭｃＫｈａｎｎら、１９８４ｂ）。軽度認知機能障害（ＭＣＩ）は、現在同意されている基準に従って診断した（Ｗｉｎｂｌａｄら、２００４）。認知的に正常な群は、神経学的疾患がない、認知機能の障害がない、または日常生活において問題がない群である。脳ＭＲＩ上で、局所性病変、頭部外傷歴または知能に影響を及ぼす可能性がある精神病を有する対象は、除外した。軽度の医学的異常（例えば、本態性高血圧、重度の合併症を伴わない糖尿病、または軽度の難聴）を有する対象は含めた。
【００３１】
ｒｓ４０５５０９の危険性（オッズ比）に使用したコーカサス人のゲノムについては、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ−Ｌａｔｅ  Ｏｎｓｅｔ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（ＮＩＡ−ＬＯＡＤ）、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（ＮＣＲＡＤ）、およびＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｎｅｕｒｏｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ（ＡＤＮＩ）からのデータセットを使用した。２つのデータセットまたは３つのデータセットを組み合わせ、解析した。Ｅ４／Ｅ４遺伝子型を有する個体のＡＰＯＥプロモーターの一塩基（single nucleotide）を使用した。ＮＩＡ−ＬＯＡＤ、ＮＣＲＡＤおよびＡＤＮＩを組み合わせ、解析する場合は、Ｅ４／Ｅ４遺伝子型を有する個体は全体で３９５人であり、その中で、３３０人はアルツハイマー型認知症の患者であり、６５人は正常対象であった。
【００３２】
（２）脳アミロイドイメージング
１８Ｆ−フロルベタベンＰＥＴイメージングを、従来の方法（Ｏｓａｍａ  Ｓａｂｒｉ、２０１５、ＣｌｉｎＴｒａｎｓ１  Ｉｍａｇｉｎｇ、Ｂａｒｔｈｅｌ、２０１１、Ｌａｎｃｅｔ＿ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）に従って実施した。アミロイドの病状を、脳アミロイド−βプラーク量（ＢＡＰＬ）スコアによって決定した。４つの脳領域（前頭皮質、後部帯状、外側側頭皮質、および頭頂葉皮質）のフロルベタベン（１８Ｆ）ＰＥＴ画像を、設定領域皮質のトレーサー取り込み（ＲＣＴＵ）スコアリングシステム（１＝取り込みなし、２＝微量の取り込み、３＝著しい取り込み）に従って評価した。次に、前頭皮質、後部皮質、外側側頭皮質、および頭頂葉皮質に対するＲＣＴＵスコアを、各ＰＥＴスキャンについて、シングルプリセット３段階スコアリングシステムにおける脳アミロイド−βプラーク量（ＢＡＰＬ）スコア（１＝アミロイド量なし、２＝微量のアミロイド量、および３＝有意なアミロイド量）によってまとめた。ピッツバーグ化合物Ｂ（ＰｉＢ）を使用して陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）で、インビボのアミロイドイメージングを実施した。脳内の関心領域（ＲＯＩ）へのＰｉＢ沈着を、ＦｒｅｅＳｕｒｆｅｒバージョン５．１ソフトウェア（Ｍａｒｔｉｎｏｓ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ）を使用して測定し、部分体積効果について補正した標準化された取り込み値の比（ＳＵＶＲ）を、各関心領域について計算した。前頭皮質、後部皮質、外側側頭皮質、および頭頂葉皮質領域の平均大脳皮質ＳＵＶＲを、ＦｒｅｅＳｕｒｆｅｒによって計算した。参照のための領域として小脳皮質を使用した。ＰｉＢ陽性は１．４２のＳＵＶＲと定義し、これは、ＰｉＢ陽性について以前に定義された０．１８の平均大脳皮質結合能に対応する。１８Ｆ−フロルベタピルと１１Ｃ−ＰｉＢの両方に対するコーカサス人のアミロイドＰＥＴデータは、ＡＤＮＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ａｄｎｉ．ｌｏｎｉ．ｕｓｃ．ｅｄｕ）から得た。
【００３３】
（３）データ生成および解析
ＳＮＰジェノタイピング
ゲノムＤＮＡを、ＥＤＴＡチューブ中に採取した全血液細胞から単離した末梢血白血球から抽出した。血液試料を１５００×ｇで１０分間遠心分離して血漿を除去し、血中白血球をＤＮＡ抽出に使用した。韓国人に最適化されたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ゲノムワイドジェノタイピングアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（登録商標）Ａｘｉｏｍ  ＫＯＲＶ１．０）を使用して、試料をジェノタイピングした。ＫＯＲＶ１．０は、Ｋｏｒｅａ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＨｅａｌｔｈのＧｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒによって設計され、Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｈｉｐ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍから得た。さらに、ＴａｑｍａｎまたはＳＮＰ  ｔｙｐｅ（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）方法によるジェノタイピング解析を実施して、チップベースＳＮＰジェノタイピングの正確性を評価した。ＡＤＮＩのジェノタイピングデータは、ＡＤＮＩデータベース（ｈｔｔｐ：／／ａｄｎｉ．ｌｏｎｉ．ｕｓｃ．ｅｄｕ）から得た。
【００３４】
