(57)【要約】  一態様では、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子により発現および提示される１つまたは複数の候補抗原をコードする外因性核酸；グランザイムＢ（ＧｚＢ）活性の分子レポーター；ならびにｃ）カスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ（ＣＡＤ）媒介ＤＮＡ分解、ＣＡＤノックアウト、またはカスパーゼノックアウト（例えば、カスパーゼ３ノックアウト）の外因性阻害剤を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）が本明細書に記載される。別の態様では、細胞傷害性リンパ球またはＮＫ細胞に対する抗原提示細胞によって認識された抗原提示の検出のためのシステムが本明細書に記載される。
2020523012.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子により発現および提示される１つまたは複数の候補抗原をコードする外因性核酸、
ｂ）グランザイムＢ（ＧｚＢ）活性の分子レポーター、ならびに
ｃ）カスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ（ＣＡＤ）媒介ＤＮＡ分解、ＣＡＤノックアウト、またはカスパーゼノックアウトの外因性阻害剤
を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）。
【請求項２】
前記外因性核酸が、任意選択で、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはトランスポゾンを介して、前記ＡＰＣのゲノム中に安定的に導入されている、請求項１に記載のＡＰＣ。
【請求項３】
前記外因性核酸の両側に、所定のプライマー認識配列が隣接している、請求項１または２に記載のＡＰＣ。
【請求項４】
前記ＧｚＢ活性の分子レポーターが、検出分子に連結したＧｚＢ切断部位（ＶＧＰＤ、配列番号１）を含む融合ポリペプチドを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＡＰＣ。
【請求項５】
前記分子レポーターが、改変された赤外蛍光タンパク質、膜係留ＣＲＥリコンビナーゼ、抗体ベースのＧｚＢ活性のレポーター、ＥＲ保持ベースのＧｚＢ活性のレポーター、細胞表面検出可能ベースのＧｚＢ活性のレポーター、またはこれらの組合せを含む、請求項４に記載のＡＰＣ。
【請求項６】
前記分子レポーターが、膜係留ＣＲＥリコンビナーゼを含み、前記ＡＰＣが、ＬｏｘＰ部位が両側に隣接している逆位ＣＲＥレポーターをさらに含み、任意選択で、前記外因性核酸が、ＣＲＥ活性化プライマー認識配列の近位に位置する、請求項４または５に記載のＡＰＣ。
【請求項７】
前記ＣＡＤ媒介ＤＮＡ分解の外因性阻害剤が、発現可能な形態でカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ阻害剤（ＩＣＡＤ）遺伝子をコードする核酸、ＣＡＤもしくはカスパーゼ３を標的とする阻害性核酸、カスパーゼ３の低分子阻害剤、化学的ＤＮＡｓｅ阻害剤、またはカスパーゼ３のペプチドもしくはタンパク質阻害剤であるか、または前記カスパーゼノックアウトが、カスパーゼ３ノックアウトである、請求項１から６のいずれか一項に記載のＡＰＣ。
【請求項８】
ｉ）内因性ＭＨＣ分子を発現せず、外因性ＭＨＣ分子を発現するように操作されており、ならびに／またはｉｉ）Ｋ  ５６２細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＨＥＫ  ２９３  Ｔ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭｅｌＪｕｓｏ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞、ＭＣＦ７細胞、ＮＴＥＲＡ２細胞、ＬＮ２２９細胞、樹状細胞、および一次自己Ｂ細胞からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか一項に記載のＡＰＣ。
【請求項９】
前記候補抗原が、８、９、１０、１１、２０、３０、５０、１００、２００、または３００アミノ酸長未満であるかまたはそれに等しい、請求項１から８のいずれか一項に記載のＡＰＣ。
【請求項１０】
前記候補抗原が、３００アミノ酸長を超える、請求項１から８のいずれか一項に記載のＡＰＣ。
【請求項１１】
候補抗原をコードする前記外因性核酸が、感染性生物またはヒトのＤＮＡに由来する、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＡＰＣ。
【請求項１２】
前記ヒトＤＮＡが、がん細胞から得られる、請求項１１に記載のＡＰＣ。
【請求項１３】
前記感染性生物が、ウイルス、細菌、真菌、プロトゾア、および多細胞寄生生物からなる群から選択される、請求項１１に記載のＡＰＣ。
【請求項１４】
各ＡＰＣが、候補抗原をコードし、それによって、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子により発現および提示される候補抗原のライブラリーを表す、様々な外因性核酸を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＡＰＣのライブラリー。
【請求項１５】
前記外因性核酸が、感染因子またはヒトＤＮＡに由来する、請求項１４に記載のライブラリー。
【請求項１６】
約１０２から約１０１４個の個々の候補抗原を含む、請求項１４または１５に記載のライブラリー。
【請求項１７】
検出分子に連結したＧｚＢ切断部位（ＶＧＰＤ、配列番号１）を含む融合ポリペプチドを含む、グランザイムＢ活性の分子レポーター。
【請求項１８】
前記検出分子が、酵素、検出可能な標識、抗体結合性抗原、またはアフィニティータグである、請求項１７に記載の分子レポーター。
【請求項１９】
前記検出可能な標識が、赤外蛍光タンパク質（ＩＦＰ）、核酸増幅標的、抗体によって認識される組成物、ＥＲから放出される組成物、および細胞表面に存在する組成物からなる群から選択される、ＧｚＢ切断後に検出可能なものである、請求項１８に記載の分子レポーター。
【請求項２０】
前記ＩＦＰが、前記ＧｚＢ切断部位によって機能的に分離したＮ断片（Ｎ−ＩＦＰ）およびＣ断片（Ｃ−ＩＦＰ）を含み、さらに、Ｃ−ＩＦＰのＮ末端側に位置する緑色蛍光タンパク質のＮ断片（Ｎ−ＧＦＰ）と、Ｎ−ＩＦＰのＣ末端側に位置する緑色蛍光タンパク質のＣ断片（Ｃ−ＧＦＰ）が両側に隣接し、その結果、前記Ｎ−ＧＦＰとＣ−ＧＦＰは構成的に活性である、請求項１３に記載の分子レポーター。
【請求項２１】
前記酵素が、ＣＲＥリコンビナーゼであり、前記融合ポリペプチドが、前記ＧｚＢ切断部位によって分離された原形質膜付着ペプチドに機能的に連結した前記ＣＲＥリコンビナーゼを含む、請求項１８に記載の分子レポーター。
【請求項２２】
アフィニティータグが、前記ＧｚＢ切断部位のＣ末端側に位置するＦｌａｇエピトープであり、その結果、前記エピトープが、前記ＧｚＢ部位が切断されるとＭ１  Ｆｌａｇ抗体によってのみ認識され、任意選択で、前記ｆｌａｇエピトープのＣ末端側に位置するＧＦＰをさらに含む、請求項１７に記載の分子レポーター。
【請求項２３】
小胞体（ＥＲ）保持シグナルおよび抗体結合原形質膜タンパク質を含み、前記ＧｚＢ部位の切断によって、前記ＥＲ保持シグナルが除去され、任意選択で、前記抗原が、ＣＤ４０、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはタグ付けされたタンパク質であり、任意選択で、前記タグが、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、またはヒスチジンタグである、請求項１８に記載の分子レポーター。
【請求項２４】
請求項１７から２３のいずれか一項に記載の分子レポーターをコードする核酸。
【請求項２５】
抗原提示細胞におけるグランザイムＢ活性の検出のためのシステムであって、
ａ）原形質膜付着ペプチドに機能的に連結したＣＲＥリコンビナーゼを含む融合ポリペプチドであり、前記ＣＲＥリコンビナーゼと膜付着ペプチドがＧｚＢ切断部位によって分離されている、融合ポリペプチド、
ｂ）ヘッドトゥヘッド方向でＧＦＰおよびＲＦＰをコードし、ＬｏｘＰ部位が両側に隣接している核酸配列を含むＣＲＥ活性のレポーター、ならびに／または
ｃ）ＬｏｘＰ部位が両側に隣接している不活性プライマーを含むＣＲＥ活性プライマー認識配列の近位に位置する、発現可能な形態の候補抗原をコードする核酸配列であって、前記ＬｏｘＰ部位のＣＲＥ誘導転位によって、機能的プライマー認識配列が生じる、核酸配列
を含む、システム。
【請求項２６】
細胞傷害性リンパ球またはＮＫ細胞に対する抗原提示細胞によって認識された抗原提示の検出のためのシステムであって、
ａ）
ｉ．細胞傷害性リンパ球および／またはＮＫ細胞に対して、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子により発現および提示される候補抗原をコードする外因性核酸、
ｉｉ．請求項１７から２４のいずれか一項に記載のグランザイムＢ（ＧｚＢ）の活性の分子レポーターまたは請求項２５に記載のグランザイムＢの活性を検出するためのシステム、および
ｉｉｉ．ＣＡＤ媒介分解の阻害剤
を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）、ならびに
ｂ）細胞傷害性リンパ球および／またはＮＫ細胞を含む、システム。
【請求項２７】
前記ＣＡＤ媒介分解の阻害剤が、ＣＡＤ媒介ＤＮＡ分解の外因性阻害剤、ＣＡＤノックアウト、またはカスパーゼノックアウトであり、任意選択で、前記カスパーゼノックアウトが、カスパーゼ３ノックアウトであるか、またはＣＡＤ媒介ＤＮＡ分解の前記外因性阻害剤が、発現可能な形態でカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ阻害剤（ＩＣＡＤ）遺伝子をコードする核酸、ＣＡＤもしくはカスパーゼ３を標的とする阻害性核酸、カスパーゼ３の低分子阻害剤、またはカスパーゼ３のペプチドもしくはタンパク質阻害剤である、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記抗原提示細胞が、Ｋ  ５６２細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＨＥＫ  ２９３  Ｔ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭｅｌＪｕｓｏ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞、ＭＣＦ７細胞、ＮＴＥＲＡ２ａ細胞、樹状細胞、および一次自己Ｂ細胞からなる群から選択される、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
前記細胞傷害性リンパ球が、細胞傷害性ＣＤ４  Ｔ細胞および細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞からなる群から選択される、請求項２６に記載のシステム。
【請求項３０】
前記細胞傷害性リンパ球および／またはＮＫ細胞が、目的の抗原受容体を発現するように改変されている、請求項２６から２９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３１】
前記細胞傷害性リンパ球および／またはＮＫ細胞が、非細胞傷害性ＣＤ４  Ｔ細胞からＴ細胞受容体を発現するように改変された細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞である、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞によって認識される抗原を特定するための方法であって、
ａ）請求項１から１６のいずれか一項に記載の抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはＡＰＣのライブラリーを、抗原認識に適した条件下で、１つまたは複数の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）および／またはＮＫ細胞と接触させるステップと、
ｂ）前記ＡＰＣにおけるグランザイムＢ活性をアッセイすることによって、認識された抗原を発現するＡＰＣを特定するステップであって、適切な対照と比較したグランザイムＢ活性の増加が、前記ＡＰＣが前記細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞によって認識された抗原を発現することを示す、ステップと、
ｃ）ステップｂ）で特定された前記ＡＰＣから、前記認識された抗原をコードする核酸を単離するステップと
を含む方法。
【請求項３３】
細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞によって認識される抗原を特定するための方法であって、
ａ）請求項２３に記載の抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはＡＰＣのライブラリーを、抗原認識に適した条件下で、１つまたは複数のＣＴＬと接触させるステップであって、前記ＧｚＢ部位の切断によって、前記ＥＲ保持シグナルが取り除かれ、前記原形質膜への輸送のために前記ＥＲから前記原形質膜タンパク質を放出させる、ステップと、
ｂ）前記ＡＰＣを、前記原形質膜タンパク質に結合する抗体と接触させることによって、認識された抗原を発現するＡＰＣを単離し、抗体が結合したＡＰＣを精製するステップと、
ｃ）ステップｂ）で単離された前記ＡＰＣから、前記認識された抗原をコードする核酸を単離するステップと
を含む方法。
【請求項３４】
ステップｃ）で単離された前記核酸をシークエンシングするステップをさらに含む、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、対象の生体試料から得られる、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記生体試料が、血液、腫瘍、健康な組織、腹水液、自己免疫の位置、腫瘍浸潤、ウイルス感染部位、病変、口腔粘膜、および皮膚からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記生体試料が、前記対象における感染部位または自己免疫反応性部位から得られる、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞傷害性Ｔ細胞が、ＣＤ４またはＣＤ８細胞である、請求項３０から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、目的の抗原受容体を発現するように改変されている、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が、非細胞傷害性ＣＤ４  Ｔ細胞からＴ細胞受容体を発現するように改変されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記特定するステップｂ）が、対照のものと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍またはそれを超えて増加する、前記ＡＰＣにおける蛍光シグナルの検出によるものである、請求項３２から４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記特定するステップｂ）が、フローサイトメトリーまたはアフィニティー精製によるものである、請求項３２から４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記特定するステップｂ）が、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）またはアフィニティー精製によるものである、請求項３２から４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記単離するステップｃ）が、ＰＣＲ増幅によるものである、請求項３２から４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記シークエンシングが、パイロシークエンシングまたは次世代シークエンシングによるものである、請求項３３から４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記ＡＰＣのライブラリーが、少なくとも５，０００種の異なる候補抗原を含む、請求項３２から４５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の主張
本出願は、２０１７年６月８日に出願した米国仮特許出願第６２／５１６，９７７号の利益を主張する。前述の内容の全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の権利
本発明は、米国国立衛生研究所によって授与される助成金番号第ＡＩ１１６８３３号の下に政府の支援によりなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
Ｔ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞に特異的な標的抗原を特定するための方法および試薬が本明細書に記載される。
【背景技術】
【０００４】
細胞媒介性免疫応答に基づく免疫療法による手法は、例えば、がん、自己免疫疾患、感染性疾患などの疾患を処置するのに有効であり得る。しかしながら、病原細胞によって発現され、免疫応答をモジュレートするのに役割を果たす抗原は特定するのが困難である。したがって、疾患に対する療法およびワクチンを開発するために、Ｔ細胞に特異的な標的抗原を特定するための方法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００５】
一態様では、ａ）ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子により発現および提示される１つまたは複数の候補抗原をコードする外因性核酸；ｂ）グランザイムＢ（ＧｚＢ）活性の分子レポーター；ならびにｃ）カスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ（ＣＡＤ）媒介ＤＮＡ分解、ＣＡＤノックアウト、またはカスパーゼノックアウト（例えば、カスパーゼ３ノックアウト）の外因性阻害剤を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）が本明細書に記載される。
【０００６】
本発明の任意の態様に適用することができ、および／または本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、様々な実施形態では、外因性核酸は、任意選択で、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはトランスポゾンを介して、ＡＰＣのゲノム中に安定的に導入されている。様々な実施形態では、外因性核酸の両側に、所定のプライマー認識配列が隣接している。様々な実施形態では、ＧｚＢ活性の分子レポーターは、検出分子に連結したＧｚＢ切断部位（ＶＧＰＤ、配列番号１）を含む融合ポリペプチドを含み、例えば、分子レポーターは、改変された赤外蛍光タンパク質、膜係留ＣＲＥリコンビナーゼ、抗体ベースのＧｚＢ活性のレポーター、ＥＲ保持ベースのＧｚＢ活性のレポーター、細胞表面検出可能ベースのＧｚＢ活性のレポーター、またはこれらの組合せを含む。様々な実施形態では、分子レポーターは、膜係留ＣＲＥリコンビナーゼを含み、ＡＰＣは、ＬｏｘＰ部位が両側に隣接している逆位ＣＲＥレポーターをさらに含み、任意選択で、外因性核酸は、ＣＲＥ活性化プライマー認識配列の近位に位置する。様々な実施形態では、ＣＡＤ媒介ＤＮＡ分解の外因性阻害剤が、発現可能な形態でカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ阻害剤（ＩＣＡＤ）遺伝子をコードする核酸；ＣＡＤまたはカスパーゼ３を標的とする阻害性核酸；カスパーゼ３の低分子阻害剤；化学的ＤＮＡｓｅ阻害剤；またはカスパーゼ３のペプチドもしくはタンパク質阻害剤であるか、またはカスパーゼノックアウトがカスパーゼ３ノックアウトである。様々な実施形態では、ＡＰＣは、ｉ）内因性ＭＨＣ分子を発現せず、外因性ＭＨＣ分子を発現するように操作されており、ならびに／またはｉｉ）Ｋ  ５６２細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＨＥＫ  ２９３  Ｔ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭｅｌＪｕｓｏ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞、ＭＣＦ７細胞、ＮＴＥＲＡ２細胞、ＬＮ２２９細胞、樹状細胞、および一次自己Ｂ細胞からなる群から選択される。様々な実施形態では、候補抗原は、８、９、１０、１１、２０、３０、５０、１００、２００、または３００アミノ酸長未満であるかまたはそれに等しい。様々な実施形態では、候補抗原は、３００アミノ酸長を超える。様々な実施形態では、候補抗原をコードする外因性核酸は、感染性生物またはヒトのＤＮＡに由来する。様々な実施形態では、ヒトＤＮＡは、がん細胞から得られる。様々な実施形態では、感染性生物は、ウイルス、細菌、真菌、プロトゾア、および多細胞寄生生物からなる群から選択される。
【０００７】
別の態様では、各ＡＰＣが、候補抗原をコードし、それによって、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子により発現および提示される候補抗原のライブラリーを表す、様々な外因性核酸を含む、上記のＡＰＣなどのＡＰＣのライブラリーが本明細書に記載される。
【０００８】
上記のように、本発明の任意の態様に適用することができ、および／または本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、様々な実施形態では、外因性核酸は、感染因子またはヒトＤＮＡに由来する。様々な実施形態では、ライブラリーは、約１０２から約１０１４個の個々の候補抗原を含む。
【０００９】
別の態様では、検出分子に連結したＧｚＢ切断部位（ＶＧＰＤ、配列番号１）を含む融合ポリペプチドを含む、グランザイムＢ活性の分子レポーターが本明細書に記載される。
【００１０】
上記のように、本発明の任意の態様に適用することができ、および／または本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、様々な実施形態では、レポーターは、ＦＲＥＴペアを形成する蛍光色素のペア、または、蛍光物質のうちの１つがクエンチされる；インタクトな蛍光物質ではない、例えば、それ自体が蛍光を発することが可能な完全なタンパク質ではない；および／もしくはロイコ色素ではない、例えば、２つの化学形態間（そのうちの1
つは無色である）を切り替えることができる色素ではない蛍光色素のペアを含まない。様々な実施形態では、検出分子は、酵素、検出可能な標識、抗体結合性抗原、またはアフィニティータグである。様々な実施形態では、検出可能な標識は、赤外蛍光タンパク質（ＩＦＰ）、核酸増幅標的、抗体によって認識される組成物、ＥＲから放出される組成物、および細胞表面に存在する組成物からなる群から選択される、ＧｚＢ切断後に検出可能なものである。様々な実施形態では、ＩＦＰは、ＧｚＢ切断部位によって機能的に分離したＮ断片（Ｎ−ＩＦＰ）およびＣ断片（Ｃ−ＩＦＰ）を含み、さらに、Ｃ−ＩＦＰのＮ末端側に位置する緑色蛍光タンパク質のＮ断片（Ｎ−ＧＦＰ）と、Ｎ−ＩＦＰのＣ末端側に位置する緑色蛍光タンパク質のＣ断片（Ｃ−ＧＦＰ）が両側に隣接し、その結果、Ｎ−ＧＦＰとＣ−ＧＦＰは構成的に活性である。様々な実施形態では、酵素は、ＣＲＥリコンビナーゼであり、融合ポリペプチドは、ＧｚＢ切断部位によって分離された原形質膜付着ペプチドに機能的に連結したＣＲＥリコンビナーゼを含む。様々な実施形態では、アフィニティータグは、ＧｚＢ切断部位のＣ末端側に位置するＦｌａｇエピトープであり、その結果、このエピトープは、ＧｚＢ部位が切断されるとＭ１  Ｆｌａｇ抗体によってのみ認識され、任意選択で、このｆｌａｇエピトープのＣ末端側に位置するＧＦＰをさらに含む。様々な実施形態では、分子レポーターは、小胞体（ＥＲ）保持シグナルおよび抗体結合原形質膜タンパク質を含み、ＧｚＢ部位の切断によって、ＥＲ保持シグナルが除去され、任意選択で、抗原は、ＣＤ４０、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、またはタグ付けされたタンパク質であり、任意選択で、タグは、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、またはヒスチジンタグである。
【００１１】
別の態様では、本明細書に記載の分子レポーターをコードする核酸が提供される。
【００１２】
別の態様では、抗原提示細胞におけるグランザイムＢ活性の検出のためのシステムであって、ａ）原形質膜付着ペプチドに機能的に連結したＣＲＥリコンビナーゼを含む融合ポリペプチドであり、ＣＲＥリコンビナーゼと膜付着ペプチドがＧｚＢ切断部位によって分離されている、融合ポリペプチド；ｂ）ヘッドトゥヘッド方向でＧＦＰおよびＲＦＰをコードし、ＬｏｘＰ部位が両側に隣接している核酸配列を含むＣＲＥ活性のレポーター；ならびに／またはｃ）ＬｏｘＰ部位が両側に隣接している不活性プライマーを含むＣＲＥ活性プライマー認識配列の近位に位置する、発現可能な形態の候補抗原をコードする核酸配列であって、ＬｏｘＰ部位のＣＲＥ誘導転位によって、機能的プライマー認識配列が生じる、核酸配列を含む、システムが本明細書に記載される。
【００１３】
同様に、別の態様では、細胞傷害性リンパ球またはＮＫ細胞に対する抗原提示細胞によって認識された抗原提示の検出のためのシステムであって、ａ）ｉ）細胞傷害性リンパ球および／またはＮＫ細胞に対して、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子により発現および提示される候補抗原をコードする外因性核酸；ｉｉ）本明細書に記載のグランザイムＢ（ＧｚＢ）の分子レポーターまたは本明細書に記載のグランザイムＢの活性を検出するためのシステム；およびｉｉｉ）ＣＡＤ媒介分解の阻害剤を含む抗原提示細胞（ＡＰＣ）；ならびにｂ）細胞傷害性リンパ球および／またはＮＫ細胞を含む、システムが本明細書に記載される。
【００１４】
