(57)【要約】  本願明細書は、形状変化センサーコンポーネントの形状の変化を電気信号に変換し、その電気信号から１つ以上の派生値が生成する、電気機械配列ディテクターを論じる。開示する実施形態において、配列検出システムは、ターゲット内のエンティティと特異的に相互作用する場合に形状を変化する機械的変化センサー、機械的変化センサーの形状の変化を電気信号に変換する形状−信号変換コンポーネント、電気信号を用いてターゲット内のエンティティのタイプを決定する分析サブシステム、および、配列−検出システムの操作特性を連続的にモニターし、配列−検出システムの操作パラメータを調節する制御サブシステムを含む。
2020533951.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ターゲット内のエンティティと特異的に相互作用する場合に１つ以上の機械的変化を示す機械的変化センサー、ここに各々のエンティティはタイプを有し；
１つ以上の機械的変化を信号に変換する機械的変化−信号トランスデューサー；
信号を使用してターゲット内のエンティティのタイプの配列を決定する分析サブシステム；および
１つ以上の操作パラメータに従って配列−検出システムを初期化し、および
配列−検出システムを制御して、信号を生成し、信号のサンプルを収集し、および信号を分析してターゲット内のエンティティのタイプの配列を決定する
制御サブシステム
を含む配列検出システム。
【請求項２】
ターゲットは、プライマー会合核酸テンプレートポリマーであり；
エンティティは、ヌクレオチドモノマーであり；
機械的変化センサーは、第1の溶液を含有するチャンバー内に含まれる核酸ポリメラーゼであり；および
機械的変化−信号トランスデューサーは、さらに
第1の溶液を含有するチャンバーと第2の溶液を含有するチャンバーとの間に流体連通を提供するポリンチャネルを通る電流のフローを調節する可変レジスター、
機械的変化コンポーネントを可変レジスターに結合する機械的カプラー、および
ポリンチャネルを通る電流のフローの割合に応じて変化する電圧信号を出力する電流−電圧コンバーターを含む、請求項１に記載の配列検出システム。
【請求項３】
操作パラメータは、
ポリンチャネルを横切って印加される読み出し電圧の電圧の大きさおよび読み出し電圧の極性；
ポリンチャネルを横切って印加されるノイズ阻害電圧の電圧の大きさおよびノイズ阻害電圧の極性；
ポリンチャネルを横切って印加される構成電圧の電圧の大きさおよび構成電圧の極性
を含む、請求項２に記載の配列検出システム。
【請求項４】
ノイズ阻害電圧の極性は、読み出し電圧の極性とは反対であり；および
ノイズ阻害電圧の極性は、構成電圧の極性とは反対である、請求項３に記載の配列検出システム。
【請求項５】
制御サブシステムは、ポリンチャネルを横切って構成電圧を構成極性で印加して、核酸ポリメラーゼ機械的変化センサーをポリン内に落ち着かせる（seat）ことによって配列検出システムを構成する、請求項３に記載の配列検出システム。
【請求項６】
配列検出システムの構成に続いて、制御サブシステムは、読み出し電圧の大きさを調節して、核酸ポリマーテザーのレポーター領域を基準変位に位置付けする、請求項５に記載の配列検出システム。
【請求項７】
配列検出システムの構成に続いて、制御サブシステムは、配列検出システムを制御して、
ポリンチャネルを横切って読み出し電圧を読み出し電圧の極性で第1の時間にわたって印加し、その間に電圧出力信号をサンプリングし、メモリに保存し、分析サブシステムによって分析し、および
ポリンチャネルを横切ってノイズ阻害電圧をノイズ阻害電圧の極性で第２の時間にわたって印加し、
これらを終了条件が生じるまで反復して行うことによって、信号を生成し、そのサンプルを収集し、分析して、ターゲット内のエンティティのタイプの配列を決定する、請求項３に記載の配列検出システム。
【請求項８】
第1および第2の時間の長さは、操作パラメータによって指定される、請求項７に記載の配列検出システム。
【請求項９】
終了条件は、
電源オフイベント；および
配列検出システムによる閾値レベル未満の配列情報生成の割合の低下
を含む、請求項７に記載の配列検出システム。
【請求項１０】
操作パラメータは、
温度；
第１および第２の溶液を含有するチャンバー中の溶液のpH；および
第１および第２の溶液を含有するチャンバー中の溶液の内容物
を含む、請求項２に記載の配列検出システム。
【請求項１１】
第１および第２の溶液を含有するチャンバー中の溶液の内容物に関連する操作パラメータは：
溶液中の1以上のタイプのイオン化された塩；
溶液中の1以上のタイプのイオン化された塩の濃度；
第1の溶液を含有するチャンバー中の溶液中の１以上のタイプのヌクレオチドポリリン酸；
第1の溶液を含有するチャンバー中の溶液中の１以上のタイプのヌクレオチドポリリン酸の濃度；
第1の溶液を含有するチャンバー中の溶液中の１以上のタイプのプライマー会合核酸テンプレートポリマー；
第１の溶液を含有するチャンバー中の溶液中の１以上のタイプのプライマー会合核酸テンプレートポリマーの濃度；および
核酸ポリマーテザーのタイプおよび構造
の１つ以上を包含する、請求項１０に記載の配列検出システム。
【請求項１２】
第1の溶液を含有するチャンバー中の溶液中の溶液の内容物に関連する操作パラメータは、調節してターゲット内のエンティティと機械的変化センサーとの一連の（sequential）特異的相互作用の割合を制御する、請求項１０に記載の配列検出システム。
【請求項１３】
3'ジデオキシヌクレオチドモノマーを有するプライマーを用いて、単一のエンティティと特異的に相互作用するように配列検出システムを制限する、請求項１０に記載の配列検出システム。
【請求項１４】
配列検出システムの信号応答は、信号応答に対応するヌクレオチド−モノマー配列を有するレポーター領域を選択することにより構成される、請求項２に記載の配列検出システム。
【請求項１５】
ターゲット内のエンティティの配列を決定する方法であって、
１以上の操作パラメータに従って配列検出システムを初期化し；および
配列検出システムを制御して、信号を生成し、そのサンプルを収集し、および分析してターゲット内のエンティティタイプの配列を決定することを含み、
前記配列検出システムは、
ターゲット内のエンティティと特異的に相互作用する場合に１つ以上の機械的変化を示す機械的変化センサー（各々のエンティティはタイプを有する）、
１つ以上の機械的変化を信号に変換する機械的変化−信号トランスデューサー、および
信号を使用してターゲット内のエンティティのタイプを決定する分析サブシステム
を有する、方法。
【請求項１６】
配列検出システムを制御して、信号応答に対応するヌクレオチド−モノマー配列を有するレポーター領域を選択することにより、ターゲット内のエンティティに対する特定の信号応答を生成することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
配列検出システムを制御して、機械的変化センサーが特定の位置のエンティティとのみ特異的に相互作用できるようにターゲットを修飾することによって、ターゲット内の特定の位置のエンティティのタイプを決定することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
力を加えて、機械的変化センサーを機械的変化−信号トランスデューサーに載せ、および
前記機械的変化センサーが機械的変化−信号トランスデューサーに載った場合の配列検出システムの信号特性を検出する
ことによって、配列検出システムを制御して配列検出システムを構成することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
１つ以上の操作パラメータに従って配列検出システムを初期化することは、機械的変化センサーを制御するように選択された1つ以上の操作パラメータ値に従って配列検出システムを初期化して、特定の平均時間の特異的相互作用でターゲット内のエンティティと順次(sequentially）、特異的に相互作用することをさらに含む、請求項１５に記載の配列検出システム。
【請求項２０】
機械的変化−信号トランスデューサーの２つのサブコンポーネントに対する相対的な位置を選択するために力を加えることによって、配列検出システムを制御して配列検出システムを較正することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景
産業および研究環境では、さまざまな種類のオブジェクトまたはエンティティの配列に遭遇する。DNA配列決定およびRNA配列決定は、多くの異なる研究、診断、法医学、および製薬のプロセスと応用で採用されている。多くの配列検出システムは、複数のタイプのディテクターと、ディテクターから出力される複数のタイプの信号を使用して、入力ターゲット配列内のエンティティとオブジェクトのタイプを識別する。多くの場合、電磁気センサーは、電磁気センサーを通過するオブジェクトやエンティティの寸法および電気特性によって異なる電気信号を生成するために使用される。特定の配列検出システムでは、光学センサーを使用して、オブジェクトまたはエンティティによって吸収される光の波長によって、またはオブジェクトまたはエンティティから生成される光学画像の計算処理によって、ターゲット配列内のエンティティおよびオブジェクトを識別および分類する。さらなるディテクターには、重量ディテクター、体積ディテクター、および磁化率ディテクターが含まれる。
【０００２】
配列ディテクターは、多くの場合、入力ターゲットのオブジェクトまたはエンティティの配列を決定および報告する信頼性および精度によって、入力ターゲット配列を同定する速度によって、および配列ディテクターのコストおよび複雑さによって特徴付けられる。多くの場合、信頼性および精度の増大は費用および複雑さの増大を伴う。現実世界の適用において配列ディテクターを最適に使用するために、システムおよびプロセスエンジニアは、特定の適用に使用するためのさまざまなタイプの配列ディテクターを評価および比較しようとしている。このため、システムおよびプロセスエンジニア、研究者、診断士、および配列ディテクターのその他のユーザーは、配列検出パラメータおよび特定の適用の目標を最適に満たす特定の配列検出プロセスおよびシステムの同定および展開を促進するために、新しい異なるタイプの配列ディテクターを継続的に探している。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本明細書では、ターゲット内のエンティティと特異的に相互作用する場合に1つまたはそれを超える機械的変化を示す機械的変化センサーを含む検出システムを論じる。各エンティティは、タイプ、1つまたはそれを超える機械的変化を信号に変換する機械的変化−信号トランスデューサー、および信号を使用してターゲット内のエンティティのタイプを決定する分析サブシステムを有する。本明細書は、活性部位内のヌクレオチドポリリン酸と特異的に会合する場合に機械的変化を示す核酸−ポリメラーゼ機械的変化コンポーネント；核酸−ポリメラーゼ機械的変化コンポーネントにおける機械的変化を出力信号に変換する機械的変化−信号トランスデューサー、および核酸ポリマーターゲット内のモノマータイプの配列を外部信号を使用して決定する分析サブシステムを含む、配列検出システムをさらに論じる。本明細書は、さらに、配列検出システムによって信号出力からモノマー配列を決定する方法を論じ、この方法には、モノマーの配列中の異なるモノマーに各々対応する信号の部分を各信号部分について同定し、信号部分からn派生値（n derived value）（nは２以上の整数）を計算し、n派生値を特定のタイプのモノマーに対応するn次元レンジボリューム（n−dimensional range volume）にマッピングし、信号部分に割り当てられたモノマータイプに相補的なモノマータイプの配列の象徴的な表示を発生および保存することが含まれる。ある種の場合において、信号派生値は、モノマーの配列中の異なるモノマーを同定するのに十分となり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００４】
【図１】図1は、１つの例において、第１のタイプの機械的変化ベースの配列ディテクターへのターゲット入力、およびそれによる決定した配列表示出力を示す。
【０００５】
【図２】図2は、第1のタイプの機械的変化ベースの配列ディテクターに基づく配列検出システムの１つの実施を示す。
【０００６】
【図３Ａ−３Ｆ】図3A〜3Fは、１つの例において、図2に示す配列検出システムの機械的変化センサーコンポーネントを示す。
【０００７】
【図４】図4は、１つの例において、図2に示す配列検出システム内の機械的変化−検出サブシステムによる機械的変化センサーコンポーネントの形状の変化からの電圧信号の生成を示す。
