(57)【要約】  ホルマリンに固定された生体試料中の特定のタンパク質を、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）質量分析、または多重反応モニタリング（ＭＲＭ）質量分析とも呼ばれる方法によって直接定量するための方法が提供される。そのような生体試料は化学的に保存および固定され、該生体試料は、ホルマリン固定組織／細胞、ホルマリン固定／パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織／細胞、ＦＦＰＥ細胞ブロックおよびそれらのブロック由来の細胞、ならびにホルマリン固定および／またはパラフィン包埋された組織培養細胞を含む、ホルムアルデヒド含有薬剤／固定剤により処理された組織および細胞から選択される。Liquid Tissue試薬およびプロトコルを使用して前記生体試料からタンパク質試料を調製し、指定タンパク質を、該タンパク質における少なくとも１種以上の記載されたペプチドをＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析法により定量することによって、Liquid Tissue試料中で定量する。検出および／定量することができる前記タンパク質は、ＴＹＭＰ、ＴＲＯＰ２、ＩＮＳＲおよび／またはＦＧＦＲファミリーのタンパク質である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホルマリン固定組織の生体試料におけるタンパク質レベルの測定方法であって、
前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中のタンパク質に由来する１種以上の修飾または非修飾フラグメントペプチドの量を、質量分析を使用して検出および定量すること、および前記試料中の前記タンパク質レベルを算出することを含み；
前記レベルが相対的レベルまたは絶対的レベルであり、かつ、
前記タンパク質が、ＴＹＭＰ、ＴＲＯＰ２、ＩＮＳＲおよび／またはＦＧＦＲファミリーのタンパク質からなる群から選択される、
前記方法。
【請求項２】
前記１種以上の修飾または非修飾フラグメントペプチドの量を検出および定量する前に、前記タンパク質消化物を分画する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記分画工程が、液体クロマトグラフィー、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーまたは逆相高速液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記タンパク質消化物がプロテアーゼ消化物を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記タンパク質消化物がトリプシン消化物を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記質量分析が、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、イオントラップ／四重極ハイブリッド質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析および／または飛行時間型質量分析を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
使用される質量分析の様式が、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）および／または多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質がＴＹＭＰであり、前記フラグメントペプチドが配列番号１のペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質がＴＲＯＰ２であり、前記フラグメントペプチドが配列番号２のペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記タンパク質がＩＮＳＲであり、前記フラグメントペプチドが配列番号３のペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記タンパク質がＦＧＦＲ１、２、３および／または４であり、前記フラグメントペプチドが配列番号４のｐａｎ−ＦＧＦＲペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記タンパク質がＦＧＦＲ１、２および／または３であり、前記フラグメントペプチドが配列番号５のＦＧＦＲペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記タンパク質がＦＧＦＲ１、３および／または４であり、前記フラグメントペプチドが配列番号６のＦＧＦＲペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記タンパク質が単独のＦＧＦＲ１であり、前記フラグメントペプチドが配列番号７の排他的ＦＧＦＲ１ペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記タンパク質が単独のＦＧＦＲ３であり、前記フラグメントペプチドが配列番号８の排他的ＦＧＦＲ３ペプチドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質が単独のＦＧＦＲ４であり、前記フラグメントペプチドが配列番号９および配列番号１０からなる排他的ＦＧＦＲ４ペプチドの群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組織がパラフィン包埋組織である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記組織が腫瘍から得られる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記腫瘍が原発性腫瘍である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記腫瘍が二次腫瘍である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記フラグメントペプチドの定量が、１つの生体試料中の前記フラグメントペプチドの量と、異なる別の生体試料中の同じフラグメントペプチドの量とを比較することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記フラグメントペプチドの定量が、生体試料中の前記フラグメントペプチドの量を、同じアミノ酸配列を有する既知の量の添加された内部標準ペプチドと比較することによって決定することを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記内部標準ペプチドが同位体標識されたペプチドである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記同位体標識された内部標準ペプチドが、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃおよび２Ｈから選択される１種以上の重安定同位体またはそれらの組み合わせを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
タンパク質消化物中の少なくとも１種のフラグメントペプチドの量の検出および定量が、対象における対応するタンパク質の存在および癌の診断ステージ／悪性度／状態との関連を示す、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１種のフラグメントペプチドの量または対応するタンパク質レベルの検出および／または定量の結果と、対象における最適な癌治療の情報提供とを相関させることをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記少なくとも１種のフラグメントペプチドの量または対応するタンパク質レベルの検出および／または定量の結果と、対象における最適な癌治療の情報提供との相関が、他のタンパク質または他のタンパク質に由来するペプチドの量の検出および／または定量と多重形式で組み合わされて、対象における最適な癌治療に関するさらなる情報が提供される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１６年１２月６日に出願された仮出願第６２／４３０，８８７号の優先権を主張するものであり、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
患者の腫瘍組織における１種以上のタンパク質ＴＹＭＰ、ＴＲＯＰ２、ＩＮＳＲおよび／またはＦＧＦＲのタンパク質発現のレベルを測定するための方法が提供される。タンパク質発現は、各全長タンパク質の部分配列に由来する特定のペプチドを定量することによって決定される。各ペプチドは、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）とも呼ばれ、本明細書でＳＲＭ／ＭＲＭアッセイとも呼ばれる、質量分析法に基づく選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を用いて検出される。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ホルマリン固定癌組織等の癌患者組織から得られる細胞において、直接的に特定のフラグメントタンパク質の存在を検出し、その量を定量的に測定するために用いられる。
【０００３】
定量は相対的または絶対的である。絶対的な定量が必要とされる場合、各ペプチドについて測定されたレベルは、測定されたペプチドと同じアミノ酸配列を有する標識された参照ペプチドの既知量と比較される。ペプチドは特定のタンパク質に固有のものであり、従って、１つのペプチド分子は１つのタンパク質分子に由来し、従って、ペプチドの定量的レベルにより、該ペプチドが由来する全体のタンパク質の定量化が可能になる。タンパク質発現の測定は、癌の診断、癌のステージ分類、癌進行の予後診断、様々な癌治療および療法に対する臨床反応の可能性の予測等に用いることができる。
【発明の概要】
【０００４】
生体試料から調製されたタンパク質消化物中のタンパク質に由来する１種以上の修飾または非修飾フラグメントペプチドの量を、質量分析を使用して検出および定量し；前記試料中の前記タンパク質レベルを算出することにより、ホルマリン固定組織の生体試料におけるタンパク質レベルの測定方法が提供される。前記レベルは相対的レベルまたは絶対的レベルであり、前記タンパク質はＴＹＭＰ、ＴＲＯＰ２、ＩＮＳＲおよび／またはＦＧＦＲファミリーのタンパク質であり得る。タンパク質消化物は、トリプシン消化物等のプロテアーゼ消化物を含み得る。組織は、パラフィン包埋組織であり得、かつ、例えば、原発性腫瘍または二次腫瘍等の腫瘍から得られ得る。
【０００５】
タンパク質はＴＹＭＰであり得、フラグメントペプチドは配列番号１のペプチドであり得る。タンパク質はＴＲＯＰ２であり得、フラグメントペプチドは配列番号２のペプチドであり得る。タンパク質はＩＮＳＲであり得、フラグメントペプチドは配列番号３のペプチドであり得る。タンパク質は、ＦＧＦＲ１、２、３および／または４であり得、フラグメントペプチドは配列番号４のｐａｎ−ＦＧＦＲペプチドであり得る。タンパク質はＦＧＦＲ１、２および／または３であり得、フラグメントペプチドは配列番号５のＦＧＦＲペプチドであり得る。タンパク質はＦＧＦＲ１、３および／または４であり得、フラグメントペプチドは配列番号６のＦＧＦＲペプチドであり得る。タンパク質は単独のＦＧＦＲ１であり得、フラグメントペプチドは配列番号７の排他的ＦＧＦＲ１ペプチドであり得る。タンパク質は単独のＦＧＦＲ３であり得、フラグメントペプチドは配列番号８の排他的ＦＧＦＲ３ペプチドであり得る。タンパク質は単独のＦＧＦＲ４であり得、フラグメントペプチドは配列番号９および／または配列番号１０の排他的ＦＧＦＲ４ペプチドであり得る。
【０００６】
消化物は、１種以上の修飾または非修飾フラグメントペプチドの量を検出および定量する前に分画されてもよい。分画工程は、例えば、液体クロマトグラフィー、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーまたは逆相高速液体クロマトグラフィーであり得る。
【０００７】
質量分析としては、タンデム質量分析、イオントラップ質量分析、三連四重極質量分析、イオントラップ／四重極ハイブリッド質量分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析、ＭＡＬＤＩ質量分析および／または飛行時間型質量分析が挙げられ、使用される質量分析の様式は、反応モニタリング（ＳＲＭ）、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）および／または多重選択反応モニタリング（ｍＳＲＭ）であり得る。
