(57)【要約】  本発明は、非小細胞肺がんの処置の分野のものである。本発明は、非小細胞肺がんを有する患者の処置のための薬剤、及び非小細胞肺がんを有するか又はそれを有する疑いがある患者に関するプラチナベースの化学療法に対する応答を予測する方法を含む、関連する診断の方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
肺がんを有するヒト患者の処置における使用のための、miR-24-3pのインヒビター、特にロックド核酸。
【請求項２】
前記患者は、非小細胞肺がん(NSCLC)、特に肺腺癌(LUAD)、とりわけステージIII又はIVのNSCLC及び/又はLUADを有する、請求項1に記載の使用のためのmiR-24-3pのインヒビター。
【請求項３】
プラチナベースの化学療法剤との組み合わせにおける使用のための、請求項1又は2に記載の使用のためのmiR-24-3pのインヒビター。
【請求項４】
肺がんを有するヒト患者、特に、非小細胞肺がん(NSCLC)及び/又は肺腺癌(LUAD)、とりわけステージIII又はIVのNSCLC及び/又はLUADを有するヒト患者におけるプラチナベースの化学療法に対する応答の改善における使用のための、miR-24-3pのインヒビター、特にロックド核酸。
【請求項５】
miR-24-3pのインヒビター、特にロックド核酸、及びプラチナベースの化学療法剤を含む、化合物の組み合わせ。
【請求項６】
前記化合物の組み合わせは、前記miR-24-3pインヒビター及び前記化学療法剤の同時投与に適している、請求項5に記載の化合物の組み合わせ。
【請求項７】
前記化合物の組み合わせは、前記miR24-3pインヒビター及び前記化学療法剤の時間を空けた投与に適している、請求項5又は6に記載の化合物の組み合わせ。
【請求項８】
肺がんを有するヒト患者、特に、NSCLC及び/又はLUAD、とりわけステージIII又はIVのNSCLC及び/又はLUADを有するヒト患者の処置における使用のための、請求項5から7のいずれか一項に記載の化合物の組み合わせ。
【請求項９】
肺がんを有するヒト患者におけるプラチナベースの化学療法に対する応答の見込みを決定するインビトロ方法であって、患者から予め得た生体サンプル中のmiR-24-3p、miR-23a-3p及びmiR-27a-3pからなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルを評価する工程を含む、方法。
【請求項１０】
前記患者は、非小細胞肺がん(NSCLC)、特に肺腺癌(LUAD)を有する、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者は、ステージIII又はIVのNSCLC及び/又はLUADを有する、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記生体サンプルは、前記患者の腫瘍からのサンプルであるか、又は前記生体サンプルは、前記患者からの血液サンプルである、請求項9から11のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記発現レベルは、miR-24-3p、miR-23a-3p及びmiR-27a-3pからなる群から選択される1つ、2つ又は3つのmiRNAに関して評価される、請求項9から12のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記miRNAの発現レベルは、定量的PCR(qPCR)、リアルタイムqPCR及び発現マイクロアレイからなる群から選択される少なくとも1つの方法を使用して測定される、請求項9から13のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記miRNAの発現レベルは、予め設定した基準レベルと比較され、前記基準レベルは、特に、LUADがんを有する患者の群において測定された平均発現レベル又は発現レベル中央値であり、前記群の前記患者は、プラチナベースの化学療法に対する応答に関して選択されていないか、又は選択された非応答者患者である、請求項9から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記患者の腫瘍からの生体サンプル中の前記miRNAの発現レベルは、前記患者の非腫瘍組織からの生体サンプル中の発現レベルである基準レベルと比較される、請求項9から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
miR-24-3p、miR-23a-3p及びmiR-27a-3pからなる群から選択される少なくとも2つのmiRNAの発現レベル、及び、任意に、前記miRNAの平均発現レベルが比較のために使用される、請求項9から16のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記患者の前記生体サンプルにおいて測定された発現レベルが前記基準レベルと等しいか又はそれよりも高い場合に、前記患者のプラチナベースの化学療法に対する抵抗性の見込みが増加していると結論する工程を更に含む、請求項9から17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者由来の生体サンプル中の前記miR-24-2クラスター由来の少なくとも1つのmiRNAの発現レベルが、特に請求項9から18のいずれか一項に記載の方法に従って、評価され、とりわけ、前記miR-24-2クラスター由来の少なくとも1つのmiRNAの発現レベルは、前記患者の生体サンプル中の基準値と等しいか又はそれよりも高いと決定されている、請求項1から4のいずれか一項に記載の使用のためのmiR-24-3pのインヒビター又は請求項6から8のいずれか一項に記載の使用のための化合物の組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非小細胞肺がん(non-small cell lung cancer)の処置の分野のものである。本発明は、非小細胞肺がんを有する患者の処置のための薬剤、及び非小細胞肺がんを有する又はそれを有する疑いがある患者に関するプラチナベースの化学療法に対する応答を予測する方法を含む、関連する診断の方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
肺がんは、世界中において主要な死因であり、1年に130万人を超える人が死亡している(Jemalら、2008年)。肺がんの大部分(>80%)は、タバコの煙が原因であり、概して9人に1人がその生涯において肺がんを発症することになると想定される(Jemalら、2008年)。肺がんは、気管支、気管又は肺組織に生じる原発性悪性新生物であり、2つの異なる主要な要素:小細胞肺がん(SCLC)及び非小細胞肺がん(NSCLC)に分けることができ、これらは、さまざまな種類の肺細胞から発生し、患者における増殖特性及び広がりに関して異なる振る舞いをする。この相違は、臨床的にも、腫瘍遺伝学及び生物学に関しても重要である(Goldstrawら、2011年)。
【０００３】
非小細胞肺癌(Non-small cell lung carcinoma)(NSCLC)は、多くの国で最も一般的な形態である肺腺癌(LUAD)の症例の少なくとも80%を占める(世界保健機関、2012年)。診断では、NSCLCを有する患者を、疾患の程度及びその結果としての処置を反映する4つのステージに分けることができる。ステージIの疾患を有する患者は、予後が最良であり、5年生存率が60%以上である。ステージII及びIIIAには、局所的又は局部的に進行した肺がんを有する患者が含まれる。これらの患者の5年生存は、10から50%の間の範囲である。最後の群には、遠隔転移を伴う又は伴わない進行した疾患を有する患者が含まれる(ステージIIIB及びIV)。こうした患者の予後は最も悪く、5年生存が10%未満である。注目すべきは、初期ステージの疾患を有する大半の患者が、最終的に腫瘍再発及び肺がんによる死を経験することになることである。最後に、NSCLCを患っている患者の全体的な推定5年生存は、わずか16%に過ぎない(Goldstrawら、2011年)。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Obadら(Nature Genetics、2010、43(4): 371〜380頁
【非特許文献２】Liedertら、Nucleic Acids Res、2006、34、e47頁
【発明の概要】
【０００５】