上記のように、本発明の任意の態様に適用することができ、および／または本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、様々な実施形態では、ＣＡＤ媒介分解の阻害剤は、ＣＡＤ媒介ＤＮＡ分解の外因性阻害剤、ＣＡＤノックアウト、またはカスパーゼノックアウト（例えば、カスパーゼ３ノックアウト）であり、任意選択で、カスパーゼノックアウトは、カスパーゼ３ノックアウトであるか、またはＣＡＤ媒介ＤＮＡ分解の外因性阻害剤は、発現可能な形態でカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ阻害剤（ＩＣＡＤ）遺伝子をコードする核酸；ＣＡＤまたはカスパーゼ３を標的とする阻害性核酸；カスパーゼ３の低分子阻害剤；またはカスパーゼ３のペプチドもしくはタンパク質阻害剤である。様々な実施形態では、抗原提示細胞は、Ｋ  ５６２細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＨＥＫ  ２９３  Ｔ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭｅｌＪｕｓｏ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞、ＭＣＦ７細胞、ＮＴＥＲＡ２ａ細胞、樹状細胞、および一次自己Ｂ細胞からなる群から選択される。様々な実施形態では、細胞傷害性リンパ球は、細胞傷害性ＣＤ４  Ｔ細胞および細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞からなる群から選択される。様々な実施形態では、細胞傷害性リンパ球および／またはＮＫ細胞は、目的の抗原受容体を発現するように改変されている。様々な実施形態では、細胞傷害性リンパ球および／またはＮＫ細胞は、非細胞傷害性ＣＤ４  Ｔ細胞からＴ細胞受容体を発現するように改変された細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞である。
【００１５】
別の態様では、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞によって認識される抗原を特定するための方法であって、ａ）本明細書に記載される抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはＡＰＣのライブラリーを、抗原認識に適切な条件下で、１つまたは複数の細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）および／またはＮＫ細胞と接触させるステップと；ｂ）ＡＰＣにおけるグランザイムＢ活性をアッセイすることによって、認識された抗原を発現するＡＰＣを特定するステップであって、適切な対照と比較したグランザイムＢ活性の増加が、ＡＰＣが細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞によって認識された抗原を発現することを示す、ステップと、ｃ）ステップｂ）で特定されたＡＰＣから、認識された抗原をコードする核酸を単離するステップとを含む方法が本明細書に記載される。
【００１６】
同様に、別の態様では、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞によって認識される抗原を特定するための方法であって、ａ）本明細書に記載される抗原提示細胞（ＡＰＣ）またはＡＰＣのライブラリーを、抗原認識に適切な条件下で、１つまたは複数のＣＴＬと接触させるステップであって、ＧｚＢ部位の切断によって、ＥＲ保持シグナルが取り除かれ、原形質膜への輸送のためにＥＲから原形質膜タンパク質を放出させる、ステップと；ｂ）ＡＰＣを、原形質膜タンパク質に結合する抗体と接触させることによって、認識された抗原を発現するＡＰＣを単離し、抗体が結合したＡＰＣを精製するステップと；ｃ）ステップｂ）で単離されたＡＰＣから、認識された抗原をコードする核酸を単離するステップとを含む方法が本明細書に記載される。
【００１７】
上記のように、本発明の任意の態様に適用することができ、および／または本明細書に記載の任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、様々な実施形態では、方法は、単離された核酸をシークエンシングするステップをさらに含む。様々な実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、対象の生体試料から得られる。様々な実施形態では、生体試料は、血液、腫瘍、健康な組織、腹水液、自己免疫の位置、腫瘍浸潤、ウイルス感染部位、病変、口腔粘膜、および皮膚からなる群から選択される。様々な実施形態では、生体試料は、対象における感染部位または自己免疫反応性部位から得られる。様々な実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ４またはＣＤ８細胞である。様々な実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、目的の抗原受容体を発現するように改変されている。様々な実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、非細胞傷害性ＣＤ４  Ｔ細胞からＴ細胞受容体を発現するように改変されている。様々な実施形態では、特定するステップｂ）は、対照のものと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍またはそれを超えて増加するＡＰＣにおける蛍光シグナルの検出によるものである。様々な実施形態では、特定するステップは、フローサイトメトリーまたはアフィニティー精製を使用して実施される。様々な実施形態では、特定するステップは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）またはアフィニティー精製を使用して実施される。様々な実施形態では、単離するステップは、ＰＣＲ増幅によって実施される。様々な実施形態では、シークエンシングは、パイロシークエンシングまたは次世代シークエンシングによって実施される。様々な実施形態では、ＡＰＣのライブラリーは、少なくとも５，０００種の異なる候補抗原を含む。
【００１８】
定義
冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、この冠詞の文法上の目的物の１つまたは複数(すなわち、少なくとも１つ)を指すために使用される。例として、「１つの要素」は、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００１９】
「単離された」によって、ネイティブな状態で見出される場合に、通常それを伴う成分を、程度に差はあっても、含まない材料を意味する。「単離する」は、もとの供給源または環境からの分離の程度を表す。例えば、単離された細胞は、動物から取り除かれ、培養皿または別の動物に置くことができる。単離されたとは、他のすべての細胞から取り除かれていることを必ずしも必要としない。
【００２０】
単離された細胞集団に関連する用語「単離された集団」は、本明細書で使用する場合、その自然環境（例えば、体内）から得られ、細胞の混合集団または異種集団から除去および分離された（例えば、自然環境からの除去プロセスにおいて、もしくはその除去に次いで、またはその両方の組合せで）細胞の集団を指す。一部の実施形態では、単離された集団は、そこから細胞が単離されるかまたはエンリッチされた異種集団と比較して、実質的に純粋な細胞の集団である。一部の実施形態では、単離された集団は、所望の細胞（例えば、細胞傷害性リンパ球）および夾雑細胞を含む細胞の異種集団と比較して、実質的に純粋な細胞の集団である、単離された細胞の集団である。このような細胞は、最初に、成体からまたは未熟な対象（例えば、誕生から、または胎児（ｅｍｂｒｙｏ）もしくは胎児（ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｆｅｔｕｓ）から１８歳以下、または１歳以下、または１カ月以下、または１日以下）から単離され得る。
【００２１】
特定の細胞集団に関連する用語「実質的に純粋」は、全細胞集団を構成する細胞に関連して、少なくとも約５０％、６０％、７０％、または７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％純粋な細胞の集団を指す。言い換えれば、細胞の集団に関する用語「実質的に純粋」または「本質的に精製された」は、約２０％未満、より好ましくは約１５％、１０％、８％、７％未満、最も好ましくは約５％、４％、３％、２％、１％未満、または１％未満しか夾雑細胞を含有しない細胞集団を指す。
【００２２】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩによって免疫細胞（例えば、細胞傷害性免疫細胞）に抗原を提示することができる任意の細胞である。ＡＰＣは、本明細書において、ＡＰＣ標的、標的細胞、または標的ＡＰＣとも称される。本明細書に記載される通りに使用されるＡＰＣは、ＡＰＣのゲノム中に安定的に挿入された外因性核酸の発現によって候補抗原を提示するように改変されている。一部の実施形態では、ＡＰＣは、本明細書に記載される候補抗原をコードするライブラリーを調製するのに好適な細胞（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、Ｕ２０Ｓ、Ｋ５６２、ＭｅｌＪｕｓｏ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＣＦ７、ＮＴＥＲＡ２ａ、樹状細胞および一次（自己）Ｂ細胞）である。
【００２３】
細胞および対象は、この用語が本明細書で使用される場合、典型的には、ヒトである。しかしながら、非ヒト動物であるものに由来する対象および細胞も使用を想定される。用語「非ヒト動物」は、これらに限定されないが、哺乳動物（例えば、ヒツジ、イヌ、ウシ、ウマ、ニワトリ、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギ、モルモット）、霊長類、イヌ科の動物、ウマ科の動物、ウシ属の動物、ネコ科の動物、ブタ）および非哺乳動物である両生類、爬虫類などを含むすべての脊椎動物を含む。本明細書に記載の細胞は、この文脈でまたはその他の箇所で、本明細書に記載の任意のこのような対象から単離することができる。非ヒト霊長類も可能な供給源である。専門家は、ＡＰＣと細胞傷害性リンパ球が同じ種の対象に由来するべきであることを認識するであろう。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「抗原」は、宿主生物において免疫応答を誘導することが可能な分子、具体的には、Ｔ細胞によって認識される分子を指す。一部の実施形態では、抗原はペプチドである。
【００２５】
本明細書で使用する場合、用語「候補抗原」は、本明細書に記載のスクリーニング方法における使用を意図した、ＡＰＣ標的中に導入される外因性核酸によってコードされるペプチドを指す。本明細書に記載されるライブラリーは、導入された候補抗原を含む標的細胞を含む。
【００２６】
「外因性」は、この用語が本明細書において使用される場合、細胞の外側または外部に起因する物質を指す（例えば、細胞のゲノム中に挿入された細胞の外側に由来する核酸は、外因性核酸と考えられる）。
【００２７】
用語「核酸」、「核酸配列」、「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用することができ、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドのいずれか、またはそのアナログを指し、天然に存在するヌクレオチドおよび／または改変されたヌクレオチドを含み得る。ポリヌクレオチドは、任意の三次元構造を有する場合があり、知られているか知られていないかにかかわらず、任意の機能を実施する可能性がある。ポリヌクレオチドの非限定例として、遺伝子、遺伝子断片、エクソン、イントロン、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボゾームＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（低分子ヘアピン型ＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（核内低分子ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（核小体低分子ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、および/またはｔＲＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたＤＮＡ、制御領域、任意の配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーが挙げられる。核酸分子は、直鎖状であっても環状であってもよい。
【００２８】
「ベクター」、「クローニングベクター」および「発現ベクター」は、本明細書で使用する場合、ポリヌクレオチド配列（例えば、外来の遺伝子）を宿主細胞に導入して、宿主を形質転換させ、導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進することができるビヒクルを指す。それぞれ、それが連結してる別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。好ましいベクターは、それらが連結する核酸分子の自己複製および／または発現を可能とするものである。それらが作動可能に連結する遺伝子の発現を支持することが可能なベクターは、「発現ベクター」と称される。ベクターとして、プラスミド、ファージ、ウイルスなどが挙げられる。
【００２９】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書で互換的に使用することができ、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これらは、コードされたおよびコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されたまたは誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。この用語は、これらに限定されないが、Ｎ末端メチオニン残基を有するか有さないかにかかわらず、異種アミノ酸配列との融合タンパク質、異種およびネイティブリーダー配列との融合物；免疫学的にタグ付けされたタンパク質；検出可能な融合パートナーとの融合タンパク質、例えば、融合パートナーとして、蛍光タンパク質、βガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼなどを含む融合タンパク質などを含む融合タンパク質を含む。
【００３０】
本明細書で使用する場合、用語「ライブラリー」は、遺伝子材料のコレクション、本明細書で使用する場合、候補抗原をコードする核酸のコレクションを指す。用語「ライブラリー」は、個々の細胞が、核酸のライブラリーを集合的に含有し、おそらくは発現する、細胞（ＡＰＣ）のコレクションも指す場合がある。一部の実施形態では、標的ＡＰＣのライブラリーは、例えば、病原体、病原体に感染した細胞、がん細胞、自己免疫疾患に関与する（例えば、標的とされる）細胞、および／または健康な対象由来の細胞のいずれかに由来する複数のペプチドを含み、これらのペプチドは、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子により提示されるように、標的細胞の表面に呈される。
【００３１】
用語「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」は、本明細書において互換可能であり、同義的に使用される。例として、これらに限定されないが、ネイティブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、またはこれらの組合せが挙げられる。
【００３２】
用語「形質導入」は、本明細書で使用する場合、ベクターを使用する、外来の核酸の細胞中への導入を指す。
【００３３】
用語「トランスフェクション」は、本明細書で使用する場合、組換えＤＮＡ技術を使用する、外来の核酸の細胞中への導入を指す。用語「形質転換」は、「外来の」（すなわち、外部の、外因性の、または細胞外の）遺伝子、ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の宿主細胞への導入を意味し、その結果、宿主細胞は、導入された遺伝子または配列を発現し、導入された遺伝子または配列によってコードされたタンパク質または酵素などの所望の物質を生成することとなる。本明細書に記載の細胞を形質転換するための１つのこのような方法は、形質導入によるものである。導入された遺伝子または配列は、「クローニングされた」または「外来の」遺伝子または配列と呼ばれる場合もあり、細胞の遺伝機構によって使用される、スタート、ストップ、プロモーター、シグナル、分泌、または他の配列などの、調節または制御配列を含んでもよい。遺伝子または配列は、非機能性配列または公知の機能を有さない配列を含んでもよい。導入されたＤＮＡまたはＲＮＡを受容および発現する宿主細胞は「形質転換され」ており、「形質転換体」または「クローン」である。宿主細胞に導入されたＤＮＡまたはＲＮＡは、宿主細胞と同じ属または種の細胞、異なる属または種の細胞を含む、任意の供給源から生じ得る。
【００３４】
用語「検出分子」は、これらに限定されないが、放射性同位体、蛍光体、化学発光体、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、染料、金属イオン、金属ゾル、リガンド（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンまたはヘプタン）などを含む、検出されることが可能な分子を指す。検出分子として使用するのに好適な例示的な検出可能な分子として、アフィニティータグおよび検出可能な標識が挙げられる。検出可能な標識の例は、限定されることなく、蛍光体、化学発光体、および発色団である。
【００３５】
用語「発色団」は、検出可能な範囲で蛍光を呈することが可能である物質またはその部分を指す。
【００３６】
用語「アフィニティータグ」は、アフィニティータグに結合し、検出可能なシグナル（例えば、蛍光化合物またはタンパク質）をもたらす分子を使用して検出することができる標的に結合され得るペプチドセグメントを示すために、本明細書において使用される。原則として、それに対して抗体または他の特異的結合剤が利用可能である任意のペプチドまたはタンパク質をアフィニティータグとして使用することができる。
【００３７】
用語「反応混合物」は、本明細書で使用する場合、候補抗原を含む標的細胞のライブラリーが、細胞傷害性リンパ球を含む生体試料と接触する液体媒体を指す。これは、例えば、候補抗原を含む標的細胞のライブラリーが、最初に、細胞傷害性リンパ球を含む生体試料と接触し、次にいずれかの洗浄ステップが、標的細胞上の候補抗原と試料中の細胞傷害性リンパ球の間の非特異的または低親和性結合を除去するように設計された反応混合物を含む。所望の場合、反応混合物の厳密な条件を改変して、候補抗原と試料中の細胞傷害性リンパ球の間での複合体形成に影響を及ぼすことができる。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「特異的結合」、「特異的に結合する」などは、反応混合物中で、他の分子または部分に対して、第２の結合分子または部位に優先的に結合する（共有結合または非共有結合により）第１の結合分子または部分の能力を指す。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「決定する」、「測定する」、「評価する」、および「アッセイする」は互換的に使用され、文脈が別段に明示していなければ、定量的決定と定性的決定の両方を含む。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「試料」または「生体試料」は、その自然環境から単離され、免疫細胞（例えば、細胞傷害性リンパ球を含むなど）を含有する生体材料を指す。試料または生体試料は、組織試料または生体液試料を含んでもよい。生体液として、これらに限定されないが、例えば、血液、血漿、唾液、尿、脳脊髄液、洗浄液、および白血球除去試料が挙げられる。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「病原体」は、別の生物（例えば、動物および植物）において、他の生物に直接感染することによって、または別の生物において疾患を引き起こす薬剤を生成すること（例えば、病原体毒素などを生成する細菌）によって、疾患を引き起こす、微生物を含む生物を指す。本明細書で使用する場合、病原体として、これらに限定されないが、細菌、プロトゾア、真菌、線形動物、ウイロイドおよびウイルス、またはこれらの任意の組合せが挙げられ、各病原体は、それ自体によってまたは別の病原体と共同で、これらに限定されないが、哺乳動物（これらに限定されないが、ヒトを含む）を含む脊椎動物において疾患を誘発することが可能である。本明細書で使用する場合、用語「病原体」は、免疫無防備状態ではない宿主において、通常病原性ではない場合のある微生物も包含する。
【００４２】
用語「免疫細胞」は、本明細書で使用する場合、これらに限定されないが、抗原提示細胞、Ｂ細胞、好塩基球、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、白血球、リンパ球（例えば、細胞傷害性リンパ球）、マクロファージ、マスト細胞、記憶細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、食細胞、プラズマ細胞およびＴ細胞を含む、哺乳動物免疫系の細胞を指す。
【００４３】
用語「免疫応答」は、本明細書で使用する場合、これらに限定されないが、先天免疫、体液性免疫、細胞免疫、免疫、炎症性応答、後天的（獲得）免疫、自己免疫、および／または過活動免疫を含む免疫を指す。
【００４４】
用語「哺乳動物」は、本明細書で使用する場合、限定されないが、ヒトおよび非ヒト霊長類、例えば、チンパンジーおよび他の猿人類および他のサル種；家畜動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ；飼育哺乳動物、例えば、イヌおよびネコ；マウス、ラットおよびモルモットなどを含むげっ歯類の実験動物などを含む哺乳綱のクラスの任意のメンバーを指す。この用語は、特定の年齢または性別を示さない。よって、オスであるかメスであるかにかかわらず、胎児と同様に、成体および新生児対象も、この用語の範囲内に含まれることを意図する。
【００４５】
用語「腫瘍」は、本明細書で使用する場合、悪性であるか良性であるかにかかわらず、すべての新生細胞の成長および増殖、ならびにすべての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。
【００４６】
用語「がん」および「がん性」は、本明細書で使用する場合、典型的には、無秩序な細胞成長により特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指し、またはそれを説明する。がんの例としては、これらに限定されないが、Ｂ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫および／または非ホジキンリンパ腫）、脳腫瘍、乳がん、結腸がん、肺がん、肝細胞がん、胃がん、膵臓がん、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、泌尿器系のがん、甲状腺がん、腎臓がん、癌腫、黒色腫、頭頚部がん、脳がん、および前立腺がん（これらに限定されないが、アンドロゲン依存性前立腺がんおよびアンドロゲン非依存性前立腺がんを含む）が挙げられる。
【００４７】
「適切な対照」は、この用語を本明細書で使用する場合、１つまたは複数の重要な因子を除いて、そうでなければ実験反応と同様に処理される対照反応を指す。対照は、活性化分子（例えば、活性化細胞傷害性リンパ球）に曝露されない以外は同一である細胞であり得る。あるいは、対照は、活性化分子に曝露されるが、レポーター分子を欠如する細胞であり得る（そうでなければ、実験細胞と同一であり得る）。適切な対照は、熟練の技術者によって決定される。
【００４８】
例示的実施形態が、参照される図面において例証される。本明細書で開示される実施形態および図面は、限定的というよりはむしろ例示的とみなされるべきであることを意図する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】Ｔ細胞抗原の系統的特定の例示的手法の外観を示す図である。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ＣＴＬ−標的相互作用に対する例示的陽性対照を示すグラフである。図２Ａは、７−ＡＡＤ染色によって決定されるように、ＣＴＬが標的細胞を認識し、対照ペプチドではないＩＶ９でパルスして標的細胞を死滅させることを示す。図２Ｂは、ＬＤＨ放出によって測定されるように、３つの異なるプロモーター由来のＩＶ９ペプチドを含有する５６個のアミノ酸ペプチド（５６量体とも称される）の発現により、効率的な抗原提示およびＩＶ９  ＣＴＬによる死滅が導かれることを示す。
【図３】例示的なＧｚＢ活性の蛍光発生レポーターを示すグラフである。 蛍光発生ＧｚＢレポーターを発現するＧＦＰ標識標的細胞を、ＩＶ９  ＣＴＬとの共培養前に、対照ペプチドまたは同種のＩＶ９ペプチドでパルスした。ＧｚＢ活性は、標的細胞における赤外蛍光タンパク質シグナルを測定することによって検出される。
【図４−１】図４Ａおよび４Ｂは、同種の抗原を呈する標的細胞のエンリッチメントを実施する再構築実験を示す図である。図４Ａは、再構築実験の概略図を示す。図４Ｂは、様々な割合で、対照抗原を呈する標的細胞中にスパイクされた場合に同種の抗原を呈する標的細胞のフォールドエンリッチメントを示す。
【図４−２】図４−１と同様である。
【図５−１】図５Ａおよび５Ｂは、スクリーニングにおけるＣＴＬ抗原の検出を示す図である。図５Ａは、スクリーニングの概略図を示す。図５Ｂは、インプットライブラリーに対して、スクリーニング後に対照（非標的）および同種の（標的）ペプチドのｑＰＣＲによって検出されたフォールドエンリッチメントを示す。Ｒｅｐ１およびＲｅｐ２は、２つの独立した生物学的複製である。
【図５−２】図５−１と同様である。
