(57)【要約】  特殊染色用の接着剤コーティングされた顕微鏡スライド、特に、ヘマトキシリン及びエオシン、尿、及びパパニコロウ染色用の接着剤コーティングされた顕微鏡スライド、より詳細には、染色プロセスの品質管理が記録されて、ヘマトキシリン反応性が客観的に測定されるように、共在する染色性能標的を、患者の組織切片又は遊離細胞と共に組み入れる特殊染色用の接着剤コーティングされた顕微鏡スライドが提供される。染色性能は、共在する組織切片又は遊離細胞で永続的にロックされるようになり、染色結果のプロセスＱＣ及デジタルイメージングを支持する。
2020523615.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）染色及び続く検査用の組織切片又は遊離細胞の適用のための領域と、
（ｂ）それぞれが、単一の染色に反応性である１個以上の標的、好ましくは無機標的を適用するための領域と、
を含むスライド。
【請求項２】
前記無機標的は、アルシアンブルー、ビルショウスキー銀染色、ビスマルクブラウン、グラム染色、クレシルバイオレット、フォンタナマッソン、ゴードンスウィート銀染色、ライトグリーンＳＦ又はファストグリーンＦＣＦ、グロコットメセナミン銀法、ホールビリルビン染色、ルクソールファストブルームチカルミン、ミュラー−モーリーコロイド鉄、ニューメチレンブルー、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、ジアスターゼ消化したＰＡＳ、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）、リンタングステン酸、ピクロシリウスレッド、プルシアンブルー反応、酸性化トルイジンブルー、トリクローム−ゴモリの１段法、トリクローム−マッソン、ヴァーヘフ−ワンギーソン、ボンコッサ、ワイゲルトレゾルシンフクシン、ゼル−ニールセンからなる群から選択される染色に特有に結合するように選択される、請求項１に記載のスライド。
【請求項３】
前記標的は、ポリリン酸及びポリビニルアルコールのブレンド、４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム、ヒドロキノン、イソブタノール、フェノールスルホン酸、塩化ｐ−トルエンスルホニル、及びスライドの接着剤コーティングに共有結合されるヒドロキシル末端基を使用した他のものを含むが、これらに限定されない、請求項１又は２に記載のスライド。
【請求項４】
それぞれが、Ｈ＆Ｅ染色の一部として使用される単一の染色に反応性である２個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個）の標的の少なくとも１個のアレイを含み、好ましくは、該染色は、エオシンＹ及びヘマトキシリン（好ましくは、媒染剤とともに）であり、より好ましくは、前記標的は、ヒドロキノン並びにポリリン酸及びポリビニルアルコールのブレンドである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項５】
前記ヘマトキシリン標的は、ポリリン酸及びポリビニルアルコールの２個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個）の勾配密度ブレンドであり、好ましくは、該勾配密度は、１〜１０００：１の段階的な希釈増分を含み、より好ましくは、該勾配密度は、−ｄＢｄプロファイルに従う、請求項１〜４のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項６】
それぞれが、Ｐａｐスメア染色の一部として使用される単一の染色に反応性である２個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、又は３０個）の標的の少なくとも１個のアレイを含み、
好ましくは、３個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、又は３０個）の標的の別の１個以上のアレイを更に含み、１個のアレイ内の該標的は、Ｐａｐスメア染色の一部として使用される同じ単一の染色に反応性であり、例えば、該染色は、リンタングステン酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項７】
Ｐａｐスメア染色の一部として使用される前記染色は、オレンジＧ、リンタングステン酸、ライトグリーンＳＦ又はファストグリーンＦＣＦ、及び任意選択で、ビスマルクブラウンを含む、請求項６に記載のスライド。
【請求項８】
Ｐａｐスメア染色の一部して使用される染色に結合する前記標的は、４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム、イソブタノール、フェノールスルホン酸、及び塩化ｐ−トルエンスルホニルを含む、請求項６又は７に記載のスライド。
【請求項９】
前記スライドを前記標的に結合させる接着剤で該スライドがコーティングされ、好ましくは、該接着剤コーティングは、ガラスに共有結合されて、アミン、アミド、カルボキシル、及びヒドロキシルからなる群から選択される反応性末端基と適合している、請求項１〜８のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項１０】
１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個又は５個）のイメージング参照ローディングドットを更に含み、好ましくは、該イメージング参照ドットは、少なくとも黒色標的又は白色標的を含み、より好ましくは、黒色標的及び白色標的がともに含まれる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項１１】
前記黒色参照標的は、カーボンダストから選択され、好ましくは、炭素化合物は、０．１ミクロン〜２ミクロンのサイズ範囲であり、及び／又は、
前記白色参照標的は、酸化チタン、酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム、又は硫酸バリウム等の酸化物又は硫酸塩状態のいずれかの元素周期表における「貧金属」から選択される、請求項１０に記載のスライド。
【請求項１２】
前記スライド上のラベルスペースの真下に適用されるロットコード番号を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項１３】
好ましくは前記スライド上の前記ラベルスペース内、又は他の場所に適用されるマークラベルを有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項１４】
きれいにされた細胞スラリーが拡がるのを防ぐように親水性バリアリングを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項１５】
液浸及び浸漬、キャピラリーギャップ、及び染色処理において類似した機能を果たす他のものは、これらのスライドによって支持される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項１６】
前記スライド上の前記無機標的又は無機付着物（例えば、染色剤）用のパラフィンコーティングで更に覆われ、好ましくは、該パラフィン保護コーティングは、下記の工程：
（ａ）固形パラフィンが液体パラフィンへと融解するまで、６０℃〜７５℃の範囲の温度で固形パラフィンを融解する工程と、
（ｂ）飽和混合物が得られるまで、溶媒を、工程（ａ）で得られる液体パラフィンに添加する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られる混合物を、３０℃〜３３℃の範囲の温度に冷却した後、ほぼ透明なパラフィン液体が得られるまで、溶媒を徐々に添加する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られる透明なパラフィンパラフィン液体の層を、顕微鏡スライド上の前記無機標的又は付着物上に塗布して、該顕微鏡スライド上にパラフィン保護コーティングを形成する工程と、
（ｅ）赤外線加熱を適用して、溶媒を該パラフィン保護コーティングから蒸発させて、それにより、前記パラフィンをその硬化された固形状態に戻す工程と、
によって、該顕微鏡スライド上にコーティングされ、
特に、該固形パラフィンは、精製されて、水を含まず、又は、
該固形パラフィンは、融点５０℃〜６０℃を有し、又は、
