(57)【要約】  本発明の種々の態様は、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドに関する。典型的には、そのような組換えポリペプチドは、典型的には、G233T、D235V、及びK237Vから選択される少なくとも1種の変異を含む血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含み、そのような組換えポリペプチドは、任意選択で、オリゴマー化ドメインを含む。
2020514269.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドであって、
組換えポリペプチドは、膜貫通ドメインを欠如し、
修飾された細胞外ドメインが、配列番号19に対して、G233T、D235V、及びK237Vから選択される少なくとも1種の変異を含む、組換えポリペプチド。
【請求項２】
前記少なくとも1種の変異を含まないがその他の点では前記組換えポリペプチドと同一である対照ポリペプチドよりも、ヒト血液試料又はヒト血漿試料のフォンヴィレブランド因子に対して高い結合親和性を有する、請求項1に記載の組換えポリペプチド。
【請求項３】
組換えポリペプチド及びヒトフォンヴィレブランド因子のKdが、1μM、750nM、500nM、250nM、又は100nM未満である、請求項1又は2に記載の組換えポリペプチド。
【請求項４】
修飾された細胞外ドメインが、配列番号19に対して、
変異C65S及びG233T、
変異C65S及びD235V、
変異C65S及びK237V、又は
変異C65S、G233T、及びM239T
を含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項５】
修飾された細胞外ドメインが、配列番号2;配列番号3;配列番号4;又は配列番号5に記載のアミノ酸配列の少なくとも約250個の連続アミノ酸に対して、少なくとも約95%の配列同一性を有する、請求項1から4のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項６】
修飾された細胞外ドメインが、配列番号2;配列番号3;配列番号4;又は配列番号5に記載のアミノ酸配列を含む、請求項5に記載の組換えポリペプチド。
【請求項７】
C末端システイン、負に荷電したC末端ドメイン、及びストレプトアビジン結合タンパク質の1種又は複数を含む架橋ドメインを更に含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項８】
架橋ドメインのアミノ酸配列が、配列番号11;配列番号12;配列番号16;配列番号17;又は配列番号18からなる群から選択される、請求項7に記載の組換えポリペプチド。
【請求項９】
ポリヒスチジンタグ、Snapタグ、Clipタグ、HaloTag、SnoopTag、SpyTag、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、Strep-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、FLAG-タグ、V5-タグ、Myc-タグ、HA-タグ、NE-タグ、AviTag、カルモジュリン-タグ、ポリグルタメート、S-タグ、SBP-タグ、Softag 1、Softag 3、TCタグ、VSV-タグ、Xpressタグ、Isopeptag、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、緑色蛍光タンパク質-タグ、Nus-タグ、チオレドキシン-タグ、及び抗体のFcドメインから選択される親和性タグを更に含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１０】
親和性タグが、6個〜8個の間のヒスチジン残基を含むポリヒスチジンタグである、請求項9に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１１】
親和性タグのアミノ酸配列が、配列番号11;配列番号12;配列番号15;配列番号16;配列番号17;配列番号18;配列番号43;配列番44;配列番号45;又は配列番号46からなる群から選択される、請求項9又は10に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１２】
オリゴマー化ドメインを更に含み、前記オリゴマー化ドメインが、ダイマー、トリマー、テトラマー、又はペンタマーを形成することができる、請求項1から11のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１３】
オリゴマー化ドメインが、p53、GCN4、クラスリン、pent-タグ、又は抗体のFcドメインからなる群から選択される、請求項12に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１４】
オリゴマー化ドメインのアミノ酸配列が、配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;又は配列番号46からなる群から選択される、請求項12又は13に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１５】
組換えポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号21;配列番号22;配列番号24;配列番号25;配列番号30;配列番号31;配列番号33;配列番号39;配列番号40;又は配列番号41に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約95%の配列同一性を有する、請求項1から14のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１６】
組換えポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号21;配列番号22;配列番号24;配列番号25;配列番号30;配列番号31;配列番号33;配列番号39;配列番号40;又は配列番号41からなる群から選択される、請求項1から15のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１７】
血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドであって、
修飾された細胞外ドメインが、配列番号19に対して、変異C65A、G233V及びM239Vを含む、組換えポリペプチド。
【請求項１８】
修飾された細胞外ドメインのアミノ酸配列が、配列番号42に記載のアミノ酸配列を含むか、又は組換えポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号26;配列番号27;若しくは配列番号28からなる群から選択される、請求項17に記載の組換えポリペプチド。
【請求項１９】
血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドであって、
修飾された細胞外ドメインが、配列番号19に対して、
A238V変異、又は
Δ(229〜240)変異
を含み、
前記A238V変異又はΔ(229〜240)変異を含まないがその他の点では前記組換えポリペプチドと同一である対照ポリペプチドよりも、ヒト血液又はヒト血漿試料のフォンヴィレブランド因子に対して低い結合親和性を有する組換えポリペプチド。
【請求項２０】
修飾された細胞外ドメインのアミノ酸配列が、配列番号6若しくは配列番号9に記載のアミノ酸配列を含むか、又は組換えポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号36若しくは配列番号38である、請求項19に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２１】
リーダーペプチドを更に含む、請求項1から20のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２２】
リーダーペプチドのアミノ酸配列が、配列番号20である、請求項21に記載の組換えポリペプチド。
【請求項２３】
少なくとも2個の請求項1から22のいずれか一項に記載の組換えポリペプチドを含むオリゴマーポリペプチド。
【請求項２４】
請求項1から22のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド又は請求項23に記載のオリゴマーポリペプチドを含む細胞。
【請求項２５】
CHO、HEK、BHK、NS0、Sp2/0、COS、C127、HT-1080、PER.C6、HeLa、又はジャーカット細胞である、請求項24に記載の細胞。
【請求項２６】
請求項1から22のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド又は請求項23に記載のオリゴマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及び
ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター
を含む核酸。
【請求項２７】
請求項26に記載の核酸を含む細胞。
【請求項２８】
請求項1から22のいずれか一項に記載の組換えポリペプチド又は請求項23に記載のオリゴマーポリペプチド、及び固体支持体を含む組成物であって、組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドが、固体支持体に共有結合的又は非共有結合的に結合している、組成物。
【請求項２９】
固体支持体が、粒子、ビーズ、膜、表面、ポリペプチドチップ、マイクロタイタープレート、又はクロマトグラフィーカラムの固相を含む、請求項28に記載の組成物。
【請求項３０】
固体支持体がラテックス粒子である、請求項29に記載の組成物。
【請求項３１】
フォンヴィレブランド因子を更に含む、請求項28から30のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
固体支持体が、複数の粒子又はビーズを含み、
フォンヴィレブランド因子が、複数の粒子又はビーズのうちの粒子又はビーズを架橋させる、請求項31に記載の組成物。
【請求項３３】
ヒト血漿を更に含む、請求項31又は32に記載の組成物。
【請求項３４】
ヒト血小板を更に含む、請求項33に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドに関する。具体的には、血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含むが、膜貫通ドメインを欠如した、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドであって、修飾された細胞外ドメインが、配列番号19に対して、G233T、D235V、及びK237Vから選択される少なくとも1種の変異を含む、組換えポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
フォンヴィレブランド病(vWD)は、かなりの診断上の課題を提起することが知られている、一般の、遺伝性の、軽度の出血障害である。vWDの患者は、彼らの日常生活の間に出血に悩まされることはないであろうが、止血が課題となる期間(例えば、セメント充填、外科的処置、分娩、又は輸血)の間に問題が起こり得る。止血が課題となる手法を行う前に、医師は、ルーチン的に、止血パネル(hemostasis panel)の指図を出し、これは、しばしば、vWDに特異的な追加の試験につながる。
【０００３】
フォンヴィレブランド因子(vWF)は、多くの異なる細胞外及び細胞-表面分子に結合し、止血及び凝固において重要な役割を演じる。vWFは、血小板プラグの形成で特に重要であり、それは、血小板及び他の細胞外分子(例えば、内皮下コラーゲン)を架橋させる糖タンパク質Ibα-V-IX複合体を含めたいくつかの血小板細胞-表面タンパク質複合体に特異的に結合する。糖タンパク質Ibα-V-IX複合体は、4つのサブユニット、GpIbα、GpIbβ、GPV及びGPIXによって構成され、血小板の膜中に存在する。GPIbα及びGPIbβは、ジスルフィド架橋によって連結されるが、GPV及びGPIXは、複合体と非共有結合的に会合する。GPIbαサブユニットは、vWF、α-トロンビン、白血球インテグリンαMβ2及びP-セレクチンに対する結合部位を有する。
【０００４】
