(57)【要約】本開示の主題は、プログラム死リガンド１（ＰＤ?Ｌ１）を検出することができる造影剤を含む組成物、キット、および方法を提供する。本開示の造影剤を使用して、被験体におけるがん、感染症、および炎症などの疾患ならびに障害を検出することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）に対して結合特異性を有するペプチドとレポーティング部位とのコンジュゲート、および任意にリンカーを含む造影剤であって、前記リンカーが、存在する場合には、前記ペプチドと前記レポーティング部位とを連結し、前記リンカーが存在しない場合には、前記レポーティング部位が前記ペプチドのアミノ酸の第一級アミンを介して前記ペプチドに直接結合している、造影剤。
【請求項２】
ＰＤ-Ｌ１に対して結合特異性を有する前記ペプチドが、ＰＤ-Ｌ１のアミノ酸Ｙ５６、Ｅ５８、Ａ１１３、Ｍ１１５、およびＹ１２３と相互作用する、請求項１に記載の造影剤。
【請求項３】
プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）に対して結合特異性を有する前記ペプチドが、ペプチドＷＬ１２、ＤＫ-Ａ-２２１、またはＤＫ-Ａ-２２２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１または２に記載の造影剤。
【請求項４】
プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）に対して結合特異性を有する前記ペプチドが、ペプチドＷＬ１２、ＤＫ-Ａ-２２１、またはＤＫ-Ａ-２２２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有する、請求項３に記載の造影剤。
【請求項５】
プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）造影剤に対して結合特異性を有する前記ペプチドが、ペプチドＷＬ１２、ＤＫ-Ａ-２２１、またはＤＫ-Ａ-２２２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、請求項４に記載の造影剤。
【請求項６】
プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）に対して結合特異性を有する前記ペプチドが、ペプチドＷＬ１２、ＤＫ-Ａ-２２１、またはＤＫ-Ａ-２２２に対して１００％の配列同一性を有する、請求項５に記載の造影剤。
【請求項７】
前記レポーティング部位が、キレート剤、放射性標識基質、蛍光染料、光音響レポーティング分子、およびラマン活性レポーティング分子からなる群より選択される、請求項１に記載の造影剤。
【請求項８】
前記レポーティング部位がキレート剤であり、前記キレート剤が、以下からなる群より選択される、請求項７に記載の造影剤：ＤＯＴＡＧＡ（１，４，７，１０-テトラアザシクロドデセカン，１-（グルタル酸）-４，７，１０-三酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１，４，７，１０-四酢酸）、ＤＯＴＡＳＡ（１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１-（２-コハク酸）-４，７，１０-三酢酸）、ＣＢ-ＤＯ２Ａ（１０-ビス（カルボキシメチル）-１，４，７，１０-テトラアザビシクロ［５．５．２］テトラデカン）、ＤＥＰＡ（７-［２-（ビス-カルボキシメチルアミノ）-エチル］-４，１０-ビス-カルボキシメチル-１，４，７，１０-テトラアザ-シクロドデカ-１-イル-酢酸））、３ｐ-Ｃ-ＤＥＰＡ（２-［（カルボキシメチル）］［５-（４-ニトロフェニル-１-［４，７，１０-トリス（カルボキシメチル）-１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１-イル］ペンタン-２-イル）アミノ］酢酸））、ＴＣＭＣ（２-（４-イソチオシアノトベンジル）-１，４，７，１０-テトラアザ-１，４，７，１０-テトラ-（２-カルバモニルメチル）-シクロドデカン）、オキソ-ＤＯ３Ａ（１-オキサ-４，７，１０-トリアザシクロドデカン-５-Ｓ-（４-イソチオシアナトベンジル）-４，７，１０-三酢酸）、ｐ-ＮＨ２-Ｂｎ-オキソ-ＤＯ３Ａ（１-オキサ-４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-５-Ｓ-（４-アミノベンジル）-４，７，１０-三酢酸）、ＴＥ２Ａ（（１，８--Ｎ，Ｎ´-ビス-（カルボキシメチル）-１，４，８，１１-テトラアザシクロテトラデカン））、ＭＭ-ＴＥ２Ａ、ＤＭ-ＴＥ２Ａ、ＣＢ-ＴＥ２Ａ（４，１１-ビス（カルボキシメチル）-１，４，８，１１-テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン）、ＣＢ-ＴＥ１Ａ１Ｐ（４，８，１１-テトラアザシクロテトラデカン-１-（メタンホスホン酸）-８-（メタンカルボン酸）、ＣＢ-ＴＥ２Ｐ（１，４，８，１１-テトラアザシクロテトラデカン-１，８-ビス（メタンホスホン酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１-テトラアザシクロテトラデカン-１，４，８，１１-四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７-トリアザシクロノナン-Ｎ，Ｎ´、Ｎ´´-三酢酸）、ＮＯＤＡ（１，４，７-トリアザシクロノナン-１，４-ジアセテート）；ＮＯＤＡＧＡ（１，４，７-トリアザシクロノナン，１-グルタル酸-４，７-酢酸）、（ＮＯＴＡＧＡ）１，４，７-トリアゾナン-１，４-ジイル）二酢酸ＤＦＯ（デスフェロキサミン）、ＮＥＴＡ（［４-［２-（ビス-カルボキシメチルアミノ）-エチル］-７-カルボキシメチル-［１，４，７］トリアゾナン-１-イル｝-酢酸）、ＴＡＣＮ-ＴＭ（-Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，トリス（２-メルカプトエチル）-１，４，７-トリアザシクロノナン）、ジアムサル（１，８-ジアミノ-３，６，１０，１３，１６，１９-ヘキサアザビシクロ（６，６，６）エイコサン、３，６，１０，１３，１６，１９-ヘキサアザビシクロ［６．６．６］エイコサン-１，８-ジアミン）、Ｓａｒａｒ（１-Ｎ-（４-アミノベンジル）-３，６，１０，１３，１６，１９-ヘキサアザビシクロ［６．６．６］ ］エイコサン-１，８-ジアミン）、ＡｍＢａＳａｒ（４-（（８-アミノ-３，６，１０，１３，１６，１９-ヘキサアザビシクロ［６．６．６］イコサン-１-イルアミノ）メチル）安息香酸）、��よびＢａＢａＳａｒ。
【請求項９】
前記キレート剤が、以下からなる群より選択される、請求項７に記載の造影剤：
【化１】
2020514278.tif 000010
【請求項１０】
前記レポーティング部位がキレート剤であり、前記キレート剤が、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、５５Ｃｏ、５７Ｃｏ、４７Ｓｃ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１５２Ｇｄ、８２Ｒｂ、８９Ｚｒ、および１６６Ｄｙからなる群より選択される放射性金属をさらに含む、請求項７に記載の造影剤。
【請求項１１】
前記レポーティング部位が放射性標識基質であり、前記放射性標識基質が、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２６Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０Ｂｒ、８０ｍＢｒ、８２Ｂｒ、８３Ｂｒ、１８Ｆ、および２１１Ａｔからなる群より選択される放射性同位体を含む、請求項７に記載の造影剤。
【請求項１２】
前記放射性標識基質が１８Ｆ標識基質を含む、請求項１１に記載の造影剤。
【請求項１３】
前記１８Ｆ標識基質が、２-フルオロ-ＰＡＢＡ、３-フルオロ-ＰＡＢＡ、２-フルオロ-マンニトール、およびＮ-スクシンイミジル-４-フルオロベンゾエートからなる群より選択される、請求項１２に記載の造影剤。
【請求項１４】
前記レポーティング部位が前記ペプチドに直接組み込まれている、請求項１に記載の造影剤。
【請求項１５】
前記レポーティング部位が、前記ペプチドの放射性標識アミノ酸を含む、請求項１４に記載の造影剤。
【請求項１６】
前記放射性標識アミノ酸が、ヨードチロシンおよびフルオロチロシンからなる群より選択される、請求項１５に記載の造影剤。
【請求項１７】
前記レポーティング部位が蛍光染料であり、前記蛍光染料が、以下からなる群より選択される、請求項７に記載の造影剤：カルボシアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、ツイカルボシアニン、メロシアニン、ポリメチン、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセイン、ホウ素-ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）染料、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＶｉｖｏＴａｇ-６８０、ＶｉｖｏＴａｇ-Ｓ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ-Ｓ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０、Ｄｙ６７７、Ｄｙ６７６、Ｄｙ６８２、Ｄｙ７５２、Ｄｙ７８０、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４７、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＩＲ  Ｄｙｅ  ８００、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ  ８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ  ７００ＤＸ、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、およびＡＤＳ８３２ＷＳ。
【請求項１８】
前記レポーティング部位が光音響レポーティング分子であり、前記光音響レポーティング分子が、染料またはナノ粒子からなる群より選択される、請求項７に記載の造影剤。
【請求項１９】
前記染料が蛍光染料を含む、請求項１８に記載の造影剤。
【請求項２０】
前記蛍光染料が、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ、ＢＨＱ ３、ＱＸＬ ６８０、ＩＲＤｙｅ ８８０ＣＷ、ＭＭＰＳｅｎｓｅ ６８０、メチレンブルー、ＰＰＣｙ-Ｃ８、およびＣｙｐａｔｅ-Ｃ１８からなる群より選択される、請求項１９に記載の造影剤。
【請求項２１】
前記ナノ粒子が、以下からなる群より選択される、請求項１８に記載の造影剤：プラズモニックナノ粒子、量子ドット、ナノダイヤモンド、ポリピロールナノ粒子、硫化銅ナノ粒子、グラフェンナノシート、酸化鉄-金コア-シェルナノ粒子、Ｇｄ２Ｏ３ナノ粒子、単層カーボンナノチューブ、色素充填ペルフルオロカーボンナノ粒子、および超常磁性酸化鉄ナノ粒子。
【請求項２２】
前記レポーティング部位がラマン活性レポーティング分子であり、前記ラマン活性レポーティング分子が単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）および表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）剤からなる群より選択される、請求項７に記載の造影剤。
【請求項２３】
前記ＳＥＲＳ剤が、ラマン活性レポーター分子で標識された金属ナノ粒子を含む、請求項２２に記載の造影剤。
【請求項２４】
前記ラマン活性レポーター分子が蛍光染料を含む、請求項２３に記載の造影剤。
【請求項２５】
前記蛍光染料が、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン、およびカルコゲノピリリウム染料からなる群より選択される、請求項２４に記載の造影剤。
【請求項２６】
前記リンカーが、以下からなる群より選択される、請求項７に記載の造影剤：
（ａ）
【化２】
2020514278.tif 000011
（式中：
Ｒｐｔは前記レポーティング部位である；
Ｗ１は、Ｃ１-Ｃ６アルキレン、Ｃ３-Ｃ６シクロアルキレン、およびアリーレンからなる群より選択される；
Ｗ２は、-ＮＲ１-（Ｃ＝Ｏ）-、-ＮＲ１-（Ｃ＝Ｓ）-、-（Ｃ＝Ｏ）-ＮＲ１-、-（Ｃ＝Ｓ）-ＮＲ１-、および-Ｓ-からなる群より選択され、ここで各Ｒ１は、独立して、ＨまたはＣ１-Ｃ４アルキルである；
各Ｒ２は、独立して、Ｈまたは-ＣＯＯＲ３であり、ここで各Ｒ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、Ｃ２-Ｃ１２アリールまたはＣ４-Ｃ１６アルキルアリールである；
ｂは、０、１、２、および３からなる群より選択される整数である；
ｄは、１、２、３、４、５、６、７、および８からなる群より選択される整数である；ならびに
式中、波線は、前記リンカーと前記ペプチドとの間の結合点を示す）；
（ｂ）      Ｒｐｔ-Ｘ-Ｙ-Ｚ-Ｗ３-
（式中：
Ｒｐｔは前記レポーティング部位である；
ＸおよびＺは、それぞれ独立して、Ｃ１-Ｃ８アルキル、Ｃ２-Ｃ８アルケニル、Ｃ２-Ｃ８アルキニル、Ｃ１-Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２-Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２-Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ１-Ｃ８アルコキシ、もしくは結合であり得、それらの各々は０〜５個のＲＡで置換され得る；
ＹおよびＷ３は、それぞれ独立して、-Ｏ-、-Ｓ（Ｏ）ｐ-、-ＮＨ-、-ＮＲＢ-、-ＣＨ＝ＣＨ-、-ＣＲＢ＝ＣＨ-、-ＣＨ＝ＣＲＢ-、-ＮＨ-ＣＯ-、-ＮＨ-ＣＯ２-、-ＮＲＢ-ＣＯ-、-ＮＲＢ-ＣＯ２-、-ＣＯ-ＮＨ-、-ＣＯ２-ＮＨ-、-ＣＯ-ＮＲＢ-、-ＣＯ２-ＮＲＢ-、もしくは結合である；
ｐは、０、１、もしくは２である；
ＲＡは、その出現ごとに、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、ＣＯ２Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロ環、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたモノもしくはジアルキルアミノ、任意に置換されたアルキルチオ、任意に置換されたアルキルスルフィニル、任意に置換されたアルキルスルホニル、任意に置換されたモノもしくはジアルキルカルボキサミド、任意に置換されたアリール、もしくは任意に置換されたヘテロアリールである；ＲＢは、その出現ごとに、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたモノもしくはジアルキルアミノ、任意に置換されたアルキルチオ、任意に置換されたアリール、もしくは任意に置換されたヘテロアリールである）；または
（ｃ）アミノ酸リンカー。
【請求項２７】
前記造影剤が、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）の化合物からなる群より選択される、請求項１に記載の造影剤：
【化３】
2020514278.tif 000012
ＤＫ-Ａ-２２１-（Ｌ）ｎ-Ｒｐｔ（ＩＩ）；または
ＤＫ-Ａ-２２２-（Ｌ）ｎ-Ｒｐｔ（ＩＩＩ）；
（式中：
ｎは、０および１からなる群より選択される整数である；
Ｌはリンカーである；および
Ｒｐｔはレポーティング部位である；ならびに
式中、前記レポーティング部位またはリンカーは、存在する場合、式（Ｉ）、式（ＩＩ）または式（ＩＩＩ）の前記造影剤を含む前記ペプチドのアミノ酸の第一級アミン基に結合している）。
【請求項２８】
前記リンカーが、存在する場合、式（Ｉ）の化合物の１３オルニチン（Ｏｒｎ）一級アミン基に結合している、請求項２７に記載の造影剤。
【請求項２９】
前記レポーティング部位がＤＯＴＡＧＡキレート剤を含む、請求項２７に記載の造影剤。
【請求項３０】
前記ＤＯＴＡＧＡキレート剤が、６４Ｃｕ放射性金属をさらに含む、請求項２９に記載の造影剤。
【請求項３１】
式（Ｉ）の化合物が以下である、請求項２７に記載の造影剤：
【化４】
2020514278.tif 000013
【請求項３２】
以下の工程を含む、プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）を検出するためのイメージング方法：
（ａ）請求項１〜２７のいずれか一項に記載の造影剤の有効量を提供する工程と；
（ｂ）１つもしくは複数の細胞または組織を前記造影剤と接触させる工程と；
（ｃ）画像を作成してＰＤ-Ｌ１を検出する工程。
【請求項３３】
前記１つもしくは複数の細胞または組織の前記造影剤との接触が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる、請求項３２に記載のイメージング方法。
【請求項３４】
前記１つもしくは複数の細胞または組織の前記造影剤との接触が、被験体において行われる、請求項３３に記載のイメージング方法。
【請求項３５】
前記被験体が、ヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ヒツジ、ウシ、サル、トリ、または両生類である、請求項３４に記載のイメージング方法。
【請求項３６】
前記ＰＤ-Ｌ１の検出が、前記被験体への前記造影剤の投与後約６０〜１２０分以内に起こる、請求項３２に記載のイメージング方法。
【請求項３７】
前記イメージング方法が、がんを検出するために使用される、請求項３２に記載のイメージング方法。
【請求項３８】
前記がんが、以下からなる群より選択される、請求項３７に記載の造影剤：芽腫、癌腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、頭部がん、頸部がん、頭頸部がん、肺がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、前立腺がん、大腸がん、食道がん、胃がん、白血病／リンパ腫、子宮がん、皮膚がん、内分泌がん、泌尿器がん、膵臓がん、消化管がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎がん、膀胱がん、脳腫瘍、腺腫、および転移性がん。
【請求項３９】
前記イメージング方法が固形腫瘍を検出するために使用される、請求項３２に記載のイメージング方法。
【請求項４０】
前記固形腫瘍が、脳、結腸、乳房、前立腺、肝臓、腎臓、肺、食道、頭頸部、卵巣、子宮頸部、胃、直腸、膀胱、子宮、精巣、および膵臓からなる群より選択される臓器にある、請求項３９に記載のイメージング方法。
【請求項４１】
前記イメージング方法が感染症を検出するために使用される、請求項３２に記載のイメージング方法。
【請求項４２】
前記感染症が微生物感染症である、請求項４１に記載のイメージング方法。
【請求項４３】
前記微生物感染症が、ヒト型結核菌、大腸菌、クレブシエラ属、エンテロバクター属、プロテウス属、セラチア・マルセッセンス、緑膿菌、黄色ブドウ球菌およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を含む黄色ブドウ球菌属、エンテロコッカス属、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、バクテロイデス属、アシネトバクター属、ヘリコバクター属、カンジダ属、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム（ＶＲＥ）からなる群より選択される１つまたは複数の微生物による感染症からなる群より選択される、請求項４２に記載のイメージング方法。
【請求項４４】
前記イメージング方法が炎症を検出するために使用される、請求項３２に記載のイメージング方法。
【請求項４５】
前記炎症が、喘息、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、セリアック病、憩室炎、糸球体腎炎、化膿性汗腺炎、過敏症、炎症性腸疾患、間質性膀胱炎、中耳炎、骨盤内炎症性疾患、再かん流傷害、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植拒絶反応、狼瘡、全身性エリテマトーデス、および血管炎からなる群より選択される障害に関連する、請求項４４に記載の造影剤。
【請求項４６】
前記炎症が、関節リウマチまたは全身性エリテマトーデスによって引き起こされる、請求項４５に記載のイメージング方法。
【請求項４７】
前記イメージング方法が、腫瘍中の１つまたは複数の免疫細胞を検出するために使用される、請求項３２に記載のイメージング方法。
【請求項４８】
前記イメージング方法が、腫瘍内または被験体内の免疫細胞の全身分布を検出するために使用される、請求項３２に記載のイメージング方法。
【請求項４９】
前記イメージング方法が、感染症に対する免疫細胞応答を検出するために使用される、請求項３２に記載のイメージング方法。
【請求項５０】
前記イメージング方法が、炎症性疾患に対する免疫細胞の腫瘍内応答または正常組織内応答を検出するために使用される、請求項３２に記載のイメージング方法。
【請求項５１】
前記イメージング方法が、前記被験体におけるＰＤ-Ｌ１発現レベルを検出する、請求項３２に記載のイメージング方法。
【請求項５２】
前記イメージング方法が、抗体またはペプチドまたは低分子量剤により、前記被験体の腫瘍部位または正常組織におけるＰＤ-Ｌ１の占有またはターゲットエンゲージメントを測定する、請求項３２に記載のイメージング方法。
【請求項５３】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の造影剤を含む、プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）を検出するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１６年１２月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／４３８，５７５号、および２０１７年６月１４日に出願された米国特許仮出願第６２／５１９，５３４の利益を主張する。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）によって授与されたＮＩＨ Ｒ０１ＣＡ１６６３１の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
分子イメージングは、腫瘍免疫微小環境の状況をレポートし、免疫調節療法の有効性を高めるための免疫療法戦略を導くことができる。免疫調節療法の標的について迅速にレポートすることができる造影剤は少ない。
【０００４】
自分自身の免疫系を抑制してがん細胞を殺す免疫療法は、様々ながんの治療において中心的な役割を果たしている（Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１６）。著しく改善された治療結果にもかかわらず、多くのがんは免疫調節療法に反応しない。免疫組織化学（ＩＨＣ）を介して作用する既存のコンパニオン診断は、動的な腫瘍免疫環境のスナップショットのみを提供し、多くの場合、治療応答を正確には予測しない（ＭａｎｓｆｉｅｌｄおよびＤｏｎｇ、２０１６）。非侵襲的イメージング技術は、腫瘍生物学の定量的でリアルタイムの評価を提供し、薬物開発を導くことができる（Ｗｉｌｌｍａｎｎら、２００８）。
【０００５】
陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、最も分子的かつ定量的な並進イメージング技術は、所与の患者の全ての病変における全体的な標的発現の反復測定に使用されてきた。エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性乳がんを検出するための［１８Ｆ］フルオロエストラジオール（１８Ｆ-ＦＥＳ）などの分子標的ＰＥＴトレーサーは、治療に対する応答および無増悪生存期間を予測することができる（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、２００８およびＬｉｎｄｅｎら、２００６）。ＰＥＴトレーサー、ならびに、限定されないが、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、蛍光イメージング、近赤外（ＮＩＲ）イメージング、光音響イメージング、およびラマンイメージングを含む他のイメージング方法論の造影剤は、免疫調節療法に関連する標的発現の迅速かつリアルタイムの評価を提供することができ、進行中の臨床試験に大きな利益をもたらし得る。
【０００６】
プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）は、いくつかのがんで過剰発現される免疫チェックポイントタンパク質であり、腫瘍の免疫抑制に寄与している。腫瘍ＰＤ-Ｌ１発現は、ＰＤ-１およびＰＤ-Ｌ１標的療法に対する腫瘍反応を示している。放射性標識抗ＰＤ-Ｌ１抗体を使用して、ヒト腫瘍異種移植片および同系腫瘍モデルにおいて非侵襲的にＰＤ-Ｌ１発現を評価することができることが示されている（Ｈｅｓｋａｍｐら、２０１５；Ｍａｕｔｅら、２０１５；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１６；Ｄｅｎｇら、２０１６；Ｈｅｔｔｉｃｈら、２０１６；Ｊｏｓｅｆｓｏｎら、２０１６年）。放射性標識抗体コンジュゲートは、腫瘍特異的タンパク質のイメージングにますます使用されているが、コントラストおよび病変検出を向上させるために、最大で数日に及ぶ長いクリアランス時間が必要とされる（Ｐａｎｄｉｔ-Ｔａｓｋａｒら、２０１５；Ｏｏｓｔｉｎｇら、２０１６）。
【発明の概要】
【０００７】
いくつかの態様では、本開示の主題は、プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）に対して結合特異性を有するペプチドとレポーティング部位とのコンジュゲート、および任意にリンカーを含む造影剤であって、リンカーが、存在する場合には、ペプチドとレポーティング部位とを連結し、リンカーが存在しない場合には、レポーティング部位がペプチドのアミノ酸の第一級アミンを介してペプチドに直接結合している造影剤を提供する。他の態様では、レポーティング部位はペプチドに直接組み込まれ、例えば、ここで、レポーティング部位は、放射標識ヨードチロシンまたはフルオロチロシンなどのペプチドの放射標識アミノ酸を含む。
【０００８】
特定の態様では、ＰＤ-Ｌ１に対して結合特異性を有するペプチドは、ＰＤ-Ｌ１のアミノ酸Ｙ５６、Ｅ５８、Ａ１１３、Ｍ１１５、およびＹ１２３と相互作用する。
【０００９】
特定の態様では、ペプチドはＷＬ１２であり、造影剤は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）からなる群より選択される化合物である：
【化１】
2020514278.tif 000002
ＤＫ-Ａ-２２１-（Ｌ）ｎ-Ｒｐｔ  （ＩＩ）；または
ＤＫ-Ａ-２２２-（Ｌ）ｎ-Ｒｐｔ  （ＩＩＩ）；
（式中、ｎは、０および１からなる群より選択される整数である；Ｌはリンカーである；およびＲｐｔはレポーティング部位である；ならびに式中、レポーティング部位またはリンカーは、存在する場合、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）の造影剤を含むペプチドのアミノ酸の第一級アミン基に結合している）。
【００１０】
特定の態様では、式（Ｉ）の化合物はＷＬ１２  ＤＯＴＡである：
【化２】
2020514278.tif 000003
【００１１】
他の態様では、本開示の主題は、以下の工程を含む、プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）を検出するためのイメージング方法を提供する：（ａ）プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）に対して結合特異性を有するペプチドとレポーティング部位とのコンジュゲート、および任意にリンカーを含む造影剤であって、リンカーが、存在する場合には、ペプチドとレポーティング部位とを連結し、リンカーが存在しない場合には、レポーティング部位がペプチドのアミノ酸の第一級アミンを介してペプチドに直接結合している造影剤の有効量を提供する工程と；（ｂ）１つもしくは複数の細胞または組織を造影剤と接触させる工程と；（ｃ）画像を作成してＰＤ-Ｌ１を検出する工程。特定の態様では、造影剤は、式（Ｉ）の化合物であるか、またはＰＤ-Ｌ１のＹ５６、Ｅ５８、Ａ１１３、Ｍ１１５およびＹ１２３と相互作用するペプチドである。
【００１２】
特定の態様では、本開示の造影剤を使用して、被験体におけるがん、感染症、および炎症などの疾患ならびに障害を検出することができる。
【００１３】
なおもさらなる態様では、本開示の主題は、プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）を検出するためのキットを提供し、キットは、プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）に対して結合特異性を有するペプチドとレポーティング部位とのコンジュゲート、および任意にリンカーを含む造影剤であって、リンカーが、存在する場合には、ペプチドとレポーティング部位とを連結し、リンカーが存在しない場合には、レポーティング部位がペプチドのアミノ酸の第一級アミンを介してペプチドに直接結合している造影剤を含む。
【００１４】
本開示の主題の特定の態様は上文に述べられており、本開示の主題によって全体的にまたは部分的に取り上げられるが、本明細書で以下に最も良く説明されるように、添付の実施例および図に関連して説明を進めると、他の態様が明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
このように本開示の主題を一般的な用語で説明してきたが、ここで添付の図面を参照し、これらは必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではない：
【図１】ＰＤ-Ｌ１に結合するＷＬ１２を示す図である。図１Ａは、ＷＬ１２およびその類似体の構造図ならびにＷＬ１２のアミノ酸配列を示す（ＷＬ１２アミノ酸配列＝シクロ-（-Ａｃ-Ｔｙｒ-ＮＭｅＡｌａ-Ａｓｎ-Ｐｒｏ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｈｙｐ-Ｔｒｐ-Ｓｅｒ-Ｔｒｐ（メチル）-ＮＭｅＮｌｅ-ＮＭｅＮｌｅ-Ｌｙｓ-Ｃｙｓ-）-Ｇｌｙ-ＮＨ２）。図１Ｂは、ＷＬ１２のＰＤ-Ｌ１への予測結合様式を示す。ＷＬ１２は、ＰＤ-Ｌ１の溝内にベータシート状構造を形成する。ＷＬ１２はシアンで示されている。ＰＤ-Ｌ１の表面図は灰色で、リボンおよび主要側鎖はマゼンタで示している；図１Ｃは、ＷＬ１２が、ＰＤ-１のＰＤ-Ｌ１への結合を模倣することを示す。ＰＤ-１の構造は青緑色で示されている。ＰＤ-１の２つの主要な相互作用するベータ鎖は、ＰＤ-Ｌ１に結合したＷＬ１２によって採用される立体配座とよく重なる；
【図２】ペプチドＷＬ１２の遠紫外ＣＤスペクトルを示す図である。
【図３】ＷＬのエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）質量スペクトルを示す図である；理論化学式：Ｃ９１Ｈ１２８Ｎ２２Ｏ２０Ｓ２。実測値ｍ／ｚ：１８８２．７-（Ｍ＋１）＋１、９４１．９-（Ｍ＋２）＋２／２。予想値：１８８２．１９；
【図４】ＷＬ１２ＤのＲＰ-ＨＰＬＣ精製を示す図である；
【図５】ＰＤＬ１-ＰＤの低分解能質量スペクトルを示す図である；理論化学式：Ｃ９１Ｈ１２８Ｎ２２Ｏ２０Ｓ２精密質量：２３３９．１４、分子量：２３４０．６５、実測値ｍ／ｚ：２３４０．９-（Ｍ＋１）＋１、１１７１．１-（Ｍ＋２）＋２／２および７８１．１-（Ｍ＋２）＋３／３；
【図６】［ＰＤＬ１-ＰＤ-Ｃｕ２＋］のＲＰ-ＨＰＬＣ精製を示す図である；
【図７】［ＰＤＬ１-ＰＤ-Ｃｕ２＋］錯体の低分解能質量スペクトルを示す図である；理論化学式：Ｃ１１０Ｈ１５６Ｎ２６Ｏ２９Ｓ精密質量：２４００．０５、分子量：２４０２．１８、実測値ｍ／ｚ：２４０２．６-（Ｍ＋１）＋１、１２０１．９-（Ｍ＋２）＋２／２；
【図８】ＰＤ-Ｌ１結合ペプチドＷＬ１２のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特性評価を示す図である；図８Ａは、ＰＤ-１：ＰＤ-Ｌ１相互作用を阻害するためのＷＬ１２類似体の親和性を実証する競合阻害アッセイを示す；図８Ｂは、可変ＰＤ-Ｌ１発現を示すｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験に使用された細胞株のフローサイトメトリーヒストグラムを示す；図８Ｃは、［６４Ｃｕ］Ｗ１２が、過剰のペプチド（ＰＥＰ）によって遮断され得る高いＰＤ-Ｌ１発現を有する細胞への結合の増加を実証することを示す；
【図９】ＰＤ-Ｌ１のＰＤ-１への結合の代表的な曲線を示す図である；ＫＤ＝６９．６６±１１．６５ｎＭ（９５％ＣＩ ４４．８２〜９４．４８ｎＭ）；
【図１０】ＷＬ１２Ｄ-Ｃｕ２＋錯体を用いた、ＰＤ-Ｌ１のＰＤ-１への結合の阻害についての代表的な曲線を示す図である；ＩＣ５０＝２．９７ｎＭ（９５％ＣＩ ２．１７〜４０．５ｎＭ）Ｋｉ＝１．３８ｎＭ（９５％ＣＩ １．０１〜１．８９ｎＭ）；
【図１１】［６４Ｃｕ］ＷＬ１２放射性トレーサー（赤）および「非放射性」ＷＬ１２-Ｃｕ２＋錯体のＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である；
【図１２】ＰＤＬ１-ＰＤと［ＰＤＬ１-ＰＤ-Ｃｕ２＋］との混合物のＲＰ-ＨＰＬＣクロマトグラムを示す図である；
【図１３】取り込みアッセイに使用した様々な細胞株の平均蛍光強度値を示す図である；
【図１４】細胞株ＭＦＩ対％ＩＤの相関関係を示す図である；
【図１５】［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を用いた腫瘍ＰＤ-Ｌ１発現の迅速なｉｎ  ｖｉｖｏ検出を示す図である；ｈＰＤ-Ｌ１（赤矢印）およびＣＨＯ腫瘍（青矢印）を有するＮＳＧマウスに、１５０μＣｉの［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を静脈内投与し、放射性トレーサー注射の１０、３０、６０および１２０分後に画像を取得した。図１５Ａは、ｈＰＤ-Ｌ１腫瘍における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の特異的蓄積を実証する断面（上）および３Ｄボリュームレンダリング（下）画像を示す；図１５Ｂは、ＰＤ-Ｌ１ ＩＨＣがｈＰＤ-Ｌ１腫瘍において強い免疫反応性（茶色）を実証することを示す；
【図１６】ＮＳＧマウスのｈＰＤ-Ｌ１腫瘍における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の特異的取り込みを示す図である；ｈＰＤ-Ｌ１およびＣＨＯ腫瘍を保有し、トレーサー注射の２４時間後に［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を注射されたＮＳＧマウスの代表的なボリュームレンダリングＰＥＴ-ＣＴ画像。ＣＨＯ（青矢印）腫瘍と比較してｈＰＤ-Ｌ１（赤矢印）腫瘍における取り込みの増加は、放射性トレーサーのＰＤ-Ｌ１媒介取り込みを確認する；
【図１７】ｈＰＤ-Ｌ１およびＣＨＯ腫瘍を有するＮＳＧマウスにおける［６４Ｃｕ］ＷＬ１２のｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布分析を示す図である；ＮＳＧマウスに２０μＣｉの［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を静脈内投与し、注射の６０および１２０分後に組織を採取した。ブロッキング試験のために、マウスに放射性トレーサー注射で過剰のペプチド（ｐｅｐ）を投与した；