該パラフィンは、融点５６℃を有するThermoFisher社によるＴｉｓｓｕｅＰｒｅｐ及びＴｉｓｓｕｅＰｒｅｐ  ２、融点５６℃を有するLeica社によるＰａｒａｐｌａｓｔ及びＰａｒａｐｌａｓｔ  ｐｌｕｓ、及び融点５０℃〜５４℃を有するLeica社によるＰａｒａｐｌａｓｔ  Ｘ−ｔｒａから選択され、又は、
該溶媒は、キシレン、脂肪族キシレン代替物（例えば、キシロール）、トルエン、塗料用シンナー、テレビン油、アセトン及びケロシンの５０：５０混合物、又はそれらの列挙される溶媒の混合物から選択され、又は、
工程（ｄ）の層は、１ミクロン〜５ミクロン、好ましくは２ミクロン〜３ミクロンの厚さを有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項１７】
前記パラフィン保護コーティングは、前記顕微鏡スライド上の前記無機標的及び／又は無機付着物を酸化及び／又は微生物攻撃から、また無機物を、酸化及び／又は大気中の酸及び塩基材料をもたらす反応から防御するのに使用されるか、又は前記パラフィン保護コーティングは、前記顕微鏡スライド上の前記無機標的及び／又は無機付着物の有効期限を増加するのに使用される、請求項１６に記載のスライド。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のスライドを用いた染色方法であって、下記の工程：
ｂ．試料を、前記スライドの組織切片又は遊離細胞の適用のための領域に適用する工程であって、好ましくは、該試料は、組織切片又は遊離細胞である、工程と、
ｃ．１個以上の染色剤（好ましくは、同時に、又は順次）を、該試料及び該染色剤に結合することができる前記標的（無機標的）に適用する工程と、
ｄ．標的勾配に基づいて、染色された組織又は細胞のカラー密度を定量的に決定する、及び／又は組織若しくは細胞の染色プロセスを標的の染色結果に基づき評価する工程と、
を含み、
任意選択で、パラフィンコーティングが、前記スライド上の前記標的に選択的に塗布され、該組織切片／遊離細胞がまた、パラフィン中に包埋される場合、下記の工程：
ａ．パラフィンを、パラフィンに包埋された組織切片又は遊離細胞及び前記標的上の前記パラフィン保護コーティングから除去すること、
は、工程（ｂ）の前に実行される、方法。
【請求項１９】
工程（ａ）におけるパラフィンの除去は、６５℃〜７５℃の範囲の温度で３分〜１０分間、前記パラフィンを加温して、半液化状態のパラフィンを得ること、続いて、緩衝溶液中で再水和されるまで、有機溶媒シリーズを用いて液化することによって実行され、好ましくは、該有機溶媒は、脂肪族溶媒をはじめとする一連の溶媒、例えば、キシレン又はキシロール、無水エタノール、９５％エタノール、７０％エタノール、５０％エタノール、及び塩ベースの緩衝溶液から選択され、それぞれ、公称３分の曝露時間を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記染色は、ヘマトキシリン−エオシン染色（Ｈ＆Ｅ染色）、Ｐａｐスメア染色、又はその両方である、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２１】
Ｈ＆Ｅ染色で使用される前記染色は、エオシンＹ及びヘマトキシリン（好ましくは、媒染剤とともに）であり、より好ましくは、Ｈ＆Ｅ染色用の染色に結合する前記標的は、ヒドロキノン並びにポリリン酸及びポリビニルアルコールのブレンドであり、更に好ましくは、該ヘマトキシリン標的は、ポリリン酸及びポリビニルアルコールの２個以上（例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個又は２０個）の勾配密度ブレンドであり、好ましくは、該勾配密度は、１〜１０００：１の段階的な希釈増分を含み、より好ましくは、該勾配密度は、−ｄＢｄプロファイルに従い、及び／又は、
Ｐａｐスメア染色で使用される前記染色は、オレンジＧ、リンタングステン酸、ライトグリーンＳＦ又はファストグリーンＦＣＦ、及び任意選択で、ビスマルクブラウンを含み、好ましくは、Ｐａｐスメア染色用の染色に結合する前記標的は、４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム、イソブタノール、フェノールスルホン酸、及び塩化ｐ−トルエンスルホニルを含み、
好ましくは、Ｐａｐスメア染色用の染色に結合する前記標的は、前記スライド上でＨ＆Ｅ染色用の染色に結合する前記標的と共存する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか一項に記載のスライドを含むか、又は請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１７年６月１５日に出願され、それぞれ、「Process Record Slide for Hematoxylin and Eosin Staining」、「Process Record Slide for Pap Smears」、「Shield Coating for Protein Deposits of a Microscope Slide」及び「IHC Imaging Baseline Reference」という表題の米国仮特許出願第６２／５２０，３３４号、同第６２／５２０，３４１号、同第６２／５２０，１６９号及び同第６２／５２０，１７８号の優先権を主張し、それらの開示はそれぞれ、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００２】
本発明は、特殊染色用のプロセス記録スライドに関する。本発明は、特に、ヘマトキシリン及びエオシン、尿、及びパパニコロウ染色用のプロセス記録スライドに関する。より詳細には、本発明は、染色プロセスの品質管理が記録されて、ヘマトキシリン反応性が客観的に測定されるように、共在する染色性能標的を、組織切片又は遊離細胞と共に組み入れる特殊染色用のプロセス記録スライドに関する。染色性能は、共在する組織切片又は遊離細胞と永続的にロックされるようになり、染色結果のプロセスＱＣ及デジタルイメージングをサポートする。
【背景技術】
【０００３】
ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、病理組織学において最も一般的な染色技法である。これは、臨床検体における核及び細胞質封入体の表示に使用される２個の色素、即ち、ヘマトキシリン及びエオシンの組合せを使用する。
【０００４】
染色方法は、アルミニウムイオン及びヘマテイン（ヘマトキシリンの酸化生成物）から形成される錯体であるヘマルム（hemalum）の適用を含む。ヘマルムは、細胞の核（及びケラトヒアリン顆粒及び石灰化材料等の他の幾つかの物体）を青色に着色する。核染色後に、エオシンＹの水溶液又はアルコール溶液で対比染色し、エオシンＹは、赤色、ピンク色及び橙色の様々な色調で、好酸性構造を着色する。
【０００５】
ヘマルムによる核の染色は、通常、色素−金属錯体の、ＤＮＡへの結合に起因するが、核染色は、組織切片からのＤＮＡの除去後に得ることができる。そのメカニズムは、チオニン又はトルイジンブルー等の塩基性（カチオン）色素による核染色のメカニズムと異なる。塩基性色素による染色は、ヘマルムよりも酸性でない溶液のみによって起こり、前もって核酸を化学的又は酵素的に除去することで妨げられる。配位結合は、アルミニウムとヘマテインとを結び付ける結合に類似して、ヘマルム錯体を、核クロマチン中のＤＮＡ及びタンパク質のカルボキシル基に結合することを示す証拠が存在する。
【０００６】
好酸性構造は概して、細胞内タンパク質又は細胞外タンパク質で構成される。レビー小体及びマロリー小体は、好酸性構造の例である。細胞質の大部分が、好酸性である。赤血球は、強く赤色に染色される。
【０００７】
これらの構造は、好塩基性及び好酸性と呼ばれるように、酸性又は塩基性である必要はなく、その専門用語は、色素に関する細胞構成要素の親和性に基づく。他のカラー、例えば、黄色及び茶色が、試料中に存在してもよく、それらは、内因性の色素、例えば、メラニンによって引き起こされる。構造によっては、十分に染色しない。基底層は、十分に可視的である必要があれば、ＰＡＳ染色又は幾つかの銀染色によって染色される必要がある。細網線維もまた、銀染色を必要とする。疎水性構造はまた、透明のままである傾向にあり、これらは通常、脂肪、例えば、脂肪細胞、ニューロン軸索周囲のミエリン、及びゴルジ装置膜に富んでいる。
【０００８】
