(57)【要約】  本出願は、移植特性が改善されたＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、前記方法は細胞サイズ縮小工程を含んでなり、前記細胞サイズ縮小工程は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを特徴とする方法を開示する。本出願は、間葉系幹細胞由来細胞を間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から得る方法であって、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌのヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなる方法をさらに提供する。本発明はまた、そのように得られた細胞および細胞集団、ならびにそれを含んでなるさらなる製品およびその使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）および少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２】
以下の工程：
（ａ）ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を含んでなる培地において、対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを培養する工程；
（ｂ）非接着性物質を除去し、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を含んでなる培地において、接着性細胞をさらに培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得る工程
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＧＦβが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびその混合物からなる群から選択され、好ましくは、ＴＧＦβがＴＧＦβ１である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
移植特性が改善されたＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、前記方法は、サイズ縮小工程を含んでなり、前記サイズ縮小工程は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを特徴とする、方法。
【請求項５】
−  ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の濃度が、少なくとも０．０５ＩＵ／ｍｌ、好ましくは約０．１ＩＵ／ｍｌであり；および／または
−  ヘパリンまたはそのヘパリン誘導体もしくは類似体が、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）；エノキサパリン、ダルテパリン、ナドロパリン、チンザパリン、セルトパリン、レビパリン、アルデパリン、パルナパリン、ベミパリンなどの低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、またはその混合物；ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、アカラン硫酸、ケラタン硫酸などのヘパリノイド、またはダナパロイドなどのその混合物；ヘパリン塩；ヘパリノイド塩；ヘパリン断片；ヘパリノイド断片；およびその混合物からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ６０≦２５μｍ）を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＭＳＣ由来細胞が、骨軟骨芽細胞、好ましくは骨芽細胞系統である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞が、血漿、血清またはその代替物の１以上、例えば、培地に付加的に含まれる血漿、血清またはその代替物の１以上とさらに接触する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなり、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ６０≦２５μｍ）を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する、方法。
【請求項１０】
−  ＭＳＣが、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触し；および／または
−  ＴＧＦβが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびその混合物からなる群から選択され、好ましくは、ＴＧＦβがＴＧＦβ１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ６０≦２５μｍ）を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する、ＭＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖により得ることができるＭＳＣ由来細胞の集団。
【請求項１２】
−  ＭＳＣ由来細胞が、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなる方法により得ることができ、好ましくは、ＴＧＦβが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびその混合物からなる群から選択され、より好ましくは、ＴＧＦβがＴＧＦβ１であり、好ましくは、ＭＳＣが、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触し、場合により、ＭＳＣが、血漿、血清またはその代替物１以上とさらに接触する；および／または
−  ＭＳＣ由来細胞が、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統であり、好ましくは、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統の実質的に総てのＭＳＣ由来細胞が、ＣＤ７３、ＣＤ６３およびＣＤ１６６に対して陽性であり；骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統の実質的に総てのＭＳＣ由来細胞が、ＣＤ４５に対して陰性であり；骨軟骨芽細胞系統または骨芽細胞のＭＳＣ由来細胞の少なくとも７０％が、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に対して陽性であり；骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の１０％未満が、ＨＬＡ−ＤＲに対して陽性である、請求項１１に記載のＭＳＣ由来細胞の集団。
【請求項１３】
請求項１１または１２に定義されるＭＳＣ由来細胞の集団を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１４】
医薬としての使用のための、好ましくは、ＭＳＣ由来細胞の移植を必要とする対象の処置における使用のための、請求項１１もしくは１２に記載のＭＳＣ由来細胞の集団または請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
−  ＭＳＣ由来細胞の集団が、約１×１０７／ｍｌ〜約１×１０８／ｍｌの間の濃度で、好ましくは、７．５×１０７個／ｍｌの濃度で存在し；および／または
−  ＭＳＣ由来細胞の集団または医薬組成物が、経皮または血管内投与に好適である、請求項１４に記載の使用のためのＭＳＣ由来細胞の集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を増殖および／または分化させる方法、ＭＳＣ由来細胞および細胞集団、ならびにそのような細胞および細胞集団を含んでなる製品、方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
骨形成分化を受ける能力がある幹細胞、骨形成分化に関与する細胞、または骨形成能を有する細胞の移植は、骨関連疾患の処置にとって、特に、処置が新たな骨組織の生成を必要とする場合に、有望な手段である。
【０００３】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨障害を処置するためにこれまで使用されている(Gangji et al., 2005 Expert Opin Biol Ther 5: 437-42)。しかしながら、そのような比較的未分化の幹細胞を移植できるものの、それらは骨芽細胞系統に関与していないため、そのように移植された幹細胞のかなりの割合が、最終的に所望の骨組織の形成に寄与しない可能性がある。さらに、そのような幹細胞の量は、満足できるものではないことが多い。
【０００４】
ＷＯ２００７／０９３４３１は、単離ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させる方法に関し、この方法は、骨芽細胞表現型を示す細胞をもたらした。前記方法では、ヒトＭＳＣが、血清または血漿および塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）の存在下で培養された。
【０００５】
ＷＯ２００９／０８７２１３は、骨前駆細胞、骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞をヒトＭＳＣからｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで得る方法であって、前記ＭＳＣをヒト血漿または血清、ＦＧＦ−２およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦ−β）と接触させることを含んでなる方法に関する。
【０００６】
新規なＭＳＣ由来細胞および細胞集団など、とりわけ療法において有用な新規な細胞および細胞集団、ならびにそれを製造する方法の継続した必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の特定の代表的な複数の実施形態を説明する実験の項により実証されるように、本発明者らは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来細胞の移植能は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでヘパリンまたは誘導体もしくは類似体と接触させることにより前記細胞を得る場合、かなり増大され得ることを認識した。より詳しくは、本発明者らは、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を、ヘパリンまたは誘導体もしくは類似体、好ましくは、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させると、その細胞が標準的で均一な、比較的小さな細胞サイズを有する新たなＭＳＣ細胞由来細胞集団が生じることを見出した。このようなＭＳＣ細胞由来細胞は、改善された移植特性、例えば、（ｉ）非経口（例えば、静脈内を含む血管内）投与に対する改善された適合性、（ｉｉ）容量が制限された調節可能かつ高い細胞濃度をｉｎ  ｖｉｖｏで送達できる可能性、（ｉｉｉ）優れたｉｎ  ｖｉｖｏ安全性プロファイル、および／または（ｉｖ）非経口で送達した場合の優れた注射筒の操作性を有する。
【０００８】
さらに、本発明のＭＳＣ由来細胞は、骨形成を誘導する能力を有する。骨誘導特性に加えて、本発明者らは、本発明のＭＳＣ由来細胞は高い骨形成活性も示すことを見出した。骨形成活性は、有利には、軟骨内骨化を通じて生成される石灰化小結節の発生をもたらす。
【０００９】
従って、ある側面において、本発明は、移植特性が改善されたＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、前記方法はサイズ縮小工程を含んでなり、前記サイズ縮小工程は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを特徴とする方法を提供する。
【００１０】
さらなる側面において、本発明は、ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなる方法を提供する。
【００１１】
さらなる側面において、本発明は、ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなり、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ６０≦２５μｍ）を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μＭ超の直径を有する方法を提供する。
【００１２】
別の側面において、本発明は、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ６０≦２５μｍ）を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μＭ超の直径を有する、ＭＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖により得ることができるＭＳＣ由来細胞の集団を提供する。
【００１３】
別の側面において、本発明は、本明細書で教示するＭＳＣ由来細胞の集団を含んでなる医薬組成物を提供する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書で教示するＭＳＣ由来細胞または医薬組成物の集団を提供する。
【００１５】
本発明のこれらのおよびさらなる側面ならびに好ましい複数の実施形態は、以下の項および添付の特許請求の範囲において説明する。添付の特許請求の範囲の主題は、これにより具的的に本明細書の一部とされる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】図１は、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）およびトランスフォーミング成長因子β１（ＴＧＦβ１）で産生されたＭＳＣ由来細胞、特にＭＳＣ由来骨形成細胞（Ａ）ならびにＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生されたＭＳＣ由来骨形成細胞（Ｂ）の細胞サイズを例示したものである。
【図２】図２は、０．１ＩＵ／ｍｌで使用した異なるヘパリノイド：未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、ダルテパリン、ダナパロイドおよびヘパラン硫酸による、ＭＳＣ由来細胞、特にＭＳＣ由来骨形成細胞の産生を例示したものである。
【図３】図３は、他の抗凝固剤：ＥＤＴＡおよびＡｃｔｉｌｙｓｅ（登録商標）（アルテプラーゼ、組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター）と比較した、ヘパリンによるＭＳＣの培養を例示したものである。培養３６時間後、２ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡおよび０．１ｍｇ／ｍｌのＡｃｔｉｌｙｓｅ（登録商標）と接触した細胞は懸濁状態であるが、一方、１または１００ＩＵ／ｍｌのヘパリンと接触した細胞は、成長および接着している。
【図４】図４は、溶媒／洗浄剤処理（Ｓ／Ｄ）血漿（５％ｖ／ｖ）が血清（５％ｖ／ｖ）と置換されている本発明の方法の実施形態により培養されたＭＳＣ由来細胞、特にＭＳＣ由来骨形成細胞を例示したものである。
【図５】図５は、アリザリンレッド染色（ＡＲＳ）によりアッセイされたＭＳＣ由来細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ石灰化を例示したものである。ＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生）を、骨形成条件下で培養した。骨形成条件下での培養の２１日後（Ａ）および２８日後（Ｂ）にＡＲＳを行い、カルシウムおよびリン酸塩沈着物を染色した（倍率１００倍）。
【図６】図６は、細胞凝集体切片のヘマトキシリン・エオシン染色および軟骨細胞外マトリックス（プロテオグリカンおよびコラーゲン）染色を例示したものである。ＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生）を遠心分離して細胞凝集体を形成し、細胞凝集体を軟骨形成条件または対照条件下で２１日間培養した。トルイジンブルーは、軟骨細胞外マトリックスおよび細胞核からのプロテオグリカンを染色する。サフラニンオレンジは、軟骨細胞外マトリックスからのプロテオグリカンを染色し、シリウスレッドはコラーゲンを染色する。
【図７】図７は、肺実質組織切片のヘマトキシリン・エオシン染色を例示したものである（倍率２００倍）。（Ａ）ＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂを注射した動物：正常肺実質；（Ｂ）骨形成細胞Ａを注射した動物：肺胞毛細血管における注射された細胞の播種性の多数の群を伴う肺実質（矢印）。
【図８】図８は、賦形剤単独（対照条件）、ＭＳＣ由来骨形成細胞Ａ（ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１で産生）またはＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生）の投与の２週後における、マウスおよびヒトカルシウム結合蛍光色素により証明された、マウス骨頭蓋冠の冠状切片での骨新形成を例示したものである。
【図９】図９は、賦形剤単独（陰性対照）、ＭＳＣ由来骨形成細胞Ａ（ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１で産生）またはＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生）の投与の２週後における、マウス頭蓋冠の冠状切片で行った骨形成（％）の定量化を例示したものである。
【図１０】図１０は、ＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生）の投与の２週後における、マウス骨頭蓋冠の冠状切片で行った抗マウスおよび抗ヒトＩ型コラーゲン二重免疫染色（免疫蛍光）を例示したものである。図１０ａは、抗ヒトおよび抗マウスＩ型コラーゲン二重免疫染色（マージ）を例示したものであり、一方、図１０ｂおよび１０ｃは、それぞれ抗ヒトおよび抗マウスＩ型コラーゲン免疫染色を示したものである。
【図１１】図１１は、（Ａ）ＭＳＣ、（Ｂ）ＭＳＣ由来骨形成細胞Ａ（ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１で産生）、ならびに（Ｃ）ＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生）の細胞サイズを例示したものである。
【図１２】図１２は、賦形剤単独、ＭＳＣ、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１で産生されたＭＳＣ由来骨形成細胞Ａ（ｂ−ｆ細胞Ａ）、またはＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生されたＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂ（ｂ−ｆ細胞Ｂ）の投与の２週後における、マウス骨頭蓋冠の冠状切片の組織学染色を例示したものである。（Ａ）カルシウム結合蛍光色素を逐次的に腹膜内注射して（アリザリンレッド→カルセイングリーン→カルセインブルー→テトラサイクリン）、骨新形成（矢印）を証明し、骨形成の動態を評価した；（Ｂ）免疫蛍光（ＩＦ）ヒト＋マウスＩ型コラーゲン；（Ｃ）ＩＦマウスＩ型コラーゲン；（Ｄ）ＩＦヒトＩ型コラーゲン。抗ヒトおよび抗マウスＩ型コラーゲン二重免疫蛍光を行い、骨基質により分泌されるヒトおよびマウスＩ型コラーゲンの検出を可能とした；（Ｅ）ＡＬＰ＋ゴールドナー染色：ＡＬＰ：黒色（実線および黒色の領域）で示される骨芽細胞活性の検出、マッソントリクロームゴールドナー：黒色の点線で示される類骨（非石灰化骨組織）、暗灰色の線で示される石灰化した骨の検出；（Ｆ）酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ（ＴＲＡＰ）：暗灰色／黒色で示される破骨細胞活性の検出。
【図１３】図１３は、賦形剤単独；ＭＳＣ；ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１で産生されたＭＳＣ由来骨形成細胞Ａ（ｂ−ｆ細胞Ａ）；またはＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生されたＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂ（ｂ−ｆ細胞Ｂ）の投与の２週後における、マウス骨頭蓋冠の冠状切片での骨新形成を示した写真を表したものである。骨新形成は、蛍光（異なる蛍光色素の逐次的統合による標識：アリザリンレッド→カルセイングリーン→カルセインブルー→テトラサイクリンイエロー）により証明される。赤色、緑色および青色の染色は、淡灰色で現れており、骨新形成の厚さは、二重矢印で示している。黄色の染色は、点線で囲まれている。
【図１４】図１４は、ＭＳＣ（暗灰色）または骨形成細胞Ｂ（淡灰色）の投与の２週後における、マウス頭蓋冠切片で測定した新形成された骨の全表面積（平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５）を示したグラフを表したものである。
【図１５】図１５は、骨形成細胞Ｂの投与の１日後において（Ｄ１）、および投与の２８日後（Ｄ２８）まで経時的に（Ｄ７、Ｄ１４、Ｄ２１）、マウス骨頭蓋冠の矢状切片で行った石灰化小結節の軟骨基質（破線で囲まれた）のサフラニンオレンジ染色を例示したものである。
【図１６Ａ−Ｂ】図１６は、区域性大腿亜臨界サイズ欠損モデルにおけるＭＳＣ由来細胞の効果を例示したものである。（Ａ）は、外科手技／品目投与の日（Ｄ０）における、および賦形剤単独、骨形成細胞Ａ（ｂ−ｆ細胞Ａ）または骨形成細胞Ｂ（ｂ−ｆ細胞Ｂ）の投与の６週後（６Ｗ）までの経時的な（１、２、３、４、５週）、Ｘ線像上での欠損サイズの測定を示したグラフを表したものである；平均±ＳＥＭ、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１；（Ｂ）は、Ｄ０および賦形剤単独または骨形成細胞Ｂ（ｂ−ｆ細胞Ｂ）の投与後６Ｗにおける区域性大腿欠損の代表的なＸ線像を表したものである。
【図１６Ｃ】図１６は、区域性大腿亜臨界サイズ欠損モデルにおけるＭＳＣ由来細胞の効果を例示したものである。（Ｃ）は、賦形剤単独（ｎ＝７）および骨形成細胞Ｂ（ｎ＝８）の投与後６Ｗにおける、マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）分析による骨修復の容量測定を示したグラフを表したものである；平均±ＳＥＭ、＊ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本明細書で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈からそうではないことが明らかでない限り、単数および複数両方の指示対象を含む。
【００１８】
用語「を含んでなる(comprising)」、「を含んでなる(comprises)」および「からなる(comprised of)」は、本明細書で使用する場合、「を含む(including)」、「を含む(includes)」または「を含有する(containing)」、「を含有する(contains)」と同義であり、包括的または非限定的であり、追加の列挙されていない部材、要素または方法の工程を排除しない。これらの用語は、特許用語法において十分に確立された意味を享受する「からなる」および「から実質的になる」も包含する。
【００１９】
終点による数値範囲の記載は、それぞれの範囲内に包含される総ての数および分数、ならびに記載した終点を含む。
【００２０】
本明細書で使用する場合、用語「約」または「およそ」は、パラメーター、量、時間的期間などの測定可能な値を指す場合、開示された発明を実施するのにそのような変動が適当である限り、明示された値のおよびからの変動、例えば、明示された値のおよびからの＋／−１０％以下、好ましくは＋／−５％以下、より好ましくは＋／−１％以下、さらにより好ましくは＋／−０．１％以下の変動を包含することを意味する。修飾語「約」が指す値自体も、具体的に、および好ましく開示されると理解されるべきである。
【００２１】
用語「１以上の」または「少なくとも１つの」、例えば、１以上の部材または部材の群の少なくとも１つの部材は、それ自体明確であるが、さらなる例示によって、この用語は、とりわけ、前記部材のいずれか１つ、または前記部材のいずれか２つ以上、例えば、前記部材のいずれか３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上もしくは７つ以上など、および総ての前記部材までへの言及を包含する。別の例では、「１以上の」または「少なくとも１つの」は、１、２、３、４、５、６、７以上を指し得る。
【００２２】
本明細書における発明の背景の考察は、本発明の文脈を説明するために含まれる。これは、言及される材料が、特許請求の範囲のいずれかの優先日の時点で、いずれかの国において発表された、公知であった、または共通の一般知識の一部であったことを容認するものとしてみなされるものではない。
【００２３】
本開示を通じて、種々の刊行物、特許および発表済みの特許明細書は、引用を確認することにより参照される。本明細書において引用される総ての文書は、ここに引用することによりその全体が本明細書の一部とされる。特に、本明細書において具体的に言及されるそのような文書の教示または項は、引用することにより本明細書の一部とされる。
【００２４】
そうではないことが定義されない限り、技術および科学用語を含む、本発明の開示において使用される総ての用語は、本発明が属する当技術分野の当業者により一般に理解される意味を有する。さらなるガイダンスにより、本発明の教示をよく理解するために用語の定義が含まれる。本発明の特定の側面または本発明の特定の実施形態に関連して特定の用語が定義される場合、そのような含意は、そうではないことが定義されない限り、本明細書全体を通じて、すなわち、本発明の他の複数の側面または実施形態の文脈においても適用されることを意味する。
【００２５】
以下の節では、本発明の異なる複数の側面または実施形態をより詳細に定義する。そのように定義された各側面または実施形態は、そうではないことが明確に示されていない限り、いずれかの他の１つまたは複数の側面または実施形態と組み合わせてよい。特に、好ましいまたは有利であると示された任意の特徴は、好ましいまたは有利であると示された任意の他の１つまたは複数の特徴と組み合わせてよい。
【００２６】
本明細書全体を通じて、「一つの実施形態」、「ある実施形態」への言及は、実施形態と関連して説明される特定の特徴(feature)、構造または特徴(characteristic)が、本発明の少なくとも一つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書全体を通じて種々の場所における句「一つの実施形態において」または「ある実施形態において」の出現は、必ずしも総てが同じ実施形態に言及するわけではないが、そうである場合もある。さらに、特定の複数の特徴(features)、構造または特徴(characteristics)は、１以上の実施形態において、本開示から当業者に明らかなように、任意の好適な様式で組み合わせてよい。さらに、本明細書に記載のいくつかの実施形態は、他の複数の実施形態に含まれる他の複数の特徴ではないいくつかの特徴を含むが、異なる複数の実施形態の複数の特徴の組合せは、当業者により理解されるように、本発明の範囲内であり、異なる複数の実施形態を形成することを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲では、特許請求の範囲に記載の複数の実施形態のいずれかを任意の組合せで使用することができる。
【００２７】
本発明の特定の代表的な複数の実施形態を説明する実験の項により実証されるように、本発明者らは、移植能が増大したＭＳＣ由来細胞またはＭＳＣ由来細胞の集団を得る方法を同定した。より詳しくは、本発明者らは、意外にも、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞をヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体、好ましくは、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させると、標準的で均一な、小さな細胞サイズを有する新たなＭＳＣ由来細胞集団を得ることができることを見出した。特定の複数の実施形態において、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の組合せ、好ましくは、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触する。このような標準的で均一な、小さなサイズは、改善された移植特性、例えば、（ｉ）前記ＭＳＣ由来細胞の非経口（例えば、静脈内を含む血管内）投与の可能性、（ｉｉ）容量が制限された調節可能かつ高い細胞濃度をｉｎ  ｖｉｖｏで送達できる可能性、（ｉｉｉ）優れたｉｎ  ｖｉｖｏ安全性プロファイル、および／または（ｉｖ）非経口で送達した場合の優れた注射筒の操作性を示す。従って、第１の側面は、ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなる方法を提供する。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「間葉系幹細胞」または「ＭＳＣ」は、間葉系統、一般に、２以上の間葉系統、より一般に、３以上の間葉系統、例えば、骨軟骨芽細胞（骨および軟骨）、骨芽細胞（骨）、軟骨芽細胞（軟骨）、筋細胞（筋肉）、腱細胞（腱）、線維芽細胞（結合組織）、脂肪細胞（脂肪）および間質生成細胞(stromogenic)（骨髄間質）系統の細胞を産生する能力を有する成熟中胚葉由来幹細胞を指す。ＭＳＣは、生体サンプル、好ましくは、ヒト対象の生体サンプル、例えば、骨髄、海綿骨、血液、臍帯、胎盤、胎児卵黄嚢、皮膚（真皮）、具体的には、胎児および青年の皮膚、骨膜、歯髄、腱ならびに脂肪組織から単離され得る。本明細書で使用する場合、用語「生体サンプル」または「サンプル」は、生物源、例えば、動物またはヒト対象、細胞培養物、組織サンプルなどの生物体から得られたサンプルを指す。動物またはヒト対象の生体サンプルは、動物またはヒト対象から除去された、その細胞を含んでなるサンプルを指す。動物またはヒト対象の生体サンプルは、１以上の組織型を含んでなり得、１以上の組織型の細胞を含んでなり得る。動物またはヒト対象の生体サンプルを得る方法は、当技術分野で周知であり、例えば、組織生検または採血が挙げられる。ヒトＭＳＣ、それらの単離、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖、および分化は、例えば、米国特許第５，４８６，３５９号；米国特許第５，８１１，０９４号；米国特許第５，７３６，３９６号；米国特許第５，８３７，５３９号；または米国特許第５，８２７，７４０号に記載されている。当技術分野で記載の、および当技術分野で記載の任意の方法により単離された任意のＭＳＣは、本発明の方法において好適であり得る。特に、ＭＳＣは、骨芽細胞、脂肪細胞、および軟骨芽細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの三系統間葉系分化の能力を示すことと定義され得る(Dominici et al., 2006, vol. 8, 315)。
