(57)【要約】  本発明は、骨粗鬆症およびその関連疾患の予防及び／または治療におけるプラスミノーゲンの用途を提供する。本発明はさらに、骨粗鬆症を予防及び／または治療するための薬物及び製品を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、骨粗鬆症及びその関連疾患を予防及び治療するための方法。
【請求項２】
前記骨粗鬆症は原発性骨粗鬆症と継発性骨粗鬆症を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記原発性骨粗鬆症は閉経後骨粗鬆症と老年性骨粗鬆症を含むである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記継発性骨粗鬆症は、内分泌疾患、リウマチ性疾患、胃腸疾患に継発する骨粗鬆症、及び薬物治療によって引き起こされる骨粗鬆症を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記継発性骨粗鬆症は、グルココルチコイド、原発性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、原発性胆汁性肝硬変、性腺機能低下、糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、慢性腎臓病、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、骨関節炎、性腺ホルモン治療、抗てんかん薬治療、化学療法薬物治療によって引き起こされる骨粗鬆症を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、疾患と合併する骨粗鬆症を予防及び治療するための方法であって、前記疾患と合併する骨粗鬆症は、グルココルチコイド、原発性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、原発性胆汁性肝硬変、性腺機能低下、糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、慢性腎臓病、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、骨関節炎、性腺ホルモン治療、抗てんかん薬治療、化学療法薬物治療と合併する骨粗鬆症を含む、疾患と合併する骨粗鬆症を予防及び治療するための方法。
【請求項７】
骨粗鬆症に罹患しやすい被験者、骨粗鬆症に罹患するリスクが高い被験者、または骨粗鬆症に罹患していると診断された被験者に、骨折の発生を予防するために有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、骨粗鬆症による骨折を予防するための方法。
【請求項８】
前記被験者は、グルココルチコイド、原発性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、原発性胆汁性肝硬変、性腺機能低下、糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、慢性腎臓病、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎または骨関節炎に罹患している被験者を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記被験者は、性腺ホルモン治療、抗てんかん薬治療または化学療法薬治療を受けている被験者を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、骨芽細胞の活性を増強するための方法。
【請求項１１】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、骨塩代謝を調節制御するための方法。
【請求項１２】
前記調節制御は、血中カルシウムレベルを低下させることと、血中リン酸塩レベルを上昇させることと、骨基質におけるカルシウムの沈着を促進すること及び／または血管壁、内臓におけるカルシウムの沈着を低下させることとを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するものである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２において、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を添加、削除及び／または置換したものであり、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ−プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記プラスミノーゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記プラスミノーゲンは、ヒト由来の天然プラスミノーゲンである、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記被験者はヒトである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン。
【請求項２５】
薬学的に許容される担体及び請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンを含む薬物組成物。
【請求項２６】
（ｉ）請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンと、（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための手段（ｍｅａｎｓ）とを含む、予防性または治療性キット。
【請求項２７】
前記手段はシリンジまたはバイアルである、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するラベルまたはプロトコルをさらに含む、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
ラベルを含む容器と、
（ｉ）請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン、またはプラスミノーゲンを含む薬物組成物とを含む製品であって、
前記ラベルは、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する、製品。
【請求項３０】
その他の薬物を含む、もう一つ以上の部材または容器をさらに含む、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載のキット、または請求項２９に記載の製品。
【請求項３１】
前記その他の薬物は、骨粗鬆症を治療するためのその他の薬物または骨粗鬆症と合併するその他の疾患を治療するための薬物を含む、請求項３０に記載のキットまたは製品。
【請求項３２】
プラスミノーゲンを含む、骨粗鬆症を治療するための薬剤。
【請求項３３】
プラスミノーゲンを含む、骨粗鬆症を治療するための薬物組成物、キット、製品。
【請求項３４】
骨粗鬆症の治療に使用されるプラスミノーゲンの用途。
【請求項３５】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法に使用される薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨粗鬆症及びその関連疾患の予防または治療におけるプラスミノーゲンの用途に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨粗鬆症（оｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ，ＯＰ）は、骨量の減少と骨組織の微細構造の破壊を特徴とし、骨脆弱性の増加を引き起こし、骨折しやすい全身性疾患である。骨粗鬆症が骨強度の低下、骨折リスクの増加を特徴とする骨格系疾患であり、骨強度が、骨密度と骨質量との骨格の二つの主要な面を反映すると、アメリカ国立衛生研究所（ＮＩＨ）は２００１年に提出した。骨粗鬆症は骨量の減少及び骨微細構造の退化を引き起こし、患者の骨格の脆弱性を増加させ、患者の運動機能及び生活品質を大いに低下させる。
【０００３】
哺乳動物の骨格発育は高度に秩序があり、多要素の共同作用によって調整制御される過程である。哺乳動物の骨格発育は主に膜内骨化と軟骨内骨化との二つのメカニズムにより完成し、その中で、四肢骨、脊椎骨などの長骨は主に軟骨内骨化により形成され、頭蓋骨、鎖骨内側部分などの扁平骨は膜内骨化により形成される［１］。骨組織が形成された後は何ら変化もしないわけではなく、骨形成と吸収との安定的な動的平衡にある。この動的平衡の過程において、ホルモン、複数のシグナル経路、骨組織細胞の相乗調節制御及び鉱物塩の安定性が重要な役割を果たしている［２］。
【０００４】
骨粗鬆症は概ね原発性と継発性との二種類に分けられ、閉経後骨粗鬆症と老年性骨粗鬆症はいずれも原発性骨粗鬆症に属し、しかもよく見られるものである。継発性骨粗鬆症はよく見られる全身性骨疾患であり、既知の疾患及び骨粗鬆症を誘発する薬物の他に、いくつかの新しい薬物と治療手段はすでに継発性骨粗鬆症の重要な病因となっている。
【０００５】
疫学調査によると、１型糖尿病患者の骨量減少と骨粗鬆症の発症率は４８％〜７２％であり［３］、２型糖尿病患者について、骨密度が増加し、低下し、または変化がないという結果はいずれも国内外の文献で報告されている［４−６］。近年来、２型糖尿病患者の代謝性骨疾患の発症率と骨粗鬆症の骨折の危険性は明らかに一般人より高く、その骨粗鬆症の発症率が２０％〜６０％に達せることは研究によって発見された［５］。糖尿病による骨粗鬆症は病理的骨折を引き起こしやすく、致傷致死率は高く、糖尿病患者の治療と回復の困難さを増加することができる。
【０００６】
百年以上の観察を経て、骨粗鬆症患者は合併された心筋梗塞、脳卒中、突然死のため死亡率が明らかに上昇し、アテローム性動脈硬化症の患者には骨量低下もよく合併され、骨粗鬆性骨折を引き起こすことは発見された［７−９］。アテローム性動脈硬化症と骨粗鬆症は加齢に伴う退行性変化であると考えられていたが、両者に対する長期的臨床観察及び分子メカニズムに対する研究が深まるにつれて、下記のことは発見されている。すなわち、（１）両者には、老衰のような共同の危険要素が存在し、糖尿血管細胞における血管石灰化細胞（Ｃａｌｃｉｆｙｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒｃｅｌｌｓ，ＣＶＣ）の分子特徴と骨生物学の特徴との間はますます一致して平行し、骨代謝に関連する遺伝子がノックアウトされた動物には血管の特徴性表現が現れ、これは、両者間には共同のシグナル経路、転写因子と細胞外基質の相互作用があることを示唆している；（３）活性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ，ＲＯＳ）及び酸化型脂質が血管及び骨格に対して共同で影響を与える；（４）内分泌が異常になり、例えば、エストロゲンが減少し、副甲状腺ホルモン（ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ，ＰＴＨ）とビタミンＤ、カルシトニンの代謝が異常である；（５）この二つの疾患の治療ストラテジーにも密接な関係がある。この二つの矛盾しているように見えるが、常に同一の生体で発生する疾患のメカニズムに対してさらに理解するにつれて、Ａｓ／ＯＰ症候群の予防と治療も深まりつつある。
【０００７】
近年の多くの研究によると、心血管系疾患と骨粗鬆症とは関連性があり、両方とも老年期に発生し、常に同一の高齢個体で見られ、しかも発症率は加齢につれて上昇する。高齢は心血管疾患と骨粗鬆症との共通の危険要素であるが、多くの研究によると、年齢という要素を無視した後、この二つの疾患の間には依然として顕著な関係がある。一方、心血管疾患は骨量の損失及び骨折リスクの増加と関連しており、同様に、骨密度の低下により心血管系疾患の発症率と死亡率が増加し得ることを示す証拠がある。さらに、心血管疾患と骨粗鬆症は発症メカニズムで緊密且つ直接な関係があることは研究によって発見されている。アテローム性動脈硬化症は心脳血管疾患の主な病理的基礎であり、動脈石灰化はその主要な表現の一つである。動脈石灰化は、心血管疾患の一つの重要なマーカー及び臨床モニタリングの指標であると考えられている。研究によると、血管石灰化の本質は、血管平滑筋細胞が骨芽細胞表型への転化及び血管組織が骨組織への転化である。血管石灰化の形成は骨塩の損失とも顕著な関連性がある。第三軍医大学周鋭博士［１０］は６０歳以上の高齢者グループに対して観察して研究し、高齢患者の動脈石灰化と骨粗鬆症及び骨折との関連性について検討した。彼の研究は次の内容を含む。１．２０１２年１月１日から１２月３１日まで、医者にかかるために病院に来た６０歳以上の適格な患者を選別して研究対象とした。２．腰椎Ｘ線側面図を利用して第１〜４腰椎に対応する腹大動脈の石灰化沈着物について採点することで、大動脈石灰化の程度の半定量測定を行った。石灰化プラークの長さと係る節分数によって、患者ごとの大動脈石灰化の採点（ａｃｓ）は０〜２４点とし、大動脈石灰化がないものは０点とし、最も深刻な大動脈石灰化は２４点とした。さらに、ａｃｓによって患者について群分けをした。３．骨密度測定は、二重エネルギーＸ線吸収測定器（ｄｘａ）を使用して行われた。骨粗鬆症は、ｄｘａに基づいて測定された骨密度の値が同じ性別、同じ人種である正常成人骨のピーク値より２．５の標準偏差以上低いこととして定義された。４．多変数回帰リスクモデルを用いて大動脈石灰化と骨粗鬆症の発症リスクとの関係を評価した。また、該研究は、１．６０歳以上の適格な閉経後女性を選別して研究対象としたこと；２．大動脈石灰化程度の半定量測定；３．Ｘ線で椎体形態（胸４〜腰５節分）を観察して椎骨骨折の発生（椎体の高さが２０％以上下がる）を確定することで椎骨骨折の診断を行ったこと；及び４．多変数回帰分析モデルを用いて大動脈石灰化と椎骨骨折との関係を評価したことを含む。さらに、該研究は、１．医者にかかるために病院に来た６０歳以上の適格な患者を選別して研究対象としたこと；２．骨密度測定及び骨粗鬆症の診断；３．６４列マルチスライスｃｔで頸動脈と冠状動脈ｃｔａを行い、三次元画像分析ワークステーションであらゆるｃｔａ画像を分析し、しかも動脈プラークの成分及び発生範囲について評価したことで、頸動脈とアテローム性動脈硬化症の石灰化プラークの検出を行ったこと；及び４．多変数回帰リスクモデルを用いて骨粗鬆及び骨量の損失と頸動脈及び冠状動脈の石灰化プラークの発生リスクとの関係を分析したことを含む。研究の結果、年齢などその他の混雑要素を調整した後、深刻な骨量損失は頸動脈プラーク、冠状動脈プラーク及び共存する石灰化プラークの発生と顕著な関係があった。結論として、高齢者の中で、深刻な大動脈石灰化と骨粗鬆症の発症とは関連している。骨粗鬆症の発症リスクはアテローム性動脈硬化の増加につれて上昇する。骨密度の低下と血２５（ＯＨ）Ｄレベルの降下も骨粗鬆症の発症と関連している。老年閉経後の女性の中で、深刻な大動脈石灰化と椎骨骨折の発生と関連している。骨密度の低下と血２５（ＯＨ）Ｄレベルの降下も椎骨骨折の発生と関連している。高齢者の中で、骨粗鬆症、低骨量及び血２５（ＯＨ）Ｄレベルの降下は、動脈石灰化プラークの発生と関連している；深刻な骨量損失は、頸動脈プラーク、冠状動脈プラーク及び共存する石灰化プラークのいずれの発生リスクとも関連している。この研究は、高齢者グループに対して観察して研究することによって、老人病のいくつかの共通の危険因子及び内在的な相互関係を明らかにし、骨粗鬆症及び心血管疾患の予防と治療に対して重要な意義を持っている。
【０００８】
骨粗鬆症は老衰の関連疾患の中の代表的な症状の一つであり、中高齢者の中で特に多い。骨粗鬆は、生体老衰が骨格における特殊な表現であり、ビタミンＤのレベルが低すぎ、または高すぎることは、骨粗鬆症と関係があることは示されている［１１］。高齢化社会の到来に伴い、骨粗鬆症の発症率は年々上昇する傾向があり、これによってもたらされる社会経済的負担も大幅に増加している。
【０００９】
骨粗鬆症の治療には、正常な骨組織含有量を回復して維持することと、骨折の発生率を低めることは鍵となる。治療の方法は多いが、現在では薬物治療が主とされている。よく使用される薬物として、骨吸収抑制剤、骨形成促進剤、骨塩が挙げられる。骨吸収抑制剤は主に破骨細胞を的とする薬物であり、破骨細胞の働きを抑制することによって骨の再吸収を減少させる；骨形成促進剤は主に骨芽細胞を的とする薬物であり、骨芽細胞の活性を増強して新骨の合成を促進することができる；骨塩は骨粗鬆を治療するための基礎薬であり、カルシウム剤とビタミンＤとを含み、骨基質成分を補う役割を果たせる。しかし、現在では、骨粗鬆症を治療するための薬物のほとんどは骨吸収抑制剤（例えば、エストロゲン、ジホスホン酸塩、カルシトニンなど）であり、骨形成促進剤（例えば、副甲状腺ホルモンなど）の種類は非常に少ない。薬物の治療効果から見ると、現在では症状を改善し、病状の進行を遅らせる程度にとどまり、病状を逆転してさらに治癒する効果をまだ収められていないため、新しい治療薬および治療方法を探す必要がある。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は下記項に係る。
【００１１】
１．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、骨粗鬆症及びその関連疾患を予防及び治療するための方法。
【００１２】
２．前記骨粗鬆症は原発性骨粗鬆症と継発性骨粗鬆症を含む、項１に記載の方法。
【００１３】
３．前記原発性骨粗鬆症は閉経後骨粗鬆症と老年性骨粗鬆症を含むである、項１に記載の方法。
【００１４】
４．前記継発性骨粗鬆症は、内分泌疾患、リウマチ性疾患、胃腸疾患に継発する骨粗鬆症、及び薬物治療によって引き起こされる骨粗鬆症を含む、項１または２に記載の方法。
【００１５】
