(57)【要約】  本発明は、生きている乳酸菌菌株およびビフィド菌菌株(プロバイオティックス)の放出、および/または、これらの薬学的に有用な酵素活性の放出および維持のための粘膜粘着性フィルム形態の医療装置に関する。
2020510099.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳酸菌およびビフィド菌の一つ以上の菌株、および／または、前記菌株から由来した一つ以上の酵素を含む粘膜粘着性フィルムの形態での製作物であって、
前記フィルムは、プロバイオティクス、および／または、対応する前記酵素が前記フィルム表面の一つの面だけに存在することを特徴とする、製作物。
【請求項２】
前記フィルムは厚さが1mm以下で、前記フィルム表面上の細菌の量は、102〜1012cfu/cm2である請求項１に記載の製作物。
【請求項３】
前記細菌は、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス・ブーフナー(Lactobacillus buchneri)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)、ラクトバチルス・カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス・カテナフォルメ(Lactobacillus catenaforme)、ラクトバチキルス・ケロビオスス(Lactobacillus cellobiosus)、ラクトバチルス・クリスパトス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス・クルヴァトゥス(Lactobacillus curvatus)、ラクトバチルス・デルブルエッキイー(Lactobacillus delbrueckii)、ラクトバチルス・イエンセン(Lactobacillus jensenii)、ラクトバチルス・ライヒマン(Lactobacillus leichmanii)、ラクトバチルス・ミヌトス(Lactobacillus minutus)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス・ロゴセ(Lactobacillus rogosae)、ラクトバチルス・サリヴァリゥス(Lactobacillus salivarius)、ラクトバチルス・ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス・ラムノサスGG(Lactobacillus rhamnosus GG)、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBB-12 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12)、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(Bifidobacterium adolescentis)、ビフィドバクテリウム・アンギュラツム(Bifidobacterium angulatum)、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム(Bifidobacterium catenulatum)、ビフィドバクテリウム・デンティウム(Bifidobacterium dentium)、ビフィドバクテリウム・エリクソニ(Bifidobacterium eriksonii)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム・ロングム(Bifidobacterium longum)、ビフィドバクテリウム・プランタルム(Bifidobacterium plantarum)、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・プソイドロングム(Bifidobacterium pseudolongum)、ストレプトコッカス・ラクチス(Streptococcus lactis)、ストレプトコッカス・ラフィノラクチス(Streptococcus raffinolactis)、ストレプトコッカス・サーモフィルス(Streptococcus thermophilus)、および、これらの混合物から選択され、前記酵素は、酸性、中性または、アルカリ性のスフィンゴミエリナーゼ、および、アルギニンデイミナーゼから選択され、また、前記酵素は、失活(non-vital)した細菌から得られる、請求項１または２に記載の製作物。
【請求項４】
前記乳酸菌菌株またはビフィド菌菌株はラクトバチルス・ブレビスATCC 4006、ラクトバチルス・サリヴァリゥスDSM 24800、ラクトバチルス・プランタルムDSM 24801、ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM 24731、ラクトバチルス・アシドフィルスDSM 24735、ラクトバチルス・デルブリッキィ亜種ブルガリクス(Lactobacillus delbrueckii ssp bulgaricus)DSM 24734、ラクトバチルス・パラカセイ(Lactobacillus paracasei) DSM 24733、ラクトバチルス・プランタルムDSM 24730、ビフィドバクテリウム・ロングムDSM 24736、ビフィドバクテリウム・インファンティスDSM 24727、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(Bifidobacterium breve)DSM 24732、および、これらの混合物から選択され、前記酵素は、酸性、中性、または、アルカリ性のスフィンゴミエリナーゼ、および、アルギニンデイミナーゼから選択され、また、前記酵素は、失活(non-vital)した細菌から得られる、請求項１〜３の何れ一項に記載の製作物。
【請求項５】
前記粘膜粘着性フィルムは、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)、ヒドロキシエトキシエチルメタクリレート(HEEMA)、ヒドロキシジエトキシエチルメタクリレート(HDEEMA)、メトキシエチルメタクリレート(MEMA)、メトキシエトキシエチルメタクリレート(MEEMA)、メトキシジエトキシエチルメタクリレート(MDEEMA)、エチレングリコールジメタクリレート(EGDMA)、N-ビニル-2-ピロリドン(NVP)、N-イソプロピルAAm(NIPAAm)、ビニルアセテート(VAc)、ラクト酸(LA)、アクリル酸(AA)、メタクリル酸(MAA)、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド(HPMA)、エチレングリコール(EG)、プロピレングリコール(PG)、PEGアクリレート(PEGA)、PEGメタクリレート(PEGMA)、PEGジアクリレート(PEGDA)、PEGジメタクリレート(PEGDMA)、エチレン酸化物(EO)、プロピレン酸化物(PO)から選択された同種重合、または、共重合可能な単量体、または、
アルギン酸ナトリウムまたはヒアルロン酸に基づくまたは含有する重合体、ゼラチン、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピル-メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレンまたはプロピレンオキシドに基づくまたは含有する重合体、ベータ-グルカン、例えばプルラン(ベータ-1,4-グルカン、ベータ-1,6-グルカン)に基づくまたは含有する重合体、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ガム、例えばキサンタンガム、ガムアドラガント(gum adragant)、グァーガム、アカシアゴム、ポリアクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸の重合体および共重合体、カルボキシビニル重合体および共重合体、デンプン、天然および合成ゼラチン、アガロースゲル、多糖類、グルカン、キサンタン、アガロース-キサンタンゲル、キトサン、デキストラン、ペクチン、セルロース、メチル-セルロース、エチル-セルロース、プロピル-セルロースから選択される重合体、または、
これらの混合物および組み合わせから得られた、請求項１〜４の何れか一項に記載の製作物。
【請求項６】
前記粘膜粘着性フィルムは可塑性物質をさらに含み、前記可塑性物質は、ポリアルキレン酸化物、例えばポリエチレングリコール、または、ポリプロピレングリコール、有機小分子、例えばグリセロール、グリセロールモノアセテート、トリアセチン、ポリソルベート、セチルアルコール、ソルビトール、プロピレングリコール、および、PEGから選択され、これらを個別で、または、混合物として使用される、請求項５に記載の製作物。
【請求項７】
医療、美容および非医療分野において、動物および人に用いられるための請求項１〜６の何れか一項に記載の製作物。
【請求項８】
前記美容および非医療分野が、動物および人に対する皮膚科学、衛生、および、個人治療分野である請求項７に記載の製作物。
【請求項９】
前記医療分野は、動物および人の、一般的には粘膜、特に口腔、生殖器、肛門、鼻腔、咽頭および結膜粘膜、および、皮膚に影響を与える状態および疾患に関するものであり、乳酸菌およびビフィド菌の投与により利益を得るものである、請求項７に記載の製作物。
【請求項１０】