【００２９】
用語「ＭＳＣ」は、ＭＳＣの後代、例えば、動物またはヒト対象の生体サンプルから得られたＭＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖(proliferation)（繁殖／増殖(expansion)）により得られた後代も包含する。
【００３０】
用語「幹細胞」は、一般に、非特殊化のまたは比較的特殊化されていない増殖能を有する細胞を指し、この細胞は、自己複製能を有する、すなわち、分化せずに増殖することができ、また、この細胞またはこの細胞の後代は、少なくとも１つの比較的より特殊化された細胞型を生じることができる。この用語は、実質的に無制限の自己複製が可能な幹細胞、すなわち、幹細胞の後代またはその少なくとも一部が、母幹細胞の非特殊化のまたは比較的特殊化されていない表現型、分化能、および増殖能を実質的に保持している幹細胞、ならびに、制限された自己複製を示す幹細胞、すなわち、その後代または一部のさらなる増殖能および／または分化能が、母細胞と比較して明らかに低減している幹細胞を包含する。例示として、限定されるものではないが、幹細胞は、１以上の系統とともに分化して、いっそう比較的より特殊化された細胞を産生することができる子孫を生じ得、そのような子孫および／またはいっそう比較的より特殊化された細胞は、それ自身が本明細書に定義される幹細胞であり得、またはさらには、最終分化細胞、すなわち、有糸分裂後であり得る完全に特殊化された細胞を産生し得る。
【００３１】
本明細書で使用する場合、用語「成熟幹細胞」は、例えば、成熟期に達した後など、胎生期または好ましくは出生後（例えば、限定されるものではないが、特に、ヒト生物体に関しては、出生後少なくとも１ヵ月齢、例えば、出生後少なくとも２ヵ月、少なくとも３ヵ月、例えば、少なくとも４ヵ月、少なくとも５ヵ月、例えば、少なくとも６ヵ月齢、例えば、出生後１年以上、５年以上、少なくとも１０年以上、１５年以上、２０年以上、または２５年以上の齢）の生物体において存在する、またはその生物体から得られた（例えば、単離された）幹細胞を指す。例示として、成熟幹細胞は、さもなければ従来の用語「乳児」、「小児」、「若年者」、「青年」または「成人」で記載されるヒト対象から得ることができる。
【００３２】
好ましいＭＳＣは、少なくとも骨軟骨芽細胞系統の細胞、例えば、骨芽細胞系統の細胞、例えば、骨軟骨前駆細胞および／もしくは骨前駆細胞および／もしくは前骨芽細胞および／もしくは骨芽細胞および／もしくは骨細胞、ならびに／または軟骨芽細胞系統の細胞、例えば、骨軟骨前駆細胞および／もしくは軟骨前駆細胞および／もしくは前軟骨芽細胞および／もしくは軟骨芽細胞および／もしくは軟骨細胞を産生する能力を有する。
【００３３】
さらに好ましいＭＳＣは、少なくとも骨芽細胞（骨）系統の細胞、例えば、骨軟骨前駆細胞および／もしくは骨前駆細胞および／もしくは前骨芽細胞および／もしくは骨芽細胞および／もしくは骨細胞など；または少なくとも軟骨芽細胞（軟骨）系統の細胞、例えば、骨軟骨前駆細胞および／もしくは軟骨前駆細胞および／もしくは前軟骨芽細胞および／もしくは軟骨芽細胞および／もしくは軟骨細胞；線維芽細胞（結合組織）系統の細胞、例えば、線維芽細胞、線維細胞；または少なくとも滑膜細胞（滑液）の細胞；または腱細胞などを産生する能力を有する。
【００３４】
特に断りのない限り、「対象」または「患者」は、互換的に使用され、動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳動物を指し、具体的には、ヒト患者および非ヒト哺乳動物を含む。好ましい患者は、ヒト対象である。動物対象は、動物の出生前形態、例えば、胎児を含む。ヒト対象は、胎児を含み得るが、胚は含まない。
【００３５】
ある実施形態において、ＭＳＣは、健常対象から得てよく、このことは、前記ＭＳＣから得られたＭＳＣ由来細胞の機能性を保証する助けとなり得る。
【００３６】
別の実施形態において、ＭＳＣは、ＭＳＣ由来細胞の移植を必要とするヒト対象から得られる。
【００３７】
本明細書で教示する製品または方法の特定の複数の実施形態において、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、処置される対象に対して同種であり得る。ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞に関する用語「同種」または「相同」は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞が、ＭＳＣ由来細胞と接触するまたはそれで処置される対象以外の、１以上の（プールされた）対象から得られることを意味する。
【００３８】
本明細書で教示する製品または方法の特定の複数の実施形態において、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、処置される対象に対して自己由来であり得る。ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞に関する用語「自己由来」は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞が、ＭＳＣ由来細胞と接触するまたはそれで処置される同じ対象から得られることを意味する。
【００３９】
本明細書で教示する製品または方法の特定の複数の実施形態において、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、上記で定義される自己由来および同種（すなわち、相同）のＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の混合物を含んでなり得る。好ましくは、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、処置される対象に対して同種である。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「間葉系幹細胞由来細胞」または「ＭＳＣ由来細胞」は、ＭＳＣの分化により得られた、特に、ＭＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏ（ｅｘ  ｖｉｖｏを含む）での分化により得られた間葉系統（例えば、骨軟骨芽細胞（骨および軟骨）、骨芽細胞（骨）、軟骨芽細胞（軟骨）、筋細胞（筋肉）、腱細胞（腱）、線維芽細胞（結合組織）、脂肪細胞（脂肪）、または間質生成細胞(stromogenic)（骨髄間質）系統）の細胞を指す。
【００４１】
ＭＳＣの分化は、所望の細胞型に向かったＭＳＣの分化を誘導することが可能な条件下でのＭＳＣの培養、より一般に、所望の細胞型に向かったＭＳＣの分化を誘導する能力を有する１以上の剤（例えば、成長因子）を含んでなる培地中でのＭＳＣの培養が関与し得る。ＭＳＣの分化に関するプロトコールは、それ自体公知である（とりわけ、WO 2007/093431;さらには、Mesenchymal Stem Cells: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology), D.J. Prockop et al.編 Humana Press, 2008, 449巻, 93-107頁におけるREGER, R.L. et al. ‘Differentiation and Characterization of Human MSCs’; VERMURI, M.C. et al. (編). Mesenchymal Stem Cell Assays and Applications (Methods in Molecular Biology). Humana Press, 2011, 698巻, 特に201-352頁参照)。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「成長因子」は、単独でまたは他の物質により調節された場合のいずれかで、種々の細胞型の増殖、成長、分化、生存および／または遊走に影響を及ぼす、また、生物体における発生的、形態的および機能的変化に影響を及ぼし得る生物活性物質を指す。成長因子は、一般に、成長因子に応答する細胞内に存在する受容体（例えば、表面または細胞内受容体）にリガンドとして結合することにより、作用する。本明細書における成長因子は、特に、１以上のポリペプチド鎖を含んでなるタンパク質性実体であり得る。例示として、限定されるものではないが、用語「成長因子」は、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ファミリー、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）ファミリー、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）ファミリー、神経成長因子（ＮＧＦ）ファミリー、表皮成長因子（ＥＧＦ）ファミリー、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）ファミリー、増殖分化因子（ＧＤＦ）ファミリー、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）ファミリー、造血成長因子（ＨｅＧＦ）、血小板由来内皮細胞成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、アンジオポエチン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリー、グルココルチコイドなどのメンバーを包含する。当業者は、成長因子または成長因子の組合せは、所望の細胞型に向かったＭＳＣの分化を誘導する能力を有することで知られる任意の成長因子または成長因子の組合せであってよいことを理解するであろう。当業者は、所望の細胞型に向かった（例えば、骨軟骨芽細胞、骨芽細胞、または軟骨芽細胞系統の細胞に向かった）ＭＳＣの分化を誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法は、所望の細胞型の実質的に純粋な（すなわち、主にそれから構成される）細胞集団をもたらし得ることを認識するであろう。限定されるものではないが、そのような由来細胞集団は、少なくとも９０％（数量）の所望の細胞型、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の所望の細胞型を含有し得る。
【００４３】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、骨軟骨芽細胞系統（骨および軟骨）、骨芽細胞系統（骨）、例えば、骨軟骨前駆細胞および／もしくは骨前駆細胞および／もしくは前骨芽細胞および／もしくは骨芽細胞および／もしくは骨細胞など；軟骨芽細胞（軟骨）系統、例えば、骨軟骨前駆細胞および／もしくは軟骨前駆細胞および／もしくは前軟骨芽細胞および／もしくは軟骨芽細胞および／もしくは軟骨細胞；脂肪生成細胞（脂肪）；筋原細胞（筋肉）；腱形成細胞(tenogenic)（腱細胞）系統；線維芽細胞（結合組織）系統、例えば、線維芽細胞、線維細胞；または滑膜細胞（滑液）系統である。
【００４４】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、骨軟骨芽細胞系統である。本明細書で使用する場合、記載「骨軟骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞」は、骨芽細胞系統の細胞、例えば、骨軟骨前駆細胞、骨前駆細胞および／もしくは前骨芽細胞および／もしくは骨芽細胞および／もしくは骨細胞など、または軟骨芽細胞系統の細胞、例えば、骨軟骨前駆細胞、軟骨前駆細胞および／もしくは前軟骨芽細胞および／もしくは軟骨芽細胞および／もしくは軟骨細胞へ分化する能力を有する前駆細胞を指し得る。当業者は、前駆細胞は、それらが曝露する条件、例えば、物理的因子、および／または成長因子などの化学的もしくは生物学的成分に応じて、骨芽細胞系統の細胞（例えば、前骨芽細胞もしくは骨芽細胞）、または軟骨芽細胞系統の細胞（例えば、前軟骨芽細胞もしくは軟骨芽細胞）のいずれかに分化することを理解するであろう。
【００４５】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、骨芽細胞または軟骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞である。好ましい複数の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞である。さらに好ましい複数の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞は、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、または骨細胞である。
【００４６】
特定の特に好ましい複数の実施形態において、記載「骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞」または「ＭＳＣ由来骨形成細胞」は、骨芽細胞表現型を有する細胞型、および骨軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞、もしくは骨細胞、またはその混合物などの、骨材料または骨基質の形成に寄与し得る細胞型、あるいはその形成に寄与し得る細胞に発達できる細胞型を等しく指し得る。本明細書で使用する場合、「骨前駆細胞」は、初期および後期の骨前駆細胞を特に含んでなり得る。さらにより好ましくは、「骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞」または「ＭＳＣ由来骨形成細胞」は、骨軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、もしくは骨芽細胞、またはその混合物を等しく指し得、さらにより好ましくは、この句は、骨軟骨前駆細胞もしくは前骨芽細胞もしくは骨芽細胞、またはその混合物を指し得、例えば、特定の例では、この句は、前骨芽細胞を指し得、あるいは、特定の他の例では、この句は、骨芽細胞を指し得る。総てのこれらの用語は、それ自体周知である。
【００４７】
さらなるガイダンスとして、限定されるものではないが、骨前駆細胞、前骨芽細胞および骨芽細胞、ならびに骨前駆細胞、前骨芽細胞および／または骨芽細胞を含んでなる細胞集団は、以下の特徴を示し得る：
【００４８】
ａ）これらの細胞は、骨芽細胞の分化を調節する多機能性転写因子であるＲｕｎｔ関連転写因子２（Ｒｕｎｘ２）の発現、および骨芽細胞の分化中における多くの細胞外マトリックスタンパク質遺伝子の発現を含んでなる；
【００４９】
ｂ）これらの細胞は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、より具体的には、骨・肝臓・腎臓型のＡＬＰのうち少なくとも１つの発現を含んでなり；より好ましくは、オステオカルシン（ＯＣＮ、ＢＧＬＡＰ）、１型プロコラーゲンアミノ末端プロペプチド（Ｐ１ＮＰ）、オステオネクチン（ＯＮ、ＳＰＡＲＣ）、オステオポンチン（ＯＰＳＴ、ＳＰＰ１、ＯＰＮ）および／もしくは骨シアロタンパク質（ＢＳＰ）などの１以上のさらなる骨マーカー、ならびに／またはデコリンおよび／もしくはオステオプロテゲリン（ＯＰＧ）などの１以上のさらなる骨基質タンパク質の発現も含んでなる；
【００５０】
ｃ）これらの細胞は、ＣＤ４５を実質的に発現しない（例えば、約１０％未満、好ましくは約５％未満、より好ましくは約２％未満のこれらの細胞が、ＣＤ４５を発現し得る）；
【００５１】
ｄ）これらの細胞は、外部環境を石灰化する、またはカルシウム含有細胞外マトリックスを合成する能力の証拠を示す（例えば、骨形成培地に曝露した場合；Jaiswal et al. J Cell Biochem, 1997, vol. 64, 295-312参照）。細胞内のカルシウム蓄積および基質タンパク質内へのカルシウム沈着は、例えば、４５Ｃａ２＋中で培養し、洗浄および再培養した後、細胞内に存在するもしくは細胞外マトリックス内に沈着したいずれかの放射能を定量することにより（US5,972,703）、またはアリザリンレッドに基づいた石灰化アッセイを使用することにより（例えば、Gregory et al. Analytical Biochemistry, 2004, vol. 329, 77-84参照）、慣習的に測定することができる；
【００５２】
ｅ）これらの細胞は、脂肪細胞系統の細胞（例えば、脂肪細胞）に向かっても、軟骨芽細胞系統の細胞（例えば、軟骨芽細胞、軟骨細胞）に向かっても実質的に分化しない。そのような細胞系統に向かう分化がないことは、当技術分野で確立された標準的な分化誘導条件（例えば、Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7参照）、およびアッセイ法（例えば、誘導された場合、脂肪細胞は一般に、脂質蓄積を示すオイルレッドＯで染色され；軟骨細胞は一般に、アルシアンブルーまたはサフラニンオレンジで染色される）を用いて試験され得る。脂肪生成および／または軟骨形成分化に向かう傾向が実質的に欠けていることは、一般に、それぞれの試験に供した場合、試験細胞の２０％未満、または１０％未満、または５％未満、または１％未満が、脂肪生成または軟骨形成分化の徴候を示すことを意味し得る。
【００５３】
例示として、限定されるものではないが、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の細胞同一性を評価するための好適な細胞表面マーカーは、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、ＣＤ７３、ＣＤ４５およびＡＬＰ、特に骨・肝臓・腎臓型のＡＬＰを含み得る。これらの細胞表面マーカーは、例えば、フローサイトメトリーによる細胞検出を可能にする蛍光色素標識モノクローナル抗体などの市販のモノクローナル抗体により検出することができる。特に、ＣＤ１０５、ＣＤ９０、およびＣＤ７３は、間葉系マーカーであり、一般に、骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞により高度に発現する；ＣＤ４５は、造血マーカーであり、一般に、骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞を実質的に欠いている；ＡＬＰは、前骨芽細胞および骨芽細胞のマーカーであり、一般に、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の実質的な画分により発現する。
【００５４】
特定の複数の実施形態において、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、骨誘導特性を有し得る。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「骨誘導特性」、「骨誘導能」または「骨誘導活性」は、他の骨基質分泌細胞を誘引する、および／または骨基質分泌細胞への他の細胞の分化（分化転換）を誘導する細胞の能力を指す。
【００５６】
例えば、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の細胞能力は、そのような細胞の骨形成特性を測定することにより決定することができる。骨形成を誘導する骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の能力は、例えば、それらの細胞を頭蓋冠上の皮下注射によりマウスに投与した後、新たに石灰化した骨の厚さを評価することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで測定することができる。骨形成を誘導する骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の能力は、例えば、ＡＬＰ基質染色によるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性評価を通じて測定することもできる。
【００５７】
特定の複数の実施形態において、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、骨形成特性を有し得る。
【００５８】
例えば、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の細胞能力は、そのような細胞の骨形成活性を測定することにより決定することができる。骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のヒトＭＳＣ由来細胞の骨形成活性は、例えば、それらの細胞を頭蓋冠上の皮下注射によりマウスに投与した後に、ヒト起源の少なくとも１つの石灰化小結節の存在を決定することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで測定することができる。ヒト骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の骨形成活性は、例えば、それらの細胞を頭蓋冠上の皮下注射によりマウスに投与した後に、ヒト起源の新たに石灰化した小結節の厚さを評価することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで測定することができる。
【００５９】
例えば、１００μｌ賦形剤に処方された２．５×１０６個などの骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のヒトＭＳＣ由来細胞は、頭蓋冠骨上の単回皮下投与により、ヌードマウスに投与することができる。骨新形成を経時的に標識するために、アリザリンレッド（赤色）、カルセイン（緑色）、カルセイン（青色）およびテトラサイクリン（黄色）などのカルシウム結合蛍光色素を、それぞれＭＳＣ由来細胞の細胞投与の３日前および４、８、および１２日後に、腹腔内注射によりマウスに逐次的に投与することができる。マウスは、細胞投与の２週後に安楽死させることができ、各マウスの頭蓋冠を回収し、組織形態計測（例えば、骨形成の定量化）により骨形成特性を評価することができる。頭蓋冠の最初および最後の厚さを用いて、細胞投与後の新骨形成のパーセンテージを算出することができる。さらに、骨形成特性は、免疫蛍光（例えば、骨形成のマウスまたはヒト起源）により評価することもできる。骨芽細胞活性は、ＡＬＰ酵素活性検出法を用いて、頭蓋冠切片上で評価することができる。破骨細胞活性は、ＴＲＡＰ酵素活性検出法を用いて、頭蓋冠切片上で評価することができる。新形成された骨の石灰化の状態は、例えば、市販のキット（例えば、Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｃａ（登録商標））を用いてＡＬＰで染色された頭蓋冠切片上のマッソントリクロームゴールドナー染色を用いて評価することができる。軟骨形成は、頭蓋冠矢状断パラフィン切片上のサフラニンオレンジ染色を用いて評価することができる。
【００６０】
本明細書で使用する場合、用語「骨形成能」は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、場合によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで、骨基質分泌細胞へ分化（分化転換）する細胞の能力または骨基質を分泌する細胞の能力（すなわち、分化（分化転換）段階を必要とせずに）を指す。この用語は、膜内骨化または軟骨内骨化により骨組織を形成する細胞の能力を包含する。膜内骨化により骨組織を形成する細胞の能力は、一般に、テンプレートとしての石灰化軟骨基質を必要とせずに骨組織を形成する細胞の能力を表す。軟骨内骨化による骨組織を形成する細胞の能力は、一般に、最初に石灰化軟骨基質を形成し、その後、前記石灰化軟骨基質を骨組織形成用のテンプレートとして使用することにより、骨組織を形成する細胞の能力を表す。この用語は、他の骨基質分泌細胞を誘引する、および／または骨基質分泌細胞への他の細胞の分化（分化転換）を誘導する細胞の能力を表す、細胞の骨誘導能を包含しない。当業者は、本明細書で意図する骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、骨形成能および骨誘導能の両方を有し得ることを理解するであろう。
【００６１】
特定の複数の実施形態において、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、骨誘導特性および骨形成特性の両方を有し得る。有利には、本明細書で教示する骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、それを必要とする対象への移植時に、従来技術の方法により得られたＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞での移植と比較した骨新形成を上回る骨新形成を可能とする。
【００６２】
例示として、限定されるものではないが、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の細胞同一性を評価するための好適な細胞表面マーカーは、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０、およびＣＤ４４を含み得る。これらの細胞表面マーカーは、例えば、フローサイトメトリーによる細胞検出を可能にする蛍光色素標識モノクローナル抗体などの市販のモノクローナル抗体により検出することができる。特に、ＣＤ７３およびＣＤ１０５は、間葉系マーカーであり；ＣＤ４４は接着マーカーであり；ＣＤ１０は、一般に、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の高画分により発現する骨軟骨芽細胞マーカーである。骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の細胞表面上のＣＤ７３の量は、一般に高く；骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の細胞表面上のＣＤ１０５の量は、一般に低く；骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の細胞表面上のＣＤ４４の量は、一般に高い。
【００６３】
特定の複数の実施形態において、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ６３およびＣＤ１６６に対して陽性であり；実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ４５に対して陰性である。
【００６４】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣから骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞を得る方法により得られた実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ６３およびＣＤ１６６に対して陽性である。
【００６５】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣから骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞を得る方法により得られた実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ６３およびＣＤ１６６に対して陽性であり；実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびＣＤ１９に対して陰性である。
【００６６】
特定の複数の実施形態において、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびＣＤ１９に対して陰性である。
【００６７】
特定の複数の実施形態において、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３４およびＣＤ３に対して陰性である。
【００６８】
特定の複数の実施形態において、実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ３４、ＣＤ３、ＣＤ１４およびＣＤ１９に対して陰性である。
【００６９】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣから骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞を得る方法により得られた実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のいずれか１つ以上、例えば、１つ、２つ、３つまたは総てに対して陽性である（すなわち、細胞表面上でＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のいずれか１つ以上、例えば、１つ、２つ、３つまたは総てを発現する）。好ましくは、ＭＳＣから骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞を得る方法により得られた実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４に対して陽性である（すなわち、細胞表面上でＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現する）。
【００７０】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣから骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞を得る方法により得られた骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、少なくとも５００のＣＤ７３に対する蛍光強度（ｎＭＦＩ）（ｎＭＦＩＣＤ７３）、少なくとも１００のＣＤ４４に対するｎＭＦＩ（ｎＭＦＩＣＤ４４）、または最大１５０のＣＤ１０５に対するｎＭＦＩ（ｎＭＦＩＣＤ１０５）の正規化中央値のいずれか１つ以上を有する。例えば、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、少なくとも５５０、少なくとも６００、少なくとも６５０、少なくとも７００、少なくとも７５０、少なくとも８００、少なくとも８５０もしくは少なくとも９００のｎＭＦＩＣＤ７３；少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００もしくは少なくとも３５０のｎＭＦＩＣＤ４４；または最大１８０、最大１７０、最大１６０、最大１５０、最大１４０、最大１３０、最大１２０、最大１１０もしくは最大１００のｎＭＦＩＣＤ１０５のいずれか１つ以上を有する。好ましくは、ＭＳＣから骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞を得る方法により得られた骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、少なくとも５００のｎＭＦＩＣＤ７３、少なくとも１００のｎＭＦＩＣＤ４４、および最大１５０のｎＭＦＩＣＤ１０５を有する。
