(57)【要約】  ＮＡＦＬＤ（非アルコール性脂肪性肝疾患）またはＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、式（Ｉ）の化合物と、その薬学的および食品用の許容可能な塩が記載される。ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、随意に任意の不活性成分、担体、または賦形剤等を有する、式Ｉの前記化合物、およびその薬学的または食品用の許容可能あるいは受容可能な塩およびそれらの組み合わせを含む、医薬組成物または栄養補助食品がさらに記載される。ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置のための方法であって、式Ｉの化合物と、その薬学的および食品用の許容可能な塩、またはそれらを含む医薬組成物、機能性食品添加物、または栄養補助食品を、必要とする被験体への投与を含む方法がさらに記載される。【化１】2020510001.tif 000049
2020510001.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、式Ｉの化合物、またはその薬学的あるいは食品用の許容可能な塩であって、
【化１】
2020510001.tif 000035
ここで独立して、
Ｒ１は、直線または環形のモノまたはジアルキルアミン；ＯＲ９、アミノアルキルアルコール、またはアミノアルキルエーテルから選択され；
Ｒ２は、ベンゼンまたは複素環から選択され；
Ｒ３は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；またはベンジル基から選択され；
Ｒ４は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；ヒドロキシまたはアルコキシのラジカル；またはハロゲンから選択され；および、
Ｒ９はアルキル基である、
化合物。
【請求項２】
−Ｒ１は、ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２（ｎは０〜４の値である）；ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３；ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−フェニル−Ｒ７；または以下から選択される環状アミンから選択され：
【化２】
2020510001.tif 000036
−Ｒ２は、以下から選択され：
【化３】
2020510001.tif 000037
−Ｒ３は、Ｈ、メチル、またはベンジルから選択され；
−Ｒ４は、Ｈ、メチル、メトキシ、またはフッ素から選択され；
−Ｒ７は、Ｈまたはｐ−ＮＯ２であり；
−Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、またはメトキシであり；および、
−Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、またはメトキシである、
請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
薬学的あるいは食品用の許容可能な塩は塩酸塩である、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記化合物は、４ａ、５ａ、７ａ、１７ａ、１７ｂ、１７ｃ、２１ａ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｄ、２１ｅ、２１ｆ、２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、２３ｅ、２３ｆ、２６ａ、２６ｂ、７ｂ、１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、１９ａ、１９ｂ、１９ｃ、１９ｄ、１９ｅ、１９ｆ、２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆ、２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ、２２ｅ、２２ｆ、２４ａ、２４ｂ、２５ａ、または２５ｂから独立して選択される、請求項１から３のいずれか１つに記載の化合物。
【化４】
2020510001.tif 000038
【化５】
2020510001.tif 000039
【化６】
2020510001.tif 000040
【化７】
2020510001.tif 000041
【化８】
2020510001.tif 000042
【化９】
2020510001.tif 000043
【化１０】
2020510001.tif 000044
【請求項５】
前記化合物は、４ａ、５ａ、または７ａから独立して選択される、請求項１から４のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項６】
関連する症状は、インスリン抵抗性、肝細胞中の脂質蓄積、ミトコンドリアの機能障害、酸化ストレス、アポトーシス、ネクローシス、炎症、または繊維症から独立して選択される、請求項１から５のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項７】
関連する病状は、硬変または肝細胞癌である、請求項１から５のいずれか１つに記載の化合物。
【請求項８】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、有効な量の式Ｉの少なくとも１つの化合物、およびその薬学的に許容可能な塩、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物であって、
【化１１】
2020510001.tif 000045
ここで独立して、
Ｒ１は、直線または環形のモノまたはジアルキルアミン；ＯＲ９、アミノアルキルアルコール、またはアミノアルキルエーテルから選択され；
Ｒ２は、ベンゼンまたは複素環から選択され；
Ｒ３は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；またはベンジル基から選択され；
Ｒ４は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；ヒドロキシまたはアルコキシのラジカル；またはハロゲンから選択され；および、
Ｒ９はアルキル基である、
医薬組成物。
【請求項９】
インスリン抵抗性改善薬、胆汁酸調整剤、デノボ脂質生成の阻害剤、脂質低下剤、酸化防止剤、抗炎症剤、免疫変調成分、抗アポトーシス剤、腸マイクロバイオーム調整剤、または抗線維化剤から独立して選択される第２の活性化合物をさらに含む、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
関連する症状は、インスリン抵抗性、肝細胞中の脂質蓄積、ミトコンドリアの機能障害、酸化ストレス、アポトーシス、ネクローシス、炎症、または繊維症から独立して選択される、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
関連する病状は、硬変または肝細胞癌である、請求項８または９に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
−Ｒ１は、ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２（ｎは０〜４の値である）；ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３；ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−フェニル−Ｒ７；または以下から選択される環状アミンから選択され：
【化１２】
2020510001.tif 000046
−Ｒ２は、以下から選択され：
【化１３】
2020510001.tif 000047
−Ｒ３は、Ｈ、メチル、またはベンジルから選択され；
−Ｒ４は、Ｈ、メチル、メトキシ、またはフッ素から選択され；
−Ｒ７は、Ｈまたはｐ−ＮＯ２であり；
−Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、またはメトキシであり；および、
−Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、またはメトキシである、
請求項８から１１のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項１３】
薬学的に許容可能な塩は塩酸塩である、請求項８から１２に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
式Ｉの少なくとも１つの化合物は、４ａ、５ａ、または７ａから独立して選択される、請求項８から１３のいずれか１つに記載の医薬組成物。
【請求項１５】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはそれらに関連する症状および／または関連する病状の緩和および／または予防するための、式Ｉの少なくとも１つの化合物、またはその食品用の許容可能な塩、および少なくとも１つの食品用の許容可能な賦形剤を含む栄養補助食品の使用であって：
【化１４】
2020510001.tif 000048
ここで独立して、
Ｒ１は、直線または環形のモノまたはジアルキルアミン；ＯＲ９、アミノアルキルアルコール、またはアミノアルキルエーテルから選択され；
Ｒ２は、ベンゼンまたは複素環から選択され；
Ｒ３は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；またはベンジル基から選択され；
Ｒ４は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；ヒドロキシまたはアルコキシのラジカル；またはハロゲンから選択され；および、
Ｒ９はアルキル基である、
使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の予防および／または処置、さらにそれらの肝疾患に関連するすべての発症または症状の予防および／または処置において使用するための化合物のファミリーに注目する。
【背景技術】
【０００２】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）とその重篤な発達段階、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）は、顕著になってきた治療分野である。ＮＡＦＬＤは、肝実質内の脂質滴としての、肝臓における脂肪の異常蓄積を特徴とし、さほどアルコールを消費しない（１，２）個体に影響を与える。これは、世界的にみても最も頻繁にみられる肝臓障害であり、一般人口の６〜３５％に影響を与え、硬変と肝細胞癌（３）への進行後の肝移植の主要な要因の１つである。
【０００３】
ＮＡＦＬＤの実際の要因は、依然としてわかっていない。しかしながら、他の疾患のうちインスリン抵抗性は、疾患プロセスにおける役割を担うと考えられている。疾患がある段階から次の段階に進行する実際の理由とメカニズムは、完全には理解されていない。
【０００４】
疾患の発達は、「クヌードソン仮説（ｔｗｏ−ｈｉｔ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ）」により説明されており、第１の打撃は肝細胞中の脂質蓄積によって表され、続いて第２の打撃により酸化ストレスと炎症がＮＡＳＨ（１）をもたらす。肝細胞中の脂質蓄積によって生み出された初期代謝ストレスは、小胞体ストレス、ミトコンドリアの機能障害、酸化ストレス（活性酸素種の産生）、アポトーシス、およびネクローシスさえをも含む、多数の細胞ストレス経路を引き起こす。生みだされた肝細胞性傷害は、炎症反応をもたらす様々な免疫細胞を導入および活性化する信号の放出をもたらす。それらの事象が集まって、結果として繊維症をもたらすコラーゲン沈着の増加を含む肝星細胞の活性化をもたらし、最終的には硬変と肝細胞癌（４）に進行する場合もある。微生物相分子への、行動習慣（食事／生活様式／運動）からの他の外部入力は、疾患の発達（５）の一因となり得る。
【０００５】
今日までに、多くの治療戦略が提案され、および薬剤の候補が試験されてきた。しかし、それらはいずれも、依然としてＮＡＳＨ（６−８）の処置のために認可されてはいない。ＮＡＦＤＬとＮＡＳＨを処置するための効果的な治療を探す際に、異なる標的と戦略が探究されてきた。これには以下が含まれる：
・インスリン抵抗性改善薬：ＰＰＡＲアゴニスト、インクレチン類似体（ＧＬＰ−１受容体アゴニスト）、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、ＡＣＥ阻害薬、およびアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（抗昇圧薬）。
・胆汁酸調整剤：ファルネソイドＸ受容体アゴニスト（消極的に胆汁酸合成を調整し、肝臓の脂質生成と脂肪症を低減する）
・デノボ脂質生成の阻害剤：ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼとアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤
・脂質低下薬：スタチン、フィブラート、リパーゼ阻害剤
・酸化防止剤：ビタミンＥ、システアミン
・抗炎症薬：ＴＮＦ−α阻害剤
・免疫変調成分：ＩκＢ阻害剤、炎症性ケモキネスアンタゴニスト（ＣＣＲ２／ＣＣＲ５阻害剤）、ＶＡＰ１阻害剤
・抗アポトーシス薬：カスパーゼ阻害剤、ＡＳＫ１阻害剤
・腸マイクロバイオームモジュレータ：抗生物質、抗ＬＰＳ  ＩｇＧ−ｒｉｃｈ抽出物、便微生物移植
・抗線維化剤：ガレクチン−３阻害剤、ＬＯＸＬ２遮断薬
【０００６】
ガレクチン−３は繊維症の標的と考えられるが、本開示に含まれる実施例で測定されるように、肝臓炎に関するマーカーでもある。上記のように、これらのアプローチはいずれも、依然として、ＮＡＳＨの処置用に承認された化合物に帰結することはないため、前記疾患の処置と予防のためにこれらのアプローチの代わりを開発する必要は明白である。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患または脂肪性肝炎に関連した肝臓の脂肪含量を低下させる方法に使用するための化合物を提供する。特に、本開示の課題は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、およびその重篤な発達段階である非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の予防および／または処置のための化合物と方法を提供することである。
【０００８】