【図１８】以下を示す図である：（図１８Ａ）Ｗ１１２-ＩＲ８００ＣＷコンジュゲート（化学式：Ｃ１３７Ｈ１７７Ｎ２４Ｏ３４、分子量：２８６４．３４）の構造、（図１８Ｂ）色素とペプチドとのコンジュゲーションを示すピーク（挿入図）下で記録した、ＵＶ-ＶｉｓスペクトルでのＷＬ１２-ＩＲ８００ＣＷのＨＰＬＣクロマトグラム；（図１８Ｃ）予想分子量と相関する、ＷＬ１２-ＩＲ８００ＣＷコンジュゲートのＥＳＩ-ＭＳスペクトル；
【図１９】ＣＨＯおよびｈＰＤＬ１腫瘍を有するマウスにおけるＷＬ１２-ＩＲ８００ＣＷの評価を示す図である：（図１９Ａ）コンジュゲート注射の２４時間後に記録した、５ｎモルのＷＬ１２-ＩＲ８００ＣＷを注射したマウスおよびｅｘ  ｖｉｖｏ臓器の代表的画像、（図１９Ｂ、ブロッキング）２４ｈ ｐｉで取得した、２５ｎモルの未修飾ＷＬ１２および５ｎモルのＷＬ１２-ＩＲ８００ＣＷを注射したマウスの代表的画像；（図１９Ｃ）１ｎモル、３ｎモル、および５ｎモルのコンジュゲートで処理し、ＷＬ１２で遮断したマウスから得た、選択された臓器および腫瘍におけるＷＬ１２-ＩＲ８００ＣＷのｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布の定量（番号は対応する臓器を示す、ｎ＝４）；
【図２０】ヒトＮＳＣＬＣおよびＴＮＢＣ異種移植片における［１１１Ｉｎ］アテゾリズマブの取り込みが完全には発現依存的ではないことを示す図である。（Ａ）可変ＰＤ-Ｌ１発現を示す様々なＴＮＢＣおよびＮＳＣＬＣ細胞株のフローサイトメトリー分析；（Ｂ）がん細胞株への［１１１Ｉｎ］ＡｔｚＭａｂの結合はＰＤ-Ｌ１発現依存的である；（Ｃ）ＰＤ-Ｌ１低ＳＵＭ１４９と比較した、ＰＤ-Ｌ１高ＭＤＡＭＢ２３１  ＴＮＢＣ異種移植片における［１１１Ｉｎ］ＡｔｚＭａｂの取り込みの増加；（Ｄ）ＰＤ-Ｌ１低Ｈ１１５５と比較した、ＰＤ-Ｌ１高Ｈ２４４４ ＮＳＣＬＣ異種移植片における［１１１Ｉｎ］ＡｔｚＭａｂの取り込みの増加。対応する組織像を示す。Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ、２０１６から；
【図２１】［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴが腫瘍中のＡｔｚＭａｂ蓄積を検出することを示す図である；（Ａ）全身［６４Ｃｕ］ＷＬ１２画像は、６０分ｐ．ｉ．によるｈＰＤ-Ｌ１腫瘍に対する放射能の特異的蓄積を示す；（Ｂ）［６４Ｃｕ］ＷＬ１２取り込みは、トレーサー注射の２４時間前に２０ｍｇ／Ｋｇ用量のＡｔｚＭａｂを投与されたマウスのｈＰＤ-Ｌ１腫瘍において有意に減少する；（Ｃ）対応する生体内分布試験により、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２が腫瘍へのＡｔｚＭａｂ ＰＤ-Ｌ１エンゲージメントを検出する可能性が確認された；（Ｄ）ＷＬ１２はＡｔｚＭａｂのＰＤ-Ｌ１への結合を阻害する。ＷＬ１２の連続希釈液と共にインキュベートしたｈＰＤ-Ｌ１細胞を、Ｃｙ５-ＡｔｚＭａｂまたは市販のＢＤ抗体ＢＤ-ＭＩＨ１-ＰＥで染色した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）対ペプチド濃度プロットは、Ｃｙ５-ＡｔｚＭａｂおよびＢＤ-ＭＩＨ１-ＰＥについて、それぞれ２．５ｎＭおよび３７．８ｎＭのＩＣ５０を示す；
【図２２】［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴが、トリプルネガティブ乳がん異種移植片におけるＡｔｚＭａｂの蓄積を検出することを示す図である；［６４Ｃｕ］ＷＬ１２取り込みは、トレーサー注射の２４時間前に２０ｍｇ／Ｋｇ用量のＡｔｚＭａｂを投与されたマウスのＭＤＡＭＢ２３１腫瘍において有意に減少する；
【図２３】以下を示す図である：（Ａ）Ｗｌ１２-ＩＲ８００コンジュゲートの構造（化学式：Ｃ１３７Ｈ１７７Ｎ２４Ｏ３４、分子量：２８６４．３４）；（Ｂ）色素とペプチドとのコンジュゲーションを示すピーク（挿入図）下で記録されたＵＶ-ＶｉｓスペクトルでのＷＬ１２-ＩＲ８００のＨＰＬＣクロマトグラム；（Ｃ）予想分子量と相関する、ＷＬ１２-ＩＲ８００のＥＳＩ-ＭＳスペクトル；
【図２４】ＣＨＯおよびｈＰＤＬ１腫瘍を有するマウスにおけるＷＬ１２-ＩＲ８００の評価を示す図である；（Ａ）コンジュゲート注射の２４時間後に記録した５ｎモルのＷＬ１２-ＩＲ８００を注射されたマウスおよびｅｘ  ｖｉｖｏ臓器の代表的画像；（Ｂ、ブロッキング）２４ｈ ｐｉで取得した、２５ｎモルの未修飾ＷＬ１２および５ｎモルのＷＬ１２-ＩＲ８００を注射したマウスの代表的な画像；（Ｃ）１ｎモル、３ｎモルおよび５ｎモルのコンジュゲートで処理し、ＷＬ１２で遮断したマウスから得た、選択された臓器および腫瘍におけるＷＬ１２-ＩＲ８００のｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布の定量化（番号は対応する臓器を示す、ｎ＝４）；
【図２５】ＣＨＯおよびＣＨＯ-ｈＰＤＬ１腫瘍モデルにおける［６８Ｇａ］ＷＬ１２の評価を示す図である；（Ａ）ＣＨＯ-ｈＰＤＬ１（赤矢印、高ＰＤ-Ｌ１発現）およびＣＨＯ（黒矢印、低ＰＤ-Ｌ１発現）腫瘍（ｎ＝３）における［６８Ｇａ］ＷＬ１２取り込みのＰＥＴ-ＣＴ（ボリュームレンダリング）画像は、ＰＤ-Ｌ１が媒介する放射性トレーサーの取り込みを確認する；（Ｂ）同じ腫瘍モデルにおける［６８Ｇａ］ＷＬ１２の注射の１時間後のｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布分析。ブロッキング用量コホートに５０マイクログラムの非放射性ペプチドを同時注射した；
【図２６】ＣＨＯおよびＣＨＯ-ｈＰＤＬ１腫瘍モデルにおける［１８Ｆ］ＷＬ１２の評価を示す図である；（Ａ）ＣＨＯ-ｈＰＤ-Ｌ１（赤い矢印、高ＰＤ-Ｌ１発現）およびＣＨＯ（青い矢印、低ＰＤ-Ｌ１発現）腫瘍（ｎ＝３）における［１８Ｆ］ＷＬ１２取り込みのＰＥＴ-ＣＴ（ボリュームレンダリング）画像は、ＰＤ-Ｌ１が媒介する放射性トレーサーの取り込みを確認する；
【図２７】ＭＤＡＭＢ２３１およびＳＵＭ１４９腫瘍を有するマウスに２０ｍｇ／Ｋｇ用量のアテゾリズマブを注射したことを示す図である；ｍＡｂ投与の２０時間後、マウスに２０μＣｉの［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を注射し、生体内分布試験をトレーサー注射の２４時間後に実施した。データは、腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１へのアテゾリズマブの結合が［６４Ｃｕ］ＷＬ１２によって定量化され得ることを実証している；
【図２８】ＰＤ-Ｌ１治療用抗体アテゾリズマブについての用量依存性ＰＤ-Ｌ１占有率決定を示す図である。ＭＤＡＢ２３１乳房腫瘍を有するマウスに様々な用量のアテゾリズマブを注射し、２４時間後、マウスに［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を注射し、トレーサー注射の２時間後に生体内分布試験を行った。データは、腫瘍中の［６４Ｃｕ］ＷＬ１２蓄積が抗体用量の増加と共に減少することを示す；
【図２９】［６４Ｃｕ］ＷＬ１２によって測定されたアテゾリズマブのＰＤ-Ｌ１占有率の時間および用量依存性変化を示す図である。ＭＤＡＭＢ２３１担腫瘍マウスに１または１０ｍｇ／Ｋｇ用量のアテゾリズマブを投与した。ｍＡｂ投与の２４または１２０時間後に、マウスに［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を注射し、放射能の腫瘍蓄積を生体内分布試験によって測定した。予想されたように、１０ｍｇ／Ｋｇ用量では、２４時間および１２０時間の両方でＰＤ-Ｌ１の完全な遮断が観察された。１ｍｇ／ｋｇ用量では、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の蓄積の増加が１２０時間で見られるが、２４時間では見られず、低ｍＡｂ用量が用いられる場合の経時的な腫瘍からのアテゾリズマブの流出を示唆している。これらのデータは、本開示のペプチドを使用して腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１治療用ｍＡｂ滞留時間が分析され得ることを示唆する；
【図３０】ＤＫ-Ａ-２２１およびＤＫ-Ａ-２２２の化学構造を示す図である；
【図３１】ＤＫ２２２ ＰＤ-Ｌ１結合ペプチドに関するデータを示す図である。ＮＯＴＡコンジュゲートＤＫ２２２を合成し、ＣＨＯ／ＣＨＯ-ＨＰＤ-Ｌ１腫瘍を有するマウスにおいて評価した。イメージング（Ａ）および生体内分布（Ｂ）データは、［６４Ｃｕ］ＤＫ２２２の優れた薬物動態を示す；
【図３２】ＣＨＯ／ＣＨＯ-ｈＰＤ-Ｌ１腫瘍を有するＮＳＧマウスにおける［６４Ｃｕ］ＤＫ２２２の生体内分布を示す図である；
【図３３】ＷＬ１２が、ＰＤ-１とＰＤ-Ｌ１治療薬との間の相互作用をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害することを実証する図である。図３３Ａは、ＰＤ-Ｌ１（緑色およびシアン）へのＷＬ１２の結合様式が、ＰＤ-１のＡｔｚＭａｂ（赤色およびシアン）、ＡｖｅＭａｂ（橙色およびシアン）およびＤｕｒＭａｂ（青色およびシアン）への結合様式と重なることを示す。相互作用しない残基は灰色で示されている。共通の結合領域（シアン）を包含する多様な接触は、異なる治療用ｍＡｂの多様な結合メカニズムを説明する。図３３Ｂは、競合的阻害を通して実証されるように、ＷＬ１２が、Ｃｙ-５にコンジュゲートしたＡｔｚＭａｂ、ＡｖｅＭａｂおよびＤｕｒＭａｂをＰＤ-Ｌ１に対して阻害することを示す。平均蛍光強度はフローサイトメトリーによって決定した。図３３Ｃは、ＰＤ-Ｌ１陽性ＨＣＣ８２７、Ｈ２２６、ｈＰＤ-Ｌ１、およびＭＤＡＭＢ２３１細胞への［６４Ｃｕ］ＷＬ１２結合が、ＰＢＳ対照と比較して、６０ｎＭのＡｔｚＭａｂ、ＡｖｅＭａｂおよびＤｕｒＭａｂの存在下で阻害されることを示す。ＰＤ-Ｌ１陰性ＣＨＯおよびＳＵＭ１４９細胞における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２結合も示される。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、非有意；
【図３４】（図３４Ａ）ＰＤ-１とのＰＤ-Ｌ１相互作用界面を囲む分子表面の図である。ＰＤ-１競合治療薬との相互作用に関与する一般的な残基はシアンで示され、ＰＤ-１相互作用に特異的な分子接触は紫色で示され、相互作用しない残基は灰色で示されている。分子間相互作用の重なりを説明するために、結合したＰＤ-１の構造は紫色で示され、ＷＬ１２の予測される立体配座は緑色で示されている；（図３４Ｂ）ＷＬ１２が、ｈＰＤ-Ｌ１細胞において、Ｃｙ５にコンジュゲートしたＰＤ-１-Ｆｃタンパク質のＰＤ-Ｌ１への結合を阻害することを示す図である。フローサイトメトリーにより決定された平均蛍光強度；（図３５Ｃ）ＷＬ１２（５ｎＭ）が、ＨＣＣ８２７細胞およびＨ２２６細胞において、Ｃｙ５にコンジュゲートしたＡｔｚＭａｂ、ＡｖｅＭａｂおよびＤｕｒＭａｂ（２ｎＭ）のＰＤ-Ｌ１への結合を阻害することを示す図である。フローサイトメトリーにより測定された平均蛍光強度ならびに図３５Ｄは、図３４Ｂおよび図３５Ｃからのフローサイトメトリーによって決定された平均蛍光強度を示す；
【図３５】ＰＤ-Ｌ１ ｍＡｂによるＰＤ-Ｌ１エンゲージメントが、可変ＰＤ-Ｌ１発現がある異種移植片で［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を用いて腫瘍において定量化されることを実証する図である。図３５Ａ〜図３５Ｈは、放射性トレーサー注射の２４時間前に２０ｍｇ／ｋｇのＡｔｚＭａｂで処理したマウスにおけるＨ２２６（図３５Ａ、図３５Ｂ）、ＨＣＣ８２７（図３５Ｃ、図３５Ｄ）、およびｈＰＤ-Ｌ１／ＣＨＯ（図３５Ｇ、図３５Ｈ）異種移植片での［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の取り込みの減少を、生理食塩水処理対照と比較して示す。全身の、ボリュームレンダリングされた［６４Ｃｕ］ＷＬ１２ ＰＥＴ-ＣＴ画像（図３５Ａ、図３５Ｄ、図３５Ｇ）およびｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布（図３５Ｂ、図３５Ｅ、図３５Ｈ）。図３５Ｃ、図３５Ｆおよび図３５Ｉは、ＰＤ-Ｌ１についてのＩＨＣ染色が対応する腫瘍から示されることを示す＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１。＊＊＊、Ｐ＜０．００１；ＮＳ、非有意；
【図３６】以下を示す図である：図３６Ａ、様々な細胞株におけるＰＤ-Ｌ１発現および対応する平均蛍光強度値。図３６Ｂ、図３６Ｃ、および図３６Ｄ、トレーサー注射の２４時間前に２０ｍｇ／Ｋｇ用量のＡｔｚＭａｂを投与されたＨ２２６（Ｂ）、ＨＣＣ８２７（Ｃ）またはｈＰＤ-Ｌ１／ＣＨＯ（Ｄ）腫瘍を持つ担腫瘍マウスにおける［６４Ｃｕ］ＷＬ１２のｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布。示されたデータは平均±ＳＥＭである。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１；ＮＳ、非有意；
【図３７】［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を用いて検出される腫瘍ＰＤ-Ｌ１発現の動的変化およびＡｔｚＭａｂによるそのエンゲージメントを実証する図である。図３７Ａは、ドキシサイクリンで６時間および７２時間処理したＡ５４９-ｉＰＤＬ１細胞におけるＰＤ-Ｌ１細胞表面発現の増加を示す。フローサイトメトリーヒストグラム。図３７Ｂは、ＷＬ１２（５ｎＭ）が、ドキシサイクリンで７２時間処理したＡ５４９-ｉＰＤ-Ｌ１細胞へのＣｙ５にコンジュゲートしたＡｔｚＭａｂ、ＡｖｅＭａｂおよびＤｕｒＭａｂ（２ｎＭ）の結合を阻害することを示す。図３７Ｃは、Ａ５４９-ｉＰＤＬ１細胞（７２時間ドキシサイクリン）への［６４Ｃｕ］ＷＬ１２結合が、対照と比較して、６０ｎＭのＡｔｚＭａｂの存在下で有意に減少することを示す。図３７Ｄおよび図３７Ｅは、Ａ５４９-ｉＰＤＬ１異種移植片における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２取り込みが、生理食塩水対照と比較して、および親Ａ５４９異種移植片と同様に、放射性トレーサー注射の２４時間前に静脈内ＡｔｚＭａｂを受けたマウスにおいて有意に低いことを示す。ボリュームレンダリングされた全身ＰＥＴ-ＣＴ画像（Ｄ）、およびｅｘ  ｖｉｖｏ定量化（図３７Ｅ）。図３７Ｆは、対応する腫瘍のＰＤ-Ｌ１についてのＩＨＣ染色を示す。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、非有意；
【図３８】７２時間ドキシサイクリンを投与され、放射性トレーサー注射の２４時間前に２０ｍｇ／ＫｇのＡｔｚＭａｂで処理されたＡ５４９-ｉＰＤＬ１およびＡ５４９対照担腫瘍マウスにおける［６４Ｃｕ］ＷＬ１２のｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布を示す図である。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、非有意；
【図３９】［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を用いて定量化された３つの異なるＰＤ-Ｌ１治療用ｍＡｂによる腫瘍ＰＤ-Ｌ１エンゲージメントを実証する図である。図３９Ａ〜図３９Ｅ。ＭＤＡＭＢ２３１異種移植片における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の取り込みは、放射性トレーサー注射の２４時間前にＡｔｚＭａｂ（２０ｍｇ／ｋｇ）、ＡｖｅＭａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＤｕｒＭａｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）を投与されたマウスにおいて有意に減少する。生理食塩水（図３９Ａ）、ＡｔｚＭａｂ（図３９Ｂ）、ＡｖｅＭａｂ（図３９Ｃ）、ＤｕｒＭａｂ（図３９Ｄ）処理マウスの、全身のボリュームレンダリングされた［６４Ｃｕ］ＷＬ１２  ＰＥＴ-ＣＴ画像、およびｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布（図３９Ｅ）。図３９Ｆは、対応する腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１のＩＨＣ染色を示す。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、非有意；
【図４０】放射性トレーサー注射の２４時間前にＡｔｚＭａｂ（２０ｍｇ／Ｋｇ）、ＡｖｅＭａｂ（１０ｍｇ／Ｋｇ）、またはＤｕｒＭａｂ（１０ｍｇ／Ｋｇ）で処理したＭＤＡＭＢ２３１保持マウスにおける［６４Ｃｕ］ＷＬ１２のｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布を示す図である。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、非有意；
【図４１】［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を使用して定量化されたＡｔｚＭａｂによる腫瘍ＰＤ-Ｌ１占有率に対する用量および時間の効果を実証する図である。図４１Ａは、ＡｔｚＭａｂ用量（ｍｇ／ｋｇ）の増加による、マウスのＭＤＡ-ＭＢ-２３１腫瘍における遊離ＰＤ-Ｌ１リガンドの減少を表す用量-ばく露関係を示す。０．０６ｍｇ／ｋｇ、０．６ｍｇ／ｋｇおよび３．２ｍｇ／ｋｇのＡｔｚＭａｂを投与されたＭＤＡＭＢ２３１担腫瘍マウスの全身［６４Ｃｕ］ＷＬ１２ ＰＥＴ-ＣＴ画像（図４１Ａ）。図４１Ｂおよび図４１Ｃは、漸増用量のＡｔｚＭａｂ（０．０００９〜２４ｍｇ／ｋｇ）で処理したマウスの腫瘍における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２取り込みのｅｘ  ｖｉｖｏ定量化を示す。ＡｔｚＭａｂを放射性トレーサー注射の２４時間前に注射した（図４１Ｂ）。０ｍｇ／ｋｇで測定された中央値遊離ＰＤ-Ｌ１リガンドに対する遊離ＰＤ-Ｌ１リガンドの割合を計算した（図４１Ｃ）。青い白丸：マウスにおける各用量レベルについて測定された遊離ＰＤ-Ｌ１リガンド。赤破線：平均モデル予測用量反応関係。図４１Ｄおよび図４１Ｅは、０．６または１ｍｇ／ｋｇの用量のＡｔｚＭａｂにおける遊離ＰＤ-Ｌ１リガンドの増加を示すが、１０または２０ｍｇ／ｋｇのＡｔｚＭａｂ用量では示さない、経時的な腫瘍ＰＤ-Ｌ１占有に対するＡｔｚＭａｂ（ｍｇ／ｋｇ）用量効果を示し、ｍＡｂの非線形動態を要約している。全身のボリュームレンダリングされた［６４Ｃｕ］ＷＬ１２ ＰＥＴ-ＣＴ画像（Ｄ）およびｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布（Ｅ）。＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、非有意；
【図４２】トレーサー注射の２４時間前の漸増量のＡｔｚＭａｂ（０．０００９〜１２ｍｇ／Ｋｇ）での、ＭＤＡＭＢ２３１担腫瘍マウスにおける［６４Ｃｕ］ＷＬ１２のｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布を示す図である；
【図４３】ＤＫ-Ａ-２２１およびＤＫ-Ａ-２２２およびその類似体の構造図ならびにＤＫ-Ａ-２２１のアミノ酸配列を示す（ＤＫ-Ａ-２２１アミノ酸配列＝シクロ-（-Ａｃ-Ｔｙｒ-ＮＭｅＡｌａ-Ａｓｎ-Ｐｒｏ-Ｈｉｓ-Ｇｌｕ-Ｈｙｐ-Ｔｒｐ-Ｓｅｒ-Ｔｒｐ（カルボキシメチル）-ＮＭｅＮｌｅ-ＮＭｅＮｌｅ-Ｌｙｓ-Ｃｙｓ-）-Ｇｌｙ-ＮＨ２）。
【００１６】
この特許または出願ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、請求に応じておよび必要な料金の支払いにより、官庁によって提供されるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
本開示の主題は、添付の図面を参照して以下により完全に説明され、その中では、本開示の主題の全てではないがいくつかの実施形態が示されている。全体を通して、同じ番号は同じ要素を指す。本開示の主題は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載の実施形態に限定されると解釈されるべきではない；むしろ、これらの実施形態は、本開示が適用可能な法的要件を満たすように提供されている。実際、本明細書に記載の本開示の主題の多くの修正形態および他の実施形態は、本開示の主題が属する分野の当業者には思い浮かび、前述の説明および関連する図面に提示された教示の恩恵を受けるであろう。したがって、本開示の主題は開示された特定の実施形態に限定されるべきではなく、修正形態および他の実施形態は添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されることを理解されたい。
【００１８】
（Ｉ．造影剤を含む組成物）
いくつかの実施形態では、本開示の主題は、ＰＤ-Ｌ１などの免疫チェックポイントタンパク質を検出するための非常に特異的なペプチドベースの陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）造影剤を提供する。これらの造影剤を使用して、腫瘍ＰＤ-Ｌ１発現を、特異的におよび被験体への投与直後に検出することができる。
【００１９】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の主題は、プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）に対して結合特異性を有するペプチドとレポーティング部位とのコンジュゲート、および任意にリンカーを含む造影剤であって、リンカーが、存在する場合には、ペプチドとレポーティング部位とを連結し、リンカーが存在しない場合には、レポーティング部位がペプチドのアミノ酸の第一級アミンを介してペプチドに直接結合している造影剤を提供する。他の実施形態では、レポーティング部位はペプチドに直接組み込まれ、例えば、ここで、レポーティング部位は、放射標識ヨードチロシンまたはフルオロチロシンなどのペプチドの放射標識アミノ酸を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）に対して結合特異性を有するペプチドは、ＰＤ-Ｌ１の４つの特定のアミノ酸と相互作用し得る。特定の実施形態では、ペプチドは、ＰＤ-Ｌ１のアミノ酸Ｙ５６、Ｅ５８、Ｄ６１、およびＡ１１３と相互作用し得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ-Ｌ１に対して結合特異性を有するペプチドは、ＰＤ-Ｌ１の５つの特定のアミノ酸と相互作用し得る。特定の実施形態では、ペプチドは、ＰＤ-Ｌ１のアミノ酸Ｙ５６、Ｅ５８、Ａ１１３、Ｍ１１５およびＹ１２３と相互作用し得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ-Ｌ１と相互作用するペプチドはペプチドＷＬ１２である。ペプチドＷＬ１２は、シクロ-（-Ａｃ-Ｔｙｒ-ＮＭｅＡｌａ-Ａｓｎ-Ｐｒｏ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｈｙｐ-Ｔｒｐ-Ｓｅｒ-Ｔｒｐ（メチル）-ＮＭｅＮｌｅ-ＮＭｅＮｌｅ-Ｌｙｓ-Ｃｙｓ-）-Ｇｌｙ-ＮＨ２）（配列番号１）のアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ＷＬ１２は、ＰＤ-Ｌ１の４つのアミノ酸と相互作用し得る。特定の実施形態では、ＷＬ１２は、ＰＤ-Ｌ１のアミノ酸Ｙ５６、Ｅ５８、Ｄ６１、およびＡ１１３と相互作用し得る。いくつかの実施形態では、ＷＬ１２は、ＰＤ-Ｌ１の５つのアミノ酸と相互作用し得る。特定の実施形態では、ＷＬ１２は、ＰＤ-Ｌ１のアミノ酸Ｙ５６、Ｅ５８、Ａ１１３、Ｍ１１５およびＹ１２３と相互作用し得る。他の実施形態では、ＰＤ-Ｌ１と相互作用するペプチドはＤＫ-Ａ-２２１である。ペプチドＤＫ-Ａ-２２１は、シクロ-（-Ａｃ-Ｔｙｒ-ＮＭｅＡｌａ-Ａｓｎ-Ｐｒｏ-Ｈｉｓ-Ｇｌｕ-Ｈｙｐ-Ｔｒｐ-Ｓｅｒ-Ｔｒｐ（カルボキシメチル）-ＮＭｅＮｌｅ-ＮＭｅＮｌｅ-Ｌｙｓ-Ｃｙｓ-）-Ｇｌｙ-ＮＨ２）（配列番号２）のアミノ酸配列を有し得る。いくつかの実施形態では、ＤＫ-Ａ-２２１はＰＤ-Ｌ１の４つのアミノ酸と相互作用し得る。特定の実施形態では、ＤＫ-Ａ-２２１は、ＰＤ-Ｌ１のアミノ酸Ｙ５６、Ｅ５８、Ｄ６１、およびＡ１１３と相互作用し得る。いくつかの実施形態では、ＤＫ-Ａ-２２１はＰＤ-Ｌ１の５つのアミノ酸と相互作用し得る。特定の実施形態では、ＤＫ-Ａ-２２１はＰＤ-Ｌ１のアミノ酸Ｙ５６、Ｅ５８、Ａ１１３、Ｍ１１５およびＹ１２３と相互作用し得る。他の実施形態では、ＰＤ-Ｌ１と相互作用するペプチドはＤＫ-Ａ-２２２である。いくつかの実施形態では、ＤＫ-Ａ-２２２はＰＤ-Ｌ１の４つのアミノ酸と相互作用し得る。特定の実施形態では、ＤＫ-Ａ-２２２は、ＰＤ-Ｌ１のアミノ酸Ｙ５６、Ｅ５８、Ｄ６１、およびＡ１１３と相互作用し得る。いくつかの実施形態では、ＤＫ-Ａ-２２２は、ＰＤ-Ｌ１の５つのアミノ酸と相互作用し得る。特定の実施形態では、ＤＫ-Ａ-２２２は、ＰＤ-Ｌ１のアミノ酸Ｙ５６、Ｅ５８、Ａ１１３、Ｍ１１５およびＹ１２３と相互作用し得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＰＤ-Ｌ１に対して結合特異性を有するペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。ＰＤ-Ｌ１に対して結合特異性を有するペプチドは、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有し得る。ＰＤ-Ｌ１に対して結合特異性を有するペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し得る。ＰＤ-Ｌ１に対して結合特異性を有するペプチドは、配列番号２に対して少なくとも８５％の配列同一性を有し得る。ＰＤ-Ｌ１に対して結合特異性を有するペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。ＰＤ-Ｌ１に対して結合特異性を有するペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９０％の配列同一性を有し得る。ＰＤ-Ｌ１に対して結合特異性を有するペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。ＰＤ-Ｌ１に対して結合特異性を有するペプチドは、配列番号２に対して少なくとも９５％の配列同一性を有し得る。ＰＤ-Ｌ１に対して結合特異性を有するペプチドは、配列番号１に対して１００％の配列同一性を有し得る。ＰＤ-Ｌ１に対して結合特異性を有するペプチドは、配列番号２に対して１００％の配列同一性を有し得る。
【００２２】
当該技術分野で知られている「パーセント同一性」という用語は、２つ以上のポリペプチド配列間または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係であり、配列を比較することによって決定される。当該技術分野において、「同一性」は、場合によっては、そのような配列のストリング間の一致によって決定されるように、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、以下に記載されるものを含むがこれらに限定されない既知の方法によって容易に計算することができる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （Ｌｅｓｋ，  Ａ．  Ｍ．，  ｅｄ．）  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９８８）；  Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ  （Ｓｍｉｔｈ，  Ｄ．  Ｗ．，  ｅｄ．）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９３）；  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，  Ｐａｒｔ  Ｉ  （Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ａ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  ｅｄｓ．）  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  （１９９４）；  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，  Ｇ．，  ｅｄ．）  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８７）；  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ  （Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，  Ｊ．，  ｅｄｓ．）  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９１）。同一性を決定するための好ましい方法は、試験した配列間の最良の一致を与えるように設計されている。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムに体系化されている。配列アラインメントおよびパーセント同一性計算は、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥバイオインフォマティクスコンピューティングスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ社、マディソン、ウィスコンシン州）を使用して実施することができる。配列の多重アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌアラインメント法（Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ  （１９８９）  ＣＡＢＩＯＳ．  ５：１５１-１５３）を用いて、ペアワイズアラインメントのデフォルトパラメータを含むデフォルトパラメータを用いて行うことができる。
【００２３】
本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」および「残基」は交換可能であり、ペプチドまたはポリペプチドの文脈において使用される場合、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびにアミノ酸類似体、アミノ酸模倣物および天然に存在するアミノ酸と化学的に類似している天然に存在しないアミノ酸を指す。
【００２４】
「天然に存在するアミノ酸」および「天然にコードされるアミノ酸」という用語は交換可能に使用され、遺伝コードによってコードされるアミノ酸、ならびに合成後に修飾される遺伝コードによってコードされるアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート、およびＯ-ホスホセリンを指す。
【００２５】
「アミノ酸類似体」は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有する化合物、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα-炭素を有する化合物であり、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、またはメチオニンメチルスルホニウムである。そのような類似体は、修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド骨格を有することができるが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を保持することになる。
【００２６】
用語「天然に存在しないアミノ酸」および「天然にコードされていないアミノ酸」は交換可能に使用され、天然に存在するアミノ酸と同じ基本化学構造を有するが、翻訳複合体によって成長中のポリペプチド鎖に組み込まれない化合物を指す。「天然に存在しないアミノ酸」は、天然にコードされたアミノ酸（２０個の標準的アミノ酸を含むが、これらに限定されない）の修飾（例えば、翻訳後修飾）によって生じるアミノ酸であるが、それ自体が翻訳複合体によって成長中のポリペプチド鎖に天然に組み込まれるわけではないアミノ酸も含むが、これらに限定されない。ポリペプチド配列に挿入することができる、またはポリペプチド配列中の野生型残基を置換することができる天然に存在しないアミノ酸の例の非限定的なリストには、β-アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸および誘導体化側鎖を持つアミノ酸が含まれる。例としては、以下が含まれる（Ｌ型またはＤ型で；かっこ内で省略される）：シトルリン（Ｃｉｔ）、ホモシトルリン（ｈＣｉｔ）、Ｎα-メチルシトルリン（ＮＭｃＣｉｔ）、Ｎα-メチルホモシトルリン（Ｎα-ＭｅＨｏＣｉｔ）、またはオルニチン（Ｏｒｎ）、Ｎα-メチルオルニチン（Ｎα-ＭｅＯｒｎまたはＮＭｅＯｒｎ）、サルコシン（Ｓａｒ）、ホモリジン（ｈＬｙｓまたはｈＫ）、ホモアルギニン（ｈＡｒｇまたはｈＲ）、ホモグルタミン（ｈＱ）、Ｎα-メチルアルギニン（ＮＭｅＲ）、Ｎα-メチルロイシン（Ｎα-ＭｅＬまたはＮＭｅＬ）、Ｎ-メチルホモリジン（ＮＭｅＨｏＫ）。Ｎα-メチルグルタミン（ＮＭｅＱ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、１，２，３，４-テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、オクタヒドロインドール-２-カルボン酸（Ｏｉｃ）、３-（１-ナフチル）アラニン（１-Ｎａｌ）、３-（２-ナフチル）アラニン（２-Ｎａｌ）、１，２，３，４-テトラヒドロイソキノリン（Ｔｉｃ）、２-インダニルグリシン（ＩｇＩ）、パラ-ヨードフェニルアラニン（ｐＩ-Ｐｈｅ）、パラ-アミノフェニルアラニン（４ＡｍＰまたは４-アミノ-Ｐｈｅ）、４-グアニジノフェニルアラニン（Ｇｕｆ）、グリシルリジン（「Ｋ（Ｎε-グリシル）」または「Ｋ（グリシル）」または「Ｋ（ｇｌｙ）」と略される）、ニトロフェニルアラニン（ｎｉｔｒｏｐｈｅ）、アミノフェニルアラニン（ａｍｉｎｏｐｈｅまたはアミノ-Ｐｈｅ）、ベンジルフェニルアラニン（ｂｅｎｚｙｌｐｈｅ）、γ-カルボキシグルタミン酸（γ-ｃａｒｂｏｘｙｇｌｕ）、ヒドロキシプロリン（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏ）、ｐ-カルボキシル-フェニルアラニン（Ｃｐａ）、α-アミノアジピン酸（Ａａｄ）、Ｎα-メチルバリン（ＮＭｅＶａｌ）、Ｎα-メチルロイシン（ＮＭｅＬｅｕ）、Ｎα-メチルノルロイシン（ＮＭｅＮｌｅ）、シクロペンチルグリシン（Ｃｐｇ）、シクロヘキシルグリシン（Ｃｈｇ）、アセチルアルギニン（ａｃｅｔｙｌａｒｇ）、α，β-ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）、α，γ-ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）、ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）、シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）、４-メチル-フェニルアラニン（ＭｅＰｈｅ）、β，β-ジフェニル-アラニン（ＢｉＰｈＡ）、アミノ酪酸（Ａｂｕ）、４-フェニル-フェニルアラニン（またはビフェニルアラニン；４Ｂｉｐ）、α-アミノ-イソ酪酸（Ａｉｂ）、ベータ-アラニン、ベータ-アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプリン酸、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎ-エチルグリシン、Ｎ-エチルアスパラギン、ヒドロキシリジン、ａｌｌｏ-ヒドロキシリジン、イソデスモシン、ａｌｌｏ-イソロイシン、Ｎ-メチルグリシン、Ｎ-メチルイソロイシン、Ｎ-メチルバリン、４-ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）。γ-カルボキシグルタメート、ε-Ｎ，Ｎ，Ｎ-トリメチルリジン、-Ｎ-アセチルリジン、Ｏ-ホスホセリン、Ｎ-アセチルセリン、Ｎ-ホルミルメチオニン、３-メチルヒスチジン、５-ヒドロキシリジン、ω-メチルアルギニン、４-アミノ-Ｏ-フタル酸（４ＡＰＡ）、Ｎ-アセチルグルコサミニル-Ｌ-セリン、Ｎ-アセチルグルコシルアミニル-Ｌ-トレオニン、Ｏ-ホスホチロシンおよび他の類似のアミノ酸、ならびに具体的に挙げられたもののいずれかの誘導体化形態。
