(57)【要約】ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６、および腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タンパク質、ならびにがんの処置に有用な医薬組成物および治療方法が記載される。本発明は、腫瘍関連抗原（表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される）、ならびにナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。かかるタンパク質は２種以上のＮＫ活性化受容体と会合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断し得る。
2020533311.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）に結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭ、がん抗原１２５（ＣＡ１２５）、ナトリウム／リン酸共輸送体２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン細胞接着分子４（Ｎｅｃｔｉｎ４）、フコシル−ＧＭ１（モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質８（ＡＤＡＭ８）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９（ＡＤＡＭ９）、溶質キャリアファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、およびシアリル化ルイスａ抗原（ＣＡ１９−９）からなる群から選択される抗原に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）表面抗原分類１６（ＣＤ１６）に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項２】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭに結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項３】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）がん抗原１２５（ＣＡ１２５）、ナトリウム／リン酸共輸送体２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン細胞接着分子４（Ｎｅｃｔｉｎ４）、フコシル−ＧＭ１（モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質８（ＡＤＡＭ８）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９（ＡＤＡＭ９）、溶質キャリアファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、およびシアリル化ルイスａ抗原（ＣＡ１９−９）から選択される腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項４】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）から選択される腫瘍関連抗原に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項５】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）腫瘍関連抗原Ｎｅｃｔｉｎ４に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項６】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）多発性骨髄腫関連抗原フコシル−ＧＭ１に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項７】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、
（ｂ）ＳＬＣ４４Ａ４から選択されるＴ細胞関連腫瘍抗原に結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項８】
前記第１の抗原結合部位が、ヒト、非ヒト霊長類、およびげっ歯動物におけるＮＫＧ２Ｄに結合する、請求項１から７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
前記第１の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１０】
前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、請求項９に記載のタンパク質。
【請求項１１】
前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項９または１０に記載のタンパク質。
【請求項１２】
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
前記第１の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する、請求項１１または１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ断片を含む第１の抗原結合部位と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項１５】
前記ｓｃＦｖが、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する前記第３の抗原結合部位に、Ａｌａ−ＳｅｒまたはＧｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結しており、前記ｓｃＦｖが、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項１４に記載のタンパク質。
【請求項１６】
前記ｓｃＦｖが、前記抗体Ｆｃドメインに連結している、請求項１５に記載のタンパク質。
【請求項１７】
前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成する、請求項１４または１５に記載のタンパク質。
【請求項１８】
前記ジスルフィド架橋が、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００との間で形成されている、請求項１７に記載のタンパク質。
【請求項１９】
前記ｓｃＦｖが前記抗体Ｆｃドメインに連結しており、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインのＮ末端に位置しており、かつ、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインに、可動性リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４（（Ｇ４Ｓ）４）を介して連結しており、前記Ｆａｂが前記抗体Ｆｃドメインに連結している、請求項１８に記載のタンパク質。
【請求項２０】
前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインに、可動性リンカーを介して連結している、請求項１５から１９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２１】
前記可動性リンカーが、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４（（Ｇ４Ｓ）４）を含む、請求項２０に記載のタンパク質。
【請求項２２】
前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置している、請求項１５から２１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２３】
前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインのＮ末端に位置している、請求項２２に記載のタンパク質。
【請求項２４】
前記Ｆａｂ断片が、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する前記第３の抗原結合部位に連結している、請求項１４から２３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２５】
前記Ｆａｂ断片の重鎖部分が、重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、前記重鎖可変ドメインが、前記ＣＨ１ドメインに連結している、請求項２４に記載のタンパク質。
【請求項２６】
前記Ｆａｂ断片が、前記抗体Ｆｃドメインに連結している、請求項２４または２５に記載のタンパク質。
【請求項２７】
配列番号２０８および配列番号２０９から選択される配列を含む、請求項１４から２６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２８】
抗体Ｆｃドメインに連結したｓｃＦｖを含み、前記抗体Ｆｃドメインに連結した前記ｓｃＦｖが、配列番号２１０および配列番号２１１から選択される配列によって表される、請求項１５から２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項２９】
配列番号２１２および配列番号２１３から選択される配列を含む、請求項１５から２７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３０】
配列番号２１０および配列番号２１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１５から２６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３１】
配列番号２１０および配列番号２１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１５から２６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３２】
配列番号２１０および配列番号２１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の配列を含む、請求項１５から２６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３３】
配列番号２１２および配列番号２１３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１５から３２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３４】
配列番号２１２および配列番号２１３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含む、請求項１５から３２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３５】
配列番号２１２および配列番号２１３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の配列を含む、請求項１５から３２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項３６】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む第１の抗原結合部位と、
（ｂ）ＥｐＣＡＭに結合する第２の抗原結合部位と、
（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位と
を含むタンパク質。
【請求項３７】
ＥｐＣＡＭに結合するさらなる抗原結合部位をさらに含む、請求項３６に記載のタンパク質。
【請求項３８】
ＥｐＣＡＭに結合する前記第２の抗原結合部位が、Ｆａｂ断片である、請求項３６または３７に記載のタンパク質。
【請求項３９】
ＥｐＣＡＭに結合する前記第２の抗原結合部位および前記さらなる抗原結合部位が、Ｆａｂ断片である、請求項３７または３８に記載のタンパク質。
【請求項４０】
ＥｐＣＡＭに結合する前記第２の抗原結合部位および前記さらなる抗原結合部位が、ｓｃＦｖである、請求項３６または３７に記載のタンパク質。
【請求項４１】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置している、請求項３６から４０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４２】
前記軽鎖可変ドメインが、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインのＮ末端に位置している、請求項４１に記載のタンパク質。
【請求項４３】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に連結している、請求項３６から４２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４４】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に、Ａｌａ−ＳｅｒまたはＧｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結している、請求項４３に記載のタンパク質。
【請求項４５】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位のＣ末端に、ＳＧＳＧＧＧＧＳを含む可動性リンカー（配列番号２０７）を介して連結している、請求項４３に記載のタンパク質。
【請求項４６】
前記抗体ＦｃドメインのＣ末端が、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインのＮ末端に連結している、請求項４５に記載のタンパク質。
【請求項４７】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインと前記ｓｃＦｖの前記軽鎖可変ドメインとの間でジスルフィド架橋が形成されている、請求項３６から４６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項４８】
前記ジスルフィド架橋が、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００との間で形成されている、請求項４７に記載のタンパク質。
【請求項４９】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖ内で、前記重鎖可変ドメインが、前記軽鎖可変ドメインに、可動性リンカーを介して連結している、請求項３６から４８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５０】
前記可動性リンカーが、（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４（Ｇ４Ｓ）４）を含む、請求項４９に記載のタンパク質。
【請求項５１】
前記第２の抗原結合部位ｓｃＦｖおよび前記さらなる抗原結合部位ｓｃＦｖが、ＣＤ１６に結合するのに十分な前記抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する前記第３の抗原結合部位に、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結している、請求項４０から５０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５２】
前記第２の抗原結合部位ｓｃＦｖおよび前記さらなる抗原結合部位ｓｃＦｖが、前記抗体Ｆｃドメインに、Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結している、請求項４０から５１のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５３】
前記第２の抗原結合部位および／または前記さらなる抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインと前記軽鎖可変ドメインとの間でジスルフィド架橋が形成されている、請求項５１または５２に記載のタンパク質。
【請求項５４】
前記ジスルフィド架橋が、前記重鎖可変ドメインのＣ４４と前記軽鎖可変ドメインのＣ１００との間で形成されている、請求項５３に記載のタンパク質。
【請求項５５】
ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、重鎖可変ドメインのＮ末端に位置している軽鎖可変ドメインを含み、前記軽鎖可変ドメインが、前記ｓｃＦｖの前記重鎖可変ドメインに、可動性リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４（Ｇ４Ｓ）４）を介して連結しており、ＮＫＧ２Ｄに結合する前記ｓｃＦｖが、前記抗体Ｆｃドメインに、Ａｌａ−ＳｅｒまたはＧｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結している、請求項３６から５４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項５６】
配列番号２０３のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項５７】
配列番号２０３および配列番号２０４のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項５８】
配列番号２０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項５９】
配列番号２０３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項６０】
配列番号２０３のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むタンパク質。
【請求項６１】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１、配列番号４１、配列番号４９、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６９、配列番号７７、配列番号８５、および配列番号９３から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６２】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号４１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号４２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６３】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号４９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号５０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６４】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号５７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号５８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６５】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号５９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号６０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６６】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号６１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号６２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６７】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号６９と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７０と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６８】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号７７と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号７８と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６９】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号８５と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号８６と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７０】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号９３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号９４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７１】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１０１と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号１０２と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７２】
前記第１の抗原結合部位が、配列番号１０３と少なくとも９０％同一の重鎖可変ドメインと、配列番号１０４と少なくとも９０％同一の軽鎖可変ドメインとを含む、請求項１から６０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７３】
前記第１の抗原結合部位が、単一ドメイン抗体である、請求項１から１０のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７４】
前記単一ドメイン抗体が、ＶＨＨ断片またはＶＮＡＲ断片である、請求項７３に記載のタンパク質。
【請求項７５】
前記第２の抗原結合部位が、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含む、請求項１から１０または７３から７４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７６】
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインおよび前記軽鎖可変ドメインが、同じポリペプチド上に存在する、請求項７５に記載のタンパク質。
【請求項７７】
前記第２の抗原結合部位がＥｐＣＡＭに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが配列番号１１５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１１９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１、２、または６１から７２のいずれかに記載のタンパク質。
【請求項７８】
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
配列番号１１６のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１１７のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１１８のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項７７に記載のタンパク質。
【請求項７９】
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
前記配列番号１２０のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列、
前記配列番号１２１のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列、および
前記配列番号１２２のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項７８に記載のタンパク質。
【請求項８０】
前記第２の抗原結合部位がＥｐＣＡＭに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが配列番号１２３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１２７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１、２、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８１】
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
配列番号１２４のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１２５のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１２６のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項８０に記載のタンパク質。
【請求項８２】
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
配列番号１２８のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１２９のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１３０のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項８１に記載のタンパク質。
【請求項８３】
前記第２の抗原結合部位がＥｐＣＡＭに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが配列番号１３１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１３５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１、２、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８４】
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
配列番号１３２のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１３３のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１３４のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項８３に記載のタンパク質。
【請求項８５】
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
配列番号１３６のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１３７のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１３８のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項８４に記載のタンパク質。
【請求項８６】
前記第２の抗原結合部位がＥｐＣＡＭに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが配列番号１３９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１４３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１、２、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８７】