【０００８】
一つの実施形態において、フラグメントペプチドの定量は、１つの生体試料中の前記フラグメントペプチドの量と、異なる別の生体試料中の同じフラグメントペプチドの量とを比較することによって達成され得る。別の実施形態では、フラグメントペプチドの定量は、生体試料中の前記フラグメントペプチドの量を、同じアミノ酸配列を有する既知の量の添加された内部標準ペプチドと比較することにより決定することによって達成され得る。内部標準ペプチドは、例えば１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃおよび２Ｈまたはそれらの組み合わせにより標識された同位体標識ペプチドであり得る。
【０００９】
特定の実施形態において、タンパク質消化物中の少なくとも１種のフラグメントペプチドの量の検出および定量は、対象における対応するタンパク質の存在および癌の診断ステージ／悪性度／状態との関連を示す。この方法はまた、少なくとも１種のフラグメントペプチドの量または対応するタンパク質レベルの検出および／または定量の結果と、対象における最適な癌治療の情報提供とを相関させることを含み得る。少なくとも１種のフラグメントペプチドの量または対応するタンパク質レベルの検出および／または定量の結果と、対象における最適な癌治療の情報提供との相関が、他のタンパク質または他のタンパク質に由来するペプチドの量の検出および／または定量と多重形式で組み合わされて、対象における最適な癌治療に関するさらなる情報が提供される。
【００１０】
測定されるタンパク質
ＴＹＭＰ（チミジンホスホリラーゼ、血小板由来内皮細胞増殖因子［ＥＣＧＦ１］、およびグリオスタチンとしても知られる）は、チミジン、デオキシウリジンおよびそれらの類似体（デオキシシチジンを除く）からそれらの各塩基（チミン／ウラシル）および２−デオキシリボース１−リン酸への可逆的リン酸を触媒する酵素であり、ＤＮＡ／ＲＮＡ分解後にヌクレオシドを回収するためのピリミジン回収に重要な役割を果たす。生物学的には、ＴＹＭＰはin vivoで血管新生を促進し、様々な内皮細胞のin vitroでの増殖を促進する血管新生因子である。ＴＹＭＰは、内皮細胞にのみ作用する高度に限定された標的細胞特異性を有する。ＴＹＭＰは、グリア細胞の増殖も制限する。ＴＹＭＰは、癌の発生および治療の両方において二重の役割を果たす。ＴＹＭＰの血管新生作用は腫瘍の増殖を促進するので、癌治療薬のＴＹＭＰ阻害剤の標的となる。ＴＹＭＰは、チミジル酸シンターゼ阻害剤として作用する抗癌剤カペシタビンの活性化において重要な役割を果たすことも見出されている。従って、ＴＹＭＰの存在および定量的レベルは癌治療の選択に関連性があり、患者の腫瘍細胞中のＴＹＭＰタンパク質の定量的な量を知ることは、癌治療決定プロセスにおいて非常に有益である。
【００１１】
ＴＲＯＰ２（腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー２および上皮糖タンパク質−１抗原［ＥＧＰ−１］としても知られる）は、多くの異なる腫瘍型において発現される癌関連タンパク質である。ＴＲＯＰ２は、少なくとも２種のＩ型膜タンパク質を含むファミリーの一員である。ＴＲＯＰ２は、細胞内カルシウムシグナルを伝達し、細胞表面受容体として作用する。ＴＲＯＰ２は癌治療薬の標的であり、従って、ＴＲＯＰ２の存在および定量的レベルは癌治療の選択に関連性がある。従って、患者の腫瘍細胞中のＴＲＯＰ２タンパク質の定量的な量を知ることは、癌治療決定プロセスにおいて非常に有益である。
【００１２】
ＩＮＳＲ（インスリン受容体［ＩＲ］としても知られる）は、インスリン、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩによって活性化される膜貫通受容体であり、チロシンキナーゼ受容体の大分類（large class）に属する。代謝的には、インスリン受容体は、グルコース恒常性の調節、すなわち変性条件下で糖尿病および癌を含む一連の臨床症状をもたらし得る機能的過程において重要な役割を果たす。ＩＮＳＲは癌治療薬の標的であり、従って、ＩＮＳＲの存在および定量的レベルは癌治療の選択に関連性がある。従って、患者の腫瘍細胞中のＩＮＳＲタンパク質の定量的な量を知ることは、癌治療決定プロセスにおいて非常に有益である。
【００１３】
ＦＧＦＲ（線維芽細胞増殖因子受容体としても知られる）は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのタンパク質のメンバーに結合するタンパク質のファミリーを含む。これらの受容体のいくつかは、癌を含む病理学的状態に関与している。これらは４つの異なる関連する受容体をコードする４つの類似のＦＧＦＲ遺伝子（ＦＧＦＲ１−４）であり、これらはそれぞれ３つの免疫グロブリン様ドメインからなる細胞外リガンドドメイン、単一の膜貫通ヘリックスドメイン、およびチロシンキナーゼ活性を有する細胞内ドメインからなる。これらの受容体は、２２のメンバーを含む最大のファミリーの成長因子リガンドのメンバーである線維芽細胞成長因子に結合する。ＦＧＦＲタンパク質の多くの異なるバージョンが癌細胞の増殖の促進に関与しているので、このタンパク質ファミリーの多くの小分子および生物学的阻害剤が癌治療剤として開発されてきた。患者の腫瘍細胞中のこのタンパク質ファミリーの様々なバージョンの定量的な量は、どの癌治療薬が患者にとって最良の治療結果をもたらす可能性が高いかを決定することによって癌治療決定プロセスの情報を提供するために用いることができる。
【００１４】
以下の方法は、癌患者由来のホルマリン固定組織中の測定されたタンパク質のそれぞれを定量する定量的プロテオミクスベースのアッセイを提供する。アッセイからのデータは、例えば、改善された治療方法の一部として、および／または癌治療のための改善された治療決定を下すために用いることができる。
