(57)【要約】【解決手段】方法は、混合プロトコルを実施する制御回路の制御下で、試薬を複数の異なる試薬容器からキャッシュチャネルに吸引するステップを含む。制御回路が実施する混合プロトコルに基づいて、試薬の指定量が、対応するシッパーによって、対応する試薬容器から自動的に吸引される。方法は、試薬をキャッシュチャネルから混合容器に排出するステップと、試薬を混合容器内で混合して試薬混合物を構成するステップと、も含む。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合プロトコルを実施する制御回路の制御下で、試薬を複数の異なる試薬容器からキャッシュチャネルに吸引するステップと、
前記試薬を前記キャッシュチャネルから混合容器に排出するステップと、
前記試薬を前記混合容器内で混合して試薬混合物を構成するステップと、
を含む方法であり、
前記制御回路が実施する前記混合プロトコルに基づいて、前記試薬の指定量が、対応するシッパーによって、対応する前記試薬容器から自動的に吸引される、方法。
【請求項２】
前記試薬混合物をフローセルに送達するステップを更に含み、
前記試薬混合物は前記フローセル上で試料テンプレートと反応して、前記フローセル上でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子のクローン集団を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試薬を前記キャッシュチャネルから前記混合容器に排出する前に、前記混合容器は前記混合容器の中に試料テンプレートを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ある量の前記試薬混合物を、前記混合容器内へ延在するノズルシッパーに吸引し、その後前記ある量の試薬混合物を前記ノズルシッパーから前記混合容器内に排出して戻すことによって、前記混合容器の前記試薬を混合する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ノズルシッパーはバッファ流体を前記ノズルシッパーの中に包含し、
前記方法は、前記ある量の試薬混合物を前記ノズルシッパーに吸引する前に、空気を前記ノズルシッパー内に導入して、前記バッファ流体と前記ノズルシッパーに吸引される前記試薬混合物との間にエアギャップを定めて、前記バッファ流体と前記試薬混合物との間の混合を妨げるステップを更に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記試薬を、順序付けられるシーケンスで１度に１つ、前記キャッシュチャネル内へ吸引する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記試薬を前記キャッシュチャネルに吸引するステップに応じて、前記キャッシュチャネルは、指定量の異なる前記試薬からなり、前記キャッシュチャネルの丈に沿う交互のパターンを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記キャッシュチャネル内の前記試薬が前記混合容器内に排出される前に、前記試薬を、少なくとも１度繰り返され順序付けられるシーケンスで１度に１つ、前記異なる試薬容器から前記キャッシュチャネル内に吸引する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
第１体積の前記試薬を前記キャッシュチャネル内に吸引し、より小さな第２体積の前記試薬を前記混合容器に排出して、前記試薬を前記混合容器に排出した後に、上流バッファゾーンを定める前記試薬の残余体積が前記キャッシュチャネルに残る、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記対応する試薬容器内へ延在するシッパーを用いて、前記試薬を前記対応する前記試薬容器から吸引し、
前記シッパーは、流体マニホールド上の対応するポート及び流体チャネルを通じて、前記キャッシュチャネルに流体的に接続される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
界面活性剤を前記試薬に導入して前記試薬間の混和性の差を低減するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試薬の少なくとも一部が互いに対して異なる比重を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
１０，０００ダルトン未満の分子量を有する密集剤を前記試薬に導入して、前記試薬の粘度を低減するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ノズルシッパー及び複数試薬シッパーを含む複数シッパーと、
ポンプ端部及び容器端部の間に延在するキャッシュチャネルと、
