(57)【要約】  本発明の態様により、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法であって、正常な血流が途絶された領域に治療有効用量の外因性NeuroD1を投与することを含む、方法が提供される。1)部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸に作動可能に連結されているグリア細胞特異的プロモーターを含む組換えアデノ随伴アデノウイルス発現ベクター、及び2)NeuroD1をコードする核酸に作動可能に連結されているユビキタスプロモーターを含む組換えアデノ随伴アデノウイルス発現ベクター、を含む組成物であって、NeuroD1をコードする核酸が反転され、2組の部位特異的リコンビナーゼ認識部位に挟まれており、それによって、リコンビナーゼの作用がNeuroD1をコードする核酸を不可逆的に反転してNeuroD1が哺乳動物細胞で発現される、組成物が提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法であって、正常な血流が途絶された領域に治療有効用量の外因性NeuroD1を投与することを含む、方法。
【請求項２】
外因性NeuroD1を投与することが、NeuroD1をコードする核酸を含む発現ベクターをその領域に送達することを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
外因性NeuroD1を投与することが、NeuroD1をコードする核酸を含む組換えウイルス発現ベクターをその領域に送達することを含む、請求項1又は2に記載の方法。
【請求項４】
外因性NeuroD1を発現することが、NeuroD1をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターをその領域に送達することを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
外因性NeuroD1を発現することが、1)NeuroD1をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクター、及び2)部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターの効果的な「フリップ切除」組換え発現ベクターの組合せをその領域に送達することを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
NeuroD1が、その領域に送達される唯一の外因的に発現される転写因子である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
外因性NeuroD1が、反応性星状細胞が存在する場合、CNSにおける正常な血流が途絶された後に一度に投与される、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
外因性NeuroD1が、グリア細胞が反応性である場合、CNSにおける正常な血流が途絶された後に一度に投与される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
CNSにおける正常な血流の途絶が、虚血、血栓症、塞栓症、出血、脳震盪、ブラスト、脳侵入、腫瘍、炎症、感染症、血管の慢性疾患媒介による制限、及び任意のそれらの2つ以上の組合せからなる群から選択される障害によるものである、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
CNSにおける正常な血流の途絶が、虚血性脳卒中;出血性脳卒中;脳動脈瘤;外傷性脳損傷;脳震盪;ブラスト;脳侵入;腫瘍;炎症;感染症;外傷性脊髄損傷;虚血性若しくは出血性の脊髄症(脊髄梗塞);心拍停止若しくは重度の低血圧(ショック)によって引き起こされる全脳虚血;低酸素、低血糖症若しくは貧血によって引き起こされる低酸素性虚血性脳症;感染性心内膜炎若しくは心房粘液腫によって引き起こされるCNS塞栓症;線維軟骨性塞栓性脊髄症;小児白血病によって引き起こされるCNS血栓症;ネフローゼ症候群(腎臓病)、慢性炎症性疾患、妊娠、エストロゲン系避妊薬の使用、脳膜炎、脱水によって引き起こされる脳静脈洞血栓症;又は任意のそれらの2つ以上の組合せからなる群から選択される障害によるものである、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
治療有効用量のNeuroD1を投与することが、NeuroD1タンパク質をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを投与することを含み、NeuroD1タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号2又はその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号4又はその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号1又はその機能的断片、配列番号3又はその機能的断片、及び配列番号2又は配列番号4と70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上の同一性を有するタンパク質又はその機能的断片をコードする核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
治療有効用量のNeuroD1を投与することが、損傷領域内又はその付近における定位注入を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
NeuroD1をコードする核酸配列がユビキタスプロモーターに作動可能に連結されている、請求項1から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列がグリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている、請求項5から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
グリア細胞特異的プロモーターがGFAPプロモーターである、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
GFAPプロモーターがヒトGFAPプロモーターである、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
対象における治療の有効性を評価することを更に含む、請求項1から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
対象における治療の有効性を評価することが、電気生理学的アッセイ、血流アッセイ、組織構造アッセイ、機能アッセイ、及びそれらの任意の2つ以上の組合せから選択されるアッセイを含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
対象における治療の有効性を評価することが脳波を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
対象における治療の有効性を評価することが、近赤外分光法及びfMRIからなる群から選択される血流のアッセイを含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
対象における治療の有効性を評価することが、MRI、PETスキャン、CATスキャン及び超音波からなる群から選択される組織構造のアッセイを含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２２】
対象における治療の有効性を評価することが、行動アッセイを含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２３】
対象における治療の有効性を評価することが、治療有効用量の外因性NeuroD1を投与する前に実施されるアッセイを含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２４】
NeuroD1をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス粒子を1010〜1014個のアデノ随伴ウイルス粒子/担体1mlの濃度で含有する薬学的に許容される担体1〜500μlを、正常な血流が途絶した領域において、0.1〜5μl/分の制御された流速で対象に注射する、請求項1から23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
血栓の除去、血流の促進、抗炎症剤の投与、酸化防止剤の投与、興奮毒性の低減、及びそれらの2つ以上からなる群から選択される治療を更に含む、請求項1から24のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
1)部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸に作動可能に連結されているグリア細胞特異的プロモーターを含む組換えアデノ随伴アデノウイルス発現ベクター、及び2)NeuroD1をコードする核酸に作動可能に連結されているユビキタスプロモーターを含む組換えアデノ随伴アデノウイルス発現ベクター、を含む組成物であって、NeuroD1をコードする核酸が反転され、2組の部位特異的リコンビナーゼ認識部位に挟まれており、それによって、リコンビナーゼの作用がNeuroD1をコードする核酸を不可逆的に反転してNeuroD1が哺乳動物細胞で発現される、組成物。
【請求項２７】
実質的に本明細書に記載されているような、その必要のある個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法。
【請求項２８】
実質的に本明細書に記載されているような、フリップ切除発現ベクターの組合せ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、2017年2月28日に出願した米国仮特許出願第62/464,469号;及び2017年6月13日に出願した米国仮特許出願第62/518,914号に基づく優先権を主張する。各出願の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所により交付された助成金番号AG045656の下で政府支援を得てなされた。政府は、本発明に特定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
哺乳動物の中枢神経系(CNS)は、損傷後、多くはそれ自体再生することができない。ニューロン及び他のCNS細胞は、細胞が位置している領域の血流を遮断する疾患又は損傷の結果、死滅又は損傷することが多い。更に、血流遮断付近の病理学的変化は、多くの有害な影響、例えば、正常な血流の途絶によって影響を受けるCNS領域におけるニューロンの破壊又は損傷、グリア細胞の破壊又は損傷、血管の破壊又は損傷、及び支持細胞の破壊又は損傷の原因である。個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する組成物及び方法が引き続き必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の態様により、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法であって、正常な血流が途絶された領域に治療有効用量の外因性NeuroD1を投与することを含む、方法が提供される。任意選択により、外因性NeuroD1の投与は、NeuroD1をコードする核酸を含む発現ベクターをその領域に送達することを含む。さらなる選択肢において、外因性NeuroD1の投与は、NeuroD1をコードする核酸を含む組換えウイルス発現ベクターをその領域に送達することを含む。任意選択により、NeuroD1は、その領域に送達される唯一の外因的に発現される転写因子である。
【０００６】
本発明の態様により、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法であって、正常な血流が途絶された領域に治療有効用量の外因性NeuroD1を投与することを含み、外因性NeuroD1の発現が、NeuroD1をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターをその領域に送達することを含む、方法が提供される。任意選択により、NeuroD1は、その領域に送達される唯一の外因的に発現される転写因子である。
【０００７】
本発明の態様によれば、NeuroD1をコードする核酸配列は、グリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている。本発明の態様によれば、グリア細胞特異的プロモーターは、GFAPプロモーターである。本発明の態様によれば、GFAPプロモーターは、ヒトGFAPプロモーターである。
【０００８】
本発明の態様により、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法であって、正常な血流が途絶された領域に治療有効用量の外因性NeuroD1を投与することを含み、外因性NeuroD1の発現が、1)NeuroD1をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクター、及び2)部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクター、の効果的な「フリップ切除(flip-excision)」組換え発現ベクターの組合せをその領域に送達することを含む、方法が提供される。任意選択により、NeuroD1は、その領域に送達される唯一の外因的に発現される転写因子である。
【０００９】
本発明の態様により、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法であって、正常な血流が途絶された領域に治療有効用量の外因性NeuroD1を投与することを含み、外因性NeuroD1の発現が、1)NeuroD1をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターであって、NeuroD1をコードする核酸配列がユビキタスプロモーター(ubiquitous promoter)に作動可能に連結されている、組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクター、及び2)部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターであって、部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列がグリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている、組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクター、の効果的な「フリップ切除」組換え発現ベクターの組合せを送達することを含む、方法が提供される。本発明の態様によれば、グリア細胞特異的プロモーターは、GFAPプロモーターである。本発明の態様によれば、GFAPプロモーターは、ヒトGFAPプロモーターである。任意選択により、NeuroD1は、その領域に送達される唯一の外因的に発現される転写因子である。
【００１０】
本発明の態様により、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法であって、正常な血流が途絶された領域において、NeuroD1をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス粒子を、1010〜1014個のアデノ随伴ウイルス粒子/担体1mlの濃度で含有する薬学的に許容される担体1〜500μlを0.1〜5μl/分の制御された流速で対象に投与することを含む、方法が提供される。
【００１１】
本発明の態様によれば、外因性NeuroD1は、反応性星状細胞が存在する場合、CNSにおける正常な血流が途絶された後に一度に投与される。
【００１２】
本発明の態様によれば、外因性NeuroD1は、グリア性瘢痕が存在する場合、CNSにおける正常な血流が途絶された後に一度に投与される。
【００１３】
本発明の態様によれば、CNSにおける正常な血流の途絶は、虚血、血栓症、塞栓症、出血、脳震盪、脳侵入(brain penetration)、ブラスト(blast)、炎症、感染症、腫瘍、血管の慢性疾患媒介による制限、及び任意のそれらの2つ以上の組合せ、からなる群から選択される障害によるものである。
【００１４】
本発明の態様によれば、CNSにおける正常な血流の途絶は、虚血性脳卒中;出血性脳卒中;脳動脈瘤;外傷性脳損傷;脳震盪;ブラスト;脳侵入;炎症;感染症;腫瘍;外傷性脊髄損傷;虚血性若しくは出血性の脊髄症(脊髄梗塞);心拍停止若しくは重度の低血圧(ショック)によって引き起こされる全脳虚血;低酸素、低血糖症若しくは貧血によって引き起こされる低酸素性虚血性脳症;感染性心内膜炎若しくは心房粘液腫によって引き起こされるCNS塞栓症;線維軟骨性塞栓性脊髄症;小児白血病によって引き起こされるCNS血栓症;ネフローゼ症候群(腎臓病)、慢性炎症性疾患、妊娠、エストロゲン系避妊薬の使用、脳膜炎、脱水によって引き起こされる脳静脈洞血栓症;又は任意のそれらの2つ以上の組合せ、からなる群から選択される障害によるものである。
【００１５】
本発明の態様により、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法であって、正常な血流が途絶された領域に治療有効用量の外因性NeuroD1を投与することを含み、治療有効用量のNeuroD1を投与することが組換え発現ベクターを投与することを含み、発現ベクターがNeuroD1タンパク質をコードする核酸配列を含み、NeuroD1タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号2又はその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号4又はその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号1又はその機能的断片、配列番号3又はその機能的断片、及び配列番号2又は配列番号4又はその機能的断片と70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上の同一性を有するタンパク質をコードする核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、方法が提供される。
【００１６】
任意選択により、治療有効用量のNeuroD1を投与することは、グリア性瘢痕内又はその付近における定位注入を含む。
【００１７】
任意選択により、本発明による、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法は、対象における治療の有効性を評価することを更に含む。任意選択により、本発明による、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法は、対象における治療の有効性を評価することを更に含み、治療の有効性を評価することは、電気生理学的アッセイ、血流アッセイ、組織構造アッセイ、機能アッセイ、及びそれらの任意の2つ以上の組合せ、から選択されるアッセイを含む。
【００１８】
任意選択により、本発明による、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法は、対象における治療の有効性を評価することを更に含み、治療の有効性を評価することは、対象の脳波を含む。
【００１９】
任意選択により、本発明による、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法は、対象における治療の有効性を評価することを更に含み、治療の有効性を評価することは、近赤外分光法及びfMRIからなる群から選択される血流のアッセイを含む。
【００２０】
任意選択により、本発明による、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法は、対象における治療の有効性を評価することを更に含み、治療の有効性を評価することは、MRI、CATスキャン、PETスキャン及び超音波からなる群から選択される組織構造のアッセイを含む。
【００２１】
任意選択により、本発明による、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法は、対象における治療の有効性を評価することを更に含み、治療の有効性を評価することは、行動アッセイを含む。
【００２２】
任意選択により、対象の治療の有効性を評価することは、治療有効用量の外因性NeuroD1を投与する前に実施されるアッセイを含む。したがって、例えば、本発明の態様によれば、1)電気生理学アッセイ、血流アッセイ、組織構造アッセイ、機能アッセイ、又はそれらの任意の2つ以上の組合せから選択される第1のアッセイであって、治療有効用量の外因性NeuroD1を投与する前に実施される、第1のアッセイを対象に実施すること、2)治療有効用量の外因性NeuroD1を、正常な血流が途絶された領域に投与すること、及び3)電気生理学アッセイ、血流アッセイ、組織構造アッセイ、機能アッセイ、又はそれらの任意の2つ以上の組合せから選択される第2のアッセイであって、治療有効用量の外因性NeuroD1の投与後に実施される、第2のアッセイを、対象に実施すること、を含む、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法が提供される。
【００２３】
本発明の態様による、1)部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸に作動可能に連結されているグリア細胞特異的プロモーターを含む組換えアデノ随伴アデノウイルス発現ベクター、及び2)NeuroD1をコードする核酸に作動可能に連結されているユビキタスプロモーターを含む組換えアデノ随伴アデノウイルス発現ベクター、を含む組成物であって、NeuroD1をコードする核酸が反転され、2組の部位特異的リコンビナーゼ認識部位に挟まれており、それによって、リコンビナーゼの作用がNeuroD1をコードする核酸を不可逆的に反転してNeuroD1が哺乳動物細胞で発現される、組成物が提供される。
【００２４】
本発明の方法によって生じるNeuroD1介在性の星状細胞からニューロンへの変換は、脳卒中領域において100〜600個のNeuN+新ニューロン/mm2を再生し、これは内部神経再生能力よりも20〜200倍効果的である。
【００２５】
神経再生に伴い、本発明の態様によるNeuroD1-治療はまた、反応性星状細胞を減少させ、神経炎症を低減し、神経生存を増強し、血管を修復し、脳卒中後の血液脳関門(BBB)を回復させる。更に、本発明の態様によるNeuroD1変換ニューロンは、局所神経回路を形成するだけでなく、全体的な脳ネットワークに統合し、虚血性脳卒中によって誘発される運動障害の機能的レスキューを達成する。したがって、本発明の治療方法によるNeuroD1介在性in vivo細胞変換は、神経障害の治療にとって先例のない神経再生効率を提供する。
【００２６】
本発明の態様による治療方法は、NeuroD1介在性in vivoグリアからニューロンへの変換が、虚血性脳卒中によって誘発される運動障害を機能的にレスキューすることができることを実証する。グリア変換後の神経再生に加えて、反応性星状細胞の低減及び神経炎症の減少後に、多くの損傷ニューロンが保存される。本発明のNeuroD1治療はまた、損傷を受けた血管を修復し、脳卒中領域のBBB完全性を回復させ、神経抑制性(neuroinhibitory)から神経許容的環境(neuropermissive environment)への特性変化をもたらす。本発明の態様による治療方法は、CNSにおける正常な血流の途絶に起因する損傷後に全ニューロンの50〜80%超を再生し保存する。
【００２７】
in vivo細胞変換による高効率の神経再生
脳機能は、ニューロンとそれらの周囲のグリア細胞との間の微妙なバランスに依存している。重度の虚血性損傷の後、ニューロンは、直ちに又は二次的な損傷により徐々に死滅するが、それらの隣接するグリア細胞は活性化され、増殖が開始され得るため、神経再生を最終的に阻害するグリア性瘢痕組織が生じる。本明細書に記載のNeuroD1介在性in vivo細胞変換技術は、反応性グリア細胞を機能性ニューロンに直接的に変換することによって、CNSにおける正常な血流の途絶から生じた損傷領域における神経機能を回復させる。本明細書に記載された本発明のグリアからニューロンへのin vivo変換技術は、脳卒中を治療するための生着及び試行に関する「古典的な」外因性幹細胞の投与と比較して、多くの利点を有する。
【００２８】
1つの利点は、神経再生のために外部細胞の代わりに内因性グリア細胞を使用し、細胞移植に関連した免疫拒絶反応を回避することである。再生のために喪失したニューロンの近くにある内因性グリア細胞を使用することは、局所回路におけるニューロン機能を回復させるおそらく最も経済的な方式である。別の利点は、分裂する反応性グリア細胞の非分裂性ニューロンへの変換は、反応性グリア細胞の数を低減させるだけでなく、分裂するグリア細胞に関連した腫瘍リスクの可能性も減少することである。対照的に、外因性幹細胞の投与を特徴とする「古典的な」幹細胞療法は、腫瘍リスクに本質的に関連している。したがって、外因性幹細胞は、本発明の態様による、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法では投与されない。
【００２９】
更に、本明細書に記載したNeuroD1介在性のグリアからニューロンへの変換療法は、平均400個のNeuN+細胞/mm2で、CNSの正常な血流の途絶を特徴とする領域、例えば脳卒中領域などにおいて多数の新しいニューロンを再生することができるが、これは虚血性脳卒中後の成体マウス皮質又は線条体における内部神経再生能力の約100倍である。
【００３０】
また、このような顕著な神経再生の有効性は、外因性幹細胞生着後の神経再生の典型的な低効率とは比べようもない。理論に拘束されるものではないが、少数の新しいニューロンでは損傷環境において生存することができないか、又は神経回路を再構築するには不十分であるので、効果的な神経再生は機能修復にとって重要である。
【００３１】
内因性神経幹細胞をモジュレートすることとは対照的に、本明細書に記載したin vivo細胞変換手法は、in situ再生及び修復において神経系全体にわたって神経損傷に密接に関連する反応性グリア細胞を利用する。また、本明細書に記載したin vivo細胞変換手法は、虚血性損傷直後の短期治療、例えば、血栓の除去、血流の促進、抗炎症、抗酸化、又は興奮毒性(excitotoxicity)の低減などに主として注目した、脳卒中治療に向けた現在開発中の他の多くの手法とは明らかに異なっている。これらの手法は短期治療にとっては必要であるが、多数のニューロンが脳卒中後に喪失するか、又は機能的に損なわれる場合、それらの長期有効性は限定される。
【００３２】
これらの短期手法を補充するものとして、本明細書に記載したin vivo細胞変換手法は、局所グリア細胞を変換し、虚血性損傷により途絶された局所神経回路を再構築することによって、多数の機能性ニューロンを再生することにより長期的解決策を提供する。特に、本明細書に記載したin vivo細胞変換手法は、神経再生及び組織修復のために、虚血性脳卒中後、数時間ではなく、数日又は数週間又は数ヶ月の広い時間窓を有する。したがって、任意選択により、本発明の態様により治療有効用量の外因性NeuroD1を正常な血流が途絶された領域に投与することに加えて、短期治療、例えば血栓の除去、血流の促進、抗炎症、抗酸化、又は興奮毒性の低減などが虚血性損傷直後に施される。
【００３３】
本発明の治療方法によって反応性グリア細胞を機能性ニューロンに変換することは、反応性グリア細胞を死滅させることとは異なる。反応性グリア細胞は神経損傷に対する正の防御応答であり、反応性グリア細胞の死滅は梗塞領域を悪化させる可能性がある。一方、反応性グリア細胞が、軸索再生及び神経再成長を阻害する可能性がある、CSPG、LCN2、TNFα、IL-1βなどを含むサイトカイン、及び炎症性因子を放出することは、周知である。
【００３４】
反応性グリア細胞を死滅させる代わりに、本明細書に記載したNeuroD1介在性のin vivo細胞変換技術は、反応性星状細胞を機能性ニューロンに変え、反応性星状細胞の数、並びに反応性グリア細胞によって分泌されるサイトカイン及び炎症性因子を低減させる。特に、本明細書に記載した星状細胞からニューロンへの変換療法において、損傷領域の星状細胞は、新しく生成された星状細胞により補充される。損傷後の反応性星状細胞の死滅は有害作用をもたらすが、本発明の治療方法により反応性星状細胞をニューロンに変換することは、神経修復をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１Ａ】局所脳卒中モデルの確立及びNeuroD1介在性のグリアからニューロンへの変換を示し、マウス運動皮質へのエンドセリン-1(1-31)の注射が、虚血性損傷の1週間後から次第に組織喪失を引き起こしたことを示す図である。PBSの注射は、偽対照として役立てた。破線は皮質領域を示す。スケールバー:(A)3mm。
【図１Ｂ】局所脳卒中モデルの確立及びNeuroD1介在性のグリアからニューロンへの変換を示し、脳卒中の1、4及び10週後の正中線から3mm外側領域までの皮質サイズの定量分析の結果を示すグラフである(各時点についてn=動物3匹)。
【図１Ｃ】局所脳卒中モデルの確立及びNeuroD1介在性のグリアからニューロンへの変換を示し、それぞれ、脳卒中後5日目(dps)(図1C)及び10日目(図1D)のNeuN(ニューロンマーカー)及びGFAP(星状細胞マーカー)の免疫染色結果を示す図である。NeuNシグナルは運動皮質において有意に損なわれ、GFAPシグナルは5dpsでは弱かったが、10dpsで有意に増加したことに注意されたい。破線は脳梁を示す。スケールバー:図1C及び図1Dの左図、200μm、図1C及び図1Dの右挿入図、40μm。
【図１Ｄ】局所脳卒中モデルの確立及びNeuroD1介在性のグリアからニューロンへの変換を示し、それぞれ、脳卒中後5日目(dps)(図1C)及び10日目(図1D)のNeuN(ニューロンマーカー)及びGFAP(星状細胞マーカー)の免疫染色結果を示す図である。NeuNシグナルは運動皮質において有意に損なわれ、GFAPシグナルは5dpsでは弱かったが、10dpsで有意に増加したことに注意されたい。破線は脳梁を示す。スケールバー:図1C及び図1Dの左図、200μm、図1C及び図1Dの右挿入図、40μm。
【図１Ｅ】局所脳卒中モデルの確立及びNeuroD1介在性のグリアからニューロンへの変換を示し、対照としてのCAG::GFP又は10dpsでのCAG::NeuroD1-IRES-GFPを有するレトロウイルスの注射の結果、及びウイルス注射後17日目(dpi)の免疫染色を示す図である。GFPのみの発現はグリア細胞のみが標識されるが、NeuroD1-GFP発現細胞はNeuNについて免疫陽性シグナルを示した。スケールバー:20μm。
【図１Ｆ】局所脳卒中モデルの確立及びNeuroD1介在性のグリアからニューロンへの変換を示し、hGFAP::NeuroD1-P2A-GFP又は対照としてのhGFAP::GFPを有するアデノ随伴ウイルス(AAV9)の10dpsでの注射結果、及び17dpiでの免疫染色の結果を示す図である。GFP対照群は主としてNeuNシグナルのないグリア細胞を示したが、NeuroD1群は多数のNeuN免疫陽性ニューロンを示した。スケールバー:40μm。
【図１Ｇ】局所脳卒中モデルの確立及びNeuroD1介在性のグリアからニューロンへの変換を示し、4dpiでの、AAV9 hGFAP::Cre及びCAG::FLEX-NeuroD1-P2A-mCherryの注射により、GFAP標識星状細胞において有意なNeuroD1発現が生じたことを示す図である(上段)。興味深いことに、いくつかのNeuroD1-mCherry標識細胞は、NeuN及びGFAPシグナルの両方を示し(下段)、このことは星状細胞からニューロンへの移行段階を示唆している。スケールバー:(G)40μm(挿入図20μm)。
【図１Ｈ】局所脳卒中モデルの確立及びNeuroD1介在性のグリアからニューロンへの変換を示し、脳卒中の誘発、AAV注射、及び免疫染色の手順についての実験設計の概略図である。このスキームのウイルス注射は、マウスにおける残りの実験でNeuroD1又はGFP(mCherry)対照を有するCre-FLEX系を示す。
【図１Ｉ】局所脳卒中モデルの確立及びNeuroD1介在性のグリアからニューロンへの変換を示し、17dpiで、GFP対照群が多数のGFAP+反応性グリア細胞を示したのに対し(上段、GFAP)、NeuroD1-GFP標識細胞の大部分はNeuN陽性ニューロンになったことを示す(下段)。スケールバー:(I)40μm。
【図２Ａ】局所脳卒中モデル及びAAV Cre-FLEX系の確立を示し、FVBマウス(左)におけるET-1(1-31)によって誘発された重度の虚血性傷害を示す代表的な画像を示すが、FVBマウスにおいてET-1(1-21)又はB6マウスにおいてET-1(1-31)によって誘発された軽度の障害の画像も示す。27dpsでのNeuN免疫染色から、ET-1(1-31)は、他の2つの条件と比較して、FVB動物においてより多くのNeuN喪失及びより重度の皮質萎縮を誘発することが明らかとなった。スケールバー:(A)400μm。
【図２Ｂ】局所脳卒中モデル及びAAV Cre-FLEX系の確立を示し、本発明の態様によるCre-FLEX系の作動機序の概略図である。
【図３Ａ】NeuroD1が反応性星状細胞を皮質ニューロンに効率的に変換することを示し、対照群及びNeuroD1群の両方で、ウイルス注射後4、7、又は17日目(dpi)のGFAP免疫染色による星状細胞の同定を示す図である。スケールバー:(A)40μm。
【図３Ｂ】NeuroD1が反応性星状細胞を皮質ニューロンに効率的に変換することを示し、4、7、又は17dpiでのNeuN免疫染色によるニューロンの同定を示す図である。矢印は、いくつかのNeuroD1変換されたニューロンを示す。スケールバー:(B)40μm。
【図３Ｃ】NeuroD1が反応性星状細胞を皮質ニューロンに効率的に変換することを示し、すべてのウイルス感染細胞におけるGFAP+細胞の定量化を示すグラフである。NeuroD1群での星状細胞の有意な減少に注意されたい。**P<0.01、二元配置分散分析とそれに続くSidak多重比較検定。n=群あたりマウス3匹。ウイルス感染した皮質領域において無作為に3画像取得した。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図３Ｄ】NeuroD1が反応性星状細胞を皮質ニューロンに効率的に変換することを示し、すべてのウイルス感染細胞におけるNeuN+細胞の定量化を示すグラフである。NeuroD1群でのニューロンの有意な増加に注意されたい。****P<0.0001、二元配置分散分析とそれに続くSidak多重比較検定。n=群あたりマウス3匹。ウイルス感染した皮質領域において無作為に3画像取得した。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図３Ｅ】NeuroD1が反応性星状細胞を皮質ニューロンに効率的に変換することを示し、60dpiで皮質マーカー(Tbr1)を発現するNeuroD1変換ニューロン(GFP+)を示す代表的な画像を示す。Tbr1+細胞には、変換細胞と非変換細胞の両方が含まれることに注意されたい。スケールバー:(E)40μm。
【図３Ｆ】NeuroD1が反応性星状細胞を皮質ニューロンに効率的に変換することを示し、NeuroD1介在性のin vivo細胞変換後のニューロン同一性の特徴を示すグラフである。多数のNeuroD1変換ニューロンが皮質ニューロンマーカーについて免疫陽性であったが、10%のみがGABA作動性ニューロンであった。n=群毎にマウス3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図４Ａ】NeuroD1変換ニューロンを追跡するTri-AAV系を示し、Tri-AAV追跡系のメカニズムを示す概略図である。AAV-hGFAP::GFPのみを注射した場合、星状細胞のみが緑色に標識される。AAV-hGFAP::GFPをCre-FLEX-mCherry制御系と一緒に注射した場合、星状細胞はGFPとmCherryの両方を発現し、黄色を示す。AAV-hGFAP::GFPをCre-FLEX-NeuroD1-mCherry変換系と一緒に注射した場合、星状細胞はニューロンに変換され、GFPとmCherryの両方を発現し、黄色を示すがNeuN+である。
【図４Ｂ】NeuroD1変換ニューロンを追跡するTri-AAV系を示し、17dpi及び60dpiの両方でのTri-AAV追跡系による変換効率の定量化を示すグラフである。hGFAP::GFP群については、すべてのGFP+細胞のうちGFP+/NeuN+細胞のパーセンテージを定量化した。hGFAP::GFP+Cre-FLEX-mCherry又はCre-FLEX-NeuroD1-mCherry群については、すべてのGFP+/mCherry+のうちGFP+/mCherry+/NeuN+細胞のパーセンテージを定量化した。(n=群あたり2匹、及び>150細胞)。
【図４Ｃ】NeuroD1変換ニューロンを追跡するTri-AAV系を示し、17dpi及び60 dpiでの3群におけるGFP、mCherry及びNeuNシグナルの異なるレベルの共局在化を示す代表的な画像を示す。スケールバー:(C)40μm。
【図５Ａ】NeuroD1治療が脳卒中領域の神経炎症を低減することを示し、17dpiでの対照群及びNeuroD1群の脳卒中皮質におけるGFAP標識反応性星状細胞を示す代表的な低倍率画像を示す。破線は皮質領域を示す。脳卒中損傷のコアには星印(＊)が付けてある。スケールバー:(A)400μm。
【図５Ｂ】NeuroD1治療が脳卒中領域の神経炎症を低減することを示し、GFP対照群(上段)及びNeuroD1群(下段)における脳卒中後の梗塞周辺領域のGFAP標識反応性星状細胞(赤色)を説明する高倍率画像である。NeuroD1群の星状細胞が、対照群と比較して形態学的に反応性が低いように思われることに注意されたい。損傷のコアには星印が付けてある。スケールバー:(B)40μm。
【図５Ｃ】NeuroD1治療が脳卒中領域の神経炎症を低減することを示し、かなりの数の星状細胞がNeuroD1変換領域に維持されていること(下段)を更に説明するトランスジェニックGFAP-GFPマウスの画像であり、星状細胞が細胞変換後に枯渇しないことを示唆している。スケールバー:(C)40μm。
【図５Ｄ】NeuroD1治療が脳卒中領域の神経炎症を低減することを示し、17dpiでの対照群及びNeuroD1群におけるミクログリアマーカーIba1を示す低倍率画像である。NeuroD1群におけるIba1シグナルの有意な低減に注意されたい。スケールバー:(D)400μm。
【図５Ｅ】NeuroD1治療が脳卒中領域の神経炎症を低減することを示し、GFP対照群ではアメーバ状の形状の反応性ミクログリア(Iba1)を示す(上)が、NeuroD1群ではより分岐した形態(下)を示す、高倍率画像である。スケールバー:(E)40μm。
【図５Ｆ】NeuroD1治療が脳卒中領域の神経炎症を低減することを示し、17dpiの梗塞周辺領域において対照群と比較してNeuroD1群における反応性グリア細胞によって放出される重要な神経阻害因子であるCSPGの有意な低減を示す免疫蛍光画像である。スケールバー:(F)40μm。
【図５Ｇ】NeuroD1治療が脳卒中領域の神経炎症を低減することを示し、17dpiの対照群と比較して、NeuroD1群における反応性グリア細胞によって分泌される炎症性因子であるLCN2の有意な低減を示す免疫蛍光画像である。スケールバー:(G)40μm。
【図５Ｈ】NeuroD1治療が脳卒中領域の神経炎症を低減することを示し、NeuroD1感染組織におけるNeuroD1発現を検証したリアルタイム定量PCR(RT-PCR)の結果を示すグラフであるが、NeuroD1群の反応性星状細胞マーカーGFAP及びLCN2の有意な減少を明らかにした。*P<0.05、**P<0.01、****P<0.0001、一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験。n=群毎にマウス4匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図５Ｉ】NeuroD1治療が脳卒中領域の神経炎症を低減することを示し、RT-PCRによって、脳卒中後の炎症性因子IL-1β、IFNγ、IL-6、及びTNFαの有意な増加が、NeuroD1治療後に有意に減少することを明らかにしたグラフである。*P<0.05、**P<0.01、一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験。n=群毎にマウス4匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図６Ａ】NeuroD1治療後の反応性グリア細胞及び炎症の低減を示し、7dpi(図6A)及び40dpi(図6B)での梗塞周辺領域における星状細胞(GFAP)及びミクログリア(Iba1)の代表的な画像である。40dpiのNeuroD1群において、対照群と比較して、星状細胞及びミクログリアの数が少なく、また形態学的に反応性が低いことに注意されたい。スケールバー:40μm。
【図６Ｂ】NeuroD1治療後の反応性グリア細胞及び炎症の低減を示し、7dpi(図6A)及び40dpi(図6B)での梗塞周辺領域における星状細胞(GFAP)及びミクログリア(Iba1)の代表的な画像である。40dpiのNeuroD1群において、対照群と比較して、星状細胞及びミクログリアの数が少なく、また形態学的に反応性が低いことに注意されたい。スケールバー:40μm。
【図６Ｃ】NeuroD1治療後の反応性グリア細胞及び炎症の低減を示し、40dpiでの梗塞周辺領域におけるGFAP及びNeuNと同時染色されたGFP(NeuroD1-GFP)の代表的な画像である。NeuroD1感染領域においては、多くの星状細胞が検出され、反応性が低く、このことは変換後に枯渇されなかったことを示唆していることに注意されたい。スケールバー:40μm。
【図６Ｄ】NeuroD1治療後の反応性グリア細胞及び炎症の低減を示し、ミクログリアマーカーIba1(図6D)、グリア瘢痕抑制因子CSPG(図6E)、及び星状細胞炎症マーカーLCN2(図6F)についてのシグナル強度(A.U.、人工単位)及びカバー領域(%)の定量化を示すグラフである。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験。n=群あたりマウス3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図６Ｅ】NeuroD1治療後の反応性グリア細胞及び炎症の低減を示し、ミクログリアマーカーIba1(図6D)、グリア瘢痕抑制因子CSPG(図6E)、及び星状細胞炎症マーカーLCN2(図6F)についてのシグナル強度(A.U.、人工単位)及びカバー領域(%)の定量化を示すグラフである。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験。n=群あたりマウス3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図６Ｆ】NeuroD1治療後の反応性グリア細胞及び炎症の低減を示し、ミクログリアマーカーIba1(図6D)、グリア瘢痕抑制因子CSPG(図6E)、及び星状細胞炎症マーカーLCN2(図6F)についてのシグナル強度(A.U.、人工単位)及びカバー領域(%)の定量化を示すグラフである。*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001。一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験。n=群あたりマウス3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図７Ａ】NeuroD1が新しいニューロンを再生し、脳卒中領域の損傷ニューロンを保存することを示し、対照群(上段)とNeuroD1群(下段)との間の運動皮質(17dpi)の比較を示す図である。左側の低倍率の図は脳卒中後の全体的な皮質形態を示し、一方、右側の図は梗塞周辺領域の拡大画像を示す。NeuroD1群は、変換ニューロン(GFP+)だけでなく、非変換ニューロン(NeuN+だがGFP-、矢印)も示すことに注意されたい。スケールバー:左の低倍率皮質画像については500μm、拡大挿入図については40μm。
【図７Ｂ】NeuroD1が新しいニューロンを再生し、脳卒中領域の損傷ニューロンを保存することを示し、17dpiでのNeuroD1群におけるNeuroD1及びNeuNの免疫蛍光染色を示しており、NeuroD1変換ニューロン及び非変換ニューロンの両方が混ざり合っていることを説明する図である。矢印は非変換ニューロン(NeuN+だがNeuroD1-)を示す。スケールバー:(B)40μm。
【図７Ｃ】NeuroD1が新しいニューロンを再生し、脳卒中領域の損傷ニューロンを保存することを示し、対照群及びNeuroD1群の梗塞周辺領域におけるNeuN+細胞の定量化を示すグラフであり、後者にはNeuroD1+ニューロン及びNeuroD1-ニューロンの両方が含まれている。NeuroD1群における非変換ニューロンの数は、対照群の数の2倍を超えており、NeuroD1変換の神経保護効果を示唆していることに注意されたい。
【図７Ｄ】NeuroD1が新しいニューロンを再生し、脳卒中領域の損傷ニューロンを保存することを示す、神経樹状突起マーカーSMI32(図7D)及びMAP2(図7E)の免疫蛍光画像であり、NeuroD1群(下段)のニューロン形態が対照群(上段)と比較して大幅に改善されていることを示す。スケールバー:40μm。
【図７Ｅ】NeuroD1が新しいニューロンを再生し、脳卒中領域の損傷ニューロンを保存することを示す、神経樹状突起マーカーSMI32(図7D)及びMAP2(図7E)の免疫蛍光画像であり、NeuroD1群(下段)のニューロン形態が対照群(上段)と比較して大幅に改善されていることを示す。スケールバー:40μm。
【図７Ｆ】NeuroD1が新しいニューロンを再生し、脳卒中領域の損傷ニューロンを保存することを示し、軸索マーカーSMI312(図7F)、NF200(図7G)及び軸索髄鞘形成マーカーMBP(図7G)の免疫染色を示す図であり、NeuroD1群(下段)における軸索及び軸索髄鞘形成が対照群(上段)と比較して増加したことを実証する。NeuroD1群においては、対照群よりもNF200及びMBPの共局在性がより良好であることに注意されたい。スケールバー:20μm。
【図７Ｇ】NeuroD1が新しいニューロンを再生し、脳卒中領域の損傷ニューロンを保存することを示し、軸索マーカーSMI312(図7F)、NF200(図7G)及び軸索髄鞘形成マーカーMBP(図7G)の免疫染色を示す図であり、NeuroD1群(下段)における軸索及び軸索髄鞘形成が対照群(上段)と比較して増加したことを実証する。NeuroD1群においては、対照群よりもNF200及びMBPの共局在性がより良好であることに注意されたい。スケールバー:20μm。
【図７Ｈ】NeuroD1が新しいニューロンを再生し、脳卒中領域の損傷ニューロンを保存することを示し、NeuroD1群の脳卒中領域におけるNeuN、Robo2及びSyn1を含む神経因子の発現レベルが対照群と比較して有意に増加することを明らかにした、RT-PCRの結果を示すグラフである。*P<0.05、一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験。n=群毎にマウス4匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図７Ｉ】NeuroD1が新しいニューロンを再生し、脳卒中領域の損傷ニューロンを保存することを示し、正中線から500〜2500μm外側の運動皮質領域におけるNeuN+細胞の総数の定量分析を示すグラフである。対照群とNeuroD1群との間に60dpiまで有意差があることに注意されたい。n=各群あたりマウス3匹。*P<0.05、**P<0.01、二元配置分散分析とそれに続くSidak多重比較試験。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図８Ａ】NeuroD1治療後の神経再生及び神経保護を示し、対照群及びNeuroD1群の梗塞周辺領域におけるNeuN陽性細胞の定量化を示すグラフである。NeuroD1群において、NeuN陽性細胞は更にNeuroD1変換ニューロン(GFP+/NeuN+二重陽性)及び非変換ニューロン(GFP陰性)に分けられた。
【図８Ｂ】NeuroD1治療後の神経再生及び神経保護を示し、40dpiでの梗塞周辺領域における神経樹状突起マーカーMap2の代表的な画像である。スケールバー:40μm。
