(57)【要約】対象におけるレーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）を処置するための組成物、及び、方法を提供する。ある態様では、レベルシリンをコードする配列を含む核酸分子を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターを提供する。別の態様では、レベルシリンは、配列番号１のアミノ酸配列を有する。なおも別の態様では、当該核酸分子は、配列番号３の配列、または、その変異体を有する。所望の実施形態では、当該対象は、ヒト、ネコ、イヌ、ヒツジ、または、非ヒト霊長類である。【選択図】図１
2020510433.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトレベルシリンをコードする配列番号３のコドン最適化の、改変型核酸配列。
【請求項２】
ヒトレベルシリンをコードする配列番号３のコドン最適化核酸配列を含む発現カセット。
【請求項３】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドと、その内部にパッケージされたベクターゲノムとを含み、前記ベクターゲノムは：
（ａ）ＡＡＶ５’逆向き末端反復（ＩＴＲ）配列；
（ｂ）プロモーター；
（ｃ）ヒトレベルシリンをコードするコード配列；
（ｄ）ＡＡＶ３’ＩＴＲ、
を含む、前記ｒＡＡＶ。
【請求項４】
前記（ｃ）のコード配列が、配列番号２の天然のヒトレベルシリンコード配列と少なくとも７０％同一であるコドン最適化ヒトＬＣＡ５である、請求項３に記載のｒＡＡＶ。
【請求項５】
前記（ｃ）のコード配列が、配列番号３である、請求項３または４に記載のｒＡＡＶ。
【請求項６】
前記ｒＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ７ｍ８もしくはその変異体、ＡＡＶ８カプシド、ＡＡＶ６カプシドもしくはその変異体、ＡＡＶ９カプシドもしくはその変異体、ＡＡＶ７カプシド、もしくはその変異体、ＡＡＶ５カプシド、もしくはその変異体、ＡＡＶ２カプシドまたはその変異体、ＡＡＶ１カプシドまたはその変異体、ＡＡＶ３カプシドもしくはその変異体、または、ＡＡＶ４カプシドもしくはその変異体である、請求項３〜５のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
【請求項７】
前記プロモーターが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、または、ＣＭＶプロモーター配列と、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター配列とを含むハイブリッドプロモーターである、請求項３〜６のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
【請求項８】
前記ＡＡＶ５’ＩＴＲ、及び／または、ＡＡＶ３’ＩＴＲが、ＡＡＶ２由来である、請求項３〜７のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
【請求項９】
前記ベクターゲノムが、ポリＡをさらに含む、請求項３〜８のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
【請求項１０】
イントロンをさらに含む、請求項３〜９のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
【請求項１１】
エンハンサーをさらに含む、請求項３〜１０のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
【請求項１２】
請求項３〜１１のいずれかに記載のｒＡＡＶと、眼への送達に適した医薬として許容可能な担体または賦形剤とを含む組成物。
【請求項１３】
ＬＣＡ患者への投与に適した水性懸濁液であって、前記懸濁液は、水性懸濁液、及び、約１×１０１０ウイルス粒子〜約１×１０１２ＧＣまたはウイルス粒子／眼である、ＬＣＡの治療薬として有用な組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含み、前記ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドを有し、及び、
（ａ）ＡＡＶ  ５’逆向き末端反復（ＩＴＲ）配列；
（ｂ）プロモーター；
（ｃ）ヒトレベルシリンをコードするコード配列；
（ｄ）ＡＡＶ  ３’ＩＴＲ、を含む、
ベクターゲノムをその内部にパッケージしている、前記水性懸濁液。
【請求項１４】
前記懸濁液が、網膜下または硝子体内注射に適している、請求項１３に記載の懸濁液。
【請求項１５】
前記プロモーターが、配列番号１０であり、コードする前記コード配列が、配列番号３である、請求項１３または１４に記載の懸濁液。
【請求項１６】
前記ｒＡＡＶカプシドが、ＡＡＶ７ｍ８カプシドである、請求項１３〜１５のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項１７】
配列番号８のｎｔ  ８２４〜ｎｔ  １７９５のＣＢＡエクソン１及びイントロンをさらに含む、請求項１３〜１６のいずれかに記載の懸濁液。
【請求項１８】
ＬＣＡを有する対象の処置のための請求項３〜１１のいずれかに記載のｒＡＡＶ、請求項１２に記載の組成物、または、請求項１３〜１８のいずれかに記載の懸濁液の使用。
【請求項１９】
前記ｒＡＡＶを、水性懸濁液において、約１×１０９〜約１×１０１３のベクターゲノム／眼（ｖｇ／眼）で送達する、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記ｒＡＡＶを、網膜下または硝子体内に投与する、請求項１８または１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記ｒＡＡＶを、約または少なくとも１５０マイクロリットルを含む容量で、１×１０９〜１×１０１３ｒＡＡＶの用量で投与し、それにより、前記対象での視覚機能を回復させる、請求項１８〜２０のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
請求項３〜１１のいずれかに記載のｒＡＡＶ、請求項１２に記載の組成物、または、請求項１３〜１８のいずれかに記載の懸濁液で、ＬＣＡを有する対象を処置する方法。
【請求項２３】
前記ｒＡＡＶを、水性懸濁液において、約１×１０９〜約１×１０１３のベクターゲノム／眼（ｖｇ／眼）で送達する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｒＡＡＶを、網膜下または硝子体内に投与する、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｒＡＡＶを、約または少なくとも１５０マイクロリットルを含む容量で、１×１０９〜１×１０１３ｒＡＡＶの用量で投与し、それにより、前記対象での視覚機能を回復させる、請求項２２〜２４のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府から資金提供を受けた研究または開発に関する陳述
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＥＩ）／Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）より、Ｇｒａｎｔ番号第Ｒ２１ＥＹ０２０６６２号、及び、第Ｐ３０ＥＹ００１５８３号の下で、合衆国政府の支援を受けて完成をした。合衆国政府は、本発明について、一定の権利を有する。
【０００２】
電子的形態で提出した資料の援用
本出願人は、電子的形態で提出した配列表資料を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。このファイルを、「ＵＰＮ−１６−７６９６ＰＣＴ＿Ｓｅｑ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」の名称で格納している。
【背景技術】
【０００３】
失明に至る遺伝性の疾患の最も重度のグループの１つは、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ；ＯＭＩＭ  ２０４０００）である。ＬＣＡは、稀少のものであり、１：５０，０００名に発症し、通常は、常染色体劣性様式で遺伝し、そして、少なくとも２２個の異なる遺伝子のいずれかの変異に起因する（ｓｐｈ．ｕｔｈ．ｅｄｕ／ＲｅｔＮｅｔ／ｓｕｍ−ｄｉｓ．ｈｔｍ）。臨床的特徴として、乳児期または幼児期の重度の異常視力（視力、視野の減少）、眼振、及び、生涯の初期に認められる視力の進行性の喪失がある。臨床検査により、暗所視及び明所視網膜電図（ＥＲＧ）応答の消失、黒内障、光感受性の低下、及び、網膜の色素変化が明らかになる。現在のところ、承認を受けたＬＣＡの治療法は存在しない。
【０００４】
網膜色素上皮の６５ｋＤａのタンパク質をコードする遺伝子、ＲＰＥ６５での変異に起因するＬＣＡの形態（Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＴＭ，  Ｙｕ  Ｓ，  Ｌｅｅ  Ｅ，  Ｂｏｋ  Ｄ，  Ｈａｍａｓａｋｉ  Ｄ，  Ｃｈｅｎ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｐｅ６５  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １１−ｃｉｓ−ｖｉｔａｍｉｎ
Ａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｖｉｓｕａｌ  ｃｙｃｌｅ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  （１９９８）  ２０（４）：３４４−５１；Ｒｅｄｍｏｎｄ  Ｔ，  Ｈａｍｅｌ  Ｃ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＰＥ６５：  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｔｏ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  （２０００）  ３１７：７０５−２４，これらの双方の文献を、本明細書の一部を構成するものとして援用する）は、複数の遺伝子増強療法の臨床試験での対象となっているため、近年、大きな注目を集めている。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）血清型２を使用して、幾つかのグループは、ＲＰＥ６５  ｃＤＮＡの野生型コピーの網膜色素上皮（ＲＰＥ）への送達が安全であり、かつ、このものが、夜盲症を含む数多くの欠損を改善できる、ことを示した（３〜９）。ＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２（または、Ｓｐａｒｋ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡが資金提供しているｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅ  ｎｅｐａｒｖｏｖｅｃ）を試験するランダム化した多施設第３相試験では、この試薬を網膜下注射すると、光感度、視野、さらには、輝度条件の範囲における視覚的刺激を用いて、正確かつ迅速に誘導する能力を改善する、ことを示した（１０，１１）。Ｔｈｅ  ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）は、Ｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅ  ｎｅｐａｒｖｏｖｅｃ−ｒｚｙｌに対して、２０１７年１２月１９日に医薬認可を付与し、これは、米国で初めて承認された遺伝子治療薬の１つになった。ＲＰＥ６５の変異に起因するＬＣＡ、つまりＬＣＡ２の処置法の開発が進展すると、ＲＰＥ特異的遺伝子だけでなく、光受容体特異的遺伝子の変異に起因する大半の初期発症網膜変性の処置法の開発への道を開く。
【０００５】
このすでに重度の病態（ＬＣＡ）の最も重度の形態の１つは、レベルシリンをコードする光受容体特異的遺伝子であるＬＣＡ５の変異に起因する（１２〜２０）。ＬＣＡ５変異は、ＬＣＡ症例の約２％を占めると推定されているが、遺伝的に単離した集団では、より一般的となり得る。（１６）ＬＣＡ５変異は、錐体ジストロフィーや常染色体劣性網膜色素変性症（ＡＲＲＰ）など、その他の網膜変性の早期発症型の原因としても特定されている。（１５，１６，２１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、必要とする対象でのレベルシリンの発現に有用な組成物が待望されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書に記載の実施形態は、ヒトＬＣＡ５を、それを必要とする対象に送達するためのＡＡＶ遺伝子治療ベクターに関する組成物及び方法に関するものであり、当該ベクターを硝子体内または網膜下に投与すると、長期間、おそらくは１０年以上、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）の臨床的に意味のある矯正をもたらす。
【０００８】
ある態様では、ヒトレベルシリンをコードするコドン最適化の、改変型核酸配列を提供する。ある実施形態では、当該コドン最適化核酸配列は、配列番号３または配列番号２の変異体である。別の実施形態では、当該コドン最適化核酸配列は、配列番号３である。別の実施形態では、当該核酸配列は、ヒトでの発現に最適化したコドンである。
【０００９】
別の態様では、レベルシリンをコードするコドン最適化核酸配列を含む発現カセットを提供する。ある実施形態では、当該発現カセットは、ヒトレベルシリンをコードする配列番号３の核酸配列を含む。さらに他の実施形態では、レベルシリンをコードする配列は、５’及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲ配列の間に位置する。
【００１０】
さらに別の態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。当該ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及び、その内部にパッケージされたベクターゲノムを含む。ある実施形態では、当該ベクターゲノムは：（ａ）ＡＡＶ  ５’逆向き末端反復（ＩＴＲ）配列、（ｂ）プロモーター、（ｃ）ヒトレベルシリンをコードするコード配列；及び、（ｄ）ＡＡＶ  ３’ＩＴＲ、を含む。ある実施形態では、当該ｒＡＡＶベクターは、宿主細胞におけるレベルシリンの発現を指向する発現制御配列をさらに含む。さらなる実施形態では、当該レベルシリン配列は、配列番号１のタンパク質配列である。ある実施形態では、当該ベクターゲノムは、配列番号８のｎｔ  １−４３７９の配列である。別の実施形態では、当該ベクターゲノムは、配列番号９のｎｔ  １−４３６８の配列である。さらに別の実施形態では、同定したベクターゲノムのいずれかにおける当該ＬＣＡ５コード配列を、本明細書に記載の別のＬＣＡ５コード配列と交換する。
【００１１】
別の態様では、ＬＣＡ患者への投与に適した水性懸濁液を提供する。ある実施形態では、当該懸濁液は、水性懸濁液、及び、約１×１０１０ＧＣまたはウイルス粒子〜約１×１０１３ＧＣのウイルス粒子またはウイルス粒子／眼である、ＬＣＡの治療に有用な本明細書に記載した組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を含む。
【００１２】
別の態様では、医薬組成物は、本明細書に具体的に説明した、医薬として許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、及び／または、アジュバント、ならびに、核酸配列、プラスミド、ベクター、または、ｒＡＡＶなどのウイルスベクターを含む。
【００１３】
別の態様では、レベルシリン遺伝子（ＬＣＡ５）の欠陥に起因するレーバー先天性黒内障を処置し、及び／または、ＬＣＡを有する哺乳動物対象における視覚機能を回復する方法であって、本明細書に記載したレベルシリンをコードする組換えＡＡＶベクターを、硝子体内、網膜下、または、血管内注射を介して、それを必要とする対象に送達する、ことを含む。
【００１４】
別の態様では、レベルシリン遺伝子（ＬＣＡ５）の欠陥に起因するレーバー先天性黒内障の処置、及び／または、ＬＣＡを有する哺乳動物対象の視覚機能の回復における、本明細書に記載したＡＡＶベクターの使用を提供する。この使用は、本明細書に記載したレベルシリンをコードする組換えＡＡＶベクターを、硝子体内、網膜下、または、血管内注射を介して、それを必要とする対象に送達する、ことを含む。
【００１５】
本発明のその他の態様、及び、利点は、以下の本発明の詳細な説明から自ずと明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１Ａは、本明細書に記載したＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡ．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５、及び、ＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡ．ＥＧＦＰを作り出すために使用した導入遺伝子カセットを示す。図１Ｂ〜１Ｄは、配列番号２のＬＣＡ５（Ｎａｔｉｖｅ＿ＬＣＡ５）のヒト核酸配列と、配列番号３のコドン最適化ＬＣＡ５（Ｃｏｄｏｎ＿ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ＿ＬＣＡ５）配列との整列とを提供する。図１Ｅ〜１Ｆは、ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＣＢＡ．ヒトコドン最適化レベルシリンベクターのプラスミドマップと、特徴リストとを提供する。当該核酸配列は、配列番号８で再現している。図１Ｇ〜１Ｈは、Ｐ５でＡＡＶ７ｍ８−ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５を注射した眼の免疫蛍光分析を提供し、及び、Ｐ１５で行った分析は、実施例１、２及び４に記載したチューブリン陽性外節の基部と共局在するレベルシリンを示す。硝子体内注射（ＩＶＴ、図１Ｇ）、または、網膜下注射（ＳＲ、図１Ｌ）の後に、レベルシリンは網膜全体に分布しており、Ｐ９５での光受容体は、ほぼ皆無であった。対照的に、レベルシリンは、未処置のＰ１５、及び、Ｐ９５  Ｌｃａ５−／−網膜には存在しない。ＳＲ、網膜下；ＩＶＴ、硝子体内；（−）未処置のＬｃａ５−／−。硝子体内注射スキーム（図１Ｇ）、及び、網膜下注射スキーム（図１Ｈ）を示す概略画を提供する。図１Ｉは、Ｐ２０で、ＡＡＶ．ＬＣＡ５ベクターを網膜下に注射した、野生型マウス、及び、Ｌｃａ５−／−マウスの双方におけるレベルシリンの発現を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｉは、ＰＮ５及びＰＮ１５で処置をしたＬｃａ５−／−マウスのコントロールの（模擬注射した）眼と比較した、ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５を注射したマウスについて、３ヶ月齢で測定した正規化した瞳孔反射振幅を示す。結果を、（Ａ）硝子体内、及び、（Ｂ）網膜下注射の後、または、（Ｃ）未処置（−）コントロールマウスについて示す。（Ｄ）（Ａ〜Ｃ）、及び、野生型（Ｃ５７Ｂ１６）ポジティブ（＋）コントロールマウスのサブグループの各々での動物の右眼の相対的瞳孔反射振幅（ベースライン瞳孔径の％）を、グラフで示す（Ｅ）。図２Ｆ及び２Ｇは、図２Ａ〜２Ｄに示した結果を得るために使用した試験スキームの典型である。図２Ｈ及び図２Ｉは、網膜下（ＳＲ、Ｉ）または硝子体内（ＩＶ、Ｈ）注射を介して、ＰＮ５対ＰＮ１５で処置した、図２Ａ〜２Ｄに示す、実験及びコントロールマウスにおける正規化瞳孔反射振幅の比較を示す。＊ｐ＜０．１；＊＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．０１。
【図３】図３Ａ〜３Ｆは、実施例３に記載した、ＰＮ５及びＰＮ１５で処置をし、かつ、３ヶ月齢で測定したＬｃａ５−／−マウスのＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５を注射した眼と、コントロールの（模擬注射した）眼に関する水迷路検査の結果を示す。図３Ａは、統計分析結果を示す表である。図３Ｂは、水迷路検査の典型的な結果の例示である。図３Ｄは、出生時にＡＡＶ７ｍ８．ＬＣＡ５ベクターを用いて、出生時に硝子体内または網膜下で処置をしたＬｃａ５−／−マウスが、ＰＮ５またはＰＮ１５で、トレーニングで初めて成功するまでの日数を示す棒グラフである。野生型マウスを、コントロールとして提供した。図３Ｄは、出生時にＡＡＶ７ｍ８．ＬＣＡ５ベクターを用いて硝子体内で処置をしたＬｃａ５−／−マウスが、ＰＮ５で、様々な光強度（ｘ軸）に対して示す成功率の折れ線グラフである。図３Ｅは、出生時にＡＡＶ７ｍ８．ＬＣＡ５ベクターを用いて網膜下で処置をしたＬｃａ５−／−マウスが、ＰＮ５で、様々な光強度（ｘ軸）に対して示す成功率の折れ線グラフである。図３Ｆは、出生時にＡＡＶ７ｍ８．ＬＣＡ５ベクターを用いて硝子体内で処置をしたＬｃａ５−／−マウスが、ＰＮ１５で、様々な光強度（ｘ軸）に対して示す成功率の折れ線グラフである。
【図４】出生して（ＰＮ）５日後に、Ｌｃａ５ｇｔ／ｇｔ網膜に対してＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５を送達した後の代表的な組織学の結果を提供するグラフである。このグラフは、ＡＡＶ．ＬＣＡ５と、模擬注射とでＩＶＴまたはＳＲ処置した後の外核層（ＯＮＬ）での列の個数を示している。
【図５】図５Ａは、ロドプシン（赤色）が、３ヶ月の時点に至るまで、処置した（しかし、コントロールは未処置である）光受容体に持続することを示す免疫蛍光の結果を提供する。時折認められる視細胞は、ｅＧＦＰポジティブである（ＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰとの同時注射で同定された注射領域）。図５Ｂ〜５Ｄは、Ｌｃａ５ｇｔ／ｇｔのＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５で処置した桿体視細胞と錐体視細胞のマルチ電極アレイ（ＭＥＡ）応答は、野生型（ＷＴ）網膜のそれと類似していることを示す。（Ｂ）応答振幅（発光前後の発火率の差異）と、発光ごとの平均トレースから測定した発光強度データ（表示なし）との対比。処置した網膜からの応答は、ＷＴ網膜からの応答の７０％と同程度の高さであり、未処置の網膜での応答は、最小限のものか、ないしは、消失している。（Ｃ）１回目と２回目の強度シリーズ試験のためのパネルＡの網膜からの応答振幅（１回目の試験の終盤に最も明るい露光を受ける前／間、及び、後に、各々の強度シリーズ試験の間に、刺激シリーズ強度は、暗所視から最も明るい明所視値にまで約０．５  ｌｏｇ増大した）（Ｄ）一時的なＯＮ−（発光開始前後の発火率の差異）、持続したＯＮ−（発光開始前と消失との差異）、及び、ＯＦＦ応答（発光消失の前後の差異）の１回目と２回目の強度シリーズ試験の発光強度の関数としての振幅。淡青色の網掛け部分は、ＷＴ応答の範囲（４つの網膜、ＭＥＡＮ±ＳＴＤ）を表しており、線だけのトレースは、平均ＷＴ応答振幅を示す。水平矢印は、１回目の強度シリーズ試験の終了時での、最も明るい発光への露出に起因する感度の右側への変化を示す。処置したＬｃａ５ｇｔ／ｇｔ、及び、ＷＴの網膜は、漂白の前後で、同様の応答／強度依存性を示すが、未処置のＬｃａ５ｇｔ／ｇｔ網膜の応答は、平坦になる。線で結んだ円は、処置したＬＣＡ５ｇｔ／ｇｔを表す。線で結んだ三角形は、コントロールＬｃａ５ｇｔ／ｇｔを表す。
【図６】図６Ａ〜６Ｅは、未処置のＬｃａ５−／−網膜では、生涯の初期の光受容体変性の間に大量の細胞死（及び、ＡＡＶ．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５で処置した後には、この変性の遅延）が存在することを示しており、このことは、（Ａ）ＴＵＮＥＬアッセイ（図６Ａ；図６Ｂ〜Ｅ、３列目）及び（Ｂ）ロドプシン免疫蛍光分析で証明されている（図６Ｂ〜Ｅ、１、３、及び、４列目）。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５−処置したＬｃａ５−／−網膜には外節が存在したが、コントロールＬｃａ５−／−網膜には存在しなかったことを示す。ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５を注射した網膜の透過型電子顕微鏡評価は、３ヶ月齢のＬｃａ５−／−では、桿体視細胞と錐体視細胞の双方の光受容体の外節が、積み重なったディスクを備え、そして、繊毛が繋がっていることを示している。そのような構造は、未処置のＬｃａ５−／−網膜には存在しなかった。（Ａ、Ｂ）ＰＮ５でＡＡＶ７ｍ８ｐ６４３（コドン最適化レベルシリン）を硝子体内に注射した後のＰＮ８０、代表的な写真；（Ａ１−Ａ３）：１２Ｋ解像度、視細胞の列、桿体視細胞（矢印の頭）、錐体視細胞（矢印）、視細胞の多くのミトコンドリア（アスタリスク）を示す貼り合わせた写真；（Ｂ）、２０Ｋ解像度；（Ｂｌ）微小管の９＋０構造、桿体視細胞由来のＯＳの膜状ディスクを示す繊毛の断面（矢印）；（Ｃ）３０Ｋ解像度、基底体（矢印の頭）；（Ｃ１）結合繊毛の矢状断面；（Ｄ）１２Ｋ解像度、ＯＮＬに視細胞は残存していない；（Ｄｌ）死滅しつつある細胞の濃縮核（矢印の頭）；（Ｄ２）起伏のあるＥＲ（矢印）を含む死滅した細胞小器官の浮遊残留物。
【図８】年齢相応の正常な視力の男性（青色トレース−下方の線）と同様の時間的特性を有するＬＣＡ５（赤色トレース−上方の線）を有する成人男性の一方の網膜の瞳孔光応答の結果を示す。収縮の振幅は、正常な個体と比較して、ＬＣＡ５患者で減少していた。
【図９】種々の網膜層の厚みの表であり、外核層（ＯＮＬ）の厚みが、コントロールの網膜と比較して、処置した（＊）ものでは、少なくとも３ヶ月間は厚さが保たれた、ことを示す。他方の網膜層（外網状層、ＯＰＬ；内核層、ＩＮＬ、内網状層、ＩＰＬ）では、そのような明確な傾向は認められなかった。各時点で、左から右へのバーは、それぞれ、ＯＮＬ、ＯＰＬ、ＩＮＬ、及び、ＩＰＬの厚みを表す。
【図１０】ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５を注射した後の光伝達特異的分子の位置における、光媒介変化の結果を提供する。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｂは、プラスミドマップ、及び、ｐＡＡＶ．ＣＭＶ．ＣＢＡ．ヒト天然レベルシリンベクターの特徴リストを提供する。その核酸配列は、配列番号９に再現している。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｆは、ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５で処置した後に、ホモ接合性ヒトＬＣＡ５  ｐ．（Ｑ２７９＊）ｉＰＳＣ−ＲＰＥで救済した繊毛表現型を示す。（Ａ）共焦点画像は、免疫蛍光検出可能なＲＰＥマーカー；ＺＯ−１及びＭＩＴＦと共に、成熟ＲＰＥ細胞の六角形の形態を示す。位相差（ＰＣ）画像は、健常者とＬＣＡ５患者の双方に由来するＲＰＥのｉＰＳＣ−ＲＰＥ培養物の構造を表示する。（Ｂ）正常視力のコントロールＲＰＥ、及び、ＬＣＡ５患者由来のＲＰＥにおける、ＬＣＡ５  ｍＲＮＡ発現の定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）。ＧＡＰＤＨを、発現レベルを正規化するために使用する。（Ｃ）ウェスタンブロット分析は、未処置（「−」）、または、ＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰで処置（「Ｇ」）した正常視力のコントロール細胞における内因性（＊）レベルシリンタンパク質を示す。未処置、または、ＡＡＶ７ｍ８．ＧＦＰで処置をしてＬＣＡ５の影響を受けた細胞には、内因性レベルシリンは認められない。健常者、及び、ＡＡＶ７ｍ８．ＬＣＡ５を有するＬＣＡ５保有者（「Ｌ」）の双方に由来する細胞の感染後にあっては、安定したレベルでレベルシリンが存在する。免疫蛍光分析は、正常−視力（Ｄ）、及び、ＬＣＡ５由来（Ｅ）ｉＰＳＣ−ＲＰＥにおける、Ａｒｌ１３ｂ−ポジティブ原発性絨毛の存在を示す。レベルシリンは、正常視力のコントロール細胞、及び、ＡＡＶ７ｍ８．ＬＣＡ５で処置して（ＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰで処置したものではない）ＬＣＡ５の影響を受けた細胞に存在する。（Ｆ）正常な視力−対ＬＣＡ５−ｉＰＳＣ−ＲＰＥにおける、細胞あたりの繊毛の数の定量分析は、ＬＣＡ５−ｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞を、ＡＡＶ７ｍ８．ＬＣＡ５（ＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰではない）で処置した後の繊毛形成の救済効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本明細書に記載した方法、及び、組成物は、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）の処置を必要とする対象に対して、レベルシリンタンパク質をコードするＬＣＡ５核酸配列を送達するための組成物及び方法を含む。ある実施形態では、そのような組成物は、レベルシリンコード配列のコドン最適化を伴う。より低用量の試薬を使用し得るため、製品の有効性を高め、したがって、安全性を高めることが望ましい。配列番号２に示すように、天然レベルシリンコード配列を含む組成物も、本明細書に包む。
【００１８】
本明細書で使用した技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が、そして、本出願で使用した多くの用語に対する一般的な指針を当業者に付与する刊行物を参照することで、通常理解するものと同じ意味を有している。本明細書に記載した定義は、本明細書に記載の成分及び組成物の説明を明確にするために与えたものであって、特許請求した本発明の限定は意図していない。
【００１９】