前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが、
配列番号１４０のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１４１のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１４２のアミノ酸配列と同一の重鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項８６に記載のタンパク質。
【請求項８８】
前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが、
配列番号１４４のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ１配列、
配列番号１４５のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ２配列、および
配列番号１４６のアミノ酸配列と同一の軽鎖ＣＤＲ３配列
を含むアミノ酸配列を含む、請求項８７に記載のタンパク質。
【請求項８９】
前記第２の抗原結合部位がＣＡ１２５に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが配列番号１５５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１５９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１、３、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９０】
前記第２の抗原結合部位がＣＡ１２５に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが配列番号１６３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１６７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１、３、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９１】
前記第２の抗原結合部位がＮａＰｉ２ｂに結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが配列番号１７１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１７５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１、４、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９２】
前記第２の抗原結合部位がＮｅｃｔｉｎ４に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが配列番号１７９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１８３と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１、５、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９３】
前記第２の抗原結合部位がフコシル−ＧＭ１に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが配列番号１８７と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１９１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１、６、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９４】
前記第２の抗原結合部位がＳＬＣ４４Ａ４に結合し、前記第２の抗原結合部位の前記重鎖可変ドメインが配列番号１９５と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、前記第２の抗原結合部位の前記軽鎖可変ドメインが配列番号１９９と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項１、７、または６１から７２のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９５】
前記抗体Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のヒンジおよびＣＨ２ドメインを含む、請求項１から９４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９６】
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１抗体のアミノ酸２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９５に記載のタンパク質。
【請求項９７】
前記Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ１のＦｃドメインと少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含み、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、Ｋ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる、請求項９６に記載のタンパク質。
【請求項９８】
ＮＫＧ２Ｄに１０ｎＭのＫＤまたはそれよりも弱い親和性で結合する、請求項１から９６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９９】
先行する請求項のいずれか一項に記載のタンパク質および薬学的に許容される担体を含む製剤。
【請求項１００】
請求項１から９８のいずれか一項に記載のタンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含む細胞。
【請求項１０１】
請求項１から９８のいずれか一項に記載のタンパク質に腫瘍およびナチュラルキラー細胞を曝露することを含む、腫瘍細胞死を直接的および／または間接的に増強する方法。
【請求項１０２】
請求項１から９８のいずれか一項に記載のタンパク質または請求項９９に記載の製剤を患者に投与することを含む、がんを処置する方法。
【請求項１０３】
前記第２の結合部位がＥｐＣＡＭに結合する場合、前記がんが、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝がん、食道がん、および肺がんからなる群から選択される、請求項１０２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年９月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５５５，１１０号、および２０１７年１０月２日に出願された米国仮特許出願第６２／５６６，８２４号の利益および優先権を主張しており、そのそれぞれの開示全体は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
【０００２】
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０１８年９月６日に作成され、ＤＦＹ−０３８ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、３２１，３９５バイトのサイズである。
【０００３】
本発明は、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６、および腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００４】
がんは、この疾患を処置するための文献に報告されている相当の研究努力および科学進歩にもかかわらず、重大な健康問題であり続けている。最も頻繁に診断されるがんの中には、前立腺がん、乳がん、肺がん、および結腸直腸がんが含まれる。前立腺がんは、男性におけるがんの最も一般的な形態である。乳がんは依然として女性における主要な死因である。多発性骨髄腫、白血病、およびリンパ腫を含む血液および骨髄がんもまた、頻繁に診断されるがんの種類である。これらのがんに対する現在の処置選択肢は、すべての患者に効果的というわけではなく、および／または実質的な有害副作用を有する可能性がある。他の種類のがんも、既存の治療選択肢を使用して処置することが依然として困難である。
【０００５】
がん免疫療法は、それらが非常に特異的であり、患者自身の免疫系を使用してがん細胞の破壊を促進することができるので望ましい。二重特異性Ｔ細胞エンゲージャーなどの融合タンパク質は、腫瘍細胞の破壊を促進するために腫瘍細胞およびＴ細胞に結合する、文献に記載されているがん免疫療法である。ある特定の腫瘍関連抗原およびある特定の免疫細胞に結合する抗体は文献に記載されている。例えば、ＷＯ２０１６／１３４３７１およびＷＯ２０１５／０９５４１２を参照されたい。
【０００６】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、先天性免疫系の構成要素であり、循環リンパ球の約１５％を構成する。ＮＫ細胞は実質的にすべての組織に浸潤し、最初は、事前感作を必要とせずに腫瘍細胞を効果的に殺傷するそれらの能力によって特徴付けられた。活性化されたＮＫ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞と同様の手段によって、すなわち、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒を介して、ならびに死受容体経路を介して、標的細胞を殺傷する。活性化されたＮＫ細胞はまた、標的組織への他の白血球の動員を促進するＩＦＮ−ガンマおよびケモカインなどの炎症性サイトカインを分泌する。
【０００７】
ＮＫ細胞は、それらの表面における様々な活性化受容体および阻害受容体を介してシグナルに応答する。例えば、ＮＫ細胞が健康な自己細胞に遭遇すると、それらの活性は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の活性化によって阻害される。あるいはＮＫ細胞が外来細胞またはがん細胞に遭遇すると、それらは、それらの活性化受容体（例えば、ナチュラルキラーグループ２メンバーＤ（ＮＫＧ２Ｄ）、ＮＣＲ、ＤＮＡＭ１）を介して活性化される。ＮＫ細胞はまた、それらの表面におけるＣＤ１６受容体を介していくつかの免疫グロブリンの定常領域によって活性化される。活性化に対するＮＫ細胞の全体的な感受性は、刺激シグナルおよび阻害シグナルの合計に依存する。
【０００８】
上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）は、上皮におけるＣａ２＋非依存性ホモタイプ細胞間接着を媒介する膜貫通糖タンパク質である。ＥｐＣＡＭは、細胞シグナル伝達、遊走、増殖、および分化にも関与する。さらに、ＥｐＣＡＭには、ｃ−ｍｙｃ、ｅ−ｆａｂｐ、ならびにサイクリンＡおよびＥを上方調節する能力により腫瘍を形成させる潜在性がある。ＥｐＣＡＭは上皮および上皮由来の新生物においてもっぱら発現されるので、ＥｐＣＡＭを、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝がん、食道がん、および肺がんなどの種々のがんの診断マーカーとして使用することができる。ＥｐＣＡＭは、腫瘍形成および癌の転移において役割を果たすようであり、したがって、ＥｐＣＡＭはまた、潜在的な予後マーカーとしておよび免疫療法戦略の潜在的な標的としての機能を果たし得る。
【０００９】
ＣＡ１２５は、ムチン１６としても公知であり、ムチンファミリー糖タンパク質のメンバーである。ＣＡ−１２５は、卵巣がん、子宮体がん、および膵がんを含む特定の種類のがんを有する一部の患者の血液において上昇し得る腫瘍マーカーまたはバイオマーカーとして適用されている。ＣＡ−１２５は、ナチュラルキラー細胞の応答を抑制し、それにより、がん細胞を免疫応答から保護することを含むいくつかの異なる機構によって、および、細胞成長を可能にし、細胞運動性を促進することによって、腫瘍形成および腫瘍増殖の進行において役割を果たすことが示されている。
【００１０】
ナトリウム依存性リン酸輸送タンパク質２ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）は、Ｎａ＋共輸送によるリン酸の細胞内への能動的輸送に関与する。例えば、ＮａＰｉ２ｂは、腸の刷子縁膜における主要なリン酸輸送タンパク質であり、肺胞におけるサーファクタントの合成において役割を有する。ＮａＰｉ２ｂはまた、肺がん、卵巣がん、および甲状腺がんなどの様々ながんにおいて発現される抗原でもある。
【００１１】
Ｎｅｃｔｉｎ４は、Ｃａ２＋非依存性細胞接着に関与する細胞接着分子のファミリーであるネクチンファミリーのメンバーである。ネクチンは、遍在的に発現され、例えば、上皮の接着結合またはニューロン組織の化学的シナプスなど、広範囲の組織における接着の役割を有する。ネクチンはまた、腫瘍関連抗原でもあり、膀胱がん、乳がん、卵巣がん、膵がん、結腸直腸がん、および肺がんなどのがんにおいて発現される。
【００１２】
ガングリオシドは、細胞シグナル伝達プロセスならびに細胞間相互作用および細胞マトリックス間相互作用の両方をモジュレートすることを通じて、成長、分化、遊走、およびアポトーシスを含む多くの生理的プロセスに関係づけられている。ＧＭ１はガングリオシドであり、フコシル−ＧＭ１は、非還元末端において末端ガラクトースがα−１，２−フコシル化された独特の構造を有するガングリオシドである。フコシル−ＧＭ１は、非常に少数の正常組織において発現されるが、小細胞肺がん、神経芽細胞腫、肝がんなどの様々ながんに存在する。したがって、フコシル−ＧＭ１は、腫瘍マーカーおよび小細胞肺がん、神経芽細胞腫、肝がんの抗体免疫療法における標的抗原としての候補と考えられている。
【００１３】
ＡＤＡＭ（ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼ）タンパク質は、膜に結合した分子のタンパク質エクトドメインシェディングにおいて優勢な役割を有する。ＡＤＡＭタンパク質は、発生の間の細胞間シグナル伝達および恒常性の重要な調節因子として現れ、その調節が変更されるがんなどの病理に寄与すると考えられている。ＡＤＡＭ８は、ＡＤＡＭファミリーのメンバーであり、膵がん、乳がん、肺がん、および腎がんにおいて過剰発現される。ＡＤＡＭ９は、ＥＧＦ、ＦＧＦＲ２ｉｉｉｂ、Ｔｉｅ−２、Ｆｌｋ−１、ＥｐｈＢ４、ＣＤ４０、ＶＣＡＭ−１、およびＶＥ−カドヘリンなどの、腫瘍形成および血管新生において重要な役割を有するいくつもの分子を切断し、放出することが示されている。ＡＤＡＭ９は、腎がん、乳がん、肺がん、肝がん、膵がん、黒色腫、子宮頸がん、前立腺がん、骨肉腫、および脳がんにおいて過剰発現される。
【００１４】
ＳＬＣ４４Ａ４は、ＣＴＬ４としても公知であり、コリン輸送体様タンパク質（ＣＴＬ１−５）として公知の溶質キャリアタンパク質のファミリーのメンバーである。ＳＬＣ４４Ａ４は、コリン輸送に関与することは示されていないが、アセチルコリン合成および輸送ならびにビタミンＢ１のリン酸化された形態であるチアミンピロリン酸の取り込みに関連付けられている。ＳＬＣ４４Ａ４は、通常、分泌性上皮細胞の頂端表面に発現されるが、様々な上皮腫瘍、中でも、膵がん、前立腺がん、および胃がんにおいて著しく上方調節される。
ＣＡ１９−９は、炭水化物抗原シアリルルイスａの一般用語である。ＣＡ１９−９は、膵がん、結腸直腸がん、胆管癌、および肝がんなどの消化器のがんにおいて過剰発現される。したがって、ＣＡ１９−９は、これら上記のがんの診断のために最も頻繁に適用される血清腫瘍マーカーである。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２０１６／１３４３７１号
【特許文献２】国際公開第２０１５／０９５４１２号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本発明は、腫瘍関連抗原（表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される）、ならびにナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。かかるタンパク質は２種以上のＮＫ活性化受容体と会合することができ、天然リガンドのＮＫＧ２Ｄへの結合を遮断し得る。ある特定の実施形態では、タンパク質は、ヒトならびにげっ歯動物およびカニクイザルなどの他の種においてＮＫ細胞を刺激し得る。本発明の様々な態様および実施形態を以下にさらに詳細に記載する。
【００１７】
したがって、本発明の一態様は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位と、ＥｐＣＡＭ、がん抗原１２５（ＣＡ１２５）、ナトリウム／リン酸共輸送体２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン細胞接着分子４（Ｎｅｃｔｉｎ４）、フコシル−ＧＭ１（モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質８（ＡＤＡＭ８）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９（ＡＤＡＭ９）、溶質キャリアファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、ならびにシアリル化ルイスａ抗原（ＣＡ１９−９）から選択される抗原に結合する第２の抗原結合部位と、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメイン、その一部分、またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを組み込んだタンパク質を提供する。抗原結合部位は各々、抗体重鎖可変ドメインおよび抗体軽鎖可変ドメイン（例えば、抗体のように配列されるか、またはｓｃＦｖを形成するために一緒に融合される）を組み込んでいてもよいか、または抗原結合部位の１つもしくは複数は、ラクダ科抗体のようなＶＨＨ抗体もしくは軟骨魚類に見出されるもののようなＶＮＡＲ抗体などの単一ドメイン抗体であってもよい。
【００１８】
本発明は、ＮＫＧ２Ｄ受容体、ＣＤ１６、ならびに、ＥｐＣＡＭ、がん抗原１２５（ＣＡ１２５）、ナトリウム／リン酸共輸送体２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン細胞接着分子４（Ｎｅｃｔｉｎ４）、フコシル−ＧＭ１（モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質８（ＡＤＡＭ８）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９（ＡＤＡＭ９）、溶質キャリアファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、ならびにシアリル化ルイスａ抗原（ＣＡ１９−９）から選択される抗原に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。
【００１９】
本開示のいくつかのタンパク質は、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に連結したＦａｂ断片を含む。
【００２０】
本開示のいくつかのタンパク質は、Ｆａｂ断片を含み、ここで、Ｆａｂ断片の重鎖部分は重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、重鎖可変ドメインはＣＨ１ドメインに連結している。
【００２１】
本開示のいくつかのタンパク質は、抗体Ｆｃドメインに連結したＦａｂ断片を含む。
【００２２】
一態様では、本発明は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ断片を含む第１の抗原結合部位と、（ｂ）ＥｐＣＡＭに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを含むタンパク質を提供する。本発明は、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位がＦａｂ断片であり、腫瘍関連抗原ＥｐＣＡＭに結合する第２の抗原結合部位がｓｃＦｖであるタンパク質を提供する。
【００２３】
本開示に記載のある特定のタンパク質は、重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを含み、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に、Ａｌａ−ＳｅｒまたはＧｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介して連結した、ＥｐＣＡＭを標的とするｓｃＦｖを含む。本開示のいくつかのタンパク質は、抗体Ｆｃドメインに連結した、ＥｐＣＡＭを標的とするｓｃＦｖを含む。本開示のいくつかのタンパク質は、ＥｐＣＡＭを標的とするｓｃＦｖの重鎖可変ドメインを含み、この重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとジスルフィド架橋を形成している。
【００２４】
本開示のいくつかのタンパク質は、重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメインのＣ１００との間でジスルフィド架橋が形成されている、ＥｐＣＡＭを標的とするｓｃＦｖを含む。
【００２５】
本開示のいくつかのタンパク質は、抗体Ｆｃドメインに連結した、ＥｐＣＡＭを標的とするｓｃＦｖを含み、ここで、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインのＮ末端に位置しており、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインに、可動性リンカー（ＧｌｙＧｌｙＧｌｙＧｌｙＳｅｒ）４（Ｇ４Ｓ）４）（配列番号２０６）を介して連結しており、ＮＫＧ２Ｄに結合するＦａｂ断片は、抗体Ｆｃドメインに連結している。
【００２６】
本開示のいくつかのタンパク質は、ＥｐＣＡＭを標的とするｓｃＦｖを含み、ここで、重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置している。
【００２７】
本開示のいくつかのタンパク質は、ＥｐＣＡＭを標的とするｓｃＦｖを含み、ここで、軽鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインのＮ末端に位置している。
【００２８】
本発明の一態様では、（ａ）ＮＫＧ２Ｄに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む第１の抗原結合部位と、（ｂ）ＥｐＣＡＭに結合する第２の抗原結合部位と、（ｃ）ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位とを含むタンパク質が提供される。ある特定の実施形態では、本開示のタンパク質は、ＥｐＣＡＭに結合するさらなる抗原結合部位をさらに含む。ある特定の実施形態では、本開示に記載のタンパク質の第２の抗原結合部位は、ＥｐＣＡＭに結合するＦａｂ断片である。ある特定の実施形態では、本開示に記載のタンパク質の第２のおよびさらなる抗原結合部位は、ＥｐＣＡＭに結合するＦａｂ断片である。
【００２９】
ある特定の実施形態では、本開示に記載のタンパク質の第２のおよびさらなる抗原結合部位は、ＥｐＣＡＭに結合するｓｃＦｖである。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖの重鎖可変ドメインは、ｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインのＮ末端またはＣ末端に位置している。ある特定の実施形態では、軽鎖可変ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖの重鎖可変ドメインのＮ末端に位置している。
【００３０】
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に連結している。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位に、Ａｌａ−Ｓｅｒ（例えば、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、ＮａＰｉ２ｂ、Ｎｅｃｔｉｎ４、フコシル−ＧＭ１、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＳＬＣ４４Ａ４、もしくはＣＡ１９−９に結合するさらなる抗原結合部位を含むＴｒｉＮＫＥＴにおいて）またはＧｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（例えば、ＥｐＣＡＭ、ＣＡ１２５、ＮａＰｉ２ｂ、Ｎｅｃｔｉｎ４、フコシル−ＧＭ１、ＡＤＡＭ８、ＡＤＡＭ９、ＳＬＣ４４Ａ４、もしくはＣＡ１９−９に結合するさらなる抗原結合部位を含まないＴｒｉＮＫＥＴにおいて）を含むヒンジを介して連結している。ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインもしくはその一部分またはＣＤ１６に結合する第３の抗原結合部位のＣ末端に、Ｇ４Ｓを含む可動性リンカーを介して連結している。ある特定の実施形態では、抗体ＦｃドメインのＣ末端は、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインのＮ末端に連結している。
【００３１】
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ内で、ｓｃＦｖの重鎖可変ドメインとｓｃＦｖの軽鎖可変ドメインとの間でジスルフィド架橋が形成されている。ある特定の実施形態では、ジスルフィド架橋は、重鎖可変ドメインのＣ４４と軽鎖可変ドメインのＣ１００との間で形成されている。
【００３２】
本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２１０および配列番号２１１から選択される配列を含む。
【００３３】
本開示のいくつかのタンパク質は、抗体Ｆｃドメインに連結したｓｃＦｖを含み、ここで、抗体Ｆｃドメインに連結したｓｃＦｖは、配列番号２０８および配列番号２０９から選択される配列によって表される。
【００３４】
本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２０５および配列番号２１３の配列を含む。
【００３５】
本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２１０および配列番号２１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。
【００３６】
本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２１０および配列番号２１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の配列を含む。
【００３７】
本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２１０および配列番号２１１から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９９％同一の配列を含む。
【００３８】
本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２０３のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２０３および配列番号２０４のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２０３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２０３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。本開示のいくつかのタンパク質は、配列番号２０３のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。
【００４１】