この10年にわたりNSCLCの処置において目覚ましい進歩があったが、この悪性腫瘍は、依然として治療に対する不十分な奏効率並びに大半の患者のひどい予後と関連づけられている(Chang、2011年)。手術は、初期のステージのNSCLCに対する治療の重要な要素と見なされており、最近のガイドラインは、ネオアジュバント又はアジュバント設定のいずれかにおいて手術又は放射線療法と共同して第一選択のプラチナベースの併用療法を使用することを推奨している(Fribouletら、2013年;Goldstrawら、2011年)。大半の患者は、NSCLCの進行したステージと診断され、外科的摘出に適しておらず、プラチナベースの併用療法がこの群の患者における第一選択の処置である。NSCLCの薬物応答及び毒性における患者間のばらつきは、(epi)遺伝的及び疾患の決定因子又は低酸素等の環境因子を含む、さまざまな原因によって起こる(Chang、2011年)。したがって、現行の治療法に対するがん細胞の抵抗性の根底にある分子メカニズムの解明は、こうした逃げ道を妨げるための方策を正確に特定するのに重要である。NSCLCの薬物抵抗性への理解に著しい進歩があったが、ノンコーディングRNA、特にmiRNAの役割については十分に文書に記録されていない。この状況において、本発明者らは、以前には報告されていなかったmiR-24-3pクラスターのmiRNAの役割を示し、NSCLCの診断及び処置に有用な方法及び製品を得た。特に、本発明者らは、予後が不良な患者においてmiR-24-3pがより高いレベルで発現すること及びmiR-24-3pの阻害がプラチナベースの化学療法に対する感受性を高めることができたことを示した。
【０００６】
したがって、本発明者らは、患者、特にヒト患者、中でも、非小細胞肺がん(NSCLC)、特に肺腺癌(LUAD)、とりわけステージIII又はIVのNSCLC又はLUADを有するヒト患者の処置に、特に使用するための、miR-24-3pのインヒビターを提供する。インヒビターはまた、プラチナベースの化学療法剤と組み合わせて提供され、及び/又は、特に前記化学療法処置がインヒビターによる処置と同時に若しくは処置後に行われる場合、プラチナベースの化学療法により処置された患者(特に、上記の患者)に使用するために提供される。
【０００７】
本発明者らはまた、本明細書において、患者、特にヒト患者、とりわけ、非小細胞肺がん(NSCLC)、特に肺腺癌(LUAD)、より詳細にはステージIII又はIVのNSCLCを有するヒト患者におけるプラチナベースの化学療法に対する応答の見込みを予測するインビトロ方法であって、(i)前記患者から生体サンプルを得る工程と、(ii)miR-24-3p、miR-23a-3p及びmiR 27a-3pからなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルを評価する工程とを含む、方法を提供する。(場合によって、プラチナベースの化学療法と組み合わせた)miR-24-3pのインヒビターによる処置から利益を得る可能性がある患者を選択するための同様の工程を含む方法も提供される。
【０００８】
本発明者らはまた、miR-24-3p、miR-23a-3p及びmiR-27a-3pからなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAの発現レベルが測定されており、特に、前記患者における前記miRNAの発現レベルが基準レベルと等しいか又はそれよりも高いことがわかった患者における使用のためのmiR-24-3pのインヒビターを提供する。インヒビターは、特に、そのような患者にプラチナベースの化学療法剤と組み合わせて使用するために提供される、及び/又はプラチナベースの化学療法により処置されるそのような患者に使用するために提供される。
【０００９】
本発明者らはまた、患者、特にヒト患者、中でも、非小細胞肺がん(NSCLC)、特に肺腺癌(LUAD)、とりわけステージIII又はIVのNSCLCを有するヒト患者における使用のためのプラチナベースの化学療法剤であって、前記患者におけるmiR-24-3p、miR-23a-3p及びmiR-27a-3pからなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAの発現レベルが測定されており、特に、前記患者における前記miRNAの発現レベルが基準レベルよりも低いことがわかった、プラチナベースの化学療法剤も提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
所与のmiRNAの発現のレベルを求める方法及び診断方法
本発明者らは、本明細書において、生体サンプル中のmiRNAの発現のレベルを評価する工程又は求める工程を含む、方法を提供する。発現のレベルを評価することは、特に、前記miRNAの絶対量の直接的な測定を指す。発現のレベルを評価することはまた、前記レベルの相対的な測定、特に、前記miRNAの量を、他のRNA、特に他のmiRNAの量に対して求める方法工程を指す場合もある。
【００１１】
値は、当業者に既知の任意の適した単位で表すことができる。特に、前記単位は、細胞中又は所与の量のサンプル中のmiRNAの量に対して直線関係又は対数関係にある。前記単位はまた、サンプル中の別の分子又は生物学的要素(又は他の要素)、特に、1つ又はいくつかのタンパク質(又はタンパク質の総量)或いは1つ又はいくつかのRNA(又はRNAの総量)、とりわけ、1つ又はいくつかのmiRNAと比較したmiRNAのモル比又は重量比に対して直線関係又は対数関係にある場合もある。前記単位はまた、miRNAの量には直接関連しないが、qPCRタイプの手順における大幅な増幅を得るためのサイクル数等の前記量に伴って変動するパラメーターに関連する場合もある。前記単位は、一般に独立した手順で求められた量と比較できない、所与の実験手順のみにおけるmiRNAの量と関連するという点で任意のものであってもよい。量は、同じ手順で求められた他の量(例えば、他のmiRNAの量)と比較されなければならず、比較が可能であるよう同様の任意の単位で表されなければならない。
【００１２】
特定の実施形態において、本発明の診断方法は、miR-24-3p、miR-23a-3p及びmiR-27a-3pからなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルを求める工程を含む。miR-24-3p、miR-23a-3p及びmiR-27a-3pは、まとめて「miR-24-2クラスターのmiRNA」と言及され、「miR-24-2クラスターのmiRNA」は、miR-24-2クラスターのmiRNAの群から選択される少なくとも1つ(すなわち、1つ、2つ又は3つ)のmiRNAを指す。発現のレベルが求められるmiRNAは、本明細書において、「目的とするmiRNA」と言及される。これには、後で詳述される較正又は正規化の目的で量が求められるmiRNAは含まれない。miR24-2クラスターの3つのmiRNAは同時に発現し、同じ転写要素の部分を形成する。
【００１３】
特定の実施形態において、この群の1つのmiRNAからの発現レベルが試験される。特定の実施形態において、miR-24-3pの発現レベルが試験される。特定の実施形態において、2つのmiRNAの発現レベルが試験される。特定の実施形態において、miR-24-3p及びmiR-23a-3p、又はmiR-24-3p及びmiR-27a-3p、又はmiR-23a-3p及びmiR-27a-3pの発現レベルが試験される。特定の実施形態において、miR-24-2クラスターの3つすべてのmiRNAの発現レベルが試験される。
【００１４】
いくつかのmiRNAの発現レベルが求められる及び/又は同じmiRNAの発現レベルが数回求められる特定の実施形態において、いくつかの値が、特に、比較(又はスコアリング)の目的で使用するために1つの値として組み合わされてもよい。「値を組み合わせること」とは、本明細書中で使用される場合、もとの値と直接関連する組み合わされた値を得るために、前記値を使用して操作、特に数学的操作を行うことを意味する。特に、組み合わされた値は、もとの値の平均値、又は中央値、又はもとの値の合計である。特に、同じmiRNAに対して何回か測定が行われる場合、このmiRNAに関する発現レベルを表すために、これらの測定の組み合わされた値、特に平均値を使用することができる。同様に、目的とするいくつかのmiRNAの発現レベルの平均値が使用されてもよい。平均値の代わりに、中央値、合計、又は任意の他の組み合わされた値が使用されてもよい。
【００１５】
特定の実施形態において、発現レベルは、正規化される。正規化は、当業者に既知の方法を使用して行われる。このレベルは、特に、1つ又はいくつかのmiRNA又は(snRNA又は「スパイクイン(spike-in)」RNAのような)他のRNAの発現レベルに対して正規化されてもよい。そのようなmiRNAは、好ましくはmiR-24-3pと無関係であり、好ましくはmiR-24-2クラスターのmiRNAのいずれとも関係がない。
【００１６】
特定の実施形態において、本発明の診断方法は、目的とするmiRNAの発現レベルを、基準レベル(又は基準発現レベル)と比較する工程を含む。
【００１７】
特定の実施形態において、基準発現レベルは、同一実験条件における同じmiRNAの発現レベルの測定(「基準測定」)から求められる。基準測定の発現レベルは、好ましくは、サンプル測定と同じ数値変換を受ける。特に、発現は、同一の規則を使用して正規化される。目的とするサンプル中の発現レベルと同様に、数回のそのような測定が行われる基準測定に対する発現レベルが組み合わされてもよい。一般に、発現レベル及び基準発現レベルに対して同じ操作が行われることになる。
【００１８】