vWDには種々の型があり、伝統的には、根底にある疾患メカニズムの明瞭な理解をもたらすには多数の試験が必要となるので、vWD診断は単純ではない。1型vWDは、vWFの量的な欠乏によって引き起こされる。2型vWDは、質的なvWF欠乏によって引き起こされる。2型vWDは、血小板接着を減少させる、機能的vWFマルチマーの割合を減少させる変異によって引き起こされる2A型;血小板-vWF結合を増加させるvWFへの変異によって引き起こされる2B型;vWF-依存性血小板接着を減少させる変異によって引き起こされる2M型;及び第VIII因子への結合を損なう変異によって引き起こされる2N型に更に細分される。3型vWDは、vWFの実質的に完全な欠乏及び第VIII因子の減少によって引き起こされ、これは、通常、循環vWFによって安定化される。後天性vWDは、別の根底にある病理学と関連して、老齢の患者で通常起こる比較的稀な後天性出血障害である。最後に、血小板型vWDは、GPIbαをコードする遺伝子の変異によって引き起こされる、vWFの糖タンパク質Ibα(GPIbα)への増強された結合から生じる。血漿中のvWFの合計濃度を測定する、vWF抗原アッセイ(vWF:Ag)、又は抗生物質リストセチンによって誘導された凝集の間に血小板のvWFのGPIbαへの結合を測定する、リストセチン捕因子アッセイ(vWF:RCo)等の、種々のアッセイが、vWF活性を定量するために開発されてきた。しかしながら、vWF:Agアッセイは、存在するVWFの質に関係なく、患者の血漿に存在するvWFの量的レベルについての情報を提供するにすぎない。かくして、vWF:Agそれ自体は、多くの質的欠陥の検出を可能にしない。同様に、vWF:RCoアッセイは、ビリルビン、ヘモグロビン、ヒト抗マウス抗体(HAWA)リウマチ因子、及びトリグリセリドからの干渉による不正確性に悩まされ得る。アッセイの不正確性に更に加え、リストセチン結合部位には遺伝的分散及び多型がある。vWF:RCoの正確性は、減少したvVWF:Ag濃度では特に低い。
【０００５】
前記アッセイは、糖タンパク質Ibαの細胞外ドメインへのvWFの結合に依拠する。しかしながら、糖タンパク質Ibα-V-IX複合体及び剪断応力の非存在下では、vWFは、比較的弱い4.5μM親和性で糖タンパク質Ibαに結合する。血小板型vWDの患者において同定された糖タンパク質Ibαへの天然に生じる変異は、W230L、G233V、G233S、D235Y、M239V、及びM239Iを含み、その各々は、vWFと糖タンパク質Ibαとの間の結合親和性を増加させる(先行技術文献)。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許第8,932,820号
【特許文献２】米国特許第8,163,496号
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】J. L. Miller、D. Cunningham、V. A. Lyle及びC. Finch、「Mutation in the gene encoding the a chain of platelet glycoprotein Ib in platelet-type von Willebrand disease」、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.、88巻、6月号、4761〜4765頁、1991。
【非特許文献２】S. D. Russell及びG. J. Roth、「Pseudo-von Willebrand Disease: A Mutation in the Platelet Glycoprotein Iba Gene Associated With a Hyperactive Surface Receptor」、Blood、81巻、7号、1787〜1792頁、1993。
【非特許文献３】A. Hamiltonら、「Frequency of Platelet type versus Type 2B von Willebrand Disease An international registry-based study」、Thromb. Haemost.、105巻、501〜508頁、2011。
【非特許文献４】S. Enayatら、「A novel D235Y mutation in the GP1BA gene enhances platelet interaction with von Willebrand factor in an Iranian family with platelet-type von Willebrand disease」、Thromb. Haemost.、108巻、5号、946〜954頁、2012。
【非特許文献５】A. I. Woodsら、「Identification of p.W246L As a Novel Mutation in the GP1BA Gene Responsible for Platelet-Type von Willebrand Disease」、Semin. Thromb. Hemost、40巻、151〜160頁、2014。
【非特許文献６】C. Lavenu-bombled、C. Guitton、A. Dupuis、M. Baas及びC. Desconclois、「A novel platelet-type von Willebrand disease mutation (GP1BA p.Met255Ile) associated with type 2B 'Malmo/New York' von Willebrand disease、Thromb. Haemost.、105巻、3号、501〜8頁、2016。
【非特許文献７】J. Dongら、「Novel Gain-of-Function Mutations of Platelet Glycoprotein Ib α by Valine Mutagenesis in the Cys209 Cys248 Disulfide Loop」、Journal、275巻、36号、27663〜70頁、2000。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
vWDの複雑性のため、実験室で行う単一の試験では、完全な診断を提供することができない。vWDの診断は、世界保健機構が100,000人中1.14人という有病率を報告する一方、診断の研究は、母集団の約1%という有病率を報告しているように、現在過小に報告されている。種々の試験が診断のために利用可能であるが、専門家の意見が重視される場合が多い。正確な試験及び明瞭に定義された診断基準によって、疾患が診断されないままである多くの患者に対する医療的結果が改善し得る。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の発明者らは、vWF A1ドメインへの結合を改善する、GpIbα  β-ヘアピンにおける新規な変異を同定した。発明者らは、vWDの診断で用いられることができる前記変異を含む新しい組換えポリペプチドも開発した。
【００１０】
実施形態の種々の態様は、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドに関する。組換えポリペプチドは、典型的には、血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含み、これは、典型的には、配列番号19に対して、G233T、D235V、及びK237Vから選択される少なくとも1種の変異を含む。組換えポリペプチドは、典型的には、膜貫通ドメインを欠如する。
【００１１】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、少なくとも1種の変異を含まないがその他の点では組換えポリペプチドと同一である対照ポリペプチドよりも、ヒト血液試料又はヒト血漿試料のフォンヴィレブランド因子に対して高い結合親和性を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチド及びヒトフォンヴィレブランド因子のKdは、1μM、750nM、500nM、250nM、又は100nM未満である。Kdは、例えば、蛍光異方性又は表面プラズモン共鳴によって決定することができるが、Kdを決定するための方法は特に限定されない。蛍光異方性分析は、例えば、ゆっくりと転動する粒子に結合した、蛍光標識されたフォンヴィレブランド因子及び組換えポリペプチドに対して行うことができる。表面プラズモン共鳴は、例えば、表面結合フォンヴィレブランド因子及び可溶性組換えポリペプチドに対して行うことができる。
【００１３】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、配列番号19に対して、変異C65S及びG233T;変異C65S及びD235V;変異C65S及びK237V;又は変異C65S、G233T、及びM239Tを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;又は配列番号9に記載のアミノ酸配列の少なくとも約250個の連続アミノ酸に対して、少なくとも約95%の配列同一性を有する。例えば、修飾された細胞外ドメインは、任意選択で、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;又は配列番号9に記載のアミノ酸配列を含むことができる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、配列番号2;配列番号3;配列番号4;又は配列番号5に記載のアミノ酸配列の少なくとも約250個の連続アミノ酸に対して、少なくとも約95%の配列同一性を有する。例えば、修飾された細胞外ドメインは、任意選択で、配列番号2;配列番号3;配列番号4;又は配列番号5に記載のアミノ酸配列を含むことができる。
【００１６】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、更に、架橋ドメインを含む。架橋ドメインは、任意選択で、C末端システイン、負に荷電したC末端ドメイン、及びストレプトアビジン結合タンパク質の1種又は複数を含む。いくつかの実施形態において、架橋ドメインのアミノ酸配列は、配列番号11;配列番号12;配列番号16;配列番号17;又は配列番号18からなる群から選択される。
【００１７】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、更に、親和性タグを含む。親和性タグは、任意選択で、ポリヒスチジンタグ、Snapタグ、Clipタグ、HaloTag、SnoopTag、SpyTag、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、Strep-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、FLAG-タグ、V5-タグ、Myc-タグ、HA-タグ、NE-タグ、AviTag、カルモジュリン-タグ、ポリグルタメート、S-タグ、SBP-タグ、Softag 1、Softag 3、TGタグ、VSV-タグ、Xpressタグ、Isopeptag、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、緑色蛍光タンパク質-タグ、Nus-タグ、チオレドキシン-タグ、及び抗体のFcドメインから選択され得るが、親和性タグの選択は特に制限されない。いくつかの実施形態において、親和性タグは、6〜8個の間のヒスチジン残基を含むポリヒスチジンタグである。いくつかの実施形態において、親和性タグのアミノ酸配列は、配列番号11;配列番号12;配列番号15;配列番号16;配列番号17;配列番号18;配列番号43;配列番号44;配列番号45;又は配列番号46からなる群から選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、更に、オリゴマー化ドメインを含む。オリゴマー化ドメインは、ホモ-ダイマー、ホモ-トリマー、ホモ-テトラマー、又はホモ-ペンタマー等の、ダイマー、トリマー、テトラマー、又はペンタマーを形成することが可能であり得る。オリゴマー化ドメインは、p53、GCN4、クラスリン、pent-タグ、又は抗体のFcドメインに由来し得る。いくつかの実施形態において、オリゴマー化ドメインは、p53、GCN4、クラスリン、pent-タグ、又は抗体のFcドメインからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、オリゴマー化ドメインのアミノ酸配列は、配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;又は配列番号46からなる群から選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号21;配列番号22;配列番号24;配列番号25;配列番号30;配列番号31;配列番号33;配列番号39;配列番号40;又は配列番号41に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約95%の配列同一性を有する。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号21;配列番号22;配列番号24;配列番号25;配列番号30;配列番号31;配列番号33;配列番号39;配列番号40;又は配列番号41からなる群から選択される。
【００２０】