ゲノムワイドなデータインピュテーション
ＮＲＣＤからの研究データセットは６，４１３個体からなっていた。ＡＤＮＩからのデータセットは、ＡＤＮＩ−１データセット由来の８１８個体、ＡＤＮＩ−ＧＯ／２データセット由来の４３２個体、およびＡＤＮＩ−ＷＧＳデータセット由来の８１８個体からなっていた。試料の品質管理は、＜９５％の個体コールレート、性別ミスマッチ、ヘテロ接合性（平均から±３ＳＤ）、重複性または双生児、＜９５％のコールレートを有するＳＮＰ、＜１０−６のＨＷＥＰ値を有するＳＮＰ、および＜１％のＭＡＦを含んでいた。ＨＲＣリファレンスパネル  バージョン１．１を使用して、各データセットを別々にインピュテーションした。ＮＲＣＤからのＨＲＣインピュテーションは、参照集団として東アジア人を選択することによって、プレフェーズ研究のハプロタイプとともに実施した。ＡＤＮＩデータセットについては、インピュテーションは、参照集団として、ＨＲＣインピュテーションサーバー中のヨーロッパ人を選択することによって、プレフェーズ研究のハプロタイプとともに、別々に実施した。インピュテーション後に、低品質でインピュテーションされたＳＮＰ（info＜０．５）をさらなる研究から除外した（ＭｃＣａｒｔｈｙら、２０１６；Ｎａｇｙら、２０１７；Ｓｕｒａｋｋａら、２０１６）。
【００３５】
（４）イメージングプロトコール
韓国人対象からのＭＲ画像の獲得
２，４４３人の韓国人対象について、１．５ＴのＭＲスキャナー（Ｍａｇｎｅｔｏｍ  Ａｖａｎｔｏ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）（ＴＲ＝１８００ｍｓ；ＴＥ＝３．４３ｍｓ；ＴＩ＝１１００ｍｓ；１５フリップ角；ＦｏＶ＝２２４×２２４；マトリックス＝２５６×２５６；スライス数＝１７６）を用いて、脳全体の、０．９ｍｍ付近のアキシャル磁化準備型高速グラディエントエコー（magnetization prepared rapid gradient-echo）（ＭＰＲＡＧＥ）画像を獲得した。３ＴのＭＲスキャナー（Ｓｋｙｒａ、Ｓｉｅｍｅｎｓ）（ＴＲ＝２３００ｍｓ；ＴＥ＝２．１４３ｍｓ；ＴＩ＝９００ｍｓ；９フリップ角；ＦｏＶ＝２５６×２５６；マトリックス＝３２０×３２０；スライス数＝１７８．体積）を用いて、０．８ｍｍ付近のサジタルＭＰＲＡＧＥ体積を獲得した。すべての画像は、韓国、光州広域市、Ｃｈｏｓｕｎ大学病院にあるＭＲスキャナーを用いて獲得した。
【００３６】
ＡＤＮＩからのＭＲ画像
認知的に正常な４６３人の対象、軽度認知機能障害を有する７９６人の対象、および３１０人のＡＤ患者由来のベースラインの１．５Ｔおよび３ＴのＭＲ画像を、ＡＤＮＩデータベース（ＡＤＮＩ、ｈｔｔｐ：／／ａｄｎｉ．ｌｏｎｉ．ｕｓｃ．ｅｄｕ／）からダウンロードした。対象に関するすべてのＭＲ画像は、標準的なＡＤＮＩ  ＭＰＲＡＧＥプロトコールに従って、１．５Ｔまたは３ＴのＧＥ、Ｐｈｉｌｉｐｓ、およびＳｉｅｍｅｎｓの機器を用いて獲得した。１．５Ｔスキャナーについては、ＭＰＲＡＧＥプロトコールに対する公称パラメーターは、以下の通りである：サジタル面、マルチコイルフェーズドアレイコヘッドコイルに対してＴＲ＝２３００〜２４００ｍｓ（バードケージまたはボリュームヘッドコイルに対してＴＲ＝３０００ｍｓ）、最小フルＴＥ、ＴＩ＝１０００ｍｓ、フリップ角８°、ＦＯＶ＝２４０×２４０ｍｍ、１９２×１９２インプレーンマトリックスおよび１．２ｍｍスライス厚。３Ｔスキャナーについては、ＭＰＲＡＧＥプロトコールに対する公称パラメーターは、以下の通りである：サジタル面、ＴＲ＝２３００または３０００ｍｓ、最小フルＴＥ、Ｔ１＝８５３〜９００ｍｓ、フリップ角８°〜９°、ＦＯＶ＝２５６〜２６０×２４０ｍｍ、２５６×２５６インプレーンマトリックスおよび１．２ｍｍスライス厚（Ｊａｃｋら、２００８）。ＡＤ対象は、ＭＭＳＥについて２０〜２６のスコア（Ｂｕｒｎｓら、１９９８）およびＣＤＲ＝０．５または１（Ｍｏｒｒｉｓ、１９９３）に基づいて含めた。さらに、選択されたＡＤ群は、可能性の高い（probable）ＡＤに対する基準であるＮＩＮＣＤＳ／ＡＡＲＤＡ基準を満たしていた。健常対照については、ＣＤＲが０であり、認知症を有していない個体を含めた（Ｗｏｌｚら、２０１１）。
【００３７】
（５）画像データの処理および解析
ＭＲ画像データ処理
画像処理は、脳構造解析（Ｄａｌｅら、１９９９；ＦｉｓｃｈｌおよびＤａｌｅ、２０００；Ｆｉｓｃｈｌら、２００４）に使用されるパブリックドメインソフトウェアのＦｒｅｅＳｕｒｆｅｒソフトウェア（ＦｒｅｅＳｕｒｆｅｒ  ５．３．０）（ＦｒｅｅＳｕｒｆｅｒ、ｈｔｔｐ：／／ｓｕｒｆｅｒ．ｎｍｒ．ｍｇｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／）を用いて実施した。ＦｒｅｅＳｕｒｆｅｒ処理のための自動化パイプラインでＤＩＣＯＭフォーマットのＭＲ画像を使用して、脳皮質表面の３次元モデルを構築した（Ｄａｌｅら、１９９９；ＤａｌｅおよびＳｅｒｅｎｏ、１９９３；Ｆｉｓｃｈｌら、１９９９ａ）。処理において、画像の強度を正規化し、正規化した画像から頭蓋骨を除去した。次に、連結コンポーネントアルゴリズムを用いて皮質下セグメンテーション処理を開始し、発見された如何なる穴も、両方の大脳皮質半球について白質の単一充填体積を表すように充填した。さらに、テッセレーションおよび表面平滑化を用いて、如何なるメトリック歪みも減少させた。次に、精密化プロセスを実施して灰白質／白質の境界を作成し、次いで、最初の表面モデル構築を実施した。次に、表面を外側に変形させて、軟膜表面を形成した。最初に、灰白質／白質の表面上の各ポイントから軟膜表面までの最短距離を計算し、軟膜表面上のポイントから灰白質／白質までの最短距離を計算し、これによって、脳皮質の厚さの測定値を得た。次に、特定のポイントにおけるこれら２つの値の平均から最終的な皮質厚を得た。