「レベルシリン」は、染色体６ｑｌ４のＬＣＡ５遺伝子によってコードされており、そして、光受容体の結合繊毛と、培養した哺乳動物細胞の微小管、中心小体、及び、原発性絨毛とに局在する繊毛タンパク質である。
【００２０】
レベルシリンは、発達を通じて広範に発現し、そして、培養細胞の繊毛、ならびに、成熟した視細胞の結合繊毛に認められる。この結合繊毛は、細胞の生合成機構を格納する光受容体内節と、オプシン駆動視覚カスケードを含有する外節との間の狭小な構造である。この結合繊毛は、導管として機能して、鞭毛内輸送（ＩＦＴ）として公知のプロセスで毛様体微小管トラックに沿って、タンパク質と小胞の双方向のやりとりを補助する。遺伝子改変したＬｃａ５マウスモデルに定量的親和性プロテオミクスを適用して、Ｂｏｌｄｔ  ｅｔ  ａｌは、Ｌｃａ５の機能喪失が、ＩＦＴを撹乱し、それにより、光受容体外節の発達に欠陥が生じ、アレスチンとオプシンとのやりとりに支障をきたす、ことを実証した。Ｌｃａ５  ｎｕｌｌ（Ｌｃａ５ｇｔ／ｇｔ）マウスは、錐体及び桿体ＥＲＧ応答を示さず、そして、１９歳２ヶ月までに、外核層（ＯＮＬ）に存在する（野生型マウスの網膜の隣接する細胞の８〜１０列と比較して）分散した核の単一の列だけが、初期の進行性の網膜変性を被る。
【００２１】
ＬＣＡ５の変異は、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）と呼ばれる遺伝性の網膜変性を引き起こす。罹患者の表現型は、眼に限定されており、失明に至る。ｄｅｎ  Ｈｏｌｌａｎｄｅｒが研究した６つの家族の内、５つでは、ホモ接合のナンセンスとフレームシフト変異とが認められており、そして、１つの家族では、ＬＣＡ５転写産物が完全に欠如していた。レベルシリンｃＤＮＡ、または、そのコドン最適化バージョンをコードする核酸は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに適合する適切なサイズのものである。例えば、図１Ａ、及び、１Ｅ〜１Ｆ、及び、図１１Ａ〜１１Ｂの配列を参照されたい。以下の実施例で説明するように、ｒＡＡＶを媒介させた遺伝子増強戦略を使用すると、ＬＣＡ５変異に起因する網膜変性を修正できる、ことが示されている。そのような療法は、遺伝子の野生型または最適化したコピーが、生涯の初期、例えば、小児期または出生後初期に送達する場合に特に有利である。さらに、ある実施形態で使用するこの硝子体内または網膜下投与は、標的細胞（例えば、光受容体）に遺伝子を効率的に提供する。
【００２２】
レベルシリン遺伝子ＬＣＡ５は、中心体または毛様体機能に関与し、マイナス末端方向の微小管輸送に関与すると考えられる６９７個のアミノ酸タンパク質であるレベルシリンをコードする。本明細書で使用する用語「ＬＣＡ５」及び「レベルシリン」は、コーディング配列を指す場合に互換的に使用する。ヒトレベルシリンをコードする天然の核酸配列は、ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ＮＭ＿１８１７１４．３（転写変異体１）、ＮＭ＿００１１２２７６９．２（転写変異体２）、ＸＭ＿０１１５３５５０４．１（転写変異体ＸＩ）、及び、ＸＭ＿００５２４８６６５．４（転写変異体Ｘ２）で報告されており、そして、本明細書では、それぞれ、配列番号４、５、６、及び、７として再現している。レベルシリンの天然のヒトアミノ酸配列は、本明細書では、配列番号１に再現している（ＮＣＢＩ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＰ＿００１１１６２４１．１、または、ＮＰ＿８５９０６５．２、ならびに、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ  ＩＤ：Ｑ８６ＶＱ０−１）。ＬＣＡ５遺伝子での変異は、レーバーの先天性黒内障（ＬＣＡ）と関連している。特定の実施形態では、用語「ＬＣＡ５」及び「レベルシリン」は、互換的に使用する。
【００２３】
レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）は、主に網膜に影響を与える眼の障害であり、この網膜は、光と色を検出する眼の後方にある特殊な組織である。この障害を有する者は、通常、乳児期から重度の視覚障害を有する。視覚障害は安定する傾向があるが、時間の経過とともに非常に緩慢に悪化し得る。レーバー先天性黒内障は、光に対する感度の増大（羞明）、眼の不随意運動（眼振）、及び、極端な遠視（遠視）など、その他の視力の問題とも
関連している。瞳孔は、通常、瞳に入る光の量に応じて拡大及び収縮するが、光に正常に応答しなくなる。代わりに、通常よりも緩慢に拡大及び収縮するか、あるいは、光にまったく応答しなくなり得る。さらに、眼の透明な前面カバー（角膜）は、円錐形で異常に薄く、円錐角膜として知られる状態となり得る。Ｆｒａｎｃｅｓｃｈｅｔｔｉの眼指徴候と呼ばれる特定の挙動は、レーバー先天性黒内障の特徴である。この徴候は、指関節または指で、眼を突く、押す、及び、擦る、ことで構成される。研究者たちは、この行動が、罹患した子供のくぼんだ目と円錐角膜に関係しているものと推測している。まれに、レーバー先天性黒内障の特徴を有する人々の発達遅延や知的障害が報告されている。しかしながら、研究者たちには、これらの人々が、実際にレーバー先天性黒内障を有するか、または、類似の徴候及び症状を伴う別の症候群を有するかどうかは不明である。少なくとも１３のタイプのレーバー先天性黒内障が報告されている。これらのタイプは、遺伝的原因、視力喪失のパターン、及び、関連する眼の異常によって区別される。
【００２４】
核酸配列の文脈における「パーセント（％）同一性」、「配列同一性」、「パーセント配列同一性」、または、「パーセント同一の」という用語は、対応させるために整列させた時に同じである２つの配列での残基のことを指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの全長、遺伝子コーディング配列の全長、または、少なくとも約５００〜５０００個のヌクレオチドの断片に及ぶものが望ましい場合がある。しかしながら、小さな断片、例えば、少なくとも約９個のヌクレオチド、通常は、少なくとも約２０〜２４個のヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２個のヌクレオチド、少なくとも約３６個以上のヌクレオチドの間の同一性が望ましい場合もある。
【００２５】
タンパク質、ポリペプチド、約３２個のアミノ酸、約３３０個のアミノ酸、または、それらのペプチド断片の全長にわたるアミノ酸配列、または、対応する核酸配列コード配列の同一性パーセントは、容易に決定し得る。適切なアミノ酸断片は、少なくとも約８個のアミノ酸の長さであり、約７００個のアミノ酸までとし得る。一般的に、２つの異なる配列間の「同一性」、「相同性」、または、「類似性」を指す場合、「同一性」、「相同性」、または、「類似性」は、「整列」配列に関して決定する。「整列」配列または「整列」とは、参照配列と比較して、複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列のことを指し、これらは、欠落または追加した塩基またはアミノ酸の修正を含むことが多い。
【００２６】
同一性は、配列の整列を準備し、そして、当該技術分野で公知の、または、市販されている様々なアルゴリズム、及び／または、コンピュータープログラムを使用して決定し得る［例えば、ＢＬＡＳＴ、ＥｘＰＡＳｙ；ＣｌｕｓｔａｌＯ；ＦＡＳＴＡ；例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する］。整列は、公的に入手可能な、または、市販されている様々なＭｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍｓのいずれかを使用して実行する。アミノ酸配列について入手可能な配列アラインメントプログラムとして、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」、及び、「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムがある。一般的に、これらのプログラムはいずれも、デフォルト設定で使用するが、当業者であれば、必要に応じて、これらの設定を変更することができる。あるいは、当業者であれば、参照するアルゴリズム及びプログラムが提供するものと少なくとも同一性レベルまたは整列のレベルのものを提供する、別のアルゴリズムまたはコンピュータープログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．  Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，”Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照されたい。
【００２７】
核酸配列に関して、複数の配列アラインメントプログラムも入手可能である。そのよう
なプログラムの例として「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ」、「ＣＡＰ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＢＬＡＳＴ」、「ＭＡＰ」、及び、「ＭＥＭＥ」があり、それらはインターネット上のウェブサーバーを介して利用可能である。そのようなプログラムに関する他の供給源は、当業者に公知である。あるいは、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩユーティリティーも使用する。上記したプログラムに含まれるものも含め、ヌクレオチド配列同一性の測定に用い得る当該技術分野で公知のアルゴリズムも数多くある。別の例として、ＧＣＧＶｅｒｓｉｏｎ６．１のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を用いて、ポリヌクレオチド配列を比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、クエリ配列と検索配列との間の最適な重複領域の整列とパーセント配列同一性とを提供する。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、本明細書の一部を構成するものとして援用する、ＧＣＧバージョン６．１で提供したようにして、デフォルトパラメーター（ワードサイズが６で、かつ、スコアリングマトリックス向けのＮＯＰＡＭ因子）を用いて、Ｆａｓｔａ（商標）を使用して決定することができる。
【００２８】
ある態様では、ヒトレベルシリンをコードするコドン最適化の、改変型核酸配列を提供する。好ましくは、当該コドン最適化レベルシリンコード配列は、全長ネイティブレベルシリンコード配列に対して、約８０％未満の同一性、好ましくは、約７５％以下の同一性を有する（図１Ｂ〜１Ｄ、配列番号２）。ある実施形態では、当該コドン最適化レベルシリンコード配列は、配列番号２の天然レベルシリンコード配列と約７４％の同一性を有する。ある実施形態では、当該コドン最適化レベルシリンコード配列は、ＡＡＶ媒介送達（例えば、ｒＡＡＶ）後の天然レベルシリンと比較して、改善された翻訳速度を特徴とする。ある実施形態では、当該コドン最適化レベルシリンコード配列は、配列番号２の全長天然レベルシリンコード配列と、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％以下の同一性を共有する。ある実施形態では、当該コドン最適化核酸配列は、配列番号３の変異体である。別の実施形態では、当該コドン最適化核酸配列は、配列番号３と、約９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、８０％、７９％、７８％、７７％、７６％、７５％、７４％、７３％、７２％、７１％、７０％、６９％、６８％、６７％、６６％、６５％、６４％、６３％、６２％、６１％以上の同一性を共有する配列である。ある実施形態では、当該コドン最適化核酸配列は、配列番号３である。別の実施形態では、当該核酸配列は、ヒトでの発現に最適化したコドンである。別の実施形態では、当該レベルシリンコード配列は、配列番号８のｎｔ  １８８３〜ｎｔ  ３９７６である。他の実施形態では、異なるレベルシリンコーディング配列を選択する。
【００２９】
コドン最適化コード領域は、様々な異なる方法でデザインすることができる。この最適化は、オンラインで利用可能な方法（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ）、公開された方法、または、例えば、コドン最適化サービスを提供する会社、例えば、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ
Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して実行し得る。あるコドン最適化方法は、例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、米国国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１２９２４号に記載されている。また、例えば、米国特許公開第２０１４／００３２１８６号、及び、米国特許公開第２００６／０１３６１８４号も参照されたい。好適には、製品のためのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長を変更する。しかしながら、幾つかの実施形態では、ＯＲＦの断片だけを改変し得る。これらの方法の１つを使用することで、あらゆる所定のポリペプチド配列に対する頻度に適用し、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を生成することができる。
【００３０】
数多くのオプションを利用して、コドンに対する実際の変更を実行すること、または、本明細書に記載したようにデザインしたコドン最適化コード領域を合成することができる。そのような修飾または合成は、当業者に周知の標準的及び日常的な分子生物学的操作を使用して実施することができる。ある手法では、長さがそれずれ８０〜９０個のヌクレオチドであり、かつ、所望の配列の長さにまで及ぶ一連の相補的オリゴヌクレオチド対を、標準的な方法で合成する。これらのオリゴヌクレオチド対を、アニーリングされ次第に合成し、それらは、付着末端を含有する８０〜９０個の塩基対の二本鎖断片を形成し、例えば、当該対の各オリゴヌクレオチドを合成して、３、４、５、６、７、８、９、１０、または、それ以上の個数の塩基を、当該対のその他のオリゴヌクレオチドに対して相補的な領域を超えて伸長させる。これらのオリゴヌクレオチドの各対の当該一本鎖末端は、これらのオリゴヌクレオチドの別の対の一本鎖末端とアニールするようにデザインする。これらのオリゴヌクレオチド対をアニーリングさせ、次いで、これらの二本鎖断片の約５〜６個を、付着性一本鎖末端を介して一緒にアニーリングさせ、そして、それらを一緒にライゲーションし、次に、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ．Ｃａｌｉｆ．から入手可能なＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。次いで、当該構築物を、標準的な方法で配列決定する。所望の配列全体が、一連のプラスミド構築物で表現できるように、一緒にライゲートした８０〜９０個の塩基対断片の５〜６個の断片、すなわち、約５００個の塩基対の断片からなるこれらの構築物の幾つかを調製する。次に、これらのプラスミドの挿入物を、適切な制限酵素で切断し、そして、ライゲートをして、最終構築物を形成する。次に、最終構築物を、標準的な細菌クローニングベクターにクローニングして、配列決定をする。さらなる方法は、当業者に直ちに自明である。加えて、遺伝子合成は、容易に商業利用できる。
【００３１】
「改変した」とは、本明細書に記載のレベルシリンタンパク質をコードする核酸配列を組み立て、そして、適切な遺伝要素、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどに配置することで、そこに担持されているレベルシリン配列を宿主細胞に移す、例えば、非ウイルス送達システム（例えば、ＲＮＡをベースとしたシステム、裸のＤＮＡなど）を生成するため、または、パッケージング宿主細胞でウイルスベクターを生成するため、及び／または、対象における宿主細胞に送達するために、移すことを意味する。ある実施形態では、当該遺伝要素は、プラスミドである。かように改変した構築物を作製するために使用する方法は、核酸操作の当業者には公知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び、合成技術が関係する。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
【００３２】
本明細書で使用する用語「宿主細胞」は、産生プラスミドから組換えＡＡＶを作り出すパッケージング細胞株のことを指し得る。あるいは、用語「宿主細胞」は、コード配列の発現が望まれているあらゆる標的細胞を指し得る。したがって、「宿主細胞」とは、あらゆる手段、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、マイクロインジェクション、形質転換、ウイルス感染、トランスフェクション、リポソーム送達、膜融合法、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及び、プロトプラスト融合により細胞内に導入した外因性又は異種ＤＮＡを含む原核または真核細胞のことを指す。本明細書の特定の実施形態では、用語「宿主細胞」は、ウイルスベクターまたは組換えウイルスを作り出し、かつ、パッケージングするために用いる細胞のことを指す。本明細書のその他の態様では、用語「宿主細胞」とは、本明細書に記載の組成物のインビトロでの評価のための様々な哺乳動物種の眼細胞の培養物のことを指す。さらに他の実施形態では、用語「宿主細胞」とは、ＬＣＡについてインビボで処置した対象の眼細胞を指す、ことを意図している。
【００３３】
本明細書で使用する用語「眼細胞」とは、眼内、または、眼の機能と関連するあらゆる細胞のことを指す。この用語は、桿体光受容体、錐体光受容体、及び、光感受性神経節細胞を含む視細胞、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、ミュラー細胞、脈絡膜細胞、双極細胞、水平細胞、ならびに、アマクリン細胞のいずれか１つを指し得る。ある実施形態では、当該眼細胞は、視細胞である。その他の実施形態では、当該眼細胞は、錐体光受容体である。別の実施形態では、当該眼細胞は、桿体光受容体である。
【００３４】
ある実施形態では、レベルシリンをコードする当該核酸配列は、それに共有結合したタグポリペプチドをコードする核酸をさらに含む。当該タグポリペプチドは、公知の「エピトープタグ」から選択し得るものであり、ｍｙｃタグポリペプチド、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグポリペプチド、緑色蛍光タンパク質タグポリペプチド、ｍｙｃ−ピルビン酸キナーゼタグポリペプチド、Ｈｉｓ６タグポリペプチド、インフルエンザウイルス血球凝集素タグポリペプチド、フラグタグポリペプチド、及び、マルトース結合タンパク質タグポリペプチドなどがあるが、これらに限定されない。
【００３５】
別の態様では、レベルシリンをコードする核酸配列を含む発現カセットを提供する。ある実施形態では、当該配列は、コドン最適化配列である。別の実施形態では、当該コドン最適化核酸配列は、ヒトレベルシリンをコードする配列番号３である。
【００３６】
本明細書で使用する「発現カセット」とは、レベルシリンタンパク質、プロモーターのためのコード配列を含み、そして、それらのための他の調節配列を含み得る核酸分子のことを指し、そのカセットは、ウイルスベクター（例えば、ウイルス粒子）のカプシドにパッケージし得る。一般的には、ウイルスベクターを生成するためのそのような発現カセットは、ウイルスゲノムのパッケージングシグナルが隣接した本明細書に記載のＬＣＡ５配列、及び、本明細書に記載したような、その他の発現制御配列を含む。例えば、ＡＡＶウイルスベクターについては、これらのパッケージングシグナルは、５’逆向き末端反復配列（ＩＴＲ）、及び、３’ＩＴＲである。ＡＡＶカプシドにパッケージする場合、当該発現カセットと併せて当該ＩＴＲは、本明細書では「組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ゲノム」または「ベクターゲノム」と称し得る。ある実施形態では、発現カセットは、レベルシリンタンパク質をコードするコドン最適化核酸配列を含む。ある実施形態では、当該カセットは、宿主細胞内でレベルシリンをコードするコドン最適化核酸配列の発現を指向する発現制御配列と作動可能に関連したコドン最適化ＬＣＡ５を提供する。ある実施形態では、当該ベクターゲノムは、配列番号８のｎｔ  １−４３７９の配列である。別の実施形態では、当該ベクターゲノムは、配列番号９のｎｔ  １−４３６８の配列である。なおも別の実施形態では、同定したベクターゲノムのいずれかにおけるＬＣＡ５コード配列を、本明細書に記載の別のＬＣＡ５コード配列と交換する。
【００３７】
別の実施形態では、ＡＡＶベクターで使用するための発現カセットを提供する。その実施形態では、当該ＡＡＶ発現カセットは、少なくとも１つのＡＡＶ逆向き末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。別の実施形態では、当該発現カセットは、５’ＩＴＲ配列及び３’ＩＴＲ配列を含む。ある実施形態では、当該５’及び３’ＩＴＲは、レベルシリンをコードするコドン最適化核酸配列に隣接し、任意で、宿主細胞内でレベルシリンをコードするコドン最適化核酸配列の発現を指向するさらなる配列を含む。したがって、本明細書に記載したように、ＡＡＶ発現カセットとは、その５’端に、５’ＡＡＶ逆向き末端反復配列（ＩＴＲ）、及び、その３’端に、３’ＡＡＶ  ＩＴＲが隣接する、上記した発現カセットを説明するものである、ことを意味する。したがって、このｒＡＡＶゲノムは、当該発現カセットを、ＡＡＶウイルス粒子、すなわち、ＡＡＶ  ５’及び３’  ＩＴＲにパッケージングするために必要な最小限の配列を含む。ＡＡＶ  ＩＴＲは、本明細書に記載したように、あらゆるＡＡＶのＩＴＲ配列から取得し得る。これらのＩＴＲは、得られた組換えＡ
ＡＶで使用するカプシドと同じＡＡＶ起源のものでも、あるいは、異なるＡＡＶ起源のもの（ＡＡＶ偽型を生成するために）としてもよい。ある実施形態では、ＡＡＶ２由来の当該ＩＴＲ配列、または、その欠失バージョン（ΔＩＴＲ）を、便宜上、及び、規制当局の承認を促すために使用する。しかしながら、その他のＡＡＶ供給源由来のＩＴＲを選択し得る。当該ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２に由来し、かつ、当該ＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ供給源に由来する場合は、得られるベクターを、偽型と称し得る。一般的には、当該ＡＡＶベクターゲノムは、ＡＡＶ  ５’ＩＴＲ、レベルシリンコード配列、及び、あらゆる調節配列、及び、ＡＡＶ  ３’ＩＴＲを含む。しかしながら、これらの要素の他の構成でも好適であり得る。ΔＩＴＲと称する５’ＩＴＲの短縮バージョンを説明しており、そこでは、Ｄ配列と端末分離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）を欠失している。その他の実施形態では、全長ＡＡＶ  ５’及び３’ＩＴＲを使用する。次に、各ｒＡＡＶゲノムを、産生プラスミドに導入することができる。
【００３８】
本明細書で使用する用語「調節配列」、「転写制御配列」、または、「発現制御配列」は、開始配列、エンハンサー配列、及び、プロモーター配列などのＤＮＡ配列のことを指すものであって、これらは、それらと作動可能に連結しているタンパク質コード核酸配列の転写を、誘導、抑制、または、制御する。
【００３９】
本明細書で使用する用語「作動可能に連結した」、または、「作動可能に関連する」とは、レベルシリンをコードする核酸配列に隣接する発現制御配列、及び／または、イントランスで、または、離間して、その転写及びその発現を制御する発現調節配列の双方のことを指す。
【００４０】
ある態様では、本明細書に記載した発現カセットのいずれかを含むベクターを提供する。本明細書に記載したように、そのようなベクターを、様々な起源のプラスミドとすることができ、また、本明細書でさらに説明をする組換え複製欠損ウイルスの生成のための特定の実施形態では有用である。
【００４１】
本明細書で使用する「ベクター」とは、外因性、または、異種の、または、改変した核酸導入遺伝子を挿入し得る核酸分子であり、次いで、適切な宿主細胞に導入することができる。これらのベクターは、好ましくは、１つ以上の複製起点と、組換えＤＮＡを挿入できる１つ以上の部位を有する。これらのベクターは、ベクターを含む細胞を、ベクターを含まない細胞から選択できる手段、例えば、薬剤耐性遺伝子をコードする手段、を有していることが多い。一般的なベクターとして、プラスミド、ウイルスゲノム、及び（主に、酵母内、及び、細菌内の）「人工染色体」がある。特定のプラスミドを、本明細書に記載している。
【００４２】
ある実施形態では、当該ベクターとは、その説明をした発現カセット、例えば、「裸のＤＮＡ」、「裸のプラスミドＤＮＡ」、ＲＮＡ、及び、ｍＲＮＡを含み、様々な組成物、及び、ナノ粒子、例えば、ミセル、リポソーム、カチオン性脂質−核酸組成物、ポリグリカン組成物、及び、その他のポリマー、脂質、及び／または、コレステロールをベースとした核酸コンジュゲート、及び、本明細書に記載したその他の構築物と連結される非ウイルスプラスミドである。例えば、本明細書の一部を構成するものとしてそれらの全内容を援用する、Ｘ．Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ，２０１１，８（３），ｐｐ  ７７４−７８７；ウェブ公開：２０１１年３月２１日；ＷＯ２０１３／１８２６８３、ＷＯ２０１０／０５３５７２、及び、ＷＯ２０１２／１７０９３０を参照されたい。そのような非ウイルスレベルシリンベクターは、本明細書に記載した経路で投与し得る。ウイルスベクター、または、非ウイルスベクターは、遺伝子導入、及び、遺伝子治療の用途での使用のために生理学的に許容する担体を用いて配合することができる。
【００４３】
別の実施形態では、当該ベクターは、その中で説明をした発現カセットを含むウイルスベクターである。「ウイルスベクター」を、外来性または異種ＬＣＡ５核酸導入遺伝子を含む複製欠損ウイルスと定義する。ある実施形態では、本明細書に記載した発現カセットは、薬剤送達またはウイルスベクターの作製のために使用するプラスミドで改変し得る。適切なウイルスベクターは、好ましくは、複製欠損性であり、眼細胞を標的とするものから選ぶ。ウイルスベクターは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、パルボウイルスなどを含むが、これらに限定されず、遺伝子療法に適したいずれのウイルスをも含み得る。しかしながら、理解を容易ならしめるために、本明細書では、アデノ随伴ウイルスを、例示的なウイルスベクターと称する。
【００４４】
「複製欠損ウイルス」または「ウイルスベクター」とは、目的とする遺伝子を含む発現カセットが、ウイルスカプシドまたはエンベロープにパッケージングされており、そこでウイルスカプシドまたはエンベロープ内にパッケージングされているあらゆるウイルスゲノム配列も複製欠損性である、合成または組換えウイルス粒子のことを指し；すなわち、それらは、子孫ビリオンは産生できないが、標的細胞に感染する能力を保持している。ある実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製に必要な酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムを、人工ゲノムの増幅、及び、パッケージングに必要なシグナルに挟まれた目的とする導入遺伝子のみを含む「ガットレス」になるように改変することができる）が、産生の間に、これらの遺伝子を供給し得る。したがって、複製に必要なウイルス酵素が存在する場合を除いて、子孫ビリオンによる複製及び感染は起こり得ないので、それを、遺伝子療法における使用に関して安全であるとみなす。
【００４５】
別の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。当該ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシド、及び、その内部にパッケージされたベクターゲノムを損なう。当該ベクターゲノムは、ある実施形態では、（ａ）ＡＡＶ  ５’逆向き末端反復（ＩＴＲ）配列；（ｂ）プロモーター；（ｃ）ヒトレベルシリンをコードするコード配列；及び、（ｄ）ＡＡＶ  ３’ＩＴＲを含む。別の実施形態では、当該ベクターゲノムは、本明細書に記載の発現カセットである。ある実施形態では、当該ＬＣＡ５配列は、全長レベルシリンタンパク質をコードする。ある実施形態では、当該レベルシリン配列は、配列番号１のタンパク質配列である。別の実施形態では、当該コード配列は、配列番号３、または、その変異体である。
【００４６】
パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、４．７キロベース（ｋｂ）〜６ｋｂの一本鎖の線状ＤＮＡゲノムを有する小さな非エンベロープの正二十面体ウイルスである。公知のＡＡＶ血清型として、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９などがある。当該ＩＴＲ、または、その他のＡＡＶ成分は、ＡＡＶから当業者に利用可能な技術を使用して、容易に単離または改変し得る。そのようなＡＡＶは、学術的、商業的、または、公的な情報源（例えば、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から単離、改変、または、取得し得る。あるいは、これらのＡＡＶ配列は、文献、または、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどのデータベースで利用可能な公開された配列を参照することにより、合成またはその他の適切な手段で改変することができる。ＡＡＶウイルスを、従来の分子生物学技術によって改変することで、これらの粒子を最適化して、核酸配列の細胞特異的送達、免疫原性の最小化、安定性と粒子寿命の調整、効率的な分解、核への正確な送達などを可能にする。
【００４７】
