(57)【要約】  本発明は、イヌ対象の口腔の炎症性疾患または状態を予防または治療する方法のために用いられる単離アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、イヌＩＣＡＭ−１に対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明はさらに、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物または製品に関する。
2020528443.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イヌ対象の口腔の炎症性疾患または状態を予防または治療する方法のために用いられる単離アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
（ｉ）配列番号１によるヌクレオチド配列；または
（ｉｉ）少なくとも１４個のヌクレオチドを有する配列番号１によるヌクレオチド配列の断片
を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記口腔の炎症性疾患または状態が歯周疾患または状態である、請求項１に記載の単離アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記歯周疾患または状態が歯肉炎、慢性歯周炎、侵襲性歯周炎、全身性疾患の発現としての歯周炎、壊死性潰瘍性歯肉炎、壊死性潰瘍性歯周炎、歯周組織の膿瘍、および歯周−歯内病変の組み合わせからなる群より選択される、請求項２に記載の単離アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
少なくとも１４個のヌクレオチドを有する配列番号１によるヌクレオチド配列の断片を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
少なくとも１６個のヌクレオチドを有する配列番号１によるヌクレオチド配列の断片を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
配列番号１によるヌクレオチド配列を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドが１４〜５０塩基の長さを有する、請求項４に記載の単離アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
前記オリゴヌクレオチドが１６〜５０塩基の長さを有する、請求項５に記載の単離アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
前記オリゴヌクレオチドが１８〜５０塩基の長さを有する、請求項６に記載の単離アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
前記断片のみからなる、請求項４または請求項５に記載の単離アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１によるヌクレオチド配列のみからなる、請求項６に記載の単離アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
基礎ＩＣＡＭ−１発現を抑制する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の単離アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に定義される単離アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物または製品。
【請求項１４】
イヌ用飼料、イヌ用チューインガム、イヌ用咀嚼玩具、イヌ用咀嚼骨、イヌ用デンタルガム、イヌ用歯ブラシ、イヌ用指ブラシ、イヌ用口腔衛生ペーストもしくはゲル  、イヌ用マウスウォッシュもしくはデンタルリンス、犬用歯磨き粉、イヌ用口腔衛生スプレー、イヌ用歯研磨剤、またはイヌ用練り歯磨きである、請求項１３に記載の組成物または製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イヌ対象の口腔の炎症性疾患または状態を予防または治療する方法のために用いられる単離アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、イヌＩＣＡＭ−１に対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明はさらに、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物または製品に関する。
【背景技術】
【０００２】
歯周炎、すなわち歯肉、歯周靭帯および歯槽の炎症、ならびに後期のセメント質および顎骨の損傷は、イヌの口腔の最も流行性の疾患である。５歳という若齢でも、５匹のイヌのうち４匹が検出可能な歯周炎を示す。この疾患は単なる美容上の問題ではなく、全身状態の悪化につながり、内臓の炎症を促進するおそれがある。
【０００３】
イヌの歯周炎の高い有病率とは対照的に、関連する症状の多くは慢性的でやや微妙な進行を示すため、疾患が診断されるのがしばしば遅れるまたは遅すぎることさえある。しかしながら、健康な口腔の再確立は、疾患の進行とともにますます困難になる。
【０００４】