皮質厚は、三角グリッドを用いて、皮質外套内の任意のポイントまたは頂点を表す別の位置から約１ｍｍ離れた、各半球の１６３，８４２個の頂点について測定した。皮質の折りたたみパターンは、０ｍｍ、５ｍｍ、１０ｍｍ、１５ｍｍ、２０ｍｍおよび２５ｍｍの半値全幅ガウシアンカーネルを用いて地図を平滑化し、非剛体高次元球状平均化方法（ｎｏｎ−ｒｉｇｉｄ  ｈｉｇｈ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｐｈｅｒｉｃａｌ  ａｖｅｒａｇｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄ）を用いて対象について平均を得ることによって、調整した。調整した地図は、対象の間のｍｍ以下の違いさえ検出することができ、ボクセル解像度によって制限されない。さらに、ＦｒｅｅＳｕｒｆｅｒを使用する自動化体積測定方法（Ｄａｌｅら、１９９９；ＦｉｓｃｈｌおよびＤａｌｅ、２０００；Ｆｉｓｃｈｌら、１９９９ｂ）によって、皮下体積を獲得した。
【００３８】
（６）画像の統計解析
異なるＡＰＯＥアレルを有する群の間の皮質厚の違いを、ＭＡＴＬＡＢ用のＳｕｒｆｓｔａｔ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｈ．ｍｃｇｉｌｌ．ｃａ／ｋｅｉｔｈ／ｓｕｒｆｓｔａｔ／）ツールボックス（Ｒ２０１２ａ、Ｔｈｅ  Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ、Ｎａｔｉｃｋ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して統計的に解析した。本発明者らは、軟膜表面上の各々の非マスクポイントを統計的に試験した。固定因子としてＡＰＯＥアレル（ｅ４／４対ｅ３／３）を、ならびに共変量として性別、年齢、教育レベルおよび場の強度を使用して、一般線形モデル（ＧＬＭ）を用いて、皮質厚のポイントごとの違いを特定した（Ｆａｎら、２０１０）。ｒｓ４０５５０９アレルの違いを評価するために、Ｔ／Ｔ−Ｅ４／４およびＧ／Ｔ−ｅ４／４＋Ｇ／Ｇ−ｅ４／４のハプロタイプを有する対象を、ｅ３／３を有する対象とは別に比較した。ｒｓ４０５５０９のＧＬＭでは、本発明者らは、固定因子としてＡＰＯＥアレル（ｒｓ４０５５０９−ｅ４／４ハプロタイプ対ｅ３／３）を、ならびに共変量として性別、年齢、教育レベルおよび場の強度を使用して、皮質厚のポイントごとの違いを特定した（Ｃｈｅｎら、２０１５ｂ）。すべての皮質厚解析では、複数のポイントごとの皮質厚の比較のためのランダム場理論（ＲＦＴ）に基づく補正を、クラスターレベルで適用し、ｐ＜０．０５の偽発見率（ＦＤＲ）補正値を通過したクラスターを有意とみなした（ＴａｙｌｏｒおよびＡｄｌｅｒ、２００３）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｈ．ｍｃｇｉｌｌ．ｃａ／ｋｅｉｔｈ／ｓｕｒｆｓｔａｔ／）。さらに、Ｒプログラム（Ｒバージョン３．３．１）を使用して、ＡＰＯＥアレルを保有する群について、海馬体積および解剖学的な関心領域を統計的に比較した。固定因子としてＡＰＯＥアレル（ｅ４／４対ｅ３／３、ｒｓ４０５５０９−ｅ４／４ハプロタイプ対ｅ３／３）を、ならびに共変量として性別、年齢、教育レベル、診断および頭蓋内体積（ＩＣＶ）を使用して、共分散解析（ＡＮＣＯＶＡ）を用いて、海馬体積の違いを評価した（Ｈｉｃｋｉｅら、２００５；Ｚｉｅｒｈｕｔら、２０１３）。次に、共変量として年齢、性別、教育レベルおよび診断を使用して、異なる群（ｅ４／４対ｅ３／３、ｒｓ４０５５０９−ｅ４／４ハプロタイプ対ｅ３／３）の間の関心領域（ＲＯＩ）の違いを比較した。解析では、有意性レベルはｐ＜０．０５で考慮し、ＦＤＲ補正がｐ＜０．０５のレベルであった場合、結果を有意とみなした（Ｓｔｒｉｃｋｅｒら、２０１３；Ｙｅら、２０１６）。
【００３９】
（７）統計解析
対照およびＡＤ群の対象の割合をカイ二乗検定によって比較した。調整した（性別および年齢）解析と未調整の解析の両方について、９５％信頼区間でロジスティック回帰分析を使用して、事象に対するオッズ比を計算した（Ｂａｓａｒｉａら、２０１０）。ＳＰＳＳ（バージョン２３．０）とＲプログラム（バージョン３．３）の両方を使用して、すべての統計的検定を実施した。
【００４０】
（８）ヒト血液試料からのＡＰＯＥ遺伝子の発現
ウエスタンブロッティング
最初に、血清を全血（ＮＲＣＤから得た）から回収した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングは、若干の変更を加えて、製造者の指示書に従い実施した（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）。０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を加えたＰＢＳ中の５％脱脂粉乳で膜を１時間ブロッキングし、続いて、一次抗体とともに室温で１時間インキュベートした。一次抗体は、以下のように希釈し、使用した：１：１，０００ウサギ抗ＡＰＯＥ（Ｄ７１９Ｎ；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）；１：１，０００ウサギ抗トランスフェリン（ａｂ１０９５０３；Ａｂｃａｍ）。西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート二次抗体は１：５，０００で使用した。免疫活性はＥＺ−Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｌｕｍｉ  Ｐｌｕｓ（ＤｏＧｅｎ）で測定した。
【００４１】
（９）レポーター遺伝子アッセイ
