(57)【要約】  癌の治療に使用するためのＴｒｅｇ枯渇抗４−１ＢＢ抗体またはＴｒｅｇ枯渇ＯＸ−４０抗体などの、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に属する標的に特異的に結合する抗体分子などの抗体分子から選択されるＴｒｅｇ枯渇抗体分子を最初に、次いで免疫刺激性抗４−１ＢＢ抗体または免疫刺激性ＯＸ−４０抗体などの免疫刺激性抗体分子の順次投与が記載されている。また、かかる順次投与に使用され得る新規抗４−１ＢＢ抗体および新規ＯＸ−４０抗体についても記載されている。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の治療に使用するためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子であって、免疫刺激性抗体分子と順次投与され、前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が前記免疫刺激性抗体分子の投与の前に投与される、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項２】
前記免疫刺激性抗体分子が、ＣＤ８活性化および／またはＣＤ８増強抗体分子である、請求項１に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
【請求項３】
前記癌が、肉腫、癌腫、リンパ腫、および卵巣癌からなる群から選択される固形腫瘍、ならびに／または扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、胸腺腫、神経芽細胞腫、もしくは卵巣癌からなる群から選択される固形腫瘍などの固形腫瘍である、請求項１または２に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項４】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子および／または前記免疫刺激性抗体分子が、完全サイズ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）2からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項５】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、任意選択的に、少なくとも１つの活性化ＦｃγＲへの改善された結合のために操作され得るヒトＩｇＧ１抗体である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項６】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に属する標的に特異的に結合する抗体分子から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項７】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、およびＴＮＦＲ２からなる群から選択される標的に特異的に結合する抗体分子である、請求項６に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項８】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５、およびニューロピリン−１から選択される標的に特異的に結合する抗体分子である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項９】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、抗４−１ＢＢモノクローナル抗体分子である、請求項７に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項１０】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号１〜６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号９〜１４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１７〜２２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号２５〜３０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号３３〜３８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号４１〜４６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号４９〜５４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号５７〜６２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号６５〜７０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１５３〜１５８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、および配列番号１６３〜１６８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項９に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
【請求項１１】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、１５９、および１６９からなる群から選択される可変重鎖、ならびに／または配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、１６０、および１７０からなる群から選択される可変軽鎖、を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
【請求項１２】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７および８、配列番号１５および１６、配列番号２３および２４、配列番号３１および３２、配列番号３９および４０、または配列番号４７および４８、配列番号５５および５６、配列番号６３および６４、配列番号７１および７２、配列番号１５９〜１６０、ならびに配列番号１６９〜１７０を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項１０または１１に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
【請求項１３】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体が、ヒト抗ＯＸ４０モノクローナル抗体分子である、請求項７に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項１４】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７３〜７８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号８１〜８６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号８９〜９４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号９７〜１０２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１０５〜１１０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１１３〜１１８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１２１〜１２６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１２９〜１３４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１３７〜１４２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１４５〜１５０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、および配列番号１７１〜１７６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項１３に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
【請求項１５】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、および１７７からなる群から選択される可変重鎖、ならびに／または配列番号８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、および１７８からなる群から選択される可変軽鎖、を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
【請求項１６】
前記免疫刺激性抗体分子が、任意選択的に、活性化Ｆｃガンマ受容体を上回る、ヒトＦｃγＲＩＩＢへの向上した結合のために操作され得るヒトＩｇＧ２抗体またはヒトＩｇＧ４抗体分子である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
【請求項１７】
前記免疫刺激性抗体分子が、任意選択的に、活性化Ｆｃガンマ受容体を上回る、ヒトＦｃγＲＩＩＢへの向上した結合のために操作され得るヒトＩｇＧ２ｂ抗体分子である、請求項１６に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
【請求項１８】
前記免疫刺激性抗体分子が、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５、ＰＤ−１、およびＰＤＬ１からなる群から選択される標的に特異的に結合する抗体である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項１９】
前記免疫刺激性抗体分子が、抗４−１ＢＢ抗体分子である、請求項１８に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項２０】
前記免疫刺激性抗体分子が、配列番号１〜６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号９〜１４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１７〜２２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号２５〜３０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号３３〜３８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号４１〜４６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号４９〜５４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号５７〜６２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号６５〜７０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１５３〜１５８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、および配列番号１６３〜１６８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項１９に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項２１】
前記免疫刺激性抗体分子が、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、１５９、および１６９からなる群から選択される可変重鎖、ならびに／または配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、１６０、および１７０からなる群から選択される可変軽鎖、を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項２０に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
【請求項２２】
免疫刺激性抗体分子が、配列番号７および８、配列番号１５および１６、配列番号２３および２４、配列番号３１および３２、配列番号３９および４０、ならびに配列番号４７および４８、配列番号５５および５６、配列番号６３および６４、配列番号７１および７２、配列番号１５９および１６０、ならびに配列番号１６９および１７０を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項２０または２１に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
【請求項２３】
前記免疫刺激性抗体分子が、抗ＯＸ４０抗体分子である、請求項１８に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項２４】
前記免疫刺激性抗体分子が、配列番号７３〜７８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号８１〜８６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号８９〜９４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号９７〜１０２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１０５〜１１０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１１３〜１１８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１２１〜１２６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１２９〜１３４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１３７〜１４２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１４５〜１５０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、および配列番号１７１〜１７６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項２３に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項２５】
前記免疫刺激性抗体分子が、配列番号７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、および１７７からなる群から選択される可変重鎖、ならびに／または配列番号８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、および１７８からなる群から選択される可変軽鎖、を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項２４に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
【請求項２６】
前記免疫刺激性抗体分子が、配列番号７９および８０、配列番号８７および８８、配列番号９５および９６、配列番号１０３および１０４、配列番号１１１および１１２、配列番号１１９および１２０、配列番号１２７および１２８、配列番号１３５および１３６、配列番号１４３および１４４、配列番号１５１および１５２、ならびに配列番号１７７〜１７８を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項２４または２５に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
【請求項２７】
前記免疫刺激性抗体分子が、ヒト抗ＰＤ１モノクローナル抗体分子、ヒト抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体分子、またはヒト抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体分子である、請求項１８に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項２８】
前記免疫刺激性抗体分子が、ニボルマブおよびペンブロリズマブからなる群から選択されるヒト抗ＰＤ１モノクローナル抗体分子、または抗ＰＤＬ１抗体アテゾリズマブ、またはイピリムマブおよびトレミリムマブからなる群から選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項２７に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
【請求項２９】
配列番号１〜６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号９〜１４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１７〜２２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号２５〜３０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号３３〜３８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号４１〜４６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号４９〜５４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号５７〜６２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号６５〜７０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１５３〜１５８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、および配列番号１６３〜１６８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体分子。
【請求項３０】
配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、１５９、および１６９からなる群から選択される可変重鎖、ならびに／または配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、１６０、および１７０からなる群から選択される可変軽鎖、を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項２９に記載の抗４−１ＢＢ抗体分子。
【請求項３１】
配列番号７および８、配列番号１５および１６、配列番号２３および２４、配列番号３１および３２、配列番号３９および４０、配列番号４７および４８、配列番号５５および５６、配列番号６３および６４、配列番号７１および７２、配列番号１５９および１６０、ならびに配列番号１６９〜１７０を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項２９または３０に記載の抗４−１ＢＢ抗体分子。
【請求項３２】
完全長ＩｇＧ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）2からなる群から選択される、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の抗４−１ＢＢ抗体分子。
【請求項３３】
前記完全長ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびそれらのＦｃ操作変異体からなる群から選択される、請求項４９に記載の抗４−１ＢＢ抗体分子。
【請求項３４】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子および／または前記免疫刺激性抗体分子が、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の抗４−１ＢＢ抗体分子。
【請求項３５】
配列番号７３〜７８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号８１〜８６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号８９〜９４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号９７〜１０２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１０５〜１１０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１１３〜１１８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１２１〜１２６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１２９〜１３４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１３７〜１４２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１４５〜１５０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、および配列番号１７１〜１７６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、抗ＯＸ４０抗体分子。
【請求項３６】
配列番号７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、および１７７からなる群から選択される可変重鎖、ならびに／または配列番号８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、および１７８からなる群から選択される可変軽鎖、を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項３５に記載の抗ＯＸ４０抗体分子。
【請求項３７】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子および／または前記免疫刺激性抗体分子が、完全長ＩｇＧ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）2からなる群から選択される、請求項３５または３６に記載の抗ＯＸ４０抗体分子。
【請求項３８】
前記完全長ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびそれらのＦｃ操作変異体からなる群から選択される、請求項３７に記載の抗ＯＸ４０抗体分子。
【請求項３９】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子および／または前記免疫刺激性抗体分子が、ヒトまたはヒト化抗体である、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体分子。
【請求項４０】
請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
【請求項４１】
請求項４０に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項４２】
請求項４１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４３】
薬に使用するための請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の、抗体。
【請求項４４】
請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項４５】
癌の治療に使用するための請求項４３に記載の抗体、または請求項４４に記載の医薬組成物。
【請求項４６】
前記癌が、肉腫、癌腫、およびリンパ腫からなる群から選択される固形腫瘍、ならびに／または扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、胸腺腫、神経芽細胞腫、もしくは卵巣癌からなる群から選択される固形腫瘍などの固形腫瘍である、請求項４５に記載の抗体または医薬組成物。
【請求項４７】
請求項２９〜３９のいずれか１項に記載の抗体、または請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の抗体および請求項３５〜３９のいずれか１項に記載の抗体を含む医薬組成物。
【請求項４８】
前記医薬組成物が癌の治療用である、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の抗体または請求項４７に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
前記癌が、肉腫、癌腫、およびリンパ腫からなる群から選択される固形腫瘍、ならびに／または扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、胸腺腫、神経芽細胞腫、もしくは卵巣癌からなる群から選択される固形腫瘍などの固形腫瘍である、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の抗体または請求項４８に記載の医薬組成物。
【請求項５０】
癌の治療に使用するための医薬組成物の製造のための請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項５１】
前記癌が、肉腫、癌腫、およびリンパ腫からなる群から選択される固形腫瘍、ならびに／または扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、胸腺腫、神経芽細胞腫、もしくは卵巣癌からなる群から選択される固形腫瘍などの固形腫瘍である、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
対象における癌を治療するための方法であって、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が前記対象に投与され、前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子の前記投与と順次、免疫刺激性抗体分子が投与される、方法。
【請求項５３】
前記免疫刺激性抗体分子が、ＣＤ８活性化および／またはＣＤ８増強抗体分子である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記癌が、肉腫、癌腫、およびリンパ腫からなる群から選択される固形腫瘍、ならびに／または扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、胸腺腫、神経芽細胞腫、もしくは卵巣癌からなる群から選択される固形腫瘍などの固形腫瘍である、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子および／または前記免疫刺激性抗体分子が、完全長ＩｇＧ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）2からなる群から選択される、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記完全長ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびそれらのＦｃ操作変異体からなる群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、任意選択的に、少なくとも１つの活性化ＦｃγＲへの改善された結合のために操作され得るヒトＩｇＧ１抗体である、請求項５２〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に属する標的に特異的に結合する抗体分子から選択される、請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、およびＴＮＦＲ２からなる群から選択される標的に特異的に結合する抗体分子である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５、およびニューロピリン−１からなる群から選択される標的に特異的に結合する抗体分子から選択される、請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、抗４−１ＢＢモノクローナル抗体分子である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号１〜６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号９〜１４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１７〜２２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号２５〜３０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号３３〜３８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号４１〜４６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号４９〜５４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号５７〜６２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号６５〜７０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１５３〜１５８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、および配列番号１６３〜１６８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、１５９、および１６９からなる群から選択される可変重鎖、ならびに／または配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、１６０、および１７０からなる群から選択される可変軽鎖、を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７および８、配列番号１５および１６、配列番号２３および２４、配列番号３１および３２、配列番号３９および４０、ならびに配列番号４７および４８、配列番号５５および５６、配列番号６３および６４、配列番号７１および７２、配列番号１５９および１６０、ならびに配列番号１６９〜１７０を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項６３または６４に記載の方法。
【請求項６５】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体が、ヒト抗ＯＸ４０モノクローナル抗体分子である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７３〜７８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号８１〜８６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号８９〜９４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号９７〜１０２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１０５〜１１０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１１３〜１１８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１２１〜１２６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１２９〜１３４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１３７〜１４２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１４５〜１５０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、および配列番号１７１〜１７６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、および１７７からなる群から選択される可変重鎖、ならびに／または配列番号８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、および１７８からなる群から選択される可変軽鎖、を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記免疫刺激性抗体分子が、任意選択的に、活性化Ｆｃガンマ受容体を上回る、ヒトＦｃγＲＩＩＢへの向上した結合のために操作され得るヒトＩｇＧ２抗体またはヒトＩｇＧ４抗体分子である、請求項７８〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記免疫刺激性抗体分子が、任意選択的に、活性化Ｆｃガンマ受容体を上回る、ヒトＦｃγＲＩＩＢへの向上した結合のために操作され得るヒトＩｇＧ２ｂ抗体分子である、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記免疫刺激性抗体分子が、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５、ＰＤ−１、およびＰＤＬ１からなる群から選択される標的に特異的に結合する抗体である、請求項５２〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記免疫刺激性抗体分子が、抗４−１ＢＢ抗体分子である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記免疫刺激性抗体分子が、配列番号１〜６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号９〜１４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１７〜２２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号２５〜３０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号３３〜３８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号４１〜４６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号４９〜５４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号５７〜６２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号６５〜７０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１５３〜１５８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、および配列番号１６３〜１６８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記免疫刺激性抗体分子が、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、１５９、および１６９からなる群から選択される可変重鎖、ならびに／または配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、１６０、および１７０からなる群から選択される可変軽鎖、を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７４】