膣炎および膣症、直腸痔核炎症、副鼻腔炎、耳炎、結膜炎、胃炎、食道炎、粘膜損傷、全身疾患の粘膜、擦過傷、開放創、皮膚潰瘍、悪創、特に褥瘡、から選択された粘膜および皮膚状態、および、口腔の粘膜の状態、例えば歯肉障害、虫歯、歯周炎、口臭、歯肉炎、口腔粘膜炎、潰瘍、例えばベーチェット症候群を患う患者における口腔潰瘍、口腔内微生物不均衡、粘膜における細胞増殖および炎症過程、口腔粘膜炎、急性および慢性歯周炎、侵襲性歯周炎、歯肉出血、特にミュータンス菌グループに属するレンサ球菌の増殖と関連した状態、細菌種、例えば、ポルフィロモナス・ジンジバリス、トレポネーマデンティコラ、タンネレラ・フォーサイシア、アグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス、の増殖に関連する状態、胃炎、食道炎、粘膜炎、アフタ性口内炎、の予防及び治療に用いられ、例えば黒色腫のように皮膚に影響を及ぼす腫瘍の治療で、化学療法、特に粘膜に問題を引き起こす化学療法で治療された患者のコンプライアンスを高めるため、請求項９に記載の製作物。
【請求項１１】
皮膚清浄剤(skin clarifiers)として美容用の請求項８に記載の製作物。
【請求項１２】
請求項１〜７の何れか一項に記載のフィルム形態での製作物を、同時、連続または遅延投与のため、他の薬学的、薬用化粧品的および皮膚科学的活性成分と組み合わせて含むキット。
【請求項１３】
乳酸菌およびビフィド菌から選択された少なくとも一つの菌株、および／または、前記菌株およびこれらの混合物から由来した酵素を含む粘膜粘着性フィルムを製造する方法であって、
粘膜粘着性重合体を、重合体重量基準で0〜5%w/wの量で、水および可塑剤と混合する工程、
そのようにして製造した混合物を表面に注いで均等な厚さを形成し、30℃以上の温度で乾燥する工程、
前の工程で得られた脱水フィルム表面に、脱水形態の細菌またはそれらの酵素もしくはそれらの混合物のアリコートを均一に沈着する工程、
つづいて、前の工程で得られた粘膜粘着性フィルムを、調製物が一定の重量に達するまで乾燥する工程、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生きたプロバイオティックスバクテリア、および/または、これらの酵素の放出のために粘膜に適用される粘膜粘着性装置に関するものである。より具体的には、本発明は、口腔粘膜粘着性フィルム(mucoadhesive buccal films)形態の医療装置に関するもので、ここで口腔粘膜は、ラクトバシラス・ブレビス(Lactobacillus brevis) ATCC 4006の放出、および/または、これらの薬学的に有用な酵素活性の放出および維持を通じて、他の粘膜で得ようとする治療結果に対する優れた予測モデルといえる。
【背景技術】
【０００２】
歯垢は生体膜であり、口腔に存在するバクテリア生態系(微生物叢)の主な成分である。このような微生物叢を構成するバクテリア種は、その数が概ね数千種余りと非常に多く、これらのうち概ね千種余りが歯周辺の生体膜を構成すると推測される。
【０００３】
研究者によれば、口腔微生物叢は病原性微生物による口内の群落形成を防止する、口腔環境のための防御システムの一部を形成する。このような防御機能は環境変化が規則的に起きるにも関わらず、時間経過にともなうそれらの相対的安定性を十分に説明している(Marsh and Brandshaw、1995（非特許文献１）、Kolenbrander and Palmer、2004（非特許文献２)）。
【０００４】
歯生体膜組成における不均衡の発生は虫歯、歯周病および口臭の発生を引き起こし得る(Badet and Thebaud、2008（非特許文献３）)。例えば、虫歯はミュータンス(mutans)群に属するレンサ球菌(Streptococcus)の成長を特徴とする(Selwiz et al.、2007（非特許文献４）)。一方、例えば本発明者が歯周炎と引用する、歯周病は宿主の防御メカニズムを回避し、歯肉下部に群落を形成して、組織損傷を惹起し得る、バクテリア種、例えばポルフィロモナス・ジンジバリス(Porphyromonas gingivalis)、トレポネーマ・デンティコラ(Treponema denticola)、タンネレラ・フォーサイシア(Tannerella forsythia)およびアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンス(Aggregatibacter actinomycetecomitans)等の成長と関連している(Houle et al.、2003（非特許文献５）、Offenbacher、1996（非特許文献６）)。また、化学療法および放射線療法は、バクテリアおよびウイルス感染の標的になり易い非常に苦痛な炎症および潰瘍の発生と共に、口腔粘膜の最表皮層内の細胞の急速な死滅を含む、口腔粘膜炎を頻繁に引き起こし得る。口腔粘膜炎は個体(ヒト)の摂食能力を制限し、個体の生活の質を深刻に損ないかねない(Naidu et al.、2004（非特許文献７）)。
【０００５】
乳酸菌は六炭糖糖類のラクト酸、またはラクト酸とエタノールでの発酵過程から自身の生存に必要なエネルギーを誘導させる能力を特徴とするグラム陽性バクテリアである。現在としては、ラクトバシラス(Lactobacillus)、ロイコノストック(Leuconostoc)、ペディオコッカス(Pediococcus)、ストレプトコッカス(レンサ球菌)(Streptococcus)およびラクトコッカス(Lactococcus)属が乳酸菌に分類される。他の代謝経路を通じて糖類からラクト酸を生産する他の細菌は、ビフィド菌（bifidobacteria）である。乳酸菌およびビフィド菌は唯一なものではないが、特に哺乳動物の腸、具体的に人間において多くの有用な作用をする「プロバイオティックス」として知られるバクテリア群に含まれる。
【０００６】
乳酸菌およびビフィド菌は数多くの抗微生物性物質、例えば有機酸、過酸化水素およびバクテリオシンを分泌して粘膜の付着部位に対して口腔病原体と競合する(Reid et al.、2003（非特許文献８）、Meurman、2005（非特許文献９）)。したがって、口腔内微生物間の障害の病理的影響を克服するために乳酸菌およびビフィド菌を用いるのは、適切な歯の健康および口腔健康の維持を通じて個人衛生を管理する効果的な方法であるのみならず、人間と動物の治療のために有望な代案治療となる。実際に乳酸菌およびビフィド菌はこれらが生きる環境のpH、および/または、酸化-還元電位を調整して病原性微生物の活力(vitality)を弱化させることができ、非特異的免疫メカニズムを刺激でき、体液性および細胞性免疫反応を調整し得る(Erickson et al.、2000（非特許文献１０）、Marco et al.、2006（非特許文献１１）)。
【０００７】
バクテリア菌株ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006は大量のアルギニンデイミナーゼおよびスフィンゴミエリナーゼを生産することができる。具体的に、原核生物酵素アルギニンデイミナーゼはアルギニンの分解を担う。この酵素の活性を通じてバクテリア菌株ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006は試験管内で腫瘍細胞の成長に影響を及ぼす(Di Marzio et al.、2001（非特許文献１２）)ポリアミン合成の前駆体であるアルギニンが周辺環境から除去されるように惹起させる。真核生物細胞はまた、アルギニンを使って炎症過程の重要な媒介因子である、酸化窒素(NO)を生産するので、細胞環境で前駆体アルギニンの除去はNO生産を顕著に減少させることができ、これらにより炎症反応を調整することができる。バクテリアスフィンゴミエリナーゼは強力な炎症性サイトカインであるPAF(Platelet Activating Factor)(血小板活性化因子)を加水分解できる酵素である(Rui-Dong Duan、2006（非特許文献１３）)。
【０００８】
また、粘膜の炎症過程を伴う疾患でこのようなプロバイオティックスの効能がこのような酵素活性を通じて説明できる。歯科学分野での応用以外にも粘膜炎、アフタ性口内炎、および虫歯の治療のために、乳酸菌、具体的にはラクトバチルス・ブレビスATCC 4006が使われ、膣炎および膣症、肛門-痔炎症、副鼻腔炎、耳炎および結膜炎の形態、胃炎および食道炎の事例で使用され得る。
【０００９】
また、ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006が一部口腔疾患の治療で有益な効果を持つことが最近立証された。このプロバイオティックスはInersan（登録商標）の名称で、口内溶解のための精製製剤として現在の市販されている。
【００１０】
文献(Della Ricciaら(Della Riccia et al.、2007（非特許文献１４))は慢性歯周炎を病む患者群においてラクトバチルス・ブレビスATCC 4006のこのような製剤の抗炎症性効果を、肯定的な効果と評価した。その他にも、L.ブレビス(L. brevis)は歯周炎の病原体のうちの一つであるプレボテーラ・メラニノジェニカ(Prevotella melaninogenica)によってもたらされた口腔生体膜の形成を防止する有望な作用剤であると証明された(Vuotto et al.、2013（非特許文献１５）)。
【００１１】