Ｐａｐスメア試験は、子宮頸癌スクリーニングを実施するために、女性に対して、その年齢に応じて様々な間隔で行われる。その頻度は、世界の大半で、５０歳を超える女性に関して、年１回にまで増えている。
【０００９】
Ｐａｐスメア試験は、使用される色素の組成及びタイミング、比、並びにタイミングにおいて完全には標準化されていない。Ｐａｐ染色は、３個の溶液に混合される５個の色素を包含する。３個の溶液は、核染色、第１の対比染色、及び第２の対比染色である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、本発明の目的は、共在する標的を、組織試料又は遊離細胞と共に組み入れる系を提供することである。好ましくは、上述の標的は、下記の特性：スライドに共有結合されて、染色分子を共有結合的に捕捉する化学分子を有する。本発明は、スライド接着剤に共有結合されて、染色分子を共有結合的に捕捉する共在する標的を有するプロセス記録スライドに供給することによって、上述の問題に対する有効な解決法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
概して、本発明の一態様において、それぞれが、Ｈ＆Ｅ及びＰＡＰ染色の一部として使用される単一の染色に反応性があり、かつスライドに、好ましくはスライドの接着剤コーティングに共有結合される無機標的のアレイを有するプロセス記録スライドが開示され、ここで、染色は、ヘマトキシリン＋媒染剤、標的の第１のアレイとしてのエオシンＹ、及び標的の第２のアレイとしてのオレンジＧ、リンタングステン酸、ライトグリーンＳＦ又はファストグリーンＦＣＦ、及び任意選択で、ビスマルクブラウン又は１個〜７個の特殊染色、並びにＨ＆Ｅ染色との特有の結合を支持する接合（mating）無機標的、及びスライドの接着剤コーティングと共有結合するための対抗するヒドロキシルを有する特殊染色の一群である。
【００１２】
本発明の別の態様において、スライドは、接着剤コーティング（上述するような）を含有して、処理用に組織切片又は遊離細胞を固定する。この用途に使用される最も一般的な接着剤スライドは、アミノ−シランでコーティングされ、ほぼ全てのガラススライド製造業者によって生産されている。アミン基は、８５℃まで安定であるヒドロキシル末端基に対する共有結合を提供する。
【００１３】
本発明の別の態様において、接合無機標的は、４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム、ヒドロキノン、イソブタノール、フェノールスルホン酸、及び塩化ｐ−トルエンスルホニル、並びにポリリン酸及びポリビニルアルコールのブレンドである。
【００１４】
本発明の更に別の態様において、ヘマトキシリン標的は、ポリリン酸及びポリビニルアルコールの２個、３個又はそれ以上の成員の勾配密度ブレンドであり、好ましくは、勾配密度は、１〜１０００：１の段階的な希釈増分を含み、より好ましくは、勾配又は一連の希釈は、−２０ｌｏｇ（希釈率）プロファイルに従う。説明：−２０ｌｏｇ（希釈率）は、ｄＢｄと同じ意味を有し、ｌｏｇ曲線であるものを線形勾配に変化させて、それらが標的のダイナミックレンジ全体にわたって線形作用になるため、希釈及び処理反応の影響を加えやすくしている。−２０ｌｏｇ（希釈率）及びｄＢｄという用語はともに、データを線形化するために、半対数ベースで希釈について記載することを指し、その結果、用語の修正が、容易に適用され得る。（希釈率）という用語は、希釈［Ｘ］を指し、ここで、Ｘが［１．．１０００］であれば１：１〜１０００：１に対応する。ｄＢｄという用語は、希釈のデシベル又は希釈強度として定義され得る。
【００１５】
本発明の更なる別の態様において、特殊染色標的として、４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム、ヒドロキノン、イソブタノール、フェノールスルホン酸、塩化ｐ−トルエンスルホニル、ポリリン酸及びポリビニルアルコールのブレンド、並びにスライドの接着剤コーティング共有結合されるヒドロキシル末端基を使用する他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１６】
本発明の別の態様において、Ｈ＆Ｅ標的は、捕捉されたデジタル画像における品質管理及びカラー補正に関して、エオシンＹ及びヘマテイン＋媒染剤染色試薬の両方の状態を評価するのに使用することができる。
【００１７】
本発明の別の態様において、プロセス記録スライドは、それぞれが、Ｐａｐスメア染色の一部として使用される単一染色に反応性があり、かつスライドの接着剤コーティングに共有結合される無機標的のアレイを含有する。
【００１８】
添付の図面及び以下の記載において、本発明の他の態様が開示される。
【００１９】
添付の図面は、本発明の更なる理解を提供するのに含まれるものであり、引用することにより本発明の一部をなし、本発明の一部を構成し、明細書とともに、本発明の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、本発明の一実施形態によるＨ＆Ｅ染色用のプロセス記録スライドの構造を示す図である。図１は、任意選択のスライドラベルを適所に有するスライドを示す。
【図２】図２Ａ〜図２Ｃは、本発明の一実施形態によるＨ＆Ｅ染色用のプロセス記録スライドの構造を示す図である。図２Ａは、製造したままのＨ＆Ｅスライドを示す。スライドは、彩色されたラベル領域におけるブランク領域とともにロットコード番号による最小ＩＤを有する。標的ドットの領域を超えて拡がる２つの太い彩色された長軸のバーが存在する。バーは、どのようにしてラベルプリンターが、スタックの最下からスライドを分配するかに対処するために最近追加したものである。バーは、上記スライドのスタックが、スライドコーティング、より重要なことには、パラフィン保護コーティング及びパラフィンより下の標的ドットに損傷を与えないことを保証する。図２Ｂは、適用される患者の組織切片を有するＨ＆Ｅスライドを示す。この場合、３個の連続した複製切片が存在するが、切片は、通常ＭＯＨＳ手術において、皮膚癌の切除を評価する際に行われる場合、更に間隔を空けることができる。灰色の文字列は、パラフィン領域が存在することを特定するためにのみそこに載せてあるが、実際のスライド上には存在しない。図２Ｃは、染色された後のＨ＆Ｅスライドを示す。標的及び組織切片はともに、ここでは可視的であり、解釈の準備が整っている。
【図３】図３Ａ〜図３Ｃは、本発明の一実施形態による手動スメアモードのＰＡＰスメア染色用のプロセス記録スライドの構造を示す図である。図３Ａは、製造したままのＰＡＰ−Ｍスライドを示す。ＰＡＰ−Ｍは、手動で適用されるＰａｐスメアに関するスライドタイプ識別子である。スライドは、彩色されたラベル領域におけるブランク領域とともにロットコード番号による最小ＩＤを有する。標的ドットの領域を超えて拡がる２つの太い彩色された長軸のバーが存在する。バーは、どのようにしてラベルプリンターが、スタックの最下からスライドを分配するかに対処するために最近追加したものである。バーは、上記スライドのスタックが、スライドコーティング、より重要なことには、パラフィン保護コーティング及びパラフィンより下の標的ドットに損傷を与えないことを保証する。図３Ｂは、遊離細胞＋粘液の患者試料及びデブリを有するＰＡＰ−Ｍスライドを示す。細胞が概して透明であるため、付着物は、スライド上のほんのわずかな透明な濁りとして出現する。図３Ｃは、染色された後のＰＡＰ−Ｍスライドを示す。標的及び手動ＰＡＰスメアはともに、ここでは可視的であり、解釈の準備が整っている。
【図４】図４Ａ〜図４Ｃは、本発明の一実施形態による、試料の自動処理により、粘液及び赤血球を除去され、きれいにされた試料が疎水性リングに配置される、ＰＡＰスメア染色用のプロセス記録スライドの構造を示す図である。図４Ａは、製造したままのＰＡＰ−Ａスライドを示す。ＰＡＰ−Ａは、自動で粘液をきれいにするＰａｐスメアに関するスライドタイプ識別子である。スライドは、彩色されたラベル領域におけるブランク領域とともにロットコード番号による最小ＩＤを有する。このスライドは、「きれいにされた」ＰＡＰ試料がその内部に付着される疎水性バリアリングを取り込んでいる。バリアリングは、試料を保持して、ラベルプリンターがリング内のコーティング及びパラフィンで覆われた対照標的に損傷を与えるのを防ぐ働きをする。図４Ｂは、疎水性バリアリング内に遊離細胞の「きれいにされた」患者試料を有するＰＡＰ−Ａスライドを示す。細胞が概して透明であるため、付着物は、スライド上のほんのわずかな透明な濁りとして出現する。図４Ｃは、染色された後のＰＡＰ−Ａスライドを示す。バリアリング内の標的及び遊離細胞はともに、ここでは可視的であり、解釈の準備が整っている。