【図８Ｃ】NeuroD1治療後の神経再生及び神経保護を示し、樹状突起マーカーMap2(図8C)、軸索マーカーSMI312(図8D)、及び髄鞘形成マーカーMBP(図8E)についてのシグナル強度(A.U.、人工単位)及びカバー領域(%)の定量化を示すグラフである。*P<0.05、**P<0.01。一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験、n=群あたりマウス3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図８Ｄ】NeuroD1治療後の神経再生及び神経保護を示し、樹状突起マーカーMap2(図8C)、軸索マーカーSMI312(図8D)、及び髄鞘形成マーカーMBP(図8E)についてのシグナル強度(A.U.、人工単位)及びカバー領域(%)の定量化を示すグラフである。*P<0.05、**P<0.01。一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験、n=群あたりマウス3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図８Ｅ】NeuroD1治療後の神経再生及び神経保護を示し、樹状突起マーカーMap2(図8C)、軸索マーカーSMI312(図8D)、及び髄鞘形成マーカーMBP(図8E)についてのシグナル強度(A.U.、人工単位)及びカバー領域(%)の定量化を示すグラフである。*P<0.05、**P<0.01。一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験、n=群あたりマウス3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図９Ａ】脳卒中領域におけるNeuroD1介在性の細胞変換による神経回路の再構成を示し、GFP対照群における皮質組織喪失(上段)及びNeuroD1治療による組織喪失のレスキュー(下段)を説明する低倍率画像である。GFPはAAV感染細胞を標識し、DAPIは細胞核を標識する。破線は皮質領域を示す。スケールバー:400μm。
【図９Ｂ】脳卒中領域におけるNeuroD1介在性の細胞変換による神経回路の再構成を示し、7、17、40及び60dpiでの対照群対NeuroD1群における皮質領域(正中線から3mm外側まで)の定量分析の結果を示すグラフである。対照群においては確実な組織喪失があるが、NeuroD1群においては明らかな皮質の保存があることに注意されたい。*P<0.01、**P<0.01、***P<0.005、二元配置分散分析とそれに続くSidak多重比較試験。n=群あたりマウス3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図９Ｃ】脳卒中領域におけるNeuroD1介在性の細胞変換による神経回路の再構成を示す、内側位置(左下)から外側位置(上)までの連続する矢状断面の代表的な画像であり、皮質(ボックス1)のNeuroD1変換ニューロンから線条体(ボックス2)、視床(ボックス3)、及び視床下部(ボックス4)への軸索投射を説明している。スケールバー:左側の矢状画像については1000μm、挿入画像については40μm。
【図９Ｄ】脳卒中領域におけるNeuroD1介在性の細胞変換による神経回路の再構成を示し、脳切片(上)におけるNeuroD1感染ニューロンを示す蛍光(GFP)及び明視野画像である。下は、NeuroD1変換ニューロンにおいて誘発された反復活動電位を示す代表的なトレースである(60dpi)。
【図９Ｅ】脳卒中領域におけるNeuroD1介在性の細胞変換による神経回路の再構成を示し、全細胞記録中の記録ピペットのビオシチン注入とそれに続く固定後免疫染色の結果を示す画像であり、記録されたニューロンはGFP+とNeuroD1+の両方であり、60dpiで複雑な先端樹状突起があることが示されている。スケールバー:上段の低倍率画像については200μm、下段の挿入画像については5μm。
【図９Ｆ】脳卒中領域におけるNeuroD1介在性の細胞変換による神経回路の再構成を示し、NeuroD1-GFP標識ニューロン(60dpi)において記録された興奮性(sEPSC)及び抑制性シナプス事象(sIPSC)の代表的なトレースを示す。
【図９Ｇ】脳卒中領域におけるNeuroD1介在性の細胞変換による神経回路の再構成を示し、脳卒中のない皮質切片(白いバー)又は脳卒中のある皮質切片(黒いバー、GFP対照、縞模様のバー、NeuroD1群)におけるsEPSC及びsIPSCの両方の周波数の定量化を示すグラフである。脳卒中後、NeuroD1群は、sEPSC及びsIPSCの両方の周波数が対照群よりも有意に高いことに注意されたい(EPSC:対照、4.3±0.6、n=22;NeuroD1、6.7±0.8、n=25;p=0.023、スチューデントt検定)(IPSC:対照、8.6±1.3、n=22;NeuroD1、14.0±2.0、n=25;p=0.032、スチューデントt検定)。
【図１０Ａ】NeuroD1治療後の脳組織修復及び長距離軸索投射(long range axonal projection)を示し、対照群対NeuroD1群における前部(A)から後部(P)までの連続した脳切片を示す画像である。対照群における重篤な組織損傷に注意されたい。ctx、皮質;c.c.、脳梁。スケールバー:400μm。
【図１０Ｂ】NeuroD1治療後の脳組織修復及び長距離軸索投射を示し、60dpiでのH&E(ヘマトキシリン及びエオシン)染色もまた対照群において重篤な組織損傷を示すことを示す画像である。典型的には重度の脳損傷に関連する、対照群における拡大した側脳室に注意されたい。スケールバー:400μm。
【図１０Ｃ】NeuroD1治療後の脳組織修復及び長距離軸索投射を示し、NeuroD1ウイルス注射の9ヶ月後のマウス皮質の冠状断面を示す画像であり、脳梁を通って反対側までの長距離軸索投射を示している。下段は、脳梁内部(ボックス1及び3に同じ側、ボックス4に反対側を示す)の軸索投射並びに線条体(ボックス2)を通った皮質下投射の拡大図を示している。スケールバー:上段:1000μm、下段:40μm。
【図１１Ａ】NeuroD1治療による血管及び血液脳関門の修復を示し、虚血性損傷によって誘発された血管及び血液脳関門(BBB)の途絶を示す図である。上段は、脳卒中以外の脳において、星状細胞エンドフィート(水チャネルアクアポリン4、AQP4、赤色で示した)が血管周囲(単球及び内皮細胞マーカーLy6C、シアンで標識)を包み、無傷のBBBを形成することを示している。矢印は、血管周囲のAQP4とGFAPとの共局在を示している。下段は、脳卒中1週間後(wps)、AQP4シグナルが血管から分離され、BBBの破壊を示唆している。スケールバー:40μm。
【図１１Ｂ】NeuroD1治療による血管及び血液脳関門の修復を示し、脳卒中後の対照群とNeuroD1群との間の血管及びBBBの比較を示す図である。上段の対照群は、血管が破壊され、脳卒中領域全体にわたってAQP4シグナルが拡散していることを示した。下段のNeuroD1群は、AQP4シグナルに関連した血管の大幅な改善を示し、細胞変換後のBBBの修復を示唆している(17dpi)。スケールバー:40μm。
【図１１Ｃ】NeuroD1治療による血管及び血液脳関門の修復を示す。AQP4で同時染色する別の血管マーカーCD31の免疫蛍光画像であり、NeuroD1治療群(17dpi)における血管及びBBBのレスキューが確認される。スケールバー:40μm。
【図１１Ｄ】NeuroD1治療による血管及び血液脳関門の修復を示す。NeuroD1群(17dpi)における星状細胞のエンドフィートの濃縮AQP4シグナルと比較した、対照群の反応性星状細胞における誤局在性AQP4シグナルを示す、AQP4及びGFAPの同時免疫染色を示した図である。スケールバー:40μm。
【図１１Ｅ】NeuroD1治療による血管及び血液脳関門の修復を示し、NeuroD1群(下段)における星状細胞エンドフィートと血管との良好な再会合と比較した、対照群(上段)における血管(CD31)からの星状細胞エンドフィート(GFAP)の解離を説明する高倍率画像である。スケールバー:5μm。
【図１１Ｆ】NeuroD1治療による血管及び血液脳関門の修復を示し、非脳卒中群、脳卒中対照群、脳卒中NeuroD1群(17dpi)におけるAQP4シグナル強度(図11F)及びカバー領域(図11G)の定量化を示すグラフである。NeuroD1群は、非脳卒中群に非常に近い。**P<0.01。一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験、n=群あたりマウス3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図１１Ｇ】NeuroD1治療による血管及び血液脳関門の修復を示し、非脳卒中群、脳卒中対照群、脳卒中NeuroD1群(17dpi)におけるAQP4シグナル強度(図11F)及びカバー領域(図11G)の定量化を示すグラフである。NeuroD1群は、非脳卒中群に非常に近い。**P<0.01。一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験、n=群あたりマウス3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図１１Ｈ】NeuroD1治療による血管及び血液脳関門の修復を示し、対照群及びNeuroD1群の梗塞周辺領域における血管(Ly6Cシグナル)の定量化を示すグラフである。NeuroD1群は、対照群よりも有意に多い血管を示した。****P<0.0001。一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験、n=群あたりマウス3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図１２Ａ】シナプス回復及び興奮抑制の再平衡化を含む、損傷組織に対するNeuroD1介在性細胞変換の広範な影響を示し、パッチクランプ記録中に注入され、その後固定後染色されたビオシチンの画像であり、NeuroD1感染ニューロンにおいて樹状突起に沿った高密度の棘を示している。スケールバー:50μm。
【図１２Ｂ】シナプス回復及び興奮抑制の再平衡化を含む、損傷組織に対するNeuroD1介在性細胞変換の広範な影響を示す、17dpiでのゴルジ含浸染色の代表的な画像であり、対照と比較して、NeuroD1群の梗塞周辺領域においてニューロン突起及び樹状突起棘の増加が示された。スケールバー:20μm。
【図１２Ｃ】シナプス回復及び興奮抑制の再平衡化を含む、損傷組織に対するNeuroD1介在性細胞変換の広範な影響を示す、17dpiでのVGluT1の免疫蛍光染色の代表的な画像(図12C)、及び対照群及びNeuroD1群におけるシグナル強度の定量化を示すグラフである(図12D)。**P<0.01、一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験、n=群あたり3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。スケールバー:40μm。
【図１２Ｄ】シナプス回復及び興奮抑制の再平衡化を含む、損傷組織に対するNeuroD1介在性細胞変換の広範な影響を示す、17dpiでのVGluT1の免疫蛍光染色の代表的な画像(図12C)、及び対照群及びNeuroD1群におけるシグナル強度の定量化を示すグラフである(図12D)。**P<0.01、一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験、n=群あたり3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。スケールバー:40μm。
【図１２Ｅ】シナプス回復及び興奮抑制の再平衡化を含む、損傷組織に対するNeuroD1介在性細胞変換の広範な影響を示す、NeuroD1変換領域におけるPV標識介在ニューロンの代表的な画像(図12E)、及びNeuroD1変換領域におけるPV標識介在ニューロンの定量化を示すグラフである(図12F)。PVニューロンは、60dpiでNeuroD1変換ニューロン(NeuroD1-GFP)と混ざり合っていることに注意されたい。更に多くのPV介在ニューロンが、対照群よりもNeuroD1群において保存されていた。**P<0.01。一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験、n=群あたり3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。スケールバー:100μm。
【図１２Ｆ】シナプス回復及び興奮抑制の再平衡化を含む、損傷組織に対するNeuroD1介在性細胞変換の広範な影響を示す、NeuroD1変換領域におけるPV標識介在ニューロンの代表的な画像(図12E)、及びNeuroD1変換領域におけるPV標識介在ニューロンの定量化を示すグラフである(図12F)。PVニューロンは、60dpiでNeuroD1変換ニューロン(NeuroD1-GFP)と混ざり合っていることに注意されたい。更に多くのPV介在ニューロンが、対照群よりもNeuroD1群において保存されていた。**P<0.01。一元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験、n=群あたり3匹。データは、平均±s.e.mとして示す。スケールバー:100μm。
【図１２Ｇ】シナプス回復及び興奮抑制の再平衡化を含む、損傷組織に対するNeuroD1介在性細胞変換の広範な影響を示し、NeuroD1群において、AQP4シグナルがNeuroD1発現細胞の高密度領域で血管との明らかな関連性を示したが、NeuroD1発現細胞の低密度の隣接領域では少ないことを示した画像である(破線により区別した)。スケールバー:40μm。
【図１２Ｈ】シナプス回復及び興奮抑制の再平衡化を含む、損傷組織に対するNeuroD1介在性細胞変換の広範な影響を示し、対照群の損傷領域において、ビオチンは血管の外側に漏れたが(Ly6Cによって標識、破線によって示した)、NeuroD1群の損傷領域においてはビオチンは血管内に大部分が留まったことを実証する、ビオチン灌流分析の代表的な画像を示す。スケールバー:5μm。
【図１２Ｉ】シナプス回復及び興奮抑制の再平衡化を含む、損傷組織に対するNeuroD1介在性細胞変換の広範な影響を示し、60dpiの梗塞周辺領域における星状細胞エンドフィートマーカーAQP4の代表的な画像を示す。NeuroD1群における血管とAQP4の有意な再会合に注意されたい。スケールバー:40μm。
【図１３Ａ】NeuroD1治療後の行動の改善を示す、マウスの前肢運動機能試験の実験計画の概略図である。脳卒中後9日目(9dps)及びウイルス注射の1日前に、行動試験を実施し、ET-1(1-31)又は偽対照としてのPBSを注射したマウスの運動機能を評価した。AAVを10dpsで注射し、指示した時点(20、30、50、及び70dps)で行動試験を実施して機能回復を評価した。
【図１３Ｂ】NeuroD1治療後の行動の改善を示し、ペレット回収試験の結果を示すグラフである。NeuroD1群は、対照群と比較して、脳卒中後の回復の加速を示した。運動皮質の虚血性損傷は、餌ペレットの回収能力を顕著に損なわせ、脳卒中前の5〜6ペレット/5分から9dpsで1ペレット/5分まで低下させた。NeuroD1治療後、ペレット回収能力は、対照群と比較して、安定した回復を示した。餌ペレット回収試験については、前肢同側の対側の運動皮質だけが脳卒中損傷を負って試験されたことに注意されたい。二元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験。ET-1+対照AAV群についてはn=12、NeuroD1 AAVについてはn=11、ET-1+非ウイルス群についてはn=6、PBS群についてはn=6。**P<0.01、***P<0.001。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図１３Ｃ】NeuroD1治療後の行動の改善を示し、グリッド歩行試験の結果を示すグラフである。NeuroD1群は、対照群と比較して、低い肢障害率を示した。脳卒中損傷は、肢障害率を有意に増加させた。NeuroD1治療は、肢障害率を減少させた。二元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験。ET-1+対照AAV対側群についてはn=9、ET-1+NeuroD1 AAV対側群についてはn=11、ET-1+NeuroD1同側群についてはn=5、ET-1+対照同側群については、n=5、ET-1+非ウイルス対側群についてはn=6、及びPBS対側群についてはn=6。**P<0.01、***P<0.001。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図１３Ｄ】NeuroD1治療後の行動の改善を示し、シリンダー試験の結果を示すグラフである。NeuroD1治療したマウスは、対照マウスと比較して、前肢の側壁上昇及びタッチ機能に顕著な回復を示した。脳卒中傷害は、シリンダーの壁の上昇及びタッチの点においてマウス前肢機能を損なった。二元配置分散分析とそれに続くTukey多重比較試験。脳卒中+対照AAV対側群についてはn=9、脳卒中+NeuroD1 AAV対側群についてはn=11、脳卒中+NeuroD1同側群についてはn=9、脳卒中+対照同側群についてはn=7、脳卒中+非ウイルス対側群についてはn=6、PBS対側群についてはn=5。**P<0.01、****P<0.0001。データは、平均±s.e.mとして示す。
【図１４Ａ】行動試験後の組織損傷の評価を示す、階段から改良したペレット回収装置の写真である。休憩チャンバー内のマウスは、18時間の絶食の後に、V字型の窪み部分のショ糖ペレットに到達するように訓練された。この設計から、マウスが順調に餌ペレットを回収するためには運動協調性及び運動強度で多大な努力を費やさなければならなかったことは明白である。
【図１４Ｂ】行動試験後の組織損傷の評価を示す、行動試験の終了後(ウイルス注射の2か月後)のマウス脳の代表的な写真である。対照群は、ET-1(1-31)誘発性局所脳卒中の後に、脳卒中側で重度の皮質組織喪失を示したが、NeuroD1治療は組織喪失の有意なレスキューを示した。
【図１４Ｃ】行動試験後の組織損傷の評価を示す、ET-1(1-31)誘発性虚血性脳卒中の後の重度の組織喪失を説明する冠状断面におけるマウス皮質の代表的な画像である。2回のET-1(1-31)注射は、一方の側の運動皮質及び感覚皮質の両方において行われ、長期の行動試験に対してより重度の損傷を誘発させたことに注意されたい。したがって、組織喪失はまた、ほとんどの細胞変換研究で実施された単回注射よりも重度である。それにもかかわらず、NeuroD1修復効果は依然として有効である。スケールバー:1000μm。
【図１４Ｄ】行動試験後の組織損傷の評価を示し、行動試験後の皮質組織損傷の定量化を示すグラフである。ET-1(1-31)注射の2カ所の部位を有するNeuroD1群においては、脳卒中側はまたその対側の非脳卒中側と比較して組織損傷を示した(P=0.012)が、対照群よりも極めて良好に保存された(****P<0.0001)。二元配置分散分析とそれに続くSidak多重比較試験、n=群あたりマウス6匹。データは、平均±s.e.mとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の態様により、個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療するための組成物及び方法が提供される。
【００３７】
本発明の態様により、CNSにおける正常な血流の途絶から生じるニューロン喪失を元に戻すのに有効な方法が提供される。
【００３８】
予想外のことに、反応性星状細胞における神経転写因子NeuroD1の発現は、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する。したがって、治療有効量のNeuroD1を対象に投与することを含む、対象のCNSにおける正常な血流の途絶の病理学的影響を治療する方法が本発明によって提供される。
【００３９】
CNSにおける正常な血流の途絶によって影響を受ける対象への治療有効量のNeuroD1の投与は、以下を介在する:反応性星状細胞のグルタミン酸作動性ニューロンへの変換による新しいグルタミン酸作動性ニューロンの生成、反応性星状細胞数の低減、GABA作動性ニューロン及びグルタミン酸作動性ニューロンを含む損傷したニューロンの生存、新しい非反応性星状細胞の生成、非変換の反応性星状細胞の反応性の低減、及び損傷した領域への血管の再統合。
【００４０】
CNSにおける正常な血流の途絶によって影響を受ける対象への治療有効量のNeuroD1の投与は、以下を介在する:損傷部位での炎症の低減、損傷部位での神経性抑制の低減、損傷部位での正常なミクログリア形態の再確立、損傷部位での神経回路の再確立、損傷部位での血管の増加、損傷部位での血液脳関門の再確立、損傷部位での正常な組織構造の再確立、及び正常な血流の途絶による運動障害の改善。
【００４１】
治療を必要とする対象は、ヒト又は非ヒト哺乳動物であってもよいが、同様に非哺乳動物であり得る。
【００４２】
驚くべきことに、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を改善する治療有効量のNeuroD1の投与は、静止した星状細胞よりも反応性星状細胞に投与した場合、典型的には対象のCNSにおける正常な血流の途絶の発生から3〜60日後、5〜45日後、又は8〜30日後に、より多大な有益な効果があるが、ある特定の有利性は、対象のCNSにおける血流の遮断の発生から2日〜1年又はそれ以降を含めた、より早期又はより後期に達成され得る。
【００４３】
対象へのNeuroD1の投与を使用して、虚血、血栓症、塞栓症、出血、脳震盪、腫瘍、感染症、炎症、外傷性脳損傷及び脊髄損傷により、又は血管の慢性疾患介在性制限により引き起こされる、CNSに正常な血流の途絶から生じる損傷を治療することができ、これはニューロン細胞死及び反応性星状細胞の活性化をもたらす。対象へのNeuroD1の投与を使用して、限定するものではないが、虚血性又は出血性脳卒中、脳動脈瘤、腫瘍、感染症、炎症、脳震盪、外傷性脳損傷、外傷性脊髄損傷、虚血性又は出血性の脊髄障害(脊髄梗塞)、心拍停止又は重度の低血圧(ショック)によって引き起こされる全脳虚血、低酸素、低血糖症、又は貧血によって引き起こされる低酸素性虚血性脳症、感染性心内膜炎又は心房粘液腫によって引き起こされるCNS塞栓症、線維軟骨性塞栓性脊髄症、小児白血病によって引き起こされるCNS血栓症、ネフローゼ症候群(腎臓病)、慢性炎症性疾患、妊娠、エストロゲン系避妊薬の使用、脳膜炎、及び脱水症によって引き起こされる脳静脈洞血栓症を含む、CNSへの正常な血流の途絶から発生する損傷を治療することができる。
【００４４】
本発明の態様による、対象に対してCNSにおける正常な血流の途絶領域に治療有効量のNeuroD1を投与することを含む、対象のCNSにおける正常な血流の途絶の病理学的影響を治療する方法。本発明の態様による、対象に対してCNSにおける正常な血流の途絶の部位又はその付近に治療有効量のNeuroD1を投与することを含む、対象のCNSにおける正常な血流の途絶の病理学的影響を治療する方法。本発明の態様による、対象に対してCNSにおける正常な血流の途絶によって引き起こされたグリア性瘢痕内又はその付近に治療有効量のNeuroD1を投与することを含む、対象のCNSにおける正常な血流の途絶の病理学的影響を治療する方法。
【００４５】
NeuroD1治療は、MRIによって診断される損傷の領域に施すことができる。電気生理学は、ニューロン細胞死又は損傷によって引き起こされる神経発火(neural firing)の機能変化を評価することができる。神経損傷をアッセイする非侵襲的方法としてはEEGが挙げられる。損傷点への血流の途絶は、近赤外分光法及びfMRIを介して非侵襲的にアッセイすることができる。その領域内の血流は、動脈瘤で見られるように増加し得るか、又は虚血で見られるように減少し得る。血流の途絶によって引き起こされるCNSへの損傷は更に、損傷点の診断に使用することができる、短期的変化及び長期的変化を組織構造にもたらす。短期においては、損傷は限局性腫脹を引き起こす。長期においては、細胞死は組織喪失点を引き起こす。組織死によって引き起こされる構造変化をアッセイする非侵襲的方法としては、MRI、PETスキャン、CATスキャン又は超音波が挙げられる。これらの方法は、損傷の主患部を正確に示すために単独で、又は任意の組合せで使用することができる。
【００４６】
