(57)【要約】  本発明は、目的とするタンパク質を植物において発現させるためのポテックスウイルスベクターを作製する方法であって、前記タンパク質をコードする第２のＯＲＦを含み、かつ、前記タンパク質を第１の異種核酸においてコードする第１のＯＲＦと比較して、増大したＧＣ含量を前記第２のＯＲＦにおいて有する第２の異種核酸配列を作製する工程、及び、以下のセグメント、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列セグメントと、（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列又はコードする核酸配列と、（ｉｉｉ）前記第２の異種核酸配列、又は前記第２のＯＲＦを含むその一部分とを含む前記ポテックスウイルスベクターを提供する工程を含む方法を提供する。
2020533989.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、目的とするタンパク質を植物において発現させるためのポテックスウイルスベクターを作製する方法
前記目的とするタンパク質をコードする第２のＯＲＦを含み、かつ、前記タンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦと比較して、増大したＧＣ含量を前記第２のＯＲＦにおいて有する第２の異種核酸配列を作製する工程、及び
以下のセグメントを含む前記ポテックスウイルスベクターを提供する工程、
（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列、  （ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列又はコードする核酸配列、
（ｉｉｉ）前記第２の異種核酸配列、又は前記第２のＯＲＦを含むその一部分。
【請求項２】
下記を含む、植物において発現させられる目的とするタンパク質をコードするポテックスウイルスレプリコンの前記植物における遠距離移行のための能力を改善する方法
前記目的とするタンパク質をコードする第２のＯＲＦを含み、かつ、前記目的とするタンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦと比較して、増大したＧＣ含量を前記第２のＯＲＦにおいて有する第２の異種核酸配列を作製する工程、及び
前記ポテックスウイルスレプリコン、あるいは前記ポテックスウイルスレプリコンを含むポテックスウイルベクター又はコードするポテックスウイルベクターを提供する工程であって、前記ポテックスウイルスレプリコンが、以下のセグメントを含む工程：
（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列  、
（ｉｉ）（ｉｉ−ａ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロック、及び（ｉｉ−ｂ）ポテックスウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列、又はトバモウイルス移行タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸配列、
（ｉｉｉ）前記第２のＯＲＦ、前記第２の異種核酸配列又は前記第２のＯＲＦを含むその一部分。
【請求項３】
下記を含む、植物において発現させられる目的とするタンパク質をコードするポテックスウイルスレプリコンの前記植物における遠距離移行のための能力を改善する方法
前記目的とするタンパク質をコードする第２のＯＲＦを含み、かつ、前記タンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦと比較して、増大したＧＣ含量を前記第２のＯＲＦにおいて有する第２の異種核酸配列を作製する工程、及び
前記ポテックスウイルスレプリコン、あるいは前記ポテックスウイルスレプリコンを含むポテックスウイルベクター又はコードするポテックスウイルベクターを提供する工程であって、前記ポテックスウイルスレプリコンが、以下のセグメントを含む、工程：
（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列、
（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列、
（ｉｉｉ）前記第２の異種核酸配列又は前記第２のＯＲＦを含むその一部分。
【請求項４】
下記を含む、植物において発現させられる目的とするタンパク質をコードするポテックスウイルスレプリコンの前記植物における遠距離移行のための能力を改善する方法
前記目的とするタンパク質をコードする第２のＯＲＦを含み、かつ、前記目的とするタンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦと比較して、増大したＧＣ含量を前記第２のＯＲＦにおいて有する第２の異種核酸配列を作製する工程、及び
前記ポテックスウイルスレプリコン、あるいは前記ポテックスウイルスレプリコンを含むポテックスウイルベクター又はコードするポテックスウイルベクターを提供する工程であって、前記ポテックスウイルスレプリコンが、以下のセグメントを含む、工程：
（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列、
（ｉｉ）（ｉｉ−ａ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロック、及び（ｉｉ−ｂ）ポテックスウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列、又はトバモウイルス移行タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸配列、
（ｉｉｉ）前記第２のＯＲＦ、前記第２の異種核酸配列又は前記第２のＯＲＦを含むその一部分。
【請求項５】
ポテックスウイルスベクター又はポテックスウイルスレプリコンを提供する工程が、第２の異種核酸配列、又は第２のＯＲＦを含むその一部分を、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列、及び（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックをコードする核酸配列とを含む核酸に挿入して、前記ポテックスウイルスベクター、あるいは前記第２の異種核酸配列、又は前記第２のＯＲＦを含むその一部分を含む前記ポテックスウイルスレプリコンを作製する工程を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
目的とするタンパク質を植物又は植物組織において発現させるための達成方法であって、請求項１又は２に記載の方法に従うポテックスウイルスベクターを作製する工程、及び作製されたポテックスウイルスベクターを前記植物の少なくとも一部に与える工程を含む、達成方法。
【請求項７】
植物が、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）の種（例えば、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）及びタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）など）、トマト、ジャガイモ、コショウ、ナス、ダイズ、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラシカカンペストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、クレス（ｃｒｅｓｓ）、ルッコラ、カラシ、イチゴ、ホウレンソウ、ケノポジウムカピタツム（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、アルファルファ、レタス、ヒマワリ、ジャガイモ、キュウリ、トウモロコシ、コムギ及びイネから選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法又は達成方法。
【請求項８】
（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列又はコードする核酸配列がさらに、ポテックスウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列、又はトバモウイルス移行タンパク質をコードする核酸配列を含む、請求項１、３、５、６又は７に記載の方法又は達成方法。
【請求項９】
以下を含む、植物において発現させられる目的とするタンパク質をコードするポテックスウイルスレプリコンの前記植物における遠距離移行のための能力を改善する方法
前記タンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦのＧＣ含量を増大させ、それにより、前記タンパク質をコードし、かつ、増大したＧＣ含量を有する第２のＯＲＦを含む第２の異種核酸配列を得る工程、及び
前記第２の異種核酸配列、又は前記第２のＯＲＦを含有するその一部分を、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列、及び（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列又はコードする核酸配列とを含む核酸に挿入して、前記ウイルスレプリコンを含むポテックスウイルスベクター又はコードするポテックスウイルスベクターを作製する工程、前記ポテックスウイルスベクターは前記第２の異種核酸配列、又は前記第２のＯＲＦを含むその一部分を含む。
【請求項１０】
目的とするタンパク質が植物ウイルスタンパク質でない、又は目的とするタンパク質が、植物ウイルスに対して異種であるタンパク質である、請求項１又は２に記載の方法によって得られる、又は得ることができるポテックスウイルスベクター、所望により請求項５又は８においてさらに定義される方法によって得られる、又は得ることができるものである。
【請求項１１】
以下のセグメントを含む異種核酸配列とを含む核酸：
（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列、
（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列又はコードする核酸配列、
（ｉｉｉ）目的とするタンパク質をコードするＯＲＦ、
前記ＯＲＦが、少なくとも２００個、最大でも４００個のヌクレオチドからなり、かつ少なくとも５０％のＧＣ含量を有し、又は
前記ＯＲＦが、少なくとも４０１個、最大でも８００個のヌクレオチドからなり、かつ少なくとも５５％のＧＣ含量を有し、及び／又は
前記ＯＲＦが、少なくとも８０１個のヌクレオチドからなり、かつ少なくとも５８％のＧＣ含量を有し、
前記目的とするタンパク質が植物ウイルスタンパク質でない、又は前記目的とするタンパク質が、植物ウイルスに対して異種であるタンパク質である。
【請求項１２】
以下のセグメントを含む核酸：（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列、（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列又はコードする核酸配列、及び（ｉｉｉ）目的とするタンパク質をコードするＯＲＦを含む異種核酸配列、
前記ＯＲＦが、少なくとも１００個、最大でも５００個のヌクレオチドからなり、かつ少なくとも５０％のＧＣ含量を有し、又は
前記ＯＲＦが、少なくとも５０１個、最大でも１０００個のヌクレオチドからなり、かつ少なくとも５５％のＧＣ含量を有し、及び／又は
前記ＯＲＦが、少なくとも１００１個のヌクレオチドからなり、かつ少なくとも５８％のＧＣ含量を有し、
前記目的とするタンパク質が植物ウイルスタンパク質でない、又は前記目的とするタンパク質が、植物ウイルスに対して異種であるタンパク質である。
【請求項１３】
好ましくは（ｉｉ）の核酸配列に、ポテックスウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列、又はトバモウイルス移行タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１１又は１２に記載の核酸。
【請求項１４】
第１の核酸と第２の核酸とを含み、前記第１の核酸は請求項１１、１２又は１３で定義されるセグメント（ｉ）及びセグメント（ｉｉ）を含み、前記第２の核酸は請求項１１又は１２で定義されるセグメント（ｉｉｉ）を含む、組合せ又はキット。
【請求項１５】
第１の核酸がセグメント（ｉｉ）の下流側において部位特異的リコンビナーゼによって認識可能である第１の部位特異的組換え部位を有し、
第２の核酸がセグメント（ｉｉｉ）の上流側において前記部位特異的リコンビナーゼによって認識可能である第２の部位特異的組換え部位を有し、前記第１の部位特異的組換え部位と前記第２の部位特異的組換え部位との間での部位特異的組換え及び請求項１１、１２もしくは１３に記載の核酸又は請求項１０に記載のポテックスウイルスベクターの形成を可能にする、請求項１４に記載の組合せ又はキット。
【請求項１６】
目的とする核酸配列を植物又は植物組織において発現させる達成方法であって、前記植物又は植物組織に、請求項１１もしくは１２に記載の核酸、請求項１０に記載のポテックスウイルスベクター、又は請求項１４もしくは１５に記載の核酸の組合せもしくはキットを与える工程を含む、達成方法。
【請求項１７】
請求項１１もしくは１２において定義される核酸、請求項１０に記載のポテックスウイルスベクター、又は請求項１４もしくは１５に記載の核酸の組合せもしくキットの使用であって、異種核酸によってコードされるタンパク質を発現させるための、及び植物におけるポテックスウイルスベクターの改善された遠距離移行を達成するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的とするタンパク質を植物において発現させるためのポテックスウイルスベクターを作製する方法に関する。本発明はまた、ポテックスウイルスレプリコンの植物における遠距離移行のための能力を改善する方法に関する。本発明はまた、ポテックスウイルスレプリコンの安定性を改善する方法に関する。本発明はまた、目的とするタンパク質を植物又は植物組織において発現を達成するための達成方法（プロセス、process）を提供する。さらに、本発明の方法及び達成するための達成方法のための核酸が提供される。
【背景技術】
【０００２】