５．前記継発性骨粗鬆症は、グルココルチコイド、原発性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、原発性胆汁性肝硬変、性腺機能低下、糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、慢性腎臓病、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、骨関節炎、性腺ホルモン治療、抗てんかん薬治療、化学療法薬物治療によって引き起こされる骨粗鬆症を含む、項４に記載の方法。
【００１６】
６．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、疾患と合併する骨粗鬆症を予防及び治療するための方法であって、前記疾患と合併する骨粗鬆症は、グルココルチコイド、原発性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、原発性胆汁性肝硬変、性腺機能低下、糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、慢性腎臓病、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎、骨関節炎、性腺ホルモン治療、抗てんかん薬治療、化学療法薬物治療と合併する骨粗鬆症を含む、疾患と合併する骨粗鬆症を予防及び治療するための方法。
【００１７】
７．骨粗鬆症に罹患しやすい被験者、骨粗鬆症に罹患するリスクが高い被験者、または骨粗鬆症に罹患していると診断された被験者に、骨折の発生を予防するために有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、骨粗鬆症による骨折を予防するための方法。
【００１８】
８．前記被験者は、グルココルチコイド、原発性副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、原発性胆汁性肝硬変、性腺機能低下、糖尿病、高血圧、アテローム性動脈硬化症、慢性腎臓病、リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎または骨関節炎に罹患している被験者を含む、項７に記載の方法。
【００１９】
９．前記被験者は、性腺ホルモン治療、抗てんかん薬治療または化学療法薬治療を受けている被験者を含む、項７に記載の方法。
【００２０】
１０．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、骨芽細胞の活性を増強するための方法。
【００２１】
１１．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、骨塩代謝を調節制御するための方法。
【００２２】
１２．前記調節制御は、血中カルシウムレベルを低下させることと、血中リン酸塩レベルを上昇させることと、骨基質におけるカルシウムの沈着を促進すること及び／または血管壁、内臓におけるカルシウムの沈着を低下させることとを含む、項１１に記載の方法。
【００２３】
１３．前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するものである、項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【００２４】
１４．前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２において、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を添加、削除及び／または置換したものであり、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【００２５】
１５．前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【００２６】
１６．前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ−プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である、項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【００２７】
１７．前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【００２８】
１８．前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【００２９】
１９．前記プラスミノーゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである、項１３〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【００３０】
２０．前記プラスミノーゲンは、ヒト由来の天然プラスミノーゲンである、項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【００３１】
２１．前記被験者はヒトである、項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００３２】
２２．前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している、項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【００３３】
２３．前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である、項２２に記載の方法。
【００３４】
２４．項１〜２３のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン。
【００３５】
２５．薬学的に許容される担体及び項１〜２３のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンを含む薬物組成物。
【００３６】
２６．（ｉ）項１〜２３のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンと、（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための手段（ｍｅａｎｓ）とを含む、予防性または治療性キット。
【００３７】
２７．前記手段はシリンジまたはバイアルである、項２６に記載のキット。
【００３８】
２８．項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するラベルまたはプロトコルをさらに含む、項２６または２７に記載のキット。
【００３９】
２９．ラベルを含む容器と、
（ｉ）項１〜２３のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン、またはプラスミノーゲンを含む薬物組成物とを含む製品であって、
前記ラベルは、項１〜２３のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する、製品。
【００４０】
３０．その他の薬物を含む、もう一つ以上の部材または容器をさらに含む、項２６〜２８のいずれか１項に記載のキット、または項２９に記載の製品。
【００４１】
３１．前記その他の薬物は、骨粗鬆症を治療するためのその他の薬物または骨粗鬆症と合併するその他の疾患を治療するための薬物を含む、項３０に記載のキットまたは製品。
【００４２】
３２．プラスミノーゲンを含む、骨粗鬆症を治療するための薬剤。
【００４３】
３３．プラスミノーゲンを含む、骨粗鬆症を治療するための薬物組成物、キット、製品。
【００４４】
３４．骨粗鬆症の治療に使用されるプラスミノーゲンの用途。
【００４５】
３５．本発明はさらに、上記項１〜２３のいずれか１項に記載の方法に使用される薬物、薬物組成物、製品、キットの製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。
【００４６】
本発明の上記いずれか一つの実施形態において、前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するものである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２において、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を添加、削除及び／または置換したものであり、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である。
【００４７】
一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ−プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸配列は２、６、８、１０または１２に示される通りである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはヒト由来の天然プラスミノーゲンである。
【００４８】
一部の実施形態において、前記被験者はヒトである。一部の実施形態において、前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している。一部の実施形態において、前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である。
【００４９】
一部の実施形態において、前記薬物組成物は、薬学的に許容される担体及び前記方法に使用されるプラスミノーゲンを含む。一部の実施形態において、前記キットは、（ｉ）前記方法に使用されるプラスミノーゲンと、（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための手段（ｍｅａｎｓ）とを含む、予防性または治療性キットであってもよい。一部の実施形態において、前記手段はシリンジまたはバイアルである。一部の実施形態において、前記キットは、前記いずれかの方法を実施するように前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するラベルまたはプロトコルをさらに含む。
【００５０】
一部の実施形態において、前記製品は、ラベルを含む容器と；（ｉ）前記方法に使用されるプラスミノーゲン、またはプラスミノーゲンを含む薬物組成物とを含む製品であり、前記ラベルは、前記いずれかの方法を実施するように前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する。
【００５１】
一部の実施形態において、前記キットまたは製品は、その他の薬物を含む、もう一つ以上の部材または容器をさらに含む。一部の実施形態において、前記その他の薬物は、脂質低下薬、抗血小板薬、血圧降下薬、血管拡張薬、血糖降下薬、抗凝固薬、血栓溶解薬、肝臓保護薬、抗不整脈薬、強心薬、利尿薬、抗感染薬、抗ウイルス薬、免疫調節薬、炎症調節薬、抗腫瘍薬からなる群より選ばれる。
【００５２】
前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは全身または局所投与により投与され、好ましくは、静脈内、筋肉内、皮下という経路により投与される。前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは適切なポリペプチド担体または安定化剤と組み合わせて投与する。前記方法の一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは毎日０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１〜８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜６００ｍｇ／ｋｇ、０．１〜４００ｍｇ／ｋｇ、１〜２００ｍｇ／ｋｇ、１〜１００ｍｇ／ｋｇ、１０〜１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１〜２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１〜８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１〜６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１〜４００ｍｇ／ｃｍ２、１〜２００ｍｇ／ｃｍ２、１〜１００ｍｇ／ｃｍ２、１０〜１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは少なくとも毎日投与する。
【００５３】
本発明は、本発明に係る実施形態どうしの技術的特徴のすべての組み合わせを明確にカバーし、且つこれらの組み合わせた技術構成は前記実施形態が単独且つ明確に開示されているように、本出願で明確に開示されている。また、本発明はさらに各実施形態及び要素のすべてのサブの組み合わせを明確にカバーし、さらに本明細書中において開示され、それぞれのサブの組み合わせが単独且つ明確に本明細書中において開示されているのと一緒である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
定義
「骨粗鬆症」は、骨量が低下し、骨微細構造が損傷して骨脆弱性の増加を引き起こし、骨折しやすいことを特徴とする全身性退行性骨疾患である。一般的には原発性、継発性、及び特発性骨粗鬆症の３種類に分けられる。
【００５５】
「原発性骨粗鬆症」はさらに閉経後骨粗鬆症（Ｉ型）と老年性骨粗鬆症（ＩＩ型）に分けられ、閉経後骨粗鬆症は一般的には女性の閉経後５〜１０年以内に発生する；老年性骨粗鬆症は一般的には、高齢者が６０歳以上に発症する骨粗鬆症を指す。原発性骨粗鬆症は主に骨量、骨損失、及び骨構造の重要な役割を強調し、骨量の減少、脆弱性の増加、構造の退化、骨折が発生し易いことをその臨床的特徴とする。
【００５６】
「継発性骨粗鬆症」とは、ある疾患、薬物またはその他の原因によって骨量が低下し、骨格の微細構造が変化し、脆弱性骨折が発生し易い疾患のことである。骨粗鬆症を引き起こすよく見られる疾患または薬物は、
１．内分泌疾患：
クッシング症候群、性腺機能低下、甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、糖尿病
２．リウマチ性疾患：
リウマチ様関節炎、全身性エリテマトーデス、強直性脊椎炎
３．血液系疾患：
多発性骨髄腫、白血病、リンパ腫、地中海貧血症（サラセミア）、血友病
４．薬物治療：
過量のグルココルチコイド、甲状腺ホルモンの過量代替、抗てんかん薬物、リチウムまたはアルミニウム中毒、細胞毒性または免疫抑制剤（シクロスポリンＡ、タクロリムス）、ヘパリン、性腺機能低下を引き起こす薬物（アロマターゼ阻害剤、ゴナドトロピン放出ホルモンアナログなど）
５．胃腸疾患：
慢性肝臓病（特に原発性胆汁性肝硬変）、炎性腸疾患（特にクローン病）、大部分胃切除手術、赤痢
６．腎臓疾患：
腎機能障害または腎不全
７．遺伝性疾患：
骨形成不全症、マルファン症候群、血色素症、ホモシスチン尿症、ポルフィリン症
８．その他の原因：
いかなる原因によるビタミンＤ不足、過量飲酒、神経性無食欲症、栄養不良、長期褥中、妊娠および授乳、慢性閉塞性肺疾患、脳血管障害（cerebralvascular accident）、器官移植、アミロイド症、多発性硬化症、後天性免疫不全症候群
を含む。
【００５７】
これらの継発性要素は骨芽細胞と破骨細胞の機能を影響することによって骨吸収を増加させ、及び／または骨形成を低下させて骨粗鬆症を引き起こす。
【００５８】
本発明の「継発性骨粗鬆症」という用語は、上記各原因による骨粗鬆症をカバーしている。
【００５９】
「特発性骨粗鬆症」は主に青少年の中で発生し、一般的には男性の発症年齢が５０歳未満、女性の発症年齢が４０歳未満の骨粗鬆症であり、潜在的な病気がなく、その原因は不明である。
【００６０】
ある疾患または状況と「合併した骨粗鬆症」とは、前記疾患または状況に伴う骨粗鬆症をいう。前記疾患または状況は骨粗鬆症との間にはある内在的な病因または発症メカニズムの関連があり得る。例えば、糖尿病と合併した骨粗鬆症、アテローム性動脈硬化症と合併した骨粗鬆症、慢性腎症と合併した骨粗鬆症、強直性脊椎炎と合併した骨粗鬆症、骨関節炎と合併した骨粗鬆症などが挙げられる。
【００６１】
プラスミンはプラスミノゲン活性化系（ＰＡ系）の重要な成分である。それは広スペクトルのプロテアーゼであり、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の幾つかの成分を加水分解することができ、これらの成分はフィブリン、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン及びプロテオグリカンを含む［１２］。また、プラスミンは一部のプロマトリックスメタロプロテアーゼ（ｐｒｏ−ＭＭＰ）を活性化させて活性のあるマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）にすることができる。そのためプラスミンは細胞外タンパク加水分解作用の一つの重要な上流調節因子である［１３−１４］。プラスミンはプラスミノゲンが二種類の生理性のＰＡ：組織型プラスミノゲン活性化剤（ｔＰＡ）またはウロキナーゼプラスミノゲン活性化剤（ｕＰＡ）をタンパク質加水分解することで形成されるものである。プラスミノゲンは血漿及び他の体液中において、相対的レベルが比較的高く、従来的にはＰＡ系の調節は主にＰＡの合成及び活性レベルよって実現されると考えられている。ＰＡ系成分の合成は異なる要素によって厳密な制御を受け、例えばホルモン、成長因子及びサイトカインである。また、この他に、プラスミンとＰＡｓの特定の生理的阻害剤が存在する。プラスミンの主な阻害剤はα２−抗プラスミン（α２−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ）である。ＰＡｓの活性は、ｕＰＡとｔＰＡのプラスミノーゲン活性剤阻害剤−１（ＰＡＩ−１）に同時に阻害され、ｕＰＡを主に阻害するプラスミノーゲン活性剤阻害剤−２（ＰＡＩ−２）によって調節される。一部の細胞表面には直接加水分解する活性のあるｕＰＡ特異性細胞表面受容体（ｕＰＡＲ）がある［１５−１６］。