実施形態の種々の態様は、血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドであって、修飾された細胞外ドメインが、配列番号19に対して、変異C65A、G233V及びM239Vを含む、組換えポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号42に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号26;配列番号27;又は配列番号28からなる群から選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、配列番号19に対して変異C65A、G233V及びM239Vを含まないがその他の点では組換えポリペプチドと同一である対照ポリペプチドよりも、ヒト血液試料又はヒト血漿試料のフォンヴィレブランド因子に対して高い結合親和性を有する。
【００２２】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、更に、架橋ドメインを含む。架橋ドメインは、任意選択で、C末端システイン、負に荷電したC末端ドメイン、及びストレプトアビジン結合タンパク質の1種又は複数を含む。いくつかの実施形態において、架橋ドメインのアミノ酸配列は、配列番号11;配列番号12;配列番号16;配列番号17;又は配列番号18からなる群から選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、更に、親和性タグを含む。親和性タグは、任意選択で、ポリヒスチジンタグ、Snapタグ、Clipタグ、HaloTag、SnoopTag、SpyTag、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、Strep-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、FLAG-タグ、V5-タグ、Myc-タグ、HA-タグ、NE-タグ、AviTag、カルモジュリン-タグ、ポリグルタメート、S-タグ、SBP-タグ、Softag 1、Softag 3、TCタグ、VSV-タグ、Xpressタグ、Isopeptag、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、緑色蛍光タンパク質-タグ、Nus-タグ、チオレドキシン-タグ、及び抗体のFcドメインから選択され得るが、親和性タグの選択は特に制限されない。いくつかの実施形態において、親和性タグは、6〜8個の間のヒスチジン残基を含むポリヒスチジンタグである。いくつかの実施形態において、親和性タグのアミノ酸配列は、配列番号11;配列番号12;配列番号15;配列番号16;配列番号17;配列番号18;配列番号43;配列番号44;配列番号45;又は配列番号46からなる群から選択される。
【００２４】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、更に、オリゴマー化ドメインを含む。オリゴマー化ドメインは、ホモ-ダイマー、ホモ-トリマー、ホモ-テトラマー、又はホモ-ペンタマー等の、ダイマー、トリマー、テトラマー又はペンタマーをすることが可能であり得る。オリゴマー化ドメインは、p53、GCN4、クラスリン、pent-タグ、又は抗体のFcドメインに由来し得る。いくつかの実施形態において、オリゴマー化ドメインは、p53、GCN4、クラスリン、pent-タグ、又は抗体のFcドメインからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、オリゴマー化ドメインのアミノ酸配列は、配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;又は配列番号46からなる群から選択される。
【００２５】
実施形態の種々の態様は、血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドであって、修飾された細胞外ドメインが、配列番号19に対して、A238V変異を含む、組換えポリペプチドに関する。そのような組換えポリペプチドは、典型的には、A238V変異を含まないがその他の点では組換えポリペプチドと同一である対照ポリペプチドよりも、ヒト血液又はヒト血漿試料のフォンヴィレブランド因子に対して低い結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号6に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号36である。
【００２６】
実施形態の種々の態様は、血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドであって、修飾された細胞外ドメインが、配列番号19に対して、Δ(229〜240)変異を含む、組換えポリペプチドに関する。そのような組換えポリペプチドは、典型的には、Δ(229〜240)変異を含まないがその他の点では組換えポリペプチドと同一である対照ポリペプチドよりも、ヒト血液又はヒト血漿試料のフォンヴィレブランド因子に対して低い結合親和性を有する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号38である。
【００２８】
実施形態の種々の態様は、血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む、ヒトフォンヴィレブランド因子に特異的に結合する組換えポリペプチドであって、修飾された細胞外ドメインが、配列番号19に対して、A238V変異又はΔ(229〜240)変異を含む、組換えポリペプチドに関する。そのような組換えポリペプチドは、典型的には、A238V変異又はΔ(229〜240)変異を含まないがその他の点では組換えポリペプチドと同一である対照ポリペプチドよりも、ヒト血液又はヒト血漿試料のフォンヴィレブランド因子に対して低い結合親和性を有する。
【００２９】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインのアミノ酸配列は、配列番号6又は配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号36又は配列番号38である。
【００３０】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、更に、架橋ドメインを含む。架橋ドメインは、任意選択で、C末端システイン、負に荷電したC末端ドメイン、及びストレプトアビジン結合タンパク質の1種又は複数を含む。いくつかの実施形態において、架橋ドメインのアミノ酸配列は、配列番号11;配列番号12;配列番号16;配列番号17;又は配列番号18からなる群から選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、更に、親和性タグを含む。親和性タグは、任意選択で、ポリヒスチジンタグ、Snapタグ、Clipタグ、HaloTag、SnoopTag、SpyTag、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、Strep-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、FLAG-タグ、V5-タグ、Myc-タグ、HA-タグ、NE-タグ、AviTag、カルモジュリン-タグ、ポリグルタメート、S-タグ、SBP-タグ、Softag 1、Softag 3、TCタグ、VSV-タグ、Xpressタグ、Isopeptag、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、緑色蛍光タンパク質-タグ、Nus-タグ、チオレドキシン-タグ及び抗体のFcドメインから選択され得るが、親和性タグの選択は特に制限されない。いくつかの実施形態において、親和性タグは、6〜8個の間のヒスチジン残基を含むポリヒスチジンタグである。いくつかの実施形態において、親和性タグのアミノ酸配列は、配列番号11;配列番号12;配列番号15;配列番号16;配列番号17;配列番号18;配列番号43;配列番号44;配列番号45;又は配列番号46からなる群から選択される。
【００３２】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、更に、オリゴマー化ドメインを含む。オリゴマー化ドメインは、ホモ-ダイマー、ホモ-トリマー、ホモ-テトラマー、又はホモ-ペンタマー等の、ダイマー、トリマー、テトラマー、又はペンタマーを形成することが可能であり得る。オリゴマー化ドメインは、p53、GCN4、クラスリン、pent-タグ、又は抗体のFcドメインに由来し得る。いくつかの実施形態において、オリゴマー化ドメインは、p53、GCN4、クラスリン、pent-タグ、又は抗体のFcドメインからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、オリゴマー化ドメインのアミノ酸配列は、配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;又は配列番号46からなる群から選択される。
【００３３】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、更に、リーダーペプチドを含む。いくつかの実施形態において、リーダーペプチドのアミノ酸配列は、配列番号20である。
【００３４】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;又は配列番号41からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の種々の態様は、本明細書中に記載された組換えポリペプチドのうちの少なくとも2種を含むオリゴマーポリペプチドに関する。
【００３６】
本発明の種々の態様は、本明細書中に記載された組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドを含む細胞に関する。細胞は、任意選択で、CHO、HEK、BHK、NS0、Sp2/0、COS、C127、HT-1080、PER.C6、HeLa、又はジャーカット細胞から選択することができる。
【００３７】
本発明の種々の態様は、本明細書中に記載された組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸に関する。核酸は、典型的には、(例えば、プロモーターが、適切な発現細胞におけるヌクレオチド配列の転写を駆動できるように)組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターも含む。
【００３８】
本発明の種々の態様は、本明細書中に記載された核酸を含む細胞(例えば、前掲)に関する。細胞は、発現細胞(例えば、CHO、HEK、BHK、NS0、Sp2/0、COS、C127、HT-1080、PER.C6、HeLa、又はジャーカット細胞)又はクローニング細胞(例えば、大腸菌(E.coli))であり得る。
【００３９】
本発明の種々の態様は、本明細書中に記載された組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチド及び固体支持体を含む組成物であって、組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドが、(a)固体支持体に共有結合的若しくは非共有結合的に結合している、及び/又は(b)固体支持体に直接的若しくは間接的に結合している、組成物に関する。
【００４０】
固体支持体は、任意選択で、粒子、ビーズ、膜、表面、ポリペプチドチップ、マイクロタイタープレート、若しくはクロマトグラフィーカラムの固相のいずれかであるか、又はそれらを含み得る。例えば、いくつかの実施形態において、固体支持体はラテックス粒子である。
【００４１】
いくつかの実施形態において、組成物は、更に、(ヒトフォンヴィレブランド因子等の)フォンヴィレブランド因子を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、組成物は、複数の粒子又はビーズを含む固体支持体を含み、フォンヴィレブランド因子は、複数の粒子又はビーズのうちの粒子又はビーズを架橋させる。
【００４３】
いくつかの実施形態において、組成物は、更に、(ヒト血漿等の)血漿を含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、組成物は、更に、(ヒト血小板等の)血小板を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】図1は、種々の組換えポリペプチドの発現及び純度を確認する、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PEGE)ゲルの写真を含有する図である。ゲルのレーンは以下のようにナンバリングされる:(1)分子量標準;(2)C65S及びG233T変異、IgG1 Fcダイマー化ドメイン、並びに8-His親和性タグを含む組換えポリペプチド(矢印;下方のバンドは、ネズミIgG1定常ドメインに対応する)(配列番号21);(3)C65S及びG233T変異、p53テトラマー化ドメイン、並びに6-His親和性タグを含む組換えポリペプチド(配列番号22);(4)C65S、G233V、及びM239V変異、p53テトラマー化ドメイン、並びに6-His親和性タグを含む組換えポリペプチド(配列番号23);(5)C65S及びG233T変異、6-His親和性タグ、並びにC末端システインを含む組換えポリペプチド(配列番号24);(6)C65S及びG233T変異、ストレプトアビジン結合タンパク質、並びに6-His親和性タグを含む組換えポリペプチド(配列番号25);(7)C65A、G233V、及びM239V変異、p53テトラマー化ドメイン、並びに6-His親和性タグを含む組換えポリペプチド(配列番号26);(8)分子量標準;(9)分子量標準;(10)C65A、G233V、及びM239V変異、並びに6-His親和性タグを含む組換えポリペプチド(配列番号27);(11)C65A、G233V、及びM239V変異、負に荷電したC末端ドメイン、並びに6-His親和性タグを含む組換えポリペプチド(配列番号28);(12)G233V及びM239V変異、FLAGタグ、並びに6-His親和性タグを含む組換えポリペプチド(配列番号29)。