植物における異種タンパク質の高収量発現を、ウイルスベクターを使用して達成することができる。様々なウイルスベクター系が主として、植物宿主への感染の後における一過性発現のために（Ｄｏｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８８：７２０４−７２０８；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｋａｖａｎａｇｈ＆Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２：５４９−５５７）、又は植物宿主へのトランスフェクションの後における一過性発現のために開発された（Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：７１８−７２３；Ｓａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０３：８６１−８６６；国際公開第２００５／０４９８３９号パンフレット）。最も良く確立された商業的に実行可能な系はプラスセンス一本鎖のＲＮＡウイルスに基づいており、好ましくはタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）由来のベクターに基づいている。ポテックスウイルス（例えば、ＰＶＸ（ジャガイモウイルスＸ）など）に由来する別の一群のＲＮＡウイルス型ベクターもまた、高収量の組換えタンパク質をもたらすことができる（Ｃｈａｐｍａｎ，Ｋａｖａｎａｇｈ＆Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，１９９２，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，２：５４９−５５７；Ｂａｕｌｃｏｍｂｅ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，１９９５，Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，７：１０４５−１０５３；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７２（４）：７５６−７６２；Ｚｅｌａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ，８６：２６３−２６７）。同様に、ポテックスウイルスも、プラスセンス一本鎖ゲノムを有する植物ＲＮＡウイルスである。
【０００３】
第一世代の全身性ウイルスベクターでは、大部分の植物資源が、ウイルスレプリコンの全身移行のために必要であるウイルスコートタンパク質を産生させるために無駄になっていた。ＴＭＶ由来のベクターについては、この問題が、コートタンパク質遺伝子を除くことによって、また、アグロ浸潤をレプリコンの効率的な全身送達のために使用することによって解決されたため、目的とする組換えタンパク質の収量が大幅に増大した（国際公開第２００５／０４９８３９号パンフレット；Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２３：７１８−７２３）。しかしながら、ＴＭＶ由来のレプリコンの場合とは異なり、ポテックスウイルス由来のレプリコンについては、ウイルスコートタンパク質が全身移行のためだけではなく、短距離（細胞間）移行のためにもまた好まれる。Ａｖｅｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００７），Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１６：５８７−５９７には、ＰＶＸ発現ベクターの安定性がインサートサイズに関連づけられることが記載される。国際公開第２００８／０２８６６１号パンフレットには、ポテックスウイルスベクターから植物又は植物組織において発現される目的とするタンパク質の発現収率を、請求項１の項目（ｉｉ）で定義される配列が項目（ｉ）のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼコード配列（ＲｄＲｐ又はＲｄＲＰ）の後に（５から３’への方向で下流側に）配置され、かつ、項目（ｉｉｉ）の前記異種核酸の前に位置するベクター設計によって増大させるための達成方法が記載される。ポテックスウイルスベクターのこの特別な場合において、このベクター設計はＲＮＡレプリコンの細胞間移行能をもたらしており、かつ、同時に、異種核酸がポテックスウイルスコートタンパク質遺伝子の上流側に置かれたポテックスウイルスベクターと比較して異種核酸のより高い発現レベルをもたらしている。
【０００４】
外来遺伝子を植物において発現させるために使用されるウイルスベクターは典型的には、発現させられる外来タンパク質をコードするＯＲＦとは別に、ベクターが、例えば、植物における細胞間移行及び／又は遠距離移行などによって植物組織又は植物全体において複製し、伝播することを可能にする残りのウイルスＯＲＦを含有する。目的とする配列を植物において発現させるとき、複製され、伝播したウイルスベクターは、発現させられる目的とする核酸配列を変化させないように安定であることが望まれる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、発現させられるＯＲＦを含有するポテックスウイルスレプリコンをコードするベクターを伝えるアグロバクテリア懸濁物を浸潤させた若齢植物の低い位置の葉のとき、様々な植物器官に伝播し、しかし、時には不安定であり、目的とする核酸配列を時間とともに失うことを観察している。他方で、異種核酸配列を含有するいくつかのポテックスウイルスベクター、例えば、ＡｔＦＴ又はｓＧＦＰをコードするポテックスウイルスベクターなどは異常なほどに安定である。
【０００６】
したがって、目的とする異種核酸又は異種タンパク質を発現させるためのポテックスウイルスベクターであって、特に植物における該ベクターの遠距離移行において安定であるポテックスウイルスベクターを提供することが、本発明の目的である。
【０００７】
本発明者らはこの問題を詳細に検討して、解決策を見出した。それによれば、本発明は下記の（１）〜（１８）に記載される発明を提供する。
（１）目的とするタンパク質を植物において発現させるためのポテックスウイルスベクターを作製する方法であって、
前記目的とするタンパク質をコードする第２のＯＲＦを含み、かつ、前記目的とするタンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦと比較して、増大したＧＣ含量を前記第２のＯＲＦにおいて有する第２の異種核酸配列を作製する工程、及び
以下のセグメント、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列又はコードする核酸配列と、（ｉｉｉ）前記第２の異種核酸配列、又は前記第２のＯＲＦを含むその一部分とを含む前記ポテックスウイルスベクターを提供する工程（ただし、前記一部分は前記第２のＯＲＦからなる場合がある）
を含む方法。
【０００８】
（２）目的とするタンパク質を植物において発現させるためのポテックスウイルスベクターを作製する方法であって、
前記目的とするタンパク質をコードする第２のＯＲＦを含み、かつ、前記目的とするタンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦと比較して、増大したＧＣ含量を前記第２のＯＲＦにおいて有する第２の異種核酸配列を作製する工程、及び
以下のセグメント、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列又はコードする核酸配列と、（ｉｉｉ）前記第２のＯＲＦとを含む前記ポテックスウイルスベクターを提供する工程
を含む方法。
【０００９】
（３）植物において発現させられる目的とするタンパク質をコードするポテックスウイルスレプリコンの前記植物における遠距離移行のための能力を改善する方法であって、
前記目的とするタンパク質をコードする第２のＯＲＦを含み、かつ、前記目的とするタンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦと比較して、増大したＧＣ含量を第２のＯＲＦにおいて有する第２の異種核酸配列を作製する工程、及び
前記ポテックスウイルスレプリコン、あるいは前記ポテックスウイルスレプリコンを含むポテックスウイルベクター又はコードするポテックスウイルベクターを提供する工程であって、前記ポテックスウイルスレプリコンが、以下のセグメント、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列と、（ｉｉｉ）前記第２の異種核酸配列、又は前記第２のＯＲＦを含むその一部分とを含む、工程（ただし、前記一部分は前記第２のＯＲＦからなる場合がある）
を含む方法。
【００１０】
（４）植物において発現させられる目的とするタンパク質をコードするポテックスウイルスレプリコンの前記植物における遠距離移行のための能力を改善する方法であって、
前記目的とするタンパク質をコードする第２のＯＲＦを含み、かつ、前記タンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦと比較して、増大したＧＣ含量を第２のＯＲＦにおいて有する第２の異種核酸配列を作製する工程、及び
前記ポテックスウイルスレプリコン、あるいは前記ポテックスウイルスレプリコンを含むポテックスウイルベクター又はコードするポテックスウイルベクターを提供する工程であって、前記ポテックスウイルスレプリコンが、以下のセグメント、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列と、（ｉｉｉ）前記第２のＯＲＦとを含む、工程
を含む方法。
【００１１】
（５）ポテックスウイルスベクター又はポテックスウイルスレプリコンを提供する工程が、第２の異種核酸配列、又は第２のＯＲＦを含むその一部分を、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックをコードする核酸配列とを含む核酸に挿入して、前記ポテックスウイルスベクター、あるいは前記第２の異種核酸配列、又は前記第２のＯＲＦを含むその一部分を含む前記ポテックスウイルスレプリコンを作製する工程を含む、（１）、（２）、（３）又は（４）のいずれか１つに記載の方法。
【００１２】
（６）目的とするタンパク質を植物又は植物組織において発現させるための達成方法であって、（１）もしくは（２）に記載の方法に従う、又は（５）においてさらに定義されるポテックスウイルスベクターを作製する工程、及び前記作製されたポテックスウイルスベクターを前記植物の少なくとも一部に与える工程を含む、達成方法。
【００１３】
（７）植物が、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）の種（例えば、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）及びタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、トマト、ジャガイモ、コショウ、ナス、ダイズ、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラシカカンペストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、クレス（ｃｒｅｓｓ）、ルッコラ、カラシ、イチゴ、ホウレンソウ、ケノポジウムカピタツム（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、アルファルファ、レタス、ヒマワリ、ジャガイモ、キュウリ、トウモロコシ、コムギ及びイネから選択される、（１）〜（６）のいずれか１つに記載の方法又は達成方法。
【００１４】
（８）（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列又はコードする核酸配列がさらに、ポテックスウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列、又はトバモウイルス移行タンパク質をコードする核酸配列を含む、（１）〜（７）のいずれか１つに記載の方法又は達成方法。
【００１５】
（９）植物において発現させられる目的とするタンパク質をコードするポテックスウイルスレプリコンの前記植物における遠距離移行のための能力を改善する方法であって、
前記タンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦのＧＣ含量を増大させ、それにより、前記タンパク質をコードし、かつ、増大したＧＣ含量を有する第２のＯＲＦを含む第２の異種核酸配列を得る工程、及び
前記第２の異種核酸配列、又は前記第２のＯＲＦを含有するその一部分を、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列又はコードする核酸配列とを含む核酸に挿入して、前記ウイルスレプリコンを含むポテックスウイルスベクター又はコードするポテックスウイルスベクターを作製する工程であって、前記ポテックスウイルスベクターが前記第２の異種核酸配列、又は前記第２のＯＲＦを含むその一部分を含む、工程
を含む方法。
【００１６】
（１０）（１）又は（２）に記載の方法、必要な場合には（５）及び／又は（８）においてさらに定義される方法によって得られる、又は得ることができるポテックスウイルスベクター。
【００１７】
（１１）以下のセグメント、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列又はコードする核酸配列と、（ｉｉｉ）目的とするタンパク質をコードするＯＲＦを含む異種核酸配列とを含む核酸であって、
前記ＯＲＦが、少なくとも２００個、最大でも４００個のヌクレオチドからなり、かつ、少なくとも５０％のＧＣ含量を有する；又は
前記ＯＲＦが、少なくとも４０１個、最大でも８００個のヌクレオチドからなり、かつ、少なくとも５５％のＧＣ含量を有する；及び／又は
前記ＯＲＦが、少なくとも８０１個のヌクレオチドからなり、かつ、少なくとも５８％のＧＣ含量を有する、核酸。
【００１８】
（１２）以下のセグメント、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列又はコードする核酸配列と、（ｉｉｉ）目的とするタンパク質をコードするＯＲＦを含む異種核酸配列とを含む核酸であって、
前記ＯＲＦが、少なくとも１００個、最大でも５００個のヌクレオチドからなり、かつ、少なくとも５０％のＧＣ含量を有する；又は
前記ＯＲＦが、少なくとも５０１個、最大でも１０００個のヌクレオチドからなり、かつ、少なくとも５５％のＧＣ含量を有する；及び／又は
前記ＯＲＦが、少なくとも１００１個のヌクレオチドからなり、かつ、少なくとも５８％のＧＣ含量を有する、核酸。
【００１９】
（１３）ポテックスウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列、又はトバモウイルス移行タンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、（１１）又は（１２）に記載の核酸。
【００２０】
（１４）目的とするタンパク質が植物ウイルスタンパク質でない、又は植物ウイルスに対して異種であるタンパク質である、好ましくは前記目的とするタンパク質がポテックスウイルスコートタンパク質又はトバモウイルス移行タンパク質でない、（１１）〜（１３）のいずれか１つに記載の核酸。
【００２１】
（１５）第１の核酸と、第２の核酸とを含み、前記第１の核酸が、（１１）、（１２）又は（１３）において定義されるセグメント（ｉ）及びセグメント（ｉｉ）を含み、前記第２の核酸が、（１１）、（１２）又は（１４）において定義されるセグメント（ｉｉｉ）を含む、組合せ又はキット。
【００２２】
（１６）第１の核酸がセグメント（ｉｉ）の下流側において、部位特異的リコンビナーゼによって認識可能である第１の部位特異的組換え部位を有し、第２の核酸がセグメント（ｉｉｉ）の上流側において、前記部位特異的リコンビナーゼによって認識可能である第２の部位特異的組換え部位を、前記第１の部位特異的組換え部位と、前記第２の部位特異的組換え部位との間での部位特異的組換えと、（１１）、（１２）、（１３）もしくは（１４）に記載の核酸、又は（１０）に記載のポテックスウイルスベクターの形成とを可能にするために有する、（１５）に記載の組合せ又はキット。
【００２３】
（１７）目的とする異種核酸配列を植物又は植物組織において発現させるための達成方法であって、前記目的する異種核酸配列を発現させるために前記植物又は植物組織に、（１１）もしくは（１２）に記載の核酸、（１０）に記載のポテックスウイルスベクター、又は（１５）もしくは（１６）に記載の核酸の組合せもしくはキットを与える工程を含む、達成方法。
【００２４】