本発明による特定の態様において、NeuroD1は、対象が未治療の場合にはグリア性瘢痕が発生する損傷部位、又はグリア性瘢痕が既に存在する損傷部位の周辺に投与される。グリア性瘢痕の位置は、組織の構造又は機能をアッセイすることにより決定されるとおりであり得る。上記のように、組織死によって引き起こされる構造変化をアッセイする非侵襲的方法としては、MRI、CATスキャン又は超音波が挙げられる。機能アッセイは、EEG記録を含み得る。
【００４７】
本発明による特定の態様において、NeuroD1は、NeuroD1をコードするDNA配列を含有する発現ベクターとして投与される。
【００４８】
本発明の態様によれば、NeuroD1をコードする核酸を含むウイルスベクターは、対象の中枢又は末梢神経組織への注射によって、例えば、脳内注射、脊髄注射、及び/又は脳脊髄液若しくは末梢神経神経節への注射によって送達される。代替のウイルスの送達方法としては、限定するものではないが、静脈注射、鼻腔内注入、筋肉内注射、髄腔内注射及び腹腔内注射が挙げられる。
【００４９】
本発明の態様によれば、NeuroD1をコードする核酸を含むウイルスベクターは、対象の脳への定位注入によって送達される。
【００５０】
用語「発現ベクター」とは、NeuroD1をコードする核酸をin vitro又はin vivoで宿主細胞に導入し、ここで核酸が発現してNeuroD1を産生する、組換えビヒクルを指す。特定の実施形態において、配列番号1若しくは配列番号3又は実質的に同一の核酸配列を含む発現ベクターを発現させて、発現ベクターを含有する細胞においてNeuroD1を産生させる。用語「組換え」とは、2つ以上の核酸が連結されており、天然には連結されていることが確認されていない核酸構築物を示すために使用される。発現ベクターとしては、限定するものではないが、プラスミド、ウイルス、BAC、及びYACが挙げられる。特定のウイルス発現ベクターとしては、例示として、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、及びレンチウイルスに由来するものが挙げられる。
【００５１】
本発明の態様により、それを必要とする対象において神経学的状態を治療する方法であって、NeuroD1をコードする核酸を含むウイルスベクターを提供すること、及び対象の中枢神経系又は末梢神経系にウイルスベクターを送達することを含み、それによりウイルスベクターがそれぞれ中枢神経系又は末梢神経系のグリア細胞に感染して、感染グリア細胞を産生し、またそれにより外因性NeuroD1が治療有効なレベルで感染グリア細胞において発現され、ここで、感染細胞におけるNeuroD1の発現は、同じ神経学的状態を有する未治療の対象と比較して対象におけるより多くのニューロンをもたらし、それにより神経学的状態が治療される、方法が提供される。新しいニューロンの生成に加えて、反応性グリア細胞の数もまた低減し、その結果、放出される神経抑制因子の低下、神経炎症の低下、均等に分布される血管の増加がもたらされ、それにより局所環境がニューロン成長又は軸索浸透をより許容しやすくなり、したがって神経学的状態が緩和される。
【００５２】
アデノ随伴ベクターは、本発明の態様による方法において特に有用であり、注射部位で、分裂細胞及び非分裂細胞の両方に感染する。アデノ随伴ウイルス(AAV)は、パルボウイルス科(parvoviridae family)のssDNA動物ウイルスの遍在性であり、非細胞変性の複製能力のないメンバーである。本発明の態様によれば、様々な組換えアデノ随伴ウイルス、例えば血清型1〜9などのうちのいずれかを使用することができる。
【００５３】
「FLEX」スイッチ手法を使用して、本発明の態様により感染細胞においてNeuroD1を発現させる。用語「FLEX」及び「フリップ切除」とは、2対のヘテロタイプの逆平行loxP型組換え部位が、逆方向NeuroD1コード配列のいずれかの側に配置される方法を示すために同義的に使用され、最初にコード配列が反転され続いて2つの部位が切除され、それぞれのオーソログ組換え部位のうちの1つが逆向きとなり、さらなる組換えが不可能となり、安定した反転が達成される。例えば、Schnutgenら、Nature Biotechnology 21:562〜565ページ、2003、及びAtasoyら、J. Neurosci、28:7025〜7030ページ、2008を参照されたい。グリア細胞特異的プロモーターの制御下の部位特異的リコンビナーゼは反応性星状細胞を含むグリア細胞において強く発現するので、NeuroD1もまた反応性星状細胞を含むグリア細胞においても発現される。次いで、NeuroD1の前の終止コドンが組換えから除去されると、構成的プロモーター又はニューロン特異的プロモーターがNeuroD1の高発現を駆動し、反応性星状細胞を機能性ニューロンに変換させる。
【００５４】
特定の態様によれば、1)星状細胞特異的プロモーター、例えばGFAP又はS100b又はAldh1L1などの転写制御下で部位特異的リコンビナーゼをコードするDNA配列を含むアデノ随伴ウイルス発現ベクター、及び2)ユビキタス(構成的)プロモーター又はニューロン特異的プロモーターの転写制御下でNeuroD1をコードするDNA配列を含むアデノ随伴ウイルス発現ベクター、を投与することにより、NeuroD1はそれらの必要のある対象に投与され、部位特異的リコンビナーゼがNeuroD1をコードする逆方向DNA配列を反転してそれによりNeuroD1を発現させることができるまで、NeuroD1をコードするDNA配列は反転され、NeuroD1の発現に対して本来とは異なる方向にある。
【００５５】
部位特異的リコンビナーゼ及びそれらの認識部位は、例えば、認識部位loxP及びlox2272部位を伴うCreリコンビナーゼ、又はFLP-FRT組換え、又はそれらの組合せを含んでいる。
【００５６】
最適な感染を達成するために、1010〜1014個のアデノ随伴ウイルス粒子/mlの濃度、1〜500μlの容積を、0.1〜5μl/分の制御された流速で注入するものとする。
【００５７】
本発明の態様によれば、ユビキタス(構成的)プロモーター又はニューロン特異的プロモーターの転写制御下でNeuroD1をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスベクターであって、部位特異的リコンビナーゼがNeuroD1をコードする逆方向DNA配列を反転してそれによりNeuroD1を発現させることができるまで、NeuroD1をコードするDNA配列は反転され、NeuroD1の発現に対して本来とは異なる方向にあり、部位特異的リコンビナーゼによるリコンビナーゼ活性の部位を更に含む、アデノ随伴ウイルスベクターは、部位特異的リコンビナーゼをコードするアデノ随伴ウイルスと共に、対象の脳への定位注入によって送達される。
【００５８】
本発明の態様によれば、ユビキタス(構成的)プロモーター又はニューロン特異的プロモーターの転写制御下でNeuroD1をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルスベクターであって、部位特異的リコンビナーゼがNeuroD1をコードする逆方向DNA配列を反転してそれによりNeuroD1を発現させることができるまで、NeuroD1をコードするDNA配列は反転され、NeuroD1の発現に対して本来とは異なる方向にあり、部位特異的リコンビナーゼによるリコンビナーゼ活性の部位を更に含む、アデノ随伴ウイルスベクターは、本発明の態様により、CNSにおける正常な血流の途絶の領域又はその部位で、部位特異的リコンビナーゼをコードするアデノ随伴ウイルスと共に、対象の脳への定位注入によって送達される。任意選択により、定位注入の部位は、CNSにおける正常な血流の途絶によって引き起こされるグリア性瘢痕内か、又はその付近である。
【００５９】
本発明の態様によれば、部位特異的リコンビナーゼはCreリコンビナーゼであり、リコンビナーゼ活性の部位は認識部位loxP及びlox2272部位である。
【００６０】
本発明の態様によれば、対象のNeuroD1治療は、治療中に又は治療後にモニタリングされ、治療の進行及び/又は最終転帰がモニタリングされる。ニューロン細胞の統合及び組織微小環境の回復の成功についての治療後アッセイは、正常な電気生理学、血流、組織構造及び機能の回復又はほぼ回復によって診断される。神経機能をアッセイする非侵襲的方法は、EEGを含む。血流は、近赤外分光法及びfMRIによって非侵襲的にアッセイされ得る。組織構造をアッセイする非侵襲的方法としては、MRI、CATスキャン、PETスキャン又は超音波が挙げられる。行動アッセイは、CNS機能の回復について非侵襲的にアッセイするために使用することができる。行動アッセイは元のCNS損傷によって引き起こされる機能の喪失に一致するものとする。例えば、損傷が麻痺を引き起こす場合、患者の運動性及び四肢の器用性を試験するものとする。損傷が発語の喪失又は減速を引き起こす場合、患者の話し言葉によるコミュニケーション能力をアッセイするものとする。NeuroD1治療後の正常な行動の回復は、効果的な神経回路の生成及び統合の成功を示している。これらの方法は、神経機能及び組織の健全性をアッセイするために、単独で又は任意の組合せで使用することができる。治療を評定するアッセイは、NeuroD1治療後の任意の時点で、例えば1日、2日、3日、1週間、2週間、3週間、1か月、又はそれ以降で実施することができる。そのようなアッセイは、所望によりベースライン比較を確立するために、NeuroD1治療の前に実施され得る。
【００６１】
本明細書で使用されている科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。そのような用語は、例示的には、J. Sambrook及びD.W. Russell, Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第3版、2001; F.M. Asubel編、Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols、第5版、2002; B. Albertsら、Molecular Biology of the Cell、第4版、Garland、2002; D.L. Nelson及びM.M. Cox、Lehninger Principles of Biochemistry、第4版、W.H. Freeman & Company、2004; Engelke, D.R.、 RNA Interference(RNAi): Nuts and Bolts of RNAi Technology、DNA Press LLC、Eagleville、PA、2003; Herdewijn, p.(編)、 Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications、Methods in Molecular Biology、Humana Press、2004; A. Nagy、M. Gertsenstein、K. Vintersten、R. Behringer、Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第3版、12月15日、2002、ISBN-10:0879695919; Kursad Turksen(編)、 Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols in Methods in Molecular Biology、2002; 185、Human Press: Current Protocols in Stem Cell Biology、ISBN:9780470151808を含めた、様々な標準の参考文献の文脈で定義され使用されていることが確認される。
【００６２】
単数形の用語「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「the」は、特に明記しない限り、又は文脈が明らかに他のことを示さない限り、限定することは意図しておらず、複数の指示物を含む。
【００６３】
用語「NeuroD1タンパク質」とは、胎児性脳の発達及び成体の神経新生に関与するbHLH前神経転写因子を指し、Cho, J.H.ら、Mol, Neurobiol.、30:35〜47ページ、2004; Kuwabara, T.ら、Nature Neurosci.、12:1097〜1105ページ、2009;及びGao, Z.ら、Nature Neurosci.、12:1090〜1092ページ、2009を参照されたい。NeuroD1は、主に神経系において、発生の後期に発現され、神経分化、成熟及び生存に関与している。
【００６４】
用語「NeuroD1タンパク質」は、本明細書で配列番号2として識別されているヒトNeuroD1タンパク質、及び本明細書で配列番号4として識別されているマウスNeuroD1タンパク質を包含している。配列番号2及び配列番号4のNeuroD1タンパク質に加えて、用語「NeuroD1タンパク質」とは、NeuroD1タンパク質のバリアント、例えば、配列番号2及び配列番号4のバリアントなどを包含しており、これらは本発明の方法に含まれ得る。本明細書で使用される場合、用語「バリアント」とは、基準NeuroD1タンパク質、例えば配列番号2又は配列番号4と比較して、そのアミノ酸配列中に1つ以上の変化をそれぞれ含む、天然に存在する遺伝的変異及び組換えにより調製した変異を指す。そのような変化は、1つ以上のアミノ酸残基がアミノ酸の置換、付加又は欠失により修飾されているものを含む。用語「バリアント」は、例えば哺乳動物及びトリのNeuroD1、例えば限定するものではないが、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ、トリ、家禽動物及びげっ歯動物、例えば限定するものではないが、マウス及びラット由来のNeuroD1オルソログを含む、ヒトNeuroD1のオルソログを包含する。非限定的な例において、配列番号4のアミノ酸配列として本明細書で例示されているマウスNeuroD1は、ヒトNeuroD1のオルソログである。
【００６５】
好ましいバリアントは、配列番号2又は配列番号4に対して少なくとも75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有する。
【００６６】
変異は、標準的な分子生物学技術、例えば、部位特異的突然変異誘発及びPCR媒介変異誘発などを使用して導入することができる。NeuroD1タンパク質の機能特性を変えることなく、1つ以上のアミノ酸変異を導入できることは、当業者には認識されよう。例えば、1つ以上のアミノ酸の置換、付加又は欠失は、配列番号2又は配列番号4のNeuroD1タンパク質の機能特性を変えることなく行うことができる。
【００６７】
保存的アミノ酸置換は、NeuroD1タンパク質で行われ、NeuroD1タンパク質バリアントを産生することができる。保存的アミノ酸置換は、1つのアミノ酸の、類似の特徴を有する別のアミノ酸への技術的に認められた置換である。例えば、それぞれのアミノ酸は、以下の特徴:電気陽性、電気陰性、脂肪族、芳香族、極性、疎水性、及び親水性のうちの1つ以上を有すると説明することができる。保存的置換は、特定の構造特性又は機能特性を有する1つのアミノ酸を同じ特徴を有する別のアミノ酸に置換することである。酸性アミノ酸としてはアスパラギン酸、グルタミン酸が挙げられ、塩基性アミノ酸としてはヒスチジン、リジン、アルギニンが挙げられ、脂肪族アミノ酸としてはイソロイシン、ロイシン、バリンが挙げられ、芳香族アミノ酸としてはフェニルアラニン、グリシン、チロシン及びトリプトファンが挙げられ、極性アミノ酸としてはアスパラギン酸、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、及びチロシンが挙げられ、疎水性アミノ酸としてはアラニン、システイン、フェニルアラニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、プロリン、バリン、及びトリプトファンが挙げられ、保存的置換としては各グループ内のアミノ酸間の置換が挙げられる。アミノ酸はまた、相対的なサイズの観点からも説明することができ、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グリシン、アスパラギン、プロリン、トレオニン、セリン、バリンはすべて典型的に小さいと考えられる。
【００６８】
NeuroD1バリアントは、限定するものではないが、アルファ-アミノ酪酸、シトルリン、カナバニン、シアノアラニン、ジアミノ酪酸、ジアミノピメリン酸、ジヒドロキシフェニルアラニン、ジエンコル酸(djenkolic acid)、ホモアルギニン、ヒドロキシプロリン、ノルロイシン、ノルバリン、3-ホスホセリン、ホモセリン、5-ヒドロキシトリプトファン、1-メチルヒスチジン、3-メチルヒスチジン、及びオルニチンを例示的に含む、合成アミノ酸類似体、アミノ酸誘導体及び/又は非標準アミノ酸を含み得る。
【００６９】
2つのアミノ酸配列又は2つの核酸配列の同一性パーセントを決定するため、配列を最適な比較目的で並べる(例えば、第2のアミノ酸配列又は核酸配列との最適なアライメントのために、第1のアミノ酸配列又は核酸配列にギャップを導入することができる)。次いで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置のアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第1の配列中のある位置が、第2の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドで占められている場合、その分子はその位置で同一である。2つの配列間の同一性パーセントは、配列が共有する同一位置の数の関数である(すなわち、同一性%=同一重複位置の数/位置の総数×100%)。一実施形態において、2つの配列は同じ長さである。
【００７０】
2つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成することもできる。2つの配列比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な好ましい例は、Karlin及びAltschul、1990、PNAS 87:2264 2268ページ、Karlin and Altschul改編、1993、PNAS. 90:5873 5877ページのアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、Altschulら、1990、J. Mol. Biol. 215:403ページのNBLAST及びXBLASTのプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTヌクレオチドプログラムパラメーターセット、例えばスコア=100、ワード長=12を用いて実施して、本発明の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得る。
【００７１】
BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラムパラメーターセット、例えばスコア50、ワード長=3で実施して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得る。比較目的でギャップのあるアライメントを得るためには、Altschulら、1997、Nucleic Acids Res. 25:3389 3402ページに記載されているGapped BLASTを利用する。或いは、PSI BLASTを使用して、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施する。BLAST、Gapped BLAST及びPSI Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムの(例えば、XBLAST及びNBLASTの)デフォルトパラメーターを使用する(例えば、NCBIウェブサイトを参照されたい)。
【００７２】
配列比較に利用される数学的アルゴリズムの非限定的な別の好ましい例は、Myers及びMiller、1988、CABIOS 4:11 17のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、GCG配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるALIGNプログラム(バージョン2.0)に組み込まれている。アミノ酸配列の比較にALIGNプログラムを利用する場合、PAM120加重残基表、ギャップ長ペナルティ12、及びギャップペナルティ4を使用する。
【００７３】
2つの配列間の同一性パーセントは、ギャップを含め又は含めずに、上記のものと同様の技術を使用して決定する。同一性パーセントの計算においては、典型的には、正確な一致のみがカウントされる。
【００７４】
用語「NeuroD1タンパク質」は、本発明の方法及び組成物で作動可能な、NeuroD1タンパク質の断片、例えば、配列番号2及び配列番号4の断片、並びにそれらの変異体を包含する。
【００７５】
NeuroD1タンパク質及び核酸は、生物の脳又はNeuroD1を発現する細胞株の細胞などの自然源から単離することができる。或いは、NeuroD1タンパク質又は核酸は、例えばin vitro又はin vivoで発現構築物を使用する発現により、組換え的に生成され得る。またNeuroD1タンパク質及び核酸は、周知の方法によっても合成することができる。
【００７６】
本発明の方法及び組成物に含まれるNeuroD1は、好ましくは、組換え核酸技術を使用して産生される。組換えNeuroD1産生には、NeuroD1をコードするDNA配列を包含する組換え発現ベクターを宿主細胞に導入することが含まれる。
【００７７】
本発明の実施形態による、NeuroD1を産生するために宿主細胞に導入されるNeuroD1をコードする核酸配列は、配列番号2、配列番号4、又はそれらの変異体をコードしている。
【００７８】
本発明の態様によれば、配列番号1として本明細書で識別される核酸配列は、配列番号2をコードし、発現ベクターに含まれ、発現してNeuroD1を産生する。本発明の態様によれば、配列番号3として本明細書で識別される核酸配列は、配列番号4をコードし、発現ベクターに含まれ、発現してNeuroD1を産生する。
【００７９】
遺伝子コードの縮重の性質により、配列番号1及び3と実質的に同一の核酸配列がNeuroD1及びNeuroD1のバリアントをコードし、そのような代替核酸が発現ベクターに含まれ、発現してNeuroD1及びNeuroD1のバリアントを産生し得ることは理解されよう。NeuroD1タンパク質をコードする核酸の断片を使用して、NeuroD1タンパク質の断片を産生できることは、当業者には理解されよう。
【００８０】
発現ベクターは、目的のポリペプチドをコードするセグメントの転写を提供する1つ以上の調節エレメントに作動可能に連結された目的のポリペプチドをコードするセグメントを含む核酸を含有する。本明細書で使用される場合の用語「作動可能に連結された」とは、第2の核酸との機能的な関係にある核酸を指す。用語「作動可能に連結された」は、2つ以上の核酸分子、例えば、転写される核酸及び調節エレメントなどの機能的接続を包含する。本明細書で使用される場合の用語「調節エレメント」とは、作動可能に連結された核酸の発現のいくつかの局面を調節するヌクレオチド配列を指す。例示的な調節エレメントとしては、エンハンサー、例えば、限定するものではないが、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント(WPRE)、内部リボソーム進入部位(IRES)又は2Aドメイン、イントロン、複製起点、ポリアデニル化シグナル(pA)、プロモーター、転写終結配列、並びに作動可能に連結された核酸配列の複製、転写、転写後プロセシングに寄与する上流調節ドメインなどを含む。当業者は、ルーチンの実験以外用いることなく、発現ベクター中のこれら及び他の調節エレメントを選択及び使用することができる。
【００８１】
本明細書で使用される場合の用語「プロモーター」とは、NeuroD1をコードする核酸配列などの、転写される核酸配列に作動可能に連結されたDNA配列を指す。プロモーターは、一般的に、転写される核酸配列の上流に配置され、RNAポリメラーゼ及び他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。特定の実施形態においては、プロモーターは、一般的に、所望の分子を生成するように転写される核酸配列の上流に配置され、RNAポリメラーゼ及び他の転写因子による特異的結合のための部位を提供する。
【００８２】