ＡＡＶの断片は、様々なベクターシステム、及び、宿主細胞で容易に利用し得る。所望のＡＡＶ断片として、ｖｐ１、ｖｐ２、ｖｐ３、及び、超可変領域を含むｃａｐタンパク質、ｒｅｐ７８、ｒｅｐ６８、ｒｅｐ５２、及び、ｒｅｐ４０を含むｒｅｐタンパク質、及び、これらのタンパク質をコードする配列がある。そのような断片は、単独で、その他
のＡＡＶ血清型配列または断片と組み合わせて、または、その他のＡＡＶまたは非ＡＡＶウイルス配列由来の要素と組み合わせて使用し得る。本明細書で使用する人工ＡＡＶ血清型として、非天然カプシドタンパク質を含むＡＡＶがあるが、これらに限定されない。そのような人工カプシドは、本発明の新規ＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を、別のＡＡＶ血清型（公知または新規）、同じＡＡＶ血清型の非連続部分、非ＡＡＶウイルス供給源、または、非ウイルス供給源から取得し得る異種配列と組み合わせて使用する、あらゆる適切な技術で生成し得る。人工ＡＡＶ血清型は、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、または、「ヒト化」ＡＡＶカプシドとし得るが、これらに限定されない。ある実施形態では、ベクターは、本発明のＡＡＶ８  ｃａｐ、及び／または、ｒｅｐ配列を含む。例えば、本明細書の一部を構成するものとして援用する、米国特許出願公開第ＵＳ２００９／０２２７００３０号を参照されたい。
【００４８】
本明細書で使用する用語「ＡＡＶ」又は「ＡＡＶ血清型」は、自然に存在する数多くのものであり、かつ、入手可能なアデノ関連ウイルス、ならびに、人工のＡＡＶのことを指す。ヒト又は非ヒト霊長類（ＮＨＰ）から単離または改変し、十分に特徴決定をしたＡＡＶの内、ヒトＡＡＶ２は、遺伝子転移ベクターとして開発した最初のＡＡＶである；それは、様々な標的組織、及び、動物モデルにおける有効な遺伝子導入実験に広く利用されている。特に断りが無い限りは、本明細書に記載のＡＡＶカプシド、ＩＴＲ、及び、その他の選択したＡＡＶ成分は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ８ｂｐ、ＡＡＶ７Ｍ８、及び、ＡＡＶＡｎｃ８０、公知の、または、説明をしたＡＡＶのあらゆる変異体、または、未発見のＡＡＶ、または、それらの変異体または混合物などのあらゆるＡＡＶから容易に選択し得るが、これらに限定されない。例えば、本明細書の一部を構成するものとして援用する、ＷＯ２００５／０３３３２１を参照されたい。別の実施形態では、当該ＡＡＶカプシドは、優先的に双極細胞を標的とするＡＡＶ８ｂｐカプシドである。本明細書の一部を構成するものとして援用する、ＷＯ２０１４／０２４２８２を参照されたい。別の実施形態では、当該ＡＡＶカプシドは、網膜の外側への優先的送達を示したＡＡＶ７ｍ８カプシドである。ＡＡＶ７ｍ８カプシド核酸配列は配列番号１１で再現され、アミノ酸配列は配列番号１２で再現される。本明細書の一部を構成するものとして援用する、Ｄａｌｋａｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎ  Ｖｉｖｏ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｎｅｗ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｏｕｔｅｒ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｖｉｔｒｅｏｕｓ，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ５，１８９ｒａ７６（２０１３）を参照されたい。
【００４９】
本明細書で使用する「ＡＡＶ７ｍ８カプシド」とは、複数のＡＡＶ７ｍ８  ｖｐ（可変タンパク質）タンパク質から構成する自己組織化ＡＡＶカプシドである。これらのＡＡＶ７ｍ８  ｖｐタンパク質は、一般的には、配列番号１１の核酸配列、または、同配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％が同一であり、配列番号１２のｖｐ１アミノ酸配列をコードする配列でコードした代替スプライス変異体として発現する。これらのスプライス変異体は、配列番号１２の異なる長さのタンパク質をもたらす。特定の実施形態では、「ＡＡＶ７ｍ８カプシド」は、配列番号１２と９９％同一であるアミノ酸配列を有するＡＡＶを含む。
【００５０】
別の実施形態では、当該ｒＡＡＶカプシドは、ＡＡＶ８カプシドまたはその変異体、ＡＡＶ６カプシドまたはその変異体、ＡＡＶ９カプシドまたはその変異体、ＡＡＶ７カプシドまたはその変異体、ＡＡＶ５カプシドまたはその変異体、ＡＡＶ２カプシドまたはその変異体、ＡＡＶ１カプシドまたはその変異体、ＡＡＶ３カプシドまたはその変異体、及び、ＡＡＶ４カプシドまたはその変異体から選択する。ある実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶ７ｍ８カプシド及び発現カセットを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）
ベクターを提供し、当該発現カセットは、レベルシリンをコードする核酸配列、逆向き末端反復配列、及び、宿主細胞においてレベルシリンの発現を指向する発現制御配列を含む。
【００５１】
さらなる実施形態では、本明細書に記載したＬＣＡ５構築物、及び、最適化した配列の送達のための組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを提供する。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ウイルスベクターとは、標的細胞への送達のために核酸配列をパッケージしたＡＡＶタンパク質カプシドを有するＡＡＶ  ＤＮａｓｅ耐性粒子である。ＡＡＶカプシドは、６０個のカプシド（ｃａｐ）タンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２、及び、ＶＰ３で構成されており、選択したＡＡＶに応じて、約１：１：１０〜１：１：２０の比率で、正二十面体対称に配置される。ＡＡＶは、先に定義したＡＡＶウイルスベクターのカプシドの供給源として選択し得る。例えば、米国公開特許出願第２００７−００３６７６０−Ａ１号；米国公開特許出願第２００９−０１９７３３８−Ａ１号；ＥＰ１３１０５７１を参照されたい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７、及び、その他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号、及び、米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１、及び、ＵＳ７，９０６，１１１（ＡＡＶ９）、ならびに、ＷＯ２００６／１１０６８９、及び、ＷＯ２００３／０４２３９７（ｒｈ．１０）、及び（Ｄａｌｋａｒａ  Ｄ，Ｂｙｒｎｅ  ＬＣ，Ｋｌｉｍｃｚａｋ  ＲＲ，Ｖｉｓｅｌ
Ｍ，Ｙｉｎ  Ｌ，Ｍｅｒｉｇａｎ  ＷＨ、ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｕｔｅｒ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｖｉｔｒｅｏｕｓ，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ（２０１３）５（１８９）：１８９ｒａ７６．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００５７０８．）（ＡＡＶ７ｍ８）も参照されたい。これらの文献のそれぞれを本明細書の一部を構成するものとして援用する。これらの文献は、ＡＡＶを作製するために選択し得るその他のＡＡＶカプシドも記載しており、また、本明細書の一部を構成するものとして援用する。幾つかの実施形態では、ウイルスベクターでの使用のためのＡＡＶ  ｃａｐは、前記したＡＡＶカプシドの１つ、または、そのコード核酸の変異誘発によって（すなわち、挿入、欠失、または、置換によって）生成することができる。幾つかの実施形態では、当該ＡＡＶカプシドは、キメラであり、前記したＡＡＶカプシドタンパク質の２つ、または、３つ、または、４つ以上に由来するドメインを含む。幾つかの実施形態では、当該ＡＡＶカプシドは、２つ、または、３つの異なるＡＡＶ、または、組換えＡＡＶ由来のＶｐ１、Ｖｐ２、及び、Ｖｐ３モノマーのモザイクである。幾つかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は、前記したＣａｐの２つ以上を含む。
【００５２】
ＡＡＶに関して、本明細書で使用する用語、変異体とは、公知のＡＡＶ配列に由来するあらゆるＡＡＶ配列であって、当該アミノ酸または当該核酸配列と、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％以上の配列同一性を共有するＡＡＶ配列のことを意味する。別の実施形態では、当該ＡＡＶカプシドは、説明をした、または、公知のＡＡＶカプシド配列から最大で約１０％の変動を含み得る変異体を含む。すなわち、当該ＡＡＶカプシドは、本明細書で提供する、及び／または、当該技術分野で公知のＡＡＶカプシドと、約９０％の同一性〜約９９．９％の同一性、約９５％〜約９９％の同一性、または、約９７％〜約９８％の同一性を共有する。ある実施形態では、当該ＡＡＶカプシドは、ＡＡＶカプシドと、少なくとも９５％の同一性を共有する。ＡＡＶカプシドのパーセント同一性を決定する場合、当該可変タンパク質（例えば、ｖｐｌ、ｖｐ２、または、ｖｐ３）のいずれかに対して比較し得る。ある実施形態では、当該ＡＡＶカプシドは、ｖｐ１、ｖｐ２、または、ｖｐ３について、ＡＡＶ７ｍ８と少なくとも９５％の同一性を共有する。別の実施形態では、当該カプシドは、２０１３年４月２６日にオンラインで公開され、本明細書の一部を構成するものとして援用する、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．ｔａｒｇ
ｅｔｉｎｇ  Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｖｉａ  Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｏｖｅｌ，  Ｃａｐｓｉｄ−Ｍｕｔａｔｅｄ  ＡＡＶ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，ＰＬｏＳ  ｏｎｅ．２０１３；８（４）：ｅ６２０９７に記載された、Ｙ４４７Ｆ、Ｙ７３３Ｆ、及び、Ｔ４９４Ｖの変異を有するＡＡＶ８カプシド（別名、「ＡＡＶ８（Ｃ＆Ｇ＋Ｔ４９４Ｖ）」及び「ｒｅｐ２−ｃａｐ８（Ｙ４４７Ｆ＋７３３Ｆ＋Ｔ４９４Ｖ）」）である。
【００５３】
ある実施形態では、所望の標的細胞、例えば、光受容体（例えば、桿体、及び／または、錐体）、ＲＰＥ、または、その他の眼細胞に対して向性を示すＡＡＶカプシドを利用することが望ましい。ある実施形態では、ＡＡＶカプシドは、特定の表面が露出したチロシン残基が、フェニルアラニン（Ｆ）で置換されているチロシンカプシド変異体である。そのようなＡＡＶ変異体は、例えば、本明細書の一部を構成するものとして援用する、Ｍｏｗａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｃａｐｓｉｄ−ｍｕｔａｎｔ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃａｎｉｎｅ  ｒｅｔｉｎａ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｕｂｒｅｔｉｎａｌ  ｏｒ  ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２１，９６−１０５（Ｊａｎｕａｒｙ  ２０１４）に記載されている。
【００５４】
本明細書で使用する「人工ＡＡＶ」とは、自然に存在しないカプシドタンパク質を有するＡＡＶを意味するが、これらに限定されない。そのような人工カプシドは、選択したＡＡＶ配列（例えば、ｖｐ１カプシドタンパク質の断片）を、異なる選択したＡＡＶ、同じＡＡＶの非連続部分、非ＡＡＶウイルス供給源、または、非ウイルス供給源から取得し得る異種配列と組み合わせて使用して、適切な方法で生成し得る。人工ＡＡＶを、偽型ＡＡＶ、キメラＡＡＶカプシド、組換えＡＡＶカプシド、または、「ヒト化」ＡＡＶカプシドとし得るが、これらに限定されない。あるＡＡＶのカプシドが、異種のカプシドタンパク質で置換されている偽型ベクターは、本発明において有用である。ある実施形態では、ＡＡＶ２／５、及び、ＡＡＶ２／８は、例示的な偽型ベクターである。
【００５５】
別の実施形態では、自己相補的なＡＡＶを使用する。「自己相補性ＡＡＶ」とは、組換えＡＡＶ核酸配列が保有するコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡテンプレートを形成するようにデザインした発現カセットを有するプラスミドまたはベクターのことを指す。感染すると、第２の鎖の細胞が媒介した合成を待つのではなく、ｓｃＡＡＶの２つの相補的な半分が会合して、直ちに複製及び転写への準備ができた１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成する。例えば、Ｄ  Ｍ  ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．”Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ  ２００１），Ｖｏｌ  ８，Ｎｕｍｂｅｒ  １６，ｐａｇｅｓ  １２４８−１２５４を参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号；第７，１２５，７１７号、及び、第７，４５６，６８３号に記載されており、本明細書の一部を構成するものとして、それらの各々の全内容を援用する。
【００５６】
核酸配列またはタンパク質を説明するために使用する用語「外因性」とは、当該核酸またはタンパク質が、染色体または宿主細胞内に存在する位置に自然に発生しない、ことを意味する。外因性核酸配列とは、同じ宿主細胞または対象に由来し、かつ、挿入されるが、非天然状態で、例えば、異なるコピー数、または、異なる調節エレメントの制御下で存在する配列をも指す。
【００５７】
核酸配列またはタンパク質を説明するために使用する用語「異種」とは、当該核酸また
はタンパク質が、発現を行う宿主細胞または対象とは異なる生物または同じ生物の異なる種に由来する、ことを意味する。用語「異種」とは、プラスミド、発現カセット、または、ベクター内のタンパク質または核酸に関して使用する場合、当該タンパク質または核酸と、別の配列または部分配列とが、問題の当該タンパク質または核酸が、自然界では、互いに同じ関係では認められない、ことを意味する。
【００５８】
さらに別の実施形態では、本明細書に記載したあらゆる当該発現カセットを使用して、組換えＡＡＶゲノムを生成する。
【００５９】
ある実施形態では、本明細書に記載した発現カセットを、ウイルスベクターの生成、及び／または、宿主細胞、例えば、裸のＤＮＡ、ファージ、トランスポゾン、コスミド、エピソームなどへの送達に有用な適切な遺伝要素（ベクター）に改変し、そこに担持させたＬＣＡ５配列を輸送する。当該選択したベクターは、トランスフェクション、エレクトロポレーション、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡコーティングペレット、ウイルス感染、及び、プロトプラスト融合などの任意の適切な方法で送達し得る。かような構築物を作製するために使用する方法は、核酸操作の当業者には公知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び、合成技術が関係する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹを参照されたい。
【００６０】
発現カセット、または、ｒＡＡＶゲノム、または、産生プラスミドを、ビリオンにパッケージングするために、ＩＴＲは、発現カセットと同じ構築物でのインシスで必要な唯一のＡＡＶ成分である。ある実施形態では、複製（ｒｅｐ）、及び／または、カプシド（ｃａｐ）のための当該コード配列は、当該ＡＡＶゲノムから除去され、そして、当該ＡＡＶベクターの作製のために、イントランスで、または、パッケージング細胞株で供給を受ける。
【００６１】
対象への送達に適したＡＡＶウイルスベクターを作製及び単離する方法は、当該技術分野において公知である。例えば、米国特許第７７９０４４９号；米国特許第７２８２１９９号；ＷＯ２００３／０４２３９７；ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、及び、米国７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。ある系では、ＩＴＲが隣接した導入遺伝子をコードする構築物、及び、ｒｅｐとｃａｐをコードする構築物（複数可）で、プロデューサー細胞株を、一時的にトランスフェクションする。第２の系では、ｒｅｐとｃａｐとを安定して供給するパッケージング細胞株を、ＩＴＲが隣接した導入遺伝子をコードする構築物で、一過的にトランスフェクションする。これらの各系では、混入ウイルスからｒＡＡＶの分離を必要とするヘルパーアデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染に応答して、ＡＡＶビリオンを産生する。最近では、当該ＡＡＶの回収にヘルパーウイルスの感染を必要としない系が開発された−必要とされるヘルパー機能（すなわち、アデノウイルスＥ１、Ｅ２ａ、ＶＡ、及び、Ｅ４、または、ヘルペスウイルスＵＬ５、ＵＬ８、ＵＬ５２、及び、ＵＬ２９、ならびに、ヘルペスウイルスポリメラーゼ）も、当該系では、イントランスで供給する。これらの新しい系では、必要とするヘルパー機能をコードする構築物を有する細胞の一過性トランスフェクションによって、当該ヘルパー機能を供給することができ、あるいは、当該ヘルパー機能をコードする遺伝子を安定して含むように細胞を改変することができ、その発現は、転写レベルまたは転写後レベルで制御し得る。
【００６２】
用語「単離した」とは、材料が、その当初の環境（例えば、それが自然に存在するものであれば、その自然環境）から脱した、ことを意味する。例えば、生存している動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離したものではないが、自然界で
共存する材料の一部または全部から分離した同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、その後、自然界に戻したとしても単離したことになる。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部とすることができ、及び／または、そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、組成物の一部となるが、それでもなおも、そのようなベクターまたは組成物は、その自然環境の一部でない点で単離したものとなる。
【００６３】
さらに別の系では、ＩＴＲ、及び、ｒｅｐ／ｃａｐ遺伝子に隣接した発現カセットを、バキュロウイルスをベースにしたベクターを用いた感染で、昆虫細胞に導入する。これらの生産システムについての総説は、一般的に、例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，”Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０：９２２−９２９を参照されたい。これらの、及び、その他のＡＡＶ生産システムを作成、及び、使用する方法は、以下の米国特許にも記載されており、本明細書の一部を構成するものとして、それらの各々の全内容を援用する。５，１３９，９４１；５，７４１，６８３；６，０５７，１５２；６，２０４，０５９；６，２６８，２１３；６，４９１，９０７；６，６６０，５１４；６，９５１，７５３；７，０９４，６０４；７，１７２，８９３；７，２０１，８９８；７，２２９，８２３；及び、７，４３９，０６５。一般的には、例えば、本明細書の一部を構成するものとして、それらの各々の全内容を援用する、Ｇｒｉｅｇｅｒ  ＆  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９−１４５；Ｂｕｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１０：７１７−７３３、及び、以下に列挙した文献を参照されたい。
【００６４】
本発明のあらゆる実施形態を構築するために使用した方法は、核酸操作の当業者には公知であり、遺伝子工学、組換え工学、及び、合成技術が関係する。例えば、Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。同様に、ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は周知であり、また、適切な方法の選択は、本発明を限定するものではない。例えば、Ｋ．Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９３）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０−５３２、及び、米国特許第５，４７８，７４５号を参照されたい。
【００６５】
「プラスミド」は、一般的に、本明細書では、当業者に周知の標準的な命名規則に従って、小文字のｐと、その前、及び／または、後の、大文字、及び／または、数字で表記される。本発明にしたがって使用することができる数多くのプラスミド、ならびに、その他のクローニング、及び、発現ベクターは、当業者に周知であり、また、容易に入手可能である。さらに、当業者は、本発明での使用に適したその他のプラスミドを、幾つでも容易に構築することができる。本発明におけるそのようなプラスミド、ならびに、その他のベクターの性質、構築、及び、使用は、本開示から当業者に自明である。
【００６６】
ある実施形態では、当該産生プラスミドは、本明細書に記載されているものまたは本明細書の一部を構成するものとして援用する、ＷＯ２０１２／１５８７５７に記載されているものである。ｒＡＡＶベクターの製造に使用するための様々なプラスミドが当技術分野で公知であり、また、本明細書において有用である。当該産生プラスミドを、ＡＡＶキャ
ップ、及び／または、ｒｅｐタンパク質を発現する宿主細胞で培養する。当該宿主細胞では、各ｒＡＡＶゲノムを、救済し、そして、カプシドタンパク質、または、エンベロープタンパク質にパッケージングして、感染性ウイルス粒子を形成する。
【００６７】
ある態様では、上記した発現カセットを含む産生プラスミドを提供する。ある実施形態では、当該産生プラスミドは、配列番号８、及び、図１Ｅ〜１Ｆに示すものであり、ｐ６４３と称されている。このプラスミドを、ｒＡＡＶ−ヒトコドン最適化レベルシリンベクターの生成の例で使用している。そのようなプラスミドは、５’ＡＡＶ  ＩＴＲ配列；選択したプロモーター；ポリＡ配列；及び、３’ＩＴＲを含むプラスミドであり；加えて、それは、ラムダなどのスタッファー配列も含む。さらなる実施形態では、当該スタッファー配列は、当該ｒＡＡＶベクターゲノムを、約３キロベース（ｋｂ）〜約６ｋｂ、約４．７ｋｂ〜約６ｋｂ、約３ｋｂ〜約５．５ｋｂ、または、約４．７ｋｂ〜５．５ｋｂのサイズで保持する。ある実施形態では、非コード化ラムダスタッファー領域は、ベクターバックボーンに含まれる。レベルシリンをコードする配列を含むｐ６４３の例は、配列番号８に記載してある。別の実施形態では、当該産生プラスミドは、図１１Ａ〜１１Ｂ、及び、配列番号９に記載のものである。別の実施形態では、当該産生プラスミドを、最適化したベクタープラスミド産生効率のために修正を行う。そのような修正として、その他の中性配列の追加、または、ラムダスタッファー配列の一部（複数可）または全部の欠失があり、当該ベクタープラスミドのスーパーコイルのレベルを調節する。本明細書では、そのような修正を企図している。その他の実施形態では、ターミネーター、及び、その他の配列を、当該プラスミドに取り込ませる。
【００６８】
特定の実施形態では、当該ｒＡＡＶ発現カセット、当該ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、当該ウイルス（ｒＡＡＶなど）、当該産生プラスミドは、ＡＡＶ逆向き末端反復配列、レベルシリンをコードするコドン最適化核酸配列、及び、宿主細胞におけるコードしたタンパク質の発現を指向する発現制御配列を含む。その他の実施形態では、当該ｒＡＡＶ発現カセット、当該ウイルス、当該ベクター（ｒＡＡＶベクターなど）、当該産生プラスミドは、イントロン、コザック配列、ポリＡ、転写後調節エレメントなどの内の１つ以上をさらに含む。ある実施形態では、当該転写後調節因子は、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節因子（ＷＰＲＥ）である。
【００６９】
当該発現カセット、ベクター、及び、プラスミドは、例えば、本明細書に記載したコドン最適化を含む当該技術分野で公知の方法を使用して、特定の種に関して最適化し得るその他の成分を含む。当該カセット、ベクター、プラスミド、及び、ウイルス、または、本明細書に記載したその他の組成物の成分は、発現制御配列の一部として、プロモーター配列を含む。別の態様では、当該プロモーターは、細胞特異的である。用語「細胞特異的」とは、組換えベクターのために選択した特定のプロモーターが、特定の眼細胞型では、最適化レベルシリンコード配列の発現を指向することができる、ことを意味する。ある実施形態では、当該プロモーターは、視細胞における導入遺伝子の発現に関して特異的である。別の実施形態では、当該プロモーターは、桿体及び錐体における発現に関して特異的である。別の実施形態では、当該プロモーターは、桿体における発現に関して特異的である。別の実施形態では、当該プロモーターは、錐体における発現に関して特異的である。ある実施形態では、当該光受容体特異的プロモーターは、ヒトロドプシンキナーゼプロモーターである。当該ロドプシンキナーゼプロモーターは、桿体及び錐体の双方で活性がある、ことが示された。例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｂｏｔｈ  Ｒｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｎｅｓ  Ｒｅｓｃｕｅｓ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ＡＩＰＬ１  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ｊａｎｕａｒｙ；１７（１）：１１７−１３１を参照されたい。ある実施形態では、当該プロモーターは、１つ以上の制限部位を加え
る修正をして、クローニングを促す。
【００７０】
別の実施形態では、当該プロモーターは、ヒトロドプシンプロモーターである。ある実施形態では、当該プロモーターは、クローニングのために、末端に制限を与える修正をする。例えば、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、Ｎａｔｈａｎｓ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ
ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｒｈｏｄｏｐｓｉｎ，ＰＮＡＳ，８１：４８５１−５（Ａｕｇｕｓｔ  １９８４）を参照されたい。別の実施形態では、当該プロモーターは、ヒトロドプシンプロモーターの一部または断片である。別の実施形態では、当該プロモーターは、ヒトロドプシンプロモーターの変異体である。
【００７１】
その他の例示的なプロモーターとして、ヒトＧ−タンパク質共役受容体タンパク質キナーゼ１（ＧＲＫ１）プロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＹ３２７５８０）がある。別の実施形態では、当該プロモーターは、ＧＲＫ１プロモーターの２９２ｎｔの断片（位置１７９３〜２０８７）である（本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、Ｂｅｌｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０１０  １７：１１６２−７４を参照されたい）。別の好ましい実施形態では、当該プロモーターは、ヒト光受容体間レチノイド−結合タンパク質近位（ＩＲＢＰ）プロモーターである。ある実施形態では、当該プロモーターは、ｈＩＲＢＰプロモーターの２３５ｎｔの断片である。ある実施形態では、当該プロモーターは、ＲＰＧＲ近位プロモーターである（本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、Ｓｈｕ  ｅｔ  ａｌ，ＩＯＶＳ，Ｍａｙ  ２１０２）。本発明において有用なその他のプロモーターとして、桿体オプシンプロモーター、赤色−緑色オプシンプロモーター、青色オプシンプロモーター、ｃＧＭＰ−β−ホスホジエステラーゼプロモーター（Ｑｇｕｅｔａ  ｅｔ  ａｌ，ＩＯＶＳ，Ｉｎｖｅｓｔ
Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２０００  Ｄｅｃ；４１（１３）：４０５９−６３）、マウスオプシンプロモーター（前出のＢｅｌｔｒａｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０）、ロドプシンプロモーター（Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ，Ｊｕｌｙ  ２０１１，１８（７）：６３７−４５）；錐体トランスデューシンのアルファ−サブユニット（Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ，ＢＭＣ  Ｄｅｖ，Ｂｉｏｌ，Ｊａｎ
２０１１，１１：３）；ベータホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）プロモーター；網膜色素変性症（ＲＰ１）プロモーター（Ｎｉｃｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ，Ｄｅｃ  ２００７，９（１２）：１０１５−２３）；ＮＸＮＬ２／ＮＸＮＬ１プロモーター（Ｌａｍｂａｒｄ  ｅｔ  ａｌ，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，Ｏｃｔ．２０１０，５（１０）：ｅｌ３０２５）、ＲＰＥ６５プロモーター；網膜変性スロー／ペリフェリン２（Ｒｄｓ／ｐｅｒｐｈ２）プロモーター（Ｃａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．２０１０