【図２】蛍光標識された組換えフォンヴィレブランド因子A1ドメインと、x-軸に示された変異及びC65S変異を含む、各々が、Fcダイマー化ドメイン及び血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む2個の組換えポリペプチドサブユニットを含む粒子結合ダイマーポリペプチドとの間、又は粒子結合モノマーポリペプチド対照(G233V、M239V-noFc(配列番号35))との間の蛍光異方性によって評価した、解離定数(Kd;y-軸)を描く棒グラフである。評価されたダイマーポリペプチドは、配列番号38(Δ(229〜240));配列番号37(WT);配列番号36(A238V);配列番号34(G233V、M239V);配列番号32(G233V);配列番号33(G233T、M239T);配列番号21(G233T);配列番号30(D235V);配列番号31(K237V)に対応する。変異を含まなかったダイマーポリペプチドは、約1.25μMのKdを示した。G233T、D235V、又はK237V変異の1種を含んだ組換えポリペプチドは、各々、500nM未満のKdを示した(例えば、それぞれ、単一の変異体について、約67nM、約250nM、及び約300nM)。
【図３】表面結合フォンヴィレブランド因子、及びG233T変異を含む血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む可溶性組換えポリペプチドのBiacore表面プラズモン共鳴分析の線グラフである。この分析は、フォンヴィレブランド因子とG233T組換えポリペプチドとの間の解離定数(Kd)が58nMであることを示唆し、これは、G233T変異体について67nMのKdを測定した、図2の蛍光異方性Kd測定を確認するものである。
【図４Ａ】図4B〜図4Dにおけるデータを生成するのに用いた酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)の略画である。固体支持体を抗糖タンパク質Ibα抗体(抗CD42b)でコーティングし、これを用いて、血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む組換えポリペプチド(CD42b;GPIbα;GP1b構築物)を固定化した。次いで、固体支持体を、ヒト血漿、フォンヴィレブランド因子標準物質、又はフォンヴィレブランド因子対照と接触させた。次いで、固体支持体を、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)をコンジュゲートした、ポリクローナルウサギ抗ヒトフォンヴィレブランド因子抗体と接触させた。次いで、組成物を、450nmにおいて強い吸光度を有するHRPによって生成物に変換することができる基質と接触させ、吸光度を測定した。
【図４Ｂ】C65S及びB235V変異を含む血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む組換えポリペプチド(配列番号30)を用いる図4AのELISAについての結果を描く棒グラフである。x-軸上の最初の4つの試料は、それぞれ、公知の1型、2B型、3型、及び1型のフォンヴィレブランド病に対応する(すなわち、GK1422(1);GH1423(2B);GK1419(3);GK1425(1))。5番目及び6番目の試料は、プールされたヒト血漿を含む対照試料である(すなわち、DG-C1;DG-C2)。7番目の試料は、(フォンヴィレブランド因子を欠如する)ヤギ血清対照である。8番目から17番目の試料は、フォンヴィレブランド病のないヒト血漿試料である(「正常」)。18番目から22番目の試料は、希釈なし(1:1)〜16倍希釈(1:16)のプールされたヒト血漿の参照標準の系列希釈に対応する。y-軸は、450nmにおける吸光度(Abs)に対応し、増大した吸光度は、増大した結合フォンヴィレブランド因子に対応する。
【図４Ｃ】C65S及びK237V変異を含む血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む組換えポリペプチド(配列番号31)を用いる図4AのELISAについての結果を描く棒グラフである。x-軸上の最初の4つの試料は、それぞれ、公知の1型、2B型、3型、1及び型のフォンヴィレブランド病の試料に対応する(すなわち、GK1422(1);GH1423(2B);GK1419(3);GK1425(1))。5番目及び6番目の試料は、プールされたヒト血漿を含む対照試料である(すなわち、DG-C1;DG-C2)。7番目の試料は、(フォンヴィレブランド因子を欠如する)ヤギ血清対照である。8番目から17番目の試料は、フォンヴィレブランド病のないヒトのプールされた血漿試料である(「正常」)。18番目から22番目の試料は、希釈なし(1:1)〜16倍希釈(1:16)のプールされたヒト血漿の参照標準の系列希釈に対応する。y-軸は、450nmにおける吸光度(Abs)に対応し、増大した吸光度は、増大した結合フォンヴィレブランド因子に対応する。
【図４Ｄ】G65S及びG233T変異を含む血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインを含む組換えポリペプチド(配列番号21)を用いる図4AのELISAについての結果を描く棒グラフである。x-軸上の最初の4つの試料は、それぞれ、公知の1型、2B型、3型、及び1型のフォンヴィレブランド病の試料に対応する(すなわち、GK1422(1);GH1423(2B);GK1419(3);GK1425(1))。5番目及び6番目の試料は、プールされたヒト血漿を含む対照試料である(すなわち、DG-C1;DG-C2)。7番目の試料は、(フォンヴィレブランド因子を欠如する)ヤギ血清対照である。8番目から17番目の試料は、フォンヴィレブランド病のないヒト血漿試料である(「正常」)。18番目〜22番目の試料は、希釈なし(1:1)〜16倍希釈(1:16)のプールされたヒト血漿の参照標準の系列希釈に対応する。y-軸は、450nmにおける吸光度(Abs)に対応し、増大した吸光度は、増大した結合フォンヴィレブランド因子に対応する。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
以下の記載は、単に、本開示の種々の実施形態を説明することを意図する。したがって、議論された具体的な修飾は、限定的であることを意図しない。本明細書中に提示された主題の精神又は範囲から逸脱することなく、種々の均等、変形、及び修飾を行うことができるのは当業者に明らかであり、そのような均等な実施形態は、ここに含まれると理解される。
【００４７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ある(a)」、「ある(an)」、及び「その(the)」は、内容がそうでないことを明瞭に指令するのでなければ、複数の言及を含む。
【００４８】
本明細書の全体にわたり、文脈がそうでないことを要求するのでなければ、単語「含む(comprise)」、又は「含む(comprises)」若しくは「含んでいる(comprising)」等の変形は、述べられたエレメント若しくは整数、又はエレメント若しくは整数の群を含めることを暗に意味すると理解されるが、いずれの他のエレメント若しくは整数又はエレメント若しくは整数の群も排除しない。
【００４９】
本明細書中の各実施形態は、そうでないことが明示的に述べられているのでなければ、必要な変更を加えてあらゆる他の実施形態に適用される。
【００５０】
以下の用語は、そうでないことが示されているのでなければ、以下の意味を有すると理解されるべきである:
【００５１】
本明細書中で用いる場合、用語「組換え」とは、(1)その天然に生じる環境から取り出された、(2)遺伝子が天然で見出されるポリペプチドの全て又は一部と会合していない、(3)それが天然では連結されていないポリヌクレオチドに作動可能に連結された、又は(4)天然では生じない生体分子、例えば、遺伝子又はタンパク質を指す。用語「組換え」は、クローニングしたDNA単離体、化学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、又は異種系によって生物学的に合成されたポリヌクレオチドアナログ、並びにそのような核酸によってコードされたタンパク質及び/又はmRNAに言及する際に用いることができる。
【００５２】
本明細書中で用いる場合、用語「核酸」とは、DNA又はRNAで構成された任意の物質を指す。核酸は、合成的に、又は生きた細胞によって産生され得る。
【００５３】
本明細書中で用いる場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのポリマー鎖を指す。用語は、DNA分子(例えば、cDNA又はゲノム若しくは合成DNA)及びRNA分子(例えば、mRNA又は合成RNA)、並びに非天然ヌクレオチド、非天然ヌクレオシド間結合、又は双方を含有するDNA及びRNAのアナログを含む。核酸は、任意のトポロジー的立体配座であり得る。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖、三本鎖、四本鎖、部分的二本鎖、分岐状、ヘアピン状、環状、又はパドロック立体配座であり得る。
【００５４】
本明細書中で用いる場合、用語「タンパク質」とは、アミノ酸残基の1つ又は複数の鎖からなる、大きな生物学的分子、又は高分子を指す。多くのタンパク質は、生化学反応を触媒し、代謝に対して極めて重要な酵素である。タンパク質は、細胞の形状を維持する足場の系を形成する、筋肉中のアクチン及びミオシン並びに細胞骨格中のタンパク質等の、構造的又は機械的機能も有する。他のタンパク質は、細胞シグナル伝達、免疫応答、細胞接着、及び細胞周期において重要である。しかしながら、タンパク質は、完全に人工的又は組換え型であってよく、すなわち、生物学的系において天然では存在しなくてよい。
【００５５】
本明細書中で用いる場合、用語「ポリペプチド」とは、天然で生じる及び天然に生じない双方のタンパク質、並びにそれらの断片、変異体、誘導体及びアナログを指す。ポリペプチドは、モノマー又はポリマーのものであってよい。ポリペプチドは、その各々が、1つ又は複数の別個の活性を有するいくつかの異なるドメインを含み得る。
【００５６】
用語「野生型配列」又は「野生型遺伝子」は、本明細書中においては相互交換可能に用いられて、天然の、又は宿主細胞において天然に生じる配列を指す。いくつかの実施形態において、野生型配列とは、タンパク質エンジニアリングプロジェクトの出発点である、目的の配列をいう。野生型配列は、相同又は異種タンパク質のいずれかをコードし得る。相同タンパク質は、宿主細胞が介入なしに生産し得るものである。異種タンパク質は、宿主細胞が、介入がなければ生産し得ないものである。
【００５７】
用語「修飾された配列」及び「修飾された遺伝子」は、本明細書中においては相互交換可能に用いられて、少なくとも、天然に生じる核酸配列に対する置換、欠失、挿入又は中断を含む配列を指す。
【００５８】
本明細書中で用いる場合、用語「変異配列」及び「変異遺伝子」は相互交換可能に用いられて、宿主細胞の野生型配列において生じる少なくとも1つのコドンにおいて改変を有する配列を指す。少なくとも1つのコドンにおける前記改変は「変異(mutation)」とも呼ばれる。変異配列の発現産物は、野生型に対して改変されたアミノ酸配列を有するタンパク質である。発現産物は、改変された機能的能力(例えば、増強された結合親和性)を有し得る。
【００５９】
用語「試料」とは、本明細書中で用いる場合、対象又は患者から得られた任意の生物学的物質も指す。一態様において、試料は、血液、腹水、CSF、唾液又は尿を含むことができる。他の態様において、試料は、全血、血漿、血清、血液試料から富化されたB細胞、及び培養された細胞(例えば、対象からのB細胞)を含むことができる。試料は、生検又は神経組織を含めた組織試料を含むこともできる。更に他の態様において、試料は、全細胞及び/又は細胞の溶解物を含むことができる。
【００６０】