文献（Piyush Shah et al.、2013（非特許文献１６））では、Inersan（登録商標）と抗生剤の併用と比較してInersan（登録商標）およびドキシサイクリン単独の経口投与を歯周炎を病む患者サンプルにおいて、そしてInersan（登録商標）およびドキシサイクリン単独に比べInersan（登録商標）および抗生剤の併用を急進性歯周炎を病む患者サンプルにおいて比較して、プロバイオティックスが歯肉炎症、カリエスの出現、および口腔環境内ラクトバチルスの存在に有利な作用を持つことを立証した。ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006を含有する製剤の効能はまたベーチェット症候群を病む患者の口腔潰瘍治療で立証された(Tasli et al.、2006（非特許文献１７）)。最近、偽薬対照群との二重盲検ランダム化試験で、Ｌ.プレビスATCC 4006を含有するロゼンジは歯垢による酸生成、歯肉出血および口腔内の望ましくないバクテリアの数を減少させる肯定的な作用をすると確認された(Campus et al.、2013（非特許文献１８）)。
【００１２】
文献（Toiviainen,A. et al.、2014（非特許文献１９)は健常な患者において歯垢および歯肉炎症の短期(4週)治療のためのラクトバチルス・ラムノサスGG(Lactobacillus rhamnosus GG)およびビフィドバクテリウム・アニマーリス亜種ラクティス BB-12 (Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12)のロゼンジ製剤の使用を記述している。この研究は歯垢および歯肉炎症を減少させるにあたって用いられたバクテリア菌株の活性を確認した。
【００１３】
抗生剤耐性現象の継続的増加頻度は、ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006のように口腔内問題発生に対抗して作用し得るプロバイオティックバクテリアに対する関心増加を引き起こした。これに加えて、腫瘍学分野において、粘膜病態の効果的で無毒性の治療が化学療法治療を受ける患者順応性を非常に増加させる可能性がある。
【００１４】
したがって、酵素放出時間を延長させて、作用部位で乳酸菌生存を延長させて、上記プロバイオティックスにより発現する酵素の活性を維持させる、乳酸菌およびビフィド菌投与の効果的な手段を探すことが根本的に重要である。
【００１５】
したがって乳酸菌およびビフィド菌の使用を通した、一般的には粘膜、具体的には口腔の治療に適合した伝達システムの選択が必須である。
【００１６】
粘膜粘着性は天然または、合成重合体または、これを含む投与運搬体(dosage vehicle)の粘膜に対する付着性を意味する。このような現象は薬品伝達に用いられバクテリアおよびこれらが生産する有益な物質の局所的放出が可能であるという点で、プロバイオティックスを使った粘膜治療、具体的に口腔治療に特に役立つ。
【００１７】
大体において、粘膜粘着性材料は水素結合を形成し得る多数の官能基、具体的には水酸基またはカルボキシル基を含む親水性高分子を含む。
【００１８】
粘膜粘着過程は粘膜の表面、具体的にはこれらを覆っているムチンと、粘膜粘着性システムを含む材料の重合体鎖の間の非常に近接し詳密な接触部形成を含む。このような詳密な接触部は本質的に二次架橋結合、具体的には水素結合の形成を基盤とする。薬品の放出および粘膜と剤形の粘着を調整する可能性は個々の薬学的応用をベースに評価される必要がある。粘膜粘着の根本的なメカニズムに関する考察のために、文献（Smart,J.D.、2005（非特許文献２０）、及び、Yadav,V.K. et al.、2010（非特許文献２１））を参照する。口腔用途の粘膜粘着性システムの例は文献（Abruzzo et al.、2012（非特許文献２２））および文献（Salamat-Miller et al.、2005（非特許文献２３））に説明されている。
【００１９】
フィルム剤形(口腔薄膜フィルム(Oral Thin Film；OTF)は、特性、例えばフィルムの薄膜性とその適用容易性のせいで、口腔に使うのに特に適合する(Peh and Wong、1999（非特許文献２４）)。適合するようにデザインされた製剤のOTFは口腔粘膜に付着して、唾液と接触して徐々に溶解することができる。これだけでなく、このようなフィルムは疾患により病変表面に直接適用され得るため良好な治療が可能となる。
【００２０】
粘膜粘着性フィルムの生産は「キャスティング(Casting)」により通常実行される(Siemann,U.、2005（非特許文献２５）)。粘膜粘着性を基盤とする伝達システムを生産するのに使用し得る材料に関して総て網羅した考察はYadav,V.K. et al.、同上）などの文献を参照する。
【００２１】
当業者は色々な要因、例えば使われる重合体の特性、存在する粘膜粘着性重合体の濃度、使われる重合体鎖の弾力性、環境要因、例えばpHと関連したこれらの空間的立体形態、初期接触時間、および使われる重合体の膨潤性によって影響され得る、粘膜接着性伝達の複雑性に対して認知している。その他にも、多くの生理的要因、例えば治療される粘膜表面に存在するムチン分子の置換、および疾患過程の間の粘膜の物理的-化学的状態もやはり、粘膜粘着性伝達の最適化に寄与する(Yadav,V.K. et al.、同上)。上記に記述された要因の他にも、口腔に乳酸菌およびビフィド菌の伝達を考慮する限り、上記バクテリアができるだけ粘膜粘着性製剤の製造過程の間に、そしてこれらの使用前の保存期間の間に、活力を維持して、これらが効果的に生きている形態で、作用部位に放出されて、最後にこれらの有用な酵素活性が保存されることが基本的に重要である。
【００２２】
乳酸菌およびビフィド菌の口腔粘膜粘着性伝達は今まで研究がほとんどなされておらず、したがって局所経口治療にこれらバクテリアの使用に関して関心が持たれたのは非常に最近のことである。口腔内問題の予防および治療において一部プロバイオティックスの有用性に関するデータは今までは制限的であった。
【００２３】
最近、Saha,S.ら(Saha,S. et al.、2013（非特許文献２６）)は口腔使用のための0.012ないし1%濃度のカルボキシメチルセルロース(CMC)を含有するOTFについて記述した。これらOTFは乳酸菌ラクトバチルス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum) NCIB 5221のための運搬体として構成された。これら著者が記述した方法は遠心分離と0.85%w/v塩水溶液に再懸濁させた新鮮培養物起源の望ましい量のバクテリアが付加された2回蒸留された水の中でCMC溶液の調剤物を提供する。続いてフィルムを空気層流下で12時間大気温度で乾燥させて大気温度でペトリ皿に密封されたまま保管する。このように得たOTFは直径100mm(10cm)のフィルムにおよそ6.75x108バクテリアを含有するポイントまで、生産過程においてプロバイオティックの活力の(概略2桁数の)相当な損失を見せた。保存の間も追加の活力損失(概略1桁数)が観察され、窮極的に生存プロバイオティックは大気温度で150日保存後完全に不存在となった。また、これらフィルムは4分内に早く溶解し、これは作用部位にてプロバイオティックの放出を着実に維持することが望ましい場合においては問題となり得る。実際に試験管内でプロバイオティックの放出は概略5分後に最大ピークに到達した。
【００２４】
ハイネマン他の研究陣は(Heinemann et al.、2013（非特許文献２７）)、アシドフィルス菌またはビフィドバクテリウム・アニマーリス亜種ラクティスW.の乗り物(媒介物)として「口腔内崩壊フィルム(orally-disintatinfilms)」を公式化した。これらの菌株はカルボキシメチルセルロース、ゼラチン、デンプンで構成されたフィルムに積載された。また、この場合において、新鮮培養物起源の望む量のバクテリアが遠心分離され、0.9%w/v食塩水溶液で再懸濁されたポリマー溶液の準備のため提供される手続きが追加された。乾燥段階は代わりに30°Cで24時間換気されたストーブで実行された。試験ではフィルム準備手続き後15%未満の生菌損失を見せたが90日保管後生菌の活力は急激に落ちたとカウントされた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Marsh and Brandshaw、1995
【非特許文献２】Kolenbrander and Palmer、2004
【非特許文献３】Badet and Thebaud、2008
【非特許文献４】Selwiz et al.、2007
【非特許文献５】Houle et al.、2003
【非特許文献６】Offenbacher、1996
【非特許文献７】Naidu et al.、2004
【非特許文献８】Reid et al.、2003
【非特許文献９】Meurman、2005
【非特許文献１０】Erickson et al.、2000
【非特許文献１１】Marco et al.、2006
【非特許文献１２】Di Marzio et al.、2001
【非特許文献１３】Rui-Dong Duan、2006
【非特許文献１４】Della Riccia et al.、2007
【非特許文献１５】Vuotto et al.、2013
【非特許文献１６】Piyush Shah et al.、2013
【非特許文献１７】Tasli et al.、2006
【非特許文献１８】Campus et al.、2013
【非特許文献１９】Toiviainen,A. et al.、2014
【非特許文献２０】Smart,J.D.、2005
【非特許文献２１】Yadav,V.K. et al.、2010
【非特許文献２２】Abruzzo et al.、2012
【非特許文献２３】Salamat-Miller et al.、2005
【非特許文献２４】Peh and Wong、1999