ＡＰＯＥ遺伝子（位置１，９８３〜＋９３５）プロモーター領域を、正常対象およびＡＤ患者から得た血液細胞由来のゲノムＤＮＡから、以下のプライマーを使用して増幅した：フォワード、５’−ＧＧＧＧＴＡＣＣＧＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＴＧＡＴ３’（配列番号１）；リバース、５’−ＣＣＣＣＴＣＧＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＣＴＧＴＧＡＴＴＧＧＣ３’（配列番号２）。増幅したＤＮＡをＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで切断し、ｐＧＬ３．ベーシックベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）中にライゲーションした。以下のプライマーを使用して、ｒｓ４０５５０９（２１９Ｇ／Ｔ）のＰＣＲベースの部位特異的変異誘発を使用するＧ→ＴおよびＴ→Ｇアレル置換を実施した：Ｔ→Ｇフォワード、５’−ＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＴＣＴＧＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＡＧ−３’（配列番号３）；リバース、５’−ＣＴＣＧＣＣＣＡＧＴＡＡＴＣＣＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣ３’（配列番号４）；Ｇ→Ｔフォワード、５’−ＧＡＧＧＡＧＧＧＴＧＴＣＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＧＧＣＧＡＧＧ−３’（配列番号５）；リバース、５’−ＣＣＴＣＧＣＣＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＧＡＣＡＣＣＣＴＣＣＴＣ−３’（配列番号６）。アッセイは、ＰｆｕＵｌｔｒａ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して実施した。
【００４２】
（１０）ルシフェラーゼアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレート中で培養した。２４時間後に、ＴｒａｎｓＦｅｃｔｉｎ（商標名）脂質試薬を使用して、０．２５μｇのホタルルシフェラーゼレポーター遺伝子を有する０．２５μｇのｐＧＬ３（Ｐｒｏｍｅｇａ）と０．２５μｇのｐＣＭＶ−β−ガラクトシダーゼ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とを、この細胞に２４時間かけてコトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞をレポーター溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）で溶解した。ルシフェラーゼ活性およびβ−ガラクトシダーゼ活性を、それぞれ、ＧｌｏＭａｘ（商標名）ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＥｐｏｃｈマイクロプレート分光光度計（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して定量化した。ルシフェラーゼ活性をβ−ガラクトシダーゼ活性に対して正規化した。結果は３つの独立した実験を表す。
【００４３】
（１１）完全長ゲノム情報
完全長ゲノム情報は以下のように得た：正常対象、アルツハイマー型軽度認知機能障害を有する患者、およびアルツハイマー型認知症の患者と診断された対象の血液から単離したバフィーコートを使用して、ＱＩＡＧＥＮ  ＤＮＡミニキットを用いて、ｇＤＮＡを抽出し、次いで、これを定量化した。定量化は、ＮＤ−１０００分光光度計ならびにＱｕａｎｔ−ｉＴ  ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ｄｓＤＮＡ試薬およびキットを使用して実施した。次に、アガロース１．０％トリス−ホウ酸−ＥＤＴＡ（ＴＢＥ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲルで電気泳動を実施することによってＤＮＡの品質を検査し、次いで、ＤＮＡ品質管理を通過した試料について、マイクロアレイベースのジェノタイピングを実施した。ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘのＡｘｉｏｍ  Ｋｏｒｅａｎチップを製造者の指示書に従って使用して、各遺伝子型に関する情報を得た。マイクロアレイ化されていないＳＮＰについて、インピュテーション方法によってジェノタイピングを実施した。完全長ゲノムインピュテーションのためにＰｌｉｎｋ、ＥＩＧＥＮＳＴＲＡＴ、Ｓｈａｐｅｉｔ、ｉｍｐｕｔｅ２、ＧＴＯＯＬ、ＥＡＧＬＥＴＯＯＬ、およびｍｉｎｉｍａｃ３プログラムを使用し、リファレンスパネルとして、１０００ゲノム（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｖａｒｉａｔｉｏｎ／ｔｏｏｌｓ／１０００ｇｅｎｏｍｅｓ／）およびＭｉｃｈｉｇａｎインピュテーションサーバー（ｈｔｔｐｓ：／／ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎｓｅｒｖｅｒ．ｓｐｈ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を使用して、インピュテーションを実施した。
【００４４】
結果
ＡＰＯＥ  ｅ４／４とアルツハイマー病の関連
