(57)【要約】本発明は、活性プロドラッグ形式で投与される条件付き二重特異性再方向付け活性化構築物またはＣＯＢＲＡに関する。腫瘍プロテアーゼに曝露されると、構築物は開裂及び活性化され、これにより構築物は、腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）ならびにＣＤ３の両方に結合し、したがって、ＣＤ３を発現させるＴ細胞を腫瘍に動員し、治療につながることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、
ａ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ）と、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）
ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメイン、
ｉｉ）拘束非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）、ならびに
ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメイン、を含む、拘束Ｆｖドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）第２のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）と、
ｇ）
ｉ）第１の偽軽可変ドメイン、
ｉｉ）非開裂性リンカー（ＮＣＬ）、及び
ｉｉｉ）第１の偽重可変ドメイン、を含む、拘束偽Ｆｖドメインと、を含み、
ｈ）第３のドメインリンカーと、
ｉ）ヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤと、を含み、
前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、前記拘束Ｆｖドメインが、ＣＤ３に結合せず、前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の偽可変軽ドメインが、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、前記第１の可変軽ドメイン及び前記第１の偽可変重ドメインが、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成する、前記タンパク質。
【請求項２】
タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、
ａ）第１のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）
ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメイン、
ｉｉ）拘束開裂性リンカー（ＣＣＬ）、ならびに
ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメイン、を含む、拘束Ｆｖドメインと、
ｄ）第２のドメインリンカーと、
ｅ）第２のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）と、
ｇ）
ｉ）第１の偽重可変ドメイン、
ｉｉ）非開裂性リンカー（ＮＣＬ）、及び
ｉｉｉ）第１の偽軽可変ドメイン、を含む、拘束偽Ｆｖドメインと、
ｈ）第３のドメインリンカーと、
ｉ）ヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤと、を含み、
前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、前記拘束Ｆｖドメインが、ＣＤ３に結合せず、前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の偽可変軽ドメインが、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、前記第１の可変軽ドメイン及び前記第１の偽可変重ドメインが、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成する、前記タンパク質。
【請求項３】
前記第１の可変重ドメインが、前記第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記偽軽可変ドメインが、前記偽可変重ドメインのＮ末端にある、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記第１の可変重ドメインが、前記第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記偽可変重ドメインが、前記偽可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記第１の可変軽ドメインが、前記第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記偽軽可変ドメインが、前記偽可変重ドメインのＮ末端にある、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記第１の可変軽ドメインが、前記第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記偽可変重ドメインが、前記偽可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項１または２に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記第１及び第２のＴＴＡが同じである、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項８】
前記第１及び第２のＴＴＡが異なる、請求項１〜６のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項９】
前記第１及び第２のＴＴＡが、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、及びＢ７Ｈ３から選択される、請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記第１及び第２のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡが、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、及び配列番号４１からなる群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記半減期延長ドメインが、配列番号４５を有する、請求項１〜１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記開裂性リンカーが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、Ｍｅｐｒｉｎ  Ａ、Ｍｅｐｒｉｎ  Ｂ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｓ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ、Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ  Ｌ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、ｕＰＡ、Ｋａｌｌｅｋｒｉｅｉｎ７、マトリプターゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される、請求項１〜１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
Ｐｒｏ１８６、Ｐｒｏ２２５、Ｐｒｏ２２６、Ｐｒｏ２３３、Ｐｒｏ３１１、Ｐｒｏ３１２、Ｐｒｏ３１３、Ｐｒｏ４９５、Ｐｒｏ２４６、Ｐｒｏ２５４、Ｐｒｏ２５５、Ｐｒｏ２５６、Ｐｒｏ４２０、Ｐｒｏ４２１、Ｐｒｏ４３２、Ｐｒｏ４７９、Ｐｒｏ４８０、Ｐｒｏ１８７、Ｐｒｏ２２１、Ｐｒｏ２２２、Ｐｒｏ２２３、Ｐｒｏ２２４、Ｐｒｏ３９３、Ｐｒｏ３９４、Ｐｒｏ３９５、Ｐｒｏ３９６、Ｐｒｏ４２９、Ｐｒｏ４３０、及びＰｒｏ４３１からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のタンパク質をコードする、核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１７】
タンパク質を作製する方法であって、前記タンパク質が発現する条件下で請求項１６に記載の宿主細胞を培養することと、前記タンパク質を回収することと、を含む、前記方法。
【請求項１８】
請求項１〜１３のいずれかに記載のタンパク質を患者に投与することを含む、がんを治療する方法。
【請求項１９】
組成物であって、
ａ）第１のタンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第１のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｉｉ）第１のドメインリンカーと、
ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端に、
１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、
２）開裂性リンカー、ならびに
３）ｉＶＬＣＤＲ１、ｉＶＬＣＤＲ２、及びｉＶＬＣＤＲ３を含む第１の偽可変軽ドメイン、を含む、偽Ｆｖドメインと、
ｉｖ）第２のドメインリンカーと、
ｖ）ヒト血清アルブミンに結合する第１のｓｄＡＢＤと、を含む、前記第１のタンパク質と、
ａ）第２のタンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）ヒト腫瘍標的抗原に結合する第３のｓｄＡＢＤと、
ｉｉ）第３のドメインリンカーと、
ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端に、
１）ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖、
２）開裂性リンカー、ならびに
３）ｉＶＨＣＤＲ１、ｉＶＨＣＤＲ２、及びｉＶＨＣＤＲ３を含む第１の偽可変重ドメイン、を含む、偽Ｆｖドメインと、
ｉｖ）第４のドメインリンカーと、
ｖ）ヒト血清アルブミンに結合する第４のｓｄＡＢＤと、を含む、前記第２のタンパク質と、を含み、
前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の可変軽ドメインが、会合したときにヒトＣＤ３に結合することが可能であり、
前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の偽可変軽ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、
前記第１の可変軽ドメイン及び前記第１の偽可変重ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、
前記第１及び第３のｓｄＡＢＤが配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、及び配列番号４１からなる群から選択される、前記組成物。
【請求項２０】
前記第１及び第２のＴＴＡが同じである、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記第１及び第２のＴＴＡが異なる、請求項１９に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記第３及び第４のｓｄＡＢＤが、配列番号４５を有する、請求項１９〜２１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項２３】
核酸組成物であって、
ａ）請求項１９〜２２のいずれかに記載の第１のタンパク質をコードする第１の核酸と、
ｂ）請求項１９〜２２のいずれかに記載の第２のタンパク質をコードする第２の核酸と、を含む、前記核酸組成物。
【請求項２４】
発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項２３に記載の第１の核酸を含む第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項２３に記載の第２の核酸を含む第２の発現ベクターと、を含む、前記発現ベクター組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
【請求項２６】
組成物を作製する方法であって、前記タンパク質が発現する条件下で請求項２５に記載の宿主細胞を培養することと、前記タンパク質を回収することと、を含む、前記方法。
【請求項２７】
請求項１９〜２２のいずれかに記載のタンパク質を患者に投与することを含む、がんを治療する方法。
【請求項２８】
組成物であって、
ａ）第１のタンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第１のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｉｉ）第１のドメインリンカーと、
ｉｉｉ）第２のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｉｖ）第２のドメインリンカーと、
ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端に、
１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、
２）開裂性リンカー、ならびに
３）ｉＶＬＣＤＲ１、ｉＶＬＣＤＲ２、及びｉＶＬＣＤＲ３を含む第１の偽可変軽ドメイン、を含む、偽Ｆｖドメインと、
ｉｖ）第３のドメインリンカーと、
ｖ）ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡと、を含む、前記第１のタンパク質と、
ａ）第２のタンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、
ｉ）第３のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｉｉ）第４のドメインリンカーと、
ｉｉｉ）第４のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、
ｉｖ）第５のドメインリンカーと、
ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端に、
１）ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖、
２）開裂性リンカー、ならびに
３）ｉＶＨＣＤＲ１、ｉＶＨＣＤＲ２、及びｉＶＨＣＤＲ３を含む第１の偽可変重ドメイン、を含む、偽Ｆｖドメインと、
ｉｖ）第６のドメインリンカーと、
ｖ）ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡと、を含む、前記第２のタンパク質と、を含み、
前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の可変軽ドメインが、会合したときにヒトＣＤ３に結合することが可能であり、
前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の偽可変軽ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、
前記第１の可変軽ドメイン及び前記第１の偽可変重ドメインが、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成する、前記組成物。
【請求項２９】
前記ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡが、配列番号４５を有する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
核酸組成物であって、
ａ）請求項２８または２９に記載の第１のタンパク質をコードする第１の核酸と、
ｂ）それぞれ、請求項２８または２９に記載の第２のタンパク質をコードする第２の核酸と、を含む、前記核酸組成物。
【請求項３１】
発現ベクター組成物であって、
ａ）請求項３０に記載の第１の核酸を含む、第１の発現ベクターと、
ｂ）請求項３０に記載の第２の核酸を含む、第２の発現ベクターと、を含む、前記発現ベクター組成物。
【請求項３２】
請求項３１に記載の発現ベクター組成物を含む、宿主細胞。
【請求項３３】
組成物を作製する方法であって、前記タンパク質が発現する条件下で請求項３２に記載の宿主細胞を培養することと、前記タンパク質を回収することと、を含む、前記方法。
【請求項３４】
請求項２８または２９に記載のタンパク質を患者に投与することを含む、がんを治療する方法。
【請求項３５】
タンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、
ａ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ）と、
ｂ）第１のドメインリンカーと、
ｃ）
ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメイン、
ｉｉ）拘束非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）、ならびに
ｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメイン、を含む、拘束Ｆｖドメインと、
ｄ）開裂性リンカー（ＣＬ）と、
ｅ）ヒト血清アルブミンに結合する第２のｓｄＡＢＤと、
ｆ）ドメインリンカーと、
ｇ）
ｉ）第１の偽軽可変ドメイン、
ｉｉ）非開裂性リンカー（ＮＣＬ）、及び
ｉｉｉ）第１の偽重可変ドメイン、を含む、拘束偽Ｆｖドメインと、を含み、
前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の可変軽ドメインが、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、前記拘束Ｆｖドメインが、ＣＤ３に結合せず、
前記第１の可変重ドメイン及び前記第１の偽可変軽ドメインが、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、
前記第１の可変軽ドメイン及び前記第１の偽可変重ドメインが、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成する、前記タンパク質。
【請求項３６】
前記第１の可変重ドメインが、前記第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記偽軽可変ドメインが、前記偽可変重ドメインのＮ末端にある、請求項３５に記載のタンパク質。
【請求項３７】
前記第１の可変重ドメインが、前記第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前記偽可変重ドメインが、前記偽可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項３５に記載のタンパク質。
【請求項３８】
前記第１の可変軽ドメインが、前記第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記偽軽可変ドメインが、前記偽可変重ドメインのＮ末端にある、請求項３５に記載のタンパク質。
【請求項３９】
前記第１の可変軽ドメインが、前記第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前記偽可変重ドメインが、前記偽可変軽ドメインのＮ末端にある、請求項３５に記載のタンパク質。
【請求項４０】
前記ＴＴＡが、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、及びＢ７Ｈ３から選択される、請求項３５〜３９に記載のタンパク質。
【請求項４１】
前記ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡが、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、及び配列番号４１からなる群から選択される、請求項３５〜４０のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４２】
前記半減期延長ドメインが、配列番号４５を有する、請求項３５〜４１のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４３】
前記開裂性リンカーが、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、Ｍｅｐｒｉｎ  Ａ、Ｍｅｐｒｉｎ  Ｂ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｓ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ、Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ  Ｌ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、ｕＰＡ、Ｋａｌｌｅｋｒｉｅｎ７、マトリプターゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される、請求項３５〜４２のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項４４】
Ｐｒｏ２５８、Ｐｒｏ３５６、Ｐｒｏ３５９、Ｐｒｏ３８８、及びＰｒｏ３６４を含む、請求項３５に記載のタンパク質。
【請求項４５】
請求項３５〜４４のいずれかに記載のタンパク質をコードする、核酸。
【請求項４６】
請求項４５に記載の核酸を含む、発現ベクター。
【請求項４７】
請求項４６に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項４８】
タンパク質を作製する方法であって、前記タンパク質が発現する条件下で請求項４７に記載の宿主細胞を培養することと、前記タンパク質を回収することと、を含む、前記方法。
【請求項４９】
請求項３５〜４４のいずれかに記載のタンパク質を患者に投与することを含む、がんを治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下、２０１７年９月８日出願の米国仮特許出願第６２／５５５，９４３号、２０１７年１１月１５日出願の米国仮特許出願第６２／５８６，６２７号、及び２０１７年１１月１６日出願の米国仮特許出願第６２／５８７，３１８号の優先権を主張し、これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に明示的に組み込まれる。
【０００２】
コンパクトディスクで提出した「配列表」、表、またはコンピュータープログラムリスティング付録への参照。
ファイル名「１１８４５９−５００５＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」に含まれ、９８４キロバイトのサイズを有する配列表は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して本明細書と電子的に提出され、ｔｘｔファイルの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
個々の細胞または特定の細胞型の選択的破壊は、様々な臨床環境において望ましい場合が多い。例えば、腫瘍細胞を特異的に破壊しながら、健康な細胞及び組織を可能な限り無傷及び非損傷の状態で残すことが、がん療法の主要目的である。１つのそのような方法は、腫瘍に対する免疫応答を誘発して、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞または細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などの免疫エフェクター細胞に腫瘍細胞を攻撃及び破壊させることによる。
【０００４】
腫瘍関連抗原に優れた結合特異性及び親和性を提供する無傷モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用は、がん治療及び診断の分野でうまく適用されてきた。しかしながら、無傷ｍＡｂの大きいサイズ、それらの不十分な生体内分布、低い効力、及び血液プール中の長い持続性は、無傷ｍＡｂの臨床用途を制限してきた。例えば、無傷抗体は、腫瘍範囲内の特定の蓄積を示し得る。生体内分布研究において、周辺領域内の一次蓄積を伴う不均質な抗体分布は、腫瘍を精密に調査するときに顕著である。腫瘍壊死、不均質な抗体分布、及び間質組織圧力の増大により、無傷抗体構築物で腫瘍の中心部分に到達することは不可能である。対照的に、より小さい抗体フラグメントは、迅速な腫瘍局在を示し、腫瘍内へとより深く浸透し、また血流から比較的迅速に除去される。しかしながら、ｓｃＦｖ及び他の構築物を含む多くの抗体は、分子が非腫瘍細胞上で活性であり、副作用を引き起こし、その一部が毒性であり得る、「オン標的／オフ腫瘍」効果を示す。本発明は、腫瘍プロテアーゼの存在下で選択的に活性化される新規の構築物に関する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、がんの治療のための多くの異なるタンパク質組成物を提供する。したがって、一態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する第１の単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ）と、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメイン、ｉｉ）拘束非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）、ならびにｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメイン、を含む、拘束Ｆｖドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）第２のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）と、ｇ）ｉ）第１の偽軽可変ドメイン、ｉｉ）非開裂性リンカー（ＮＣＬ）、及びｉｉｉ）第１の偽重可変ドメイン、を含む、拘束偽Ｆｖドメインと、ｈ）第３のドメインリンカーと、ｉ）ヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤと、を含む「形式２」タンパク質を提供し、前述の第１の可変重ドメイン及び前述の第１の可変軽ドメインは、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、前述の拘束Ｆｖドメインは、ＣＤ３に結合せず、前述の第１の可変重ドメイン及び前述の第１の偽可変軽ドメインは、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、前述の第１の可変軽ドメイン及び前述の第１の偽可変重ドメインは、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成する。
【０００６】
さらなる態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、ａ）第１のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメイン、ｉｉ）拘束開裂性リンカー（ＣＣＬ）、ならびにｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメイン、を含む、拘束Ｆｖドメインと、ｄ）第２のドメインリンカーと、ｅ）第２のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、ｆ）開裂性リンカー（ＣＬ）と、ｇ）ｉ）第１の偽軽可変ドメイン、ｉｉ）非開裂性リンカー（ＮＣＬ）、及びｉｉｉ）第１の偽重可変ドメイン、を含む、拘束偽Ｆｖドメインと、ｈ）第３のドメインリンカーと、ｉ）ヒト血清アルブミンに結合する第３のｓｄＡＢＤと、を含む「形式１」タンパク質を提供し、前述の第１の可変重ドメイン及び前述の第１の可変軽ドメインは、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、前述の拘束Ｆｖドメインは、ＣＤ３に結合せず、前述の第１の可変重ドメイン及び前述の第１の偽可変軽ドメインは、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、前述の第１の可変軽ドメイン及び前述の第１の偽可変重ドメインは、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成する。
さらなる態様では、本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、ａ）ヒト腫瘍標的抗原（ＴＴＡ）に結合する単一ドメイン抗原結合ドメイン（ｓｄＡＢＤ）（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ）と、ｂ）第１のドメインリンカーと、ｃ）ｉ）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む第１の可変重ドメイン、ｉｉ）拘束非開裂性リンカー（ＣＮＣＬ）、ならびにｉｉｉ）ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３を含む第１の可変軽ドメイン、を含む、拘束Ｆｖドメインと、ｄ）開裂性リンカー（ＣＬ）と、ｅ）ヒト血清アルブミンに結合する第２のｓｄＡＢＤと、ｆ）ドメインリンカーと、ｇ）ｉ）第１の偽軽可変ドメイン、ｉｉ）非開裂性リンカー（ＮＣＬ）、及びｉｉｉ）第１の偽重可変ドメイン、を含む、拘束偽Ｆｖドメインと、を含む「形式４」タンパク質を提供し、前述の第１の可変重ドメイン及び前述の第１の可変軽ドメインは、ヒトＣＤ３に結合することが可能であるが、前述の拘束Ｆｖドメインは、ＣＤ３に結合せず、前述の第１の可変重ドメイン及び前述の第１の偽可変軽ドメインは、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成し、前述の第１の可変軽ドメイン及び前述の第１の偽可変重ドメインは、分子内で会合して不活性Ｆｖを形成する。