【００２７】
「ペプチド」または「タンパク質」は、ペプチド結合によって互いに結合した一連の少なくとも３つのアミノ酸を含む。用語「タンパク質」および「ペプチド」は交換可能に使用され得る。ペプチドは、個々のペプチドまたはペプチドの集合体を指し得る。また、本開示の造影剤中の１つまたは複数のアミノ酸は、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、スルホキシド基、脂肪酸基などの化学物質の付加、コンジュゲーションのためのリンカー、官能化、または他の修飾などによって修飾され得る。いくつかの実施形態では、他の修飾には、Ｄ-アミノ酸の取り込み、Ｎ-末端およびＣ-末端にコンジュゲートされた他の分子、蛍光プローブ、ポリ（エチレングリコール）などの生体分子、標的化リガンドなどのコンジュゲーション、レトロ逆位などが含まれ得る。いずれの修飾も、ペプチドの所望の生物活性を実質的に妨げるべきではない。
【００２８】
本開示の造影剤のいくつかの実施形態では、レポーティング部位は、キレート剤、放射性標識基質、蛍光染料、光音響レポーティング分子、およびラマン活性レポーティング分子からなる群より選択される。
【００２９】
本開示の造影剤のいくつかの実施形態では、レポーティング部位はキレート剤であり、キレート剤は、以下からなる群より選択される：ＤＯＴＡＧＡ（１，４，７，１０-テトラアザシクロドデセカン，１-（グルタル酸）-４，７，１０-三酢酸）、ＤＯＴＡ（１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１，４，７，１０-四酢酸）、ＤＯＴＡＳＡ（１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１-（２-コハク酸）-４，７，１０-三酢酸）、ＣＢ-ＤＯ２Ａ（１０-ビス（カルボキシメチル）-１，４，７，１０-テトラアザビシクロ［５．５．２］テトラデカン）、ＤＥＰＡ（７-［２-（ビス-カルボキシメチルアミノ）-エチル］-４，１０-ビス-カルボキシメチル-１，４，７，１０-テトラアザ-シクロドデカ-１-イル-酢酸））、３ｐ-Ｃ-ＤＥＰＡ（２-［（カルボキシメチル）］［５-（４-ニトロフェニル-１-［４，７，１０-トリス（カルボキシメチル）-１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１-イル］ペンタン-２-イル）アミノ］酢酸））、ＴＣＭＣ（２-（４-イソチオシアノトベンジル）-１，４，７，１０-テトラアザ-１，４，７，１０-テトラ-（２-カルバモニルメチル）-シクロドデカン）、オキソ-ＤＯ３Ａ（１-オキサ-４，７，１０-トリアザシクロドデカン-５-Ｓ-（４-イソチオシアナトベンジル）-４，７，１０-三酢酸）、ｐ-ＮＨ２-Ｂｎ-オキソ-ＤＯ３Ａ（１-オキサ-４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-５-Ｓ-（４-アミノベンジル）-４，７，１０-三酢酸）、ＴＥ２Ａ（（１，８--Ｎ，Ｎ´-ビス-（カルボキシメチル）-１，４，８，１１-テトラアザシクロテトラデカン））、ＭＭ-ＴＥ２Ａ、ＤＭ-ＴＥ２Ａ、ＣＢ-ＴＥ２Ａ（４，１１-ビス（カルボキシメチル）-１，４，８，１１-テトラアザビシクロ［６．６．２］ヘキサデカン）、ＣＢ-ＴＥ１Ａ１Ｐ（４，８，１１-テトラアザシクロテトラデカン-１-（メタンホスホン酸）-８-（メタンカルボン酸）、ＣＢ-ＴＥ２Ｐ（１，４，８，１１-テトラアザシクロテトラデカン-１，８-ビス（メタンホスホン酸）、ＴＥＴＡ（１，４，８，１１-テトラアザシクロテトラデカン-１，４，８，１１-四酢酸）、ＮＯＴＡ（１，４，７-トリアザシクロノナン--Ｎ，Ｎ´、Ｎ´´-三酢酸）、ＮＯＤＡ（１，４，７-トリアザシクロノナン-１，４-ジアセテート）；ＮＯＤＡＧＡ（１，４，７-トリアザシクロノナン，１-グルタル酸-４，７-酢酸）、（ＮＯＴＡＧＡ）１，４，７-トリアゾナン-１，４-ジイル）二酢酸ＤＦＯ（デスフェロキサミン）、ＮＥＴＡ（［４-［２-（ビス-カルボキシメチルアミノ）-エチル］-７-カルボキシメチル-［１，４，７］トリアゾナン-１-イル｝-酢酸）、ＴＡＣＮ-ＴＭ（-Ｎ，Ｎ´，Ｎ´´，トリス（２-メルカプトエチル）-１，４，７-トリアザシクロノナン）、ジアムサル（１，８-ジアミノ-３，６，１０，１３，１６，１９-ヘキサアザビシクロ（６，６，６）エイコサン、３，６，１０，１３，１６，１９-ヘキサアザビシクロ［６．６．６］エイコサン-１，８-ジアミン）、Ｓａｒａｒ（１-Ｎ-（４-アミノベンジル）-３，６，１０，１３，１６，１９-ヘキサアザビシクロ［６．６．６］ ］エイコサン-１，８-ジアミン）、ＡｍＢａＳａｒ（４-（（８-アミノ-３，６，１０，１３，１６，１９-ヘキサアザビシクロ［６．６．６］イコサン-１-イルアミノ）メチル）安息���酸）、およびＢａＢａＳａｒ。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ペプチド、リンカー、レポーターコンジュゲートは、クリックケミストリーによって調製される。例えば、Ｐｏｍｐｅｒらに対する国際特許出願公開ＷＯ／２０１７／０２７８７０を、トリアゾールコンジュゲート尿素、チオ尿素、カルバメートについて、ならびに１９９７年２月１６日に公開された、ＰＳＭＡ標的化造影剤およびその使用のための「逆転」カルバメート、ならびに米国特許出願公開第２０１４０３４１８０４号明細書を、２０１４年１１月２０日に公開されたＰｏｍｐｅｒらに対する前立腺特異的膜抗原（Ｐｍｓａ）のホモ多価およびヘテロ多価阻害剤ならびにその使用についてを参照し、これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる。
【００３１】
特定の実施形態では、キレート剤は以下から選択される構造を有する：
【化３】
2020514278.tif 000004
【００３２】
さらに特定の実施形態では、レポーティング部位はキレート剤であり、キレート剤は、９４ｍＴｃ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、８６Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、５５Ｃｏ、５７Ｃｏ、４７Ｓｃ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、１５２Ｇｄ、８２Ｒｂ、８９Ｚｒ、および１６６Ｄｙからなる群より選択される放射性金属をさらに含む。  
【００３３】
本開示の造影剤の他の実施形態では、レポーティング部位は放射性標識基質であり、放射性標識基質は、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２６Ｉ、１３１Ｉ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、８０Ｂｒ、８０ｍＢｒ、８２Ｂｒ、８３Ｂｒ、および２１１Ａｔからなる群より選択される放射性同位体を含む。特定の実施形態では、放射性標識基質は１８Ｆ標識基質を含む。さらに特定の実施形態では、１８Ｆ標識基質は、２-フルオロ-ＰＡＢＡ、３-フルオロ-ＰＡＢＡ、２-フルオロ-マンニトール、およびＮ-スクシンイミジル-４-フルオロベンゾエートからなる群より選択される。いくつかの実施形態では、基質は、例えば、ＮＯＴＡ、ＮＯＤＡ、または当該技術分野で知られている任意の他の適切なキレート剤によるフッ化アルミニウムのキレート化に基づいて、ＡｌＦ法を使用して１８Ｆで標識される。例えば、以下を参照：Ｌｉｕ  Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｏｎｅ-ｓｔｅｐ  ｒａｄｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  １８Ｆ-ＡｌＦ-ＮＯＴＡ-ＲＧＤ２  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｓｉｓ  ＰＥＴ  ｉｍａｇｉｎｇ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｍｏｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ．  ２０１１，  ３８（９）：１７３２-４１；  ＭｃＢｒｉｄｅ  Ｗ．Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  “Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  １８Ｆ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｉｎｇ  ｆｏｒ  ＰＥＴ．  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．  ２００９；５０：９９１-９９８；  ＭｃＢｒｉｄｅ  Ｗ．Ｊ，  Ｄ’Ｓｏｕｚａ  ＣＡ，  Ｓｈａｒｋｅｙ  ＲＭ，  Ｓｈａｒｋｅｙ  ＲＭ，  Ｋａｒａｃａｙ  Ｈ，  Ｒｏｓｓｉ  ＥＡ，  Ｃｈａｎｇ  Ｃ-Ｈ，  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ＤＭ．  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  １８Ｆ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆｌｕｏｒｉｄｅ-ａｌｕｍｉｎｕｍ-ｃｈｅｌａｔｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．  ２０１０；２１：１３３１-１３４０。
【００３４】
本開示の造影剤の他の実施形態では、レポーティング部位は蛍光染料であり、蛍光染料は、以下からなる群より選択される：カルボシアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、ツイカルボシアニン、メロシアニン、ポリメチン、クマリン、ローダミン、キサンテン、フルオレセイン、ホウ素-ジピロメタン（ＢＯＤＩＰＹ）染料、またはその誘導体、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＲ、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ ６３０／６５０、およびＢＯＤＩＰＹ ６５０／６６５を含むがこれらに限定されない、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＶｉｖｏＴａｇ-６８０、ＶｉｖｏＴａｇ-Ｓ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ-Ｓ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６６０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６８０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７００、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７５０、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ７９０、Ｄｙ６７７、Ｄｙ６７６、Ｄｙ６８２、Ｄｙ７５２、Ｄｙ７８０、ＤｙＬｉｇｈｔ５４７、Ｄｙｌｉｇｈｔ６４７、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０、ＩＲ８００（ジメチル｛４-［１，５，５-トリス（４-ジメチルアミノフェニル）-２，４-ペンタジエニリデン］-２，５-シクロヘキサジエン-１-イリデン｝過塩素酸アンモニウム）、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ  ８００ＲＳ、ＩＲＤｙｅ  ７００ＤＸ、ＡＤＳ７８０ＷＳ、ＡＤＳ８３０ＷＳ、およびＡＤＳ８３２ＷＳ。
【００３５】
本開示の造影剤の他の実施形態では、レポーティング部位は光音響レポーティング分子であり、光音響レポーティング分子は、染料またはナノ粒子からなる群より選択される。特定の実施形態では、染料は蛍光染料を含む。さらに特定の実施形態では、蛍光染料は、インドシアニングリーン（ＩＣＧ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ７５０、Ｅｖａｎｓ Ｂｌｕｅ、ＢＨＱ ３、ＱＸＬ ６８０、ＩＲＤｙｅ ８８０ＣＷ、ＭＭＰＳｅｎｓｅ ６８０、メチレンブルー、ＰＰＣｙ-Ｃ８、およびＣｙｐａｔｅ-Ｃ１８からなる群より選択される。Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｓｃｉ．，  １５，  ２３６１６-２３６３９  （２０１４）を参照。
【００３６】
他の実施形態では、ナノ粒子は、金ナノスフェア、金ナノシェル、金ナノロッド、金ナノケージ、金ナノスター、および金ナノクラスターを含むが、これらに限定されないプラズモニックナノ粒子、量子ドット、ナノダイヤモンド、ポリピロールナノ粒子、硫化銅ナノ粒子、グラフェンナノシート、酸化鉄-金コア-シェルナノ粒子、Ｇｄ２Ｏ３ナノ粒子、単層カーボンナノチューブ、色素充填ペルフルオロカーボンナノ粒子、および超常磁性酸化鉄ナノ粒子からなる群より選択される。
【００３７】
本開示の造影剤の他の実施形態では、レポーティング部位はラマン活性レポーティング分子であり、ラマン活性レポーティング分子は、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）および表面増強ラマン散乱（ＳＥＲＳ）剤からなる群より選択される。特定の実施形態では、ＳＥＲＳ剤は、ラマン活性レポーター分子で標識された金属（例えば、金または銀）ナノ粒子を含む。さらに特定の実施形態では、ラマン活性レポーター分子は蛍光染料を含む。特定の実施形態では、蛍光染料は、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ローダミン、およびカルコゲノピリリウム染料からなる群より選択される。
【００３８】
本開示の造影剤の他の実施形態では、リンカーは、以下からなる群より選択される：
（ａ）
【化４】
2020514278.tif 000005
（式中：Ｒｐｔはレポーティング部位である；Ｗ１は、Ｃ１-Ｃ６アルキレン、Ｃ３-Ｃ６シクロアルキレン、およびアリーレンからなる群より選択される；Ｗ２は、-ＮＲ１-（Ｃ＝Ｏ）-、-ＮＲ１-（Ｃ＝Ｓ）-、-（Ｃ＝Ｏ）-ＮＲ１-、-（Ｃ＝Ｓ）-ＮＲ１-、および-Ｓ-からなる群より選択され、ここで各Ｒ１は、独立して、ＨまたはＣ１-Ｃ４アルキルである；各Ｒ２は、独立して、Ｈまたは-ＣＯＯＲ３であり、ここで各Ｒ３は、独立して、Ｈ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、Ｃ２-Ｃ１２アリールまたはＣ４-Ｃ１６アルキルアリールである；ｂは、０、１、２、および３からなる群より選択される整数である；ｄは、１、２、３、４、５、６、７、および８からなる群より選択される整数である；ならびに式中、波線は、リンカーとペプチドとの間の結合点を示す）；
（ｂ）      Ｒｐｔ-Ｘ-Ｙ-Ｚ-Ｗ３-
（式中：Ｒｐｔはレポーティング部位である；ＸおよびＺは、それぞれ独立して、Ｃ１-Ｃ８アルキル、Ｃ２-Ｃ８アルケニル、Ｃ２-Ｃ８アルキニル、Ｃ１-Ｃ８ヘテロアルキル、Ｃ２-Ｃ８ヘテロアルケニル、Ｃ２-Ｃ８ヘテロアルキニル、Ｃ１-Ｃ８アルコキシ、もしくは結合であり得、それらの各々は０〜５個のＲＡで置換され得る；ＹおよびＷ３は、それぞれ独立して、-Ｏ-、-Ｓ（Ｏ）ｐ-、-ＮＨ-、-ＮＲＢ-、-ＣＨ＝ＣＨ-、-ＣＲＢ＝ＣＨ-、-ＣＨ＝ＣＲＢ-、-ＮＨ-ＣＯ-、-ＮＨ-ＣＯ２-、-ＮＲＢ-ＣＯ-、-ＮＲＢ-ＣＯ２-、-ＣＯ-ＮＨ-、-ＣＯ２-ＮＨ-、-ＣＯ-ＮＲＢ-、-ＣＯ２-ＮＲＢ-、もしくは結合である；ｐは、０、１、もしくは２である；ＲＡは、その出現ごとに、ハロゲン、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ニトロ、ＣＯ２Ｈ、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたシクロアルキル、任意に置換されたヘテロ環、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたアルキニル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたモノもしくはジアルキルアミノ、任意に置換されたアルキルチオ、任意に置換されたアルキルスルフィニル、任意に置換されたアルキルスルホニル、任意に置換されたモノもしくはジアルキルカルボキサミド、任意に置換されたアリール、もしくは任意に置換されたヘテロアリールである；ＲＢは、その出現ごとに、任意に置換されたアルキル、任意に置換されたアルコキシ、任意に置換されたモノもしくはジアルキルアミノ、任意に置換されたアルキルチオ、任意に置換されたアリール、もしくは任意に置換されたヘテロアリールである）；または
（ｃ）アミノ酸リンカー。
【００３９】
特定の実施形態では、造影剤は、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、および式（ＩＩＩ）からなる群より選択される化合物である：
【化５】
2020514278.tif 000006
ＤＫ-Ａ-２２１-（Ｌ）ｎ-Ｒｐｔ（ＩＩ）；または
ＤＫ-Ａ-２２２-（Ｌ）ｎ-Ｒｐｔ（ＩＩＩ）；
（式中：ｎは、０および１からなる群より選択される整数である；Ｌはリンカーである；およびＲｐｔはレポーティング部位である；ならびに式中、レポーティング部位またはリンカーは、存在する場合、式（Ｉ）、式（ＩＩ）、または式（ＩＩＩ）の造影剤を含むペプチドの第一級アミン基に結合している）。
【００４０】
特定の実施形態では、リンカーは、存在する場合、式（Ｉ）の化合物の１３オルニチン（Ｏｒｎ）一級アミン基に結合している。特定の実施形態では、レポーティング部位はＤＯＴＡＧＡキレート剤を含む。さらに特定の実施形態では、ＤＯＴＡＧＡキレート剤は６４Ｃｕ放射性金属をさらに含む。
【００４１】
さらに特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は以下である：
【化６】
2020514278.tif 000007
【００４２】
当業者は、本開示の主題を検討すれば、本明細書に開示の造影剤と共に使用するのにキレート剤／放射性金属イオンの様々な組み合わせが適切であることを認識するであろう。代表的なキレート剤は、当該技術分野において知られている。非限定的な例として、特定のキレート剤およびリンカーは、米国特許出願公開第２０１５／０２４６１４４号および第２０１５／０１０４３８７号に開示されており、それらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、造影剤は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏでＰＤ-Ｌ１を検出することができる。いくつかの態様では、造影剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＤ-Ｌ１を検出することができる。ＰＤ-Ｌ１は様々な腫瘍によって発現され、その過剰発現は、腫瘍浸潤性細胞傷害性Ｔ細胞に応答した適応機構として腫瘍細胞において誘導される（Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１６）。当業者は、ＰＤ-Ｌ１が修飾および／または突然変異を含み得、それが本開示の造影剤によってなお検出され得る限り、本開示の方法に依然として適用可能であり得ることを認識するであろう。
【００４４】
いくつかの実施形態では、ＰＤ-Ｌ１とそのリガンドであるプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ-１）との相互作用を阻害する本開示の造影剤のＩＣ５０は、約１００ｎＭ〜約１ｐＭの範囲である。いくつかの実施形態では、ＩＣ５０は１００ｎＭ未満、他の実施形態では１０ｎＭ未満、他の実施形態では８ｎＭ未満、他の実施形態では５ｎｍ未満、他の実施形態では４ｎｍ未満、他の実施形態では３ｎＭ未満である。
【００４５】
用語「結合親和性」は、２つ以上の化合物が非共有関係で互いにどれだけ強く会合しているかを表す特性である。結合親和性は、定性的に（「強い」、「弱い」、「高い」、もしくは「低い」など）または定量的に（Ｋｄの測定など）特性評価することができる。
【００４６】
（ＩＩ．造影剤を用いる検出方法）
いくつかの実施形態では、本開示の主題は、ＰＤ-Ｌ１などの免疫チェックポイントタンパク質を検出するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本開示の主題は、がん、炎症、感染症などの、ＰＤ-Ｌ１の過剰発現をもたらす疾患、障害、または状態を検出する方法を提供する。
【００４７】
いくつかの実施形態では、本開示の主題は、以下の工程を含む、プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）を検出するためのイメージング方法を提供する：（ａ）プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）に対して結合特異性を有するペプチドとレポーティング部位とのコンジュゲート、および任意にリンカーを含む造影剤であって、直前に記載の通り、リンカーが、存在する場合には、ペプチドとレポーティング部位とを連結し、リンカーが存在しない場合には、レポーティング部位がペプチドのアミノ酸の第一級アミンを介してペプチドに直接結合している造影剤の有効量を提供する工程と；（ｂ）１つもしくは複数の細胞または組織を造影剤と接触させる工程と；（ｃ）画像を作成してＰＤ-Ｌ１を検出する工程。
【００４８】
本明細書で使用される場合、用語「イメージング」または「画像を作成すること」は、化合物から放出されるエネルギーを測定することによって検出可能な化合物を視覚化する任意のイメージング技術の使用を指す。いくつかの実施形態では、「イメージング」という用語は、投与後の化合物の局在化後に化合物から放出されるエネルギーを測定することによって、被験体への投与後に検出可能な化合物を視覚化する任意のイメージング技術の使用を指す。いくつかの実施形態では、イメージング技術は、被験体の外部から検出することができる化合物を被験体に投与することを含む。いくつかの実施形態では、画像は、被験体の様々な場所に蓄積する造影剤の空間分布の違いによって生成される。いくつかの実施形態では、造影剤の投与は注射によって行われる。
【００４９】
「造影剤」という用語は、例えば陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）によって造影することができる化合物を含むことを意図している。本明細書で使用される場合、「陽電子放出断層撮影イメージング」すなわち「ＰＥＴ」は、全ての陽電子放出断層撮影イメージングシステムまたは同等物、および陽電子放出断層撮影イメージングが可能な全ての装置を含む。本開示の主題の方法は、任意のそのような装置、もしくはＰＥＴ装置もしくはその同等物の変形形態を使用して、または任意の既知ＰＥＴ方法論と併せて実施することができる。例えば、その各々が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，１５１，３７７；６，０７２，１７７；５，９００，６３６；５，６０８，２２１；５，５３２，４８９；５，２７２，３４３；５，１０３，０９８号を参照。動物イメージングモダリティには、例えばマイクロＰＥＴ（Ｃｏｒｃｏｒｄｅ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社）が含まれる。
【００５０】
レポーティング部位に応じて、本開示の造影剤を、ＰＥＴ、単光子放出型コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、近赤外（蛍光）、光音響、およびラマンイメージングにおいて使用することができる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、イメージングは、検出システムを使用して、被験体もしくは患者全体、または被験体もしくは患者の特定の領域をスキャンし、シグナルを検出することを含む。検出された信号は、次いで画像に変換される。得られた画像は、例えば医師などの熟練した観察者によって解釈されるべきである。一般に、造影剤の投与後約１分〜約４８時間でイメージングが行われる。イメージングの正確なタイミングは、当業者には容易に明らかになるように、投与される化合物のクリアランス速度などの要因によって決まる。イメージングの時間枠は、使用されている放射性ヌクレオチドに基づいて変わり得る。特定の実施形態では、イメージングは、投与後約１分〜約４時間の間に、例えば１５分〜３０分の間に、３０分〜４５分の間に、４５分〜６０分の間に、６０分〜９０分の間に、および６０分〜１２０分の間に行われる。いくつかの実施形態では、ＰＤ-Ｌ１の検出は、造影剤を被験体に投与した後約６０分経ったらすぐに行われる。いくつかの実施形態では、イメージングは、Ｚｒ-８９で標識されたペプチドの注射の２４時間後に行われてもよい。いくつかの実施形態では、イメージングは、Ｉ-１２４で標識されたペプチドの注射の２４時間後に行われてもよい。
【００５２】
画像が得られたら、当業者は化合物の位置を決定することができる。この情報を使用して、当業者は、例えば、感染症、炎症、またはがんなどの状態が存在するかどうか、その状態の程度、または被験体が受けている治療の有効性を判断することができる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、細胞または組織の造影剤との接触が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで行われる。「接触させる」とは、本開示の主題の少なくとも１つの造影剤が、少なくとも１つの細胞または組織と物理的に接触することをもたらす任意の作用を意味する。したがって、それは、少なくとも１つの造影剤と少なくとも１つの細胞または組織との接触をもたらすのに十分な量で、細胞（単数もしくは複数）または組織（単数もしくは複数）を造影剤にばく露させることを含み得る。いくつかの実施形態では、本方法は、培養皿または管などの制御された環境に造影剤および細胞または組織を導入し、好ましくは混合することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施することができる。いくつかの実施形態では、本方法はｉｎ  ｖｉｖｏで実施することができ、その場合、接触は、被験体の少なくとも１つの細胞または組織を、本開示の主題の少なくとも１つの造影剤にばく露させること、例えば造影剤を任意の適切な経路を介して被験体に投与することなどを意味する。いくつかの実施形態では、細胞または組織と造影剤との接触は、被験体内で行われる。
【００５４】
造影剤の「有効量」という用語は、本明細書に記載の技術、例えば、陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）を用いて画像化したときに読み取り可能なシグナルを提供するのに必要または十分な量である。有効量は、被験体の大きさおよび体重、病気の種類、または特定の化合物などの要因に応じて変わり得る。例えば、化合物の選択は、「有効量」を構成するものに影響を及ぼし得る。当業者は、本明細書に含まれる要因を調べ、過度の実験をすることなく化合物の有効量に関して決定を下すことができるであろう。
【００５５】
それらの多くの実施形態において本開示の方法により診断または治療を受ける被験体は、望ましくはヒト被験体であるが、本明細書に記載の方法は、「被験体」という用語に含まれることが意図される全ての脊椎動物種に関して有効であることを理解すべきである。したがって、「被験体」は、既存の疾患、障害、状態の診断または治療のためなどの医学的目的のためのヒト被験体、または医学的目的、獣医学的目的、もしくは開発的目的のための動物被験体を含み得る。適切な動物被験体には以下が含まれる：霊長類、例えば、ヒト、サル、類人猿、テナガザル、チンパンジー、オランウータン、マカクなどを含むがこれらに限定されない哺乳動物；畜牛、例えばウシ、牛など；ヒツジ、例えば羊など；ヤギ、例えば山羊など；ブタ、例えば豚および成豚など；ウマ科、例えばウマ、ロバ、シマウマなど；ネコ科動物、野生および飼い猫を含む；イヌ科、犬を含む；ウサギ目、ウサギ、ノウサギなどを含む；げっ歯類、マウス、ラット、モルモットなどを含む。動物は、遺伝子導入動物であり得る。いくつかの実施形態では、被験体は、胎児、新生児、幼児、若年、および成人の被験体を含むがこれらに限定されないヒトである。さらに、「被験体」は、疾患、障害、または状態に罹患しているかまたは罹患している疑いのある患者を含み得る。したがって、「被験体」および「患者」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。被験体は、動物疾患モデル（例えば、実験に使用されるラットまたはマウスなど）も含む。いくつかの実施形態では、被験体は、ヒト、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウマ、ヒツジ、ウシ、サル、トリ、または両生類である。
【００５６】
一般に、本開示の造影剤は、以下を含む任意の適切な投与経路によって、疾患、障害、または状態の検出のために被験体に投与され得る：経口、経鼻、経粘膜、眼内、直腸内、膣内、または非経口を含む、静脈内、筋肉内、皮下、髄内注射、ならびに髄腔内、直接脳室内、静脈内、関節内、胸骨内、滑液内、肝内、病巣内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、または眼内注射、嚢内、局所的に、粉剤、軟膏剤または滴剤（点眼薬を含む）によるもの、口腔内および舌下に、経皮的に、吸入スプレーを介して、または当該技術分野で知られている他の送達様式。
【００５７】
本明細書で使用される「全身性投与」、「全身投与」、「末梢性投与」および「末梢投与」という語句は、それらが被験体または患者の系に入り、したがって代謝および他の類似のプロセスを受けるような組成物の投与、例えば、皮下投与または静脈内投与を意味する。
【００５８】
本明細書で使用される「非経口的投与」および「非経口投与」という語句は、通常は注射による、経腸投与および局所投与以外の投与様式を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、眼内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内注射ならびに注入を含むが、これらに限定されない。
【００５９】
いくつかの実施形態では、造影剤は少なくとも３：１の標的対非標的比を示す。いくつかの実施形態では、用語「標的」は、ＰＤ-Ｌ１タンパク質の過剰発現を示す細胞または組織を指し、用語「非標的」は、ＰＤ-Ｌ１タンパク質の過剰発現を示さない細胞または組織を指す。
【００６０】
いくつかの実施形態では、イメージング方法はがんを検出するために使用される。被験体または患者における「がん」は、がんを引き起こす細胞に典型的な特徴を有する細胞の存在、例えば、制御されない増殖、特殊機能の喪失、不死性、顕著な転移能、抗アポトーシス活性の有意な増加、急速な成長と増殖率、および特定の特徴的な形態と細胞マーカーを指す。状況によっては、がん細胞は腫瘍の形態をとる；そのような細胞は、動物内に局所的に存在し得るか、または独立した細胞、例えば白血病細胞として血流中を循環し得る。本明細書で使用されるがんは、芽腫、癌腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、および肉腫を含むが、これらに限定されない、新しく診断されたまたは再発性のがんを含む。本明細書で使用されるがんは、頭部がん、頸部がん、頭頸部がん、肺がん、トリプルネガティブ乳がんなどの乳がん、前立腺がん、大腸がん、食道がん、胃がん、白血病／リンパ腫、子宮がん、皮膚がん、内分泌がん、泌尿器がん、膵臓がん、消化管がん、卵巣がん、子宮頸がん、腎がん、膀胱がん、脳腫瘍、および腺腫を含むが、これらに限定されない。いくつかの態様では、がんは、病期０がんを含む。いくつかの実施形態では、がんは、病期Ｉがんを含む。いくつかの態様では、がんは、病期ＩＩがんを含む。いくつかの実施態様では、がんは、病期ＩＩＩがんを含む。いくつかの実施形態では、がんは、病期ＩＶがんを含む。いくつかの実施形態では、がんは、難治性および／または転移性である。
【００６１】
本明細書で使用される「腫瘍」は、悪性であろうと良性であろうと、全ての新生物細胞の成長および増殖、ならびに全ての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。本明細書で使用される「固形腫瘍」は、通常、嚢胞や液体領域を含まない異常な組織塊である。固形腫瘍は、非限定的な例として、脳、結腸、乳房、前立腺、肝臓、腎臓、肺、食道、頭頸部、卵巣、子宮頸部、胃、結腸、直腸、膀胱、子宮、精巣、および膵臓に存在し得る。いくつかの実施形態では、イメージング方法は、固形腫瘍を検出するために使用される。さらに他の実施形態では、イメージング方法は転移性がんを検出するために使用される。
【００６２】
いくつかの実施形態では、イメージング方法は感染症を検出するために使用される。任意の真菌または細菌による感染症などの感染症は、本開示の主題を使用した検出のために企図されている。本明細書中で使用される場合、用語「感染」は、疾患を引き起こす生物による宿主生物の体組織の侵入、それらの増殖、ならびにこれらの生物およびそれらが産生する毒素に対する宿主組織の反応を指す。感染としては、院内感染、外科感染、ならびに腹膜炎、膵炎、胆嚢膿胸および胸膜膿胸などの重度の腹部感染、ならびに骨髄炎などの骨感染が挙げられるが、これらに限定されない。敗血症、敗血症および敗血症性ショックの検出、免疫抑制薬の使用に起因するまたは使用後の感染、がん化学療法、放射線、汚染された点滴、出血性ショック、虚血、外傷、がん、免疫不全、ウイルス感染、および糖尿病も考えられる。細菌および／または真菌感染などの微生物感染の例には、ヒト型結核菌、大腸菌、クレブシエラ属、エンテロバクター属、プロテウス属、セラチア・マルセッセンス、緑膿菌、黄色ブドウ球菌およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌を含む黄色ブドウ球菌属、エンテロコッカス属、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、バクテロイデス属、アシネトバクター属、ヘリコバクター属、カンジダ属による感染が含まれるが、これらに限定されない。耐性微生物による感染、例えば、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）およびバンコマイシン耐性エンテロコッカス・フェシウム（ＶＲＥ）が含まれる。いくつかの実施形態では、感染は細菌感染である。いくつかの実施形態では、感染は慢性細菌感染である。いくつかの実施形態では、細菌感染症は結核である。いくつかの実施形態では、感染症は播種性結核である。いくつかの実施形態では、感染症は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、および／またはヒト免疫不全ウイルスであり得る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、イメージング方法は炎症を検出するために使用される。炎症に関連する障害の例としては、喘息、自己免疫疾患、自己炎症性疾患、セリアック病、憩室炎、糸球体腎炎、化膿性汗腺炎、過敏症、炎症性腸疾患、間質性膀胱炎、中耳炎、骨盤内炎症性疾患、再かん流傷害、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、移植拒絶反応、全身性エリテマトーデスを含む狼瘡、および血管炎が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、炎症は、関節リウマチまたは全身性エリテマトーデスによって引き起こされる。