アルツハイマー病との関連性の点から、本発明者らは、東アジア人、コーカサス人、およびアフリカ人系統という異なる人種群においてＡＰＯＥ変異の危険性を解析した。対照およびアルツハイマー病と臨床的に診断された患者を含むすべての人種群において、対照とアルツハイマー病患者群との間で、ＡＰＯＥ遺伝子型の分布およびアレル頻度の大きな違いが示された。これらの結果は、対照よりも、アルツハイマー病群のｅ４を有する対象で顕著であった。ＡＰＯＥ  ｅ４はアルツハイマー病の重要な危険因子であるが、ｅ４媒介性の危険性の人種差は確認されていなかった。アルツハイマー病の可能性が高いと臨床的に診断された患者、および正常対照を使用した解析において、東アジア人であるｅ４／４対象は、コーカサス人と比較して非常に高いオッズ比を示した（東アジア人およびコーカサス人について、それぞれ、オッズ比：ｅ４／４＝３３．４０および１５．８６）（表１）。表１では、オッズ比は、ｅ３／３を参照してロジスティック回帰によって解析した。
【００４５】
【表１】
2020510411.tif 000003
【００４６】
ｅ４／４媒介性の危険性が人種群に依存的であること、およびこの危険性が東アジア人およびコーカサス人の順番で高かったことは非常に驚くべき結果であった。本発明の結果は、ＡＰＯＥ遺伝子型とアルツハイマー病との関連性を解析した以前の研究と矛盾がなかった（表１）。以下の表２は、臨床診断に基づくアルツハイマー病群および対照群の対象を示す。
【００４７】
【表２】
2020510411.tif 000004
【００４８】
アルツハイマー病のｅ４／４媒介性の発症における人種差を特定するために、本発明者らは、韓国人およびコーカサス人からの神経病理学的診断データセットを使用して、それらの間の関連を解析した（表３）。
【００４９】
【表３】
2020510411.tif 000005
【００５０】
両方の人種群において、アミロイド陰性群よりもアミロイド陽性群で多くのｅ４保因者が特定された（表４）。
【００５１】
【表４】
2020510411.tif 000006
【００５２】
ＡＰＯＥ遺伝子型とアミロイド蓄積との関連に関する研究では、韓国人のｅ４／４対象は、コーカサス人と比較して著しく高いオッズ比を示し（韓国人およびコーカサス人について、それぞれ、ｅ４／４に対するオッズ比＝１２５．１および２０．９２）、これは、臨床的に診断された対象からの結果と矛盾がなかった（表１および５）。これらの結果は、東アジア人のｅ４ホモ接合体は、他の人種群よりもアルツハイマー病にかかりやすいことを示唆する。
【００５３】
【表５】
2020510411.tif 000007
【００５４】
ＡＰＯＥ遺伝子周辺の多型のスクリーニング
東アジア人、コーカサス人、およびアフリカ人系統の順番である、人種的に異なるｅ４／４の危険性は、ＡＰＯＥ周辺の遺伝子多型のためであることが推定された。原因となるメカニズムを調べるために、本発明者らは、異なる人種群の間のアレル頻度と関連する、ＡＰＯＥ周辺の遺伝子の４０ｋｂ領域内のＳＮＰをスクリーニングした（図１Ａ）。４０ｋｂにわたる６３０個のインピュテーションされたＳＮＰのうち、基準、すなわち、例えば東アジア人、コーカサス人、およびアフリカ人系統の順番またはその逆の順番のアレル頻度などの基準に従って、７２個のＳＮＰを選択した。続いて、本発明者らは、ＡＰＯＥの調整なしで、アルツハイマー病との有意な関連性およびマイナーアレル頻度に従って、ＳＮＰを取り出した。その結果、３つのＳＮＰ、ｒｓ４４９６４７、ｒｓ４０５５０９、およびｒｓ４４０４４６が得られた。これらの多型は、ＡＰＯＥプロモーターおよびイントロン領域に位置した（図１Ｂ）。これらは、東アジア人、コーカサス人、およびアフリカ人系統の間で、アレル（ｒｓ４４９６４７−Ａ、ｒｓ４０５５０９−Ｔ、およびｒｓ４４０４４６−Ｇ）頻度の大きな違いを示した（図１Ｃ）。これらの中で、ｒｓ４０５５０９は、人種群の間で著しい違いを示した（１０００個のゲノムデータベースに基づいて、東アジア人、コーカサス人、およびアフリカ人系統について、それぞれ、Ｔ−アレル頻度＝０．６７、０．４８、および０．２４）。特に、東アジア人由来のｅ４ホモ接合体は、９０．４％のＴＴ−遺伝子型を有していたが、コーカサス人およびアフリカ人由来のｅ４ホモ接合体は、それぞれ６４．２％および２１．３％のＴＴ−遺伝子型を有しており、これは、ｒｓ４０５５０９のアレル頻度の違いが、異なる人種群の間のｅ４／４に関して、ＡＤ発症に対する感受性の違いをもたらし得ることを示す。ｒｓ４４９６４７およびｒｓ４４０４４６は、異なる人種群の間で異なるアレル頻度を示したが、ｅ４／４におけるそれらの頻度は、人種群の間で大きく違わなかった。
【００５５】
ｒｓ４０５５０９とアルツハイマー病との関連
ｅ３／４およびｅ４／４においてｒｓ４０５５０９のＴＴ遺伝子型がアルツハイマー病の高い危険性を与えるかどうかを調べるために、本発明者らは、ｅ３／４およびｅ４／４対象においてｒｓ４０５５０９の関連性を試験した。予想通り、ｒｓ４０５５０９−ＴＴは、ＮＲＣＤデータセット（東アジア人）由来の３／４とｅ４／４対象群の両方において著しく高いオッズ比を示し（表６）、これは、ｅ４／４の危険性の人種差を示唆する。東アジア人において高いｒｓ４０５５０９−ＴＴ頻度を有するＥ４ホモ接合体は、コーカサス人およびアフリカ人系統よりも、アルツハイマー病に対して高い感受性を示した。
【００５６】
【表６】
2020510411.tif 000008
【００５７】
さらに、ｅ３／４およびｅ４／４媒介性アルツハイマー病の危険性に対するｒｓ４０５５０９の影響を確認するために、本発明者らは、他のｒｓ４０５５０９遺伝子型背景、すなわち、ｒｓ４０５５０９−ＴＴ、ＧＴ、およびＧＧにおいて、ｅ３／４およびｅ４／４の関連性を解析した（表７）。その結果、ｅ３／４およびｅ４／４対象は、ＮＲＣＤとＡＤＮＩデータセットの両方において、ｒｓ４０５５０９−Ｇアレル背景よりもｒｓ４０５５０９−ＴＴ遺伝子型に対して高いオッズ比を示した。