【００７１】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣから骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞を得る方法により得られた実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のいずれか１つ以上、例えば、１つ、２つ、３つまたは総てに対して陽性であり（すなわち、細胞表面上でＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０またはＣＤ４４のいずれか１つ以上、例えば、１つ、２つ、３つまたは総てを発現する）、ＭＳＣから骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞を得る方法により得られた骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、少なくとも５００のｎＭＦＩＣＤ７３、少なくとも１００のｎＭＦＩＣＤ４４または最大１５０のｎＭＦＩＣＤ１０５のいずれか１つ以上を有する。好ましくは、ＭＳＣから骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞を得る方法により得られた実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４に対して陽性であり（すなわち、細胞表面上でＣＤ７３、ＣＤ１０５、ＣＤ１０およびＣＤ４４を発現する）、ＭＳＣから骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞を得る方法により得られた骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、少なくとも５００のｎＭＦＩＣＤ７３、少なくとも１００のｎＭＦＩＣＤ４４、および最大１５０のｎＭＦＩＣＤ１０５を有する。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「蛍光強度の正規化中央値」または「ｎＭＦＩ」は、イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）などの蛍光色素と抱合した免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）対照などの、１以上の蛍光色素抱合アイソタイプ対照抗体で標識された細胞集団のＭＦＩ（ＭＦＩアイソタイプ＿チャネル）に対する１以上の蛍光色素抱合抗体で標識された全分析細胞集団のＭＦＩ（ＭＦＩマーカー＿チャネル）の比を指す。ｎＭＦＩの結果は、目的の集団の細胞表面に存在するマーカーの量に比例する。（ｎ）ＭＦＩは、一般に、蛍光シグナルの発光が測定される波長と関連している。
【００７３】
本明細書で使用する場合、記載「ＣＤ７３に対するｎＭＦＩ」または「ｎＭＦＩＣＤ７３」は、ＡＰＣと抱合したＩｇＧ対照（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５５７５１）で標識された細胞集団のＭＦＩに対する、ＣＤ７３に対するＡＰＣ抱合抗体（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６０８４７）で標識された全分析細胞集団のＭＦＩの比を指す。好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ７３は、ＡＰＣに対して６３３ｎｍの励起波長および６６０ｎｍの発光波長で測定される。
【００７４】
本明細書で使用する場合、記載「ＣＤ４４に対するｎＭＦＩ」または「ｎＭＦＩＣＤ４４」は、ＰＥと抱合したＩｇＧ対照（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５６６５０）で標識された細胞集団のＭＦＩに対する、ＣＤ４４に対するＰＥ抱合抗体（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５０９８９）で標識された全分析細胞集団のＭＦＩの比を指す。好ましくは、ｎＭＦＩＣＤ４４は、ＰＥに対して４８８ｎｍの励起波長および５８０ｎｍの発光波長で測定される。
【００７５】
本明細書で使用する場合、記載「ＣＤ１０５に対するｎＭＦＩ」または「ｎＭＦＩＣＤ１０５」は、ＡＰＣと抱合したＩｇＧ対照（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５５７５１）で標識された細胞集団のＭＦＩに対する、ＣＤ１０５に対するＡＰＣ抱合抗体（例えば、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６２４０８）で標識された全分析細胞集団のＭＦＩの比を指す。好ましくは、ｎＭＦＩ１０５は、ＡＰＣに対して６３３ｎｍの励起波長および６６０ｎｍの発光波長で測定される。
【００７６】
特定の複数の実施形態において、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＭＳＣにおけるそれぞれの遺伝子の発現と比較して、
−  ＲＵＮＸ２、ＳＯＸ９、ＺＮＦ５２１、ＡＬＰＬ、ＢＭＰ２、ＯＰＧ、ＰＯＳＴＮ、ＣＨＩ３Ｌ１、ＭＭＰ１３、ＣＡＤＭ１、ＣＸ４３、ＣＤ１０、およびＷＩＳＰ１からなる群から選択される骨軟骨芽細胞マーカーをコードする遺伝子の増加した発現；
−  ＤＣＮまたはＳＰＯＮ１から選択される骨または軟骨基質タンパク質をコードする遺伝子の増加した発現；
−  骨軟骨形成阻害物質をコードする遺伝子ＤＫＫ１の減少した発現；ならびに／あるいは
−  ＫＩ６７またはＰＣＮＡから選択される増殖マーカーをコードする遺伝子の減少した発現、
のうち１つ以上を含んでなる。
【００７７】
特定の複数の実施形態において、ＢＣＬ２またはＢＡＸから選択されるアポトーシス関連マーカーをコードする遺伝子の発現は、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞およびＭＳＣで類似し得る。
【００７８】
特定の複数の実施形態において、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ヘパリンまたはその類似体もしくは誘導体の存在対非存在以外に、ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る本明細書で教示する方法と実質的に総てのパラメーターにおいて実質的に同じである方法により産生された骨形成細胞におけるそれぞれの遺伝子の発現と比較して、
−  脂肪生成に関与するタンパク質をコードする遺伝子ＰＰＡＲＧの増加した発現；
−  ＣＤ７３またはＢＭＰ２から選択される骨軟骨芽細胞タンパク質をコードする遺伝子の増加した発現；ならびに／あるいは
−  ＣＯＬ１Ａ１、ＢＧＮ、ＳＰＡＲＣ、ＡＬＰＬ、およびＢＣＬ２からなる群から選択される骨軟骨芽細胞タンパク質をコードする遺伝子の減少した発現、
のうち１つ以上を含んでなる。
【００７９】
特定の複数の実施形態において、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞におけるタンパク質をコードする遺伝子の発現は、本明細書に定義される対応する対照細胞における前記遺伝子の発現に対して（すなわち、比較して）少なくとも約１％増加（すなわち、亢進）し得る（すなわち、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞におけるタンパク質をコードする遺伝子の発現は、少なくとも約１．０１倍であり得る）。例えば、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞におけるタンパク質をコードする遺伝子の発現は、本明細書に定義される対応する対照細胞における前記遺伝子の発現に対して（すなわち、比較して）少なくとも約２％（すなわち、１．０２倍）、少なくとも約５％（すなわち、１．０５倍）、少なくとも約１０％（すなわち、１．１０倍）、少なくとも約１５％（すなわち、１．１５倍）、少なくとも約２０％（すなわち、１．２０倍）、少なくとも約２５％（すなわち、１．２５倍）、少なくとも約３０％（すなわち、１．３０倍）、少なくとも約３５％（すなわち、１．３５倍）、少なくとも約４０％（すなわち、１．４０倍）、少なくとも約４５％（すなわち、１．４５倍）、少なくとも約５０％（すなわち、１．５０倍）、少なくとも約５５％（すなわち、１．５５倍）、少なくとも約６０％（すなわち、１．６０倍）、少なくとも約６５％（すなわち、１．６５倍）、少なくとも約７０％（すなわち、１．７０倍）、少なくとも約７５％（すなわち、１．７５倍）、少なくとも約８０％（すなわち、１．８０倍）、少なくとも約８５％（すなわち、１．８５倍）、少なくとも約９０％（すなわち、１．９０倍）、少なくとも約９５％（すなわち、１．９５倍）、または少なくとも約１００％（すなわち、２倍）増加（すなわち、亢進）し得る。
【００８０】
特定の複数の実施形態において、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞におけるタンパク質をコードする遺伝子の発現は、本明細書に定義される対応する対照細胞における対照遺伝子の発現の少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約１０００倍、少なくとも約２０００倍、少なくとも約３０００倍、または少なくとも約５０００倍であり得る。
【００８１】
特定の複数の実施形態において、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞におけるタンパク質をコードする遺伝子の発現は、本明細書に定義される対応する対照細胞における前記遺伝子の発現に対して（すなわち、比較して）少なくとも約１％減少（すなわち、低減）し得る（すなわち、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞におけるタンパク質をコードする遺伝子の発現は、少なくとも約０．９９倍であり得る）。例えば、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞におけるタンパク質をコードする遺伝子の発現は、本明細書に定義される対応する対照細胞における前記遺伝子の発現に対して（すなわち、比較して）少なくとも約２％（すなわち、０．９８倍）、少なくとも約５％（すなわち、０．９５倍）、少なくとも約１０％（すなわち、０．９０倍）、少なくとも約１５％（すなわち、０．８５倍）、少なくとも約２０％（すなわち、０．８０倍）、少なくとも約２５％（すなわち、０．７５倍）、少なくとも約３０％（すなわち、０．７０倍）、少なくとも約３５％（すなわち、０．６５倍）、少なくとも約４０％（すなわち、０．６０倍）、少なくとも約４５％（すなわち、０．５５倍）、少なくとも約５０％（すなわち、０．５０倍）、少なくとも約５５％（すなわち、０．４５倍）、少なくとも約６０％（すなわち、０．４０倍）、少なくとも約６５％（すなわち、０．３５倍）、少なくとも約７０％（すなわち、０．３０倍）、少なくとも約７５％（すなわち、０．２５倍）、少なくとも約８０％（すなわち、０．２０倍）、少なくとも約８５％（すなわち、０．１５倍）、少なくとも約９０％（すなわち、０．１０倍）、少なくとも約９５％（すなわち、０．０５倍）、または少なくとも約９９％（すなわち、０．０１倍）減少（すなわち、低減）し得る。
【００８２】
特定の複数の実施形態において、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞におけるタンパク質をコードする遺伝子の発現は、本明細書に定義される対応する対照細胞における対照遺伝子の発現の少なくとも約０．００５倍、少なくとも約０．００１倍、少なくとも約０．０００５倍、または少なくとも約０．０００１倍であり得る。
【００８３】
特定の複数の実施形態において、本明細書で教示する対照細胞は、ＭＳＣであってもよいし、または、ヘパリンまたはその類似体もしくは誘導体の存在対非存在以外に、ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る本明細書で教示する方法と実質的に総てのパラメーターにおいて実質的に同じである方法により産生された骨形成細胞であってもよい。
【００８４】
特定の複数の実施形態において、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＭＳＣあるいは、ヘパリンまたはその類似体もしくは誘導体の存在対非存在以外に、ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る本明細書で教示する方法と実質的に総てのパラメーターにおいて実質的に同じである方法により産生された骨形成細胞と比較して、高い量のＣＨＩ３Ｌ１またはＭＭＰ１３から選択される骨軟骨形成に関与するタンパク質を分泌する。特定の複数の実施形態において、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＭＳＣあるいは、ヘパリンまたはその類似体もしくは誘導体の存在対非存在以外に、ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る本明細書で教示する方法と実質的に総てのパラメーターにおいて実質的に同じである方法により産生された骨形成細胞と比較して、低い量の骨形成の阻害に関与するＤＫＫ１タンパク質を分泌する。
【００８５】
前述のように、上記の詳細な方法は、細胞が、例えば同種対象に対する細胞移植により好適であることを示す、優れた特徴、例えば、特に、（ｉ）骨軟骨芽細胞もしくは骨芽細胞系統に向かう細胞の関与を表す、ＡＬＰの高発現、および（ｉｉ）骨軟骨芽細胞もしくは骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の限られた免疫原性を表す、低ＨＬＡ−ＤＲ発現、を有する、骨軟骨芽細胞もしくは骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞、またはそのようなＭＳＣ由来細胞の集団を得ることができる。
【００８６】
従って、特定の複数の実施形態において、少なくとも７０％（数量）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に対して陽性であり；１０％（数量）未満の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＨＬＡ−ＤＲに対して陽性である。
【００８７】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣから骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞を得る方法により得られた実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ７３、ＣＤ６３およびＣＤ１６６に対して陽性であり；実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ４５に対して陰性であり；少なくとも７０％の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に対して陽性であり；１０％未満の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＨＬＡ−ＤＲに対して陽性である。
【００８８】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣから骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞を得る方法により得られた実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ６３およびＣＤ１６６に対して陽性であり；実質的に総て（例えば、少なくとも９０％（数量）、例えば、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞のＭＳＣ由来細胞は、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびＣＤ１９に対して陰性であり；少なくとも７０％の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に対して陽性であり；１０％未満の骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、ＨＬＡ−ＤＲに対して陽性である。
【００８９】
特定の特に好ましい複数の実施形態において、記載「軟骨芽細胞（軟骨）系統のＭＳＣ由来細胞」は、軟骨芽細胞表現型を有し、軟骨または軟骨基質の形成に寄与し得る、またはそれに寄与し得る細胞に発達できる細胞型を指し得る。本明細書で使用する場合、「軟骨前駆細胞」は、初期および後期の軟骨前駆細胞を特に含んでなり得る。さらにより好ましくは、「軟骨芽細胞（軟骨）系統のＭＳＣ由来細胞」は、骨軟骨前駆細胞、軟骨前駆細胞、前軟骨芽細胞、もしくは軟骨芽細胞、またはその混合物を指し得、さらにより好ましくは、この句は、前軟骨芽細胞もしくは軟骨芽細胞、またはその混合物を指し得、例えば、特定の例では、この句は、前軟骨芽細胞を指し得、あるいは、特定の他の例では、この句は、軟骨芽細胞を指し得る。総てのこれらの用語は、それ自体周知である。
【００９０】
さらなるガイダンスとして、限定されるものではないが、骨軟骨芽細胞および／または軟骨芽細胞系統の細胞、例えば、骨軟骨前駆細胞、軟骨前駆細胞、前軟骨芽細胞および軟骨芽細胞、ならびに骨軟骨前駆細胞、軟骨前駆細胞、前軟骨芽細胞および／または軟骨芽細胞を含んでなる細胞集団は、以下の特徴を示し得る：
ａ）これらの細胞は、軟骨芽細胞分化および軟骨形成中に中心的な役割を果たす転写因子であるＳＯＸ９の発現を含んでなる；
ｂ）これらの細胞は、アグリカン（ＡＣＡＮ）、ＩＩ型コラーゲン、またはＣＤ９０のうち少なくとも１つの発現を含んでなる；
ｃ）これらの細胞は、ＣＤ４５を実質的に発現しない（例えば、約１０％未満、好ましくは約５％未満、より好ましくは約２％未満のこれらの細胞が、ＣＤ４５を発現し得る）；
ｄ）これらの細胞は、高レベルの、ｉｎ  ｓｉｔｕでのヒアリン細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の主成分であるＩＩ、ＩＸ、およびＸＩ型コラーゲンならびにプロテオグリカンを産生する能力の証拠を示す。軟骨形成は、例えば、それぞれプロテオグリカンおよび非コラーゲン性タンパク質を染色するためのサフラニンオレンジ／ファストグリーンアッセイを用いて、慣習的に測定することができる（例えば、Lee et al. Tissue Engineering, 2011, vol. 18, 484-98参照）；
【００９１】
ｅ）ヒト関節軟骨細胞は、Diaz-Romero et al. 2005 (J Cell Physiol, vol. 202(3), 731-42)において要約されている細胞発現の特徴を示し得、例えば、それらは、インテグリンおよび他の接着分子（ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５１／６１、ＣＤ５４、ＣＤ１０６、ＣＤ１６６、ＣＤ５８、ＣＤ４４）、テトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ１５１）、受容体（ＣＤ１０５、ＣＤ１１９、ＣＤ１３０、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ２２１、ＣＤ９５、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ７１、ＣＤ１４）、エクトエンザイム（ＣＤ１０、ＣＤ２６）、ならびに他の表面分子（ＣＤ９０、ＣＤ９９）を発現し得る。単層培養中、軟骨細胞は、間葉系幹細胞に特有なものとしてみなされる特定のマーカー（ＣＤ１０、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１６６）をアップレギュレートし得る。従って、そのようなマーカーは、さほど成熟していない前軟骨芽細胞または軟骨芽細胞によっても発現され得る。
【００９２】
ｆ）これらの細胞は、脂肪細胞系統の細胞（例えば、脂肪細胞）に向かっても、骨芽細胞系統の細胞（例えば、骨芽細胞、骨細胞）に向かっても実質的に分化しない。そのような細胞系統に向かう分化がないことは、当技術分野で確立された標準的な分化誘導条件（例えば、Pittenger et al. Science, 1999, vol. 284, 143-7参照）、およびアッセイ法（例えば、誘導された場合、脂肪細胞は一般に、脂質蓄積を示すオイルレッドＯで染色され；前骨芽細胞および骨芽細胞は一般に、ＡＬＰに対して染色される）を用いて試験され得る。脂肪生成および／または骨芽細胞分化に向かう傾向が実質的に欠けていることは、一般に、それぞれの試験に供した場合、試験細胞の２０％未満、または１０％未満、または５％未満、または１％未満が、脂肪生成または骨芽細胞分化の徴候を示すことを意味し得る。
【００９３】
当技術分野で公知なように、線維芽細胞系統の細胞は、結合組織の形成に寄与し得る、またはそれに寄与し得る細胞に発達できる。
【００９４】
さらなるガイダンスとして、限定されるものではないが、線維芽細胞は、以下の特徴を示し得る：
ａ）これらの細胞は、ＦＳＰ１（線維芽細胞特異的タンパク質１）の発現を含んでなる；
ｂ）これらの細胞は、コラーゲン、ビメンチン、デスミンまたはＣＤ９０のうち少なくとも１つの発現を含んでなる；
ｃ）これらの細胞は、ＣＤ４５を実質的に発現しない（例えば、約１０％未満、好ましくは約５％未満、より好ましくは約２％未満のこれらの細胞が、ＣＤ４５を発現し得る）；
ｄ）これらの細胞は、コラーゲン、グリコサミノグリカン、細網および弾性線維、糖タンパク質を産生して、結合組織の細胞外マトリックスを形成する能力の証拠を示す。線維芽細胞は、靱帯および腱の構造的完全性に寄与し、組織修復機能を有する。コラーゲン沈着は、トリクローム染色を用いて可視化することができる（Li et al. World J Gastroenterol, 2014 vol. 20(16), 4648-61）。Ｉ型コラーゲン（Ｃｈｏｎｄｒｅｓ、レドモンド、ワシントン州）およびテネイシンＣ（Ｔｎ−Ｃ；ＩＢＬ−Ａｍｅｒｉｃａ、ミネアポリス、ミネソタ州）は、靱帯線維芽細胞に対する２つのマーカーであり、ＥＬＩＳＡによりアッセイすることができる（Brissett et al. Arthritis Rheum, 2012, vol. 64(1), 272-80）。
【００９５】
当技術分野で公知なように、腱細胞(tendinocytic)系統の細胞は、腱材料または腱基質の形成に寄与し得る。腱は、コラーゲン原線維のネットワークを含んでなる大きな線維束と、滑膜細胞、内皮細胞、腱芽細胞、およびコラーゲン分子内に列として縦方向に位置する腱細胞を含む異なる種類の細胞とで構成される。腱芽細胞は、代謝活性の低下とともにそれらが加齢するにつれ、腱細胞に向かって分化する腱細胞の未熟型である。
【００９６】
さらなるガイダンスとして、限定されるものではないが、腱細胞は、以下の特徴を示し得る：
ａ）これらの細胞は、腱における細胞分化および細胞外マトリックスの組織化に関与する転写因子のベーシック・ヘリックス・ループ・ヘリックスファミリーのメンバーであるスクレラキシス（ＳＣＸ）の発現を含んでなる；
ｂ）これらの細胞は、テノモジュリン（ＴＮＭＤ）およびテネイシンＣ（ＴＮＣ）のうち少なくとも１つの発現を含んでなる；
ｃ）これらの細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０およびＣＤ１０５を実質的に発現するが、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ１４６、またはｓｔｒｏ−１を発現しない；
ｄ）これらの細胞は、腱組織再生のためにＩ、ＩＩＩおよびＶ型コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン、および弾性原線維からなる腱の細胞外成分を産生する能力の証拠を示す（Guengoermues et al. Connect Tissue Res, 2008, vol. 53(6), 485-91）；
ｅ）これらの細胞は、脂肪細胞系統の細胞（例えば、脂肪細胞）に向かっても、軟骨芽細胞系統の細胞（例えば、軟骨芽細胞、軟骨細胞）に向かっても、骨芽細胞系統の細胞（例えば、骨芽細胞、骨細胞）に向かっても実質的に分化しない。
【００９７】
当技術分野で公知なように、滑膜細胞（滑液）系統の細胞は、一般に、Ａ型またはマクロファージ様滑膜細胞およびＢ型または線維芽細胞様滑膜細胞（ＦＬＣ）を包含し、滑膜および滑液の形成に寄与し得る。総てのこれらの用語は、それ自体周知である。従って、本明細書で使用する場合、用語「滑膜細胞」は、いずれか１つおよびまとめて総てのそのような細胞型を指す。
【００９８】
さらなるガイダンスとして、限定されるものではないが、滑膜細胞は、以下の特徴を示し得る：
【００９９】
ａ）これらの細胞は、プロテオグリカン４（ＰＲＧ４）を分泌する能力の証拠を示し、表面活性リン脂質（ＳＡＰＬ）および滑液に存在するヒアルロナン（ＨＡ）の主要源である（Tamer et al. Interdiscip Toxicol, 2013, vol. 6(1), 111-125）；
【０１００】
ｂ）Ａ型またはマクロファージ様滑膜細胞は、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ８６、ＣＤ１４、ＣＤ１６３、ＤＲ抗原およびＦｃ受容体を含む造血起源マーカーの発現を含んでなる。Ｂ型または線維芽細胞様滑膜細胞は、ＩＶおよびＶ型コラーゲン、ビメンチン、およびＣＤ９０の発現を含む、線維芽細胞の多くの特徴を示す間葉系細胞である。さらに、Ｂ型細胞は、下内層の常在線維芽細胞を含む、多くの他の線維芽細胞系統と区別するｉｎ  ｓｉｔｕでのいくつかの独特の特性を有する。例えば、カドヘリン−１１（ＦＬＳの同型凝集において重要な役割を果たす特異的接着分子）、ＣＤ５５（崩壊促進因子）、ＶＣＡＭ−１（血管接着分子１）およびＩＣＡＭ−１（細胞間接着分子１）（Bartok et al. Immunol Rev, 2011, vol. 233(1), 233-255）；
【０１０１】
ｃ）これらの細胞は、ＣＤ４５を実質的に発現しない（例えば、約１０％未満、好ましくは約５％未満、より好ましくは約２％未満のこれらの細胞が、ＣＤ４５を発現し得る）；
【０１０２】
ｄ）これらの細胞は、脂肪細胞系統の細胞（例えば、脂肪細胞）に向かっても、軟骨芽細胞系統の細胞（例えば、軟骨芽細胞、軟骨細胞）に向かっても、骨芽細胞系統の細胞（例えば、骨芽細胞、骨細胞）に向かっても実質的に分化しない。
【０１０３】
細胞は、特定のマーカーに対して陽性である（またはそれを発現するもしくはその発現を含んでなる）と言われており、このことは、当業者ならば、好適な対照と比較して、適当な測定を実施した場合、そのマーカーに対する明確なシグナル、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応による抗体検出可能なまたは検出、の存在または証拠を結論付けるであろうことを意味する。方法がマーカーの定量的評価を可能にする場合、陽性細胞は、平均して、対照と有意に異なるシグナル、例えば、限定されるものではないが、対照細胞により生成されたそのようなシグナルよりも少なくとも１．５倍高い、例えば、少なくとも２倍、少なくとも４倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍高いまたはそれより高いシグナルを生成し得る。
【０１０４】
上記の細胞特異的マーカーの発現は、当技術分野で公知の任意の好適な免疫学的技法、例えば、免疫組織化学もしくはアフィニティー吸着、ウエスタンブロット分析、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡなどを用いて、または酵素活性（例えば、ＡＬＰに対して）の任意の好適な生化学的アッセイにより、またはマーカーｍＲＮＡの量を測定する任意の好適な技法、例えば、ノーザンブロット、半定量的もしくは定量的ＲＴ−ＰＣＲなどにより、検出することができる。本開示に記載のマーカーに対する配列データは公知であり、ジェンバンク（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）などの公開データベースから得ることができる。
【０１０５】
本明細書で教示する方法の特定の複数の実施形態において、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、動物細胞、好ましくは、温血動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞または非ヒト哺乳動物細胞などの哺乳動物細胞、および最も好ましくは、ヒト細胞であり得る。
【０１０６】
本明細書で意図するＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、好ましくは、接着性である、すなわち、成長のための表面を必要とし、一般に、培養培地中の浮遊細胞（懸濁培養物）としてではなく、前記表面上の接着性単層（すなわち、接着性細胞培養物）として成長する。組織培養プラスチック容器の表面などの表面への細胞の接着は、倒立顕微鏡下での目視検査により容易に調べることができる。接着培養において成長した細胞は、定期的な継代を必要とし、それらの細胞は、表面から酵素的に（例えば、トリプシンを用いて）除去され、増殖培地に懸濁され、新しい培養容器に再播種され得る。一般に、それへの細胞の接着を可能とする表面または基質は、任意の実質的に親水性の基質であってよい。当技術分野で公知なように、組織培養容器、例えば、培養フラスコ、ウェルプレート、ディッシュなどは、通常、多種多様なポリマー材料製であり得、好適には、親水性基質表面を提供するために、成形後に表面処理または被覆され得る。本明細書で使用する場合、用語「接触」は、直接的または間接的のいずれかで、１以上の分子、成分または材料を別のものと合わせて、それにより、それらの間の相互作用を促進することを意味する。一般に、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の増殖および／または分化を誘導する能力を有する１以上の剤は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞が培養される培地にそれらを含めることにより、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞と接触し得る。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、動物またはヒトの身体の外側、または外部を意味する。本明細書で使用する場合、用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、「ｅｘ  ｖｉｖｏ」を含むものと理解されるべきである。用語「ｅｘ  ｖｉｖｏ」は、一般に、動物またはヒトの身体から除去され、身体の外側、例えば、培養容器中で維持または繁殖された組織または細胞を指す。用語「線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ−２）」、「塩基性ＦＧＦ」、「ＦＧＦ−ｂ」、「ＦＧＦＢ」、「ＢＦＧＦ」、「ヘパリン結合性成長因子２（ＨＢＧＦ−２）」、または「プロスタトロピン」は、互換的に使用され得、線維芽細胞成長因子ファミリーのよく知られたメンバーを指す。本発明者らは、ＦＧＦ−２は、本発明の方法において特に有効であることを認識している。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、用語「トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）」、「ＴＧＦＢ」または「ＴＧＦベータ」は、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）ファミリーのメンバーを指す。本発明者らは、ＴＧＦβは、本発明の方法において特に有効であることを認識している。さらなる実施形態において、ＴＧＦβファミリーの前記メンバーは、ＴＧＦ−β−１、ＴＧＦ−β−２、ＴＧＦ−β−３、ＴＧＦ−β−４、ＧＤＦ１（増殖分化因子１）、ＧＤＦ−２、ＧＤＦ−３、ＧＤＦ−５、ＧＤＦ−６、ＧＤＦ−７、ＧＤＦ−８、ＧＤＦ−９、ＧＤＦ−１１、ＧＤＦ−１５、ＩＮＨＡ（インヒビンα鎖）、ＩＮＨＢＡ（インヒビンβＡ鎖）、ＩＮＨＢＢ（インヒビンβＢ鎖）、ＩＮＨＢＣ（インヒビンβＣ鎖）、ＩＮＨＢＥ（インヒビンβＥ鎖）、ＭＩＳ（ミュラー管抑制因子）、およびさらには、ＧＤＮＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子）、ＮＲＴＮ（ニュールツリン）、ＰＳＰＮ（パーセフィン）を含むＧＤＮＦサブファミリーのメンバー、ならびにその混合物からなる群から選択される。
【０１０９】
特定の実施形態において、ＴＧＦβは、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびその混合物からなる群から選択される。特定の実施形態において、ＴＧＦβはＴＧＦβ１である。例示として、ＴＧＦβ１は、単独のＴＧＦＢサイトカインとして本発明の方法において使用され得る。