一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、例えば、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一のアミノ酸配列を有すること、および／または配列番号１のＣＤＲ１配列（配列番号１０５）、ＣＤＲ２配列（配列番号１０６）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１０７）と同一のアミノ酸配列を組み込むことにより、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを様々な軽鎖可変ドメインと連結して、ＮＫＧ２Ｄ結合部位を形成することができる。例えば、配列番号１に関連する重鎖可変ドメインを組み込んだ第１の抗原結合部位は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、および４０に関連する配列のいずれか１つから選択される軽鎖可変ドメインをさらに組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位は、配列番号１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインおよび配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、および４０から選択される配列のいずれか１つと少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。
【００４２】
代替的に、第１の抗原結合部位は、配列番号４１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号４２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号４１のＣＤＲ１配列（配列番号４３）、ＣＤＲ２配列（配列番号４４）、およびＣＤＲ３配列（配列番号４５）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号４２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号４２のＣＤＲ１配列（配列番号４６）、ＣＤＲ２配列（配列番号４７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号４８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００４３】
他の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号４９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号５０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号４９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号４９のＣＤＲ１配列（配列番号５１）、ＣＤＲ２配列（配列番号５２）、およびＣＤＲ３配列（配列番号５３）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号５０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号５０のＣＤＲ１配列（配列番号５４）、ＣＤＲ２配列（配列番号５５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号５６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００４４】
代替的に、第１の抗原結合部位は、例えば、配列番号５７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列と、配列番号５８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列とを有することにより、それぞれ、配列番号５７に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号５８に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。
【００４５】
別の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号５９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号６０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号５９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号５９のＣＤＲ１配列（配列番号１０９）、ＣＤＲ２配列（配列番号１１０）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１１１）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号６０のＣＤＲ１配列（配列番号１１２）、ＣＤＲ２配列（配列番号１１３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１１４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００４６】
一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄに結合する第１の抗原結合部位は、配列番号６１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号６２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号６１のＣＤＲ１配列（配列番号６３）、ＣＤＲ２配列（配列番号６４）、およびＣＤＲ３配列（配列番号６５）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号６２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号６２のＣＤＲ１配列（配列番号６６）、ＣＤＲ２配列（配列番号６７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号６８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００４７】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号６９に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号７０に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号６９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号６９のＣＤＲ１配列（配列番号７１）、ＣＤＲ２配列（配列番号７２）、およびＣＤＲ３配列（配列番号７３）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７０と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号７０のＣＤＲ１配列（配列番号７４）、ＣＤＲ２配列（配列番号７５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号７６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００４８】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号７７に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号７８に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号７７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号７７のＣＤＲ１配列（配列番号７９）、ＣＤＲ２配列（配列番号８０）、およびＣＤＲ３配列（配列番号８１）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号７８と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号７８のＣＤＲ１配列（配列番号８２）、ＣＤＲ２配列（配列番号８３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号８４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００４９】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号８５に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号８６に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号８５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号８５のＣＤＲ１配列（配列番号８７）、ＣＤＲ２配列（配列番号８８）、およびＣＤＲ３配列（配列番号８９）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号８６と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号８６のＣＤＲ１配列（配列番号９０）、ＣＤＲ２配列（配列番号９１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号９２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００５０】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、配列番号９３に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号９４に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。例えば、第１の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号９３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号９３のＣＤＲ１配列（配列番号９５）、ＣＤＲ２配列（配列番号９６）、およびＣＤＲ３配列（配列番号９７）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号９４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号９４のＣＤＲ１配列（配列番号９８）、ＣＤＲ２配列（配列番号９９）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１００）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００５１】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、例えば配列番号１０１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列と、配列番号１０２と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列とを有することにより、それぞれ、配列番号１０１に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１０２に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。
【００５２】
一部の実施形態では、第１の抗原結合部位は、例えば配列番号１０３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列と、配列番号１０４と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％）同一のアミノ酸配列とを有することにより、それぞれ、配列番号１０３に関連する重鎖可変ドメインと、配列番号１０４に関連する軽鎖可変ドメインとを組み込んでいてもよい。
【００５３】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＥｐＣＡＭに結合することができ、配列番号１１５に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１１９に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１１５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１１５のＣＤＲ１配列（配列番号１１６）、ＣＤＲ２配列（配列番号１１７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１１８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１１９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１１９のＣＤＲ１配列（配列番号１２０）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１２２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００５４】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＥｐＣＡＭに結合することができ、配列番号１２３に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１２７に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１２３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１２３のＣＤＲ１配列（配列番号１２４）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１２６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１２７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１２７のＣＤＲ１配列（配列番号１２８）、ＣＤＲ２配列（配列番号１２９）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１３０）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００５５】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＥｐＣＡＭに結合することができ、配列番号１３１に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１３５に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１３１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１３１のＣＤＲ１配列（配列番号１３２）、ＣＤＲ２配列（配列番号１３３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１３４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１３５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１３５のＣＤＲ１配列（配列番号１３６）、ＣＤＲ２配列（配列番号１３７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１３８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００５６】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＥｐＣＡＭに結合することができ、配列番号１３９に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１４３に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１３９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１３９のＣＤＲ１配列（配列番号１４０）、ＣＤＲ２配列（配列番号１４１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１４２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１４３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１４３のＣＤＲ１配列（配列番号１４４）、ＣＤＲ２配列（配列番号１４５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１４６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００５７】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＡ１２５に結合することができ、配列番号１５５に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１５９に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１５５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１５５のＣＤＲ１配列（配列番号１５６）、ＣＤＲ２配列（配列番号１５７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１５８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１５９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１５９のＣＤＲ１配列（配列番号１６０）、ＣＤＲ２配列（配列番号１６１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１６２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００５８】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＣＡ１２５に結合することができ、配列番号１６３に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１６７に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１６３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１６３のＣＤＲ１配列（配列番号１６４）、ＣＤＲ２配列（配列番号１６５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１６６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１６７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１６７のＣＤＲ１配列（配列番号１６８）、ＣＤＲ２配列（配列番号１６９）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１７０）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００５９】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＮａＰｉ２ｂに結合することができ、配列番号１７１に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１７５に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１７１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１７１のＣＤＲ１配列（配列番号１７２）、ＣＤＲ２配列（配列番号１７３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１７４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１７５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１７５のＣＤＲ１配列（配列番号１７６）、ＣＤＲ２配列（配列番号１７７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１７８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００６０】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、Ｎｅｃｔｉｎ４に結合することができ、配列番号１７９に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１８３に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１７９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１７９のＣＤＲ１配列（配列番号１８０）、ＣＤＲ２配列（配列番号１８１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１８２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１８３と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１８３のＣＤＲ１配列（配列番号１８４）、ＣＤＲ２配列（配列番号１８５）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１８６）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００６１】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、フコシル−ＧＭ１に結合することができ、配列番号１８７に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１９１に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１８７と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１８７のＣＤＲ１配列（配列番号１８８）、ＣＤＲ２配列（配列番号１８９）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１９０）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９１と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１９１のＣＤＲ１配列（配列番号１９２）、ＣＤＲ２配列（配列番号１９３）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１９４）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００６２】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＳＬＣ４４Ａ４に結合することができ、配列番号１９５に関連する重鎖可変ドメインおよび配列番号１９９に関連する軽鎖可変ドメインを組み込んでいてもよい。例えば、第２の抗原結合部位の重鎖可変ドメインは、配列番号１９５と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１９５のＣＤＲ１配列（配列番号１９６）、ＣＤＲ２配列（配列番号１９７）、およびＣＤＲ３配列（配列番号１９８）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。同様に、第２の抗原結合部位の軽鎖可変ドメインは、配列番号１９９と少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％）同一であってよく、かつ／または配列番号１９９のＣＤＲ１配列（配列番号２００）、ＣＤＲ２配列（配列番号２０１）、およびＣＤＲ３配列（配列番号２０２）と同一のアミノ酸配列を組み込んでいてもよい。
【００６３】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、第１の抗原結合部位に存在する軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインを組み込んでいる。
【００６４】
一部の実施形態では、タンパク質は、ＣＤ１６に結合するのに十分な抗体Ｆｃドメインの一部を組み込んでおり、ここで、抗体Ｆｃドメインは、ヒンジおよびＣＨ２ドメイン、ならびに／またはヒトＩｇＧ抗体のアミノ酸配列２３４〜３３２と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含む。
【００６５】
本開示のいくつかのタンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに１０ｎＭのＫＤまたはそれよりも弱い親和性で結合する。
【００６６】
これらのタンパク質の１つを含有する製剤；これらのタンパク質を発現する１つまたは複数の核酸を含有する細胞、およびこれらのタンパク質を使用して腫瘍細胞死を増強する方法も提供される。
【００６７】
本発明の別の態様は、患者におけるがんを処置する方法を提供する。方法は、治療有効量の本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を、それを必要とする患者に投与することを含む。多重特異性結合タンパク質を使用して処置される例示的ながんとしては、例えば、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝がん、食道がん、および肺がんが挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、ヘテロ二量体の多重特異性抗体（三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ））の図である。各アームは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン、または腫瘍関連抗原結合ドメインのいずれかを表し得る。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインと腫瘍関連抗原結合ドメインは共通の軽鎖を共有し得る。
【００６９】
【図２】図２は、ヘテロ二量体の多重特異性抗体の図である。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインまたは腫瘍関連抗原結合ドメインのいずれかは、ｓｃＦｖフォーマットを取り得る（右アーム）。
【００７０】
【図３】図３は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるヒト組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。
【００７１】
【図４】図４は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるカニクイザル組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。
【００７２】
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡアッセイにおけるマウス組換えＮＫＧ２Ｄに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合親和性を示す線グラフである。
【００７３】
【図６】図６は、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）倍率を示すフローサイトメトリーによる、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示す棒グラフである（ＦＯＢ）。
【００７４】