【非特許文献２５】Siemann,U.、2005
【非特許文献２６】Saha,S. et al.、2013
【非特許文献２７】Heinemann et al.、2013
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
したがって、これら全てに基づいて、既存の先行文献に記述されたフィルムなどと比較して画期的な特徴を持つ粘膜粘着性フィルムを開発しなければならない必要性を感じていた。
【００２７】
（解決しようとする課題）
上記問題点を解決するために、本発明は、乳酸菌菌株、ビフィド菌菌株、または、上記菌株から由来した一つ以上の酵素を含む粘膜粘着性フィルムであって、上記粘膜粘着性フィルムは上記乳酸菌菌株、ビフィド菌菌株、または、上記菌株から由来した酵素がフィルムの表裏どちらか一方の面(片面)にだけ存在することを特徴とする粘膜粘着性フィルムを提供する。
【課題を解決するための手段】
【００２８】
（課題の解決手段）
ここで、a)少なくとも一つ以上の乳酸菌またはビフィド菌に存在する有益な酵素の活性が長期間保存されて、b)生体内で少なくとも一つの乳酸菌またはビフィド菌の放出が局在的で、放出量は長時間にかけて維持され得る。
【００２９】
これら粘膜粘着性フィルムは、処理段階と保管期間において、選択されたバクテリア菌株の活力およびこれらに存在する有益な酵素活性が維持されるという面で、そして作用部位に生きているバクテリアの放出が可能だという面で優れた特徴を持つ。
【００３０】
本発明のまた他の目的は、特に望ましい乳酸菌がラクトバシラス プレビス(Lactobacillus brevis) ATCC 4006であり、特に望ましい粘液接着性重合体がヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)頬側粘膜接着フィルムだ。他の望ましい乳酸菌とビフィド菌は、およびこれら相応の混合物、およびATCC 4006との混合物を含む。
【００３１】
本発明のまた他の目的は、乳酸菌およびビフィド菌から選択された少なくとも一つのバクテリア菌株、およびこれら相応の酵素活性を含有する上記粘膜接着フィルムの製造方法に関するものである。
【００３２】
特に、少なくとも好ましい細菌株は、ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006であり、他の好ましいまたは乳酸菌とフィズス菌は、ラクトバチルス・サリヴァリゥスDSM 24800、ラクトバチルス・プランタルムDSM 24801、ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM 24731、ラクトバチルス・アシドフィルスDSM 24735、ラクトバチルス・デルブリッキィ亜種ブルガリクスDSM 24734、ラクトバチルス・パラカセイDSM 24733、ラクトバチルス・プランタルムDSM 24730、ビフィドバクテリウム・ロングム(longum)DSM 24736、ビフィドバクテリウム・インファンティス(infantis)DSM 24727、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(breve)DSM 24732、または、これら2以上の混合物である。
【００３３】
また、上記酵素は上記失活(non-vital)乳酸菌菌株または、失活(non-vital)ビフィド菌菌株でも得られる。
【００３４】
粘膜疾患は、膣炎および膣症、肛門-痔炎症、副鼻腔炎、耳炎、結膜炎、胃炎、食道炎、粘膜の損傷、全身疾患の粘膜徴候、擦過傷、開放創、皮膚潰瘍、悪創、床擦れ、歯肉障害、虫歯、歯周障害、口臭、歯肉炎、口腔粘膜炎、口腔潰瘍、口腔内微生物不均衡症、歯周炎、急進性歯周炎、歯肉出血、胃炎、食道炎、粘膜炎、アフタ口内炎、皮膚腫瘍、またはガン治療時に発生する粘膜疾患であり得る。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】脱水された形態で噴霧された粘膜粘着性フィルムの片面上だけに乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006の存在を示す走査電子顕微鏡を使って取得したイメージ（Ａ）。バクテリアがないフィルムの基底面に対するイメージ（Ｂ)。
【図２】未積載のHPMCを含有するかまたは、乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006を含有する粘膜粘着性フィルムに対する試験管内水和試験の結果。各ポイントのデータは3ロットの相異なる5種のフィルムを意味する。
【図３ａ】2〜8℃、および24℃(大気温度)の温度で12ヶ月(48週)保存期間の間の粘膜フィルム内の乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006の活力に対する実験結果。ａ）ロットI（図３ａ）、ｂ）ロットII（図３ｂ）、ｃ）ロットIII（図３ｃ）。t0=基準点、t1=2週、t2=4週、t3=8週、t4=12週、t5=24週、t6=36週、t7=48週。
【図３ｂ】2〜8℃、および24℃(大気温度)の温度で12ヶ月(48週)保存期間の間の粘膜フィルム内の乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006の活力に対する実験結果。ａ）ロットI（図３ａ）、ｂ）ロットII（図３ｂ）、ｃ）ロットIII（図３ｃ）。t0=基準点、t1=2週、t2=4週、t3=8週、t4=12週、t5=24週、t6=36週、t7=48週。
【図３ｃ】2〜8℃、および24℃(大気温度)の温度で12ヶ月(48週)保存期間の間の粘膜フィルム内の乳酸菌ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006の活力に対する実験結果。ａ）ロットI（図３ａ）、ｂ）ロットII（図３ｂ）、ｃ）ロットIII（図３ｃ）。t0=基準点、t1=2週、t2=4週、t3=8週、t4=12週、t5=24週、t6=36週、t7=48週。
【図４ａ】2〜8℃、および24℃(大気温度)の温度で12ヶ月(48週)保存期間の間の粘膜フィルム内酵素活性の進行に対する実験結果。ａ）ロットI（図４ａ）、ｂ）ロットII（図４ｂ）、ｃ）ロットIII（図４ｃ）。t0=基準点、t4=12週、t5=24週、t6=36週、t7=48週。
【図４ｂ】2〜8℃、および24℃(大気温度)の温度で12ヶ月(48週)保存期間の間の粘膜フィルム内酵素活性の進行に対する実験結果。ａ）ロットI（図４ａ）、ｂ）ロットII（図４ｂ）、ｃ）ロットIII（図４ｃ）。t0=基準点、t4=12週、t5=24週、t6=36週、t7=48週。
【図４ｃ】2〜8℃、および24℃(大気温度)の温度で12ヶ月(48週)保存期間の間の粘膜フィルム内酵素活性の進行に対する実験結果。ａ）ロットI（図４ａ）、ｂ）ロットII（図４ｂ）、ｃ）ロットIII（図４ｃ）。t0=基準点、t4=12週、t5=24週、t6=36週、t7=48週。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
（発明を実施するための具体的な内容）
本文にて、そして本発明の目的のために、用語「粘膜粘着性OTF(s)」(Oral Thin Film；OTF)および「粘膜粘着性フィルム(s)」は同義語と見なし、したがってこれらの用途もやはり口腔粘膜以外の他のすべての類型の粘膜を意図する。
【００３７】
本発明で、そして本発明の目的のために用語「プロバイオティック」および「プロバイオティックス」は上記に定義されたことのような乳酸菌およびビフィド菌のうちから選択された少なくとも一つのバクテリア菌株およびこれの混合物を意味する。
【００３８】
本発明者らは、予想外に、適合した環境条件下で長期間(12ヶ月およびそれ以上まで)にわたり、活力、および/または、酵素活性を維持できる、高い数量の生存プロバイオティックを含有する粘膜粘着性OTF(Oral Thin Film；OTF)を得ることが可能な製造方法を発見した。
【００３９】
ここで口腔粘膜は、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis) ATCC 4006の放出、および/または、これらの薬学的に有用な酵素活性の放出および維持を通じて他の粘膜で得ようとする治療結果に対する優れた予測モデルといえる。
【００４０】
本発明にかかる生体内粘膜粘着性OTFはすべての1回適用後で、口腔、または、概して粘膜でバイタルプロバイオティックの長期間放出(少なくとも10時間)を可能にする。
【００４１】
適合した粘膜粘着性重合体は文献（Yadav,V.K. et al. 同上）に記述されたものを参照する。
【００４２】
粘膜粘着性フィルムの通常の製造で粘膜粘着性同種重合体および共重合体を得るために当業者に知られている単量体は、例えば、ヒドロキシエチルメタクリレート(HEMA)、ヒドロキシエトキシエチルメタクリレート(HEEMA)、ヒドロキシジエトキシエチルメタクリレート(HDEEMA)、メトキシエチルメタクリレート(MEMA)、メトキシエトキシエチルメタクリレート(MEEMA)、メトキシジエトキシエチルメタクリレート(MDEEMA)、エチレングリコールジメタクリレート(EGDMA)、N-ビニル-2-ピロリドン(NVP)、N-イソプロピルAAm(NIPAAm)、ビニルアセテート(VAc)、ラクト酸(LA)、アクリル酸(AA)、メタクリル酸(MAA)、N-(2-ヒドロキシプロピル)メタクリルアミド(HPMA)、エチレングリコール(EG)、プロピレングリコール(PG)、PEGアクリレート(PEGA)、PEGメタクリレート(PEGMA)、PEGジアクリレート(PEGDA)、PEGジメタクリレート(PEGDMA)、エチレン酸化物(EO)、プロピレン酸化物(PO)、およびこれらの組合である。
