(57)【要約】ＡＡＶ末端逆位反復配列と、４つの異なる免疫グロブリン領域（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）をコードする少なくとも１つの核酸配列とを含むベクターゲノムを中にパッケージングして有しているＡＡＶカプシドを有する非複製性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。ｒＡＡＶが発現させる免疫グロブリンは、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢに対する受動免疫化を提供するために有用である。本明細書ではさらに、ｒＡＡＶを含有する組成物について記載する。患者にインフルエンザに対するワクチン接種を施す方法を提供する。【選択図】図１５
2020510430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡＶ末端逆位反復配列と、
免疫グロブリン領域（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）をコードする少なくとも１つの核酸配列と
を含むベクターゲノムを中にパッケージングして有しているＡＡＶカプシドを有する非複製性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）であって、免疫グロブリン領域（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）の各々が前記ｒＡＡＶから発現するものであり、
（ａ）が、配列番号１のアミノ酸配列：（Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ）を有する第１免疫グロブリン領域であり、
（ｂ）が、配列番号２のアミノ酸配列：（Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ）を有する第２免疫グロブリン領域であり、
（ｃ）が、配列番号３のアミノ酸配列：（Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ）を有する第３免疫グロブリン領域であり、
（ｄ）が、配列番号４のアミノ酸配列：（Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ）を有する第４免疫グロブリン領域である、前記ｒＡＡＶ。
【請求項２】
前記第１、第２、第３及び／または第４免疫グロブリン領域が融合構築物中にあり、前記融合構築物がさらにＦｃ領域を含み、前記融合構築物には前記４つの免疫グロブリン領域と前記Ｆｃ領域とを繋ぎ合わせる連結配列が場合によって存在している、請求項１に記載のｒＡＡＶ。
【請求項３】
前記融合構築物がさらに、前記免疫グロブリン領域のうちの２つ以上の間に位置する前記連結配列を含む、請求項２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項４】
各連結配列が独立して選択される、請求項２または請求項３に記載のｒＡＡＶ。
【請求項５】
少なくとも１つの連結配列がＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７）である、請求項２〜４のいずれかに記載のｒＡＡＶ。
【請求項６】
前記ベクターゲノムが、前記第１免疫グロブリンのアミノ末端にある免疫グロブリンにとって外来性である供給源からのシグナルペプチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項７】
前記シグナルペプチドがヒトインターロイキン−２シグナルペプチドである、請求項６に記載のｒＡＡＶ。
【請求項８】
前記ベクターゲノムがモノシストロン性の発現カセットを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項９】
前記ベクターゲノムがバイシストロン性の発現カセットを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１０】
前記免疫グロブリン領域のうち２つが第１Ｆｃに連結されて第１鎖を形成しており、もう２つの免疫グロブリン領域が第２Ｆｃに連結されて第２鎖を形成している、請求項９に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１１】
前記ベクターゲノムがＩＲＥＳまたはＦ２Ａ配列を含む、請求項９または請求項１０に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１２】
前記ベクターゲノムが５’ＵＴＲを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１３】
前記５’ＵＴＲがヒトｃ−ｍｙｃ  ５’ＵＴＲの断片である、請求項１２に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１４】
前記ベクターゲノムが一本鎖ＡＡＶ  ５’末端逆位反復配列と、ＡＡＶ  ３’末端逆位反復配列とを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１５】
前記ベクターゲノムが、配列番号２７、配列番号１２または配列番号３０のアミノ酸配列を有する抗インフルエンザ融合構築物をコードする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１６】
前記ベクターゲノムが、配列番号２１、配列番号１９、配列番号１５、配列番号１４、配列番号５、配列番号２６、配列番号２０、配列番号１３、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１７】
前記ｒＡＡＶがＡＡＶｈｕ６８カプシドを有し、前記ＡＡＶｈｕ６８カプシドが、
配列番号１６の１〜７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号１８から産生されるｖｐ１タンパク質、または配列番号１６の１〜７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１８と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質
から選択されるＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ１タンパク質の異種集団、
配列番号１６の少なくとも約アミノ酸１３８〜７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号１８の少なくともヌクレオチド４１２〜２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、または配列番号１６の少なくとも約アミノ酸１３８〜７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１８の少なくともヌクレオチド４１２〜２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質
から選択されるＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ２タンパク質の異種集団、
配列番号１６の少なくとも約アミノ酸２０３〜７３６の予測アミノ酸配列コードする核酸配列からの発現によって産生されるｖｐ３、配列番号１８の少なくともヌクレオチド６０７〜２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、または配列番号１６の少なくとも約アミノ酸２０３〜７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１８の少なくともヌクレオチド６０７〜２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質
から選択されるＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ３タンパク質の異種集団
を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１８】
前記タンパク質をコードする前記核酸配列が、
配列番号１８、または
配列番号１６のアミノ酸配列をコードし配列番号１８と少なくとも８０％〜少なくとも９９％同一である配列
である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項１９】
前記配列が配列番号１８と少なくとも８０％〜９７％同一である、請求項１７または請求項１８のいずれか１項に記載のｒＡＡＶ。
【請求項２０】
前記ＡＡＶがＡＡＶ９カプシドを有し、前記ＡＡＶ９カプシドが、
配列番号１７のアミノ酸配列または
配列番号３６によってコードされるアミノ酸配列
を有するｖｐ１カプシドタンパク質を含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のｒＡ
ＡＶ。
【請求項２１】
担体、希釈剤または賦形剤と、少なくとも、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の非複製性ｒＡＡＶの材料とを含む、組成物。
【請求項２２】
前記組成物が鼻腔内投与のために製剤化される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物が筋肉内または静脈内投与のために製剤化される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ヒト患者にインフルエンザに対するワクチン接種または免疫化を施すのに有用である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶまたは請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
約１０９〜約７×１０１３ＧＣのｒＡＡＶを患者の鼻腔内に投薬するのに適合している請求項２４に記載のｒＡＡＶまたは組成物。
【請求項２６】
インフルエンザからヒト患者を防護するための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶまたは請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の組成物の用途。
【請求項２７】
インフルエンザに対してヒト患者を免疫化する方法であって、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶまたは請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の組成物を有効量投与することを含む、前記方法。
【請求項２８】
前記患者が用量を鼻腔内にｒＡＡＶの約１０９〜約７×１０１３ＧＣの量で投与される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載のｒＡＡＶを含む容器、任意選択の希釈剤、及び投与のための説明書を含む、製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
インフルエンザ感染は米国で７番目に多い死因であり、年間およそ４９，０００人の死亡に相当し、世界全体でのほぼ５００，０００人の死亡のうちの大きな割合を占めている。ワクチンは、ヒトをインフルエンザから防護するのに必ずしも有効であるとは限らない。さらに、新たなインフルエンザ大流行の発生は、大幅な人命損失及び世界的な経済崩壊を招き得る脅威であり続けている。ヒト集団において１９９７年にＨ５Ｎ１、２０１３年にＨ７Ｎ９の高病原性鳥インフルエンザが発生したことに例示されるように、水鳥が広範にインフルエンザＡウイルスを保有していることは大流行の継続的脅威を意味している（Ｊ．Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  Ｈ５Ｎ１  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｂｉｒｄｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９，１２０６（２００５）、Ｈ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｖｉａｎ  ｆｌｕ：Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓ  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｉｎ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ
ｗａｔｅｒｆｏｗｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３６，１９１−１９２（２００５）、及びＲ．Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｖｉａｎ−ｏｒｉｇｉｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ（Ｈ７Ｎ９）  ｖｉｒｕｓ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６８，１８８８−１８９７（２０１３））。動物インフルエンザ流行の経済的負荷はおよそ８７０億ドルほどであると推定される。このコストの半分よりも多くを、ほぼ１００万人に及ぶ患者に必要な病院看護が占めており、患者の７０％は（６５歳より高齢の）老人患者である。
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は直径２０〜２６ｎｍの無エンベロープ二十面体一本鎖ＤＮＡウイルスである。１９８０年代初頭に遺伝子送達ベクターとして野生型ＡＡＶを初めて遺伝子操作して以来、組換えＡＡＶは、慢性疾患のための遺伝子療法における効果的及び安全な臨床適用のための有望な遺伝子送達ビヒクルとなった。ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）は、遺伝子移入用途のためにベクター化された最初のＡＡＶであった。低い形質導入効率、ヒトにおける中和抗体（ＮＡｂ）の高い血清陽性率、及びカプシドに対する潜在的に破壊的なＴ細胞応答を含めて、ＡＡＶ２のいくつかの制約が出現した。
【０００３】
インフルエンザに対する抗体の送達にとって理想的なＡＡＶカプシドは、ヒトにおいて低い血清陽性率を有し、高く安定な導入遺伝子発現を付与することができ、中枢神経系または生殖腺への生体内分布を最小限に抑え、好ましい免疫学的プロファイルを有するものであろう。選択されるカプシドは、高収率での製造が簡単であり臨床上の安全性の履歴を有するものでなければならない。選択が検討されるＡＡＶカプシドとしては、遺伝子療法臨床試験において試験されたことのあるＡＡＶカプシド：ＡＡＶ１、２、６、８、９及びｒｈ１０が挙げられる。以前の研究では、ＡＡＶ９が気道を効果的に指向し、既存のＡＡＶ９特異的ＮＡｂの環境下で効果的に再投与され得ることが実証された（Ｌｉｍｂｅｒｉｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，２００６，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，１０３，３５，１２９９３−１２９９８（２００６））。より最近になって、本発明者らは、ＦＩ６抗体を発現させるＡＡＶ９ベクターがマウス及びフェレットの両方をＨ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１インフルエンザ株の様々な臨床単離体による致死的空気感染攻撃から守ることを実証した（Ｌｉｍｂｅｒｉｓ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１３  Ｍａｙ  ２９；５（１８７）：１８７ｒａ７２）。
【０００４】
強化された性能プロファイルを有する好適な代替インフルエンザワクチンは、なおも必要とされている。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】Ａは、ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１カプシドタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１６、アラインメントにｈｕ．６８．ＶＰ１と標記してある）をＡＡＶ９（配列番号１７）、ＡＡＶｈｕ３１（配列番号３４、アラインメントにｈｕ．３１と標記してある）及びＡＡＶｈｕ３２（配列番号３５、アラインメントにｈｕ．３２と標記してある）と共に示したアラインメントを示す。ＡＡＶ９、ＡＡＶｈｕ３１及びＡＡＶｈｕ３２に比べてＡＡＶｈｕ６８では２つの突然変異（Ａ６７Ｅ及びＡ１５７Ｖ）が必須であると見出され、Ａでは丸で囲まれている。Ｂ〜Ｄは、ＡＡＶ９（配列番号３６）、ＡＡＶｈｕ３１（アラインメントにｈｕ．３１と標記してある配列番号３７）及びＡＡＶｈｕ３２（アラインメントにｈｕ．３２と標記してある配列番号３８）と共に、ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１カプシドをコードする核酸配列（アラインメントにｈｕ．６８．ＶＰ１と標記してある配列番号１８）のアラインメントを示す。
【図２】Ａ〜Ｂは、マウス適合性インフルエンザＡ（ＰＲ８）による致死的攻撃に対する、ｈＪＡｂを発現させるＡＡＶ１、ＡＡＶ９及びＡＡＶｈｕ６８ベクターの防御有効性の評価の結果を示す。Ａでは、ＣＢ７プロモーターの転写制御の下でｈＪＡｂを発現させるＡＡＶ１、ＡＡＶ９またはＡＡＶｈｕ６８ベクター（すなわち、ＡＡＶ．ＣＢ７．ｈＪＡｂなど）を６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻腔内に１０９ゲノムコピー（ＧＣ）与えた（ＡＡＶ１．ｈＪＡｂ、四角；ＡＡＶ９．ｈＪＡｂ、丸；ＡＡＶｈｕ６８．ｈＪＡＢ，上向き三角；及びナイーブ、逆向き三角）。マウスを７日後（ここでは０日目と記される）に５ＬＤ５０のＰＲ８で攻撃し、毎日体重を測定した。攻撃の日のマウス体重を基準として体重減少百分率を算出した。Ｂでは、カプラン・マイヤープロットに描写されているようにマウスに苦痛がみられるかまたはその体重が３０％より多く減少する場合にマウスを安楽死させた。
【図３】Ａ〜Ｂは、マウス適合性インフルエンザＢ（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）による致死的攻撃に対する、ｈＪＡｂを発現させるＡＡＶ１、ＡＡＶ９及びＡＡＶｈｕ６８ベクターの防御有効性の評価の結果を示す。Ａは、ｈＪＡｂを発現させるＡＡＶベクターを鼻腔内に１０９ＧＣ与えた６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを７日後（ここでは０日目と記される）に５ＬＤ５０のＢ／Ｌｅｅ／４０で攻撃して毎日体重を測定した結果を示す（ＡＡＶ１．ｈＪＡｂ、四角；ＡＡＶ９．ｈＪＡｂ、丸；ＡＡＶｈｕ６８．ｈＪＡｂ，上向き三角；及びナイーブ、逆向き三角）。攻撃の日のマウス体重を基準として体重減少百分率を算出した。Ｂは、カプラン・マイヤープロットに描写されているようにマウスに苦痛がみられるかまたはその体重が３０％より多く減少する場合に安楽死させたマウスの結果を示す。
【図４】気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）におけるＡＡＶｈｕ６８の媒介によるｈＪＡｂ発現のプロファイルを示す。６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの鼻腔内（ＩＮ）に、ｈＪＡｂを発現させるＡＡＶｈｕ６８ベクターを１０９ＧＣ〜１０１１ＧＣの範囲の用量で与えた。マウスを７日後に屠殺し、プロテインＡ  ＥＬＩＳＡによるｈＪＡｂ濃度の決定のためにＢＡＬＦを採集した。
【図５】Ａ及びＢは、インフルエンザＡ（ＰＲ８）の効果的な予防のためのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａのＭＥＤの決定を示す。６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスのＩＮにＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａベクターを３×１０８ＧＣ〜１０１０ＧＣの範囲の用量で与え、７日後（ここでは０日目と記される）に５ＬＤ５０のＰＲ８で攻撃し、毎日体重を測定した。攻撃の日のマウスの体重を基準として体重減少百分率を算出し、Ａにプロットした。Ｂは生存率をグラフにしたものである。全てのマウスはベクター用量に関係なく攻撃を生き抜いた。
【図６】Ａ及びＢは、インフルエンザＢ（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）の効果的な予防のためのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａのＭＥＤの決定を示す。６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスのＩＮにＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａベクターを３×１０８ＧＣ〜１０１０ＧＣの範囲の用量で与え、７日後（ここでは０日目と記される）に５ＬＤ５０のＢ／Ｌｅｅ／４０で攻撃し、毎日体重を測定した。攻撃の日のマウスの体重を基準として体重減少百分率を算出し、Ａにプロットした。Ｂは生存率をグラフにしたものである。全てのマウスはベクター用量に関係なく攻撃を生き抜いた。
【図７】Ａ〜Ｃは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａの媒介によるインフルエンザＡ（ＰＲ８）予防の速やかな開始を示す。Ａは、１０１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａを６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに与え、ベクター処置マウスの群を１日後、２日後、３日後または７日後に５ＬＤ５０のＰＲ８で攻撃したことを示す時間表を示す。Ｂは、ベクター投与後の様々な時点で攻撃した動物の体重の変化率（％）を示す線グラフである。ｘ軸上のデータ点で表されるように、攻撃した動物の体重を毎日測定した。攻撃の日のマウスの体重を基準として体重減少百分率を算出した。Ｃは、ＰＲ８攻撃の後の生存率のグラフである。これらのデータは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａベクターを受けている全てのマウスがベクター投薬と５ＬＤ５０のＰＲ８による攻撃との間の時間間隔に関係なく攻撃を生き抜いたことを示している。
【図８】Ａ〜Ｄは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａの媒介によるインフルエンザＢ（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）予防の速やかな開始を例証する。Ａは、１０９または１０１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａを６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに与え、マウスの群を１日後、２日後、３日後または７日後に５ＬＤ５０のＢ／Ｌｅｅ／４０で攻撃し、毎週体重を測定したことを示す時間表である。Ｂは、１０９ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａを与えたマウスについて、攻撃の日のマウスの体重を基準として算出した体重減少百分率を示す。Ｃは、全てのマウスがベクター投薬とＢ／Ｌｅｅ／４０による攻撃との間の時間間隔に関係なく攻撃を生き抜いたことを示している。Ｄは、１０１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａを与えたマウスについて、攻撃の日のマウスの体重を基準として算出した体重減少百分率を示す。全てのマウスはベクター投薬とＢ／Ｌｅｅ／４０による攻撃との間の時間間隔に関係なく攻撃を生き抜いた。
【図９】Ａ〜Ｆは、ＰＲ８による致死的攻撃に対するＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ媒介による予防の有効性に及ぼす血清中循環ＡＡＶｈｕ６８中和抗体（ＮＡｂ）の影響を示す。（ＡＡＶｈｕ６８に対するＮＡｂを誘導するために与えた）ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ．ＬａｃＺベクターへの最初の曝露からおよそ３０日後に、既存の血清中循環ＡＡＶｈｕ６８特異的ＮＡｂを様々なレベルで有する６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの群にＩＮへの１０９ＧＣ（Ａ）、３×１０９ＧＣ（Ｂ）及び１０１０ＧＣ（Ｃ〜Ｆ）のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａベクターを与えた。７日後（ここでは０日目と記される）にマウスを５ＬＤ５０のＰＲ８で攻撃し、毎日体重を測定した。感染の日のマウスの体重を基準として体重百分率を算出した。
【図１０】Ａ〜Ｃは、ＰＲ８による致死的攻撃（９０日目）に対するＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ媒介による予防の有効性に及ぼす血清中循環ＡＡＶｈｕ６８  ＮＡｂの影響を示す。（ＡＡＶｈｕ６８に対するＮＡｂを誘導するために与えた）ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ．ＬａｃＺベクターへの最初の曝露から９０日後に、既存の血清中循環ＡＡＶｈｕ６８特異的ＮＡｂを様々なレベルで有する雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの群にＩＮへの１０９ＧＣ（Ａ）、３×１０９ＧＣ（Ｂ）または１０１０ＧＣ（Ｃ）のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａベクターを与えた。７日後（ここでは０日目と記される）にマウスを５ＬＤ５０のＰＲ８で攻撃し、毎日体重を測定した。感染の日のマウスの体重を基準として体重減少百分率を算出した。
【図１１】マウスにおけるｈＪＡｂを発現させるＡＡＶｈｕ６８ベクターの生体内分布プロファイルを描写する。６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスのＩＮにＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＪＡｂベクターを１０１１ＧＣ（高）〜１０９ＧＣ（低）の範囲の用量で与え、７日後に剖検した。組織（肺、肝臓、脾臓、心臓及び脳）を生体内分布分析のために採取した。点線はアッセイのバックグラウンドを表す。各組織について、５つのバーは、左から右にそれぞれ１０１１ＧＣ、３×１０１０ＧＣ、１０１０ＧＣ、３×１０９ＧＣ及び１０９ＧＣで処置したマウスから集めたデータを表す。高用量のＡＡＶｈｕ６８ベクター（図１１及び図１２）を使用する場合、ＡＡＶｈｕ６８ベクターゲノムは肺以外の組織で検出された。
【図１２】Ａ及びＢは、マウスにおけるＪＡｂ２１０ａを発現させるＡＡＶｈｕ６８ベクターの生体内分布プロファイルを示す。６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスのＩＮにＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａベクターを１０１１ＧＣの高用量で与えた。３０日後にマウスを剖検した。組織（肺、脾臓、気管、腎臓、肝臓、心臓、脳、卵巣及び眼）を生体内分布分析のために採取した。点線はアッセイのバックグラウンドを表す。Ａはデータを二倍体細胞１つあたりのＧＣとして示す一方、ＢはデータをＤＮＡ１μｇあたりのＧＣとして示す。高用量のＡＡＶｈｕ６８ベクターを使用する場合（図１１及び図１２）、ＡＡＶｈｕ６８ゲノムは肺以外の組織で検出された。Ａは、ベクターゲノム蓄積の大部分が肺及びそれに続いて脾臓において起こったことを示す。ＡＡＶｈｕ６８ベクターゲノムは非常に低いレベルで腎臓、肝臓及び心臓に存在していた（Ａ）。さらに、脳、卵巣または眼におけるＡＡＶｈｕ６８ゲノムのレベルはバックグラウンドに近すぎてデータの正確な解釈ができなかった（Ａ）。Ｂにおいて、気管、腎臓、肝臓、心臓、脳、卵巣、眼及び視神経を表した棒グラフの縮尺は１００〜１０４であるのに対し、肺及び脾臓（左）の場合、ＧＣ／μｇＤＮＡを描写する縮尺は１００〜１０６である。
【図１３】Ａ及びＢは、老齢マウス（９〜１８月齢）におけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａの防護プロファイルを示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスに１０９ＧＣまたは３×１０９ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａを与え、７日後に５ＬＤ５０のＰＲ８で攻撃した。Ａは、ベクター投与から７日後に攻撃した老齢マウスの体重の変化率（％）を示す線グラフである。ｘ軸上のデータ点で表されるように、マウスの体重を毎日測定した。インフルエンザ攻撃の日の体重を基準として体重減少百分率を算出した。Ｂは、ＰＲ８攻撃後の生存率をグラフにしたものである。これらのデータは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａを受けている全てのマウスが５ＬＤ５０のＰＲ８による攻撃を生き抜いたことを示す。ナイーブマウスは８日目までに安楽死させた。
【図１４】Ａ〜Ｃは、インフルエンザウイルスで攻撃したマウスにおけるＡＡＶによって発現するＭＤ３６０６の予防有効性を示す。示された用量のＡＡＶ９．ＭＤ３６０６ベクター［ゲノムコピー（ＧＣ）として表す］を鼻腔内に処置して７日目に致死的用量（５ＬＤ５０）のマウス適合性Ｈ１Ｎ１（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４−ＭＡ）（Ａ）、マウス適合性Ｈ３Ｎ２（Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１／６８−ＭＡ）（Ｂ）またはマウス適合性Ｂ（Ｂ／Ｌｅｅ／４０−ＭＡ）ウイルス（Ｃ）で攻撃したＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率曲線（上）及び体重減少（下）。
【図１５】ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧベクターゲノムの模式図を示す。
【図１６】実施例１６に記載されるベクターゲノムプラスミドの模式図を示す。
【図１７】Ａ〜Ｂは、ＡＡＶトランスプラスミドの模式図を示す。Ａは、ＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスパッケージングプラスミドｐＡＡＶ２／ｈｕ６８の線形表示を示す。Ｂでは、ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８（ｐ００６５）のアンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置き換えてｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲ（ｐ００６８）を得た。
【図１８】Ａ〜Ｂは、アデノウイルスヘルパープラスミドの模式図を示す。Ａは、親プラスミドｐＢＨＧ１０から中間体ｐＡｄΔＦ１及びｐＡｄΔＦ５を経るヘルパープラスミドｐＡｄΔＦ６の誘導を示す。Ｂでは、ｐＡｄΔＦ６のアンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置き換えてｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）を得た。これら３つのアデノウイルス遺伝子の同一性はＱｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって実施されるＤＮＡプラスミド配列決定によって確認した。ＤＮＡ分析から、３つのアデノウイルス５型遺伝子領域（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ３６９９６５）との１００％の相同性が明らかになった。
【図１９】Ａ〜Ｂは、実施例１６で説明する製造プロセスフロー図を示す。
【図２０】インフルエンザＡによる攻撃に対するＲａｇ  ＫＯマウスのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧ媒介による予防を示す。Ｒａｇ  ＫＯマウスに１０１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧ（丸で示す）を与え、７日後にマウスを５ＬＤ５０のＰＲ８で攻撃し、毎日体重を測定した。ナイーブマウス（逆三角）は進行性の体重減少のために８日目までに安楽死させた。
【図２１】Ａ〜Ｂは、インフルエンザによる２回目の攻撃に対するＲａｇ  ＫＯマウスのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧ媒介による予防を示す。５ＬＤＬ５０のＰＲ８による攻撃を生き抜いたベクター処置Ｒａｇ  ＫＯマウスを５ＬＤ５０のＢ／Ｌｅｅ／４０で再攻撃し、毎日体重を測定した。ナイーブマウス（三角）は進行性の体重減少のために８日目までに安楽死させた。陽性対照マウス（丸）は、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧベクターを与えて７日後に５ＬＤ５０のＢ／Ｌｅｅ／４０で攻撃したマウスであり、全てのマウスは攻撃を生き抜いた。インフルエンザＡへの事前曝露の後にＢ／Ｌｅｅ／４０攻撃に供したベクター処置マウスを四角で表す（ＰＲ８、図２０）。
【図２２】サルにおけるアカゲザルαフェトタンパク質（ｒｈＡＦＰ）を発現させるＡＡＶ９ベクターの生体内分布プロファイルを示す。総用量２×１０１３ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ｒｈＡＦＰを、直接液体滴下注入物（丸）として、あるいはＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）（青色四角）によって動物に与え、９９日後に剖検した。生体内分布分析のために組織を採取した。アッセイのバックグラウンドは２５ゲノムコピー／５００ｎｇ組織ＤＮＡであった。
【発明の概要】
【０００６】
抗インフルエンザ構築物をコードする非複製性組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。ｒＡＡＶは、ＡＡＶカプシドの中にパッケージングされたベクターゲノムを有する。本明細書において提供される組成物は、ｒＡＡＶから発現する下記の抗インフルエンザ免疫グロブリン領域の組み合わせのための配列をコードするベクターゲノムを含む。第１免疫グロブリン領域は、配列番号１のアミノ酸配列：（Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ  Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ）を有する。特定の実施形態では、配列番号１の代わりに、配列番号３０のａａ２４〜ａａ１４７として再現されＩ１１０Ｍ突然変異を伴って配列番号１のアミノ酸配列を有する代替の免疫グロブリン領域を、使用のために選択してもよい。第２免疫グロブリン領域は、配列番号２のアミノ酸配列：（Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌ
ｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ）を有する。第３免疫グロブリン領域は、配列番号３のアミノ酸配列：（Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ）を有する。第４免疫グロブリン領域は、配列番号４のアミノ酸配列：（Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ）を有する。
【０００７】
特定の実施形態では、１つより多い本明細書に記載の免疫グロブリン領域は、Ｆｃ領域をさらに含む融合構築物の中にあり、当該融合構築物には４つの免疫グロブリン領域とＦｃ領域とを繋ぎ合わせる連結配列が場合によって存在している。
【０００８】
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号２６、配列番号２１、配列番号２０、配列番号１９、配列番号１５、配列番号１４、配列番号１３、配列番号５、配列番号３１及び配列番号３２からなる群から選択される核酸配列を含む。特定の実施形態では、担体、希釈剤または賦形剤と、少なくとも本明細書に記載の非複製性ｒＡＡＶの材料とを含む組成物が提供される。組成物は、鼻腔内または筋肉内または静脈内投与のために製剤化され得る。
【０００９】
特定の実施形態では、インフルエンザに対してヒト患者を免疫化する方法が提供され、この方法は、本明細書に記載のｒＡＡＶ．ＪＡｂ、ｒＡＡＶ．ｈＪＡｂまたはｒＡＡＶ．ＪＡｂ２１０ａを含む組成物を有効量投与することを含む。組成物は、約１０９ＧＣ〜約７×１０１３ＧＣの用量のｒＡＡＶ．ＪＡｂ、ｒＡＡＶ．ｈＪＡｂまたはｒＡＡＶ．ＪＡｂ２１０ａを含み得る。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドが選択される。他の実施形態では、容器と、本明細書に記載のｒＡＡＶ．ＪＡｂ、ｒＡＡＶ．ｈＪＡｂまたはｒＡＡＶ．ＪＡｂ２１０ａを含む組成物とを場合によって希釈剤及び投与のための説明書と共に含む製品が提供される。
【００１０】
上記実施形態の現在好ましい形態では、ｒＡＡＶはＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。別の実施形態では、ｒＡＡＶはＡＡＶ９カプシドを有する。さらに別の実施形態では、ｒＡＡＶはＡＡＶ１カプシドを有する。
【００１１】
特定の実施形態では、本明細書において提供されるｒＡＡＶ．ＪＡｂ及びそれを含有する組成物は、ヒト患者にインフルエンザに対するワクチン接種または免疫化を施すのに有用である。
【００１２】
特定の実施形態では、ヒト患者にインフルエンザに対するワクチン接種または免疫化を施すための、ｒＡＡＶ．ＪＡｂまたはそれを含有する組成物の用途が提供される。
【００１３】
本発明のこれら及びその他の利点は以下の本発明の詳細な説明から明らかとなろう。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明によって提供されるのは、生体内で抗インフルエンザ抗体構築物を発現させ、インフルエンザＡ及び／またはインフルエンザＢ感染による感染に対する受動免疫性を提供するのに有用となる、組換えベクターである。特定の実施形態では、ベクターは、本明細書中でＡＡＶｈｕ６８と呼称される新規クレードＦカプシドを有する増殖能欠損型の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）である。
【００１５】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶが発現させる抗体（Ａｂ）構築物は、インフルエンザＡ及び／またはインフルエンザＢウイルスに対する中和活性を発揮する。特定の実施形態では、本発明のＡｂ構築物は、インフルエンザＡまたはＢウイルスが宿主細胞に感染するのを、Ａｂ構築物の非存在下での上記インフルエンザウイルスによる宿主細胞の感染に比べて少なくとも９９％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも３５％、少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％または少なくとも１０％防止する。抗体によって媒介される中和活性は例えば本明細書に記載されているとおりに測定することができる。中和活性を測定する代替のアッセイは例えば、ＷＨＯ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｎ
Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ，Ｇｅｎｅｖａ：Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ，２００５，ｖｅｒｓｉｏｎ  ２００２．５に記載されている。典型的には、本発明による結合分子は、試験管内でのウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）で決定したときに１０００ｎＭ以下、好ましくは１００ｎＭ以下の中和活性、より好ましくは１０ｎＭ以下、よりいっそう好ましくは１ｎＭ以下の中和活性を有する。
【００１６】
特定の好ましい実施形態では、インフルエンザＡ及びインフルエンザＢ株に対する免疫性を提供するように設計された４つの抗インフルエンザ免疫グロブリンドメインの各々を増殖能欠損型アデノ随伴ベクターが発現させる組成物が提供される。特定の実施形態では、４つ全ての免疫グロブリンドメインが単一のｒＡＡＶベクター材料から発現する。この実施形態において単一のｒＡＡＶベクター材料は、モノシストロン性またはバイシストロン性の発現カセットを含有し得る。他の実施形態では、免疫グロブリンドメインはｒＡＡＶベクター材料以外のものから発現する。この実施形態においてｒＡＡＶは、モノシストロン性またはバイシストロン性の発現カセットを有し得る。
【００１７】
一実施形態では、ｒＡＡＶベクター材料は、本明細書に記載の免疫グロブリンドメインのうち１つ、２つ、３つまたは４つが融合タンパク質として発現するベクターゲノムを含有する。そのような融合タンパク質は免疫グロブリンＦｃ領域及び／またはヒンジ領域を
含み得、そのような融合タンパク質には、４つの免疫グロブリン領域のうちの２つ以上を繋ぎ合わせる連結配列が場合によって存在している。場合によって、連結配列は免疫グロブリンドメインとＦｃ領域及び／またはヒンジ領域との間に存在し得る。連結配列は、ドメインまたは領域のうち２つ、３つまたは４つを離隔させるために使用されて第１ドメイン（領域）のＣ末端及び第２ドメイン（領域）のＮ末端のすぐ隣にあってもよい。長さ約１〜２０アミノ酸の任意の好適な配列を選択してよいが、その長さは好ましくは３〜１８アミノ酸、または約５〜約１２アミノ酸である。コードされる単一のタンパク質配列の中に複数の連結配列が存在していてもよく、これらは独立して選択され得る。一実施形態では、少なくとも１つの連結配列はＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７）である。
【００１８】
特定の実施形態では、発現した免疫グロブリンまたは免疫グロブリン融合タンパク質は、発現したタンパク質を宿主細胞内へ導くシグナルペプチドを含有する。場合によって、シグナルペプチドは、免疫グロブリンにとって外来性である供給源からのものであり得る。以下の例はヒトインターロイキン−２シグナルペプチドの使用を示す。しかしながら、別の好適な、例えばヒトまたはウイルスのシグナルペプチドを選択してもよい。一実施形態では、シグナルペプチドのアミノ酸配列は配列番号６で再現される。
【００１９】
特定の実施形態では、免疫グロブリン領域のうち２つは第１Ｆｃに連結されて第１鎖を形成しており、もう２つの免疫グロブリン領域は第２Ｆｃに連結されて第２鎖を形成している。そのような発現カセット構築物は典型的にはＦ２ＡまたはＩＲＥＳを２本の鎖のコード配列の間に含有することになる。
【００２０】
特定の実施形態では、免疫グロブリン領域の４つは、単一のオープンリーディングフレームの中のＦｃ領域に連結される。一実施形態では、融合構築物は配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
【００２１】
本明細書において提供される４つの免疫グロブリンドメインのためのこれら及びその他の配置は、ドメインに関する以下の説明に鑑みれば当業者にとって明らかであろう。
【００２２】
抗体「Ｆｃ領域」は、細胞表面受容体（Ｆｃ受容体）と相互作用する抗体の領域である結晶性断片を指す。一実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ１  Ｆｃである。一実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ２  Ｆｃである。一実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＩｇＧ４
Ｆｃである。一実施形態では、Ｆｃ領域は、操作されたＦｃ断片である。例えば、Ｌｏｂｎｅｒ，Ｅｌｉｓａｂｅｔｈ，ｅｔ  ａｌ．“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＩｇＧ１−Ｆｃ−ｏｎｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｔｏ  ｂｉｎｄ  ｔｈｅｍ  ａｌｌ．”Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２７０．１（２０１６）：１１３−１３１、Ｓａｘｅｎａ，Ａｂｈｉｓｈｅｋ，ａｎｄ  Ｄｏｎｇｈｕｉ  Ｗｕ．“Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ−ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｇＧ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ．”Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ７（２０１６）、Ｉｒａｎｉ，Ｖａｓｈｔｉ，ｅｔ  ａｌ．“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｓｕｂｃｌａｓｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ
ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ
ｄｉｓｅａｓｅｓ．”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７．２（２０１５）：１７１−１８２、Ｒａｔｈ，Ｔｉｍｏ，ｅｔ  ａｌ．“Ｆｃ−ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ＦｃＲｎ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｏｒ  ｌｏｎｇｅｒ−ｌａｓｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｍｏｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．”Ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３５．２（２０１５）：２３５−２５４、及びＩｎｖｉｖｏｇｅｎ，ＩｇＧ−Ｆｃ  
Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ，ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｄｏｃｓ／Ｉｎｓｉｇｈｔ２００６０５．ｐｄｆ，Ａｐｒｉｌ  ２００６を参照されたく、参照によりこれらの各々を本明細書に援用する。さらなる実施形態において、Ｆｃ領域は、配列番号１１で再現されるアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は標的細胞における抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導することができる。
【００２３】
抗体「ヒンジ領域」は、ＩｇＧ及びＩｇＡ免疫グロブリンクラスの重鎖の柔軟なアミノ酸部分であり、これらの２本の鎖をジスルフィド結合によって連結している。一実施形態では、ヒンジは配列番号８のアミノ酸配列を有する。
【００２４】
「免疫グロブリン分子」は、共有結合で繋がり合っており抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の免疫学的活性部分を含有するタンパク質である。免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）またはサブクラスのものである。「抗体」及び「免疫グロブリン」という用語は本明細書中で交換可能に使用され得る。
【００２５】
「免疫グロブリン重鎖」は、免疫グロブリンの抗原結合ドメインの少なくとも一部と、免疫グロブリン重鎖の可変領域の少なくとも一部または免疫グロブリン重鎖の定常領域の少なくとも一部とを含有するポリペプチドである。したがって、免疫グロブリン由来重鎖は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーとのアミノ酸配列相同性を有する大きな領域を有する。例えば、Ｆａｂ断片の中の重鎖は免疫グロブリン由来重鎖である。
【００２６】
「免疫グロブリン軽鎖」は、免疫グロブリンの抗原結合ドメインの少なくとも一部と、免疫グロブリン軽鎖の可変領域の少なくとも一部または定常領域の少なくとも一部とを含有するポリペプチドである。したがって、免疫グロブリン由来軽鎖は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーとのアミノ酸相同性を有する大きな領域を有する。
【００２７】
「イムノアドヘシン」は、大抵において受容体、リガンド、抗体ｓｃＦｖ断片または細胞接着分子である結合タンパク質の機能性ドメインと、ヒンジ及びＦｃ領域を大抵含んでいる免疫グロブリン定常ドメインとを結合させる、キメラ抗体様分子である。
【００２８】
「抗原結合性断片」（Ｆａｂ）断片」は、抗原に結合する抗体上の領域である。それは、重軽鎖の各々の１つの定常ドメイン及び１つの可変ドメインからなる。
【００２９】
本明細書中で使用する場合、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は、他のＶ領域またはドメインとは無関係に抗原またはエピトープに特異的に結合する単一の単量体可変抗体ドメインからなる結合分子である。単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）は当技術分野で知られており、大抵、天然に存在する「重鎖単独」抗体、すなわち軽鎖を欠く重鎖抗体に由来する。そのような重鎖単独抗体は、ラクダ科の種、例えば、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダまたはアルパカから得ることができる（ラクダ抗体とも呼ばれる）。上記重鎖単独抗体に由来する可変領域は、ＶＨＨドメインまたはｓｄＡｂとして一般に知られている。本明細書中で使用されるｓｄＡｂは、２本の重鎖と２本の軽鎖とを含む一般的な免疫グロブリンから単離された単一の可変ドメイン（ＶＬまたはＶＨ）も指す。この免疫グロブリンは、ヒト化配列を含有していてもよいし、または他の非ラクダ源からの領域を含有していてもよい。
【００３０】
本明細書中で使用する場合、「多重ドメイン抗体」は、互いに直接、または連結配列で
繋げられた少なくとも２つのヒト化ＶＨＨ抗体を含む結合分子を指す。
【００３１】
本明細書中で使用する場合、「ＮＡｂ力価」という用語は、標的とするエピトープ（例えばＡＡＶ）の生理学的作用を中和する中和抗体（例えば抗ＡＡＶ  Ｎａｂ）がどれくらい多く産生されるかについての測定結果である。抗ＡＡＶ  ＮＡｂ力価は、例えば、参照により本明細書に援用するＣａｌｃｅｄｏ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，２００９．１９９（３）：ｐ．３８１−３９０に記載されているように測定され得る。
【００３２】
「ｓｃ」という略語は自己相補性を指す。「自己相補性ＡＡＶ」は、組換えＡＡＶ核酸配列が有するコード領域が分子内二本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するように設計されている構築物を指す。感染時には、第２の鎖の細胞媒介合成を待つことなくｓｃＡＡＶの相補的な両半分が会合して、即時複製及び転写の準備が整った１つの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）単位を形成することになる。例えば、Ｄ  Ｍ  ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，“Ｓｅｌｆ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ（ｓｃＡＡＶ）ｖｅｃｔｏｒｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（Ａｕｇｕｓｔ  ２００１），Ｖｏｌ  ８，Ｎｕｍｂｅｒ  １６，Ｐａｇｅｓ  １２４８−１２５４を参照されたい。自己相補性ＡＡＶは、例えば、米国特許第６，５９６，５３５号、第７，１２５，７１７号及び第７，４５６，６８３号に記載されており、参照によりこれらの各々の全体を本明細書に援用する。
【００３３】
本明細書中で使用する場合、「機能可能に繋げられている」という用語は、関心対象の遺伝子と連続している発現制御配列を指すだけでなく、トランスで、または遠くで作用して関心対象の遺伝子を制御する発現制御配列も指す。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、「異なる特異性」は、言及されている免疫グロブリン構築物（例えば、完全長抗体、重鎖または、固有の標的に結合することができる他の構築物）が異なる標的部位に結合することを表す。これらは、同じ抗原上にある異なる標的、同じ病原体の異なる株（例えば異なるウイルス株）、または異なる抗原を指し得る。
【００３５】
「同じ特異性」は、病原体（例えばインフルエンザウイルス）の複数の鎖、またはウイルスもしくはその他の病原体の単一もしくはサブセットの鎖に存在し得る固有の標的部位に結合する免疫グロブリンの能力を指す。これらの特異性は、非対象部位への著しいまたは測定可能な結合がない程度のものであることが好適である。
【００３６】
「異種」という用語は、タンパク質または核酸に関して使用する場合、タンパク質または核酸が、互いに同じ関係性では天然に見つからない２つ以上の配列または小配列を含むことを表す。例えば、核酸は典型的には組換え的に生産され、無関係の遺伝子からの２つ以上の配列が配置されて新たな機能性核酸を作っている。例えば、一実施形態において核酸は、ある遺伝子からのプロモーターが別の遺伝子からのコード配列の発現を促すように配置されている。かくして、コード配列に関してプロモーターは異種である。「異種軽鎖」という用語は、重鎖の特異性とは異なる標的特異性を有する抗体からの可変ドメイン及び／または定常ドメインを含有する軽鎖である。
【００３７】
「増殖能欠損型ウイルス」または「ウイルスベクター」とは、関心対象の遺伝子を含有している発現カセットがウイルスカプシドまたはエンベロープの中にパッケージングされており、ウイルスカプシドまたはエンベロープの中に同じくパッケージングされている任
意のウイルスゲノム配列が増殖能欠損型である、つまりそれらが子孫ビリオンを生み出すことができないが標的細胞に感染する能力を保持している、合成または人工のウイルス粒子を指す。一実施形態では、ウイルスベクターのゲノムは、複製するのに必要とされる酵素をコードする遺伝子を含まない（ゲノムは、人工ゲノムの増幅及びパッケージングに必要とされるシグナルに挟まれた関心対象の導入遺伝子のみを含有して「ガットレス」になるように操作され得る）が、これらの遺伝子は生産中に供給され得るものである。したがってそれは、複製のために必要とされるウイルス酵素の存在下にある場合以外は子孫ビリオンによる複製及び感染が起こり得ないことから、遺伝子療法に使用するために安全であるとみなされる。
【００３８】
「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」は、ＡＡＶカプシドと、ＡＡＶカプシド内にパッケージングされた非ＡＡＶコード配列を少なくとも含有するベクターゲノムとの２つの要素を含有するＤＮアーゼ耐性ウイルス粒子である。特定の実施形態では、カプシドは、自己組織化してカプシドを形成するｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及びｖｐ３タンパク質からなる約６０個のタンパク質を含有する。特に明記しない限り、「組換えＡＡＶ」または「ｒＡＡＶ」は「ｒＡＡＶベクター」という語句と交換可能に使用され得る。ｒＡＡＶは、いかなる機能性ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子または機能性ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子も欠き、子孫を生み出すことができないことから、「増殖能欠損型ウイルス」または「ウイルスベクター」である。特定の実施形態では、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）が唯一のＡＡＶ配列であり、これは、ＩＴＲ間に位置する遺伝子及び調節配列をＡＡＶカプシド内にパッケージングするのを可能にするためにベクターゲノムの最遠の５’及び３’端部に位置していることが典型的である。
【００３９】
「ヌクレアーゼ耐性」という用語は、ＡＡＶカプシドが、宿主細胞に導入遺伝子を送達するように設計された発現カセットの周囲で組織化し、生産プロセスゆえに存在している可能性がある汚染核酸を除去することを意図したヌクレアーゼインキュベーションステップの間これらのパッケージングされたゲノム配列を分解（消化）から保護する、ということを示す。
【００４０】
本明細書中で使用する場合、「ベクターゲノム」は、ウイルス粒子を形成するｒＡＡＶカプシドの内部にパッケージングされる核酸配列を指す。そのような核酸配列は、ＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）を含有する。本明細書中の例では、ベクターゲノムは、５’から３’へと、最低でもＡＡＶ  ５’ＩＴＲ、コード配列（複数可）及びＡＡＶ  ３’ＩＴＲを含有する。カプシドとは異なるＡＡＶ源であるＡＡＶ２からのＩＴＲを選択してもよいし、または完全長ＩＴＲ以外のＩＴＲを選択してもよい。特定の実施形態では、ＩＴＲは、生産中にｒｅｐ機能を提供するＡＡＶまたは相互補完的なＡＡＶと同じＡＡＶ源からのものである。さらに、他のＩＴＲを使用してもよい。さらに、ベクターゲノムは、遺伝子産物の発現を促す調節配列を含有する。ベクターゲノムの好適な構成要素については本明細書中でより詳しく述べる。
【００４１】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶの製造に使用する非ウイルス性の遺伝要素をベクター（例えば生産ベクター）と呼ぶことにする。特定の実施形態ではこれらのベクターがプラスミドであるが、他の好適な遺伝要素の使用は企図される。そのような生産プラスミドは、ｒＡＡＶの中にパッケージングされないｒＡＡＶ生産中に発現する配列、例えばｒＡＡＶの生産に必要とされるＡＡＶカプシドまたはｒｅｐタンパク質をコードし得る。あるいは、ｒＡＡＶの中にパッケージングされるベクターゲノムをそのような生産プラスミドが保有していてもよい。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「発現カセット」は、コード配列、プロモーターを含む核酸分子を指し、そのための他の調節配列を含み得る。特定の実施形態では、ベクターゲノ
ムは、２つ以上の発現カセットを含有し得る。他の実施形態では、「導入遺伝子」という用語は、「発現カセット」と交換可能に使用され得る。
【００４３】
本発明との関連において、「翻訳」という用語は、ｍＲＮＡ鎖がアミノ酸配列の組立てを制御してタンパク質またはペプチドを生成する、リボソームにおけるプロセスに関する。
【００４４】
インフルエンザＡウイルスに関して「インフルエンザウイルス亜型」という用語は、ヘマグルチニン（Ｈ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）ウイルス表面タンパク質の様々な組み合わせによって特徴付けられるインフルエンザＡウイルス株を指す。インフルエンザＡウイルス亜型は、例えば「Ｈ１またはＨ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス」もしくは「Ｈ１インフルエンザウイルス」「Ｈ３インフルエンザウイルス」のようにそれらのＨ数で、または例えば「インフルエンザウイルス亜型「Ｈ３Ｎ２」または「Ｈ５Ｎ１」」のようにＨ数とＮ数との組み合わせで呼称され得る。インフルエンザウイルス「亜型」という用語には、具体的にはそのような亜型の中のあらゆる個々のインフルエンザウイルス「株」が含まれ、これらは大抵、突然変異によって得られるものであり、異なる病原体プロファイルを示し、天然の単離体及び人工の突然変異体または遺伝子再集合体などを含む。そのような株は、ウイルス亜型の様々な「単離体」とも呼称され得る。したがって、本明細書中で使用する場合、「株」及び「単離体」という用語は交換可能に使用され得る。
【００４５】
本明細書中で使用する場合、「インフルエンザ」または「インフルエンザウイルス疾患」という用語は、インフルエンザＡまたはＢウイルスによる細胞または対象の感染に起因する病状を指す。具体的な実施形態において、当該用語は、インフルエンザＡまたはＢウイルスによって引き起こされる呼吸器の病気を指す。本明細書中で使用する場合、「インフルエンザウイルス感染」という用語は、細胞内または対象内のインフルエンザウイルスによる侵襲、その増殖及び／または存在を意味する。
【００４６】
本明細書に記載のベクターは、受動免疫性を提供する新規抗インフルエンザ抗体構築物を発現させ、それが投与後にヒト集団におけるインフルエンザＡ及び／またはインフルエンザＢ感染の１つ以上の株への感染を防御する及び／またはインフルエンザ感染症に関連する症候を軽減する場合には治療上有効である。そのような症候には、限定されないが、熱（悪寒）、咳、咽頭痛、鼻水または鼻詰まり、筋肉痛または体の痛み、頭痛、倦怠感（疲労感）、及び二次的細菌感染のリスク、例えば気管支炎及び肺炎が含まれ得る。
【００４７】
本明細書中で使用する場合、「免疫グロブリン構築物（複数可）」、「抗体構築物（複数可）」または「ａＡｂ構築物（複数可）」は、交換可能に使用されるものであるが、標的部位に結合することができる構築物を指す。一実施形態では、標的部位は、抗原のエピトープ、または病原体の部位である。さらなる実施形態では、標的部位は、インフルエンザウイルスのエピトープである。一実施形態では、Ａｂ構築物は、限定されないが、免疫グロブリン分子、イムノアドヘシン、単一ドメイン抗体、多重ドメイン抗体、完全長抗体、免疫グロブリン重鎖、及び免疫グロブリン軽鎖から選択される。
【００４８】
「発現」という用語は、本明細書中ではその最も広い意味で使用され、ＲＮＡの産生、またはＲＮＡとタンパク質との産生を含む。ＲＮＡに関して「発現」または「翻訳」という用語は、詳しくは、ペプチドまたはタンパク質の産生に関する。発現は一過的である場合もあるし、または安定的である場合もある。
【００４９】
本明細書中で使用する場合、「有効量」とは、インフルエンザ感染を軽減または防止するに足る量の抗インフルエンザ抗体を標的細胞に送達する及び発現させるｒＡＡＶ組成物の量を指す。有効量は、ヒト患者ではなく動物モデルに基づいて決定され得る。好適なマ
ウスモデルの例は本明細書中に記載されている。
【００５０】
本明細書中で使用する場合、「標的組織」という用語は、本明細書に記載の実施形態、療法計画または組成物の標的となる組織、臓器または細胞種を指す。一実施形態では、標的組織は呼吸器官または呼吸器組織である。代替または追加の実施形態では、標的組織は肺である。代替または追加の実施形態では、標的組織は鼻である。代替または追加の実施形態では、標的組織は鼻咽頭である。代替または追加の実施形態では、標的組織は呼吸器上皮である。代替または追加の実施形態では、標的組織は鼻道上皮である。代替または追加の実施形態では、標的組織は鼻腔細胞である。代替または追加の実施形態では、標的組織は鼻咽頭細胞である。代替または追加の実施形態では、標的組織は鼻腔上皮細胞であり、これは、線毛鼻腔上皮細胞、円柱上皮細胞、（線毛上皮細胞からなる鼻腔の表面に粘液を分泌する）杯細胞、及び鼻咽頭の表面に沿って並ぶ重層扁平鼻腔上皮細胞であり得る。代替または追加の実施形態では、標的組織は肺上皮細胞である。さらに他の実施形態では、標的組織は筋肉、例えば骨格筋である。
【００５１】
上記のとおり、数値を修飾する場合に使用する「約」という用語は、特に指定がない限り、±１０％の変動を意味する。
【００５２】
本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」という用語、ならびに数あるその変化形の中でも「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有している」を含めた変化形は、他の成分、要素、整数、ステップなどを包含する。「からなる」または「からなっている」という用語は、他の成分、要素、整数、ステップなどを排除する。
【００５３】
「ａ」または「ａｎ」という用語が１つ以上を指すことに留意されたく、例えば、「エンハンサー（ａｎ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）」は１つ以上のエンハンサー（複数可）を表すものと理解される。このように、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は本明細書中で交換可能に使用される。
【００５４】
これらの本発明の説明に関して、本明細書において記載される組成物の各々は、別の実施形態で本発明の方法において有用であることが意図される。加えて、本明細書において方法に有用であると記載される組成物の各々は別の実施形態においてそれ自体が本発明の実施形態である、ということも意図される。
【００５５】
本明細書中の他のどこかで定義していない限り、本明細書中で使用する科学技術用語は、本発明が属する技術分野において通常の技量を有する者によって、及び本願で使用する用語の多くに対する一般的手引きを当業者に提供するものである公開文を参照することによって通常理解されるのと同じ意味を有する。
【００５６】
Ｉ．抗インフルエンザ抗体導入遺伝子
本明細書に記載の組成物は、４つの抗免疫グロブリン領域を発現させるように設計されるが、これらは場合によって１つ以上の融合タンパク質として発現する。以下の「第１」、「第２」、「第３」及び「第４」への言及が、どの領域に言及しているのかを明確にするために使用されているということは理解されよう。しかしながらこれは、ベクターゲノム（複数可）からこれらが発現する順序、または融合タンパク質中にこれらが出現する順序に限定されない。したがって、融合タンパク質が、第１領域もしくは第２領域の上流もしくは下流に位置する「第３」領域を含有していてもよく、及び／または「第１」領域が、「第２」、「第３」もしくは「第４」領域の下流に位置していてもよい。
【００５７】
特定の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列を有する第１免疫グロブリン領域が選択される：Ｇｌｎ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ
Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ
Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｉｌｅ  Ｐｈｅ
Ａｓｐ  Ｉｌｅ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ
Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｎ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ａｌａ
Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ
Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ
Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ
Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ
Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｈｉｓ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ
Ｔｙｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ
Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ
Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ。特定の実施形態では、このアミノ酸配列におけるいくつかの変異が許容され、つまり、この配列と約９５％〜約９９％同一である配列は本発明に包含される。換言すれば、配列番号１の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸が修飾されていてもよい。一実施形態では、代替の第１免疫グロブリン領域は、配列番号３０のａａ２４〜ａａ１４７として再現されＩ１１０Ｍ突然変異を伴って配列番号１のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン領域を指す。特定の実施形態では、これらのアミノ酸配列は、保存された変化である。しかしながら、非保存残基を選択してもよい。本明細書中で使用する場合、「保存された変化」という用語は、アミノ酸を、類似する生物化学的特性（例えば、電荷、疎水性及び大きさ）を有する別のアミノ酸に変化させることを指す。
【００５８】
特定の実施形態では、第２免疫グロブリン領域は配列番号２のアミノ酸配列：Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ｍｅｔ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ａｌａ  Ｌｅｕ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｔｒｐ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ｔｙｒ  Ｇｌｕ  Ｐｈｅ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒを有する。特定の実施形態では、このアミノ酸配列におけるいくつかの変異が許容され、つまり、この配列と約９５％〜約９９％同一である配列は本発明に包含される。換言すれば、配列番号２の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸が修飾されていてもよい。特定の実施形態では、これらのアミノ酸配列は、保存された変化である。
【００５９】
第３免疫グロブリン領域は配列番号３のアミノ酸配列：Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ａｓｎ  Ｌｙｓ  Ａｌａ  Ｉｌｅ  Ｇｌｙ  Ｔｒｐ  Ｐｈｅ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｕ  Ｇｌｙ  Ｖａｌ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａ
ｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｃｙｓ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒを有する。特定の実施形態では、このアミノ酸配列におけるいくつかの変異が許容され、つまり、この配列と約９５％〜約９９％同一である配列は本発明に包含される。換言すれば、配列番号３の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸が修飾されていてもよい。特定の実施形態では、これらのアミノ酸配列は、保存された変化である。
【００６０】
第４免疫グロブリン領域は配列番号４のアミノ酸配列：Ｇｌｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｕ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｇｌｎ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｌｅｕ  Ｓｅｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｐｈｅ  Ｓｅｒ  Ｔｈｒ  Ｓｅｒ  Ｔｒｐ  Ｍｅｔ  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ｇｌｎ  Ａｌａ  Ｐｒｏ  Ｇｌｙ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ｌｅｕ  Ｇｌｕ  Ｔｒｐ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｉｌｅ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ａｓｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ｌｙｓ  Ｇｌｙ  Ａｒｇ  Ｐｈｅ  Ｔｈｒ  Ｉｌｅ  Ｓｅｒ  Ａｒｇ  Ａｓｐ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｙｓ  Ａｓｎ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｔｙｒ  Ｌｅｕ  Ｇｌｎ  Ｍｅｔ  Ａｓｎ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｇｌｕ  Ａｓｐ  Ｔｈｒ  Ａｌａ  Ｖａｌ  Ｔｙｒ  Ｔｙｒ  Ｃｙｓ  Ａｌａ  Ｌｙｓ  Ａｓｐ  Ｔｒｐ  Ｇｌｙ  Ｇｌｙ  Ｐｒｏ  Ｇｌｕ  Ｐｒｏ  Ｔｈｒ  Ａｒｇ  Ｇｌｙ  Ｇｌｎ  Ｇｌｙ  Ｔｈｒ  Ｌｅｕ  Ｖａｌ  Ｔｈｒ  Ｖａｌ  Ｓｅｒ  Ｓｅｒを有する。特定の実施形態では、このアミノ酸配列におけるいくつかの変異が許容され、つまり、この配列と約９５％〜約９９％同一である配列は本発明に包含される。換言すれば、配列番号４の１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたは６つのアミノ酸が修飾されていてもよい。特定の実施形態では、これらのアミノ酸配列は、保存された変化である。
【００６１】
さらに本発明の範囲に含まれるのは、免疫グロブリン領域と本明細書に記載のその他のタンパク質、ペプチド及び断片とをコードする核酸配列である。配列番号１のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン領域の好適なコード配列の例は、例えば、配列番号５のｎｔ２０５２〜２４２３、配列番号１３のｎｔ１８４０〜２２１１、配列番号１４のｎｔ２０５２〜２４２３、配列番号１５のｎｔ２０５２〜２４２３、配列番号１９のｎｔ１８４０〜２１１１、配列番号２０のｎｔ１２１０〜１５８１、配列番号２１のｎｔ５５〜４８６、及び配列番号３２のｎｔ７０〜４４１で示される。
【００６２】
配列番号２のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン領域の好適なコード配列の例は、例えば、配列番号５のｎｔ２４５４〜２８２２、配列番号１３のｎｔ２２４２〜２１６０、配列番号１４のｎｔ２４５４〜２８２２、配列番号１５のｎｔ２４５４〜２８２２、配列番号１９のｎｔ２２４２〜２６１０、配列番号２０のｎｔ１６１２〜１９８０、配列番号２１のｎｔ５１７〜８８５、及び配列番号３２のｎｔ４７２〜８４０で示される。
【００６３】
配列番号３のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン領域の好適なコード配列の例は、例えば、配列番号５のｎｔ２８５３〜３２３９、配列番号１３のｎｔ２６４１〜３０２７、配列番号１４のｎｔ２８５３〜３２３９、配列番号１５のｎｔ２８５３〜３２３９、配列番号１９のｎｔ３４４８〜３８３４、配列番号２０のｎｔ２８０３〜３１８９、配列番号２１のｎｔ９１６〜１３０２、及び配列番号３２のｎｔ８７１〜１２５７で示される。
【００６４】
配列番号４のアミノ酸配列を有する免疫グロブリン領域の好適なコード配列の例は、例えば、配列番号５のｎｔ３２７０〜３６１７、配列番号１３のｎｔ３０５８〜３４０５、配列番号１４のｎｔ３２７０〜３６１７、配列番号１５のｎｔ３２７０〜３６１７、配列番号１９のｎｔ３８６５〜４２１２、配列番号２０のｎｔ３２２０〜３５６７、配列番号２１のｎｔ１３３３〜１６８０、及び配列番号３２のｎｔ１２８８〜１６３５で示される。
【００６５】
核酸配列は、ヌクレオチドの高分子形態を指し、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ならびに上記の合成形態及び混合ポリマーを含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、またはどちらかのタイプのヌクレオチドの改変形態を指す。当該用語はＤＮＡの一本鎖形態及び二本鎖形態も含む。当業者であれば、これらの核酸分子の機能性変異型も本発明の一部であることが意図されることを認識するであろう。機能性変異型は、標準的な遺伝コードを使用して直接翻訳されて、親核酸分子から翻訳されたものと同一のアミノ酸配列を提供することができる核酸配列である。好ましい実施形態では、免疫グロブリンドメイン、融合タンパク質及びその他の構築物をコードする核酸分子は本明細書に包含され、発現カセット及びベクターゲノムを生成するのに有用である。これらの配列は、酵母細胞または哺乳動物細胞、例えばヒト細胞における発現のためにコドン最適化されていてもよい。コドン最適化方法は既知であり、以前に教示がなされている（例えばＷＯ９６／０９３７８）。配列は、野生型配列と比較して少なくとも１つの非好適コドンがより好適なコドンで置き換えられているならば、コドン最適化されているとみなされる。本明細書において、非好適コドンは、生物において同じアミノ酸をコードする別のコドンよりも低い頻度で使用されるコドンであり、より好ましいコドンは、生物において非好適コドンよりも頻繁に使用されるコドンである。特定生物のコドン使用の頻度は、コドン頻度表、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎで見つけることができる。好ましくは１つより多い非好適コドン、好ましくはほとんどまたは全ての非好適コドンが、より好ましいコドンで置き換えられる。好ましくは、生物において最も頻繁に使用されるコドンをコドン最適化配列に使用する。好適コドンによる置き換えは大抵、より高い発現につながる。当業者であれば、種々様々な核酸分子が遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることも理解するであろう。ポリペプチドを発現させる任意の特定宿主生物のコドン使用を反映すべく、核酸分子にコードされるアミノ酸配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を当業者が慣例的技術を用いて行い得ることも、理解される。したがって、特に明記しない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸配列」には、互いに関して縮重形態であり同じアミノ酸配列をコードするあらゆるヌクレオチド配列が含まれる。核酸配列は、慣例的な分子生物学の技術を用いてクローニングされ得るかまたは、ＤＮＡ合成及び／または分子クローニングの分野にビジネスを有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ）によって慣例的手順を用いて実施され得るＤＮＡ合成によってｄｅ  ｎｏｖｏで生成され得る。
【００６６】
一実施形態では、ｒＡＡＶベクター材料は、免疫グロブリンドメインのうち１つ、２つ、３つまたは４つを融合タンパク質として発現させるベクターゲノムを含有する。
【００６７】
特定の実施形態では、免疫グロブリンドメイン同士は化学結合によって連結され得、または、直接あるいは短いポリペプチドリンカーで繋ぎ合わされ得る。そのようなリンカー配列は、天然に存在する配列であってもよいし、または天然に存在しない配列であってもよい。リンカー配列は、好ましくは、結果として得られる抗体構築物に十分な柔軟性を提供すると同時にタンパク質分解に対して耐性である。
【００６８】
場合によって、同種及び異種二量体の作出のために、免疫グロブリンコード配列をまとめてクローニングするか、あるいは完全長遺伝子を直接合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、
発現ベクターにライゲートすることができる。二量体構築物において第１免疫グロブリン領域のＣ末端は第２免疫グロブリン領域の末端に繋げられ得る。様々な長さ（１０、１５、３５及び５７アミノ酸）のリンカー配列はアミノ酸グリシン（Ｇ）及びセリン（Ｓ）からなる。連結配列は、ドメインまたは領域のうち２つ、３つまたは４つを離隔させるために使用されて第１ドメイン（領域）のＣ末端及び第２ドメイン（領域）のＮ末端のすぐ隣にあってもよい。長さ約１〜６０アミノ酸のいかなる好適な配列を選択してよいが、その長さは好ましくは３〜３５アミノ酸、または約５〜約１５アミノ酸である。コードされる単一のタンパク質配列の中に複数の連結配列が存在していてもよく、これらは独立して選択され得る。
【００６９】
好適なリンカーの例としては、
配列番号７：ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ；
配列番号２３：ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ；
配列番号２４：ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ
配列番号２５：ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ  ＧＧＧＧＳ
が挙げられる。
【００７０】
好適なリンカーコード配列の例は、例えば、配列番号１３のｎｔ２２１２〜２２４１、ｎｔ２６１１〜ｎｔ２６４０、ｎｔ３０２８〜３０５７、ｎｔ３４０６〜３４３５；配列番号１９のｎｔ２２１２〜２２４１、ｎｔ２６１１〜２６４０、ｎｔ３８３５〜３８６４、及びｎｔ４２１３〜４２４２；配列番号２０のｎｔ１５８２〜１６１１、ｎｔ３１９０〜３２１９；配列番号２１のｎｔ４８７〜５１６、ｎｔ８８６〜９１５、ｎｔ１３０３〜１３３２；ならびに配列番号３２のｎｔ４４２〜４７１、ｎｔ８４１〜８７０、ｎｔ１２５８〜１２８７で示される。
【００７１】
特定の実施形態では、タンパク質はさらにＦｃ尾部を含む。したがって、特定の実施形態では、上記免疫グロブリン結合ドメインは、抗体、好ましくはヒト抗体のＦｃ断片、例えばヒトＩｇＧ抗体の、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはＩｇＧ４のＦｃ断片に繋げられる。ドメインは直接、またはリンカーを使用して、Ｆｃ断片と遺伝学的に融合していてもよい。特定の実施形態では、結合分子は、１〜１００アミノ酸、好ましくは１〜６０アミノ酸または１０〜６０アミノ酸を含む連結配列によってＦｃ断片に繋げられる。リンカーの例としては、限定されないが、上に列挙した連結配列が挙げられる。特定の実施形態では、免疫グロブリンドメインはＦｃ断片のＣ末端と遺伝学的に融合している。さらなる実施形態では、免疫グロブリンドメインまたは融合タンパク質は、Ｆｃ断片のＮ末端及びＣ末端の両方と融合している。例えばＷＯ２０１６／１２４７６８を参照されたく、これを参照により本明細書に援用する。一実施形態では、Ｆｃ断片は、配列番号３０のａａ５５１〜ａａ７７２で再現されるアミノ酸配列を有する。一実施形態では、Ｆｃ断片をコードする核酸配列は配列番号１０である。
【００７２】
特定の実施形態では、ベクターゲノムは、配列番号１、２、３及び４のアミノ酸配列を有する抗インフルエンザ融合構築物をコードする。そのような構築物の一例は配列番号１２で示される。別の例は配列番号２７である。これらの例のどちらにおいても、１つのリーダー配列をベクターゲノムの５’免疫グロブリンコード領域のすぐ上流に組み込む操作がなされている。しかしながら、特定の実施形態では、ベクターゲノムは、免疫グロブリンコード領域の上流に各々位置する１つより多いリーダー配列を含有し得る。特定の実施形態では、これらの融合タンパク質はさらに、少なくとも１つの免疫グロブリンヒンジ領域及びＦｃ領域を含む［例えば配列番号１２］。さらに、これらの融合タンパク質の各々は複数のリンカー配列を含有する。他の実施形態では、ヒンジ領域を伴わずにＦｃ領域が
融合タンパク質中に含まれ得る。一実施形態では、ベクターゲノムは配列番号３１である。
【００７３】
特定の実施形態において本明細書中で提示されるのは、抗インフルエンザＡ及びＢ活性を有する単一の抗体様タンパク質（多重ドメイン抗体またはｍｄＡｂもしくはＭＤＡｂと呼称される）であり、当該タンパク質は、本明細書に記載の１つ以上の免疫グロブリンドメイン及び１つ以上のリンカーを含んでいる融合タンパク質である。特定の実施形態において本明細書中で提示されるのは、本明細書に記載のＭＤＡｂの発現のための組成物である。
【００７４】
核酸またはその断片に言及する場合、「実質的な相同性」または「実質的な類似性」という用語は、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って別の核酸（またはその相補鎖）との最適なアラインメントをしたときに、アラインメントされた配列の少なくとも約９５〜９９％にヌクレオチド配列同一性があることを表す。相同性は、完全長配列またはそのオープンリーディングフレーム、または長さが少なくとも１５ヌクレオチドである別の好適な断片にわたっていることが好ましい。好適な断片の例は本明細書に記載されている。
【００７５】
核酸配列に関する「配列同一性」、「配列同一性パーセント」または「パーセント同一」という用語は、最大限に対応させるためにアラインメントしたときに同一である、２つの配列の中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、ゲノムの完全長、遺伝子コード配列の完全長に及び得、または少なくとも約５００〜５０００ヌクレオチドの断片が望まれる。しかしながら、より小さい、例えば少なくとも約９ヌクレオチド、通常少なくとも約２０〜２４ヌクレオチド、少なくとも約２８〜３２ヌクレオチド、少なくとも約３６またはそれより多いヌクレオチドの断片の同一性が望まれることもある。同様に、「配列同一性パーセント」は、アミノ酸配列に対してタンパク質の完全長またはその断片にわたって容易に決定され得る。好適な断片は長さが少なくとも約８アミノ酸であり、約７００アミノ酸以下であり得る。好適な断片の例は本明細書に記載されている。
【００７６】
アミノ酸またはその断片に言及する場合、「実質的な相同性」または「実質的な類似性」という用語は、適切なアミノ酸挿入または欠失を伴って別のアミノ酸（またはその相補鎖）との最適なアラインメントをしたときに、アラインメントされた配列の少なくとも約９５〜９９％にアミノ酸配列同一性があることを表す。相同性は、完全長配列またはそのタンパク質、例えば免疫グロブリン領域またはドメイン、ＡＡＶ  ｃａｐタンパク質、または長さが少なくとも８アミノ酸もしくはより望ましくは少なくとも１５アミノ酸であるその断片にわたっていることが好ましい。好適な断片の例は本明細書に記載されている。
【００７７】
「高度に保存された」という用語は、少なくとも８０％の同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性、より好ましくは９７％を上回る同一性を意味する。同一性は、当業者に知られているアルゴリズム及びコンピュータプログラムを利用することで当業者によって容易に決定される。
【００７８】
一般に、２つの異なるアデノ随伴ウイルス同士の「同一性」、「相同性」または「類似性」に言及する場合、「同一性」、「相同性」または「類似性」は、「アラインメントされた」配列に関して決定される。「アラインメントされた」配列、または「アラインメント」とは、基準配列に比べて欠落しているかまたは追加されている塩基またはアミノ酸の補正をしばしば含有する複数の核酸配列またはタンパク質（アミノ酸）配列を指す。アラインメントは、公的または商業的に入手することができる様々な多重配列アラインメントプログラムのいずれかを使用して実施される。そのようなプログラムの例としては、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ」、「ＣＡＰ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ」、「ＭＡＰ」及び「ＭＥＭＥ」が挙げられ、これらはインターネット
上のウェブサービスを通じて入手可能である。そのようなプログラムの他の提供元は当業者に知られている。あるいは、ベクターＮＴＩユーティリティーも使用される。また、上記プログラムの中に含まれているものを含めて、ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用することができる当技術分野で知られている多くのアルゴリズムが存在する。別の例として、ＧＣＧ  バージョン６．１の中のプログラムであるＦａｓｔａ（商標）を使用してポリヌクレオチド配列を比較することができる。Ｆａｓｔａ（商標）は、クエリー配列と検索配列との間で最もよく重複している領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する。例えば、参照により本明細書に援用するＧＣＧ  バージョン６．１において提供されるようなデフォルトパラメータ（６のワードサイズ、スコア行列のためのＮＯＰＡＭ係数）でＦａｓｔａ（商標）を使用して核酸配列同士の配列同一性パーセントを決定することができる。また、複数の配列アラインメントプログラム、例えば、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ」、「Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ」、「ＭＡＰ」、「ＰＩＭＡ」、「ＭＳＡ」、「ＢＬＯＣＫＭＡＫＥＲ」、「ＭＥＭＥ」及び「Ｍａｔｃｈ−Ｂｏｘ」プログラムがアミノ酸配列に対しても利用可能である。一般的にはこれらのプログラムのいずれかをデフォルト設定で使用するが、当業者であればこれらの設定を必要に応じて変更することができる。あるいは、当業者であれば、もたらされる同一性またはアラインメントのレベルが基準アルゴリズム及びプログラムによってもたらされるそのレベルと少なくとも同程度である別のアルゴリズムまたはコンピュータプログラムを利用することができる。例えば、Ｊ．Ｄ．Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，“Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ”，２７（１３）：２６８２−２６９０（１９９９）を参照されたい。
【００７９】
本明細書中に記載されるとおり、核酸配列を任意の好適なベクターの中に組み込む操作がなされ得る。「ベクター」という用語は、第２核酸分子が、それを複製することになる宿主細胞の中への導入のために中に挿入され得る、核酸分子を指す。換言すると、ベクターは、それに繋げられた核酸分子を輸送することができる。本明細書中で使用される「ベクター」という用語によってクローニングベクター及び発現ベクターが企図される。特定のベクターは、それらが導入された宿主において自律複製することができる（例えば、細菌性複製起点を有するベクターは細菌において複製することができる）。他のベクターは、宿主細胞内へ導入された際に宿主のゲノムの中に組み込まれることができ、それによって、宿主ゲノムと一緒に複製される。本発明に係るベクターは当業者によく知られている方法で簡単に作ることができる。
【００８０】
ＩＩ．クレードＦのＡＡＶｈｕ６８
本明細書中で使用する場合、ＡＡＶの群に関する「クレード」という用語は、ＡＡＶ  ｖｐ１アミノ酸配列のアラインメントに基づいて（少なくとも１０００個の複製物の）少なくとも７５％のブートストラップ値及び０．０５以下のポアソン補正距離測定値による近接結合アルゴリズムを用いて判定した場合に系統学的に互いに関連し合っているＡＡＶの群を指す。近接結合アルゴリズムは文献に記載されている。例えば、Ｍ．Ｎｅｉ  ａｎｄ  Ｓ．Ｋｕｍａｒ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２０００）を参照されたい。このアルゴリズムを実行するために使用することができるコンピュータプログラムは入手可能である。例えば、ＭＥＧＡ  ｖ２．１プログラムは改変Ｎｅｉ−Ｇｏｊｏｂｏｒｉ法を実装している。これらの技術及びコンピュータプログラムならびにＡＡＶ  ｖｐ１カプシドタンパク質の配列を用いて当業者は、選択されたＡＡＶが本明細書で特定されるクレードの１つに含まれているか、別のクレードに含まれているか、またはこれらのクレードから外れるかについて容易に判定することができる。例えば、クレードＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦを同定し新規ＡＡＶ、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＹ５３０５５３〜ＡＹ５３０６２９の核酸配列を提供しているＧ  Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ，
Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，２００４  Ｊｕｎ；７８（１２）：６３８１−６３８８を参照されたい。また、ＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。
【００８１】
本明細書中で使用する場合、「ＡＡＶ９カプシド」は、複数のＡＡＶ９  ｖｐタンパク質からなる自己組織化ＡＡＶカプシドである。ＡＡＶ９  ｖｐタンパク質は典型的には、配列番号３６の核酸配列、またはそれに対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％であり配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋ受託：ＡＡＳ９９２６４）のｖｐ１アミノ酸配列をコードする配列によってコードされる、代替スプライシング変異型として発現する。これらのスプライシング変異型は、配列番号１７の様々な長さのタンパク質となる。特定の実施形態では、「ＡＡＶ９カプシド」は、ＡＡＳ９９２６４と９９％同一であるかまたは配列番号１７と９９％同一であるアミノ酸配列を有するＡＡＶを含む。ＵＳ７９０６１１１及びＷＯ２００５／０３３３２１も参照されたい。本明細書中で使用する「ＡＡＶ９変異型」には、例えば、ＷＯ２０１６／０４９２３０、ＵＳ８，９２７，５１４、ＵＳ２０１５／０３４４９１１及びＵＳ８，７３４，８０９に記載されているものが含まれる。
【００８２】
ｒＡＡＶｈｕ６８はＡＡＶｈｕ６８カプシド及びベクターゲノムからなる。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１の異種集団、ｖｐ２の異種集団及びｖｐ３タンパク質の異種集団の集合体である。本明細書中で使用する「異種」という用語またはその任意の文法的変化形は、ｖｐカプシドタンパク質に言及するために使用される場合、同じでない要素、例えば、異なる修飾アミノ酸配列を有するｖｐ１、ｖｐ２またはｖｐ３単量体（タンパク質）を有している要素からなる集団を指す。配列番号１６は、コードされているＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ１タンパク質のアミノ酸配列を提供する。各々「Ｎｏｖｅｌ  Ａｄｅｎｏ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒｕｓ（ＡＡＶ）Ｃｌａｄｅ  Ｆ  Ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｆｏｒ」と題された米国仮特許出願第６２／６１４，００２号、第６２／５９１，００２号及び第６２／４６４，７４８号も参照されたく、参照によりこれらの全体を本明細書に援用する。
【００８３】
ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１６の予測アミノ酸残基からの修飾を有するｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内及びｖｐ３タンパク質内の亜集団を含有する。これらの亜集団は、最低でも、特定の脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、特定の亜集団は少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）位置を配列番号１６のアスパラギン−グリシン対に含んでおり、場合によってはさらに他の脱アミド化アミノ酸を含んでおり、脱アミド化がアミノ酸変化及びその他の任意選択の修飾をもたらしている。配列番号３９は改変型ＡＡＶｈｕ６８カプシドのアミノ酸配列を示し、脱アミド化あるいは修飾され得る残基位置を例示する。
【００８４】
本明細書中で使用する場合、ｖｐタンパク質の「亜集団」は、特に明記しない限り、共通して少なくとも１つの定義された特質を有しかつ、基準となる群の少なくとも１つの群メンバー〜全メンバー未満からなる、ｖｐタンパク質の群を指す。例えば、ｖｐ１タンパク質の「亜集団」は、特に明記しない限り、組織化ＡＡＶカプシド中の少なくとも１つのｖｐ１タンパク質でありかつ全ｖｐ１タンパク質未満である。ｖｐ３タンパク質の「亜集団」は、特に明記しない限り、組織化ＡＡＶカプシド中の１つのｖｐ３タンパク質〜全ｖｐ３タンパク質未満であり得る。例えば、ｖｐ１タンパク質はｖｐタンパク質の亜集団であり得、ｖｐ２タンパク質はｖｐタンパク質の別の亜集団であり得、ｖｐ３は組織化ＡＡＶカプシド中のｖｐタンパク質のさらに別の亜集団である。別の例では、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質は、異なる修飾、例えば、少なくとも１つ、２つ、３つまたは４つの高度に脱アミド化されたアスパラギン、例えばアスパラギン−グリシン対を有する亜集団を含有し得る。
【００８５】
特に明記しない限り、高度に脱アミド化されているとは、基準アミノ酸位置の予測アミノ酸配列と比較して基準アミノ酸位置において少なくとも４５％脱アミド化されていること、少なくとも５０％脱アミド化されていること、少なくとも６０％脱アミド化されていること、少なくとも６５％脱アミド化されていること、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、９７％、９９％、約１００％以下が脱アミド化されていることを指す（例えば、全ｖｐ１タンパク質を基準として配列番号１６のアミノ酸５７のアスパラギンの少なくとも８０％が脱アミド化されていてもよいし、またはｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質の全てを基準として配列番号１６のアミノ酸４０９のアスパラギンの１０％が脱アミド化されていてもよい）。そのような百分率は、２Ｄゲル、質量分析技術または他の好適な技術を用いて決定され得る。
【００８６】
理論に拘泥することは望まないが、少なくとも、ＡＡＶｈｕ６８カプシド中のｖｐタンパク質中の高度に脱アミド化された残基の脱アミド化は、選択されたアスパラギン残基の脱アミド化及びより低い程度でのグルタミン残基の脱アミド化をするカプシドタンパク質中の官能基によって引き起こされるため、主として非酵素的な性質のものであると考えられる。大半の脱アミド化ｖｐ１タンパク質の効率的なカプシド組織化は、これらの事象がカプシド組織化の後に起こるか、または個々の単量体（ｖｐ１、ｖｐ２またはｖｐ３）での脱アミド化が構造的に十分な耐性を有しかつ組織化動態に概して影響を及ぼさないかのどちらかであることを暗示する。細胞進入前には内部に位置していると一般に考えられているＶＰ１固有（ＶＰ１−ｕ）領域（約ａａ１〜１３７）での広範囲に及ぶ脱アミド化は、ＶＰ脱アミド化がカプシド組織化に先立って起こっている可能性があることを示唆している。
【００８７】
理論に拘泥することは望まないが、Ｎの脱アミド化は、そのＣ末端残基の主鎖窒素原子がＡｓｎの側鎖アミド基炭素原子に求核攻撃を行うことによって起こり得る。中間体の閉環スクシンイミド残基が形成すると考えられている。スクシンイミド残基はその後、速い加水分解を行って最終生成物であるアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはイソアスパラギン酸（ＩｓｏＡｓｐ）をもたらす。したがって、特定の実施形態では、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）の脱アミド化はＡｓｐまたはＩｓｏＡｓｐをもたらすが、これらはスクシンイミド中間体を介して例えば以下に例示するように相互変換され得る。
【化１】
2020510430.tif 000003
本明細書中で提供する場合、配列番号１６の各脱アミド化Ｎは、独立してアスパラギン酸（Ａｓｐ）、イソアスパラギン酸（ｉｓｏＡｓｐ）、アスパルテート及び／または、ＡｓｐとｉｓｏＡｓｐとの相互変換ブレンド、またはそれらの組み合わせであり得る。α−及びイソアスパラギン酸がいかなる好適な比で存在していてもよい。例えば、特定の実施形態では、比は１０：１〜１：１０のアスパラギン酸対イソアスパラギン酸、約５０：５０
のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、または約１：３のアスパラギン酸：イソアスパラギン酸、または別の選択された比であり得る。
【００８８】
特定の実施形態では、配列番号１６中の１つ以上のグルタミン（Ｑ）は脱アミド化してグルタミン酸（Ｇｌｕ）、すなわち、α−グルタミン酸、γ−グルタミン酸（Ｇｌｕ）または、共通のグルタルイミド（ｇｌｕｔａｒｉｎｉｍｉｄｅ）中間体を介して相互変換され得るα−及びγ−グルタミン酸のブレンドとなる。α−及びγ−グルタミン酸はいかなる好適な比で存在していてもよい。例えば、特定の実施形態では、比は１０：１〜１：１０のα対γ、約５０：５０のα：γ、または約１：３のα：γ、または別の選択された比であり得る。
【化２】
2020510430.tif 000004
【００８９】
したがって、ｒＡＡＶｈｕ６８は、脱アミド化アミノ酸を有するｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの中の亜集団を含み、これは、最低でも、少なくとも１つの高度に脱アミド化されたアスパラギンを含んでいる少なくとも１つの亜集団を含む。加えて、他の修飾は異性化を含み得、詳しくは、選択されたアスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）残基位置に含み得る。さらに他の実施形態では、修飾はＡｓｐ位置でのアミド化を含み得る。
【００９０】
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、少なくとも４個〜少なくとも約２５個の脱アミド化アミノ酸残基位置を有するｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３の亜集団を含有しているが、このうちの少なくとも１〜１０％が、コードされる配列番号１６のアミノ酸配列と比較して脱アミド化されている。これらの大部分はＮ残基であり得る。しかしながら、Ｑ残基も脱アミド化されていることがある。
【００９１】
特定の実施形態では、ＡＡＶ６８カプシドは、下記のうちの１つ以上によってさらに特徴付けられる。ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質は、配列番号１６の１〜７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ１タンパク質、配列番号１８から産生されるｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号１６の１〜７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１８と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質；配列番号１６の少なくとも約アミノ酸１３８〜
７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ２タンパク質、配列番号１８の少なくともヌクレオチド４１２〜２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号１６の少なくとも約アミノ酸１３８〜７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１８の少なくともヌクレオチド４１２〜２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、及び／または、配列番号１６の少なくとも約アミノ酸２０３〜７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ３タンパク質、配列番号１８の少なくともヌクレオチド６０７〜２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、もしくは配列番号１６の少なくとも約アミノ酸２０３〜７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１８の少なくともヌクレオチド６０７〜２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質を含む。
【００９２】
さらに、またはあるいは、ｖｐ１タンパク質の異種集団、位置１５７にバリンを場合によって含んでいるｖｐ２タンパク質の異種集団、及びｖｐ３タンパク質の異種集団を含み、少なくともｖｐ１及びｖｐ２タンパク質の亜集団が、配列番号１６のｖｐ１カプシドの付番に基づく位置１５７にバリンを含むものでありかつ場合によってはさらに位置５７にグルタミンを含むものである、ＡＡＶカプシドを提供する。さらに、またはあるいは、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号１６の少なくとも約アミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号１６の少なくともアミノ酸２０３〜７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団を含み、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質が、アミノ酸修飾を有する亜集団を含有するものである、ＡＡＶｈｕ６８カプシドを提供する。
【００９３】
ＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質は典型的には、配列番号１６の完全長ｖｐ１アミノ酸配列（アミノ酸１〜７３６）をコードする同じ核酸配列によってコードされる代替スプライシング変異型として発現する。場合によってｖｐ１コード配列は、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質を発現させるべく単独で使用される。あるいは、この配列と、ｖｐ１固有領域（約ａａ１〜約ａａ１３７）及び／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１〜約ａａ２０２）を含まずに配列番号１６のＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３〜７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１８の約ｎｔ６０７〜約ｎｔ２２１１）、または配列番号１６のａａ２０３〜７３６をコードし配列番号１８と少なくとも７０％〜少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列のうちの１つ以上とを共発現させてもよい。さらに、またはあるいは、ｖｐ１コード及び／またはｖｐ２コード配列と、ｖｐ１固有領域（約ａａ１〜約ａａ１３７）を含まずに配列番号１６のＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８〜７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１８のｎｔ４１２〜２２１１）、または配列番号１６の約ａａ１３８〜７３６をコードし配列番号１８と少なくとも７０％〜少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列とを共発現させてもよい。
【００９４】
本明細書中に記載するように、ｒＡＡＶｈｕ６８は、配列番号１６のｖｐ１アミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８核酸から、及び場合によっては例えばｖｐ１及び／またはｖｐ２固有領域を含まずにｖｐ３タンパク質をコードする追加の核酸配列からカプシドを発現させる産生システムで産生される、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。単一の核酸配列ｖｐ１を使用した産生の結果として得られるｒＡＡＶｈｕ６８は、ｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及びｖｐ３タンパク質の異種集団を産生する。より詳しくは、ＡＡＶ
ｈｕ６８カプシドは、配列番号１６の予測アミノ酸残基からの修飾を有するｖｐ１タンパク質内、ｖｐ２タンパク質内及びｖｐ３タンパク質内の亜集団を含有する。これらの亜集団は最低でも脱アミド化アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）残基を含む。例えば、アスパラギン−グリシン対のアスパラギンが高度に脱アミド化されている。
【００９５】
一実施形態において、ＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ１核酸配列は、配列番号１８の配列またはそれに相補的な鎖、例えば対応するｍＲＮＡまたはｔＲＮＡを有する。さらに、またはあるいは、特定の実施形態ではｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質をｖｐ１とは異なる核酸配列から発現させて例えば選択された発現系におけるｖｐタンパク質の比を変化させてもよい。特定の実施形態ではさらに、ｖｐ１固有領域（約ａａ１〜約ａａ１３７）及び／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１〜約ａａ２０２）を含まずに配列番号１６のＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３〜７３６）をコードする核酸配列またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡまたはｔＲＮＡ（配列番号１８の約ｎｔ６０７〜約ｎｔ２２１１）も提供される。特定の実施形態ではさらに、ｖｐ１固有領域（約ａａ１〜約ａａ１３７）を含まずに配列番号１６のＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８〜７３６）をコードする核酸配列またはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡまたはｔＲＮＡ（配列番号１８のｎｔ４１２〜２２１１）も提供される。
【００９６】
しかしながら、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする他の核酸配列を、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドの生産に使用するために選択してもよい。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１８の核酸配列、または配列番号１６をコードする配列番号１８と少なくとも７０％〜９９％同一である、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一である配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１８の核酸配列、または配列番号１６のｖｐ２カプシドタンパク質（約ａａ１３８〜７３６）をコードする配列番号１８の約ｎｔ４１２〜約ｎｔ２２１１と少なくとも７０％〜９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一である配列を有する。特定の実施形態では、核酸配列は、配列番号１８の約ｎｔ６０７〜約ｎｔ２２１１の核酸配列、または配列番号１６のｖｐ３カプシドタンパク質（約ａａ２０３〜７３６）をコードする配列番号１８と少なくとも７０％〜９９％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９９％同一である配列を有する。
【００９７】
このＡＡＶｈｕ６８カプシドをコードするＤＮＡ（ゲノムまたはｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）を含めた核酸配列を設計することは当技術分野における技量の範囲内である。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列は配列番号１８に示される。図１Ｂ〜Ｄも参照されたい。他の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質を発現させるために配列番号１８との７０〜９９．９％の同一性を有する核酸配列が選択され得る。他の特定の実施形態では、核酸配列は配列番号１８と少なくとも約７５％同一、少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％〜９９．９％同一である。そのような核酸配列は、選択されたシステム（例えば細胞種）における発現のためにコドン最適化されてもよく、様々な方法によって設計され得る。この最適化は、オンライン入手可能な方法（例えばＧｅｎｅＡｒｔ）、公開されている方法、またはコドン最適化サービスを提供する会社、例えばＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を用いて実施され得る。１つのコドン最適化方法は例えば米国の国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１２９２４号に記載されており、参照によりこの全体を本明細書に援用する。また、例えば米国特許公開第２０１４／００３２１８６号及び米国特許公開第２００６／０１３６１８４号も参照されたい。産物のためのオープンリーディングフレーム（Ｏ
ＲＦ）の完全長を改変することが好適である。しかしながら、いくつかの実施形態ではＯＲＦの一部のみが変更されていてもよい。これらの方法のうちの１つを用いることによって、頻度を任意の所与のポリペプチド配列に適用することができ、ポリペプチドをコードするコドン最適化コード領域の核酸断片を産生させることができる。コドンに対する実際の変更を実施するためまたは本明細書に記載されているとおりに設計されたコドン最適化コード領域を合成するために、多くの選択肢が利用可能である。そのような改変または合成は、当業者によく知られている標準的及び慣例的な分子生物学的操作を用いて実施され得る。１つの手法では、長さが各々８０〜９０ヌクレオチドであり所望の配列の長さにまたがる一連の相補的オリゴヌクレオチド対は、標準的な方法によって合成される。これらのオリゴヌクレオチド対は、それらがアニーリング時に付着末端を含有する８０〜９０塩基対の二本鎖断片を形成するように合成され、例えば、対の各オリゴヌクレオチドは、対のもう一方のオリゴヌクレオチドに相補的な領域を越えて３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれより多い塩基を延出させるように合成される。各対のオリゴヌクレオチドの一本鎖端部は、別の対のオリゴヌクレオチドの一本鎖端部とアニーリングするように設計される。オリゴヌクレオチド対をアニーリングさせ、その後、これらの二本鎖断片のおよそ５〜６個を付着一本鎖端部を介してアニーリングさせ、その後、それらをライゲートし合わせ、標準的な細菌クローニングベクター、例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆから入手することができるＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングする。その後、構築物の配列決定を標準的な方法で行う。ライゲートされ合った５〜６断片の８０〜９０塩基対断片、すなわち約５００塩基対の断片からなるこれらの構築物のいくつかは、所望の配列の全体が一連のプラスミド構築物として表されるように作製される。その後、これらのプラスミドのインサートを適切な制限酵素で切断し、ライゲートし合わせて最終構築物を形成する。その後、最終構築物を標準的な細菌クローニングベクターにクローニングし、配列決定する。さらなる方法は当業者であればすぐに分かるであろう。加えて、遺伝子合成は商業的に容易に利用することができる。
【００９８】
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質中のＮ−Ｇ対のアスパラギン（Ｎ）が高度に脱アミド化されている。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質中の高度に脱アミド化された少なくとも４つのアスパラギン（Ｎ）位置を有するＡＡＶ  ｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３カプシドタンパク質の亜集団を含有する。特定の実施形態では、Ｎ−Ｎ対（Ｎ−Ｎ−Ｎ三つ組を除く）の約２０〜５０％は脱アミド化を示す。特定の実施形態では、最初のＮが脱アミド化されている。特定の実施形態では、２つ目のＮが脱アミド化されている。特定の実施形態では、脱アミド化は約１５％〜約２５％の脱アミド化である。配列番号１６の位置２５９にあるＱにおける脱アミド化は、ＡＡＶｈｕ６８タンパク質のＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３カプシドタンパク質の約８％〜約４２％である。
【００９９】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質のＤ２９７におけるアミド化によってさらに特徴付けられる。特定の実施形態では、配列番号１６の付番に基づいて、ＡＡＶｈｕ６８カプシド中のｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の位置２９７にあるＤの約７０％〜約７５％がアミド化されている。
【０１００】
特定の実施形態では、カプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３において少なくとも１つのＡｓｐがＤ−Ａｓｐに異性化している。そのような異性体は通常、配列番号１６の付番に基づく残基位置９７、１０７、３８４のうちの１つ以上にあるＡｓｐの約１％未満の量で存在する。
【０１０１】
特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８は、以下の表に示す位置にある２つ、３つ、４つまたはそれ以上の脱アミド化残基の組み合わせを含む亜集団を有するｖｐ１、ｖｐ２及
びｖｐ３タンパク質を有しているＡＡＶｈｕ６８カプシドを有する。ｒＡＡＶにおける脱アミド化は、２Ｄゲル電気泳動及び／または質量分析及び／またはタンパク質モデリング技術を用いて決定され得る。Ａｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐカラム、及びＮａｎｏＦｌｅｘソースを備えたＱ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と連結したＴｈｅｒｍｏ  ＵｌｔｉＭａｔｅ３０００ＲＳＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてオンラインクロマトグラフィーを実施してもよい。ＭＳデータは、検査スキャン（２００〜２０００ｍ／ｚ）から最も豊富な配列未決定の前駆体イオンを動的に選択する、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦのためのデータ依存的上位２０位法を用いて取得される。配列決定は、予測自動ゲイン制御を用いて決定される目標値を１ｅ５イオンとする高エネルギー衝突解離フラグメンテーションによって実施し、前駆体の単離は余裕枠を４ｍ／ｚとして実施した。検査スキャンは、ｍ／ｚ２００で１２０，０００の分解能で取得した。ＨＣＤスペクトルの分解能は、最大イオン注入時間を５０ｍｓとし正規化衝突エネルギーを３０としてｍ／ｚ２００で３０，０００に設定され得る。Ｓ−レンズＲＦレベルは、消化物からのペプチドが占有するｍ／ｚ領域の透過を最適化するために５０に設定され得る。前駆体イオンは、単一の未帰属の、または６つ以上の荷電状態によってフラグメンテーション選択から除外され得る。取得したデータの解析のためにＢｉｏＰｈａｒｍａ  Ｆｉｎｄｅｒ  １．０ソフトウェア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が使用され得る。ペプチドマッピングのためには単一入力タンパク質ＦＡＳＴＡデータベースを使用し、カルバミドメチル化を固定の修飾に設定し、酸化、脱アミド化及びリン酸化を可変の修飾に設定し、質量精度を１０−ｐｐｍとし、高いプロテアーゼ特異性とし、信頼度レベルをＭＳ／ＭＳスペクトルのために０．８として、検索を実施する。好適なプロテアーゼの例には、例えばトリプシンまたはキモトリプシンが含まれ得る。脱アミド化は未処理の分子の質量に＋０．９８４Ｄａ（−ＯＨ基と−ＮＨ２基との質量差）だけ足すので、質量分析による脱アミド化ペプチドの同定は比較的平易である。特定のペプチドの脱アミド化パーセントは、脱アミド化ペプチドの決定された質量面積を脱アミド化ペプチドと元のペプチドとの合計面積で割ったものである。脱アミド化可能な部位の数を考える場合、異なる部位で脱アミド化されている同重体種同士は、寄り合って１本のピークとなり得る。結果として、複数の潜在的脱アミド化部位を有するペプチドから発生するフラグメントイオンを用いて脱アミド化の複数の部位を突き止める、または区別することができる。これらの場合には、観察された同位体パターンの相対強度を用いて種々の脱アミド化ペプチド異性体の相対存在量を具体的に決定することができる。この方法は、全ての異性体種についてフラグメンテーション効率が同じであり脱アミド化の部位に無関係であることを仮定している。当業者であれば、これらの例示的方法に対する多くの変更を用いることができることを理解するであろう。例えば、好適��質量分析装置としては、Ｗａｔｅｒｓ  ＸｅｖｏもしくはＡｇｉｌｅｎｔ  ６５３０などの四重極型飛行時間質量分析装置（ＱＴＯＦ）または、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＦｕｓｉｏｎもしくはＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）などのオービトラップ型装置が挙げられ得る。好適な液体クロマトグラフィーシステムとしては、例えば、ＷａｔｅｒｓからのＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステム、またはＡｇｉｌｅｎｔシステム（シリーズ１１００または１２００）が挙げられる。好適なデータ解析ソフトウェアは、例えば、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）、Ｐｉｎｐｏｉｎｔ
ａｎｄ  Ｐｅｐｆｉｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｐｅａｋｓ  ＤＢ（Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）を含み得る。さらに他の技術は、例えば、２０１７年６月１６日にオンライン公開されたＸ．Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２８，Ｎｏ．５，ｐｐ．２５５−２６７に記載されている可能性がある。
【表１−１】
2020510430.tif 000005
【表１−２】
2020510430.tif 000006
【０１０２】
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１６のアミノ酸配列の付番に基づく位置Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２及び／またはＮ５１２のうちの少なくとも１つにおいてＮ残基の少なくとも４５％が脱アミド化されているカプシドタンパク質を有することによって特徴付けられる。特定の実施形態では、これらのＮ−Ｇ位置（すなわち、配列番号１６のアミノ酸配列の付番に基づいてＮ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２及び／またはＮ５１２）のうちの１つ以上にあるＮ残基の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも９０％が脱アミド化されている。これら及びその他の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１６のアミノ酸配列の付番に基づく位置Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７及び／またはＱ５９９のうちの１つ以上においてＮ残基の約１％〜約２０％が脱アミド化を有しているタンパク質の集団を有することによってさらに特徴付けられる。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８は少なくとも、配列番号１６のアミノ酸配列の付番に基づく位置Ｎ３５、Ｎ５７、Ｎ６６、Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３２９、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４５２、Ｎ４７７、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９、Ｎ７３５のうちの１つ以上またはその組み合わせにおいて脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は１つ以上のアミド化アミノ酸を有し得る。
【０１０３】
さらに他の修飾が認められるが、そのほとんどは、あるアミノ酸から別のアミノ酸残基への変換をもたらさない。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３の少なくとも１つのＬｙｓがアセチル化されている。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＡｓｐがＤ−Ａｓｐに異性化している。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＳ（Ｓｅｒ、セリ
ン）がリン酸化されている。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＴ（Ｔｈｒ、スレオニン）がリン酸化されている。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＷ（ｔｒｐ、トリプトファン）が酸化されている。場合によってはカプシドのｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３の少なくとも１つのＭ（Ｍｅｔ、メチオニン）が酸化されている。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は１つ以上のリン酸化を有する。例えば、特定のｖｐ１カプシドタンパク質が位置１４９においてリン酸化されている場合がある。
【０１０４】
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質であって位置６７のグルタミン酸（Ｇｌｕ）及び／または位置１５７のバリン（Ｖａｌ）を含んでいる当該ｖｐ１タンパク質の異種集団；位置１５７に場合によってバリン（Ｖａｌ）を含んでいるｖｐ２タンパク質の異種集団；ならびにｖｐ３タンパク質の異種集団を含む。ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１６のアミノ酸配列の残基付番に基づいてｖｐ１タンパク質の位置５７に位置するアスパラギン−グリシン対のアスパラギン（Ｎ）の少なくとも６５％、ならびにｖｐ１、ｖ２及びｖｐ３タンパク質の位置３２９、４５２及び／または５１２にあるアスパラギン−グリシン対のアスパラギン（Ｎ）の少なくとも７０％が脱アミド化されており、脱アミド化がアミノ酸変化をもたらしている、少なくとも１つの亜集団を含有する。本明細書中でより詳しく述べるように、脱アミド化アスパラギンは、脱アミド化されてアスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換されるアスパラギン酸／イソアスパラギン酸対、またはそれらの組み合わせとなったものであり得る。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８は、（ａ）ｖｐ２タンパク質の各々が独立して、少なくとも配列番号１６のｖｐ２タンパク質をコードする核酸配列の産物であること；（ｂ）ｖｐ３タンパク質の各々が独立して、少なくとも配列番号１６のｖｐ３タンパク質をコードする核酸配列の産物であること；（ｃ）ｖｐ１タンパク質をコードする核酸配列が配列番号１８、または配列番号１６のアミノ酸配列をコードし配列番号１８と少なくとも７０％〜少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％）同一である配列であることのうちの１つ以上によってさらに特徴付けられる。場合によってはその配列を単独で使用してｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質を発現させる。あるいは、この配列と、ｖｐ１固有領域（約ａａ１〜約ａａ１３７）及び／またはｖｐ２固有領域（約ａａ１〜約ａａ２０２）を含まずに配列番号１６のＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ３アミノ酸配列（約ａａ２０３〜７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１８の約ｎｔ６０７〜約ｎｔ２２１１）、または配列番号１６のａａ２０３〜７３６をコードし配列番号１８と少なくとも７０％〜少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列のうちの１つ以上とを共発現させてもよい。さらに、またはあるいは、ｖｐ１コード及び／またはｖｐ２コード配列と、ｖｐ１固有領域（約ａａ１〜約ａａ１３７）を含まずに配列番号１６のＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ２アミノ酸配列（約ａａ１３８〜７３６）をコードする核酸配列もしくはそれに相補的な鎖、対応するｍＲＮＡもしくはｔＲＮＡ（配列番号１８のｎｔ４１２〜２２１１）、または配列番号１６の約ａａ１３８〜７３６をコードし配列番号１８と少なくとも７０％〜少なくとも９９％（例えば、少なくとも８５％、��なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％）同一である配列とを共発現させてもよい。
【０１０５】
さらに、またはあるいは、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは少なくとも、配列番号１６の付番に基づく位置Ｎ５７、Ｎ６６、Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３２９、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４５２、Ｎ４７７、Ｎ５１２、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９のうちの１つ以上またはその組み合わせにおいて
脱アミド化されているｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｅ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１６の付番に基づく位置Ｎ６６、Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４７７、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９のうちの１つ以上またはその組み合わせにおいて１〜２０％の脱アミド化を含むｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｆ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１６の付番に基づいてｖｐ１タンパク質の位置５７にあるＮの６５〜１００％が脱アミド化されているｖｐ１の亜集団を含む；（ｇ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ｖｐ１タンパク質の位置５７にあるＮの７５〜１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質の亜集団を含む；（ｈ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１６の付番に基づく位置３２９にあるＮの８０〜１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｉ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１６の付番に基づく位置４５２にあるＮの８０〜１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｊ）ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは、配列番号１６の付番に基づく位置５１２にあるＮの８０〜１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む；（ｋ）ｒＡＡＶは、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１〜１．５対３〜１０の比で含む；（ｌ）ｒＡＡＶは、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１対３〜９の比で含む。
【０１０６】
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８は、脱アミド化を減少させるべくアスパラギン−グリシン対のグリシンを変化させるように改変される。他の実施形態では、アスパラギンを、より遅い速度で脱アミド化される別のアミノ酸、例えばグルタミン；またはアミド基（例えば、グルタミン及びアスパラギンはアミド基を含有する）を欠くアミノ酸；及び／またはアミン基（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジンはアミド基を含有する）を欠くアミノ酸に変化させる。本明細書中で使用する場合、アミドまたはアミン側基を欠くアミノ酸は、例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、シスチン、フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファン及び／またはプロリンを指す。記載しているような改変は、コードされるＡＡＶｈｕ６８アミノ酸配列にみられるアスパラギン−グリシン対のうちの１つ、２つまたは３つにおいてなされ得る。特定の実施形態では、４つ全てのアスパラギン−グリシン対においてそのような改変がなされるわけではない。このように、脱アミド化速度がより低い、ＡＡＶｈｕ６８及び／または操作型ＡＡＶｈｕ６８変異型の脱アミド化を減少させる方法。さらに、またはあるいは、他の１つ以上のアミドアミノ酸を非アミドアミノ酸に変えてＡＡＶｈｕ６８の脱アミド化を減少させてもよい。
【０１０７】
これらのアミノ酸修飾は従来の遺伝子操作技術によってなされ得る。例えば、配列番号１６の位置５８、３３０、４５３及び／または５１３においてグリシン（アルギニン−グリシン対）をコードするコドンの１つ〜３つが改変されてグリシン以外のアミノ酸をコードしている改変されたＡＡＶｈｕ６８  ｖｐコドンを含有する核酸配列が生み出され得る。特定の実施形態では、改変されたアルギニンコドンを含有する核酸配列は、配列番号１６の位置５７、３２９、４５２及び／または５１２に位置するアルギニン−グリシン対の１つ〜３つにおいて、改変されたコドンがアルギニン以外のアミノ酸をコードするように操作されていてもよい。改変された各コドンは、異なるアミノ酸をコードしていてもよい。あるいは、変更したコドンの１つ以上が同じアミノ酸をコードしていてもよい。特定の実施形態では、これらの改変型ＡＡＶｈｕ６８核酸配列は、天然ｈｕ６８カプシドよりも低い脱アミド化を有するカプシドを有している突然変異ｒＡＡＶｈｕ６８を生み出すために使用され得る。そのような突然変異ｒＡＡＶｈｕ６８は、低減された免疫原性を有し得
、及び／または貯蔵時、特に懸濁液形態での貯蔵時の安定性を向上させ得る。
【０１０８】