【０１１０】
さらなる実施形態において、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβに加えて、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ以外の１以上の追加の外因的に加えられた成長因子と接触し得る。別の実施形態において、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβは、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞が接触する単独の外因性成長因子であり得る。
【０１１１】
好ましい実施形態において、本発明の方法において使用される成長因子は、ヒト成長因子である。本明細書で使用する場合、用語「ヒト成長因子」は、天然に存在するヒト成長因子と実質的に同じ成長因子を指す。例えば、成長因子がタンパク質性実体である場合、その成分ペプチドまたはポリペプチドは、天然に存在するヒト成長因子と同一の一次アミノ酸配列を有し得る。本発明の方法におけるヒト成長因子の使用は、そのような成長因子は細胞機能に対して望ましい効果を誘発することが期待されるため、好ましい。
【０１１２】
用語「天然に存在する」は、ヒトにより人工的に製造されたものとは異なる、自然に見出され得る物体または実体を説明するために使用される。例えば、自然における資源から単離され得、実験室においてヒトによって意図的に改変されていない、生物体に存在するポリペプチド配列は、天然に存在するものである。特定の実体、例えば、ポリペプチドまたはタンパク質に言及する場合、この用語は、例えば、個体間の正常な多様性のために、天然に存在する総ての形態およびその多様体を包含する。例えば、タンパク質性成長因子に言及する場合、用語「天然に存在する」は、個体間の正常な対立遺伝子多様性のために、それらの成分ペプチドまたはポリペプチドの一次配列の差を有する成長因子を包含する。
【０１１３】
本発明の方法は、成長因子の生物学的に活性な多様体または断片を利用し得る。本発明の方法では、成長因子の「生物学的に活性な」多様体または断片は、他の条件が実質的に同じである場合、それぞれの成長因子としてＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから少なくとも約同程度に得ることを達成する。
【０１１４】
ポリペプチドの「多様体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列と実質的に同一の（すなわち、全体がではないが大部分が同一の）アミノ酸配列を有する。本明細書において、「実質的に同一」は、少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも９０％同一、好ましくは、少なくとも９５％同一、例えば、少なくとも９９％同一を指す。配列の差は、１以上の(one of more)アミノ酸の挿入（付加）、欠失および／または置換から生じ得る。
【０１１５】
別の実施形態において、本発明の方法において使用される成長因子、すなわち、少なくともＦＧＦ−２およびＴＧＦβは、非ヒト動物成長因子、特に非ヒト哺乳動物成長因子、またはその生物学的に活性な多様体もしくは誘導体であり得る。本明細書で使用する場合、用語「非ヒト動物成長因子」および「非ヒト哺乳動物成長因子」は、それぞれ、天然に存在する非ヒト動物または非ヒト哺乳動物成長因子と実質的に同じ成長因子を指す。例えば、成長因子がタンパク質性実体である場合、その成分ペプチドまたはポリペプチドは、天然に存在する非ヒト動物または非ヒト哺乳動物成長因子と同一の一次アミノ酸配列を有し得る。当業者ならば、非ヒト動物または非ヒト哺乳動物成長因子は、後者はＭＳＣ細胞と同じ起源であるため、ヒト動物成長因子より低い程度でではあるが、本発明の方法において適用可能であり得ることを理解するであろう。特に、非ヒト動物または非ヒト哺乳動物成長因子は、それらが所望の効果、例えば、（類似の）ヒト成長因子と類似の効果を誘発する場合、使用され得る。
【０１１６】
好ましい実施形態において、成長因子またはその生物学的に活性な多様体もしくは誘導体は、組換えである、すなわち、宿主生物体またはその祖先に導入されており、かつ前記ポリペプチドをコードする配列を含んでなる組換え核酸分子の発現を通じて宿主生物体により産生される。本明細書で使用する場合、用語「組換え核酸分子」は、組換えＤＮＡ技術を用いてともに連結されたセグメントからなる核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはｃＤＮＡ分子）を指す。
【０１１７】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、血漿、血清またはその代替物の１以上、例えば、培地に付加的に含まれる血漿、血清またはその代替物の１以上とさらに接触する。
【０１１８】
用語「血漿」は、慣習的に定義された通りであり、新鮮血漿、解凍された凍結血漿、溶媒／洗浄剤処理血漿、処理血漿（例えば、ＰＲＰ）、またはそのいずれか２つ以上の混合物を含んでなる。血漿は通常、全血のサンプルから得られ、抗凝固剤（例えば、ヘパリン（非常に低濃度、一般に約１５×１０−５ＩＵ／ｍｌ）、クエン酸塩、シュウ酸塩もしくはＥＤＴＡ）が与えられるまたはそれと接触する。その後、血液サンプルの細胞成分は、適当な技法、一般に遠心分離により、液体成分（血漿）から分離される。具体例として、限定されるものではないが、本発明における使用に好適な血漿を得るために、血液サンプルは、抗凝固剤ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を含有するバキュテナーチューブ（例えば、ＢＤバキュテイナプラスチックＥＤＴＡチューブ、１０ｍｌ、１．８ｍｇ／ｍＬ）に採取され得る。サンプルを緩やかに振り混ぜた後、１，０００〜２，０００ｇにて室温で１０分間遠心分離し、血漿を赤血球から分離する。上清（血漿）を回収し、場合によりプールし（複数の血液サンプルを使用する場合）、クライオバイアルに分取し、使用するまで−８０℃で保存する。用語「血漿」は、ヒトまたは動物の身体の一部を形成しない組成物を指す。用語「血漿」は、特定の複数の実施形態において、具体的には、処理血漿、すなわち、その組成、具体的には、その化学的、生化学的、または細胞組成を変化させる１以上の処理工程に、全血から分離された後に供された血漿を含み得る。従って、本明細書で意図する用語「血漿」は、多血小板血漿（ＰＲＰ）、すなわち、血小板に富んでいる血漿を含み得る。一般に、ＰＲＰは約１．０×１０６血小板／μｌを含有し得、一方、全血中血小板濃度は約１．５×１０５〜３．５×１０５／μＬであり得る。
【０１１９】
血漿は、溶媒／洗浄剤処理され得る。用語「溶媒／洗浄剤処理血漿」、「Ｓ／Ｄ処理血漿」、または「Ｓ／Ｄ血漿」は、一般に、（ａ）血漿を溶媒および洗浄剤で処理する工程、ならびに（ｂ）溶媒／洗浄剤処理血漿を濾過する工程、を含んでなる方法により得ることができるまたは得られた脱細胞化血漿を指す。そのような処理に好適な溶媒は、ジまたはトリアルキルリン酸塩などの溶媒ならびにＵＳ４，７６４，３６９に記載の洗浄剤である。Ｓ／Ｄ血漿の調製に使用される洗浄剤は、好ましくは、無毒性洗浄剤（例えば、ツイーン（登録商標）２０またはツイーン（登録商標）８０）である。
【０１２０】
用語「血清」は、慣習的に定義された通りであり、新鮮血清、解凍された凍結血清もしくは血漿から調製された血清、またはそのいずれか２つ以上の混合物を含んでなる。血清は、通常、最初にサンプル中で凝固を生じさせ、引き続き、適当な技法、一般に遠心分離により、そのように形成された凝塊および血液サンプルの細胞成分を液体成分（血清）から分離することにより、全血のサンプルから得ることができる。凝固は、不活性触媒、例えば、ガラスビーズまたは粉末により促進することができる。あるいは、血清は、抗凝固剤およびフィブリンを除去することにより、血漿から得ることができる。具体例として、限定されるものではないが、本発明における使用に好適な血清を得るために、血液サンプルは、抗凝固剤を含有するバキュテナーチューブ（例えば、ＢＤバキュテイナプラスプラスチック血清チューブ、１０ｍｌ）に採取され得、室温で３０〜４５分間インキュベートし、凝固を可能にし得る。次に、チューブを１，０００〜２，０００ｇにて室温で１５分間遠心分離し、血清を赤血球から分離する。上清（血清）を回収し、場合によりプールし（複数の血液サンプルを使用する場合）、クライオバイアルに分取し、使用するまで−８０℃で保存する。従って、用語「血清」は、ヒトまたは動物の身体の一部を形成しない無細胞組成物を指す。本明細書で意図する血清は、ヒト血清である、すなわち、単一のヒト対象または複数のヒト対象（例えば、血清混合プール）から得られる。血清は、未処理血清、すなわち、全血からの分離により得られ、任意選択の熱不活化、保存（極低温もしくは非極低温）、滅菌、凍結乾燥および／または濾過以外の、その化学的、生化学的、または細胞組成を変化させる下流の処理工程に供しない血清であり得る。特定の複数の実施形態において、血清は、溶媒／洗浄剤処理血漿から得られ得る。
【０１２１】
単離された血漿、血清またはその代替物は、本発明の方法において直接使用することができる。それらは、その後の使用のために適当に保存することもできる（例えば、血漿、血清もしくはその代替物のそれぞれの凝固点より高い温度であるが、周囲温度未満で（この温度は通常約４℃〜５℃となる）、短期間、例えば、最大約１〜２週間；または通常約−７０℃〜約−８０℃の間の凍結保存により長期間）。
【０１２２】
単離された血漿、血清またはその代替物は、特に補体を除去するために、当技術分野で公知のように熱不活化され得る。本発明の方法が、その存在下で培養された細胞に対して自己由来の血漿、血清、またはその代替物を利用する場合、血漿、血清またはその代替物を熱不活化することは不要であり得る。血漿、血清またはその代替物が、培養細胞に対して少なくとも部分的に同種である場合、血漿、血清またはその代替物を熱不活化することが有利であり得る。場合により、血漿、血清またはその代替物は、好ましくは、孔径が０．２μｍ以下の従来の微生物学的フィルターを用いて、保存または使用する前に滅菌してもよい。
【０１２３】
ある実施形態において、本発明の方法は、それと接触するヒトＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞に対して自己由来であるヒト血漿、血清またはその代替物を利用し得る。血漿、血清またはその代替物に関する用語「自己由来」は、血漿、血清またはその代替物が、前記血漿、血清またはその代替物と接触するＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞と同じ対象から得られることを意味する。自己由来の血漿、血清またはその代替物の使用は、対象による細胞の最適な受容を保証し得、かつ／または、例えば、他の血清からの感染病原体の偶発的な伝播を回避し得る。
【０１２４】
別の実施形態において、方法は、それと接触するヒトＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞に対して「相同」または「同種」である、すなわち、ＭＳＣが得られる対象以外の１以上の（プールされた）ヒト対象から得られるヒト血漿、血清またはその代替物を利用し得る。
【０１２５】
さらなる実施形態において、方法は、上記で定義される自己由来および同種（すなわち、相同）の血漿、血清またはその代替物の混合物を利用し得る。本明細書で使用する場合、句「血清または血漿の代替物」は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞の成長および／または増殖を誘導する能力を有する組成物など、血漿および／または血清の機能の１以上を有する天然または人工の無毒性の組成物を指す。血清または血漿の代替物の限定されない例としては、血小板ライセート、ならびにヒト血清アルブミンなどの血漿または血清の１以上の分画成分を含んでなる細胞培養のための組成物が挙げられる。当業者ならば、ヒト血漿、血清およびその代替物は、複雑な生物学的組成物であり、これは、１以上の成長因子、サイトカインまたはホルモンを含んでなり得ることを認識する。
【０１２６】
血漿、血清またはその代替物の１以上に加えて、すなわち、それに対して外因的にまたはそれを補って、成長因子ＦＧＦ−２およびＴＧＦβまたはそれらのそれぞれの生物学的に活性な多様体または誘導体が提供されることが意図される。
【０１２７】
本明細書で使用する場合、用語「ヘパリン」は、その抗凝固作用を特徴とする、分子量が３〜３０ｋＤａの範囲の、炭水化物のグリコサミノグリカンファミリーのポリマーを指す。ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の効力は、ヒツジまたはヤギまたはヒト血漿の凝固を防止するのに必要なヘパリンの濃度を、ミリグラムあたりのヘパリン活性の単位に基づいた国際的に容認された参照標準の濃度と比較する生物学的アッセイにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定され得る。ヘパリン１ｍｇは、一般に、１４０〜１８０国際単位（ＩＵ）と等しい。
【０１２８】
用語「ＩＵ」または「国際単位」は、生物学的物質の量の標準尺度であり、前記生物学的物質の生物学的活性または効果として表される。この単位が割り当てられる総ての物質に対して、国際的に容認された生物学的手順に従って試験した場合、１ＩＵの用量の国際的に容認された生物学的活性または効果が期待される。
【０１２９】
特定の複数の実施形態において、ヘパリンまたはヘパリン誘導体もしくは類似体は、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）；エノキサパリン、ダルテパリン、ナドロパリン、チンザパリン、セルトパリン、レビパリン、アルデパリン、パルナパリン、ベミパリンなどの低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、またはその混合物；ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、アカラン硫酸、ケラタン硫酸などのヘパリノイド、またはダナパロイドなどのその混合物；ヘパリン塩；ヘパリノイド塩；ヘパリン断片；ヘパリノイド断片；およびその混合物からなる群から選択される。好ましくは、ヘパリンまたはヘパリン誘導体もしくは類似体は、ＵＦＨ、ダルテパリン、ダナパロイドおよびヘパラン硫酸からなる群から選択される。
【０１３０】
特定の複数の実施形態において、前記ＦＧＦ−２、前記ＴＧＦβ、前記ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体、および場合により血漿、血清またはその代替物の１以上は、培地、一般に液体細胞培養培地に含まれる。一般に、培地は、当技術分野で公知の基本培地処方物を含んでなる。多くの基本培地処方物（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ＡＴＣＣ；またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールスバッド、カリフォルニア州から入手可能）は、本明細書における細胞の培養に使用することができ、その例としては、限定されるものではないが、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎまたはＣａｍｂｒｅｘ（ニュージャージー州）から入手可能な、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地α改変型（α−ＭＥＭ）、基本必須培地（ＢＭＥ）、ＢＧＪｂ、Ｆ−１２  Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（Ｈａｍ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、またはＸ−ＶＩＶＯ（商標）無血清培地（臨床グレード）、ならびにその改変および／または組合せが挙げられる。上記の基本培地の組成は、一般に当技術分野で公知であり、培養された細胞に必要な培地および／または培地添加物の濃度を改変または調節することが、当技術分野の技術の範囲内である。そのような基本培地処方物は、それ自体公知である哺乳動物細胞の発生に必要な成分を含有する。例示として、限定されるものではないが、これらの成分は、無機塩（特に、Ｎａ、Ｋ、Ｍｇ、Ｃａ、Ｃｌ、ＰならびにおそらくＣｕ、Ｆｅ、ＳｅおよびＺｎを含有する塩）、生理学的緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ、重炭酸塩）、ヌクレオチド、ヌクレオシドおよび／または核酸塩基、リボース、デオキシリボース、アミノ酸、ビタミン、抗酸化剤（例えば、グルタチオン）ならびに炭素源（例えば、グルコース、ピルビン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム）などを含み得る。
【０１３１】
培養に使用するために、基本培地は、１以上のさらなる成分を供給され得る。例えば、追加の添加物を使用して、最適な成長および増殖のために、必要な微量元素および物質を細胞に供給することができる。そのような添加物としては、インスリン、トランスフェリン、セレニウム塩、およびその組合せが挙げられる。これらの成分は、限定されるものではないが、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、アール塩類溶液などの塩類溶液に含まれ得る。例えば、β−メルカプトエタノールなど、さらなる抗酸化剤添加物を加えてよい。多くの基本培地がすでにアミノ酸を含有しているが、例えば、溶液中の場合安定性が低いことで知られるＬ−グルタミンなど、いくつかのアミノ酸を後で添加してよい。培地には、抗生物質および／もしくは抗真菌化合物、例えば、一般に、ペニシリンとストレプトマイシンの混合物、ならびに／または他の化合物、例として、限定されるものではないが、アムホテリシン、アンピシリン、ゲンタマイシン、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、カナマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ナリジクス酸、ネオマイシン、ナイスタチン、パロモマイシン、ポリミキシン、ピューロマイシン、リファンピシン、スペクチノマイシン、テトラサイクリン、タイロシン、およびゼオシンをさらに供給してよい。脂質および脂質担体も、細胞培養培地に添加するために使用することができる。そのような脂質および担体としては、限定されるものではないが、とりわけ、シクロデキストリン、コレステロール、アルブミンに抱合したリノール酸、アルブミンに抱合したリノール酸およびオレイン酸、非抱合リノール酸、アルブミンに抱合したリノール・オレイン・アラキドン酸、アルブミンに非抱合のおよび抱合したオレイン酸が含まれ得る。アルブミンは、脂肪酸不含処方物において同様に使用することができる。
【０１３２】
特定の複数の実施形態において、ヒト血漿、血清またはその代替物の１以上は、約０．５％〜約３０％の間、好ましくは、約１％〜約１５％の間、より好ましくは、２％〜１０％の間の割合（血漿、血清、またはその代替物の１以上の容量／培地の容量）で、前記培地に含まれ得る。本発明の方法は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を培養するために得ることが必要な血漿、血清またはその代替物の１以上の容量を減少させることが可能な、血漿、血清またはその代替物の１以上が比較的少量で、例えば、約５または１０容量％以下、例えば、約１、約２、約３または約４容量％で、良好に実施され得る。
【０１３３】
なおさらなる複数の実施形態において、濃縮血漿製品（例えば、凍結血漿からの濃縮物などの血漿濃縮物）、濃縮血清製品または血漿もしくは血清の濃縮代替物の製品の１以上が利用され得る。そのような濃縮製品は、濃度係数を相殺する（平衡させる、補償する）ためなど、血漿、血清またはその代替物の１以上の所望の濃度より低い濃度で、組成物中に含まれ得る。
【０１３４】
特定の複数の実施形態において、ヒト血漿、血清および／またはその代替物のいずれか２つ以上の組合せまたは混合物が使用され得る。
【０１３５】
特定の複数の実施形態において、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβは、所望の細胞型に向かう分化を誘導するのに十分な濃度で、前記培地に含まれる。
【０１３６】
特定の複数の実施形態において、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβは、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞へのＭＳＣの分化を誘導するのに十分な濃度で、前記培地に含まれる。一般に、ＦＧＦ−２またはその生物学的に活性な多様体もしくは断片は、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは、０．５〜２０ｎｇ／ｍｌの間の濃度、例えば、約１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７もしくは６ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ以下、例えば、約４、３、２、１もしくは０．５ｎｇ／ｍｌで、培地に含まれ得る。一般に、ＴＧＦβ１などのＴＧＦβ、またはその生物学的に活性な多様体もしくは断片は、０．１〜１００ｎｇ／ｍｌの間、好ましくは、０．２５〜２０ｎｇ／ｍｌの間の濃度、例えば、約１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７もしくは６ｎｇ／ｍｌ、または約５ｎｇ／ｍｌ以下、例えば、約４、３、２、１もしくは０．５ｎｇ／ｍｌで、培地に含まれ得る。前記値は、培地に外因的に添加された、それぞれの成長因子またはその生物学的に活性な多様体もしくは断片の濃度を指すものとする。
【０１３７】
特定の複数の実施形態において、ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体は、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０２ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０３ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０４ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０５ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０６ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０７ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０８ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．０９ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．１ＩＵ／ｍｌ、少なくとも０．５ＩＵ／ｍｌ、少なくとも１ＩＵ／ｍｌ、少なくとも５ＩＵ／ｍｌ、少なくとも１０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも２０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも３０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも４０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも５０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも６０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも７０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも８０ＩＵ／ｍｌ、少なくとも９０ＩＵ／ｍｌ、または少なくとも１００ＩＵ／ｍｌの濃度で、前記培地に含まれる。特定の複数の実施形態において、ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体は、少なくとも０．１０ＩＵ／ｍｌの濃度で前記培地に含まれる。特定の好ましい複数の実施形態において、ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体は、約０．１ＩＵ／ｍｌの濃度で前記培地に含まれる。特定の複数の実施形態において、ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体は、約０．１０ＩＵ／ｍｌ、０．２０ＩＵ／ｍｌ、０．３０ＩＵ／ｍｌ、０．４０ＩＵ／ｍｌ、０．５０ＩＵ／ｍｌ、０．６０ＩＵ／ｍｌ、０．７０ＩＵ／ｍｌ、０．８０ＩＵ／ｍｌ、０．９０ＩＵ／ｍｌまたは１．０ＩＵ／ｍｌの濃度で、前記培地に含まれ得る。
【０１３８】
特定の複数の実施形態において、ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の濃度は、少なくとも０．０５ＩＵ／ｍｌ、好ましくは約０．１ＩＵ／ｍｌである。
【０１３９】
ある実施形態において、上記の濃度は、培地中の成長因子またはその生物学的に活性な多様体もしくは断片あるいは前記ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の総濃度、すなわち、前記成長因子またはその生物学的に活性な多様体もしくは断片あるいは血漿、血清または代替物により寄与されたおよびそれに加えて提供された前記ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の合計濃度を指し得る。
【０１４０】
別の実施形態において、上記の濃度は、前記成長因子またはその生物学的に活性な多様体もしくは断片あるいは血漿または血清によりすでに寄与されたものに加えて提供された前記ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の濃度を指し得る。当然ながら、加えられる成長因子あるいはヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体が、血漿、血清またはその代替物中に正常に存在していない（検出不可能である）場合、成長因子あるいはヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の総濃度および添加濃度は、（実質的に）同じになる。
【０１４１】
特定の複数の実施形態において、本明細書に記載のＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法は、以下の工程：
（ａ）ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を含んでなる培地において、対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを培養する工程；
（ｂ）非接着性物質を除去し、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を含んでなる培地において、接着性細胞をさらに培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得る工程、を含んでなる。好ましい実施形態において、本明細書において他所に定義される対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣは、培養容器中で培養される。培養容器は、細胞接着を可能にするプラスチック表面を提供し得る。別の実施形態において、表面はガラス表面であり得る。さらに別の実施形態において、表面は、細胞の接着および成長を可能にする適当な材料、例えば、マトリゲル（登録商標）、ラミニンまたはコラーゲンで被覆され得る。
【０１４２】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣは、基質表面、例えば、プラスチック表面に接着することができるそれらの（単核）細胞を選択することにより、骨髄（または他の源）から回収され得る。
【０１４３】
特定の複数の実施形態において、細胞は、工程（ｂ）における非接着性物質を除去する前に、約１〜８日間、より一般に約２〜６日間の間、より一般に約４日間接着させてよい。さもなければ、工程（ｂ）は、工程（ａ）の開始後、最大８日目、最大６日目、最大４日目、好ましくは最大４日目に実施される。
【０１４４】
特定の複数の実施形態において、細胞は、約７〜約３５日の間、通常約１０〜約２８日の間、より好ましくは約１２〜２１日の間の期間、まとめて工程（ａ）および（ｂ）において培養することができる。さもなければ、細胞は、それらのコンフルエンスが約６０％以上、または約８０％以上、または約９０％以上、またはさらには最大１００％に達するまで、まとめて工程（ａ）および（ｂ）において培養してよい。
【０１４５】
ある実施形態において、工程（ｂ）の後、方法は、そのように得られた細胞または細胞集団を回収すること含んでなり得る。
【０１４６】
ある実施形態において、工程（ｂ）の後、方法は、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび好ましくは、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を含んでなる培地において、ＭＳＣ由来細胞を剥離、再播種および培養することを含んでなり得る。
【０１４７】
ある実施形態において、工程（ｂ）の後、方法は、骨形成または軟骨形成分化培地においてＭＳＣ由来細胞を剥離、再播種および培養することを含んでなり得る。
【０１４８】
骨形成および軟骨形成分化培地は、当技術分野で公知である。限定されるものではないが、骨形成分化培地は、アスコルビン酸、β−グリセロリン酸、およびデキサメタゾンが供給された基本培地を含み得る。限定されるものではないが、軟骨形成分化培地は、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、アスコルビン酸、ＴＧＦβ−１、ピルビン酸ナトリウムおよびデキサメタゾンが供給された基本培地を含み得る。
【０１４９】
工程（ｂ）の後のＭＳＣ由来細胞の剥離、再播種および培養は、１回以上、例えば、１回、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回または１０回実施してよい。当業者は、これは、それぞれ継代１（Ｐ１）、継代２（Ｐ２）、継代３（Ｐ３）、継代４（Ｐ４）、継代５（Ｐ５）、継代６（Ｐ６）、継代７（Ｐ７）、継代８（Ｐ８）、継代９（Ｐ９）または継代１０（Ｐ１０）を生じ得ることを理解するであろう。継代０（Ｐ０）は、剥離および／または再播種されていないＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を指し得る。
【０１５０】
特に、ＭＳＣの骨形成分化など、ＭＳＣの分化は、一般に、それらが由来するＭＳＣよりも大きい細胞サイズを有するＭＳＣ由来細胞をもたらす。本発明者らは、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることにより、ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る場合、この細胞サイズの増加は生じないまたは低減するもしくは最小限になることを見出した。そのような小さなＭＳＣ由来細胞は、本明細書において他所に記載の有利に改善された移植特性を有する。
【０１５１】
従って、さらなる側面は、移植特性が改善されたＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、前記方法はサイズ縮小工程を含んでなり、前記サイズ縮小工程は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを特徴とする方法を提供する。
【０１５２】