miR-24-2クラスターのmiRNAの測定発現レベルが基準発現レベルと比較される実施形態において、前記測定発現レベルは、測定レベルが任意の量だけ基準レベルよりも高いときに、前記基準発現レベル「よりも高い」と言われる場合もあり、或いは、測定レベルは、差が有意であるのに十分なときにのみ基準レベル「よりも高い」と言われる場合もある。特に、測定発現レベルは、比(測定/基準)が1よりも大きいとき又は比が1.1よりも大きいとき、好ましくは比が1.5よりも大きいときに、基準発現レベルよりも高いと言われる場合もある。反対に、測定発現レベルは、(i)それが上記の基準の1つに従い高くないとき、又は(ii)それが任意の量だけ基準レベルよりも低いとき、又は(iii)それが基準レベルよりも有意な量低いとき、特に、測定/基準の比が1よりも低い若しくは0.9よりも低い若しくは0.5もよりも低い若しくは0.1よりも低いときに、基準発現レベルよりも低いと言われる場合もある。
【００１９】
本明細書において示される試験方法は、好ましくは、インビトロで行われる。一般的に言えば、当業者は、患者のサンプル中のmiRNAの発現レベルを試験するためのインビトロ方法を知っている。案内は、実施例のセクション及び本明細書中で引用される参考文献に見出すことができる。
【００２０】
特定の実施形態において、サンプルは、腫瘍サンプル、すなわち、がん細胞を含む組織から採取されたサンプル、特に、原発性腫瘍又は転移からのサンプルである。特定の実施形態において、サンプルは、肺生検からのサンプルである。針生検試料、又は当該技術分野において既知の任意の他の方法によって得られた生検試料が使用されてもよい。特定の実施形態において、サンプルは、体液サンプル、すなわち、生体液からのサンプル、特に血液サンプル、とりわけ血清サンプル又は血漿サンプルである。特定の実施形態において、サンプルは、血中循環腫瘍細胞、すなわち、血流中に見られる腫瘍細胞を含むか又はそれからなる。当業者は、血液サンプルからそのような細胞を単離する(又は濃縮する)ための方法を知っており、サンプルは、特に、単離された血中循環腫瘍細胞のサンプルであってもよい。
【００２１】
特定の実施形態において、基準発現は、同じ患者の非腫瘍細胞における発現レベルである。特に、基準発現は、前記患者の非腫瘍組織における発現レベルである。特定の実施形態において、基準レベルは、基準集団において測定された発現レベルから確立される。特定の実施形態において、基準発現レベルは、基準集団において行われた測定の平均として確立される。特定の実施形態において、基準発現レベルは、基準集団における発現レベル中央値である。
【００２２】
特定の実施形態において、基準集団は、特に、少なくとも10人の個人、好ましくは少なくとも50人、より好ましくは少なくとも100人、より一層好ましくは少なくとも250人の個人を含む。特定の実施形態において、基準集団は、任意抽出の集団であり、すなわち、集団中の個人は、いかなる特定の基準によっても選択されていない。特定の実施形態において、基準集団は、大部分が診断されたいかなるがんも患っていない個人を含むか、又はそうした個人だけを含む。特定の実施形態において、基準集団は、大部分が肺がん、特にNSCLC、とりわけLUADを患っている個人を含むか、又はそうした個人だけを含む。特定の実施形態において、基準集団は、大部分がNSCLC、とりわけLUADを患っている個人を含むか、又はそうした個人だけを含み、こうした個人は、化学療法に対する応答に関して選択されていない(すなわち、プラチナベースの化学療法に対する応答又は非応答は、選択因子ではない)か、又は選択された非応答者患者であり、すなわち、基準集団に含まれる患者は、プラチナベースの化学療法に対して応答を示さない(及び/又は後天的な抵抗性を示す)。
【００２３】
本発明の診断方法は、一般に、患者の状態、前記状態の進展、前記状態の予測可能な進展、特に、プラチナベースの化学療法による処置に対する患者の応答(すなわち、前記処置下にあるときの状態の進展)及び/又は前記処置に対する予測可能な応答のうちの少なくとも1つの評価を支援するのに有用である。そのような使用に適した方法及び/又はそれを対象とする方法が本明細書において提供される。そのような方法は、本明細書において、当業者による用語の最も広い解釈でまとめて「診断方法」と言及される。特に、診断方法は、患者の病的状態の存在及び性質、並びに、予後(状態の予測可能な進展の決定)、ステージ分類(状態の重症度及び/又はその進展の程度の決定)、コンパニオン診断(処置に対する応答、又は応答の見込みの決定)、素因試験等を決定する狭い意味での診断を含む。
【００２４】
好適な実施形態において、患者は、ヒト患者、特に非小細胞肺がん、とりわけ肺腺癌を患っている患者である。特定の実施形態において、がんは、非小細胞肺がん(NSCLC)である。特定の実施形態において、がんは、肺腺癌(LUAD)である。特定の実施形態において、がんは、ステージIII又はIVのNSCLC及び/又はLUADである。
【００２５】
好適な実施形態において、本方法は、プラチナベースの化学療法処置に対する抵抗性の見込みの増加又は応答の見込みの増加を予測することを対象とする。(処置に対する応答及び/又は抵抗性の)見込みの予測は、前記見込みに関する情報の任意の部分の提供を意味することが意図され、情報の前記部分は、患者の臨床状態及びmiR-24-2クラスターのmiRNAの発現に直接関連しない任意のパラメーターによっては得られなかったものであり、又はそれらによって提供された情報に加えられる。特に、応答及び/又は抵抗性の「ベースライン」の見込みは、患者の臨床所見、医用画像、(miR-24-2クラスターのmiRNAの発現に直接関連しない)生物学的試験等に基づいて、本発明の方法の実施前に(又はそれと独立して)確立され、得られたベースラインの値(又は推定値)は、本発明の方法を使用して測定された発現レベルを考慮して、(そのような増加又は低減の程度の定量的評価を用いて、又は用いずに)改変される(増加又は低減される)。
【００２６】
特に、miR-24-2クラスターのmiRNAの前記発現レベルが基準値よりも低いと決定された場合、本発明の方法と独立して決定される応答のベースラインの見込みは増加している、及び/又は前記発現レベルが基準値と等しいか若しくはそれよりも高いと決定された場合、抵抗性の見込みは増加している。
【００２７】
特に、前記化学療法に応答する見込み(又は確率)ががんを有する患者、或いは、より具体的には、同じ若しくは同様のタイプ及び/又は同じ若しくは同様のステージのがんを有する患者、特にNSCLC、特にLUAD、とりわけステージIII又はIVのNSCLC又はLUADを有する患者間の平均の応答の見込みよりも高い場合に、患者は、プラチナベースの化学療法に応答する見込みがあると言われる。
【００２８】
したがって、本明細書において提供される方法は、
(i)患者から予め得た生体サンプル、好ましくは、腫瘍サンプル中の、miR-24-3p、miR-23a-3p及びmiR-27a-3pからなる群から選択される少なくとも1つのmiRNAの発現レベルを評価する工程と、任意に、(ii)前記miRNAの発現レベルを基準レベルと比較する工程と、任意に、(iv)患者において測定された発現レベルが前記基準レベルと等しいか又はそれよりも高い場合に、患者のプラチナベースの化学療法に対する抵抗性の見込みが増加していると結論する工程と、を含む。
【００２９】
特定の実施形態において、本方法は、(v)患者のサンプルにおいて測定された発現レベルが前記基準レベルよりも低い場合に、プラチナベースの化学療法により患者を処置する工程を更に含む。
【００３０】
特定の実施形態において、本方法は、(v')患者のサンプルにおいて測定された発現レベルが前記基準レベルと等しいか又はそれよりも高い場合に、非プラチナベースの処置により患者を処置する工程を更に含む。
【００３１】
特定の実施形態において、本方法は、(v")患者のサンプルにおいて測定された発現レベルが前記基準レベルと等しいか又はそれよりも高い場合に、任意にプラチナベースの化学療法と組み合わせて、miR-24-3pのインヒビターにより患者を処置する工程を更に含む。
【００３２】
したがって、患者における使用のためのプラチナベースの化学療法剤であって、miR-24-2クラスターの少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルは、特に本明細書において開示されているいずれかの方法に従って、評価されており、特に、少なくとも1つのmiRNAの発現レベル及び/又は目的とするmiRNAの組み合わされた発現レベルは基準値と等しいか又はそれよりも高いことがわかっており、前記値は特に本明細書において示されるとおりに測定される、プラチナベースの化学療法剤が本明細書において提供される。
【００３３】
患者における使用のためのmiR-24-3pのインヒビターであって、miR-24-2クラスターの少なくとも1つのmiRNAの発現のレベルは、特に本明細書において開示されているいずれかの方法に従って、評価され、特に、少なくとも1つのmiRNAの発現レベル及び/又は目的とするmiRNAの組み合わされた発現レベルは基準値と等しいか又はそれよりも高いことがわかっており、前記値は特に本明細書において示されるとおりに測定される、miR-24-3pのインヒビターも本明細書において提供される。そのようなインヒビターは、特に、プラチナベースの化学療法剤と組み合わせた処置に使用するために提供される。
【００３４】