Ａｕｇ；９１（２）：１８６−９４）；及び、ＶＭＤ２プロモーター（Ｋａｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２００９（２０：３１−９））があるが、これらに限定されない。本明細書の一部を構成するものとして、これらの文献の各々の全内容を援用する。別の実施形態では、当該プロモーターを、ヒトヒトＥＦ１αプロモーター、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼ、光受容体間結合タンパク質（ＩＲＢＰ）、錐体オプシンプロモーター（赤色−緑色、青色）、赤色−緑色錐体遺伝子座制御領域を含む錐体オプシン上流配列、錐体形質導入、及び、転写因子プロモーター（神経網膜ロイシンジッパー（Ｎｒｌ）、及び、光受容体特異的核受容体Ｎｒ２ｅ３、ｂＺＩＰ）から選択する。
【００７２】
別の実施形態では、当該プロモーターは、遍在性または構成的プロモーターである。適切なプロモーターの例として、図１Ｅ〜１Ｆに示す配列などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー要素を有するハイブリッドニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。別の実施形態では、当該プロモーターは、ＣＢ７プロモーターである。その
他の好適なプロモーターとして、ヒトβ−アクチンプロモーター、ヒト伸長因子−１αプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、サルウイルス４０プロモーター、及び、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーターがある。例えば、Ｄａｍｄｉｎｄｏｒｊ  ｅｔ  ａｌ，（Ａｕｇｕｓｔ  ２０１４）Ａ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  Ｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ９（８）：ｅ１０６４７２を参照されたい。さらに他の好適なプロモーターとして、ウイルスプロモーター、構成的プロモーター、調節可能プロモーターがある［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８、及び、ＷＯ２０１３／０４９４３を参照されたい］。あるいは、生理学的合図に応答するプロモーターを、本明細書に記載した発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、ベクター、プラスミド、及び、ウイルスで利用し得る。ある実施形態では、ＡＡＶベクターが大きさの制限を受けるが故に、当該プロモーターは、１０００ｂｐ未満の小さなサイズである。別の実施形態では、当該プロモーターは、４００ｂｐ未満である。その他のプロモーターは、当業者が選択し得る。
【００７３】
さらなる実施形態では、当該プロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、及び、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター、桿体オプシンプロモーター、赤色−緑色オプシンプロモーター、青色オプシンプロモーター、光受容体間結合タンパク質（ＩＲＢＰ）プロモーター、及び、ｃＧＭＰ−β−ホスホジエステラーゼプロモーター、ファージラムダ（ＰＬ）プロモーター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、テトラサイクリン制御トランス活性化因子応答プロモーター（ｔｅｔ）システム、長末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、例えば、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲ、ＢＩＶ  ＬＴＲ、または、ＨＩＶ  ＬＴＲなど、モロニーマウス肉腫ウイルスのＵ３領域プロモーター、グランザイムＡプロモーター、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（複数可）、ＣＤ３４プロモーター、ＣＤ８プロモーター、チミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、Ｂ１９パルボウイルスプロモーター、ＰＧＫプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）プロモーター、例えば、ＨＳＰ６５及びＨＳＰ７０プロモーターなど、免疫グロブリンプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｌａｃプロモーター、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、ノパリンシンテターゼプロモーター、ＭＮＤプロモーター、または、ＭＮＣプロモーターから選択する。これらのプロモーター配列は、当業者に公知であるか、または、文献またはデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＰｕｂＭｅｄなどから公的に入手可能である。
【００７４】
別の実施形態では、当該プロモーターは、誘導可能なプロモーターである。当該誘導可能なプロモーターは、ラパマイシン／ラパログプロモーター、エクジソンプロモーター、エストロゲン−応答性プロモーター、及び、テトラサイクリン−応答性プロモーター、または、ヘテロダイマーリプレッサースイッチなどの公知のプロモーターから選択し得る。本明細書の一部を構成するものとして双方の全内容を援用する、Ｓｏｃｈｏｒ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎ  Ａｕｔｏｇｅｎｏｕｓｌｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｏｃｕｌａｒ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１５  Ｎｏｖ  ２４；５：１７１０５、及び、Ｄａｂｅｒ  Ｒ，Ｌｅｗｉｓ  Ｍ．，Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｗｉｔｃｈ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００９  Ａｕｇ  ２８；３９１（４）：６６１−７０，Ｅｐｕｂ  ２００９  Ｊｕｎ  ２１を参照されたい。
【００７５】
さらなる実施形態では、当該プロモーターは、配列番号８のｎｔ  ５４６〜ｎｔ  ２８３までの核酸配列を有するニワトリベータ−アクチンプロモーターである。
【００７６】
その他の実施形態では、本明細書に記載した発現カセット、ベクター、プラスミド、及
び、ウイルスは、その他の適切な転写開始、終止、エンハンサー配列、効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシング、及び、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなど；ＴＡＴＡ配列；細胞質ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）；イントロン；タンパク質安定性を高める配列；及び、必要に応じて、コードした産物の分泌を高める配列を含む。発現カセット、または、ベクターは、本明細書に説明した要素を何も含まず、あるいは、それらの１つ以上を含み得る。
【００７７】
適切なポリＡ配列の例として、例えば、合成ポリＡ、または、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、ＳＶ４０、ウサギβ−グロビン（ＲＧＢ）、または、修飾ＲＧＢ（ｍＲＧＢ）がある。さらなる実施形態では、当該ポリＡは、配列番号８のｎｔ  ３９９３〜ｎｔ  ４２００までの核酸配列を有する。
【００７８】
適切なエンハンサーの例として、例えば、特に、ＣＭＶエンハンサー、ＲＳＶエンハンサー、アルファフェトプロテインエンハンサー、ＴＴＲ最小プロモーター／エンハンサー、ＬＳＰ（ＴＨ−結合グロブリンプロモーター／アルファ１−ミクログロブリン／ビクニンエンハンサー）、ＡＰＢエンハンサー、ＡＢＰＳエンハンサー、アルファｍｉｃ／ｂｉｋエンハンサー、ＴＴＲエンハンサー、ｅｎ３４、ＡｐｏＥがある。ある実施形態では、当該エンハンサーは、配列番号８のｎｔ  ２４１〜ｎｔ  ５４４までの核酸配列を有する。
【００７９】
ある実施形態では、レベルシリンコーディング配列の上流にコザック配列を置いて、正しい開始コドンからの翻訳を促す。別の実施形態では、ＣＢＡエクソン１、及び、イントロンを、発現カセットに取り入れる。ある実施形態では、レベルシリンコード配列を、ハイブリッドニワトリβアクチン（ＣＢＡ）プロモーターの制御下に置く。このプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサー、近位ニワトリβアクチンプロモーター、及び、イントロン１配列が隣接するＣＢＡエクソン１から構成されている。
【００８０】
別の実施形態では、当該イントロンは、ＣＢＡ、ヒトベータグロビン、ＩＶＳ２、ＳＶ４０、ｂＧＨ、アルファ−グロブリン、ベータ−グロブリン、コラーゲン、オボアルブミン、ｐ５３、または、それらの断片から選択する。
【００８１】
ある実施形態では、当該発現カセット、当該ベクター、当該プラスミド、及び、当該ウイルスは、５’ＩＴＲ、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡエクソン１、及び、イントロン、ヒトコドン最適化レベルシリン配列、ｂＧＨポリＡ、及び、３’ＩＴＲを含む。さらなる実施形態では、当該発現カセットは、配列番号８のｎｔ  １〜４３７９を含む。さらに別の実施形態では、当該５’ＩＴＲは、配列番号８のｎｔ  １〜ｎｔ  １３０までの核酸配列を有し、また、当該３’ＩＴＲは、配列番号８のｎｔ  ４２５０〜ｎｔ  ４３７９までの核酸配列を有する。さらなる実施形態では、当該ＣＢＡエクソン１、及び、イントロンは、配列番号８のｎｔ  ８２４〜ｎｔ
１７９５までの核酸配列を有する。さらなる実施形態では、当該産生プラスミドは、配列番号８の配列を有し、図１Ｅ〜１Ｆにも示している。さらなる実施形態では、当該産生プラスミドは、配列番号９の配列を有し、図１Ａ〜１１Ｂにも示している。
【００８２】
別の態様では、レベルシリン遺伝子の欠損に起因するレーバー先天性黒内障を処置し、及び／または、ＬＣＡを有する対象の視覚機能を回復する方法は、本明細書に記載した通り、それを必要とする対象に対して、レベルシリンをコードするベクター（ｒＡＡＶなど）を送達することを含む。ある実施形態では、ＬＣＡを有する対象を、本明細書に記載のｒＡＡＶで処置する方法を提供する。
【００８３】
本方法で使用する「投与する」とは、ＬＣＡであると特徴決定した標的選択細胞に対して組成物を送達する、ことを意味する。ある実施形態では、当該方法は、網膜下注射で、当該組成物を、ＲＰＥ、視細胞、または、その他の眼細胞に送達することを含む。別の実施形態では、当該対象に対して硝子体内注射をする。別の実施形態では、当該対象に対して網膜下注射をする。さらに別の方法では、眼瞼静脈を介した注射などの血管内注射を使用し得る。本開示に接した当業者であれば、さらにその他の投与方法を選択し得る。
【００８４】
「投与する」または「投与の経路」とは、本明細書に記載の組成物を、医薬担体または賦形剤を使用して、または、使用せずに、対象へ送達することである。必要に応じて、投与経路は組み合わせ得る。幾つかの実施形態では、当該投与を、定期的に繰り返す。本明細書に記載の医薬組成物は、あらゆる適切な経路、または、異なる経路の組み合わせによって、それを必要とする対象へ送達するようにデザインしている。幾つかの実施形態では、眼への直接送達（任意に、眼内送達、網膜下注射、網膜内注射、硝子体内、局所を介して）、または、全身経路、例えば、血管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、及び、その他の非経口投与経路を介した送達を使用する。本明細書に記載した核酸分子、発現カセット、及び／または、ベクターを、単一の組成物、または、複数の組成物で送達し得る。任意に、２つ以上の異なるＡＡＶ、または、複数のウイルスを送達し得る［例えば、ＷＯ２０  ２０１１／１２６８０８、及び、ＷＯ２０１３／０４９４９３を参照されたい］。別の実施形態では、複数のウイルスは、単独で、または、タンパク質と組み合わせて、異なる複製欠損ウイルス（例えば、ＡＡＶ、及び、アデノウイルス）を含み得る。
【００８５】
本明細書では、医薬組成物も提供する。本明細書に記載の医薬組成物は、あらゆる適切な経路、または、異なる経路の組み合わせによって、それを必要とする対象への送達のためにデザインする。これらの送達手段は、本明細書に記載のＡＡＶ組成物（複数可）を含有する懸濁液の直接全身送達を回避するようにデザインする。適切には、こうすることは、全身投与と比較して、用量を減らし、毒性を小さくし、及び／または、ＡＡＶ及び／または導入遺伝子産物に対する望ましくない免疫応答を抑制するという利点を有し得る。
【００８６】
さらに他の態様では、これらの核酸配列、ベクター、発現カセット、及び、ｒＡＡＶウイルスベクターは、医薬組成物において有用であり、同組成物は、医薬として許容可能な担体、賦形剤、緩衝剤、希釈剤、界面活性剤、防腐剤、及び／または、アジュバントなども含む。そのような医薬組成物は、そのような組換え改変をしたＡＡＶまたは人工ＡＡＶによる送達によって、最適化レベルシリンを宿主細胞内で発現させるために使用する。
【００８７】
核酸配列、ベクター、発現カセット、及び、ｒＡＡＶウイルスベクターを含むこれらの医薬組成物を調製するために、配列、または、ベクター、または、ウイルスベクターは、好ましくは、通常の方法によって、混入に関して評価され、次いで、眼への投与に適した医薬組成物へと配合する。そのような製剤は、医薬的、及び／または、生理学的に許容可能なビヒクル、または、担体、特に、ｐＨを適切な生理学的レベルに保つための緩衝生理食塩水、または、その他の緩衝剤、例えば、ＨＥＰＥＳなどの眼への投与に適したもの、ならびに、任意に、その他の医薬品、薬剤、安定剤、緩衝剤、担体、添加剤、希釈剤、界面活性剤、または賦形剤などの使用を含む。注射の場合、一般的には、担体は液体である。例示的な生理学的に許容可能な担体として、発熱物質を含まない滅菌水、及び、発熱物質を含まない滅菌リン酸塩緩衝生理食塩水がある。様々なそのような公知の担体を、本明細書の一部を構成するものとして援用する米国特許公開第７，６２９，３２２号で提供している。ある実施形態では、当該担体は、等張塩化ナトリウム溶液である。別の態様では、当該担体は、平衡塩溶液である。ある実施形態では、当該担体は、ｔｗｅｅｎを含む。ウイルスを長期間保存する場合、グリセロールまたはＴｗｅｅｎ２０の存在下で、それを凍結し得る。
【００８８】
特定の実施形態では、ヒト患者への投与のために、当該ｒＡＡＶを、生理食塩水、界面活性剤、及び、生理学的に適合する塩、または、それら塩の混合物を含む水溶液に適切に懸濁する。適切には、当該製剤は、生理学的に許容可能なｐＨ、例えば、ｐＨ６〜９、または、ｐＨ６．５〜７．５、ｐＨ７．０〜７．７、または、ｐＨ７．２〜７．８の範囲に調整する。脳脊髄液のｐＨは、約７．２８〜約７．３２であるので、髄腔内送達には、この範囲内のｐＨが望ましく；一方で、硝子体内または網膜下送達の場合、６．８〜約７．２のｐＨが望ましい場合がある。しかしながら、最も広範囲でのその他のｐＨ、及び、これらの部分範囲は、その他の送達経路のために選択し得る。
【００８９】
適切な界面活性剤、または、界面活性剤の組み合わせは、非毒性の非イオン性界面活性剤から選択し得る。ある実施形態では、一級ヒドロキシル基を末端に有する二官能性ブロックコポリマー界面活性剤、例えば、中性のｐＨを示し、平均分子量が８４００である、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］、別名、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８などを選択する。その他の界面活性剤、及び、その他のＰｏｌｏｘａｍｅｒｓは、すなわち、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が隣接するポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中心疎水性鎖で構成された非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ  ＨＳ  １５（マクロゴール−１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリルグリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール、及び、ポリエチレングリコールを選択し得る。ある実施形態では、当該製剤は、ポロキサマーを含む。これらの共重合体は、一般に、「Ｐ」（ポロキサマーの場合）の後に３桁の数字が続き；最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアのおおよその分子量を示し、そして、最後の桁×１０は、ポリオキシエチレン含有率を示す。ある実施形態では、Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８を選択する。当該界面活性剤は、当該懸濁液の約０．０００５％〜約０．００１％までの量で存在し得る。
【００９０】
一例では、当該製剤は、例えば、塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、デキストロース、硫酸マグネシウム（例えば、硫酸マグネシウム−７Ｈ２Ｏ）、塩化カリウム、塩化カルシウム（例えば、塩化カルシウム−２Ｈ２Ｏ）、二塩基性リン酸ナトリウム、及び、それらの混合物の１つ以上を含んだ水溶液を含む緩衝生理食塩水を含み得る。適切には、髄腔内送達については、浸透圧は、脳脊髄液に適合する範囲内（例えば、約２７５〜約２９０）とする；例えば、ｅｍｅｄｉｃｉｎｅ．ｍｅｄｓｃａｐｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅ／２０９３３１６−ｏｖｅｒｖｉｅｗを参照されたい。任意に、髄腔内送達については、市販の希釈剤を懸濁剤として、または、別の懸濁剤と、その他の任意の賦形剤とを組み合わせて使用し得る。例えば、Ｅｌｌｉｏｔｔｓ  Ｂ（登録商標）溶液［Ｌｕｋａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ］を参照されたい。その他の実施形態では、当該製剤は、１つ以上の透過促進剤を含み得る。適切な透過促進剤の例として、例えば、マンニトール、グリココール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、サリチル酸ナトリウム、カプリル酸ナトリウム、カプリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン−９−ラウレルエーテル、または、ＥＤＴＡを含み得る。
【００９１】
別の実施形態では、当該組成物は、担体、希釈剤、賦形剤、及び／または、アジュバントを含む。適切な担体は、トランスファーウイルスに起因する適応症を考慮して、当業者は容易に選択し得る。例えば、ある適切な担体として、生理食塩水があり、このものは、様々な緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）とともに製剤化し得る。その他の例示的な担体として、滅菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、落花生油、ゴマ油、及び、水がある。当該緩衝液／担体には、当該ｒＡＡＶが、注入管の閉塞を防ぐ一方で、インビボでのｒＡＡＶ結合活性を妨げない成分を含む必要がある。
【００９２】
任意に、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び担体（複数可）に加えて、保存剤または化学安定剤などのその他の従来の医薬成分を含み得る。適切な例示的な防腐剤として、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、及び、パラクロロフェノールがある。適切な化学安定剤として、ゼラチン及びアルブミンがある。
【００９３】
本発明の組成物は、上記で定義したような医薬として許容可能な担体を含み得る。適切には、本明細書に記載した組成物は、医薬として適切な担体に懸濁する、及び／または、注射、浸透圧ポンプ、髄腔内カテーテルを介して対象に送達するために、または、別のデバイスまたは経路で送達するためにデザインした適切な賦形剤と混合した、有効量の１つ以上のＡＡＶを含む。ある例では、当該組成物は、硝子体内送達用に製剤化する。ある例では、当該組成物は、網膜下送達用に製剤化する。
【００９４】
ある例示的な特定の実施形態では、当該組成物での当該担体または賦形剤は、１８０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＰｉ、ｐＨ７．３と、０．０００１％〜０．０１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（ＰＦ６８）を含む。当該緩衝剤の生理食塩水成分の正確な組成は、１６０ｍＭ〜１８０ｍＭ  ＮａＣｌの範囲である。任意に、具体的に説明した緩衝剤の代わりに、異なるｐＨ緩衝剤（潜在的には、ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム、ＴＲＩＳ）を使用する。さらに、０．９％ＮａＣｌを含む緩衝剤が有用である。
【００９５】
ＡＡＶウイルスベクターの場合、ゲノムコピー（「ＧＣ」）、ベクターゲノム（「ＶＧ」）、または、ウイルス粒子の定量は、製剤または懸濁液に含まれる用量の尺度として使用し得る。当該技術分野で公知のあらゆる方法を使用して、本発明の複製欠損ウイルス組成物のゲノムコピー（ＧＣ）数を決定することができる。ＡＡＶ  ＧＣ数の滴定を行う方法の一例は、次の通りである：まず、精製したＡＡＶベクター試料をＤＮａｓｅで処理して、カプシド化していないＡＡＶゲノムＤＮＡ、または、混入があるプラスミドＤＮＡを、生産プロセスから排除する。次に、ＤＮａｓｅ耐性粒子を熱処理して、カプシドからゲノムを放出する。次いで、放出したゲノムを、ウイルスゲノムの特定の領域（通常はポリＡシグナル）を標的とするプライマー／プローブセットを使用して、リアルタイムＰＣＲで定量する。別の方法では、最適化レベルシリンコード配列をコードする核酸配列を保有する組換えアデノ随伴ウイルスの有効量を、本明細書の一部を構成するものとしてその全内容を援用する、Ｓ．Ｋ．  ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８８  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３に説明されているようにして、測定をする。
【００９６】
本明細書で使用する用語「用量」とは、処置の過程で対象に送達する総用量、または、単一単位（または、複数単位、または、分割用量）投与で送達する量のことを指す、ことができる。当該医薬ウイルス組成物は、本明細書に記載のレベルシリンをコードするコドン最適化核酸配列を保有する複製欠損ウイルスの量を含む投与単位で製剤化することができ、同量は、約１．０×１０９ＧＣ〜約１．０×１０１５ＧＣ／用量の範囲であり、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。ある実施形態では、当該組成物を、少なくとも１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、または、９×１０９ＧＣ／用量を含むように製剤化し、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。別の実施形態では、当該組成物を、少なくとも１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または、９×１０１０ＧＣ／用量を含むように製剤化し、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。別の実施形態では、当該組成物を、少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または、９×１０１１ＧＣ／用量を含むように製剤化し、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。別の実施形態
では、当該組成物を、少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または、９×１０１２ＧＣ／用量を含むように製剤化し、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。別の実施形態では、当該組成物を、少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または、９×１０１３ＧＣ／用量を含むように製剤化し、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。別の実施形態では、当該組成物を、少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、または、９×１０１４ＧＣ／用量を含むように製剤化し、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。別の実施形態では、当該組成物を、少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、または、９×１０１５ＧＣ／用量を含むように製剤化し、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。ある実施形態では、ヒトへの適用について、当該用量は、１×１０１０〜約１×１０１２ＧＣ／用量であり、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。すべての用量は、例えば、本明細書の一部を構成するものとして援用する、Ｍ．Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１４  Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１に記載されているような、ｏｑＰＣＲ、または、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）による測定などのあらゆる公知の方法で測定し得る。
【００９７】
ある実施形態では、ＬＣＡ患者への投与に適した水性懸濁液を提供する。当該懸濁液は、水性懸濁液と、約１×１０１０ＧＣまたはウイルス粒子〜約１×１０１２ＧＣまたはウイルス粒子／眼である、ＬＣＡの治療薬として有用な本明細書に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）とを含む。
【００９８】
本発明の医薬組成物を、複数の「ブースター」投与量で投与することも望ましい場合がある。例えば、眼の標的細胞内の導入遺伝子の持続期間に応じて、６ヶ月間隔で、または、最初の投与の後に毎年、ブースター投与量を送達し得る。ｒＡＡＶベクターの投与によってＡＡＶ中和抗体が生成されないという事実は、さらなるブースター投与を可能にする。
【００９９】
そのようなブースター用量、及び、その必要性は、例えば、以下の実施例に記載した、網膜及び視覚機能検査ならびに視覚行動検査を使用して、主治医はモニターすることができる。その他の同様の検査を使用して、処置した対象の病態を経時的に判断し得る。適切な検査の選択は、主治医が行い得る。あるいは、本発明の方法は、大容量の単一または多重感染のウイルス含有溶液を注射して、野生型網膜に認められるレベルに近い視覚機能のレベルを可能にする。
【０１００】
別の実施形態では、レベルシリンをコードするコドン最適化核酸配列を保有する本明細書に記載のベクター、ウイルス、及び、複製欠損ウイルスの量は、約１．０×１０７ＶＧ／眼〜約１．０×１０１５ＶＧ／眼の範囲であり、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。ある実施形態では、当該量は、少なくとも１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、または９×ｌ０７ＶＧ／眼であり、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。ある実施形態では、当該量は、少なくとも１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、または９×ｌ０８ＶＧ／眼であり、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。ある実施形態では、当該量は、少なくとも１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、または９×ｌ０９ＶＧ／眼であり、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。ある実施形態では、当該量は、少なくとも１×１０１０、２×１０１０