免疫刺激性抗体分子が、配列番号７および８、配列番号１５および１６、配列番号２３および２４、配列番号３１および３２、配列番号３９および４０、または配列番号４７および４８、配列番号５５および５６、配列番号６３および６４、配列番号７１および７２、配列番号１５９および１６０、ならびに配列番号１６９および１７０を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記免疫刺激性抗体分子が、抗ＯＸ４０抗体分子である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
前記免疫刺激性抗体分子が、配列番号７３〜７８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号８１〜８６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号８９〜９４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号９７〜１０２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１０５〜１１０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１１３〜１１８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１２１〜１２６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１２９〜１３４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１３７〜１４２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１４５〜１５０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、および配列番号１７１〜１７６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記免疫刺激性抗体分子が、配列番号７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、および１７７からなる群から選択される可変重鎖、ならびにまたは配列番号８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、および１７８からなる群から選択される可変軽鎖、を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項７４または７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記免疫刺激性抗体分子が、配列番号７９および８０、配列番号８７および８８、配列番号９５および９６、配列番号１０３および１０４、配列番号１１１および１１２、配列番号１１９および１２０、配列番号１２７および１２８、配列番号１３５および１３６、配列番号１４３および１４４、配列番号１５１および１５２、ならびに配列番号１７７および１７８を含む抗体分子からなる群から選択される、請求項７４〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記免疫刺激性抗体分子が、ヒト抗ＰＤ１モノクローナル抗体分子、ヒト抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体分子、またはヒト抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体分子である、請求項７０に記載の方法。
【請求項８０】
前記免疫刺激性抗体分子が、ニボルマブおよびペンブロリズマブからなる群から選択されるヒト抗ＰＤ１モノクローナル抗体分子、または抗ＰＤＬ１抗体アテゾリズマブ、またはイピリムマブおよびトレミリムマブからなる群から選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
本明細書の説明、実施例および／または図に記載の使用、方法、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療に使用するための、最初にＴｒｅｇ枯渇抗体分子、次いで免疫刺激性抗体分子の順次投与に関する。本発明はまた、新規抗４−１ＢＢ抗体および新規抗ＯＸ４０抗体を含む、かかる治療に使用するための新規抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫調節性ｍＡｂを用いる有望な臨床結果によって、免疫系が癌制御の鍵を握っているとの考えが復活している。最近、チェックポイントブロッカー（アンタゴニスト）または共刺激分子（アゴニスト）の両方のタイプが活性化ＦｃγＲ結合および抑制性制御Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の枯渇を通じて腫瘍と闘うことができるという例が見出され、これらのｍＡｂを、チェックポイントブロッカーまたは共刺激分子の活性化因子に分類することが、疑問視されている。これらの知見とは対照的に、抗ＣＤ４０ｍＡｂは、アゴニスト免疫を刺激するのに、抑制性ＦｃγＲ架橋に依存している。したがって、免疫調節性ｍＡｂは、癌免疫療法の相当な有望性を提供するが、様々なｍＡｂによって用いられるエフェクター機序、およびその結果としての最適な用途は、依然として明らかではない。
【０００３】
イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ４）、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、および抗ＣＤ４０などの免疫調節性ｍＡｂは、少数の患者ではあるが、治療が困難な悪性腫瘍で試験すると肯定的な結果を示した（１〜４）。これらの有望な結果は、免疫系が癌制御の鍵を握り得るという考えの再活性化を助長している。これらのｍＡｂは、Ｔ細胞またはＡＰＣの重要な分子調節因子を標的とし、抑制シグナルの遮断（チェックポイントブロッカー）、または共刺激シグナルの送達（アゴニスト）を通じて、抗癌免疫を増強するために生成された。抗ＣＴＬＡ４、抗ＧＩＴＲ、および抗ＯＸ４０（すべてがＴ細胞を標的とする）の治療活性が、活性化ＦｃγＲの共結合に依存して、抑制性ＣＤ４＋Ｔ調節細胞の欠失に関与することが見出されると、最近、この二元性の分類が疑問視されている（５〜７）。対照的に、アゴニストＡＰＣ標的化抗ＣＤ４０ｍＡｂの活性は、ＣＤ４０シグナル伝達および免疫刺激に必要な、効果的なｍＡｂ架橋を促進する抑制性ＦｃγＲの共結合を必要とする（８〜１０）。したがって、免疫調節性ｍＡｂは癌免疫療法に相当な有望性を提供するが、用いられる機序は、病気によって定まる様式でｍＡｂのＦａｂおよびＦｃ領域の両方に依存し、標的となる細胞のタイプに依存し得る。直接免疫刺激に対するＴreg枯渇の相対的な重要性を理解することは、免疫調節性ｍＡｂの開発、および患者への翻訳の成功に不可欠であろう。
【発明の概要】
【０００４】
本発明は、抗体アイソタイプおよびＦｃγＲの利用可能性に依存する主要な機序を用いて、抗４−１ＢＢ  ｍＡｂが、固形腫瘍において直接免疫刺激またはＴreg枯渇のいずれかを用いることができることを実証する研究に基づいている。重要なことに、枯渇と免疫刺激とは、競合する機序であると思われ、おそらくＦｃγＲ結合の制限によって限定される。本発明に至る研究はさらに、アイソタイプが異なる抗４−１ＢＢ  ｍＡｂまたはアイソタイプが最適な抗４−１ＢＢ  ｍＡｂ、続いて抗ＰＤ−１ｍＡｂを順次投与することによって、最初にＴｒｅｇを欠失させ、次いでＣＤ８  Ｔ細胞を刺激することが、反応の増強につながり、療法の向上および結果の改善をもたらすことを示している。さらに、本発明者らは、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域「Ｂ」（ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２Ｂ）を有する枯渇抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａを操作して、ＦｃγＲに依存しないアゴニズムを提供し、この単一ｍＡｂが両方の機序を利用して向上した療法を送達する可能性を実証する。
【０００５】
次いで、免疫刺激性抗４−１ＢＢ抗体、免疫刺激性抗ＯＸ４０抗体などの免疫刺激性抗体分子または免疫活性化ＰＤ−１遮断抗体と組み合わせた、抗４−１ＢＢ  ｍＡｂに加えてさらなる抗体、すなわち腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に属する標的に特異的に結合する抗体分子、例えば、Ｔｒｅｇ枯渇抗４−１ＢＢ抗体またはＴｒｅｇ枯渇抗ＯＸ４０抗体などのＴｒｅｇ枯渇抗体分子を用いる、Ｔｒｅｇ枯渇に続く免疫刺激によってこれを達成することができるという実証によって、この可能性は広がり、投与の順序は、所望の効果を達成するために重要である。この研究はまた、新規抗４−１ＢＢ抗体および新規抗ＯＸ４０抗体の開発にも至る。
【０００６】
したがって、本発明は、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、免疫刺激性抗体分子と順次投与され、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が免疫刺激性抗体分子の投与の前に投与される、癌の治療に使用するためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子に関する。
【０００７】
本発明はさらに、対象の癌を治療する方法に関し、当該治療が、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子の投与、続いて免疫刺激性抗体分子の順次投与を含む。
【０００８】
本発明はさらに、配列番号１〜６、９〜１４、１７〜２２、２５〜３０、３３〜３８、４１〜４６、４９〜５４、５７〜６２、６５〜７０、１５３〜１５８、および１６３〜１６８から選択されるＣＤＲのうちの１つ以上を含む抗体分子からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体分子に関する。「１つ以上」とは、この文脈において、抗体分子が、示された配列のうちの１、２、３、４、５、または６個、すなわち示された配列のうちの１〜６個を含むことを意味する。したがって、抗４−１ＢＢ抗体分子は、配列番号１〜６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号９〜１４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１７〜２２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号２５〜３０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号３３〜３８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号４１〜４６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号４９〜５４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号５７〜６２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号６５〜７０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１５３〜１５８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、または配列番号１６３〜１６８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個を含み得る。
【０００９】
本発明はさらに、上記の抗４−１ＢＢ抗体分子をコードする核酸に関する。
【００１０】
本発明はさらに、配列番号７３〜７８、８１〜８６、８９〜９４、９７〜１０２、１０５〜１１０、配列番号１１３〜１１８、配列番号１２１〜１２６、配列番号１２９〜１３４、配列番号１３７〜１４２、配列番号１４５〜１５０、および配列番号１７１〜１７６から選択されるＣＤＲのうちの１つ以上を含む抗体分子からなる群から選択される抗ＯＸ４０抗体分子に関する。再び、「１つ以上」とは、この文脈において、抗体分子が、示された配列のうちの１、２、３、４、５、または６個、すなわち示された配列のうちの１〜６個を含むことを意味する。したがって、抗ＯＸ４０抗体分子は、配列番号７３〜７８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号８１〜８６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号８９〜９４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号９７〜１０２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１０５〜１１０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１１３〜１１８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１２１〜１２６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１２９〜１３４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１３７〜１４２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１４５〜１５０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、または配列番号１７１〜１７６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個を含み得る。
【００１１】
本発明はさらに、上記の核酸を含むベクターに関する。
【００１２】
本発明はさらに、上記の核酸および／または上記のベクターを含む宿主細胞に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
制御性Ｔ細胞、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ細胞、ＴｒｅｇまたはＴreg（以前は抑制性Ｔ細胞として知られ、時に抑制性制御性Ｔ細胞とも称される）は、正常および病理学的な免疫環境で他の免疫細胞を抑制することが可能なＴ細胞の亜集団である。
【００１４】
本明細書では、Ｔｒｅｇの枯渇、すなわちＴｒｅｇ枯渇とは、細胞の物理的クリアランスを通じたＴｒｅｇの枯渇、欠失、または排除を指す。具体的には、腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇を指す。
【００１５】
エフェクターＴ細胞は、刺激に応答して、抗原：ＭＨＣ：ＴＣＲによって制限される様式で、抗原発現細胞を活性化、攻撃、または破壊するＴ細胞またはＴリンパ球である。エフェクターＴ細胞は、癌を制御し、腫瘍細胞を直接根絶する（細胞傷害性Ｔ細胞）か、あるいは他の免疫細胞の活性化を通じて間接的に根絶する（Ｔヘルパー細胞）ことができる。
【００１６】
抗体は、免疫学および分子生物学当業者には周知である。典型的には、抗体は、２つの重鎖（Ｈ）と２つの軽鎖（Ｌ）とを含む。本明細書では、時にこの完全な抗体分子を完全サイズ抗体または完全長抗体と称する。抗体の重鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＨ）と３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）とを含み、抗体の分子軽鎖は、１つの可変ドメイン（ＶＬ）と１つの定常ドメインと（ＣＬ）を含む。可変ドメイン（時にＦV領域と総称される）は、抗体の標的、すなわち抗原に結合する。各可変ドメインは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３つのループで構成され、これらのループが標的の結合を担う。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、様々なエフェクター機能を呈する。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体または免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、ヒトでは、これらのうちのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４；ＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分割される抗体の別の部分は、Ｆｃドメイン（あるいは断片結晶性ドメインとしても知られている）であり、抗体の重鎖の各々の２つの定常ドメインを含む。Ｆｃドメインは、抗体とＦｃ受容体との間の相互作用を担う。
【００１７】
Ｆｃ受容体は、多くの場合、免疫系の細胞の細胞表面上に見られる膜タンパク質である（すなわち、Ｆｃ受容体は、標的細胞膜上に見られる−あるいは形質膜または細胞質膜としても知られている）。Ｆｃ受容体の役割は、Ｆｃドメインを介して抗体に結合し、抗体を細胞内に取り込むことである。免疫系では、これによって、抗体が媒介する食作用、および抗体に依存して細胞が媒介する細胞傷害をもたらし得る。
【００１８】
本明細書で使用される場合、抗体分子という用語は、完全長または完全サイズ抗体、ならびに完全長抗体の機能的断片およびかかる抗体分子の誘導体を包含する。
【００１９】
完全サイズ抗体の機能的断片は、対応する完全サイズ抗体と同じ抗原結合特徴を有し、対応する完全サイズ抗体と同じ可変ドメイン（すなわち、ＶＨおよびＶＬ配列）および／または同じＣＤＲ配列のいずれかを含む。機能的断片が、対応する完全サイズ抗体と同じ抗原結合特徴を有するということは、完全サイズ抗体と同じ標的上のエピトープに結合することを意味する。かかる機能的断片は、完全サイズ抗体のＦｖ部分に対応し得る。あるいは、かかる断片は、Ｆｃ部分を含有しない、一価の抗原結合断片であるＦ（ａｂ）とも表されるＦａｂ、またはジスルフィド結合によって一緒に連結された２つの抗原結合Ｆａｂ部分を含有する二価の抗原結合断片であるＦ（ａｂ’）2、またはＦ（ａｂ’）、すなわちＦ（ａｂ’）2の一価の変異体であり得る。かかる断片は、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）でもあり得る。
【００２０】
機能的断片は、対応する完全サイズ抗体の６つすべてのＣＤＲを常に含有するわけではない。３つ以下のＣＤＲ領域（場合によっては、単一ＣＤＲまたはその一部のみ）を含有する分子は、そのＣＤＲ（複数可）に由来する抗体の抗原結合活性を保持可能であることが理解される。例えば、ＶＬ鎖全体（３つすべてのＣＤＲを含む）がその基質に対して高い親和性を有することが、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：３２３８９−９３に記載されている。
【００２１】
２つのＣＤＲ領域を含有する分子については、例えば、Ｖａｕｇｈａｎ＆Ｓｏｌｌａｚｚｏ  ２００１，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＆Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，４：４１７−４３０に記載されている。４１８頁（右欄−３（Ｏｕｒ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｄｅｓｉｇｎ））に、フレームワーク領域内に散在するＨ１およびＨ２  ＣＤＲ超可変領域のみを含むミニボディについて記載されている。ミニボディは、標的に結合可能であると記載されている。Ｐｅｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：３６７−９、およびＢｉａｎｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３６：６４９−５９は、Ｖａｕｇｈａｎ＆Ｓｏｌｌａｚｚｏによって参照され、Ｈ１およびＨ２ミニボディ、ならびにその特性についてより詳細に記載している。Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：９２１−９では、２つの連結されたＣＤＲからなる分子が抗原に結合可能であることが実証されている。Ｑｕｉｏｃｈｏ  １９９３，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２９３−４は、「ミニボディ」技術の概要を提供している。Ｌａｄｎｅｒ  ２００７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２５：８７５−７は、２つのＣＤＲを含有する分子が抗原結合活性を保持可能であると言明している。
【００２２】
単一ＣＤＲ領域を含有する抗体分子については、例えば、Ｌａｕｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，ＪＢＣ，２７２：３０９３７−４４に記載されており、ここで、ＣＤＲに由来する一連のヘキサペプチドが抗原結合活性を示すことを実証し、完全な単一ＣＤＲの合成ペプチドが強力な結合活性を示すことに留意している。Ｍｏｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，ＪＢＣ，２７４：３７８９−９６では、一連の１２量体ペプチドおよび関連するフレームワーク領域が、抗原結合活性を有することが示されており、ＣＤＲ３様ペプチド単独で抗原に結合可能であることを明言している。Ｈｅａｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，８６：１７９１−１８００では、「マイクロ抗体」（単一ＣＤＲを含有する分子）は、抗原結合可能であることが報告されており、抗ＨＩＶ抗体の環状ペプチドが、抗原結合活性および機能を有することが示されている。Ｎｉｃａｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３：１８８２−９１では、単一ＣＤＲが、そのリゾチーム抗原に対する抗原結合活性および親和性を付与することができることが示されている。
【００２３】
したがって、５個、４個、３個またはそれ以下のＣＤＲを有する抗体分子は、それらが由来する完全長抗体の抗原結合特性を保持可能である。
【００２４】
抗体分子は、完全長抗体の誘導体またはかかる抗体の断片であってもよい。誘導体が、対応する完全サイズ抗体と同じ抗原結合特徴を有するということは、完全サイズ抗体と同じ標的上のエピトープに結合することを意味する。
【００２５】
したがって、本明細書で使用する場合、「抗体分子」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体、組換えて生成された抗体、多重特異性抗体、二重特異性抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗体重鎖、抗体軽鎖、抗体重鎖のホモ二量体、抗体軽鎖のホモ二量体、抗体重鎖のヘテロ二量体、抗体軽鎖のヘテロ二量体、かかるホモおよびヘテロ二量体の抗原結合機能的断片を含む、すべてのタイプの抗体分子、ならびにそれらの機能的断片およびそれらの誘導体を含む。
【００２６】
さらに、本明細書で使用される場合、「抗体分子」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含む、すべてのクラスの抗体分子および機能的断片を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１である。当業者は、マウスＩｇＧ２ａおよびヒトＩｇＧ１が、活性化Ｆｃガンマ受容体と生産的に結合し、例えばＡＤＣＰおよびＡＤＣＣによる、活性化Ｆｃガンマ受容体を担持する免疫細胞（例えばマクロファージおよびＮＫ細胞）の活性化を通じて、標的細胞の欠失を活性化する能力を共有していることを認識している。このように、マウスＩｇＧ２ａは、マウスでの欠失に好ましいアイソタイプである一方で、ヒトＩｇＧ１は、ヒトにおける欠失に好ましいアイソタイプである。逆に、ＴＮＦＲスーパーファミリーのアゴニスト受容体、例えば４−１ＢＢ、ｏｘ４０、ＴＮＦＲＩＩ、ＣＤ４０の最適な共刺激は、抑制性ＦｃγＲＩＩの抗体結合に依存することが知られている。マウスでは、抑制性Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲＩＩＢ）に優先的に結合し、活性化Ｆｃガンマ受容体に弱くのみ結合するＩｇＧ１アイソタイプは、ｍＡｂを標的とするＴＮＦＲスーパーファミリーの共刺激活性に最適であることが知られている。ヒトでのマウスＩｇＧ１アイソタイプの直接的な同等物については記載されていないが、活性化ヒトＦｃガンマ受容体を上回る抑制性ヒトＦｃガンマ受容体への同様に向上した結合を示すように抗体を操作することができる。かかる操作されたＴＮＦＲスーパーファミリー標的化抗体はまた、ヒト活性化および抑制性Ｆｃガンマ受容体を発現するように操作されたトランスジェニックマウスにおいて、インビボでの共刺激活性を改善している（４９）。
【００２８】
上記で概説したように、抗体分子の異なるタイプおよび形態が本発明に含まれ、免疫学当業者には既知であろう。治療目的に使用される抗体は、多くの場合、抗体分子の特性を変更する追加の構成成分を用いて改変されることが周知である。
【００２９】
したがって、本発明の抗体分子または本発明に従って使用される抗体分子（例えば、モノクローナル抗体分子、および／またはポリクローナル抗体分子、および／または二重特異性抗体分子）は、検出可能な部分および／または細胞傷害性部分を含むことを含む。
【００３０】
「検出可能な部分」としては、酵素、放射性原子、蛍光部分、化学発光部分、生物発光部分で構成される群からの１つ以上が挙げられる。検出可能な部分によって、抗体分子をインビトロ、および／またはインビボ、および／またはエクスビボで視覚化することが可能になる。
【００３１】
「細胞傷害性部分」としては、放射性部分および／または酵素が挙げられ、酵素が、カスパーゼおよび／または毒素であり、毒素が、細菌毒素または毒液であり、細胞傷害性部分が、細胞溶解を誘導可能である。
【００３２】
さらに、抗体分子は、単離された形態および／もしくは精製された形態である場合、ならびに／またはＰＥＧ化されている場合を含む。
【００３３】
上述のように、抗体のＣＤＲは、抗体標的に結合する。本明細書に記載の各ＣＤＲへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  ＥＡら、１９９１、”Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２，ｐｐ  ｘｖ−ｘｖｉｉによる定義に従う。
【００３４】
当業者が認識するであろうように、アミノ酸を各ＣＤＲに割り当てるための他の方法も存在する。例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ（Ｒ））（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／およびＬｅｆｒａｎｃ  ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ”Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ＦａｃｔｓＢｏｏｋ”ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，２００１）。
【００３５】
さらなる実施形態では、本発明の、または本発明に従って使用される抗体分子は、本明細書で提供される特定の抗体と競合可能な抗体分子、例えば、特定の標的に結合するための例えば配列番号１〜１５２と定められるアミノ酸配列のうちのいずれかを含む抗体分子である。
【００３６】
「競合可能である」とは、競合抗体が、本明細書で定義される抗体分子の特定の標的への結合を少なくとも部分的に抑制または干渉可能であることを意味する。
【００３７】
例えば、かかる競合抗体分子は、本明細書に記載の抗体分子の結合を、少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約１００％抑制可能であり得るか、かつ／あるいは本明細書に記載の抗体の特定の標的への結合能力を抑制可能であり得、少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約１００％防止または低減し得る。
【００３８】
競合結合は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）などの当業者に周知の方法によって決定することができる。
【００３９】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、エピトープ改変抗体または遮断抗体を評価することができる。競合抗体を同定するのに好適な追加の方法は、参照により本明細書に組み込まれるＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅに開示されている（例えば、５６７〜５６９頁、５７４〜５７６頁、５８３頁、および５９０〜６１２頁、１９８８，ＣＳＨＬ，ＮＹ，ＩＳＢＮ０−８７９６９−３１４−２を参照されたい）。
【００４０】
抗体が定義された標的分子または抗原に特異的に結合することは周知である。つまり、抗体は、抗体の標的に優先的かつ選択的に結合し、標的ではない分子には結合しない。
【００４１】
本発明に従った抗体の標的、または本発明に従って使用される抗体の標的は、細胞の表面上で発現する、すなわち、それらは抗体にとっての、エピトープ（あるいは、この文脈では細胞表面エピトープとして知られる）を含むであろう細胞表面抗原である。細胞表面抗原およびエピトープは、免疫学または細胞生物学当業者によって容易に理解されるであろう用語である。
【００４２】
「細胞表面抗原」とは、細胞表面抗原が、細胞膜の細胞外側に露出しているが、細胞膜の細胞外側に一時的にのみ露出する場合を含む。「一時的に露出される」とは、細胞表面抗原が、細胞内に取り込まれるか、あるいは細胞膜の細胞外側から細胞外空間に放出されている場合を含む。細胞表面抗原は、開裂によって細胞膜の細胞外側から放出され得、これはプロテアーゼによって媒介され得る。
【００４３】
また、細胞表面抗原は、細胞膜に接続し得るが、一時的にのみ細胞膜と会合する場合を含む。「一時的に会合する」とは、細胞表面抗原が、細胞膜の細胞外側から細胞外空間に放出されている場合を含む。細胞表面抗原は、開裂によって細胞膜の細胞外側から放出され得、これはプロテアーゼによって媒介され得る。
【００４４】
さらに、細胞表面抗原は、ペプチド、またはポリペプチド、または炭水化物、またはオリゴ糖鎖、または脂質、および／またはタンパク質、もしくは糖タンパク質、もしくはリポタンパク質上に存在するエピトープである場合を含む。
【００４５】
タンパク質の結合を評価する方法は、生化学および免疫学当業者には既知である。当業者であれば、それらの方法を使用して、抗体の標的への結合および／または抗体のＦｃドメインのＦｃ受容体への結合、ならびにそれらの相互作用の相対的な強度、または特異性、抑制、または防止、または低減を評価することができることを理解するであろう。タンパク質の結合を評価するために使用され得る方法の例は、例えば、イムノアッセイ、ＢＩＡｃｏｒｅ、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である（抗体特異性に関する考察については、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、３３２−３３６頁（１９８９）を参照されたい）。
【００４６】
したがって、「特異的に結合する抗体分子」または「標的特異性抗体分子」とは、抗体分子が標的に特異的に結合するが、非標的には結合しないか、あるいは非標的に、標的よりも（例えば低い親和性で）弱く結合することを含む。
【００４７】
また、抗体が、非標的よりも標的に少なくとも２倍強く、または少なくとも５倍強く、または少なくとも１０倍強く、または少なくとも２０倍強く、または少なくとも５０倍強く、または少なくとも１００倍強く、または少なくとも２００倍強く、または少なくとも５００倍強く、または少なくとも約１０００倍強く、特異的に結合するという意味を含む。
【００４８】
加えて、抗体が標的に、少なくとも約１０-1Ｋd、または少なくとも約１０-2Ｋd、または少なくとも約１０-3Ｋd、または少なくとも約１０-4Ｋd、または少なくとも約１０-5Ｋd、または少なくとも約１０-6Ｋd、または少なくとも約１０-7Ｋd、または少なくとも約１０-8Ｋd、または少なくとも約１０-9Ｋd、または少なくとも約１０-10Ｋd、または少なくとも約１０-11Ｋd、または少なくとも約１０-12Ｋd、または少なくとも約１０-13Ｋd、または少なくとも約１０-14Ｋd、または少なくとも約１０-15ＫdのＫdで結合する場合、抗体が標的に特異的に結合するという意味を含む。
【００４９】
