(57)【要約】  本発明は、ＩＬ−１５又は機能的変異体を含む１つのドメインとＩＬ−７又はＩＬ−２１に特異的な結合ドメインとを有する多特異的融合タンパク質複合体を特徴とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された可溶性融合タンパク質複合体であって、
ａ）インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含む第一の可溶性タンパク質と、及び
ｂ）免疫グロブリンＦｃドメインに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体αスシ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含む第二の可溶性タンパク質と、
を含む少なくとも２つの可溶性タンパク質を含み、
前記第一若しくは第二の可溶性タンパク質の１つがＩＬ−７結合ドメイン若しくはその機能的断片をさらに含み、及び／又は
前記第一若しくは第二の可溶性タンパク質の１つがＩＬ−２１結合ドメイン若しくはその機能的断片をさらに含み、及び
前記第一の可溶性タンパク質のＩＬ−１５ドメインが前記第二の可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する、
単離された可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項２】
前記第一のタンパク質の前記ＩＬ−１５ドメインがＮ７２Ｄ変異を含むＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）を含む、請求項１に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項３】
前記第一及び／又は第二の可溶性タンパク質に生物学的に活性な部分が付随している、請求項１又は２に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項４】
前記生物学的に活性な部分が、サイトカイン、抗体若しくはその断片、Ｔ細胞受容体若しくはその断片、受容体結合分子、受容体ドメイン、免疫チェックポイントアゴニスト、免疫チェックポイントアンタゴニスト、ケモカイン、増殖因子、毒素、細胞傷害性因子、これらの機能的断片又はこれらの組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項５】
前記生物学的に活性な部分が１つ以上のサイトカインを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項６】
前記１つ以上のサイトカインがインターロイキン７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）又はこれらの組み合わせを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項７】
前記第一の可溶性タンパク質がＩＬ−７結合ドメイン又はその機能的断片をさらに含む、請求項６に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項８】
前記第二の可溶性タンパク質がＩＬ−２１結合ドメイン又はその機能的断片をさらに含む、請求項７に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項９】
前記第一の可溶性融合タンパク質複合体が、前記第一の可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインを前記第二の可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインに結合するジスルフィド結合によって、前記第二の可溶性融合タンパク質複合体に共有結合されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項１０】
請求項１に記載の請求項に記載の第二の可溶性融合タンパク質複合体に共有結合された請求項１に記載の第一の可溶性融合タンパク質複合体を含む可溶性融合タンパク質複合体であって、前記第一の可溶性タンパク質複合体と前記第二のタンパク質複合体が同一であり又は異なる、可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項１１】
前記第一の可溶性融合タンパク質複合体が、前記第一の可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインを前記第二の可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインに結合するジスルフィド結合によって、前記第二の可溶性融合タンパク質複合体に共有結合されている、請求項１０に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項１２】
前記第一又は第二の可溶性タンパク質の１つが、疾病抗原及び／又は免疫チェックポイント又はシグナル伝達分子を認識する結合ドメインをさらに含む、請求項１０に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項１３】
前記疾病抗原が新形成又は感染性疾患と関連する、請求項１２に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項１４】
単離された可溶性融合タンパク質複合体であって、
ａ）インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含む第一の可溶性タンパク質と、及び
ｂ）免疫グロブリンＦｃドメインに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体αスシ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含む第二の可溶性タンパク質と、
を含む少なくとも２つの可溶性タンパク質を含み、
前記第一の可溶性タンパク質がＩＬ−７結合ドメイン若しくはその機能的断片をさらに含み、及び／又は
前記第二の可溶性タンパク質がＩＬ−２１結合ドメイン若しくはその機能的断片をさらに含み、及び
前記第一の可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ドメインが前記第二の可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する、
単離された可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項１５】
前記第一のタンパク質の前記ＩＬ−１５ドメインがＮ７２Ｄ変異を含むＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）を含む、請求項１４に記載の可溶性融合タンパク質複合体。
【請求項１６】
前記第一の可溶性タンパク質をコードする核酸配列が配列番号３を含む、請求項１４に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項１７】
前記第一の可溶性タンパク質をコードするアミノ酸配列が配列番号４を含む、請求項１４に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項１８】
前記第二の可溶性タンパク質をコードする核酸配列が配列番号１を含む、請求項１４に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項１９】
前記第二の可溶性タンパク質をコードするアミノ酸配列が配列番号２を含む、請求項１４に記載の可溶性融合タンパク質。
【請求項２０】
第一の可溶性タンパク質をコードする核酸配列であって、前記核酸配列が配列番号３に記載されている配列を含む、核酸配列。
【請求項２１】
第二の可溶性タンパク質をコードする核酸配列であって、前記核酸配列が配列番号１に記載されている配列を含む、核酸配列。
【請求項２２】
前記核酸配列が、可溶性タンパク質をコードする配列に作用可能に連結された、プロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列をさらに含む、請求項２０又は２１に記載の核酸配列。
【請求項２３】
請求項２０及び／又は請求項２１に記載の核酸配列を含む発現ベクター。
【請求項２４】
免疫機能を強化するための方法であって、免疫細胞を請求項１〜２３のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、これにより前記免疫細胞の免疫機能を強化することを含む、方法。
【請求項２５】
前記免疫細胞が、１）前記可溶性融合タンパク質複合体のＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、２）前記可溶性融合タンパク質複合体のＩＬ−７ドメインによって認識されるＩＬ−７Ｒ鎖、及び／又は３）前記可溶性融合タンパク質複合体のＩＬ−２１ドメインによって認識されるＩＬ−２１Ｒ鎖を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及び／又はＩＬ−２１Ｒ鎖のシグナル伝達を介して前記免疫細胞を活性化させることをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
標的細胞を死滅させるための方法であって、
複数の細胞を請求項１〜２３のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させることを含み、前記複数の細胞が標的疾病細胞及び免疫細胞を含む、方法。
【請求項２８】
前記免疫細胞が、１）前記可溶性融合タンパク質複合体のＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、２）前記可溶性融合タンパク質複合体のＩＬ−７ドメインによって認識されるＩＬ−７Ｒ鎖、及び／又は３）前記可溶性融合タンパク質複合体のＩＬ−２１ドメインによって認識されるＩＬ−２１Ｒ鎖を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫細胞の増殖を誘導すること、
前記免疫細胞を活性化すること、及び
前記活性化された免疫細胞によって前記標的疾病細胞を死滅させることを
さらに含む、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫細胞増殖がＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及び／若しくはＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達を介して誘導され、並びに／又は前記免疫細胞がＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及び／又はＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達を介して活性化される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的細胞が、腫瘍細胞、感染細胞又は老化細胞である、請求項２６〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
対象中の免疫応答を強化する方法であって、
ａ）免疫細胞を請求項１〜２３のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、
ｂ）前記免疫細胞の増殖及び活性化を誘導すること、並びに
ｃ）前記対象に前記活性化された免疫細胞を投与すること（又は養子移植する）、
を含む、方法。
【請求項３３】
前記免疫細胞が、前記可溶性融合タンパク質複合体のＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、前記可溶性融合タンパク質複合体のＩＬ−７ドメインによって認識されるＩＬ−７Ｒ鎖、及び／又は前記可溶性融合タンパク質複合体のＩＬ−２１ドメインによって認識されるＩＬ−２１Ｒ鎖を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記免疫細胞の増殖及び活性化が、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及び／又はＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達を介して誘導される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
投与すること又は養子移植が前記対象中の免疫応答を強化する、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
対象中の疾病を予防又は処置する方法であって、
ａ）免疫細胞を請求項１〜２３のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、
ｂ）前記免疫細胞の増殖及び活性化を誘導すること、
ｃ）前記対象に有効量の前記活性化された免疫細胞を投与すること（又は養子移植する）、並びに
ｄ）前記対象中の前記疾病を予防又は処置するのに十分な前記活性化された免疫細胞を介して前記疾病細胞を損傷すること又は死滅させること、
を含む、方法。
【請求項３７】
前記免疫細胞が、前記可溶性融合タンパク質複合体のＩＬ−１５ドメインによって認識される、インターロイキン−１５受容体（ＩＬ−１５Ｒ）若しくはその機能的断片、前記可溶性融合タンパク質複合体のＩＬ−７ドメインによって認識される、インターロイキン−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）若しくはその機能的断片及び／又は前記可溶性融合タンパク質複合体のＩＬ−２１ドメインによって認識される、インターロイキン−２１受容体（ＩＬ−２１Ｒ）若しくはその機能的断片を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記免疫細胞の増殖及び活性化が、ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及び／又はＩＬ−２１のシグナル伝達を介して誘導される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記疾病が、新形成、感染性疾患又は老化細胞若しくは年齢に関連する疾患である、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
対象中の免疫応答を強化する方法であって、有効量の請求項１〜２３のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項４１】
新形成、感染性疾患又は老化細胞若しくは年齢に関連する疾患の処置を必要としている対象中の新生物、感染性疾患又は老化細胞若しくは年齢に関連する疾患を処置するための方法であって、有効量の、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体を含む薬学的組成物を前記対象に投与すること、これにより、前記新生物、感染性疾患、又は老化細胞若しくは年齢に関連する疾患を処置することを含む、方法。
【請求項４２】
前記新形成が、神経膠芽腫、前立腺癌、血液癌、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌腫、黒色腫、肺癌、腎細胞癌腫、乳癌、胃及び食道癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌腫及び扁平上皮細胞頭部及び頸部癌腫からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記老化細胞又は年齢に関連する疾患が、代謝的（肥満、糖尿病）、神経性（アルツハイマー及びパーキンソン病）、筋肉、骨及び軟骨関連（筋肉減少症、変形性関節症、脊柱後弯症、椎間板ヘルニア）、組織機能不全関連（肺気腫、心血管疾患及び腎疾患並びにアテローム性動脈硬化症）疾患又はこれらの組み合わせを含む、請求項４１又は４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記免疫細胞がＮＫ細胞、Ｔ細胞又は幹細胞メモリーＴ細胞である、請求項２４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
有効量の活性化された免疫細胞が１×１０４細胞／ｋｇ〜約１×１０１０細胞／ｋｇである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記免疫細胞が１週間に少なくとも１回投与される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
有効量が約１〜１００μｇ／ｋｇの融合タンパク質複合体である、請求項２４〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記融合タンパク質複合体が１週間に少なくとも１回投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記融合タンパク質複合体が、免疫細胞増殖、活性化マーカー、標的細胞に対する細胞傷害性及びＡＤＣＣ、グランザイムＢの発現、炎症促進性サイトカインの産生、ＩＦＮ−γ又はこれらの組み合わせを増加させる、請求項２４〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
対象中の免疫応答を刺激する方法であって、
免疫細胞を単離すること、
前記免疫細胞を請求項１〜２３のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、
前記免疫細胞を前記対象中に再注入すること；これにより、
対象中の前記免疫応答を刺激すること、
を含む、方法。
【請求項５１】
前記免疫細胞が、自家、ハプロタイプ一致、ハプロタイプマッチ又はこれらの組み合わせを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記免疫細胞が自家又は同種幹細胞に由来する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記免疫細胞が、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、活性化ＮＫ（ａＮＫ）細胞、キメラ抗原受容体−ＮＫ（ＣＡＲ−ＮＫ）細胞、キメラ抗原受容体−Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞又はこれらの組み合わせを含む、請求項５１又は５２に記載の方法。
【請求項５４】
１つ以上のアジュバントを投与することを必要に応じて含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
新形成、感染性疾患又は老化細胞若しくは年齢に関連する疾患を有する対象を処置する方法であって、
ａ）免疫細胞の増殖及び活性化を誘導するために、免疫細胞を請求項１〜２３のいずれか一項に記載の可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、
ｂ）前記対象に有効量の前記活性化された免疫細胞を投与すること（又は養子移植する）、並びに
ｃ）前記対象中の前記疾病を予防又は処置するのに十分な前記活性化された免疫細胞を介して前記疾病細胞を損傷すること又は死滅させること、
を含む、方法。
【請求項５６】
前記新形成が、神経膠芽腫、前立腺癌、血液癌、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌腫、黒色腫、肺癌、腎細胞癌腫、乳癌、胃及び食道癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌腫及び扁平上皮細胞頭部及び頸部癌腫からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記老化細胞又は年齢に関連する疾患が、代謝性疾患、神経性疾患、筋肉、骨及び軟骨関連疾患、組織機能不全関連疾患又はこれらの組み合わせを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記免疫細胞が、自家、ハプロタイプ一致、ハプロタイプマッチ又はこれらの組み合わせを含む、請求項５５又は５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記免疫細胞が自家又は同種幹細胞に由来する、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫細胞が、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、活性化ＮＫ（ａＮＫ）細胞、キメラ抗原受容体−ＮＫ（ＣＡＲ−ＮＫ）細胞、キメラ抗原受容体−Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞又はこれらの組み合わせを含む、請求項５５〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年８月２８日に出願された米国仮出願第６２／５５１，２１８号の利益を主張し、その内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一般的には、多量体の融合分子の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
本明細書に記載されている発明の以前には、非特異的な免疫活性に付随する副作用なしに治療的有用性を与えるために、様々なエフェクター分子を疾病部位へ標的誘導するための新しい戦略を開発することに切迫した必要性が存在した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、多特異的なインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）をベースとするタンパク質複合体が免疫細胞の刺激を強化し、疾病細胞に対する免疫細胞の活性を促進し、これにより、疾病の縮小又は予防をもたらすという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づいている。これらのＩＬ−１５をベースとするタンパク質複合体は、疾病及び標的抗原に結合することも可能である。本明細書に提供されているのは、ＩＬ−７及びＩＬ−２１結合ドメインを含む多特異的なＩＬ−１５をベースとするタンパク質複合体である（図１）。具体的には、ＩＬ−７及びＩＬ−２１結合ドメインに融合されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ−Ｉｇ  Ｆｃ足場を含むタンパク質複合体が本明細書に記載されている。以下に詳述されているように、ヒト免疫細胞を用いて性質決定される場合、これらの複合体は、ＩＬ−１５、ＩＬ−７及びＩＬ−２１サイトカインのそれぞれの結合及び生物活性を呈する。さらに、これらの複合体は、ＩＦＮ−γの増強された産生を伴って、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の両方の増殖及び活性化を誘導する。驚くべきことに、これらの複合体は、個別のサイトカイン単独又は組み合わせによって観察されたよりも大きな程度まで、免疫応答を誘導することが可能であった。
【０００５】
そのため、単一分子としての複合体は、ＮＫ及びＴ細胞上の複数のサイトカイン受容体に結合し、これらの受容体を介してシグナルを伝達して、以前には、複数のサイトカインの組み合わせを用いた場合にのみ観察された応答を与える。さらに、これらの複合体はＩｇ分子のＦｃ領域を含んでおり、Ｉｇ分子のＦｃ領域は二量体を形成して可溶性多ポリペプチド複合体を与え、精製の目的でプロテインＡを結合し、ＮＫ細胞及びマクロファージ上のＦｃγ受容体と相互作用することができ、これにより、個別のサイトカインの組み合わせには存在しない利点を複合体に供する。臨床等級材料の大規模生産に適したこれらの複合体を作製するための、哺乳動物細胞発現をベースとする方法が、本明細書中に記載されている。本発明のタンパク質複合体による誘導に引き続き増殖するＮＫ及びＴ細胞を作製及び使用するためのさらなる方法も提供される。
【０００６】
したがって、少なくとも２つの可溶性タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体が提供される。例えば、第一のタンパク質は、ＩＬ−１５ポリペプチド、例えば、Ｎ７２Ｄ変異を含む変異体ＩＬ−１５ポリペプチド（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）を含む。第二のタンパク質は、免疫グロブリンＦｃドメインに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体αスシ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）（ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ）を含む。単離された可溶性融合タンパク質複合体の第三の成分はＩＬ−７の結合ドメインを含み、ＩＬ−７結合ドメインはＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質のいずれかに融合されている。単離された可溶性融合タンパク質複合体の第四の成分はＩＬ−２１の結合ドメインを含み、ＩＬ−２１結合ドメインはＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質のいずれかに融合されている。いくつかの事例では、ＩＬ−７及び／又はＩＬ−２１結合ドメインは、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質の両方に融合されている。他の事例では、ＩＬ−７又はＩＬ−２１結合ドメインのいずれかはＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃタンパク質に融合されており、別の結合ドメインは他のタンパク質に融合されている。例示的な融合タンパク質複合体は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄに共有結合されたＩＬ−７ポリペプチドとＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質に共有結合されたＩＬ−２１ポリペプチドとを含む（図１）。
【０００７】
例示的な第一のタンパク質は、配列番号２及び配列番号４に記載されたアミノ酸配列を含む。例示的な、第一のタンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１及び配列番号３に記載された配列を含む。一態様において、核酸配列は、融合タンパク質をコードする配列に作用可能に連結された、プロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列をさらに含む。本明細書に記載されている核酸配列を含むＤＮＡベクターも提供される。例えば、核酸配列は、複製、発現又はその両方のためにベクター中に存在する。
【０００８】
第二の可溶性融合タンパク質複合体に共有結合された第一の可溶性融合タンパク質複合体を含む可溶性融合タンパク質複合体も提供される。例えば、本発明の可溶性融合タンパク質複合体は、多量体化、例えば、二量体化、三量体化又はそれ以外に多量体化（例えば、４複合体、５複合体など）されている。例えば、多量体は、ホモ多量体又はヘテロ多量体である。可溶性融合タンパク質複合体は、共有結合、例えば、ジスルフィド結合、化学的架橋剤によって連結される。いくつかの事例において、第一の可溶性タンパク質のＦｃドメインを第二の可溶性タンパク質のＦｃドメインに連結するジスルフィド結合によって、ある可溶性融合タンパク質が別の可溶性融合タンパク質に共有結合されている。
【０００９】
Ｆｃドメイン又はその機能的断片には、ＩｇＧＦｃドメイン、ヒトＩｇＧ１Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ２Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ３Ｆｃドメイン、ヒトＩｇＧ４Ｆｃドメイン、ＩｇＡＦｃドメイン、ＩｇＤＦｃドメイン、ＩｇＥＦｃドメイン及びＩｇＭＦｃドメイン；マウスＩｇＧ２Ａドメイン又はこれらのあらゆる組み合わせからなる群から選択されるＦｃドメインが含まれる。必要に応じて、Ｆｃドメインは、変化した補体若しくはＦｃ受容体結合特性又は変化した二量体化若しくはグリコシル化特性を有するＦｃドメインをもたらすアミノ酸変化を含む。変化した補体若しくはＦｃ受容体結合特性又は変化した二量体化若しくはグリコシル化特性を有するＦｃドメインを生じるアミノ酸変化は本分野において既知である。例えば、ＩｇＧ１ＣＨ２の２３４位及び２３５位（付番は抗体コンセンサス配列に基づく）のロイシン残基（すなわち、．．．Ｐ  Ｅ  Ｌ  Ｌ  Ｇ  Ｇ．．．）のアラニン残基による置換（すなわち、．．．Ｐ  Ｅ  Ａ  Ａ  Ｇ  Ｇ．．．）はＦｃγ受容体結合の低下をもたらすのに対して、ＩｇＧ１ＣＨ２の３２２位（付番は抗体コンセンサス配列に基づく）のリジン残基（すなわち、．．．Ｋ  Ｃ  Ｋ  Ｓ  Ｌ．．．）のアラニン残基による置換（すなわち、．．．Ｋ  Ｃ  Ａ  Ｓ  Ｌ．．．）は補体活性化の低下をもたらす。いくつかの例では、このような変異が組み合わされる。
【００１０】
いくつかの態様において、ＩＬ−７又はＩＬ−２１結合ドメインは、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５ポリペプチド（又はその機能的断片）に共有結合されている。同様に、ＩＬ−７又はＩＬ−２１結合ドメインは、ポリペプチドリンカー配列によってＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能的断片）に共有結合されている。必要に応じて、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能的断片）は、ポリペプチドリンカー配列によってＦｃドメイン（又はその機能的断片）に共有結合されている。各ポリペプチドリンカー配列は、独立に選択することができる。必要に応じて、ポリペプチドリンカー配列は同一である。または、ポリペプチドリンカー配列は異なる。
【００１１】
必要に応じて、可溶性融合タンパク質の少なくとも１つが１つ以上の結合ドメイン又は検出可能な標識を含む本発明の可溶性融合タンパク質複合体が提供される。このような結合ドメインは、抗体、可溶性Ｔ細胞受容体、リガンド、可溶性受容体ドメイン又はこれらの機能的断片を含み得る。このような結合ドメインを含む、ＩＬ−１５をベースとする融合タンパク質複合体は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，４９２，１１８号に以前に記載されている。検出可能な標識には、ビオチン、ストレプトアビジン、酵素若しくは触媒的に活性なその断片、放射線核種、ナノ粒子、常磁性金属イオン、又は蛍光、リン光若しくは化学発光分子又はこれらのあらゆる組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【００１２】
本発明は、本発明の可溶性融合タンパク質複合体を作製するための方法を提供する。この方法は、ａ）第一のタンパク質をコードする適切な調節配列を有するＤＮＡベクターを第一の宿主細胞中に導入する工程と、ｂ）細胞又は培地中で第一のタンパク質を発現させるのに十分な条件下で、培地中で第一の宿主細胞を培養する工程と、ｃ）宿主細胞又は培地から第一のタンパク質を精製する工程と、ｄ）第二のタンパク質をコードする適切な調節配列を有するＤＮＡベクターを第二の宿主細胞中に導入する工程と、ｅ）細胞又は培地中で第二のタンパク質を発現させるのに十分な条件下で、培地中で第二の宿主細胞を培養する工程と、及びｆ）宿主細胞又は培地から第二のタンパク質を精製する工程と、及びｇ）可溶性融合タンパク質複合体を形成するために、第一のタンパク質のＩＬ−１５ドメインと第二のタンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の結合を可能にするのに十分な条件下で、第一及び第二のタンパク質を混合する工程と、を含む。
【００１３】
いくつかの事例において、この方法は、発現ベクターから発現されたポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能にするのに十分な条件下で、第一及び第二のタンパク質を混合することをさらに含む。
【００１４】
または、本発明の可溶性融合タンパク質複合体を作製するための方法は、ａ）第一のタンパク質をコードする適切な調節配列を有するＤＮＡベクターと第二のタンパク質をコードする適切な調節配列を有するＤＮＡベクターとを宿主細胞中に導入すること、ｂ）可溶性融合タンパク質複合体を形成するために、細胞又は培地中でタンパク質を発現させるのに及び第一のタンパク質のＩＬ−１５ドメインと第二のタンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の会合を可能にするのに十分な条件下で、培地中で宿主細胞を培養すること、並びにｃ）宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製することによって実施される。
【００１５】
一態様において、この方法は、発現ベクターから発現されたポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能にするのに十分な条件下で、第一及び第二のタンパク質を混合することをさらに含む。
【００１６】
可溶性融合タンパク質複合体を作製するための方法であって、ａ）第一及び第二のタンパク質をコードする適切な調節配列を有するＤＮＡベクターを宿主細胞中に導入すること、ｂ）可溶性融合タンパク質複合体を形成するために及びポリペプチド間でのジスルフィド結合の形成を可能にするために、細胞又は培地中でタンパク質を発現させるのに及び第一のタンパク質のＩＬ−１５ドメインと第二のタンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の会合を可能にするのに十分な条件下で、培地中で宿主細胞を培養すること、並びにｃ）宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製することを含む方法も提供される。
【００１７】
必要に応じて、この方法は、発現ベクターから発現されたポリペプチド間のジスルフィド結合の形成を可能にするのに十分な条件下で、第一及び第二のタンパク質を混合することをさらに含む。
【００１８】
いくつかの事例において、この方法は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー及び／又は臨床用試薬又は治療薬としての使用に適した十分に純粋なタンパク質複合体を生成するのに十分なその他の標準的な方法（ウイルス不活化及び／又はろ過を含む。）による複合体の精製をさらに含む。
【００１９】
本発明の可溶性融合タンパク質複合体のある態様において、ＩＬ−１５ポリペプチドは、天然のＩＬ−１５ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するＩＬ−１５変異体である。ヒトＩＬ−１５ポリペプチドは、本明細書において、ｈｕＩＬ−１５、ｈＩＬ−１５、ｈｕＩＬ１５、ｈＩＬ１５、ＩＬ−１５野生型（ｗｔ）と表され、その変異体は、天然のアミノ酸、成熟した配列中のその位置及び変異アミノ酸を用いて表される。例えば、ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄは、７２位におけるＮのＤへの置換を含むヒトＩＬ−１５を表す。一態様において、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然のＩＬ−１５ポリペプチドと比較してＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する増加した結合活性によって実証されるように、ＩＬ−１５アゴニストとして機能する。または、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然のＩＬ−１５ポリペプチドと比較してＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する減少した結合活性によって実証されるように、ＩＬ−１５アンタゴニストとして機能する。
【００２０】
免疫機能を強化する方法は、ａ）複数の細胞を本発明の可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、複数の細胞はＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、ＩＬ−７ドメインによって認識されるＩＬ−７Ｒ鎖又はＩＬ−２１ドメインによって認識されるＩＬ−２１Ｒ鎖を有する免疫細胞をさらに含み、及びｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ又はＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達を介して免疫細胞増殖及び活性化を誘導すること、によって実施される。一態様において、免疫機能を強化する方法は、可溶性融合タンパク質複合体によるＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及びＩＬ−２１Ｒの少なくとも２つ又は全部の組み合わせのシグナル伝達を介した免疫細胞の活性化をさらに含む。免疫機能を強化するための例示的な方法は、可溶性融合タンパク質複合体によるＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−１２Ｒ及びＩＬ−１８Ｒのシグナル伝達を介したＮＫ及びＴ細胞の増殖及び活性化を誘導することを含む。このような方法は、ＮＫ及びＴ細胞の増殖及び活性化を含み、増加したインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）産生をもたらす。
【００２１】
標的細胞を死滅させるための方法は、ａ）複数の細胞を本発明の可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、複数の細胞はＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、ＩＬ−７ドメインによって認識されるＩＬ−７Ｒ鎖又はＩＬ−２１ドメインによって認識されるＩＬ−２１Ｒ鎖を有する免疫細胞と標的疾病細胞とをさらに含み、ｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ又はＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達を介した免疫細胞の増殖及び活性化を誘導すること、及びｃ）活性化された免疫細胞によって標的疾病細胞を死滅させること、によって実施される。一態様において、この方法は、可溶性融合タンパク質複合体によるＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及びＩＬ−２１Ｒの少なくとも２つ又は全部の組み合わせのシグナル伝達を介した免疫細胞増殖及び活性化を誘導することを含む。例示的な方法は、可溶性融合タンパク質複合体によるＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及びＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達を介したＮＫ及びＴ細胞の増殖及び活性化を誘導することを含む。このような方法は、ＮＫ及びＴ細胞の増殖及び活性化を含み、増加したＩＦＮ−γ産生をもたらす。
【００２２】
本発明は、患者中の疾病を予防又は処置するための方法であって、ａ）ＩＬ−１５Ｒ鎖又はチェックポイント若しくはシグナル伝達分子を有する免疫細胞を本発明の可溶性融合タンパク質複合体と混合する工程と、ｂ）免疫細胞の増殖及び活性化を誘導する工程と、ｃ）患者に活性化された免疫細胞を投与する（又は養子移植する）工程と、及びｄ）患者中の疾病を予防又は処置するのに十分な活性化された免疫細胞を介して疾病細胞を損傷すること又は死滅させる工程と、を含む、方法も提供する。一態様において、この方法は、可溶性融合タンパク質複合体によるＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及びＩＬ−２１Ｒの少なくとも２つ又は全部の組み合わせのシグナル伝達を介した免疫細胞増殖及び活性化を含む。例示的な方法は、可溶性融合タンパク質複合体によるＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及びＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達を介したＮＫ及びＴ細胞の増殖及び活性化を誘導することを含む。この方法のいくつかの態様は、キメラ抗原受容体を発現するＮＫ及びＴ細胞（ＣＡＲ  ＮＫ及びＣＡＲ  Ｔ細胞）の使用を含む。本発明のいくつかの実施形態において、養子移植された細胞の生着又は生存を促進するために、患者は前処置又は前処理される。前処理の例には、シクロホスファミド及びフルダラビンでの処置が含まれる。さらに、患者は、細胞移入前及び／又は細胞移入後に、養子移植された細胞の活性化、生存又は持続性を促進する因子で処置され得る。このような処置の例には、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＡＬＴ−８０３（本明細書において互換的に「Ｎ−８０３」とも表される。）又はその他の免疫賦活性因子の使用が含まれる。養子細胞療法の分野において既知の他の治療的アプローチも（すなわち、同種、自家、ハプロタイプ一致、ＤＬＩ、幹細胞、ＮＫ９２ベースの及びＣＡＲ  ＮＫ療法を含むが、これらに限定されない。）、本明細書中の方法において使用され得る。
【００２３】
患者中の疾病を予防又は処置するための方法であって、ａ）本発明の可溶性融合タンパク質複合体を患者に投与する工程と、ｂ）患者中の免疫細胞の増殖及び活性化を誘導する工程と、並びにｃ）患者中の疾病を予防又は処置するのに十分な活性化された免疫細胞を介して疾病細胞を損傷又は死滅する工程とを含む方法も提供される。
【００２４】
本発明の融合タンパク質複合体の投与は、対象中で免疫応答を誘導する。例えば、本発明の融合タンパク質複合体の投与は、新形成、感染性疾患、老化細胞若しくは年齢に関連する疾患又は自己免疫疾患と関連する細胞に対する免疫応答を誘導する。一態様において、本発明の融合タンパク質複合体は、免疫細胞増殖、活性化マーカー、標的細胞に対する細胞傷害性及び／又は炎症促進性サイトカインの産生を増加させる。
【００２５】
本発明は、有効量の本発明の可溶性融合タンパク質複合体を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物中の免疫応答を刺激する方法を提供する。本発明は、有効量の本発明のいずれか１つの可溶性融合タンパク質複合体を哺乳動物に投与することによって、哺乳動物中の免疫応答を抑制する方法も提供する。
【００２６】
新形成、感染性疾患、老化細胞若しくは年齢に関連する疾患又は自己免疫疾患の処置を必要としている対象中の新形成、感染性疾患、老化細胞若しくは年齢に関連する疾患又は自己免疫疾患を処置するための方法は、有効量の、増大された及び活性化された免疫細胞又は本明細書に記載された可溶性融合タンパク質複合体を含む薬学的組成物を対象に投与することによって実施される。例えば、固形又は血液の悪性病変の処置を必要とする対象中の固形又は血液の悪性病変を処置するための方法であって、本発明の可溶性融合タンパク質複合体によってエクスビボで増大された、有効量の、ＮＫ細胞及びＴ細胞並びに／又はＣＡＲ  ＮＫ及びＣＡＲ  Ｔ細胞を対象に投与すること、これにより、悪性病変を処置することによって実施される。例示的な可溶性融合タンパク質複合体は、配列番号２及び配列番号４に記載されたアミノ酸配列を含む。
【００２７】
本明細書中に記載されている方法を用いた処置のために適切な新形成には、神経膠芽腫、前立腺癌、急性骨髄性白血病、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌腫、黒色腫、肺癌、腎細胞癌腫、乳癌、胃及び食道癌、頭部及び頸部癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌腫及び扁平上皮細胞頭部及び頸部癌腫が含まれる。
【００２８】
本明細書に記載された方法を用いた処置のための例示的な感染症には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）による感染症が含まれる。本明細書に記載された方法は、細菌性感染症（例えば、グラム陽性又はグラム陰性細菌）を処置するためにも有用である（例えば、Ｏｌｅｋｓｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．５２６：１２４−３１参照、参照により本明細書に組み込まれる。）。
【００２９】
本発明の細胞療法は、有効量の増大された及び活性化された免疫細胞の投与を含む。例えば、有効量の増大された及び活性化されたＮＫ又はＴ細胞は、１×１０４細胞／ｋｇ〜１×１０１０細胞／ｋｇ、例えば、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９及び１×１０１０細胞／ｋｇ又は白血球除去によって単離されることができる量である。または、増大された免疫細胞は、固定された用量で又は体表面積に基づいて（すなわち、ｍ２当たり）投与される。細胞は、エクスビボでの増大後に投与することができ、又は冷凍保存され、融解（及び必要に応じて洗浄）した後に投与することができる。
【００３０】