【００６２】
プラスミノゲンは単一鎖の糖タンパクであり、７９１個のアミノ酸からなり、分子量は約９２ｋＤａである［１７−１８］。プラスミノゲンは主に肝臓で合成され、大量に細胞外液に存在している。血漿中に含まれるプラスミノゲンの含有量は約２μＭである。そのためプラスミノゲンは組織及び体液中のタンパク質加水分解活性の大きな潜在的な由来である［１９−２０］。プラスミノゲンには二種類の分子の形が存在する：グルタミン酸−プラスミノゲン（Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）及びリジン−プラスミノゲン（Ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）である。天然的に分泌されかつ分解していない形のプラスミノゲンは一つのアミノ基末端（Ｎ−末端）グルタミン酸を有し、そのためグルタミン酸−プラスミノゲンと称される。しかし、プラスミンが存在する場合、グルタミン酸−プラスミノゲンはＬｙｓ７６−Ｌｙｓ７７においてリジン−プラスミノゲンに加水分解される。グルタミン酸−プラスミノゲンと比較して、リジン−プラスミノゲンはフィブリンとより高い親和力を有し、さらにより高い速度でＰＡによって活性化されることができる。この二種類の形のプラスミノゲンのＡｒｇ５６０−Ｖａｌ５６１ペプチド結合はｕＰＡ  またはｔＰＡによって切断され、これによりジスルフィド結合によって接続された二重鎖プロテアーゼプラスミンの形成をもたらす［２１］。プラスミノゲンのアミノ基末端部分は五つの相同性三環を含み、即ちいわゆるｋｒｉｎｇｌｅｓであり、カルボキシル基末端部分はプロテアーゼドメインを含む。一部のＫｒｉｎｇｌｅｓはプラスミノゲンとフィブリン及びその阻害剤α２−ＡＰの特異的相互作用を介在するリジン結合部位を含む。最も新しく発見されたのは３８ｋＤａのフィブリンプラスミノゲンフラグメントであり、ｋｒｉｎｇｌｅｌ−４を含み、血管生成の有効的な阻害剤である。このフラグメントはアンジオスタチン（Angiostatin）と命名され、幾つかのプロテアーゼ加水分解プラスミノゲンから生成される。
【００６３】
プラスミンの主な基質はフィブリンであり、フィブリンの溶解は病理学的血栓の形成を予防するキーポイントである［２２］。プラスミンはさらにＥＣＭの幾つかの成分に対する基質特異性を有し、これらはラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン及びゼラチンを含み、これはプラスミンがＥＣＭ再建において重要な作用を有することを示している［１８、２３−２４］。間接的に、プラスミンはさらにいくつかのプロテアーゼ前駆体を活性プロテアーゼに変換することによりＥＣＭのその他の成分を分解し、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−９を含む。そのため、以下のように提唱する人がいる。プラスミンは細胞外タンパク加水分解の重要な上流調節因子である可能性がある［２５］。また、プラスミンはいくつかの潜在的な形の成長因子を活性化させる能力を有する［２６−２８］。体外において、プラスミンはさらに補体系の成分を加水分解させて走化性の補体フラグメントを放出することができる。
【００６４】
「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解する。
【００６５】
「プラスミノーゲン」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドのヒト由来の天然プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列４）は計算によれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９０ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノーゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ  Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１−５）を含む。ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ１９を含み、ＰＡｐは残基Ｇｌｕ２０−Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３−Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４−Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５−Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７−Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１−Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１−Ａｒｇ８０４を含む。
【００６６】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは天然のフルサイズのプラスミノーゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）。該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。体内において、さらにＧｌｕ−プラスミノーゲンの第７６−７７位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ−プラスミノーゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。δ−プラスミノーゲン（δ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノーゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２−Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず［２９−３０］、δ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり［３１］、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノーゲン（Ｍｉｎｉ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドＧｌｕ−プラスミノーゲン配列を含まないＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており［３１］、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノーゲン（Ｍｉｃｒｏ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し［３２］、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１−Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許の配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。
【００６７】
本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノーゲン」と「フィブリンプラスミノーゲン」、「繊維タンパクプラスミノーゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
【００６８】
本願において、プラスミノーゲンの「欠乏」とは、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より低く、被験者の正常な生理学的機能に影響を及ぼすのに十分に低いことをいう。プラスミノーゲンの「欠乏」の意味は、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より明らかに低く、活性または発現が極微量であり、外部供給によってのみ正常な生理学的機能を維持できることである。
【００６９】
当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノーゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノーゲン及びプラスミンをカバーするものである。
【００７０】
循環プロセスにおいて、プラスミノーゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノーゲン活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミンとなる。活性を有するプラスミンはさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解させ、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノーゲンのＰＡｐドメインはプラスミノーゲンを非活性閉鎖コンフォメーションにする重要なエピトープであり、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノーゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、以下を含む：組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び血液凝固因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などである。
【００７１】
「プラスミノーゲン活性フラグメント」とはプラスミノーゲンタンパク質において、基質中のターゲット配列と結合してタンパク質加水分解機能を発揮できる活性フラグメントである。本発明はプラスミノーゲンの技術構成に係り、プラスミノーゲン活性フラグメントでプラスミノーゲンの代替とする技術構成を含む。本発明に記載のプラスミノーゲン活性フラグメントはプラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むタンパク質であり、好ましくは、本発明に記載のプラスミノーゲン活性フラグメントは配列１４、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含むものである。そのため、本発明に記載のプラスミノーゲンは該プラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つ依然として該プラスミノーゲン活性を有するタンパク質を含む。
【００７２】
現在、血液中のプラスミノーゲン及びその活性測定方法は以下を含む：組織フィブリンプラスミノーゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ−ＰＡＡ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ−ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノーゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織プラスミノーゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿プラスミン−抗プラスミン複合体に対する測定（ＰＡＰ）。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象(被験者)の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のプラスミノーゲンはＳＫの作用下においてプラスミンとなり、後者は発光基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はプラスミノーゲンの活性と正比例の関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のフィブリンプラスミノーゲン活性に対して測定を行うことができる。
【００７３】
「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは異なる種どうしのホモログであり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含む。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノーゲンはヒト由来の天然プラスミノーゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノーゲン活性を有するプラスミノーゲンオルソログを含む。
【００７４】
「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、塩基性、疎水性など）のアミノ酸でペアレントタンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性の塩基性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％〜９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素を含み、、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然またはペアレントタンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
【００７５】
「分離された」プラスミノーゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノーゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノーゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になる精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノーゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造することができ、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノーゲンを含む。
【００７６】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するか有しない）を含む融合物；等々である。
【００７７】
参照ポリペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要に応じてギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は配列をアライメントするための適切なパラメータを決めることができ、比較対象の配列のフルサイズに対して最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ−２により得られるものである。
【００７８】
ＡＬＩＧＮ−２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、所定のアミノ酸配列Ａの所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、と、またはについてのあるアミノ酸配列と同一性を有する又は含む所定のアミノ酸配列Ａともいう）は以下のように計算される：
分数Ｘ／Ｙ×１００
【００７９】
そのうちＸは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２において該プログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。特に断りのない限り、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムによって得られるものである。
【００８０】
本文において使用されているように、用語の「治療」及び「処理」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状を完全または一部予防すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む：（ａ）疾患が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況であること；（ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害すること；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状を減退させること。
【００８１】
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。
【００８２】
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノーゲンの量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノーゲン、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
【００８３】
本発明のプラスミノーゲンの調製