【図７】図７は、バックグラウンドに対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）倍率を示すフローサイトメトリーによる、マウスＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の結合を示す棒グラフである（ＦＯＢ）。
【００７５】
【図８】図８は、天然リガンドのＵＬＢＰ−６と競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。
【００７６】
【図９】図９は、天然リガンドのＭＩＣＡと競合することによる、組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。
【００７７】
【図１０】図１０は、天然リガンドのＲａｅ−１デルタと競合することによる、組換えマウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の特異的結合親和性を示す線グラフである。
【００７８】
【図１１】図１１は、ヒトＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−アルファ陽性細胞のパーセンテージを定量することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。
【００７９】
【図１２】図１２は、マウスＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータ融合タンパク質を発現するＴＮＦ−アルファ陽性細胞のパーセンテージを定量することにより、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫＧ２Ｄの活性化を示す棒グラフである。
【００８０】
【図１３】図１３は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【００８１】
【図１４】図１４は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるヒトＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【００８２】
【図１５】図１５は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【００８３】
【図１６】図１６は、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）によるマウスＮＫ細胞の活性化を示す棒グラフである。
【００８４】
【図１７】図１７は、腫瘍細胞に対するＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の細胞傷害効果を示す棒グラフである。
【００８５】
【図１８】図１８は、示差走査型蛍光定量法によって測定された、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン（クローンとして列記されている）の融解温度を示す棒グラフである。
【００８６】
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｃは、ＣＤ１６結合およびＮＫＧ２Ｄ結合を使用したＮＫ細胞の相乗的活性化の棒グラフである。図１９Ａは、ＣＤ１０７ａのレベルを示し、図１９Ｂは、ＩＦＮ−γのレベルを示し、図１９Ｃは、ＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γのレベルを示す。グラフは、平均（ｎ＝２）±ＳＤを示している。データは、５名の異なる健康なドナーを使用した、５つの独立した実験を代表するものである。
【００８７】
【図２０】図２０は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体であるＴｒｉｏｍａｂ形態における三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）の図である。このキメラは、２つの親抗体に由来する２つの半抗体からなり、各半抗体が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。Ｔｒｉｏｍａｂ形態は、ラット抗体の１／２およびマウス抗体の１／２を含有するヘテロ二量体構築物であり得る。
【００８８】
【図２１】図２１は、ノブイントゥホール（ＫＩＨ：ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）技術を用いるＫｉＨ共通の軽鎖形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＫｉＨは、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、およびヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。ＫｉＨフォーマットにおけるＴｒｉＮＫＥＴは、２つの異なる重鎖と、両方の重鎖と対合する共通の軽鎖とを含有する、標的１および標的２に結合する２つのＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物であり得る。
【００８９】
【図２２】図２２は、自然起源の可動性リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）とは、抗原２を標的とする可変ドメインが、抗原１を標的とするＦａｂ断片の可変ドメインのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である。ＤＶＤ−Ｉｇ（商標）形態は通常のＦｃを含有する。
【００９０】
【図２３】図２３は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つのＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、直交性Ｆａｂ界面（オルト−Ｆａｂ）形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。軽鎖（ＬＣ）−重鎖（ＨＣ）対合は、直交界面によって確実になっている。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける変異によって確実になっている。
【００９１】
【図２４】図２４は、２−ｉｎ−１  ＩｇフォーマットにおけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。
【００９２】
【図２５】図２５は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電的ステアリング変異によって確実になっている。
【００９３】
【図２６】図２６は、Ｆａｂ断片アーム交換形態におけるＴｒｉＮＫＥＴ、すなわち、重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子の重鎖−軽鎖対とスワップすることによりＦａｂアームを交換した結果、二重特異性抗体となった抗体の図である。Ｆａｂアーム交換形態（ｃＦａｅ）は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である。
【００９４】
【図２７】図２７は、標的１および２に結合する２つのＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体である、ＳＥＥＤ  Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。
【００９５】
【図２８】図２８は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーを使用する、ＬｕＺ−Ｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。ＬｕＺ−Ｙ形態は、Ｆｃに融合した標的１および２に結合する２つの異なるｓｃＦａｂを含有するヘテロ二量体である。ヘテロ二量体化は、ＦｃのＣ末端に融合したロイシンジッパーモチーフによって確実になっている。
【００９６】
【図２９】図２９は、Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。
【００９７】
【図３０−１】図３０Ａおよび３０Ｂは、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、κλ−Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。抗原１を標的とする１つのＦａｂ断片はカッパＬＣを含有し、抗原２を標的とする第２のＦａｂ断片はラムダＬＣを含有する。図３０Ａは、κλ−Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のκλ−Ｂｏｄｙの例示的な図である。
【図３０−２】図３０Ａおよび３０Ｂは、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、κλ−Ｂｏｄｙ形態におけるＴｒｉＮＫＥＴの図である。抗原１を標的とする１つのＦａｂ断片はカッパＬＣを含有し、抗原２を標的とする第２のＦａｂ断片はラムダＬＣを含有する。図３０Ａは、κλ−Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のκλ−Ｂｏｄｙの例示的な図である。
【００９８】
【図３１】図３１は、どちらもＦｃドメインに融合した、標的１に結合するＦａｂ断片と、標的２に結合するｓｃＦａｂとを含む、Ｏａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体構築物である。ヘテロ二量体化は、Ｆｃドメインにおける変異によって確実になっている。
【００９９】
【図３２】図３２は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂである。Ｆａｂ断片１および２は、軽鎖および重鎖の正確な対合を確実にする特異なＳ−Ｓ架橋を含有する。
【０１００】
【図３３】図３３は、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃを有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂである。ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインと、ＶＨドメインおよびＶＬドメインとが切り換わっており、例えば、ＣＨ１は、ＶＬと一列をなして融合しており、ＣＬは、ＶＨと一列をなして融合している。
【０１０１】
【図３４】図３４は、抗原２に結合するＦａｂ断片が、抗原１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ−Ｉｇである。この構築物は、野生型Ｆｃを含有する。
【０１０２】
【図３５】図３５は、腫瘍関連抗原に結合するｓｃＦｖ、ＮＫＧ２Ｄを標的とするＦａｂ、およびＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化した抗体定常領域／ドメイン（「ＣＤドメイン」）を含有する三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）（ｓｃＦｖ−Ｆａｂフォーマット）を例示する。この抗体フォーマットは、本明細書ではＦ３’−ＴｒｉＮＫＥＴと称される。
【０１０３】
【図３６】図３６は、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖ第１の抗原結合部位、腫瘍関連抗原（例えば、ＥｐＣＡＭ）に結合する第２の抗原結合部位、腫瘍関連抗原（例えば、ＥｐＣＡＭ）に結合するさらなる腫瘍関連抗原結合部位、およびＣＤ１６に結合するヘテロ二量体化した抗体定常領域を含む、例示的な三重特異性抗体（ＴｒｉＮＫＥＴ）を例示する。これらの抗体フォーマットは、本明細書ではＦ４−ＴｒｉＮＫＥＴと称される。
【０１０４】
【図３７】図３７は、ＴｒｉＮＫＥＴおよびｍＡｂが、Ｈ７４７ヒト結腸直腸がん細胞上に発現されるＥｐＣＡＭに結合することを示す線グラフである。
【０１０５】
【図３８】図３８は、ＴｒｉＮＫＥＴおよびｍＡｂが、ＨＣＣ８２７ヒト肺がん細胞上に発現されるＥｐＣＡＭに結合することを示す線グラフである。
【０１０６】
【図３９】図３９は、ＴｒｉＮＫＥＴおよびｍＡｂが、ＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸がん細胞上に発現されるＥＰＣＡＭに結合することを示す線グラフである。
【０１０７】
【図４０】図４０Ａおよび図４０Ｂは、２名の異なるドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞を用いた、Ｈ７４７細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介殺滅を示す線グラフである。エフェクター対標的比は１０：１であった。
【０１０８】
【図４１】図４１Ａおよび図４１Ｂは、２名の異なるドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞を用いた、ＨＣＣ８２７細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介殺滅を示す線グラフである。エフェクター対標的比は１０：１であった。
【０１０９】
【図４２】図４２Ａおよび図４２Ｂは、２名の異なるドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞を用いた、ＭＣＦ７細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介殺滅を示す線グラフである。エフェクター対標的比は１０：１であった。
【０１１０】
【図４３】図４３Ａおよび図４３Ｂは、２名の異なるドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞を用いた、ＨＣＴ１１６細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介殺滅を示す線グラフである。エフェクター対標的比は１０：１であった。
【発明を実施するための形態】
【０１１１】
詳細な説明
本発明は、がん細胞におけるＥＰＣＡＭならびにナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に結合してナチュラルキラー細胞を活性化させる多重特異性結合タンパク質、かかる多重特異性結合タンパク質を含む医薬組成物、ならびに、がんの処置などのためにかかる多重特異性タンパク質および医薬組成物を使用する治療方法を提供する。本発明の様々な態様を複数のセクションに分けて以下に記述する。しかしながら、１つの特定のセクションに記載される本発明の態様は、いずれかの特定のセクションに限定されるものではない。
【０１１２】
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および句を以下に定義する。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」という用語は、「１つまたは複数」を意味し、文脈が不適切でない限り、複数を含む。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の一部分を指す。ヒト抗体において、抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に分岐したストレッチは、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知である、より保存された隣接するストレッチの間に介在している「超可変領域」と称される。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリンにおける超可変領域の間におよびそれに隣接して天然に見出されるアミノ酸配列を指す。ヒト抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するように三次元空間において互いに対して配置される。抗原結合表面は、結合した抗原の三次元表面と相補的であり、重鎖および軽鎖の各々の３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称される。ラクダおよび軟骨魚類などのある特定の動物において、抗原結合部位は、「単一ドメイン抗体」を提供する単一抗体鎖によって形成される。抗原結合部位は、インタクトな抗体中、抗原結合表面を保持する抗体の抗原結合断片中、またはｓｃＦｖなどの組換えポリペプチド中に存在し、ペプチドリンカーを使用して単一ポリペプチドにおいて重鎖可変ドメインを軽鎖可変ドメインに連結することができる。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」という用語は、がんに関連するタンパク質、糖タンパク質、ガングリオシド、炭水化物、脂質を含むがこれらに限定されない、任意の抗原を意味する。このような抗原は、悪性細胞において、または腫瘍関連血管、細胞外マトリックス、間葉系間質、もしくは免疫浸潤物におけるような腫瘍微小環境中で発現され得る。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、本明細書に記載の方法および組成物によって処置される生物を指す。かかる生物には、好ましくは、限定されないが、哺乳動物（例えば、ネズミ、サル、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコなど）が含まれ、より好ましくはヒトが含まれる。
【０１１７】
本明細書中で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な化合物（例えば、本発明の化合物）の量を指す。有効量は、１回または複数回の投与、適用または投薬量で投与されてもよく、特定の製剤または投与経路に限定されることを意図しない。本明細書中で使用される場合、「処置する」という用語は、何らかの効果、例えば、状態、疾患、障害などの好転をもたらす、減少、低減、モジュレート、改善もしくは除去、またはそれらの症状の改善を含む。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、組成物を、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの診断的使用または治療的使用に特に適切にする、活性剤と、不活性または活性な担体との組合せを指す。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、エマルション（例えば、油／水または水／油エマルションなど）、および種々の種類の湿潤剤などの標準的な医薬担体のいずれかを指す。組成物はまた、安定剤および保存剤を含んでもよい。担体、安定剤およびアジュバントの例に関しては、例えば、Martin、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、第１５版、Mack  Publ.Co.、Easton、PA［１９７５年］を参照されたい。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」という用語は、対象に投与すると、本発明の化合物またはその活性代謝産物もしくは残留物を提供することができる、本発明の化合物の任意の薬学的に許容される塩（例えば、酸または塩基）を指す。当業者に公知であるように、本発明の化合物の「塩」は、無機または有機の酸および塩基から誘導され得る。例示的な酸には、限定されないが、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、マレイン酸、リン酸、グリコール酸、乳酸、サリチル酸、コハク酸、トルエン−ｐ−スルホン酸、酒石酸、酢酸、クエン酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ギ酸、安息香酸、マロン酸、ナフタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸などが含まれる。シュウ酸などの他の酸は、それら自体では薬学的に許容されないが、本発明の化合物およびそれらの薬学的に許容される酸付加塩を得る際の中間体として有用な塩の調製に利用され得る。
【０１２１】
例示的な塩基には、限定されないが、アルカリ金属（例えば、ナトリウム）水酸化物、アルカリ土類金属（例えば、マグネシウム）水酸化物、アンモニアおよび式ＮＷ４＋（式中、ＷはＣ１〜４アルキルである）の化合物などが含まれる。
【０１２２】
例示的な塩には、限定されないが、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、ショウノウ酸塩、ショウノウスルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、フルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、ウンデカン酸塩などが含まれる。塩の他の例には、Ｎａ＋、ＮＨ４＋およびＮＷ４＋（式中、ＷはＣ１〜４アルキル基である）などの適切なカチオンと配合された本発明の化合物のアニオンが含まれる。
【０１２３】
治療的使用のために、本発明の化合物の塩は、薬学的に許容されると意図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩も、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において使用することができる。
【０１２４】
組成物が特定の成分を有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されているか、またはプロセスおよび方法が特定のステップを有する、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、もしくは含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）と記載されている説明全体にわたって、さらに、列挙された成分から本質的になる、またはそれからなる本発明の組成物が存在すること、ならびに列挙されたプロセスステップから本質的になる、またはそれからなる本発明によるプロセスおよび方法が存在することが意図される。
【０１２５】
一般的事項として、パーセンテージを特定する組成物は、特に明記しない限り、重量による。さらに、変数が定義を伴わない場合、変数の以前の定義が優先する。
Ｉ．タンパク質
【０１２６】
本発明は、ナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体、ならびに表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に結合する多重特異性結合タンパク質を提供する。多重特異性結合タンパク質は、本明細書に記載の医薬組成物および治療方法において有用である。ナチュラルキラー細胞におけるＮＫＧ２Ｄ受容体およびＣＤ１６受容体に多重特異性結合タンパク質が結合すると、表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の破壊に向けてのナチュラルキラー細胞の活性が増強される。腫瘍関連抗原を発現する細胞に多重特異性結合タンパク質が結合すると、がん細胞をナチュラルキラー細胞に近接させるため、ナチュラルキラー細胞によるがん細胞の直接的および間接的な破壊が容易になる。いくつかの例示的な多重特異性結合タンパク質のさらなる記載を以下に提供する。
【０１２７】
多重特異性結合タンパク質の第１の構成成分は、ＮＫ細胞、γδＴ細胞およびＣＤ８＋αβＴ細胞を含み得るがこれらに限定されない、ＮＫＧ２Ｄ受容体を発現する細胞に結合する。多重特異性結合タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄに結合すると、ＵＬＢＰ６（ＵＬ１６結合タンパク質６）およびＭＩＣＡ（主要組織適合性遺伝子複合体クラスＩ鎖関連Ａ）などの天然リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合することおよびＮＫＧ２Ｄ受容体を活性化することを遮断し得る。
【０１２８】
多重特異性結合タンパク質の第２の構成成分は、表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に結合する。例えば急性骨髄性白血病およびＴ細胞白血病などの白血病において見出すことができる腫瘍関連抗原を発現する細胞。
【０１２９】
多重特異性結合タンパク質の第３の構成要素は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、マスト細胞、および濾胞性樹状細胞を含む白血球の表面にあるＦｃ受容体であるＣＤ１６を発現する細胞に結合する。
【０１３０】
本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、様々なフォーマットをとることができる。例えば、１つのフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第１の免疫グロブリン軽鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、および第２の免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体の多重特異性抗体（図１）である。第１の免疫グロブリン重鎖は、第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第１の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第１のＣＨ１重鎖ドメインとを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の軽鎖可変ドメインおよび第１の軽鎖定常ドメインを含む。第１の免疫グロブリン軽鎖は、第１の免疫グロブリン重鎖と一緒に、ＮＫＧ２Ｄに結合する抗原結合部位を形成する。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第２の重鎖可変ドメインと、必要に応じて第２のＣＨ１重鎖ドメインとを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の軽鎖可変ドメインおよび第２の軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン重鎖と一緒に、表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に結合する抗原結合部位を形成する。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは一緒にＣＤ１６に結合することができる（図１）。一部の実施形態では、第１の免疫グロブリン軽鎖は、第２の免疫グロブリン軽鎖と同一である。
【０１３１】
別の例示的なフォーマットは、第１の免疫グロブリン重鎖、第２の免疫グロブリン重鎖、および免疫グロブリン軽鎖を含む、ヘテロ二量体の多重特異性抗体（図２）に関する。第１の免疫グロブリン重鎖は、対合し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、または表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に結合する重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインから構成される一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に、リンカーまたは抗体ヒンジのいずれかを介して融合した第１のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、第２のＦｃ（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）ドメインと、第２の重鎖可変ドメインと、必要に応じてＣＨ１重鎖ドメインとを含む。免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む。第２の免疫グロブリン重鎖は、免疫グロブリン軽鎖と対合し、ＮＫＧ２Ｄに結合する、または表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に結合する。第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは、一緒にＣＤ１６に結合することができる（図２）。
【０１３２】
１つまたは複数のさらなる結合モチーフが、必要に応じてリンカー配列を介して、定常領域ＣＨ３ドメインのＣ末端に融合され得る。ある特定の実施形態では、抗原結合モチーフは、四価分子または三価分子を形成する一本鎖またはジスルフィド安定化可変領域（ｓｃＦｖ）である。
【０１３３】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＩｇＧ様形状を維持する三機能性の二重特異性抗体である、Ｔｒｉｏｍａｂ形態である。このキメラは、２つの親抗体に由来する２つの半抗体からなり、各半抗体が１本の軽鎖および１本の重鎖を有する。