【００６４】
ＰＤ-Ｌ１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄細胞上に見出されるその受容体であるＰＤ-１に結合し、活性化または阻害を調節する。したがって、ＰＤ-Ｌ１発現を検出する本開示の造影剤は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、および骨髄細胞などの免疫細胞を検出するために使用することができる。いくつかの実施形態では、本開示の造影剤は腫瘍中の免疫細胞を検出する。いくつかの実施形態では、本開示の造影剤は、被験体における免疫細胞の分布を全身的に検出する。いくつかの実施形態では、イメージング方法は、感染性細胞における免疫細胞応答を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、イメージング方法は、炎症細胞における免疫細胞応答を検出するために使用される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本開示のイメージング方法は、ＰＤ-Ｌ１発現の治療誘導変化などのＰＤ-Ｌ１発現の変化を検出および／または測定する。そのような方法は、特定の治療方法の有効性を確かめるためにおよび／または有効な治療用量範囲を決定するために使用することができる。
【００６６】
（ＩＩＩ．造影剤を含むキット）
いくつかの実施形態では、上記の通り、本開示の主題は、プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）を検出するためのキットを提供し、キットは、プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）に対して結合特異性を有するペプチドとレポーティング部位とのコンジュゲート、および任意にリンカーを含む造影剤であって、リンカーが、存在する場合には、ペプチドとレポーティング部位とを連結し、リンカーが存在しない場合には、レポーティング部位がペプチドのアミノ酸の第一級アミンを介してペプチドに直接結合している造影剤を含む。
【００６７】
典型的には、本開示の主題のキットは、本開示の造影剤および少なくとも１つの本開示方法を実施する方法についての説明書を含む。造影剤は通常、ＰＤ-Ｌ１を少なくとも１個体の被験体または患者において少なくとも１回検出するのに十分な量でキット中に供給される。キットは、本開示の方法の少なくとも１つの実施形態を実施するのに必要な他の試薬および供給物のいくつかまたは全ても含み得る。
【００６８】
その最も単純な形態では、本開示の主題のキットは、本開示の主題の少なくとも１種類の造影剤を含有する容器を含む。いくつかの実施形態では、キットは複数の容器を含み、各容器は少なくとも１つの造影剤または本開示の方法の１つまたは複数の実施形態を実施するのに有用な他の物質を含み得る。
【００６９】
容器は、本開示の組成物または本開示の方法を実施するのに有用な他の物質を収容するのに適した任意の材料であり得る。したがって、容器はバイアルまたはアンプルであり得る。それは、ガラス、プラスチック、金属、または紙もしくは紙製品などの任意の適切な材料から製造することができる。実施形態では、それは、ストッパー、ストッパーおよびクリンプシール、もしくはプラスチック製もしくは金属製キャップなどによって密封することができるガラス製もしくはプラスチック製のアンプルまたはバイアルである。容器に含まれる造影剤の量は、本開示の主題に関連する多数のパラメータに基づいて、過度の実験をすることなく当業者によって選択され得る。
【００７０】
実施形態では、容器は、典型的には包装材料を含むより大きなユニットの構成要素として提供される（以下では簡潔さのためにキットと呼ぶ）。本開示のキットは、適切な包装および説明書、ならびに／または組成物の使用に関する他の情報を含み得る。通常、キットは、ボール紙やプラスチックなどの頑丈な材料で製造されており、説明書やその他の情報を直接印刷することができる。キットは、本発明の組成物を含む複数の容器を含み得る。そのようなキットでは、各容器は他の各容器と同じサイズであり、同じ量の組成物を含み得るか、あるいは、異なる容器は、異なるサイズであり得、および／または異なる量の組成物または異なる成分を有する組成物を含み得る。当業者は、容器サイズおよび内容物の多数の異なる構成が本発明によって想定されており、したがって、全ての置換が本明細書に具体的に列挙される必要があるわけではないことを容易に認識するであろう。
【００７１】
本明細書では特定の用語が使用されているが、それらは一般的かつ説明的な意味でのみ使用されており、限定の目的では使用されていない。別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、この本明細書に記載の主題が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００７２】
長年の特許法の慣習に従い、用語「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、特許請求の範囲を含む本出願において使用されるとき、「１つまたは複数」を指す。したがって、例えば、文脈が明らかに反対でない限りなど（例えば、複数の被験体など）では、「被験体」への言及は複数の被験体を含む。
【００７３】
本明細書および特許請求の範囲を通して、「含む」、「備える」、および「含んでいる」という用語は、文脈上別段の要求がない限り、非排他的な意味で使用される。同様に、「含有する」という用語およびその文法的変形は、リスト内の項目の列挙が、列挙された項目に置換または追加され得る他の同様の項目を排除するものではないように、非限定的であることを意図する。
【００７４】
本明細書および添付の特許請求の範囲の目的のために、別段に指示されない限り、量、大きさ、寸法、割合、形状、配合、パラメータ、百分率、パラメータ、量、特性、ならびに本明細書および特許請求の範囲で使用される他の数値は、「約」という用語がその値、量または範囲と共に明示的に現れなくても、全ての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解されるべきである。したがって、反対に示さない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは厳密ではなく、および厳密である必要はないが、おおよそおよび／またはより大きくても小さくてもよく、公差、換算係数、四捨五入、測定誤差など、ならびに、本開示の主題によって得られることが求められる所望の特性によって決まる当業者に知られている他の要因を反映する。例えば、値について言及する場合の「約」という用語は、特定量から、いくつかの実施形態では、±１００％、いくつかの実施形態では±５０％、いくつかの実施形態では±２０％、いくつかの実施形態では±１０％、いくつかの実施形態では±５％、いくつかの実施形態では±１％、いくつかの実施形態では±０．５％、いくつかの実施形態では±０．１％の変動を、そのような変形が開示の方法を実施するのに適切であるかまたは開示の組成物を採用するのに適切である場合に包含することを意味し得る。
【００７５】
さらに、「約」という用語は、１つまたは複数の数または数値範囲と関連して使用される場合、範囲内の全ての数を含む全てのそのような数を指すと理解されるべきであり、示された数値の上下に境界を広げることによってその範囲を修正する。端点による数値範囲の列挙は、その範囲内に包含される全ての数、例えば、その範囲内に包含されるその小数を含む整数全体（例えば、１〜５の列挙は、１、２、３、４、および５、およびその小数、例えば、１．５、２．２５、３．７５、４．１などを含む）ならびにその範囲内の任意の範囲を含有する。
【実施例】
【００７６】
以下の実施例は、本開示の主題の代表的な実施形態を実施するための手引きを当業者に提供するために含まれている。本開示および当該技術分野の一般的な技術水準に照らして、以下の実施例は例示のみを意図しており、多数の変更、修正および代替を本開示の主題の範囲から逸脱することなく採用できることを、当業者は理解することができる。以下の合成の説明および特定の実施例は、例示の目的のためだけに意図されており、他の方法によって本開示の化合物を製造するいかなる様式においても限定的であると解釈されるべきではない。
【００７７】
（実施例１）
（非常に特異的なペプチドを用いる、ＰＥＴでの迅速な腫瘍ＰＤ-Ｌ１検出）
１．１背景：腫瘍微小環境（ＴＭＥ）におけるＰＤ-Ｌ１の増加は、能動免疫浸潤物によって発現されるプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ-１）受容体への結合を介した免疫浸潤物の不活性化による免疫抑制を引き起こす（Ｏｋａｚａｋｉら、２００７、およびＴｏｐａｌｉａｎら、２０１５）。腫瘍細胞上およびＴＭＥ中のＰＤ-Ｌ１発現は、患者の層別化および治療的モニタリングのための潜在的なバイオマーカーと考えられている（Ｈｅｒｂｓｔら、２０１４）。ＰＤ-Ｌ１ ＩＨＣに基づく補足的な診断試験が、米国食品医薬品局によって近年承認され、ＰＤ-Ｌ１がｉｎ  ｖｉｖｏでのイメージングに適切な標的であり得ることを示唆している（Ｒｏａｃｈら、２０１６）。
【００７８】
現在、免疫組織化学（ＩＨＣ）検出は、ＰＤ-Ｌ１／ＰＤ-１標的治療の治療モニタリングのために最も研究されている予測バイオマーカーであるが、このアプローチおよびＰＤ-Ｌ１に対するその利用可能なＦＤＡ承認診断ＩＨＣ試験には重大な限界があり、Ｒｏａｃｈら、２０１６；ＭａｎｓｆｉｅｌｄおよびＤｏｎｇ、２０１６；ならびにＰｈｉｌｌｉｐｓら、２０１５、抗原陽性の定義の矛盾、検出抗体の不一致、アッセイ間の合意の不十分さ、ならびに正確性と信頼性を損なう腫瘍内および腫瘍間の不均一性、したがって治療上の意思決定の妨げとなっている。また、検査のために生検によって取得された組織サンプルは通常、非常に限られており、他の経路における標的化可能な発がん性突然変異（例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、未分化リンパ腫キナーゼ、ＤＮＡ修復遺伝子）を同定するための分子プロファイリングにとって必要となる場合があり、それは既存の治療法に対して感受性や抵抗性を与える。そのような貴重なサンプルは、ＰＤ-Ｌ１発現の信頼できる描写のために複数のＰＤ-Ｌ１評価を行うことを非実用的にすることが多い。ＰＤ-Ｌ１の発現レベル、動態および分布の非侵襲的評価を可能にし、投与の６０分以内のイメージングの標準的臨床ワークフロー内でそれらを行う新規ＰＥＴ造影剤は、ＰＤ-Ｌ１発現状態を評価するための利用可能な（ＩＨＣベースの）方法の欠点を克服するだろう。
【００７９】
腫瘍免疫微小環境の動的性質は、ＴＭＥの迅速な評価を可能にするＰＥＴトレーサーの開発の理論的根拠を提供する。これに関して、低分子量のペプチドベースのＰＥＴトレーサーは、それらの速いクリアランスおよび合成の扱いやすさのために、臨床適用にとって望ましい候補である（Ｒｅｕｂｉら、２００８；Ｓｕｎら、２０１６）。ソマトスタチン受容体およびケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）を標的とするペプチドベースのＰＥＴトレーサーは、患者において高い標的対非標的比を生じる（Ｈｅｒｒｍａｎｎら、２０１６；Ｇｏｕｒｎｉら、２０１１）。
【００８０】
近年、ＰＤ-Ｌ１に特異的に結合するペプチドが報告されている（以下を参照：２０１６年３月１７日に公開された、Ｍｉｌｌｅｒらの国際ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２０１６０３９７４９、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＤ-１／ＰＤ-Ｌ１  ａｎｄ  ＣＤ８０  （Ｂ７-１）／ＰＤ-Ｌ１  Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ；２０１６年６月２３日に公開された、Ｍａｐｅｌｌｉらの国際ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２０１６／１００２８５、Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ；２０１６年６月２３日に公開された、Ｓｕｎらの国際ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２０１６／１００６０８、Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ；２０１６年８月１１日に公開された、Ｍｉｌｌｅｒらの国際ＰＣＴ特許出願公開番号ＷＯ２０１６／１２６６４６、Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ、その各々の全体が本明細書に組み込まれる）；しかしながら、ｉｎ  ｖｉｖｏでＰＤ-Ｌ１発現を検出するそれらの可能性は確立されていない。これらのＰＤ-Ｌ１結合ペプチドは、腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１発現を迅速かつ高い特異性で検出する可能性があると仮定された。この仮説を検証するために、コンジュゲーションに最も適し、単一の第一級アミンを有する報告されているペプチドライブラリーからペプチド、ＷＬ１２を選択し、そのＰＤ-Ｌ１への結合様式を評価した。ＤＯＴＡＧＡキレート剤を６４Ｃｕでの放射性標識のためにＷＬ１２に結合させて［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を生成し（Ｅｉｓｅｎｗｉｅｎｅｒら、２０００）、ＰＤ-Ｌ１に対するペプチド誘導体の結合親和性を評価し、ＰＤ-Ｌ１発現が変動する細胞株における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ取り込みを評価した。概念実証として、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２がｉｎ  ｖｉｖｏでＰＥＴイメージングによってＰＤ-Ｌ１発現を検出する能力を、構成的ヒトＰＤ-Ｌ１発現（ｈＰＤ-Ｌ１）を有するチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）腫瘍および同質遺伝子陰性対照腫瘍（ＣＨＯ）を持つＮＳＧマウスにおいて評価した。［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の組織分布および標的特異性は、ｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布およびブロッキング試験によって確認した。
【００８１】
（１．２結果および考察）
１．２．１：ＷＬ１２は、ＰＤ-１と同様の様式でＰＤ-Ｌ１に結合する。ＷＬ１２のＰＤ-Ｌ１への結合様式を評価するために、ＰＤ-１の代わりにＷＬ１２をドッキングするための、ＰＤ-１に結合したヒトＰＤ-Ｌ１の共結晶構造（ＰＤＢ  ＩＤ：４ＺＱＫ）（Ｚａｋら、２０１５）を使用した。大環状分子ＷＬ１２の構造的複雑性を考慮し、本発明者らは、最初に立体配座検索を行い、Ｇｌｉｄｅを用いてＰＤ-Ｌ１上のＰＤ-１結合部位に配座異性体をドッキングした（Ｆｒｉｅｓｎｅｒら、２００４；Ｈａｌｇｒｅｎら、２００４）。ＷＬ１２は、２つの大環状鎖の骨格間に２つの水素結合を持つベータシート様構造を形成する（図１Ｂ）。この立体配座は、円偏光二色性実験によって支持されている（図２）。ＰＤ-１の構造を、結合されたＷＬ１２と重ね合わせると、これら２つの間の結合モードの類似性が明らかになる。ＰＤ-Ｌ１との結合界面を形成するＰＤ-１の２本のベータ鎖は、ＷＬ１２の偽鎖と重なる（図１Ｃ）。ＷＬ１２のＬ-ロイシンは、ＰＤ-１のＩｌｅ１３４と同じ小さい疎水性ポケットに挿入され、２つのノルロイシン残基のうちの１つは、ＰＤ-１のＩｌｅ１２６と整列する。これらの疎水性相互作用に加えて、多数の水素結合がＷＬ１２とＰＤ-Ｌ１との間に存在する。ＷＬ１２上のアスパラギンのカルボキサミドはＴｙｒ１２３と水素結合を形成し、グリシンアミドはＧｌｙ１２０の骨格と水素結合を形成し、セリンヒドロキシルはＧｌｎ６６と相互作用する。オルニチン残基は露出しており、ＰＤ-Ｌ１との結合には関与しない。任意の１つの特定の理論に縛られることを望むものではないが、これは、アミンカップリング法による適切な標識のコンジュゲーションが、ＷＬ１２のＰＤ-Ｌ１への結合を妨害しないことを示唆する。
【００８２】
１．２．２：［６４Ｃｕ］ＷＬ１２は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤ-Ｌ１特異的細胞取り込みを示す。１３オルニチン（Ｏｒｎ）第一級アミンを利用してＤＯＴＡＧＡをコンジュゲートし、次いでこれを使用して非放射性Ｃ２＋類似体（ＷＬ１２-Ｃｕ）を調製し、６４Ｃｕで放射性標識した。得られたＷＬ１２Ｄおよび対応するＷＬ１２-ＣｕをＨＰＬＣにより精製し、質量分析法により特性評価し（図２、図３、図４、図５、図６、および図７）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価にかけた。ＰＤ-Ｌ１のＰＤ-１との相互作用を阻害するＷＬ１２およびその誘導体の最大半分阻害濃度（ＩＣ５０）を評価するために、蛍光共鳴エネルギー移動に依存する前述のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを最適化した（Ｗｏｏｄａｒｄら、２０１４）。ＷＬ１２、ＷＬ１２Ｄ、およびＷＬ１２-Ｃｕについて、それぞれ２２、２３、および２．９ｎＭのＩＣ５０値が観察された（図８Ａ、図９、図１０および下記の表１）。これらのデータは、１３Ｏｒｎ側鎖をＤＯＴＡＧＡで修飾し、Ｃｕ２＋にキレート化しても、ＷＬ１２がＰＤ-Ｌ１に対して高い結合親和性を保持していることを示している。
【００８３】
【表１】
2020514278.tif 000008
【００８４】
ＰＤ-Ｌ１特異性および細胞取り込みを実証するために、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を高い比放射能（１．９±０．１ｍＣｉ／μｇ）および放射化学的純度（＞９５％）で生成した（図１１および図１２）。［６４Ｃｕ］ＷＬ１２と１時間インキュベートしたｈＰＤ-Ｌ１細胞は、陰性対照ＣＨＯ細胞と比較して、インキュベートした用量の＞５０％の取り込みおよび結合放射能の４３倍の増加を示した（図８Ｃ）。次いで、ｈＰＤ-Ｌ１細胞を［６４Ｃｕ］ＷＬ１２単独で、または１μＭのブロッキング用量のＷＬ１２の存在下でインキュベートすることによって結合特異性を試験した。結合した［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の＞９５％の減少がペプチドの存在下で観察され、ＰＤ-Ｌ１への［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の結合が特異的であることを示した（図８Ｃ）。内因性ＰＤ-Ｌ１発現を検出する［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の能力を、それぞれ高いおよび低いＰＤ-Ｌ１発現を示す２つのトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）細胞株、ＭＤＡＭＢ２３１およびＳＵＭ１４９においてさらに試験した（図８Ｂ）。ＳＵＭ１４９細胞と比較してＭＤＡＭＢ２３１細胞における放射能の２倍高い取り込みは、ＰＤ-Ｌ１に対する［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の特異性をさらに確認した（図８Ｃ）。ＰＤ-Ｌ１発現についてのフローサイトメトリー分析は、次の順序で平均蛍光強度値を示した：ｈＰＤ-Ｌ１＞ ＭＤＡＭＢ２３１＞ ＳＵＭ１４９＞ ＣＨＯ、これは放射能の取り込みと相関した（ｒ＝０．９９７７、図１３および図１４）。まとめると、これらの結果は、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＤ-Ｌ１発現依存的にがん細胞に結合することを実証している。
【００８５】
１．２．３：［６４Ｃｕ］ＷＬ１２は、高ＰＤ-Ｌ１発現の腫瘍に特異的に蓄積する。［６４Ｃｕ］ＷＬ１２のｉｎ  ｖｉｖｏ特異性および分布についての洞察を得るために、ｈＰＤ-Ｌ１およびＣＨＯ腫瘍を持つマウスにおいてＰＥＴ-ＣＴイメージング試験を行った（ｎ＝４）。ＰＥＴイメージング試験は、ｈＰＤ-Ｌ１腫瘍における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の確実な取り込みを示した。ｈＰＤ-Ｌ１腫瘍における取り込みの増加は１０分という早さで観察され、注射後２４時間まで保持され（図１５Ａおよび図１６）、ＰＤ-Ｌ１発現はＩＨＣによって確認された（図１５Ｂ）。腫瘍に加えて、腎臓および肝臓でも高い取り込みが観察された。ＰＥＴイメージング観察を確認するために、生体内分布試験を［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の注射の１および２時間後に行った（それぞれｎ＝３およびｎ＝５）。ＰＤ-Ｌ１陽性腫瘍で観察された急速な取り込みを考慮すると、１時間および２時間での生体内分布は１８Ｆ標識類似体の開発にとってより有益であると考えられた。イメージング試験と一致して、ｈＰＤ-Ｌ１腫瘍は１時間で１４．９±０．８の注射量／ｇ（％ＩＤ／ｇ）値の百分率で放射能の取り込みを示した。対照的に、対照ＣＨＯ腫瘍取り込みは４．０±０．６％ＩＤ／ｇであった（図１７）。腎臓および肝臓での取り込みも比較的高く、それぞれ３４．４±３．１および２４．２±２．５％ＩＤ／ｇの取り込み値であった。ｈＰＤ-Ｌ１腫瘍の腫瘍対筋肉および腫瘍対血液比は、それぞれ２５．６±１．９および４．７±１．２であり、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２がＰＤ-Ｌ１特異的画像を高いシグナル対ノイズ比で提供する能力と一致した（図１５Ａおよび図１５Ｂ）。
【００８６】
２時間後に行われた生体内分布試験は、腎臓、肝臓および腫瘍における放射能の減少に向かう傾向を伴う同様のプロファイルを示した（図１７）。Ｉｎ  ｖｉｖｏ特異性を実証するために、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を過剰のＷＬ１２（５０μｇ、２ｍｇ／ｋｇ）と同時注射し、２時間で生体内分布試験を行った。ｈＰＤ-Ｌ１腫瘍において％ＩＤ／ｇ値の＞７５％の減少（Ｐ＜０．０００１）が観察され、対照ＣＨＯ腫瘍における有意差は観察されなかった。腎臓でも摂取量の減少が見られた。他の組織では放射能の取り込みに有意差は見られなかった。肝臓への取り込みの増加、６４Ｃｕベースの造影剤でしばしば観察される傾向（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００９）は、キレート剤からのＣｕ２＋の解離およびそれに続くアルブミンおよびセルロプラスミンなどの血漿タンパク質へのトランスキレート化に起因し得る（Ｓｍｉｔｈ-Ｊｏｎｅｓら、１９９１；Ｗａｄａｓら、２００７；およびＢｏｓｗｅｌｌら、２００４）。腎臓取り込みの増加は、ペプチドの腎臓クリアランスも主に示唆する。ＰＤ-Ｌ１を発現することが知られており、放射性標識抗体の取り込みの増加を示すことが報告されている組織である、脾臓、胸腺、および褐色脂肪において、低い取り込みが観察され（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１６；Ｈｅｔｔｉｃｈら、２０１６；およびＪｏｓｅｆｓｓｏｎら、２０１６）、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２が、マウスＰＤ-Ｌ１に対して親和性が非常に低いまたは全く親和性がないことを示唆する。ヒトＰＤ-Ｌ１に対する［６４Ｃｕ］ＷＬ１２特異性をさらに支持するものとして、腎臓を除いて、これらの組織では対照群とブロッキング用量群との間で有意な摂取差は認められなかった。イメージングおよび生体内分布試験は、共同で、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２がヒトＰＤ-Ｌ１に迅速かつ特異的に結合することを実証している。
【００８７】
１．２．４：ＣＤの結果。水溶液中および膜模倣溶液中のＷＬ１２の二次構造を評価するために、ＣＤ分光法を水、ＤＰＣ、およびＳＤＳの組み合わせで行った。図２に示すように、Ｔｒｐ残基は、２２０〜２４０ｎｍの領域でＷＬ１２ペプチドのＣＤスペクトルに大きな影響を及ぼす。界面活性剤を含まない溶液では、約２２０ｎｍで最小値および約２３０ｎｍでポジティブショルダーが観察された。界面活性剤を添加すると、両方のバンドがわずかに赤方偏移し、後者の強度の増加が認められる。これらのバンドはＴｒｐ-Ｔｒｐカップリングに起因している。両方のＴｒｐ発色団は近接しており、それらは単一の吸収単位として振舞う。その結果、それらの励起状態は相互作用し、二量体系の励起状態は両方の単量体にわたって非局在化する。励起子効果と呼ばれるこの現象は、励起状態の２つの成分への分裂を引き起こし、そのうちの一方は２つの単量体励起の同相結合から、そしてもう一方は異相結合から生じる。（Ｇｒｉｓｈｉｎａ  １９９４、およびＫｅｌｌｙ  ２０００）。
【００８８】
無秩序ペプチドのＣＤスペクトルは、典型的には２００ｎｍ未満の単一バンドによって特徴付けられ、一方αヘリックスは、２０８および２２２ｎｍで２つのネガティブバンドを、１９２ｎｍで１つのポジティブバンドを示し、βシート構造は通常２１７ｎｍでネガティブバンドを、１９５ｎｍでポジティブバンドを示す。それ故、ＷＬ１２ペプチドのＣＤスペクトル上の〜２０５ｎｍでの強いネガティブバンドおよび〜１９０ｎｍでの強いポジティブバンドは、ランダムコイル構造およびより秩序のある構造の混合物を示唆し得る。ＣＤスペクトルのデコンボリューションは、全ての測定条件下で高いβシート含量（〜４０％）を示す。それにもかかわらず、ＷＬ１２の遠紫外ＣＤスペクトルへのＴｒｐ発色団の強い寄与は、二次構造含量の定量分析の精度に影響を及ぼし、その結果は慎重に解釈されるべきである。
【００８９】
１．３要約：要約すると、迅速な腫瘍ＰＤ-Ｌ１検出およびＰＤ-Ｌ１選択性が、非常に特異的なＰＤ-Ｌ１結合ペプチド［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＰＥＴで実証された。［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の薬物動態および生体内分布は、ＰＤ-Ｌ１検出が放射性トレーサー投与の６０分以内に患者をイメージングする標準的な臨床ワークフロー内に適合させることが実現可能であることを示唆している。全ての悪性病変全体におけるＰＤ-Ｌ１発現の迅速かつ非侵襲的な検出は、免疫調節療法について患者を層別化する前例のない機会を提供する。
【００９０】
（１．４材料および方法）
１．４．１材料：ＰＤ-Ｌ１結合ペプチド、ＷＬ１２は、＞９５％の純度でＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カリフォルニア州サニーベール）によってカスタム合成された。別段に指定されない限り、他の全ての化学物質を、Ｓｉｇｍａ-ＡｌｄｒｉｃｈまたはＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。２，２´，２´´-（１０-（２，６-ジオキソテトラヒドロ-  ２Ｈ-ピラン-３-イル）-１，４，７，１０-テトラアザシクロドデカン-１，４，７-トリイル）三酢酸（ＤＯＴＡＧＡ無水物）および［６４Ｃｕ］Ｃｌ２を、それぞれＣｈｅＭａｔｅｃｈ  Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カタログ番号Ｃ１０９；ディジョン、フランス）およびウィスコンシン大学から購入した。特に指定しない限り、全ての細胞培養関連試薬をＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ-Ｅｕ３＋クリプテート（カタログ番号６１ＨＦＣＫＬＡ）およびＸＬ６６５コンジュゲートマウスモノクローナル抗６ヒスチジン抗体（カタログ番号６１ＨＩＳＸＬＡ）を、Ｃｉｓｂｉｏ  Ａｓｓａｙｓ（ベッドフォード、マサチューセッツ州）から購入した。組み換えヒトＰＤ-１ Ｆｃキメラタンパク質（カタログ番号１０８６-ＰＤ-０５０）および組み換えヒトＰＤ-Ｌ１（Ｂ７-Ｈ１）-Ｈｉｓ-タグタンパク質（カタログ番号９０４９-Ｂ７）を、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネアポリス、ミネソタ州）から得た。
【００９１】
１．４．２ドッキング試験：ＷＬ１２のＰＤ-Ｌ１へのドッキングを実施するために、ＰＤ-Ｌ１に結合したヒトＰＤ-１の結晶構造（ＰＤＢ ＩＤ：４ＺＱＫ）をテンプレートとして使用した。モデルは、ＭａｅｓｔｒｏのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｗｉｚａｒｄ  ｉｎ  Ｍａｅｓｔｒｏ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１６-２：  Ｍａｅｓｔｒｏ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．６，  Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，  ＬＬＣ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ２０１６）を用いて最初に調製した（Ｓａｓｔｒｙら、２０１３）。これは、結合次数および形式電荷の割り当て、水素原子の付加、および欠けている側鎖の付加を伴う。タンパク質内の水素結合ネットワークが最適化され（チオールおよびヒドロキシル基の再配向、Ａｓｎ、ＧｌｎおよびＨｉｓ側鎖のサンプリング、ならびにＨｉｓ、ＡｓｐおよびＧｌｕのプロトン化状態の予測を含む）、続いて簡単な最小化が行われる。ＰＤ-１の構造は削除された。Ｐｒｉｍｅ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  Ｓｅａｒｃｈ  （Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１６-２：  Ｐｒｉｍｅ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．４，  Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，  ＬＬＣ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ２０１６）を用いて、ＷＬ１２の構造について立体配座検索を行った。ドッキング実験のために、１００個の最低エネルギー配座異性体を選択した。デフォルト設定および入力リング立体配座を使用して、Ｇｌｉｄｅ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２０１６-２：  Ｇｌｉｄｅ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．１，  Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，  ＬＬＣ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＮＹ，  ２０１６）でドッキングを行った（Ｆｒｉｅｓｎｅｒら、２００４、Ｈａｌｇｒｅｎら、２００４）。これらの計算に使用されたソフトウェアは、ＳＢＧｒｉｄによって作成された（Ｍｏｒｉｎら、２０１３）。
【００９２】
１．４．３円偏光二色性（ＣＤ）測定：界面活性剤を含まない水溶液中およびドデシルホスファチジルコリン（ＤＰＣ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のミセル水溶液中およびモル比５：１の混合ＤＰＣ：ＳＤＳミセル中のペプチドのＣＤスペクトルを、Ｊａｓｃｏ  Ｊ-８１５分光偏光計（Ｊａｓｃｏ、Ｅａｓｔｏｎ、ＭＤ）を用いて得た。全ての測定を、２５℃で０．１５ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液を用いて行った。実験を１８５〜２６０ｎｍの範囲にわたって行い、３連で実施してシグナル対ノイズ比を増加させた。最終スペクトルをバックグラウンド減算によって補正し、平均残基モル楕円率、ＭＲＭＥ（度×ｃｍ２×ｄｍｏｌ-１）対波長λ（ｎｍ）として分析した。二次構造の含量を、ＣＯＮＴＩＮ法を用いてスペクトルから計算した（Ｓｒｅｅｒａｍａら、２０００）。
【００９３】
１．４．４：ＷＬ１２-ＤＯＴＡＧＡ（ＷＬ１２Ｄ）の合成：３ｍｇのペプチド（１．５μｍｏｌ）を０．５ｍＬのＤＭＦに溶解させ、３．７ｍｇの無水ＤＯＴＡＧＡ（０．５ｍＬのＤＭＦ中７．５１μｍｏｌ）および２０μＬのジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）と混合させた。反応混合液を室温で２時間撹拌し、生成物を、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ-ＨＰＬＣ）システム（Ｖａｒｉａｎ ＰｒｏＳｔａｒ）で、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙフォトダイオードアレイ検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＤＥ）と共に、セミ分取Ｃ-１８ルナカラム（５ｍｍ、１０×２５０ｍｍ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、トーランス、カリフォルニア州）および９８％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）と２％ＭｅＯＨ（０．１％ＴＦＡ）から開始して４ｍＬ／分の流速で６０分で１００％のＭｅＯＨに達するグラジエント溶出を用いて精製した。所望のＷＬ１２Ｄを４４．５分で集め、蒸発させ、脱イオン水中に溶解させて凍結乾燥させ、３．１ｍｇ（１．３μｍｏｌ）の生成物を白色粉末として得た（収率：８２．９％、図２）。得られたコンジュゲートを、０．１％のギ酸を含む５０％（ｖ／ｖ）のＨ２Ｏ-ＭｅＯＨに可溶化し、電子スプレーイオン化質量分析法（ＥＳＩ ＭＳ、Ｅｓｑｕｉｒｅ  ３０００  Ｐｌｕｓ分光計、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ、ビレリカ、マサチューセッツ州）によって分析した（図４）。理論化学式：Ｃ９１Ｈ１２８Ｎ２２Ｏ２０Ｓ２。観測ＥＳＩ-ＭＳ ｍ／ｚ：２３４０．９-（Ｍ＋１）＋１、１１７１．１-（Ｍ＋２）＋２／２および７８１．１-（Ｍ＋２）＋３／３。（予測値：２３４０．６５）
【００９４】
１．４．５：ＷＬ１２-Ｃｕ２＋錯体の調製：１．５ｍｇのＷＬ１２Ｄ（０．６４μｍｏｌ）を、２００μＬの酢酸ナトリウム（０．１Ｍ、氷酢酸でｐＨ＝４．５に調整）に溶解させ、５５μＬの０．０２Ｍ ＣｕＣｌ２水溶液（１．１μｍｏｌ）を添加した。得られた反応混合液を６５℃で３０分間インキュベートし、ＷＬ１２Ｄについて記載したようにＲＰ-ＨＰＬＣにより精製し（図５）、凍結乾燥し、得られた淡青色粉末をＥＳＩ ＭＳにより分析した（図６）。次いで、放射標識の標準として、ならびにＰＤ-Ｌ１およびＰＤ-１競合結合アッセイの標準として、ＷＬ１２-Ｃｕ２＋錯体を用いてＲＰ-ＨＰＬＣ条件を最適化した（図７）。理論化学式：Ｃ１１０Ｈ１５６Ｎ２６Ｏ２９Ｓ。観測ＥＳＩ-ＭＳ ｍ／ｚ：２４０２．６ -（Ｍ＋１）＋１、１２０１．９ -（Ｍ＋２）＋２／２（予測値：２４０２．１８）