【０００７】
上記に列挙した形式１、形式２、及び形式４タンパク質のさらなる態様では、前述の第１の可変重ドメインは、前述の第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前述の偽軽可変ドメインは、前述の偽可変重ドメインのＮ末端にある。
【０００８】
上記に列挙した形式１、形式２、及び形式４タンパク質のさらなる態様では、前述の第１の可変重ドメインは、前述の第１の可変軽ドメインのＮ末端にあり、前述の偽可変重ドメインは、前述の偽可変軽ドメインのＮ末端にある。
【０００９】
上記に列挙した形式１、形式２、及び形式４タンパク質のさらなる態様では、前述の第１の可変軽ドメインは、前述の第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前述の偽軽可変ドメインは、前述の偽可変重ドメインのＮ末端にある。
【００１０】
上記に列挙した形式１、形式２、及び形式４タンパク質のさらなる態様では、前述の第１の可変軽ドメインは、前述の第１の可変重ドメインのＮ末端にあり、前述の偽可変重ドメインは、前述の偽可変軽ドメインのＮ末端にある。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、前述の第１及び第２のＴＴＡが同じである、形式１及び２タンパク質を提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、前述の第１及び第２のＴＴＡが異なる、形式１及び２タンパク質を提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、前述の第１及び第２のＴＴＡが、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、及びＢ７Ｈ３から選択される、形式１、２、及び４タンパク質を提供する。これらの配列は、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、及び配列番号４１からなる群から選択され得る。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、前述の半減期延長ドメインが、配列番号４５を有する、形式１、２、及び４タンパク質を提供する。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、ＭＭＰ２、ＭＭＰ９、Ｍｅｐｒｉｎ  Ａ、Ｍｅｐｒｉｎ  Ｂ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｓ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ、Ｃａｔｈｅｓｐｉｎ  Ｌ、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、ｕＰＡ、Ｋａｌｌｅｋｒｉｅｉｎ７、マトリプターゼ、及びトロンビンからなる群から選択されるヒトプロテアーゼによって開裂される、形式１、２、及び４タンパク質を提供する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、Ｐｒｏ１８６、Ｐｒｏ２２５、Ｐｒｏ２２６、Ｐｒｏ２３３、Ｐｒｏ３１１、Ｐｒｏ３１２、Ｐｒｏ３１３、Ｐｒｏ４９５、Ｐｒｏ２４６、Ｐｒｏ２５４、Ｐｒｏ２５５、Ｐｒｏ２５６、Ｐｒｏ４２０、Ｐｒｏ４２１、Ｐｒｏ４３２、Ｐｒｏ４７９、Ｐｒｏ４８０、Ｐｒｏ１８７、Ｐｒｏ２２１、Ｐｒｏ２２２、Ｐｒｏ２２３、Ｐｒｏ２２４、Ｐｒｏ３９３、Ｐｒｏ３９４、Ｐｒｏ３９５、Ｐｒｏ３９６、Ｐｒｏ４２９、Ｐｒｏ４３０、及びＰｒｏ４３１からなる群から選択されるタンパク質を提供する。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の形式１、２、または４タンパク質をコードする核酸、ならびにタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクター及び宿主細胞を提供する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、本発明のタンパク質を作製する方法、及び治療を必要としている患者にそれを行う方法を提供する。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、ａ）第１のタンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、ｉ）第１のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、ｉｉ）第１のドメインリンカーと、ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端に、１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、２）開裂性リンカー、ならびに３）ｉＶＬＣＤＲ１、ｉＶＬＣＤＲ２、及びｉＶＬＣＤＲ３を含む第１の偽可変軽ドメイン、を含む、偽Ｆｖドメインと、ｉｖ）第２のドメインリンカーと、ｖ）ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡと、を含む、第１のタンパク質と、ａ）第１第２のタンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、ｉ）ヒト腫瘍標的抗原に結合する第３のｓｄＡＢＤと、ｉｉ）第３のドメインリンカーと、ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端に、１）ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖、２）開裂性リンカー、ならびに３）ｉＶＨＣＤＲ１、ｉＶＨＣＤＲ２、及びｉＶＨＣＤＲ３を含む第１の偽可変重ドメイン、を含む、偽Ｆｖドメインと、ｉｖ）第４のドメインリンカーと、ｖ）ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡと、を含む、第１第２のタンパク質と、を含む、プロドラッグタンパク質の「形式３Ａ」対を含む組成物を提供し、前述の第１の可変重ドメイン及び前述の第１の可変軽ドメインは、会合したときにヒトＣＤ３に結合することが可能であり、前述の第１の可変重ドメイン及び前述の第１の偽可変軽ドメインは、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、前述の第１の可変軽ドメイン及び前述の第１の偽可変重ドメインは、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、前記第１及び第３のｓｄＡＢＤは、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、及び配列番号４１からなる群から選択される。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、ａ）第１のタンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、ｉ）第１のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、ｉｉ）第１のドメインリンカーと、ｉｉｉ）第２のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、ｉｖ）第２のドメインリンカーと、ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端に、１）ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む可変重鎖、２）開裂性リンカー、ならびに３）ｉＶＬＣＤＲ１、ｉＶＬＣＤＲ２、及びｉＶＬＣＤＲ３を含む第１の偽可変軽ドメイン、を含む、偽Ｆｖドメインと、ｉｖ）第３のドメインリンカーと、ｖ）ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡと、を含む、第１のタンパク質と、ａ）第１第２のタンパク質であって、Ｎ末端からＣ末端に、ｉ）第３のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、ｉｉ）第４のドメインリンカーと、ｉｉｉ）第４のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡと、ｉｖ）第５のドメインリンカーと、ｉｉｉ）Ｎ末端からＣ末端に、１）ＶＬＣＤＲ１、ＶＬＣＤＲ２、及びＶＬＣＤＲ３を含む可変軽鎖、２）開裂性リンカー、ならびに３）ｉＶＨＣＤＲ１、ｉＶＨＣＤＲ２、及びｉＶＨＣＤＲ３を含む第１の偽可変重ドメイン、を含む、偽Ｆｖドメインと、ｉｖ）第６のドメインリンカーと、ｖ）ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡと、を含む、第１第２のタンパク質と、を含む、プロドラッグタンパク質の「形式３Ｂ」対を含む組成物を提供し、前述の第１の可変重ドメイン及び前述の第１の可変軽ドメインは、会合したときにヒトＣＤ３に結合することが可能であり、前述の第１の可変重ドメイン及び前述の第１の偽可変軽ドメインは、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成し、前述の第１の可変軽ドメイン及び前述の第１の偽可変重ドメインは、分子間で会合して不活性Ｆｖを形成する。
【００２１】
さらなる態様では、形式３Ａ及び形式３Ｂタンパク質は、配列番号４５を有するｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを有する。
【００２２】
さらなる態様では、形式３Ａ及び形式３Ｂタンパク質は、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、及びＢ７Ｈ３から選択されるＴＴＡに結合するｓｄＡＢＤ−ＴＴＡを有する。ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３、配列番号１７、配列番号２１、配列番号２５、配列番号２９、配列番号３３、配列番号３７、及び配列番号４１からなる群から選択され得る。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、プロドラッグ対の第１のタンパク質メンバーをコードする第１の核酸、及び対の第２のタンパク質メンバーをコードする第２の核酸、ならびに核酸を含有する発現ベクター及び宿主細胞を含む、核酸組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本明細書において「拘束開裂性構築物」または「ｃｃ構築物」と称される、本発明のプロテアーゼ活性化の「形式１」型を示す。この実施形態では、代表的な構築物は、Ｐｒｏ１４０であり、２つＴＴＡに対してＡＢＤが存在する（図１に示されるように、これらは両方同じであるが、本明細書に記載のように、それらは異なってもよい）。開裂すると、プロドラッグ構築物は、３つの構成成分に分裂し、１つは、ドメインリンカーを介してαＣＤ３の活性ＶＨに連結されたα−ＴＴＡドメインを含有し、第２の構成成分は、ドメインリンカーを介してαＣＤ３の活性ＶＬに連結されたα−ＴＴＡドメインを含有し、「残りの」片は、不活性ＶＨ及びＶＬに連結された半減期延長ドメインを含む。次いで、２つの活性可変ドメインは自由に会合して、機能的抗ＣＤ３結合ドメインを形成する。「形式１」の実施形態において、得られる活性構成成分が三価であり、ＣＤ３に結合する一価及びＴＴＡに結合する二価が存在し、二重特異性結合タンパク質をもたらすが、場合によっては、この三価は、三重特異性であり得、一価がＣＤ３に結合し、一価が第１のＴＴＡに結合し、一価が第２のＴＴＡに結合することに留意されたい。図１はまた、半減期延長ドメイン、多くの実施形態では、本明細書に定義されるようにｓｄＡＢＤとして、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ドメインを示すが、本明細書で考察されるように、これは任意であり、かつ／または他の半減期延長ドメインによって置き換えられ得、加えて、半減期延長ドメインはまた、構築物のＮ末端にあってもよいか、もしくは同様に内部にあってもよい。図１はまた、ＦｖのＶＨ及びＶＬ、ならびに偽ＦｖのｉＶＨ及びｉＶＬを特定の順序で、例えば、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ−リンカー−ＶＬ（及びｉＶＬ−リンカー−ｉＶＨ）で有するが、当業者によって理解されるように、これらは逆でもよい（ＶＬ−リンカー−ＶＨ及びｉＶＨ−リンカー−ｉＶＬ）。あるいは、これらのＦｖのうちの１つは、１つの配向にあってもよく、もう１つは、もう１つの配向にあってもよいが、ここに示される配向のタンパク質の発現は、他の配向よりも驚くほど高かった。
【図２】本明細書において「拘束非開裂性構築物」または「ＣＮＣＬ構築物」と称され、また本明細書において、本明細書で考察されるように「二量化構築物」と称されるときもある、本発明のプロテアーゼ活性化の「形式２」型を示す。これらの構築物は、本明細書で考察されるように異性化しない。開裂すると、２つのプロドラッグ構築物は、４つの構成成分に分裂し、２つは、偽ドメイン（リンカーの長さ及び不活性化突然変異に応じて、自己会合することが可能であってもなくてもよい）に連結された２つの半減期延長ドメイン（この場合、ＨＳＡに対するｓｄＡＢＤ）であり、２つは、４つの抗ＴＴＡドメイン（全て同じであってもよく、または２つが同じであり、他の２つが異なる）を含有する二量体活性部分に自己集合する活性部分である。「形式２」の実施形態において、得られる活性構成成分が六価であり、ＣＤ３に結合する二価及びＴＴＡに結合する四価が存在し、二重特異性結合タンパク質をもたらすが、場合によっては、この六価は、三重特異性であり得、二価がＣＤ３に結合し、二価が第１のＴＴＡに結合し、二価が第２のＴＴＡに結合することに留意されたい。図２はまた、半減期延長ドメイン、多くの実施形態では、本明細書に定義されるようにｓｄＡＢＤとして、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ドメインを示すが、本明細書で考察されるように、これは任意であり、かつ／または他の半減期延長ドメインによって置き換えられ得、加えて、半減期延長ドメインはまた、構築物のＮ末端にあってもよいか、もしくは同様に内部にあってもよい。図２はまた、ＦｖのＶＨ及びＶＬ、ならびに偽ＦｖのｉＶＨ及びｉＶＬを特定の順序で、例えば、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ−リンカー−ＶＬ（及びｉＶＬ−リンカー−ｉＶＨ）で有するが、当業者によって理解されるように、これらは逆でもよい（ＶＬ−リンカー−ＶＨ及びｉＶＨ−リンカー−ｉＶＬ）。あるいは、これらのＦｖのうちの１つは、１つの配向にあってもよく、もう１つは、もう１つの配向にあってもよいが、ここに示される配向のタンパク質の発現は、他の配向よりも驚くほど高かった。
【図３Ａ】これらが本明細書でさらに考察されるようにＭＣＥ治療薬を一緒に構成する２つの異なるポリペプチド鎖であるため、本明細書で概説されるように「半構築物」または「半ＣＯＢＲＡ（商標）」と称されるときもある、「形式３」型の構築物を示す。この実施形態では、構築物は、対で送達され、開裂前の分子内自己集合は、不活性の抗ＣＤ３  Ｆｖドメインをもたらす。開裂すると、非活性可変ドメインが放出され、次いで、２つの活性可変ドメインが分子間で集合して、活性抗ＣＤ３結合ドメインを形成する。２つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、腫瘍細胞表面上で対応する受容体に結合し、開裂がプロテアーゼによって行われる。これは、分子が物理的に定位置に保持され、活性抗ＣＤ３ドメインの集合を好むため、分子間集合を可能にする。形成１及び２に関する上記のように、この実施形態では、可変ドメインのＮ末端からＣ末端への順序は逆であってもよく、または同様に混合されてもよい。さらに、ｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）は、各半構築物のＮ末端またはＣ末端のいずれかにあってもよい。Ｐｒｏ１６は、Ｃ末端にｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）を有し、Ｐｒｏ１７は、Ｎ末端にｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）を有する（Ｐｒｏ１９、配列番号ＸＸがＣ末端にｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）を有することを参照）。図３Ａは、半構築物当たり単一のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡドメインを有する形式３構築物を示し、図３Ｂは、「二重標的化」または「ヘテロ標的化」形式で、半構築物当たり２つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡを有する形式３構築物を示す。図３Ｂが、２つのＴＴＡとしてＦＯＬＲ１及びＥＧＦＲを使用するが、本明細書で概説されるような他の組み合わせもまた使用され得ることに留意されたい。
【図３Ｂ】これらが本明細書でさらに考察されるようにＭＣＥ治療薬を一緒に構成する２つの異なるポリペプチド鎖であるため、本明細書で概説されるように「半構築物」または「半ＣＯＢＲＡ（商標）」と称されるときもある、「形式３」型の構築物を示す。この実施形態では、構築物は、対で送達され、開裂前の分子内自己集合は、不活性の抗ＣＤ３  Ｆｖドメインをもたらす。開裂すると、非活性可変ドメインが放出され、次いで、２つの活性可変ドメインが分子間で集合して、活性抗ＣＤ３結合ドメインを形成する。２つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、腫瘍細胞表面上で対応する受容体に結合し、開裂がプロテアーゼによって行われる。これは、分子が物理的に定位置に保持され、活性抗ＣＤ３ドメインの集合を好むため、分子間集合を可能にする。形成１及び２に関する上記のように、この実施形態では、可変ドメインのＮ末端からＣ末端への順序は逆であってもよく、または同様に混合されてもよい。さらに、ｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）は、各半構築物のＮ末端またはＣ末端のいずれかにあってもよい。Ｐｒｏ１６は、Ｃ末端にｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）を有し、Ｐｒｏ１７は、Ｎ末端にｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）を有する（Ｐｒｏ１９、配列番号ＸＸがＣ末端にｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）を有することを参照）。図３Ａは、半構築物当たり単一のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡドメインを有する形式３構築物を示し、図３Ｂは、「二重標的化」または「ヘテロ標的化」形式で、半構築物当たり２つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡを有する形式３構築物を示す。図３Ｂが、２つのＴＴＡとしてＦＯＬＲ１及びＥＧＦＲを使用するが、本明細書で概説されるような他の組み合わせもまた使用され得ることに留意されたい。
【図４】「形式２」構築物と同様であるが、単一のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡのみを有する、「形式４」型の構築物を示す。図は、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡからＥＧＦＲを示すが、当業者によって理解されるように、他のＴＴＡも使用され得る。開裂すると、プロドラッグ構築物は、２つの構成成分、偽Ｆｖに連結された半減期延長ドメイン（この場合、ＨＳＡに対するｓｄＡＢＤ）、及び異なる開裂分子からの第２の活性部分の存在下で、２つの抗ＴＴＡドメインを含有する二量体活性部分に自己集合する活性部分に分裂する。「形式４」の実施形態において、得られる活性構成成分が四価であり、ＣＤ３に結合する二価及びＴＴＡに結合する二価が存在し、二重特異性結合タンパク質をもたらすことに留意されたい。図４はまた、半減期延長ドメイン、多くの実施形態では、本明細書に定義されるようにｓｄＡＢＤ（１／２）として、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ドメインを示すが、本明細書で考察されるように、これは任意であり、かつ／または他の半減期延長ドメインによって置き換えられ得、加えて、半減期延長ドメインはまた、構築物のＮ末端にあってもよいか、もしくは同様に内部にあってもよい。図４はまた、ＦｖのＶＨ及びＶＬ、ならびに偽ＦｖのｉＶＨ及びｉＶＬを特定の順序で、例えば、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ−リンカー−ＶＬ（及びｉＶＬ−リンカー−ｉＶＨ）で有するが、当業者によって理解されるように、これらは逆でもよい（ＶＬ−リンカー−ＶＨ及びｉＶＨ−リンカー−ｉＶＬ）。あるいは、これらのＦｖのうちの１つは、１つの配向にあってもよく、もう１つは、もう１つの配向にあってもよいが、ここに示される配向のタンパク質の発現は、他の配向よりも驚くほど高かった。
【図５Ａ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図５Ｂ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図５Ｃ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図５Ｄ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図５Ｅ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図５Ｆ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図５Ｇ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図６Ａ】多くの好適なプロテアーゼ開裂部位を示す。当業者によって理解されるように、これらの開裂部位は、開裂性リンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、例えば、より柔軟な開裂性リンカーが必要とされる場合、これらの開裂部位のＮ末端及びＣ末端のいずれかまたは両方にある追加のアミノ酸（一般にグリシン及びセリン）が存在し得る。
【図６Ｂ】多くの好適なプロテアーゼ開裂部位を示す。当業者によって理解されるように、これらの開裂部位は、開裂性リンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、例えば、より柔軟な開裂性リンカーが必要とされる場合、これらの開裂部位のＮ末端及びＣ末端のいずれかまたは両方にある追加のアミノ酸（一般にグリシン及びセリン）が存在し得る。
【図７Ａ】「形式３」または「半ＣＯＢＲＡ（商標）」構築物と関連するいくつかのデータを示す。これは、形式３構築物が、プロテアーゼ（この場合、ＥＫプロテアーゼであるが、本明細書で概説され、図５及び図６に示されるプロテアーゼ開裂部位のうちのいずれかが使用され得る）による開裂後にＣＤ３に協調的に結合し、サンドイッチＦＡＣＳ分析によって示されるように、ＣＤ３結合部位を作り出すことを示す。
【図７Ｂ】「形式３」または「半ＣＯＢＲＡ（商標）」構築物と関連するいくつかのデータを示す。これは、形式３構築物が、プロテアーゼ（この場合、ＥＫプロテアーゼであるが、本明細書で概説され、図５及び図６に示されるプロテアーゼ開裂部位のうちのいずれかが使用され得る）による開裂後にＣＤ３に協調的に結合し、サンドイッチＦＡＣＳ分析によって示されるように、ＣＤ３結合部位を作り出すことを示す。
【図７Ｃ】「形式３」または「半ＣＯＢＲＡ（商標）」構築物と関連するいくつかのデータを示す。これは、形式３構築物が、プロテアーゼ（この場合、ＥＫプロテアーゼであるが、本明細書で概説され、図５及び図６に示されるプロテアーゼ開裂部位のうちのいずれかが使用され得る）による開裂後にＣＤ３に協調的に結合し、サンドイッチＦＡＣＳ分析によって示されるように、ＣＤ３結合部位を作り出すことを示す。
【図７Ｄ】「形式３」または「半ＣＯＢＲＡ（商標）」構築物と関連するいくつかのデータを示す。これは、形式３構築物が、プロテアーゼ（この場合、ＥＫプロテアーゼであるが、本明細書で概説され、図５及び図６に示されるプロテアーゼ開裂部位のうちのいずれかが使用され得る）による開裂後にＣＤ３に協調的に結合し、サンドイッチＦＡＣＳ分析によって示されるように、ＣＤ３結合部位を作り出すことを示す。
【図８Ａ】プロテアーゼ開裂が、相補的半ＣＯＢＲＡ（商標）対とＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞死滅を協調的に活性化することを示す。図８Ａ及び図８Ｂは、単離しているが、異なる濃度のプロテアーゼで開裂された構築物が、標的細胞の生存率に影響を与えないことを示す。しかしながら、図８Ｃは、組み合わせて、プロテアーゼの存在下で、標的細胞の生存率が有意に減少していることを示す。図８Ｄは、一般的機構を示す。
【図８Ｂ】プロテアーゼ開裂が、相補的半ＣＯＢＲＡ（商標）対とＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞死滅を協調的に活性化することを示す。図８Ａ及び図８Ｂは、単離しているが、異なる濃度のプロテアーゼで開裂された構築物が、標的細胞の生存率に影響を与えないことを示す。しかしながら、図８Ｃは、組み合わせて、プロテアーゼの存在下で、標的細胞の生存率が有意に減少していることを示す。図８Ｄは、一般的機構を示す。
【図８Ｃ】プロテアーゼ開裂が、相補的半ＣＯＢＲＡ（商標）対とＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞死滅を協調的に活性化することを示す。図８Ａ及び図８Ｂは、単離しているが、異なる濃度のプロテアーゼで開裂された構築物が、標的細胞の生存率に影響を与えないことを示す。しかしながら、図８Ｃは、組み合わせて、プロテアーゼの存在下で、標的細胞の生存率が有意に減少していることを示す。図８Ｄは、一般的機構を示す。
【図８Ｄ】プロテアーゼ開裂が、相補的半ＣＯＢＲＡ（商標）対とＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞死滅を協調的に活性化することを示す。図８Ａ及び図８Ｂは、単離しているが、異なる濃度のプロテアーゼで開裂された構築物が、標的細胞の生存率に影響を与えないことを示す。しかしながら、図８Ｃは、組み合わせて、プロテアーゼの存在下で、標的細胞の生存率が有意に減少していることを示す。図８Ｄは、一般的機構を示す。
【図８】形式１構築物の有効性を試験するためのアッセイで使用するためのいくつかの非標的対照を示す。
【図９Ａ−１０Ｆ】活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方の「アーム」、例えば、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡドメイン（それらのうちの１つは、２つの構築物の各々の上にある）の標的結合に依存していることを示す。ＴＤＣＣアッセイを、実施例に記載されるように行った。
【図１０】好適な半ＣＯＢＲＡ（商標）対の概略図を示す。「Ｍｅｐ」は、メプリンプロテアーゼ開裂部位を表し、「Ｈｉｓ−６」は、本明細書でより十分に考察されるタグであり、ＳＴ１４は、マトリプターゼプロテアーゼ開裂部位であり、「Ｔｈｂ」は、トロンビンプロテアーゼ開裂部位である。
【図１１Ａ−１２Ｃ】図１０の構築物に関連したＴＤＣＣデータを示す。図１１Ａは、予め開裂された半ＣＯＢＲＡ対の付加が、ＯｖＣＡＲ８細胞に対する有効性をもたらすことを示し、図１１Ｂは、予め開裂された半ＣＯＢＲＡ対の付加が、ＨＣＴ１１６細胞に対する有効性をもたらすことを示し、図１１Ｃは、予め開裂された半ＣＯＢＲＡ対の付加が、ＬｏＶｏ細胞に対する有効性をもたらすことを示し、それらの全てが、がん細胞株である。
【図１２Ａ−１３Ｂ】ＭＭＰ９リンカーが、インビボで安定していることを示す。ＮＳＧマウスに、０．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで尾静脈を介して、Ｐｒｏ４０（ＭＭＰ９開裂可能）、Ｐｒｏ７４（開裂不可能）のいずれかの単回静脈内ボーラス用量を投与した。各化合物の投与溶液を、２５ｍＭのクエン酸、７５ｍＭのＬ−アルギニン、７５ｍＭのＮａＣｌ、及び４％スクロース、ｐＨ７．０のビヒクル中で調製した。２つの血液試料を各動物から予め選択された時間に採取し、１つは、研究の開始の頃に眼窩出血または顎下腺出血によって採取し、もう１つは、最終時点で心臓穿刺によって採取した。採血の時点は、０．０８３、１、６、２４、７２、及び１６８時間であった。血漿を、Ｋ２  ＥＤＴＡ管を使用して各個々の血液試料から調製した。濃度を、抗ＨＳＡ  ｓｄＡＢＤに特異的なＭＡｂを用いたＭＳＤアッセイを使用して決定し、ＥＧＦＲ細胞外ドメインで検出した。
【図１３】図１４に示される実験で使用される形式３Ａ半ＣＯＢＲＡ（商標）構築物の概略図を示す。Ｐｒｏ５１は、それが活性抗ＣＤ３  Ｆｖを形成することから「常にオン」であるため、陽性対照である。Ｐｒｏ９８は、そのｓｄＡＢＤが、ニワトリ卵白リゾチームに向けられ、それが腫瘍によって発現しないため、陰性対照である。Ｐｒｏ７７及びＰｒｏ５３は、ＥＧＦＲに対するｓｄＡＢＤ及びＭＭＰ９開裂部位を使用した、プロドラッグ形式３Ａ対である。Ｐｒｏ７４及びＰｒｏ７２は、それらが開裂部位を有しないため、陰性対照の形式３Ａ対である。
【図１４】形式１構築物が、実施例のプロトコルを使用してマウスに移植された２つの異なる腫瘍細胞株を使用して、インビボで腫瘍を退行させるよう作用することを示す。半ＣＯＢＲＡ構築物（Ｐｒｏ７７及びＰｒｏ５３）を用いた抗腫瘍活性は、活性抗ＣＤ３  Ｆｖと共に抗ＥＧＦＲ  ｓｄＡＢＤ及びＭＭＰ９開裂性リンカーの両方を含むことに依存している。
【図１５】参照により本明細書に組み込まれるＵＳ  ２０１８／０１３４７８９に概して記載されるように、２つの偽Ｆｖドメインを有し、それらの間に開裂可能な部位がある、次世代形式の完全長構築物の概略図を示す。しかしながら、以下の図に示されるように、この第１世代の完全長構築物は、それが異性化して活性構築物及び不活性構築物の両方を形成し得るため、非常に良好な条件付けを示さない。