したがって、持続的な歯科衛生が不可欠であり、獣医または獣医学歯科医での定期的な管理および治療が極めて重要である。さらに、イヌの飼い主が歯周炎を防ぐためのいくつかの手段、最も重要なことにはイヌの歯の定期的なブラッシングを講じることができる。さらに、イヌの歯の十分な摩耗を保証する咀嚼玩具が利用可能である。それにもかかわらず、イヌ歯周炎を予防および治療するための単純で効率的な手段の必要性は依然として大きい。
【０００５】
これに関連して、イヌ歯周炎の従来の治療法は経験および合理的設計に基づいているが、炎症の分子病理機序を考慮していない。したがって、病理機序に基づいた治療選択肢が、高い有効性の優れた可能性を有すると想定するのが妥当と思われる。
【０００６】
炎症過程を予防または治療するための細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１；ＣＤ５４）の抑制は、当技術分野でかねてから知られている。ヒトでは、ＩＣＡＭ−１に対して向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用が記載されている。しかしながら、イヌＩＣＡＭ−１の抑制に基づいてイヌ歯周炎を予防または治療する手段は、これまでのところとらえどころのないものであった。
【０００７】
しかしながら、従来の治療は経験的または部分的に合理的であるが、炎症の分子病理機序とは関係ない。したがって、分子機序に基づいた治療は、高い有効性の優れた可能性を有する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、本発明の根底にある技術的課題は、イヌ歯周炎およびイヌ対象の口腔の他の炎症性疾患または状態を予防または治療するための単純で効率的な手段を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記の技術的課題の解決は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態によって達成される。
【００１０】
特に、第１の態様では、本発明は、イヌ対象の口腔の炎症性疾患または状態を予防または治療する方法のために用いられる単離アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、
（ｉ）配列番号１によるヌクレオチド配列；または
（ｉｉ）少なくとも１４個のヌクレオチドを有する配列番号１によるヌクレオチド配列の断片
を含むオリゴヌクレオチドに関する。
【００１１】
これに関連して、本明細書で使用される特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトにおいて刺激されたＩＣＡＭ−１発現を抑制することが当技術分野で知られている。しかしながら、刺激された発現とは対照的に、ヒトにおける基礎ＩＣＡＭ−１発現のレベルは、前記オリゴヌクレオチドによって抑制されない。対照的に、本発明は、イヌ対象で、基礎ＩＣＡＭ−１発現が本発明の特異的アンチセンスオリゴヌクレオチドによって有利かつ予想外に有意な程度まで抑制されることを特定した。
【００１２】
好ましい実施形態では、本発明によって予防または治療される口腔の炎症性疾患または状態が、歯周疾患または状態、より好ましくは歯肉炎、慢性歯周炎、侵襲性歯周炎、全身性疾患の発現としての歯周炎、壊死性潰瘍性歯肉炎、壊死性潰瘍性歯周炎、歯周組織の膿瘍、および歯周−歯内病変の組み合わせからなる群より選択される歯周疾患または状態である。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明の単離アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１の少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個または１７個のヌクレオチドを有する配列番号１によるヌクレオチド配列の断片を含む、すなわち、前記断片が、配列番号１の１４個、１５個、１６個または１７個のヌクレオチドを有する。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、前記断片のみからなる、すなわち、前記オリゴヌクレオチドが、１４個、１５個、１６個または１７個のヌクレオチドの長さを有する。前記断片を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは少なくとも１４個、１５個、１６個または１７個のヌクレオチド、および最大で５０塩基以下、より好ましくは４０塩基以下、より好ましくは３０塩基以下、より好ましくは２５塩基以下、最も好ましくは２１塩基以下の長さを有する。
【００１４】
特に好ましい実施形態では、本発明の単離アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号１によるヌクレオチド配列全体を含む。好ましくは、前記オリゴヌクレオチドが、前記ヌクレオチド配列のみからなる、すなわち、前記オリゴヌクレオチドが１８個のヌクレオチドの長さを有する。前記ヌクレオチド配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは１８〜５０塩基、より好ましくは１８〜４０塩基、より好ましくは１８〜３０塩基、より好ましくは１８〜２５塩基、最も好ましくは１８〜２１塩基の長さを有する。
【００１５】