【００４３】
特に適合した粘膜粘着性重合体は、アルギン酸ナトリウム、または、ヒアルロン酸、ゼラチンおよびカルボキシメチルセルロースを基盤としたり、または、これを含有するものなどから選択される。本発明にかかる粘膜粘着性フィルムの生産には特にヒドロキシプロピルメチルセルロースが適合する。
【００４４】
本発明にかかる粘膜粘着性フィルムはまた、他の既知の粘膜粘着性重合体、例えば、セルロース含有重合体、または、セルロースの重合体、例えばヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、エチレン、または、プロピレン酸化物を基盤としたり含有する重合体、ベータ-グルカンを基盤としたり含有する重合体、例えばプルラン(ベータ-1,4-；ベータ-1,6-グルカン)、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、ガム例えば、キサンタンガム、ガムアドラガント(gum adragant)、グァーガム、アカシアゴム、ポリアクリル酸、アクリル酸およびメタクリル酸の重合体および共重合体、カルボキシビニル重合体および共重合体、デンプン、天然および合成ゼラチン、アガロースゲル、多糖類、グルカン、キサンタン、アガロース-キサンタンゲル、デンプン、キトサン、デキストラン、ペクチン、セルロース、メチル-セルロース、エチル-セルロース、プロピル-セルロース；およびこれらの混合物および組合せを用いて製造し得る。
【００４５】
最終フィルムをより一層柔軟性あるようにさせる物質である、当業者に公知の可塑性物質が使われた重合体の重量を基準として0.5ないし30%または望ましくは0.5ないし20%の割合でこれら重合体に付加し得る。これら可塑性物質のうちで、我々が言及するのは、例えば、個別的にまたは、これらの混合物として、ポリアルキレン酸化物、例えばポリエチレングリコールおよびポリプロピレングリコール、小型有機分子、例えばグリセロール、グリセロールモノアセテート、グリセロールトリアセテート(トリアセチンとも言われる)、ポリソルベート、セチルアルコール、またはソルビトールである。これらの中で、望ましい可塑剤はポリプロピレングリコールおよびPEG(ポリエチレングリコール)だ。
【００４６】
粘膜粘着性は統合技術を基盤として、当業者は最終用途のために最も適切な粘膜粘着性システムを選択することができる。
【００４７】
本発明にかかる粘膜粘着性フィルムは「フィルムキャスティング(casting)」と言われる技術によって製造される。本発明にかかるフィルムキャスティング方法は当業者に公知の基本方法と比較してかなり別な方法を導入する。このような別な方法は、現在の慣行によって特定され文献（Saha et al. 同上）に記載された溶解液(一般的に水)にプロバイオティックスを直接混合する方法の代わりに、キャスティングされたフィルムにプロバイオティックスを吹き付ける。その他にも、本発明にかかる別な方法として、可塑剤が望ましく粘膜粘着性重合体の水溶液に付加され、これは文献（Saha et al.、同上）に記載されているのとは異なる点である。
【００４８】
粘膜粘着性フィルムを生産するすべての段階は望ましい滅菌環境で実行される。
【００４９】
本発明にかかる粘膜粘着性フィルムを製造する方法は次の段階を含む。
−粘膜粘着性重合体を水(望ましいように、1%w/wないし3%w/w)および可塑剤(望ましいように、重合体の重量基準で0%または0.5%ないし5%)と混合して、弱い撹はんによって促進される溶解を、例えば8〜12時間遂行する段階。引き続き粘性溶液は望ましくは気泡が無くなるように追加で10〜12時間定置する。
−このように製造された混合物を均一な厚さ、望ましくは≦5mmとなるように平面上に注ぐ段階。望ましいサイズの適切な金型を使用でき、≧30℃(望ましくは30〜60℃、より望ましくは45〜55℃)の温度で、典型的に2〜12時間、(望ましくは4〜6時間)乾燥させる。
−プロバイオティックス(例えば、ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006)または、事前選択された酵素生成物、例えばアルギニンデイミナーゼまたはスフィンゴミエリナーゼを以前の段階で得た脱水フィルムの表面上に、例えば噴霧によって、単位表面積当り望ましい濃度、および純粋に脱水された形態で、例えば凍結乾燥された形態、または、噴霧-乾燥または、当業者に公知の他の技術によって脱水された生成物で沈着および分配させる。
−そして、調製物が定量に到達する時まで以前の段階で得られた粘膜粘着性フィルムを乾燥させる段階。この乾燥段階は大気温度で、望ましくは真空下で、脱水剤、例えばシリカゲルの存在下で、典型的には18〜26時間、適切に脱水された安定した生成物が得られるまで実行される。
【００５０】
このような方式で得たOTFは高度で再現可能なスペックを備える。これらは厚さが≦1mm(望ましくは≦500μｍ、より望ましくは≦100μｍ)、例えば80.00ないし90.00μｍ(例えば88.33μｍ)であり、プロバイオティックがフィルムの片面にだけ存在するという点で、プロバイオティックの放出が単方向である方式で成形される(図１参照)。既存のOTF(Saha et al.)に存在しない、このような特徴は最終使用者が治療的要求にしたがって、粘膜または、外部環境(例えば、口腔)と直接接触するようにプロバイオティックを位置させることを可能にしている。図１のＡはバクテリア凍結乾燥物が噴霧されたフィルム表面上でラクトバチルスの均一な分布を立証する。
【００５１】
一つ特に有利で予想できない特徴は、各粘膜粘着性フィルムに積載できるプロバイオティックの量である。直径が1cmであるOTF上に1×108cfu、または、それ以上のバクテリア、一般的に1×102〜1×1012cfuを積載することが可能である。従来の口腔粘膜粘着性フィルム[Saha et al.、同上]と比較すると特に優秀である。
【００５２】
大量のプロバイオティック積載およびバクテリアの長期間放出の可能性は従来口腔粘膜粘着性フィルムと比較して注目するほどの予期しない改善を成し遂げることになる。
【００５３】
個別ロット内の粘膜粘着性フィルム間の重量偏差は非常に制限的で9.0mgないし9.6mgである。
【００５４】
重量と同様に、フィルムの厚さもやはり「実施例」部分の表１に示した通り、低い標準偏差値で、概略5〜10%の可変性で、非常によく再現可能だということが立証された。これらデータは生産方法が重量および厚さの面で再現可能な均一なフィルムを提供する可能性があることを示唆する。フィルムは典型的にサイズが10×10cmであるユニットに細分することができ、薬学および非薬学用途に適するよう包装材で包装することができる。それぞれのユニットは以後にそのユニットが適用される部分、例えば粘膜病変、具体的には口腔粘膜にフィルムのサイズを合わせるために適用時点に普通のはさみを使って切断することができる。フィルムはまた、紐状(ストリップ)に製造されて巻き取られ使用時に切断可能なテープを形成することができる。都合の良いようにフィルムの個々の部分は均一な濃度の活性成分(プロバイオティック、および/または、酵素)を含有する。
【００５５】
本発明にかかるOTFの試験管内水和容量に関するデータを図２に図示し、模擬人間唾液存在下で、プロバイオティックがないフィルムと比較して、プロバイオティックが積載されたフィルムで実行された測定に関するものである(実験細部事項は下記「実施例」部分を参照)。使われた実験条件下で本発明にかかるOTFは120分(2時間)で最大比率水和ピークとして、比較的徐々に水和されるものと立証され、この段階においてOTFは粘膜に効果的に付着でき時間とともに長期間放出可能なゲル化半固体システムに変形した。このような特徴は従来のOTFと比較して注目するほどの改善である。文献（Saha et al.、同上）の粘膜粘着性フィルムは、例えば、試験管内のプロバイオティックの最大ピーク放出が概略5分で高い溶解率(概略4分)を見せた。
【００５６】
プロバイオティックが積載された本発明にかかる粘膜粘着性フィルムはプロバイオティックがないものよりさらに水和され難かった。しかしこのような特徴は以下に例示するように、これらの生体内機能に対する障害物とはならない。
【００５７】
粘膜粘着試験を以下の「実施例」部分に記述した通り、健常な被験者で生体内遂行した。被験者は本発明にかかるOTFの使用に関しいかなる不便な点も評さず、口腔でフィルム除去後、歯肉粘膜に対していかなる損傷または、炎症兆候も見られなかった。口腔粘膜は他の粘膜の治療で獲得できる結果に対する良好な予想モデルになると思われる。
【００５８】
歯肉粘膜に粘着すれば、フィルムは完全な水和に概略2時間が必要で、これらが除去されたり、または、溶解する時まで追加で8±2時間粘着したまま残っていた。粘膜へのフィルムの迅速な粘着は、異質物存在による正常な不快感を引き起こさず、また、唾液の生産を減少させた。このような特性はすでに口腔および粘膜でプロバイオティックおよびこれらの酵素生成物の良好な永続性を助ける。
【００５９】
プロバイオティックの放出を健常な被験者で生体内実験した。これら実験に使われた実験手続きは以下「実施例」部分に報告されている。表３および４はプロバイオティックを含有する面が口腔に向くように(表3)、プロバイオティックを含有する面が歯肉粘膜に向くように(表４)、フィルムを適用して得たデータを示している。唾液サンプルはフィルム適用前(t0h)および2時間(t2h)および10時間(t10h)後に採取した。口腔に向くようにプロバイオティックを有するフィルムを適用して得たデータは本発明にかかる粘膜粘着性フィルムが少しずつプロバイオティックを放出でき、また、口腔内ラクトバチルス個体群を明確に増加させる可能性があることを示唆する。ラクトバチルス濃度の増加はt10hに個体DおよびEで特に明確だったが、個体AおよびBのサンプルでも明白だった。