本明細書中に開示された実施形態の種々の態様は、糖タンパク質Ibα-V-IX複合体及び剪断応力の双方の非存在下で、野生型に比べて、vWFに対するその結合親和性を増加させる、天然で生じることが知られていない、糖タンパク質Ibα細胞外ドメインに対する変異を含む新しい組換えポリペプチドに関する。本明細書中に開示された実施形態の種々の態様は、糖タンパク質Ibα細胞外ドメインと、糖タンパク質Ibα-V-IX複合体及び剪断応力の双方の非存在下で、オリゴマー化ドメインを欠如するポリペプチドに比べて、vWFに対する組換えポリペプチドの結合親和性を増加させるオリゴマー化ドメインとを含む組換えポリペプチドに関する。
【００６１】
実施形態の種々の態様は、本明細書中に開示された新規な組換えポリペプチドは、頑強な発現及び適切な折畳みの双方が可能であって、複合体機能アッセイに適しているという決定に関する。特に、本明細書中に開示された組換えポリペプチドの多くは、凝固における小さな欠陥を区別し、これらの欠陥をvWFに帰すことができる。
【００６２】
I.組換えポリペプチド
実施形態の種々の態様は、血小板糖タンパク質Ibα(GPIbα)の修飾された細胞外ドメインを含む、ヒトフォンヴィレブランド因子(vWF)に特異的に結合する組換えポリペプチドに関する。
【００６３】
用語「特異的に結合する」とは、例えば、ヒト血漿中、又はHEPES若しくはリン酸緩衝液中等の、生理学的条件下で、及び例えば、組換えポリペプチド(又はそのオリゴマーポリペプチド)と野生型ヒトvWFとの間で、約6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM、950nM、900nM、850nM、800nM、750nM、700nM、650nM、600nM、550nM、500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、若しくは50nM以下、又は約10μM、6μM、5μM、4μM、3μM、2μM、1μM、950nM、900nM、850nM、800nM、750nM、700nM、650nM、600nM、550nM、500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、若しくは50nM未満のいずれか等の、10μM以下の解離定数(Kd)を有する相互作用を指す。組換えポリペプチドが、特定の解離定数でヒトwWFに特異的に結合するか否かは、例えば、本明細書中で後に記載される蛍光異方性又は表面プラズモン共鳴によって決定することができる。
【００６４】
組換えポリペプチドは、典型的には、約250個〜約550個、約500個〜約750個、約600個〜800個、約750個〜約1000個、約250個〜約300個、約290個〜約350個、約300個〜約400個、約350個〜約450個、約400個〜約500個、約450個〜約550個、約560個〜約600個のアミノ酸、約550個〜約650個、約600個〜約700個、約650個〜約750個、約700個〜約800個、約750個〜約850個、約800個〜約900個、約850個〜約950個、又は約900個〜約1000個のアミノ酸等の、約250個のアミノ酸〜約1000個のアミノ酸の長さを有する。
【００６５】
組換えポリペプチドは、典型的には、約25〜約55、約50〜約75、約60〜約80、約75〜約100、約25〜約30、約29〜約35、約30〜約40、約35〜約45、約40〜約50、約45〜約55、約50〜約60のアミノ酸、約55〜約65、約60〜約70、約65〜約75、約70〜約80、約75〜約85、約80〜約90、約85〜約95、又は約90〜約100キロダルトン(kDa)等の、約25kDa〜約100kDaの分子量を有する。
【００６６】
本明細書中に開示された種類の組換えポリペプチドは、配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;又は配列番号41に記載のアミノ酸配列を有することができる。本明細書中に開示された種類の組換えポリペプチドは、配列番号21;配列番号22;配列番号23;配列番号24;配列番号25;配列番号26;配列番号27;配列番号28;配列番号29;配列番号30;配列番号31;配列番号32;配列番号33;配列番号34;配列番号35;配列番号36;配列番号37;配列番号38;配列番号39;配列番号40;又は配列番号41に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有することができ、すなわち、組換えポリペプチドの完全なアミノ酸配列は、天然に生じるアミノ酸配列ではない。
【００６７】
A.修飾された細胞外ドメイン
GPIbαの修飾された細胞外ドメインは、少なくとも1つの「機能獲得」又は「機能喪失」変異を含む1つ又は複数の変異を含有する、配列番号19に記載のアミノ酸配列、又はそのサブ配列に対応するGPIbαのvWF-結合ドメインである。機能獲得及び機能喪失変異は、それぞれ、修飾された細胞外ドメインと同一の、GPIbαのアミノ酸配列に及ぶ野生型細胞外ドメインに比べて、vWFに対する修飾された細胞外ドメインの結合親和性を増加又は減少させる。天然で生じることが知られていない機能獲得変異は、G233T、D235V、及びK237Vを含む(すなわち、アミノ酸は配列番号19におけるようにナンバリングされる)。天然で生じることが知られていない機能喪失変異は、A238V又はΔ(229〜240)を含む(すなわち、配列番号19におけるようにナンバリングされる)。
【００６８】
GPIbαの修飾された細胞外ドメインは、G233T、D235V、及びK237Vから選択される1つ又は複数の変異を含むことができる。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチド又はそのオリゴマーポリペプチドは、(a)組換えポリペプチドと同一のGPIbαのサブ配列を含み、かつ(b)1つ又は複数の変異を欠如する対照ポリペプチド(例えば、組換えポリペプチド及び対照ポリペプチドは、組換えポリペプチドにおける1つ又は複数の変異の存在及び対照ポリペプチドにおける1つ又は複数の変異の欠如を除いて同一である)よりも、ヒト血液試料又はヒト血漿試料のvWFに対して高い結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、組換えポリペプチド又はそのオリゴマーポリペプチド及びヒトvWFのKdは、例えば、ヒト血漿中、又はHEPES若しくはリン酸緩衝液中等の、生理学的条件下で、4μM、3μM、2μM、1μM、950nM、900nM、850nM、800nM、750nM、700nM、650nM、600nM、550nM、500nM、450nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、又は50nM未満である。Kdは、例えば、蛍光標識されたvWF、及びゆっくりと転動する粒子に結合した組換えポリペプチドの蛍光異方性分析によって、又は表面結合vWF及び可溶性組換えポリペプチドの表面プラズモン共鳴分析によって決定することができるが、組換えポリペプチド又はそのオリゴマーポリペプチドとvWFとの間のKdを決定するのに、いくつかの種々の方法も有用である。
【００６９】
GPIbαの修飾された細胞外ドメインは、A238V変異を含み得る。
【００７０】
修飾された細胞外ドメインは、典型的には、ヒトvWFに特異的に結合するのに十分な、ヒトGPIbαの一次構造を含む。修飾された細胞外ドメインは、例えば、配列番号19に記載のアミノ酸配列の、少なくとも約250、260、270、280、又は290個の連続アミノ酸に対して、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、99.5%の配列同一性を有し得る。修飾された細胞外ドメインは、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;又は配列番号42に記載のアミノ酸配列の、少なくとも約250、260、270、280、又は290個の連続アミノ酸に対して、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%の配列同一性を有し得る。修飾された細胞外ドメインは、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;又は配列番号42に記載のアミノ酸配列の、少なくとも約250、260、270、280、又は290個の連続アミノ酸に対して、100%の配列同一性を有し得る。修飾された細胞外ドメインは、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;又は配列番号42に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%、又は99.5%の配列同一性を有し得る。修飾された細胞外ドメインは、配列番号1;配列番号2;配列番号3;配列番号4;配列番号5;配列番号6;配列番号7;配列番号8;配列番号9;又は配列番号42に記載のアミノ酸配列を有し得る。
【００７１】
修飾された細胞外ドメインは、典型的には、野生型ヒトGPIbαの分子内ジスルフィド結合パターンを含めた、野生型ヒトGPIbα  vWF-結合ドメインと同様な二次及び三次構造を含む。野生型ヒトGPIbαの二次及び三次構造は、vWFに対して低い親和性を有する立体配座と、vWFに対して高い親和性を有する立体配座との間の、動的平衡状態で存在する。いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、例えば、組換えポリペプチド又はそのオリゴマーポリペプチドとvWFとの間の解離定数の測定によって評価して、vWFに対して高い親和性を有する立体配座にとって有利である。
【００７２】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、野生型ヒトGPIbαタンパク質に見出されるグリコシル化及び/又は他の翻訳後修飾を含む。いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、天然に存在する野生型ヒトGPIbαの糖型に対応する。
【００７３】
組換えポリペプチドは、典型的には、配列番号19に記載のvWF-結合ドメインに続く、GPIbαのアミノ酸291〜517に対応する天然変性細胞外領域を欠如する。組換えポリペプチドは、好ましくは、天然変性細胞外領域に続く、アミノ酸518〜540に対応するGPIbαの膜貫通ドメインを欠如する。組換えポリペプチドは、典型的には、任意の膜貫通ドメインを欠如する。組換えポリペプチドは、好ましくは、天然に生じるGPIbα中の膜貫通ドメインに続く、GPIbαのサイトゾルドメインを欠如する。
【００７４】
ある特定の好ましい実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、(すなわち、アミノ酸C65が配列番号19にナンバリングされるように)C65S又はC65A等のC65に対する変異を含む。
【００７５】
修飾された細胞外ドメインは、例えば、変異C65S及びG233T、変異C65S及びD235V、変異C65S及びK237V、又は変異C65S、G233T、及びM239Tを含み得る。
【００７６】
修飾された細胞外ドメインは、例えば、変異C65A、G233V及びM239Vを含み得る。いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、配列番号42に記載のアミノ酸配列を含む。
【００７７】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、野生型GPIbαアミノ酸のβ-分岐アミノ酸(例えば、バリン又はスレオニン)への変異を含み、野生型GPIbαアミノ酸は、β-分岐アミノ酸ではない。いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、野生型GPIbαアミノ酸の、ヒドロキシルを含むアミノ酸(例えば、スレオニン)への変異を含み、野生型GPIbαアミノ酸は、ヒドロキシルを含まない。いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、野生型GPIbαアミノ酸の、ヒドロキシルを含むβ-分岐アミノ酸(例えば、スレオニン)への変異を含み、野生型GPIbαアミノ酸は、ヒドロキシルを含むβ-分岐アミノ酸ではない。
【００７８】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、天然で生じることが知られていない変異を含む。
【００７９】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、修飾された細胞外ドメインと同一の、アミノ酸のストレッチにわたり、野生型細胞外ドメインの静電荷とは異なる生理学的pHにおける静電荷を有する(例えば、静電荷は、約1.0だけ等の、少なくとも約0.5だけ、野生型とは異なる)。