【００１５】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、測定されたタンパク質のそれぞれからの特定のペプチドの相対的または絶対的な定量的レベルを測定するために使用され得、従って、生体試料から得られる所定のタンパク質調製物中の各タンパク質の量を質量分析によって測定する手段を提供する。より具体的には、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ホルマリン固定癌患者組織等の患者組織試料から得た細胞から調製した複合的なタンパク質溶解物試料中で、これらのペプチドを直接測定することができる。ホルマリン固定組織からタンパク質試料を調製する方法は、米国特許第７，４７３，５３２号に記載されており、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第７，４７３，５３２号に記載されている方法は、Expression Pathology Inc.(Rockville, MD)から入手可能なLiquid Tissue試薬およびプロトコルを用いて簡便に実施することができる。
【００１６】
癌患者の組織由来の最も広くそして有利に利用可能な形態の組織は、ホルマリン固定組織、パラフィン包埋組織である。外科的に摘出された組織のホルムアルデヒド／ホルマリン固定は、世界中で癌組織試料を保存する最も一般的な方法であり、標準的な病理診療で認められている慣例である。ホルムアルデヒドの水溶液はホルマリンと呼ばれる。「１００％」ホルマリンは、少量の安定剤、通常は酸化および重合度を制限するためのメタノールを含む、水中のホルムアルデヒド飽和溶液（約４０体積％または３７質量％）からなる。組織を保存する最も一般的な方法は、一般的に１０％中性緩衝ホルマリンと呼ばれる水性ホルムアルデヒドに組織全体を長期間浸漬させ、次いで、固定した組織全体を室温で長い保存期間パラフィンワックスに包埋することである。このように、ホルマリン固定癌組織を分析するための分子分析法は最も広く受け入れられており、癌患者組織の分析のために最も利用されている方法であろう。
【００１７】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの結果は、組織（生体試料）が採取され保存された患者または対象の特定の組織試料（例えば、癌組織試料）中の特定のタンパク質のそれぞれの精密かつ正確な定量レベルを相関させるために用いることができる。これは、癌に関する診断情報を提供するだけでなく、医師または他の医療専門家が患者における適切な治療法を決定することを可能にする。罹患組織または他の患者試料中のタンパク質発現レベルに関する診断上および治療上重要な情報を提供するそのようなアッセイは、コンパニオン診断アッセイと呼ばれる。例えば、そのようなアッセイは、癌のステージまたは悪性度を診断し、患者が最も応答しそうな治療薬を決定するように設計することができる。
【００１８】
本明細書中に記載されるアッセイは、特定のタンパク質からの特定の非修飾ペプチドの相対的または絶対的レベルを測定し、さらに、該特定のタンパク質のそれぞれからの特定の修飾ペプチドの絶対的または相対的レベルを測定することができる。修飾の例としては、ペプチド上に存在するリン酸化アミノ酸残基およびグリコシル化アミノ酸残基が挙げられる。
【００１９】
各タンパク質の相対的定量レベルは、ＳＲＭ／ＭＲＭ法によって、例えば、異なる試料中のタンパク質に由来する個々のフラグメントペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積（signature peak area）（例えば、特徴的ピーク面積または積分フラグメントイオン強度）を比較することによって決定される。あるいは、各ペプチドがそれ自体の特定のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを有する複数の特徴的ペプチドについての複数のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積を比較して、１種以上のさらなるまたは異なる生物学的試料における同じタンパク質の含有量に対する１種の生体試料中の相対的なタンパク質含有量を決定することができる。このようにして、対象のタンパク質からの特定のタンパク質またはペプチドの量、従って、指定タンパク質の量は、同じ実験条件下の２種以上の生物学的化合物における同一のペプチドまたは複数のペプチドに対して相対的に決定される。さらに、ＳＲＭ／ＭＲＭ法によるそのペプチドの特徴的ピーク面積と、生体試料からの同じタンパク質調製物中の異なるタンパク質または異なる複数のタンパク質からの別の異なるペプチドまたは異なる複数のペプチドの特徴的ピーク面積とを比較することによって、生体試料中の所定のタンパク質からの所定のペプチドまたは異なる複数の所定のペプチドについて相対的な量を決定することができる。このようにして、指定タンパク質からの特定のペプチドの量、従って、そのタンパク質の量は、同じ試料内で互いに相対的に決定される。これらのアプローチは、生体試料からのタンパク質調製物における選択されたペプチドの体積に対する絶対的重量または重量に対する絶対的重量に関わらず、指定タンパク質に由来する個々のペプチドまたは複数の個々のペプチドの、試料間または試料中の他のペプチドまたは複数の他のペプチドの量であって、特徴的ピーク面積により決定される該量が互いに相対的である量に対する定量化が行われる。異なる試料間の個々の特徴的ピーク面積の相対的定量データは、試料ごとに分析されたタンパク質の量に対して正規化される。相対的定量化は、他のペプチド／タンパク質に対する１種のペプチド／タンパク質等の相対的なタンパク質量に関する知見を得るために、単一および／または多くの生体試料中の複数のタンパク質および１種以上の指定タンパク質からの多くのペプチドにおいて同時に行われる。
【００２０】
指定タンパク質の絶対的定量レベルは、例えば、生体試料中の指定タンパク質からの個々のペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積が、スパイク（spiked）内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較することによるＳＲＭ／ＭＲＭ法によって決定される。一つの実施形態では、内部標準は、１種以上の重同位体で標識された１つ以上のアミノ酸残基を含む、指定タンパク質に由来する合成バージョンの同じ正確なペプチドである。そのような同位体標識された内部標準は、質量分析によって分析されたときに、標準が、天然のペプチド特徴的ピークとは異なりかつ区別される、比較の基準となるピーク（comparator peak）として用いられ得る予測可能で一貫性のあるＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを生成するように合成される。従って、内部標準を既知量の生体試料からのタンパク質調製物にスパイクし、質量分析によって分析する場合、天然ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積が内部標準ペプチドのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と比較され、この数値比較は、生体試料由来の元のタンパク質調製物中に存在する天然ペプチドの絶対モル濃度および／または絶対重量のいずれかを示す。フラグメントペプチドの絶対的定量データは、試料ごとの分析されたタンパク質の量に従って表示される。絶対的定量化は、個々の生体試料中および個々の試料の全コホート中の絶対的なタンパク質量についての知見を得るために、単一の生体試料および／または多くの試料において、多くのペプチド、従って多くのタンパク質について同時に行われる。