前記ポンプ及び試薬セレクタバルブに動作可能に接続され、前記ポンプ及び前記試薬セレクタバルブを制御して、対応試薬シッパーを通じて混合プロトコルに基づく指定量の前記試薬を前記キャッシュチャネルに自動的に吸引することで前記混合プロトコルを実施し、続いて前記ポンプ及び前記試薬セレクタバルブを制御して前記試薬を前記キャッシュチャネルから前記ノズルシッパーを通じて混合容器内に排出するとともに、前記混合容器内で前記試薬を混合して試薬混合物を構成する制御回路と、
を備えるシステムであり、
前記複数試薬シッパーは、異なる試薬を前記複数試薬シッパー内に包含する、異なる対応試薬容器内に延在して、前記複数試薬シッパーのそれぞれの先端チップが前記試薬容器の前記試薬に接触し、
前記ノズルシッパーは前記混合容器内へ延在し、
前記キャッシュチャネルの前記ポンプ端部はポンプに動作可能に接続され、前記キャッシュチャネルの前記容器端部は前記試薬セレクタバルブ及び対応流体チャネルを通じて前記シッパーに流体的に接続される、システム。
【請求項１５】
前記制御回路は前記ポンプを制御して、ある量の前記試薬混合物を前記ノズルシッパー内に吸引し、その後ある体積の前記試薬混合物を前記ノズルシッパーから前記混合容器に排出して戻すことによって、前記混合容器で前記試薬を混合する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１６】
前記制御回路は前記ポンプ及び前記試薬セレクタバルブを制御して、前記試薬混合物を前記混合容器内に吸引しその後排出することを複数回行って前記試薬を混合する、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１７】
前記ノズルシッパーは前記ノズルシッパー内にバッファ流体を包含し、
前記試薬混合物を前記ノズルシッパー内に吸引する前に、前記制御回路は前記ポンプを制御して空気を前記ノズルシッパー内に導入して、前記バッファ流体と前記ノズルシッパー内に吸引される前記試薬混合物との間にエアギャップを定めて前記バッファ流体と前記試薬混合物との間の混合を妨げる、請求項１５に記載のシステム。
【請求項１８】
前記ノズルシッパーの内径が、前記試薬シッパーのそれぞれの内径よりも小さい、請求項１４に記載のシステム。
【請求項１９】
前記制御回路は前記ポンプ及び前記試薬セレクタバルブを更に制御して、前記試薬混合物を、前記ノズルシッパー及び前記試薬セレクタバルブを通じて前記混合容器に流体的に接続されるフローセルに送達し、
前記試薬混合物は前記フローセル上の試料テンプレートと反応してＤＮＡ分子のクローン集団を前記フローセル上に生成する、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２０】
前記制御回路は前記ポンプ及び前記試薬セレクタバルブを制御して、前記異なる試薬を順序付けられるシーケンスで１度に１つ前記キャッシュチャネル内に吸引するとともに、前記キャッシュチャネルの前記試薬が前記混合容器内に排出される前に、前記順序付けられるシーケンスを少なくとも１度繰り返す、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２１】
前記制御回路は前記ポンプ及び前記試薬セレクタバルブを制御して、第１体積の前記試薬を前記キャッシュチャネル内に吸引し、その後より小さい第２体積の前記試薬を前記キャッシュチャネルから前記混合容器内に排出して、前記試薬を前記混合容器内に排出した後に、上流バッファゾーンを定める前記試薬の残余体積が前記キャッシュチャネルに残る、請求項１４に記載のシステム。
【請求項２２】
複数試薬シッパー及びノズルシッパーを含む複数シッパー、並びにキャッシュチャネルを含む流体マニホールドと、
前記キャッシュチャネル及び前記シッパーの間に動作可能に接続される試薬セレクタバルブと、
前記キャッシュチャネルのポンプ端部に動作可能に接続されるポンプと、
を備えるシステムであり、
前記複数試薬シッパーは異なる試薬を中に包含する異なる対応試薬容器内へ延在して、前記複数試薬シッパーの先端チップは前記試薬に接触し、
前記ノズルシッパーは混合容器内へ延在し、
前記キャッシュチャネルは前記ポンプ端部及び容器端部の間に延在し、
前記容器端部は流体マニホールドに沿う対応流体チャネルを通じて前記シッパーに流体的に接続され、
前記ポンプ及び前記試薬セレクタバルブは混合プロトコルに従って自動的に制御されて、前記混合プロトコルに基づく指定量の前記試薬を、試薬容器から対応試薬シッパーを通じて前記キャッシュチャネル内へ吸引し、
前記ポンプ及び前記試薬セレクタバルブは自動的に続いて制御されて、前記試薬を前記キャッシュチャネルから前記ノズルシッパーを通じて前記混合容器内へ排出し、ある体積の試薬混合物を前記混合容器から前記ノズルシッパー内へ吸引するとともにその後前記ある体積の前記試薬混合物を前記ノズルシッパーから前記混合容器内へ排出して戻すことによって、前記混合容器で前記試薬を混合して前記試薬混合物を構成する、システム。
【請求項２３】
前記ポンプ及び前記試薬セレクタバルブは自動的に制御されて、前記試薬を、順序付けられるシーケンスで１度に１つ、前記試薬容器から前記キャッシュチャネルに吸引し、前記試薬を前記キャッシュチャネルから前記混合容器内に排出する前に、前記順序付けられるシーケンスを少なくとも１度繰り返す、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