ＮＡＦＬＤは、疾患の活動度のスペクトルを包含すると考えられる。このスペクトルは、説明されるように、肝臓（脂肪肝）における脂肪蓄積で始まる。肝臓は、肝機能の妨害がなくとも脂肪が多いままであり得るが、異なるメカニズムと、可能性のある肝臓への攻撃性とが進行し、結果として非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の発達をもたらす場合もあり、この状態において脂肪症は炎症と繊維症（脂肪性肝炎）を併発する。
【０００９】
したがって、ＮＡＦＬＤからＮＡＳＨへのこの疾患の進行は、前記障害に直接つながる種々の症状および／または関連する病状を含む。
【００１０】
初期段階に関して、前記症状および／または関連する病状は、小胞体ストレス、ミトコンドリアの機能障害、酸化ストレス（活性酸素種の産生）、アポトーシス、およびネクローシスさえをも含む多数の細胞ストレス経路を引き起こす、インスリン抵抗性と肝細胞中の脂質蓄積を指す。
【００１１】
第２の段階では、生み出された肝細胞性傷害は、炎症と関係するＮＡＦＬＤの症状をもたらす。
【００１２】
それらの事象が集まって、結果として繊維症の増加、それらの障害の関連する病状としての硬変と肝細胞癌をもたらすコラーゲン沈着の増加を含む肝細胞の活性化をもたらす。
【００１３】
したがって、本発明によって解決されるべき課題は、その発達のすべての段階においてＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための式Ｉの化合物を提供することであり；好ましくは、関連する症状は、インスリン抵抗性、肝細胞内の脂質蓄積、ミトコンドリアの機能障害、酸化ストレス、アポトーシス、ネクローシス、炎症、または繊維症から独立して選択され；および好ましくは、関連する病状は硬変または肝細胞癌である。
【００１４】
本発明で開示される式Ｉの化合物およびその合成は、２０１２年３月２８日に出願された国際特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５５７０に開示された。ＰＣＴ／ＥＰ２０１２／０５５５７０によれば、前記化合物はメタボリック症候群の処置に有用である。ここで出願人は、驚くべきことに、前記化合物およびその合成の中間体がさらに、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨの予防および／または処置、さらにそれらに関連する発症または症状の予防および／または処置に有用であることを発見している。
【００１５】
したがって、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはそれらに関連する症状および／または関連する病状の処置に使用するための、一般式Ｉの化合物、およびその薬学的な、または食品用の許容可能な塩に関し：
【００１６】
【化１】
2020510001.tif 000003
ここで、独立して、
Ｒ１は：直線または環形の、モノまたはジアルキルアミン；ＯＲ９、アミノアルキルアルコールまたはアミノアルキルエーテルから選択可能であり；
Ｒ２は、ベンゼン環または複素環から選択可能であり；
Ｒ３は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；またはベンジル基から選択可能であり；
Ｒ４は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；ヒドロキシまたはアルコキシのラジカル；またはハロゲンから選択可能であり；および、
Ｒ９はアルキル基である。
【００１７】
一実施形態は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはそれらに関連する症状および／または関連する病状の処置に使用するための、本明細書に記載される式Ｉの化合物に関し、ここで関連する症状は、インスリン抵抗性、肝細胞中の脂質蓄積、ミトコンドリアの機能不全、酸化ストレス、アポトーシス、ネクローシス、炎症あるいは繊維症から独立して選択され；および関連する病状は硬変または肝細胞癌である。
【００１８】
本発明に係る使用のための一般式Ｉの好ましい化合物は、独立して、
Ｒ１が、直線のアルキルアミンである場合：ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２（ｎは０〜４の値である）；ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−フェニル−Ｒ７から選択され；
およびＲ１は、環形のアミンである場合に以下から選択され：
【００１９】
【化２】
2020510001.tif 000004
アミノアルキルアルコール基である場合、Ｒ１はＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＨであり；およびアミノアルキルエーテル基である場合、Ｒ１はＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３であり；
ＯＲ９、Ｒ９である場合、Ｒ１はＣ１−４アルキル基であり；
ベンゼン置換環である場合、Ｒ２は以下から選択され：
【００２０】
【化３】
2020510001.tif 000005
および複素環である場合、以下であり、
【００２１】
【化４】
2020510001.tif 000006
１〜５の炭素の直線のアルキルから選択される炭化水素ラジカルである場合、Ｒ３はメチルであり；
１〜５の炭素の直線のアルキルから選択される炭化水素ラジカルである場合、Ｒ４はメチルであり；
アルコキシラジカルである場合、Ｒ４はメトキシラジカルであり；および、
ハロゲンである場合、Ｒ４はフッ素であり；
Ｒ５は、Ｈ；アルコキシ；ハロゲン；ヒドロキシ；またはハロゲン−アルキルから選択可能であり；
Ｒ７は、ＨまたはＮＯ２から選択可能であり；
Ｒ８は、Ｈ；ヒドロキシ；アルコキシから選択可能である。
【００２２】
用語「薬学的に許容可能な塩」は、患者への投与に際し、本明細書に記載の化合物を（直接または間接的に）提供することができる任意の塩を指す。
【００２３】
用語「食品用の許容可能な塩」は、機能性食品添加物または栄養補助食品に加えることのできる、記載の生成物の任意の塩を指す。
【００２４】
そのような塩は好ましくは、生理的に許容可能な有機酸または無機酸を伴う酸付加塩である。酸付加塩の例として、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸等の鉱酸付加塩、および例えば、酢酸塩、トリフルオロ酢酸、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、酒石酸、リンゴ酸塩、マンデル酸塩、メタンスルフォネート、およびｐ−トルエンスルホン酸等の有機酸付加塩があげられる。アルカリ加算塩の例として、例えばナトリウム、カリウム、カルシウム、およびアンモニウム塩等の無機塩、および例えばエチレンジアミン、エタノールアミン、Ｎ，Ｎ−ジアルキルエタノールアミン、トリエタノールアミン、および基本的なアミノ酸塩等の有機アルカリ塩があげられる。
【００２５】
本発明の好ましい実施形態では、塩は塩酸塩である。
【００２６】
したがって、本発明は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、本明細書に上記の、式Ｉの化合物、およびその薬学的または食品用の許容可能な塩を指す。
【００２７】
本発明はまた、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置のための薬剤の製造のための、式Ｉの化合物、およびその薬学的または食品用の許容可能な塩の使用を指す。
【００２８】
付加的に、本発明は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを患う、またはそれらに関連する症状および／または関連する病状を患う被験体を予防および／または処置する方法を指し、該方法は、本明細書に開示される、有効な量の式Ｉの化合物、およびその薬学的または食品用の許容可能な塩を前記被験体に投与する工程を含む。
【００２９】
本発明に記載される、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための好ましい化合物は、式Ｉの化合物であり、式中、Ｒ５は：Ｈ、メトキシ；塩素、ＯＨ、またはトリフルオロメチルから選択可能であり、好ましくは、Ｒ５がＨである場合、Ｒ８はＯＨであり、およびＲ５がＯＨである場合、Ｒ８はＨまたはＯＣＨ３である。
【００３０】
本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式Ｉの化合物であり、式中、Ｒ９はメチルである。
【００３１】
本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式Ｉの化合物であり、式中、Ｒ２は以下である。
【００３２】
【化５】
2020510001.tif 000007
【００３３】
本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式Ｉの化合物であり、式中、Ｒ３はメチルまたはベンジルである。
【００３４】
本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式Ｉの化合物であり、式中、Ｒ４はメチル、メトキシ、またはフッ素である。
【００３５】
本開示に係る好ましい化合物は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、式Ｉ（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩であり、
【００３６】
【化６】
2020510001.tif 000008
式中、
−Ｒ１は、ＯＲ９；ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２（ｎは０〜４の値である）；ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３；ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−フェニル−Ｒ７；または環状アミンから選択され、
−Ｒ２は、以下から選択され、
【００３７】
【化７】
2020510001.tif 000009
−Ｒ３は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；またはベンジル基から選択可能であり；
−Ｒ４は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；ヒドロキシまたはアルコキシのラジカル；またはハロゲンから選択可能であり；および、
−Ｒ７はＨまたはｐ−ＮＯ２であり
−Ｒ５は、Ｈ；アルコキシ；ハロゲン；ヒドロキシ；またはハロゲン−アルキルから選択され；
−Ｒ８は、Ｈ；ヒドロキシ；アルコキシから選択され、
−Ｒ９はメチルである。
【００３８】
付加的に、本開示に係る好ましい化合物は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、式Ｉ（Ｉ）の化合物またはその薬学的に許容可能な塩であり、
【００３９】
【化８】
2020510001.tif 000010
式中、
−Ｒ１は、ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、ＮＨ（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２（ｎは０〜４の値である）；ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３；ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−フェニル−Ｒ７；または以下から選択される環状アミンから選択され：
【００４０】
【化９】
2020510001.tif 000011
−Ｒ２は、以下から選択され、
【００４１】
【化１０】
2020510001.tif 000012
−Ｒ３は、Ｈ、メチル、またはベンジルから選択され；
−Ｒ４は、Ｈ、メチル、メトキシ、またはフッ素から選択され；
−Ｒ７はＨまたはｐ−ＮＯ２であり；
−Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、またはメトキシであり；および、
−Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、またはメトキシである。
【００４２】
好ましい実施形態において、薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩である。
【００４３】
付加的に、本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式ＩＩまたはＩＩＩを有する化合物であり、
【００４４】
【化１１】
2020510001.tif 000013
ここで、独立して、
Ｒ１は；ＯＨ、ＯＣＨ３、ｎが０〜３の値であるＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２、ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２；ＮＨ（ＣＨ２）２−ＯＨ；ＮＨ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、またはＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−フェニル−Ｒ７から選択可能であり；
Ｒ５は、ＯＣＨ３またはＨから選択可能であり；
Ｒ７は、Ｈまたはｐ−ＮＯ２から選択可能である。
【００４５】
より具体的には、本発明に係る使用のための好ましい化合物は、Ｒ１がＯＨ基である場合にＲ５がＨまたはｐ−ＯＣＨ３から選択される化合物である。
【００４６】
本発明に係る使用のための好ましいさらなる化合物は、Ｒ１がＯＨ基であり、かつＲ５がｐ−ＯＣＨ３である式１ａから；またはＲ１がＯＨ基であり、かつＲ５がＨである式１ｂから選択される、式ＩＩを有する化合物である。
【００４７】
さらに、本発明に係る使用のための好ましい化合物は、Ｒ１がＯＣＨ３基である場合にＲ５がＨまたはｐ−ＯＣＨ３から選択される化合物である。
【００４８】
本発明に係る使用のための好ましい化合物は：Ｒ１がＯＣＨ３基であり、かつＲ５がｐ−ＯＣＨ３である式２ａ；Ｒ１がＯＣＨ３基であり、かつＲ５がＨである式２ｂから選択される式ＩＩを有する化合物；または、Ｒ１がＯＣＨ３基でありＲ５がｐ−ＯＣＨ３である式３ａ、またはＲ１がＯＣＨ３基でありＲ５がＨである式３ｂから選択される式ＩＩＩを有する化合物である。
【００４９】
さらに、本発明に係る使用のための好ましい化合物は、Ｒ１がＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２であり、ｎ＝２または３の値である場合に、Ｒ５がｐ−ＯＣＨ３である化合物である。
【００５０】
本発明に係る使用のための好ましい化合物は、Ｒ１がＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２でありＲ５がｐ−ＯＣＨ３である式４ａから；またはＲ１がＮＨ（ＣＨ２）３ＮＨ２でありＲ５がｐ−ＯＣＨ３である式５ａから選択される式ＩＩＩを有する化合物である。