本明細書で使用する場合、用語「サイズ縮小」は、（ｉ）サイズ縮小工程を含まないその他の点で同一の方法により得られたＭＳＣ由来細胞と比較して、サイズ縮小工程を含んでなる方法により得られたＭＳＣ由来細胞の低減した物理的寸法またはサイズ（例えば、平均サイズ、直径もしくは容量により測定されたもの、または好適な細胞サイズ指示変数、例えば、Ｄ６０、Ｄ６５、Ｄ７０、もしくはＤ７５）を指す。サイズ縮小は、サイズ縮小工程を用いずに得られたＭＳＣ由来細胞の平均細胞サイズと比較して、サイズ縮小工程を用いて得られたＭＳＣ由来細胞の少なくとも３０％、少なくとも２５％、少なくとも２０％、好ましくは、少なくとも３０％の平均細胞サイズの減少であり得る。
【０１５３】
特定の複数の実施形態において、本明細書に記載の移植特性が改善されたＭＳＣからＭＳＣ由来細胞を得る方法は、適当な添加培養培地においてＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで培養して、後期および初期の分化の特徴を伴う高い増殖率に到達させる工程を含んでなり、前記工程は、サイズ縮小工程と同時にまたはその前に実施される。
【０１５４】
特定の複数の実施形態において、方法は、細胞を少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させると同時にまたはその前に、ＭＳＣの増殖および／または分化を誘導する能力を有する１以上の剤とＭＳＣを接触させることを含んでなり得る。
【０１５５】
用語「剤」は、大まかに、任意の化学的（例えば、無機もしくは有機）、生化学的もしくは生物学的物質、分子もしくは高分子（例えば、生物学的高分子）、その組合せもしくは混合物、未確定の組成のサンプル、または細菌、植物、真菌、もしくは動物の細胞もしくは組織などの生物学的材料から作られた抽出物を指す。ＭＳＣの増殖および／または分化を誘導する能力を有する剤の限定されない例としては、ＦＧＦ−２およびＴＧＦβなどの成長因子、ならびに血漿または血清もしくはその代替物が挙げられる。当業者は、成長因子または成長因子の組合せは、所望の細胞型に向かったＭＳＣの分化を誘導する能力を有することで知られる任意の成長因子または成長因子の組合せであってよいことを理解するであろう。
【０１５６】
特定の複数の実施形態において、本明細書に記載の移植特性が改善されたＭＳＣからＭＳＣ由来細胞を得る方法は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでＦＧＦ−２およびＴＧＦβと接触させる工程をさらに含んでなる。前記ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることは、好ましくは、同時に実施される。
【０１５７】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞は、例えば、培地が、血漿、血清またはその代替物の１以上をさらに含んでなるように、血漿、血清またはその代替物の１以上とさらに接触する。
【０１５８】
前述のように、上記の詳細な方法は、優れた特徴、例えば、特に、前述のＭＳＣ由来細胞より小さくかつ均一なサイズを有する、ＭＳＣ由来細胞、またはそれを含んでなる集団をもたらす。本明細書に記載の方法により得ることができるＭＳＣ由来細胞のより小さくかつより均一なサイズは、移植特性が改善された細胞をもたらす。より詳しくは、本明細書に記載の方法により得ることができるＭＳＣ由来細胞のより小さくかつより均一なサイズは、とりわけ、優れたｉｎ  ｖｉｖｏ安全性プロファイルおよび／または注射筒の操作性を提供することにより、肺塞栓および肺梗塞のリスクを低減または排除することにより、総ての投与経路、特に血管内投与に適した細胞をもたらす。さらに、本明細書に記載の方法により得ることができるＭＳＣ由来細胞は、投与容量が制限された部位に調節可能かつ高い細胞濃度を送達することを可能にする。
【０１５９】
本明細書を考慮すると、本発明の方法は、ＭＳＣをＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることにより得られたＭＳＣ由来細胞の、細胞の直径および／または容量により特徴付けられるサイズによって、さらに定義され得る。
【０１６０】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径は、３０μｍ未満、２９μｍ未満、２８μｍ未満、２７μｍ未満、２６μｍ未満、２５μｍ未満、または２４μｍ未満である。好ましくは、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径は、２４μｍ未満である。
【０１６１】
用語「懸濁液」および「細胞懸濁液」は、一般に、液相に分散された、ＭＳＣ由来細胞、特に生存ＭＳＣ由来細胞を指す。
【０１６２】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径は、１０μｍ超、１１μｍ超、１２μｍ超、１３μｍ超、１４μｍ超、１５μｍ超、１６μｍ超、１７μｍ超または１８μｍ超である。
【０１６３】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径は、１６μｍ〜２６μｍの間、好ましくは、２０μｍ〜２５μｍの間である。
【０１６４】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下（Ｄ６０≦２５μｍ）、２４μｍ以下（Ｄ６０≦２４μｍ）、２３μｍ以下（Ｄ６０≦２３μｍ）、２２μｍ以下（Ｄ６０≦２２μｍ）、２１μｍ以下（Ｄ６０≦２１μｍ）、または２０μｍ以下（Ｄ６０≦２０μｍ）、好ましくは、２５μｍ以下（Ｄ６０≦２５μｍ）の直径を有する。
【０１６５】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６５％が、２５μｍ以下（Ｄ６５≦２５μｍ）、２４μｍ以下（Ｄ６５≦２４μｍ）、２３μｍ以下（Ｄ６５≦２３μｍ）、２２μｍ以下（Ｄ６５≦２２μｍ）、２１μｍ以下（Ｄ６５≦２１μｍ）、または２０μｍ以下（Ｄ６５≦２０μｍ）、好ましくは、２５μｍ以下（Ｄ６５≦２５μｍ）の直径を有する。
【０１６６】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも７０％が、２５μｍ以下（Ｄ７０≦２５μｍ）、２４μｍ以下（Ｄ７０≦２４μｍ）、２３μｍ以下（Ｄ７０≦２３μｍ）、２２μｍ以下（Ｄ７０≦２２μｍ）、２１μｍ以下（Ｄ７０≦２１μｍ）、または２０μｍ以下（Ｄ７０≦２０μｍ）、好ましくは、２５μｍ以下（Ｄ７０≦２５μｍ）の直径を有する。
【０１６７】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも７５％が、２５μｍ以下（Ｄ７５≦２５μｍ）、２４μｍ以下（Ｄ７５≦２４μｍ）、２３μｍ以下（Ｄ７５≦２３μｍ）、２２μｍ以下（Ｄ７５≦２２μｍ）、２１μｍ以下（Ｄ７５≦２１μｍ）、または２０μｍ以下（Ｄ７５≦２０μｍ）、好ましくは、２５μｍ以下（Ｄ７５≦２５μｍ）の直径を有する。
【０１６８】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞は、２５μｍ以下のＤ６０（Ｄ６０≦２５μｍ）を示し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する。特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞は、２５μｍ以下のＤ６５（Ｄ６５≦２５μｍ）を示し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する。
【０１６９】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞は、２５μｍ以下のＤ７０（Ｄ７０≦２５μｍ）を示し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する。
【０１７０】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞は、２５μｍ以下のＤ７５（Ｄ７５≦２５μｍ）を示し、懸濁液のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する。
【０１７１】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞は、約２５μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６０≦２５μｍ）、約２４μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６０≦２４μｍ）、約２３μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６０≦２３μｍ）、約２２μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６０≦２２μｍ）、約２１μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６０≦２１μｍ）または約２０μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６０≦２０μｍ）、好ましくは、約２５μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６０≦２５μｍ）のＤ６０を示す。
【０１７２】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞は、約２５μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６５≦２５μｍ）、約２４μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６５≦２４μｍ）、約２３μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６５≦２３μｍ）、約２２μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６５≦２２μｍ）、約２１μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６５≦２１μｍ）または約２０μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６５≦２０μｍ）、好ましくは、約２５μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ６５≦２５μｍ）のＤ６５を示す。
【０１７３】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞は、約２５μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７０≦２５μｍ）、約２４μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７０≦２４μｍ）、約２３μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７０≦２３μｍ）、約２２μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７０≦２２μｍ）、約２１μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７０≦２１μｍ）または約２０μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７０≦２０μｍ）、好ましくは、約２５μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７０≦２５μｍ）のＤ７０を示す。
【０１７４】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞は、約２５μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７５≦２５μｍ）、約２４μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７５≦２４μｍ）、約２３μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７５≦２３μｍ）、約２２μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７５≦２２μｍ）、約２１μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７５≦２１μｍ）または約２０μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７５≦２０μｍ）、好ましくは、約２５μｍ〜約１０μｍの間（１０μｍ≦Ｄ７５≦２５μｍ）のＤ７５を示す。
【０１７５】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも９０％が、３０μｍ以下（Ｄ９０≦３０μｍ）、２９μｍ以下（Ｄ９０≦２９μｍ）、２８μｍ以下（Ｄ９０≦２８μｍ）、２７μｍ以下（Ｄ９０≦２７μｍ）、２６μｍ以下（Ｄ９０≦２６μｍ）または２５μｍ以下（Ｄ９０≦２５μｍ）、好ましくは、３０μｍ以下（Ｄ９０≦３０μｍ）の直径を有する。
【０１７６】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞は、３０μｍ以下のＤ９０（Ｄ９０≦３０μｍ）を示し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する。
【０１７７】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞は、約３０μｍ〜約１０μｍの間のＤ９０（１０μｍ≦Ｄ９０≦３０μｍ）を示す。
【０１７８】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中の各ＭＳＣ由来細胞の直径は、１０μｍ超、１１μｍ超、１２μｍ超、１３μｍ超、１４μｍ超または１５μｍ超、好ましくは、１０μｍ超である。
【０１７９】
細胞の直径は、当技術分野で公知の任意の方法により、例えば、デジタル顕微鏡および付属の画像解析用ソフトウエア（例えば、Ｍｏｔｉｃ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｌｕｓ  ２．０２）により、決定され得る。本明細書で言及される平均細胞直径は、浮遊非接着状態の細胞、従って、懸濁液中の細胞の直径に基づいて決定すべきである。細胞は、好ましくは、ＰＢＳなどの透明で無毒性の等張緩衝液、および場合により、トリパンブルーなどの生細胞と死細胞を区別するための色素を含んでなる溶液に懸濁される。好ましくは、解析を統計的に有意とみなすためには、少なくとも１００個の細胞を測定する必要がある。
【０１８０】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中の各ＭＳＣ由来細胞の直径は、３８μｍ未満、３７μｍ未満、３６μｍ未満、３５μｍ未満、好ましくは、３５μｍ未満である。
【０１８１】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径の標準偏差は、７．０μｍ未満、６．５μｍ未満、６．０μｍ未満、５．５μｍ未満、５μｍ未満、４．５μｍ未満、４μｍ未満または３．５μｍ未満である。好ましくは、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径の標準偏差は、４．０μｍ未満、例えば、３．０〜３．５μｍの間である。
【０１８２】
本発明者らは、本明細書に記載の方法により得られたＭＳＣ由来細胞の細胞サイズ分布は安定であることを見出した。従って、本明細書に記載の方法により得られたＭＳＣ由来細胞の直径および／または容量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養中に、任意の時点および任意の集密度で決定され得る。好ましい複数の実施形態において、細胞が、３０％〜８０％の間、好ましくは、４０％〜７０％の間、例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％または７０％の集密度に達したとき、ＭＳＣ由来細胞の直径および／または容量は決定される。
【０１８３】
さらなる側面は、ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなり、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径は、２５μｍ未満、例えば２４μｍ未満または例えば２０μｍ〜２５μｍの間である方法を提供する。
【０１８４】
さらなる側面は、ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなり、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ６０≦２５μｍ）を有し、好ましくは、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも７０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ７０≦２５μｍ）を有し、細胞集団の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する方法を提供する。
【０１８５】
ＭＳＣ由来細胞の平均直径、ＭＳＣ由来細胞の最大個別直径、ＭＳＣ由来細胞の平均容量、Ｄ６０、Ｄ６５、Ｄ７０、Ｄ７５、Ｄ９０、ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の濃度、ＭＳＣの増殖および／または分化を誘導する能力を有するＭＳＣ由来細胞の系統および剤に関するそれらの実施形態を含む、前述の総ての実施形態は、本明細書で教示するＭＳＣ由来細胞を得る総ての方法に適用されることは、当業者にとって明らかであろう。
【０１８６】
さらなる側面は、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径が、３０μｍ未満、２９μｍ未満、２８μｍ未満、２７μｍ未満、２６μｍ未満、２５μｍ未満または２４μｍ未満である、ＭＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖により得ることができるＭＳＣ由来細胞の集団を提供する。好ましくは、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径は、２４μｍ未満である。
【０１８７】
さらなる側面は、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ６０≦２５μｍ）を有し、好ましくは、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも７０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ７０≦２５μｍ）を有し、細胞集団の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する、ＭＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖により得ることができるＭＳＣ由来細胞の集団を提供する。本明細書で使用する場合、用語「集団」は、所望のＭＳＣ由来細胞型の細胞の実質的に純粋な（すなわち、主にそれから構成される）、均一な群を指す。
【０１８８】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中の各ＭＳＣ由来細胞の直径は、３８μｍ未満、３７μｍ未満、３６μｍ未満、好ましくは、３５μｍ未満である。
【０１８９】
特定の複数の実施形態において、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径の標準偏差は、６．０μｍ未満、５．５μｍ未満、５．０μｍ未満、４．５μｍ未満、４．０μｍ未満または３．５μｍ未満である。好ましくは、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径の標準偏差は、４．０μｍ未満、例えば、３．０〜３．５μｍの間である。
【０１９０】
特定の複数の実施形態において、ＭＳＣ由来細胞の集団は、本明細書で教示するＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法により、得ることができる。
【０１９１】
ＭＳＣ由来細胞の平均直径、ＭＳＣ由来細胞の最大個別直径、ＭＳＣ由来細胞の平均容量、Ｄ６０、Ｄ６５、Ｄ７０、Ｄ７５、Ｄ９０、ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の濃度、ＭＳＣの増殖および／または分化を誘導する能力を有するＭＳＣ由来細胞の系統および剤に関するそれらの実施形態を含む、前述の総ての実施形態は、本明細書で教示するＭＳＣ由来細胞を得る総ての方法に適用され、従って、本明細書で教示する前記方法により得ることができるＭＳＣ由来細胞およびＭＳＣ由来細胞の集団にも適用されることは、当業者にとって明らかであろう。
【０１９２】
従って、さらなる側面は、本明細書に定義されるＭＳＣ由来細胞またはＭＳＣ由来細胞の集団を含んでなる組成物に関する。本明細書で教示するＭＳＣ由来細胞またはＭＳＣ由来細胞の集団を含んでなり、１以上の他の成分をさらに含んでなる組成物も提供される。例えば、細胞の生存率を維持または亢進することができる成分が含まれ得る。例示として、限定されるものではないが、そのような成分としては、実質的に等張の条件を保証するための塩、緩衝系などのｐＨ安定剤（例えば、実質的に中性のｐＨを保証するためのもの、例えば、リン酸または炭酸緩衝系）、例えばアルブミンなどの担体タンパク質、基本培地および／もしくは培地添加物、血清もしくは血漿を含む培地、栄養素、炭水化物源、保存剤、安定剤、抗酸化剤または当業者に周知の他の材料が挙げられ得る。また、それぞれのＭＳＣ由来細胞またはＭＳＣ由来細胞の集団を上記の前記１以上のさらなる成分と混合することにより、前記組成物を製造する方法も開示される。組成物は、例えば、液体であってもよいし、または半流動もしくは固体であってもよい（例えば、凍結組成物であってもよいし、またはゲルとして存在してもよいし、または固体支持体もしくは足場上に存在してもよい、など）。とりわけ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの凍結保存剤は、当技術分野で周知である。
【０１９３】
用語「組成物」、「処方物」、または「調製物」は、本明細書において互換的に使用され得る。
【０１９４】
特定の複数の実施形態において、組成物は、本明細書に定義されるＭＳＣ由来細胞またはＭＳＣ由来細胞の集団、および場合により、１以上の薬学上許容可能な賦形剤を含んでなる医薬組成物である。
【０１９５】
本明細書で使用する場合、用語「薬学上許容可能な」は、当技術分野と一致し、医薬組成物の他の成分と適合し、かつその受容者に対して有害ではないことを意味する。
【０１９６】
本明細書で使用する場合、「担体」または「賦形剤」は、任意のおよび総ての溶媒、希釈剤、緩衝剤（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、可溶化剤、コロイド、分散媒、ビヒクル、増量剤、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン）、アミノ酸（例えば、グリシン）、タンパク質、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、甘味剤、着色剤、矯味剤、芳香剤、増粘剤、デポ効果を達成するための剤、コーティング剤、抗真菌剤、保存剤、安定剤、抗酸化剤、張度調節剤、吸収遅延剤などを含む。医薬活性物質に対するそのような培地および剤の使用は、当技術分野で周知である。そのような材料は、無毒性であるべきであり、細胞の活性を妨げてはならない。
【０１９７】
担体または賦形剤または他の材料の正確な性質は、投与経路に依存する。例えば、組成物は、発熱物質不含であり、好適なｐＨ、等張性および安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形態であり得る。医薬処方における一般原則については、読者は、Cell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan編, Cambridge University Press, 1996; and Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill Livingstone, 2000を参照されたい。
【０１９８】
液体医薬組成物は、一般に、水または薬学上許容可能な水溶液などの液体担体を含み得る。例えば、生理食塩水、組織もしくは細胞培養培地、デキストロースもしくは他の糖類溶液またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールが挙げられ得る。
【０１９９】
組成物は、１以上の細胞保護分子、細胞再生分子、成長因子、抗アポトーシス因子または細胞における遺伝子発現を調節する因子を含み得る。そのような物質は、細胞をその環境に依存しないようにし得る。
【０２００】
そのような医薬組成物は、その中の細胞の生存率を保証するさらなる成分を含有し得る。例えば、組成物は、望ましいｐＨ、より通常は、中性に近いｐＨに達するための好適な緩衝系（例えば、リン酸もしくは炭酸緩衝系）を含んでなり得、浸透圧ストレスを防ぐために細胞に対して等張条件を保証するために十分な塩を含んでなり得る。例えば、これらの目的のための好適な溶液は、当技術分野で公知のように、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）、塩化ナトリウム溶液、リンゲル注射液または乳酸リンゲル注射液であり得る。さらに、組成物は、細胞の生存率を増加させ得る担体タンパク質、例えば、アルブミン（例えば、ウシまたはヒトアルブミン）を含んでなり得る。
【０２０１】
さらに好適に薬学上許容可能な担体または添加剤は、当業者に周知であり、例えば、コラーゲンまたはゼラチンなどのタンパク質、デンプンなどの炭水化物、多糖、糖（デキストロース、グルコースおよびスクロース）、カルボキシメチルセルロースナトリウムもしくはカルシウム、ヒドロキシプロピルセルロースまたはヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体、アルファ化デンプン、ペクチン寒天、カラゲナン、粘土、親水性ガム（アカシアガム、グアーガム、アラビアガムおよびキサンタンガム）、アルギン酸、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、ポリグリコール酸およびポリ乳酸、デキストラン、ペクチン、水溶性アクリルポリマーまたはポリビニルピロリドンなどの合成ポリマー、プロテオグリカン、リン酸カルシウムなどから選択され得る。
【０２０２】
所望により、改善された組織再生を提供するために、細胞調製物を、支持体、足場、マトリックスまたは材料に投与することができる。例えば、材料は、粒状セラミック、またはゼラチン、コラーゲン、またはフィブリノーゲンなどの生体高分子であり得る。多孔質マトリックスは、標準的な技法に従って合成することができる（例えば、Mikos et al., Biomaterials 14: 323, 1993; Mikos et al., Polymer 35:1068, 1994; Cook et al., J. Biomed. Mater. Res. 35:513, 1997）。そのような支持体、足場、マトリックスまたは材料は、生分解性であってもよく、または非生分解性であってもよい。従って、細胞は、移植に供するために、好適な基質、例えば多孔質または非多孔質基質に移され得るおよび／またはその上で培養され得る。例えば、増殖している、または培養皿において分化中の細胞は、必要に応じて、本発明の液体栄養培地中で固体支持体をインキュベートすることにより、それらの細胞を増殖させるおよび／または分化過程を継続させるために、三次元固体支持体上に移すことができる。例えば、前記細胞を含有する液体懸濁液に前記支持体を含浸させることにより、細胞を三次元固体支持体上に移すことができる。このように得られた含浸支持体は、対象に移植することができる。そのような含浸支持体は、最終的に移植される前に、液体培養培地にそれらを浸漬することにより、再培養することもできる。三次元固体支持体は、それをヒトに移植可能とするために、生体適合性である必要がある。これは、生分解性であってもよく、または非生分解性であってもよい。
【０２０３】
細胞または細胞集団は、それらが、生存、成長、増殖および／または例えば肝細胞などの所望の細胞型に向かった分化をすることを可能にする様式で、投与され得る。細胞または細胞集団は、例えば肝臓などの意図する臓器に移植され得る、またはそれに向かって遊走するおよびその中に生着し得る。他の場所、組織または臓器、例えば、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓被膜、腹膜または網における細胞または細胞集団の生着が、想定され得る。
【０２０４】
ある実施形態において、上記で定義される医薬細胞調製物は、液体組成物の形態で投与され得る。複数の実施形態において、細胞またはそれを含んでなる医薬組成物は、全身的、局所的、臓器内、臓器機能不全もしくは病変の部位または組織病変の部位に投与され得る。
【０２０５】
好ましくは、医薬組成物は、治療上有効な量の所望の細胞を含んでなり得る。用語「治療上有効な量」は、研究者、獣医師、医師または他の臨床家により探究されている組織、系、動物またはヒトにおいて生物学的または医薬的応答を誘発し得る量、特に、処置されている疾患または状態の局所または全身症状または特徴の１以上を予防または軽減し得る量を指す。適当な治療上有効な量は、所望の細胞の性質、病態および重症度、ならびに対象の年齢、サイズおよび状態に相応の注意を払い、有資格医師により決定され得る。
【０２０６】
また、本発明の細胞を、上記の１以上のさらなる成分および上記の１以上の医薬賦形剤と混合することにより、前記医薬組成物を製造する方法も提供される。
【０２０７】
また、例えば全身的に、例えば注射により、など、対象に対して本明細書で教示するＭＳＣ由来細胞もしくはＭＳＣ由来細胞の集団または本明細書に定義される医薬組成物を投与するための外科機器またはデバイスを含んでなり、本明細書で教示するＭＳＣ由来細胞もしくはＭＳＣ由来細胞の集団または本明細書に定義される医薬組成物をさらに含んでなる、部品の配置またはキットも開示される。
【０２０８】
ある実施形態において、上記で定義される医薬組成物は、液体または粘性組成物の形態で投与され得る。
【０２０９】
関連側面において、本発明は、医薬としての使用のための、上記で定義されるＭＳＣ由来細胞もしくはＭＳＣ由来細胞集団または前記ＭＳＣ由来細胞もしくはＭＳＣ由来細胞集団を含んでなる医薬組成物を提供する。関連側面において、本発明は、ＭＳＣ由来細胞の移植を必要とする対象の処置における使用のための、上記で定義されるＭＳＣ由来細胞もしくはＭＳＣ由来細胞集団または前記ＭＳＣ由来細胞もしくはＭＳＣ由来細胞集団を含んでなる医薬組成物を提供する。関連側面において、本発明は、ＭＳＣ由来細胞の移植を必要とする対象を処置する方法であって、前記対象に、治療上有効な量の上記で定義されるＭＳＣ由来細胞もしくはＭＳＣ由来細胞集団または前記ＭＳＣ由来細胞もしくはＭＳＣ由来細胞集団を含んでなる医薬組成物を投与することを含んでなる方法を提供する。関連側面において、本発明は、ＭＳＣ由来細胞の移植を必要とする対象の処置のための医薬の製造のための、上記で定義されるＭＳＣ由来細胞もしくはＭＳＣ由来細胞集団または前記ＭＳＣ由来細胞もしくはＭＳＣ由来細胞集団を含んでなる組成物の使用を提供する。
【０２１０】
本明細書で使用する場合、用語「処置する」または「処置」は、治療的処置および予防的(prophylactic)または予防的(preventive)処置の両方を指し、その目的は、望まれない生理学的変化または障害を予防または減速（軽減）することである。有益なまたは所望の臨床結果としては、限定されるものではないが、症状の軽減、疾患の程度の減少、疾患の安定した（すなわち、悪化していない）状態、疾患進行および合併症の発生の遅延または緩徐化、病態の寛解または緩和が含まれる。「処置」は、処置を受けていない場合に予想される生存期間と比較した、生存期間の延長も意味し得る。