融合タンパク質複合体を含む薬学的組成物は、有効量で投与される。例えば、有効量の薬学的組成物は、約１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、例えば、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は１００μｇ／ｋｇである。または、ＴｘＭ複合体は、固定された用量として、又は体表面積に基づいて（すなわち、ｍ２当たり）投与される。
【００３１】
養子移植された免疫細胞又は融合タンパク質複合体を含む薬学的組成物は、一ヶ月に少なくとも１回、例えば、一ヶ月に２回、一週に１回、一週に２回、１日に１回、１日に２回、８時間ごと、４時間ごと、２時間ごと又は１時間ごとに投与される。養子移植された免疫細胞についての適切な投与の様式には、全身投与、静脈内投与又は局所投与が含まれる。薬学的組成物についての適切な投与の様式には、全身投与、静脈内投与、局所投与、皮下投与、筋肉内投与、腫瘍内投与、吸入及び腹腔内投与が含まれる。
【課題を解決するための手段】
【００３２】
一態様において、本開示は、少なくとも２つの可溶性タンパク質を含む単離された可溶性融合タンパク質複合体であって、第一の可溶性タンパク質がインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含み、及び第二の可溶性タンパク質が免疫グロブリンＦｃドメインに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体αスシ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含み、第一又は第二の可溶性タンパク質の１つがＩＬ−７結合ドメイン若しくはその機能的断片をさらに含み、第一又は第二の可溶性タンパク質の１つがＩＬ−２１結合ドメイン若しくはその機能的断片をさらに含み、及び第一の可溶性タンパク質のＩＬ−１５ドメインが第二の可溶性タンパク質のＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する、単離された可溶性融合タンパク質複合体を提供する。
【００３３】
一実施形態において、ＩＬ−１５ポリペプチドは、Ｎ７２Ｄ変異を含むＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）である。
【００３４】
一実施形態において、第一の可溶性タンパク質は配列番号２に記載されたアミノ酸配列を含む。
【００３５】
一実施形態において、第二の可溶性タンパク質は配列番号４に記載されたアミノ酸配列を含む。
【００３６】
一実施形態において、第一の可溶性融合タンパク質複合体は、第二の可溶性融合タンパク質複合体に共有結合され得る。
【００３７】
一実施形態において、第一の可溶性融合タンパク質複合体は、第一の可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインを第二の可溶性融合タンパク質複合体のＦｃドメインに結合するジスルフィド結合によって、第二の可溶性融合タンパク質複合体に共有結合されている。
【００３８】
一実施形態において、第一又は第二の可溶性タンパク質は、疾病抗原を認識する結合ドメインをさらに含む。
【００３９】
一実施形態において、第一又は第二の可溶性タンパク質は、免疫チェックポイント又はシグナル伝達分子を認識する結合ドメインをさらに含む。
【００４０】
一実施形態において、疾病抗原は、新形成、感染性疾患又は老化細胞若しくは年齢に関連する疾患と関連する。
【００４１】
一実施形態において、第一の可溶性タンパク質は配列番号１に記載された核酸配列によってコードされる。
【００４２】
一実施形態において、核酸配列は、可溶性タンパク質をコードする配列に作用可能に連結された、プロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列をさらに含む。
【００４３】
一実施形態において、第二の可溶性タンパク質は配列番号３に記載された核酸配列によってコードされ得る。
【００４４】
一実施形態において、核酸配列は、可溶性タンパク質をコードする配列に作用可能に連結された、プロモーター、翻訳開始シグナル及びリーダー配列をさらに含む。
【００４５】
一実施形態において、ＤＮＡベクターは、上に列挙された核酸配列のいずれをも含み得る。
【００４６】
一実施形態において、免疫機能を強化するための方法は、ａ）複数の細胞を上記可溶性融合タンパク質複合体のいずれかと接触させること、複数の細胞はＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、ＩＬ−７ドメインによって認識されるＩＬ−７Ｒ鎖及び／又はＩＬ−２１ドメインによって認識されるＩＬ−２１Ｒ鎖を有する免疫細胞をさらに含み、並びにｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及び／又はＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達を介して免疫細胞の増殖及び活性化を誘導すること、を含む。
【００４７】
一態様において、本開示は、標的細胞を死滅させるための方法であって、ａ）複数の細胞を上記可溶性融合タンパク質複合体のいずれかと接触させること、複数の細胞はＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、ＩＬ−７ドメインによって認識されるＩＬ−７Ｒ鎖及び／又はＩＬ−２１ドメインによって認識されるＩＬ−２１Ｒ鎖を有する免疫細胞と標的疾病細胞とをさらに含み、ｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及び／又はＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達を介した免疫細胞の増殖及び活性化を誘導すること、並びにｃ）増大された及び活性化された免疫細胞によって標的疾病細胞を死滅させることを含む方法を提供する。
【００４８】
一実施形態において、標的細胞は、腫瘍細胞又は感染細胞である。
【００４９】
一態様において、本開示は、対象中の免疫応答を強化する方法であって、ａ）複数の細胞を上記可溶性融合タンパク質複合体のいずれかと接触させること、複数の細胞はＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、ＩＬ−７ドメインによって認識されるＩＬ−７Ｒ鎖及び／又はＩＬ−２１ドメインによって認識されるＩＬ−２１Ｒ鎖を有する免疫細胞をさらに含み、ｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及び／又はＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達を介した免疫細胞の増殖及び活性化を誘導すること、ｃ）増大された及び活性化された免疫細胞を患者に投与する（又は養子移植する）こと、並びにｄ）患者中の免疫応答を強化することを含む方法を提供する。
【００５０】
一態様において、本開示は、患者中の疾病を予防又は処置する方法であって、ａ）複数の細胞を本明細書中で具体化された可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、複数の細胞はＩＬ−１５ドメインによって認識されるＩＬ−１５Ｒ鎖、ＩＬ−７ドメインによって認識されるＩＬ−７Ｒ鎖及び／又はＩＬ−２１ドメインによって認識されるＩＬ−２１Ｒ鎖を有する免疫細胞をさらに含み、ｂ）ＩＬ−１５Ｒ、ＩＬ−７Ｒ及び／又はＩＬ−２１Ｒのシグナル伝達を介した免疫細胞の増殖及び活性化を誘導すること、ｃ）有効量の増大された及び活性化された免疫細胞を患者に投与する（又は養子移植する）こと、並びにｄ）患者中の疾病を予防又は処置するのに十分な増大された免疫細胞を介して疾病細胞を損傷すること又は死滅させること、を含む方法を提供する。
【００５１】
ある実施形態において、対象中の免疫応答を刺激する方法は、免疫細胞を単離すること、免疫細胞を本明細書中に具体化された可溶性融合タンパク質複合体と接触させること、免疫細胞を対象中に再注入すること；これにより、対象中の免疫応答を刺激すること、を含む。ある実施形態において、免疫細胞は、自家、ハプロタイプ一致、ハプロタイプマッチ又はこれらの組み合わせを含む。ある実施形態において、免疫細胞は自家又は同種幹細胞に由来する。ある実施形態において、免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、幹細胞メモリーＴ細胞、活性化ＮＫ（ａＮＫ）細胞、キメラ抗原受容体−ＮＫ（ＣＡＲ−ＮＫ）細胞、キメラ抗原受容体−Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞又はこれらの組み合わせを含む。ある実施形態において、１つ以上のアジュバントが、本明細書中に具体化された可溶性融合タンパク質複合体とともに必要に応じて投与される。
【００５２】
一実施形態において、疾病は、新形成、感染性疾患又は老化細胞若しくは年齢に関連する疾患である。
【００５３】
一態様において、本開示は、対象中の免疫応答を強化する方法であって、有効量の上記可溶性融合タンパク質複合体のいずれかを対象に投与することを含む方法を提供する。
【００５４】
一態様において、本開示は、新形成、感染性疾患又は老化細胞若しくは年齢に関連する疾患の処置を必要としている対象中の新形成、感染性疾患又は老化細胞若しくは年齢に関連する疾患を処置するための方法であって、有効量の、上記可溶性融合タンパク質複合体のいずれかを含む薬学的組成物を前記対象に投与すること、これにより、前記新形成、感染性疾患、又は老化細胞若しくは年齢に関連する疾患を処置することを含む、方法を提供する。
【００５５】
他の態様において、新形成、感染性疾患又は老化細胞若しくは年齢に関連する疾患を有する対象を処置する方法は、ａ）免疫細胞の増殖及び活性化を誘導するために、免疫細胞を上記可溶性融合タンパク質複合体のいずれかと接触させること、ｂ）対象に有効量の活性化された免疫細胞を投与する（又は養子移植する）こと、並びにｃ）対象中の疾病を予防又は処置するのに十分な活性化された免疫細胞を介して疾病細胞を損傷すること又は死滅させること、を含む。
【００５６】
一実施形態において、新形成は、神経膠芽腫、前立腺癌、血液癌、Ｂ細胞新生物、多発性骨髄腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、固形腫瘍、尿路上皮／膀胱癌腫、黒色腫、肺癌、腎細胞癌腫、乳癌、胃及び食道癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸直腸癌、卵巣癌、非小細胞肺癌腫及び扁平上皮細胞頭部及び頸部癌腫からなる群から選択される。
【００５７】
別の実施形態において、老化細胞又は年齢に関連する疾患は、代謝的（肥満、糖尿病）、神経性（アルツハイマー及びパーキンソン病）、筋肉、骨及び軟骨関連（筋肉減少症、変形性関節症、脊柱後弯症、椎間板ヘルニア）又は組織機能不全関連（肺気腫、心血管疾患及び腎疾患並びにアテローム性動脈硬化症）疾患からなる群から選択される。
【００５８】
一実施形態において、免疫細胞は、ＮＫ細胞又はサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＬ；ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｍｏｒｙ  ｌｉｋｅ）ＮＫ細胞である。
【００５９】
別の実施形態において、免疫細胞は、Ｔ細胞又はメモリー幹Ｔ細胞（ＴＳＣＭ）である。
【００６０】
一実施形態において、増大された及び活性化された免疫細胞の有効量は、１×１０４細胞／ｋｇ〜１×１０１０細胞／ｋｇである。
【００６１】
一実施形態において、免疫細胞は１週間に少なくとも１回投与される。
【００６２】
一実施形態において、有効量は約１〜１００μｇ／ｋｇ前記融合タンパク質複合体である。
【００６３】
一実施形態において、融合タンパク質複合体は１週間に少なくとも１回投与される。
【００６４】
一実施形態において、融合タンパク質複合体は、免疫細胞増殖、活性化マーカー、標的細胞に対する細胞傷害性及び／又はＩＦＮ−γを含む炎症促進性サイトカインの産生を増加させる。
【００６５】
好ましくは、融合タンパク質複合体は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の血清レベルを増加させ及び／又はＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞及びＮＫ細胞を刺激して、対象中の疾病細胞又は腫瘍細胞を死滅させる。
【００６６】
定義
別段の定義がなければ、本明細書で使用されている全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野において通常の知識を有する者によって通常理解される意味を有する。本明細書中で使用される用語法は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、本発明の限定を意図しない。
【００６７】
以下の参考文献は、本発明において使用される用語の多くの一般的定義を当業者に与える：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（２ｎｄ  ｅｄ．１９９４）；Ｔｈｅ  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄ．，１９８８）；Ｔｈｅ  Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，５ｔｈ  Ｅｄ．，Ｒ．Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ（１９９１）；及びＨａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，Ｔｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１）。本明細書において使用される以下の用語は、別段の記載がなければ、以下でそれらの用語に帰属された意味を有する。
【００６８】
本明細書において使用される単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に反対の意味を示さなければ、複数形も含むものとする。さらに、用語「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「ともに（ｗｉｔｈ）」又はこれらの変形が詳細な説明及び／又は特許請求の範囲のいずれかにおいて使用されている限りにおいては、このような用語は、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同様に包括的（ｉｎｃｌｕｓｉｖｅ）であることが意図される。
【００６９】
具体的に記載されていなければ又は文脈から明白でなければ、本明細書において使用される用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、単数又は複数であると理解される。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される「又は（ｏｒ）」という用語は、文脈が明確に反対の意味を規定しなければ、「及び／又は」を含むその意味で一般に使用される。
【００７０】
具体的に記載されていなければ又は文脈から明白でなければ、本明細書において使用される用語「約」は、本分野における通常の許容の範囲内、例えば平均の２標準偏差以内として理解される。約は、記載された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％以内として理解することができる。文脈から反対の意味であることが明確でなければ、本明細書中に提供される全ての数値は、約という用語によって修飾される。
【００７１】
「因子（ａｇｅｎｔ）」によって、ペプチド、核酸分子又は小さな化合物が意味される。
【００７２】
「ＡＬＴ−８０３」又は「Ｎ−８０３」によって、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質と非共有結合で会合されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄを含み、及び免疫刺激活性を有する複合体が意味される。この複合体は、ＩＬ−１５ＳＡとも表される。一実施形態において、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質は、参照配列と比較して、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれより多いアミノ酸の変異を含む。
【００７３】
「ＴｘＭ」によって、結合ドメインに連結されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ足場を含む複合体が意味される（図１）。例示的なＴｘＭは、ＩＬ−７及びＩＬ−２１サイトカインへの融合物を含むＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ複合体である。
【００７４】
「軽減する」によって、病気の発生又は進行を減少する、抑制する、弱化する、減弱する、停止する、又は安定化することが意味される。
【００７５】
「類縁体」によって、同一でないが、類似の機能的又は構造的特徴を有する分子が意味される。例えば、ポリペプチド類縁体は、対応する天然に存在するポリペプチドの生物活性を保持するが、天然に存在するポリペプチドと比較して類縁体の機能を強化するある生化学的修飾を有する。このような生化学的修飾は、例えば、リガンド結合を変化させずに、類縁体のプロテアーゼ耐性、膜透過性又は半減期を増加させ得る。類縁体は、非天然のアミノ酸を含み得る。ヌクレオシドに関する「類縁体」には、修飾された塩基部分及び／又は修飾された糖部分を有する合成ヌクレオシドが含まれ、例えば、Ｓｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０；Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．，１９９７，２５（２２），４４２９−４４４３，Ｔｏｕｌｍｅ，Ｊ．Ｊ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９：１７−１８（２００１）；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  Ｍ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １４８９：１１７−１３９（１９９９）；Ｆｒｅｉｅｒ  Ｓ．Ｍ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５：４４２９−４４４３（１９９７），Ｕｈｌｍａｎ，Ｅ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，３：２０３−２１３（２０００），Ｈｅｒｄｅｗｉｎ  Ｐ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１０：２９７−３１０（２０００））；２’−Ｏ，３’−Ｃ−ｌｉｎｋｅｄ［３．２．０］ｂｉｃｙｃｌｏａｒａｂｉｎｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ（例えば、Ｎ．ＫＣｈｒｉｓｔｉｅｎｓｅｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０：５４５８−５４６３（１９９８）参照）によって一般的に記載されている。このような類縁体には、例えば、二重の又は三重の安定性、特異性など結合特性を増強するように設計された合成ヌクレオシドが含まれる。
【００７６】
本発明は、所望の生物学的活性を呈する限り、抗体又はこのような抗体の断片を含む。ヒト化抗体などのキメラ抗体も本発明に含まれる。一般に、ヒト化抗体は、その中に導入された非ヒト起源からの１つ以上のアミノ酸残基を有する。ヒト化は、例えば、本分野において記載された方法を用いて、げっ歯類の相補性決定領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域で置換することによって実施することができる。
【００７７】
「抗体」又は「免疫グロブリン」という用語は、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方を包含するものとする。好ましい抗体は、抗原と反応するモノクローナル抗体である。「抗体」という用語は、抗原と反応する１より多い抗体の混合物（例えば、抗原と反応するモノクローナル抗体の異なる種類のカクテル）も包含するものとする。「抗体」という用語は、全抗体、生物学的に機能的なその断片、一本鎖抗体、並びに１より多い種から得られる部分を含むキメラ抗体、二機能性抗体、抗体接合体、ヒト化及びヒト抗体などの遺伝子改変された抗体を包含することがさらに意図される。同じく使用することができる生物学的に機能的な抗体断片は、抗原への結合のために十分である抗体由来のペプチド断片である。本明細書において使用される「抗体」は、完全な抗体及び目的のエピトープ、抗原又は抗原性断片を結合することが可能なあらゆる抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）を含むものとする。
【００７８】
本明細書において使用される「と会合した」、「接合された」、「連結された」、「付着された」及び「繋留された」という用語は、２つ以上の部分に関して使用される場合、直接的に（例えば、共有結合）又は連結因子としての役割を果たす１つ以上のさらなる部分を介して、これらの部分が互いに物理的に会合し、又は接続されて、当該構造が使用されている条件、例えば、生理的条件下で、これらの部分が物理的に会合された状態を保つように十分に安定した構造を形成することを意味する。いくつかの実施形態において、十分な数のより弱い相互作用は、部分が様々な異なる条件下で物理的に会合された状態を保つために十分な安定性を与えることができる。
【００７９】
分子「に結合する」によって、その分子に対して物理化学的親和性を有することを意味する。
【００８０】
「結合ドメイン」という用語は、抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン又は本分野において既知の他の抗原特異的ポリペプチドを包含するものとする。
【００８１】
本明細書において使用される「生物学的に活性な部分」又は「エフェクター分子」という用語は、本明細書中に論述されているような所望の効果をもたらすことができる、核酸配列、タンパク質、ポリペプチド又はペプチドなどのアミノ酸配列；糖又は多糖；脂質又は糖脂質、糖タンパク質又はリポタンパク質を意味する。エフェクター分子は、化学的因子も含む。生物学的に活性な又はエフェクタータンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコードするエフェクター分子核酸も想定される。このため、適切な分子には、制御因子、酵素、抗体又は薬物並びにＤＮＡ、ＲＮＡ及びオリゴヌクレオチドが含まれる。生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子は、天然に存在することができ、又は、例えば組換え若しくは化学的合成によって、既知の成分から合成することができ、異種の成分を含むことができる。生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子は、遠心又はＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの標準的な分子サイズ測定技術によって判断した場合に、一般的には、約０．１〜１００ＫＤ又はより大きく最大約１０００ＫＤであり、好ましくは約０．１、０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０と５０ＫＤの間である。本発明の所望の効果には、例えば、例えば、疾病を予防若しくは処置する上で、細胞増殖若しくは細胞死を誘導し、免疫応答を開始するために、又は診断目的のための検出分子として作用するために、増加した結合活性を有する本発明の融合タンパク質複合体を形成すること、標的細胞を死滅させることが含まれるが、これらに限定されない。このような検出のために、アッセイ、例えば、細胞を増殖させるために細胞を培養する工程、及び細胞を本発明の融合複合体と接触させる工程及び次いで、融合複合体が細胞のさらなる発達を阻害するかどうかを評価する工程という逐次的工程を含むアッセイを使用することができる。
【００８２】
本発明にしたがって、本発明の融合タンパク質複合体にエフェクター分子を共有結合することは、多数の著しい利点を提供する。既知の構造のペプチドを含む、単一のエフェクター分子を含有する本発明の融合タンパク質複合体を作製することができる。さらに、様々なエフェクター分子を類似のＤＮＡベクター中で作製することができる。すなわち、異なるエフェクター分子のライブラリーは、感染した細胞又は疾病細胞の認識のために融合タンパク質複合体に連結することができる。さらに、治療的用途については、対象への本発明の融合タンパク質複合体の投与よりむしろ、融合タンパク質複合体のインビボ発現のために、融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列ベクターを投与することができる。このようなアプローチは、組換えタンパク質の調製に通例伴う費用のかかる精製工程を回避し、従来のアプローチに伴う抗原取り込み及び加工の複雑さを回避する。
【００８３】
記載されているように、融合タンパク質が意図された機能を有せば、ほぼあらゆる様式で、本明細書中に開示された融合タンパク質の成分、例えば、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質毒素、免疫グロブリンドメイン又はその他の生理活性分子及びあらゆるペプチドリンカーなどのエフェクター分子を組織化することができる。特に、融合タンパク質の各成分は、所望であれば、少なくとも１つの適切なペプチドリンカー配列によって、別の成分から間隔を空けることができる。さらに、融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質の修飾、同定及び／又は精製を促進するために、タグを含み得る。より具体的な融合タンパク質は、以下に記載された実施例中にある。
【００８４】
本明細書において使用される「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語は、免疫細胞を活性化又は刺激することが可能な細胞内シグナル伝達ドメインに融合された抗原−結合ドメインを表し、ある実施形態において、ＣＡＲは膜貫通ドメインも含む。ある実施形態において、ＣＡＲの細胞外抗原−結合ドメインは、マウス又はヒト化モノクローナル抗体の可変重及び軽領域を融合することによって得られた一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）から構成される。または、（例えば、Ｆａｂライブラリーから得られた、抗体からに代えて）Ｆａｂに由来するｓｃＦｖが使用され得る。様々な実施形態において、ｓｃＦｖは膜貫通ドメインに融合され、次いで、細胞内シグナル伝達ドメインに融合される。「第一世代」ＣＡＲには、抗原結合に際してＣＤ３ζシグナルを専ら与えるものが含まれ、「第二世代」ＣＡＲには、共刺激（例えば、ＣＤ２８又はＣＤ１３７）及び活性化（ＣＤ３ζ）の両方を与えるものが含まれる。「第三世代」ＣＡＲには、多重共刺激（例えば、ＣＤ２８及びＣＤ１３７）及び活性化（ＣＤ３ζ）を与えるものが含まれる。ＣＡＲの第四世代、ＣＡＲ構築物を含有するベクターがサイトカインカセット（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｃａｓｓｅｔｔｅ）を有するサイトカインキリングのために再誘導されたＣＡＲ  Ｔ細胞（ＴＲＵＣＫＳ（Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｆｏｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｋｉｌｌｉｎｇ））が記載されてきた。ＣＡＲが連結されると、ＣＡＲ  Ｔ細胞は腫瘍病変中に炎症促進性サイトカインを堆積する。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞である。ＣＡＲ−ＮＫ細胞は、キメラ抗原受容体を発現するＮＫ細胞である。キメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）は、細胞外ドメインに抗原が結合した際に、細胞が特殊化された機能を発揮するように指示する細胞内ドメインに連結された抗原特異的細胞外ドメインを有する。「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」及び「キメラ免疫受容体」という用語は、本明細書において、それぞれ、「キメラ抗原受容体」という用語と互換的に使用され得る。キメラ抗原受容体は、ＭＨＣ非依存性抗原を結合し、かつその細胞内ドメインを介して活性化シグナルを伝達する能力によって、他の抗原結合因子と区別される。
【００８５】
「検出する」とは、検出されるべき分析物の存在、不存在又は量を特定することを表す。
【００８６】
「疾病」によって、細胞、組織又は器官の正常な機能を損傷し、又は妨害するあらゆる症状又は障害が意味される。疾病の例には、新形成、自己免疫疾患、ウイルス性感染症並びに老化細胞及び年齢に関連する疾患が含まれる。
【００８７】
調合物又は調合物成分の「有効量」又は「治療的に有効な量」という用語によって、単独で又は組み合わせで、所望の効果を与える製剤又は成分の十分な量が意味される。例えば、「有効量」によって、単独で又は組み合わせで、処置されていない患者と比べて疾病の症候を軽減するのに必要とされる化合物の量が意味される。疾病の治療的処置のために本発明を実施するために使用される活性化合物の有効量は、投与の様式、対象の年齢、体重及び全般的な健康に応じて変動する。最終的には、主治医又は獣医師が、適切な量及び投与計画を決定するであろう。このような量は、「有効」量と称される。
【００８８】
「断片」によって、ポリペプチド又は核酸分子の一部が意味される。この部分は、好ましくは、参照核酸分子又はポリペプチドの全体の長さの少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％を含有する。例えば、断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００又は１０００のヌクレオチド又はアミノ酸を含有し得る。しかしながら、それぞれ、完全長のポリペプチド及び核酸の所望される生物活性を示す限り、本発明は、ポリペプチド及び核酸断片も含む。ほとんどあらゆる長さの核酸断片が利用される。例えば、長さが約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００、約５０塩基対の全長（全ての中間の長さを含む。）を有する例示的なポリヌクレオチドセグメントが、本発明の多くの実施に含まれる。同様に、ほとんどあらゆる長さのポリペプチド断片が利用される。例えば、長さが約１０，０００、約５，０００、約３，０００、約２，０００、約１，０００、約５，０００、約１，０００、約５００、約２００、約１００又は約５０アミノ酸の全長（全ての中間の長さを含む。）を有する例示的なポリペプチドセグメントが、本発明の多くの実施に含まれる。
【００８９】
本明細書において使用される「免疫細胞」という用語は、骨髄中で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌｓ）（白血球細胞（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ））を全般的に含み、「免疫細胞」は、例えば、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）及び骨髄系由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）を含む。
【００９０】
本明細書において使用される「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫応答に、例えば、免疫エフェクター応答の促進に関与する細胞を表す。免疫エフェクター細胞の例には、Ｔ細胞、例えば、α／βＴ細胞及びγ／δＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫ−Ｔ）細胞、肥満細胞並びに骨髄系由来貪食細胞が含まれる。「免疫エフェクター機能又は免疫エフェクター応答」は、この用語が本明細書において使用される場合、標的細胞の免疫攻撃を強化又は促進する、例えば免疫エフェクター細胞の機能又は応答を表す。例えば、免疫エフェクター機能又は応答は、標的細胞の、死滅又は成長若しくは増殖の阻害を促進するＴ又はＮＫ細胞の特性を表す。Ｔ細胞の場合には、一次刺激又は共刺激が免疫エフェクター機能又は応答の例である。
【００９１】
「単離された」、「精製された」又は「生物学的に純粋な」という用語は、その天然状態で見出されたときに通常その物質を伴っている成分を様々な程度で含まない物質を表す。「単離する」は、元の供給源又は環境からのある程度の分離を表す。「精製する」は、単離より高い分離の程度を表す。
【００９２】
「精製された」又は「生物学的に純粋な」タンパク質は、いずれの不純物もタンパク質の生物学的特性に対して実質的に影響を及ぼさない又はその他の有害な結果を引き起こさないように、十分に他の物質を含まない。すなわち、細胞物質、ウイルス物質、又は組換えＤＮＡ技術によって産生されたときの培地、又は化学的に合成されたときの化学的前駆体若しくは他の化学物質を実質的に含まなければ、本発明の核酸又はペプチドは精製されている。純度又は均一性は、典型的には、分析的化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーを用いて測定される。「精製された」という用語は、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲル中において本質的に１つのバンドを生じることを表すことができる。修飾、例えば、リン酸化又はグリコシル化に供することができるタンパク質については、異なる修飾が、異なる単離されたタンパク質を生じることがあり得、それらは別個に精製することができる。
【００９３】
同様に、「実質的に純粋な」によって、自然な状態で当該ヌクレオチド又はポリペプチドを伴っている成分から分離されたヌクレオチド又はポリペプチドが意味される。典型的には、ヌクレオチド及びポリペプチドは、自然な状態で当該ヌクレオチド及びポリペプチドに付随しているタンパク質及び天然に存在する有機分子を少なくとも６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％又は９９重量％含まないときに実質的に純粋である。
【００９４】
「単離された核酸」によって、当該核酸が由来する生物の天然に存在するゲノム中で当該核酸に隣接する遺伝子が存在しない核酸が意味される。この用語は、例えば、（ａ）天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部であるＤＮＡであるが、当該ＤＮＡが自然な状態でその中に存在する生物のゲノム中の該分子のその部分に隣接する核酸配列の両方が隣接していないＤＮＡ；（ｂ）生じた分子がいずれの天然に存在するベクター又はゲノムＤＮＡとも同一でないように、ベクター中に又は原核生物若しくは真核生物のゲノムＤＮＡ中に組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって産生された断片又は制限断片などの分離した分子；及び（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列を包含する。本発明による単離された核酸分子には、合成的に生産された分子並びに化学的に改変された及び／又は修飾された骨格を有するあらゆる核酸がさらに含まれる。例えば、単離された核酸は精製されたｃＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドである。単離された核酸分子には、メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）分子も含まれる。
【００９５】
「単離されたポリペプチド」によって、自然な状態で当該ポリペプチドを伴っている成分から分離された本発明のポリペプチドが意味される。典型的には、ポリペプチドは、自然な状態で当該ポリペプチドに付随しているタンパク質及び天然に存在する有機分子を少なくとも６０重量％含まないときに単離されている。好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％、本発明のポリペプチドである。本発明の単離されたポリペプチドは、例えば、天然源からの抽出によって、このようなポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、又はタンパク質を化学的に合成することによって取得され得る。純度は、任意の適切な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はＨＰＬＣ分析によって測定することができる。
【００９６】
「マーカー」によって、疾病又は障害に関連する発現レベル又は活性の変化を有するいずれのタンパク質又はポリヌクレオチドも意味される。
【００９７】
「新形成」によって、過剰な増殖又は低下したアポトーシスによって特徴付けられる疾病又は障害が意味される。それに対して本発明を使用することができる例示的な新生物には、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病）、真性多血症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、ワルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病並びに肉腫及び癌腫などの固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸（ｃｏｌｏｎ）癌腫、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮細胞癌腫、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌腫、気管支原性肺癌腫、腎細胞癌腫、肝細胞腫、胆管癌腫（ｎｉｌｅ  ｄｕｃｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、絨毛癌腫、精上皮腫、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮癌、精巣癌、肺癌腫、小細胞肺癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、多形神経膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫及び網膜芽細胞腫）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、新形成は、多発性骨髄腫、β細胞リンパ腫、尿路上皮／膀胱癌腫又は黒色腫である。本明細書において使用される、「因子を取得すること」におけるような「取得すること」には、因子を合成し、購入し、又はその他獲得することが含まれる。
【００９８】
本明細書において使用される、「核酸配列」、「ポリヌクレオチド」及び「遺伝子」という用語は、本明細書を通じて互換的に使用され、デオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、これらの置換された及びαアノマー形態、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ホスホロチオエート、メチルホスホネートなどを含む、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、天然の及び／又は修飾された単量体又は連結の直鎖又は環状オリゴマー又はポリマーを含む。ポリヌクレオチドには、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術及びＰＣＲＴＭなどを用いた組換えライブラリー又は細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングを含むがこれらに限定されない本分野において利用可能なあらゆる手段によって、及び合成手段によって取得される全ての核酸配列が含まれるが、これに限定されない。
【００９９】
核酸配列は、「キメラ」であってもよい、すなわち、異なる領域から構成されてもよい。本発明の文脈において、「キメラ」化合物は、２つ以上の化学的領域、例えば、１つ又は複数のＤＮＡ領域、１つ又は複数のＲＮＡ領域、１つ又は複数のＰＮＡ領域などを含有するオリゴヌクレオチドである。各化学的領域は、少なくとも１つの単量体単位、すなわち、ヌクレオチドから構成される。これらの配列は、１つ以上の所望の特性を示すために配列が修飾されている少なくとも１つの領域を典型的に含む。
【０１００】
本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチド又はその断片をコードするいずれの核酸分子も含まれる。このような核酸分子は内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示すであろう。内在性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリッド形成することができる。本発明の方法において有用な核酸分子には、本発明のポリペプチド又はその断片をコードするいずれの核酸分子も含まれる。このような核酸分子は内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、典型的には実質的な同一性を示すであろう。内在性配列に対して「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的には、二本鎖核酸分子の少なくとも１つの鎖とハイブリッド形成することができる。「ハイブリッド形成する」によって、様々なストリンジェンシーの条件下において、相補的ポリヌクレオチド配列（例えば、本明細書中に記載されている遺伝子）又はその一部の間で二本鎖分子を形成する対が意味される。（例えば、Ｗａｈｌ，Ｇ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｓ．Ｌ．Ｂｅｒｇｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：３９９；Ｋｉｍｍｅｌ，Ａ．Ｒ．（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５２：５０７を参照。）
【０１０１】
例えば、ストリンジェントな塩濃度は、通常、約７５０ｍＭ未満ＮａＣｌ及び約７５ｍＭ未満クエン酸三ナトリウム、好ましくは約５００ｍＭ未満ＮａＣｌ及び約５０ｍＭ未満クエン酸三ナトリウム、より好ましくは約２５０ｍＭ未満ＮａＣｌ及び約２５ｍＭ未満クエン酸三ナトリウムであろう。低ストリンジェンシーハイブリッド形成は、有機溶媒、例えばホルムアミドの不存在下で得ることができるのに対して、高ストリンジェンシーハイブリッド形成は、少なくとも約３５％ホルムアミド、より好ましくは、少なくとも約５０％ホルムアミドの存在下で得ることができる。ストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約３０℃の、より好ましくは少なくとも約３７℃の、最も好ましくは少なくとも約４２℃の温度を含むであろう。ハイブリッド形成時間、界面活性剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の濃度、及び担体ＤＮＡの包含又は除外など、様々なさらなるパラメータが当業者に周知である。必要に応じてこれらの様々な条件を組み合わせることによって、様々なレベルのストリンジェンシーが達成される。好ましい実施形態において、ハイブリッド形成は、７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム及び１％ＳＤＳ中、３０℃で起こるであろう。より好ましい実施形態において、ハイブリッド形成は、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、３５％ホルムアミド及び１００μｇ／ｍＬ変性サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）中、３７℃で起こるであろう。最も好ましい実施形態において、ハイブリッド形成は、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭクエン酸三ナトリウム、１％ＳＤＳ、５０％ホルムアミド及び２００μｇ／ｍＬ  ｓｓＤＮＡ中、４２℃で起こるであろう。これらの条件に対する有用な変形は、当業者に自明であろう。
【０１０２】
多くの用途に対して、ハイブリッド形成に続く洗浄工程のストリンジェンシーも変動するであろう。洗浄ストリンジェンシー条件は、塩濃度によって及び温度によって規定され得る。上記のように、洗浄ストリンジェンシーは、塩濃度を減少することによって、又は温度を増加することによって増加させることができる。例えば、洗浄工程に対するストリンジェントな塩濃度は、好ましくは約３０ｍＭ未満ＮａＣｌ及び約３ｍＭ未満クエン酸三ナトリウム、最も好ましくは約１５ｍＭ未満ＮａＣｌ及び約１．５ｍＭ未満クエン酸三ナトリウムであろう。洗浄工程に対するストリンジェントな温度条件は、通常、少なくとも約２５℃の、より好ましくは少なくとも約４２℃の、さらに好ましくは少なくとも約６８℃の温度を含むであろう。好ましい実施形態において、洗浄工程は、３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳ中、２５℃で起こるであろう。より好ましい実施形態において、洗浄工程は、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳ中、４２℃で起こるであろう。より好ましい実施形態において、洗浄工程は、１５ｍＭ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭクエン酸三ナトリウム及び０．１％ＳＤＳ中、６８℃で起こるであろう。これらの条件に対するさらなる変形は、当業者に自明であろう。ハイブリッド形成技術は当業者に周知であり、例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９６：１８０，１９７７）；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，７２：３９６１，１９７５）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）；Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９８７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されている。