【００５１】
本発明に係る使用のためのより好ましい化合物は４ａであり、ここでＲ１がＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基、ｎ＝２の値である場合、Ｒ５はｐ−ＯＣＨ３である。
【００５２】
本発明に係る使用のためのより好ましい化合物は５ａであり、ここでＲ１がＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基、ｎ＝３の値である場合、Ｒ５はｐ−ＯＣＨ３である。
【００５３】
【化１２】
2020510001.tif 000014
【００５４】
本発明に係る使用のためのより好ましい化合物は、式ＩＩＩを有する化合物であり、ここでＲ１がＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２基、ｎ＝０の値である場合、Ｒ５はＨまたはｐ−ＯＣＨ３から選択される。
【００５５】
本発明に係る使用のための化合物は、Ｒ１がＮＨＮＨ２でありＲ５がｐ−ＯＣＨ３である式６ａから；またはＲ１がＮＨＮＨ２でありＲ５がＨである式６ｂから選択される、式ＩＩＩを有する化合物をさらに含む。
【００５６】
さらにとりわけ、本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式ＩＩＩにおいて、Ｒ１がＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−フェニル基である場合、Ｒ５がｐ−ＯＣＨ３であり、Ｒ１がｐ−ＮＯ２基により置換されたＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−フェニル基である場合、Ｒ５がＨである化合物である。
【００５７】
本発明に係る使用のための化合物は、Ｒ１がＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−フェニル基でありＲ５がｐ−ＯＣＨ３である式７ａから；またはＲ１がＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−フェニル−ｐ−ＮＯ２基でありＲ５がＨである式７ｂから選択される、式ＩＩＩを有する化合物をさらに含む。
【００５８】
【化１３】
2020510001.tif 000015
【００５９】
さらに、本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式ＩＩＩを有する化合物であり、ここでＲ１がＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２基、ｎ＝２の値である場合、Ｒ５はｐ−ＯＣＨ３である。
【００６０】
さらに、本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式ＩＩＩを有する化合物であり、ここでＲ１は以下から選択される環状アミンであり、
【００６１】
【化１４】
2020510001.tif 000016
およびＲ５はｐ−ＯＣＨ３である。
【００６２】
さらに、本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式ＩＩＩを有する化合物であり、ここでＲ１がＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２、ｎ＝４の値である場合、Ｒ５はｐ−ＯＣＨ３である。
【００６３】
さらに、本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式ＩＩＩを有する化合物であり、ここでＲ１がＮＨ−（ＣＨ２）２−ＯＨである場合、Ｒ５はｐ−ＯＣＨ３である。
【００６４】
さらに、本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式ＩＩＩを有する化合物であり、ここでＲ１がＮＨ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３である場合、Ｒ５はｐ−ＯＣＨ３である。
【００６５】
さらに、本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式ＩＩＩを有する化合物であり、ここでＲ１がＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２、ｎ＝２の値である場合、Ｒ５は塩素である。さらに、本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式ＩＩＩを有する化合物であり、ここでＲ１がＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２、ｎ＝２の値である場合、Ｒ５はＯＨである。
【００６６】
さらに、本発明に係る使用のための好ましい化合物は、式ＩＩＩを有する化合物であり、ここでＲ１がＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２、ｎ＝２の値である場合、Ｒ５はトリフルオロメチルである。
【００６７】
好ましい実施形態は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物、またはその薬学的な塩、または有効な量の前記化合物を含む医薬組成物を指し、ここで関連する症状は、インスリン抵抗性、肝細胞内の脂質蓄積、ミトコンドリアの機能障害、酸化ストレス、アポトーシス、ネクローシス、炎症、または繊維症から独立して選択され；および、関連する病状は硬変または肝細胞癌である。
【００６８】
好ましい実施形態は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の予防および／または処置に使用するための、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物、またはその薬学的な塩、または前記化合物を含む医薬組成物を指す。
【００６９】
好ましい実施形態は、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の予防および／または処置に使用するための、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物、またはその薬学的な塩、または前記化合物を含む医薬組成物を指す。
【００７０】
好ましい実施形態は、インスリン抵抗性、肝細胞内の脂質蓄積、ミトコンドリアの機能障害、酸化ストレス、アポトーシス、ネクローシス、炎症、または繊維症の予防および／または処置に使用するための、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物、またはその薬学的な塩、または前記化合物を含む医薬組成物を指す。
【００７１】
好ましい実施形態は、インスリン抵抗性、肝細胞内の脂質蓄積、肝臓炎または肝繊維症の予防および／または処置に使用するための、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物、またはその薬学的な塩、または前記化合物を含む医薬組成物を指す。
【００７２】
好ましい実施形態は、硬変または肝細胞癌の予防および／または処置に使用するための、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物、またはその薬学的な塩、または前記化合物を含む医薬組成物を指す。
【００７３】
本発明はまた、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、随意に任意の不活性成分、担体、または賦形剤等を有する、一般式Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩによって表わされる前記の化合物の少なくともいずれか、およびその薬学的または食品用の許容可能あるいは受容可能な塩およびそれらの組み合わせを含む、医薬組成物、機能性食品添加物、または栄養補助食品を含む。
【００７４】
本発明はまた、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、先に開示されたような、一般式Ｉに包含される化合物のいずれか、およびその薬学的な塩、またはそれらを含む医薬組成物を包含する。
【００７５】
付加的に、本発明は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、本明細書に記載される、有効な量の式Ｉの少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物に関する。
【００７６】
本発明の目的のための有効な量は、症状の自覚的な緩和、または、臨床医あるいは有資格の観察者によって留意されるような客観的に特定可能な改善のいずれかを提供する量である。
【００７７】
本発明はまた、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、有効な量の式Ｉの少なくとも１つの化合物、およびその薬学的に許容可能な塩、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関し：
【００７８】
【化１５】
2020510001.tif 000017
ここで、独立して、
Ｒ１は、直線または環形のモノまたはジアルキルアミン；ＯＲ９、アミノアルキルアルコール、またはアミノアルキルエーテルから選択され；
Ｒ２は、ベンゼンまたは複素環から選択され；
Ｒ３は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；またはベンジル基から選択され；
Ｒ４は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；ヒドロキシまたはアルコキシのラジカル；またはハロゲンから選択され；
およびＲ９はアルキル基である。
【００７９】
付加的に、有効な量の少なくとも１つの式Ｉの化合物、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む、上記のような使用のための医薬組成物が開示され、ここで：−Ｒ１は、ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２（ｎは０〜４の値である）；ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３；ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−フェニル−Ｒ７；または以下から選択される環状アミンから選択され：
【００８０】
【化１６】
2020510001.tif 000018
−Ｒ２は、以下から選択され、
【００８１】
【化１７】
2020510001.tif 000019
−Ｒ３は、Ｈ、メチル、またはベンジルから選択され；
−Ｒ４は、Ｈ、メチル、メトキシ、またはフッ素から選択され；
−Ｒ７はＨまたはｐ−ＮＯ２であり
−Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、またはメトキシであり；および、
−Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、またはメトキシである。
【００８２】
付加的に、本発明はまた、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、先に開示された一般式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩにより包含される化合物のいずれか、およびその薬学的な塩、さらに第２の活性化合物を含む。前記第２の活性化合物は、一般式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩにより包含される化合物のいずれか、およびその薬学的な塩と同時に、連続して、または独立して投与することができる。
【００８３】
本発明の目的のために、「活性化合物または有効成分」は同義語としてとらえるべきであり、およびヒトまたは動物への投与時に治療効果を発揮する化学物質を意味する。前記第２の活性化合物は、インスリン抵抗性改善薬、胆汁酸調整剤、デノボ脂質生成の阻害剤、脂質低下剤、酸化防止剤、抗炎症剤、免疫変調成分、抗アポトーシス剤、腸マイクロバイオーム調整剤、または抗線維化剤から独立して選択可能である。
【００８４】
本発明の目的のために、インスリン抵抗性改善薬は、限定されないがＰＰＡＲアゴニスト、インクレチン類似体（ＧＬＰ−１受容体アゴニスト）、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、ＡＣＥ阻害薬、またはアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬（抗昇圧薬）を含む。胆汁酸調整剤は、限定されないがファルネソイドＸ受容体アゴニストを含む。デノボ脂質生成の阻害剤は、限定されないがステアロイルＣｏＡデサチュラーゼまたはアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤を含む。脂質低下剤は、限定されないがスタチン、フィブラートまたはリパーゼ阻害剤を含む。酸化防止剤は、限定されないがビタミンＥまたはシステアミンを含む。抗炎症剤は、限定されないがＴＮＦ−α阻害剤を含む。免疫変調成分は、限定されないがＩκＢ阻害剤、炎症性ケモキネスアンタゴニスト（ＣＣＲ２／ＣＣＲ５阻害剤）またはＶＡＰ１阻害剤を含む。抗アポトーシス剤は、限定されないがカスパーゼ阻害剤またはＡＳＫ１阻害剤を含む。腸マイクロバイオーム調整剤は、限定されないが抗生物質、抗ＬＰＳ  ＩｇＧ−ｒｉｃｈ抽出物、または便微生物移植を含む。抗線維化剤は、限定されないがガレクチン−３阻害剤またはＬＯＸＬ２遮断薬を含む。
【００８５】
本発明はまた、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）と非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、および／またはそれらに関連する症状および／または関連する病状の緩和および／または予防に使用するための、式Ｉの少なくとも１つの化合物、またはその食品用の許容可能な塩、および少なくとも１つの食品用の許容可能な賦形剤を含む栄養補助食品の使用に関し：
【００８６】
【化１８】
2020510001.tif 000020
ここで、独立して、
Ｒ１は、直線または環形のモノまたはジアルキルアミン；ＯＲ９、アミノアルキルアルコール、またはアミノアルキルエーテルから選択され；
Ｒ２は、ベンゼンまたは複素環から選択され；
Ｒ３は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；またはベンジル基から選択され；
Ｒ４は、Ｈ；１〜５の炭素の直線または分枝したアルキルから選択された炭化水素ラジカル；ヒドロキシまたはアルコキシのラジカル；またはハロゲンから選択され；