【図６−１】図６Ａおよび６Ｂは、例示的なＧｚＢ活性のＣｒｅレポーターの開発を示す図である。図６Ａは、ＤＮＡにコードされたペプチドを発現する抗原提示細胞（ＡＰＣ）が、その細胞表面のＭＨＣ  Ｉ分子に、ペプチドに由来するエピトープを提示することを示す。Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介してこの複合体を認識すると、パーフォリンとグランザイムを分泌する免疫シナプスを形成する。グランザイムはＡＰＣに侵入し、以前に膜に結合したＣｒｅリコンビナーゼを切断する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、３’プライマー部位の方向を逆転させ、ＤＮＡがコードするペプチドの生産的ＰＣＲ増幅を可能とする。図６Ｂは、膜係留Ｃｒｅを発現し、ＮＫ細胞によって送達されたＧｚＢに曝露された標的細胞におけるＣｒｅ媒介逆位（Ｃｒｅ活性）の検出結果を示す。逆位レポーターカセットに特異的なプライマーを使用するｑＰＣＲによってＣｒｅ活性を検出した。ＮＫ細胞で処理した細胞と対照の未処理細胞に由来するゲノムＤＮＡを精製し、逆転頻度をｑＰＣＲによって定量し、各試料におけるレポーターの存在量（逆位非依存性ｑＰＣＲプライマーを使用して定量した）に対して正規化した。Ｃｒｅ活性に関するレポーターのみを発現する標的細胞（Ｃｒｅなしの対照）では、ＧｚＢ送達の際に検出可能なＣｒｅ活性が実証されなかった。
【図６−２】図６−１と同様である。
【図７−１】図７Ａおよび７Ｂは、例示的な抗体ベースのＧｚＢ活性のレポーターの開発を示す図である。図７Ａは、抗体ベースのレポーター手法の概略図を示す。一般的に、レポーター物質は、ＧｚＢ切断部位の前にＦｌａｇエピトープを含有する。ＧｚＢ切断後に、Ｆｌａｇエピトープは、タンパク質のＮ末端に特異的なＦｌａｇエピトープを認識したＭ１抗体による認識にアクセス可能である。図７Ｂは、ＮＫ細胞によるＧｚＢの送達の有無にかかわらず、ＧｚＢレポーターを発現する標的細胞由来の細胞溶解物に関して、Ｍ１  Ｆｌａｇ抗体を使用するウエスタンブロッティング解析の結果を示す。レポーターとその後のＧｚＢ送達の存在下で、抗体標的の劇的な増加が観察される。
【図７−２】図７−１と同様である。
【図８】ＩＶ９  Ｔ細胞のスクリーニング結果のグラフ表示である。各ドットは、ライブラリーの１つのペプチドに対する２つの生物学的複製のそれぞれにおけるフォールドエンリッチメントを表す。数値標識で特定したドットは、ＩＶ９  Ｔ細胞の公知の標的を含有するすべてのペプチドである。
【図９】解析によって発見されたモチーフを列挙するチャートである。ＩＶ９エピトープは、このモチーフ解析によって特定した。ＩＶ９のスクリーニング由来の１００個の最もエンリッチされたペプチドに関するＭＥＭＥ解析によって特定された最上位のエンリッチされたモチーフは、正確なＩＶ９エピトープ（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）を含有する。
【図１０】ＣＤ４  ＴＣＲに関するＧｚＢレポーターを使用した実験においてＧｚＢレポーターを活性化した標的細胞のパーセンテージを示す表である。一次ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、Ｏｂ１Ａ．１２  ＴＣＲまたは対照のＴＣＲのいずれかを発現するようにレンチウイルスによって改変された。次いで、改変されたＴ細胞を、Ｏｂ１Ａ．１２  ＴＣＲの標的抗原または突然変異体の対照抗原を呈する標的細胞と混合した。Ｏｂ１Ａ．１２  ＴＣＲを発現することにより、ＧｚＢレポーターを使用して検出することができるＭＨＣ  ＩＩに関連して、同種のＭＢＰペプチドの特異的認識がもたらされた。
【図１１】ＩＦＰを利用するＧｚｂレポーターの線形概略図である。レポーターは、ＧｚＢ切断配列を含有する、リンカーによって分割された二等分のＩＦＰの部分を含有する。ＩＦＰカセットの全体は、分割されたＧＦＰがその両側に隣接している。
【図１２】レポーター活性化のメカニズムの概略図である。活性化の前に、レポーターは、リンカー配列によって成熟を抑制した二等分のＩＦＰを含む。ＧｚＢ切断に際し、リンカーが放出され、二等分のＩＦＰが一緒になって、活性な蛍光ＩＦＰを形成する。構築物のＮおよびＣ末端において分割されたＧＦＰにより、構成的ＧＦＰ蛍光がもたらされ、タンパク質全体を安定化させる助けとなる。
【図１３−１】例示的ＧｚＢ  ＩＦＰレポーターのヌクレオチド（配列番号２）およびアミノ酸（配列番号３３）配列を示す図である。
【図１３−２】図１３−１と同様である。
【図１３−３】図１３−１と同様である。
【図１４】ＧＦＰの活性化とＲＦＰの損失による蛍光検出によるよりもむしろｑＰＣＲによる、Ｃｒｅの存在に関するレポーターカセットの逆位事象の検出を促進するために設計されたｑＰＣＲプライマーを示す図である。
【図１５−１】ＧＦＰの活性化とＲＦＰの損失によりＣｒｅ活性の蛍光検出を可能とする、Ｃｒｅの存在に関する例示的レポーターカセットのヌクレオチド（配列番号３）およびアミノ酸（配列番号３４）配列を示す図である。
【図１５−２】図１５−１と同様である。
【図１５−３】図１５−１と同様である。
【図１６】ＮＬＶ２  ＴＣＲに関するＣＭＶのゲノムワイドスクリーニングの結果を示すグラフである。ＣＭＶゲノムにわたって２８個のアミノ酸ごとに並べて表示された２，８８２個の５６アミノ酸長のペプチドを、２つの異なるＤＮＡバーコードでコードした。散布図の各ドットは、１つのペプチド配列に対応する２つのバーコードの性能を示す。数値標識に関連して特定した上部右側角の２つのドットは、ＮＬＶ２  ＴＣＲ（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号４））の公知の標識を含有するライブラリーにおける２つだけのエピトープである。
【図１７】患者のＴ細胞に関するウイルス叢−ワイドスクリーニングの結果を示すグラフである。２０６のウイルス種のゲノムにわたって２８個のアミノ酸ごとに並べて表示された９３，９０４個の５６アミノ酸長のペプチドを、ＮＬＶペプチドの存在下で増殖させた患者のＴ細胞に関してスクリーニングした。散布図の各ドットは、スクリーニングの２つの生物学的複製のそれぞれにおける１つのペプチドの性能を示す。数値標識「２４７４１」および「２４７４２」に関連して特定した２つのドットは、ＮＬＶエピトープ（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号４））を含有するライブラリーにおける２つだけのエピトープである。数値標識「３２２５５」および「３２２５６」に関連して特定した２つのドットは、図１８に示す試料Ｔ細胞のうちの２％によって標的とされるＵＬ１２３（ＩＥ１）タンパク質から重複する５６量体をコードする。
【図１８】ウイルス叢−ワイドスクリーニングで発見した新規エピトープの検証を示すグラフである。陰性対照のペプチド、公知のｐｐ６５  ＮＬＶペプチド、または新たに発見されたＩＥ１（ＵＬ１２３）ペプチドを負荷したＨＬＡ−Ａ２四量体を使用して、ウイルス叢−ワイドスクリーニングで使用したＴ細胞集団を染色した。インプット集団のＣＤ８−陽性Ｔ細胞の２７．７％がＮＬＶペプチドを認識したが、一方、２．１％がＩＥ１エピトープを認識した。
【図１９】ＣＭＶゲノム−ワイドライブラリー対ポリクローナルメモリーＴ細胞を使用するライブラリースクリーニングの結果を示すグラフである。ＣＭＶ−陽性、ＨＬＡ−Ａ２陽性のドナー由来のメモリーＴ細胞を使用して、ＣＭＶゲノムにわたって２８個のアミノ酸ごとに並べて表示された２，８８２個の５６アミノ酸長のペプチドをスクリーニングした。各ドットは、特定の５６アミノ酸ペプチドをコードする２つの独立したＤＮＡバーコードの性能を表す。エンリッチされた２つの重複する５６アミノ酸ペプチドを有するペプチドを数値標識に関連して特定する。
【図２０】ＴＣＲ結合の並べて表示した突然変異誘発の特徴付けの結果を示すグラフである。ＮＬＶエピトープ（ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ（配列番号４））に対して増殖したＴ細胞をＮＬＶエピトープとその両側に隣接する２つのアミノ酸の網羅的突然変異誘発ライブラリーに対してスクリーニングした。ヒートマップの各ボックスは、エピトープの野生型バージョンと比較して、この突然変異体がどのように実施されたかを示す濃淡および値と共に、１つの突然変異体を表す。
【図２１】ＴＣＲ標識の検出が、複数回のスクリーニングで改善されることを示すグラフである。各ドットは、ＩＶ９特異的ＴＣＲによる１回目（左パネル）または２回目（右パネル）のスクリーニング後の所与のペプチドに関する２つのＤＮＡバーコードの性能を表す。数値標識に関連して特定した６個のドットは、ＴＣＲの公知の標識である、抗原ライブラリーにおける６個のペプチドを示す。
【図２２】腫瘍特異的ＴＣＲのシグナルノイズ解析の結果を示すグラフである。ＮＬＶ特異的ＣＭＶ  ＴＣＲ（ウイルスのＴＣＲ）およびＭＡＧＥ−Ａ３腫瘍特異的ＴＣＲ（親和性が増強されなかった、腫瘍ＴＣＲ）をドナーのＣＤ８  Ｔ細胞中に導入した。同種の抗原の非存在下（対照）または存在下（＋抗原）におけるＭＨＣ適合細胞の認識を測定し、ＴＣＲに相当する性能を実証した。
【図２３】突然変異体ＩＣＡＤの過剰発現によって、アポトーシスの間のＤＮＡ分解が妨げられることを示す図である。突然変異体ＩＣＡＤの過剰発現を有さない（対照）またはそれを有する（ＩＣＡＤ）標的細胞をアポトーシス誘導剤である、カンプトテシンおよびスタウロスポリンで処理した。ゲノムＤＮＡを精製し、対照細胞でアポトーシスが誘導された場合には、特徴的ＤＮＡスミアとラダーが示されたが、突然変異体ＩＣＡＤの存在下では示されなかった。
【図２４】突然変異体ＩＣＡＤの発現により、スクリーニング設定における抗原カセット回収が増強されることを示すグラフである。シークエンシングによって回収された抗原カセット数を抗原回収の有効性を計算するために選別した細胞数と比較した。各バーは、過剰に発現した突然変異体ＩＣＡＤの非存在下（ＩＣＡＤなし）または存在下（ＩＣＡＤ）で実施した１回のスクリーニング複製における抗原回収パーセントを示す。
【図２５】操作したプロテアーゼレポーターの設計および試験の結果を示す図である。レポータータンパク質（ＣＤ４）をＧＦＰに融合し、Ｃ末端ＫＫＸＸモチーフの付加によってＥＲ中に保持した。ＴＥＶプロテアーゼ（右のパネル）の発現によって、抗ＣＤ４  ＡＰＣ抗体による染色によって検出されるように、ＥＲ保持モチーフを切断することによるＣＤ４の表面発現の増加がもたらされる。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
免疫応答は、いくつかの「分子プレイヤー」に関与する複雑なプロセスである。しかしながら、免疫応答の基本的部分の１つは、ＣＴＬによるエピトープ／抗原の認識である。エピトープは、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によって、細胞膜に提示されるタンパク質またはタンパク質の断片である。大きなタンパク質は、特異的な酵素によって数百もの短いペプチド断片に分断されるが、これらの断片のうちのほんの少しによって免疫応答が誘発されることになる。
【００５１】
Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）とＡＰＣによって提示される抗原などの抗原との間の生産的相互作用は、非常に稀であり、百万個の標的細胞のうちの１つよりも少ない中で生じる場合が多い。所与のＴ細胞によって認識される抗原は、典型的には、非常に低い頻度、例えば、１００，０００個の抗原中１またはそれより少ない頻度で存在する。さらに、所与の抗原を呈するすべての標的細胞が、その同種のＴ細胞、特に混合したＴ細胞集団の所与の特異性に遭遇する訳ではない。したがって、抗原およびそのエピトープとのＴ細胞受容体の相互作用を特定するための努力は、Ｔ細胞受容体とエピトープ／抗原の複雑な混合物の中で、このような稀な事象を検出することが不可能であるため、Ｔ細胞応答の直接的測定に基づく相互作用の個々または少数のペアに焦点を当ててきた（例えば、生理学的に関連するおよび／またはゲノムスケールの解析）。さらに、既存の手法は、抗原提示細胞によるＭＨＣへのペプチドの内因性処理および負荷を可能とすることができない結果をもたらす、非細胞系プラットフォームに焦点を当てる。よって、このような非細胞ベースのプラットフォームによって特定された標的抗原は、実際に、ｉｎ  ｖｉｖｏで機能的に呈される傾向が少ない。
【００５２】
この問題を解決するために、Ｔ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞に特異的な抗原のハイスループットな発見を可能とするエレメントの組合せを使用して、再生可能な方式でバックグラウンドノイズを超える相互作用シグナルを特定する方式および提示するＡＰＣと相互作用を駆動する抗原の回収を可能とする方式で、このような稀な相互作用を検出するための組成物および方法が、本明細書において提供される。このような組成物および方法は、これらがロースループットの問題ならびにハイスループット（例えば、ゲノム−ワイド）スケール、かつモジュール様式の複雑な抗原ライブラリーを使用して、Ｔ細胞受容体−エピトープ／抗原の相互作用の感受性かつ強固な検出を可能とすることによって、偏ったＴ細胞受容体−エピトープ／抗原の発見の問題を克服するため、特に有用である。
【００５３】
一般的に、本明細書において提供される組成物および方法は、認識されたＡＰＣのマーカー／読出しを使用して、候補抗原を提示する標的ＡＰＣからＤＮＡを単離することによって、細胞傷害性リンパ球によって認識される抗原を特定し、それによって、多種多様な可能な抗原断片（例えば、試験抗原のライブラリー）から免疫応答を活性化することができる抗原の特定を可能とするのに有用である。遺伝子材料をＡＰＣ中に送達し（例えば、ウイルスベクターにより）、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子における発現および提示に関する１つまたは複数の候補抗原をコードする。複数のＡＰＣへの送達された遺伝子材料のライブラリーにより、標的ＡＰＣのライブラリーが生じる。ライブラリーをスクリーニングして、本明細書に記載の方法によって、細胞傷害性リンパ球により生産的に認識される抗原を特定することができる。それによって、ＡＰＣまたはＡＰＣのライブラリーは、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩ分子により発現および提示される１つまたは複数の候補抗原をコードする外因性核酸を含む。外因性核酸は、ＡＰＣのゲノムに（例えば、ベクター、例えば、ウイルスベクター、またはトランスポゾンを介して）安定的に導入することができる。一部の実施形態では、挿入された外因性核酸は、上流と下流の両方に、所定のプライマー認識配列（本明細書において、フランキングプライマー認識配列と称される）を有する。これらの配列によって、ＡＰＣから認識される抗原の後の特定が容易になる。
【００５４】
ＡＰＣは、細胞傷害性リンパ球による抗原認識を示す分子レポーターを含有するようにさらに改変されてもよい。生産的な抗原認識は、例えば、応答するＴ細胞を直接測定するよりもむしろ抗原認識から生じる活性の検出によって特定される。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞の活性の代用の尺度、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴによって測定されるＩＦＮ−γ分泌は、典型的には、Ｔ細胞の相互作用を調査するためにこの技術分野において使用される。しかしながら、これらの態様の尺度は、ＣＴＬのｉｎ  ｖｉｖｏでの機能に対して不確かな関連性を有し（Sekaly、JEM 205（1）: 7（2008））、ＴＣＲ−エピトープ／抗原結合を直接的に特定しない。対照的に、本明細書に記載の改変されたＡＰＣによって、プロテアーゼ様グランザイムＢ（ＧｚＢ）を含有する細胞傷害性顆粒の放出などの、ＡＰＣの細胞傷害性リンパ球媒介改変によって引き起こされる生産的抗原認識のレポーターの検出によって、細胞傷害性リンパ球の結合の特定が可能となる。これは、ＡＰＣの、ＡＰＣによって提示された抗原に結合することが可能なＴ細胞受容体を発現する細胞傷害性リンパ球との接触の際、および抗原認識に適した条件下で接触した場合に生じる。これは、ＡＰＣの検出されたＴ細胞の改変が、細胞溶解の誘導に関与するため、機能的に関連するＴ細胞の活性も特定する。例えば、細胞傷害性リンパ球による生産的抗原認識により、ＡＰＣにおける細胞溶解に関与するセリンプロテアーゼであるＧｚＢの活性がもたらされ、これは、１％の偽のシグナルレベルでさえ真の陽性をマスクするのに十分であるため、バックグラウンドノイズを最小限にして、真の陽性シグナルの特定を可能とすることが本明細書において実証される。一部の実施形態では、ＧｚＢレポーターは、ＧｚＢの蛍光発生レポーターである。一部の実施形態では、ＧｚＢレポーターは、光学的に検出可能なシグナルを生じないが、例えば、アフィニティー精製によって、ＣＴＬによって認識される抗原を発現するＡＰＣの単離を可能とする細胞表面シグナルを生じる。一部の実施形態では、ＧｚＢレポーターによって生成される検出可能なシグナルを使用して、その発現された抗原が細胞傷害性リンパ球によって生産的に認識されるＡＰＣをエンリッチする。
【００５５】
生産的抗原認識のマーカーにより、シグナルノイズの増強によって、候補抗原の複雑さが増すことになる（すなわち、シグナルがＴ細胞の標的を補正するライブラリーに含まれ得る候補抗原の数を特定するのに成功することができる）。例えば、Ｔ細胞受容体−抗原の相互作用分析の伝統的方法と異なり、百万個の標的細胞に対してアッセイすることができる候補抗原の複雑さは、５ｋ（すなわち、５，０００）を超えるか、１０ｋ、１５ｋ、２０ｋ、２５ｋ、３０ｋ、３５ｋ、４０ｋ、４５ｋ、５０ｋ、５５ｋ、６０ｋ、６５ｋ、７０ｋ、７５ｋ、８０ｋ、８５ｋ、９０ｋ、９５ｋ、１００ｋ、１０５ｋ、１１０ｋ、１１５ｋ、１２０ｋ、１２５ｋ、１３０ｋ、１３５ｋ、１４０ｋ、１４５ｋ、１５０ｋ、１５５ｋ、１６０ｋ、１６５ｋ、１７０ｋ、１７５ｋ、１８０ｋ、１８５ｋ、１９０ｋ、１９５ｋ、２００ｋ、２１０ｋ、２２０ｋ、２３０ｋ、２４０ｋ、２５０ｋ、２６０ｋ、２７０ｋ、２８０ｋ、２９０ｋ、３００ｋ、３１０ｋ、３２０ｋ、３３０ｋ、３４０ｋ、３５０ｋ、３６０ｋ、３７０ｋ、３８０ｋ、３９０ｋ、４００ｋ、４１０ｋ、４２０ｋ、４３０ｋ、４４０ｋ、４５０ｋ、４６０ｋ、４７０ｋ、４８０ｋ、４９０ｋ、５００ｋ、６００ｋ、７００ｋ、８００ｋ、９００ｋ、１０００ｋ、１１００ｋ、１２００ｋ、１３００ｋ、１４００ｋ、１５００ｋ、１６００ｋ、１７００ｋ、１８００ｋ、１９００ｋ、２０００ｋ、もしくはそれを超えるか、または包括的に、この間の任意の範囲（例えば、１００Ｋから２０００Ｋ）の標的細胞であり得る。各細胞が特有のペプチドを呈する、ランダムペプチドのライブラリーなどの一部の抗原ライブラリー形式では、スクリーニングすることができる抗原は、１×１０８の桁（すなわち、数億）から１×１０９またはそれを超える桁である。
【００５６】
本明細書に記載の組成物および方法に従ってスクリーニングすることができる抗原の増強された複雑さに加えて、方法および組成物は、好ましくは、抗原回収の効率を増加させるために、ＤＮＡ分解（例えば、カスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ（ＣＡＤ）媒介ＤＮＡ分解）の阻害剤も含むＡＰＣも含むことができる。目的のＣＴＬによって認識される抗原は、生産的抗原認識によってマークされた、改変されたＡＰＣからこれらを回収することができる場合（例えば、Ｔ細胞受容体により結合した同種の抗原をコードする外因性核酸の配列を得ること）にのみ特定され得る。しかしながら、ＣＴＬによって誘導される細胞溶解によって、抗原同一性の効率的回収を妨げるＤＮＡ分解が開始される。ＤＮＡ分解の阻害剤を含まなければ、生産的抗原認識によってマークされる１００個の改変されたＡＰＣから、およそ１個の単一の抗原（すなわち、１００個の改変されたＡＰＣのうちの１個が提示している抗原または１％の効率）を特定することができる。以下でさらに記載されるように、ＤＮＡ分解の阻害剤、例えば、ＣＡＤ媒介ＤＮＡ分解の阻害剤を含むことによって、抗原回収は少なくとも５倍（すなわち、５％の効率）増加し、抗原回収の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、もしくはそれを超えるか、または包括的にその間の任意の範囲（例えば、５％〜５０％）であり得る。よって、本発明の方法を使用して、５％を超える、例えば、５０％またはそれより高い回収（１００％は理論限界である）を達成することができる。
【００５７】
スクリーニングすることができる多数の抗原および個々の実験における抗原回収の効率によって、本明細書に記載の方法は、少数のＴ細胞しか必要とせず、したがって、ｅｘ  ｖｉｖｏで、直接的に、限定数のＴ細胞を試料に適用することができる。
【００５８】
本明細書に記載されるように改変された複数のＡＰＣも本明細書において提供され、ここで、ＡＰＣは、候補抗原をコードする様々な外因性核酸を含み、その結果、ＡＰＣは、候補抗原のライブラリーを集合的に提示する。一部の実施形態では、各ＡＰＣは、単一の核酸を、おそらく複数の複製において、含有し、かつ発現させ、それによって、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩの分子により単一の候補抗原を提示する。他の実施形態では、各ＡＰＣは、異なる候補抗原を発現する一握りの異なる核酸を、おそらく複数の複製において、含有し、かつ発現させ、それによって、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩの分子によりいくつかの候補抗原（例えば、２、３、４、５、６、またはそれを超える）を提示する。
【００５９】
好ましくは、ライブラリーに関するＡＰＣは、同じ細胞型（例えば、改変の前にクローンであるように）に由来する。本明細書に記載の様々な実施形態では、ライブラリーは、単離された細胞集団および／または実質的に純粋な細胞集団である、複数のＡＰＣから構成される。好適な細胞の例として、限定されないが、Ｋ  ５６２細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＨＥＫ  ２９３  Ｔ細胞、Ｕ２ＯＳ  細胞、ＭｅｌＪｕｓｏ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞、ＭＣＦ７細胞、ＮＴＥＲＡ２ａ細胞、樹状細胞、および一次自己Ｂ細胞が挙げられる。
【００６０】
本明細書に記載の方法では、一般的に、ＡＰＣ、またはその複数は、抗原認識に好適な条件下で、細胞傷害性リンパ球によって接触される。一部の実施形態では、ＡＰＣ標的を含む反応試料を目的の細胞傷害性リンパ球を含む生体試料と混合し、インキュベートして、同種の抗原を呈する任意の標的細胞の細胞傷害性リンパ球による認識を可能とする。認識に際し、細胞傷害性リンパ球は、検出可能な方式で、標的細胞を改変する（例えば、死滅プロセスを開始させるために、セリンプロテアーゼであるグランザイムＢ（ＧｚＢ）を含有する細胞傷害性顆粒を放出する）。このように改変される細胞が特定され、同種の抗原をコードする外因性核酸がそこから単離される。単離された外因性核酸のシークエンシングによって認識された抗原が特定される。候補抗原のライブラリーを発現する複数のＡＰＣを用いて使用されるこの方法を使用して、所与の細胞傷害性リンパ球に特異的な標的抗原を包括的に特定することができる。追加の詳細および代表的実施形態を以下にさらに記載する。
【００６１】
組成物および方法の使用
ＣＴＬは、細胞内の病原体によって感染した細胞を認識すると長く理解されてきており、ＨＩＶを含む多くの感染性疾患の制御に必須である。一方、自己抗原の異常なＣＴＬによる認識は、１型糖尿病を含む自己免疫疾患を引き起こし得る。腫瘍免疫学における最近の進歩では、ＣＴＬの別の重要な機能：腫瘍を認識し、除去するそれらの能力が強調されている。この機能は、養子Ｔ細胞移入および免疫チェックポイント遮断などの有望な免疫療法に対する基礎として機能し、以前に難治性がんを有した患者のサブセットの持続的治癒をもたらす。主要な進行中の課題は、これらの状況のそれぞれにおいて、抗原に駆動されるＴ細胞の活性の特徴付けである。
【００６２】
保護的および病原性Ｔ細胞応答を理解することは、より広範な患者を助けるために、免疫療法を改善することができるバイオマーカーまたは共介入の発見を知らせるために重要である。本明細書に開示された技術を使用して、公平なプロファイリングのために保護的または病原性Ｔ細胞応答を特徴付けるのと同様に、目的のＴ細胞の標的抗原を特定することができる。
【００６３】
目的のＴＣＲの標的抗原の特定
本明細書で実証されるように、単離されたＴ細胞クローンの標的を特定するためにこの技術を直接的に適用することができる。さらに、ＤＮＡシークエンシングによって特定される目的のＴＣＲの標的を特定するために使用することができる。この手法は、ＣＤ４またはＣＤ８  Ｔ細胞のいずれかから生じるＴＣＲに適用され得る。これらのＴＣＲ配列を合成し、一次Ｔ細胞中に導入し、次に、本発明者らのプラットフォームでスクリーニングすることができる。注目すべきことに、ＴＣＲをシークエンシングするための技術は劇的に改良されており、このプラットフォームに対する多くの他の適用を明らかにする見込みがある。
【００６４】
自己免疫疾患
ハイスループットシークエンシングにおける進歩によって、潜在的な病原性Ｔ細胞クローンまたは患者内で増殖されるかもしくは１型糖尿病、多発性硬化症、強直性脊椎炎、再生不良性貧血、大顆粒リンパ球性白血病、多発性筋炎、甲状腺炎、および心筋症などの疾患を有する患者を通して保存されるＴＣＲの特定が可能となった。これらのＴ細胞によって認識される抗原を特定するための既存の方法は、ＴＣＲ配列が公知である場合であっても、公平な抗原の発見を可能とするスループットを欠いている。これらのＴ細胞および／またはＴＣＲを本明細書に記載の方法において使用し、これらの標的抗原を特定することができる。このことにより、病因への見識が得られ、バイオマーカーが与えられ、病原性自己免疫反応を特異的に抑制する標的療法に対するとびらが開かれることになる。
【００６５】
がんの免疫療法
がんの免疫療法の分野における、主要な、際立った課題は、生産的抗腫瘍免疫を媒介する腫瘍抗原を特定することである。腫瘍浸潤由来のＴ細胞クローンを単離して、腫瘍浸潤のＴＣＲシークエンシングによって、腫瘍特異的Ｔ細胞のオリゴクローナル増殖を実証した。患者の腫瘍における体細胞突然変異から生じる新規タンパク質断片を含有する患者の特異的新生抗原ライブラリーが作製され得る。次いで、腫瘍特異的Ｔ細胞を、これらの新生エピトープの認識に関して系統的にスクリーニングし、非突然変異腫瘍抗原の認識に関してゲノムワイドにスクリーニングすることができる。生産的抗腫瘍免疫を理解することによって、免疫療法の成功を増進するバイオマーカーおよび共介入の開発を導くことができる。
【００６６】
保護的または病原性Ｔ細胞応答の公正なプロファイリング