【図５】図５は、パラフィン保護が、どのようにしてその付着物の縁でシールを保証するかを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、本開示の一部をなす、添付の図面と組み合わせて本発明の以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解され得る。本発明は、本明細書で記載されるか、及び／又は、示される特定の装置、方法、条件、又はパラメータに限定されるものではなく、本明細書で使用される専門用語は単なる例であり、特許請求する発明の限定を意図するものではないと理解されるべきである。また、添付の特許請求の範囲を含む明細書で使用される数量を特定していない単数形（'a', 'an', and 'the'）は、複数形を含み、特定の数値に対する言及は、内容により明確に異なることが指示されない場合は、少なくともその特定の数値を含むものである。本明細書中、他の実施形態において表現されている場合は、範囲は、「約（about）」又は「およそ（approximately）」他の特定値からと表現してもよい。また、特段の指示がない限り、本明細書で言及する寸法及び材料特性は、限定的なものではなく例示であり、好適に実用できるサンプル実施形態をより理解するためのものであり、言及した値を外れる変形形態も、特定の用途によって本発明の範囲に含まれ得ると理解されるべきである。
【００２２】
本発明は、その適用において、以下の記載において明示する、又は以下の記載において説明される、又は図面において説明される構造の詳細及び構成要素の配列に限定されるものではない。本発明においては、他の実施形態が可能であり、種々の方法で実施又は実行することができる。また、本明細書で使用の用語及び専門用語は、説明を目的として使用されており、限定的に解釈されるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「伴う（involving）」、及びこれらの変化形の使用は、追加の項目を含む。
【００２３】
ここで、本発明の好ましい実施形態に対して詳細に言及する。好ましい実施形態の例が添付の図面で図示される。可能な限り、図面及び明細書で使用する同じ参照番号は、同じ部品か、又は同様の部品を指す。
【００２４】
本発明の理解を容易にするために、本発明で使用される幾つかの用語の定義について言及し得る。
【００２５】
「無機標的」は、検出で使用される染色に結合することが可能である標的又は材料を表すのに使用される。染色は、アルシアンブルー、ビルショウスキー銀染色、ビスマルクブラウン、グラム染色、クレシルバイオレット、フォンタナマッソン、ゴードン及びスウィート銀染色、ライトグリーンＳＦ又はファストグリーンＦＣＦ、グロコットメセナミン（正：Grocott's Methenamine）銀法、ホールビリルビン染色、ルクソールファストブルームチカルミン、ミュラー−モーリーコロイド鉄、ニューメチレンブルー、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、ジアスターゼ消化したＰＡＳ、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）、リンタングステン酸、ピクロシリウスレッド、プルシアンブルー反応、酸性化トルイジンブルー、トリクローム−ゴモリの１段法、トリクローム−マッソン、ヴァーヘフ−ワンギーソン（正：Verhoff-Van Gieson）、ボンコッサ、ワイゲルトレゾルシンフクシン、ゼル−ニールセンからなる群から選択される。
【００２６】
前記標的は、ポリリン酸及びポリビニルアルコールのブレンド、４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウム、ヒドロキノン、イソブタノール、フェノールスルホン酸、塩化ｐ−トルエンスルホニル、及びスライドの接着剤コーティングに共有結合されるヒドロキシル末端基を使用した他のものを含むが、これらに限定されない。
【００２７】
「無機付着物」は、染色プロセス後の蓄積された量の染色粒子を示すのに使用される。幾つかの実施形態において、無機付着物は、染色剤である。
【００２８】
ナチュラルブラックとも呼ばれる「ヘマトキシリン」は、ログウッドの木（アカミノキ（Haematoxylum campechianum））の心材から抽出される化合物である。ヘマトキシリン及びエオシンが一緒になって、組織学で最も一般的に使用される染色の１つであるヘマトキシリン及びエオシン染色を作り上げる。
【００２９】
「エオシン」は、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）染色においてヘマトキシリンに対する対比染色として最も多くの場合に使用される。Ｈ＆Ｅ染色は、組織学で最も一般的に使用される技法の１つである。ヘマトキシリン及びエオシンで染色された組織は、ピンク色〜橙色で染色された細胞質及び暗色で、即ち青色又は紫色のいずれかで染色された核を示す。
【００３０】
ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、免疫組織化学的（ＩＨＣ）処理の第１の表示である仕上がった結果としてのＨ＆Ｅを支持するために、又は特殊染色を用いて仕上がった結果を送達するために、無数の生物学的試料を処理するのに使用される。
【００３１】
「パパニコロウ染色」（また、Ｐａｐ染色）は、様々な体分泌液の細胞病理学評価のための多色染色技法である。最も一般的な使用は、婦人科用スメア（Ｐａｐスメア）に関するものである。他の用途として、痰、歯磨き液（brushings）、洗浄液、尿、脳脊髄液、腹水、胸水、滑液、精液、穿刺吸引材料、腫瘍触診試料、及び遊離細胞を含有する他の材料が挙げられる。
【００３２】
Ｐａｐスメア試験は、子宮頸癌スクリーニングを実施するために、女性に対して、その年齢に応じて様々な間隔で行われる。その頻度は、世界の大半で、５０歳を超える女性に関して、年１回にまで増えている。この例でのＰａｐスメア実験は、具体的には外側扁平子宮頸部細胞が腺子宮頸管内細胞と接触する子宮頸部の外側開口部において女性の子宮から掻把した扁平細胞を、前癌状態又は子宮頸癌の徴候である異常成長に関して試験するのに使用される。
【００３３】
Ｐａｐスメア試験は、使用される色素の組成及びタイミング、比、並びにタイミングにおいて完全には標準化されていない。Ｐａｐ染色は、３個の溶液に混合される５個の色素を包含する。３個の溶液は、核染色、第１の対比染色、及び第２の対比染色である。
【００３４】
媒染剤を付した（Mordanted）ヘマトキシリン混合物である核染色は、細胞核を染色するのに使用される。
【００３５】
第１の対比染色は、リンタングステン酸及びオレンジＧの混合物であるオレンジグリーンである。
【００３６】
第２の対比染色は、エオシンＹ、ライトグリーンＳＦ（又はファストグリーンＦＣＦ）、及びビスマルクブラウンの混合物であるエオシンアズールである。
【００３７】
したがって、本発明の目的は、共在する標的を、組織試料又は遊離細胞と共に組み入れる系を提供することである。したがって、上述の標的は、下記の特性：スライドの接着剤に共有結合されて、続いて、染色分子を共有結合的に捕捉する化学分子を有さなくてはならない。
【００３８】
本発明の一実施形態において、プロセス記録スライドは、染色される生物学的材料と共在する、種々の無機染色特異的標的の一群を組み入れる。標的は、各染色構成要素の有効性、及び経年劣化の挙動が既知の染色に関しては、勾配密度アレイを表す。上述の標的は、染色構成要素のたった１つと特有に反応しなくてはならない。生物学的材料を使用することは、反応部位濃度が良好に管理されず、したがって、反復可能ではないため、実用的ではない。
【００３９】
本開示の別の実施形態において、プロセス記録スライドは、様々な反応性化学を使用して標的及び組織切片又は遊離細胞を捕捉する接着剤でコーティングされる。上記の特殊染色用に開発された標的溶液において、全てが、スライドコーティングへの共有結合をサポートするためにヒドロキシル末端基を使用する。最も一般的な接着剤コーティングされたスライドは、ほぼ全ての顕微鏡スライド製造業者から入手可能なアミノ−シランコーティングを使用する。アミン末端基は、ヒドロキシルと共有結合を形成し、結合は８５℃まで安定なままである。しかしながら、本発明は、種々の接着剤スライドコーティング化学に適合するのにそのように必要とされる場合、標的上の他の末端基の使用又は中間体カプラーの使用を制限しない。