およびＲ９はアルキル基である。
【００８７】
付加的に、有効な量の少なくとも１つの式Ｉの化合物、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む、上記のような栄養補助食品の使用が開示され、ここで：
−Ｒ１は、ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２、ＮＨ−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ（ＣＨ３）２（ｎは０〜４の値である）；ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＨ；ＨＮＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３；ＮＨ−Ｎ＝ＣＨ−フェニル−Ｒ７；または以下から選択される環状アミンから選択され：
【００８８】
【化１９】
2020510001.tif 000021
−Ｒ２は、以下から選択され、
【００８９】
【化２０】
2020510001.tif 000022
−Ｒ３は、Ｈ、メチル、またはベンジルから選択され；
−Ｒ４は、Ｈ、メチル、メトキシ、またはフッ素から選択され；
−Ｒ７は、Ｈまたはｐ−ＮＯ２であり；
−Ｒ８は、Ｈ、ＯＨ、またはメトキシであり；および、
−Ｒ５は、Ｈ、ＯＨ、またはメトキシである。
【００９０】
本発明は、先に開示されたように、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための薬剤の製造における、一般式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに包含される化合物のいずれか、およびその薬学的な塩、またはそれらを含む医薬組成物の使用を含む。
【００９１】
本発明はさらに、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを患う、またはそれらに関連する症状および／または関連する病状を患う被験体を予防および／または処置する方法を含み、該方法は、有効な量の一般式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩにより包含される化合物のいずれか、およびその薬学的または食品用の許容可能な塩、またはそれらを含む医薬組成物、食品添加物または栄養補助食品を、前記被験体に投与する工程を含む。
【００９２】
本発明はさらに、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを患う、またはそれらに関連する症状および／または関連する病状を患う被験体を予防および／または処置する方法を含み、該方法は、一般式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩにより包含される化合物のいずれか、およびその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物を前記被験体に投与する工程を含む。
【００９３】
付加的に、本発明はさらに、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを患う、またはそれらに関連する症状および／または関連する病状を患う被験体を予防および／または処置する方法を含み、該方法は、一般式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩにより包含される化合物のいずれか、およびその食品用の許容可能な塩を含む機能性食品添加物または栄養補助食品を前記被験体に投与する工程を含む。
【００９４】
本発明に係る、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための最も好ましい化合物は、以下の化合物から選択される：表１に示される、４ａ、５ａ、７ａ、１７ａ、１７ｂ、１７ｃ、２１ａ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｄ、２１ｅ、２１ｆ、２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、２３ｅ、２３ｆ、２６ａ、または２６ｂ。
【００９５】
本発明はさらに、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、表１に示される、４ａ、５ａ、７ａ、１７ａ、１７ｂ、１７ｃ、２１ａ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｄ、２１ｅ、２１ｆ、２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、２３ｅ、２３ｆ、２６ａ、または２６ｂから独立して選択された化合物、またはそれを含む医薬組成物を含む。
【００９６】
より好ましいものは、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、４ａ、５ａ、および７ａから独立して選択された化合物、またはそれを含む医薬組成物である。
【００９７】
より好ましいものは、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、４ａ、２６ａ、２１ａ、２６ｂ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｅ、２１ｄ、１７ａ、１７ｃ、１７ｂ、または２１ｆから独立して選択された化合物、またはそれを含む医薬組成物である。
【００９８】
より好ましいものは、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、４ａ、５ａ、７ａ、２３ｂ、２３ｃ、２６ａ、２３ａ、２３ｅ、２３ｄ、２６ｂ、２１ｄ、１７ａ、１７ｃ、１７ｂ、または２３ｆから独立して選択された化合物、またはそれを含む医薬組成物である。
【００９９】
より好ましいものは、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、４ａ、２６ａ、１７ａ、１７ｃ、または１７ｂから独立して選択された化合物、またはそれを含む医薬組成物である。
【０１００】
より好ましいものは、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、４ａまたは５ａから独立して選択された化合物、またはそれを含む医薬組成物である。
【０１０１】
より好ましいものは、本発明に係る使用のための化合物は、４ａまたは５ａの塩酸塩である。より好ましくは、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、４ａから独立して選択された化合物、またはそれを含む医薬組成物である。より好ましくは、本発明に係る使用のための化合物は、４ａの塩酸塩である。
【０１０２】
付加的に、本発明は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを患う、またはそれらに関連する症状および／または関連する病状を患う被験体を予防および／または処置する方法を含み、該方法は、表１に示されるように、有効な量の４ａ、５ａ、７ａ、１７ａ、１７ｂ、１７ｃ、２１ａ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｄ、２１ｅ、２１ｆ、２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、２３ｅ、２３ｆ、２６ａ、または２６ｂ、またはそれを含む医薬組成物、食品添加物、または栄養補助食品を前記被験体に投与する工程を含む。より好ましくは、有効な量の４ａ、５ａ、および７ａ；または４ａ、２６ａ、２１ａ、２６ｂ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｅ、２１ｄ、１７ａ、１７ｃ、１７ｂ、または２１ｆ；または４ａ、５ａ、７ａ、２３ｂ、２３ｃ、２６ａ、２３ａ、２３ｅ、２３ｄ、２６ｂ、２１ｄ、１７ａ、１７ｃ、１７ｂ、または２３ｆ；または４ａ、２６ａ、２６ｂ、１７ａ、１７ｃ、または１７ｂ；または４ａまたは５ａを被験体に投与する工程を含む。
【０１０３】
より好ましくは、本発明は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを患う、またはそれらに関連する症状および／または関連する病状を患う被験体を予防および／または処置する方法を含み、該方法は、有効な量の４ａ、またはそれを含む医薬組成物、食品添加物、または栄養補助食品を前記被験体に投与する工程を含む。
【０１０４】
本発明はさらに、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、随意に任意の不活性成分、担体、または賦形剤等を有する、表１に示されるような４ａ、５ａ、７ａ、１７ａ、１７ｂ、１７ｃ、２１ａ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｄ、２１ｅ、２１ｆ、２３ａ、２３ｂ、２３ｃ、２３ｄ、２３ｅ、２３ｆ、２６ａまたは２６ｂから独立して選択される少なくとも１つの化合物、またはそれらの薬学的または食品用の許容可能あるいは受容可能な塩およびそれらの組み合わせを含む、医薬組成物、機能性食品添加物、または栄養補助食品を含む。より好ましくは、４ａ、５ａ、および７ａから；または４ａ、２６ａ、２１ａ、２６ｂ、２１ｂ、２１ｃ、２１ｅ、２１ｄ、１７ａ、１７ｃ、１７ｂ、または２１ｆから；または４ａ、５ａ、７ａ、２３ｂ、２３ｃ、２６ａ、２３ａ、２３ｅ、２３ｄ、２６ｂ、２１ｄ、１７ａ、１７ｃ、１７ｂ、または２３ｆから；または４ａ、２６ａ、２６ｂ、１７ａ、１７ｃ、または１７ｂから；または４ａあるいは５ａから独立して選択される少なくとも１つの化合物を含む。
【０１０５】
好ましい実施形態では、本発明は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、随意に任意の不活性成分、担体、または賦形剤等を有する、４ａ、およびその薬学的または食品用の許容可能あるいは受容可能な塩およびそれらの組み合わせを含む、医薬組成物、機能性食品添加物、または栄養補助食品を含む。
【０１０６】
【表１−１】
2020510001.tif 000023
【０１０７】
【表１−２】
2020510001.tif 000024
【０１０８】
【表１−３】
2020510001.tif 000025
【０１０９】
【表１−４】
2020510001.tif 000026
【０１１０】
【表１−５】
2020510001.tif 000027
【０１１１】
【表１−６】
2020510001.tif 000028
【０１１２】
本発明はまた、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するための、表１に先に記載された化合物の、化合物の合成におけるすべての中間化合物を包含する。
【０１１３】
特に、本発明は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または病状の予防および／または処置に使用するために、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、３ａ、３ｂ、６ａ、６ｂ、７ｂ、８、１３ａ、１３ｂ、１３ｃ、１４ａ、１４ｂ、１４ｃ、１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、１８ａ、１８ｂ、１８ｃ、１８ｄ、１８ｅ、１８ｆ、１９ａ、１９ｂ、１９ｃ、１９ｄ、１９ｅ、１９ｆ、２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆ、２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ、２２ｅ、２２ｆ、２４ａ、２４ｂ、２５ａ、または２５ｂから選択された中間化合物を包含し、および本発明はさらに、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを患う、またはそれらに関連する症状および／または関連する病状を患う被験体を予防および／または処置するための方法を含み、該方法は、前記中間化合物、またはそれを含む医薬組成物、食品添加物、または栄養補助食品を前記被験体に投与する工程を含む。
【０１１４】
【化２１−１】
2020510001.tif 000029
【０１１５】
【化２１−２】
2020510001.tif 000030
【０１１６】
【化２１−３】
2020510001.tif 000031
【０１１７】
【化２１−４】
2020510001.tif 000032
【０１１８】
【化２１−５】
2020510001.tif 000033
【０１１９】
特に、本発明は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するために、以下から選択される中間化合物を包含する：７ｂ、１５ａ、１５ｂ、１５ｃ、１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、１９ａ、１９ｂ、１９ｃ、１９ｄ、１９ｅ、１９ｆ、２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆ、２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ、２２ｅ、２２ｆ、２４ａ、２４ｂ、２５ａ、または２５ｂ。および本発明はさらに、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを患う、またはそれらに関連する症状および／または関連する病状を患う被験体を予防および／または処置するための方法を含み、該方法は、前記中間化合物、またはそれを含む医薬組成物、食品添加物、または栄養補助食品を前記被験体に投与する工程を含む。
【０１２０】
特に、本発明は、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の予防および／または処置に使用するために、７ｂ、１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、２０ａ、２０ｂ、２０ｃ、２０ｄ、２０ｅ、２０ｆ、２２ａ、２２ｂ、２２ｃ、２２ｄ、２２ｅ、２２ｆ、２４ａ、２４ｂ、２５ａ、または２５ｂから選択される中間化合物を包含し、および本発明はさらに、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨを患う、またはそれらに関連する症状および／または関連する病状を患う被験体を予防および／または処置するための方法を含み、該方法は、前記中間化合物、またはそれを含む医薬組成物、食品添加物、または栄養補助食品を前記被験体に投与する工程を含む。
【０１２１】