本発明の単離アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野で知られているオリゴヌクレオチド修飾、例えばＬＮＡ（ロックされた核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ））修飾などのアンチセンスオリゴヌクレオチド−標的ＲＮＡ複合体の安定性を高める修飾を含むことができる。
【００１６】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様について上に定義される単離アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物または製品に関する。
【００１７】
好ましくは、組成物または製品が、イヌ用飼料、イヌ用チューインガム、イヌ用咀嚼玩具、イヌ用咀嚼骨、イヌ用デンタルガム、イヌ用歯ブラシ、イヌ用指ブラシ、イヌ用口腔衛生ペーストまたはゲル、イヌ用マウスウォッシュまたはデンタルリンス、犬用歯磨き粉、イヌ用口腔衛生スプレー、イヌ用歯研磨剤、イヌ用練り歯磨き、あるいは口腔衛生および／または口腔の健康を改善する任意の製剤または混合物である。本発明のオリゴヌクレオチドをそれぞれの組成物または製品に組み込む手段は特に限定されず、当技術分野で知られている。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ＮＭ＿００１００３２９１によるイヌＩＣＡＭ−１：アンチセンスオリゴヌクレオチドの局所標的配列および配列位置（アンチセンス種ａｓ１５５９ａ（配列番号２）、ａｓ１５５９ｂ（配列番号１）、ａｓ１５５９ｃ（配列番号３）および陰性対照、すなわち、スクランブル配列ｓｃ１２８４（配列番号４））を示す図である。
【図２】イヌＩＣＡＭ−１の基礎遺伝子発現のａｓ１５５９ｂ媒介阻害の用量依存性を示す図である。
【図３】ａｓ１５５９由来アンチセンス種によるＩＣＡＭ−１の基礎発現の抑制を示す図である。播種時の細胞密度２５００００細胞／ウェルおよび２０時間のインキュベーション時間で測定したデータを左パネルに示し、播種時の細胞密度５０００００細胞／ウェルおよび４４時間のインキュベーション時間での測定値を右パネルに示す。ここでは、オリゴヌクレオチド処理の２０時間前に、ＤＨ８２細胞を１２ウェル組織培養プレートに２５００００または５０００００細胞／ウェルの密度で播種した。リポフェクタミン２０００を最終濃度５μｇ／ｍＬで４時間使用して、細胞を１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、本明細書に記載されるその後の分析のために、トランスフェクションの２０時間または４４時間後に収集した。さらなる実験の詳細については、以下の「材料および方法」の節を参照されたい。エラーバーは、細胞培養で２連で行った４つのＰＣＲ実験からの標準偏差を表す。
【図４】ＩＣＡＭ−１のイヌ遺伝子発現の基礎レベルはａｓ１５５９ｂによって抑制することができるが、ａｓ１５５９ａによってもａｓ１５５９ｃによっても抑制することができず（右のバー群）、ヒトＥＣＶ−３０４細胞では有意には抑制できない（左のバー群）ことを示す図である。
【図５】アンチセンスオリゴヌクレオチドａｓ１５５９ｂが、イヌ細胞での高い再現性および有効性を特徴とすることを示す図である。オリゴヌクレオチド処理の２４時間前に、ＤＨ８２細胞を１２ウェル組織培養プレートに２５００００細胞／ウェルの密度で播種した。リポフェクタミン２０００を最終濃度５μｇ／ｍＬで４時間使用して、細胞を１００ｎＭアンチセンスオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、ＲＴｑＰＣＲによってＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡレベルを測定するために、トランスフェクションの２０時間後に収集した。さらなる実験の詳細については、以下の「材料および方法」の節を参照されたい。エラーバーは、細胞培養でそれぞれ３連で行った３つの独立した生物学的実験の標準偏差を表す。
【００１９】
本発明を以下の実施例でさらに説明するが、これらに限定されるものではない。
実施例
【００２０】
材料および方法：
細胞株および細胞培養：
細胞株ＤＨ８２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、ミュンヘン、ドイツ）を、悪性組織球増殖症の１０歳の雄ゴールデンレトリバーから得た。細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で、３．７  ｇ／Ｌ  ＮａＨＣＯ３、４．５  ｇ／Ｌ  Ｄ−グルコース、安定グルタミン、ピルビン酸Ｎａ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）および１５％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＧｍｂＨ、ベルリン、ドイツ）を補充したダルベッコのＭＥＭで維持し、１週間に２〜３回分割した。
【００２１】
細胞株ＥＣＶ−３０４は、誘導性様式でＩＣＡＭ−１を発現するヒト膀胱癌細胞株Ｔ−２４の誘導株である。細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃で、ＨＥＰＥＳ（２５  ｍＭ）、０．６８  ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ダイゼンホーフェン、ドイツ）および１０％ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カールスバッド、米国）を含有する培地１９９で維持し、１週間に２〜３回分割した。ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）の刺激のために、２００  Ｕ／ｍｌのインターロイキン１β（ＩＬ−１β；  ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、ハイデルベルク、ドイツ）を培地に添加し、細胞を一晩１６〜１８時間インキュベートした。