【００２１】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイ法は、例えばホルマリン固定組織等の患者由来の組織において直接的に癌のステージの診断を補助するために、そして該患者の治療において使用するためにどの治療薬が最も有効であるかを決定するのを補助するために使用できる。部分的または全体的な腫瘍の治療的除去のため等の外科手術によって、または疑わしい疾患の有無を決定するために行われる生検手順を通じてのいずれかによって患者から除去された癌組織を分析し、特定のタンパク質または複数の特定のタンパク質、およびタンパク質を形成するものがその患者の組織に存在するか否かが決定される。さらに、１つのタンパク質または複数のタンパク質の発現レベルを決定し、健康な組織に見られる「正常な」レベルまたは参照レベルと比較することができる。健康な組織に見られる正常レベルまたは参照レベルのタンパク質は、例えば、癌に罹患していない１または複数の個体の関連組織に由来し得る。あるいは、癌に罹患していない関連組織の分析によって、癌を有する個体について正常レベルまたは参照レベルを得ることができる。指定タンパク質のうちの１種、いくつか、または全てからのタンパク質レベルのアッセイもまた、タンパク質レベルを用いることによって、癌と診断された患者または対象における癌のステージを診断するために使用され得る。
【００２２】
指定タンパク質に由来する個々のペプチドのレベルは、分析されたタンパク質溶解物の総量当たりの、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって決定されたペプチドのモル量として定義される。従って、１または複数の指定タンパク質に関する情報は、該タンパク質（または該タンパク質からのフラグメントペプチド）のレベルを、正常組織で観察されるレベルと相関させることによって、癌のステージまたはグレードを決定するのに有用である。１または複数の指定タンパク質の量が癌細胞において決定されると、その情報は、例えば、アッセイされた該タンパク質の異常な発現で特徴付けられる癌細胞を特異的に治療するために開発された（化学的または生物学的）治療薬のリストと適合させることができる。タンパク質アッセイからの情報を、例えば、指定タンパク質またはタンパク質を発現する細胞／組織を特異的に標的とする治療薬のリストと適合させることにより、疾患を治療するための個別化医療アプローチと呼ばれるものが定義される。本明細書に記載のアッセイ方法は、患者自身の組織からのタンパク質の分析を診断および治療決定のための情報源として使用することによって、個別化医療アプローチの基礎を形成する。
【００２３】
原則として、例えば既知の特異性を有するプロテアーゼ（例えば、トリプシン）で消化することによって調製された、指定タンパク質に由来する任意の予測されるペプチドは、質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを用いて試料中の指定タンパク質の存在量を決定するための代替レポーターとして使用できる。同様に、指定タンパク質中で潜在的に修飾されていることが知られている部位にアミノ酸残基を含有する任意の予測されるペプチド配列もまた、潜在的に試料中の指定タンパク質の修飾の程度をアッセイするために使用できる。
【００２４】
指定タンパク質に由来する適切なフラグメントペプチドは、米国特許第７，４７３，５３２号において提供されているLiquid Tissueプロトコルの使用によることを含む様々な手段によって生成され得る。Liquid Tissueプロトコルおよび試薬は、組織／生体試料であるタンパク質ＩＩＩをタンパク質消化することによって、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から質量分析に適したペプチド試料を調製することができる。Liquid Tissueプロトコルでは、組織／生体試料を緩衝液中で長時間加熱して（例えば、約８０℃〜約１００℃で約１０分〜約４時間）、タンパク質架橋を置き換える（reverse）か、または除去する。使用される緩衝剤は中性緩衝剤（例えば、トリスベースの緩衝剤、または界面活性剤を含有する緩衝剤）である。熱処理後、組織／生体試料を、限定されないが、トリプシン、キモトリプシン、ペプシンおよびエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃを含む１または複数のプロテアーゼで、生体試料の組織および細胞構造を破壊するのに十分な時間処理する。加熱およびタンパク質分解の結果物は、液体の可溶性の希釈可能な生体分子溶解物である。
【００２５】
驚くべきことに、上に列挙したタンパク質からの最も可能性のあるペプチド配列は、すぐには明らかではない理由から、質量分析ベースのＳＲＭ／ＭＲＭアッセイでの使用には不適当であるかまたは無効であることが分かった。ＭＲＭ／ＳＲＭアッセイに最も適したペプチドを予測することは不可能であったので、実際のLiquid Tissue溶解物中の修飾および非修飾ペプチドを実験的に同定して、指定タンパク質のそれぞれについて信頼でき正確なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを実施する必要があった。いかなる理論にも束縛されることを望まないが、いくつかのペプチドは、それらが十分にイオン化しないか、または他のタンパク質と異なるフラグメントを生成しないので、例えば、質量分析による検出が困難であり得ると考えられる。ペプチドはまた、分離（例えば、液体クロマトグラフィー）において十分に分割することができないか、またはガラスまたはプラスチック製品に付着することがある。