本明細書で使用する場合、Ｔｒｅｇ枯渇抗体という用語は、ヒトなどの対象に投与すると、Ｔｒｅｇの表面上に発現する標的に特異的に結合し、この結合がＴｒｅｇの枯渇をもたらす抗体を指す。したがって、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に属する標的に特異的に結合する抗体から選択されるＴｒｅｇ枯渇抗体は、ヒトなどの対象に投与すると、Ｔｒｅｇの表面上に発現する腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属する標的に結合し、結合がＴｒｅｇの枯渇をもたらす抗体である。いくつかの実施形態では、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーに属する標的は、腫瘍上または腫瘍微小環境内で優先的に発現する標的である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体は、Ｔｒｅｇ枯渇効果に加えて免疫刺激効果を全く有しない。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体はまた、Ｔｒｅｇ枯渇効果に加えて、免疫刺激効果も有し、かかる実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体は、十分に乏しい免疫刺激活性を有して、第２の免疫刺激性抗体の順次投与に続く治療活性の向上を可能にする。
【００５１】
抗体が本発明の意味においてＴｒｅｇ枯渇抗体であるかどうかを決定するために、インビトロ抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）または抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイを使用することが可能である。
【００５２】
ＡＤＣＣアッセイは、標的細胞をカルセインＡＭで標識し、続いて希釈濃度のＡｂを添加することによって行うことができる。次いで、標的細胞を、５０：１のＥ：Ｔ比のヒトＰＢＭＣと３７°Ｃで４時間共培養する。プレートを４００  ３ｇで５分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を白色の９６ウェルプレートに移す。カルセイン放出は、４８５ｎｍの励起波長および５３０ｎｍの発光波長を使用するＶａｒｉｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定する。最大放出の割合は、次のように計算する：最大放出％＝（サンプル／トリトン処理）＊１００。
ＡＤＣＰアッセイは、室温で１０分間、５ｍＭのＣＦＳＥで標的細胞を標識し、その後完全培地中で洗浄して行うことができる。次いで、ＣＦＳＥ標識化標的を希釈濃度のＡｂでオプソニン化し、その後９６ウェルプレートで１：５のＥ：Ｔ比のＢＭＤＭと、３７°Ｃで１時間共培養する。次いで、ＢＭＤＭを室温で１５分間、抗Ｆ４／８０−アロフィコシアニンで標識し、ＰＢＳで２回洗浄する。プレートを氷上に保持し、ウェルを削ってＢＭＤＭを収集し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を使用するフローサイトメトリーによって食作用を評価し、Ｆ４／８０＋細胞集団内のＦ４／８０＋ＣＦＳＥ＋細胞の割合を決定する。
【００５３】
抗体が免疫刺激効果を有するかどうかを判断するために、インビトロアゴニズムアッセイを使用することが可能である。かかるアッセイでは、次の一般的な方法が使用され得る。細胞培養は、５％のＣＯ2中、３７℃で、１０％ウシ胎児血清、グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸（１ｍＭ）、ペニシリン、およびストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ(商標)）で行う。未使用のＰＢＭＣを、２ｍＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識する。次いで、Ｒｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ（５１）によって記載されているように、ＰＢＭＣを、ｍＡｂ刺激性アッセイの４８時間前に、２４ウェルプレート中の１×１０7細胞／ｍＬと培養する。ＰＢＭＣ刺激性用に、丸底９６ウェルプレートに、ＰＢＳ中０．０１μｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体（インハウス）で４時間ウェットコーティングし、その後過剰な抗体を廃棄し、プレートをＰＢＳで洗浄する。１Ｘ１０5のＰＢＭＣ／ウェルをプレートに移し、５μｇ／ｍＬの試験ｍＡｂで刺激する。刺激後４または５日目に、細胞を抗ＣＤ８−ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および抗ＣＤ４−ＰＥ（インハウス）で標識し、増殖をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＣＦＳＥ希釈によって評価する。
【００５４】
Ｔｒｅｇ欠失および免疫刺激性抗体の順次治療によって治療活性の改善がもたらされるかどうかを決定するために、腫瘍を有し、活性化および抑制性Ｆｃガンマ受容体を発現する免疫能力のある動物を用いるインビボアッセイを使用することができる。かかるアッセイでは、例えば図１ａおよび４ｃに図示されるように、以下の例に記載されているものを使用してもよい。
【００５５】
本明細書で使用する場合、免疫刺激性抗体または免疫刺激抗体という用語は、ヒトなどの対象に投与すると、エフェクターＴ細胞の表面上に存在する標的に特異的に結合する抗体を指す。免疫刺激性抗体の標的への結合は、（例えば、抗４−１ＢＢ、ＯＸ４０抗体などのＴＮＦスーパーファミリーアゴニスト受容体に対する抗体の）アゴニズムを通じて直接か、または抑制シグナルの遮断を通じる（例えば、ＰＤ１／ＰＤＬ１軸の抗体遮断を通じる）エフェクターＴ細胞の刺激を通じて間接的にのいずれかで、免疫応答の刺激をもたらす。かかるエフェクターＴ細胞は、ＣＤ８+細胞であり得、かかる実施形態では、免疫刺激性抗体は、ＣＤ８活性化および／またはＣＤ８増強抗体である。あるいは、または加えて、かかるエフェクターＴ細胞は、ＣＤ４+細胞であり得、かかる実施形態では、免疫刺激性抗体は、ＣＤ４活性化および／またはＣＤ４増強抗体である。
【００５６】
本明細書では、Ｆｃ：ＦｃγＲに依存するかあるいは依存しない様式で作用する免疫刺激性または共抑制性の性質の異なる標的に対する異なる抗体を、免疫刺激に使用することができることを示している。免疫刺激性抗体は、エフェクターＴ細胞上にＦｃ：ＦｃγＲに依存する様式で発現する免疫刺激性受容体に作用する４−１ＢＢなどの抗体、またはＦｃ：ＦｃγＲに依存しない様式でエフェクターＴ細胞上に発現する免疫チェックポイント受容体に拮抗するＰＤ−１などの抗体であり得る。
【００５７】
抗体が、本発明の意味において免疫刺激性抗体であるかどうかを決定するために、ｍＡｂに応答するＴ細胞増殖を実証するインビトロアッセイを使用可能である。上述のアッセイは、本目的に使用することができる。
【００５８】
抗体が、Ｔｒｅｇ枯渇効果を欠くかあるいはＴｒｅｇ枯渇効果が乏しいかを決定するために、インビトロ食作用アッセイまたはインビボ枯渇試験を使用可能である。実施例に記載のアッセイは、本目的に使用することができる。例えば、試験マウスの群は、０日目に腫瘍を受ける。腫瘍が触知可能な（または腫瘍モデルに適切な段階の）とき、マウスにｍＡｂに静脈内投与し、続いて１日おきにさらに３回腹腔内投与する（最終用量またはｍＡｂの確立用量２００μｇ）。次いでに、最終ｍＡｂ投与の１日または２日後にマウスを犠牲にし、ＴＩＬ含有量およびプロットされた腫瘍および脾臓（対照組織）のＣＤ４＋集団内のＦｏｘｐ３＋細胞の頻度について、脾臓および腫瘍をフローサイトメトリーによって分析する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体は、ヒト抗体である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体は、ヒト化抗体である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、ヒト抗体である。
【００６２】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、ヒト化抗体である。
【００６３】
本発明に従って組み合わせて使用されるＴｒｅｇ枯渇抗体および免疫刺激性抗体は、上述のように抗体の他の部分の改変によって枯渇／免疫刺激効果を調節することができるため、両方とも同じＣＤＲを含んでもよい。
【００６４】
例えば、Ｔｒｅｇ枯渇抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体の形態の抗体を使用して入手することができ、したがって、いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体である。Ｔｒｅｇ枯渇抗体はまた、１つまたはいくつかの活性化Ｆｃ受容体への結合の改善を示す、かつ／あるいは１つまたはいくつかの活性化Ｆｃ受容体への結合の改善のために操作されたヒトＩｇＧ１抗体の形態の抗体を使用することによって入手することができ、したがって、いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体は、Ｆｃ操作されたヒトＩｇＧ１抗体である。Ｔｒｅｇ枯渇抗体はまた、マウスまたはヒト化マウスＩｇＧ２ａ抗体を使用することによって入手することもでき、したがって、いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体は、ヒト化マウスＩｇＧ２ａ抗体である。
【００６５】
さらに、免疫刺激性抗体は、ヒトＩｇＧ２ｂ抗体などのヒトＩｇＧ２抗体の形態の抗体、またはヒトＩｇＧ４抗体の形態の抗体を使用することによって入手することができる。したがって、いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、ヒトＩｇＧ２抗体である。いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、ヒトＩｇＧ２ｂ抗体である。いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、ヒトＩｇＧ４抗体である。免疫刺激性抗体はまた、マウスまたはヒト化マウスＩｇＧ１抗体を使用することによって入手することができ、いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、ヒト化マウスＩｇＧ１抗体である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、活性化Ｆｃγ受容体を上回る抑制性Ｆｃγ受容体への向上した結合を示す抗体である。いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、活性化Ｆｃγ受容体を上回るヒトＦｃγＲＩＩＢへの向上した結合を示す抗体である。
【００６７】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、活性化Ｆｃγ受容体を上回る抑制性Ｆｃγ受容体への向上した結合のために操作されている。いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、活性化Ｆｃγ受容体を上回るヒトＦｃγＲＩＩＢへの向上した結合のために操作されている。
【００６８】
本発明のＴｒｅｇ枯渇抗体または本発明に従って使用されるＴｒｅｇ枯渇抗体が結合する標的は、ＴＮＦＲＳに属する標的からなる群から選択され得る。ＴＮＦＲＳに属する標的は、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、およびＴＮＦＲ２からなる群から選択され得る。
【００６９】
あるいは、本発明のＴｒｅｇ枯渇抗体または本発明に従って使用されるＴｒｅｇ枯渇抗体が結合する標的は、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５、およびニューロピリン−１からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、標的は、ＣＤ２５ではない。
【００７０】
本発明の免疫刺激性抗体または本発明に従って使用される免疫刺激性が結合する標的は、４−１ＢＢおよびＯＸ４０からなる群から選択され得る。
【００７１】
あるいは、本発明の免疫刺激性抗体または本発明に従って使用されるＴｒｅｇ枯渇抗体が結合する標的は、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＴＮＦＲ２、ＣＤ２５、およびＰＤ−１からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、標的は、ＣＤ２５ではない。
【００７２】
本発明のいくつかの実施形態では、少なくとも１つの標的は４−１ＢＢであり、これはまたＣＤ１３７および腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）とも表される。４−１ＢＢはＴｒｅｇ上に発現し、続いてＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞が活性化し、そのライゲーションが、マウスのウイルスおよびＢ細胞リンパ腫に対する最適な保護ＣＤ８Ｔ細胞応答に必要である（１１、１２）。抗４−１ＢＢ特異性抗体は、インビトロで抗原に刺激されたＴ細胞の増殖および生存を向上し、抗ＣＤ４０と同様に、抗４−１ＢＢ  ｍＡｂは、主にＣＤ８Ｔ細胞に依存して前臨床癌モデルで抗腫瘍免疫を促進する（１２、１３）。４−１ＢＢは、Ｔｒｅｇ系統を定義する転写因子Ｆｏｘｐ３の下流の標的であり、休止中のＴｒｅｇ細胞上で発現し、Ｔｒｅｇの活性化で上方制御され（１４、１５）、したがって、抗４−１ＢＢは、Ｔｒｅｇ細胞の枯渇を通じて部分的に作用し得る可能性がある。抗４−１ＢＢ抗体が枯渇抗体であるか刺激性抗体であるかは、おそらくそのＦｃγＲの使用に依存し、本発明に至る研究では、発明者らは、腫瘍環境における治療用抗４−１ＢＢ  ｍＡｂに最適なアイソタイプを探索するためにインビトロおよびインビボ実験を行った。
【００７３】
ｍＩｇＧ１アイソタイプｍＡｂは、同じ特異性のｍＩｇＧ２ａバージョンと比較して、ＣＤ８＋Ｔ細胞の優れたアゴニスト活性および直接的な免疫刺激を発揮したが、確立された固形腫瘍環境では、ｍＩｇＧ２ａ  ｍＡｂが最適な治療活性を提供することが見出された。ｍＩｇＧ２ａ  ｍＡｂの効力は、腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇に起因することが見出された。枯渇が防止されても、活性化ＦｃγＲを欠くマウスではｍＩｇＧ２ａの治療可能性が保持された。これらの条件下で、ｍＩｇＧ２ａは、抑制性ＦｃγＲＩＩＢと結合することによってアゴニストに変換された。これに加えて、枯渇およびアゴニズムは競合する機序であり、両方を同時に結合すると有効性が低下することが確認された。この活性の鈍化は、ＦｃγＲに依存しないアゴニズムと一緒に最適なＦｃγＲ枯渇能力を有する二重活性抗４−１ＢＢ  ｍＡｂを生成するために、Ｔｒｅｇ枯渇とその後の免疫刺激性アイソタイプとの順次投与を通じて、またはＦｃ操作を通じて克服することができた。これらの結果は一緒に、同じ標的特異性を有する免疫調節性ｍＡｂが、異なる機序を利用して療法を媒介することができ、それらの最適な使用が、免疫抑制およびエフェクター細胞の両方の、アイソタイプ、局所的ＦｃγＲレパートリー、豊富さおよび機能、ならびに腫瘍微小環境におけるそれらの相対的および絶対的標的発現に依存することをさらに実証する。重要なことに、結果は、相補的であるが競合する作用機序を有する免疫調節性ｍＡｂの一時的投与を使用して結果を最適化し得、さらにｍＡｂの操作を通じて、向上した治療有効性を送達する複数の機序を利用することが可能な単一薬剤を生成することが可能であることを実証する。これらの結果は、既存のおよび開発中の免疫調節性ｍＡｂの投与、および次世代の免疫調節性抗体の設計と密接な関係を有する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子は、以下の表１に提示される群から選択される抗４−１ＢＢ抗体分子である。
【００７５】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子は、配列番号１〜６、配列番号９〜１４、配列番号１７〜２２、配列番号２５〜３０、配列番号３３〜３８、配列番号４１〜４６、配列番号４９〜５４、配列番号５７〜６２、配列番号６５〜７０、配列番号１５３〜１５８、および配列番号１６３〜１６８から選択される各群からのＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体分子である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子は、配列番号１〜６、配列番号９〜１４、配列番号１７〜２２、配列番号２５〜３０、配列番号３３〜３８、配列番号４１〜４６、配列番号４９〜５４、配列番号５７〜６２、配列番号６５〜７０、配列番号１５３〜１５８、および配列番号１６３〜１６８から選択される６個のＣＤＲを含む抗体分子からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体分子である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子は、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、１５９、１６１、および１６９からなる群から選択されるＶＨを含む抗体分子からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体分子である。
【００７８】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子は、配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、１６０、１６２、および１７０からなる群から選択されるＶＬを含む抗体分子からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体分子である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子は、配列番号７〜８、１５〜１６、２３〜２４、３１〜３２、３９〜４０、４７〜４８、５５〜５６、６３〜６４、７１〜７２、１５９〜１６０、１６１〜１６２、および１６９〜１７０からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬを含む抗体分子からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体分子である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体分子は、以下の表１に提示される群から選択される抗４−１ＢＢ抗体分子である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体分子は、配列番号１〜６、配列番号９〜１４、配列番号１７〜２２、配列番号２５〜３０、配列番号３３〜３８、配列番号４１〜４６、配列番号４９〜５４、配列番号５７〜６２、配列番号６５〜７０、配列番号１５３〜１５８、および配列番号１６３〜１６８の各群からのＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体分子である。
【００８２】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体分子は、配列番号１〜６、配列番号９〜１４、配列番号１７〜２２、配列番号２５〜３０、配列番号３３〜３８、配列番号４１〜４６、配列番号４９〜５４、配列番号５７〜６２、配列番号６５〜７０、１５３〜１５８、および配列番号１６３〜１６８から選択される６個のＣＤＲを含む抗体分子からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体分子である。
【００８３】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体分子は、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、１５９、１６１、および１６９からなる群から選択されるＶＨを含む抗体分子からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体分子である。
【００８４】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体分子は、配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、１６０、１６２、および１７０からなる群から選択されるＶＬを含む抗体分子からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体分子である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体分子は、配列番号７〜８、１５〜１６、２３〜２４、３１〜３２、３９〜４０、４７〜４８、５５〜５６、６３〜６４、７１〜７２、１５９〜１６０、１６１〜１６２、および１６９〜１７０からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬを含む抗体分子からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体である。
【表１−１】
2020528765.tif 000003
【表１−２】
2020528765.tif 000004
【表１−３】
2020528765.tif 000005
【表１−４】
2020528765.tif 000006
【００８６】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子は、以下の表２に提示される群から選択される抗ＯＸ４０抗体分子である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子は、配列番号７３〜７８、配列番号８１〜８６、配列番号８９〜９４、配列番号９７〜１０２、配列番号１０５〜１１０、配列番号１１３〜１１８、配列番号１２１〜１２６、配列番号１２９〜１３４、配列番号１３７〜１４２、配列番号１４５〜１５０、および配列番号１７１〜１７６から選択される各群からのＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、抗ＯＸ４０抗体分子である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子は、配列番号７３〜７８、配列番号８１〜８６、配列番号８９〜９４、配列番号９７〜１０２、配列番号１０５〜１１０、配列番号１１３〜１１８、配列番号１２１〜１２６、配列番号１２９〜１３４、配列番号１３７〜１４２、配列番号１４５〜１５０、および配列番号１７１〜１７６から選択される各群からの６個のＣＤＲを含む抗体分子からなる群から選択される、抗ＯＸ４０抗体分子である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子は、配列番号７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、および１７７からなる群から選択されるＶＨを含む群から選択される、抗ＯＸ４０抗体分子である。
【００９０】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子は、配列番号８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、および１７８からなる群から選択されるＶＬを含む抗体分子からなる群から選択される、抗ＯＸ４０抗体分子である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子は、配列７９〜８０、８７〜８８、９５〜９６、１０３〜１０４、１１１〜１１２、１１９〜１２０、１２７〜１２８、１３５〜１３６、１４３〜１４４、１５１〜１５２、および１７７〜１７８からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬを含む抗体分子からなる群から選択される、抗ＯＸ４０抗体分子である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体分子は、以下の表２に提示される群から選択される抗ＯＸ４０抗体分子である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体分子は、配列番号７３〜７８、配列番号８１〜８６、配列番号８９〜９４、配列番号９７〜１０２、配列番号１０５〜１１０、配列番号１１３〜１１８、配列番号１２１〜１２６、配列番号１２９〜１３４、配列番号１３７〜１４２、配列番号１４５〜１５０、および配列番号１７１〜１７６から選択される各群からのＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、抗ＯＸ４０抗体分子である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体分子は、配列番号７３〜７８、配列番号８１〜８６、配列番号８９〜９４、配列番号９７〜１０２、配列番号１０５〜１１０、配列番号１１３〜１１８、配列番号１２１〜１２６、配列番号１２９〜１３４、配列番号１３７〜１４２、１４５〜１５０、および配列番号１７１〜１７６から選択される６個のＣＤＲを含む抗体分子からなる群から選択される、抗ＯＸ４０抗体分子である。
【００９５】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体分子は、配列番号７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、および１７７からなる群から選択されるＶＨを含む抗体結合分子からなる群から選択される、抗ＯＸ４０抗体分子である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体分子は、配列番号８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、および１７８からなる群から選択されるＶＬを含む抗体分子からなる群から選択される、抗ＯＸ４０抗体分子である。
【００９７】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体分子は、配列７９〜８０、８７〜８８、９５〜９６、１０３〜１０４、１１１〜１１２、１１９〜１２０、１２７〜１２８、１３５〜１３６、１４３〜１４４、１５１〜１５２、および１７７〜１７８からなる群から選択されるＶＨおよびＶＬを含む抗体分子からなる群から選択される、抗ＯＸ４０抗体分子である。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【００９８】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、抗ＰＤ１抗体、好ましくはヒト抗ＰＤ１抗体である。抗ＰＤ１抗体は、ニボルマブおよびペンブロリズマブからなる群から選択され得る。
【００９９】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、抗ＰＤ１抗体、好ましくはヒト抗ＰＤ１抗体である。抗ＰＤ１抗体は、ニボルマブおよびペンブロリズマブからなる群から選択され得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、抗ＰＤＬ１抗体、好ましくはヒト抗ＰＤＬ１抗体である。抗ＰＤＬ１抗体は、アテゾリズマブであり得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、免疫刺激性抗体は、抗ＣＴＬＡ−４抗体、好ましくはヒト抗ＣＴＬＡ−４抗体である。抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブおよびトレミリムマブからなる群から選択され得る。
【０１０２】
Ｔｒｅｇ枯渇抗体は、免疫刺激性抗体の投与の前に、ヒトなどの対象に投与される。これは、Ｔｒｅｇ枯渇効果を達成するために、最初にＴｒｅｇ枯渇抗体が腫瘍に投与されることを意味する。Ｔｒｅｇ枯渇効果が現れると、免疫刺激性抗体が投与される。この順次投与は、２つの抗体を一時的に分離することで達成され得る。あるいは、または最初の選択肢と組み合わせて、免疫刺激性抗体の前に腫瘍に到達するように、腫瘍内などの方式でＴｒｅｇ枯渇抗体を投与し、次いで、Ｔｒｅｇ枯渇抗体の後に腫瘍に到達するように全身投与などの方式で免疫刺激性抗体を投与することによる、２つの抗体の空間的分離によっても、順次投与を達成してもよい。
【０１０３】
例えば薬が体に吸収される速度を変更するように、薬は異なる添加物で改変することができること、例えば身体への特定の投与経路を可能にするために異なる形式で変更することができることは、医学当業者には既知であろう。
【０１０４】
したがって、本発明の組成物、および／または抗体、および／または薬剤、および／または薬は、賦形剤、ならびに／または薬学的に許容可能な担体、ならびに／または薬学的に許容可能な希釈剤および／もしくはアジュバントと組み合わせる場合を含む。
【０１０５】
本発明の組成物、および／または抗体、および／または薬剤、および／または薬はまた、抗酸化剤を含有し得る水性および／もしくは非水性滅菌注射溶液、ならびに／または意図する受容個体の血液と製剤を等張にする緩衝液、および／もしくは静菌剤、および／もしくは溶質；ならびに／または懸濁剤および／もしくは増粘剤を含み得る水性および／もしくは非水性滅菌懸濁液を含む、非経口投与に好適である場合を含む。本発明の組成物、および／または抗体、および／または薬剤、および／または薬は、単位用量または複数用量容器、例えば、密封されたアンプルおよびバイアル内に含まれてもよく、使用直前に滅菌液担体、例えば注射用水の添加のみを必要とするフリーズドライ（凍結乾燥）状態で保存されてもよい。
【０１０６】
即時注射液および懸濁液は、前述のタイプの滅菌散剤、および／または顆粒、および／または錠剤から調製され得る。
【０１０７】
ヒト患者への非経口投与では、Ｔｒｅｇ枯渇抗体および／または免疫刺激性抗体の１日投与量レベルは通常、患者の体重の１ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであり、あるいは場合によっては、最大１００ｍ／ｋｇを単回または分割用量で投与するであろう。特別な状況、例えば長期投与と組み合わせて、より低い用量を使用してもよい。いずれにしても、医師は個々の患者に最も適した実際の投与量を決定し、それは特定の患者の年齢、体重、および反応によって変動するであろう。上述の投与量は平均的な場合の例示である。当然ながら、より高いかまたはより低い投与量範囲が妥当である個々の事例があり得、それらも本発明の範囲内に含まれる。
【０１０８】
典型的には、本発明の組成物および／または薬は、およそ２ｍｇ／ｍｌ〜１５０ｍｇ／ｍｌ、またはおよそ２ｍｇ／ｍｌ〜２００ｍｇ／ｍｌの濃度で、Ｔｒｅｇ枯渇抗体および／または免疫刺激性抗体を含有するであろう。好ましい実施形態では、本発明の薬および／または組成物は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で、Ｔｒｅｇ枯渇抗体および／または免疫刺激性抗体を含有するであろう。
【０１０９】
一般に、ヒトでは、本発明の組成物、および／または抗体、および／または薬剤、および／または薬の経口または非経口投与が好ましい経路であり、最も便利である。獣医学的使用では、本発明の薬剤、および／または抗体、および／または薬剤、および／または薬は、通常の獣医学的診療に従って適宜許容可能な製剤として投与され、獣医師は、ある特定の動物にとって最も適切であろう投与計画および投与経路を決定するであろう。したがって、本発明は、（上述および以下でさらに説明する）様々な状態を治療するのに有効な量の、本発明の抗体および／または薬剤を含む医薬製剤を提供する。好ましくは、組成物、および／または抗体、および／または薬剤、および／または薬は、静脈内、筋肉内、皮下を含む群から選択される経路による送達に適合している。
【０１１０】
本発明はまた、本発明のポリペプチド結合部分の薬学的に許容可能な酸または塩基付加塩を含む組成物、および／または抗体、および／または薬剤、および／または薬を含む。本発明で有用な前述の塩基化合物の薬学的に許容可能な酸付加塩を調製するために使用される酸は、とりわけ、非毒性の酸付加塩、すなわち塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、酸性リン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酸性クエン酸塩、酒石酸塩、重酒石酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、糖酸塩、安息香酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、およびパモエート、［すなわち、１，１’−メチレン−ビス−（２−ヒドロキシ−３ナフトエート）］塩などの薬理学的に許容可能なアニオンを含有する塩を形成するものである。また、薬学的に許容可能な塩基付加塩を使用して、本発明に従った薬剤の、薬学的に許容可能な塩の形態を生成してもよい。本質的に酸性である本薬剤の薬学的に許容可能な塩基塩を調製するための試薬として使用され得る化学塩基は、かかる化合物と非毒性の塩基塩を形成するものである。かかる非毒性塩基塩には、限定されないが、とりわけ、アルカリ金属カチオン（例えばカリウムおよびナトリウム）およびアルカリ土類金属カチオン（例えばカルシウムおよびマグネシウム）、アンモニウムまたはＮ−メチルグルカミン−（メグルミン）などの水溶性アミン付加塩、および低級アルカノールアンモニウム、ならびに他の薬学的に許容可能な有機アミンの塩基塩などのそのような薬理学的に許容可能なカチオンに由来するものが挙げられる。本発明の薬剤および／またはポリペプチド結合部分は、保存のために凍結乾燥され、使用前に好適な担体で再構成されてもよい。任意の好適な凍結乾燥法（例えば、噴霧乾燥、ケーキ乾燥）、および／または再構成技法を用いてもよい。凍結乾燥および再構成によって、抗体活性低下の程度の変動に至る場合があり（例えば、従来の免疫グロブリンでは、ＩｇＭ抗体はＩｇＧ抗体よりも活性が大きく低下する傾向を有する）、使用レベルを上方調節して補う必要があり得ることを当業者は理解するであろう。一実施形態では、凍結乾燥（フリーズドライ）ポリペプチド結合部分は、再水和されるとき、（凍結乾燥前の）その活性のうちの約２０％以下、または約２５％以下、または約３０％以下、または約３５％以下、または約４０％、または約４５％以下、または約５０％以下を損失する。
【０１１１】
Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、対象への免疫刺激性抗体分子の投与の前に対象に投与される、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子と免疫刺激性抗体分子との組み合わせは、癌の治療に使用することができる。
【０１１２】
対象は、哺乳類または非哺乳類である場合を含む。好ましくは、馬、または牛、または羊、または豚、またはラクダ、または犬、または猫などの哺乳類対象はヒトであるか、あるいは非哺乳類である。最も好ましくは、哺乳類対象はヒトである。
【０１１３】
「呈する」とは、対象が、癌症状および／もしくは癌診断マーカーを表すこと、ならびに／または癌症状および／もしくは癌診断マーカーを測定、および／または評価、および／または定量化する場合を含む。
【０１１４】
医学当業者であれば、癌症状および癌診断マーカーがどのようなものであるか、ならびに癌症状の重篤度に低減または増加があるかどうかを測定および／もしくは評価および／もしくは定量化する方法、または癌診断マーカーの低減もしくは増加、ならびに癌症状および／もしくは癌診断マーカーを使用して、癌の予後を形成することができる方法は、即座に明らかであろう。
【０１１５】