【００９５】
１．４．６：ＰＤ-Ｌ１およびＰＤ-１結合阻害アッセイ：ＰＤ-１へのＰＤ-Ｌ１結合の競合的阻害アッセイを、Ｃｉｓｂｉｏ（Ｗｏｏｄａｒｄら、２０１４）との議論において、前述の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ベースのアッセイから最適化した。全ての結合／阻害アッセイを２１μＬのＦＲＥＴアッセイ緩衝液（ｄＰＢＳ、ウシ血清アルブミン（０．１％、ｗ／ｖ）、Ｔｗｅｅｎ-２０（０．０５％ｖ／ｖ）およびフッ化ナトリウム（４００ｍＭ））中で実施した。アッセイ条件を、最初にＰＤ-１およびＰＤ-Ｌ１濃度について最適化した。１０ｎＭ、２０ｎＭおよび４０ｎＭの最終濃度のＰＤ-１-Ｉｇを、０．６５〜３２０ｎＭに及ぶ最終濃度（各濃度３連で）のＰＤ-Ｌ１-Ｈｉｓ-タグとともに１５分間インキュベートし、続いて、抗ヒトＩｇＧ-Ｅｕ３＋クリプテート（ＩｇＧ-Ｅｕ、最終濃度２ｎＭ）および抗６ＨＩＳ-ＸＬ６６５モノクローナル抗体（抗６ＨＩＳ-ＸＬ６６５、最終濃度４０ｎＭ）を含有する１０μＬのＦＲＥＴ緩衝液を添加した。室温で１時間インキュベートした後、１μＬのＮａＦアッセイ緩衝液を添加し（最終濃度、４００ｍＭ）、プレートをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ３  １４２０マルチラベルカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて読み取った。
【００９６】
競合的阻害アッセイのために、阻害剤（ＷＬ１２、ＷＬ１２ＤおよびＷＬ１２-Ｃｕ２＋、範囲：１ｐＭ〜１ｍＭ）をＰＤ-Ｌ１-Ｈｉｓ-タグ（最終８０ｎＭ）と共に１０μＬのアッセイ緩衝液中で１５分間プレインキュベートし、続いて、ＰＤ-１-Ｉｇ（最終濃度２０ｎＭ）を含有する５μＬのアッセイ緩衝液を添加し、１５分間インキュベートした。次いで、ＩｇＧ-Ｅｕ（最終濃度２ｎＭ）および抗６ＨＩＳ-ＸＬ６６５（最終濃度４０ｎＭ）を含む５μＬのアッセイ緩衝液を加えた。室温で１時間インキュベートした後、１μＬのＮａＦを添加し（最終濃度４００ｍＭ）、プレートをＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｖｉｃｔｏｒ３  １４２０マルチラベルカウンターで読み取った。データをシグモイド用量反応曲線およびＣｈｅｎｇ-Ｐｒｕｓｏｆｆ式に適合させることによって、ＩＣ５０およびＫｉ値を算出し、８０ｎＭの濃度のＰＤ-Ｌ１について、ＫＤ＝７０ｎＭを導き出した。全ての実験を３連で行い、３回繰り返した。
【００９７】
１．４．７．［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の生成：ウィスコンシン大学から購入した６４ＣｕＣｌ２を少量まで蒸発させ、０．１Ｍ酢酸ナトリウム溶液で滴定することによって６４Ｃｕ（ＯＡｃ）２に変換させた。放射標識のために、１００μＬの酢酸ナトリウム中の約１０μｇのＷＬ１２Ｄペプチドコンジュゲート（４．２７ｎｍｏｌ）を、約１８５ＭＢｑ（約５ｍＣｉ）の６４Ｃｕ（ＯＡｃ）２と混合させ、６５℃で３０分間インキュベートした。得られた放射性トレーサーを、Ｃ-１８（Ｌｕｎａ、５μｍ、１０ｘ２５０ｍｍ；Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）セミ分取カラムで、放射性単一チャンネル放射線検出器を装備したＶａｒｉａｎ  ＰｒｏＳｔａｒシステム（モデル１０５Ｓ；Ｂｉｏｓｃａｎ、パウウェイ、カリフォルニア州）および２８０ｎｍに設定したＶａｒｉａｎ ＰｒｏＳｔａｒ ＵＶ吸光度検出器を使用して精製した。９８％Ｈ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）と２％ＭｅＯＨ（０．１％ＴＦＡ）で開始して５ｍＬ／分の流速で７０分かけて９０％ＭｅＯＨに達するグラジエント溶出を適用した。［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を〜５６．２分で回収し（未標識ペプチドの保持時間：５３．６分）、蒸発させ、５％ＤＭＳＯを含有する生理食塩水で希釈し、２滴のＴｗｅｅｎ ２０をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ評価に使用した。［６４Ｃｕ］ＷＬ１２が、５２．０９±６．３％の収率で、１．９±０．１１ｍＣｉ／μｇの比放射能で得られた。
【００９８】
１．４．７．細胞系：チャイニーズハムスター卵巣細胞系ＣＨＯ-Ｋ１（以後ＣＨＯと呼ぶ）およびトリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）細胞系ＭＤＡＭＢ２３１を、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、マナッサス、バージニア州）から購入し、３ヶ月未満の間継代し、その後凍結細胞のバイアルから新しい培養を開始した。ＳＵＭ１４９細胞株を、サウスカロライナ医科大学Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｐ．  Ｅｔｈｉｅｒ博士から賜り、ジョンズホプキンス遺伝資源施設においてＳＴＲプロファイリングにより認証された。ＳＵＭ１４９細胞は、５％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓおよび５μｇ／ｍＬのインスリン、ならびに０．５μｇ／ｍＬのヒドロコルチゾンを含むハムＦ-１２培地で維持した。他の全ての細胞株を、５％ＣＯ２を含有する雰囲気中、３７℃のインキュベーター内でＡＴＣＣ推奨の培地中で培養した。ヒトＰＤ-Ｌ１（以後、ｈＰＤ-Ｌ１と呼ぶ）を安定的に発現するＣＨＯ細胞系を、本発明者らの研究室（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１６）で作製し、１０％ＦＢＳ、１％Ｐ／Ｓおよび２％ｍｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＦ-１２Ｋ培地中で維持した。
【００９９】
１．４．８．フローサイトメトリー：懸濁液中の細胞を遠心分離により回収し、接着細胞を、酵素を含まないＰＢＳベースの細胞解離緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いて剥離した。回収した細胞をフローサイトメトリー緩衝液（２ｍＭのＥＤＴＡおよび０．５％のＦＢＳを含む１×ＰＢＳ）で２回洗浄した。細胞を、フィコエリトリンとコンジュゲートした抗ヒトＰＤ-Ｌ１抗体（ＢＤ-ＭＩＨ-ＰＥ、クローン番号ＭＩＨ１、カタログ番号５５７９２４、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、フランクリンレイクス、ニュージャージー州と表示）で、製造業者のプロトコルに従って染色し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒで分析したフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で分析した。少なくとも２０，０００の事象が記録された。
【０１００】
１．４．９．Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合：ｈＰＤ-Ｌ１、ＣＨＯ、ＭＤＡＭＢ２３１およびＳＵＭ１４９細胞への［６４Ｃｕ］ＷＬ１２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合を、１μＣｉの放射性トレーサーを１×１０６細胞と共に３７℃で１時間インキュベートすることによって決定した。インキュベーション後、自動ガンマカウンター（１２８２ Ｃｏｍｐｕｇｍａｍａ ＣＳ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ／ＬＫＢ Ｎｕｃｌｅａｒ社、ゲーサーズバーグメリーランド州）でカウントする前に、細胞を冷ＰＢＳで３回洗浄した。［６４Ｃｕ］ＷＬ１２のＰＤ-Ｌ１特異的結合を実証するために、１μＭのＷＬ１２ペプチドまたはヒト化抗ＰＤ-Ｌ１抗体アテゾリズマブでＰＤ-Ｌ１ブロッキングを行った。平均蛍光強度値は、インキュベートされた用量の％（％ＩＤ）の取り込みと相関していた。全ての細胞取り込み試験を各細胞株について３連で行い、３回繰り返した。
【０１０１】
１．４．１０．動物モデル：動物実験を、ＪＨＵ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＡＣＵＣ）によって承認されたプロトコルに従って行った。６〜８週齢の雌の非肥満性糖尿病重症複合免疫不全ガンマ（ＮＳＧ）マウスを、ＪＨＵ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｏｍｐｒｏｍｏｚｅｄ Ａｍｅｒｉｃａｌ Ｃｏｒｅから入手した。マウスの上腹部の両側に１０×１０６個のＣＨＯ-ＰＤＬ１およびＣＨＯ細胞を皮下移植した。腫瘍が２００〜３００ｍｍ３の体積に達したときに、マウスをイメージングまたは生体内分布実験に使用した。
【０１０２】
１．４．１１．マウス異種移植片のＰＥＴ-ＣＴイメージング：マウスに、２００μＬの生理食塩水中の１５０μＣｉの［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を静脈内に注射し（ｎ＝３）、スキャナーに置く前に３％イソフルラン下で麻酔した。イメージング中、マウスを１％イソフルオランレベルに維持した。ＰＥＴ画像を、１０分間／ベッドで２つのベッド位置で、ＡＲＧＵＳ小動物ＰＥＴ／ＣＴスキャナー（Ｓｅｄｅｃａｌ、マドリード、スペイン）にて取得した。解剖学的コレジストレーション用に、各ＰＥＴスキャンの終わりにＣＴスキャン（５１２投影）を実施した。ＰＥＴデータを、二次元規則サブセット-期待値最大化アルゴリズム（２Ｄ-ＯＳＥＭ）を用いて再構成し、デッドタイムおよび放射性崩壊について補正した。既知放射能量から得られた較正係数に基づいて、ｃｃ当たりの％ＩＤ値を計算した。最終的なデータの視覚化および画像生成は、Ａｍｉｒａ（登録商標）（ＦＥＩ、ヒルズボロ、オレゴン州）を用いて達成した。
【０１０３】
１．４．１２．Ｅｘ  ｖｉｖｏ生体内分布：それぞれ高いおよび低いＰＤ-Ｌ１発現（ｎ＝５）を有するｈＰＤ-Ｌ１およびＣＨＯ腫瘍を持つマウスに、４０μＣｉの［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を静脈内注射した。［６４Ｃｕ］ＷＬ１２注射の１時間後および２時間後に、血液、腫瘍、および選択された組織を採取し、秤量し、自動ガンマカウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ-２４８０自動ガンマカウンター-Ｗｉｚａｒｄ２  ３´´Ｗａｌｌａｃ）でカウントした。ブロッキング試験用に、マウスに２ｍｇ／ｋｇ（５０μｇ）の未修飾ペプチドを放射性トレーサーと共に同時注射した。組織１グラム当たりの注射量の百分率（％ＩＤ／ｇ）値を、３連で測定したシグナル減衰補正および外部［６４Ｃｕ］標準に対する正規化に基づいて計算した。示された生体内分布データは、平均値±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）である。
【０１０４】
１．４．１３．データ分析：Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、ラホーヤ、カリフォルニア州）を使用して対応のない両側ｔ検定を使用し、統計分析を行った。Ｐ値＜０．０５が有意であると考慮し、比較対照を低いＰＤ-Ｌ１発現を有する細胞株または腫瘍とした。フローサイトメトリーデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ、アシュランド、オレゴン州）を用いて分析した。ＩＣ５０およびＫｉ値を、Ｐｒｉｓｍ ６ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて計算した。
【０１０５】
（実施例２）
（ＰＤ-Ｌ１指向性ＰＥＴからＰＤ-Ｌ１標的薬開発）
２．１概要：がん免疫療法（ＣＩＴ）は、さまざまな悪性腫瘍で持続的な反応をもたらすことによって患者の生存率を高めている。しかしながら、免疫チェックポイント標的療法で治療された患者のほぼ７０％が単剤療法に反応しない（Ｌｉｐｓｏｎら、２０１５；Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１５）。精密免疫療法に対する応答の決定要因を同定するという、満たされていない要求がある。チェックポイント併用療法は生存期間を延ばすが、多くの場合、免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）の増加を犠牲にし、併用戦略に関する知識の増加が毒性を軽減するために必要であることを示唆している（Ｍａｒｒｏｎｅら、２０１６）。免疫チェックポイント治療のための新しいバイオマーカーと、その幅広さおよび耐久性を高めてｉｒＡＥを減らすそれらの組み合わせとを特定するための集中的研究が大いに求められている。したがって、本開示の主題の一態様は、ＰＤ-Ｌ１標的治療薬の開発および評価においてＰＤ-Ｌ１ベースのＰＥＴイメージングを使用するための戦略を開発することである。進行期患者において侵襲性で非実用的である血漿または組織（生検）ベースのバイオマーカーに頼る現在の戦略とは異なり、本発明は、ＰＤ-Ｌ１標的治療薬（抗体、ペプチド、小分子）の用量対占有関係を、関連するｉｎ  ｖｉｖｏモデルの腫瘍においてＰＤ-Ｌ１ ＰＥＴイメージングを使用して確立する。
【０１０６】
２．１．１．ＰＤ-Ｌ１動態のＰＥＴベースの定量化によって可能になる進歩：ＮＳＣＬＣ、ＴＮＢＣおよび結腸腫瘍内のＰＤ-Ｌ１標的治療ＡｔｚＭａｂおよびそのマウスキメラ（ＰＲＯ）の蓄積が、完全にはＰＤ-Ｌ１発現依存性ではないことが最近発見されたが、高いＰＤ-Ｌ１発現を有するＨ２４４４  ＮＳＣＬＣ異種移植片が、ＩＨＣおよびフローサイトメトリーにより検出されたように、低いＰＤ-Ｌ１発現を有する乳がん異種移植片において見られるものに対してかなり少量の放射性標識ＡｔｚＭａｂを蓄積したためである（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１６）。同様に、同系マウス腫瘍モデルにおいて、全身注射された放射性標識ＰＲＯは主に腫瘍血管系と関連し、腫瘍において腫瘍実質組織への拡散をほとんどまたは全く示さなかった（Ｄｅｎｇら、２０１６）。そのような所見は、腫瘍内の間質圧の上昇を含む病態生理学的特徴に起因する可能性があり（Ｂａｘｔｅｒら、１９８９；Ｂａｘｔｅｒら、１９９０）、腫瘍内の治療薬の蓄積を妨げ、それは治療抵抗性の重要な一因である（Ｇｏｅｌら、２０１１）。また、そのような効果は、主に腫瘍細胞および腫瘍免疫浸潤物に作用するＰＤ-Ｌ１標的治療薬の腫瘍細胞への接近を潜在的に妨げる可能性がある。したがって、ＷＬ１２／［１８Ｆ］ＷＬ１２などのペプチドまたは類似の放射性標識ペプチドは、それらの非常に小さい分子サイズのために、抗体よりも効果的かつ効率的に腫瘍組織に浸透して標的細胞に到達し得る。したがって、適切な分析および補正を使用することによって、［１８Ｆ］ＷＬ１２測定または同様の放射性標識ペプチドを使用して行われた測定は、標的腫瘍細胞において腫瘍組織内の所望の占有を達成するために必要な治療用ｍＡｂ用量の同定／最適化に役立ち得る。
【０１０７】
したがって、ＰＤ-Ｌ１指向性ＰＥＴは、ＰＤ-Ｌ１標的薬開発に適用されてきた。その潜在的価値を評価するために、革新的な戦略において、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を用いて、ＰＥＴで見られる腫瘍における用量対ｍＡｂ局在に関して、治療用ＰＤ-Ｌ１抗体アテゾリズマブ（ＡｔｚＭａｂ）の腫瘍ＰＤ-Ｌ１エンゲージメント特性を評価および比較した。本明細書に開示される前臨床所見は、臨床的に実用的な所見を有するであろう。患者では、同様のＰＤ-Ｌ１ ＰＥＴベースのイメージング測定を使用して治療用量強化を誘導し、治療効果を改善することができる可能性がある（Ｙａｎｇら、２０１３；Ｏｕｄｅ  Ｍｕｎｎｉｎｋら、２０１６）。また、そのようなＰＤ-Ｌ１ ＰＥＴ測定は、腫瘍部位におけるそれらの潜在的なターゲットエンゲージメントの定量化を可能にすることによって、新規ＰＤ-Ｌ１標的治療薬の将来の開発を導くことができる可能性がある。
【０１０８】
２．１．２．薬物開発および評価におけるＰＤ-Ｌ１ ＰＥＴの使用における革新：本開示の革新的なＰＤ-Ｌ１ペプチドベースのＰＥＴイメージング戦略は、現在および将来の抗ＰＤ-Ｌ１治療薬の、それが最も関連している腫瘍でのターゲットエンゲージメント効力（すなわち占有および滞留時間）の評価を可能にする。動的ＰＤ-Ｌ１密度／代謝回転、および血清ｍＡｂ濃度に影響を与えるＰＤ-Ｌ１発現腫瘍量の程度は、腫瘍かん流の完全性および結果として生じる腫瘍内ｍＡｂ蓄積と共に、治療効果に著しく影響を与える。放射性標識抗体は、必要なｍＡｂ投与レベルを定義し、標的表面分子占有率を計算するために以前から使用されてきたが（Ｄｅｎｇら、２０１６）、そのアプローチの重要な制限は、腫瘍作用部位におけるＰＤ-Ｌ１占有率を予測できるだけである。本開示のアプローチはこの問題に効果的に取り組み、腫瘍部位でのＰＤ-Ｌ１占有を定量化する。したがって、有効なｍＡｂ投与量および到達した累積量に対する主要な腫瘍生理学的パラメータの寄与を考慮することに加えて、本発明者らは、本発明者らの新規のＰＥＴトレーサーベースの測定が、なぜＰＤ-Ｌ１陽性腫瘍を持つ一部の患者がＣＩＴに反応しないのかについての現在の理解を向上させ、腫瘍における望ましい占有レベルに達するための投与量増加戦略を導く可能性があることを期待している。
【０１０９】
（２．１．３．ＰＤ-Ｌ１標的治療薬の開発および評価におけるＰＤ-Ｌ１-ＰＥＴの有用性を評価する：）
（２．１．３．１論拠）
ＰＤ-Ｌ１およびＰＤ-１を標的とする治療用抗体は、ＰＤ-Ｌ１陽性腫瘍を有する患者のごく一部で非常に優れた有効性を示している。現在使用されている用量では、レスポンダーおよび非レスポンダー集団は、ＰＢＭＣにおける約６５％のＰＤ-Ｌ１占有率を示しているが、ＰＢＭＣにおけるＰＤ-Ｌ１占有率と腫瘍における占有率との関係は、動的であり、よくわかっていない（Ｂｒａｈｍｅｒら、２０１２）。また、腫瘍モデルにおける試験は、いくつかの腫瘍において、ＰＤ-Ｌ１抗体が腫瘍血管系に限定されることを見出した（Ｄｅｎｇら、２０１６）。放射性標識ＡｔｚＭａｂを用いた予備的結果は、ＮＳＣＬＣ異種移植片におけるこれらの発見を総括した（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１６）。まとめると、これらの所見は、腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１占有率およびその用量依存性、ならびに腫瘍における抗ＰＤ-Ｌ１抗体の滞留時間の理解を向上させることが、より良い情報に基づくＰＤ-Ｌ１指向治療に必要であることを示唆する。任意の１つの特定の理論に縛られることを望むものではないが、ＰＤ-Ｌ１ ＰＥＴは、抗ＰＤ-Ｌ１抗体（またはペプチドおよび小分子）のそのようなＰＫ測定を標的結合および滞留時間に関して評価するための貴重なツールを提供すると考えられる。また、ＰＥＴ情報に基づく投与は、ＰＤ-Ｌ１ ＰＥＴによって定量化することができ、腫瘍のＰＤ-Ｌ１発現および免疫細胞浸潤における治療誘導性変化と相関させることができる腫瘍内の免疫プロファイルの変化をもたらすと考えられる。
【０１１０】
２．１．３．２代表的データ：利用可能な抗ＰＤ-Ｌ１抗体およびＰＤ-１誘導体の放射標識バージョンは、非侵襲的にＰＤ-Ｌ１発現を検出するために使用されてきた（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１６；Ｄｅｎｇら、２０１６；Ｈｅｔｔｉｃｈら、２０１６；Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら、２０１６；Ｌｅｓｎｉａｋら、２０１６；Ｈｅｓｋａｍｐら、２０１５；Ｍａｕｔｅら、２０１５）。そのために、治療用抗体ＡｔｚＭａｂをそのヒトおよびマウスの交差反応性について選択し、そのＰＤ-Ｌ１検出の特異性を、免疫無防備状態マウスおよび４Ｔ１同系乳房腫瘍モデルにおけるヒトＴＮＢＣおよびＮＳＣＬＣ異種移植片において、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴおよび光学イメージングによって実証した（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１６；Ｌｅｓｎｉａｋら、２０１６）（図２０Ａ、図２０Ｂ、図２０Ｃ、および図２０Ｄ）。ＡｔｚＭａｂは、ヒトおよびマウスの両方のＰＤ-Ｌ１に高い親和性で結合し、解離定数（Ｋｄ）はそれぞれ０．４３ｎＭおよび０．１３ｎＭである。（Ｉｒｖｉｎｇら、２０１２；Ｐｏｗｌｅｓら、２０１４）ＡｔｚＭａｂは、進行性または転移性の膀胱がん、（Ｐｏｗｌｅｓら、２０１４）黒色腫、（Ｈａｍｉｄら、２０１３）ＮＳＣＬＣ、（Ｓｐｉｇｅｌら、２０１３）ＲＣＣ、（Ｃｈｏら、２０１３）ＴＮＢＣおよび他のいくつかのがんの治療について臨床評価段階にある。
【０１１１】
腫瘍内の放射性標識ＡｔｚＭａｂの蓄積は、両方のがんタイプ（ＮＳＣＬＣおよびＴＮＢＣ）においてＰＤ-Ｌ１特異的であることが見出された（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１６；Ｌｅｓｎｉａｋら、２０１６年）。［１１１Ｉｎ］ＡｔｚＭａｂの腫瘍内蓄積も、完全にはＰＤ-Ｌ１発現依存性ではないことがわかり、これは、間質液圧、腫瘍対流、および血管外遊出の空間的変動が寄与する要因のいくつかであることを示唆しており、これは抗体でしばしば観察される問題である（Ｂａｘｔｅｒら、１９８９）。ＭＤＡＭＢ２３１  ＴＮＢＣ異種移植片は、皮下および同所性Ｈ２４４４  ＮＳＣＬＣ腫瘍よりも高い組織蓄積を示し（グラム当たりの注射量の百分率；％ＩＤ／ｇ）、これはフローサイトメトリーおよびＩＨＣ分析の両方により高いＰＤ-Ｌ１発現を示した（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１６）。本発明者らの新規ペプチドベースのＰＤ-Ｌ１  ＰＥＴトレーサーの特異性および柔軟性を利用することによって、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＤ-Ｌ１発現腫瘍内のＡｔｚＭａｂ蓄積の動態を分析し、腫瘍内の抗体分布に影響を与える多数の要因を説明する、全く異なるアプローチにより、様々なＰＤ-Ｌ１標的化抗体に適用することができる。
【０１１２】
２．１．３．３ ＰＤ-Ｌ１ ＰＥＴによる腫瘍中のＰＤ-Ｌ１治療用抗体の蓄積：ＰＤ-Ｌ１に対するＷＬ１２の特異性を評価している間、ＷＬ１２は、ＰＤ-Ｌ１上の同じ結合部位に対してＡｔｚＭａｂと競合することが発見された。これは、ＰＤ-Ｌ１指向性ＰＥＴを使用して、ＡｔｚＭａｂ療法を必要とされる腫瘍部位で評価するための新規かつ以前には予想されていなかった手段を提供する。腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１抗体の分布の理解の向上は、臨床的な抗体投与および治療的モニタリングに影響を与える可能性がある。したがって、腫瘍内のＰＤ-Ｌ１へのＡｔｚＭａｂの結合を評価する［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴの能力を試験した。［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴおよび生体内分布試験によって定量化されるように、ｈＰＤ-Ｌ１腫瘍における放射能の蓄積は、ＡｔｚＭａｂ（２０ｍｇ／ｋｇ）を注射されたマウスにおいて８０％減少した（図２１Ａ、図２１Ｂ、および図２１Ｃ）。腎臓以外の他の組織における放射能摂取量は減少したが有意差は観察されず、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２結合がヒトＰＤ-Ｌ１に特異的であることを示した（Ｌｅｓｎｉａｋら、２０１６）。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合試験により、本発明者らは、非標識ＷＬ１２がＣｙ５コンジュゲートＡｔｚＭａｂのＰＤ-Ｌ１への結合を濃度依存的に阻害し、ＩＣ５０が３７．８ｎＭであり、両方のリガンドがＰＤ-Ｌ１結合について競合するが（図２１Ｄ）、ＡｔｚＭａｂは［６４Ｃｕ］ＷＬ１２結合の阻害においてＷＬ１２よりも強力であり、ＡｔｚＭａｂ投与時に腫瘍中の未占有ＰＤ-Ｌ１レベルを検出することを可能にするはずであることを確認した。まとめると、これらの結果は、ＷＬ１２とＡｔｚＭａｂの結合部位が重なり合うことを実証し、ＰＤ-Ｌ１発現腫瘍におけるＡｔｚＭａｂターゲットエンゲージメントおよび滞留時間（ターゲットエンゲージメント効力）を評価するための［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴの潜在的有用性を示す。このアプローチの適用性は、ＰＤ-Ｌ１発現が自然に増加しているがん細胞株にも拡大された。トリプル乳がん異種移植片において、高ＰＤ-Ｌ１発現ＭＤＡＭＢ２３１異種移植片中のＡｔｚＭａｂ蓄積を検出する［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の能力が観察された（図２２）。２０ｍｇ／ＫｇのＡｔｚＭａｂ用量を受けたマウスにおけるＰＤ-Ｌ１ ＰＥＴ造影剤の取り込みの有意な減少も観察された。
【０１１３】
Ａｖｅｌｕｍａｂ（ＡｖＭａｂ）などの他のＰＤ-Ｌ１標的治療用抗体と同様の適用が考えられる。ＡｖＭａｂは、ＮＳＣＬＣ（ＮＣＴ０２３９５１７２）、進行性ＲＣＣおよび胃がんを含むいくつかのがんにおいて現在複数の第ＩＩＩ相臨床試験中のヒトＩｇＧ１抗体である。ＡｖＭａｂと複合体を形成したＰＤ-Ｌ１の結晶構造を分析したところ、ＡｖＭａｂは、ＷＬ１２と同様に、ＰＤ-Ｌ１上の同じアミノ酸のいくつか（Ｒ１１３、Ｄ６１、およびＥ５８）と相互作用することがわかり（Ｌｉｕら、２０１６）、これは、ＡｖＭａｂおよびおそらく他のＰＤ-Ｌ１指向性治療用ｍＡｂによるｉｎ  ｖｉｖｏターゲットエンゲージメントを評価するためのＷＬ１２ベースのトレーサーの潜在的に有利な有用性を示している。これらの研究は、ＰＤ-Ｌ１-ＰＥＴが進行中のＰＤ-Ｌ１  ｍＡｂ療法をそのターゲットエンゲージメント能に関して評価する可能性を検証するものである。
【０１１４】
（実施例３）
（セラノスティック抗体によるＰＤ-Ｌ１エンゲージメントの非侵襲的定量化）
３．１概要：プログラム死リガンド-１（ＰＤ-Ｌ１）を標的とした抗体治療薬は、免疫チェックポイント阻害剤を含む臨床試験のほぼ４分の１に採用されている。総ＰＤ-Ｌ１レベル、それらのＰＤ-Ｌ１治療薬による占有率、ならびに最適な免疫応答を確実にするための腫瘍内のターゲットエンゲージメントの程度と持続時間とに対する投与の関連性は、未知のままである。腫瘍内のＰＤ-Ｌ１の占有率は、ＰＤ-Ｌ１の発現の動的変化、ならびに血漿および腫瘍抗体濃度を変化させる腫瘍の内因性および外因性パラメータによって影響を受ける可能性がある。しかしながら、そのような重要な変動は、末梢薬物動態学的および薬力学的評価によっては捉えられていない。ＰＤ-Ｌ１治療薬の用量-薬物ばく露関係におけるギャップに対処するために、ＰＤ-Ｌ１発現の動的変化の定量化を可能にする放射性標識ＰＤ-Ｌ１結合ペプチドを調べた。構造分析は、ペプチドおよび治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＰＤ-Ｌ１との相互作用における重なりを示し、腫瘍中の治療用ｍＡｂの占有率を陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）を用いて測定することを可能にした。複数の異種移植片モデルにおいて、ＰＥＴイメージングおよび生体内分布試験は、変動するＰＤ-Ｌ１発現、およびＰＤ-Ｌ１治療用抗体によるその飽和が定量化され得ることを示した。さらに、３つの異なる抗体による腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１占有率を測定し、腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１占有率に対する用量および時間の影響を定量した。ペプチドベースのＰＤ-Ｌ１ ＰＥＴは、免疫関連有害事象を減らすことを目的として、用量および治療計画を最適化するためのツールとして有望である。
【０１１５】
より具体的には、本開示の主題は、ために定量的陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）イメージングを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１発現レベルおよびＰＤ-Ｌ１ ｍＡｂターゲットエンゲージメントを特性評価する必要性に取り組む。それは腫瘍における標的発現の反復測定（Ｗｉｌｍａｎら、２００８）および薬物開発および評価に有効であるが、腫瘍学における受容体占有研究にはめったに使用されず（Ｒａｔｈｋｏｐｆら、２０１３）、特にＰＤ-Ｌ１またはＰＤ-１  ｍＡｂｓの薬物動態学的および薬力学的評価については実現されていない（Ｐｅｔｅｒｓｏｎら、２００８；Ｌｉｎｄｅｎら、２００６）。
【０１１６】
ヒトＰＤ-Ｌ１に対して高い親和性および特異性で結合し、放射性トレーサー投与の１２０分以内に高コントラスト画像を生成する、６４Ｃｕで放射性標識された小型ペプチド、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２が近年開発された（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１７）。この実施例は、ＰＤ-Ｌ１検出のための［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴを記載し、肺がんおよび乳がんの実験モデルにおけるＰＤ-Ｌ１発現の動的変化を定量化する。３つの異なるＦＤＡ承認ｍＡｂ、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブ（ＤｕｒＭａｂ）によるＰＤ-Ｌ１エンゲージメントを評価する［６４Ｃｕ］ＷＬ１２ ＰＥＴの能力を評価した。さらに、腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１エンゲージメントの程度および持続時間に対するＰＤ-Ｌ１ ｍＡｂ用量の関連性を非侵襲的に評価した。
【０１１７】
３．２背景：がん免疫療法（ＣＩＴ）は、さまざまな悪性腫瘍に対して持続的な反応を示す。好ましいＣＩＴ標的の１つは、チェックポイントタンパク質プログラム死リガンド１（ＰＤ-Ｌ１）である。ＰＤ-Ｌ１は、腫瘍浸潤性細胞傷害性Ｔ細胞を回避する手段として多くの腫瘍によって発現され（Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１６）、ＰＤ-１受容体への直接結合を介して免疫抑制を引き起こす（Ｏｋａｚａｋｉら、２００７；Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１５）。ＰＤ-Ｌ１：ＰＤ-１相互作用を阻害する複数のＰＤ-Ｌ１標的化モノクローナル抗体治療薬（ｍＡｂ）が臨床試験中であり、これらの治療を受けている患者の３０％近くが持続的な反応を示す（Ｔｏｐａｌｉａｎら、２０１５；Ｌｉｐｓｏｎら、２０１５）。しかしながら、これら成功にもかかわらず、臨床上の課題を引き起こし、チェックポイント療法を進める臨床医の能力を制限する、遅延または混合腫瘍退縮などの異常な反応パターンに寄与する生物学的メカニズムの不完全な理解がある。
【０１１８】
抗ＰＤ-Ｌ１ ｍＡｂの治療作用は、主に腫瘍の微小環境内で起こると考えられている（Ｔｏｐａｒｉａｎら、２０１５）。しかしながら、薬力学（ＰＤ）データは限られている；それらは作用部位（腫瘍）でのターゲットエンゲージメントを反映しておらず、限られた数の試験でしか報告されておらず、それらは末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を用いて得られている。ＰＤ-Ｌ１抗体ＢＭＳ-９３６５５９については、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇに及ぶ用量について６４〜７０％の均一な標的占有率が報告されている（Ｂｒａｈｍｅｒら、２０１２年）。最も関連性のある部位、すなわち腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１ ｍＡｂの配置、および最適な免疫応答を確実にするためのターゲットエンゲージメントの程度および持続時間への投与の関連性について、多くのことが未知のままである。
【０１１９】
ＰＤ-Ｌ１／ＰＤ-１標的治療の治療モニタリングのための最も研究されている予測バイオマーカーは、ＰＤ-Ｌ１免疫組織化学（ＩＨＣ）（Ｇｉｂｎｅｙら、２０１６）。しかしながら、その方法は、利用可能性が限られている生検標本を必要とし、時間的に動的な免疫腫瘍微小環境（ＴＭＥ）、ならびにＰＤ-Ｌ１発現の腫瘍内および腫瘍間異質性を正しく反映し得ないため、重大な制限を有する（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら、２０１６；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、２０１６）。原発性および転移性腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１発現レベル、動態、およびＰＤ-Ｌ１治療薬の体内動態の非侵襲的評価、ならびにイメージングの標準的な臨床ワークフローの範囲内でそうするための満たされていない必要性がある。
【０１２０】
（３．３結果）
３．３．１：ＷＬ１２およびＰＤ-Ｌ１ ｍＡｂとのＰＤ-Ｌ１相互作用の構造分析およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ検証。ＷＬ１２は、ＰＤ-Ｌ１：ＰＤ-１相互作用を高親和性（ＩＣ５０：２０ｎＭ）で阻害する１４アミノ酸ペプチドである（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１７）。初期の分子モデリング解析は、重要な分子相互作用に寄与する、ＰＤ-Ｌ１：ＷＬ１２およびＰＤ-Ｌ１：ＰＤ-１の、ＰＤ-Ｌ１の４つのアミノ酸（Ｙ５６、Ｅ５８、Ｄ６１およびＡ１１３）での相互作用面における重なりを示唆した（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１７）。治療用抗体アテゾリズマブ（ＡｔｚＭａｂ）と複合体を形成しているＰＤ-Ｌ１の埋没面（２，１０６Å２）は、ＰＤ-１のそれ（１，９７０Å２）よりも大きい（Ｌｅｅら、２０１７）。任意の１つの特定の理論に縛られることを望むものではないが、ＰＤ-Ｌ１上のＷＬ１２相互作用面も臨床的に入手可能な治療用ｍＡｂのそれと重なると考えられ、その理由はＰＤ-Ｌ１：ＰＤ-１相互作用を阻害するようにそれらが同様に設計されているためである。それを試験するために、ＷＬ１２の予測される結合立体配座をＰＤ-Ｌ１  ｍＡｂのそれと比較した。全てのｍＡｂ、ならびにＰＤ-１およびＷＬ１２でのＡＡ接触の重なりは、ＰＤ-Ｌ１残基Ｙ５６、Ｅ５８、Ａ１１３、Ｍ１１５およびＹ１２３からなる共通の結合ドメインを明らかにする。ＰＤ-Ｌ１分子表面の視覚化（図３３Ａ、図３４Ａ）において明らかにされているように、重複領域（シアン）は深いポケットを形成し、全ての相互作用点に対するアンカー点として作用する。表面積に関して、ＡｔｚＭａｂ（赤）は、ＰＤ-１（紫色）、ＷＬ１２（緑）、アベルマブ（ＡｖｅＭａｂ、オレンジ）、およびデュルバルマブ（ＤｕｒＭａｂ、青）からの相互作用表面と重なり合う共通結合コアの全ての側面上の残基との分子接触を生成する抗体からのループを持つＰＤ-Ｌ１表面とより相互作用する。
【０１２１】