【００４０】
プロセス記録スライドに対するＨ＆Ｅの実行を示す図１について言及し得る。一実施形態における二重マーク配置におけるＨ＆Ｅスライドに関する共在する標的の基本構造を図１に示す。
【００４１】
一実施形態において、プロセス記録スライドは、ロット番号を有するラベル領域の真下のマークの、及び任意選択で、スライドタイプを有するスライドのラベルのマークの一般的な構造に従う。全て〜ほとんどの標識領域が、使用者が、その２次元バーコード及びテキスト情報を適用できるよう残される。スライドタイプは、ＰＲＳ−Ｈ＆Ｅｘｘであり、ここで、ｘｘは、第２の行で適用される「特殊染色」組を規定する。ｘｘが存在しない場合、標的の第２の列は存在しない。標的は、組織切片複製物のための領域を最大限にするために、ラベル末端付近に印刷される。図２Ａ〜図２Ｃは、一連のＩＨＣスライドの用法を説明している。明らかであるように、表題は、これが任意選択であるために省かれ、ロットコードに埋め込まれ得る。
【００４２】
別の実施形態において、スライドの基本バージョンは、１個のエオシンＹ、並びに黒色標的及び白色標的によって末端で境界されるヘマトキシリン用の勾配密度アレイで構成される標的シリーズを含有する。黒色標的及び白色標的は、デジタルイメージングに関するダイナミックレンジを確立させるのに使用される。他の標的が概して透明であるため、標的がスライド上のどこに位置付けられるかどうかを、使用者は黒色末端標的及び白色末端標的により知ることが可能となり、そのため、組織切片は、標的の最上部上には適用されない。これは、凍結された組織切片を、スライドブランクに移動させる場合には、大きな価値がある。
【００４３】
ここで、ＰＡＰスメア染色用のスライドを示す図３及び図４について言及し得る。
【００４４】
本発明の一実施形態において、Ｐａｐスメア用のプロセス記録スライドは、２つの配置：手動スメア図３及び自動で粘液をきれいにする図４において実行される。説明は、両方のバージョンで示される。
【００４５】
別の実施形態において、スライドはともに、ロット番号を有するラベル領域の真下のマークの、及び任意選択で、スライドタイプを有するスライドのラベルのマークの一般的なプロセス記録スライド構造に従う。全て〜ほとんどの標識領域が、使用者がその２次元バーコード及びテキスト情報を適用できるよう残される。
【００４６】
別の実施形態において、染色試薬標的は、２つの群で存在する。最上行は、黒色参照標的及び白色参照標的によって境界されるヘマトキシリン＋媒染剤反応性標的の勾配密度アレイを含有する。最下の行は、ビスマルクブラウンに関する単一標的、リンタングステン酸に関する２つの異なる密度標的、緑色染色に関する２つの異なる密度標的、オレンジＧに関する単一標的、及びエオシンＹに関する単一標的を含有する。患者のＰａｐスメアは、スライド上の有効領域の中央に適用される。自動接着剤−ＰＡＰスライドバージョンは、スライドメーカー由来のきれいにされた細胞スラリーが拡がるのを防ぐように疎水性バリアリングを使用する。コーティングの親水性挙動は、細胞が、リングの壁に沿って積み重ならないことを保証する。液浸及び浸漬浴（dip-n-dunk bath）並びにキャピラリーギャップ染色処理はともに、これらのスライドによって支持され得る。
【００４７】
別の実施形態において、各染色、並びに遊離細胞及び組織切片との結合の様式について、以下に記載される。その後、染色を特有に捕捉する化学構築物について記載される。
【００４８】
本開示は、下記の実施形態を更に含む。
【００４９】
１．それぞれが、単一の染色に反応性であり、かつ接着剤コーティングに共有結合される無機標的のアレイを含有する接着剤コーティングされた顕微鏡スライドであって、
（ａ）任意選択で、ラベルのスペースの真下にあるロットコード番号と、
（ｂ）共在する標的のための領域と、
（ｃ）組織切片又は遊離細胞の適用のための領域と、
を含み、任意選択で、特殊染色の組は、スライドタイプマーク又はロットコードマークに応じて、スライドに適用される、接着剤コーティングされた顕微鏡スライド。
【００５０】
２．前記無機標的は、アルシアンブルー、ビルショウスキー銀染色、ビスマルクブラウン、グラム染色、クレシルバイオレット、フォンタナマッソン、ゴードンスウィート銀染色、ライトグリーンＳＦ又はファストグリーンＦＣＦ、グロコットメセナミン銀法、ホールビリルビン染色、ルクソールファストブルームチカルミン、ミュラー−モーリーコロイド鉄、ニューメチレンブルー、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、ジアスターゼ消化したＰＡＳ、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）、リンタングステン酸、ピクロシリウスレッド、プルシアンブルー反応、酸性化トルイジンブルー、トリクローム−ゴモリの１段法、トリクローム−マッソン、ヴァーヘフ−ワンギーソン、ボンコッサ、ワイゲルトレゾルシンフクシン、ゼル−ニールセンから選択される特殊染色に特有に反応するように選択される、実施形態１と同様の接着剤コーティングされたスライド。
【００５１】
３．スライドのラベル部分上のスライドタイプマークは、ヘマトキシリン及びエオシン、パパニコロウ、又は尿染色用の生体材料試料を処理する特殊染色の特定の組を選択し得る、実施形態１と同様の接着剤コーティングされたスライド。
【００５２】
４．共在する反応性標的は、ヘマトキシリン、リンタングステン酸、オレンジＧ、エオシンＹ、ライトグリーンＳＦ又はファストグリーンＦＣＦ、ビスマルクブラウンに特有に結合するように選択される、実施形態１と同様の接着剤コーティングされたスライド。
【００５３】
５．共在する標的は、組織切片複製物のための領域を最大限にするようにラベル末端付近に印刷される、実施形態１と同様の接着剤コーティングされたスライド。
【００５４】
６．きれいにされた細胞スラリーが拡がるのを防ぐ親水性バリアリングを任意選択で含み得る、実施形態１と同様の接着剤コーティングされたスライド。
【００５５】
７．液浸及び浸漬、並びにキャピラリーギャップ染色処理は、これらのスライドによって支持され得る、実施形態１と同様の接着剤コーティングされたスライド。
【００５６】
保護コーティング
パラフィンワックスは概して、石油、石炭又はオイルシェールに由来する白色又は無色の軟質固体であり、２０個〜４０個の炭素原子を含有する炭化水素分子の混合物からなる。パラフィンワックスは、室温で固体であり、およそ３７℃（９９°Ｆ）を超えると融解し始め、その沸点は、３７０℃（６９８°Ｆ）を超える。パラフィンワックスの一般的な用途として、潤滑、電気絶縁、及びろうそくが挙げられ、染色されたパラフィンワックスは、クレヨンにすることができる。パラフィンワックスは、場合によってはパラフィンと呼ばれるケロシン及び他の石油製品と異なる。
【００５７】
病理学研究室では、パラフィンワックスは、組織の薄い試料を切り分ける前に組織を含浸させるのに使用される。水は、濃度を上昇させるアルコール（７５％〜無水）により組織から除去されて、組織は、キシレン、又は脂肪族代替物の１つ、例えばキシロール等の有機溶媒中で透徹する。次に、組織は、パラフィンワックス中に数時間配置させた後、ワックスとともに型にはめられて、冷却されて、凝固されて、続いて、切片は、ミクロトームで切断される。
【００５８】
組織切片をパラフィンに包埋することは、組織切片を長期間保存するために日常的に実施されている。しかしながら、顕微鏡スライドの選択領域上に薄いコーティング層としてパラフィンを塗布することは報告されていない。
【００５９】
組織ブロック及び組織ブロックから切り取られた切片に、組織の細胞構造の水含有量を完全に置き換えるパラフィンが注入される。パラフィンは本質的に、細菌成長及び真菌成長をサポートせず、包埋された生体材料の長期安定性を保証する。
【００６０】
無機染色の化学構造と特有に反応する標的はまた、酸化及び大気中の材料との反応を受けやすい。かかる染色反応物標的として、ヘマトキシリン、エオシン、及び特殊染色群の大部分に関するものが挙げられる。これらの染色に対する標的は、たった１個の染色と特異的に反応するように設計される。生物学的標的は、大部分がかかる特異性を提供しないが、化学的構築物は提供することができる。したがって、本発明は、標的及び無機付着物（例えば、染色）を選択的にコーティングして、任意の種類の顕微鏡スライド上での任意の種類の分解から、標的及び無機付着物を保護する方法を提供することによる解決法を提供する。