、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×ｌ０１０ＶＧ／眼であり、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。ある実施形態では、当該量は、少なくとも１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、または９×ｌ０１１ＶＧ／眼であり、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。ある実施形態では、当該量は、少なくとも１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、または９×ｌ０１２ＶＧ／眼であり、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。ある実施形態では、当該量は、少なくとも１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３、または９×ｌ０１３ＶＧ／眼であり、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。ある実施形態では、当該量は、少なくとも１×１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４、または９×ｌ０１４ＶＧ／眼であり、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。ある実施形態では、当該量は、少なくとも１×１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５、または９×ｌ０１５ＧＣ／眼であり、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。ある実施形態では、当該方法は、１×１０９〜約１×１０１３ＶＧ／眼／用量の用量範囲を含み、その範囲内のすべての整数または小数の数値を含む。別の実施形態では、当該方法は、水性懸濁液でのベクターの送達を含む。別の実施形態では、当該方法は、約、または、少なくとも１５０マイクロリットルの容量にて、１×１０９〜１×１０１３ＧＣの用量で、本明細書に記載のｒＡＡＶを投与することを含み、それにより、当該対象の視覚機能を回復する。すべての用量は、例えば、本明細書の一部を構成するものとして援用する、Ｍ．Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１４  Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１に記載されているような、ｏｑＰＣＲ、または、デジタル液滴ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）による測定などのあらゆる公知の方法で測定し得る。
【０１０１】
上記したこれらの用量を、処置する領域の大きさ、使用するウイルス力価、投与の経路、及び、当該方法の所望の効果に応じて、約２５〜約１０００マイクロリットルの範囲で、その範囲内のすべての数値を含む、様々な容量の担体、賦形剤、または、緩衝剤製剤で投与し得る。ある実施形態では、担体、賦形剤、または、緩衝剤の容量は、少なくとも約２５μＬである。ある実施形態では、当該容量は、約５０μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約７５μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約１００μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約１２５μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約１５０μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約１７５μＬである。なおも別の実施形態では、当該容量は、約２００μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約２２５μＬである。なおも別の実施形態では、当該容量は、約２５０μＬである。なおも別の実施形態では、当該容量は、約２７５μＬである。なおも別の実施形態では、当該容量は、約３００μＬである。なおも別の実施形態では、当該容量は、約３２５μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約３５０μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約３７５μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約４００μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約４５０μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約５００μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約５５０μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約６００μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約６５０μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約７００μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約８００μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約１５０〜８００μＬである。別の実施形態では、当該容量は、約７００と１０００μＬとの間である。別の実施形態では、当該容量は、約２５０と５００μＬとの間である。
【０１０２】
ある実施形態では、当該ウイルス構築物は、マウスなどの小動物対象に対して、約１μＬ〜約３μＬの容量で、少なくとも１×１０９〜少なくとも１×１０１１ＧＣの用量で送達し得る。ヒトの眼と概ね同じ大きさの眼を有する大型家畜対象については、上記したヒト向けの大きな用量と容量が有用である。例えば、様々な家畜動物への物質の投与に関する優良事例の考察に関する、Ｄｉｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ，２１：１５−２３（２００１）を参照されたい。この文献は、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【０１０３】
毒性、網膜異形成、及び、剥離などの望ましくない影響のリスクを軽減するために、最低有効濃度のウイルス、または、その他の送達ビヒクルを利用することが望ましい。処置を受けている対象、好ましくはヒトの身体的状態、対象の年齢、ＬＣＡ、及び、進行性のものであれば、障害の程度を考慮して、主治医は、これらの範囲内のさらに別の用量を選択し得る。
【０１０４】
本明細書に記載のなおも別の態様は、哺乳動物対象のＬＣＡの進行を処置、遅延、または、停止する方法である。ある実施形態では、好ましくは、生理学的に適合性のある担体、希釈剤、賦形剤、及び／または、アジュバントに懸濁した、レベルシリンネイティブの修飾した、または、コドン最適化配列を保有するｒＡＡＶを、ヒト対象などの所望の対象に投与し得る。この方法は、それを必要とする対象に、核酸配列、発現カセット、ｒＡＡＶゲノム、プラスミド、ベクター、または、ｒＡＡＶベクター、または、それらを含有する組成物のいずれかを投与する、ことを含む。ある実施形態では、当該組成物を、網膜下に送達する。別の実施形態では、当該組成物を、硝子体内に送達する。さらに別の実施形態では、当該組成物を、ＬＣＡの処置に適した投与経路の組み合わせを使用して送達し、そして、眼静脈、または、その他の静脈内、または、従来の投与経路を介した投与も含む得る。
【０１０５】
これらの方法での使用については、各用量の容量、及び、ウイルス力価を、本明細書でさらに説明するようにして個別に決定し、そして、同じ側または反対側の眼で行われるその他の処置と同じ、または、異なるようにし得る。用量、投与、または、管理は、本明細書の教示を考慮して、主治医が決定し得る。ある実施形態では、罹患した眼には、当該組成物を、上掲したものから選択した単一の用量で投与する。別の実施形態では、罹患した両眼には、当該組成物を、上掲したものから選択した単一の用量で、同時投与、または、連続投与する。連続投与は、数分、数時間、数日、数週間、または、数ヶ月の間隔という、一方の眼から他方の眼への投与の時間差を意味し得る。別の実施形態では、当該方法は、当該組成物を、２つ以上の用量（例えば、分割用量）で、眼に投与することを含む。別の実施形態では、同じ眼の異なる部分に、複数回の注射を行う。別の実施形態では、選択した発現カセット（例えば、ＬＣＡ５含有カセット）を含むｒＡＡＶの第２の投与を、後の時点で行う。そのような時点は、最初の投与から数週間、数ヶ月、または、数年後とし得る。ある実施形態では、そのような第２の投与は、最初の投与でのｒＡＡＶとは異なるカプシドを有するｒＡＡＶを用いて行う。別の実施形態では、第１及び第２の投与でのｒＡＡＶは、同じカプシドを有する。
【０１０６】
さらに他の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、単一の組成物、または、複数の組成物で送達し得る。任意に、２つ以上の異なるＡＡＶ、または、複数のウイルスを送達し得る［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８、及び、ＷＯ２０１３／０４９４９３を参照されたい］。別の実施形態では、複数のウイルスは、異なる複製欠損ウイルス（例えば、ＡＡＶ、及び、アデノウイルス）を含み得る。
【０１０７】
本発明の特定の実施形態では、治療の標的となる桿体、及び、錐体視細胞の領域を特定し、処置の有効性を試験するために、非侵襲性網膜イメージング、及び、機能研究を実施
することが望ましい。これらの実施形態では、１つ以上の網膜下注射（複数可）のための正確な位置（複数可）を決定するために、臨床診断試験を使用する。これらの試験として、処置を受ける対象の種、それらの身体的状態、及び、健康ならびに用量に応じて、網膜電図写真（ＥＲＧ）、視野測定、網膜の層のトポグラフィックマッピング、及び、共焦点走査レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ）、及び、光干渉断層法（ＯＣＴ）の手段を用いた、その層の厚みの測定、適応光学（ＡＯ）、機能的眼科検査、多電極アレイ（ＭＥＡ）、瞳孔光応答などを介した、錐体密度のトポグラフィックマッピングがある。画像化及び機能性研究の観点から、本発明の幾つかの実施形態では、罹患した眼の異なる領域を標的とするために、同じ眼で１回以上の注射を行う。本明細書でさらに説明する通り、各注射の容量及びウイルス力価を、個別に決定し、そして、同じ側または反対側の眼で行うその他の注射と同じもの、あるいは、異なるものとし得る。別の実施形態では、眼全体を処置するために、単一の大きな容量を注射する。ある実施形態では、当該ｒＡＡＶ組成物の容量及び濃度は、損傷した眼細胞の領域だけに影響が及ぶように選択する。別の実施形態では、ｒＡＡＶ組成物の容量、及び／または、濃度をさらに大きくして、損傷を受けていない光受容体を含む眼の大半の部分に到達するようにする。
【０１０８】
別の実施形態では、当該方法は、さらなる研究、例えば、機能性及び画像化研究を行って、処置の有効性を決定することを含む。動物での検査のために、そのような試験は、桿体及び錐体視細胞機能を見る網膜電図（ＥＲＧ）、視覚運動性眼振、瞳孔測定、水迷路試験、明暗選択、光干渉断層撮影（網膜の様々な層の厚みを測定する）、組織学（網膜の厚み、外核層の核の列、導入遺伝子発現を記録するための免疫蛍光法、錐体視細胞の計数、錐体視細胞鞘を同定するピーナッツ凝集素を用いた網膜切片の染色）を介した、網膜及び視覚機能評価を含む。
【０１０９】
特に、ヒト対象については、本明細書に記載した用量の組成物の投与に続いて、桿体及び錐体視細胞機能を検査する網膜電図（ＥＲＧ）、瞳孔測定視力、コントラスト感度色覚検査、視野試験（ハンフリー視野／ゴールドマン視野）、視野移動性検査（障害物コース）、及び、読み取り速度検査を用いて、処置の有効性に関して当該対象を調べる。本明細書に記載の医薬組成物を用いる処置に続いて、当該対象に行う、その他の有用な処置をした後の有効性試験は、機能的磁気共鳴画像法（ｆＭＲＩ）、全視野光感度試験、光干渉断層撮影を含む網膜構造研究、眼底写真、眼底自家蛍光、補償光学レーザー走査型眼底検査法、移動性試験、読み取り速度と正確度の試験、マイクロペリメトリー、及び／または、検眼鏡検査法である。これら、及び、その他の有効性試験は、本明細書の一部を構成するものとして援用する、米国特許第８，１４７，８２３号；同時係属している国際特許出願公開国際公開ＷＯ２０１４／０１１２１０またはＷＯ２０１４／１２４２８２に記載されている。
【０１１０】
本明細書に記載の方法のある実施形態では、本明細書に記載の組成物の１度の眼内送達、例えば、最適化したＬＣＡ５カセットのＡＡＶ送達は、対象のＬＣＡの処置に有用である。本明細書に記載の方法の別の実施形態では、本明細書に記載の組成物の１度の眼内送達、例えば、最適化したＬＣＡ５カセットのＡＡＶ送達は、リスクのある対象のＬＣＡの処置に有用である。
【０１１１】
したがって、ある実施形態では、当該組成物を、疾患の発症前に投与する。別の実施形態では、当該組成物を、視覚障害または視力喪失が始まる前に投与する。別の実施形態では、当該組成物を、視覚障害または視力喪失が始まった後に投与する。なおも別の実施形態では、当該組成物を、罹患していない眼と比較して、桿体、及び／または、錐体、または、光受容体の９０％未満が機能または残存している場合に投与する。ある実施形態では、新生児の処置は、本明細書に記載のレベルシリンコード配列、発現カセット、または、ベクターを、送達の８時間以内、最初の１２時間以内、最初の２４時間以内、または、最
初の４８時間以内に投与する、と定義する。別の実施形態では、特に霊長類（ヒト、または、非ヒト）については、新生児への送達は、約１２時間から約１週間、２週間、３週間、または、約１ヶ月の期間内、または、約２４時間〜約４８時間後とする。別の実施形態では、当該組成物を、症状の発症後に送達する。ある実施形態では、当該患者の処置（例えば、最初の注射）を、生後１年の前に始める。別の実施形態では、処置を、最初の１年後、または、最初の２〜３歳齢の後、５歳齢の後、１１歳齢の後、または、それより高齢にて始める。ある実施形態では、処置を、約４歳齢〜約１２歳齢の年齢で始める。ある実施形態では、処置を、約４歳齢以降に始める。ある実施形態では、処置を、約５歳齢以降に始める。ある実施形態では、処置を、約６歳齢以降に始める。ある実施形態では、処置を、約７歳齢以降に始める。ある実施形態では、処置を、約８歳齢以降に始める。ある実施形態では、処置を、約９歳齢以降に始める。ある実施形態では、処置を、約１０歳齢以降に始める。ある実施形態では、処置を、約１１歳齢以降に始める。ある実施形態では、処置を、約１２歳齢以降に始める。しかしながら、処置は、約１５歳、約２０歳、約２５歳、約３０歳、約３５歳、または、約４０歳以上で始めることができる。ある実施形態では、子宮内での処置を、本明細書に記載の組成物を胎児に投与する、ものと定義する。例えば、本明細書の一部を構成するものとして援用する、Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ，  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎ  ｕｔｅｒｏ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｇｉｖｅｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｈｅｅｐ，  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２０１１  Ａｐｒ；２２（４）：４１９−２６．  ｄｏｉ：
１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１０．００７．  Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｆｅｂ  ２を参照されたい。
【０１１２】
別の実施形態では、当該組成物を、後日に再投与する。任意に、複数回の再投与が許容される。そのような再投与は、本明細書に記載したものと同じタイプのベクター、異なるウイルスベクター、または、非ウイルス送達を用いたものとし得る。ある実施形態では、当該ベクターを、最初に注射をした網膜の異なる箇所に対して患者に再投与する。ある実施形態では、当該ベクターを、最初に注射をした網膜の同じ箇所で患者に再投与する。
【０１１３】
さらに別の実施形態では、上記した方法のいずれもが、別の、または、二次的な治療と組み合わせて行う。当該二次療法は、これらの変異または欠陥、または、それに関連する作用のいずれかを予防、阻止、または、改善するのに役立つ、公知の、または、未だ公知でない療法とし得る。当該二次療法は、上記した組成物の投与前、投与と同時に、または、投与後に投与することができる。ある実施形態では、二次療法は、神経栄養因子、抗酸化剤、抗アポトーシス剤の投与など、網膜細胞の健康を維持するための非特異的アプローチを伴う。当該非特異的アプローチは、タンパク質、組換えＤＮＡ、組換えウイルスベクター、幹細胞、胎児組織、または、遺伝子組み換え細胞の注射によって達成される。後者として、カプセル化した遺伝子組み換え細胞を含み得る。
【０１１４】
ある実施形態では、組換えｒＡＡＶを生成する方法は、上記したＡＡＶ発現カセットを含むプラスミドを得ること、及び、ＡＡＶウイルスゲノムの感染性ＡＡＶエンベロープまたはカプシドへのパッケージングを可能にするのに十分なウイルス配列の存在下で、プラスミドを保有するパッケージング細胞を培養することを含む。ｒＡＡＶベクター生成の特定の方法は、上記した通りであり、そして、上記し、かつ、以下の実施例に記載した発現カセット及びゲノムにおいて、コドン最適化ＬＣＡ５を送達できるｒＡＡＶベクターの生成に使用し得る。
【０１１５】
本発明の特定の実施形態では、対象は、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）を有しており、それを処置するよう、本発明の構成要素、組成物、及び、方法は、デザインしている。本明細書で使用する用語「対象」とは、ヒト、家畜または農場家畜、屋内家畜またはペッ
ト、及び、臨床研究に通常使用する動物を含む哺乳動物のことを意味する。ある実施形態では、これらの方法及び組成物の対象は、ヒトである。さらに他の適切な対象として、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、非ヒト霊長類などがあるが、これらに限定されない。本明細書で使用する用語「対象」は、「患者」と互換可能に使用する。
【０１１６】
本明細書で使用する用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、ＬＣＡの１つ以上の症状の改善の目的で、本明細書に記載した１つ以上の化合物または組成物を対象に投与すること含む、ものとして定義する。したがって、「処置」は、所与の対象におけるＬＣＡの発症または進行の軽減、疾患の予防、疾患の症状の重篤度の軽減、または、失明の進行を含むそれらの進行の遅延、疾患の症状の除去、疾患の発症の遅延、または、疾患の進行もしくは治療の有効性をモニターする、ことの１つ以上を含むことができる。
【０１１７】
用語「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を指すことに留意されたい。そのため、用語「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」、及び、「少なくとも１つ」は、本明細書では互換的に使用する。
【０１１８】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、排他的ではなく、包括的に解釈する。用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）」、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」、及び、その変形は、包含的ではなく、排他的に解釈する。本明細書での様々な実施形態は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の言語を使用して提示をしているが、その他の状況下では、関連する実施形態は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「本質的にからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」の言語を使用して解釈及び説明することも意図している。
【０１１９】
本明細書で使用する「疾患」、「障害」及び「病態」は、対象の異常な状態を示すために互換的に使用する。
【０１２０】
本明細書で使用する用語「約」または「〜」は、特に断りの無い限り、与えられる基準から１０％の変動を意味する。
【０１２１】
本明細書で使用する用語「調節」またはその変形は、生物学的経路の１つ以上の成分を阻害する組成物の能力のことを指す。
【０１２２】
本明細書で特に定義がされていない限りは、本明細書で使用する技術用語及び科学的用語は、当業者によって、及び、公開された文書を参照することで、一般に理解するものと同じ意味を有しており、それらは、当業者に対して、本願で使用した用語の多くについての一般的な指針を示す。
【実施例】
【０１２３】
以下の実施例は例示にすぎず、本発明の限定を意図するものではない。
【０１２４】
実施例１：組換えｒＡＡＶ、及び、インビトロ発現研究
最も研究が進んだ組換えＡＡＶ血清型であるＡＡＶ２を使用した網膜遺伝子導入を、ヒト対象で、かつ、２９の異なる臨床試験（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ）において、３１０を超える個数の眼で実施した。これらの試験は、常染色体異常（ＲＰＥ６５欠損、ＭＥＲＴＫ変異による網膜色素変性症、脈絡膜血症、色覚異常）、ミトコンドリア病（レーバーの遺伝性視神経障害）、加齢黄斑変性の合併症（脈絡膜血管新生）、及び、末期網膜変性（光遺伝療法を使用する）などの多様な疾患を標的とする。これらの研究の
大部分（１８／２９、または、ＡＡＶと網膜下注射を使用した２２の研究の内の１８）では、ＲＰＥ細胞を効率的に標的にすることを目標とした。最終結果は、ＡＡＶの眼内送達に関する大量の安全性データである。網膜下注射は、ＬＣＡ５患者の光受容体を標的とするために必要なものと同じ外科的手法である。
【０１２５】
得られた情報に基づいて、多大な努力を払って、ＬＣＡ５、及び、原発性光受容体欠陥が関係するその他の疾患を処置する手順を開発した。残念ながら、ＡＡＶ２ベクターは、光受容体を効率的に標的とせず、そして、前述したように、光受容体は、ＬＣＡ５、及び、その他の大半の遺伝性網膜変性の主要な細胞型を含む。このため、進化的デザインで生成させたベクターであるＡＡＶ７ｍ８を選択した。このベクターは、多様な種（マウス、及び、非ヒト霊長類（ＮＨＰ））の光受容体を効率的に標的とし、そして、異なる投与経路を使用する、ことを示した。
【０１２６】
本明細書で報告した有効性として、処置した動物の視覚的刺激を使用して進む能力の改善、瞳孔測定で認められた脳に至る視覚経路の回復、光受容体アポトーシスの減少、及び、当該網膜の外側でのロドプシンの存在など、この細胞型に特徴的な形態及びマーカーを有する機能的光受容体の保存がある。処置したＬｃａ５ｇｔ／ｇｔ光受容体は、外節ディスクが積み重なった外節が保存された、厚い外核層を示す。このことは、未処置のＬｃａ５ｇｔ／ｇｔ網膜とは著しく対照的であり、網膜は、１９歳３ヶ月までに隣接しない光受容体核の単一列にまで減少した。改善は、永続的ではなかった。しかしながら、それらは、少なくとも３ヶ月間持続し、その時点で、未処置のＬｃａ５ｇｔ／ｇｔマウスには光受容体が残存していない。網膜電図、及び、ＭＥＡの結果は、光受容体の伝達に成功すると、ＬＣＡ５遺伝子療法が、桿体と錐体光受容体の双方で媒介した応答を、少なくとも部分的に回復できる、ことを示している。細胞の応答は、様々な神経節細胞型の活性を反映する応答だけでなく、未処置のＬｃａ５ｇｔ／ｇｔ網膜で認められる支配的なメラノプシン応答の反転を含んでおり、ほぼ正常な動態を有している。これらの結果は、瞳孔測定と視覚行動の知見を補完するものであり、また、処置効果をさらに特徴付けて最適化することを目的とした将来の研究（低照度条件での視覚行動の研究を含む）のフレームワークを提供する。これらのデータは、Ｌｃａ５ｇｔ／ｇｔマウスで使用したのと同様のヒトでの遺伝子増強アプローチが、視力を改善する見込みがあることを示している。治療介入をさらに最適化して、さらに永続的な救済効果を取得することが可能となり得る。導入遺伝子カセットの構成要素（プロモーターなど）、及び、処置する網膜の領域を変化させることで、さらなる利益につながり得る。投与研究は、治療効果に最適な用量を特定する。ＬＣＡ５を持たない患者が、成人期を通して光受容体を保持し得るという事実（マウスでは、その生涯の初期に光受容体を喪失する）は、Ｌｃａ５−／−マウスと比較して、ＬＣＡ５ヒトの方が絶好の機会が大きくなり得る、ことを示唆している。最長３０年間、中心窩外核層にＬＣＡ５を持たないヒトで、光受容体が報告されている。遺伝子療法を成功させるには、影響を受けた細胞が存在する必要があるため、このことは重要である。ＬＣＡ５変異を有する成人において保持された光受容体が、正常な視力の個体に由来する光受容体と同様の光応答性の時間的パターン（振幅は減少したが）を示す、ことを我々は実証できた。これらの結果は、構造的及び生理学的欠陥にもかかわらず、ＬＣＡ５患者の残存光受容体が機能的である、ことを示している。ＬＣＡ５変異患者に由来するｉＰＳＣ−ＲＰＥの主要な繊毛は、コントロール細胞に由来する繊毛よりも、はるかに少なかった。Ｌｃａ５ｇｔ／ｇｔマウスにおける光受容体での絨毛の欠陥は、遺伝子増強療法で修正でき、そして、繊毛の数を、正常レベルに増やすことができるという事実は、この条件を有するヒトに認められる絨毛の欠陥を改善し得ることを示唆している。
【０１２７】
Ａ．組換えＡＡＶ
組換えＡＡＶを、ＡＡＶ２よりも効率的に光受容体に感染することが知られているＡＡＶ７ｍ８カプシドを使用して、ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅ
ｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｏｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（ＣＡＲＯＴ）にて生成した（Ｄａｌｋａｒａ  Ｄ，  Ｂｙｒｎｅ  ＬＣ，  Ｋｌｉｍｃｚａｋ  ＲＲ，  Ｖｉｓｅｌ  Ｍ，  Ｙｉｎ  Ｌ，  Ｍｅｒｉｇａｎ  ＷＨ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｕｔｅｒ  ｒｅｔｉｎａｌ
ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｖｉｔｒｅｏｕｓ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  （２０１３）  ５（１８９）：  １８９ｒａ７６．  ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００５７０８．）。ヒト（ｈ）野生型レベルシリンをコードする最適化ｃＤＮＡ（ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５）を、最適なコドンを使用するために個別のデザインを行い、そして、ＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）で合成した。ＬＣＡ５  ｃＤＮＡを、イントロン１配列とサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーが隣接するハイブリッドニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）エクソン１の制御下に置いた（図１Ａ及びＩＥ）。ウシ成長ホルモンポリ（Ａ）が、このｃＤＮＡに続いた。ＡＡＶ２逆向き末端反復由来の逆パッケージング（すなわち、非導入遺伝子を含む）ベクターを防ぐために、長いスタッファー配列を含んでいた。これらのベクターを、トリプルトランスフェクションで作成し、そして、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含み、そして、０．００１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８（ＰＦ６８）からなる賦形剤で製剤化した。例えば、Ｍｉｚｕｋａｍｉ，  Ｈｉｒｏａｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｄｉｓｓ．  Ｄｉ−ｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ，  １９９８．を参照されたい。コントロールベクターには、ＬＣＡ５  ｃＤＮＡの代わりに、改善した緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）ｃＤＮＡを組み込んだ。
【０１２８】
これらのｒＡＡＶを、ウェスタンブロットによって、適切な大きさのトランスジェニックタンパク質の発現について試験をした。８４３１個の細胞を、２×１０６細胞／ウェルで播種した。播種の２日後、これらの細胞に、ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５（または、コントロールとして、ＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡ．ＥＧＦＰ）を、１×１０５または５×１０５ｖｇで形質導入した。４８時間後に、細胞を回収し、そして、電気泳動とウェスタンブロットのために処理した。抗体は、ＬＣＡ５ウサギポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ，Ｒｏｓｅｍｏｎｔ，ＩＬ）を含んでおり、そして、シグナルを定量して、ＧＡＰＤＨ免疫シグナルで正規化してバックグラウンドとタンパク質負荷との違いについて各数値を補正する。
【０１２９】
当該ＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡ．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５ウイルスは、８４３１個の細胞において、ＬＣＡ５導入遺伝子の効率的な発現を促すことができる。ＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡ．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５で感染させた後に、予測した約８１ｋＤＡレベルシリンタンパク質が産生したことは、用量依存的な応答を実証している。