当業者により認識されるように、遺伝子の5'非コード領域を単離し、作動可能に連結された核酸の発現を駆動するためのプロモーターとしてその全体を使用することができる。或いは、5'非コード領域の一部を単離し、作動可能に連結された核酸の発現を駆動するために使用することができる。一般に、遺伝子の約500〜6000bpの5'非コード領域を使用し、作動可能に連結された核酸の発現を駆動する。任意選択により、作動可能に連結された核酸の発現を駆動するのに必要とされる最小量の5'非コード領域を含有する遺伝子の5'非コード領域の一部を使用する。作動可能に連結された核酸の発現を駆動するための遺伝子の5'非コード領域の指定した部分の能力を決定するアッセイは、当技術分野において周知である。
【００８３】
本明細書に記載の方法によってNeuroD1の発現を駆動するために使用される特定のプロモーターは、発現ベクターが移入される生物の多くの、ほとんどの、又はすべての細胞型において発現を駆動する、「ユビキタス」プロモーター又は「構成的」プロモーターである。NeuroD1の発現に使用することができるユビキタスプロモーターの非限定的な例は、サイトメガロウイルスプロモーター、シミアンウイルス40(SV40)初期プロモーター、ラウス肉腫(rous sarcoma)ウイルスプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、ベータアクチンプロモーター、グリセルアルデヒド3-リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース調節タンパク質78プロモーター、グルコース調節タンパク質94プロモーター、熱ショックタンパク質70プロモーター、ベータキネシンプロモーター、ROSAプロモーター、ユビキチンBプロモーター、真核生物開始因子4A1プロモーター及び伸長因子Iプロモーターであり、これらはすべて当技術分野で周知であり、またルーチンな方法を使用して主要供給源から単離するか、又は市販の供給源から得ることができる。プロモーターは、完全に単一の遺伝子に由来し得るか、又は複数の遺伝子に由来した部分を有してキメラ的であってもよい。
【００８４】
調節配列の組合せは、発現ベクターに含まれ、NeuroD1の発現を駆動するように使用され得る。NeuroD1の発現を駆動するように発現ベクターに含まれる非限定的な例は、サイトメガロウイルスCMV初期エンハンサーエレメントとニワトリベータアクチンプロモーターとを組み合わせたCAGプロモーターである。
【００８５】
本明細書に記載の方法によりNeuroD1の発現を駆動するように使用される特定のプロモーターは、グリア細胞、特に星状細胞及び/又はNG2細胞において優先的に発現を駆動するものである。こうしたプロモーターは、「星状細胞特異的」及び/又は「NG2細胞特異的」プロモーターと称する。
【００８６】
星状細胞特異的プロモーターの非限定的な例は、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)プロモーター及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー、メンバーL1(Aldh1L1)プロモーターである。ヒトGFAPプロモーターは、配列番号6として本明細書に示されている。マウスAldh1L1プロモーターは、配列番号7として本明細書に示されている。
【００８７】
NG2細胞特異的プロモーターの非限定的な例は、ニューロン-グリア抗原2(NG2)としても知られている、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4遺伝子のプロモーターである。ヒトNG2プロモーターは、配列番号8として本明細書に示されている。
【００８８】
本明細書に記載の方法によりNeuroD1の発現を駆動するように使用される特定のプロモーターは、反応性グリア細胞、特に反応性星状細胞及び/又は反応性NG2細胞において優先的に発現を駆動するものである。こうしたプロモーターは、「反応性星状細胞特異的」及び/又は「反応性NG2細胞特異的」プロモーターと称する。
【００８９】
「反応性星状細胞特異的」プロモーターの非限定的な例は、リポカリン2(lcn2)遺伝子のプロモーターである。マウスlcn2プロモーターは、配列番号5として本明細書に示されている。
【００９０】
ユビキタスプロモーター及び細胞型特異的プロモーターの相同体及び変異体は、NeuroD1の発現に使用することができる。
【００９１】
プロモーター相同体及びプロモーターバリアントは、本発明によりNeuroD1を発現する発現ベクターに含まれ得る。用語「プロモーター相同体」及び「プロモーターバリアント」とは、本明細書に記載されたものと比較して、作動可能に連結されたNeuroD1をコードする核酸に対して所望の発現のタイプ、例えば、NeuroD1の細胞型特異的発現又はNeuroD1のユビキタス発現を付与するための、実質的に同様の機能特性を有するプロモーターを指す。例えば、プロモーター相同体又はバリアントは、GFAP、S100b、Aldh1L1、NG2、lcn2及びCAGプロモーターと比較して、実質的に類似の機能特性を有し、作動可能に連結されたNeuroD1をコードする核酸に対して細胞型特異的発現を付与する。
【００９２】
1つ以上の核酸変異を、所与のプロモーターの機能特性を変えることなく導入できることは、当業者には認識されよう。変異は、標準の分子生物学的技術、例えば、部位特異的変異誘発及びPCR媒介変異誘発などを使用して導入し、プロモーターバリアントを作製することができる。本明細書で使用される場合、用語「プロモーターバリアント」とは、限定するものではないが、GFAP、S100b、AldhlL1、NG2、lcn2及びpCAGプロモーターなどの基準プロモーターの単離された自然発生変異又は組換え調製変異のいずれかを指す。
【００９３】
他の種由来のプロモーターが機能性であることは、例えば、マウスAldh1L1プロモーターがヒト細胞において機能的であることは、当技術分野では公知である。他の種由来の相同体及び相同プロモーターは、当技術分野で公知のバイオインフォマティクスツールを使用して同定することができ、例えば、Xuanら、2005、Genome Biol 6:R72; Zhaoら、2005、Nucl Acid Res 33:D103-107ページ;及びHaleesら, 2003、Nucl. Acids. Res. 2003 31: 3554〜3559ページを参照されたい。
【００９４】
構造的に、NeuroD1の細胞型特異的プロモーター及び/又はユビキタスプロモーターの相同体及びバリアントは、基準の発生的に調節されたプロモーター及び/又はユビキタスプロモーターに対して、少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又はそれ以上の核酸配列同一性を有し、RNAポリメラーゼに対する結合部位を含み、任意選択により、転写因子に対する1つ以上の結合部位を含む。
【００９５】
配列番号1又は配列番号3と実質的に同一である核酸配列は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1又は配列番号3にハイブリダイズすることができる相補的核酸配列を有することを特徴とする。
【００９６】
NeuroD1をコードする1つ以上の核酸に加えて、追加のタンパク質をコードする1つ以上の核酸配列を発現ベクターに含めることができる。例えば、そのような追加のタンパク質としては、非NeuroD1タンパク質、例えば、限定するものではないが、ベータ-ガラクトシダーゼ、緑色蛍光タンパク質、及び抗生物質耐性レポーターを含む、レポーターなどが挙げられる。
【００９７】
特定の実施形態において、組換え発現ベクターは、少なくとも配列番号2のNeuroD1、配列番号2と少なくとも95%の同一性を有するタンパク質、又は配列番号1と実質的に同一の核酸配列によってコードされているタンパク質をコードする。
【００９８】
特定の実施形態において、組換え発現ベクターは、少なくとも配列番号4のNeuroD1、配列番号4と少なくとも95%の同一性を有するタンパク質、又は配列番号2と実質的に同一の核酸配列によってコードされているタンパク質をコードする。
【００９９】
配列番号9は、NeuroD1をコードする核酸に作動可能に連結されているCAGプロモーターを含み、EGFP及びエンハンサー、WPREをコードする核酸配列を更に含む核酸の一例である。IRESは、NeuroD1をコードする核酸とEGFPをコードする核酸を分離する。配列番号9は、NeuroD1及びレポーター遺伝子EGFPを発現させるために発現ベクターに挿入される。任意選択により、IRES及びEGFPをコードする核酸は除去され、残りのCAGプロモーター及び作動可能に連結されたNeuroD1をコードする核酸が、NeuroD1の発現のために発現ベクターに挿入される。WPRE又は別のエンハンサーが、任意選択により含まれる。
【０１００】
任意選択により、レポーター遺伝子がNeuroD1をコードする組換え発現ベクターに含まれる。レポーター遺伝子を含めることで、組換え発現ベクターからNeuroD1を発現させる代用マーカーの役割を果たすペプチド又はタンパク質を産生することができる。本明細書で使用される場合の用語「レポーター遺伝子」とは、例えば、化学発光、蛍光、比色反応、抗体結合、誘導マーカー及び/又はリガンド結合アッセイにより、発現された際に容易に検出可能な遺伝子を指す。例示的なレポーター遺伝子としては、限定するものではないが、緑色蛍光タンパク質(GFP)、増強緑色蛍光タンパク質(eGFP)、黄色蛍光タンパク質(YFP)、増強黄色蛍光タンパク質(eYFP)、シアン蛍光タンパク質(CFP)、増強シアン蛍光タンパク質(eCFP)、青色蛍光タンパク質(BFP)、増強青色蛍光タンパク質(eBFP)、MmGFP(Zernicka-Goetzら、Development、124:1133〜1137ページ、1997)、dsRed、ルシフェラーゼ及びベータ−ガラクトシダーゼ(lacZ)が挙げられる。
【０１０１】
例えば、宿主細胞内の遺伝物質によってコードされている所望のタンパク質の一過性発現又は安定的発現のために、遺伝物質をレシピエント宿主細胞に導入する方法は、「トランスフェクション」と呼ばれる。トランスフェクション技術は当技術分野で周知であり、限定するものではないが、エレクトロポレーション、「遺伝子銃」技術としても知られている粒子加速形質転換、リポソーム介在トランスフェクション、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈介在トランスフェクション、DEAEデキストラン介在トランスフェクション、マイクロインジェクション、ポリエチレングリコール介在トランスフェクション、熱ショック介在トランスフェクション、及びウイルス介在トランスフェクションが挙げられる。本明細書に記載しているように、ウイルス介在トランスフェクションは、ウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス及びレンチウイルスに由来するものを使用して達成することができる。
【０１０２】
任意選択により、宿主細胞はex-vivoでトランスフェクトされ、次いで宿主生物に再導入される。例えば、細胞又は組織を対象から取り出し、NeuroD1をコードする発現ベクターでトランスフェクトし、次いで対象に戻すことができる。
【０１０３】
グリア細胞をニューロンに変換するよう宿主グリア細胞で外因性NeuroD1を発現させるために、NeuroD1又はその機能的断片をコードする核酸を含む組換え発現ベクターをin vitro又はin vivoで宿主グリア細胞に導入することは、様々なトランスフェクション方法論のうちのいずれかによって達成される。
【０１０４】
グリア細胞をニューロンに変換するための宿主グリア細胞における外因性NeuroD1の発現は、任意選択により、NeuroD1又はその機能的断片をコードするmRNAをin vitro又はin vivoで宿主グリア細胞に導入することによって達成される。
【０１０５】
グリア細胞をニューロンに変換するための宿主グリア細胞における外因性NeuroD1の発現は、任意選択により、NeuroD1タンパク質をin vitro又はin vivoで宿主グリア細胞に導入することにより達成される。これらの技術及び他の技術の詳細は、例えば、J. Sambrook及びD.W. Russell、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第3版、2001; F.M. Ausubel編、Short Protocols in Molecular Biology, Current Protocols、第5版、2002;及びEngelke, D.R.、RNA Interference(RNAi): Nuts and Bolts of RNAi Technology、DNA Press LLC、Eagleville、PA、2003に記載されているように当技術分野において公知である。
【０１０６】
NeuroD1若しくはその機能的断片をコードする核酸を含む発現ベクター、NeuroD1若しくはその機能的断片をコードするmRNA、及び/又はNeuroD1タンパク質、完全長若しくはその機能的断片は、任意選択により、in vitro又はin vivoで宿主細胞に導入するための担体と会合される。
【０１０７】
特定の態様において、担体は、粒子状担体、例えば、リポソーム、ミセル、単層若しくは多層小胞を含む脂質粒子;ポリマー粒子、例えばヒドロゲル粒子、ポリグリコール酸粒子又はポリ乳酸粒子;無機粒子、例えばリン酸カルシウム粒子、例えば米国特許第5,648,097号に記載されているもの;及び無機/有機粒子状担体、例えば米国特許第6,630,486号に記載されているものである。
【０１０８】
粒子状担体は、脂質粒子、ポリマー粒子、無機粒子、及び無機/有機粒子の中から選択することができる。また粒子タイプの混合物も、粒子状の薬学的に許容される担体として含まれ得る。
【０１０９】
粒子状担体は、典型的には、粒子が約1nm〜10ミクロンの範囲の平均粒径を有するように製剤化される。特定の態様において、粒子状担体は、粒子が約1nm〜100nmの範囲の平均粒径を有するように製剤化される。
【０１１０】
リポソーム及びそれらの調製及び使用に関する方法のさらなる説明は、Liposomes: A Practical Approach(The Practical Approach Series、264), V. P. Torchilin及びV. Weissig(編)、Oxford University Press、第2版、2003に見出すことができる。ナノ粒子のさらなる態様は、S.M. Moghimiら、FASEB J. 2005、19、311〜30ページに記載されている。
【０１１１】
組換え発現ベクターを使用するNeuroD1の発現は、真核又は原核宿主細胞発現系、例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞、酵母細胞、細菌細胞、又は当技術分野で認識されている任意の他の単細胞又は多細胞生物への発現ベクターの導入によって達成される。宿主細胞は、任意選択により、初代細胞又は不死化誘導細胞である。不死化細胞は、少なくとも5回の複製継代の間in vitroで維持され得る細胞である。
【０１１２】
組換え発現ベクターを含有する宿主細胞は、NeuroD1が産生される条件下で維持される。宿主細胞は、例えばCelis、Julio編、1994、Cell Biology Laboratory Handbook、Academic Press、N.Y.に記載されているような公知の細胞培養技術を使用して培養、維持され得る。特定の栄養素に関する培地製剤、酸素、張力、二酸化炭素及び血清レベル低減を含む、これらの細胞に対する様々な培養条件は、当業者によって選択及び最適化され得る。
【０１１３】
本発明の態様によれば、NeuroD1をコードする核酸を含む組換え発現ベクターは、対象のグリア細胞に導入される。グリア細胞における外因性NeuroD1の発現は、グリア細胞をニューロンに「変換」する。
【０１１４】
本発明の態様によれば、NeuroD1又はその機能的断片をコードする核酸を含む組換え発現ベクターは、対象の星状細胞に導入される。グリア細胞における外因性NeuroD1の発現は、星状細胞をニューロンに「変換」する。
【０１１５】
本発明の態様によれば、NeuroD1又はその機能的断片をコードする核酸を含む組換え発現ベクターは、対象の反応性星状細胞に導入される。反応性星状細胞における外因性NeuroD1又はその機能的断片の発現は、反応性星状細胞をニューロンに「変換」する。
【０１１６】
本発明の態様によれば、NeuroD1又はその機能的断片をコードする核酸を含む組換え発現ベクターは、対象のNG2細胞に導入される。NG2細胞における外因性NeuroD1又はその機能的断片の発現は、NG2細胞をニューロンに「変換」する。
【０１１７】
外因性NeuroD1又はその機能的断片をコードする核酸を含む組換え発現ベクターを導入した後の外因性NeuroD1の発現の検出は、限定するものではないが、NeuroD1を検出するイムノアッセイ、NeuroD1核酸を検出する核酸アッセイ、及び外因性NeuroD1と共発現されるレポーター遺伝子の検出を含む様々な標準方法論のうちのいずれかを使用して達成される。
【０１１８】
用語「変換する」及び「変換(された)」は、グリア細胞、星状細胞又は反応性星状細胞表現型のニューロン表現型への変化をもたらす、NeuroD1又はその機能的断片の発現の効果を説明するために本明細書で使用される。同様に、語句「NeuroD1変換ニューロン」及び「変換ニューロン」は、結果として生じたニューロン表現型を有する、外因性NeuroD1タンパク質又はその機能的断片を含む細胞を指定するために本明細書で使用される。
【０１１９】
用語「表現型」とは、本明細書で言及した細胞の周知の検出可能な特徴を指す。ニューロン表現型は、限定するものではないが、ニューロン形態、1つ以上のニューロンマーカーの発現、ニューロンの電気生理学的特徴、シナプス形成及び神経伝達物質の放出のうちの1つ以上であり得る。例えば、ニューロン表現型は、限定するものではないが、ニューロンの特徴的な形態学的側面、例えば、樹状突起、軸索及び樹状突起棘の存在；特徴的なニューロンタンパク質の発現及び分布、例えば、シナプス点(synaptic puncta)におけるシナプスタンパク質の存在、樹状突起におけるMAP2の存在;及び特徴的な電気生理学的サイン、例えば、自発型及び誘発型シナプス事象を包含する。
【０１２０】
さらなる例において、グリア表現型、例えば星状細胞表現型及び反応性星状細胞表現型は、限定するものではないが、一般的に「星形」と言われる形態などの星状細胞及び反応性星状細胞の特徴的な形態学的側面;及び特徴的な星状細胞及び反応性星状細胞タンパク質発現、例えばグリア細胞繊維性酸性タンパク質(GFAP)の存在を包含する。
【０１２１】
用語「核酸」とは、一本鎖、二本鎖、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む任意の形態の複数のヌクレオチドを有するRNA又はDNA分子を指す。用語「ヌクレオチド配列」とは、核酸の一本鎖形態のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの順序を意味する。
【０１２２】
用語「NeuroD1核酸」とは、単離されたNeuroD1核酸分子を指し、配列番号1若しくは配列番号3に示したDNA配列、又はその相補体に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、又は99%の同一性を有する配列を有する単離されたNeuroD1核酸又はその断片、或いは、配列番号1若しくは配列番号3として示した核酸、その相補体に対して高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列を有する単離されたDNA分子又はその断片を包含する。
【０１２３】
配列番号3の核酸は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で配列番号1に記載の核酸にハイブリダイズする配列を有する単離されたDNA分子の例である。NeuroD1核酸の断片は、NeuroD1核酸を含む本発明の態様において作動可能なNeuroD1核酸の任意の断片である。
【０１２４】
標的NeuroD1 mRNA又はcDNAにハイブリダイズすることができる核酸プローブ又はプライマーは、NeuroD1タンパク質をコードするmRNA又はcDNAの検出及び/又は定量に使用できる。核酸プローブは、少なくとも10、15、30、50又は100ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下でNeuroD1 mRNA若しくはcDNA又はその相補的配列に特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。核酸プライマーは、少なくとも10、15又は20ヌクレオチド長であり、ストリンジェントな条件下でmRNA若しくはcDNA又はその相補的配列に特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドであり得る。
【０１２５】
用語「相補体」及び「相補的」とは、ヌクレオチド間のワトソン-クリック塩基対形成を指し、特に、2つの水素結合によりアデニン残基に連結されているチミン又はウラシル残基と、3つの水素結合により連結されているシトシン及びグアニン残基で、互いに水素結合されているヌクレオチドを指す。一般に、核酸は、特定の第2のヌクレオチド配列に対してある「相補性パーセント」を有すると記載されるヌクレオチド配列を含む。例えば、ヌクレオチド配列は、特定の第2のヌクレオチド配列に対して80%、90%、又は100%の相補性を有し、その配列の10ヌクレオチド中の8、10ヌクレオチド中の9又は10ヌクレオチド中の10のヌクレオチドが特定の第2のヌクレオチド配列に相補的であることを示している。例えば、ヌクレオチド配列3'-TCGA-5'は、ヌクレオチド配列5'-AGCT-3'に100%相補的である。更に、ヌクレオチド配列3'-TCGA-は、ヌクレオチド配列5'-TTAGCTGG-3'のある領域に対して100%相補的である。
【０１２６】
用語「ハイブリダイゼーション」及び「ハイブリダイズする」とは、相補的な核酸の対形成及び結合を指す。ハイブリダイゼーションは、当技術分野で周知のように、2つの核酸の間で、核酸の相補性の程度、核酸の融解温度、Tm、及びハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーなどの要因に応じて様々な程度で生じる。用語「ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシー」とは、温度、イオン強度、並びに特定の一般的な添加物、例えばホルムアミド及びデンハルト溶液などに関するハイブリダイゼーション媒体の組成の条件を指す。
【０１２７】
特定の核酸に関連する特定のハイブリダイゼーション条件の決定はルーチンであり、例えば、J. Sambrook及びD.W. Russell、Molecular Cloning: A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、第3版、2001;及びF.M. Ausubel編、Short Protocols in Molecular Biology、Current Protocols、第5版、2002に記載されているように当技術分野において周知である。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、実質的に相補的な核酸だけをハイブリダイゼーションさせる条件である。典型的には、約85〜100%の相補性を有する核酸は高度に相補的であると考えられ、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。中間ストリンジェンシー条件は、中間の相補性、約50〜84%の相補性を有する核酸、並びに高い程度の相補性を有する核酸がハイブリダイズする条件によって例示される。反対に、低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、低い程度の相補性を有する核酸がハイブリダイズする条件である。
【０１２８】
用語「特異的ハイブリダイゼーション」及び「特異的にハイブリダイズする」とは、試料中の標的核酸以外の核酸に実質的にハイブリダイゼーションすることのない、特定の核酸の標的核酸へのハイブリダイゼーションを指す。
【０１２９】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー及び洗浄条件は、当業者に周知のように、プローブ及び標的のTm並びにハイブリダイゼーション及び洗浄条件のイオン強度を含む、いくつかの要因に依存する。所望のハイブリダイゼーションストリンジェンシーを達成するハイブリダイゼーション及び条件は、例えば、Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press、2001;及びAusubel, F.ら(編)、Short Protocols in Molecular Biology、Wiley、2002に記載されている。