前述の構造分析を裏付けるために、Ｃｙ５標識ＡｔｚＭａｂ、ＡｖｅＭａｂおよびＤｕｒＭａｂを、市販のＣｙ５蛍光Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステルへの抗体のコンジュゲーションによって調製し、続いてＰＤ-Ｌ１を構成的に発現するＣＨＯ細胞（Ｃｈｏ-ｈＰＤ-Ｌ１）およびＰＤ-Ｌ１を自然に発現するＭＤＡＭＢ２３１乳がん細胞（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１６）におけるＷＬ１２との競合阻害アッセイを行った。２〜５ｎＭの阻害濃度で、ＰＤ-Ｌ１へのＣｙ５-ＰＤ-Ｌ１  ｍＡｂ結合のＷＬ１２用量依存的阻害が観察された（図３３Ｂ）。ＨＣＣ８２７およびＨ２２６非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）細胞も試験した。それぞれがＰＤ-Ｌ１を天然に発現し、５ｎＭのＷＬ１２の存在下で蛍光型のＡｔｚＭａｂ、ＡｖｅＭａｂおよびＤｕｒＭａｂと共にインキュベートした。フローサイトメトリーは、結合蛍光の有意な減少（Ｐ＜０．００１）を示し、抗体-ＰＤ-Ｌ１相互作用を破壊するＷＬ１２の能力をさらに実証した（図３４Ｃおよび３４Ｄ）。ＣＸＣＲ４特異的抗体であるＭＤＸ１３３８を使用した場合、結合蛍光の変化が観察されないことにより、ＷＬ１２：ＰＤ-Ｌ１相互作用の特異性のさらなる確認を得た。ＰＤ-Ｌ１陽性（ＨＣＣ８２７、Ｈ２２６、ＭＤＡＭＢ２３１およびｈＰＤ-Ｌ１）ならびにＰＤ-Ｌ１陰性（Ｓｕｍ１４９およびＣＨＯ）細胞を、６４Ｃｕで放射性標識したＷＬ１２類似体（［６４Ｃｕ］ＷＬ１２）と共にインキュベートした。ＷＬ１２類似体は、ｈＰＤ-Ｌ１／ＣＨＯ細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで高い親和性（ＩＣ５０＜２０ｎＭ）および選択性でＰＤ-Ｌ１に結合することが以前に実証されたが、可変発現を有するヒトがん細胞株においては検証されていない（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１７）。ＰＤ-Ｌ１陰性細胞と比較して、ＰＤ-Ｌ１陽性細胞における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の高い発現依存性取り込みが観察された（Ｐ＜０．０００１）。さらに、ＰＤ-Ｌ１結合特異性についてのさらなるチェックとして、ＰＢＳ処理対照と比較して６０ｎＭ  ｍＡｂｓで処理した場合、全てのＰＤ-Ｌ１陽性細胞における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２取り込みの有意な遮断（Ｐ＜０．０００１）が観察された（図３３Ｃ）。結果は、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を使用して、腫瘍中の遊離ＰＤ-Ｌ１レベルを検出し、ＰＤ-Ｌ１  ｍＡｂによるＰＤ-Ｌ１エンゲージメントをモニターすることができることを示している。
【０１２２】
３．３．２ ＡｔｚＭａｂによる腫瘍ＰＤ-Ｌ１エンゲージメントの定量化。腫瘍における治療用ｍＡｂによるＰＤ-Ｌ１エンゲージメントを非侵襲的にｉｎ  ｖｉｖｏで評価するために、ＮＳＣＬＣ異種移植片モデルを試験した。これらのモデルは、ＮＳＣＬＣのほぼ５０％がＰＤ-Ｌ１陽性であり、ＰＤ-Ｌ１  ＩＨＣが免疫チェックポイント療法を受けているＮＳＣＬＣ患者の予測バイオマーカーとして使用されるという理由で選択された（Ｍａｎｓｆｉｅｌｄら、２０１６）。低および中程度のＰＤ-Ｌ１発現をそれぞれ示すＨ２２６およびＨＣＣ８２７細胞由来異種移植片を有するＮＯＤ  ｓｃｉｄガンママウス（図３６Ａ）を、静脈内投与されたＡｔｚＭａｂの単回用量（２０ｍｇ／ｋｇ、２４時間）でそれらを処理した。［６４Ｃｕ］ＷＬ１２注射の２時間後に取得したＰＥＴ画像は、Ｈ２２６と比較して、ＨＣＣ  ８２７腫瘍における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２のより高い蓄積を示した。ＡｔｚＭａｂ処理マウスの腫瘍における放射能の蓄積の明らかな減少があり、処理対照と比較して利用可能なＰＤ-Ｌ１部位のレベルの減少を示している（図３５Ａおよび図３５Ｂ）。ＰＥＴイメージングの結果は、生体内分布のｅｘ  ｖｉｖｏ測定によってさらに確認され（図３５Ｄおよび図３５Ｅ、図３６Ｂおよび図３６Ｃ）、これは食塩水対照と比較したＡｔｚＭａｂ処理マウスにおける１グラムあたりの注射量の［６４Ｃｕ］ＷＬ１２パーセントの有意な減少を示した（％ＩＤ／ｇ）：Ｈ２２６を有するマウスにおいて３４％（Ｐ＜０．０００１）およびＨＣＣ８２７異種移植片において４７％（Ｐ＜０．００１）。ＰＤ-Ｌ１発現レベルは、異種移植片のＰＤ-Ｌ１  ＩＨＣによって確認された（図３５Ｃおよび図３５Ｆ）。結果は、［６４Ｃｕ］１２を使用して、ＡｔｚＭａｂによる腫瘍でのＰＤ-Ｌ１のｉｎ  ｖｉｖｏ標的化を定量化することができることを実証する。
【０１２３】
腫瘍中の異なるＰＤ-Ｌ１レベルを標的とすることに対するＡｔｚＭａｂの単回投与の効果を評価するために、ＮＳＣＬＣ細胞よりも４〜１０倍高いＰＤ-Ｌ１発現を有するＣＨＯ-ｈＰＤＬ１細胞株由来の腫瘍において、ＰＥＴおよび生体内分布試験を行った（図３６）。ＡｔｚＭａｂ（２０ｍｇ／ｋｇ、２４時間）で処理したＣＨＯ-ｈＰＤＬ１／ＣＨＯ担腫瘍マウスは、対照と比較して、ＣＨＯ-ｈＰＤＬ１腫瘍における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２取り込みの有意な減少を示した（図３５Ｇ）。生体内分布試験は、ＡｔｚＭａｂ処理腫瘍と比較してＣＨＯ-ｈＰＤＬ１腫瘍における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２結合の７７％の減少を示し（図３５Ｈ、図３６Ｄ）（Ｐ＜０．０００１）、ＡｔｚＭａｂによる腫瘍ＰＤ-Ｌ１標的化の測定を実証した。ＰＤ-Ｌ１陰性ＣＨＯ腫瘍において低レベルの［６４Ｃｕ］ＷＬ１２取り込みが観察されたが、これはＡｔｚＭａｂで処理したｈＰＤ-Ｌ１腫瘍のそれと類似していた。これらの観察結果は、ｈＰＤ-Ｌ１およびＣＨＯ腫瘍におけるそれぞれ強いおよび弱い免疫反応性の観察によって確認された（図３５Ｉ）。結果は、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴが腫瘍における段階的なレベルのＰＤ-Ｌ１発現を検出することができ、単一の２０ｍｇ／ｋｇのＡｔｚＭａｂ用量が腫瘍における広範囲のＰＤ-Ｌ１レベルに関与し得ることを実証する。
【０１２４】
３．３．３．ＰＤ-Ｌ１発現における動的変化の定量化。ＰＤ-Ｌ１は、様々なサイトカイン、特にＰＤ-Ｌ１発現における動的および時空的不均一性に寄与するインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）に応答して上方制御されることが知られている（Ｔａｕｂｅら、２０１５；Ｔａｕｂｅら、２０１２）。腫瘍内の誘導性ＰＤ-Ｌ１発現をｉｎ  ｖｉｖｏで定量化する［６４Ｃｕ］ＷＬ１２のロバスト性を評価し、ＡｔｚＭａｂ処理によるそのような上方制御されたＰＤ-Ｌ１の遮断が［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴによってモニターできるかどうかを判断した（図３７Ａ、図３７Ｂ、図３７Ｃ、図３７Ｄ、図３７Ｅ、および図３７Ｆ）。
【０１２５】
そうするために、ドキシサイクリン誘導性ＰＤ-Ｌ１発現を有するＡ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞株（Ａ５４９-ｉＰＤ-Ｌ１）を作製した。Ａ５４９はベースラインでＰＤ-Ｌ１を低発現するＫｒａｓ  Ｇ１２Ｓ肺腺がん細胞株である。それを、オールインワンレンチウイルスｐＩＮＤＵＣＥＲ２０ベクター（Ｍｅｅｒｂｒｅｙら、２０１１）中ＰＤ-Ｌ１で形質導入し、Ｇ４１８で選択し、フローサイトメトリーによりＰＤ-Ｌ１誘導を確認し（図３７Ａ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの試験で使用した。ドキシサイクリン処理したＡ５４９-ｉＰＤＬ１細胞へのＣｙ５-ＰＤ-Ｌ１-ｍＡｂの結合は、ＷＬ１２によって遮断され、ＷＬ１２の特異性を立証した（図３７Ｂ）。また、細胞の［６４Ｃｕ］ＷＬ１２とのインキュベーションは、ドキシサイクリン処理細胞対未処理細胞およびＰＤ-Ｌ１が低いＡ５４９細胞における放射能取り込みの５．５倍の増加を示した（Ｐ＜０．０００１）。ドキシサイクリン処理Ａ５４９-ｉＰＤＬ１細胞への［６４Ｃｕ］ＷＬ１２結合は、６０ｎＭのＡｔｚＭａｂ、ＡｖｅＭａｂおよびＤｕｒＭａｂの存在下で有意に減少した（６５％、Ｐ＞０．０００１）（図３７Ｃ）。これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、７２時間のドキシサイクリン処理後のＡ５４９-ｉＰＤＬ１  ＮＳＣＬＣ腫瘍における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の蓄積が、Ａ５４９対照腫瘍におけるよりも６５％高かったことを示すｉｎ  ｖｉｖｏ試験によって立証された（Ｐ＞０．０００１）。腫瘍における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２取り込みの増加は、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴおよび生体内分布試験によって定量化されるように、対照Ａ５４９腫瘍と比較して、２０ｍｇ／ｋｇのＡｔｚＭａｂ処理群で＞７５％減少した（図３７Ｄおよび図３７Ｅ）。腫瘍のＩＨＣ分析は、Ａ５４９-ｉＰＤＬ１では強いＰＤ-Ｌ１シグナルを示したが、Ａ５４９腫瘍では示さず、イメージングおよび生体内分布の結果を確認した（図３７Ｆ）。まとめると、これらの結果は、ＰＤ-Ｌ１発現レベルの動的変化を検出する［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の可能性、およびＡｔｚＭａｂによるその遮断を実証している。したがって、標準的な臨床業務フロー内でのＰＤ-Ｌ１発現の動的変化を定量化する上でＰＥＴが重要な役割を果たすことが期待され、治療法の決定に情報を提供するための新しい方法を提供する。
【０１２６】
３．３．４．異なる抗体による腫瘍ＰＤ-Ｌ１エンゲージメントの定量化。放射性標識抗ＰＤ-Ｌ１抗体が開発され、ヒト腫瘍異種移植片および同系マウス腫瘍モデルにおけるＰＤ-Ｌ１発現を非侵襲的に評価するそれらの可能性が実証されている（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１６；Ｈｅｓｋａｍｐら、２０１５；Ｍａｕｔｅら、２０１５；Ｄｅｎｇら、２０１６；Ｈｅｔｔｉｃｈら、２０１６；Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら、２０１６年）。そのような放射性標識抗体コンジュゲートは現在、ＰＤ-Ｌ１を検出し（ＮＣＴ０２４５３９８４）、他の腫瘍特異的タンパク質をイメージングし（Ｇｅｂｈａｒｔら、２０１６）、抗体動態を決定するために臨床的に使用されているが、それらの日常的な臨床応用は限られている。コントラストと病変の検出を強化するために（Ｐａｎｄｉｔ-Ｔａｓｋａｒら、２０１５；Ｏｏｓｔｉｎｇら、２０１６）、より速いクリアランス時間（時間対日数）を有する放射性トレーサーが必要である（Ｗｕ、２０１４）。さらなる制限は、放射性標識抗体を用いてなされた観察は調査中の抗体に非常に特異的であり、価数、形状、大きさ、等電点、および投与量などの抗体特性によって決まり、それぞれがその薬物動態に影響を与える。ｍＡｂのそのような固有の生物物理学的特徴も、血漿半減期、組織ばく露、および最終的には有効性に影響を与える。（ｉ）ＰＤ-Ｌ１抗体のターゲットエンゲージメントを説明し、（ｉｉ）ｍＡｂの特性を考慮に入れ、（ｉｉｉ）全ての抗体に適用可能である新しいアプローチが必要である。
【０１２７】
３つのＦＤＡ承認抗体、ＡｔｚＭａｂ、ＡｖｅＭａｂおよびＤｕｒＭａｂのそれぞれによる、腫瘍における非侵襲的なＰＤ-Ｌ１エンゲージメントを定量化する［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴの能力を評価した。ＭＤＡＭＢ２３１腫瘍を有するＮＳＧマウスをＡｔｚＭａｂ、またはＡｖｅＭａｂ、またはＤｕｒＭａｂで処理し、そして２４時間後にそれらを［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴでイメージングした（図３９Ａ、図３９Ｂ、図３９Ｃ、および図３９Ｄ）。全ての処理マウスにおいて、生理食塩水対照と比較して腫瘍においてシグナルが低く、腫瘍ＰＤ-Ｌ１エンゲージメントからの低レベルの遊離ＰＤ-Ｌ１およびｍＡｂによる放射性トレーサー遮断が確認された。腫瘍のｅｘ  ｖｉｖｏ定量化はそれらの所見を立証し、注射後１２０分で、ｍＡｂ処理マウスの腫瘍における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の取り込みが、食塩水対照（図３９Ｅ）と比較して約６０％少ないことを実証した。生理食塩水対照のＩＨＣ分析は、腫瘍において中程度から高いＰＤ-Ｌ１強度を示した（図３９Ｆ）。結果は、ＰＤ-Ｌ１治療用ｍＡｂによる腫瘍ＰＤ-Ｌ１エンゲージメントが、各抗体の異なる生物物理学的性質、血漿および組織動態にかかわらず、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴによって定量化できることを実証している。
【０１２８】
３．３．５．腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１占有に対する用量の影響。腫瘍における抗体動態は、腫瘍の内因性パラメータと外因性パラメータの両方によって支配されている（Ａｇｏｒａｍ、２００９）。近年、ＰＤ-Ｌ１発現自体以外の因子が、ＮＳＣＬＣ、ＴＮＢＣおよび結腸腫瘍内のＰＤ-Ｌ１標的治療薬ＡｔｚＭａｂおよびそのマウスキメラ（ＰＲＯ３０４３９７）の蓄積を減少させることができることが発見された（Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅら、２０１６）。さらに、１ｍｇ／ｋｇ未満の用量では、全身注射された放射性標識抗ＰＤ-Ｌ１抗体ＰＲＯ３０４３９７は主に腫瘍血管系と関連し、ＰＤ-Ｌ１発現同系マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍実質組織への最小拡散を示した（Ｄｅｎｇら、２０１６）。これらの知見は、腫瘍内の間質性圧力の上昇などの要因に起因する可能性があり（Ｂａｘｔｅｒら、１９８９；Ｂａｘｔｅｒら、１９９０）、これは、耐性の一因となる、腫瘍におけるｍＡｂの蓄積を妨げる（Ｇｏｅｌら、２０１１）。そのような効果はまた、標的とされた腫瘍細胞および免疫浸潤物への大きなＰＤ-Ｌ１指向剤の接近を妨げるかもしれない。ＰＤ-Ｌ１およびＰＤ-１治療薬の占有率の測定は腫瘍では報告されておらず、ＰＢＭＣを使用した評価に限定されている。
【０１２９】
腫瘍における腫瘍ＰＤ-Ｌ１占有に対する用量の効果を評価するために、ＭＤＡＭＢ２３１腫瘍を有するマウスに、０．００９〜２４ｍｇ／ｋｇ体重の漸増用量のＡｔｚＭａｂを注射した。２４時間後、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２の注射の２時間後にイメージングおよび生体内分布の試験を行った。０．０６ｍｇ／ｋｇを受けたマウスのＰＥＴ画像は、未処理対照と比較して［６４Ｃｕ］ＷＬ１２取り込みに差がなく、腫瘍でのＡｔｚＭａｂによるＰＤ-Ｌ１占有率が低いことを示した（図４１Ａ）。０．６および３．２ｍｇ／ｋｇの投与量では、腫瘍においてシグナル強度が比例して減少し、３．２ｍｇ／ｋｇの投与量については、抗体による腫瘍へのほぼ１００％のターゲットエンゲージメントが示された。
【０１３０】
次いで、腫瘍中に蓄積された放射能（％ＩＤ／ｇ）を用い、抑制性シグモイドＥｍａｘモデルを適合させた。％ＩＤ／ｇデータは、本発明者らの実験で使用されたＡｔｚＭａｂの用量と、ペプチド放射性トレーサー［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を使用して検出された腫瘍における遊離ＰＤ-Ｌ１リガンドの減少との間の関係を適切に当てはめ、説明した（図４１Ｂおよび図４１Ｃ）。腫瘍における最大ＰＤ-Ｌ１エンゲージメントの５０％（ＩＤ５０）またはベースラインからの遊離ＰＤ-Ｌ１リガンドの最大部分減少（Ｉｍａｘ）の原因であるＡｔｚＭａｂの用量は、０．４３ｍｇ／ｋｇであると推定された（表２）。Ｉｍａｘの９０％および９６％に関与するＩＤ９０およびＩＤ９６は、それぞれ０．８７ｍｇ／ｋｇおよび１．１９ｍｇ／ｋｇに相当した。これらの用量レベルは、ＰＲＯ３０４３９７についてＤｅｎｇｅｔらによって報告された１ｍｇ／ｋｇの用量に匹敵する（Ｄｅｎｇら、２０１６）。抗ＰＤ-Ｌ１抗体およびキメラ抗ＰＤ-Ｌ１抗体ＰＲＯ３０４３９７（２１）について同様の平均Ｖｓｓを５０ｍＬ／ｋｇと仮定すると、ＩＤ５０、ＩＤ９０およびＥＤ９６から生じる予想平均血漿濃度は、暫定的にそれぞれ５９ｎＭ（８．６ｍｃｇ／ｍＬ）、１２０ｎＭ（１７．４ｍｃｇ／ｍＬ）および１６４ｎＭ（２３．８ｍｃｇ／ｍＬ）であると推定された。これらの結果は、用量選択および最適化のために腫瘍で行われた測定値を使用する可能性を示している。
【０１３１】
抗体とそれらの標的との相互作用は、抗体結合がＰＤ-Ｌ１の安定化または内在化および抗治療抗体の開発などのＰＤ-Ｌ１の自然の動態に影響を及ぼし得るという点で、小分子の相互作用とは異なり、抗体の腫瘍および血清動態に重大な影響を与え得る（Ｔａｂｒｉｚｉら、２００６）。ＡｔｚＭａｂの初期の薬物動態試験では、０．６〜１ｍｇ／ｋｇ未満の非線形ＰＫおよび１ｍｇ／ｋｇ超の用量の線形ＰＫが報告されており、ＡＴＡを発症した患者では血清抗体濃度の低下傾向が認められた（Ｓｔｒｏｈら、２０１７）。しかしながら、腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１抗体のＰＫおよび占有率に対するそのような腫瘍内因性および外因性パラメータの影響は知られていない。
【０１３２】
【表２】
2020514278.tif 000009
【０１３３】
腫瘍における抗体動態の時間的変化を検出する［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴの能力を調べるために、ＭＤＡＭＢ２３１腫瘍を有するＮＳＧマウスに、それぞれ非線形および線形動力学を生じる０．６および１０または２０ｍｇ／ｋｇの用量のＡｔｚＭａｂを注射し、ＰＥＴイメージングおよび生体内分布試験を２４および１２０時間で行った。２４時間では、未処理対照と比較して、３つの用量群全てにおいて腫瘍取り込み値にも反映された［６４Ｃｕ］ＷＬ１２取り込みの有意な減少があった（図４１Ｄおよび図４１Ｅ）。１２０時間では、２４時間と比較して０．６ｍｇ／ｋｇ用量群で［６４Ｃｕ］ＷＬ１２取り込みが有意に増加した。対照的に、１０または２０ｍｇ／ｋｇの治療群では、［６４Ｃｕ］ＷＬ１２取り込みに有意な時間的差異はなかった。１２０時間では、腫瘍における［６４Ｃｕ］ＷＬ１２取り込みは、０．０６ｍｇ／ｋｇ処理および食塩水対照群で同様であり、腫瘍からの薬物の排除を示唆し、低用量でのＡｔｚＭａｂの非線形ＰＫを反映していた。結果は、マウスモデルにおいて、ＰＤ-Ｌ１エンゲージメントの用量依存的および時間依存的変化の両方が［６４Ｃｕ］ＷＬ１２-ＰＥＴによって評価され得ることを示す。
【０１３４】
３．３．６．論考
免疫チェックポイント治療薬は何百もの臨床試験で試験されており、そのうちの約２５％がＰＤ-Ｌ１を標的としている。ＰＤ-Ｌ１治療を受けている患者のわずか３０％のみが治療に反応するため、反応の分子的および細胞的根拠ならびにこれらの療法に対する耐性は、転写、遺伝、およびエピジェネティック試験を用いて調査されている。腫瘍における有効性に関連する薬物蓄積および標的飽和に対する用量の関連性は知られていない。加えて、大きなサイズの抗体治療薬は腫瘍浸透を制限し、作用部位での薬力学的評価に特有の課題を提起する。腫瘍内因性および腫瘍外因性の両方のパラメータを考慮し、腫瘍においてリアルタイムでＰＤ-Ｌ１飽和／占有データを提供し、広く適用することができる有効な方法は不足していた。この知識の欠如は、用量選択、用量最適化、治療開発、および毒性を低減するための治療最適化を妨げる。本発明者らの現在の研究では、放射性標識ＰＤ-Ｌ１結合ペプチドは、可変で動的なＰＤ-Ｌ１発現レベルを非侵襲的に検出することができ、腫瘍内因性パラメータ（ＰＤ-Ｌ１発現、再利用、間質圧）および外因性パラメータ（抗体アイソタイプ、動態、ＡＴＡ、異化）を考慮しながら、腫瘍の占有率を測定するために使用でき、したがって、腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１：ＰＤ-１相互作用阻害ＰＤ-Ｌ１抗体の治療活性をモニターするための普遍的な手段を提供することが示された。
【０１３５】
腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１発現を評価するためにＩＨＣベースの臨床試験が以前から開発されているが（Ｈｅｒｂｓｔら、２０１４；Ｒｏａｃｈら、２０１６；Ｍｅｎｇら、２０１５）、ＰＤ-Ｌ１  ＩＨＣは、単一病変のごく一部（０．１％）のみを考慮に入れる。腫瘍微小環境におけるＰＤ-Ｌ１発現は空間的および時間的に不均一であり、免疫療法反応は本質的に遅延し、複雑かつアブスコパルであるため、そのようなアプローチには重大な制限がある。また、試験用に生検によって取得された組織サンプルは、典型的には非常に限られており、既存の療法に対する感受性または耐性を付与する他の経路（例えば、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＰＡＲＰ）における標的化可能な発がん性変異を同定するための分子プロファイリングに必要とされ得る（Ｎｏｌａｎら、２０１７）。そのような貴重なサンプルは、ＰＤ-Ｌ１発現の信頼できる描写のために複数のＰＤ-Ｌ１評価を行うことを非実用的にすることが多い（Ｇｉｂｎｅｙら、２０１６）。これらの問題は、免疫チェックポイント治療法が広く研究されている集団である転移性疾患を有する患者において悪化している。そのような要因は、免疫療法を進める上での我々の限られた成功に寄与する。ＰＤ-Ｌ１発現およびより広い腫瘍免疫微小環境の両方の動的性質は、ＴＭＥの迅速な評価を可能にするＰＥＴ放射性トレーサーの開発を必要とする。［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を用いた本開示の研究は、ＰＤ-Ｌ１発現における可変的かつ動的な変化が、標準的な臨床作業フロー内で定量化でき、患者選択およびモニタリング治療にとって重要な臨床的意義をもたらすことを実証する。
【０１３６】
ＰＤ-Ｌ１治療用抗体は、がん免疫療法において重要な薬剤となっている。小分子については、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性測定および占有試験は、ＣＮＳ疾患における用量選択および薬理学的反応の予測のために日常的に使用されている（Ｌｅｅら、２００６）。しかしながら、抗体などの大きな分子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結合親和性に基づいてｉｎ  ｖｉｖｏでの受容体占有率を予測することにおいて特有の課題を提起する（Ａｇｏｒａｍ、２００９）。腫瘍中の抗体濃度は、抗原密度および代謝回転、腫瘍量、および腫瘍内へのｍＡｂの浸透を制限する腫瘍かん流などのいくつかの腫瘍固有パラメータによって影響を受ける。ｍＡｂの腫瘍濃度および血漿濃度は、親和性、用量、患者の多様性、悪液質、および抗治療抗体の開発などの腫瘍外因性因子によってさらに影響を受ける（Ｓｈｅｎｇら、２０１７）。既存のＰＫ／ＰＤ予測モデルは、最適用量を予測するのに、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびＰＢＭＣに基づく測定に依存している（Ｄｅｎｇら、２０１６）。しかしながら、本開示の主題は、ＰＥＴを使用し、腫瘍においてリアルタイムで非侵襲的に治療用抗体によるＰＤ-Ｌ１占有を測定することができることを実証している。
【０１３７】
末梢薬力学評価およびＰＫ／ＰＤモデリングによって支持されるアテゾリズマブなどの放射標識抗体は、腫瘍において所望のＰＤ-Ｌ１占有率を達成するのに必要なｍＡｂ投与レベルを予測するために日常的に使用されている（Ｄｅｎｇら、２０１６）。抗体の血漿中および腫瘍中濃度は抗体のアイソタイプおよび電荷や価数などの生物物理学的特性の影響を受けるため、これらの測定および数学モデリング由来の占有予測は、多くの場合所与の抗体に特異的であり、したがって、そのような観察の他のＰＤ-Ｌ１  ｍＡｂへの一般化は限定される（Ｋａｍａｔｈ、２０１６）。ますます拡大している数々のＰＤ-Ｌ１治療用ｍＡｂについて、抗体動態および腫瘍でのターゲットエンゲージメント能を評価するために使用することができるツールが必要とされている。本開示の主題はこの必要性に対処する。ＷＬ１２-ＰＥＴを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏデータと組み合わせたｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリング試験は、腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１飽和／占有を定量化できることを実証しており、これは臨床試験における全てのＰＤ-Ｌ１治療用ｍＡｂに適用できる概念である。
【０１３８】
まとめると、本開示のデータは、腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１発現の動的変化、および治療用抗体によるＰＤ-Ｌ１飽和／占有が、２つの特徴、すなわち抗体特性とは無関係であること、および腫瘍の内因性および外因性のパラメータを考慮することによって、非侵襲的に定量化できることを実証する。３つの異なる治療用抗体、ＡｔｚＭａｂ、ＡｖｅＭａｂ、ＤｕｒＭａｂについて、用量を腫瘍でのＰＤ-Ｌ１占有率と関連づける本開示の結果は、治療反応および投薬効果に関連性があると予想される。
【０１３９】
３．３．７．概要。
本開示の主題は、放射性標識ＰＤ-Ｌ１結合ペプチドが、可変で動的なＰＤ-Ｌ１発現レベルを非侵襲的に検出することができ、腫瘍内因性パラメータ（ＰＤ-Ｌ１発現、再利用、間質圧）および外因性パラメータ（抗体アイソタイプ、動態、ＡＴＡ、異化）を考慮しながら、腫瘍の占有率を測定するために使用でき、したがって、腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１：ＰＤ-１相互作用阻害ＰＤ-Ｌ１抗体の治療活性をモニターするための普遍的な手段を提供することを実証する。
【０１４０】
［６４Ｃｕ］ＷＬ１２を用いた試験は、ＰＤ-Ｌ１発現における可変的かつ動的な変化が、標準的な臨床作業フロー内で定量化でき、患者選択およびモニタリング治療にとって重要な臨床的意義をもたらすことを実証する。
【０１４１】
抗体についての既存のＰＫ／ＰＤ予測モデルは、最適用量を予測するのに、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびＰＢＭＣに基づく測定に依存している（Ｄｅｎｇら、２０１６）。しかしながら、本開示の主題は、ＰＥＴを使用し、腫瘍においてリアルタイムで非侵襲的に治療用抗体によるＰＤ-Ｌ１占有を測定することができることを実証している。
【０１４２】
ますます拡大している数々のＰＤ-Ｌ１治療用ｍＡｂについて、抗体動態および腫瘍でのターゲットエンゲージメント能を評価するために使用することができるツールが必要とされている。本開示の主題はこの必要性に対処する。ＷＬ１２-ＰＥＴを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏデータと組み合わせたｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリング試験は、腫瘍におけるＰＤ-Ｌ１飽和／占有を定量化できることを実証しており、これは臨床試験における全てのＰＤ-Ｌ１治療用ｍＡｂに適用できる概念である。
【０１４３】
（参考文献）
本明細書で言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、本開示の主題が関連する当業者のレベルを示している。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献（例えば、ウェブサイト、データベースなど）は、その内容全体が、あたかもそれぞれ個々の刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献が具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書では多数の特許出願、特許、および他の参考文献を参照しているが、そのような参考文献は、これらの文書のいずれも当該技術分野における共通の一般的知識の一部を形成することを承認するものではないことが理解されよう。本明細書と任意の組み込まれた参考文献との間に矛盾がある場合、本明細書（その任意の修正を含み、これは組み込まれた参考文献に基づくことができる）が優先するものとする。本明細書では、別段の指示がない限り、技術上許容されている用語の標準的な意味を使用する。本明細書では、様々な用語の標準的な略語が使用されている。
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Ｂｏｓｗｅｌｌ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｓｕｎ，  Ｘ．，  Ｎｉｕ，  Ｗ．，  Ｗｅｉｓｍａｎ，  Ｇ．  Ｒ．，  Ｗｏｎｇ，  Ｅ．  Ｈ．，  Ｒｈｅｉｎｇｏｌｄ，  Ａ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｃ．  Ｊ．  （２００４）  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｃｏｐｐｅｒ-６４-ｌａｂｅｌｅｄ  ｃｒｏｓｓ-ｂｒｉｄｇｅｄ  ａｎｄ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ  ｔｅｔｒａａｚａｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４７，  １４６５-７４．
Ｂｒａｈｍｅｒ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｔｙｋｏｄｉ，  Ｓ．  Ｓ．，  Ｃｈｏｗ，  Ｌ．  Ｑ．，  Ｈｗｕ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｔｏｐａｌｉａｎ，  Ｓ．  Ｌ．，  Ｈｗｕ，  Ｐ．，  Ｄｒａｋｅ，  Ｃ．  Ｇ．，  Ｃａｍａｃｈｏ，  Ｌ．  Ｈ．，  Ｋａｕｈ，  Ｊ．，  Ｏｄｕｎｓｉ，  Ｋ．，  Ｐｉｔｏｔ，  Ｈ．  Ｃ．，  Ｈａｍｉｄ，  Ｏ．，  Ｂｈａｔｉａ，  Ｓ．，  Ｍａｒｔｉｎｓ，  Ｒ．，  Ｅａｔｏｎ，  Ｋ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｓ．，  Ｓａｌａｙ，  Ｔ．  Ｍ．，  Ａｌａｐａｒｔｈｙ，  Ｓ．，  Ｇｒｏｓｓｏ，  Ｊ．  Ｆ．，  Ｋｏｒｍａｎ，  Ａ．  Ｊ．，  Ｐａｒｋｅｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ａｇｒａｗａｌ，  Ｓ．，  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｐａｒｄｏｌｌ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｇｕｐｔａ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｗｉｇｇｉｎｔｏｎ，  Ｊ．  Ｍ．  （２０１２）  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ-ＰＤ-Ｌ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６，  ２４５５-２４６５．  
Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，  Ｓ．，  Ｌｅｓｎｉａｋ，  Ｗ．  Ｇ．，  Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ，  Ｍ．，  Ｌｉｓｏｋ，  Ａ．，  Ｗｈａｒｒａｍ，  Ｂ．，  Ｓｙｓａ-Ｓｈａｈ，  Ｐ．，  Ａｚａｄ，  Ｂ．  Ｂ．，  Ｐｏｍｐｅｒ，  Ｍ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｎｉｍｍａｇａｄｄａ，  Ｓ．  （２０１６）  Ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｌｉｇａｎｄ  ＰＤ-Ｌ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ７，  １０２１５-２７．
Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，  Ｓ．，  Ｌｅｓｎｉａｋ，  Ｗ．  Ｇ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｌｉｓｏｋ，  Ａ．，  Ｓｉｋｏｒｓｋａ，  Ｅ．，  Ｗｈａｒｒａｍ，  Ｂ．，  Ｋｕｍａｒ，  Ｄ．，  Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ，  Ｍ．，  Ｐｏｍｐｅｒ，  Ｍ．  Ｇ．，  Ｇａｂｅｌｌｉ，  Ｓ．  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｎｉｍｍａｇａｄｄａ，  Ｓ．  （２０１７）  Ｒａｐｉｄ  ＰＤ-Ｌ１  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ＰＥＴ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４８３，  ２５８-２６３．
Ｃｈｏ，  Ｄ．  Ｃ．，  Ｓｏｓｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｓｚｎｏｌ，  Ｍ．，  Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｈｏｌｌｅｂｅｃｑｕｅ，  Ａ．，  Ｈａｍｉｄ，  Ｏ．，  ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，  Ｄ．  Ｆ．，  Ｄｅｌｏｒｄ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｒｈｅｅ，  Ｉ．  Ｐ．，  Ｍｏｋａｔｒｉｎ，  Ａ．，  Ｋｏｗａｎｅｔｚ，  Ｍ．，  Ｆｕｎｋｅ，  Ｒ．  Ｐ．，  Ｆｉｎｅ，  Ｇ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｐｏｗｌｅｓ，  Ｔ．  （２０１３）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ｓａｆｅｔｙ，  ａｎｄ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ＭＰＤＬ３２８０Ａ，  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＰＤ-Ｌ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  （ｍＲＣＣ）．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３１，  １５＿ｓｕｐｐｌ，  ４５０５-４５０５．
Ｄｅｎｇ，  Ｒ．，  Ｂｕｍｂａｃａ，  Ｄ．，  Ｐａｓｔｕｓｋｏｖａｓ，  Ｃ．  Ｖ．，  Ｂｏｓｗｅｌｌ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｗｅｓｔ，  Ｄ．，  Ｃｏｗａｎ，  Ｋ．  Ｊ．，  Ｃｈｉｕ，  Ｈ．，  ＭｃＢｒｉｄｅ，  Ｊ．，  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｃ．，  Ｘｉｎ，  Ｙ．，  Ｋｏｅｐｐｅｎ，  Ｈ．，  Ｌｅａｂｍａｎ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｉｙｅｒ，  Ｓ．  （２０１６）  Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ，  ｔｉｓｓｕｅ  ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ-ＰＤ-Ｌ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，  ａｎ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．  ＭＡｂｓ  ８，  ５９３-６０３．