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４ページ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ  Ａ．２００６Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．６：３−１０及びＣａｍａｒｅｒｏ  ＪＡら  ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンと単一のＮ保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と接続する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
【００８４】
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノーゲンを生産する。例えば、プラスミノーゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に接続させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーターシステムとすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノーゲンの収集及び精製に適した条件下において宿主を維持する。
【００８５】
適切な発現ベクターは通常宿主体内において附加体または宿主染色体ＤＮＡの整合部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、インビトロで所望のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
【００８６】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は目的抗体をコードするポリヌクレオチドをクローンする原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と相容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β−ラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージλ由来のプロモーターシステムである。プロモーターは一般的に発現を制御し、必要に応じて遺伝子配列を制御する場合に、転写及び翻訳を起動するために、さらにリボソームの結合位置配列を有してもよい。
【００８７】
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えばサッカロミセス（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母プロモーターはアルコール脱水素酵素、イソチトクロムＣ、及びマルトースとガラクトースの利用のための酵素のプロモーターを含む。
【００８８】
微生物以外に、哺乳動物細胞（例えば体外細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明のプラスミノーゲンの発現および生成に用いることができる（例えば目的抗−Ｔａｕ抗体をコードするポリヌクレオチド）。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマを含む。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報位置、例えばリボソームの結合サイト、ＲＮＡの切断サイト、ポリアデノシン酸化サイト、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなどの派生のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。
【００８９】
一旦合成（化学または組み換え的に）されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノーゲンを精製することができる。該プラスミノーゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％〜９０％の純度で、少なくとも約９０％〜９５％の純度で、または９８％〜９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、目的抗体以外の大分子などである。
【００９０】
薬物配合剤
所望の純度のプラスミノーゲンと必要に応じた薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；ｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（少なくとも１０個の残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成対イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛−タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましくは凍結乾燥された抗−ＶＥＧＦ抗体配合剤であり、ＷＯ  ９７／０４８０１に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。
【００９１】
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、血圧降下薬、抗不整脈薬、糖尿病治療薬等である。
【００９２】
本発明のプラスミノーゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に内包ことができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたは粗エマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【００９３】
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノーゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌濾過膜で濾過することで容易に実現できる。
【００９４】
本発明のプラスミノーゲンは緩衝製剤を調製できる。緩衝製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過マトリックスを含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。緩衝基質の実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ（ビニールアルコール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン−ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｖｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン−酢酸エチル及び乳酸−ヒドロキシ酢酸は、持続的に分子を１００日間以上放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。
【００９５】
投与及び使用量
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈）、筋肉内投与により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。
【００９６】
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。
【００９７】
医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノーゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１−５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってに従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量のスケジュール表は連続数日１−１０ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において治療効果及び安全性はリアルタイムに評価すべきである。
【００９８】
製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、骨粗鬆症及びその関連疾患を治療するための本発明のプラスミノーゲンまたはプラスミンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはプロトコルを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲン／プラスミンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の前記骨粗鬆症及びその関連疾患の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
【００９９】
治療の効力と治療安全性
本発明の一つの実施形態はプラスミノーゲンを用いて被験者を治療した後、治療効力および治療安全性に対して判断を行うことに係る。よく用いられる骨粗鬆症治療効果のモニタリングと評価内容は、定着フォロー（不良反応、規範服薬、基礎措置および骨折リスク因子再評価など）、新発骨折評価（臨床的骨折、身長低下、映像学検査）、骨密度（ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ，ＢＭＤ）測定と骨代謝回転マーカー（ｂｏｎｅ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｍａｒｋｅｒｓ，ＢＴＭ）測定、及びこれらのデータに基づく総合的再評価などを含む。その中で、ＢＭＤと骨量は現在最も広範に応用されている治療効果のモニタリングと評価方法である。例えば、二重エネルギーＸ線吸収測定器（ｄｕａｌ  ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−ｒａｙ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ，ＤＸＡ）、定量ＣＴ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，ＱＣＴ）、単一光子吸収法（ＳＰＡ）、または超音波測定法によりＢＭＤを測定することができる。治療開始後、毎年ＢＭＤを１回測定し、ＢＭＤが安定してから間隔を適切に延長することができ、例えば、２年に１回モニタリングすることができる。ＢＴＭについて、現在、血清学指標においてよく使用されている骨形成指標は、血清１型プロコラゲンＮ末端プロペプチド（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  １  ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ，ＰＩＮＰ）であり、骨吸収指標は血清１型プロコラゲンＣ末端テロペプチド（ｓｅｒｕｍ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ，Ｓ−ＣＴＸ）である。研究の進展により、より合理的な測定指標を適時に調整することができる。治療開始前に基線値を測定し、形成を促進する薬物を用いて治療してから３ヶ月、吸収を抑制する薬物を用いて治療してから３〜６ヶ月に測定すべきである。ＢＴＭは骨格の動態情報を提供することができ、作用と機能ではＢＭＤから独立しているとともに、ＢＭＤと相互補完のモニタリング手段となり、両者を結合するとより高い臨床的価値を有する。一般的には、治療後ＢＭＤが上昇したり安定したり、ＢＴＭには予想される変化があり、しかも治療中に骨折がない場合、治療反応が良好であると考えられる。また、本発明はさらに、プラスミノーゲン及びその変異体を用いて被験者を治療する過程中および治療後に該治療案の安全性に対する判断に係り、これは、被験者体内での薬物の血清半減期、治療半減期、半数中毒量（ＴＤ５０）、半数致死量（ＬＤ５０）を統計し、または治療過程においてまたは治療後に発生する、アレルギー反応のような様々な不良事件を観察することを含むが、これらに限定されていない。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は１５週齢の野生型とプラスミノーゲン欠陥型マウスの膝関節のＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏの染色の代表的な写真を示すものである。Ａは野生型マウスであり、Ｂはプラスミノーゲン欠陥型マウスである。野生型マウスと比べ、プラスミノーゲン欠陥型マウスには広範な骨質減少と骨髄細胞の増加が現れる。
【図２】図２は１５週齢のプラスミノーゲン欠陥型および野生型マウスの血中カルシウムの検出結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン欠陥型（Ｋｏ）マウスの血中カルシウムレベルは野生型マウス（Ｗｔ）より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが正常なカルシウム代謝を維持することにおいて重要な役割を果たすことを示している。
【図３】図３はプラスミノーゲン欠陥型（Ｐｌｇ−／−）マウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の膝関節Ｈ＆Ｅの染色観察結果を示すものである。ＡとＣは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、ＢとＤはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群は成長板（矢印に表記される）の排列が乱れ、一部の骨髄腔内の骨髄が消えた（三角に表記される）；プラスミノーゲン投与群は成長板（矢印に表記される）の排列が整っている。これは、プラスミノーゲンがＰｌｇ−／−マウスの膝関節の成長板の正常な成長を促進することができることを示している。
【図４】図４はＰｌｇ−／−マウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の膝関節の関節軟骨のアルカリフォスファターゼの染色観察結果を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群の関節軟骨表面には極少ないアルカリフォスファターゼの着色しかなく、プラスミノーゲン投与群の関節軟骨表面には多くの深紅のアルカリフォスファターゼの着色がある（矢印に表記される）。これは、プラスミノーゲン投与群の関節軟骨表面のアルカリフォスファターゼの活性は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、すなわち、プラスミノーゲンが膝関節の関節軟骨の骨芽細胞の活性の増加を明らかに促進したことを示している。
【図５】図５はＰｌｇ−／−マウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の膝関節の成長板のアルカリフォスファターゼの染色観察結果を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群の成長板の骨芽細胞の活性箇所にはアルカリフォスファターゼの着色があり（矢印に表記される）、浅紅色を呈する；プラスミノーゲン投与群の成長板には多くのアルカリフォスファターゼの着色があり、しかも深紅色を呈する。これは、プラスミノーゲンを投与した後、膝関節の成長板の骨芽細胞の活性の増加を促進することができることを示している。
【図６】図６は０．５μｇ／ｋｇビタミンＤ老衰モデルＣ５７マウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の血清のアルカリフォスファターゼの検出結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの血清のアルカリフォスファターゼの活性は溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスより明らかに高く、しかもその統計学的に有意であり（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群マウスの血清アルカリフォスファターゼの活性はブランク対照群マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンがビタミンＤ老衰モデルマウスの骨芽細胞活性の増加を顕著に促進できることを示唆している。
【図７】図７は１μｇ／ｋｇビタミンＤ老衰モデルＣ５７マウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膝関節の成長板のアルカリフォスファターゼ染色の代表的な写真を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの膝関節の成長板のアルカリフォスファターゼの陽性着色（矢印に表記される）はブランク対照群マウスより明らかに少ない；プラスミノーゲン投与群の膝関節の成長板のアルカリフォスファターゼの陽性着色は溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスより明らかに高い。これは、プラスミノーゲンがビタミンＤにより誘発された老衰モデルマウスの膝関節の成長板の骨芽細胞の活性を改善できることを示している。
【図８】図８は異なる週齢段階のＰｌｇ−／−とＰｌｇ＋／＋マウスの頭蓋骨のＭｉｃｒｏ  ＣＴ骨密度の検出結果を示すものである。Ａは皮質骨密度であり、Ｂは頭蓋骨の全骨密度である。その結果、週齢が増えるにつれて、Ｐｌｇ＋／＋マウスの皮質骨密度と全骨密度はしだいに増加する傾向があるが、Ｐｌｇ−／−マウスの頭蓋骨の皮質骨密度と全骨密度はしだいに低下した。この二種類のマウスの骨密度は２０〜２１週齢において極有意な差があり、２９〜３０週齢においてその差がより有意になる。これは、プラスミノーゲンが頭蓋骨の骨密度の調節において重要な役割を果たし、骨粗鬆と密接な関係があることを示している。