本明細書に記載の技術を適用して、Ｔ細胞の混合集団の特異性を特定することができる。このことにより、目的の特異的クローンまたはＴＣＲが未だ特定されていない場合でも、保護的または病原性Ｔ細胞応答の特徴付けが可能となる。
【００６７】
上記の状況のそれぞれにおけるＴ細胞の集団に、このプラットフォームを適用することができる。例えば、このプラットフォームは、１型糖尿病患者から単離したバルクＴ細胞をスクリーニングし、患者のＴ細胞によって認識される膵臓の自己抗原の完全なセットを特定するために使用することができる。同様に、Ｔ細胞に浸潤するポリクローナル腫瘍をスクリーニングして、抗腫瘍免疫において認識される突然変異および非突然変異腫瘍抗原の範囲をプロファイリングすることができる。
【００６８】
感染性疾患からの保護
Ｔ細胞は、広範な感染性疾患に対する保護を媒介すると考えられる。例えば、ＭＨＣクラスＩの対立遺伝子ＨＬＡ−Ｂ５７とＨＩＶの選ばれた対照の間には強い関連があり、ウイルス対照の有望な決定として、ＣＤ８  Ｔ細胞と特異的標的抗原を関係させる。本明細書に開示される技術を使用して、特定の臨床帰結、例えば、制御されたマラリアへの曝露またはＨＩＶの選ばれた対照に対する免疫を有する患者におけるＣＴＬ特異性を系統的にプロファイリングして、保護の相関関係を特定し、ワクチン設計についての情報を与えることができる。
【００６９】
このプラットフォームは、有効なＴ細胞エピトープの特徴を特定することによって、ワクチン設計の改良にも寄与することができる。一部のアルゴリズムは、ＭＨＣ分子に対するペプチドの親和性を予測するために存在するが、Ｔ細胞によって生産的に認識される傾向がより強い特定のペプチドを作製する他の特徴についての理解は存在しない。本明細書に開示される技術によって、標的細胞によって生産的に呈され、かつ患者のＴ細胞によって認識される多数のＴ細胞エピトープの発見が可能となる。これらのエピトープについて研究し、効果的なＴ細胞エピトープの特性を明らかにすることができる。次いで、この知識を、最適化ワクチンを生成するため、ならびにがんおよび感染性疾患（例えば、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス感染症、およびマラリア）におけるＴ細胞療法に適用することができる。
【００７０】
細胞傷害性リンパ球およびＮＫ細胞
一部の実施形態では、細胞傷害性リンパ球は、細胞傷害性Ｔ細胞である。これらは、ＣＤ４またはＣＤ８のいずれであってもよい。細胞傷害性Ｔ細胞は、その内因性受容体を発現することができるか、または目的の外因性抗原受容体を発現するように改変されてもよい。一部の実施形態では、外因性受容体は、細胞傷害性の活性を有さないＴ細胞（例えば、非細胞傷害性ＣＤ４  Ｔ細胞）に由来する。Ｔ細胞の特異性は、そのＴ細胞受容体の配列に含有される。１つのＴ細胞に由来するＴＣＲを別のＴ細胞に導入することによって、新たなＴＣＲの特異性を移行しながら、レシピエント細胞のエフェクター機能を保持することができることが実証されてきた。これは、一般的にＴＣＲ療法の基礎である。さらに、ＣＤ８  Ｔ細胞に由来するＴＣＲは、ドナーＣＤ４細胞中に導入された場合に、ＣＤ４  Ｔ細胞のエフェクター機能を駆動することができる（Ghorashian et al., J Immunol, 194（3）: 1080-1089（2015））。本明細書で実証されるように、ＣＤ４  Ｔ細胞に由来するＴＣＲをドナーＣＤ８細胞中に移行させることにより、ＭＨＣクラスＩＩに提示され、ＣＤ４  ＴＣＲによって認識される抗原に対して、ＧｚＢ媒介性細胞傷害性の活性を与えることができる（本明細書の図１０を参照のこと）。一部の実施形態では、外因性Ｔ細胞受容体は、ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１またはＴｈ２）または調節Ｔ細胞に由来する。天然のキラー細胞などの他の種類の細胞傷害性細胞をアッセイにおいて使用し、これらの細胞が認識する因子を特定することができる。この方法において使用される細胞傷害性リンパ球は、クローン集団または混合集団であり得る。あるいは、またはさらに、ＣＴＬに対して、Ｔ細胞受容体を発現するように操作されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を使用することができる。
【００７１】
細胞傷害性リンパ球またはＮＫ細胞は、種々の供給源から得ることができる。典型的には、細胞傷害性リンパ球は、生体試料から得られる。
【００７２】
試料
一部の実施形態では、「反応試料」は、標的細胞または候補抗原を含む標的細胞のライブラリーを含む。反応試料は、標的細胞表面の候補抗原と目的の試料中のＴ細胞の間の複合体形成を促進するために、追加の緩衝液、塩、浸透物質なども含むことができる。
【００７３】
「生体試料」は、細胞傷害性リンパ球または抗原提示細胞などの目的の細胞を含む、目的の体液または組織を指す。例示的な実施形態では、生体試料は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）および／またはナチュラルキラー細胞を含む。生体試料は、生体試料が目的の細胞を含む限り、個体の任意の器官または組織から得ることができる。器官または組織は、健康であってもよく、または罹患されていてもよい。一部の実施形態では、生体試料は、自己免疫の位置、自己免疫反応の部位、腫瘍浸潤、ウイルス感染、または病変に由来する。
【００７４】
一部の実施形態では、生体試料は、生体粒子または望ましくない細胞を除去するために処理される。血液または他の生体試料から細胞を除去するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、遠心分離、超遠心分離、免疫選択、または沈降などを含み得る。生体試料の一部の非限定例として、血液試料、尿試料、精液試料、リンパ液試料、脳脊髄液試料、血漿試料、血清試料、膿試料、羊水試料、体液試料、便試料、生検試料、針吸引生検試料、綿棒試料、うがい薬試料、口腔粘膜試料、がん試料、腫瘍試料、腫瘍浸潤、組織試料（例えば、皮膚）、細胞試料、関節液試料、またはこのような試料の組合せが挙げられる。本明細書に記載の方法では、生体試料が、血液または組織生検（例えば、腫瘍、自己免疫または他の病理）であることが好ましい。
【００７５】
ＡＰＣの改変
ＡＰＣは、トランスフェクションまたは遺伝子改変によるなどによって操作されて、候補抗原をコードする外因性核酸を発現する。ＡＰＣは、遺伝子、タンパク質、化学標識、レポーター分子をコードする外因性核酸などの目的の組成物の発現を下方調節および／または上方調節するようにさらに改変されてもよい。
【００７６】
上記のように、ＡＰＣは、細胞傷害性リンパ球および／またはＮＫ細胞による抗原認識を示す分子レポーターを含有するようにさらに改変されてもよい。生産的抗原認識は、例えば、応答するＴ細胞を直接的に測定するよりもむしろ、抗原認識から生じる活性の検出によって特定される。一部の実施形態では、本明細書でさらに記載される１つまたは複数のＧａｚＢベースのレポーターなどのＧｚＢ活性のレポーターが使用される。
【００７７】
本明細書に記載の方法および組成物では、ＡＰＣは、ＤＮＡ分解の阻害剤をさらに含んでもよい。一部の実施形態では、阻害剤は、ＣＡＤによって直接的にＤＮＡ分解を遮断する。ＧｚＢは、カスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ（ＣＡＤ）によるゲノムＤＮＡのヌクレオソーム間の分解を導く、標的細胞におけるカスパーゼ活性化を開始する。このゲノムＤＮＡの分解は、ＣＡＤ媒介ＤＮＡ分解の阻害剤を提供することによって、いくつかの企図された方式で遅延または阻害され得る。例えば、アポトーシスの間のＤＮＡの分解を遮断する、カスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼのタンパク質阻害剤（ＩＣＡＤ）を使用することができる。例えば、一部の実施形態では、細胞は、活性ＧｚＢによって媒介されるゲノムＤＮＡの分解を阻害するためにカスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼのタンパク質阻害剤（ＩＣＡＤ）を発現するように改変されてもよい。一部の実施形態では、ＡＰＣ標的を操作して、ＩＣＡＤを過剰発現されるか、または活性の増加したＩＣＡＤの突然変異体を発現させる。
【００７８】
一部の実施形態では、ＩＣＡＤは、カスパーゼによる切断に対する耐性を与える突然変異（例えば、Ｄ１１７Ｅおよび／またはＤ２２４Ｅ）を含有し、そうでなければ、本明細書において、カスパーゼ耐性突然変異体と称される（Sakahira et al., Arch Biochem Biophys. 2001 Apr 1;388(1):91-9；Enari et al., Nature. 1998 Jan 1；391(6662):43-50；Sakahira et al., Nature. 1998 Jan 1;391(6662):96-9を参照のこと）。ＩＣＡＤ前駆体（ＤＮＡ断片化因子サブユニットアルファまたはＤＦＦＡとしても知られる）の例示的配列は、ＮＰ＿００４３９２．１（アイソフォーム１）をコードするＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００４４０１．２（転写バリアント１）；およびＮＰ＿９９８７３１．１（アイソフォーム２）をコードするＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿２１３５６６．１（転写バリアント２）で利用可能である。例示的な成熟ＩＣＡＤ配列は以下の通りである；Ｄ１１７およびＤ２２４の残基は、上の場合には以下の通りである：
【００７９】
【化１】
2020523012.tif 000003
【００８０】
あるいはまたはさらに、細胞は、ＣＡＤノックアウト（例えば、ＣＲＩＳＰＲを使用するＣＡＤ遺伝子の破壊；例示的参照遺伝子配列は、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ  ＮＧ＿０２９０９８．１、範囲５００１〜１７０２６にある）またはノックダウン（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＬＮＡ、またはアンチセンスなどの阻害性核酸を使用する）を含み得る。化学的または低分子ＤＮＡｓｅ阻害剤、例えば、核酸と相互作用するタンパク質を阻害するミリン、ＭＲＥ１１ヌクレアーゼの細胞浸透性阻害剤、またはエチジウムブロマイドのようなインターカレーション染料も使用することができる。
【００８１】
カスパーゼ阻害を使用して、ＩＣＡＤの切断およびアポトーシスの間に生じるＣＡＤの活性化を妨げることもできる。カスパーゼ３は、ＤＦＦ４５（ＤＮＡ断片化因子−４５）／ＩＣＡＤ（カスパーゼ活性化ＤＮＡｓｅの阻害剤）を切断して、活性酵素ＣＡＤを放出させることによってＤＮＡ分解を開始させる（Wolf et al., J Biol Chem. 1999 Oct 22;274(43):30651-6）。よって、細胞は、カスパーゼ３ノックアウト（例えば、ＣＲＩＳＰＲを使用するカスパーゼ３遺伝子の破壊；例示的な参照遺伝子配列は、ＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅ番号ＮＣ＿０００００４．１２、範囲１８４６２７６９６〜１８４６４９４７５の補体にある）またはノックダウン（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ＬＮＡ、またはアンチセンスなどの阻害性核酸を使用する）を含み得る。ヒトカスパーゼ３に関する例示的配列は、ＮＰ＿００４３３７．２（カスパーゼ３アイソフォームのプレプロタンパク質）をコードするＧｅｎＢａｎｋのＮＭ＿００４３４６．３（転写バリアント１）にあり；他のアイソフォームを使用することもできる。化学的または低分子カスパーゼ阻害剤を使用することもできる（例えば、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ（ベンジルオキシカルボニル−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＯＭｅ）−フルオロメチルケトン）；Ｚ−ＤＥＶＤ−ＦＭＫ；Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＣＨＯ；Ｑ−ＶＤ−Ｏｐｈ（キノリル−Ｖａｌ−Ａｓｐ−ＯＰｈ）；Ｍ８２６（Han et al., The Journal of Biological Chemistry (277):30128-30136 (2002)）；Chu et al., J. Med. Chem., 2005, 48 (24), pp 7637-7647に記載されるＮ−ベンジリザチンスルホンアミドアナログ；Chen et al., J. Med. Chem., 2006, 49 (5), pp 1613-1623に記載されるイソキノリン−ー１，３，４−トリオン誘導体）；およびカスパーゼのタンパク質またはペプチド阻害剤（例えば、哺乳動物のＸＩＡＰ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆｓｅｑ：  ＮＰ＿００１１５８．２）またはＣｏｗｐｏｘ  ＣｒｍＡ（ＧｅｎＢａｎｋ  Ｒｅｆｓｅｑ：  ＮＰ＿００１１５８．２）。カスパーゼ３は、この目的のための重要なカスパーゼであるが、カスパーゼ３の非存在下では、アポトーシスの間にＣＡＤが活性化されないことを示すレポートが公開されており（Tang et a., J Biol Chem. 1998 Oct 30;273(44):28549-52）、カスパーゼ３の阻害剤が例示され、他のレポートでは、他のカスパーゼがＩＣＡＤを切断することができると判定した。よって、他のカスパーゼの阻害剤、例えば、汎カスパーゼ阻害剤、またはエグゼキューショナーカスパーゼ（カスパーゼ６または７）もしくはイニシエーターカスパーゼ（カスパーゼ２、８、９、または１０）の阻害剤を使用することもできる。一部の実施形態では、カスパーゼ阻害剤は、カスパーゼ３と、同様に他のカスパーゼ、例えば、カスパーゼ６、７、２、８、および／または９を阻害することになる。
【００８２】
所望の改変を作出するために種々の方法が利用可能である。典型的には、ベクターを使用して、核酸を細胞中に導入する。
【００８３】
外因性遺伝子を標的哺乳動物細胞中に移行させる（例えば、形質転換により）のに有用な多くのこのようなベクターは、本明細書に記載のＡＰＣおよびライブラリーを作製するのに利用可能である。ベクターは、エピソームベクター、例えば、プラスミド、サイトメガロウイルス、アデノウイルスなどのウイルス由来のベクターであってもよく、または、例えば、ＭＭＬＶ、ＨＩＶ−１、ＡＬＶなどのレトロウイルス由来のベクターなど、相同組換えまたはランダム組込みによって、標的細胞のゲノムに組み込まれてもよい。ＨＩＶまたはＦＩＶ  ｇａｇ配列に基づくものなどのレンチウイルスベクターを、ヒト幹細胞の静止期などの非分裂細胞にトランスフェクトすることもできる（Uchida et al.（1998）P.N.A.S.95（20）: 11939-44を参照のこと）。一部の実施形態では、レトロウイルスと適切なパッケージング細胞株の組合せにも使用を見出すことができ、ここで、カプシドタンパク質は、標的細胞に感染するのに機能的である。通常、細胞とウイルスは、培養培地中で少なくとも約２４時間インキュベートされることになる。次いで、細胞は、いくつかの適用で、例えば、２４〜７３時間、または少なくとも２週間短い間隔で、培養培地中で成長させられ、解析前に５週間またはそれより長い間成長させられてもよい。共通して使用されるレトロウイルスは「欠陥を有し」、すなわち、生産的感染に必要なウイルスタンパク質を生成することができない。ベクターの複製には、パッケージング細胞株中での成長が必要とされる。
【００８４】
多くのウイルスベクターまたはウイルス関連ベクターが当技術分野で公知である。このようなベクターを、細胞への核酸構築物のキャリアとして使用することができる。レトロウイルスおよびレンチウイルスのベクターを含む構築物は、細胞への感染または形質導入のために、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、またはヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）などのような非複製の欠陥ウイルスゲノム中に組み込まれ、パッケージングされてもよい。ベクターは、細胞ゲノム中に組み込まれても組み込まれなくてもよい。使用され得るウイルスベクターとして、これらに限定されないが、ＳＩＮレンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、泡沫状ウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ハイブリッドベクターおよび／またはプラスミドトランスポゾン（例えば、スリーピングビューティートランスポゾン系）またはインテグラーゼベースのベクター系が挙げられる。代替の実施形態と関連して使用され得る他のベクターは、当業者にとって明らかであろう。
【００８５】
構築物は、所望の場合、トランスフェクションのためのウイルス配列を含んでもよい。あるいは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター、例えば、ＥＰＶおよびＥＢＶベクター中に組み込まれてもよい。
【００８６】
本明細書に記載のベクターの挿入された材料は、発現制御配列がそのポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御および調節する場合、発現制御配列に作動可能に連結され得る。用語「作動可能に連結した」は、発現されるポリヌクレオチド配列の前に適切な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有すること、ならびに発現制御配列の制御下でのポリヌクレオチド配列の発現、およびポリヌクレオチド配列によってコードされる所望のポリペプチドの産生を可能にする正しいリーディングフレームを維持すること含む。一部の例では、挿入された材料の転写は、発現が意図される細胞型において、組換え遺伝子の発現を制御するプロモーター配列（または他の転写調節配列）の制御下においてである。挿入された材料が、天然に存在する形態のタンパク質の転写を制御する配列と同じであるかまたは異なる転写調節配列の制御下にあり得ることも理解されるであろう。一部の例では、プロモーター配列は、細胞の合成機構によって認識されるか、または合成機構に導入され、特定の遺伝子の転写を開始するのに必要とされる。
【００８７】
プロモーター配列は、「組織特異的プロモーター」であってもよく、これは、プロモーターとして作用する、すなわち、プロモーターに作動可能に連結した、選択された核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味し、特定の細胞内での選択された核酸配列の発現に影響を及ぼす。この用語は、主に１つの組織内で選択された核酸の発現を調節するが、他の組織では発現を同様に引き起こさない、いわゆる「リーキー」プロモーターも網羅する。
【００８８】
ＡＰＣの細胞型は特に制限されない。基本的な必要条件は、ＡＰＣが、ＭＨＣ  Ｉ上の抗原を内因的に処理および提示すること（例えば、プロテアソームの発現、ＴＡＰ輸送体の発現、およびＭＨＣ分子の適当なフォールディングと輸送）ができることである。このことは、ほとんどすべてのヒト細胞および他の哺乳動物細胞について真であると考えられる。本発明のシステムは、内因性抗原の処理対する必要性を回避する単鎖ＭＨＣ−ペプチド融合体と共に使用することもできる（Yu et al., Immunol 168(7): 3145-3149(2002)）。しかしながら、これには、ライブラリーのサイズの増大が必要であり、ペプチドが内因的に再現されるかどうかに関する情報を失う場合がある。ＡＰＣは、例えば、それに対する方法が当技術分野で周知である、レンチウイルス／レトロウイルスによる形質導入またはトランスフェクションによって、外因性ＤＮＡを細胞中に効率的に導入する能力も有するべきである。
【００８９】
本明細書に記載のＩＦＰベースのＧｚＢレポーター系に関して、ＡＰＣは、ＩＦＰタンパク質が成熟して蛍光を発することができるものである。よって、細胞は、これらの細胞株におけるＩＦＰ成熟に関する重要な補因子である、十分なレベルのビリベルジンを発現する。ビリベルジンは、外因的にも補充することができ（例えば、内因性ビリベルジンの発現を増加させることによって、またはビリベルジンを細胞に添加することによって）、追加の細胞が使用されるのを可能とする。ＩＦＰレポーターに基づく発現に好適な細胞は、当技術分野で周知であり、限定されないが、ＨＥＫ  ２９３Ｔ、ＭｅｌＪｕｓｏ、ＭＤＡ−ＭＢ２３１、ＭＣＦ７、およびＮＴＥＲＡ２を含む。これは、ＬＮ２２９細胞、一次ニューロン、および肝細胞においても機能することが文献で報告されている（Yu et al., Nature Communications 5:3626(2014)）。
【００９０】
自己スクリーニングのために、一次樹状細胞および一次Ｂ細胞を使用することができる。ＩＦＰベースのレポーターが使用される場合、必要に応じて、補充されたビリベルジンを使用することができる。ビリベルジンは、当技術分野で周知の方法を使用して、必要に応じて細胞に供給され得る。
【００９１】
一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法のＡＰＣは、ＭＨＣ欠損であり、すなわち、内因性ＭＨＣを発現しない。このことにより、ＡＰＣによって発現されるように操作される、特異的に選択されたＭＨＣ対立遺伝子に制限されるＴ細胞応答のプロファイリングが可能となる。例えば、単一のＭＨＣ対立遺伝子を導入することにより、検出される任意の応答がこの１つの対立遺伝子に表われ、よって、いずれのさらなる逆重畳の必要性もなく、結果を解釈することができる。このような結果は、内因性ＭＨＣ対立遺伝子のセットが存在する場合には、容易に得られない。これは、異なる患者由来のＴ細胞または目的の新たなＭＨＣに導入することによって異なるＭＨＣ対立遺伝子を有するＴ細胞をプロファイリングするために、同じ標的細胞の再使用も可能とする。そうすることにより、他の抗原を認識するＴ細胞によるバックグラウンド死滅活性も低減されることも、本明細書において決定された。標的細胞におけるＭＨＣ発現のレベルが、Ｔ細胞活性化のバックグラウンド速度に影響を及ぼす。ＭＨＣ欠乏標的細胞で始めることによって、シグナルノイズを最適化するために、表面のＭＨＣ量を微調整することが可能である。一部の実施形態では、Ｋ  ５６２細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞、ＨＥＫ  ２９３  Ｔ細胞、Ｕ２ＯＳ細胞、ＭｅｌＪｕｓｏ細胞、ＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞、ＭＣＦ７細胞、ＮＴＥＲＡ２ａ細胞、樹状細胞、および一次自己Ｂ細胞が使用される。
【００９２】
よって、本明細書に記載の組成物および方法は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、および細胞認識に関してプロテアーゼを送達する任意の他の細胞に適用することができる。本明細書の実施例の項で詳述する実験により、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の抗原とナチュラルキラー細胞による認識を与える因子を特定するための方法の実行可能性が実証される。ＣＤ４＋  Ｔ細胞の抗原は、細胞傷害性ＣＤ４  Ｔ細胞を直接スクリーニングすることによって、または非毒性ＣＤ４  Ｔ細胞由来のＴＣＲを細胞傷害性ＣＴＬ（例えば、ＣＤ８  Ｔ細胞）（できる限りＣＤ４の同時発現と共に）中に導入することによって、特徴付けることができる。
【００９３】
ＡＰＣ標的のライブラリー
例えば、ＭＨＣ標的細胞中に導入される候補抗原のライブラリーの作製において、コードされたポリペプチドの発現に関する配列の大きな、ゲノムスケールのライブラリーの構築のための一般的方法は、熟練の技術者に公知である。このような方法の一部の例は、その内容が全体として参照により本明細書に組み込まれる、Xu GJ, Kula T, Xu Q, Li MZ, Vernon SD, Ndung’u T, et al. Comprehensive serological profiling of human populations using a synthetic human virome. Science. 2015;348(6239)；Larman HB, Zhao Z, Laserson U, Li MZ, Ciccia A, Gakidis MA, et al. Autoantigen discovery with a synthetic human peptidome Nat Biotechnol. 2011;29(6):535-41. Epub 2011/05/24. doi: 10.1038/nbt.1856. pmid:21602805；Zhu J, Larman HB, Gao G, Somwar R, Zhang Z, Laserson U, Ciccia A, Pavlova N, Church G, Zhang W, Kesari S, Elledge SJ. Protein interaction discovery using parallel analysis of translated ORFs(PLATO).Nat Biotechnol. 2013 Apr;31(4):331-4. doi: 10.1038/nbt.2539に見出される。
【００９４】
複数の候補抗原を含むＡＰＣ標的細胞のライブラリーも本明細書において提供される。一部の実施形態では、標的細胞は、本明細書に記載のものなど、活性化ＡＰＣの特定に有用な１つまたは複数のレポーター構築物をさらに含む。一部の実施形態では、レポーターは、グランザイムＢ活性に感受性である。一部の実施形態では、ＡＰＣ標的細胞は、ＣＡＤ媒介ＤＮＡ分解の阻害剤をさらに含む。多数の代表例が本明細書に記載される。例えば、一部の実施形態では、標的細胞は、ゲノムＤＮＡの分解を阻害するためにＧｚＢによって活性化されるカスパーゼの外因性阻害剤、または本明細書に記載のものなどのＣＡＤもしくはカスパーゼのノックアウトをさらに含む。例えば、一部の実施形態では、ＧｚＢによって活性化されるカスパーゼ活性化ＤＮＡｓｅ（ＣＡＤ）は、カスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ阻害剤（ＩＣＡＤ）またはその突然変異体によって阻害される。一部の実施形態では、ＩＣＡＤの突然変異はＤ１１７Ｅであり、１１７位のアスパラギン酸がグルタミン酸で置換されている。一部の実施形態では、ＩＣＡＤは突然変異Ｄ２２４Ｅをさらに含み、ここで、２２４位のアスパラギン酸がグルタミン酸で置換されている。一部の実施形態では、ＩＣＡＤのアイソフォームは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｏ００２７３−２に開示された配列を有する。ＩＣＡＤの他のアイソフォームもまた、本明細書に記載の組成物および方法において、受容可能な結果生じるであろう。一部の実施形態では、外因性阻害剤は野生型である。