【０１０３】
本明細書で使用される「ヌクレオシド」には、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）に記載されているように、２’−デオキシ及び２’−ヒドロキシル形態を含む天然のヌクレオシドが含まれる。
【０１０４】
「老化細胞に関連する疾患」又は「年齢に関連する疾患」によって、代謝的（肥満、糖尿病）、神経性（アルツハイマー及びパーキンソン病）、筋肉、骨及び軟骨関連（筋肉減少症、変形性関節症、脊柱後弯症、椎間板ヘルニア）又は組織機能不全関連（肺気腫、心血管疾患及び腎疾患並びにアテローム性動脈硬化症）疾患からなる群から選択される疾病又は障害が意味される。
【０１０５】
「低下する」によって、少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％の負の変化が意味される。
【０１０６】
「参照」によって、標準的な又は対照条件が意味される。
【０１０７】
「参照配列」は、配列比較のための基礎として使用される規定の配列である。参照配列は、指定された配列のサブセット又は全体、例えば、完全長ｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列のセグメント又は完全なｃＤＮＡ若しくは遺伝子配列であり得る。ポリペプチドに関しては、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６アミノ酸、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、さらにより好ましくは約３５アミノ酸、約５０アミノ酸又は約１００アミノ酸であろう。核酸に関しては、参照核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約５０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、さらにより好ましくは約１００ヌクレオチド又は約３００ヌクレオチド又は概ねこれらの若しくはこれらの間のあらゆる整数であろう。
【０１０８】
「特異的に結合する」によって、本発明のポリペプチドを認識及び結合するが、本発明のポリペプチドを天然に含む試料、例えば、生物学的試料中の他の分子を実質的に認識及び結合しない化合物又は抗体が意味される。
【０１０９】
「実質的に同一の」によって、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載されているアミノ酸のいずれかの１つ）又は参照核酸配列（例えば、本明細書に記載されている核酸配列のいずれかの１つ）と少なくとも５０％の同一性を示すポリペプチド又は核酸分子が意味される。好ましくは、このような配列は、比較のために使用される配列と、アミノ酸レベル又は核酸で、少なくとも６０％、より好ましくは８０％又は８５％、より好ましくは９０％、９５％又は９９％同一である。
【０１１０】
配列同一性は、典型的には、配列分析ソフトウェアを用いて測定される（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，７７５  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｒｉｖｅ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ；Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ，Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，３１７５  Ｓｔａｌｅｙ  Ｒｄ．Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失及び／又はその他の修飾に対して相同性の程度を割り当てることによって、同一の又は類似の配列をマッチさせる。保存的な置換には、典型的には、以下の群内での置換、グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシンが含まれる。同一性の程度を決定するための例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムが使用され得、ｅ−３〜ｅ−１００の確率スコアが密接に関連した配列を示す。
【０１１１】
「対象」によって、ヒト又はウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ若しくはネコなどの非ヒト哺乳動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物が意味される。対象は、好ましくは、このような処置を必要とする哺乳動物、例えば、Ｂ細胞リンパ腫又はＢ細胞リンパ腫に対する素因を有すると診断された対象である。哺乳動物は、あらゆる哺乳動物、例えば、ヒト、霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ並びに家畜又は食用のために育てられる動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ及びヤギである。好ましい実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０１１２】
本明細書に挙げられている範囲は、その範囲内の値の全てに対する省略表現であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０からなる群から得られるあらゆる数字、数字の組み合わせ、部分的範囲を含むことが理解される。
【０１１３】
本明細書において使用される「処置する」及び「処置」という用語は、症候の重度及び／又は頻度の低下を達成し、症候及び／又は症候の基礎として存在する原因を除去し、及び／又は損傷の改善若しくは修復を促進するために、有害な症状、障害又は疾病を患った臨床的に症候性の個体への因子又は調合物の投与を表す。完全に除去することが除外されるわけではないが、障害又は症状を処置することは、障害、症状又はこれらに付随する症候を完全に除去することを必要としないことが理解されるであろう。処置において使用される因子又は調合物は、細胞又は組織を含み得る。
【０１１４】
新形成を有する患者の処置は、以下のもの：初期療法（例えば、手術）によって既知の腫瘍が除去された後に存在し得る残存する腫瘍細胞を破壊し、これにより、起こり得る癌の再発を予防するアジュバント療法（補助療法又は補助的療法とも称される。）；癌を縮小させるために外科的手法の前に与えられる術前補助（ｎｅｏａｄｊｕｖａｎｔ）療法；通例急性白血病に対して、寛解を引き起こすための導入療法；寛解が達成されたら、寛解を持続させるために与えられる地固め療法（強化療法とも称される。）；寛解の延長を補助するために、より低い又はより少ない頻度の用量で与えられる維持療法；第一次療法（標準療法とも称される。）；第二次（又は第三次、第四次など）療法（サルベージ療法とも称される。）は、疾病が応答せず又は第一次療法後に再発した場合に与えられる；及び癌を著しく低下させることを期待せずに症候管理に対処するための対症療法（支持療法とも称される。）のいずれもが含まれ得る。
【０１１５】
「予防する」及び「予防」という用語は、特定の有害な症状、障害又は疾病に罹患しやすい又は素因を有する臨床的に無症候の個体への因子又は組成物の投与を表し、このため、症候及び／又は症候の基礎として存在する原因の発生の予防に関する。
【０１１６】
ポリヌクレオチド配列の文脈において使用される場合、「変異体」という用語は、野生型遺伝子に関連するポリヌクレオチド配列を包含し得る。この定義は、例えば、「対立遺伝子」、「スプライス」、「種」又は「多型」変異体も含み得る。スプライス変異体は、参照分子に対して著しい同一性を有し得るが、一般的には、ｍＲＮＡプロセッシングの間のエキソンの選択的（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）スプライシングのために、より多い又はより少ない数のポリヌクレオチドを有するであろう。対応するポリペプチドは、さらなる機能的ドメイン又はドメインの不存在を有し得る。種変異体は、ある種と別の種で変動するポリヌクレオチド配列である。本発明において特に有用なのは、野生型標的遺伝子産物の変異体である。変異体は、核酸配列中の少なくとも１つの変異に起因し得、変化したｍＲＮＡ又はその構造若しくは機能が変化されていてもよく、若しくは変化されていなくてもよいポリペプチドをもたらし得る。いずれの与えられた天然又は組換え遺伝子も、対立遺伝子形態を全く有さなくてもよく、１つ又は多数の対立遺伝子形態を有し得る。変異体を生じさせる普通の変異的変化は、一般に、ヌクレオチドの天然の欠失、付加又は置換に帰せられる。これらの種類の変化の各々は、単独で、又は他のものと組み合わせて、所定の配列中で１回以上起こり得る。得られるポリペプチドは、一般的には、互いに対して著しいアミノ酸同一性を有するであろう。多型変異体は、所定の種の個体間での特定の遺伝子のポリヌクレオチド配列中の変動である。多型変異体は、ポリヌクレオチド配列が一塩基だけ変動する「一ヌクレオチド多型」（ＳＮＰｓ）又は一塩基変異も包含し得る。ＳＮＰｓの存在は、例えば、ある集団が疾病状態に対して傾向を有する指標、すなわち、感受性対耐性、となり得る。
【０１１７】
本明細書において使用されるポリペプチドの「変異体」は、１つ以上のアミノ酸残基が変化されたアミノ酸配列を表す。変異体は、置換されたアミノ酸が類似の構造的又は化学的特性を有する「保存的」変化（例えば、ロイシンのイソロイシンによる置換）を有し得る。より稀には、変異体は、「非保存的」変化（例えば、グリシンのトリプトファンによる置換）を有し得る。類似の軽微な変動は、アミノ酸の欠失若しくは挿入又は両方も含み得る。生物学的活性を損なわずに、いずれのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失され得るかを決定する上での指針は、本分野で周知のコンピュータプログラム、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥソフトウェア（ＤＮＡＳＴＡＲ）を用いて見出され得る。
【０１１８】
本明細書中の変数のあらゆる定義における化学基の列記は、あらゆる単一の基又は列記された基の組み合わせとしてその変数の定義を含む。本明細書において変数又は態様に対する実施形態の記述は、あらゆる単一の実施形態として、又はあらゆる他の実施形態若しくはその一部との組み合わせとしてその実施形態を含む。
【０１１９】
本明細書中に提供されているあらゆる組成物又は方法は、本明細書中に提供されているその他の組成物及び方法のいずれかの１つ以上と組み合わせることができる。
【０１２０】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」又は「によって特徴付けられる（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｂｙ）」と同義である「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という移行句は、包摂的又は非限定的であり、さらなる述べられていない要素又は方法の工程を除外しない。対照的に、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という移行句は、請求項中に明記されていない一切の要素、工程又は成分を除外する。「から本質的になる」という移行句は、明記された物質又は工程と、「及び特許を請求された発明の基本的及び新規特徴に実質的に影響を及ぼさない物質又は工程」とに請求項の範囲を限定する。
【０１２１】
本明細書に開示されたあらゆる遺伝子、遺伝子名、遺伝子産物又はペプチドは、本明細書中に開示されている組成物及び方法が適応可能なあらゆる種に由来する相同体に対応することが意図される。このため、これらの用語には、ヒト及びマウスからの遺伝子及び遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されない。特定の種からの遺伝子又は遺伝子産物が開示されている場合、この開示は例示に過ぎないことが意図され、遺伝子又は遺伝子産物が出現する文脈が明確に示していなければ、限定として解釈されるべきではないことが理解される。このため、例えば、いくつかの実施形態において、哺乳動物の核酸及びアミノ酸配列に関する本明細書に開示されている遺伝子に関しては、相同的な及び／又はオルソロガスな遺伝子並びに他の哺乳動物、魚類、両生類、爬虫類及び鳥類を含むがこれらに限定されない他の動物由来の遺伝子産物を包含することが意図される。好ましい実施形態において、遺伝子、核酸配列又はペプチドはヒトである。
【０１２２】
本明細書に引用された受入番号によって示されたＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩ提出は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用されている全ての他の公表された参考文献、文献、原稿及び科学文献は、参照により、本明細書に組み込まれる。抵触が生じる場合には、定義を含む本明細書が優越する。さらに、物質、方法及び実施例は例示に過ぎず、限定することを意図していない。
【０１２３】
本発明の他の特徴及び利点が、本発明の好ましい実施形態の以下の記述から及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。別段の定義がなければ、本明細書で使用されている全ての技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解される意味と同一の意味を有する。本発明の実施又は検査において、本明細書に記載されているものと類似の又は均等な方法及び物質を使用することができるが、以下には、適切な方法及び物質が記載されている。本明細書において引用される全ての公開された外国の特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１２４】
【図１】図１は、ＩＬ−７及びＩＬ−２１結合ドメインに融合されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ足場（ＩＬ７−ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ２１−ＩＬ１５ＲαＳｕＦｃ）を含むＴｘＭ融合タンパク質複合体を例示する模式図である。いくつかの事例において、二量体ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合複合体は、１つ又は２つのＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質タンパク質を含む。
【図２】図２Ａは、プロテインＡ樹脂上での結合及び溶出後のｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭタンパク質含有細胞培養上清のクロマトグラフィープロファイルを示す線グラフである。図２Ｂは、調製用サイズ排除カラム上での溶出後の、プロテインＡ精製されたｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体のクロマトグラフィープロファイルを示す線グラフである。図２Ｃは、分析用サイズ排除カラム上での溶出後の、プロテインＡ／ＳＥＣ精製されたｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体のクロマトグラフィープロファイルを示す線グラフであり、単量体の多タンパク質ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体のタンパク質凝集物からの分離を実証している。
【図３】図３Ａは、ジスルフィド結合還元後のｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の、１）ヒトＩｇＧＦｃドメインを含有するタンパク質バンドを検出するためのウェスタンブロット（左パネル）、及び２）クーマシーブルー染色されたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（４〜１２％）電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析（右パネル）の写真を示している。図３Ｂは、ジスルフィド結合還元後のｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の、１）ヒトＩＬ−１５ドメインを含有するタンパク質バンドを検出するためのウェスタンブロット（左パネル）、及び２）クーマシーブルー−ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル（４〜１２％）電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析（右パネル）の写真を示している。各種類の分析について、レーン１はＮｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐタンパク質標準であり、レーン２及び３：精製されたｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ  ロット２０１７０７１４及びレーン４：ＡＬＴ−８０３（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体）対照。
【図４】図４は、ジスルフィド結合還元後の、ＡＬＴ−８０３（対照）（レーン２及び３）及びｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体（レーン４及び５）のクーマシーブルー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の写真を示している。レーン３及び５中のタンパク質試料は、製造業者の指示書にしたがって、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  ＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）によって脱グリコシル化されていた。レーン１は、Ｎｏｖｅｘ  Ｓｈａｒｐタンパク質標準であり、レーン２：ＡＬＴ−８０３、レーン３：脱グリコシル化されたＡＬＴ−８０３、レーン４：ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭロット２０１７０７１４、レーン５：脱グリコシル化されたｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭロット２０１７０７１４及びレーン６：脱グリコシル化反応緩衝液（デグリコシラーゼ酵素を含有する）。
【図５】図５は、ヒトＩＬ−１５及びヒトＩｇＧに対して特異的な抗体へのｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の結合活性を示す線グラフである。
【図６】図６は、ヒトＩｇＧ（ＧＡＨ）（上図左）、ＩＬ１５（上図右）、ＩＬ７及びＩＬ１５（下図左）、ＩＬ２１及びＩＬ１５（下図中央）並びにＩＬ７及びＩＬ２１（下図右）に対して特異的な抗体へのｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の結合活性を図示する一連の線グラフである。
【図７】図７は、ＡＬＴ−８０３と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体によって媒介されたＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞の増殖を示す線グラフである。
【図８】図８Ａは、フローサイトメトリーによりマウス２Ｅ８細胞中でのＳｔａｔ５のリン酸化を測定することによる、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体、組換えＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３の組み合わせ（ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３）及び組換えＩＬ−７単独のＩＬ−７生物学的活性を示す棒グラフである。データは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）変化倍率を表す。図８Ｂは、フローサイトメトリーによりマウス２Ｅ８細胞中でのＳｔａｔ５のリン酸化を測定することによる、培地対照と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体、組換えＩＬ−１７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３の組み合わせ（ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３）及び組換えＩＬ−７単独のＩＬ−７生物学的活性を示すヒストグラムである。図８Ｃは、フローサイトメトリーにより精製されたヒトＴ細胞中でのＳｔａｔ３のリン酸化を測定することによる、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体、組換えＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３の組み合わせ（ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３）及び組換えＩＬ−２１単独のＩＬ−２１生物学的活性を示す棒グラフである。データは、ＭＦＩ変化倍率を表す。図８Ｄは、フローサイトメトリーにより精製されたヒトＴ細胞中でのＳｔａｔ３のリン酸化を測定することによる、培地対照と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体、組換えＩＬ−１７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３の組み合わせ（ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３）及び組換えＩＬ−２１単独のＩＬ−２１生物学的活性を示すヒストグラムである。図８Ｅは、フローサイトメトリーにより３２Ｄβ細胞中でのＳｔａｔ５のリン酸化を測定することによる、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体、組換えＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３の組み合わせ（ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３）及びＡＬＴ−８０３単独のＩＬ−１５生物学的活性を示す棒グラフである。データは、ＭＦＩ変化倍率を表す。図８Ｆは、フローサイトメトリーにより３２Ｄβ細胞中でのＳｔａｔ５のリン酸化によって培地対照と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体、組換えＩＬ−１７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３の組み合わせ（ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３）及びＡＬＴ−８０３単独のＩＬ−１５生物学的活性を示すヒストグラムである。
【図９】図９は、組換えＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３の組み合わせ（ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３）による刺激と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体による刺激後の精製されたヒトナイーブＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生を示す棒グラフである。ＩＦＮ−γ産生は、ＥＬＩＳＡによって測定された。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、培地対照と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体又は組換えＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３（ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３）の組み合わせによって様々な時間刺激した後での、２つのドナー（ドナーＡ、図１０Ａ；ドナーＢ、図１０Ｂ）から得た精製されたヒトナイーブＴ細胞の増殖を示す棒グラフである。増殖は、Ｐｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ  Ａｓｓａｙを用いて測定した。図１０Ｃは、図１０Ａ及び１０Ｂに示されたデータに対する、７２時間の時点での平均ヒトＴ細胞増殖を示す棒グラフである。
【図１１】図１１は、培地対照と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体又は組換えＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３（ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３）の組み合わせによる刺激後の、精製されたＣＳＦＥ標識されたヒトＴ細胞の増殖を示すドットプロットである。増殖は、細胞分裂後のＣＦＳＥシグナルの希釈によって評価した。
【図１２】図１２は、ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３、ＡＬＴ−８０３単独又は対照培地と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含有する培地中での温置後の精製されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増大を示す棒グラフである。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭとの温置は、ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３組み合わせ処置で観察されたより、ＣＤ８＋Ｔ細胞のより良好な増大をもたらした。
【図１３】図１３は、ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３、ＡＬＴ−８０３単独又は対照培地と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含有する培地中での温置後の精製されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖及び表現型を示す密度プロットである。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭとの温置は、ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３組み合わせ処置で観察されたより、ＣＤ８＋Ｔ細胞のより多い増殖をもたらした。
【図１４】図１４は、対照培地（ＵＳ）、ＩＬ−７＋ＩＬ−２１、ＩＬ−７＋ＡＬＴ−８０３、ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３又はＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３の組み合わせと比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含有する培地中での温置後の精製されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの増大を示す棒グラフを図示する。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭとの温置は、培地対照と比べて、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー及びメモリー幹ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの増大をもたらし、個別のサイトカインのあらゆる他の組み合わせより、セントラルメモリー及びエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのより良好な増殖をもたらした。
【図１５】図１５は、対照培地（ＵＳ）、ＩＬ−７＋ＩＬ−２１、ＩＬ−７＋ＡＬＴ−８０３、ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３又はＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３の組み合わせと比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含有する培地中での温置後の精製されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの増殖を示す線グラフ（フローサイトメトリーヒストグラム）を示す。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭとの温置は、培地対照と比較して、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー及びメモリー幹ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの増殖をもたらした。個別のサイトカインのあらゆる他の組み合わせより、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭによって、セントラルメモリー及びエフェクターメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットのより多い増殖が見られた。
【図１６】図１６は、ＡＬＴ−８０３と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体によって媒介された精製されたヒトＮＫ細胞の増殖を示す線グラフである。線は、異なるドナーから単離されたＮＫ細胞を表す。
【図１７】図１７は、ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３、ＡＬＴ−８０３単独又はｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体含有培地と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含有する培地中での温置後の精製されたヒトＮＫ細胞の表現型を示す密度プロットである。
【図１８】図１８は、ＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３、ＡＬＴ−８０３単独又はｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ融合タンパク質複合体含有培地と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体を含有する培地中での温置後の精製されたヒトＮＫ細胞によって媒介されたＫ５６２標的細胞死滅のレベルを示す棒グラフである。
【図１９】図１９は、ＡＬＴ−８０３又は対照培地と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体によって誘導された膵臓腫瘍細胞標的に対するヒトＮＫ細胞細胞傷害性及びＮＫ媒介性抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のレベルを示す棒グラフである。２人の異なるドナーから単離されたＮＫ細胞から得たデータが示されている。
【図２０】図２０は、ＡＬＴ−８０３又は対照培地と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体に対して応答したヒトＮＫ細胞によって放出されたＩＦＮγのレベルを示す棒グラフである。２人の異なるドナーから単離されたＮＫ細胞から得たデータが示されている。
【図２１】図２１は、ＡＬＴ−８０３又は対照培地と比較した、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体に対して応答したヒトＮＫ細胞によって発現されたグランザイムＢのレベルを示す棒グラフである。２人の異なるドナーから単離されたＮＫ細胞から得たデータが示されている。
【図２２】図２２は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ中でのＩＬ−１５、ＩＬ−７及びＩＬ−２１成分の捕捉及び検出を実証する一連のグラフを示す。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｃは、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭがＩＬ−７（図２３Ａ）、ＩＬ−２１（図２３Ｂ）及びＩＬ−１５（図２３Ｃ）受容体の特異的な活性化を誘導することを示す一連のグラフである。図２３Ａ：ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ又はＩＬ−７でＩＬ−７依存性２Ｅ８細胞（１０５）を２日間刺激し、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅを用いて細胞増殖を評価した。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭにおけるＩＬ−７のＥＣ５０は１４ｐＭである。２つの実験からｎ＝４。図２３Ｂ：ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ又はＮ−８０３で、活性化されたナチュラルキラー（ａＮＫ）細胞ａＮＫ細胞（２×１０５）を４０時間刺激し、ＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって測定した。１実験からｎ＝２。図２３Ｃ：ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ又はＮ−８０３で、ＩＬ−２／１５依存性３２Ｄ−ＩＬ２／１５Ｒβ細胞（１０４）を３日間刺激し、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅを用いて細胞増殖を評価した。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭにおけるＩＬ−１５のＥＣ５０は５３０ｐＭである。２つの実験からｎ＝４。
【図２４】図２４は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭによって誘導されたヒトＮＫ細胞中でのグランザイムＢ発現の強化を実証するグラフである。予め活性化されたヒトＮＫ細胞中でのグランザイムＢ発現（１６時間、５０ｎＭ、ｎ＝２）。
【図２５】図２５Ａ、２５Ｂは、ＳＷ１９９０膵臓癌細胞に対する、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ活性化されたヒトＮＫ細胞の細胞傷害性及びＡＤＣＣ活性を実証するグラフである。２：１のＥ：Ｔで、４０時間、新鮮なＮＫ細胞をＳＷ１９９０細胞と混合した。αＴＦ＝０．１ｎＭ。Ｎ−８０３又はｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ＝５０。図２５Ａ：ＮＫ細胞細胞傷害性。図２５Ｂ：ＮＫ細胞細胞傷害性関連ＩＦＮγ。
【図２６】図２６は、Ｒａｍｏｓリンパ腫細胞に対する、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ活性化されたヒトＮＫ細胞の細胞傷害性及びＡＤＣＣ活性を実証するグラフである。１：１のＥ：Ｔで、４０時間、新鮮なＮＫ細胞をＲａｍｏｓ細胞と混合した。αＣＤ２０＝１ｎＭ。Ｎ−８０３又はｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ＝０．５ｎＭ。図示するためにｎ＝２。
【図２７】図２７は、精製されたＮＫ細胞を増大させる上で、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭが個別のサイトカインより優れていることを実証するために使用された方法の実施形態の模式的表示（左パネル）である。得られた結果は、グラフとして示されている（右パネル）。
【図２８】図２８は、ヒトドナーから得たＮＫ細胞を増大させる上で、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭが個別のサイトカインより優れていることを実証する一連のグラフである。
【図２９】図２９Ａ〜２９Ｃは、他のエクスビボＮＫ増大法とｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭを比較する一連のグラフである。図２９Ａ：照射されたＥＢＶリンパ芽球支持細胞＋ＩＬ−２  ＮＫ増大。図２９Ｂ：膜結合ＩＬ−２１（ｍｂＩＬ２１）を有するＫ５６２ベースの活性化された抗原提示細胞（ａＡＰＣｓ）。図２９Ｃ：ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ媒介性ＮＫ細胞増大。
【図３０】図３０は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ増大後のＮＫ細胞表現型を示す一連の密度プロトである。
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｃは、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭがＮＫ細胞中でＩＦＮγ（図３１Ａ）、グランザイム（図３１Ｂ）及びパーフォリン（図３１Ｃ）を誘導することを実証するグラフである。別々のサイトカイン又はＴｘＭによって一晩、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ増大されたＮＫ細胞を刺激した。
【図３２】図３２は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ増大されたＮＫ細胞の直接的及び抗体媒介性細胞傷害性を実証するグラフである：９日間。９日間、２０ｎＭ  ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭを用いて、精製されたヒトＮＫ細胞（０．５×１０６／ｍＬ）を増大させ、１回洗浄し、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識したＣＤ２０＋ラモスバーキットリンパ腫細胞（１０５）と４時間混合した後、７−ＡＡＤ生死判定試薬の存在下でフローサイトメトリー分析を行った。
【図３３】図３３は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ処置後の選別されたＴ細胞集団の増大を実証する一連のグラフを図示する。選別されたＣＤ８＋ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー及び幹細胞メモリーＴ細胞をＣＦＳＥで標識し、３７℃、５％ＣＯ２中、９６ウェル平底プレート中２００ｍＬの総容量で、培地のみ（ＵＳ）又はＩＬ−７／ＩＬ−２１（２５ｎｇ）、ＩＬ−７／Ｎ−８０３（２５ｎｇ／１４４ｎｇ）、ＩＬ−２１／Ｎ−８０３（２５ｎｇ／１４４ｎｇ）、ＩＬ−７／ＩＬ−２１／Ｎ−８０３（２５ｎｇ／２５ｎｇ／１４４ｎｇ）、ＴｘＭ（１．４ｍｇ）で刺激した。
【図３４】図３４は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭが、αＣＤ３／ＣＤ２８ビーズへの短時間の曝露後に、選別されたＣＤ８＋Ｔ細胞集団を効果的に増大させることを実証する一連のグラフを図示する。
【図３５】図３５は、ｈ２＊ＩＬ２１／ＴｘＭ（ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ２１−ＩＬ１５ＲαＳｕＦｃ）の模式的表示である。
【図３６】図３６Ａ及び３６Ｂは、ｈ２＊ＩＬ２１／ＴｘＭがＩＬ−２１（図３６Ａ）及びＩＬ−１５（図３６Ｂ）受容体の特異的な活性化を誘導することを実証するグラフである。図３６Ａ：ａＮＫ細胞（２×１０５）をｈ２＊ＩＬ２１／ＴｘＭ又はＮ−８０３で４０時間刺激し、ＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって測定した。１実験からｎ＝２。図３６Ｂ：ｈ２＊ＩＬ２１／ＴｘＭ又はＮ−８０３で、ＩＬ−２／１５依存性３２Ｄ−ＩＬ２／１５Ｒβ細胞（１０４）を３日間刺激し、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅを用いて細胞増殖を評価した。ｈ２＊ＩＬ２１／ＴｘＭにおけるＩＬ−１５のＥＣ５０は５６ｐＭである。２つの実験からｎ＝４。
【図３７】図３７は、ｈ２＊ＩＬ７（ＩＬ１５）／ＴｘＭ（ＩＬ７−ＩＬ１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ１５ＲαＳｕＦｃ）の模式的表示である。
【図３８】図３８Ａ〜３８Ｃは、ｈ２＊ＩＬ７（ＩＬ１５）／ＴｘＭがＩＬ−７（図３８Ａ）及びＩＬ−１５（図３８Ｂ）受容体の特異的な活性化を誘導することを示すグラフである。図３８Ａ：ｈ２＊ＩＬ７（ＩＬ１５）／ＴｘＭ又はＩＬ−７でＩＬ−７依存性２Ｅ８細胞（１０５）を２日間刺激し、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅを用いて細胞増殖を評価した。ｈ２＊ＩＬ７（ＩＬ１５）／ＴｘＭにおけるＩＬ−７のＥＣ５０は１３．３ｐＭである。２つの実験からｎ＝４。図３８Ｂ：ａＮＫ細胞（２×１０５）をｈ２＊ＩＬ７（ＩＬ１５）／ＴｘＭ又はＮ−８０３で４０時間刺激し、ＩＦＮγの産生をＥＬＩＳＡによって測定した。１実験からｎ＝２。図３８Ｃ：ｈ２＊ＩＬ７（ＩＬ１５）／ＴｘＭ又はＮ−８０３で、ＩＬ−２／１５依存性３２Ｄ−ＩＬ２／１５Ｒβ細胞（１０４）を３日間刺激し、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅを用いて細胞増殖を評価した。ｈ２＊ＩＬ７（ＩＬ１５）／ＴｘＭにおけるＩＬ−１５のＥＣ５０は８１．３ｐＭである。２つの実験からｎ＝４。
【図３９】図３９は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ対ｈ２＊ＩＬ２１／ＴｘＭ対ｈ２＊ＩＬ７（ＩＬ１５）／ＴｘＭの構造の比較を示す模式的表示である。
【図４０】図４０は、還元（左のパネル）及び非還元（右のパネル）条件下でゲル上に走行されたｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ対ｈ２＊ＩＬ２１／ＴｘＭ対ｈ２＊ＩＬ７（ＩＬ１５）／ＴｘＭを示している。
【図４１】図４１は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ対ｈ２＊ＩＬ２１／ＴｘＭ対ｈ２＊ＩＬ７（ＩＬ１５）／ＴｘＭで刺激されたＮＫ細胞増大を実証するグラフである。精製されたヒトＮＫ細胞を１９．４ｎＭ  ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ、ｈ２＊ＩＬ２１／ＴｘＭ又はｈＩＬ７（ＩＬ１５）／ＴｘＭで刺激し、細胞数を０．５〜２×１０６／ｍｌに維持した。Ｖｉ−ＣＥＬＬ  ＸＲを用いて細胞数を評価した。１つの実験からｎ＝２。
【図４２】図４２は、スーパーカイン（ｈＩＬ７ＩＬ１５／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の存在下での強化された抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞応答を示すグラフである。非接着性ＰＢＭＣからＴ細胞を選択し、次いで、ＴＣＲ刺激（ＣＤ２／３／２８アゴニストＡｂｓ、２日）とともに培養し、次いで、ＴＣＲ刺激を洗浄し、その後、ＩＬ−７／１５／２１スーパーカインとともに培養した。Ｔ細胞増大後、ＰＢＭＣの接着性画分に由来した自家樹状細胞（ＤＣ）にＴ細胞を添加した。また、Ｔ／ＤＣ培養物に、何も添加せず、（ＣＭＶ由来の）ｐｐ６５を発現していないＢＬ２１イー・コリ又はｐｐ６５を発現しているＢＬ２１を添加した。培養物を一晩刺激し、次いで、スポット形成細胞（ＩＦＮ−γ産生）の数を示すためにＥＬＩＳＰＯＴを展開した。
【発明を実施するための形態】