【００８０】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、グリシンのスレオニンへの変異等の、野生型アミノ酸よりも低い立体配座エントロピーを有するアミノ酸への、野生型GPIbαアミノ酸の変異を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、配列番号19のアミノ酸番号226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、又は244に対する変異から選択される1つ又は複数の変異を欠如する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、C65A、N226V、Y228V、W230L、K231V、Q232V、G233V、G233S、D235V、D235Y、K237V、A238V、M239S、M239V、M239I、T240V、及びA244Vから選択される1つ又は複数の変異を欠如する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、A238V変異を含み、組換えポリペプチドは、(a)組換えポリペプチドと同一の、GPIbαのサブ配列を含み、かつ(b)A238V変異を欠如する対照ポリペプチド(例えば、組換えポリペプチド及び対照ポリペプチドは、組換えポリペプチドにおけるA238V変異の存在及び対照ポリペプチドにおけるA238V変異の欠如を除いて同一である)よりも、ヒト血液試料又はヒト血漿試料のvWFに対して低い結合親和性を有する。いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、配列番号6に記載のアミノ酸配列を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、配列番号19に対して、アミノ酸229〜240の欠失(Δ(229〜240)変異)を含み、組換えポリペプチドは、(a)組換えポリペプチドと同一の、GPIbαのサブ配列を含み、かつ(b)Δ(229〜240)変異を欠如する対照ポリペプチドよりも、ヒト血液試料又はヒト血漿試料のvWFに対して低い結合親和性を有する(例えば、組換えポリペプチド及び対照ポリペプチドは、組換えポリペプチドにおけるΔ(229〜240)変異の存在及び対照ポリペプチドにおけるΔ(229〜240)変異の欠如を除いて同一である)。いくつかの実施形態において、修飾された細胞外ドメインは、配列番号9に記載のアミノ酸配列を含む。
【００８５】
B.架橋ドメイン
実施形態の種々の態様は、架橋ドメインを含む組換えポリペプチドに関する。架橋ドメインは、典型的には、組換えポリペプチドが、可溶性分子又は固体支持体に共有結合的又は非共有結合的に架橋されるのを可能とする。
【００８６】
発明者らは、組換えポリペプチドの第一級アミン(例えば、リジン)又はカルボキシル(例えば、アスパルテート、グルタメート、C末端)を、1-エチル-3-(-3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)又はN-ヒドロキシスクシンイミド(NHS)化学による等の、固体支持体又はアッセイの他の成分にランダムに架橋させる伝統的な化学の結果、アッセイの正確性及び精度を低下させる機能的欠陥がもたらされることを見出し、それを開示する。ランダム架橋は、多くの場合、アッセイ開発のための優れた戦略である。なぜならば、ランダム架橋は、多数の異なる配向の架橋された分子の集団を提供し、これは、架橋された分子の各表面と、アッセイにおけるそれらの結合パートナーとの間の相互作用を可能とするからである。一定方向の架橋(directional cross-linking)は、多くの場合、アッセイ開発のためのランダム架橋よりも劣っている。なぜならば、特に、分子が固体支持体に架橋された場合に、一定方向の架橋は、架橋された分子の表面をマスクし、各分子の構造及び動態に、並びにそれらと結合パートナーとの相互作用に影響を及ぼすことがあり、それにより、系統誤差をアッセイに導入するからである。例えば、一定方向の架橋は、組換えポリペプチドの設計、クローニング、発現、及び分析、並びに一定方向に架橋された組換えポリペプチドを利用するアッセイの検証の双方を必要とし、いずれの設計も系統誤差を回避するという保障がないため、一定方向の架橋は、一般的に、ランダム架橋と比較すると煩雑であり、費用がかかる。
【００８７】
実施形態の種々の態様は、組換えポリペプチドのC末端によって媒介される、本明細書中に記載された組換えポリペプチドの固体支持体への架橋が、ランダム架橋と比較すると優れた精度及び正確性を備えたアッセイを可能とするという知見に関する。
【００８８】
いくつかの実施形態において、組換えポリペプチドは、架橋ドメインを含む。架橋ドメインは、任意選択で、負に荷電したC末端ドメインを含み得る。負に荷電したC末端ドメインは、典型的には、約-1、-2、-3、-4、-5、又は-6未満の正味の電荷等の、中性pHにおける正味の負の電荷を有する3個〜20個のアミノ酸(すなわち、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20個のアミノ酸)のストレッチを含む。用語「負に荷電したC末端ドメイン」は、負に荷電したC末端ドメインのアミノ酸配列が、組換えポリペプチドのC末端のアミノ酸を含むことを必ずしも意味しないが、負に荷電したC末端ドメインは、C末端アミノ酸を含み得る。むしろ、「C末端」とは、組換えポリペプチドにおける血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインに対して相対的な、負に荷電したドメインの位置を指し、すなわち、負に荷電したC末端ドメインは、修飾された細胞外ドメインに対してC末端側である。
【００８９】
負に荷電したC末端ドメインは、典型的には、グルタメート及びアスパルテート(例えば、少なくとも3、4、5、6、7、8、9、又は10個のグルタメート及びアスパルテート)等のアミノ酸を含み、アルギニン、リジン、及びヒスチジン(例えば、6、5、4、3、2、又は1個以下のアルギニン、リジン、及びヒスチジン)等のアミノ酸を欠如する。負に荷電したC末端ドメインは、任意選択で、二次構造をとることが不利になるようにするのに有用である、程度が高い立体配座エントロピーを示す小さな親水性アミノ酸(例えば、グリシン、アラニン、セリン)及び/又はプロリンも含み得る。
【００９０】
いくつかの実施形態において、架橋ドメインは、負に荷電したC末端ドメイン及び親和性タグを含み得る。いくつかの実施形態において、親和性タグは、ポリヒスチジンタグである。ポリヒスチジンタグ及び負に荷電したC末端ドメインの双方を含む組換えポリペプチドにおいて、負に荷電したC末端ドメインは、典型的には、修飾された細胞外ドメインとポリヒスチジンタグとの間に位置する。負に荷電したC末端ドメイン及びポリヒスチジンタグを含むアミノ酸配列の例は、配列番号17に示される。
【００９１】
親和性タグ及び負に荷電したC末端ドメインの双方を含む組換えポリペプチドにおいて、負に荷電したC末端ドメインは、典型的には、修飾された細胞外ドメインと親和性タグとの間に位置する。
【００９２】
架橋ドメインは、任意選択で、C末端システインを含むことができる。C末端システインは、例えば、チオール-マレイミド化学又はチオール-金相互作用を用いて、組換えポリペプチドを固体支持体又はアッセイの他の成分に架橋させるのに有用である。いくつかの実施形態において、架橋ドメインは、C末端システイン及び親和性タグを含み得る。いくつかの実施形態において、親和性タグは、ポリヒスチジンタグである。ポリヒスチジンタグ及びC末端システインを含むアミノ酸配列の例は、配列番号16に記載されている。
【００９３】
用語「C末端システイン」は、C末端システインが組換えポリペプチドのC末端アミノ酸であることを必ずしも意味しないが、C末端システインは、C末端アミノ酸であり得る。むしろ、「C末端」とは、組換えポリペプチドにおける血小板糖タンパク質Ibαの修飾された細胞外ドメインに対して相対的な、C末端システインの位置を指し、すなわち、C末端システインは、修飾された細胞外ドメインに対してC末端側である。
【００９４】
架橋ドメインは、任意選択で、ストレプトアビジン結合タンパク質又はその機能的等価物を含むことができる。ストレプトアビジン結合タンパク質は、組換えポリペプチドをストレプトアビジンに非共有結合的に架橋させるのに有用である。いくつかの実施形態において、架橋ドメインは、ストレプトアビジン結合タンパク質及び親和性タグを含み得る。いくつかの実施形態において、親和性タグは、ポリヒスチジンタグである。ストレプトアビジン結合タンパク質及びポリヒスチジンタグを含むアミノ酸配列の例は、配列番号18に記載されている。
【００９５】
いくつかの実施形態において、架橋ドメインは、抗体のFcドメインを含み得る。抗体のFcドメインを含むアミノ酸配列の例は、配列番号11又は配列番号12に記載されている。
【００９６】
本発明による架橋ドメインは、配列番号11;配列番号12、配列番号16;配列番号17;又は配列番号18に記載のアミノ酸配列を有し得る。
【００９７】
C.親和性タグ
組換えポリペプチドは、任意選択で、親和性タグを含み得る。親和性タグは精製で有用であり、それらは、組換えポリペプチドを利用するアッセイにおいても有用であり得る。例示的な親和性タグは、ポリヒスチジンタグ、Snapタグ、Clipタグ、HaloTag、SnoopTag、SpyTag、キチン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、Strep-タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ、FLAG-タグ、V5-タグ、Myc-タグ、HA-タグ、NE-タグ、AviTag、カルモジュリン-タグ、ポリグルタメート、S-タグ、SBP-タグ、Softag 1、Softag 3、TCタグ、VSV-タグ、Xpressタグ、Isopeptag、ビオチンカルボキシルキャリアタンパク質、緑色蛍光タンパク質-タグ、Nus-タグ、チオレドキシン-タグ、及び抗体のFcドメインを含むが、親和性タグの選択は特に制限されない。組換えポリペプチドは、それにもかかわらず、例えば、親和性タグが使用後に除去される場合、又は親和性タグを必要としない戦略を用いて組換えポリペプチドが精製される場合、親和性タグを欠如し得る。例示的な親和性タグは、典型的には、6個又は8個の連続ヒスチジンを含むアミノ酸配列を含むポリヒスチジンタグであるが、ヒスチジン残基の数は特に制限されない(例えば、配列番号15〜18、43、44、46参照)。いくつかの実施形態において、親和性タグは、グリシンリンカーを含み得る(例えば、配列番号44参照)。いくつかの実施形態において、親和性タグは、抗体のFcドメインを含み得る(例えば、配列番号46参照)。いくつかの実施形態において、親和性タグは、抗体のFcドメインである(例えば、配列番号11又は12参照)。
【００９８】
本発明による親和性タグは、配列番号11;配列番号12;配列番号15;配列番号16;配列番号17;配列番号18;配列番号43;配列番号44;配列番号45;又は配列番号46に記載のアミノ酸配列を有することができる。
【００９９】
C.オリゴマー化ドメイン
組換えポリペプチドは、任意選択で、オリゴマー化ドメインを含み得る。オリゴマー化ドメインは、ダイマー、トリマー、テトラマー、ペンタマー、及び/又はより高次のオリゴマー等のオリゴマーの形成を可能とする。オリゴマー化ドメインは、特定の化学量論にとって有利であり得、例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、若しくはペンタマー、又はオリゴマー化ドメインは、異なる化学量論を有するオリゴマーの分布を可能とし得る。オリゴマー化ドメインは、ホモ-オリゴマーを形成するように設計され得るが、ホモ-オリゴマーとヘテロ-オリゴマーとの間の区別は特に制限されない。いくつかの実施形態において、オリゴマー化ドメインは、ホモ-ダイマー、ホモ-トリマー、ホモ-テトラマー、又はホモ-ペンタマーを形成することができ、例えば、組換えポリペプチドのオリゴマー化の結果、圧倒的に単分散のオリゴマーがもたらされる。オリゴマー化ドメインは、例えば、p53、GCN4、クラスリン、pent-タグ、又は抗体のFcドメインからのオリゴマー化ドメインであり得る。
【０１００】
オリゴマー化ドメインは、アッセイで用いる組換えポリペプチドに、いくつかの利点を提供する。オリゴマー化ドメインは、お互いに対して組換えポリペプチドを配向させることができ、これは、例えば、血小板の脂質二重層中の天然GPIbαの配向を模倣することができる。例えば、vWFは多価であり、オリゴマーポリペプチドの、多数の修飾された細胞外ドメインのvWFへの結合は、本質的に、単一の修飾された細胞外ドメインのvWFへの結合よりも高い結合親和性を有するため、オリゴマー化ドメインは、vWFに対する組換えポリペプチドの親和性を増加させることもできる。
【０１０１】
例示的なオリゴマー化ドメインは、抗体Fcドメインヒンジ領域のアミノ酸配列を含む。上記のオリゴマー化ドメインの利点に加えて、Fcドメインは、多くの場合、発現細胞における組換えポリペプチドの発現及び/又は分泌を増加させる。
【０１０２】
抗体Fcドメインの種は、組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドの所望の使用に基づいて選択され得る。例えば、抗体Fcドメインの種は、特定の試薬がアッセイにおいて抗体Fcドメインを標的とするか又はそれを無視するかのいずれかになるように選択され得る。例えば、抗マウス二次抗体を、アッセイにおいて他のマウス抗体を検出するために用いない場合、マウスFcドメインは有用であり得る。同様に、マウスFcドメインは、抗マウス抗体を用いて、組換えポリペプチドを固体支持体又はアッセイの他の成分に架橋させるのに有用であり得る。Fcドメインの種は、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、又は前述の種のいずれかのキメラであり得るが、Fcドメインの種は特に制限されない。