【０１３４】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ノブ・イントゥ・ホール（ＫＩＨ）技術を用いるＫｉＨ共通軽鎖（ＬＣ）形態である。ＫＩＨは、ヘテロ二量体化を促進するために、ＣＨ３ドメインを工学操作して各重鎖に「ノブ」または「ホール」のいずれかを作出することを伴う。「ノブ・イントゥ・ホール（ＫｉＨ）」Ｆｃ技術の背後にある概念は、小さな残基を嵩高の残基で置換することにより、１つのＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ａ）に「ノブ」（例えば、ＥＵ付番でＴ３６６ＷＣＨ３Ａ）を導入することであった。この「ノブ」に適応するように、他方のＣＨ３ドメイン（ＣＨ３Ｂ）において、ノブに最も近い隣接残基をより小さな残基に置き換えること（すなわち、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７ＶＣＨ３Ｂ）により、相補的な「ホール」表面が作出された。「ホール」突然変異は、構造情報に基づくファージライブラリスクリーニング（Atwell  S、Ridgway  JB、Wells  JA、Carter  P.、Stable  heterodimers  from  remodeling  the  domain  interface  of  a  homodimer  using  a  phage  display  library、J  Mol  Biol（１９９７年）２７０巻（１号）：２６〜３５頁）によって最適化された。ＫｉＨ  Ｆｃ変異体のＸ線結晶構造（Elliott  JM、Ultsch  M、Lee  J、Tong  R、Takeda  K、Spiess  Cら、Antiparallel  conformation  of  knob  and  hole  aglycosylated  half-antibody  homodimers  is  mediated  by  a  CH2-CH3  hydrophobic  interaction.  J  Mol  Biol  （２０１４年）４２６巻（９号）：１９４７〜５７頁、Mimoto  F、Kadono  S、Katada  H、Igawa  T、Kamikawa  T、Hattori  K.  Crystal  structure  of  a  novel  asymmetrically  engineered  Fc  variant  with  improved  affinity  for  FcγRs.  Mol    Immunol（２０１４年）５８巻（１号）：１３２〜８頁）は、ＣＨ３ドメイン間のコア界面では、立体的相補性によって推進される疎水性相互作用がヘテロ二量体化に熱力学的に有利に働くが、ノブ−ノブおよびホール−ホールの界面は、それぞれ立体障害および好ましい相互作用の妨害が原因でホモ二量体化に有利に働かないことを示した。
【０１３５】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、自然起源の可動性リンカーを介して２つのモノクローナル抗体の標的結合ドメインを組み合わせ、四価のＩｇＧ様分子をもたらす、二重可変ドメイン免疫グロブリン（ＤＶＤ−Ｉｇ（商標））形態におけるものである。
【０１３６】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、直交性Ｆａｂ界面（オルト−Ｆａｂ）形態におけるものである。オルト−Ｆａｂ  ＩｇＧアプローチ（Lewis  SM、Wu  X、Pustilnik  A、Sereno  A、Huang  F、Rick  HLら、Generation  of  bispecific  IgG  antibodies  by  structure-based  design  of  an  orthogonal  Fab  interface.  Nat.  Biotechnol.（２０１４年）３２巻（２号）：１９１〜８頁）では、構造に基づく領域デザインにより、一方のＦａｂ断片におけるＬＣおよびＨＣＶＨ−ＣＨ１の界面にのみ相補的突然変異が導入され、他方のＦａｂが変化することはない。
【０１３７】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２−ｉｎ−１  Ｉｇフォーマットにおけるものである。一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合した標的１および標的２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を含有するヘテロ二量体構築物である、ＥＳ形態におけるものである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける静電的ステアリング変異によって確実になっている。
【０１３８】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化変異によって安定化されたＦｃに融合した２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、κλ−Ｂｏｄｙ形態におけるものである。抗原１を標的とするＦａｂ断片１はカッパＬＣを含有し、抗原２を標的とする第２のＦａｂ断片はラムダＬＣを含有する。図３０Ａは、κλ−Ｂｏｄｙの一形態の例示的な図であり、図３０Ｂは、別のκλ−Ｂｏｄｙの例示的な図である。
【０１３９】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆａｂアーム交換形態（重鎖および結合した軽鎖（半分子）を別の分子の重鎖−軽鎖対とスワップすることによりＦａｂアームを交換した結果、二重特異性抗体となった抗体）である。
【０１４０】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ＳＥＥＤ  Ｂｏｄｙ形態におけるものである。ＳＥＥＤ（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ）プラットフォームは、天然抗体の治療用途を広げる可能性がある非対称かつ二重特異性抗体様の分子を生成するためにデザインされた。このタンパク質工学操作プラットフォームは、保存されたＣＨ３ドメインにおける免疫グロブリンの構造的に関連した配列の交換に基づく。ＳＥＥＤデザインは、ＡＧおよびＧＡ  ＳＥＥＤ  ＣＨ３ドメインのホモ二量体化を回避しつつ、ＡＧ／ＧＡヘテロ二量体の効果的な生成を可能にする（Muda  M.ら、Protein  Eng.  Des.  Sel.（２０１１年、２４巻（５号）：４４７〜５４頁））。
【０１４１】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、２つの異なるＨＣのヘテロ二量体化を誘導するためにロイシンジッパーを使用する、ＬｕＺ−Ｙ形態におけるものである（Wranik,  BJ.ら、J.  Biol.  Chem.（２０１２年）、２８７巻：４３３３１〜９頁）。
【０１４２】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｃｏｖ−Ｘ−Ｂｏｄｙ形態におけるものである。二重特異性ＣｏｖＸ−Ｂｏｄｙでは、分枝状のアゼチジノンリンカーを使用して２つの異なるペプチドをひとつに結合させ、温和な条件下にてスキャフォールド抗体に部位特異的様式で融合させる。機能的活性に関与するのはファルマコフォアだが、抗体スキャフォールドは長い半減期およびＩｇ様の分布をもたらす。最適化された、または独特の二重特異性抗体を生成するために、ファルマコフォアは化学的に最適化するか、または他のファルマコフォアに置き換えることができる（Doppalapudi  VRら、PNAS（２０
１０年）、１０７巻（５２号）；２２６１１〜２２６１６頁）。
【０１４３】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、Ｆｃに融合した、標的１に結合するＦａｂ断片と、標的２に結合するｓｃＦａｂとを含む、Ｏａｓｃ−Ｆａｂヘテロ二量体形態におけるものである。ヘテロ二量体化は、Ｆｃにおける突然変異によって確実になっている。
【０１４４】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片、ならびにヘテロ二量体化突然変異によって安定化されたＦｃを含有するヘテロ二量体構築物である、ＤｕｅｔＭａｂ形態におけるものである。Ｆａｂ断片１および２は、ＬＣおよびＨＣの正確な対合を確実にする特異なＳ−Ｓ架橋を含有する。
【０１４５】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、ヘテロ二量体化によって安定化されたＦｃに融合した、標的１および２に結合する２つの異なるＦａｂ断片を有するヘテロ二量体構築物である、ＣｒｏｓｓｍＡｂ形態におけるものである。ＣＬドメインおよびＣＨ１ドメインと、ＶＨドメインおよびＶＬドメインとが切り換わっており、例えば、ＣＨ１は、ＶＬとインラインで融合しており、ＣＬは、ＶＨとインラインで融合している。
【０１４６】
一部の実施形態では、多重特異性結合タンパク質は、抗原２に結合するＦａｂが、抗原１に結合するＦａｂ断片のＨＣのＮ末端に融合しているホモ二量体構築物である、Ｆｉｔ−Ｉｇ形態におけるものである。この構築物は、野生型Ｆｃを含有する。
【０１４７】
表１は、組み合わさってＮＫＧ２Ｄに結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列記する。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは、ＮＫＧ２Ｄに対するそれらの結合親和性が変動し得るにもかかわらず、すべてがヒトＮＫＧ２ＤおよびＮＫ細胞を活性化する。
【表１−１】
2020533311.tif 000003
【表１−２】
2020533311.tif 000004
【表１−３】
2020533311.tif 000005
【表１−４】
2020533311.tif 000006
【表１−５】
2020533311.tif 000007
【表１−６】
2020533311.tif 000008
【表１−７】
2020533311.tif 000009
【表１−８】
2020533311.tif 000010
【０１４８】
代替的に、ＵＳ９，２７３，１３６において説明されているように、配列番号１０１によって表される重鎖可変ドメインを配列番号１０２によって表される軽鎖可変ドメインと対合させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成してもよい。
【化１】
2020533311.tif 000011
【０１４９】
代替的に、ＵＳ７，８７９，９８５において説明されているように、配列番号１０３によって表される重鎖可変ドメインを配列番号１０４によって表される軽鎖可変ドメインと対合させて、ＮＫＧ２Ｄに結合することができる抗原結合部位を形成してもよい。
【化２】
2020533311.tif 000012
【０１５０】
表２は、組み合わさってＥｐＣＡＭに結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列記する。
【表２−１】
2020533311.tif 000013
【表２−２】
2020533311.tif 000014
【表２−３】
2020533311.tif 000015
【０１５１】
代替的に、ＥｐＣＡＭに結合することができる新規の抗原結合部位は、配列番号１４７によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。
【化３】
2020533311.tif 000016
【０１５２】
腫瘍関連抗原ＣＡ１２５に結合することができる抗原結合部位は、配列番号１４８によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。
【化４】
2020533311.tif 000017
【化５】
2020533311.tif 000018
【化６】
2020533311.tif 000019
【化７】
2020533311.tif 000020
【化８】
2020533311.tif 000021
【化９】
2020533311.tif 000022
【０１５３】
腫瘍関連抗原ＮａＰｉ２ｂに結合することができる抗原結合部位は、配列番号１４９によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。
【化１０】
2020533311.tif 000023
【０１５４】
腫瘍関連抗原Ｎｅｃｔｉｎ４に結合することができる抗原結合部位は、配列番号１５０によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。
【化１１】
2020533311.tif 000024
【０１５５】
腫瘍関連抗原フコシル−ＧＭ１に結合することができる抗原結合部位は、モノシアロテトラヘキソシルガングリオシドへの結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。
【０１５６】
腫瘍関連抗原ＡＤＡＭ８に結合することができる抗原結合部位は、配列番号１５１によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。
【化１２】
2020533311.tif 000025
【０１５７】
腫瘍関連抗原ＡＤＡＭ９に結合することができる抗原結合部位は、配列番号１５２によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。
【化１３】
2020533311.tif 000026
【化１４】
2020533311.tif 000027
【０１５８】
腫瘍関連抗原ＳＬＣ４４Ａ４に結合することができる抗原結合部位は、配列番号１５３によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。
【化１５】
2020533311.tif 000028
【０１５９】
腫瘍関連抗原ＣＡ１９−９に結合することができる抗原結合部位は、配列番号１５４によって定義されるアミノ酸配列への結合についてスクリーニングすることによって同定することができる。
【化１６】
2020533311.tif 000029
【０１６０】
代替的に、表３は、組み合わさって、ＣＡ１２５（アバゴボマブ、ソフィツズマブ）、ＮａＰｉ２ｂ（リファスツズマブ）、Ｎｅｃｔｉｎ４（エンホルツマブ）、フコシル−ＧＭ１（米国特許出願公開第２０１３０１４２７８９号に記載、具体的な配列が参照により本明細書に組み込まれる）、またはＳＬＣ４４Ａ４（国際出願公開第ＷＯ２０１０１１１０１８号に記載、具体的な配列が参照により本明細書に組み込まれる）に結合することができる重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのペプチド配列を列記する。
【表３−１】
2020533311.tif 000030
【表３−２】
2020533311.tif 000031
【表３−３】
2020533311.tif 000032
【０１６１】
２本のポリペプチド鎖のヘテロ二量体化を可能にする変異も含む抗体定常領域に連結したｓｃＦｖの例を以下に列記する。抗ＮＫＧ２Ｄ抗体由来の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含有するｓｃＦｖを本開示の多重特異性タンパク質の調製に使用する。各配列は、ヘテロ二量体化変異を含有するＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨ−ヒンジ（ＡＳまたはＧＡＳ）−Ｆｃを表す（下線）。ＶＬおよびＶＨは、１００ＶＬ−４４ＶＨＳ−Ｓ架橋（下線）を含有し、腫瘍を標的とするまたはＮＫＧ２Ｄに結合する任意の抗体に由来するものであってよい。柔軟性と最適な幾何学的形状との間のバランスをとるためにＡｌａ−Ｓｅｒ（ＡＳ、太字および下線）をエルボーヒンジ領域配列に含める。ある特定の実施形態では、さらなるＧｌｙをＡＳ配列のＮ末端に付加し、それにより、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒの配列（ＧＡＳ、太字および下線）を有するヒンジを生成することができる。ある特定の実施形態では、さらなる配列Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−ＧｌｙをヒンジのＡＳ配列に付加することができる。以下の段落に列記されている配列において（Ｇ４Ｓ）４リンカーに下線が引かれている。
【０１６２】
本開示のＴｒｉＮＫＥＴは、配列番号２０３の配列を含む第１のポリペプチド（Ｆ４−ＥｐＣＡＭＦｃ−ＡＪｃｈａｉｎＢ−ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ）と、配列番号２０４の配列を含む第２のポリペプチド（抗ＥｐＣＡＭ  ＨＣ−ヒンジ−Ｆｃ）とを含むＮＫＧ２Ｄ結合Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＥｐＣＡＭである。ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＥｐＣＡＭは、それぞれが配列番号２１４の配列を含む抗ＥｐＣＡＭ  ＶＬ定常ドメインを含む２本のＥｐＣＡＭを標的とする軽鎖も含む。例えば、図３６の構造において、Ｆａｂ断片がＥｐＣＡＭを標的とする場合、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＥｐＣＡＭは、ＴｒｉＮＫＥＴの１つのアームを形成する配列番号２０３および配列番号２１４、ならびにＴｒｉＮＫＥＴの第２のアームを形成する配列番号２０４および配列番号２１４を含む。
【０１６３】
アームの各々は、ＥｐＣＡＭ結合Ｆａｂ断片を含み、ＥｐＣＡＭ結合Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分であって、重鎖可変ドメインとＣＨ１ドメインが連結している重鎖部分と、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメイン（配列番号２１４）を含む軽鎖部分とを含む。第１のアームにおいて（例えば、Ｆ４−ＥｐＣＡＭＦｃ−ＡＪｃｈａｉｎＢ−ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖにおいて）、ＣＨ１ドメインはＦｃドメインに連結し、ＦｃドメインはＮＫＧ２Ｄを標的とするｓｃＦｖに連結して、配列番号２０３の配列を含むポリペプチドが形成される。第２のアームにおいて、ＣＨ１ドメインはＦｃドメインに連結して、配列番号２０４の配列を含むポリペプチドが形成される。
【０１６４】
例えば、Ｆ４−ＥｐＣＡＭＦｃ−ＡＪｃｈａｉｎＢ−ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ（配列番号２０３）は、ＥｐＣＡＭを標的とする重鎖可変ドメイン（ＶＨ）（配列番号１３９）と、Ｆｃドメイン（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に連結したＣＨ１ドメインとを含み、これは、ＦｃのＣ末端においてＮＫＧ２Ｄに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に連結している。配列番号２０３内のＦｃドメインは、Ｓ３５４Ｃ置換を含み、これは別のＦｃドメインにおけるＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する（配列番号２０４、下記）。配列番号２０３内のＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ置換、Ｄ３９９Ｖ置換、およびＦ４０５Ｔ置換を含む。ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖは、配列番号２０５のアミノ酸配列によって表され、（Ｇ４Ｓ）４リンカー、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２０６）を介して重鎖可変ドメイン（ＶＨ）に連結した軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。配列番号２０５内に含まれるＶＬおよびＶＨは、ＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨとして連結しており、ＶＬおよびＶＨは、１００ＶＬ−４４ＶＨＳ−Ｓ架橋を含有する（それぞれＧ１００Ｃ置換およびＧ４４Ｃ置換に起因する）（システイン残基は太字のイタリック体であり、下線が引かれている）。配列番号２０３に表される通り、ＦｃドメインのＣ末端はｓｃＦｖのＮ末端（配列番号２０５）に、短いＳＧＳＧＧＧＧＳリンカー（配列番号２０７）を介して連結している。
ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ
【化１７】
2020533311.tif 000033
Ｆ４−ＥｐＣＡＭＦｃ−ＡＪｃｈａｉｎＢ−ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ
【化１８】
2020533311.tif 000034
【０１６５】
抗ＥｐＣＡＭ  ＨＣ−ヒンジ−Ｆｃ（配列番号２０４）は、ＥｐＣＡＭを標的とする重鎖可変ドメインおよびＦｃドメイン（ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に連結したＣＨ１ドメインを含む。配列番号２０４内のＦｃドメインは、Ｙ３４９Ｃ置換を含み、これは、ＮＫＧ２Ｄに結合するｓｃＦｖに連結したＦｃのＣＨ３ドメイン（配列番号２０３）におけるＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。配列番号２０４において、Ｆｃドメインは、Ｋ３６０Ｅ置換およびＫ４０９Ｗ置換も含む。
抗ＥｐＣＡＭ  ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ
【化１９】
2020533311.tif 000035
【０１６６】
抗ＥｐＣＡＭ  ＶＬ定常ドメイン（配列番号２１４）は、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを含む、ＥｐＣＡＭを標的とする軽鎖部分を含む。
抗ＥｐＣＡＭ  ＶＬ定常ドメイン
【化２０】
2020533311.tif 000036
【０１６７】
例示的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖ断片に連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗの変異を含み、ＥＰＣＡＭ  Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体を形成するための適合した変異Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０５Ｔを含む。
【０１６８】
例示的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃ置換を含み、これは、ＮＫＧ２Ｄ結合ｓｃＦｖに連結していないＦｃドメインにおけるＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。
【０１６９】
本開示の別のＴｒｉＮＫＥＴは、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＥＰＣＡＭであり、その配列を以下に記載する（ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ付番）に下線が引かれている）。
【０１７０】
本開示の一部のＴｒｉＮＫＥＴは、Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＥＰＣＡＭの形態であり、その配列を以下に提供する（ＣＤＲ（Ｋａｂａｔ付番）に下線が引かれている）。
【０１７１】
Ａ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＥＰＣＡＭは、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジを介してＦｃドメインに連結した、ＥＰＣＡＭに結合する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（配列番号２０８および２０９は、かかるＥＰＣＡＭ結合ｓｃＦｖポリペプチドの例示的な配列である）（例えば、配列番号２１０および配列番号２１１）と、重鎖可変ドメイン（配列番号８５）およびＣＨ１ドメインを含む重鎖部分、ならびに軽鎖可変ドメイン（配列番号８６）および軽鎖定常ドメインを含む軽鎖部分を含むＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片（「Ａ４９」）であって、重鎖可変ドメインがＣＨ１ドメインに連結しており、ＣＨ１ドメインがＦｃドメインに連結している、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片（「Ａ４９」）とを含む。ＥｐＣＡＭを標的とするＦａｂに連結したＦｃドメインは、Ｋ３６０Ｅ置換およびＫ４０９Ｗ置換を含むＦａｂとヘテロ二量体を形成するためのＱ３４７Ｒ置換、Ｄ３９９Ｖ置換、およびＦ４０５Ｔ置換を含む（例えば、下記の配列番号２１２を参照されたい）。
【０１７２】
本開示のＥＰＣＡＭ結合ｓｃＦｖは、（Ｇ４Ｓ）４リンカーで軽鎖可変ドメインに連結した重鎖可変ドメインを含み得る（ＶＬがＶＨのＮ末端側にある場合ＶＬ（Ｇ４Ｓ）４ＶＨまたはＬＨと表され、ＶＨがＶＬのＮ末端側にある場合、ＶＨ（Ｇ４Ｓ）４ＶＬまたはＨＬと表される）。配列番号２０８および２０９は、かかるＥＰＣＡＭ結合ｓｃＦｖポリペプチドの例示的な配列である。ｓｃＦｖ（配列番号２０８または２０９）内に含まれるＶＬおよびＶＨは、１００ＶＬ−４４ＶＨＳ−Ｓ架橋（それぞれＧ１００Ｃ置換およびＧ４４Ｃ置換に起因する）を含有する（以下の配列においてシステイン残基は太字のイタリック体であり、下線が引かれている）。（Ｇ４Ｓ）４は、配列番号２０８および配列番号２０９において太字の下線が引かれた配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２０６）である。
ＥＰＣＡＭ（ＭＴ１１０ＬＨ）ｓｃＦｖ
【化２１】
2020533311.tif 000037
ＥＰＣＡＭ（ＭＴ１００ＨＬ）ｓｃＦｖ
【化２２】
2020533311.tif 000038
【０１７３】
配列番号２１０および配列番号２１１は、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｓｅｒを含むヒンジ（太字、下線）を介してＦｃドメインに連結することができるＥＰＣＡＭ結合ｓｃＦｖの２つの配列を表す。ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ置換、Ｄ３９９Ｖ置換、およびＦ４０５Ｔ置換を含む。
ＥＰＣＡＭ（ＭＴ１１０ＬＨ）ｓｃＦｖ−Ｆｃ
【化２３】
2020533311.tif 000039
ＥＰＣＡＭ（ＭＴ１１０ＨＬ）ｓｃＦｖ−Ｆｃ
【化２４】
2020533311.tif 000040
【０１７４】
配列番号２１２は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の重鎖可変ドメイン（配列番号８５）、およびＦｃドメインに連結したＣＨ１ドメインを含む、Ｆａｂ断片の重鎖部分を表す。配列番号２１２内のＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインにおけるＹ３４９Ｃ置換を含み、これは、ＥｐＣＡＭに結合するｓｃＦｖに連結したＦｃにおけるＳ３５４Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する（例えば、配列番号２１０および配列番号２１１）。配列番号２１２において、Ｆｃドメインは、Ｋ３６０Ｅ置換およびＫ４０９Ｗ置換も含む。
Ａ４９−ＶＨ
【化２５】
2020533311.tif 000041
Ａ４９  ＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ
【化２６】
2020533311.tif 000042
【０１７５】
配列番号２１３は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位の軽鎖可変ドメイン（配列番号８６）、および軽鎖定常ドメインを含むＦａｂ断片の軽鎖部分を表す。
Ａ４９−ＶＬ
【化２７】
2020533311.tif 000043
Ａ４９  ＬＣ  ＶＬ定常ドメイン
【化２８】
2020533311.tif 000044
【０１７６】