【０１２５】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞及びＴ細胞を利用する治療は、疾病細胞を死滅させ、炎症促進性サイトカインを放出するこれらの細胞の能力故に、癌及びウイルス性感染症に対する処置となり得るとして登場した（例えば、Ｆｅｈｎｉｇｅｒ  ＴＡ  ａｎｄ  Ｃｏｏｐｅｒ  ＭＡ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；３７：８７７−８８８；及びＣｅｒｗｅｎｋａ  Ａ  ａｎｄ  Ｌａｎｉｅｒ  ＬＬ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６  １６：１１２−２３参照。）特に興味深いのは、腫瘍特異的免疫応答の誘導のために、キメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）を発現するように遺伝的に改変されたＴ細胞の養子移植である。ＣＡＲ  Ｔ細胞の表現型に対するサイトカインの影響は、以前に記載されてきた。ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５による刺激は、他のサイトカイン又はサイトカインの不存在より良好にＣＡＲ  Ｔ細胞のエクスビボ増大をもたらした（Ｎａｙａｒ  Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２０１４；４：ｅ１００２７２０；Ｇｏｌｕｂｏｖｓｋａｙａ  Ｖ．ａｎｄ  Ｗｕ，Ｌ．Ｃａｎｃｅｒｓ  ２０１６；８：２３６；Ｓａｂａｔｉｎｏ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１６；１２８：５１９−５２８；Ｘｕ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４：１２３：３７５０−３７５９；及びＧｏｍｅｚ−Ｅｅｒｌａｎｄ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４；２５：２７７−２８７）。
【０１２６】
最近の臨床データは、より分化度が低いＴ細胞の養子移植は、特にメモリー幹Ｔ細胞（ＴＳＣＭ）は、深くて持続的な腫瘍根絶を引き起こすことができることを示唆する（例えば、Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ  ＣＡ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ．２００５；１０２（２７）：９５７１−９５７６；及びＳｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１６：３０（２）：４９２−５００参照。）。循環中のＴＳＣＭ細胞の数は少ないので、養子細胞療法のために妥当な数の臨床的等級のＴＳＣＭ細胞を単離し、生産することは困難な課題であった（例えば、Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ  Ｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１３；１２１（４）：５６７−５６８参照。）。新たな報告は、培養期間全体を通じたＣＤ３／ＣＤ２８共刺激並びにＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＩＬ−１５の添加を用いて、ＴＳＣＭ細胞の生成及び増大がエクスビボで達成できることを示した（例えば、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｆｅｒｎａｂｄｅｚ  Ｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｔｒａｎｓ  Ｍｅｄ．２０１６；１４；２１４；及びＳａｂａｔｉｎｏ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１６；１２８（４）：５１９−５２８参照。）。ＩＬ−７はＣＡＲ  ＴＳＣＭ細胞の増大を増加させるのに最も効果的であることが示され、ＩＬ−２１はより多くの幹細胞様表現型を有するＣＡＲ  Ｔ細胞の増殖を支えるのに対して、ＩＬ−２はより分化したＣＡＲ  Ｔ細胞を誘導した。ＩＬ−２及びＩＬ−１５処理されたＣＡＲ  Ｔ細胞は、より多くの炎症促進性サイトカインを産生し、インビトロで増加した抗腫瘍活性を示した。さらに、インビボでＣＡＲ  Ｔ細胞を用いてＩＬ−１５及びＩＬ−２１で処理すると、その腫瘍細胞溶解能力を増加した。
【０１２７】
４ヘリックス共通γ鎖サイトカインの一員であるＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の分化、発育、成熟、増殖及び活性化において中心的な役割を果たしている（Ｗａｌｄｍａｎ  Ｔ  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２００６；６：５９５−６０１；Ｌｅｏｎａｒｄ  Ｗ．Ｊ．ａｎｄ  Ｗａｎ  Ｃ．−Ｋ．Ｆ１０００Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１６；５：２４４；Ｌｉｎ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１７；３７：９３６−９６８）。ＮＫ細胞の養子移植は、癌及び感染性因子に対する有望な免疫療法である。ＮＫ細胞療法における大きな課題は、多数の高度に細胞傷害性のＮＫ細胞が必要なことである。このため、エクスビボでのＮＫ細胞増大アプローチが開発されており、これらの培養戦略の多くは、最終的なＮＫ細胞産物の臨床的な適用前に除去することが必要な支持細胞又は補助細胞の使用を基礎としている（Ｔｏｎｇ  Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１７；６：ｅ１３０３５８６；Ｄｅｎｍａｎ  ＣＪ  ＰＬｏｓ  Ｏｎｅ  ７：ｅ３０２６４；Ｆｕｊｉｓａｋｉ  Ｈ．ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９；６９：４０１０−４０１７）。最近、増大及び活性化のための支持細胞の不存在下で共通γ鎖サイトカイン、特にＩＬ−１５及びＩＬ−２１を使用するというアプローチが検討された（Ｗａｇｎｅｒ  Ｊ．ｅｔ．ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１７；８：６７６）。
【０１２８】
本明細書に記載されている発明より以前には、ＴＳＣＭ細胞を生成及び増大するための最適な方法は完全には解明されていなかった。戦略は、哺乳動物細胞によって産生されるサイトカインと比べて、グリコシル化が相違し、その他の転写後修飾が相違する可能性がある組換えヒトＩＬ−７、ヒトＩＬ−２１及びヒトＩＬ−１５を利用した。組換えサイトカインは、異なる純度及び安定性も有することもあり得、一般的には、臨床等級の材料としては利用できない。さらに、各サイトカインは、固有の受容体結合、内部移行及びリサイクル特性を有することが予想される。
【０１２９】
したがって、本明細書に記載されているのは、ＩＬ−７及びＩＬ−２１結合ドメインを含む多特異的なＩＬ−１５をベースとするタンパク質複合体である（図１）。具体的には、ＩＬ−７及びＩＬ−２１結合ドメインに融合されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ−Ｉｇ  Ｆｃ足場を含むタンパク質複合体が本明細書に記載されている。ヒト免疫細胞を用いて性質決定される場合、これらの複合体は、ＩＬ−１５、ＩＬ−７及びＩＬ−２１サイトカインの各々の結合及び生物活性を呈する。さらに、これらの複合体は、上昇したＴＳＣＭ細胞マーカー及びＩＦＮ−γの増強された産生を伴って、Ｔ細胞の増殖及び活性化を誘導するように作用する。これらの複合体はエクスビボでＮＫ細胞も増大させ、増大されたＮＫ細胞は増強された細胞傷害性を示す。このため、単一分子としての複合体は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞上の複数のサイトカイン受容体に結合し、該受容体を介してシグナルを伝達して、以前には、複数のサイトカインの組み合わせを用いた場合にのみ観察された相乗的応答を与える。さらに、これらの複合体はＩｇ分子のＦｃ領域を含んでおり、Ｉｇ分子のＦｃ領域が二量体を形成して可溶性マルチポリペプチド複合体を与え、精製の目的のためにプロテインＡを結合し、トランスプレゼンテーション（ｔｒａｎｓｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）のためにＮＫ細胞及びマクロファージ上のＦｃγ受容体と相互作用することができ、これにより、個別のサイトカインの組み合わせには存在しない利点を複合体に付与する。哺乳動物細胞発現をベースとした方法は、よりよい活性及び／又は安定性を有し得るグリコシル化されたタンパク質としてこれらの複合体を産生する。これらの方法は、本明細書に記載されているように臨床等級の材料の生産にも適している。ＮＫ及びＴ細胞の増殖及び活性化を誘導し、本発明のタンパク質複合体によって誘導されるＴＳＣＭ細胞及びＣＩＭＬ  ＮＫ細胞を生成するためのさらなる方法も提供される。
【０１３０】
インターロイキン−１５
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）は、エフェクターＮＫ細胞及びＣＤ８＋メモリーＴ細胞の発育、増殖及び活性化のための重要なサイトカインである。ＩＬ−１５はＩＬ−１５受容体α（ＩＬ−１５Ｒα）に結合し、エフェクター細胞上のＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体β−共通γ鎖（ＩＬ−１５Ｒβγｃ）複合体にトランスに提示される。ＩＬ−１５及びＩＬ−２は、ＩＬ−１５Ｒβγｃへの結合を共有し、ＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ５経路を通じてシグナル伝達する。しかしながら、ＩＬ−２と異なり、ＩＬ−１５は、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞の維持を支持せず、又は活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞死を誘導しないが、これらは多発性骨髄腫に対するＩＬ−２の治療活性を制限した可能性がある効果である。さらに、ＩＬ−１５は、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞に抗アポトーシス性シグナル伝達を与えることが知られた唯一のサイトカインである。ＩＬ−１５は、単独で又はＩＬ−１５Ｒαとの複合体のいずれかとして投与されると、実験動物モデルで、十分に確立された固形腫瘍に対して強力な抗腫瘍活性を示し、このため、癌を治癒することができる可能性を秘めた最も有望な免疫治療薬の１つとして同定されてきた。
【０１３１】
ＩＬ−１５をベースとする癌治療薬の臨床的開発を促進するために、ＩＬ−１５と比べて増加した生物学的活性を有するＩＬ−１５変異体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）を同定した（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８３：３５９８−３６０７，２００９）。このＩＬ−１５スーパーアゴニスト（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）の薬物動態及び生物学的活性は、スーパーアゴニスト複合体がインビボで天然のサイトカインの活性の少なくとも２５倍を有するように、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合複合体（ＡＬＴ−８０３）の作製によってさらに改善された（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，５６：８０４−８１０，２０１１）。
【０１３２】
ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体
上述されているように、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体は、天然のＩＬ−１５Ｒαの可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインに非共有結合されたＩＬ−１５を有する複合体を表すことができる。いくつかの事例において、可溶性ＩＬ−１５Ｒαは、生物学的に活性なポリペプチドに及び／又はＩｇＧＦｃドメインに共有結合されている。ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５又は別の生物学的に活性なポリペプチドに共有結合されたＩＬ−１５のいずれかであり得る。ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体の結晶構造は、Ｃｈｉｒｉｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８，１００１−１００７に示されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
本明細書中に記載された本発明の上記態様又はいずれかの他の態様の様々な実施形態において、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質は、可溶性ＩＬ−１５Ｒα、例えば、生物学的に活性なポリペプチド（例えば、ＩｇＧの重鎖定常ドメイン、ＩｇＧの重鎖定常ドメインのＦｃドメイン又はサイトカイン）に共有結合されたＩＬ−１５Ｒαを含む。上記態様の本発明の別の実施形態において、ＩＬ−１５は、ＩＬ−１５、例えば、別の生物学的に活性なポリペプチド、例えば、サイトカインに共有結合されたＩＬ−１５を含む。別の実施形態において、宿主細胞又は培地からＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を精製することは、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質複合体を特異的に結合する親和性試薬上にＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を捕捉することを含む。別の実施形態において、ＩＬ−１５Ｒα融合タンパク質は、ＩＬ−１５Ｒα／Ｆｃ融合タンパク質を含有し、親和性試薬はＦｃドメインを特異的に結合する。別の実施形態において、親和性試薬はプロテインＡ又はプロテインＧである。別の実施形態において、親和性試薬は抗体である。別の実施形態において、宿主細胞又は培地からＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を精製することは、イオン交換クロマトグラフィーを含む。別の実施形態において、宿主細胞又は培地からＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体を精製することは、サイズ排除クロマトグラフィーを含む。
【０１３４】
別の実施形態において、ＩＬ−１５ＲαはＩＬ−１５Ｒαスシ（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含む。別の実施形態において、ＩＬ−１５は変異体ＩＬ−１５（例えば、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）である。別の実施形態において、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体のＩＬ−１５結合部位は完全に占有されている。別の実施形態において、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体の両ＩＬ−１５結合部位は完全に占有されている。別の実施形態において、ＩＬ−１５：ＩＬ−１５Ｒα複合体は、複合体の電荷又はサイズ特性に基づいて精製される。別の実施形態において、完全に占有されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体は、複合体の電荷特性に基づいて、陰イオンクロマトグラフィーによって精製される。別の実施形態において、完全に占有されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体は、低イオン強度中性ｐＨ緩衝液を利用する結合条件及び増加するイオン強度の緩衝液を利用する溶出条件で、第四級アミンをベースとする樹脂を用いて精製される。
【０１３５】
本発明の可溶性融合タンパク質複合体のある実施形態において、ＩＬ−１５ポリペプチドは、天然のＩＬ−１５ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有するＩＬ−１５変異体である。ヒトＩＬ−１５ポリペプチドは、本明細書において、ｈｕＩＬ−１５、ｈＩＬ−１５、ｈｕＩＬ１５、ｈＩＬ１５、ＩＬ−１５野生型（ｗｔ）と表され、その変異体は、天然のアミノ酸、成熟した配列中のその位置及び変異体アミノ酸を用いて表される。例えば、ｈｕＩＬ１５Ｎ７２Ｄは、７２位におけるＮのＤへの置換を含むヒトＩＬ−１５を表す。ある実施形態において、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然のＩＬ−１５ポリペプチドと比較してＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する増加した結合活性によって実証されるように、ＩＬ−１５アゴニストとして機能する。ある実施形態において、ＩＬ−１５変異体は、例えば、天然のＩＬ−１５ポリペプチドと比較してＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対する減少した結合活性によって実証されるように、ＩＬ−１５アンタゴニストとして機能する。ある実施形態において、ＩＬ−１５変異体は、天然のＩＬ−１５ポリペプチドと比較して、ＩＬ−１５ＲβγＣ受容体に対して増加した結合親和性又は減少した結合活性を有する。ある実施形態において、ＩＬ−１５変異体の配列は、天然のＩＬ−１５配列と比較して、少なくとも１つの（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又はこれより多い）アミノ酸変化を有する。アミノ酸変化は、ＩＬ−１５Ｒβ及び／又はＩＬ−１５ＲγＣと相互作用するＩＬ−１５のドメイン中に、１つ以上のアミノ酸置換又は欠失を含むことができる。ある実施形態において、アミノ酸変化は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の８、６１、６５、７２、９２、１０１、１０８又は１１１位での１つ以上のアミノ酸置換又は欠失である。例えば、アミノ酸変化は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の８位でのＤのＮ又はＡへの、６１位でのＤのＡへの、６５位でのＮのＡへの、７２位でのＮのＲへの、１０８位でのＱのＡへの置換又はこれらの置換の任意の組み合わせである。ある実施形態において、アミノ酸変化は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の７２位でのＮのＤへの置換である。
【０１３６】
ＡＬＴ−８０３（Ｎ−８０３）
ＡＬＴ−８０３は、ＩＬ−２Ｒβγを結合する増加した能力及び増強された生物学的活性を有するＩＬ−１５変異体を含む（米国特許第８，５０７，２２２号、参照により本明細書に組み込まれる。）。ＩＬ−１５のこのスーパーアゴニスト変異体は、刊行物に記載された（Ｚｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，１８３：３５９８−３６０７、参照により本明細書に組み込まれる。）。可溶性ＩＬ−１５α受容体融合タンパク質（ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ）と組み合わせたこのＩＬ−１５スーパーアゴニストは、インビトロ及びインビボで極めて強力なＩＬ−１５活性を有するタンパク質複合体をもたらす（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｙｔｏｋｉｎｅ，５６：８０４−８１０；Ｘｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７３：３０７５−８６，Ｗｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：ｅ２６４４２）。ＩＬ−１５スーパーアゴニスト複合体（ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ）は、「ＡＬＴ−８０３」と表記される。
【０１３７】
薬物動態分析は、マウスに静脈内投与した後に、この複合体が２５時間の半減期を有することを示した。ＡＬＴ−８０３は、免疫応答性マウス中で、侵襲性固形腫瘍及び血液腫瘍モデルに対して目覚ましい抗腫瘍活性を示す。ＡＬＴ−８０３は、週に２回又は毎週、静脈内投与計画を用いる単独療法として、又は抗体との併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ）として投与することができる。ＡＬＴ−８０３抗腫瘍応答も持続的である。ＡＬＴ−８０３処置後に治癒された腫瘍保有マウスは、同じ腫瘍細胞による再攻撃に対しても極めて抵抗性があり、ＡＬＴ−８０３が再導入された腫瘍細胞に対して有効な免疫記憶応答を誘導することを示している。
【０１３８】
ＩＬ−７
ＩＬ−７は、適応免疫細胞の発育、生存及び増殖にとって不可欠なサイトカインである。ＩＬ−７は、主として、骨髄及び胸腺中の間質細胞によって分泌されるのに対して、樹状細胞（ＤＣｓ）などのその他の免疫細胞もＩＬ−７を産生することができる。ＩＬ−７受容体は、２つの鎖、すなわち、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）と共有されるＩＬ−７Ｒα（ＣＤ１２７）と、並びにＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１と共有される共通γ鎖（ＣＤ１３２）とからなるヘテロ二量体である。γ鎖は全ての造血細胞種上に発現されているのに対して、ＩＬ−７Ｒαは主にリンパ球上に発現されている。ＩＬ−７Ｒαは、リンパ器官の発育及び病原体に対する自然免疫応答において重要である、ＮＫ細胞及び腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）由来ＬＴｉ細胞などの、自然リンパ球系細胞（ＩＬＣｓ）中にも見出される。ＩＬ−７は、ＬＴｉ細胞のプールを調節することによって、リンパ器官形成も制御することができる。ＩＬ−７受容体の別の種類は可溶性ＩＬ−７Ｒであり、ＩＬ−７Ｒ発現細胞による過剰なＩＬ−７消費を低減するために細胞結合型ＩＬ−７Ｒと競合し、サイトカインが限られているときに、ＩＬ−７の生物活性を増強する（Ｇａｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．２０１５；１６（１０２６７−１０２８０））。
【０１３９】
ＩＬ−７の作用には、Ｊａｋ−Ｓｔａｔ及びＰＩ３Ｋ−Ａｋｔという２つの主要なシグナル伝達経路が関与している。ＩＬ−７Ｒαは、タンパク質チロシンキナーゼであるヤヌスキナーゼ１（Ｊａｋ１）と会合しており、γ鎖のサイトゾル側末端はＪａｋ３と会合している。ＩＬ−７の受容体へのＩＬ−７の結合は、サイトゾル中のＪａｋの活性化をもたらし、Ｓｔａｔタンパク質をリン酸化する。二量体のリン酸化されたＳｔａｔタンパク質は、続いて、核内に移行し、遺伝子発現を誘導する。Ｊａｋ３−Ｓｔａｔ５経路を介して、ＩＬ−７は抗アポトーシス性遺伝子であるＢｃｌ−２及びＭｃｌ−１を活性化し、並びにＢａｘ及びＢａｋなどのアポトーシス促進性タンパク質を抑制し、これによって、順次、ナイーブＴ細胞及びメモリーＴ細胞の生存がもたらされる。より高濃度のＩＬ−７は胸腺移住Ｔ細胞増殖を誘導するのに対して、より低い濃度は細胞の生存を維持するように、この機能は用量依存的である。ＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ経路を活性化することによって、ＩＬ−７は、細胞周期阻害剤ｐ２７ｋｉｐ１を下方制御して、細胞周期進行のためにサイクリンＤ１の発現を誘導する。さらに、ＩＬ−７は、グルコース輸送体１発現、グルコース取り込み及びミトコンドリアの完全性を促進して、細胞代謝とサイズを正に制御する（Ｇａｏ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｓｃｉ．２０１５；１６（１０２６７−１０２８０）；及びＪａｔｉａｎｉ  ＳＳ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ．２０１０；１（１０）：９７９−９９３）。
【０１４０】
ＩＬ−２１
ＩＬ−２１は、炎症促進活性と抗炎症活性の両方を有する多面的サイトカインであり、活性化されたＣＤ４＋及びＮＫ  Ｔ細胞によって主に産生される。ＩＬ−２１は、共通γ鎖サイトカインファミリーに属し、リンパ球活性化、増殖、分化及び生存に関与している。ＩＬ−２１は、特異的なＩＬ−２１Ｒ及び共通γ鎖受容体からなるヘテロ二量体受容体シグナル伝達を介して機能する。ＩＬ−２１は、Ｊａｋ−Ｓｔａｔ、ＰＩ３Ｋ及びＭＡＰＫ経路を通じてシグナルを伝達する。ＩＬ−２１は、Ｔ細胞分化にとって極めて重要であるＳｔａｔ３の強力な継続的活性化を誘導する（Ｏｕｙａｎｇ  Ｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１２；２８（４）４５４−４６７）。
【０１４１】
ＩＬ−２１は、ＩＬ−１５及びＩＬ−７とともに、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞数及びそれらのエフェクター機能の増大を促進し、腫瘍の退縮をもたらす。ＩＬ−２１は、初期分化表現型の誘導によって、ナイーブＴ細胞とセントラルメモリーＴ細胞の両方の発育及び生存において重要な役割を果たすことも示されている。重要なことに、ＩＬ−２１によって生成されたＴ細胞は、実験モデルにおいて、インビボで卓越した抗腫瘍性効果を示した。
【０１４２】
ＩＬ−２１は、ＮＫ細胞の生成において、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＦｌｔ−３Ｌと協働することも示されている。ＩＬ−１５はＮＫ細胞の増大において役割を果たしているのに対して、ＩＬ−２１は、炎症性サイトカインの増加された脱顆粒及び分泌によって細胞傷害活性を誘導することが最近報告された（Ｗａｇｎｅｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７；８：６７６）。
【０１４３】
抗原特異的結合ドメイン
抗原特異的結合ドメインは、疾病細胞上の標的に特異的に結合するポリペプチドからなる。または、これらのドメインは、腫瘍増殖を支える間質細胞上の標的又は疾病媒介性免疫抑制を支える免疫細胞上の標的など、疾病状態を支える他の細胞上の標的に結合し得る。抗原特異的結合ドメインには、抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、Ｔ細胞受容体結合ドメイン、リガンド結合ドメイン、受容体結合ドメイン、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体、ミニボディ、ナノボディ、ペプチボディ、又は本分野において公知の様々な他の抗体模倣物（アフィマー（ａｆｆｉｍｅｒｓ）、アフィチン（ａｆｆｉｔｉｎｓ）、アルファボディ（ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ）、アトリマー（ａｔｒｉｍｅｒｓ）、ＣＴＬＡ４をベースとする分子、アドネクチン、アンチカリン、クニッツドメインをベースとするタンパク質、アビマー、ノッチン、フィノマー（ｆｙｎｏｍｅｒｓ）、ダルピン（ｄａｒｐｉｎｓ）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ）、アフィリン（ａｆｆｉｌｉｎｓ）、モノボディ（ｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ）及びアルマジロリピートタンパク質をベースとするタンパク質（Ｗｅｉｄｌｅ，ＵＨ，ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ＆Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １０：１５５−１６８）など）が含まれる。
【０１４４】
ある実施形態において、抗原特異的結合ドメインに対する抗原は、細胞表面受容体又はリガンドを含む。さらなる実施形態において、抗原は、ＣＤ抗原、サイトカイン若しくはケモカイン受容体若しくはリガンド、増殖因子受容体若しくはリガンド、組織因子、細胞接着分子、ＭＨＣ／ＭＨＣ様分子、Ｆｃ受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、ＮＫ受容体、ＴＣＲ、ＢＣＲ、正／負の共刺激受容体若しくはリガンド、細胞死受容体若しくはリガンド、腫瘍関連抗原又はウイルスコード化抗原（ｖｉｒｕｓ  ｅｎｃｏｄｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）を含む。
【０１４５】
好ましくは、抗原特異的結合ドメインは、腫瘍細胞上の抗原に結合することができる。腫瘍特異的結合ドメインは、癌を有する患者の処置に対して承認された抗体に由来し得、リツキシマブ、オファツムマブ及びオビヌツズマブ（抗ＣＤ２０抗体）；トラスツズマブ及びペルツズマブ（抗ＨＥＲ２抗体）；セツキシマブ及びパニツムマブ（抗ＥＧＦＲ抗体）；並びにアレムツズマブ（抗ＣＤ５２抗体）が含まれる。同様に、ＣＤ２０（９０Ｙ標識されたイブリツモマブチウキセタン、１３１Ｉ標識されたトシツモマブ）、ＨＥＲ２（アド−トラスツズマブエムタンシン）、ＣＤ３０（ブレンツキシマブベドチン）及びＣＤ３３（ゲムツズマブオゾガマイシン）に対して特異的な承認された抗体エフェクター分子接合体からの結合ドメイン（Ｓｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ＭＸ，Ｍｅｌｌｍａｎ  Ｉ．２０１３  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：１１９２）を使用することができるであろう。
【０１４６】
さらに、本発明の好ましい結合ドメインには、本分野において既知の様々な他の腫瘍特異的抗体ドメインが含まれ得る。癌の処置用の抗体及びそれらの各標的には、ニボルマブ（抗ＰＤ−１抗体）、ＴＡ９９（抗ｇｐ７５）、３Ｆ８（抗ＧＤ２）、８Ｈ９（抗Ｂ７−Ｈ３）、アバゴボマブ（抗ＣＡ−１２５（イミテーション（ｉｍｉｔａｔｉｏｎ）））、アデカツムマブ（ａｄｅｃａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＥｐＣＡＭ）、アフツズマブ（抗ＣＤ２０）、アラシズマブペゴール（ａｌａｃｉｚｕｍａｂ  ｐｅｇｏｌ）（抗ＶＥＧＦＲ２）、アルツモマブペンテテート（ａｌｔｕｍｏｍａｂ  ｐｅｎｔｅｔａｔｅ）（抗ＣＥＡ）、アマツキシマブ（ａｍａｔｕｘｉｍａｂ）（抗メソテリン）、ＡＭＥ−１３３（抗ＣＤ２０）、アナツモマブマフェナトクス（ａｎａｔｕｍｏｍａｂ  ｍａｆｅｎａｔｏｘ）（抗ＴＡＧ−７２）、アポリズマブ（ａｐｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＨＬＡ−ＤＲ）、アルシツモマブ（ａｒｃｉｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＥＡ）、バビツキシマブ（ｂａｖｉｔｕｘｉｍａｂ）（抗ホスファチジルセリン）、ベクツモマブ（ｂｅｃｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＤ２２）、ベリムマブ（ｂｅｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＢＡＦＦ）、ベシレソマブ（ｂｅｓｉｌｅｓｏｍａｂ）（抗ＣＥＡ関連抗原）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）（抗ＶＥＧＦ−Ａ）、ビバツズマブメルタンシン（ｂｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（抗ＣＤ４４ｖ６）、ブリナツモマブ（ｂｌｉｎａｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＣＤ１９）、ＢＭＳ−６６３５１３（抗ＣＤ１３７）、ブレンツキシマブベドチン（ｂｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）（抗ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８））、カンツズマブメルタンシン（抗ムチンＣａｎＡｇ）、カンツズマブラブタンシン（抗ＭＵＣ１）、カプロマブペンデチド（抗前立腺癌腫細胞）、カルルマブ（抗ＭＣＰ−１）、カツマキソマブ（抗ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３）、ｃＢＲ９６−ドキソルビシン免疫複合体（抗Ｌｅｗｉｓ−Ｙ抗原）、ＣＣ４９（抗ＴＡＧ−７２）、セデリズマブ（ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ４）、Ｃｈ．１４．１８（抗ＧＤ２）、ｃｈ−ＴＮＴ（抗ＤＮＡ関連抗原）、シタツズマブボガトクス（ｃｉｔａｔｕｚｕｍａｂ  ｂｏｇａｔｏｘ）（抗ＥｐＣＡＭ）、シズツムマブ（抗ＩＧＦ−１受容体）、イバツズマブテトラキセタン（ｉｖａｔｕｚｕｍａｂ  ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）（抗ＭＵＣ１）、コナツムマブ（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＣＰ−８７０８９３（抗ＣＤ４０）、ダセツズマブ（（抗ＣＤ４０）、ダクリズマブ（抗ＣＤ２５）、ダロツズマブ（抗インシュリン様増殖因子Ｉ受容体）、ダラツムマブ（抗ＣＤ３８（環状ＡＤＰリボースヒドロラーゼ））、デミシズマブ（抗ＤＬＬ４）、デツモマブ（ｄｅｔｕｍｏｍａｂ）（抗Ｂリンパ腫細胞）、ドロジツマブ（抗ＤＲ５）、デュリゴツマブ（ｄｕｌｉｇｏｔｕｍａｂ）（抗ＨＥＲ３）、デュシギツマブ（抗ＩＬＧＦ２）、エクロメキシマブ（ｅｃｒｏｍｅｘｉｍａｂ）（抗ＧＤ３ガングリオシド）、エドレコロマブ（抗ＥｐＣＡＭ）、エロツズマブ（抗ＳＬＡＭＦ７）、エルシリモマブ（ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）（抗ＩＬ−６）、エナバツズマブ（ｅｎａｖａｔｕｚｕｍａｂ（抗ＴＷＥＡＫ受容体）、エノチクマブ���抗ＤＬＬ４）、エンシツキシマブ（ｅｎｓｉｔｕｘｉｍａｂ）（抗５ＡＣ）、エピツモマブシツキセタン（ｅｐｉｔｕｍｏｍａｂ  ｃｉｔｕｘｅｔａｎ）（抗エピシアリン）、エプラツズマブ（抗ＣＤ２２）、エルツマキソマブ（ｅｒｔｕｍａｘｏｍａｂ）（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＣＤ３）、エタラシズマブ（ｅｔａｒａｃｉｚｕｍａｂ）（抗インテグリンａｖ〜３）、ファラリモマブ（ｆａｒａｌｉｍｏｍａｂ）（抗インターフェロン受容体）、ファーレツズマブ（抗フォレート受容体１）、ＦＢＴＡ０５（抗ＣＤ２０）、フィクラツズマブ（ｆｉｃｌａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＨＧＦ）、フィギツムマブ（抗ＩＧＦ−１受容体）、フランボツマブ（ｆｌａｎｖｏｔｕｍａｂ）（抗ＴＹＲＰ１（糖タンパク質７５））、フレソリムマブ（ｆｒｅｓｏｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＴＧＦ〜）、フツキシマブ（ｆｕｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＥＧＦＲ）、ガリキシマブ（抗ＣＤ８０）、ガニツマブ（抗ＩＧＦ−１）、ゲムツズマブオゾガマイシン（抗ＣＤ３３）、ギレンツキシマブ（ｇｉｒｅｎｔｕｘｉｍａｂ）（抗炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ））、グレンバツムマブベドチン（ｇｌｅｍｂａｔｕｍｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）（抗ＧＰＮＭＢ）、グセルクマブ（抗ＩＬ１３）、イバリズマブ（抗ＣＤ４）、イブリツモマブチウキセタン（抗ＣＤ２０）、イクルキュマブ（ｉｃｒｕｃｕｍａｂ）（抗ＶＥＧＦＲ−１）、イゴボマブ（ｉｇｏｖｏｍａｂ）（抗ＣＡ−１２５）、ＩＭＡＢ３６２（抗ＣＬＤＮ１８．２）、ＩＭＣ−ＣＳ４（抗ＣＳＦｌＲ）、ＩＭＣ−ＴＲ１（ＴＧＦ〜ＲＩＩ）、イムガツズマブ（ｉｍｇａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＥＧＦＲ）、インクラキュマブ（ｉｎｃｌａｃｕｍａｂ）（抗セレクチンＰ）、インダツキシマブラブタンシン（ｉｎｄａｔｕｘｉｍａｂ  ｒａｖｔａｎｓｉｎｅ）（抗ＳＤＣ１）、イノツズマブオゾガマイシン（抗ＣＤ２２）、インテツムマブ（ｉｎｔｅｔｕｍｕｍａｂ）抗ＣＤ５１）、イピリムマブ（抗ＣＤ１５２）、イラツムマブ（ｉｒａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８））、ＫＭ３０６５（抗ＣＤ２０）、ＫＷ−０７６１（抗ＣＤ１９４）、ＬＹ２８７５３５８（抗ＭＥＴ）ラベツズマブ（抗ＣＥＡ）、ランブロリズマブ（抗ＰＤＣＤ１）、レクサツムマブ（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、リンツズマブ（抗ＣＤ３３）、リリルマブ（ｌｉｒｉｌｕｍａｂ）（抗ＫＩＲ２Ｄ）、ロルボツズマブメルタンシン（ｌｏｒｖｏｔｕｚｕｍａｂ  ｍｅｒｔａｎｓｉｎｅ）（抗ＣＤ５６）、ルカツムマブ（ｌｕｃａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ４０）、ルミリキシマブ（抗ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体））、マパツムマブ（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、マルゲツキシマブ（ｍａｒｇｅｔｕｘｉｍａｂ）（抗ｃｈ４Ｄ５）、マツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、マブリリムマブ（ｍａｖｒｉｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＧＭＣＳＦ受容体ａ鎖）、ミラツズマブ（抗ＣＤ７４）、ミンレツモマブ（ｍｉｎｒｅｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＴＡＧ−７２）、ミツモマブ（ｍｉｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＧＤ３ガングリオシド）、モガムリズマブ（抗ＣＣＲ４）、モキセツモマブパスドトクス（ｍｏｘｅｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｓｕｄｏｔｏｘ）（抗ＣＤ２２）、ナコロマブタフェナトクス（ｎａｃｏｌｏｍａｂ  ｔａｆｅｎａｔｏｘ）（抗Ｃ２４２抗���）、ナプツモマブエスタフェナトクス（抗５Ｔ４）、ナルナツマブ（ｎａｒｎａｔｕｍａｂ）（抗ＲＯＮ）、ネシツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、ネスバキュマブ（ｎｅｓｖａｃｕｍａｂ）（抗アンジオポエチン２）、ニモツズマブ（抗ＥＧＦＲ）、ニボルマブ（抗ＩｇＧ４）、ノフェツモマブメルペンタン（ｎｏｆｅｔｕｍｏｍａｂ  ｍｅｒｐｅｎｔａｎ）、オクレリズマブ（抗ＣＤ２０）、オカラツズマブ（ｏｃａｒａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、オララツマブ（抗ＰＤＧＦ−Ｒ  ａ）、オナルツズマブ（抗ｃ−ＭＥＴ）、オンツキシズマブ（ｏｎｔｕｘｉｚｕｍａｂ）（抗ＴＥＭ１）、オポルツズマブモナトクス（ｏｐｏｒｔｕｚｕｍａｂ  ｍｏｎａｔｏｘ）（抗ＥｐＣＡＭ）、オレゴボマブ（抗ＣＡ−１２５）、オトレルツズマブ（ｏｔｌｅｒｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ３７）、パンコマブ（ｐａｎｋｏｍａｂ）（抗腫瘍特異的グリコシル化型ＭＵＣ１）、パルサツズマブ（ｐａｒｓａｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＥＧＦＬ７）、パスコリズマブ（ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＬ−４）、パトリツマブ（抗ＨＥＲ３）、ペムツモマブ（ｐｅｍｔｕｍｏｍａｂ）（抗ＭＵＣ１）、ペルツズマブ（抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ピディリズマブ（抗ＰＤ−１）、ピナツズマブベドチン（ｐｉｎａｔｕｚｕｍａｂ  ｖｅｄｏｔｉｎ）（抗ＣＤ２２）、ピンツモマブ（ｐｉｎｔｕｍｏｍａｂ）（抗腺癌抗原）、ポラツズマブベドチン（抗ＣＤ７９Ｂ）、プリツムマブ（ｐｒｉｔｕｍｕｍａｂ）（抗ビメンチン）、ＰＲＯ１３１９２１（抗ＣＤ２０）、クイリズマブ（ｑｕｉｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＧＨＥ）、ラコツモマブ（ｒａｃｏｔｕｍｏｍａｂ）（抗Ｎ−グリコリルノイラミン酸）、ラドレツマブ（ｒａｄｒｅｔｕｍａｂ）（抗フィブロネクチンエクストラドメイン−Ｂ）、ラムシルマブ（抗ＶＥＧＦＲ２）、リロツムマブ（抗ＨＧＦ）、
ロバツムマブ（ｒｏｂａｔｕｍｕｍａｂ）（抗ＩＧＦ−１受容体）、ロレヅマブ（ｒｏｌｅｄｕｍａｂ）（抗ＲＨＤ）、ロベリズマブ（ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ１１及びＣＤ１８）、サマリズマブ（ｓａｍａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ２００）、サツモマブペンデチド（ｓａｔｕｍｏｍａｂ  ｐｅｎｄｅｔｉｄｅ）（抗ＴＡＧ−７２）、セリバンツマブ（ｓｅｒｉｂａｎｔｕｍａｂ）（抗ＥＲＢＢ３）、ＳＧＮ−ＣＤ１９Ａ（抗ＣＤ１９）、ＳＧＮ−ＣＤ３３Ａ（抗ＣＤ３３）、シブロツズマブ（ｓｉｂｒｏｔｕｚｕｍａｂ）（抗ＰＡＰ）、シルツキシマブ（抗ＩＬ−６）、ソリトマブ（ｓｏｌｉｔｏｍａｂ）（抗ＥｐＣＡＭ）、ソンツズマブ（ｓｏｎｔｕｚｕｍａｂ）（抗エピシアリン）、タバルマブ（抗ＢＡＦＦ）、タカツズマブテトラキセタン（ｔａｃａｔｕｚｕｍａｂ  ｔｅｔｒａｘｅｔａｎ）（抗α−胎児タンパク質）、タプリツモマブパプトクス（ｔａｐｌｉｔｕｍｏｍａｂ  ｐａｐｔｏｘ）（抗ＣＤ１９）、テリモマブアリトクス（ｔｅｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ）、テナツモマブ（ｔｅｎａｔｕｍｏｍａｂ）（抗テネイシンＣ）、テネリキシマブ（ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ４０）、テプロツムマブ（抗ＣＤ２２１）、ＴＧＮ１４１２（抗ＣＤ２８）、チシリムマブ（ｔｉｃｉｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＣＴＬＡ−４）、ティガツズマブ（抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＴＮＸ−６５０（抗ＩＬ−１３）、トシツモマブ（抗ＣＳ２０）、トベツマブ（ｔｏｖｅｔｕｍａｂ）（抗ＣＤ１４０ａ）、ＴＲＢＳ０７（抗ＧＤ２）、トレガリズマブ（ｔｒｅｇａｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ４）、トレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ＴＲＵ−０１６（抗ＣＤ３７）、ツコツズマブセルモロイキン（ｔｕｃｏｔｕｚｕｍａｂ  ｃｅｌｍｏｌｅｕｋｉｎ）（抗ＥｐＣＡＭ）、ウブリツキシマブ（ｕｂｌｉｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＣＤ２０）、ウレルマブ（抗４−１ＢＢ）、バンチクツマブ（ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ）（抗Ｆｒｉｚｚｌｅｄ受容体）、バパリキシマブ（ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）（抗ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１））、バテリズマブ（ｖａｔｅｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＩＴＧＡ２）、ベルツズマブ（抗ＣＤ２０）、ベセンキュマブ（ｖｅｓｅｎｃｕｍａｂ）（抗ＮＲＰ１）、ビジリズマブ（ｖｉｓｉｌｉｚｕｍａｂ）（抗ＣＤ３）、ボロシキシマブ（抗インテグリンα５β１）、ボルセツズマブマフォドチン（ｖｏｒｓｅｔｕｚｕｍａｂ  ｍａｆｏｄｏｔｉｎ）（抗ＣＤ７０）、ボツムマブ（ｖｏｔｕｍｕｍａｂ）（抗腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８）、ザルツムマブ（抗ＥＧＦＲ）、ザノリムマブ（抗ＣＤ４）、ザツキシマブ（ｚａｔｕｘｉｍａｂ）（抗ＨＥＲ１）、ジラリムマブ（ｚｉｒａｌｉｍｕｍａｂ）（抗ＣＤ１４７（ベイシジン））、ＲＧ７６３６（抗ＥＴＢＲ）、ＲＧ７４５８（抗ＭＵＣ１６）、ＲＧ７５９９（抗ＮａＰｉ２ｂ）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤ−Ｌ１）、ＲＧ７４５０（抗ＳＴＥＡＰ１）及びＧＤＣ−０１９９（抗Ｂｃｌ−２）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４７】