一実施形態では、（Ａ）（１）配列番号１６の１〜７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ１タンパク質、配列番号１８から産生されるｖｐ１タンパク質、もしくは配列番号１６の１〜７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１８と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ１タンパク質、配列番号１６の少なくとも約アミノ酸１３８〜７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ２タンパク質、配列番号１８の少なくともヌクレオチド４１２〜２２１１を含む配列から産生されるｖｐ２タンパク質、もしくは配列番号１６の少なくとも約アミノ酸１３８〜７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１８の少なくともヌクレオチド４１２〜２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ２タンパク質、配列番号１６の少なくとも約アミノ酸２０３〜７３６の予測アミノ酸配列をコードする核酸配列からの発現によって産生されるＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ３タンパク質、配列番号１８の少なくともヌクレオチド６０７〜２２１１を含む配列から産生されるｖｐ３タンパク質、もしくは配列番号１６の少なくとも約アミノ酸２０３〜７３６の予測アミノ酸配列をコードし配列番号１８の少なくともヌクレオチド６０７〜２２１１と少なくとも７０％同一である核酸配列から産生されるｖｐ３タンパク質を含む、ＡＡＶｈｕ６８カプシドタンパク質；及び／または（２）ｖｐ１タンパク質の異種集団、位置１５７に場合によってバリンを含んでいるｖｐ２タンパク質の異種集団、及びｖｐ３タンパク質の異種集団を含み、少なくともｖｐ１及びｖｐ２タンパク質の亜集団が、配列番号１６のｖｐ１カプシドの付番に基づく位置１５７にバリンを含むものでありかつ場合によってはさらに位置５７にグルタミンを含むものである、ＡＡＶカプシドタンパク質；及び／または（３）配列番号１６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ１タンパク質の異種集団、配列番号１６の少なくとも約アミノ酸１３８〜７３６のアミノ酸配列をコードする核酸配列の産物であるｖｐ２タンパク質の異種集団、及び配列番号１６の少なくともアミノ酸２０３〜７３６をコードする核酸配列の産物であるｖｐ３タンパク質の異種集団のうちの、１つ以上を含み、ｖｐ１、ｖｐ２及びｖｐ３タンパク質が、配列番号１６のアスパラギン−グリシン対において少なくとも２つの高度に脱アミド化されたアスパラギン（Ｎ）を含むアミノ酸修飾を有する亜集団を含有するものでありかつ場合によっては他の脱アミド化アミノ酸を含む亜集団をさらに含むものであり、脱アミド化がアミノ酸変化をもたらしている、ＡＡＶ６８カプシド；ならびに（Ｂ）ＡＡＶｈｕ６８カプシド内のベクターゲノムであって、ＡＡＶ末端逆位反復配列と、産物をコードしており宿主における当該産物の発現を促す配列に機能可能に繋げられている非ＡＡＶ核酸配列とを含む核酸分子を含んでいる当該ベクターゲノムを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が提供される。例えば、４つの残基（Ｎ５７、Ｎ３２９、Ｎ４５２、Ｎ５１２）は通例、高レベルの脱アミド化を呈する。さらなる残基（Ｎ９４、Ｎ２５３、Ｎ２７０、Ｎ３０４、Ｎ４０９、Ｎ４７７及びＱ５９９）も様々なロットにわたって約２０％以下の脱アミド化レベルを呈する。
【０１０９】
特定の実施形態では、脱アミド化アスパラギンは、脱アミド化されてアスパラギン酸、イソアスパラギン酸、相互変換されるアスパラギン酸／イソアスパラギン酸対、またはそれらの組み合わせとなっている。特定の実施形態では、脱アミド化グルタミン（複数可）は、脱アミド化されて（α）−グルタミン酸、γ−グルタミン酸、相互変換される（α）−グルタミン酸／γ−グルタミン酸対、またはそれらの組み合わせになっている。
【０１１０】
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、（ａ）配列番号１６の付番に基づいてｖｐ１タンパク質の位置５７に位置するアスパラギン−グリシン対のアスパラギン（Ｎ）の少なくとも６５％が脱アミド化されていること；（ｂ）配列番号１６のアミノ酸配列の残基付番に基づいてｖｐ１、ｖ２及びｖｐ３タンパク質の位置３２９にあるアスパラギン−グリシン対のＮの少なくとも７５％が脱アミド化されていること；（ｃ）配列番号１
６のアミノ酸配列の残基付番に基づいてｖｐ１、ｖ２及びｖｐ３タンパク質の位置４５２にあるアスパラギン−グリシン対のＮの少なくとも５０％が脱アミド化されていること；及び／または（ｄ）配列番号１６のアミノ酸配列の残基付番に基づいてｖｐ１、ｖ２及びｖｐ３タンパク質の位置５１２にあるアスパラギン−グリシン対のＮの少なくとも７５％が脱アミド化されていることのうちの１つ以上を有する亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、質量分析を用いて決定した場合にｖｐ１タンパク質の位置５７にあるＮの７５〜１００％が脱アミド化されているｖｐ１の亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、質量分析を用いて決定した場合に配列番号１６の付番に基づく位置３２９にあるＮの７５〜１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、質量分析を用いて決定した場合に配列番号１６の付番に基づく位置４５２にあるＮの７５〜１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、配列番号１６の付番に基づく位置５１２にあるＮの７５〜１００％が脱アミド化されているｖｐ１タンパク質、ｖｐ２タンパク質及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、タンパク質をコードする核酸配列は、配列番号１８、または配列番号１６のアミノ酸配列をコードし配列番号１８と少なくとも８０％〜少なくとも９９％同一である配列である。特定の実施形態では、配列は配列番号１８と少なくとも８０％〜９７％同一である。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８カプシドは少なくとも、Ｎ５７、３２９、４５２、５１２またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上から選択される少なくとも４つの位置における少なくとも約５０〜１００％の脱アミド化を含む配列番号１６からのアミノ酸修飾を有しているｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団をさらに含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、位置Ｎ９４、Ｎ１１３、Ｎ２５２、Ｎ２５３、Ｑ２５９、Ｎ２７０、Ｎ３０３、Ｎ３０４、Ｎ３０５、Ｎ３１９、Ｎ３２８、Ｎ３３６、Ｎ４０９、Ｎ４１０、Ｎ４７７、Ｎ５１５、Ｎ５９８、Ｑ５９９、Ｎ６２８、Ｎ６５１、Ｎ６６３、Ｎ７０９またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも１つ以上における１％〜約４０％の脱アミド化をさらに含むｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む。特定の実施形態では、ｈｕ６８カプシドは、以下のうちの１つ以上における１つ以上の修飾から選択される１つ以上の修飾をさらに含むｖｐ１、ｖｐ２及び／またはｖｐ３タンパク質の亜集団を含む：アセチル化リジン、リン酸化セリン及び／またはスレオニン、異性化アスパラギン酸、酸化トリプトファン及び／またはメチオニン、またはアミド化アミノ酸。特定の実施形態では、ｒＡＡＶｈｕ６８は、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１〜１．５対３〜１０の比で含む。特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドの合計約６０個のカプシドタンパク質はｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の比が約１対約１対３〜９である。特定の実施形態では、ベクターゲノムは、ＡＡＶｈｕ６８以外のＡＡＶ源からのＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含む。
【０１１１】
特定の実施形態では、組換えアデノ随伴ウイルスｈｕ６８（ｒＡＡＶｈｕ６８）の混合集団を含む組成物が提供され、当該ｒＡＡＶｈｕ６８の各々は独立して、本明細書に記載のｒＡＡＶｈｕ６８から選択されるものである。特定の実施形態では、平均的なＡＡＶｈｕ６８カプシドは、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１〜１．５対３〜１０の比で含む。特定の実施形態では、平均的なＡＡＶｈｕ６８カプシドは、合計約６０個のカプシドタンパク質をｖｐ１対ｖｐ２対ｖｐ３タンパク質の約１対約１対３〜６の比で含む。特定の実施形態では、組成物は静脈内送達のために製剤化される。特定の実施形態では、組成物は鼻腔内または筋肉内送達のために製剤化される。特定の実施形態では、組成物は少なくとも、ｒＡＡＶｈｕ６８ベクター材料ならびに、任意選択の担体、賦形剤及び／または保存剤を含む。
【０１１２】
組換えＡＡＶｈｕ６８を産生させるために有用となるいかなる好適なｒＡＡＶ産生シス
テムを使用してもよい。例えば、そのような産生システムは、（ａ）配列番号１６のアミノ酸配列をコードするＡＡＶｈｕ６８カプシド核酸配列；（ｂ）ＡＡＶｈｕ６８カプシド内へのパッケージングに適した核酸分子であって、少なくとも１つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）と、遺伝子産物をコードしており宿主細胞における当該産物の発現を促す配列に機能可能に繋げられている非ＡＡＶ核酸配列とを含む当該核酸分子；ならびに（ｃ）組換えＡＡＶｈｕ６８カプシド内への核酸分子のパッケージングを可能にするに足るＡＡＶ  ｒｅｐ機能及びヘルパー機能を含み得る。特定の実施形態では、（ａ）の核酸配列は少なくとも、配列番号１８、または配列番号１６のアミノ酸配列をコードし配列番号１８と少なくとも７０％〜少なくとも９９％同一である配列を含む。特定の実施形態では、システムは場合によってさらに、配列番号１６の約ａａ２０３〜約アミノ酸７３６のＡＡＶｈｕ６８  ｖｐ３をコードする配列番号１８の約ｎｔ６０７〜約ｎｔ２２１１の核酸配列を含む。特定の実施形態では、システムは、ヒト胚性腎臓２９３細胞またはバキュロウイルスシステムを含む。
【０１１３】
特定の実施形態では、ＡＡＶｈｕ６８カプシドの脱アミド化を減少させる方法が提供される。方法は、改変されたＡＡＶｈｕ６８  ｖｐコドンを含有する核酸配列からＡＡＶｈｕ６８カプシドを産生させることを含み、当該核酸配列は、配列番号１６の位置５８、３３０、４５３及び／または５１３に位置するアルギニン−グリシン対の１つ〜３つにおいて独立して、グリシン以外のアミノ酸をコードするような改変されたグリシンコドンを含むものである。特定の実施形態では、方法は、改変されたＡＡＶｈｕ６８  ｖｐコドンを含有する核酸配列からＡＡＶｈｕ６８カプシドを産生させることを含み、当該核酸配列は、配列番号１６の位置５７、３２９、４５２及び／または５１２に位置するアルギニン−グリシン対の１つ〜３つにおいて独立して、アルギニン以外のアミノ酸をコードするような改変されたアルギニンコドンを含むものである。特定の実施形態では、改変された各コドンは異なるアミノ酸をコードする。特定の実施形態では、改変された２つ以上のコドンが同じアミノ酸をコードする。特定の実施形態では、本明細書に記載の突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、アルギニン−グリシン対において、グリシンがアラニンまたはセリンに変化しているような突然変異を含有する。突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、基準ＡＡＶｈｕ６８が本来４つのＮＧ対を含有するものである場合、１つ、２つまたは３つの突然変異体を含有し得る。特定の実施形態では、突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＮＧ対における突然変異をたった１つだけ含有する。特定の実施形態では、突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、２つの異なるＮＧ対において突然変異を含有する。特定の実施形態では、突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＡＡＶｈｕ６８カプシド中の構造的に離れた場所に位置する２つの異なるＮＧ対において突然変異を含有する。特定の実施形態では、突然変異はＶＰ１固有領域の中にはない。特定の実施形態では、突然変異の１つがＶＰ１固有領域の中にある。場合によって、突然変異ＡＡＶｈｕ６８カプシドは、ＮＧ対には修飾を含有していないが、ＮＧ対の外側に位置する１つ以上のアスパラギンまたはグルタミンにおいて脱アミド化を最小限にするかまたはなくす突然変異を含有している。
【０１１４】
本明細書中で使用する場合、「コードされるアミノ酸配列」とは、アミノ酸に翻訳される基準核酸配列の既知ＤＮＡコドンの翻訳に基づいて予測されるアミノ酸を指す。以下の表はＤＮＡコドン及び２０個の一般的なアミノ酸を示し、一文字コード（ＳＬＣ）及び三文字コード（３ＬＣ）を両方とも示す。
【表２−１】
2020510430.tif 000007
【表２−２】
2020510430.tif 000008
【０１１５】
カプシドを生み出す方法、そのためのコード配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターを生産する方法については教示がなされている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１−６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
【０１１６】
上に示したとおり、ＡＡＶｈｕ６８配列及びタンパク質は、ｒＡＡＶの生産に有用である。以下の例は、ＡＡＶｈｕ６８を有するｒＡＡＶベクターまたはＡＡＶ９ベクターの生産について記載している。しかしながら、他の実施形態では別のＡＡＶカプシドが選択される。組織特異性はカプシドの種類によって決まる。例えば、ＡＡＶｈｕ６８を有するウイルスベクターは、鼻腔上皮細胞に形質導入するために有用であることが以下の例で示される。ＡＡＶｈｕ６８の配列は本明細書に記載されている。さらに、ＡＡＶ９カプシドを有するベクター、及びＡＡＶ９に由来するキメラカプシドを生み出す方法については教示がなされている。例えばＵＳ７，９０６，１１１（参照によりこれを本明細書に援用する）を参照されたい。鼻腔細胞または別の好適な標的（例えば筋肉または肺）に形質導入する他のＡＡＶ血清型、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ６４Ｒ２、ｒｈ８（例えば、米国公開特許出願第２００７−００３６７６０−Ａ１号、米国公開特許出願第２００９−０１９７３３８−Ａ１号及びＥＰ１３１０５７１を参照のこと）をＡＡＶウイルスベクター（ＤＮアーゼ耐性ウイルス粒子）のカプシドの供給源として選択してもよい。また、ＷＯ２００３／０４２３９７（ＡＡＶ７及び他のサルＡＡＶ）、米国特許第７７９０４４９号及び米国特許第７２８２１９９号（ＡＡＶ８）、ＷＯ２００５／０３３３２１（ＡＡＶ９）及びＷＯ２００６／１１０６８９も参照されたく、またはそれに基づく未発見もしくは組換えのＡＡＶをＡＡＶカプシドの供給源として使用してもよい。これらの文献は、ＡＡＶを生み出すために選択され得る他のＡＡＶも教示しており、参照により援用される。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターに使用するためのＡＡＶカプシド（ｃａｐ）を上記ＡＡＶ  ｃａｐまたはそのコード核酸の１つの突然変異誘発によって（つまり、挿入、欠失または置換によって）生み出すことができる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、上記ＡＡＶカプシドタンパク質のうちの２つまたは３つまたは４つまたはそれ以上からのドメインを含むキメラである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶカプシドは、２つまたは３つの異なるＡＡＶまたは組換えＡＡＶからのＶｐ１、Ｖｐ２及びＶｐ３単量体のモザイクである。いくつかの実施形態では、ｒＡＡＶ組成物は上記ｃａｐを１つより多く含む。
【０１１７】
ＩＩＩ．発現カセット及びベクター
ＡＡＶカプシド内にパッケージングされ宿主細胞に送達されるゲノム配列は、典型的には、最低でも、導入遺伝子及びその調節配列、ならびにＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ
）からなる。一本鎖ＡＡＶ及び自己相補性（ｓｃ）ＡＡＶはどちらもｒＡＡＶに包含される。導入遺伝子は、ベクター配列にとって異種である核酸コード配列であるが、これは、関心対象のポリペプチド、タンパク質、機能性ＲＮＡ分子（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ阻害物質）またはその他の遺伝子産物をコードするものである。核酸コード配列は、標的組織の細胞における導入遺伝子の転写、翻訳及び／または発現を可能にするように調節性構成要素に機能的に繋げられる。
【０１１８】
ベクターのＡＡＶ配列は典型的には、シス作用性５’及び３’末端逆位反復配列を含む（例えば、Ｂ．Ｊ．Ｃａｒｔｅｒ，ｉｎ“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ”，ｅｄ．，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｒ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１５５  １６８（１９９０）を参照のこと）。ＩＴＲ配列は長さが約１４５ｂｐである。ＩＴＲをコードする配列の実質的に全体が分子に使用されることが好ましいが、これらの配列のある程度の小さな改変は容認される。これらのＩＴＲ配列を改変する能力は当技術分野における技量の範囲内である。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９）、及びＫ．Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０  ５３２（１９９６）などの文書を参照のこと）。本発明において採用されるそのような分子の一例は、選択された導入遺伝子配列と関連する調節エレメントとが５’及び３’ＡＡＶ  ＩＴＲ配列に挟まれた、導入遺伝子を含有する「シス作用性」プラスミドである。一実施形態では、ＩＴＲは、カプシドを供給しているものとは異なるＡＡＶからのものである。一実施形態では、ＩＴＲ配列はＡＡＶ２からのものである。ΔＩＴＲと呼ばれる、Ｄ−配列及び末端分解部位（ｔｒｓ）が欠失している５’ＩＴＲの短縮形態について教示がなされている。他の実施形態では、完全長のＡＡＶ５’及び３’ＩＴＲが使用される。しかしながら、他のＡＡＶ源からのＩＴＲを選択してもよい。ＩＴＲの供給源がＡＡＶ２でありＡＡＶカプシドが別のＡＡＶ源からのものである場合、結果として得られるベクターは、偽型化されていると呼称され得る。しかしながら、これらの要素の他の構成が好適である場合がある。
【０１１９】
組換えＡＡＶベクターに関して上に特定した主要なエレメントに加えて、ベクターはさらに、プラスミドベクターをトランスフェクトされたかまたは本発明によって生産されたウイルスに感染した細胞における導入遺伝子の転写、翻訳及び／または発現を可能にするように導入遺伝子に機能可能に繋げられた必要な一般的制御エレメントも含む。本明細書中で使用する場合、「機能可能に繋げられている」配列には、関心対象遺伝子と連続している発現制御配列と、トランスで、または遠くで作用して関心対象遺伝子を制御する発現制御配列との両方が含まれる。
【０１２０】
調節制御エレメントは典型的には、例えば選択された５’ＩＴＲ配列とコード配列との間に位置する、発現制御配列の一部としてのプロモーター配列を含有する。恒常的プロモーター、調節可能なプロモーター［例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８及びＷＯ２０１３／０４９４３を参照のこと］、組織特異的プロモーター、または生理学的合図に応答するプロモーターを本明細書に記載のベクターに使用、利用してもよい。
【０１２１】
治療用産物の発現を制御するのに適する恒常的プロモーターの例としては、限定されないが、ニワトリβ−アクチン（ＣＢ）プロモーター、ＣＢ７プロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ユビキチンＣプロモーター（ＵｂＣ）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）の早期及び後期プロモーター、Ｕ６プロモーター、メタロチオネインプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、ユビキチンプロモーター、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）プロモーター（Ｓｃｈａｒｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４６２６−４６３０（１９９１）、アデノシンデアミナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ピルビン酸キナーゼプロモーター  ホスホグリセロールムターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１０００６−１００１０（１９８９））、モロニー白血病ウイルス及びその他のレトロウイルスの長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、ならびに当業者に知られている他の恒常的プロモーターが挙げられる。本発明における使用に適する組織または細胞特異的プロモーターの例としては、限定されないが、内皮細胞に特有のエンドセリン−Ｉ（ＥＴ−Ｉ）及びＦｌｔ−Ｉ、（線毛細胞を指向する）ＦｏｘＪ１が挙げられる。
【０１２２】
治療用産物の発現を制御するのに適する誘導性プロモーターには、外来薬剤（例えば薬物）または生理学的合図に応答するプロモーターが含まれる。これらの応答エレメントとしては、限定されないが、ＨＩＦ−Ｉα及びβに結合する低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）、金属イオン応答エレメント、例えば、Ｍａｙｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２，Ｃｅｌｌ
２９：９９−１０８）、Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）及びＳｅａｒｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１４８０−１４８９）によって教示されているもの、または熱ショック応答エレメント、例えばＮｏｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．によって（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，ｅｄ．Ｎｏｕｅｒ，Ｌ．，ＣＲＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，ｐｐＩ６７−２２０，１９９１の中で）教示されているものが挙げられる。
【０１２３】
一実施形態では、中和抗体構築物の発現は、中和抗体構築物、例えば薬物をコードする遺伝子の転写に対する、または薬物もしくは代替実施形態では生理学的合図によって活性化される転写因子に対する厳密な制御を提供する調節性プロモーターによって制御される。漏れがなく厳密に制御され得るプロモーターシステムが好ましい。
【０１２４】
本発明において使用され得るリガンド依存性転写因子複合体である調節性プロモーターの例としては、限定されないが、各々のリガンド（例えば、グルココルチコイド、エストロゲン、プロゲスチン、レチノイド、エクジソンならびにそれらの類縁体及び模倣体）によって活性化される核受容体スーパーファミリーのメンバー、及びテトラサイクリンによって活性化されるｒＴＴＡが挙げられる。本発明の一態様では、遺伝子スイッチはＥｃＲ系遺伝子スイッチである。そのようなシステムの例としては、限定されないが、米国特許第６，２５８，６０３号、第７，０４５，３１５号、米国公開特許出願第２００６／００１４７１１号、第２００７／０１６１０８６号、及び国際公開第ＷＯ０１／７０８１６号に記載されているシステムが挙げられる。キメラエクジソン受容体システムの例が米国特許第７，０９１，０３８号、米国公開特許出願第２００２／０１１０８６１号、第２００４／００３３６００号、第２００４／００９６９４２号、第２００５／０２６６４５７号及び第２００６／０１００４１６号、ならびに国際公開第ＷＯ０１／７０８１６号、第ＷＯ０２／０６６６１２号、第ＷＯ０２／０６６６１３号、第ＷＯ０２／０６６６１４号、第ＷＯ０２／０６６６１５号、第ＷＯ０２／２９０７５号及び第ＷＯ２００５／１０８６１７号に記載されており、参照によりこれらの各々の全体を援用する。非ステロイドエクジソン作動薬によって調節されるシステムの一例は、ＲｈｅｏＳｗｉｔｃｈ（登録商標）Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎシステム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）である。
【０１２５】
さらに他のプロモーターシステムとしては、限定されないが、テトラサイクリン（ｔｅｔ）応答エレメント（例えば、Ｇｏｓｓｅｎ  ＆Ｂｕｊａｒｄ（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５５４７−５５１）によって教示されるもの）を含む応答エレメント；またはホルモン応答エレメント、例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ
．（１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９４：２２８−２３２）、Ｈｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：２０３８−２０４２）、Ｋｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７，Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：７３４−７３６）、及びＩｓｒａｅｌ  ＆Ｋａｕｆｍａｎ（１９８９，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：２５８９−２６０４）によって教示されるもの、ならびに当技術分野で知られている他の誘導性プロモーターが挙げられ得る。そのようなプロモーターを使用して、例えばＴｅｔ−ｏｎ／ｏｆｆシステム（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６８：１７６６−９、Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８９（１２）：５５４７−５１）、ＴｅｔＲ−ＫＲＡＢシステム（Ｕｒｒｕｔｉａ  Ｒ．，２００３，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，４（１０）：２３１、Ｄｅｕｓｃｈｌｅ  Ｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（４）：１９０７−１４）、ｍｉｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ（ＲＵ４８６）調節性システム（Ｇｅｎｅｓｗｉｔｃｈ；Ｗａｎｇ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１（１７）：８１８０−４、Ｓｃｈｉｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１０２（３９）：１３７８９−９４）、及びヒト化タモキシフェン−ｄｅｐ調節性システム（Ｒｏｓｃｉｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．６（５）：６５３−６３）によって、中和抗体構築物の発現を制御することができる。
【０１２６】
本発明の別の態様では、遺伝子スイッチは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）とＦＫＢＰラパマイシン関連タンパク質（ＦＲＡＰ）との異種二量体化に基づくものであり、ラパマイシンまたはその非免疫抑制性類縁体によって調節される。そのようなシステムの例としては、限定されないが、ＡＲＧＥＮＴ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＡＲＩＡＤ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）、ならびに米国特許第６，０１５，７０９号、第６，１１７，６８０号、第６，４７９，６５３号、第６，１８７，７５７号及び第６，６４９，５９５号、米国公開第２００２／０１７３４７４号、米国公開第２００９１０１００５３５号、米国特許第５，８３４，２６６号、米国特許第７，１０９，３１７号、米国特許第７，４８５，４４１号、米国特許第５，８３０，４６２号、米国特許第５，８６９，３３７号、米国特許第５，８７１，７５３号、米国特許第６，０１１，０１８号、米国特許第６，０４３，０８２号、米国特許第６，０４６，０４７号、米国特許第６，０６３，６２５号、米国特許第６，１４０，１２０号、米国特許第６，１６５，７８７号、米国特許第６，９７２，１９３号、米国特許第６，３２６，１６６号、米国特許第７，００８，７８０号、米国特許第６，１３３，４５６号、米国特許第６，１５０，５２７号、米国特許第６，５０６，３７９号、米国特許第６，２５８，８２３号、米国特許第６，６９３，１８９号、米国特許第６，１２７，５２１号、米国特許第６，１５０，１３７号、米国特許第６，４６４，９７４号、米国特許第６，５０９，１５２号、米国特許第６，０１５，７０９号、米国特許第６，１１７，６８０号、米国特許第６，４７９，６５３号、米国特許第６，１８７，７５７号、米国特許第６，６４９，５９５号、米国特許第６，９８４，６３５号、米国特許第７，０６７，５２６号、米国特許第７，１９６，１９２号、米国特許第６，４７６，２００号、米国特許第６，４９２，１０６号、ＷＯ９４／１８３４７、ＷＯ９６／２０９５１、ＷＯ９６／０６０９７、ＷＯ９７／３１８９８、ＷＯ９６／４１８６５、ＷＯ９８／０２４４１、ＷＯ９５／３３０５２、ＷＯ９９１１０５０８、ＷＯ９９１１０５１０、ＷＯ９９／３６５５３、ＷＯ９９／４１２５８、ＷＯ０１１１４３８７に記載されているシステム、ＡＲＧＥＮＴ（商標）Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓキット、バージョン２．０（９１０９１０２）、及びＡＲＧＥＮＴ（商標）Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｐｌａｓｍｉｄキット、バージョン２．０（９１０９／０２）が挙げられ、参照によりこれらの各々の全体を本明細書に援用する。Ａｒｉａｄシステムは、ラパマイシン及び「ラパログ」と呼ばれるその類縁体によって誘導されるように設計されている。好適なラパマイシンの例は、ＡＲＧＥＮ
Ｔ（商標）システムの説明に関連して上に列挙した文献の中に示されている。一実施形態では、分子はラパマイシン［例えば、ＰｆｉｚｅｒによってＲａｐａｍｕｎｅ（商標）として販売されているもの］である。別の実施形態では、ＡＰ２１９６７［ＡＲＩＡＤ］として知られるラパログを使用する。本発明において使用することができるこれらの二量体化剤分子の例としては、限定されないが、ラパマイシン、ＦＫ５０６、ＦＫ１０１２（ＦＫ５０６の同種二量体）、内因性ＦＫＢＰ及び／またはＦＲＡＰへの親和性を低減または消去する「こぶ」を付け加える化学修飾を天然産物に対して行うことによって容易に調製されるラパマイシン類縁体（「ラパログ」）が挙げられる。ラパログの例としては、限定されないが、例えば、内因性ＦＫＢＰとの相互作用を最小限に抑える意図された「こぶ」を有する、ＡＰ２６１１３（Ａｒｉａｄ）、ＡＰ１５１０（Ａｍａｒａ，Ｊ．Ｆ．，ｅｔ
ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４（２０）：１０６１８−２３）  ＡＰ２２６６０、ＡＰ２２５９４、ＡＰ２１３７０、ＡＰ２２５９４、ＡＰ２３０５４、ＡＰ１８５５、ＡＰ１８５６、ＡＰ１７０１、ＡＰ１８６１、ＡＰ１６９２及びＡＰ１８８９が挙げられる。さらに他のラパログ、例えばＡＰ２３５７３［Ｍｅｒｃｋ］を選択してもよい。
【０１２７】
他の好適なエンハンサーには、所望の標的組織兆候に適するものが含まれる。一実施形態では、発現カセットは１つ以上の発現エンハンサーを含む。一実施形態では、発現カセットは２つ以上の発現エンハンサーを含有する。これらのエンハンサーは同じであってもよいし、または互いに異なっていてもよい。例えば、エンハンサーはＣＭＶ即時早期エンハンサーを含み得る。このエンハンサーは、互いに隣接して位置する２コピーとして存在していてもよい。あるいは、エンハンサーの二重コピーは１つ以上の配列によって互いに隔てられていてもよい。さらに別の実施形態では、発現カセットはさらにイントロン、例えばニワトリベータアクチンイントロンを含有する。他の好適なイントロンとしては、当技術分野で知られているもの、例えば、ＷＯ２０１１／１２６８０８に記載されているものなどが挙げられる。好適なポリＡ配列の例としては、例えば、ウサギ結合グロブリン（ｒＢＧ）、ＳＶ４０、ＳＶ５０、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）、ヒト成長ホルモン、及び合成ポリＡが挙げられる。場合によって、ｍＲＮＡを安定化させるために１つ以上の配列を選択してもよい。そのような配列の一例は改変型ＷＰＲＥ配列であるが、これは、ポリＡ配列の上流及びコード配列の下流において操作されたものであり得る（例えば、ＭＡ  Ｚａｎｔａ−Ｂｏｕｓｓｉｆ，ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）１６：６０５−６１９を参照のこと）。
【０１２８】
ＡＡＶウイルスベクターは複数の導入遺伝子を含んでいてもよい。特定の状況では、異なる導入遺伝子を使用してタンパク質の各サブユニット（例えば、免疫グロブリンドメイン、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン軽鎖）をコードしてもよい。一実施形態では、細胞は、異なるサブユニットの各々を含有するウイルスによる感染／トランスフェクションの後に複数のサブユニットタンパク質を産生する。別の実施形態では、タンパク質の異なるサブユニットは同じ導入遺伝子によってコードされ得る。この場合、単一の導入遺伝子は、各サブユニットのためのＤＮＡが配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または自己切断型ペプチド（例えば２Ａ）によって離隔された状態で、サブユニットの各々をコードするＤＮＡを含む。ＩＲＥＳは、サブユニットの各々をコードするＤＮＡの大きさが小さい、例えば、サブユニット及びＩＲＥＳをコードするＤＮＡの全体の大きさが５キロ塩基未満である場合に、望ましい。ＩＲＥＳの代わりに、翻訳後事象において自己切断されるものである２Ａペプチドをコードする配列でＤＮＡを離隔してもよい。例えば、ＭＬ  Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ，（Ｊａｎ  １９９７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，７８（Ｐｔ  １）：１３−２１、Ｓ．Ｆｕｒｌｅｒ，Ｓ  ｅｔ  ａｌ，（Ｊｕｎｅ  ２００１）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８（１１）：８６４−８７３、Ｈ．Ｋｌｕｍｐ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｍａｙ  ２００１）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，８（１０）：８１１−８１７を参照されたい。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳよりも著しく小さく、そのことによって、空間が制
限因子である場合の使用によく適する。より頻繁にあるのは、導入遺伝子が大きいか、複数のサブユニットからなるか、または２つの導入遺伝子が共送達される場合に、所望の導入遺伝子（複数可）またはサブユニットを保有するｒＡＡＶを共投与して、それらを生体内で鎖状体化させ、単一のベクターゲノムを形成させることである。そのような実施形態では、第１ＡＡＶは、単一の導入遺伝子を発現する発現カセットを保有し得、第２ＡＡＶは、宿主細胞における共発現のための異なる導入遺伝子を発現する発現カセットを保有し得る。しかしながら、選択される導入遺伝子は任意の生物学的活性産物または他の産物、例えば試験のために望ましい産物をコードしてよい。
【０１２９】
発現カセットに関して上に特定したエレメントに加えて、ベクターはさらに、プラスミドベクターをトランスフェクトされたかまたは本発明によって生産されたウイルスに感染した細胞においてコードされる産物（例えば中和抗体またはその一部）の転写、翻訳及び／または発現を可能にするようにコード配列に機能可能に繋げられた従来の制御エレメントも含む。本明細書中で使用する場合、「機能可能に繋げられている」配列には、関心対象遺伝子と連続している発現制御配列と、トランスで、または遠くで作用して関心対象遺伝子を制御する発現制御配列との両方が含まれる。
【０１３０】
発現制御配列は、適切なエンハンサー；転写因子；転写終結因子；プロモーター；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えばスプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列、例えばウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、コザック共通配列）；タンパク質安定性を向上させる配列；及び、望まれる場合には、コードされる産物の分泌を増進する配列を含む。
【０１３１】
一実施形態では、調節配列は、全体のｒＡＡＶベクターゲノムの大きさが約２．０〜約５．５キロ塩基となるように選択される。一実施形態では、ｒＡＡＶベクターゲノムは大きさが天然ＡＡＶゲノムに近いことが望ましい。したがって、一実施形態では、調節配列は、全体のｒＡＡＶベクターゲノムの大きさが約４．７ｋｂとなるように選択される。別の実施形態では、全体のｒＡＡＶベクターゲノムの大きさは約５．２ｋｂ未満である。ベクターゲノムの大きさは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリＡなどを含めた調節配列の大きさに基づいて操作され得る。Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，Ｊａｎ  ２０１０  １８（１）：８０−６を参照されたく、参照によりこれを本明細書に援用する。
【０１３２】
かくして、一実施形態ではイントロンがベクター中に含められる。好適なイントロンとしては、ニワトリベータアクチンイントロン、ヒトベータグロブリンＩＶＳ２（Ｋｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４３（９）：４７２１−３２（２０１５））、Ｐｒｏｍｅｇａキメライントロン（Ａｌｍｏｎｄ，Ｂ．ａｎｄ
Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ，Ｅ．Ｔ．Ａ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｐＣＩ−ｎｅｏ  Ｖｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｐｃＤＮＡ４／ＨｉｓＭａｘ  Ｖｅｃｔｏｒ）、及びｈＦＩＸイントロンが挙げられる。本明細書において適する様々なイントロンが当技術分野で知られており、これには、限定されないが、参照により本明細書に援用されるｂｐｇ．ｕｔｏｌｅｄｏ．ｅｄｕ／〜ａｆｅｄｏｒｏｖ／ｌａｂ／ｅｉｄ．ｈｔｍｌにおいて見出されるものが含まれる。Ｓｈｅｐｅｌｅｖ  Ｖ．，Ｆｅｄｏｒｏｖ  Ａ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｅｘｏｎ−Ｉｎｔｒｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ．Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２００６，７：１７８−１８５も参照されたく、参照によりこれを本明細書に援用する。
【０１３３】
本明細書に記載の試験において種々様々なウイルスゲノムが生み出された。しかしながら、当業者であれば、他の調節配列を含めて他のゲノム配置でプロモーター、エンハンサ
ーを置き換えてもよいこと、及び他のコード配列を選択してもよいことを理解するであろう。本明細書に記載の免疫グロブリンドメイン及び／または融合タンパク質をコードするベクターゲノム及び発現カセットの例は、例えば、配列番号５、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１及び配列番号３１で示される。これらの例示的ベクターゲノムは、プロモーター（例えば、ニワトリベータアクチン、ＵＢＣまたはＴＢＧ）、イントロン（例えばＳＶ４０イントロンまたはキメライントロン）、５’ＵＴＲ配列（例えば、ｃ−ｍｙｃ）、コザック配列、ポリＡ（例えば、ＳＶ４０、ウシ成長ホルモンまたはウサギグロビン）を含めたベクターエレメントを含むことが好適である。特定の実施形態では、ＩＲＥＳまたはフューリン、フューリン／Ｆ２Ａ、または両方ともが発現カセットに含められる。他のベクターエレメントを選択してもよいことは理解されよう。
【０１３４】
ＩＶ．ｒＡＡＶベクター生産
ＡＡＶウイルスベクター（例えば組換え（ｒ）ＡＡＶ）の生産に使用するためには、発現カセットは、パッケージング宿主細胞へ送達される任意の好適なベクター、例えばプラスミドに保有され得る。本発明に有用なプラスミドは、数ある中でも原核細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞における試験管内での複製及びパッケージングに適するように操作され得る。好適なトランスフェクション技術及びパッケージング宿主細胞は知られている、及び／または当業者によって容易に設計され得る。
【０１３５】
ＡＡＶに基づく（例えば、ＡＡＶ９または別のＡＡＶカプシドを有する）ベクターを作製する方法は既知である。例えば、米国公開特許第２００７／００３６７６０号（２００７年２月１５日）を参照されたく、参照によりこれを本明細書に援用する。本発明は、ＡＡＶ９またはその他のクレードＦのＡＡＶアミノ酸配列の使用に限定されず、例えば化学合成、他の合成技術または他の方法によるものを含めて当技術分野で知られている他の方法によって生み出された末端β−ガラクトース結合性を含有するペプチド及び／またはタンパク質を包含する。本明細書において提供されるＡＡＶカプシドのいずれかの配列は、様々な技術を用いて容易に生成され得る。好適な生産技術は当業者によく知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）を参照されたい。あるいは、既知の固相ペプチド合成法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，（１９６２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９、Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９６９）ｐｐ．２７−６２）を用いてペプチドを合成することもできる。これらの方法は、例えば、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列；機能性ｒｅｐ遺伝子；最低でもＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）及び導入遺伝子からなるミニ遺伝子；ならびにＡＡＶカプシドタンパク質内へのミニ遺伝子のパッケージングを可能にするに足るヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含み得る。これら及びその他の好適な生産方法は当業者の知識の範囲内であり、本発明に対する限定ではないない。
【０１３６】
ＡＡＶカプシド内にＡＡＶミニ遺伝子をパッケージングするために宿主細胞内で培養することを必要とする構成要素は、宿主細胞に対してトランスで提供され得る。あるいは、当業者に知られている方法を用いて必要な構成要素の１つ以上を含有するように操作された安定な宿主細胞によって、必要な構成要素（例えば、ミニ遺伝子、ｒｅｐ配列、ｃａｐ配列及び／またはヘルパー機能）のいずれか１つ以上を提供してもよい。最も好適なのは、そのような安定な宿主細胞が、必要な構成要素（複数可）を誘導性プロモーターの制御下で含有することであろう。しかしながら、必要な構成要素（複数可）は恒常的プロモーターの制御下にあってもよい。好適な誘導性及び恒常的プロモーターの例は、本明細書中で、導入遺伝子と共に使用するのに適する調節エレメントについての記述において提供さ
れている。さらに別の代替として、選択される安定な宿主細胞は、恒常的プロモーターの制御下にある選択された構成要素（複数可）と、１つ以上の誘導性プロモーターの制御下にある他の選択された構成要素（複数可）とを含有してもよい。例えば、（恒常的プロモーター制御下のＥ１ヘルパー機能を含有する）２９３細胞に由来しながらも誘導性プロモーター制御下のｒｅｐ及び／またはｃａｐタンパク質を含有する安定な宿主細胞を生成してもよい。さらに他の安定な宿主細胞は当業者によって生み出され得る。
【０１３７】
これらのｒＡＡＶは、治療目的のための、及び防御免疫性を含めた免疫化のための遺伝子送達に特によく適している。さらに、本発明の組成物を、試験管内での所望の遺伝子産物の生産のために使用してもよい。試験管内生産の場合、所望の産物（例えばタンパク質）は、所望の産物をコードする分子を含有するｒＡＡＶを宿主細胞にトランスフェクトし、発現を可能にする条件の下で細胞培養物を培養した後に、所望の培養物から得られ得る。発現した産物はその後、所望により精製及び単離され得る。トランスフェクション、細胞培養、精製及び単離のための好適な技術は当業者に知られている。ベクターとしての用途に適するＡＡＶを生成及び単離する方法は当技術分野で知られている。例えば、Ｇｒｉｅｇｅｒ  ＆Ｓａｍｕｌｓｋｉ，２００５，“Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ａｓ  ａ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｖｅｃｔｏｒ：Ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，”Ａｄｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｎｇｉｎ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９９：１１９−１４５、Ｂｕｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，“Ｒｅｃｅｎｔ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，”Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．１０：７１７−７３３、及び以下に引用する参考文献を全体的に参照されたく、参照によりこれらの各々の全体を本明細書に援用する。導入遺伝子をビリオン内にパッケージングするためには、ＩＴＲは、発現カセットを含有する核酸分子と同じ構築物においてシスで必要とされる唯一のＡＡＶ成分である。ｃａｐ及びｒｅｐ遺伝子はトランスで供給され得る。