【０１３０】
実施例２：ＬＣＡマウスモデルＬｃａ５−／−マウスの研究
Ｌｃａ５ｇｔ／ｇｔマウスモデルにおける遺伝子増強療法の概念実証の開発には、幾つかの課題が伴う：１）網膜変性の変化は非常に初期に始まり、急速に進行するため、新生児マウスでは治療介入を行う必要がある；２）これは光受容体特異的疾患であるので、光受容体を効率的に標的とする組換えＡＡＶベクターを使用しなければならない。ＲＰＥ細胞を標的とする動物及びヒトの研究で広く使用されているＡＡＶ２ベクターは、同等の用量で感染させた後において、異なる血清型の形質導入比較が示したように、その他のＡＡＶ血清型ほど効率的に光受容体を標的にしない。理想的には、最終的にヒトの臨床試験に移行できる治療法を開発する必要があり、及び、３）網膜及び視覚機能は、ベースラインでは非常に低く、スコア付けが困難であり、これらの改善を、正確に特定及び定量するアウトカム評価を開発する必要がる。本明細書では、我々は、指向進化に応じてデザインし
た組換えＡＡＶベクター（ＡＡＶ７ｍ８）を使用して、コドン最適化ヒトレベルシリンをコードするｃＤＮＡを提供した。ＡＡＶ７ｍ８を使用して、生涯の初期の段階で疾患を有する光受容体にＬＣＡ５を送達することで、遺伝子増強療法が、Ｌｃａ５ｇｔ／ｇｔマウス網膜の構造的改善と、その視覚の機能的改善との双方をもたらす、ことを我々は示している。
【０１３１】
レベルシリンは、視細胞の結合繊毛に局在する（２２）。この結合繊毛は、タンパク質と膜小胞の選択的輸送を支える視細胞体内節とアンテナ様外節との間の移行帯である。したがって、当該結合繊毛は、毛様体微小管トラック、または、鞭毛内輸送（ＩＦＴ）に沿った双方向タンパク質輸送を支える導管である。定量的親和性プロテオミクス（アフィニティー精製、質量分析、及び、バイオインフォマティクス分析）と遺伝子組換えマウスモデルとの双方を使用して、Ｂｏｌｄｔ  ｅｔ  ａｌは、ＬＣＡ５変異が、ＩＦＴに干渉することを実証しており（２２）、これにより、光受容体外節の発達における早発型異常を招き、そして、光受容体、アレスチン、及び、オプシンで特異的に発現する２つの異なるタンパク質を正しく輸送できなくする。マウスにおけるＬｃａ５遺伝子のノックアウトは、網膜変性の表現型をもたらした。当該Ｌｃａ５−／−マウスは、色素脱失した網膜の斑点を発達させ、外節を発達させることは決して無く、そして、光に対する錐体及び桿体のＥＲＧ応答を欠く。早期かつ急速に進行する網膜変性があり、２ヶ月齢までにＯＮＬに存在するのは、核の単一の（病的な）列だけである。（２２）したがって、当該Ｌｃａ５−／−マウスを、ＬＣＡの動物モデルとして利用した。
【０１３２】
成体のＬｃａ５ｇｔ／ｇｔ（Ｌｃａ５−／−）マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｕｒ，ＭＥ）から購入し、そして、きょうだい交配をして、系統を作成した。この研究で使用したすべての動物の遺伝子型の検証を行った（補足方法を参照されたい）。マウスを、１２時間の明／１２時間の暗のサイクルに供し、そして、食餌／水は自由に与えた。この研究は、連邦政府、及び、当局の規制に準拠して実施した。
【０１３３】
仔マウスのコホートについては、以前に報告がされたようにして（２８）、網膜下注射を、新生児マウスの片側について行った。生後５日目（ＰＮ５）のマウスの麻酔は、低体温法で行った。生後１５日目（ＰＮ１５）に、ケタミン／キシラジンで動物に麻酔をかけた。表１は、コホートごとに使用した動物の数を示している。
【０１３４】
ＡＡＶ７ｍ８の硝子体内注射も行っており、この注射は、このベクターが、硝子体側から標的光受容体に向けてマウス網膜に浸透することが以前に報告されていたことによる。（２５）ＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡ．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５を、コホート１に、１μｌで、合計で９．２０×１０９ｖｇを注射した（表１）。この注射液は、５％ｖ／ｖのＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡ．ＥＧＦＰを含んでおり、これにより、強化した緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）の存在により、後の時点で確実に注入領域を特定できた。さらなる動物に対して、偽の注射を行い（コホート２）、ＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡ．ＥＧＦＰだけの注射を行い（コホート３）、または、コントロールとして注射せずに維持した（コホート４）。注射後は、離乳するまで仔マウスを、母親のマウスの元に戻した。
【表１】
2020510433.tif 000003
【０１３５】
注射をして約１ヶ月に検眼鏡検査を実施して、中膜が透明で、網膜が剥離しておらず、したがって、外科的合併症が無いことを確認した。角膜または硝子体の混濁を有する動物は、さらなる研究から除外した。
【０１３６】
マウスのコホートを飼育及び研究をして、生後早期（ＰＮ５）、及び、若年期の時点（ＰＮ１５）で注射を行った（表１）。注射による、合併症はほとんど認められなかった。ＰＮ５で注射した後、大部分の動物には、さらなる試験を妨げる角膜または硝子体の混濁は認められなかった。混濁が認められた若干の動物を、さらなる分析から除外した。
【０１３７】
このＡＡＶ７ｍ８．ＣβＡ．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５ウイルスを、硝子体内（ＩＶＴ）及び網膜下（ＳＲ）の双方に対して投与した後（それぞれ、図１Ｃ及び１Ｄ）に、マウス網膜におけるヒトＬＣＡ５導入遺伝子の効率的な発現を促進することができた（図１Ａ及び１Ｂ）。ウェスタンブロット分析は、ＰＮ２０の、Ｌｃａ５ｇｔ／ｇｔにおいて、及び野生型マウスにおいて、ＡＡＶ７ｍ８．ＣβＡ．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５を眼内送達した後に、予測された約８１ｋＤａのＬＣＡ５タンパク質の産生を示している（図１Ｂ）。免疫蛍光分析は、野生型成体網膜のＯＮＬ、内節（ＩＳ）、及び、結合繊毛（ＣＣ）でのレベルシリンタンパク質の存在を示している（図１Ｅ）。Ｌｃａ５ｇｔ／ｇｔ網膜において、ＡＡＶ７ｍ８．ＣβＡ．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５を、硝子体内または網膜下に注射をした後に、レベ
ルシリンは、ＣＣならびにＩＳ及びＯＮＬに認められている（図１Ｇ及び１Ｈ）。対照的に、偽注射したＬｃａ５ｇｔ／ｇｔ網膜では、レベルシリンは認められない（図１Ｆ）。加えて、ＩＶＴ注射した後に、相当数のミュラー細胞が、レベルシリンを産生する（図１Ｇ）。
【０１３８】
実施例３：網膜／視覚機能の試験
視覚及び網膜機能の試験として、光合図水迷路（注射後２〜３ヶ月）、瞳孔測定（注射後２．５ヶ月）、多電極アレイ（注射後３ヶ月）、及び、実施例２に示した、または、記載したマウスを使用した網膜電図検査を行った。次に、実施例４に記載したようにして、組織病理学、及び、免疫蛍光について、網膜を評価した。組織分析も徹底して行った。
【０１３９】
Ａ．網膜電図法
左眼に賦形剤、右眼にＡＡＶ７ｍ８．ＣβＡ．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５を、ＰＮ５で、硝子体内注射をした、８匹のＬｃａ５ｇｔ／ｇｔマウス、５匹の野生型動物、及び、１６匹のＬｃａ５ｇｔ／ｇｔマウスのＥＲＧを記録した。Ｌｃａ５ｇｔ／ｇｔを注射していないコントロールの眼、または、賦形剤を注射したＬｃａ５ｇｔ／ｇｔの眼（合計で３２眼）は、検出可能なＥＲＧ応答を生成しなかった。ＡＡＶ７ｍ８．ＣβＡ．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５を注射した１６眼の内、４眼は、シグナルの桿体媒介と一致する暗順応状態での薄暗い閃光に対するＥＲＧ応答、ならびに、小規模の野生型（ＷＴ）混合桿体−錐体ＥＲＧ波形に似た、より明るい閃光に対する混合桿体−錐体応答を示した（図Ｓ２）。光に順応したＥＲＧも、これらの眼で検出可能であることは、明所視応答の錐体媒介を示唆している。治療後の検出可能なＥＲＧの振幅は、ＷＴ振幅の２０〜２５％の範囲であった（図Ｓ２）。この結果は、一部の動物での遺伝子治療後の桿体と錐体の双方の視細胞機能の回復を示唆している。全分野に及ぶＥＲＧでの知見の不一致は、出生後初期に行われるこれらの技術的に困難な網膜下注射後に持続する不完全な網膜被覆、及び／または、組織損傷（白内障、未解決の剥離など）を反映している可能性がある。しかしながら、これらの結果は、規模や頻度は様々であるが、未処置のＬｃａ５ｇｔ／ｇｔの眼で観察した検出不能なＥＲＧとは劇的に異なっていた。Ｂ．水迷路誘導研究
【０１４０】
水迷路検査を実施して、５つのチャンバーの水迷路内に水没させたプラットフォームを含むチャンバーを特定する、各動物の能力を評価した（図１１）。この装置を、外部光のない部屋に置き、そして、試験前に光源をプラットフォームの直上に置いた。暗闇に適応したマウスを迷路の中央で放し、中断することなく６０秒を与えて、点灯したプラットフォームを見つけて、４本の足をすべて着地させた。
【０１４１】
マウスを暗順応させ、そして、薄明かりの手順下で試験を実施する前に、室内灯（約２００ルクス）でトレーニングを実施した。トレーニングの間に、６０秒の終わりに、マウスがプラットフォームを発見できなかった場合、実験者は、マウスをプラットフォームに誘導した。各試行では、ランダム選択を使用して、ライトとプラットフォームを異なるチャンバーに配置した。
【０１４２】
トレーニングパスの基準は、マウスが異なるチャンバーに逸脱することなく、適切なチャンバーに独立して進入し、そして、９回の連続試行の内、５回超で、６０秒以内にプラットフォームを登る能力として定義した。トレーニング合格基準が満たされた日に関係なく、すべてのマウスを５日間かけて訓練した。トレーニングで使用した手順と同じ手順を使用して、光源をさらに暗くするための一連のフィルターを使用して、テストを４日間かけて行った。フィルターの使用により、輝度は：１．０６×１０５、８．６９×１０３、５．８７×１０２  ｓｃｏｔ  ｃｄ  ｍ２であり、または、消灯時の輝度は、０  ｓｃｏｔ  ｃｄ  ｍ２であった。
【０１４３】
動物をトレーニングし、そして、生後２〜２．５ヶ月齢で、光合図水迷路で試験をした。光合図水迷路試験の結果は、ＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡ．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５網膜下または硝子体内注射群は、対照群よりも有意に優れたパフォーマンスを示した。（表２Ｂ。太字の値を参照されたい。図３）。表２Ａは、各コホートで分析を行い、そして、水迷路を使用して光レベルを指定するために試験した動物の数の生データを示す。表２Ｂは、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用した統計分析の結果を示す。処置した動物は、８．６９×１０３  ｓｃｏｔ  ｃｄ  ｍ２で試験に合格したが、コントロールの賦形剤を注射したコホートの動物ではそのようにならなかった（ｐ＜０．０１）。
【表２−１】
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【表２−２】
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【０１４４】
Ｃ．瞳孔光反射
瞳孔収縮の振幅は、連続する１０回の閃光／眼で測定した。閃光強度は、１，０００  ｓｃｏｔルクスであった。ＰＬＲを、刺激前直径の標準偏差の３を超えた閃光に続く、０．６〜１．２秒間隔内の瞳孔収縮応答の最大振幅を有する、と定義した。処置パラダイムを知らされていない科学者が、分析前に各動物のデータを評価して、各瞳孔が正確に追跡されている、と確認した。そうでない場合、その特定の動物は、さらなる分析から除外した。
【０１４５】
統計分析については、処置した（右）、及び、反対側の偽注射したコントロール（左）Ｌｃａ５−／−眼を、各光強度で比較した。処置した眼の収縮の正規化した振幅を、未処置の眼の収縮で除算して、応答の最大差分振幅（ＭＤＡＲ）の割合を得ることができた。ＭＤＡＲの割合が高いほど、治療介入に対する応答が強いことを示す。同じ年齢のさらなる未処置Ｌｃａ５−／−、及び、野生型（Ｃ５７Ｂ１／６）マウスを、それぞれ、ポジティブ及びネガティブコントロールとして使用した。未処置のＬｃａ５−／−、及び、Ｃ５７Ｂ１／６マウスのＭＤＡＲは、両眼の差異が最小限であったため、約０とした。
【０１４６】
さらなる分析では、異なるコホートのマウスの右眼の瞳孔収縮の振幅の大きさを評価した。したがって、収縮の振幅は、処置した、及び、未処置のＬｃａ５−／−マウスと、未処置のＣ５７Ｂ１／６マウスとの間で比較することができた。
【０１４７】
処置した眼と、コントロールの眼とを刺激して生ずる瞳孔光反射の振幅の分析は、網膜下または硝子体内のいずれかで、ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５で処置したＬｃａ５−／−マウスの眼の瞳孔反射の振幅が、未処置のコントロールＬｃａ５−／−動物と比較して、有意な（ｐ＜０．０５）改善があることを明らかにした（図２）。ＰＮ５でのいずれかの送達経路（図２Ａ、２Ｂ、２Ｈ、及び、２Ｉ）、及び、ＰＮ１５での網膜下送達の注射をした動物では、瞳孔光反射（ＰＬＲ）が大幅に改善されており、硝子体内送達による改善の傾向もあった（図２Ｈ及び２Ｉ）。
【０１４８】
Ｄ．多電極アレイ
５％（ｖ／ｖ）ＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡ．ＧＦＰを混ぜたＡＡＶ７ｍ８．ＣＭＶ／ＣＢＡ．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５（約９．８７×１０１０ｖｇ／眼）を片眼に硝子体内注射をして２．５〜３．５ヶ月後に、多電極アレイ（ＭＥＡ）試験を、５匹の動物で実施した。他方の眼に偽注射をして、ネガティブコントロールとして使用した。未処置で同年齢の５匹の野生型（ＷＴ）Ｃ５７Ｂ１／６マウスを、ポジティブコントロールとした。光に適応したマウスの網膜を、赤色光の下で切開し、そして、穿孔したＭＥＡチャンバーに神経節細胞を
下向きに設置した。外植片でのＧＦＰの存在により、光受容体のＡＡＶへの曝露を確認した。異なる強度の４５５ｎｍ光の更正した全視野閃光（色素励起効率約４０％：ロドプシン、及び、Ｍ−オプシン；約０．２％：Ｓ−オプシン）を、光刺激に使用した（０．１Ｈｚで２秒間の閃光、または、４Ｈｚで５０ｍｓの閃光）。Ｍａｔｌａｂ（ＭａｔＬａｂ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）のカスタムコードを使用して、データを分析した；スパイクの選別は、Ｐｌｅｘｏｎ  Ｏｆｆｌｉｎｅ  Ｓｏｒｔｅｒ（Ｐｌｅｘｏｎ，Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）で行った。ＰＮ５でのＡＡＶ７ｍ８．ＣβＡ．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５を、多電極アレイ（ＭＥＡ）分析を使用してプローブした。ＭＥＡを使用する理由は、それが、脳に送られる網膜の出力信号を測定し、光受容体機能を試験することに加えて、網膜の神経回路網に関する情報も提供するからである。ＭＥＡで試験した５つの網膜／動物の内、２つは明確に検出可能な桿体と錐体のＥＲＧを有しており（図Ｓ２の代表的な記録を参照されたい）、１つは残留している僅かな、約１０ＶのＥＲＧを有しており、そして、２つは検出可能なＥＲＧを有していなかった。ＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡ．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５を注射した５つの網膜の内の３つは、強い光応答を示し、１つは応答の中央値を示し、そして、１つはＭＥＡ試験で最小限の応答を示した（図５Ａ〜Ｄ）。応答は、暗所視強度で検出可能になり（４２〜１１２光子＊ｓ−１＊μｍ−２、または、平均で、８．２８ｅｌ  ｈｖ／μｍ２；４５５ｎｍ）、そして、２．００ｅ９光子＊ｓ−１＊μｍ−２という最も明るい明所強度で、強い応答が観察された。エンドオン照明の桿体と錐体の収集領域が、ピーク感度の波長で約１μｍ２であり２３、２４（ＥＲＧと我々のＭＥＡ実験の双方で、光が神経節細胞側から網膜に入射することに留意されたい）、及び、ロドプシンの４５５ｎｍの光、及び、Ｍ−及びＳ−錐体オプシンによる刺激の効率が、それぞれ、約６０％、５０％、０．３％である、２５〜２７と仮定すると、我々の実験で明確に検出可能な応答を生成する薄明かりは、桿体では、７０未満／秒／細胞の光異性化、Ｍ−錐体では、６０未満、そして、Ｓ−錐体では、約０．３の光異性化を生じるはずである。吸引ピペット記録からのデータは、この速度の色素励起桿体では、検出可能な光応答（最大の２０％を超える応答振幅）を生成できるが、錐体応答は、最も好ましい条件下（暗順応したＭ錐体を含む桿体−トランスデューシンノックアウト網膜）では、少なくとも２０倍小さくなると考えられ、また、桿体が支配的なマウス網膜では検出できないはずである２５、２６、２８（吸引ピペット記録におけるサイドオン照明の収集領域は、錐体では、約０．５μｍ−２であり、そして、錐体では、０．２μｍ−２である）。このように、我々の実験において、調光器の強度範囲での光応答の観察は、処置したＬｃａ５ｇｔ／ｇｔ網膜における桿体機能の回復を証明している。明るさの強度が大きい端部での応答は、錐体に由来するはずである（最も明るい強度は、Ｍ−、及び、Ｓ−錐体のそれぞれで、約１．００ｅ９と６．００ｅ６の光異性化／秒／細胞を生じ、少なくとも、Ｍ−、及び、Ｓ−錐体の双方を駆動できるものでなくてはならな���）。桿体／錐体駆動の応答については予想した通り、最も明るい刺激シリーズに曝露の後に、１回目の強度シリーズを終えた時点で（光に敏感な網膜は、暗暗視から最も明るい明所視の強度まで、約０．５ｌｏｇを増大して、少なくとも２回の強度シリーズ試験に供した）、暗所応答は消失したが、明所視応答は有意な影響を受けなかった（図５Ｃ及びＤ）。ＷＴ及び処置したＬｃａ５ｇｔ／ｇｔ網膜は、錐体応答を促すと考えられる強度で、４Ｈｚフリッカー刺激にも応答した（データ示さず）。偽注射した反対側の眼の網膜は、最小限の応答、乃至は、消失した応答しか示さず、高い自己発光性と顕著なメラノプシン応答を伴っていた。
【０１４９】
緩慢なメラノプシン駆動応答も、ＡＡＶ７ｍ８．ＣβＡ．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５で処置したＬｃａ５ｇｔ／ｇｔ網膜の双方で検出されており、そして、野生型マウスの（一連の内の最初の閃光後の回復が緩慢なため、２回目の閃光の開始時の発光率が上昇して出現する）メラノプシン応答は、未処置の網膜と比較して、処置した網膜では認められないようである。
【表３】
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【０１５０】
処置した２つのＬｃａ５−／−網膜は、注射後に損傷の徴候が認められ、そして、強い自己発光性があるにもかかわらず、光応答を示さなかった。
【０１５１】
ＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡ．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５で処置した網膜の応答は、未処置の野生型網膜のそれと同様であった。注射後の最短期間で試験をした処置済のある網膜の１つは、光感度の低下と、ＯＦＦ−、及び、持続性ＯＮ−応答の欠如を示した（図５Ｄの赤色の下向き三角形）。ＯＦＦ−応答の発生は、ＯＮ−応答と比較して、注射後により長い時間を必要とし、処置した１０の網膜で観察されたＯＦＦ−応答振幅における変動性の高まりと符合する。全領域の刺激下においてＷＴ網膜で識別可能なすべての神経節細胞型の機能が、スパイク選別した後のＬｃａ５ｇｔ／ｇｔ  ＡＡＶで処置した網膜で検出された（図Ｓ１０）。暗所視、及び、明所視刺激下で、最も明るい強度（ほぼ１００ｍＷ／ｃｍ２）までの強い応答を観察した。桿体／錐体駆動の応答で予想したように、最も明るい光へ曝露した後に、暗所視応答は消失したが、明所視応答は有意な影響を受けなかった（データ示さず）。
【０１５２】
ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５で処置した網膜の応答は、暗所視強度で検出可能になり（４２−１１２光子＊ｓ−１＊μｍ−２、または、平均で、８．２８ｅｌ  ｈｖ／μｍ２；４５５ｎｍ）、そして、２．００ｅ９光子＊ｓ−１＊μｍ−２の最も明るい明所視強度で強い応答が認められた。偽注射した反対側の眼に由来する網膜は、最小限の応答、乃至は、消失した応答を示した（データ示さず。コントロールＬｃａ５−／−）。ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５で処置した網膜における応答は、野生型マウスの網膜での応答と類似していた。最も明るい光（２Ｅ９  ｈｖ／ｃｍ２）に曝露した後に、フリッカー応答は、明所視応答が、有意な影響を受けなかったことを示す（データ示さず、Ｌｃａ５−／−処置した）。フリッカー応答強度シリーズ（３．５３Ｅ２−１．５２Ｅ６  ｈｖ／
ｃｍ２の代表的なＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡｈｏｐｔ．ＬＣＡ５で処置した網膜から始まる）は、光の強度が高まるにつれて、応答の振幅が増加する、ことを示す。最も明るい閃光後の桿体及び錐体の耐久性応答の試験は、野生型網膜で認められたのと同様に、錐体応答の持続性が示された。フリッカー応答試験は、野生型マウスの網膜と比較して、処置したＬｃａ５−／−網膜と同様の応答を示している。処置したＬｃａ５−／−網膜での桿体と錐体の発光率は、光強度の関数として、（コントロールの未処置のＬｃａ５−／−網膜とは対照的に）野生型網膜の発光率に近似する。
【０１５３】
応答動態は、ＷＴ網膜の応答動態と類似していた（データ示さず）。８〜２１光子＊ｓ−１＊μｍ−２で最初の応答が検出された最も感度の高いＷＴ網膜に対して、処置したＬｃａ５−／−の光感度はわずかに低かった（データ示さず）。全領域の刺激下においてＷＴ網膜で識別可能なすべての神経節細胞型（ＯＮ、ＯＦＦ、及び、ＯＮ／ＯＦＦ型）は、スパイク選別した後に、Ｌｃａ５−／−処置した網膜で検出された。ＷＴ及び処置したＬｃａ５−／−網膜は、３．５３ｅ２−２．００ｅ９光子＊ｓ−１＊μｍ−２で、４Ｈｚのフリッカー刺激に応答した（データ示さず）。すべての未処置のＬｃａ５−／−網膜は、光感受性である処置したＬｃａ５−／−網膜には存在しなかった明るい強度で緩慢なメラノプシン駆動応答を示した。知見の要約を、表３に示す。
【０１５４】
網膜電図、及び、ＭＥＡ実験で得た結果は、少なくとも一部の動物において桿体及び錐体機能の回復を示したが、これらの方法は、処置したマウスの４分の１に対してのみ有用なＥＲＧシグナルを生成したため、大半の動物での治療介入の効率の評価としては不十分であった。したがって、我々は、２つのさらなる方法、すなわち、瞳孔光反射（ＰＬＲ）と視覚挙動の分析に基づいて治療介入の有効性を評価したところ、まず、網膜電図よりも大きな感度を示し、そして、次に、Ｌｃａ５ｇｔ／ｇｔ網膜を、ＡＡＶ７ｍ８．ＣβＡ．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５で処置すると、脳に至る視覚経路を介して、当該網膜を越えて中継して伝わる光誘導シグナルをもたらす、ということを証明した。
【０１５５】
瞳孔光反射（ＰＬＲ）は、まず、光受容体から網膜神経節細胞へ、次に、脳のエディンガー−ウェストファール核へ、そして、最後に、虹彩の直径を制御する毛様体神経節を介して瞳孔括約筋に戻る信号の中継に依存している。偽注射したコントロールと比較して、ＡＡＶ７ｍ８．ＣβＡ．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５で処置したＬｃａ５ｇｔ／ｇｔマウスの眼のＰＬＲの振幅は、処置した眼とコントロールの眼の刺激後のＰＬＲの分析で有意（ｐ＜０．０５）に増加した（図２Ｃ）。ＰＮ５で硝子体内または網膜下に注射した動物で検出したＰＬＲが著しく改善されており（図２Ａ−２Ｂ及び２Ｅ−２Ｆ）、ほぼ野生型の応答が観察された（図２Ｄ）。ＰＬＲの振幅の統計的に有意な改善も、応答の最大差分振幅の比較を通じて示された（ＭＤＡＲ；図２Ｇ−２Ｉ；図Ｓ１）。ＡＡＶ７ｍ８．ＣβＡ．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５をＩＶＴまたはＳＲ送達した動物も、ＭＤＡＲによって定量したＰＬＲの大幅な改善を示した（図２Ｈ及び２Ｉ）。
【０１５６】
ＰＬＲは、網膜のシグナル伝達と機能を実証するが、形成された視覚に関する情報を提供しないため、我々は、前述したようにして、機能的視覚を測定するために、光合図水迷路試験を使用した。未処置の野生型（通常の視力の）マウスの大部分は、すべての光レベルで水迷路をうまく進んだが、未処置のＬｃａ５ｇｔ／ｇｔは、大きく機能が損なわれていた（表２、図３Ａ）。水迷路検査の結果は、ＩＶＴと網膜下の双方でＡＡＶ７ｍ８．ＣβＡ．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５を注射したＬｃａ５ｇｔ／ｇｔ動物は、少なくとも１つの光条件下で、統計的に有意な方法で、非注射のコントロールよりも優れた性能を示した。（表２；図３）。ＰＮ５にて網膜下処置を受けた動物は、すべての照明試験条件（１．０６Ｅ＋０５、８．６９Ｅ＋０３、及び、５．８７Ｅ＋０２  ｓｃｏｄ  ｃｄ  ｍ−２）で、コントロールの賦形剤を注射したコホートよりも有意に改善された成功率を示した（ｐ＜０．０１）。動物にＰＮ１５（ＩＶＴまたはＳＲ）を注射したとき、改善は最小限であった
（図３）。マウスが、所定の光合図だけを使用したことを確認するために、試験を無光条件（０．００  ｓｃｏｔ  ｃｄ  ｍ２）で行ったところ、９０％を超えるマウスが試験に合格できなかった（正常視力のマウスを含む、図３Ｂ）。
【０１５７】
実施例４：眼の組織学、組織病理学、免疫蛍光、及び、ＴＵＮＥＬアッセイ
ＡＡＶ７ｍ８．ＣβＡ．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５で処置した後のＰＮ５でのＬｃａ５ｇｔ／ｇｔ光受容体の組織学的救済を、光変換カスケードの適切な機能に関連する分子の評価と構造的測定の双方を通じて評価した。実施例２及び３に記載の動物を、３ヶ月齢で安楽死させた。眼球を摘出し、そして、網膜切片を、Ｂｏｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．が報告した方法の変法で評価した。（２２）組織を、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定し、そして、凍結、及び、凍結切片の作成前に、３０％スクロース／ＰＢＳで凍結保護した。病理組織学は、４’、６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，  ＰＡ）染色切片の検査、及び／または、ヘマトキシリン、及び、エオシンでの染色によって分析した。免疫蛍光研究のために、切片を、ブロッキング溶液の存在下で、抗レベルシリン（１：３００、（１２、２２））とインキュベートし、洗浄してからＣｙ３結合二次抗体で処理した。使用した追加の抗体は、抗ロドプシン（１：５００，Ｌｅｉｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、抗赤色／緑色錐体オプシン（１：２５０，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）、抗アセチル化チューブリン（１：１，０００，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）であった。染色した切片を、ＤＡＰＩ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，  Ｈａｔｓｆｉｅｌｄ，  ＰＡ）を含有するＣｉｔｉｆｌｕｏｒ封入剤でカバースリップした。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ｄＵＴＰニックエンドラベリング（ＴＵＮＥＬ）アッセイキットを使用して、製造業者（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，  ＣＡ）の推奨に従って、ＴＵＮＥＬ染色を行った。落射蛍光及びＡｘｉｏ−Ｖｉｓｉｏｎ  ４．６ソフトウェアを搭載したＺｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｉｍａｇｅｒ  Ｍ２顕微鏡、及び、共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｌｕｏｖｉｅｗ  １０００，Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ、ＵＳＡ）で、切片を評価した。ＦＥＩ−Ｔｅｃｎａｉ  Ｔ１２  Ｓ／ＴＥＭを使用して、指定した組織サンプルに対して、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を実施した。
【０１５８】
ＰＮ５でＡＡＶ７ｍ８−ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５を注射し、ＰＮ１５で分析をした眼の免疫蛍光分析を行ったところ、チューブリン陽性の外節の基部と共局在するレベルシリンを示した。硝子体内注射後、レベルシリンは、網膜全体に分布しており、ＰＮ９５の光受容体はほぼ皆無であった。対照的に、レベルシリンは、未処置のＰＮ１５及びＰＮ９５  Ｌｃａ５−／−網膜には存在していなかった。
【０１５９】