本発明において有用なその他の抗体ドメイン又は腫瘍標的結合タンパク質（例えば、ＴＣＲドメインには、以下の抗原を結合するものが含まれるが、これらに限定されない（示されている癌の適応症は非限定的な例を表すことに注意されたい。）：アミノペプチダーゼＮ（ＣＤ１３）、アネキシンＡ１、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６、様々な癌）、ＣＡ１２５（卵巣癌）、ＣＡ１５−３（癌腫）、ＣＡ１９−９（癌腫）、Ｌ６（癌腫）、ＬｅｗｉｓＹ（癌腫）、ＬｅｗｉｓＸ（癌腫）、α胎児タンパク質（癌腫）、ＣＡ２４２（結腸直腸癌）、胎盤アルカリホスファターゼ（癌腫）、前立腺特異抗原（前立腺）、前立腺酸性ホスファターゼ（前立腺）、上皮増殖因子（癌腫）、ＣＤ２（ホジキン病、ＮＨＬリンパ腫、多発性骨髄腫）、ＣＤ３ε（Ｔ細胞リンパ腫、肺、乳房、胃、卵巣癌、自己免疫疾患、悪性腹水）、ＣＤ１９（Ｂ細胞悪性腫瘍）、ＣＤ２０（非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞新生物、自己免疫疾患）、ＣＤ２１（Ｂ細胞リンパ腫）、ＣＤ２２（白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、ＳＬＥ）、ＣＤ３０（ホジキンリンパ腫）、ＣＤ３３（白血病、自己免疫疾患）、ＣＤ３８（多発性骨髄腫）、ＣＤ４０（リンパ腫、多発性骨髄腫、白血病（ＣＬＬ））、ＣＤ５１（転移性黒色腫、肉腫）、ＣＤ５２（白血病）、ＣＤ５６（小細胞肺癌、卵巣癌、メルケル細胞癌腫、及び液性腫瘍、多発性骨髄腫）、ＣＤ６６ｅ（癌腫）、ＣＤ７０（転移性腎細胞癌腫及び非ホジキンリンパ腫）、ＣＤ７４（多発性骨髄腫）、ＣＤ８０（リンパ腫）、ＣＤ９８（癌腫）、ＣＤ１２３（白血病）、ムチン（癌腫）、ＣＤ２２１（固形腫瘍）、ＣＤ２２７（乳房、卵巣癌）、ＣＤ２６２（ＮＳＣＬＣ及びその他の癌）、ＣＤ３０９（卵巣癌）、ＣＤ３２６（固形腫瘍）、ＣＥＡＣＡＭ３（結腸直腸、胃癌）、ＣＥＡＣＡＭ５（ＣＥＡ、ＣＤ６６ｅ）（乳房、結腸直腸及び肺癌）、ＤＬＬ４（Ａ様−４）、ＥＧＦＲ（様々な癌）、ＣＴＬＡ４（黒色腫）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４、ヘム腫瘍学（ｈｅｍｅ−ｏｎｃｏｌｏｇｙ）、固形腫瘍）、エンドグリン（ＣＤ１０５、固形腫瘍）、ＥＰＣＡＭ（上皮細胞接着分子、膀胱、頭部、頸部、結腸、ＮＨＬ前立腺及び卵巣癌）、ＥＲＢＢ２（肺、乳房、前立腺癌）、ＦＣＧＲｌ（自己免疫疾患）、ＦＯＬＲ（フォレート受容体、卵巣癌）、ＦＧＦＲ（癌腫）、ＧＤ２ガングリオシド（癌腫）、Ｇ−２８（細胞表面抗原糖脂質、黒色腫）、ＧＤ３イディオタイプ（癌腫）、熱ショックタンパク質（癌腫）、ＨＥＲ１（肺、胃癌）、ＨＥＲ２（乳房、肺及び卵巣癌）、ＨＬＡ−ＤＲｌＯ（ＮＨＬ）、ＨＬＡ−ＤＲＢ（ＮＨＬ、Ｂ細胞白血病）、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（癌腫）、ＩＧＦ１Ｒ（固形腫瘍、血液癌）、ＩＬ−２受容体（Ｔ細胞白血病及びリンパ腫）、ＩＬ−６Ｒ（多発性骨髄腫、ＲＡ、キャッスルマン病、ＩＬ６依存性腫瘍）、インテグリン（ανβ３、αβ５１、α６β４、α１１β３、α５β５、ανβ５、様々な癌向け）、ＭＡＧＥ−１（癌腫）、ＭＡＧＥ−２（癌腫）、ＭＡＧＥ−３（癌腫）、ＭＡＧＥ４（癌腫）、抗トランスフェリン受容体（癌腫）、ｐ９７（黒色腫）、ＭＳ４Ａｌ（膜貫通４−ドメインサブファミリーＡメンバー１、非ホジキンＢ細胞リンパ腫、白血病）、ＭＵＣ１（乳房、卵���、子宮頸部、気管支及び胃腸癌）、ＭＵＣ１６（ＣＡ１２５）（卵巣癌）、ＣＥＡ（結腸直腸癌）、ｇｐ１００（黒色腫）、ＭＡＲＴＩ（黒色腫）、ＭＰＧ（黒色腫）、ＭＳ４Ａｌ（膜貫通４−ドメインサブファミリーＡ、小細胞肺癌、ＮＨＬ）、ヌクレオリン、Ｎｅｕ癌遺伝子産物（癌腫）、Ｐ２１（癌腫）、ネクチン−４（癌腫）、抗−（Ｎ−グリコリルノイラミン酸のパラトープ、乳房、黒色腫癌）、ＰＬＡＰ様精巣アルカリホスファターゼ（卵巣、精巣癌）、ＰＳＭＡ（前立腺腫瘍）、ＰＳＡ（前立腺）、ＲＯＢ０４、ＴＡＧ７２（腫瘍関連糖タンパク質７２、ＡＭＬ、胃、結腸直腸、卵巣癌）、Ｔ細胞膜貫通タンパク質（癌）、Ｔｉｅ（ＣＤ２０２ｂ）、組織因子、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｂ、癌腫）、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１３Ｂ、多発性骨髄腫、ＮＨＬ、その他の癌、ＲＡ及びＳＬＥ）、ＴＰＢＧ（栄養膜糖タンパク質、腎細胞癌腫）、ＴＲＡＩＬ−Ｒｌ（腫瘍壊死アポトーシス誘発リガンド受容体１、リンパ腫、ＮＨＬ、結腸直腸、肺癌）、ＶＣＡＭ−１（ＣＤ１０６、黒色腫）、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−２（ＣＤ３０９）（様々な癌）。いくつかの他の腫瘍関連抗原標的が概説されている（Ｇｅｒｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ，ｍＡｂｓ  ２００９  １：２４７−２５３；Ｎｏｖｅｌｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００５  ５４：１８７−２０７，Ｆｒａｎｋｅ，ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ．２０００，１５：４５９−７６，Ｇｕｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１３；１１９：４２１−４７５，Ｐａｒｍｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７  １７８：１９７５−９）。これらの抗原の例には、表面抗原分類（ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｅ、ＣＤ１２ｗ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤｗ１７、ＣＤ１８、ＣＤ２１、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ４１、ＣＤ４２、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７９、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ１００、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０９、ＣＤ１１７、ＣＤ１２０、ＣＤ１２７、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５４、ＣＤ１５６、ＣＤ１５８、ＣＤ１６３，ＣＤ１６６、ＣＤ１６８、ＣＤ１８４、ＣＤｗ１８６、ＣＤ１９５、ＣＤ２０２（ａ、ｂ）、ＣＤ２０９、ＣＤ２３５ａ、ＣＤ２７１、ＣＤ３０３、ＣＤ３０４）、アネキシンＡ１、ヌクレオリン、エンドグリン（ＣＤ１０���）、ＲＯＢ０４、アミノペプチダーゼＮ様−４（ＤＬＬ４）、ＶＥＧＦＲ−２（ＣＤ３０９）、ＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）、Ｔｉｅ２、Ｂ７−Ｈ３、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７、ＥＧＦＲｖｌｌｌ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３非変異体、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ変異体、ｇｐ１００、ｐ５３変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ  融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＧＤ３、フコシルＧＭＩ、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰＩＢ  Ｉ、ＰＬＡＣＩ、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ１、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＰＤＧＦＲ−β、ＭＡＤ−ＣＴ−２及びＦａｓ関連抗原１が含まれる。
【０１４８】
さらに、本発明の好ましい結合ドメインには、本分野において既知である、感染細胞に付随する抗原及びエピトープ標的に対して特異的な結合ドメインが含まれる。このような標的には、興味深い以下の感染性因子：ＨＩＶウイルス（特に、ＨＩＶエンベロープスパイク並びに／又はｇｐ１２０及びｇｐ４１エピトープ由来の抗原）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ｍｅｔｈｉｃｉｌｌｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ナイセリア・ゴノレー（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、肺炎球菌（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、インフルエンザ菌Ｂ型（ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  Ｂ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ライム病スピロヘータ（Ｌｙｍｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｐｉｒｏｃｈｅｔｅｓ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、マイコプラズマ・レプラエ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、ブルセラ・アボルタス（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルスＩＩ型、ヒト血清パルボ様ウイルス（ｈｕｍａｎ  ｓｅｒｕｍ  ｐａｒｖｏ−ｌｉｋｅ  ｖｉｒｕｓ）、呼吸器多核体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、エプスタイン・バーウイルス、マウス白血病ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、いぼウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、サルウイルス４０、マウス乳癌ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモディウム・ビバックス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、トキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）、ランゲルトリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒａｎｇｅｌｉ）、トリパノソーマ・クルージ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、トリパノソーマ・ローデシエンセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅｉ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、マンソ���住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、バベシア・ボビス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ）、ニワトリ盲腸コクシジウム（Ｅｌｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）、旋毛虫（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、タイレリア・パルバ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ）、胞状条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ）、テニア・オービス（Ｔａｅｎｉａ  ｏｖｉｓ）、無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）、メソセストイデス・コルチ（Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ  ｃｏｒｔｉ）、マイコプラズマ・アルスリチジス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、エム・ハイオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、エム・オラーレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、エム・アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）、アコレプラズマ・レイドロウイ（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）、エム・サリバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）及びエム・ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）に由来するものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４９】
免疫チェックポイント阻害剤及び免疫アゴニストドメイン
別の実施形態において、結合ドメインは、免疫チェックポイント又はシグナル伝達分子又はそのリガンドに対して特異的であり、免疫チェックポイント抑制活性の阻害剤として、又は免疫賦活活性のアゴニストとして作用する。このような免疫チェックポイント及びシグナル伝達分子及びリガンドには、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１  ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＩＣＯＳ、ＢＴＬＡ、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ１３７、ＨＶＥＭ、ＫＩＲ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ４７、ＣＩＳ、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＩＤＯ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１５５、ＴＩＧＩＴ，ＬＩＧＨＴ、ＬＡＩＲ−１、Ｓｉｇｌｅｃｓ及びＡ２ａＲが含まれる（Ｐａｒｄａｌｌ  ＤＭ．２０１２Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：２５２−２６４，Ｔｈａｖｅｎｔｈｉｒａｎ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，Ｓ１２：００４）。さらに、本発明の好ましい抗体ドメインには、イピリムマブ及び／又はトレメリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ピディリズマブ、ＴＳＲ−０４２、ＡＮＢ０１１、ＡＭＰ−５１４及びＡＭＰ−２２４（リガンド−Ｆｅ融合物）（抗ＰＤ１）、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、ＭＥＤＩ０６８０及びＢＭＳ−９３６５５６９（抗ＰＤＬ１）、ＭＥＤＩ６４６９（抗ＯＸ４０アゴニスト）、ＢＭＳ−９８６０１６、ＩＭＰ７０１、ＩＭＰ７３１、ＩＭＰ３２１（抗ＬＡＧ３）並びにＧＩＴＲリガンドが含まれ得る。
【０１５０】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
Ｔ細胞は、他の免疫細胞種（多形核細胞、好酸球、好塩基球、肥満細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）とともに、免疫系の細胞成分を構成する細胞の部分群である。生理的条件下で、Ｔ細胞は、免疫監視において及び外来抗原の排除において機能する。しかしながら、生理的条件下において、Ｔ細胞が疾病の原因及び伝播において主要な役割を果たしているという有力な証拠が存在する。これらの障害では、中枢又は末梢のいずれかにおける、Ｔ細胞免疫寛容の破壊が、自己免疫疾患の原因における基本的過程である。
【０１５１】
ＴＣＲ複合体は、少なくとも７つの膜貫通タンパク質から構成される。ジスルフィド結合された（αβ又はγδ）ヘテロ二量体は単型の抗原認識ユニットを形成するのに対して、ε、γ、δ、ζ及びη鎖からなるＣＤ３の不変鎖は、Ｔ細胞活性化と細胞性免疫応答の精緻化をもたらすシグナル伝達経路にリガンド結合を共役させる役割を有する。ＴＣＲ鎖の遺伝子多様性に関わらず、２つの構造的特徴が全ての既知のサブユニットに共通である。第一に、ＴＣＲ鎖は、おそらくαヘリックスの単一の膜貫通ドメインを有する膜貫通タンパク質である。第二に、全てのＴＣＲ鎖は、予想される膜貫通ドメイン内に帯電したアミノ酸を有するという珍しい特徴を有している。不変鎖は、マウスとヒトの間で保存された単一の負の電荷を有し、変異鎖（ｖａｒｉａｎｔ  ｃｈａｉｎｓ）は１つ（ＴＣＲ−β）又は２つ（ＴＣＲ−α）の正の電荷を有する。ＴＣＲ−αの膜貫通配列は多数の種において高度に保存されており、このため、系統学的に、重要な機能的役割を果たしている可能性がある。親水性アミノ酸であるアルギニンとリジンを含有するオクタペプチド配列は、種間で同一である。
【０１５２】
Ｔ細胞応答は、ＴＣＲへの抗原結合によって調節される。ＴＣＲの１つの種類は、免疫グロブリン可変（Ｖ）及び定常（Ｃ）領域に似たα及びβ鎖からなる膜結合ヘテロ二量体である。ＴＣＲα鎖は、共有結合されたＶ−αとＣ−α鎖を含むのに対して、β鎖は、Ｃ−β鎖に共有結合されたＶ−β鎖を含む。Ｖ−α鎖とＶ−β鎖は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）（ヒトでは、ＨＬＡ複合体として知られる。）との関係において、スーパー抗原又は抗原を結合することができるポケット又は裂け目を形成する。Ｄａｖｉｓ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３：５３７（１９８５）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．，Ｗ．Ｐａｕｌ  Ｅｄ．Ｒｓｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＬＴＤ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照されたい。
【０１５３】
ＴＣＲ鎖（αβ又はγδ）の細胞外ドメインは、細胞表面上での発現のため、異種の膜貫通ドメインへの融合物として加工することもできる。このようなＴＣＲには、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ及び／又はキメラ活性化受容体（ＣＡＲ）膜貫通又は活性化ドメインへの融合物が含まれる。ＴＣＲは、αβ又はγδ鎖の抗原結合ドメインの１つ以上を含む可溶性タンパク質でもあり得る。このようなＴＣＲには、ＴＣＲ定常ドメインあり又はなしの、ＴＣＲ可変ドメイン又はその機能的断片が含まれ得る。可溶性ＴＣＲは、ヘテロ二量体又は一本鎖分子であり得る。
【０１５４】
Ｆｃドメイン
本発明のタンパク質複合体は、Ｆｃドメインを含有し得る。例えば、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭは、ＩＬ−７／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−２１／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／ｈｕＩｇＧ１Ｆｃ融合複合体を含む。様々なサイトカイン及び可溶性受容体など、別のタンパク質のドメインとＩｇＧのＦｃ領域を組み合わせる融合タンパク質が報告されている（例えば、Ｃａｐｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１，１９８９；Ｃｈａｍｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：５２−６０，１９９６）；米国特許第５，１１６，９６４号及び米国特許第５，５４１，０８７号を参照。）。原型の融合タンパク質は、ＩｇＧＦｃのヒンジ領域中のシステイン残基を通じて連結されたホモ二量体タンパク質であり、重鎖可変並びにＣＨ１ドメイン及び軽鎖なしのＩｇＧ分子に類似した分子が得られる。Ｆｃドメインを含む融合タンパク質の二量体の性質は、他の分子とのより高次の相互作用（すなわち、二価又は二重特異性結合）を与える点で有利であり得る。構造的相同性の故に、Ｆｃ融合タンパク質は、類似のアイソタイプを有するヒトＩｇＧと同等のインビボ薬物動態特性を示す。ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ヒト血液中に最も豊富に存在するタンパク質の１つであり、それらの循環半減期は２１日の長さに達し得る。ＩＬ−１５若しくはＩＬ−１５融合タンパク質の循環半減期を延長するために、及び／又はその生物学的活性を増加させるために、ヒト重鎖ＩｇＧタンパク質のＦｃ部分に共有結合されたＩＬ−１５Ｒαに非共有結合されたＩＬ−１５ドメインを含有する融合タンパク質複合体が本明細書に記載されている。
【０１５５】
「Ｆｃ」という用語は、Ｆｃ受容体と呼ばれる細胞表面受容体及び補体系のいくつかのタンパク質と相互作用する抗体の定常領域である断片結晶化可能領域を表す。このような「Ｆｃ」は、二量体形態である。天然のＦｃの元の免疫グロブリン源は、好ましくは、ヒト起源のものであり、免疫グロブリンのいずれでもあり得るが、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２が好ましい。天然のＦｃは、共有（すなわち、ジスルフィド結合）及び非共有会合によって、二量体又は多量体の形態へ連結され得る単量体ポリペプチドから構成されている。天然のＦｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）に応じて、１〜４の範囲である。天然のＦｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じるジスルフィド結合された二量体である（Ｅｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：４０７１−９参照。）。本明細書において使用される「天然のＦｃ」という用語は、単量体、二量体及び多量体の形態に対する総称である。プロテインＡ、プロテインＧ、様々なＦｃ受容体及び補体タンパク質に対する結合部位を含有するＦｃドメイン。いくつかの実施形態において、複合体のＦｃドメインは、抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は抗体依存性細胞貪食を媒介する（ＡＤＣＰ）を媒介するために、Ｆｃ受容体と相互作用することができる。他の適用において、複合体は、ＡＤＣＣ又はＡＤＣＰを効果的に媒介することができないＦｃドメイン（例えば、ＩｇＧ４Ｆｃ）を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態において、「Ｆｃ変異体」という用語は、天然のＦｃから改変されているが、サルベージ受容体、ＦｃＲｎに対する結合部位をなお含む分子又は配列を表す。国際出願ＷＯ９７／３４６３１号及びＷＯ９６／３２４７８号は、例示的なＦｃ変異体及びサルベージ受容体との相互作用を記載しており、参照により本明細書に組み込まれる。このため、「Ｆｃ変異体」という用語は、非ヒト天然のＦｃからヒト化された分子又は配列を含む。さらに、天然のＦｃは、本発明の融合分子にとって必要でない構造的特徴又は生物学的活性を与えるので除去され得る部位を含む。このため、ある実施形態において、「Ｆｃ変異体」という用語は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合性（３）選択された宿主細胞中で発現したときのＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、（７）抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は（８）抗体依存性細胞性細胞貪食（ＡＤＣＰ）に影響を及ぼし、又はこれらに関与する１つ以上の天然のＦｃ部位又は残基を変える分子又は配列を含む。このような変化は、これらのＦｃ特性のいずれか１つ以上を増加又は減少させることができる。Ｆｃ変異体は、さらに詳しく以下に記載されている。
【０１５７】
「Ｆｃドメイン」という用語は、上に定義されているように、天然のＦｃ及び変異体分子及び配列を包含する。Ｆｃ変異体及び天然のＦｃと同様に、「Ｆｃドメイン」という用語は、全抗体から消化されるか又は組換え遺伝子発現によって若しくは他の手段によって作製されたかどうかを問わず、単量体又は多量体形態の分子を含む。
【０１５８】
リンカー
いくつかの事例において、本発明の融合複合体は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５ＲαドメインとＩＬ−１２及び／又はＩＬ−１８結合ドメインとの間に挿入された柔軟なリンカー配列も含む。リンカー配列は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに関してポリペプチドの効果的な配置を可能にして、両ドメインの機能的活性を可能にすべきである。
【０１５９】
ある事例において、可溶性融合タンパク質複合体はリンカーを有しており、第一のポリペプチドは、ポリペプチドリンカー配列によって、ＩＬ−１５（又はその機能的断片）に共有結合されている。他の態様において、本明細書に記載されている可溶性融合タンパク質複合体はリンカーを有しており、第二のポリペプチドは、ポリペプチドリンカー配列によって、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチド（又はその機能的断片）に共有結合されている。
【０１６０】
好ましくは、リンカー配列は、提示している抗原の認識のためにＴＣＲ分子の結合溝を効果的に配置することができ、又は抗原の認識のために抗体分子の結合ドメインを効果的に配置することができるペプチドをもたらすヌクレオチド配列によってコードされる。本明細書において使用される「ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに関して生物学的に活性なポリペプチドの有効な配置」という用語又はその他の類似の用語は、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインが互いに相互作用して、タンパク質複合体を形成することができるように、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに連結された生物学的に活性なポリペプチドが配置されていることを意味するものとする。例えば、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインは、免疫反応を開始若しくは阻害するために、又は細胞の発育を阻害若しくは刺激するために、免疫細胞との相互作用を可能にするように効果的に配置される。
【０１６１】
本発明の融合複合体は、好ましくは、ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインと免疫グロブリンＦｃドメインとの間に挿入された柔軟なリンカー配列も含む。リンカー配列は、Ｆｃドメイン、生物学的に活性なポリペプチド及びＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインの効果的な配置を可能にして、各ドメインの機能的活性を可能にするべきである。例えば、適切な融合タンパク質複合体の形成及び／又は免疫細胞上のＦｃ受容体若しくは補体系のタンパク質との相互作用を可能にして、オプソニン化、細胞溶解、肥満細胞、好塩基球及び好酸球の脱顆粒及びその他のＦｃ受容体依存性過程；補体経路の活性化；並びに融合タンパク質複合体の増大されたインビボ半減期などのＦｃ媒介性効果を刺激するために、Ｆｃドメインは効果的に配置される。
【０１６２】
生物学的に活性なポリペプチドの２つ以上のポリペプチドを連結して、所望の機能的活性を有する一本鎖分子を生成するために、リンカー配列を使用することもできる。
【０１６３】
好ましくは、リンカー配列は、約７〜２０のアミノ酸、より好ましくは、約１０〜２０アミノ酸を含む。単一の所望されない立体構造に生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子を固定しないようにするために、リンカー配列は、好ましくは、柔軟である。リンカー配列は、例えば、認識部位を融合された分子から離隔するために使用することができる。具体的には、例えば、生物学的に活性なポリペプチドとエフェクター分子を化学的に架橋するために、及び分子の柔軟性を与えるために、ペプチドリンカー配列は、生物学的に活性なポリペプチドとエフェクター分子の間に配置することができる。リンカーは、柔軟性を与えるために、好ましくは、主として、グリシン、アラニン及びセリンなどの小さな側鎖を有するアミノ酸を含む。好ましくは、リンカー配列の約８０％又は９０％又はそれより多くが、グリシン、アラニン又はセリン残基、特にグリシン及びセリン残基を含む。
【０１６４】
抗体可変領域を一緒に連結するために首尾よく使用されてきた多数の柔軟なリンカーデザインのいずれをも含む様々なリンカー配列が使用できるであろう（Ｗｈｉｔｌｏｗ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２：９７−１０５）。
【０１６５】
養子細胞療法
養子細胞療法（ＡＣＴ）（同種及び自家造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）及び組換え細胞（すなわち、ＣＡＲ  Ｔ）療法を含む。）は、多くの悪性障害に対して選択される処置である（ＨＳＣＴ及び養子細胞療法アプローチの概説については、Ｒａｇｅｒ＆Ｐｏｒｔｅｒ，Ｔｈｅｒ  Ａｄｖ  Ｈｅｍａｔｏｌ（２０１１）２（６）４０９−４２８；Ｒｏｄｄｉｅ＆Ｐｅｇｇｓ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１１）１１（４）：４７３−４８７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ：（２０１５）１３６，１７５１−１７６８；及びＣｈａｎｇ，Ｙ．Ｊ．ａｎｄ  Ｘ．Ｊ．Ｈｕａｎｇ，Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ，２０１３．２７（１）：５５−６２を参照されたい。）。このような養子細胞療法には、同種及び自家造血幹細胞移植、ドナー白血球（又はリンパ球）輸液（ＤＬＩ）、腫瘍浸潤リンパ球の養子移植又はＴ細胞若しくはＮＫ細胞の養子移植（組換え細胞、すなわち、ＣＡＲ  Ｔ、ＣＡＲ  ＮＫを含む。）が含まれるが、これらに限定されない。放射線照射及び化学療法後に、ドナー由来の細胞が造血を回復させる必要性以外に、移植された細胞からの免疫の回復は残存する腫瘍細胞の除去のために重要である。悪性病変に対する治療上の選択肢としてのＡＣＴの有効性は、ドナー細胞の起源、組成及び表現型（リンパ球サブセット、活性化状態）、基礎疾患、移植前の調整計画及び移植後の免疫補助（すなわち、ＩＬ−２療法）及び移植片内のドナー細胞によって媒介される移植片対腫瘍（ＧＶＴ）効果を含む多数の因子によって影響される。さらに、これらの因子は、調整計画（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅｎ）及び／又は宿主内でのドナー細胞の過剰な免疫活性（すなわち、移植片対宿主病、サイトカイン放出症候群など）から典型的に生じる、移植関連死亡率に対して釣り合いを取らなければならない。
【０１６６】
養子ＮＫ細胞療法を用いたアプローチは、非常に関心を持たれるようになった。自家ＨＳＣＴを受けている患者では、血液ＮＫ細胞数は、移植後極めて早期に回復し、ＮＫ細胞のレベルは有益な結果と相関する（Ｒｕｅｆｆ  ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２０，８９６−８９９）。自家ＮＫ細胞移植を用いた治療戦略は、多数の要因のために限られた成功を収めたが、エクスビボで活性化された同種（又はハプロタイプ一致）ＮＫ細胞の養子移植が、癌に対する有望な免疫治療戦略として出現した（Ｇｕｉｌｌｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１６．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１０２５−１０３６）。これらの細胞の活性は、自家ＮＫ細胞と比べて、自己ＭＨＣ分子によって抑制される可能性がより低い。多数の研究は、腫瘍細胞に対するアロ反応性を活用するためにハプロタイプが一致したＮＫ細胞を用いる養子療法は安全であり、ＡＭＬ患者中で著しい臨床活性を媒介することができることを示してきた。これらの知見をさらに取り込んで、最近の研究は、ＮＫ細胞又はＮＫ前駆体（すなわち、幹細胞）に対するエクスビボ活性化／増大法及び移植前調整及び移植後免疫補助戦略を最適化すること；ＮＫ細胞株又は組換え腫瘍標的化ＮＫ細胞の使用；治療用抗体、免疫調節因子（レナリドミド）並びに抗ＫＩＲ及びチェックポイント抗体などの他の因子との併用療法の評価に焦点を当ててきた。各事例において、これらの戦略は、ＮＫ細胞の増殖及び活性化を増強する能力を有する本発明の融合タンパク質複合体によって補完されることができるであろう。本明細書に示されているように、本発明の融合タンパク質複合体とともにＮＫ細胞をエクスビボで温置することによって、上昇した活性化マーカー、腫瘍細胞に対する増加した細胞傷害性及びＩＦＮ−γの増大した産生を示すＣＩＭＬ  ＮＫ細胞の誘導をもたらす。さらに、本発明の融合タンパク質複合体は、ヒトＮＫ細胞株を活性化することが可能である。さらに、本発明の融合タンパク質複合体の直接的な投与又は本発明の融合タンパク質複合体によって活性化された免疫細胞の投与によって、免疫応答を増強し、新形成及び感染疾患を処置するための方法が提供される。
【０１６７】
ナチュラルキラー細胞：循環する単核細胞の主要な種類の１つはナチュラルキラーのもの、すなわち、ＮＫ細胞である（Ｍ．Ｍａｎｏｕｓｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５８：１１２−１１９，１９９７）。元々は、ある種の腫瘍及びウイルス感染細胞を殺す能力に基づいて定義されたＮＫ細胞は、現在では、初期の自然免疫系の成分の１つとして知られている。その細胞傷害能に加えて、ＮＫ細胞は、様々なサイトカインを放出することによって免疫応答の制御因子としての役割を果たす。さらに、複雑な免疫応答の生成は、ＮＫ細胞上に発現された様々な表面分子を介した他の細胞とのＮＫ細胞の直接的相互作用によって促進される。
【０１６８】
ＮＫ細胞は、骨髄前駆体に由来する（Ｏ．Ｈａｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４５：１４１１−１４２０，１９７７）。ＮＫ細胞は、Ｔ細胞と近縁関係にあるようであり、２つの細胞種は多くの細胞表面マーカーを共有する（Ｍ．Ｍａｎｏｕｓｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。上述のように、これらの細胞表面マーカーは、ＮＫ細胞活性において重要な役割を果たしている。例えば、マウスＮＫ細胞は、その表面上に、アシアロＧＭ１、ＮＫ１及びＮＫ２抗原などの特異的な抗原を発現し（Ｄ．Ｓｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４６：２１７−２２４，１９９７）、これらの抗原に対する抗体の投与はインビボでＮＫ細胞の枯渇をもたらす（同文献）。
【０１６９】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）と同様に、ＮＫ細胞は、様々な細胞種を溶解することによって、細胞傷害効果を発揮する（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｓ．，Ｌｕｎｄｑｖｉｓｔ，Ａ．＆Ｃｈｉｌｄｓ，Ｒ．Ｗ．Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｎｅｗ  ｈｏｐｅ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １０，７７５−７８３；２００８）。これらには、正常な幹細胞、感染細胞及び形質転換された細胞が含まれる。細胞の溶解は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ及びパーフォリンを含有する細胞質顆粒の作用を通じて起こる。ＭＨＣクラスＩを欠く細胞も、ＮＫ細胞媒介性溶解を受けやすい（Ｈ．Ｒｅｙｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５５：１１９−１２５，１９９７）。さらに、ＮＫ細胞は、非ＭＨＣ拘束性の様式で細胞傷害性を発揮する（Ｅ．Ｃｉｃｃｉｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：４７，１９９０；Ａ．Ｍｏｒｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：１５８９，１９９０；及びＥ．Ｃｉｃｃｉｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７５：７０９）。ＮＫ細胞は、抗体依存性細胞性細胞傷害によって細胞を溶解することもできる。
【０１７０】
上述のように、ＮＫ細胞は、インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦｓ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）及びＩＬ−８などのサイトカインの分泌を通じてその機能のいくつかを媒介する。ＮＫ細胞の細胞傷害活性は、細胞傷害活性の微調整を可能にする活性化及び阻害的受容体のバランスを通じて制御され、腫瘍細胞に対する効果的な細胞傷害能を維持しながら、健康な細胞に対する細胞傷害性を抑制する。実際に、複数の研究が、養子ＮＫ細胞移植の安全性及び臨床的な抗癌効果を実証しており、効果的な癌免疫療法としてのＮＫ細胞の潜在能力を強調している（（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ，Ｍ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７，６２８７−６２９７（２０１１）；Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９５，２０９７−２１００，（２００２）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １０５，３０５１−３０５７，（２００５；Ｂａｃｈａｎｏｖａ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２３，３８５５−３８６３，（２０１４）；Ｒｕｂｎｉｔｚ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２８，９５５−９５９，（２０１０））。例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−１を含むサイトカインは、ＮＫ細胞にサイトカインの産生を誘導することができる。ＩＦＮ−α及びＩＬ−２は、ＮＫ細胞の細胞傷害活性の強力な誘導因子である（Ｇ．Ｔｒｉｎｉｃｈｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １６０：１１４７−１１６９，１９８４；Ｇ．Ｔｒｉｎｉｃｈｉｅｒｉ及びＤ．Ｓａｎｔｏｌｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １４７：１３１４−１３３３，１９７７）。ＩＬ−２の存在は、ＮＫ細胞を刺激し、かつ増大させる（Ｋ．Ｏｓｈｉｍｉ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ６３：２７９−２９０，１９９６）。ＩＬ−１２は、Ｔ及びＮＫ細胞からのサイトカイン産生を誘導し、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害を増強することが示されている（Ｍ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １７０：８２７−８４６，１９８９）。
【０１７１】
ＮＫ細胞は、癌転移に対する抵抗性及び癌転移の調節の両方に関与している。癌免疫監視概念の登場以来、免疫細胞、特にＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の養子移植が、癌に対する免疫系を活用する標的化された方法として出現した（Ｋｒｏｅｍｅｒ，Ｇ．，Ｓｅｎｏｖｉｌｌａ，Ｌ．，Ｇａｌｌｕｚｚｉ，Ｌ．，Ａｎｄｒｅ，Ｆ．＆Ｚｉｔｖｏｇｅｌ，Ｌ．Ｎａｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２１，１１２８−１１３８，（２０１５））。ＮＫ細胞は、癌を処置するための有望な免疫療法因子として大きな注目を集めてきた。ＮＫ細胞は、悪性細胞に対する自然の細胞傷害性のために、癌に対する身体の防御の第一線にとって極めて重要である（Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １０，７７５−７８３；２００８）。
【０１７２】
ＮＫ細胞は、末梢血及び臍帯血（ＣＢ）を含む複数の源から増大されてきた（（Ｄｅｎｍａｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ＩＬ−２１  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ３０２６４，（２０１２）；Ｋｎｏｒｒ，Ｄ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ−ｓｃａｌｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２，２７４−２８３，（２０１３）；Ｓｈａｈ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ｙｉｅｌｄｓ  ｌｏｇ−ｓｃａｌｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−ｍｙｅｌｏｍａ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８，ｅ７６７８１，（２０１３）；Ｗｏｌｌ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ａ  ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｌｏｏｄ  １１３，６０９４−６１０１，（２００９））。支持細胞として人工の抗原提示細胞（ａＡＰＣｓ）を組み合わせてサイトカインを使用する、
エクスビボでのＮＫ細胞増大法が開発されてきた（（Ｄｅｎｍａｎ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７，ｅ３０２６４，（２０１２）；Ｂｅｒｇ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ  １１，３４１−３５５，（２００９）；Ｇｏｎｇ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ７６，４６７−４７５，（２０１０）；Ｚｈａｎｇ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ３４，１８７−１９５，（２０１１））。
【０１７３】
老化細胞及び加齢と関連する病変におけるサイトカインをベースとする療法
損傷した細胞は、アポトーシス又は老化のいずれかを経る。老化細胞は自身の増殖を抑制し、シグナル伝達分子を分泌する−細胞老化関連分泌現象（ＳＡＳＰ）として知られる現象（Ｃｏｐｐｅ  Ｊ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２０１０  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐａｔｈｏｌ  ５：９９−１１８）。ＳＡＳＰは、免疫細胞を引き付けることによって組織修復に取り組むために、より損傷の程度が低い隣接細胞を刺激することによって組織機能を回復させることであると提案されている（Ｄｅｍａｒｉａ  Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ３１：７２２−７３３）。これらの免疫細胞は、ＳＡＳＰ媒介性シグナルを遮断するために老化細胞を除去する。損傷が修復能力を超えるか又は免疫細胞がＳＡＳＰの効果に対して応答しなくなると、老化細胞の異常な蓄積が起きる。その結果、老化細胞は老化した及び／又は損傷を受けた器官中に蓄積し、組織機能不全を悪化させる（Ｏｖａｄｙａ  Ｙ．ａｎｄ  Ｋｒｉｚｈａｎｏｖｓｋｙ  Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，２０１４  Ｂｉｏｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ  １５：６２７−６４２）。老化細胞の除去は、マウスにおいて、健康寿命を増加させ、年齢に関連する疾患の重篤度を低下させることが示されている（Ｂａａｒ  Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２０１７  Ｃｅｌｌ  １６９：１３２−１４７；Ｂａｋｅｒ  ＤＪ  ２０１６  ５３０：１８４−１８９）。