【０００８】
【図５】図5は、１つの例において、図2に示す機械的変化ベースの配列ディテクター204の内部コンポーネントを示す。
【０００９】
【図６Ａ−６Ｄ】図6A〜6Dは、１つの例において、ターゲット内で生じる4つの異なるタイプのオブジェクトのそれぞれによって生成された電圧信号を示す。
【００１０】
【図７】図7は、4つのオブジェクトタイプa、b、c、dそれぞれの10個のオブジェクトを含む試験ターゲットから配列検出システムによって生成された仮想分析結果を示す。
【００１１】
【図８】図8は、図7に示すデータ表に含まれる平均電圧−大きさデータのプロットを示す。
【００１２】
【図９】図9は、図7に示す表に含まれるデータの2次元プロットを示す。
【００１３】
【図１０】図10は、1つの例において、オブジェクトタイプの決定に3つの派生値を使用することを示す。
【００１４】
【図１１】図11は、図1〜10を参照して先に論じた配列検出システムをまとめたものである。
【００１５】
【図１２】図12は、図1〜11を参照して先に論じた１つの例の第１の配列−決定システム、および本明細書のこのサブセクションで論じる第２の配列−決定システムを比較する表を提供する。
【００１６】
【図１３】図13は、１つの例において、第2の配列検出システムに含まれる機械的変化ベースの配列ディテクターを示す。
【００１７】
【図１４Ａ−１４Ｂ】図14A〜14Bは、第2の配列検出システムのさまざまな実施態様で別々にまたは一緒に使用される2つの異なる電流−電圧コンバーター回路を示す。
【００１８】
【図１５】図15は、１つの例において、並列配列決定を提供するセルのアレイを示す。
【００１９】
【図１６】図16は短いDNAポリマーを示す。
【００２０】
【図１７Ａ−１７Ｂ】図17A〜17Bは、2つの対向する平行DNA鎖のプリン塩基およびピリミジン塩基間の水素結合を示す。
【００２１】
【図１８Ａ−１８Ｂ】図18A〜18Bは二本鎖DNAを示す。
【００２２】
【図１９】図19は、20種類の一般的なアミノ酸の名前と化学構造を示す。
【００２３】
【図２０】図20は、第2の配列検出システムで機械的変化センサーコンポーネントとして使用するE.coli DNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメントによって触媒される重合反応を示す。
【００２４】
【図２１Ａ−２１Ｅ】図21A〜21Eは、E.coli DNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメントによって触媒されるコピー鎖伸長を示す。
【００２５】
【図２２Ａ−２２Ｂ】図22A〜22Bは、１つの例において、第2の配列検出システムの可変抵抗コンポーネントを示す。
【００２６】
【図２３】図23は、１つの例において、DNAポリメラーゼを可変抵抗コンポーネントに機械的に結合し、さらに可変抵抗コンポーネントの一部分を形成するDNAポリマーテザーのいくつかの特徴機能を示す。
【００２７】
【図２４】図24は、１つの例において、セルの信号応答の調整を示す。
【００２８】
【図２５】図25は、１つの例において、E.coli DNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメントを形状変化センサーコンポーネントとして使用した場合の第2のタイプの配列検出システム内での周期的なノイズの発生を示す。
【００２９】
【図２６】図26は、E.coli DNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメントによって触媒されるコピー鎖伸長を示す。
【００３０】
【図２７】図27は、１つの例において、単一位置のデオキシヌクレオチド−モノマータイプの決定のために構成されたプライマー会合型テンプレートDNA鎖を示す。
【００３１】
【図２８】図28は、１つの例において、第2のタイプの配列検出システムの動作を設定、校正、調整操作するために調整できるさまざまなタイプのパラメータをリストしている。
【００３２】
【図２９Ａ−２９Ｃ】図29A〜29Cは、１つの例において、ポリンチャネル内にDNAポリマーテザーを確実に保持するためのロックオリゴヌクレオチド（locking oligonucleotide）の使用を示す。
【００３３】
【図３０Ａ−３０Ｄ】図30A〜30Dは、第2のタイプの配列検出システムの1つの実施形態の制御の一例を示す制御フロー図を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本明細書では、ターゲット内のエンティティのタイプの配列を決定し得る信号を生成する配列ディテクターを論じる。本明細書に記載する配列ディテクターは、例えば、電気機械装置であってもよい。電気機械装置とは、電気コンポーネントと機械コンポーネントの両方を含む装置であり、追加の光学コンポーネント、流体コンポーネント、およびその他のコンポーネントを含んでいてもよい。配列ディテクターの例は、ターゲットのエンティティタイプの配列を決定できる信号を生成することにより配列を検出する。配列ディテクターは、信号を分析してエンティティタイプの配列を決定する、マイクロプロセッサ制御の信号分析コンポーネントなどのコンポーネントを含んでもよい。ターゲットにはエンティティの配列が含まれ、各エンティティにはタイプがある。配列ディテクターは、ターゲットと物理的に相互作用し、配列ディテクター内の機械的変化センサーがターゲット中の異なるタイプのエンティティと特異的に相互作用するときに変化する信号を生成する。特異的な相互作用は、機械的変化センサーと、機械的変化−信号トランスデューサーによって対応する信号に変換されるエンティティが属するエンティティタイプの機械的変化センサー特性における機械的変化を決定論的に生成するエンティティとの間の相互作用であり、対応する信号はエンティティが属するエンティティタイプの特性でもある。機械的変化には、機械的変化−信号トランスデューサーの形状および／またはサイズの変化、他のコンポーネントに対する機械的変化−信号トランスデューサーのポジションの変化、他のコンポーネントに対する機械的変化−信号トランスデューサーの向きの変化、および他のそのような機械的変化が含まれ得る。本明細書においては、ターゲットおよび対応する配列ディテクターの2つの異なる例について、以下の2つのサブセクションで論じている。第１の例のターゲットは、ストリングまたはワイヤで一緒に接続されたマクロスケールオブジェクトの線形配列である。各オブジェクトは、4つの異なる形状のいずれか１つを有する。オブジェクトのタイプは、オブジェクトの形状に対応する。第1の対応する配列ディテクターは、ターゲットが機械的変化センサーを通過し、機械的変化センサーが各オブジェクトと特異的に相互作用し、可変レジスターによるオブジェクトの形状の電気信号特性に変換される機械的変化センサーにおける機械的変化を生じる際に、時間変化する電気信号を生成する。第2の例のターゲットは、共有結合によって互いに結合したモノマーの配列を含む生体高分子である。以下の説明で例として使用するDNAおよびRNAポリマーにおいては、化学組成および構造が互いに異なる4つの一般的に発生する異なるタイプのモノマーがあり、追加のタイプのモノマーはあまり発生しない。第2の対応する配列ディテクターは、ターゲット生体高分子が機械的変化センサーを通過し、機械的変化センサーがモノマーと特異的に会合して機械的変化センサー内における機械的変化を生じ、ついでそれがカップラーによって可変レジスターに連絡される際に、時間変化する電気信号を生成する。これらの２つのタイプのディテクターは例であって、他の構成も存在し、実施し得る。
第１のタイプの機械的変化ベースの電気機械的配列ディテクター
【００３５】
図1は、１つの例において、最初の（タイプの）機械的変化ベースの配列ディテクター、へのターゲット入力、および決定された配列表示出力を示す。ターゲット102は、オブジェクト104〜116の線形配列である。この例では、ターゲットに含まれるオブジェクトには4つの異なるタイプが存在する：（1）タイプaという円筒形オブジェクトタイプ120；（2）タイプbという立方体オブジェクトタイプ122；（3）タイプcという球体オブジェクトタイプ124；および（4）タイプdという四角錐オブジェクトタイプ126。ターゲット102は、オブジェクト104〜116がしっかりと取り付けられるワイヤまたはコードなどの線形間隔部材130を含む。ターゲットは、ターゲット内のオブジェクトタイプ132の配列の記号表示を出力する第1のタイプの配列ディテクターに機械的に入力される。
【００３６】
図2は、第1のタイプの機械的変化ベースの配列ディテクターをベースとする配列検出システムの１つの実施形態を示す。配列検出システム202には、ターゲット206が機械的に入力される機械的変化ベースの配列ディテクター204が含まれる。機械的変化ベースの配列ディテクターは、ターゲット208を機械的に出力し、電気信号210を分析サブシステムに出力する。分析サブシステムは、特定の配列ディテクターのコンピュータシステム212で実行されるコンピュータプログラムとして実装され、電気信号を処理してターゲット内のオブジェクトタイプの配列を決定し、オブジェクトタイプ214の決定した配列をコンピュータディスプレイデバイス216上に出力する。別の実施形態においては、分析サブシステムは、汎用コンピュータシステム以外のプロセッサー制御サブシステムによって実装される。コンピュータシステムはさらに、1つまたはそれを超えるメモリおよび／または1つまたはそれを超えるマスストレージデバイスに配列の符号化した表示を保存してもよい。配列の符号化された表示は、リモートコンピュータシステムに送信され、その後、ユーザーへの表示およびさらなる分析のために検索することができる。
【００３７】
図3A〜3Fは、１つの例において、図2に示す配列検出システムの機械的変化センサーコンポーネントを示す。図3Aに示すように、機械的変化センサーコンポーネント302は、タイン306を含む多数の柔軟なバネ状のタインが取り付けられた剛性の円形リング304を含む漏斗型デバイスである。タインは、図3Bの上方から下方への投影図に示すように、内側に放射状の向きで円錐部の表面にあるかのように配置される。図3Cは、機械的変化センサーコンポーネント310のロジカル表示を示す。図3D〜3Fを含む一連の図には、機械的変化センサーコンポーネントの操作が示されている。タイプbのオブジェクト312（図1の122）は、図3Dの機械的変化センサーコンポーネント302の背後に配置されて示されている。図3E〜3Fにおいては、オブジェクトは、機械的変化センサーコンポーネント302を通して機械的に翻訳されている。機械的変化センサーコンポーネントを通過すると、オブジェクトは図3Fに示すように柔軟なタインを外側に押し、機械的変化コンポーネントの漏斗形状をゆがめる。
【００３８】
図4は、１つの例において、図2に示す配列検出システム内の機械的変化−検出サブシステムによる機械的変化センサーコンポーネントの形状の変化からの電圧信号の生成を示す。図4の左手側には、機械的変化センサーコンポーネントの漏斗様形状が歪んでいない場合の機械的変化−検出サブシステム402が示されている。図4の右側には、機械的変化センサーコンポーネントの漏斗様形状が、機械的変化−センサーコンポーネント内のオブジェクトの存在によって歪んだ場合の、機械的変化−検出サブシステム404が示されている。機械的変化−検出サブシステム402には、機械的変化センサーコンポーネント302、ポテンショメーター406、および電圧計408が含まれる。機械的変化センサーコンポーネント302は、一端が機械的変化センサーコンポーネントのタイン412の1つに取り付けられ、もう１つの端が摺動可能なポテンショメーターアーム414に取り付けられたコードまたはワイヤ410によってポテンショメーター406に機械的に接続されている。コードまたはワイヤ410は、3つの自由に回転するプーリー416〜418を通過する。摺動可能なポテンショメーターアーム414は、ポテンショメーターアームシリンダ422内の弱いバネ420の力に抗してタイン412によって第1の位置に保持される。図4の右手側に示すように、オブジェクトの存在によって機械的変化センサーコンポーネントが歪むと、タイン412が下向きに押され、その結果、摺動可能なポテンショメーターアーム414がポテンショメーターアームシリンダー422内のバネ420によって上向きに引っ張られる。この例では、ポテンショメーター406は可変レジスターとして機能する。可変レジスターは、変更可能な電流フローに対する抵抗を備えた回路エレメントであり、ポテンショメーターは可変レジスターの一例である。図4の左手側に示す位置では、ポテンショメーターアームは抵抗426下方のポテンショメーター回路424に接続されており、その結果、電圧計408を通過する場合に電圧の低下はほとんどまたは全くない。しかしながら、ポテンショメーターアームが図4の右手側に示す位置にある場合、ポテンショメーターアームは抵抗428の途中のポイントでポテンショメーター回路424に接続され、その結果、電圧計を通過する場合に著しい電圧降下が存在する。したがって、機械的変化−検出サブシステムは、機械的変化センサーコンポーネントの形状の歪みの程度に応じて、変化する電圧信号を生成する。出力電圧信号の大きさは、機械的変化センサーコンポーネントの歪みの程度に対応する。