（１８）（１１）〜（１４）において定義される異種核酸、（１０）に記載のポテックスウイルスベクター、又は（１５）もしくは（１６）に記載の組合せもしくキットの使用であって、前記異種核酸によってコードされるタンパク質を発現させるための、及び、植物におけるポテックスウイルスベクターの改善された遠距離移行を達成するための使用。
【００２５】
本発明者らは驚くべきことに、異種核酸のＧＣ含量、特に目的とするタンパク質をコードするＯＲＦのＧＣ含量を増大させれば、目的とするタンパク質をコードする異種核酸を植物又は植物組織における発現のために運ぶポテックスウイルスレプリコンが植物における遠距離移行のための改善された能力を有し、かつ／又は当該植物におけるレプリコン安定性が改善されることを見出している。それにより、目的とするタンパク質の植物又は植物組織における発現収量が改善され、目的とするタンパク質を精製するためのコストが削減される。１つの実施形態において、目的とするタンパク質により、植物には農業形質が与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）に基づくエントリーベクターで、目的とするインサートをクローニングするためのｐＮＭＤ４３００及びｐＮＭＤ６７０を図式的に示す。これらのベクターのヌクレオチド配列が配列番号２４及び配列番号２３としてそれぞれ示される。  ＲＢ及びＬＢはバイナリーベクターのＴ−ＤＮＡの右境界領域及び左境界領域を示している。Ｐ３５Ｓ：カリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーター；ＰＶＸ−ｐｏｌ：ＰＶＸ由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ；ＣＰ：コートタンパク質ＯＲＦ；２５Ｋ、１２Ｋ及び８Ｋは一緒に、ＰＶＸ由来の２５ｋＤａ三重遺伝子ブロックモジュール、１２ｋＤａ三重遺伝子ブロックモジュール及び８ｋＤａ三重遺伝子ブロックモジュールを示している；Ｎ：ＰＶＸ由来の３’非翻訳領域。ＩＮＳＥＲＴは、目的とするＤＮＡインサートを表す；ＢｓａＩは、対応するヌクレオチド突出端が下記で示されるＢｓａＩ制限部位を表す。ｖｉｒＧＮ５４Ｄは、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＬＢＡ４４０４株に由来するＮ５４Ｄ変異を有するｖｉｒＧ遺伝子である。
【図２】ＰＶＸウイルスベクターにおける外来インサート安定性のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。  ３６日齢のトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）「Ｂａｌｃｏｎｙ  Ｒｅｄ」植物を、ＰＶＸベクターを伝えるアグロバクテリウム培養物のシリンジ浸潤によるトランスフェクションに供した。浸潤を２枚の子葉に行った。総ＲＮＡを、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ植物キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して浸潤後２６日のＰＶＸ感染植物の全身の葉から単離した。ＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ試薬キット（Ｔａｋａｒａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡを、ＰＶＸ（上段パネル）、又はＲＮＡ負荷コントロールとして使用されるタバコの伸長因子ＥＦ１α（下段パネル）のいずれかについて特異的なオリゴを用いたＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。予想されたサイズのＰＣＲフラグメントが矢印により示される。存在が確認できない予想されたＰＣＲ産物のゲル上での位置が破線により示される。  ＲＴ−ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分離した。ＭＷＬ：分子量ラダー；ＧＦＰ：ＧＦＰ挿入物を伝えるＰＶＸベクターを感染させた植物についてのＲＴ−ＰＣＲ産物；ＧＵＳ、ＡｔＦＴ、ＣａＤＲＥＢ、ＳｌＳＵＮ、ＳｌＬＯＧ１、ＳｌＤＲＥＢ１、ＳｌＧＲ、ＳｌＯＶＡＴＥ、ＳｌＷＯＯＬＬＹ：ＧＵＳ遺伝子、ＡｔＦＴ遺伝子、ＣａＤＲＥＢ遺伝子、ＳｌＳＵＮ遺伝子、ＳｌＬＯＧ１遺伝子、ＳｌＤＲＥＢ１遺伝子、ＳｌＧＲ遺伝子、ＳｌＯＶＡＴＥ遺伝子、ＳｌＷＯＯＬＬＹ遺伝子の挿入を有するＰＶＸベクターをそれぞれ感染させた植物についてのＲＴ−ＰＣＲ産物；Ｖ：外来挿入のない空のＰＶＸエントリーベクターを感染させた植物。予想ＰＣＲフラグメントのサイズが括弧内に示される。
【図３】インサートの長さと安定性との関係を示す。全長インサートが検出された浸潤後の最後の日（Ｙ軸）を、対応する外来インサートの長さ（Ｘ軸）に対してプロットした。分析のために、ＧＦＰ、ＧＵＳ、ＡｔＦＴ、ＣａＤＲＥＢ、ＳｌＳＵＮ、ＳｌＬＯＧ１、ＳｌＤＲＥＢ１、ＳｌＧＲ、ＳｌＯＶＡＴＥ及びＳｌＷＯＯＬＬＹの各インサートについての値（表１）を使用した。
【図４】インサートのＧＣ含量と安定性との関係を示す。全長インサートが検出された浸潤後の最後の日（Ｙ軸）を、対応する外来インサートのＧＣ含量（％）（Ｘ軸）に対してプロットした。分析のために、ＧＦＰ、ＧＵＳ、ＡｔＦＴ、ＣａＤＲＥＢ、ＳｌＳＵＮ、ＳｌＬＯＧ１、ＳｌＤＲＥＢ１、ＳｌＧＲ、ＳｌＯＶＡＴＥ及びＳｌＷＯＯＬＬＹの各インサートについての値（表１）を使用した。インサートのＧＣ含量を、ＥＮＤＭＥＭＯオンラインＤＮＡ／ＲＮＡ  ＧＣ含量計算機（ｗｗｗ．ｅｎｄｍｅｍｏ．ｃｏｍ／ｂｉｏ／ｇｃ．ｐｈｐ）を使用して求めた。
【図５】インサートのＧＣ含量対長さ比と安定性との関係を示す。全長インサートが検出された浸潤後の最後の日（Ｙ軸）を、対応する外来インサートのＧＣ含量対長さ比（Ｘ軸）に対してプロットした。分析のために、ＧＦＰ、ＧＵＳ、ＡｔＦＴ、ＣａＤＲＥＢ、ＳｌＳＵＮ、ＳｌＬＯＧ１、ＳｌＤＲＥＢ１、ＳｌＧＲ、ＳｌＯＶＡＴＥ及びＳｌＷＯＯＬＬＹの各インサートについての値（表１）を使用した。インサートのＧＣ含量と長さとの比率を、下記の式を使用して計算した：ＧＣ含量／長さ比＝（ＧＣ含量（％）／長さ（ｂｐ）×１００）。
【図６】コドン使用頻度が異なるＳＩＡＮＴ１挿入物を含有する構築物についての浸潤後２１日（ｄｐｉ）でのＰＶＸベクター安定性のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。３つの独立したトマト「Ｂａｌｃｏｎｙ  Ｒｅｄ」植物の全身の葉を例２に記載されるように分析した。  生来型（３５．２％；４．３）：３５．２％のＧＣ含量及び４．３のＧＣ含量／長さ比を有する生来型ＳＩＡＮＴ１コード配列（ｐＮＭＤ７２１構築物）。  タバコ（３９．５％；４．８）：タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）のコドン使用頻度について最適化されるＳＩＡＮＴ１コード配列（３９．５％のＧＣ含量及び４．８のＧＣ含量／長さ比；ｐＮＭＤ２９５６１）。  シロイヌナズナ（４１．０％；５．０）：シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のコドン使用頻度について最適化されるＳＩＡＮＴ１コード配列（４１．０％のＧＣ含量及び５．０のＧＣ含量／長さ比；ｐＮＭＤ２９５４１）。  ヒト（４８．０％、５．８）：ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）のコドン使用頻度について最適化されるＳＩＡＮＴ１コード配列（４８．０％のＧＣ含量及び５．８のＧＣ含量／長さ比；ｐＮＭＤ２９５３１）。  イネ（４８．４％；５．９）：ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）のコドン使用頻度について最適化されるＳＩＡＮＴ１コード配列（４８．４％のＧＣ含量及び５．９のＧＣ含量／長さ比；ｐＮＭＤ２９５５１）。  Ｖ：空のエントリーＰＶＸベクターｐＮＭＤ４３００。ＰＬ：プラスミド；１、２及び３：植物１、植物２及び植物３（それぞれ）。プラスミド増幅のＰＣＲフラグメントが陽性のサイズコントロールとして役立つ。
【図７】コドン使用頻度が異なるＳＩＡＮＴ１挿入物を含有する構築物についての浸潤後５２日でのＰＶＸベクター安定性のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。３つの独立したトマト「Ｂａｌｃｏｎｙ  Ｒｅｄ」植物の全身の葉を例２に記載されるように分析した。  生来型（３５．２％；４．３）：３５．２％のＧＣ含量及び４．３のＧＣ含量／長さ比を有する生来型ＳＩＡＮＴ１コード配列（ｐＮＭＤ７２１構築物）。  タバコ（３９．５％；４．８）：タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）のコドン使用頻度について最適化されるＳＩＡＮＴ１コード配列（３９．５％のＧＣ含量及び４．８のＧＣ含量／長さ比；ｐＮＭＤ２９５６１）。  ＰＶＸ（４４．７％；５．４）：ＰＶＸのコドン使用頻度について最適化されるＳＩＡＮＴ１コード配列（４４．７％のＧＣ含量及び５．４のＧＣ含量／長さ比；ｐＮＭＤ３０８８１）。  オオムギ（５１．０％；６．２）：オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）のコドン使用頻度について最適化されるＳＩＡＮＴ１コード配列（５１．０％のＧＣ含量及び６．２のＧＣ含量／長さ比；ｐＮＭＤ３０７２２）。  Ｂｉｆｉｄｏ（５６．１％；６．８）：ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のコドン使用頻度について最適化されるＳＩＡＮＴ１コード配列（５６．１％のＧＣ含量及び６．８のＧＣ含量／長さ比；ｐＮＭＤ３０８９１）。  Ｖ：空のエントリーＰＶＸベクターｐＮＭＤ４３００。ＰＬ：プラスミド；１、２及び３：植物１、植物２及び植物３（それぞれ）。プラスミド増幅のＰＣＲフラグメントが陽性のサイズコントロールとして役立つ。
【図８】ＳｌＬＯＧ１遺伝子及びＳｌＯＶＡＴＥ遺伝子の生来型配列及びコドン最適化配列を含有する構築物についてのＰＶＸベクター安定性のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。  （Ａ）ＳｌＬＯＧ１挿入物を有するベクターの分析。  トマト「Ｂａｌｃｏｎｙ  Ｒｅｄ」植物の全身の葉からの植物材料を浸潤後３４日で分析した。１：生来型ＳｌＬＯＧ１配列（４１．９％のＧＣ含量及び６．２のＧＣ含量／長さ比）を含有するｐＮＭＤ２７５３３構築物によりトランスフェクションされた植物。２：イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）のコドン使用頻度について最適化されるＳｌＬＯＧ１配列（５３．２％のＧＣ含量及び７．８のＧＣ含量／長さ比）を含有するｐＮＭＤ３１０８４構築物によりトランスフェクションされた植物。完全な形での挿入についてのＰＣＲフラグメントの予想サイズが８７０ｂｐであり、矢印により示される。  （Ｂ）ＳｌＬＯＧ１挿入物を有するベクターの分析。上段パネル：浸潤後２７日で分析された植物材料；下段パネル：浸潤後８２日で分析された植物材料。  生来型（４１．０％；３．９）：４１．０％のＧＣ含量及び４．６のＧＣ含量／長さ比を有する生来型ＳＩＯＶＡＴＥコード配列（ｐＮＭＤ２７９３１構築物）。  イネ（４８．８％；４．６）：イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）のコドン使用頻度について最適化されるＳＩＯＶＡＴＥコード配列（４８．８％のＧＣ含量及び４．６のＧＣ含量／長さ比；ｐＮＭＤ２９５５１）。  Ｖ：空のエントリーＰＶＸベクターｐＮＭＤ４３００。ＰＬ：プラスミド；１及び２：植物１及び植物２（それぞれ）。プラスミド増幅のＰＣＲフラグメントが陽性のサイズコントロールとして役立つ。
【図９】表１：ＰＶＸベクター挿入物及びそれらの安定性（例２）を示す。
【図１０】表３：ＳｌＬＯＧ１遺伝子及びＳｌＯＶＡＴＥ遺伝子の生来型配列及びコドン最適化配列（例４）を示す。
【図１１】ｓＧＦＰの元の配列の挿入物を含有するＰＶＸベクターが接種されたトマト「Ｂａｌｃｏｎｙ  Ｒｅｄ」植物の実におけるＧＦＰ蛍光（図１１、Ａ）、及びタバコのコドン使用頻度について適合化されるｓＧＦＰ配列（ｓＧＦＰ−タバコ）の挿入物を含有するＰＶＸベクターが接種されたトマト「Ｂａｌｃｏｎｙ  Ｒｅｄ」植物の実におけるＧＦＰ蛍光（図１１、Ｂ）を示す。写真を浸潤後１０２日で撮影した。白抜きの矢印は、ＧＦＰ蛍光を有する実の区域を示す。それぞれの構築物について、２つの独立した植物（植物１及び植物２）を使用した（例５）。  ｓＧＦＰ（６１．４％；８．５）：６１．４％のＧＣ含量及び８．５のＧＣ含量／長さ比を有する元のｓＧＦＰコード配列（ｐＮＭＤ５８００構築物）。  ｓＧＦＰ−タバコ（４０．３％；５．６）：タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に適合化されたコドン使用頻度を有するｓＧＦＰコード配列（４０．３％のＧＣ含量及び５．６のＧＣ含量／長さ比；ｐＮＭＤ３２６８５）。
【図１２】元のコドン使用頻度を有するｓＧＦＰ挿入物を含有する構築物（ｓＧＦＰ）、及びタバコに適合化されたコドン使用頻度を有するｓＧＦＰ挿入を含有する構築物（ｓＧＦＰ−タバコ）についての２５ｄｐｉ（上段パネル）及び１０２ｄｐｉ（下段パネル）でのＰＶＸベクター安定性のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。それぞれの構築物について、２つの独立したトマト「Ｂａｌｃｏｎｙ  Ｒｅｄ」植物に接種した。２５ｄｐｉにおいて、接種された植物の全身の葉を分析した。１０２ｄｐｉにおいて、成熟した実を分析のために使用した。分析を例５に記載されるように行った。  ＰＬ：プラスミド；１及び２：接種植物１及び接種植物２。プラスミド増幅のＰＣＲフラグメントが陽性のサイズコントロールとして役立った。黒の矢印は、無傷の非分解ｓＧＦＰインサートに対応するサイズを有するＰＣＲフラグメントを示す。  ｓＧＦＰ（６１．４％；８．５）：６１．４％のＧＣ含量及び８．５のＧＣ含量／長さ比を有する元のｓＧＦＰコード配列（ｐＮＭＤ５８００構築物）。  ｓＧＦＰ−タバコ（４０．３％；５．６）：タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に適合化されたコドン使用頻度を有するｓＧＦＰコード配列（４０．３％のＧＣ含量及び５．６のＧＣ含量／長さ比；ｐＮＭＤ３２６８５）。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本明細書中において、ポテックスウイルスレプリコンは、植物細胞において複製され、かつ、植物及び植物組織における細胞間移行及び遠距離移行が可能である核酸である。ポテックスウイルスレプリコンでは、植物又は植物細胞におけるポテックスウイルスの複製が使用され、好ましくは植物又は植物細胞におけるポテックスウイルスのタンパク質発現系が使用される。ポテックスウイルスレプリコンは、例えば、ポテックスウイルス由来の遺伝子成分を含むことによって、又はポテックスウイルスの遺伝子成分と比較して好適に変更された遺伝子成分を使用することによって天然型ポテックスウイルスに基づいて組み立てられる場合がある。ポテックスウイルスレプリコンはＲＮＡであり、又はＲＮＡを含む。本発明のポテックスウイルスベクターは、植物又は植物組織の細胞にポテックスウイルスレプリコンを与えるために使用される媒体である。ポテックスウイルスレプリコンはそれ自体が、本発明のポテックスウイルスベクターとして使用される場合がある。しかしながら、ポテックスウイルスベクターはポテックスウイルスレプリコンを含む場合があり、又はコードする場合がある。ポテックスウイルスベクターは、下記で言及される核酸と同様に、ＤＮＡ又はＲＮＡである場合がある。ポテックスウイルスベクターがＲＮＡであるならば、ポテックスウイルスベクターはポテックスウイルスレプリコンであり、又はポテックスウイルスレプリコンを含む。ポテックスウイルスベクターがＤＮＡであるならば、ポテックスウイルスベクターはポテックスウイルスレプリコンをコードする。ポテックスウイルスベクター又は前記核酸がＤＮＡであるならば、セグメント（ｉ）〜セグメント（ｉｉｉ）もまた一般にＤＮＡである。前記ポテックスウイルスベクター又は前記核酸がＲＮＡであるならば、セグメント（ｉ）〜セグメント（ｉｉｉ）もまた一般にＲＮＡである。