【０１７４】
このため、生理的な加齢は、老化細胞の出現を伴う。証拠は、老化細胞は組織の恒常性及び機能を損ない、老化細胞の蓄積は年齢に関連する病変の発症に寄与することを示唆する（Ｂａｋｅｒ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，２００８  Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０：８２５−８３６；Ｂａｋｅｒ  ＤＪ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，５３０：１８４−１８９）。短縮された寿命に加えて、老化細胞は、代謝的（肥満、糖尿病）、神経性（アルツハイマー及びパーキンソン病）、筋肉、骨及び軟骨関連（筋肉減少症、変形性関節症、脊柱後弯症、椎間板ヘルニア）又は組織機能不全関連（肺気腫、心血管疾患及び腎疾患並びにアテローム性動脈硬化症）疾患を含む病変と関連する。研究は、自然及び適応免疫系が老化細胞の認識及び除去に関与していることを示している（Ｓｏｔｏ−Ｇａｍｅｚ  Ａ．ａｎｄ  Ｄｅｍａｒｉａ  Ｍ．，２０１７  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ２２：７８６−７９５；Ｈａｚｅｌｄｉｎｅ  Ｊ．ａｎｄ  Ｌｏｒｄ，Ｊ．Ｍ．，２０１３  Ａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １２：１０６９−１０７８）。例えば、ＮＫ細胞は、顆粒開口放出経路を介して老化細胞を除去することが示された。したがって、これらの応答を増強させることは、老化監視の自然の機構を増加させ得、老化細胞関連病変を抑制し得る。パーフォリン媒介性ＮＫ細胞細胞傷害の加齢性衰退は、加齢組織中の老化細胞の増加した頻度の一因であることも示唆されてきた（Ｒｕｋａｖｉｎａ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９２：２４１０−２４２０；Ｓａｇｉｖ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．２０１２  Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １−７）。肝線維症では、ＮＫ細胞の主要な活性化している受容体であるＮＫＧ２Ｄ受容体を欠くマウスにおいて、老化した活性化された星状細胞の蓄積（ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ）が増加し、増大した繊維症をもたらす（Ｓａｇｉｖ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，２０１６  Ａｇｉｎｇ  ８：３２８−３４４）。
【０１７５】
本発明のＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体は、ＮＫ及びＴ細胞を含む自然及び適応免疫細胞の両方の細胞傷害性を強化するための強力な活性を有することが実証された。本明細書に開示されているように、ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体は、老化細胞に対する免疫応答を活性化及び／又は維持すること、並びに抗加齢治療剤として適用できる可能性を秘めていると予測される。記されているように、ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体は、ＮＫ及びＴ細胞の両方に対してより強力な免疫刺激を与える点で、個別のサイトカインを上回る利点を有する。さらに、エクスビボでＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体によって刺激された免疫細胞は、老化細胞及び／又は年齢に関連する疾患の処置のための養子細胞移植において使用することができるであろう。このような療法は、養子ＮＫ又はＴ細胞療法であり得る。養子細胞移植後のＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体の投与は、移植された細胞の増殖、活性化及び持続を支えるためにも実施することができるであろう。
【０１７６】
薬学的治療薬
本発明は、治療薬として使用するための、融合タンパク質複合体を含む薬学的組成物を提供する。一態様において、本発明の融合タンパク質複合体は、例えば、生理的食塩水などの薬学的に許容され得る緩衝液中に調合されて、全身的に投与される。好ましい投与の経路には、例えば、患者中に組成物の継続的、持続的又は効果的なレベルを付与する、膀胱内への滴下注入、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、腫瘍内又は皮内注射が含まれる。ヒト患者又はその他の動物の処置は、生理的に許容され得る担体中に、治療的に有効な量の本明細書中で特定された治療薬を用いて実施される。適切な担体及びその調合は、例えば、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ中に記載されている。投与されるべき治療剤の量は、投与の様式、患者の年齢及び体重並びに新形成の臨床的症候に応じて変動する。一般的に、量は、新形成、自己免疫疾患又は感染性疾患を伴うその他の疾病の処置において使用されるその他の因子に対して使用される量の範囲内にあるであろうが、ある事例においては、化合物の増加した特異性の故に、より少ない量が必要とされるであろう。当業者に既知の方法によって測定した場合に、対象の免疫応答を強化し、又は新形成細胞、感染細胞、自己免疫細胞若しくは老化細胞の増殖、生存若しくは侵襲性を低下させる用量で化合物が投与される。
【０１７７】
薬学的組成物の調合
新形成細胞、感染性細胞、老化細胞若しくは年齢関連疾患又は自己免疫疾患の処置のための、本発明の融合タンパク質複合体の投与は、他の成分と組み合わされて、前記新形成細胞、感染性細胞、老化細胞若しくは年齢関連疾患又は自己免疫疾患を軽減し、低減し、又は安定化させるのに有効である治療薬の濃度をもたらすあらゆる適切な手段による。本発明の融合タンパク質複合体は、任意の適切な担体物質中に、任意の適切な量で含有され得、組成物の総重量の１〜９５重量％の量で一般に存在する。組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内、小胞内、腫瘍内又は腹腔内）投与経路に適した剤形で与えられ得る。例えば、薬学的組成物は、従来の薬学的慣行にしたがって調合される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（２０ｔｈ  ｅｄ．），ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０００  ａｎｄ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ｊ．Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｊ．Ｃ．Ｂｏｙｌａｎ，１９８８−１９９９，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照。）。
【０１７８】
当業者は動物モデルと比較してヒトに対する用量を修正することが本分野における定型作業であることを認識するように、ヒトの投薬量は、まず、マウス又は非ヒト霊長類で使用された化合物の量から推定することによって決められる。例えば、投与量は、約１μｇ化合物／ｋｇ体重〜約５０００ｍｇ化合物／ｋｇ体重；又は約５ｍｇ／ｋｇ体重〜約４０００ｍｇ／ｋｇ体重又は約１０ｍｇ／ｋｇ体重〜約３０００ｍｇ／ｋｇ体重；又は約５０ｍｇ／ｋｇ体重〜約２０００ｍｇ／ｋｇ体重；又は約１００ｍｇ／ｋｇ体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ体重；又は約１５０ｍｇ／ｋｇ体重〜約５００ｍｇ／ｋｇ体重の間で変動し得る。例えば、用量は、約１、５、１０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１，０００、１，０５０、１，１００、１，１５０、１，２００、１，２５０、１，３００、１，３５０、１，４００、１，４５０、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００又は５，０００ｍｇ／ｋｇ体重である。または、用量は、約５ｍｇ化合物／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ化合物／ｋｇ体重の範囲である。別の例では、用量は、約８、１０、１２、１４、１６又は１８ｍｇ／ｋｇ体重である。好ましくは、融合タンパク質複合体は、０．５ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ（例えば、０．５、１、３、５、１０ｍｇ／ｋｇ）で投与される。もちろん、このような処置プロトコールにおいて日常的に行われているように、初期臨床試験の結果及び特定の患者の要求に応じて、この投薬量は、増量又は減量して調整され得る。
【０１７９】
薬学的組成物は、投与すると、制御された様式で治療薬を放出する薬学的組成物中に適切な賦形剤とともに調合される。例には、単一又は複数単位錠剤又はカプセル組成物、油溶液、懸濁液、エマルジョン、マイクロカプセル、小球体、分子複合体、ナノ粒子、パッチ及びリポソームが含まれる。好ましくは、融合タンパク質複合体は非経口投与に適した賦形剤中に調合される。
【０１８０】
非経口組成物
本発明の融合タンパク質複合体を含む薬学的組成物は、剤形、調合物で、又は従来の非毒性な薬学的に許容される担体及び補助剤を含有する適切な送達装置又はインプラントを介して、注射、輸液（ｉｎｆｕｓｉｏｎ）又は埋め込み（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）（皮下、静脈内、筋肉内、腫瘍内、小胞内、腹腔内）によって非経口的に投与される。このような組成物の調合及び調製は、医薬調合の分野における当業者に周知である。調合物は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、上記に見出すことができる。
【０１８１】
非経口用途のための本発明の融合タンパク質複合体を含む組成物は、単位投薬形態（例えば、１回量アンプル中）で与えられる。または、複数回量を含有し、その中に適切な防腐剤（下記参照）が添加され得るバイアル中に組成物が与えられる。組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、輸液用器具又は埋め込み用送達装置の形態であり、又は使用前に、水若しくは別の適切はビヒクルで戻されるべき乾燥粉末として与えられる。新形成細胞、感染性細胞、老化細胞若しくは年齢関連疾患又は自己免疫疾患を低減又は軽減する活性因子とは別に、組成物は、非経口的に許容され得る適切な担体及び／又は賦形剤を含む。活性な治療剤は、調節された放出のために、小球体、マイクロカプセル、ナノ粒子、リポソーム中に組み込まれ得る。さらに、組成物は、懸濁剤、可溶化剤、安定化剤、ｐＨ調整剤、浸透圧調整剤及び／又は分散剤を含み得る。
【０１８２】
上記のように、本発明の融合タンパク質複合体を含む薬学的組成物は、無菌注射に適した形態であり得る。このような組成物を調製するために、適切な活性治療薬は、非経口的に許容され得る液体ビヒクル中に溶解又は懸濁される。使用し得る許容されるビヒクル及び溶媒に属するのは、水、適切な量の塩酸、水酸化ナトリウムの添加によって適切なｐＨに調整された水、又は適切な緩衝液、１，３−ブタンジオール、リンゲル溶液、並びに等張の、塩化ナトリウム溶液及びデキストロース溶液である。水性調合物は、１つ以上の防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、エチル又はｎ−プロピル）も含有し得る。化合物の１つが水の中に若干又は僅かに可溶性であるに過ぎない場合には、溶解増強剤若しくは可溶化剤を添加することができ、又は溶媒は、１０〜６０％ｗ／ｗのプロピレングリコールを含み得る。
【０１８３】
本発明は、新形成、感染性疾患、老化細胞若しくは年齢に関連する疾患又はこれらの症候を処置する方法であって、治療的に有効な量の、本明細書中の処方の化合物を含む薬学的組成物を対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）に投与することを含む方法を提供する。このため、一実施形態は、新形成、感染性疾患、老化細胞又は年齢に関連する疾患又はこれらの症候に罹患し、又は罹患しやすい対象を処置する方法である。この方法は、前記疾病若しくは障害若しくはこれらの症候を処置するのに十分な、治療量の量の本明細書中の化合物を、疾病又は障害が処置されるような条件下で、哺乳動物に投与する工程を含む。
【０１８４】
本明細書中の方法は、対象（このような処置を必要とするとして特定された対象を含む。）に、このような効果を生じさせるために有効量の本明細書に記載された化合物又は本明細書に記載された組成物を投与することを含む。このような処置を必要とする対象を特定することは、対象又は医療専門職の判断に属し得、又は主観的（例えば、意見）若しくは客観的（例えば、検査又は診断方法によって測定可能）であり得る。
【０１８５】
本発明の治療方法（予防的処置を含む。）は、一般に、治療的に有効な量の、本明細書中の処方の化合物などの本明細書中の化合物の、哺乳動物、特にヒトを含むこれを必要としている対象（例えば、動物、ヒト）への投与を含む。このような処置は、新形成、感染性疾患、老化細胞又は年齢に関連する疾患、障害又はこれらの症候に罹患し、これらを有し、これらに罹患しやすい、又はこれらのリスクがある対象、特にヒトに適切に投与されるであろう。「リスクがある」対象の決定は、診断検査又は対象若しくは医療従事者の意見によるあらゆる客観的又は主観的決定（例えば、遺伝子検査、酵素又はタンパク質マーカー、（本明細書中に定義されている）マーカー、家族歴など）によってなされ得る。本発明の融合タンパク質複合体は、免疫応答の増加が所望されるあらゆるその他の障害の処置において使用され得る。
【０１８６】
本発明は、処置の進行をモニタリングする方法も提供する。この方法は、診断マーカー（マーカー）（例えば、本明細書中の化合物によって調節される本明細書に記載されたあらゆる標的、タンパク質又はそれらの指標など）のレベルを測定する工程、又は、対象が新形成と関連する障害又はその症候を処置するのに十分な、治療量の本明細書中の化合物を投与される、前記疾病若しくはその症候に罹患しまた若しくは罹患しやすい対象中での診断的測定（例えば、スクリーニング、アッセイ）を含む。前記方法において決定されるマーカーのレベルは、対象の病状を確定するために、健康な正常な対照中又は他の罹患した患者中のマーカーの既知のレベルと比較することができる。いくつかの事例では、第一のレベルの決定より遅い時点で、対象中のマーカーの第二のレベルが決定され、疾病の経過又は治療の有効性をモニターするために、２つのレベルが比較される。ある態様において、本発明にしたがって処置を開始する前に、対象中のマーカーの処置前レベルが決定される；次いで、このマーカーの処置前レベルは、処置の有効性を決定するために、処置開始後における対象中のマーカーのレベルと比較することができる。
【０１８７】
併用療法
必要に応じて、本発明の融合タンパク質複合体は、あらゆる他の標準的治療法と組み合わせて投与され、このような方法は当業者に既知であり、Ｅ．Ｗ．ＭａｒｔｉｎによるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓに記載されている。所望であれば、本発明の融合タンパク質複合体は、免疫療法、治療用抗体、標的療法、手術、放射線療法又は化学療法を含むがこれらに限定されない、あらゆる従来の抗新形成療法と組み合わて投与される。
【０１８８】
キット又は医薬系
本発明の融合タンパク質複合体を含む薬学的組成物は、新形成、感染性疾患又は老化細胞若しくは年齢に関連する疾患を軽減する上で使用するためのキット又は医薬系の中に組み入れてもよい。本発明のこの態様にしたがうキット又は医薬系は、バイアル、管、アンプル、瓶などの１つ以上の容器手段をその中に詰め込んで有している、箱、紙箱（ｃａｒｔｏｎ）、管などの運搬手段を含む。本発明のキット又は医薬系は、本発明の融合タンパク質複合体を使用するための付属説明書も含み得る。
【０１８９】
組換えタンパク質発現
一般に、本発明の融合タンパク質複合体（例えば、ＴｘＭ複合体の成分）の調製は、本明細書に開示されている手法によって及び認知された組換えＤＮＡ技術によって遂行することができる。
【０１９０】
一般に、組換えポリペプチドは、適切な発現ビヒクル中の、ポリペプチドをコードする核酸分子又はその断片の全部又は一部での適切な宿主細胞の形質転換によって作製される。分子生物学分野の当業者は、組換えタンパク質を提供するために、多様な発現系のいずれをも使用し得ることを理解するであろう。使用される正確な宿主細胞は、本発明にとって重要でない。組換えポリペプチドは、実質的にあらゆる真核生物宿主中（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、昆虫細胞、例えば、Ｓｆ２１細胞、又は哺乳動物細胞、例えば、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅＬａ又は好ましくはＣＯＳ細胞）で産生され得る。このような細胞は、多様な範囲の入手先から入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、Ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍｄ．；例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９７も参照されたい。）。形質移入の方法及び発現媒体の選択は、選択された宿主系に依存するであろう。形質転換法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（上記）に記載されており、発現媒体は、例えば、Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｐ．Ｈ．Ｐｏｕｗｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｓｕｐｐ．１９８７）に掲載されているものから選択され得る。
【０１９１】
組換えポリペプチドの作製のための様々な発現系が存在する。このようなポリペプチドを作製するために有用な発現ベクターには、染色体、エピソーム及びウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入因子、酵母染色体要素、バキュロウイルス、ＳＶ４０などのパポーバウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ワクチン及びレトロウイルスなどのウイルスに由来するベクター並びにこれらの組み合わせに由来するベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９２】
組換えポリペプチドが発現されたら、例えば、アフィニティークロマトグラフィーを用いて単離される。一例では、ポリペプチドに対して産生された（例えば、本明細書に記載されたように作製された）抗体がカラムに付着され、組換えポリペプチドを単離するために使用され得る。アフィニティークロマトグラフィーに先立つポリペプチドを有する細胞の溶解及び分画は、標準的な方法によって実施され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照されたい。）。単離されたら、組換えタンパク質は、所望であれば、例えば、高速液体クロマトグラフィーによってさらに精製することができる（例えば、Ｆｉｓｈｅｒ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．，Ｗｏｒｋ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８０を参照されたい。）。
【０１９３】
本明細書で使用されているように、本発明の生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子には、サイトカイン、ケモカイン、増殖因子、タンパク質毒素、免疫グロブリンドメイン又は酵素などのその他の生物活性タンパク質などの因子が含まれ得る。また、生物学的に活性なポリペプチドには、非タンパク質毒素、細胞傷害性因子、化学療法剤、検出可能な標識、放射性物質などの他の化合物への接合体が含まれ得る。
【０１９４】
本発明のサイトカインは、他の細胞に影響を与える細胞によって産生されるあらゆる因子によって定義され、細胞性免疫の多数の複数の効果のいずれにも関与している。サイトカインの例には、ＩＬ−２ファミリー、インターフェロン（ＩＦＮ）、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＬ−１、ＩＬ−１７、ＴＧＦ及びＴＮＦサイトカインファミリー並びにＩＬ−１〜ＩＬ−３５、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α及びＴＮＦ−βが含まれるが、これらに限定されない。
【０１９５】
本発明の一態様において、第一のタンパク質は、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメイン又はその機能的断片に共有結合された第一の生物学的に活性なポリペプチドを含む。ＩＬ−１５は、Ｔ細胞活性化及び増殖に影響を及ぼすサイトカインである。免疫細胞活性化及び増殖に影響を及ぼす上でのＩＬ−１５活性は、いくつかの点で、ＩＬ−２に類似するが、基本的な相違が十分に特定されてきた（Ｗａｌｄｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．２００６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５９５−６０１）。
【０１９６】
本発明の別の態様において、第一のタンパク質は、ＩＬ−１５変異体（本明細書においてはＩＬ−１５変異体とも称される。）であるインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ドメインを含む。ＩＬ−１５変異体は、好ましくは、天然の（すなわち野生型）ＩＬ−１５タンパク質とは異なるアミノ酸配列を含む。ＩＬ−１５変異体は、好ましくは、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチドを結合し、ＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニストとして機能する。好ましくは、アゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体は、スーパーアゴニスト活性を有する。ＩＬ−１５変異体は、ＩＬ−１５Ｒαとのその会合とは無関係に、ＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニストとして機能することができる。ＩＬ−１５アゴニストは、野生型ＩＬ−１５と比較して同等の又は増加した生物学的活性によって例示される。ＩＬ−１５アンタゴニストは、野生型ＩＬ−１５と比較して減少した生物学的活性によって、又はＩＬ−１５媒介性応答を阻害する能力によって例示される。いくつかの例では、ＩＬ−１５変異体は、ＩＬ−１５ＲβγＣ受容体へ、増加した又は減少した活性で結合する。いくつかの事例において、ＩＬ−１５変異体の配列は、天然のＩＬ−１５配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変化、例えば、置換又は欠失を有し、このような変化はＩＬ−１５アゴニスト又はアンタゴニスト活性をもたらす。好ましくは、アミノ酸置換／欠失は、ＩＬ−１５Ｒβ及び／又はγＣと相互作用するＩＬ−１５のドメイン中にある。より好ましくは、アミノ酸置換／欠失は、ＩＬ−１５Ｒαポリペプチドへの結合又はＩＬ−１５変異体を産生する能力に影響を与えない。推定される又は既知のＩＬ−１５構造、既知の構造を有するＩＬ−２などの相同的分子とのＩＬ−１５の比較に基づいて、本明細書に掲載されているような合理的な又は無作為の突然変異誘発及び機能的なアッセイ又はその他の経験的方法を通じて、ＩＬ−１５変異体を生成するための適切なアミノ酸置換／欠失を同定することができる。さらに、適切なアミノ酸置換は保存的又は非保存的変化及びさらなるアミノ酸の挿入であり得る。好ましくは、本発明のＩＬ−１５変異体は、成熟ヒトＩＬ−１５配列の６、８、１０、６１、６５、７２、９２、１０１、１０４、１０５、１０８、１０９、１１１又は１１２位に１つ又は１つより多いアミノ酸置換／欠失を含有する；特に、Ｄ８Ｎ（「Ｄ８」は、天然の成熟ヒトＩＬ−１５配列中のアミノ酸及び残基位置を表し、「Ｎ」はＩＬ−１５変異体中の当該位置にある置換されたアミノ酸残基を表す。）、Ｉ６Ｓ、Ｄ８Ａ、Ｄ６１Ａ、Ｎ６５Ａ、Ｎ７２Ｒ、Ｖ１０４Ｐ又はＱ１０８Ａ置換は、アンタゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体をもたらし、Ｎ７２Ｄ置換は、アゴニスト活性を有するＩＬ−１５変異体をもたらす。
【０１９７】
ケモカインは、サイトカインのように、他の細胞に曝されたときに、細胞性免疫の多くの効果に関与するあらゆる化学的因子又は分子として定義される。適切なケモカインには、ＣＸＣ、ＣＣ、Ｃ及びＣＸ３Ｃケモカインファミリー並びに、ＣＣＬ−１〜ＣＣＬ−２８、ＣＸＣ−１〜ＣＸＣ−１７、ＸＣＬ−１、ＸＣＬ−２、ＣＸ３ＣＬ１、ＭＩＰ−１ｂ、ＩＬ−８、ＭＣＰ−１及びＲａｎｔｅｓが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０１９８】
増殖因子には、特定の細胞に曝されたときに、影響を受けた細胞の増殖及び／又は分化を誘導するあらゆる分子が含まれる。増殖因子には、タンパク質及び化学分子が含まれ、そのうちのいくつかには、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ヒト増殖因子及び幹細胞増殖因子が含まれる。さらなる増殖因子も、本明細書に記載されている用途に適切であり得る。
【０１９９】
毒素又は細胞傷害性因子には、細胞に曝されたときに、致死的効果又は増殖に対する阻害的効果を有するあらゆる物質が含まれる。より具体的には、エフェクター分子は、例えば、ジフテリア毒素（ＤＴ）、志賀毒素、アブリン、コレラ毒素、リシン、サポリン、シュードモナス外毒素（ＰＥ）、ポークウィード抗ウイルスタンパク質又はゲロニンなどの、例えば、植物又は細菌起源の細胞毒素であり得る。このような毒素の生物学的に活性な断片は本分野において周知であり、例えば、ＤＴ  Ａ鎖及びリシンＡ鎖を含む。さらに、毒素は、例えば、ホスホリパーゼ酵素（例えば、ホスホリパーゼＣ）などの、細胞表面で活性な因子であり得る。
【０２００】
さらに、エフェクター分子は、例えば、ビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキセート、アドリアマイシン、ブレオマイシン又はシスプラチンなどの化学療法薬であり得る。
【０２０１】
さらに、エフェクター分子は、診断又は画像化研究に適した検出可能に標識された分子であり得る。このような標識には、ビオチン又はストレプトアビジン／アビジン、検出可能なナノ粒子又は結晶、酵素若しくは触媒的に活性なその断片、緑色蛍光タンパク質、ＦＩＴＣ、フィコエリトリン、ｃｙｃｈｏｍｅ、テキサスレッド又は量子ドットなどの蛍光標識；放射線核種、例えば、ヨウ素−１３１、イットリウムー９０、レニウム−１８８又はビスマス−２１２；リン光又は化学発光分子又はＰＥＴ、超音波又はＧｄ若しくは常磁性金属イオンをベースとする造影剤などのＭＲＩによって検出可能な標識が含まれる。エフェクター又はタグを含むタンパク質の製造及び使用に関する開示に関して、例えば、Ｍｏｓｋａｕｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４，１５７０９（１９８９）；Ｐａｓｔａｎ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ４７，６４１，１９８６；Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｔｏｘｉｎｓ  ａｓ  Ｎｏｖｅｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１，３３１，（１９９２）；“Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｔｏｘｉｎｓ”  Ｏｌｓｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌ，Ｐｈａｒｍａｃ．Ｔｈｅｒ．，２５，３５５（１９８２）；公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／２９３５０号；公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４／０４６８９号；公開されたＰＣＴ出願ＷＯ２００５０４６４４９号及び米国特許第５，６２０，９３９号を参照されたい。
【０２０２】
本発明のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒαポリペプチドは、適切には、アミノ酸配列において、天然に存在するＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα分子、例えば、ヒト、マウス若しくはその他のげっ歯類又はその他の哺乳動物のＩＬ−１５及びＩＬ−１５Ｒα分子に対応する。ヒトインターロイキン１５（ＩＬ１５）ｍＲＮＡ−ＧｅｎＢａｎｋ：Ｕ１４４０７．１（参照により本明細書に組み込まれる。）、ムス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）インターロイキン１５（ＩＬ１５）ｍＲＮＡ−Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｕ１４３３２．１（参照により本明細書に組み込まれる。）、ヒトインターロイキン−１５受容体α鎖前駆体（ＩＬ１５ＲＡ）ｍＲＮＡ−Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｕ３１６２８．１（参照により本明細書に組み込まれる。）、ムス・ムスクルスインターロイキン１５受容体、α鎖−ＧｅｎＢａｎｋ：ＢＣ０９５９８２．１（参照により本明細書に組み込まれる。）など、これらのポリペプチド及びコードする核酸の配列は文献において既知である。
【０２０３】
いくつかの状況では、例えば、ｓｃ抗体の価数を増加させるために、本発明のタンパク質融合物又は接合体複合体を多価とすることが有用であり得る。特に、融合タンパク質複合体のＩＬ−１５とＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の相互作用は、多価複合体を生成する手段を与える。さらに、多価融合タンパク質は、例えば、標準的なビオチン−ストレプトアビジン標識技術を使用することによって、又はラテックスビーズなどの適切な固体支持体への接合によって、１〜４つのタンパク質（同一又は異なる）間で共有的に又は非共有的に連結することによって作製され得る。化学的に架橋されたタンパク質（例えば、デンドリマーに架橋された）も、適切な多価の種である。例えば、ビオチン化ＢｉｒＡタグなどの修飾可能なタグ配列又はＣｙｓ若しくはＨｉｓなどの化学的に反応性が高い側鎖を有するアミノ酸残基をコードする配列を含めることによって、タンパク質は修飾することができる。このようなアミノ酸タグ又は化学的に反応性が高いアミノ酸は、融合タンパク質中の様々な位置、好ましくは、生物学的に活性なポリペプチド又はエフェクター分子の活性部位に対して遠位の位置に配置され得る。例えば、可溶性融合タンパク質のＣ末端は、タグ又はこのような反応性アミノ酸を含む他の融合されたタンパク質に共有結合することができる。２つ以上の融合タンパク質を適切なデンドリマー又は他のナノ粒子に化学的に連結して多価分子を得るために、適切な側鎖を含めることができる。デンドリマーは、その表面の多数の異なる官能基のいずれか１つを有することができる合成化学ポリマーである（Ｄ．Ｔｏｍａｌｉａ，Ａｌｄｒｉｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，２６：９１：１０１（１９９３））。本発明にしたがって使用するための例示的なデンドリマーには、例えば、システイン残基を連結することができる、Ｅ９スターバーストポリアミンデンドリマー及びＥ９コンバスト（ｃｏｍｂｕｓｔ）ポリアミンデンドリマーが含まれる。例示的なナノ粒子には、リポソーム、コアシェル粒子又はＰＬＧＡをベースとする粒子が含まれる。
【０２０４】
別の態様において、融合タンパク質複合体のポリペプチドの一方又は両方が、免疫グロブリンドメインを含む。または、タンパク質結合ドメイン−ＩＬ−１５融合タンパク質は、免疫グロブリンドメインにさらに連結することができる。好ましい免疫グロブリンドメインは、上記のような多鎖タンパク質を形成するために、他の免疫グロブリンドメインとの相互作用を可能にする領域を含む。例えば、ＩｇＧ１ＣＨ２−ＣＨ３などの免疫グロブリン重鎖領域は、Ｆｃ領域を作るために、安定に相互作用することが可能である。Ｆｃドメインを含む好ましい免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体又は補体タンパク質結合活性を含むエフェクター機能を有する及び／又はグリコシル化部位を有する領域も含む。いくつかの態様において、融合タンパク質複合体の免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体又は補体結合活性又はグリコシル化又は二量体化を低減又は増強し、これにより、生じたタンパク質の生物学的活性に影響を及ぼす変異を含有する。例えば、Ｆｃ受容体への結合を低減する変異を含有する免疫グロブリンドメインは、Ｆｃ受容体を有する細胞へのより低い結合活性を有する本発明の融合タンパク質複合体を生成するために使用することができ、これは、特異的な抗原を認識又は検出するように設計された試薬にとって有利であり得る。
【０２０５】
核酸及びベクター
本発明は、本融合タンパク質（例えば、ＴｘＭの成分）をコードする核酸配列、特にＤＮＡ配列をさらに提供する。好ましくは、ＤＮＡ配列は、ファージ、ウイルス、プラスミド、ファ−ジミド、コスミド、ＹＡＣ又はエピソームなどの染色体外複製に適したベクターによって運搬される。特に、本明細書に記載されている調製方法を促進するために、及び多量の融合タンパク質を取得するために、所望の融合タンパク質をコードするＤＮＡベクターを使用することができる。ＤＮＡ配列は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入されたタンパク質コード配列の転写及び翻訳のための必要な要素を含有するベクター中に挿入することができる。様々な宿主−ベクター系は、タンパク質コード配列を発現するために使用され得る。これらには、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルスなど）で感染された哺乳動物細胞系；ウイルス（例えば、バキュロウイルス）で感染された昆虫細胞系；酵母ベクターを含有する酵母又はバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌などの微生物が含まれる。使用される宿主−ベクター系に応じて、多数の適切な転写及び翻訳因子のいずれの１つも使用され得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記及びＡｕｓｕｂｅｌら上記を参照されたい。
【０２０６】
可溶性融合タンパク質複合体を作製するための方法であって、第一及び第二のタンパク質をコードする本明細書中に記載されたＤＮＡベクターを宿主細胞中に導入すること、細胞又は培地中で融合タンパク質を発現させるのに及び第一のタンパク質のＩＬ−１５ドメインと第二のタンパク質の可溶性ＩＬ−１５Ｒαドメインとの間の会合を許容して可溶性融合タンパク質複合体を形成するのに十分な条件下で、培地中で宿主細胞を培養すること、宿主細胞又は培地から可溶性融合タンパク質複合体を精製することを含む方法が、本発明に含まれる。
【０２０７】
一般に、本発明による好ましいＤＮＡベクターは、エフェクター分子をコードする配列に作用可能に連結された、生物学的に活性なポリペプチドをコードする第一のヌクレオチド配列を導入するための第一のクローニング部位を５’から３’方向に含む、ホスホジエステル結合によって連結されたヌクレオチド配列を含む。
【０２０８】
ＤＮＡベクターによってコードされる融合タンパク質成分は、カセット形式で提供されることができる。「カセット」という用語によって、標準的な組換え法によって、各成分が別の成分に容易に置換され得ることが意味される。特に、コードされる融合複合体が血清型を生じる能力を有し得る又は有する病原体に対して使用されるべき場合には、カセット形式で設計されたＤＮＡベクターは特に望ましい。
【０２０９】
融合タンパク質複合体をコードするベクターを作製するために、生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列は、適切なリガーゼの使用によって、エフェクターペプチドをコードする配列に連結される。提示するペプチドをコードするＤＮＡは、適切な細胞株からなど天然源からＤＮＡを単離することによって、又は既知の合成法、例えば、リン酸トリエステル法によって取得することができる。例えば、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）を参照されたい。合成オリゴヌクレオチドは、市販の自動化されたオリゴヌクレオチド合成機を用いても調製され得る。単離されたら、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は本分野で既知の他の手段によって増幅することができる。生物学的に活性なポリペプチド遺伝子を増幅するための適切なＰＣＲプライマーは、ＰＣＲ産物に制限部位を付加し得る。ＰＣＲ産物は、好ましくは、エフェクターペプチドに対するスプライス部位と、並びに生物学的に活性なポリペプチド−エフェクター融合複合体の適切な発現及び分泌に必要なリーダー配列とを含む。ＰＣＲ産物は、好ましくは、リンカー配列をコードする配列又はこのような配列の連結のための制限酵素部位も含む。
【０２１０】
本明細書に記載された融合タンパク質は、好ましくは、標準的な組換えＤＮＡ技術によって作製される。例えば、生物学的に活性なポリペプチドをコードするＤＮＡ分子が単離されたら、エフェクターポリペプチドをコードする別のＤＮＡ分子に配列を連結することができる。生物学的に活性なポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、エフェクターペプチドをコードするＤＮＡ配列に直接結合してもよく、又は、より典型的には、本明細書に論述されているようなリンカー配列をコードするＤＮＡ配列が、生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列とエフェクターペプチドをコードする配列との間に挿入され、適切なリガーゼを用いて連結されてもよい。得られたハイブリッドＤＮＡ分子は、融合タンパク質複合体を産生するために、適切な宿主細胞中で発現させることができる。連結後に、コードされたポリペプチドの翻訳フレームが変化されないように（すなわち、ＤＮＡ分子がインフレームに互いに連結されている。）、ＤＮＡ分子は、５’から３’方向に互いに連結される。得られたＤＮＡ分子は、インフレームの融合タンパク質をコードする。
【０２１１】
他のヌクレオチド配列も、遺伝子構築物中に含めることができる。例えば、エフェクターペプチドに融合された生物学的に活性なポリペプチドをコードする配列の発現を調節するプロモーター配列又は細胞表面若しくは培地に融合タンパク質を誘導するリーダー配列が、構築物中に含められることができ、又は構築物がその中に挿入された発現ベクター中に存在することができる。免疫グロブリン又はＣＭＶプロモーターが、特に好ましい。
【０２１２】
変異体の、生物学的に活性なポリペプチド、ＩＬ−１５、ＩＬ−１５Ｒα又はＦｃドメインコード配列を取得する上で、当業者は、生物学的活性の喪失又は低下なしに、ある種のアミノ酸置換、付加、欠失及び翻訳後修飾によってポリペプチドが修飾され得ることを認識するであろう。特に、保存的アミノ酸置換は、すなわち、あるアミノ酸を、類似のサイズ、電荷、極性及び立体構造の別のアミノ酸に置換することは、タンパク質機能を著しく変化させる可能性は低いことが周知である。タンパク質の構成要素である２０の標準アミノ酸は、以下のように、保存的なアミノ酸の４つの群に広く分類することができる：非極性（疎水性）群は、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン及びバリンを含み；極性（無電荷、中性）群は、アスパラギン、システイン、グルタミン、グリシン、セリン、スレオニン及びチロシンを含み；正に帯電した（塩基性）群は、アルギニン、ヒスチジン及びリジンを含有し、並びに負に帯電した（酸性）群はアスパラギン酸及びグルタミン酸を含有する。タンパク質中のあるアミノ酸の同じ群内の別のアミノ酸への置換は、タンパク質の生物学的活性に対して悪影響を有する可能性が低い。他の例では、タンパク質の生物学的活性を低下又は増強するために、アミノ酸位置への修飾を施すことができる。このような変化は、標的とされる残基の既知の又は推定される構造的又は機能的特性に基づいて、無作為に又は部位特異的変異を介して導入することができる。変異体タンパク質の発現後、修飾による生物学的活性の変化は、結合又は機能的アッセイを用いて容易に評価することができる。
【０２１３】
ヌクレオチド配列間の相同性は、ＤＮＡハイブリッド形成分析によって決定することができ、二本鎖ＤＮＡハイブリッドの安定性は生じる塩基対の程度に依存する。高温及び／又は低い塩含量の条件はハイブリッドの安定性を低下させ、選択された相同性の程度を下回る配列のアニーリングを防ぐために変化させることができる。例えば、約５５％Ｇ−Ｃ含量を有する配列に対しては、４０〜５０℃、６×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝液）及び０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）のハイブリッド形成及び洗浄条件は、約６０〜７０％の相同性を示し、５０〜６５℃、１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳのハイブリッド形成及び洗浄条件は、約８２〜９７％の相同性を示し、並びに５２℃、０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳのハイブリッド形成及び洗浄条件は約９９〜１００％の相同性を示す。ヌクレオチド及びアミノ酸配列を比較する（及び相同性の程度を測定する）ための幅広いコンピュータプログラムも利用可能であり、市販及び無料ソフトウェアの両方の入手源を掲載したリストが、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９９９）に見出される。容易に入手可能な配列比較及び複数配列並列アルゴリズムは、ぞれぞれ、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９７）及びＣｌｕｓｔａｌＷプログラムである。ＢＬＡＳＴは、ワールド・ワイド・ウェブ上で、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで入手可能であり、ＣｌｕｓｔａｌＷのバージョンは、２．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋで入手可能である。
【０２１４】
融合タンパク質の成分は、それぞれがその意図される機能を実行することが可能である限り、ほぼあらゆる順序で組み立てることができる。例えば、一実施形態において、生物学的に活性なポリペプチドは、エフェクター分子のＣ又はＮ末端に位置している。
【０２１５】
本発明の好ましいエフェクター分子は、そのドメインが意図される機能をもたらすサイズを有するであろう。本発明のエフェクター分子は、作製され、周知の化学的架橋法を含む様々な方法によって、生物学的に活性なポリペプチドに融合することができる。例えば、Ｍｅａｎｓ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ  Ｆｅｅｎｅｙ，Ｒ．Ｅ．（１９７４）ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｈｏｌｄｅｎ−Ｄａｙを参照されたい。Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ（１９９１）ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓも参照されたい。しかしながら、インフレームの融合タンパク質を作製するために、組換え操作を使用することが一般的には好ましい。
【０２１６】
記載されているように、本発明による融合分子又は接合体分子は、いくつかの方法で組み立てることができる。例示的な配置では、生物学的に活性なポリペプチドのＣ末端は、エフェクター分子のＮ末端に作用可能に連結されている。その連結は、所望であれば、組換え法によって達成することができる。しかしながら、別の配置では、生物学的に活性なポリペプチドのＮ末端は、エフェクター分子のＣ末端に連結されている。
【０２１７】
これに代えて又はこれに加えて、必要に応じて、生物学的に活性なポリペプチド又は接合体複合体中に、１つ以上のさらなるエフェクター分子を挿入することができる。
【０２１８】
ベクター及び発現