Ｅｉｓｅｎｗｉｅｎｅｒ，  Ｋ．  Ｐ．，  Ｐｏｗｅｌｌ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｍａｃｋｅ，  Ｈ．  Ｒ．  （２０００）  Ａ  ｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｃｈｅｌａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｏ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ｒａｄｉｏｍｅｔａｌ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ．  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  １０，  ２１３３-５．
Ｆｒｉｅｓｎｅｒ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｂａｎｋｓ，  Ｊ．  Ｌ．，  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｒ．  Ｂ．，  Ｈａｌｇｒｅｎ，  Ｔ．  Ａ．，  Ｋｌｉｃｉｃ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｍａｉｎｚ，  Ｄ．  Ｔ．，  Ｒｅｐａｓｋｙ，  Ｍ．  Ｐ．，  Ｋｎｏｌｌ，  Ｅ．  Ｈ．，  Ｓｈｅｌｌｅｙ，  Ｍ．，  Ｐｅｒｒｙ，  Ｊ．  Ｋ．，  Ｓｈａｗ，  Ｄ．  Ｅ．，  Ｆｒａｎｃｉｓ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｓｈｅｎｋｉｎ，  Ｐ．  Ｓ．  （２００４）  Ｇｌｉｄｅ：  ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ，  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｏｒｉｎｇ．  １．  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ａｃｃｕｒａｃｙ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４７，  １７３９-４９．
Ｇｅｂｈａｒｔ，  Ｇ．，  Ｌａｍｂｅｒｔｓ，  Ｌ．  Ｅ．，  Ｗｉｍａｎａ，  Ｚ．，  Ｇａｒｃｉａ，  Ｃ．，  Ｅｍｏｎｔｓ，  Ｐ．，  Ａｍｅｙｅ，  Ｌ．，  Ｓｔｒｏｏｂａｎｔｓ，  Ｓ．，  Ｈｕｉｚｉｎｇ，  Ｍ．，  Ａｆｔｉｍｏｓ，  Ｐ．，  Ｔｏｌ，  Ｊ．，  Ｏｙｅｎ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｖｕｇｔｓ，  Ｄ．  Ｊ．，  Ｈｏｅｋｓｔｒａ，  Ｏ．  Ｓ．，  Ｓｃｈｒｏｄｅｒ，  Ｃ．  Ｐ．，  Ｍｅｎｋｅ-ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｕｖｅｎ  ｖａｎ  Ｏｏｒｄｔ，  Ｃ．  Ｗ．，  Ｇｕｉｏｔ，  Ｔ．，  Ｂｒｏｕｗｅｒｓ，  Ａ．  Ｈ．，  Ａｗａｄａ，  Ａ．，  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，  Ｅ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｆｌａｍｅｎ，  Ｐ．  （２０１６）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｓ  ａ  ｔｏｏｌ  ｔｏ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ＨＥＲ２-ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｔｏ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｕｎｄｅｒ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ  ｅｍｔａｎｓｉｎｅ  （Ｔ-ＤＭ１）：  ｔｈｅ  ＺＥＰＨＩＲ  ｔｒｉａｌ．  Ａｎｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７，  ６１９-６２４．
Ｇｉｂｎｅｙ，  Ｇ．  Ｔ．，  Ｗｅｉｎｅｒ，  Ｌ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ａｔｋｉｎｓ，  Ｍ．  Ｂ．  （２０１６）  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ-ｂａｓｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １７，  ｅ５４２-ｅ５５１．
Ｇｏｅｌ，  Ｓ．，  Ｄｕｄａ，  Ｄ．  Ｇ．，  Ｘｕ，  Ｌ．，  Ｍｕｎｎ，  Ｌ．  Ｌ．，  Ｂｏｕｃｈｅｒ，  Ｙ．，  Ｆｕｋｕｍｕｒａ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｊａｉｎ，  Ｒ．  Ｋ．  （２０１１）  Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ９１，  １０７１-１１２１．        Ｇｏｕｒｎｉ，  Ｅ．，  Ｄｅｍｍｅｒ，  Ｏ．，  Ｓｃｈｏｔｔｅｌｉｕｓ，  Ｍ．，  Ｄ´Ａｌｅｓｓａｎｄｒｉａ，  Ｃ．，  Ｓｃｈｕｌｚ，  Ｓ．，  Ｄｉｊｋｇｒａａｆ，  Ｉ．，  Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ，  Ｕ．，  Ｓｃｈｗａｉｇｅｒ，  Ｍ．，  Ｋｅｓｓｌｅｒ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｅｒ，  Ｈ．  Ｊ．  （２０１１）  ＰＥＴ  ｏｆ  ＣＸＣＲ４  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａ  （６８）Ｇａ-ｌａｂｅｌｅｄ  ｈｉｇｈｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔ．  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ５２，  １８０３-１０．
Ｇｒｉｓｈｉｎａ，  Ｉ．  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｙ，  Ｒ．  Ｗ．  （１９９４）  Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ｏｆ  ｇｌｏｂｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｅｘｃｉｔｏｎ  ｃｏｕｐｌｅｔｓ  ａｎｄ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｏｓｃｉｌｌａｔｏｒｓ．  Ｆａｒａｄａｙ  ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎｓ  ９９，  ２４５-２６２．
Ｈａｌｇｒｅｎ，  Ｔ．  Ａ．，  Ｍｕｒｐｈｙ，  Ｒ．  Ｂ．，  Ｆｒｉｅｓｎｅｒ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｂｅａｒｄ，  Ｈ．  Ｓ．，  Ｆｒｙｅ，  Ｌ．  Ｌ．，  Ｐｏｌｌａｒｄ，  Ｗ．  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｂａｎｋｓ，  Ｊ．  Ｌ．  （２００４）  Ｇｌｉｄｅ：  ａ  ｎｅｗ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｒａｐｉｄ，  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｃｏｒｉｎｇ．  ２．  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ４７，  １７５０-９．
Ｈａｍｉｄ，  Ｏ．，  Ｓｏｓｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｄ．  Ｐ．，  Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｉｂｒａｈｉｍ，  Ｎ．，  Ｋｌｕｇｅｒ，  Ｈ．  Ｍ．，  Ｂｏａｓｂｅｒｇ，  Ｐ．  Ｄ．，  Ｆｌａｈｅｒｔｙ，  Ｋ．，  Ｈｗｕ，  Ｐ．，  Ｂａｌｌｉｎｇｅｒ，  Ｍ．，  Ｍｏｋａｔｒｉｎ，  Ａ．，  Ｋｏｗａｎｅｔｚ，  Ｍ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｄ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｈｏｄｉ，  Ｆ．  Ｓ．  （２０１３）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ｓａｆｅｔｙ，  ａｎｄ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ＭＰＤＬ３２８０Ａ，  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＰＤ-Ｌ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ  （ｍＭ）．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３１，  １５＿ｓｕｐｐｌ，  ９０１０-９０１０．
Ｈｅｒｂｓｔ，  Ｒ．  Ｓ．，  Ｓｏｒｉａ，  Ｊ．  Ｃ．，  Ｋｏｗａｎｅｔｚ，  Ｍ．，  Ｆｉｎｅ，  Ｇ．  Ｄ．，  Ｈａｍｉｄ，  Ｏ．，  Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｓｏｓｍａｎ，  Ｊ．  Ａ．，  ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，  Ｄ．  Ｆ．，  Ｐｏｗｄｅｒｌｙ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｓ．  Ｎ．，  Ｋｏｈｒｔ，  Ｈ．  Ｅ．，  Ｈｏｒｎ，  Ｌ．，  Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  Ｄ．  Ｐ．，  Ｒｏｓｔ，  Ｓ．，  Ｌｅａｂｍａｎ，  Ｍ．，  Ｘｉａｏ，  Ｙ．，  Ｍｏｋａｔｒｉｎ，  Ａ．，  Ｋｏｅｐｐｅｎ，  Ｈ．，  Ｈｅｇｄｅ，  Ｐ．  Ｓ．，  Ｍｅｌｌｍａｎ，  Ｉ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｄ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｈｏｄｉ，  Ｆ．  Ｓ．  （２０１４）  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ-ＰＤ-Ｌ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＭＰＤＬ３２８０Ａ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５１５，  ５６３-７．
Ｈｅｒｒｍａｎｎ，  Ｋ．，  Ｓｃｈｏｔｔｅｌｉｕｓ，  Ｍ．，  Ｌａｐａ，  Ｃ．，  Ｏｓｌ，  Ｔ．，  Ｐｏｓｃｈｅｎｒｉｅｄｅｒ，  Ａ．，  Ｈａｎｓｃｈｅｉｄ，  Ｈ．，  Ｌｕｃｋｅｒａｔｈ，  Ｋ．，  Ｓｃｈｒｅｄｅｒ，  Ｍ．，  Ｂｌｕｅｍｅｌ，  Ｃ．，  Ｋｎｏｔｔ，  Ｍ．，  Ｋｅｌｌｅｒ，  Ｕ．，  Ｓｃｈｉｒｂｅｌ，  Ａ．，  Ｓａｍｎｉｃｋ，  Ｓ．，  Ｌａｓｓｍａｎｎ，  Ｍ．，  Ｋｒｏｐｆ，  Ｓ．，  Ｂｕｃｋ，  Ａ．  Ｋ．，  Ｅｉｎｓｅｌｅ，  Ｈ．，  Ｗｅｓｔｅｒ，  Ｈ．  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｋｎｏｐ，  Ｓ．  （２０１６）  Ｆｉｒｓｔ-ｉｎ-Ｈｕｍａｎ  Ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＸＣＲ４-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｎｄｏｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  １７７Ｌｕ-  ａｎｄ  ９０Ｙ-  Ｌａｂｅｌｅｄ  Ｐｅｎｔｉｘａｔｈｅｒ  ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ-Ｓｔａｇｅ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｙｅｌｏｍａ  ｗｉｔｈ  Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  Ｉｎｔｒａ-  ａｎｄ  Ｅｘｔｒａｍｅｄｕｌｌａｒｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ５７，  ２４８-５１．
Ｈｅｓｋａｍｐ，  Ｓ．，  Ｈｏｂｏ，  Ｗ．，  Ｍｏｌｋｅｎｂｏｅｒ-Ｋｕｅｎｅｎ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｏｌｉｖｅ，  Ｄ．，  Ｏｙｅｎ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｄｏｌｓｔｒａ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｂｏｅｒｍａｎ，  Ｏ．  Ｃ．  （２０１５）  Ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  ＰＤ-Ｌ１  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ  Ａｎｔｉ-ＰＤ-Ｌ１  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７５，  ２９２８-３６．
Ｈｅｔｔｉｃｈ，  Ｍ．，  Ｂｒａｕｎ，  Ｆ．，  Ｂａｒｔｈｏｌｏｍａ，  Ｍ．  Ｄ．，  Ｓｃｈｉｒｍｂｅｃｋ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｎｉｅｄｅｒｍａｎｎ，  Ｇ．  （２０１６）  Ｈｉｇｈ-Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＰＥＴ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｗｉｔｈ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ-ｂａｓｅｄ  ＰＤ-１／ＰＤ-Ｌ１  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｔｒａｃｅｒｓ  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ６，  １６２９-１６４０．
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ＷＯ２０１６０３９７４９  ｔｏ  Ｍｉｌｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｆｏｒ    Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＤ-１／ＰＤ-Ｌ１  ａｎｄ  ＣＤ８０  （Ｂ７-１）／ＰＤ-Ｌ１  Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｍａｒｃｈ  １７，  ２０１６．
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ＷＯ  ２０１６／１００２８５  ｔｏ  Ｍａｐｅｌｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｆｏｒ    Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｎｅ  ２３，  ２０１６．
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ＷＯ  ２０１６／１００６０８  ｔｏ  Ｓｕｎ，  ｅｔ  ａｌ．  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｊｕｎｅ  ２３，  ２０１６．
Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＰＣＴ  ｐａｔｅｎｔ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．  ＷＯ  ２０１６／１２６６４６  ｔｏ  Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ，  ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ａｕｇｕｓｔ  １１，  ２０１６．
Ｉｒｖｉｎｇ，  Ｂ．，  Ｃｈｉｕ，  Ｈ．，  Ｍａｅｃｋｅｒ，  Ｈ．，  Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎ，  Ｓ．，  Ｌｅｈａｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｗｕ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｃｈｅｕｎｇ，  Ｊ．  （２０１２）  （Ｏｆｆｉｃｅ，  Ｕ．  Ｓ．  Ｐ．，  Ｅｄ．），  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ．
Ｉｒｖｉｎｇ，  Ｂ．，  Ｃｈｉｕ，  Ｈ．，  Ｍａｅｃｋｅｒ，  Ｈ．，  Ｍａｒｉａｔｈａｓａｎ，  Ｓ．，  Ｌｅｈａｒ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｗｕ，  Ｙ．，  ａｎｄ  Ｃｈｅｕｎｇ，  Ｊ．  （２０１２）  Ａｎｔｉ-ＰＤ-Ｌ１  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｒｔｉｃｌｅｓ  ｏｆ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ．    （Ｏｆｆｉｃｅ，  Ｕ．  Ｓ．  Ｐ．，  ｅｄ），  Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，  Ｉｎｃ．，  ＵＳＡ．
Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎ，  Ａ．，  Ｎｅｄｒｏｗ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｐａｒｋ，  Ｓ．，  Ｂａｎｅｒｊｅｅ，  Ｓ．  Ｒ．，  Ｒｉｔｔｅｎｂａｃｈ，  Ａ．，  Ｊａｍｍｅｓ，  Ｆ．，  Ｔｓｕｉ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｓｇｏｕｒｏｓ，  Ｇ．  （２０１６）  Ｉｍａｇｉｎｇ，  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｄｏｓｉｍｅｔｒｙ  ｏｆ  Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ-  Ｌａｂｅｌｅｄ  ＰＤ-Ｌ１  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７６，  ４７２-９．
Ｋａｍａｔｈ，  Ａ．  Ｖ．  （２０１６）  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌ  ２１-２２，  ７５-８３．
Ｋｅｌｌｙ，  Ｓ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｐｒｉｃｅ，  Ｎ．  Ｃ．  （２０００）  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｃｉｅｎｃｅ  １，  ３４９-３８４．
Ｌｅｅ，  Ｃ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｆａｒｄｅ，  Ｌ．  （２００６）  Ｕｓｉｎｇ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｔｏ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅ  ＣＮＳ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ  ２７，  ３１０-３１６．  
Ｌｅｅ，  Ｈ．  Ｔ．，  Ｌｅｅ，  Ｊ．  Ｙ．，  Ｌｉｍ，  Ｈ．，  Ｌｅｅ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｍｏｏｎ，  Ｙ．  Ｊ．，  Ｐｙｏ，  Ｈ．  Ｊ．，  Ｒｙｕ，  Ｓ．  Ｅ．，  Ｓｈｉｎ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｈｅｏ，  Ｙ．  Ｓ．  （２０１７）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ＰＤ-１／ＰＤ-Ｌ１  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｖｉａ  ａｎｔｉ-ＰＤ-Ｌ１  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ  ａｎｄ  ｄｕｒｖａｌｕｍａｂ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ７，  ５５３２．  
Ｌｅｓｎｉａｋ，  Ｗ．  Ｇ．，  Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，  Ｓ．，  Ｇａｂｒｉｅｌｓｏｎ，  Ｍ．，  Ｌｉｓｏｋ，  Ａ．，  Ｗｈａｒｒａｍ，  Ｂ．，  Ｐｏｍｐｅｒ，  Ｍ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｎｉｍｍａｇａｄｄａ，  Ｓ．  （２０１６）  ＰＤ-Ｌ１  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｕｍｏｒｓ  Ｕｓｉｎｇ  ［（６４）Ｃｕ］Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ  ｗｉｔｈ  ＰＥＴ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２７，  ２１０３-２１１０，  
Ｌｉｎｄｅｎ，  Ｈ．  Ｍ．，  Ｓｔｅｋｈｏｖａ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｌｉｎｋ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｇｒａｌｏｗ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，  Ｒ．  Ｂ．，  Ｅｌｌｉｓ，  Ｇ．  Ｋ．，  Ｐｅｔｒａ，  Ｐ．  Ｈ．，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｌ．  Ｍ．，  Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，  Ｅ．  Ｋ．，  Ｄｕｎｎｗａｌｄ，  Ｌ．  Ｋ．，  Ｋｒｏｈｎ，  Ｋ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｋｏｆｆ，  Ｄ．  Ａ．  （２００６）  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｆｌｕｏｒｏｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ｐｏｓｉｔｒｏｎ  ｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２４，  ２７９３-９．
Ｌｉｐｓｏｎ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｆｏｒｄｅ，  Ｐ．  Ｍ．，  Ｈａｍｍｅｒｓ，  Ｈ．  Ｊ．，  Ｅｍｅｎｓ，  Ｌ．  Ａ．，  Ｔａｕｂｅ，  Ｊ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｔｏｐａｌｉａｎ，  Ｓ．  Ｌ．  （２０１５）  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ＰＤ-１  ａｎｄ  ＰＤ-Ｌ１  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ４２，  ５８７-６００．
Ｌｉｕ，  Ｋ．，  Ｔａｎ，  Ｓ．，  Ｃｈａｉ，  Ｙ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｄ．，  Ｓｏｎｇ，  Ｈ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｃ．  Ｗ．，  Ｓｈｉ，  Ｙ．，  Ｌｉｕ，  Ｊ．，  Ｔａｎ，  Ｗ．，  Ｌｙｕ，  Ｊ．，  Ｇａｏ，  Ｓ．，  Ｙａｎ，  Ｊ．，  Ｑｉ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｇａｏ，  Ｇ．  Ｆ．  （２０１６）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ-ＰＤ-Ｌ１  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ａｖｅｌｕｍａｂ  ｆｏｒ  ｔｕｍｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １０．１０３８／ｃｒ．２０１６．１０２．
Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ，  Ａ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｄｏｎｇ，  Ｈ．  （２０１６）  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  １  Ｌｉｇａｎｄ  １  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｗｉｔｈ  Ｎｏｎ-Ｓｍａｌｌ  Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ｔｏ  Ｒｅｃｅｉｖｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  １００，  ２２０-２．
Ｍａｒｒｏｎｅ，  Ｋ．  Ａ．，  Ｙｉｎｇ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｎａｉｄｏｏ，  Ｊ．  （２０１６）  Ｉｍｍｕｎｅ-Ｒｅｌａｔｅｄ  Ａｄｖｅｒｓｅ  Ｅｖｅｎｔｓ  Ｆｒｏｍ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  １００，  ２４２-２５１．  
Ｍａｕｔｅ，  Ｒ．  Ｌ．，  Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｓ．  Ｒ．，  Ｍａｙｅｒ，  Ａ．  Ｔ．，  ＭｃＣｒａｃｋｅｎ，  Ｍ．  Ｎ．，  Ｎａｔａｒａｊａｎ，  Ａ．，  Ｒｉｎｇ，  Ｎ．  Ｇ．，  Ｋｉｍｕｒａ，  Ｒ．，  Ｔｓａｉ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｍａｎｇｌｉｋ，  Ａ．，  Ｋｒｕｓｅ，  Ａ．  Ｃ．，  Ｇａｍｂｈｉｒ，  Ｓ．  Ｓ．，  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，  Ｉ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｒｉｎｇ，  Ａ．  Ｍ．  （２０１５）  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｈｉｇｈ-ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＰＤ-１  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏ-ＰＥＴ  ｉｍａｇｉｎｇ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１２，  Ｅ６５０６-１４．
ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，  Ｊ．，  Ｈａｎ，  Ｇ．，  Ｓｃｈａｌｐｅｒ，  Ｋ．  Ａ．，  Ｃａｒｖａｊａｌ-Ｈａｕｓｄｏｒｆ，  Ｄ．，  Ｐｅｌｅｋａｎｏｕ，  Ｖ．，  Ｒｅｈｍａｎ，  Ｊ．，  Ｖｅｌｃｈｅｔｉ，  Ｖ．，  Ｈｅｒｂｓｔ，  Ｒ．，  ＬｏＲｕｓｓｏ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｒｉｍｍ，  Ｄ．  Ｌ．  （２０１６）  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ＰＤ-Ｌ１  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｎｏｎ-Ｓｍａｌｌ-Ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．  ＪＡＭＡ  Ｏｎｃｏｌ  ２，  ４６-５４．
Ｍｅｅｒｂｒｅｙ，  Ｋ．  Ｌ．，  Ｈｕ，  Ｇ．，  Ｋｅｓｓｌｅｒ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｒｏａｒｔｙ，  Ｋ．，  Ｌｉ，  Ｍ．  Ｚ．，  Ｆａｎｇ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｈｅｒｓｃｈｋｏｗｉｔｚ，  Ｊ．  Ｉ．，  Ｂｕｒｒｏｗｓ，  Ａ．  Ｅ．，  Ｃｉｃｃｉａ，  Ａ．，  Ｓｕｎ，  Ｔ．，  Ｓｃｈｍｉｔｔ，  Ｅ．  Ｍ．，  Ｂｅｒｎａｒｄｉ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｆｕ，  Ｘ．，  Ｂｌａｎｄ，  Ｃ．  Ｓ．，  Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｔ．  Ａ．，  Ｓｃｈｉｆｆ，  Ｒ．，  Ｒｏｓｅｎ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ，  Ｔ．  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｅｌｌｅｄｇｅ，  Ｓ．  Ｊ．  （２０１１）  Ｔｈｅ  ｐＩＮＤＵＣＥＲ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｔｏｏｌｋｉｔ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０８，  ３６６５-３６７０．  
Ｍｅｎｇ，  Ｘ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｚ．，  Ｔｅｎｇ，  Ｆ．，  Ｘｉｎｇ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｙｕ，  Ｊ．  （２０１５）  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ＰＤ-１／ＰＤ-Ｌ１  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ  ４１，  ８６８-８７６．
Ｍｏｒｉｎ，  Ａ．，  Ｅｉｓｅｎｂｒａｕｎ，  Ｂ．，  Ｋｅｙ，  Ｊ．，  Ｓａｎｓｃｈａｇｒｉｎ，  Ｐ．  Ｃ．，  Ｔｉｍｏｎｙ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｏｔｔａｖｉａｎｏ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｓｌｉｚ，  Ｐ．  （２０１３）  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｏｎ  ｇｅｔｓ  ｔｈｅ  ｍｏｓｔ  ｏｕｔ  ｏｆ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．  Ｅｌｉｆｅ  ２，  ｅ０１４５６．
Ｎｏｌａｎ，  Ｅ．，  Ｓａｖａｓ，  Ｐ．，  Ｐｏｌｉｃｈｅｎｉ，  Ａ．  Ｎ．，  Ｄａｒｃｙ，  Ｐ．  Ｋ．，  Ｖａｉｌｌａｎｔ，  Ｆ．，  Ｍｉｎｔｏｆｆ，  Ｃ．  Ｐ．，  Ｄｕｓｈｙａｎｔｈｅｎ，  Ｓ．，  Ｍａｎｓｏｕｒ，  Ｍ．，  Ｐａｎｇ，  Ｊ．  Ｂ．，  Ｆｏｘ，  Ｓ．  Ｂ．，  Ｋａｔｈｌｅｅｎ  Ｃｕｎｉｎｇｈａｍ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｉｎｔｏ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｂｒｅａｓｔ，  Ｃ．，  Ｐｅｒｏｕ，  Ｃ．  Ｍ．，  Ｖｉｓｖａｄｅｒ，  Ｊ．  Ｅ．，  Ｇｒａｙ，  Ｄ．  Ｈ．  Ｄ．，  Ｌｏｉ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｅｍａｎ，  Ｇ．  Ｊ．  （２０１７）  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ａｓ  ａ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ＢＲＣＡ１-ｍｕｔａｔｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ９，  ３９３，  ｅａａｌ４９２２．
Ｏｋａｚａｋｉ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｈｏｎｊｏ，  Ｔ．  （２００７）  ＰＤ-１  ａｎｄ  ＰＤ-１  ｌｉｇａｎｄｓ：  ｆｒｏｍ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９，  ８１３-２４．