【図９】図９は２０〜２１週齢段階のＰｌｇ−／−とＰｌｇ＋／＋マウスの頭蓋骨のＭｉｃｒｏ  ＣＴ骨塩含有量の検出結果を示すものである。その結果、２０〜２１週齢のＰｌｇ＋／＋マウスの皮質骨と全骨の骨塩含有量はＰｌｇ−／−マウスより明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である。これは、プラスミノーゲンが頭蓋骨の骨塩含有量の調節において重要な役割を果たし、骨粗鬆と密接な関係があることを示している。
【図１０】図１０は異なる週齢段階のＰｌｇ−／−とＰｌｇ＋／＋マウスの大腿骨のＭｉｃｒｏ  ＣＴ骨密度の検出結果を示すものである。Ａは皮質骨密度であり、Ｂは海綿骨密度であり、Ｃは小柱骨密度であり、Ｄは全骨密度である。その結果、１２〜３０週齢の間、週齢が増えるにつれてＰｌｇ＋／＋マウスの大腿骨密度はしだいに増加するに対して、Ｐｌｇ−／−マウスの大腿骨の皮質骨密度、海綿骨密度、小柱骨密度および全骨密度はしだいに減少する。この間、Ｐｌｇ＋／＋マウスの大腿骨密度はＰｌｇ−／−マウスより高く、２０週齢において二種類のマウスの骨密度の差が有意であり、しかも週齢が増えるにつれて、両者の差がますます有意になる。これは、プラスミノーゲンが大腿骨密度の調節に寄与し、しかも一定の時期において重要な役割を果たすことを示している。
【図１１】図１１は異なる週齢段階のＰｌｇ−／−とＰｌｇ＋／＋マウスの大腿骨のＭｉｃｒｏ  ＣＴ骨塩含有量の検出結果を示すものである。Ａは皮質骨塩含有量であり、Ｂは海綿骨塩含有量であり、Ｃは小柱骨塩含有量であり、Ｄは全骨塩含有量である。その結果、１２〜３０週齢の間、週齢が増えるにつれてＰｌｇ＋／＋マウスの大腿骨の異なる部分の塩含有量はあまり変化しないかしだいに増加するに対して、Ｐｌｇ−／−マウスの大腿骨の海綿骨と小柱骨塩含有量はしだいに減少する。この間、Ｐｌｇ＋／＋マウスの大腿骨塩含有量はＰｌｇ−／−マウスより高く、２０週齢において二種類のマウスの大腿骨皮質骨、小柱骨および全骨骨塩含有量の差が有意であり、しかも週齢が増えるにつれて、両者の骨塩含有量の差がますます有意になる。これは、プラスミノーゲンが大腿骨骨塩代謝の調節に関与し、しかも一定の時期において重要な役割を果たすことを示している。
【図１２】図１２は異なる週齢段階のＰｌｇ−／−とＰｌｇ＋／＋マウスの腰椎骨のＭｉｃｒｏ  ＣＴ骨密度の検出結果を示すものである。Ａは皮質骨密度であり、Ｂは海綿骨密度であり、Ｃは小柱骨密度であり、Ｄは全骨密度である。その結果、１２〜３０週齢の間、週齢が増えるにつれてＰｌｇ＋／＋マウスの腰椎骨骨密度はしだいに増加するに対して、Ｐｌｇ−／−マウスの腰椎骨の皮質骨密度、海綿骨密度、小柱骨密度および全骨密度はしだいに減少する。この間、Ｐｌｇ＋／＋マウスの骨密度はＰｌｇ−／−マウスより高く、１２週齢において二種類のマウスの腰椎骨骨密度の差が有意であり、しかも週齢が増えるにつれて、両者の差がますます有意になる。これは、プラスミノーゲンが腰椎骨密度の調節に関与し、しかも一定の時期において重要な役割を果たすことを示している。
【図１３】図１３は異なる週齢段階のＰｌｇ−／−とＰｌｇ＋／＋マウスの腰椎骨のＭｉｃｒｏ  ＣＴ骨塩含有量の検出結果を示すものである。Ａは皮質骨塩含有量であり、Ｂは海綿骨塩含有量であり、Ｃは小柱骨塩含有量であり、Ｄは全骨塩含有量である。その結果、１２〜３０週齢の間、週齢が増えるにつれてＰｌｇ＋／＋マウスの腰椎骨の異なる部分の塩含有量はあまり変化しないに対して、Ｐｌｇ−／−マウスの腰椎骨の皮質骨、海綿骨、小柱骨および全骨塩含有量はしだいに減少する。この間、Ｐｌｇ＋／＋マウスの腰椎骨塩含有量はＰｌｇ−／−マウスより高く、２０週齢において二種類のマウスの腰椎骨の海綿骨と皮質骨の区域の骨塩含有量の差が有意であり、しかも週齢が増えるにつれて、両者の差がますます有意になる。これは、プラスミノーゲンが腰椎骨骨塩代謝の調節に関与し、しかも一定の時期において重要な役割を果たすことを示している。
【図１４】図１４は異なる週齢段階のＰｌｇ−／−とＰｌｇ＋／＋マウスの血清のアルカリフォスファターゼの検出結果を示すものである。その結果、１２〜３０週齢において、Ｐｌｇ＋／＋マウスの血清のアルカリフォスファターゼの活性は変動するがその変化が有意ではないに対して、Ｐｌｇ−／−マウスの血清のアルカリフォスファターゼの活性は週齢の増加につれてしだいに低下する；Ｐｌｇ＋／＋マウスの血清のアルカリフォスファターゼの活性はＰｌｇ−／−マウスより明らかに高く、二種類のマウスの血清のアルカリフォスファターゼの活性は１２週齢においてその差が有意であり、しかも週齢が増えるにつれて、その差がますます有意になる。これは、プラスミノーゲンが骨芽細胞の活性を促進し、骨再建を促進することができることを示している。
【図１５】図１５はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の血中カルシウムの検出結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの血中カルシウム濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの血中カルシウムの含有量を低下させることができることを示している。
【図１６】図１６はＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを３０日投与した後の大動脈洞のアリザリンレッド染色の代表的な写真を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの大動脈洞のカルシウム沈着は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化における大動脈洞の石灰化を改善することができることを示している。
【図１７】図１７はアテローム性動脈硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを投与した後の大腿骨密度の検出結果を示すものである。Ａは皮質骨密度であり、Ｂは海綿骨密度であり、Ｃは小柱骨密度であり、Ｄは全骨密度である。その結果、プラスミノーゲンを１０日投与した後、プラスミノーゲン投与群マウスの大腿骨密度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかも海綿骨密度と全骨密度の差が有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）；３０日投与した後、プラスミノーゲン投与群マウスの海綿骨密度、小柱骨密度および全骨密度は溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べて明かに上昇し、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。皮質骨密度では二つの群には明らかな差はない。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症モデルマウスの骨密度の上昇を促進し、アテローム性動脈硬化症による骨粗鬆症を改善できることを示している。
【図１８】図１８はアテローム性動脈硬化症モデルマウスにプラスミノーゲンを投与した後の膝関節のＨ＆Ｅ染色の代表的な写真を示すものである。Ａ〜Ｃは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｄ〜Ｅはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群の軟骨表面には軽度の繊維化があり（細い矢印に表記される）、小柱骨（三角に表記される）が明らかに細くなり、太さが均一ではなく、軟骨組織（スターに表記される）の排列が乱れ、成長板（太い矢印に表記される）の分層が乱れ、軟骨細胞が軽度に減少し、潮標（tidemark）が基本的に鮮明である；プラスミノーゲン投与群の関節軟骨表面は基本的に正常であり、潮標が鮮明であり、骨小柱の太さが均一であり、成長板の構造がはっきりし、分層が規則して識別できる。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの膝関節の状況を改善できることを示している。
【図１９】図１９はＣ５７卵巣切除およびデキサメタゾン注射により誘発された骨粗鬆症モデルマウスにプラスミノーゲンを投与した後の体重への影響を示すものである。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの体重は正常対照群より明らかに低く、プラスミノーゲン投与群の体重は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（Ｐ＜０．０５）。これは、プラスミノーゲンが卵巣切除およびデキサメタゾン注射により誘発された骨粗鬆症モデルマウスの体重の回復を顕著に促進できることを示している。
【図２０】図２０はＣ５７卵巣切除およびデキサメタゾン注射により誘発された骨粗鬆症モデルマウスにプラスミノーゲンを投与した後の大腿骨のＭｉｃｒｏ  ＣＴスキャンの測定結果を示すものである。Ａは骨体積の測定結果であり、Ｂは骨塩含有量の測定結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの大腿骨の海綿骨、小柱骨および全骨の体積と骨塩含有量は、いずれも溶媒ＰＢＳ投与対照群より大きく、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが骨粗鬆症モデルマウスの大腿骨塩の沈着と骨体積の増加を促進し、骨粗鬆を改善できることを示している。
【図２１】図２１はＣ５７卵巣切除およびデキサメタゾン注射により誘発された骨粗鬆症モデルマウスにプラスミノーゲンを投与した後の大腿骨のＭｉｃｒｏ  ＣＴスキャンの測定結果を示すものである。  図２１Ａは大腿骨骨密度の測定結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの大腿骨の皮質骨、海綿骨、小柱骨および全骨骨密度はいずれも正常対照群より小さいに対して、プラスミノーゲン投与群マウスの各部分の骨密度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より大きい。その傾向が明確であるが、マウスの数が少ないため、その差が統計学的に有意に近いだけである。マウスの数を増やすと統計学的な差が現れると予測できる。  図２１Ｂは大腿骨骨塩含有量の測定結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの大腿骨の各部分の骨塩含有量はいずれも正常対照群より小さいに対して、プラスミノーゲン投与群マウスの各部分の骨塩含有量はいずれも溶媒ＰＢＳ投与対照群より大きい。その傾向が明確であるが、マウスの数が少ないため、その差が統計学的に有意に近いだけである。マウスの数を増やすと統計学的な差が現れると予測できる。  図２１Ｃは小柱骨の体積の測定結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの大腿骨の小柱骨の体積は正常対照群より小さいに対して、プラスミノーゲン投与群マウスの大腿骨の小柱骨の体積は溶媒ＰＢＳ投与対照より大きい。その傾向が明確であるが、マウスの数が少ないため、その差が統計学的に有意に近いだけである。マウスの数を増やすと統計学的な差が現れると予測できる。  以上によって、プラスミノーゲンが骨粗鬆を明らかに改善し、大腿骨の各部分の骨密度と骨量の増加を促進することができ、しかも小柱骨に対する改善作用が特に明らかである。
【図２２】図２２はＣ５７卵巣切除およびデキサメタゾン注射により誘発された骨粗鬆症モデルマウスにプラスミノーゲンを投与した後の膝関節のＨ＆Ｅ染色とＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏ染色の代表的な写真を示すものである。ＡとＣは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、ＢとＤはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群の骨小柱（矢印に表記される）は明らかに細くなって裂け、大きい面積の無骨小柱骨髄腔が現れ、髄腔が増大し、骨小柱の連接が中断し、成長板下の骨細胞が軽度に減少した（三角に表記される）；プラスミノーゲン投与群の骨小柱部分は細くなり、溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、骨小柱の連続性が良く、太く、大きい面積の無骨小柱区域がなく、軟骨組織の分層構造も規則している。これは、プラスミノーゲンが骨粗鬆症モデルマウスの膝関節の状況を明らかに改善できることを示している。
【図２３】図２３はＣ５７卵巣切除およびデキサメタゾン注射により誘発された骨粗鬆症モデルマウスにプラスミノーゲンを投与した後の膝関節のアルカリフォスファターゼ染色の代表的な写真を示すものである。ＡとＣは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、ＢとＤはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの膝関節の軟骨組織（細い矢印に表記される）と成長板（太い矢印に表記される）のアルカリフォスファターゼ着色はプラスミノーゲン投与群より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンが骨粗鬆症モデルマウスの膝関節の骨芽細胞活性の増加を促進できることを示している。
【図２４】図２４はＰｌｇ＋／＋卵巣切除により誘発された骨粗鬆症モデルマウスにプラスミノーゲンを投与した後の血清カルシウムの検出結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの血清カルシウム濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが卵巣切除された骨粗鬆症モデルマウスの血中カルシウムの濃度を顕著に低下させることができることを示している。
【図２５】図２５はＰｌｇ＋／＋卵巣切除により誘発された骨粗鬆症モデルマウスにプラスミノーゲンを投与した後の血清リンの検出結果を示すものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの血清リン濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが卵巣切除された骨粗鬆症モデルマウスの血中リンの濃度を顕著に上昇させることができることを示している。
【図２６】図２６はプラスミノーゲンを投与した後の３％コレステロール高脂血症モデルマウスの膝関節のアルカリフォスファターゼの染色結果を示すものである。ＡとＣ溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、ＢとＤはブランク対照群であり、Ｅは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの膝関節のアルカリフォスファターゼ着色（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが３％コレステロール高脂血症モデルマウスの膝関節の骨芽細胞の活性を顕著に増加させることができることを示している。
【図２７】図２７はＣ５７卵巣切除およびデキサメタゾン注射により誘発された骨粗鬆症モデルマウスにプラスミノーゲンを投与した後の膝関節のＨ＆Ｅ染色とＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏ染色の代表的な写真を示すものである。ＡとＣは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、ＢとＤはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群の膝関節の骨小柱（矢印に表記される）は明らかに細くなって裂け、大きい面積の無骨小柱骨髄腔が現れ、骨小柱の連接が中断し、関節表面部分には繊維化があり、成長板下の骨形成区域の骨芽組織が明らかに減少した（三角に表記される）；プラスミノーゲン投与群の骨小柱部分は細くなり、溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、骨小柱の連続性が良く、ひどい裂けがなく、大きい面積の無骨小柱区域がなく、軟骨組織の分層構造も規則し、潮標も鮮明である。これは、プラスミノーゲンが骨粗鬆症モデルマウスの膝関節の状況を明らかに改善できることを示している。
【実施例】
【０１０１】
材料と方法：
動物：Ｃ５７マウスとＰｌｇ＋／＋およびＰｌｇ−／−マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂ）を相関実験に使用した。動物は中国国家標準に合致する実験動物の使用環境に飼育された。
試薬：ビタミンＤ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、品目番号Ｄ１５３０）、コーンオイル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、品目番号Ｃ８２６７）、低カルシウムの特殊飼料（０．２％カルシウム、１％リン酸塩、２０００ＵビタミンＤ３／ｋｇ、南通トロフィー飼料科技有限公司、１５ｋｇ）、カルシウム含有量測定キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ｃ００４−２）、ヒトプラスミノーゲン（１０ｍｇ／ｍｌ、健常な血漿献血者から精製された）。
Ａｌｏｋａ  Ｍｉｃｒｏ  ＣＴはマウス、ラットの形態観察に専用され、最新の第三代Ｘ線測定を採用し、短時間で高品質の断層撮影画像が得られる。骨測定（骨密度、骨塩含有量、骨体積、骨微細構造など）、体脂肪率測定、内臓、皮下脂肪の識別および測定、シンクロ撮影などに使用できる。骨測定はマウスの大腿骨、頭蓋骨または腰椎骨を測定対象とする。マウスを殺処分してから大腿骨、頭蓋骨、及び腰椎骨を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行い、Ｍｉｃｒｏ  ＣＴ（Ａｌｏｋａ、日本ＨＩＴＡＣＨＩ社製）を採用して骨を測定した。