本発明の融合タンパク質複合体の成分（例えば、ＴｘＭ）を発現するために、多数の戦略を利用することができる。例えば、本発明の融合タンパク質複合体の１つ以上成分をコードする構築物は、構築物を挿入し、その後連結するためにベクターの中に切断を作るために、制限酵素を用いて、適切なベクター中に組み込むことができる。遺伝子構築物を含有するベクターは、次いで、融合タンパク質の発現のために適切な宿主中に導入される。全般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい。適切なベクターの選択は、クローニングプロトコールに関連する要素に基づいて経験的に行うことができる。例えば、ベクターは、利用されている宿主と適合的であり、宿主に対する適切なレプリコンを有するべきである。ベクターは、発現されるべき融合タンパク質複合体をコードするＤＮＡ配列を収容することができなければならない。適切な宿主細胞には、真核細胞及び原核細胞、好ましくは、容易に形質転換することができ、培地中で急速な成長を呈することができる細胞が含まれる。特に好ましい宿主細胞には、イー・コリ、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｕｓ）などの原核生物並びに動物細胞及び酵母株、例えば、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）などの真核生物が含まれる。哺乳動物細胞、特にＪ５５８、ＮＳＯ、ＳＰ２−Ｏ又はＣＨＯが一般に好ましい。他の適切な宿主には、例えば、Ｓｆ９などの昆虫細胞が含まれる。従来の培養条件が利用される。Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい。次いで、安定な形質転換された又は形質移入された細胞株細胞株を選択することができる。本発明の融合タンパク質複合体を発現している細胞は、既知の手法によって決定することができる。例えば、免疫グロブリンに連結された融合タンパク質複合体の発現は、連結された免疫グロブリンに対して特異的なＥＬＩＳＡによって及び／又は免疫ブロッティングによって決定することができる。ＩＬ−１５又はＩＬ−１５Ｒαドメインに連結された生物学的に活性なポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を検出するための他の方法は、実施例に開示されている。
【０２１９】
上で一般的に述べられているように、所望の融合タンパク質をコードする核酸を増やすために、宿主細胞は調製目的のために使用することができる。このため、宿主細胞には、融合タンパク質の産生が具体的にその中で予定される原核又は真核細胞が含まれ得る。このため、宿主細胞には、具体的に、酵母、ハエ、虫、植物、カエル、哺乳動物細胞及び融合物をコードする核酸を増加させることが可能な器官が含まれる。使用することができる哺乳動物細胞株の非限定的な例には、ＣＨＯ  ｄｈｆｒ−細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｍ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６（１９８０））、２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９（１９７７））又はＳＰ２若しくはＮＳＯのような骨髄腫細胞（Ｇａｌｆｒｅ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３（Ｂ）：３（１９８１））が含まれる。
【０２２０】
所望の融合タンパク質複合体をコードする核酸を増やすことが可能な宿主細胞は、昆虫（例えば、エスピー・フルギペルダ（Ｓｐ．ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、酵母（例えば、Ｆｌｅｅｒ，Ｒ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３（５）：４８６４９６（１９９２）によって一般的に概説されているような、エス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、エス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、ピー・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ケー・ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、エイチ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、真菌及び植物細胞を含む、非哺乳動物の真核細胞も包含する。イー・コリ及びバチルスなどのある種の原核生物も想定される。
【０２２１】
所望の融合タンパク質をコードする核酸は、細胞を形質移入するための標準的な技術によって、宿主細胞中に導入することができる。「形質移入する」又は「形質移入」という用語は、リン酸カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性形質移入、リポフェクション、電気穿孔、微量注入、ウイルスの形質導入及び／又は組込みを含む、宿主細胞中に核酸を導入するための全ての従来技術を包含するものとする。宿主細胞を形質移入するための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記及びその他の研究用テキストブックに見出すことができる。
【０２２２】
様々なプロモーター（転写開始制御領域）が、本発明にしたがって使用され得る。適切なプロモーターの選択は、提案された発現宿主に依存する。選択された宿主中で機能的である限り、異種の源からのプロモーターが使用され得る。
【０２２３】
プロモーター選択は、ペプチド又はタンパク質産生の所望される効率及びレベルにも依存する。イー・コリ中でのタンパク質発現のレベルを劇的に増加させるために、ｔａｃなどの誘導性プロモーターがしばしば利用される。タンパク質の過剰発現は、宿主細胞に対して有害であり得る。その結果、宿主細胞の成長が制限され得る。誘導性プロモーター系の使用によって、遺伝子発現の誘導以前に、許容され得る密度まで宿主細胞を培養することが可能となり、これにより、より高い産物収量を促進する。
【０２２４】
様々なシグナル配列が、本発明にしたがって使用され得る。生物学的に活性なポリペプチドコード配列と相同であるシグナル配列が使用され得る。または、発現宿主中での効率的な分泌及びプロセッシングのために選択された又は設計されたシグナル配列も使用され得る。例えば、適切なシグナル配列／宿主細胞対には、ビー・スブチリス中での分泌のためのビー・スブチリスｓａｃＢシグナル配列、及びサッカロミセス・セレビシエα−接合因子又はピー・パストリス分泌のためのピー・パストリス酸性ホスファターゼｐｈｏＩシグナル配列が含まれる。シグナル配列は、シグナルペプチダーゼ切断部位をコードする配列を通じてタンパク質コード配列に直接的に連結され得、又は下流ＴＣＲ配列の正しい読み枠を確保する、通常１０未満のコドンからなる短いヌクレオチド架橋を通じて連結され得る。
【０２２５】
真核生物タンパク質発現系に対して、転写及び翻訳を増強するための要素が同定されている。例えば、異種プロモーターのいずれかの側にカリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）プロモーター１０００ｂｐを配置することは、植物細胞中で１０〜４００倍転写レベルを上昇させ得る。発現構築物は、適切な翻訳開始配列も含むべきである。適切な翻訳開始のためにＫｏｚａｋコンセンサス配列を含める発現構築物の修飾は、翻訳のレベルを１０倍増加させ得る。
【０２２６】
選択的マーカーがしばしば利用され、選択的マーカーは発現構築物の一部であってもよく、又はマーカーが目的の遺伝子とは異なる部位に統合し得るように、発現構築物から離れていてもよい（例えば、発現ベクターによって運搬される。）。例には、抗生物質に耐性を付与するマーカー（例えば、ｂｌａは、イー・コリ宿主細胞にアンピシリンに対する耐性を付与し、ｎｐｔＩＩは幅広い原核細胞及び真核細胞にカナマイシン耐性を付与する。）又は宿主が最小培地上で成長することを可能にするマーカー（例えば、ＨＩＳ４は、ピー・パストリス又はＨｉｓ−エス・セレビシエがヒスチジンの不存在下で増殖することを可能にする。）が含まれる。選択可能なマーカーは、マーカーの独立した発現を可能にするために、それ自身の転写及び翻訳開始及び終結制御領域を有する。抗生物質耐性がマーカーとして利用される場合には、選択のための抗生物質の濃度は、抗生物質に応じて変動し、一般的には、１０〜６００μｇ抗生物質／ｍＬ培地の範囲である。
【０２２７】
発現構築物は、既知の組換えＤＮＡ技術を利用することによって組み立てられる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。制限酵素消化及び連結は、ＤＮＡの２つの断片を連結するために利用される基本的な工程である。ＤＮＡ断片の末端は、連結の前に修飾を必要とすることがあり得、これは、突出部中に充填すること、ヌクレアーゼ（ＥｘｏＩＩＩ）を用いて断片の末端部分を除去すること、部位特異的突然変異誘発、又はＰＣＲによって新たな塩基対を追加することによって達成され得る。
選択された断片の連結を促進するために、ポリリンカー及びアダプターが利用され得る。発現構築物は、典型的には、制限、連結及びイー・コリの形質転換のラウンドを利用して、段階的に組み立てられる。発現構築物の構築に適した多数のクローニングベクターが本分野において既知であり（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９中に引用されている、λＺＡＰ及びｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ  ＳＫ−１、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ｐＥＴ、Ｎｏｖａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、具体的な選択は本発明にとって重要でない。クローニングベクターの選択は、発現構築物の宿主細胞中への導入のために選択された遺伝子導入系によって影響されるであろう。各段階の終わりに、生じた構築物は、制限、ＤＮＡ配列、ハイブリッド形成及びＰＣＲ分析によって分析され得る。
【０２２８】
発現構築物は、直鎖又は環状のいずれかであるクローニングベクター構築物として、宿主中に形質転換され得、又はクローニングベクターから取り出され、そのまま使用され若しくは送達ベクター上に導入され得る。送達ベクターは、選択された宿主細胞種中での発現構築物の導入及び維持を促進する。発現構築物は、多数の既知の遺伝子導入系のいずれによっても宿主細胞中に導入される（例えば、天然の形質転換受容性、化学的に媒介される形質転換、プロトプラスト形質転換、電気穿孔、遺伝子銃形質転換、形質移入又は接合）（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）。選択される遺伝子導入系は、使用される宿主細胞及びベクター系に依存する。
【０２２９】
例えば、発現構築物は、プロトプラスト形質転換又は電気穿孔によって、エス・セレビシエ細胞中に導入することができる。エス・セレビシエの電気穿孔は、容易に達成され、スフェロプラスト形質転換と同等の形質転換効率を与える。
【０２３０】
本発明は、目的の融合タンパク質を単離するための製造方法をさらに提供する。この方法では、制御配列に作用可能に連結された目的のタンパク質をコードする核酸がその中に導入された宿主細胞（例えば、酵母、真菌、昆虫、細菌又は動物細胞）は、目的の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列の転写を刺激するための培地中において、製造規模で増殖される。その結果、目的の融合タンパク質は、採集された宿主細胞から又は培地から単離される。培地から又は採集された細胞から目的のタンパク質を単離するために、標準的なタンパク質精製技術を使用することができる。特に、精製技術は、ローラーボトル（ｒｏｌｌｅｒ  ｂｏｔｔｌｅｓ）、スピナーフラスコ、組織培養プレート、バイオリアクター又は発酵槽などの様々な器具から、大規模に（すなわち、少なくともミリグラム量で）、所望の融合タンパク質を発現及び精製するために使用することができる。
【０２３１】
発現されたタンパク質融合複合体は、既知の方法によって単離及び精製することができる。典型的には、培地は遠心又はろ過され、次いで、アフィニティー又はイムノアフィニティークロマトグラフィー、例えば、プロテインＡ若しくはプロテインＧアフィニティークロマトグラフィー又は発現された融合複合体を結合するモノクローナル抗体の使用を含むイムノアフィニティープロトコールによって、上清が精製される。本発明の融合タンパク質は、既知の技術の適切な組み合わせによって分離及び精製することができる。これらの方法には、例えば、塩析沈殿及び溶媒沈殿などの溶解度を使用する方法、透析、限外ろ過、ゲルろ過及びＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動などの分子量の差を使用する方法、イオン交換カラムクロマトグラフィーなどの電荷の差を使用する方法、アフィニティークロマトグラフィーなどの特異的な親和性を使用する方法、逆相高速液体クロマトグラフィーなどの疎水性の差を使用する方法並びに等電点電気泳動、Ｎｉ−ＮＴＡなどの金属アフィニティーカラムなどの等電点の差を使用する方法が含まれる。これらの方法に関連する開示に関して、一般的に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら及びＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたい。
【０２３２】
本発明の融合タンパク質は実質的に純粋であることが好ましい。すなわち、融合タンパク質が好ましくは少なくとも８０％又は９０％〜９５％の均一性（ｗ／ｗ）で存在するように、融合タンパク質は、自然な状態で融合タンパク質を伴う細胞置換成分（ｃｅｌｌ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ）から単離されている。多くの薬学、臨床及び研究用途のためには、少なくとも９８〜９９％の均一性（ｗ／ｗ）を有する融合タンパク質が最も好ましい。実質的に精製されたら、融合タンパク質は、治療用途のために実質的に夾雑物を含むべきでない。部分的に又は実質的な純度まで生成されたら、可溶性融合タンパク質は、治療的に又は本明細書に開示されているようなインビトロ若しくはインビボアッセイを実施する上で使用することができる。実質的な純度は、クロマトグラフィー及びゲル電気泳動などの様々な標準的技術によって測定することができる。
【０２３３】
本融合タンパク質複合体は、様々な、癌性若しくは感染された細胞又は１つ以上の疾病よって感染し得る細胞とともにインビトロ又はインビボで使用するのに適している。
【０２３４】
ヒトインターロイキン−１５（ｈｕＩＬ−１５）は、抗原提示細胞上に発現されたヒトＩＬ−１５受容体α鎖（ｈｕＩＬ−１５Ｒα）によって、免疫エフェクター細胞にトランス提示される。ＩＬ−１５Ｒαは、主として細胞外スシドメイン（ｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕ）を通じて、高い親和性（３８ｐＭ）でｈｕＩＬ−１５を結合する。本明細書に記載されているように、ｈｕＩＬ−１５及びｈｕＩＬ−１５ＲαＳｕドメインは、マルチドメイン融合複合体を構築するための足場として使用することができる。
【０２３５】
ＩｇＧドメイン、特にＦｃドメインは、承認された生物学的薬物を含む多数の治療用分子に対する二量体足場として首尾よく使用されてきた。例えば、エタネルセプトは、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインに連結された可溶性ヒトｐ７５腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）受容体（ｓＴＮＦＲ）の二量体である。この二量体化は、エタネルセプトを単量体ｓＴＮＦＲよりＴＮＦ−α活性の阻害において最大１，０００倍強力とすることを可能にし、融合物に単量体形態より５倍長い血清半減期を与える。その結果、エタネルセプトは、インビボでのＴＮＦ−αの炎症促進性活性の中和に効果的であり、多数の異なる自己免疫適応症に対する患者の治療結果を改善する。
【０２３６】
その二量体化活性に加えて、Ｆｃ断片は、補体活性化及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、貪食細胞及び樹状細胞上にディスプレイされたＦｃγ受容体との相互作用を通じて、細胞傷害性エフェクター機能も提供する。抗癌治療用抗体及びその他の抗体ドメイン−Ｆｃ融合タンパク質との関連で、これらの活性は、動物腫瘍モデル中で及び癌患者中で観察された有効性において、おそらく重要な役割を果たす。しかしながら、これらの細胞傷害性エフェクター応答は、多数の治療的用途において十分でないことがあり得る。このため、Ｆｃドメインのエフェクター活性を改善及び増大させること、並びに標的化された治療分子を介して疾病部位に、Ｔ細胞活性などの細胞溶解性免疫応答を動員する他の手段を開発することに多大な関心が存在してきた。ＩｇＧドメインは、二重特異性抗体を形成して、伝統的なハイブリドーマ融合技術によって生成された産物の質と量を改善するための足場として使用されてきた。これらの方法は他の足場の欠点を回避しているが、臨床的な開発及び使用を支えるのに十分なレベルで、哺乳動物細胞中において二重特異性抗体を産生することは困難であった。
【０２３７】
ヒト由来の免疫賦活性多量体足場を開発するための努力において、ヒトＩＬ−１５（ｈｕＩＬ−１５）及びＩＬ−１５受容体ドメインが使用された。ｈｕＩＬ−１５は、高い結合親和性（平衡解離定数（ＫＤ）〜１０−１１Ｍ）で、ｈｕＩＬ−１５受容体α鎖（ｈｕＩＬ−１５Ｒα）と会合する、サイトカインの小型４α−ヘリックスバンドルファミリーの一員である。次いで、得られる複合体は、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の表面上にディスプレイされたヒトＩＬ−２／１５受容体β／共通γ鎖（ｈｕＩＬ−１５ＲβγＣ）複合体にトランス提示される。このサイトカイン／受容体相互作用は、ウイルスに感染された細胞及び悪性細胞を根絶する上で重要な役割を果たしているエフェクターＴ細胞及びＮＫ細胞の増大及び活性化をもたらす。通常、ｈｕＩＬ−１５及びｈｕＩＬ−１５Ｒαは樹状細胞中で同時生産されて細胞内で複合体を形成し、この複合体は、その後、分泌され、細胞表面上にヘテロ二量体分子としてディスプレイされる。このため、ｈｕＩＬ−１５とｈｕＩＬ−１５Ｒαの相互作用の特徴は、標的特異的な結合をすることが可能な可溶性二量体分子を作るために、これらの鎖間結合ドメインがヒト由来免疫賦活性足場としての役割を果たし得ることを示唆する。
【０２３８】
本発明の実施は、別段の記載がなければ、分子生物学（組換え技術を含む。）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の慣用技術を利用し、これらは、当業者の範囲内に十分に属する。このような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｇａｉｔ，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”  “Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗｅｉｒ，１９９６）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ａｕｓｕｂｅｌ，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”（Ｍｕｌｌｉｓ，１９９４）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｃｏｌｉｇａｎ，１９９１）などの文献中で完全に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの産生に適用可能であり、このため、本発明を作製及び実施する上で検討され得る。特定の実施形態に対して特に有用な技術は、以下の節で論述されている。
【０２３９】
以下の実施例は、アッセイ、スクリーニング及び本発明の治療方法の製造及び使用方法の完全な開示及び記述を当業者に与えるために記載されており、本発明者らが自己の発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではない。
［実施例］
【０２４０】
［実施例１］
ＩＬ−１５、ＩＬ−７及びＩＬ−２１ドメインを含む融合タンパク質複合体の生成及び性質決定
癌又は感染性疾患を処置するための重要な治療的アプローチは、疾病細胞に対する免疫細胞活性を増強させることに依拠する。この戦略は、エクスビボで免疫細胞を刺激した後の養子移植及び又は患者中で、免疫細胞レベル又は活性をインビボで直接増加させることを含む。これらのアプローチに関与する免疫細胞は、自然（すなわち、ＮＫ細胞）又は適応（すなわち、Ｔ細胞）免疫系の免疫細胞であり得る。
【０２４１】
免疫活性を増強するための１つのアプローチは、免疫細胞に免疫賦活性サイトカインを与えることである。このようなサイトカインは本分野において既知であり、単独で、又は他のサイトカイン若しくは因子と組み合わせて使用することができる。以下に詳述されているように、ＩＬ−７及びＩＬ−２１結合ドメインに融合されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ足場を含む融合タンパク質複合体が生成された（図１）。これらの融合タンパク質複合体は、ＮＫ及びＴ細胞への結合並びにサイトカイン受容体の各々を介したシグナル伝達細胞応答に利点を有する。Ｉｇ分子のＦｃ領域は二量体を形成して可溶性多ポリペプチド複合体を与え、精製の目的でプロテインＡを結合することができ、ＮＫ細胞及びマクロファージ上のＦｃγ受容体と相互作用することができ、このため、個別のサイトカインの組み合わせには存在しない利点を融合タンパク質複合体に供する。さらにＩＬ−１５Ｎ７２ＤとＩＬ−１５ＲαＳｕドメイン間の相互作用は、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ、ＩＬ−７及びＩＬ−２１（及びおそらくは他のタンパク質ドメイン又は因子）を単一の免疫賦活性融合タンパク質複合体中に連結するための手段を提供する。
【０２４２】
具体的には、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及びＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖にＩＬ−７及びＩＬ−２１ドメインを連結する構築物が作製された。いくつかの事例では、ＩＬ−７又はＩＬ−２１ポリペプチドのいずれかが、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖のＮ末端に連結される。他の事例では、ＩＬ−７又はＩＬ−２１ポリペプチドが、ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ及び／又はＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ鎖のＮ末端に連結される。ＩＬ−７及びＩＬ−２１結合ドメインに融合されたＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ足場を含む具体的な融合タンパク質複合体が以下に記載されている。
【０２４３】
１）ＩＬ−２１／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−７／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質を含む融合タンパク質複合体が生成された。ヒトＩＬ−７及びヒトＩＬ−２１配列はＵｎｉＰｒｏｔウェブサイトから取得し、これらの配列に対するＤＮＡはＧｅｎｅｗｉｚによって合成した。具体的には、重複ＰＣＲを介して、ＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＦｃのＮ末端コード領域に合成されたＩＬ−２１配列を直接連結して、構築物を作製した。ＩＬ−１５ＲαＳｕ／ＦｃのＮ末端に連結されたＩＬ−２１を含む構築物の核酸及びタンパク質配列が以下に示されている。
【０２４４】
ＩＬ−２１／ＩＬ−１５ＲａＳｕ／Ｆｃ構築物（シグナルペプチド配列を含む。）の核酸配列は、以下のとおりである（配列番号１）。
（シグナルペプチド）
ａｔｇａａｇｔｇｇｇｔｇａｃｃｔｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｃｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｔｃｃａｇｃｇｃｃｔａｃｔｃｃ
（ヒトＩＬ−２１）
ｃａｇｇｇｃｃａｇｇａｃａｇｇｃａｃａｔｇａｔｃｃｇｇａｔｇａｇｇｃａｇｃｔｃａｔｃｇａｃａｔｃｇｔｃｇａｃｃａｇｃｔｇａａｇａａｃｔａｃｇｔｇａａｃｇａｃｃｔｇｇｔｇｃｃｃｇａｇｔｔｔｃｔｇｃｃｔｇｃｃｃｃｃｇａｇｇａｃｇｔｇｇａｇａｃｃａａｃｔｇｃｇａｇｔｇｇｔｃｃｇｃｃｔｔｃｔｃｃｔｇｃｔｔｔｃａｇａａｇｇｃｃｃａｇｃｔｇａａｇｔｃｃｇｃｃａａｃａｃｃｇｇｃａａｃａａｃｇａｇｃｇｇａｔｃａｔｃａａｃｇｔｇａｇｃａｔｃａａｇａａｇｃｔｇａａｇｃｇｇａａｇｃｃｔｃｃｃｔｃｃａｃａａａｃｇｃｃｇｇｃａｇｇａｇｇｃａｇａａｇｃａｃａｇｇｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｃｃａｇｃｔｇｔｇａｃｔｃｃｔａｃｇａｇａａｇａａｇｃｃｃｃｃｃａａｇｇａｇｔｔｃｃｔｇｇａｇａｇｇｔｔｃａａｇｔｃｃｃｔｇｃｔｇｃａｇａａｇａｔｇａｔｃｃａｔｃａｇｃａｃｃｔｇｔｃｃｔｃｃａｇｇａｃｃｃａｃｇｇｃｔｃｃｇａｇｇａｃｔｃｃ
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
ａｔｃａｃｇｔｇｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔａｔｇｔｃｃｇｔｇｇａａｃａｃｇｃａｇａｃａｔｃｔｇｇｇｔｃａａｇａｇｃｔａｃａｇｃｔｔｇｔａｃｔｃｃａｇｇｇａｇｃｇｇｔａｃａｔｔｔｇｔａａｃｔｃｔｇｇｔｔｔｃａａｇｃｇｔａａａｇｃｃｇｇｃａｃｇｔｃｃａｇｃｃｔｇａｃｇｇａｇｔｇｃｇｔｇｔｔｇａａｃａａｇｇｃｃａｃｇａａｔｇｔｃｇｃｃｃａｃｔｇｇａｃａａｃｃｃｃｃａｇｔｃｔｃａａａｔｇｃａｔｔａｇａ
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
ｇａｇｃｃｇａａａｔｃｔｔｇｔｇａｃａａａａｃｔｃａｃａｃａｔｇｃｃｃａｃｃｇｔｇｃｃｃａｇｃａｃｃｔｇａａｃｔｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｃｃｇｔｃａｇｔｃｔｔｃｃｔｃｔｔｃｃｃｃｃｃａａａａｃｃｃａａｇｇａｃａｃｃｃｔｃａｔｇａｔｃｔｃｃｃｇｇａｃｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａｃａｔｇｃｇｔｇｇｔｇｇｔｇｇａｃｇｔｇａｇｃｃａｃｇａａｇａｃｃｃｔｇａｇｇｔｃａａｇｔｔｃａａｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｃｇｇｃｇｔｇｇａｇｇｔｇｃａｔａａｔｇｃｃａａｇａｃａａａｇｃｃｇｃｇｇｇａｇｇａｇｃａｇｔａｃａａｃａｇｃａｃｇｔａｃｃｇｔｇｔｇｇｔｃａｇｃｇｔｃｃｔｃａｃｃｇｔｃｃｔｇｃａｃｃａｇｇａｃｔｇｇｃｔｇａａｔｇｇｃａａｇｇａｇｔａｃａａｇｔｇｃａａｇｇｔｃｔｃｃａａｃａａａｇｃｃｃｔｃｃｃａｇｃｃｃｃｃａｔｃｇａｇａａａａｃｃａｔｃｔｃｃａａａｇｃｃａａａｇｇｇｃａｇｃｃｃｃｇａｇａａｃｃａｃａｇｇｔｇｔａｃａｃｃｃｔｇｃｃｃｃｃａｔｃｃｃｇｇｇａｔｇａｇｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｃａｇｇｔｃａｇｃｃｔｇａｃｃｔｇｃｃｔｇｇｔｃａａａｇｇｃｔｔｃｔａｔｃｃｃａｇｃｇａｃａｔｃｇｃｃｇｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇａｇｃａａｔｇｇｇｃａｇｃｃｇｇａｇａａｃａａｃｔａｃａａｇａｃｃａｃｇｃｃｔｃｃｃｇｔｇｃｔｇｇａｃｔｃｃｇａｃｇｇｃｔｃｃｔｔｃｔｔｃｃｔｃｔａｃａｇｃａａｇｃｔｃａｃｃｇｔｇｇａｃａａｇａｇｃａｇｇｔｇｇｃａｇｃａｇｇｇｇａａｃｇｔｃｔｔｃｔｃａｔｇｃｔｃｃｇｔｇａｔｇｃａｔｇａｇｇｃｔｃｔｇｃａｃａａｃｃａｃｔａｃａｃｇｃａｇａａｇａｇｃｃｔｃｔｃｃｃｔｇｔｃｔｃｃｔｇｇｔａａａ
【０２４５】
ＩＬ−２１／ＩＬ−１５ＲａＳｕ／Ｆｃ構築物（シグナルペプチド配列を含む。）のアミノ酸配列は、以下のとおりである（配列番号２）。
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（ヒトＩＬ−２１）
ＱＧＱＤＲＨＭＩＲＭＲＱＬＩＤＩＶＤＱＬＫＮＹＶＮＤＬＶＰＥＦＬＰＡＰＥＤＶＥＴＮＣＥＷＳＡＦＳＣＦＱＫＡＱＬＫＳＡＮＴＧＮＮＥＲＩＩＮＶＳＩＫＫＬＫＲＫＰＰＳＴＮＡＧＲＲＱＫＨＲＬＴＣＰＳＣＤＳＹＥＫＫＰＰＫＥＦＬＥＲＦＫＳＬＬＱＫＭＩＨＱＨＬＳＳＲＴＨＧＳＥＤＳ
（ヒトＩＬ−１５Ｒαスシドメイン）
ＩＴＣＰＰＰＭＳＶＥＨＡＤＩＷＶＫＳＹＳＬＹＳＲＥＲＹＩＣＮＳＧＦＫＲＫＡＧＴＳＳＬＴＥＣＶＬＮＫＡＴＮＶＡＨＷＴＴＰＳＬＫＣＩＲ
（ヒトＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３（Ｆｃ）ドメイン）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【０２４６】
いくつかの事例では、可溶性であり得又は分泌され得る成熟形態を生成するために、完全な状態のポリペプチドからリーダーペプチドが切断される。
【０２４７】
重複ＰＣＲを介して、ＩＬ−１５Ｎ７２ＤのＮ末端コード領域に合成されたＩＬ−７配列を連結して、構築物も作製した。ＩＬ−１５Ｎ７２ＤのＮ末端に連結されたＩＬ−７を含む構築物の核酸及びタンパク質配列が以下に示されている。
【０２４８】
ＩＬ−７／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物（リーダー配列を含む。）の核酸配列は、以下のとおりである（配列番号３）。
（シグナルペプチド）
ａｔｇａａｇｔｇｇｇｔｇａｃｃｔｔｃａｔｃａｇｃｃｔｇｃｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃｔｃｃａｇｃｇｃｃｔａｃｔｃｃ
（ヒトＩＬ−７）
ｇａｔｔｇｃｇａｃａｔｃｇａｇｇｇｃａａｇｇａｃｇｇｃａａｇｃａｇｔａｃｇａｇａｇｃｇｔｇｃｔｇａｔｇｇｔｇｔｃｃａｔｃｇａｃｃａｇｃｔｇｃｔｇｇａｃａｇｃａｔｇａａｇｇａｇａｔｃｇｇｃｔｃｃａａｃｔｇｃｃｔｃａａｃａａｃｇａｇｔｔｃａａｃｔｔｃｔｔｃａａｇｃｇｇｃａｃａｔｃｔｇｃｇａｃｇｃｃａａｃａａｇｇａｇｇｇｃａｔｇｔｔｃｃｔｇｔｔｃａｇｇｇｃｃｇｃｃａｇｇａａａｃｔｇｃｇｇｃａｇｔｔｃｃｔｇａａｇａｔｇａａｃｔｃｃａｃｃｇｇｃｇａｃｔｔｃｇａｃｃｔｇｃａｃｃｔｇｃｔｇａａｇｇｔｇｔｃｃｇａｇｇｇｃａｃｃａｃｃａｔｃｃｔｇｃｔｇａａｃｔｇｃａｃｃｇｇａｃａｇｇｔｇａａｇｇｇｃｃｇｇａａａｃｃｔｇｃｔｇｃｔｃｔｇｇｇａｇａｇｇｃｃｃａａｃｃｃａｃｃａａｇａｇｃｃｔｇｇａｇｇａｇａａｃａａｇｔｃｃｃｔｇａａｇｇａｇｃａｇａａｇａａｇｃｔｇａａｃｇａｃｃｔｇｔｇｃｔｔｃｃｔｇａａｇａｇｇｃｔｇｃｔｇｃａｇｇａｇａｔｃａａｇａｃｃｔｇｃｔｇｇａａｃａａｇａｔｃｃｔｇａｔｇｇｇｃａｃｃａａｇｇａｇｃａｔ
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
ａａｃｔｇｇｇｔｔａａｃｇｔａａｔａａｇｔｇａｔｔｔｇａａａａａａａｔｔｇａａｇａｔｃｔｔａｔｔｃａａｔｃｔａｔｇｃａｔａｔｔｇａｔｇｃｔａｃｔｔｔａｔａｔａｃｇｇａａａｇｔｇａｔｇｔｔｃａｃｃｃｃａｇｔｔｇｃａａａｇｔａａｃａｇｃａａｔｇａａｇｔｇｃｔｔｔｃｔｃｔｔｇｇａｇｔｔａｃａａｇｔｔａｔｔｔｃａｃｔｔｇａｇｔｃｃｇｇａｇａｔｇｃａａｇｔａｔｔｃａｔｇａｔａｃａｇｔａｇａａａａｔｃｔｇａｔｃａｔｃｃｔａｇｃａａａｃｇａｃａｇｔｔｔｇｔｃｔｔｃｔａａｔｇｇｇａａｔｇｔａａｃａｇａａｔｃｔｇｇａｔｇｃａａａｇａａｔｇｔｇａｇｇａａｃｔｇｇａｇｇａａａａａａａｔａｔｔａａａｇａａｔｔｔｔｔｇｃａｇａｇｔｔｔｔｇｔａｃａｔａｔｔｇｔｃｃａａａｔｇｔｔｃａｔｃａａｃａｃｔｔｃｔ
【０２４９】
成熟ＩＬ−７／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質（リーダー配列を含む。）のアミノ酸配列は、以下のとおりである（配列番号４）。
（シグナルペプチド）
ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ
（ヒトＩＬ−７）
ＤＣＤＩＥＧＫＤＧＫＱＹＥＳＶＬＭＶＳＩＤＱＬＬＤＳＭＫＥＩＧＳＮＣＬＮＮＥＦＮＦＦＫＲＨＩＣＤＡＮＫＥＧＭＦＬＦＲＡＡＲＫＬＲＱＦＬＫＭＮＳＴＧＤＦＤＬＨＬＬＫＶＳＥＧＴＴＩＬＬＮＣＴＧＱＶＫＧＲＫＰＡＡＬＧＥＡＱＰＴＫＳＬＥＥＮＫＳＬＫＥＱＫＫＬＮＤＬＣＦＬＫＲＬＬＱＥＩＫＴＣＷＮＫＩＬＭＧＴＫＥＨ
（ヒトＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ）
ＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＤＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ
【０２５０】
いくつかの事例では、可溶性であり得又は分泌され得る成熟形態を生成するために、完全な状態のポリペプチドからリーダーペプチドが切断される。
【０２５１】
以前に記載されたように（米国特許第８，５０７，２２２号実施例１、参照により、本明細書に組み込まれる。）、ＩＬ−２１／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−７／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ構築物を発現ベクター中にクローニングし、発現ベクターをＣＨＯ細胞中に形質移入した。ＣＨＯ細胞中での２つの構築物の同時発現は、可溶性ＩＬ−７／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−２１／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体（ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭとも称される。）の形成及び分泌を可能にした。プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーによって、ＣＨＯ細胞培養上清からｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭタンパク質を精製して、ＩＬ−２１／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ二量体及びＩＬ−７／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ融合タンパク質からなる可溶性（非凝集）融合タンパク質複合体を得た（図２）。
【０２５２】
プロテインＡ精製されたＩＬ−７／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−２１／ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析が図３に示されている。ウェスタンブロット分析のために、４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上での還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、精製されたタンパク質を分離した。Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｉＢｌｏｔ２システムを用いて、分離されたタンパク質バンドをゲルから膜へ転写した。１）ヒトＦｃドメインを含有するタンパク質バンドの検出のために、ヤギ抗ｈＩｇＧＦｃ  Ａｂ（一次）及びウサギ抗ヤギＩｇＧ−ＡＰ（二次）、並びに２）ヒトＩＬ−１５ドメインを含有するタンパク質バンドの検出のために、ビオチン化されたマウス抗ｈＩＬ１５Ａｂ（一次）及びストレプトアビジン−ＨＲＰ（二次）を用いて、膜のプローブを行った。Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＮＡＰ  ｉ．ｄ．２．０タンパク質検出システムを用いて、適切な基質（ＮＢＴ／ＢＣＩＰ又はＴＭＢ）との温置後にプローブ試薬の結合を検出した。それぞれ、約５４ｋＤａ及び約３８〜４５ｋＤａに移動した可溶性ＩＬ−２１／ＩＬ−１５ＲａＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−７／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質に対応するＳＤＳ−ＰＡゲル及びウェスタンブロット中のバンドが観察された（図３Ａ及びＢ）。
【０２５３】
ＩＬ−２１／ＩＬ−１５ＲａＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−７／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質の計算された分子量は、それぞれ、約４９ｋＤａ及び３０ｋＤａである。計算された分子量と観察された分子量間の差を評価するために、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  ＩＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を用いて、精製されたタンパク質複合体に対して脱グリコシル化研究を実施した。簡潔に述べると、１×Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２中の１００μｇのタンパク質複合体を７５℃で、１０分間変性した。室温まで冷却した後、５μＬのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ  ＩＩをタンパク質混合物に添加した。室温での３０分間の温置後に、３７℃で一晩、タンパク質を脱グリコシル化した。脱グリコシル化反応後に、試料は、還元されたクーマシー染色されたＳＤＳ−ＰＡＧＥ上ですぐに分析できる。脱グリコシル化されなかったＡＬＴ−８０３、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭタンパク質及びＰｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ  Ｍｉｘ（デグリコシラーゼ酵素を含有する）も対照として分析した。結果は、脱グリコシル化されたＩＬ−２１／ＩＬ−１５ＲａＳｕ／Ｆｃ及びＩＬ−７／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄタンパク質に対応するバンドが、計算された分子量と一致する、それぞれ、約５１ｋＤａ及び３０ｋＤａに移動することを示している（図４）。これらの知見は、哺乳動物細胞が産生したｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ複合体のタンパク質がグリコシル化されていることを確認する。ＥＬＩＳＡをベースとする方法は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の形成を確認した。図５では、捕捉抗体、抗ヒトＩＬ−１５抗体（ＭＡＢ６４７、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及び検出抗体、西洋ワサビペルオキシダーゼが接合された抗ヒトＩｇＧ抗体を用いるｈｕＩｇＧ１／ＩＬ１５特異的ＥＬＩＳＡを使用して、形質移入されたＣＨＯ細胞からの培養上清中のＩＬ−７／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−２１／ＩＬ−１５ＲａＳｕ／Ｆｃ融合タンパク質複合体が検出された。既知の濃度を有する類似のサイトカインＴｘＭ融合タンパク質複合体（ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ）とこれを比較する。融合タンパク質濃度を推定するために、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体からのシグナルをｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ対照のシグナルと比較することができる。
【０２５４】
ヒトＩｇＧ（ＧＡＨ）及びＩＬ−１５に対する捕捉及びプローブ抗体並びにＩＬ７及びＩＬ１５、ＩＬ２１及びＩＬ１５及びＩＬ７及びＩＬ２１に対する抗体の組み合わせを用いて、精製されたｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭに対して類似のＥＬＩＳＡを実施した（図６）。これらのアッセイでは、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ及びＡＬＴ−８０３を対照として使用した。これらのアッセイから得られる結果は、可溶性ＩＬ−７／ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ、ＩＬ−２１／ＩＬ−１５ＲａＳｕ／Ｆｃタンパク質がＣＨＯ細胞中で産生されることができ、及びｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体が形成し、培地中に分泌されることができることを実証する。分泌されたタンパク質は精製することができ、融合タンパク質複合体は完全な状態を保つ。
【０２５５】
［実施例２］
ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の活性のインビトロでの性質決定
ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体のＩＬ−１５免疫賦活活性を評価するために、マウス造血細胞株であるＩＬ−１５依存性３２Ｄβ細胞の増殖を評価した。２００μＬのＩＭＤＭ：１０％ＦＢＳ培地中の３２Ｄβ細胞（１０４細胞／ウェル）に、増加するレベルのｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭを添加し、３７℃で３日間、細胞を温置した。次いで、ＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ細胞生死判定試薬（２０μＬ／ウェル）を添加した。４時間後に、代謝的に活性な細胞による、レサズリンをベースとする溶液であるＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅの還元に基づいて細胞増殖を決定するために、（標準化のための６００ｎｍ参照波長とともに）５７０ｎｍで、吸光度を測定した。ＩＬ−１５Ｎ７２Ｄ：ＩＬ−１５ＲαＳｕ／Ｆｃ複合体（ＡＬＴ−８０３）の生物活性を陽性対照として評価した。図７に示されているように、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭは３２Ｄβ細胞の細胞増殖を促進することができ、これにより、ＩＬ−１５活性を実証する。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭの活性は、おそらく、ＩＬ−１５Ｎ７２ＤドメインへのＩＬ−７の連結のために、ＡＬＴ−８０３の活性と比べて低下した。
【０２５６】
各サイトカイン（ＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＩＬ−１５）の個別の活性を実証するために、各サイトカインによる受容体シグナル伝達（ＩＬ−７：Ｓｔａｔ５、ＩＬ−２１：Ｓｔａｔ３及びＩＬ−１５：Ｓｔａｔ５）に応答して一意にリン酸化されるタンパク質を用いることにより、フローサイトメトリーをベースとした細胞内リンタンパク質アッセイを開発した。ＩＬ−７活性を検査するために、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、０．０５ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、１ｎｇ／ｍＬマウスインターロイキン−７及び２０％ＦＢＳを加えたイスコブ変法ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）中で、マウス２Ｅ８細胞株を培養した。ホスホ−フローメトリーをベースとするＳｔａｔ５アッセイのために、ＩＭＤＭ中で細胞を２回洗浄し、３７℃、５％ＣＯ２恒温槽中、ＩＬ−７なしの完全培地中で一晩、０．５×１０６／ｍＬで培養した。翌日、ＩＭＤＭ中で細胞を洗浄し、計数した。
【０２５７】
フローサイトメーターによりホスホ−Ｓｔａｔ５を測定することによって、３２Ｄβ細胞株中でＩＬ−１５活性を測定した。２ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−２及び１０％ＦＢＳを加えたＩＭＤＭ中で３２Ｄβ細胞株を培養した。ホスホ−フローメトリーをベースとするＳｔａｔ５アッセイのために、ＩＭＤＭ中で細胞を２回洗浄し、３７℃、５％ＣＯ２恒温槽中、ＩＬ−７なしの完全培地中で一晩、０．５×１０６／ｍＬで培養した。翌日、ＩＭＤＭ中で細胞を洗浄し、計数した。
【０２５８】
フローサイトメーターによりホスホ−Ｓｔａｔ３（７２７）を測定することによって、精製されたヒトＴ細胞中でＩＬ−２１活性を測定した。新鮮なヒト白血球を血液バンクから取得し、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ／ヒトＣＤ３＋Ｔ細胞試薬（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、ＣＤ３＋Ｔ細胞を単離した。ＣＤ３＋Ｔ細胞の純度は、９５％より大きかった。２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン及び１０％ＦＢＳを補充されたＲＰＭＩ１６４０中で細胞を培養した。