【図１６】形式３Ａ構築物対が実際に、Ｐｒｏ１００の第１世代の完全長構築物よりも良好な条件付けを示すことを示す。
【図１７】図１８で試験した追加の第１世代の完全長構築物を示す。
【図１８】第１世代の構築物が、未開裂形式、例えば、不十分な条件付けにおいてさえ、高い活性を示すことを示す。
【図１９】第１世代の完全長構築物が、分析ＳＥＣ上で２つのモノマーピークを示すことを示す。
【図２０】非開裂活性の理由の概略図を示し、これは、完全長の第１世代の構築物が異性化して２つの配座を形成することであり、１つは、形成された活性抗ＣＤ３  Ｆｖ（「二価ｓｃＦｖ」）がないため不活性であり、もう１つは、プロテアーゼの非存在下で、「単鎖ダイアボディ」型の配置である。ＰＥＤＳ  ２３（８）：６６７−６７７（２０１０）を参照されたい。
【図２１】第１世代の単鎖構築物を用いた、２日間３７Ｃで実行したＴＤＣＣアッセイの結果を示す。結果は、未開裂構築物が強力な死滅を示すことを示す。これらの結果は、形式１構築物の生成をもたらす。
【図２２Ａ−２３Ｇ】本発明で使用される形式１構築物を示す。当業者によって理解されるように、かつ本明細書に記載されるように、これらは、ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ標的化部分を有して図示されるが、他のＴＴＡに対するｓｄＡＢＤも使用され得る。
【図２３】形式１構築物（この場合、Ｐｒｏ１４０）が、３７Ｃで安定している単一異性体を形成することを示す。
【図２４】形式１構築物が、Ｏｃｔｅｔアッセイによって測定されるように、未開裂形式でヒトＣＤ３に対して非常に低い結合を有することを示す。一番上の線は、Ｐｒｏ１２０であり、中央の線は、Ｐｒｏ５１（陽性対照）であり、一番下の線は、３日間４Ｃまたは３７Ｃのいずれかで保持されたＰｒｏ１４０である。
【図２５】形式１構築物が、未開裂形態で非常に低いＴＤＣＣ活性を有することを同様に示す。
【図２６】標的化部分としてｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ、及びＭＭＰ９開裂部位を使用したインビボ試験で使用される、特定の形式１構築物Ｐｒｏ１４０を示す。
【図２７Ａ−２８Ｂ】形式１構築物を使用した腫瘍退行を示す。
【図２８】拘束Ｆｖの開裂部位により、いくつかの異なるフラグメント、部分的開裂フラグメント及び完全開裂フラグメントが生成され得ることを示す。驚くべきことに、部分的開裂形式は、完全開裂形式よりも活性であり、形式２の生成をもたらす。
【図２９】多くの形式２の概略図を示し、これらの全ては、ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ標的化ドメインを使用するが、本明細書で概説されるように、かつ配列に列挙されるように、他のＴＴＡに対するｓｄＡＢＤが使用され得る。Ｐｒｏ５１及びＰｒｏ２０１は、陽性対照（活性「半」配置において）であり、Ｐｒｏ２１４は、開裂部位がないため、完全長陰性対照である。
【図３０】メプリン開裂部位を使用する形式２構築物Ｐｒｏ１８７のＴＤＣＣ活性を示す。ＴＤＣＣアッセイにおけるＰｒｏ１８７は、未開裂で付加されたときよりも予め開裂されて付加されたときに１２００倍活性であった。予め開裂されたＰｒｏ１８７は、陽性対照Ｐｒｏ５１とＰｒｏ２０１との間に位置した活性を実証した。未開裂Ｐｒｏ１８７は、プロテアーゼ開裂性リンカーを含有しないＰｒｏ２１４と同様の活性を実証した。
【図３１】ＭＭＰ９開裂部位を使用する形式２構築物Ｐｒｏ１８６のＴＤＣＣ活性を示す。ＴＤＣＣアッセイにおけるＰｒｏ１８６は、未開裂で付加されたときよりも予め開裂されて付加されたときに１８倍活性であった。予め開裂されたＰｒｏ１８６は、陽性対照Ｐｒｏ５１とＰｒｏ２０１との間に位置した活性を実証した。未開裂Ｐｒｏ１８６は、プロテアーゼ開裂性リンカーを含有しないＰｒｏ２１４よりも高い活性を実証した。
【図３２】Ｐｒｏ１８６構築物が、異なるレベルのＥＧＦＲ受容体を有する細胞に結合し、ＣＨＯ細胞が、細胞表面上にＥＧＦＲを発現させないことを示す。Ｐｒｏ１８６は、同様のＣＯＢＲＡ濃度で異なるレベルのＥＧＦＲを発現させる細胞を飽和状態にする。
【図３３】図３４のインビボ研究で使用される形式２構築物の概略図を示し、これらの全ては、ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ標的化ドメインを使用する。
【図３４】形式２構築物Ｐｒｏ１８６が、両方の濃度で高度に有効性であり、より低い濃度で形式１構築物Ｐｒｏ１４０よりも良好であることを示す。
【図３５】Ｐｒｏ１８６に基づくが、異なるプロテアーゼ開裂部位を有する、多くの形式２構築物を示す。これらの構築物の全てが両方の標的化ドメインに対してｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲを使用するが、異なるＴＴＡに対して他のｓｄＡＢＤが使用され得、同じであっても異なっていてもよい。つまり、ホモ標的化（同じＴＴＡに対して両方の標的化ｓｄＡＢＤ）またはヘテロ標的化（第１のＴＴＡに対して１つのｓｄＡＢＤ及び異なるＴＴＡに対してもう１つのｓｄＡＢＤ）の両方が行われ得る。
【図３６】Ｆｖドメインによってリンカー長が異なる、異なる形式２構築物の概略図を示す。これらは、ＭＭＰ９開裂部位を使用して示されるが、本明細書で概説されるように、他が使用され得る。同様に、これらの構築物の全てが両方の標的化ドメインに対してｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲを使用するが、異なるＴＴＡに対して他のｓｄＡＢＤが使用され得、同じであっても異なっていてもよい。
【図３７】偽Ｆｖのリンカー長が異なり得ること、例えば、活性Ｆｖ間の短いリンカー（「短い活性」）及び偽Ｆｖ間のより長いリンカー（「長い不活性」）を有する形式２構築物が、「短い不活性」を伴う「短い活性」と同様の活性を示すことを示す。したがって、ＣＯＢＲＡ構築物の条件付けは、拘束されている活性ｓｃＦｖリンカー及び不活性ｓｃＦｖリンカーの両方に依存せず、それらのうちの１つが拘束されている限り、単鎖ダイアボディフォールディングは、二価ｓｃＦｖフォールディングよりも有利であるように思われる。
【図３８】活性Ｆｖのリンカー長が異なり得ること、例えば、「長い活性」及び「短い不活性」を有する形式２構築物が、「短い活性」及び「短い不活性」構築物と同様に挙動することを示す。したがって、ＣＯＢＲＡ構築物の条件付けは、拘束されている活性ｓｃＦｖリンカー及び不活性ｓｃＦｖリンカーの両方に依存せず、それらのうちの１つが拘束されている限り、単鎖ダイアボディフォールディングは、二価ｓｃＦｖフォールディングよりも有利であるように思われる。
【図３９Ａ−４０Ｃ】多くの異なる構築物の概略図を示す。Ｐｒｏ１８８は、偽Ｆｖにおける長いリンカー（１６ｍｅｒ）を除いてＰｒｏ１４０と同様である、形式１構築物である。Ｐｒｏ１８９及びＰｒｏ１９０（形式２構築物）は、偽Ｆｖにおける長いリンカー（１６ｍｅｒ）を除いてＰｒｏ１８６及びＰｒｏ１８７と同様である。Ｐｒｏ１９１及びＰｒｏ１９２（同様に形式２構築物）は、それらがｓｄＡＢＤ（１／２）上流に追加の開裂部位を有することを除いて、Ｐｒｏ１８９及びＰｒｏ１９０と同様である。Ｐｒｏ１９３（形式４）は、単一のＥＧＦＲ標的化ドメイン、逆の順序になるように再配置されたｉＶＨ及びｉＶＬ、ならびにｓｄＡＢＤ（１／２）の上流の追加の開裂部位を有する。Ｐｒｏ１９５は、標的化ドメインが同じＴＴＡ、ＥＧＦＲに結合するが、異なるエピトープに結合する、Ｐｒｏ１８６と同様の形式２構築物である。Ｐｒｏ１９６、Ｐｒｏ１９７、及びＰｒｏ１９８は、再配置された可変ドメインを有する形式２構築物である。
【図４０】ヒトＦＯＬＲ１に向けられた異なるｓｄＡＢＤクローンが、異なる死滅を示すという事実を示す。ヒトＦＯＬＲ１に結合するＰｒｏ２２型構築物（ＮＣＬの代わりにＦＬＡＧ配列を有するＰｒｏ５１）を、多くの細胞株ファミリーに対するＰｒｏ２２−ＥＧＦＲ構築物と比較した。
【図４１】ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ２（２つの分子が分子間で会合して、ＣＤ３に対して２つの活性Ｆｖを形成する）を使用したＰｒｏ２０１陽性対照、及び２つの形式２試験物品、ｈ７７．２  ｓｄＡＢＤを使用したＰｒｏ３１１及びｈ５９．３  ｓｄＡＢＤを使用したＰｒｏ３１２、ならびに２つの陰性対照、ｈ７７．２  ｓｄＡＢＤを使用したＰｒｏ２９９及びｈ５９．３  ｓｄＡＢＤを使用したＰｒｏ３０３の使用を含む、４つのｓｄＡＢＤ−ＦＯＬＲ１構築物の概略図を示す。
【図４２】インビボ設計におけるＦＯＬＲ／ＭＭＰ９の形式２構築物の概略図を示す。
【図４３】インビボでのＰｒｏ３１２構築物の有効性を示し、ＭＭＰ９開裂性リンカーが抗腫瘍活性に必要であることを実証する。
【図４４】Ｐｒｏ２４４、陽性対照（ｓｄＡＢＤ−Ｂ７Ｈ３（ｈＦ７）を使用（２つの分子が分子間で会合して、ＣＤ３に対して２つの活性Ｆｖを形成する）、ならびに２つの形式２試験物品、Ｐｒｏ２２５の形式２構築物、及びＰｒｏ２９５の開裂部位を欠いている陰性対照を含む、ヒトに対するｓｄＡＢＤを使用したいくつかの形式（ｓｄＡＢＤ−Ｂ７Ｈ３）の概略図を示す。
【図４５】Ｐｒｏ２２５が対照のＰｒｏ２９５と比較して大きい条件付けを有することを示す。
【図４６】メプリンリンカーを使用する形式２構築物、Ｐｒｏ３７３が、Ｐｒｏ２９５と比較して大きい条件付けを示す。
【図４７】ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲを使用したＰｒｏ５１の陽性対照、ｓｄＡＢＤ−ｈＦ１２  Ｂ７Ｈ３を使用したＰｒｏ２４４の陽性対照、試験構築物のＰｒｏ２２６、及び開裂部位なしの陰性対照Ｐｒｏ２９６を示す、多くのｓｄＡＢＤ−Ｂ７Ｈ３（ｈＦ１２配列を使用）構築物を示す。
【図４８】ＴＤＣＣアッセイにおいてＰｒｏ２２６構築物の良好な条件付けを示す。
【図４９】ヒトＥｐＣＡＭへのｓｄＡＢＤのヒト化を示す。
【図５０】多くの形式の概略図を示し、Ｐｒｏ２２ｈＶＩＢ１３及びＰｒｏ２０５は、陽性対照であり、Ｐｒｏ１９９は、形式２構築物であり、Ｐｒｏ１７５は、陰性対照である。
【図５１】良好な条件付けを示すｓｄＡＢＤ−ＥｐＣＡＭ構築物のＴＤＣＣ活性を示す。
【図５２Ａ−５３Ｂ】ＨＴ２９及びＬｏＶｏ細胞モデルにおいて良好な条件付けを示すｓｄＡＢＤ−ＥｐＣＡＭ  Ｐｒｏ１９９構築物のＴＤＣＣ活性を示す。
【図５３Ａ−５４Ｂ】ＨＴ２９及びＬｏＶｏ細胞モデルにおいて良好な条件付けを示すｓｄＡＢＤ−ＥｐＣＡＭ  Ｐｒｏ２００構築物のＴＤＣＣ活性を示す。
【図５４】二重ＥｐＣＡＭ  ｓｄＡＢＤを有するＰｒｏ１９９と比較して、１つがＥＧＦＲ（ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ）に対し、もう１つがＥｐＣＡＭ（ｓｄＡＢＤ−ＥｐＣＡＭ）に対する、２つの異なるｓｄＡＢＤ−ＴＴＡを使用するＰｒｏ２５５の概略図を示す。これらは、本明細書において「ヘテロ標的化」構築物、この場合、形式２構築物と称されるときもある。
【図５５】ＭＭＰ９開裂部位を有するＰｒｏ２５５二重標的化分子が、良好な条件付けを示すことを示す。
【図５７Ａ】３つの異なる細胞型に対する実験の結果を示す。最初に、ＲａｊｉトランスフェクタントをＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、及びＥｐＣＡＭ＋ＥＧＦＲの同様の発現レベルで作り出した（データは図示せず）。次いで、ＥｐＣＡＭ及びＥＧＦＲの両方を標的とするＰｒｏ２５５を、各細胞型を使用したＴＤＣＣアッセイで試験した。図５７Ａは、いずれの受容体も発現させない親Ｒａｊｉ株を示す
【図５７Ｂ】３つの異なる細胞型に対する実験の結果を示す。最初に、ＲａｊｉトランスフェクタントをＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、及びＥｐＣＡＭ＋ＥＧＦＲの同様の発現レベルで作り出した（データは図示せず）。次いで、ＥｐＣＡＭ及びＥＧＦＲの両方を標的とするＰｒｏ２５５を、各細胞型を使用したＴＤＣＣアッセイで試験した。図５７Ｂは、ＥｐＣＡＭ株に対する条件付けを示す。
【図５７Ｃ】３つの異なる細胞型に対する実験の結果を示す。最初に、ＲａｊｉトランスフェクタントをＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、及びＥｐＣＡＭ＋ＥＧＦＲの同様の発現レベルで作り出した（データは図示せず）。次いで、ＥｐＣＡＭ及びＥＧＦＲの両方を標的とするＰｒｏ２５５を、各細胞型を使用したＴＤＣＣアッセイで試験した。図５７Ｃは、ＥＧＲＦ株に対する条件付けを示す。
【図５７Ｄ】３つの異なる細胞型に対する実験の結果を示す。最初に、ＲａｊｉトランスフェクタントをＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、及びＥｐＣＡＭ＋ＥＧＦＲの同様の発現レベルで作り出した（データは図示せず）。次いで、ＥｐＣＡＭ及びＥＧＦＲの両方を標的とするＰｒｏ２５５を、各細胞型を使用したＴＤＣＣアッセイで試験した。図５７Ｄは、ＥｐＣＡＭ／ＥＧＦＲ株に対する条件付けを示す。
【図５６】形式４構築物のＰｒｏ２５８の概略図を示す。
【図５７Ａ−５９Ｂ】Ｐｒｏ２５８がＦＢＳ及びヒト血清の両方において条件付きであることを示す。ＭＭＰ９リンカーの条件付けは、培養物中のＭＭＰ９活性により過小評価される。興味深いことに、Ｐｒｏ５１  ＴＤＣＣ活性がＨＳＡによって阻害される一方で、Ｐｒｏ２５８  ＴＤＣＣ活性は、ＨＳＡの存在下でＰｒｏ５１と同様である。最後に、Ｐｒｏ２５８の条件付けは、６ＸによってＨＳＡの存在下でやや増強される。
【図５８Ａ−６０Ｃ】他のＭＭＰによるＭＭＰ９基質の開裂を示す。
【図５９Ａ−６１Ｂ】例示的な構築物及びそれらの形式のいくつかを示す。
【図６０Ａ−６２Ｕ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
Ａ．導入
本発明は、ＣＤ３及び腫瘍抗原などの重要な生理学的標的に結合する二重特異性抗体（抗体様機能タンパク質を含む）の毒性及び副作用を低減する方法に関する。抗体などの多くの抗原結合タンパク質は、有意なオフ標的副作用を有する可能性があり、したがって、罹患組織の近くの治療用分子の結合能力のみを活性化して、オフ標的相互作用を回避する必要性がある。したがって、本発明は、多くの機能タンパク質ドメインを有する多価の条件的に有効な（「ＭＣＥ」）タンパク質に関する。一般に、これらのドメインのうちの１つは、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）であり、もう１つは、ある特定の条件下でＣＤ３などのＴ細胞抗原に結合するＡＢＤである。加えて、ＭＣＥタンパク質はまた、１つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。つまり、治療用分子は、ＣＤ３結合ドメインが腫瘍環境に曝露されるまで不活性である「プロドラッグ」様形式で作製される。腫瘍環境は、プロテアーゼを含有し、これによりプロテアーゼに曝露されると、プロドラッグは開裂され、活性になる。
【００２６】
これは概して、本明細書において、ＭＣＥのＣＤ３  Ｆｖを本明細書で考察されるような不活性形式に拘束する、ＣＤ３などのＴ細胞抗原に向けられた「偽」可変重ドメイン及び「偽」可変軽ドメインを含むタンパク質を使用することによって達成される。ＴＴＡが腫瘍の付近でＭＣＥを標的とし、したがって、ＭＣＥは、プロテアーゼを曝露される。開裂すると、活性可変重ドメイン及び活性軽ドメインがここで、対になってＣＤ３に対する１つ以上の活性ＡＢＤを形成し、したがってＴ細胞を腫瘍に動員し、治療につながることが可能である。
【００２７】
一般に、ＣＤ３結合ドメイン（「Ｆｖ」）は、拘束された形式であり、従来Ｆｖを形成する活性可変重ドメインと活性可変軽ドメインとの間のリンカーは、２つの活性可変ドメインが互いに結合することを可能にするには短すぎ、これは、「拘束リンカー」と称され、これらは、拘束され開裂可能であり得るか（形式１で使用されるようなＣＣＬ）、または拘束され開裂可能ではない（形式２で使用されるようなＣＮＣＬ）。むしろ、プロドラッグ（例えば、未開裂）形式において、プロドラッグポリペプチドはまた、「偽Ｆｖドメイン」も含む。偽Ｆｖドメインは、標準的なフレームワーク領域であるが、「非活性」または「不活性」のＣＤＲを有する、可変重及び軽ドメインを含む。偽Ｆｖドメインはまた、不活性可変重ドメインと不活性可変軽ドメインとの間に拘束リンカーを有する。Ｆｖドメインも偽Ｆｖドメインも、立体障害により自己集合することができないため、各々のフレームワーク領域の親和性により、ＶＬをｉＶＨと、かつａＶＨをｉＶＬと対にする分子内集合が存在する。しかしながら、偽ドメインの「非活性」ＣＤＲにより、得られるＡＢＤは、ＣＤ３に結合せず、したがってオフ標的毒性を防止する。しかしながら、腫瘍内またはその近くにあるプロテアーゼの存在下で、プロドラッグ構築物は、偽Ｆｖドメインが表面から放出されるように開裂され、したがって「真の」可変重及び可変軽ドメインが分子間で会合する（例えば、２つの開裂構築物が一緒になる）ことを可能にし、したがって活性ＣＤ３結合及び得られる腫瘍有効性を引き起こす。これらの構築物は概して、本明細書において、条件付き二重特異性再方向付け活性化構築物または「ＣＯＢＲＡ（商標）」と称される。分子内集合の安定性は、本明細書において条件付け実験によって示され、プロテアーゼの非存在下で、未開裂構築物は、活性を有しない（例えば、活性ＣＤ３結合ドメインは形成されない）。
【００２８】
興味深いことに、説明を簡単にするために、これらの構築物が全て、本明細書において「拘束された」と称される一方で、さらなる研究は、分子内集合が、Ｆｖドメインのうちの１つが拘束されていない場合、例えば、ドメインのうちの１つがより長く柔軟なリンカーを有することができる場合でさえ好ましいことを示す。すなわち、図３６、図３７、及び図３８に示されるように、分子内集合は、Ｆｖドメインのうちの１つのみ、活性ＶＬ及びＶＨを有するドメイン、または偽Ｆｖドメインのいずれかが拘束されている場合でもやはり生じる（例えば、未開裂構築物は、プロテアーゼ開裂の非存在下で不活性である）。しかしながら、本系において、両方のリンカーが拘束されているとき、タンパク質は、より良好な発現を有する。しかしながら、当業者によって理解されるように、本明細書の形式１、形式２、または形式４構築物のいずれかは、「非拘束」または「柔軟性」リンカーを有するこれらのＦｖドメインのうちの１つを有することができる。参照を容易にするために、構築物は、両方のＦｖドメインが拘束された形式で示される。
【００２９】
本発明の構築物及び形式は、参照によりその全体が本明細書に明示的に組み込まれるＷＯ２０１７／１５６１７８に記載される発明の変化形態である。図２０に示されるように、以前の構築物は、単一ポリペプチド中のＶＨ及びＶＬドメインの２つのセットの存在により異性化して、二価ｓｃＦｖ及び単鎖ダイアボディの両方を形成する能力を有する。各アイソフォームの精製後でさえ、二価構築物はなお、ダイアボディアイソフォームとの均衡状態に達することができる。単鎖ダイアボディは、プロテアーゼ開裂の非存在下でＣＤ３に結合する能力を有し、構築物の有用性は低下する。
【００３０】
この問題を解決するために、本発明は、この条件付き活性化を達成するために４つの別々のタイプの構築物を提供する。プロドラッグ活性化は、図面に概して示されるように、４つの一般的な方法のうちの１つで起こり得る。図１中、「形式１」機構が示される。この実施形態では、プロドラッグ構築物は、２つの開裂部位を有し、１つは、拘束ＦｖのＶＨドメインとｖｌドメインとの間にあり、したがって、２つの可変ドメインを自由に会合させ、第２の開裂部位は、プロドラッグ構築物から偽Ｆｖドメインを放出する部位にあり、可変重及び可変軽ドメインの固有の自己集合により会合する２つの分子を残し、各々は、同様に腫瘍抗原に対する抗原結合ドメインを有し、したがって、Ｔ細胞の腫瘍部位への動員を可能にする。
【００３１】
代替の実施形態では、プロドラッグ構築物は、図２の「形式２」機構に示される。この実施形態では、活性可変重鎖と活性軽鎖との間のドメインリンカーは、拘束されているが非開裂性のリンカー（「ＣＮＣＬ」）である。プロドラッグ形式において、拘束偽Ｆｖドメイン不活性ＶＨ及びＶＬは、ＣＤ３結合が存在しないように、拘束ＦｖドメインのＶＨ及びＶＬと会合する。しかしながら、いったん腫瘍環境における開裂が起こると、各々が活性可変重及び軽ドメインを含む２つの異なる活性化タンパク質は会合して、２つの抗ＣＤ３結合ドメインを形成する。
【００３２】
構成成分の全てが単一のアミノ酸配列上に含有される、上記で考察される「単鎖タンパク質」ＣＯＢＲＡ形式に加えて、図３に示されるように、対で作用する２つのタンパク質「半ＣＯＢＲＡ」に依存する構築物も存在する。この実施形態では、各タンパク質は、ロテアーゼ開裂部位によって分離される１つの活性可変ドメイン及び１つの非活性可変ドメインを有する。各分子は、ＴＴＡ結合ドメインを含有し、これにより、分子がＴＴＡに結合され、腫瘍プロテアーゼに曝露されたとき、非活性ドメインが開裂され、２つの活性可変ドメインが自己集合して、抗ＣＤ３結合ドメインを形成する。
【００３３】
さらに、本発明は、図４に示されるように、同様に「形式４」構築物を提供する。これらは、ＴＴＡに対して単一のＡＢＤが使用され、これにより、開裂すると、以下にさらに記載されるように、プロドラッグ分子のうちの２つがここで、２つの活性抗ＣＤ３ドメインを含有する四価の二重特異性構築物を形成することを除いて、「形式２」の設計と同様である。
【００３４】
したがって、本発明の形式及び構築物は、疾患の治療で使用される。
【００３５】
Ｂ．定義
本出願がより完全に理解され得るために、いくつかの定義が以下に記載される。そのような定義は、文法的等価物を包含するよう意図される。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸」及び「アミノ酸同一性」とは、特定の定義された位置に存在し得る２０個の天然に存在するアミノ酸または任意の非天然類似体のうちの１つを意味する。多くの実施形態では、「アミノ酸」は、２０個の天然に存在するアミノ酸のうちの１つを意味する。本明細書の「タンパク質」とは、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、及びペプチドを含む、少なくとも２つの共有結合したアミノ酸を意味する。
【００３７】
本明細書の「アミノ酸修飾」とは、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換、挿入、及び／もしくは欠失、またはタンパク質に化学的に連結された部分への改変を意味する。例えば、修飾は、タンパク質に付着した、改変した炭水化物またはＰＥＧ構造であり得る。明確にするために、特に断りのない限り、アミノ酸修飾は常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ中にコドンを有する２０個のアミノ酸に対してである。本明細書の好ましいアミノ酸修飾は、置換である。
【００３８】
本明細書の「アミノ酸置換」または「置換」は、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸の、異なるアミノ酸配列による置き換えを意味する。具体的には、いくつかの実施形態では、置換は、特定の位置において天然に存在しない、その生物内または任意の生物内のいずれかに天然に存在しないアミノ酸に対してである。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させない（例えば、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（なおもアルギニンをコードする）に交換して宿主生物発現レベルを増大させる）ように操作されたタンパク質は、「アミノ酸置換」ではなく、つまり、同じタンパク質をコードする新しい遺伝子の生成にもかかわらず、タンパク質が、それが出発した特定の位置における同じアミノ酸を有する場合、それはアミノ酸置換ではない。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸配列の付加を意味する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置におけるアミノ酸配列の除去を意味する。
【００４１】
本発明のポリペプチドは、本明細書で概説されるように、ＣＤ３に特異的に結合し、標的細胞受容体などの標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）を標的とする。抗原またはエピトープへの「特異的結合」またはそれ「に特異的に結合する」またはそれ「に特異的」とは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に結合活性を有しない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定され得る。例えば、特異的結合は、標的と同様である対照分子との競合によって決定され得る。
【００４２】
特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、少なくとも約１０−４Ｍ、少なくとも約１０−５Ｍ、少なくとも約１０−６Ｍ、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、少なくとも約１０−１１Ｍ、少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれ以上の抗原またはエピトープに対するＫＤを有する抗体によって示され得、ＫＤは、特定の抗原−抗体相互作用の解離速度を指す。典型的には、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原またはエピトープと比較して、対照分子に対して２０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００倍、またはそれ以上であるＫＤを有する。
【００４３】
また、特定の抗原またはエピトープへの特異的結合は、例えば、対照と比較して、エピトープに対して少なくとも２０、５０、１００、５００、１０００、５，０００、１０，０００倍、またはそれ以上の抗原またはエピトープのＫＡまたはＫａを有する抗体によって示され得、ＫＡまたはＫａは、特定の抗体−抗原相互作用の会合速度を指す。結合親和性は概して、当該技術分野において既知であるようなＢｉａｃｏｒｅアッセイまたはＯｃｔｅｔを使用して測定される。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「親ポリペプチド」または「前駆体ポリペプチド」（Ｆｃ親または前駆体を含む）とは、後に修飾されて変異体を生成するポリペプチドを意味する。前述の親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド、または天然に存在するポリペプチドの変異体もしくは操作された型であってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を指し得る。したがって、本明細書で使用される場合、「親Ｆｃポリペプチド」とは、修飾されて変異体を生成する未修飾Ｆｃポリペプチドを意味し、本明細書で使用される場合、「親抗体」とは、修飾されて変異体抗体を生成する未修飾抗体を意味する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「位置」とは、タンパク質の配列中の場所を意味する。位置は、順次に、または確立された形式、例えば、抗体ナンバリングのためのＥＵインデックスに従って番号付けされ得る。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「標的抗原」とは、所与の抗体の可変領域によって特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質、または他の化合物であってもよい。幅広い好適な例示的な標的抗原が本明細書に記載される。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「標的細胞」とは、標的抗原を発現させる細胞を意味する。概して、本発明の目的で、標的細胞は、ＴＴＡを発現させる腫瘍細胞またはＣＤ３抗原を発現させるＴ細胞のいずれかである。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「Ｆｖ」または「Ｆｖドメイン」または「Ｆｖ領域」とは、概して抗体からの抗原結合ドメインのＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆｖドメインは通常、それらが活性ＶＨ及びＶＬドメインを含有する場合、本明細書で考察されるような「抗原結合ドメイン」または「ＡＢＤ」を形成する（場合によっては、拘束リンカーを含有するＦｖが使用され、これにより活性ＡＢＤは、開裂前に形成されないが）。以下で考察されるように、Ｆｖドメインは、本発明の多くの方法で組織化され得、ｓｃＦｖ形式、拘束Ｆｖ形式、偽Ｆｖ形式などで「活性」または「不活性」であり得る。本発明において、場合によっては、Ｆｖドメインが、図１及び図２に示されるように、単一のポリペプチド鎖上のＶＨ及びＶＬドメインで構成されるが、分子内ＡＢＤを形成することができないように拘束リンカーを有することが理解されるべきである。これらの実施形態では、２つの活性ＡＢＤが形成されるのは開裂後である。場合によっては、Ｆｖドメインは、ＶＨ及びＶＬドメインで構成され、そのうちの１つは非活性であり、これにより、開裂後にのみ分子間ＡＢＤが形成される。以下で考察されるように、Ｆｖドメインは、本発明の多くの方法で組織化され得、ｓｃＦｖ形式、拘束Ｆｖ形式、偽Ｆｖ形式などで「活性」または「不活性」であり得る。加えて、本明細書で考察されるように、ＶＨ及びＶＬを含有するＦｖドメインは、ＡＢＤであり得／ＡＢＤを形成することができ、ＶＨ及びＶＬドメインを含有しない他のＡＢＤは、ｓｄＡＢＤを使用して形成され得る。
【００４９】
本明細書の「可変ドメイン」とは、それぞれカッパ、ラムダ、及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶκ、Ｖλ、及び／またはＶＨ遺伝子のうちのいずれかによって実質的にコードされた１つ以上のＩｇドメインを含む、免疫グロブリンの領域を意味する。場合によっては、ｓｄＦｖ（また、本明細書においてｓｄＡＢＤとも称される）などの単一の可変ドメインが使用され得る。
【００５０】