【００５８】
【表７】
2020510411.tif 000009
【００５９】
ＡＰＯＥ  ｅ４／４と脳萎縮との関連
ＡＰＯＥ  ｅ４／４によって媒介される脳萎縮において人種差が示されるかどうかを確認するために、本発明者らは、東アジア人およびコーカサス人に対して、ｅ４／４とｅ３／３対象との間で、一般線形モデルによって、ポイントごとの皮質厚解析を実施した。東アジア人とコーカサス人の両方で、ｅ４／４対象は、ｅ３／３よりも薄い皮質領域を示した（図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃ）。ｅ４／４依存的収縮が生じた領域は、嗅内皮質−海馬傍回−紡錘状回（entorhinal-parahippocampal-fusiform）、楔前部、および下頭頂小葉であった（Ｐ＜０．０５）。驚くべきことに、これらの領域の皮質厚の減少は、コーカサス人と比較して、東アジア人で強く示された。共分散解析（ＡＮＣＯＶＡ）を実施して、ｅ４／４誘導性皮質萎縮の人種差を測定した。皮質萎縮が生じた領域の相対的平均皮質厚を、ｅ３／３を参照して、ｅ４／４対象について計算した。東アジア人とコーカサス人の両方で、嗅内皮質および海馬傍回皮質を含む内側側頭皮質、ならびに楔前部内の平均皮質厚に関して、ｅ４／４とｅ３／３の間で大きな違いが示された（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。さらに、東アジア人は、ｅ４／４／とｅ３／４の間でコーカサス人よりも大きな違いを示した（図２Ｂおよび２Ｃ）。東アジア人とコーカサス人の間の、ｅ４／４における相対的皮質収縮の直接比較（ｅ３／３に対して正規化）も、有意な結果を示した（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１）。さらに、本発明者らは、東アジア人およびコーカサス人において、ｅ４／４とｅ３／３対象の間で海馬体積を解析した。東アジア人とコーカサス人の両方で、海馬の萎縮は、ｅ３／３よりもｅ４／４で著しく示され、ｅ３／３と比較した場合のｅ４／４誘導性の海馬萎縮率は、コーカサス人よりも東アジア人で高かった（＊＊Ｐ＜０．０１）（図２Ｄ）。これらの結果は、東アジア人は、皮質厚の減少および海馬の収縮を含めたＡＰＯＥ  ｅ４／４媒介性脳萎縮に、よりかかりやすいことを示唆する。ｅ４／４ホモ接合体における脳萎縮に対するｒｓ４０５５０９の影響を調べるために、本発明者らは、コーカサス人対象において、ｅ３／３を参照して、ｅ４／４ならびにｒｓ４０５５０９のそれぞれの遺伝子型の組み合わせ（ｅ４／４−ＴＴ、ｅ４／４−ＧＴ、およびｅ４／４−ＧＧ）に依存した皮質厚の減少を解析した（図２Ｅ、２Ｆおよび２Ｇ）。ｒｓ４０５５０９−ＴＴを有するｅ４／４対象は、内側側頭皮質（嗅内皮質および海馬傍回皮質）ならびに楔前部内で著しいクラスターを示した（Ｐ＜０．０５）。これに反して、ｒｓ４０５５０９−Ｇアレルを有するｅ４／４対象は、そのようなクラスターを示さなかった。ＡＣＮＯＶＡを用いた定量的比較解析により、ｒ４０５５０９−ＴＴ遺伝子型を有するｅ４／４対象は、ｅ３／３対象と比較して、内側側頭皮質（Ｆ＝８．３８、Ｐ＜０．０１）および楔前部（Ｆ＝１０．７０７、Ｐ＜０．０１）内で著しい萎縮を示すことが示されたが、ｒｓ４０５５０９−ＧＧを有するｅ４／４対象は、皮質領域内で如何なる有意性も示さなかった（図２Ｆおよび２Ｇ）。本発明者らは、コーカサス人におけるｒｓ４０５５０９−ＴＴおよびｒｓ４０５５０９−ＧＧを有するｅ４／４対象において、海馬の萎縮も試験した。ｒｓ４０５５０９−ＴＴを有するｅ４／４対象の海馬の収縮は、ｅ３／３対象よりも強く示されたが、ｒｓ４０５５０９−ＧＧを有するｅ４／４対象の収縮は顕著でなかった（図２Ｈ）。これらの神経イメージングの結果は、ｒｓ４０５５０９におけるＴＴ遺伝子型が、ｅ４／４対象において、アルツハイマー病の危険性に影響を及ぼすだけでなく脳収縮にも関連することを支持する。表８は、神経イメージング解析に参加した対象を示す。
【００６０】
【表８】
2020510411.tif 000010
【００６１】
ＡＰＯＥの発現
本発明によれば、ｒｓ４０５５０９は、ｅ４ホモ接合体において、アルツハイマー病の発症および脳収縮と関連する。したがって、本発明者らは、ｒｓ４０５５０９とＡＰＯＥの調節との生物学的関連性を解析した。ｒｓ４０５５０９遺伝子型がＡＰＯＥタンパク質の発現を調節するかどうかを調べるために、本発明者らは、ｅ３／３対象のｒｓ４０５５０９−ＴＴ、ＧＴ、およびＧＧ遺伝子型のヒト血清に対してウエスタンブロッティングを実施した（図３Ａ）。ｒｓ４０５５０９−ＴＴを有する対象のＡＰＯＥタンパク質のレベルは、ｒｓ４０５５０９−ＧＧおよびＧＴを有する対象のレベルと比較して、驚くべきレベルまで低下した（図３Ａ）。これらの結果は以前の研究と矛盾がなく、これは、ＡＰＯＥのレベルの低下がアルツハイマー病の危険性の増大と関連することを示唆する。さらに、ＡＰＯＥの転写活性に対するｒｓ４０５５０９の影響を、レポーター遺伝子アッセイによって確認した。このアッセイは、ｒｓ４０５５０９−Ｔアレルを有するＡＤ患者およびｒｓ４０５５０９−Ｇを有する認知的に正常な個体に由来するＡＰＯＥプロモーター断片を使用して実施した。各プロモーター領域のｒｓ４０５５０９アレルを別のアレルに変更し、次いで、ルシフェラーゼベースのレポーター遺伝子アッセイを実施した（図３Ｃおよび３Ｄ）。ｒｓ４０５５０９位置におけるＴからＧへの一塩基多型は、ＡＰＯＥプロモーター活性の驚くべき増大をもたらした（対照と比較して１６０％）が、ＧからＴへの置換は、プロモーター活性の劇的な低下をもたらした（対照と比較して６６％）。これは、ｒｓ４０５５０９−Ｔアレルが、Ｇアレルと比較してＡＰＯＥの転写を低下させることを示唆する。これらの結果は、ｒｓ４０５５０９が、ＡＰＯＥタンパク質のレベルを調節することによってｅ４／４の影響を調節することを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【００６２】