【００９５】
一部の実施形態では、候補抗原は、ゲノムＤＮＡによってコードされる。ゲノムＤＮＡは、対象（例えば、ヒト）からもしくは感染生物またはそれらの組合せから単離されてもよい。一部の実施形態では、対象は健康である。一部の実施形態では、対象は疾患である。一部の実施形態では、感染生物は、これらに限定されないが、細菌、ウイルス、細菌、真菌、プロトゾア、および多細胞寄生生物を含む病原体である。一部の実施形態では、それらからライブラリーが作製される複数の候補抗原は、健康な対象または疾患（例えば、これらに限定されないが、がん、自己免疫疾患、心血管疾患、感染性疾患などを含む疾患）を有する対象のゲノムに由来する、実質的に完全な抗原のセットを表す。一部の実施形態では、複数の候補抗原は、病原体もしくは病原体の群、ウイルス、細菌、または真菌（例えば、すべての病原性ウイルス、細菌または真菌）に由来する実質的に完全なペプチドのセットを表す。
【００９６】
一部の実施形態では、限定されないが、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）コレクション、ゲノム−ワイドペプチドライブラリー、および適用特異的カスタムライブラリーなどの抗原ライブラリーを使用することができる。一部の実施形態では、候補抗原のゲノム−ワイド検出が使用される。一部の実施形態では、ライブラリーは、ヒトのプロテオームを並べて表示するもの（例えば、４５アミノ酸の重複を有する９０個のアミノ酸断片におけるヒトプロテオーム全体にわたって２５９，３４５個のペプチドを含むもの）などのヒトゲノム−ワイドペプチドライブラリーである。一部の実施形態では、ライブラリーは、ウイルス叢を並べて表示するもの（例えば、２８アミノ酸の重複を有する５６個のアミノ酸断片においてヒトに感染すると注釈を付けられたすべてのウイルスのプロテオームにわたって並べて表示する９３，９０４個のペプチドを含むもの）などのウイルス叢−ワイドライブラリーである。一部の実施形態では、ライブラリーは、ＣＭＶプロテオームを並べて表示するもの（例えば、２８アミノ酸の重複を有する５６個のアミノ酸断片において、確認および予測されたヒトサイトメガロウイルスタンパク質のすべてにわたって並べて表示する５７６４個のペプチドを含むもの）などのＣＭＶゲノム−ワイドペプチドライブラリーである。
【００９７】
抗原は、ＤＮＡレベルの単一の複製でコードされることが最も多いであろう。抗原は、典型的には、細胞当たり１０から１，０００個の分子で、ＭＨＣにおいて生成、処理、および提示されるであろう。しかしながら、細胞表面に単一のペプチドであっても、細胞傷害性リンパ球によって生産的に認識され得るため、このシステムは、非常に低い複製数の表面発現抗原に対しても機能的である。
【００９８】
様々な実施形態では、候補抗原を含む標的細胞のライブラリーは、約１０２から約１０１４個の標的細胞を含む。
【００９９】
一部の実施形態では、各標的細胞は、特有の候補抗原をコードする。あるいは、一部の実施形態では、標的細胞は、細胞当たり、１つ以上の特有の候補抗原、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００個、もしくはそれを超えるか、または包括的に、この間の任意の範囲（例えば、５〜１０個）の候補抗原をコードすることができる。細胞当たり複数の抗原を使用する場合に、スクリーニングによってより高いバックグラウンドが生じる場合、方法は、細胞当たりたった１つの抗原（好ましくは、第１のパスから再度クローニングされた抗原）を有する２回目のスクリーニングを実施するステップを含むことができる。
【０１００】
例示的な実施形態では、ライブラリーは、約１×１０２から約１０１４個の標的細胞、約１×１０３から約１０１４個の標的細胞、約１×１０４から約１０１４個の標的細胞、約１×１０５から約１０１４個の標的細胞、約１×１０６から約１０１４個の標的細胞、約１×１０７から約１０１４個の標的細胞、約１×１０８から約１０１４個の標的細胞、約１×１０９から約１０１４個の標的細胞、約１×１０１０から約１０１４個の標的細胞、約１×１０１１から約１０１４個の標的細胞、約１×１０１２から約１０１４個の標的細胞、約１×１０１３から約１０１４個の標的細胞、または約１×１０１４個の標的細胞のうちの任意の１つまたは複数を含む。本明細書に記載の標的細胞のライブラリーは、少なくとも約１０２から約１０１４個の候補抗原を提供し、ここで、十分量の標的細胞は、有効なライブラリースクリーニングのために特有の候補抗原を含む。一部の実施形態では、１０から１０，０００個の間の代表が使用され、各候補抗原は、１０〜１０，０００個の細胞によって提示されることを意味する。
【０１０１】
様々な実施形態では、各標的細胞は、約１０２から約１０１４分子の候補抗原を含む。例示的な実施形態では、各標的細胞は、候補抗原の約１×１０２から約１０１４個の複製、候補抗原の約１×１０３から約１０１４個の複製、候補抗原の約１×１０４から約１０１４個の複製、候補抗原の約１×１０５から約１０１４個の複製、候補抗原の約１×１０６から約１０１４個の複製、候補抗原の約１×１０７から約１０１４個の複製、候補抗原の約１×１０８から約１０１４個の複製、候補抗原の約１×１０９から約１０１４個の複製、候補抗原の約１×１０１０から約１０１４個の複製、候補抗原の約１×１０１１から約１０１４個の複製、候補抗原の約１×１０１２から約１０１４個の複製、候補抗原の約１×１０１３から約１０１４個の複製、または候補抗原の約１×１０１４個の複製を含む。
【０１０２】
様々な実施形態では、候補抗原は、約２１から約１５０ヌクレオチド長である核酸によってコードされる。さらなる実施形態では、候補抗原は、約２４から約１５０ヌクレオチド長、約３０から約１５０ヌクレオチド長、約４０から約１５０ヌクレオチド長、約５０から約１５０ヌクレオチド長、約６０から約１５０ヌクレオチド長、約７０から約１５０ヌクレオチド長、約８０から約１５０ヌクレオチド長、約９０から約１５０ヌクレオチド長、約１００から約１５０ヌクレオチド長、約１１０から約１５０ヌクレオチド長、約１２０から約１５０ヌクレオチド長、約１３０から約１５０ヌクレオチド長、約１４０から約１５０ヌクレオチド長または約１５０ヌクレオチド長である核酸によってコードされる。一部の実施形態では、候補抗原をコードするＯＲＦまたは核酸は、１５０ｎｔよりも長い。
【０１０３】
一部の実施形態では、標的細胞の表面に呈される候補抗原は、少なくとも８、９、１０、または１１アミノ酸長であり；他の実施形態では、候補抗原は、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０アミノ酸長であるかまたはそれより長い。発現の際に、より長い抗原（例えば、数百個のアミノ酸）を、標的細胞の表面に呈される８〜１１個のアミノ酸の短いペプチドにプロセシングする。
【０１０４】
一部の実施形態では、候補抗原は、完全なＯＲＦ（例えば、数百アミノ酸長）である。全長候補抗原は、ＡＰＣの表面に必ずしも完全に呈されない。代わりに、このような抗原は細胞によって発現され、細胞表面に呈されるより短いペプチドに内因的に処理される。次いで、このような長い候補抗原をコードする核酸を有するＡＰＣの特定の後に、特定された候補の様々な断片についてさらにスクリーニングしてもよい。
【０１０５】
様々な実施形態では、候補抗原は、約１ｆＭから約１００μＭ、約１ｐＭから約１００μＭ、約１００ｎＭから約１００μＭ、約１μＭから約１００μＭ、約１μＭから約１０μＭ、約１ｐＭから約１００ｎＭ、約１ｐＭから約１０ｎＭ、約１ｐＭから約５ｎＭのＫｄで、リンパ球に結合する。一部の実施形態では、候補抗原は、１ｍＭのＫｄで、リンパ球に結合する。
【０１０６】
抗原を特定するための標的細胞のスクリーニングライブラリー
候補抗原は、細胞傷害性リンパ球に対するＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子における提示のためのＡＰＣのライブラリーにおいて発現される。次いで、このライブラリーを、反応混合物中などのこれらの同種の抗原を提示する任意の標的細胞の認識に好適な条件下で、目的の細胞傷害性リンパ球（例えば、ＣＴＬ）の試料と混合する。認識の際に、リンパ球は、標的細胞の死滅プロセスを開始する（例えば、ＣＴＬは、セリンプロテアーゼであるグランザイムＢ（ＧｚＢ）を含有する細胞傷害性顆粒を放出する）。標的細胞において開始された死滅プロセスのレポーター（例えば、細胞内のＧｚＢ活性）を使用して、認識された標的細胞からゲノムＤＮＡを単離する。次いで、呈され、認識された抗原をコードする核酸が特定される（例えば、ＰＣＲ増幅と次世代シークエンシングによって）。
【０１０７】
さらに、Ｔ細胞（例えば、ＣＴＬ）に対して特異的な抗原を特定するための候補抗原を含む標的細胞のライブラリーをスクリーニングするための方法が本明細書に記載される。この方法は、（ｉ）本明細書に記載される標的細胞のライブラリーを準備するステップと、（ｉｉ）標的細胞のライブラリーを細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含む生体試料と接触させるステップと、（ｉｉｉ）ＣＴＬに結合した標的細胞を単離するステップであって、標的細胞における候補抗原の結合によって所望の特性が生じる、ステップと、（ｉｖ）ＣＴＬに特異的に結合し、所望の効果を生じる抗原を含む単離された標的細胞からＤＮＡを単離するステップとを含む。一部の実施形態では、この方法は、試料中のＣＴＬに特異的な候補抗原をエンリッチするステップ（例えば、ＰＣＲ増幅を介して）および特定するステップ（例えば、シークエンシングを介して）をさらに含む。一部の実施形態では、本明細書に記載されるスクリーニングのための方法は反復性である。このように、標的ＣＴＬに対して特異的な候補抗原を特定することができる。
【０１０８】
様々な実施形態では、所望の特性として、これらに限定されないが、物理的に検出可能な変化、化学的に検出可能な変化、光学的に検出可能な変化またはこれらの組合せのうちのいずれか１つまたは複数が挙げられる。一部の実施形態では、所望の特性は、標的結合活性もしくは標的結合に誘導される活性、例えば、触媒活性もしくは改変された触媒活性；阻害活性、活性化活性、もしくは阻害活性もしくは活性化活性の改変；活性を切り替える構造もしくは活性を切り替える構造の改変；または協同活性であってもよい。
【０１０９】
認識されたＡＰＣの特定
一部の実施形態では、ＧｚＢプロテアーゼ活性は、認識されたＡＰＣのマーカーとして使用される。ＧｚＢは、細胞傷害性リンパ球によって認識されたＡＰＣ中に分泌される細胞傷害性プロテアーゼである。ＧｚＢは、ＡＰＣにおいて、カスパーゼ活性とアポトーシスを誘発する。以前の研究は、細胞溶解性の死滅の間に標的細胞中に放出されたＧｚＢによって、ＧｚＢ標的のタンパク質分解が完了され、レポーターの基礎として作用する強固な酵素活性を示すことを実証した。ＧｚＢ活性を検出するために、本明細書に記載のものなど、ＧｚＢ活性の分子レポーターを使用することができる。ＧｚＢのこのようなレポーターは、典型的には、一般的なアポトーシス経路では活性化されない。細胞傷害性Ｔリンパ球によって分泌される他のプロテアーゼ（グランザイムＡ、Ｋ、Ｍ）または標的細胞中に分泌される、Ｔ細胞中に操作されたＴＥＶプロテアーゼなどの他の酵素もしくはプロテアーゼなどの、認識されたＡＰＣの他のマーカーを使用することができることを、当業者は認識するであろう。
【０１１０】
本明細書に記載のレポーター分子を使用して、グランザイムＢ活性の増加を示すことができる。一部の実施形態では、方法は、レポーター分子の検出可能な標識からのシグナルを定量するステップを含む。一部の実施形態では、方法は、定量したシグナルに基づいて、標的細胞集団をエンリッチするステップを含む。一部の実施形態では、方法は、所望の特性を有する１つまたは複数の候補抗原中に、１つまたは複数の変異を導入するステップを含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、方法は、上記の接触させるステップ、単離するステップおよび特定するステップのうちの１つまたは複数を反復的に繰り返すステップを含む。方法は、例えば、１、２、３、または４回以上のスクリーニングするステップを含んでもよい。
【０１１２】
グランザイムＢ活性のレポーター
さらに、その例が本明細書に記載される、グランザイムＢ活性の分子レポーター、また、分子レポーターをコードする核酸、また、核酸および／または分子レポーターを含む細胞（例えば、ＡＰＣ）が本明細書で提供される。
【０１１３】
グランザイムＢ（ＧｚＢ）は、ＣＴＬによって、標的細胞中に分泌されるプロテアーゼである。ＧｚＢは、エフェクターカスパーゼおよび下流のカスパーゼ基質を含む基質のセットを切断し、標的細胞においてアポトーシスを誘発する。
【０１１４】
一部の実施形態では、レポーターは、検出分子に連結したＧｚＢ切断部位（例えば、ＶＧＰＤ、配列番号１）を含む融合ポリペプチドを含む。この用語は、Ｇｚｂのこのようなレポーターを参照して本明細書で使用されるため、「検出分子」は、Ｇｚｂ切断部位の切断によって遊離する分子であり、酵素活性、結合活性、または光の放出などの活性を有する。切断によって活性化されると、本明細書に記載のものなどのアッセイによって、活性を検出することができる（例えば、検出可能な標識の検出、ＣＲＥなどの酵素活性の検出、またはアフィニティータグの検出）。ＧｚＢは、タンパク質分解切断のアスパラギン酸Ｎ末端を有する、Ｐ４からＰ１アミノ酸、Ｉｌｅ／Ｖａｌ、Ｇｌｕ／Ｍｅｔ／Ｇｌｎ、Ｐｒｏ／Ｘａａを含有する基質を優先する。Ｐ１’では非帯電アミノ酸が好ましく、Ｐ２’ではＳｅｒ、Ａｌａ、またはＧｌｙが好ましい。好ましくは、使用されるＧｚＢ切断配列は、ＧｚＢによって切断されるが、カスパーゼによっては切断されないもの、例えば、ＶＧＰＤ（配列番号１；Choi and Mitchison, PNAS, 110(16): 6488-6493(2013)）である。一部の実施形態では、他のＧｚＢ切断配列、例えば、Casciola-Rosen et al., Journal of Biological Chemistry, 282(7):4545-4552(2007)に記載されるＩＥＴＤ（配列番号６）が使用される。
【０１１５】
一般的に、レポーターは、レポーターのＧｚＢ媒介切断の後にのみ、蛍光シグナルなどの検出可能なシグナルをもたらす。これにより、ＣＴＬによって認識され、ＧｚＢを受容した細胞の単離が可能となる。
【０１１６】
一部の実施形態では、検出分子は、赤外蛍光タンパク質（ＩＦＰ）である。一部の実施形態では、ＩＦＰは、ＧｚＢ切断部位によって機能的に分離されたＮ断片（Ｎ−ＩＦＰ）およびＣ断片（Ｃ−ＩＦＰ）を含み、さらに、Ｃ−ＩＦＰのＮ末端側に位置する緑色蛍光タンパク質のＮ断片（Ｎ−ＧＦＰ）、およびＮ−ＩＦＰのＣ末端側に位置する緑色蛍光タンパク質のＣ断片（Ｃ−ＧＦＰ）がその両側に隣接し、その結果、Ｎ−ＧＦＰとＣ−ＧＦＰは、構成的に活性な（蛍光）分子を形成する。これの一実施形態を図１１〜１３に示す。特に、図１１および１２は、レポーターとそれが機能する機構を示す図である。図１３は、レポーター分子の核酸とコードされたアミノ酸配列である。本発明者らのレポーターにおける不活性ＩＦＰは、それ自体、分割ＧＦＰと融合される（図１１）。分割ＧＦＰは、構成的に蛍光であり、レポーターの存在についてのマーカーをもたらす。これはまた、切断の活性化前および後の両方でＩＦＰを安定化させるために作用する。しかしながら、ＧＦＰ自体は切断されず、ＧｚＢの存在に対して応答しない。この不活性ＩＦＰは、To et al. PNAS 112(11): 3338-3343(2015)に記載されるように、野生型ＩＦＰを分割し、Ｎ末端半分とＣ末端半分を逆位させ、Ｎ末端半分とＣ末端半分をリンカーで分離することによって作製した。リンカーは、このタンパク質の２つの半分が、適当にフォールディングして活性な蛍光ＩＦＰとなるのを妨げる。しかしながら、リンカー領域の切断の際に、ＩＦＰの半分は、一緒になって成熟し、蛍光であるタンパク質を生じることができる。
【０１１７】
このＧｚＢレポーターでは、ＩＦＰの半分の間のリンカーを、ＧｚＢによって特異的に切断されるが、他のプロテアーゼによっては切断されないアミノ酸配列で置き換える。結果として、各細胞の成熟ＩＦＰシグナルを定量することによって、ＧｚＢ活性を検出することができる。ＧｚＢは、ＣＴＬによって送達される外部プロテアーゼであり、不活性ＩＦＰタンパク質の部分を分離するリンカーを切断することによってレポーターを活性化することができる。レポーターにおけるＧＦＰは切断されず、構成的蛍光シグナルをもたらす。
【０１１８】
用語「機能的に分離される」は、ＧｚＢ切断部位を指すために本明細書で使用され、これは、切断部位で分子の部分を分離し、それによって分子を不活性化することを指し、ここで、切断によって機能（蛍光）が促進または回復される。一般的に、レポーターは、ＦＲＥＴ対を形成するか、またはフルオロフォアのうちの１つがクエンチされる発色団の対を含まない。
【０１１９】
ＣＴＬによって生産的に認識される、標的細胞におけるＧｚＢ活性の検出を可能にする目的を果たすいくつかの代替のＧｚＢレポーターが企図される。これらのレポーターを個別にまたは上述の蛍光発生的プロテアーゼレポーターと組み合わせて使用して、ＣＴＬによって認識される標的細胞を単離することができる。例えば、ＧＦＰまたはｍＣＨｅｒｒｙ由来の小さな１６アミノ酸のペプチド（ＧＦＰ１１）を使用して、ＧＦＰまたはｍＣＨｅｒｒｙを欠くペプチドを活性化することができる。このペプチドはタンパク質に融合されるが（ここでは、これは不活性である）、グランザイムの切断によって遊離されると活性化される。例えば、Kamiyama et al.,  Nat Commun. 2016；7: 11046を参照のこと。
【０１２０】
一部の実施形態では、分子レポーターはアフィニティータグ（例えば、ｆｌａｇエピトープ）である。検出は、ＧｚＢに対する基質として作用する、レポーターのＧｚＢによる切断後にのみ明らかになる抗体標的に対する染色に基づく。アフィニティータグは、ＧｚＢ切断部位に対してＣ末端に位置してもよく、その結果、タグは、ＧｚＢ部位の切断においてのみ機能的である（例えば、Ｍ１  ｆｌａｇ抗体によって認識されるＦｌａｇエピトープ）。一実施形態が図７Ａに例証される。切断の前に、内部のタグ（例えば、Ｆｌａｇエピトープ）は、Ｍ１  Ｆｌａｇ抗体によって認識されず、Ｎ末端のＦｌａｇエピトープのみを認識する。しかしながら、ＧｚＢ切断後に、タグは、Ｃ末端切断断片のＮ末端に曝露され、適切な結合パートナー（例えば、Ｍ１抗体）を使用して染色することができる。一部の実施形態では、分子レポーターは、内部タグの近位に位置するＧＦＰをさらに有する。一部の実施形態では、ＧＦＰは、タグのＣ末端に位置する。
【０１２１】
一部の実施形態では、分子レポーターは、ＧｚＢ切断部位を含むリンカーを有する小胞体（ＥＲ）保持配列に連結した血漿膜タンパク質である。インタクトである場合、レポーターは、ＥＲ内に保持される。リンカーの切断により、ＥＲ保持配列の放出、および血漿膜へのタンパク質の輸送がもたらされ、ここで、タンパク質は、細胞外に適用された抗体（またはその抗原結合性断片）によって認識され得る。この抗体を使用して、認識されたエピトープを発現するＡＰＣを単離または精製することができる。この手法によって、タンパク質分解シグナルを、エピトープのアクセシビリティ、例えば、細胞表面におけるレポータータンパク質の存在に変換した。抗原は、グランザイム切断によって抗体または他の結合部分にアクセス可能となるが、これは、抗原が特有の結合部位を生じるかまたはその位置を変化させる（細胞内、またはタンパク質内で）ためである。結合することが可能となる任意の結合タンパク質を使用することができ、例えば、それらのうちの１つが会合を妨げるタンパク質に融合する、相互作用するタンパク質の対を使用することができる。遮断セグメントのグランザイム切断により、その結合パートナーによって、タンパク質の検出が可能となる。抗体の代わりに、核酸アプタマーも使用することができる。
【０１２２】
このことは、レポータータンパク質に対する蛍光抗体などのアフィニティー試薬（ＦＡＳＣに結合したもの）により、またはアフィニティーカラム（例えば、ＭＡＣＳ細胞分離カラム）におけるＧｚＢ陽性細胞の直接的捕捉により、ＧｚＢ陽性細胞の単離を可能とする。結果として、ＣＤ４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ４０、またはこれらに限定されないが、Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、およびヒスチジンタグなどの他のタンパク質のタグ付けされたバージョンを含む、細胞表面に内因的に存在しない任意のレポータータンパク質を使用することができる。例えば、Kimple, M.E., Brill, A.L., Pasker, R.L.(2013)Overview of Affinity Tags for Protein Purification. Curr Protoc Protein Sci. 73: Unit-9.9を参照のこと。
【０１２３】
一部の実施形態では、検出分子は酵素である。融合ポリペプチドは、原形質膜付着ペプチド（例えば、ＭＧＶＫＶＬＦＡＬＩＣＩＡＶＡＥＡＳＳＧＳＳＧＤＹＫＤＤＤＤＫＰＶＱＰＭＡＬＩＶＬＧＧＶＡＧＬＬＬＦＩＧＬＧＩＦＦＣＶＲＣＲＨＲＲＲＱ（配列番号７））に機能的に連結した酵素（例えば、ＣＲＥリコンビナーゼ）を含み、その結果、発現されると、融合タンパク質であるタンパク質が、発現細胞の原形質膜でのみ見出される。
酵素および膜付着タンパク質は、ＧｚＢ切断部位によって分離され、その結果、切断の際に、酵素が原形質膜から放出される。この一例は、本明細書の実施例の項に記載されるＣｒｅリコンビナーゼプロテアーゼレポーターである。Ｃｒｅリコンビナーゼは、膜付着ペプチドによって膜に係留した場合に不活性であるが、ＧｚＢ切断によって活性化され、Ｃｒｅを放出して核に侵入し、そこでＣｒｅ活性のレポーターを活性化する。一部の実施形態では、ＡＰＣ核内のレポーターはＬｏｘＰレポーターのＣｒｅ媒介組換えを利用して、活性を示す。一部の実施形態では、Ｃｒｅ活性は、細胞レポーターの活性化を介して検出される。この手法では、認識された標的細胞におけるＣｒｅ活性がレポーター遺伝子（ＧＦＰ、ピューロマイシンなど）をオンにし、例えば、ＦＡＣＳによって、または抗生物質の選択により、細胞の単離を可能とする。次いで、まさにこれらの細胞に由来するゲノムＤＮＡを単離することができる。ＧＦＰ／ＲＦＰ逆位カセットは、Ｃｒｅ活性に応答して蛍光シグナルを発する細胞レポーターの一例である。一部の実施形態では、ＬｏｘＰレポーターの組換えにより、認識された細胞における抗原カセットのＰＣＲ増幅が可能となるプライマー構造が生じる。生産的に認識される抗原は、細胞傷害性細胞による処理後に標的細胞に由来するＰＣＲ産物のＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングによって特定することができる。この手法は、図６Ａに図示される。本明細書の組成物および方法において、検出分子として使用するのに有用な他の酵素は、ＴＥＶプロテアーゼ、および転写因子である。一部の実施形態では、膜付着シグナルペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＳＱ（配列番号８）である。
【０１２４】
さらに、ＡＰＣにおけるグランザイムＢ活性の検出のためのシステムが本明細書に記載される。このようなシステムは、グランザイムＢ活性を示すために相互作用する２つの別個のレポーティング構築物を利用することができる。このシステムは、好ましくは、本明細書に記載の原形質膜付着ペプチドに連結したＣＲＥリコンビナーゼを含む融合ポリペプチドを含有し、ここで、ＣＲＥリコンビナーゼと膜付着ペプチドはＧｚＢ切断部位によって分離されている。システムは、本明細書に記載されるＣＲＥ活性のレポーターをさらに含有することができる。ＣＲＥ活性のレポーターは、ヘッドトゥヘッド方向でＧＦＰおよびＲＦＰをコードし、ＬｏｘＰ部位が両側に隣接している核酸配列であってもよい。このシステムは、ＬｏｘＰ部位が両側に隣接している不活性プライマーを含むＣＲＥ活性プライマー認識配列の近位に位置する、発現可能な形態の候補抗原をコードする核酸配列であって、ＬｏｘＰ部位のＣＲＥ誘導転位によって、機能的プライマー認識配列が生じる、核酸配列を、代わりにまたはさらに含有してもよい。このＣＲＥ媒介逆位事象は、ＰＣＲおよびシークエンシングによって、ゲノムＤＮＡにおいて直接的に検出することができる。この手法では、Ｃｒｅ媒介逆位事象によって、抗原提示カセットのＰＣＲ増幅を可能にする適当なプライマー方向が生じことができる。標的細胞のすべてに由来するゲノムＤＮＡ（いずれの選別もなく）を抽出することができ、このバルクｇＤＮＡからのＰＣＲによって、ＧｚＢを受容し、Ｃｒｅを活性化し、抗原提示カセットを囲むプライマーを逆位させる標的細胞のみから抗原提示カセットを増幅することになる。この手法をｑＰＣＲで使用して、図６の概念証明実験において逆位事象の頻度を定量した。これら２つの手法は、個別にまたは組み合わせて使用することができる。
【０１２５】
標識
本明細書に記載のレポーター分子中に組み込まれ得る好適な検出分子として、限定されないが、放射性同位体、蛍光体、化学発光体、発色団、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、染料、金属イオン、金属ゾルが挙げられる。
【０１２６】
任意の蛍光ポリペプチド（本明細書において、蛍光標識とも称される）は、検出可能な標識として使用するのに好適であり得る。好適な蛍光ポリペプチドは、定性的（陽性／陰性）および定量的（蛍光に相当する程度）に評価することができる検出可能なシグナルを容易にもたらすことになるものであろう。
【０１２７】
例示的蛍光ポリペプチドとして、これらに限定されないが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ＧＦＰ、ｍＲＦＰ、ＲＦＰ（ｔ二量体２）、ＨＣＲＥＤなど、またはその任意の突然変異体（例えば、蛍光の増強または、発光スペクトルのシフトをもたらすように改変された蛍光タンパク質）、アナログ、または誘導体が挙げられる。さらに好適な蛍光ポリペプチド、および本明細書で列挙したものの具体例は、当技術分野で提供され、周知である。
【０１２８】