ａｓＯＮによる細胞のトランスフェクション：
【００２２】
オリゴヌクレオチドによるトランスフェクションの２０時間前に、ＤＨ８２細胞を１２ウェル組織培養プレートに２．５×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カールスバッド、米国）を用いたトランスフェクションミックスの調製を、製造業者の指示に従って行った。細胞のトランスフェクションを、１ウェル当たり様々な濃度のａｓＯＮ（１２．５  ｎＭ〜２００  ｎＭ）および５  μｇ／ｍＬのリポフェクタミン２０００を含有する０．５  ｍＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カールスバッド、米国）で行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。その後、トランスフェクション培地を１５％ＦＣＳを含有する新鮮なＤＭＥＭ培地に交換し、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。
【００２３】
オリゴヌクレオチド処理の１５時間前に、ＥＣＶ−３０４細胞を１２ウェル培養プレートに２．０×１０５細胞／ウェルの密度で播種した。リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カールスバッド、米国）を用いたトランスフェクションミックスの調製を、製造業者の指示に従って行った。ａｓＯＮのトランスフェクションを、１ウェル当たり１００  ｎＭのａｓＯＮおよび５  μｇ／ｍＬのリポフェクチンを含有する１．０  ｍＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カールスバッド、米国）で行った。細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。その後、トランスフェクション培地を１０％ＦＣＳを含有する培地１９９に交換した。３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートした後、培地を１０％ＦＣＳおよび２００Ｕ／ｍＬのＩＬ−１βを含有する培地１９９で置換して、１６〜１８時間ＩＣＡＭ−１発現を刺激した。全ての細胞培養実験を、３連で、少なくとも２回の独立した実行で行った。
【００２４】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成および定量的ＰＣＲ：
Ｑｉａｚｏｌ試薬（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）を使用して、トランスフェクト細胞から全細胞ＲＮＡを抽出した。その後、製造業者の指示に従って、ＲＮＡをＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅ（Ａｍｂｉｏｎ  ｂｙ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カールスバッド、米国）で処理した。ＲＮＡの収量および純度を、分光光度法によって決定した。
【００２５】
ｃＤＮＡの合成を、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キットおよび２００ｎｇのランダムヘキサマープライマー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カールスバッド、米国）を使用して、等量のＲＮＡ（３μｇ）を含む２０μｌの容量で逆転写によって行った。
【００２６】
定量的ＰＣＲを、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ダルムシュタット、ドイツ）およびＳＹＢＲ  Ｓｅｌｅｃｔ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ、カールスバッド、米国）を使用して行った。イヌＩＣＡＭ−１  ｃＤＮＡ（３ｎｇ／ＰＣＲ）を順方向プライマー５’−ＴＧＡＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＴＣＴＴＡＧＧＡＡ−３  ’（配列番号５）および逆方向プライマー５’−ＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＴＧＧＣ−３’（配列番号６）で増幅し、１２４ｂｐの断片を得た。イヌ１８Ｓ  ｃＤＮＡ（０．０３  ｎｇ／ＰＣＲ）を順方向プライマー、５’−ＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧ−３  ’（配列番号７）および逆方向プライマー、５’−ＧＡＣＴＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＧＧＡＴＣＣ−３’（配列番号８）で増幅し、１５２ｂｐの産物を得た。全てのｑＰＣＲの実行を、９５℃で２分間、次いで、９５℃で１５秒間と６０℃で６０秒間の４０サイクルで行った。反応の特異性を、融解曲線分析によって検証した。各反応を３連で実行した。各試料のｍＲＮＡ発現レベルを１８Ｓ  ｒＲＮＡの量に正規化し、比較ΔＣｔ法によって分析し、陰性対照（ｓｃ１２８４）に対する相対量として表した。