例示的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、Ｑ３４７Ｒ、Ｄ３９９Ｖ、およびＦ４０５Ｔの変異を含み、ＥＰＣＡＭ  ｓｃＦｖに連結したＦｃドメインは、ヘテロ二量体を形成するための適合した変異Ｋ３６０ＥおよびＫ４０９Ｗを含む。例示的な実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆａｂ断片に連結したＦｃドメインは、ＣＨ３ドメインにおけるＳ３５４Ｃ置換を含み、これは、ＥＰＣＡＭ結合ｓｃＦｖに連結したＦｃにおけるＹ３４９Ｃ置換とジスルフィド結合を形成する。
【０１７７】
Ｆｃドメイン内で、ＣＤ１６結合はヒンジ領域およびＣＨ２ドメインによって媒介される。例えば、ヒトＩｇＧ１内で、ＣＤ１６との相互作用は主に、アミノ酸残基Ａｓｐ２６５〜Ｇｌｕ２６９、Ａｓｎ２９７〜Ｔｈｒ２９９、Ａｌａ３２７〜Ｉｌｅ３３２、Ｌｅｕ２３４〜Ｓｅｒ２３９、およびＣＨ２ドメインにおける炭水化物残基Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンに焦点が当てられている（Sondermannら、Nature、４０６巻（６７９３号）：２６７〜２７３頁を参照されたい）。既知のドメインに基づいて、突然変異は、ファージディスプレイライブラリもしくは酵母表面ディスプレイｃＤＮＡライブラリを使用することなどによって、ＣＤ１６に対する結合親和性を増強もしくは低減させるように選択され得るか、または相互作用の既知の三次元構造に基づいてデザインされ得る。
【０１７８】
ヘテロ二量体抗体重鎖の構築は、同じ細胞内で２つの異なる抗体重鎖配列を発現させることによって達成することができ、これにより、各抗体重鎖のホモ二量体の構築およびヘテロ二量体の構築をもたらすことができる。ヘテロ二量体の選択的構築の促進は、ＵＳ１３／４９４８７０、ＵＳ１６／０２８８５０、ＵＳ１１／５３３７０９、ＵＳ１２／８７５０１５、ＵＳ１３／２８９９３４、ＵＳ１４／７７３４１８、ＵＳ１２／８１１２０７、ＵＳ１３／８６６７５６、ＵＳ１４／６４７４８０およびＵＳ１４／８３０３３６に示されているように、各抗体重鎖定常領域のＣＨ３ドメイン内に異なる突然変異を組み込むことによって達成することができる。例えば、突然変異は、ヒトＩｇＧ１に基づき、これらの２つの鎖が互いに選択的にヘテロ二量体化することを可能にする第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチド内にアミノ酸置換の異なる対を組み込んでいるＣＨ３ドメイン内で作製され得る。以下に例示したアミノ酸置換の位置は、Ｋａｂａｔにおけるように、すべてＥＵインデックスに従って番号付けしている。
【０１７９】
１つの状況では、第１のポリペプチドにおけるアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）またはトリプトファン（Ｗ）から選択される、より大きなアミノ酸で置換し、第２のポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸置換は、元のアミノ酸を、より大きなアミノ酸置換（突出）が、より小さなアミノ酸置換（空洞）の表面に適合するように、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、またはバリン（Ｖ）から選択される、より小さなアミノ酸で置換する。例えば、一方のポリペプチドはＴ３６６Ｗ置換を組み込むことができ、他方のポリペプチドは、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む３つの置換を組み込むことができる。
【０１８０】
本発明の抗体重鎖可変ドメインは、必要に応じて、ＣＨ１ドメインを有するまたは有さないヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ定常領域などの、抗体定常領域と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と連結され得る。一部の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ヒトＩｇＧ１定常領域、ＩｇＧ２定常領域、ＩｇＧ３定常領域、またはＩｇＧ４定常領域などの、ヒト抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。一部の他の実施形態では、定常領域のアミノ酸配列は、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス、またはウマなどの別の哺乳動物由来の抗体定常領域と少なくとも９０％同一である。１つまたは複数の突然変異が、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えば、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１および／またはＫ４３９において定常領域に組み込まれ得る。例示的な置換には、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅが含まれる。
【０１８１】
ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣＨ１に組み込まれ得る突然変異は、アミノ酸Ｖ１２５、Ｆ１２６、Ｐ１２７、Ｔ１３５、Ｔ１３９、Ａ１４０、Ｆ１７０、Ｐ１７１、および／またはＶ１７３であり得る。ある特定の実施形態では、ヒトＩｇＧ１定常領域のＣκに組み込まれ得る突然変異は、アミノ酸Ｅ１２３、Ｆ１１６、Ｓ１７６、Ｖ１６３、Ｓ１７４、および／またはＴ１６４であり得る。
【０１８２】
あるいは、アミノ酸置換は以下の表４にされる置換のセットから選択され得る。 
【表４】
2020533311.tif 000045
【０１８３】
代替的に、アミノ酸置換は以下の表５に示される置換のセットから選択され得る。
【表５】
2020533311.tif 000046
【０１８４】
代替的に、アミノ酸置換は以下の表６に示される置換のセットから選択され得る。
【表６】
2020533311.tif 000047
【０１８５】
代替的に、各ポリペプチド鎖における少なくとも１つのアミノ酸置換は表７から選択され得る。
【表７】
2020533311.tif 000048
【０１８６】
代替的に、以下の表８の置換のセットから少なくとも１つのアミノ酸置換を選択してもよく、ここで「第１のポリペプチド」欄に示される位置（複数可）は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、「第２のポリペプチド」欄に示される位置（複数可）は、任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられる。
【表８】
2020533311.tif 000049
【０１８７】
代替的に、以下の表９のセットから少なくとも１つのアミノ酸置換を選択してもよく、ここで「第１のポリペプチド」欄に示される位置（複数可）は、任意の公知の正に帯電したアミノ酸によって置き換えられ、「第２のポリペプチド」欄に示される位置（複数可）は、任意の公知の負に帯電したアミノ酸によって置き換えられる。
【表９】
2020533311.tif 000050
【０１８８】
代替的に、アミノ酸置換は、以下の表１０のセットから選択され得る。
【表１０】
2020533311.tif 000051
【０１８９】
代替的にまたは加えて、ヘテロ多量体タンパク質の構造安定性は、第１または第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃを導入し、反対のポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入することによって増大させることができ、これにより、２つのポリペプチドの界面内に人工ジスルフィド架橋を形成する。
【０１９０】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６位において異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。
【０１９１】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｌ３６８およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６位において異なる。
【０１９２】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。
【０１９３】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｅ３５７、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｔ３９４、Ｄ４０１、Ｆ４０５、およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。
【０１９４】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。
【０１９５】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＴ４１１からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｄ３９９、Ｓ４００およびＹ４０７からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。
【０１９６】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７、Ｙ３４９、Ｋ３６０およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。
【０１９７】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｑ３４７、Ｅ３５７、Ｄ３９９およびＦ４０５からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｋ３６０、Ｑ３４７およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。
【０１９８】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。
【０１９９】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｄ３５６、Ｅ３５７およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３７０、Ｋ３９２、Ｋ４０９およびＫ４３９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。
【０２００】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。
【０２０１】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｌ３６８、Ｋ３９２およびＫ４０９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なり、ここで、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｌ３５１、Ｅ３５６、Ｔ３６６およびＤ３９９からなる群から選択される１つまたは複数の位置において異なる。
【０２０２】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｓ３５４Ｃ置換によって異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９Ｃ置換によって異なる。
【０２０３】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｙ３４９Ｃ置換によって異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｓ３５４Ｃ置換によって異なる。
【０２０４】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３６０Ｅ置換およびＫ４０９Ｗ置換によって異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｏ３４７Ｒ置換、Ｄ３９９Ｖ置換およびＦ４０５Ｔ置換によって異なる。
【０２０５】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｏ３４７Ｒ置換、Ｄ３９９Ｖ置換およびＦ４０５Ｔ置換によって異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｋ３６０Ｅ置換およびＫ４０９Ｗ置換によって異なる。
【０２０６】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｗ置換によって異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｓ置換、Ｔ３６８Ａ置換およびＹ４０７Ｖ置換によって異なる。
【０２０７】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｓ置換、Ｔ３６８Ａ置換およびＹ４０７Ｖ置換によって異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３６６Ｗ置換によって異なる。
【０２０８】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ置換、Ｌ３５１Ｙ置換、Ｆ４０５Ａ置換およびＹ４０７Ｖ置換によって異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ置換、Ｔ３６６Ｌ置換、Ｋ３９２Ｌ置換およびＴ３９４Ｗ置換によって異なる。
【０２０９】
一部の実施形態では、抗体定常領域の一方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ置換、Ｔ３６６Ｌ置換、Ｋ３９２Ｌ置換およびＴ３９４Ｗ置換によって異なり、抗体定常領域の他方のポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、ＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列と、Ｔ３５０Ｖ置換、Ｌ３５１Ｙ置換、Ｆ４０５Ａ置換およびＹ４０７Ｖ置換によって異なる。
【０２１０】
上記の多重特異性タンパク質は、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得る。例えば、第１の免疫グロブリン重鎖をコードする第１の核酸配列を第１の発現ベクターにクローニングすることができ、第２の免疫グロブリン重鎖をコードする第２の核酸配列を第２の発現ベクターにクローニングすることができ、免疫グロブリン軽鎖をコードする第３の核酸配列を第３の発現ベクターにクローニングすることができ、第１、第２および第３の発現ベクターを一緒に宿主細胞に安定にトランスフェクトして多量体タンパク質を産生することができる。
【０２１１】
多重特異性タンパク質の最も高い収率を達成するために、第１、第２および第３の発現ベクターの異なる比率を調べて宿主細胞へのトランスフェクションのための最適比率を決定することができる。トランスフェクション後、限界希釈、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、顕微鏡法、またはＣｌｏｎｅｐｉｘなどの当技術分野において公知の方法を使用して、細胞バンク生成のために単一クローンを単離することができる。
【０２１２】
クローンは、バイオリアクタスケールアップに適した条件下で培養することができ、多重特異性タンパク質の発現を維持することができる。多重特異性タンパク質は、遠心分離、深層濾過、細胞溶解、均質化、凍結融解、親和性精製、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用交換クロマトグラフィー、およびミックスモードクロマトグラフィーを含む、当技術分野において公知の方法を使用して単離され、精製され得る。
ＩＩ．多重特異性タンパク質の特徴
【０２１３】
本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、ＮＫＧ２Ｄ結合部位、ＣＤ１６結合部位、および表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原を含む。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、ＮＫ細胞などのＮＫＧ２Ｄおよび／またはＣＤ１６を発現する細胞と、表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞に同時に結合する。多重特異性タンパク質がＮＫ細胞に結合すると、腫瘍細胞の破壊に向けてのＮＫ細胞の活性が増強され得る。
【０２１４】
【表１１】
2020533311.tif 000052
【０２１５】
一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に、対応するモノクローナル抗体（すなわち、多重特異性タンパク質に組み込まれているものと同じ腫瘍関連抗原結合部位を含有するモノクローナル抗体（表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される））と同様の親和性で結合する。一部の実施形態では、多重特異性タンパク質は、表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞の殺滅に関して、対応するモノクローナル抗体よりも効果的である。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位および表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に対する結合部位を含む本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、腫瘍関連抗原を発現する細胞と共培養すると初代ヒトＮＫ細胞を活性化させる。ＮＫ細胞の活性化は、ＣＤ１０７ａ脱顆粒およびＩＦＮ−γサイトカイン産生量の増加によって示される。さらに、表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に対する対応するモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、腫瘍関連抗原を発現する細胞の存在下でヒトＮＫ細胞の優れた活性化を示し得る。
【０２１７】
ある特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ結合部位および表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に対する結合部位を含む本明細書に記載の多重特異性タンパク質は、腫瘍関連抗原を発現する細胞と共培養して休止ヒトＮＫ細胞およびＩＬ−２活性化ヒトＮＫ細胞の活性を増強する。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、表１１に提示されている抗原のいずれか１つから選択される腫瘍関連抗原に結合する対応するモノクローナル抗体と比較して、多重特異性タンパク質は、腫瘍関連抗原を発現する腫瘍細胞を標的とすることに関して利点をもたらす。本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、腫瘍成長の低減およびがん細胞の殺滅に関して、より効果的であり得る。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、ＥｐＣＡＭを標的とするＦ４−ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＥｐＣＡＭ）は、ＥｐＣＡＭを標的とする親ｍＡｂよりも効果的に標的細胞を死滅させた。ある特定の実施形態では、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴはまた、Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ（例えば、ＮＫＧ２Ｄ結合Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＥｐＣＡＭ）よりも強力に標的細胞を死滅させ、これは、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴが標的細胞により強力に結合することを反映し得る。
ＩＩＩ．治療用途
【０２２０】
本発明は、本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質および／または本明細書に記載の医薬組成物を使用してがんを処置するための方法を提供する。本方法は、それを必要とする患者に、治療有効量の本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質を投与することにより、ＥＰＣＡＭを発現する様々ながんを処置するために使用され得る。
【０２２１】
この治療方法は、処置されるがんによって特徴付けられ得る。例えば、ある特定の実施形態では、がんは、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、胸腺腫、腺様嚢胞癌、胃腸がん、腎がん、乳がん、神経膠芽腫、肺がん、卵巣がん、脳がん、前立腺がん、膵がん、または黒色腫である。
【０２２２】
ある特定の他の実施形態では、がんは、固形腫瘍である。ある特定の他の実施形態では、がんは、結腸がん、膀胱がん、子宮頸がん、子宮体がん、食道がん、白血病、肝がん、直腸がん、胃がん、精巣がん、または子宮がんである。さらに他の実施形態では、がんは、血管化腫瘍、扁平上皮癌、腺癌、小細胞癌、黒色腫、神経膠腫、神経芽細胞腫、肉腫（例えば、血管肉腫または軟骨肉腫）、喉頭がん、耳下腺がん、胆道がん（bilary tract cancer）、甲状腺がん、末端黒子型黒色腫、日光角化症、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺様嚢胞癌（adenoid cycstic carcinoma）、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、肛門管がん、肛門がん、肛門直腸がん、星細胞系腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、胆管がん、骨がん、骨髄がん、気管支がん、気管支腺癌、カルチノイド、胆管癌、軟骨肉腫（chondosarcoma）、脈絡叢乳頭腫（choriod plexus papilloma）／癌、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、明細胞癌、結合組織がん、嚢胞腺腫、消化器系がん、十二指腸がん、内分泌系がん、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜過形成、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、内皮細胞がん、上衣がん、上皮細胞がん、ユーイング肉腫、眼および眼窩のがん、女性性器がん、限局性結節性過形成、胆嚢がん、胃前庭部がん、胃底部がん、ガストリノーマ、神経膠芽腫、グルカゴノーマ、心臓がん、血管芽腫（hemangiblastoma）、血管内皮腫、血管腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝胆道がん、肝細胞癌、ホジキン病、回腸がん、インスリノーマ、上皮内新生物（intaepithelial neoplasia）、上皮間扁平上皮新生物（interepithelial squamouscell neoplasia）、肝内胆管がん、浸潤性扁平上皮癌、空腸がん、関節がん、カポジ肉腫、骨盤がん、大細胞癌、大腸がん、平滑筋肉腫、悪性黒子黒色腫、リンパ腫、男性生殖器がん、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄芽腫、髄上皮腫、髄膜がん、中皮がん、転移性癌、口腔がん（mouth cancer）、粘表皮癌、多発性骨髄腫、筋肉がん、鼻道がん（nasal tract cancer）、神経系がん、神経上皮腺癌  結節性黒色腫、非上皮性皮膚がん、非ホジキンリンパ腫、燕麦細胞癌、乏突起神経膠がん（oligodendroglialcancer）、口腔がん（oral cavity cancer）、骨肉腫、漿液性乳頭腺癌、陰茎がん、咽頭がん、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、直腸がん、腎細胞癌、呼吸器系がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、副鼻腔がん、皮膚がん、小細胞癌、小腸がん、平滑筋がん、軟部組織がん、ソマトスタチン分泌腫瘍、脊椎がん、扁平上皮癌、横紋筋がん、中皮下がん、表在拡大型黒色腫、Ｔ細胞白血病、舌がん、未分化癌、尿管がん、尿道がん、膀胱がん、泌尿器系がん、子宮頸部がん、子宮体がん、ぶどう膜黒色腫、膣がん、疣状癌、ビポーマ、外陰部がん、高分化癌、またはウィルムス腫瘍である。
【０２２３】
ある特定の他の実施形態では、がんは、Ｂ細胞リンパ腫またはＴ細胞リンパ腫などの非ホジキンリンパ腫である。ある特定の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、脾性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、または原発性中枢神経系（ＣＮＳ）リンパ腫などのＢ細胞リンパ腫である。ある特定の他の実施形態では、非ホジキンリンパ腫は、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、血管免疫芽球性Ｔ細胞リンパ腫、節外性ナチュラルキラー／Ｔ細胞リンパ腫、腸症型Ｔ細胞リンパ腫、皮下脂肪織炎様Ｔ細胞リンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、または末梢Ｔ細胞リンパ腫などのＴ細胞リンパ腫である。
【０２２４】
処置されるがんは、がん細胞の表面で発現する特定の抗原の存在に従って特徴付けられ得る。ある特定の実施形態では、がん細胞は、ＥｐＣＡＭに加えて、以下：ＣＤ２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ７０、ＥＧＦＲ／ＥＲＢＢ１、ＩＧＦ１Ｒ、ＨＥＲ３／ＥＲＢＢ３、ＨＥＲ４／ＥＲＢＢ４、ＭＵＣ１、ＴＲＯＰ２、ｃＭＥＴ、ＳＬＡＭＦ７、ＰＳＣＡ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＴＲＡＩＬＲ１、ＴＲＡＩＬＲ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＣＴＬＡ４、およびＰＤ１のうちの１つまたは複数を発現し得る。
【０２２５】
一部の他の実施形態では、第２の結合部位がＥｐＣＡＭに結合する場合、処置されるがんは、頭頸部がん、卵巣がん、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、胃がん、肝がん、食道がん、および肺がんから選択される。一部の他の実施形態では、第２の結合部位が、がん抗原１２５（ＣＡ１２５）、ナトリウム／リン酸共輸送体２Ｂ（ＮａＰｉ２ｂ）、ネクチン細胞接着分子４（Ｎｅｃｔｉｎ４）、フコシル−ＧＭ１（モノシアロテトラヘキソシルガングリオシド）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質８（ＡＤＡＭ８）、ディスインテグリンおよびメタロプロテイナーゼドメイン含有タンパク質９（ＡＤＡＭ９）、溶質キャリアファミリー４４メンバー４（ＳＬＣ４４Ａ４）、およびシアリル化ルイスａ抗原（ＣＡ１９−９）から選択される抗原に結合する場合、処置されるがんは、卵巣がん、子宮体がん、膵がん、肺がん、甲状腺がん、膀胱がん、乳がん、結腸直腸がん、小細胞肺がん、神経芽細胞腫、肝がん、腎がん、黒色腫、子宮頸がん、前立腺がん、骨肉腫、脳がん、胃がん、胆管癌から選択される。
ＩＶ．併用療法
【０２２６】
本発明の別の態様は併用療法を提供する。本明細書に記載の多重特異性結合タンパク質は、がんを処置するためにさらなる治療剤と組み合わせて使用することができる。
【０２２７】
がんを処置する際の併用療法の一部として使用され得る例示的な治療剤には、例えば、放射線、マイトマイシン、トレチノイン、リボムスチン、ゲムシタビン、ビンクリスチン、エトポシド、クラドリビン、ミトブロニトール、メトトレキサート、ドキソルビシン、カルボコン、ペントスタチン、ニトラクリン、ジノスタチン、セトロレリクス、レトロゾール、ラルチトレキセド、ダウノルビシン、ファドロゾール、フォテムスチン、チマルファシン、ソブゾキサン、ネダプラチン、シタラビン、ビカルタミド、ビノレルビン、ベスナリノン、アミノグルテチミド、アムサクリン、プログルミド、酢酸エリプチニウム、ケタンセリン、ドキシフルリジン、エトレチナート、イソトレチノイン、ストレプトゾシン、ニムスチン、ビンデシン、フルタミド、ドロゲニル、ブトシン、カルモフール、ラゾキサン、シゾフィラン、カルボプラチン、ミトラクトール、テガフール、イホスファミド、プレドニムスチン、ピシバニール、レバミゾール、テニポシド、インプロスルファン、エノシタビン、リスリド、オキシメトロン、タモキシフェン、プロゲステロン、メピチオスタン、エピチオスタノール、ホルメスタン、インターフェロン−アルファ、インターフェロン−２アルファ、インターフェロン−ベータ、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、コロニー刺激因子−１、コロニー刺激因子−２、デニロイキンディフティトックス、インターロイキン−２、黄体形成ホルモン放出因子、ならびにその同種受容体に対して特異な結合、および増加したまたは減少した血清半減期を示し得る上述の薬剤の変形型が含まれる。