【００３９】
図5は、１つの例において、図2に示す機械的変化ベースの配列ディテクター204の内部コンポーネントを示す。機械的変化ベースの配列ディテクターには、図4に示す機械的変化−検出サブシステム402と、機械的変化センサーコンポーネント302を介してターゲット506のオブジェクトを供給する２つの電気モーター駆動の一対の反転ギアドラム502および504が含まれる。一対の反転ギアドラムは、機械的変化センサーコンポーネント302を介してターゲット506のオブジェクトを供給する。ターゲットが機械的変化センサーコンポーネントを通して引っ張られると、電圧計は分析サブシステム（図2の212）に入力される電圧信号210を出力する。
【００４０】
図6A〜6Dは、１つの例において、ターゲット内で発生する4種類のオブジェクトの各々によって生成される電圧信号を示す。図6Aは、タイプdのオブジェクト604が機械的変化センサーコンポーネントを通過する場合に生成された電圧信号のプロット602を示す。出力信号の電圧は垂直軸606で表され、水平方向のオブジェクトの位置はプロットの水平軸608で表される。位置は、ターゲットがセンサーを一定の速度で移動すると仮定して、水平変位または時間のいずれかで表現し得ることには注意されたい。タイプdのオブジェクトは、上部頂点と基部の中心を通る内部軸に対して回転が不安定であるため、タイプdのオブジェクトは、機械的変化センサーコンポーネントを通過する場合にこの軸を中心に前後に回転する傾向がある。また、4つの内部水平軸を中心に回転する傾向がある。その結果、オブジェクトが機械的変化センサーを通過する際に、電圧信号610は振動する傾向がある。タイプcのオブジェクト612は、図6Bに示すように、滑らかで対照的な信号614を生成する。タイプbのオブジェクト616は、図6Cに示すように、わずかな回転の不安定性によるわずかな振動を伴う対照的な信号618を示す。タイプａのオブジェクト620も、図6Dに示すように、わずかな振動を伴う対照的な出力信号622を生成する。出力された電圧信号は、計算分析サブシステム（図2の212）によって分析される。データは、矢印624などの矢印、および垂直破線626および628などの垂直破線によって図6A−6Dの各プロットに示すように、電圧信号がピーク高さの半分まで上昇したときに開始し、信号がピーク高さの半分まで戻ったときに終了する各電圧−信号曲線の領域から収集される。分析サブシステムは、各々のオブジェクト表示電圧−信号曲線、平均電圧大きさ630のような平均電圧の大きさμ、分散632のような分散σ2、および面積634のような電圧−信号曲線下の面積Aから計算する。
【００４１】
計算値は、電圧−信号曲線の中央部分内の異なる時点または変位からn個のサンプル電圧振幅viを収集することによって得られる。種々の異なる実施形態においては、現在の大きさまたは他の値が代わりにサンプリングされる場合がある。例えば、1 KHzのサンプリング頻度では、1000個のサンプル電圧の大きさが得られる。面積Aは、離散積分：
【数１】
2020533951.tif 000003
により計算される。
平均電圧の大きさは：
【数２】
2020533951.tif 000004
として計算される。
標準偏差は：
【数３】
2020533951.tif 000005
として計算される。
最終的に標準偏差は：
【数４】
2020533951.tif 000006
として計算される。
【００４２】
図7は、4つのオブジェクトタイプa、b、c、dそれぞれの10個のオブジェクトを含む試験ターゲットから配列検出システムによって生成された仮想分析結果を示す。4種類のオブジェクトのそれぞれの分析結果を表702〜705に示す。各表には、機械的変化ベースの配列ディテクターによって出力された各電圧−信号曲線の計算された電圧−大きさの平均、分散、および面積に対応する３つの列が含まれる。実験データでよく見られるように、3つの計算値は、4つの異なる種類のオブジェクトの10個の例間で変動している。分析サブシステムは、出力電圧−信号曲線を使用して、機械的変化センサーコンポーネントを通過する各オブジェクトのタイプを一意的に識別しようとする。
【００４３】
出力電圧信号を使用する一般的な方法は、平均電圧の大きさなどの単一の計算値を選択して、各タイプのオブジェクトを残りのタイプのオブジェクトから区別することである。図8は図7に示すデータ表に含まれる平均電圧−大きさデータのプロットを示す。キー802は図8の左手上部部分に示す。キーは、さまざまな種類のオブジェクトごとに平均電圧の大きさの値をプロットするために使用されるさまざまな記号を記述する。図8の下部は、電圧の大きさを表す水平軸806に対する平均電圧大きさのデータのプロット804を示す。各種類のオブジェクトの平均電圧振幅値は、破線楕円808~811によって図8に示すように水平軸のサブ領域内に密集している。タイプcのオブジェクトの平均電圧の大きさは、例えば、楕円808で示される電圧−大きさの範囲内に収っている。図8に示すデータプロットから、この例ではタイプcのオブジェクトの平均電圧の大きさの範囲と、タイプa、b、およびdのオブジェクトの平均電圧の大きさの範囲との間にはオーバーラップがないため、タイプcのオブジェクトは、平均電圧の大きさのみに基づいて残りのオブジェクトタイプと一意的に区別できる。同様に、タイプbのオブジェクト、楕円811で表される範囲内にある平均電圧の大きさの値は、平均電圧の大きさのみに基づいて、残りのタイプのオブジェクトと一意的に区別できる。しかしながら、楕円809〜810で表されるタイプdおよびaのオブジェクトの平均電圧の大きさの範囲は、互いにほぼ完全に重なり、その結果として、平均電圧の大きさの値のみを用いてはタイプdおよびaのオブジェクトを区別することはできない。
【００４４】
いくつかの例では、特定の出力信号が配列中の異なるタイプのオブジェクトを区別するのに不十分な場合は、配列ディテクターの設計者は、複数の出力信号の組み合わせが、オブジェクトを互いに区別するための十分な情報を提供するように追加の出力信号を生成するために、追加の種類のセンサーを配列ディテクターに組み込むことを求める。例えば、変化カウンターは、個別のサイズ検出センサー、重量ディテクター、および磁気感受性ディテクター（magnetic-susceptibility detector）を使用して、コインの種類ごとに明確な出力信号由来の痕跡を一緒に提供する個別の出力信号を生成する。対照的に、本明細書に記載する例の配列検出システムは、ターゲット内の各タイプのオブジェクトを区別するために、単一の出力電圧信号から複数の派生値を計算する。図6A〜6Dおよび図7を参照して先に論じたように、分析サブシステムは、オブジェクトに対応する電圧−信号曲線からの平均電圧の大きさのみならず、分散も計算する。図9は、図7に示す表に含まれるデータの2次元プロットを示す。水平軸902は、図8のように、電圧−信号曲線から得られた平均電圧の大きさを表し、垂直軸904は、電圧−信号曲線から得られた分散を表す。図8のように、破線の楕円906〜909は、異なるオブジェクトタイプごとにプロットされたデータポイントのクラスターを囲んでいる。図9で簡単にわかるように、これらの楕円内に含まれる2次元の領域は重なっていない。したがって、特定のオブジェクトの単一の出力電圧信号から計算された平均電圧の大きさおよび分散値のペアには、オブジェクトにタイプを明確に割り当てるのに十分な情報が含まれている。換言すれば、この例では、機械的変化−検出サブシステムによって生成された単一の出力電圧信号には、各オブジェクトにタイプを割り当てるのに十分な情報が含まれているが、各電圧−信号曲線内の情報は、ある意味で、2次元である。
【００４５】
図9を参照して論じたように、配列検出システムの分析サブシステムによる平均電圧の大きさおよび分散を含む2つの派生値の使用は、図1を参照して記載するターゲットが各オブジェクトまたはターゲット内のエンティティを同定するのに十分である。分析システムは、2つの派生値を座標として使用して、2つの派生値を特定のオブジェクトまたはエンティティタイプに対応する範囲エリアにマッピングする。範囲領域が重複している場合、電圧−信号曲線の下の計算された領域などの追加の派生値を使用して、ターゲット内のオブジェクトのタイプを一意的に区別し得る。図10は、1つの例において、オブジェクトタイプの決定に3つの派生値を使用することを示す。図10においては、3つの異なる派生値のそれぞれが、3つの軸1002、1004、および1006で表されている。4つの異なるオブジェクトタイプのプロットされたデータポイントは、4つの個別の重複しない楕円範囲ボリューム1010〜1013に入る。一般に、派生値の数が増えると、派生信号が適度に直交し、オブジェクトタイプの違いに敏感な場合に、異なるオブジェクトタイプの派生値の範囲でオーバーラップする確率が低下する。
【００４６】
図11は、図1〜10を参照して先に論じた配列検出システムをまとめたものである。オブジェクトまたはエンティティの配列1102を含むターゲットは、配列検出システム1104に入力され、機械翻訳コンポーネント1108によって機械的変化コンポーネント1106を介して機械的に翻訳される。電源1110は、機械翻訳のための電力を提供する。機械的変化コンポーネント1106は、カプラー1112によって可変抵抗コンポーネント1114に機械的に結合されている。機械的カプラーは、マクロスケールデバイスではストリングやコードなどの物理的カプラー、あるいはナノスケールおよびマイクロスケールデバイスではDNAポリマーなどの線形分子によって2つ以上のエンティティを結合する。可変抵抗コンポーネント1114は、機械的変化コンポーネント1106の形状の変化によって引き起こされるカプラー1112の動きに応答して、電流1116に対する可変抵抗を提供する。電源1118は、電流フロー1116を駆動する。測定コンポーネント1120は、機械的変化コンポーネント1106の形状の変化とともに変化する出力電気信号1122を生成するために、電流フローチャネルまたは電流フロー自体の電位を測定する。出力信号は、図11には示されていない分析サブシステムによって計算処理され、ターゲット1102中のオブジェクトタイプの配列の表示を生成する。図1〜11を参照して先に論じた配列検出システムは、ターゲット内のマクロスケールオブジェクトタイプの配列を決定するマクロスケールデバイスである。
第2のタイプの機械的変化ベースの電気機械配列ディテクター
【００４７】
本明細書で論じている第2の（タイプの）配列検出システムは、マクロスケール、マイクロスケール、およびナノスケールのコンポーネントを含む混合スケールのデバイスである。第2の配列検出システムは、核酸ポリマー内のデオキシヌクレオチドモノマーの配列を決定する。
【００４８】