癌治療は、多くの場合、一連の治療として投与される、すなわち治療剤は、ある期間にわたって投与される。一連の治療の時間的な長さは、他の理由のなかでもとりわけ、投与される治療剤のタイプ、治療される癌のタイプ、治療される癌の重篤度、ならびに対照の年齢および健康状態を含む多数の要因に依存する。
【０１１６】
「治療中」とは、対象が現在一連の治療を受けていること、および／または治療薬を受けていること、および／または一連の治療剤を受けていることを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、本発明に従って治療される癌は、固形腫瘍である。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、癌は、肉腫、癌腫、およびリンパ腫からなる群から選択される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、癌は、扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、胸腺腫、神経芽細胞腫、または卵巣癌からなる群から選択される。
【０１２０】
上述の癌のいずれもが周知であり、症状および癌診断マーカーは、それらの癌を治療するのに使用される治療剤であるため、よく記載されている。したがって、症状、上述のタイプの癌を治療するために使用される癌診断マーカーおよび治療剤は、医学当業者には既知であろう。
【０１２１】
大多数の癌の診断、予後、進行の臨床的定義は、ステージ分類としてとして知られている、ある特定の分類による。それらのステージ分類システムは、多くの異なる癌診断マーカーおよび癌症状を照合して、癌の診断、および／または予後、および／または進行の概要を提供するように機能する。腫瘍学当業者であれば、ステージ分類システムを使用して、癌の診断、および／または予後、および／または進行を評価する方法、ならびにそのためにどの癌診断マーカーおよび癌症状を使用すべきかを知っているであろう。
【０１２２】
「癌のステージ分類」としては、ステージ０、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、およびステージＩＶを含むＲａｉステージ分類、ならびに／またはステージＡ、ステージＢ、およびステージＣを含むＢｉｎｅｔステージ分類、ならびに／またはステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、およびステージＩＶを含むＡｎｎ  Ａｒｂｏｕｒステージ分類が挙げられる。
【０１２３】
癌は、細胞の形状に異常を引き起こし得ることが知られている。これらの異常は、多くの場合、ある特定の癌で再現性よく生じ、これは形状におけるこれらの変化の検査（あるいは組織学的検査としても知られている）が、癌の診断または予後に使用することができることを意味する。細胞の形状を検査するためにサンプルを視覚化し、視覚化用にサンプルを準備するための技法は、例えば光学顕微鏡法または共焦点顕微鏡法など、当技術分野で周知である。
【０１２４】
「組織学的検査」としては、小さな成熟リンパ球の存在、ならびに／または細胞質の境界が狭い小さな成熟リンパ球の存在、識別可能な核小体を欠く密な核を有する小さな成熟リンパ球の存在、ならびに／または細胞質の境界が狭く、識別可能な核小体を欠く密な核を有する小さな成熟リンパ球の存在、ならびに／または異型細胞、および／もしくは開裂細胞、および／もしくは前リンパ球の存在が挙げられる。
【０１２５】
癌は、細胞のＤＮＡの変異の結果であり、これによって細胞の細胞死回避、または制御不能な増殖に至り得ることは周知である。したがって、これらの変異の検査（細胞遺伝学的検査としても知られている）は、癌の診断および／または予後を評価するための有用なツールであり得る。この例は、慢性リンパ球性白血病の特徴である染色体位置１３ｑ１４．１の欠失である。細胞内の変異を検査するための技法は、例えば、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）など、当技術分野で周知である。
【０１２６】
「細胞遺伝学的検査」としては、細胞内のＤＮＡ、具体的には染色体の検査が挙げられる。細胞遺伝学的検査を使用して、難治性癌および／または再発した癌の存在に関連し得る、ＤＮＡの変化を同定することができる。そのようなものとしては、１３番染色体の長腕の欠失、ならびに／または染色体位置１３ｑ１４．１の欠失、ならびに／または１２番染色体のトリソミー、ならびに／または１２番染色体の長腕の欠失、ならびに／または１１番染色体の長腕の欠失、ならびに／または１１ｑの欠失、ならびに／または６番染色体の長腕の欠失、ならびに／または６ｑの欠失、ならびに／または１７番染色体の短腕の欠失、ならびに／または１７ｐの欠失、ならびに／またはｔ（１１：１４）転座、ならびに／または（ｑ１３：ｑ３２）転座、ならびに／または抗原遺伝子受容体再配列、ならびに／またはＢＣＬ２再配列、ならびに／またはＢＣＬ６再配列、ならびに／またはｔ（１４：１８）転座、ならびに／またはｔ（１１：１４）転座、ならびに／または（ｑ１３：ｑ３２）転座、ならびに／または（３：ｖ）転座、ならびに／または（８：１４）転座、ならびに／または（８：ｖ）転座、ならびに／またはｔ（１１：１４）および（ｑ１３：ｑ３２）転座を挙げることができる。
【０１２７】
癌を有する対象は、ある特定の身体的症状を呈することが知られており、これは多くの場合、癌が身体に負担をかけている結果である。これらの症状は、多くの場合、同じ癌で再発するため、疾患の診断、および／または予後、および／または進行の特徴であり得る。医学当業者であれば、どの身体的症状がどの癌に関連しているか、ならびにそれらの身体系の評価が疾患の診断、および／または予後、および／または進行とどのように相関し得るかを理解するであろう。「身体的症状」としては、肝腫大および／または脾腫が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
以下の例では、次の図を参照している。
【図１−１】抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａ  ｍＡｂは、複数の癌モデルで延命効果を付与するが、ｍＩｇＧ１は付与しない。図１Ａ：０日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に５×１０5のＣＴ２６の皮下投与をチャレンジした。腫瘍が触知可能なときに、マウスに抗４−１ＢＢ（ＬＯＢ１２．０）ｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２ａ、またはＰＢＳ対照を静脈内投与し、続いて１日おきにさらに３回腹腔内投与した（最終用量２００μｇ）。
【図１−２】図１Ｂ：Ａ／Ｊマウスの群に２×１０6のＮＸＳ２細胞の皮下投与をチャレンジし、腫瘍が触知可能なときに、２００μｇの抗４−１ＢＢ  ｍＡｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂを腹腔内投与した。３日後に２回目の２００μｇの用量を与えた。両方の実験モデルでは、腫瘍の成長を監視し、平均腫瘍面積が２２５ｍｍ2を超えるとマウスを処分した。データは、示されるように、腫瘍チャレンジ数日後の腫瘍面積（ｍｍ2）として表され、各線は個々のマウスを表す。右パネルは、人道的エンドポイントまでの生存率を示している。データは、群ごとにｎ＝５匹のマウスである、少なくとも２つの独立した実験の例を表す。
【図２−１】抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ１は、インビトロおよびインビボでアゴニスト活性を発揮する。図２Ａ：ＧＦＰ＋細胞（−Ｔreg）かまたはＧＦＰ＋細胞ではない細胞（＋Ｔreg）のいずれかを排除して選別したＦｏｘｐ３−ＧＦＰマウスの脾細胞を、示されるように、０．１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および示されている濃度の抗４−１ＢＢ（ＬＯＢ１２．０）ｍＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａのいずれかと培養した。７２時間の培養の最後の１６時間の間、［3Ｈ］−チミジンの取り込みを測定した。図２Ｂ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞を、０．１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３、および示されている濃度の抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２ａ、または２つの１：１混合液と同様に培養し、その後［3Ｈ］−チミジン取り込みを評価した。図２Ａおよび図２Ｂのデータは、３つのウェルの１分あたりの平均（＋／−ＳＥＭ）カウントを示している。図２Ｃ：０日目に５ｍｇのＯＶＡ、および２００μｇの抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａをマウスの群に腹腔内投与した。末梢血におけるＳＩＩＮＦＥＫＬ特異性Ｔ細胞応答を、フローサイトメトリーによって定量化し、総ＣＤ８＋細胞の％として表した。データは、３つの別個の実験からのものであり、応答の時間経過（平均±ＳＥＭ、群ごとに６匹のマウス）、および応答のピーク（平均および個々の応答、群ごとに９匹のマウス、＊ｐ＝０．０２３）を示している。
【図２−２】図２Ｄ：０日目に、Ａ／Ｊマウスの群に２×１０6のＮＸＳ２細胞の皮下投与をチャレンジし、３日目に２００μｇの抗４−１ＢＢ  ｍＡｂまたはアイソタイプ対照ｍＡｂの腹腔内投与、および対照（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、左パネル）またはＴＨ（ＦＥＴＦＥＡＫＩ、右パネル）ペプチドを与えた。６日後に２回目のｍＡｂ（２００μｇ）の用量を与えた。図２Ｂおよび図２Ｃのデータは、群ごとにｎ＝５匹のマウスの場合の少なくとも２つの実験の例を表している。
【図３−１】マウスおよびヒト腫瘍内在Ｔｒｅｇ細胞は、４−１ＢＢを優先的に発現する。図３Ａ：ＣＴ２６腫瘍で腫瘍内Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを発現する４−１ＢＢを示す、免疫蛍光顕微鏡画像（左パネル）。スケールバー＝５０μＭ。ＴＩＬおよび脾細胞からのＴ細胞サブセット上での４−１ＢＢ発現を実証しているフローサイトメトリーのヒストグラム（右パネル）。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋（挿入図上部パネル）、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−（挿入図中央パネル）、およびＣＤ８＋Ｔ細胞（挿入図底部パネル）でのアイソタイプ対照（灰色線）に対する、４−１ＢＢ発現（黒線）。ＣＴ２６腫瘍を有するマウスから細胞を単離した。
【図３−２】図３Ｂ：手術で切除したばかりの卵巣腫瘍、腹水、血液のサンプルを患者から入手し、健康なＰＢＭＣと比較した。腫瘍サンプルは、小さく刻み、分離する前に密度に勾配をつけて消化させた。一致する末梢血を入手し、遠心分離によって末梢血単核細胞を分離した。フローサイトメトリーによって、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７−Ｔｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋非Ｔｒｅｇ細胞、およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞上での４−１ＢＢ発現を評価した。上部パネルは、同じ患者の腫瘍組織（黒の実線）、血液（灰色の破線）、および腹水（黒の破線）での４−１ＢＢ発現の代表的なヒストグラムを示している。灰色の実線でアイソタイプ対照を示した。下部パネルは、異なる組織サンプルのＴ細胞サブセット上での４−１ＢＢ発現を示している。データポイントは、個々の患者／ドナーを表し、健康なＰＢＭＣではｎ＝１１、腹水ではｎ＝２０、腫瘍ではｎ＝９、患者の血液ではｎ＝５である。図３Ｃ：手術で切除したばかりの扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）および正常な皮膚サンプルを、患者から入手した。サンプルは、小さく刻み、分離する前に密度に勾配をつけて消化させた。一致する末梢血を入手し、遠心分離によって末梢血単核細胞を分離した。４−１ＢＢ用に細胞を染色し、フローサイトメトリーによって染色を検出した。上部パネルは、４−１ＢＢ染色がオープンヒストグラム（ｏｐｅｎ  ｈｉｓｔｏｇｒａｍｓ）として示されている代表的なヒストグラムを示し、腫瘍組織（黒の実線）、血液（灰色の破線）、正常皮膚（黒の破線）、およびアイソタイプ対照（灰色の実線）として示されている。下部パネルは、異なる組織サンプルのＴ細胞サブセット上での４−１ＢＢ発現を示している。データポイントは、１０人の個々の患者を表している。
【図４−１】固形腫瘍における抗４−１ＢＢ  ｍＡｂ療法の主要な機序は、抗体アイソタイプおよびＦｃγＲの可用性に依存する。図４Ａ：０日目に、３〜４匹のＷＴ、ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯ、またはγ鎖ＫＯのＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、５×１０４のＣＴ２６細胞の皮下投与をチャレンジした。腫瘍が触知可能なときに、マウスに抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２ａ、またはＰＢＳ対照を静脈内投与し、続いて１日おきにさらに３回腹腔内投与した（最終用量２００μｇ）。１３日目にマウスを犠牲にし、脾臓および腫瘍をフローサイトメトリーによって分析した。データは、腫瘍（左パネル）または一致する脾臓（右パネル）のＣＤ４＋集団内のＦｏｘｐ３＋細胞の頻度を示している。データは、２つの独立した実験を表している。図４Ｂ：マウスを（Ａ）のように治療し、ＣＤ８＋、Ｋｉ６７＋Ｔ細胞を数え、対照と比較した変化倍率としてプロットした。
【図４−２】図４Ｃ：ＷＴ、γ鎖ＫＯ、またはＦｃγＲヌルマウス（γ鎖ＫＯｘＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯ）、γ鎖ＫＯ、またはＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯのＢＡＬＢ／ｃマウスの群を、５×１０４のＣＴ２６細胞をチャレンジし、（Ａ）のように抗４−１ＢＢ  ｍＡｂで治療した。腫瘍の成長を監視し、平均腫瘍面積が２２５ｍｍ２を超えるとマウスを処分した。データは、示されるように、腫瘍チャレンジ数日後の腫瘍面積（ｍｍ２）として表され、各線は個々のマウスを表す。右パネルは、人道的エンドポイントまでの生存率を示している。データは、群ごとにｎ＝５匹のマウスである、少なくとも２つの実験の例を表す。
【図４−３】図４Ｄ：抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２ａ、または対照ｍＡｂでオプソニン化したＣＦＳＥ標識化標的マウス脾臓Ｔ細胞を、野生型（実線棒グラフ）またはＦｃｇＲＩＩＢ  ＫＯ（白抜き棒グラフ）ｍＢＭＤＭと共培養し、次いで食作用について評価した。（Ｅ）（左パネル）抗ヒト４−１ＢＢ  ｈＩｇＧ１  ｍＡｂクローンＳＡＰ３−６、ＢＩ５−Ｂ０２（００５−ＢＩ０２としても表される）、または対照でオプソニン化したＣＦＳＥ標識化標的ヒトＴ細胞を、ｈＭＤＭと共培養し、次いでＡＤＣＰを評価した。（右パネル）フローサイトメトリーによって決定した４−１ＢＢ発現レベルに関連して、食作用のレベルをプロットした。すべての場合において、食作用を二重陽性マクロファージの％としてプロットする。
【図５−１】異種の抗４−１ＢＢの計画的投与、または抗ＰＤ−１ｍＡｂとの計画的な組み合わせは、抗腫瘍活性を向上する。図５Ａ：０日目に、年齢および性別が一致するＢＡＬＢ／ｃマウスの群に５×１０４のＣＴ２６の皮下投与をチャレンジした。腫瘍が触知可能なときに、マウスに抗４−１ＢＢ（ＬＯＢ１２．０）ｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２ａ、ｍＩｇＧ１とｍＩＧ２ａとを同時に、またはＰＢＳ対照を静脈内投与し、続いて１日おきにさらに３回腹腔内投与した（最終用量２００μｇ）。計画的投与では、ｍＩｇＧ２ａを静脈内投与し、次いで４日後にｍＩｇＧ１を腹腔内投与した。腫瘍の成長を監視し、平均腫瘍面積が２２５ｍｍ2を超えるとマウスを処分した。データは、示されるように、腫瘍チャレンジ後の数日間の平均腫瘍面積（ｍｍ２）として表される。提示されているデータは、群ごとにｎ＝１０匹のマウスである２つの独立した実験から組み合わされている。図５Ｂ：マウスにＣＴ２６腫瘍をチャレンジし、次いで図５Ａのように単独療法薬、または抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ１もしくはｍＩｇＧ２ａおよび／もしくは抗ＰＤ−１  ｒＩｇＧ１（ＷＴ）、もしくはその脱グリコシル化形態の計画的な組み合わせを投与した。組み合わせでは、腫瘍が最初に触知可能になったときに抗４−１ＢＢ  ｍＡｂを静脈内投与し、次いで４日後に抗ＰＤ−１を腹腔内投与した。腫瘍の成長を監視し、図５Ａのようにデータをプロットした。データは、群ごとにｎ＝４または５匹のマウスである、少なくとも２つの独立した実験の例を表す。
【図５−２】異種の抗４−１ＢＢの計画的投与、または抗ＰＤ−１ｍＡｂとの計画的な組み合わせは、抗腫瘍活性を向上する。図５Ａ：０日目に、年齢および性別が一致するＢＡＬＢ／ｃマウスの群に５×１０４のＣＴ２６の皮下投与をチャレンジした。腫瘍が触知可能なときに、マウスに抗４−１ＢＢ（ＬＯＢ１２．０）ｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２ａ、ｍＩｇＧ１とｍＩＧ２ａとを同時に、またはＰＢＳ対照を静脈内投与し、続いて１日おきにさらに３回腹腔内投与した（最終用量２００μｇ）。計画的投与では、ｍＩｇＧ２ａを静脈内投与し、次いで４日後にｍＩｇＧ１を腹腔内投与した。腫瘍の成長を監視し、平均腫瘍面積が２２５ｍｍ2を超えるとマウスを処分した。データは、示されるように、腫瘍チャレンジ後の数日間の平均腫瘍面積（ｍｍ２）として表される。提示されているデータは、群ごとにｎ＝１０匹のマウスである２つの独立した実験から組み合わされている。図５Ｂ：マウスにＣＴ２６腫瘍をチャレンジし、次いで図５Ａのように単独療法薬、または抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ１もしくはｍＩｇＧ２ａおよび／もしくは抗ＰＤ−１  ｒＩｇＧ１（ＷＴ）、もしくはその脱グリコシル化形態の計画的な組み合わせを投与した。組み合わせでは、腫瘍が最初に触知可能になったときに抗４−１ＢＢ  ｍＡｂを静脈内投与し、次いで４日後に抗ＰＤ−１を腹腔内投与した。腫瘍の成長を監視し、図５Ａのようにデータをプロットした。データは、群ごとにｎ＝４または５匹のマウスである、少なくとも２つの独立した実験の例を表す。
【図６】Ｆｃ操作した抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２Ｂは、二重活性を有し、増強された癌療法を送達する。図６Ａ：抗４−１ＢＢ（ＬＯＢ１２．０）ｍＩｇＧ２ａ、ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２、および「偏りのある」ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２ＢのｎｒＣＥ−ＳＤＳプロファイル。図６Ｂ：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの脾細胞を、０．０１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３および示されている濃度の抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２ａ、またはｍＩｇＧ２ａ／ｈ２Ｂのいずれかと示されるように培養した。７２時間の培養の最後の１６時間の間、［３Ｈ］−チミジンの取り込みを測定した。図６Ｃ：抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａ、ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２Ｂ、または対照ｍＡｂでオプソニン化したＣＦＳＥ標識化標的マウス脾臓Ｔ細胞を、野生型ｍＢＭＤＭと共培養し、次いで食作用について評価した。食作用を、二重陽性マクロファージの％としてプロットする。図６Ｄ：０日目に、年齢および性別が一致するＣ５７Ｂｌ／６マウスの群に５×１０５のＥＧ７の皮下投与をチャレンジした。３、５および７日目に、示されるように、マウスに２００μｇのｍＡｂまたはＰＢＳ対照を腹腔内投与した。２０日目に、腫瘍を採取し、フローサイトメトリーによってＴＩＬを数えた（群あたりｎ＝４匹のマウス）。（Ｅ）マウスを（Ｄ）のように設定し、腫瘍の成長を監視し、平均腫瘍面積が４００ｍｍ２を超えるとマウスを処分した。データは、群ごとにｎ＝５匹のマウスである、少なくとも２つの独立した実験の例を表す。
【図７−１】抗４−１ＢＢ  ｍＡｂの特徴評価。図７Ａ：抗４−１ＢＢ（クローンＬＯＢ１２．０）ｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２ａ、および親ｒＩｇＧ２ａのマウスＦｃγＲＩ、ＩＩＢ、ＩＩＩ、およびＩＶへの結合の表面プラズモン共鳴分析。５０００ＲＵで固定した４−１−ＢＢ  ｍＡｂは、組換え可溶性ＦｃγＲタンパク質（０、６、２３、９４、３７５、１５００ｎＭ）を上回った。センサーグラムを示している。
【図７−２】図７Ｂ：マウス４−１ＢＢの細胞外および膜貫通領域をコードする構築物で安定にトランスフェクトしたヒト細胞株を、ある濃度範囲のｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプの抗４−１ＢＢ、または親ｒＩｇＧ２ａ  ｍＡｂと培養し、その後ＰＥ標識化二次抗体によって染色した。データは、各濃度での最大パーセントとしての平均蛍光強度を示している。図７Ｃ：示された濃度でラット抗４−１ＢＢをマウスｍＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａ抗４−１ＢＢ  ｍＡｂと混合し、その後マウス４−１ＢＢトランスフェクト細胞株と培養した。ラットｍＡｂ結合は、抗ラット二次抗体で検出され、データは、競合マウス抗４−１ＢＢの濃度に対するラット抗４−１ＢＢ抗体の平均蛍光強度として表す。
【図８】抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａ  ｍＡｂの抗腫瘍有効性は、ＣＤ８＋Ｔ細胞に依存する。０日目の５×１０4のＣＴ２６細胞の皮下投与でのチャレンジと関連して、−１、１、および４日目の５００μｇのＣＤ８枯渇抗体でＢＡＬＢ／ｃマウスの群を治療したか、あるいは治療しなかった。６日目に抗４１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａ  ｍＡｂを静脈内投与し、８、１０、および１２日目に２００μｇの最終総用量まで腹腔内投与した。腫瘍サイズを記録し、平均腫瘍径が１５ｍｍに達するとマウスを処分した。データは、各線が個々のマウスを表す、腫瘍チャレンジ後の示された日の腫瘍面積（ｍｍ2）を示している。（ｎ＝５匹／群）
【図９−１】ＯＶＡおよび抗４−１ＢＢ  ｍＡｂに応答したＯＴ−Ｉ細胞の一次インビボ増殖。図９Ａ：３匹の野生型またはＦｃγＲＩＩＢ−／−マウスの群に、２×１０5のＯＴ−Ｉ細胞を静脈内投与し、２４時間後（０日目）に、０．５ｍｇのＯＶＡおよび２００μｇのｍＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａ抗４−１ＢＢを腹腔内注射した。対照マウスには、ＯＶＡ単独を与えた。血液サンプルを採取して、応答中の循環ＳＩＩＮＦＥＫＬ四量体＋ＣＤ８＋細胞を測定し、総ＣＤ８＋細胞の％（平均値±ＳＥＭ）として表した。データは、２つの実験を表している。
【図９−２】図９Ｂ：０日目に、５匹のＣ５７ＢＬ／６マウスの群に、２．５×１０5のＢ１６／ＢＬ６細胞を皮内注射し、その後３、６、および９日目に、反対側の脇腹に１×１０6の照射ＦＶＡＸ細胞を皮内投与した。ＦＶＡＸ注射と同時に、マウスに、ＰＢＳ、１００μｇの抗ＣＴＬＡ−４（クローン９Ｄ９）または抗ＣＴＬＡ−４、および３００μｇの抗４−１ＢＢ抗体のいずれかを示されるように腹腔内投与した。人道的エンドポイントまでの生存率が示されている。
【図１０】抗ＰＤ−１ｍＡｂの特徴評価。図１０Ａ：抗ＰＤ−１（クローンＥＷ１−９）ｒＩｇＧ１（黒の実線）、およびｒＩｇＧ１脱グリコシル化（灰色の実線）のマウスＦｃγＲＩ、ＩＩＢ、ＩＩＩ、およびＩＶへの結合の表面プラズモン共鳴分析。ＰＤ−１ｍＡｂ（５００ｎＭ）は、抗ヒスチジンｍＡｂ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でＣＭ５チップ上に捕捉した組換えＦｃγＲ−ｈｉｓタンパク質（１０００ＲＵ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を上回った。センサーグラムは、０ｎＭ曲線を差し引いて示されている。図１０Ｂ：抗ＰＤ−１ｍＡｂがＰＤ−１に結合し、ＰＤ−Ｌ１の結合を遮断することを実証する分析。抗ヒスチジンｍＡｂでＣＭ５チップ上に捕捉した組換えＰＤ−１−ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（２０００ＲＵ）よりも、抗ＰＤ−１  ｒＩｇＧ１（黒の実線）、ｒＩｇＧ１脱グリコシル化（灰色の実線）、または緩衝液（黒の破線）が上回った。矢印で示された時点で、組換えＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）よりも上回り、ＰＤ−１への結合および抗ＰＤ−１による遮断が実証された。
【図１１】抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２Ｂ  ＦｃγＲ結合。抗４−１ＢＢ（クローンＬＯＢ１２．０）ｍＩｇＧ２ａ、およびｍＩｇＧ２ａ／ｈ２ＢのマウスＦｃγＲＩ、ＩＩＢ、ＩＩＩ、およびＩＶへの結合の表面プラズモン共鳴分析。５０００ＲＵで固定した４−１ＢＢ  ｍＡｂは、組換え可溶性ＦｃγＲタンパク質（０、６、２３、９４、３７５、１５００ｎＭ）を上回った。センサーグラムを示している。
【図１２】ＨＤＬＭ２細胞の結合タイトレーション曲線を示している。
【図１３】リガンド遮断を示している。
【図１４】左パネルに４−１ＢＢ＋ＩＶＡ  ＣＤ４ｓのＡＤＣＣ、右パネルにＣＤ８  Ｔ細胞増殖を用いたインビトロアッセイの結果を示している。
【図１５】インビトロ活性化ヒトＣＤ４＋細胞への結合を示している。
【図１６】活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞でのｃｙｏｎ交差反応性を示している。
【図１７】リガンド遮断を示している。
【図１８】Ｔ細胞でのＡＤＣＣを示し、いくつかのｍＡｂがＯＸ４０発現ＣＤ４＋Ｔ細胞に有意なＡＤＣＣを誘導することを実証している。図は、５回の実験の平均を示している。Ｃａｍｐａｔｈは、陽性対照として、Ｙｅｒｖｏｙはコンパラトールとして使用する。
【図１９】インビトロでの増殖アッセイの結果を示している。
【図２０】異なる抗体のｈ  ＯＸ４０  ＫＩ／ＯＴ１トランスファーモデルを使用した、インビボでのアゴニスト活性を実証している。
【図２１】本明細書に記載の抗体のうちのいくつかの特徴の概要をまとめた表を示している。
【図２２】ヒトの異なる区画からのＴｒｅｇ細胞およびエフェクター細胞を示し、腫瘍組織および／または腫瘍組織の近傍のＴｒｅｇが、末梢Ｔｒｅｇと比較して、明確に可能性のある標的発現プロファイルを有することを明らかに実証している。
【図２３】マウスの異なる器官のＴｒｅｇ細胞上の受容体発現を示している。
【図２４】マウスの他の細胞のタイプと比較した、Ｔｒｅｇ細胞上の受容体発現を示している。
【実施例】
【０１２９】
本発明のある特定の態様を具体化する、特定の非限定的な実施例を、以下説明する。
【０１３０】
順次投与に関する実施例
結果
抗４−１ＢＢ  ｍＡｂの治療活性は、アイソタイプによって決定される
ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーを標的とする免疫刺激性ｍＡｂ活性が、抑制性ＦｃγＲＩＩＢによって提供される架橋に依存することが、以前より確認されている。この要件が抗４−１ＢＢに同様に適用されるかどうかを確認するために、他のｍＡｂ特異性について前述したように（１７〜１９）、ｒＩｇＧ２ａ抗４−１ＢＢ  ｍＡｂのｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａキメラバージョンを生成した（インハウスで生成したＬＯＢ１２．０（１６））。ＬＯＢ１２．０ｍＩｇＧ１重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１７９で示され、対応するアミノ酸配列は、配列番号１８０で示される。ＬＯＢ１２．０ｍＩｇＧ２ａ重鎖をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８１で示され、対応するアミノ酸配列は、配列番号１８２で示される。表面プラズモン共鳴およびフローサイトメトリーによる分析によって、ｍＩｇＧ２ａが高い活性化ＦｃγＲ対抑制性ＦｃγＲ比（Ａ：Ｉ）を有し、逆にｍＩｇＧ１が低いＡ：Ｉを有する（図７Ａ、（１９、２０））と、これらのｍＡｂが期待されるｍＦｃγＲ結合プロファイルを有し、両方のｍＡｂが同等の４−１ＢＢ特異性および結合を保持した（図７Ｂおよび７Ｃ）ことが確認された。次いで、ＣＴ２６結腸癌腫（図１Ａ）およびＮＸＳ２神経芽細胞腫（図１Ｂ）を使用して確立した３つの異なる固形腫瘍モデルにおける、これらのマウス抗４−１ＢＢ  ｍＡｂの治療可能性を評価した。抗ＣＤ４０の研究（１８、１９、２１）およびＤＲ５を標的とする他のアゴニスト抗ＴＮＦＲスーパーファミリーｍＡｂについての発表された報告（２２、２３）とは顕著に対照的に、われわれの研究では、抗４−１ＢＢは、高いＡ：Ｉ比のｍＩｇＧ２ａ  ｍＡｂは、相当な治療効果（すべてのモデルで８０％の長期生存）を提供したが、低いＡ：Ｉ比のｍＩｇＧ１バージョンはほとんど効果がなかった（０〜２０％の生存率）。注目すべきことに、これらの設定で保護的であったのはｍＩｇＧ２ａ  ｍＡｂであったが、その治療効果は、依然としてＣＤ８＋Ｔ細胞に依存しており（図８）、腫瘍の再チャレンジ実験で決定されたように、長期的な生産的抗腫瘍免疫をもたらした。これらの結果は、ｍＩｇＧ２ａ抗４−１ＢＢの保護効果は、適応性抗腫瘍免疫応答を通じて媒介されるが、このｍＡｂは、抗ＣＤ４０  ｍＡｂとは対照的に、ＦｃγＲＩＩＢに依存しない様式で生じる分子機序を利用することを示唆している。
【０１３１】
抗４−１ＢＢの免疫刺激活性は、マウスＩｇＧ１アイソタイプで最適である
腫瘍モデルで得られた結果、および抗４−１ＢＢ  ｍＡｂの効果を媒介するＣＤ８＋Ｔ細胞の重要な役割を実証する以前の研究を考慮して、インビトロおよびインビボのＴ細胞集団で、アイソタイプに依存する抗４−１ＢＢ  ｍＡｂ活性を確認しようと努めた。インビトロＴ細胞共刺激アッセイ（図２Ａ）を使用すると、ｍＩｇＧ１のみが、アゴニスト活性を実証し、ｍＩｇＧ２ａ（上記で使用したのと同じ抗体）では実証されなかった。これは、公開されている他の結果（１８、１９）と一致している。ｍＩｇＧ１の共刺激活性は、Ｔ細胞培養アッセイにおいてＴｒｅｇ細胞とは無関係であり、この抗４−１ＢＢ  ｍＡｂはエフェクターＴ細胞上の４−１ＢＢの標的化を通じてその効果を媒介することを示唆している。最後に、ｍＩｇＧ１の共刺激活性は、ｍＩｇＧ２ａの添加によって無効化され、両方のｍＡｂ変異体が、同様の結合力で結合し、エフェクターＴ細胞上の４−１ＢＢへの結合を競合することを実証した（図２Ｂ）。これらのインビトロ結果は、内因性（図２Ｃ）およびＯＴ１  Ｔ細胞トランスファー環境（図８Ａ）の両方で、モデル抗原ＯＶＡを用いたインビボ免疫モデルを使用して確認された。この背景では、ｍＩｇＧ１の優れたアゴニスト活性は、抗ＣＤ４０  ｍＡｂについて以前に示したように（１８、１９、２４、２５）、抑制性ＦｃγＲＩＩＢ（図２Ｃ、図９Ａ）に依存した。最後に、２つの免疫モデル（ＮＸＳ２ペプチドおよびＢ１６−ｓＦｌｔ３Ｌ−Ｉｇ、それぞれ図２Ｄおよび図９Ｂ）では、ｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａアイソタイプ抗体は、等しく治療効果があった（図２Ｄおよび図９Ｂ）。注目すべきは、ＩｇＧ２ａではなくｍＩｇＧ１の有効性が、ワクチン接種の非存在下で無効化されたことであり、ｍＩｇＧ２ａではなくｍＩｇＧ１が免疫活性化に依存する機序、おそらくＦｃγＲＩＩＢ架橋を通じて動作することが確認された（図２Ｄ）。
【０１３２】
４−１ＢＢは、マウス腫瘍モデルおよびヒト癌患者の腫瘍内Ｔｒｅｇ細胞上に発現する。マウスの確立した腫瘍の治療にはｍＩｇＧ１よりも抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａがより活性であると確認されたが、これらのマウスｍＩｇＧ２ａでは、共刺激活性を送達する能力に欠け、その免疫調節効果を説明することができる代替的な機序を探求した。４−１ＢＢ  ｍＲＮＡおよびタンパク質は、休止中のエフェクターＴ細胞と比較して、Ｔｒｅｇ細胞で優先的に発現し（１４、２６、２７）、その発現は、さらに上方制御され、続いてＴｒｅｇ細胞が活性化し（２７、２８）、ごく最近少なくとも転写レベルで、ヒト固形癌の腫瘍内Ｔｒｅｇにおいて上方制御されることが示されている（２９、３０）。したがって、高いＡ：ＩのＦｃγＲ結合プロファイルを有する抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａが、Ｔｒｅｇ細胞の欠失を介して抗腫瘍応答を増強することができる可能性を検討した。まず、２つのマウス腫瘍モデルＣＴ２６（図３Ａ）およびＮＸＳ２のＴｒｅｇ細胞上に４−１ＢＢが存在することを確認することから開始し、４−１ＢＢが、かなりの割合の腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇおよび少数のみのエフェクターＴ細胞上に発現することを見出した。さらに、脾臓Ｔｒｅｇ細胞のごく一部のみが、４−１ＢＢを発現した。これらの観察が、タンパク質レベルでヒトに翻訳される可能性があることを確認するために、卵巣癌および扁平上皮癌腫の患者の腫瘍内Ｔｒｅｇ上に４−１ＢＢが存在するかどうかをフローサイトメトリーによって決定した。４−１ＢＢが、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞上で見られたが、腫瘍のエフェクターＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞では見られず、４−１ＢＢは健康なＰＢＭＣから単離されたＴｒｅｇ、一致する血液、腹水または正常な皮膚で、より低いレベルで発現することが、図３Ｂおよび図３Ｃに見ることができる。
【０１３３】
抗４−１ＢＢ  ｍＡｂの抗腫瘍活性の媒介におけるＦｃγＲの役割