【００２７】
ヒトＥＣＶ−３０４細胞の実験では、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ、ヒルデン、ドイツ）による処理を含むＲＮｅａｓｙミニキットを使用して、トランスフェクト細胞から総ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの収量および純度を、分光光度法によって決定した。ｃＤＮＡの合成を、製造業者の仕様（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｂｙ  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カールスバッド、米国）に従って、ランダムヘキサマープライマーおよびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＮａｓｅ  Ｈ逆転写酵素を使用して行った。ＩＣＡＭ−１の遺伝子発現を定量的ＰＣＲによって分析した。したがって、ＳＹＢＲグリーンＰＣＲコア試薬（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｓｅｒａｉｎｇ、セラン、ベルギー）を使用して、１００ｎｇの逆転写ＲＮＡを分析した。反応を、それぞれ３００ｎＭの遺伝子特異的５’および３’プライマーを含有する５０μｌで行い、ＧｅｎｅＡｍｐ  ５７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ダルムシュタット、ドイツ）でアッセイした。ヒトＩＣＡＭ−１  ｃＤＮＡを、順方向プライマー５’−ＧＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＡＡＧＴＣＴＧＴＧＧＧ−３  ’（配列番号９）および逆方向プライマー５’−ＣＴＡＣＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＧ−３’（配列番号１０）で増幅した。試料を、ヒトＧＡＰＤＨをコードするｃＤＮＡに特異的なプライマー（順方向プライマー、５’−ＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＣ−３  ’（配列番号１１）および逆方向プライマー、５’−ＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧＴＧＴＧＧＴ−３’（配列番号１２））を使用して正規化した。各ＰＣＲ実行内で、全ての増幅反応を３連で行った。結果を、１００％に設定した対照ＯＮでの発現の割合として表す。
【００２８】
実施例１：
イヌＩＣＡＭ−１の発現は、ａｓ１５５９ｂによって濃度依存的に抑制される。
図２は、イヌＤＨ８２細胞におけるＩＣＡＭ−１発現の基礎レベル（１００％）をアンチセンスオリゴヌクレオチドａｓ１５５９ｂによって濃度依存的に抑制することができることを示している。この実験は上記のように行った。詳細には、トランスフェクションの２０時間後に、ＲＮＡを単離し、ＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡならびに１８Ｓ  ｒＲＮＡのレベルをＲＴ−ｑＰＣＲによって３連で測定した。各試料のＩＣＡＭ−１発現レベルを、最初に１８Ｓ  ｒＲＮＡの量に正規化し、次いで、同じ総用量で対照オリゴヌクレオチド（ｓｃ１２８４）でトランスフェクトした細胞と比較した。図２は、３連でのＲＴ−ｑＰＣＲベースの定量化の平均および標準偏差を示している。
【００２９】
これに関連して、ＩＣＡＭ−１のこの濃度依存的抑制は、サイトカイン刺激レベルではなく、ヒト系では決して観察されなかった基礎遺伝子発現のレベルで起こることに留意すべきである。ヒト細胞では、比較可能な実験条件下で、基礎遺伝子発現はａｓＯＮの影響を受けることができなかった。
【００３０】
実施例２：
ａｓ１５５９ｂによるＩＣＡＭ−１の基礎遺伝子発現の実質的な抑制。
３つのａｓ１５５９関連アンチセンスオリゴヌクレオチドは全て、イヌＤＨ８２細胞におけるＩＣＡＭ−１の遺伝子発現の基礎レベルを抑制する。しかしながら、ａｓ１５５９ｂの使用で最大の標的阻害が観察される（図３、図５）。この実験では、ＤＨ８２細胞（２５０．０００細胞／ウェル）を、５μｇ／ｍｌのリポフェクタミン２０００を含有するＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ培地で４時間、それぞれ１００ｎＭの最終濃度のオリゴヌクレオチドａｓ１５５９ａ、ａｓ１５５９ｂまたはａｓ１５５９ｃでトランスフェクトした。トランスフェクションの２０時間後に細胞を収集した。ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成および定量的ＰＣＲを、上記のように行った。各試料のＩＣＡＭ−１発現レベルを、最初に１８Ｓ  ｒＲＮＡの量に正規化し、次いで、同じ総用量で対照オリゴヌクレオチド（ｓｃ１２８４）でトランスフェクトした細胞と比較した。図２、図３および図５は、３連でのＲＴ−ｑＰＣＲベースの定量化の平均および標準偏差を示している。
【００３１】