図12は、図1〜11を参照して先に論じた第1の配列検出システムと、本明細書のこのサブセクションで論じる第2の配列検出システムとを比較する表である。表の第１の列1202には、図11を参照して先に論じた配列検出システムコンポーネントがリストされている。表の第2の列1204は、第1の配列検出システムに関して第1の列にリストされている各コンポーネントをさらに説明している。第3列1206は、第2の配列検出システムに関して第1の列にリストされた各コンポーネントをさらに説明し、以下でさらに説明する。第1の配列検出システムでは、ターゲットの機械翻訳の電源はバッテリーまたは線電流から得られる電流であるのに対し、第2の配列検出システムでは、ターゲットの機械翻訳の電源はホスホアンヒドリド結合の加水分解および無機ピロリン酸塩の加水分解により生成された化学エネルギーである。第1の配列検出システムでは、ターゲットを翻訳する機械翻訳器は2対の逆回転電気モーター駆動ギアドラムであり、表2の行1210に示されているとおり、第2の配列検出システムでは、機械翻訳器はE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ・フラグメントである。第1の配列検出システムにおいては、機械的変化コンポーネントは一連の漏斗様のばねまたは剛毛であり、第2の配列検出システムでは、表の3行目1212に示すように、機械的変化コンポーネントはDNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメントである。第1の配列検出システムにおいては、カプラーはコードまたはワイヤであり、第2の配列検出システムでは、表の4行目1214に示すように、カプラーはDNAポリマーである。第1の配列検出システムでは、可変レジスターはポテンショメーターであり、第2の配列検出システムでは、表の5行目1216に示すように、可変レジスターはMspA−ポリンチャネル内に存在するDNAポリマーカップラーの一部分である。両方の配列検出システムにおいて、流通しているのは電流である。第1の配列検出システムでは、電荷キャリアは金属線を流れる伝導帯電子であり、第2の配列検出システムでは、表の6行目1218に示すように、電荷キャリアは正および負に帯電したイオンである。しかし、もちろん、電極は通電ワイヤで接続されている。第1の配列検出システムにおいて、電流を駆動する電源はバッテリーまたは線電流から取得され、第2の配列検出システムでは、表の7行目1220に示すように、電流を駆動する電源は線電流から取得される。第1の配列検出システムでは、電流または電位測定デバイスは電圧計であり、第2の配列検出システムでは、表の8行目1222に示すように、電流または電圧測定デバイスは電流−電圧コンバーターである。したがって、第1および第2の配列検出システムは、構成と操作が互いに似ているが、異なる特定のタイプのコンポーネントを含む。
【００４９】
図13は、１つの例において、第2の配列検出システムに含まれる機械的変化ベースの配列ディテクターを示す。以下の議論では、機械的変化ベースの配列ディテクター1302を「セル」という。図13の図は、さまざまなコンポーネントの相対的なサイズおよび体積を反映していない。多くの実施形態においては、セル1302はマクロスケールまたはマイクロスケールのデバイスであるが、機械的変化センサーコンポーネント1304はナノスケールのコンポーネントである。図13は、コンポーネントの相対的なスケールを正確に描写するのではなく、機械的変化ベースの配列ディテクターのさまざまなコンポーネントの全体的な構成ならびに相対的な位置および向きを示すことを目的としている。
【００５０】
セル1302は、テフロンバリア1312および脂質二重層1314によって第2の溶液含有チャンバー1310から分離された第1の溶液含有チャンバー1308を備えた2部分容器1306を含む。１つの実施形態において、脂質二重層は、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロール−3−ホスホコリンを含む。テフロンバリアは、脂質二重層で覆われた開口部1316を含むため、第1の溶液含有チャンバー1308および第2の溶液含有チャンバー1310は、開口部1316内の脂質二重層のみによって分離される。脂質二重層を通る狭いチャネル1316は、マイコバクテリアのポリン（「MspAポリン」）、8回転対称性を有する8量体のタンパク質凝集体によって提供される。狭いチャネルは、２つの溶液含有チャンバー間でイオンの受動拡散を可能にするのに十分な幅である。第1および第2の溶液含有チャンバー1308および1310は、pH 8.0の緩衝液を含む。１つの実施形態において、緩衝液は、50 mMの4−（2−ヒドロキシエチル）−1−ピペラジンエタンスルホン酸（「HEPES」）、150 mM KCl、1 mM ジチオトレイトール（「DDT」）、および3 mM MgCl2を含む。HEPESは、両性イオンの緩衝化合物である。KClは、イオン電流を運ぶイオンを提供する。ジチオトレイトールは、タンパク質の遊離スルフヒドリル基を促進する還元剤である。MgCl2は、以下に論じる機械的変化センサーコンポーネント1304の触媒活性を支援するMg2+イオンに寄与する。第1の溶液含有チャンバー1308には、デオキシヌクレオチド三リン酸およびプライマー関連デオキシリボ核酸テンプレートがさらに含まれる。プライマー関連デオキシリボ核酸テンプレート1318〜1319は、第2の配列検出システムによってデオキシヌクレオチドモノマーの配列が決定されるターゲットである。ある種の実施形態において、第2の溶液含有チャンバー1310には、以下に論じるロックコンポーネントがさらに含まれる。第2の溶液含有チャンバー1310内の溶液は正電極または参照電極1320と流体接触し、第1の溶液含有チャンバー1308内の溶液は、負電極1322と流体接触する。１つの実施形態において、銀／塩化銀電極を用いる。電極を通してセルに電圧が印加されると、負イオンはポリンチャネルを通って正の陽極に向かって流れ、正イオンはポリンチャネルを通って負の電極に向かって流れる。１つの例において、DNAまたはRNAポリマーが細孔内に存在する場合、マイナスイオンの下向きの流れを抑制し得る。換言すれば、2つの電極1320および1322に電圧を印加することにより、ポリンチャネル内に電流が確立される。以下でさらに論じるように、セルの動作中のさまざまな時点で、電極の極性を反転させることにより、印加電圧の極性を一時的に反転させることができる。
【００５１】
別の実施形態において、テフロンバリアおよび脂質二重層を使用するのではなく、フォトリソグラフィプロセスを使用してシリコン基板または他のタイプの基板に開口部を作成し、ポリンチャネルを介する以外の2つのチャンバー間の流体連通を防ぐために合成ポリマー膜が使用する。１つの例において、トリブロックコポリマーを膜に使用し得る。別の実施形態において、単一鎖バージョンまたは8個未満または8個を超えるサブユニットを含むバージョンを含む、MspA−ポリン変異体を使用し得る。ある種の変異体は、配列が異なる複数のサブユニットを含み得る。他のタイプの細孔含有生体高分子および合成ポリマーは、別の実施形態で代替的に使用し得る。別の実施形態において、Mn2+を含む追加のタイプの二価金属イオンも使用し得る。特定の状況では、Ca2＋およびSr2＋を含む非触媒金属イオンも使用し得る。
【００５２】
１つの実施形態において、機械的変化センサーコンポーネント1304は、E.coli DNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメントである。クレノウ・フラグメントは、プロテアーゼで処理するかまたは遺伝子組み換え細菌株から目的の断片を発現させることにより、E.coli DNAポリメラーゼIから5'→3'エキソヌクレアーゼ構造ドメインを除去することにより得られる。クレノウ・フラグメントは、5'→3'重合機能を保持している。さらに後述するように、プライマー関連DNAテンプレートおよびデオキシヌクレオチド三リン酸を供給すると、E.coli DNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメントは、デオキシヌクレオチド三リン酸の逐次重合を触媒して、配列に相補的なコピーDNA鎖をテンプレートDNA鎖に形成する。結合成分1324は、DNAポリマーテザーである。それは、DNAポリマーは負に帯電し、印加電圧下で正極に向かって移動するため、機械的変化センサーコンポーネント1304に取り付き、電極に印加される電圧によってポリンチャネルに引き込まれる。以下にさらに論じるように、ポリンチャネル内の狭いくびれにまたがるDNAポリマーテザーの小さな領域は、狭いくびれに沿って、2つの溶液含有チャンバー間のイオンの流れを調整する可変レジスターとして、狭いくびれに対するDNA−ポリマーテザーの小さな領域の位置に依存して異なる程度で一緒に作用する。E.coli DNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメントおよびポリンを含むシステムはE.coli DNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメント内の活性部位を占める各々の異なるタイプのデオキシヌクレオチド三リン酸に対して差異を示すため、異なるデオキシヌクレオチド三リン酸が活性部位と特異的に会合した場合にDNA−ポリマーテザーはポリンチャネル内の狭いくびれに対して異なる動的位置を有し、それは伸長するDNAポリマー鎖内に逐次的に取り込まれる各々の異なるタイプのデオキシヌクレオチド三リン酸についてポリンチャネルを通る異なる動的電流に反映される。分子と活性部位との間の特異的な会合にはキーインロックまたは誘導適合型の会合が含まれ、そこでは、分子の特定の静電気的および化学的な特徴が相補的な静電気的および化学的特徴の活性部位と関連して、活性部位と特異的に会合しない分子に対してよりも分子または分子のクラスに対してより大きな結合親和性に通じる。違いは、1つまたはそれを超えるコンホメーション変化、ポリンチャネルに対するクレノウ・フラグメントの動き、およびその他の変化に起因し得る。以下に論じる電流検出回路は、ポリンチャネルを流れる電流の変化に対応して変化する電圧信号を生成する。別の実施形態においては、上記のクレノウ・フラグメントの代わりに、多くの異なるポリメラーゼ、ポリメラーゼフラグメント、および配列決定のために生体高分子ターゲットと相互作用する他のタイプの生体分子を使用できる。デオキシヌクレオチドヘキサホスフェートなどのより大きなリン酸エステル、異なる炭水化物成分、異なる塩基、および異なる官能基を有するヌクレオチドなど、さまざまなタイプの天然および合成ヌクレオチドを使用できる。多くのさらなるタイプの機械的変化コンポーネントを使用して、さまざまな種類のターゲット生体高分子および合成ポリマーを配列決定することができる。これには、酵素やその他のタンパク���、配列特異的な様式でターゲットタンパク質と相互作用するタンパク質／核酸複合体が含まれる。また、第２の配列検出システムに適用する場合のフレーズ「機械的変化センサーコンポーネント」は、第２の配列検出システムに適用する場合、１つの例として、信号生成が、ポリメラーゼフラグメントの形状の変化、ポリンに関するポリメラーゼフラグメントの相対的位置の変化、および／またはポリンに関するポリメラーゼフラグメントの向きの変化を示すことを示すことに注意されたい。ある種の実施形態において、ポリメラーゼフラグメントの形状の変化は、可変レジスターの動きに通じる機械的変化を提供する。最終的に、機械的変化センサーコンポーネント、および機械的変化センサーコンポーネントとターゲットおよび細孔含有成分との相互作用により、可変レジスターの位置に機械的変化が生じる。別の実施形態において、DNAポリマー以外の結合コネクタおよび可変レジスターを使用できる。
【００５３】
第1の配列検出システムはマクロスケールシステムであり、第2の配列検出システムはマクロスケールおよびナノスケールのコンポーネントを含む混合スケールシステムであるが、第2の配列検出システムは第1の配列検出システムに類似している。両方の配列検出システムは、機械的変化センサーコンポーネントを使用して、機械的変化センサーコンポーネントによって現在処理または関連付けられているオブジェクトまたはエンティティの種類によって異なる機械的信号を生成する。両方の配列検出システムは、機械的変化センサーコンポーネントによって処理する、またはそれと会合する現在のオブジェクトまたはエンティティのタイプで変化する機械的信号を生成するために機械的変化センサーコンポーネントを用いる。両方の配列検出システムは、可変抵抗コンポーネントに機械的変化センサーコンポーネントを結合するために機械的結合を採用する。両方の配列検出システムは、機械的変化センサーコンポーネントによって生成された機械信号を電気信号に変換することにより、出力電圧信号を生成する。両方の配列検出システムは、出力信号の計算分析を使用して、ターゲット配列内のオブジェクトまたはエンティティのタイプの配列を識別するために一緒に使用される複数の派生値を生成する。第2の配列検出システムでは、検出したデオキシヌクレオチド−モノマータイプの配列は、テンプレート鎖ターゲット内のデオキシヌクレオチド−モノマータイプの配列に相補的であり、逆の極性を有している。
【００５４】
図14A〜14Bは、第2の配列検出システムの種々の実施形態において別々にまたは一緒に使用される2つの異なる電流−電圧コンバーター回路を示す。図14Aでは、電圧源1402がセル1404に電圧を印加している。フィードバックレジスター1410を含むフィードバックループ1408を備えた反転増幅器、またはオペアンプ1406は、セルを流れる電流に比例する電圧信号を出力する。第2のオペアンプ1412は、入力の電圧差を増幅して増幅された電圧信号を生成し、それは周波数補正回路1414を通過して、セル1404を流れる電流に比例する最終出力電圧信号1416を生成する。図14Bは、フィードバック抵抗ではなくフィードバックコンデンサを使用する電流−電圧コンバーターを示す。