Ｏｏｓｔｉｎｇ，  Ｓ．  Ｆ．，  ｖａｎ  Ａｓｓｅｌｔ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｂｒｏｕｗｅｒｓ，  Ａ．  Ｈ．，  Ｂｏｎｇａｅｒｔｓ，  Ａ．  Ｈ．，  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｄ．，  ｄｅ  Ｊｏｎｇ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｌｕｂ-ｄｅ  Ｈｏｏｇｅ，  Ｍ．  Ｎ．，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｒｓｔ-Ｓｃｈｒｉｖｅｒｓ，  Ａ．  Ｎ．，  Ｗａｌｅｎｋａｍｐ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｈｏｖｉｎｇ，  Ｅ．  Ｗ．，  Ｓｌｕｉｔｅｒ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｚｏｎｎｅｎｂｅｒｇ，  Ｂ．  Ａ．，  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，  Ｅ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｌｉｎｋｓ，  Ｔ．  Ｐ．  （２０１６）  ８９Ｚｒ-Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ＰＥＴ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ-  Ｌｉｎｄａｕ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ５７，  １２４４-５０．
Ｏｕｄｅ  Ｍｕｎｎｉｎｋ，  Ｔ．  Ｈ．，  Ｈｅｎｓｔｒａ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｓｅｇｅｒｉｎｋ，  Ｌ．  Ｉ．，  Ｍｏｖｉｇ，  Ｋ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｂｒｕｍｍｅｌｈｕｉｓ-Ｖｉｓｓｅｒ，  Ｐ．  （２０１６）  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｒｕｇ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｄｉｓｅａｓｅ：  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｎｇ  ＴＮＦ-ａｌｐｈａ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ  ｔｏ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ．  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  ９９，  ４１９-４３１．
Ｏｏｓｔｉｎｇ，  Ｓ．  Ｆ．，  ｖａｎ  Ａｓｓｅｌｔ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｂｒｏｕｗｅｒｓ，  Ａ．  Ｈ．，  Ｂｏｎｇａｅｒｔｓ，  Ａ．  Ｈ．，  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｊ．  Ｄ．，  ｄｅ  Ｊｏｎｇ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｌｕｂ-ｄｅ  Ｈｏｏｇｅ，  Ｍ．  Ｎ．，  ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｈｏｒｓｔ-Ｓｃｈｒｉｖｅｒｓ，  Ａ．  Ｎ．，  Ｗａｌｅｎｋａｍｐ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｈｏｖｉｎｇ，  Ｅ．  Ｗ．，  Ｓｌｕｉｔｅｒ，  Ｗ．  Ｊ．，  Ｚｏｎｎｅｎｂｅｒｇ，  Ｂ．  Ａ．，  ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ，  Ｅ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｌｉｎｋｓ，  Ｔ．  Ｐ．  （２０１６）  ８９Ｚｒ-Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ＰＥＴ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ-Ｌｉｎｄａｕ  Ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ５７，  １２４４-１２５０．  
Ｐａｎｄｉｔ-Ｔａｓｋａｒ，  Ｎ．，  Ｏ´Ｄｏｎｏｇｈｕｅ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｄｕｒａｃｋ，  Ｊ．  Ｃ．，  Ｌｙａｓｈｃｈｅｎｋｏ，  Ｓ．  Ｋ．，  Ｃｈｅａｌ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｂｅｙｌｅｒｇｉｌ，  Ｖ．，  Ｌｅｆｋｏｗｉｔｚ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｃａｒｒａｓｑｕｉｌｌｏ，  Ｊ．  Ａ．，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｄ．  Ｆ．，  Ｆｕｎｇ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｓｏｌｏｍｏｎ，  Ｓ．  Ｂ．，  Ｇｏｎｅｎ，  Ｍ．，  Ｈｅｌｌｅｒ，  Ｇ．，  Ｌｏｄａ，  Ｍ．，  Ｎａｎｕｓ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｔａｇａｗａ，  Ｓ．  Ｔ．，  Ｆｅｌｄｍａｎ，  Ｊ．  Ｌ．，  Ｏｓｂｏｒｎｅ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｌｅｗｉｓ，  Ｊ．  Ｓ．，  Ｒｅｕｔｅｒ，  Ｖ．  Ｅ．，  Ｗｅｂｅｒ，  Ｗ．  Ａ．，  Ｂａｎｄｅｒ，  Ｎ．  Ｈ．，  Ｓｃｈｅｒ，  Ｈ．  Ｉ．，  Ｌａｒｓｏｎ，  Ｓ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｍ．  Ｊ．  （２０１５）  Ａ  Ｐｈａｓｅ  Ｉ／ＩＩ  Ｓｔｕｄｙ  ｆｏｒ  Ａｎａｌｙｔｉｃ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ８９Ｚｒ-Ｊ５９１  ＩｍｍｕｎｏＰＥＴ  ａｓ  ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ａｇｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２１，  ５２７７-８５．
Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  Ｌ．  Ｍ．，  Ｍａｎｋｏｆｆ，  Ｄ．  Ａ．，  Ｌａｗｔｏｎ，  Ｔ．，  Ｙａｇｌｅ，  Ｋ．，  Ｓｃｈｕｂｅｒｔ，  Ｅ．  Ｋ．，  Ｓｔｅｋｈｏｖａ，  Ｓ．，  Ｇｏｗｎ，  Ａ．，  Ｌｉｎｋ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｔｅｗｓｏｎ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｋｒｏｈｎ，  Ｋ．  Ａ．  （２００８）  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｅｓｔｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｗｉｔｈ  ＰＥＴ  ａｎｄ  １８Ｆ-ｆｌｕｏｒｏｅｓｔｒａｄｉｏｌ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ：  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４９，  ３６７-７４．
Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  Ｔ．，  Ｓｉｍｍｏｎｓ  Ｐ．，  Ｉｎｚｕｎｚａ  Ｈ．  Ｄ．，  Ｃｏｇｓｗｅｌｌ  Ｊ．，  Ｎｏｖｏｔｎｙ  Ｊ．  Ｊｒ，  Ｔａｙｌｏｒ  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ  Ｘ．  （２０１５）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ＰＤ-Ｌ１  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （ＩＨＣ）  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｎｏｎ-ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ，  Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌ．  ２３（８）：５４１-９．
Ｐｏｗｌｅｓ，  Ｔ．，  Ｅｄｅｒ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｆｉｎｅ，  Ｇ．  Ｄ．，  Ｂｒａｉｔｅｈ，  Ｆ．  Ｓ．，  Ｌｏｒｉｏｔ，  Ｙ．，  Ｃｒｕｚ，  Ｃ．，  Ｂｅｌｌｍｕｎｔ，  Ｊ．，  Ｂｕｒｒｉｓ，  Ｈ．  Ａ．，  Ｐｅｔｒｙｌａｋ，  Ｄ．  Ｐ．，  Ｔｅｎｇ，  Ｓ．  Ｌ．，  Ｓｈｅｎ，  Ｘ．  Ｄ．，  Ｂｏｙｄ，  Ｚ．，  Ｈｅｇｄｅ，  Ｐ．  Ｓ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｄ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｖｏｇｅｌｚａｎｇ，  Ｎ．  Ｊ．  （２０１４）  ＭＰＤＬ３２８０Ａ  （ａｎｔｉ-ＰＤ-Ｌ１）  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  ５１５，  ５５８-５６２．
Ｒａｔｈｋｏｐｆ，  Ｄ．  Ｅ．，  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｆｏｘ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｄａｎｉｌａ，  Ｄ．  Ｃ．，  Ｓｌｏｖｉｎ，  Ｓ．  Ｆ．，  Ｈａｇｅｒ，  Ｊ．  Ｈ．，  Ｒｉｘ，  Ｐ．  Ｊ．，  Ｃｈｏｗ  Ｍａｎｅｖａｌ，  Ｅ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｉ．，  Ｇｏｎｅｎ，  Ｍ．，  Ｆｌｅｉｓｈｅｒ，  Ｍ．，  Ｌａｒｓｏｎ，  Ｓ．  Ｍ．，  Ｓａｗｙｅｒｓ，  Ｃ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｓｃｈｅｒ，  Ｈ．  Ｉ．  （２０１３）  Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＡＲＮ-５０９，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ，  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ-ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３１，  ３５２５-３５３０．  
Ｒｅｕｂｉ，  Ｊ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｍａｅｃｋｅ，  Ｈ．  Ｒ．  （２００８）  Ｐｅｐｔｉｄｅ-ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍａｇｉｎｇ．  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ４９，  １７３５-８．
Ｒｏａｃｈ，  Ｃ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｎ．，  Ｃｏｒｉｇｌｉａｎｏ，  Ｅ．，  Ｊａｎｓｓｏｎ，  Ｍ．，  Ｔｏｌａｎｄ，  Ｇ．，  Ｐｏｎｔｏ，  Ｇ．，  Ｄｏｌｌｅｄ-Ｆｉｌｈａｒｔ，  Ｍ．，  Ｅｍａｎｃｉｐａｔｏｒ，  Ｋ．，  Ｓｔａｎｆｏｒｔｈ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｋｕｌａｎｇａｒａ，  Ｋ．  （２０１６）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ＰＤ-Ｌ１  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｎｏｎ-Ｓｍａｌｌ-ｃｅｌｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．  Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌ  ２４，  ３９２-７．
Ｓａｓｔｒｙ，  Ｇ．  Ｍ．，  Ａｄｚｈｉｇｉｒｅｙ，  Ｍ．，  Ｄａｙ，  Ｔ．，  Ａｎｎａｂｈｉｍｏｊｕ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，  Ｗ．  （２０１３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ：  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ａｎｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｖｉｒｔｕａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔｓ．  Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ  Ｄｅｓ  ２７，  ２２１-３４．
Ｓｈｅｎｇ，  Ｊ．，  Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  Ｓ．，  Ｓａｎｇｈａｖｉ，  Ｋ．，  Ｌｕ，  Ｚ．，  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｂ．  Ｊ．，  Ｂｅｌｌｏ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｇｕｐｔａ，  Ｍ．  （２０１７）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５７  Ｓｕｐｐｌ  １０，  Ｓ２６-Ｓ４２．
Ｓｍｉｔｈ-Ｊｏｎｅｓ，  Ｐ．  Ｍ．，  Ｆｒｉｄｒｉｃｈ，  Ｒ．，  Ｋａｄｅｎ，  Ｔ．  Ａ．，  Ｎｏｖａｋ-Ｈｏｆｅｒ，  Ｉ．，  Ｓｉｅｂｏｌｄ，  Ｋ．，  Ｔｓｃｈｕｄｉｎ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｍａｅｃｋｅ，  Ｈ．  Ｒ．  （１９９１）  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｃｏｐｐｅｒ-６７  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｃｒｏｃｙｃｌｅ  ４-［（１，４，８，１１-ｔｅｔｒａａｚａｃｙｃｌｏｔｅｔｒａｄｅｃ-１-ｙｌ）ｍｅｔｈｙｌ］ｂｅｎｚｏｉｃ  ａｃｉｄ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ  ２，  ４１５-２１．
Ｓｐｉｇｅｌ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒ，  Ｓ．  Ｎ．，  Ｈｏｒｎ，  Ｌ．，  Ｈｅｒｂｓｔ，  Ｒ．  Ｓ．，  Ｇａｎｄｈｉ，  Ｌ．，  Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｃｒｕｚ，  Ｃ．，  Ｃｏｎｋｌｉｎｇ，  Ｐ．，  Ｃａｓｓｉｅｒ，  Ｐ．  Ａ．，  Ａｎｔｏｎｉａ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｂｕｒｒｉｓ，  Ｈ．  Ａ．，  Ｆｉｎｅ，  Ｇ．  Ｄ．，  Ｍｏｋａｔｒｉｎ，  Ａ．，  Ｋｏｗａｎｅｔｚ，  Ｍ．，  Ｓｈｅｎ，  Ｘ．  Ｄ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｄ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｓｏｒｉａ，  Ｊ．  Ｃ．  （２０１３）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，  ｓａｆｅｔｙ，  ａｎｄ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ＭＰＤＬ３２８０Ａ，  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＰＤ-Ｌ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｎｏｎ-ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  （ＮＳＣＬＣ）．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３１，  １５＿ｓｕｐｐｌ，  ８００８-８００８．
Ｓｒｅｅｒａｍａ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｙ，  Ｒ．  Ｗ．  （２０００）  Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｆｒｏｍ  ｃｉｒｃｕｌａｒ  ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ  ｓｐｅｃｔｒａ：  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ＣＯＮＴＩＮ，  ＳＥＬＣＯＮ，  ａｎｄ  ＣＤＳＳＴＲ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｓｅｔ．  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２８７，  ２５２-６０．
Ｓｔｒｏｈ，  Ｍ．，  Ｗｉｎｔｅｒ，  Ｈ．，  Ｍａｒｃｈａｎｄ，  Ｍ．，  Ｃｌａｒｅｔ，  Ｌ．，  Ｅｐｐｌｅｒ，  Ｓ．，  Ｒｕｐｐｅｌ，  Ｊ．，  Ａｂｉｄｏｙｅ，  Ｏ．，  Ｔｅｎｇ，  Ｓ．  Ｌ．，  Ｌｉｎ，  Ｗ．  Ｔ．，  Ｄａｙｏｇ，  Ｓ．，  Ｂｒｕｎｏ，  Ｒ．，  Ｊｉｎ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｇｉｒｉｓｈ，  Ｓ．  （２０１７）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ  ｉｎ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｕｒｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ  １０２，  ３０５-３１２．
Ｓｕｎ，  Ｘ．，  Ｌｉ，  Ｙ．，  Ｌｉｕ，  Ｔ．，  Ｌｉ，  Ｚ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｘ．，  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  Ｘ．  （２０１６）  Ｐｅｐｔｉｄｅ-ｂａｓｅｄ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．
Ｓｕｎｓｈｉｎｅ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｔａｕｂｅ，  Ｊ．  Ｍ．  （２０１５）  ＰＤ-１／ＰＤ-Ｌ１  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２３，  ３２-８．
Ｔａｂｒｉｚｉ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｔｓｅｎｇ，  Ｃ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｒｏｓｋｏｓ，  Ｌ．  Ｋ．  （２００６）  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ  １１，  ８１-８８．  
Ｔａｕｂｅ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ａｎｄｅｒｓ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｙｏｕｎｇ，  Ｇ．  Ｄ．，  Ｘｕ，  Ｈ．，  Ｓｈａｒｍａ，  Ｒ．，  ＭｃＭｉｌｌｅｒ，  Ｔ．  Ｌ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｓ．，  Ｋｌｅｉｎ，  Ａ．  Ｐ．，  Ｐａｒｄｏｌｌ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｔｏｐａｌｉａｎ，  Ｓ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  Ｌ．  （２０１２）  Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｂ７-ｈ１  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ａｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｓｃａｐｅ．  Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ４，  １２７ｒａ１３７．
Ｔａｕｂｅ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｙｏｕｎｇ，  Ｇ．  Ｄ．，  ＭｃＭｉｌｌｅｒ，  Ｔ．  Ｌ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｓ．，  Ｓａｌａｓ，  Ｊ．  Ｔ．，  Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ，  Ｔ．  Ｓ．，  Ｘｕ，  Ｈ．，  Ｍｅｅｋｅｒ，  Ａ．  Ｋ．，  Ｆａｎ，  Ｊ．，  Ｃｈｅａｄｌｅ，  Ｃ．，  Ｂｅｒｇｅｒ，  Ａ．  Ｅ．，  Ｐａｒｄｏｌｌ，  Ｄ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｔｏｐａｌｉａｎ，  Ｓ．  Ｌ．  （２０１５）  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ-Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｇｅｎｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＰＤ-Ｌ１  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｉｎ  Ｍｅｌａｎｏｍａ：  Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＰＤ-１  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｂｌｏｃｋａｄｅ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２１，  ３９６９-３９７６．
Ｔｏｐａｌｉａｎ，  Ｓ．  Ｌ．，  Ｄｒａｋｅ，  Ｃ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｐａｒｄｏｌｌ，  Ｄ．  Ｍ．  （２０１５）  Ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ：  ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｄｅｎｏｍｉｎａｔｏｒ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２７，  ４５０-６１．
Ｔｏｐａｌｉａｎ，  Ｓ．  Ｌ．，  Ｔａｕｂｅ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ａｎｄｅｒｓ，  Ｒ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｐａｒｄｏｌｌ，  Ｄ．  Ｍ．  （２０１６）  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ-  ｄｒｉｖｅｎ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｔｏ  ｇｕｉｄｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １６，  ２７５-８７．
Ｗａｄａｓ，  Ｔ．  Ｊ．，  Ｗｏｎｇ，  Ｅ．  Ｈ．，  Ｗｅｉｓｍａｎ，  Ｇ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｃ．  Ｊ．  （２００７）  Ｃｏｐｐｅｒ  ｃｈｅｌａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｃｏｐｐｅｒ  ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ．  Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ  １３，  ３-１６．
Ｗｉｌｌｍａｎｎ，  Ｊ．  Ｋ．，  ｖａｎ  Ｂｒｕｇｇｅｎ，  Ｎ．，  Ｄｉｎｋｅｌｂｏｒｇ，  Ｌ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｇａｍｂｈｉｒ，  Ｓ．  Ｓ．  （２００８）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｉｎ  ｄｒｕｇ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ７，  ５９１-６０７．
Ｗｏｏｄａｒｄ，  Ｌ．  Ｅ．，  Ｄｅ  Ｓｉｌｖａ，  Ｒ．  Ａ．，  Ｂｅｈｎａｍ  Ａｚａｄ，  Ｂ．，  Ｌｉｓｏｋ，  Ａ．，  Ｐｕｌｌａｍｂｈａｔｌａ，  Ｍ．，  Ｗ，  Ｇ．  Ｌ．，  Ｍｅａｓｅ，  Ｒ．  Ｃ．，  Ｐｏｍｐｅｒ，  Ｍ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｎｉｍｍａｇａｄｄａ，  Ｓ．  （２０１４）  Ｂｒｉｄｇｅｄ  ｃｙｃｌａｍｓ  ａｓ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４  （ＣＸＣＲ４）．  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ  ４１，  ５５２-６１．
Ｗｕ，  Ｄ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｌ．，  Ｊｉａｎｇ，  Ｍ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｊｉａｎｇ，  Ｈ．  （２０１４）  Ｃｏｎｔｒａｓｔ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｐｈｏｔｏａｃｏｕｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏａｃｏｕｓｔｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ：    Ａ  ｒｅｖｉｅｗ．    Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｓｃｉ．  １５，  ２３６１６-２３６３９．
Ｗｕ，  Ａ．  Ｍ．  （２０１４）  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５，  １３９-１４７．
Ｙａｎｇ，  Ｊ．，  Ｚｈａｏ，  Ｈ．，  Ｇａｒｎｅｔｔ，  Ｃ．，  Ｒａｈｍａｎ，  Ａ．，  Ｇｏｂｂｕｒｕ，  Ｊ．  Ｖ．，  Ｐｉｅｒｃｅ，  Ｗ．，  Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，  Ｇ．，  Ｓｕｍｍｅｒｓ，  Ｊ．，  Ｋｅｅｇａｎ，  Ｐ．，  Ｂｏｏｔｈ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，  Ｙ．  （２０１３）  Ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ-ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｎｄ  ｃａｓｅ-ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎａｌｙｓｅｓ  ｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｄｅｃｉｓｉｏｎ  ｍａｋｉｎｇ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ５３，  １６０-１６６，  
Ｚａｋ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｋｉｔｅｌ，  Ｒ．，  Ｐｒｚｅｔｏｃｋａ，  Ｓ．，  Ｇｏｌｉｋ，  Ｐ．，  Ｇｕｚｉｋ，  Ｋ．，  Ｍｕｓｉｅｌａｋ，  Ｂ．，  Ｄｏｍｌｉｎｇ，  Ａ．，  Ｄｕｂｉｎ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｈｏｌａｋ，  Ｔ．  Ａ．  （２０１５）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ  １，  ＰＤ-１，  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｌｉｇａｎｄ  ＰＤ-Ｌ１．  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２３，  ２３４１-８．
前述の主題を、理解を明確にする目的で例示および実施例によってある程度詳細に説明してきたが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および修正を実施できることが当業者には理解されよう。
配列表：
配列番号１
ＷＬ１２アミノ酸配列＝シクロ-（-Ａｃ-Ｔｙｒ-ＮＭｅＡｌａ-Ａｓｎ-Ｐｒｏ-Ｈｉｓ-Ｌｅｕ-Ｈｙｐ-Ｔｒｐ-Ｓｅｒ-Ｔｒｐ（メチル）-ＮＭｅＮｌｅ-ＮＭｅＮｌｅ-Ｌｙｓ-Ｃｙｓ-）-Ｇｌｙ-ＮＨ２） 
配列番号２
ＤＫ-Ａ-２２１アミノ酸配列＝シクロ-（-Ａｃ-Ｔｙｒ-ＮＭｅＡｌａ-Ａｓｎ-Ｐｒｏ-Ｈｉｓ-Ｇｌｕ-Ｈｙｐ-Ｔｒｐ-Ｓｅｒ-Ｔｒｐ（カルボキシメチル）-ＮＭｅＮｌｅ-ＮＭｅＮｌｅ-Ｌｙｓ-Ｃｙｓ-）-Ｇｌｙ-ＮＨ２ 
【図１Ａ】
2020514278.tif 000014
【図１Ｂ】
2020514278.tif 000015
【図１Ｃ】
2020514278.tif 000016
【図２】
2020514278.tif 000017
【図３】
2020514278.tif 000018
【図４】
2020514278.tif 000019
【図５】
2020514278.tif 000020
【図６】
2020514278.tif 000021
【図７】
2020514278.tif 000022
【図８Ａ】
2020514278.tif 000023
【図８Ｂ】
2020514278.tif 000024
【図８Ｃ】
2020514278.tif 000025
【図９】
2020514278.tif 000026
【図１０】
2020514278.tif 000027
【図１１】
2020514278.tif 000028
【図１２】
2020514278.tif 000029
【図１３】
2020514278.tif 000030
【図１４】
2020514278.tif 000031
【図１５Ａ】
2020514278.tif 000032
【図１５Ｂ】
2020514278.tif 000033
【図１６】
2020514278.tif 000034
【図１７】
2020514278.tif 000035
【図１８Ａ】
2020514278.tif 000036
【図１８Ｂ】
2020514278.tif 000037
【図１８Ｃ】
2020514278.tif 000038
【図１９Ａ】
2020514278.tif 000039
【図１９Ｂ】
2020514278.tif 000040
【図１９Ｃ】
2020514278.tif 000041
【図２０】
2020514278.tif 000042
【図２１】
2020514278.tif 000043
【図２２】
2020514278.tif 000044
【図２３Ａ】
2020514278.tif 000045
【図２３Ｂ】
2020514278.tif 000046
【図２３Ｃ】
2020514278.tif 000047
【図２４Ａａｎｄ２４Ｂ】
2020514278.tif 000048
【図２４Ｃ】
2020514278.tif 000049
【図２５Ａ】
2020514278.tif 000050
【図２５Ｂ】
2020514278.tif 000051
【図２６】
2020514278.tif 000052
【図２７】
2020514278.tif 000053
【図２８】
2020514278.tif 000054
【図２９】
2020514278.tif 000055
【図３０】
2020514278.tif 000056
【図３１】
2020514278.tif 000057
【図３２】
2020514278.tif 000058
【図３３Ａ】
2020514278.tif 000059
【図３３Ｂ】
2020514278.tif 000060
【図３３Ｃ】
2020514278.tif 000061
【図３４−１】
2020514278.tif 000062
【図３４−２】
2020514278.tif 000063
【図３５−１】
2020514278.tif 000064
【図３５−２】
2020514278.tif 000065
【図３５−３】
2020514278.tif 000066
【図３６】
2020514278.tif 000067
【図３７】
2020514278.tif 000068
【図３８】
2020514278.tif 000069
【図３９】
2020514278.tif 000070
【図４０】
2020514278.tif 000071
【図４１】
2020514278.tif 000072
【図４２】
2020514278.tif 000073
【図４３】
2020514278.tif 000074
【国際調査報告】
2020514278.tif 000075
2020514278.tif 000076
2020514278.tif 000077
2020514278.tif 000078
2020514278.tif 000079