【０１３８】
一実施形態では、本明細書に記載の発現カセットは、それが保有している免疫グロブリン構築物配列をウイルスベクター産生のためのパッケージング宿主細胞の中に移入させる遺伝要素（例えばシャトルプラスミド）となるように操作される。一実施形態では、選択された遺伝要素は、トランスフェクション、電気穿孔、リポソーム送達、膜融合技術、高速ＤＮＡ被覆ペレット、ウイルス感染及びプロトプラスト融合を含めた任意の好適な方法によってＡＡＶパッケージング細胞へ送達され得る。安定なＡＡＶパッケージング細胞を作ることもできる。あるいは、ＡＡＶ以外のウイルスベクターを生み出すために、または試験管内で抗体の混合物を産生させるために、発現カセットを使用してもよい。そのような構築物を作るために用いる方法は、核酸操作の技量を有する者に知られており、これには遺伝子操作、組換え操作及び合成技術が含まれる。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄ．Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（２０１２）を参照されたい。
【０１３９】
「ＡＡＶ中間体」または「ＡＡＶベクター中間体」という用語は、中にパッケージングされる所望のゲノム配列を欠いている組織化ｒＡＡＶカプシドを指す。これらは、「空」カプシドとも呼称され得る。そのようなカプシドは、検出可能な発現カセットのゲノム配列を含有し得ないかまたは、遺伝子産物の発現を達成するには不十分な部分的にのみパッケージングされたゲノム配列を含有し得る。これらの空カプシドは、関心対象の遺伝子を宿主細胞に移入させるには非機能的である。
【０１４０】
本明細書に記載の組換えＡＡＶは、既知の技術を用いて生成され得る。例えば、ＷＯ２００３／０４２３９７、ＷＯ２００５／０３３３２１、ＷＯ２００６／１１０６８９、Ｕ
Ｓ７５８８７７２Ｂ２を参照されたい。そのような方法は、ＡＡＶカプシドをコードする核酸配列；機能性ｒｅｐ遺伝子；最低でもＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）と導入遺伝子とからなる発現カセット；及びＡＡＶカプシドタンパク質内への発現カセットのパッケージングを可能にするに足るヘルパー機能を含有する宿主細胞を培養することを含む。カプシドを生成する方法、そのためのコード配列、及びｒＡＡＶウイルスベクターを生産するための方法については教示がなされている。例えば、Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１００（１０），６０８１−６０８６（２００３）及びＵＳ２０１３／００４５１８６Ａ１を参照されたい。
【０１４１】
一実施形態では、組換えＡＡＶｈｕ６８を生産するために有用となる生産細胞培養物が提供される。そのような細胞培養物は、宿主細胞においてＡＡＶｈｕ６８カプシドを発現する核酸；ＡＡＶｈｕ６８カプシド内へのパッケージングに適した核酸分子、例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲと、遺伝子産物をコードしており宿主細胞における当該産物の発現を促す配列に機能可能に繋げられている非ＡＡＶ核酸配列とを含有するベクターゲノム；ならびに組換えＡＡＶｈｕ６８カプシド内への核酸分子のパッケージングを可能にするに足るＡＡＶ  ｒｅｐ機能及びアデノウイルスヘルパー機能を含有する。一実施形態では、細胞培養物は、哺乳動物細胞（例えば、数ある中でもヒト胚性腎臓２９３細胞）または昆虫細胞（例えばバキュロウイルス）からなる。場合によって、ｒｅｐ機能はｈｕ６８以外のＡＡＶによって提供される。特定の実施形態では、ｒｅｐ機能の少なくとも一部はＡＡＶｈｕ６８からのものである。場合によって、ｒｅｐ及びｃａｐ配列は細胞培養物中で同じ遺伝要素上にある。ｒｅｐ配列とｃａｐ遺伝子との間にスペーサーがあってもよい。場合によって、スペーサーは、ａｔｇａｃｔｔａａａｃｃａｇｇｔ（配列番号３３）である。これらのＡＡＶｈｕ６８または突然変異ＡＡＶカプシド配列のいずれかが、宿主細胞におけるその発現を促す外来調節制御配列の制御下にあり得る。
【０１４２】
一実施形態では、細胞は、好適な細胞培養物（例えばＨＥＫ２９３細胞）で製造される。本明細書に記載の遺伝子療法ベクターを製造する方法には、当技術分野でよく知られている方法、例えば、遺伝子療法ベクターの生産のために使用するプラスミドＤＮＡの生成、ベクターの生成、及びベクターの精製が含まれる。いくつかの実施形態では、遺伝子療法ベクターはＡＡＶベクターであり、生成されるプラスミドは、ＡＡＶゲノム及び関心対象の遺伝子をコードするＡＡＶシスプラスミド、ＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有するＡＡＶトランスプラスミド、ならびにアデノウイルスヘルパープラスミドである。ベクター生成プロセスは、細胞培養の開始、細胞の継代、細胞の播種、プラスミドＤＮＡによる細胞のトランスフェクション、トランスフェクション後の無血清培地との培地交換、ならびにベクター含有細胞及び培養培地の採集などの方法ステップを含み得る。採集されたベクター含有細胞及び培養培地のことを本明細書では粗細胞採集物と呼ぶ。さらに別のシステムでは、バキュロウイルス系ベクターによる感染によって昆虫細胞内に遺伝子療法ベクターを導入する。これらの産生システムに関する総説については例えばＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｖｉｒｕｓ  ｈｙｂｒｉｄ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，”Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２０：９２２−９２９を全体的に参照されたく、参照によりこの全体を本明細書に援用する。これら及びその他のＡＡＶ産生システムを作り使用する方法は以下の米国特許に記載されており、参照によりこれらの各々の内容全体を本明細書に援用する：第５，１３９，９４１号、第５，７４１，６８３号、第６，０５７，１５２号、第６，２０４，０５９号、第６，２６８，２１３号、第６，４９１，９０７号、第６，６６０，５１４号、第６，９５１，７５３号、第７，０９４，６０４号、第７，１７２，８９３号、第７，２０１，８９８号、第７，２２９，８２３号及び第７，４３９，０６５号。
【０１４３】
その後、粗細胞採集物は、ベクター採集物の濃縮、ベクター採集物の透析濾過、ベクター採集物の微小流動化、ベクター採集物のヌクレアーゼ消化、微小流動化中間物の濾過、クロマトグラフィーによる粗精製、超遠心分離による粗精製、タンジェンシャルフロー濾過による緩衝液交換、及び／または、一まとまりのベクターを調製するための製剤化及び濾過などの方法ステップに供され得る。
【０１４４】
高塩濃度での２ステップの親和性クロマトグラフィー精製及びそれに続くアニオン交換樹脂クロマトグラフィーを用いてベクター薬製品を精製し、空カプシドを除去する。これらの方法は、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７０号ならびにその優先権文書である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０７１号及び「Ｓｃａｌａｂｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＡＡＶ９」と題して２０１５年１２月１１日に出願された米国特許出願第６２／２２６，３５７号により詳しく記載されており、参照によりこれらの各々を本明細書に援用する。ＡＡＶ８の精製方法については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７６号ならびにその優先権文書である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０９８号及び２０１５年１２月１１日に出願された米国特許出願第６２／２６６，３４１号に記載されており、ｒｈ１０については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ１６／６６０１３号ならびにその優先権文書である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０５５号及び「Ｓｃａｌａｂｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＡＡＶｒｈ１０」と題しさらに２０１５年１２月１１日に出願された米国特許出願第６２／２６６，３４７号に記載されており、ＡＡＶ１については、２０１６年１２月９日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６５９７４号ならびにその優先権文書である２０１６年４月１３日に出願された米国特許出願第６２／３２２，０８３号及び２０１５年１２月１１日に出願された「Ｓｃａｌａｂｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ＡＡＶ１」の米国特許出願第６２／２６，３５１号に記載されており、参照により全てを本明細書に援用する。
【０１４５】
空及び充満粒子の含有量を算出するために、選択された試料（例えば、本明細書中の例ではイオジキサノール勾配精製されたＧＣ数＝粒子数の調製物）のｖｐ３バンド体積を、投入したＧＣ粒子に対してプロットする。結果として得た線形方程式（ｙ＝ｍｘ＋ｃ）を使用して試験物品ピークのバンド体積中の粒子の数を算出する。その後、投入量２０μＬあたりの粒子の数（ｐｔ）に５０を掛けて粒子（ｐｔ）／ｍＬを得る。Ｐｔ／ｍＬをＧＣ／ｍＬで割ることで、粒子対ゲノムコピー（ｐｔ／ＧＣ）の比率が得られる。Ｐｔ／ｍＬ−ＧＣ／ｍＬによって空ｐｔ／ｍＬが得られる。空ｐｔ／ｍＬをｐｔ／ｍＬで割って１００を掛けることによって空粒子の百分率が得られる。
【０１４６】
一般に、空カプシド、及びパッケージングされたゲノムを含んでいるＡＡＶベクター粒子を検査する方法は当技術分野で知られている。例えば、Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）６：１３２２−１３３０、及びＳｏｍｍｅｒ  ｅｔ
ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｔｈｅｒ．（２００３）７：１２２−１２８を参照されたい。変性カプシドを試験するために、方法は、処理したＡＡＶ材料を、３つのカプシドタンパク質を分離することができる任意のゲル、例えば緩衝液中３〜８％のトリス−酢酸を含有する勾配ゲルからなるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、その後、試料材料が分離するまでゲルを流し、ゲルをナイロン製またはニトロセルロース製、好ましくはナイロン製の膜にブロッティングすることを含む。その後、抗ＡＡＶカプシド抗体、好ましくは抗ＡＡＶカプシドモノクローナル抗体、最も好ましくはＢ１抗ＡＡＶ−２モノクローナル抗体を、変性カプシドタンパク質に結合する一次抗体として使用する（Ｗｏｂｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（２０００）７４：９２８１−９２９３）。その後、一次抗体との結合を検出するための手段を含有し一次抗体に結合する二次抗体、より好まし
くは、検出分子を含有しそれと共有結合的に結合している抗ＩｇＧ抗体、最も好ましくは西洋ワサビペルオキシダーゼに共有結合的に繋げられたヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体を使用する。結合を検出する方法を用いて半定量的に一次抗体と二次抗体との結合を決定するが、検出方法は、放射性同位体放射、電磁波または比色変化を検出できることが好ましく、最も好ましくは化学発光検出キットである。例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのために試料はカラム画分から採取され得、還元剤（例えばＤＴＴ）を含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥ装填用緩衝液中で加熱され得るが、カプシドタンパク質はプレキャスト勾配ポリアクリルアミドゲル（例えばＮｏｖｅｘ）で分離された。ＳｉｌｖｅｒＸｐｒｅｓｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＣＡ）を製造者の使用説明書に従って使用して銀染色を実施してもよいし、他の好適な染色方法、すなわちＳＹＰＲＯルビーまたはクーマシー染色剤を使用してもよい。一実施形態では、カラム画分中のＡＡＶベクターゲノム（ｖｇ）の濃度は定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ）によって測定することができる。試料を希釈し、ＤＮアーゼＩ（または別の好適なヌクレアーゼ）で消化して外来ＤＮＡを除去する。ヌクレアーゼを不活性化させた後、試料をさらに希釈し、プライマーと、プライマー間のＤＮＡ配列に特異的なＴａｑＭａｎ（商標）発蛍光プローブとを使用して増幅する。定義されたレベルの蛍光に達するのに必要とされるサイクル数（閾値サイクル、Ｃｔ）を各試料についてＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００配列検出システムで測定する。ＡＡＶベクターが含有しているのと同一である配列を含有するプラスミドＤＮＡを採用してＱ−ＰＣＲ反応の標準曲線を生成する。試料から得られたサイクル閾（Ｃｔ）値を使用して、それをプラスミド標準曲線のＣｔ値に対して正規化することによってベクターゲノム力価を決定する。デジタルＰＣＲに基づく終点分析法を用いることもできる。
【０１４７】
さらに、空対充満粒子の比率を測定する別の例も当技術分野で知られている。分析的超遠心分離機（ＡＵＣ）で測定される沈降速度は、凝集物、その他の少量成分を検出することができるだけでなく、異なる粒子種の相対量の良好な定量をそれらの異なる沈降係数に基づいて提供することもできる。これは、長さ及び時間の基本的単位に基づく絶対的方法であり、基準としての標準分子を必要としない。１２ｍｍの光路長を有する２流路型ｃｈａｒｃｏａｌ−ｅｐｏｎ  ｃｅｎｔｅｒｐｉｅｃｅを備えたセルの中にベクター試料を装填する。供給される希釈用緩衝液を各セルの基準流路内に装填する。その後、装填されたセルをＡＮ−６０Ｔｉ分析ローター内に配置し、吸光度及びＲＩの両方の検出器を備えたＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＰｒｏｔｅｏｍｅＬａｂ  ＸＬ−Ｉ分析的超遠心分離機内に入れる。温度が完全に２０℃の平衡に達した後、ローターを１２，０００ｒｐｍの最終回転速度にする。Ａ２８０スキャンをおよそ５．５時間にわたっておよそ３分ごとに記録する（試料１つにつき合計１１０回のスキャン）。ｃ（ｓ）法を使用して生データを解析し、解析プログラムＳＥＤＦＩＴ内に実装する。結果として得られる粒径分布をグラフ化し、ピークを積分する。各ピークに関連する百分率値は全ピーク下の総面積に占めるピーク面積の分率を表し、２８０ｎｍで生成された生データに基づく。多くの実験室はこれらの値を使用して空粒子：充満粒子の比を算出する。しかしながら、空粒子及び充満粒子はこの波長において異なる消光係数を有するため、生データは適宜調節され得る。消光係数調節の前と後との両方における空粒子と充満単量体とのピーク値の比を使用して空−充満粒子比率を決定する。
【０１４８】
一態様では、広範なセリンプロテアーゼ、例えばプロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎから市販されているものなど）を利用する最適化ｑ−ＰＣＲ法を用いる。より詳しくは、最適化ｑＰＣＲゲノム力価アッセイは、ＤＮアーゼＩ消化後に試料をプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈し、プロテイナーゼＫで処理し、その後に熱不活性化させることを別とすれば、標準的アッセイに類似している。試料は試料サイズに等しい量のプロテイナーゼＫ緩衝液で希釈することが好適である。プロテイナーゼＫ緩衝液は２倍以上に濃縮され得る。典型的には、プロテイナーゼＫ処理は約０．２ｍｇ／ｍＬであるが、０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬに変更してもよい。処理ステップは大抵約５５℃で約１５分間行われるが、より
低い温度（例えば約３７℃〜約５０℃）でより長い期間（例えば約２０分〜約３０分）にわたって、またはより高い温度（例えば約６０℃以下）でより短い期間（例えば約５〜１０分）にわたって実施してもよい。同様に、熱不活性化は大抵約９５℃で約１５分間であるが、温度を下げ（例えば約７０〜約９０℃）、時間を延長してもよい（例えば約２０分〜約３０分）。その後、試料を（例えば１０００倍）希釈し、標準的アッセイにおいて記載したようなＴａｑＭａｎ分析に供する。定量はＶｉｒｏＣｙｔまたはフローサイトメトリーを用いて行うこともできる。
【０１４９】
さらに、またはあるいは、液滴デジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）を用いてもよい。例えば、一本鎖及び自己相補性ＡＡＶベクターゲノム力価をｄｄＰＣＲによって決定する方法は教示がなされている。例えば、Ｍ．Ｌｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｕ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１４  Ａｐｒ；２５（２）：１１５−２５．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｇｔｂ．２０１３．１３１．Ｅｐｕｂ  ２０１４  Ｆｅｂ  １４を参照されたい。
【０１５０】
手短に述べると、パッケージングされたゲノム配列を有するｒＡＡＶｈｕ６８粒子をゲノム欠如ＡＡＶｈｕ６８中間体から分離する方法は、組換えＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子とＡＡＶｈｕ６８９カプシド中間体とを含む懸濁液を高速液体クロマトグラフィーに供することを含み、ここで、ＡＡＶｈｕ６８ウイルス粒子及びＡＡＶｈｕ６８中間体は、１０．２のｐＨに平衡させた強力なアニオン交換樹脂に結合するものであり、溶出液に約２６０及び約２８０における紫外線吸収があるかどうかを監視しつつ、塩勾配に供される。ｒＡＡＶ９ｈｕ６８には最適未満であるものの、ｐＨは約１０．０〜１０．４の範囲であり得る。この方法では、ＡＡＶｈｕ６８充満カプシドは、Ａ２６０／Ａ２８０の比率が変曲点に到達する時に溶出する画分から回収される。一例において、透析濾過された生成物は、親和性クロマトグラフィーステップのために、ＡＡＶ２／ｈｕ６８血清型を効率的に捕捉するＣａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ（商標）Ｐｏｒｏｓ−ＡＡＶ２／９親和性樹脂（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に塗布され得る。これらのイオン性条件下では、残存する細胞ＤＮＡ及びタンパク質はかなりの割合でカラムを通り抜けて流れる一方、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉される。
【０１５１】
Ｖ．組成物及び用途
本明細書において提供するのは、少なくとも１つのｒＡＡＶ材料（例えば、ｒＡＡＶｈｕ６８材料）ならびに任意選択の担体、賦形剤及び／または保存剤を含有する組成物である。ｒＡＡＶ材料とは、例えば濃度及び投薬量単位についての記述において以下に記載する量などが同じである、複数のｒＡＡＶベクターを指す。
【０１５２】
本明細書中で使用する場合、「ＡＡＶｈｕ６８．ＪＡｂ」という用語は、抗インフルエンザ抗体（Ａｂ）ドメインをコードするベクターゲノムを中にパッケージングして有している本明細書中で定義されるＡＡＶｈｕ６８カプシドを有するｒＡＡＶを指す。本明細書中で使用する場合、「ＡＡＶ９．ＪＡｂ」という用語は、抗インフルエンザ抗体（Ａｂ）ドメインをコードするベクターゲノムを中にパッケージングして有している本明細書中で定義されるＡＡＶ９カプシドを有するｒＡＡＶを指す。特定の実施形態では、単一のｒＡＡＶ材料は、場合によって１つ以上の融合タンパク質（複数可）として、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４の４つ全ての免疫グロブリン領域をコードする。ベクターゲノムは、本明細書、例えば、配列番号１９、配列番号１５、配列番号１４、配列番号５及び配列番号３１において例示されるもののいずれか、または本明細書に記載のとおりに操作された別のベクターゲノムを含み得る。
【０１５３】
特定の実施形態では、組成物は、少なくとも第２の異なるｒＡＡＶ材料を含有し得る。この第２のベクター材料は、異なるＡＡＶカプシド及び／または異なるベクターゲノムを
有することによって第１のベクター材料とは異なり得る。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載の発現カセット、または別の抗インフルエンザ成分（例えば、抗体構築物、別の生物製剤、及び／または低分子薬）を発現する異なるベクターを含有し得る。
【０１５４】
本明細書中で使用する場合、「担体」には、ありとあらゆる溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーティング剤、希釈剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが含まれる。医薬活性物質のためのそのような媒体及び薬剤の用途は当技術分野でよく知られている。補助的活性原料を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容できる」という語句は、宿主に投与されたときにアレルギー性または類似する望ましくない反応を生まない分子実体及び組成物を指す。送達ビヒクル、例えば、リポソーム、ナノカプセル、微粒子、マイクロスフェア、脂質粒子、小胞などは、本発明の組成物を好適な宿主細胞の中に導入するために使用され得る。詳しくは、ｒＡＡＶベクターで送達する導入遺伝子は、脂質粒子、リポソーム、小胞、ナノスフェアまたはナノ粒子などのいずれかの中に封入された状態での送達のために製剤化され得る。
【０１５５】
一実施形態では、組成物は、対象への送達に適した最終製剤であり、例えば、生理学的に適合するｐＨ及び塩濃度に緩衝された水性液体懸濁液である。場合によって、１つ以上の界面活性剤が製剤中に存在する。別の実施形態では、組成物は、対象への投与のために希釈される濃縮物として輸送され得る。他の実施形態では、組成物は、凍結乾燥され得、投与時に再構成され得る。
【０１５６】
好適な界面活性剤または界面活性剤の組み合わせは非毒性の非イオン性界面活性剤の中から選択され得る。一実施形態では、第一級ヒドロキシル基で終結している二官能性ブロックコポリマー界面活性剤、例えば、中性ｐＨを有しており平均分子量が８４００であるポロキサマー１８８としても知られるプルロニック（登録商標）Ｆ６８［ＢＡＳＦ］などが選択される。他の界面活性剤及び他のポロキサマー、すなわち、２つのポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の親水性鎖に挟まれた中央のポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の疎水性鎖からなる非イオン性トリブロックコポリマー、ＳＯＬＵＴＯＬ  ＨＳ  １５（Ｍａｃｒｏｇｏｌ−１５ヒドロキシステアレート）、ＬＡＢＲＡＳＯＬ（ポリオキシカプリル酸グリセリド）、ポリオキシ１０オレイルエーテル、ＴＷＥＥＮ（ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル）、エタノール及びポリエチレングリコールを選択してもよい。一実施形態では、製剤はポロキサマーを含有する。これらのコポリマーには共通して（ポロキサマーの）「Ｐ」の文字とそれに続く３つの数字で名前が付けられ、最初の２つの数字に１００を掛けるとポリオキシプロピレンコアのおおよその分子量が得られ、最後の数字に１０を掛けると百分率で表したポリオキシエチレン含有量が得られる。一実施形態ではポロキサマー１８８が選択される。界面活性剤は最大で懸濁液の約０．０００５％〜約０．００１％の量で存在し得る。
【０１５７】
ベクターは、過度の有害作用を伴わないかまたは医学的に許容できる生理学的効果を伴って治療的利益をもたらすべく細胞にトランスフェクトしかつ十分なレベルの遺伝子移入及び発現をもたらすのに十分な量で投与されるが、この量は医学分野において技量を有する者であれば決定することができる。一般的な、及び薬学的に許容できる投与経路としては、限定されないが、所望の臓器（例えば、（場合によって肝動脈を介して）肝臓、肺、心臓、眼、腎臓）への直接送達、経口、吸入、鼻腔内、クモ膜下腔内、気管内、動脈内、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内及びその他の非経口的投与経路が挙げられる。投与経路は所望により組み合わせてもよい。
【０１５８】
ウイルスベクターの投薬量は、主として患者の治療症状、年齢、体重及び健康状態などの因子に依存するであろうし、それゆえに患者間で異なり得る。例えば、ウイルスベクタ
ーの治療的に有効なヒト投薬量は大抵、約１０９〜４×１０１４ＧＣのＡＡＶベクターの用量を含有する約２５〜約１０００マイクロリットル〜約５ｍＬの範囲の水性懸濁液である。投薬量は、治療的利益と任意の副作用との釣り合いをとるように調節されることになり、そのような投薬量は、組換えベクターを採用する治療的用途に応じて様々であり得る。導入遺伝子の発現レベルは、ミニ遺伝子を含有するウイルスベクター、好ましくはＡＡＶベクターをもたらす投薬頻度を決定すべく追跡され得る。場合によっては、治療目的のために記載されているものに類似する投薬計画を、本発明の組成物を使用する免疫化のために利用してもよい。
【０１５９】
増殖能欠損型ウイルス組成物は、（７０ｋｇの体重の平均的対象を処置するために）約１０９ＧＣ〜約１０１６ＧＣの範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて当該範囲内に入る量、好ましくは１０１２〜１０１４ＧＣの範囲内に入る量の増殖能欠損型ウイルスを含有する投薬量単位でヒト患者のために製剤化され得る。一実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９または９×１０９ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０または９×１０１０ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１または９×１０１１ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２または９×１０１２ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３または９×１０１３ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１０１４、２×１０１４、３×１０１４、４×１０１４、５×１０１４、６×１０１４、７×１０１４、８×１０１４または９×１０１４ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。別の実施形態では、組成物は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて少なくとも１０１５、２×１０１５、３×１０１５、４×１０１５、５×１０１５、６×１０１５、７×１０１５、８×１０１５または９×１０１５ＧＣを１用量あたりに含有するように製剤化される。一実施形態において、ヒトに適用する場合、用量の範囲は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて１用量あたり１０１０〜約１０１２ＧＣであり得る。一実施形態において、ヒトに適用する場合、用量の範囲は、範囲内のあらゆる整数または分数量を含めて１用量あたり１０９〜約７×１０１３ＧＣであり得る。一実施形態において、ヒトに適用する場合、用量の範囲は、６．２５×１０１２〜５．００×１０１３ＧＣである。さらなる実施形態では、用量は約６．２５×１０１２ＧＣ、約１．２５×１０１３ＧＣ、約２．５０×１０１３ＧＣ、または約５．００×１０１３ＧＣである。特定の実施形態では、用量をその２分の１に等しく分割して各鼻孔に投与する。特定の実施形態では、ヒトに適用する場合、用量は、０．８ｍｌの総体積を各対象に送達するために鼻孔１つあたり０．２ｍｌのアリコート２つとして投与される６．２５×１０１２〜５．００×１０１３ＧＣの範囲である。
【０１６０】
これらの上記用量は、処置面積の大きさ、用いるウイルス力価、投与経路及び方法の所望の効果に応じて、範囲内のあらゆる数を含めた約２５〜約１０００マイクロリットルの範囲またはそれより多い体積の様々な量の担体、賦形剤または緩衝液製剤の中に入って投与され得る。一実施形態では、担体、賦形剤または緩衝液の体積は少なくとも約２５μＬ
である。一実施形態では、体積は約５０μＬである。別の実施形態では、体積は約７５μＬである。別の実施形態では、体積は約１００μＬである。別の実施形態では、体積は約１２５μＬである。別の実施形態では、体積は約１５０μＬである。別の実施形態では、体積は約１７５μＬである。さらに別の実施形態では、体積は約２００μＬである。別の実施形態では、体積は約２２５μＬである。さらに別の実施形態では、体積は約２５０μＬである。さらに別の実施形態では、体積は約２７５μＬである。さらに別の実施形態では、体積は約３００μＬである。さらに別の実施形態では、体積は約３２５μＬである。別の実施形態では、体積は約３５０μＬである。別の実施形態では、体積は約３７５μＬである。別の実施形態では、体積は約４００μＬである。別の実施形態では、体積は約４５０μＬである。別の実施形態では、体積は約５００μＬである。別の実施形態では、体積は約５５０μＬである。別の実施形態では、体積は約６００μＬである。別の実施形態では、体積は約６５０μＬである。別の実施形態では、体積は約７００μＬである。別の実施形態では、体積は約７００〜１０００μＬである。
【０１６１】
特定の実施形態では、組換えベクターは、各鼻孔に対する２回の噴霧を用いて鼻腔内に投薬され得る。一実施形態では、２回の噴霧は各鼻孔に交互に行うこと、例えば、左鼻孔への噴霧、右鼻孔への噴霧、次いで左鼻孔への噴霧、右鼻孔への噴霧によって投与される。特定の実施形態では、交互に行う噴霧の間に遅延があってもよい。例えば、約１０〜６０秒、または２０〜４０秒、または約３０秒、数分またはより長い間隔だけ隔てられた複数回の噴霧を各鼻孔に与えてもよい。そのような噴霧は例えば、約２００μＬ〜約６００μＬ、４００μＬ〜７００μＬ、または４５０μＬ〜１０００μＬの合計投薬体積を実現するために、１回の噴霧ごとに約１５０μＬ〜３００μＬ、または約２５０μＬを送達し得る。
【０１６２】
特定の実施形態では、組換えＡＡＶベクターは、投薬後、例えばベクターの投与から１〜４週間後または約２週間後に鼻腔洗浄溶液を測定した場合に５〜２０ｎｇ／ｍｌの導入遺伝子の発現産物（例えば中和抗体構築物、ＪＡｂ２１０ａ  ＭＤＡｂ）の濃度を実現すべく鼻腔内に投薬され得る。対象の鼻腔洗浄溶液を得る方法及び導入遺伝子の発現産物を定量する方法は慣例に従う。例えば実施例１８及び１９を参照されたい。
【０１６３】
他の投与経路、例えば静脈内または筋肉内の場合、用量レベルは鼻腔内送達の場合よりも多くなるであろう。例えば、そのような懸濁液の体積用量は約２．５×１０１５ＧＣまでの用量で約１ｍＬ〜約２５ｍＬであり得る。
【０１６４】
上記組換えベクターは、公開されている方法に従って宿主細胞に送達され得る。ｒＡＡＶは、好ましくは生理学的に適合する担体の中に懸濁して、ヒトまたは非ヒト哺乳動物患者に投与され得る。別の実施形態では、組成物は、担体、希釈剤、賦形剤及び／または佐剤を含む。当業者であれば、移入ウイルスが対象といている適応症を考慮して好適な担体を容易に選択し得る。例えば、ある好適な担体は生理食塩水を含み、これは様々な緩衝溶液（例えばリン酸緩衝生理食塩水）と共に製剤化され得る。他の例示的な担体としては、無菌生理食塩水、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油及び水が挙げられる。緩衝液／担体は、ｒＡＡＶが輸注管類に付着するのを防止するが生体内でのｒＡＡＶ結合活性を妨害しない成分を含むべきである。
【０１６５】
場合によって、本発明の組成物は、ｒＡＡＶ及び担体（複数可）以外にも他の一般的な医薬原料、例えば保存剤または化学安定剤を含有し得る。好適な保存剤の例としては、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール及びパラクロロフェノールが挙げられる。好適な化学安定剤としてはゼラチン及びアルブミンが挙げられる。
【０１６６】
本発明に係る組成物は、上に定義したものなどの薬学的に許容できる担体を含み得る。本明細書に記載の組成物は、薬学的に適する担体の中に懸濁させた、及び／または注射、浸透圧ポンプ、クモ膜下腔内カテーテルによる対象への送達のためまたは別の装置もしくは経路による送達のために設計された好適な賦形剤と混合した、１つ以上のＡＡＶを有効量含むことが好適である。一例において、組成物は鼻腔内投与のために製剤化される。別の例では、組成物は筋肉内投与のために製剤化される。さらに別の例では、組成物は静脈内投与のために製剤化される。さらに別の例では、組成物は腹腔内投与のために製剤化される。
【０１６７】
一実施形態では、抗病原体構築物（例えば中和抗体構築物）をコードするウイルスベクターを含有する組成物は、肺の形質導入を最小限に抑えるために比較的小さい滴下注入体積で液体（例えば、霧化物、エアゾール、噴霧物など）として対象に鼻腔内送達される。一実施形態では、低体積ＡＡＶの送達は、（発現によって測定される）形質導入の約７０％超、８０％超、９０％超、約９５％超、または約９９％超を鼻腔上皮に制限する。別の実施形態では、ウイルスベクターは鼻腔内噴霧以外の手段、例えば鼻腔内注入によって局所送達され得る。
【０１６８】
特定の実施形態では、鼻腔内送達装置は、大きさ約３０ミクロン〜約１００ミクロンの粒径範囲を有する粒子の霧を送達する噴霧器を提供する。特定の実施形態では、平均径範囲は約１０ミクロン〜約５０ミクロンである。好適な装置は文献に記載があり、いくつかは市販されており、例えば、ＬＭＡ  ＭＡＤ  ＮＡＳＡＬ（商標）（Ｔｅｌｅｆｌｅｘ  Ｍｅｄｉｃａｌ；Ｉｒｅｌａｎｄ）、Ｔｅｌｅｆｌｅｘ  ＶａｘＩＮａｔｏｒ（商標）（Ｔｅｌｅｆｌｅｘ  Ｍｅｄｉｃａｌ；Ｉｒｅｌａｎｄ）、Ｋｕｒｖｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＣｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｐａｒｔｉｃｌｅ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ（登録商標）（ＣＰＤ）が挙げられる。ＰＧ  Ｄｊｕｐｅｓｌａｎｄ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌ．Ｒｅｓ（２０１３）３：４２−６２も参照されたい。特定の実施形態では、粒径及び送達体積は、鼻腔上皮細胞を優先的に指向し、肺への指向を最小限に抑えるべく制御される。他の実施形態では、肺細胞に送達するために霧粒子は約０．１ミクロン〜約２０ミクロンまたはそれ未満である。そのようなより小さい粒径は鼻腔上皮における保持を最小限に抑え得る。
【０１６９】
任意の好適な方法または経路を使用して、本明細書に記載のＡＡＶ含有組成物を投与すること、及び場合によって他の活性薬または療法を本明細書に記載のＡＡＶ媒介抗体と一緒に共施与することができる。投与経路としては、例えば、全身、経口、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内への投与が挙げられる。
【０１７０】
一実施形態では、凍結形態で本明細書に記載の緩衝溶液中にｒＡＡＶを含有する凍結組成物が提供される。場合によっては１つ以上の界面活性剤（例えばプルロニックＦ６８）、安定剤または保存剤がこの組成物の中に存在する。好適には使用のために組成物を解凍して適切な希釈剤、例えば無菌生理食塩水または緩衝生理食塩水で滴定して所望の用量にする。
【０１７１】
場合によって、本明細書に記載の組成物は、他の抗ウイルス薬及び／または他のウイルス標的に対するワクチン、例えば、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ及びインフルエンザＣを含めて他のインフルエンザワクチンと組み合わせて使用されてもよい。Ａ型インフルエンザウイルスは最も毒性の強いヒト病原体である。流行病に関連付けられたインフルエンザＡの血清型としては、１９１８年のスペイン風邪及び２００９年の豚インフルエンザを引き起こしたＨ１Ｎ１；１９５７年にアジア風邪を引き起こしたＨ２Ｎ２；１９６８年に香港風邪を引き起こしたＨ３Ｎ２；２００４年に鳥インフルエンザを引き起こした
Ｈ５Ｎ１；Ｈ７Ｎ７；Ｈ１Ｎ２；Ｈ９Ｎ２；Ｈ７Ｎ２；Ｈ７Ｎ３及びＨ１０Ｎ７が挙げられる。インフルエンザＡに対する広域中和抗体について教示されている。本明細書中で使用する場合、「広域中和抗体」は、複数の亜型からの複数の株を中和することができる中和抗体を指す。例えば、ＣＲ６２６１［Ｔｈｅ  Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ／Ｃｒｕｃｅｌｌ］は、１９１８「スペイン風邪」（ＳＣ１９１８／Ｈ１）を含む広範なインフルエンザウイルス、及び２００４年にベトナムでニワトリからヒトへと飛躍した鳥インフルエンザのＨ５Ｎ１クラスのウイルス（Ｖｉｅｔ０４／Ｈ５）に結合するモノクローナル抗体として記載されている。ＣＲ６２６１は、インフルエンザウイルス表面上の主たるタンパク質であるヘマグルチニンの膜近傍ステムの高度に保存されたヘリックス領域を認識する。この抗体は、参照により本明細書に援用するＷＯ２０１０／１３０６３６に記載されている。別の中和抗体Ｆ１０［ＸＯＭＡ  Ｌｔｄ］は、Ｈ１Ｎ１及びＨ５Ｎ１に対して有用であると教示されている（Ｓｕｉ，Ｊｉａｎｈｕａ，ｅｔ  ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｖｉａｎ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．”Ｎａｔｕｒｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  １６．３（２００９）：２６５−２７３）。インフルエンザに対する他の抗体、例えばＦａｂ２８及びＦａｂ４９を選択してもよい。例えばＷＯ２０１０／１４０１１４及びＷＯ２００９／１１５９７２を参照されたく、参照によりこれらを援用する。さらに他の抗体、例えば、ＷＯ２０１０／０１０４６６、米国公開特許公報第ＵＳ／２０１１／０７６２６５号、及びＷＯ２００８／１５６７６３に記載されているものは容易に選択され得る。
【０１７２】
これらのｒＡＡＶを例えば受動免疫化のために使用する方法は例えばＷＯ２０１２／１４５５７２に記載されている。他の送達方法及び用途は当業者にとって明らかであろう。例えば、本明細書に記載の療法計画は、本明細書に記載の組み合わせのうちの１つ以上の他に、バイオ医薬品、低分子薬、化学療法剤、免疫増強剤、放射線、外科手術などのうちの１つ以上とのさらなる組み合わせを含み得る。本明細書に記載のバイオ医薬品は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、核酸分子、ベクター（ウイルスベクターを含む）などに基づくものである。
【０１７３】
併用療法では、本明細書に記載のＡＡＶ送達される免疫グロブリン構築物は、別の薬剤、例えば、抗ウイルス療法、抗生物質との療法を開始する前、間または後に、及びそれらの組み合わせで、つまり、療法を開始する前及び間、前及び後、間及び後、または前、間及び後に投与される。例えば、ＡＡＶは８時間〜３０日に投与され得、特定の実施形態ではそれは療法開始の約１２時間前、１日前、約３日前、約３〜３０日前または５〜１２日前であり得る。
【実施例】
【０１７４】
以下の実施例は単なる例示に過ぎず、本明細書に記載の本発明に対する限定ではない。
【０１７５】
本明細書中で使用するいくつかの略語を以下に示す：ＡＡＶはアデノ随伴ウイルス；ＢＡＬＦは気管支肺胞洗浄液；ＣＢ７は、サイトメガロウイルスエンハンサーエレメントを有するニワトリβ−アクチンプロモーター；ｃＤＮＡは相補的ＤＮＡ；ＧＣはゲノムコピー；ＨＲＰは西洋ワサビペルオキシダーゼ；ＩＮは鼻腔内；ＩＰは腹腔内；ＩＴＲは末端逆位反復配列；ｋｇはキログラム；ＯＲＦはオープンリーディングフレーム；ポリＡはポリアデニル化；そしてｒＢＧはウサギβ−グロビンである。
【０１７６】
季節性及び／または流行性インフルエンザ感染の設定において、従来のインフルエンザワクチンの代替としてのインフルエンザＡ及びＢに対するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに基づく予防療法計画を開発するために、気道上皮における強化された性能プロ
ファイルを有する新規ＡＡＶベクターを発見した。様々なヒト及び非ヒト霊長類組織から内因性ＡＡＶを検出及び単離することを意図した高度に専門的な分子技術を用いて、新規ＡＡＶであるＡＡＶｈｕ６８がヒト組織から単離された。このベクターは、向上した製造可能性及び多くの異なる組織種にわたって強化された形質導入を含めた好ましい表現型を発揮する。ＡＡＶｈｕ６８を候補ＡＡＶベクター血清型の好例として使用してインフルエンザ抗体発現カセットを最適化した。多重ドメインＡｂ（ＭＤＡｂ）の発現のための単一のオープンリーディングフレームをコードするＡＡＶベクターを１つだけ試験した。
【０１７７】
実施例１−新規クレードＦ  ＡＡＶ  −  ＡＡＶｈｕ６８
以下の改変を伴ってＱＩＡａｍｐカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の推奨に従って使用してヒト組織試料からＰＣＲ鋳型としての組織ＤＮＡを抽出した。Ｇａｏ，ｅｔ  ａｌ［Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２００２  Ｓｅｐ  ３，９９（１８）：１１８５４−１１８５９（電子公開２００２年８月２１日）］によって記載されているようにＱ５ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５（登録商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ２Ｘ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ，ＮＥＢ）を、試料中の潜在的ＡＡＶの完全長ＶＰ１遺伝子を回収するその極めて高い忠実度及び堅牢な効率ゆえに選択し、以下のとおりに改変されたプライマー組を使用した：ＡＶ１ＮＳの代わりにプライマーｐｒｍ５０４［ＧＣＴＧＣＧＴＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＡＡＴＧＡＧＡＡＣ、配列番号２８］を使用し、逆方向プライマーＡＶ２ＣＡＳの代わりにｐｒｍ５０５［ＣＧＣＡＧＡＧＡＣＣＡＡＡＧＴＴＣＡＡＣＴＧＡＡＡＣＧＡ、配列番号２９］を使用した。
【０１７８】
ＰＣＲ条件を以下のとおりに改変した。
【表３】
2020510430.tif 000009
ＰＣＲプログラム
【表４】
2020510430.tif 000010
【０１７９】
ＰＣＲからの約３ｋｂのバンドをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを抽出し、Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。プラスミドを配列決定してＡＡＶ  ＶＰ１遺伝子の完全長を得た。試料の大部分について少なくとも３つのプラスミドが完全に配列決定され、その試料の最終ＡＡＶ配列としての共通配列が導き出された。
【０１８０】
取得した、ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列を配列番号１８に示す。図１Ｂ〜Ｄも参照されたい。ＡＡＶｈｕ６８のｖｐ１アミノ酸配列を図１Ａ及び配列番号１６に示す。ＡＡＶ９（配列番号１７）、ＡＡＶｈｕ３１（配列番号３４）及びＡＡＶｈｕ３２（配列番号３５）と比較してＡＡＶｈｕ６８では２つの突然変異（Ａ６７Ｅ及びＡ１５７Ｖ）が必須であると同定された（図１Ａ中に丸で囲って示す）。
【０１８１】
その後、パッケージング効率、収率及び形質導入特性を評価するために、ｐＡＡＶ２／９主鎖のＡＡＶ９  ＶＰ１遺伝子の場所にＡＡＶｈｕ６８のＶＰ１遺伝子を搭載することによってｐＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドを作った。ｐＡＡＶ２／９プラスミドは、カプシド遺伝子を挟んでＡＡＶ２の５’及び３’ＩＴＲを含有し、Ｐｅｎｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ  ＵＳ，ｐｅｎｎｖｅｃｔｏｒｃｏｒｅ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ］から入手することができる。
【０１８２】
実施例２−ＡＡＶｈｕ６８ベクターの収率
ＧＦＰ及びＬａｃＺなどの様々な導入遺伝子カセットを保有しているＡＡＶｈｕ６８及びＡＡＶ９ベクターを生成及び評価した。Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ［Ｇａｏ，Ｇｕａｎｇ−Ｐｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ａｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９９．１８（２００２）：１１８５４−１１８５９］によって記載されているように２９３細胞において三重トランスフェクション技術を用いてベクターの各々を生成した。
【０１８３】
ａ．ｐＡＡＶｈｕ６８トランスプラスミドの生産
ｖｐ１カプシドタンパク質をコードする核酸配列を配列番号１８に示す。
パッケージング効率、収率及び形質導入特性を評価するために、ｐＡＡＶ２／９主鎖のＡＡＶ９  ＶＰ１遺伝子の場所にＡＡＶｈｕ６８のＶＰ１遺伝子を搭載することによって
ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８トランスプラスミドを作った。ｐＡＡＶ２／９プラスミドは、カプシド遺伝子を挟んでＡＡＶ２の５’及び３’ＩＴＲを含有し、Ｐｅｎｎ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｃｏｒｅ［Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，Ｐｈｉｌａ，ＰＡ
ＵＳ，ｐｅｎｎｖｅｃｔｏｒｃｏｒｅ．ｍｅｄ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ］から入手することができる。
【０１８４】
ｂ．ＡＡＶｈｕ６８ベクターの収率
１０％のウシ胎仔血清を含むイーグル最小必須培地中で２９３細胞を５％のＣＯ２の雰囲気下、３７℃で培養及び維持した。トランスフェクションは、ベクタープラスミドをｐＡＡＶ２／ｈｕ６８またはｐＡＡＶ２／９で置き換えてＧａｏ  ｅｔ  ａｌ［Ｇａｏ，Ｇｕａｎｇ−Ｐｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｒｈｅｓｕｓ  ｍｏｎｋｅｙｓ  ａｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ９９．１８（２００２）：１１８５４−１１８５９］によって記載されているように実施された。トランスフェクトした細胞をさらに６ウェルプレートで培養した。Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ［Ｇａｏ，Ｇｕａｎｇｐｉｎｇ，ｅｔ  ａｌ．“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．”Ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  １１．１５（２０００）：２０７９−２０９１．］に記載されているようにポリＡ領域を標的とするプローブ及びプライマーを使用することによるＴａｑＭａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）分析によってウイルス定量を行うために、細胞の全溶解物及び上清を回収した。上清の力価と全溶解物の力価との両方に関して６つのｐＡＡＶ２／９プラスミド及び６つのｐＡＡＶ２／ｈｕ６８プラスミドの収率を６ウェルプレートで直接比較した。各プラスミドは個々の細菌コロニーから得たものであった。
【０１８５】
全溶解物に関してＡＡＶｈｕ６８の収率は、ＡＡＶ９のそれと類似していることが分かった。しかしながら、上清ではＡＡＶｈｕ６８の収率がＡＡＶ９のそれよりも有意に高かった。したがって、規模変更可能な生産の観点からＡＡＶｈｕ６８はＡＡＶ９に比べてより良好なベクターであることが実証された、というのも、製造規模拡大には上清が好まれるからである。
【０１８６】
ｃ．抗体構築物を有する異なるＡＡＶカプシドの比較
１つの試験において、ＡＡＶｈｕ６８ベクターでは収率が向上した（表１）。
【表５】
2020510430.tif 000011
【０１８７】
実施例３−Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（ＰＲ８−ＭＴＳ）による鼻腔攻撃を防御するためのＢＡＬＢ／ｃマウスへのＡＡＶｈｕ６８媒介による鼻腔内投与
この試験の目的はＡＡＶ１．ＣＢ７．ｈＪＡｂ、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＪＡｂ及びＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＪＡｂベクターの防御有効性を評価及び比較することであったが、これらは全て、マウスに鼻腔内（ＩＮ）投与された場合にインフルエンザＡ（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４）の予防を付与するように設計されたものであった。全ての試験において、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（６週齢）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入し、ペンシルバニア大学のトランスレーショナル研究所の動物施設で飼育した。本明細書に記載されている動物に対する全ての手順は、ペンシルバニア大学の動物実験委員会によって承認された。
【０１８８】
麻酔を掛けたマウスを上顎前歯で懸垂し、１７μｌのアリコート３つとして送達される５１μｌの総体積にＰＢＳで希釈した１０９ゲノムコピー（ＧＣ）の各ＡＡＶベクターを鼻腔内（ＩＮ）に与えた。攻撃試験はベクター投与から７日後に起こった。麻酔を掛けたマウスを上顎前歯で懸垂し、１７μｌのアリコート３つとして送達される５１μｌのインフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（すなわちＰＲ８）（５ＬＤ５０）をＩＮに投与した。マウスの体重を１日１回、最初の１４日間測定した。苦痛の兆候または３０％以上の体重減少を示しているマウスはどれも安楽死させた。生き残ったマウスは攻撃から２１日後に屠殺した。結果を図２Ａ〜Ｂに示す。
【０１８９】
要約すると、１０９ＧＣのＡＡＶ１．ＣＢ７．ｈＪＡｂのＩＮ送達は、顕著な体重減少（２０％超）を伴ってＰＲ８攻撃に対する部分的防御（４０％）を付与した。対照的に、１０９ＧＣの用量のＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＪＡｂ及びＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＪＡｂのＩＮ送達は１０〜２０％の体重減少を伴ってＰＲ８攻撃に対する８０％の防御を付与した。
【０１９０】
実施例４−Ｂ／Ｌｅｅ／４０による鼻腔攻撃を防御するためのＢＡＬＢ／ｃマウスへのＡＡＶｈｕ６８ベクター投与
この試験の目的は、ＡＡＶ１．ＣＢ７．ｈＪＡｂ、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＪＡｂ及びＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＪＡｂベクターの防御有効性を評価及び比較することであったが、これらは全て、マウスにＩＮ投与する場合にインフルエンザＢ（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）の予防を付与するために設計されたものである。
【０１９１】
麻酔を掛けたマウスを上顎前歯で懸垂し、１７μｌのアリコート３つとして送達される５１μｌの総体積にＰＢＳで希釈した１０９ＧＣの各ＡＡＶベクターをＩＮに与えた。
【０１９２】
攻撃試験はベクター投与から７日後に起こった。麻酔を掛けたマウスを上顎前歯で懸垂し、１７μｌのアリコート３つとして送達される５１μｌのインフルエンザＢ／Ｌｅｅ／４０（５ＬＤ５０）をＩＮに投与した。マウスの体重を１日１回、最初の１４日間測定した。苦痛の兆候または３０％以上の体重減少を示しているマウスはどれも安楽死させた。生き残ったマウスは攻撃から２１日後に屠殺した。結果を図３Ａ〜Ｂに示す。
【０１９３】
手短に述べると、１０９ＧＣのＡＡＶ１．ＣＢ７．ｈＪＡｂ、ＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＪＡｂまたはＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＪＡｂのＩＮ送達は、攻撃の過程全体にわたって顕著な体重減少を伴わずにＢ／Ｌｅｅ／４０によるＩＮ攻撃に対する完全な防御を付与した。
【０１９４】
実施例５−ＢＡＬＢ／ｃマウスの気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）におけるＡＡＶｈｕ６８媒介によるｈＪＡｂの発現の発現プロファイル
この試験の目的は、様々な用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＪＡｂをＢＡＬＢ／ｃマウスのＩＮに送達したときのＢＡＬＦにおけるｈＪＡｂ発現のレベルを評価することであった。
【０１９５】
マウスのＩＮに１０９〜１０１１ＧＣの範囲の用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＪＡｂベクターを送達した。７日後にマウスを剖検し、５００μｌのＰＢＳの中にＢＡＬＦを採集した。プロテインＡ  ＥＬＩＳＡを用いてＡｂの量を以下のとおりに定量した。ＥＬＩＳＡプレートをプロテインＡで被覆した。一晩インキュベートした後、プレートを０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳで洗浄し、ブロッキングした。ＢＡＬＦ試料をＰＢＳで希釈し、プレートに３７℃で１時間加えた。ビオチン−ＳＰ−ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃｇ特異的Ａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）及びストレプトアビジン−ＨＲＰ複合体（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を使用して結合を検出した。プレートをＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で現像した。結果を図４に示す。
【０１９６】
マウスのＢＡＬＦにおいて、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＪＡｂのＩＮ送達から７日後にｈＪＡｂの顕著な発現が検出された。予測されるように、ベクター用量が１０９ＧＣから１０１１ＧＣに増加するとベクター処置マウスのＢＡＬＦにおけるｈＪＡｂの発現が増加した。
【０１９７】
実施例６−インフルエンザＡまたはインフルエンザＢに対する防御のためのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａの最小有効用量（ＭＥＤ）の決定
この試験の目的は、インフルエンザＡまたはＢの予防に必要とされるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａベクターのＭＥＤを決定することであった。
【０１９８】
ＰＢＳで５１μｌの総体積に希釈した３×１０８〜１０１０ＧＣの範囲の用量のＡＡＶｈｕ６８．ＪＡｂ２１０ａベクターをＢＡＬＢ／ｃマウスのＩＮに与え、７日後（ここでは０日目と記される）に５ＬＤ５０のＰＲ８またはＢ／ＬＥＥ／４０で攻撃し、試験の継続期間（２１日）にわたって毎日体重を測定した。感染日の体重を基準として体重百分率を算出した。
【０１９９】
上述したような５１μｌの中の１０７〜１０１１ＧＣの範囲の用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａベクターをマウスのＩＮに与えた。攻撃試験はベクター投与から７日後に起こった。マウスのＩＮを５ＬＤ５０のインフルエンザＡ（ＰＲ８）（図５Ａ及び図５Ｂ）かインフルエンザＢ（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）（図６Ａ及び図６Ｂ）かのどちらかで攻撃し、毎日体重を測定した。
【０２００】
図５Ａ及び図５Ｂに示すように、１０９ＧＣ用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧベクターによってＰＲ８攻撃に対する効果的な防御が、動物の逸失または体重減少を伴わずに実現された。図５Ａ及び図５Ｂに示すように、顕著な体重減少を伴う生存が３×１０８ＧＣ用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧベクターによって実現された。
【０２０１】
図６Ａ及び図６Ｂに示すように、１０９ＧＣ用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧベクターによってＢ／Ｌｅｅ／４０攻撃に対する効果的な防御が、動物の逸失及び体重減少を伴わずに実現された。図６Ａ及び図６Ｂに示すように、顕著な体重減少を伴う生存が３×１０８ＧＣ用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧベクターによって実現された。
【０２０２】
結論として、ＰＲ８を防御するためのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａのＭＥＤは１０９ＧＣである。さらに、体重減少を伴わないＰＲ８に対する完全な防御を付与するＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａの用量は３×１０９ＧＣである。
【０２０３】
Ｂ／Ｌｅｅ／４０に対する防御のためにはＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａのＭＥＤは３×１０８ＧＣであり、これは、Ｂ／Ｌｅｅ／４０に対するＭＥＤが１０９ＧＣであった２０１６年１２月１５日公開のＷＯ２０１６／２００５４３に記載されているＡＡＶ９．ＦＩ６及びＡＡＶ９．ＣＲ８０３３の混合物である併用療法に勝る著しい改善である。体重減少を伴わずにＢ／Ｌｅｅ／４０に対する完全な防御を付与するＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａの用量は１０９ＧＣである。
【０２０４】
実施例７−改善された生体内での発現のためのｈＪＡｂのコドン最適化
この試験の目的は、気道に沿って並ぶ細胞からのｈＪＡｂの発現を改善すると予測されるコドン最適化体系を用いて気道上皮の細胞からのｈＪＡｂの優先的発現を実現することにより、証明されたＡＡＶ媒介によるｈＪＡｂ発現の有効性をさらに改善することであった。生体内での気道におけるｈＪＡｂの発現を改善するために種々様々なコドン最適化体系を用いた。インフルエンザ攻撃試験におけるその有効性の評価に加えてベクター産物の収率も評価した。コドン最適化の結果としてＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａの収率は親ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＪＡｂよりも約２０％高くなった。加えて、（ａ）インフルエンザＡまたはＢのどちらかによるＩＮ攻撃に対する防御のＭＥＤを確立すること、（ｂ）ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａベクターによって付与される防御の開始を評価すること、及び（ｃ）血清中循環ＡＡＶｈｕ６８特異的ＮＡｂの存在下で効果的に再投与されるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａベクターの能力を評価することを意図した一連の攻撃試験において、インフルエンザＡ及びＢに対する防御についてＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａを評価した。
【０２０５】
実施例８−インフルエンザＡまたはＢへの感染に対するＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ媒介による防御の迅速な開始
この試験の目的は、マウスにおけるＩＮ送達後のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａベクターによる、インフルエンザＡ（ＰＲ８）またはＢ（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）に対する有効な防御の開始を判定することであった。
【０２０６】
先に記載したようにＰＢＳで５１μｌの総体積に希釈した１０９ＧＣまたは１０１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａベクターをＢＡＬＢ／ｃマウスのＩＮに与え、５ＬＤ５０のＰＲ８またはＢ／ＬＥＥ／４０ウイルスで１日後、２日後、現在、または７日後に攻撃し（図７Ａ（ＰＲ８）及び図８Ａ（Ｂ／Ｌｅｅ／４０）のそれぞれに攻撃の−１日前、−２日前、−３日前及び−７日前と示す）、試験の継続期間にわたって毎日体重を測定した。感染日の体重を基準として体重百分率を算出した。
【０２０７】
図７Ｂ及び図７Ｃに示すように、１０１０ＧＣ用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａベクターを使用して、動物の逸失を伴わずにＰＲ８攻撃に対する効果的な防御の迅速な開始が実現された。Ｂ／Ｌｅｅ／４０に対する防御の場合、図８Ｂ及び図８Ｃに示すように、効果的な防御の迅速な開始は、対数が１つ低い１０９ＧＣの用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａベクターを使用して実現された。
【０２０８】
実施例９−ＡＡＶｈｕ６８特異的血清中循環Ａｂの存在下でのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａベクターの鼻腔投与
この試験の目的は、ＡＡＶｈｕ６８に対する血清中循環ＮＡｂの存在にもかかわらず気道上皮の細胞に効果的に形質導入するＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａベクターの能力を決定することであった。先に記載したように５１μｌ中の１０９ＧＣ〜３×１０
１０ＧＣの範囲の用量でＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｎＬａｃＺベクター（インフルエンザに無関係な導入遺伝子を発現する）をマウスのＩＮに与えた。２８日後（抗体応答のピーク時）または９０日目（Ｎａｂが安定化するはずの時間）に血清をベクター処置（及び非ベクター処置）マウスの各々から単離し、血清中ＡＡＶｈｕ６８特異的ＮＡｂの力価を評価した。２８日目及び９０日目の群のマウスをそれらのＮＡｂ状態によって層別し、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａベクターの投与のための３つの群の各々に分配した（図９Ａ〜Ｆ及び図１０Ａ〜Ｃ）。群１には、１０９ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａを投与した（図９Ａ、２８日目及び図１０Ａ、９０日目）。群２には、３×１０９ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａを投与した（図９Ｂ、２８日目及び図１０Ｂ、９０日目）。群３には、１０１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａを投与した（図９Ｃ、２８日目及び図１０Ｃ、９０日目）。
【０２０９】
予測どおり、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ．ｎＬａｃＺベクターのＩＮ送達は、図９及び図１０で各グラフの右側に示す血清中循環ＡＡＶｈｕ６８特異的ＮＡｂの生成をもたらした。
【０２１０】
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａベクターは血清中循環ＡＡＶｈｕ６８特異的ＮＡｂの存在下で効果的に再投与され得る。既存の血清中循環ＡＡＶｈｕ６８特異的ＮＡｂは１０９ＧＣのベクターの効果的な再投与に影響を与える。しかしながら、ベクターの用量を２分の１対数だけ増やして３×１０９ＧＣとするかまたは１対数だけ増やして１０１０ＧＣとすることによって本発明者らは、インフルエンザＡ攻撃マウスの生存率を著しく改善した。マウスにＩＮ送達された１０１０ＧＣの用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａは、１：２０〜１：１，２８０のＡＡＶｈｕ６８  ＮＡｂが血清中に循環している状態で、マウスをＰＲ８攻撃から効果的に防護した。ＡＡＶｈｕ６８カプシドへの初回曝露とＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａの投与との間の時間間隔を延ばすと、ＰＲ８に対する防御は改善される傾向にあった。
【０２１１】
実施例１０−マウスにおけるＩＮ送達後のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＪＡｂの生体内分布プロファイル
１０１１ＧＣ（高）〜１０９ＧＣ（低）の範囲の用量のＡＡＶｈｕ６８．ｈＪＡｂベクターをＢＡＬＢ／ｃマウスのＩＮに与え、７日後に剖検した。組織（肺、肝臓、脾臓、心臓及び脳）を生体内分布分析のために採取した。点線はアッセイのバックグラウンドのレベルを表す。
【０２１２】
この試験の目的は、ａ）１０９〜１０１１ＧＣの範囲のベクター用量をＩＮ送達して７日後に剖検した後のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ｈＪＡｂベクター、及びｂ）提案されるＭＥＤよりも１００倍高いベクター用量（１０１１ＧＣ）をＩＮ送達した後のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａの生体内分布プロファイルを決定することであった。試験は２部に分けて実施した。Ａの部では、１０９〜１０１１ＧＣの範囲の用量でマウスのＩＮに与えてベクター送達後７日目に剖検したときのＡＡＶｈｕ６８．ｈＪＡｂの生体内分布プロファイルを評価した。Ｂの部では、ＭＥＤよりも１００倍高い最高用量（１０１１ＧＣ）でマウスに与えたＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａの生体内分布プロファイルを評価した。マウスはベクター投与から３０日後に剖検した。
【０２１３】
Ａの部の試験では、先に記載したようにＰＢＳで５１μｌの総体積に希釈した１０９〜１０１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＪＡｂをマウスのＩＮに与えた。マウスを７日後に剖検し、組織をＡＡＶｈｕ６８生体内分布の分析のために採取した。
【０２１４】
Ｂの部の試験では、先に記載したようにＰＢＳで５１μｌの総体積に希釈した１０１１ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａをマウスのＩＮに与えた。マウス
を３０日後に剖検し、いくつかの組織をＡＡＶｈｕ６８生体内分布の分析のために採取した。
【０２１５】
予測されるように、ベクターをＩＮに送達する場合、ベクターゲノムの大部分が肺に蓄積する。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＪＡｂの提案されるＭＥＤ（１０９ＧＣ）では、ＡＡＶｈｕ６８ゲノムは脳及び心臓で検出されなかった（図１１）一方、脾臓及び肝臓で検出されたＡＡＶｈｕ６８ベクターゲノムのレベルはバックグラウンドに近かった（図１１）。
【０２１６】
ベクター用量が増加するにつれて肺、脾臓、心臓及び脳に蓄積するベクターゲノムの量は用量依存的に増加した（図１１）。
【０２１７】
高用量のＡＡＶｈｕ６８ベクターを使用する場合（図１１、図１２Ａ及び図１２Ｂ）、ＡＡＶｈｕ６８ゲノムは肺以外の組織で検出された。図１２Ａ及び図１２Ｂに示すように、ベクターゲノム蓄積の大部分は肺及びそれに続いて脾臓において起こった。ＡＡＶｈｕ６８ベクターゲノムは非常に低いレベルで腎臓、肝臓及び心臓に存在していた（図１２Ａ及び図１２Ｂ）。さらに、脳、卵巣または眼におけるＡＡＶｈｕ６８ゲノムのレベルはバックグラウンドに近すぎてデータの正確な解釈ができなかった（図１２Ａ）。
【０２１８】
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ｈＪＡｂの提案されるＭＥＤ（１０９ＧＣ）では、ＡＡＶｈｕ６８ゲノムは脳及び心臓で検出されなかった一方、脾臓及び肝臓で検出されたＡＡＶｈｕ６８ゲノムのレベルはバックグラウンドに近かった。高用量のＡＡＶｈｕ６８ベクターを使用する場合（図１１、図１２Ａ及び図１２Ｂ）、ＡＡＶｈｕ６８ベクターゲノムは肺以外の組織で検出された。図１２Ａに示すように、脳、卵巣または眼におけるＡＡＶｈｕ６８ゲノムのレベルはバックグラウンドに近すぎてデータの正確な解釈ができなかった。
【０２１９】
実施例１１
ＡＡＶｈｕ６８．ｈＪＡｂ及びＡＡＶｈｕ６８．ＪＡｂ２１０ａベクターは、インフルエンザＡ及びＢの様々な株による致死的攻撃に対して生体内で見事な予防プロファイルを発揮した。マウスの鼻に塗布した場合、それは、低用量で投与したときでさえインフルエンザＡまたはＢの株に対する十分な防御を付与した。
【０２２０】
興味深いことに、防護的低ＡＡＶベクター用量は、低レベルの血清中循環ＡＡＶ特異的中和抗体の産生をもたらした。本発明者らは、これらの抗体が効果的なベクター再投与を損なわなかったことを示すが、これは、有効な普遍的ＡＡＶ予防の利用可能期間中に発生し得る流行性インフルエンザ株に対する防御が万一必要となった場合に役に立つ。
【０２２１】
ベクターの安全性プロファイルは現在、この予防製品の第Ｉ相の治験への前進を支援する試験を可能にするＩＮＤにおいて評価されつつある。
【０２２２】
実施例１２−ＬＭＡ（登録商標）ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）鼻腔内粘膜噴霧（ＭＡＤ
ｎａｓａｌ）装置を使用してサルの鼻に送達されたＡＡＶ９．ＣＢ７．ｈＪＡｂの発現及びベクター分布プロファイルの評価
この試験は、アカゲザルの鼻への代用ベクター（ＡＡＶ９）発現アカゲザルαフェトタンパク質（ｒｈＡＦＰ；ＪＡｂ２１０ａの代用）の送達について、臨床的送達装置ＬＭＡ（登録商標）ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）鼻腔内粘膜噴霧（ＭＡＤ  ｎａｓａｌ）を評価することを意図したものであった。鼻腔洗浄液において導入遺伝子産物ｒｈＡＦＰの開始及びピーク発現レベルを評価し、剖検時にベクター生体内分布を評価した。
【０２２３】
ベクター投与日に動物を鎮静させ、体重を測定し、バイタルサインを記録した。鼻腔洗
浄液（ＮＬＦ）採取のために、小児用フォーリーカテーテルを片方の鼻孔の中に配置し、定位置に配置された時点でバルーンを空気で拡張させ、抵抗が得られるまでカテーテルを引き戻した。隔離された鼻腔の中に５ｍｌ以下のリン酸緩衝生理食塩水を輸注し、頭部を横に傾けて、鼻孔直下に配置された５０ｍｌＦａｌｃｏｎチューブ内に洗浄液を流れ込ませた。過程の最後に、遠位に配置されたカテーテルを解除して取り出し、外側を無菌ＰＢＳで浄化し、隣の鼻孔内に配置して手順を繰り返した。サルに気管内チューブを挿管して開存気道を維持し、仰臥位に保った。ＡＡＶベクターの液体送達（動物ＲＡ００６５）のために、小児用フォーリーカテーテルを片方の鼻孔の中に配置し、バルーンを空気で拡張させ、抵抗が得られるまでカテーテルを引き戻した。１０１３ＧＣの用量のＡＡＶベクター（体積１ｍＬ中）を各鼻孔に添加し、そこで約５分間保持させた（合計用量２×１０１３ＧＣ）。
【０２２４】
ＭＡＤ  ｎａｓａｌによるＡＡＶベクターの送達（動物ＲＱ９４７６）のために、両方の鼻孔に１回投薬する鼻孔１つあたり合計０．５ｍｌ中の１０１３ＧＣとしてＡＡＶベクターをＭＡＤ  ｎａｓａｌによって送達した（合計用量２×１０１３ＧＣ）。
【０２２５】
選択された日（７、２１、３５、５０、８１及び９９日目）にサルのバイタルサイン、臨床病態、及び左右両方の鼻孔から採取した鼻腔洗浄液における代用導入遺伝子産物の発現を追跡評価した。剖検時に組織をＡＡＶ９ベクターゲノムの分析のために採取した。ＭＡＤ  ｎａｓａｌとＡＡＶ９ベクターとの組み合わせの安全性プロファイルには脳及び嗅球におけるベクターゲノムの非存在を加えた。
【０２２６】
ＡＡＶ９形質導入気道細胞からの分泌ＡＦＰは、ヒトαフェトタンパク質ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  ＭＮ，ＵＳＡ）を使用してＮＬＦ試料を検査することによって検出された。
【０２２７】
総体積０．５ｍｌ中の２×１０１３ＧＣの用量のｒｈＡＦＰを発現するＡＡＶ９ベクターをＭＡＤ  ｎａｓａｌによってアカゲザルの鼻孔に送達した場合、本発明者らは、ＮＬＦにおける遺伝子発現を経時的に検査することができた。興味深いことに、ＡＡＶ９ベクター生体内分布を分析したところ、本発明者らは、ＭＡＤ  ｎａｓａｌによって送達されたＡＡＶ９ベクターの全身的散在が最小限に抑えられ、ベクターゲノムの大部分が鼻及び気管で検出されたことを認めた。
【０２２８】
雄のアカゲザルのＩＮにＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｒｈＡＦＰ．ｒＢＧを与えた。具体的には、ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）を使用して１頭のサルのＩＮに総体積０．３４ｍｌ中５．４５×１０１２ＧＣのＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｒｈＡＦＰ．ｒＢＧ（鼻孔１つあたり０．１７０ｍｌのアリコート１つとして与える）を与えた（四角で表す、図２２）。ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）は、承認薬をＩＮに投与され得る微細な霧にして噴霧する。対照サル（丸で表す、図２２）にはベクターを液体として送達した（鼻孔１つあたり０．５ｍｌ）。この短期試験は、ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）を使用してアカゲザルの鼻に送達した場合のＡＡＶ９．ＣＢ７．ＣＩ．ｒｈＡＦＰ．ｒＢＧの生体内分布プロファイルを評価することを意図したものであった。動物は９９日後に剖検した。ＡＡＶ９ベクターは脳（データ示さず）及び嗅球では検出されなかった（図２２）。
【０２２９】
実施例１３−アカゲザルの鼻におけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａの発現プロファイルの評価
この試験は、ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）を使用してアカゲザルの鼻に送達した場合のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧの発現プロファイルを評価することを意図したものであった。体積０．３４ｍＬ中２×１０１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａを鼻孔のために２等分してＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）装
置によって雄のアカゲザルに投与した。ＭＡＤ  ｎａｓａｌは、承認薬をＩＮに投与され得る微細な霧にして噴霧する。全ての動物に対して生存能確認をＳＯＰ７４０４に従って毎日実施する。ＳＯＰに従って体重、体温、呼吸速度及び心拍数を追跡評価し、全時点で記録する。７、１４、２１、２８及び３５日目に鼻腔擦過検体をＪＡｂ２１０ａ発現のＲＴ−ＰＣＲによる分析のために採取する。３５日目のデータの評価の後、動物を長期にわたって追跡するかまたはベクター生体内分布について剖検するかの判断を下す。７、１４、２１、２８、３５、５６及び７７日目にＮＬＦ及び血液試料をＪＡｂ２１０ａ発現の分析のために採取した。７７日目に採取した試料（微細ブラシを使用して鼻から採取した解離鼻腔細胞）において、ＪＡｂ２１０ａを検出することを特に意図したＲＴ−ＰＣＲに基づくアッセイによってＪＡｂ２１０ａの発現が確認された。
【０２３０】
組織交差反応性試験
治療剤としてのモノクローナルＡｂの用途には、Ａｂの正常ヒト及びアカゲザル組織に対する交差反応性の評価が必要とされる。組織交差反応性試験は、１９９７年２月にＦＤＡによって公表された「Ｐｏｉｎｔｓ  ｔｏ  Ｃｏｎｓｉｄｅｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｂ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｕｓｅ」及び２００８年１２月にＥＭＡによって公表された「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ
Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ」（ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＢＷＰ／１５７６５３／２００７）に準じた、モノクローナルＡｂの様々な正常ヒト及びアカゲザル組織に対する免疫組織化学的または細胞化学的検査を含む。この試験の目的は、ヒト及びアカゲザル組織の選択されたパネルによって免疫組織化学を用いてＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａの導入遺伝子産物の潜在的な交差反応性を評価することである。
【０２３１】
実施例１４−老齢マウスにおけるインフルエンザＡに対するＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａの防御有効性の評価
この試験の目的は、老齢マウスの効果的な予防の可能性を評価すること、及び老齢（９〜１８月齢）ＢＡＬＢ／ｃ雌マウスにＩＮ投与された場合のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａベクターのインフルエンザＡ（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４）に対する防御有効性を評価することであった。麻酔を掛けたマウスを上顎前歯で懸垂し、１７μｌのアリコート３つとして送達される５１μｌの総体積にＰＢＳで希釈した１０９ＧＣまたは３×１０９ＧＣのＡＡＶベクターをＩＮに与えた。攻撃試験はベクター投与から７日後に起こった。麻酔を掛けたマウスを上顎前歯で懸垂し、１７μｌのアリコート３つとして送達される５１μｌのＰＲ８（５ＬＤ５０）をＩＮに投与した。図１３Ａに示すように、攻撃後、マウスの体重を毎日測定した。体重減少百分率はインフルエンザ攻撃の日の体重を基準として算出した。苦痛の兆候または３０％以上の体重減少を示しているマウスはどれも安楽死させた。生き残ったマウスは攻撃から２１日後に屠殺した。図１３Ｂは、ＰＲ８攻撃後の生存率をグラフ化したものである。
【０２３２】
要約すると、１０９ＧＣか３×１０９ＧＣかのどちらかのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａのＩＮ送達はＰＲ８攻撃に対する十分な防御を付与し、インフルエンザＡによる致死的攻撃（５ＬＤ５０のＰＲ８）から老齢マウスを防護した。
【０２３３】
実施例１５−インフルエンザヘマグルチニンに対する多重ドメイン抗体によるインフルエンザ感染に対する普遍的防御
本明細書では、インフルエンザヘマグルチニンに対する様々なラマ単一ドメイン抗体のパネルから生み出され、インフルエンザＡ及びＢウイルスに対するかつてない幅広さ及び力価を有して繋げられた、多重ドメイン抗体を報告した。多重ドメイン抗体は、静脈内に
投与されるかまたは組換えアデノ随伴ウイルスベクターから局所的に発現する場合、マウスにおけるインフルエンザＡ及びＢへの感染を防御する。結果は、複数のエピトープを標的とする多重ドメイン抗体が、強化されたウイルス交差反応性及び力価を発揮し、アデノ随伴ウイルス送達と組み合わせて使用される場合にインフルエンザ及びその他の高可変性抗原への感染の防止を提供することを示す。
【０２３４】
ワクチンはインフルエンザの管理及び防止のために必須であり続けているが、インフルエンザワクチンによって誘導されるほとんどの抗体は、ヘマグルチニン（ＨＡ）表面糖タンパク質の高可変性領域を認識する。そのような抗体は主として株特異的であり、類似する変異型のほんの小さなサブセットのみに対する防御を付与する。適切なワクチン株を毎年選択することも多くの課題を提起し、流布しているウイルスとの一致が乏しいとワクチンの有効性が最適未満となり得る（Ｈ．Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈ３Ｎ２  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｏｆ  ２０１４−１５  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ
ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｅｔ  Ａｎｔｉｓｅｒａ  ｄｅｒｉｖｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｍａｐｓ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５，１５２７９（２０１５））。しかも、いくつかの研究は、インフルエンザ関連の合併症を発症するリスクが高い高齢者においてインフルエンザワクチンの有効性が著しく低下することを示している。例えば、Ｈ．Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｖｉａｎ  ｆｌｕ：Ｈ５Ｎ１  ｖｉｒｕｓ  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｉｎ  ｍｉｇｒａｔｏｒｙ  ｗａｔｅｒｆｏｗｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ４３６，１９１−１９２（２００５）、Ｍ．Ｔ．Ｏｓｔｅｒｈｏｌｍ，Ｎ．Ｓ．Ｋｅｌｌｅｙ，Ａ．Ｓｏｍｍｅｒ，Ｅ．Ａ．Ｂｅｌｏｎｇｉａ，Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ａｎｄ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ
Ｄｉｓ．１２，３６−４４（２０１２）、及びＷ．Ｅ．Ｂｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｃｈｒａｎｅ  ｒｅ−ａｒｒａｎｇｅｄ：ｓｕｐｐｏｒｔ  ｆｏｒ  ｐｏｌｉｃｉｅｓ
ｔｏ  ｖａｃｃｉｎａｔｅ  ｅｌｄｅｒｌｙ  ｐｅｏｐｌｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ３１，６０３０−６０３３（２０１３）を参照されたい。インフルエンザＡ及びＢウイルスからの広範なＨＡに対する広域中和抗体（ｂｎＡｂ）は広く特性評価されてきた。例えば、Ａ．Ｋ．Ｋａｓｈｙａｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ  ｆｒｏｍ  ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔｕｒｋｉｓｈ  Ｈ５Ｎ１  ａｖｉａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｏｕｔｂｒｅａｋ  ｒｅｖｅａｌ  ｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０５，５９８６−５９９１（２００８）、Ｍ．Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｈ５Ｎ１  ａｎｄ  Ｈ１Ｎ１  ｒｅｃｏｖｅｒｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＭ＋  ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ３，ｅ３９４２（２００８）、Ｄ．Ｃｏｒｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｓｍａ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  ｇｒｏｕｐ  １  ａｎｄ  ｇｒｏｕｐ
２  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，８５０−８５６（２０１１）、Ｃ．Ｄｒｅｙｆｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ｂ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７，１３４３−１３４８（２０１２）、Ｄ．Ｃ．Ｅｋｉｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｅｐｉｔｏｐｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２４，２４６−２５１（２００９）、Ｊ．Ｓｕｉ  ｅｔ
ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｂａｓｅｓ  ｆｏｒ
ｂｒｏａｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｖｉａｎ  
ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６，２６５−２７３（２００９）、Ｄ．Ｃ．Ｅｋｉｅｒｔ  ｅｔ
ａｌ．，Ａ  ｈｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｏｎ  ｇｒｏｕｐ  ２  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３３，８４３−８５０（２０１１）、Ｒ．Ｈ．Ｆｒｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｃｏｍｍｏｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｇｒｏｕｐ  ２  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１，４４５−４５０（２０１４）、Ｐ．Ｓ．Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｔｅｒｏｓｕｂｔｙｐｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ
ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｂｙ  ａｖｉｄｉｔｙ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０９，１７０４０−１７０４５（２０１２）、及びＡ．Ｆｏｒｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｌａｍａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｒｏｓｓ−ｓｕｂｔｙｐｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  １（ＨＩＶ−１）−ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｆｏｒ  ＨＩＶ−１  ｇｐ１２０．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２，１２０６９−１２０８１（２００８）を参照されたい。以前にこれらのｂｎＡｂは高齢者及びその他の高リスク群における予防剤として提案されたが、そのような用途は、（ｉ）十分な交差反応性ならびにインフルエンザＡ及びＢの両方のウイルスに対する防御が欠如しており、これによって少なくとも２つのｂｎＡｂの投与が必要になること、ならびに（ｉｉ）インフルエンザの季節全体を通して防御のための複数回の高用量注射が必要であることによって甚だしく妨げられる。
【０２３５】
本明細書では、抗インフルエンザＡ及びＢ活性を有する単一の抗体様タンパク質（多重ドメイン抗体またはＭＤＡｂまたはＪＡｂと呼ぶ）の粘膜における発現に基づくインフルエンザ防止のための方策を提案する。ＭＤＡｂ導入遺伝子は、ＭＤＡｂ導入遺伝子をコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの鼻腔内投与の後に呼吸器上皮の表面に発現する。以前の研究では、鼻咽頭粘膜でのＡＡＶ媒介によるｂｎＡｂ発現がインフルエンザＡウイルス感染に対する長期持続的な防御を提供することができることが示された。例えば、Ｍ．Ｐ．Ｌｉｍｂｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｆｅｒｒｅｔｓ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｂｒｏａｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，１８７ｒａ７２（２０１３）、及びＶ．Ｓ．Ａｄａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ  ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｉｒｗａｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ｏｌｄ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ．Ｃｌｉｎ．Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１，１５２８−１５３３（２０１４）を参照されたい。
【０２３６】
Ａ．ＡＡＶ９によって発現するＭＤ３６０６の予防有効性。
ＡＡＶによって発現するＭＤ３６０６（ＡＡＶ９．ＭＤ３６０６）による生体内での防御を評価するために、本発明者らは、マウス適合性インフルエンザＨ１Ｎ１、Ｈ３Ｎ２及びＢウイルスで攻撃したＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、抗インフルエンザ抗体（Ａｂ）ドメインをコードするヒト化配列をコードする組換えＡＡＶ９ベクターの予防有効性を評価した（図１４Ａ〜Ｂ）。インフルエンザ攻撃の７日前にＡＡＶ９．ＭＤ３６０６ｈを４×１０７〜５×１０９ゲノムコピー（ＧＣ）の範囲のベクター用量で鼻腔内に投与した。５×１０９ＧＣの投与はマウスをＨ１Ｎ１ウイルス（Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４−ＭＡ）による致死的攻撃から完璧に防護した一方、８匹中７匹のマウスは５分の１低くした用量で生存した。Ｈ３Ｎ２ウイルス（Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１／６８−ＭＡ）で攻撃したマウスは、５×１０８ＧＣ（試験した最低用量）のＡＡＶ９．ＭＤ３６０６ｈ
の鼻腔内投与によって十分に防護された。最後に、インフルエンザＢウイルス（Ｂ／Ｌｅｅ／４０−ＭＡ）で攻撃したマウスは１×１０９ＧＣのＡＡＶ９．ＭＤ３６０６ｈの鼻腔内投与によって完璧に防護された。
【０２３７】