腫瘍内Ｔｒｅｇが、４−１ＢＢを発現することが確認されたため、ＣＴ２６腫瘍モデルを使用して、抗４−１ＢＢ  ｍＡｂの潜在的な役割および相対的枯渇能力を決定した。データは、野生型マウスでは、ｍＩｇＧ２ａ  ｍＡｂが腫瘍内Ｔｒｅｇを効率的に欠失させたが、ｍＩｇＧ１変異体（上記で使用したのと同じ抗体（図４Ａ））は効果がなかったことを実証している。この枯渇効果は腫瘍に制限され、活性化ＦｃγＲ複合体の重要な構成成分である共通のγ鎖の発現に依存していた。さらに、ＦｃγＲＩＩＢノックアウトマウスでは、ｍＩｇＧ１  ｍＡｂの枯渇活性が、ｍＩｇＧ２ａのものと同様のレベルに向上され、これらのｍＡｂの枯渇効率が、ＦｃγＲのＡ：Ｉ比と密接に関連しており、ＦｃγＲ発現の変化を通じて枯渇効力を操作することができることが実証された。次に、これらのマウスで腫瘍浸潤性ＣＤ８  Ｔ細胞の活性化を観察することができるかどうかを決定しようと努め、ＷＴ腫瘍を有するマウスでのｍＩｇＧ１  ｍＡｂの有効性はなかったにも関わらず、抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ１  ｍＡｂの投与によって、Ｋｉ−６７陽性によって監視されるように、ＣＤ８  Ｔ細胞の増殖に明らかかつ有意な増加をもたらしたことを観察した（図４Ｂ）。ｍＩｇＧ２ａアイソタイプもＣＤ８活性化の増加を誘発したが、これはｍＩｇＧ１よりも有意に少なかった。これらのデータは、おそらくＣＴ２６腫瘍モデルにおけるＴｒｅｇの優勢な役割を実証しており、Ｔｒｅｇ抑制を除去せずに野生型マウスでｍＩｇＧ１を用いてＣＤ８応答を誘導することは、生産的な抗腫瘍応答を誘導するには不十分であることを示唆している。
【０１３４】
抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａは、活性化ＦｃγＲの発現に依存する様式で腫瘍内Ｔｒｅｇ細胞の枯渇を媒介するのに効率的であったので、活性化ＦｃγＲの非存在は、このｍＡｂの治療効果に有害であろうと推論した。しかしながら、驚くべきことに、ＣＴ２６腫瘍モデル（図４Ｃ）では、抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａは、活性化ＦｃγＲの非存在下で抗腫瘍活性を保持しており、Ｔｒｅｇ細胞枯渇がその治療活性の十分な根拠ではない場合があることを示唆している。抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａの有効性に対する最小限の効果とは対照的に、活性化ＦｃγＲの非存在下での抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ１の抗腫瘍免疫を促進する能力に実質的な改善があった（ＣＴ２６の２／５）。ｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａ  ｍＡｂで実証されたＦｃγＲ結合プロファイル（図７）を考慮すると、これらの知見は、ｍＡｂの活性化ＦｃγＲへの競合的結合がない場合、ｍＩｇＧ１およびｍＩｇＧ２ａの両方によるＦｃγＲＩＩＢの生産的結合があり、したがってｍＡｂの最適な架橋が、共刺激の送達を可能にすることを示唆している。この概念は、ＯＶＡモデルのＦｃＲｇ  ＫＯ動物で観察されたｍＩｇＧ２ａのＴ細胞活性化によってさらに裏付けられている（図２Ｃ）。ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯマウスで治療を行うと、ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯマウスでのｍＩｇＧ１の向上したＴｒｅｇ枯渇活性と一致して（図４Ａ）、ｍＩｇＧ１アイソタイプｍＡｂは、ｍＩｇＧ２ａと同等の向上した活性を実証した。これらの結果は、すべてのＦｃγＲの非存在下では、いずれのｍＡｂも、治療活性を生じないという観察と相まって（図４Ｃ）、最適なインビボ活性のための効率的で非競合的なＦｃγＲ結合の重要性を裏付けている。
【０１３５】
次に、マウスおよびヒトの両方の標的およびエフェクターをインビトロで使用して、抗４−１ＢＢ  ｍＡｂの枯渇能力を正式に実証しようと努めた。ＷＴマウス骨髄由来マクロファージおよび４−１ＢＢ発現Ｔ細胞標的を使用して、ｍＩｇＧ２ａが、標的細胞の効果的な食作用を誘導し、ｍＩｇＧ１  ｍＡｂは効果がないことが観察された（図４Ｄ）。インビボ枯渇結果（図４Ｂ）および治療反応（図４Ｃ）と一致して、ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯマクロファージをエフェクターとして使用すると、ｍＩｇＧ１媒介性食作用の有意な増加が、ｍＩｇＧ２ａおよびＷＴエフェクターで得られたレベルと一致して観察された。次いで、ヒト標的および単球由来のマクロファージエフェクターを使用して、完全にヒト全身で、知見の翻訳の可能性を確認した。この全身では、２つの異なるｈｕＩｇＧ１抗ヒト４−１ＢＢクローン（ＳＡＰ３−６および００５−Ｂ０２）が、効果的な食細胞クリアランスを媒介することができることが見出された（図４Ｅ）。最後に、枯渇の有効性を決定したのは、細胞のタイプそのものではなく、４−１ＢＢの発現レベルであることを確認しようと努めた。ヒト（図４Ｅ）およびマウス（データ示さず）の両方を使用してこれを行い、インビトロでマクロファージおよび様々なレベルで４−１ＢＢを発現する標的細胞を生成し、４−１ＢＢ発現と標的細胞枯渇の効率との間の直接的な相関関係を見出した。これは、腫瘍微小環境におけるＴｒｅｇ上での４−１ＢＢ発現が高レベルであり、それらを良好な標的にし、低発現ＣＤ８細胞はおそらく使われないという概念を裏付けている。
【０１３６】
Ｔｒｅｇ枯渇および免疫刺激性ｍＡｂの計画的投与は、抗癌療法の向上をもたらす
抗４−ＢＢ  ｍＡｂのアイソタイプ変異体の治療活性が異なる機序を介して生じることを実証している結果は、併用が治療効果を向上する可能性を示した。しかしながら、Ｔｒｅｇ細胞（ｍＩｇＧ２ａ）の枯渇および共刺激（ｍＩｇＧ１）の送達は、いずれもＦｃγＲの結合に依存しており、競合的な様式に起因して依存するように思われるため、同時投与ではなく順次投与が最適であり得ると推測した。したがって、次の（上記で使用したのと同じ抗体の）抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａとｍＩｇＧ１  ｍＡｂとの同時投与および順次投与に続く治療効果を比較した。以前に観察されたように、ｍＩｇＧ１ではなくｍＩｇＧ２ａ変異体が単剤として活性であった。ｍＩｇＧ２ａとｍＩｇＧ１抗４−１ＢＢ  ｍＡｂとの同時投与は、ｍＩｇＧ２ａ単剤治療と比較して、腫瘍サイズの増加（図５Ａ）および腫瘍のないマウスの数の低減（図５Ｂ）によって示されるように、治療有効性の低減をもたらした。顕著に対照的に、最初にＴｒｅｇ細胞を欠失させるためのｍＩｇＧ２ａ、続いて共刺激を提供するアゴニストｍＩｇＧ１の順次送達は、いずれかの抗体変異体単独での単剤治療と比較して、腫瘍成長阻害、および腫瘍のないマウスの数の向上の両方を改善した（図５ＡおよびＢ）。これらの知見は、ＦｃγＲに依存する免疫調節性ｍＡｂの治療有効性が順次投与によって最適化することができることを実証した。重要なことに、この知見はまた、Ｔｒｅｇ枯渇が、特にＦｃｇＲ非競合的な様式で使用されると、抗４−１ＢＢを超えて免疫刺激性抗体を改善する幅広い有用性を有し得ることも示した。
【０１３７】
次に、したがって、Ｔｒｅｇ枯渇抗４−１ＢＢを臨床的に検証された免疫アゴニスト抗ＰＤ１と組み合わせる治療可能性を調査した。最適以下の単独療法薬を入手するためにｍＡｂの投与を低減し、次いでアイソタイプ最適抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａとＦｃγＲヌル結合脱グリコシル化（３１）変異体抗ＰＤ−１遮断抗体（図１０Ａおよび１０Ｂ）を順次組み合わせて、臨床的に検証された抗ＰＤ−１抗体ニボルマブおよびペンブロリズマブを欠いた／乏しいＦｃγＲ結合を模した。この組み合わせによって、療法に有意な増加が生じ、単独療法薬での２０〜２５％と比較して、８０％の長期的レスポンダーをもたらした（図５Ｃ）。注目すべきことに、ｍＡｂの最適以下のアイソタイプの組み合わせは、応答の向上をもたらさず、最適な併用療法には、あらゆる組み合わせの各構成成分のアイソタイプ、および計画的な要件を理解することが不可欠であることを実証している。
【０１３８】
二重活性を有するように操作された抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２Ｂは、増強された癌療法を送達する
Ｔｒｅｇ枯渇およびアゴニズム／免疫抑制の放出の最適な組み合わせを通じて、いずれかの機序単独よりも良好な応答を達成できることが実証されたため、単一ｍＡｂの操作を通じてこれらの複数の機序を送達可能であることを実証しようと努めた。ｍＡｂが媒介するＴｒｅｇ枯渇および免疫刺激性アゴニズムは、異なり競合するＦｃγＲの要件を有するという観察を考慮し、ヒトＩｇＧ２ヒンジ領域が、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーメンバーｍＡｂにＦｃγＲに依存しないアゴニスト特性を提供可能であるという以前の知見（２５）を利用しようと努めた。ここで、以前に詳述したように（２５）、ヒトＩｇＧ２領域を抗４−１ＢＢのマウスｍＩｇＧ２ａ定常領域にクローニングし、次いでヒンジをアゴニズム向上「Ｂ」形態に偏らせて、抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２Ｂを作製した（図６Ａ）。ＬＯＢ１２．０  ｍＫａｐｐａをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８３で示され、対応するアミノ酸配列は、配列番号１８４で示される。ＬＯＢ１２．０  ＨｕＩｇＧｈｉｎｇｅ２．ｍＩｇＧ２ａＦｃ（ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２Ｂ）をコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８５で示され、対応するアミノ酸配列は、配列番号１８６で示される。ＬＯＢ１２ヒトカッパをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１８７で示され、対応するアミノ酸配列は、配列番号１８８で示される。Ｔ細胞増殖についてインビトロで試験すると、ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２Ｂは、ＦｃγＲ結合プロファイルが変化していないにも関わらず（図１１）、ｍＩｇＧ２ａ親と比較してアゴニスト活性が有意に向上した（図６Ｂ）。この向上したアゴニスト活性にも関わらず、操作されたｍＡｂはまた、ＢＭＤＭおよび４−１ＢＢ発現標的細胞を使用して、インビトロで強力な貪食能力を保持し（図６Ｃ）、ＦｃγＲ要件に競合することなくアゴニストおよび枯渇の両方の可能性を備えた試薬を生成したことを実証している。最後に、このｍＡｂをＥＧ７腫瘍モデルの親ｍＩｇＧ２ａと比較し、二重活性ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２Ｂが、親ｍＩｇＧ２ａと同等の強力なＴｒｅｇ枯渇能力を有するが、ＣＤ８／Ｔｒｅｇ比の向上をもたらす顕著なＣＤ８刺激能力も有することを見出した（図６Ｄ）。この向上した二重活性ｍＡｂはまた、標準のｍＩｇＧ２ａの６０％と比較して、治療されたマウスの１００％を治癒する大きな治療可能性も示した（図６Ｅ）。これらのデータは、枯渇およびアゴニズムを最適に媒介するように単一ｍＡｂを操作し、この向上した二重活性を通じてより良好な療法を送達することができることを初めて実証している。
【０１３９】
考察
多様なインビトロおよびインビボモデルで、抗ＴＮＦＲスーパーファミリーｍＡｂが、アゴニスト効果を誘発するために効率的な架橋を必要とすることが確認されており、ほとんどのｍＡｂでこれは抑制性ＦｃγＲ結合によって最も良好に提供される（８、９、１８、１９、２３、３２、３３）。これらの知見にも関わらず、かかるアゴニストの結合が固形腫瘍環境におけるこれらのｍＡｂの治療活性に寄与する作用の主要な機序であるかどうかは明らかではない。それぞれ、高いおよび低い活性化：抑制性ＦｃγＲ比を有し、結果的に良好な枯渇およびアゴニストである可能性を有するｍＩｇＧ２ａおよびｍＩｇＧ１アイソタイプ抗４−１ＢＢ  ｍＡｂを使用することに対するこの疑問について調査した（１０）。
【０１４０】
マウスの異なる野生型系統で２つの異なる固形腫瘍モデルを使用すると、ｍＩｇＧ２ａ  ｍＡｂが実質的な治療効果を生じたのに対し、ｍＩｇＧ１はほとんど効果がなかったことを見出した（図１Ａ、図１Ｂ）。これらの結果は、ｍＩｇＧ１がより効果的であったＣＤ８＋Ｔ細胞に対するこれらのｍＡｂのアゴニスト活性とは顕著に対照的である（図２Ａ、図２Ｂ、および図９Ａ）。注目すべきことに、抗ＣＤ４０  ｍＡｂに関する以前の出版物とは対照的に、抗４−１ＢＢ  ｍＩｇＧ２ａはインビボでＴ細胞アゴニスト活性がないわけではなく、４−１ＢＢはＣＤ４０よりも低いシグナル伝達の架橋閾値を有し得ることを示唆している（１８、１９）。これらの異なる腫瘍モデルで表示されたｍＩｇＧ２ａに依存する治療活性は、おそらく療法が、エフェクター細胞に依存する枯渇効果によって媒介されていることを示唆した。使用された腫瘍はいずれも４−１ＢＢ陽性ではなく、これは抗ＣＤ２０  ｍＡｂで見られるような直接的な腫瘍標的化効果ではあり得ないことを意味している（３４）。
【０１４１】
ＣＴＬＡ−４、ＯＸ４０、およびＧＩＴＲを標的とするｍＡｂが、腫瘍内Ｔreg枯渇を通じて療法を媒介可能である（５〜７）という最近の知見を考慮して、これらのモデルで４−１ＢＢの発現を検査し、４−１ＢＢが腫瘍内Ｔｒｅｇ細胞上で特異的に上方制御されたことを見出した（図３Ａ）。これらの知見のヒトへの翻訳の可能性について重要なことは、４−１ＢＢが卵巣癌および扁平上皮癌腫の両方の患者の腫瘍内Ｔｒｅｇ細胞上に制限的に発現することを実証したことを見出し（それぞれ図３Ｂと図３Ｃ）、患者におけるこの機序的アプローチの治療可能性を裏付けている。さらに、ｍＩｇＧ２ａは、この抑制集団を活性化ＦｃγＲに依存する様式で枯渇させたが、ｍＩｇＧ１はほとんど効果がなかった（図４Ａ）。生産的枯渇のための抑制性ＦｃＲ結合に対する高い活性化の要件と一致して、これらの実験をＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯマウスで行うと、ｍＩｇＧ１は、インビボ（図４Ａ）およびインビトロ（図４Ｄ）の両方で、その枯渇能力においてｍＩｇＧ２ａに匹敵するようになった。
【０１４２】
Ｔｒｅｇ枯渇は、これらのモデルの４−１ＢＢ  Ａｂの最も効果的な機序作用であったが、活性化ＦｃγＲとの結合に競合がないと、これらのｍＡｂは、そのアゴニスト機能を通じて治療効果を生じ得ると仮定した。ＣＴ２６モデルを使用してこの可能性を試験し、活性化ＦｃγＲの非存在下では、ｍＩｇＧ１  ｍＡｂが実際に治療薬になることを見出した（図４Ｃ）。また、注目すべきことに、４−１ＢＢが相対的に低いインビボ架橋の閾値を有するという主張と一致して、活性化ＦｃγＲ  ｍＩｇＧ２ａの非存在下でも活性が維持された。ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯマウスで治療を行うと、ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯマウスでのｍＩｇＧ１の向上したＴｒｅｇ枯渇活性（図４Ａおよび図４Ｃ）と一致して、ｍＩｇＧ１アイソタイプｍＡｂは、ｍＩｇＧ２ａと同等の向上した活性を実証した。さらに、いずれのｍＡｂも、ＦｃγＲの非存在下でマウスを保護することができず（図４Ｃ）、アゴニストおよび枯渇の両方の機序がＦｃγＲに依存することを実証した。
【０１４３】
適切なＦｃγＲの提供を考慮すると、抗４−１ＢＢ  ｍＡｂが２つの別個の機序を使用する治療薬であり得るという事実は、ｍＡｂが順次投与される場合、両方の機序が関与することができることを示唆している。実際、これは、Ｔｒｅｇ細胞を欠失させるために最初にｍＩｇＧ２ａを与え、次いでアゴニストシグナルを送達するためにｍＩｇＧ１を与える場合であることを見出した（図５Ａおよび図５Ｂ）。重要なことに、ｍＡｂを同時投与した場合、治療効果はほとんどなかった。これらの観察は、単一抗原の結合を通じたこれら２つのＦｃγＲに依存する機序の同時結合は不可能であり得るが、本明細書に示されるように、一時的、または場合によってはこれらのｍＡｂの空間的（腫瘍内対全身）分離が、それらの組み合わせた有効性を促進し得るという仮説を裏付けている。
【０１４４】
おそらく併用アプローチが必要であることを臨床的結果が示唆する患者の、抗４−１ＢＢ  ｍＡｂのための、可能性が高いアイソタイプおよび計画的要件をさらに実証するために、異なるｍＡｂと抗ＰＤ−１との組み合わせを調査した。この設定では、抗４−１ＢＢおよび抗ＰＤ−１の両方のアイソタイプ最適バージョンが、単独療法薬の２０〜２５％の治癒およびアイソタイプ最適以下の組み合わせとは顕著に対照的に、治療されたマウスの８０％で治癒をもたらす、有意な併用効果を生じることを見出した。
【０１４５】
臨床では、アゴニスト抗体を使用して４−１ＢＢを標的にすることに大きな関心が寄せられている。しかしながら、データは、腫瘍部位のＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の約１％のみが、４−１ＢＢを発現することを示している。さらに、最近の知見は、メラノーマ患者の腫瘍部位に浸潤しているＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞の約１０％のみが、４−１ＢＢを発現するが、これらは腫瘍反応性クローンが豊富であることを示している（３５）。したがって、抗４−１ＢＢを使用して免疫療法応答を放出するためにＴｒｅｇを枯渇させることができるという現在の知見は、この戦略が患者に特に魅力的であり得ることを示唆している。他の推定的なＴｒｅｇ枯渇免疫療法薬（例えば、抗ＯＸ４０および抗ＣＴＬＡ−４）を用いる臨床研究は、有望であると思われ（５、３６、３７）、さらに患者におけるＴｒｅｇ枯渇抗４−１ＢＢ  ｍＡｂの可能性を確認している。
【０１４６】
現在、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによって製造されるＩｇＧ４抗体、およびＰｆｉｚｅｒによって製造される完全ヒト化ＩｇＧ２であるＰＦ−０５０８２５６６の、２つの完全ヒト化抗４−１ＢＢ  ｍＡｂが開発中である。これまでのところ、ＰＦ−０５０８２５６６は、患者にグレード１の毒性のみを引き起こす安全性が証明されている（３８）は、ウレルマブは、肝臓酵素の増加、掻痒症（ｐｒｕｒｉｔｉｓ）、下痢を含む有害作用を患者のうちの１５％に引き起こした（３９）。有望な安全性プロファイルにも関わらず、ウレルマブまたはＰＦ−０５０８２５６６のいずれも、ＦｃγＲＩＩＢに強く結合するとは予測されず、いずれかの抗体が患者に有効性を提供するかどうかが疑問視されている（４０）。発明者らのグループからの最近のデータは、４−１ＢＢを標的とするヒトＩｇＧ２抗体がＦｃγＲに依存しないスーパーアゴニストとして作用することができ、ＰＦ−０５０８２５６６が同様の様式で作用し得る可能性が依然としてあることを示している（２５）。本明細書に提示されたデータは、免疫アゴニスト変異体抗４−１ＢＢ抗体と比較したＴｒｅｇ欠失の改善された有効性、およびＣＤ８エフェクター細胞と比較したＴｒｅｇ上での選択的な腫瘍内４−１ＢＢ発現を示しており、Ｔｒｅｇ枯渇能力で選択される、ヒト治療用抗４−１ＢＢ  ＩｇＧ１アイソタイプ抗体の開発を支持する（４０）。最近、かかるＴｒｅｇ欠失抗体が、相乗作用して応答を増強し、チェックポイント遮断に対する耐性の克服に役立つことが実証された（５０）。
【０１４７】
ここまでの知見は、免疫調節性ｍＡｂが療法に複数の作用機序を利用することができるという主張を裏付け、枯渇およびアゴニズムの両方を最適に行うように単一抗体を操作することができるかどうかの可能性を検討した。インビトロおよびインビボでのこれらの機序に対する、競合するＦｃγＲ要件を実証するデータを考慮すると、いずれか１つのｍＡｂが一度に単一のＦｃγＲにしか結合することができない場合、ｍＡｂが向上した活性化および抑制性ＦｃγＲ結合を有するように操作することは機能しそうにないと思われる。これらの可能性の限定を考慮して、アゴニズムの最適な「Ｂ」形態に偏らせたｈＩｇＧ２ヒンジ領域を組み込む最適な枯渇能力を有するｍＩｇＧ２ａ  ｍＡｂを生成した。このｍＡｂが、両方の機能を実施可能であろうと仮定し、インビトロ（図６ＢおよびＣ）およびインビボ（図６Ｄ）の両方の場合に当てはまることを見出し、これによって固形腫瘍モデルの療法の向上がもたらされた（図６Ｅ）。これらの結果は、既存のおよび開発中の免疫調節性ｍＡｂの投与、ならびに将来の試薬の設計および開発、ならびにその使用のための戦略に直接密接な関係を有する。
【０１４８】
配列
配列番号１７９−ＬＯＢ１２．０  ｍＩｇＧ１重鎖をコードするヌクレオチド配列。
【表３】
2020528765.tif 000011
配列番号１８０−ＬＯＢ１２．０  ｍＩｇＧ１重鎖のアミノ酸配列。下線付きの配列は、リーダー配列を示している。
【表４】
2020528765.tif 000012
配列番号１８１−ＬＯＢ１２．０  ｍＩｇＧ２ａ重鎖をコードするヌクレオチド配列。
【表５】
2020528765.tif 000013
配列番号１８２−ＬＯＢ１２．０  ｍＩｇＧ２ａ重鎖のアミノ酸配列。下線付きの配列は、リーダー配列を示している。
【表６】
2020528765.tif 000014
配列番号１８３−ＬＯＢ１２．０  ｍカッパをコードするヌクレオチド配列。
【表７】
2020528765.tif 000015
配列番号１８４−ＬＯＢ１２．０  ｍカッパのアミノ酸配列。下線付きの配列は、リーダー配列を示している。
【表８】
2020528765.tif 000016
配列番号１８５−ＬＯＢ１２．０  ＨｕＩｇＧｈｉｎｇｅ２．ｍＩｇＧ２ａＦｃ（ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２Ｂ）をコードするヌクレオチド配列。
【表９】
2020528765.tif 000017
配列番号１８６−ＬＯＢ１２．０  ＨｕＩｇＧｈｉｎｇｅ２．ｍＩｇＧ２ａＦｃ（ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２Ｂ）のアミノ酸配列。下線付きの配列は、リーダー配列を示している。
【表１０】
2020528765.tif 000018
配列番号１８７−ＬＯＢ１２ヒトカッパをコードするヌクレオチド配列。
【表１１】
2020528765.tif 000019
配列番号１８８−ＬＯＢ１２ヒトカッパのアミノ酸配列。下線付きの配列は、リーダー配列を示している。
【表１２】
2020528765.tif 000020
【０１４９】
方法
動物および細胞。マウスは、地元の施設で飼育され維持された。使用された遺伝子改変系統は、ＯＴ１  ＴＣＲトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウス（Ｄｒ．Ｍａｔｔｈｉａｓ  Ｍｅｒｋｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，Ｉｍｐｅｒｉａｌ  Ｃｏｌｌｅｇｅ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｕ．Ｋ．）、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰ、γ鎖ＫＯ、ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯ、およびＦｃγＲヌル（γ鎖ＫＯｘＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯ）であった。マウスは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および／またはフローサイトメトリーによって確認された遺伝子型との交配によって入手した。ＣＴ２６結腸癌腫（１６）、ＮＸＳ２神経芽腫（４１）、Ｂ１６  Ｆｌｔ３ｖａｘメラノーマ（４２）、およびＥＧ７胸腺腫（４３）モデルについては、すべて以前に説明されている。
【０１５０】
免疫療法。０日目に、ＣＴ２６−年齢と性別が一致するＷＴ、γ鎖ＫＯ、ＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯ、またはＦｃγＲヌル（γ鎖ＫＯｘＦｃγＲＩＩＢ  ＫＯ）ＢＡＬＢ／ｃマウスの群に、５×１０4のＣＴ２６の皮下投与をチャレンジした。腫瘍が触知可能なときに、マウスにｍＡｂまたはＰＢＳ対照を静脈内投与し、続いて１日おきにさらに３回腹腔内投与した（特に示されない限り最終用量２００μｇ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇すると、０．５ｍｇの抗ＣＤ８（ＹＴＳ１６９）を、腫瘍およびｍＡｂの投与の前に前述のように（４４）、−１、＋１、および＋４日目に腹腔内投与した。ＮＸＳ２−０日目に、年齢および性別が一致するＡ／Ｊマウスの群に２×１０6のＮＸＳ２細胞の皮下投与をチャレンジし、個々の実験で指定された抗体／ペプチドワクチンを与えた。すべての抗体は、ＰＢＳで腹腔内投与した。皮内注射の前に、ＰＢＳ中のチロシンヒドロキシラーゼ（ＦＥＴＦＥＡＫＩ）および対照（ＳＩＩＮＦＥＫＬまたはＦＥＡＮＧＮＬＩ）ペプチドを、等量の不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）で乳化させた。すべてのモデルの腫瘍サイズをキャリパーで定期的に監視し、断面積が２２５ｍｍ2を超えるとマウスを処分した。ＥＧ７−０日目に、年齢および性別が一致するＣ５７ＢＬ／６の群に、５×１０5のＥＧ７細胞の皮下投与をチャレンジした。３、５および７日目に、示されるように、マウスに２００μｇのｍＡｂまたはＰＢＳ対照を腹腔内投与した。人道的エンドポイントまでの生存期間を、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用してプロットし、Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用するログランク試験による有意性を分析した。
【０１５１】
抗体および試薬。抗４１ＢＢ（クローンＬＯＢ１２．０）ｍＡｂ  ｍＩｇＧ１、ｍＩｇＧ２ａ、およびｍＩｇＧ２ａ  ｈｕＩｇＧ２ヒンジ（ｍＩｇＧ２ａ／ｈ２Ｂ）アイソタイプは、以前に説明したように構築した（上述の抗体１８、２５）。抗ＣＤ８（ＹＴＳ１６９）は、インハウスで生成した。抗マウスＰＤ−１（ＥＷ１−９）ｍＡｂ  ｒＩｇＧ１は、組換えマウスＰＤ−１（Ｌｅｕ２５−Ｇｌｎ１６７）Ｆｃ融合タンパク質（ＲｎＤ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でＷｉｓｔａｒラットを免疫接種した後、従来のハイブリドーマ技術を使用して産生した。免疫接種したラットまたはマウスの脾臓を、ＮＳ−１メラノーマ細胞と融合させ、ＥＬＩＳＡおよびフローサイトメトリーによってプレートをスクリーニングした。ｍＡｂを最初にスクリーニングし、陽性ウェルの細胞を２回クローニングし、ＩｇＧ生成のために培養で増殖させた。抗体は、ハイブリドーマまたはＣＨＯＫ１細胞から生成し、プロテインＡで精製し、電気泳動（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＥＰ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）およびＳＥＣ  ＨＰＬＣによる凝集の欠如によって純度を評価した。Ｅｎｄｏｓａｆｅ−ＰＴＳポータブル試験システム（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ，ＦＲ）を使用して決定した、すべての調製物は、エンドトキシンが低かった（＜１ｎｇのエンドトキシン／ｍｇ）。抗ＣＴＬＡ−４（９Ｄ９）は、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌから購入した。抗ＰＤ−１  ｄｅ−ｇｌｙは、ＥＷ１−９を０．０５ＵのＰＮＧａｓｅＦ／μｇの抗体で処理することによって生成した。Ｎ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧａｓｅＦ）は、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｖ４８３Ａ）から入手した。サンプルは、３７℃で一晩保管した。脱グリコシル化は、ＥＰまたはＳＰＲ分析のいずれかによって確認した。酵素からの抗体の精製は、ｓｅｐｈａｄｅｘ（商標）２００を使用するサイズ排除クロマトグラフィーを通じて達成した。ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、ＦＥＴＦＥＡＫＩ、およびＦＥＡＮＧＮＬＩ）は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌｔｄから入手した。
【０１５２】
インビトロＴ細胞増殖。ＧＦＰ＋細胞を排除するためにＦｏｘｐ３−ＧＦＰマウスからの脾臓を選別し（−Ｔｒｅｇ細胞、Ｔｒｅｇ細胞の９９％が除去されている）、あるいはヌルを選別し、示されるように０．１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３およびある濃度範囲の抗４−１ＢＢ  ｍＡｂを１×１０5細胞／ウェルでプレーティングした。５６時間後に１μＣｉ／ウェルの［3Ｈ］−チミジンを添加し、さらに１６時間の培養後にプレートを採取した。
【０１５３】
内因性ＯＶＡ特異性免疫応答。図の説明で特定されるように、０日目に５ｍｇのＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ）および２００μｇのｍＡｂでマウスを免疫接種した。末梢血中の内因性ＯＶＡ特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を経時的に監視し、前述のようにフローサイトメトリーによって分析した（１８）。
【０１５４】
リンパ球の単離。マウス−ＣＴ２６またはＥＧ７をチャレンジしたマウスのそれらの腫瘍を切除し、３７oＣで２０分間、０．５Ｗｕ／ｍｌのリベラーゼＤＬ（Ｒｏｃｈｅ）および５０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅＩ（Ｒｏｃｈｅ）で消化させた。次いで、細胞を１００μｍのセルストレーナーに通し、アッセイに直接使用するか、あるいは４０％および７０％のパーコール勾配を使用して腫瘍浸潤リンパ球を単離した。ヒト−単離した単一細胞懸濁液として腹水を評価した。卵巣腫瘍サンプルは、Ｓｋａｎｅｓ大学病院の産婦人科で手術を受けている患者から入手した。材料を小片に切断し、３７℃で２０分間、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ）およびリベラーゼ（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含むＲ１０で培養した。残りの組織は、機械的に解離し、細胞懸濁液と一緒に７０μｍのセルストレーナーを通した。Ｓｏｕｔｈ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｈａｍｐｓｈｉｒｅ  Ｂ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（参照番号０７／Ｈ０５０４／１８７）によって承認されているように、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ  ＮＨＳ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｔｒｕｓｔの皮膚科で手術を受けている患者から切除したばかりの有棘細胞癌（ｃＳＣＣ）および正常な皮膚のサンプルを入手した。サンプルを細かく刻み、３７°Ｃで１．５時間、ＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ）中の１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＡ（Ｓｉｇｍａ）および１０μｇ／ｍｌのＤＮＡｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ）で処理した後、７０μｍのセルフィルター（ＢＤ）、およびＯｐｔｉｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）密度勾配による遠心分離（６００ｘｇ、２０分）を通じてろ過した。一致する末梢血サンプルを入手し、６００ｘｇで３０分間、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ）で遠心分離することによって、末梢血単核細胞を分離した。
【０１５５】
フローサイトメトリー。マウス−細胞表面染色：単離したリンパ球を洗浄し、氷上のＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）中で３０分間、暗所で抗体と培養し、細胞をＰＢＳ／１％ＢＳＡで１回洗浄した。染色後、Ｅｒｙｔｈｒｏｌｙｓｅ赤血球溶解緩衝液（ＡｂＤ  ＳｅｒｏＴｅｃ）を使用して、サンプルを固定した。サンプルをＰＢＳ／１％ＢＳＡで１回洗浄し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩまたはＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒのいずれかで実験し、ＦＣＳ  Ｅｘｐｒｅｓｓを使用してデータを分析した。細胞内染色：表面染色後、細胞を固定し、抗マウス／ラットＦｏｘｐ３染色セット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞内を染色した。抗体は、抗ＣＤ４  ｅＦ４５０（ＧＫ１．５）、抗ＣＤ８−ＡＰＣ−ｅＦ７８０（５３−６．７）、抗Ｆｏｘｐ３  ＡＰＣ（ＦＪＫ−１６）、抗４−１−ＢＢ（１７−Ｂ５）（すべてｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗Ｋｉ６７  ＡＰＣ（Ｂ５６）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、またはアイソタイプ対照であった。ヒト−関連抗体で染色する前に、卵巣癌患者の細胞を１０ｍｇ／ｍｌのＫＩＯＶＩＧ（Ｂａｘａｌｔａ）と１０分間培養した。細胞生存率：細胞は、４°ＣのＰＢＳで固定可能なｅＦｌｕｏｒ７８０  生細胞死細胞染色（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）またはａｑｕａ生細胞死細胞判別染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかで染色した。細胞表面染色：抗体を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）＋１０％ＦＣＳ（Ｇｉｂｃｏ）中、４℃で３０分間、暗所で細胞と培養した。細胞内染色は、Ｆｏｘｐ３染色緩衝液セット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を用いた。ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａまたはＢＤ  ＦＡＣＳＶｅｒｓｅを使用するフローサイトメトリーによって、細胞を分析した。次の細胞マーカーに対するフルオロフォア抱合抗体を使用した：卵巣−ＣＤ４−ＢＶ５１０（ＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ２５−ＢＶ４２１（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ１２７−ＦＩＴＣ（ＨＩＬ−７Ｒ−Ｍ２１）、ＣＤ８−ＡＰＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、４１ＢＢ−ＰＥ（４Ｂ４−１）、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ、κ対照−ＰＥ（Ｇ１５５−１７８、すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）、ＳＣＣ−ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、またはＰｅｒＣＰ  Ｃｙ５．５、ＣＤ８−ＰＥ  Ｃｙ７（すべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）、４−１ＢＢ−ＰＥ、およびＦｏｘｐ３−ＡＰＣ（どちらもｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。