好ましくは、本発明はまた、単独または組み合わせて、４ａ、５ａ、７ａ、２１ａ、２１ｂ、２１ｅ、２３ａ、２３ｂ、２３ｄ、２３ｅ、２３ｆ、または２６ｂと名づけられた化合物、またはそれを含む医薬組成物を含み、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の処置または予防に使用するのに、または、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨ、およびそれらに関連する症状および／または関連する病状の処置のための薬剤の製造に使用するのに、特に適している。
【０１２２】
発明はさらに、特にＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨに関連する症状、およびそれらに関連する病状を予防または低減するための機能性食品添加物または栄養補助食品として使用するための、先に開示された一般式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩにより包含される化合物のいずれか、またはそれを含む機能性食品添加物または栄養補助食品を含む。
【０１２３】
好ましくは、本発明はまた、単独または組み合わせて、４ａ、５ａ、７ａ、２１ａ、２１ｂ、２１ｅ、２３ａ、２３ｂ、２３ｄ、２３ｅ、２３ｆ、または２６ｂと名づけられた化合物、またはそれを含む機能性食品添加物または栄養補助食品を含み、それらは特に、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨに関連する症状、およびそれらに関連する病状を特に予防または低減するための機能性食品添加物または栄養補助食品として使用するのに適している。
【０１２４】
付加的に、本発明はまた、ＮＡＦＬＤまたはＮＡＳＨに関連する症状、およびそれらに関連する病状を、前記症状および関連する病状を患う患者において予防または低減するための方法を含み、該方法は、先に開示された一般式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩにより包含される有効な量の化合物のいずれか、またはそれを含む機能性食品添加物または栄養補助食品を前記被験体に投与する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１２５】
【図１】食塩水溶液（０．９％のＮａＣｌ）で処置された対照と、メトホルミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）で処置された陽性対照に対する、すべて５０ｍｇ／ｋｇの用量の化合物４ａ（ＳＪＴ４Ａ）と５ａ（ＳＪＴ５Ａ）、および化合物７ａ（ＳＪＴ７Ａ）の塩酸塩の、３６日間の処置中のＤＩＯモデルマウスにおけるインスリン抵抗性（ＨＯＭＡ−ＩＲ）の低下に際するインビボ効果。
【図２Ａ】肝脂肪を減らす本発明の化合物のインビボ効果。食塩水溶液（０．９％のＮａＣｌ）で処置された対照と、メトホルミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）で処置された陽性対照と比較した、３６日間、化合物４ａ（ＳＪＴ４Ａ）の塩酸塩および化合物７ａ（ＳＪＴ７Ａ）（共に５０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたＤＩＯマウスにおけるコレステロール肝臓含量を示す。
【図２Ｂ】肝脂肪を減らす本発明の化合物のインビボ効果。食塩水溶液（０．９％のＮａＣｌ）で処置された対照と、メトホルミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）で処置された陽性対照と比較した、３６日間、化合物４ａ（ＳＪＴ４Ａ）の塩酸塩および化合物７ａ（ＳＪＴ７Ａ）（共に５０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたＤＩＯマウスにおける肝性トリグリセリドレベルを示す。
【図２Ｃ】肝脂肪を減らす本発明の化合物のインビボ効果。食塩水溶液（０．９％のＮａＣｌ）で処置された対照と、メトホルミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）で処置された陽性対照と比較した、３６日間、化合物４ａ（ＳＪＴ４Ａ）の塩酸塩および化合物７ａ（ＳＪＴ７Ａ）（共に５０ｍｇ／ｋｇ）で処置されたＤＩＯマウスにおける肝脂肪酸レベルを示す。
【図３Ａ】肝脂質含量中の化合物４ａ（ＳＪＴ４ａ）の塩酸塩のインビボ効果を示す。ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、ビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で共に処置したＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、８週間、化合物４ａの塩酸塩（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）で処置した。
【図３Ｂ】処置の終わりの前記３匹のマウスに関する肝臓形態の代表的な画像を示す（倍率ｘ２０）。
【図４Ａ】肝性トリグリセリド含量中の化合物４ａ（ＳＪＴ４ａ）の塩酸塩のインビボ効果を示す。
【図４Ｂ】肝性トリグリセリド含量中の化合物４ａ（ＳＪＴ４ａ）の塩酸塩のインビボ効果を示す。両方の場合において、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスと比較し、化合物４ａの塩酸塩で８週間（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）処置した。
【図５】食塩水溶液（０．９％のＮａＣｌ）で処置された対照と、メトホルミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）で処置された陽性対照と比較した、３６日の処置後のＤＩＯマウスにおける、共に５０ｍｇ／ｋｇの化合物４ａ（ＳＪＴ４Ａ）と５ａ（ＳＪＴ５Ａ）の塩酸塩の、脂肪肝に関連する肝臓の重量超過を減らすインビボ効果。
【図６】肝臓の総重量における、化合物４ａ（ＳＪＴ４ａ）の塩酸塩のインビボ効果を示す。ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、化合物４ａの塩酸塩で８週間（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）処置した。
【図７Ａ】絶対的な体重で化合物４ａ（ＳＪＴ４ａ）の塩酸塩のインビボ効果を示す。ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、化合物４ａの塩酸塩で８週間（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）処置した。
【図７Ｂ】相対的な体重で化合物４ａ（ＳＪＴ４ａ）の塩酸塩のインビボ効果を示す。ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、化合物４ａの塩酸塩で８週間（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）処置した。
【図８Ａ】血漿ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）中の化合物４ａ（ＳＪＴ４ａ）の塩酸塩のインビボ効果を示す。ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷに対して、化合物４ａの塩酸塩で８週間（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）処置した。
【図８Ｂ】血漿ＡＳＴ（アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）中の化合物４ａ（ＳＪＴ４ａ）の塩酸塩のインビボ効果を示す。ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷに対して、化合物４ａの塩酸塩で８週間（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）処置した。
【図９】８週間、５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回、（Ａ）ビヒクルで処置されたＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウス、（Ｂ）ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス、または（Ｃ）化合物４ａ（ＳＪＴ４ａ）の塩酸塩で処置されたたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスにおける、ＮＡＦＬＤ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ（ＮＡＳ）を測定するためのインビボアッセイ。
【図１０Ａ】肝臓繊維症における化合物４ａ（ＳＪＴ４ａ）の塩酸塩のインビボ効果を示し、繊維症マーカーとしてＩ型コラーゲン（ｃｏｌ１ａ１）を測定した。共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と、非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、肝臓サンプルを、８週間（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）、化合物４ａの塩酸塩で処置したＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）から得た。
【図１０Ｂ】試験の終わりの、抗Ｉ型コラーゲンで染色された前記マウス群の各々に関する肝臓サンプルの代表的な画像を示す（倍率２０ｘ）。
【図１１Ａ】肝臓炎における化合物４ａ（ＳＪＴ４ａ）の塩酸塩のインビボ効果を示し、肝臓炎マーカーとしてガレクチン−３を測定した。共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と、非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、肝臓サンプルを、８週間（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）、化合物４ａの塩酸塩で処置したＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）から得た。
【図１１Ｂ】試験の終わりの、抗ガレクチン−３で染色された前記マウス群の各々に関する肝臓サンプルの代表的な画像を示す（倍率２０ｘ）。
【図１２】繊維症マーカーとしてのコラーゲン遺伝子の発現における、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置したＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対する、化合物４ａ（ＳＪＴ４ａ）の塩酸塩５０ｍｇ／ｋｇでのＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの８週間の処置効果：（Ａ）Ｉ型コラーゲン−アルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）と（Ｂ）アルファ２（ＣＯＬ１Ａ２）と（Ｃ）ＩＩＩ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ３Ａ１）。
【図１３】繊維症マーカーとしてのコラーゲン遺伝子の発現における、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置したＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対する、化合物４ａ（ＳＪＴ４ａ）の塩酸塩５０ｍｇ／ｋｇでのＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの８週間の処置効果：（Ａ）コラーゲンＶアルファ１（ＣＯＬ５Ａ１）、（Ｂ）アルファ２（ＣＯＬ５Ａ２）と（Ｃ）アルファ３（ＣＯＬ５Ａ３）、（Ｄ）ＩＶ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ６Ａ１）、（Ｅ）アルファ２（ＣＯＬ６Ａ２）と（Ｆ）アルファ３（ＣＯＬ６Ａ３）。
【実施例】
【０１２６】
実施例１：インスリン抵抗性を低減する本発明の化合物のインビボ効果。
【０１２７】
本明細書で上記のように、インスリン抵抗性は、ＮＡＦＬＤの発達に関係する重要な発症または症状と認められる。
【０１２８】
インスリン抵抗性の低減における本開示の化合物の性能を評価するために、食塩水溶液（０．９％のＮａＣｌ）で処置された対照、および陽性対照としてメトホルミンで処置されたＤＩＯマウスと比較して、ＤＩＯマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊのオスのマウス）を、化合物４ａ、５ａの塩酸塩；および化合物７ａで、３６日間処置した。
【０１２９】
評価のために、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｆｒａｎｃｅから得た６０  Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊのオスのマウス（発送時に１６週齢、４０ｇの平均体重）に１０週間、高脂肪食を与えた。実験過程を通じて、換気して豊かにしたケージ（３１０×１２５×１２７ｍｍ３）に動物を収容した。動物のケージの寝わらを、少なくとも週１回交換した。２２±２℃および５０±１０％の相対湿度で、通常の１２時間の光サイクル（午後０８：００にライトのスイッチを切った）で、マウスを１０マウスの群に収容した。受付の後、新環境順応のためにさらに３週間、マウスを保全した。全試験の間（順化＋処置段階）、高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ  Ｉｎｃ．から購入したＤ１２４９２；６０％の脂肪）と水道水を適宜、提供した。
【０１３０】
順化期間の後、マウスを６時間、断食させ、そして血糖と血漿インスリンを測定した。より低い血糖／血漿インスリンを有する１０匹の動物を試験から切り捨てた。次に、血糖／血漿インスリンレベル（ＨＯＭＡ−ＩＲまたはホメオスタシスモデルアセスメント−インスリン抵抗性指数）と体重に従って、他方を５つの均質群（１つの群当たりｎ＝１０マウス）に無作為化した。食塩水溶液（対照群）、試験化合物（４ａ、５ａ、７ａ；５０ｍｇ／ｋｇ）またはメトホルミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）で３６日間、マウスを経口的に１日２回処置した。
【０１３１】
６時間の断食後、血糖と血漿インスリンと共に体重を毎週、測定した。
【０１３２】