【００２８】
ポテックスウイルスレプリコンは、少なくとも下記のセグメント（ｉ）〜セグメント（ｉｉｉ）を好ましくは５’から３’の方向においてこの順で含むＲＮＡ（一般にはＲＮＡ分子）である：
（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）をコードする核酸配列；
（ｉｉ）下記を含む核酸配列：
（ａ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロック、及び
（ｂ）必要な場合には、ポテックスウイルスコートタンパク質をコードする配列；又はトバモウイルス移行タンパク質をコードする配列；ならびに
（ｉｉｉ）目的とするタンパク質をコードするＯＲＦを含む異種核酸配列。
【００２９】
本発明のポテックスウイルスベクターは、上記ポテックスウイルスレプリコンを含む核酸又はコードする核酸である。したがって、ポテックスウイルスベクターは、好ましくは５’から３’の方向においてこの順で、下記のセグメント（ｉ）〜セグメント（ｉｉｉ）を含む：
（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）をコードする核酸配列；
（ｉｉ）核酸配列であって、
（ａ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む、又はコードする、かつ
（ｂ）必要な場合には、ポテックスウイルスコートタンパク質をコードする配列を含む；又はトバモウイルス移行タンパク質をコードする配列を含む
核酸配列；及び
（ｉｉｉ）目的とするタンパク質をコードするＯＲＦを含む異種核酸配列。
【００３０】
セグメント（ｉ）〜セグメント（ｉｉｉ）の順序は５’から３’の方向において、上記で示されるように、好ましくはセグメント（ｉ）からセグメント（ｉｉ）に、セグメント（ｉｉｉ）にであるが、セグメント（ｉｉ）のセグメント（ａ）及びセグメント（ｂ）の順序は特に限定されない。セグメント（ｉ）〜セグメント（ｉｉｉ）のこの好ましい順序はまた、本発明の他の実施形態にも当てはまる。
【００３１】
上記ポテックスウイルスベクターの「核酸」及び上記ポテックスウイルスレプリコンの「ＲＮＡ」又は「ＲＮＡ分子」はまた、「本発明の核酸」としてまとめて示される。項目（ｉｉｉ）の異種核酸配列はまた、本明細書中では「第２の異種核酸（配列）」として示され、前記ＯＲＦはまた、本明細書中では「第２のＯＲＦ」として示される。これらの要素及びそれらの作製がさらに下記で記載される。本明細書中において、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）は、目的とするタンパク質のコード核酸配列である。ＯＲＦは、開始コドンから終止コドンまでの、両コドンを含む塩基トリプレットからなり、イントロンを含む場合がある。ＯＲＦは、目的とするタンパク質をそのＮ末端からそのＣ末端までコードする。目的とするタンパク質は、翻訳後に切断されることがあるＮ末端ペプチド又はＣ末端ペプチドを含む場合がある。したがって、本発明において、「目的とするタンパク質」は、タンパク質を発現させるための達成方法において産生される一次翻訳産物である場合があり、一方で、目的とするタンパク質を発現させた後で精製されることがある最終タンパク質は、翻訳後に修飾されている場合がある。
【００３２】
「核酸配列」又は簡単に「配列」は一般には、核酸分子、又はより長い核酸分子の核酸セグメントである。（核酸の）セグメントは、より長い核酸分子の内部における複数の連続した塩基である。「核酸配列」又は簡単に「配列」は一本鎖又は二本鎖である場合がある。同様に、核酸又は核酸分子は一本鎖又は二本鎖である場合がある。本発明の第１の異種核酸配列及び第２の異種核酸配列はまた、第１の異種核酸及び第２の異種核酸としてそれぞれ示される場合がある。
【００３３】
ポテックスウイルスレプリコンは、項目（ｉ）及び項目（ｉｉ）のポテックスウイルス要素又はポテックスウイルスセグメントと、必要な場合にはポテックスウイルスレプリコンのさらなる遺伝子要素とが存在するために植物細胞において複製することができる。これらのさらなる遺伝子要素はまた、ポテックスウイルスベクターに含有されてもよく、又はコードされてもよい。そのようなさらなる遺伝子要素の例として、５’非翻訳領域及び３’非翻訳領域、ならびにサブゲノムプロモーターがある。
【００３４】
本発明の方法において、上記の項目（ｉｉｉ）の第２の異種核酸配列が作製される。第２の異種核酸配列は一般には、第１の異種核酸配列と同じタンパク質をコードする。第２の異種核酸配列は、第２の異種核酸配列のＯＲＦが第１の異種核酸配列のＯＲＦよりも高いＧＣ含量を有するという点で、第１の異種核酸配列とは異なる。ＧＣ含量がより高いことは、Ｇ（グアニン）塩基及びＣ（シトシン）塩基の合計がより大きいことを意味する。したがって、本明細書中における「ＧＣ含量」は、Ｇ＋Ｃの含量を意味する。ＧＣ含量は、所与の核酸におけるＧ塩基及びＣ塩基の数を数えることによって求められる。第２の異種核酸配列は、目的とするタンパク質のＯＲＦ又はコード配列からなる場合がある。目的とするタンパク質のコード配列は本明細書中ではまた、ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）として示される。代替において、第２の異種核酸配列は、目的とするタンパク質のコード配列（ＯＲＦ）と、目的とするタンパク質をポテックスウイルスレプリコンから植物又は植物細胞において発現させるためのポテックスウイルスベクター又は遺伝子要素を操作するための１つ又は複数のさらなるヌクレオチド又はヌクレオチド区域（例えば、制限エンドヌクレアーゼ部位など）とを含む場合がある。第２の異種核酸配列はさらに、他の遺伝子要素を含有する場合があり、例えば、第２のＯＲＦをクローニングするために、あるいは第２のＯＲＦをポテックスウイルスレプリコン又はポテックスウイルスベクターに導入するために使用される要素を含有する場合がある。また、第２の異種核酸配列が付加的なヌクレオチド又は配列区域又は他の遺伝子要素を含むならば、本明細書中で定義されるＧＣ含量は、目的とするタンパク質のコード配列（ＯＲＦ）からなるセグメントのＧＣ含量である。好ましくは、第２の異種核酸配列は、第１の異種核酸配列よりも高いＧＣ含量を有する。
【００３５】
第１の異種核酸配列もまた、目的とするタンパク質をコードするＯＲＦを含む。第１の異種核酸配列は物理的実体物（例えば、核酸分子など）である場合がある。しかしながら、本発明のためには、第２の異種核酸のＯＲＦのより高いＣＧ含量が、ＧＣ塩基を数えることによって決定され得ることが十分である。したがって、第１の異種核酸及びそのＯＲＦが物理的実体物であることは必要なく、第１の異種核酸は、仮想的な核酸、例えば、紙に書かれる、又はコンピューター読み取り可能な電子ファイルに書き込まれる一般に使用されている文字（Ｃ、Ｇ、Ａ及びＴ／Ｕ）によって表される仮想的な核酸であることで十分である。一般に知られているように、これらの文字は、核酸配列におけるシトシン、グアニン、アデニン及びチミン／ウラシルのヌクレオチドをそれぞれ表している。
【００３６】
目的とするタンパク質をコードするＯＲＦのＧＣ含量が、第１の異種核酸配列の目的とするタンパク質をコードするＯＲＦのＧＣ含量よりも高いという条件のもとで、第２の異種核酸を作製するために用いられる方法は限定されない。核酸を作製する様々な方法が分子生物学における一般的知識の一部である。第２の異種核酸は、例えば、自動化されたＤＮＡ合成によって作製される場合がある。第２の異種核酸は代替において、目的とするタンパク質をコードするＯＲＦのＧＣ含量が増大するようにヌクレオチドを置換することにより第１の異種核酸を改変することによって作製される場合がある。ＯＲＦのヌクレオチドとは異なる第１の異種核酸のヌクレオチドはまた、所望されるならば、第２の異種核酸を作製する際に変更されることがある。
【００３７】
作製された第２の異種核酸を使用して、ポテックスウイルスレプリコン又はポテックスウイルスベクターが提供され得る。この工程において適用可能な方法は、分子生物学の一般に知られている方法であり、本発明は、使用される具体的な方法に関して限定されない。一般には、ＤＮＡレベルでの必要な核酸修飾を行うことが好ましく、また、より一般的である。したがって、第２の異種核酸配列がＤＮＡであること、そして、ポテックスウイルスレプリコンをコードするポテックスウイルスベクターが作製されることが好ましい。例えば、第２の異種核酸配列が、本発明のポテックスウイルスベクターを作製するために、上記のセグメント（ｉ）及びセグメント（ｉｉ）を含む核酸を含む核酸に挿入される場合がある。第２の異種核酸配列を挿入する工程は、第２の異種核酸の一部又はヌクレオチド（例えば、エンドヌクレアーゼ制限部位のヌクレオチド）が作製物において失われることがある、すなわち、作製物に存在しないことがある通常のサブクローニング工程である場合がある。したがって、第２の異種核酸配列の全体が必ずしもポテックスウイルスベクターに収まらないことが起こり得る。いずれにせよ、第２の異種核酸の目的とするタンパク質のＯＲＦ（すなわち、前記第２のＯＲＦ）を含む少なくとも一部分が、ポテックスウイルスベクターである作製物に挿入される。別の実施形態において、第２のＯＲＦが、例えば、第２のＯＲＦを超える付加的な配列区域を伴うことなく、ポテックスウイルスベクターである作製物に挿入される。しかしながら、この場合でもまた、目的とするタンパク質を発現させるために必要である遺伝子要素が好ましくは、ポテックスウイルスベクターに与えられる。
【００３８】
第２の異種核酸配列は、前記ＯＲＦとは別に、目的とするタンパク質を植物又は植物細胞においてポテックスウイルスレプリコンから発現させるための遺伝子要素、例えば、リボソーム結合部位、５’非翻訳領域及び／又は３’非翻訳領域などをさらに含む場合がある。
【００３９】
その前記一部分、すなわち、第２のＯＲＦを含む、又は第２のＯＲＦからなる第２の異種核酸配列の一部分は、第２の異種核酸の（配列）セグメントで、第２のＯＲＦを含む、又は第２のＯＲＦからなる（配列）セグメントである。前記一部分は、消化産物をポテックスウイルスベクターに挿入するための１つ又は２つの制限酵素又はエンドヌクレアーゼによる消化の後における第２の異種核酸配列の産物である場合がある。この一部分は、前述の段落で言及される遺伝子要素として、目的とするタンパク質を植物又は植物細胞においてポテックスウイルスレプリコンから発現させるための遺伝子要素を含有する場合がある。
【００４０】
以下では、核酸の様々な実施形態が記載される。
【００４１】
本発明の核酸は、以下のセグメント、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）ポテックスウイルス三重遺伝子ブロックを含む核酸配列又はコードする核酸配列と、（ｉｉｉ）目的とするタンパク質をコードするＯＲＦを含む異種核酸配列とを含む。
【００４２】
１つの実施形態において、前記ＯＲＦは、少なくとも１００個、最大でも５００個のヌクレオチドからなり、ＧＣ含量が少なくとも５０％である；又は前記ＯＲＦは、少なくとも５０１個、最大でも１０００個のヌクレオチドからなり、ＧＣ含量が少なくとも５５％である；及び／又は前記ＯＲＦは、少なくとも１００１個のヌクレオチドからなり、ＧＣ含量が少なくとも５８％である。
【００４３】
別の実施形態において、前記ＯＲＦは、少なくとも１００個、最大でも５００個のヌクレオチドからなり、ＧＣ含量が少なくとも５０％である；又は前記ＯＲＦは、少なくとも５０１個、最大でも１０００個のヌクレオチドからなり、ＧＣ含量が少なくとも５５％である；及び／又は前記ＯＲＦは、少なくとも１００１個のヌクレオチドからなり、ＧＣ含量が少なくとも５８％である。
【００４４】
さらなる実施形態において、前記ＯＲＦは、少なくとも２００個、最大でも４００個のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部において、好ましくは少なくとも１００個、最大でも５００個のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部においてＧＣ含量が少なくとも５０％である；又は前記ＯＲＦは、４０１個〜８００個のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部において、好ましくは５０１個〜１０００個のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部においてＧＣ含量が少なくとも５５％である；及び／又は前記ＯＲＦは、８０１個以上のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部において、好ましくは１００１個以上のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部においてＧＣ含量が少なくとも５８％である。好ましくは、前記ＯＲＦは、少なくとも２００個、最大でも４００個のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部において、好ましくは少なくとも１００個、最大でも５００個のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部においてＧＣ含量が少なくとも５２％である；又は前記ＯＲＦは、４０１個〜８００個のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部において、好ましくは５０１個〜１０００個のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部においてＧＣ含量が少なくとも５７％である；及び／又は前記ＯＲＦは、８０１個以上のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部において、好ましくは１００１個以上のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部においてＧＣ含量が少なくとも６０％である。核酸の別の実施形態において、前記ＯＲＦは、少なくとも１００個、最大でも５００個のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部においてＧＣ含量が少なくとも５０％である；又は前記ＯＲＦは、５０１個〜１０００個のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部においてＧＣ含量が少なくとも５５％である；及び／又は前記ＯＲＦは、１００１個以上のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部においてＧＣ含量が少なくとも５８％である；好ましくは、前記ＯＲＦは、少なくとも１００個、最大でも５００個のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部においてＧＣ含量が少なくとも５２％である；又は前記ＯＲＦは、５０１個〜１０００個のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部においてＧＣ含量が少なくとも５７％である；及び／又は前記ＯＲＦは、１００１個以上のヌクレオチドからなる前記異種核酸配列のセグメントの内部においてＧＣ含量が少なくとも６０％である。