治療用薬剤は、両薬剤が同じ患者に、同じ疾患(又は同じ原因に由来する疾患)の処置のために投与されるときはいつも、別の治療用薬剤と組み合わせて使用されることが本明細書において述べられている。特に、そのような組み合わせでの使用は、両薬剤の効果が同時に生じることが意図される使用、並びに/又は一方の薬剤の効果が他方の薬剤の治療効果を可能にする、促進する及び/若しくは増加させる使用を含む。特に、患者の同じ疾患の処置のために同じ処方に列挙されている薬剤は、組み合わせて使用されると見なされる。同様に、特に、規制機関又は医学界によって確立された処置ガイドラインにおいて、疾患の処置のために同じ処置プロトコル内で投与が推奨されている薬剤は、患者に投与されるときに組み合わせて使用されると見なされる。
【００３５】
がんの処置における使用のためのプラチナベースの化学療法剤
がんを患っている患者における使用のためのプラチナベースの化学療法剤であって、前記患者のサンプル中のmiR-24-3p及び/又はmiR-24-2クラスターのmiRNAの発現レベルは、本明細書において開示されているいずれかの方法に従って評価されており、特に、前記レベルは基準値よりも低いと決定されている、プラチナベースの化学療法剤が本明細書において提供され。
【００３６】
本明細書において提供される方法、製品、及び前記製品の使用は、がんを患っている患者、又はがんを患っている疑いがある患者及び/若しくは遺伝的素因を有する患者、又はがんの発症を促進する環境条件で生活している若しくは生活していた患者に使用することが意図される。
【００３７】
ある場合には、方法、製品及びその使用は、患者が実際にがん、特に非小細胞肺がん、とりわけ肺腺癌を患っていることを確認する診断方法の一部である。いくつかの実施形態において、方法、製品及び使用は、がんと診断された患者に対する処置を選択することを対象とする。いくつかの実施形態において、方法、製品及び使用は、プラチナベースの化学療法に対する応答の見込み及び/又は患者の予後を決定すること、又はその決定に関与することを対象とする。
【００３８】
したがって、本明細書において開示されているいずれかの方法に従ってmiR-24-2クラスターのmiRNAの発現レベルを評価する工程と、特に前記レベルが基準値よりも低いと決定された場合に、患者がプラチナベースの化学療法に応答する見込みがあると結論する工程と、プラチナベースの化学療法剤により前記患者を処置する工程とを含む、処置の方法が本明細書において提供される。患者を処置するための薬剤の製造に対するプラチナベースの化学療法剤の使用であって、miR-24-2クラスターの1つ以上のmiRNAの発現レベルが本明細書において開示されているいずれかの方法に従って評価され、特に、前記レベルは基準値よりも低いと決定されている、プラチナベースの化学療法剤の使用も本明細書において提供される。
【００３９】
特定の実施形態において、がんは、非小細胞肺がん(NSCLC)である。特定の実施形態において、がんは、肺腺癌(LUAD)である。特定の実施形態において、がんは、ステージIII又はIVのNSCLCである。プラチナベースの化学療法は、少なくとも1つのプラチナ原子を含むDNA挿入及び/又は架橋及び/又はDNA損傷誘発化学剤の投与を含む、がんを処置するために使用される処置である。特に、プラチナベースの化学療法剤は、プラチナの配位錯体であり、特に、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン及びリポプラチンを含む。
【００４０】
特にがんの処置における使用のための、miR-24-3pインヒビター、及びそのようなインヒビターを含む組成物
miR-24-3pの過剰発現が、プラチナベースの化学療法剤に対する抵抗性に直接関与することが本発明者らによって示された。したがって、本発明者らは、本明細書において、miR-24-3pの過剰発現又は過剰発現の影響を阻害する工程を含む、そのような化学療法剤に対する応答を改善させる方法を提供する。
【００４１】
したがって、患者、特にがんを有するヒト患者、中でも、NSCLC、特にLUAD、とりわけステージIII又はIVのNSCLC及び/又はLUADを有する患者の処置における使用のためのmiR-24-3pのインヒビターが本明細書において提供される。特定の実施形態において、そのようなインヒビターが、そのような患者におけるプラチナベースの化学療法に対する応答の改善における使用のために提供される。
【００４２】
「プラチナベースの化学療法に対する応答の改善」は、前記化学療法の治療効果の増加を得ることを意味するよう本明細書中で使用される。当業者は、そのような化学療法の予想される治療効果及びそのような効果をモニターする方法を知っている。そのような効果の改善は、前記改善の前に何も観察されなかった場合、又は前記改善なしには何も生じることが見込めない場合、効果の実際の観察結果であってもよい。改善はまた、(予想される効果又は予め観察された効果と比較した)観察された効果の大きさの増加にある場合もある。
【００４３】
好ましくは、インヒビターは、そのような患者の処置にプラチナベースの化学療法剤と組み合わせて使用される。したがって、miR-24-3pのインヒビター及びプラチナベースの化学療法剤を含む組成物又は化合物のキットが本明細書において提供される。特定の実施形態において、そのような組成物又は化合物のキット(以降単純に化合物の組み合わせと言及する)は、本明細書において開示されているとおりに患者、特にステージIII又はIVのNSCLC及び/又はLUADを有するヒト患者の処置に使用するために提供される。
【００４４】
特定の実施形態において、化合物の組み合わせは、miR-24-3pインヒビター及び化学療法剤の同時投与に適している。特定の実施形態において、化合物のキットは、miRNA-24-3pインヒビター及び化学療法剤の個別投与、特に時間を空けた投与に適している。
【００４５】
本明細書において開示されているような患者、特にステージIII又はIVのNSCLC及び/又はLUADを有するヒト患者への、miR-24-3pインヒビターの投与を含む、処置の方法も本明細書において提供される。好ましくは、そのような方法は、プラチナベースの化学療法剤の投与を更に含む。特定の実施形態において、miR-24-3pインヒビター及び化学療法剤の投与は同時である。特定の実施形態において、インヒビター及び化学療法剤の投与は、時間が空けられる。
【００４６】
薬剤の投与は、本明細書において、特に2つの薬剤が同じ日のうちに、とりわけ、同じ1時間のうちに投与されるときに、時間において同時であると見なされる。同時投与は、特に、時間において同時の投与を意味する。特定の実施形態において、投与は、例えば、両薬剤を含む溶液を注射することによって及び/又は両薬剤を一緒に経口投与することによって、単回投与が行われるという意味で同時である。2つの薬剤の投与は、2つの薬剤が一緒に投与されない、例えば、異なる経路によって又は2つの個別の注射で投与される場合に、個別であると言われる。投与は、特に、薬剤が少なくとも1時間あけて、とりわけ、異なる2日に投与される場合に、時間を空けてと言われる。
【００４７】
miR-24-3pインヒビター及びプラチナベースの化学療法剤の投与を含む本明細書において開示されている方法及び使用は、miR-24-2クラスターのmiRNAの発現レベルの評価を含む開示されている方法と組み合わされてもよい。その特定の実施形態において、そのようなインヒビターの投与を含む処置の方法における患者及び/又はインヒビターが使用される患者は、本明細書において開示されている試験方法のいずれかの対象であり、特に、前記患者の生体サンプルにおけるmiR-24-2クラスターのmiRNAの発現レベルが基準値と等しいか又はそれよりも高いと決定されている。
【００４８】
本明細書において開示されているmiR-24-3pインヒビターは、miR-24-3p活性を阻害する、すなわち、細胞中に存在するmiR-24-3pの量を低下させること及び/又は細胞中のmiR-24-3pの活性を妨げることによってmiR-24-3pの活性化レベルを低下させることが意図される。特に、miR-24-3p miRNAを過剰発現している細胞において、前記miRNAの制御下での遺伝子におけるmiR-24-3pの活性、特に調節効果の阻害は、プラチナベースの化学療法剤に対する細胞の感受性を取り戻すことを可能にする。
【００４９】
miR-24-3pの活性を阻害するための薬剤は、例えば、小分子、核酸、核酸アナログ、ペプチド、タンパク質、抗体、又はそれらの変異体及びフラグメントであってもよい。いくつかの実施形態において、核酸薬剤は、DNA、RNA、核酸類似体、ペプチド核酸(PNA)、偽相補性(pseudo-complementary)PNA(pcPNA)、ロックド核酸(locked nucleic acid)(LNA)又はその類似体であってもよい。いくつかの実施形態において、核酸薬剤は、短い干渉RNA(RNAi)、siRNA、マイクロRNA、shRNA、miRNA、pri-miRNA並びに遺伝子サイレンシングにおいて効果的なそのアナログ及びホモログ及び変異体であってもよい。
【００５０】