本発明は、血液または生物試料から採取したゲノムＤＮＡにおいて、ＡＰＯＥ遺伝子型およびＡＰＯＥプロモーター中のｒｓ４０５５０９の遺伝的変異を解析することにより、認知症の危険性に対するより正確な予測を可能にする方法を提供する。本発明は、複雑な臨床的および病理学的情報、例えばＭＲＩ脳画像、神経心理学的検査、脳脊髄液（ＣＳＦ）検査、およびアミロイドＰＥＴ検査とともに、認知症に関するビッグデータに基づいて、将来の診断技術に寄与することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年8月30日(2019.8.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象から単離された核酸を含む試料において軽度認知機能障害またはアルツハイマー病（ＡＤ）を示す遺伝的変異を検出するための方法であって、
（ａ）ＡＰＯＥ  Ｅ４アレルをコードする遺伝子から選択される遺伝子またはそれらの遺伝子産物中の遺伝的変異の有無を検出することができる試薬と前記試料を接触させる工程と、
（ｂ）ＡＰＯＥプロモーターのｒｓ４０５５０９  Ｔアレルをコードする遺伝子またはそれらの遺伝子産物から選択される遺伝的変異の有無を検出することができる試薬と前記試料を接触させる工程と
を含み、
ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４およびｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ遺伝的変異の存在が、前記対象が軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病を有する患者であること、または軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病の危険性を有することを示す、方法。
【請求項２】
ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４およびｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ遺伝的変異の有無を検出する方法が、前記対象から単離された前記試料から一本鎖形態の核酸を得、前記核酸を相補的プライマーセットと複合体を形成させ、次いで、前記複合体中の前記遺伝的変異の有無を解析することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複合体中の前記ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４およびｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ遺伝的変異の有無を解析することが、ポリメラーゼ連鎖反応、ヌクレアーゼ消化、ハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、制限酵素断片多型分析、シークエンシング、プライマー伸長法もしくは一本鎖高次構造多型分析を使用して、またはそれらの組み合わせを使用して解析を実施することを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸を増幅する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸がゲノムＤＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸がＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記対象の大脳皮質厚の画像を得る工程
をさらに含み、
前記大脳皮質厚の萎縮が、前記対象が軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病を有する患者であること、または軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病の危険性を有することを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
大脳皮質厚の前記画像がＭＲ脳画像である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
神経心理学的検査、脳脊髄液（ＣＳＦ）検査、およびアミロイドＰＥＴ検査からなる検査の１つ以上を実施する工程
をさらに含む、請求項１、７および８の何れか１項に記載の方法。
【請求項１０】
軽度認知機能障害またはアルツハイマー病を診断または予測するためのキットであって、ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４遺伝的変異の有無を、ＡＰＯＥ  Ｅ４アレルをコードする遺伝子から選択される遺伝子またはそれらの遺伝子産物において検出し、ＡＰＯＥプロモーターのｒｓ４０５５０９  Ｔアレルをコードする遺伝子またはそれらの遺伝子産物から選択されるｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ遺伝的変異の有無をさらに検出する、キット。
【請求項１１】
前記ＡＰＯＥ  Ｅ４アレルおよび前記ＡＰＯＥプロモーターの前記ｒｓ４０５５０９  Ｔアレルに相補的なプライマーセット、ならびに
反応酵素
を含む、請求項１０に記載のキット。
【請求項１２】
前記遺伝的変異を解析するための解析方法が含まれる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１３】