【０１０２】
［実施例１］
実施例１は、プラスミノーゲンの欠乏が骨粗鬆症と密接な関係があることに関するものである。
１５週齢の野生型とプラスミノーゲン欠陥型（Ｐｌｇ−／−）マウス各５匹ずつを取った。膝関節を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において２４時間固定を行い、１０％ＥＤＴＡにおいて三週間脱カルシウムを行い、段階的にスクロース溶液で洗浄した。以上の操作は４℃の条件下で行う必要がある。そしてパラフィンで包埋し、８μｍ切片に対してＳａｆｒａｎｉｎ  Ｏ染色を行った。切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、野生型マウス（図１Ａ）と比べ、Ｐｌｇ−／−マウス（図１Ｂ）には広範な骨質減少と骨髄細胞の増加が現れる。
【０１０３】
［実施例２］
実施例２は、野生マウスとプラスミノーゲン欠陥型マウスのカルシウム流失の対比に関するものである。
１５週齢の野生型（ｗｔ）とプラスミノーゲン欠陥型（ｋо）マウス各５匹ずつを取った。二つの群のマウスについて眼球を摘出して採血し、血中カルシウム濃度を検出した。正常な状況下で、体内カルシウムバランスは非常に精密に調節されている。しかし、骨粗鬆症の場合、カルシウム流失は骨粗鬆症の重要な指標の一つである。野生型とＰｌｇ−／−マウスにおけるカルシウムのレベルを研究した結果、１５週齢において、Ｐｌｇ−／−（ｋо）マウスの血中カルシウムレベルは野生型マウスより明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）（図２）。
【０１０４】
［実施例３］
実施例３は、プラスミノーゲンがＰｌｇ−／−マウスの膝組織構造に対する保護作用に関するものである。
２０週齢のＰｌｇ−／−マウス８匹を取ってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で各４匹ずつとした。実験の１日目に体重を測って群に分け、プラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、３１日目にマウスを殺処分し、膝関節を取って固定液において４℃で２４時間固定を行った。固定液は、２％パラホルムアルデヒド、０．０７５ｍоｌ／Ｌリジン、０．０１ｍоｌ／Ｌ過ヨウ素酸ナトリウムを含む。固定後、４℃  ＰＢＳ洗浄液で段階的に１２時間洗浄してから４℃脱カルシウム液において２週間脱カルシウムを行い、５日ごとに脱カルシウム液を置き換えた。脱カルシウムが終わってから４℃  ＰＢＳ洗浄液で段階的に１２時間洗浄し、膝関節をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。切片の厚みは５ｕｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水してヘマトキシリン及びエオシンで染色（Ｈ＆Ｅ染色）させ、１％塩酸エタノールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹化処理した後に中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３Ａ、Ｃ）は成長板（矢印に表記される）の排列が乱れ、一部の骨髄腔内の骨髄が消えた（三角に表記される）；プラスミノーゲン投与群は成長板（矢印に表記される）の排列が整っている。これは、プラスミノーゲンがＰｌｇ−／−マウスの膝関節の成長板の成長を促進することができることを示している。
【０１０５】
［実施例４］
実施例４は、プラスミノーゲンがＰｌｇ−／−マウスの膝関節の関節軟骨表面の骨芽細胞活性の増加を促進することに関するものである。
２０週齢のＰｌｇ−／−マウス８匹を取ってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で各４匹ずつとした。実験の１日目に体重を測って群に分け、プラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間投与し、３１日目にマウスを殺処分し、大腿骨を取って固定液において４℃で２４時間固定を行った。固定液は、２％パラホルムアルデヒド、０．０７５ｍоｌ／Ｌリジン、０．０１ｍоｌ／Ｌ過ヨウ素酸ナトリウムを含む。固定後、４℃  ＰＢＳ洗浄液で段階的に１２時間洗浄してから４℃脱カルシウム液において２週間脱カルシウムを行い、５日ごとに脱カルシウム液を置き換えた。脱カルシウムが終わってから４℃  ＰＢＳ洗浄液で段階的に１２時間洗浄し、膝関節をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。切片の厚みは５ｕｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水して塩化マグネシウム緩衝液で４℃終夜インキュベーションをした。アルカリフォスファターゼ基質溶液で室温で１時間インキュベーションをしてヘマトキシリンで２分間染色した。流水で５分間流してから６０℃で３０分間乾かし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
アルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＬＰ）は骨芽細胞の初期に分化するマーカーである［３５］。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図４Ａ）の関節軟骨表面には極少ないアルカリフォスファターゼの着色しかなく（矢印に表記される）、プラスミノーゲン投与群（図４Ｂ）の関節軟骨表面には多くの深紅のアルカリフォスファターゼの着色がある。これは、プラスミノーゲン投与群の関節軟骨表面のアルカリフォスファターゼの活性は対照群より明らかに高く、すなわち、プラスミノーゲンが膝関節の関節軟骨の骨芽細胞の活性の増加を明らかに促進したことを示している。
【０１０６】
［実施例５］
実施例５は、プラスミノーゲンがＰｌｇ−／−マウスの膝関節の成長板の骨芽細胞活性の増加を促進することに関するものである。
２０週齢のＰｌｇ−／−マウス８匹を取ってランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で各４匹ずつとした。実験の１日目に体重を測って群に分け、プラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。３０日間連続的に投与し、３１日目にマウスを殺処分し、大腿骨を取って固定液において４℃で２４時間固定を行った。固定液は、２％パラホルムアルデヒド、０．０７５ｍоｌ／Ｌリジン、０．０１ｍоｌ／Ｌ過ヨウ素酸ナトリウムを含む。固定後、４℃  ＰＢＳ洗浄液で段階的に１２時間洗浄してから４℃脱カルシウム液において２週間脱カルシウムを行い、５日ごとに脱カルシウム液を置き換えた。脱カルシウムが終わってから４℃  ＰＢＳ洗浄液で段階的に１２時間洗浄し、大腿骨をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。切片の厚みは５ｕｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水して塩化マグネシウム緩衝液で４℃終夜インキュベーションをした。アルカリフォスファターゼ基質溶液で室温で１時間インキュベーションをしてヘマトキシリンで２分間染色した。流水で５分間流してから６０℃で３０分間乾かし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察して撮影した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図５Ａ）の成長板の骨芽細胞の活性箇所にはアルカリフォスファターゼの着色があり（矢印に表記される）、浅紅色を呈する；プラスミノーゲン投与群（図５Ｂ）の成長板には多くのアルカリフォスファターゼの着色があり、しかも深紅色を呈する。これは、プラスミノーゲンを投与した後、膝関節の成長板の骨芽細胞の活性の増加を促進することができることを示している。これは、プラスミノーゲンを投与した後、膝関節の成長板の骨芽細胞の活性の増加を促進することができることを示している。
【０１０７】
［実施例６］
実施例６は、プラスミノーゲンがビタミンＤにより誘発された老衰モデルマウスの血清のアルカリフォスファターゼ活性を改善することに関するものである。
５〜６週齢のオスＣ５７マウス２５匹を取り、体重を測ってからランダムに三つの群に分け、ブランク対照群で５匹、プラスミノーゲン投与群で１０匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群で１０匹とした。ブランク対照群マウスに毎日５０μｌのコーンオイルを腹腔注射により投与した；プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスに０．５μｇ／ｋｇ／日でビタミンＤ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔注射により投与して老衰を誘発した［３４，３５］。これと同時にマウスに投薬し始め、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、ブランク対照群マウスには投薬処理をしなかった。連続して２８日間投与してモデルを建築した。投与期間中、ブランク対照群マウスに低カルシウム食を与え、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスに低カルシウム食を与えた。投薬、モデル建築の開始当日を１日目とし、２９日目に眼球を摘出して採血し、遠心分離して上澄み液を取り、血清のアルカリフォスファターゼ（ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＬＰ）の活性の測定をした。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの血清のアルカリフォスファターゼの活性は溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスより明らかに高く、しかもその統計学的に有意であり、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群マウスの血清のアルカリフォスファターゼの活性はブランク対照群マウスにより近い（図６）。
血清ＡＬＰはイソ酵素糖タンパク質であり、血清ＡＬＰは主に肝臓と骨格から由来し、骨格から由来するＡＬＰは４０％〜７５％を占める。ＡＬＰ活性の測定は主に肝胆と骨格系疾患の診断に用いられる。臨床上では、肝臓疾患、妊娠などの要素の他に、血清ＡＬＰは骨形成状況をも反映することができる。骨代謝が旺盛である時に骨芽細胞が活躍し、ＡＬＰ分泌量が増え、骨芽細胞の周りおよび表面に存在し、血液に放出して血清ＬＰ活性を上昇しさせやすい。そのため、血清ＡＬＰは骨再建の活躍性の変化を示すマーカーの一つである［３６］。
本研究では、プラスミノーゲン投与群マウスの血清のアルカリフォスファターゼの活性は溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスより明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である。これは、プラスミノーゲンがビタミンＤ老衰モデルマウスの骨芽細胞活性の増加を顕著に促進できることを示唆している。
【０１０８】
［実施例７］
実施例７は、プラスミノーゲンがビタミンＤにより誘発された老衰モデルマウスの膝関節の成長板のアルカリフォスファターゼ活性の増加を促進することに関するものである。
５〜６週齢のオスＣ５７マウス１５匹を取り、体重を測ってからランダムに三つの群に分け、ブランク対照群、プラスミノーゲン投与群、溶媒ＰＢＳ投与対照群で各５匹ずつとした。ブランク対照群マウスに毎日５０μｌのコーンオイルを腹腔注射により投与した；プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスに１μｇ／ｋｇ／日でビタミンＤ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を腹腔注射により投与して老衰を誘発した［３４，３５］。これと同時にマウスに投薬し始め、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、ブランク対照群マウスには投薬処理をしなかった。連続して２８日間投与してモデルを建築した。投与期間中、すべてのマウスに低カルシウム食（南通トロフィー）を与えた。投薬、モデル建築の開始当日を１日目とし、２９日目にマウスを殺処分し、膝関節を取って固定液において２４時間固定を行った。固定液は、２％パラホルムアルデヒド、０．０７５ｍоｌ／Ｌリジン、０．０１ｍоｌ／Ｌ過ヨウ素酸ナトリウムを含む。固定後、４℃  ＰＢＳ洗浄液で段階的に１２時間洗浄してから４℃脱カルシウム液において２週間脱カルシウムを行い、５日ごとに脱カルシウム液を置き換えた。脱カルシウムが終わってから４℃  ＰＢＳ洗浄液で段階的に１２時間洗浄し、膝関節をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。切片の厚みは５ｕｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水して塩化マグネシウム緩衝液で４℃終夜インキュベーションをした。アルカリフォスファターゼ基質溶液で室温で１時間インキュベーションをしてヘマトキシリンで２分間染色した。流水で５分間流してから６０℃で３０分間乾かし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図７Ｂ）の膝関節の成長板のアルカリフォスファターゼの陽性着色（矢印に表記される）はブランク対照群マウス（図７Ａ）より明らかに少ない；プラスミノーゲン投与群（図７Ｃ）の膝関節の成長板のアルカリフォスファターゼの陽性着色は溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスより明らかに高い。これは、プラスミノーゲンがビタミンＤにより誘発された老衰モデルマウスの膝関節の成長板の骨芽細胞の活性を改善できることを示している。
【０１０９】
［実施例８］
実施例８は、プラスミノーゲンが頭蓋骨密度に対する影響に関するものである。
１２〜１３、２０〜２１、２９〜３０週齢のＰｌｇ＋／＋マウスとＰｌｇ−／−マウスを各５匹取り、各群のマウスの体重はほぼ同じであった。実験においてマウスに同じ食物と水を与えた。頭蓋骨を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において２４時間固定を行い、Ｍｉｃｒｏ  ＣＴスキャンをして骨密度を測定した。
その結果、週齢が増えるにつれて、Ｐｌｇ＋／＋マウスの皮質骨密度（図８Ａ）と全骨密度（図８Ｂ）はしだいに増加する傾向があるが、Ｐｌｇ−／−マウスの頭蓋骨の皮質骨密度と全骨密度はしだいに低下した。この二種類のマウスの骨密度は２０〜２１週齢において極有意な差があり、２９〜３０週齢においてその差がより有意である。これは、プラスミノーゲンが骨塩代謝の調節に関与し、しかも一定の時期において重要な役割を果たすことを示している。
骨粗鬆は、骨量の減少、骨の微細構造の退化を特徴とし、骨の脆弱性を増加させ、骨折しやすい全身性骨格疾患である。ＷＨＯは、骨密度（ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ，ＢＭＤ）の測定結果を用いて骨粗鬆症を診断することを提議している［３７，３８］。上記実験結果は、プラスミノーゲンが骨塩代謝の調節に関与し、しかも一定の時期において重要な役割を果たすことを示している。
【０１１０】
［実施例９］
実施例９は、プラスミノーゲンが頭蓋骨骨塩の含有量に対する影響に関するものである。
２０〜２１週齢のＰｌｇ＋／＋マウスとＰｌｇ−／−マウスを各５匹取り、マウスの体重はほぼ同じであった。実験においてマウスに同じ食物と水を与えた。頭蓋骨を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において２４時間固定を行い、Ｍｉｃｒｏ  ＣＴスキャンをして骨塩含有量を測定した。
その結果、２０〜２１週齢のＰｌｇ＋／＋マウスの皮質骨と全骨の骨塩含有量はＰｌｇ−／−マウスより明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である。これは、プラスミノーゲンが頭蓋骨の骨塩含有量の調節において重要な役割を果たし、骨粗鬆と密接な関係があることを示している。
【０１１１】
［実施例１０］
実施例１０は、プラスミノーゲンが欠乏しているマウスの大腿骨骨密度が低下することに関するものである。
１２〜１３、２０〜２１、２９〜３０週齢のＰｌｇ＋／＋マウスとＰｌｇ−／−マウスを各５匹取り、各群のマウスの体重はほぼ同じであった。実験においてマウスに同じ食物と水を与えた。大腿骨を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において２４時間固定を行い、Ｍｉｃｒｏ  ＣＴスキャンをして骨密度を測定した。
その結果、１２〜３０週齢の間、週齢が増えるにつれてＰｌｇ＋／＋マウスの大腿骨密度はしだいに増加するに対して、Ｐｌｇ−／−マウスの大腿骨の皮質骨密度（１０Ａ）、海綿骨密度（図１０Ｂ）、小柱骨密度（図１０Ｃ）および全骨密度（図１０Ｄ）はしだいに減少する。この間、Ｐｌｇ＋／＋マウスの大腿骨密度はＰｌｇ−／−マウスより高く、２０週齢において二種類のマウスの骨密度の差が有意であり、しかも週齢が増えるにつれて、両者の差がますます有意になる。これは、プラスミノーゲンが大腿骨骨塩代謝の調節に関与し、しかも一定の時期において重要な役割を果たすことを示している。
【０１１２】
［実施例１１］
実施例１１は、プラスミノーゲンが欠乏しているマウスの大腿骨の骨塩含有量が減少することに関するものである。
１２〜１３、２０〜２１、２９〜３０週齢のＰｌｇ＋／＋マウスとＰｌｇ−／−マウスを各５匹取り、各群のマウスの体重はほぼ同じであった。実験においてマウスに同じ食物と水を与えた。大腿骨を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において２４時間固定を行い、Ｍｉｃｒｏ  ＣＴスキャンをして骨塩含有量を測定した。