可変重（ＶＨ）ドメイン及び可変軽（ＶＬ）ドメインの両方を利用する実施形態では、各ＶＨ及びＶＬは、次の順序、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される、３つの超可変領域（「相補性決定領域」、「ＣＤＲ」）及び４つの「フレームワーク領域」または「ＦＲ」からなる。したがって、ＶＨドメインは、構造ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４を有し、ＶＬドメインは、構造ｖｌＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を有する。本明細書においてより十分に記載されるように、ｖｈＦＲ領域及びｖｌＦＲ領域は自己集合して、Ｆｖドメインを形成する。一般に、本発明のプロドラッグ形式では、ＶＨ及びＶＬドメインが自己会合することができない「拘束Ｆｖドメイン」、ならびにＣＤＲが自己会合したときに抗原結合ドメインを形成しない「偽Ｆｖドメイン」が存在する。
【００５１】
超可変領域は、抗原結合特異性を与え、概して、軽鎖可変領域内のおよそアミノ酸残基２４−３４（ＬＣＤＲ１、「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０−５６（ＬＣＤＲ２）、及び８９−９７（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域内の約３１−３５Ｂ（ＨＣＤＲ１、「Ｈ」は重鎖を示す）、５０−６５（ＨＣＤＲ２）、及び９５−１０２（ＨＣＤＲ３）（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、ならびに／または軽鎖可変領域内の超可変ループ（例えば、残基２６−３２（ＬＣＤＲ１）、５０−５２（ＬＣＤＲ２）、及び９１−９６（ＬＣＤＲ３）、ならびに重鎖可変領域内の２６−３２（ＨＣＤＲ１）、５３−５５（ＨＣＤＲ２）、及び９６−１０１（ＨＣＤＲ３）を形成する残基（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）のアミノ酸残基を包含する。本発明の特定のＣＤＲは、以下に記載される。
【００５２】
当業者によって理解されるように、ＣＤＲの正確な番号付け及び配置は、異なるナンバリングシステムによって異なり得る。しかしながら、可変重及び／または可変軽配列の開示が、関連する（固有の）ＣＤＲの開示を含むことが理解されるべきである。したがって、各可変重領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３）の開示である。
【００５３】
ＣＤＲ番号付けの有用な比較は、以下の通りであり、Ｌａｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２７（１）：５５−７７（２００３）を参照されたい。
表１
2020537496.tif 000002
【００５４】
本明細書全体を通して、Ｋａｂａｔナンバリングシステムは概して、可変ドメインの残基（およそ、軽鎖可変領域の残基１−１０７及び重鎖可変領域の残基１−１１３）を指すときに使用され、Ｆｃ領域に対してはＥＵナンバリングシステムが使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、上記を参照（１９９１））。
【００５５】
本発明は、多数の異なるＣＤＲセットを提供する。この場合、抗ＣＤ３構成成分の文脈における「完全ＣＤＲセット」は、３つの可変軽ＣＤＲ及び３つの可変重ＣＤＲ、例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、ｖｌＣＤＲ３、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３を含む。当業者によって理解されるように、ＣＤＲの各セット、ＶＨ及びＶＬ  ＣＤＲは、両方が個々に、かつセットとして抗原に結合することができる。例えば、拘束Ｆｖドメインにおいて、ｖｈＣＤＲは、例えばＣＤ３に結合することができ、ｖｌＣＤＲは、ＣＤ３に結合することができるが、拘束された形式では、それらはＣＤ３に結合することができない。
【００５６】
標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合するために本明細書において概して使用されるような単一ドメインＡＢＤ（「ｓｄＡＢＤ」）の文脈において、ＣＤＲセットは、３つのＣＤＲのみであり、これらは、当該技術分野において、「ＶＨＨ」ドメインとも称されるときがある。
【００５７】
これらのＣＤＲは、丁寧に、より大きい可変軽ドメインまたは可変重ドメインの一部であり得る。加えて、本明細書においてより十分に概説されるように、可変重及び可変軽ドメインは、本明細書の部分の形式及び配置に応じて、別々のポリペプチド鎖上、またはｓｃＦｖ配列の場合は単一ポリペプチド鎖上にあり得る。
【００５８】
ＣＤＲは、抗原結合部位、より具体的には、エピトープ結合部位の形成に寄与する。「エピトープ」は、パラトープとして既知の可変領域内の特定の抗原結合部位と相互作用する決定基を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の集団であり、通常、特定の構造特性ならびに特定の電荷特性を有する。単一の抗原が２つ以上のエピトープを有し得る。
【００５９】
エピトープは、結合に直接関与するアミノ酸残基（エピトープの免疫優性構成成分とも呼ばれる）、及び結合に直接関与しない他のアミノ酸残基、例えば、特定の抗原結合ペプチドによって効果的にブロックされるアミノ酸残基を含んでもよく、換言すれば、アミノ酸残基は、特定の抗原結合ペプチドのフットプリント内にある。
【００６０】
エピトープは、立体配座または線状のいずれかであり得る。立体配座エピトープは、線状ポリペプチド鎖の異なるセグメントからの空間的に並置されたアミノ酸によって産生される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖における隣接するアミノ酸残基によって産生されるものである。立体配座及び非立体配座エピトープは、前者への結合が変性溶媒の存在下で失われるが、後者は失われないという点で区別され得る。
【００６１】
エピトープは典型的には、独特の空間的立体配座で少なくとも３つ、通常は少なくとも５つまたは８〜１０個のアミノ酸を含む。同じエピトープを認識する抗体は、１つの抗体が別の抗体の標的抗原への結合をブロックする能力を示す単純な免疫測定法、例えば「ビニング」で検証され得る。以下で概説されるように、本発明は、本明細書の列挙される抗原結合ドメイン及び抗体だけではなく、列挙される抗原結合ドメインによって結合されたエピトープとの結合を競合するものも含む。
【００６２】
本発明の可変重及び可変軽ドメインは、「活性」または「不活性」であり得る。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「不活性ＶＨ」（「ｉＶＨ」）及び「不活性ＶＬ」（「ｉＶＬ」）は、それらの同種ＶＬまたはＶＨパートナーとそれぞれが対になったときに、「不活性」ではない類似ＶＬまたはＶＨに結合すれば、「活性」ＶＨまたは「活性」ＶＬが結合するであろう抗原に特異的に結合しない得られるＶＨ／ＶＬ対を形成する、偽Ｆｖドメインの構成成分を指す。例示的な「不活性ＶＨ」及び「不活性ＶＬ」ドメインは、以下でより十分に概説されるように、野生型ＶＨまたはＶＬ配列の突然変異によって形成される。例示的な突然変異は、ＶＨまたはＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３内である。例示的な突然変異は、ＣＤＲ２内にドメインリンカーを配置し、それにより「不活性ＶＨ」または「不活性ＶＬ」ドメインを形成することを含む。対照的に、「活性ＶＨ」また「活性ＶＬ」は、その「活性」同種パートナー、すなわちＶＬまたはＶＨと対になると、その標的抗原に特異的に結合することが可能であるものである。したがって、偽ＦｖがＶＨ／ｉＶＬ対、ｉＶＨ／ＶＬ対、またはｉＶＨ／ｉＶＬ対であり得ることが理解されるべきである。
【００６４】
対照的に、本明細書で使用される場合、「活性」という用語は、ＣＤ−３に特異的に結合することが可能であるＣＤ−３結合ドメインを指す。この用語は、２つの文脈、（ａ）その同種パートナーと対になり、ＣＤ−３に特異的に結合することが可能である、Ｆｖ結合対の単一メンバー（すなわち、ＶＨまたはＶＬ）を指す場合、及び（ｂ）ＣＤ−３に特異的に結合することが可能な配列の同種の対（すなわち、ＶＨ及びＶＬ）で使用される。例示的な「活性」ＶＨ、ＶＬ、またはＶＨ／ＶＬ対は、野生型または親配列である。
【００６５】
「ＣＤ−ｘ」は、分化クラスター（ＣＤ）タンパク質を指す。例示的な実施形態では、ＣＤ−ｘは、本発明のポリペプチド構築物が投与された対象におけるＴ細胞の動員または活性化に関与するＣＤタンパク質から選択される。例示的な実施形態では、ＣＤ−ｘは、ＣＤ３であり、その配列は、図５に示される。
【００６６】
「結合ドメイン」という用語は、本発明に関連して、標的分子（抗原）上の所与の標的エピトープまたは所与の標的部位、ＥＧＦＲ及びＣＤ−３のそれぞれに（特異的に）結合する／それと相互作用する／それを認識するドメインを特徴付ける。標的抗原結合ドメイン（ＥＧＦＲを認識する）の構造及び機能、また好ましくはＣＤ−３結合ドメイン（ＣＤ３を認識する）の構造及び／または機能は、抗体、例えば、ｓｄＡＢＤを含む完全長または全免疫グロブリン分子の構造及び／または機能に基づく。本発明によると、標的抗原結合ドメインは概して、標的腫瘍抗原に結合する３つのＣＤＲの存在によって特徴付けられる（概して、当該技術分野において可変重ドメインと称されるが、対応する軽鎖ＣＤＲは、存在しない）。あるいは、ＴＴＡに対するＡＢＤは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、ならびに／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含むことができる。ＣＤ−３結合ドメインは好ましくは、標的結合を可能にする抗体の少なくとも最小の構造要件も含む。より好ましくは、ＣＤ−３結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、ならびに／または３つの重鎖ＣＤＲ（すなわち、ＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）を含む。例示的な実施形態では、標的抗原及び／またはＣＤ−３結合ドメインが、ファージディスプレイまたはライブラリスクリーニング方法によって産生されるか、または取得可能であることが想定される。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ドメイン」とは、本明細書で概説されるように、機能を有するタンパク質配列を意味する。本発明のドメインは、腫瘍標的抗原結合ドメイン（ＴＴＡドメイン）、可変重ドメイン、可変軽ドメイン、リンカードメイン、及び半減期延長ドメインを含む。
【００６８】
本明細書の「ドメインリンカー」とは、本明細書で概説されるような２つのドメインを結合するアミノ酸配列を意味する。ドメインリンカーは、開裂性リンカー、拘束開裂性リンカー、非開裂性リンカー、拘束非開裂性リンカー、ｓｃＦｖリンカーなどであり得る。
【００６９】
本明細書の「開裂性リンカー」（「ＣＬ」）とは、本明細書で概説されるように、プロテアーゼ、好ましくは罹患組織におけるヒトプロテアーゼによって開裂され得るアミノ酸配列を意味する。開裂性リンカーは概して、少なくとも３アミノ酸長であり、必要な柔軟性に応じて、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５個、またはそれ以上のアミノ酸が本発明で使用される。多くの開裂性リンカー配列が図６及び図５に見られる。
【００７０】
本明細書の「非開裂性リンカー」（「ＮＣＬ」）とは、正常な生理学的条件下でヒトプロテアーゼによって開裂することができないアミノ酸配列を意味する。
【００７１】
本明細書の「拘束開裂性リンカー」（「ＣＣＬ」）とは、２つのドメインが、それらが異なるポリペプチド鎖上に存在するまで、例えば、開裂後まで互いと有意に相互作用することができない方法で、本明細書で概説されるような２つのドメインを結合するプロテアーゼ開裂部位（本明細書で定義されるような）を含有する、短いポリペプチドを意味する。ＣＣＬが本明細書で定義されるようなＶＨ及びＶＬドメインと結合する場合、ＶＨ及びＶＬは、分子内での立体障害により、開裂前に自己集合して機能的Ｆｖを形成することができない（それらは、分子間で偽Ｆｖドメインに集合し得るが）。関連するプロテアーゼによって開裂すると、ＶＨ及びＶＬは集合して、分子間で活性抗原結合ドメインを形成することができる。一般に、ＣＣＬは、１０アミノ酸長未満であり、９、８、７、６、５、及び４つのアミノ酸が本発明で使用される。一般に、プロテアーゼ開裂部位は概して、図６に示されるように、十分な特異性を与えるために少なくとも４＋アミノ酸長である。
【００７２】
本明細書の「拘束非開裂性リンカー」（「ＣＮＣＬ」）とは、２つのドメインが互いと有意に相互作用することができない方法で、本明細書で概説されるような２つのドメインを結合し、生理学的条件下でヒトプロテアーゼによって有意に開裂されない、短いポリペプチドを意味する。
【００７３】
本明細書の「拘束Ｆｖドメイン」とは、活性重及び軽可変ドメインが分子内で相互作用して、ＣＤ３などの抗原に結合する活性Ｆｖを形成することができない方法で、本明細書で概説されるような拘束リンカーと共有結合した、活性可変重ドメイン及び活性可変軽ドメインを含むＦｖドメインを意味する。したがって、拘束Ｆｖドメインは、ｓｃＦｖと同様であるが、拘束リンカーの存在により抗原に結合することが可能ではないものである（それらは、分子間で非活性可変ドメインと集合して、偽Ｆｖドメインを形成し得るが）。
【００７４】
本明細書の「偽Ｆｖドメイン」とは、ドメインリンカー（開裂性、拘束、非開裂性、非拘束などであり得る）を使用して連結された、偽もしくは不活性可変重ドメインまたは偽もしくは不活性可変軽ドメイン、あるいは両方を含むドメインを意味する。偽ＦｖドメインのｉＶＨ及びｉＶＬドメインは、互いと会合したとき（ｉＶＨ／ｉＶＬ）、または活性ＶＨまたはＶＬと会合したときのいずれかにおいてヒト抗原に結合せず、したがって、ｉＶＨ／ｉＶＬ、ｉＶＨ／ＶＬ、及びｉＶＬ／ＶＨ  Ｆｖドメインは、ヒトタンパク質にはっきりと結合せず、これにより、これらのドメインは、ヒト体内で非活性である。
【００７５】
本明細書の「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」とは、概して本明細書で考察されるようなドメインリンカーを使用して可変軽（ＶＬ）ドメインに共有結合されて、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖドメインを形成する、可変重（ＶＨ）ドメインを意味する。ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端配向のいずれかであり得る（ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨ）。
【００７６】
本明細書の「単一ドメインＦｖ」、「ｓｄＦｖ」、または「ｓｄＡＢＤ」とは、概してラクダ抗体技術に基づき、３つのＣＤＲのみを有する抗原結合ドメインを意味する。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（７）：１１２９−３５（１９９４）、Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ７４：２７７−３０２（２００１）、Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ８２：７７５−９７（２０１３）を参照されたい。本明細書で概説されるように、２つの一般的なタイプのｓｄＡＢＤ、ＴＴＡに結合し、そのようなものとして注釈が付けられるｓｄＡＢＤ（一般名称にはｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ、またはＥＧＦＲに結合するものにはｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１に結合するものにはｓｄＡＢＤ−ＦＯＬＲ１など）、及びＨＳＡに結合するｓｄＡＢＤ「ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡ」または「ｓｄＡＢＤ（１／２）」）が本明細書で使用される。
【００７７】
「プロテアーゼ開裂部位」とは、プロテアーゼによって認識及び開裂されるアミノ酸配列を指す。好適なプロテアーゼ開裂部位は、以下で概説され、図５及び図６に示される。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ開裂ドメイン」は、「プロテアーゼ開裂部位」、ならびに個々のプロテアーゼ開裂部位間、及びプロテアーゼ開裂部位（複数可）と本発明の構築物の他の機能的構成成分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬ、標的抗原結合ドメイン（複数可）、半減期延長ドメインなど）との間の任意のリンカーを組み込むペプチド配列を指す。本明細書で概説されるように、プロテアーゼ開裂ドメインはまた、必要に応じて、例えば、柔軟性を与えるために、追加のアミノ酸も含み得る。
【００７９】
「ＣＯＢＲＡ（商標）」及び「条件付き二重特異性再方向付け活性化」という用語は、多くの機能タンパク質ドメインを有する二重特異性の条件的に有効なタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、機能ドメインのうちの１つは、標的腫瘍抗原（ＴＴＡ）に結合する抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）である。ある特定の実施形態では、別のドメインは、ある特定の条件下でＴ細胞抗原に結合するＡＢＤである。Ｔ細胞抗原としては、ＣＤ３が挙げられるが、これに限定されない。「半ＣＯＢＲＡ（商標）」という用語は、標的発現細胞の表面上に集中したときの固有の自己集合により、半ＣＯＢＲＡの可変重鎖が別の半ＣＯＢＲＡ（商標）（相補的半ＣＯＢＲＡ（商標））の可変軽鎖に会合することができる場合に、Ｔ細胞抗原に結合することができる、条件的に有効なタンパク質を指す。
【００８０】
ＶＩＩ．本発明の融合タンパク質
本発明の融合タンパク質は、様々な方法で一緒に連結された、本明細書において概してドメインと称される多くの異なる構成成分を有する。ドメインのうちのいくつかは、各々が標的抗原（例えば、ＴＴＡまたは例えば、ＣＤ３）に結合する結合ドメインである。それらが２つ以上の抗原に結合するため、それらは、本明細書において「多重特異性」と称され、例えば、本発明のプロドラッグ構築物は、ＴＴＡ及びＣＤ３に結合し得、したがって、「二重特異性」である。タンパク質はまた、より高い特異性を有することができ、例えば、第１のαＴＴＡがＥＧＦＲに結合し、第２のαＴＴＡがＥｐＣＡＭに結合し、抗ＣＤ３結合ドメインが存在する場合、これは、「三重特異性」分子である。同様に、この構築物への抗ＨＳＡ結合ドメインの付加は、図３Ｂに示されるように「四重特異性」である。
【００８１】
当業者によって理解されるように、本発明のタンパク質は、異なる原子価を有することができ、かつ多重特異性であり得る。つまり、本発明のタンパク質は、標的を２つ以上の結合部位と結合することができ、例えば、Ｐｒｏ１４０は、ＥＧＦＲに対して二価である。
【００８２】
本発明のタンパク質は、腫瘍標的抗原結合ドメイン、半減期延長ドメイン、リンカーなど、本明細書で概説されるような様々な方法で配置されたＣＤ３抗原結合ドメインを含むことができる。
【００８３】
Ａ．ＣＤ３抗原結合ドメイン
Ｔ細胞の応答の特異性は、Ｔ細胞受容体複合体による抗原（主要組織適合遺伝子複合体、ＭＨＣにおいて提示される）の認識によって媒介される。Ｔ細胞受容体複合体の一部として、ＣＤ３は、細胞表面に存在するＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖、２つのＣＤ３ｅ（イプシロン）鎖、及び２つのＣＤ３ζ（ゼータ）鎖を含む、タンパク質複合体である。ＣＤ３分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のα（アルファ）及びβ（ベータ）鎖と会合して、ＴＣＲ複合体を含む。ＣＤ３に結合するＦｖドメインなどによるＴ細胞上のＣＤ３のクラスタリングは、Ｔ細胞受容体の関与と同様であるが、そのクローンに典型的な特異性とは無関係の、Ｔ細胞活性化をもたらす。
【００８４】
しかしながら、当該技術分野において既知であるように、ＣＤ３活性化は、多くの毒性副作用を引き起こす可能性があり、したがって、本発明は、後に本発明のプロドラッグポリペプチドを開裂して活性ＣＤ３結合ドメインを提供する特定のプロテアーゼが見つかる、腫瘍細胞の存在下でのみ、本発明のポリペプチドの活性ＣＤ３結合を提供することに関する。したがって、本発明において、抗ＣＤ−３  ＦｖドメインのＣＤ−３への結合は、高いレベルのプロテアーゼを有する罹患細胞または組織の微小環境においてのみ、例えば、本明細書に記載されるような腫瘍微小環境において、ＣＤ−３  ＦｖドメインのＣＤ−３への結合を制限するプロテアーゼ開裂ドメインによって調節される。
【００８５】
したがって、本発明は、ＶＨ及びＶＬドメインの２つのセット、活性セット（ＶＨ及びＶＬ）ならびに不活性セット（ｉＶＨ及びｉＶＬ）を提供し、４つ全てが、プロドラッグ構築物中に存在する。構築物は、ＶＨ及びＶＬセットが自己会合することができず、むしろ不活性パートナー、例えば、本明細書に示されるようなｉＶＨ及びＶＬならびにｉＶＬ及びＶＨと会合するように形式設定される。
【００８６】
１．活性抗ＣＤ３可変重及び可変軽ドメイン
本発明で使用される、当該技術分野において既知である多くの好適な活性ＣＤＲセット、ならびに／またはＶＨ及びＶＬドメインが存在する。例えば、ＣＤＲならびに／またはＶＨ及びＶＬドメインは、例えば、ムロモナブ−ＣＤ−３（ＯＫＴ３）、オテリキシズマブ（ＴＲＸ４）、テプリズマブ（ＭＧＡ０３１）、ビシリズマブ（Ｎｕｖｉｏｎ）、ＳＰ３４またはＩ２Ｃ、ＴＲ−６６またはＸ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１−４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＴＲ−６６、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ−４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２−４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２、Ｆ１０１．０１、ＵＣＨＴ−１、及びＷＴ−３１などの既知の抗ＣＤ−３抗体に由来する。
【００８７】
一実施形態では、ヒトＣＤ３に結合する活性Ｆｖドメインを形成するＶＨ及びＶＬ配列は、図５に示される。本明細書に示されるように、これらの活性ＶＨ（「ａＶＨ」）及び活性ＶＬ（「ａＶＬ」）ドメインは、異なる配置ならびに形式１、２、３、及び４で使用され得る。
【００８８】
２．不活性抗ＣＤ３可変重及び可変軽ドメイン
不活性ｉＶＨ及びｉＶＬドメインは、会合を可能にする「規則的な」フレームワーク領域（ＦＲ）を含有し、これにより、不活性可変ドメインは活性可変ドメインと会合し、対を不活性にする、例えば、ＣＤ３に結合できないようにする。
【００８９】
当業者によって理解されるように、本発明で使用される多くの「不活性」可変ドメインが存在する。基本的に、どんなアミノ酸が可変領域内のＣＤＲ位置にあろうと、別の可変ドメインとの自己集合を可能にするヒトフレームワーク領域を有する任意の可変ドメインが使用され得る。明確にするために、不活性ドメインは、ＣＤＲを含むと言われているが、技術的に、不活性可変ドメインは結合能力を与えない。
【００９０】
当該技術分野において理解されるように、不活性ＶＨまたはＶＬドメインを生成することが概して単純であり、様々な方法で行われ得る。いくつかの実施形態では、不活性可変ドメインの生成は概して、活性可変ドメインの３つのＣＤＲのうちの１つ以上を変化させることを含む、活性ＦｖのＣＤＲのうちの１つ以上を改変することによって行われる。これは、１つ以上のＣＤＲの機能的に重要な残基において１つ以上のアミノ酸置換を行うこと、いくつかもしくは全てのＣＤＲ残基をランダム配列で置き換えること、１つ以上のＣＤＲをタグもしくはフラグ配列で置き換えること、及び／またはＣＤＲ及び／もしくは可変領域を無関係の抗体（例えば、異なる生物のタンパク質に向けられたもの）からのものと交換することによって行われ得る。
【００９１】
場合によっては、可変領域内のＣＤＲのうちの１つのみがそれを不活性にするように改変され得るが、他の実施形態は、１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲの改変を含む。
【００９２】
場合によっては、不活性ドメインは、プロドラッグ形式で選択的結合を促進して、開裂前の分子内ｉＶＨ−ＶＬ及びＶＨ−ｉＶＬドメインの形成を（例えば、分子間対形成よりも）促すように操作され得る。例えば、参照によりその全体が、特に界面残基アミノ酸置換に関して本明細書に明示的に組み込まれるＩｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ２３（８）：６６７−６７７（２０１０）を参照された。
【００９３】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチド構築物のＣＤ−３結合ドメインは、ヒトＣＤ−３との強力なＣＤ−３結合親和性を示すだけではなく、個々のカニクイザルＣＤ−３タンパク質との優れた交差反応性も示す。場合によっては、ポリペプチド構築物のＣＤ−３結合ドメインは、カニクイザルからのＣＤ−３と交差反応性である。ある特定の場合では、ＣＤ−３に対するヒト：カニクイザＫＤ比率は、５〜０．２である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ−３結合ドメインは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組み換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体からのドメインが挙げられるが、これらに限定されない、ＣＤ−３に結合する任意のドメインであり得る。場合によっては、ＣＤ−３結合ドメインが、抗原結合タンパク質が最終的に使用される同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおいて使用するために、抗原結合タンパク質のＣＤ−３結合ドメインが、抗体または抗体フラグメントの抗原結合ドメインからのヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
【００９５】
したがって、一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化またはヒト結合ドメインを含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ−３結合ドメインは、本明細書に記載のヒト化もしくはヒト抗ＣＤ−３結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ  ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ  ＣＤＲ２）、及び軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ  ＣＤＲ３）、ならびに／または本明細書に記載のヒト化もしくはヒト抗ＣＤ−３結合ドメインの１つ以上の（例えば、３つ全ての）重鎖相補性決定領域１（ＨＣ  ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ  ＣＤＲ２）、及び重鎖相補性決定領域３（ＨＣ  ＣＤＲ３）、例えば、１つ以上の、例えば３つ全てのＬＣ  ＣＤＲ及び１つ以上の、例えば３つ全てのＨＣ  ＣＤＲを含むヒト化またはヒト抗ＣＤ−３結合ドメインを含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ−３結合ドメインは、ＣＤ−３に特異的なヒト化またはヒト軽鎖可変領域を含み、ＣＤ−３に特異的な軽鎖可変領域は、ヒト軽鎖フレームワーク領域内にヒトまたは非ヒト軽鎖ＣＤＲを含む。ある特定の場合では、軽鎖フレームワーク領域は、λ（ラムダ）軽鎖フレームワークである。他の場合では、軽鎖フレームワーク領域は、κ（カッパ）軽鎖フレームワークである。
【００９７】
いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ−３結合ドメインが、ヒト化または完全ヒトである。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ−３結合ドメインは、ＣＤ−３発現細胞上でＣＤ−３に対して１０００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ−３結合ドメインは、ＣＤ−３発現細胞上でＣＤ−３に対して１００ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上の活性化ＣＤ−３結合ドメインは、ＣＤ−３発現細胞上でＣＤ−３に対して１０ｎＭ以下のＫＤ結合を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ−３結合ドメインは、カニクイザルＣＤ−３との交差反応性を有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のＣＤ−３結合ドメインは、本明細書に提供されるアミノ酸配列を含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ−３結合ドメインは、ＣＤ−３に特異的なヒト化またはヒト重鎖可変領域を含み、ＣＤ−３に特異的な重鎖可変領域は、ヒト重鎖フレームワーク領域内にヒトまたは非ヒト重鎖ＣＤＲを含む。
【００９９】