【００４５】
緑色蛍光タンパク質をコードする異種核酸を含むポテックスウイルスベクター又は核酸は本発明のポテックスウイルスベクター又は核酸からそれぞれ除外される場合がある。
【００４６】
本発明の前記ポテックスウイルスベクター又は核酸は、ポテックスウイルスをコードする核酸構築物に第２の異種核酸配列を挿入し、それにより、前記異種核酸配列が、三重遺伝子ブロックをコードする配列の下流側、及び／又は前記ポテックスウイルスのコートタンパク質をコードする配列の下流側に挿入され得ることによって得ることができる場合がある。しかしながら、様々な改変が、天然型ポテックスウイルスの遺伝子成分に対して、例えば、ＲｄＲＰ遺伝子、三重遺伝子ブロック、コートタンパク質遺伝子、又はポテックスウイルスの５’非翻訳領域もしくは３’非翻訳領域などに対して行われる場合があり、それらについての様々な例が下記に記載される。
【００４７】
本発明のポテックスウイルスベクターは、一般には５’末端から３’末端までの順で、本発明の前記セグメント（ｉ）からセグメント（ｉｉｉ）までを含む。さらなる遺伝子要素が、植物細胞におけるポテックスウイルスレプリコンの複製のために、かつ／又は目的とするタンパク質の発現のために前記レプリコン又はベクターに存在する場合がある。レプリコンであるために、すなわち、植物細胞における自律的複製のために、ポテックスウイルスレプリコンはＲｄＲｐをコードする。ポテックスウイルスレプリコンはさらに、ポテックスウイルスの５’非翻訳領域及び／又は３’非翻訳領域ならびにプロモーター配列を、ポテックスウイルスのＲｄＲｐと結合するために、また、ポテックスウイルスレプリコンを複製するために、前記ポテックスウイルスレプリコンの５’非翻訳領域又は３’非翻訳領域に有する場合がある。前記ポテックスウイルスレプリコンはさらに、項目（ｉｉ）及び項目（ｉｉｉ）のセグメントによってコードされるタンパク質を発現させるためのサブゲノムＲＮＡを生成させるためのサブゲノムプロモーターを項目（ｉｉ）及び／又は項目（ｉｉｉ）のセグメントに有する場合がある。前記ポテックスウイルスベクター又は核酸がＤＮＡであるならば、ポテックスウイルスベクター又は核酸は典型的には、植物細胞における前記ポテックスウイルスレプリコンの転写による産生を可能にするための転写プロモーターをその５’末端に有するであろう。植物体内におけるＤＮＡ核酸からの前記ＲＮＡレプリコンの転写を可能にする転写プロモーターの一例が、植物バイオテクノロジーにおいて広く使用される３５Ｓプロモーターである。３５Ｓプロモーターは構成的プロモーターの一例である。ポテックスウイルスベクターが植物又は植物細胞における目的とするタンパク質に関する一過性トランスフェクション及び一過性発現のために使用される場合には特に、構成的な転写プロモーターがポテックスウイルスベクターにおいて使用されることが好ましい。ポテックスウイルスベクターが植物の染色体ＤＮＡに、又は植物の細胞に安定的に組み込まれるならば、転写プロモーターは、ポテックスウイルスレプリコンの形成及び目的とするタンパク質の発現が所望の時点で開始され得るような制御されたプロモーターである場合がある。制御されたプロモーターの一例が、例えば、国際公開第２００７／１３７７８８号パンフレットに記載されるエタノール誘導性プロモーターである。
【００４８】
セグメント（ｉ）はポテックスウイルスのＲｄＲｐをコードする。コードされたポテックスウイルスＲｄＲｐは所与のポテックスウイルス（例えば、ジャガイモウイルスＸなど）のＲｄＲｐである場合があり、あるいは、コードされたポテックスウイルスＲｄＲｐは、所与のポテックスウイルスのＲｄＲｐの機能保存的変異体である場合がある。したがって、用語「ポテックスウイルス（の）」は、所与のポテックスウイルスにまさに存在する配列に限定されない；用語「ポテックスウイルス」又は用語「ポテックスウイルスの」は、指定された要素又はセグメントが所与のポテックスウイルスに由来することを意味する。セグメント（ｉ）の前記配列が、配列番号３７によってコードされるタンパク質に対して少なくとも３６％の配列同一性を有するタンパク質をコードするならば、ＲｄＲｐは、所与のポテックスウイルスのＲｄＲｐの機能保存的変異体であるとみなされる場合がある。別の実施形態において、前記配列同一性は、配列番号３７によってコードされるタンパク質に対して少なくとも４５％であり、さらなる実施形態においては少なくとも５５％であり、別の実施形態においては少なくとも６５％であり、なおさらにさらなる実施形態においては少なくとも７５％である。これらの配列同一性が配列番号３７の配列の全体にわたって存在する場合がある。代替において、これらの配列同一性が、少なくとも３００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントの内部において、少なくとも５００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントの内部において、少なくとも９００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントの内部において、又は少なくとも１４００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントの内部において存在する場合がある。
【００４９】
本明細書中において、配列同一性及び配列類似性の判定が、Ａｌｉｇｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴＰ  ２．６．１＋）（Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．Ａｌｔｓｃｈｕｌ、Ｔｈｏｍａｓ  Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ、Ａｌｅｊａｎｄｒｏ  Ａ．Ｓｃｈａｆｆｅｒ、Ｊｉｎｇｈｕｉ  Ｚｈａｎｇ、Ｚｈｅｎｇ  Ｚｈａｎｇ、Ｗｅｂｂ  Ｍｉｌｌｅｒ、及びＤａｖｉｄ  Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９９７）、”Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ａｎｄ  ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ：ａ  ｎｅｗ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｐｒｏｇｒａｍｓ”、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２）を使用して行われる。
【００５０】
一例において、配列番号３７によってコードされるＲｄＲＰと、ポテックスウイルスＲｄＲｐの機能保存的変異体との間における前記配列同一性が、少なくとも９００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントにおいて少なくとも４５％である。別の一例において、配列番号３７によってコードされるタンパク質と、ポテックスウイルスＲｄＲｐの機能保存的変異体との間における前記配列同一性が、少なくとも９００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントにおいて少なくとも５５％である。
【００５１】
代替において、項目（ｉ）の前記配列が、配列番号３７によってコードされるタンパク質に対して少なくとも５０％の配列類似性を有するタンパク質をコードするならば、ポテックスウイルスレプリコンにおいて使用されるＲｄＲｐは、所与のポテックスウイルスのＲｄＲｐの機能保存的変異体であるとみなされる場合がある。別の実施形態において、前記配列類似性は、配列番号３７によってコードされるタンパク質に対して少なくとも６０％であり、さらなる実施形態においては少なくとも７０％であり、別の実施形態においては少なくとも８０％である。これらの配列類似性が配列番号３７の配列の全体にわたって存在する場合がある。代替において、これらの配列類似性が、少なくとも３００アミノ酸残基、少なくとも５００アミノ酸残基、少なくとも９００アミノ酸残基、又は少なくとも１４００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントの内部において存在する場合がある。アミノ酸配列類似性が、上記で定義されるＢＬＡＳＴＸを使用して求められる場合がある。
【００５２】
一例において、配列番号３７によってコードされるタンパク質と、ポテックスウイルスＲｄＲｐの機能保存的変異体との間における配列類似性が、少なくとも９００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントにおいて少なくとも７０％である。別の一例において、配列番号３７によってコードされるタンパク質と、ポテックスウイルスＲｄＲｐの機能保存的変異体との間における前記配列類似性が、少なくとも９００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントにおいて少なくとも８０％である。
【００５３】
代替において、項目（ｉ）の前記配列が、配列番号３７に対して少なくとも５５％の配列同一性、少なくとも６０％の配列同一性、又は少なくとも７０％の配列同一性を有するならば、前記ポテックスウイルスレプリコンにおいて使用されるＲｄＲｐは、所与のポテックスウイルスのＲｄＲｐの機能保存的変異体であるとみなされる場合がある。前記配列同一性が、配列番号３７の内部、又は配列番号３７の少なくとも９００ヌクレオチドの配列セグメントの内部、少なくとも１５００ヌクレオチドの配列セグメントの内部、少なくとも２０００ヌクレオチドの配列セグメントの内部、もしくは少なくとも４２００ヌクレオチドの配列セグメントの内部において存在する場合がある。ヌクレオチド配列同一性が、上記のＢＬＡＳＴを使用して求められる場合がある。
【００５４】
ポテックスウイルスレプリコンは、植物又は植物組織における前記ポテックスウイルスレプリコンの細胞間移行を可能にするための項目（ｉｉ）の核酸セグメントを含む。ポテックスウイルスレプリコンの細胞間移行は、前記植物又は前記組織のできるだけ多くの細胞における項目（ｉｉｉ）のセグメントの発現を達成するために重要である。項目（ｉｉ）の核酸配列はポテックスウイルスの三重遺伝子ブロック（本明細書中では「ＴＧＢ」と略記される）を含むか、又はコードする（ＴＧＢに関する総説が、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（２００３）８４，１３５１−１３６６に見出される）。ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックは、細胞間移行の能力をポテックスウイルスに与えるために必要な３つのタンパク質をコードする。用語「ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロック」には、ポテックスウイルスのＴＧＢの様々な変異体が含まれ、ただし、前記変異体は、必要な場合には他の必要な成分とともに、本発明のポテックスウイルスレプリコンに植物又は細胞組織における細胞間移行の能力を与えることができる。
【００５５】
ポテックスウイルスＴＧＢの例として、所与のポテックスウイルスのＴＧＢが挙げられる。ポテックスウイルスＴＧＢの一例が、ジャガイモウイルスＸのＴＧＢ（これは本明細書中では「ＰＶＸ  ＴＧＢ」として示される）である。ＰＶＸ  ＴＧＢは、その近似分子量に従って２５Ｋ、１２Ｋ及び８Ｋと呼ばれる３つのタンパク質をコードする３つの遺伝子からなる。ＰＶＸ  ２５Ｋ、ＰＶＸ  １２Ｋタンパク質、及びＰＶＸ  ８Ｋタンパク質をコードする遺伝子配列が、配列番号２９、配列番号３１、及び配列番号３３でそれぞれ示される。ＰＶＸ  ２５Ｋタンパク質、ＰＶＸ  １２Ｋタンパク質、及びＰＶＸ  ８Ｋタンパク質のタンパク質配列が、配列番号３０、配列番号３２、及び配列番号３４でそれぞれ示される。
【００５６】
１つの実施形態において、ポテックスウイルスＴＧＢの前記変異体は３つの遺伝子のブロックであり、この場合、前記ブロックは、１つがＰＶＸ  ２５Ｋタンパク質に対して少なくとも３３％の配列同一性を有し、１つがＰＶＸ  １２Ｋタンパク質に対して少なくとも３６％の配列同一性を有し、１つがＰＶＸ  ８Ｋタンパク質に対して少なくとも３０％の配列同一性を有する３つのタンパク質をコードする。別の実施形態において、ポテックスウイルスＴＧＢの前記機能保存的変異体は、１つがＰＶＸ  ２５Ｋタンパク質に対して少なくとも４０％の配列同一性を有し、１つがＰＶＸ  １２Ｋタンパク質に対して少なくとも４０％の配列同一性を有し、１つがＰＶＸ  ８Ｋタンパク質に対して少なくとも４０％の配列同一性を有する３つのタンパク質をコードする。さらなる実施形態において、ポテックスウイルスＴＧＢの前記機能保存的変異体は、１つがＰＶＸ  ２５Ｋタンパク質に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、１つがＰＶＸ  １２Ｋタンパク質に対して少なくとも５０％の配列同一性を有し、１つがＰＶＸ  ８Ｋタンパク質に対して少なくとも５０％の配列同一性を有する３つのタンパク質をコードする。さらなる実施形態において、対応する配列同一性の値がそれぞれのタンパク質について少なくとも６０％である。さらなる実施形態において、対応する配列同一性の値がそれぞれのタンパク質について少なくとも７０％であり、好ましくは少なくとも８０％である。
【００５７】
別の実施形態において、ポテックスウイルスＴＧＢの機能保存的変異体は、下記のような３つのタンパク質をコードする：少なくとも２００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントを含み、前記セグメントがＰＶＸ  ２５Ｋタンパク質の配列セグメントに対して少なくとも４０％の配列同一性を有する、第１のタンパク質；少なくとも１００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントを含み、前記配列セグメントがＰＶＸ  １２Ｋタンパク質の配列セグメントに対して少なくとも４０％の配列同一性を有する、第２のタンパク質；及び少なくとも５５アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントを含み、前記配列セグメントがＰＶＸ  ８Ｋタンパク質の配列セグメントに対して少なくとも４０％の配列同一性を有する、第３のタンパク質。さらなる実施形態において、対応する配列同一性の値がそれぞれのタンパク質について少なくとも５０％である。さらなる実施形態において、対応する配列同一性の値が、前記第１のタンパク質、第２のタンパク質及び第３のタンパク質のそれぞれについて少なくとも６０％である。
【００５８】
項目（ｉｉ）の前記核酸配列は好ましくは、前記ポテックスウイルスレプリコンの細胞間移行及び遠距離移行のためのタンパク質（例えば、ポテックスウイルスコートタンパク質又はその機能保存的変異体など）をコードするさらなる配列を含む。前記ポテックスウイルスコートタンパク質の変異体は、他の必要な成分（例えば、ＴＧＢなど）と一緒になって前記ポテックスウイルスレプリコンに、植物又は植物組織における細胞間移行及び遠距離移行の能力を与えることができるならば、前記コートタンパク質の機能保存的変異体であるとみなされる。前記ポテックスウイルスレプリコンがポテックスウイルスのコートタンパク質を含む１つの実施形態において、前記ポテックスウイルスレプリコンは、会合した植物ウイルスの形態での植物から植物への前記ポテックスウイルスレプリコンの伝播を避けるためにウイルス粒子会合の起点を有しない。前記ポテックスウイルスレプリコンがポテックスウイルスコートタンパク質遺伝子及びポテックスウイルスＴＧＢを含むならば、前記ＴＧＢが前記コートタンパク質遺伝子の上流側に位置すること、又は逆に前記コートタンパク質遺伝子が前記ＴＧＢの上流側に位置することが可能である。したがって、前記ポテックスウイルスコートタンパク質遺伝子及び前記ポテックスウイルスＴＧＢは項目（ｉｉ）の前記核酸配列においてどのような順で存在してもよい。