【００６１】
本発明の一実施形態において、パラフィンは、溶媒とブレンドされて、材料状態を、室温で固体から液体へ変化させる。ブレンドは、Ｐａｒａｐｌａｓｔ  Ｘ−ｔｒａ又は等価体を、キシレン若しくはグリーンキシレン代替物：脂肪族溶媒、例えばキシロールとともに使用して、粘度を低減させて、付着後の凝固を減速させる。別の実施形態において、溶媒は、トルエン、塗料用シンナー、テレビン油、又はアセトン及びケロシンの５０：５０混合物から選択され得るが、これらに限定されない。
【００６２】
別の実施形態において、固形パラフィンは、液体になるまで、パラフィン融点より高い７５℃以下で融解させた後、飽和点が観察される（固体が形成される）まで、脂肪族溶媒を徐々に添加する。混合物を４５℃に冷却させて、完全に透明になるまで、より多くの脂肪族溶媒を徐々に添加する。
【００６３】
別の実施形態において、上述のパラフィンコーティングは、適用される抗体及び二次染色試薬と反応する特殊染色材料を特有に捕捉する特殊染色反応性末端基を有する無機標的及び接着剤コーティングされた顕微鏡スライドに予め適用される特殊染色反応性付着物上に塗布される。
【００６４】
別の実施形態において、パラフィン層は、接着剤コーティングされた顕微鏡スライド上に付着されてもよく、それらとして、スプレー、インクジェット付着、転写印刷（例えば、パッド印刷）、スクリーン印刷、及び蒸着が挙げられるが、これらに限定されない。全ての付着方法において、パラフィン層は、染色プロセスのパラフィン除去工程中に、確実にパラフィン全て（保護及び組織切片包埋用）が溶解されて、取り除くことができるように、５μｍ未満の厚さでなくてはならない。付着プロセス／方法と独立して、パラフィンの判断基準は、
薄層、好ましくは、約５ミクロン以下での厚さあり、
６０℃未満、好ましくは５６℃未満の融点を有し、キシレン又はキシロール（脂肪族代替物）溶媒への曝露により溶解し、
包埋用パラフィンに類似した外気温硬度を有する。
【００６５】
別の実施形態において、組織ブロック包埋用パラフィン材料として、Thermo Fisher社によるＴｉｓｓｕｅＰｒｅｐ及びＴｉｓｓｕｅＰｒｅｐ  ２（融点５６℃）、Leica社によるＰａｒａｐｌａｓｔ及びＰａｒａｐｌａｓｔ  ｐｌｕｓ（融点５６℃）、Leica社によるＰａｒａｐｌａｓｔ  Ｘ−ｔｒａ（融点５０℃〜５４℃）が挙げられ得るが、これらに限定されない。Ｐａｒａｐｌａｓｔ  Ｘ−ｔｒａは、無機標的の酸化分解を低減するために、フェノール系酸化防止剤であるブチル化ヒドロキシトルエンを組み入れる。
【００６６】
別の実施形態において、それぞれが、融点、硬度、及び粘度を確立させるための精製パラフィン、合成ポリマー、及び他の材料のブレンドである。微生物成長を支持しないことは、パラフィンに固有である。
【００６７】
別の実施形態において、特殊染色として、アルシアンブルー、アニリンブルー−オレンジＧ溶液、アザン染色、ビルショウスキー銀染色、ブロウ及びベン−グラム染色、クレシルバイオレット、ＤＡＢ、フォンタナマッソン、ゴードンスウィート銀染色、グロコットメセナミン銀法、ホールビリルビン染色、ジョーンズメタンアミン銀法、ルクソールファストブルー、ルクソールファストブルー−クレシルバイオレット、ムチカルミン（マイヤー法）、ミュラー−モーリーコロイド鉄、オレンジＧ、ヌクレアファストレッド、ジアスターゼ消化したＰＡＳ、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）、リンタングステン酸、ヘマトキシリン、ピクロシリウスレッド、酸性化トルイジンブルー、トリクローム−ゴモリの１段階、トリクローム−マッソン、ビクトリアブルー、ボンコッサ、ワイゲルトレゾルシンフクシン、ワウゲルト鉄ヘマトキシリン、ゼル−ニールセン法が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００６８】
別の実施形態において、標的は、黒色及び白色等の色素で着色された付着物から選択され得るが、これらに限定されず、任意の色素カラーを含むことができる。
【００６９】
別の実施形態において、上述のパラフィンコートが塗布され得る顕微鏡スライドは、ガラス、プラスチック又は任意のポリマー材料から選択され得るが、これらに限定されない。別の実施形態において、パラフィンは、精製され、無水でもよい。
【００７０】
別の実施形態において、得られた顕微鏡スライドは、後に熱せられて、パラフィン粒子を、一様な表面コーティングへと融解及び／又はブレンドしてもよく、付着物及び付着物の周囲のスライド表面の両方を封止する。
【００７１】
更に別の実施形態において、得られた顕微鏡スライドは、パラフィンが付着された後に加熱し、パラフィンから溶媒を追い出して、確実にパラフィンは硬化状態に戻る。これは、好ましくは赤外光を使用して、スライドのパラフィン側から行われなくてはならない。パラフィンを最上部から下へ融解させることにより、確実に溶媒は上昇して、妨げなくパラフィンから蒸発する。結果を図５に示し、図５は、溶融したパラフィンがどのようにして、その付着物の縁での良好なシールを保証するかを示している。
【００７２】
イメージング参照標的
標的アレイの他に、黒色イメージング参照標的及び白色イメージング参照標的が印刷される。
【００７３】
染色された生体材料を含有する顕微鏡スライドのデジタルイメージングは、染色された材料に対するプレスクリーニング及び潜在的には完全な診断決定を実施するように発展しつつある。概して、デジタル画像が、白色境界又は黒色境界のいずれかで圧縮状態にないように、イメージングシステムは、照明光レベルを調節しなくてはならない。従来の解決法は、標識が位置すると予測される場所に位置付けられる黒色標的及び白色標的を有することである。白色標的及び黒色標的が、スライドが存在し得る極値を表すことが、基礎を成す前提である。しかしながら、黒色標的及び白色標的を有する場合、組織切片の染色によって実現され得るよりも、黒色は遥かに黒く、白色は遥かに白くなるため、デジタルスケールで圧縮状態になる。
【００７４】
本発明の１つの好ましい実施形態において、患者の組織切片又は遊離細胞付着物と共在する対照及び参照標的標準物質を組み込んだ顕微鏡スライドが開示される。参照標的及び組織切片は、組織捕捉と染色されたスライドのカバースリッピングとの間に受けた処理を記録する。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、顕微鏡スライド標的アレイの中に、共在する黒色参照標的及び白色参照標的が存在する。黒色参照標的及び白色参照標的は、他の標的及び組織切片と同じ、試薬への曝露及び処理を受けた。
【００７６】
本発明の別の実施形態において、参照標的の両方、即ち、黒色標的及び白色標的は、スライドを処理するのに使用される試薬のいずれにも非反応性である印刷された塗料付着物である。理想的な状況における白色標的は、完全な白色である。しかしながら、黒色から白色までの中間を過ぎるようになる染色された生体材料の有用性は、限りなく低い。したがって、白色は、完全な白色から５％〜１０％外れる場合があり、依然として有用な値であり得る。好ましい実施形態において、白色は、太陽光に曝露されない場合、時間の経過に伴って安定である金属酸化物又は硫酸塩組成物の白色である。より好ましい実施形態において、白色は、酸化アルミニウム及び酸化チタンである。
【００７７】
別の実施形態において、黒色標的及び白色標的はともに、公称３６５ｎｍでの直接ＵＶ光曝露によって触媒される無水物系エポキシ塗料基剤に基づいている。上記無水物触媒は、メチルテトラヒドロフタル酸無水物及びジフェニルヨードニウムヘキサフルオロヒ酸塩で構成される。ＵＶによって反応開始することに加えて、無水物は、エポキシの架橋の触媒機能のために、熱の添加を必要とする。ＵＶによって反応開始する好ましい無水物及びその仲間を列挙するが、無水物製造業者を探せば他の可能な解決法を見つけることができる。かかる塗料／インクは、必要に応じて構築することができるが、通常は使用される印刷方法に関して最適化された市販成分である。塗料／インクの製造は、色素粒子とエポキシバインダーとの間で良好な濡れを達成することの難しさに対処しなくてはならない。無水物系塗料（低粘度を有する場合にはインクとも呼ばれる）は、可使時間が持続期間数ヶ月であり得る場合、エポキシと無水物とを混合する場合が多い。粘度を下げることは、印刷産業に関わるものの既知の知識であり、配合物は、エポキシ混合物が適用される表面及び使用される印刷方法に応じて様々である。熱誘発性の無水物−エポキシ塗料／インクが一般的に使用される一方で、反応を開始させるのに必要な熱は、塗料／インクと共在し得る生体材料（タンパク質、ペプチド及び化学的標的）に潜在的に損傷を与え得る。