【０１３０】
高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件の例は、約100ヌクレオチド長を超える核酸を、6×SSC、5×デンハルト溶液、30%ホルムアミド、及び100マイクログラム/mlの変性サケ精子を含有する溶液中で、37℃一晩ハイブリダイゼーション後、0.1×SSC及び0.1%SDSの溶液中で60℃で、15分間、洗浄するものである。SSCは、0.15M NaCl/0.015M クエン酸Naである。デンハルト溶液は、0.02%ウシ血清アルブミン/0.02% FICOLL/0.02%ポリビニルピロリドンである。高ストリンジェント条件下で、配列番号1及び配列番号3は、実質的に同一の標的の相補体にハイブリダイズし、無関係の配列にはハイブリダイズしない。
【０１３１】
本発明の態様により、それらを必要とする対象における神経学的状態を治療する方法であって、治療有効量のNeuroD1を対象の中枢神経系又は末梢神経系のグリア細胞に送達することを含み、グリア細胞における治療有効量のNeuroD1が、同じ神経学的状態を有する未治療の対象と比較して、対象においてより多くのニューロンをもたらし、それにより神経学的状態が治療される、方法が提供される。
【０１３２】
また、反応性グリア細胞のニューロンへの変換は、反応性グリア細胞に関連した神経炎症及び神経抑制因子を低減し、それによりグリア瘢痕組織がニューロンをより成長させる結果、神経学的状態が緩和される。
【０１３３】
本明細書で使用される場合の用語「神経学的状態」とは、追加のニューロンによって緩和され、改善され、又は予防される対象の中枢神経系及び/又は末梢神経系の任意の状態を指す。ニューロンの喪失若しくは阻害及び/又はニューロン機能の喪失若しくは阻害をもたらす損傷又は疾患は、本発明の態様による方法によって治療するための神経学的状態である。
【０１３４】
グルタミン酸作動性ニューロンの喪失若しくは阻害及び/又はグルタミン作動性ニューロン機能の喪失若しくは阻害をもたらす損傷又は疾患は、本発明の態様による方法によって治療するための神経学的状態である。他のタイプのニューロン、例えば、GABA作動性、コリン作動性、ドーパミン作動性、ノルエピネフリン作動性、又はセロトニン作動性のニューロンなどの喪失又は阻害も、類似の方法で治療され得る。
【０１３５】
したがって、例えば、ニューロンの喪失若しくは阻害、及び/又は、限定するものではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、脳卒中、てんかん、身体損傷、例えば脳損傷又は脊髄損傷、及び腫瘍を含むニューロン機能の喪失若しくは阻害をもたらす損傷又は疾患は、本発明の態様による方法によって治療するための神経学的状態である。
【０１３６】
本明細書で使用される場合の用語「治療有効量」とは、治療すべき神経学的状態の症状又は兆候を緩和、改善又は予防するのに有効な本発明の組成物の量を意味するものとする。特定の実施形態において、治療有効量は、神経学的状態の兆候及び/又は症状を有する対象において有用な効果を有する量である。
【０１３７】
本明細書で使用される場合の用語「治療する(treat)」、「治療(treatment)」、「治療すること(treating)」及び「NeuroD1治療」又は文法上の同意語は、神経学的状態、神経学的状態の症状又は兆候を緩和、阻害又は改善し、また神経学的状態の症状又は兆候を予防することを意味し、限定するものではないが、治療的及び/又は予防的な処置を含む。
【０１３８】
神経学的状態の兆候及び症状は、そのような兆候及び症状の検出及び評価の方法と共に当技術分野では周知である。
【０１３９】
対象の神経学的状態の療法の組合せは、本発明の態様に従って施される。
【０１４０】
特定の態様によれば、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療するために対象に投与される追加の医薬剤又は療法的治療としては、例えば、限定するものではないが、血栓の除去、血流の促進、1つ以上の抗炎症剤の投与、1つ以上の酸化防止剤の投与、及び興奮毒性を低減するのに有効な1つ以上の薬剤の投与などの治療が挙げられる。
【０１４１】
用語「対象」とは、ヒト、及び非ヒト哺乳動物、例えば、限定するものではないが、非ヒト霊長類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ、ブタ及びげっ歯類、例えば限定するものではないが、マウス及びラット、並びに非哺乳動物、例えば限定するものではないが、鳥類、家禽、爬虫類、両生類も指す。
【０１４２】
本発明の組成物及び方法の実施形態を以下の実施例において説明する。これらの実施例は例示目的で提供されており、本発明の組成物及び方法の範囲に対する制限とは考えないものとする。
【０１４３】
[実施例]
材料及び方法
脳卒中のマウスモデル及びウイルス注射
野生型(WT)FVB/NJ及びGFAP-GFPトランスジェニックマウスを、本研究で記載する実験の大部分に対して用いた。GFAP-GFPトランスジェニックマウスは、Zhuo, L.ら、1997、Dev Biol 187、36〜42ページに記載されているJackson Laboratory[FVB/N-Tg(GFAPGFP)14Mes/J]から購入し、FVB/NJマウス(Jackson Laboratory)と交配した。エンドセリン-1(1-31)を、Horie, N.ら、2008、J. Neurosci. Methods 173、286〜290ページ;及びRoome, R.B.ら、2014、J. Neurosci. Methods、233、34〜44ページに記載されているように、成体WT FVB/NJ又はGFAPA-GFPトランスジェニックマウス(28〜40g、5〜10ヶ月齢)の運動皮質に注射し、局所的な虚血性損傷を生じさせた。
【０１４４】
ケタミン/キシラジン(100mg/kgケタミン、12mg/kgキシラジン)の腹腔内注射による麻酔下で、マウスを定位固定装置に入れ、正中切開により頭蓋骨及び前頂部を露出させた。約1mmの小さな孔を頭蓋骨に前肢運動皮質の座標で開けた(前頂部に対して): +0.2mm前後(AP)、+1.5mm内側-外側(ML)。ET-1(1-31)(Peptide international、Inc.、PED-4360-s)を2μg/μlでリン酸緩衝生理食塩水(PBS; OSM約320、pH約7.3)中に溶解させた。
【０１４５】
全容積0.5μl(1μg)を、-1.6mmの背側腹側(DV)から各部位に注射した。注射は10分間にわたり注入ポンプによって実施し、注射針は0.1mm/分でゆっくりと引き抜いた。注射後、針は、完全に引き抜かれる前に、更に3分間1.1mmのDVで維持した。
【０１４６】
ウイルス注射は、ウイルス注射を典型的にはET-1注射の約10日後にET-1注射用に開けた同じ孔を介して実施することを除き、同様の手順に従った。
【０１４７】
5〜10ヶ月齢のマウスを使用した。マウスを12時間の明暗サイクルで飼育し、十分な餌及び水を供給した。行動実験でオスのマウスのみを使用したことを除き、オスマウスとメスマウスの両方を使用した。
【０１４８】
AAVベクター構築
hGFAPプロモーターはpDRIVE-hGFAPプラスミド(InvivoGen, Inc.)から入手し、pAAV-MCS(Cell Biolab)のMluIとSacIIとの間に挿入し、CMVプロモーターを置き換えた。Cre遺伝子は、PCRによってhGFAP-Cre(Addgene plasmid #40591)から取得し、pAAV MCSのEcoRI部位とSal1部位との間に挿入し、pAAV-hGFAP::Creベクターを作製した。
【０１４９】
pAAV-FLEX-mCherry-P2A-mCherry(又はpAAV-FLEX-GFP-P2A-GFP)ベクター及びpAAV-FLEX-NeuroD1-P2A-mCherry(又はpAAV-FLEX-NeuroD1-P2A-GFP)ベクターを構築するため、NeuroD1、mCherry又はGFPをコードするcDNAを、Guo, Z.ら、2014、Cell Stem Cell 14、188〜202ページに記載されているレトロウイルス構築物を使用するPCRによって取得した。
【０１５０】
NeuroD1遺伝子をP2A-mCherry又はP2A-GFPと融合させ、pAAV-FLEX-GFPベクター(Addgeneプラスミド＃28304)のKpn1部位とXho1部位との間にサブクローニングした。プラスミド構築物を検証のため配列決定した。
【０１５１】
AAVウイルス産生
組換えAAV9は、293AAV細胞(Cell Biolabs)で産生させた。簡単に説明すると、ポリエチレンイミン(PEI、直鎖、分子量25,000)をトリプルプラスミド:pAAV発現ベクター、pAAV9-RC(Cell Biolab)、及びpHelper(Cell Biolab)のトランスフェクションに使用した。
【０１５２】
トランスフェクションの72時間後、培地中の細胞をプレートから掻き取り、遠心分離し、ドライアイス/エタノール中と37℃の水浴中に交互に置くことにより4回凍結融解させた。AAV粗溶解物は、不連続なイオジキサノール勾配中、Beckman SW55Tiローターを用いて54,000rpmで1時間遠心分離することにより精製した。
【０１５３】
ウイルス含有層を抽出し、ウイルスをMillipore Amicon Ultra Centrifugal Filterによって濃縮した。ウイルス力価は、QuickTiter(商標)AAV定量キット(Cell Biolabs)によって決定して、hGFAP::Cre、hGFAP::NeuroD1-GFP及びhGFAP::GFPについては1.2×1012GC/mlであり、CAG::FLEX-NeuroD1-P2A-GFP及びCAG::FLEX-NeuroD1-P2A-mCherryについては1.4×1012GC/mlであり、CAG::FLEX-mCherry-P2A-mCherry及びCAG::FLEX-GFP-P2A-GFPについては1.6×1012GC/mlであった。
【０１５４】
レトロウイルス産生
pCAG-NeuroD1-IRES-GFP及びpCAG-GFPは、Guo, Z.ら、2014、Cell Stem Cell 14、188〜202ページに記載されている。レトロウイルス粒子をパッケージングするため、gpgヘルパー不含ヒト胎児腎臓(HEK)細胞を、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質(VSV-G)ベクターと一緒に標的プラスミドでトランスフェクトし、NeuroD1又はGFPを発現するレトロウイルスを産生した。レトロウイルス粒子の力価は、HEK細胞の形質導入後に決定して、約107粒子/mlであった。
【０１５５】
免疫組織化学
マウス脳の浮遊凍結切片の免疫組織化学は、Guo, Z.ら、2014、Cell Stem Cell 14、188〜202ページに記載されているように実施した。2.5%アベルチンを用いて動物を麻酔し、人工脳脊髄液(ACSF)を経心的に灌流して脳組織中の血液を洗い流した。次いで、脳を解剖し、トリミングし、後固定のために、4℃で一晩、4%パラホルムアルデヒド(PFA)に入れた。固定後、脳組織をビブラトーム(Leica)により40μmの切片に切断した。
【０１５６】
脳切片を1時間PBS中の2%Triton X-100で透過処理し、続いてブロッキングバッファー(PBS中の2.5%正常ヤギ血清、2.5%正常ロバ血清、及び0.1%Triton X-100)で1時間インキュベートした。脳切片を含むブロッキングバッファーに一次抗体を加え、一晩4℃でインキュベートした。
【０１５７】
PBS中の一次抗体を洗い流した後、脳切片を、異なるフルオロフォア(1:800、Jackson ImmunoResearch)とコンジュゲートされた二次抗体と共に室温で1時間インキュベートし、Triton-PBS中で洗浄し、次いでDAPI(Invitrogen)を含有する抗退色マウント溶液を用いてスライドガラス上にマウントした。画像は、共焦点顕微鏡(Olympus FV1000又はZeiss LSM800)及びKeyence顕微鏡で得た。
【０１５８】
抗体特異性を試験するため、一次抗体を取り除き、すべての一次抗体のサイドバイサイド対照として二次抗体のみを免疫染色に使用した。特異的シグナルは、これらの対照では検出されなかった。
【０１５９】
BBB透過性試験
深く麻酔したマウスに、上記のように人工脳脊髄液を用いて灌流し、続いてPBS中の0.5mg/mlのスルホ-NHS-LC-ビオチン15mlを灌流した。免疫組織化学検査のために、脳切片を、PBS中1:800に希釈したテキサスレッドストレプトアビジン(Vector SA-5006)+0.3%トリトン+2.5%正常ヤギ又はロバ血清と共に室温で1時間インキュベートし、続いて通常のマウント手順を実施した。
【０１６０】
電気生理学
脳切片の記録は、Guo, Z.ら、2014、Cell Stem Cell 14、188〜202ページ;及びWu, Z.ら、2014、Nat. Commun. 5, 4159ページに記載されている方法と同様に実施した。AAV注射の2〜3か月後、マウスを2.5%アベルチンで麻酔し、次いで、NMDG系の切断溶液(mMで):93 NMDG、93 HC1、2.5 KC1、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、15 グルコース、12 N-アセチル-L-システイン、5 アスコルビン酸ナトリウム、2 チオ尿素、3 ピルビン酸ナトリウム、7 MgSO4、0.5 CaCl2、pH7.3〜7.4、300 mOsmo、95%O2/5%CO2で通気、灌流した。
【０１６１】
300μm厚の冠状切片は、室温でビブラトーム(VT1200S、Leica、Germany)を用いて、AAV注入皮質領域の周囲をカットした。切片を回収し、10〜15分間、酸素化NMDGカッティング溶液中で33.0±1.0℃にてインキュベートした。次いで、切片を、95%O2/5%CO2連続通気の保持溶液(mMで):92 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、30 NaHCO3、20 HEPES、15 グルコース、12 N-アセチル-L-システイン、5 アスコルビン酸ナトリウム、2 チオ尿素、3 ピルビン酸ナトリウム、2 MgSO4、2 CaCl2に移した。
【０１６２】
保持溶液中室温で少なくとも0.5時間回復させた後、33.0±1.0℃で95%O2/5%CO2により飽和した標準aCSF(人工脳脊髄液)を用いて連続的に灌流した記録チャンバーに、単一切片を移した。標準aCSFは、以下(mMで)を含有していた:124 NaCl、2.5 KCl、1.25 NaH2PO4、26 NaHCO3、10 グルコース、1.3 MgSO4、2.5 CaCl2。
【０１６３】
NeuroD1-GFP-感染したニューロンにおける活動電位の発火を検出するため、全細胞の記録を、以下(mMで)を含有するピペット溶液で実施した:135 K-グルコン酸、10 KCl、5 Naホスホクレアチン、10 HEPES、2 EGTA、4 MgATP、及び0.3 Na2GTP、KOHで調整したpH7.3、280〜290 mOsm。脱分極電流を注入し、電流固定モデル下で活動電位を誘発させた。
【０１６４】
自発性興奮性シナプス後電流(sEPSC)及び自発性抑制性シナプス後電流(sIPSC)を記録するため、ピペット溶液は以下(mMで)を含有していた:120 Cs-メタンスルホネート、10 KCl、10 Na-ホスホクレアチン、10 HEPES、5 QX-314、1 EGTA、 4 MgATP及び0.3 Na2GTP、KOHで調整したpH7.3、280〜290 mOsm。記録したニューロンの標識化のため、0.5%ビオシチンをピペット溶液に添加した。
【０１６５】
細胞膜電位は、sEPSC記録の場合は-70mV(GABAA受容体の反転電位)、sIPSC記録の場合は0mV(イオンチャネル型グルタミン酸受容体の反転電位)でそれぞれ保持した。データはMultiClamp 700A増幅器で収集し、pCLAMPIOソフトウェア(Molecular Devices)で分析した。
【０１６６】
マウス行動試験
餌ペレット回収試験
マウスにおけるすべての行動実験では、重度の運動障害を誘発するために、ET-1(1-31)を前肢運動皮質の2点に注射した。2点の座標は次のとおりである:(i)+0.2mm AP、+/-1.35mm ML、(ii)+0.38mm AP、+/-2.45mm ML(+ML又は-MLは、脳卒中前のペレット回収トレーニングにおいて優勢な前肢の対側に基づいた)。
【０１６７】
餌ペレット回収チャンバーは、Baird, A.L.ら、2001、Brain Res. Bull. 54、243〜250ページ;及びRoome, R.B.ら、2014、J. Neurosci. Methods、233、34〜44ページに記載されているようにマウス用の階段装置から変更した。簡単に説明すると、階段を、単一のV字型の窪み部分と、試験中に餌ペレットがウェルの外に落ちるのを防ぐため、端部に備えた小型の邪魔板を有するアームに変更した。図14Aに示したように、窪み部分は長さ33mmであり、窪み部分の最下部は天板の底から16mmである。
【０１６８】
ペレット回収試験前に、マウスの動機を増大させるため、18時間絶食させた。最初の餌絶食トレーニング中、慣れさせるために、マウスにホームケージで30個のショ糖ペレット(14mg、TestDiet、Inc)を与えた。トレーニングの最初の部分では、中央台座の天板を取り外して難易度を下げ、動物が食物に到達しやすいようにした。5個のペレットを窪み部分の右側又は左側のいずれかに置き、優性の前肢を決定した。マウスに5分間与え、各側で2回試験した。優位な側は、回収されたペレットの数を数えることによって、この段階で決定した。ほとんどの動物は、片側の、時には両側の約5個のペレットを得ることができた。動物が全くペレットを得られなかった場合、それらの動物はその後の試験から除外した。
【０１６９】
トレーニングの第2の部分とその後のすべての試験においては、天板を中央台座上に戻し、8個のペレットを優位な側の窪みに置いた。動物は毎日連続して3回試験され、各回でペレット回収に5分間与えた。平均回収が連続する3回のトレーニング日で4個よりも多かった場合、動物をさらなる外科手術及び試験に使用した。
【０１７０】
トレーニング後に、虚血性脳卒中を、優性前肢を制御する対側の運動皮質で誘発した。脳卒中後9日目及びウイルス注射の1日前にペレット回収試験を実施し、それらの機能レベルを決定した。回収されたペレット数が脳卒中前のレベルの半分より少ない場合、これらの動物は翌日(脳卒中後10日目)のウイルス注射に使用した。
【０１７１】
ウイルスを注射した後、20、30、50、及び70dpsでペレット回収試験を実施し、機能回復を評価した。各時点において、ペレット回収試験は、1日目をトレーニングとして、2日目を実際の試験として、2日間連続して繰り返した。動物をコード化し、動物のアイデンティティーを知らない第2の実験者が試験及びペレットのカウントを実施した。
【０１７２】
グリッド歩行試験
グリッド歩行試験は、Baskin, Y.K.ら、2003、J. Neurosci. Methods 129、87〜93ページ;及びClarkson, A.N.ら、2010、Nature 468、305〜309ページに記載されているのと同様であった。
【０１７３】
高さ24cmに上げた、長さ24cm、幅20cmの1cm2グリッドワイヤメッシュを使用した。ビデオカメラをグリッドの下に置き、45°の角度で上向きにした。スローモーション映像を記録し、動物の肢の障害を評価した。個々のマウスをグリッド床上に置き、5分間自由に歩行させた。動物にはコードを付け、ビデオ映像は、動物のアイデンティティーを知らない第2の研究者によってオフラインにより分析された。
【０１７４】
優性の四肢の肢の障害の総数及び肢の障害のないステップの総数をカウントした。肢の障害のパーセンテージは、次のように計算した:肢の障害の数/ステップの総数×100。
【０１７５】
シリンダー試験
シリンダー試験は、Roome, R.B.ら、2014、J. Neurosci. Methods、233、34〜44ページに記載されている方法に基づいた。この試験には、マウスの立ち上がり、前肢による透明シリンダー(直径10cm、高さ15cm)の側壁へのタッチのビデオ録画を含めた。各動物を透明な板上のシリンダーに入れ、カメラを用いて下からビデオ記録した。マウスが立ち上がり、側壁に30回よりも多くタッチすることを試みた後に実験は停止したが、これは通常約3〜4分間続いた。
【０１７６】
ビデオは、動物のアイデンティティーを知らされていない実験者によってオフラインで分析された。立ち上がりと壁へのタッチについての合計30回の試行が分析された。正常な肢のタッチは、動物が立ち上がっている間に壁に両方の肢を置き、降りている間に壁を押すために両方の肢を使用することとして定義される。異常なタッチとは、壁にタッチするために肢のうちの一方のみを使用すること、又はタッチの後に1本の肢が壁に沿って引きずられることを含む。
【０１７７】
ひきずられ(dragging)行動とは、一方の肢、典型的には障害のある方が、壁に対して安定した状態を保てずに、側壁に沿ってスライドすることとして定義される。非タッチ行動とは、マウスが立ち上がってから降りるまでの間、損傷した肢を使用せず、損傷していない肢のみを使用することと定義される。非タッチは、マウスが損傷した肢を完全に放棄するので、より深刻な損傷表現型と考えられる。正常な立ち上がり及びタッチ行動は、次のように定量化された:正常な肢のタッチ/試行の合計×100。
【０１７８】
定量的リアルタイムPCR
損傷コア(約2mm×2mmの正方形)の周囲の皮質組織を灌流後に取得し、液体窒素中で瞬間凍結した。RNA抽出は、Macherey-Nagel NucleoSpin RNAキットを使用して実行し、RNA濃度はNanoDropにより測定した。cDNAは、Quanta Biosciences qScript cDNA supermixを使用して合成した。
【０１７９】
反応混合物を25℃で5分間、42℃で30分間、85℃で5分間インキュベートし、4℃で保持した。次いで、混合物を、RNase/DNaseを含まない水で5倍に希釈し、2.5μlをqRT-PCR用に取った。qRT-PCRのプライマーは、Applied Biosystems Primer Expressソフトウェアを使用して設計した。
【０１８０】
qRT-PCRは、Quanta Biosciences PerfeCTa SYBR Green Supermix、ROXを使用して実行した。GAPDHを内部標準として使用し、健常マウス由来の非脳卒中皮質組織を対照として使用した。比較Ct法(comparative Ct method)を倍率変化の計算に使用し、Prism 6を統計分析及び棒グラフに使用した。
【０１８１】
ゴルジ含浸染色
切片ゴルジキット(Bieoenno Tech、LLC)をゴルジ染色に使用した。簡単に説明すると、マウスをaCSFで灌流し、続いてキットの固定液を灌流した。脳を取り出し、5日間含浸させ、200μmのビブラトームで切片化し、染色し、キットのプロトコールに基づいてマウントし、DPXマウント剤で覆った。4×及び100×の明視野画像を、Keyence BZ-9000螢光顕微鏡を使用して得た。
【０１８２】
定量化及び統計分析
皮質領域サイズ分析
皮質領域は、Keyence BZ-9000蛍光顕微鏡において4×レンズで得られた画像を使用して定量化した。最も明白な脳卒中損傷を有する注射点(+0.2 AP)の周囲の3つの切片を、画像取得のために選択した。DAPI及びNeuNシグナルを使用して、皮質上方境界と下方界面を帯状皮質と共に特定した。正中線から3mm外側までの皮質領域をImageJで測定した。
【０１８３】
変換効率分析のためのGFAP+とNeuN+の比
GFAP又はNeuNと同時染色したmCherry/GFPの40×共焦点画像を、4、7、及び17dpiでの定量化に使用した。各動物について、4つの画像を脳梗塞付近のウイルス感染領域で動物ごとに得た。GFAP比については、mCherry/GFP及びGFAPに二重陽性であった細胞を、Zeiss共焦点ソフトウェアZenを使用してカウントした。すべてのmCherry又はGFP陽性細胞(すべてのウイルス感染細胞)のうち二重陽性細胞のパーセンテージを計算した。同様の方法をNeuN比に適用した。
【０１８４】
変換細胞のアイデンティティー分析のための皮質ニューロンマーカー