【００６０】
プロバイオティックを持つ面が歯肉に向くように粘膜粘着性ゲルを使った健常な被験者の試験に関するデータは表４に図示した。この場合でも再び、プロバイオティック計測分増加は適用後10時間ですべての被験者に現れた。このような動きは個体BとEでさらに明らかだったが、これらはそのプロバイオティック濃度が検出限界値未満の値から出発して3.61 log CFUおよび4.36 log CFUの値に到達した。
【００６１】
本発明にかかる粘膜粘着性フィルムはまた、積載されたバクテリアにおいて有用な酵素活性を保存することを可能にさせる。「実施例」部分に報告された表5はプロバイオティックが口腔に向くようにフィルムを適用した後、上述された通り採取された唾液サンプルでシトルリンの存在を測定して得た結果を示す。シトルリンは酵素アルギニンデイミナーゼにより引き起こされるアルギニン転換反応の最終産物である。これらデータは具体的に相当なアルギニンデイミナーゼ活性を持つバクテリアである、プロバイオティックラクトバチルス・ブレビスATCC 4006を含有する本発明にかかる粘膜粘着性フィルムに関するものである。シトルリンの量はフィルムの適用後2時間に唾液サンプルで増加(個体Dは除外)して、フィルムから酵素の放出を立証した。シトルリン量の減少はまた、適用後10分で起きると確認された(個体A除外)。10時間後活性の減少は処理10時間後可能な環境変化の結果として、酵素発現の減少または、その活性の抑制として説明することができる。
【００６２】
本発明にかかる粘膜粘着性フィルムの挙動をもまた、生産後の保存期間において実験した。
【００６３】
「実施例」部分のチケット2は表示された期間、+2〜8℃および+24℃で保存されたフィルムの水分含有量を示す。
【００６４】
環境に存在する水分を捕集できる容器に保存した結果として、水分含有量が減少すると観察された。また、予想した通り、+24℃で保存したフィルムは+2〜8℃に保存したフィルムよりさらに多く水分が失われた。しかし、このような現象はフィルムの特徴および完全性にいかなる巨視的変化を見せることはなかった。
【００６５】
再び上述された同じ温度で保存された三つのロットの実験フィルムで、プロバイオティックＬ.プレビスATCC 4006の活力を実験した。
【００６６】
図３に図示したデータは、3種の生産ロットに対する12ヶ月の保存期間の間のプロバイオティックＬ.プレビスATCC 4006の活力を示す。ロットIで、生きたバクテリア細胞は粘膜粘着性OTFを+2〜8℃で保存した場合、8.20 log CFUで4.92 log CFUで減少(3.28 logぐらい損失、60.00%生存)し、フィルムを+24℃で保存時4.22 log CFUまで落ちた(3.98 log損失、51.46%生存)。ロットIIで、生残バクテリア細胞は+2〜8℃の時7.31 log CFUから3.37 log CFU(3.94 log損失、46.10%生存)に落ち、+24℃では3.13 log CFUに落ちた(4.18 log損失、42.82%生存)。ロットIIIで、生残バクテリア細胞は+2〜8℃の時7.61 log CFUから6.02 log CFUへ減少(1.59 log損失、79.11%生存)したのに反して、+24℃では5.35 log CFUに落ちた(2.26 log損失、70.30%生存)。
【００６７】
+2〜8℃で保存された口腔フィルムのプロバイオティックＬ.プレビスATCC 4006の平均生存率は61.74%である反面、+24℃で保存されたものは54.86%であった。
【００６８】
上述したのと同じ温度で保存された三つのロットの実験フィルムにて、酵素アルギニンデイミナーゼの酵素活性の持続性をまた評価した。
【００６９】
図４は、2〜8℃および+24℃の温度でフィルムの12ヶ月保存の間モニタリングした菌株Ｌ.プレビスATCC 4006のアルギニンデイミナーゼの活性を示す。三つすべてのロットで、酵素活性は両方の温度で薬学的に許される範囲内で減少を見せた。+2〜8℃で保存された口腔フィルムに存在する酵素活性の平均値は0時に1.72μmols/h/フィルムで、12ヶ月保存期間後は0.93μmols/h/フィルムに減少した。+24℃で保存された口腔フィルムに存在する平均酵素活性値は0時に1.95μmols/h/フィルムで、12ヶ月保存後は0.85μmols/h/フィルムに減少した。
【００７０】
図３および図４に図示された結果は、フィルムを生産する方法がプロバイオティック(ス)の活力と高い商用性において、微生物およびこれらの代謝活性を、特に低温状態であれば、少なくとも12ヶ月間のあいだ満足に保存可能だということを立証している。
【００７１】
真菌類およびバクテリアによる汚染跡は存在しなかった。
【００７２】
本発明にかかるフィルム上に適用するのに適合したラクトバチルスおよびビフィド菌は、
ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・ブーフナー、ラクトバチルス・ブレビス、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・カテナフォルメ、ラクトバチルス・ケロビオスス、ラクトバチルス・クリスパトス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス・クルヴァトゥス、ラクトバチルス・デルブルエッキイー、ラクトバチルス・イエンセン、ラクトバチルス・ライヒマン、ラクトバチルス・ミヌトス(Lactobacillus minutus)、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ロゴセ(Lactobacillus rogosae)、ラクトバチルス・サリヴァリゥス、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・ラムノサスGG、ビフィドバクテリウム・アニマリス亜種ラクティスBB-12、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ビフィドバクテリウム・アンギュラツム、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥム、ビフィドバクテリウム・カテヌラツム、ビフィドバクテリウム・デンティウム、ビフィドバクテリウム・エリクソニ、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・プランタルム、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュラタム(pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・プソイドロングム(pseudolongum)、ストレプトコッカス・ラクチス、ストレプトコッカス・ラフィノラクチス、ストレプトコッカス・サーモフィルス、およびこれらの混合物である。
【００７３】
単独で、または、混合物として得られる、望ましいものなどとしては、ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006、ラクトバチルス・サリヴァリゥスDSM 24800、ラクトバチルス・プランタルムDSM 24801、ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM 24731、ラクトバチルス・アシドフィルスDSM 24735、ラクトバチルス・デルブリッキィ亜種ブルガリクスDSM 24734、ラクトバチルス・パラカセイDSM 24733、ラクトバチルス・プランタルムDSM 24730、ビフィドバクテリウム・ロングム(longum)DSM 24736、ビフィドバクテリウム・インファンティス(infantis)DSM 24727、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(breve)DSM 24732がある。
【００７４】
特に望ましいのはラクトバチルス・ブレビスATCC 4006である。
【００７５】
上記に列挙された乳酸菌およびビフィド菌と組み合わせたりまたは、単独で、本発明にかかるフィルムに適用のための望ましい酵素は失活バクテリア、例えば超音波で溶解させたりまたは、不活性化させて関心酵素の活性に有害でない方法で溶解させたバクテリアから得ることもできる、酸性、中性およびアルカリ性スフィンゴミエリナーゼ、アルギニンデイミナーゼから選択される。
【００７６】
フィルムはまた、合成または天然起源の他の活性成分、例えば局所麻酔作用物質、例えば、リドカインおよびプリロカイン、抗炎症性活性物質、例えば、ケトプロフェン、イブプロフェン、アルニカ、こでまり(spirea)、マロー(mallow)、抗生剤、例えばドキシサイクリン、または、化粧品および医用化粧品、例えば、皮膚清浄剤を含んだり、または、これらと連合させることができる。フィルムはまた、他の賦形剤物質、例えば、風味補正物質、例えば、精油、天然または合成香味料、甘美料、食品および医学用途で承認された着色料、人工甘美料および口腔用途製剤の製造分野で熟練者に公知の他の物質を含み得る。
【００７７】
その他にも、本発明にかかる粘膜粘着性フィルムは、組合せて、同時に、連続（sequential）に、または遅延させて投与のための他の薬学的、医用化粧品的、そして皮膚科学的に活性である成分と組み合わせてキットに含まれてもよい。