一実施形態では、抗ＣＤ−３結合ドメインは、本明細書に提供されるアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むＦｖである。一実施形態では、抗ＣＤ−３結合ドメインは、本明細書に提供される軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２、もしくは３つの修飾（例えば、置換）であるが、３０、２０、もしくは１０個以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書に提供されるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、軽鎖可変領域、及び／あるいは本明細書に提供される重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１、２、もしくは３つの修飾（例えば、置換）であるが、３０、２０、もしくは１０個以下の修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または本明細書に提供されるアミノ酸配列と９５〜９９％の同一性を有する配列を含む、重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ヒト化またはヒト抗ＣＤ−３結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、ｓｃＦｖリンカーを介して、本明細書に記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に付着している。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、次の配向、軽鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−重鎖可変領域または重鎖可変領域−ｓｃＦｖリンカー−軽鎖可変領域のいずれかであり得る。
【０１００】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ−３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＫＤでの、ＣＤ−３発現細胞上でのＣＤ−３への親和性を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ−３結合ドメインは、１０００ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下のＫＤでのＣＤ−３εへの親和性を有する。さらなる実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＤ−３結合ドメインは、ＣＤ−３に対する低い親和性、すなわち、約１００ｎＭ以上を有する。
【０１０１】
ＣＤ−３への結合親和性は、例えば、当該技術分野において既知であるように、概してＢｉａｃｏｒｅまたはＯｃｔｅｔアッセイを使用して、抗原結合タンパク質自体またはそのＣＤ−３結合ドメインがアッセイプレート上でコーティングされた、微生物細胞表面上に提示された、溶液中などのＣＤ−３に結合する能力によって決定され得る。ＣＤ−３に対する本開示の抗原結合タンパク質自体またはそのＣＤ−３結合ドメインの結合活性は、リガンド（例えば、ＣＤ−３）または抗原結合タンパク質自体もしくはそのＣＤ−３結合ドメインをビーズ、基質、細胞などに固定化することによってアッセイされ得る。薬剤は、適切な緩衝液に添加され得、結合パートナーが所与の温度である期間にわたってインキュベートされ得る。未結合材料を除去するための洗浄後、結合タンパク質は、例えば、高いｐＨのＳＤＳ緩衝液などで放出され、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって分析され得る。
【０１０２】
多くの実施形態では、好ましい活性及び非活性結合ドメインは、図５に示されるものである。
【０１０３】
Ｂ．腫瘍標的抗原に対する抗原結合ドメイン
記載されるＣＤ３及び半減期延長ドメインに加えて、本明細書に記載のポリペプチド構築物はまた、１つ以上の標的抗原、または単一標的抗原上の１つ以上の領域に結合する標的ドメインも含む。本明細書において、本発明のポリペプチド構築物が、例えば、プロテアーゼ開裂ドメインにおいて疾患特異的な微小環境または対象の血液中で開裂されること、及び各標的抗原結合ドメインが、標的細胞上の標的抗原に結合し、それによりＣＤ３結合ドメインをＴ細胞に結合するように活性化することが企図される。一般に、ＴＴＡ結合ドメインは、プロテアーゼ開裂前にそれらの標的に結合することができ、したがって、それらは、Ｔ細胞誘導として活性化されるために標的細胞上で「待つ」ことができる。少なくとも１つの標的抗原が、疾患、障害、または状態に関与及び／または関連している。例示的な標的抗原は、増殖性疾患、腫瘍性疾患、炎症性疾患、免疫学的障害、自己免疫疾患、感染性疾患、ウイルス性疾患、アレルギー反応、寄生反応、移植片対宿主病、または宿主対移植片病に関連したものを含む。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞上に発現した腫瘍抗原である。あるいは、いくつかの実施形態では、標的抗原は、ウイルスまたは細菌などの病原体に関連している。少なくとも１つの標的抗原はまた、健康な組織に向けられ得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、標的抗原は、タンパク質、脂質、またはポリサッカライドなどの細胞表面分子である。いくつかの実施形態では、標的抗原は、腫瘍細胞、ウイルス感染細胞、細菌感染細胞、損傷した赤血球、動脈プラーク細胞、または線維性細胞上にある。
【０１０５】
本発明の好ましい実施形態は、標的化ドメインとしてｓｄＡＢＤを利用する。これらは、本発明の構築物への他のＶＨ及びＶＬドメインの付加が、偽Ｆｖドメインの形式を複雑にし得るため、ｓｃＦｖ  ＡＢＤよりも好ましい。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本発明のプロドラッグ構築物は、概してｓｄＡＢＤ−ＴＴＡの対として図３Ａに、かつ「形式４」配置として図４に示されるような、単一ＴＴＡ結合ドメインを利用する。図４は、単一抗ＥＧＦＲ  ＡＢＤの使用を示すが、他のＴＴＡ結合ドメインが使用され得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、特に、形式１及び形式２構築物において、本発明のプロドラッグ構築物は、この場合もやはり好ましくはｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ形式で、２つのＴＴＡ  ＡＢＤを利用する。二重標的化ドメインが使用される場合、それらは、同じＴＴＡの同じエピトープに結合することができる。例えば、本明細書で考察されるように、本明細書の構築物のうちの多くは、２つの同一の標的化ドメインを利用する。いくつかの実施形態では、同じＴＴＡの異なるエピトープに結合する２つの標的化ドメインが使用され得、例えば、図５に示されるように、２つのＥＧＦＲ  ｓｄＡＢＤが、ヒトＥＧＦＲ上の異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、２つの標的化ドメインは、異なるＴＴＡに結合し、例えば、図５４を参照されたい。
【０１０８】
本明細書で企図されるポリペプチド構築物は、少なくとも１つの抗原結合ドメインを含み、抗原結合ドメインは、少なくとも１つの標的抗原に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、細胞表面分子に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、腫瘍抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、標的抗原結合ドメインは、ＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ−２、ＨＥＲ−３、ｃＭｅｔ、ＬｙＰＤ３、Ｂ７Ｈ３、ＣＥＡ、及びＦＯＬＲ１のうちの少なくとも１つから選択される腫瘍標的抗原（「ＴＴＡ」）に特異的に、かつ独立して結合する。
【０１０９】
図５に示されるようなヒトＥＧＦＲに対するｓｄＡＢＤが、本発明で特に使用される。
【０１１０】
本発明で使用するための追加の実施形態は、図５に示されるようなヒトＦＯＬＲ１に対するｓｄＡＢＤである。
【０１１１】
本発明で使用するためのさらなる実施形態は、図５に示されるようなヒトＢ７Ｈ３に対するｓｄＡＢＤである。
【０１１２】
本発明で使用するための追加の実施形態は、図５に示されるようなヒトＥｐＣＡＭに対するｓｄＡＢＤである。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂ドメインの開裂前のタンパク質は、約１００ｋＤａ未満である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂ドメインの開裂後のタンパク質は、約２５〜約７５ｋＤａである。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、初回通過クリアランスの腎閾値を超えるサイズを有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、少なくとも約５０時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ開裂前のタンパク質は、少なくとも約１００時間の消失半減期を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するＩｇＧと比較して、増大した組織浸透を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、同じ標的抗原に対するＩｇＧと比較して、増大した組織分布を有する。
【０１１４】
Ｃ．半減期延長ドメイン
本発明のＭＣＥタンパク質（この場合もやはり、本明細書において、「ＣＯＢＲＡ（商標）」タンパク質または構築物とも称される）は、任意に、半減期延長ドメインを含む。そのようなドメインは、ＨＳＡ結合ドメイン、Ｆｃドメイン、小分子、及び当該技術分野において既知の他の半減期延長ドメインが挙げられるが、これらに限定されないことが企図される。
【０１１５】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（分子質量約６７ｋＤａ）は、約５０ｍｇ／ｍＬ（６００ｕＭ）で存在する血漿中で最も豊富なタンパク質であり、ヒトにおいて約２０日間の半減期を有する。ＨＳＡは、血漿ｐＨを維持する働きをし、コロイド血圧に寄与し、多くの代謝物及び脂肪酸の担体として機能し、血漿中の主要な薬物輸送タンパク質としての役割を果たす。
【０１１６】
アルブミンとの非共有結合性会合は、短命タンパク質の消失半減期を延長する。例えば、Ｆａｂフラグメントへのアルブミン結合ドメインの組み換え融合は、Ｆａｂフラグメント単独の投与と比較して、マウス及びウサギのそれぞれに静脈内投与されたときに、２５〜５８倍の低減されたインビボクリアランス及び２６〜３７倍の半減期延長をもたらした。別の例では、インスリンが脂肪酸でアシル化されてアルブミンとの会合を促進する場合、ウサギまたはブタに皮下注射されたときに持続的な効果が観察された。合わせて、これらの研究は、アルブミン結合と持続性作用との間のつながりを実証した。
【０１１７】
一態様では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、半減期延長ドメイン、例えば、ＨＳＡに特異的に結合するドメインを含む。他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、ペプチドである。さらなる実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、小分子である。抗原結合タンパク質のＨＳＡ結合ドメインが、かなり小さく、いくつかの実施形態では、２５ｋＤ以下、２０ｋＤ以下、１５ｋＤ以下、または１０ｋＤ以下であることが企図される。ある特定の場合では、ＨＳＡ結合ドメインは、それがペプチドまたは小分子である場合、５ｋＤ以下である。
【０１１８】
多くの実施形態では、半減期延長ドメインは、ＨＳＡに結合する単一ドメイン抗体からの単一ドメイン抗原結合ドメインである。このドメインは概して、これらの結合ドメインをＴＴＡに対するｓｄＡＢＤと区別するために、本明細書においてヒトＨＳＡに対する「ｓｄＡＢＤ」（ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡ）、あるいは「ｓｄＡＢＤ（１／２）」と称される。特に有用なｓｄＡＢＤ（１／２）は、図５に示される。
【０１１９】
抗原結合タンパク質の半減期延長ドメインは、抗原結合タンパク質自体の改変した薬力学及び薬物動態を提供する。上記の通り、半減期延長ドメインは、消失半減期を延長する。半減期延長ドメインはまた、抗原結合タンパク質の組織分布、浸透、及び拡散の改変を含む、薬理学的特性を改変させる。いくつかの実施形態では、半減期延長ドメインは、半減期延長結合ドメインなしのタンパク質と比較して、改善された組織（腫瘍を含む）標的化、組織浸透、組織分布、組織内の拡散、及び増強した有効性を提供する。一実施形態では、治療法は、低減した量の抗原結合タンパク質を効果的かつ効率的に利用し、非腫瘍細胞の細胞毒性の低減などの副作用の低減をもたらす。
【０１２０】
さらに、半減期延長ドメイン、例えば、ＨＳＡ結合ドメインの特徴は、ＨＳＡに対するＨＳＡ結合ドメインの結合親和性を含む。前述のＨＳＡ結合ドメインの親和性は、特定のポリペプチド構築物における特定の消失半減期を標的とするように選択され得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、高い結合親和性を有する。他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、中程度の結合親和性を有する。さらに他の実施形態では、ＨＳＡ結合ドメインは、低いまたはわずかな結合親和性を有する。例示的な結合親和性は、１０ｎＭ以下（高）、１０ｎＭ〜１００ｎＭ（中）、及び１００ｎＭ超（低）のＫＤ濃度を含む。上記の通り、ＨＳＡへの結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）などの既知の方法によって決定される。
【０１２１】
Ｄ．プロテアーゼ開裂部位
本発明のタンパク質組成物、特にプロドラッグ構築物は、本明細書で概説されるように、概して開裂性リンカー内に存在する１つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。
【０１２２】
本明細書に記載されるように、本発明のプロドラッグ構築物は、少なくとも１つのプロテアーゼによって開裂されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つのプロテアーゼ開裂部位を含む。場合によっては、本明細書に記載のＭＣＥタンパク質は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上のプロテアーゼ開裂部位を含む。本明細書でより十分に考察されるように、２つ以上のプロテアーゼ開裂部位がプロドラッグ構築で使用される場合、それらは同じであっても（例えば、単一プロテアーゼによって開裂される複数の部位）、異なっていてもよい（２つ以上の開裂部位が少なくとも２つの異なるプロテアーゼによって開裂される）。当業者によって理解されるように、３つ以上のプロテアーゼ開裂部位を含有する構築物は、１、２、３個などを利用することができ、例えば、いくつかの構築物は、２つの異なるプロテアーゼに対して３つの部位などを利用することができる。
【０１２３】
プロテアーゼ開裂部位のアミノ酸配列は、標的とされるプロテアーゼに依存する。当該技術分野において既知であるように、体内で見つかり、疾患状態に関連し得る多くのヒトプロテアーゼが存在する。
【０１２４】
プロテアーゼは、いくつかの罹患細胞及び組織、例えば腫瘍またはがん細胞によって分泌され、プロテアーゼが豊富である微小環境またはプロテアーゼに富んだ微小環境を作り出すことが既知である。場合によっては、対象の血液は、プロテアーゼが豊富である。場合によっては、腫瘍を包囲する細胞が、プロテアーゼを腫瘍微小環境中に分泌する。プロテアーゼを分泌する腫瘍を包囲する細胞としては、腫瘍間質細胞、筋線維芽細胞、血液細胞、マスト細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、間葉系幹細胞多形核細胞、及び他の細胞が挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、プロテアーゼ、例えば、微生物ペプチドで見られるアミノ酸配列を標的とするプロテアーゼは、対象の血液中に存在する。この特徴は、標的細胞または組織のプロテアーゼに富んだ微小環境を除いて、Ｔ細胞が抗原結合タンパク質によって結合されないため、抗原結合タンパク質などの標的化治療薬がさらなる特異性を有することを可能にする。
【０１２５】
プロテアーゼは、場合によっては、配列特異的な方法でタンパク質を開裂するタンパク質である。プロテアーゼとしては、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、アスパラギンペプチドリアーゼ、血清プロテアーゼ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ（例えば、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｂ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｃ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｄ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｅ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｋ、Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  Ｌ、ＣａｔｈｅｐｓｉｎＳ）、ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ、ｈＫ１、ｈＫ１０、ｈＫ１５、ＫＬＫ７、ＧｒａｎｚｙｍｅＢ、プラスミン、コラゲナーゼ、ＩＶ型コラゲナーゼ、ストロメリシン、第Ｘａ因子、キモトリプシン様プロテアーゼ、トリプシン様プロテアーゼ、エラスターゼ様プロテアーゼ、サブチリシン様プロテアーゼ、アクチニジン、ブロメライン、カルパイン、Ｃａｓｐａｓｅ（例えば、Ｃａｓｐａｓｅ−３）、Ｍｉｒ１−ＣＰ、パパイン、ＨＩＶ−１プロテアーゼ、ＨＳＶプロテアーゼ、ＣＭＶプロテアーゼ、キモシン、レニン、ペプシン、マトリプターゼ、レグマイン、プラスメプシン、ネペンテシン、メタロエキソペプチダーゼ、メタロエンドペプチダーゼ、マトリクスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１４、メプリン、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、エンテロキナーゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ、ｈＫ３）、インターロイキン−１β変換酵素、トロンビン、ＦＡＰ（ＦＡＰ−α）、ジペプチジルペプチダーゼ、及びジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
いくつかの好適なプロテアーゼ及びプロテアーゼ開裂配列が図５及び図６に示される。
【０１２７】
Ｅ．リンカー
本明細書で考察されるように、本発明の異なるドメインは概して、アミノ酸リンカーを使用して一緒に連結され、これは、同様に柔軟性または非柔軟性（例えば、立体障害）を含む機能性、ならびに原位置プロテアーゼを使用して開裂される能力を与えることができる。これらのリンカーは、多くの方法で分類され得る。
【０１２８】
本発明は、２つ以上のドメインを結合するために使用される「ドメインリンカー」を提供する（例えば、ＶＨ及びＶＬ、ＶＨまたはＶＬに対する標的腫瘍抗原結合ドメイン（ＴＴＡＢＤ、本明細書において「αＴＴＡ」（「抗ＴＴＡ」に対して）と称されるときもある）、別の構成成分に対する半減期延長ドメインなど）。ドメインリンカーは、例えば、非開裂性（ＮＣＬ）、開裂性（「ＣＬ」）、拘束及び開裂性（ＣＣＬ）、ならびに拘束及び非開裂性（ＣＮＣＬ）であり得る。
【０１２９】
１．非開裂性リンカー
いくつかの実施形態では、ドメインリンカーは、非開裂性である。概して、これらは、構築物のリンカーの構成成分「上流」及び「下流」がある特定の方法で分子内で自己集合することを可能にする非開裂性及び柔軟性、またはリンカーによって分離された２つの構成成分が分子内で自己集合することができない非開裂性及び拘束、の２つのタイプのうちの１つであり得る。しかしながら、後者の場合、非開裂性拘束リンカーによって分離された２つの構成成分ドメインが分子内で自己集合しない一方で、他の分子内構成成分が自己集合して、偽Ｆｖドメインを形成することに留意されたい。
【０１３０】
（ｉ）非開裂性であるが柔軟性のリンカー
この実施形態では、リンカーは、概して、患者において原位置プロテアーゼによって開裂されないより長い柔軟性ドメインを通して、ドメインに結合してドメインの機能性を維持するために使用される。本発明のポリペプチド中のドメインに連結するのに好適な内部の非開裂性リンカーの例としては、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳＧ）ｎ、（ＧＧＳＧＧ）ｎ、または（ＧＧＧＧＳ）ｎが挙げられるが、これらに限定されず、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態では、リンカーの長さは、約１５アミノ酸であり得る。
【０１３１】
（ｉｉ）非開裂性及び拘束リンカー
場合によっては、リンカーは、開裂部位を含有せず、またリンカーによって分離されたタンパク質ドメインが分子内で自己集合することを可能にするには短すぎ、「拘束非開裂性リンカー」または「ＣＮＣＬ」である。例えば、Ｐｒｏ１８６において、活性ＶＨ及び活性ＶＬは、ＶＨ及びＶＬが活性抗原結合ドメインに自己集合することを可能にしない８アミノ酸（「８ｍｅｒ」）によって分離される。いくつかの実施形態では、リンカーは、なおも柔軟性、例えば、（ＧＧＧＳ）ｎ（ｎ＝２）である。他の実施形態では、概してあまり好ましくないが、プロリンまたはかさ高いアミノ酸を含むものなどのより剛性のリンカーが使用され得る。
【０１３２】
２．開裂性リンカー
本明細書のプロドラッグ構築物の全ては、少なくとも１つの開裂性リンカーを含む。したがって、一実施形態では、ドメインリンカーは、開裂性（ＣＬ）であり、本明細書において「プロテアーゼ開裂ドメイン」（「ＰＣＤ」）と称されるときもある。この実施形態では、ＣＬは、本明細書で概説されるように、かつ図５及び図６に示されるように、プロテアーゼ開裂部位を含有する。場合によっては、ＣＬは、プロテアーゼ開裂部位飲みを含有する。任意に、開裂認識部位の長さに応じて、ＣＬのＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方にさらに数個の連結アミノ酸が存在し得、例えば、開裂部位のＮ末端またはＣ末端のいずれかまたは両方に１、２、３、４、または５つのアミノ酸が存在し得る。したがって、開裂性リンカーはまた、拘束されているか（例えば、８ｍｅｒ）または柔軟性である。
【０１３３】
本発明で特に興味深いのは、ＭＭＰ９開裂性リンカー及びメプリン開裂性リンカー、特にＭＭＰ９拘束開裂性リンカー及びメプリン拘束開裂性リンカーである。
【０１３４】
ＶＩＩＩ．本発明のドメイン
本発明は、本発明のプロドラッグポリペプチドに対する多くの異なる形式を提供する。本発明は、拘束Ｆｖドメイン及び拘束偽Ｆｖドメインを提供する。加えて、本発明は、２つのＦｖドメインを含有するが、非異性化構築物である、多価の条件的に有効な（「ＭＣＥ」）タンパク質を提供する。本明細書で概説されるように、これらは、非異性化開裂性形式または非異性化非開裂性形式であり得るが、全ての構築物が、少なくとも１つのプロテアーゼ開裂ドメインを含有する。
【０１３５】
重要なことに、これらのドメイン（Ｆｖドメイン及び偽Ｆｖドメイン）の両方が、本明細書において「拘束された」と称され、上記で考察されるように、かつ図３６、図３７、及び図３８に示されるように、これらのうちの１つのみが拘束される必要があることを意味するが、概して、両方のリンカーが拘束されているときに、タンパク質は、より良好な発現を有する。
【０１３６】
当業者は、形式１、２、及び４に関して、本発明の拘束及び偽ＦｖドメインのＮ末端からＣ末端への順序（リンカーは示さず）に対して４つの可能性、ａＶＨ−ａＶＬ及びｉＶＬ−ｉＶＨ、ａＶＨ−ａＶＬ及びｉＶＨ−ｉＶＬ、ａＶＬ−ａＶＨ及びｉＶＬ−ｉＶＨ、ａＶＬ−ａＶＨ及びｉＶＨ−ｉＶＬがあることを理解するであろう。４つ全てが試験され、４つ全てが活性を有するが、第１の順序、ａＶＨ−ａＶＬ及びｉＶＬ−ｉＶＨは、他の３つよりも良好な発現を示す。したがって、本明細書の説明は概して、このａＶＨ−ａＶＬ及びｉＶＬ−ｉＶＨ形式で示されるが、本明細書の全ての開示は、これらのドメインの他の順序も含む。
【０１３７】
概して、本発明の完全長構築物のＮ末端からＣ末端への順序が、ａＶＨ−ａＶＬ及びｉＶＬ−ｉＶＨ配向に基づくことに留意されたい。
【０１３８】
加えて、ある特定のＡＢＤのＣ末端配列に由来するヒトにおける免疫原性が存在し得ることが、当該技術分野において既知である。したがって、一般に、特に構築物のＣ末端がｓｄＡＢＤ（例えば、構築物のうちの多くのｓｄＡＢＤ−ＨＳＡドメイン）で終端するとき、ヒスチジンタグ（Ｈｉｓ６またはＨｉｓ１０のいずれか）が使用され得る。本明細書の配列のうちの多くまたはほとんどを、精製の理由でＨｉｓ６  Ｃ末端タグを使用して生成したが、これらの配列はまた、Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，ＤＯＩ  １０．１００７／ｓ１０８７５−０１３−９９１５−０及びＷＯ２０１３／０２４０５９によって示されるように、ヒトにおける免疫原性を低減するためにも使用され得る。
【０１３９】
Ａ．拘束Ｆｖドメイン
本発明は、拘束リンカー（本明細書で概説されるように、開裂性（形式１及び３）または非開裂性（形式２及び４）であり得る）を使用して供給結合された活性ＶＨ及び活性ＶＬドメインを含む、拘束Ｆｖドメインを提供する。拘束リンカーは、開裂の非存在下でＶＨとＶＬとの間の分子内会合を防止する。したがって、拘束Ｆｖドメインは概して、可変ドメイン内に含有された６つのＣＤＲのセットを含み、ＶＨのｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、及びｖｈＣＤＲ３は、ヒトＣＤ−３に結合し、ＶＬのｖｌＣＤＲ１、ｖＣＤＲ２、及びｖｌＣＤＲ３は、ヒトＣＤ−３に結合するが、プロドラッグ形式（例えば、未開裂）では、ＶＨ及びＶＬは、立体的に会合して活性結合ドメインを形成することができず、むしろ偽Ｆｖと分子内で対になることを好む。
【０１４０】
拘束Ｆｖドメインは、本明細書に記載されるように、活性ＶＨ及び活性ＶＬ（ａＶＨ及びａＶＬ）もしくは不活性ＶＨ及びＶＬ（ｉＶＨ及びｉＶＬ、この場合、それは拘束偽Ｆｖドメインである）、またはこれらの組み合わせを含むことができる。
【０１４１】
当業者によって理解されるように、拘束Ｆｖドメイン中のＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかであり得る。
【０１４２】
本明細書で概説されるように、形式１構築物に関して、拘束Ｆｖドメインは、図５及び図６に示されるものなどの場合、開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬを含むことができる。この実施形態では、拘束Ｆｖドメインは、構造（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を有する。一般に、拘束Ｆｖドメインは、活性ＶＨ及びＶＬドメイン（例えば、会合したときにＣＤ３に結合することが可能）を含有し、したがって構造（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｈＦＲ１−ａｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ａｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ａｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＣＬ−ｖｌＦＲ１−ａｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ａｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ａｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を有する。
【０１４３】
本明細書で概説されるように、形式２構築物に関して、拘束Ｆｖドメインは、非開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬを含むことができる。この実施形態では、拘束Ｆｖドメインは、構造（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｈＦＲ１−ｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＮＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を有する。一般に、拘束Ｆｖドメインは、活性ＶＨ及びＶＬドメイン（例えば、会合したときにＣＤ３に結合することが可能）を含有し、したがって構造（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｈＦＲ１−ａｖｈＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ａｖｈＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ａｖｈＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＮＣＬ−ｖｌＦＲ１−ａｖｌＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ａｖｌＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ａｖｌＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を有する。
【０１４４】
配列番号６１を有するＶＨ、配列番号４９を有するＶＬ、及び配列番号７４を有するドメインリンカーを有する拘束非開裂性Ｆｖドメインが、本発明で特に使用される。
【０１４５】
Ｂ．拘束偽Ｆｖドメイン
本発明は、拘束リンカー（本明細書で概説されるように、開裂性または非開裂性であり得る）を使用して供給結合された不活性または偽ｉＶＨ及びｉＶＬドメインを含む、拘束偽Ｆｖドメインを提供する。拘束リンカーは、開裂の非存在下でｉＶＨとｉＶＬとの間の分子内会合を防止する。したがって、拘束偽Ｆｖドメインは概して、ｉＶＨ及びｉＶＬの会合（非拘束形式であるとき）を可能にするフレームワーク領域を有するｉＶＨ及びｉＶＬを含むが、得られる偽Ｆｖドメインは、ヒトタンパク質に結合しない。ｉＶＨドメインは、ａＶＬドメインと集合することができ、ｉＶＬドメインは、ａＶＨドメインと集合することができるが、得られる構造は、ＣＤ３に結合しない。