ビオチンベースの標識も、本明細書に開示される方法において使用を見い出す。標的分子のビオチン化は周知であり、例えば、タンパク質、核酸、炭水化物、カルボン酸のビオチン化のためのアミン反応性およびチオール反応性薬剤を含む多数のビオチン化剤が公知である；例えば、これによって、参照により本明細書に組み込まれるchapter 4, Molecular Probes Catalog, Haugland, 6th Ed. 1996を参照のこと。ビオチン化された物質は、検出可能に標識されたビオチン結合パートナー、例えば、アビジンまたはストレプトアビジンの結合によって検出することができる。同様に、多数のヘプテニル化試薬も公知である。
【０１２９】
使用するのに好適な例示的アフィニティータグとして、これらに限定されないが、単球アダプタータンパク質（ＭＯＮＡ）結合ペプチド、Ｔ７結合ペプチド、ストレプトアビジン結合ペプチド、ポリヒスチジントラクト、タンパク質Ａ（Nilsson et al, EMBO J. 4: 1075(1985)；Nilsson et al, Methods Enzymol .198:3(1991)）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（Smith and Johnson, Gene 67:31(1988)）、Glu-Glu アフィニティータグ（Grussenmeyer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:7952(1985)）、サブスタンスＰ、ＦＬＡＧペプチド（Hopp et al, Biotechnology 6: 1204(1988)）、または他の抗原エピトープもしくは結合ドメインが挙げられる。一般的に、Ford et al, Protein Expression and Purification 2:95(1991)を参照のこと。アフィニティータグをコードするＤＮＡ分子は、供給業者（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）から入手可能である。
【０１３０】
活性化ＡＰＣにおける抗原の特定
さらに、細胞傷害性リンパ球に対する抗原提示細胞による認識された抗原提示の検出のためのシステムが本明細書で提供される。このシステムは、候補抗原をコードする外因性核酸を含有する抗原提示細胞、または複数の抗原提示細胞を含有し、候補抗原は、本明細書に記載されるように、細胞傷害性リンパ球に対して、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩ分子により発現および提示される。このシステムは、本明細書に記載されるグランザイムＢ活性の分子レポーター、または本明細書に記載されるグランザイムＢ活性を検出するためのシステムをさらに含有する。一部の実施形態では、このシステムは、本明細書に記載される細胞傷害性リンパ球をさらに含有する。一部の実施形態では、このシステムの抗原提示細胞は、ＣＡＤ媒介ＤＮＡ分解の阻害剤、例えば、発現形態のＩＣＡＤ遺伝子をさらに含む。
【０１３１】
本明細書に記載されるように、細胞傷害性リンパ球により認識された標的ＡＰＣで提示された生産的抗原認識により、ＡＰＣ内に認識可能な変化が生じる。このような変化の検出は、ＡＰＣの特定およびそれが発現した抗原の最終的決定において使用される。認識された標的細胞の特定およびその抗原の特定は、そのレポーターを検出し、それによって特定された細胞を単離および／または選別するハイスループットシステムの使用によって達成され得る。
【０１３２】
本明細書に記載される単離するステップおよび／または選別するステップは、当技術分野で公知の種々の方法および／またはデバイス、例えば、フローサイトメトリー（例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）またはラマンフローサイトメトリー）、蛍光顕微鏡、光ピンセット、マイクロピペット、アフィニティー精製およびミクロ流体磁気分離デバイスおよび方法を使用して行うことができる。一部の実施形態では、検出可能に標識された標的細胞が蛍光標識された標的細胞である場合、ＦＡＳＣを利用して、１つまたは複数の蛍光シグナルに基づいて細胞を定性的に選別することができる。例示的実施形態では、候補抗原を含む標的細胞がそれらの同種のＴ細胞に特異的に結合する場合、標的細胞は、赤外蛍光シグナル（例えば、標的細胞によってコードされた活性化ＩＦＰ−ＧＦＰ融合タンパク質からの）を発光することになる。ＦＡＣＳを使用して、赤外蛍光シグナルに基づいて、未結合細胞から結合タンパク質を選別してもよい。１つまたは複数の選別ゲートまたは閾値レベルを、１つまたは複数の検出分子に関連して利用して、広範な標的細胞−Ｔ細胞相互作用に対する定量的選別を提供してもよい。さらに、スクリーニングのストリンジェンシーは、例えば、標的の濃度をモジュレートし、選別ゲートの位置を設定することによって、定量的に制御することができる。
【０１３３】
例えば、蛍光シグナルが、細胞傷害性リンパ球（例えば、ＣＴＬ）に対する候補抗原の結合アフィニティーに関連する場合、選別ゲートおよび／またはストリンジェンシー条件を調整して、標的に対する所望のアフィニティーまたは所望のアフィニティー範囲を有する抗原を選択してもよい。一部の場合には、最も高いアフィニティーの抗原を候補抗原配列の特定のライブラリーから単離することが望ましい場合もある。しかしながら、他の場合には、結合アフィニティーが特定範囲内にある候補抗原が単離されてもよい。
【０１３４】
認識された抗原を有するとして特定された細胞を処理して、外因性核酸を単離することができる。一部の実施形態では、外因性核酸は、公知のプライマー配列（例えば、核酸のＡＰＣへのトランスフェクションから公知）を使用するＰＣＲ増幅によって単離される。あるいは、ＲＴ−ＰＣＲを使用して、抗原カセットの転写形態を増幅することができる。抗原がエピソーム的に（ウイルスゲノムまたはプラスミドの一部として）発現される場合、エピソームＤＮＡは、抗原提示カセットを単離する方法として捕捉することができる。特異的に認識された抗原の決定は、ＤＮＡシークエンシングなどのハイスループットシステムの使用によって達成することができる。
【０１３５】
蛍光ベースのシークエンシング方法論を含む、いくつかのＤＮＡシークエンシング技法が公知である（例えば、Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, N.Y.を参照のこと）。一部の実施形態では、当技術分野で理解される自動シークエンシング技法が利用される。一部の実施形態では、本明細書に記載のハイスループットシステムは、分割アンプリコンの並列シークエンシング（例えば、ＰＣＴ国際公開第２００６／０８４１３２号パンフレット）をもたらす方法を使用する。一部の実施形態では、ＤＮＡシークエンシングは、並列オリゴヌクレオチド伸長（例えば、米国特許第５，７５０，３４１号明細書、および米国特許第６，３０６，５９７号明細書を参照のこと）によって達成される。シークエンシング技法の追加の例として、チャーチポロニー技術（Mitra et al.,2003,Analytical Biochemistry 320,55-65；Shendure et al.,2005 Science 309,1728-1732；米国特許第６，４３２，３６０号明細書；米国特許第６，４８５，９４４号明細書および米国特許第６，５１１，８０３号明細書）、４５４ピコタイターパイロシーケンシング技術（Margulies et al.,2005 Nature 437,376-380；米国特許出願公開第２００５／０１３０１７３号明細書）、Ｓｏｌｅｘａ単一塩基付加技術（Bennett et al.,2005,Pharmacogenomics,6,373-382；米国特許第６，７８７，３０８号明細書；米国特許第６，８３３，２４６号明細書）、Ｌｙｎｘ大規模並列シグネチャーシークエンシング技術（Brenner et al.,(2000).Nat.Biotechnol.18:630-634；米国特許第５，６９５，９３４号明細書；米国特許第５，７１４，３３０号明細書）、およびＡｄｅｓｓｉＰＣＲコロニー技術（Adessi et al.(2000).Nucleic Acid Res.28,E87；国際公開第０００１８９５７号パンフレット）が挙げられる。
【０１３６】
次世代シークエンシング（ＮＧＳ）方法は、古いシークエンシング方法に比べて低コストを目標に大規模並列でハイスループットな戦略を共通の特徴として共有する（例えば、Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean et al.,Nature Rev.Microbiol.,7:287-296を参照のこと）。ＮＧＳ方法は、典型的には、テンプレート増幅を使用するものとそうでないものに広く分けることができる。増幅を必要とする方法としては、４５４技術プラットフォームとしてＲｏｃｈｅにより市販されているパイロシーケンシング（例えば、ＧＳ  ２０およびＧＳ  ＦＬＸ）、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（商標）により市販されているＳｏｌｅｘａプラットフォーム、およびＡＰＰＬＩＥＤ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ（商標）により市販されているＳｕｐｐｏｒｔｅｄ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ（商標）（ＳＯＬｉＤ）プラットフォームが挙げられる。単一分子シークエンシングとしても知られている非増幅手法は、ＨＥＬＩＣＯＳ  ＢＩＯＳＹＳＴＥＭＳ（商標）により市販されているＨＥＬＩＳＣＯＰＥプラットフォーム、およびＶＩＳＩＧＥＮ（商標）、ＯＸＦＯＲＤ  ＮＡＮＯＰＯＲＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ  ＬＴＤ．、およびＰＡＣＩＦＩＣ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（商標）によりそれぞれ市販されている最新のプラットフォームによって例示される。
【０１３７】
パイロシーケンシング（Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean et al.,Nature Rev.Microbial.,7:287-296；米国特許第６，２１０，８９１号明細書；米国特許第６，２５８，５６８号明細書）では、テンプレートＤＮＡが断片化され、末端修復され、アダプターにライゲーションされ、アダプターに相補的なオリゴヌクレオチドを保有するビーズで単一のテンプレート分子を捕捉することによってｉｎ−ｓｉｔｕでクローン的に増幅される。単一のテンプレート型を保有する各ビーズは、油中水型マイクロベシクルに区画され、テンプレートは、エマルジョンＰＣＲと称される技法を使用してクローン的に増幅される。エマルジョンは、増幅後に破壊され、ビーズは、シークエンシング反応の間にフローセルとして機能ピコタイタープレートの個々のウェルに堆積される。４つのｄＮＴＰ試薬のそれぞれの順序付けられた反復導入が、シークエンシング酵素およびルシフェラーゼなどの発光レポーターの存在下でフローセルに起こる。適切なｄＮＴＰがシークエンシングプライマーの３’末端に付加される事象では、得られるＡＴＰの産生により、ＣＣＤカメラを使用して記録されるウェル内の発光の破壊が引き起こされる。４００塩基より多いかまたはそれに等しいリード長を達成することが可能であり、１０６の配列リードを達成することができ、最大５億塩基対（Ｍｂ）の配列となる。
【０１３８】
ＳＯＬＥＸＡ／ＩＬＬＵＭＩＮＡプラットフォーム（Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean et al.,Nature Rev.Microbial.,7:287-296；米国特許第６，８３３，２４６号明細書；米国特許第７，１１５，４００号明細書；米国特許第６，９６９，４８８号明細書）では、シークエンシングデータは、より短い長さのリードの形態で作製される。この方法では、１本鎖断片化ＤＮＡは末端修復されて、５’−リン酸化平滑末端を生成し、続いて、単一Ａ塩基が断片の３’末端にクレノウ媒介的に付加される。Ａ−添加は、オリゴヌクレオチドアンカーでちりばめられるフローセルの表面にテンプレートアダプター分子を捕捉するためにその後に使用されるＴ−オーバーハングアダプターオリゴヌクレオチドの付加を容易にする。アンカーは、ＰＣＲプライマーとして使用されるが、テンプレートの長さと他の近くのアンカーオリゴヌクレオチドへの近さのため、ＰＣＲによる伸長は、分子の「アーチ形成」に至り、隣接するアンカーオリゴヌクレオチドとハイブリダイズし、フローセルの表面にブリッジ構造を形成する。ＤＮＡのこれらのループは、変性され切断される。次いで、フォワード鎖は、可逆色素ターミネーターを用いてシークエンスされる。取り込まれたヌクレオチドの配列は、ｄＮＴＰ添加の次のサイクルの前に除去される蛍光体およびブロックのそれぞれで、取込み後の蛍光を検出することによって決定される。配列リード長は、解析ラン当たり１０億の塩基対を超える全体のアウトプットで、３６ヌクレオチドから５０を超えるヌクレオチドの範囲である。
【０１３９】
ＳＯＬIＤ（商標）技術（Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean et al.,Nature Rev.Microbial.,7:287-296；米国特許第５，９１２，１４８号明細書；米国特許第６，１３０，０７３号明細書）を使用する核酸分子のシークエンシングもまた、テンプレートの断片化、オリゴヌクレオチドアダプターのライゲーション、ビーズへの付着、およびエマルジョンＰＣＲによるクローン増幅に関与する。これに続いて、テンプレートを保有するビーズが、ガラスフローセルの誘導体化表面に固定され、アダプターオリゴヌクレオチドに相補的なプライマーがアニーリングされる。しかしながら、このプライマーは、３’伸長のために利用するよりもむしろ、２つのプローブ特異的塩基、続いて６つの縮重塩基と４つの蛍光標識のうちの１つを含有するインターロゲーションプローブへのライゲーションのための５’リン酸基を提供するために代わりに使用される。ＳＯＬIＤ（商標）システムでは、インターロゲーションプローブは、各プローブの３’末端に２つの塩基と５’末端に４つの蛍光体のうちの１つとの１６の可能な組合せを有する。蛍光体の色、よって、各プローブの同一性は、特定の色−空間コードスキームに対応する。複数（通常は７）回のプローブアニーリング、ライゲーション、および蛍光体検出の後に、変性、次いで、初期プライマーに対して１つの塩基でオフセットされるプライマーを使用する２回目のシークエンシングを行う。この方法では、テンプレート配列はコンピュータで再構築することができ、テンプレート塩基は２度インターロゲーションされて、高い精度が得られる。配列リード長は、平均で３５個のヌクレオチドであり、全体のアウトプットは、シークエンシングのラン当たり４０億の塩基を超える。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、ナノ細孔シークエンシング（例えば、Astier et al.,J.Am.Chem.Soc.2006 Feb 8;128(5)1705-10を参照のこと）が用いられる。ナノ細孔シークエンシングの背後にある理論は、ナノ細孔が導電性流体中に浸漬され、電位（電圧）がこれに印加されたときに起こるものに関係している。これらの条件下で、ナノ細孔を通るイオンの伝導による僅かな電流を観察することができ、電流の量は、ナノ細孔の大きさに非常に敏感である。核酸の各塩基がナノ細孔を通過するため、４つの塩基のそれぞれと別個のナノ細孔を通る電流の大きさに変化が起こり、それによって、決定されるべきＤＮＡ分子のシークエンスが可能となる。
【０１４１】
ある特定の実施形態では、ＨＥＬＩＣＯＳ  ＢＩＯＳＣＩＥＮＣＥＳ（商標）によるＨＥＬＩＳＣＯＰＥ（商標）（Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641-658,2009；MacLean et al.,Nature Rev.Microbial.,7:287-296；米国特許第７，１６９，５６０号明細書；米国特許第７，２８２，３３７号明細書；米国特許第７，４８２，１２０号明細書；米国特許第７，５０１，２４５号明細書；米国特許第６，８１８，３９５号明細書；米国特許第６，９１１，３４５号明細書；米国特許第７，５０１，２４５号明細書）が用いられる。テンプレートＤＮＡが断片化され、蛍光標識を保有する最終的なアデノシンにより３’末端でポリアデニル化される。変性されたポリアデニル化テンプレート断片は、フローセルの表面のポリ（ｄＴ）オリゴヌクレオチドにライゲーションされる。捕捉されたテンプレート分子の最初の物理的位置は、ＣＣＤカメラによって記録され、次いで、標識が切断され、洗い流される。シークエンシングは、ポリメラーゼおよび蛍光標識されたｄＮＴＰ試薬の一連の添加によって達成される。取込み事象は、ｄＮＴＰに対応する蛍光体シグナルを生じ、シグナルは、各回のｄＮＴＰ添加の前に、ＣＣＤカメラによって捕捉される。配列リード長は、解析ラン当たり１０億の塩基対を超える全体のアウトプットで、２５〜５０ヌクレオチドの範囲である。
【０１４２】
Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ技術は、ＤＮＡの重合の間に放出される水素イオンの検出に基づくＤＮＡシークエンシング方法である（例えば、Science 327(5970):1190(2010)；米国特許出願公開第２００９／００２６０８２号明細書；同第２００９／０１２７５８９号明細書；同第２０１０／０３０１３９８号明細書；同第２０１０／０１９７５０７号明細書；同第２０１０／０１８８０７３号明細書；および同第２０１０／０１３７１４３号明細書を参照のこと）。マイクロウェルは、シークエンシングされるテンプレートＤＮＡ鎖を含有する。マイクロウェルの層の下は、過敏性ＩＳＦＥＴのイオンセンサーである。すべての層は、エレクトロニクス産業において使用されるものと同様のＣＭＯＳの半導体チップ内に含有されている。ｄＮＴＰが成長する相補性鎖に組み込まれる場合、水素イオンが放出され、過敏性イオンセンサーを誘発する。ホモポリマーの反復がテンプレート配列中に存在する場合、複数のｄＮＴＰ分子は単一サイクル中に組み込まれる。これは、放出された水素の対応する数と、比例してより高い電子シグナルにつながる。この技術は、改変ヌクレオチドまたは光学部品が使用されない点で、他のシークエンシング技術とは異なる。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔシーケンサーの塩基当たりの精度は、ラン当たり約１００Ｍｂの生成で、５０塩基のリードについて約９９．６％である。リード長は１００塩基対である。長さが５反復のホモポリマー反復についての精度は約９８％である。
【０１４３】
本明細書に記載の方法に関して使用するために採用することができる別の例示的核酸シークエンシング手法は、ＳＴＲＡＴＯＳ  ＧＥＮＯＭＩＣ、Ｉｎｃ．によって開発され、ＸＰＡＮＤＯＭＥＲＳ（商標）の使用に関与する。このシークエンシングプロセスは、典型的には、テンプレート指向合成によって生産される娘鎖を提供することを含む。娘鎖は、一般的に、個々のサブユニットが、テザー、少なくとも１つのプローブまたは核酸塩基残基、および少なくとも１つの選択的に切断可能な結合を含む、標的核酸のすべてまたは一部の連続ヌクレオチド配列に対応する配列に結合された複数のサブユニットを含む。選択的に切断可能な結合が切断されて、娘鎖の複数のサブユニットよりも長い長さのＸＰＡＮＤＯＭＥＲ（商標）を得る。ＸＰＡＮＤＯＭＥＲ（商標）は、典型的には、標的核酸のすべてまたは一部の連続するヌクレオチド配列に対応する配列における遺伝情報を解析するためのテザーおよびレポーターエレメントを含む。次いで、ＸＰＡＮＤＯＭＥＲ（商標）のレポーターエレメントが検出される。ＸＰＡＮＤＯＭＥＲ（商標）に基づく手法に関するさらなる詳細は、例えば、２００８年６月１９日に出願された「拡張によるハイスループット核酸シークエンシング（ＨＩＧＨ  ＴＨＲＯＵＧＨＰＵＴ  ＮＵＣＬＥＩＣ  ＡＣＩＤ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ  ＢＹ  ＥＸＰＡＮＳＩＯＮ）」と題する米国特許出願公開第２００９／００３５７７７号明細書に記載されており、これは、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４４】
他の最新の単一分子シークエンシング法は、ＶＩＳＩＧＥＮ（商標）プラットフォーム（Voelkerding et al.,Clinical Chem.,55:641-58,2009；米国特許第７，３２９，４９２号明細書；米国特許出願第１１／６７１９５６号明細書；米国特許出願公開第１１／７８１１６６号明細書）を使用する合成によるリアルタイムシークエンシングを含み、ＶＩＳＩＧＥＮプラットフォームでは、固定され、プライムされたＤＮＡテンプレートが、蛍光修飾されたポリメラーゼおよび蛍光アクセプター分子を使用する鎖拡張に供されて、塩基添加時の検出可能な蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を生じる。
【０１４５】
本明細書において別段に定義されていなければ、本出願に関連して使用される化学および技術用語は、当業者に理解される通常の意味を有する。Allen et al., Remington: The Science and Practice of Pharmacy 22nd ed., Pharmaceutical Press (September 15, 2012)；Hornyak et al., Introduction to Nanoscience and Nanotechnology, CRC Press (2008)；Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 3rd ed., revised ed., J.Wiley & Sons (New York, NY 2006)；Smith, March's Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 7th ed., J.Wiley & Sons (New York, NY 2013)；Singleton, Dictionary of DNA and Genome Technology 3rded., Wiley-Blackwell (November 28, 2012)；およびGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (Cold Spring Harbor, NY 2012)は、本出願で使用される用語の多くへの一般的な指針を当業者に提供する。抗体をどのようにして調製するかについての参考文献に関しては、Greenfield, Antibodies A Laboratory Manual 2nd ed., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor NY, 2013)；Kohler and Milstein, Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion, Eur.J.Immunol.1976 Jul, 6(7):511-9；Queen and Selick, Humanized immunoglobulins、米国特許第５，５８５，０８９号明細書（1996 Dec）；およびRiechmann et al., Reshaping human antibodies for therapy, Nature 1988 Mar 24, 332(6162):323-7を参照のこと。さらに、文脈によって別段に要求されていなければ、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含むものとする。
【０１４６】
操作例において以外、または別段に示されていない場合、本明細書で使用される成分または反応条件についての量を表すすべての数は、すべての例で、用語「約」によって修飾されているものと理解すべきである。用語「約」は、本発明を説明するために使用する場合、パーセンテージに関しては、±５％を意味する。
【０１４７】
一観点では、本明細書に記載される組成物、方法、およびその各構成成分は、必須であり、必須であろうとなかろうと特定されていない要素の包含についてもオープンである（「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」）。一部の実施形態では、組成物、方法またはその各構成成分についての記載に含まれる他の要素は、その基本的および新規の特徴に物質的に影響を及ぼさないものに限定される（「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」）。これは、記載された方法内のステップおよびその中の組成物および構成成分に等しく適用される。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物、方法、およびその各構成成分は、構成成分、組成物または方法に対して本質的要素と思われないいずれの要素にも排他的であることが意図される（「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」）。
【０１４８】
特定されるすべての特許、特許出願、および刊行物は、例えば、本発明と関連して使用され得るこのような刊行物に記載される方法論を記載および開示するために、参照により明示的に本明細書に組み込まれる。これらの刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示についてのみ提供される。これに関してはいずれも、先行発明のせいで、または任意の他の理由でも、本発明者らがこのような開示に先行する権利を有さないことの自認として解釈されるべきではない。日付けについてのすべての記載またはこれらの文書の内容についてのすべての表現は、本出願に利用可能な情報に基づき、これらの文書の日付けまたは内容の正しさについてのいかなる自認も構成しない。
【０１４９】
本発明は、以下の実施例によってさらに例証されるが、これらはさらなる限定として解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１５０】
材料および方法
以下の材料および方法を本明細書の実施例において使用した。
Ｔ細胞の調製
ＩＶ９エピトープを認識するクローンＴ細胞（ＨＩＶ  Ｐｏｌのアミノ酸３０９〜３１７、ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ）は、Ｂｒｕｃｅ  Ｗａｌｋｅｒにより好意で提供された。Ｔ細胞を１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、および５０Ｕ／ｍｌのヒト組換えＩＬ−２（Ｒｏｃｈｅ）を含むＲＰＭＩ中で培養した。抗ＣＤ３（ＯＫＴ３、０．１ｕｇ／ｍｌ）の存在下で、２０Ｅ６で照射した（５０Ｇｙ）同種間ＰＭＢＣを用いて１Ｅ６のＴ細胞を培養することによって、Ｔ細胞を増殖させた。