ＡＡＶ９．ＭＤ３６０６ｈの鼻腔内送達は５×１０８ＧＣ／マウスという低さのベクター用量でインフルエンザＡ及びＢウイルスに対する十分な防御を提供した。ＭＤ３６０６自体は、インフルエンザの曝露後の予防または治療のような長期的な抗体曝露を必要としない適応症のために開発され得るが、ＡＡＶによって発現するＭＤ３６０６は、インフルエンザ感染に対する長期持続的な防御を提供するために使用されることができる。単一のＡＡＶベクター発現ヒト化ＭＤ３６０６の年１回の鼻腔内投与は、インフルエンザの季節全体を通して受動的防御を提供するのに十分であり得る。そのような予防的手法は、高齢者、及びワクチン接種の効果が低いその他の高リスク群にとっては特に有益であろう。この予防的方策の安全性及び有効性を評価する。また、ＭＤ３６０６の鳥インフルエンザ株に対する防御の迅速な開始及びかつてない交差反応性はインフルエンザ流行の開始直後の予防処置も提供し、標準的な卵ベースのワクチン製造に比べて顕著な利点をもたらす。
【０２３８】
Ｂ．材料及び方法−マウスにおけるＡＡＶ９．ｈＪＡｂの予防有効性
ヒト化ＪＡｂであるｈＪＡｂをハイブリッド型サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＢ７）の制御下で発現するＡＡＶ９ベクターを構築し、以前に教示されているように生産した（Ｍ．Ｐ．Ｌｉｍｂｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎ
ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｆｅｒｒｅｔｓ  ｅｌｉｃｉｔｓ  ｂｒｏａｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐａｎｄｅｍｉｃ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ．Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，１８７ｒａ７２（２０１３））。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡから購入した６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスをペンシルバニア大学のトランスレーショナル研究所の動物施設で飼育した。マウスにＰＢＳ中の１００ｍｇ／ｋｇのケタミン／１０ｍｇ／ｋｇのキシラジン混合物を腹腔内注射することによって麻酔を掛け、後肢を台の上で支えながら上顎前歯で懸垂し、１７μｌのアリコート３つとして送達される総体積５１μｌのＰＢＳ中のＡＡＶ９．ｈＪＡｂベクターを鼻腔内に投与した。ベクター投与から１週間後に処置マウス及びナイーブマウスの体重を測定し、上記のとおりに麻酔を掛け、上記のとおりＰＢＳの５１μｌの総体積中の攻撃ウイルス（５ＬＤ５０のＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４−ＭＡ  Ｈ１Ｎ１、５ＬＤ５０のＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１／６８−ＭＡ  Ｈ３Ｎ２、または５ＬＤ５０のＢ／Ｌｅｅ／４０−ＭＡ）を鼻腔内に投与した。マウスの体重を毎日測定し、疾患または苦痛の兆候がないかを監視した。苦痛の行動兆候を呈したかまたは初期体重の２５％をなくした動物は安楽死させた。実験はペンシルバニア大学の動物実験委員会の指針に従って承認及び実施された。
【０２３９】
実施例１６−ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧの生産及び製造
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧは、外部のベクター構成要素と内部のＤＮＡゲノムとからなる。外部ベクター構成要素は、１：１：１８の比でＶＰ１とＶＰ２とＶＰ３との３つのＡＡＶウイルスタンパク質の６０コピーからなる血清型ｈｕ６８、Ｔ＝１の二十面体カプシドである。カプシドは、２つのＡＡＶ末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたＪＡｂ２１０ａ導入遺伝子からなる一本鎖ＤＮＡゲノムを含有する。エンハンサー、プロモーター、イントロン、ＪＡｂ２１０ａコード配列及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルがＪＡｂ２１０ａ導入遺伝子を構成している。ＩＴＲは、ベクター生産中にゲノムの複製及びパッケージングを担う遺伝要素であり、ｒＡＡＶを生成するのに必要とされる唯一のウイルスシスエレメントである。ＪＡｂ２１０ａコード配列の発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期エンハンサー（Ｃ４）とニワトリベータアクチンプロモーターとのハイブリッドであるＣＢ７プロモーターによって促される。この
プロモーターからの転写はニワトリベータアクチンイントロン（ＣＩ）の存在によって増進される。ヒトＪＡｂ２１０ａ  ｍＲＮＡ転写産物の終結を媒介するためにウサギベータグロビンポリＡシグナルが含められる。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧベクターゲノムの模式図を図１５に示す。
【０２４０】
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧの製造プロセスは、プラスミドＤＮＡによるヒト胚性腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞の一過的トランスフェクションを含む。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧの生産に使用されるＨＥＫ２９３マスターセルバンク（ＭＣＢ）は、ＦＤＡ及びＩＣＨガイドラインに詳しく示されているとおりに試験及び適格性確認を行った。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６層ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ（登録商標）（ＨＳ−３６）においてポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介によるＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによってバルク薬物質（ＢＤＳ）のバッチを生産する。下流でのプロセスには、可能な限り、使い捨て可能な閉鎖バイオプロセス系を伴う（濾過、タンジェンシャルフロー濾過及びカラムクロマトグラフィー）。ベクター精製にはいくつかの直交ステップを伴い、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧは最終製剤用緩衝液（ＦＦＢ；２００ｍＭの合計塩濃度、０．００１％（ｗ／ｖ）プルロニックＦ６８及び５％のグリセロールを含むＰＢＳ）で製剤化する。ＢＤＳバッチを冷凍し、後に解凍し、プールし、目標濃度に調節し、０．２２μｍフィルターで無菌濾過し、Ｄａｉｋｙｏ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｚｅｎｉｔｈ（登録商標）２ｍｌバイアル（Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．（登録商標））に充填する。充填データ及び培地適格性証明書はロット証明書類パッケージの一部として提供する。必要とされるベクター量を満足する必要に応じて複数のバッチを計画及び使用しつつ、５０ｘ  ＨＳ−３６細胞培養容器までのＧＭＰ生産バッチサイズを用いる。
【０２４１】
ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧは、（ｉ）ベクターゲノムプラスミド、（ｉｉ）ＡＡＶ  ｒｅｐ２及びｃａｐ  ｈｕ６８野生型遺伝子を含有しｐＡＡＶｈｕ６８．ＫａｎＲと呼称されるＡＡＶヘルパープラスミド、ならびに（ｉｉｉ）ｐＡｄΔＦ６（Ｋａｎ）と呼称されるヘルパーアデノウイルスプラスミドによるヒトＨＥＫ２９３ＭＣＢ細胞の三重プラスミドトランスフェクションによって生産する。パッケージングされるｐＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａ（ｐ３６１８）ベクターゲノムの大きさは４７１８ｂｐである。
【０２４２】
Ａ．ＡＡＶベクターゲノムプラスミド：ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧ（ｐ３６１８）
ＡＡＶベクターゲノムプラスミドｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧ（ｐ３６１８、図１６）を構築し、この大きさは７９７６ｂｐである。このプラスミドから導かれるベクターゲノムは、ＪＡｂ２１０ａ発現カセットを挟んでＡＡＶ２由来のＩＴＲを有する一本鎖ＤＮＡゲノムである。導入遺伝子カセットからの発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時早期エンハンサー（Ｃ４）とニワトリベータアクチンプロモーターとのハイブリッドであるＣＢ７プロモーターによって促される一方、このプロモーターからの転写はニワトリベータアクチンイントロン（ＣＩ）の存在によって増進される。発現カセットのためのポリＡシグナルはウサギベータグロビン（ｒＢＧ）ポリＡである。プラスミドは、コドン最適化、及び複数のインフルエンザ抗原を認識するＭＤＡｂ様ポリペプチドに融合させたヒトＩｇＧ１  ＦＣ領域をコードする配列（ＧｅｎｅＡｒｔ）の合成によって構築し、結果として得られた構築物を、ＣＢ７、ＣＩ及びｒＢＧ発現エレメントを含有しＡＡＶ２ＩＴＲに挟まれた発現カセットであるプラスミドｐＮ４６９にクローニングして、ｐＡＡＶ．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧ（ｐ３６１８）を得た。プラスミドの全ての構成部分はＱｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓによる直接配列決定によって検証され、Ｐｕｒｅｘｙｎでの製造プロセスの一部として確認される。
【０２４３】
Ｂ．配列エレメントの説明
末端逆位反復配列（ＩＴＲ）：ＡＡＶ  ＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ＃ＮＣ００１４０１）は、両端が同一であるが反対向きになっている配列である。ＡＡＶ及びアデノウイルスヘルパー機能がトランスで提供されるのに対し、ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列はベクターＤＮＡ複製起点としてもベクターゲノムのパッケージングシグナルとしても機能する。このように、ＩＴＲ配列はベクターゲノムの複製及びパッケージングに必要とされる唯一のシス配列に相当する。
【０２４４】
ＣＭＶ即時早期エンハンサー（３８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｋ０３１０４．１）。
【０２４５】
ニワトリβ−アクチンプロモーター（２８２ｂｐ、ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｘ００１８２．１）プロモーターは、高レベルのＪａｂ２１０ａ発現を促すために使用される。
【０２４６】
ＣＢ７プロモーターは、高レベルの気道特異的発現をもたらすことから、ｈＪＡｂの発現を促すために選択された。ＣＢ７プロモーターによって促される種々の導入遺伝子の強い気道特異的発現ならびに、マウス、フェレット及びＭＨＰを含めた様々な種の間での良好な翻訳可能性が認められている。
【０２４７】
ニワトリβ−アクチンイントロン：ニワトリβ−アクチン遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｘ００１８２．１）からの９７３ｂｐのイントロンはベクター発現カセット内に存在する。イントロンは転写されるが、スプライシングによって成熟ｍＲＮＡから除去され、結果としてその両側にある配列がまとめ合わされる。発現カセットにおけるイントロンの存在は、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送を容易にしてそれゆえに翻訳のためのｍＲＮＡの定常レベルの蓄積を増進することが示された。これは、遺伝子発現のレベルを向上させるために意図される遺伝子ベクターの一般的特徴である。
【０２４８】
コード配列：複数のインフルエンザ抗原を認識するＭＤＡｂ様ポリペプチドと融合したヒトＩｇＧ１  ＦＣ領域をコドン最適化及び合成した。元の可変ドメインは、様々なインフルエンザ抗原に照らして選り出すことによってラマＶＨＨライブラリーから同定された。インフルエンザ特異的ラマＶＨＨ鎖を完全にヒト化した。ヒト化多重ドメインポリペプチドの特異性及び幅はヒト化プロセス後も維持された。多重ドメインポリペプチドは、柔軟なＧｌｙ−Ｓｅｒリンカーによって繋げられた４つの可変重鎖ＩｇＧドメインを含有する。
【０２４９】
ポリアデニル化シグナル：１２７ｂｐのウサギβ−グロビンポリアデニル化シグナル（ＧｅｎＢａｎｋ＃Ｖ００８８２．１）は、抗体ｍＲＮＡの効率的なポリアデニル化のためのシス配列を提供する。このエレメントは、転写終結、新生転写産物の３’端部における特異的切断事象、及び長鎖ポリアデニル尾部の追加のためのシグナルとして機能する。
【０２５０】
Ｃ．ＡＡＶｈｕ６８ヘルパープラスミド：ｐＡＡＶ２／ｈｕ６８．ＫａｎＲ（ｐ００６８）
ＡＡＶ２／ｈｕ６８ヘルパープラスミドｐＡＡＶ２／ｈｕ６８（ロット＃：ｐ００６５；７３２９ｂｐ）を構築した。それは、ＡＡＶ血清型ｈｕ６８からの４つの野生型ＡＡＶ２  ｒｅｐタンパク質及び３つの野生型ＡＡＶ  ＶＰカプシドタンパク質をコードするＡＡＶヘルパープラスミドである。ヒト心臓組織ＤＮＡから新規ＡＡＶ配列が得られ、ＡＡＶ血清型ｈｕ６８と名付けた。キメラパッケージング構築物を作出するために、野生型ＡＡＶ２ｒｅｐ及びＡＡＶ９  ｃａｐ遺伝子を含有する、プラスミドｐＡＡＶ２／９（ｐ００６１−２）由来のＡＡＶ２  ｃａｐ遺伝子を除去し、ＡＡＶｈｕ６８  ｃａｐ遺伝子プラスミドｐＡＡＶ２／ｈｕ６８（ｐ００６５）の断片で置き換えた（図１７Ａ）。通常はｒｅｐ発現を促すものであるＡＡＶ  ｐ５プロモーターをこの構築物内でｒｅｐの５’端
部からｃａｐの３’端部へと移動させる。この配置は、プロモーターとｒｅｐ遺伝子（すなわちプラスミド主鎖）との間にスペーサーを導入すること、ｒｅｐの発現を下方制御すること、及びベクター産生を支援する能力を高めることのために役立つ。ｐＡＡＶ２／９のプラスミド主鎖はｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＫＳからのものである。プラスミドの全ての構成部分は直接配列決定によって検証した。その後、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置き換えてｐＡＡＶ２／ｈｕ６８ｎ．ＫａｎＲ（ｐ００６８）を得た（図１７Ｂ）。ＡＡＶｈｕ６８カプシド遺伝子の同一性は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって実施されるＤＮＡプラスミド配列決定によって確認された。
【０２５１】
Ｄ．ｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）アデノウイルスヘルパープラスミド
プラスミドｐＡｄＤｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）を構築したが、その大きさは１５，７７４ｂｐである。当該プラスミドは、ＡＡＶ複製にとって重要なアデノウイルスゲノムの領域、すなわちＥ２Ａ、Ｅ４及びＶＡ  ＲＮＡ（アデノウイルスＥ１の機能は２９３細胞によって提供される）を含有するが、その他のアデノウイルス複製または構造遺伝子を含有しない。プラスミドは、複製に必須なシスエレメント、例えばアデノウイルス末端逆位反復配列を含有せず、したがって、感染性アデノウイルスは生成しないと推測される。それはＡｄ５のＥ１、Ｅ３を欠失させた分子クローン（ｐＢＲ３２２系プラスミドであるｐＢＨＧ１０）から得られた。欠失は、不必要なアデノウイルス遺伝子の発現を除去するため及びアデノウイルスＤＮＡの量を３２Ｋｂから１２ｋｂに減らすためにＡｄ５  ＤＮＡ中に導入された（図１８Ａ）。最後に、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子で置き換えてｐＡｄｅｌｔａＦ６（Ｋａｎ）を得た（図１８Ｂ）。このプラスミドの中に残っているＥ２、Ｅ４及びＶＡＩアデノウイルス遺伝子は、ＨＥＫ２９３細胞内に存在するＥ１と共に、ＡＡＶベクター産生のために必要なものである。
【０２５２】
Ｅ．細菌性マスターセルバンク
細菌マスターセルバンク（ＢＭＣＢ）グリセロール原液は、プラスミドＤＮＡ増幅のために使用する終夜細菌培養物１Ｌのうちの１ｍＬを等体積の無菌５０％グリセロールと混合することによって作られる。混合物から構築物１つにつきＢＭＣＢグリセロール原液の２つの０．５ｍＬアリコートを調製し、Ｎａｌｇｅｎｅ冷凍用バイアルの中で−８０℃で保存する。ＢＭＣＢグリセロール原液の検証を行うために、増幅したプラスミドＤＮＡを、制限酵素消化に続くゲル電気泳動を含む構造解析、及びＱｉａｇｅｎでのサンガー配列決定による完全プラスミド配列解析に供する。プラスミドＤＮＡ製造者（Ｐｕｒｅｓｙｎ）へ出荷するための細菌ワーキングセルバンク（ＢＷＣＢ）グリセロール原液アリコートを調製するために、ＢＭＣＢグリセロール原液からの３ｍＬの培養物を接種し、一晩生育させる。終夜培養物１ｍＬを使用して上記のようなＢＷＣＢグリセロール原液アリコートを調製する。新しいＢＷＣＢグリセロール原液アリコートを、終夜細菌培養物の残りの２ｍｌから抽出したＤＮＡに対する上記構造解析によって検証する。ＢＷＣＢグリセロール原液は、プラスミドＤＮＡ製造者に受け取られた時点でプロジェクト固有の場所に−８０℃で保存される。生産培養物は、凍結ＢＷＣＢグリセロール原液から削り取ることによって播種される。
【０２５３】
Ｆ．プラスミドＤＮＡ製造
毒性学／生体内分布試験及び第１／２相治験のためのＡＡＶベクターの生産に使用する全てのプラスミドは、Ｐｕｒｅｓｙｎによって彼らの特別な臨床及びＩＮＤ準備プログラムを通して作られた。Ｐｕｒｅｓｙｎは、最終生成物の生産においてスーパーコイルプラスミドが中間体となる場合に組換えウイルスベクター及びその他の生成物のｃＧＭＰ製造に使用されるスーパーコイルプラスミドを生産している。プロセスに使用される全ての培地は（成分製品についての各販売会社からの分析証明書に基づいて）「動物質不含」である。発酵フラスコ、容器、膜、樹脂、カラム、管類からの、プロセスに使用するあらゆる
構成要素、及びプラスミドと接触するいかなる成分も、単一のプラスミド専用のものであり、ＢＳＦ不含の認証を受けている。共用される構成要素はなく、使い捨て製品を適宜使用する。ＰｏｌｙＦｌｏ（登録商標）樹脂、カラム及び利用する構成要素はＰｕｒｅｓｙｎによって専らプラスミドの製造のために使用される。特定プラスミド専用の構成要素を使用することに加えて、プラスミドを活動ベースで処理する。プラスミドの発酵、溶解及び精製は、特定プラスミドの生産専用の部屋で起こる。全ての部屋には指定のプラスミド名で印が付けられ、他のプラスミドはそれらの部屋で同時には処理されない。部屋及び装備はプラスミド生産活動ごとの合間に清掃する。各プラスミドの規格を表２に示す。さらに、生産された各プラスミドを、組換えＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧベクターの生産に使用される前に完全に配列決定する。
【表６】
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【０２５４】
Ｇ．ヒト胚性腎臓２９３マスターセルバンク
ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞は元来、切断されたアデノウイルス５型ＤＮＡでＨＥＫ細胞を形質転換することによって、Ｆｒａｎｋ  Ｇｒａｈａｍ及び同僚によって生み出された（Ｇｒａｈａｍ  ＦＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ  ５．Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  １９７７；３６：５９−７４）。細胞は、高力価ｒＡＡＶ産生に必要とされるＥ１Ａ及びＥ１Ｂ遺伝子産物を発現させる。ＨＥＫ２９３細胞は、接着性であり、トランスフェクト能が高く、ＤＮＡプラスミドトランスフェクションによって高力価のｒＡＡＶを生む。
【０２５５】
Ｈ．製造プロセス
製造プロセスフロー図は図１９Ａ〜Ｂに示されており、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧベクター生産プロセスを表す。製品調製に組み込まれる主な試薬を図の左側に示し、工程内品質評価を図の右側に描写する。各生産及び精製ステップの説明も提供されている。製品製造は直線的単位操作フローに従って行い、特に指定しない限り使い捨てのバイオ処理閉鎖系を利用する。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２
１０ａ．ｒＢＧは、特定の生産室内で製造される唯一の製品である。細胞播種から上清採集までの細胞培養を伴う生産プロセスの全ステップは、滅菌された単回使用管類及びバッグ組立体を使用して無菌的に実施される。Ｃｏｒｎｉｎｇ  １０層型ＣｅｌｌＳＴＡＣＫｓ（登録商標）（ＣＳ−１０）及びＨＹＰＥＲｓｔａｃｋ（登録商標）３６層（Ｓ−３６）において細胞を培養し、全ての開放型操作はクラスＩＩのバイオセーフティーキャビネット内でＩＳＯクラス５環境で実施する。精製プロセスは可能な場合には閉鎖系で実施するが、カラムクロマトグラフィー操作は、完全に閉鎖系であるとはみなされない。このリスクを最小限に抑えるために、単回使用流路をカラムクロマトグラフィー生産流れ基盤の一部として利用する。カラムクロマトグラフィー精製後、生成物をＦＦＢで透析濾過する。その後、ＢＤＳを−６０℃以下で冷凍する。認証済み規格に対してＢＤＳバッチを個別に試験及び検証し、それらを解凍し、必要に応じてプールし、最終製剤用緩衝液で目標濃度に調節し、無菌濾過し、それらの充填室内で無菌Ｄａｉｋｙｏ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｚｅｎｉｔｈ（登録商標）２ｍｌバイアル（Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．（登録商標））容器に充填する。無菌濾過に使用されたフィルターは、使用後にフィルターの完全性試験が行われる。充填後、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧは発売前検査及び品質保証（ＱＡ）再調査を受ける。細胞増殖から最終充填までの生産プロセス全体は、臨床現場への公表の前に職員及びＱＡ技術的再調査を受ける作成済みのバッチレコード書類（ＢＲＤ）に載録される。
【０２５６】
ａ．細胞播種
適格なＨＥＫ２９３細胞株を生産プロセスに使用する。ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）は、十分に特性評価されたＭＣＢから生産された。ベクター生産に使用する細胞培養物は、１回解凍したＷＣＢバイアルから開始し、マスターバッチレコード書類（ＭＢＲ）に従って増殖させる。Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｔ−フラスコ及びＣＳ−１０を使用して、細胞を５×１０９〜５×１０１０細胞にまで増殖させるが、これは、ＢＤＳロット１つあたりベクター生産のために４５個までのＨｙｐｅｒｓｔａｃｋ−３６（ＨＳ−３６）に播種するのに十分な細胞量を生成することを可能にする。ガンマ線照射され米国から提供される１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなる培地中で細胞を培養する。細胞は固定化依存性であり、細胞解離は、動物産物を含まない細胞解離用試薬であるＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔを使用して成し遂げられる。細胞播種は、無菌の単回使用バイオ処理バッグ及び管類のセットを使用して成し遂げられる。細胞は５％（±０．５％）ＣＯ２雰囲気下で３７℃（±２℃）で維持される。
【０２５７】
ｂ．一過的トランスフェクション
およそ３日間の増殖（ＤＭＥＭ培地＋１０％ＦＢＳ）の後、ＨＳ−３６細胞培養培地を新鮮な無血清ＤＭＥＭ培地で交換し、最適化ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）に基づくトランスフェクション方法を用いて３つの生産プラスミドをトランスフェクトする。生産プロセスに使用する全てのプラスミドは、ＣＭＯ品質システムならびに、トレーサビリティ、書類管理及び材料分離を可能にする管理を利用する基本的施設との関連において生産される。ＢＳＣにおいて十分なプラスミドＤＮＡトランスフェクション複合体を作製して（ＢＤＳバッチ１回あたり）５０ＨＳ−３６にトランスフェクトする。まず、シス（ベクターゲノム）プラスミド、トランス（カプシド遺伝子）プラスミド及びヘルパー（Ａｄ）プラスミドを０．１：１：２の比で含有しＧＭＰグレードのＰＥＩ（ＰＥＩＰｒｏ、ＰｏｌｙＰｌｕｓ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ＳＡ）を含有するＤＮＡ／ＰＥＩ混合物を調製する。このプラスミド比は、小規模最適化試験においてＡＡＶ産生にとって最適となるように決定されたものである。十分に混合した後、溶液を室温で２５分間静置し、その後、反応を停止させるために無血清培地に加え、最後にＨＳ−３６に加える。トランスフェクション混合物をＨＳ−３６の３６層全てにおいて等しくし、細胞を５％（±０．５％）ＣＯ２雰囲気下で５日間３７℃（±２℃）でインキュベートする。
【０２５８】
ｃ．細胞培地採集
使い捨てバイオ処理バッグを使用して培地をユニットから無菌的に排出させることによって、各ＨＳ−３６からトランスフェクトした細胞及び培地を採集する。培地採集後、およそ２００リットルの体積にＭｇＣｌ２（ベンゾナーゼの補助因子）を２ｍＭの終濃度になるまで補充し、ベンゾナーゼヌクレアーゼ（カタログ＃：１．０１６７９７．０００１、Ｍｅｒｃｋ  Ｇｒｏｕｐ）を２５ユニット／ｍＬの終濃度になるまで添加する。インキュベータ内で（使い捨てバイオ処理バッグに入った）産物を３７℃で２時間インキュベートして、トランスフェクション手順の結果としての採集物の中に残存する細胞ＤＮＡ及びプラスミドＤＮＡの酵素的消化のために十分な時間を提供する。このステップは、最終ベクター中に残存するＤＮＡの量を最小限に抑えるために実施される。インキュベート後、濾過及び下流でのタンジェンシャルフロー濾過の間の産物回収に役立てるためにＮａＣｌを５００ｍＭの終濃度になるまで添加する。
【０２５９】
ｄ．清澄化
細胞及び細胞残屑は、蠕動ポンプによって駆動される無菌閉鎖型管類及びバッグのセットとして直列で連結されたデプスフィルターカプセル（１．２／０．２２μｍ）を使用して産物から除去される。清澄化は、下流のフィルター及びクロマトグラフィーカラムが汚染から保護されることを保証し、生物汚染軽減濾過は、上流での生産プロセスの間に潜在的に取り込まれたいかなる生物汚染も下流での精製よりも前の一連の濾過の最後に除去されていることを保証する。採集材料はＳａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ  ＰＥＳカプセルフィルター（１．２／０．２２μｍ）（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．）に通される。
【０２６０】
ｅ．大規模タンジェンシャルフロー濾過
清澄化した生成物の体積の低減（１０分の１）は、あつらえの無菌閉鎖型バイオ処理管類、バッグ及び膜のセットを使用してタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって実現される。ＴＦＦの原理は、圧力下で溶液を好適な多孔度の膜（１００ｋＤａ）に平行に流すことである。圧力差分は、膜孔よりも大きい分子を保持しつつ、より小さい径の分子を膜中へ、そして効果的に排液流中へと送り込む。溶液を再循環させることによって、平行流は膜表面をかっさらい、膜孔の詰まりを防止する。適切な膜孔径及び表面積を選択することによって、液体試料の体積が急速に低減され得る一方で所望の分子が保持及び濃縮され得る。ＴＦＦ用途における透析濾過には、液体が膜を通り抜けて排液流へと流れるのと同じ速度で再循環している試料に新鮮な緩衝液を添加することを伴う。透析濾過の体積が増加するにつれて、ますます多くの量の小分子が再循環試料から除去される。これによって清澄化生成物は適度に精製されるだけでなく、次の親和性カラムクロマトグラフィーステップに適合する緩衝液交換も成し遂げられる。したがって、濃縮のために１００ｋＤａのＰＥＳ膜を利用し、そうしてｐＨ７．５の２０ｍＭのトリスと４００ｍＭのＮａＣｌとからなる最低４ダイア容積の緩衝液で透析濾過する。透析濾過生成物は、４℃で一晩保存され、その後、いかなる析出物質も除去すべく１．２／０．２２μｍデプスフィルターカプセルでさらに清澄化される。
【０２６１】
ｆ．親和性クロマトグラフィー
ＡＡＶｈｕ６８血清型を効率的に捕捉するＰｏｒｏｓ  ＴＭ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ＳｅｌｅｃｔＴＭ  ＡＡＶ９親和性樹脂（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に対して透析濾過生成物を使用する。これらのイオン性条件下では、残存する細胞ＤＮＡ及びタンパク質はかなりの割合でカラムを通り抜けて流れる一方、ＡＡＶ粒子は効率的に捕捉される。使用後、カラムを５体積の低塩ベンゾナーゼ溶液（２５００ユニット／ｍＬのベンゾナーゼ、ｐＨ７．５の２０ｍＭのトリス、及び４０ｍＭのＮａＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２）で処理して、残存するいかなる宿主細胞及びプラスミド核酸も除去する。カラムを洗浄して追加給液不純物を除去し、続いて、１／１０の体積の中和用緩衝液（ｐＨ１０．２の
２００ｍＭのビストリスプロパン）中への回収によって速やかに中和される低ｐＨステップ溶離（４００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５の２０ｍＭのクエン酸ナトリウム）を行う。
【０２６２】
ｇ．アニオン交換クロマトグラフィー
空のＡＡＶ粒子を含めた工程内不純物のさらなる低減を実現するために、Ｐｏｒｏｓ−ＡＡＶｈｕ６８溶離プールを５０倍に希釈（２０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ１０．２の０．００１％のプルロニックＦ６８）してイオン強度を下げ、ＣＩＭｕｌｔｕｓＴＭ
ＱＡモノリスマトリックス（ＢＩＡ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）への結合を可能にする。低塩洗浄に続いて、６０カラム容積（ＣＶ）のＮａＣｌ線形塩勾配（１０〜１８０ｍＭのＮａＣｌ）を用いてベクター産物を溶離させる。この緩やかな塩勾配は、ベクターゲノムを含有する粒子（充満粒子）から、ベクターゲノムを有さないカプシド粒子（空の粒子）を効果的に分離し、充満カプシドが濃縮された配合物をもたらす。画分は、１／１００の体積の０．１％プルロニックＦ６８及び１／２７の体積のビストリスｐＨ６．３がそれぞれチューブとの非特異的結合及び高ｐＨへの長い曝露を最小限に抑えるために入っている無菌ポリプロピレンチューブの中へと回収される。プールした充満粒子ピーク画分を２０ｍＭのビストリスプロパン、ｐＨ１０．２の０．００１％のプルロニックＦ６８で２０倍に希釈し、洗浄して準備しておいた同じカラムに対して再び使用する。１０〜１８０ｍＭのＮａＣｌ塩勾配を再び用い、適切な充満粒子ピーク画分を回収する。ピーク面積を評価し、おおよそのベクター収率の決定のために以前のデータと比較する。
【０２６３】
ｈ．ＢＤＳを得るための最終製剤用緩衝液（ＦＦＢ）及び生物汚染軽減濾過
２００ｍＭの合計塩濃度、０．００１％（ｗ／ｖ）プルロニックＦ６８及び５％のグリセロールを含むＰＢＳ、そして濃縮して所望の目標（すなわち４．５〜５．５×１０１３ＧＣ／ｍｌ）のＢＤＳ中間物質が得られる。ＢＤＳ中間物質検査のために試料を抜き取る。ＢＤＳ中間物質を無菌濾過（０．２２μｍ）し、無菌ポリプロピレンチューブの中に保存し、最終充填のための取出し時まで隔離された場所に−６０℃以下で冷凍する。
【０２６４】
ｉ．最終充填
２００ｍＭの合計塩濃度、０．００１％（ｗ／ｖ）プルロニックＦ６８及び５％のグリセロールを含むＰＢＳ。その後、最終的に生成物を０．２２μｍフィルターに通し、無菌のＤａｉｋｙｏ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｚｅｎｉｔｈバイアル（Ｗｅｓｔ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．（登録商標））に充填し、バイアル１個あたり０．５ｍＬ以上１．０ｍＬ以下の充填容積のところにかしめシール付き栓をする。個々のバイアルにラベルを付ける。ラベルを付けたバイアルは−６０℃以下で保管する。投与前にＦＦＢで希釈することを必要とする用量もあるであろう。投薬時に希釈は臨床現場の薬局によって行われる。
【０２６５】
ｊ．生体適合性
投薬レベルの変動性を生む可能性がある問題は、ベクター保存中及び患者への投与の間のプラスチック及びその他の固体表面への結合によるＡＡＶベクターの逸失である。この点に関して、臨床上適する界面活性剤であるプルロニックＦ６８は、ＡＡＶベクターの最終製剤用緩衝液に添加され、この種の逸失を最小限に抑えることが期待される。
【０２６６】
実施例１７−ＡＡＶｈｕ６８．ＪＡｂ２１０ａ媒介による免疫不全マウスのインフルエンザＡの予防
機能的免疫系を欠くマウスの効果的な予防の可能性を評価した。成熟Ｔ細胞またはＢ細胞を欠くＲａｇ  ＫＯマウス（Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ、Ｊａｘ００２２１６）を使用した。Ｒａｇ  ＫＯ雌マウス（６〜８週齢）のＩＮに、１７μｌのアリコート３つとして送達される５１μｌの総体積にＰＢＳで希釈した１０１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧを与えた。７日後にマウスを５ＬＤ５０のＰＲ８で攻撃した
。図２０は、ベクター投与から７日後に攻撃したＲａｇ  ＫＯマウスの体重の変化率（％）を示す線グラフである。ｘ軸で表されるように、マウスの体重を毎日測定した。感染インフルエンザ攻撃の日の体重を基準として体重減少百分率を算出した。苦痛の兆候または３０％以上の体重減少を示しているマウスはどれも安楽死させた。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧを受けている全てのＲａｇ  ＫＯマウスはＰＲ８攻撃を生き抜いた。
【０２６７】
攻撃を生き抜いたＲａｇ  ＫＯマウスをその後、インフルエンザＢによる第２の攻撃に供した。Ｒａｇ  ＫＯマウスは機能的免疫系を欠くことから、この実験は、先行する感染が次のインフルエンザ攻撃の予防の有効性に及ぼす影響を扱う上で役に立った。先行する感染の非存在下でインフルエンザＢを予防する有効性を確認するために、対照Ｒａｇ  ＫＯマウスに、１７μｌのアリコート３つとして送達される５１μｌの総体積にＰＢＳで希釈した１０１０ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧを与えた。７日後、ナイーブマウス及びベクター処置生存マウスを含むマウスの群（先に図２０に示した）を５ＬＤ５０のＢ／Ｌｅｅ／４０で攻撃した（図２１Ａ及び図２１Ｂ）。
【０２６８】
図２１Ａは、５ＬＤ５０のＢ／Ｌｅｅ／４０で攻撃したＲａｇ  ＫＯマウスの体重の変化率（％）を示す線グラフである。ｘ軸で表されるように、マウスの体重を毎日測定した。感染インフルエンザ攻撃の日の体重を基準として体重減少百分率を算出した。苦痛の兆候または３０％以上の体重減少を示しているマウスはどれも安楽死させた。生存しているマウスを攻撃から４２日後に屠殺した。図２１Ｂは、Ｂ／Ｌｅｅ／４０攻撃後の生存率をグラフ化したものである。先行するインフルエンザ感染の非存在下でＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧベクターを受けているマウスは５ＬＤ５０のＢ／Ｌｅｅ／４０による攻撃を生き抜いた。しかしながら、以前にＰＲ８攻撃に曝露されたマウスの群の生存に対する影響があった。本発明者らは、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧベクターを受けてＰＲ８で攻撃されたＲａｇ  ＫＯマウスの生存率が８０％であることを認めた。
【０２６９】
実施例１８−ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧの毒性及び忍容性；アカゲザルにおけるＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧの非臨床薬理学／毒性及び生体内分布試験
Ａ．概要
この非臨床薬理学／毒性試験のために、１または２回用量のＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧまたは対照としてのビヒクル（ＦＦＢ）単独の鼻腔内送達をアカゲザルに与える。ベクターは無菌の１×ＤＰＢＳ＋０．００１％プルロニックＦ−６８で希釈する。第Ｉ相治験のための臨床用ベクター製剤は、終塩濃度２００ｍＭ、０．００１％（ｗ／ｖ）のプルロニックＦ６８、及び５％のグリセロールを有するＰＢＳである。ベクター投与後、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）の全体的所見を毎日監視する。週に２回、ＮＨＰの包括的臨床病態（鑑別を伴う細胞数算定、臨床化学及び凝血パネル）を追跡評価し、遺伝子移入ベクターに対する免疫反応を毎月追跡評価する［ＡＡＶｈｕ６８カプシドに対する中和抗体（ＮＡｂ）、及びカプシドと導入遺伝子との両方に対する細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって評価する］。
【０２７０】
この試験のベクター投与後２８日目及び９０日目の存命期間の終了後にサルを剖検し、組織を包括的組織学的検査のために採取する。ｑＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲによるそれぞれゲノムコピー及び導入遺伝子発現分析のためにＤＮＡ及びＲＮＡを鼻、気管及び肺の試料から抽出する。鼻腔洗浄及び血清においてＪＡｂ２１０ａ発現も評価する。剖検時にリンパ球を肺、脾臓及び骨髄から採集してこれらの器官におけるＣＴＬの存在を調べる。
【０２７１】
Ｂ．ベクター
試験品ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧを実施例１６に記載のとおりに製造する。最終生成物をＦＦＢで希釈する。生産後、投薬の日までベクターを−６０℃未満で保存する。ベクター調製は投薬の日に実施する。調製及び希釈は検証される。希釈したベクターは６時間以内の投薬まで濡れた氷の上または２〜８℃に保つ。対照動物にはベクターを含有しないビヒクル緩衝液（対照品）を投与する。これは、この試験のためのビヒクル対照としての役割を果たす。対照品は受け入れてから投薬日まで室温で保存する。投薬後、残ったベクター製剤及び対照品は−６０℃未満で保持及び冷凍する。
【０２７２】
ＬＭＡ（登録商標）ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）（ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標））装置（Ｔｅｌｅｆｌｅｘ，Ｉｎｃ）をＳＯＰ７４１０に従って使用してＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧベクターを非侵襲的に各鼻孔に送達する。ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）は、承認薬をＩＮに送達され得る微細な霧にして噴霧する。他の種、例えばマウスでの同様の試験は鼻道を介した直接液体滴下注入を用いて実施した。しかしながら、液体送達によるマウスの鼻道に対する遺伝子発現は、臨床装置ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）を使用してベクターが送達されるもっと高等な種のそれと同等にはならない。しかも、ＮＨＰにおける特定の毒性学的応答及び免疫応答はヒトのそれに近いものを表す。
【表７】
2020510430.tif 000013
【０２７３】
ヒトの鼻の表面積（０．０１８１ｍ２）はアカゲザルの鼻の表面積（０．００６１６ｍ２）よりもおよそ２．９４倍大きい（表３）。それゆえ、ＮＨＰの鼻内に送達するために提案される体積は、０．８０ｍＬ（ヒトの鼻内にベクターを送達する体積）÷２．９４＝０．２７２ｍＬである。ヒトに使用するための最高臨床用量は５×１０１３ＧＣであると提案される。この用量をアカゲザルの鼻の表面積に基づいて外挿すると、アカゲザルに使用するための類似した用量は５×１０１３ＧＣ÷２．９４＝１．７×１０１３ＧＣである。小さい体積をサルの鼻に送達するとき、改善された精度を可能にするためには、体積を０．２８ｍＬに増やして鼻孔１つあたり６８μＬの代わりに７０μＬのアリコート２つを送達して向上した精度を可能にし、両方の鼻孔を処置する。
【０２７４】
Ｃ．動物
７頭の雄及び７頭の雌のアカゲザル（３〜６歳、３〜１０ｋｇ）をこの試験で使用し、ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧの２つの異なる用量を検査する。ＮＨＰのある群（群１）は、ヒトの鼻の表面積（表３）に基づいて外挿した場合に治験の最高ベクター用量に相当する０．２８ｍＬ（７０μＬのアリコート４つとして与えられる）の総体積で１．７×１０１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧを受ける。ＮＨＰの他の群（群２）は、総体積０．５６ｍＬとして与えられる（０．０７ｍＬのアリコート８つとして与えられる）４．２５×１０１３ＧＣのＡＡＶｈｕ
６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧを受ける。この用量は、ＮＨＰの鼻の表面積に基づいて外挿したとき、治験の最高ベクター用量よりも２．５倍高い。
【０２７５】
ベクターは、ＭＡＤ  ｎａｓａｌを使用してＩＮに投与される。ベクターは、左右両方の鼻孔に与える０．０７ｍＬのアリコートとして送達され、１．７×１０１３ＧＣ用量の場合には鼻孔１つあたり２つのアリコートが５分掛けて送達され、４．２５×１０１３ＧＣ用量の場合には鼻孔１つあたり４つのアリコートが５分掛けて送達される。鼻腔路を介したＩＮ経路の利用が選択される、というのも、それは、疾患標的の臨床部位である鼻を指向するための最も効率的な経路であるからである。
【０２７６】
各性別のＮＨＰをオンラインプログラムＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｒ（ｗｗｗ．ｒａｎｄｏｍｉｚｅｒ．ｏｒｇ／ｆｏｒｍ．ｈｔｍ）によって無作為に３つのコホートのうちの１つに割り当てる。ベクター投薬前の少なくとも３つの時点で血液を採取し、鑑別を伴う細胞数算定及び臨床化学のためにＡｎｔｅｃｈ  ＧＬＰへ送る。試験開始前の少なくとも２回、ＮＡＢ力価を決定し、ベクターカプシド及び導入遺伝子に対する細胞性免疫応答のベースラインレベルを提供するためにＰＢＭＣを単離する。全てのベースライン評価は試験開始前の１ヶ月以内に実施する。
【０２７７】
試験室は廊下に対して陽圧となる気流の条件下で維持される。部屋は独立的にフィルターを通して１時間あたり最低１０回の換気による１００％新鮮な空気が供給される。動物待機室は３０〜７０％の湿度範囲で６４〜７９°Ｆ（１８〜２６℃）の範囲の温度に維持される。温度、湿度、換気はＳＯＰ８０２６に準拠してＥｄｓｔｒｏｍ  Ｗａｔｃｈｄｏｇ  Ｓｙｓｔｅｍによって監視される。
【０２７８】
動物は個別にＡＢＳＬ−２条件下で床面積４．３〜６．０平方フィート及び高さ３０〜３２インチのステンレス鋼製ケージ内にそれぞれ収容する。全てのケージサイズ及び収容条件は、実験動物の管理と使用に関する指針に準拠し、ＳＯＰ７７００及びＳＯＰ７７１０に準拠する。収容室及びケージは常時施錠が保たれ、権限を与えられた者だけが利用できる。ベクター投与前の抗体陽転（ＡＡＶベクターカプシド特異的ＮＡＢの発達）を防止するために、ＩＡＣＵＣによって承認される適用除外の下で動物を個別に収容する。ＳＯＰ７７０９に準じてベクター投与後２週目から動物をペア飼育することができる。動物の行動的、情動的及び社会的要求は、ＳＯＰ７７０１に準拠して人間及び同種との相互作用（すなわち聴覚的及び視覚的刺激）、餌報酬ならびに遊具によって提供される。２週間ごとに遊具を衛生化して使用を交代させる。施設内への立ち入りは鍵及び記章アクセスによって管理される。明るい１２時間：暗い１２時間の自動制御光周期が維持され、建物自動化システムによって管理され、Ｅｄｓｔｒｏｍ  Ｗａｔｃｈｄｏｇ  Ｓｙｓｔｅｍによって監視される。暗期は１９００時間（±３０分）で開始される。ケージは、ＳＯＰ７７１０及びＳＯＰ７７１１に準拠して毎日清掃され２週間ごとに変更及び衛生化される。ケージ及び台の衛生化は、汚れ、屑、汚物、便または疾患危険源が過度に蓄積するのを防止するためにケージ洗浄装置を使用して２週間に１回及び必要となる度に行われる。ＳＯＰ７７１０に従って動物はＰＭＩ  Ｆｅｅｄｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｒｅｎｔｗｅｅｄ，ＭＯからのＣｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｐｒｉｍａｔｅ  Ｄｉｅｔ  ５０４８が不断給餌される。餌供給者によって分析が慣例的に実施される。水は自動給水システムによって不断で提供される。給水はフィラデルフィア市から引き込まれ、逆浸透によって濾過される。処理水は、あり得る化学汚染について年に２回（Ｌａｎｃａｓｔｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＰＡ）、及び細菌汚染について年に４回（ＱＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ，ＰＡ）分析される。試験期間全体にわたって各試験動物のケージに認可済みのエンリッチメント装置が加えられる。汚染についての分析は製造業者によって実施され、分析データは入手可能である。果物、野菜、ナッツ及び穀物などの食餌エンリッチメントを毎日提供する。コング、鏡、パズル型給餌器及びレーズンボール