【００５９】
ＰＶＸコートタンパク質のコード配列が配列番号３５として示され、ＰＶＸコートタンパク質のアミノ酸配列が配列番号３６として示される。タンパク質が、少なくとも２００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメント、代替では少なくとも２２０アミノ酸残基のタンパク質配列セグメント、さらなる代替では２３７アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントを含み、前記配列セグメントが配列番号３６の配列セグメントに対して少なくとも３５％の配列同一性を有するならば、当該タンパク質はポテックスウイルスコートタンパク質の機能保存的変異体であるとみなすことができる。別の実施形態において、タンパク質が、少なくとも２００アミノ酸残基のタンパク質配列セグメント、代替では少なくとも２２０アミノ酸残基のタンパク質配列セグメント、さらなる代替では２３７アミノ酸残基のタンパク質配列セグメントを含み、前記配列セグメントが配列番号３６の配列セグメントに対して少なくとも４５％の配列同一性を有するならば、当該タンパク質はポテックスウイルスコートタンパク質の機能保存的変異体であるとみなされる。代替の実施形態において、対応する配列同一性の値が少なくとも５５％であり、好ましくは少なくとも６５％であり、より好ましくは少なくとも７５％である。
【００６０】
代替において、項目（ｉｉ）の前記核酸配列は、場合によっては前記ポテックスウイルスコートタンパク質又はその変異体をコードする前記配列の代わりに、植物ウイルス移行タンパク質（ＭＰ）をコードする配列を含む場合がある。好適なＭＰの一例がトバモウイルスのＭＰであり、例えば、タバコモザイクウイルスのＭＰ又はカブ葉脈透化ウイルス（ｔｕｒｎｉｐ  ｖｅｉｎ  ｃｌｅａｒｉｎｇ  ｖｉｒｕｓ）のＭＰなどである。植物ウイルス移行タンパク質をコードする前記配列と、前記ポテックスウイルスＴＧＢ（又はその機能保存的変異体）とは項目（ｉｉ）の前記核酸配列においてどのような順で存在してもよい。
【００６１】
上記で記載されるように、項目（ｉｉｉ）の異種核酸配列は、植物又は植物組織において発現させられる目的とするタンパク質のＯＲＦを少なくとも含む。項目（ｉｉｉ）の異種核酸配列は方法クレームの第２の異種核酸配列に対応する。前記異種配列は、前記ポテックスウイルスレプリコンが基づくポテックスウイルスに対して異種であるという点で異種である。多くの場合において、前記配列はまた、配列が発現させられることになる前記植物又は前記植物組織に対して異種である。植物又は植物組織において前記ポテックスウイルスレプリコンから発現可能であるために、項目（ｉｉｉ）の第２の異種核酸は典型的には、発現のために要求されるサブゲノムプロモーター及び他の配列（例えば、リボソーム結合部位及び／又は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）など）を含む。好ましい実施形態において、項目（ｉｉｉ）の第２の異種核酸は、目的とする１つのタンパク質をコードする１つのＯＲＦを有する。本発明の目的とするタンパク質は好ましくは植物ウイルスタンパク質でなく、あるいは、本発明の目的とするタンパク質は、植物ウイルスに対して異種であるタンパク質であり、とりわけ、前記ポテックスウイルスレプリコンが基づくポテックスウイルスに対して異種でなければならない。植物ウイルスタンパク質は、植物ウイルスによってコードされるタンパク質である。１つの実施形態において、前記目的とするタンパク質はポテックスウイルスコートタンパク質又はトバモウイルス移行タンパク質のどちらでもない。
【００６２】
本発明の核酸、ポテックスウイルスベクター及び／又はポテックスウイルスレプリコンは、ポテックスウイルスの５’非翻訳領域、又は好ましくはポテックスウイルス５’非翻訳領域（５’−ＮＴＲ）と、ポテックスウイルスの３’非翻訳領域、又は好ましくはポテックスウイルス３’非翻訳領域（３’−ＮＴＲ）とを含む場合がある。
【００６３】
本発明の好ましい方法が下記の通りである：
植物において発現させられる目的とするタンパク質をコードするポテックスウイルスレプリコンの前記植物における遠距離移行のための能力を改善する方法であって、
前記目的とするタンパク質をコードする第２のＯＲＦを含み、かつ、前記目的とするタンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦと比較して、増大したＧＣ含量を第２のＯＲＦにおいて有する第２の異種核酸配列を作製する工程、及び
前記ポテックスウイルスレプリコン、あるいは前記ポテックスウイルスレプリコンを含むポテックスウイルスベクター又はコードするポテックスウイルスベクターを提供する工程であって、前記ポテックスウイルスレプリコンが、以下のセグメント、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）（ａ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロック、及び（ｂ）ポテックスウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列又はトバモウイルス移行タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸配列と、（ｉｉｉ）前記第２のＯＲＦ、前記第２の異種核酸配列、又は前記第２のＯＲＦを含む後者の一部分とを含む、工程
を含む方法；
植物において発現させられる目的とするタンパク質をコードするポテックスウイルスレプリコンの前記植物における遠距離移行のための能力を改善する方法であって、
前記目的とするタンパク質をコードする第２のＯＲＦを含み、かつ、前記目的とするタンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦと比較して、増大したＧＣ含量を第２のＯＲＦにおいて有する第２の異種核酸配列を作製する工程、及び
前記ポテックスウイルスレプリコン、あるいは前記ポテックスウイルスレプリコンを含むポテックスウイルスベクター又はコードするポテックスウイルスベクターを提供する工程であって、前記ポテックスウイルスレプリコンが、以下のセグメント、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）（ａ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロック、及び（ｂ）ポテックスウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列又はトバモウイルス移行タンパク質をコードする核酸配列を含む核酸配列と、（ｉｉｉ）前記第２のＯＲＦ、前記第２の異種核酸配列、又は前記第２のＯＲＦを含む後者の一部分とを含む、工程
を含む方法。
【００６４】
これらの好ましい実施形態において、セグメント（ｉ）からセグメント（ｉｉｉ）までの順序は好ましくは、ベクター又はレプリコンの５’末端から３’末端までこの順である。代替において、順序は、ベクター又はレプリコンの５’末端から３’末端まで、セグメント（ｉ）、セグメント（ｉｉｉ）及びセグメント（ｉｉ）である場合がある。セグメント（ｉｉ）において、下位項目（ｉｉ−ａ）及び下位項目（ｉｉ−ｂ）の順序は限定されない。しかしながら、順序は、ベクター又はレプリコンの５’から３’の方向において（ｉｉ−ａ）から（ｉｉ−ｂ）である場合がある。ポテックスウイルスコートタンパク質をコードする核酸配列、及びトバモウイルス移行タンパク質をコードする核酸配列は、本明細書中において他のどこかで記載される通りである。
【００６５】
植物又は植物組織において目的とするタンパク質を発現させる本発明の達成方法は一般には、本発明の前記核酸又はポテックスウイルスベクターを植物又は植物組織に与えることを含む。当然のことながら、植物又は植物組織に本発明のポテックスウイルスレプリコンを感染させることもまた可能である。１つの実施形態において、前記達成方法は、植物宿主の染色体ＤＮＡへの本発明の核酸又はポテックスウイルスベクターの組み込みが必要でなく、かつ、選択されない一過性発現の達成方法である。代替において、ポテックスウイルスベクターが、遺伝子組換え植物を作製するために染色体ＤＮＡに安定的に組み込まれる場合がある。遺伝子組換え植物の作製は当業者には知られており、とりわけ、植物細胞又は植物組織の形質転換、形質転換された細胞又は組織の選択、及び形質転換された植物の再生を含む。
【００６６】
本発明の前記核酸又は前記ポテックスウイルスベクターがＲＮＡであるならば、前記核酸又は前記ポテックスウイルスベクターは、植物又は植物組織に感染させるために、好ましくは、感染させた植物組織（例えば、葉など）の機械的傷害との組合せで植物又は植物組織に感染させるために使用される場合がある。別の実施形態において、本発明の前記核酸又はポテックスウイルスベクターはＤＮＡである。前記ＤＮＡは、例えば、粒子衝撃によって、又はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介の形質転換によって植物又は植物組織の細胞に導入される場合がある。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介の形質転換は、例えば、大規模なタンパク質製造方法のために、いくつかの植物に本発明の前記核酸又はポテックスウイルスベクターが与えられることになるならば、好んで選ばれる方法である。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介の形質転換又はトランスフェクションのための特に効率的な様々な方法が国際公開第２０１２／０１９６６０号パンフレット及び国際公開第２０１３／０５６８２９号パンフレットに記載される。
【００６７】
目的とするタンパク質を植物において発現させる達成方法は、植物又は植物組織に本発明の核酸の前記キット又は組合せを与えることによって、プロベクター法（国際公開第０２０８８３６９号パンフレットにおいて、また、Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１０１：６８５２−６８５７）によって記載される手法）を使用して実施される場合がある。この実施形態において、本発明の核酸は、前記植物の細胞における第１の核酸と第２の核酸との間での部位特異的組換えによって作製される。前記第１の核酸、及び第２の核酸は、国際公開第０２０８８３６９号パンフレットにおいて、また、Ｍａｒｉｌｌｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（上記）によって記載されるプロベクターとして作用し、これらもまた本明細書中ではプロベクターとして示される。１つの実施形態において、項目（ｉ）及び項目（ｉｉ）のセグメントを含む、又はコードする第１の核酸（プロベクター）と、項目（ｉｉｉ）のセグメントを含む、又はコードする第２の核酸（プロベクター）とが、（例えば、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介の形質転換（例えば、浸潤など）によって）植物又は植物組織に与えられ、この場合、前記第１のプロベクター及び前記第２のプロベクターはそれぞれが、前記第１のプロベクターと前記第２のプロベクターとの間での部位特異的組換えによる本発明の核酸の組立てを可能にするための組換え部位を有する。好ましくは、前記第１の核酸はセグメント（ｉｉ）の下流側において、部位特異的なリコンビナーゼによって認識可能である第１の部位特異的組換え部位を有しており、前記第２の核酸はセグメント（ｉｉｉ）の上流側において、部位特異的なリコンビナーゼによって、好ましくは同じ部位特異的なリコンビナーゼによって認識可能である第２の部位特異的組換え部位を、前記第１の部位特異的組換え部位と前記第２の部位特異的組換え部位との間での部位特異的組換え、及び本発明による核酸の形成を可能にするために有している。
【００６８】
２つ以上のベクター又は前記第１及び第２の核酸が、これらのベクターの混合物、あるいは前記ベクター又はプロベクターの１つをそれぞれの株が含有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株の混合物を植物又は植物組織に与えることによって植物又は植物組織に与えられる場合がある。植物又は植物組織はさらに、第１及び第２の核酸（プロベクター）の組換え部位を認識する部位特異的リコンビナーゼを有する場合があり、あるいは植物又は植物組織にはさらに、第１及び第２の核酸（プロベクター）の組換え部位を認識する部位特異的リコンビナーゼが与えられる場合がある。植物又は植物組織がリコンビナーゼを発現しないならば、リコンビナーゼをコードする植物発現可能な遺伝子が、前記プロベクターの１つで、又は別個のベクターで植物又は植物組織に与えられる場合がある。使用可能な部位特異的リコンビナーゼの様々な例が、国際公開第０２０８８３６９号パンフレットに記載される通りである；国際公開第０２０８８３６９号パンフレットで言及されるようなインテグラーゼもまた、部位特異的リコンビナーゼであるとみなされる。
【００６９】
前記目的とするタンパク質は、前記植物又は植物組織における産生の後で精製される場合がある。様々な方法、又はタンパク質を植物又は植物細胞から精製することがこの技術分野では知られている。１つの方法において、目的とするタンパク質は、国際公開第０３／０２０９３８号パンフレットに記載されるように植物アポプラストに誘導され、植物アポプラストから精製される場合がある。
【００７０】
目的とする１つのタンパク質を産生又は発現させる必要があるならば、前記目的とするタンパク質をコードする異種核酸又はＯＲＦが、前記ポテックスウイルスレプリコンをコードする前記核酸に含まれる場合がある。目的とする２つ以上のタンパク質が同じ植物又は同じ植物組織において産生させられることになるならば、前記植物又は植物細胞には、さらなるポテックスウイルスレプリコンを含む又はコードする別の核酸又はポテックスウイルスベクターが与えられる場合がある。前記さらなるポテックスウイルスレプリコンはその場合、目的とする１つ又は複数のさらなるタンパク質をコードする場合がある。１つの実施形態において、本発明の第１の核酸及びさらなる核酸は、国際公開第２００６／０７９５４６号パンフレットに記載されるような競合しないポテックスウイルスレプリコンを含む場合があり、又はコードする場合がある。
【００７１】
目的とするタンパク質を植物において発現させる本発明の達成方法は、植物に関しては特に限定されない。１つの実施形態において、双子葉植物又はその組織が使用される。別の実施形態において、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）及びタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）のようなタバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）の種が使用される。タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）の種とは異なる好ましい植物種が、トマト、ジャガイモ、コショウ、ナス、ダイズ、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ブラシカカンペストリス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）、カラシナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｊｕｎｃｅａ）、クレス、ルッコラ、カラシ、イチゴ、ホウレンソウ、ケノポジウムカピタツム（Ｃｈｅｎｏｐｏｄｉｕｍ  ｃａｐｉｔａｔｕｍ）、アルファルファ、レタス、ヒマワリ、ジャガイモ、キュウリ、トウモロコシ、コムギ及びイネである。