【００７８】
本発明にかかる粘膜粘着性フィルムは上記定義された通り理解されるプロバイオティックスで効果的に治療できる、動物および人間の粘膜の疾患および病態の予防と治癒、そして治癒的個人衛生のために用いることができる。特に望ましいプロバイオティックは、ラクトバチルス・ブレビスATCC 4006である。他の望ましいプロバイオティックスは、ラクトバチルス・サリヴァリゥスDSM 24800、ラクトバチルス・プランタルムDSM 24801、ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM 24731、ラクトバチルス・アシドフィルスDSM 24735、ラクトバチルス・デルブリッキィ亜種ブルガリクスDSM 24734、ラクトバチルス・パラカセイDSM 24733、ラクトバチルス・プランタルムDSM 24730、ビフィドバクテリウム・ロングム(longum)DSM 24736、ビフィドバクテリウム・インファンティス(infantis)DSM 24727、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(breve)DSM 24732である。
【００７９】
特に望ましくは、口腔の病態、例えば、多様な原因の口腔潰瘍、アフタおよび歯周病態である。胃、生殖器、肛門、鼻、耳および皮膚粘膜の病態、例えば、非制限的な例として、膣炎および膣症、直腸痔核炎症、副鼻腔炎、耳炎、結膜炎、胃炎、食道炎、粘膜損傷、全身疾患の粘膜兆候、擦過傷、開放創、皮膚潰瘍および悪創、具体的に褥瘡（pressure sore）が特に望ましい。
【００８０】
具体的に、口腔の病態は、例えば虫歯、歯周障害、および口臭、歯肉炎、口腔粘膜炎、アフタ口内炎、潰瘍、例えばベーチェット症候群を病む患者に存在する口腔潰瘍、口腔内微生物不均衡症、粘膜内細胞増殖および炎症性過程、急性および慢性歯周炎、急進性歯周炎、歯肉出血、特にミュータンス菌グループに属するレンサ球菌の成長と関連した病態、バクテリア種、例えばポルフィロモナス・ジンジバリス、トレポネーマデンティコラ、タンネレラ・フォーサイシア、およびアグリゲイティバクター・アクチノミセテムコミタンスの増殖に関連する状態である。本発明にかかるフィルムはまた、粘膜に影響を及ぼしかねない化学療法治療を受けた患者の問題をも緩和させて、抗腫瘍治療に対する順応性を増加させるのにも役立つ。皮膚で発生した腫瘍、例えば、黒色腫がまた望ましい。
【００８１】
本発明の長所を次の通り要約することができる。
【００８２】
新鮮な培養物を使うのと比較時より高い濃度の凍結乾燥されたプロバイオティックスを使って、高いプロバイオティック積載が可能で、生産工程が簡単であり、バクテリア酵素生成物が使われる場合に保存寿命が延びて、保存される期間の安定性が優秀で、フィルムの両方の表面上に菌株を異なるように分布させて酵素または、菌株の指向的放出、および多様な適用(口腔に向けたり、または、粘膜に向けるようにすることができる)が可能である。また、決まった位置で粘膜粘着性システムの長期間滞留が可能で、活性酵素成分の長期間の持続放出が可能で、長期間活性酵素放出を持続させる長い水和時間(吸湿性/吸水性)を確保し、製剤戦略によりフィルムのきわめて低いフィルム重量およびフィルム厚さを確保することができる。
【００８３】
これらデータは本発明にかかる粘膜粘着性フィルムがこの粘膜粘着性フィルムの片方面にだけプロバイオティックが存在するおかげで、治療に必要な条件にしたがい、口腔または歯肉に向かって長期間、適合するように指向可能な放出に適合していることを示唆している。
【００８４】
本発明にかかる粘膜粘着性フィルムは薬学および非薬学用途のための製造物品、例えば、適合のため包装材ユニットに包装され得る個別使い捨てユニット、または、後にフィルムのサイズをユニットが適用される部分に合わせるために適用時点ではさみを使って分けられるより大きいサイズのユニットを製造するのに用いることができる。このフィルムで、また、例えば、使用時点で切断できるテープを形成するように適合するように装填されて巻き取られた紐状のストリップを製造することが可能である。
【００８５】
本発明にかかる方法において、粘膜、具体的に口腔粘膜によく合う、厚さが0.01〜2mm、望ましく0.015〜0.2mmである高度な柔軟性を持つフィルムを得ることが可能だ。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例は本発明の例示のための観点で提供するものであり、その範囲を限定するものではない。
【００８７】
材料
ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC,Methocel K100)、ポリビニルピロリドンK15(PVP)およびプロピレングリコール(PG)はFluka(Milan,Italy)から入手した。Ｌ.プレビスATCC 4006はNamu(Seoul,Korea)から純粋な凍結乾燥形態[(グラム当り1011コロニー形成ユニット(CFUC/g)]で供給された。MRS、栄養寒天(NA)およびサブローデキストロース寒天(SDA)はDifco(Becton,Dickinson and Co.、Sparks,MD)から入手し、Anaerocult AはMerck KGaA(Darmstadt,Germany)から取得した。すべての他の化学物および溶媒は分析用等級でありCarlo Erba(Milan,Italy)から取得した。水和、粘膜粘着および放出実験は燐酸でpH6.8へ上昇させた水性緩衝液(33.87mMのKH2PO4、46.79mMのNa2HPO4・12H2O)で遂行した。
【００８８】
実施例１：HPMCおよびプロピレングリコールを含有するOTFの製造
ヒドロキシプロピルメチルセルロース(2.5%w/w)およびプロピレングリコール(1%)を蒸溜水に溶解させて、その溶液を8時間撹はんした。粘性溶液を大気温度で一晩定置し気泡が確実に消えるようにした。続いて、この溶液(6.7g)をペトリ皿(直径5cm)に注いで均一に分布させて50℃で5時間乾燥させた。続けて、表面積を限定するために高さが1cmで直径が1cmであるガラスリングを使ってＬ.プレビスATCC 4006の凍結乾燥粉末を1cm直径のフィルム表面上に噴霧した(12.7mg/cm2)。最後に、ペトリ皿をフィルムが定量となるときまで24時間乾燥器に置いた。
【００８９】
実施例２：実施例１の口腔フィルムの特徴づけ
2.1.フィルム厚さ
平均厚さ(ミツトヨゲージ、Mitutoyo Mfc Co. Ltd,Tokyo,Japan)および平均重量(電子秤)を各ロットの3つのフィルムの観察によって決めた。厚さの均一性は各ロットのフィルム当り5つのポイントで評価した。実行された測定結果を表1に示す。
【００９０】
【表１】
2020510099.tif 000003
【００９１】
2.2.口腔フィルム水和実験
試験管内水和実験は人間唾液を模擬したpH6.8の燐酸塩緩衝液で遂行し、事前に定めた時点で重量増加を測定した(Abruzzo et al.、2012)。フィルムを秤量してpH6.8の燐酸塩緩衝液で液浸されたフィルター(直径40mm)上に置いてあらかじめ水和媒質に液浸させたスポンジ(5cm×5cm×2cm)上に位置させて0.5cm深さで同一の緩衝液が満たされたペトリ皿に置いた。水吸収率は次の式を使って、6時間後フィルムの重量増加として定めた。
【００９２】
（式１）
%吸収率(WU)=(WHip-WHp-WDi)/WDi
【００９３】
上記式でWHipは水和されたフィルムおよび湿潤なフィルター紙の重量で、WHpは湿潤なフィルター紙の重量であり、WDiは乾燥フィルムの初期重量である。このような測定は各ロットの3つのフィルムで遂行しその結果を図２に示した。
【００９４】
2.3.熱重量分析(TGA)による水分含有量の決定
本発明にかかる粘膜粘着性フィルムの水分含有量は相異なる保存条件下でフィルムの完全性を評価して水分含有量を研究するためにTA Q50装備(β=10 K m-1、静的空気雰囲気、温度30-100℃、15分間100℃で一定に維持)を使って測定した。このような測定は各ロットの3つのフィルムで遂行した。
【００９５】
3種のフィルムロットを生産した。これらロットは6ヶ月の間、２つの異なる温度(+2〜8℃および+24℃)で、例えば、無数シリカゲルを含有する、脱水容器内に保存した。水分含有量は異なった時点:0時(t0)、2週(t1)、4週(t2)、8週(t3)、12週(t4)、24週(t5)、36週(t6)および48週(t7)でに評価した。
【００９６】
【表２】
2020510099.tif 000004
【００９７】
2.4.口腔フィルムの粘膜粘着性特性の生体内研究
口腔フィルムの粘膜粘着特性は、25才ないし40才の健常な5人の被験者でテストした。被験者はフィルムを糸切り歯上の歯肉粘膜に適用して、60秒間押して(Perioli et al.、2004)、試験過程の間食べたり飲むのを慎むように指示を受けた。試験前に、熱い飲み物(例えば、茶、コーヒー、牛乳など)を少なくとも2時間避ける一方、プロバイオティックスおよび殺菌口腔清潔剤を含有する食べ物/飲み物を少なくとも1週間避けた。フィルムは5時間に渡り観察した。被験者は粘膜の任意刺激および滞留時間(フィルムの完全な除去に必要な時間)を評価するためにモニタリングした。
【００９８】
2.5.安定性研究
2.5.1.Ｌ.プレビスATCC 4006の活力
2〜8℃、および+24℃で保存された粘膜粘着性口腔フィルムでＬ.プレビスATCC 4006の活力を図3に示した通り、多様な時間(t0=基準点、t1=2週、t2=4週、t3=8週、t4=12週、t5=24週、t6=36週、t7=48週)で評価した。