ヘマトキシリン、及び、エオシンで染色処置した網膜切片とコントロールの網膜切片とを、ＰＮ４０対ＰＮ９９で、ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５（５％ｖ／ｖ  ＡＡＶ７ｍ８．ｅＧＦＰ）の硝子体内（ＩＶＴ）または網膜下（ＳＲ）に注射した後の結果を、偽注射と比較した。ヘマトキシリン、及び、エオシン染色（Ｈ＆Ｅ）網膜の顕微鏡写真は、ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５のＩＶＴまたはＳＲのいずれかの注射後に、３ヶ月の時点（ＰＮ９９）で、内節／外節（ＩＳ／ＯＳ）、及び、ＯＮＬが、保存されていることを示した（データ示さず）。対照的に、偽注射したコントロール網膜には、ＰＮ９９で、そのような層は認められない（データ示さず）。さらに、レベルシリンは、処置した網膜で検出されたが、偽処置したコントロールの網膜では検出されなかった（データ示さず）。ＯＮＬにおけるロドプシンの持続的発現も、免疫蛍光分析によって確認された（データ示さず）が、処置した眼だけに認められた。
【０１６０】
ＰＮ５で、ＡＡＶ７ｍ８．ＣβＡ．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５を、ＩＶＴまたはＳＲ注射で処置した網膜の視細胞層の厚みは、コントロールの網膜よりも有意に大きかった（図４）。
網膜下注射で処置した網膜のＡＡＶに曝露された、または、曝露されていない網膜の領域の間の厚さにも顕著な境界線があった（データ示さず）。光受容体層の保存は、最新の時点（ＰＮ９９）まで持続した。厚みの増大は、外核層の列数の増加と、内節及び外節の存在に起因するものであった（図４）。このことと符合して、特に治療介入をして最初の１ヶ月以内に、ＴＵＮＥＬラベリングで判断したとき、ＡＡＶ．ＬＣＡ５で処置した網膜と比較して、コントロールでは、死滅しかかった光受容体の割合が非常に高かった（データ示さず）。
【０１６１】
注射をして１〜３ヶ月で、ＰＮ５にＡＡＶ７ｍ８．ｈＬＣＡ５を注射したＬｃａ５−／−マウス網膜を評価したところ、外核層の厚さの増大が明らかになった（図５Ａ及び図９）。免疫蛍光分析は、レベルシリンが、ＡＡＶ７ｍ８．ｈＯＰ．ＬＣＡ５で処置したＬｃａ５−／−網膜のチューブリン陽性外節の基部と共局在することを明らかにした（図１Ｍ）。未処置のＬｃａ５−／−網膜では、生後１ヶ月で数多くのＴＵＮＥＬ陽性細胞があったが、ＡＡＶ７ｍ８．ｈＯＰＴ．ＬＣＡ５で処置した網膜では有意に少なかった（図６Ｂ及び６Ｃ）。ＴＵＮＥＬ陽性細胞の数は、これらの動物が、３ヶ月齢になるまでに減少した（図６Ｄ及び６Ｅ）。コントロール（未処置）の網膜における未処置のＬｃａ５−／−網膜で経時的に変性する細胞の大部分は、ロドプシン陽性細胞がＡＡＶ処置した網膜にだけ認められるという事実が示すように、光受容体であった（図６Ｂ）。免疫蛍光分析は、この結果を確認しており（青色のＤＡＰＩ染色したＯＮＬを参照されたい）、そして、３ヶ月の時点で持続するロドプシンの増加（赤色染色）を示した（図６Ｄ）。ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５を注射した後に、光伝達特異的分子の位置において、光が媒介する変化の証拠を認めた（図１０）。
【０１６２】
ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ．ＬＣＡ５で処置した網膜の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）は、積み重ねられた外節ディスク、原発性絨毛に典型的な９＋０微小管アレイ（図７Ｂ）、及び、結合繊毛（図７）を備えた、外節の詳細を示した。対照的に、未処置のＬｃａ５−／−網膜は、結合繊毛と外節との双方を欠いていた。未処置の網膜には外節がなく、そして、濃縮核と視細胞小器官の残骸のみを伴う光受容体の大規模な変性を示す。コントロールの未処置の網膜、または、偽注射した網膜には、無秩序に変性した視細胞体だけが存在していた。
【０１６３】
ＰＮ５にＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５で処置して暗順応した成体Ｌｃａ５ｇｔ／ｇｔ網膜の光刺激は、光伝達タンパク質の正常な転座パターンを、外節に導入した。アレスチンは、ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５で処置した網膜に光を曝露した後に、適切に移行する。このような挙動は、ＩＳ／ＯＳの変性が故に、コントロールの網膜では評価できない。このデータは、野生型（ＷＴ）ｈＬＣＡ５  ｃＤＮＡを送達した後のマウス網膜における鞭毛内輸送欠陥の回復を反映している。
【０１６４】
Ｌｃａ５−／−マウスモデルにおける遺伝子増強療法の概念実証の開発には、幾つかの課題が伴う：１）網膜変性の変化は生涯の初期に始まり、急速に進行するため、新生児マウスでの治療介入を行う必要がある；２）これは光受容体特異的疾患であるので、光受容体を効率的に標的とする組換えＡＡＶベクターを使用しなければならない。ＲＰＥ細胞を標的とする動物及びヒトの研究で広く使用されているＡＡＶ２ベクターは、その他のＡＡＶほど効率的に光受容体を標的にしない（２３、２４）。理想的には、最終的にヒトの臨床試験に使用できる試薬を使用する必要があり、及び、３）網膜及び視覚機能は、ベースラインでは測定が困難なほど低レベルであり、これらの改善を反映するアウトカム測定を開発する必要がある。本明細書では、指向進化に応じてデザインした組換えＡＡＶ、ＡＡＶ７ｍ８（２５）を使用して、天然のヒトレベルシリンをコードするｃＤＮＡの送達後の有効性を試験した。このベクターが、硝子体内送達後に光受容体を効率的に標的にする、ことが他で報告している（２５〜２７）。ＡＡＶ７ｍ８を使用して、ｈＬＣＡ５  ｃＤＮ
Ａを生涯の初期の段階で疾患を有する光受容体に送達することで、遺伝子増強療法が、Ｌｃａ５−／−マウス網膜の構造的改善と、その視覚の機能的改善との双方が実現した。
【０１６５】
実施例３及び４では、Ｌｃａ５−／−マウスにおけるＡＡＶ７ｍ８媒介遺伝子増強療法が、網膜、及び、視覚機能、そして、網膜構造をも救済することを実証した。
【０１６６】
本実施例で報告した有効性として、視覚的合図を使用して進行する、このモデルの改善した能力、多電極アレイ（ＭＥＡ）が示した桿体及び錐体視細胞応答の回復、アポトーシス細胞死の減少（すなわち、光受容体の保存）、及び、正常に機能する光受容体に特徴的な細胞生物学的及び物理的特徴の存在、例えば、網膜の外側におけるロドプシンの存在、及び、積み重ねられた外節ディスクを用いた正常に見える外節の発達が含まれた。ＭＥＡの結果は、注射を成功裏に行い、そして、注射後に十分な時間を与えて、トランスジェニックタンパク質を発現し、及び、桿体／錐体外節の機能を回復すると、遺伝子治療が、変性網膜細胞を、ＷＴ状態とほとんど区別できない状態にまで回復させる、ことを示した。さらに、野生型ＬＣＡ５の送達は、光受容体を変性から保護した。未処置のＬｃａ５−／−網膜は、３ヶ月齢までに、一列の病的な光受容体にまで減少したが、ＡＡＶで処置した当該領域は、後に内節及び外節を備える厚みのある外核を有していた。これらの利点は、少なくとも３ヶ月持続した−とりわけ、この年齢までに、未処置のＬｃａ５−／−マウス網膜に光受容体が残存していないことを考慮すると、非常に重要な発見である。このデータは、Ｌｃａ５−／−マウスで使用したものと同様のヒトにおける遺伝子増強アプローチによって、視力が改善することを示唆した。
【０１６７】
実施例５：ヒトの研究：瞳孔光反射試験
ＩＲＢ承認プロトコル（＃８１５３４８）に関するインフォームドコンセントを書面で得た後に、試験を実施した。瞳孔応答を、Ｐｒｏｃｙｏｎ  Ｐ３０００瞳孔計、及び、ＰｕｐｉｌＦｉｔ６ソフトウェア（Ｍｏｎｍｕｔｈｓｈｉｒｅ，ＵＫ）で、両眼について、同時に記録した。光に対する瞳孔応答を、１０  ｌｕｘの緑色光刺激を、０．２秒間、右眼にあてた後に、暗間隔の後に記録した。２５フレーム／秒でビデオ画像を捕捉する赤外線感知カメラは、４０ミリ秒ごとに、両眼の瞳孔径を測定が可能である。
【０１６８】
瞳孔光反射試験を実施して、ホモ接合型ＬＣＡ５変異を有する成人に存在する残存光受容体における機能の証拠の有無を判定した。図８に示すように、瞳孔光反射は、この個体に存在しており、正常な視力を持つ個体と同じ時間的順序であった。しかしながら、正常な視力の個体と比較して、応答の振幅はかなり減少していた。
【０１６９】
実施例６：ＬＣＡ５の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）モデル
マウス救済研究のヒトへの橋渡しを支援するために、我々は、正常な視力を有する個体、及び、ＬＣＡ５変異によりＬＣＡに罹患した個体から研究目的で生成したヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）系統を研究した。最近、ｉＰＳＣ由来の網膜色素上皮（ＲＰＥ）が、胎児及び成人のＲＰＥと比較して、分泌、遺伝子発現、及び、成熟特性によって、分極した上皮の機能的表現型を再現する、ことが報告されている２９。これらの細胞は、繊毛生物学での欠陥に関連する疾患のメカニズムを理解する上で大いに有望である３０、３１。本明細書で、我々は、ｉＰＳＣを、ＲＰＥ細胞に分化させ（図１２Ａ）、そのプロセスがニューロン／視細胞を生成したとき以上に短時間で、さらに効率的に、繊毛細胞の評価を可能にした（図Ｓ１２）。我々は、ＬＣＡ５遺伝子発現を評価し、そして、ＬＣＡ５  ｍＲＮＡを、影響を受けていないｉＰＳＣ由来のＲＰＥで発現し、そして、ＬＣＡ患者のＲＰＥでのＬＣＡ５の発現レベルを、コントロールと比較して、有意に減少させることを示した（図１２Ｂ）。毛様体分布を測定したところ、ＬＣＡ５患者由来のｉＰＳＣ−ＲＰＥに存在する繊毛は、正常視力の個体に由来するＲＰＥよりも著しく少なかった（図１２Ｄ〜Ｅ）。ＬＣＡ５−ｉＰＳＣ−ＲＰＥを、ＡＡＶ７ｍ８．ｈｏｐｔ−ＬＣＡ５で処理す
ると、レベルシリンタンパク質の産生を招き（図１２Ｃ）、そして、ＡＡＶ７ｍ８．ＬＣＡ５で処置した個体、及び、正常視力の個体のＲＰＥ細胞に匹敵する数の繊毛をもたらした（図１２Ｄ−Ｆ）。
【０１７０】
ＬＣＡ５変異を有する２名の異なる発端者から署名済みのインフォームドコンセント（ＩＲＢ承認プロトコル＃８０８８２８）を得た後に、末梢血単球（ＰＢＭＣ）を採取した。１名の発端者、ＪＢ６０５は、ＬＣＡ５  Ｇｌｎ２７９Ｓｔｏｐ  ＣＡＧ＞ＴＡＧ  ｈｅｔ、及び、Ｌｙｓ１７２ｄｅｌ４ｃｔｃＡＡＡＧｈｅｔの複合ヘテロ接合体であり；もう１名、ＪＢ５９０は、ＬＣＡ５ｃ．８３５Ｃ＞Ｔｐ．Ｑ２７９Ｘのホモ接合体であった。野生型細胞は、個々のＰＢＷＴ４．６に由来するものであった。誘導した多能性幹細胞株は、３名の個体のそれぞれから生成した。これらのＰＢＭＣを、サイトカインとホルモンを補充したＱＢＳＦ−６０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ．ＣＡ）培地からなる増殖培地で培養した。細胞が指数関数的増殖の段階に入るまで、７〜９日間、２〜３日ごとに、培地を補充した。
【０１７１】
リプログラミングのために、ＯＣＴ４、ＫＬＦ４、ＳＯＸ２、及び、ｃＭｙｃ  ｃＤＮＡ、ならびに、ＴｅｔＯ／ＣＭＶプロモーターで駆動するマイクロＲＮＡ  ３０２／３６７クラスターを送達するレンチウイルスベクターにて、ｒＴＴＡレンチウイルス、及び、ドキシサイクリン誘導性「幹細胞カセット」を用いて、拡大させたＰＢＭＣを形質導入した。細胞を、ポリブレン（５μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を補充した増殖培地で増殖させた。これらの細胞を、３７℃で、２０〜２４時間インキュベートした。次に、感染細胞を洗浄し、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（ＤＯＸ）を添加した増殖培地に入れた。４８時間後に、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、ベータ−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、４ｎｇ／ｍｌの基本的な線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、及び、１μｇ／ｍｌのＤＯＸ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）に、細胞を再懸濁し、次いで、マトリゲル被覆（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）マウス胚線維芽細胞プレート（ＭＥＦプレート）に移した。細胞を、この培地に１０日間残存させた後に、それらを、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２０％ノックアウト血清代替物、非必須アミノ酸、４ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ、０．００１％ベータ−メルカプトエタノール、ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン、及び、１μｇ／ｍｌのＤＯＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌａｓｂａｄ，ＣＡ）に移した。４週間後、ｉＰＳＣ−様コロニーを、手作業で採取し、そして、６継代にわたって、マトリゲル被覆ＭＥＦプレートで増殖させ、その後、少なくとも１５継代にわたって、０．１％ゼラチン被覆ＭＥＦプレートへと移した。ｉＰＳＣの特徴決定は、ＳＳＥＡ３＋、ＳＳＥＡ４＋、ＴＲＡ−１−６０、及び、ＴＲＡ−１−８１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に対する抗体を使用したフローサイトメトリーで測定された表面抗原発現、及び、多能性発現マーカー：ＤＭＮＴ３Ｂ、ＡＢＣＧ２、ＲＥＸ１、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ｃＭＹＣ、ＫＬＦ４などを含むＲＴ−ｑＰＣＲ分析に基づいた。ｉＰＳＣの核型分析を、Ｇバンディングで行って、目視可能な核型を生成した。これらの細胞が複数の異なる系統に分化する能力は、ＰＣＲ生殖層アッセイ（Ｑｉａｇｅｎ．Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＭＤ，ＵＳＡ）を用いて行った。
【０１７２】
Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化、線維芽細胞成長因子シグナル伝達経路の阻害、及び、Ｒｈｏ関連のコイルドコイル含有プロテインキナーゼシグナル伝達経路の阻害によって、特徴決定したｉＰＳＣを、ＲＰＥに分化した。ｇｅｌｔｒｅｘマトリックスに載せた８チャンバースライドで、プレート接着によって、増殖し、色素沈着した細胞を精製した。濃縮した細胞を、立方体形状の石畳の外観になるまで培養した。ｉＰＳ−ＲＰＥの特性を、遺伝子発現、免疫細胞化学、及び、顕微鏡検査で確認した。繊毛の長さを、ＡＲＬ  １
３Ｂ、及び、ペリセントリンの固定及び染色をした後に測定した。繊毛の長さを、Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｗｉｓｔａｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ）がデザインしたカスタムデザインソフトウェアを使用して、３次元で測定した。
【０１７３】
繊毛を、密度と長さについて、コントロール、及び、ＬＣＡ５  ｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞株で評価する。２名のＬＣＡ５患者に由来するＲＰＥ細胞に存在する繊毛は、野生型細胞株よりも著しく少ない。加えて、ＬＣＡ５由来株の繊毛は、野生型細胞の繊毛よりも著しく短い。
【０１７４】
ＬＣＡ５患者が、中心窩外核層を含む光受容体を、最大で３０年間保持できる、ことが以前から認められていた。（２１、２９）。遺伝子治療の成功には、細胞の存在が欠かせないので（たとえ病気であっても）、ＬＣＡ５光受容体は、治療に適し得る。ＬＣＡ５を有する成体に保持された光受容体が、正常な視力の個体の光受容体と同様の光応答性の時間的パターンを示した（振幅は減少したが）ことを本実施例が実証したという事実は、希望となるものである。これらの結果は、これらの異常な網膜の残存光受容体が、構造的及び機能的欠陥にもかかわらず生存可能である、という事実をさらに支持した。さらに、ＬＣＡ患者由来ｉＰＳＣ−ＲＰＥ細胞の繊毛は、野生型コントロール細胞の繊毛よりも著しく短かった。Ｌｃａ５−／−マウスの光受容体での絨毛の欠損が、遺伝子増強療法によって修正できるという事実は、この病態のヒトに存在する絨毛欠損を改善し得る、ことを示唆した。ｉＰＳＣ由来のＲＰＥ細胞の絨毛の欠損をインビトロで修正することを目的とした研究が、現在行われている。
【０１７５】
ＬＣＡ５を用いたヒトでの遺伝子増強療法は、その安全性と有効性を試験するために研究が行われている。この重度の盲目病態に対する適切なアウトカム測定法を開発する必要性に加えて、本出願は、救済を達成する上での制限の拡大を含めて、ヒト臨床試験の計画における幾つかの課題の解決策を提供した。Ｌｃａ５−／−マウスでは、新生児（ＰＮ５）マウスと若年（ＰＮ１５）マウスの双方で、救済を実証した。このマウスモデルでは、光受容体が早期に喪失するため、疾患の後期に治療介入は見られなかった。マウスモデルの発達の異常（光受容体の変性と一致する）は、疾患の発達要素がある、ことを示唆した。同様に、ヒトの病態にも発達要素がある可能性があった。上記したように、ＬＣＡ５を有するヒトでは、成人であっても、幾つかの黄斑光受容体の持続性についての証拠がある。（２１）これらの光受容体の機能を改善する方法を決定するための研究、ならびに、ＲＰＥ６５遺伝子治療の臨床試験に登録したヒトの皮質視覚の蘇生に成功したという事実に基づいて、何十年にもわたって視力の低下に悩まされた後であっても、ＬＣＡ５を有するヒトにおける視覚経路の蘇生の可否を決定するための研究が進められている。（４、３０、３１）
【０１７６】
実施例７：Ｌｃａ５−／−マウスの遺伝子型決定
以下のオリゴ類：ＬＣＡ−１３Ｆ６（共通Ｆ）ＧＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＴＡＣ（配列番号１３として含めた）；ＬＣＡ−１３Ｒ２（ＷＴリバース）ＴＧＣＴＴＴＣＣＡＡＡＧＴＡＡＧＣＡＣＡＡＡ（配列番号１４として含めた）を使用して、ゲノムＤＮＡを、ＰＣＲ増幅した。
【０１７７】
ｅｎ２．８ｒ（変異体リバース）ＣＣＴＧＧＣＣＴＣＣＡＧＡＣＡＡＧＴＡＧ（配列番号１５として含めた）。ＰＣＲは、５０℃のアニーリング温度、７２℃の伸長ステップで、３５サイクル実行した。予測した産物は、３５３ｂｐ（野生型）、及び、４３９ｂｐ（Ｌｃａ５−／−）であった。
【０１７８】
実施例８：ＡＡＶ７ｍ８．ｈＬＣＡ５の硝子体内注射は、Ｌｃａ５−／−マウスの光受容
体機能を、概ねＷＴレベルにまで回復する
早期に発症する視力喪失は、光受容体の健常性と機能に対して重要なタンパク質であるレベルシリンをコードする遺伝子であるＬＣＡ５の変異に起因する。光受容体の相体的保存があるので、ＬＣＡ５疾患は、遺伝子増強療法に適し得る。ＡＡＶ７ｍ８．ＣＭＶ／ＣＢＡ．ｈＬＣＡ５の硝子体内送達を使用する遺伝子増強療法の可能性は、試験したＬｃａ５マウスモデル（Ｌｃａ５−／−）において、多電極アレイ（ＭＥＡ）を使用して、光受容体と網膜機能を回復する。
【０１７９】
生後５日目に、Ｌｃａ５−／−マウスに対して、５％（ｖ／ｖ）ＡＡＶ７ｍ８．ＣＢＡ．ＧＦＰを混合したＡＡＶ７ｍ８．ＣＭＶ／ＣＢＡ．ｈＬＣＡ５（約９．８７×１０１０ｖｇ／眼）を硝子体内に注射した。反対側の眼には注射を行わず、ネガティブコントロールとして使用した。治療介入の３ヶ月後に、光に適応した条件下で、Ｌｃａ５−／−網膜を、赤色光の下で切開し、そして、有孔のＭＥＡチャンバーに神経節細胞側を下にして置いた。ポジティブコントロールとして、年齢が一致する未処置の野生型マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６）に対して、同じ解剖及び準備手順を行った。ＧＦＰの存在により、光受容体がＡＡＶに曝露されたことを確認した。暗所視及び明所視強度範囲での４５５ｎｍ光の更正した全視野閃光（０．１  Ｈｚで１０  ２秒閃光、または、４Ｈｚで４００  ５０ミリ秒閃光）を、光刺激に使用した（Ｍ−及びＳ−錐体の双方を標的として応答検出の機会を最大化するために青色光を使用しており、Ｍ−及びＳ−錐体の励起効率は、それに応じて、約４０％と０．２％とする）。Ｍａｔｌａｂのカスタムコードを使用してデータを分析し、Ｐｌｌｅｘｏｎ  Ｏｆｆｌｉｎｅ  Ｓｏｒｔｉｎｇを使用して、スパイク選別を行った。
【０１８０】
３ヶ月後に、無傷の網膜を有する眼の内、５個の内の３個が、強い光応答を実証しており、１個は、応答の中央値を示し、そして、１個は、ＭＥＡ記録を使用して試験したときに最小限の応答を示した。強い応答を示す３個の網膜では、暗所視範囲（４２〜１１２光子×ｓ−１×μｍ−２）で光応答が検出可能になり、そして、２．００×１０９光子×ｓ−１×μｍ−２の最も明るい明所強度まで、強い応答が認められた。一方で、注射していない反対側の眼の網膜での応答は、最小限のものか、ないしは、消失を示した。桿体／錐体駆動応答で予想したように、最も明るい刺激シリーズへ曝露した後に、暗所応答は消失したが、明所視範囲の応答は有意な影響を受けなかった。応答の動態と感度は、同一プロトコルで試験した５つのＷＴ網膜で認められたものと非常に似ていた（処置した網膜の感度は、最も感度の高いＷＴ網膜と比較してわずかに低く、桿体駆動応答を生成する最も暗い閃光は、８〜２１光子×ｓ−１×μｍ−２の範囲にあった）。注射の２ヶ月後に試験をした処置済網膜の１つは、より低い光感度（１．５２×１０４光子×ｓ−１×μｍ−２の明所視強度で開始した応答）を示しており、また、最も明るい曝露を受けた後に大半の応答が消失していた。このことは、標的タンパク質の十分な発現と、機能的な桿体／錐体外節の生成には、３ヶ月が必要であり得る、ことを示している。全視野刺激下でのＷＴ網膜で識別可能なすべての神経節細胞型（ＯＮ、ＯＦＦ−、及び、ＯＮ／ＯＦＦ型）は、スパイク選別後のＬｃａ５−／−処置した網膜で検出された。ＷＴ網膜と同様に、処置したＬｃａ５−／−網膜は、３．５３×１０２〜２．００×１０９光子×ｓ−１×μｍ−２の強度範囲で、４Ｈｚのフリッカー刺激に応答した。７個のコントロールの未処置Ｌｃａ５−／−網膜の内の１個だけが、残存する錐体機能を示し得る明るい明所視刺激で非常に弱い光応答を実証した。すべての未処置Ｌｃａ５−／−網膜は、光感受性処置したＬｃａ５−／−網膜には存在しなかった、明るい強度で緩慢なメラノプシン駆動応答を実証した。
【０１８１】
処置したＬｃａ５−／−網膜の内の２個は、注射後に傷病の兆候があり、強い自己発光性があるにもかかわらず、光応答を示さなかった。処置した網膜の１個は、注射後に傷病の明らかな兆候を示さなかったが、刺激強度の明るい側の端部（８．０７×１０８光子×ｓ−１×μｍ−２以上）で、非常に弱い光応答だけを示しており、このことは、標的タンパク質の低発現、及び／または、残存する弱い錐体機能の指標となり得る。
【０１８２】
注射が成功し、そして、標的タンパク質を発現し、及び、桿体／錐体外節の機能を回復するのに十分な注射後の時間が与えられると、遺伝子治療は、変性網膜細胞を、ＷＴ状態とほとんど区別できない状態にまで回復する。
【０１８３】
すなわち、ＬＣＡそれ自体が、最も重度の網膜変性疾患の１つであり、また、ＬＣＡ５は、このカテゴリで最も重度のサブタイプの１つである。大抵の場合、ＬＣＡ５患者は、生涯の早い段階で光の知覚のみを享受し、そして、眼振が故に、これらの超低視力の対象での視覚機能の構造研究や特殊試験を実施することさえ困難である。したがって、この疾患は、アプローチが難しいと考えられる。しかしながら、Ｌｃａ５−／−マウスの表現型は、ＬＣＡ５変異を有するヒトの臨床所見の多くを反映している。Ｌｃａ５−／−マウスの救済データは、ヒトにおけるのと同様の遺伝子増強法が、視力を改善するとの希望をもたらす。ヒトの臨床試験につながる前臨床試験と並行して、ＬＣＡ５網膜の構造と機能を正確に測定する方法論を開発して、臨床試験における遺伝子治療の効果を確実かつ正確に捕捉できるようにすることが重要である。このような研究と遺伝子治療の臨床試験は、この壊滅的な病態の処置につながるだけでなく、その他の重度の早期発症盲目状態への治療介入の効果を測定するための枠組みをも提供する。
【０１８４】
実施例９：ヒトにおけるＬＣＡ５疾患の予備分析
ホモ接合型ＬＣＡ５変異を有するヒト成人に存在する残存光受容体における機能の証拠の有無を判定するために、ＰＬＲ試験を行った。図Ｓ１１に示したように、ＰＬＲは、正常な視力を有する個体と同じ時間列で、この個体にも存在した。しかしながら、正常な視力の個体と比較して、応答の振幅はかなり減少していた。
【０１８５】
実施例１０：レベルシリンの喪失は、細胞モデル及び動物モデルにおいて、ＲＰＥ成熟と繊毛機能の調節不全を招く
レーバー先天性黒内障５（ＬＣＡ５）の視覚系に発生する病理学的変化である、レベルシリンをコードするＬＣＡ５遺伝子の発現の喪失に起因する疾患を調査した。これまでの研究は、神経網膜、特に、光受容体に対するレベルシリン欠乏の有害な影響を解明してきた。この研究は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の発達と機能に対する正常なＬＣＡ５発現の寄与に焦点を当てることで、ＬＣＡ５に至る病因メカニズムをさらに解明することを目的としたものである。
【０１８６】
２つの独立した実験パラダイムを実施した：１つは、正常な視力を有する個体とＬＣＡ５を有する個体の双方に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来するＲＰＥ細胞を生成して使用した。ＲＰＥ細胞の形態、色素沈着、細胞特異的マーカー、及び、原発性絨毛の特性を測定した。第２の方法は、ＬＣＡ５欠損のマウスモデル（Ｌｃａ５ｇｔ／ｇｔマウス）の網膜と比較して、野生型マウスの網膜の研究を評価した。空間時間的分化パターンを、ＬＣＡ５タンパク質の欠如に起因する視覚系で発生する変性と発達との間の変化を線引きするために、特徴決定した。
【０１８７】
それらの結果は、ヒトＲＰＥ細胞モデルと、生存しているマウスのＲＰＥの双方におけるＬＣＡ５欠損が、これらの細胞の発達に重大な変化を招く、ことを実証している。遺伝子発現分析を通じて、我々は、繊毛形成と鞭毛内輸送、色素沈着、及び、発達過程にあるＷＮＴシグナル伝達経路に関与する重要なタンパク質の調節不全を特定した。免疫染色は、ＬＣＡ５タンパク質機能の喪失に起因する成熟の変化と符合する上皮バリアの違いも特定した。
【０１８８】
、
この研究は、潜在的に、細胞内輸送の阻害による、または、間接的に、これらの細胞の成熟進行を遅延させることによる、色素沈着などのプロセスの変化を通じて、ＲＰＥにお
けるＬＣＡ５抑制という有害な効果を明らかにする。この研究において、我々は、伝統的に光受容体の機能不全に起因すると考えられている網膜病理におけるＲＰＥ細胞の潜在的な主要な役割を紹介する。
【０１８９】
本明細書で引用したすべての特許、特許公報、及び、その他の刊行物、ならびに、優先権出願である２０１７年３月１日に出願した米国仮特許出願第６２／４６５，６４９号、及び、２０１７年３月１０日に出願した米国仮特許出願第６２／４６９，６４２号は、本明細書の一部を構成するものとして援用する。同様に、本明細書に参照され、かつ、添付した配列表に認められる配列番号を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。本発明を、特定の実施形態を参照して説明してきたが、本発明の要旨から逸脱せずとも修正を加えることが可能である、ことは理解されよう。そのような修正は、添付した特許請求の範囲に該当する、ことを意図している。
【０１９０】
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は、数値識別子＜２２３＞の下にフリーテキストを含んでいる配列表に対して提供する。
【表４】
2020510433.tif 000007
【０１９１】
出典
１．  Ｒｅｄｍｏｎｄ  ＴＭ，  Ｙｕ  Ｓ，  Ｌｅｅ  Ｅ，  Ｂｏｋ  Ｄ，  Ｈａｍａｓａｋｉ  Ｄ，  Ｃｈｅｎ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｐｅ６５  ｉｓ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ
ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １１−ｃｉｓ−ｖｉｔａｍｉｎ  Ａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｖｉｓｕａｌ  ｃｙｃｌｅ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  （１９９８）  ２０（４）：３４４−５１．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ９８４３２０５．
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５．  Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＳＧ，  Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ  ＡＶ，  Ｒａｔｎａｋａｒａｍ
Ｒ，  Ｈｅｏｎ  Ｅ，  Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＳＢ，  Ｒｏｍａｎ  ＡＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｌｅｂｅｒ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ａｍａｕｒｏｓｉｓ  Ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ＲＰＥ６５  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  １５  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  Ａｄｕｌｔｓ  Ｆｏｌｌｏｗｅｄ  Ｕｐ  ｔｏ  ３  Ｙｅａｒｓ．  Ａｒｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  （２０１２）  １３０（１）：９−２４．  Ｅｐｕｂ  ２０１１／０９／１４．  ｄｏｉ：
ａｒｃｈｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１１．２９８  ［ｐｉｉ］