【００２６】
表Ｉに見られるペプチドは、ホルマリン固定癌組織から得られた細胞から調製された複合的なLiquid Tissue溶解物内の全てのタンパク質のプロテアーゼ消化によって、それぞれの指定タンパク質から誘導された。特記しない限り、それぞれの場合においてプロテアーゼはトリプシンであった。次いで、Liquid Tissue溶解物を質量分析によって分析して、質量分析によって検出および分析された、指定タンパク質に由来するペプチドを決定した。質量分析のためのペプチドの特定の好ましいサブセットの同定は以下に基づく；１）Liquid tissue溶解物の質量分析において、どのペプチドまたはタンパク質由来のペプチドがイオン化するかの実験的決定、および２）Liquid tissue溶解物の調製に用いられるプロトコルおよび実験条件に耐えるペプチドの能力。この後者の性質は、ペプチドのアミノ酸配列だけでなく、ペプチド内の修飾アミノ酸残基が試料調製中に修飾形態で生き残る能力にも及ぶ。
【００２７】
ホルマリン（ホルムアルデヒド）固定組織から直接得られた細胞からのタンパク質溶解物を、Liquid Tissue試薬と、組織顕微解剖を介して細胞を試料チューブに収集し、次いで、該細胞をLiquid tissue緩衝液中で長時間加熱することを伴うプロトコルとを用いて調製した。ホルマリン誘導架橋が悪影響を受けたら、組織／細胞をプロテアーゼを用いて一般的な方法で完全に消化する。適切なプロテアーゼとしては、限定されないが、トリプシンが挙げられる。各タンパク質溶解物は、完全なポリペプチドをプロテアーゼで消化することによってペプチドの集合体に還元される。各Liquid Tissue溶解物を（例えば、イオントラップ質量分析によって）分析して、ペプチドの複数の包括的なプロテオーム調査を行った。単一の複合的なタンパク質／ペプチド溶解物から可能な限り多くのペプチドを同定するための包括的なプロファイリングを行うことができるイオントラップ質量分析計または別の形態の質量分析計が典型的には使用される。しかしながら、イオントラップ質量分析計が、ペプチドの包括的なプロファイリングを行うための最良の種類の質量分析計であり得る。
【００２８】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ、イオントラップまたは三連四重極を含む任意の種類の質量分析計において展開および実行することができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに最も有利な装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。使用された条件下で、単一の溶解物の単一のＭＳ分析において可能な限り多くのペプチドが同定されると、次にペプチドのリストが照合され、その溶解物中に検出されたタンパク質を決定するために使用された。そのプロセスを複数のLiquid Tissue溶解物について繰り返し、非常に長いペプチドのリストを単一のデータセットにまとめた。その種類のデータセットは、（プロテアーゼ消化後に）分析されるその種類の生体試料中で、具体的には生体試料のLiquid Tissue溶解物中で検出することができ、従って、指定タンパク質のそれぞれに対するペプチドを含むペプチドを表すと考えることができる。
【００２９】
一つの実施形態において、指定タンパク質の絶対量または相対量の決定において有用であると同定されたトリプシン処理ペプチドを表１に列挙する。これらのペプチドのそれぞれを、ホルマリン固定パラフィン包埋組織から調製したLiquid Tissue溶解物中の質量分析により検出した。従って、各ペプチドは、ホルマリン固定患者組織において直接を含む、ヒト生体試料中の指定タンパク質についての定量的ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを展開するために使用され得る。
【００３０】
【表１】
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【００３１】
配列番号４のペプチドはＦＧＦＲ１〜４に見出されるため、このペプチドを検出することにより４つ全ての受容体の定量化が可能となる。配列番号５のペプチドはＦＧＦＲ１〜３に見出されるため、このペプチドを検出することによりこれら３つの受容体の定量化が可能となる。配列番号６のペプチドはＦＧＦＲ１、３および４に見出だされるため、このペプチドを検出することによりこれら３つの受容体の定量化が可能となる。配列番号７〜１０のペプチドは、それぞれＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３およびＦＧＦＲ４に見出されるため、各ペプチドを検出することにより単一の受容体の排他的な定量化が可能となる。
【００３２】
表１に列挙されたトリプシンペプチドは、典型的には、例えば前立腺、結腸および乳房を含む異なるヒト臓器の複数の異なるホルマリン固定組織の複数のLiquid Tissue溶解物から検出される。
【００３３】
ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを実施する際の考慮すべき事項の１つは、ペプチドの分析に用いられ得る機器の種類である。ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、ＭＡＬＤＩ、イオントラップまたは三連四重極を含む任意の種類の質量分析計で展開および実施することができるが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに最も有利な装置プラットフォームは、三連四重極装置プラットフォームであると考えられることが多い。その種類の質量分析計は、細胞内に含まれる全てのタンパク質からの数十万から数百万の個々のペプチドからなり得る非常に複雑なタンパク質溶解物中の単一の単離された標的ペプチドを分析するための最適な装置であると考えられ得る。記載された方法は、１）指定タンパク質についての質量分析ベースＳＲＭ／ＭＲＭアッセイに使用することができる各指定タンパク質から候補ペプチドを同定する、２）指定タンパク質からの標的ペプチドを相関させるために個々のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイまたはアッセイを展開する、および３）癌診断および／または最適な治療法の選択のための定量的アッセイを適用するために用いられる。