【００７８】
別の実施形態において、無水物触媒は、アミノ−シランベースの触媒で見られる未反応アミンを排除する。排除されない場合、未反応アミンは非特異的な染色を支持する。遊離アミン末端基は、生体材料及び特殊染色の幾つかの両方を捕捉することができ、また捕捉するであろう。具体的には、これは、スライド処理試薬、特に染色試薬による白色標的の望ましくない染色の問題に対処する。塗料／インクの表面上の遊離アミン末端基として、それは、一次抗体及び二次染色試薬の両方を捕捉することができ、染色されるようになる。したがって、スライド上に白色標的が組み込まれた価値を無効にする。
【００７９】
別の実施形態において、黒色色素は、直径２ミクロン未満のカーボンダストを使用する一方で、白色は、酸化アルミニウム、酸化チタン、又は硫酸バリウムビーズを使用する。硫酸バリウムが、本出願での好ましい白色色素である。
【００８０】
別の実施形態において、好ましいエポキシインク／塗料配合物は、完全に界面活性剤を回避して、これらのスライドが受け得る範囲の染色及び試薬に反応性であるインク／塗料を残すのを防ぐ。
【００８１】
別の実施形態において、標的の印刷は、スタンプ台及びシリンジによって行われ得る。更に別の実施形態において、シリンジは、それが標的付着のより良好な形状及び大きさ（feature size）の管理を支持するため好ましい。
【００８２】
別の実施形態において、上述の白色標的は、無水物で触媒されるエポキシ内の金属酸化物又は硫酸塩色素で構成される。別の実施形態において、上述の黒色標的は、ＵＶによって反応開始する無水物で触媒されるエポキシ内の炭素色素で構成される。別の実施形態において、無水物触媒は、直接的なＵＶ光曝露によってＵＶによって反応開始される。ＵＶによって反応開始する無水物触媒を使用する主な利点は、無水物−エポキシ反応を開始させるのに必要な熱が、生体材料（タンパク質、ペプチド、及び化学的標的）が損傷なく許容し得るものを超えることである。染色試薬と反応し得る任意の遊離アミンの排除は、より重要である。
【００８３】
ヘマトキシリン
ヘマトキシリンは、それ自体が色素ではなく、生体材料に結合しない。しかしながら、弱酸である媒染剤、及び他の材料と混合されると、標的部位に共有結合を形成する色素が形成される。媒染剤の選択は、色素がどの組織要素に結合するかに影響を及ぼす。Ｐａｐスメアに関して、ヘマトキシリンが使用されて、細胞核を染色する。したがって、細胞核を染色するための媒染剤の選択は、アルミニウム、鉄、及びタングステンであり、通常、アルミニウムが選択される。ヘマテインは、以下に示すように、酸化ヘマトキシリンである。
【化１】
2020523615.tif 000003
【００８４】
ヘマテイン末端基へのアルミニウム媒染剤の修飾は、下記のように行われる：
【化２】
2020523615.tif 000004
【００８５】
ＤＮＡ内のリン酸塩基単位へのヘマテイン＋媒染剤の結合を以下に示す：
【化３】
2020523615.tif 000005
【００８６】
合成ポリリン酸は、ＤＮＡ鎖を置き換えて、ヘマテイン＋媒染剤色素を捕捉する特有の標的部位を形成する。しかしながら、組成を完成させるためには、標的濃度が、標的部位の勾配密度アレイに関して調節され得るように、色素と非反応性である類似したポリマーが必要とされる。ポリリン酸塩は、弱酸である。しかしながら、ポリマーはポリリン酸へ変換されなくてはならず、それにはＯ−末端基への水素原子の供与を要する。これは、過酸化水素ＨＯＨＯを使用して行うことができ、それにより脱離基としてＨ２Ｏを生じる。
【化４】
2020523615.tif 000006
【化５】
2020523615.tif 000007
【００８７】
ポリリン酸部位の密度を管理して、勾配密度アレイを形成することが目標である。これを達成するために、ポリリン酸は、ともに、基板接着剤への共有結合を実現できるよう、別のヒドロキシルポリマーと混合されなくてはならない。ポリビニルアルコール、即ちＰＶＡ、又は類似したポリマーを使用することが解決法である。
【００８８】
ヘマトキシリンに関する標的の勾配密度アレイを提供するための論理的根拠は、他の材料を含むヘマトキシリンの有機起源及び媒染剤を付したヘマテイン色素への変換に源を発する。ヘマトキシリン標的及び共在する組織のカラー並びにカラー密度に影響を及ぼす要因は、下記である。
【００８９】
媒染剤を付したヘマテイン色素の濃度は、特に処理が浴中で行われる場合に、経時的に変化する。すすぎ水のキャリーオーバーは、浴を希釈する。試薬が動いている状態で保たれない場合、スライドが、浴のより深くに達するほど、浴に形成される勾配密度はより濃くなる。色素の分子量は、浴の大部分を構成する水と比較して大きいので、沈降が起きる。
【００９０】
１．ヘマトキシリンをヘマテインに変換する酸化プロセスは、不規則性を継続して、経時的に行われて、色素強度の低減、及び除去されなくてはならない色素の沈殿をもたらす。
【００９１】
２．ヘマトキシリンの酸化は、幾つかの酸化誘導体：モノ、ジ、トリ、ペンタ及びテトラヘマテインを産生し得る。アルミニウム媒染剤ヘマテインはそれぞれ、酸化誘導体に応じて、種々のカラーを有する：ジ及びトリは、紫〜青色であり、テトラは、茶色がかっており、ペンタは、透明である。他の媒染剤は、類似した様式で、カラーベースをシフトさせる。
【００９２】
３．ヘマテインストック溶液の好気的酸化はまた、分解に寄与し得る。
【００９３】
ヘマテイン＋媒染剤色素条件及びタイプの同定は、種々の反応部位密度の標的シリーズが使用される場合に、より容易となる。勾配シリーズは、飽和から中間まで進む。したがって、染色濃度が弱まり、及び／又は酸化が低下すると、飽和された標的であるヘマテインは、飽和から落ちて、色素濃度を評価することが可能となる。
【００９４】
リンタングステン酸
リンタングステン酸（ＴＰＡ）は、Ｈ３ＰＷ１２Ｏ４０の化学式を有するヘテロポリ酸である。リンタングステン酸（ＴＰＡ）は、以下に示すように、単一リン酸分子周囲にあるタングステン酸ケージとして、より良好に記載することができる：
【化６】
2020523615.tif 000008
【００９５】
リンタングステン酸は単独で、バリン及びロイシンアミノ酸に見られる隣接するＣＨ３末端基の対により生体材料を結合する。リンタングステン酸は、これらの材料から色素の陰イオンを置き換えることによって、フィブリン及びコラーゲンに結合して、それらを選択的に脱色させる。
【化７】
2020523615.tif 000009
【００９６】
リンタングステン酸内の２つの隣接するタングステン酸基は、２つのＣＨ３末端基と反応して下記を形成する：
Ｒ’−ＣＨ（ＣＨ３）２＋−−Ｗ＝Ｏ３−Ｏ３＝Ｗ−−＞＞Ｒ’−ＣＨ［（ＣＨ＝Ｗ＝Ｏ２］２＋２Ｈ２Ｏ
【００９７】
無機標的は、イソブタノール（イソブチルアルコール）ＨＯＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）２となり、ここで、ヒドロキシルは、接着剤コーティングに結合する。
【化８】
2020523615.tif 000010
【００９８】
オレンジＧ
オレンジＧは、通常ジナトリウム塩を備えている合成アゾ色素である。Ｐａｐ染色に関して、オレンジＧは、ケラチンを染色するのに使用される。元の機能は、痰中に存在する角化型扁平上皮癌の小細胞を染色することであった。
【化９】
2020523615.tif 000011
【００９９】
標的は、−ＳＯ３Ｎａ末端基及び−ＯＨ末端基を有するベンゼン環である必要がある。これは、ＮａＣｌと混合された４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸によって構築されるか、又は変換形態で購入される必要がある。
【化１０】
2020523615.tif 000012
【０１００】
生成物は、４−ヒドロキシベンゼンスルホン酸ナトリウムとなる。
【０１０１】
標的末端基Ｒ（Ｃ６Ｈ４）ＳＯ４Ｎａが、オレンジＧ染色上の−ＲＳＯ４Ｎａと反応すると、反応は下記のようになる：
【化１１】
2020523615.tif 000013
【０１０２】
したがって、ＨがＮａである場合を除いて、廃棄生成物は、Ｎａ２ＳＯ４、即ち硫酸ナトリウムとなり、これは、白色粉末として沈殿する。
【０１０３】
エオシンＹ