いくつかの実施形態において、薬剤は、miR-24-3pヌクレオチド配列の少なくとも一部と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである。例えば、オリゴヌクレオチドは、pre-miR-24ヌクレオチド配列、例えば、miR-24-1(受入登録MI0000080)及び/又はmiR-24-2ステムループ配列(受入登録MI0000081)の少なくとも一部と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含んでもよい。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、成熟miR-24-3p配列:UGGCUCAGUUCAGCAGGAACAG(配列番号1)の少なくとも一部と実質的に相補的又は前記配列と完全に相補的なヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００５１】
いくつかの実施形態において、薬剤は、miR-24-3pのシード配列(seed sequence)と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、miR-24-3pのGGCUCAと実質的に相補的なヌクレオチド配列を含む(配列番号2を参照)。
【００５２】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチドは、核酸修飾を含む。例となる核酸修飾としては、核酸塩基修飾、糖修飾、糖間結合修飾(inter-sugar linkage modification)、主鎖修飾、及び任意のそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。核酸修飾については、更に詳細に以下に示される。
【００５３】
いくつかの実施形態において、薬剤は、アンタゴmir、完全に2'-0-メトキシエチル(2'-MOE)、2'-F/MOEミックスマー、完全にLNA、LNA/DNAミックスマー、小さなLNA又はその組み合わせである。いくつかの実施形態において、薬剤は、小さなLNAオリゴヌクレオチドである。本明細書中で使用される場合、「小さなLNA」という用語は、ロックド核酸モノマーから完全に構成される、短い、例えば、7、8、9、10、11又は12merのオリゴヌクレオチドを指す。小さなLNAは、miRNAが関係するインビボにおける遺伝子抑制を阻害するのに効果的なことが証明され、内容が参照によって本明細書に組み込まれるObadら(Nature Genetics、2010、43(4): 371〜380頁に記載されている。いくつかの実施形態において、薬剤は、ショートマー(shortmer)である。本明細書中で使用される場合、「ショートマー」という用語は、2'-MOE修飾核酸モノマーから完全に構成される、短い、例えば、7、8、9、10、11又は12merのオリゴヌクレオチドを指す。
【００５４】
いくつかの実施形態において、オリゴヌクレオチド薬剤は、発現ベクターによってコードされてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】A549細胞における発現の増加がシスプラチン抵抗性を誘発するmiRNAに関するハイスループットスクリーニングを示す図である。A549細胞をpre-miRライブラリーで2日間トランスフェクションし、トランスフェクション細胞を、その後、60μMのシスプラチンに3日間曝露した。Cell Titer Glowアッセイを使用して1つのウェルにおいて細胞生存度を測定した。(A):A549細胞において過剰発現したすべてのmiRNAに関する正規化生存度対-log10 FDR補正P値のプロット。垂直の破線は、選択正規化生存度カットオフを表し、横線は、0.01の選択FDR補正P値カットオフを表す。それぞれの点は、miRNAを表す。上側右四半分に囲まれた点は、選択カットオフでシスプラチン抵抗性と関連づけられたmiRNAを表す。miR-24-3p miRNAの標準化された残存生存度は4.9512と推定された。(B)ベン図は、機能獲得スクリーニングにおいて特定したmiRNAとA549細胞において発現するmiRNAとの間の共通部分を示す。発現は、SOLiD 5500 WFTechnologyにおけるsmall RNA Seq解析によって求めた)。発現の閾値は、少なくとも1つの実験条件において、100の読み取り/総成熟miRNAの何百万の読み取りの最小値とした。
【図２】シスプラチン又はビノレルビン誘導細胞死のいずれかに対するA549細胞におけるmiR-24-3p過剰発現の影響を示す図である。A549細胞をpre-miR-24-3pで2日間トランスフェクションした後、トランスフェクション細胞をシスプラチン又はビノレルビンのいずれかに曝露した。(A):miR-24-3pを過剰発現しているA549細胞のアネキシンV/PI染色及び24時間60μMシスプラチンへの曝露。(B):miR-24-3pを過剰発現しているA549細胞のビノレルビン用量応答解析。ATPベースのアッセイを使用して細胞生存度を評価した。
【図３】シスプラチン抵抗性に関与するmiR-24-3p標的を特定するための方策。
【図４】BIM及びPUMAはmiR-24-3pの直接的な標的である。pre-miR-24-3p又はpre-miR-NegとヒトBIM 3'UTR-又はPUMA 3'UTR-とのコトランスフェクションによりHEK293細胞においてpsiCHECK-2コンストラクトを得た。(A):psiCHECK-2においてXhoI及びNotI制限部位にクローン化された配列。(B):示した構成及びpre-miR-24-3p又は対照miRNAでトランスフェクションしたHEK293細胞におけるルシフェラーゼアッセイの結果。トランスフェクションの2日後に細胞を回収し、ルシフェラーゼ活性を分析した。すべてのウミシイタケルシフェラーゼ活性を、ホタルルシフェラーゼ活性を用いて正規化した。**p<0.01。
【図５】miR-24-3pを過剰発現しているA549細胞のシスプラチンによって誘導されたDNA損傷応答を示す図である。miR-24-3pを過剰発現しているA549細胞をシスプラチンに7時間曝露し、(i)SER139におけるリン酸化ヒストンH2A.X(γ-HAX)及び(ii)Ser1981におけるリン酸化ATM(p-ATM)の核内フォーカスを共焦点顕微鏡法によって評価した。(A):γ-HAXの代表的な免疫蛍光顕微鏡写真、(B):p-ATMの代表的な免疫蛍光顕微鏡写真。(C):シスプラチンに曝露され、それぞれ、miR-24-3p過剰発現後のγ-HAX及びリン酸ATMの6以上の核内フォーカスを含む細胞(n=3)のパーセンテージ。
【図６】A549細胞における(A)BIM及びPUMA、(B)PNPO及びPDXK、(C)シスプラチンによって誘導されるカスパーゼ3依存性アポトーシス応答に対するmiR-24-3p過剰発現の影響を示すウエスタンブロットを示す図である。
【図７】シスプラチンによって誘導されるカスパーゼ3依存性アポトーシス応答に対する(A)BIM、(B)PUMA、(C)PDXK及び(D)PNPOサイレンシングの効果を示す図である。
【図８】(A)BIM及びPUMA、(B)PNPO及びPDXK、(C)シスプラチンによって誘導されるカスパーゼ3依存性アポトーシス応答に対するmiR-24-3p阻害の効果を示す図である。
【図９】miR-24-3pによって誘導されるシスプラチン抵抗性に対するTP53突然変異状態の影響を示す図である。(A)miR-24-3p又はmiRNA対照を過剰発現している漸増用量のシスプラチンに曝露したH1299細胞(TP53遺伝子のホモ接合型部分欠失を有する)の死滅曲線。(B)2つのLUAD細胞株、H1299(TP53遺伝子のホモ接合型部分欠失を有する)及びH1975(TP53遺伝子のc.818G<A突然変異に関してホモ接合型)におけるシスプラチンの効果の検証。
【図１０】インビボ実験。LNA修飾オリゴヌクレオチド(配列番号:11及び12)によるmiR-24-3p阻害を示す図である。この結果は、肺全RNAに対するRT-qPCR後に得た。
【図１１】A549細胞におけるmiR-24-3p、miR-27a-3p及びmiR-23a-3p過剰発現のシスプラチン感受性に対する影響を示す図である。
【図１２】miR-24-3p、miR-27a-3p及びmiR-23a-3pの予想される標的のネットワークを示す図である。ベン図は、miR-24-3p、miR-23a-3p及びmiR-27a-3pによって大幅にダウンレギュレートされる遺伝子及び予想される標的(太字*で示す)の概要を示す。
【図１３】miR-23a-27a-24-2クラスターの発現及びTCGAデータベースのカプランマイヤー生存曲線を示すグラフである。パネルA、C及びE:診断の5年後の生存状態による初期ステージのLUAD患者においてSmall RNA-Seqによって測定されたmiR-24-2*(A)、miR-23a(C)及びmiR-27a(E)の発現レベルを示す箱ひげ図(n=293)。それぞれのプロットに対して対応するP値を示す。A:生きている;D:死亡。パネルB、D、F及びG:miR-24-2*(B)、miR-23a(D)、miR-27a(E)の発現及び3つの成熟miRNAの平均発現(F)に従い中央値によって層別されたLUADを有する患者の全生存に関するカプランマイヤー曲線。あらゆる場合において、中央値よりも低い正規化値を有する患者の全生存が高い。それぞれプロットに対するP値を示す:(B)p値=0.073;(D)p値=0.0052;(F)p値=0.02;(G)p値=0.0365。(*名称miR-24-2は遺伝子を指すが、名称miR-24-3pはmiRNAを指す)