核酸を増幅するための方法が含まれる、請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
参照対照が含まれる、請求項１０に記載のキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
本発明は、血液または生物試料から採取したゲノムＤＮＡにおいて、ＡＰＯＥ遺伝子型およびＡＰＯＥプロモーター中のｒｓ４０５５０９の遺伝的変異を解析することにより、認知症の危険性に対するより正確な予測を可能にする方法を提供する。本発明は、複雑な臨床的および病理学的情報、例えばＭＲＩ脳画像、神経心理学的検査、脳脊髄液（ＣＳＦ）検査、およびアミロイドＰＥＴ検査とともに、認知症に関するビッグデータに基づいて、将来の診断技術に寄与することができる。
以下に、出願当初の特許請求の範囲に記載された発明を付記する。
［１］  対象から単離された核酸を含む試料において軽度認知機能障害またはアルツハイマー病（ＡＤ）を示す遺伝的変異を検出することによって、軽度認知機能障害またはアルツハイマー病の診断をするかまたは危険性を予測するための方法であって、
（ａ）ＡＰＯＥ  Ｅ４アレルをコードする遺伝子から選択される遺伝子またはそれらの遺伝子産物中の遺伝的変異の有無を検出することができる試薬と前記試料を接触させる工程と、
（ｂ）ＡＰＯＥプロモーターのｒｓ４０５５０９  Ｔアレルをコードする遺伝子またはそれらの遺伝子産物から選択される遺伝的変異の有無を検出することができる試薬と前記試料を接触させる工程と
を含み、
ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４およびｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ遺伝的変異の存在が、前記対象が軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病を有する患者であること、または軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病の危険性を有することを示す、方法。
［２］  ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４およびｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ遺伝的変異の有無を検出する方法が、前記対象から単離された前記試料から一本鎖形態の核酸を得、前記核酸を相補的プライマーセットと複合体を形成させ、次いで、前記複合体中の前記遺伝的変異の有無を解析することを含む、［１］に記載の方法。
［３］  前記複合体中の前記ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４およびｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ遺伝的変異の有無を解析することが、ポリメラーゼ連鎖反応、ヌクレアーゼ消化、ハイブリダイゼーション、サザンブロッティング、制限酵素断片多型分析、シークエンシング、プライマー伸長法もしくは一本鎖高次構造多型分析を使用して、またはそれらの組み合わせを使用して解析を実施することを含む、［２］に記載の方法。
［４］  前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸を増幅する、［１］に記載の方法。
［５］  前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸がゲノムＤＮＡである、［１］に記載の方法。
［６］  前記対象から単離された前記試料から得られた前記核酸がＲＮＡである、［１］に記載の方法。
［７］  前記対象の大脳皮質厚の画像を得る工程
をさらに含み、
前記大脳皮質厚の萎縮が、前記対象が軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病を有する患者であること、または軽度認知機能障害もしくはアルツハイマー病の危険性を有することを示す、［１］に記載の方法。
［８］  大脳皮質厚の前記画像がＭＲ脳画像である、［７］に記載の方法。
［９］  神経心理学的検査、脳脊髄液（ＣＳＦ）検査、およびアミロイドＰＥＴ検査からなる検査の１つ以上を実施する工程
をさらに含む、［１］、［７］および［８］の何れか１に記載の方法。
［１０］  軽度認知機能障害またはアルツハイマー病を診断または予測するためのキットであって、ＡＰＯＥ  Ｅ４／Ｅ４遺伝的変異の有無を、ＡＰＯＥ  Ｅ４アレルをコードする遺伝子から選択される遺伝子またはそれらの遺伝子産物において検出し、ＡＰＯＥプロモーターのｒｓ４０５５０９  Ｔアレルをコードする遺伝子またはそれらの遺伝子産物から選択されるｒｓ４０５５０９  Ｔ／Ｔ遺伝的変異の有無をさらに検出する、キット。
［１１］  前記ＡＰＯＥ  Ｅ４アレルおよび前記ＡＰＯＥプロモーターの前記ｒｓ４０５５０９  Ｔアレルに相補的なプライマーセット、ならびに
反応酵素
を含む、［１０］に記載のキット。
［１２］  前記遺伝的変異を解析するための解析方法が含まれる、［１０］に記載のキット。
［１３］  核酸を増幅するための方法が含まれる、［１０］に記載のキット。
［１４］  参照対照が含まれる、［１０］に記載のキット。
【国際調査報告】
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2020510411.tif 000017
2020510411.tif 000018
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