その結果、１２〜３０週齢の間、週齢が増えるにつれてＰｌｇ＋／＋マウスの大腿骨の異なる部分の塩含有量はあまり変化しないかしだいに増加するに対して、Ｐｌｇ−／−マウスの大腿骨の海綿骨（１１Ｂ）と小柱骨塩含有量はしだいに減少する。この間、Ｐｌｇ＋／＋マウスの大腿骨塩含有量はＰｌｇ−／−マウスより高く、２０週齢において二種類のマウスの大腿骨皮質骨（１１Ａ）、小柱骨（１１Ｃ）および全骨（１１Ｄ）骨塩含有量の差が有意であり、しかも週齢が増えるにつれて、両者の骨塩含有量の差がますます有意になる。これは、プラスミノーゲンが大腿骨骨塩代謝の調節に関与し、しかも一定の時期において重要な役割を果たすことを示している。
【０１１３】
［実施例１２］
実施例１２は、プラスミノーゲンが欠乏しているマウスの腰椎骨の骨密度が低下することに関するものである。
１２〜１３、２０〜２１、２９〜３０週齢のＰｌｇ＋／＋マウスとＰｌｇ−／−マウスを各５匹取り、各群のマウスの体重はほぼ同じであった。実験においてマウスに同じ食物と水を与えた。腰椎骨を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において２４時間固定を行い、Ｍｉｃｒｏ  ＣＴスキャンをして骨密度を測定した。
その結果、１２〜３０週齢の間、週齢が増えるにつれてＰｌｇ＋／＋マウスの腰椎骨骨密度はしだいに増加するに対して、Ｐｌｇ−／−マウスの腰椎骨の皮質骨密度（１２Ａ）、海綿骨密度（図１２Ｂ）、小柱骨密度（図１２Ｃ）および全骨密度（図１２Ｄ）はしだいに減少する。この間、Ｐｌｇ＋／＋マウスの骨密度はＰｌｇ−／−マウスより高く、１２週齢において二種類のマウスの腰椎骨骨密度の差が有意であり、しかも週齢が増えるにつれて、両者の差がますます有意になる。これは、プラスミノーゲンが腰椎骨密度の調節に関与し、しかも一定の時期において重要な役割を果たすことを示している。
【０１１４】
［実施例１３］
実施例１３は、プラスミノーゲンが欠乏しているマウスの腰椎骨の骨密度が低下することに関するものである。
１２〜１３、２０〜２１、２９〜３０週齢のＰｌｇ＋／＋マウスとＰｌｇ−／−マウスを各５匹取り、各群のマウスの体重はほぼ同じであった。実験においてマウスに同じ食物と水を与えた。腰椎骨を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において２４時間固定を行い、Ｍｉｃｒｏ  ＣＴスキャンをして骨塩含有量を測定した。
１２〜３０週齢の間、週齢が増えるにつれてＰｌｇ＋／＋マウスの腰椎骨の骨塩含有量はあまり変化しないに対して、Ｐｌｇ−／−マウスの腰椎骨の皮質骨塩含有量（１３Ａ）、海綿骨塩含有量（図１３Ｂ）、小柱骨塩含有量（図１３Ｃ）および全骨塩含有量（図１３Ｄ）はしだいに減少する。この間、Ｐｌｇ＋／＋マウスの腰椎骨塩含有量はＰｌｇ−／−マウスより高く、２０週齢において二種類のマウスの腰椎骨の海綿骨と皮質骨の区域の骨塩含有量の差が有意であり、しかも週齢が増えるにつれて、両者の差がますます有意になる。これは、プラスミノーゲンが腰椎骨骨塩代謝の調節に関与し、しかも一定の時期において重要な役割を果たすことを示している。
【０１１５】
［実施例１４］
実施例１４は、プラスミノーゲン欠乏がマウスの血清のアルカリフォスファターゼの活性はに対する影響に関するものである。
１２〜１３、２０〜２１、２９〜３０週齢のＰｌｇ＋／＋マウスとＰｌｇ−／−マウスを各５匹取り、各群のマウスの体重はほぼ同じであった。実験においてマウスに同じ食物と水を与えた。すべてのマウスについて眼球を摘出して採血し、遠心分離して上澄み液を取り、アルカリフォスファターゼ検出キットを用いて血清のアルカリフォスファターゼの活性を測定した。
その結果、１２〜３０週齢において、Ｐｌｇ＋／＋マウスの血清のアルカリフォスファターゼの活性は変動するがその変化が有意ではないに対して、Ｐｌｇ−／−マウスの血清のアルカリフォスファターゼの活性は週齢の増加につれてしだいに低下する；Ｐｌｇ＋／＋マウスの血清のアルカリフォスファターゼの活性はＰｌｇ−／−マウスより明らかに高く、二種類のマウスの血清のアルカリフォスファターゼの活性は１２週齢においてその差が有意であり、しかも週齢が増えるにつれて、その差がますます有意になる（図１４）。これは、プラスミノーゲンが骨芽細胞の活性を促進し、骨再建を促進することができることを示している。
【０１１６】
［実施例１５］
実施例１５は、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症ＡｐｏＥマウスの血中カルシウム濃度を低めることに関するものである。
６週齢のＡｐｏＥオスマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症を誘発した［３９，４０］。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取し、総コレステロール濃度を測定し、マウスをランダムに二つの群に分け、各溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、投与期間中にマウスに引き続き高脂肪食を与えた。３０日にマウスを１６時間禁食した後、３１日目に眼球を摘出して採血し、遠心分離して上澄み液を取り、血清カルシウム濃度の検出に用いた。カルシウム検出キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ｃ００４−２）を用いてそのプロトコルに記載する方法に従って血中カルシウムを測定した。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの血中カルシウム濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（図１５）。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの血中カルシウムの含有量を低下させることができることを示している。
【０１１７】
［実施例１６］
実施例１６は、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症ＡｐｏＥマウスの大動脈洞の石灰化を改善することに関するものである。
６週齢のＡｐｏＥオスマウス１３匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症を誘発した［３９，４０］。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取し、総コレステロール濃度を測定し、それによってマウスをランダムに二つの群に分け、各溶媒ＰＢＳ投与対照群で７匹とプラスミノーゲン投与群で６匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、投与期間中にマウスに引き続き高脂肪食を与えた。投与の３１日目にマウスを殺処分して心臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において２４〜４８時間固定を行った。それぞれ１５％、３０％スクロース中において脱水して沈めさせ、ＯＣＴで包埋処理を行い、凍結切片の厚みは８μｍであり、アリザリンレッドＳで３分間染色した。切片を光学顕微鏡下で４０倍にて観察した。
アリザリンレッド染色は石灰化の程度を示すことができる。その結果、プラスミノーゲン投与群（図１６Ｂ）マウスの大動脈洞のカルシウム沈着は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１６Ａ）より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化における大動脈洞のカルシウム沈着を改善することができることを示している。
【０１１８】
［実施例１７］
実施例１７は、プラスミノーゲンがＡｏｐＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの大腿骨骨密度に対する影響に関するものである。
６週齢のＡｐｏＥオスマウス１９匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症を誘発した［３９，４０］。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取し、総コレステロール濃度を測定し、それによってマウスをランダムに二つの群に分け、各溶媒ＰＢＳ投与対照群で９匹とプラスミノーゲン投与群で１０匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、投与期間中にマウスに引き続き高脂肪食を与えた。投与の１１日目に各群からマウス５匹を取り、殺処分してから大腿骨を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。投与の３１日目に残ったマウスを殺処分して大腿骨を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。取った大腿骨についてＭｉｃｒｏ  ＣＴスキャンをして骨密度を測定した。
アテローム性動脈硬化症と骨粗しょう症との関連性についてはすでに報告があり、高血脂はアテローム性動脈硬化症の重要な致病要素である。近年の研究より明らかに、アポリポタンパク質Ｅ（ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅ，ＡｐｏＥ）は脂肪代謝を影響するだけではなく、骨密度、骨損失および骨粗鬆性骨折に関係する［４１，４２］。
その結果、プラスミノーゲンを１０日投与した後、プラスミノーゲン投与群マウスの大腿骨密度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかも海綿骨密度（図１７Ｂ）と全骨密度（図１７Ｄ）の差が有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）；３０日投与した後、プラスミノーゲン投与群マウスの海綿骨密度、小柱骨密度（図１７Ｃ）および全骨密度は溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べて明かに上昇し、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。皮質骨密度（図１７Ａ）では二つの群には明らかな差はない。これは、プラスミノーゲンがアテローム性動脈硬化症モデルマウスの骨密度の上昇を促進し、アテローム性動脈硬化症に伴われる骨粗鬆症を改善できることを示している。
研究によると、血管石灰化の本質は、血管平滑筋細胞が骨芽細胞表型への転化及び血管組織が骨組織への転化である。血管石灰化の形成は骨塩の損失とも顕著な関連性がある［１０］。上記実施例１６と１７の実験結果から分かるように、プラスミノーゲンが動脈壁におけるカルシウム沈着を低下させると同時に骨密度を増強することができる。これは、骨粗鬆症および心血管疾患の予防と治療に対して重要な意義を持っている。
【０１１９】
［実施例１８］
実施例１８は、プラスミノーゲンがＡｏｐＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの膝関節組織構造に対する保護作用に関するものである。
６週齢のＡｏｐＥオスマウス７匹に高脂肪高コレステロール食（南通トロフィー、ＴＰ２０３１）を１６週間給餌してアテローム性動脈硬化症を誘発した［３９，４０］。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取し、総コレステロール濃度を測定し、それによってマウスをランダムに二つの群に分け、各溶媒ＰＢＳ投与対照群で３匹とプラスミノーゲン投与群で４匹とした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、投与期間中にマウスに引き続き高脂肪食を与えた。投与の３１日目にマウスを殺処分して大腿骨を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。そして酸性脱カルシウム液（超純水で体積分率８％塩酸と１０％ギ酸の脱カルシウム液を調製した）で３．５時間脱カルシウムをした。そしてパラフィンで包埋し、８μｍ切片をＨ＆Ｅ染色し、切片を光学顕微鏡下で１００倍（Ａ、Ｄ）、２００倍（Ｂ、Ｃ、Ｅ、Ｆ）にて観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１８Ａ〜Ｃ）の軟骨表面には軽度の繊維化があり（細い矢印に表記される）、小柱骨（三角に表記される）が明らかに細くなり、太さが均一ではなく、軟骨組織（スターに表記される）の排列が乱れ、成長板（太い矢印に表記される）の分層が乱れ、軟骨細胞が軽度に減少し、潮標が基本的に鮮明である；プラスミノーゲン投与群（図１８Ｄ〜Ｆ）の関節軟骨の表面は基本的に正常であり、潮標が鮮明であり、骨小柱の太さが均一であり、成長板の構造がはっきりし、分層が規則して識別できる。これは、プラスミノーゲンがＡｐｏＥアテローム性動脈硬化症モデルマウスの膝関節の状況を改善できることを示している。
【０１２０】
［実施例１９］
実施例１９は、プラスミノーゲンが卵巣切除−デキサメタゾンによる骨粗鬆症モデルマウスの体重に対する影響に関するものである。
８〜１０週齢のＣ５７メスマウス１７匹を取って体重を測り、体重によってマウスをランダムに二つの群に分け、正常対照群で３匹とモデル群で１４匹とした。モデル群マウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重でペントバルビタールナトリウムを腹腔注射により投与して麻酔させ、マウスの背部の両側の毛髪を脱いで７０％のアルコールとヨードチンキで消毒し、皮膚、背部筋肉および腹膜を切り分け、小さいピンセットでそっと白色の光っている脂肪塊を切り口から引き出し、脂肪塊を分離して卵巣が見えた。卵巣の下部の輸卵管を糸で結んで卵巣を摘出した。切り口を縫い合わせた後、外部に消炎剤粉末を塗布した。同じ方法で反対側の卵巣を摘出した。正常対照群マウスに対してただ同じ位置で切り分け、卵巣の切除をしなかった。卵巣を切除してから１４日後に、モデル群マウスを体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で、各群で７匹ずつとした。モデル群マウスに１２５μｇ／匹でデキサメタゾンを腹腔注射により投与し、５日／週の注射頻度で１２日間注射して骨粗鬆症を誘発し［４３］、正常対照群マウスに対して注射処理をしなかった。デキサメタゾンを注射すると同時にマウスに投薬し、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１６日間投与した。正常対照群マウスに対してプラスミノーゲンまたはＰＢＳを注射しなかった。投与し始めた日を１日目とし、１７日目にマウスの体重を測った。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの体重は正常対照群より明らかに低く、プラスミノーゲン投与群の体重は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（Ｐ＜０．０５）（図１９）。これは、プラスミノーゲンが卵巣切除およびデキサメタゾン注射により誘発された骨粗鬆症モデルマウスの体重の回復を顕著に促進できることを示している。
【０１２１】
［実施例２０］
実施例２０は、プラスミノーゲンが卵巣切除−デキサメタゾンによる骨粗鬆症モデルマウスの大腿骨に対する影響に関するものである。
８〜１０週齢のＣ５７メスマウス１４匹を取って体重を測った。すべてのマウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重でペントバルビタールナトリウムを腹腔注射により投与して麻酔させ、マウスの背部の両側の毛髪を脱いで７０％のアルコールとヨードチンキで消毒し、皮膚、背部筋肉および腹膜を切り分け、小さいピンセットでそっと白色の光っている脂肪塊を切り口から引き出し、脂肪塊を分離して卵巣が見えた。卵巣の下部の輸卵管を糸で結んで卵巣を摘出した。切り口を縫い合わせた後、外部に消炎剤粉末を塗布した。同じ方法で反対側の卵巣を摘出した。卵巣を切除してから１４日後に、マウスを体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で、各群で７匹ずつとした。モデル群マウスに１２５μｇ／匹でデキサメタゾンを腹腔注射により投与し、５日／週の注射頻度で１２日間注射して骨粗鬆症を誘発した［４３］。モデル建築と同時にマウスに投薬し、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１６日間投与した。投与し始めた日を１日目とし、１７日目にマウスを殺処分して大腿骨を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。Ｍｉｃｒｏ  ＣＴスキャンをして大腿骨の各指標を測定した。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの大腿骨の海綿骨、小柱骨および全骨の体積（図２０Ａ）と骨塩含有量（図２０Ｂ）は、いずれも溶媒ＰＢＳ投与対照群より大きく、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）。これは、プラスミノーゲンが骨粗鬆症モデルマウスの大腿骨の海綿骨、小柱骨および全骨の体積の増加および骨塩の沈着を促進し、骨粗鬆を改善できることを示している。
【０１２２】
［実施例２１］
実施例２１は、プラスミノーゲンが卵巣切除−デキサメタゾンによる骨粗鬆症モデルマウスの大腿骨構造を改善することに関するものである。