【０２１１】
本明細書で使用する場合、用語「ＭＳＣ由来細胞の移植を必要とする対象」は、所与の状態、好ましくは、上記の状態または疾患の処置から利益が得られる哺乳動物またはヒト対象などの対象を含む。そのような対象は、一般に、限定されるものではないが、状態と診断されている対象、前記状態を有するもしくは発症する傾向がある対象、および／または状態が予防されるべき対象を含む。
【０２１２】
用語「移植」または「細胞移植」は、その通常の意味を有し、特に、対象に対する細胞の投与を指す。用語「細胞移植」は、「細胞療法」と互換的に使用され得る。細胞移植は、当技術分野で公知の任意の技法により実施され得る。例示として、限定されるものではないが、細胞は、注入により対象に移植され得る。一般に、細胞注入は、非経口、例えば、血管内、皮下、皮内、または筋肉内、好ましくは、血管内で実施され得る。細胞は、例えば、限定されるものではないが、全身的、局所的または病変の部位に投与され得る。特定の適用、標的組織、治療目的または細胞型に応じて、投与経路および処方、濃度などに関して、それに合うように調整してよいことは明らかであり得る。
【０２１３】
本明細書で教示するＭＳＣ由来細胞の均一で小さな細胞サイズは、対象に対する前記細胞の静脈内投与時、急性毒性の低減または抑制をもたらす。従って、本明細書で教示するＭＳＣ由来細胞は、血管内または経皮投与に特に好適である。
【０２１４】
従って、特定の複数の実施形態において、上記で定義されるＭＳＣ由来細胞もしくはＭＳＣ由来細胞の集団または医薬組成物は、ＭＳＣ由来細胞の移植を必要とする前記対象に対して、経皮または血管内で投与され得る。
【０２１５】
さらに、本発明者らは、骨軟骨芽細胞系統または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞は、本明細書で教示する方法により得られ、より強力な骨形成特性を有することを見出した。
【０２１６】
従って、特定の実施形態において、前記状態または疾患は、筋骨格疾患である。
【０２１７】
本明細書で使用する場合、用語「筋骨格疾患」は、いずれかの種類の骨疾患、筋肉疾患、関節疾患、または軟骨異栄養症を指し、その処置は、疾患を有する対象に対する本発明の医薬処方物の投与から利益が得られ得る。特に、そのような疾患は、例えば、減少した骨および／もしくは軟骨形成または過剰な骨および／もしくは軟骨吸収、骨に存在する骨芽細胞もしくは骨細胞および／または軟骨に存在する軟骨芽細胞もしくは軟骨細胞の数、生存率または機能の減少、対象における減少した骨質量および／または軟骨質量、骨の非薄化、損なわれた骨の強度または弾性などによって特徴付けられ得る。
【０２１８】
筋骨格疾患の限定されない例としては、局所または全身障害、例えば、いずれかの種類の骨粗鬆症または骨減少症、例えば、原発性、閉経後、老人性、コルチコイド誘発性、ビスホスホネート誘発性、および放射線療法誘発性；いずれかの続発性、単一または多部位骨壊死；いずれかの種類の骨折、例えば、偽関節、変形癒合、遷延治癒骨折または圧迫、顎顔面骨折；骨の癒合（例えば、脊椎固定および再建）を要する状態；先天性骨欠損；骨再建、例えば、外傷後または癌手術後、および頭蓋顔面骨再建；外傷性関節炎、限局性軟骨および／または関節欠損、限局性変形性関節症；変形性関節症、変形性関節症、変形性膝関節症、および変形性股関節症；骨形成不全症；溶骨性骨癌；パジェット病；内分泌学的障害；低リン酸血症；低カルシウム血症；腎性骨異栄養症；骨軟化症；無形成骨症、副甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、続発性副甲状腺機能亢進症；歯周病；ゴーハム・スタウト病およびマッキューン・オルブライト症候群；関節リウマチ；強直性脊椎炎、乾癬性関節炎、腸炎性関節症、および未分化脊椎関節炎を含む脊椎関節症、ならびに反応性関節炎；全身性エリテマトーデスおよび関連症候群；強皮症および関連障害；シェーグレン症候群；巨細胞性動脈炎（ホートン病）、高安動脈炎、リウマチ性多発筋痛症、ＡＮＣＡ関連血管炎（ウェゲナー肉芽腫症、顕微鏡的多発血管炎、およびチャーグ・ストラウス症候群など）、ベーチェット症候群、および他の多発動脈炎を含む全身性血管炎、ならびに関連障害（結節性多発動脈炎、コーガン症候群、およびバージャー病など）；アミロイドーシスおよびサルコイドーシスを含む他の全身性炎症性疾患を伴う関節炎；痛風、ピロリン酸カルシウム二水和物疾患、リン酸カルシウムまたはシュウ酸カルシウム結晶の関節沈着に関連した障害または症候群を含む結晶性関節炎；軟骨石灰化症および神経障害性関節症；フェルティ症候群およびライター症候群；ライム病およびリウマチ熱が挙げられ得る。
【０２１９】
特定の実施形態において、前記状態または疾患は、骨関連障害である。
【０２２０】
従って、本明細書で使用する場合、用語「骨関連障害」は、いずれかの種類の骨疾患を指し、その処置は、障害を有する対象に対する、骨形成特性を有する細胞、例えば、骨軟骨前駆細胞、骨前駆細胞、前骨芽細胞、骨芽細胞または骨芽細胞表現型細胞の移植から利益を得られ得る。特に、そのような障害は、例えば、減少した骨形成または過剰な骨吸収、骨に存在する骨芽細胞または骨細胞の数、生存率または機能の減少、対象における減少した骨質量、骨の非薄化、損なわれた骨の強度または弾性などによって特徴付けられ得る。
【０２２１】
例示として、限定されるものではないが、本発明の方法により得られた骨形成特性を有するＭＳＣ由来細胞（例えば、骨芽細胞系統の細胞）の移植から利益を得られ得る骨関連障害としては、局所または全身障害、例えば、いずれかの種類の骨粗鬆症または骨減少症、例えば、原発性、閉経後、老人性、コルチコイド誘発性、いずれかの続発性、単一または多部位骨壊死、いずれかの種類の骨折、例えば、偽関節、変形癒合、遷延治癒骨折または圧迫、骨の癒合（例えば、脊椎固定および再建）を要する状態、顎顔面骨折、骨再建、例えば、外傷後または癌手術後、頭蓋顔面骨再建、骨形成不全症、溶骨性骨癌、パジェット病、内分泌学的障害、低リン酸血症、低カルシウム血症、腎性骨異栄養症、骨軟化症、無形成骨症、関節リウマチ、副甲状腺機能亢進症、原発性副甲状腺機能亢進症、続発性副甲状腺機能亢進症、歯周病、ゴーハム・スタウト病およびマッキューン・オルブライト症候群が挙げられ得る。
【０２２２】
本明細書に記載のＭＳＣ由来細胞、ＭＳＣ由来細胞の集団および医薬組成物は、単独で使用してもよいし、または、それぞれの障害に対する公知の療法または有効化合物のいずれかと組み合わせて使用してもよい。投与は、他所に説明するように、同時でもよいし、または任意の順序での逐次的でもよい。
【０２２３】
細胞が、異種（すなわち、非自己、非相同または非同種）の源に由来する場合、例えば、シクロスポリンまたはタクロリムス（ＦＫ５０６）などの免疫抑制剤を用いて、併用免疫抑制療法が一般に投与され得る。
【０２２４】
投与される細胞の量は、処置されている対象によって変わる。好ましい実施形態において、投与される細胞の量は、１０２〜１０１０個の間もしくは１０２〜１０９個の間、または１０３〜１０１０個の間もしくは１０３〜１０９個の間、または１０４〜１０１０個の間もしくは１０４〜１０９個の間、例えば、１０４〜１０８個の間、または１０５〜１０７個の間であり、例えば、約１×１０５、約５×１０５、約１×１０６、約５×１０６、約１×１０７、約５×１０７、約１×１０８、約５×１０８、約１×１０９、約２×１０９、約３×１０９、約４×１０９、約５×１０９、約６×１０９、約７×１０９、約８×１０９、約９×１０９または約１×１０１０個の細胞が、ヒト対象に投与され得る。さらなる複数の実施形態において、ｋｇ体重あたり１０６〜１０８個の間の細胞またはｋｇ体重あたり１×１０７〜９×１０７個の間の細胞、例えば、ｋｇ体重あたり約１×１０７、約２×１０７、約３×１０７、約４×１０７、約５×１０７、約６×１０７、約７×１０７、約８×１０７、約９×１０７または約１×１０８個の細胞が、ヒト対象に投与され得る。例えば、そのような数の細胞またはそのような数のｋｇ体重あたりの細胞は、特に、対象投与される細胞の総数を指し得、その投与は、１日以上にわたって（例えば、１、２、３、４または５日以上にわたって）投与される１以上の用量にわたって好適に分布し得る（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０以上の用量にわたって分布し得る）。しかしながら、治療上有効な量の正確な決定は、患者のサイズ、年齢、組織損傷のサイズ、および損傷が生じてからの期間を含む、各患者に個別の因子に基づき得、本開示および当技術分野における知識から当業者により容易に確認することができる。
【０２２５】
好適には、投与される組成物において、細胞は、約１０４／ｍｌ〜約１０９／ｍｌの間、好ましくは、約１０５／ｍｌ〜約１０８／ｍｌの間、さらにより好ましくは、約１×１０６／ｍｌ〜約１×１０８／ｍｌの間、さらにより好ましくは、約１×１０７／ｍｌ〜約１×１０８／ｍｌ、例えば、約７．５×１０７／ｍｌの濃度で存在し得る。本明細書で教示するのＭＳＣ由来細胞の低減した細胞サイズは、調節可能なおよび／または高い細胞濃度を可能とする。従って、組成物が液体組成物である場合、ＭＳＣ由来細胞の移植を必要とする対象に投与される本明細書で教示する方法により得られたＭＳＣ由来細胞を含んでなる組成物の容量は、他の方法により得られたＭＳＣ由来細胞を含んでなる組成物の容量より小さい。
【０２２６】
従って、本発明の複数の側面および複数の実施形態は、以下の陳述（statements）のいずれか１つおよび総てにおいて示される主題を包含し、本明細書はそれを説明している。
【０２２７】
陳述１：間葉系幹細胞由来細胞を間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から得る方法であって、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなる、方法。
【０２２８】
陳述２：以下の工程：
（ａ）ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を含んでなる培地において、対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを培養する工程；
（ｂ）非接着性物質を除去し、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を含んでなる培地において、接着性細胞をさらに培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得る工程
を含んでなる、陳述１に記載の方法。
【０２２９】
陳述３：ＴＧＦβが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびその混合物からなる群から選択され、好ましくは、ＴＧＦβがＴＧＦβ１である、陳述１または２に記載の方法。
【０２３０】
陳述４：移植特性が改善されたＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、前記方法はサイズ縮小工程を含んでなり、前記サイズ縮小工程は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを特徴とする、方法。
【０２３１】
陳述５：ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の濃度が、少なくとも０．０５ＩＵ／ｍｌ、好ましくは約０．１ＩＵ／ｍｌである、陳述１〜４のいずれか一つに記載の方法。
【０２３２】
陳述６：ヘパリンまたはヘパリン誘導体もしくは類似体が、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）；エノキサパリン、ダルテパリン、ナドロパリン、チンザパリン、セルトパリン、レビパリン、アルデパリン、パルナパリン、ベミパリンなどの低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、またはその混合物；ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、アカラン硫酸、ケラタン硫酸などのヘパリノイド、またはダナパロイドなどのその混合物；ヘパリン塩；ヘパリノイド塩；ヘパリン断片；ヘパリノイド断片；およびその混合物からなる群から選択される、陳述１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【０２３３】
陳述７：懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径が、２５μｍ未満、例えば２４μｍ未満、例えば２０μｍ〜２５μｍの間である、陳述１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【０２３４】
陳述８：懸濁液中の各ＭＳＣ由来細胞の直径が、３５μｍ未満である、陳述１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【０２３５】
陳述９：懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ６０≦２５μｍ）を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する、陳述１〜８のいずれか一つに記載の方法。
【０２３６】
陳述１０：ＭＳＣ由来細胞が、骨軟骨芽細胞系統である、陳述１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【０２３７】
陳述１１：ＭＳＣ由来細胞が、骨芽細胞または軟骨芽細胞系統、好ましくは、骨芽細胞系統である、陳述１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【０２３８】
陳述１２：ＭＳＣが、血漿、血清またはその代替物の１以上、例えば、培地に付加的に含まれる血漿、血清またはその代替物の１以上とさらに接触する、陳述１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【０２３９】
陳述１３：ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなり、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径は、２５μｍ未満、例えば２４μｍ未満、例えば２０μｍ〜２５μｍの間である、方法。
【０２４０】
陳述１４：懸濁液中の各ＭＳＣ由来細胞の直径が、３５μｍ未満である、陳述１３に記載の方法。
【０２４１】
陳述１５：ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなり、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ６０≦２５μｍ）を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する、方法。
【０２４２】
陳述１６：ＭＳＣが、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触する、陳述１３〜１５のいずれか一つに記載の方法。
【０２４３】
陳述１７：ＴＧＦβが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびその混合物からなる群から選択され、好ましくは、ＴＧＦβがＴＧＦβ１である、陳述１３〜１６のいずれか一つに記載の方法。
【０２４４】
陳述１８：懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の平均直径が、２５μｍ未満、例えば２４μｍ未満、例えば２０μｍ〜２５μｍの間である、ＭＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖により得ることができるＭＳＣ由来細胞の集団。
【０２４５】
陳述１９：懸濁液中の各ＭＳＣ由来細胞の直径が、３５μｍ未満である、陳述１８に記載のＭＳＣ由来細胞の集団。
【０２４６】
陳述２０：懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ６０≦２５μｍ）を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する、ＭＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖により得ることができるＭＳＣ由来細胞の集団。
【０２４７】
陳述２１：ＭＳＣ由来細胞が、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなる方法により得ることができる、陳述１８〜２０のいずれか一つに記載のＭＳＣ由来細胞の集団。
【０２４８】
陳述２２：ＭＳＣが、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触する、陳述２１に記載のＭＳＣ由来細胞の集団。
【０２４９】
陳述２３：ＭＳＣ由来細胞が、骨軟骨芽細胞系統である、陳述１８〜２２のいずれか一つに記載のＭＳＣ由来細胞の集団。
【０２５０】
陳述２４：ＭＳＣ由来細胞が、骨芽細胞または軟骨芽細胞系統、好ましくは、骨芽細胞系統である、陳述１８〜２３のいずれか一つに記載のＭＳＣ由来細胞の集団。
【０２５１】
陳述２５：ＭＳＣが、血漿、血清またはその代替物１以上とさらに接触する、陳述１８〜２４のいずれか一つに記載のＭＳＣ由来細胞の集団。
【０２５２】
陳述２６：ＴＧＦβが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびその混合物からなる群から選択され、好ましくは、ＴＧＦβがＴＧＦβ１である、陳述１８〜２５のいずれか一つに記載のＭＳＣ由来細胞の集団。
【０２５３】
陳述２７：骨軟骨芽細胞系統の実質的に総てのＭＳＣ由来細胞が、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ６３およびＣＤ１６６に対して陽性であり；骨軟骨芽細胞系統の実質的に総てのＭＳＣ由来細胞が、ＣＤ４５、ＣＤ１４およびＣＤ１９に対して陰性であり；骨軟骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の少なくとも７０％が、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に対して陽性であり；骨軟骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の１０％未満が、ＨＬＡ−ＤＲに対して陽性である、陳述２３〜２７のいずれか一つに記載の骨軟骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の集団。
【０２５４】
陳述２８：陳述１８〜２７のいずれか一つに定義されるＭＳＣ由来細胞の集団を含んでなる、医薬組成物。
【０２５５】
陳述２９：医薬としての使用のための、陳述１８〜２７のいずれか一つに記載のＭＳＣ由来細胞の集団または陳述２８に記載の医薬組成物。
【０２５６】
陳述３０：ＭＳＣ由来細胞の集団が、約１×１０７／ｍｌ〜約１×１０８／ｍｌの間の濃度で、好ましくは、７．５×１０７個／ｍｌの濃度で存在する、陳述２９に記載の使用のためのＭＳＣ由来細胞の集団。
【０２５７】
陳述３１：ＭＳＣ由来細胞の移植を必要とする対象の処置における使用のための、陳述１８〜２７のいずれか一つに記載のＭＳＣ由来細胞の集団または陳述２８に記載の医薬組成物。
【０２５８】
陳述３２：ＭＳＣ由来細胞の集団または医薬組成物が、経皮または血管内投与に好適である、陳述２９〜３１のいずれか一つに記載の使用のためのＭＳＣ由来細胞の集団。
【０２５９】
その特定の複数の実施形態について本発明を説明したが、多くの代替、改変、および変形が、先の記載を踏まえて当業者には明らかであることは明白である。従って、添付の特許請求の範囲の趣旨および広範な範囲において、以下の通り総てのそのような代替、改変、および変形を包含するものとする。
【０２６０】
上記の複数の側面および複数の実施形態は、以下の限定されない例によりさらに支持される。
【実施例】
【０２６１】
実施例１：小サイズのＭＳＣ由来骨形成細胞を得る方法
１．実験手順
１．１  ヒト骨髄の回収およびヒトＢＭ−ＭＳＣ培養物
２０〜６０ｍｌのヒト骨髄（ＢＭ）吸引液を、８名の健常者ドナーの腸骨稜から得た。回収後、骨髄白血球を数え、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを含有する従来の培養培地において５０，０００個／ｃｍ２の密度で播種し、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下にて３７℃でインキュベートした。２４時間後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｌｏｎｚａ  ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標））ですすぐことにより、非接着性細胞を除去し、新鮮培地を加えた。培養培地は、２〜３日毎に交換した。８０％の細胞集密度が達成されるまで、接着性細胞のコロニーを培養した。次に、細胞をトリプシン−ＥＤＴＡ（ＴｒｙｐＺｅａｎ（登録商標）ＥＤＴＡ、Ｌｏｎｚａ  ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標））で剥離した。ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）により、トリプシン活性を中和した。細胞を数え、さらなる培養のために再播種した。８０％の細胞集密度が達成されるまで、培養培地を２〜３日毎に交換した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、上記のように剥離した。
【０２６２】
１．２  ＭＳＣ由来骨形成細胞ならびに細胞培養および血漿調製
上記のように、２０〜６０ｍｌのヘパリン化骨髄（ＢＭ）を、８名のヒト健常者の腸骨稜から得た。回収後、骨髄を一定の白血球密度（５００００個／ｃｍ２）で培養フラスコに播種し、以下のいずれかにおいて培養した。
−  ＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂを得るため：５％ｖ／ｖ溶媒／洗浄剤処理（Ｓ／Ｄ）血漿（Ｏｃｔａｐｌａｓ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ  ＡＧ、ヒト起源）、０．１ＩＵ／ｍｌヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ  ＬＥＯ、ＬＥＯ  Ｐｈａｒｍａ  ＳＡ、ベルギー、ロットＡ１７６０５）、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ１）を添加した従来の培養培地；
−  ＭＳＣ由来骨形成細胞Ｚを得るため：５％ｖ／ｖ溶媒／洗浄剤処理（Ｓ／Ｄ）血漿（Ｏｃｔａｐｌａｓ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ  ＡＧ、ヒト起源）および塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）を添加した従来の培養培地；または
−  ＭＳＣ由来骨形成細胞Ａを得るため：５％ｖ／ｖ溶媒／洗浄剤処理（Ｓ／Ｄ）血漿（Ｏｃｔａｐｌａｓ（登録商標）、Ｏｃｔａｐｈａｒｍａ  ＡＧ、ヒト起源）、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ１）を添加した従来の培養培地。
【０２６３】
細胞を、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下にて３７℃で培養した。最初の培地交換の前に、ＭＳＣを接着させた。培地は、３または４日毎に交換した。初代培養の最後に、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を用いて、３７℃で１〜５分間細胞を剥離し、細胞を数え、同じ培地において培養フラスコ中で二次培養のために再播種した。二次培養の最後に、ＭＳＣ由来骨形成細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄した。
【０２６４】
１．３  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞キャラクタリゼーション
１．３．１．細胞の計数および生存率
トリパンブルー排除アッセイを用いて、細胞密度および生存率を決定した。回収後、細胞をトリパンブルー（０．４％、Ｌｏｎｚａ  ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標））で１：２に希釈し、細胞生存率をビルケルチャンバー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））および倒立顕微鏡（ＡＥ３１、Ｍｏｔｉｃ（登録商標））を用いて分析した。細胞生存率はまた、アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（商標）およびＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウエア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（登録商標））を用いたフローサイトメトリーによっても分析した。回収後、２．５μｌの７−ＡＡＤとともにＰＢＳ−１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｌｏｎｚａ  ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ（登録商標））中で、室温にて１０分間暗所において５０，０００個の細胞をインキュベートした。
【０２６５】
１．３．２  マーカーの発現
１．３．２．１  フローサイトメトリー分析
上記の１．１項に記載の、二次培養後に得られたＭＳＣ由来骨形成細胞を回収し、細胞表面マーカーをフローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（商標）およびＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウエア；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、米国）により分析した。細胞を、以下の抱合モノクローナル抗体：抗ＣＤ７３、抗ＣＤ９０、抗ＣＤ１０５および抗ＣＤ１６６（これらは間葉系マーカーであり、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞により高度に発現するはずである）、抗ＣＤ３、抗ＣＤ３４および抗ＣＤ４５（これらは造血マーカーであり、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞を実質的に欠いているはずである）、抗ＣＤ４４、抗ＣＤ５１／６１、抗ＣＤ４９ａ−ｅ、抗ＣＤ２９（これらは接着マーカーである）、抗ＣＤ４０、抗ＣＤ８６および抗ＨＬＡ−ＤＲ（これらは免疫原性マーカーである）、ならびに抗アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）で、室温にて１５分間インキュベートし、次に、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、遠心分離し、０．３ｍｌ  ＰＢＳに再懸濁させた。
【０２６６】
細胞表面マーカーＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＣＤ１０およびＣＤ４４のキャラクタリゼーションのために、ＰＢＳ−１％ＢＳＡ中１×１０６個／ｍｌの濃度の５００００個の細胞を、５μｌの抗体で暗所にて１０分間インキュベートした。このインキュベーション時間の後、細胞をＰＢＳで１回洗浄した。細胞外染色に用いた異なる抗体は、ＣＤ１０５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６２４０８）、ＣＤ７３（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５６０８４７）に対するアロフィコシアニン（ＡＰＣ）抱合抗体、ＣＤ１０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５５３７５）、ＣＤ４４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：５５０９８９）に対するフィコエリトリン（ＰＥ）抱合抗体である。非特異的染色は、ＦＩＴＣ、ＡＰＣおよびＰＥ（総てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、カタログ番号：それぞれ５５６６４９；５５５７５１；５５６６５０）と抱合した免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）対照で細胞をインキュベートすることにより、決定した。分析の前に、一重項および目的の集団のゲーティングを行った。ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））およびＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ（登録商標）８．０ソフトウエア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標））を用いて、ゲーティングした集団の１００００イベントに対して、フローサイトメトリー分析を行った。分析に用いた設定パラメーターは、ビーズ（ＢＤ  ＣｏｍｐＢｅａｄｓ  Ｐｌｕｓ（登録商標）、カタログ番号５６０４９７）で自動的に行った。各抱合体に対して、陽性カットオフを対照アイソタイプ抗体の陽性の１％に固定し、各マーカーの陽性を決定した。全分析集団の蛍光強度（ＭＦＩ）の中央値も決定し、それを、対応するアイソタイプ対照抗体のＭＦＩで割り、正規化ＭＦＩ（ｎＭＦＩ）を得た。
【０２６７】
【表１】
2020537539.tif 000002
【０２６８】
１．３．２．２．ＡＬＰ染色
細胞を、それらのそれぞれの培養培地において６０．０００個／ｃｍ２で製造方法の最後に播種し、加湿インキュベーター（３７℃−５％ＣＯ２）に入れる。２４時間後に、ＡＬＰ染色を接着性細胞に対して実施する。細胞を、クエン酸緩衝アセトンで固定し、４％ｖ／ｖナフトールＡＳ−ＭＸリン酸アルカリ（Ｓｉｇｍａ；参照番号：８５５）から構成されるＡＬＰ染色溶液および９６％ｖ／ｖファストブルーＲＲ塩溶液（Ｓｉｇｍａ；参照番号：ＦＢＳ２５）で、暗所にて３０分間インキュベートする。
【０２６９】
１．３．２．３．ＡＬＰ酵素活性測定
ＡＬＰ酵素活性を、ｐ−ニトロフェニルリン酸（ｐＮＰＰ）の加水分解に基づいた生化学的アッセイにより測定した。ＡＬＰにより脱リン酸化した後、ｐＮＰＰは黄色となり、４１０ｎｍで分光光度計により検出することができる。細胞のＡＬＰ酵素活性は、精製仔ウシ腸アルカリホスファターゼ活性に基づいた標準曲線を基準にして決定する。ＡＬＰ活性は、ＡＬＰ／ｍｇタンパク質の単位で報告される。１単位のＡＬＰは、３７℃で１分間中に１μｍｏｌのｐＮＰＰを加水分解する。
【０２７０】
１．３．３．逆転写定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ｑＰＣＲ）
回収後、ＲＮＡ抽出まで、細胞を乾燥ペレット（５００，０００個の細胞）として−８０℃で保存した。製造業者の説明書に従って、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ（登録商標））を用いて、全ＲＮＡを抽出した。ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ（登録商標）１６（Ｔｒｉｎｅａｎ（登録商標））を用いて、ＲＮＡ濃度を測定した。製造業者の説明書に従って、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ試薬キット（Ｔａｋａｒａ（登録商標））を用いて、１μｇの全ＲＮＡ抽出物からＲＴを行った。製造業者の説明書に従って、２μｌのｃＤＮＡから、Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（登録商標）（Ｔａｋａｒａ（登録商標））を用いて、ｑＰＣＲを行った。以下の目的の遺伝子の発現レベルを定量化した：