【０１５１】
ＴＣＲの再生のために、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  ＣＤ８  Ｔ細胞精製キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して、ドナーの血液から一次ＣＤ８  Ｔ細胞を精製した。１Ｅ６のＴ細胞を、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して活性化し、同時に、目的のＴＣＲとＺｅｓｔｙ  Ｇｒｅｅｎ（Ｚｓｇ）蛍光マーカーをコードするレンチウイルスベクターで形質導入した。形質導入した細胞を、５日後に、Ｚｓｇシグナル（ＦＩＴＣ  ｃｈａｎｎｅｌ）に基づくＦＡＣＳ（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）  ＩＩ）で選別した。
【０１５２】
ＮＫ細胞を、ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ  ＮＫ細胞精製キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用してドナーの血液から精製し、ＲＰＭＩおよび１０％のＦＢＳ中１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２中で２４時間活性化した。
【０１５３】
細胞傷害性アッセイ
Ｈｍｙ２．ＣＩＲ−ＨＬＡ−Ａ２標的細胞を、製造業者のプロトコールに従ってＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識し、１０ｕｇ／ｍｌのＩＶ９ペプチド（ＮｅｏＢｉｏＬａｂ）または対照のペプチド（ＮｅｏＢｉｏＬａｂ）で１時間パルスした。細胞をＰＢＳで３回洗浄した。 ５Ｅ４の標的細胞を、９６ウェルプレートのウェルごとに播種し、１０倍過剰のＩＶ９  Ｔ細胞と混合し、３００ｇで２分間スピンダウンさせ、３７℃で４時間インキュベートした。細胞をピペッティングすることによって再懸濁させ、１：２０希釈の７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で１０分間インキュベートした。標的細胞を、ＣＦＳＥ染色（ＦＩＴＣ）によって特定し、死細胞をＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５チャネル（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）  ＩＩ）において検出した。ＬＤＨアッセイでは、インキュベーション４時間後の上清を回収し、製造業者のプロトコール（Ｐｉｅｒｃｅ）に従って処理した。
【０１５４】
蛍光発生ＧｚＢレポーター
蛍光発生ＧｚＢレポーターを、ｉＴＥＶ−ＨＯ１ベクター（To et al. PNAS 112(11): 3338-3343(2015)）におけるＴＥＶ切断部位を、ＧｚＢ切断配列（ＶＧＰＤＦＧＲ（配列番号９）で置き換えることによって作製した。Choi, P.J. and Mitchison, T.J.(2013)PNAS 110(15): 6488-6493）。新たなレポーターを、ｐＨＡＧＥ  ＴＲｅｘハイグロマイシンレンチウイルス発現ベクター中にクローニングし、約１のＭＯＩでＨＥＫ２９３Ｔ細胞中に形質導入した。細胞を、２００ｕｇ／ｍｌのハイグロマイシンで４日間選択した。標的細胞を、ＧＦＰシグナルに基づいて、Ｔ細胞から識別し、レポーターの活性化を、ＡＰＣ−Ｃｙ７チャネル（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉ（商標）ａ  ＩＩ）における蛍光の増加によって検出した。
【０１５５】
ＧｚＢ活性のＣｒｅレポーター
シグナルペプチド（ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰＳＱ（配列番号８））、ｆｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１０））、ＣＤ８膜貫通ドメイン、ＧｚＢ切断部位（ＶＧＰＤＦＧＲ（配列番号９））、およびＣｒｅリコンビナーゼを含有する膜係留Ｃｒｅ融合体をコードする構築物を作製した。この構築物を合成し（ＩＤＴ）、ｐＥＮＴＲベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）中にクローニングし、次いで、レンチウイルスのｐＨＡＧＥ  ＣＭＶ  ｈｙｇｒｏ  ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクター中にクローニングし、レンチウイルスの形質導入によってＫ５６２標的細胞中に導入した。Ｃｒｅ活性のレポーターとして、ヘッドトゥヘッド方向でＧＦＰおよびＲＦＰを含有し、ｌｏｘＰ部位が両側に隣接しているベクターを使用した。これは、ＧＦＰの活性化とＲＦＰの損失によるＣｒｅ活性の蛍光検出を可能にする、Ｃｒｅの存在に関するレポーターカセットである。さらに、ｑＰＣＲプライマー（図１４に図示した、図１５に示す配列）を設計し、蛍光検出よりもｑＰＣＲによって同じ逆位事象の検出を可能にした。このレポーターカセットをｐＨＡＧＥ  ＣＭＶレンチウイルスベクターにクローニングし、レンチウイルスの形質導入によって（２００ｕｇ／ｍｌで４日間のハイグロマイシン選択）レポーター細胞中に導入した。最後に、カスパーゼ耐性Ｄ１１７Ｅ  ＩＣＡＤ遺伝子を、レンチウイルスの形質導入によって（４０ｕｇ／ｍｌで５日間のブラストサイジン選択）標的細胞中に導入した。標的細胞を、２：１過剰の活性化一次ＮＫ細胞と４時間混合した。ＧｅｎｅＪＥＴ（商標）精製キットを使用して、ゲノムＤＮＡを精製し、Ｃｒｅレポーターの逆位を、逆位特異的プライマーを使用するｑＰＣＲによるＰＣＲ増幅産物の定量によって定量した。逆位カセットは、他の内容では、Ｃｒｅ活性の蛍光検出のためにＲＦＰとＧＦＰをそれ自体に含有したが、この実験では蛍光シグナルを全く使用しなかった。シグナルを、方向にかかわらずレポーターカセットを定量したプライマーのセットに対して正規化した。
【０１５６】
抗体ベースのＧｚＢレポーター
ＨＡタグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号１１））、ＧｚＢ切断部位（ＶＧＰＤ（配列番号１））、Ｆｌａｇタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号１０））、およびＧＦＰの融合体をコードする構築物を合成し（ＩＤＴ）、ｐＥＮＴＲベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にクローニングし、次いで、ＧａｔｅｗａｙクローニングによってｐＨＡＧＥ  Ｔｒｅｘ  ｎｅｏ発現ベクターにクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、発現ベクターまたは対照空ベクターをトランスフェクトし、次いで、一次ＮＫ細胞と２時間共培養した。細胞溶解液を採取し、４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓゲルにランし、Ｍ１抗Ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）でブロッティングした。
【０１５７】
ＣＤ４  ＴＣＲ試験
Ｐ２Ａ配列によって分離したＯＢ１ａ．１２  ＴＣＲのアルファおよびベータ鎖（ＭＢＰペプチドに特異的）を、ｐＨＡＧＥ  ＥＦ１ａ−ＰＧＫ−Ｚｓｇベクターにクローニングした。対照として、ＩＶ９ペプチドを標的とするＴＣＲのアルファおよびベータ鎖（Kolowo、W. et al.(1999)Journal of Immunology, 162:7525-7533）を、同じベクターにクローニングした。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で再度刺激した一次ＣＤ８  Ｔ細胞を、ＯＢ１ａ．１２または対照のＴＣＲを発現するレンチウイルスで形質導入した。５日後に、Ｚｓｇ陽性Ｔ細胞をＦＡＣＳによって選別した。ＯＢ１ａ．１２または対照のＴ細胞を、蛍光ＧｚＢレポーターを単独で発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞と、またはＭＢＰペプチドもしくはＭＢＰペプチドの突然変異体を有する単鎖ＭＨＣＩＩ構築物と共培養した。ＧｚＢレポーターの活性化をＦＡＣＳによって４時間後に検出した。
【０１５８】
混合実験
ＩＶ９エピトープを含有する５６アミノ酸の断片（ＧＡＫＡＬＴＤＩＶＰＬＴＲＥＡＥＬＥＬＡＥＮＫＥＩＬＫＥＰＶＨＧＶＹＹＤＳＡＫＥＬＩＡＥＶＱＫＱＧＬＤＱＷＴＹＱ；配列番号１２）を、ｐＨＡＧＥ  ＣＭＶピューロレンチウイルス発現ベクターにクローニングした。蛍光発生ＧｚＢレポーターを発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞をレンチウイルスで形質導入しこのＩＶ９エピトープを発現させるか、または対照のレンチウイルス（ＭＯＩ約１）で形質導入し、１ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンで３日間選択した。ＩＶ９構築物を発現する細胞を、製造業者のプロトコール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）のバイオレット細胞色素で標識し、様々な比で未標識対照細胞と混合し、９６ウェルプレートに播種した。１２時間成長させた後、１０：１の比のＩＶ９  Ｔ細胞を添加し、細胞を４時間共培養した。細胞をピペッティングすることによって再懸濁させ、ＧＦＰ、ＡＰＣ−Ｃｙ７、およびＤＡＰＩ（バイオレット色素）について、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）  ＩＩ）によって解析した。
【０１５９】
ＩＶ９  Ｔ細胞のスクリーニング
１０種のＨＩＶ株の完全なプロテオームにわたって並べて表示する、５６アミノ酸の断片をコードする２４９４オリゴのライブラリーを合成した（Ａｇｉｌｅｎｔ）。 ライブラリーは、以下のプライマーを使用して増幅させ：
ＨＩＶ＿ｌｉｂ＿Ｆ  ５’  ｇｇｇｇａｃａａｇｔｔｔｇｔａｃａａａａａａｇｃａｇｇｃｔｃａＡＧＡＡＴＴＣＴＣＣＧＴＧＧＣ（配列番号１３）
ＨＩＶ＿ｌｉｂ＿Ｒ  ５’  ｇｇｇｇａｃｃａｃｔｔｔｇｔａｃａａｇａａａｇｃｔｇｇｇｔｃａｇｃｔａｇｔｔａＣＡＣＴＣＧＡＧＡＧＣＴＣＡＣ（配列番号１４）
ｐＤＯＮＲ２２１ベクターにクローニングした。大文字のセクションは、本発明者らの抗原カセットに直接的に相補的である領域を示す（小文字はＰＣＲによって付加されているオーバーハングである）。次いで、ＬＲクロナーゼを使用して、ライブラリーをｐＨＡＧＥ  ＣＭＶ  Ｎ−ＦｌａｇＨＡ  ＩＲＥＳ  ｐｕｒｏ  ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎベクターにクローニングした。３０Ｅ６の標的細胞の２つの複製（ＧｚＢレポーターとＩＣＡＤを発現するＨＥＫ２９３Ｔ）を、ＭＯＩが約０．２のＨＩＶペプチドライブラリーで形質導入し、１ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンで３日間選択した。各複製からの３Ｅ６の標的細胞を、１０Ｅ６の活性化ＩＶ９  Ｔ細胞と１２時間共培養した。細胞をピペッティングすることによって再懸濁させ、ＧｚＢレポーターを活性化する標的細胞をＦＡＣＳによって選別した。ゲノムＤＮＡを、ＧｅｎｅＪＥＴ（商標）キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して、選別した細胞と３Ｅ６の予め選別した対照から精製した。ペプチドカセットを以下のプライマーを使用して増幅させ：
Ｔ＿ｓｅｌｌ＿ＰＣＲ１＿Ｆ  ５’  CＣＡＧＴＣＡＧＧＴＧＴＧＡＴＧＣＴＣＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＧＡＡＴＴＣＡＧＴＴＴＧＴＡＣＡＡＡＡＡＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡ（配列番号１５）；Ｔ＿ｃｅｌｌ＿ＰＣＲ１＿Ｒ  ５’  ＣＧＡＧＣＴＴＡＴＣＧＴＣＧＴＣＡＴＣＣＣＣＡＣＴＴＴＧＴＡＣＡＡＧＡＡＡＧＣＴＧＧＧＴＣＡ（配列番号１６）、１ｕｌのＰＣＲ１産物を、以前に記載したように（Xu, et al., (2015)Science, 348(6239),  aaa0698）、２回のライブラリーｐｒｅｐ  ＰＣＲのためのテンプレートとして使用し、産物をプールし、ゲル抽出し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑのシングルエンド３００ｂｐのシークエンシングにかけた。リードを、ＢＷＡを使用してアラインメントし、インプット周波数に対する選別した集団における各ペプチドの存在量を計算した。
【０１６０】
ＣＭＶのサブライブラリースクリーニング
このスクリーニングは、以下の修正を含む上記ＩＶ９  Ｔ細胞スクリーニングとして実施した。簡潔には、ＮＬＶ２  ＴＣＲ（Schub et al., J Immunol、183:6819-6830(2009)）を、ｇＢｌｏｃｋ断片（ＩＤＴ）として合成し、ｐＨＡＧＥ  ＥＦ１ａ  Ｚｓｇ  ＤＥＳＴレンチウイルスベクターにクローニングし、レンチウイルスにパッケージングし、一次ＣＤ８  Ｔ細胞中に形質導入した。  二連の、ＣＭＶ  Ｍｅｒｌｉｎ株の完全なプロテオームをコードする５，７８４オリゴのライブラリーを、放出可能なマイクロアレイ（Ｔｗｉｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で合成し、ｐＨＡＧＥ  ＣＭＶ  ＮＦｌａｇＨＡ  ｐｕｒｏ  ＤＥＳＴレンチウイルスベクターにクローニングし、レンチウイルスにパッケージングし、およそ０．５のＭＯＩで（１ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンで３日間選択した）、ＨＬＡ−Ａ２標的細胞（ＭＨＣ  Ｎｕｌｌ  ＨＥＫ２９３Ｔ／ｄｍＩＣＡＤ−ｂｓｄ／ｉＧｚＢ−ｈｙｇ／ＨＬＡ−Ａ２）中に形質導入した。
【０１６１】
１０Ｅ６のＣＭＶ標的細胞の３つの複製を、５０Ｅ６のＮＬＶ２  Ｔ細胞と１２時間共培養し、その後、ＩＦＰ陽性標的細胞を選別した（ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）  ＩＩ）。選別した細胞を、５００ｇで５分間スピンダウンさせ、ｇＤＮＡを、ＧｅｎｅＪＥＴ（商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して抽出した。シークエンシングアダプターとマルチプレックスインデックスを、上記ＩＶ９  Ｔ細胞のスクリーニングについて記載したように、３回のＰＣＲにおいて添加し、試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑのハイスループットシークエンシングにかけた。リードを、ＢＷＡを使用してアラインメントし、インプット周波数に対する選別した集団における各ペプチドの存在量を計算した。
【０１６２】
細菌叢−ワイドスクリーニング
このスクリーニングは、以下の修正を含む上記ＩＶ９  Ｔ細胞スクリーニングとして実施した。 簡潔には、ｐｐ６５特異的一次Ｔ細胞は、Ｋｉｍ  Ｌｙｅｒｌｙによって好意で提供された。ＶｉｒＳｃａｎライブラリー（Xu et al. Science、348(6239), aaa0698(2015)）を、ｐＨＡＧＥ  ＣＭＶ  ＮＦｌａｇＨＡ  ｐｕｒｏ  ＤＥＳＴレンチウイルスベクターにクローニングし、レンチウイルスにパッケージングし、およそ０．５のＭＯＩで（１ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンで３日間選択した）、ＨＬＡ−Ａ２標的細胞（ＭＨＣ  Ｎｕｌｌ  ＨＥＫ２９３Ｔ／ｄｍＩＣＡＤ−ｂｓｄ／ｉＧｚＢ−ｈｙｇ／ＨＬＡ−Ａ２）に形質導入した。
【０１６３】
１２０Ｅ６のウイルス叢標的細胞の４つの複製を、１２０Ｅ６のＴ細胞と１２時間共培養し、その後、ＩＦＰ陽性標的細胞を選別した（ＦａｃｓＡｒｉａ（商標）  ＩＩ）。選別した細胞を、５００ｇで５分間スピンダウンさせ、ｇＤＮＡを、ＧｅｎｅＪＥＴ（商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｔｈｅｒｍｏ）を使用して抽出した。シークエンシングアダプターとマルチプレックスインデックスを、上記ＩＶ９  Ｔ細胞のスクリーニングについて記載したように、３回のＰＣＲにおいて添加し、試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑのハイスループットシークエンシングにかけた。リードを、ＢＷＡを使用してアラインメントし、インプット周波数に対する選別した集団における各ペプチドの存在量を計算した。
【０１６４】
ＣＭＶライブラリー対ライブラリースクリーニング
このスクリーニングは、以下の修正を含む上記ＣＭＶサブライブラリースクリーニングとして実施した。メモリーＴ細胞を、ドナー番号２２４のＰＢＭＣ（７６Ｅ６の開始細胞、Ａｓｔａｒｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）から精製し、前記したように増殖させた。
【０１６５】
３０Ｅ６のＣＭＶ標的細胞の４つの複製を、２５Ｅ６のＴ細胞と８時間共培養し、その後、ＩＦＰ陽性標的細胞を選別し（ＦａｃｓＡｒｉａ（商標）  ＩＩ）、上記のように処理した。
【０１６６】
タイリング突然変異誘発スクリーニング
このスクリーニングは、以下の修正を含む前記ＩＶ９  Ｔ細胞スクリーニングとして実施した。簡潔には、ｐｐ６５特異的一次Ｔ細胞は、Ｋｉｍ  Ｌｙｅｒｌｙによって好意で提供された。二連の、４つのＴ細胞エピトープ（ｐｐ６５エピトープ：ＮＬＶＰＭＶＡＴＶを含む）の単一アミノ酸突然変異体の完全なセットをコードする３，３７６オリゴ（ＣＴＬ＿ｍｕｔ  ライブラリー）のライブラリーを、放出可能なマイクロアレイ（Ｔｗｉｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で合成し、ｐＨＡＧＥ  ＣＭＶ  ＮＦｌａｇＨＡ  ｐｕｒｏ  ＤＥＳＴレンチウイルスベクターにクローニングし、レンチウイルスにパッケージングし、およそ０．２のＭＯＩで（１ｕｇ／ｍｌのピューロマイシンで３日間選択した）、ＨＬＡ−Ａ２標的細胞（ＭＨＣ  Ｎｕｌｌ  ＨＥＫ２９３Ｔ／ｄｍＩＣＡＤ−ｂｓｄ／ｉＧｚＢ−ｈｙｇ／ＨＬＡ−Ａ２）中に形質導入した。
【０１６７】
２５Ｅ６のＣＴＬ＿ｍｕｔ標的細胞の３つの複製を、２５Ｅ６のＴ細胞と１２時間共培養し、その後、ＩＦＰ陽性標的細胞を選別し（ＦａｃｓＡｒｉａ（商標）  ＩＩ）し、上記のように処理した。
【０１６８】
２回の選択スクリーニング
このスクリーニングは、以下の修正を含む上記ＩＶ９  Ｔ細胞スクリーニングとして実施した。簡潔には、ＩＶ９特異的「ＨＡ」ＴＣＲ（Kolowos et al., J Immunol 162:7525-7533 1999）を、ｇＢｌｏｃｋ断片（ＩＤＴ）として合成し、ｐＨＡＧＥ  ＥＦ１ａ  Ｚｓｇ  ＤＥＳＴレンチウイルスベクターにクローニングし、レンチウイルスにパッケージングし、一次ＣＤ８  Ｔ細胞中に形質導入した。
【０１６９】
５Ｅ６の標的細胞の３つの複製を、４０Ｅ６の「ＨＡ」Ｔ細胞と１０時間共培養し、その後、ＩＦＰ陽性標的細胞を選別し（ＦａｃｓＡｒｉａ（商標）  ＩＩ）し、上記のように処理した。
【０１７０】
２回目の選択を実施するために、３つのスクリーニング複製のそれぞれに由来するＰＣＲ１産物を、ｐＨＡＧＥ  ＣＭＶ  ＮＦｌａｇＨＡ  ｐｕｒｏ  ＤＥＳＴベクターにバッククローニングし、レンチウイルスにパッケージングし、およそ０．２のＭＯＩで、ＨＬＡ−Ａ２標的細胞中に形質導入した。３つの再クローニングライブラリーのそれぞれを発現する５Ｅ６の標的細胞の１つの複製を、２５Ｅ６の「ＨＡ」Ｔ細胞と１０時間共培養し、その後、ＩＦＰ陽性標的細胞を選別し（ＦａｃｓＡｒｉａ（商標）  ＩＩ）し、上記のように処理した。以下のシークエンシングおよびリードアラインメント、１回および２回の選択後に回収したペプチドの存在量を、選択前のインプットライブラリーと比較した。
【０１７１】
スクリーニング最適化の詳細
ＩＦＰ陽性細胞の単離後にゲノムＤＮＡを保存するために、選別した細胞を常に氷上で維持し、スピンダウンさせ、選別の４時間以内に凍結させた。
【０１７２】
標的検出の最適なシグナルノイズを与えるために、各スクリーニングの直前に最適化実験を実施した。簡潔には、公知のＴ細胞抗原（パルスしたペプチド、最終１０ｕｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、ＭＨＣ適合標的細胞（ｉＧｚＢレポーターを発現する）を、スクリーニングに使用したＴ細胞の連続希釈物と４時間共培養した。レポーターの活性化を、フローサイトメトリーによって、各条件下で決定し、バックグラウンド活性化（パルスした抗原が非存在）とオンターゲット活性化（パルスした抗原が存在）の比を計算した。最適なＴ細胞：標的細胞の比を、ライブラリースクリーニングのために選択した。
【０１７３】
複数の抗原を呈する細胞数を低減するために、標的細胞を、０．２〜０．５の感染多重度（ＭＯＩ）のレンチウイルスライブラリーで形質導入した。
【０１７４】
抗原配列の強固な検出を与えるために、試料を、選別した細胞の数の少なくとも２倍の深度にシークエンシングした（すなわち、１００，０００個の細胞がＦＡＣＳによって選別された場合、１つの試料に対して２００，０００のリード）。
【０１７５】
ＦＡＣＳによるＴ細胞と標的細胞の明確な分離を可能にするために、標的細胞を、Ｔ細胞との共培養の前に、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ（商標）バイオレット色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色する。
【０１７６】
[実施例１]
ハイスループットシークエンシングによって複雑なライブラリーからＴ細胞抗原を特定するための組成物および方法
Ｔ細胞の標的抗原を包括的に、ゲノム−ワイドに特定するための組成物および方法が本明細書に開示される。この手法では、標的細胞のＭＨＣクラスＩ分子における提示に対する、候補抗原のレンチウイルスによる送達が使用される。次いで、標的細胞のこのライブラリーを、目的の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の試料と混合し、ＣＴＬに、同種の抗原を呈する任意の標的細胞を認識する時間を与える。認識に際し、ＣＴＬは、死滅プロセスを開始させるために、セリンプロテアーゼであるグランザイムＢ（ＧｚＢ）を含有する細胞傷害性顆粒を放出する。細胞内ＧｚＢ活性のレポーターを使用して、認識された標的細胞からゲノムＤＮＡを単離する。最後に、ＰＣＲ増幅と次世代シークエンシング（ＮＧＳ）によって、これらの細胞が呈した抗原の包括的な特定が可能となる。このことにより、ＣＴＬのインプット集団によって認識された抗原の定量的なシークエンシングリードアウトがもたらされる。この手法は、図１に例証される。
【０１７７】
細胞傷害性Ｔ細胞に特異的な候補抗原を特定するための方法が、ＣＴＬの同種の抗原を呈する標的細胞を強固にエンリッチすることができることを実証するために、概念証明実験を実施した。開発および試験の目的のために、ＨＬＡ  Ａ＊０２０１に制限されたＨＩＶ  ｐｏｌペプチドＩＶ９（Ｐｏｌ残基４７６〜４８４）に非常に特異的なＣＴＬクローンを入手した。ＣＴＬクローンは、同種であるが対照ではないペプチドでパルスしたＭＨＣ適合標的細胞において、膜透過性についての７−ＡＡＤ染色によって検出されるように、アポトーシスを誘導することができた（図２Ａ）。
【０１７８】
遺伝子によってコードされる候補抗原を、標的細胞によって、ＭＨＣ  Ｉ分子上に、効率的に提示することができ、標的細胞ライブラリーの作製が可能となる。同種のＩＶ９配列を含有するＨＩＶ  ｐｏｌの５６アミノ酸断片の単一の複製のレンチウイルスによる発現が、ＩＶ９ペプチドの効率的処理と提示を可能にするかどうかを決定するための試験を実施した。ＬＤＨ放出細胞傷害性アッセイによって決定したように、この断片の発現は、ＩＶ９  ＣＴＬによる標的細胞の認識を与えるのに十分であったことが観察された（図２Ｂ）。このことは、標的細胞ライブラリーの作製の実行可能性を実証した。
【０１７９】
ＣＴＬによって生産的に認識された標的細胞からＤＮＡを単離するために、標的細胞における生産的抗原認識に対するレポーターアッセイを開発した。ＧｚＢプロテアーゼ活性を、認識された標的細胞のリードアウト／マーカーとして使用した。ＧｚＢは、ＣＴＬによって、認識された標的細胞中に分泌される細胞傷害性プロテアーゼであり、カスパーゼ活性化とアポトーシスを誘発する。ＧｚＢのレポーターは、一般的なアポトーシス経路によって活性化されず、このことは、ＣＴＬによって、死滅した標的細胞のみが単離されることを意味する。このことにより、本明細書に記載の方法における抗原に依存しないバックグラウンドノイズが低減される。以前の研究により、細胞傷害性の死滅の間に、標的細胞中に放出されたＧｚＢにより、ＧｚＢ標的の完全なタンパク質分解がもたらされことが実証され、このことは、レポーターの基礎として作用する強固な酵素活性を示唆した。
【０１８０】
ＧｚＢ活性を検出するために、To et al. PNAS 112(11): 3338-3343(2015)に記載された研究に基づいて、新たな蛍光発生ＧｚＢレポータータンパク質を開発し、２つのドメイン間の拘束ペプチドリンカーによって成熟することができない改変された赤外蛍光タンパク質を作製した。このリンカーのタンパク質分解による切断によって、タンパク質の適当なフォールディングが可能となり、最大１０００倍の蛍光の増加が生じる。To et al. PNAS 112(11): 3338-3343(2015)は、このレポーターを使用して、カスパーゼの活性とＴＥＶプロテアーゼの活性を検出することに成功した。本明細書に記載されるようにレポーターを改変して、代わりに、ＧｚＢ切断を検出した。このレポーターの試験として、蛍光発生ＧｚＢレポーターを安定して発現する標的細胞を作製した。ＩＶ９  ＣＴＬとの共培養により、ＩＶ９でパルスしたが、対照ではパルスしていない標的細胞における赤外蛍光タンパク質シグナルの増加が導かれ（図３）、ＧｚＢ活性の効率的検出と一致した。
【０１８１】