皮質ニューロンマーカー(Tbr1、Emx1、Satb2、PV、GABA)と同時染色したGFP(NeuroD1-GFP)の40×共焦点画像を、60dpiでの定量化に使用した。各動物について、3つの画像を、GFPシグナルを示すウイルス感染領域で得た。すべてのGFP陽性細胞(NeuroD1-GFP感染細胞)のうちのGFP、及び個々のマーカーについての二重陽性細胞のパーセンテージをそれぞれ計算した。
【０１８５】
グリア及びニューロンのマーカー強度並びにカバー領域分析
グリアマーカー(LCN2、CSPG、AQP4及びIba1)及びニューロン突起マーカー(Map2、SMI312、VGluT1及びMBP)の単層共焦点画像を、17dpiでの定量化に使用した。63×レンズを使用したSMI312を除き、40×レンズをほとんどのマーカーに使用した。3つの画像を、脳卒中梗塞に近いウイルス感染領域(脳卒中コアボーダーから500μm以内)及び皮質厚全体の中間で得た。1つの画像は、正規化のために比較的健全な領域で得た。健全な領域のバックグラウンドに基づいて閾値を設定した後、ImageJを使用して、画像領域全体の強度とカバー領域を定量化した。3つの画像の結果を使用して、各動物についての平均データを取得した。
【０１８６】
全体的なNeuN及びPV細胞数の分析
NeuN及びPVの細胞数は、正中線の外側500μm〜2500μmの皮質領域内で、Zeiss LSM800共焦点顕微鏡のタイル機能によって得られたNeuN又はPV免疫染色の画像でカウントした。共焦点ソフトウェアZenを細胞カウントに使用した。最も明白な脳卒中損傷を有する注射点の周囲の切片(+0.2 AP)を得られた画像に使用した。
【０１８７】
局所NeuN数の分析
NeuN免疫染色の40×共焦点画像を17dpiでの定量化に使用した。図4Aに示したように、3つの画像を、脳卒中梗塞に近いウイルス感染領域(脳卒中コアボーダーから500μm以内)で得た。1μm間隔で10個の切片でZスタック機能を使用した。共焦点ソフトウェアZenを細胞カウントに使用した。NeuroD1群においては、GFP(NeuroD1-GFP)及びNeuN(変換されたニューロン)の両方についての陽性細胞又はNeuN陽性GFP陰性(既存のニューロン)をカウントした。GFP対照群については、NeuN陽性細胞の総数をカウントした。
【０１８８】
電気生理学的解析
sEPSC及びsIPSCは、Mini Analysis Program(Synaptosoft、New Jersey、USA)を使用して分析した。大きな事象の複数の検出を回避するため、分析結果を自動検出後、更に視覚的にチェックした。異なる群の間のsEPSCとsIPSCの周波数を比較するため、平均値を取得する前に、各細胞について200を超える事象又は少なくとも3分の記録期間をサンプリングした。
【０１８９】
血管数分析
Ly6C数の定量化については、単層40×画像をZeiss共焦点により得た。Ly6Cの強度をImageJで測定し、バックグラウンドよりも3倍高い強度を有する血管を陽性シグナルとして同定した。梗塞周辺領域の3つの画像におけるLy6C+血管の数を定量化し、各マウスについて平均化した。
【０１９０】
統計学及びブラインド分析
統計分析は、Prism 6(GraphPad)ソフトウェアを使用して実施した。示したすべての実験は、少なくとも3匹の動物において繰り返し、代表的なデータを示している。群間の有意性を決定するため、比較は、示したように、対応のある両側スチューデントt検定、又は反復測定ANOVA試験を使用して行った。ウイルス注射前に重度の脳卒中について第一次スクリーニングをした後、動物を、欠損レベルが一致する群に無作為に割り当てた。定量化用のすべての画像は、1人の研究者によって取得し、動物の状態及びアイデンティティーを知らない別の研究者によって定量化された。上述のように、マウス行動試験は盲検様式で実施した。
【０１９１】
[実施例1]
NeuroD1は脳卒中誘発反応性星状細胞をニューロンに変換する
この実施例において、in vivoでの細胞変換が虚血性脳卒中後の機能的な脳修復を達成できるかどうかについて調査した。血管収縮ペプチドのエンドセリン-1(ET-1)によって誘発した局所脳卒中モデルを使用し、げっ歯動物において一貫した局所虚血性損傷を生じさせた(Fuxeら、1997; Hughesら、2003; Roomeら、2014; Windleら、2006)。
【０１９２】
21アミノ酸(ET-1(1-21))を有するペプチドと31アミノ酸(ET-1(1-31))を有する別のペプチドの2つの異なるET-1ペプチドを比較した場合、ET-1(1-31)がET-1(1-21)よりも重度で長引く脳損傷を引き起こすことを発見した(図2Aを参照)。FVBバックグラウンドを有するマウスの遺伝系統は、一般に使用されているB6/C57マウスよりも重度の脳卒中損傷をもたらした(図2Aを参照)。特に、FVBマウスの運動皮質へのET-1(1-31)の注射により有意な皮質組織の喪失が観察され(図1A及び図1Bを参照)、2カ月の経時的経過にわたる一貫した組織損傷を有する重度の局所脳卒中モデルが確立された。
【０１９３】
脳卒中後のNeuroD1ウイルス注射の適切な時間窓を決定した。NeuroD1は反応性星状細胞をニューロンに変換できるので、脳卒中領域を異なる時点で調査し、星状細胞が反応性になった時点を調べた。
【０１９４】
脳卒中後5日目(dps)、予想通り、ニューロンシグナルNeuNの有意な喪失があった(図1Cを参照)。興味深いことに、一般に使用される反応性星状細胞マーカーであるGFAPシグナルも非常に低く、このことは星状細胞がこの初期段階では活性化されていなかったことを示唆している。しかし、10dpsでは、GFAPシグナルが有意に上方調節され(図1Dを参照)、星状細胞がこの時期に反応性になったことを示唆している。
【０１９５】
次いで、虚血性脳卒中によって誘発されたこれらの反応性星状細胞をニューロンに変換することができるかどうかについて決定した。NeuroD1レトロウイルスに感染した反応性グリア細胞は、NeuN陽性ニューロンに順調に変換された(図1E;ウイルス注射後17日目、脳卒中後27日目を参照)。
【０１９６】
レトロウイルスは、損傷後に分裂性の反応性グリア細胞を主として標的とするという利点を有するが、分裂しているグリア細胞の数はむしろ限定されるので、それらは神経修復のために多数のニューロンを生成することはできない。脳卒中後、機能修復に十分な数のニューロンを生成するために、アデノ随伴ウイルス(AAV)を使用して、分裂グリア細胞及び非分裂グリア細胞の両方を感染させた。AAVは、ヒトにおける高感染率及び低病原性という利点を有し、CNS障害の治療における臨床試験に向けてFDAによって承認されている。
【０１９７】
星状細胞を特異的に感染させるため、ヒトGFAPプロモーターの制御下でNeuroD1を発現する(hGFAP::NeuroD1-P2A-GFP)AAVベクター(組換え血清型AAV9)を構築した。感染の2週間後、多くのNeuroD1感染細胞もまたNeuN陽性ニューロンに変換された(図1Fを参照)。しかし、GFAPプロモーター駆動発現が有する注意点の1つは、GFAPプロモーターが星状細胞からニューロンへの変換後にサイレンシングされ、未変換ニューロンと変換ニューロンとを区別することが困難になることである。
【０１９８】
この制限を克服するため、GFAPプロモーター及びNeuroD1は、Cre-FLEX(フリップ切除)相同組換え系を使用することで、2つの異なるAAV9ベクターに分離した(Atasoyら、2008を参照)。次いで、ヒトGFAPプロモーターを使用してCreリコンビナーゼ(hGFAP::Cre)の発現を駆動し、その後、これが、別のベクター(CAG::FLEX-NeuroD1-P2A-GFP/mCherry)中のCAGプロモーターの制御下で、NeuroD1-P2A-GFP(又はNeuroD1-P2A-mCherry)の逆方向配列に隣接する異型の逆平行loxP型組換え部位の2対に作用し得る(図2Bを参照)。この系の利点は、Cre介在による反転後、NeuroD1の発現が強力なプロモーターCAGによって駆動され、その発現レベルが有意に増大することである。このことは、ウイルス注射後(AAV9 hGFAP::Cre及びCAG::FLEX-NeuroD1-P2A-mCherry)の4日目に、多くの感染星状細胞が既に高レベルのNeuroD1を発現しているという観察によって確認された(図1G、上段を参照)。
【０１９９】
興味深いことには、NeuN陽性ニューロンへの移行段階のGFAP陽性星状細胞のいくつかが明白に捉えられた(図1G、下段を参照)。ウイルス注射の2週間後、多くのNeuroD1感染細胞はGFAPシグナルを失い、NeuN陽性ニューロンになったが(図1I、下段を参照)、対照AAV FLEX-GFP感染細胞はほとんどがグリア形態を保持した(図1I、上段を参照)。したがって、Cre-FLEX系を使用した場合、NeuroD1が、虚血性脳卒中後に、多くの反応性星状細胞をニューロンに変換できることが実証される。
【０２００】
次いで、変換効率及び脳卒中領域で生成されたニューロンのタイプを評価した。NeuroD1介在性変換効率を試験するため、ウイルス注射後4、7、及び17日目の脳卒中領域におけるAAV感染細胞のうちの星状細胞及びニューロンの数を試験した(図3A〜図3Dを参照)。GFAP免疫染色を使用して星状細胞を特定すると、対照ウイルスmCherry/GFP感染細胞のうち、大部分が4〜17dpiでGFAPと共局在していることが確認された(図3A、上段を参照)。
【０２０１】
しかし、AAV-NeuroD1-mCherry感染細胞では、GFAPシグナルは4から17dpiで劇的な低減を示し(図3A、下段を参照)、このことは、多くのAAV-NeuroD1感染細胞が星状細胞のアイデンティティーを喪失したことを示唆している。GFAPとは対照的に、NeuN染色はmCherryに感染した対照群のうちニューロンはほとんど示されなかったが、NeuroD1-mCherry発現細胞は、次第にNeuNと共局在化した(図3Bを参照)。
【０２０２】
定量分析からは、mCherry感染細胞の約70%が4〜17dpiにわたりその星状細胞のアイデンティティーを維持したが(図3Cを参照)、NeuroD1感染細胞の>70%は17dpiまでニューロンのアイデンティティーを得ていた(図3Dを参照)ことが明らかとなった。
【０２０３】
変換効率及び特異性を更に調査するため、星状細胞変換ニューロンを追跡するTri-AAV追跡系が開発されたが、これには、本発明のCre-FLEX系と一緒に星状細胞でGFPを発現するウイルス(AAV9 hGFAP::GFP)が含まれていた(図4A〜図4Cを参照)。mCherry対照群において、GFP+細胞の10%のみが60dpiまでNeuN+シグナルを示したが、NeuroD1-mCherry群では、GFP+細胞の95%もが60dpiでNeuN+であり(図4Bで定量)、星状細胞で発現された場合、NeuroD1の変換効率が高いことが更に確認された。これらの結果は、本発明のNeuroD1 AAVが脳卒中領域において星状細胞をニューロンに効率的に変換できることを示唆している。
【０２０４】
次いで、脳卒中領域において星状細胞から変換されたニューロンのアイデンティティーを評価した。運動皮質における星状細胞変換型ニューロンは、Emx1、Tbr1、及びSatb2を含む皮質錐体ニューロンマーカーに対して免疫陽性であることが確認された(図3E及び図3Fを参照)。約10%だけが、パルブアルブミン及びGABAを含むGABA作動性ニューロンマーカーに対して免疫陽性であった(図3Fを参照)。したがって、脳卒中領域におけるNeuroD1の異所性発現の後、星状細胞変換型ニューロンは、それらの隣接する皮質ニューロンと同様のニューロンアイデンティティーを示した。
【０２０５】
[実施例2]
細胞変換後の神経炎症の低減
脳卒中領域におけるNeuroD1感染後の星状細胞からニューロンへの変換に伴って、脳卒中領域におけるGFAPシグナルの有意な低減が観察された(図5Aを参照)。NeuroD1感染反応性星状細胞の>70%がニューロンに変換され、GFAPシグナルがそれに応じて減少するので、このことは予測される。しかし、またこれによって、変換された領域で星状細胞が枯渇されるのではないかという疑問が生じる。これに答えるため、星状細胞からニューロンへの変換がほとんど終了した際、ウイルス注射後17日目(dpi; 27dps)に、NeuroD1 AAVに高度に感染された梗塞に近い脳卒中領域(*)を試験した。
【０２０６】
星状細胞はNeuroD1感染領域で低減を示したが、依然としてまだかなりの数の星状細胞が残っていた(図5Bを参照)。驚くべきことに、星状細胞の数が低減しただけでなく、NeuroD1変換領域において星状細胞の形態が有意に変化していた。対照群において、星状細胞は肥大し、損傷コアを取り巻く領域で相互に密に混ざり合っていたが(図5B、上段を参照)、NeuroD1群においては、ほとんどの星状細胞が細長い突起を有しており、肥大した形態を示すものはごくわずかであった(図5B、下段;及び図6A〜図6Cを参照)。このことは、残存した星状細胞がNeuroD1変換領域において反応性が弱くなったことを示唆している。
【０２０７】
GFAPは星状細胞の主たる突起のみを標識したので、GFAP-GFPトランスジェニックマウスを使用して、星状細胞全体の形態を明らかにした。GFAP免疫染色と同様に、GFAP-GFPマウスを使用した場合も、NeuroD1群で肥大星状細胞が少ないことが明らかになった(図5Cを参照)。特に、多量のGFP標識星状細胞がNeuroD1-mCherry発現領域において確認され(図5C、下段を参照)、変換後に星状細胞が枯渇していないことを示唆している。これは、星状細胞を死滅させる手法とは著しく異なる。in vivoの細胞変換での星状細胞の持続性は、星状細胞が分裂し自ら再生する固有の能力を有するという事実によると思われる。
【０２０８】
NeuroD1感染した反応性星状細胞の70〜95%が脳卒中部位においてニューロンに変換された場合、星状細胞とニューロン並びに星状細胞とミクログリアとの密接な関係から、反応性星状細胞のこのような大幅な低減は局所環境に重大な影響を及ぼすことが予想される。実際、ミクログリア細胞介在性の神経炎症は、脳卒中損傷後の反応性星状細胞と密接に関係している。
【０２０９】
対照群において、17dpiで損傷コアに大量のミクログリア(Iba1でマーク)が観察された(図5D、上図を参照)。しかし、NeuroD1群においては、ミクログリアは有意な低減を示し(図5D、下図を参照)、これはミクログリアと星状細胞との間の相互作用を支持するものである。形態学的に、対照群のミクログリアはほとんどアメーバ型であった(5E、上図を参照)が、NeuroD1群においては、ミクログリアは主に明らかな突起を有する分岐形状を示した(図5Eの下図;図6Dで定量化;また7dpi及び40dpiシグナルについてはそれぞれ図6A〜図6Bも参照)。
【０２１０】
グリアの形態学的変化に伴って、グリア分泌タンパク質、例えばコンドロイチン硫酸プロテオグリカン(CSPG)及びリポカリン-2(LCN2)などは、対照群と比較してNeuroD1群で有意に低減した(図5F及び図5Gを参照、図6E〜Fで定量化)。CSPGは、軸索再生を阻害するグリア性瘢痕形成中の重要な担い手であり、LCN2は、反応性グリア細胞において高度に発現され、神経炎症と関連している。
【０２１１】
免疫染色の結果を確認するため、17dpiでRT-PCR実験を実施し、対照又はNeuroD1に感染した皮質組織におけるグリアマーカー及びサイトカインを定量的に分析した。まず、NeuroD1が実際にNeuroD1注射試料において高度に発現されていることが確認された(図5Hを参照)。GFAP転写レベルは、脳卒中後に約50倍まで増加したが、NeuroD1治療後には有意に減少した(図5Hを参照)。神経炎症関連因子LCN2は、脳卒中後に約1600倍まで劇的に増加したが、NeuroD1治療群においてはわずか15倍に低下した(図5Gを参照)。
【０２１２】
同様に、インターフェロンγ、TNFα、インターロイキン1β(IL-β)、及びインターロイキン6(IL-6)を含む炎症性因子はすべて、脳卒中後に増加を示したが、NeuroD1治療後には下方調節された(図5Iを参照)。NeuroD1治療後の予期せぬ神経炎症の低減は、反応性星状細胞のニューロンへの変換が、単に新しいニューロンを生成するということ以外のはるかに広範な影響を有していることを示唆している。
【０２１３】
[実施例3]
神経再生は神経保護に結びつく
神経炎症の低減と一致して、NeuN陽性ニューロンの数は、NeuroD1感染領域において有意に増加するようであった(図7Aを参照)。驚くべきことに、損傷コアに近い脳卒中領域においては、NeuroD1-GFP標識ニューロンが検出されただけでなく、GFP陽性(図7A、矢印を参照)でもNeuroD1-陽性でもない(図7B、矢印を参照)、多数の非変換ニューロンも検出された。
【０２１４】
定量分析により、梗塞周辺領域のNeuN+ニューロンの約40%がNeuroD1陽性であり、ニューロンの約60%がNeuroD1陰性であることが明らかとなった(図7Cを参照、対照群NeuN+、27.1±8.1/0.1mm2、NeuroD1群:NeuroD1-/NeuN+、64.9、±7.9/0.1mm2、NeuroD1+/NeuN+、39.9、±2.4/0.1mm2、n=群あたりマウス3匹)。
【０２１５】
NeuroD1-NeuroD1-GFP感染ニューロンにおけるGFP+/NeuN+ニューロンを定量化した場合、同様の結果が得られた(図8Aを参照)。更に、NeuroD1治療領域の非変換ニューロンは、対照GFP感染領域のニューロン数の2倍よりも多かったが(図7Cを参照)、このことは、NeuroD1介在性のグリアからニューロンへの変換がニューロン生存を顕著に増強することを示唆している。
【０２１６】
全体として、NeuroD1感染領域におけるNeuN+ニューロンは、対照群におけるニューロンの3倍よりも多かった。NeuroD1治療後のニューロン数の有意な増加に従って、微小管関連タンパク質2(Map2)及びSMI32を含むニューロン樹状突起マーカーの免疫染色は、NeuroD1群においては明確な樹状突起形態を示したが、GFP対照群においては見られなかった(図7D及び図7E;図8CでMap2定量化、また40dpiでのMap2染色については図8Bも参照)。
【０２１７】
同様に、軸索マーカーSMI312及びNF200並びに髄鞘形成マーカーMBPを使用した場合、NeuroD1群において脳卒中領域の軸索がより多く観察され(図7Fを参照、図8Dで定量化)、これは高レベルの髄鞘形成に関連していた(図7Gを参照、図8Eで定量化)。免疫染色の結果を確証するため、RT-PCR実験を実施し、ニューロン遺伝子の発現レベルを試験した。NeuN、Robo2及びSyn1を含むニューロン遺伝子はすべて、脳卒中後に有意な減少を示したが、NeuroD1治療によってレスキューされた(図7Hを参照)。
【０２１８】
最後に、ウイルス感染後2週間から2ヶ月までの脳卒中損傷皮質領域内(正中線から500μm〜2500μm、正中線から1500μmの注射部位)のNeuN陽性ニューロンの総数を定量化した。脳卒中後の対照群におけるNeuN陽性ニューロンの総数は、脳卒中ではない脳のわずか約20%であり、重度の局所脳卒中モデルにおいて80%のニューロン喪失を示す。しかし、NeuroD1群におけるニューロンの数は2か月間にわたり大幅に増加し、脳卒中領域におけるニューロン全体の約70%がレスキューされた(図7Iを参照)。
【０２１９】
変換されたニューロン及び保護されたニューロンの両方を含む、in vivoでの細胞変換後の皮質ニューロンの数におけるこうした有意な増加は、機能回復の確固たる基盤を形成する。
【０２２０】
[実施例4]
脳卒中後の機能的神経回路の再構成
in vivoでの細胞変換に関する極めて重要な問題の1つは、グリア変換ニューロンが機能的神経回路を形成することができる否かである。この質問に答えるため、NeuroD1介在性の細胞変換後の脳卒中領域における形態学的構造を試験した。脳卒中及びウイルス注射の後、対照及びNeuroD1治療マウスの両方において、7、17、40、及び60dpiでの虚血損傷運動皮質を試験した(図9Aを参照)。
【０２２１】
2か月の時間経過にわたり、GFP対照ウイルスを注射した群においては皮質組織が徐々に喪失することが観察されたが、NeuroD1治療群は有意な組織保存を示した(図9Aを参照)。運動皮質組織の分析によると、対照群においては2カ月間にわたり損傷組織の70%が喪失したのに対し、NeuroD1治療群では損傷組織の大部分は保存され、組織喪失はわずかに20%であったことが明らかになった(図9Bを参照、連続切片については図10Aも参照)。
【０２２２】
特に、NeuroD1感染の60日後、明らかな皮質層構造がすべての治療動物において観察され(図9A、60dpi、NeuroD1画像を参照)、NeuroD1治療が新しいニューロンを生成するだけでなく、皮質層を再構成/保存できることが示唆された。
【０２２３】
60dpiでH&E(ヘマトキシリン及びエオシン)染色(図10Bを参照)も実施した。対照群においては、組織損傷に加えて、多くのニューロンがエオシン好性の細胞質及び濃縮した核(pyknotic nuclei)を有し、収縮しているように見えたが、NeuroD1群においては、ニューロンは非常に健全な形態を示した。更に、冠側断面においては、脳卒中領域のNeuroD1変換ニューロンに由来する線条体の軸索束が検出された。in vivoでの細胞変換後に脳卒中領域のNeuroD1感染ニューロンの突出した場所を追跡するため、矢状縫合切断分析を行い、NeuroD1によって変換された皮質ニューロンが軸索を線条体、視床及び視床下部に同側的に送ることができることを決定した(図9Cを参照)。対側では、NeuroD1変換ニューロンは、それらの軸索が脳梁を介して正中線を横切り対側の皮質領域へと突出した(図10Cを参照)。したがって、NeuroD1変換ニューロンは、全体的脳回路に統合され得る。
【０２２４】
NeuroD1介在性の細胞変換後の脳卒中領域における神経機能も調査した。全細胞のパッチクランプ記録は、ウイルス注射後の2ヶ月目に皮質切片のAAV-NeuroD1-GFP感染ニューロンで実施した(9Dを参照)。脱分極電流のニューロンへの注入は、反復活動電位を誘発した(図9Dを参照)。
【０２２５】
脳卒中後のNeuroD1発現ニューロンにおける堅牢な自発的シナプス事象(興奮性及び抑制性の双方)(図9Fを参照)を記録したが、これからは、これらのニューロンが、他のニューロンとのシナプス接続を介して脳回路に統合されたことが示唆された。対照群とNeuroD1群との間の定量的比較から、NeuroD1群におけるEPSCとIPSCの両方の周波数が対照群よりも有意に高いことが実証された(図9Gを参照)。
【０２２６】
記録したニューロンが既存のニューロンではなくNeuroD1変換されたことを確認するため、ビオシチンを記録するピペットに含め、電気生理学的記録後に免疫染色を実施した。図9Eは、記録されたニューロン(ビオシチン陽性)が実際にNeuroD1陽性であったことを実証している。またビオシチン免疫染色は、運動皮質内のNeuroD1変換ニューロンの複雑な樹状突起構造を明らかにした(図9Eを参照)。
【０２２７】
脳卒中領域においてNeuroD1により変換されたビオシチン標識ニューロンに明確な樹状突起棘が観察されたが(図12Aを参照)、これはゴルジ染色で確認された(図12Bを参照)。グルタミン酸作動性シナプスマーカーVGluT1(小胞性グルタミン酸トランスポーター1)を用いるさらなる免疫染色によって、NeuroD1群におけるシナプス密度が対照群と比較して有意に増加したことが明らかになった(図12C〜図12Dを参照)。
【０２２８】
更に、GABA作動性ニューロンが、パルブアルブミン(PV、GABA作動性ニューロンのサブタイプの特異的マーカー)の免疫染色により観察された。虚血性脳卒中はPVニューロンの有意な喪失を引き起こしたが(図12Fを参照)、NeuroD1治療群では、脳卒中領域において多数のPVニューロンが検出された(図12Eを参照、図12Fで定量化)。PVニューロンは、典型的にはNeuroD1-GFP細胞と共局在化していないが、それらはNeuroD1-GFP発現ニューロンと混在しており(図12Eを参照)、このことは、GABA作動性ニューロンがNeuroD1治療によって保護された可能性があることを示唆している。
【０２２９】
総合すると、このデータは、NeuroD1介在性の細胞変換が、興奮性ニューロン及び抑制性ニューロンの再生及び保存の両方を介して、脳卒中領域における機能的神経回路を再構成することができることを実証している。
【０２３０】
[実施例5]
細胞変換後の血管及び血液脳関門のレスキュー
NeuroD1治療が脳卒中領域において脳組織の喪失をレスキューし神経回路を形成することができる場合、細胞変換後に血管及び血液脳関門を回復させることができるであろうか？