【００７２】
本発明のポテックスウイルスレプリコンが基づき得る最も好ましい植物ウイルスがポテックスウイルスであり、例えば、ジャガイモウイルスＸ（ＰＶＸ）、パパイヤモザイクポテックスウイルス又はタケモザイクポテックスウイルスなどである。
【００７３】
本発明はまた、植物において発現させられるタンパク質をコードするポテックスウイルスＲＮＡレプリコンの前記植物における遠距離移行のための能力を改善するために使用される場合がある。１つの実施形態において、この方法は下記の工程を含む：
前記タンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦのＧＣ含量を増大させ、それにより、前記タンパク質をコードし、かつ、増大したＧＣ含量を有する第２のＯＲＦを含む第２の異種核酸配列を得る工程、及び
前記第２の異種核酸配列、又は前記第２のＯＲＦを含有するその一部分を、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸又はコードする核酸とを含む核酸に挿入して、前記ＲＮＡレプリコンを含むポテックスウイルスベクター又はコードするポテックスウイルスベクターを作製する工程であって、前記ポテックスウイルスベクターが前記第２の異種核酸、又は前記第２のＯＲＦを含むその一部分を含む、工程。
【００７４】
別の実施形態において、この方法は下記の工程を含む：
前記タンパク質をコードする第２のＯＲＦを含み、かつ、前記タンパク質を第１の異種核酸配列においてコードする第１のＯＲＦと比較して、増大したＧＣ含量を第２のＯＲＦにおいて有する第２の異種核酸配列を作製する工程、及び
前記ポテックスウイルスＲＮＡレプリコン、あるいは前記ポテックスウイルスＲＮＡレプリコンを含むポテックスウイルベクター又はコードするポテックスウイルベクターを提供する工程であって、前記ポテックスウイルスＲＮＡレプリコンが、以下のセグメント、（ｉ）ポテックスウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする核酸配列と、（ｉｉ）ポテックスウイルスの三重遺伝子ブロックを含む核酸配列と、（ｉｉｉ）前記第２の異種核酸、又は前記第２のＯＲＦを含むその一部分とを含む、工程。
【００７５】
上記の増大させる工程、挿入する工程、作製する工程及び与える工程は、上記で記載されるのと同様に実施され得る。ポテックスウイルスレプリコンの植物における遠距離移行のための能力を増大させる方法の後には、得られたポテックスウイルスレプリコン又はポテックスウイルスベクターを前記植物の少なくとも一部に与えることが続く場合がある。植物における遠距離移行のための能力の増大が、例えば、例において記載されるように、実験的に追跡される場合がある。一般に、植物には、選択された葉でポテックスウイルスベクターが与えられる場合がある。所定の期間の後で、例えば、５日後、７日後又は９日後に、全身の葉の組織が、ポテックスウイルスベクターによってコードされるポテックスウイルスレプリコンの存在について調べられる場合がある。ＲＴ−ＰＣＲが、ポテックスウイルスベクターによってコードされるポテックスウイルスレプリコンのすべての成分の正しさ及び／又は存在について、どのようなポテクスウイルスレプリコンであっても全身の葉において試験するために使用される場合がある。全身の葉は、接種された葉とは異なる葉である；全身の葉は、ウイルスが遠距離全身移行のために接種葉における一次感染部位又はトランスフェクション部位から移動する葉である。
【００７６】
例
例１：プラスミド構築物
ＰＶＸに基づく組み立てられたウイルスベクターのｐＮＭＤ６７０及びｐＮＭＤ４３００（図１）を、目的とするＤＮＡインサートのクローニングのために使用した。ｐＮＭＤ４３００は、国際公開第２０１２／０１９６６０号パンフレットに記載されるｐＮＭＤ６７０構築物の改変型である。ｐＮＭＤ６７０とは対照的に、ｐＮＭＤ４３００は、Ｔ−ＤＮＡ移入の効率を増大させるためにプラスミド骨格に挿入される、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＬＢＡ４４０４株からのｖｉｒＧ  Ｎ５４Ｄ変異遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＣＰ００７２２８、ヌクレオチド位置１６１０００〜１６１７２５）を含有する。
【００７７】
目的とするインサートのヌクレオチド配列をＧｅｎＢａｎｋから直接に取得したか、又はある特定の生物のために最適化されるコドン使用頻度に基づく改変されたＧＣ含量とともに設計した。クローニング用の配列を、ｃＤＮＡをテンプレートとして使用して増幅したか、又はクローニング用の配列が、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、ドイツ）によって合成された。コドン使用頻度の改変を、平均ＧＣ含量が異なる生物のコドン使用頻度パターンに基づくＥｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓオンラインツール（ＧＥＮＥｉｕｓソフトウエア）を用いて行った。目的とするインサートを、ＣＡＴＧ及びＧＡＴＣの突出端を有するＢｓａＩ制限部位を使用してｐＮＭＤ４３００ベクターにサブクローニングした（図１）。隣接するＢｓａＩ部位を、ＰＣＲによって、又は遺伝子合成の期間中にそのどちらかで、目的とする配列に加えた。
【００７８】
クローニングのために使用される遺伝子インサートの配列が、表１、表２及び表３に列挙される。
【００７９】
例２：長さ、ＧＣ含量、及びＧＣ含量と長さとの比率が異なるインサートに関するＰＶＸベクター安定性
ＡｔＦＴ、ＣａＤＲＥＢ−ＬＰ１、ＡｍＲＯＳ１、ＧｍＬＯＧ１、ＳｌＬＯＧ１、ｓＧＦＰ、ＳＩＧＲ、ＳＩＤＲＥＢ１、ＳＩＯＶＡＴＥ、ＳｌＳＵＮ、ＧＵＳ及びＳｌＷｏｏｌｌｙのコード配列（合計で１２個）をｐＮＭＤ４３００クローニングベクターにサブクローニングした（表１）。ｓＧＦＰを除くそれらのすべてが、対応する生物からの生来型配列であった。ｓＧＦＰは、発現効率における実質的な増大をもたらした、高発現のヒトタンパク質の好んで使用されるコドンに一致するように変更されるオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）由来の緑色蛍光タンパク質のための合成コード配列である（Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ  １９９６；Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ  １９９６）。
【００８０】
遺伝子インサートはその長さ及びＧＣ含量が異なった。最も短い挿入物がＡｔＦＴ（５２８ｂ）であり、最も長い挿入物がＳｌＷｏｏｌｌｙ（２１９３ｂｐ）であった（表１）。インサートのＧＣ含量を、ＥＮＤＭＥＭＯオンラインＤＮＡ／ＲＮＡ  ＧＣ含量計算機（ｗｗｗ．ｅｎｄｍｅｍｏ．ｃｏｍ／ｂｉｏ／ｇｃ．ｐｈｐ）を使用して求めた。列挙されたインサートのＧＣ含量は４０．０％（ＳｌＳＵＮ）〜６１．４％（ｓＧＦＰ）の間の範囲であった（表１）。インサートのＧＣ含量と長さとの比率もまた計算した。計算を、下記の式を使用して行った：
ＧＣ含量／長さ比＝（ＧＣ含量（％）／長さ（ｂｐ）×１００。
【００８１】
ｘ１００の乗数を、小さすぎる小数を避けるために便宜上使用した。この式によると、ＧＣ含量／長さ比は２．０（ＳｌＷｏｏｌｌｙ）〜８．６（ＡｔＦＴ）の間で変化した。
【００８２】
子葉と、３６日齢のトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）「Ｂａｌｃｏｎｙ  Ｒｅｄ」植物の最初の２つの本葉とに、表１に列挙されるＰＶＸベクターを伝えるアグロバクテリウム培養物をシリンジにより接種した（１つの構築物につき１つの独立した植物）。浸潤させた葉からの植物材料を、９ｄｐｉにおいてコルクボーラーを使用して集め、全身の葉からの材料を、２６ｄｐｉ、２７ｄｐｉ、３４ｄｐｉ及び５５ｄｐｉにおいて集めた。集めた植物材料から単離される総ＲＮＡを、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＴ試薬キット（Ｔａｋａｒａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びオリゴｄＴプライマーを使用して逆転写した。得られたｃＤＮＡを、ＰＶＸについて特異的なオリゴ（８Ｋ−ＲＴ：ｔｔｔｇａａｇａｃａｔｃｔｃａａｃｇｃａａｔｃａｔａｃｔｔｇｔｇｃ（配列番号２５）及び３ＮＴＲ−ＲＴ：ｔｔｔｇａａｇａｃｔｔｃｔｃｇｇｔｔａｔｇｔａｇａｃｇｔａｇｔｔａｔｇｇｔｇ（配列番号２６））、又はＲＮＡ負荷コントロールとして使用されるベンサミアナタバコ（Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）由来の伸長因子ＥＦ１αについて特異的なオリゴ（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．ＡＹ２０６００４．１、オリゴＮｂＥＦ＿ｆｏｒ及びオリゴＮｂＥＦ＿ｒｅｖ（Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００５））を用いたＰＣＲのためのテンプレートとして使用した。ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで分離した。図２は、ｓＧＦＰ遺伝子、ＧＵＳ遺伝子、ＡｔＦＴ遺伝子、ＣａＤＲＥＢ−ＬＰ１遺伝子、ＳｌＳＵＮ遺伝子、ＳｌＬＯＧ１遺伝子、ＳｌＤＲＥＢ１遺伝子、ＳｌＧＲ遺伝子、ＳｌＯＶＡＴＥ遺伝子及びＳｌＷｏｏｌｌｙ遺伝子の挿入物を含有するＰＶＸベクターについての浸潤後２６日におけるＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を例示する。認められ得るように、この時点において、ｓＧＦＰ、ＡｔＦＴ、ＣａＤＲＥＢ１−ＬＰ１、ＳＩＳＵＮ及びＳＩＧＲに関してのＰＶＸベクターは依然としてかなり安定している。対照的に、ＧＵＳ、ＳｌＬＯＧ１、ＳＩＤＲＥＢ１及びＳｌＷｏｏｌｌｙに関してのベクターは既にそのインサートを失っている。
【００８３】
完全長のインサートが検出された浸潤後の最後の日（部分的なインサート排除から生じるさらなるより短いフラグメントが存在したとしても）を全長インサート最終時点とみなし、ベクター安定性の判断基準として使用した（表１）。ＡｔＦＴ、ＣａＤＲＥＢ−ＬＰ１、ＡｍＲＯＳ１及びｓＧＦＰに関してのベクターが最も安定であることが見出され、それらのインサートは５５ｄｐｉにおいて検出可能であった。ＳｌＬＯＧ１遺伝子、ＳｌＤＲＥＢ１遺伝子、ＧＵＳ遺伝子及びＳｌＷｏｏｌｌｙ遺伝子に関してのベクターは非常に不安定であり、それらのインサートは全身の葉において全く検出できなかった。ＧｍＬＯＧ１、ＳｌＧＲ、ＳｌＯＶＡＴＥ及びＳｌＳＵＮに関してのベクターは中程度の安定性であり、それらのインサートは２６ｄｐｉ〜３４ｄｐｉの後で失われた。
【００８４】
試験されたインサートの長さと、それらの安定性との関係を分析した。この目的のために、全長インサート最終時点（Ｙ軸）をインサートの長さ（Ｘ軸）に対してプロットした（図３）。インサートのサイズを増大させると、ベクター安定性が低下することが見出された。このことは、文献（例えば、Ａｖｅｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）から得られる以前のデータと一致している。
【００８５】
インサートのＧＣ含量と安定性との関係もまた分析した（図４）。おそらくは個々のインサートの間でサイズが大きく異なるために（例えば、ＳｌＷｏｏｌｌｙとＡｔＦＴとの間には４倍の差がある）、明確な傾向が、分析された一群の配列について見出されなかった。次に、ＧＣ含量／長さ比とインサート安定性との関係を分析した。この場合には、明確な傾向が認められた。すなわち、ＧＣ含量／長さ比の増大はインサート安定性の増大をもたらした（図５）。
【００８６】
例３：ＳｌＡＮＴ１インサートを有するＰＶＸの安定性を改善すること
トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）のアントシアニン１（ＳｌＡＮＴ１）遺伝子（ＡＹ３４８８７０．１）はＭＹＢ転写因子アントシアニン１（ＳｌＡＮＴ１）（ＡＡＱ５５１８１）をコードする。ＡＮＴ１転写因子は、アントシアニンの蓄積を引き起こす生合成経路を活性化する；ＡＮＴ１遺伝子を過剰発現する植物は、アントシアニンが蓄積するために非常に濃い紫色となる（Ｍａｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００３）。
【００８７】
ＳＩＡＮＴ１遺伝子を、ＰＶＸに基づくウイルスベクターを使用してトマト「Ｂａｌｃｏｎｙ  Ｒｅｄ」植物において過剰発現させることを試みた。生来型のＳＩＡＮＴ１コード配列をｐＮＭＤ６７０（ＶｉｒＧ非存在）ベクターにサブクローニングし、これにより、ｐＮＭＤ７２１構築物（表２）を得た。ｐＮＭＤ７２１構築物を、２８日齢の植物へのシリンジによる浸潤を介したアグロバクテリウム送達を使用して植物体で試験した。２１ｄｐｉにおいて、比較的濃い紫色の着色が、浸潤させた葉において認められた。対照的に、散在する着色した斑点が全身の葉においてわずかに認められた。このベクターによりトランスフェクションされた３つの独立した植物の全身の葉をＳＩＡＮＴ１インサートの完全性について分析した。ＲＴ−ＰＣＲ分析を例２に記載されるように行った。ＰＶＸベクターによるインサートの喪失が検出された。
【表１】
2020533989.tif 000003
【００８８】
ＳＩＡＮＴ１配列分析では、非常に低いＧＣ含量（３５．２％）及び極めて低いＧＣ含量／長さ比（４．３）が明らかにされた。ＧＣ含量が増大した、その結果として、ＧＣ含量と長さとの比が増大した７つの新しい型の配列を設計した（表２）。この設計を、ＧＣ含量の平均値がそのゲノムにおいて異なる生物のコドン使用頻度（Ｋａｚｕｓａコドン使用頻度データベース（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ）から検索されるデータ）に基づく、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓからのオンラインコドン使用頻度最適化ツール（ＧＥＮＥｉｕｓソフトウエア）を使用して行った。この目的のために、平均ＧＣ含量がそれぞれ、３９．２％、４１．０％、４４．７％、４８．０％、４８．４％、５１．０％及び５６．１％であるタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）、シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ジャガイモウイルスＸ、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）及びビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のコドン使用頻度パターンを選択した。加えて、ポリｄＡ（ＡＡＡＡＡ）配列及びポリｄＡ（ＡＡＡＡＡＡＡ）配列ならびにポリｄＴ（ＴＴＴＴＴ）配列、同様にまたＢｓａＩ切断部位（ＧＧＴＣＴＣＮＮＮＮＮ（配列番号２７））及び予測されたドナー／アクセプタースプライシング部位（ＡＧＧＴＲＡＧ／ＧＣＡＧＧＴ（配列番号２８））を配列内において避けた。設計された配列が、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成され、これらをｐＮＭＤ６７０ベクターにサブクローニングし、これにより、表２に列挙される構築物を得た。すべての構築物を、シリンジ浸潤を介したアグロバクテリウム送達を使用してトマト「Ｂａｌｃｏｎｙ  Ｒｅｄ」において試験した（１つの構築物につき３つの独立した２８日齢の植物）。感染させたトマト植物の全身の葉を２１ｄｐｉ及び５２ｄｐｉにおいてＰＶＸベクターの完全性について分析した（図６及び図７）。