８〜１０週齢のＣ５７メスマウス１７匹を取って体重を測り、体重によってマウスをランダムに二つの群に分け、正常対照群で３匹とモデル群で１４匹とした。モデル群マウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重でペントバルビタールナトリウムを腹腔注射により投与して麻酔させ、マウスの背部の両側の毛髪を脱いで７０％のアルコールとヨードチンキで消毒し、皮膚、背部筋肉および腹膜を切り分け、小さいピンセットでそっと白色の光っている脂肪塊を切り口から引き出し、脂肪塊を分離して卵巣が見えた。卵巣の下部の輸卵管を糸で結んで卵巣を摘出した。切り口を縫い合わせた後、外部に消炎剤粉末を塗布した。同じ方法で反対側の卵巣を摘出した。正常対照群マウスに対してただ同じ位置で切り分け、卵巣の切除をしなかった。卵巣を切除してから１４日後に、モデル群マウスに１２５μｇ／匹でデキサメタゾンを腹腔注射により投与し、５日／週の注射頻度で１２日間注射して骨粗鬆症を誘発し［４３］、正常対照群マウスに対して注射処理をしなかった。デキサメタゾンの注射が終わった後、モデル群マウスを体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で、各群で７匹ずつとした。モデル建築後に（デキサメタゾン注射が終わった次の日）、マウスに投薬し始めた。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１６日間投与した。正常対照群マウスに対してプラスミノーゲンまたはＰＢＳを注射しなかった。投与し始めた日を１日目とし、１７日目にマウスを殺処分して大腿骨を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。取った大腿骨についてＭｉｃｒｏ  ＣＴスキャンをして大腿骨密度を測定した。
骨密度
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの大腿骨の皮質骨、海綿骨、小柱骨および全骨骨密度はいずれも正常対照群より小さいに対して、プラスミノーゲン投与群マウスの各部分の骨密度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より大きい。その傾向が明確であるが、マウスの数が少ないため、その差が統計学的に有意に近いだけである。マウスの数を増やすと統計学的な差が現れると予測できる（図２１Ａ）。
骨塩含有量
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの大腿骨の各部分の骨塩含有量はいずれも正常対照群より小さいに対して、プラスミノーゲン投与群マウスの各部分の骨塩含有量はいずれも溶媒ＰＢＳ投与対照群より大きい。その傾向が明確であるが、マウスの数が少ないため、その差が統計学的に有意に近いだけである。マウスの数を増やすと統計学的な差が現れると予測できる（図２１Ｂ）。
骨体積
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの大腿骨の小柱骨の体積は正常対照群より小さいに対して、プラスミノーゲン投与群マウスの大腿骨の小柱骨の体積は溶媒ＰＢＳ投与対照より大きい。その傾向が明確であるが、マウスの数が少ないため、その差が統計学的に有意に近いだけである。マウスの数を増やすと統計学的な差が現れると予測できる（図２１Ｃ）。
以上によって、プラスミノーゲンが骨粗鬆を明らかに改善し、大腿骨の各部分の骨密度と骨量の増加を促進することができ、しかも小柱骨に対する改善作用が特に明らかである。
【０１２３】
［実施例２２］
実施例２２は、プラスミノーゲンが卵巣切除−デキサメタゾンによる骨粗鬆症モデルマウスの膝関節の組織構造の状況を改善することに関するものである。
８〜１０週齢のＣ５７メスマウス１４匹を取って体重を測った。すべてのマウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重でペントバルビタールナトリウムを腹腔注射により投与して麻酔させ、マウスの背部の両側の毛髪を脱いで７０％のアルコールとヨードチンキで消毒し、皮膚、背部筋肉および腹膜を切り分け、小さいピンセットでそっと白色の光っている脂肪塊を切り口から引き出し、脂肪塊を分離して卵巣が見えた。卵巣の下部の輸卵管を糸で結んで卵巣を摘出した。切り口を縫い合わせた後、外部に消炎剤粉末を塗布した。同じ方法で反対側の卵巣を摘出した。卵巣を切除してから１４日後に、マウスを体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で、各群で７匹ずつとした。モデル群マウスに１２５μｇ／匹でデキサメタゾンを腹腔注射により投与し、５日／週の注射頻度で１２日間注射して骨粗鬆症を誘発した［４３］。モデル建築と同時にマウスに投薬し、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１６日間投与した。投与し始めた日を１日目とし、１７日目にマウスを殺処分して膝関節を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。そして酸性脱カルシウム液（超純水で体積分率８％塩酸と１０％ギ酸の脱カルシウム液を調製した）で３．５時間脱カルシウムをした。そしてパラフィンで包埋し、３μｍ切片をＨ＆Ｅ（Ａ、Ｂ）とＳａｆｒａｉｎ  Ｏ染色（Ｃ、Ｄ）をして、切片を光学顕微鏡下で１００倍にて観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２２Ａ、Ｃ）マウスの膝関節の骨小柱（矢印に表記される）は明らかに細くなって裂け、大きい面積の無骨小柱骨髄腔が現れ、髄腔が増大し、骨小柱の連接が中断し、成長板下の骨細胞が軽度に減少した（三角に表記される）；プラスミノーゲン投与群（図２２Ｂ、Ｄ）の骨小柱部分は細くなり、溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、骨小柱の連続性が良く、太く、大きい面積の無骨小柱区域がなく、軟骨組織の分層構造も規則している。これは、プラスミノーゲンが骨粗鬆症モデルマウスの膝関節の組織構造の状況を明らかに改善できることを示している。
【０１２４】
［実施例２３］
実施例２３は、プラスミノーゲンが卵巣切除−デキサメタゾンによる骨粗鬆症モデルマウスの膝関節の骨芽細胞の活性を増加させることに関するものである。
８〜１０週齢のＣ５７メスマウス１４匹を取って体重を測った。すべてのマウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重でペントバルビタールナトリウムを腹腔注射により投与して麻酔させ、マウスの背部の両側の毛髪を脱いで７０％のアルコールとヨードチンキで消毒し、皮膚、背部筋肉および腹膜を切り分け、小さいピンセットでそっと白色の光っている脂肪塊を切り口から引き出し、脂肪塊を分離して卵巣が見えた。卵巣の下部の輸卵管を糸で結んで卵巣を摘出した。切り口を縫い合わせた後、外部に消炎剤粉末を塗布した。同じ方法で反対側の卵巣を摘出した。卵巣を切除してから１４日後に、マウスを体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で、各群で７匹ずつとした。二つの群のマウスに１２５μｇ／匹でデキサメタゾンを腹腔注射により投与し、５日／週の注射頻度で１２日間注射して骨粗鬆症を誘発した［４３］。モデル建築と同時にマウスに投薬し、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１６日間投与した。投与し始めた日を１日目とし、１７日目にマウスを殺処分して膝関節を取って固定液において固定を行った。固定液は、２％パラホルムアルデヒド、０．０７５ｍоｌ／Ｌリジン、０．０１ｍоｌ／Ｌ過ヨウ素酸ナトリウムを含む。固定後、４℃  ＰＢＳ洗浄液で段階的に１２時間洗浄してから４℃脱カルシウム液において２週間脱カルシウムを行い、５日ごとに脱カルシウム液を置き換えた。脱カルシウムが終わってから４℃  ＰＢＳ洗浄液で段階的に１２時間洗浄し、膝関節をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。切片の厚みは３ｕｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水して塩化マグネシウム緩衝液で４℃終夜インキュベーションをした。アルカリフォスファターゼ基質溶液で室温で１時間インキュベーションをしてヘマトキシリンで２分間染色した。流水で５分間流してから６０℃で３０分間乾かし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウス（図２３Ａ、Ｃ）の膝関節の軟骨組織（細い矢印に表記される）と成長板（太い矢印に表記される）のアルカリフォスファターゼ着色はプラスミノーゲン投与群（図２３Ｂ、Ｄ）より明らかに少ない。これは、プラスミノーゲンが骨粗鬆症モデルマウスの膝関節の骨芽細胞活性の増加を促進できることを示している。
【０１２５】
［実施例２４］
実施例２４は、プラスミノーゲンが卵巣切除による骨粗鬆症モデルマウスの血中カルシウム濃度を低下させることに関するものである。
８〜１０週齢のＰｌｇ＋／＋メスマウス１１匹を取った。マウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重でペントバルビタールナトリウムを腹腔注射により投与して麻酔させ、マウスの背部の両側の毛髪を脱いで７０％のアルコールとヨードチンキで消毒し、皮膚、背部筋肉および腹膜を切り分け、小さいピンセットでそっと白色の光っている脂肪塊を切り口から引き出し、脂肪塊を分離して卵巣が見えた。卵巣の下部の輸卵管を糸で結んで卵巣を摘出した。切り口を縫い合わせた後、外部に消炎剤粉末を塗布した。同じ方法で反対側の卵巣を摘出した［４４，４５］。卵巣を切除してから６５日後に、マウスの体重を測って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群で６匹と溶媒ＰＢＳ投与対照群で５匹とし、投薬し始めた。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１１日間投与した。投与し始めた日を１日目とし、１２日目に眼球を摘出して採血し、遠心分離して上澄み液を取り、血中カルシウム濃度を検出した。カルシウム検出キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ｃ００４−２）を用いてそのプロトコルに記載する方法に従って血中カルシウムを測定した。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの血清カルシウム濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）（図２４）。これは、プラスミノーゲンが卵巣切除による骨粗鬆症モデルマウスの血中カルシウムの濃度を顕著に低下させることができることを示している。
【０１２６】
［実施例２５］
実施例２５は、プラスミノーゲンが卵巣切除による骨粗鬆症モデルマウスの血中リン濃度を上昇させることに関するものである。
８〜１０週齢のＰｌｇ＋／＋メスマウス１１匹を取った。マウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重でペントバルビタールナトリウムを腹腔注射により投与して麻酔させ、マウスの背部の両側の毛髪を脱いで７０％のアルコールとヨードチンキで消毒し、皮膚、背部筋肉および腹膜を切り分け、小さいピンセットでそっと白色の光っている脂肪塊を切り口から引き出し、脂肪塊を分離して卵巣が見えた。卵巣の下部の輸卵管を糸で結んで卵巣を摘出した。切り口を縫い合わせた後、外部に消炎剤粉末を塗布した。同じ方法で反対側の卵巣を摘出した［４４，４５］。卵巣を切除してから６５日後に、マウスの体重を測って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群で６匹と溶媒ＰＢＳ投与対照群で５匹とし、投薬し始めた。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１１日間投与した。投与し始めた日を１日目とし、１２日目に眼球を摘出して採血し、遠心分離して上澄み液を取り、血中リン濃度を検出した。リン検出キット（南京建成生物工程研究所、品目番号Ｃ００６−３）を用いてそのプロトコルに記載する方法に従って血中リンを測定した。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの血清リン濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）（図２５）。これは、プラスミノーゲンが卵巣切除による骨粗鬆症モデルマウスの血中リンの濃度を顕著に上昇させることができることを示している。
【０１２７】
［実施例２６］
実施例２６は、プラスミノーゲンが３％コレステロール高脂血症モデルマウスの膝関節の骨芽細胞の活性を増加させることに関するものである。
９週齢のオスＣ５７マウス１６匹に３％コレステロール高脂肪食（南通トロフィー）を４週間給餌して高脂血症を誘発し［４６，４７］、このモデルを３％コレステロール高脂血症モデルとした。モデル化後のマウスに引き続き３％コレステロール高脂肪食を与えた。投薬の３日前に各マウスから５０μＬの血液を採取し、総コレステロールを測定し、モデルマウスを総コレステロール濃度と体重によってランダムに二つの群に分け、各群で８匹ずつとした。投薬し始めた日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、２０日間投与した。２０日目にマウスを１６時間禁食し、２１日目にマウスを殺処分し、膝関節を取って固定液において固定を行った。固定液は、２％パラホルムアルデヒド、０．０７５ｍоｌ／Ｌリジン、０．０１ｍоｌ／Ｌ過ヨウ素酸ナトリウムを含む。固定後、４℃  ＰＢＳ洗浄液で段階的に１２時間洗浄してから４℃脱カルシウム液において２週間脱カルシウムを行い、５日ごとに脱カルシウム液を置き換えた。脱カルシウムが終わってから４℃  ＰＢＳ洗浄液で段階的に１２時間洗浄し、膝関節をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。切片の厚みは３ｕｍであり、切片を脱パラフィンさせ、さらに浸水して塩化マグネシウム緩衝液で４℃終夜インキュベーションをした。アルカリフォスファターゼ基質溶液で室温で１時間インキュベーションをしてヘマトキシリンで２分間染色した。流水で５分間流してから６０℃で３０分間乾かし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
高脂血症は脂肪代謝障害の一種であり、一系列の合併症を引き起こし得る疾患である。近年の多くの研究によって、高脂血脂は骨粗鬆症とアテローム性動脈硬化症の共同の病因であることは発見された［４８，４９］。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図２６Ｂ、Ｄ）マウスの膝関節のアルカリフォスファターゼ着色（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２６Ａ、Ｃ）より明らかに多く、しかもその差が統計学的に有意である（図２６Ｅ）。これは、プラスミノーゲンが３％コレステロール高脂血症モデルマウスの膝関節の骨芽細胞の活性を増加させることができることを示している。
【０１２８】
［実施例２７］
実施例２７は、プラスミノーゲンが卵巣切除−デキサメタゾンによる骨粗鬆症モデルマウスの膝関節の組織構造の状況を改善することに関するものである。
８〜１０週齢のＣ５７メスマウス１４匹を取って体重を測った。マウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重でペントバルビタールナトリウムを腹腔注射により投与して麻酔させ、マウスの背部の両側の毛髪を脱いで７０％のアルコールとヨードチンキで消毒し、皮膚、背部筋肉および腹膜を切り分け、小さいピンセットでそっと白色の光っている脂肪塊を切り口から引き出し、脂肪塊を分離して卵巣が見えた。卵巣の下部の輸卵管を糸で結んで卵巣を摘出した。切り口を縫い合わせた後、外部に消炎剤粉末を塗布した。同じ方法で反対側の卵巣を摘出した。卵巣を切除してから１４日後に、モデル群マウスに１２５μｇ／匹でデキサメタゾンを腹腔注射により投与し、５日／週の注射頻度で１２日間注射して骨粗鬆症を誘発した［４３］。デキサメタゾン注射が終わった後、マウスを体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で、各群で７匹ずつとした。モデル建築後（デキサメタゾン注射が終わった次の日）にマウスに投薬し始めた。プラスミノーゲン投与群マウスに１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒトプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１６日間投与した。投与し始めた日を１日目とし、１７日目にマウスを殺処分して膝関節を取って４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。そして酸性脱カルシウム液（超純水で体積分率８％塩酸と１０％ギ酸の脱カルシウム液を調製した）で３．５時間脱カルシウムをした。そしてパラフィンで包埋し、３μｍ切片をＨ＆Ｅ（Ａ、Ｂ）とＳａｆｒａｉｎ  Ｏ染色（Ｃ、Ｄ）をして、切片を光学顕微鏡下で１００倍にて観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２７Ａ，Ｃ）マウスの骨小柱（矢印に表記される）は明らかに細くなって裂け、大きい面積の無骨小柱骨髄腔が現れ、骨小柱の連接が中断し、関節表面部分には繊維化があり、成長板下の骨形成区域の骨芽組織が明らかに減少した（三角に表記される）；プラスミノーゲン投与群（図２７Ｂ、Ｄ）の骨小柱部分は細くなり、溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、骨小柱の連続性が良く、ひどい裂けがなく、大きい面積の無骨小柱区域がなく、軟骨組織の分層構造も規則し、潮標も鮮明である。これは、プラスミノーゲンが骨粗鬆症モデルマウスの膝関節の組織構造の状況を明らかに改善できることを示している。
【０１２９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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