【０１４６】
拘束偽Ｆｖドメインは、不活性ＶＨ及びＶＬ（ｉＶＨ及びｉＶＬ）を含む。
【０１４７】
当業者によって理解されるように、拘束偽Ｆｖドメイン中のＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかであり得る。
【０１４８】
本明細書で概説されるように、拘束偽Ｆｖドメインは、形式１、２、及び４に示されるような非開裂性リンカーを使用して、または形式３に示されるような開裂性リンカーを用いて連結されたｉＶＨ及びｉＶＬを含むことができる。
【０１４９】
一般に、拘束Ｆｖドメインは、非活性ＶＨ及びＶＬドメインを含有し（例えば、会合したときにＣＤ３に結合することが可能）、したがって、構造（Ｎ末端からＣ末端に）ｖｈＦＲ１−ｉｖｌＣＤＲ１−ｖｈＦＲ２−ｉｖｌＣＤＲ２−ｖｈＦＲ３−ｉｖｌＣＤＲ３−ｖｈＦＲ４−ＣＮＣＬ−ｖｌＦＲ１−ｉｖｈＣＤＲ１−ｖｌＦＲ２−ｉｖｈＣＤＲ２−ｖｌＦＲ３−ｉｖｈＣＤＲ３−ｖｌＦＲ４を有する。
【０１５０】
配列番号６５または配列番号６９を有するｉＶＨ、配列番号５３または配列番号５７を有するｉＶＬ、及び配列番号７４を有するドメインリンカーを有する拘束非開裂性偽Ｆｖドメインが、本発明で特に使用される。
【０１５１】
ＩＸ．本発明の形式
本明細書で考察されるように、本発明のプロドラッグ構築物は、二重ＴＴＡ結合ドメインを有する開裂性形式、二重ＴＴＡ結合ドメインを有する非開裂性形式（そのうちのいずれかが同じＴＴＡ結合ドメインまたは異なる結合ドメインを有することができる）、及び単一標的化ドメインを有する非開裂性形式を含む、多くの異なる形式をとることができる。
【０１５２】
Ａ．二重標的化を有する開裂性形式
本発明は、図１の「形式１」型の非異性化開裂性形式を提供する。この実施形態では、拘束Ｆｖドメインは、拘束開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬドメインを含み、拘束偽Ｆｖドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用する。考察を容易にするために、これらのうちの両方が本明細書において「拘束された」と称されるが、上記で考察されるように、かつ図３６、図３７、及び図３８に示されるように、これらのうちの１つのみが拘束される必要があるが、概して、両方のリンカーが拘束されているときに、タンパク質は、より良好な発現を有する。
【０１５３】
形式１（ならびに他の形式）の全ての構築物はまた、ヒト腫瘍プロテアーゼによって開裂される開裂性リンカー（ＣＬ）を有する。
【０１５４】
本発明は、Ｎ末端からＣ末端に（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−拘束Ｆｖドメイン−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−拘束偽Ｆｖドメイン−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む、プロドラッグタンパク質を提供する。
【０１５５】
当業者によって理解されるように、拘束Ｆｖドメインまたは拘束偽ＦｖドメインのいずれかのＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかであり得る。
【０１５６】
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。
【０１５７】
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＨ−ＣＣＬ−ｉＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。
【０１５８】
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＬ−ＣＣＬ−ａＶＨ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ＮＣＬ−ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、及びｉＶＬは、図５に示される配列を有する。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、またはＢ７Ｈ３であり得る同じＴＴＡに結合し、この配列は、図５に示される。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、異なるＴＴＡに結合する。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭに結合し、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、図５の配列を有する。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥＧＦＲ及びＦＯＬＲ１に結合し、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、図５の配列を有する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥＧＦＲ及びＢ７Ｈ３に結合し、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、図５の配列を有する。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥｐＣＡＭ及びＦＯＬＲ１に結合し、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、図５の配列を有する。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥｐＣＡＭ及びＢ７Ｈ３に結合し、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、図５の配列を有する。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、Ｂ７Ｈ３及びＦＯＬＲ１に結合し、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、図５の配列を有する。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、プロドラッグ構築物は、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（１／２）を含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、またはＥｐＣＡＭであり得る同じＴＴＡに結合し、この配列は、図５に示され、ＣＣＬ及びＣＬは、ＭＭＰ９またはメプリンによって開裂されるリンカーから選択され、ｓｄＡＢＤ（１／２）は、配列番号４５を有する。
【０１６９】
形式１において、好ましいドメインリンカーは、配列番号７４である（これはまた、好ましい拘束非開裂性リンカーとしても機能する）。
【０１７０】
形式１において、好ましい構築物は、Ｐｒｏ１４０及びＰｒｏ１４０ｂである。
Ｂ．非開裂性形式
【０１７１】
図２に示されるように、本発明は、非異性化非開裂性形式を提供する。この実施形態では、プロドラッグ構築物において活性化開裂部位が存在するため、「非開裂性」が拘束Ｆｖドメインの連結にのみ適用されることが理解される。この実施形態では、拘束Ｆｖドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬドメインを含み、拘束偽Ｆｖドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用する。
【０１７２】
当業者によって理解されるように、拘束Ｆｖドメインまたは拘束偽ＦｖドメインのいずれかのＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかであり得る。
【０１７３】
本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−拘束Ｆｖドメイン−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）−開裂性リンカー−拘束偽Ｆｖドメイン−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む、プロドラッグタンパク質を提供する。
【０１７４】
当業者によって理解されるように、拘束Ｆｖドメインまたは拘束偽ＦｖドメインのいずれかのＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかであり得る。
【０１７５】
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。
【０１７６】
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＨ−ＣＮＣＬ−ｉＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。
【０１７７】
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＬ−ＣＮＣＬ−ａＶＨ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。
【０１７８】
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＬ−ＣＮＣＬ−ａＶＨ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＨ−ＣＮＣＬ−ｉＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、またはＢ７Ｈ３であり得る同じＴＴＡに結合し、この配列は、図５に示される。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、異なるＴＴＡに結合する。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥＧＦＲ及びＥｐＣＡＭに結合し、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、図５の配列を有する。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥＧＦＲ及びＦＯＬＲ１に結合し、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、図５の配列を有する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥＧＦＲ及びＢ７Ｈ３に結合し、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、図５の配列を有する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥｐＣＡＭ及びＦＯＬＲ１に結合し、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、図５の配列を有する。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥｐＣＡＭ及びＢ７Ｈ３に結合し、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、図５の配列を有する。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＦＯＬＲ１及びＢ７Ｈ３に結合し、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、図５の配列を有する。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２）−ＣＬ−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、２つの標的化ドメインは、ＥＧＦＲ、ＦＯＬＲ１、Ｂ７Ｈ３、またはＥｐＣＡＭであり得る同じＴＴＡに結合し、この配列は、図５に示され、ＣＣＬ及びＣＬは、ＭＭＰ９またはメプリンによって開裂されるリンカーから選択され、ｓｄＡＢＤ（１／２）は、配列番号４５を有する。
【０１８８】
形式２において、好ましいドメインリンカーは、配列番号７４である（これはまた、好ましい拘束非開裂性リンカーとしても機能する）。
【０１８９】
形式２において、特定の使用の実施形態としては、Ｐｒｏ１８６、Ｐｒｏ２２５、Ｐｒｏ２２６、Ｐｒｏ２３３、Ｐｒｏ３１１、Ｐｒｏ３１２、Ｐｒｏ３１３、Ｐｒｏ４９５、Ｐｒｏ２４６、Ｐｒｏ２５４、Ｐｒｏ２５５、Ｐｒｏ２５６、Ｐｒｏ４２０、Ｐｒｏ４２１、Ｐｒｏ４３２、Ｐｒｏ４７９、Ｐｒｏ４８０、Ｐｒｏ１８７、Ｐｒｏ２２１、Ｐｒｏ２２２、Ｐｒｏ２２３、Ｐｒｏ２２４、Ｐｒｏ３９３、Ｐｒｏ３９４、Ｐｒｏ３９５、Ｐｒｏ３９６、Ｐｒｏ４２９、Ｐｒｏ４３０、及びＰｒｏ４３１が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９０】
Ｃ．単一ＴＴＡ構築物
図４に示されるように、形式２構築物と同様であるが、第２のＴＴＡ  ＡＢＤがない「形式４」構築物もまた、本発明の組成物に含まれる。この実施形態では、プロドラッグ構築物において活性化開裂部位が存在するため、「非開裂性」が拘束Ｆｖドメインの連結にのみ適用されることが理解される。この実施形態では、拘束Ｆｖドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用して連結されたＶＨ及びＶＬドメインを含み、拘束偽Ｆｖドメインは、拘束非開裂性リンカーを使用する。
【０１９１】
当業者によって理解されるように、拘束Ｆｖドメインまたは拘束偽ＦｖドメインのいずれかのＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかであり得る。
【０１９２】
本発明は、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ）−ドメインリンカー−拘束Ｆｖドメイン−開裂性リンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡ−拘束偽Ｆｖドメインを含む、プロドラッグタンパク質を提供する。（この形式の全ての構築物について、ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡが概してＨｉｓ６を有しないが、それが含まれ得ることに留意されたい）。
【０１９３】
当業者によって理解されるように、拘束Ｆｖドメインまたは拘束偽ＦｖドメインのいずれかのＶＨ及びＶＬの順序は、（Ｎ末端からＣ末端に）ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨのいずれかであり得る。
【０１９４】
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ＣＬ−（ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡ）−ドメインリンカー−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨを含む。
【０１９５】
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ＣＬ−（ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡ）−ドメインリンカー−ｉＶＨ−ＣＮＣＬ−ｉＶＬを含む。
【０１９６】
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ）−ドメインリンカー−ａＶＬ−ＣＮＣＬ−ａＶＨ−ＣＬ−（ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡ）−ドメインリンカー−ｉＶＨ−ＣＮＣＬ−ｉＶＬを含む。
【０１９７】
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ）−ドメインリンカー−ａＶＬ−ＣＮＣＬ−ａＶＨ−ＣＬ−（ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡ）−ドメインリンカー−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨを含む。
【０１９８】
したがって、一実施形態では、プロドラッグタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、（ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＮＣＬ−ａＶＬ−ＣＬ−（ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡ）−ドメインリンカー−ｉＶＬ−ＣＮＣＬ−ｉＶＨを含む。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬは、図５に示される配列を有する。この実施形態では、標的化ドメインは、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、またはＢ７Ｈ３であり得るＴＴＡに結合し、この配列は、図５に示される。
【０１９９】
形式４において、好ましいドメインリンカーは、配列番号７４である（これはまた、好ましい拘束非開裂性リンカーとしても機能する）。
【０２００】
形式４において、好ましいｓｄＡＢＤ−ＨＳＡは、配列番号４５のものである。
【０２０１】
Ｄ．２つのタンパク質組成物
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、開裂の非存在下で、分子内で会合して偽Ｆｖを形成する、「半ＣＯＢＲＡ（商標）」または「半構築物」と称されるときがある、２つの異なる分子を含む。プロテアーゼの存在下で、開裂部位は開裂され、非活性可変ドメインを放出し、次いで、タンパク質対は、概して図３に示されるように、ＣＤ３に対する活性抗原結合ドメインを形成する。
【０２０２】
半構築物の設計で重要なことは、活性可変ドメイン及びｓｄＡＢＤ−ＴＴＡが開裂後に一緒のままであり、これにより、２つの開裂部分が腫瘍表面上の腫瘍抗原受容体によって一緒に保持され、次いで活性抗ＣＤ３結合ドメインを形成することができることである。
【０２０３】
対の各メンバーが単一ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡを有するもの（図３Ａ）、及び各々が異なるＴＴＡに対する２つの異なるｓｄＡＢＤ−ＴＴＡを有するもの（図３Ｂ）の、２つの異なる一般的な形式３構築物が存在する。
【０２０４】
１．単一ＴＴＡ結合ドメインを有する半ＣＯＢＲＡ（商標）構築物（形式３Ａ）
いくつかの実施形態では、第１の半ＣＯＢＲＡ（商標）は、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ１）−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＬ−ｉＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（１／２）を有し、第２の半ＣＯＢＲＡ（商標）は、ｓｄＡＢＤ（１／２）−ドメインリンカー−ｉＶＨ−ＣＬ−ａＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（ＴＴＡ２）を有する。この実施形態では、ａＶＨ、ａＶＬ、ｉＶＨ、ｉＶＬ、及びｓｄＡＢＤ（１／２）は、図５に示される配列を有し、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡａは、ヒトＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＦＯＬＲ１、及び／またはＢ７Ｈ３に結合し、図５に示される配列を有する。
【０２０５】
２．二重ＴＴＡ  ＡＢＤを有する半ＣＯＢＲＡ（商標）構築物
いくつかの実施形態では、対になったプロドラッグ構築物は、図３Ｂに示されるように、構築物当たり２つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ結合ドメインを有することができる。この実施形態では、対の第１のメンバーは、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２−ドメインリンカー−ａＶＨ−ＣＬ−ｉＶＬ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ（ＨＡＳ）を含み、第２のメンバーは、Ｎ末端からＣ末端に、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ１−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡ２−ａＶＬ−ＣＬ−ｉＶＨ−ドメインリンカー−ｓｄＡＢＤ−ＨＳＡを含む。
【０２０６】
対の各メンバー上の２つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは異なるが、概して、両方のメンバー（半ＣＯＢＲＡ（商標））が、同じ２つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡを有し、例えば、両方がＥＧＦＲ及びＦＯＬＲ１またはＥＧＦＲ及びＢ７Ｈ３などを有する。
【０２０７】
２つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、いくつかの実施形態では、図５に示されるものから選択される。
【０２０８】
Ｘ．本発明の組成物の作製方法
本発明のプロドラッグ組成物は、概して当業者によって理解されるように、かつ以下で概説されるように作製される。
【０２０９】
本発明は、本発明のプロドラッグ組成物をコードする核酸組成物を提供する。当業者によって理解されるように、核酸組成物は、プロドラッグポリペプチド（複数可）の形式によって決まる。したがって、例えば、「形式３」構築物など、形式が２つのアミノ酸配列を必要とする場合、２つの核酸配列は、発現のために１つ以上の発現ベクターに組み込まれ得る。同様に、単一ポリペプチドであるプロドラッグ構築物（形式１、２、及び４）は、産生のために単一発現ベクター中に単一核酸を必要とする。
【０２１０】
当該技術分野において既知であるように、本発明の構成成分をコードする核酸は、当該技術分野において既知であるように、かつ本発明のプロドラッグ組成物を産生するために使用される宿主細胞に応じて、発現ベクターに組み込まれ得る。概して、核酸は、任意の数の調節エレメント（プロモーター、複製起点、選択可能なマーカー、リボゾーム結合部位、誘導因子など）に作動可能に連結されている。発現ベクターは、染色体外または組み込みベクターであり得る。
【０２１１】
次いで、本発明の核酸及び／または発現ベクターは、多くの実施形態で使用される哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、２９３細胞）で、哺乳動物、細菌、酵母、昆虫、及び／または真菌細胞を含む、当該技術分野において周知であるような任意の数の異なる型の宿主細胞に変換される。
【０２１２】
本発明のプロドラッグ組成物は、当該技術分野において周知であるように、発現ベクター（複数可）を含む宿主細胞を培養することによって作製される。いったん産生されると、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィステップ及び／またはイオン交換クロマトグラフィステップを含む、従来の抗体精製ステップが行われる。
【０２１３】
ＸＩ．本発明のプロドラッグ組成物の製剤及び投与
本発明に従って使用されるプロドラッグ組成物の製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、（概して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ´ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．［１９８０］で概説されるように）任意の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤を伴い所望の純度を有するプロドラッグ（形式１、２、及び４の場合は単一タンパク質、ならびに形式３の場合は２つのタンパク質）を混合することによって、保存のために調製される。
【０２１４】
本発明のプロドラッグ組成物は、ボーラスとしての、またはある期間にわたる持続注入による静脈内投与などの既知の方法に従って、対象に投与される。
【０２１５】
本発明のプロドラッグ組成物は、がんの治療に有用である。
【０２１６】
ＸＩＩ．実施例
Ａ．実施例１：プロ構築物の構築及び精製
トランスフェクション
各タンパク質（例えば、形式１、２、及び４については単一タンパク質）または構築物の対（形式３）を、別個の発現ベクター（ｐｃｄｎａ３．４誘導体）から発現させた。半ｃｏｂｒａまたは単鎖構築物の対をコードした等量のプラスミドＤＮＡを混合し、製造業者のトランスフェクションプロトコルに従ってＥｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。条件培地を遠心分離（６０００ｒｐｍ×２５´）及び濾過（０．２ｕＭフィルタ）によって、トランスフェクションの５日後に採取した。タンパク質発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。構築物を精製し、最終緩衝液組成物は、２５ｍＭのクエン酸塩、７５ｍＭのアルギニン、７５ｍＭのＮａＣｌ、４％スクロース、ｐＨ７であった。最終調製物を−８０°Ｃで保存した。
【０２１７】
ＭＭＰ９の活性化
組み換えヒト（ｒｈ）ＭＭＰ９を以下のプロトコルに従って活性化した。組み換えヒトＭＭＰ−９（Ｒ＆Ｄ  ＃９１１−ＭＰ−０１０）は、０．４４ｍｇ／ｍＬ（４．７ｕＭ）であった。酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ）を、ＤＭＳＯ中１００ｍＭのストック濃度で調製する。アッセイ緩衝液は、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５、１０ｍＭのＣａＣｌ２、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％  Ｂｒｉｊ−３５である。
【０２１８】
−ｒｈＭＭＰ９をアッセイ緩衝液で約１００ｕｇ／ｍＬに希釈する（２５ｕＬのｈＭＭＰ９＋７５ｕＬのアッセイ緩衝液）
【０２１９】
−ＤＭＳＯ中１００ｍＭのストックからの酢酸ｐ−アミノフェニル水銀（ＡＰＭＡ）を、１ｍＭ（１ｕＬ〜１００ｕＬ）の最終濃度になるように添加する
【０２２０】
−３７℃で２４時間インキュベートする
【０２２１】
−ＭＭＰ９を１０ｎｇ／ｕＬに希釈する（９００ｕＬのアッセイ緩衝液を１００ｕＬの活性化溶液に添加する）
【０２２２】
活性化ｒｈＭＭＰ９の濃度は、約１００ｎＭである。
【０２２３】
ＴＤＣＣアッセイのための構築物の開裂
【０２２４】
構築物を開裂するために、製剤緩衝液（２５ｍＭのクエン酸、７５ｍＭのＬ−アルギニン、７５ｍＭのＮａＣｌ、４％スクロース）中１ｍｇ／ｍＬの濃度（１０．５ｕＭ）の１００ｕＬのタンパク質試料に、最大１０ｍＭのＣａＣｌ２を供給した。活性化ｒｈＭＭＰ９を２０〜３５ｎＭの濃度になるまで添加した。試料を室温で一晩（１６〜２０時間）インキュベートした。開裂の完全性を、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（１０〜２０％  ＴＧ、ＴＧ泳動用緩衝液、２００ｖ、１時間）を使用して検証した。試料を典型的には９８％開裂した。
【０２２５】
Ｂ．実施例２：Ｔ細胞依存性細胞障害作用（ＴＤＣＣ）アッセイ
ホタルルシフェラーゼ形質導入ＨＴ−２９細胞を約８０％密集度まで成長させ、Ｖｅｒｓｅｎｅ（ＰＢＳ−Ｃａ−Ｍｇ中０．４８ｍＭのＥＤＴＡ）で分離した。細胞を遠心分離し、ＴＤＣＣ培地（ＨＥＰＥＳ、ＧｌｕｔａＭａｘ、ピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸、及びβ−メルカプトエタノールを有するＲＰＭＩ  １６４０中の５％熱失活ＦＢＳ）中に再懸濁した。精製したヒトＰａｎ−Ｔ細胞を解凍、遠心分離、及びＴＤＣＣ培地中に再懸濁した。
【０２２６】
ＨＴ−２９＿Ｌｕｃ細胞及びＴ細胞の共培養を３８４ウェル細胞培養プレートに添加した。次いで、連続希釈したＣＯＢＲＡを共培養に添加し、３７℃で４８時間インキュベートした。最後に、等量のＳｔｅａｄｙＧｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬をプレートに添加し、２０分間インキュベートした。プレートを０．１秒／ウェルの曝露時間でＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎにおいて読み取った。全発光を記録し、データをＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７で分析した。
【０２２７】
Ｃ．実施例３：インビボ養子Ｔ細胞移入有効性モデルの一般的なプロトコル設計
これらのプロトコルを図面の実験の多くで使用した。腫瘍細胞をＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号００５５５７）の右脇腹に皮下移植（ＳＣ）し、約２００ｍｍ３の平均体積を有する確立された腫瘍が達成されるまで成長させた。並行して、ヒトＴ細胞を、約１０日間、Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９１−４４１）からのＭＡＣＳｉＢｅａｄを有するＧ−Ｒｅｘ１００Ｍガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）内のＴ細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ  １５［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４−４１８Ｑ］、５％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０１ｍＭの２−メルカプトエタノール）で培養し、組み換えヒトＩＬ−２タンパク質を補充した。マウスにおける腫瘍成長及びヒトＴ細胞活性化／拡大を調整し、これにより研究の０日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群（Ｎ＝６）に分け、次いで、各々に２．５×１０６の培養したヒトＴ細胞を静脈内注射（ＩＶ）し、ＣＯＢＲＡまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、３日毎に７用量（０、３、６、９、１２、１５、及び１８日目）、次いで腫瘍が２０００ｍｍ３を越える体積に到達するまで、または研究は終了するまでさらに２〜３週間投与した。腫瘍体積を３日毎に測定した。