本明細書に記載のプラットフォームによって、ＣＴＬの同種の抗原を呈する標的細胞をエンリッチすることができることを実証するために、再構築実験を実施した。ＧｚＢレポーターを発現し、ＩＶ９ペプチドを呈する標的細胞を、バイオレット細胞染色で標識した。次いで、これらの細胞を、ＧｚＢレポーターをまた発現するが、対照ペプチドを呈さない未染色標的細胞と混合した。対照細胞に対する様々な比のＩＶ９の提示を使用して、複雑さの増した抗原ライブラリーをシミュレーションした。混合した細胞をＩＶ９  ＣＴＬと共培養し、ＧｚＢレポーターを活性化した標的細胞を単離した。バイオレット染色を使用して、ＧｚＢレポーターを活性化したすべての標的細胞の中で、ＩＶ９ペプチドを呈する標的細胞のエンリッチメントを計算した。この実験は、図４に例証される。
【０１８２】
実験の結果を図４Ｂに表し、同種のＩＶ９抗原を呈する標的細胞の強力なエンリッチメントを実証する。１：１０００の初期希釈を使用した場合（本発明者らが試験した最も低い希釈）、同種の抗原を呈する標的細胞の２１倍のエンリッチメントが観察された。この条件で、１，０００個の異なる抗原のライブラリーをシミュレーションし、このプラットフォームを使用して、候補の非常に複雑なライブラリーから標的を特定することができることを実証する。
【０１８３】
この手法と適用することに対する最終ステップは、認識された標的細胞のゲノムＤＮＡからインタクト抗原のライブラリーの回収を可能とすることである。しかしながら、ＧｚＢは、標的細胞においてカスパーゼ活性化を開始し、カスパーゼ活性化デオキシリボヌクレアーゼ（ＣＡＤ）によるゲノムＤＮＡのヌクレオソーム間の分解を引き起こす。ＣＡＤは、通常、カスパーゼ基質である、ＣＡＤのタンパク質阻害剤（ＩＣＡＤ）によって不活性化されるが、カスパーゼ耐性（Ｄ１１７Ｅ）ＩＣＡＤの過剰発現は、アポトーシスの間にＤＮＡの分解を遮断することが示されている（Sakahira et al.,  Nature. 1:391(6662):96-9. 1998）。レンチウイルスによる形質導入と選択によって、カスパーゼ耐性Ｄ１１７Ｅ  ＩＣＡＤ遺伝子を発現するように改変された標的細胞を使用した。得られた結果は、この戦略によって、アポトーシス細胞からのインタクトなゲノムＤＮＡの回収が可能となることを実証する。
【０１８４】
このプラットフォームによって、複雑な抗原ライブラリーからＣＴＬ標的をエンリッチするのに成功できることを実証するために、Ｔ細胞クローンの標的に対するスクリーニングを実施した。５６アミノ酸ステップで１０種のＨＩＶ株の完全なプロテオームにわたって並べて表示する２，４９４ペプチド断片のライブラリーを作製した。このライブラリーをレンチウイルスベクターにクローニングし、本発明者らのＧｚＢレポーターと変異Ｄ１１７ＥおよびＤ２２４Ｅを有する突然変異体ＩＣＡＤを発現する標的細胞中に導入した。次いで、標的細胞のライブラリーを、ＩＶ９  ＣＴＬクローンと終夜共培養し、ＧｚＢレポーターを活性化した標的細胞をＦＡＣＳによって単離した。インプットおよび選別した細胞のゲノムＤＮＡ由来の抗原カセットを増幅するためにＰＣＲを実施し、選別した細胞における選択したペプチドのエンリッチメントを定量するためにｑＰＣＲを実施した。この実験は、図５Ａに例証され、結果を図５Ｂに示す。ＩＶ９  ＣＴＬ抗原をコードするペプチドの有意かつ再生可能なエンリッチメントが観察され、一方、対照抗原は有意にエンリッチされなかった。このことは、このプラットフォームを使用して、ＣＴＬの標的に対して、複雑な抗原ライブラリーをスクリーニングすることができること、およびこれらの標的細胞が、次世代シークエンシングを使用することによって包括的に検出され得ることを実証する。
【０１８５】
[実施例２]
ハイスループットシークエンシングによる複雑なライブラリーからのＴ細胞抗原の特定
このプラットフォームを使用して、複雑な抗原ライブラリーからＣＴＬ標的を発見することができることを実証するために、目的のＴ細胞クローンの標的に対する再構築スクリーニングを実施した。５６アミノ酸ステップで１０種のＨＩＶ株の完全なプロテオームにわたって並べて表示する２，４９４ペプチド断片をコードするライブラリーを作製した。このライブラリーをレンチウイルスベクターにクローニングし、本発明者らのＧｚＢレポーターと変異Ｄ１１７ＥおよびＤ２２４Ｅを有する突然変異体ＩＣＡＤを発現する標的細胞中に導入した。次いで、標的細胞のライブラリーを、ＩＶ９  ＣＴＬクローンと終夜共培養し、ＧｚＢレポーターを活性化した標的細胞を蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって単離した。インプットおよび選別した細胞のゲノムＤＮＡ由来の抗原カセットを増幅するためにＰＣＲを使用し、Ｔ細胞クローンによって認識された細胞においてエンリッチされた抗原を特徴付けるためにＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングを実施した。
【０１８６】
図８は、この実験の２つの生物学的複製にわたって、本発明者らのライブラリーの各ペプチドを選別した後のフォールドエンリッチメントをプロットする。数値の注釈を付けてプロットしたペプチドは、使用されたＩＶ９  ＣＴＬクローンの公知の標的エピトープを含有する。最も強力で最も再生可能なエンリッチメントは、ＩＶ９エピトープを含有するペプチドに対するものであり、ほとんどすべてのこのようなペプチドに少なくとも中程度のエンリッチメントが存在する。さらに、このスクリーニングにおいて最もエンリッチされたペプチドについての公平なモチーフ解析によって、最も出現するモチーフとして、正確なＩＶ９エピトープが明らかとなった（図９）。まとめると、これらのデータは、この組成物および方法を使用して、非常に複雑な抗原プールからＴ細胞標的を正確に特定することができることを実証する。
【０１８７】
[実施例３]
ＣＤ４  Ｔ細胞に対するＧｚＢレポーターの適用
この手法を使用して、それ自身が細胞傷害活性を有さないＣＤ４  Ｔ細胞または他のＴ細胞の標的を特定することができることを実証するためのステップも得た。これは、目的のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を一次ＣＤ８  Ｔ細胞中に導入することによって達成することができる。次いで、細胞傷害性Ｔ細胞は、導入されたＴＣＲの標的細胞を認識し、死滅させるように再指示される。次いで、目的のＴＣＲによって認識された標的細胞を、本明細書に記載されるＧｚＢのレポーターを使用して特定することができる。
【０１８８】
この手法を使用して、ＣＤ４  ＴＣＲの特異性を呈するＣＴＬを作製するのに成功できることを実証するために、実験を実施した。レンチウイルス感染を使用して、ＭＨＣクラスＩＩ分子の状況でＭＢＰペプチドを認識するＣＤ４  ＴＣＲ（Ｏｂ１Ａ．１２）を一次細胞傷害性ＣＤ８  Ｔ細胞中に導入した。Ｏｂ１Ａ．１２  ＴＣＲで改変したが、対照のＴＣＲで改変していないＣＤ８  Ｔ細胞は、適当なＭＨＣ  ＩＩ分子でＭＢＰペプチドを呈する標的細胞において、ＧｚＢレポーターを特異的に活性化することができた（図１０）。この結果は、ＧｚＢレポーターが、ＣＤ４  Ｔ細胞の標的を特定することができ、感染性疾患、がん、および自己免疫の状況で、Ｔｈ１、Ｔｈ２、およびＴｒｅｇ  ＣＤ４  Ｔ細胞の標的の特定を可能とすることを実証する。
【０１８９】
[実施例４]
代替的グランザイムＢレポーター
本明細書に記載されるように、ＣＴＬによって生産的に認識された標的細胞において、ＧｚＢ活性の検出を可能にする多くのＧｚＢベースのレポーターが企図される。例えば、ＧｚＢ活性のいくつかの代替的レポーターが作製されてきた。これらのレポーターを独立して、または上記蛍光発生プロテアーゼレポーターと組み合わせて使用して、ＣＴＬによって認識される標的細胞を単離することができる。
【０１９０】
例えば、その係留のＧｚＢによる切断によって活性化される、不活性な、膜係留Ｃｒｅリコンビナーゼを使用する、ＧｚＢ活性の検出のための１つの方法が開発された。これは、Ｃｒｅを放出し、核に侵入し、Ｔ細胞認識に応答してレポーターを活性化する。ＬｏｘＰレポーターのＣｒｅ媒介組換えにより、認識された細胞における抗原カセットのＰＣＲ増幅が可能となるプライマー構造が生じる。生産的に認識される抗原は、細胞傷害性細胞による処置後に標的細胞に由来するＰＣＲ産物のＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングによって特定することができる。 sequencing of the PCR product from target cells after treatment with cytotoxic cells.  この手法は、図６Ａに図示される。
【０１９１】
この手法の実行可能性を実証するために、試験を実施した。標的細胞は、１）テザー上にＧｚＢ切断配列を有する膜係留Ｃｒｅリコンビナーゼ、２）Ｃｒｅリコンビナーゼによって逆位し得る２つのｌｏｘＰ部位を含有するレポーターカセット、および３）アポトーシスの間にゲノムＤＮＡを保存するためのＩＣＡＤのＤ１１７Ｅ突然変異体形態を発現するように改変された。ナチュラルキラー細胞によるこれらの標的細胞へのＧｚＢの導入により、ｑＰＣＲによって検出されるように、Ｃｒｅリコンビナーゼの切断とレポーターの逆位のおよそ３倍の増加がもたらされた（図６Ｂ）。このレポーターは、細胞傷害性Ｔ細胞にも同様に作用し、ＮＫ細胞と同じパーフォリンおよびグランザイム媒介細胞分解の機構を使用する。これは、ＧｚＢ活性を検出するために、Ｃｒｅリコンビナーゼを使用することの実行可能性を実証し、死滅のために標的とされる細胞からインタクトなＤＮＡを回収する本発明者らの能力を強調する。
【０１９２】
別の代替案は、ＧｚＢよりもむしろ、カスパーゼレポーターを使用することであろう。しかしながら、グランザイムレポーターは、カスパーゼレポーターと異なり、カスパーゼ媒介アポトーシスの間に活性化されず、本発明者らのＴ細胞死滅アッセイの状況で、より低いレベルのバックグラウンド活性化を有する（陽性シグナルの影響を受けず、およそ３倍バックグラウンドを低減した）。
【０１９３】
ＧｚＢ活性を検出するために開発された別の手法は、抗体標的に対する染色に基づき（細胞内であっても細胞外であっても、レポーターが細胞質で発現するかまたは膜に対して標的とされるかに応じて）、これは、ＧｚＢに対する基質として作用するレポーターの、次に起こるＧｚＢによる切断でのみで明らかとなる。レポーターは、ＧｚＢ切断モチーフに直接的に先行するＦｌａｇエピトープを含有する。切断の前には、内部のＦｌａｇエピトープはＭ１  Ｆｌａｇ抗体によって認識されず、Ｎ末端のＦｌａｇエピトープを認識するにすぎない。しかしながら、ＧｚＢ切断後には、ＦｌａｇエピトープがＣ末端切断断片のＮ末端に曝露され、Ｍ１抗体を使用して染色され得る。この手法は、図７Ａに例証される。
【０１９４】
この方法によって、ＮＫ細胞（この概念証明実験において細胞傷害性リンパ球として作用する）によるＧｚＢの送達の有無にかかわらず、ＧｚＢレポーターを発現する標的細胞由来の細胞溶解液に関して、Ｍ１  Ｆｌａｇ抗体を使用するウエスタンブロット解析によって検出されるように、ＮＫ細胞によって送達されたＧｚＢに対するレポーターの曝露後に、Ｍ１抗体標的の存在量に顕著な増加が生じた（図７Ｂ）。切断された基質は、本明細書に記載のスクリーニング方法に適合する抗体染色およびフローサイトメトリーによってさらに検出され得る。
【０１９５】
標的細胞におけるＧｚＢ活性のさらに別のレポーターは、ＥＲ保持モチーフを有する細胞内に隔離されるレポータータンパク質に基づく。ＥＲ保持モチーフのＧｚＢによる切断に際し、レポータータンパク質を、細胞表面への輸送などによって、放出および検出することができ、標的細胞の単離のために使用することができる。この手法によってタンパク質分解を検出するのに成功することができることを実証するために、ＥＲ保持モチーフの前にＴＥＶ切断部位を含むＣＤ４をレポータータンパク質として使用した。ＥＲ保持のために、ＥＲにおいてタンパク質を隔離することが以前に報告されている、Ｃ末端のＫＫＸＸモチーフ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）、例えば、ＫＫＹＬ（配列番号１７）を使用した（Nilsson et al., Cell、58(4): 707-718(1989)を参照のこと）。レポーターの発現を追跡するために、このレポーターをＧＦＰに融合させた。構築物および配列の全体を以下に表す。ＴＥＶの構築物との共培養によって、細胞表面のＣＤ４が有意に増加した（図２５）。
【０１９６】
使用されるＫＫＸＸレポーター配列は、以下の通りである：
【０１９７】
【化２】
2020523012.tif 000004
【０１９８】
[実施例５]
ゲノム−ワイドスクリーニングにより公知および新規のＴ細胞標的を特定する
様々なＴ細胞集団に対して記載された組成物および方法を適用するスクリーニングのセットを実施した。これらのスクリーニングは、この組成物および方法によって、以前に特徴付けたＴＣＲの正確な標的抗原が特定され、重要なことに、ゲノム−ワイドスケールのＴ細胞集団の、新規の、生物学的に意味のある抗原が発見されることを実証した。
【０１９９】
公知のＴＣＲの標的が正確に特定されることを実証するために、ＣＭＶ  ＰＰ６５のＮＬＶエピトープを認識するＴＣＲを合成した。これは、ＴＣＲが、レンチウイルスの形質導入によって一次ドナーＣＤ８  Ｔ細胞中に導入され、これらの細胞を使用して、ＣＭＶゲノムにわたって並べて表示する２８８２の候補５６量体のライブラリーをスクリーニングした。ＮＬＶエピトープを含有するライブラリーにおいて２つの５６アミノ酸ペプチドだけが、ライブラリーにおける上位２つのスコアのペプチドであり、７から２０倍エンリッチされていた（図１６および表１）。 注目すべきことに、他のペプチドは、４倍を超えて再生可能にエンリッチされなかった。この実験は、このプラットフォームによって、ドナーのＣＤ８  Ｔ細胞中に導入された「復活した」ＴＣＲの標的を特定することに成功したことを実証した。
【０２００】
【表１】
2020523012.tif 000005
【０２０１】
このプラットフォームによって、十から何十万もの抗原のさらに複雑なセットをスクリーニングすることができることを実証するために、ウイルス叢−ワイドスクリーニングを実施した。このスクリーニングでは、ＮＬＶペプチドの存在下で増殖させた、ＨＬＡ−Ａ２陽性、ＣＭＶ陽性のドナーに由来する一次Ｔ細胞を使用した。２８アミノ酸の重複を有する５５アミノ酸ステップにおける２０６ウイルス種の全ゲノムにわたって並べて表示する９３，０００を超える候補のライブラリーに対して、これらの細胞をスクリーニングした。ＮＬＶエピトープを含有するライブラリーにおいて２つの５６量体だけが、上位２つのエンリッチされたペプチドであり、２５から１００倍エンリッチされていた（図１７および表２）。２つのさらに重複する５６量体は、１５から４０倍エンリッチされており、これらの２つの５６量体によって共有される２８アミノ酸領域のエピトープは、インプットＣＤ８  Ｔ細胞のおよそ２％まで認識されたことが確認された（図１８）。この実験は、このプラットフォームによって、ゲノム−ワイドスケールで新規のＴ細胞標的が特定されたことを実証した。注目すべきことに、スクリーニングされた９３，０００の候補ライブラリーは、ヒトのＯＲＦｅｏｍｅコレクション全体（およそ２０，０００全長のＯＲＦ）よりも複雑である。さらに、この実験は、Ｔ細胞の２％のサブセットによって認識されたにすぎない新規標的が特定および確認されたため、複数のＴ細胞集団を一度に特徴付けることができることを示した。
【０２０２】
【表２】
2020523012.tif 000006
【０２０３】
次に、ポリクローナルＴ細胞の新規の免疫優勢標的を全ゲノムスケールで特定できたことを実証するために、ゲノム−ワイドライブラリー対ライブラリースクリーニングを実施した。バルクメモリーＴ細胞をＨＬＡ−Ａ２陽性、ＣＭＶ陽性のドナーから精製した。これらのＴ細胞を、２，８８２エピトープのＣＭＶ−ワイドライブラリーに対してスクリーニングした。再生可能にエンリッチされた６セットの重複する５６量体を特定した（表３）。 これらの候補抗原の６つすべてが、２８アミノ酸の重複する領域において、高いアフィニティーが予測されるＨＬＡ−Ａ２バインダーを含有する（図２０）。対照的に、２８アミノ酸のストレッチの１０％だけが、高いアフィニティーのＨＬＡ−Ａ２バインダーを含有することが予測される。エンリッチされたエピトープのうちの１つは、公知の免疫優性ＰＰ６５エピトープであり、Ｔ細胞の０．３％まで認識されたことが確認された。残りの５つの特定されたエピトープは、以前には報告されていなかった。この実験は、ポリクローナルＴ細胞の新規のＴ細胞標的が、ライブラリー対ライブラリーの設定で、ゲノムスケールで特定され得ることを実証した。
【０２０４】
【表３】
2020523012.tif 000007
【０２０５】
表３は、図１９に記載されるスクリーニングにおいて再生可能にエンリッチされた重複する５６量体の６つのセットを示す。６／６の場合には、２８アミノ酸重複領域（太字）に見出される高いアフィニティーが予測されるＨＬＡ−Ａ２結合エピトープが存在する。対照的に、２８量体の１０％だけが、高いアフィニティーのＨＬＡ−Ａ２結合エピトープを有することが予測される。エピトープ１３３６〜１３３７は、十分に確立された免疫優勢エピトープであるが、一方、残りの５つのエピトープは、以前には報告されていなかった。
【０２０６】
このプラットフォームによって、ＴＣＲ−エピトープ相互作用のランドスケープがマッピングされることを実証するために、包括的突然変異誘発スクリーニングを実施した。上記のＮＬＶにより増殖された一次Ｔ細胞を使用した。２つの上流および下流の残基に加えて、公知の標的エピトープの単一のアミノ酸突然変異体のすべてのライブラリーをスクリーニングした。上流または下流のアミノ酸の突然変異体は、Ｔ細胞の認識を破棄しなかったが、一方、エピトープ自体におけるほとんどの突然変異は、エピトープ認識を低下させた（図６）。この手法によって、より大きな抗原が認識される状況で、Ｔ細胞の正確に認識されたエピトープが正確にマッピングされる。さらに、この手法を使用して、関連するオフターゲットペプチド配列を検索するために使用することができる、重要な、許容されるＴＣＲ相互作用残基をマッピングすることによって、Ｔ細胞に対する潜在的なオフターゲットを特定することができる。
【０２０７】
このプラットフォームによって、複数回のスクリーニングによって、標的エピトープの継続的なエンリッチメントが可能となる。ＨＩＶポリメラーゼのＩＶ９エピトープを認識するＴＣＲをコードする遺伝子を合成し、レンチウイルスの形質導入によって、一次ドナーＣＤ８  Ｔ細胞中に導入した。得られた細胞を使用して、ＨＩＶの１０種の株のゲノムにわたって並べて表示する１，２４７の候補の５６量体のライブラリーをスクリーニングした。２回目の選択を実施するために、単離した抗原を増幅させ、レンチウイルス発現ベクターに再度クローニングした。次いで、これらを、ウイルスの形質導入によって、標的細胞中に導入した。同じＩＶ９  Ｔ細胞に関して、スクリーニングを繰り返した。ＩＶ９  ＴＣＲの公知の標的のエンリッチメントの増加が、２回目の選択で観察された（図２１）。したがって、このプラットフォームを複数回の選択で使用して、抗原特定の性能を改善することができる。
【０２０８】
[実施例６]
腫瘍由来のＴＣＲへのプラットフォームの適用
このプラットフォームによって、腫瘍由来のＴＣＲの標的を特定することができることを実証するために、シグナルノイズ解析を行った。Ｔ細胞活性のシグナルノイズ解析により、その既知の抗原の非存在下に対する存在下での、Ｔ細胞がレポーターを活性化する効率を定量する。ウイルススクリーニングのすべてについて、実際のスクリーニングにおいて観察される標的のエンリッチメントについて、シグナルノイズ測定は非常に予測的であった。腫瘍抗原を認識することについて本発明者らが研究しているＴ細胞は、本発明者らが以前に使用した抗ウイルスＴ細胞に匹敵するシグナルノイズを与え、このスクリーニング研究に十分な信頼をさらに与える（図２２）。これによって、腫瘍由来のＴＣＲなどのＴＣＲの公知かつ新規の標的を特定するための様々なゲノム−ワイドヒトスクリーニングが可能となる。
【０２０９】
[実施例７]
ＣＡＤ媒介ＤＮＡ分解を阻害すること
Ｔ細胞活性についてのグランザイムベースの検出の重要な課題は、グランザイムが、標的細胞中に侵入した際に、ヌクレアーゼＣＡＤによるゲノムＤＮＡの特徴的なヌクレオソーム間の分解を含む、アポトーシスを開始することである。アポトーシスの前に、その阻害剤タンパク質であるＩＣＡＤによって、ＣＡＤを不活性に保つ。ＩＣＡＤは、アポトーシスの間に分解される、直接的なカスパーゼ基質であり、ＣＡＤがＤＮＡを分解するのを妨げる。このプラットフォームによって、グランザイムを受容した細胞からのインタクトな抗原カセットのＤＮＡの回収が可能となる。よって、早期のアポトーシスの間に起こるＤＮＡ分解が、Ｔ細胞認識を駆動した抗原を特定する能力を制限する。この課題は、ＣＡＤ媒介ＤＮＡ分解を阻害することによって克服できることが、本明細書において決定されている。例えば、標的細胞において、過剰発現する突然変異体である、ＩＣＡＤタンパク質のカスパーゼ耐性バージョンによって、グランザイム送達後のＣＡＤヌクレアーゼ活性が妨げられることを決定している。この突然変異体ＩＣＡＤの過剰発現により、アポトーシスの誘導後のゲノムＤＮＡのラダリングが妨げられることが確認された（図２３）。
【０２１０】
抗原情報を回収するために、ＣＡＤ媒介ＤＮＡ分解を阻害することが、スクリーニングの設定において重要であることが決定された。ＩＣＡＤの過剰発現の有無にかかわらず、実施された別々のスクリーニング状況での抗原回収の効率を計算した。簡潔には、予期されるポワゾン分布の細胞数に対する抗原当たりのリードの観察された分布をマッピングし、フィットを使用して、各スクリーニング複製において特徴付けた細胞総数を推定した。次いで、シークエンシングによって回収したこの細胞数をＦＡＣＳによって単離された公知の細胞数と比較し、抗原回収の正味の効率を決定した。ＩＣＡＤの非存在下で行ったスクリーニングの６つの複製にわたって、選別した細胞の１〜２％のみから抗原情報を回収した（図２４）。対照的に、突然変異体ＩＣＡＤの過剰発現に関して実施したスクリーニングは、およそ１０倍高い抗原回収の効率をもたらした（図２４）。注目すべきことに、スクリーニング間のゲノムＤＮＡ調製、ＰＣＲ、およびシークエンシングステップにおいて差はなかった。これらの結果は、例えば、突然変異体ＩＣＡＤの過剰発現による、ＤＮＡ分解の阻害により、アッセイの性能がおよそ１０倍改善し、有意により複雑な抗原ライブラリーのスクリーニングが可能となることを示す。
【０２１１】
（参照文献）
Cameron, BJ et al. Identification of a Titin-Derived HLA-A1-Presented Peptide as a Cross-Reactive Target for Engineered MAGE A3-Directed T Cells. Sci Trans Med 197ra103 (2013).
Sakahira, H., Enari, M. & Nagata, S. Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis. Nature 391, 96-99 (1998).
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Kolowos, W., Schmitt, M., Herrman, M., Harrer, E., Low, P., Kalden, J.R., Harrer, T. (1999) Biased TCR Repertoire in HIV-1-Infected Patients Due to Clonal Expansion of HIV-1-Reverse Transcriptase-Specific CTL Clones. J Immunol 162:7525-7533.
Schub, A., Schuster, I.G., Hammerschmidt, W., Moosmann, A. (2009) CMV-Specific TCR-Transgenic T Cells for Immunotherapy. J Immunol, 183:6819-6830.
Xu, G.J.,* Kula, T.,* Xu, Q., Li, M.Z., Vernon, S.D., Ndung’u, T., Ruxrungtham, K., Sanchez, J., Brander, C., Chung, R.T., O’Connor, K.C., Walker, B., Larman, H.B., Elledge, S.J. (2015) Comprehensive serological profiling of human populations using a synthetic human virome. Science, 348 (6239), aaa0698
【０２１２】
他の実施形態
ある特定の実施形態および実施例の文脈において本出願を開示したが、当業者であれば、本出願の実施形態は、具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替的実施形態および／または使用、ならびにそれらの改変および均等物にも拡張されることを理解するであろう。
【０２１３】
本明細書において参照されるすべての特許、特許出願、特許出願の公報、および他の資料、例えば、論文、書籍、明細書、刊行物、文書、物品などは、それらと関連付けられるいずれかの起訴ファイル履歴、本文書と不一致または対立するそれらのうちのいずれか、または現在または今後、本文書と関連付けられる請求項の最も広範な範囲に関して限定的な作用を有し得るそれらのうちのいずれかを除いて、あらゆる目的で、これによって、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例としては、組み込まれる資料のいずれかと関連付けられる用語の説明、定義、および／または使用と、本文書に関連付けられる用語の説明、定義、および／または使用との間にいずれかの不一致または対立が存在する場合、本文書における用語の説明、定義、および／または使用が優先される。
【０２１４】
本明細書に開示の本出願の実施形態は、本出願の実施形態の原則の例証であることを理解するべきである。用いることができる他の修正は、本出願の範囲内にあり得る。よって、例として、限定するものではないが、本出願の実施形態の代替の構成を、本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本出願の実施形態は、正確に示され、記載されたものに限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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