【０２２８】
がんを処置する際の併用療法の一部として使用され得る薬剤のさらなるクラスは免疫チェックポイント阻害剤である。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、（ｉ）細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ４）、（ｉｉ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）、（ｉｉｉ）ＰＤＬ１、（ｉｖ）ＬＡＧ３、（ｖ）Ｂ７−Ｈ３、（ｖｉ）Ｂ７−Ｈ４、および（ｖｉｉ）ＴＩＭ３のうちの１つまたは複数を阻害する薬剤が含まれる。ＣＴＬＡ４阻害剤であるイピリムマブは、黒色腫を処置するために米国食品医薬品局によって承認されている。
【０２２９】
がんを処置する際に併用療法の一部として使用され得るさらに他の薬剤は、非チェックポイント標的を標的とするモノクローナル抗体薬剤（例えば、ハーセプチン）および非細胞傷害剤（例えば、チロシンキナーゼ阻害剤）である。
【０２３０】
抗がん剤のさらに他のカテゴリーには、例えば、（ｉ）ＡＬＫ阻害剤、ＡＴＲ阻害剤、Ａ２Ａアンタゴニスト、塩基除去修復阻害剤、Ｂｃｒ−Ａｂｌチロシンキナーゼ阻害剤、ブルトン型チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＣ７阻害剤、ＣＨＫ１阻害剤、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤、ＤＮＡ−ＰＫおよびｍＴＯＲの両方の阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤、ＤＮＭＴ１阻害剤＋２−クロロ−デオキシアデノシン、ＨＤＡＣ阻害剤、ヘッジホッグシグナル伝達経路阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、ｍＴＯＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＭＥＬＫ阻害剤、ＭＴＨ１阻害剤、ＰＡＲＰ阻害剤、ホスホイノシチド３−キナーゼ阻害剤、ＰＡＲＰ１およびＤＨＯＤＨの両方の阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼ−ＩＩ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＶＥＧＦＲ阻害剤、ならびにＷＥＥ１阻害剤から選択される阻害剤；（ｉｉ）ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＨＶＥＭ、ＴＮＦＲＳＦ２５、またはＩＣＯＳのアゴニスト；ならびに（ｉｉｉ）ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＧ−ＣＳＦから選択されるサイトカインが含まれる。
【０２３１】
本発明のタンパク質はまた、原発病巣の外科的除去の補助として使用され得る。
【０２３２】
多重特異性結合タンパク質およびさらなる治療剤の量ならびに投与の相対的タイミングは、所望の併用療法効果を達成するために選択され得る。例えば、このような投与を必要とする患者に併用療法を投与する場合、組み合わせる治療剤、または治療剤を含む１つもしくは複数の医薬組成物は、例えば、連続的に、併せて、一緒に、同時になどの任意の順序で投与され得る。さらに、例えば、多重特異性結合タンパク質は、さらなる治療剤がその予防効果または治療効果を発揮する時間の間投与されてもよく、またはその逆であってもよい。
Ｖ．医薬組成物
【０２３３】
本開示はまた、治療有効量の本明細書に記載のタンパク質を含有する医薬組成物を特徴とする。組成物は、種々の薬物送達系で使用されるように製剤化することができる。適切な製剤を作るために、１種または複数の生理学的に許容される賦形剤または担体を組成物に含めることもできる。本開示で使用される好適な製剤は、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、Mack  Publishing  Company、Philadelphia、Pa.、第１７版、１９８５年に見出される。薬物送達のための方法に関する簡潔な概説については、例えば、Langer（Science、２４９巻：１５２７〜１５３３頁、１９９０年）を参照されたい。
【０２３４】
医薬組成物は、治療有効量の、抗原（表１１に列記されている）部位を含む多重特異性結合タンパク質を含有し得る。
【０２３５】
本開示の静脈内薬物送達製剤は、バッグ、ペン、または注射器に含有されてもよい。ある特定の実施形態では、バッグはチューブおよび／または針を含むチャネルに接続されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は凍結乾燥製剤または液体製剤であってもよい。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライ（凍結乾燥）されてもよく、約１２〜６０個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤はフリーズドライされてもよく、４５ｍｇのフリーズドライされた製剤が１個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、約４０ｍｇ〜約１００ｍｇのフリーズドライされた製剤が１個のバイアルに含有されてもよい。ある特定の実施形態では、１２、２７、または４５個のバイアルからのフリーズドライされた製剤は、静脈内薬物製剤中に治療用量のタンパク質を得るために組み合わされてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約２５０ｍｇ／バイアル〜約１０００ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約６００ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。ある特定の実施形態では、製剤は液体製剤であってもよく、約２５０ｍｇ／バイアルとして保存されてもよい。
【０２３６】
タンパク質は、製剤を形成する緩衝溶液中に治療有効量のタンパク質を含む液体水性医薬製剤中に存在し得る。
【０２３７】
これらの組成物は従来の滅菌技術によって滅菌されてもよく、または濾過滅菌されてもよい。得られた水溶液はそのままで使用するためにパッケージ化されてもよく、または凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥された調製物は投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的に、３から１１の間、より好ましくは５から９の間または６から８の間、最も好ましくは７から８の間、例えば７〜７．５である。得られた固形の組成物は複数の単回用量単位でパッケージ化されてもよく、各々は一定量の上述の１つまたは複数の薬剤を含有する。固形の組成物はまた、柔軟な量のための容器にパッケージ化されてもよい。
【０２３８】
ある特定の実施形態では、本開示は、マンニトール、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、リン酸二水素ナトリウム二水和物、塩化ナトリウム、ポリソルベート８０、水、および酸化ナトリウムと組み合わせて本開示のタンパク質を含む、延長された貯蔵寿命を有する製剤を提供する。
【０２３９】
ある特定の実施形態では、ｐＨ緩衝溶液中に本開示のタンパク質を含む水性製剤が調製される。本発明の緩衝液は、約４〜約８、例えば、約４．５〜約６．０、もしくは約４．８〜約５．５の範囲のｐＨを有してもよく、または約５．０〜約５．２のｐＨを有してもよい。上記に列挙したｐＨの中間の範囲も、本開示の一部であることが意図される。例えば、上限および／または下限として上記に列挙した値のいずれかの組合せを使用する値の範囲が含まれることが意図される。ｐＨをこの範囲内に制御する緩衝液の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（コハク酸ナトリウムなど）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩および他の有機酸緩衝液が含まれる。
【０２４０】
ある特定の実施形態では、製剤は、ｐＨを約４〜約８の範囲に維持するためにクエン酸塩およびリン酸塩を含有する緩衝系を含む。ある特定の実施形態では、ｐＨの範囲は、約４．５〜約６．０、または約ｐＨ４．８〜約５．５、または約５．０〜約５．２のｐＨ範囲であってもよい。ある特定の実施形態では、緩衝系には、クエン酸一水和物、クエン酸ナトリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、および／またはリン酸二水素ナトリウム二水和物が含まれる。ある特定の実施形態では、緩衝系は、約１．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸（例えば、１．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約０．３ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム（例えば、０．３０５ｍｇ／ｍＬ）、約１．５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物（例えば、１．５３ｍｇ／ｍＬ）、約０．９ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物（例えば、０．８６）、および約６．２ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム（例えば、６．１６５ｍｇ／ｍＬ）を含む。ある特定の実施形態では、緩衝系は、１〜１．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸、０．２５〜０．５ｍｇ／ｍＬのクエン酸ナトリウム、１．２５〜１．７５ｍｇ／ｍＬのリン酸二ナトリウム二水和物、０．７〜１．１ｍｇ／ｍＬのリン酸二水素ナトリウム二水和物、および６．０〜６．４ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウムを含む。ある特定の実施形態では、製剤のｐＨは水酸化ナトリウムを用いて調整される。
【０２４１】
トニシファイヤー（tonicifier）として作用し、抗体を安定化させることができるポリオールも、製剤に含めることができる。ポリオールは、製剤の所望の等張性に関して変化し得る量で製剤に添加される。ある特定の実施形態では、水性製剤は等張性であってもよい。添加されるポリオールの量も、ポリオールの分子量に関して変化し得る。例えば、二糖（トレハロースなど）と比較して、少量の単糖（例えば、マンニトール）が添加されてもよい。ある特定の実施形態では、等張化剤として製剤に使用され得るポリオールはマンニトールである。ある特定の実施形態では、マンニトール濃度は約５〜約２０ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約７．５〜１５ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１０〜１４ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、マンニトールの濃度は約１２ｍｇ／ｍｌであってもよい。ある特定の実施形態では、ポリオールソルビトールを製剤に含めることができる。
【０２４２】
洗剤または界面活性剤もまた、製剤に添加してもよい。例示的な洗剤としては、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０、８０など）またはポロクサマー（例えば、ポロクサマー１８８）などの非イオン性洗剤が挙げられる。添加される洗剤の量は、製剤化された抗体の凝集を低減させ、かつ／または製剤中の微粒子の形成を最低限に抑え、かつ／または吸着を低減させるようなものである。ある特定の実施形態では、製剤は、ポリソルベートである界面活性剤を含み得る。ある特定の実施形態では、製剤は、洗剤のポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ  ８０を含有し得る。Ｔｗｅｅｎ  ８０は、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエートを表すために使用される用語である（Fiedler、Lexikon  der  Hifsstoffe、Editio  Cantor  Verlag  Aulendorf、第４版、１９９６年を参照されたい）。ある特定の実施形態では、製剤は、約０．１ｍｇ／ｍＬから約１０ｍｇ／ｍＬの間のポリソルベート８０、または約０．５ｍｇ／ｍＬから約５ｍｇ／ｍＬの間を含有し得る。ある特定の実施形態では、約０．１％のポリソルベート８０が製剤に添加され得る。
【０２４３】
実施形態では、本開示のタンパク質産物は、液体製剤として製剤化される。液体製剤は、ゴム栓で閉じ、アルミニウムクリンプシールクロージャで密封した、ＵＳＰ／Ｐｈ  ＥｕｒいずれかのタイプＩ  ５０Ｒバイアルにおいて、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で提供され得る。栓は、ＵＳＰおよびＰｈ  Ｅｕｒに準拠したエラストマーで作られていてもよい。ある特定の実施形態では、６０ｍＬの採取容量を可能にするために、バイアルに６１．２ｍＬのタンパク質産物溶液が充填され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、０．９％の生理食塩水で希釈され得る。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、安定化レベルで糖と組み合わせた１０ｍｇ／ｍＬ濃度溶液として調製され得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は水性担体中で調製され得る。ある特定の実施形態では、安定剤は、静脈内投与に望ましくないまたは不適切な粘度をもたらし得る量以下の量で添加され得る。ある特定の実施形態では、糖は、二糖、例えば、スクロースであり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤はまた、緩衝剤、界面活性剤、および保存剤のうちの１つまたは複数を含み得る。
【０２４５】
ある特定の実施形態では、液体製剤のｐＨは薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、塩基は水酸化ナトリウムであり得る。
【０２４６】
凝集に加えて、脱アミドは、発酵、採取／細胞清澄化、精製、薬物物質／薬物製品貯蔵の間および試料分析の間に発生し得るペプチドおよびタンパク質の一般的な産物のバリアントである。脱アミドは、加水分解を受け得るスクシンイミド中間体を形成するタンパク質からのＮＨ３の喪失である。スクシンイミド中間体は、親ペプチドの１７ダルトンの質量減少をもたらす。その後の加水分解は、１８ダルトンの質量増加をもたらす。スクシンイミド中間体の単離は、水性条件下での不安定性に起因して困難である。したがって、脱アミドは、典型的に１ダルトンの質量増加として検出可能である。アスパラギンの脱アミドは、アスパラギン酸またはイソアスパラギン酸のいずれかを生じる。脱アミドの速度に影響を及ぼすパラメータには、ｐＨ、温度、溶媒誘電率、イオン強度、一次配列、局所ポリペプチド立体配座および三次構造が含まれる。ペプチド鎖におけるＡｓｎに隣接するアミノ酸残基は、脱アミド化速度に影響を及ぼす。タンパク質配列におけるＡｓｎに続くＧｌｙおよびＳｅｒは、脱アミドに対してより高い感受性を生じる。
【０２４７】
ある特定の実施形態では、本開示の液体製剤は、タンパク質産物の脱アミノを阻止するためのｐＨおよび湿度の条件下で保存され得る。
【０２４８】
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０２４９】
保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加することができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にすることができる。
【０２５０】
静脈内（ＩＶ）製剤は、患者が、移植後に入院しており、ＩＶ経路を介してすべての薬物を受けている場合などの特定の場合に好ましい投与経路であり得る。ある特定の実施形態では、液体製剤は、投与前に０．９％の塩化ナトリウム溶液により希釈される。ある特定の実施形態では、注射のための希釈された薬物製品は等張であり、静脈内注入による投与に適している。
【０２５１】
ある特定の実施形態では、塩または緩衝成分は１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加することができる。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いて種々の公知の酸（無機および有機）から誘導される。ある特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート、炭酸、クエン酸緩衝液であってもよく、これらの場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
【０２５２】
保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減させるために本明細書における製剤に添加することができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の生産を容易にすることができる。
【０２５３】
本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な担体には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０２５４】
本開示のタンパク質は、タンパク質および凍結乾燥保護剤を含む凍結乾燥製剤として存在することもできる。凍結乾燥保護剤は糖、例えば二糖であり得る。ある特定の実施形態では、凍結乾燥保護剤は、スクロースまたはマルトースであり得る。凍結乾燥製剤はまた、緩衝剤、界面活性物質、増量剤、および／または保存剤のうちの１つまたは複数を含んでもよい。
【０２５５】
凍結乾燥された薬物製品の安定化に有用なスクロースまたはマルトースの量は、少なくとも１：２のタンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比であり得る。ある特定の実施形態では、タンパク質対スクロースまたはマルトースの重量比は１：２〜１：５であり得る。
【０２５６】
ある特定の実施形態では、凍結乾燥前の製剤のｐＨは、薬学的に許容される酸および／または塩基の添加によって設定され得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される酸は塩酸であり得る。ある特定の実施形態では、薬学的に許容される塩基は水酸化ナトリウムであり得る。
【０２５７】
凍結乾燥前に、本開示のタンパク質を含有する溶液のｐＨは６から８の間に調整され得る。ある特定の実施形態では、凍結乾燥した薬物製品についてのｐＨ範囲は７〜８であり得る。
【０２５８】
ある特定の実施形態では、塩または緩衝成分は１０ｍＭ〜２００ｍＭの量で添加することができる。塩および／または緩衝液は薬学的に許容され、「塩基形成」金属またはアミンを用いて種々の公知の酸（無機および有機）から誘導される。ある特定の実施形態では、緩衝液はリン酸緩衝液であり得る。ある特定の実施形態では、緩衝液は、グリシネート、炭酸、クエン酸緩衝液であってもよく、これらの場合、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムイオンが対イオンとして機能し得る。
【０２５９】
ある特定の実施形態では、「増量剤」を添加することができる。「増量剤」は、凍結乾燥混合物に質量を付加し、凍結乾燥ケーキの物理的構造に寄与する（例えば、開放気孔構造を維持する本質的に均一な凍結乾燥ケーキの製造を容易にする）化合物である。例示的な増量剤には、マンニトール、グリシン、ポリエチレングリコールおよびソルビトールが含まれる。本発明の凍結乾燥製剤はこのような増量剤を含有し得る。
【０２６０】
保存剤は必要に応じて、細菌作用を低減するために本明細書における製剤に添加することができる。保存剤の添加は、例えば、多数回使用（複数回投与）製剤の製造を容易にすることができる。
【０２６１】
ある特定の実施形態では、凍結乾燥薬物製品は水性担体で構成され得る。本明細書における目的の水性担体は、薬学的に許容され（例えば、ヒトへの投与に安全かつ無毒であり）、凍結乾燥後、液体製剤の調製に有用であるものである。例示的な希釈剤には、注射用滅菌水（ＳＷＦＩ）、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー液またはデキストロース溶液が含まれる。
【０２６２】
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥薬物製品は、注射用滅菌水、ＵＳＰ（ＳＷＦＩ）または０．９％の塩化ナトリウム注射液、ＵＳＰのいずれかで再構成される。再構成の間、凍結乾燥粉末は溶液に溶解する。
【０２６３】
ある特定の実施形態では、本開示の凍結乾燥タンパク質製品は、約４．５ｍＬの注射用水に構成され、０．９％の生理食塩水溶液（塩化ナトリウム溶液）により希釈される。
【０２６４】
本発明の医薬組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、患者に毒性を生じず、特定の患者、組成物、および投与様式に対して所望の治療応答を達成するのに有効である活性成分の量を得るように変化し得る。
【０２６５】
特定の用量は、各患者に対して均一な用量、例えば、５０〜５０００ｍｇのタンパク質であってもよい。代替的に、患者の用量は、患者のおおよその体重または表面積に合わせられ得る。適切な投薬量を決定する際の他の要因には、処置または予防される疾患または状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに患者の年齢、性別および医学的状態が含まれ得る。処置のための適切な投薬量を決定するために必要な計算のさらなる改良は、特に、本明細書に開示される投薬量情報およびアッセイを考慮して当業者によって慣用的になされる。投薬量はまた、適切な用量応答データと併せて使用される投薬量を決定するための公知のアッセイの使用によって決定することができる。個々の患者の投薬量は、疾患の進行がモニターされるにつれて調節されてもよい。患者における標的化可能な構築物または複合物の血中レベルは、有効濃度に達するか、または有効濃度を維持するように投薬量が調節される必要があるかどうかを調べるために測定され得る。どの標的化可能な構築物および／または複合物、ならびにそれらの投薬量が、所与の個体に対して効果的である可能性が高いかを決定するために薬理ゲノム学が使用され得る（Schmitzら、Clinica  Chimica  Acta  ３０８巻：４３〜５３頁、２００１年；Steimerら、Clinica  Chimica  Acta  ３０８巻：３３〜４１頁、２００１年）。
【０２６６】
一般に、体重に基づく投薬量は、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、例えば、約０．０１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約０．０１μｇ〜約０．１μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約０．１μｇ〜約１μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約１μｇ〜約１０μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ〜約５０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。
【０２６７】
用量は、１日に１回もしくは複数回、１週間に１回もしくは複数回、１ヶ月に１回もしくは複数回または１年に１回もしくは複数回、またはさらに２〜２０年に１回与えられ得る。当業者は、体液または組織中の標的化可能な構築物または複合体の測定された滞留時間および濃度に基づいて投薬のための反復率を容易に推定することができる。本発明の投与は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内、髄腔内、腔内であってもよく、カテーテルを介する潅流によってでもよく、または直接的な病巣内注射によってでもよい。これは、１日に１回または複数回、１週間に１回または複数回、１ヶ月に１回または複数回、および１年に１回または複数回、投与され得る。
【０２６８】
上記の説明は本発明の複数の態様および実施形態を記載している。本出願は特に、態様および実施形態のすべての組合せおよび置換を意図する。
【実施例】
【０２６９】
ここで概して記載されている本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され、これらの実施例は本発明のある特定の態様および実施形態の例示の目的のためにのみ含まれ、本発明を限定することを意図していない。
（実施例１）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄに結合する
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは精製した組換えＮＫＧ２Ｄに結合する
【０２７０】
ヒト、マウス、またはカニクイザルＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインの核酸配列を、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインをコードする核酸配列と融合させ、発現させる哺乳動物細胞に導入した。精製後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させた。非特異的結合を防ぐためにウシ血清アルブミンでウェルをブロッキングした後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを滴定し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ融合タンパク質を予め吸着させたウェルに添加した。一次抗体結合を、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートし、Ｆｃ交差反応を回避するためにヒトカッパ軽鎖特異的に認識する二次抗体を使用して検出した。西洋ワサビペルオキシダーゼの基質である３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）をウェルに添加して結合シグナルを可視化し、その吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローン、アイソタイプ対照または陽性対照（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖および軽鎖可変ドメイン、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５を含む）を各ウェルに添加した。
【０２７１】
アイソタイプ対照は組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質に対してわずかな結合を示したが、陽性対照が組換え抗原に対して最も強く結合した。クローン毎に親和性は異なったが、すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒト、マウス、およびカニクイザルの組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質のすべてで結合を示した。概して、各抗ＮＫＧ２Ｄクローンは、ヒト（図３）およびカニクイザル（図４）の組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに同様の親和性で結合したが、マウス（図５）の組換えＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃに対する親和性は比較的低かった。