ＲＵＮＸ２（フォワード：ＧＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＧＴＡＧＣＴＧＡＧ（配列番号１）、リバース：ＡＧＡＣＡＣＣＡＡＡＣＴＣＣＡＣＡＧＣＣ（配列番号２））、ＳＯＸ９（Ｆ：ＴＡＡＡＧＧＣＡＡＣＴＣＧＴＡＣＣＣＡＡ（配列番号３）、Ｒ：ＡＴＴＣＴＣＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＣＡＣＧ（配列番号４）、ＢＭＰ２（Ｆ：ＧＧＡＡＣＧＧＡＣＡＴＴＣＧＧＴＣＣＴＴ（配列番号５）、Ｒ：ＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＧＡＣＣＴＴＴＡＧＧＡ（配列番号６））、ＡＬＰＬ（Ｆ：ＡＣＣＡＴＴＣＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＡＣＡＴＴＴＧ（配列番号７）、Ｒ：ＡＧＡＣＡＴＴＣＴＣＴＣＧＴＴＣＡＣＣＧＣＣ（配列番号８））、ＭＭＰ１３（Ｆ：ＴＧＧＡＡＴＴＡＡＧＧＡＧＣＡＴＧＧＣＧＡ（配列番号９）、Ｒ：ＡＡＣＴＣＡＴＧＣＧＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧ（配列番号１０））、ＣＨＩ３Ｌ１（Ｆ：ＴＧＧＧＴＣＴＣＡＡＡＧＡＴＴＴＴＣＣＡＡＧＡ（配列番号１１）、Ｒ：ＧＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＴＣＣＧＴＣＣＡ（配列番号１２））、ＤＣＮ（Ｆ：ＡＡＡＡＴＧＣＣＣＡＡＡＡＣＴＣＴＴＣＡＧＧ（配列番号１３）、Ｒ：ＧＣＣＣＣＡＴＴＴＴＣＡＡＴＴＣＣＴＧＡＧ（配列番号１４））、ＯＣＮ（Ｆ：ＡＡＧＧＴＧＣＡＧＣＣＴＴＴＧＴＧＴ（配列番号１５）、Ｒ：ＧＣＴＣＣＣＡＧＣＣＡＴＴＧＡＴＡＣＡＧ（配列番号１６））、ＳＰＯＮ１（Ｆ：ＣＣＴＧＣＧＧＡＡＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡ（配列番号１７）、Ｒ：ＣＡＣＧＧＧＴＧＡＧＣＣＣＡＡＴＴＣＴ（配列番号１８））、ＰＯＳＴＮ（Ｆ：ＴＴＴＧＧＧＣＡＣＣＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴ（配列番号１９）、Ｒ：ＴＴＣＴＣＡＴＡＴＡＡＣＣＡＧＧＧＣＡＡＣＡ（配列番号２０））。
ｑＰＣＲは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））を用いて、繰り返して実施した。３つのハウスキーピング遺伝子：
ＲＰＬ１３Ａ（Ｆ：ＣＡＴＡＧＧＡＡＧＣＴＧＧＧＡＧＣＡＡＧ（配列番号２１）、Ｒ：ＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＴＧ（配列番号２２））、ＴＢＰ（Ｆ：ＡＡＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＴＡ（配列番号２３）、Ｒ：ＧＣＣＡＴＡＡＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＧＡＣ（配列番号２４））、ＨＰＲＴ（Ｆ：ＣＣＣＴＧＧＣＧＴＣＧＴＧＡＴＴＡＧＴ（配列番号２５）、Ｒ：ＧＴＧＡＴＧＧＣＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴ（配列番号２６））
から得られた幾何平均を用いて、正規化を行った。目的の各遺伝子に対して２−ΔΔＣｔ法を用いて、遺伝子発現（倍率変化）を算出することにより、同じドナーからの異なるＭＳＣ由来細胞製品間の比較を行った（Schmittgen and Livak, 2008, 3(6), 1101-8; Nature Protocols, 3(6), 1101−1108）。
【０２７１】
統計解析は、ＪＭＰ（登録商標）（１３．１．０）ソフトウエアを用いて行った。倍率変化で表されたＲＴ−ｑＰＣＲデータを対数変換し、スチューデント検定（α＝０．０５で）を行い、細胞型間で認められた差の統計的有意性を評価した。
【０２７２】
得られたｐ値（ｐ）に応じて、統計的有意性を図示した：＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す。
【０２７３】
１．３．４．マルチプレックスアッセイ
回収後、細胞を５０，０００個／ｃｍ２の密度で播種した。５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下における３７℃でのインキュベーションの４８時間後、細胞培養上清を回収し、遠心分離し（室温にて１５００ｒｐｍで５分間）、−８０℃で保存した。Ｈｕｍａｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））を用いたＬｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイにより、上清を分析した。プレミックスマルチプレックスは、注文製であった（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））。以下の分泌因子を検討した：ＢＭＰ−２、ＣＯＬ１Ａ１、ＭＭＰ１３、ＯＰＮ、ＯＰＧ、ＳＰＡＲＣ、ＲＡＮＫＬ、ＣＨＩ３Ｌ１。アッセイは、製造業者の説明書に従って行い、分析は、ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標））およびＢｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｍａｎａｇｅｒ５．０ＴＭソフトウエア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標））を用いて行った。
【０２７４】
１．４  細胞サイズの測定
上記の１．１項に記載の、二次培養後に得られたＭＳＣ由来骨形成細胞を回収し、１２．５×１０６個／ｍｌの細胞密度で、０．４％トリパンブルーとともにＰＢＳ中に懸濁させた。１０μｌの細胞懸濁液を目盛り付きスライド（Ｍｏｔｉｃ（登録商標））に載せた後、カバーガラスで保護し、倍率４０倍の倒立顕微鏡（ＡＥ３１；Ｍｏｔｉｃ）下に置いた。細胞直径を測定するために、顕微鏡に置かれたカメラ（Ｍｏｔｉｃａｍ）で撮影された画像を、Ｍｏｔｉｃ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｌｕｓ２．０２ソフトウエアにより解析した。解析を統計的に有意とみなすために、少なくとも１００個の細胞を測定した。
【０２７５】
ｅｘ  ｖｉｖｏ培養の異なる時点で得られたＭＳＣ由来骨形成細胞のサイズも、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏ  ＩＩ（商標）およびＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａ（商標）ソフトウエア；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＳＡ）により分析した。簡単に述べれば、１．１項に記載のｅｘ  ｖｉｖｏ細胞培養の開始後２１、２３、２６および２８日目に、細胞を回収し、１．１０６個／ｍｌの細胞密度でリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させ、前方散乱（ＦＳＣ）測定（相対蛍光単位で表す）のためにフローサイトメーターで分析した。前方散乱は、レーザーパスの方向の散乱光を測定し、従って、フローチャンバーを通過する細胞に対して相対サイズを与える。
【０２７６】
２．結果
２．１  細胞マーカー発現プロファイル
フローサイトメトリー分析では、骨形成細胞Ａ（ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ−１で産生）ならびに骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生；本発明の実施形態）の細胞表面マーカー発現プロファイルに基づいた細胞同一性は、同等であることが明らかにされた。
【０２７７】
骨形成細胞ＡおよびＢ両方の集団は、間葉系マーカーＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ６３、ＣＤ１６６を発現し、造血マーカーＣＤ４５、ＣＤ３４およびＣＤ３を発現しない（細胞集団の５％未満が、これらのマーカーを発現した）（表２および３）。骨形成細胞Ｂは、（ｉ）低レベルのＨＬＡ−ＤＲなどのＭＨＣクラスＩＩ細胞表面受容体を発現し続け、（ｉｉ）ＡＬＰを高度に発現した。ＨＬＡ−ＤＲの弱発現により示される弱免疫原性は、有利には、例えば、同種対象に対する細胞移植を可能にする（表５）。さらに、骨形成細胞Ａおよび骨形成細胞Ｂは、未分化ＭＳＣと比較して、それらの表面に接着マーカーＣＤ４９ｅ、ＣＤ４４および酵素ＡＬＰを高度に発現した（表３および４）。この最後のマーカー（ＡＬＰ）の高発現は、骨形成細胞の骨芽細胞系統に向かう関与を強調している。さらに、ＡＬＰの高発現は、骨形成細胞Ｂの骨芽細胞系統に向かう関与（未分化ＭＳＣと比較して）を証明している。表６はまた、ＡＬＰ発現は、ヘパリンの非存在下で培養された細胞（骨形成細胞Ａ）よりも、ヘパリンの存在下で培養された細胞（骨形成細胞Ｂ）に対して高かったことを示す。
【０２７８】
【表２】
2020537539.tif 000003
【０２７９】
【表３】
2020537539.tif 000004
【０２８０】
【表４】
2020537539.tif 000005
【０２８１】
【表５】
2020537539.tif 000006
【０２８２】
【表６】
2020537539.tif 000007
【０２８３】
細胞表面マーカー発現プロファイルは、細胞表面上のマーカーの存在（集団陽性パーセンテージ）によってのみならず、異なるマーカーの細胞表面上に発現したマーカーの量を分析すること（蛍光の集団正規化中央値）によっても特徴付けられた。これらの分析は、異なるＭＳＣ由来骨形成細胞間のいくつかの差を強調するものであった。
【０２８４】
ヘパリンの存在下で培養された骨形成細胞Ｂは、ヘパリンの非存在下で培養されたＭＳＣおよび骨形成細胞Ａよりも高いレベルのＡＬＰを発現し（表７、ＡＬＰ−ＰＥ  ｎＭＦＩの結果）、このことにより、骨形成細胞の骨芽細胞系統に向かう関与が確認された。
【０２８５】
細胞表面での間葉系マーカーＣＤ７３およびＣＤ１０５の発現も、細胞型に依存する。ヘパリンの存在下で産生された骨形成細胞（骨形成細胞Ｂ）は、骨形成細胞Ａよりも高いレベルのＣＤ７３およびＣＤ１０５を発現した（表７）。
【０２８６】
【表７】
2020537539.tif 000008
【０２８７】
２．２  ＲＴ−ｑＰＣＲおよびマルチプレックスアッセイ
分析では、骨軟骨芽細胞マーカーをコードする遺伝子ＲＵＮＸ２、ＳＯＸ９、ＺＮＦ５２１、ＡＬＰＬ、ＢＭＰ２、ＯＰＧ、ＰＯＳＴＮ、ＣＨＩ３Ｌ１、ＭＭＰ１３、ＣＡＤＭ１、ＣＸ４３、ＣＤ１０、ＷＩＳＰ１ならびに骨および軟骨基質タンパク質をコードする遺伝子ＤＣＮ、ＳＰＯＮ１は、ＭＳＣと比較して、骨形成細胞ＡおよびＢにおいて有意に過剰発現したことが明らかにされた（表８）。一貫して、骨軟骨形成阻害物質をコードするＤＫＫ１の遺伝子発現は、ＭＳＣと比較して、骨形成細胞ＡおよびＢにおいて有意にダウンレギュレートした（表８）。
【０２８８】
増殖マーカーをコードする遺伝子ＫＩ６７およびＰＣＮＡの発現は、ＭＳＣと比較して、骨形成細胞ＡおよびＢの両方において有意にダウンレギュレートし、アポトーシス関連マーカーＢＣＬ２およびＢＡＸの遺伝子発現は、全細胞型において同等であった（表８）。
【０２８９】
骨形成細胞Ａと比較した場合、骨形成細胞Ｂは（得られたｐ値（ｐ）に応じて、統計的有意性を図示した：＊はｐ＜０．０５を表し、＊＊はｐ＜０．０１を表し、＊＊＊はｐ＜０．００１を表す）：
−  高いレベルの（脂肪生成に関与するタンパク質をコードする）遺伝子ＰＰＡＲＧ（＊＊＊）を発現し；
−  高いレベルの（骨軟骨芽細胞タンパク質をコードする）遺伝子ＣＤ７３（＊＊＊）、ＢＭＰ２（＊＊＊）を発現し；
−  低いレベルの（骨軟骨芽細胞タンパク質をコードする）遺伝子ＣＯＬ１Ａ１（＊＊＊）、ＢＧＮ（＊＊＊）、ＳＰＡＲＣ（＊＊＊）、ＡＬＰＬ（＊）、ＢＣＬ２（＊＊＊）を発現した。
【０２９０】
骨形成細胞Ａと比較して骨形成細胞Ｂにおいて過剰発現した遺伝子に関しては、ＰＰＡＲＧ、ＭＭＰ１３、ＢＭＰ２も、ＭＳＣと比較して骨形成細胞Ｂにおいて有意に過剰発現したが、一方、発現は、骨形成細胞ＢおよびＭＳＣにおいて同じ発現レベルを示した。
【０２９１】
骨形成細胞Ａと比較して骨形成細胞Ｂにおいてダウンレギュレートした遺伝子（すなわち、ＣＯＬ１Ａ１、ＢＧＮ、ＳＰＡＲＣ、ＢＣＬ２）に関しては、ＭＳＣと比較して骨形成細胞Ｂにおいて依然として過剰発現していたＡＬＰＬを除き、それらの総てが、ＭＳＣと比較して骨形成細胞Ｂにおいて同じ発現レベルを示した。
【０２９２】
【表８】
2020537539.tif 000009
2020537539.tif 000010
2020537539.tif 000011
【０２９３】
細胞分泌分析は、骨形成細胞Ｂは、骨形成細胞ＡおよびＭＳＣよりも、高い量の骨軟骨形成に関与するタンパク質ＣＨＩ３Ｌ１およびＭＭＰ１３を分泌し（表９）、骨形成細胞ＡおよびＭＳＣよりも、低い量の骨形成の阻害に関与するＤＫＫ１を分泌したことを示した。分泌されたＣＯＬ１Ａ１の量に関して、細胞型間に有意差は認められなかった（表９）。
【０２９４】
【表９】
2020537539.tif 000012
【０２９５】
２．３  細胞サイズ
（ｉ）Ｍｏｔｉｃ  Ｉｍａｇｅ  Ｐｌｕｓ２．０／３．０ソフトウエアおよび（ｉｉ）フローサイトメトリーＦＳＣ分析を用いた細胞サイズの測定では、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生されたＭＳＣ由来骨形成細胞（骨形成細胞Ｂ）は、ヘパリンを用いずにＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１で産生されたＭＳＣ由来骨形成細胞（例えば、骨形成細胞Ａ）より小さくかつより均一であることを確認した（表１０および１１、図１および１１）。
【０２９６】
非常に興味深いことに、大多数の骨形成細胞Ｂ（７０％以上）は、直径２５μｍを超えておらず、それらの５％以下が、直径３５μｍを超えている（表８および９）。対照的に、ヘパリンの供給なしに得られた骨形成細胞集団（骨形成細胞Ａ）は、直径２５μｍを超えない細胞を２０％しか含まず、直径３５μｍを超える細胞を４１％含む（図１および表１０）。実施例３においてさらに詳述するように、そのような大きな直径の細胞は、対象への移植時に有害になり得る。
【０２９７】
【表１０】
2020537539.tif 000013
【０２９８】
【表１１】
2020537539.tif 000014
【０２９９】
【表１２】
2020537539.tif 000015
【０３００】
【表１３】
2020537539.tif 000016
【０３０１】
フローサイトメトリーＦＳＣ実験を用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養の異なる時点における、従って、異なる細胞コンフルエンス、すなわち、４５％、７０％、９０％および１００％の集密度における、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生された骨形成細胞Ｂの相対平均細胞サイズを評価した。表１４は、骨形成細胞Ｂの細胞サイズは安定であり、細胞培養コンフルエンスとともに最終的に増加することを示す。すなわち、表１４は、よりコンフルエントな細胞フラスコからの骨形成細胞Ｂの平均サイズは、低いコンフルエントの培養フラスコからのものよりも大きいことを示す。フローサイトメトリーＦＳＣ実験は、異なるサンプルの平均細胞サイズを比較できるが、平均細胞サイズの絶対値に関する情報は与えないことに留意されたい。
【０３０２】
【表１４】
2020537539.tif 000017
【０３０３】
実施例２：実施例１のＭＳＣ由来細胞を調製する方法の特異性
１．実験手順
１．１  細胞培養および血漿調製
細胞培養および血漿調製を、実施例１に記載の通りに実施した。
【０３０４】
ヘパリンとその類似体との比較に関する実験のために、従来の培養培地に、（ｉ）５％ｖ／ｖ  Ｓ／Ｄ血漿；（ｉｉ）塩基性ＦＧＦ−２；（ｉｉｉ）ＴＧＦβ１；および（ｉｖ）０．１ＩＵ／ｍｌの未分画ヘパリン（ＵＦＨ）、ダルテパリン、ヘパラン硫酸、またはダナパロイドを添加した。
【０３０５】
ヘパリンと他の抗凝固剤との比較に関する実験のために、従来の培養培地に、（ｉ）５％ｖ／ｖ  Ｓ／Ｄ血漿；（ｉｉ）塩基性ＦＧＦ−２；（ｉｉｉ）ＴＧＦβ；および（ｉｖ）１ＩＵ／ｍｌヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ  ＬＥＯ、ＬＥＯ  Ｐｈａｒｍａ  ＳＡ、ベルギー、ロットＡ１７６０５）、１００ＩＵ／ｍｌヘパリン、２ｍｇ／ｍｌのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）または０．１ｍｇ／ｍｌＡｃｔｉｌｙｓｅ（登録商標）を添加した。
【０３０６】
Ｓ／Ｄ血漿と血清との比較に関する実験のために、従来の培養培地に、（ｉ）５％ｖ／ｖ  Ｓ／Ｄ血漿または５％血清；（ｉｉ）塩基性ＦＧＦ−２；（ｉｉｉ）ＴＧＦβ；および（ｉｖ）０．１ＩＵ／ｍｌのヘパリンを添加した。
【０３０７】
Ｓ／Ｄ血漿または血清の存在または非存在の比較に関する実験のために、従来の培養培地に、（ｉ）５％ｖ／ｖ  Ｓ／Ｄ血漿、５％ｖ／ｖ血清、または０％Ｓ／Ｄ血漿および０％血清；（ｉｉ）塩基性ＦＧＦ−２；（ｉｉｉ）ＴＧＦβ；および（ｉｖ）０．１ＩＵ／ｍｌのヘパリンを添加した。
【０３０８】
２．結果
２．１  ヘパリン対その類似体
図２および表１５は、培養培地中に存在するヘパリンは、その誘導体（ヘパリノイド化合物）、すなわち、ダルテパリン、ヘパラン硫酸、またはヘパラン硫酸を含むダナパロイドなどのグリコサミノグリカン混合物により置換され得ることを示す。４つのヘパリン誘導体は、細胞生存率およびマーカー発現プロファイルに対して、ヘパリンと同じ効果を有する（表１５）。
【０３０９】
【表１５】
2020537539.tif 000018
【０３１０】
２．２  ヘパリン対他の抗凝固剤
図３は、ヘパリンおよびその誘導体（１ＩＵ／ｍｌまたは１００ＩＵ／ｍｌの濃度）は、ＥＤＴＡ２ｍｇ／ｍｌ（Ｅ８００８、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ロットＲＮＢＢＢ７７９３）、Ａｃｔｉｌｙｓｅ（登録商標）０．１ｍｇ／ｍｌ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ、ロット００１４０８）などの他の抗凝固剤により置換されることはできないことを示す。
【０３１１】
２．３  血漿対血清
図４は、Ｓ／Ｄ血漿は、本発明によるＭＳＣ由来骨形成細胞を産生するために、血清により置換され得ることを示す。本明細書を考慮すると、ヘパリンまたはその類似体は、骨形成細胞Ｂを調製する方法において重要な要素であると思われる。
【０３１２】
実施例３：実施例１の方法により得られたＭＳＣ由来細胞Ｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ石灰化能
１．実験手順
石灰化アッセイでは、細胞を骨形成培地で数週間培養することにより、石灰化基質を生じるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の能力を検討する。石灰化基質は、後に、アリザリンレッドＳ（ＡＲＳ）染色を用いて染色される。
【０３１３】
簡単に述べれば、上記の実験１の１．１項に記載の、二次培養後に得られたＭＳＣ由来骨形成Ｂを回収し、それらがコンフルエンスに達するまで（１〜２日）、４８ウェルプレート中にて６０，０００個／ｃｍ２で、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）およびウェルあたり５％の血清を添加した塩基性培地α−ＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）に播種した。引き続き、培地を、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）、５％の血清、１０−８Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、５０μｇ／ｍｌアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）および５ｍＭβ−グリセロリン酸（Ｓｉｇｍａ）を添加した塩基性培地α−ＭＥＭ（Ｌｏｎｚａ）を含んでなる骨形成培地と交換した。骨形成培地は、３±２日毎に新鮮調製骨形成培地と交換した。
【０３１４】
以下のように、骨形成誘導後２１日目および２８日目に、ＡＲＳ染色を行った：細胞をリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、室温にて１５分間ホルムアルデヒド４％でインキュベートし、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した後、脱塩水で洗浄した。次に、細胞を、室温で１０分間、ｐＨ４．２のＡＲＳ溶液（２０ｇ／Ｌ）に曝露させた。洗浄液が澄明になるまで、細胞を脱塩水で洗浄し、肉眼的および顕微鏡的に観察した。ウェルを、倒立顕微鏡（ＡＥ３１；Ｍｏｔｉｃ）下に置いた。ウェルに沈着したカルシウムの橙赤色染色を評価するために、顕微鏡に置かれたカメラ（Ｍｏｔｉｃａｍ）で撮影された画像を解析した。
【０３１５】
２．結果
肉眼的および顕微鏡的観察では、陽性のＡＲＳ染色が明らかとなり、２１日目〜２８日目にＡＲＳ染色が増加し、従って、カルシウム／リン酸塩の沈着が経時的に増加した（図５）。これらの結果は、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生された骨形成細胞Ｂは、骨基質を合成することができ、カルシウムおよびリン酸塩の沈着により、骨基質を石灰化することを示している。より詳しくは、これらの結果は、骨形成細胞Ｂは、高い骨形成特性を示すことを示している。
【０３１６】
実施例４：実施例１の方法により得られたＭＳＣ由来細胞Ｂのｉｎ  ｖｉｔｒｏ軟骨形成能
１．実験手順
特定の培養条件下で、実施例１の方法により得られたＭＳＣ由来細胞は、軟骨細胞分化を受けることができる。これらの条件には、高い細胞密度および細胞間相互作用が軟骨形成の機序に寄与する、凝集体中の細胞の三次元立体構造が含まれる。簡単に述べれば、上記の実施例１の１．１項に記載の、二次培養後に得られたＭＳＣ由来骨形成細胞Ｂを回収し、軟骨形成分化培地に再懸濁し、２．５×１０５個／ウェルの密度で９６ウェルプレート（非接着性円錐形底部）に入れた。軟骨形成培養培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、１０％ヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、および亜セレン酸ナトリウム（ＩＴＳ）（ＩＴＳ＋１、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した高グルコース（４．５ｇ／ｌ）（ＤＭＥＭ−ＨＧ、Ｌｏｎｚａ）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｌｏｎｚａ）、１０−７Ｍデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ）、１μＭアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）および１０ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１（ＨｕｍａｎＺｙｍｅ）からなる。陰性対照品目は、可溶性分化因子デキサメタゾン、アスコルビン酸およびＴＧＦβ１を含まない軟骨形成培地からなるものであった。次に、マルチウェルプレートを、２００×ｇで５分間遠心分離して、細胞凝集体を形成し、次に、９５％空気および５％ＣＯ２の加湿雰囲気下に３７℃で３週置いた。軟骨形成培養培地は、２または３日毎に交換した。凝集体形成の２４時間後の肉眼的観察では、細胞凝集体が培養培地中で自由に浮遊していることが示された。
【０３１７】
軟骨形成誘導の３週後に、細胞凝集体を回収し、組織学的分析のために処理した：回収した細胞凝集体を３．７％ホルムアルデヒドに固定し、パラフィンワックスに包埋した。パラフィンブロックを５μｍの切片に切り出した。切片は、（ｉ）ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）、（ｉｉ）プロテオグリカンを染色するためのトルイジンブルーおよびサフラニンオレンジ、ならびに（ｉｉｉ）コラーゲン線維を染色するためのシリウスレッドを用いて、染色した。方法は、標準的な脱パラフィン、染色、脱水およびスライドガラスへの積載からなるものであった。染色後の切片を、顕微鏡で定性的に観察した（細胞充実性、細胞の局在および外観、細胞外マトリックスの外観ならびにコラーゲンおよびプロテオグリカンの含量）。
【０３１８】
２．結果
顕微鏡観察所見および凝集体直径の測定値からは、軟骨形成培地で培養された細胞凝集体は、対照培地で培養された細胞凝集体よりも大きなサイズを示したことが示された（資料未記載）。軟骨形成培地におけるこのサイズの増加は、（１）細胞による細胞外マトリックスの産生および蓄積、ならびに／または（２）凝集体における細胞増殖と関連していた可能性がある。
【０３１９】
ヘマトキシリン・エオシンで染色された凝集体切片の定性的観察は、対照と軟骨形成培地との間の細胞形態の差を示した（Ｈ＆Ｅ染色、図６）。実際に、対照培地において「小核」が観察され、細胞質を観察することは困難であった。一方、軟骨形成培地においては、２つの細胞型が観察することができ、すなわち、平らな核を有する細胞（凝集体の周辺）と、周辺から離れるにつれ、円形の核を有する細胞が観察された。軟骨細胞外マトリックスのプロテオグリカンおよびコラーゲンの染色を通じて、軟骨形成分化が確認された。比較すると、対照凝集体は、総ての試験した染色に対して陽性の染色を示していない（トルイジンブルー、サフラニンオレンジおよびシリウスレッド染色、図６）。
【０３２０】
これらの結果は、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生された骨形成細胞Ｂは、軟骨形成培地で培養した場合、コラーゲンおよびプロテオグリカンなどの軟骨特異的分子から主に構成される豊富な細胞外マトリックスを産生できることを示している。
【０３２１】
実施例５：実施例１の方法により得られた骨形成細胞ＡおよびＢのｉｎ  ｖｉｖｏ安全性
１．実験手順
１．１  細胞培養および血漿調製
細胞培養および血漿調製を、実施例１に記載の通りに実施した。
【０３２２】
投与前に、骨形成細胞ＡおよびＢを、生存率、細胞サイズ、同一性（フローサイトメトリー分析による表面抗原の発現、ＡＬＰ酵素活性およびＡＬＰ染色アッセイを含む）ならびに無菌性に関して試験した。
【０３２３】
１．２  マウス毒性試験
１２週齢の雌雄ＮＭＲＩヌードマウスに対し、以下の試験品目：（ｉ）骨形成細胞Ａ（２００μｌの賦形剤中に懸濁された５００万個の細胞）、（ｉｉ）ヘパリン（Ｈｅｐａｒｉｎ  ＬＥＯ  １００ＵＩ／ｍｌ、ＬＥＯ  Ｐｈａｒｍａ  ＳＡ、ロットＡ１７６０５；４単位）ありの骨形成細胞Ａ（２００μｌの賦形剤に懸濁された５００万個の細胞）または（ｉｉｉ）骨形成細胞Ｂ（２００μｌの賦形剤に懸濁された５００万個の細胞）のうち１つを静脈内注射した。対照品目は、２００μｌの賦形剤（単独）からなるものであった。対照および試験品目の投与は、尾側静脈への静脈内注射により、緩徐ボーラスとして行った。注射の時間は、少なくとも６０秒であった。動物あたりの細胞の量および投与容量は、一定であった。
【０３２４】
動物を最大６ヵ月間観察し、とりわけ、以下のいくつかのパラメーターを追跡期間中にモニタリングおよび／または評価した：死亡率および罹病率、動物の体重、臨床観察／理学的検査、血液学的および化学的血液分析、ならびに動物の安楽死後の病理組織学的分析のための臓器回収。
【０３２５】
１．３．  病理組織学的分析
マウス肺を、病理組織学的分析のために回収した。回収したマウス肺を、病理組織学的分析のために処理した：サンプルを脱水し、パラフィンワックスに包埋した。切片を３〜５μｍ厚（横断面）に切り出し、ヘマトキシリン・エオシンで染色した。スライドを上級病理学者に提出し、急性死亡率の原因を判定した。
【０３２６】
２．結果
２．１  急性毒性
毒性試験を実施し、マウスにおける骨形成細胞Ａ（ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１で産生）ならびに小サイズの骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生）の静脈内注射の潜在的な有害作用を評価した。
【０３２７】
表１６に示すように、骨形成細胞Ａ（Ａ−１およびＡ−２）の静脈内投与後に急性死亡率（１０〜３５％）が認められ、細胞懸濁液中の抗凝固剤ヘパリン（４単位）の添加は、そのような死亡率を低減させなかった（ヘパリンありのＡ−３〜Ａ−５）。対照的に、対照品目（賦形剤）および小サイズの骨形成細胞Ｂ（Ｂ−１〜Ｂ−４）の静脈内投与後には、急性毒性は認められなかった。
【０３２８】
【表１６】
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【０３２９】
２．２  病理組織学的検査
安楽死の後、全動物に対して剖検を行った。小サイズの骨形成細胞Ｂを注射されたマウスは、全体的に正常な肺構造を示し、肺胞および細気管支毛細血管の細胞塞栓は認められなかった（図７Ａ）。骨形成細胞Ａを注射されたマウスは、しばしば急性間質性炎症を伴う多数の中サイズの細胞（注射細胞と解釈される）による肺胞および細気管支毛細血管の中等度〜重度の播種性塞栓を特徴とする肺病変を示した（図７Ｂ）：３０％〜５０％の肺胞毛細血管および小〜中サイズの細気管支小動脈が、血管腔の全体を閉塞する細胞の群により、無作為に拡張されていた。閉塞した毛細血管のより大きな群が、それらの近傍で細気管支を圧迫し、肺胞虚脱により囲まれていた。肺胞内および細気管支内微小出血は、細胞群の近傍ではほとんど認められなかった。
【０３３０】
総ての観察された標本の主な特徴は、多数の注射細胞（骨形成細胞Ａ）による肺胞および細気管支毛細血管の中等度〜重度の播種性塞栓であった。これらの細胞の数および閉塞した肺胞毛細血管の数は、肺胞におけるガス交換が著しく妨げられ、呼吸器系の虚脱に至っている可能性を示唆している。この過程が、調べた動物の死の原因である可能性が非常に高い。観察された血管のうっ血および微小出血は、死戦期変化と解釈される。
【０３３１】
心臓、肝臓、腎臓または脾臓において微小血栓の形成は認められなかった。
【０３３２】
実施例６：実施例１の方法により得られた骨形成細胞ＡおよびＢのｉｎ  ｖｉｖｏ骨形成特性
頭蓋冠骨形成モデルは、１２週齢の雌ＮＭＲＩヌードマウスの頭蓋冠上の、１００μｌの賦形剤中に処方された２．５×１０６個の骨形成細胞（または陰性対照として１００μｌの賦形剤単独）の単回皮下投与からなるものであった。特定の時点で、カルシウム結合蛍光色素（すなわち、アリザリンレッド、カルセイングリーン、カルセインブルー、テトラサイクリン）を投与し、新骨形成を標識した。アリザリンレッドは、骨形成細胞投与前に投与したが、一方、カルセイングリーン、カルセインブルーおよびテトラサイクリンは、骨形成細胞投与後に投与した。体重、一般臨床徴候および投与部位の臨床徴候に関して、投与後２週間実験動物をモニタリングした。２週間後、実験動物を安楽死させ、Ｘ線イメージング、組織形態計測（骨形成の定量化）および免疫蛍光により、骨形成細胞の骨形成特性を評価した。
【０３３３】
１．実験手順
１．１  細胞培養および血漿調製
細胞培養および血漿調製を、実施例１に記載の通りに実施した。
【０３３４】
１．２  マウス