この質問に答えるため、脳卒中領域における血管及び血管に接触して血液脳関門を形成する星状細胞エンドフィートを試験した(図11A〜図11Hを参照)。脳卒中のない正常脳においては、血管(Ly6C、内皮細胞及び単球マーカーによって標識)の周囲を包む星状細胞エンドフィートのマーカーアクアポリン4(AQP4、水チャネル)は、無傷の血液脳関門(BBB)を示した(図11A、上段を参照)。反対に、ET-1(1-31)誘発性局所脳卒中の1週間後、血管と星状細胞エンドフィートの両方で有意な破壊が観察された(図11A、下段を参照)。
【０２３１】
AQP4標識した星状細胞エンドフィートは血管から分離され、GFAPと共局在化され(図11A、下段を参照)、エンドフィートから星状細胞の他の領域へのAQP4の誤局在化を示唆している。NeuroD1治療後に、脳卒中領域において血管の有意な回復と一緒に、AQP4標識した星状細胞エンドフィートの再会合が観察された(図11B〜図11C、17dpi、27dpsを参照)。
【０２３２】
AQP4とGFAPとの同時免疫染色から、脳卒中後の対照群においては、AQP4は星状細胞プロセスの全体に散在的に分布されていたが、NeuroD1治療群においては、AQP4が血管の周囲を包むエンドフィートに大部分が集結されていたことが明らかになった(図11Dを参照)。NeuroD1群における血管上の星状細胞エンドフィートの再配列もまた、CD31(血管)及びGFAPの同時免疫染色により明確に示された(図11C〜図11Eを参照)。
【０２３３】
定量分析からは、GFP対照群と比較して、NeuroD1治療群においてAQP4強度(図11Fを参照)及びAQP4カバー領域(図11Gを参照)の両方の有意な減少が明らかになった。NeuroD1群においてでさえ、NeuroD1シグナルが少ない領域よりもNeuroD1が高度に発現された領域において、AQP4シグナルが血管とより会合しているように思われた(図12Gを参照)。
【０２３４】
血管は、対照群と比較して、NeuroD1群において有意な増加を示した(図11Hを参照)。BBB(血液脳関門)の完全性を検討するため、ビオチン灌流試験(biotin perfusion test)を使用してBBB漏出を検出した。梗塞周辺領域において、ビオチンは対照群で血管(Ly6Cで標識)の外側に強いシグナルを示し、BBB漏出が示された(図12Hを参照)。
【０２３５】
NeuroD1群においては、ビオチンシグナルは、主として血管内部に留まった(図12Hを参照)。ウイルス注射の2ヶ月後であっても、AQP4とLy6Cシグナルの違いは、対照群とNeuroD1群との間で依然として非常に顕著であった(図12Iを参照)。総合すると、これは、NeuroD1介在性の細胞変換が脳卒中領域の血管新生を促進し、脳卒中損傷後のBBBを回復させることを示唆している。
【０２３６】
[実施例6]
運動障害及び記憶障害の機能的なレスキュー
NeuroD1治療後の脳卒中領域における有意水準の神経再生を考慮して、この治療が脳卒中によって引き起こされた機能障害をレスキューすることができるかどうかを判定する実験を実施した。様々な動物行動試験に関する予備試験の後に、マウスの前肢機能に対する詳細な分析を、以下の3つの試験を使用して実施した:餌ペレット回収試験、グリッド歩行試験、及びシリンダー試験(図13A、行動試験パラダイムを参照)。
【０２３７】
すべての行動試験において、餌ペレット回収試験に従い、ET-1(1-31)を、皮質の一方の側の2点(1つは前肢運動皮質と1つは前肢感覚皮質)に注射し、優性側に重度の片側性脳卒中を生じさせた。餌ペレット回収を試験するため、試験前にマウスを絶食させ、餌に対するモチベーションを高めるようにした。脳卒中の前に、正常な動物を訓練し、5分間で合計8個のうち平均5〜6個のペレットを回収するようにした(ペレット回収装置については図14Aを参照)。
【０２３８】
脳卒中後9日目に、それらのペレット回収能力は著しく損なわれた(5分間で平均して約1ペレットまで低下)(13Bを参照)。次いで、GFP単独又はNeuroD1-GFPのいずれかを発現するAAV9の注射のために、脳卒中の動物を無作為に同様の欠損を有する2つの群に分け、2ヶ月間にわたりそれらの機能回復をモニタリングした。ウイルス注射後10日目(脳卒中後20日目)に、2つの群の間に有意差はなかったが、ウイルス注射の20日後、NeuroD1群は改善を示し始めた。ウイルス注射後60日目までに、NeuroD1群は約4ペレット/5分に達したが、GFP対照群は2ペレット未満/5分のままであった(図13Bを参照)。
【０２３９】
同様に、グリッド歩行試験においては、脳卒中前の正常な動物の肢障害率は低く、典型的には、5分以内のグリッド上の自由な歩行で約5%であったが、脳卒中後の肢障害率は>10%に増加した(図13Cを参照)。ウイルス注射後、NeuroD1群は治療の20日後及び40日後に一貫して改善を示し、肢障害率が約7%まで減少したが、GFP対照群は>9%の高い肢障害率のままであった(図13Cを参照)。
【０２４０】
動物が立ち上がり、シリンダーの側壁にタッチした際の前肢機能を評価するシリンダー試験も実施した。典型的には、正常動物は両前肢を使用して、側壁に対して着実にタッチして押し、その通常のタッチ率は約85%である。前肢運動皮質における片側脳卒中の後には、対側の前肢の機能は有意に弱まり、障害の肢は側壁にタッチすることができないか、又は短時間タッチした後に壁に沿って引きずられることが多かった(図13Dを参照、通常のタッチ率が約35%に低下)。
【０２４１】
ウイルス感染の40〜60日後、NeuroD1群は両方の前肢による側壁へのタッチで有意な回復を示したが(約65%)、GFP対照群マウスの大部分は弱まったままで、損傷した前肢を使用することはできなかった(図13Dを参照)。3つの試験すべてにおいて、ET-1(1-31)の偽対照としてのPBSの注射はいかなる行動障害ももたらさず、また、ウイルス注射なしのET-1(1-31)の注射は、GFP対照ウイルス注射と同様の障害をもたらした。
【０２４２】
グリッド歩行試験及びシリンダー試験において、非脳卒中側の前肢は、脳卒中のない対照動物と比較して、有意な障害を示さなかった。餌ペレット回収試験においては、トレーニングセッション中餌ペレットを摂取するために優先的に使用された前肢のみが脳卒中による損傷を受け、試験された。ウイルス注射の約2ヶ月後に行動試験を終えた後、マウスを犠牲にし、解剖学的分析及び免疫細胞化学的分析を実施した。行動障害と一致して、GFP対照群の脳は脳卒中領域に顕著な空洞を示したが、NeuroD1群は脳卒中部位で極めて小さい損傷を示した(図14Bを参照)。
【０２４３】
また行動試験後の免疫染色の結果も対照群においては大きな組織喪失を示したが、NeuroD1群においてはより良好に保存された皮質を示した(図14Cを参照、図14Dで定量化)。したがって、3つの異なるマウスの行動モデルを使用することにより、NeuroD1治療が新しいニューロンを再生し、脳組織の喪失を低減するだけでなく、虚血性脳卒中によって誘発された運動機能障害もレスキューすることが実証される。
【０２４４】
NeuroD1介在性のin vivo細胞変換の広範な影響
NeuroD1介在性のin vivoでのグリアからニューロンへの変換後の脳卒中領域においては、グリアの形態と機能の両方がNeuroD1感染領域で顕著に改善された。ニューロン変換後のかなりの数の星状細胞は、反応性星状細胞の増殖能力と一致している。NeuroD1発現領域における肥大性から通常の分岐したアストログリア細胞形態への改善は、反応性グリア細胞がより少ない損傷シグナルに暴露されること、新しく生成された星状細胞の反応性が低いこと、又はその両方を示唆している。
【０２４５】
NeuroD1治療後の脳卒中領域におけるアメーバ状の形状からより分岐した形状へのミクログリア形態の変化は、神経炎症の低減と一致しており、これはTNFα及びIL-1βの炎症性因子の低減によって確認された。これまでの研究では、脳卒中領域におけるCSPG及びLCN2の有意な上方調節が報告されている。本明細書で実証されているように、NeuroD1治療は、脳卒中領域におけるCSPG及びLCN2のレベルを有意に低減させることができ、これは変換後の反応性グリア細胞の有意な低減と一致する。
【０２４６】
神経再生の後、NeuroD1治療は、脳卒中領域における血管の修復及びBBBの回復をもたらす。神経再生後のこのタイプの修復は、脳の発達及び神経修復中の神経血管相互作用と一致している。特に、NeuroD1介在性のin vivoでの細胞変換は、多数の新しいニューロンの生成、同数の反応性星状細胞の減少、神経炎症の低減、血管の修復、及びBBBの回復を含む、局所ニューロン-グリア回路に対して広範な影響を有する。ニューロン-グリア回路全体のそのような様子の変化は先例がない。
【０２４７】
機能レスキューの構造的サポート
in vivoでのグリアからニューロンへの変換はまた、げっ歯類モデルにおける虚血性脳卒中によって引き起こされた運動障害を機能的にレスキューすることもできる。この機能レスキューは、NeuroD1治療後の細胞変換及び回路再構築の両方を含む構造変化に基づく。NeuroD1-GFP標識ニューロンと非標識ニューロンとの混合物がNeuroD1治療後の脳卒中領域において観察された。これは、修復された脳回路が、新しく生成されたニューロンと古い成熟ニューロンの両方の統合であることを示唆している。
【０２４８】
NeuroD1変換されたニューロンは主としてグルタミン酸作動性であるが、NeuroD1-GFPによって標識されていないかなりの数のGABA作動性ニューロンが観察された。このことは、GABA作動性ニューロンがNeuroD1治療によってレスキューされたニューロン中にあることを示唆している。GABA作動性ニューロンの保存は、NeuroD1治療が、正常な脳機能を達成するために重要である興奮-抑制バランスをin vivoでの細胞変換後に維持し得ることを示唆している。NeuroD1治療は、脳卒中で損傷した運動皮質の70%を超えるニューロンをレスキューすることができるので、機能回復も達成される。
【０２４９】
項目
項目1。それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法であって、正常な血流が途絶された領域に治療有効用量の外因性NeuroD1を投与することを含む、方法。
【０２５０】
項目2。外因性NeuroD1を投与することが、NeuroD1をコードする核酸を含む発現ベクターをその領域に送達することを含む、項目1に記載の方法。
【０２５１】
項目3。外因性NeuroD1を投与することが、NeuroD1をコードする核酸を含む組換えウイルス発現ベクターをその領域に送達することを含む、項目1又は2に記載の方法。
【０２５２】
項目4。外因性NeuroD1を発現することが、NeuroD1をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクターをその領域に送達することを含む、項目1から3のいずれか一項に記載の方法。
【０２５３】
項目5。外因性NeuroD1を発現することが、1)NeuroD1をコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクター、及び2)部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルス発現ベクター、の効果的な「フリップ切除」組換え発現ベクター組合せをその領域に送達することを含む、項目1から4のいずれかに記載の方法。
【０２５４】
項目6。NeuroD1が、その領域に送達される唯一の外因的に発現される転写因子である、項目1から5のいずれかに記載の方法。
【０２５５】
項目7。外因性NeuroD1が、反応性星状細胞が存在する場合、CNSにおける正常な血流が途絶された後に一度に投与される、項目1から6のいずれかに記載の方法。
【０２５６】
項目8。外因性NeuroD1が、グリア性瘢痕が存在する場合、CNSにおける正常な血流が途絶された後に一度に投与される、項目1から7のいずれかに記載の方法。
【０２５７】
項目9。CNSにおける正常な血流の途絶が、虚血、血栓症、塞栓症、出血、血管の慢性疾患媒介による制限、及び任意のそれらの2つ以上の組合せからなる群から選択される障害によるものである、項目1から8のいずれかに記載の方法。
【０２５８】
項目10。CNSにおける正常な血流の途絶が、虚血性脳卒中;出血性脳卒中;脳動脈瘤;脳震盪、腫瘍、感染症、炎症、外傷性脳損傷、外傷性脊髄損傷;虚血性若しくは出血性の脊髄症(脊髄梗塞);心拍停止若しくは重度の低血圧(ショック)によって引き起こされる全脳虚血;低酸素、低血糖症若しくは貧血によって引き起こされる低酸素性虚血性脳症;感染性心内膜炎若しくは心房粘液腫によって引き起こされるCNS塞栓症;線維軟骨性塞栓性脊髄症;小児白血病によって引き起こされるCNS血栓症;ネフローゼ症候群(腎臓病)、慢性炎症性疾患、妊娠、エストロゲン系避妊薬の使用、脳膜炎、脱水によって引き起こされる脳静脈洞血栓症、又は任意のそれらの2つ以上の組合せ、からなる群から選択される障害によるものである、項目1から9のいずれかに記載の方法。
【０２５９】
項目11。治療有効用量のNeuroD1を投与することが、NeuroD1タンパク質をコードする核酸配列を含む組換え発現ベクターを投与することを含み、NeuroD1タンパク質をコードする核酸配列が、配列番号2又はその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号4又はその機能的断片をコードする核酸配列、配列番号1又はその機能的断片、配列番号3又はその機能的断片、及び配列番号2又は配列番号4と70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上の同一性を有するタンパク質又はその機能的断片をコードする核酸配列からなる群から選択される核酸配列を含む、項目1から10のいずれかに記載の方法。
【０２６０】
項目12。治療有効用量のNeuroD1を投与することが、損傷部位内又はその付近における定位注入を含む、項目1から11のいずれかに記載の方法。
【０２６１】
項目13。NeuroD1をコードする核酸配列がユビキタスプロモーターに作動可能に連結されている、項目1から12のいずれかに記載の方法。
【０２６２】
項目14。部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸配列がグリア細胞特異的プロモーターに作動可能に連結されている、項目5から12のいずれかに記載の方法。
【０２６３】
項目15。グリア細胞特異的プロモーターがGFAPプロモーターである、項目14に記載の方法。
【０２６４】
項目16。GFAPプロモーターがヒトGFAPプロモーターである、項目15に記載の方法。
【０２６５】
項目17。対象における治療の有効性を評価することを更に含む、項目1から16のいずれかに記載の方法。
【０２６６】
項目18。対象における治療の有効性を評価することが、電気生理学的アッセイ、血流アッセイ、組織構造アッセイ、機能アッセイ、及びそれらの任意の2つ以上の組合せから選択されるアッセイを含む、項目17に記載の方法。
【０２６７】
項目19。対象における治療の有効性を評価することが脳波を含む、項目17に記載の方法。
【０２６８】
項目20。対象における治療の有効性を評価することが、近赤外分光法及びfMRIからなる群から選択される血流のアッセイを含む、項目17に記載の方法。
【０２６９】
項目21。対象における治療の有効性を評価することが、MRI、PETスキャン、CATスキャン及び超音波からなる群から選択される組織構造のアッセイを含む、項目17に記載の方法。
【０２７０】
項目22。対象における治療の有効性を評価することが行動アッセイを含む、項目17に記載の方法。
【０２７１】
項目23。対象における治療の有効性を評価することが、治療有効用量の外因性NeuroD1を投与する前に実施されるアッセイを含む、項目17に記載の方法。
【０２７２】
項目24。正常な血流が途絶した領域において、NeuroD1をコードする核酸を含むアデノ随伴ウイルス粒子を1010〜1014個のアデノ随伴ウイルス粒子/担体1mlの濃度で含有する薬学的に許容される担体1〜500μlを0.1〜5μl/分の制御された流速で対象に投与することを含む、項目1から23のいずれかに記載の方法。
【０２７３】
項目25。血栓の除去、血流の促進、抗炎症剤の投与、酸化防止剤の投与、興奮毒性の低減、及びそれらの2つ以上からなる群から選択される治療を更に含む、項目1から24のいずれかに記載の方法。
【０２７４】
項目26。1)部位特異的リコンビナーゼをコードする核酸に作動可能に連結されているグリア細胞特異的プロモーターを含む組換えアデノ随伴アデノウイルス発現ベクター、及び2)NeuroD1をコードする核酸に作動可能に連結されているユビキタスプロモーターを含む組換えアデノ随伴アデノウイルス発現ベクター、を含む組成物であって、NeuroD1をコードする核酸が反転され、2組の部位特異的リコンビナーゼ認識部位に挟まれており、それによって、リコンビナーゼの作用がNeuroD1をコードする核酸を不可逆的に反転してNeuroD1が哺乳動物細胞で発現される、組成物。
【０２７５】
項目27。実質的に本明細書に記載されているような、それを必要とする個々の対象のCNSにおける正常な血流の途絶の影響を治療する方法。
【０２７６】
項目28。実質的に本明細書に記載されているような、フリップ切除発現ベクターの組合せ。
【０２７７】
配列
配列番号１−ヒトNeuroD1タンパク質をコードするヒトNeuroD1核酸配列−終止コドンを含む1071ヌクレオチド
2020514328.tif 000003
【０２７８】
配列番号２−ヒトNeuroD1アミノ酸配列−356アミノ酸−配列番号１によりコードされる
2020514328.tif 000004
【０２７９】
配列番号３−マウスNeuroD1タンパク質をコードするマウスNeuroD1核酸配列−終止コドンを含む1074ヌクレオチド
2020514328.tif 000005
【０２８０】
配列番号４−マウスNeuroD1アミノ酸配列−357アミノ酸−配列番号３によりコードされる
2020514328.tif 000006
【０２８１】
マウスLCN2プロモーター−配列番号５
2020514328.tif 000007
【０２８２】
ヒトGFAPプロモーター−配列番号６
2020514328.tif 000008
【０２８３】
マウスAldh1L1プロモーター−配列番号７
2020514328.tif 000009
【０２８４】
ヒトNG2プロモーター−配列番号８
2020514328.tif 000010
【０２８５】
CAG::NeuroD1-IRES-GFP−配列番号９
2020514328.tif 000011
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2020514328.tif 000013
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2020514328.tif 000015
【０２８６】
本明細書中で言及した特許又は文献は、参照により、個々の文献が具体的かつ個別に参照により組み込まれるように示されているのと同じ程度まで、本明細書に組み込まれる。
本明細書に記載した組成物及び方法は、好ましい実施形態の現在の代表的なものであり、本発明の範囲に対する制限を意図するものではない。変更及び他の使用が、当業者には想定されるであろう。そのような変更及び他の使用は、特許請求の範囲に示された本発明の範囲から逸脱することなく実施することができる。
【図１Ａ】
2020514328.tif 000016
【図１Ｂ】
2020514328.tif 000017
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
2020514328.tif 000022
【図１Ｈ】
2020514328.tif 000023
【図１Ｉ】
2020514328.tif 000024
【図２Ａ】
2020514328.tif 000025
【図２Ｂ】
2020514328.tif 000026
【図３Ａ】
2020514328.tif 000027
【図３Ｂ】
2020514328.tif 000028
【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
2020514328.tif 000033
【図４Ｂ】
2020514328.tif 000034
【図４Ｃ】
2020514328.tif 000035
【図５Ａ】
2020514328.tif 000036
【図５Ｂ】
2020514328.tif 000037
【図５Ｃ】
2020514328.tif 000038
【図５Ｄ】
2020514328.tif 000039
【図５Ｅ】
2020514328.tif 000040
【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
2020514328.tif 000044
【図６Ａ】
2020514328.tif 000045
【図６Ｂ】
2020514328.tif 000046
【図６Ｃ】
2020514328.tif 000047
【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
2020514328.tif 000049
【図６Ｆ】
2020514328.tif 000050
【図７Ａ】
2020514328.tif 000051
【図７Ｂ】
2020514328.tif 000052
【図７Ｃ】
2020514328.tif 000053
【図７Ｄ】
2020514328.tif 000054
【図７Ｅ】
2020514328.tif 000055
【図７Ｆ】
2020514328.tif 000056
【図７Ｇ】
2020514328.tif 000057
【図７Ｈ】
2020514328.tif 000058
【図７Ｉ】
2020514328.tif 000059
【図８Ａ】
2020514328.tif 000060
【図８Ｂ】
2020514328.tif 000061
【図８Ｃ】
2020514328.tif 000062
【図８Ｄ】
2020514328.tif 000063
【図８Ｅ】
2020514328.tif 000064
【図９Ａ】
2020514328.tif 000065
【図９Ｂ】
2020514328.tif 000066
【図９Ｃ】
2020514328.tif 000067
【図９Ｄ】
2020514328.tif 000068
【図９Ｅ】
2020514328.tif 000069
【図９Ｆ】
2020514328.tif 000070
【図９Ｇ】
2020514328.tif 000071
【図１０Ａ】
2020514328.tif 000072
【図１０Ｂ】
2020514328.tif 000073
【図１０Ｃ】
2020514328.tif 000074
【図１１Ａ】
2020514328.tif 000075
【図１１Ｂ】
2020514328.tif 000076
【図１１Ｃ】
2020514328.tif 000077
【図１１Ｄ】
2020514328.tif 000078
【図１１Ｅ】
2020514328.tif 000079
【図１１Ｆ】
2020514328.tif 000080
【図１１Ｇ】
2020514328.tif 000081
【図１１Ｈ】
2020514328.tif 000082
【図１２Ａ】
2020514328.tif 000083
【図１２Ｂ】
2020514328.tif 000084
【図１２Ｃ】
2020514328.tif 000085
【図１２Ｄ】
2020514328.tif 000086
【図１２Ｅ】
2020514328.tif 000087
【図１２Ｆ】
2020514328.tif 000088
【図１２Ｇ】
2020514328.tif 000089
【図１２Ｈ】
2020514328.tif 000090
【図１２Ｉ】
2020514328.tif 000091
【図１３Ａ】
2020514328.tif 000092
【図１３Ｂ】
2020514328.tif 000093
【図１３Ｃ】
2020514328.tif 000094
【図１３Ｄ】
2020514328.tif 000095
【図１４Ａ】
2020514328.tif 000096
【図１４Ｂ】
2020514328.tif 000097
【図１４Ｃ】
2020514328.tif 000098
【図１４Ｄ】
2020514328.tif 000099
【配列表】
2020514328000001.app
【国際調査報告】
2020514328.tif 000100
2020514328.tif 000101