エオシンＹは、エオシンの一形態である。エオシンＹは、細胞における細胞質を強調するための酸性赤色染色として、一般的に使用されている。Ｐａｐスメアにおいて、エオシンＹは、表在性扁平上皮細胞、核小体、繊毛、及び赤血球を染色する。エオシンＹは、３個の既知の末端基：
フェノール基、
カルボキシル基、
金属酸化物、
に結合する。
【化１２】
2020523615.tif 000014
【０１０４】
本発明者らの適用に関して、エオシンと特有に反応して、他の特殊染色とは反応しない標的を使用することが重要である。フェノール基は、唯一の実現可能な選択である。
【化１３】
2020523615.tif 000015
【０１０５】
他のＰａｐ標的と一致するためには、フェノールは、下記で見られるように、対向するヒドロキシル末端基を有さなくてはならない：
【化１４】
2020523615.tif 000016
【０１０６】
ライトグリーンＳＦ又はファストグリーンＦＣＦ
ライトグリーンＳＦは、緑色のトリアリールメタン色素であるのに対して、ファストグリーンＦＣＦは、海緑色のトリアリールメタン色素である。色素は、角化型扁平細胞以外の細胞の細胞質を染色する。構造は、非常に類似しており、単一の標的が、両方の緑色色素を支持するのを可能にする。
【化１５】
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ファストグリーンＦＣＦ
【０１０７】
緑色染色はともに、標的部位上の−Ｒ（Ｃ６Ｈ４）ＳＯ３Ｈ末端基を求める。これは、フェノールスルホン酸、即ちＨＯ（Ｃ６Ｈ４）ＳＯ３Ｈによって実現される。
【化１６】
2020523615.tif 000018
【０１０８】
ビスマルクブラウン
ビスマルクブラウンは、酸性ムチンを染色するのに使用されるジアゾ色素である。
【化１７】
2020523615.tif 000019
【０１０９】
染色上の−ＮＨ２末端基にカップリングすることが重要である。トシルカップリング反応を使用することが、解決法であり、ここで、下記が行われる：
【化１８】
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【０１１０】
解決法は、下記の通りである。
【０１１１】
トシル活性化剤である塩化ｐ−トルエンスルホニルを、スライド接着剤上のヒドロキシル末端基に適用させる。
Ｒ’−−ＣＨ（ＣＨ２）２ＯＨ＋Ｃｌ（Ｓ＝Ｏ２）Ｃ６Ｈ４ＣＨ３＞＞Ｒ’−−−ＣＨ２Ｏ（Ｓ＝Ｏ２）Ｃ６Ｈ４ＣＨ３＋ＨＣｌ
【０１１２】
染色剤のＮＨ２末端基が提示されると、活性化剤が放出されて、アミンが捕捉される。
Ｒ’−−ＣＨ２（Ｓ＝Ｏ２）Ｃ６Ｈ４ＣＨ３＋Ｒ”−−ＮＨ２＞＞−Ｒ’−−ＣＨ２ＮＨ−Ｒ”＋ＨＯ（Ｓ＝Ｏ２）Ｃ６Ｈ４ＣＨ３
【０１１３】
一実施形態において、染色標的の第２の行は、選ばれた場合には、特殊染色の用法を支持する。これらの標的は、無機であり、特定の染色を特有に標的とし、共有結合を用いて特定の染色を捕捉する。特殊染色反応性標的は、アルシアンブルー、ビルショウスキー銀染色、ビスマルクブラウン、グラム染色、クレシルバイオレット、フォンタナマッソン、ゴードンスウィート銀染色、ライトグリーンＳＦ又はファストグリーンＦＣＦ、グロコットメセナミン銀法、ホールビリルビン染色、ルクソールファストブルームチカルミン、ミュラー−モーリーコロイド鉄、ニューメチレンブルー、ヌクレアファストレッド、オイルレッドＯ、オレンジＧ、ジアスターゼ消化したＰＡＳ、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）、リンタングステン酸、ピクロシリウスレッド、プルシアンブルー反応、酸性化トルイジンブルー、トリクローム−ゴモリの１段法、トリクローム−マッソン、ヴァーヘフ−ワンギーソン、ボンコッサ、ワイゲルトレゾルシンフクシン、ゼル−ニールセンから選択され得るが、これらに限定されない。
【０１１４】
別の実施形態において、接着剤コーティングされた顕微鏡スライドを用いたＨ＆Ｅ染色に関する好ましい解決法は、下記の通りである。
【０１１５】
ＰＲＳ−Ｈ＆Ｅの基本バージョンは、Ｈ＆Ｅ標的のみを支持する。標的は、ヘマテイン＋媒染剤及びエオシンＹと特有に反応するように設計されている。しかしながら、ヘマテイン用の媒染剤が、リンタングステン酸である場合、更なる標的部位が、リンタングステン酸単独に必要とされる。
【０１１６】
ヘマテイン＋媒染剤
ポリリン酸及びポリビニルアルコールのブレンドは、ｄＢｄプロファイルに従って、５個の要素の最小の勾配密度アレイを形成する。
【０１１７】
エオシンＹ
ヒドロキノン
これらの無機標的化学は、考え得る唯一の解決法ではないが、それらは、それぞれが一連のＨ＆Ｅ染色において、唯一の染色と単独で反応する標的シリーズの実現性を表す。化学の専門家は、同じ結果を達成するのに代替の標的配合物を開発することができるが、それにより本発明の範囲又は結果は変化しない。
【実施例】
【０１１８】
実施例１  各染色標的又は勾配密度標的組の実験
Ｈ＆Ｅ（図２）、ＰＡＰ−Ｍ（図３）、及びＰＡＰ−４（図４）スライドを製造し、それらは、ヘマトキシリン及びエオシン染色実験用の同じ一番上の列の標的を共有する。両方のＰａｐスライドの第２の列は、リンタングステン酸、オレンジＧ、ライトグリーンＳＦ又はファストグリーンＦＣＦ、及びビスマルクブラウンに対する標的を含有する。ＰＡＰ−Ａは、３個全てのスライドの標的を含み、したがって、ＰＡＰ−Ａスライドは、３個のスライドタイプの全ての要素を試験するように良好に機能することが観察され得る。実験は、染色がどのように挙動するかに応じて、４個のグループに分けた。
【０１１９】
試験Ａ：オレンジＧ、ライトグリーンＳＦ又はファストグリーンＦＣＦ、及びビスマルクブラウンに関する染色の存在の二元実験。実験は、スライドを、列挙される染色の１つに単に曝露して、正確な捕捉標的が染色されるのに対して、標的の残余は、染色しないことを確認する。
【０１２０】
試験Ｂ：エオシンＹのｐＨベースの実験。この試験では、エオシンＹのｐＨを、４．５、５．５、及び６．５にする。低ｐＨ条件及び高ｐＨ条件はともに、極めて不十分に染色するはずであるのに対して、中間範囲のｐＨ標的は、正確に染色する。
【０１２１】
試験Ｃ：ヘマトキシリンの濃度ベースの実験。試験は、高さ２７ｍｍのＩＤジャー中で５０ｍｌの量で作りたての濃度で開始する。スライドは染色されて、濃縮物は、液体に通気しながら３０分間置いておき、酸化させる。試験は、４時間継続する。
【０１２２】
試験Ｄ：リンタングステン酸に対するｐＨの影響。染色性能は、ｐＨを８．５から７まで下げると変化する。
【０１２３】
試験Ａの結果：高さ２７ｍｍのＩＤジャー中の５０ｍｌの量の標準的な濃縮混合物を、各染色に関して作製した。染色はそれぞれ、３回試験して、反復（replication）を示した。スライドは全て、正確な標的が染色され、他の標的はまた、染色されないことを示した。
【０１２４】
試験Ｂの結果：５個のスライド保管チューブを、新鮮なエオシンＹを使用する準備が整っている購入品で充填した。容器には、試薬約２０ｍｌが保持される。実験は、対で、正常ｐＨ及び低ｐＨ、続いて正常ｐＨ及び高ｐＨで行われた。公称ｐＨは、必要に応じて、ホウ素水和物及びホウ酸を用いた調節により、４．５に設定された。試験サイクル１回当たり３個のスライドを作製した。正常なベースラインスライド染色後、ｐＨを３．５に下げて、新たなスライドを染色した。正常なベースラインスライド染色後、ｐＨを５．５に上げて、新たなスライドを染色した。予想通り、染色密度は、各スライド組に関して１％を有し、ｐＨ変化とともに、５０％近く低下した。
【０１２５】
試験Ｃの結果：ヘマトキシリンは、マイヤーのヘマルム溶液として購入した。標的は全て、飽和で開始し、試薬の酸化が継続されるにつれ、勾配スケールを経時的に示した。試験は、分解を加速させて、挙動を示した。４時間が経過する頃までには、標的１００％が、５０％超分解された。
【０１２６】
試験Ｄの結果：リンタングステン酸を、高さ２７ｍｍのＩＤジャー中で標準的な５０ｍｌの量で混合して、ＨＣｌを用いて、ｐＨを８．５に調節した。スライドを染色して、ｐＨをｐＨ０．５下げた。ｐＨが７に下がるまで、試験サイクルを繰り返した。予想通り、標的は全て、ｐＨ８．５で飽和であった。ｐＨを７まで下げると、勾配密度スケールは、可視的であり、１００％標的が、カラー密度を約３０％損失した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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