【図１４Ａ】生体液中の循環miR-23a-27a-24-2クラスターの検出のためのqPCRアッセイの設定の図である。対照患者の血漿において分析されたmiRNAの概要。
【図１４Ｂ】生体液中の循環miR-23a-27a-24-2クラスターの検出のためのqPCRアッセイの設定の図である。2つの独立したアッセイプレートにおける同じサンプルの選択されたmiRNAの正規化された発現間の相関関係。
【図１４Ｃ】生体液中の循環miR-23a-27a-24-2クラスターの検出のためのqPCRアッセイの設定の図である。2つの独立した実験において分析された同じシリーズの14の対照血漿間のmiR-24の正規化発現値の相関関係。
【図１４Ｄ】生体液中の循環miR-23a-27a-24-2クラスターの検出のためのqPCRアッセイの設定の図である。そのシリーズの対照血漿におけるmiR-24の正規化発現値のヒストグラム。
【図１４Ｅ】生体液中の循環miR-23a-27a-24-2クラスターの検出のためのqPCRアッセイの設定の図である。対照患者の血漿中のmiR-21-5p、miR-23a-3p、miR-24-3p及びmiR-27a-3pの発現を示す箱ひげ図。
【図１５】健康なドナー及びLUAD患者の血漿中の循環miRNAレベルの比較を示すグラフである。健康なドナー(n=14)及びLUAD患者(n=20)の血漿におけるmiR-21-5p(A)、miR-23a-3p(B)、miR-24-3p(C)及びmiR-27a-3p(D)の正規化された発現を示す箱ひげ図。
【００５６】
実施例１．  機能性遺伝子スクリーニングを使用した肺腺癌のシスプラチン抵抗性と関連づけられるmiRNAの特定。
機能性遺伝子スクリーニングは、がん薬物抵抗性遺伝子の発見及び検証に対する極めて有力なアプローチである(Iornsら、2007年)。したがって、本発明者らは、このアプローチを使用して、miRbaseバージョン16に対応するmiRNA模倣物のライブラリーを使用して発現の増加が肺腺癌細胞のシスプラチン抵抗性を誘発するmiRNAを広範囲に特定した。機能獲得データは、約10のmiRNAの過剰発現がシスプラチン抵抗性を再現可能に誘発することを示している(2回行った模倣物ライブラリーを使用した独立した2回のスクリーニング)(図1A)。重要なことに、スクリーニングで特定され、発現の増加がシスプラチン抵抗性と最も関連づけられるいかなるmiRNAも、LUADのシスプラチン応答に影響を及ぼすことは現在示されていない。更に、スクリーニングにおいて特定された10のmiRNAのうちの5つは、A549細胞でも発現した(図1B)。したがって、本発明者らは、まずA549細胞で発現するmiRNA、miR-24-3pに的を絞る選択をし、統計学及びその過剰発現によって付与される抵抗性の程度に従って最良のmiRNA候補として特定した。重要なことに、miR-24-3pは、NSCLCにおいてでもアップレギュレートされることが知られている(Zhaoら、2015年)。
【００５７】
これらの発見を確かなものにするために、シスプラチンの感受性に対するmiR-24-3pの影響をA549細胞株において独立して実証した(図2)。これらの結果は、pre-miR-24-3pでトランスフェクションした(その結果、miR-24-3pを過剰発現している)A549細胞では、シスプラチンに対する応答がmiR-24-3pを過剰発現していない細胞においてよりも低かったことを示した。更に、miR-24-3pを過剰発現しているA549細胞は、特に(ビノレルビン処置と比較)、第2世代プラチナアナログ:オキサリプラチンを含む、プラチナベースの化合物に対して強く抵抗性を示す(すなわち、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチンに対して抵抗性である;図2及びデータは示していない)。
【００５８】
実施例２．  関連するmiR-24-3p標的遺伝子の特定。
関連するmiR-24-3p標的遺伝子を特定するために、本発明者らは、2つの異なる相補的なアプローチを使用した(図3)。
【００５９】
1.miR-24-3p標的候補を生物情報学的アプローチ及び実験的アプローチの組み合わせを使用して特定した。このために、本発明者らは、このmiRNAを過剰発現している又はしていないA549細胞の全遺伝子発現プロフィールを決定し、本発明者らが開発したツールを使用して、(i)3'UTRが1つ(以上)のmiR-24-3p結合部位を含み、(ii)そのアノテーションが細胞死、アポトーシス、細胞生存、細胞周期又は老化と関連づけられるGO用語に対応する、遺伝子に関する生物情報学的調査を行った。これは、本発明者らを、miR-24-3p標的として2つのアポトーシス促進性BH3-onlyタンパク質BIM及びPUMAのルシフェラーゼコンストラクトを使用した特定及び検証に導いた(図4)。
【００６０】
2.(i)発現の低下がA549細胞におけるシスプラチン抵抗性を誘発し、(ii)3'UTRが1つ(以上)のmiR-24-3p結合部位を含む、遺伝子を特定するためのゲノム全域にわたるsiRNAスクリーニング調査により得たデータの比較解析(Galluzziら、2012年)。ゲノム全域にわたるsiRNAスクリーニングアプローチによって明らかになった32の遺伝子のうち、1つのみがその3'UTRにmiR-24-3p結合部位を含み、PDXKは、シスプラチン応答の中心的制御因子であるビタミンB6をリン酸化するキナーゼである(Galluzziら、2012年)。興味深いことに、ビタミンB6の代謝に関与する別の遺伝子、PNPOもその3'UTRに潜在的miR-24-3p部位を含むことがわかり、更に上記のmiR-24-3pシグネチャープロファイリングにおいて抑制されていることがわかった。
【００６１】
実施例３．  miR-24-3pはLUADのシスプラチン誘導細胞死の強力な制御因子である
シスプラチンがDNA傷害を誘導することによって細胞死を開始したため、本発明者らは、シスプラチンに曝露されたA549細胞におけるmiR-24-3pの過剰発現が、アポトーシスが生じる前のATMが関係するDNA損傷応答に影響を与えるかどうかを調査した。本発明者らの結果は、miR-24-3pを過剰発現しているA549細胞が、シスプラチン曝露の7時間後に、腫瘍細胞におけるシスプラチンの配置に影響を及ぼすことなく、低いDNA損傷(リン酸γH2AX核内フォーカスによって評価した)を示し、ATMシグナル伝達も低下することを示した(図5)。
【００６２】
miR-24-3pが関係する抗アポトーシス効果に対するさらなる見識を得るために、本発明者らは、こうした4つの標的及びシスプラチンによって誘導されるカスパーゼ3依存性アポトーシス応答に対するmiR-24-3p調節の影響を更に調査した(図6〜8)。全体的にみて、これらの結果は、miR-24-3pが4つの遺伝子:BIM、PUMA、PDXK及びPNPOを標的とすることによると考えられるシスプラチンによって誘導されるカスパーゼ3依存性アポトーシス応答を強く阻害することを示唆する。
【００６３】
A549細胞のシスプラチンに対する感受性に関する各miR-24-3p標的の寄与を評価するために、これらの細胞をBIM、PUMA、PDXK、PNPOのいずれかに対する個々のsiRNA又はsiRNA対照によりトランスフェクションした。切断カスパーゼ3の発現を使用して、シスプラチンによって誘導されたアポトーシス応答を評価した。図7に示した結果は、siRNAが関係するそれぞれの転写物の欠乏がシスプラチン誘導アポトーシスを低減することを示し、したがって、miR-24-3pがBIM、PUMA、PDXK及びPNPOを直接標的とすることによりシスプラチン抵抗性を助長したことを示した。
【００６４】
A549細胞をmiR-24-3pインヒビター又は対照により24時間トランスフェクションした後、シスプラチンに24時間曝露したか、又はしなかった。その結果は、miR-24-3pの阻害が、アポトーシスの過程の2つの特徴的なマーカーである切断カスパーゼ3及び切断PARPの両方の発現の増加によって示されるA549細胞におけるシスプラチン誘導アポトーシス応答を増加させたことを示した(図8)。これらの結果は、シスプラチンに対して抵抗性である細胞の感受性を高めるためにmiR-24-3pのインヒビターを使用することの可能性を示した。
【００６５】
興味深いことに、このデータは、独立して2つの他のLUAD細胞株、H1299(TP53遺伝子のホモ接合型部分欠失を有する)、及びH1975(TP53遺伝子のc.818G>A突然変異に関してホモ接合型)において確認し、これは、miR-24-3pがp53とは無関係にシスプラチン抵抗性に寄与したことを示唆した(図9)。
【００６６】
実施例４．  インビボ実験
9〜12週齢の雄のC57BL/6マウス及びmiR-24-3pに対して設計したLNA修飾オリゴヌクレオチドを使用してインビボ実験を行った。miR-24-3pのこれらのインヒビターをExiqon社から購入した:配列がTGCTGAACTGAGCC(配列番号11)のLNA miR-24-3pインヒビター番号1及び配列がGCTGAACTGAGCC(配列番号12)のLNA miR-24-3pインヒビター番号2。
【００６７】