【００５５】
図15は、１つの例において、並列配列決定を提供するセルのアレイを示す。並列配列決定は、システムの配列決定スループットを増大するために使用できる。セルのアレイには、セル1502などの複数のセルと、複数のセルからの電圧信号出力を並行して処理および分析する分析サブシステム1504が含まれる。一般に、配列検出システムによって出力される配列には、機械的変化センサーコンポーネント、機械的に結合し可変抵抗コンポーネント、および電流または電位測定回路を含む、配列検出システムコンポーネントにしばしば存在する種々の異なる操作エラーソースによるエラーが含まれ得る。したがって、望ましい精度のレベルに応じて、複数の同一のターゲットを配列決定し、複数の同一のターゲットについて決定した複数の配列からコンセンサス配列を計算で生成できる。多くの場合、複数のターゲットの配列が望ましい。図15に示すセルのアレイでは、各セルに複数の異なるタイプのターゲットのそれぞれの複数のコピーをロードし得る。セルは、E.coli DNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメントとプライマー会合テンプレートとのランダムな会合に基づいて非決定的な順序で処理され、複数のタイプのターゲットから配列情報を連続的に生成する。分析サブシステム1502は、セル1504などの複数のセルから配列情報を連続的に収集し、各配列を特定のターゲットによって生成された配列のグループに割り当て、その後、各ターゲットのタイプから得られた配列のグループから各々の異なるタイプのターゲットについてコンセンサス配列を集める。並列処理を使用すると、複数のターゲットについて迅速かつ効率的なコンセンサス配列決定ができる。
【００５６】
図16〜19は、デオキシリボ核酸およびペプチドを示す。図16は短いDNAポリマーを示す。デオキシリボ核酸（「DNA」）は、ポリマーに組み込まれた場合にデオキシヌクレオチドモノマーと呼ばれる4種類の異なるデオキシヌクレオチド三リン酸から合成される線状ポリマーである。デオキシヌクレオチドモノマーには、次のものが含まれる：（1）デオキシアデニル酸、略称「A」、プリン含有デオキシヌクレオチド；（2）デオキシチミジジル酸、略称「T」、ピリミジンを含むデオキシヌクレオチド；（3）デオキシシチジル酸、略称「C」、ピリミジン含有デオキシヌクレオチド；および （4）デオキシグアニジレート、略称「G」、プリン含有デオキシヌクレオチド。対応するヌクレオシドは、ホスホジエステル結合を介してリボースヒドロキシル酸素に結合するリン酸基を欠いており、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシシチジン、およびデオキシグアノシンと呼ばれる。図16は、「オリゴマー」または「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる短いDNAポリマー1600であり、以下のサブユニットからなる：（1）デオキシアデニル酸1602；（2）デオキシチミジジル酸1604；（3）デオキシシチジル酸1606；および（4）デオキシグアニジル酸1608。デオキシヌクレオチドサブユニットは、ホスホジエステル結合1610〜1615を介して一緒に連結し、DNAポリマーを形成する。図16に示すオリゴマーなどの線状DNA分子には、5'末端1618および3'末端1620がある。しばしば、5'末端1618は、リン酸エステル結合を介して5'ヒドロキシル酸素に結合したリン酸基を含む。DNAポリマーは、5'末端から3'末端までの配列に、DNAポリマーを一緒に構成するデオキシヌクレオチドサブユニットの１文字略語を書くことによって化学的に特徴付けることができる。例えば、図16に示すオリゴマー1600は、「ATCG」として象徴的に表すことができる。デオキシヌクレオチドは、プリンまたはピリミジン塩基（例えば、デオキシアデニル酸1602のアデニン1622）、デオキシリボース糖（例えば、デオキシアデニル酸1602のデオキシリボース1624）、およびDNAポリマー中の１つのデオキシヌクレオチドを別のデオキシヌクレオチドに連結するリン酸基（例えば、リン酸1626）を含む。多くの非天然ヌクレオチドは、DNA様およびRNA様ポリヌクレオチドに組み込まれ得る。ポリヌクレオチドに含まれ得る修飾ヌクレオチドの例は、天然の骨格または類似体構造を有するかどうかにかかわらず、イノシン、キサタニン、ヒポキサタニン、イソシトシン、イソグアニン、2−アミノプリン、5−メチルシトシン、5−ヒドロキシメチルシトシン、2−アミノアデニン、6−メチルアデニン、6−メチルグアニン、2−プロピルグアニン、2−プロピルアデニン、2−チオリラシル、2−チオチミン、2−チオシトシン、15−ハロウラシル、15−ハロシトシン、5−プロピニルウラシル、5−プロピニルシトシン、6−アゾウラシル、6−アゾシトシン、6−アゾチミン、5−ウラシル、4−チオウラシル、8−ハロアデニンまたはグアニン、8−アミノアデニンまたはグアニン、8−チオールアデニンまたはグアニン、8−チオアルキルアデニンまたはグアニン、8−ヒドロキシルアデニンまたはグアニン、5−ハロ置換ウラシルまたはシトシン、7−メチルグアニン、7−メチルアデニン、8−アザグアニン、8−アザアデニン、7−デアザグア��ン、7−デアザアデニン、3−デアザグアニン、3−デアザアデニンなどが含まれる。特定のヌクレオチド類似体、例えばアデノシン5'−ホスホ硫酸などのヌクレオチド類似体は、ポリヌクレオチドに組み込むことができない。
【００５７】
生物の組織情報を含むDNAポリマーは、細胞の核内で対で発生し、二本鎖DNAヘリックスを形成する。対の１つのポリマーは5'から3'方向にレイアウトされ、3'から5'方向にレイアウトされた相補的なポリマーと対を形成する。したがって、二本鎖DNAヘリックスの２つのDNAポリマーは、反平行であると説明される。二本鎖DNAヘリックス内の２つのDNAポリマー、または鎖は、積み重なったプリンおよびピリミジン塩基間の疎水性相互作用、およびプリンおよびピリミジン塩基間の水素結合、DNAポリマーのコンホメーション制約によって強調される引力を介して互いに結合する。多くの化学的および形状的な制約のため、二本鎖DNAヘリックスは、一方の鎖のデオキシアデニル化サブユニットが他方の鎖のデオキシチミジル酸サブユニットに水素結合し、一方の鎖のデオキシグアニル酸サブユニットが他方の鎖の対応するデオキシシチジル酸サブユニットに水素結合する場合に最も安定する。
【００５８】
図17A〜17Bは、2つの逆平行DNA鎖のプリン塩基およびピリミジン塩基の間の水素結合を示す。図17Aは、対応するデオキシアデニル酸およびデオキシチミジジル酸サブユニットのアデニン塩基およびチミン塩基の間の水素結合を示し、図17Bは、対応するデオキシグアニジル酸およびデオキシシチジル酸サブユニットのグアニン塩基およびシトシン塩基間の水素結合を示す。アデニン／チミン塩基対には２つの水素結合1002および1003があり、グアノシン／シトシン塩基対には3つの水素結合1004〜1006があることに注意されたい。その結果、GC塩基対はAT塩基対よりもDNA二重鎖に大きな熱力学的安定性をもたらす。図10A〜Bに示すATおよびGC塩基対は、Watson−Crick（「WC」）塩基対として知られている。
【００５９】
図18A〜18Bは二本鎖DNAを示す。図18Aに示すように、相補配列を持つDNAポリマー1802および1804の2つの鎖は、2つの鎖の相補的な塩基間の水素結合を介して逆平行2本鎖複合体を形成する。2本鎖は反対の5'−3'の方向または極性を持つため、二本鎖複合体は逆平行である。一方の鎖1806のアデニン塩基は、他方の鎖のチミン塩基1808と対になり、一方の鎖1810のグアニン塩基は、他方の鎖のシトシン塩基1812と対になる。一方の鎖に沿った5'−3'方向のデオキシヌクレオチドの配列は、もう一方の鎖に沿った3'−5'方向のデオキシヌクレオチドの配列と相補的である。DNAポリメラーゼがテンプレート鎖へのコピー鎖の重合を触媒すると、逆平行二本鎖DNAポリマー内の2つの鎖の相補性が生成される。図18Bは、生理的温度、圧力、pH、イオン濃度の下で発生するおなじみの二本鎖DNAのコンホメーションを示す。
【００６０】
図19は、20種類の一般的なアミノ酸の名前と化学構造を示す。アミノ酸は、リボソームを介した翻訳プロセスで重合してタンパク質を形成する。アミノ酸は、リボソームを介した翻訳プロセスで重合してタンパク質を形成する。図19は、アラニン、グルタミン酸、グリシンおよびリシンモノマーを含む「ペプチド」という短い４アミノ酸のポリマー1902を示す。タンパク質ポリマーは、通常、数百から数千のアミノ酸モノマーを有する。MspAポリンのような多くのタンパク質は、複数のタンパク質ポリマーを含んでいる。生理学的条件下では、タンパク質は一般的にMspAポリンオクタマーのゴブレット様コンホメーションのような複雑な三次元コンホメーションを有する。
【００６１】
図20は、第2の配列検出システムで機械的変化センサーコンポーネントとして使用するE.coli DNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメントによって触媒される重合反応を示す。この重合反応により、成長するコピー鎖2004の3'末端にヌクレオチド三リン酸2002が追加される。図20では、コピー鎖の残りのデオキシヌクレオチドモノマーは、矢印2006および5'ラベル2008で示されている。コピー鎖の3'末端デオキシヌクレオチドモノマーの脱プロトン化された3'ヒドロキシル2010は、デオキシヌクレオチド三リン酸2002のαリン酸2012に対して求核攻撃を行い、ホスホジエステル結合2014を形成し、無機ピロリン酸2016を置換する。この反応は、標準的な生理学的条件下では、自由エネルギーの変化が比較的小さくなるが、ピロリン酸2018のその後の加水分解によって引き起こされ、大きな自由エネルギーの変化を伴う。ピロリン酸の加水分解により放出される化学エネルギーは、重合反応を促進するだけでなく、プライマー会合テンプレート鎖に対するDNAポリメラーゼの翻訳も促進し、異なるデオキシヌクレオチド三リン酸が活性部位と特異的に会合し、テンプレート鎖中の相補的なデオキシヌクレオチドモノマーと水素結合を形成する場合にDNAポリメラーゼによって示される異なる動的コンホメーションに寄与し得るプライマー会合テンプレート鎖に対するDNAポリメラーゼの翻訳も駆動する。
【００６２】
図21A〜21Eは、E.coli DNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメントによって触媒されるコピー鎖伸長を示す。図21A〜Eはすべて、図21Aを参照して次に説明する同じ図の規則を使用している。DNAポリメラーゼは、断面が円形に見える球体2102で表される。DNAポリメラーゼ内の活性部位は、垂直方向の影付きの長方形2104で表される。テンプレートDNA鎖2106およびコピーDNA鎖2108は、一連の長方形および円盤によって表される。プリンおよびピリミジンの塩基は、グアニン塩基を表す長方形2110などの、垂直方向の長い、ラベル付き長方形で表される。各デオキシヌクレオチドモノマー内のリボース部分は、小さな正方形2112などの小さな正方形で表される。鎖内のデオキシヌクレオチドモノマーに結合するホスホジエステル結合は、円2114などの円で表される。曲線矢印2116などの曲線矢印は、鎖が指示した方向に続くことを示す。
【００６３】
図21Aは、活性部位を占めるデオキシヌクレオチド三リン酸を含まないDNAポリメラーゼを示す。DNAポリメラーゼは、コピー鎖の3'末端に追加するために次のデオキシヌクレオチド三リン酸を受け取る準備ができている。DNAポリメラーゼの活性部位は、いくつかの結合マグネシウムイオンとアミノ酸モノマー側鎖の多数の官能基を含む複雑な化学環境であり、すべてがテンプレートとコピー鎖の特異的結合、図20に示す反応を介してコピー鎖の3'末端に付加するためのデオキシヌクレオチド三リン酸の特異的結合、および１つまたはそれを超える遷移状態の安定化を含む、重合反応の触媒に寄与する。図21Bでは、デオキシヌクレオチド三リン酸がDNAポリメラーゼのチャネルを通って活性部位に向かって拡散する。少なくとも1つの例において、4つの異なるタイプのデオキシヌクレオチド三リン酸のいずれかが活性部位に接近する可能性があるが、活性部位内のテンプレート鎖の不対のデオキシヌクレオチドモノマーに相補的なデオキシヌクレオチド三リン酸のみが、図21Cに示すように、不対の活性部位に存在するテンプレート鎖デオキシヌクレオチドモノマーとの水素結合のために活性部位に安定して会合する。デオキシヌクレオチド三リン酸と活性部位の安定した会合は、図21Cの楕円形で表されるDNAポリメラーゼのコンホメーションの変化に関連する。実際のコンホメーション変化は複雑であり、DNAポリメラーゼ内の複数の異なるドメインに影響を及す。DNA−ポリメラーゼのコンホメーションは動的であり、一般的に、種々のタイプの微妙な振動モードおよび種々の構造ドメインの相対運動に関連付けられる。異なるタイプのデオキシヌクレオチド三リン酸と活性部位との特異的な会合は、異なる動的DNA−ポリメラーゼコンホメーション、DNA−ポリメラーゼとポリンの相対的な位置または方向の変化、および/または第2の配列検出システムの機械的変化センサーコンポーネントとして作用するDNAポリメラーゼによって生成される機械的変化の機械的信号のソースであると考えられる他の変化を誘導する。