【００９９】
口腔フィルムを0.05%のL-システインを含有する10mLの燐酸塩緩衝液(pH6.8)に懸濁した。24時間37℃で恒温反応がフィルムの完全な溶解のために必要だった。生理的溶液のうち連続希薄物をラクトバチルス用選別バッジである、0.05%のL-システインを含有する固化させたMRSプレート上に接種した。すべてのプレートはAnaerocult Aを含有する嫌気性培養槽を使って、無酸素条件下で48時間37℃で恒温培養させた。その他にも、微生物によるフィルムの汚染を評価するために、同じ連続希薄物をそれぞれ種バクテリアおよび真菌を計測するためのNAおよびSDAプレート上に接種した。すべてのプレートは48時間37℃(NA)および30℃(SDA)で無酸素条件下で恒温培養した。プレート計測は二重に遂行した。得た結果をログ値に変換して平均と標準偏差を計算した。
【０１００】
2.5.2.酵素活性の保存
2〜8℃および+24℃で保存した粘膜粘着性口腔フィルム内のＬ.プレビスATCC 4006の酵素活性を図4に示した通り、多様な時間(t0=基準点、t1=2週、t2=4週、t3=8週、t4=12週、t5=24週、t6=36週、t7=48週)で評価した。
【０１０１】
口腔フィルムを1mLの0.9MのNaClに再懸濁してMisonix超音波装置を使って氷で超音波(30分、交代で1分超音波および1分休息)で処理した(フィルムで得た未処理のバクテリア抽出物)。アルギニンデイミナーゼは一部変形を加えて文献（Zuniga et al.、1998）に記述された通り測定した。簡略に、アルギニンデイミナーゼは引用された文献に提示された既知の方法を使って10mMの燐酸塩緩衝液(pH7.0)、3mMのL-アルギニンおよびフィルムで得た未処理されたバクテリア抽出物の特定体積を含有する反応混合物で検定した。1時間37℃で恒温反応後、12MのHCl付加を通じて反応を中断させた。サンプルを11000×gで20分間遠心分離した。反応で得たシトルリンを変形されたアーチバルド方法(Archibald、1944)を使って決めた。1.5mLの酸性混合物(H2SO4-H3P04；1:3,vol/vol)および1.5%w/vである0.25mLのジアセチルモノオキシム(2,3-ブタンジオンモノオキシム)を1 mLの遠心分離されたサンプルに付加した。このように得た混合物を暗室で30分間沸かした。暗室で20分間冷却させた後、同じ方式で製造されたサンプルおよび標準物(無料シトルリン)の吸光度を490nmで判読した。口腔フィルムのアルギニン加水分解はμmolシトルリン/h/フィルムで表示し、無料シトルリンを使って得た標準曲線と比較して決めた。
【０１０２】
2.6.生体内放出研究
2.6.1.L.プレビスATCC 4006の放出
プロバイオティックの生体内放出研究は、25才ないし40才年齢の5人の健常な被験者で遂行した。
【０１０３】
一連の実験(表３)で、粘膜粘着性フィルムはプロバイオティックを持つ面が口腔に向くようにして、歯肉粘膜に付着するようにした。唾液サンプルはフィルム適用前(t0h)に、そして2時間(t2h)および10時間(t10h)後で得た。微生物学的分析に関連した部門で記述した通り、1 mLの唾液を連続して薄めてラクトバチルスの量を決めた。
【０１０４】
他の実験(表４)で、歯肉粘膜での放出を研究するために、プロバイオティックを持つ面が歯肉に向くように粘膜粘着性フィルムを使った。
【０１０５】
【表３】
2020510099.tif 000005
【０１０６】
【表４】
2020510099.tif 000006
【０１０７】
歯肉綿棒はまた、フィルムの適用前(t0h)およびプロバイオティックがない面を使用して歯肉にフィルムの適用後10時間後(t10h)に得た。上記綿棒を2mLの生理的溶液に直ちに含浸させた。生理的溶液を薄めてラクトバチルスを計測した。唾液サンプルと綿棒に対するラクトバチルスの検出限界値は10 CFU/mL(1 log CFU/mL)だった。
【０１０８】
2.6.2.酵素アルギニンデイミナーゼの放出
酵素アルギニンデイミナーゼの生体内放出研究を25才ないし40才年齢の健常な5人の被験者で遂行した。
【０１０９】
粘膜粘着性フィルムをプロバイオティックを持つ面が口腔に向くようにして歯肉粘膜に付着するようにした。唾液サンプルはフィルム適用前(t0h)および適用2時間(t2h)および10時間(t10h)後に得た(表５)。
【０１１０】
唾液サンプルのうちアルギニンデイミナーゼ活性は先に2.5.2で記述した通り測定した。唾液サンプル内アルギニン加水分解はシトルリンのmMとして表示した。
【０１１１】
【表５】
2020510099.tif 000007
【０１１２】
2.7.形態学的分析
SEM(走査電子顕微鏡)分析を口腔フィルムの形態学的構造を研究するために遂行した。フィルムを適合した支持体上に固定させてアルゴンの雰囲気下で金/パラジウムでコーティングした。次にサンプルを1.5kVに設定されたLEO 420顕微鏡(LEO Electron Microscopy Ltd.、England)を使って観察した。
【０１１３】
2.8.統計分析
すべての実験は三重に遂行した。結果は平均± SDで表示した。統計的有意性を決めるためにANOVA検定法を使った。偏差はp <0.05の値で重要と判断した。
【０１１４】
実施例３：HPMC、PVPおよびプロピレングリコールを含有するOTFの製造
ヒドロキシプロピルメチルセルロース(2.5%w/w)、ポリビニルピロリドンK15(17.5%w/w)およびプロピレングリコール(8%w/w)を蒸溜水に溶解させてその溶液を8時間撹はんした。粘性溶液を大気温度に一晩定置し完全に気泡が消えるようにした。続いて、この溶液を0.5 mmの厚さとなるようペトリ皿に注いで均一に分布させて50℃で5時間置いて乾燥させた。続けて凍結乾燥されたＬ.プレビスATCC 4006粉末を、表面積を限定するために高さ1cmで直径が1cmであるガラスリングを使って1cm直径のフィルム表面上に噴霧した(12.7mg/cm2)。最後に、ペトリ皿をフィルム重量が一定になる時まで24時間除湿機に入れた。
【０１１５】
実施例４：他の粘膜粘着性重合体を含有するOTFの製造
実施例３を次の重合体を使って繰り返した。アルギン酸ナトリウム、ヒアルロン酸ナトリウム、アラビアガム(アカシアゴム)、ゼラチンおよびこれの混合物。下記のプロバイオティックスの混合物をフィルムに吹き付けた。ラクトバチルス・サリヴァリゥスDSM 24800、ラクトバチルス・プランタルムDSM 24801、ストレプトコッカス・サーモフィルスDSM 24731、ラクトバチルス・アシドフィルスDSM 24735、ラクトバチルス・デルブリッキィ亜種ブルガリクスDSM 24734、ラクトバチルス・パラカセイDSM 24733、ラクトバチルス・プランタルムDSM 24730、ビフィドバクテリウム・ロングム(longum)DSM 24736、ビフィドバクテリウム・インファンティス(infantis)DSM 24727、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(breve)DSM 24732。
【０１１６】
プロバイオティック混合物は10ないし15mg/cm2の多様な濃度で吹き付けた。
【０１１７】
実施例５：塗布機を使ったHPMC、PVPおよびプロピレングリコールを含有するOTFの製造
ヒドロキシプロピルメチルセルロース(2.0%w/w)、ポリビニルピロリドンK15(18.0%w/w)、およびプロピレングリコール(4.0%)を蒸溜水に希薄にさせてこの溶液を8時間撹はんした。粘性溶液を大気温度に一晩定置し完全に気泡が消えるようにした。次に、この溶液を適合したスクレーパーが装着されたMathis LTE-S(M)塗布機(Mathis,Oberhasli,Switzerland)を使って塗布した。500ミクロン厚さでシリコン基板上に塗布した。このような方式で塗布された溶液を50℃で4分間強制循環式で乾燥させた(塗布器に加熱チャネルが提供されている)。続けて、凍結乾燥されたＬ.プレビスATCC 4006粉末を表面積を限定するために高さ1cmおよび直径1cmのガラスリングを使って1cm直径の表面上に噴霧した(12.7mg/cm2)。続いて、このフィルムを< 40℃の温度で8分間強制循環を行ってより一層乾燥させた。最後に、このフィルムを切断して水分および酸素化透過性分包(sachets)に個別単位で包装した。
【図１Ａ】
2020510099.tif 000008
【図１Ｂ】
2020510099.tif 000009
【図２】
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【図３ａ】
2020510099.tif 000011
【図３ｂ】
2020510099.tif 000012
【図３ｃ】
2020510099.tif 000013
【図４ａ】
2020510099.tif 000014
【図４ｂ】
2020510099.tif 000015
【図４ｃ】
2020510099.tif 000016
【国際調査報告】
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2020510099.tif 000018
2020510099.tif 000019
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2020510099.tif 000021
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