尾の先端から血液をサンプリングすることにより血糖を測定した：１滴の血液を採取し、血糖値測定器の板（Ａｃｃｕ−Ｃｈｅｃｋ  Ｒ  ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ，Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に配置する。血漿インスリンを、５μｌのサンプルを使用してＥＬＩＳＡ（（Ｅｌｉｓａ  Ｋｉｔ，Ｅｕｒｏｂｉｏ，Ｆｒａｎｃｅ）によって検出した。
【０１３３】
インスリン抵抗性を定量化するために使用されるホメオスタシスモデルアセスメント−インスリン抵抗性指数（ＨＯＭＡ−ＩＲ）を、空腹時血糖から算出し、および血漿インスリン値を以下のように計算した：ＨＯＭＡ−ＩＲ＝（ｍＭ  グルコース  Ｘ  μＵ／ｍＬ  インスリン）／２２．５、この定数を標準化因子と見なす（Ｍａｔｔｈｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２８（７），４１２−９）。
【０１３４】
図１は、１、８、１５、２２、２９、および３６日後の、試験された化合物の各々で処置されたマウス、メトホルミンで処置されたマウス、さらに対照動物に関するＨＯＭＡＲ−ＩＲ結果を示す。化合物４ａと５ａの塩酸塩、および化合物７ａで処置されたマウスは、処置の全期間にわたり、対照動物と比較してより低い、およびメトホルミンで処置された動物に類似するインスリン抵抗性を示した。
【０１３５】
データは、１０匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。
【０１３６】
実施例２：本発明の化合物の、脂肪肝に関連した肝脂質含量に対するインビボ効果。
【０１３７】
２．１．肝脂質含量に対する化合物４ａと７ａの効果：ＤＩＯマウスでの３６日間のアッセイ。
肝脂質含量の減少における本開示の化合物の性能を評価するために、食塩水溶液（０．９％のＮａＣｌ）で処置したＤＩＯマウスの対照、および陽性対照としてメトホルミンで処置したＤＩＯマウスに対して、ＤＩＯマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、化合物４ａの塩酸塩；および化合物７ａで３６日間処置した。実験過程を通じて、換気して豊かにしたケージ（３１０×１２５×１２７ｍｍ３）に動物を収容した。動物のケージの寝わらを、少なくとも週１回交換した。２２±２℃および５０±１０％の相対湿度で、通常の１２時間の光サイクル（午後０８：００にライトのスイッチを切った）で、マウスを１０マウスの群に収容した。受付の後、新環境順応のためにさらに３週間、マウスを保全した。全評価の間（順化＋処置段階）、高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ  Ｉｎｃ．から購入したＤ１２４９２；６０％の脂肪）と水道水を適宜、提供した。
【０１３８】
順化期間の後、マウスを６時間、断食させ、そして血糖と血漿インスリンを測定した。より低い血糖／血漿インスリンを有する１０匹の動物を試験から切り捨てた。次に、血糖／血漿インスリンレベル（ＨＯＭＡ−ＩＲ）と体重に従って、他方を５つの均質群（１つの群当たりｎ＝１０マウス）に無作為化した。食塩水溶液（対照群）、ＳＪＴ試験化合物（４ａ、７ａ；５０ｍｇ／ｋｇ）またはメトホルミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）で３６日間、マウスを経口的に１日２回処置した。
【０１３９】
最後に、マウスを殺し、そして肝臓を回収し、加重し、追加の分析のために−８０℃で保存した。肝臓脂質アッセイのために肝臓サンプルを解剖した。Ｍｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ，２００４，４５，１４１０−１７に記載されるように、デオキシコール酸塩における脂質可溶化後に、肝臓サンプルのホモジネートから、比色定量の市販のアッセイキットを使用して肝脂質を分析した。わずか数秒間、５００μｌの蒸留水を用いて超音波プローブでサンプルを均質化した。次に、１％でコール酸を加えて脂質を可溶性にした。次に、Ｓｏｂｉｏｄａ，Ｆｒａｎｃｅからの比色定量キットを使用して種々の脂質の測定を行なった。
【０１４０】
図２Ａ、２Ｂ、および２Ｃは、化合物４ａの塩酸塩および化合物７ａでの３６日間の処置後の、肝臓コレステロール、肝臓トリグリセリド、および肝脂肪酸それぞれのレベルを示す。各場合において、化合物４ａと７ａで処置されたマウス群は共に、未処置の対照動物よりも低い脂質レベルを示した。データは、１０匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。
【０１４１】
２．２．肝脂質含量に対する化合物４ａの塩酸塩の効果：ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスにおける８週間のアッセイ。
ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスモデルに、結果として非アルコール性脂肪性肝疾患をもたらす高脂肪食を与え、およびＣ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに基づいてアッセイ前に４０％の高脂肪食を与える。非アルコール性脂肪性肝疾患における肝脂質含量に対する本発明の化合物の効果の評価のために、Ｊａｎｖｉｅｒ、Ｆｒａｎｃｅから得た３４のＣ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス（発送時に５週齢）を使用した。試験に先立ち３５週間、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群に高脂肪食（４０％のＡＭＬＮ食、Ｄ０９１００３０１Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、アメリカ）を与え、および対照群（ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ）に、通常の固形食（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を与えた。
【０１４２】
動物（単一のハウジングで飼う）を毎日最低１回チェックし、ここで異常行動の徴候、異常な自発運動、運動失調、または疾患の臨床的徴候（毛づくろいの欠如、膨らんだ毛皮、取り扱い時の痛みの徴候、過度の体重減少）を密に追跡した。追加の評価が正当と判断された健康状態が、臨床獣医により、または臨床獣医の監督下で働く専門家により検査された。試験期間中、動物が成育しておらず、道義的理由により終了するべきであるかを判定するために、疾患の同じ異常行動と臨床的症状を使用した。獣医により推奨される可能な処置を、試験責任者と同意後に行った。マウスを通常の１２時間の光サイクル（３ｐｍに消灯）で収容し、および部屋の環境を制御した（標的範囲：温度２１±２℃；相対湿度５０±１％）。
【０１４３】
各動物を、動物ユニットへの到着に際し移植可能なマイクロチップ（Ｐｅｔ  ＩＤ  Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ，Ｅ−ｖｅｔ）によって独自に識別した。ＨＭ０２Ｌａｂソフトウェア（Ｅｌｌｅｇａａｒｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を実行するラップトップに接続されたＷＳ−１秤量所（ＭＢｒｏｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を使用して動物を識別した。ＨＭ０２Ｌａｂソフトウェアは、体重を動物ＩＤと一致させる。肝生検のために、イソフルラン（２−３％）を使用し吸入麻酔によってマウスに麻酔をかけた。小さな腹部切開を中線で行い、肝臓の左側方向葉を露出させた。肝臓組織の円錐形のウェッジ（およそ５０ｍｇ）を葉の遠位部から切除し、そして組織学のために１０％の中性緩衝ホルマリン（４％のホルムアルデヒド）に固定した。肝臓の切断面を、バイポーラ凝固（ＥＲＢＥ  ＶＩＯ  １００  電気メス）を使用して即座に電気凝固した。肝臓を腹腔に戻し、腹壁を縫合し、そして皮膚をステープラーで閉じる。術後の回復のために、マウスは、手術日および手術後１日目と２日目に、皮下投与されるカルプロフェン（５ｍｇ／ｋｇ）を受けた。組織学試験に先立って試験サンプルを−８０℃で保存した。
【０１４４】
２．２．Ａ．肝臓中の全脂肪含量
非アルコール性脂肪性肝疾患を有するマウスにおける肝脂質含量に対する化合物４ａの効果を評価するために、食塩水溶液（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの対照と、陽性対照としてさらに食塩水溶液（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を８週間、化合物４ａの塩酸塩で処置した（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）。肝脂質含量を形態計測によって判定した。先に言及したように、試験に先立ち３５週間、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群に高脂肪食（４０％のＡＭＬＮ食、Ｄ０９１００３０１Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、アメリカ）を与え、および対照群（ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ）に、通常の固形食（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を与えた。
【０１４５】
図３Ａは、アッセイの最後に、ビヒクルで処置されたＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウス対照群（左の列）と比較して、ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス対照群（中央の列）において肝臓含量が増加したことを示し、化合物４ａの塩酸塩で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群（右の列）は、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス対照群と比較して肝脂質含量の減少（脂肪症の低減）を示した。
【０１４６】
データは、１０〜１２匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。＊＊＊ｐ＜０．００１ 対 ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクル；ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析。
【０１４７】
図３Ｂは、処置の最後の、３つのマウス群に関する肝臓形態学の代表的な画像を示し（倍率ｘ２０）、ここで、ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス対照群と比較して、化合物４ａでの処置はＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスにおける脂肪症を縮小したことがわかる。肝臓サンプルをＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ＆Ｅｏｓｉｎ（Ｈ＆Ｅ）で染色した。そのために、サンプルをＭａｙｅｒ’ｓ  Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ（Ｄａｋｏ）でインキュベートし、水道水で洗浄し、エオシンＹ溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色し、水和し、Ｐｅｒｔｅｘに据え付け、次に走査前に乾燥させた。
【０１４８】
２．２．Ｂ．トリグリセリドとコレステロールの肝臓含量
非アルコール性脂肪性肝疾患を有する動物におけるトリグリセリドまたはコレステロールに対する化合物４ａの効果を評価するために、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と、非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を８週間、化合物４ａの塩酸塩で処置した（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）。試験に先立ち３５週間、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群に高脂肪食（４０％のＡＭＬＮ食、Ｄ０９１００３０１Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、アメリカ）を与え、および対照群（ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ）に、通常の固形食（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を与えた。
【０１４９】
肝臓のトリグリセリド含量は、Ｃｏｂａｓ（商標）Ｃ−５０１自動分析器で、トリグリセリド試薬（Ｃａｔ．ｎｏ．２２−０４５−７９５，Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して判定した。均質化した肝臓組織を、８０〜１００℃で２回加熱し、微量遠心機で遠心分離にかけ、そしてトリグリセリド含量を上清中で測定した。
【０１５０】
図４Ａは、アッセイの最後に、ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス対照群（中央の列）が、ビヒクルで処置されたＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウス対照群（左の列）と比較してトリグリセリドレベルの増加を示し、化合物４ａの塩酸塩で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群（右の列）は、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス対照群と比較してトリグリセリドレベルの減少を見せたことを示す。
【０１５１】
データは、１０〜１２匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。＊＊＊ｐ＜０．００１ 対 ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクル；ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクルに対する全ての列）。
【０１５２】