【０１０３】
例示的なオリゴマー化ドメインは、オリゴマー化ドメインを含む組換えポリペプチドが共有結合ホモダイマーを形成するのを可能とする、ヒンジ領域を含むマウスIgG Fcドメインである。ダイマーマウスIgG Fcドメインは、配列番号11若しくは配列番号12に記載のアミノ酸配列、又は配列番号11若しくは配列番号12に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約95%、96%、97%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【０１０４】
Fcドメインを含むポリペプチドを精製する方法は周知であるので、Fcドメインは、組換えポリペプチドの精製を助けることもできる。Fcドメインは、架橋ドメインとしても作用し得る。Fcドメインは親和性タグとしても作用し得る。
【０１０５】
別の例示的なオリゴマー化ドメインは、p53テトラマー化ドメインである。p53テトラマー化ドメインは、配列番号10に記載のアミノ酸配列、又は配列番号10に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約95%、96%、97%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【０１０６】
別の例示的なオリゴマー化ドメインは、GCN4トリマー化ドメインである。GCN4トリマー化ドメインは、配列番号13に記載のアミノ酸配列、又は配列番号13に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約95%、96%、97%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。GCN4様配列を含む組換えポリペプチドは、例えば、平行トリマーとなるように設計され得る。代替のGCN4様配列は、当該分野で公知の方法に従い、平行又は逆平行構成を有するダイマー、トリマー、及びテトラマーオリゴマーを調製するために、当該分野で公知のように設計され得る(例えば、Harbury、Zhang、Kim及びAlber、「A switch between two-, three-, and four-stranded coiled coils in GCN4 leucine zipper mutants」、Science (1993) 262:1401参照)。
【０１０７】
別の例示的なオリゴマー化ドメインは、クラスリントリマー化ドメインである。クラスリントリマー化ドメインは、配列番号14に記載のアミノ酸配列、又は配列番号14に記載のアミノ酸配列に対して、少なくとも約95%、96%、97%、98%、若しくは99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し得る。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、オリゴマー化ドメインは、親和性タグを含み得る。
【０１０９】
本発明によるオリゴマー化ドメインは、配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;又は配列番号46に記載のアミノ酸配列を有することができる。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、vWFと、オリゴマー化ドメインを含む組換えポリペプチドとの間の解離定数(Kd)は、vWFと、(a)組換えポリペプチドと同一の、GPIbαのサブ配列又はその変異体サブ配列を含み、かつ(b)オリゴマー化ドメインを欠如する対照ポリペプチド(例えば、対照ポリペプチド及び組換えポリペプチドは、組換えポリペプチドにおけるオリゴマー化ドメインの存在及び対照ポリペプチドにおけるオリゴマー化ドメインの欠如を除いて同一である)との間の解離定数未満である。そのような組換えポリペプチドと対照ポリペプチドとの間の解離定数(Kd)の差は、典型的には、主として、又は単に、組換えポリペプチド及び対照ポリペプチドのオリゴマー化状態に帰すことができる。
【０１１１】
他のオリゴマー化ドメインは当該分野で公知であり、オリゴマー化ドメインの具体的な選択は特に制限されない。ストレプトアビジンは、例えば、特に有用なオリゴマー化ドメインであり得る。なぜならば、それはテトラマーを形成し、また、ビオチンに結合し、これは、精製を助けることができ、また、種々のアッセイで有用であり得るからである。
【０１１２】
D.リーダーペプチド配列
本明細書中に開示された組換えポリペプチドは、典型的には、ヒト細胞等の哺乳動物細胞等の、発現ベクターの細胞膜を横切っての組換えポリペプチドの移行にとって有利なように、リーダーペプチド配列を含む。組換えポリペプチドは、それにもかかわらず、例えば、リーダーペプチド配列が酵素的又は化学的切断によって組換えポリペプチドから切断される場合、リーダーペプチド配列を欠如し得る。合成により生じた組換えポリペプチドは、同様に、リーダーペプチド配列を欠如し得る。
【０１１３】
リーダーペプチド配列は、典型的には、組換えポリペプチドのN末端に含まれる。リーダーペプチド配列は、好ましくは、真核生物細胞における組換えポリペプチドの翻訳後に真核生物細胞(例えば、ヒト細胞等の哺乳動物細胞)の細胞表面膜の外側に組換えポリペプチドを移行させるのに十分であるが、組換えポリペプチドの他の配列モチーフも移行を助け得る。
【０１１４】
例示的なリーダーペプチド配列は、ヒト組織プラスミノーゲンシグナルペプチドである、配列番号20に記載のアミノ酸配列を有する。このよく特徴付けられた配列は、ヒト細胞外へ、及び他の哺乳動物細胞外へとポリペプチドを移行させることができる。
【０１１５】
II.オリゴマーポリペプチド
実施形態の種々の態様は、本明細書中に記載された2個、3個、4個、又はそれを超える組換えポリペプチド(サブユニット)を含むオリゴマーポリペプチドに関する。いくつかの実施形態において、オリゴマーポリペプチドは、ダイマーポリペプチド、すなわち、2個のサブユニットを含むオリゴマーポリペプチドであり、各サブユニットは本明細書中に記載された組換えポリペプチドである。修飾語「オリゴマー」、「ダイマー」、又はマルチサブユニット形態への他の明示的な言及なしに用いられる用語「ポリペプチド」とは、ダイマー、トリマー、又はテトラマー等のオリゴマーに存在してもしよいし、していなくてもよい組換えポリペプチドを指す。
【０１１６】
オリゴマーポリペプチドの各サブユニットは、典型的には、同一のアミノ酸配列を有するが、オリゴマーポリペプチドの異なるサブユニットは、異なるアミノ酸配列を有し得る。ヘテロダイマーポリペプチドは、例えば、第1のサブユニットのシステインチオールを脱離基で(例えば、2-2'ジチオ-ビス-(5-ニトロピリジン)で)活性化し、第2のサブユニットのチオールを(例えば、β-メルカプトエタノール又はトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィンで)還元し、次いで、第1のサブユニット及び第2のサブユニットを接触させることによって作製し得る。或いは、サブユニットは、ランダムに架橋され、次いで、精製され得る。ホモダイマーポリペプチドは、同様な戦略を用いて作製し得る。オリゴマーポリペプチドを、オリゴマー化後に精製して、所望のオリゴマーポリペプチドをモノマーサブユニット及び他の望まない種から分離し得る。
【０１１７】
オリゴマーポリペプチドは、対称であり得る、又はオリゴマーポリペプチドは、対称性を欠如し得る。例えば、オリゴマーポリペプチドは、「分子間」ジスルフィド結合パターンを形成でき、その結果、対称性を欠如する第四級構造がもたらされる。
【０１１８】
オリゴマーポリペプチドは、非共有結合又は共有結合相互作用によって架橋され得る。非共有結合相互作用の例は、GCN4若しくはクラスリンオリゴマー化ドメインのトリマー化、又はp53オリゴマー化ドメインのテトラマー化である。共有結合相互作用の例は、抗体Fcドメインヒンジ領域のジスルフィド-結合媒介ダイマー化である。抗体Fcドメインを含むサブユニットを有するダイマーポリペプチドは、少なくとも1個のジスルフィド結合、(例えば、IgG1及びIgG4由来Fcドメインのための)典型的には2個のジスルフィド結合、又は(例えば、IgG2由来Fcドメインのための)4個のジスルフィド結合によって共有結合的に架橋し得るが、ジスルフィド結合の数は特に制限されない。IgG3は、例えば、11個のジスルフィド結合で架橋され得る。
【０１１９】
ダイマーポリペプチドは2個のサブユニットを含むことができ、各サブユニットは抗体Fcドメインを含み、抗体Fcドメインはダイマーポリペプチドの2個のサブユニットを架橋させる。
【０１２０】
トリマーポリペプチドは3個のサブユニットを含むことができ、各サブユニットはGCN4トリマー化ドメインを含み、GCN4トリマー化ドメインは、トリマーポリペプチドの3個のサブユニットを非共有結合的に架橋させる。トリマーポリペプチドは3個のサブユニットを含むことができ、各サブユニットはクラスリントリマー化ドメインを含み、クラスリントリマー化ドメインは、トリマーポリペプチドの3個のサブユニットを非共有結合的に架橋させる。
【０１２１】
テトラマーポリペプチドは4個のサブユニットを含むことができ、各サブユニットはp53テトラマー化ドメインを含み、p53テトラマー化ドメインは、テトラマーポリペプチドの4個のサブユニットを非共有結合的に架橋させる。
【０１２２】
本発明の種々の実施形態は、ダイマーポリペプチドを含む組成物を含み、組成物は、ダイマーポリペプチドでないオリゴマーポリペプチドを本質的に含まない。組成物は、ダイマーポリペプチドでないオリゴマーポリペプチドを欠如し得る。
【０１２３】
本発明の種々の実施形態は、トリマーペプチドを含む組成物を含み、組成物は、トリマーポリペプチドではないオリゴマーポリペプチドを本質的に含まない。組成物は、トリマーポリペプチドではないオリゴマーポリペプチドを欠如し得る。
【０１２４】
本発明の種々の実施形態は、テトラマーポリペプチドを含む組成物を含み、組成物は、テトラマーポリペプチドではないオリゴマーポリペプチドを本質的に含まない。組成物は、テトラマーポリペプチドではないオリゴマーポリペプチドを欠如し得る。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、組成物は、モノマー組換えポリペプチドを含み、組成物は、オリゴマーポリペプチドを本質的に含まない。組成物は、オリゴマーポリペプチドを欠如し得る。
【０１２６】
III.核酸、クローニング細胞、及び発現細胞
本明細書中に記載された実施形態は、本明細書中に記載された修飾された細胞外ドメイン(例えば、配列番号1〜9、又は42)及び/又は組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸も含む。核酸は、DNA又はRNAであり得る。本明細書中に記載された組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むDNAは、典型的には、ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、好ましくは、目的の発現細胞におけるヌクレオチド配列の構成的又は誘導性発現を駆動することができる。核酸の正確なヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列が本明細書中に記載された組換えポリペプチドをコードする限り、特に制限されない。コドンは、例えば、目的の発現細胞(例えば、ヒト細胞等の哺乳動物細胞)のコドンバイアスと適合するように、及び/又はクローニングの間の便宜のために選択され得る。DNAは、例えば、(例えば、原核生物細胞におけるプラスミドの複製のために)複製起点を含み得るプラスミドであり得る。
【０１２７】
実施形態の種々の態様は、本明細書中に記載された修飾された細胞外ドメイン及び/又は組換えポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む細胞に関する。細胞は、発現細胞又はクローニング細胞であり得る。核酸は、典型的には、大腸菌においてクローニングされるが、他のクローニング細胞を使用することができる。細胞が発現細胞である場合、核酸は、任意選択で、染色体の核酸であり、すなわち、ヌクレオチド配列は染色体に組み込まるが、次いで、核酸は、例えば、染色体外DNAとして発現細胞に存在し得る。
【０１２８】