【０２５９】
各サイトカインの活性を検査するために、ＦＡＣＳ管中に、細胞（０．２５×１０６／管）を播種した。３７℃、５％ＣＯ２恒温槽中で１５分間、ＩＬ−７（１００ｎｇ）、ＩＬ−２１（１００ｎｇ）及びＡＬＴ−８０３（１００ｎｇ）単独で、若しくは同じ濃度で組み合わせて、又はｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ（１０００〜６２．５ｎｇ／ｍＬ）で細胞を刺激した。培地及びサイトカインの最終容量を１００μＬに調整した。１５分の温置後に、１．６％の最終濃度でパラホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ）を添加し、さらに１０分間、暗所において、室温で細胞を温置した。次いで、室温で５分間、１５００ｒｐｍでの遠心によって、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、０．１％ＮａＮ３）で細胞を洗浄した。穏やかに渦撹拌することによって、１００μＬの冷却した１００％メタノール中に、細胞沈渣を再懸濁した。４℃で３０分間、細胞をさらに温置し、次いで、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液を用いて洗浄した。次いで、ＩＬ−７及びＩＬ−１５活性を検査するためのＰｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ５  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｒｏ−４８８抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）又はＩＬ−２１活性を検査するためのＰｈｏｓｐｈｏ−Ｓｔａｔ３  Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｒｏ−４８８抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含有する５０μＬのＦＡＣｓ緩衝液中に、細胞沈渣を再懸濁した。暗所において、室温で３０分温置した後、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を洗浄し、３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、フローサイトメトリーによって分析した。
【０２６０】
１μｇ／ｍＬ（６．３ｎＭ）ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭを用いて、マウス２Ｅ８細胞又は精製されたヒトＴ細胞（＞９５％ＣＤ３＋）又は３２Ｄβ細胞の短時間刺激後に、組換えＩＬ−７（１０７ｎｇ／ｍＬ；６．３ｎＭ）、ＩＬ−２１（１１２ｎｇ／ｍＬ；６．３ｎＭ）及びＡＬＴ−８０３（１５．１２ｎｇ／ｍＬ：６．３ｎＭ）の組み合わせを用いて見られたものと類似の応答をもたらした（図８Ａ〜Ｆ）。これらの結果は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体のサイトカインドメインの各々がその特異的な免疫賦活性生物活性を保持することを実証する。
【０２６１】
ＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＩＬ−１５活性の組み合わせは、これらのサイトカインのいずれか単独より、ナイーブＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生を誘導する上でより効果的であることが知られている。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ複合体の組み合わされたサイトカイン活性を評価するために、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ複合体（６．３ｎＭ）、ＩＬ−７（６．３ｎＭ）、ＩＬ−２１（６．３ｎＭ）及びＡＬＴ−８０３（６．３ｎＭ）の組み合わせ又は各サイトカイン単独とともに、精製されたＴ細胞を温置した。３日後に、ＥＬＩＳＡ法によって、培養上清中のＩＦＮ−γレベルを測定した。図９に示されているように、組み合わされた個別のサイトカインＩＬ−７＋ＩＬ−２１＋ＡＬＴ−８０３の存在下にある精製されたＴ細胞は、ＩＦＮ−γ産生を誘導した。しかしながら、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ複合体の存在下で培養すると、ナイーブＴ細胞は高レベルのＩＦＮ−γを産生した。これらの結果は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体は、組み合わされたＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＩＬ−１５サイトカインの予想された免疫賦活活性を示すことを立証する。
【０２６２】
［実施例３］
ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体による刺激後の、精製されたナイーブＴ細胞、ＣＤ３＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖
以前の研究は、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の存在下で、Ｔ細胞増殖が効率的に誘導され得ることを示した。Ｔ細胞の増殖を促進するｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体の能力を評価するために、２人の健康なドナーから得た血液から、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐヒトナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて、ヒトナイーブＴ細胞を精製した（１×１０５細胞／ｍＬ）。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ又は個別の組換えＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３の組み合わせとともに、２〜５日間、これらの細胞（＞８５％ＣＤ３＋）を培養した。Ｐｒｅｓｔｏ−Ｂｌｕｅによって、サイトカインで刺激されたナイーブＴ細胞の増殖を評価し、フローサイトメトリーによって分析した。結果は、ＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＩＬ−１５の組み合わせと同様又はより大きな程度で、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体が精製されたナイーブＴ細胞の増殖を誘導することが可能であることを示している（図１０Ａ及びＢは２人の異なるドナーから得た結果を示し、図１０Ｃは、７２時間の時点に対する平均化された結果を示している。）。このように、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体を用いた刺激は、精製されたナイーブＴ細胞の増殖を誘導することができる。
【０２６３】
同様に、Ｔ細胞の増強された増殖は、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１での精製されたＴ細胞の刺激によって、エキソビボで誘導された。Ｔ細胞の増殖を促進するｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭの能力を評価するために、精製されたＣＦＳＥ標識されたヒトＴ細胞（＞９０％ＣＤ３＋、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭＨｕｍａｎ  ＣＤ８＋Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを介して精製された）（１×１０５細胞／ｍＬ）を、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ又は各別の組換えＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３の組み合わせで７日間刺激し、サイトカインで誘導されたＴ細胞増殖をフローサイトメーターによって評価した。結果は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ複合体がＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＩＬ−１５の組み合わせより良好に、精製されたＴ細胞の増殖を誘導することが可能であったことを示す（図１１）。
【０２６４】
さらなる研究において、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅバイオレットで標識されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞（＞９０％ＣＤ８＋、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭＨｕｍａｎ  ＣＤ８＋Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを介して精製された）（２．５×１０５細胞／ｍＬ）を、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ又は各別の組換えＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３の組み合わせで刺激した。７日後に、計数及びＴ細胞表現型を決定するための抗体での染色のために細胞を集めた。ＡＬＴ−８０３（１０ｎＭ）、ＩＬ−７（２５ｎｇ／ｍＬ）及びＩＬ−２１（２５ｎｇ／ｍＬ）の混合物（３．９倍）又はＡＬＴ−８０３単独（１０ｎＭ）（２．５倍）と比べて、１０ｎＭ  ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ（４．６倍）との７日間の温置後に、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の増大は最大であった（図１２）。培地単独中で生育された細胞は、増大を示さなかった。
【０２６５】
Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅバイオレット希釈（すなわち、各分裂に伴う細胞当たりの減少したシグナル）によって測定された場合に細胞増殖を行っているＣＤ８Ｔ細胞の表現型を評価するために、フローサイトメトリーを使用した（図１３）。結果は、ＡＬＴ−８０３、ＩＬ−７及びＩＬ−２１の混合物又はＡＬＴ−８０３単独中で生育された細胞と比べて、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭとともに温置されたヒトＣＤ８＋Ｔ細胞において、より高いレベルの細胞増殖が見られたように増大倍率データを確認する。培地単独中で生育された細胞中では、増殖は観察されなかった。ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７及びＣＤ９５を発現しているＣＤ８＋Ｔ細胞は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭとの温置後に著しい増殖を示す。低いＣＣＲ７及びＣＤ６２Ｌを有するＣＤ８＋Ｔ細胞中でも増殖が観察されたのに対して、上昇したＣＤ４５ＲＡを有する細胞は増殖したが、より低い程度であるか、又はｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭでの活性化後にＣＤ４５ＲＯ表現型へと転換した。結果は、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞及びＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞の増殖がｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭによって誘導され、ＡＬＴ−８０３＋ＩＬ−７＋ＩＬ−２１の組み合わせで見られたより大きなレベルであることを示す。
【０２６６】
［実施例４］
ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体によるヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の異なるサブセットのインビトロでの増大
ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞の異なるサブセットのインビトロでの増大を評価するために、血液バンクからバフィーコートを受領した。ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭＨｕｍａｎ  ＣＤ８  Ｎｅｇａｔｉｖｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、全ＣＤ８  Ｔ細胞を単離した。ＣＤ８  Ｔ細胞の濃縮後に、以下のマーカーを用いて、フローサイトメトリーによって、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー及びメモリー幹ＣＤ８  Ｔ細胞サブセットを選別した。ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、生きたＣＤ８＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ−及びＣＤ９５−細胞として表現型が決定された。ＣＤ８＋Ｔエフェクターメモリー細胞は、生きたＣＤ８＋、ＣＣＲ７−及びＣＤ４５ＲＯ＋細胞として表現型が決定された。ＣＤ８＋Ｔセントラルメモリー細胞は、生きたＣＤ８＋、ＣＣＲ７＋及びＣＤ４５ＲＯ＋細胞として表現型が決定された。ＣＤ８＋Ｔメモリー幹細胞は、生きたＣＤ８＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ−及びＣＤ９５＋細胞として表現型が決定された。選別された細胞を純度に関してチェックした（すなわち、細胞の９５％超が所望の表現型を有していた場合に、試料を純粋と考えた。）。
【０２６７】
製造業者の説明書のとおりに、選別された異なる集団細胞をＣＦＳＥ（カルボキシフルオレセインサクシニミジルエステル）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。３７℃、５％ＣＯ２で、９６ウェル平底プレート中の２００μＬの培地中の、培地単独、ＩＬ−７＋ＩＬ−２１（各２５ｎｇ）、ＩＬ７（２５ｎｇ）＋ＡＬＴ−８０３（１４４ｎｇ）、ＩＬ２１（２５ｎｇ）＋ＡＬＴ−８０３（１４４ｎｇ）、ＩＬ７（２５ｎｇ）＋ＩＬ２１（２５ｎｇ）＋ＡＬＴ−８０３（１４４ｎｇ）又はｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ（１．４μｇ）のいずれかで、ＣＦＳＥ標識されたＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットを刺激した。７日後に、２％ＦＢＳ−ＰＢＳでウェルを４回洗浄し、管中に洗浄液を集めることによって、ウェルから細胞を採集した。５分間、１５００ＲＰＭでの遠心によって、採集された細胞を２％ＦＢＳ−ＰＢＳで１回さらに洗浄した。１００μＬの％ＦＢＳ−ＰＢＳ中に細胞を再懸濁し、０．４％Ｔｒｙｐａｎ  Ｂｌｕｅでの１：１希釈後に、血球計数器によって細胞を計数するために、そこから１０μＬを使用した。サイトカイン又はｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ複合体との７日の温置後に、精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの増大を評価するために、細胞数を決定した。結果は、培地単独又は検査されたサイトカインの２つの組み合わせへの温置と比べて、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合複合体での処理がナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー及びメモリー幹ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの増大を増加させることができたことを示す。さらに、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ複合体は、ＣＤ８＋Ｔ細胞セントラルメモリー及びエフェクターメモリーサブセットの集団を増大させるのに、ＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３の組み合わせより効果的であり（図１４）、選別されなかったヒトＣＤ８＋Ｔ細胞で見られた結果と一致した。
【０２６８】
増大の他に、フローサイトメトリーによるＣＳＦＥ希釈に基づいて、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの増殖を評価した。この分析のために、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で残りの細胞を１回洗浄し、抗ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＣＲ７及びＣＤ８抗体で細胞を染色した（ＦＡＣＳ緩衝液中、３０分間、２μＬ／試料）。暗所において、室温で３０分後、１ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を洗浄し、３００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。集団の異なるサブセットに対してゲートされたフローサイトメトリーによって、細胞を分析した。ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞は、生きたＣＤ８＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ−及びＣＤ９５−細胞として表現型が決定された。ＣＤ８＋Ｔエフェクターメモリー細胞は、生きたＣＤ８＋、ＣＣＲ７−及びＣＤ４５ＲＯ＋細胞として表現型が決定された。ＣＤ８＋Ｔセントラルメモリー細胞は、生きたＣＤ８＋、ＣＣＲ７＋及びＣＤ４５ＲＯ＋細胞として表現型が決定された。ＣＤ８＋Ｔメモリー幹細胞は、生きたＣＤ８＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ４５ＲＯ−及びＣＤ９５＋細胞として表現型が決定された。ＣＳＦＥ希釈に基づいて、増殖に関して各集団を評価した。図１５を参照されたい。この研究は、培地対照細胞において観察されたほとんど又は全く存在しない増殖と比べて、各ヒトＣＤ８Ｔ細胞サブセットの増殖がｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭによって誘導されたことを確認した。ＡＬＴ−８０３＋ＩＬ−７＋ＩＬ−２１の組み合わせを含む全ての他の条件と比べて、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭとの温置後に、ＣＤ８＋Ｔ細胞セントラルメモリー及びエフェクターメモリーサブセットにおいて、最高レベルの細胞増殖が見られた。
【０２６９】
［実施例５］
ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ融合タンパク質複合体での刺激後における精製されたＮＫ細胞の増強された増殖、細胞傷害性及び活性化
ヒトＮＫ細胞の増殖及び活性化に影響を与えるｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭの能力も評価した。ＮＫ細胞は、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐＴＭＨｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを用いて、精製されたヒト白血球であった。５０ｎＭ  ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ、５０ｎＭ  ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ（対照）又は１０ｎＭ  ＡＬＴ−８０３（対照）を含有する培地中、２４ウェルプレート中に、２×１０６細胞／ｍＬで、精製されたＮＫ細胞（９０％超の純度）を播種した。３日後に、細胞を計数し、１０ｎＭ  ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ又は１０ｎＭ  ＡＬＴ−８０３（対照）のいずれかを含有する培地とともに、０．５×１０６細胞／ｍＬで再度播種した。さらに３日後に、１０ｎＭ  ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ又は１０ｎＭ  ＡＬＴ−８０３（対照）のいずれかを含有する培地とともに、０．５×１０６細胞／ｍＬで細胞を再び再播種した。１０日目に、細胞を採集し、増殖及び細胞表現型に関して評価し、Ｋ５６２標的細胞に対する細胞傷害性に関して検査した。
【０２７０】
この研究の結果は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭを含有する培地中での４日目から１０日目までの成長に引き続き、１０日目までに、ＮＫ細胞培養物の大半が１０倍超の増大を示したように、当初の刺激（１〜３日目）のために使用されたサイトカインに関わらず、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭは、精製されたヒトＮＫ細胞の増大に対して、ＡＬＴ−８０３より優れたサイトカインサポート（ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｕｐｐｏｒｔ）（４〜１０日目）を与えることを示した（図１６）。ＮＫｐ４６及びＣＤ２５抗体でのフローサイトメトリー染色に基づいて、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭによってサポートされたＮＫ細胞は、ｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭとの短時間の温置後のＡＬＴ−８０３サイトカインサポート後に観察されたサイトカイン誘導メモリー様（ＣＩＭＫ；ｃｙｔｏｋｉｎｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｍｏｒｙ−ｌｉｋｅ）ＮＫ細胞に匹敵する活性化されたＣＤ２５＋表現型を示した（図１７）。
【０２７１】
Ｋ５６２標的細胞を用いた４時間のキリングアッセイにおいて、これらの細胞の細胞傷害活性を評価した。簡潔に述べれば、Ｋ５６２標的細胞をＣｅｌｌｔｒａｃｅバイオレット（ＣＶＴ）で標識し、次いで、２．５：１（エフェクター：標的）の比率で、増大されたヒトＮＫエフェクター細胞とともに４時間共培養した。細胞を採集し、洗浄し、２μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウムを含有するＲＰＭＩ中に再懸濁した。ヨウ化プロピジウムとＣＴＶの共染色によって、腫瘍細胞溶解を測定した。ＮＫ細胞とともに共培養されなかったウェルから測定されたＫ５６２細胞の全てのバックグラウンド死を差し引くことによって、パーセント特異的死滅を計算する。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭでの最初の３日間の刺激が与えられた後、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ又はＡＬＴ−８０３のいずれかによるサイトカインサポートが与えられたヒトＮＫ細胞は、最初にｈＩＬ１８／ＩＬ１２／ＴｘＭ刺激を受けた後に、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ又はＡＬＴ−８０３サイトカインサポートを受けたものより良好な、Ｋ５６２細胞に対する細胞傷害性を示した（図１８）。ＣＤ２５染色に基づくと、これらの細胞の活性化表現型は同等であるように見受けられたので、この結果は驚くべきことであった。これらの知見を総合すると、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭは、ヒトＮＫ細胞増殖を誘導するのに極めて効果的であり、上昇した細胞傷害活性を有する活性化された表現型をもたらすことを示している。
【０２７２】
ヒト腫瘍細胞に対してＮＫ細胞細胞傷害性を誘導するｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭの能力をさらに性質決定するために、さらなる研究を行った。２：１のエフェクター：標的比率（Ｅ：Ｔ）で、４０時間、２人の異なるドナーから得た精製されたヒトの新鮮なＮＫ細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレット標識されたヒトＴＦ陽性膵臓癌ＳＷ１９９０細胞と混合した。ヒトＮＫ細胞を活性化させるために、５０ｎＭでＡＬＴ−８０３又はｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭを添加し、培地のみは対照としての役割を果たした。いくつかの培養物では、ＡＤＣＣを誘導するために、ヒト化抗ヒト組織因子抗体ＩｇＧ１（ｈＯＡＴ）が０．１ｎＭで添加された。温置期間の終了時に、ヨウ化プロピジウムでの染色後のフローサイトメトリーによって、死んだバイオレット標識されたＳＷ１９９０細胞の百分率を測定した（図１９）。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ単独での刺激後に、ヒトＮＫ細胞は、ＡＬＴ−８０３又は対照培地と比べて、ＳＷ１９９０腫瘍細胞に対して著しい細胞傷害性を示した。これらの結果は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ刺激されたＮＫ細胞を用いて観察されたＫ５６２標的に対する強化された細胞傷害性と合致している。抗ＴＦ抗体の添加は、ＴＦ陽性腫瘍細胞のＮＫ媒介性ＡＤＣＣのさらなる増加をもたらし、同じく、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭで刺激されたＮＫ細胞が最高の細胞傷害性を示した。これらの知見は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭがヒトＮＫ細胞の強力な活性化を与え、腫瘍細胞に対して強化されたナチュラルキリング（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ）及びＡＤＣＣをもたらすことを示している；
【０２７３】
ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭのあり得る作用機序を評価するために、上記されたＮＫ細胞／ＳＷ１９９０腫瘍細胞培養物の上清を用いて、ＥＬＩＳＡによってＩＦＮγのレベルを測定した。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭを含有するＮＫ細胞／ＳＷ１９９０細胞培養物中では、上昇したレベルのＩＦＮγが見出されたのに対して、ＡＬＴ−８０３又は対照培地条件では、ほとんど又は全くＩＦＮγは見られなかった（図２０）。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ刺激された細胞への抗ＴＦ抗体の添加によって、ＩＦＮγ放出がさらに誘導されたが、ＡＬＴ−８０３又は対照培地条件では、ずっと低い程度で誘導されるか、又は全く誘導されなかった。これらの結果は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭはＮＫ細胞ＩＦＮγ産生を誘導するのに極めて効果的であり、ＡＤＣＣ抗体の添加によってさらに上昇させることができることを示している。
【０２７４】
グランザイムＢのヒトＮＫ細胞発現に対するｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭの効果も評価した。５０ｎＭ  ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ、５０ｎＭ  ＡＬＴ−８０３を加えたＲＰＭＩ−１０培地又は対照培地中で１６時間、２人の異なるドナーからの精製されたヒトＮＫ細胞（４×１０６細胞／ウェル）を温置した。次いで、ＦＩＴＣ接合された抗グランザイムＢ抗体でＮＫ細胞を細胞内染色し、フローサイトメトリーによって、グランザイムＢのレベル（ＭＦＩ−平均蛍光強度）を分析した。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ中での温置は、ＮＫ細胞中のグランザイムＢレベルの２．８〜５．３倍の増加をもたらしたのに対して、ＡＬＴ−８０３処理されたＮＫ細胞中では、穏やかな増加（１．１〜１．４倍）のみが観察された。図２１を参照されたい。これらの知見は、ヒトＮＫ細胞の細胞傷害能を強化するｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭの能力をさらに例示する。
【０２７５】
［実施例６］
ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体のインビトロ及びインビボ活性並びに老化細胞及び老化細胞及び年齢関連病変に対するＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ刺激された免疫細胞の養子細胞移植
上に記されているように、器官及び組織中での老化細胞の蓄積は、年齢に関連する疾患と関連する。老化細胞及びそれに伴う病変をインビトロ及びインビボで低下させるための治療戦略を評価するための方法を開発した。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ複合体の活性を評価するために、本分野において既知の方法を通じて老化細胞をインビトロで生成する。簡潔に述べると、ヒト二倍体線維芽細胞、ＩＭＲ−９０及びＷＩ３８（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）、ヒト包皮線維芽細胞ＢＪ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）及び初代ヒト肝筋線維芽細胞（活性化された肝星（ＨＳ）細胞）を標準的な条件（すなわち、１０％ＦＣＳ、１％Ｌ−グルタミン及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンが補充され、７．５％ＣＯ２、３７℃に保たれたＤＭＥＭ）で生育する。成長している細胞をエトポシド（１００μＭ、Ｓｉｇｍａ）で４８時間処理することによって、ＤＮＡ損傷誘発老化（ＤＩＳ；ＤＮＡ  ｄａｍａｇｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ）細胞を生成する。エトポシド除去の７日後に、細胞が老化したと考えた。または、癌遺伝子誘発老化は、ｍＣｈｅｒｒｙ−Ｈ−Ｒａｓｖ１２（又は対照としてｍＣｈｅｒｒｙ）でのＩＭＲ−９０細胞のレトロウイルス感染によって達成し、感染の終了から９日後に細胞が老化したと考えた。ＩＭＲ−９０細胞は、２日の間隔を置いて、０．１μＭドキソルビシンで２回処理することによっても老化に誘導することができ、７日後に分析した。このような細胞は、化学療法誘発老化の代表である。老化細胞は、インビトロ及び組織中でこれらの細胞を検出するための免疫組織化学的（ＩＨＣ）バイオマーカーとしてアッセイすることができるβ−ガラクトシダーゼの上昇したレベルを発現する（Ｄｉｍｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９５；９２，９３６３−９３６７）。老化細胞の他の検出可能なバイオマーカーには、ｐ１６ｉｎｋ４ａ、ＩＬ−１α（初期ＳＡＳＰ因子）及びＩＬ−６（後期ＳＡＳＰ因子）が含まれる（Ｂａａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１７；１６９，１３２−４７）。
【０２７６】
老化細胞に対するヒトＮＫ細胞株（すなわち、ＮＫ−９２）及び精製されたヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性をインビトロで評価する。簡潔に述べれば、５×１０５／ウェルで１２ウェルプレート中に、成長している又はＤＩＳ  ＩＭＲ−９０標的細胞（又は成長している若しくはＤＩＳ  ＷＩ３８、ＢＪ若しくはＨＳ細胞）を播種し、続いて、１０×１０５ＮＫ−９２又は精製されたＮＫ細胞を各ウェルに添加する。２時間の共温置後に、非接着ＮＫ細胞を穏やかに洗浄し、製造業者の説明書にしたがってＰｒｅｓｔｏ  Ｂｌｕｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）（又はＰＩ若しくはクリスタルバイオレット染色）を用いて、残りの接着性標的細胞の定量に基づいて、細胞傷害性を測定する。公表された結果に基づいて（例えば、Ｓａｇｉｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０１３；３２，１９７１−１９７７参照）、Ｅ：Ｔ比率のある範囲で、ＤＩＳ細胞は、ＮＫ細胞媒介性細胞傷害に対して、成長している細胞より感受性が高いと予想される。このモデルにおいて、免疫細胞活性に対するｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ複合体の効果を評価するために、様々な濃度のｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ複合体又はＩＬ−７、ＩＬ−２１及びＡＬＴ−８０３単独若しくは組み合わせとともに、ヒトＮＫ細胞株（すなわち、ＮＫ−９２）及び精製されたヒトＮＫ細胞を温置する。次いで、上記のように、様々なＥ：Ｔ比で、成長している又はＤＩＳ標的細胞とともに、活性化されたＮＫ細胞を共温置し、ＤＩＳ標的に対するＮＫ媒介性細胞傷害性を決定する。ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ複合体で活性化されたＮＫ細胞は、処理されていないＮＫ細胞対照より、ＤＩＳ細胞に対してより強力な細胞傷害性を示すことが予測される。成長している及びＤＩＳ標的に対するｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ処理されたＮＫ細胞の選択性も評価する。これらの研究の結果は、ｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭが効果的な「老化細胞除去」因子（正常な細胞に対しては最小の有害性で、老化細胞のレベルを低下させることができる因子として定義される。）であることを実証すると予測される。さらに、養子移植された細胞を含むｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ処理されたＮＫ細胞は、老化細胞除去活性を示すと予測される。ＤＩＳ標的細胞に対する免疫応答を刺激するｈＩＬ７／ＩＬ２１／ＴｘＭ複合体の能力を実証するために、Ｔ細胞を用いて類似の研究が実施される。
【０２７７】
老化細胞及び年齢に関連する疾患に対するＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体の効果は、動物モデルにおいて評価される。ドキソルビシン処理は、マウスにおいて老化を誘導し、低下した体重、肝臓中の老化細胞の増加したレベル、アスパラギン酸アミノ転移酵素（ＡＳＴ）の上昇した血漿レベルによって測定される減少した肝機能をもたらすことが以前に示されている（Ｂａａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１７；１６９，１３２−４７）。このモデルでのＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体の効果を評価するために、１０〜４０週齢のＣ５７ＢＬ６マウスを０日及び１０日目に、１０ｍｇ／ｋｇドキソルビシンで腹腔内処置して、老化及び肝損傷を誘導する。処置されていないマウスは、対照としての役割を果たす。次いで、様々な用量のＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体（マウス又はヒトバージョン）又はＩＬ−７、ＩＬ−２１若しくはＡＬＴ−８０３単独若しくは組み合わせでマウスを処理する。ＰＢＳは、対照処置としての役割を果たす。２４日目に開始し、静脈内又は皮下経路によって、週に１回又は２回、処置を与える。体重は、処置期間を通じて測定する。３８日目に、動物を屠殺し、ＡＳＴ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて、血漿ＡＳＴレベルを評価する。上に記載されたバイオマーカーを用いたＩＨＣによって、組織学及び老化細胞の存在についても、肝臓切片を評価する。特異的な免疫細胞サブセット及び活性化／細胞傷害性マーカーを検出するために抗体を用いるフローサイトメトリーによって、並びに血清サイトカインレベルを検出するための方法によって、血液、脾臓及び肝臓において免疫細胞（すなわち、ＮＫ及びＴ細胞及びサブセット）に対する処置効果を評価する。処置によって刺激された免疫細胞（すなわち、血液又は脾臓から得られる）の老化細胞に対する機能的活性は、上記方法を用いて測定される。ＰＢＳ対照群と比べて、ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体の投与は、ドキソルビシン処置後にマウスで観察された体重減少を低下させると予測される。血漿ＡＳＴのレベル並びに肝臓中の老化細胞及び病変の発生も、ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ療法によって、ドキソルビシン処置されたマウスにおいて低下されると予測される。ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭによる免疫応答の対応する活性化は、免疫によって媒介される作用機序を裏付ける証拠を与えるであろう。ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭの処置効果と、ＩＬ−７、ＩＬ−２１又はＡＬＴ−８０３単独又は組み合わせとの比較は、ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ療法のより強力な抗老化活性を実証すると予測される。
【０２７８】
直接的なＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ注射の評価に加えて、養子移植されたＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ刺激されたＮＫ又はＴ細胞の抗老化活性が、ドキソルビシン処置されたＣ５７ＢＬ６マウスモデルにおいて評価される。この研究では、上述のようにマウスをドキソルビシンで処置し、２４日目に、ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体（マウス又はヒトバージョン）又はＩＬ−７、ＩＬ−２１若しくはＡＬＴ−８０３単独若しくは組み合わせで、エクスビボで処置されたＮＫ又はＴ細胞をマウス中に養子移植する。養子移植された細胞にサイトカインサポートを与えるために、ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ又はサイトカインでのマウスのさらなる処置が、いくつかの群において実施され得る。免疫応答に対する処置効果、体重及びドキソルビシン誘発肝臓老化及び障害は、上述のように評価される。ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ刺激されたＮＫ又はＴ細胞の養子移植は、ドキソルビシン誘発老化を有するマウスに対して多大な治療上の利益を与えると予測される。
【０２７９】
ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ療法及びＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ刺激されたＮＫ又はＴ細胞の養子細胞移植のさらなる研究が、自然に老化したマウスで実施されるであろう。ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体又はＩＬ−７、ＩＬ−２１若しくはＡＬＴ−８０３単独若しくは組み合わせが、最長４週間、上述のように、１１５〜１３０週齢（高齢）又は２６週齢（若年）Ｃ５７ＢＬ６マウスに投与されるであろう。または、養子移植されたＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ刺激されたＮＫ又はＴ細胞の活性が、上述のように、高齢及び若年マウスで評価されるであろう。以前に記載されたように（Ｂａａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１７；１６９，１３２−４７）、処置期間を通じて、体重、毛皮の密度及び刺激へのマウスの応答性の変化が評価されるであろう。さらに、尿素及びクレアチニンの血漿レベルは、腎機能の加齢性低下の評価として、処置前及び後に収集された試料から、それぞれ、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍ  Ｕｒｅａ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎｔａｕｒ）及びＣｒｅａｔｉｎｉｎｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いて測定されるであろう。上記されたように、腎臓切片は老化細胞の存在に関しても評価されるであろう。ＰＢＳ対照群と比べて、ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体の投与は、毛皮密度の加齢性減少と高齢マウスの不活動を軽減することが予想される。血漿尿素及びクレアチニンのレベル並びに高齢マウスの腎臓中での老化細胞の発生も、ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ療法によって、低下されると予測される。養子移植されたＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ刺激されたＮＫ又はＴ細胞を受けている高齢マウス中で、類似の治療上の利益が予想される。総合すると、これらの研究の結果は、ＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ複合体での処理及びＩＬ−７／ＩＬ−２１／ＴｘＭ刺激されたＮＫ又はＴ細胞の養子細胞移植は、インビボでの老化細胞除去活性並びに低下された老化細胞及び年齢関連病変を呈することを示すことが予想される。
その他の実施形態
【０２８０】
本発明をその詳細な説明とともに記載してきたが、上記説明は例示を意図するものであり、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって規定される。他の態様、利点及び改変が以下の特許請求の範囲内にある。
【０２８１】
本明細書中に引用された特許及び科学文献は、当業者に利用可能である知識を確定する。本明細書中に引用された全ての米国特許及び公開された又は公開されていない米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書において引用される全ての公開された外国の特許及び特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用された受入番号によって示されたＧｅｎｂａｎｋ及びＮＣＢＩ提出は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書で引用されている全ての他の公開された参考文献、文献、原稿及び科学文献は、参照により、本明細書に組み込まれる。
【０２８２】
本発明は、本発明の好ましい実施形態を参照しながら具体的に示され、説明されてきたが、添付の特許請求の範囲によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、形態及び細部の様々な変更が本発明になされ得ることが当業者によって理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年10月19日(2020.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】請求項１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【請求項１】
単離された可溶性融合タンパク質複合体であって、
ａ）インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）ポリペプチドドメインを含む第一の可溶性タンパク質と、及び
ｂ）免疫グロブリンＦｃドメインに融合された可溶性ＩＬ−１５受容体αスシ結合ドメイン（ＩＬ−１５ＲαＳｕ）を含む第二の可溶性タンパク質と、
を含む少なくとも２つの可溶性タンパク質を含み、
前記第一若しくは第二の可溶性タンパク質の１つがＩＬ−７ドメインをさらに含み、及び／又は
前記第一若しくは第二の可溶性タンパク質の１つがＩＬ−２１ドメインをさらに含み、及び
前記第一の可溶性タンパク質のＩＬ−１５ドメインが前記第二の可溶性タンパク質の前記ＩＬ−１５ＲαＳｕドメインに結合して可溶性融合タンパク質複合体を形成する、
単離された可溶性融合タンパク質複合体。
【国際調査報告】
2020533971.tif 000062
2020533971.tif 000063
2020533971.tif 000064