【００３４】
アッセイ法
１．タンパク質に対するＳＲＭ／ＭＲＭ候補フラグメントペプチドの同定
ａ．タンパク質を消化するために、（トリプシンを含んでも含まなくてもよい）１または複数のプロテアーゼを使用してホルマリン固定生体試料からLiquid Tissueタンパク質溶解物を調製する
ｂ．イオントラップタンデム質量分析計でLiquid Tissue溶解液中の全てのタンパク質フラグメントを分析し、個々のフラグメントペプチドにリン酸化やグリコシル化等のペプチド修飾が含まれていない指定タンパク質からの全てのフラグメントペプチドを同定する
ｃ．イオントラップタンデム質量分析計でLiquid Tissue溶解液中の全てのタンパク質フラグメントを分析し、例えばリン酸化またはグリコシル化残基等のペプチド修飾を有するタンパク質からの全ての断片ペプチドを同定する
ｄ．全長タンパク質の全体から特異的消化法によって生成された全てのペプチドが潜在的に測定され得るが、ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイの実施に使用される好ましいペプチドは、ホルマリン固定生体試料から調製される複雑なLiquid Tissueタンパク質溶解物において質量分析によって直接的に同定されるものである
【００３５】
２．指定タンパク質からのフラグメントペプチドの質量分析アッセイ
ａ．Liquid Tissue溶解物中で同定された個々のフラグメントペプチドに対する三連四重極質量分析計によるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが、タンパク質由来のペプチドに適用される
ｉ．限定されないが、ゲル電気泳動、液体クロマトグラフィー、キャピラリー電気泳動、ナノ逆相液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーまたは逆相高速液体クロマトグラフィーを含む最適なクロマトグラフィー条件に対するフラグメントペプチドの最適な保持時間を決定する
ｉｉ．ペプチドのモノアイソトピック質量、各ペプチドの前駆体の電荷状態、各ペプチドの前駆体のｍ／ｚ値、各ペプチドのｍ／ｚ遷移イオン、および各フラグメントペプチドの各遷移イオンのイオン型を決定を決定し、各ペプチドについてＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを展開する。
ｉｉｉ．次いで、三連四重極質量分析計による（ｉ）および（ｉｉ）からの情報を用いてＳＲＭ／ＭＲＭアッセイが行われ、各ペプチドは、三連四重極質量分析計により行われた特異的なＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを正確に定義する特徴的かつ特異的なＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークを有する
ｂ．ＳＲＭ／ＭＲＭ質量分析からの特異的なＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積の関数として、検出されたタンパク質のフラグメントペプチドの量が、特定のタンパク質溶解物中のタンパク質の相対量および絶対量の両方を示すことができるように、ＳＲＭ／ＭＲＭ分析を実施する。
ｉ．相対的定量は、以下によって達成され得る：
１．１つのホルマリン固定生体試料からのLiquid Tissue溶解物中で検出された特定のフラグメントペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と、少なくとも第２、第３、第４またはそれ以上のホルマリン固定生体試料からの少なくとも第２、第３、第４またはそれ以上のLiquid Tissue溶解物中の同じフラグメントの同じＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積とを比較することによって、タンパク質の存在の増加または減少を決定する
２．１つのホルマリン固定生体試料からのLiquid Tissue溶解物中で検出された特定のフラグメントペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と、異なる別個の生体資源に由来する他の試料中の他のタンパク質からのフラグメントペプチドから得られたＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積とを比較することによって、タンパク質の存在の増加または減少を決定し、ペプチドフラグメントに関する前記２つの試料間のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積の比較を、各試料中で分析されたタンパク質の量に正規化する
３．タンパク質の変化レベルを、様々な細胞条件下でその発現レベルが変化しない他のタンパク質のレベルに正規化するために、所定のフラグメントペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と、ホルマリン固定生体試料からの同じLiquid Tissue溶解物中の異なるタンパク質に由来する異なるフラグメントペプチドからのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークとを比較することによって、タンパク質の存在の増加または減少を決定する
４．これらのアッセイは、タンパク質の非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドの両方に適用することができ、前記修飾は、限定されないが、リン酸化および／またはグリコシル化を含み、前記修飾ペプチドの相対的レベルが、非修飾ペプチドの相対的レベルを決定するのと同様にして決定される。
ｉｉ．所定のペプチドの絶対的定量化は、個々の生体試料中の指定タンパク質からの所定のフラグメントペプチドについてのＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積と、生体試料からのタンパク質溶解物にスパイクされたフラグメントペプチド内部標準のＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークとを比較することによって達成される