図４Ｂは、アッセイの最後に、ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス対照群（中央の列）が、ビヒクルで処置されたＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウス対照群（左の列）と比較してコレステロールレベルの増加を示し、化合物４ａの塩酸塩で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群（右の列）は、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス対照群と比較してコレステロールレベルの減少を見せたことを示す。
【０１５３】
データは、１０〜１２匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１ 対 ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクル；ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクルに対する全ての列）。
【０１５４】
実施例３：本発明の化合物の肝臓重量に対するインビボ効果。
【０１５５】
３．１：肝臓重量に対する化合物４ａと５ａの効果：ＤＩＯマウスでの３６日間のアッセイ。
肝臓重量を減らす本開示の化合物の性能を評価するために、ビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯマウスの対照と、陽性対照としてメトホルミンで処置されたＤＩＯマウスと比較して、ＤＩＯマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、化合物４ａおよび５ａの塩酸塩で３６日間処置した。
【０１５６】
評価のために、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｆｒａｎｃｅから得た６０  Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊのオスのマウス（発送時に１６週齢、４０ｇの平均体重）に１０週間、高脂肪食を与えた。実験過程を通じて、換気して豊かにしたケージ（３１０×１２５×１２７ｍｍ３）に動物を収容した。動物のケージの寝わらを、少なくとも週１回交換した。２２±２℃および５０±１０％の相対湿度で、通常の１２時間の光サイクル（午後０８：００にライトのスイッチを切った）で、マウスを１０マウスの群に収容した。受付の後、新環境順応のためにさらに３週間、マウスを保全した。全試験の間（順化＋処置段階）、高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔ  Ｉｎｃ．から購入したＤ１２４９２；６０％の脂肪）と水道水を適宜、提供した。
【０１５７】
順化期間の後、マウスを６時間、断食させ、そして血糖と血漿インスリンを測定した。より低い血糖／血漿インスリンを有する１０匹の動物を試験から切り捨てた。次に、血糖／血漿インスリンレベル（ＨＯＭＡ−ＩＲ）と体重に従って、他方を５つの均質群（１つの群当たりｎ＝１０マウス）に無作為化した。食塩水溶液（対照群）、ＳＪＴ試験化合物（化合物４ａおよび５ａの塩酸塩；５０ｍｇ／ｋｇ）またはメトホルミン（１５０ｍｇ／ｋｇ）のいずれかで３６日間、マウスを経口的に１日２回処置した。
【０１５８】
最後に、マウスを殺し、そして肝臓を回収し、加重し、追加の分析のために−８０℃で保存した。
【０１５９】
図５は、化合物４ａおよび５ａの塩酸塩での３６日間の処置後の、肝臓の過重量を示す。化合物４ａおよび５ａの塩酸塩で処置された両マウス群は、メトホルミンで処置されたマウス、または対照動物のいずれかよりも低い肝臓重量を示す。
【０１６０】
データは、１０匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。
【０１６１】
３．２．肝臓重量に対する化合物４ａの効果：ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスにおける８週間のアッセイ。
実施例２．２で使用した同じ条件で、動物を飼育し、検査した。肝生検もまた、実施例２．２と同じ条件下で実行した。
【０１６２】
非アルコール性脂肪性肝疾患を有するマウスの肝臓重量に対する化合物４ａの効果を評価するために、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と、非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を８週間、化合物４ａの塩酸塩で処置した（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）。試験に先立ち３５週間、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群に高脂肪食（４０％のＡＭＬＮ食、Ｄ０９１００３０１Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、アメリカ）を与え、および対照群（ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ）に、通常の固形食（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を与えた。
【０１６３】
図６は、アッセイの終わりにおけるに肝臓総重量を示し、ここで、ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス対照群（中央の列）は、ビヒクルで処置されたＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウス対照群（左の列）と比較して重量の増加を示し、化合物４ａの塩酸塩で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群（右の列）は、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス対照群と比較して肝臓重量の減少を見せた。
【０１６４】
データは、１０〜１２匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。＊＊＊ｐ＜０．００１ 対 ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクル；ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（ＤＩＯ−ＮＡＳＨビヒクルに対する全ての列）。
【０１６５】
実施例４：絶対的および相対的な体重に対する化合物４ａのインビボ効果。
【０１６６】
非アルコール性脂肪性肝疾患を有する動物（ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス）の体重に対する本発明の化合物の効果を評価するために、アッセイを行った。このアッセイのために、絶対的および相対的な体重における化合物４ａの効果を評価した。ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、化合物４ａの塩酸塩で８週間（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）処置した。試験に先立ち３５週間、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群に高脂肪食（４０％のＡＭＬＮ食、Ｄ０９１００３０１Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、アメリカ）を与え、および対照群（ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ）に、通常の固形食（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を与えた。
【０１６７】
群の各々に関して体重を毎日とった。実施例２．２で使用したものと同じ条件下で、動物を飼育した。
【０１６８】
図７Ａは、３つの動物群の各々に関して測定された絶対的な体重を示す。ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスは、ビヒクルで処置されたＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスと比較して体重の増加を実証し、化合物４ａの塩酸塩での処置は、ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスと比較した場合に、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスにおいて体重を減らした。
【０１６９】
データは、１０〜１２匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ 対 ＮＡＳＨビヒクル。処置の５４日目に行われた、ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（ＮＡＳＨビヒクルに対する）。
【０１７０】
図７Ｂは、処置の開始時における体重に対する（０日目は１００％）、３つの動物群の各々に関して測定された相対的な体重の％を示す。ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨおよびＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ動物は、ビヒクルでの処置中に有意な体重変化を示さなかったが、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの化合物４ａの塩酸塩での処置は、相対的な体重を有意に減らした。
【０１７１】
データは、１０〜１２匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。＊＊＊Ｐ＜０．００１ 対 ＮＡＳＨビヒクル。処置の５４日目に行われた、ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（ＮＡＳＨビヒクルに対する）。
【０１７２】
実施例５：肝臓毒性に対する化合物４ａのインビボ効果
【０１７３】
アッセイは、非アルコール性脂肪性肝疾患を有する動物（ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス）に関して、肝臓毒性に対する本発明の化合物の効果を評価するために実行された。このアッセイでは、血漿アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）と血漿アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）における化合物４ａの効果を評価した。ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、化合物４ａの塩酸塩で８週間（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）処置した。実施例２．２で使用したものと同じ条件下で動物を飼育した。試験に先立ち３５週間、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群に高脂肪食（４０％のＡＭＬＮ食、Ｄ０９１００３０１Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、アメリカ）を与え、および対照群（ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ）に、通常の固形食（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を与えた。
【０１７４】
アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）とアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）を評価するために、血液サンプルをヘパリン処理されたチューブに採取し、血漿を分離し、そして分析まで−８０℃で保存した。ＡＬＴとＡＳＴを、メーカーの説明書に従いＣｏｂａｓ（商標）Ｃ−５０１自動分析器において市販のキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。
【０１７５】
図８Ａは、処置の最後の、３つの動物群の各々に関する血漿ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）を示す。ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨ対照群は、ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ動物と比較して、血漿ＡＬＴの増加を示した。ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨ動物と比較した場合、化合物４ａの塩酸塩での処置は、ＤＩＯ−ＮＡＳＨ動物の血漿ＡＬＴレベルを下げた。
【０１７６】
データは、１０〜１２匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。＊＊＊Ｐ＜０．００１ 対 ＮＡＳＨビヒクル。ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（ＮＡＳＨビヒクルに対する全ての列）。
【０１７７】
図８Ｂは、処置の最後の、３つの動物群の各々に関する血漿ＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）を示す。ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨ対照群は、ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ動物と比較して、血漿ＡＳＴの増加を示した。ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨ動物と比較した場合、化合物４ａの塩酸塩での処置は、ＤＩＯ−ＮＡＳＨ動物の血漿ＡＳＴレベルを下げた。
【０１７８】
データは、１０〜１２匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。＊＊＊Ｐ＜０．００１ 対 ＮＡＳＨビヒクル。ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（ＮＡＳＨビヒクルに対する全ての列）。
【０１７９】
実施例６：ＮＡＦＬＤ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅ（ＮＡＳ）により測定された、肝臓繊維症および肝臓炎に対する化合物４ａのインビボ効果
【０１８０】
非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｓｃｏｒｅまたはＮＡＳを、肝臓の脂肪症、小葉状炎症、風船変性および繊維症の測定によって評価した。全ＮＡＳスコアは、脂肪症、炎症、および風船に関するスコアの合計を表し、以下のように０〜８の範囲である：