【０２２８】
Ｄ．実施例４：ＥＧＦＲ／ＭＭＰ９半ＣＯＢＲＡ対Ｐｒｏ７７及びＰｒｏ５３を用いたインビボ活性。
５×１０６のＬｏＶｏ細胞または５×１０６のＨＴ２９細胞を、ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号Ｎｏ．００５５５７）の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。並行して、ヒトＴ細胞を、１０日間、Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９１−４４１）からのＭＡＣＳｉＢｅａｄを有するＧ−Ｒｅｘ１００Ｍガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）内のＴ細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ  １５［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４−４１８Ｑ］、５％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０１ｍＭの２−メルカプトエタノール）で培養し、組み換えヒトＩＬ−２タンパク質を補充する。マウスにおける腫瘍成長及びヒトＴ細胞活性化／拡大を調整し、これにより研究の０日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群（Ｎ＝６）に分け、次いで、各々に２．５×１０６の培養したヒトＴ細胞を静脈内注射（ＩＶ）し、ＣＯＢＲＡまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、３日毎に７用量（０、３、６、９、１２、１５、及び１８日目）、次いで腫瘍が２０００ｍｍ３を越える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、０．２ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の抗ＥＧＦＲ×ＣＤ３陽性対照、Ｐｒｏ５１二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）、０．５ｍｐｋの陰性対照、抗ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）×ＣＤ３  ｂｓＡｂ  Ｐｒｏ９８、０．５ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡ対Ｐｒｏ７７及びＰｒｏ５３を含有するＭＭＰ９開裂性リンカーの各々、または０．５ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ半ＣＯＢＲＡ対Ｐｒｏ７４及びＰｒｏ７２を含有する非開裂性（ＮＣＬ）リンカーの各々を投与した。腫瘍体積を３日毎に測定した。
【０２２９】
Ｅ．実施例５：ＥＧＦＲ／ＭＭＰ９  ＣＯＢＲＡ  Ｐｒｏ１４０を用いたインビボ活性。
５×１０６のＬｏＶｏ細胞または５×１０６のＨＴ２９細胞を、ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号Ｎｏ．００５５５７）の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。並行して、ヒトＴ細胞を、１０日間、Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９１−４４１）からのＭＡＣＳｉＢｅａｄを有するＧ−Ｒｅｘ１００Ｍガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）内のＴ細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ  １５［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４−４１８Ｑ］、５％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０１ｍＭの２−メルカプトエタノール）で培養し、組み換えヒトＩＬ−２タンパク質を補充する。マウスにおける腫瘍成長及びヒトＴ細胞活性化／拡大を調整し、これにより研究の０日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群（Ｎ＝６）に分け、次いで、各々に２．５×１０６の培養したヒトＴ細胞を静脈内注射（ＩＶ）し、ＣＯＢＲＡまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、３日毎に７用量（０、３、６、９、１２、１５、及び１８日目）、次いで腫瘍が２０００ｍｍ３を越える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、０．２ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ×ＣＤ３陽性対照、Ｐｒｏ５１二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）、０．５ｍｐｋの陰性対照、抗ニワトリ卵白リゾチーム（ＨＥＬ）×ＣＤ３  ｂｓＡｂ  Ｐｒｏ９８、または０．５ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ  ＣＯＢＲＡ  Ｐｒｏ１４０を含有するＭＭＰ９開裂性リンカーを投与した。腫瘍体積を３日毎に測定した。
【０２３０】
Ｆ．実施例６：ＥＧＦＲ／ＭＭＰ９  ＣＯＢＲＡ  Ｐｒｏ１８６を用いたインビボ活性。
５×１０６のＨＴ２９細胞を、ＮＳＧ（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウス（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、カタログ番号Ｎｏ．００５５５７）の右脇腹に皮下移植し、腫瘍が確立されるまで成長させた。並行して、ヒトＴ細胞を、１０日間、Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９１−４４１）からのＭＡＣＳｉＢｅａｄを有するＧ−Ｒｅｘ１００Ｍガス透過性フラスコ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ、カタログ番号８１１００Ｓ）内のＴ細胞培地（Ｘ−ＶＩＶＯ  １５［Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４−４１８Ｑ］、５％ヒト血清、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、０．０１ｍＭの２−メルカプトエタノール）で培養し、組み換えヒトＩＬ−２タンパク質を補充する。マウスにおける腫瘍成長及びヒトＴ細胞活性化／拡大を調整し、これにより研究の０日目にマウスを腫瘍サイズに基づいて無作為に群（Ｎ＝６）に分け、次いで、各々に２．５×１０６の培養したヒトＴ細胞を静脈内注射（ＩＶ）し、ＣＯＢＲＡまたは対照分子の初回用量を投与した。マウスに、３日毎に７用量（０、３、６、９、１２、１５、及び１８日目）、次いで腫瘍が２０００ｍｍ３を越える体積に到達するまで、または研究は終了するまで投与した。群に、０．１ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の抗ＥＧＦＲ×ＣＤ３陽性対照、Ｐｒｏ５１二重特異性抗体（ｂｓＡｂ）、０．３ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ  ＣＯＢＲＡ  Ｐｒｏ２１４を含有する非開裂性（ＮＣＬ）対照リンカー、０．１もしくは０．３ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ  ＣＯＢＲＡ  Ｐｒｏ１４０を含有するＭＭＰ９開裂性リンカー、または０．１もしくは０．３ｍｐｋの抗ＥＧＦＲ  ＣＯＢＲＡ  Ｐｒｏ１８６を含有するＭＭＰ９開裂性リンカーを投与した。腫瘍体積を３日毎に測定した。
【０２３１】
Ｇ．実施例：抗ＥＧＦＲ配列のヒト化の成功
結果が以下に示される。
2020537496.tif 000003
【０２３２】
これらの結果は、ＥＧＦＲ結合ドメインのヒト化が成功したこと、及び２つの結合部位が分子上に存在するときに標的ＥＧＦＲに対して強力な結合力があることの両方を示す。
【０２３３】
実施例：ＥｐＣＡＭ  ｓｄＡＢＤのヒト化の成功
【０２３４】
結果が以下に示される。
2020537496.tif 000004
【０２３５】
これらの結果は、ＥｐＣＡＭ結合ドメインのヒト化が成功したことの両方を示す。
【図１】
2020537496.tif 000005
【図２】
2020537496.tif 000006
【図３Ａ】
2020537496.tif 000007
【図３Ｂ】
2020537496.tif 000008
【図４】
2020537496.tif 000009
【図５Ａ】
2020537496.tif 000010
【図５Ｂ】
2020537496.tif 000011
【図５Ｃ】
2020537496.tif 000012
【図５Ｄ】
2020537496.tif 000013
【図５Ｅ】
2020537496.tif 000014
【図５Ｆ】
2020537496.tif 000015
【図５Ｇ】
2020537496.tif 000016
【図６Ａ】
2020537496.tif 000017
【図６Ｂ】
2020537496.tif 000018
【図７−１】
2020537496.tif 000019
【図７−２】
2020537496.tif 000020
【図８−１】
2020537496.tif 000021
【図８−２】
2020537496.tif 000022
【図９】
2020537496.tif 000023
【図１０−１】
2020537496.tif 000024
【図１０−２】
2020537496.tif 000025
【図１０−３】
2020537496.tif 000026
【図１１】
2020537496.tif 000027
【図１２−１】
2020537496.tif 000028
【図１２−２】
2020537496.tif 000029
【図１３】
2020537496.tif 000030
【図１４】
2020537496.tif 000031
【図１５】
2020537496.tif 000032
【図１６】
2020537496.tif 000033
【図１７】
2020537496.tif 000034
【図１８】
2020537496.tif 000035
【図１９】
2020537496.tif 000036
【図２０】
2020537496.tif 000037
【図２１】
2020537496.tif 000038
【図２２】
2020537496.tif 000039
【図２３Ａ】
2020537496.tif 000040
【図２３Ｂ】
2020537496.tif 000041
【図２３Ｃ】
2020537496.tif 000042
【図２３Ｄ】
2020537496.tif 000043
【図２３Ｅ】
2020537496.tif 000044
【図２３Ｆ】
2020537496.tif 000045
【図２３Ｇ】
2020537496.tif 000046
【図２４】
2020537496.tif 000047
【図２５】
2020537496.tif 000048
【図２６】
2020537496.tif 000049
【図２７】
2020537496.tif 000050
【図２８】
2020537496.tif 000051
【図２９】
2020537496.tif 000052
【図３０】
2020537496.tif 000053
【図３１】
2020537496.tif 000054
【図３２】
2020537496.tif 000055
【図３３】
2020537496.tif 000056
【図３４】
2020537496.tif 000057
【図３５】
2020537496.tif 000058
【図３６】
2020537496.tif 000059
【図３７】
2020537496.tif 000060
【図３８】
2020537496.tif 000061
【図３９】
2020537496.tif 000062
【図４０Ａ】
2020537496.tif 000063
【図４０Ｂ】
2020537496.tif 000064
【図４０Ｃ】
2020537496.tif 000065
【図４１】
2020537496.tif 000066
【図４２】
2020537496.tif 000067
【図４３】
2020537496.tif 000068
【図４４】
2020537496.tif 000069
【図４５】
2020537496.tif 000070
【図４６】
2020537496.tif 000071
【図４７】
2020537496.tif 000072
【図４８】
2020537496.tif 000073
【図４９】
2020537496.tif 000074
【図５０】
2020537496.tif 000075
【図５１】
2020537496.tif 000076
【図５２】
2020537496.tif 000077
【図５３】
2020537496.tif 000078
【図５４】
2020537496.tif 000079
【図５５】
2020537496.tif 000080
【図５６】
2020537496.tif 000081
【図５７−１】
2020537496.tif 000082
【図５７−２】
2020537496.tif 000083
【図５８】
2020537496.tif 000084
【図５９】
2020537496.tif 000085
【図６０】
2020537496.tif 000086
【図６１Ａ】
2020537496.tif 000087
【図６１Ｂ】
2020537496.tif 000088
【図６２Ａ】
2020537496.tif 000089
【図６２Ｂ】
2020537496.tif 000090
【図６２Ｃ】
2020537496.tif 000091
【図６２Ｄ】
2020537496.tif 000092
【図６２Ｅ】
2020537496.tif 000093
【図６２Ｆ】
2020537496.tif 000094
【図６２Ｇ】
2020537496.tif 000095
【図６２Ｈ】
2020537496.tif 000096
【図６２Ｉ】
2020537496.tif 000097
【図６２Ｊ】
2020537496.tif 000098
【図６２Ｋ】
2020537496.tif 000099
【図６２Ｌ】
2020537496.tif 000100
【図６２Ｍ】
2020537496.tif 000101
【図６２Ｎ】
2020537496.tif 000102
【図６２Ｏ】
2020537496.tif 000103
【図６２Ｐ】
2020537496.tif 000104
【図６２Ｑ】
2020537496.tif 000105
【図６２Ｒ】
2020537496.tif 000106
【図６２Ｓ】
2020537496.tif 000107
【図６２Ｔ】
2020537496.tif 000108
【図６２Ｕ】
2020537496.tif 000109
【配列表】
2020537496000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年5月14日(2020.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
【図１】本明細書において「拘束開裂性構築物」または「ｃｃ構築物」と称される、本発明のプロテアーゼ活性化の「形式１」型を示す。この実施形態では、代表的な構築物は、Ｐｒｏ１４０であり、２つＴＴＡに対してＡＢＤが存在する（図１に示されるように、これらは両方同じであるが、本明細書に記載のように、それらは異なってもよい）。開裂すると、プロドラッグ構築物は、３つの構成成分に分裂し、１つは、ドメインリンカーを介してαＣＤ３の活性ＶＨに連結されたα−ＴＴＡドメインを含有し、第２の構成成分は、ドメインリンカーを介してαＣＤ３の活性ＶＬに連結されたα−ＴＴＡドメインを含有し、「残りの」片は、不活性ＶＨ及びＶＬに連結された半減期延長ドメインを含む。次いで、２つの活性可変ドメインは自由に会合して、機能的抗ＣＤ３結合ドメインを形成する。「形式１」の実施形態において、得られる活性構成成分が三価であり、ＣＤ３に結合する一価及びＴＴＡに結合する二価が存在し、二重特異性結合タンパク質をもたらすが、場合によっては、この三価は、三重特異性であり得、一価がＣＤ３に結合し、一価が第１のＴＴＡに結合し、一価が第２のＴＴＡに結合することに留意されたい。図１はまた、半減期延長ドメイン、多くの実施形態では、本明細書に定義されるようにｓｄＡＢＤとして、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ドメインを示すが、本明細書で考察されるように、これは任意であり、かつ／または他の半減期延長ドメインによって置き換えられ得、加えて、半減期延長ドメインはまた、構築物のＮ末端にあってもよいか、もしくは同様に内部にあってもよい。図１はまた、ＦｖのＶＨ及びＶＬ、ならびに偽ＦｖのｉＶＨ及びｉＶＬを特定の順序で、例えば、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ−リンカー−ＶＬ（及びｉＶＬ−リンカー−ｉＶＨ）で有するが、当業者によって理解されるように、これらは逆でもよい（ＶＬ−リンカー−ＶＨ及びｉＶＨ−リンカー−ｉＶＬ）。あるいは、これらのＦｖのうちの１つは、１つの配向にあってもよく、もう１つは、もう１つの配向にあってもよいが、ここに示される配向のタンパク質の発現は、他の配向よりも驚くほど高かった。
【図２】本明細書において「拘束非開裂性構築物」または「ＣＮＣＬ構築物」と称され、また本明細書において、本明細書で考察されるように「二量化構築物」と称されるときもある、本発明のプロテアーゼ活性化の「形式２」型を示す。これらの構築物は、本明細書で考察されるように異性化しない。開裂すると、２つのプロドラッグ構築物は、４つの構成成分に分裂し、２つは、偽ドメイン（リンカーの長さ及び不活性化突然変異に応じて、自己会合することが可能であってもなくてもよい）に連結された２つの半減期延長ドメイン（この場合、ＨＳＡに対するｓｄＡＢＤ）であり、２つは、４つの抗ＴＴＡドメイン（全て同じであってもよく、または２つが同じであり、他の２つが異なる）を含有する二量体活性部分に自己集合する活性部分である。「形式２」の実施形態において、得られる活性構成成分が六価であり、ＣＤ３に結合する二価及びＴＴＡに結合する四価が存在し、二重特異性結合タンパク質をもたらすが、場合によっては、この六価は、三重特異性であり得、二価がＣＤ３に結合し、二価が第１のＴＴＡに結合し、二価が第２のＴＴＡに結合することに留意されたい。図２はまた、半減期延長ドメイン、多くの実施形態では、本明細書に定義されるようにｓｄＡＢＤとして、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ドメインを示すが、本明細書で考察されるように、これは任意であり、かつ／または他の半減期延長ドメインによって置き換えられ得、加えて、半減期延長ドメインはまた、構築物のＮ末端にあってもよいか、もしくは同様に内部にあってもよい。図２はまた、ＦｖのＶＨ及びＶＬ、ならびに偽ＦｖのｉＶＨ及びｉＶＬを特定の順序で、例えば、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ−リンカー−ＶＬ（及びｉＶＬ−リンカー−ｉＶＨ）で有するが、当業者によって理解されるように、これらは逆でもよい（ＶＬ−リンカー−ＶＨ及びｉＶＨ−リンカー−ｉＶＬ）。あるいは、これらのＦｖのうちの１つは、１つの配向にあってもよく、もう１つは、もう１つの配向にあってもよいが、ここに示される配向のタンパク質の発現は、他の配向よりも驚くほど高かった。
【図３Ａ】これらが本明細書でさらに考察されるようにＭＣＥ治療薬を一緒に構成する２つの異なるポリペプチド鎖であるため、本明細書で概説されるように「半構築物」または「半ＣＯＢＲＡ（商標）」と称されるときもある、「形式３」型の構築物を示す。この実施形態では、構築物は、対で送達され、開裂前の分子内自己集合は、不活性の抗ＣＤ３  Ｆｖドメインをもたらす。開裂すると、非活性可変ドメインが放出され、次いで、２つの活性可変ドメインが分子間で集合して、活性抗ＣＤ３結合ドメインを形成する。２つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、腫瘍細胞表面上で対応する受容体に結合し、開裂がプロテアーゼによって行われる。これは、分子が物理的に定位置に保持され、活性抗ＣＤ３ドメインの集合を好むため、分子間集合を可能にする。形成１及び２に関する上記のように、この実施形態では、可変ドメインのＮ末端からＣ末端への順序は逆であってもよく、または同様に混合されてもよい。さらに、ｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）は、各半構築物のＮ末端またはＣ末端のいずれかにあってもよい。Ｐｒｏ１６は、Ｃ末端にｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）を有し、Ｐｒｏ１７は、Ｎ末端にｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）を有する（Ｐｒｏ１９、配列番号ＸＸがＣ末端にｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）を有することを参照）。図３Ａは、半構築物当たり単一のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡドメインを有する形式３構築物を示し、図３Ｂは、「二重標的化」または「ヘテロ標的化」形式で、半構築物当たり２つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡを有する形式３構築物を示す。図３Ｂが、２つのＴＴＡとしてＦＯＬＲ１及びＥＧＦＲを使用するが、本明細書で概説されるような他の組み合わせもまた使用され得ることに留意されたい。
【図３Ｂ】これらが本明細書でさらに考察されるようにＭＣＥ治療薬を一緒に構成する２つの異なるポリペプチド鎖であるため、本明細書で概説されるように「半構築物」または「半ＣＯＢＲＡ（商標）」と称されるときもある、「形式３」型の構築物を示す。この実施形態では、構築物は、対で送達され、開裂前の分子内自己集合は、不活性の抗ＣＤ３  Ｆｖドメインをもたらす。開裂すると、非活性可変ドメインが放出され、次いで、２つの活性可変ドメインが分子間で集合して、活性抗ＣＤ３結合ドメインを形成する。２つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡは、腫瘍細胞表面上で対応する受容体に結合し、開裂がプロテアーゼによって行われる。これは、分子が物理的に定位置に保持され、活性抗ＣＤ３ドメインの集合を好むため、分子間集合を可能にする。形成１及び２に関する上記のように、この実施形態では、可変ドメインのＮ末端からＣ末端への順序は逆であってもよく、または同様に混合されてもよい。さらに、ｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）は、各半構築物のＮ末端またはＣ末端のいずれかにあってもよい。Ｐｒｏ１６は、Ｃ末端にｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）を有し、Ｐｒｏ１７は、Ｎ末端にｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）を有する（Ｐｒｏ１９、配列番号ＸＸがＣ末端にｓｄＡＢＤ（ＨＳＡ）を有することを参照）。図３Ａは、半構築物当たり単一のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡドメインを有する形式３構築物を示し、図３Ｂは、「二重標的化」または「ヘテロ標的化」形式で、半構築物当たり２つのｓｄＡＢＤ−ＴＴＡを有する形式３構築物を示す。図３Ｂが、２つのＴＴＡとしてＦＯＬＲ１及びＥＧＦＲを使用するが、本明細書で概説されるような他の組み合わせもまた使用され得ることに留意されたい。
【図４】「形式２」構築物と同様であるが、単一のｓｄＡＢＤ−ＴＴＡのみを有する、「形式４」型の構築物を示す。図は、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡからＥＧＦＲを示すが、当業者によって理解されるように、他のＴＴＡも使用され得る。開裂すると、プロドラッグ構築物は、２つの構成成分、偽Ｆｖに連結された半減期延長ドメイン（この場合、ＨＳＡに対するｓｄＡＢＤ）、及び異なる開裂分子からの第２の活性部分の存在下で、２つの抗ＴＴＡドメインを含有する二量体活性部分に自己集合する活性部分に分裂する。「形式４」の実施形態において、得られる活性構成成分が四価であり、ＣＤ３に結合する二価及びＴＴＡに結合する二価が存在し、二重特異性結合タンパク質をもたらすことに留意されたい。図４はまた、半減期延長ドメイン、多くの実施形態では、本明細書に定義されるようにｓｄＡＢＤ（１／２）として、抗ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）ドメインを示すが、本明細書で考察されるように、これは任意であり、かつ／または他の半減期延長ドメインによって置き換えられ得、加えて、半減期延長ドメインはまた、構築物のＮ末端にあってもよいか、もしくは同様に内部にあってもよい。図４はまた、ＦｖのＶＨ及びＶＬ、ならびに偽ＦｖのｉＶＨ及びｉＶＬを特定の順序で、例えば、Ｎ末端からＣ末端にＶＨ−リンカー−ＶＬ（及びｉＶＬ−リンカー−ｉＶＨ）で有するが、当業者によって理解されるように、これらは逆でもよい（ＶＬ−リンカー−ＶＨ及びｉＶＨ−リンカー−ｉＶＬ）。あるいは、これらのＦｖのうちの１つは、１つの配向にあってもよく、もう１つは、もう１つの配向にあってもよいが、ここに示される配向のタンパク質の発現は、他の配向よりも驚くほど高かった。
【図５Ａ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図５Ｂ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図５Ｃ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図５Ｄ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図５Ｅ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図５Ｆ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図５Ｇ】本発明の多くの配列を示す。抗原結合ドメインに関して、ＣＤＲは下線が引かれている。本明細書でさらに十分に概説されるように、これらのドメインは、「形式１」、「形式２」、「形式３」、及び「形式４」配向を含む、本発明における広い構成で集合し得る。注目すべきは、配列番号９０が配列番号７５及び７６よりもわずかに速くＭＭＰ９によって開裂され、配列番号９１が配列番号７５及び７６よりもゆっくり開裂されることである。
【図６Ａ】多くの好適なプロテアーゼ開裂部位を示す。当業者によって理解されるように、これらの開裂部位は、開裂性リンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、例えば、より柔軟な開裂性リンカーが必要とされる場合、これらの開裂部位のＮ末端及びＣ末端のいずれかまたは両方にある追加のアミノ酸（一般にグリシン及びセリン）が存在し得る。
【図６Ｂ】多くの好適なプロテアーゼ開裂部位を示す。当業者によって理解されるように、これらの開裂部位は、開裂性リンカーとして使用され得る。いくつかの実施形態では、例えば、より柔軟な開裂性リンカーが必要とされる場合、これらの開裂部位のＮ末端及びＣ末端のいずれかまたは両方にある追加のアミノ酸（一般にグリシン及びセリン）が存在し得る。
【図７Ａ】「形式３」または「半ＣＯＢＲＡ（商標）」構築物と関連するいくつかのデータを示す。これは、形式３構築物が、プロテアーゼ（この場合、ＥＫプロテアーゼであるが、本明細書で概説され、図５及び図６に示されるプロテアーゼ開裂部位のうちのいずれかが使用され得る）による開裂後にＣＤ３に協調的に結合し、サンドイッチＦＡＣＳ分析によって示されるように、ＣＤ３結合部位を作り出すことを示す。
【図７Ｂ】「形式３」または「半ＣＯＢＲＡ（商標）」構築物と関連するいくつかのデータを示す。これは、形式３構築物が、プロテアーゼ（この場合、ＥＫプロテアーゼであるが、本明細書で概説され、図５及び図６に示されるプロテアーゼ開裂部位のうちのいずれかが使用され得る）による開裂後にＣＤ３に協調的に結合し、サンドイッチＦＡＣＳ分析によって示されるように、ＣＤ３結合部位を作り出すことを示す。
【図７Ｃ】「形式３」または「半ＣＯＢＲＡ（商標）」構築物と関連するいくつかのデータを示す。これは、形式３構築物が、プロテアーゼ（この場合、ＥＫプロテアーゼであるが、本明細書で概説され、図５及び図６に示されるプロテアーゼ開裂部位のうちのいずれかが使用され得る）による開裂後にＣＤ３に協調的に結合し、サンドイッチＦＡＣＳ分析によって示されるように、ＣＤ３結合部位を作り出すことを示す。
【図７Ｄ】「形式３」または「半ＣＯＢＲＡ（商標）」構築物と関連するいくつかのデータを示す。これは、形式３構築物が、プロテアーゼ（この場合、ＥＫプロテアーゼであるが、本明細書で概説され、図５及び図６に示されるプロテアーゼ開裂部位のうちのいずれかが使用され得る）による開裂後にＣＤ３に協調的に結合し、サンドイッチＦＡＣＳ分析によって示されるように、ＣＤ３結合部位を作り出すことを示す。
【図８Ａ】プロテアーゼ開裂が、相補的半ＣＯＢＲＡ（商標）対とＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞死滅を協調的に活性化することを示す。図８Ａ及び図８Ｂは、単離しているが、異なる濃度のプロテアーゼで開裂された構築物が、標的細胞の生存率に影響を与えないことを示す。しかしながら、図８Ｃは、組み合わせて、プロテアーゼの存在下で、標的細胞の生存率が有意に減少していることを示す。図８Ｄは、一般的機構を示す。