１．内部標準は、調査されている指定タンパク質からのフラグメントペプチドの標識合成バージョンである。この標準は既知の量で試料にスパイクされ、ＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピーク面積は、生体試料中のフラグメントペプチド内部標準とネイティブフラグメントペプチドの両方について別々に決定され、次いで、両方のピーク面積が比較される
２．これは、非修飾フラグメントペプチドおよび修飾フラグメントペプチドに適用され、前記修飾としては、限定されないが、リン酸化および／またはグリコシル化が挙げられ、前記修飾ペプチドの絶対的レベルは、非修飾ペプチドの絶対的レベルを決定するのと同様にして決定することができる。
【００３６】
３．癌の診断と治療にフラグメントペプチド定量を適用する
ａ．指定タンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量化を行い、癌の分野でよく理解されているように、患者の腫瘍組織における癌のステージ／グレード／状態と、指定タンパク質の発現の事前に決定された関連性が確認されることを示す
ｂ．指定タンパク質のフラグメントペプチドレベルの相対的および／または絶対的定量化を行い、異なる治療戦略からの臨床転帰との相関を示し、この相関はすでに当該分野で示されているか、または患者コホートおよびそれらの患者からの組織の相関研究を通して将来示すことができる。従来確立された相関または将来派生する相関のいずれかがこのアッセイによって確認されると、アッセイ法を使用して最適な治療戦略を決定することができる。
【００３７】
それぞれの指定タンパク質からの特異的フラグメントペプチドに関する特徴的かつ特異的な特徴は、イオントラップおよび三連四重極質量分析計の両方による全てのフラグメントペプチドの分析によって明らかになった。興味深いことに、本明細書に記載されるように任意の指定タンパク質由来の全てのペプチドがそのような溶解物中でＳＲＭ／ＭＲＭを使用して検出できるわけではなく、検出されないフラグメントが、ホルマリン固定試料／組織からのLiquid Tissue溶解物中におけるペプチド／タンパク質の直接的な定量化に用いられるＳＲＭ／ＭＲＭアッセイを展開するための候補ペプチドと考えられないことが示唆されることから、その情報は、ホルマリン固定試料／組織からのLiquid Tissue溶解物中において直接的にそれぞれおよび全ての候補ＳＲＭ／ＭＲＭペプチドについて実験的に決定されなければならない。
【００３８】
特定のフラグメントペプチドについての特定のＳＲＭ／ＭＲＭアッセイは、三連四重極質量分析計で行われる。特定のタンパク質ＳＲＭ／ＭＲＭアッセイによって分析される実験試料は、例えば、ホルマリン固定およびパラフィン包埋された組織から調製されたLiquid Tissueタンパク質溶解物である。そのようなアッセイからのデータは、ホルマリン固定試料中のこのフラグメントペプチドについての特異的なＳＲＭ／ＭＲＭ特徴的ピークの存在を示す。
【００３９】
このペプチドの特定の遷移イオン特性は、ホルマリン固定生体試料中の特定のフラグメントペプチドを定量的に測定するために使用される。これらのデータは、分析したタンパク質溶解物１マイクログラム当たりのペプチドのモル量の関数としてのこのフラグメントペプチドの絶対量を示す。ホルマリン固定された患者由来の組織の分析に基づく組織中の対応するタンパク質レベルの評価は、各特定の患者についての診断的、予後的、および治療的に関連する情報を提供することができる。一つの実施形態では、本開示は、生体試料中の表１に列挙される各タンパク質のレベルを測定するための方法を記載し、前記生体試料から調製されたタンパク質消化物中の１種以上の修飾または非修飾フラグメントペプチドの量を、質量分析を使用して検出および／または定量すること；および、前記試料中の修飾または非修飾タンパク質レベルを算出することを含み；前記レベルが相対的レベルまたは絶対的レベルである。関連する実施形態では、１種以上のフラグメントペプチドの定量は、生体試料中の各フラグメントペプチドの量を、既知量の添加された内部標準ペプチドと比較することにより決定することを含み、前記生体試料中の各フラグメントペプチドは、同じアミノ酸配列を有する内部標準ペプチドと比較される。いくつかの実施形態では、内部標準は、同位体標識された内部標準ペプチドであり、１８Ｏ、１７Ｏ、３４Ｓ、１５Ｎ、１３Ｃ、２Ｈから選択される１種以上の重安定同位体またはそれらの組み合わせを含む。
【００４０】
本明細書に記載の生体試料中の指定タンパク質（またはその代替物としてのフラグメントペプチド）のレベルを測定するための方法は、患者または対象における癌の診断指標として使用され得る。一つの実施形態では、指定タンパク質のレベルの測定からの結果を用いて、組織中に見出されるタンパク質のレベルと、正常組織および／または癌組織または前癌組織において見出される該タンパク質のレベルとを相関させることにより、癌の診断ステージ／悪性度／状態が決定される。
【００４１】
核酸とタンパク質の両方を同じLiquid Tissue生体分子調製物から分析することができるので、タンパク質が分析されたのと同じ試料中の核酸から疾患診断および薬物治療の決定に関する追加の情報を得ることが可能である。例えば、指定タンパク質の発現が特定の細胞によって増加する場合、ＳＲＭによってアッセイされると、細胞の状態およびそれらの制御されない増殖の可能性、潜在的な薬剤耐性および癌の発生に関する情報を提供することができるデータを得ることができる。同時に、対応する遺伝子および／または核酸およびそれらがコードするタンパク質の状態に関する情報（例えば、ｍＲＮＡ分子およびそれらの発現レベルまたはスプライス変異）は、同じLiquid Tissue生体分子調製物中に存在する核酸から得ることができ、指定タンパク質のＳＲＭ分析と同時に評価することができる。指定タンパク質由来ではなく、同じ生体分子調製物中に存在する任意の遺伝子および／または核酸は、指定タンパク質のＳＲＭ分析と同時に評価することができる。一つの実施形態では、指定タンパク質および／または１、２、３、４種またはそれ以上の追加のタンパク質に関する情報は、それらのタンパク質をコードする核酸を調べることによって評価することができる。これらの核酸は、例えば、配列決定法、ポリメラーゼ連鎖反応法、制限断片多型分析、欠失、挿入の同定、および／または、限定されないが、一塩基対多型含む突然変異の存在の決定、転移のうちの１つ以上、２つ以上、または３つ以上、またはそれらの組み合わせによって調べることができる。
【配列表】
2020514686000001.app
【国際調査報告】
2020514686.tif 000003
2020514686.tif 000004