図10に示されるとおり、両LNA抗miR-24-3pオリゴヌクレオチド効率は、局所経路(気管内投与)により投与された場合も、全身経路の投与(腹腔内投与)において使用された場合もmiR-24-3pを阻害した。これらの結果は、インビボにおけるmiR-24-3p阻害の実現性を示し、これらのインヒビターがインビボにおけるシスプラチン活性を改善させるために使用することができることを示唆した。
【００６８】
実施例５．  miR-24-2クラスターのmiRNAの発現レベル及びLUADがん患者の予後。
本発明者らは、TCGAデータベースから腫瘍small RNA-seqデータを有するLUAD患者の293症例を収集した。本発明者らは、診断の5年後の患者の生存状態による、患者の2つのサブグループにおけるmiR-24-3pの発現を分析し、全体的な発現が生きている患者と死亡した患者の間で有意に異なることがわかった(図13、パネルA)。興味深いことに、本発明者らは、同じクラスターから発現した2つの他の成熟miRNAによる同様のデータを見出した(図13、パネルB及びC)。カプランマイヤー生存解析から、これら3つのmiRNAのそれぞれの発現が高い患者の群が低発現群と比較して短い生存期間を有することが明らかになった(図13、パネルD、E及びF)。これらのデータもクラスターの3つのmiRNAの平均発現値を使用して確認した(図13、パネルG)。
【００６９】
これらのデータは、miR-24-3pの高い発現レベルがLUADがん患者の不良な予後と関連づけられることを示した。したがって、患者を層別化するため及びシスプラチン処置に対する不良な治療応答に関してリスクがある患者を選択するためにmiR-24-3p(及びクラスターの他の2つのメンバー)の発現レベルを測定することが臨床的に適切である可能性がある。
【００７０】
そのようなアッセイは、対象から得た生体サンプルを接触させて、少なくとも1つ(例えば、1つ、2つ、3つ)のmiR-23a-3p、miR-24-3p及びmiR-27a-3pのレベル(又はこれら3つのmiRNAの平均レベル)を検出することを含む。この場合、予め定義された基準レベルを超えるこれらのmiRNAの発現のレベルが、不良な治療応答のリスクがあると予想される対象を特定した。
【００７１】
少なくとも1つのmiR遺伝子産物のレベルは、対象から得た生体サンプルの細胞において測定することができた。例えば、組織サンプルは、肺の手術後又は従来の生検技術によって対象から取り出すことができた。別の例において、血液サンプルは、対象から取り出すことができ、循環RNAは、標準的な技術によって単離することができた。血液又は組織サンプルは、任意の治療的処置(放射線療法又は化学療法)の開始に先立って、好ましくは、診断時に対象から得ることができた。対応する対照肺組織サンプルは、対象の罹患していない組織から得ることができた(肺の手術の場合、対応する正常な周囲組織)。対照組織又は血液サンプルは、その後、対象のサンプルとともに処理し、その結果、対象のサンプルの成熟miRNAのレベルを対照サンプルの対応するレベルと比較することができた。対照サンプル中の対応するmiRNA遺伝子産物のレベルに対する、対象から得たサンプル中のmiR-23a-3p/miR-24-3p/miR-27a-3pの発現のレベルの増加は、腫瘍の攻撃性及びシスプラチン抵抗性を示す可能性があった。他のリスクがあるLUAD患者を特定するために使用される閾値は、RECIST基準に従って(プラチナベースの化学療法薬を含む)化学療法に対する初期応答が分かっているLUAD患者の有望なコホートに対して発現分析を実施することによって得ることができる。100の患者サンプル(腫瘍組織及び対応する正常な周囲組織及び血漿)の選択は、Nice Hospital Tumor Biobank (Pr Paul Hofman)の支援を受けて現在も継続しており、miR-23a-3p/miR-24-3p/miR-27a-3pの発現レベルは、TCGAコホートに対して得たデータを統合するために以下に示される方法を使用して行われる。
【００７２】
サンプル中のmiRNA遺伝子産物のレベルは、生体サンプル中のRNA発現レベルを検出するのに適した任意の技術を使用して測定することができる。生体サンプルの細胞中のRNA発現レベルを求めるのに適した技術(例えば、qRT-PCR、インサイツハイブリダイゼーション、small RNA-Seq、マイクロアレイ)は、当業者に周知である。
【００７３】
実施例６．  miR-23a-27a-24-2クラスターはLUADのシスプラチン抵抗性を助長する
miR-24-3pは、1つの一次miRNAとして転写されたmiRNAクラスターの一部であり、その後、3つの成熟miRNA:miR-23a-3p、miR-27a-3p及びmiR-24-3pにプロセシングされるため、本発明者らは、miR-23a-3p及び/又はmiR-27a-3pもシスプラチン抵抗性に寄与するかどうか評価した。A549 LUAD細胞株において実施された本発明者らの結果は、miR-24-3pよりも低い程度ではあるが、miR-23a-3pの過剰発現もA549細胞のシスプラチン抵抗性を誘発することが可能であることを示した(図11)。興味深いことに、本発明者らは、これらのmiRNAの間にいくつかの共通の予想される標的を発見し、それらのいくつかはアポトーシス性/壊死性細胞死及びPPIF及びNEK6等のDNA損傷と関連づけられている(図12)。
【００７４】
実施例７．  シスプラチン抵抗性を予測するためのバイオマーカーとしてのmiR-24-3p
TCGAからのデータの解析は、miR-24-3p及びそのクラスターの他のメンバーの高い発現レベルがLUADがん患者の不良な予後と関連づけられることを示した(図13)。本発明者らは、シスプラチン抵抗性の予測のためのLUAD患者の肺組織又は血漿中のmiR-24-3p発現の予測値を特に評価するために局地的な有望なコホート(P. Hofman及びC-H Marquette、CHU Nice)を作り上げた。この目的のため、生体液中の循環miR-23a-27a-24-2クラスターの検出のためにマルチプレックスqPCRプロトコルを設定した(図14)。データは、本発明者らが14人の健康なドナーのコホートからの血漿中のmiR-23a-27a-24-2クラスターを含む60を超えるmiRNA候補のレベルを再現性よく測定できたことを示した。LUAD患者(さまざまな診断ステージ)からの第1のセットの20の血清に対して得た事前のデータは、miR-23a-27a-24-2クラスターの血中レベルが健康なドナーと比較してLUADではアップレギュレートされたことを示した(図15)。
【００７５】
方法
RNA単離。肺組織及び細胞サンプルからTRIzol溶液(Invitrogen社)により全RNAを抽出した。RNAの完全性は、Agilent BioAnalyser 2100(Agilent Technologies社)を使用することによって評価した(RIN 7超)。
【００７６】
成熟miRNA発現。miR-24-3p発現を、プロトコルに明記されるとおりにTaqMan MicroRNA Assay (Applied Biosystems社)を使用して評価した。Universal Master Mix (Applied Biosystems社)及びABI 7900HTリアルタイムPCR装置を使用してリアルタイムPCRを実施した。成熟マイクロRNAの発現レベルを、比較CT法(2-デルタCT)を使用して評価した。miRNA精製した血漿に対して、miScript Microfluidics PCR Kit(Qiagen社)を使用してBiomark装置(Fluidigm社)においてマルチプレックスqPCRアッセイを行った。正規化は、200μlの血漿からRNAを抽出する前に添加した外因的なスパイクインコントロール(spike-in control)を使用して行った。
【００７７】
発現マイクロアレイ。遺伝子発現アレイに関して、供給業者によって推奨されるとおりにlow RNA input QuickAmp kit(Agilent社)を使用してRNAサンプルをCy3色素で標識した。825ngの標識cRNAプローブを8x60K高密度ヒトAgilentマイクロアレイにおいてハイブリダイズさせた。それぞれの比較に対して2回の(生物学的反復実験を行った。データをlog2変換し、Rプログラミング環境において循環loess(cyclic loess)アルゴリズムを使用して正規化した。
【００７８】
トランスフェクション。Pre-miR-24-3p、及び対照miRNA(miR-Neg # 1)をLife technologies社から購入した。miR-24-3pノックダウン実験のために、LNA抗miR-24-3p及びLNA陰性対照をExiqon社に注文した。BIM、PUMA、PNPO及びPDXKに対するsiRNAを、Life technologies社から購入した。A549細胞及びH1299細胞をDMEM中の10% FCSにおいて増殖させ、示されていない限り5nMの最終濃度のpre-miRNA、siRNA LNAインヒビターによりLipofectamin RNAi MAX(商標)(Life technologies社)を使用して6、12又は96ウェルプレート中、30から40%の培養密度でトランスフェクションした。
【００７９】