【０１５６】
抗体依存性細胞貪食。ＡＤＣＰアッセイは、マウス（１７、４５）またはヒトマクロファージ（１８、４６）を用いて、前述のように実施した。端的には、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの大腿骨から骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）を生成し、２０％のＬ９２９上清を含有する完全なＲＰＭＩ中で培養した。あるいは、ヒト単球由来マクロファージ（ｈＭＤＭ）をＰＢＭＣから生成し、Ｍ−ＣＳＦを含有する完全ＲＰＭＩ（インハウス）中で培養した。標的細胞は、ＣＦＳＥで染色（５μＭ）し、次いで抗体でオプソニン化した後、マクロファージと約１時間共培養した。マクロファージは、ＣＤ１６−ＡＰＣまたはＦ４／８０−ＡＰＣで染色し、サンプルを、フローサイトメトリーによって二重陽性（ＣＦＳＥ／ＡＰＣ）マクロファージの割合について評価した。
【０１５７】
統計分析。データの対応のないスチューデントのｔ検定分析を実施したか、あるいは腫瘍治療実験には、ログランク検定による有意性の分析を用いるＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ法を使用して、人道的終点までの生存期間をプロットした。すべての統計分析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａ）を使用して行った。ｐ＜０．０５のとき、有意性を認めた。
【０１５８】
表面プラズモン共鳴。抗４１ＢＢ  ｍＡｂと可溶性ＦｃγＲと相互作用の分析は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して評価した。抗体または対照としてのＢＳＡは、製造元の指示に従って標準アミンカップリングによって、５０００共鳴単位［ＲＵ］）で、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）のフローセルに固定した。可溶性ＦｃγＲ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）は、ＨＢＳ−ＥＰ＋泳動用緩衝液（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）中の１５００、３７５、９４、２３、６、および０ｎＭのフローセルを通して３０μｌ／分の流速で注入した。可溶性Ｆｃ受容体を２分間注射し、解離を５分間監視した。制御フローセルへのバックグラウンド結合は、自動的に差し引かれた。親和定数は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｂｉｏｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用して、示されるように平衡結合分析によるデータから導出した。
【０１５９】
インビトロ結合アッセイ。尾のない形態のマウス４−１ＢＢ（ｐＴＬ）（４７）で安定的に形質導入されたＫａｒｐａｓ−２９９細胞を、４oＣで示される濃度の抗４−１ＢＢ  ｍＡｂと２０分間培養し、その後洗浄し、ＰＥ標識化抗マウスまたはＰＥ標識化抗ラット二次抗体（どちらもＪａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓ）で染色した。空のベクター対照を安定して発現するＫａｒｐａｓ−２９９細胞には染色は観察されなかった（データ示さず）。競合的結合アッセイでは、０．１μｇ／ｍｌの親ラット抗４−１ＢＢ  ｍＡｂを、抗４−１ＢＢのｍＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａバージョンのいずれかと、示されるように段階的濃度で混合し、その後Ｋａｒｐａｓ−２９９  ｐＴＬ細胞と培養した。細胞を洗浄し、ＡＰＣ抱合およびマウス吸着ロバ抗ラット二次抗体で染色し、二次抗体は、ｍＩｇＧ１またはｍＩｇＧ２ａのいずれにも結合しなかった。ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩおよびＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェアを使用して、フローサイトメトリー分析を実施した。
【０１６０】
ＯＶＡ特異性免疫応答。ＯＴＩトランスジェニックマウスの脾細胞を採取し洗浄した。次いで、尾の静脈注射によって、およそ２×１０5のＯＶＡ特異性ＣＤ８  Ｔ細胞を受容個体マウスに移した。翌日、個々の実験で説明したように、ＯＶＡ（Ｓｉｇｍａ）をマウスに免疫接種した。末梢血のＯＴＩ増殖は、以前に説明されているようにフローサイトメトリーによって分析した（１８）。応答のピーク時の結果が示されている（免疫接種後４〜５日）。
【０１６１】
腫瘍チャレンジ。Ｂ１６−ｓＦｌｔ３Ｌ−Ｉｇ（ＦＶＡＸ）−０日目に、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの群に２．５×１０4のＢ１６／ＢＬ６細胞の皮内投与をチャレンジした。３、６、および９日目に、示されるようにマウスの反対側の腹部に１×１０6の照射ＦＶＡＸ細胞、ならびにＰＢＳ、１００μｇの抗ＣＴＬＡ−４（クローン９Ｄ９）または抗ＣＴＬＡ−４、および３００μｇの抗４−１ＢＢのいずれかを皮内投与し、以前公開されたプロトコルに基づいて、３、６、および９日目にも腹腔内投与した（４８）。
【０１６２】
特異性４−１ＢＢ抗体および特異性ＯＸ４０抗体に関する実施例
材料および方法
動物および細胞
マウスは、ホームオフィスのガイドラインに従って、地元の施設で飼育および維持した。１０〜１２週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７  ｂｌ６マウスは、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｂｏｍｈｏｌｔ，Ｄｅｎｍａｒｋ）から供給され、地元の動物施設で維持した。原発腫瘍細胞を用いる異種移植研究のために、６〜８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃおよびＣ５７  ｂｌ６マウスに、それぞれ同系の腫瘍細胞株ＣＴ２６およびＴＨ０３を移植した。
【０１６３】
臨床サンプル
臨床サンプルの使用に関する倫理的承認は、Ｓｋａｎｅ大学病院の倫理委員会から取得した。インフォームドコンセントは、ヘルシンキ宣言に従って提供した。サンプルは、ＬｕｎｄのＳｋａｎｅ大学病院の婦人科および腫瘍科を通じて入手した。単離した単一細胞懸濁液として腹水を評価した。腫瘍材料を小片に切断し、３７℃で２０分間、ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）およびリベラーゼ（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を含むＲ１０で培養した。残りの組織は、機械的に破砕し、細胞懸濁液と一緒に７０μｍのセルストレーナーを通した。腹水および腫瘍から単離した細胞を染色した。ＦＡＣＳＶｅｒｓｅを使用してデータ収集を実施し、ＦｌｏｗＪｏを使用してデータを分析した。
【０１６４】
細胞培養
細胞培養は、補充したＲＰＭＩ（２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリンおよびストレプトマイシン、ならびに１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＧＩＢＣＯ）で実施した。ヒト末梢ＣＤ４+Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ  ＣＤ４  Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，ＵＫ）を使用する陰性選択によって精製した。
【０１６５】
抗体および試薬
次の抗体および試薬を使用した：精製抗ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、精製抗ＣＤ２８（ＣＤ２８．２、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＫＩＯＶＩＧ（Ｂａｘａｌｔａ，Ｌｅｓｓｉｎｅｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）、Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  ＣＦＳＥ（ＤＭＳＯ中に溶解）およびヨウ化プロピジウムは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。
次の試薬を使用して、ヒトリンパ球を染色した：ＣＤ４−ＢＶ５１０（ＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ２５−ＢＶ４２１（Ｍ−Ａ２５１）、抗ＣＤ１２７−ＦＩＴＣ（ＨＩＬ−７Ｒ−Ｍ２１）、Ｏｘ４０−ＰＥ（ＡＣＴ３５）、４１ＢＢ−ＰＥ（４Ｂ４−１）、ＩＣＯＳ−ＰＥ（ＤＸ２９）、ＧＩＴＲ−ＰＥ（６２１）、ＰＤ−１−ＰＥ（ＭＩＨ４）、ＣＴＬＡ−４−ＰＥ（ＢＮＩ３）、ＣＤ４−ＡＰＣ（ＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８−ＡＰＣ（ＲＰＡ−Ｔ８）、マウスＩｇＧ１、κアイソタイプ対照−ＰＥ（ＭＯＰＣ−２１）、マウスＩｇＧ２ａアイソタイプ、κ対照−ＰＥ（Ｇ１５５−１７８）、マウスＩｇＧ２ｂアイソタイプ、κ対照−ＰＥ（２７−５３、すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから）、ＴＮＦＲＩＩ−ＰＥ（ＦＡＢ２２６Ｐ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
次の試薬を使用して、マウスリンパ球を染色した：ＣＤ４−ＢＶ５１０（ＲＭ４−５）、ＣＤ２５−ＢＶ４２１（７Ｄ４）、ＣＤ８−Ａｌｅｘａ  ４８８（５３−６．７、ＢＤ）、Ｏｘ４０、４１ＢＢ、ＴＮＦＲＩＩ、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＦＩＴＣ陰性対照（ｓｃＦｖ、ＢｉｏＩｎｖｅｎｔインハウス生成）。
【０１６６】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、標準的な手順に従って実施した。死細胞（ヨウ化プロピジウム+として同定、またはＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ７８０を使用）および細胞凝集体は、すべての分析から除外した。蛍光抱合ｍＡｂは、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入したか、インハウスで作製した。ＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）でデータ収集を実施し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で分析した。遺伝子発現分析のために、ＦＡＣＳＡｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して細胞を選別した。インハウスで生成したｓｃＦｖでの染色は、インハウスのＡｌｅｘａ  ６４７標識化脱グリコシル化抗Ｈｉｓタグ抗体（ＡＤ１．１．１０，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出した。Ｔ細胞のＣＦＳＥ標識は、製造業者の指示に従って実施した。
【０１６７】
抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
ＡＤＣＣアッセイは、２つの方法で実施した：ａ）ＧＦＰ（Ｃｏｎｋｗｅｓｔ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから購入）２４と共にＣＤ１６−１５８Ｖ対立遺伝子を発現するように安定的にトランスフェクトしたＮＫ−９２細胞株を使用して、ＡＤＣＣアッセイを実施した。ＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、健康なドナーの末梢血からＣＤ４＋標的Ｔ細胞を単離した。３７°Ｃで２日間、細胞を、ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）および５０ｎｇ／ｍｌのｒｈ  ＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で刺激した。４℃で３０分間、標的細胞を０．１〜１０μｇ／ｍｌのｍＡＢと事前培養し、その後ＮＫ細胞と混合した。細胞を、２：１のエフェクター：標的細胞比で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、および１０％のＦＢＳ低ＩｇＧを含有するＲＰＭＩ１６４０＋ＧｌｕｔａＭＡＸ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４時間培養した。溶解は、フローサイトメトリーによって決定した。端的には、培養の最後に、細胞懸濁液を、４°Ｃの暗所で２０分間、１０ｎＭのＳＹＴＯＸ  Ｒｅｄ死細胞染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＦｉｘａｂｌｅ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ｄｙｅ  ｅＦｌｕｏｒ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに、ＢＶ５１０抱合抗ＣＤ４で染色し、次いで細胞をＦＡＣＳＶｅｒｓｅ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して分析した。ｂ）
標的細胞をカルセインＡＭで標識し、続いて希釈濃度のＡｂを添加した。標的細胞を、５０：１のＥ：Ｔ比のヒトＰＢＭＣと３７°Ｃで４時間共培養した。プレートを４００  ３ｇで５分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を白色の９６ウェルプレートに移した。カルセイン放出は、４８５ｎｍの励起波長および５３０ｎｍの発光波長を使用するＶａｒｉｏｓｋａｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して測定した。最大放出の割合は、次のように計算した：最大放出％＝（サンプル／トリトン処理）＊１００。
【０１６８】
抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）
完全培地で洗浄する前に、標的細胞を室温で１０分間、５ｍＭのＣＦＳＥで標識した。次いで、ＣＦＳＥ標識化標的を希釈濃度のＡｂでオプソニン化し、その後９６ウェルプレートで１：５のＥ：Ｔ比のＢＭＤＭと、３７°Ｃで１時間共培養した。次いで、ＢＭＤＭを室温で１５分間、抗Ｆ４／８０−アロフィコシアニンで標識し、ＰＢＳで２回洗浄した。プレートを氷上に保持し、ウェルを削ってＢＭＤＭを収集し、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ）を使用するフローサイトメトリーによって食作用を評価し、Ｆ４／８０＋細胞集団内のＦ４／８０＋ＣＦＳＥ＋細胞の割合を決定した。
【０１６９】
Ｔ細胞増殖アッセイ
抗体のアゴニスト活性は、２つのプロトコルを使用して試験した：ａ）抗体を室温で１時間、ＩｇＧ：Ｆ（ａｂ’）２のモル比＝１．５：１の、Ｆ（ａｂ’）２ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃｇ断片特異性またはＦ（ａｂ’）２ヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃｇ断片特異性と架橋させた。１×１０５のＭＡＣＳ精製ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、ＣＦＳＥ標識し、プレート結合抗ＣＤ３（０．５μｇ／ｍｌ）および４μｇ／ｍｌの可溶性架橋ＩｇＧで３７°Ｃで３日間刺激し、その後分析した。ｂ）細胞培養は、３７°Ｃの５％のＣＯ２中で、１０％ウシ胎児血清、グルタミン（２ｍＭ）、ピルビン酸（１ｍＭ）、ペニシリン、およびストレプトマイシン（１００ＩＵ／ｍＬ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（ＧｉｂｃｏＴＭ）で行った。未使用のＰＢＭＣを、２ｍＭのカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。次いで、Ｒｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ（５１）によって記載されているように、ＰＢＭＣを、ｍＡｂ刺激性アッセイの４８時間前に、２４ウェルプレート中の１ｘ１０７細胞／ｍＬと培養した。ＰＢＭＣ刺激用に、丸底９６ウェルプレートに、ＰＢＳ中０．０１／ｍＬのＯＫＴ３抗体（インハウス）で４時間ウェットコーティングし、その後過剰な抗体を廃棄し、プレートをＰＢＳで洗浄した。１Ｘ１０５のＰＢＭＣ／ウェルをプレートに移し、５μｇ／ｍＬの試験ｍＡｂ（抗４−１ＢＢ、抗ＯＸ４０  ｍＡｂ）で刺激した。刺激後４または５日目に、細胞を抗ＣＤ８−ＡＰＣ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）および抗ＣＤ４−ＰＥ（インハウス）で標識し、増殖をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＣＦＳＥ希釈によって評価した。
【０１７０】
リガンド遮断ＥＬＩＳＡ
ヒト受容体（ｈｏｘ４０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ｈ４１ＢＢ、インハウス生産）を９６ウェルプレート（Ｌｕｍｉｔｒａｃ  ６００  ＬＩＡ  ｐｌａｔｅ，Ｇｒｅｉｎｅｒ）に１ｐｍｏｌｅ／ウェルでコーティングした。洗浄後、ｍＡｂｓ（１０μｇ／ｍｌ〜０．０１μｇ／ｍｌ）を１時間結合させた。リガンドを５ｎＭで添加し（ｈｏｘ４０−Ｌ、ｈ４１ＢＢ−Ｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、プレートをさらに１５分間培養した。洗浄後、結合したリガンドをビオチン化抗体（抗ｈｏｘ４０−Ｌ、抗ｈ４１ＢＢ−Ｌ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で検出し、続いて中間洗浄してストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を検出した。Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を基質として使用し、Ｔｅｃａｎ  Ｕｌｔｒａ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒを使用してプレートを分析した。
【０１７１】
マイクロアレイ分析
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋標的細胞およびＣＤ４＋ＣＤ２５非標的細胞を、腫瘍を有するマウス（ＣＴ２６およびＴＨ０３）のリンパ節から選別した。ＣＤ３非標的細胞は、健康なＣ５７／Ｂｌ６およびＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓から選別した。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、健康なＢａｌｂ／ｃマウスの脾臓から単離した。すべてのサンプルからのＲＮＡは、製造元の指示に従ってＭａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ（Ｄｕｅｒｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＲＮＡ単離Ｍｉｄｉキットで調製した。単離したＲＮＡは増幅し、Ｌｕｎｄ大学統合生物学Ｓｗｅｇｅｎｅセンター（ＳＣＩＢＬＵ）（Ｓｗｅｄｅｎ）のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｏｕｓｅ  Ｇｅｎｅ  ２．０ＳＴアレイへのハイブリダイゼーション用に調製した。データ分析は、標準的な方法に従ってＳＣＩＢＬＵで実施した。
【０１７２】
上記のアッセイの結果および研究した抗体の特徴を、図１２〜２４に示している。
【０１７３】
実施形態
次に、本発明の異なる実施形態の項目別リストを提示する。
１．癌の治療に使用するためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子であって、免疫刺激性抗体分子と順次投与され、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が免疫刺激性抗体分子の投与の前に投与される、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子。
２．当該免疫刺激性抗体分子が、ＣＤ８活性化および／またはＣＤ８増強抗体分子である、実施形態１に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
３．癌が、固形腫瘍である、実施形態１または２に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
４．固形腫瘍が、肉腫、癌腫、リンパ腫、および卵巣癌からなる群から選択される、実施形態３に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
５．固形腫瘍が、扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、胸腺腫、神経芽細胞腫、または卵巣癌である、実施形態３に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
６．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子および／または当該免疫刺激性抗体分子が、完全サイズ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）2からなる群から選択される、実施例１〜５のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
７．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子および／または当該免疫刺激性抗体分子が、ヒトまたはヒト化抗体である、実施形態１〜６のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
８．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、ヒトＩｇＧ１抗体である、実施形態１〜７のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
９．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、少なくとも１つの活性化ＦｃγＲへの改善された結合のために操作されたヒトＩｇＧ１抗体分子である、実施形態１〜８のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
１０．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に属する標的に特異的に結合する抗体分子から選択される、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
１１．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、およびＴＮＦＲ２からなる群から選択される標的に特異的に結合する抗体分子である、実施形態１０に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
１２．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＴＬＡ−４、およびＣＤ２５から選択される標的に特異的に結合する抗体分子である、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
１３．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、抗４−１ＢＢモノクローナル抗体分子である、実施形態１１に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
１４．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号１〜６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列９〜１４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列１７〜２２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列２５〜３０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列３３〜３８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列４１〜４６から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列４９〜５４から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列５７〜６２から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列６５〜７０から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、配列番号１５３〜１５８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個、および配列番号１６３〜１６８から選択されるＣＤＲのうちの１〜６個を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１３に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
１５．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号１〜６、配列番号９〜１４、配列番号１７〜２２、配列番号２５〜３０、配列番号３３〜３８、配列番号４１〜４６、配列番号４９〜５４、配列番号５７〜６２、配列番号６５〜７０、配列番号１５３〜１５８、および配列１６３〜１６８を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１４に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
１６．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、１５９、および１６９からなる群から選択される可変重鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１４または１５に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
１７．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、１６０、および１７０からなる群から選択される可変軽鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１４〜１６のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
１８．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７および８、配列番号１５および１６、配列番号２３および２４、配列番号３１および３２、配列番号３９および４０、ならびに配列番号４７および４８、配列番号５５および５６、配列番号６３および６４、配列番号７１および７２、配列番号１５９および１６０、ならびに配列番号１６９および１７０を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１４〜１７のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
１９．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体が、ヒト抗ＯＸ４０モノクローナル抗体分子である、実施形態１１に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
２０．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７３〜７８、８１〜８６、８９〜９４、９７〜１０２  １０５〜１１０、１１３〜１１８、１２１〜１２６、１２９〜１３４、１３７〜１４２、１４５〜１５０、および１７１〜１７６から選択されるＣＤＲのうちの１つ以上を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１９に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
２１．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号配列番号７３〜７８、配列番号８１〜８６、配列番号８９〜９４、配列番号９７〜１０２、配列番号１０５〜１１０、配列番号１１３〜１１８、配列番号１２１〜１２６、配列番号１２９〜１３４、配列番号１３７〜１４２、配列番号１４５〜１５０、および配列番号１７７〜１７８を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態２０に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
２２．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、および１７７からなる群から選択される可変重鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態２０または２１に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
２３．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、および１７８からなる群から選択される可変軽鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態２０〜２２のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
２４．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７９および８０、配列番号８７および８８、配列番号９５および９６、配列番号１０３および１０４、配列番号１１１および１１２、配列番号１１９および１２０、配列番号１２７および１２８、配列番号１３５および１３６、配列番号１４３および１４４、配列番号１５１および１５２、ならびに配列番号１７７および１７８を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態２０〜２３のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
２５．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５、およびニューロピリン−１からなる群から選択される標的に特異的に結合する抗体分子から選択される、実施形態１〜９のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
２６．免疫刺激性抗体分子が、ヒトＩｇＧ２抗体またはヒトＩｇＧ４抗体分子である、実施形態１〜２５のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
２７．免疫刺激性抗体分子が、ヒトＩｇＧ２ｂ抗体分子である、実施形態２６に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
２８．免疫刺激性抗体分子が、活性化Ｆｃガンマ受容体を上回る、ヒトＦｃγＲＩＩＢへの向上した結合のために操作されている、実施形態１〜２７のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
２９．免疫刺激性抗体分子が、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５、ＰＤ−１、およびＰＤＬ１からなる群から選択される標的に特異的に結合する抗体である、実施形態１〜２８のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
３０．免疫刺激性抗体分子が、抗４−１ＢＢ抗体分子である、実施形態２９に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
３１．免疫刺激性抗体分子が、配列１〜６、９〜１４、１７〜２２、２５〜３０、３３〜３８、４１〜４６、４９〜５４、５７〜６２、６５〜７０、１５３〜１５８、および１６３〜１６８から選択されるＣＤＲのうちの１つ以上を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態３０に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
３２．免疫刺激性抗体分子が、配列番号１〜６、配列番号９〜１４、配列番号１７〜２２、配列番号２５〜３０、配列番号３３〜３８、配列番号４１〜４６、配列番号４９〜５４、配列番号５７〜６２、配列番号６５〜７０、配列番号：１５３−１５８およびＳＥＱ。番号１６３〜１６８を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態３１に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
３３．免疫刺激性抗体分子が、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、１５９、および１６９からなる群から選択される可変重鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態３１または３２に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
３４．免疫刺激性抗体分子が、配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、１６０、および１７０からなる群から選択される可変軽鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態３１〜３３のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