【００８９】
２１ｄｐｉにおいて、生来型配列を有するインサートの完全な喪失が３つの植物のうちの２つで見出された。１つの植物では、無傷のベクター配列と、部分分解されたベクター配列との両方が検出された（図６）。すべての他の配列（タバコ、シロイヌナズナ、ヒト及びイネについてのコドン最適化）については、すべての試験された植物が無傷のベクター配列を含有しており、だが、いくつかの場合には、挿入物の部分的喪失を示しているさらなるバンドもまた存在した（図６）。
【００９０】
５２ｄｐｉにおいて、それぞれの構築物について２つの植物を分析した（図７）。インサートの完全な喪失が生来型配列については両方の植物で見出された。ベクターの分解がまた、ＧＣ含量及びＧＣ含量と長さとの比率がより低いタバコ最適化配列及びＰＶＸ最適化配列について認められた。対照的に、ＧＣ含量がより高い配列（オオムギ及びビフィズス菌のコドン使用頻度）については、２つの植物のうちの１つが、ＳＩＡＮＴ１の挿入を有する無傷のベクターを含有した（図７）。
【００９１】
これらのデータは、外来インサート配列のＧＣ含量を増大させ、それに対応してＧＣ含量と長さとの比を増大させることにより、安定性を改善すること、そして、全身的ＰＶＸベクターの寿命を増大させることが可能となることを示す。
【００９２】
例４：ＳｌＬＯＧ１インサート及びＳｌＯＶＡＴＥインサートに関してＰＶＸの安定性を改善することＳｌＬＯＧ１インサート及びＳｌＯＶＡＴＥインサートを有するＰＶＸベクターの安定性を改善することもまた試みた。例２で示されたように、生来型配列を有するＳＩＬＯＧ１インサート（ｐＮＭＤ２７５３３）は全身の葉において検出することができず、このことは、不安定性が非常に高いことを示していた（表１）。ＳＩＯＶＡＴＥ（ｐＮＭＤ２７９３１）は中程度の安定性を示した；無傷のインサートが、分解産物と同様に、２６ｄｐｉにおいて全身の葉で依然として検出可能であった；しかしながら、無傷のインサートは、既に２７ｄｐｉにおいて完全に失われていた（表１）。
【００９３】
ＳＩＬＯＧ１の生来型配列は長さが６７８ｂｐであり、４１．９％のＧＣ含量及び６．２のＧＣ含量と長さとの比を有する。ＳＩＯＶＡＴＥは長さが１０５９ｂｐであり、４１．０％のＧＣ含量及び３．９のＧＣ含量と長さとの比を有する。使用されたイネ適合化コドンに基づいた両方の配列を再設計した。得られた配列は、増大したＧＣ含量を有した：ＳＩＬＯＧ１−イネについては５３．２％、ＳｌＯＶＡＴＥ−イネについては４８．８％。両方の配列が、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成され、これらをｐＮＭＤ４３００ベクターにサブクローニングした。
【００９４】
得られた構築物（ＳｌＬＯＧ１−イネについてはｐＮＭＤ３１０８４、ＳｌＯＶＡＴＥ−イネについてはｐＮＭＤ３１６１１）を、例２で記載されるように２４日齢及び２５日齢のトマト「Ｂａｌｃｏｎｙ  Ｒｅｄ」植物において試験した。３４ｄｐｉにおいて、ＲＴ−ＰＣＲ分析により、生来型配列と比較したならば、ＳＩＬＯＧ１−イネインサートの安定性の劇的な増大が明らかにされた（図８、Ａ）。インサート安定性の有意な増大がまた、コドン最適化されたＳｌＯＶＡＴＥについて示された。イネのコドン使用頻度に適合化されたインサートは２７ｄｐｉにおいて依然として安定なままであり、これに対して、生来型配列は完全に失われている（図８、Ｂ、上段パネル）。ベクター分解の生成物が存在するにもかかわらず、ＳＩＯＶＡＴＥ−イネの無傷インサートを８２ｄｐｉにおいてさえ検出することができる（図８、Ｂ、下段パネル）。
【００９５】
例５：ＰＶＸベクターにおけるｓＧＦＰインサートの安定性を低下させること。
インサートのＧＣ含量における低下がＰＶＸベクターの不安定性をもたらすかどうかもまた分析した。
【００９６】
ｓＧＦＰ（配列番号６）はＧＣ含量が６１．４％であり、８．５３のＧＣ含量と長さとの比を有する。本発明者らの実験において、ｓＧＦＰインサートを有するＰＶＸベクターは、大きい安定性を明らかにした。タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）に適合化されたコドン使用頻度に基づくｓＧＦＰ配列を再設計した。得られた配列（ｓＧＦＰ−タバコ、配列番号３８）は４０．３％のＧＣ含量及び５．６０のＧＣ含量と長さとの比を有した。
【００９７】
ｓＧＦＰ配列及びｓＧＦＰ−タバコ配列をｐＮＭＤ４３００ベクターにサブクローニングし、これにより、ｐＮＭＤ５８００構築物及びｐＮＭＤ３２６８５構築物をそれぞれ得た。両方の構築物をアグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＮＭＸ０２１細胞に移した。
【００９８】
２５日齢のトマト「Ｂａｌｃｏｎｙ  Ｒｅｄ」植物の最初の光合成葉に、ｐＮＭＤ５８００構築物及びｐＮＭＤ３２６８５構築物を伝えるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）培養物を接種した（構築物あたり２つの植物）。接種を、ＯＤ６００＝１．５のアグロバクテリウム懸濁物の１：１００希釈物を用いたシリンジ浸潤を使用して行った。
【００９９】
２５ｄｐｉ後、接種された植物の全身の葉からのサンプルをＲＴ−ＰＣＲ分析のために採取した。
【０１００】
１０２ｄｐｉ後、接種された植物のすべての成熟した実を収集し、ＵＶ光での目視検査を使用してＧＦＰの蛍光について分析した。実サンプルはまた、ＲＴ−ＰＣＲ分析にも供された。ｐＮＭＤ５８００処理された植物（元のｓＧＦＰ配列）のすべての実がＧＦＰの蛍光を示した（図１１、Ａ）。対照的に、ｐＮＭＤ３２６８５構築物によるトランスフェクションを受けた２つの植物（ｓＧＦＰ−タバコ配列）のほんの少数の実のみが、ごく小さいＧＦＰ斑点を示した（図１１、Ｂ）。
【０１０１】
ベクターインサートの安定性を、ＲＴ−ＰＣＲを使用して分析した。２５ｄｐｉにおける葉サンプル及び１０２ｄｐｉにおける実のサンプルから単離されるＲＮＡをｃＤＮＡ合成のために使用した。得られたｃＤＮＡサンプルを、ＰＶＸ特異的なオリゴの８Ｋ−ＲＴ（ｔｔｔｇａａｇａｃａｔｃｔｃａａｃｇｃａａｔｃａｔａｃｔｔｇｔｇｃ）（配列番号２５）及びｐｖｘ３ＮＴＲ−ＲＴ（ｔｔｔｇａａｇａｃｔｔｃｔｃｇｇｔｔａｔｇｔａｇａｃｇｔａｇｔｔａｔｇｇｔｇ）（配列番号２６）を用いたＰＣＲ増幅のためのテンプレートとして使用した。図１２に示されるように、ｓＧＦＰ−タバコ構築物の分解が、既に２５ｄｐｉ後において全身の葉で検出可能であった（上段パネル）。このことがさらに継続し、その結果、植物あたり１つの分解産物のみが１０２ｄｐｉ後において検出され得るようになった（下段パネル）。より高いＧＣ含量を有する元のｓＧＦＰ構築物は２５ｄｐｉ（上部パネル）及び１０２ｄｐｉ（下部パネル）において安定であったことには留意しなければならない。いくつかの軽微な分解産物が１０２ｄｐｉにおいてのみ検出可能であった（下段パネル）。
【０１０２】
これらのデータは、ＰＶＸベクターインサートのＧＣ含量における低下がベクター安定性の低下をもたらすことを明確に示す。
【０１０３】
参考文献
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【０１０４】
ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列
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【０１０５】
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【０１０６】
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【０１０７】
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【０１０８】
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【０１０９】
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【０１１１】
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【０１１２】
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【０１１３】
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【０１１４】
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【０１１６】
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【０１１７】
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【０１１８】
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【０１１９】
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【０１２０】
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【０１２１】
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【０１２２】
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【０１２３】
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【０１２４】
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【０１２５】
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【０１２６】
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【０１２７】
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【０１２８】
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【０１２９】
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【０１３０】
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【０１３１】
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【０１３２】
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【０１３３】
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【０１３４】
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【０１３５】
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【０１３６】
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【０１３７】
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【０１３８】
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【０１３９】
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【０１４０】
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【０１４１】
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【０１４２】
本特許出願が優先権を主張する欧州特許出願第１７１９１５２４．２号（２０１７年９月１８日出願）の内容は、すべての請求項、説明、すべての図面及び配列を含めてその全体が参照によって組み込まれる。
【配列表フリーテキスト】
【０１４３】
配列表１  ＜２２３＞ＡｔＦＴ、１つのヌクレオチド交換
配列表１１  ＜２２３＞ＧＵＳ、ヌクレオチド交換：Ｇ８３５Ｃ及びＧ９０３Ａ
配列表１４  ＜２２３＞タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）のコドン使用頻度を有するＳｌＡＮＴ１
配列表１５  ＜２２３＞シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）のコドン使用頻度を有するＳｌＡＮＴ１
配列表１６  ＜２２３＞ジャガイモウイルスＸのコドン使用頻度を有するＳｌＡＮＴ１
配列表１７  ＜２２３＞ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）のコドン使用頻度を有するＳｌＡＮＴ１
配列表１８  ＜２２３＞イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）のコドン使用頻度を有するＳｌＡＮＴ１
配列表１９  ＜２２３＞オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）のコドン使用頻度を有するＳｌＡＮＴ１
配列表２０  ＜２２３＞ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）のコドン使用頻度を有するＳｌＡＮＴ１
配列表２１  ＜２２３＞イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）のコドン使用頻度を有するＳｌＬＯＧ１
配列表２２  ＜２２３＞イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ）のコドン使用頻度を有するＳｌＯＶＡＴＥ
配列表２５  ＜２２３＞オリゴヌクレオチド
配列表２６  ＜２２３＞オリゴヌクレオチド
配列表２７  ＜２２３＞ＢｓａＩ切断部位
＜２２３＞ｎは、ａ、ｃ、ｇ又はｔである
配列表２８  ＜２２３＞ドナー／アクセプタースプライシング部位
配列表３８  ＜２２３＞タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）のコドン使用頻度を有するｓＧＦＰのコード配列
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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