【００６４】
図21C〜21Dを含む図の配列では、図20に示す重合反応が起こり、新しいデオキシヌクレオチドモノマーをコピー鎖に組み込んだホスホジエステル結合ブリッジ2120が形成される。ピロリン酸塩2122は活性部位から放出される。図21C〜21Eを含む図の配列では、DNAポリメラーゼがテンプレートとコピー鎖に関連して翻訳し、ヌクレオチド三リン酸のない活性部位2126を再び形成し、後続のデオキシヌクレオチド三リン酸を特異的に取り込む準備ができる。DNAポリメラーゼのコンホメーションは元のコンホメーションに戻り、図21Eでは球形2128で表していることに注意されたい。ある種の実施形態において、デオキシヌクレオチドモノマーと活性部位との特異的な会合は、単独で、組み込まれずに、ターゲット配列を決定できる信号に変換できるポリメラーゼの機械的変化につながり得ることに注意されたい。これらの実施形態において、ヌクレオチドがコピー鎖に組み込まれる必要はない。
【００６５】
図22A〜22Bは、１つの例において、第2の配列検出システムの可変抵抗コンポーネントを示す。図22Aに示すように、DNA−ポリマーテザー2202はDNAポリメラーゼ2204に付着し、ポリンチャネルを通って脂質二重層2206の下方のセルの第2の溶液含有チャンバー1310まで伸びている。デオキシヌクレオチド三リン酸は、コピー鎖伸長の間にDNAポリメラーゼの活性部位に特異的に会合しているため、DNAポリメラーゼの動的コンホメーションの変化は、ポリンチャネルの狭い構造2208と比較してDNA−ポリマーテザーの翻訳をもたらす。
【００６６】
図22Bは、ポリンチャネルの狭い狭窄に関するDNA−ポリマーテザーの翻訳が、ポリンチャネルを通るイオンの流れに対する抵抗を変化させることを示す。図22Bは、ポリンチャネル2210〜2213内のDNAポリマーテザーの4つの異なる位置を示す。DNA−ポリマーテザーは、直径の異なる一連の円として表される。円2216などの大径の円は、1つまたはそれを超えるデオキシヌクレオチドモノマーを表し、それは生まれたチャネルの狭い狭窄2218内に位置する場合に、ポリンチャネルを通るイオン流に高い抵抗を与える。直径が次第に小さくなる円は、１つまたはそれを超えるデオキシヌクレオチドモノマーを表し、狭い狭窄部内に位置する場合にポリンチャネルを通るイオン流に対する抵抗がますます小さくなる。第1の位置2210では、1つまたはそれを超える低抵抗のデオキシヌクレオチドモノマーは狭い狭窄部2218内に位置し、その結果、ポリンチャネルを通るイオン電流の割合が比較的高くなる。ポリンチャネルに入る多数の正の2220および負の2222イオン記号が示されている。DNAポリマーテザーが狭い狭窄に対して上方に移動すると、位置2211〜2213で、イオン流に対してますます大きな抵抗を与える1つまたはそれを超えるデオキシヌクレオチドモノマーが狭い狭窄に移動し、ポリンチャネルを通るイオン−電流の割合がますます小さくなる。したがって、ポリンチャネル内のDNAポリマーテザーの位置付けは、ポリンチャネルを通るイオン流に対する抵抗を変化させ、DNAポリメラーゼの活性側へのデオキシヌクレオチド三リン酸の特異的な取り込みによって生成される機械的な機械的−変化信号を、図14A〜14Bを参照して先に論じた電流−電圧変換回路により、出力電圧信号に変換される。
第2のタイプの形状−変化ベースの配列ディテクターの較正および調整
【００６７】
図23は、１つの例において、DNAポリメラーゼを可変抵抗コンポーネントに機械的に結合し、さらに可変抵抗コンポーネントの一部を形成するDNAポリマーテザーのいくつかの特徴を示す。DNA−ポリマーテザー2302は、ある種の実施形態において、DNAポリマーテザーがDNAポリメラーゼに結合するリンカー2304、ある種の実施形態において、約6つのデオキシヌクレオチドモノマーを含むプレ−レポーター領域2306、一般的に少なくとも４つのデオキシヌクレオチドモノマーを含むレポーター領域2308、および数個から数十個のデオキシヌクレオチドモノマー2310を含むポスト−レポーター領域を含む。レポーター領域2308は、DNAポリメラーゼが、第2の配列検出システムの形状変化センサーコンポーネントによって示される形状変化を一緒に含む種々の異なるコンホメーションを示す場合に、ポリンチャネル内の狭い狭窄内にある領域である。種々のDNAポリマーテザー領域の長さは、異なるポリンおよび／または異なるDNAポリメラーゼを使用する異なる実施形態によって変化し得る。領域は、DNAポリマーテザーのDNAポリメラーゼへの付着点とポリンチャネルの狭い狭窄の間の距離、およびDNAポリメラーゼのコンホメーション変化によって誘導されるDNAポリマーテザーの位置の変位範囲によって定義される。
【００６８】
図23の下部に示すように、DNAポリマーテザーは、一般的に、ある程度の寸法の柔軟性を有している。セル2312に比較的低い電圧が印加されると、DNAポリマーテザーは種々の緩和状態2314のいずれかに落ち着くが、セル2316に高い電圧が印加されると、DNAポリマーテザーは種々の伸張状態または緊張状態2318のいずれかに落ち着く。所定のデオキシヌクレオチドモノマー2320は、緩和状態ではプレ−レポーターとレポーター領域の境界に存在し得るが、伸張した状態または緊張状態では、同じデオキシヌクレオチドモノマーがレポーター領域内のウェルに存在し得る。セルに印加する電圧を変えることにより、DNAテザーの静止位置またはベースライン位置、特に、ポリンチャネルの狭窄に対するレポーター領域の静止位置またはベースライン位置に対して、比較的細かい調整が行われる。これは、セルの出力電圧の大きさおよび機械的−電気的信号変換の応答性に関してセルを較正する手段を提供する。
【００６９】
レポーター領域内のデオキシヌクレオチドモノマーの異なる配列は、ポリンチャネルを通るイオン−電流に異なる抵抗を提供する。異なるレポーター領域のデオキシヌクレオチドモノマー配列を有するDNAポリマーテザーを用いた種々の実験により、多数の低電流、高抵抗レポーター領域配列および多数の高電流、低抵抗レポーター領域配列の同定につながる。ポリンチャネル内のDNA−ポリマーテザーの機械翻訳に関する可変抵抗コンポーネントの可変抵抗プロファイルは、レポーター領域のデオキシヌクレオチド−モノマー配列を変えることで正確に設計できる。
【００７０】
図24は、１つの例において、セルの信号応答の調整を示す。DNA−ポリメラーゼ機械的変化コンポーネントは、ポリンチャネルに対して異なる位置を占める場合があり、異なる条件およびセルパラメータ値の下で異なるコンホメーションを採用する場合があり、その結果、ポリン収縮に対する相対的なレポーター領域の位置が異なる場合がある。仮想のレポーター領域2404を図24の左手側に示す。先に論じたように、レポーター領域はポリンチャネル内で上下に移動する。移動は、値0、d0を有するとみなされる基準変位2404からの負の変位、または上方向の変位と、正の変位、または下方向の変位として特徴付けられる。レポーターの変位に関する信号強度のプロット2406、または出力信号の電圧の大きさを、図24の右手側に示す。垂直軸2408は、ポリンチャネルを流れる電流の割合、または出力電圧信号の大きさを表し、水平軸2410は、基準変位d0に対するポリンチャネル内のレポーターの変位を表す。レポーター領域2402は、正方形2412などの一連のラベル付き正方形で表される。各正方形は、単一のデオキシヌクレオチドモノマーまたはデオキシヌクレオチドモノマーの短い配列を表す。「Ｌ」という文字は低電流を表し、「Ｍ」という文字は中電流を表し、「Ｈ」という文字は高電流を表す。電流信号曲線2414は、レポーター領域2402の表示の電流表示をミラーリングし、デオキシヌクレオチドモノマーの抵抗率、または、レポーター領域2402の表示の小さな四角形で表されるデオキシヌクレオチドモノマーの短い配列を逆にミラーリングする。換言すれば、レポーター領域の表示が反時計回りに90°回転し、プロット2406の水平軸2410と重なり、各デオキシヌクレオチドモノマーまたは一連のデオキシヌクレオチドモノマーの電流表示と変位軸に沿ったそれらの位置は、プロットにポイントを配置するための垂直および水平座標として使用でき、連続曲線で接続すると、プロット2406に示す電流信号曲線2414が生成される。電流信号曲線2414の最も急な部分2420は、図24の垂直破線2422によって示されるように、変位座標がd0に等しい点で二分される。一般に、この基準位置は、DNA−ポリメラーゼ機械的変化センサーコンポーネントのコンホメーションの変化に対してセルによる電圧信号出力で最大の感度を提供するため、ポリンチャネル内のレポーターに対して望ましい休憩ポイントまたはベースラインポイントを表す。レポーターおよびポリンチャネルはナノスケールのコンポーネントであるため、レポーターをポリンチャネル内の目的の参照変位位置に配置するように機械的にセルを構成することは困難である。しかしながら、図23を参照して先に論じたように、セルに印加する電圧を変化させると、ポリンチャネル内のレポーターのベースライン位置または静止位置をきめ細かく調整できる。電流−信号曲線2414の形状と形態は、レポーター領域内のデオキシヌクレオチドモノマーの配列によって決定するため、セルの応答は、レポーター領域を望ましい基準変位に位置に位置付けし、電流−信号曲線の最も急な部分を二分するためにセルに印加される電圧を変化することによって最初に較正できる。このように、DNAポリメラーゼのコンホメーション変化によるレポーター領域変位に対する電流応答は、DNAポリマーテザーレポーター領域内のデオキシヌクレオチド配列の慎重な設計により正確に調整でき、電流応答はセルに印加される電圧を変化させることにより較正される。
【００７１】
図25は、１つの例において、E.coli DNAポリメラーゼIのクレノウ断片が機械的変化センサーコンポーネントとして使用される場合の第2のタイプの配列検出システム内での周期的なノイズの発生を示す。このタイプのノイズは、第2のタイプの配列検出システムで別のDNA−ポリメラーゼ機械的変化センサーが使用される場合に観察されている。図25は、水平軸2506で表される時間に関して、垂直軸2504で表される電流信号のプロット2502を示す。ある種の期間2508〜2510には、平均電流フローは比較的低い値2512になっている。しかしながら、2514および2515の他の期間では、平均電流フローの値は著しく高い値2518になっている。加えて、低電流フロー期間2508〜2510における平均電流フローへの変位の範囲は、高電流フロー期間2514および2515における平均電流フローへの変位の範囲よりもはるかに小さい。データを含む電流信号曲線は、図25に示すノイズの多い信号2520に重なる。データを含む電流信号曲線は、低ノイズ、低電流フロー期間2508〜2510の間に出力される電流信号から容易に抽出されるが、高電流フロー期間2514および2515に出力されるノイズの多い電流信号からは抽出できない。これは、ノイズは本質的に比較的小さい情報を運ぶ電流の変動をマスクするためである。低ノイズ、低電流の期間2508〜2510には図25中に「測定」と標識され、一方で高電流フロー期間2514および2515は「ノイズ」と標識している。ノイズの多い期間を削減または排除するための措置を講じない場合、大量の配列情報が失われる。これは、DNA−ポリメラーゼ機械的変化センサーコンポーネントによるコピー鎖の伸長が、出力電圧が対応するノイズの多い期間中も続くためですDNA−ポリメラーゼのコンホメーションの変化に対する機械的変化センサーコンポーネントは、出力電圧信号から抽出できません。配列情報の損失を無視しても、配列情報マスキングノイズの期間は、配列情報取得率の大幅な低下を表す。ただし、以下でさらに論じるように、配列情報マスキングノイズの期間は、DNAポリマーテザーがポリンチャネルに通され、DNAポリメラーゼがポリンに関連付けられている場合にのみ配列情報マスキングノイズが発生するという利点があり、したがって、機械的変化センサーコンポーネントと可変抵抗コンポーネントが最初に構成されていることを示す。