３５．免疫刺激性抗体分子が、配列番号７および８、配列番号１５および１６、配列番号２３および２４、配列番号３１および３２、配列番号３９および４０、ならびに配列番号４７および４８、配列番号５５および５６、配列番号６３および６４、配列番号７１および７２、配列ＮＯ：１５９および１６０、およびＳＥＱ番号１６９および１７０を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態３１〜３４のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
３６．免疫刺激性抗体分子が、抗ＯＸ４０抗体分子である、実施形態２９に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
３７．免疫刺激性抗体分子が、配列番号７３〜７８、８１〜８６、８９〜９４、９７〜１０２  １０５〜１１０、１１３〜１１８、１２１〜１２６、１２９〜１３４、１３７〜１４２、１４５〜１５０、および１７１〜１７６から選択されるＣＤＲのうちの１つ以上を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態３６に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
３８．免疫刺激性抗体分子が、配列番号７３〜７８、配列番号８１〜８６、配列番号８９〜９４、配列番号９７〜１０２、配列番号１０５〜１１０、配列番号１１３〜１１８、配列番号１２１〜１２６、配列番号１２９〜１３４、配列番号１３７〜１４２、配列番号１４５〜１５０、および配列番号１７１〜１７６を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態３７に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
３９．免疫刺激性抗体分子が、配列番号７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、および１７７からなる群から選択される可変重鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態３７または３８に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
４０．免疫刺激性抗体分子が、配列番号８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、および１７８からなる群から選択される可変軽鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態３７〜３９のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
４１．免疫刺激性抗体分子が、配列番号７９および８０、配列番号８７および８８、配列番号９５および９６、配列番号１０３および１０４、配列番号１１１および１１２、配列番号１１９および１２０、配列番号１２７および１２８、配列番号１３５および１３６、配列番号１４３および１４４、配列番号１５１および１５２、ならびに配列番号１７７〜１７８を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態３７〜４０のいずれか一項に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体。
４２．免疫刺激性抗体分子が、ヒト抗ＰＤ１モノクローナル抗体分子、ヒト抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体分子、またはヒト抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体分子である、実施形態２９に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
４３．免疫刺激性抗体分子が、ニボルマブおよびペンブロリズマブからなる群から選択されるヒト抗ＰＤ１モノクローナル抗体分子、または抗ＰＤＬ１抗体アテゾリズマブ、またはイピリムマブおよびトレミリムマブからなる群から選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である、実施形態４２に記載の使用のためのＴｒｅｇ枯渇抗体分子。
４４．配列１〜６、９〜１４、１７〜２２、２５〜３０、３３〜３８、４１〜４６、４９〜５４、５７〜６２、６５〜７０、１５３〜１５８、および１６３〜１６８から選択されるＣＤＲのうちの１つ以上を含む抗体分子からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体分子。
４５．配列番号１〜６、配列番号９〜１４、配列番号１７〜２２、配列番号２５〜３０、配列番号３３〜３８、配列番号４１〜４６、配列番号４９〜５４、配列番号５７〜６２、配列番号６５〜７０、配列番号１５３〜１５８、および配列番号１６３〜１６８を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態４４に記載の抗４−１ＢＢ抗体分子。
４６．配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、１５９、および１６９からなる群から選択される可変重鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態４４または４５に記載の抗４−１ＢＢ抗体分子。
４７．配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、１６０、および１７０からなる群から選択される可変軽鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態４４〜４６のいずれか一項に記載の抗４−１ＢＢ抗体分子。
４８．配列番号７および８、配列番号１５および１６、配列番号２３および２４、配列番号３１および３２、配列番号３９および４０、配列番号４７および４８、配列番号５５および５６、配列番号６３および６４、配列番号７１および７２、配列番号１５９および１６０、ならびに配列番号１６９〜１７０を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態４４〜４７のいずれか一項に記載の抗４−１ＢＢ抗体分子。
４９．完全長ＩｇＧ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）2からなる群から選択される、実施形態４４〜４８のいずれか一項に記載の抗４−１ＢＢ抗体分子。
５０．完全長ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびそれらのＦｃ操作変異体からなる群から選択される、実施形態４９に記載の抗４−１ＢＢ抗体分子。
５１．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子および／または当該免疫刺激性抗体分子が、ヒトまたはヒト化抗体である、実施形態４４〜５０のいずれか一項に記載の抗４−１ＢＢ抗体分子。
５２．配列番号７３〜７８、８１〜８６、８９〜９４、９７〜１０２、１０５〜１１０、１１３〜１１８、１２１〜１２６、１２９〜１３４、１３７〜１４２、１４５〜１５０、および１７１〜１７６から選択されるＣＤＲのうちの１つ以上を含む抗体分子からなる群から選択される、抗ＯＸ４０抗体分子。
５３．配列番号７３〜７８、配列番号８１〜８６、配列番号８９〜９４、配列番号９７〜１０２、配列番号１０５〜１１０、配列番号１１３〜１１８、配列番号１２１〜１２６、配列番号１２９〜１３４、配列番号１３７〜１４２、配列番号１４５〜１５０、および配列番号１７１〜１７６を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態５２に記載の抗ＯＸ４０抗体分子。
５４．配列番号７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、および１７７からなる群から選択される可変重鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態５２または５３に記載の抗ＯＸ４０抗体分子。
５５．配列番号８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、および１７８からなる群から選択される可変軽鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態５２〜５４のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体分子。
５６．配列番号７９および８０、配列番号８７および８８、配列番号９５および９６、配列番号１０３および１０４、配列番号１１１および１１２、配列番号１１９および１２０、配列番号１２７および１２８、配列番号１３５および１３６、配列番号１４３および１４４、配列番号１５１および１５２、ならびに配列番号１７７および１７８を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態５２〜５５のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体分子。
５７．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子および／または当該免疫刺激性抗体分子が、完全長ＩｇＧ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）2からなる群から選択される、実施形態５２〜５６のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体分子。
５８．完全長ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびそれらのＦｃ操作変異体からなる群から選択される、実施形態５７に記載の抗ＯＸ４０抗体分子。
５９．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子および／または当該免疫刺激性抗体分子が、ヒトまたはヒト化抗体である、実施形態５２〜５８のいずれか一項に記載の抗ＯＸ４０抗体分子。
６０．実施形態４４〜５９のいずれか一項に記載の抗体をコードする、単離された核酸。
６１．実施形態６０に記載の核酸を含む、ベクター。
６２．実施形態６１に記載のベクターを含む、宿主細胞。
６３．薬に使用するための実施形態４４〜５９のいずれか一項に記載の、抗体。
６４．実施形態４４〜５９のいずれか一項に記載の抗体を含む、医薬組成物。
６５．癌の治療に使用するための実施形態６３に記載の抗体、または実施形態６４に記載の医薬組成物。
６６．癌が、固形腫瘍である、実施形態６５に記載の抗体または医薬組成物。
６７．固形腫瘍が、肉腫、癌腫、およびリンパ腫からなる群から選択される、実施形態６６に記載の抗体または医薬組成物。
６８．固形腫瘍が、扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、胸腺腫、神経芽細胞腫、または卵巣癌である、実施形態６７に記載の抗体または医薬組成物。
６９．実施形態４４〜５９のいずれか一項に記載の抗体、または実施形態４４〜５１のいずれか一項に記載の抗体および実施形態５２〜５９のいずれか一項に記載の抗体を含む医薬組成物。
７０．医薬組成物が、癌の治療用である、実施形態４４〜５９のいずれか１つに記載の抗体または実施形態６９に記載の医薬組成物。
７１．癌が、固形腫瘍である、実施形態４４〜５９のいずれか一項に記載の抗体または実施形態７０に記載の医薬組成物。
７２．固形腫瘍が、肉腫、癌腫、およびリンパ腫からなる群から選択される、実施形態４４〜５９のいずれか一項に記載の抗体または実施形態７１に記載の医薬組成物。
７３．固形腫瘍が、扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、胸腺腫、神経芽細胞腫、または卵巣癌である、実施形態４４〜５９のいずれか一項に記載の抗体または実施形態７２に記載の医薬組成物。
７４．癌の治療に使用するための医薬組成物の製造のための実施形態４４〜５９のいずれか一項に記載の抗体の使用。
７５．癌が、固形腫瘍である、実施形態７４に記載の使用。
７６．固形腫瘍が、肉腫、癌腫、およびリンパ腫からなる群から選択される、実施形態７５に記載の使用。
７７．固形腫瘍が、扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、胸腺腫、神経芽細胞腫、または卵巣癌である、実施形態７６に記載の使用。
７８．対象における癌を治療するための方法であって、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が対象に投与され、Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子の投与と順次、免疫刺激性抗体分子が投与される、方法。
７９．当該免疫刺激性抗体分子が、ＣＤ８活性化および／またはＣＤ８増強抗体分子である、実施形態７８に記載の方法。
８０．癌が、固形腫瘍である、実施形態７８または７９に記載の方法。
８１．固形腫瘍が、肉腫、癌腫、およびリンパ腫からなる群から選択される、実施形態８０に記載の方法。
８２．固形腫瘍が、扁平上皮癌腫（ＳＣＣ）、胸腺腫、神経芽細胞腫、または卵巣癌である、実施形態８１に記載の方法。
８３．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子および／または当該免疫刺激性抗体分子が、完全長ＩｇＧ抗体、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、および（Ｆａｂ’）2からなる群から選択される、実施形態７８〜８２のいずれか一項に記載の方法。
８４．完全長ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、およびそれらのＦｃ操作変異体からなる群から選択される、実施形態８３に記載の方法。
８５．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子および／または当該免疫刺激性抗体分子が、ヒトまたはヒト化抗体である、実施形態７８〜８４のいずれか一項に記載の方法。
８６．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、ヒト抗ＩｇＧ１抗体である、実施形態７８〜８５のいずれか一項に記載の方法。
８７．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、少なくとも１つの活性化ＦｃγＲへの改善された結合のために操作されたヒトＩｇＧ１抗体分子である、実施形態７８〜８６のいずれか一項に記載の方法。
８８．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）に属する標的に特異的に結合する抗体分子から選択される、実施形態７８〜８７のいずれか一項に記載の方法。
８９．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、およびＴＮＦＲ２からなる群から選択される標的に特異的に結合する抗体分子である、実施形態８８に記載の方法。
９０．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、抗４−１ＢＢモノクローナル抗体分子である、実施形態８７に記載の方法。
９１．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列１〜６、９〜１４、１７〜２２、２５〜３０、３３〜３８、４１〜４６、４９〜５４、５７〜６２、６５〜７０、１５３〜１５８、および１６３〜１６８から選択されるＣＤＲのうちの１つ以上を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態８９に記載の方法。
９２．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号１〜６、配列番号９〜１４、配列番号１７〜２２、配列番号２５〜３０、配列番号３３〜３８、配列番号４１〜４６、配列番号４９〜５４、配列番号５７〜６２、配列番号６５〜７０、配列番号１５３〜１５８、および配列番号１６３〜１６８を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態９１に記載の方法。
９３．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、１５９、および１６９からなる群から選択される可変重鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態９１または９２に記載の方法。
９４．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、１６０、および１７０からなる群から選択される可変軽鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態９１〜９３のいずれか一項に記載の方法。
９５．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７および８、配列番号１５および１６、配列番号２３および２４、配列番号３１および３２、配列番号３９および４０、ならびに配列番号４７および４８、配列番号５５および５６、配列番号６３および６４、配列番号７１および７２、配列番号１５９および１６０、ならびに配列番号１６９〜１７０を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態９１〜９４のいずれか一項に記載の方法。
９６．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体が、ヒト抗ＯＸ４０モノクローナル抗体分子である、実施形態８９に記載の方法。
９７．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７３〜７８、８１〜８６、８９〜９４、９７〜１０２  １０５〜１１０、１１３〜１１８、１２１〜１２６、１２９〜１３４、１３７〜１４２、１４５〜１５０、および１７１〜１７６から選択されるＣＤＲのうちの１つ以上を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態９６に記載の方法。
９８．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７３〜７８、配列番号８１〜８６、配列番号８９〜９４、配列番号９７〜１０２、配列番号１０５〜１１０、配列番号１１３〜１１８、配列番号１２１〜１２６、配列番号１２９〜１３４、配列番号１３７〜１４２、配列番号１４５〜１５０、および配列番号１７１〜１７６を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態９７に記載の方法。
９９．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、および１７７からなる群から選択される可変重鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態９６〜９８のいずれか一項に記載の方法。
１００．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、および１７８からなる群から選択される可変軽鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態９６〜９９のいずれか一項に記載の方法。
１０１．Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、配列番号７９および８０、配列番号８７および８８、配列番号９５および９６、配列番号１０３および１０４、配列番号１１１および１１２、配列番号１１９および１２０、配列番号１２７および１２８、配列番号１３５および１３６、配列番号１４３および１４４、配列番号１５１および１５２、ならびに配列番号１７７および１７８を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態９６〜１００のいずれか一項に記載の方法。
１０２．当該Ｔｒｅｇ枯渇抗体分子が、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５、およびニューロピリン−１からなる群から選択される標的に特異的に結合する抗体分子から選択される、実施形態７８〜８７のいずれか一項に記載の方法。
１０３．免疫刺激性抗体分子が、ヒトＩｇＧ２抗体またはヒトＩｇＧ４抗体分子である、実施形態７８〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
１０４．免疫刺激性抗体分子が、ヒトＩｇＧ２ｂ抗体分子である、実施形態１０３に記載の方法。
１０５．免疫刺激性抗体分子が、活性化Ｆｃガンマ受容体を上回る、ヒトＦｃγＲＩＩＢへの向上した結合のために操作されている、実施形態７８〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
１０６．免疫刺激性抗体分子が、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２５、ＰＤ−１、およびＰＤＬ１からなる群から選択される標的に特異的に結合する抗体である、実施形態７６〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
１０７．免疫刺激性抗体分子が、抗４−１ＢＢ抗体分子である、実施形態１０６に記載の方法。
１０８．免疫刺激性抗体分子が、配列１〜６、９〜１４、１７〜２２、２５〜３０、３３〜３８、４１〜４６、４９〜５４、５７〜６２、６５〜７０、１５３〜１５８、および１６３〜１６８から選択されるＣＤＲのうちの１つ以上を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１０７に記載の方法。
１０９．免疫刺激性抗体分子が、配列番号１〜６、配列番号９〜１４、配列番号１７〜２２、配列番号２５〜３０、配列番号３３〜３８、配列番号４１〜４６、配列番号４９〜５４、配列番号５７〜６２、配列番号６５〜７０、配列番号１５３〜１５８、および配列番号１６３〜１６８を含む抗体分子からなる群から選択される、１０８に記載の方法。
１１０．免疫刺激性抗体分子が、配列番号７、１５、２３、３１、３９、４７、５５、６３、７１、１５９、および１６９からなる群から選択される可変重鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１０７〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
１１１．免疫刺激性抗体分子が、配列番号８、１６、２４、３２、４０、４８、５６、６４、７２、１６０、および１７０からなる群から選択される可変軽鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１０７〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
１１２．免疫刺激性抗体分子が、配列番号７および８、配列番号１５および１６、配列番号２３および２４、配列番号３１および３２、配列番号３９および４０、または配列番号４７および４８、配列番号５５および５６、配列番号６３および６４、配列番号７１および７２、配列番号１５９および１６０、ならびに配列番号１６９および１７０を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１０７〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
１１３．免疫刺激性抗体分子が、抗ＯＸ４０抗体分子である、実施形態１０６に記載の方法。
１１４．免疫刺激性抗体分子が、配列番号７３〜７８、８１〜８６、８９〜９４、９７〜１０２  １０５〜１１０、１１３〜１１８、１２１〜１２６、１２９〜１３４、１３７〜１４２、１４５〜１５０、および１７１〜１７６から選択されるＣＤＲのうちの１つ以上を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．免疫刺激性抗体分子が、配列番号７３〜７８、配列番号８１〜８６、配列番号８９〜９４、配列番号９７〜１０２、配列番号１０５〜１１０、配列番号１１３〜１１８、配列番号１２１〜１２６、配列番号１２９〜１３４、配列番号１３７〜１４２、配列番号１４５〜１５０、および配列番号１７１〜１７６を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１１４に記載の方法。
１１６．免疫刺激性抗体分子が、配列番号７９、８７、９５、１０３、１１１、１１９、１２７、１３５、１４３、１５１、および１７７からなる群から選択される可変重鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１１３〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
１１７．免疫刺激性抗体分子が、配列番号８０、８８、９６、１０４、１１２、１２０、１２８、１３６、１４４、１５２、および１７８からなる群から選択される可変軽鎖を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１１３〜１１６のいずれか一項に記載の方法。
１１８．免疫刺激性抗体分子が、配列番号７９および８０、配列番号８７および８８、配列番号９５および９６、配列番号１０３および１０４、配列番号１１１および１１２、配列番号１１９および１２０、配列番号１２７および１２８、配列番号１３５および１３６、配列番号１４３および１４４、配列番号１５１および１５２、ならびに配列番号１７７および１７８を含む抗体分子からなる群から選択される、実施形態１１３〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
１１９．免疫刺激性抗体分子が、ヒト抗ＰＤ１モノクローナル抗体分子、ヒト抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体分子、またはヒト抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体分子である、実施形態１０６に記載の方法。
１２０．免疫刺激性抗体分子が、ニボルマブおよびペンブロリズマブからなる群から選択されるヒト抗ＰＤ１モノクローナル抗体分子、または抗ＰＤＬ１抗体アテゾリズマブ、またはイピリムマブおよびトレミリムマブからなる群から選択される抗ＣＴＬＡ−４抗体である、実施形態１１９に記載の方法。
１２１．本明細書の説明、実施例および／または図に記載の使用、方法、抗体、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物。
【０１７４】
参考文献
上記の本文では、次の出版物を参照しているが、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
１．Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．，Ｏ’Ｄａｙ，Ｓ．Ｊ．，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｄ．Ｆ．，Ｗｅｂｅｒ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｏｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｈａａｎｅｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｒ．，Ｒｏｂｅｒｔ，Ｃ．，Ｓｃｈａｄｅｎｄｏｒｆ，Ｄ．，Ｈａｓｓｅｌ，Ｊ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６３：７１１−７２３．
２．Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｈｏｄｉ，Ｆ．Ｓ．，Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｇｅｔｔｉｎｇｅｒ，Ｓ．Ｎ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｃ．，ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ，Ｄ．Ｆ．，Ｐｏｗｄｅｒｌｙ，Ｊ．Ｄ．，Ｃａｒｖａｊａｌ，Ｒ．Ｄ．，Ｓｏｓｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ａｔｋｉｎｓ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｓａｆｅｔｙ，ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６：２４４３−２４５４．
３．Ｂｒａｈｍｅｒ，Ｊ．Ｒ．，Ｔｙｋｏｄｉ，Ｓ．Ｓ．，Ｃｈｏｗ，Ｌ．Ｑ．，Ｈｗｕ，Ｗ．Ｊ．，Ｔｏｐａｌｉａｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｈｗｕ，Ｐ．，Ｄｒａｋｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｃａｍａｃｈｏ，Ｌ．Ｈ．，Ｋａｕｈ，Ｊ．，Ｏｄｕｎｓｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６：２４５５−２４６５．
４．Ｂｅａｔｔｙ，Ｇ．Ｌ．，Ｃｈｉｏｒｅａｎ，Ｅ．Ｇ．，Ｆｉｓｈｍａｎ，Ｍ．Ｐ．，Ｓａｂｏｕｒｙ，Ｂ．，Ｔｅｉｔｅｌｂａｕｍ，Ｕ．Ｒ．，Ｓｕｎ，Ｗ．，Ｈｕｈｎ，Ｒ．Ｄ．，Ｓｏｎｇ，Ｗ．，Ｌｉ，Ｄ．，Ｓｈａｒｐ，Ｌ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２０１１．ＣＤ４０  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ａｌｔｅｒ  ｔｕｍｏｒ  ｓｔｒｏｍａ  ａｎｄ  ｓｈｏｗ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３１：１６１２−１６１６．
５．Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｔ．Ｒ．，Ｌｉ，Ｆ．，Ｍｏｎｔａｌｖｏ−Ｏｒｔｉｚ，Ｗ．，Ｓｅｐｕｌｖｅｄａ，Ｍ．Ａ．，Ｂｅｒｇｅｒｈｏｆｆ，Ｋ．，Ａｒｃｅ，Ｆ．，Ｒｏｄｄｉｅ，Ｃ．，Ｈｅｎｒｙ，Ｊ．Ｙ．，Ｙａｇｉｔａ，Ｈ．，Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｆｃ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏ−ｄｅｆｉｎｅｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＴＬＡ−４  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１０：１６９５−１７１０．
６．Ｂｕｌｌｉａｒｄ，Ｙ．，Ｊｏｌｉｃｏｅｕｒ，Ｒ．，Ｗｉｎｄｍａｎ，Ｍ．，Ｒｕｅ，Ｓ．Ｍ．，Ｅｔｔｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，Ｋｎｅｅ，Ｄ．Ａ．，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎ．Ｓ．，Ｄｒａｎｏｆｆ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｂｒｏｇｄｏｎ，Ｊ．Ｌ．２０１３．Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１０：１６８５−１６９３．
７．Ｍａｒａｂｅｌｌｅ，Ａ．，Ｋｏｈｒｔ，Ｈ．，Ｓａｇｉｖ−Ｂａｒｆｉ，Ｉ．，Ａｊａｍｉ，Ｂ．，Ａｘｔｅｌｌ，Ｒ．Ｃ．，Ｚｈｏｕ，Ｇ．，Ｒａｊａｐａｋｓａ，Ｒ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．，Ｔｏｒｃｈｉａ，Ｊ．，Ｂｒｏｄｙ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔｒｅｇｓ  ａｔ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｓｉｔｅ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２３：２４４７−２４６３．
８．Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｌ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｂｅｅｒｓ，Ｓ．Ａ．，Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．，Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．２０１３．ＦｃｇａｍｍａＲＩｏｔａＩｏｔａＢ  ｃｏｎｔｒｏｌｓ  ｔｈｅ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉ−ＴＮＦＲ  ｍＡｂｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ６２：９４１−９４８．
９．Ｌｉ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．２０１３．Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉ−ＴＮＦＲ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ  ｃｏｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１０：１９５０１−１９５０６．
１０．Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｌ．，Ｂｅｅｒｓ，Ｓ．Ａ．，ａｎｄ  Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．２０１４．ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ  ａｓ  ａ  ｋｅｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３８２：３５５−３７２．
１１．Ｍｉｄｄｅｎｄｏｒｐ，Ｓ．，Ｘｉａｏ，Ｙ．，Ｓｏｎｇ，Ｊ．Ｙ．，Ｐｅｐｅｒｚａｋ，Ｖ．，Ｋｒｉｊｇｅｒ，Ｐ．Ｈ．，Ｊａｃｏｂｓ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｂｏｒｓｔ，Ｊ．２００９．Ｍｉｃｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ＣＤ１３７  ｌｉｇａｎｄ  ａｒｅ  ｐｒｅｄｉｓｐｏｓｅｄ  ｔｏ  ｄｅｖｅｌｏｐ  ｇｅｒｍｉｎａｌ  ｃｅｎｔｅｒ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｂｌｏｏｄ  １１４：２２８０−２２８９．