ａｓ１５５９ａおよびａｓ１５５９ｃと比較した１５５９ｂの有効性の増加は、初期細胞密度が低く、観測時間が短い場合は中程度で有意であるが、初期細胞密度が高く、観測時間が長い場合にａｓ１５５９ｂは大幅に効率的に作用する。要約すると、ａｓ１５５９ｂは、細胞密度およびａｓ１５５９ｂへの曝露期間に応じて、正常な発現レベルの５０％の範囲で堅牢かつ再現可能なＩＣＡＭ−１発現の基礎レベルの驚くほど強い阻害を示すと結論付けらる。
【００３２】
実施例３：
アンチセンスオリゴヌクレオチドａｓ１５５９ｂは、イヌ細胞で驚くほど効率的である。
【００３３】
ＩＣＡＭ−１に対する３つのアンチセンス種全て、すなわちａｓ１５５９ａ、ａｓ１５５９ｂおよび１５５９ｃはそれぞれ、それらの標的の同じ局所標的モチーフ、すなわちＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡに対して向けられている（図１）。
【００３４】
ＩＣＡＭ−１の遺伝子発現に関して、これは基礎レベルと刺激範囲に細分されることに留意すべきである（図４、右パネルおよびＹ軸参照）。この分割は、オリゴヌクレオチドベースの阻害剤に対する反応性が異なるため重要である。ヒト細胞、およびおそらく他の哺乳動物でＩＣＡＭ−１遺伝子発現の刺激範囲を完全に抑制することは極めて容易であるが、この図で１００％に設定されている基礎発現レベルを下方制御することは非常に困難である。ほとんどのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび多くのｓｉＲＮＡもまた、この基礎範囲のＩＣＡＭ−１発現に有意な影響を及ぼさない。
【００３５】
図４に示されるデータは、３つのアンチセンスオリゴヌクレオチドのいずれも、ヒト細胞の基礎遺伝子発現に実質的な効果を示さないことを実証している（左パネル）。これは、イヌ細胞においてａｓ１５５９ａおよびａｓ１５５９ｃによって媒介される強い効果の欠如によって反映されている（右パネル）。２つの理由のために、ａｓ１５５９ｂがイヌ細胞でＩＣＡＭ−１を１３％のレベルに下方制御することは驚くべきことである（右パネル、円）。第一に、ａｓ１５５９ｂによる阻害の程度は、これまでにアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用では観察されてこなかった。第二に、ａｓ１５５９ｂはイヌ系で高度に活性であるが、このことはヒト系から予測できない。
【００３６】
本発明は、以下のヌクレオチド配列に関する。
【００３７】
配列番号：１
アンチセンスオリゴヌクレオチドａｓ１５５９ｂ
ＴＣＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＧＴＴＡＴ
配列番号２
アンチセンスオリゴヌクレオチドａｓ１５５９ａ
ＣＣＧＣＴＧＧＣＧＧＴＴＡＴＡＧＡＧ
配列番号３
アンチセンスオリゴヌクレオチドａｓ１５５９ｃ
ＡＴＣＴＴＣＣＧＣＴＧＧＣＧＧＴＴＡ
配列番号４
スクランブル陰性対照オリゴヌクレオチドｓｃ１２８４
ＣＡＧＧＴＧＧＴＣＡＧＡＴＧＧＡＣＣ
配列番号５
プライマー配列
ＴＧＡＣＡＡＣＣＡＴＴＧＴＣＡＴＣＴＴＡＧＧＡＡ
配列番号６
プライマー配列
ＧＧＴＧＴＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＡＴＧＧＣ
配列番号７
プライマー配列
ＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧ
配列番号８
プライマー配列
ＧＡＣＴＴＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＧＧＡＴＣＣ
配列番号９
プライマー配列
ＧＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＴＧＴＡＡＧＴＣＴＧＴＧＧＧ
配列番号１０
プライマー配列
ＣＴＡＣＣＧＧＣＣＣＴＧＧＧＡＣＧ
配列番号１１
プライマー配列
ＡＡＣＡＧＣＧＡＣＡＣＣＣＡＣＴＣＣＴＣ
配列番号１２
プライマー配列
ＧＧＡＧＧＧＧＡＧＡＴＴＣＡＧＴＧＴＧＧＴ
配列番号１３
イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）ＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡの部分配列
ＴＧＴＡＧＣＣＧＣＴＴＡＣＣＴＣＴＡＴＡＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＡＡＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＴＡＣＡＡＧＣＴ
配列番号１４
ｓｉ１５５９ａの鎖
ＣＵＣＵＡＵＡＡＣＣＧＣＣＡＧＣＧＧＡＴＴ
配列番号１５
ｓｉ１５５９ａの鎖
ＵＣＣＧＣＵＧＧＣＧＧＵＵＡＵＡＧＡＧＴＴ
【表１】
2020528443.tif 000003
2020528443.tif 000004
2020528443.tif 000005
2020528443.tif 000006
【図１】
2020528443.tif 000007
【図２】
2020528443.tif 000008
【図３】
2020528443.tif 000009
【図４】
2020528443.tif 000010
【図５】
2020528443.tif 000011
【配列表】
2020528443000001.app
【国際調査報告】
2020528443.tif 000012
2020528443.tif 000013
2020528443.tif 000014
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