９〜１０週齢の雌ＮＭＲＩヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウスをＪａｎｖｉｅｒ  Ｓ．Ａ．Ｓ．（Ｌｅ  Ｇｅｎｅｓｔ−Ｓｔ−Ｉｓｌｅ、フランス）から購入し、飼料および水を自由摂取させる標準条件下で飼育した。合計１９６匹のマウスを本試験に使用した。
【０３３５】
１．３  頭蓋冠骨形成マウスモデル
１２週齢の雌ＮＭＲＩヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（ｎ＝１３７）をイソフルラン（ＩｓｏＦｌｏ（登録商標））で麻酔し、頭蓋冠骨上に、ＭＳＣ、骨形成細胞Ａ（ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１で産生）、または骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生）（マウスあたり１００μｌ中２．５×１０６個）または賦形剤（１００μｌ）の単回皮下投与を行った。骨新形成を経時的に標識するため、カルシウム結合蛍光色素をマウスに逐次的に投与した。アリザリンレッド（赤色）、カルセイン（緑色および青色）ならびにテトラサイクリン（黄色）（総てＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標）から）を、それぞれ細胞投与の３日前および４、８、および１２日後に、腹膜内に注射した。体重、一般臨床徴候および投与部位の臨床徴候に関して、投与後２週間実験動物をモニタリングした。マウスを頸椎脱臼により細胞投与の２週後に安楽死させ、各マウスの頭蓋冠を回収し、組織形態計測（骨形成の定量化）および免疫蛍光により骨形成細胞の骨形成特性を評価した。
【０３３６】
１．４  サンプル包埋および組織切片作成
組織形態計測、ＡＬＰ、ＴＲＡＰ（酒石酸抵抗性酸ホスファターゼ）、マッソントリクロームゴールドナー染色および免疫蛍光のために、頭蓋冠を固定し、穏やかに振り混ぜながら、４℃で、７０％、８０％および９０％エタノールバス中で各１２時間の連続インキュベーションにより脱水し、メタクリル酸ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）プラスチック樹脂（ＨｉｓｔｏＲｅｓｉｎ、Ｌｅｉｃａ（登録商標））に包埋した。４μｍ厚および８μｍ厚の冠状切片を、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ（登録商標）、ＲＭ２２５５）を用いて切り出した。サフラニンオレンジ染色および免疫ペルオキシダーゼのために、頭蓋冠を３．７％ホルムアルデヒドに２４時間固定し、ｐＨ７．４の１０％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）中で３日間脱灰し、パラフィンに包埋した。７μｍ厚の冠状断および矢状断パラフィン切片を、ミクロトーム（Ｌｅｉｃａ（登録商標）、ＲＭ２２５５）を用いて切り出した。
【０３３７】
１．５．免疫蛍光染色
免疫蛍光によるヒトおよびマウスコラーゲンＩの評価を、頭蓋冠の４μｍ厚の冠状断プラスチック組織切片に対して行った。簡単に述べれば、ＰＢＳ１倍／トリトン０．３％の溶液を用いた室温（ＲＴ）で３０分間の透過処理の工程の後、組織切片をブロッキング溶液（すなわち、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ウマ血清／トリトン（商標））中にてＲＴで１時間インキュベートし、非特異的結合部位を飽和させた。次に、組織学的スライドをマウス抗ヒトおよびウサギ抗マウスコラーゲンＩ一次抗体（それぞれＡｂｃａｍ；＃ａｂ１３８４９２およびＡｂｃａｍ；＃ａｂ２１２８６）で４℃にて一晩インキュベートした。ＲＴで５分間のＰＢＳ中でのすすぎの３工程の後、ブロッキング溶液を用いてＲＴで１時間ブロッキングを実現した。次に、ブロッキング溶液に希釈した二次抗体を、遮光してＲＴで２時間加えた。二次抗体Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８  Ｄｏｎｋｅｙ抗ウサギＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、＃Ａ２１２０６）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）Ｃｙ３（登録商標）ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（Ａｂｃａｍ；＃ａｂ９７０３５）を用いて、それぞれマウスコラーゲンＩを緑色で、ヒトコラーゲンＩを赤色で可視化した。次に、スライドをＰＢＳ１倍でＲＴにて５分間３回すすぎ、ＮｕｃＢｌｕｅ（登録商標）溶液でＲＴにて１分間インキュベートし、核を染色した。最後に、スライドをＰＢＳ中で簡単に１回すすぎ、次に、ＧｌｙｃｅｒＧｅｌ（登録商標）試薬を載せた。免疫蛍光の陰性対照として、隣接する組織学的スライドに対して一次抗体の省略を行った。
【０３３８】
１．６  組織学的染色
骨芽細胞および破骨細胞活性を、それぞれＡＬＰおよびＴＲＡＰ酵素活性検出法を用いて、それぞれ頭蓋冠切片上で評価した。ＡＬＰ染色のために、４μｍ厚の頭蓋冠冠状断プラスチック切片を、ファストブルーＲＲ塩（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））およびナフトールＡＳ−ＭＸリン酸アルカリ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））の溶液で、１時間インキュベートした。製造業者の説明書に従って、酸ホスファターゼ白血球（ＴＲＡＰ）キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））を用いて、ＴＲＡＰ染色を８μｍ厚の頭蓋冠冠状断プラスチック切片上で行った。新形成された骨の石灰化の状態を評価するため、製造業者の説明書に従って、キット（Ｂｉｏ−Ｏｐｔｉｃａ（登録商標））を用いて、ＡＬＰで染色された頭蓋冠切片上でマッソントリクロームゴールドナー染色を行った。軟骨形成を証明するため、７μｍ厚の頭蓋冠矢状断パラフィン切片上でサフラニンオレンジ染色を行った。簡単に述べれば、脱パラフィン後、組織切片を、ワイゲルトヘマトキシリン（Ｋｌｉｎｉｐａｔｈ（登録商標））中で１０分間、０．１％ファストグリーン（Ｋｌｉｎｉｐａｔｈ（登録商標））中で５分間、１％酢酸（ＶＷＲ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）中で１５分間および０．１％サフラニンオレンジ（Ｆｌｕｋａ（登録商標）参照番号：８４１２０）中で５分間、順次インキュベートした。脱水後、スライドに、Ｐｅｒｔｅｘ（登録商標）（ＨｉｓｔｏＬａｂ（登録商標））を用いてガラス製カバーガラスを載せた。光学顕微鏡（Ｌｅｉｃａ（登録商標））およびＬｅｉｃａ（登録商標）ＬＡＳ  ＥＺソフトウエアを用いて、デジタル画像を撮影した。
【０３３９】
１．７  免疫ペルオキシダーゼ
脱パラフィン後、７μｍ厚の頭蓋冠冠状断または矢状断パラフィン切片を、２．５％ヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））で３７℃にて３０分間、３％Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））中で室温にて３０分間、０．３％トリトンＸ−１００を含有するＰＢＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（登録商標））中で室温にて３０分間、およびブロッキング溶液（すなわち、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ウマ血清／トリトン）中で室温にて１時間、順次インキュベートした。切片を、マウス抗ヒトＩ型コラーゲン一次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ９０３９５）、ウサギ抗マウスＩ型コラーゲン一次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２１２８６）またはウサギ抗Ｋｕ８０一次抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ８０５９２）で４℃にて一晩インキュベートした。製造業者の説明書に従って、ベクタステインキット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰＫ６２００）および３，３’ジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて、染色を可視化した。切片をマイヤーヘマトキシリン（Ｋｌｉｎｉｐａｔｈ（登録商標））で対比染色した。スライドにＰｅｒｔｅｘ（登録商標）を用いてガラス製カバーガラスを載せた。
【０３４０】
１．８  頭蓋冠の組織形態計測学的分析：骨形成の定量化
骨形成の定量化（すなわち、骨形成のパーセンテージ）を、プラスチック包埋組織上で行った。頭蓋冠の最初（アリザリンレッドにより蛍光標識された基底石灰化前線）および最後の厚さ（カルセインおよびテトラサイクリンにより蛍光標識された新骨形成）の測定値を、ＺＥＮ（登録商標）画像解析ソフトウエア（Ｚｅｉｓｓ）により、４μｍ厚の冠状切片上で測定した（単位μｍ）。次に、頭蓋冠の最初および最後の厚さを用いて、投与後の各実験動物における新骨形成のパーセンテージを算出した。各動物につき、最初および最後の厚さの４回の測定を、各レベル間に２００μｍの距離をとった５つの独立したレベルに対して行った。最初の工程として、最初および最後の厚さ±ＳＤの平均（すなわち、５つのレベル上のレベルあたり４回の測定値の平均）を、各動物に対して算出した。次に、各マウスに対する骨形成のパーセンテージを、最初の厚さの平均に対する最後の厚さの平均の比として算出した。
【０３４１】
１．９  組織画像上での新形成された骨の表面積の定量化（ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウエア）
骨誘導および骨形成小結節の表面積分析のために、冠状縫合後の２レベル毎にとられた６つの独立したレベルのデジタル画像を、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｓｃｏｐｅ  Ａ１、Ｚｅｉｓｓ、ドイツ）の複数の蛍光および明視野フィルターの組合せを用いて、頭蓋冠のプラスチック樹脂組織切片（４μｍ）から撮影した。各測定レベル上で、骨誘導された骨新形成の選択は、ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウエアを用いて、明視野ステッチ画像において手動で定義した。この選択の石灰化された全表面積を測定した（単位ｍｍ２）。同じ手順を、骨形成小結節の石灰化された全表面積に対して行った。
【０３４２】
骨誘導および骨形成小結節に関して、次に、全表面積の平均および石灰化表面積の平均を、実験動物あたりおよび群あたりで算出した。骨新形成の全表面積を、骨誘導および骨形成小結節の表面積の和として、最後に算出した。
【０３４３】
１．１０  統計解析
結果は、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表す。統計解析は、ＪＭＰ（登録商標）ソフトウエア（ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．）を用いて行った。ｉｎ  ｖｉｔｒｏデータ（フローサイトメトリー、ＲＴ−ｑＰＣＲおよびマルチプレックス）に関しては、ｌｏｇ１０変換値に対して対応のあるｔ検定を行い、ｉｎ  ｖｉｖｏデータに関しては、マン・ホイットニーのＵ検定を用いた。特に断りのない限り、ｐ＜０．０５の場合、群間差は統計的に有意とみなした。
【０３４４】
２．結果
骨形成細胞Ａ（ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１で産生）および骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生）の両方とも、投与の２週後に、対照（賦形剤）よりも有意に高い骨形成を示した（図８〜９、表１７）。より詳しくは、図１０は、骨形成細胞Ｂが、骨誘導特性（頭蓋冠上のマウス起源の均一な骨形成）、および骨形成特性（ヒトおよびマウス起源の石灰化小結節）を示したことを示す。
【０３４５】
【表１７】
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【０３４６】
骨誘導特性（すなわち、移植後に新形成されたマウス骨の量）は、骨形成細胞ＡとＢとで同等であった（図８〜９）。
【０３４７】
非常に興味深いことに、本発明の骨形成細胞Ｂは、移植後に新形成されたヒトおよびマウス骨の量が高いことにより示されるように、強力な骨形成特性および骨誘導特性を示した（ヒトおよびマウスＣｏｌＩ  ＩＦ染色、図１０）。
【０３４８】
骨形成細胞Ｂでは７／８のドナーおよび８０％のマウスにおいて、骨形成細胞Ａでは４／１１のドナーおよび２０％のマウスにおいて、小結節の存在が認められた。ＭＳＣまたは賦形剤の投与後には、小結節は認められなかった。骨誘導活性に加えて、骨形成細胞Ｂは、従って、処置マウスの８０％において認められた大きな石灰化小結節の存在により強調される高い骨形成活性を促進しているが、一方、骨形成細胞Ａは、処置マウスのわずか２０％において、弱い骨形成活性、すなわち、小さな小結節を示している（表１８）。
【０３４９】
【表１８】
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【０３５０】
投与（賦形剤単独、ＭＳＣ、骨形成細胞Ａ（ＦＧＦ−２およびＴＧＦβ１で産生；ｂ−ｆ細胞Ａ）または骨形成細胞Ｂ（ＦＧＦ−２、ＴＧＦβ１およびヘパリンで産生；ｂ−ｆ細胞Ｂ））の２週後におけるマウス骨頭蓋冠冠状切片の組織学染色では、総ての処置条件（ＭＳＣ、ｂ−ｆ細胞Ａおよびｂ−ｆ細胞Ｂ）は、骨誘導により形成された骨における中等度のリモデリング活性（ＡＬＰおよびＴＲＡＰ染色）を伴う高い骨誘導能を有することが明らかにされた。
【０３５１】
興味深いことに、骨形成細胞Ｂで処置されたマウスにおいて認められた石灰化小結節は、マウス（宿主）およびヒト（ドナー）両方の骨組織から構成されており（ヒトおよびマウスＩ型コラーゲン染色により証明される）、このことは、小結節は、両方の骨形成過程：骨形成（ドナーの骨形成）および骨誘導過程（宿主の骨形成）により形成されたことを示している。高い骨芽細胞および破骨細胞活性（ＡＬＰ＋ＴＲＡＰ染色）に加えて、小結節は、類骨組織（非石灰化組織）を示し、このことは、投与の２週後においても骨形成は依然として進行していたが、全条件において認められた骨誘導過程は、すでに完了したことを示唆している（図１２）。
【０３５２】
図１２は、ヒト骨形成(bone formation)（すなわち、骨形成(osteogeny)）（抗ヒトＩ型コラーゲン染色で認められた）、ならびに高い骨芽細胞および破骨細胞活性（それぞれＡＬＰ＋ゴールドナー染色およびＴＲＡＰ染色で認められた）は、大部分が、骨形成細胞Ｂを投与されたマウスの小結節において検出され、それにより、完了したように思われたＭＳＣおよび骨形成細胞Ａの骨誘導過程とは異なり、小結節における骨形成過程は進行中であり、２週目において完了していなかったことが示されることを示す。総ての処置条件（ＭＳＣ、ｂ−ｆ細胞Ａ、ｂ−ｆ細胞Ｂ）は、骨誘導された骨形成における中等度のリモデリング活性（ＡＬＰおよびＴＲＡＰ染色）を伴う高い骨誘導能を有していた（図１２）。
【０３５３】
賦形剤単独、ＭＳＣ、ｂ−ｆ細胞Ａまたはｂ−ｆ細胞Ｂでの処置の２週後において、骨新形成を蛍光により評価した（図１３）。この目的を達成するため、特定の時点において、骨カルシウム結合蛍光色素（すなわち、アリザリンレッド、カルセイングリーンおよびブルー、テトラサイクリンイエロー）をマウスに投与し、新形成された骨を標識した。投与される最後の蛍光色素は、テトラサイクリンであり、細胞の投与の１２日後に投与した。
【０３５４】
図１３に示されるように、骨形成細胞Ｂを投与されたマウスの小結節は、大部分が、テトラサイクリン蛍光色素により染色され（黄色の染色は、図１３において点線で囲まれている）、このことは、骨誘導された骨形成において認められた骨誘導（アリザリンレッド（赤色）、カルセイン（緑色）およびカルセインブルー（青色）：これらの染色は淡灰色で出現し、二重矢印は骨形成の厚さを示す）と比較して、遅い段階の形成を確認するものである。
【０３５５】
処置マウスの骨新形成を、組織画像（ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウエア）上での新形成された骨の表面積の定量化により、評価した。新形成された骨の全表面積は、各分析レベルおよび各マウスに関して骨誘導および骨小結節表面積を合計することにより、決定した。
【０３５６】
結果は、骨形成細胞Ｂ（ｎ＝７のマウス、図１４において淡灰色で示す）は、ＭＳＣ（ｎ＝６のマウス、図１４において暗灰色で示す；表１９）と比較して約２倍、細胞の投与の２週後に有意に骨新形成を亢進したことを示す。この差は、骨形成細胞Ｂにより示される高い骨形成特性およびＭＳＣに関してはそのような特性がないことに起因していた。
【０３５７】
【表１９】
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【０３５８】
さらに、組織学的染色を用いた経時的な骨新形成の評価では、骨形成細胞Ｂを投与されたマウスの頭蓋冠の上部で認められた小結節は、軟骨内骨化機序を通じて骨化していたことが明らかにされた。図１５において、サフラニンオレンジ染色は、プロテオグリカン（軟骨に特異的）マトリックス（破線により囲まれた領域）；核；骨組織；および細胞質を示す。膜内骨化により産生された骨誘導骨とは対照的に、骨小結節は軟骨内骨化を通じて産生され、投与の１週後〜３週後の間に軟骨基質が生じた（図１５）。
【０３５９】
骨形成細胞Ｂの投与の４週後に行われたヒトＩ型コラーゲン、マウスＩ型コラーゲンおよびヒト核（すなわち、Ｋｕ８０）を標的とした免疫組織化学染色では、小結節におけるヒト骨の存在が確認された。さらに、Ｋｕ８０染色では、骨形成細胞Ｂは、骨基質（小結節）に生着し、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後に骨細胞となったことが明らかにされた。
【０３６０】
実施例７：実施例１の方法により得られた骨形成細胞Ｂにより修復されたｉｎ  ｖｉｖｏマウス大腿区域性亜臨界サイズ欠損（サブＣＳＤ）
１．実験手順
１．１  大腿区域性亜臨界サイズ欠損（サブＣＳＤ）モデル
文献（Manassero et al., 2013, Tissue Engineering, Part C Methods, 19(4):271-80; Manassero et al., 2016, Journal of Visualized Experiments; (116): 52940）に従って、無菌条件下で外科手技を行った。簡単に述べれば、１３週齢の雌ＮＭＲＩヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（ｎ＝２７）を、デクスメデトミジン塩酸塩（Ｄｅｘｄｏｍｉｔｏｒ（登録商標）、Ｏｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａ、１ｍｇ／ｋｇ体重）およびケタミン（Ｎｉｍａｔｅｋ（登録商標）、Ｅｕｒｏｎｅｔ、１５０ｍｇ／ｋｇ体重）の混合物の腹腔内注射により麻酔し、加温板に腹側位で置いた。左大腿骨の前側に対して６穴チタンマイクロロッキングプレート（ＲＩＳｙｓｔｅｍ  ＡＧ（登録商標））を適用した後、ギグリ線鋸およびジグ（ＲＩＳｙｓｔｅｍ  ＡＧ（登録商標））を用いて、２ｍｍ長の中骨幹大腿骨切り術を行った。予防薬として、抗生物質（Ｂａｙｔｒｉｌ（登録商標）、１０ｍｇ／ｋｇ体重）を手術前日に投与し（飲料水中）および鎮痛薬（ブプレノルフィン塩酸塩、Ｔｅｍｇｅｓｉｃ（登録商標）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、０．１ｍｇ／ｋｇ体重）を、手術前日および手術後１２時間毎に少なくとも３日間投与した。ＭＳＣ由来細胞（マウスあたり３０μｌの容量中２．２５×１０６個）または賦形剤（対照群）を、手術日（縫合糸で創傷を閉鎖した直後）に、５０μｌハミルトンシリンジを用いて経皮注射により、骨欠損部位に局所投与した。マウスは、頸椎脱臼により、細胞または賦形剤投与の６週後に安楽死させた。各マウスの左大腿骨を解剖し、回収し、Ｘ線イメージングまで室温で０．９％ＮａＣｌ中に保存した。
【０３６１】
１．２  Ｘ線分析による骨修復の定量化
手術直後に、Ｆａｘｉｔｒｏｎ（登録商標）ＭＸ−２０デバイスを用いて、各マウスの左大腿骨のｉｎ  ｖｉｖｏ  Ｘ線イメージングを行い、プレート固定および区域性大腿欠損サイズを調節し、ベースライン値を得、また、ＭＳＣ由来細胞または賦形剤の投与の６週後まで２週毎に行った。電圧を３５ｋＶに、照射時間を４．８秒に、輝度を４，３００に、コントラストを７，１００に設定して、手動モードにおいて倍率４倍で、中外方向および前後方向にてデジタル画像を撮影した。細胞投与の６週後に、安楽死時に回収した左大腿骨に対して、ｅｘ  ｖｉｖｏ  Ｘ線イメージングを行った。電圧を２６ｋＶに、照射時間を１５秒に、輝度を４，８５０に、コントラストを６，８５０に設定して、手動モードにおいて倍率５倍で、中外方向および前後方向にてデジタル画像を撮影した。ＩｍａｇｅＪ（登録商標）ソフトウエアを用いて、中外方向および前後方向のＸ線像上での３つの位置（欠損の右、中央および左）における骨欠損の２端間の距離（μｍ）を測定することにより、欠損サイズを各マウスに対して経時的に定量化した。６つの測定値の平均を、各時点において各マウスに対して算出した。
【０３６２】
１．３  マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）分析
安楽死時に回収した後、左大腿骨を３．７％ホルムアルデヒドで固定し、マイクロＣＴ分析のためにＣｅｎｔｅｒ  Ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ（ＣＭＭＩ、ＵＬＢ、ゴスリ、ベルギー）に移送した。マルチモーダルマイクロＰＥＴ／ＣＴ  ｎａｎｏＳｃａｎ（登録商標）ＰＥＴ／ＣＴカメラ（Ｍｅｄｉｓｏ）およびＮｕｃｌｉｎｅＴＭ  ｖ２．０１ソフトウエア（Ｍｅｄｉｓｏ）を用いて、サンプルをスキャンした。スキャンは、半円スキャン、最大ズーム、管電圧３５ｋＶｐ、ガントリー回転あたり７２０回の投影、投影あたり照射時間３００ｍｓ、検出器ピクセルビニング１×１を用いて行った。ＸおよびＹ次元におけるスキャン長さを、各取得に対して適合させた。マイクロＣＴスキャニングの全時間は、３分４２秒であった。各マイクロＣＴスキャンは、シェップ・ローガンフィルタおよび８つの通常のサンプルのマルチサンプリングモードを用いて、一辺４０μｍの立方ボクセルで後再構成した。ＸおよびＹ像の次元を、各再構成に対して適合させた。Ｚ像のサイズは、取得に関して定義されたスキャン長さに対応していた。Ｚ軸（スキャナー軸）で骨を再配向し、Ｚ軸上の大腿骨における一方の近位スクリューから他方の近位スクリューまでの画像をトリミングし、横断（Ｘ−Ｙ）面においては可能な限り狭くトリミングした後、マイクロＣＴ像上で骨修復の定性的評価を行った。次に、３Ｄ最大値投影法（ＭＩＰ）レンダリングを行った。骨修復を定量的に評価するため、直径２ｍｍおよび軸方向長さ２ｍｍの仮想円柱を、マイクロＣＴスキャン上の欠損空間に入れ、１５００ＨＵ以上の放射線強度でボクセルを閾値処理することにより、この円柱において平均骨容量を評価した。
【０３６３】
２．結果
２．１  骨形成細胞Ｂはマウス大腿亜臨界区域性欠損の修復を改善した
ＮＭＲＩヌードマウスにおける亜臨界サイズ区域性欠損（ＣＳＤ）モデルにおいて、骨形成細胞Ｂ（ｎ＝１２のマウス、２バッチ）は、投与の２〜６週後において、賦形剤（ｎ＝１１のマウス）、および骨形成細胞Ａ（ｎ＝４のマウス）と比較して、骨欠損サイズの有意な低減により示されるように、骨折修復を改善した（図１６Ａ）。
【０３６４】
Ｄ０および賦形剤、骨形成細胞Ａ（示さず）または骨形成細胞Ｂの投与後６Ｗにおける区域性大腿欠損のＸ線像は、賦形剤（図１６Ｂ）または骨形成細胞Ａ（示さず）を投与されたマウスと比較して、本発明の一つの実施形態に従って骨形成細胞Ｂを投与されたマウスにおいて、骨欠損サイズの低減を示した。
【０３６５】
賦形剤および骨形成細胞Ｂの投与後６Ｗにおいて、マイクロコンピュータ断層撮影（マイクロＣＴ）分析により、区域性大腿欠損の骨修復容量を定量化した。結果は、骨形成細胞Ｂは、賦形剤と比較して高い骨修復を誘導したことを確認するものであった（図１６Ｃ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月6日(2020.7.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、線維芽細胞成長因子−２（ＦＧＦ−２）、トランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）および少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなる、方法。
【請求項２】
以下の工程：
（ａ）ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を含んでなる培地において、対象の生体サンプルから回収されたＭＳＣを培養する工程；
（ｂ）非接着性物質を除去し、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよび少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体を含んでなる培地において、接着性細胞をさらに培養し、それにより、ＭＳＣ由来細胞を得る工程
を含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＴＧＦβが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびその混合物からなる群から選択され、好ましくは、ＴＧＦβがＴＧＦβ１である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
移植特性が改善されたＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、前記方法は、サイズ縮小工程を含んでなり、前記サイズ縮小工程は、ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを特徴とする、方法。
【請求項５】
−  ヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体の濃度が、少なくとも０．０５ＩＵ／ｍｌ、好ましくは約０．１ＩＵ／ｍｌであり；および／または
−  ヘパリンまたはそのヘパリン誘導体もしくは類似体が、未分画ヘパリン（ＵＦＨ）；エノキサパリン、ダルテパリン、ナドロパリン、チンザパリン、セルトパリン、レビパリン、アルデパリン、パルナパリン、ベミパリンなどの低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）、またはその混合物；ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、コンドロイチン硫酸、アカラン硫酸、ケラタン硫酸などのヘパリノイド、またはダナパロイドなどのその混合物；ヘパリン塩；ヘパリノイド塩；ヘパリン断片；ヘパリノイド断片；およびその混合物からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ６０≦２５μｍ）を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
ＭＳＣ由来細胞が、骨軟骨芽細胞、好ましくは骨芽細胞系統である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ＭＳＣまたはＭＳＣ由来細胞が、血漿、血清またはその代替物の１以上、例えば、培地に付加的に含まれる血漿、血清またはその代替物の１以上とさらに接触する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ＭＳＣ由来細胞をＭＳＣから得る方法であって、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなり、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ６０≦２５μｍ）を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する、方法。
【請求項１０】
−  ＭＳＣが、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触し；および／または
−  ＴＧＦβが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびその混合物からなる群から選択され、好ましくは、ＴＧＦβがＴＧＦβ１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＭＳＣのｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの分化により得られた間葉系統の細胞であるＭＳＣ由来細胞の集団であって、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の少なくとも６０％が、２５μｍ以下の直径（Ｄ６０≦２５μｍ）を有し、懸濁液中のＭＳＣ由来細胞の最大５％が、３５μｍ超の直径を有する、ＭＳＣ由来細胞の集団。
【請求項１２】
−  ＭＳＣ由来細胞が、ＭＳＣをｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで、ＦＧＦ−２、ＴＧＦβおよびヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触させることを含んでなる方法により得ることができ、好ましくは、ＴＧＦβが、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＧＦβ３、およびその混合物からなる群から選択され、より好ましくは、ＴＧＦβがＴＧＦβ１であり、好ましくは、ＭＳＣが、少なくとも０．０１ＩＵ／ｍｌの濃度のヘパリンまたはその誘導体もしくは類似体と接触し、場合により、ＭＳＣが、血漿、血清またはその代替物１以上とさらに接触する；および／または
−  ＭＳＣ由来細胞が、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統であり、好ましくは、骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統の実質的に総てのＭＳＣ由来細胞が、ＣＤ７３、ＣＤ６３およびＣＤ１６６に対して陽性であり；骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統の実質的に総てのＭＳＣ由来細胞が、ＣＤ４５に対して陰性であり；骨軟骨芽細胞系統または骨芽細胞のＭＳＣ由来細胞の少なくとも７０％が、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に対して陽性であり；骨軟骨芽細胞または骨芽細胞系統のＭＳＣ由来細胞の１０％未満が、ＨＬＡ−ＤＲに対して陽性である、請求項１１に記載のＭＳＣ由来細胞の集団。
【請求項１３】
請求項１１または１２に定義されるＭＳＣ由来細胞の集団を含んでなる、医薬組成物。
【請求項１４】
医薬としての使用のための、好ましくは、ＭＳＣ由来細胞の移植を必要とする対象の処置における使用のための、請求項１１もしくは１２に記載のＭＳＣ由来細胞の集団または請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
−  ＭＳＣ由来細胞の集団が、約１×１０７／ｍｌ〜約１×１０８／ｍｌの間の濃度で、好ましくは、７．５×１０７個／ｍｌの濃度で存在し；および／または
−  ＭＳＣ由来細胞の集団または医薬組成物が、経皮または血管内投与に好適である、請求項１４に記載の使用のためのＭＳＣ由来細胞の集団。
【国際調査報告】
2020537539.tif 000044
2020537539.tif 000045
2020537539.tif 000046
2020537539.tif 000047