１２．Ｓｎｅｌｌ，Ｌ．Ｍ．，Ｌｉｎ，Ｇ．Ｈ．，ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｊ．，Ｍｏｒａｅｓ，Ｔ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｗａｔｔｓ，Ｔ．Ｈ．２０１１．Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＧＩＴＲ  ａｎｄ  ４−１ＢＢ  ｄｕｒｉｎｇ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２４４：１９７−２１７．
１３．Ｍｅｌｅｒｏ，Ｉ．，Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ−Ｃｙｍｅｒｍａｎ，Ｄ．，Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｋａｓｔｒｅｓａｎａ，Ａ．，Ｓａｎｍａｍｅｄ，Ｍ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．２０１３．Ａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ＴＮＦＲ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｅ  Ｔ  ａｎｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９：１０４４−１０５３．
１４．ＭｃＨｕｇｈ，Ｒ．Ｓ．，Ｗｈｉｔｔｅｒｓ，Ｍ．Ｊ．，Ｐｉｃｃｉｒｉｌｌｏ，Ｃ．Ａ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｄ．Ａ．，Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｅ．Ｍ．，Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｂｙｒｎｅ，Ｍ．Ｃ．２００２．ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ：  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １６：３１１−３２３．
１５．Ｍａｒｓｏｎ，Ａ．，Ｋｒｅｔｓｃｈｍｅｒ，Ｋ．，Ｆｒａｍｐｔｏｎ，Ｇ．Ｍ．，Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｅ．Ｓ．，Ｐｏｌａｎｓｋｙ，Ｊ．Ｋ．，ＭａｃＩｓａａｃ，Ｋ．Ｄ．，Ｌｅｖｉｎｅ，Ｓ．Ｓ．，Ｆｒａｅｎｋｅｌ，Ｅ．，ｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｒ．Ａ．２００７．Ｆｏｘｐ３  ｏｃｃｕｐａｎｃｙ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｋｅｙ  ｔａｒｇｅｔ  ｇｅｎｅｓ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ４４５：９３１−９３５．
１６．Ｔａｒａｂａｎ，Ｖ．Ｙ．，Ｒｏｗｌｅｙ，Ｔ．Ｆ．，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｌ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｈａｓｗｅｌｌ，Ｌ．Ｅ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｈ．，Ｔｕｔｔ，Ａ．Ｌ．，Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ，Ａ．２００２．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＮＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ＣＤ１３４  （ＯＸ４０）  ａｎｄ  ＣＤ１３７  （４−１ＢＢ），ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｏｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２：３６１７−３６２７．
１７．Ｂｅｅｒｓ，Ｓ．Ａ．，Ｃｈａｎ，Ｃ．Ｈ．，Ｊａｍｅｓ，Ｓ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ａｔｔｆｉｅｌｄ，Ｋ．Ｅ．，Ｂｒｅｎｎａｎ，Ｃ．Ｍ．，Ａｈｕｊａ，Ａ．，Ｓｈｌｏｍｃｈｉｋ，Ｍ．Ｊ．，Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．２００８．Ｔｙｐｅ  ＩＩ（ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ）ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｕｔ  ｐｅｒｆｏｒｍｓ  ｔｙｐｅ  Ｉ（ｒｉｔｕｘｉｍａｂ−ｌｉｋｅ）ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｒｅｇａｒｄｌｅｓｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  １１２：４１７０−４１７７．
１８．Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｌ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｒｏｇｈａｎｉａｎ，Ａ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｍｏｃｋｒｉｄｇｅ，Ｃ．Ｉ．，Ｔｕｔｔ，Ａ．Ｌ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｓ．Ｖ．，Ａｊｏｎａ，Ｄ．，Ｖｅｒｂｅｅｋ，Ｊ．Ｓ．，Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ  ｉｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ４０  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８７：１７５４−１７６３．
１９．Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｌ．，Ｄｏｕ，Ｌ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｆｉｅｌｄ，Ｖ．Ｌ．，Ｍｏｃｋｒｉｄｇｅ，Ｃ．Ｉ．，Ｍｏｓｓ，Ｋ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅ．Ｌ．，Ｂｏｏｔｈ，Ｓ．Ｇ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｐｏｔｔｅｒ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃａｎ  ｂｅ  ｏｖｅｒｃｏｍｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９３：１８２８−１８３５．
２０．Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．２００５．Ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇ  ｓｕｂｃｌａｓｓ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：１５１０−１５１２．
２１．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｎ．Ｓ．，Ｙａｎｇ，Ｂ．，Ｙａｎｇ，Ａ．，Ｌｏｅｓｅｒ，Ｓ．，Ｍａｒｓｔｅｒｓ，Ｓ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ，Ｄ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｐｉｔｔｉ，Ｒ．，Ｔｏｔｐａｌ，Ｋ．，Ｙｅｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ａｎ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｄｒｉｖｅｓ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔａｒｇｅｔ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １９：１０１−１１３．
２２．Ｈａｙｎｅｓ，Ｎ．Ｍ．，Ｈａｗｋｉｎｓ，Ｅ．Ｄ．，Ｌｉ，Ｍ．，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｎ．Ｍ．，Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ，Ｇ．Ｊ．，Ｓｃｈｗｅｎｄｅｎｅｒ，Ｒ．，Ｗｉｎｏｔｏ，Ａ．，Ｗｅｎｓｋｙ，Ａ．，Ｙａｇｉｔａ，Ｈ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．２０１０．ＣＤ１１ｃ＋  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＤＲ５  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８５：５３２−５４１．
２３．Ｌｉ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．２０１２．Ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｄｅａｔｈ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０９：１０９６６−１０９７１．
２４．Ｍｉｍｏｔｏ，Ｆ．，Ｋａｔａｄａ，Ｈ．，Ｋａｄｏｎｏ，Ｓ．，Ｉｇａｗａ，Ｔ．，Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ，Ｔ．，Ｍｕｒａｏｋａ，Ｍ．，Ｗａｄａ，Ｙ．，Ｈａｒａｙａ，Ｋ．，Ｍｉｙａｚａｋｉ，Ｔ．，ａｎｄ  Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｋ．２０１３．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩｂ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｖｅｒ  ｂｏｔｈ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩａ（Ｒ１３１）ａｎｄ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩａ（Ｈ１３１）．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２６：５８９−５９８．
２５．Ｗｈｉｔｅ，Ａ．Ｌ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｗｉｌｌｏｕｇｈｂｙ，Ｊ．，Ｍｏｃｋｒｉｄｇｅ，Ｃ．Ｉ．，Ｒｏｇｈａｎｉａｎ，Ａ．，Ｐｅｎｆｏｌｄ，Ｃ．Ａ．，Ｂｏｏｔｈ，Ｓ．Ｇ．，Ｄｏｄｈｙ，Ａ．，Ｐｏｌａｋ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．２０１５．Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｇ２  ｈｉｎｇｅ  ｉｍｐａｒｔｓ  ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｔｏ  ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２７：１３８−１４８．
２６．Ｇａｖｉｎ，Ｍ．Ａ．，Ｃｌａｒｋｅ，Ｓ．Ｒ．，Ｎｅｇｒｏｕ，Ｅ．，Ｇａｌｌｅｇｏｓ，Ａ．，ａｎｄ  Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．２００２．Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  ａｎｅｒｇｙ  ｏｆ  ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：３３−４１．
２７．Ｅｌｐｅｋ，Ｋ．Ｇ．，Ｙｏｌｃｕ，Ｅ．Ｓ．，Ｆｒａｎｋｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｌａｃｅｌｌｅ，Ｃ．，Ｓｃｈａｂｏｗｓｋｙ，Ｒ．Ｈ．，ａｎｄ  Ｓｈｉｒｗａｎ，Ｈ．２００７．Ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋  Ｔ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｙｎｅｒｇｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ＩＬ−２  ａｎｄ  ４−１ＢＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９：７２９５−７３０４．
２８．Ｚｈｅｎｇ，Ｇ．，Ｗａｎｇ，Ｂ．，ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，Ａ．２００４．Ｔｈｅ  ４−１ＢＢ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ａｕｇｍｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７３：２４２８−２４３４．
２９．Ｐｌｉｔａｓ，Ｇ．，Ｋｏｎｏｐａｃｋｉ，Ｃ．，Ｗｕ，Ｋ．，Ｂｏｓ，Ｐ．Ｄ．，Ｍｏｒｒｏｗ，Ｍ．，Ｐｕｔｉｎｔｓｅｖａ，Ｅ．Ｖ．，Ｃｈｕｄａｋｏｖ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，Ａ．Ｙ．２０１６．Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｘｈｉｂｉｔ  Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４５：１１２２−１１３４．
３０．Ｄｅ  Ｓｉｍｏｎｅ，Ｍ．，Ａｒｒｉｇｏｎｉ，Ａ．，Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，Ｇ．，Ｇｒｕａｒｉｎ，Ｐ．，Ｒａｎｚａｎｉ，Ｖ．，Ｐｏｌｉｔａｎｏ，Ｃ．，Ｂｏｎｎａｌ，Ｒ．Ｊ．，Ｐｒｏｖａｓｉ，Ｅ．，Ｓａｒｎｉｃｏｌａ，Ｍ．Ｌ．，Ｐａｎｚｅｒｉ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．２０１６．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  Ｌａｎｄｓｃａｐｅ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  Ｕｎｖｅｉｌｓ  Ｕｎｉｑｕｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４５：１１３５−１１４７．
３１．Ｔｉｐｔｏｎ，Ｔ．Ｒ．，Ｍｏｃｋｒｉｄｇｅ，Ｃ．Ｉ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｔｕｔｔ，Ａ．Ｌ．，Ｃｒａｇｇ，Ｍ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｂｅｅｒｓ，Ｓ．Ａ．２０１５．Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＶ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ９Ｅ９  ａｌｓｏ  ｂｌｏｃｋｓ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｂｌｏｏｄ  １２６：２６４３−２６４５．
３２．Ｌｉ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．２０１１．Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  Ｆｃｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｄｒｉｖｅｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３：１０３０−１０３４．
３３．Ｌｉ，Ｆ．，ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．２０１２．Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＢ  ｃｏ−ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉ−ＴＮＦＲ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  １１：３３４３−３３４４．
３４．Ｍｉｎａｒｄ−Ｃｏｌｉｎ，Ｖ．，Ｘｉｕ，Ｙ．，Ｐｏｅ，Ｊ．Ｃ．，Ｈｏｒｉｋａｗａ，Ｍ．，Ｍａｇｒｏ，Ｃ．Ｍ．，Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，Ｙ．，Ｈａａｓ，Ｋ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｔｅｄｄｅｒ，Ｔ．Ｆ．２００８．Ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ＣＤ２０  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ＦｃｇａｍｍａＲＩ，ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩ，ａｎｄ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＶ．Ｂｌｏｏｄ  １１２：１２０５−１２１３．
３５．Ｇｒｏｓ，Ａ．，Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｆ．，Ｙａｏ，Ｘ．，Ｌｉ，Ｙ．Ｆ．，Ｔｕｒｃｏｔｔｅ，Ｓ．，Ｔｒａｎ，Ｅ．，Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ，Ｊ．Ｒ．，Ｍｉｘｏｎ，Ａ．，Ｆａｒｉｄ，Ｓ．，Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．２０１４．ＰＤ−１  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｔｈｅ  ｐａｔｉｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８（＋）ｔｕｍｏｒ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２４：２２４６−２２５９．
３６．Ｃｕｒｔｉ，Ｂ．Ｄ．，Ｋｏｖａｃｓｏｖｉｃｓ−Ｂａｎｋｏｗｓｋｉ，Ｍ．，Ｍｏｒｒｉｓ，Ｎ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｅ．，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ，Ｌ．，Ｆｌｏｙｄ，Ｋ．，Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．，Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｉ．，Ｍｅｅｕｗｓｅｎ，Ｔ．，Ｆｏｘ，Ｂ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２０１３．ＯＸ４０  ｉｓ  ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｉｍｍｕｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｌａｔｅ−ｓｔａｇｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７３：７１８９−７１９８．
３７．Ｓｈａｒｍａ，Ｐ．，Ｗａｇｎｅｒ，Ｋ．，Ｗｏｌｃｈｏｋ，Ｊ．Ｄ．，ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．２０１１．Ｎｏｖｅｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｇｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｂｅｎｅｆｉｔ：ｒｅｃｅｎｔ  ｓｕｃｃｅｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｎｅｘｔ  ｓｔｅｐｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １１：８０５−８１２．
３８．Ｓｅｇａｌ，Ｎ．Ｈ．，Ｇｏｐａｌ，Ａ．Ｋ．，Ｂｈａｔｉａ，Ｓ．，Ｋｏｈｒｔ，Ｈ．，Ｌｅｖｙ，Ｒ．，Ｐｉｓｈｖａｉａｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｈｏｕｏｔ，Ｒ．，Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｎ．，Ｎｇｈｉｅｍ，Ｎ．，Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２０１４．Ａ  ｐｈａｓｅ  １  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＰＦ−０５０８２５６６（ａｎｔｉ−４−１ＢＢ）ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３２：ｓｕｐｐｌ；ａｂｓｔｒ  ３００７．
３９．Ｍｏｌｃｋｏｖｓｋｙ，Ａ．，ａｎｄ  Ｓｉｕ，Ｌ．Ｌ．２００８．Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｃｌａｓｓ，ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｇｅｎｔｓ：ｈｉｇｈｌｉｇｈｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ２００８  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｍｅｅｔｉｎｇ．Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １：２０．
４０．Ｆｕｒｎｅｓｓ，Ａ．Ｊ．，Ｖａｒｇａｓ，Ｆ．Ａ．，Ｐｅｇｇｓ，Ｋ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｑｕｅｚａｄａ，Ｓ．Ａ．２０１４．Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３５：２９０−２９８．
４１．Ｌｏｄｅ，Ｈ．Ｎ．，Ｘｉａｎｇ，Ｒ．，Ｖａｒｋｉ，Ｎ．Ｍ．，Ｄｏｌｍａｎ，Ｃ．Ｓ．，Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｓ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，Ｒ．Ａ．１９９７．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｔｏ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  ８９：１５８６−１５９４．
４２．Ｃｕｒｒａｎ，Ｍ．Ａ．，ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．２００９．Ｔｕｍｏｒ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｆｌｔ３  ｌｉｇａｎｄ  ｓｙｎｅｒｇｉｚｅ  ｗｉｔｈ  ｃｔｌａ−４  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｔｏ  ｒｅｊｅｃｔ  ｐｒｅｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６９：７７４７−７７５５．
４３．Ｍｏｏｒｅ  ＭＷ，Ｃａｒｂｏｎｅ  ＦＲ，ａｎｄ  Ｂｅｖａｎ  ＭＪ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．１９８８；５４（６）：７７７−８５．
４４．Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｔｕｔｔ，Ａ．Ｌ．，ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｍ．Ｊ．１９９９．ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｖｏｋｅｓ  ａ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｈａｔ  ｅｒａｄｉｃａｔｅｓ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ａｎｄ  ｂｙｐａｓｓｅｓ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ５：５４８−５５３．
４５．Ｂｅｅｒｓ，Ｓ．Ａ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｌｉｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｔ．Ｃ．，Ｖｉｄａｌ，Ｒ．Ｍ．，Ｗｉｊａｙａｗｅｅｒａ，Ｓ．Ｓ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｓ．Ｖ．，Ｋｉｍ，Ｈ．，Ｃｏｘ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．２０１０．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｌｉｍｉｔｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ２０  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｂｌｏｏｄ  １１５：５１９１−５２０１．
４６．Ｌｉｍ，Ｓ．Ｈ．，Ｖａｕｇｈａｎ，Ａ．Ｔ．，Ａｓｈｔｏｎ−Ｋｅｙ，Ｍ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｅ．Ｌ．，Ｄｉｘｏｎ，Ｓ．Ｖ．，Ｃｈａｎ，Ｈ．Ｔ．，Ｂｅｅｒｓ，Ｓ．Ａ．，Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．Ｒ．，Ｃｏｘ，Ｋ．Ｌ．，Ｄａｖｉｅｓ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩｂ  ｏｎ  ｔａｒｇｅｔ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｉｔｕｘｉｍａｂ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ．Ｂｌｏｏｄ  １１８：２５３０−２５４０．
４７．Ｂｕｃｈａｎ，Ｓ．Ｌ．，ａｎｄ  Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ，Ａ．２０１２．Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｏｔｉｆｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＣＤ３０  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ４５２４４．
４８．Ｃｕｒｒａｎ，Ｍ．Ａ．，Ｋｉｍ，Ｍ．，Ｍｏｎｔａｌｖｏ，Ｗ．，Ａｌ−Ｓｈａｍｋｈａｎｉ，Ａ．，ａｎｄ  Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｊ．Ｐ．２０１１．Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ＣＴＬＡ−４  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ａｎｄ  ４−１ＢＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ，ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ６：ｅ１９４９９．
４９．Ｄａｈａｎ  Ｒ，Ｂａｒｎｈａｒｔ  ＢＣ，Ｌｉ  Ｆ，Ｙａｍｎｉｕｋ  ＡＰ，Ｋｏｒｍａｎ  ＡＪ，Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ．Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ａｇｏｎｉｓｔｉｃ，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ＦｃγＲ  Ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２０１６  Ｊｕｎ  １３；２９（６）：８２０−３１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｃｅｌｌ．２０１６．０５．００１．Ｅｐｕｂ  ２０１６  Ｊｕｎ  ２．ＰＭＩＤ：２７２６５５０５．
５０．Ａｒｃｅ  Ｖａｒｇａｓ  Ｆ，Ｆｕｒｎｅｓｓ  ＡＪＳ，Ｓｏｌｏｍｏｎ  Ｉ，Ｊｏｓｈｉ  Ｋ，Ｍｅｋｋａｏｕｉ  Ｌ，Ｌｅｓｋｏ  ＭＨ，Ｍｉｒａｎｄａ  Ｒｏｔａ  Ｅ，Ｄａｈａｎ  Ｒ，Ｇｅｏｒｇｉｏｕ  Ａ，Ｓｌｅｄｚｉｎｓｋａ  Ａ，Ｂｅｎ  Ａｉｓｓａ  Ａ，Ｆｒａｎｚ  Ｄ，Ｗｅｒｎｅｒ  Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ  Ｍ，Ｗｏｎｇ  ＹＮＳ，Ｈｅｎｒｙ  ＪＹ，Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  Ｔ，Ｎｉｃｏｌ  Ｄ，Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ  Ｂ，Ｂｅｅｒｓ  ＳＡ；Ｍｅｌａｎｏｍａ  ＴＲＡＣＥＲｘ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ；Ｒｅｎａｌ  ＴＲＡＣＥＲｘ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ；Ｌｕｎｇ  ＴＲＡＣＥＲｘ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，Ｔｕｒａｊｌｉｃ  Ｓ，Ｇｏｒｅ  Ｍ，Ｌａｒｋｉｎ  Ｊ，Ｓｗａｎｔｏｎ  Ｃ，Ｃｈｅｓｔｅｒ  ＫＡ，Ｐｕｌｅ  Ｍ，Ｒａｖｅｔｃｈ  ＪＶ，Ｍａｒａｆｉｏｔｉ  Ｔ，Ｐｅｇｇｓ  ＫＳ，Ｑｕｅｚａｄａ  ＳＡ．Ｆｃ−Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ａｎｔｉ−ＣＤ２５  Ｄｅｐｌｅｔｅｓ  Ｔｕｍｏｒ−Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｓｙｎｅｒｇｉｚｅｓ  ｗｉｔｈ  ＰＤ−１  Ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｔｏ  Ｅｒａｄｉｃａｔｅ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  Ｔｕｍｏｒｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１７  Ａｐｒ  １８；４６（４）：５７７−５８６．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１７．０３．０１３．Ｅｐｕｂ  ２０１７  Ａｐｒ  １１．ＰＭＩＤ：２８４１０９８８
５１．Ｒｏｍｅｒ  ＰＳ１，Ｂｅｒｒ  Ｓ，Ａｖｏｔａ  Ｅ，Ｎａ  ＳＹ，Ｂａｔｔａｇｌｉａ  Ｍ，ｔｅｎ  Ｂｅｒｇｅ  Ｉ，Ｅｉｎｓｅｌｅ  Ｈ，Ｈｕｎｉｇ  Ｔ．；Ｐｒｅｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ＰＢＭＣｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｙ  ＣＤ２８  ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ  ＴＧＮ１４１２．Ｂｌｏｏｄ．２０１１  Ｄｅｃ  ２２；１１８（２６）：６７７２−８２．ｄｏｉ：  １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１０−１２−３１９７８０．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｓｅｐ  １９．
【図１−１】
2020528765.tif 000021
【図１−２】
2020528765.tif 000022
【図２−１】
2020528765.tif 000023
【図２−２】
2020528765.tif 000024
【図３−１】
2020528765.tif 000025
【図３−２】
2020528765.tif 000026
【図４−１】
2020528765.tif 000027
【図４−２】
2020528765.tif 000028
【図４−３】
2020528765.tif 000029
【図５−１】
2020528765.tif 000030
【図５−２】
2020528765.tif 000031
【図６】
2020528765.tif 000032
【図７−１】
2020528765.tif 000033
【図７−２】
2020528765.tif 000034
【図８】
2020528765.tif 000035
【図９−１】
2020528765.tif 000036
【図９−２】
2020528765.tif 000037
【図１０】
2020528765.tif 000038
【図１１】
2020528765.tif 000039
【図１２】
2020528765.tif 000040
【図１３】
2020528765.tif 000041
【図１４】
2020528765.tif 000042
【図１５】
2020528765.tif 000043
【図１６】
2020528765.tif 000044
【図１７】
2020528765.tif 000045
【図１８】
2020528765.tif 000046
【図１９】
2020528765.tif 000047
【図２０】
2020528765.tif 000048
【図２１】
2020528765.tif 000049
【図２２】
2020528765.tif 000050
【図２３】
2020528765.tif 000051
【図２４】
2020528765.tif 000052
【配列表】
2020528765000001.app
【国際調査報告】
2020528765.tif 000053
2020528765.tif 000054
2020528765.tif 000055
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