【００７２】
図26は、E.coli DNAポリメラーゼIのクレノウ・フラグメントによって触媒されるコピー鎖伸長を示す。DNAポリメラーゼ内の活性部位は、ヌクレオチド三リン酸のコピーDNA鎖への取り込み中のさまざまな時点で、垂直方向の長方形2602〜2607で表される。これらの活性部位表示で示される時点は、タイムライン2610に沿って示される。ヌクレオチド三リン酸の取り込みの1つの完全なサイクルは、タイムラインの下に示す時間セグメント2612に及ぶ。図26では、図21A〜Eで使用したのと同じ図の規則を使用している。図21A〜Eのように水素結合が表されているが、塩基対ヌクレオチドの同一性が特定されていないため、AT塩基対の2つの水素結合であろうがCG塩基対間の3つの水素結合であろうが、3つの短い水平線分が一般的に水素結合を表す。テンプレートDNA鎖2616およびコピーDNA鎖2618の部分は、長方形および円盤で表す。プリンおよびピリミジンの塩基は、長方形2620などの長くて垂直方向の長方形で表す。各デオキシヌクレオチドモノマー内のリボース部分は、小さな正方形2622などの小さな正方形で表す。鎖内の2つのデオキシヌクレオチドモノマーを結合するホスホジエステル結合は、円2624などの円で表す。
【００７３】
最初に、活性部位2602は、コピーDNA鎖2618の3'末端に付加するために次のデオキシヌクレオチド三リン酸を受け取る準備ができている。次に、デオキシヌクレオチド三リン酸2626は活性部位に近づく。もちろん、4種類の異なるデオキシヌクレオチド三リン酸のいずれかが活性部位に近づく可能性があるが、活性部位内のテンプレート鎖の不対のデオキシヌクレオチドモノマーに相補的な活性部位に対するデオキシヌクレオチド三リン酸の親和性は、一般的に非相補的デオキシヌクレオチド三リン酸の結合親和性よりも高く、および相補的デオキシヌクレオチド三リン酸の結合親和性は、水素結合の活性部位2628と、不対の活性部位常在テンプレート鎖デオキシヌクレオチドフォルダーと特異的に会合する可能性が最も高い。次のヌクレオチド三リン酸と活性部位との特異的な会合に必要なこの時間は、セルチャンバー溶液中のヌクレオチド三リン酸の濃度と種類、温度など、多くのセルのパラメータの影響を受ける。次に、図20に示す重合反応2630〜2631が発生し、新しいデオキシヌクレオチドモノマーをコピー鎖に組み込むホスホジエステル結合ブリッジ2632が形成される。この反応に必要な時間は、例えば、セルチャンバー溶液中のヌクレオチド三リン酸のタイプ、温度、セルチャンバー溶液中のマグネシウムイオンの濃度、セルチャンバー溶液のpH、セルチャンバー溶液中の他のイオン化塩の濃度を含む多くのセルパラメータの影響を受ける。無機ピロリン酸塩2634は活性部位から放出される。DNAポリメラーゼはテンプレートに対して翻訳し、DNA鎖をコピーしてヌクレオチド三リン酸を含まない活性部位2607を再び形成し、後続のデオキシヌクレオチド三リン酸の特異的会合の準備ができる。この翻訳は、１つの例において、温度などの種々のセルパラメータの影響を受ける。
【００７４】
線分2612で表されるヌクレオチド三リン酸−付加サイクルの長さは、第2のタイプの配列検出システムの操作に関して重要なパラメータである。分析サブシステムによって出力電圧信号から信頼性の高いデータを抽出するためには、DNA−ポリメラーゼ機械的変化センサーコンポーネントのコンホメーションの変化が、十分な時間をかけて起こり、電流−電圧コンバーターデータサンプリング回路が対応する電流フロー変化におけるコンホメーション変化を検出し、十分な情報を含む電流信号を生成して分析サブシステム内の信号処理によってヌクレオチド三リン酸のタイプが決定されることを許容する。しかしながら、配列決定の速度は、ヌクレオチド三リン酸がコピーDNA鎖に組み込まれる速度に直接比例する。以下に論じるように、第2のタイプの配列検出システムに関連する多くの異なる調整可能なパラメータがあり、それらは正確なDNAテンプレート配列決定を保証するのに十分な長いが配列決定の望ましい速度が達成されることを保証するのに十分に短い、望ましいヌクレオチドトリリン酸付加サイクル長を提供するように調整できる。
【００７５】
ある種の実施形態において、第2のタイプの配列検出システムを構成して、DNAテンプレート内の特定の単一位置のデオキシヌクレオチドモノマーのタイプのみを決定することが望ましい。図27は、１つの例において、単一位置のデオキシヌクレオチド−モノマータイプの決定のために構成されたプライマー会合テンプレートDNA鎖を示す。図27では、図26で使用したのと同じ図の規則を使用して、プライマーDNA 2702とプライマー会合テンプレートDNA鎖2704を表す。ある種のDNAポリメラーゼの場合、RNAプライマーをDNAプライマーの代わりに使用し得る。どちらの場合でも、プライマーは3'末端にジデオキシヌクレオチドモノマー2710を含み得る。ジデオキシヌクレオチドモノマーは3'ヒドロキシルを欠いているため、図20を参照して先に論じたヌクレオチド三リン酸付加反応によるヌクレオチド三リン酸の付加によって伸長することができない。しかしながら、図26の活性部位表示2604に示すように、相補的ヌクレオチド三リン酸は、それにもかかわらず、プライマー会合テンプレートDNA鎖の第1の不対デオキシヌクレオチドモノマー2712と会合し得る。DNAポリメラーゼの形状変化センサーコンポーネントで信号を生成するコンホメーションの変化を誘発するのは、活性部位の相補的ヌクレオチド三リン酸の特異的な会合である。したがって、プライマーの3'末端にジデオキシヌクレオチドモノマーを有するプライマー会合テンプレートDNA鎖は、プライマー会合DNA鎖の第1の不対デオキシヌクレオチドモノマー2712に相補的なヌクレオチド三リン酸のタイプを示す単一の電圧−信号曲線のみを生成する。もう１つの実施形態において、プライマーの3'末端にデオキシヌクレオチドまたはリボヌクレオチド部分が存在する。ヌクレオチド三リン酸の取り込みを防ぐため、例えばMg2＋やMn2＋などの触媒2価金属カチオンは存在しないが、0.5 mMから10 mMの濃度で、Ca2＋やSr2＋などの非触媒2価金属を使用する。
【００７６】
図28は、１つの例において、第2のタイプの配列検出システムの操作を構成、較正、および調整するために調整し得る異なるタイプのパラメータをリストしている。最初の列2802には、配列検出の開始前にのみ一般的に調整可能な初期固定値のパラメータが含まれるが、ある種のマイクロ流体および他の実施形態において、セルの溶液を含むチャンバー中の溶液の組成を動的に変更することが可能かもしれず、これらの他のパラメータを動的に調整することが可能かもしれない。第2の列2804は、セルの操作中に調整できる値を有するパラメータを示すが、その調整にはかなりの遅延時間が伴う。第3の列2806は、セルの操作中に容易かつ直接的に調整できる連続的に調整可能なパラメータを含む。この3番目のグループのパラメータは、セルの操作中にコントロールコンポーネントによってセルを微調整するための基礎を提供する。
【００７７】
列2802に示されている最初に固定されたパラメータには、セルチャンバーで使用される緩衝液の1つまたはそれを超える一価カチオン／塩化物塩の一価カチオンのタイプ、一価カチオン／塩化物塩の濃度、セルチャンバーで使用される二価カチオン／塩化物塩のタイプおよび濃度、セルチャンバーで使用されるpH緩衝化合物（またはその複数）のタイプ、ジチオトレイトールなどの還元剤を含む他のセルチャンバー緩衝液成分のタイプおよび濃度、DNAポリメラーゼのタイプ、ポリンのタイプ、テザーのタイプおよび構造は、可変抵抗コンポーネントにDNAポリメラーゼを機械的に結合するためにおよび可変抵抗コンポーネントの一部として使用されるテザーのタイプおよび構造、プライマー会合テンプレートのタイプ、プライマー会合テンプレート濃度、ヌクレオチド三リン酸のタイプおよび濃度、膜または二重層の構成要素、電極のタイプ、セルチャンバーの容積、形状および寸法、ならびにセルの他のさまざまなパラメータが含まれる。異なるタイプの電極を使用する場合、異なるタイプの塩を電解質として使用できる。
【００７８】
最初に固定されたパラメータの多くは、図26を参照して先に論じたヌクレオチド三リン酸−付加サイクルの長さに直接影響する。ヌクレオチド三リン酸−付加サイクルの長さは、ヌクレオチド三リン酸のタイプおよび濃度、ポリメラーゼのタイプ、緩衝液のpH、および種々のイオン化した塩の濃度に敏感である。１つの例において、ある種の場合においては、K+の代わりにNa+、Li+、Rb+、NH4+および／またはCs+を用いると、ヌクレオチド三リン酸−付加サイクルを延長し、開孔電流を増加させ、または塩基識別を増加させる。これらのカチオンは、これらのカチオンの塩と種々の異なる無機および有機アニオンとを添加することによって導入し得る。他のカチオン、アニオン、および他の溶液成分の濃度は、ヌクレオチド三リン酸−付加サイクルの長さに影響し得る。したがって、第2のタイプの配列検出システムの操作を構成、較正、および調整するために調整できるパラメータとし得る。セルのタイプごとに、列2802に示されているパラメータの値を実験により評価して、最適またはほぼ最適な操作に合わせてセル操作を調整する。これには、ヌクレオチド三リン酸−付加サイクルの長さを調整して、配列決定精度の閾値レベルを保持しつつ望ましい配列決定速度を提供することが含まれる。
【００７９】
ある種のパラメータはセル操作中に調整可能で、ヌクレオチド三リン酸−付加サイクルの長さや、第2のタイプの配列検出システムの他の多くの操作特性に大きく影響する。これらは、化学反応およびシステムならびに他の多くのタイプのシステムの決定的で再現可能な結果を得るために変化および制御される古典的なパラメータである。これらのパラメータには、セルおよびその内容物の温度、圧力、およびpHが含まれる。ラグタイムに関連付けられる調整可能なパラメータは、最初に固定されたパラメータと同様に、実験により評価して、望ましいセル操作特性を提供するパラメータ値を選択し得ることに注意されたい。
【００８０】
調整可能なパラメータには、セルに印加する電圧の大きさ、印加電圧の極性、ならびに電流−電圧コンバーター回路および分析サブシステムの動作に関連する種々の機器パラメータが含まれ、マイクロ秒、ミリ秒、およびより長い時間尺度でセル操作を微調整する機会を提供する。第2のタイプの配列検出システムの操作を制御するためのこれらのパラメータの使用については、一連の制御フロー図で以下に記載する。
【００８１】
図29A〜29Cは、１つの例において、ポリンチャネル内にDNAポリマーテザーを確実に保持するためのロックオリゴヌクレオチドの使用を示す。図29Aは、図24で以前に使用したのと同じ図の規則を使用して、ロックオリゴヌクレオチドを有するDNA−ポリマーテザーを示す。図29Aに示すように、ロックオリゴヌクレオチド2902は、DNA−ポリマーテザー2904のデオキシヌクレオチド−モノマー配列の一部に相補的なデオキシヌクレオチド−モノマー配列を有し、水素結合および塩基スタッキングを介してDNA−ポリマーテザーと安定して会合する。図29B〜Cは、セル操作中のロックオリゴヌクレオチドの使用を示す。最初は、DNAポリメラーゼ2906およびDNA−ポリマーテザー2908は、ポリン2910と会合しない。セル2912に電圧降下を印加すると、DNAポリマーテザーの糸がポリンチャネル2914に通り、DNAポリメラーゼがポア2916内に落ち着く（seat）。次いで、ロックオリゴヌクレオチドは、セルの第2の溶液含有チャンバーに伸びるDNA−ポリマーテザー2918の部分と会合する。図29Cに示すように、ロックオリゴヌクレオチドは、逆極性の電圧2922がセルに印加される場合にDNAポリマーテザーがポリンチャネル2920から引き出されるのを防ぐ。その結果、印加された電圧降下2924の元の極性を復元すると、ポリン2926内にDNAポリメラーゼが再度落ち着く（reseat）。しかしながら、はるかに大きな逆の大きさの電圧降下2928を適用すると、ロックオリゴヌクレオチド2930をDNAポリマーテザー2932から剥ぎ取り、DNAポリメラーゼとDNAポリマーテザーがポートから完全に解離するのに十分な力が発生する。ある種の実施形態において、ロックオリゴヌクレオチド以外のロックコンポーネントを使用し得る。例えば、ビオチン基をテザーに結合し、ストレプトアビジンをロックコンポーネントとして使用し得る。別の実施形態においては、他のタイプの生体高分子ロックコンポーネントも使用し得る。
【００８２】