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄを発現する細胞に結合する
【０２７２】
ＥＬ４マウスリンパ腫細胞株を、ヒトまたはマウスのＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインキメラ抗原受容体を発現するように工学操作した。ＮＫＧ２Ｄ結合クローン、アイソタイプ対照または陽性対照を１００ｎＭ濃度にて使用して、ＥＬ４細胞において発現した細胞外ＮＫＧ２Ｄを染色した。フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して抗体結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、親ＥＬ４細胞と比較したＮＫＧ２Ｄ発現細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を使用してバックグラウンドに対する倍率（ＦＯＢ）を計算した。
【０２７３】
すべてのクローンによって産生されたＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが、ヒトおよびマウスのＮＫＧ２Ｄを発現するＥＬ４細胞に結合した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖および軽鎖可変ドメイン、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにおいて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５を含む）が最も良好なＦＯＢ結合シグナルをもたらした。各クローンのＮＫＧ２Ｄ結合親和性は、ヒトＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（図６）とマウスＮＫＧ２Ｄを発現する細胞（図７）との間で同様であった。
（実施例２）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２Ｄへの天然リガンドの結合を遮断する
ＵＬＢＰ−６との競合
【０２７４】
組換えヒトＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウシ血清アルブミンでウェルをブロッキングした。飽和濃度のＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンを添加した。２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンを、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートしたストレプトアビジンおよびＴＭＢ基質によって検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ウェル中のＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質への結合を遮断されたＵＬＢＰ−６−Ｈｉｓ−ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）および種々のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２ＤへのＵＬＢＰ−６の結合を遮断したが、アイソタイプ対照はＵＬＢＰ−６との競合をほとんど示さなかった（図８）。ＵＬＢＰ−６配列は配列番号１０８により表される
【化２９】
2020533311.tif 000053
ＭＩＣＡとの競合
【０２７５】
組換えヒトＭＩＣＡ−Ｆｃタンパク質をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウシ血清アルブミンでウェルをブロッキングした。ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーションおよび洗浄後、ＭＩＣＡ−Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、ＭＩＣＡ−Ｆｃでコーティングされたウェルへの結合を遮断されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照抗体（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖および軽鎖可変ドメインを含む）および種々のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫＧ２ＤへのＭＩＣＡの結合を遮断したが、アイソタイプ対照はＭＩＣＡとの競合をほとんど示さなかった（図９）。
Ｒａｅ−１デルタとの競合
【０２７６】
組換えマウスＲａｅ−１デルタ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した）をマイクロプレートのウェルに吸着させ、非特異的結合を低減させるためにウシ血清アルブミンでウェルをブロッキングした。マウスＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンをウェルに添加し、続いてＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを添加した。インキュベーションおよび洗浄後、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃでコーティングされたウェルに結合したままであったＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンを、ストレプトアビジン−ＨＲＰおよびＴＭＢ基質を使用して検出した。吸光度を４５０ｎＭにて測定し、５４０ｎＭにて補正した。バックグラウンドを差し引いた後、ＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃタンパク質へのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの特異的結合を、Ｒａｅ−１デルタ−Ｆｃでコーティングされたウェルへの結合を遮断されたＮＫＧ２Ｄ−Ｆｃ−ビオチンのパーセンテージから計算した。陽性対照（配列番号１０１〜１０４から選択される重鎖および軽鎖可変ドメイン、またはｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにおいて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５を含む）ならびに種々のＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンはマウスＮＫＧ２ＤへのＲａｅ−１デルタの結合を遮断したが、アイソタイプ対照抗体はＲａｅ−１デルタとの競合をほとんど示さなかった（図１０）。
（実施例３）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインクローンはＮＫＧ２Ｄを活性化させる
【０２７７】
ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをコードする核酸配列に、ヒトおよびマウスＮＫＧ２Ｄの核酸配列を融合させて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）構築物を得た。次に、ギブソンアセンブリを使用してＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ構築物をレトロウイルスベクターにクローニングし、レトロウイルス産生のためにｅｘｐｉ２９３細胞にトランスフェクトした。８μｇ／ｍＬのポリブレンと共にＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを含有するウイルスにＥＬ４細胞を感染させた。感染の２４時間後、ＥＬ４細胞中のＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲの発現レベルをフローサイトメトリーによって分析し、細胞表面で高レベルのＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲを発現するクローンを選択した。
【０２７８】
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがＮＫＧ２Ｄを活性化させるかどうかを判定するために、それらをマイクロプレートのウェルに吸着させ、抗体断片でコーティングされたウェルにおいてＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ  ＥＬ４細胞をブレフェルジン−Ａおよびモネンシンの存在下で４時間にわたって培養した。ＮＫＧ２Ｄ活性化の指標である細胞内ＴＮＦα産生をフローサイトメトリーによってアッセイした。陽性対照で処置した細胞に対してＴＮＦα陽性細胞のパーセンテージを正規化した。すべてのＮＫＧ２Ｄ結合ドメインがヒトＮＫＧ２Ｄ（図１１）およびマウスＮＫＧ２Ｄ（図１２）の両方を活性化させた。
（実施例４）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインはＮＫ細胞を活性化させる
初代ヒトＮＫ細胞
【０２７９】
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血バフィコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクションを使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）を単離し、単離されたＮＫ細胞の純度は典型的には＞９５％であった。次に、単離されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＩＬ−２を含有する培地中で２４〜４８時間にわたって培養した後、それらを、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａ、およびモネンシンを含有する培地中で培養した。培養後、ＣＤ３、ＣＤ５６およびＩＦＮ−γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３−ＣＤ５６＋細胞におけるＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γの染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の会合による、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび陽性対照（例えば、重鎖可変ドメインは配列番号１０１または配列番号１０３によって表され、軽鎖可変ドメインは配列番号１０２または配列番号１０４によって表される）では、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ＋およびＩＦＮ−γ＋になることが示された（図１３および図１４は、ＮＫ細胞の調製のために異なるドナーのＰＢＭＣをそれぞれ使用した、２つの独立した実験からのデータを表す）。
初代マウスＮＫ細胞
【０２８０】
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスから脾臓を得、７０μｍのセルストレイナーを通して押しつぶして、単一細胞懸濁液を得た。細胞をペレット化し、ＡＣＫ溶解緩衝剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した、＃Ａ１０４９２０１；１５５ｍＭ塩化アンモニウム、１０ｍＭ炭酸水素カリウム、０．０１ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁して赤血球を除去した。残りの細胞を１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２と共に７２時間にわたって培養し、その後採取し、ＮＫ細胞単離の用意をした。次に、磁気ビーズを用いたネガティブディプリーション（negative depletion）技術を使用し、典型的には＞９０％の純度で脾臓細胞からＮＫ細胞（ＣＤ３−ＮＫ１．１＋）を単離した。精製されたＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのｍＩＬ−１５を含有する培地中で４８時間にわたって培養した後、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインを吸着させたマイクロプレートのウェルに移し、フルオロフォアコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ抗体、ブレフェルジン−Ａ、およびモネンシンを含有する培地中で培養した。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインでコーティングされたウェルにおいて培養した後、ＣＤ３、ＮＫ１．１およびＩＦＮ−γに対するフルオロフォアコンジュゲート抗体を使用したフローサイトメトリーによってＮＫ細胞をアッセイした。ＣＤ３−ＮＫ１．１＋細胞におけるＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γの染色を分析して、ＮＫ細胞の活性化を評価した。ＣＤ１０７ａ／ＩＦＮ−γ二重陽性細胞の増加は、１つの受容体ではなく２つの活性化受容体の会合による、より良好なＮＫ細胞の活性化を示す。ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインおよび陽性対照（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅにおいて入手可能な抗マウスＮＫＧ２ＤクローンＭＩ−６およびＣＸ−５から選択される）は、アイソタイプ対照よりも高いパーセンテージのＮＫ細胞がＣＤ１０７ａ＋およびＩＦＮ−γ＋になることを示した（図１５および図１６は、ＮＫ細胞の調製のために異なるマウスをそれぞれ使用した、２つの独立した実験からのデータを表す）。
（実施例５）
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインは標的腫瘍細胞の細胞傷害性を可能にする
【０２８１】
ヒトおよびマウス初代ＮＫ細胞活性化アッセイは、ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインとのインキュベーション後、ＮＫ細胞における細胞傷害性マーカーの増加を実証した。これが腫瘍細胞溶解の増加につながるかどうかに対処するために、各ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインが単一特異性抗体に発達させる細胞ベースのアッセイを利用した。Ｆｃ領域を１つの標的化アームとして使用し、一方、Ｆａｂ断片領域（ＮＫＧ２Ｄ結合ドメイン）はＮＫ細胞を活性化するための別の標的化アームとして働いた。ヒト起源であり、高レベルのＦｃ受容体を発現するＴＨＰ−１細胞を腫瘍標的として使用し、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性キットを使用した。ＴＨＰ−１細胞をＢＡＴＤＡ試薬で標識し、１０５／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。次に、標識したＴＨＰ−１細胞をＮＫＧ２Ｄ抗体と組み合わせ、マイクロタイタープレートのウェル中で３７℃にて３時間、マウスＮＫ細胞を単離した。インキュベーション後、２０μＬの培養上清を取り出し、２００μＬのユーロピウム溶液と混合し、暗所で１５分間振盪しながらインキュベートした。時間分解蛍光モジュール（励起３３７ｎＭ、発光６２０ｎＭ）を備えたＰｈｅｒａＳｔａｒプレートリーダーによって蛍光を経時的に測定し、キットの指示に従って特異的溶解を計算した。
【０２８２】
Ｆｃとコンジュゲートした陽性対照のＵＬＢＰ−６（ＮＫＧ２Ｄに対する天然リガンドである）は、マウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解の増加を示した。ＮＫＧ２Ｄ抗体も、ＴＨＰ−１標的細胞の特異的溶解を増加させたが、アイソタイプ対照抗体は特異的溶解の低減を示した。点線は、抗体を添加していないマウスＮＫ細胞によるＴＨＰ−１細胞の特異的溶解を示す（図１７）。
（実施例６）
ＮＫＧ２Ｄ抗体は高い熱安定性を示す
【０２８３】
ＮＫＧ２Ｄ結合ドメインの融解温度を、示差走査型蛍光定量法を使用してアッセイした。外挿した見かけの融解温度は典型的なＩｇＧ１抗体と比較して高い（図１８）。
（実施例７）
ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１６の架橋によるヒトＮＫ細胞の相乗的活性化
初代ヒトＮＫ細胞活性化アッセイ
【０２８４】
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血バフィコートから末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。ネガティブ磁気ビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＃１７９５５）を使用してＰＢＭＣからＮＫ細胞を精製した。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーによって決定して＞９０％のＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。次に、細胞を、活性化アッセイに使用する前に１００ｎｇ／ｍＬのｈＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ  ＃２００−０２）を含有する培地中で４８時間増やした。抗体を、滅菌ＰＢＳ  １００μＬ中２μｇ／ｍＬ（抗ＣＤ１６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３０２０１３）および５μｇ／ｍＬ（抗ＮＫＧ２Ｄ、Ｒ＆Ｄ  ＃ＭＡＢ１３９）の濃度にて４℃で一晩、９６ウェル平底プレート上にコーティングし、続いてウェルを十分に洗浄して過剰の抗体を除去した。脱顆粒の評価のために、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのヒトＩＬ−２（ｈＩＬ２）および１μｇ／ｍＬのＡＰＣコンジュゲート抗ＣＤ１０７ａ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３２８６１９）を補充した培養培地に５×１０５個の細胞／ｍＬにて再懸濁した。次に、１×１０５個の細胞／ウェルを、抗体でコーティングされたプレート上に添加した。タンパク質輸送阻害剤であるブレフェルジンＡ（ＢＦＡ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃４２０６０１）およびモネンシン（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃４２０７０１）を、それぞれ１：１０００および１：２７０の最終的希釈度にて添加した。蒔いた細胞を、３７℃にて４時間にわたって５％ＣＯ２中でインキュベートした。ＩＦＮ−γの細胞内染色のために、ＮＫ細胞を、抗ＣＤ３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３００４５２）および抗ＣＤ５６  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃３１８３２８）で標識し、続いて固定し、透過処理し、抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  ＃５０６５０７）で標識した。ＮＫ細胞を、生ＣＤ５６＋ＣＤ３−細胞においてゲーティングした後、フローサイトメトリーによってＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γの発現について分析した。
【０２８５】
受容体の組合せの相対的効力を調査するため、プレート結合刺激により、ＮＫＧ２ＤまたはＣＤ１６の架橋および両受容体の共架橋を行った。図１９（図１９Ａ〜１９Ｃ）に示したように、ＣＤ１６およびＮＫＧ２Ｄの組み合わせた刺激は、ＣＤ１０７ａのレベル（脱顆粒）（図１９Ａ）および／またはＩＦＮ−γ産生（図１９Ｂ）の大きな上昇をもたらした。点線は、各受容体の個々の刺激の相加効果を表す。
抗ＣＤ１６、抗ＮＫＧ２Ｄまたは両方のモノクローナル抗体の組合せを用いた４時間のプレート結合刺激の後、ＩＬ−２活性化ＮＫ細胞のＣＤ１０７ａレベルおよび細胞内ＩＦＮ−γ産生を分析した。グラフは、平均（ｎ＝２）±Ｓｄを示している。図１９Ａは、ＣＤ１０７ａのレベルを示し、図１９Ｂは、ＩＦＮ−γのレベルを示し、図１９Ｃは、ＣＤ１０７ａおよびＩＦＮ−γのレベルを示す。図１９Ａ〜１９Ｃに示したデータは、５名の異なる健康なドナーを使用した、５つの独立した実験を代表するものである。
（実施例８）
三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）に媒介される標的細胞の細胞傷害性の増強
ヒトがん抗原を発現した細胞へのＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂの結合の評価
【０２８６】
ＥＰＣＡＭを発現するヒトがん細胞株を使用して、Ｆ４フォーマットおよびＦ３’フォーマットの、ＥＰＣＡＭを標的とするクローンＭＴ１１０に由来するＴｒｉＮＫＥＴの腫瘍抗原結合を評価した。ヒト細胞株Ｈ７４７、ＨＣＣ８２７およびＨＣＴ１１６を使用して、ＴｒｉＮＫＥＴおよびｍＡｂのＥＰＣＡＭを発現した細胞への結合を評価した。ＴｒｉＮＫＥＴまたはｍＡｂを希釈し、それぞれの細胞とインキュベートした。フルオロフォアコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ二次抗体を使用して結合を検出した。細胞をフローサイトメトリーによって分析し、ＥＰＣＡＭを発現した細胞に対する結合ＭＦＩをヒト組換えＩｇＧ１で染色した対照に対して正規化してバックグラウンド値に対する倍率を得た。
【０２８７】
図３７は、本開示の三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）（Ａ４９−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＴ１１０およびＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＴ１１０）および親モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＥｐＣＡＭを発現するＨ７４７ヒト結腸直腸がん細胞への結合を示す。図３８は、本開示の三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）（Ａ４９−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＴ１１０およびＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＴ１１０）および親モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＥｐＣＡＭを発現するＨＣＣ８２７ヒト肺がん細胞への結合を示す。図３９は、本開示の三重特異性結合タンパク質（ＴｒｉＮＫＥＴ）（Ａ４９−Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＴ１１０およびＡ４９−Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴ−ＭＴ１１０）および親モノクローナル抗体（ｍＡｂ）のＥｐＣＡＭを発現するＨＣＴ１１６ヒト結腸直腸がん細胞への結合を示す。全体的な結合は、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴでは、ＭＴ１１０  ＥＰＣＡＭ結合体が組み込まれたＦ３’−ＴｒｉＮＫＥＴと比較してより強力であった。
初代ヒトＮＫ細胞の細胞傷害性アッセイ
【０２８８】
密度勾配遠心分離を使用し、ヒト末梢血バフィコートからＰＢＭＣを単離した。単離されたＰＢＭＣを洗浄し、ＮＫ細胞単離のために用意した。磁気ビーズを用いたネガティブセレクション技術を使用してＮＫ細胞を単離した。達成された単離されたＮＫ細胞の純度は、典型的には９０％よりも高いＣＤ３−ＣＤ５６＋であった。単離されたＮＫ細胞をサイトカインなしで一晩インキュベートし、翌日、細胞傷害性アッセイに使用した。
ＤＥＬＦＩＡ細胞傷害性アッセイ
【０２８９】
目的の標的を発現するヒトがん細胞株を培養物から採取し、ＨＢＳで洗浄し、ＢＡＴＤＡ試薬（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＡＤ０１１６）で標識するために成長培地に１０６個の細胞／ｍＬにて再懸濁した。製造業者の指示に従って標的細胞を標識した。標識後、細胞をＨＢＳで３回洗浄し、０．５×１０５個の細胞／ｍＬにて培養培地に再懸濁した。バックグラウンドウェルを用意するために、標識した細胞のアリコートを取っておき、細胞を培地からスピンアウトした。培地１００μＬを、ペレット化した細胞を乱さないように３連でウェルに注意深く添加した。１００μＬのＢＡＴＤＡ標識細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。ウェルを標的細胞からの自然放出のために保存し、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘの添加による標的細胞の溶解のために用意した。目的の腫瘍標的に対するモノクローナル抗体またはＴｒｉＮＫＥＴを培養培地で希釈し、５０μＬの希釈したｍＡｂまたはＴｒｉＮＫＥＴを各ウェルに添加した。休止ＮＫ細胞を培養物から採取し、洗浄し、所望のエフェクター細胞と標的細胞の比に応じて培養培地に１．０×１０５〜２．０×１０６個の細胞／ｍＬにて再懸濁した。５０μＬのＮＫ細胞をプレートの各ウェルに添加して合計２００μＬの培養体積にした。アッセイの展開前にプレートを３７℃にて５％ＣＯ２で２〜４時間にわたってインキュベートした。
【０２９０】
２〜３時間培養した後、プレートをインキュベーターから取り出し、細胞を２００×ｇで５分間の遠心分離によってペレット化した。２０μＬの培養上清を、製造業者から提供された清浄なマイクロプレートに移し、２００μＬの室温ユーロピウム溶液を各ウェルに添加した。プレートを光から保護し、プレートシェーカーにおいて２５０ｒｐｍにて１５分にわたってインキュベートした。プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）ｉ３Ｘ機器（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して読み取り、パーセント特異的溶解を計算した（特異的溶解％＝（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出））×１００）。
【０２９１】
図４０Ａおよび図４０Ｂは、Ｈ７４７ヒトがん細胞に対する、２名の異なる健康なドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介細胞傷害性である。図４１Ａおよび図４１Ｂは、ＨＣＣ８２７ヒトがん細胞に対する、２名の異なる健康なドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介細胞傷害性である。図４２Ａおよび図４２Ｂは、ＭＣＦ７ヒトがん細胞に対する、２名の異なる健康なドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介細胞傷害性である。図４３Ａおよび図４３Ｂは、ＨＣＴ１１６ヒトがん細胞に対する、２名の異なる健康なドナー由来の休止ヒトＮＫ細胞のＴｒｉＮＫＥＴ媒介細胞傷害性である。ＥＰＣＡＭを標的とするＦ４−ＴｒｉＮＫＥＴは、ＥＰＣＡＭを標的とする親ｍＡｂよりも効果的に標的細胞を死滅させた。Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴはまた、Ｆ３’−ＴｒｉＮＫＥＴよりも強力に標的細胞を死滅させ、これは、Ｆ４−ＴｒｉＮＫＥＴの標的細胞への結合がより強力であることを反映するものであり得る。
参照による組込み
【０２９２】
本明細書で参照される特許文書および科学論文の各々の開示全体は、すべての目的のために参照により組み込まれる。
等価物
【０２９３】
本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱せずに他の特定の形態で実現されてもよい。したがって、前述の実施形態は、本明細書で記載している本発明を限定するのではなく、すべての点で例示的であるとみなされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の等価の意味および範囲に入るすべての変更はその中に包含されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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