１０．１００１／ａｒｃｈｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．２０１１．２９８．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１９１１６５０．
６．  Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ  ＡＶ，  Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＳＧ，  Ｂｅｌｔｒａｎ  ＷＡ，  Ｓｕｍａｒｏｋａ  Ａ，  Ｓｗｉｄｅｒ  Ｍ，  Ｉｗａｂｅ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．
Ｈｕｍａｎ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｌｅｂｅｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ  ｓｈｏｗｓ  ａｄｖａｎｃｉｎｇ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｄｅｓｐｉｔｅ  ｅｎｄｕｒｉｎｇ  ｖｉｓｕａｌ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  （２０１３）．  Ｅｐｕｂ  ２０１３／０１／２４．  ｄｏｉ：  １２１８９３３１１０  ［ｐｉｉ］
１０．１０７３／ｐｎａｓ．  １２１８９３３１１０．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３３４１６３５．
７．  Ｂａｉｎｂｒｉｄｇｅ  ＪＷ，  Ｓｍｉｔｈ  ＡＪ，  Ｂａｒｋｅｒ  ＳＳ，  Ｒｏｂｂｉｅ  Ｓ，  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｒ，  Ｂａｌａｇｇａｎ  Ｋ，  ｅｔ  ａｌ．
Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｎ  ｖｉｓｕａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｌｅｂｅｒ’ｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  （２００８）  ３５８（２１）：２２３１−９．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １８４４１３７１．
８．  Ｗｅｌｅｂｅｒ  ＲＧ，  Ｐｅｎｎｅｓｉ  ＭＥ，  Ｗｉｌｓｏｎ  ＤＪ，  Ｋａｕｓｈａｌ  Ｓ，  Ｅｒｋｅｒ  ＬＲ，  Ｊｅｎｓｅｎ  Ｌ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ａｔ  ２  Ｙｅａｒｓ  ａｆｔｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ＲＰＥ６５−Ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｌｅｂｅｒ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ａｍａｕｒｏｓｉｓ
ａｎｄ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ｅａｒｌｙ  −  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ−Ｏｎｓｅｔ  Ｒｅｔｉｎａｌ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  （２０１６）  １２３（７）：  １６０６−２０．  ｄｏｉ：
１０．１０１６／ｊ．ｏｐｈｔｈａ．２０１６．０３．００３．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２７１０２０１０．
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ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｏｒｔｈ  ａｆｒｉｃａｎ  ｊｅｗｉｓｈ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：  ｈｕｍ
ａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎｉｔｉａｔｅｄ  ｉｎ  Ｉｓｒａｅｌ．  Ｈｕｍ
Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  （２０１０）  ２１（１２）：  １７４９−  ５７．  Ｅｐｕｂ
２０１０／０７／０８．  ｄｏｉ：  １０．１０８９／ｈｕｍ．２０１０．０４７．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２０６０４６８３．
１０．  Ｍａｇｕｉｒｅ  Ａ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｓ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｊ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｄ，  Ｗｅｌｌｍａｎ  Ｊ，  Ｈｉｇｈ  Ｋ，  ｅｄｉｔｏｒｓ．  Ｐｈａｓｅ  ３  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＡＡＶ２−ｈＲＰＥ６５ｖ２  （ＳＰＫ−ＲＰＥ６５）  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ＲＰＥ６５  ｍｕｔａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ．  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  Ｒｅｔｉｎａ  Ｓｕｂｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｄａｙ；２０１５；，  Ｌｏｓ  Ｖｅｇａｓ，  ＮＶ．
１１．  Ｒｕｓｓｅｌｌ  Ｓ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｊ，  Ｈｉｇｈ  Ｋ，  Ｃｈｕｎｇ  Ｄ，  Ｗｅｌｌｍａｎ  Ｊ，  Ｍａｇｕｉｒｅ  Ａ．  Ｐｈａｓｅ  ３  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＡＡＶ２−  ｈＲＰＥ６５ｖ２  （ＳＰＫ−ＲＰＥ６５）  ｔｏ  ｔｒｅａｔ  ＲＰＥ６５  ｍｕｔａｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｅｓ．  Ｓａｕｄｉ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  （２０１６）．
１２．  ｄｅｎ  Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ＡＩ，  Ｋｏｅｎｅｋｏｏｐ  ＲＫ，  Ｍｏｈａｍｅｄ  ＭＤ，  Ａｒｔｓ  ＨＨ，  Ｂｏｌｄｔ  Ｋ，  Ｔｏｗｎｓ  ＫＶ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＬＣＡ５，  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｃｉｌｉａｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｅｂｅｒｃｉｌｉｎ，  ｃａｕｓｅ  Ｌｅｂｅｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ．
Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  （２００７）  ３９（７）：８８９−９５．  Ｅｐｕｂ  ２００７／０６／０５．  ｄｏｉ：  ｎｇ２０６６  ［ｐｉｉ］
１０．１０３８／ｎｇ２０６６．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １７５４６０２９．
１３．  Ｇｅｒｂｅｒ  Ｓ，  Ｈａｎｅｉｎ  Ｓ，  Ｐｅｒｒａｕｌｔ  Ｉ，  Ｄｅｌｐｈｉｎ  Ｎ，  Ａｂｏｕｓｓａｉｒ  Ｎ，  Ｌｅｏｗｓｋｉ  Ｃ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ＬＣＡ５  ａｒｅ  ａｎ  ｕｎｃｏｍｍｏｎ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ
Ｌｅｂｅｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ  （ＬＣＡ）  ｔｙｐｅ  ＩＩ．  Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  （２００７）  ２８（１２）：  １２４５．  ｄｏｉ：  １０．１００２／ｈｕｍｕ．９５１３．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １８０００８８４．１４．  Ｃｈｅｎ  Ｘ，  Ｓｈｅｎｇ  Ｘ，  Ｓｕｎ  Ｘ，  Ｚｈａｎｇ  Ｙ，  Ｊｉａｎｇ  Ｃ，  Ｌｉ  Ｈ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｅｘｔ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｅｘｔｅｎｄｓ  ｔｈｅ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｆｏｒ  ＬＣＡ５  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：  Ｎｏｖｅｌ  ＬＣＡ５  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｅ  Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  （２０１６）  ６：２４３５７．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｓｒｅｐ２４３５７．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２７０６７２５８；
ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ４８２８７２１．
１５．  Ｃｏｒｔｏｎ  Ｍ，  Ａｖｉｌａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ａ，  Ｖａｌｌｅｓｐｉｎ  Ｅ，  Ｌｏｐｅｚ−Ｍｏｌｉｎａ  ＭＩ，  Ａｌｍｏｇｕｅｒａ  Ｂ，  Ｍａｒｔｉｎ−  Ｇａｒｒｉｄｏ  Ｅ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ＬＣＡ５  ｉｎ  Ｌｅｂｅｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｐａｎｉｓｈ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  （２０１４）  １２１（ｌ）：３９９−４０７．
ｄｏｉ：
１０．１０１６／ｊ．ｏｐｈｔｈａ．２０１３．０８．０２８．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２４１４４４５１．
１６．  Ｍａｃｋａｙ  ＤＳ，  Ｂｏｒｍａｎ  ＡＤ，  Ｓｕｉ  Ｒ，  ｖａｎ  ｄｅｎ
Ｂｏｒｎ  ＬＩ，  Ｂｅｒｓｏｎ  ＥＬ，  Ｏｃａｋａ  ＬＡ，  ｅｔ  ａｌ．
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｃｏｈｏｒｔ  ｏｆ  ｌｅｂｅｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｎｏｖｅｌ  ＬＣＡ５  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｎｅｗ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ．  Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  （２０１３）  ３４（１１）：  １５３７−４６．  ｄｏｉ：  １０．１００２／ｈｕｍｕ．２２３９８．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３９４６１３３；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ４３３７９５９．
１７．  Ｖａｌｌｅｓｐｉｎ  Ｅ，  Ａｖｉｌａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ａ，  Ａｌｍｏｇｕｅｒａ  Ｂ，  Ｖｅｌｅｚ−Ｍｏｎｓａｌｖｅ  Ｃ，  Ｃａｎｔａｌａｐｉｅｄｒａ
Ｄ，  Ｇａｒｃｉａ−Ｈｏｙｏｓ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．  Ｇｅｎｅ  ｓｙｍｂｏｌ：  ＬＣＡ５．  Ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｌｅｂｅｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  （２０１０）  １２７（４）：４８７．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：
２１４８８２６５．
１８．  Ｖａｌｌｅｓｐｉｎ  Ｅ，  Ａｖｉｌａ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  Ａ，  Ａｌｍｏｇｕｅｒａ  Ｂ，  Ｃａｎｔａｌａｐｉｅｄｒａ  Ｄ，  Ｇａｒｃｉａ−Ｈｏｙｏｓ  Ｍ，  Ｒｉｖｅｉｒｏ−Ａｌｖａｒｅｚ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｏｖｅｌ  ｈｕｍａｎ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．  Ｇｅｎｅ  ｓｙｍｂｏｌ：  ＬＣＡ５．  Ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｌｅｂｅｒ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ａｍａｕｒｏｓｉｓ  （ＬＣＡ）．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  （２０１０）  １２７（１）：  １１８．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２０１０８３９５．
１９．  Ａｈｍａｄ  Ａ，  Ｄａｕｄ  Ｓ，  Ｋａｋａｒ  Ｎ，  Ｎｕｒｎｂｅｒｇ  Ｇ，  Ｎｕｒｎｂｅｒｇ  Ｐ，  Ｂａｂａｒ  ＭＥ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＬＣＡ５  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  Ｐａｋｉｓｔａｎｉ  ｆａｍｉｌｙ  ｗｉｔｈ  Ｌｅｂｅｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃａｔａｒａｃｔｓ．  Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  （２０１１）  １７：１９４０−５．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１８５０１６８；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ３１５４１２６．
２０．  Ｓｅｏｎｇ  ＭＷ，  Ｋｉｍ  ＳＹ，  Ｙｕ  ＹＳ，  Ｈｗａｎｇ  ＪＭ，  Ｋｉｍ  ＪＹ，  Ｐａｒｋ  ＳＳ．  ＬＣＡ５，  ａ  ｒａｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃａｕｓｅ  ｏｆ  ｌｅｂｅｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ  ｉｎ  Ｋｏｒｅａｎｓ．  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｇｅｎｅｔ  （２００９）  ３０（ｌ）：５４−５．
ｄｏｉ：  １０．１０８０／１３８１６８１０８０２５９２５６７．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １９１７２５１３．
２１．  Ｊａｃｏｂｓｏｎ  ＳＧ，  Ａｌｅｍａｎ  ＴＳ，  Ｃｉｄｅｃｉｙａｎ  ＡＶ，  Ｓｕｍａｒｏｋａ  Ａ，  Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ＳＢ，  Ｗｉｎｄｓｏｒ  ＥＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｅｂｅｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  Ｌｅｂｅｒｃｉｌｉｎ  （ＬＣＡ５）  ｍｕｔａｔｉｏｎ：  ｒｅｔａｉｎｅｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｄｊａｃｅｎｔ  ｔｏ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｉｓｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｖｉｓ  （２００９）  １５：１０９８−１０６．  Ｅｐｕｂ  ２００９／０６／０９．  ｄｏｉ：  １１６  ［ｐｉｉ］，  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １９５０３７３８；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ２６９０９５５．
２２．  Ｂｏｌｄｔ  Ｋ，  Ｍａｎｓ  ＤＡ，  Ｗｏｎ  Ｊ，  ｖａｎ  Ｒｅｅｕｗｉｊｋ  Ｊ，  Ｖｏｇｔ  Ａ，  Ｋｉｎｋｌ  Ｎ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｆｌａｇｅｌｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｉｌｉａ  ｃａｕｓｅｓ  Ｌｅｂｅｒ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  （２０１１）  １２１（６）：２１６９−８０．  Ｅｐｕｂ  ２０１１／
０５／２５．  ｄｏｉ：  ４５６２７  ［ｐｉｉ］  １０．１１７２／ＪＣＩ４５６２７．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１６０６５９６；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３１０４７５７．
２３．  Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｇｈｅ  Ｌ，  Ｂｅｌｌ  Ｐ，  Ｍａｇｕｉｒｅ  Ａ，  Ｃｅａｒｌｅｙ  Ｃ，  Ｘｉａｏ  Ｒ，  Ｃａｌｃｅｄｏ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｏｓａｇｅ  Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄｓ  ｆｏｒ  ＡＡＶ２  ａｎｄ  ＡＡＶ８  Ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｍｏｎｋｅｙ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ
Ｍｅｄ  （２０１１）  ３（８８）：８８ｒａ５４．  Ｅｐｕｂ  ２２  Ｊｕｎｅ  ２０１１．
２４．  Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ＰＳ，  Ｌｅｅ  Ｖ，  Ｗｅｉ  Ｚ，  Ｓｏｎｇ  ＪＹ，  Ｃａｓａｌ  Ｇ，  Ｃｒｏｎｉｎ  Ｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ
ｏｆ  Ｄｏｓｅ  ａｎｄ  Ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ＡＡＶ７ｍ８  ａｎｄ  ＡＡＶ８ＢＰ２  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｎｏｎ−Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｒｅｔｉｎａ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  （２０１６）．  ｄｏｉ：  １０．１０８９／ｈｕｍ．２０１６．１１１．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２７７５０４６１．
２５．  Ｄａｌｋａｒａ  Ｄ，  Ｂｙｒｎｅ  ＬＣ，  Ｋｌｉｍｃｚａｋ  ＲＲ，  Ｖｉｓｅｌ  Ｍ，  Ｙｉｎ  Ｌ，  Ｍｅｒｉｇａｎ  ＷＨ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｕｔｅｒ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｖｉｔｒｅｏｕｓ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  （２０１３）  ５（１８９）：  １８９ｒａ７６．  ｄｏｉ：  １０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００５７０８．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２３７６１０３９．
２６．  Ｄａｌｋａｒａ  Ｄ，  Ｋｏｌｓｔａｄ  ＫＤ，  Ｃａｐｏｒａｌｅ  Ｎ，  Ｖｉｓｅｌ  Ｍ，  Ｋｌｉｍｃｚａｋ  ＲＲ，  Ｓｃｈａｆｆｅｒ  ＤＶ，  ｅｔ  ａｌ．
Ｉｎｎｅｒ  ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｔｏ  ＡＡＶ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｖｉｔｒｅｏｕｓ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  （２００９）  １７（１２）：２０９６−１０２．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｍｔ．２００９．１８１．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  １９６７２２４８；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ２８１４３９２．
２７．  Ｍａｃｅ  Ｅ，  Ｃａｐｌｅｔｔｅ  Ｒ，  Ｍａｒｒｅ  Ｏ，  Ｓｅｎｇｕｐｔａ  Ａ，  Ｃｈａｆｆｉｏｌ  Ａ，  Ｂａｒｂｅ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃｈａｎｎｅｌｒｈｏｄｏｐｓｉｎ−２  ｔｏ  ＯＮ−ｂｉｐｏｌａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｖｉｔｒｅａｌｌｙ  ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ＡＡＶ  Ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ＯＮ  ａｎｄ  ＯＦＦ
ｖｉｓｕａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｂｌｉｎｄ  ｍｉｃｅ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ
（２０１５）  ２３（１）：７−１６．  ｄｏｉ：  １０．１０３８／ｍｔ．２０１４．１５４．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２５０９５８９２；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣＰＭＣ４２７０７３３．
２８．  Ｌｉａｎｇ  ＦＱ，  Ａｎａｎｄ  Ｖ，  Ｍａｇｕｉｒｅ  ＡＭ，  Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｊ．  Ｉｎｔｒａｏｃｕｌａｒ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  （２００１）  ４７：１２５−３９．  ｄｏｉ：  １０．１３８５／１−５９２５９−０８５−３：１２５．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２１３９４５８２．
２９．  Ｍｏｈａｍｅｄ  Ｍ，  Ｔｏｐｐｉｎｇ  Ｎ，  Ｊａｆｒｉ  Ｈ，  Ｒａａｓｈｅｄ  Ｙ，  ＭｃＫｉｂｂｉｎ  Ｍ，  Ｉｎｇｌｅｈｅａｒｎ  Ｃ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  Ｌｅｂｅｒ’ｓ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ａｍａｕｒｏｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ＬＣＡ５  ｌｏｃｕｓ．  Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  （２００３）  ８７（４）：４７３−５．
３０．  Ａｓｈｔａｒｉ  Ｍ，  Ｃｙｃｋｏｗｓｋｉ  ＬＬ，  Ｍｏｎｒｏｅ  ＪＦ，  Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＫＡ，  Ｃｈｕｎｇ  ＤＣ，  Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｖｉｓｕａｌ  ｃｏｒｔｅｘ  ｒｅｓｐｏｎｄｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎａｌ
ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２１（６）：２１６０−８．  Ｅｐｕｂ  ２０１１／０５／２５．  ｄｏｉ：  ５７３７７  ［ｐｉｉ］
１０．１１７２／ＪＣＩ５７３７７．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２１６０６５９８；ＰｕｂＭｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ３１０４７７９．
３１．  Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｊ，  Ａｓｈｔａｒｉ  Ｍ，  Ｗｅｌｌｍａｎ  Ｊ，  Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＫＡ，  Ｃｙｃｋｏｗｓｋｉ  ＬＬ，  Ｃｈｕｎｇ  ＤＣ，  ｅｔ  ａｌ．
ＡＡＶ２  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ  ａｄｕｌｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ
４（１２０）：  １２０ｒａ１５．  Ｅｐｕｂ  ２０１２／０２／１１．  ｄｏｉ：  ４／１２０／１２０ｒａｌ５  ［ｐｉｉ］
１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００２８６５．  ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：  ２２３２３８２８．
【図１−１】
2020510433.tif 000008
【図１−２】
2020510433.tif 000009
【図１−３】
2020510433.tif 000010
【図１−４】
2020510433.tif 000011
【図１−５】
2020510433.tif 000012
【図１−６】
2020510433.tif 000013
【図２−１】
2020510433.tif 000014
【図２−２】
2020510433.tif 000015
【図２−３】
2020510433.tif 000016
【図３】
2020510433.tif 000017
【図４】
2020510433.tif 000018
【図５−１】
2020510433.tif 000019
【図５−２】
2020510433.tif 000020
【図５−３】
2020510433.tif 000021
【図６】
2020510433.tif 000022
【図７】
2020510433.tif 000023
【図８】
2020510433.tif 000024
【図９】
2020510433.tif 000025
【図１０】
2020510433.tif 000026
【図１１Ａ】
2020510433.tif 000027
【図１１Ｂ】
2020510433.tif 000028
【図１２−１】
2020510433.tif 000029
【図１２−２】
2020510433.tif 000030
【図１２−３】
2020510433.tif 000031
【配列表】
2020510433000001.app
【国際調査報告】
2020510433.tif 000032
2020510433.tif 000033
2020510433.tif 000034