図30A〜30Hは、第2のタイプの配列検出システムを使用した配列決定プロセスの一例を示す制御フロー図を提供する。ステップには、分析サブシステム内に実装された制御コンポーネントを含む、配列検出システムの制御コンポーネント内の制御ロジックによって実行される自動制御アクティビティが含まれるが、技術者が実行する手動および半手動のステップも含み得る。
【００８３】
図30Aは、ルーチンの「検出配列」についての制御−フロー図を提供し、これは、配列検出システムが最初に構成され、その後いくつかの異なる終了条件の1つが発生するまで出力信号を生成するように操作する1つの配列決定の実行を行うための配列検出システムの操作を表す。ステップ3002において、ルーチンの「検出配列」は、それぞれが一定のインデックスに関連付けられる配列ディテクター操作上のパラメータ値のアレイへのポインターparamを受け取る。セルに印加して配列同定情報を含む出力信号を生成する電圧の大きさを含むパラメータなどの特定のパラメータは、param［ボルトを読む］として示し、ここでボルトを読むとはポインターparamによって示されるパラメータのアレイ中のパラメータに関するインデックスである。これらのパラメータ値には、図28を参照して先に論じた種々の固定および調整可能なパラメータの値が含まれる。パラメータ値には、以下にさらに論じるいくつかのしきい値、およびこれも以下に論じる種々のタイミングパラメータも含まれる。ステップ3004においては、ルーチン「セットアップ・セル」は、配列−識別実験用の配列−検出セルを構成することをいう。セル構成には、自動構成ステップ、半自動構成ステップ、および手動構成ステップの1つまたはそれを超えるものが含まれる。テキスト「（param）」は、ポインターparamが引数としてルーチンにパスされることを示す。ステップ3006においては、ルーチンの「シークエンサーを構成する」を呼び出して、配列−ディテクターを準備して出力信号を生成し始める。図30Bに参照して、ルーチンの「シークエンサーを構成する」を以下に論じる。ルーチン「シークエンサーを構成する」がステップ3008で決定される成功の表示に戻る場合、ステップ3010で「シークエンサーを読む」が呼ばれ、配列ディテクターの分析サブシステムによってセルに導入された生体高分子の配列が決定される出力信号を生成する。その他、ルーチンの「シークエンサーを構成する」が失敗表示に戻る場合、ステップ3012においてエラー取り扱いルーチンが呼ばれる。このエラー取り扱いルーチンは配列識別実験用の配列−ディテクターを構成する不可能性を報告し得、ある種の実施形態において、自動化された改善ステップを行って構成の失敗を取り扱い、および／または技術者および他の個人に警告を行う。
【００８４】
図30Bは、図30Aのステップ3010でルーチンの「シークエンサーを構成」という制御−フロー図を提供する。ルーチンの「シークエンサーを構成」は、配列−決定実験を行うための配列検出システムの構成を示す。１つの実施形態において、セルに電圧を印加し、出力電圧信号を分析して、図25を参照して先に論じた配列情報マスキングノイズの期間を探る。配列情報マスキングノイズが検出されると、制御ロジックは、DNAポリマーテザーがポリンチャネルを介して引き込まれたこと、およびDNAポリメラーゼ機械的変化センサーコンポーネントがポリン内に定着したと推測する。ステップ3016で、ローカル変数トライが0に初期化される。ステップ3018では、アレイcurrentDataによって表されるメモリバッファが、信号サンプルを保存するメモリバッファ内の次の位置を示すインデックスnxtSampleとともに初期化される。ステップ3020では、パラメータ値param［電圧を構成]によって示される大きさおよびパラメータparam［Polを構成]によって示される極性を有する電圧が、サンプリングされた出力信号がメモリバッファcurrentDataに収集される間にセルに印加される。ステップ3022では、メモリバッファcurrentData中のデータが分析されて、パラメータ値param［ノイズＴ］によって示される閾値ノイズレベルを超えるノイズがサンプリングされた信号に観察されるかどうかを判定する。ステップ3024で決定されるように、このようなノイズが観察されると、ルーチンの「シークエンサーを構成する」は、機械的変化−センサーコンポーネントがポリン内に定着したと推測する。ステップ3026で決定されるように、パラメータ値param［ロック］が0に等しくない場合、図29A〜29Cを参照して先に論じたように、ステップ3028でテザーがロックされる。その後、ルーチンの「シークエンサーを構成」は成功の表示に戻る。ステップ3024で決定されるようなノイズが観測されない場合、およびステップ3030で決定されるローカル変数トライの値がパラメータ値param［リトライ］よりも小さい場合、ステップ3032において逆極性電圧がセルに簡単に印加され、ステップ3018で開始する、ポリン内にDNA−ポリメラーゼ機械的変化−センサーコンポーネントを再び定着させようとする準備として、ステップ3034でローカル変数トライの値を増分する。ローカル変数トライに保存された値が、ステップ3030で決定されたパラメータparam［リトライ］の値以上である場合、失敗の指示がルーチン「シークエンサーを構成」によって戻される。
【００８５】
図30Cは、図30Aのステップ3010で「配列を読む」と呼ぶルーチンの制御−フロー図を提供する。ルーチン「配列を読む」は、配列検出システムによって行われる配列決定の実行を表す。ルーチン「配列を読む」は、終了条件が発生するまで一連の電圧−印加サイクルを繰り返す。ステップ3040において、アレイcurrentDataによって表されるメモリバッファは、信号サンプルを保存するメモリバッファ内の次の位置を示すインデックスnxtSampleとともに初期化される。ステップ3042で、ルーチン「配列を読む」は、param［ボルトを読む］および極性パラメータ[Polを読む]の電圧をパラメータバッファ[間隔を読む]で示される時間だけセルに適用し、メモリバッファcurrentDataにサンプリングされた出力信号を収集する。ステップ3044で、ルーチン「配列を読む」は次に、パラメータparam［間隔を逆転]で示される時間の長さにわたって、大きさparam［電圧を逆転]および極性param[Polを逆転]の電圧をセルに印加する。この逆の極性の電圧印加は、図25を参照して先に論じたように、シーケンス情報マスキングノイズの発生を抑制する。ステップ3046で、ルーチン「配列を読む」は、ルーチン「終了をチェック」を呼び出すことにより、終了イベントをチェックする。ステップ3048で決定されるように、終了イベントが発生すると、ルーチン「配列を読む」が戻る。そうでない場合、制御は別の電圧印加サイクルのステップ3042に戻る。
【００８６】
図30Dは、図30Dのステップ3046で呼び出されるルーチン「終了をチェック」の制御フロー図を提供する。ステップ3050で、ルーチン「終了をチェック」は、電源オフイベントが発生したかどうかを判断し、セルの電源が切られようとしていることを示す。その場合、ルーチン「終了をチェック」は終了指示を戻す。それ以外の場合、ステップ3052で、「終了をチェック」は、メモリバッファの現在のデータに保存されている最新の出力信号サンプルを分析する。最新の出力信号サンプルは、パラメータ値param［ウィンドウ］で示され、メモリバッファcurrentData中の多数の最新の出力信号サンプルを用いて配列データを用いてデータが閾値シーケンスデータレートを超えるレートでセルによってまだ生成されているかどうかを判断する。分析により、ステップ3054で決定されたように、配列データがまだ許容可能な速度で収集されていることが示されると、ルーチンの「終了をチェック」は継続の指示を返す。それ以外の場合、最新のルーチン「終了をチェック」は終了指示を戻す。配列データの速度は、ポリンチャネルの詰まり、電極の劣化、およびその他の多くの理由により低下する場合がある。
【００８７】
本発明を特定の実施形態に関して説明したが、本発明をこれらの実施形態に限定することを意図するものではない。本発明のスピリット内での修正は、当業者に明らかであろう。例えば、特定の配列検出システムは、種々の異なるタイプの機械的変化センサーコンポーネント、機械的カプラー、可変抵抗コンポーネント、電気信号生成コンポーネントおよび回路を使用できる。たとえば、特定の配列検出システムでは、さまざまな種類の機械的変化センサーコンポーネント、機械的カプラー、可変抵抗コンポーネント、電気信号生成コンポーネントおよび回路を使用し得る。例えば、前記した第2の配列検出システムは、異なるDNAポリメラーゼおよびDNAポリメラーゼフラグメントを使用し、異なるポリンを使用し、異なるタイプのポリマーを含む異なるタイプの機械的カプラーを使用し、多くの異なる形状、サイズ、および構成のセルを用い得る。MspA−ポリンの代わりに使用できるポリペプチド細孔の例には、α−ヘモリシン、Mycobacterium smegmatisポリンA、グラミシジンA、マルトポリン、OmpF、OmpC、PhoE、Tsx、F−pilus、SP1、ミトコンドリアポリン（VDAC）、Tom40、外膜ホスホリパーゼA、およびナイセリア自動輸送体リポタンパク質（NaIP）が含まれる。先に論じたクレノウ・フラグメントに代えて使用できるポリメラーゼまたはその断片の例には、T7 DNAポリメラーゼ、真核生物ミトコンドリアDNAポリメラーゼγ、E.coli DNA Pol I、Thermus aquaticのPol I、Bacillus stearothermophilus Pol、真核生物DNAポリメラーゼα、δ、およびε、DNAポリメラーゼζ、T4 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼ、RB69バクテリオファージDNAポリメラーゼ、E.coli DNAポリメラーゼIII アルファサブユニット、古細菌Euryarchaeotaサブドメイン由来のポリメラーゼ、真核生物ポリメラーゼPolβ、Polσ、Polλ、Polμ、S.cerevisiae Pol4、Polη、Pol イオタ、Pol カッパ、E.coli Pol IV（DINB）、E.coli Pol V（UmuD'2C）、レトロウイルス逆転写酵素および真核生物テロメラーゼ、T7 RNAポリメラーゼなどのウイルスRNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼI、RNAポリラーゼII、RNAポリメラーゼIII、RNAポリメラーゼIV、RNAポリメラーゼVなどの真核生物RNAポリメラーゼ、および古細菌RNAポリメラーゼが含まれる。別のテザーの例には、PEG（ポリエチレングリコール）、PPG（ポリプロピレングリコール）、PVA（ポリビニルアルコール）、およびPE（ポリエチレン）のような合成ポリマーが含まれる。さらに、例えば、DNA、RNA、PNAまたはLNAラベル、モルホリノ、または鏡像異性DNAが含まれる。さらに、1つの例示的な実施形態において、isoGおよびisoCの塩基をテザー上に存在させることができる。出力電圧信号から導出される種々の異なる値は、ターゲット配列中のオブジェクトまたはエンティティのタイプを一意に同定するための異なる面として使用できる。電圧信号から計算された平均電圧信号の大きさ、分散、および標準偏差は、オブジェクトまたはエンティティのタイプ同定に使用できるさまざまなタイプの派生値のほんの数例である。多数の異なるタイプの修飾デオキシヌクレオチド三リン酸を、7−デアザ デオキシアデノシン三リン酸に加えて、コピー鎖伸長に使用し得る。コピー鎖伸長は、テンプレート鎖の配列を決定するためにのみ使用されるため、配列決定中に生成されるコピー鎖の化学組成は、第2の配列検出システムの���常な操作とは無関係である。論じた概念、コンポーネント、および方法のすべての組み合わせが考慮され、理解されている。
【００８８】
前述の概念と追加の概念のすべての組み合わせ（そのような概念が相互に矛盾しない限り）は、本明細書で開示される本発明の主題の一部として意図されていることを理解されたい。特に、本開示の最後に現出する特許請求された主題のすべての組み合わせは、本明細書に開示された本発明の主題の一部であると考えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２１Ｄ】
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【図２１Ｅ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【国際調査報告】
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