実施形態の種々の態様は、本明細書中に記載された組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチド(例えば、ダイマー、トリマー、又はテトラマーポリペプチド)を含む細胞に関する。実施形態の種々の態様は、本明細書中に記載された細胞、細胞培養培地、及び組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドを含む組成物であって、細胞が、組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドのサブユニットをコードする核酸を含み、細胞培養液が、組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドを含む(例えば、細胞は、組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドを細胞培養液中に分泌したからである)、組成物に関する。細胞は典型的には、発現細胞である。発現細胞の性質は特に制限されない。哺乳動物発現細胞は、好ましい折畳み、翻訳後修飾、及び/又は組換えポリペプチド若しくはオリゴマーポリペプチドの分泌を可能とし得るが、他の真核生物細胞又は原核生物細胞も発現細胞として使用し得る。例示的な発現細胞は、CHO、HEK、BHK、NS0、Sp2/0、COS、C127、HT-1080、PER.C6、HeLa、及びジャーカット細胞を含む。
【０１２９】
IV.組成物及びアッセイに関連する方法
本発明の種々の態様は、本明細書中に記載された組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドを含む組成物であって、組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドが、固体支持体に直接的又は間接的に結合している、組成物に関する。用語「直接的」結合とは、本明細書中で用いる場合、固体支持体への分子の直接的コンジュゲーション、例えば、組換えポリペプチドのシステインチオールを金表面に結合する金-チオール相互作用を指す。用語「間接的」結合は、本明細書中で用いる場合、固体支持体に直接的に結合した別の分子への組換えポリペプチドの特異的結合を含み、例えば、組換えポリペプチドは、固体支持体に直接的に結合した抗体に結合でき、それにより、組換えポリペプチドを固体支持体に間接的に結合する(例えば、図4A参照)。用語「間接的」結合は、(a)分子のデイジー鎖(daisy chain)の間の各相互作用が特異的若しくは共有結合相互作用であり、(b)デイジー鎖の末端分子が固体支持体に直接的に結合している限り、組換えポリペプチドと固体支持体との間の分子の数から独立している(例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ(HRP)、抗vWF抗体、vWF、及び組換えポリペプチド(「GPIbα」)が、各々、抗CD42b抗体の固体支持体への直接的結合を介して固体支持体に間接的に結合している図4A参照)。
【０１３０】
本発明の種々の態様は、本明細書中に記載された組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドを含む組成物であって、組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドが、固体支持体に共有結合的又は非共有結合的に結合している、組成物に関する。用語「非共有結合的に結合した」とは、本明細書中で用いる場合、例えば、ストレプトアビジン結合タンパク質とストレプトアビジン、又は抗体とその抗原との間の相互作用によって例示される、抗体とその抗原、リガンドとその受容体、又は酵素とその基質との間等の特異的結合を指す(例えば、図4A参照)。特異的結合とは、一般には、約1μM未満、約100nM未満、又は約10nM未満等の、約10μM未満の解離定数(Kd)を有する相互作用を指す。
【０１３１】
固体支持体は、粒子、ビーズ、膜、表面、ポリペプチドチップ、マイクロタイタープレート、又はクロマトグラフィーカラムの固相を含み得る。例えば、固体支持体はラテックスビーズであり得る。
【０１３２】
組成物は、複数のビーズ又は粒子を含むことができ、複数のビーズ又は粒子の各ビーズ又は粒子は、本明細書中に記載された少なくとも1つの組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドに直接的又は間接的に結合している。組成物は、複数のビーズ又は粒子を含むことができ、複数のビーズ又は粒子の各ビーズ又は粒子は、本明細書中に記載された少なくとも1つの組換えポリペプチド又はオリゴマーポリペプチドに共有結合的又は非共有結合的に結合している。
【０１３３】
組成物は、フォンヴィレブランド因子を含み得る。組成物は、例えば、全血又は血漿等のその画分等の水性溶液又は懸濁液中に、ヒトvWFを含み得る。組成物は、固体支持体を含むことができ、固体支持体は、複数のビーズ又は粒子を含み、vWFは、複数の粒子又はビーズのうちの粒子又はビーズを架橋させる。
【０１３４】
組成物は、ヒト血漿を含み得る。組成物は、ヒト血小板を含み得る。組成物は、ヒト血漿及びヒト血小板を含み得る。
【０１３５】
組成物は抗体を含むことができ、例えば、抗体はヒト抗体ではない。抗体は、例えば、マウス、ウサギ、ラット、ハムスター、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ニワトリ、又は前述の種のキメラであり得るが、種の抗体は特に制限されない。組成物は、抗vWF抗体、好ましくは抗ヒトvWF抗体を含み得る。組成物は、蛍光標識された抗体を含み得る。いくつかの実施形態において、抗ヒトvWF抗体は、色素、フルオロフォア、又は酵素に直接的又は間接的に結合している。
【０１３６】
組成物は、HEPES又はリン酸緩衝液等のpH緩衝液を含み得る。組成物は、ポリビニルピロリドン(PVP)、Tween(例えば、Tween 20)、又はデキストラン-500を含み得る。
【０１３７】
組成物は、更に、リストセチンを含み得る。本明細書中に開示された組換えポリペプチドの1つの利点は、リストセチンを必要としないアッセイの開発である。いくつかの実施形態において、本明細書中に開示された組成物はリストセチンを欠如する。
【０１３８】
実施形態の種々の態様は、本明細書中に記載された組成物及び使用のための説明書を含むキットに関する。
【実施例】
【０１３９】
(実施例1)
組換えポリペプチドの発現及び精製
290個のアミノ酸からなる糖タンパク質Ibα(GPIbα)のフォンヴィレブランド因子(vWF)-結合ドメイン(配列番号19)を、ヒト組織プラスミノーゲンアクチベーターからのN末端リーダーペプチド(配列番号20)及びC末端ポリヒスチジンタグ(配列番号15、16、17、18、43、44又は46)を伴う形でクローニングした。選択したアミノ酸変異をGPIbαのvWF-結合ドメインに導入した。オリゴマー化ドメイン及び架橋ドメインを選択した構築物にクローニングした。構築物を、ヒト胚性腎臓(HEK)細胞又はチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中で一過的に又は安定に発現させた。0.02%のアジ化ナトリウムを含むリン酸緩衝化生理食塩水(PPS)移動相を用いる固定化金属親和性クロマトグラフィー(IMAC)によって、組換えポリペプチドを細胞培養上清から精製した。組換えポリペプチドの純度は、4〜15%のTGX(商標)ポリアクリルアミドゲル(Bio-Rad社、California)中での還元条件下で、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)によって評価した。選択した組換えポリペプチドを含有するゲルの像を、図1に示す。
【０１４０】
(実施例2)
vWFと組換えポリペプチドとの間の結合親和性(Kd)の測定
vWFと選択したダイマーポリペプチド若しくはポリマーポリペプチド対照(G233V、M239V-noFc(配列番号35))との間の解離定数(Kd)を、蛍光異方性によって評価した。各ダイマーポリペプチドは、各々が、ネズミFcダイマー化ドメイン及びGPIbαの修飾された細胞外ドメインを含む、2個の組換えポリペプチドサブユニットを含んだ。評価したダイマーポリペプチドは、配列番号38(Δ(229〜240));配列番号37(WT);配列番号36(A238V);配列番号34(G233V、M239V);配列番号32(G233V);配列番号33(G233T、M239T);配列番号21(G233T);配列番号30(D235V);配列番号31(K237V)に対応する。GPIbα vWF-結合ドメインに特異的に結合するvWF A1ドメイン(ヒトvWFのアミノ酸1277〜1453)を、システイン-チオール-マレイミド化学反応を用いて、AlexaFluor(商標)488蛍光標識(Molecular Probes社、Oregon)にコンジュゲートした。組換えポリペプチドは、ゆっくりと転動する粒子にコンジュゲートした。5μM〜9.75nMの各組換えポリペプチドの2倍系列希釈を、室温にて、150nMのvWF A1-AlexaFluor(商標)488種と共に30分を超えてインキュベートし、次いで、蛍光異方性を測定した。結果を図2に示す。変異を含まなかった組換えポリペプチドは、約1.25μMのKdを示した。G233T、D235V、又はK237V変異の1種を含んだ組換えポリペプチドは、各々、500nM未満のKdを示した(すなわち、それぞれ、単一の変異体について、約67nM、約250nM、及び約300nM)。G233T、D235V、又はK237V変異体の相対的結合親和性は、ELISAによって確認した(それぞれ、図4D、図4B及び図4C、並びに以下の実施例3参照)。
【０１４１】
蛍光異方性の結果は、Biacore(商標) (Biacore社、Sweden)を用いる表面プラズモン共鳴によって確認した(図3)。vWF A1ドメインをBiacore社CM5チップにコンジュゲートした。GPIbα細胞外ドメインに対するG233T変異、C末端ネズミFcドメイン、及びC末端8-Hisタグを含む組換えポリペプチド(配列番号21)のオン-及びオフ-速度を測定し、解離定数は、約58nMと計算され、これは、蛍光異方性によって得られた約67nM測定値と合致する。
【０１４２】
(実施例3)
組換えポリペプチドは、ELISAによってvWF結合における質的欠陥を検出することができる
酵素免疫吸着検定法(ELISA)を用いて、G233T(配列番号21)、D235V(配列番号30)、及びK237V(配列番号31)変異を含む組換えポリペプチドが、vWF結合親和性における質的差を検出することができることを決定した。図4Aは、ELISAアッセイの略画を示す。簡単に述べれば、組換えポリペプチドのGPIbαの修飾された細胞外ドメインに特異的に結合し、マルチ-ウェルプレート(すなわち、固体支持体)へ組換えポリペプチドを間接的に架橋するのに用いた抗CD42b抗体でマルチ-ウェルプレートのウェルをコーティングした。種々の対照試料、標準、及びその系列希釈を、1型、2B型、及び3型のフォンヴィレブランド病に関連する血漿試料、プールされたヒト血漿の対照試料、フォンヴィレブランド病を有しないことが知られているヒト血漿の対照試料、希釈なし〜16倍希釈のプールされたヒト血漿の参照標準の2倍系列希釈、及び陰性対照としてのヤギ血清を含む、マルチ-ウェルプレートの異なるウェルに添加した。インキュベーションの後、ウェルを洗浄し、次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートされたポリクローナルウサギ抗ヒトvWF抗体と接触させた。450nmにおける吸収分光法によってホースラディッシュペルオキシダーゼ基質の生成物への変換をモニターすることによって、結合したvWFを定量した。
【０１４３】
G233T、D235V、又はK237V変異を含む組換えポリペプチドの各々は、例えば、正常な血漿試料及び対照試料に対して、1型、2B型及び3型のフォンヴィレブランド病に関連する血漿試料における欠陥を検出することができた(図4B〜図4D)。G233T、D235V、及びK237V変異を含む組換えポリペプチドの各々は、系列希釈の5つの試料と吸光度測定との間の正確な相関付けも可能とした。これらの結果は、G233T、D235V、及びK237V変異のうちの少なくとも1種を含む本明細書中に記載された組換えポリペプチドが、フォンヴィレブランド病を検出するためのアッセイで用いることができ、そのようなアッセイは、1桁以上に及ぶダイナミックレンジにわたって、血漿中のvWF濃度及び/又は結合親和性の正確な測定を可能し得ることを示す。
【０１４４】
（参考文献）
2020514269.tif 000003
【図１】
2020514269.tif 000004
【図２】
2020514269.tif 000005
【図３】
2020514269.tif 000006
【図４Ａ】
2020514269.tif 000007
【図４Ｂ】
2020514269.tif 000008
【図４Ｃ】
2020514269.tif 000009
【図４Ｄ】
2020514269.tif 000010
【配列表】
2020514269000001.app
【国際調査報告】
2020514269.tif 000011
2020514269.tif 000012
2020514269.tif 000013
2020514269.tif 000014
2020514269.tif 000015
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