などの遊具を毎日提供する。また、動物は日常的に人間との相互作用と共に視覚エンリッチメントを受ける。ＳＯＰ７４０８に準拠してサルに麻酔を掛ける。
【０２７９】
ＳＯＰ７４０８に準拠してサルに麻酔を掛ける。以下のとおり０．２８〜０．５６ｍＬのアリコートの範囲の体積でベクターを鼻に投与する。ＭＡＤ  ｎａｓａｌを使用してＡＡＶベクターを送達する。ベクターを０．０７ｍＬのアリコートとして各鼻孔に送達する。１．７×１０１３ＧＣ用量の場合には各鼻孔に２つのアリコートを５分掛けて送達する。４．２５×１０１３ＧＣ用量の場合には各鼻孔に４つのアリコートを５分掛けて送達する。ベクター投与後、動物の全般的所見を毎日監視する。ＳＯＰ７４０４に準拠して全ての所見を記録する。
【０２８０】
動物の全体的外観、毒性の兆候、苦痛及び行動変化を毎日の目視観察によって監視する。全ての動物について、採血のための麻酔を掛けるときは毎回身体検査を行う。剖検時には巨視的異常がないか動物を検査する。
【０２８１】
Ｄ．試験予定表
【表８−１】
2020510430.tif 000014
【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【０２８２】
ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）を使用してベクターをＩＮに投与する。ベクターを、左右両方の鼻孔に与える７０μＬのアリコートとして送達するが、１．７×１０１３ＧＣ用量の場合には鼻孔１つあたり２つのアリコートを５分掛けて送達し、４．２５×１０１３ＧＣ用量の場合には鼻孔１つあたり４つのアリコートを５分掛けて送達する。１．７×１０１３ＧＣ及び４．２５×１０１３ＧＣの用量をこの試験のために選択した。治験の対象に投与する最高用量は０．８０ｍＬのＰＢＳ中の５×１０１３ＧＣであり、これは、ＭＡＤ
Ｎａｓａｌ（商標）を使用して０．２０ｍＬのアリコートにして与えられる。群１（１．７×１０１３ＧＣ）及び群２（４．２５×１０１３ＧＣ）のために選択される用量はそれぞれ、治験のために計画される最高用量である５×１０１３ＧＣ、及び治験のために計画される最高用量よりも２．５倍高い用量を反映している。
【０２８３】
各ベクター処置群は、６頭の動物を含み、アカゲザルの雄雌混合である。対照群は、２頭の動物を含み、２８日目に屠殺される。試験は、ＡＡＶｈｕ６８に酷似した血清型であるＡＡＶ９の発現プロファイルを評価することが意図されたアカゲザルの鼻道において実
施した。アカゲザルＡＦＰ（ｒｈＡＦＰ）を含めたいくつかの導入遺伝子を利用して、ＡＡＶを鼻に直接塗布した場合のＮＨＰの鼻腔洗浄液における発現の動態の時間表を打ち立てた。導入遺伝子発現は、早くもベクター送達後１４日目に検出され、１４日目から２８日目までの間にそのピークに達した。その後、導入遺伝子発現は安定し、５６日目から８４日目までの間に減衰し始めた。本明細書に記載の目下の試験のために選択した時点は、遺伝子発現のピーク（２８日目）、さらにはベクター発現のピークより後（９０日目）を捉えるために選択した。これらの時点は、早い時間（２８日目）及び遺伝子発現が減衰する長い期間（９０日目）でのベクターの安全性及び毒性に関する重要な情報を収集することを可能にする。
【０２８４】
試験０日目にＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）を使用してサルの鼻の中に総体積０．２８ｍＬ中１．７×１０１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧ（７０μＬのアリコート４つ）か、総体積０．５６ｍＬ中４．２５×１０１３ＧＣのＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧ（７０μＬのアリコート８つ）かのどちらかを投薬する。
【０２８５】
ＳＯＰに準拠して全ての動物に対して生存能力確認を毎日実施する。ＳＯＰに準拠して体重、体温、呼吸速度及び心拍数を追跡評価し、全時点で記録する。ＳＯＰ７４０８及びＳＯＰ７４１１に準拠してＮＨＰに麻酔を掛け、血液を採取する。採取した血液はＣＢＣ、臨床化学及び凝血パネル検査のために使用する。臨床病理学、臨床化学及び凝血パネルはＡｎｔｅｃｈ  ＧＬＰによって実施される。動物の血液化学及び血液プロファイルの変化を分析する。化学、鑑別を伴う全血球算定（ＣＢＣ）、及び血小板計数を、示された時点の動物からの試料に対して評価する。ＳＯＰ７４０８に準拠して動物に麻酔を掛ける。小児用フォーリーカテーテルが片方の鼻孔の中に配置され得、定位置に配置された時点でバルーンを空気で拡張させ、抵抗が得られるまでカテーテルを引き戻す。サルの頭部／身体をそれぞれ横に傾け、その後、（鼻孔１つあたり）５ｍｌ以下のＰＢＳを使用して鼻腔を洗浄し、それぞれ鼻孔直下に配置されたＦａｌｃｏｎチューブ内に流体を液滴として採集する。過程の最後にカテーテルを取り出して廃棄し、隣の鼻孔において手順を繰り返す。血清を分離させ、ラベルを付けた微量遠心チューブ内に等量ずつ入れる。ＳＯＰに準拠して、示された時点からの血清に対してＮＡＢアッセイを用いて体液性免疫応答を検査する。ＳＯＰ６００３に準拠してＰＢＭＣを単離及び凍結保存する。ＳＯＰ６００２に準拠して、ＡＡＶｈｕ６８及びＪＡｂ２１０ａに対するＴ細胞応答をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによって分析するが、この場合、陽性応答の基準は、スポット形成単位（ＳＦＵ）／１０６細胞が５５及び培地陰性対照値（刺激なし）×３よりも大きいことである。血清ＮＡＢアッセイはＳＯＰに準拠して行い、ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴはＳＯＰ６００２に準拠して行い、ＡＡＶベクター排出はＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲによってＳＯＰに準拠して行う。ＳＯＰ７４２８に準拠して、示された時点に尿及び便試料を採取し、ドライアイス上で冷凍し、−６０℃以下で保存する。ＳＯＰ３００１の趣旨でＤＮＡを抽出しＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲ反応を実施するが、試料に基づいてプロトコールに対する改変が必要となる場合がある。
【０２８６】
予定された剖検時点（ベクター投薬後２８日目及び９０日目）でＮＨＰをＳＯＰ７４２２及びＳＯＰ７６００に従って安楽死させる。ＳＯＰ７４２２に準拠して、心拍及び呼吸の欠如によって死亡を確認する。病理学のためにＳＯＰ７６００に準拠して動物を剖検し組織を採取する。生体内分布のための組織も採取し、−６０℃以下で保存する。
【０２８７】
生体内分布及び組織学の両方のために採取する組織は、心血管系の心臓、大動脈（胸部及び腹部）；消化管系の肝臓（尾状葉、左葉、中葉及び右葉）、胆嚢、食道、胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、膵臓；内分泌系の下垂体、副甲状腺が付いた甲状腺左葉及び右葉、副腎（左及び右）；造血系の脾臓、胸腺、リンパ節（鼠径部、左及び右）、リン
パ節（腸間膜）、リンパ節（腋窩、左及び右）、骨髄（肋骨）、パイエル板（腸の切片と共に採取される）；筋骨格系の骨格筋（大腿四頭筋）；呼吸器系の副鼻腔、篩板、鼻中隔、咽頭、喉頭、気管、肺（４つの肺葉）；神経系の脳（大脳葉［前頭葉及び後頭葉］を含む）、中脳、視神経（左及び右）、視交叉、小脳、髄質／橋、眼（左及び右、改変ダビッドソン固定液中に採取される）；脊髄（頚部、胸中部、腰部）、坐骨神経（左及び右）；生殖器系（雄）の精巣（左及び右、改変ダビッドソン固定液中に採取される）、精巣上体（左及び右）、前立腺；生殖器系（雌）の卵巣（左及び右）、子宮、乳腺（左及び右）；泌尿器系の腎臓（左及び右）、膀胱；ならびに種々雑多な胸部入れ墨、皮膚、巨視的所見（剖検時になされ、組織病理学がふさわしくないもの（例えば、流体、排泄空気、欠けている解剖学的部分）は採取しない）を含む。
【０２８８】
ＳＯＰ４００３、４００４、４００６及び４００７に準拠して、全ての組織を１０％ＮＢＦまたは改変ダビッドソン固定液で固定及び処理する。剖検中に認められる巨視的病変部は採取し、１０％ＮＢＦ中に貯蔵する。組織処理、組織病理学的評価、Ｔ細胞応答及びＲＮＡ調製は以下の各ＳＯＰに従って行う。組織病理学スライドを評価する。
【０２８９】
ＳＯＰ６００４、６００５及び６００６に準拠して剖検時にそれぞれ肺、肝臓、脾臓及び骨髄を採取し、リンパ球を各組織から単離する。ＳＯＰ６００２に準拠してＡＡＶｈｕ６８及びＪＡｂ２１０ａに対するＴ細胞応答をＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴによって分析するが、この場合、陽性応答の基準は、スポット形成単位（ＳＦＵ）／１０６細胞が５５及び培地陰性対照値（刺激なし）×３よりも大きいことであった。剖検時に組織を生体内分布のために採取し、ドライアイス上で冷凍し、−６０℃以下で保存する。必要とされる場合には、ＳＯＰ３００１に準拠して、ＤＮＡを組織から抽出しＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲ反応を実施した。加えて、剖検時に組織をＲＮＡ発現のために採取し、ドライアイス上で冷凍し、−６０℃以下で保存する。ＤＮアーゼで処理した全ＲＮＡを１００ｍｇの鼻、気管、及び種々の肺葉のいくつかの肺野から単離する。分光光度測定によってＲＮＡを定量し、ランダムプライマーを使用してアリコートをｃＤＮＡに逆転写する。ベクター由来のメッセージを含有するｃＤＮＡをｑＰＣＲで定量して、導入遺伝子及びポリＡシグナルにまたがる領域であるベクター固有配列を検出する。
【０２９０】
血液化学値に対して統計解析を実施する。野生型アカゲザルの正常値の範囲は、ベクター投薬前の試験動物（最低２つのベースライン）について収集した全ての値の平均を採ること、及び標準偏差（ＳＤ）を算出することによって生成される。範囲は平均±ＳＤとして表される。平均の２つのＳＤよりも外にある値は極値とみなされる。
【０２９１】
以下の臨床化学パラメータを決定する：アルブミン、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アミラーゼ、（直接）ビリルビン、（総）ビリルビン、カルシウム、塩化物、コレステロール、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、クレアチニン、ガンマグルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、グルコース、乳酸脱水素酵素（ＬＤ）、リパーゼ、マグネシウム、リン、カリウム、ナトリウム、トリグリセリド、総タンパク質及び尿素窒素。
【０２９２】
ＣＢＣ及び血小板算定のための血液を採取し、一晩掛けてＡｎｔｅｃｈ  ＧＬＰへと出荷するときまで２〜８℃で保存する。以下の血液学的パラメータが決定される：全血球数、平均血小板体積（８時間安定）、赤血球数、赤血球分布幅、ヘモグロビン、ヘマトクリット、平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、血小板数、白血球数、白血球鑑別及びＲＢＣ形態。
【０２９３】
実施例１９−臨床展開−抗インフルエンザ抗体の送達のためのＡＡＶベクターの安全性
及び忍容性
Ａ．概要
第１相治験は、次の第２相有効性評価のためにＡＡＶ２／ｈｕ６８によって発現する導入遺伝子の適切な用量を決定すべく研究中である。臨床展開は、ＪＡＢ２１０ａ  ＭＤＡｂを送達するＡＡＶ２／ｈｕ６８ベクターの単回投与を評価する第１相用量漸増試験から開始され、最適用量での安全性評価のための拡張を伴う。最初の第１相試験においてベクターが、許容される安全性及びＰＫプロファイルを有している場合、次の第２相展開は、制御されたインフルエンザ攻撃モデルにおける安全性、ＰＫ及び予備的有効性についてのベクターの評価を含み得る。高齢者集団（６５歳以上）がこの臨床製品開発計画の標的集団である。ベクターは、２つの潜在的役割を有することが予測される：流行病に対する対抗策、及び従来の季節ごとのワクチンに対する代替策。流行病対抗策としてのその用途は、インフルエンザ流行病が出現する間の備蓄または製造活動に関連するものであり得る。第１相試験は、適格なＣＲＯにて第２相有効性試験（すなわち攻撃試験）への拡張の可能性を有して米国内で開始される。健常ボランティアにおいて安全性及び予備的有効性が実証される場合、さらなる展開のために次の拡張された集団群での試験が検討される。
【０２９４】
第１相試験が、許容される安全性（満６ヶ月の安全性データ及び要求される前臨床安全性データを含む）、薬理動態（ＰＫ）及び初期免疫学的（例えば、インフルエンザ中和活性、導入遺伝子発現のレベル及び持続期間、カプシド及び導入遺伝子に対する免疫応答）プロファイルを実証することを条件として、第２相試験を行う。用量を、第１相試験を基に選択し、制御されたインフルエンザ攻撃モデルで試験する。第２相試験の目標は、予備的有効性を評価すること、及びベクターの効果的な用量を確立することであろう。
【０２９５】
ベクターは実施例１６に記載されているとおりに製造する。ベクターを、２００ｍＭの合計塩濃度、０．００１％（ｗ／ｖ）プルロニックＦ６８及び５％のグリセロールを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（最終製剤用緩衝液、ＦＦＢ）中に含有している溶液として製剤化する。ＡＡＶｈｕ６８．ＣＢ７．ＣＩ．ＪＡｂ２１０ａ．ｒＢＧをＦＦＢで４つの用量レベルに希釈した後に鼻腔内に投与する。初期用量レベルは前臨床有効性データに基づいて選択し、非臨床的安全性評価に基づいて調整し、最高用量は、ＡＡＶベクター粒子凝集を伴わずに実現され得る濃度を上限とする。６．２５×１０１２ゲノムコピー（ＧＣ）〜５×１０１３ＧＣの用量範囲を、各対象に０．８ｍｌの総体積で送達するための鼻孔１つあたり０．２ｍｌのアリコート２つとして、Ｔｅｌｅｆｌｅｘ  Ｍｅｄｉｃａｌからの商業化認可済みＬＭＡ鼻腔内粘膜噴霧装置（ＩＭＡＤ）（ＭＡＤ３００）（ＭＡＤ
Ｎａｓａｌ（商標））によって投与する。目標は、ベクターの投与から２週間後の鼻腔洗浄溶液において測定されるＪＡｂ２１０ａ  ＭＤＡｂの５〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度を実現することであろう。ベクターの単回用量を４つの用量コホート（６．２５×１０１２ＧＣ、１．２５×１０１３ＧＣ、２．５×１０１３ＧＣ、または５×１０１３ＧＣ）のうちの１つで０日目に投与する。各投薬計画において対象を安全性及び免疫原性パラメータに関して試験１８０（±２）日目まで追跡評価する。
【０２９６】
Ｂ．目的
主目的は、高齢対象におけるベクターの安全性及び忍容性を、ＣＢＣ、化学、検尿、鼻に限局される局所免疫応答、及び臨床所見に基づく有害事象の発生によって評価することであった。有害事象を２００７年９月にＦＤＡによって公表されたＴｏｘｉｃｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ａｄｕｌｔ  ａｎｄ  Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ  Ｅｎｒｏｌｌｅｄ  ｉｎ  Ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓの修正版に準じて評定する。
【０２９７】
第二の目的は、鼻腔洗浄液及び血清、例えば、抗イディオタイプＥＬＩＳＡ及び抗ＨＡ
ＥＬＩＳＡに基づくアッセイにおいて、インフルエンザ中和活性のレベル及び持続期間
を評価すること；鼻腔洗浄液及び血清においてＪＡｂ２１０ａ  ＭＤＡｂ発現のレベル及び持続期間を評価すること；導入遺伝子及びカプシドに対する中和抗体のレベルを評価すること；ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって測定したときの導入遺伝子、ＪＡｂ２１０ａ  ＭＤＡｂ及びカプシドに対する細胞性応答のレベル、ならびに鼻腔、咽頭、尿、直腸及び血液の試料におけるベクターの排出を評価することである。
【０２９８】
Ｃ．試験デザイン
予備的安全性及び忍容性を評価し、健常ボランティアにおけるベクターの薬理動態を理解し、さらなる展開のために用量レベルを選択するために、前臨床データに基づく用量レベルでの非盲検用量漸増試験を実施する。試験はコホート１つあたり対象を４名として５つ以下のコホートを参加させる。対象を処置の４〜１２週間前に選考し、６ヶ月までにわたって追跡する。
【０２９９】
健常ボランティアのＩＮをベクターで処置する。試験の目標は、安全性及び忍容性を評価すること、及びベクターの薬理動態を理解すること、及び将来の展開のために最適な用量を選択することである。
【０３００】
用量漸増に先立って行われる、各用量群の正式な安全性評価による単回漸減ベクター用量を用いる非盲検試験。コホート１つあたり対象を４名とする４つのコホート、及び鼻腔洗浄液における５〜２０ｎｇ／ｍｌのＭＤＡｂの産生をもたらすものとして定義される最適用量のための８名への適応拡張。
【０３０１】
ａ．投与
各ボランティアに１回の０．８ｍｌ用量のベクターを、認可済みＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）を使用して鼻孔１つあたり０．２ｍｌを各鼻孔内に２回連続塗布することによってＩＮに与える。５つのコホートとして２４名以下のボランティアを参加させる。コホート１〜４には漸増用量レベルのベクターを与え、最終コホート（コホート５）は最適用量レベル（コホート１〜４における安全性及び薬理動態パラメータによって定義される）で８名のボランティアに拡張する。
【０３０２】
ＭＡＤ  ＮａｓａｌＴＭを使用して０日目にベクターを投与する。
コホート１：用量６．２５×１０１２ＧＣ；
コホート２：用量１．２５×１０１３ＧＣ；
コホート３：用量２．５０×１０１３ＧＣ；
コホート４：用量５．００×１０１３ＧＣ；
コホート５：最適用量レベルでの拡張コホート。
【０３０３】
コホート内で対象の投薬の合間に１週間の観察が必要とされる。コホート間の合計４週間を使用して、次の用量に増やす前に安全性データを評価する。
【０３０４】
ベクター投与前日に対象を研究入院患者ユニットに収容する。朝に空腹時血液を得、その後、対象のＩＮに投与する。最初の２４時間は頻繁にバイタルサインを追跡評価する。１、３、７、１４及び２８日目ならびに２ヶ月目、４ヶ月目及び試験の最後に相当する６ヶ月目に、安全性検査のために血液、鼻腔洗浄液、尿及び直腸スワブを採取する。試料は、安全性実験室、ベクター排出の検出、導入遺伝子発現の評価ならびに、導入遺伝子及びベクターカプシドの免疫原性のために使用される。
【０３０５】
ベクター投与後の試験継続期間は６ヶ月（１８０日）である。
【０３０６】
中止規則は用量制限毒性の発生に基づく。用量制限毒性は、コホート内での任意の１つ
の処置関連グレード４または任意の２つのグレード３処置関連有害事象の発生として定義される。全ての有害事象は、用量漸増、コホート拡張または中止に関する判断に先立って慎重に再検討される。
【表９】
2020510430.tif 000018
【０３０７】
ｂ．標的集団、組入れ／除外基準
診断及び主要組入れ基準は、肥満指数が１９ｋｇ／ｍ２以上３０ｋｇ／ｍ２以下であり体重が５０ｋｇ以上１００ｋｇ以下である６５歳以上の健常な男性または女性の対象である。出産の可能性を有する女性は、試験登録前に血清妊娠試験で陰性であり避妊の効果的な方法（ホルモン剤、ＩＵＤ）を用いているならば参加者として適格である。
【０３０８】
組入れ基準は、６５歳以上の男性または女性の対象であり；参画のための書面によるインフォームドコンセントを提出することができ；医療歴、身体検査、バイタルサイン、及びベースライン時の臨床安全性研究所試験によって判定した場合に健常であり；常習的喫煙者でなく（常習的喫煙者とは、毎週４本より多いタバコまたはその他のタバコ製品を吸う人のことである）、参画中はタバコ製品を使用しないことに同意し；さらに、女性は以下の基準のうちの１つを満たさねばならない：閉経から少なくとも１年後である、または外科的不妊である。
【０３０９】
除外基準は：季節性枯草熱または季節性アレルギー鼻炎もしくは通年性アレルギー鼻炎または慢性もしくは鼻腔もしくは副鼻腔の症状の顕著な病歴；ベクター投与前に１年以下にわたって治療を必要とする喘息の病歴；鼻中隔偏位及び鼻ポリープを含めた異常な鼻構造、慢性副鼻腔炎、喘息またはＣＯＰＤを有する対象；鼻腔内ステロイドの現行使用；研究者によって評価される制御されない顕著な病気または精神病（急性または慢性）の存在（これには、限定されないが、新たな医学的または外科的治療の策定、または制御されない症候もしくは薬物毒性のための顕著な用量変更がスクリーニングの３ヶ月以内にあり攻撃前に０日目に再確認されることが含まれる）；ＨＩＶ−１もしくはＨＩＶ−２またはＨＢｓＡｇもしくはＨＣＶ抗体の陽性血清学；許容されるものである基底細胞癌腫または扁平細胞癌腫を除いてがんまたはがんの治療が３年以内にあること；免疫抑制または、限定されないが真性糖尿病を含めた何らかの免疫応答不全関連の病状の存在；先行する３ヶ月の期間の間、アレルギー注射、免疫グロブリン、インターフェロン、免疫調節薬、細胞毒
性薬、または顕著な主要臓器毒性に関連している場合が多いと知られている他の薬物、または全身コルチコステロイド（経口または注射）（局所コルチコステロイドは許容されよう）など、免疫系に悪影響を与える可能性がある何らかの医療またはその他の治療を現在受けていること（または受けていることの履歴）；試験前の年における薬物または化学物質の乱用歴；ベクター投与前３０日以内に研究製品または非登録薬を受けること、または何らかの研究薬試験に現在参加している、もしくはそのような試験に後の試験期間内に参加する意図があること；ベクター投与または試験期間中に計画される投与の６ヶ月前に血液または血液製品を受けること；発熱の有無にかかわらず軽度もしくは重度の病気の存在（医療歴及び身体検査によって研究者によって判定される）、または口内で３８℃より高い熱の存在として定義される、ベクター投与前７２時間以内の急性疾患；妊娠及び／または授乳している女性；１：８０より高い、ＡＡＶ２／ｈｕ６８に対する血清循環中和抗体；ならびに研究者の意見において試験の主な目的及び評価を妨害する可能性があるとされる何らかの症状である。
【０３１０】
ｃ．用量レベル決定
初期用量レベルは前臨床有効性データに基づいて選択し、非臨床安全性評価に基づいて調整し、最高用量はＡＡＶの凝集特性によって制限する。用量は、ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）によって鼻孔１つあたり２×０．２ｍｌとして投与される６．２５×１０１２〜５×１０１３ＧＣ／用量の範囲である。目標は、ベクター投与から２週間後の鼻腔洗浄液において目標の５〜２０ｎｇ／ｍｌのＪＡｂ２１０ａ  ＭＤＡｂが得られることであろう。これらの用量は、全体重で調節したときサル、マウス及びフェレットに与えた用量よりもかなり低い。治験のベクターに構造が類似しているベクターまたはＡＡＶベクターの変異型の任意の用量でこれらの種に行ったどの前臨床試験においても実質的な毒性は認められなかった。
【０３１１】
ｄ．投薬量の投与及び持続期間
各用量群に、鼻孔１つあたり０．４ｍｌ中のベクターをＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）によって与える。対象は一人ずつ投薬される。同じ用量群内での処置間隔は非臨床試験によって決定されよう（例えば１週間）。１つのコホート内の全ての対象が試験１４日目を経過した時点で予備的安全性データを再検討する。識別される安全上の問題がない場合に次の用量への用量漸増を開始する。コホート４が終了し最高用量の予備的安全性が実証された後、５番目の最終コホートを、最大耐量または投与され得る最高用量である最適用量で合計８名の対象（追加の４名の対象）への拡張のために参加させる。最大の対象人数は２４名である。
【０３１２】
ｅ．提案される臨床試験の継続期間
インフォームドコンセント／ＨＩＰＡＡ、人口学的評価／医療歴、及び組入れ／除外選考を−１２〜−４週目における訪問０（選考）中に行う。
【０３１３】
−１２〜−４週目の訪問０（選考）、−４〜−１週目の訪問１（選考）、０日目の訪問２、７日目の訪問３、１４日目の訪問４、２８日目の訪問５、２ヶ月目の訪問６、４ヶ月目の訪問７、及び６ヶ月目の訪問８を含む訪問中に医療歴及び安全性研究所（包括的代謝パネル［ナトリウム、カリウム、塩化物、二酸化炭素、グルコース、血液尿素窒素、乳酸脱水素酵素、クレアチニン、クレアチニンホスホキナーゼ、カルシウム、総タンパク質、アルブミン、ＡＳＴ、ＡＬＴ、アルカリホスファターゼ、及び総ビリルビン］、ＣＢＣ［白血球数、ヘモグロビン、ヘマトクリット、血小板数、赤血球分布幅、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン、平均赤血球ヘモグロビン濃度］、検尿［尿の色、濁度、ｐＨ、グルコース、ビリルビン、ケトン、血液、タンパク質、ＷＢＣ］、凝固［ＰＴ、ＩＮＲ、ＰＴＴ］、血清学（ＨＩＶＡｂ、ＨＢｓＡｇ、ＨｅｐＣＡｂ、ＲＰＲ）を含む）を確認する
【０３１４】
−４〜−１週目の訪問１（選考）、０日目の訪問２、７日目の訪問３、１４日目の訪問４、２８日目の訪問５、２ヶ月目の訪問６、４ヶ月目の訪問７、及び６ヶ月目の訪問８において、尿妊娠試験（出産の可能性のある女性のみ）、妊娠回避相談、心電図（各回の訪問からのＱＴ及びＱＴＣの変化を最新のＦＤＡ指針に基づいて分析する）及び肺機能検査（肺活量測定（肺活量、努力性肺活量、０．５、１、２及び３秒間隔のタイミングでの努力呼気量（ＦＥＶ）、努力呼気流量２５〜７５％（ＦＥＦ２５−２７）、ならびに最大努力換気量（ＭＶＶ）を含む）、身体検査（体重、身長（訪問１でのみ測定する）、ＢＭＩ）、胸部Ｘ線（胸部Ｘ線は、選考の３ヶ月以内に実施されて正常であると判明し、対象に肺の兆候または症候が存在し続けていない場合、繰り返される必要はない）、生命関連（点滴日中、点滴前、投与から１５（±５）、３０（±５）分後及び１（±１０）分後、３（±１０）分後、及び６時間（±１０分）後のバイタルサイン。血圧、心拍数、体温、呼吸を含む。）、研究血液（カプシド及び導入遺伝子に対するＴ細胞応答）、研究鼻腔洗浄液（細胞に基づく中和アッセイによるＡｂレベル）、研究血清（カプシド及び導入遺伝子に対するＮＡＢ、Ａｂレベル）、ピーク時鼻呼気流量（携帯型吸気流量計を使用して実施する。息を吐いた後、小さなマスクが取り付けられた計器を水平に保持して鼻の周りに気密シールを形成する。その後、努力して勢いよく息を（約１秒間）吸い込むように対象に指示する。各試験終了後に流速は較正済み目盛上のカーソルの位置によって示される）、ならびにＳＮＯＴ−２２質問票（患者に健康及び生活の質についての様々な質問をして彼らが症候を０（症候なし）〜５（極めて悪い）に評定する２２点質問票）。成績は、選択された数全ての加算結果である（最大１１０）。さらに、患者に彼らにとって最も重要な問題／心配事に５つまで印を付けさせる。）を評価する。
【０３１５】
０日目の訪問２において、ベクター投与及び２４時間滞在の受け入れを実施する。
【０３１６】
０日目の訪問２、７日目の訪問３、１４日目の訪問４、２８日目の訪問５、２ヶ月目の訪問６、４ヶ月目の訪問７、及び６ヶ月目の訪問８において、有害事象を監視する
【０３１７】
０日目の訪問２、７日目の訪問３、１４日目の訪問４、２８日目の訪問５において、局所及び全身反応原性評価を実施する。
【０３１８】
ｆ．観察及び測定方法論
主目的は、ベースラインから処置の６ヶ月後までの、有害事象の発生ならびに研究所パラメータ及びバイタルサインの変化によって定義されるベクター溶液の単回漸増用量の安全性及び忍容性である。安全性評価には、ベクター溶液投与後１４日間の急性期にわたる鼻腔粘膜及び肺における反応原性評価も含まれる。
【０３１９】
第二の目的は、鼻腔洗浄液中の導入遺伝子の濃度、血清中濃度、最大濃度、クリアランス、排除半減期を含めたＰＫの評価ならびに、ＩＰのあらゆる成分（ＡＡＶ２／ｈｕ６８カプシド、ＪＡｂ２１０ａ  ＭＤＡｂ）に対する抗体結合及びＴ細胞応答を測定することによる単回漸増用量の免疫原性の評価である。
【０３２０】
評価には、血液化学（肝機能試験［ＬＦＴ］、クレアチニン）、血液学（鑑別を伴う全血球算定［ＣＢＣ］、血小板、プロトロンビン時間／部分トロンボプラスチン時間（ＰＴ／ＰＴＴ）、クレアチニンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、トロポニンが含まれ、検尿を試験の過程全体にわたって評価し、ベクター溶液投与後の急性／亜急性期においては追跡評価をより頻繁に行う。導入遺伝子発現を追跡評価するためならびに導入遺伝子及びＡＡＶ２／ｈｕ６８カプシドに対する抗体及び細胞性応答を評価するために、試験全体にわたって血清、鼻腔洗浄液及びＰＢＭＣ試料採取を行う。ベクター溶液投与前に全ての女性ボランティアに対して尿中ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ＨＣＧ）を実施する。
【０３２１】
試験の継続期間（すなわち６ヶ月）にわたって有害事象（ＡＥ）及び重篤な有害事象（ＳＡＥ）を収集する。
【０３２２】
試験の過程全体にわたって薬理動態（ＰＫ）を慣例的に評価してＪＡｂ２１０ａ  ＭＤＡｂの発現の動態を決定する。鼻腔洗浄液及び血清を一定間隔で試料採取し、Ａｂレベルを質量分析及びアッセイを用いるＥＬＩＳＡによって決定する。
【０３２３】
質量分析、抗イディオタイプアッセイ、導入遺伝子発現（ＥＬＩＳＡ）、ベクター排出の評価は従来の方法に従って開発された。
【０３２４】
ｇ．ベクター溶液の投与
ベクター溶液の投与は、各鼻孔内への２つの連続する０．２ｍｌ用量（つまり、合計０．８ｍｌのベクター溶液）で起こる。ベクター溶液は、Ｔｅｌｅｆｌｅｘ  Ｍｅｄｉｃａｌ（Ｔｅｌｅｆｌｅｘ．ｃｏｍ）によって製造された商業化認可済みの装置を使用して投与される。装置はＬＭＡ  ＭＡＤ  Ｎａｓａｌ（商標）（鼻腔内粘膜噴霧装置）と呼ばれる。鼻腔粘膜にＩＰを送達するための最良の装置使用方法についての詳細は当該会社の手順ガイドに提供されている。基本的には対象を側臥位に配置し、装置の先端を各鼻道の開口部に（一つずつ）配置し、その後、噴霧器によってシリンジを介して流体を押し出すことによってベクター溶液を送達する。
【０３２５】
ｈ．試験デザイン及び試料サイズ決定
用量漸増体系が基づく主な評価項目は安全性である。安全性の追跡評価は、臨床所見と研究所検査の結果との両方を含み、２００７年９月にＦＤＡによって公表されたＴｏｘｉｃｉｔｙ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ  ｆｏｒ  Ｈｅａｌｔｈｙ  Ａｄｕｌｔ  ａｎｄ
Ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔ  Ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ  Ｅｎｒｏｌｌｅｄ  ｉｎ  Ｐｒｅｖｅｎｔａｔｉｖｅ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｒｉａｌｓの修正に準じて評定される。唯一の改訂は臨床異常の評価に関するものであり、指針文書中では注射部位に関係する所見に焦点が当てられている。近位及び遠位呼吸器系における臨床所見に関連する基準は確立されている。
【０３２６】
最大耐量（ＭＴＤ）は、２名の対象における任意の処置関連グレード３または１つの処置関連グレード４事象として定義される用量制限毒性（ＤＬＴ）が対象によって示される用量よりも低い用量として定義される。ＭＴＤは、提案される用量の範囲内では到達され得ないと認識されている。この場合、使用される最高用量が将来の試験のための推奨用量である。最低でも８名の対象をＭＴＤで、またはＭＴＤに到達しない場合には最高用量で処置する。このように、８名の対象が推奨用量で処置されることを保証するためには追加で４名の対象を加える必要があり得る。
【０３２７】
デザインは、用量レベル１つにつき４名の患者を用い、用量制限毒性（ＤＬＴ）の場合には任意のレベルにおいてレベル１つにつき８名の患者に拡張し、最適用量及びそのレベルでの毒性率をよりよく特性評価するために推奨用量で追加の４名の患者に拡張することを規定する、標準的な「４＋４」第Ｉ相用量漸増試験である。潜在的な短期毒性の十分な評価を保証するために、用量コホート内で患者間に最低でも７日を用い、コホート間に２週間を用いる。投薬後は対象を６ヶ月間観察するが、ＭＴＤに達したかを判定するため及び／または次の用量へと漸増するために用いる観察期間は、コホート内の最後の対象の後に最低でも１４日含む、コホートからのデータの全体である。
【０３２８】
グレード３または４の毒性を被る対象がコホート内で０／４である場合には、用量を漸増し、次のより高い用量で次の４名の対象を処置し；１／４の対象が処置関連グレード３
毒性を被る場合には、追加で４名の対象を同じ用量で処置する。当該追加の対象が誰も処置関連グレード３または４の毒性を被らない場合には（全体で１／８）、用量を漸増し、次のより高い用量で次の４名の対象を処置する。当該追加の対象の誰かがグレード３または４の毒性を被る場合には（全体で１／８より多い）、４名の対象を追加でより低いコホートに参加させ、問題がなければそれをＭＴＤとみなし；処置関連グレード４毒性を被る対象がいる場合には、この用量でさらに多くの対象を参加させることをせず、グレード４毒性が起こった用量よりも低い用量を受けているコホートに追加で４名の対象を参加させてＭＴＤを確立する。
【０３２９】
ｉ．安全性及び有害事象
対象またはその他の者へのリスクを伴う不測の問題は、以下の基準を全て満たす任意の出来事、経験または結末として定義される：性質、重症度または頻度が予想外であること（つまり、試験関連書面、例えば、ＩＲＢ承認済みのプロトコールまたは同意書、研究者が作った冊子などに記載がない）；研究への参画に関係するまたは関係する可能性があること（つまり、関係する可能性があるとは、出来事の経験または結末が、研究に含まれる手順によって引き起こされた合理的な可能性があるということを意味する）；ならびに、研究が対象またはその他の者にさらに大きな危害（物理的、心理的、経済的または社会的な危害を含む）のリスクを負わせることを示唆していること。
【０３３０】
有害事象（ＡＥ）は、試験の過程の間に重度が進行または悪化する任意の症候、兆候、病気または経験である。併発性の病気または損傷は有害事象とみなされるべきである。診断手順の異常な転帰は、異常が、試験脱退を招く場合；重篤な有害事象に関係する場合；臨床兆候または症候に関係する場合；追加処置またはさらなる診断試験につながる場合；研究者によって臨床上重大であるとみなされる場合に、有害事象とみなされる。
【０３３１】
有害事象は、重篤または非重篤として分類される。重篤な有害事象とは、致命的である、生命を脅かす、入院を必要とするかまたは長引かせる、持続的または顕著な身体障害または不自由、先天性異常または先天性欠損、重要な医学的事象を招く、任意のＡＥである。
【０３３２】
重要な医学的事象とは、すぐに生命を脅かす可能性はないが臨床上の重大性が大きい事が明らかであるもののことである。それらは、対象を危険に曝す可能性があり、他の上に記した重篤な転帰の１つを防止するための介入を必要とする可能性がある。例えば、薬物過剰摂取もしくは乱用、患者の入院をもたらさない発作、または緊急診療部での気管支痙攣の集中治療は、重篤とみなされることが典型的であろう。
【０３３３】
重篤についての基準のいずれかを満たさない全ての有害事象は、非重篤有害事象とみなされるべきである。
【０３３４】
既存の症状とは、試験開始時に存在するもののことである。既存の症状は、試験期間中に症状の頻度、強度または特質が悪化するならば有害事象として記録されねばならない。
【０３３５】
選考時に、いかなる臨床上重大な異常も既存の症状として記録されねばならない。試験の最後にも、有害事象の定義を満たすいかなる新たな臨床上重大な所見／異常も有害事象として記録及び載録されねばならない。
【０３３６】
未解決の全ての有害事象は、事象が解決するか、対象が追跡からいなくなるか、または有害事象に他の説明が付くまで、研究者によって追跡される。予定される最後の訪問時に研究者は、対象または対象のかかりつけの医師が合理的にこの試験での参画に関係があるかもしれないと考えているいかなる後発事象（複数可）も報告するよう各対象に指示せね
ばならない。研究者は、試験参画を対象が中断または終了した後の何らかの時に起こっている合理的にこの試験に関係付けられ得るいかなる死亡または有害事象も、試験提供者に知らせなければならない。研究者が万一、この試験に参画した対象のがんの発症または後に身ごもった子孫の先天性異常に気付いた場合にも、スポンサーに知らせなければならない。
【０３３７】
臨床研究所異常は、以下の条件のいずれか１つを満たす場合に有害事象として載録される：研究所異常が、異常性を確認する再試験によって他に否定されないこと；異常が、疾患及び／または臓器毒性を示唆していること；異常が、能動的管理、例えば、用量の変更、薬物の中断、より頻繁な追跡評価、さらなる診断調査などを必要とする程のものであること。
【０３３８】
入院または長引く入院を招くいかなる有害事象も、具体的に特段の指示がない限り重篤な有害事象として載録及び報告される。外科手術の原因となるいかなる症状も、症状が有害事象の基準を満たす場合に有害事象として載録される。以下の状況では、症状も、入院も、長引く入院も、外科手術も、有害事象として報告されない：既存の症状に対する診断または待機的外科手技のための入院または長引く入院。外科手術は、外科手術の目的が待機的または診断的であり転帰に問題がなかった場合には有害事象の転帰として報告されるべきでない。試験のための有効性測定を可能にするために必要とされる入院または長引く入院。
【０３３９】
研究者には、ＡＥが以下の記述語に従ってＣＲＦの適切なページに載録されることを確保する責任がある：軽度：通常の活動に制限がないかまたはほんのわずかな不快感があることに関連する；中程度：通常の活動に制限があるかまたは顕著な不快感があることに関連する；重度：通常の活動ができないかまたは非常に際立った不快感があることに関連する。試験薬との関係性。
【０３４０】
ＡＥと試験薬との関係性は、研究者によって以下の定義に従って判定される：
【０３４１】
まず確実である：ベクター溶液の投与からの合理的な時系列に従っており、疑わしい試験追跡子に対する既知または予測応答パターンに従っており、その対象／患者の臨床状態の既知の特徴によって合理的に説明することができない、反応；
【０３４２】
可能性はある：試験追跡子の投与からの合理的な時系列に従っており、疑わしい試験追跡子に対する既知または予測応答パターンに従っているが、他の多くの因子によって容易に生成された可能性がある、反応；
【０３４３】
ありそうにない：試験追跡子の投与からの合理的な時系列に従わない反応。但し、ベクター溶液による因果関係を無視することはできない。
【０３４４】
ない：病因が試験追跡子に無関係であることを示す十分なデータが存在している反応。
【０３４５】
対象に対するリスクを最小限に抑えることを確保するために、各々４〜８名の対象からなる別個のコホートにける試験に対象を参加させる。コホート内の全ての対象にベクター溶液を投与した後、コホート内の最後の対象が少なくとも２週間の追跡を完遂しかつコホート全体に対して一次安全性評価が行われて検査されて初めて、他コホート内の対象の投薬が起こる。コホートのメンバー間の投薬は１週間以上の間隔を空けて起こる。この試験では、用量制限毒性（ＤＬＴ）はコホート内での２つのグレード３毒性または１つのグレード４事象として定義されるが、これらは処置関連のものであると考えられる。上に記載したように、コホート内にグレード３処置関連毒性を被る対象が１名いることで、そのコ
ホート内の８名以下の対象のために追加で４名の対象にその用量で投薬することが引き起こされる。その用量で処置関連グレード３毒性を伴う２人目の対象がいることで用量低減が引き起こされ、これに伴い、合計８名の対象を処置することを確保する必要がある場合には追加で４名の対象がいっそう低い用量で処置され、このいっそう低い用量においてグレード３毒性が２名以下でありグレード４毒性ない場合にはそれをＭＴＤとみなす。処置関連グレード４毒性がいるとその用量での累加は中止され、もっと低い用量で追加の４名の対象の累加が引き起こされて、ＭＴＤを確立するために役立てられる。いかなる重篤な有害事象も速やかに報告され、試験処置とのその関係性が評価される。ＳＡＥが処置関連のものであると考えられる場合、それは試験の中止基準として役立つ。
【０３４６】
ｊ．統計解析
図式的方法を含めた様々な記述統計学を用いて有効性評価項目を要約する。測定された連続変数について平均、標準偏差、中央値及び範囲を計算する。適宜、要約統計値のために信頼区間を生成する。仮説検定はα＝０．０５の両側有意性レベル（第一種過誤）を用いて行うが、実際のｐ値を報告する。測定された連続変数について、（例えば用量コホート間の）２群比較は概してウィルコクソンの順位和検定を採用し、ウィルコクソンの符号順位検定を肺機能パラメータのベースラインからの変化などの対データのために用いる。群間ではフィッシャーの正確検定を用い、患者の中ではマクネマー検定を用いて、カテゴリカル変数を比較する。
【０３４７】
全ての特許、特許公報、及び本明細書中に列挙する他の刊行物、ならびに「１７−７９８７ＰＣＴ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けた配列表、ならびに優先権出願である２０１８年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／６１８，４４３号、２０１７年９月２０日に出願された出願第６２／５６０，８３４号、２０１７年５月１０日に出願された出願第６２／５０４，２９３号、及び２０１７年２月２日に出願された出願第６２／４６４，７５３号を参照により本明細書に援用する。本発明を特に好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の趣旨から逸脱することなく改変を行うことができることは理解されよう。そのような改変は別記の請求項の範囲に含まれることが意図される。
【０３４８】
（配列表フリーテキスト）
以下の情報は数字識別子＜２２３＞の下でフリーテキストを含んでいる配列のために提供される。
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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【表１０−４】
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【表１０−５】
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【表１０−８】
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【表１０−９】
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【表１０−１０】
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【表１０−１１】
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【表１０−１２】
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【表１０−１３】
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【表１０−１４】
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【表１０−１５】
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【表１０−１６】
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【表１０−１７】
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【表１０−１８】
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【表１０−１９】
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【表１０−２０】
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【表１０−２１】
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【表１０−２２】
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【表１０−２３】
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【表１０−２４】
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【表１０−２５】
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【表１０−２６】
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【表１０−２７】
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【表１０−２８】
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【表１０−２９】
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【表１０−３０】
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【表１０−３１】
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【表１０−３２】
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【表１０−３３】
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【表１０−３４】
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【表１０−３５】
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【表１０−３６】
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【表１０−３７】
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【表１０−３８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020510430.tif 000085
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