【０１８１】
【表２】
2020510001.tif 000034
脂肪症度の％は、低から中のパワー検査で評価される、脂肪症によって含まるサンプルの表面積の量を指す。
【０１８２】
炎症を測定するために与えられる値は、２００ｘ倍率を使用した１つのフィールド当たりの炎症性の病巣の数に対応する。病巣は、＞３の炎症細胞の、行ではなくクラスタとして定義される。好酸性細胞体は炎症の評価に含まれない。
【０１８３】
風船変性値を、除去された細胞質、肥大、膨潤、丸くなった、および網状になった細胞質を有する退化した肝細胞に対応する、気球細胞の量によって測定する。
【０１８４】
非アルコール性脂肪性肝疾患を有するマウスのＮＡＳに対する化合物４ａの効果を評価するために、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と、非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を８週間、化合物４ａの塩酸塩で処置した（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）。実施例２．２で使用した同じ条件で、動物を飼育し、検査した。肝生検もまた、実施例２．２と同じ条件下で実行した。試験に先立ち３５週間、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群に高脂肪食（４０％のＡＭＬＮ食、Ｄ０９１００３０１Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、アメリカ）を与え、および対照群（ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ）に、通常の固形食（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を与えた。
【０１８５】
肝臓サンプルをホルマリン固定し、パラフィン包埋し、そし切片をヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）とシリウスレッドで染色した。Ｋｌｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００５により概説される臨床基準を使用して、ＮＡＳと繊維症に関してサンプルをスコア付けする。
【０１８６】
図９は、動物の群の各々に関する、試験前と後の肝生検のＮＡＳスコア変化を示す。各動物ごとに、試験前の生検から試験後の生検までの変化が線によって示される。
【０１８７】
図９Ａは、ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ群のＮＡＳスコア（ビヒクルで処置された対照）における有意な変化を示さず、ここで全ての動物は、試験の前後両方で低いスコアを示す。図９Ｂは、ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスのスコアと比較した場合に、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスが試験前にどのようにより高いスコアの特徴を示すか、およびスコアが試験後にどのように増加する傾向にあるかを示す。図９Ｃは、化合物４ａの塩酸塩で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスが概して、処理後にどのようにＮＡＳスコアを減少させたかを示す。
【０１８８】
非アルコール性脂肪性肝疾患の処置において、肝臓の繊維症における本発明の化合物の効果を評価するために、肝臓におけるＩ型コラーゲン（繊維症）レベルを８週間の試験後に測定し、試験においてＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、化合物４ａの塩酸塩で８週間（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）処置した。
【０１８９】
Ｉ型コラーゲン含量を、ＩＨＣ染色による着色によって測定した：Ｉ型コラーゲン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｃａｔ．１３１０−０１）ＩＨＣを、標準手順を使用して行なった。手短かに言えば、抗原の回収と内因性ペルオキシダーゼ活性の遮断後、一次抗体を用いて肝臓スライドをインキュベートした。一次抗体を、ビオチン化二次抗体を使用して検出し、ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ−ＴＳＡ−ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ法、高分子ＨＲＰリンカー抗体複合体を使用して増幅した。次に、一次抗体をクロモゲンとしてＤＡＢで視覚化した。最後に、切片をヘマトキシリン中で対比染色し、カバーを滑らせた。
【０１９０】
図１０Ａは、マウスの３つの群における形態計測によって判定された肝臓Ｉ型コラーゲン（ｃｏｌ１ａ１）の総含量の定量化を示す。ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨ対照マウス群は、ビヒクルで処置されたＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ対照群と比較して、肝臓ｃｏｌ１ａ１の増加を実証した。
化合物４ａの塩酸塩で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスは、ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨ対照群と比較して、全肝臓ｃｏｌ１ａ１の減少を示した。
【０１９１】
データは、１０〜１２匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１ 対 ＮＡＳＨビヒクル。ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（ＮＡＳＨビヒクルに対する全ての列）。
【０１９２】
図１０Ｂは、試験の最後の、抗Ｉ型コラーゲン（ｃｏｌ１ａ１）で染色されたマウス群の各々に関する肝臓サンプルの代表的な画像を示す（倍率２０ｘ）。画像は、ＤＩＯ−ＮＡＳＨ動物が化合物４ａの塩酸塩で処置された後の、この繊維症マーカーにおける可視変化を示し、図１０Ａの結果を確認する。
【０１９３】
非アルコール性脂肪性肝疾患の処置において、肝臓の炎症における本発明の化合物の効果を評価するために、肝臓ガラクチン−３（炎症マーカー）レベルを８週間の試験後に判定し、ここでＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、化合物４ａの塩酸塩で８週間（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）処置した。
【０１９４】
ガレクチン−３を、ガレクチン（ｇａｌｔａｃｔｉｎ）−３  ＩＨＣ染色により測定した：ガレクチン−３（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｃａｔ．＃１２５４０２）ＩＨＣを、標準手順を使用して行なった。手短かに言えば、抗原の回収と内因性ペルオキシダーゼ活性の遮断後、スライドを一次抗体を用いてインキュベートした。一次抗体を、リンカー二次抗体を使用して検出し、続いて高分子ＨＲＰリンカー抗体複合体を使用して増幅した。
次に、一次抗体をクロモゲンとしてＤＡＢで視覚化した。最後に、切片をヘマトキシリン中で対比染色し、カバーを滑らせた。
【０１９５】
図１１Ａは、マウスの３つの群における形態計測によって判定された肝臓のガレクチン−３総含量の定量化を示す。ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨ対照マウス群は、ビヒクルで処置されたＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ対照群と比較して、ガレクチン−３含量の増加を実証した。化合物４ａの塩酸塩で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスは、ビヒクルで処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨ対照群と比較して、ガレクチン−３総含量の減少を示した。
【０１９６】
データは、１０〜１２匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。＊＊＊Ｐ＜０．００１ 対 ＮＡＳＨビヒクル。ダネットの多重比較検定を用いた一元配置分散分析（ＮＡＳＨビヒクルに対する全ての列）。
【０１９７】
図１１Ｂは、試験の終わりの、抗ガレクチン−３で染色されたマウス群の各々に関する肝臓サンプルの代表的な画像を示す（倍率２０ｘ）。画像は、ＤＩＯ−ＮＡＳＨ動物が化合物４ａの塩酸塩で処置された後の、この炎症マーカーにおける可視変化を示し、図１１Ａの結果を確認する。
【０１９８】
実施例７：差次的発現分析：化合物４ａのインビボ効果。
【０１９９】
肝臓繊維症の発達における本発明の化合物の効果をさらに、ＲＮＡｓｅｑによる差次的遺伝子発現分析によって試験し、ここでＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス（Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊ  オスのマウス）を、共にビヒクル（０．９％のＮａＣｌ）で処置されたＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの病的な対照と非病的な対照ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷマウスに対して、化合物４ａの塩酸塩で８週間（５０ｍｇ／ｋｇ、経口投与、１日２回）処置した。
【０２００】
実施例２．２で使用した同じ条件で動物を飼育し、検査した。肝生検もまた、実施例２．２と同じ条件下で実行した。試験に先立ち３５週間、ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群に高脂肪食（４０％のＡＭＬＮ食、Ｄ０９１００３０１Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、アメリカ）を与え、および対照群（ＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ）に、通常の固形食（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  １３２４、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を与えた。
【０２０１】
図１２と１３は、繊維症マーカーであるコラーゲン遺伝子の発現における、化合物４ａの塩酸塩でのＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの処置 対 ビヒクルで処置された対照ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群、およびビヒクルで処置されたＬＥＡＮ−ＣＨＯＷ陽性対照群の効果を示す：Ｉ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ１Ａ１）とアルファ２（ＣＯＬ１Ａ２）、ＩＩＩ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ３Ａ１）、コラーゲンＶアルファ１（ＣＯＬ５Ａ１）、アルファ２（ＣＯＬ５Ａ２）とアルファ３（ＣＯＬ５Ａ３）、ＶＩ型コラーゲンアルファ１（ＣＯＬ６Ａ１）、アルファ２（ＣＯＬ６Ａ２）とアルファ３（ＣＯＬ６Ａ３）。
【０２０２】
結果は、各マウス群に関するＲＰＫＭの発現レベルとして与えられ、ここでＲＰＫＭ（１００万のマッピングされた読み取りにつきキロ塩基ごとの読み取り）は、全読み取り長さとシーケンシング読み取りの数を標準化することによりＲＮＡシーケンシングデータから遺伝子発現を定量化する方法である。
【０２０３】
データは、６匹の動物からの平均±ｓ．ｅ．ｍ．値として示された。＊＊＊Ｐ＜０．００１ 対 ＮＡＳＨビヒクル。
【０２０４】
化合物４ａの塩酸塩でのＤＩＯ−ＮＡＳＨモデルマウスの処置は、対照ＤＩＯ−ＮＡＳＨマウス群と比較して、コラーゲン遺伝子の発現を有意に減らした。実際、化合物４ａは、２０００より多くの遺伝子の調節を引き起こし、多くがＮＡＳＨに関係している。特に、８週間のＤＩＯ−ＮＡＳＨマウスの化合物４ａでの処置（５０ｍｇの経口投与、１日２回）は：
―ＣＤ６８、ＣＣＲ２、ＭＡＣ−２等の、単球動員に関係するいくつかの原型の炎症マーカーの減少をもたらした；
―  Ｃｏｌ１ａ１、Ｃｏｌ３ａ１、およびＴＩＭＰ１等の、星細胞活性化に関係するいくつかの原型の繊維症遺伝子の減少をもたらした；
―炎症シグナル伝達に関して、ＴＬＲ４、ＴＧＦＢ、およびＴＧＦＢＲ遺伝子発現における減少をもたらした；
―インスリンシグナル伝達に関して、ＭＡＰＫとＡＫＴの発現の減少と、ＧＬＵＴ４の発現の増加をもたらした；
―脂質代謝に関して、ＣＤ３６の発現の減少と、ＳＱＬＥの発現の増加をもたらした；および
―肝細胞性細胞死に関して、Ｃａｓｐ７とＩＬ１８の発現の増加をもたらした。
【０２０５】
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【図１】
2020510001.tif 000050
【図２Ａ】
2020510001.tif 000051
【図２Ｂ】
2020510001.tif 000052
【図２Ｃ】
2020510001.tif 000053
【図３Ａ】
2020510001.tif 000054
【図３Ｂ】
2020510001.tif 000055
【図４Ａ】
2020510001.tif 000056
【図４Ｂ】
2020510001.tif 000057
【図５】
2020510001.tif 000058
【図６】
2020510001.tif 000059
【図７Ａ】
2020510001.tif 000060
【図７Ｂ】
2020510001.tif 000061
【図８Ａ】
2020510001.tif 000062
【図８Ｂ】
2020510001.tif 000063
【図９】
2020510001.tif 000064
【図１０Ａ】
2020510001.tif 000065
【図１０Ｂ】
2020510001.tif 000066
【図１１Ａ】
2020510001.tif 000067
【図１１Ｂ】
2020510001.tif 000068
【図１２】
2020510001.tif 000069
【図１３】
2020510001.tif 000070
【国際調査報告】
2020510001.tif 000071
2020510001.tif 000072
2020510001.tif 000073
2020510001.tif 000074