ルシフェラーゼアッセイ。XhoI及びNotI制限部位においてウミシイタケルシフェラーゼの後ろにクローニングすることによってpsiCHECK-2(Promega社)において分子コンストラクトを作製し、BIM、PUMA 3' UTR由来のオリゴヌクレオチドとアニーリングした。HEK293細胞を96ウェルに播き、lipofectamin 2000(Invitrogen社)を使用して0.2μgのpsiCHECK-2プラスミドコンストラクト及び異なる濃度のpre-miR-24-3p又は対照miRNAによりコトランスフェクションした。トランスフェクションの48時間後、ホタル及びウミシイタケルシフェラーゼ活性をDual-Glo Luciferaseアッセイ(Promega社)を使用して測定した。
【００８０】
アネキシンVアッセイ。アネキシンV-FITCアポトーシス検出キット(Life technologies社)を使用して、アポトーシス活性を検出した。細胞を回収し、結合バッファーに再懸濁させ、アネキシンV-FITC及びヨウ化プロピジウムとともに暗所において15分間インキュベーションした。アネキシン-V-FITC結合は、FITCシグナル検出器(FL1)を使用してフローサイトメトリー(励起波長488nm;蛍光波長530nm)によって測定し、ヨウ化プロピジウム染色はフィコエリトリン蛍光シグナル検出器(FL2)によって検出した。
【００８１】
機能性遺伝子スクリーニング。本物であることが立証されたA549肺腺癌細胞株において96ウェルプレート方式で模倣物をトランスフェクションした。トランスフェクションの48時間後、細胞を60μM(DL50の2倍;DL50は腫瘍細胞の50%を死滅させる薬物濃度に相当する)のシスプラチンに3日間曝露した。cell titer gloアッセイ(Promega社)を使用して生存度を評価した。各サンプル値をプレート上のすべてのサンプルの中央値で割ることによって正規化を行った(したがって、サンプルウェルの大部分が基準として働くことになる)。ヒットは、ランクプロダクト(rank-product)法を使用して特定した。正規化及び統計学は、Rソフトウェア環境を使用して行われる。
【００８２】
miRNA候補選択。統計的有意性(p<0.01)及び誘発された抵抗性の程度(薬物曝露後の生存度によって評価した、正規化生存度3超)に基づいてさらなる分析のためにmiRNA候補を選択した。
【００８３】
miR-24-3pに関する機能性遺伝子スクリーニングの検証。異なる肺腺癌細胞株(H1299)に対するデータを独立して確認した。ドセタキセル及びビノレルビンを使用してシスプラチン抵抗性に対する特異性を評価した。
【００８４】
miRNA標的解析。MiRonTopは、DNAマイクロアレイデータを統合して、特定の生物系に対するmiRNAの密接な関係の可能性を特定するオンラインjavaウェブツール(http://www.microarray.fr:8080/miRonTop/indexで利用可能)である(Lebrigandら、2010年)。簡単にいえば、MiRonTopは、発現レベル及び発現差異に関する閾値により転写物を2つのカテゴリー(「アップレギュレート」及び「ダウンレギュレート」)に分類する。その後、それは、各セットの遺伝子において選択された予測ソフトウェア(Targetscan、MiRBase、PicTar、厳密なシード検索:miRNAの最初の2〜7又は1〜8ヌクレオチド、TarBase v1)によりそれぞれのmiRNA対して予想される標的の数を算出する。各カテゴリーにおけるmiRNA標的の豊富さを、その後、超幾何関数を使用して検定する。
【００８５】
タンパク質抽出及びイムノブロッティング。細胞を溶解バッファー(M-PERタンパク質抽出試薬)及びプロテアーゼインヒビターカクテル(Pierce社)に溶解させた。ブラッドフォードアッセイ(Biorad社)を使用してライセートのタンパク質濃度を定量した。タンパク質(サンプル当たり10μg)をSDSポリアクリルアミドゲルによって分離し、ニトロセルロース膜(GE Healthcare社)に転写した。その膜を0.1% Tween-20(TBS-T)を含むトリス緩衝生理的食塩水(TBS)中の5%無脂肪乳でブロッキングした後、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベーションした。TBS-Tにより室温で30分間洗浄した後、その膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体とともに1.5時間更にインキュベーションした後、TBS-Tで30分間洗浄した。タンパク質バンドをAmersham ECL基質(GE Healthcare社)により視覚化した。
【００８６】
免疫蛍光解析。12マルチウェルプレートの内側に置いた円形カバーガラス直径16mm(thermo scientific社)上でA549細胞を増殖させた。カバーガラスをリン酸緩衝生理的食塩水中で洗浄し、4%パラホルムアルデヒド中で15分間固定した後、細胞を0.1% Triton X-102(Agilent Technologies社)を使用して10分間透過させ、BSA(3%)を含有するPBS溶液で30分間ブロッキングした。一次抗体とのインキュベーションは、ブロッキング溶液BSA(1%)中、37℃で1時間行った。PBSによる3回の洗浄後、細胞を二次抗体とともにインキュベーションした。45分後に、DAPI含有ProLong Gold褪色防止試薬(Invitrogen社)を使用してカバーガラスを顕微鏡スライドに固定した。蛍光をFV10i Olympus共焦点走査型顕微鏡で見た。
【００８７】
細胞内プラチナの定量。全細胞プラチナ蓄積実験のために、氷冷PBSで徹底的に洗浄した後、RIPA溶解バッファー中で細胞を溶解させ、インキュベーターにおいて一晩安定させた。プラチナの細胞内定量は、原子吸光分析(AA分光計)によって測定した。プラチナレベルは、タンパク質レベルに対して正規化した。
【００８８】
シスプラチン-GG DNA付加体の検出。特定のDNAプラチネーション(platination)産物の免疫蛍光染色及び測定を基本的に以前に記載された(Liedertら、Nucleic Acids Res、2006、34、e47頁)とおりにCDDP-GG DNA付加体を特異的に認識するラット一次抗体(RC-18)を使用して行った。
【００８９】
Charles River社から購入した9〜12週齢の雄のC57BL/6マウスを使用してインビボ実験を行った。miR-24-3pに対して設計したLNA修飾オリゴヌクレオチドをExiqon社から購入した:配列がTGCTGAACTGAGCC(配列番号:11)のLNA miR-24-3pインヒビター番号1及び配列がGCTGAACTGAGCC(配列番号:12)のLNA miR-24-3pインヒビター番号2。前記LNA miR-24-3pインヒビターをPBSに溶解させた後、MicroSprayer Aerosolizer(5mg/kgの単回用量)を使用して気管内に又はインスリンシリンジ(10mg/kgの単回用量)を使用して腹腔内に注射した。miR-24-3pインヒビター注射の3日後、肺を採取し、フェノールクロロホルム法を使用して全RNAを抽出した。
【００９０】
RT qPCR:製造業者によって指定されたとおりにTaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit及びTaqMan MicroRNA Assays(Thermo Fisher Scientific社)を使用してmiRNA発現を評価した。Universal Master Mix II(Thermo Fisher Scientific社)及びABI 7900HTリアルタイムPCR装置を使用してリアルタイムPCRを行った。比較CT法を使用して成熟マイクロRNAの発現レベルを評価した。正規化のために、SN0251(マウスサンプル)の転写物レベルを、miRNAリアルタイムPCRのための内在性コントロールとして使用した。
【００９１】
（参考文献）
2020502263.tif 000002
【図１】
2020502263.tif 000003
【図２】
2020502263.tif 000004
【図３】
2020502263.tif 000005
【図４】
2020502263.tif 000006
【図５】
2020502263.tif 000007
【図６】
2020502263.tif 000008
【図７】
2020502263.tif 000009
【図８】
2020502263.tif 000010
【図９】
2020502263.tif 000011
【図１０】
2020502263.tif 000012
【図１１】
2020502263.tif 000013
【図１２】
2020502263.tif 000014
【図１３】
2020502263.tif 000015
【図１４Ａ】
2020502263.tif 000016
【図１４Ｂ】
2020502263.tif 000017
【図１４Ｃ】
2020502263.tif 000018
【図１４Ｄ】
2020502263.tif 000019
【図１４Ｅ】
2020502263.tif 000020
【図１５】
2020502263.tif 000021
【配列表】
2020502263000001.app
【国際調査報告】
2020502263.tif 000022
2020502263.tif 000023
2020502263.tif 000024