【図８Ｂ】プロテアーゼ開裂が、相補的半ＣＯＢＲＡ（商標）対とＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞死滅を協調的に活性化することを示す。図８Ａ及び図８Ｂは、単離しているが、異なる濃度のプロテアーゼで開裂された構築物が、標的細胞の生存率に影響を与えないことを示す。しかしながら、図８Ｃは、組み合わせて、プロテアーゼの存在下で、標的細胞の生存率が有意に減少していることを示す。図８Ｄは、一般的機構を示す。
【図８Ｃ】プロテアーゼ開裂が、相補的半ＣＯＢＲＡ（商標）対とＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞死滅を協調的に活性化することを示す。図８Ａ及び図８Ｂは、単離しているが、異なる濃度のプロテアーゼで開裂された構築物が、標的細胞の生存率に影響を与えないことを示す。しかしながら、図８Ｃは、組み合わせて、プロテアーゼの存在下で、標的細胞の生存率が有意に減少していることを示す。図８Ｄは、一般的機構を示す。
【図８Ｄ】プロテアーゼ開裂が、相補的半ＣＯＢＲＡ（商標）対とＥＧＦＲ＋標的細胞のＴ細胞死滅を協調的に活性化することを示す。図８Ａ及び図８Ｂは、単離しているが、異なる濃度のプロテアーゼで開裂された構築物が、標的細胞の生存率に影響を与えないことを示す。しかしながら、図８Ｃは、組み合わせて、プロテアーゼの存在下で、標的細胞の生存率が有意に減少していることを示す。図８Ｄは、一般的機構を示す。
【図９】形式１構築物の有効性を試験するためのアッセイで使用するためのいくつかの非標的対照を示す。
【図１０Ａ】活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方の「アーム」、例えば、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡドメイン（それらのうちの１つは、２つの構築物の各々の上にある）の標的結合に依存していることを示す。ＴＤＣＣアッセイを、実施例に記載されるように行った。
【図１０Ｂ】活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方の「アーム」、例えば、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡドメイン（それらのうちの１つは、２つの構築物の各々の上にある）の標的結合に依存していることを示す。ＴＤＣＣアッセイを、実施例に記載されるように行った。
【図１０Ｃ】活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方の「アーム」、例えば、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡドメイン（それらのうちの１つは、２つの構築物の各々の上にある）の標的結合に依存していることを示す。ＴＤＣＣアッセイを、実施例に記載されるように行った。
【図１０Ｄ】活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方の「アーム」、例えば、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡドメイン（それらのうちの１つは、２つの構築物の各々の上にある）の標的結合に依存していることを示す。ＴＤＣＣアッセイを、実施例に記載されるように行った。
【図１０Ｅ】活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方の「アーム」、例えば、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡドメイン（それらのうちの１つは、２つの構築物の各々の上にある）の標的結合に依存していることを示す。ＴＤＣＣアッセイを、実施例に記載されるように行った。
【図１０Ｆ】活性ＣＤ３結合ドメインの生成が、両方の「アーム」、例えば、ｓｄＡＢＤ−ＴＴＡドメイン（それらのうちの１つは、２つの構築物の各々の上にある）の標的結合に依存していることを示す。ＴＤＣＣアッセイを、実施例に記載されるように行った。
【図１１】好適な半ＣＯＢＲＡ（商標）対の概略図を示す。「Ｍｅｐ」は、メプリンプロテアーゼ開裂部位を表し、「Ｈｉｓ−６」は、本明細書でより十分に考察されるタグであり、ＳＴ１４は、マトリプターゼプロテアーゼ開裂部位であり、「Ｔｈｂ」は、トロンビンプロテアーゼ開裂部位である。
【図１２Ａ】図１１の構築物に関連したＴＤＣＣデータを示す。図１２Ａは、予め開裂された半ＣＯＢＲＡ対の付加が、ＯｖＣＡＲ８細胞に対する有効性をもたらすことを示し、図１２Ｂは、予め開裂された半ＣＯＢＲＡ対の付加が、ＨＣＴ１１６細胞に対する有効性をもたらすことを示し、図１２Ｃは、予め開裂された半ＣＯＢＲＡ対の付加が、ＬｏＶｏ細胞に対する有効性をもたらすことを示し、それらの全てが、がん細胞株である。
【図１２Ｂ】図１１の構築物に関連したＴＤＣＣデータを示す。図１２Ａは、予め開裂された半ＣＯＢＲＡ対の付加が、ＯｖＣＡＲ８細胞に対する有効性をもたらすことを示し、図１２Ｂは、予め開裂された半ＣＯＢＲＡ対の付加が、ＨＣＴ１１６細胞に対する有効性をもたらすことを示し、図１２Ｃは、予め開裂された半ＣＯＢＲＡ対の付加が、ＬｏＶｏ細胞に対する有効性をもたらすことを示し、それらの全てが、がん細胞株である。
【図１２Ｃ】図１１の構築物に関連したＴＤＣＣデータを示す。図１２Ａは、予め開裂された半ＣＯＢＲＡ対の付加が、ＯｖＣＡＲ８細胞に対する有効性をもたらすことを示し、図１２Ｂは、予め開裂された半ＣＯＢＲＡ対の付加が、ＨＣＴ１１６細胞に対する有効性をもたらすことを示し、図１２Ｃは、予め開裂された半ＣＯＢＲＡ対の付加が、ＬｏＶｏ細胞に対する有効性をもたらすことを示し、それらの全てが、がん細胞株である。
【図１３Ａ】ＭＭＰ９リンカーが、インビボで安定していることを示す。ＮＳＧマウスに、０．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで尾静脈を介して、Ｐｒｏ４０（ＭＭＰ９開裂可能）、Ｐｒｏ７４（開裂不可能）のいずれかの単回静脈内ボーラス用量を投与した。各化合物の投与溶液を、２５ｍＭのクエン酸、７５ｍＭのＬ−アルギニン、７５ｍＭのＮａＣｌ、及び４％スクロース、ｐＨ７．０のビヒクル中で調製した。２つの血液試料を各動物から予め選択された時間に採取し、１つは、研究の開始の頃に眼窩出血または顎下腺出血によって採取し、もう１つは、最終時点で心臓穿刺によって採取した。採血の時点は、０．０８３、１、６、２４、７２、及び１６８時間であった。血漿を、Ｋ２  ＥＤＴＡ管を使用して各個々の血液試料から調製した。濃度を、抗ＨＳＡ  ｓｄＡＢＤに特異的なＭＡｂを用いたＭＳＤアッセイを使用して決定し、ＥＧＦＲ細胞外ドメインで検出した。
【図１３Ｂ】ＭＭＰ９リンカーが、インビボで安定していることを示す。ＮＳＧマウスに、０．５ｍｇ／ｋｇの用量レベルで尾静脈を介して、Ｐｒｏ４０（ＭＭＰ９開裂可能）、Ｐｒｏ７４（開裂不可能）のいずれかの単回静脈内ボーラス用量を投与した。各化合物の投与溶液を、２５ｍＭのクエン酸、７５ｍＭのＬ−アルギニン、７５ｍＭのＮａＣｌ、及び４％スクロース、ｐＨ７．０のビヒクル中で調製した。２つの血液試料を各動物から予め選択された時間に採取し、１つは、研究の開始の頃に眼窩出血または顎下腺出血によって採取し、もう１つは、最終時点で心臓穿刺によって採取した。採血の時点は、０．０８３、１、６、２４、７２、及び１６８時間であった。血漿を、Ｋ２  ＥＤＴＡ管を使用して各個々の血液試料から調製した。濃度を、抗ＨＳＡ  ｓｄＡＢＤに特異的なＭＡｂを用いたＭＳＤアッセイを使用して決定し、ＥＧＦＲ細胞外ドメインで検出した。
【図１４】図１４に示される実験で使用される形式３Ａ半ＣＯＢＲＡ（商標）構築物の概略図を示す。Ｐｒｏ５１は、それが活性抗ＣＤ３  Ｆｖを形成することから「常にオン」であるため、陽性対照である。Ｐｒｏ９８は、そのｓｄＡＢＤが、ニワトリ卵白リゾチームに向けられ、それが腫瘍によって発現しないため、陰性対照である。Ｐｒｏ７７及びＰｒｏ５３は、ＥＧＦＲに対するｓｄＡＢＤ及びＭＭＰ９開裂部位を使用した、プロドラッグ形式３Ａ対である。Ｐｒｏ７４及びＰｒｏ７２は、それらが開裂部位を有しないため、陰性対照の形式３Ａ対である。
【図１５】形式１構築物が、実施例のプロトコルを使用してマウスに移植された２つの異なる腫瘍細胞株を使用して、インビボで腫瘍を退行させるよう作用することを示す。半ＣＯＢＲＡ構築物（Ｐｒｏ７７及びＰｒｏ５３）を用いた抗腫瘍活性は、活性抗ＣＤ３  Ｆｖと共に抗ＥＧＦＲ  ｓｄＡＢＤ及びＭＭＰ９開裂性リンカーの両方を含むことに依存している。
【図１６】参照により本明細書に組み込まれるＵＳ  ２０１８／０１３４７８９に概して記載されるように、２つの偽Ｆｖドメインを有し、それらの間に開裂可能な部位がある、次世代形式の完全長構築物の概略図を示す。しかしながら、以下の図に示されるように、この第１世代の完全長構築物は、それが異性化して活性構築物及び不活性構築物の両方を形成し得るため、非常に良好な条件付けを示さない。
【図１７】形式３Ａ構築物対が実際に、Ｐｒｏ１００の第１世代の完全長構築物よりも良好な条件付けを示すことを示す。
【図１８】図１９で試験した追加の第１世代の完全長構築物を示す。
【図１９】第１世代の構築物が、未開裂形式、例えば、不十分な条件付けにおいてさえ、高い活性を示すことを示す。
【図２０】第１世代の完全長構築物が、分析ＳＥＣ上で２つのモノマーピークを示すことを示す。
【図２１】非開裂活性の理由の概略図を示し、これは、完全長の第１世代の構築物が異性化して２つの配座を形成することであり、１つは、形成された活性抗ＣＤ３  Ｆｖ（「二価ｓｃＦｖ」）がないため不活性であり、もう１つは、プロテアーゼの非存在下で、「単鎖ダイアボディ」型の配置である。ＰＥＤＳ  ２３（８）：６６７−６７７（２０１０）を参照されたい。
【図２２】第１世代の単鎖構築物を用いた、２日間３７Ｃで実行したＴＤＣＣアッセイの結果を示す。結果は、未開裂構築物が強力な死滅を示すことを示す。これらの結果は、形式１構築物の生成をもたらす。
【図２３Ａ】本発明で使用される形式１構築物を示す。当業者によって理解されるように、かつ本明細書に記載されるように、これらは、ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ標的化部分を有して図示されるが、他のＴＴＡに対するｓｄＡＢＤも使用され得る。
【図２３Ｂ】本発明で使用される形式１構築物を示す。当業者によって理解されるように、かつ本明細書に記載されるように、これらは、ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ標的化部分を有して図示されるが、他のＴＴＡに対するｓｄＡＢＤも使用され得る。
【図２３Ｃ】本発明で使用される形式１構築物を示す。当業者によって理解されるように、かつ本明細書に記載されるように、これらは、ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ標的化部分を有して図示されるが、他のＴＴＡに対するｓｄＡＢＤも使用され得る。
【図２３Ｄ】本発明で使用される形式１構築物を示す。当業者によって理解されるように、かつ本明細書に記載されるように、これらは、ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ標的化部分を有して図示されるが、他のＴＴＡに対するｓｄＡＢＤも使用され得る。
【図２３Ｅ】本発明で使用される形式１構築物を示す。当業者によって理解されるように、かつ本明細書に記載されるように、これらは、ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ標的化部分を有して図示されるが、他のＴＴＡに対するｓｄＡＢＤも使用され得る。
【図２３Ｆ】本発明で使用される形式１構築物を示す。当業者によって理解されるように、かつ本明細書に記載されるように、これらは、ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ標的化部分を有して図示されるが、他のＴＴＡに対するｓｄＡＢＤも使用され得る。
【図２３Ｇ】本発明で使用される形式１構築物を示す。当業者によって理解されるように、かつ本明細書に記載されるように、これらは、ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ標的化部分を有して図示されるが、他のＴＴＡに対するｓｄＡＢＤも使用され得る。
【図２４】形式１構築物（この場合、Ｐｒｏ１４０）が、３７Ｃで安定している単一異性体を形成することを示す。
【図２５】形式１構築物が、Ｏｃｔｅｔアッセイによって測定されるように、未開裂形式でヒトＣＤ３に対して非常に低い結合を有することを示す。一番上の線は、Ｐｒｏ１２０であり、中央の線は、Ｐｒｏ５１（陽性対照）であり、一番下の線は、３日間４Ｃまたは３７Ｃのいずれかで保持されたＰｒｏ１４０である。
【図２６】形式１構築物が、未開裂形態で非常に低いＴＤＣＣ活性を有することを同様に示す。
【図２７】標的化部分としてｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ、及びＭＭＰ９開裂部位を使用したインビボ試験で使用される、特定の形式１構築物Ｐｒｏ１４０を示す。
【図２８Ａ】形式１構築物を使用した腫瘍退行を示す。
【図２８Ｂ】形式１構築物を使用した腫瘍退行を示す。
【図２９】拘束Ｆｖの開裂部位により、いくつかの異なるフラグメント、部分的開裂フラグメント及び完全開裂フラグメントが生成され得ることを示す。驚くべきことに、部分的開裂形式は、完全開裂形式よりも活性であり、形式２の生成をもたらす。
【図３０】多くの形式２の概略図を示し、これらの全ては、ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ標的化ドメインを使用するが、本明細書で概説されるように、かつ配列に列挙されるように、他のＴＴＡに対するｓｄＡＢＤが使用され得る。Ｐｒｏ５１及びＰｒｏ２０１は、陽性対照（活性「半」配置において）であり、Ｐｒｏ２１４は、開裂部位がないため、完全長陰性対照である。
【図３１】メプリン開裂部位を使用する形式２構築物Ｐｒｏ１８７のＴＤＣＣ活性を示す。ＴＤＣＣアッセイにおけるＰｒｏ１８７は、未開裂で付加されたときよりも予め開裂されて付加されたときに１２００倍活性であった。予め開裂されたＰｒｏ１８７は、陽性対照Ｐｒｏ５１とＰｒｏ２０１との間に位置した活性を実証した。未開裂Ｐｒｏ１８７は、プロテアーゼ開裂性リンカーを含有しないＰｒｏ２１４と同様の活性を実証した。
【図３２】ＭＭＰ９開裂部位を使用する形式２構築物Ｐｒｏ１８６のＴＤＣＣ活性を示す。ＴＤＣＣアッセイにおけるＰｒｏ１８６は、未開裂で付加されたときよりも予め開裂されて付加されたときに１８倍活性であった。予め開裂されたＰｒｏ１８６は、陽性対照Ｐｒｏ５１とＰｒｏ２０１との間に位置した活性を実証した。未開裂Ｐｒｏ１８６は、プロテアーゼ開裂性リンカーを含有しないＰｒｏ２１４よりも高い活性を実証した。
【図３３】Ｐｒｏ１８６構築物が、異なるレベルのＥＧＦＲ受容体を有する細胞に結合し、ＣＨＯ細胞が、細胞表面上にＥＧＦＲを発現させないことを示す。Ｐｒｏ１８６は、同様のＣＯＢＲＡ濃度で異なるレベルのＥＧＦＲを発現させる細胞を飽和状態にする。
【図３４】図３５のインビボ研究で使用される形式２構築物の概略図を示し、これらの全ては、ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ標的化ドメインを使用する。
【図３５】形式２構築物Ｐｒｏ１８６が、両方の濃度で高度に有効性であり、より低い濃度で形式１構築物Ｐｒｏ１４０よりも良好であることを示す。
【図３６】Ｐｒｏ１８６に基づくが、異なるプロテアーゼ開裂部位を有する、多くの形式２構築物を示す。これらの構築物の全てが両方の標的化ドメインに対してｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲを使用するが、異なるＴＴＡに対して他のｓｄＡＢＤが使用され得、同じであっても異なっていてもよい。つまり、ホモ標的化（同じＴＴＡに対して両方の標的化ｓｄＡＢＤ）またはヘテロ標的化（第１のＴＴＡに対して１つのｓｄＡＢＤ及び異なるＴＴＡに対してもう１つのｓｄＡＢＤ）の両方が行われ得る。
【図３７】Ｆｖドメインによってリンカー長が異なる、異なる形式２構築物の概略図を示す。これらは、ＭＭＰ９開裂部位を使用して示されるが、本明細書で概説されるように、他が使用され得る。同様に、これらの構築物の全てが両方の標的化ドメインに対してｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲを使用するが、異なるＴＴＡに対して他のｓｄＡＢＤが使用され得、同じであっても異なっていてもよい。
【図３８】偽Ｆｖのリンカー長が異なり得ること、例えば、活性Ｆｖ間の短いリンカー（「短い活性」）及び偽Ｆｖ間のより長いリンカー（「長い不活性」）を有する形式２構築物が、「短い不活性」を伴う「短い活性」と同様の活性を示すことを示す。したがって、ＣＯＢＲＡ構築物の条件付けは、拘束されている活性ｓｃＦｖリンカー及び不活性ｓｃＦｖリンカーの両方に依存せず、それらのうちの１つが拘束されている限り、単鎖ダイアボディフォールディングは、二価ｓｃＦｖフォールディングよりも有利であるように思われる。
【図３９】活性Ｆｖのリンカー長が異なり得ること、例えば、「長い活性」及び「短い不活性」を有する形式２構築物が、「短い活性」及び「短い不活性」構築物と同様に挙動することを示す。したがって、ＣＯＢＲＡ構築物の条件付けは、拘束されている活性ｓｃＦｖリンカー及び不活性ｓｃＦｖリンカーの両方に依存せず、それらのうちの１つが拘束されている限り、単鎖ダイアボディフォールディングは、二価ｓｃＦｖフォールディングよりも有利であるように思われる。
【図４０Ａ】多くの異なる構築物の概略図を示す。Ｐｒｏ１８８は、偽Ｆｖにおける長いリンカー（１６ｍｅｒ）を除いてＰｒｏ１４０と同様である、形式１構築物である。Ｐｒｏ１８９及びＰｒｏ１９０（形式２構築物）は、偽Ｆｖにおける長いリンカー（１６ｍｅｒ）を除いてＰｒｏ１８６及びＰｒｏ１８７と同様である。Ｐｒｏ１９１及びＰｒｏ１９２（同様に形式２構築物）は、それらがｓｄＡＢＤ（１／２）上流に追加の開裂部位を有することを除いて、Ｐｒｏ１８９及びＰｒｏ１９０と同様である。Ｐｒｏ１９３（形式４）は、単一のＥＧＦＲ標的化ドメイン、逆の順序になるように再配置されたｉＶＨ及びｉＶＬ、ならびにｓｄＡＢＤ（１／２）の上流の追加の開裂部位を有する。Ｐｒｏ１９５は、標的化ドメインが同じＴＴＡ、ＥＧＦＲに結合するが、異なるエピトープに結合する、Ｐｒｏ１８６と同様の形式２構築物である。Ｐｒｏ１９６、Ｐｒｏ１９７、及びＰｒｏ１９８は、再配置された可変ドメインを有する形式２構築物である。
【図４０Ｂ】多くの異なる構築物の概略図を示す。Ｐｒｏ１８８は、偽Ｆｖにおける長いリンカー（１６ｍｅｒ）を除いてＰｒｏ１４０と同様である、形式１構築物である。Ｐｒｏ１８９及びＰｒｏ１９０（形式２構築物）は、偽Ｆｖにおける長いリンカー（１６ｍｅｒ）を除いてＰｒｏ１８６及びＰｒｏ１８７と同様である。Ｐｒｏ１９１及びＰｒｏ１９２（同様に形式２構築物）は、それらがｓｄＡＢＤ（１／２）上流に追加の開裂部位を有することを除いて、Ｐｒｏ１８９及びＰｒｏ１９０と同様である。Ｐｒｏ１９３（形式４）は、単一のＥＧＦＲ標的化ドメイン、逆の順序になるように再配置されたｉＶＨ及びｉＶＬ、ならびにｓｄＡＢＤ（１／２）の上流の追加の開裂部位を有する。Ｐｒｏ１９５は、標的化ドメインが同じＴＴＡ、ＥＧＦＲに結合するが、異なるエピトープに結合する、Ｐｒｏ１８６と同様の形式２構築物である。Ｐｒｏ１９６、Ｐｒｏ１９７、及びＰｒｏ１９８は、再配置された可変ドメインを有する形式２構築物である。
【図４０Ｃ】多くの異なる構築物の概略図を示す。Ｐｒｏ１８８は、偽Ｆｖにおける長いリンカー（１６ｍｅｒ）を除いてＰｒｏ１４０と同様である、形式１構築物である。Ｐｒｏ１８９及びＰｒｏ１９０（形式２構築物）は、偽Ｆｖにおける長いリンカー（１６ｍｅｒ）を除いてＰｒｏ１８６及びＰｒｏ１８７と同様である。Ｐｒｏ１９１及びＰｒｏ１９２（同様に形式２構築物）は、それらがｓｄＡＢＤ（１／２）上流に追加の開裂部位を有することを除いて、Ｐｒｏ１８９及びＰｒｏ１９０と同様である。Ｐｒｏ１９３（形式４）は、単一のＥＧＦＲ標的化ドメイン、逆の順序になるように再配置されたｉＶＨ及びｉＶＬ、ならびにｓｄＡＢＤ（１／２）の上流の追加の開裂部位を有する。Ｐｒｏ１９５は、標的化ドメインが同じＴＴＡ、ＥＧＦＲに結合するが、異なるエピトープに結合する、Ｐｒｏ１８６と同様の形式２構築物である。Ｐｒｏ１９６、Ｐｒｏ１９７、及びＰｒｏ１９８は、再配置された可変ドメインを有する形式２構築物である。
【図４１】ヒトＦＯＬＲ１に向けられた異なるｓｄＡＢＤクローンが、異なる死滅を示すという事実を示す。ヒトＦＯＬＲ１に結合するＰｒｏ２２型構築物（ＮＣＬの代わりにＦＬＡＧ配列を有するＰｒｏ５１）を、多くの細胞株ファミリーに対するＰｒｏ２２−ＥＧＦＲ構築物と比較した。
【図４２】ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ２（２つの分子が分子間で会合して、ＣＤ３に対して２つの活性Ｆｖを形成する）を使用したＰｒｏ２０１陽性対照、及び２つの形式２試験物品、ｈ７７．２  ｓｄＡＢＤを使用したＰｒｏ３１１及びｈ５９．３  ｓｄＡＢＤを使用したＰｒｏ３１２、ならびに２つの陰性対照、ｈ７７．２  ｓｄＡＢＤを使用したＰｒｏ２９９及びｈ５９．３  ｓｄＡＢＤを使用したＰｒｏ３０３の使用を含む、４つのｓｄＡＢＤ−ＦＯＬＲ１構築物の概略図を示す。
【図４３】インビボ設計におけるＦＯＬＲ／ＭＭＰ９の形式２構築物の概略図を示す。
【図４４】インビボでのＰｒｏ３１２構築物の有効性を示し、ＭＭＰ９開裂性リンカーが抗腫瘍活性に必要であることを実証する。
【図４５】Ｐｒｏ２４４、陽性対照（ｓｄＡＢＤ−Ｂ７Ｈ３（ｈＦ７）を使用（２つの分子が分子間で会合して、ＣＤ３に対して２つの活性Ｆｖを形成する）、ならびに２つの形式２試験物品、Ｐｒｏ２２５の形式２構築物、及びＰｒｏ２９５の開裂部位を欠いている陰性対照を含む、ヒトに対するｓｄＡＢＤを使用したいくつかの形式（ｓｄＡＢＤ−Ｂ７Ｈ３）の概略図を示す。
【図４６】Ｐｒｏ２２５が対照のＰｒｏ２９５と比較して大きい条件付けを有することを示す。
【図４７】メプリンリンカーを使用する形式２構築物、Ｐｒｏ３７３が、Ｐｒｏ２９５と比較して大きい条件付けを示す。
【図４８】ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲを使用したＰｒｏ５１の陽性対照、ｓｄＡＢＤ−ｈＦ１２  Ｂ７Ｈ３を使用したＰｒｏ２４４の陽性対照、試験構築物のＰｒｏ２２６、及び開裂部位なしの陰性対照Ｐｒｏ２９６を示す、多くのｓｄＡＢＤ−Ｂ７Ｈ３（ｈＦ１２配列を使用）構築物を示す。
【図４９】ＴＤＣＣアッセイにおいてＰｒｏ２２６構築物の良好な条件付けを示す。
【図５０】ヒトＥｐＣＡＭへのｓｄＡＢＤのヒト化を示す。
【図５１】多くの形式の概略図を示し、Ｐｒｏ２２ｈＶＩＢ１３及びＰｒｏ２０５は、陽性対照であり、Ｐｒｏ１９９は、形式２構築物であり、Ｐｒｏ１７５は、陰性対照である。
【図５２】良好な条件付けを示すｓｄＡＢＤ−ＥｐＣＡＭ構築物のＴＤＣＣ活性を示す。
【図５３Ａ】ＨＴ２９及びＬｏＶｏ細胞モデルにおいて良好な条件付けを示すｓｄＡＢＤ−ＥｐＣＡＭ  Ｐｒｏ１９９構築物のＴＤＣＣ活性を示す。
【図５３Ｂ】ＨＴ２９及びＬｏＶｏ細胞モデルにおいて良好な条件付けを示すｓｄＡＢＤ−ＥｐＣＡＭ  Ｐｒｏ１９９構築物のＴＤＣＣ活性を示す。
【図５４Ａ】ＨＴ２９及びＬｏＶｏ細胞モデルにおいて良好な条件付けを示すｓｄＡＢＤ−ＥｐＣＡＭ  Ｐｒｏ２００構築物のＴＤＣＣ活性を示す。
【図５４Ｂ】ＨＴ２９及びＬｏＶｏ細胞モデルにおいて良好な条件付けを示すｓｄＡＢＤ−ＥｐＣＡＭ  Ｐｒｏ２００構築物のＴＤＣＣ活性を示す。
【図５５】二重ＥｐＣＡＭ  ｓｄＡＢＤを有するＰｒｏ１９９と比較して、１つがＥＧＦＲ（ｓｄＡＢＤ−ＥＧＦＲ）に対し、もう１つがＥｐＣＡＭ（ｓｄＡＢＤ−ＥｐＣＡＭ）に対する、２つの異なるｓｄＡＢＤ−ＴＴＡを使用するＰｒｏ２５５の概略図を示す。これらは、本明細書において「ヘテロ標的化」構築物、この場合、形式２構築物と称されるときもある。
【図５６】ＭＭＰ９開裂部位を有するＰｒｏ２５５二重標的化分子が、良好な条件付けを示すことを示す。
【図５７Ａ】３つの異なる細胞型に対する実験の結果を示す。最初に、ＲａｊｉトランスフェクタントをＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、及びＥｐＣＡＭ＋ＥＧＦＲの同様の発現レベルで作り出した（データは図示せず）。次いで、ＥｐＣＡＭ及びＥＧＦＲの両方を標的とするＰｒｏ２５５を、各細胞型を使用したＴＤＣＣアッセイで試験した。図５７Ａは、いずれの受容体も発現させない親Ｒａｊｉ株を示す
【図５７Ｂ】３つの異なる細胞型に対する実験の結果を示す。最初に、ＲａｊｉトランスフェクタントをＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、及びＥｐＣＡＭ＋ＥＧＦＲの同様の発現レベルで作り出した（データは図示せず）。次いで、ＥｐＣＡＭ及びＥＧＦＲの両方を標的とするＰｒｏ２５５を、各細胞型を使用したＴＤＣＣアッセイで試験した。図５７Ｂは、ＥｐＣＡＭ株に対する条件付けを示す。
【図５７Ｃ】３つの異なる細胞型に対する実験の結果を示す。最初に、ＲａｊｉトランスフェクタントをＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、及びＥｐＣＡＭ＋ＥＧＦＲの同様の発現レベルで作り出した（データは図示せず）。次いで、ＥｐＣＡＭ及びＥＧＦＲの両方を標的とするＰｒｏ２５５を、各細胞型を使用したＴＤＣＣアッセイで試験した。図５７Ｃは、ＥＧＲＦ株に対する条件付けを示す。
【図５７Ｄ】３つの異なる細胞型に対する実験の結果を示す。最初に、ＲａｊｉトランスフェクタントをＥｐＣＡＭ、ＥＧＦＲ、及びＥｐＣＡＭ＋ＥＧＦＲの同様の発現レベルで作り出した（データは図示せず）。次いで、ＥｐＣＡＭ及びＥＧＦＲの両方を標的とするＰｒｏ２５５を、各細胞型を使用したＴＤＣＣアッセイで試験した。図５７Ｄは、ＥｐＣＡＭ／ＥＧＦＲ株に対する条件付けを示す。
【図５８】形式４構築物のＰｒｏ２５８の概略図を示す。
【図５９Ａ】Ｐｒｏ２５８がＦＢＳ及びヒト血清の両方において条件付きであることを示す。ＭＭＰ９リンカーの条件付けは、培養物中のＭＭＰ９活性により過小評価される。興味深いことに、Ｐｒｏ５１  ＴＤＣＣ活性がＨＳＡによって阻害される一方で、Ｐｒｏ２５８  ＴＤＣＣ活性は、ＨＳＡの存在下でＰｒｏ５１と同様である。最後に、Ｐｒｏ２５８の条件付けは、６ＸによってＨＳＡの存在下でやや増強される。
【図５９Ｂ】Ｐｒｏ２５８がＦＢＳ及びヒト血清の両方において条件付きであることを示す。ＭＭＰ９リンカーの条件付けは、培養物中のＭＭＰ９活性により過小評価される。興味深いことに、Ｐｒｏ５１  ＴＤＣＣ活性がＨＳＡによって阻害される一方で、Ｐｒｏ２５８  ＴＤＣＣ活性は、ＨＳＡの存在下でＰｒｏ５１と同様である。最後に、Ｐｒｏ２５８の条件付けは、６ＸによってＨＳＡの存在下でやや増強される。
【図６０Ａ】他のＭＭＰによるＭＭＰ９基質の開裂を示す。
【図６０Ｂ】他のＭＭＰによるＭＭＰ９基質の開裂を示す。
【図６０Ｃ】他のＭＭＰによるＭＭＰ９基質の開裂を示す。
【図６１Ａ】例示的な構築物及びそれらの形式のいくつかを示す。
【図６１Ｂ】例示的な構築物及びそれらの形式のいくつかを示す。
【図６２Ａ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｂ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｃ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｄ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｅ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｆ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｇ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｈ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｉ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｊ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｋ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｌ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｍ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｎ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｏ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｐ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｑ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｒ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｓ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｔ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【図６２Ｕ】本発明の多くの配列を示すが、多くの追加の配列も配列表に見られる。ＣＤＲは、下線が引かれ、太字であり、リンカーは、二重下線が引かれ（開裂性リンカーは、イタリック体で二重下線が引かれている）、ドメイン分離は、「／」によって示される。全てのＨｉｓ６タグは、それらがヒトにおける免疫原性を低減するために使用され得、かつ精製タグであり得るため、任意である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2020537496.tif 000110
【国際調査報告】
2020537496.tif 000111
2020537496.tif 000112
2020537496.tif 000113
2020537496.tif 000114
2020537496.tif 000115
2020537496.tif 000116
2020537496.tif 000117
2020537496.tif 000118