前記流体マニホールド、前記試薬セレクタバルブ及び前記ポンプは器械のハウジング内に共通して配置される、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
ハウジングと、
前記ハウジング内に配置されるとともに、異なる対応容器内へ延在するシッパーに流体的に接続される複数チャネルを含む流体マニホールドと、
前記ハウジング内に配置されるとともに、前記流体マニホールドの前記複数チャネルの少なくとも１つに動作可能に接続されるポンプと、
前記ハウジング内に配置されるとともに、前記流体マニホールドの前記複数チャネルの少なくとも２つに動作可能に接続される試薬セレクタバルブと、
前記ハウジング内に配置されるとともに、前記流体マニホールドの前記複数チャネルの少なくとも１つに流体的に接続されるフローセルと、
を備える器械であり、
前記ポンプ及び前記試薬セレクタバルブが混合プロトコルに従って自動的に制御されて、容器の少なくとも一部の中に包含される試薬を、前記混合プロトコルに基づく指定量だけ、前記対応容器から前記シッパーを通じて前記流体マニホールドの前記複数チャネルに輸送し、
前記ポンプ及び前記試薬セレクタバルブは自動的に制御されて、前記流体マニホールドに輸送される前記試薬を混合して試薬混合物を構成し、その後前記試薬混合物を前記マニホールドから前記フローセルに送達する、器械。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は、2017年1月5日に出願した米国特許仮出願第62/442,647号の優先権の利益と、2017年1月5日に出願した米国特許仮出願第62/442,647号の優先権の利益を同様に主張する2017年3月24日に出願した英国（ＧＢ）特許出願第1704747.3号の優先権の利益とを主張し、これら全出願の全内容を参照により本明細書に援用するものとする。
【背景技術】
【０００２】
対象分子、特にデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）及び他の生体試料をシーケンシングする器械が開発され進化し続けている。シーケンシング作業に先立って、試薬と混合され最終的にはフローセルに導入される、ライブラリ又はテンプレートを形成するために対象分子の試料を調製する。フローセルでは個々の分子が部位に付着し検出性を高めるために増幅されるであろう。シーケンシング作業はその後、部位で分子を結合するステップと、結合した成分をタグ付けするステップと、部位で成分を撮像するステップと、結果として生じる画像データを処理するステップと、から成るサイクルを繰り返すことを含む。
【０００３】
このようなシーケンシングシステムでは、試薬を互いに手作業で混合して試薬混合物を生成でき、その後試薬を試料テンプレートと手作業で混合し、フローセル上を流れるクラスタステーションにロードする。シーケンシング作業の性能は、様々な試薬要因に影響されることがあり、当該試薬要因は例えば、試薬混合物の各試薬の量、試薬が混合される順序、どれほど良く試薬同士を混合して試薬を試料テンプレートと混合したか、試薬混合物の温度、並びに試薬が混合された時及び結合される試薬混合物と試料テンプレートとがクラスタステーションにロードされた時から生じる時間の長さ等である。手作業での試薬の輸送及び混合を利用することで、試薬要因の変動性がもたらされ、シーケンシング作業の性能に支障を来すことがある。例えば、試薬及び試料テンプレートの不十分な混合によって、シーケンシングに使用されるフローセル上の分子の良質クラスタの生成量の低下によって特徴付けられる、性能の低下をもたらすことがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一実施例では、混合プロトコルを実施する制御回路の制御下で、試薬を複数の異なる試薬容器からキャッシュチャネルに吸引するステップを含む方法（例えば試薬混合方法）が提供される。制御回路が実施する混合プロトコルに基づいて、試薬の指定量が、対応するシッパーによって、対応する試薬容器から自動的に吸引される。方法は、試薬をキャッシュチャネルから混合容器に排出するステップと、試薬を混合容器内で混合して試薬混合物を構成するステップと、も含む。
【０００５】
一実施例では、方法は、試薬混合物をフローセルに送達するステップを更に含み、試薬混合物はフローセル上で試料テンプレートと反応して、フローセル上でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子のクローン集団を生成する。
【０００６】
方法の一実施例では、試薬をキャッシュチャネルから混合容器に排出する前に、混合容器は混合容器の中に試料テンプレートを包含する。
【０００７】
更なる実施例では、ある量の試薬混合物を、混合容器内へ延在するノズルシッパーに吸引し、その後ある量の試薬混合物をノズルシッパーから混合容器内に排出して戻すことによって、混合容器の試薬を混合する。この実施例では、ノズルシッパーはバッファ流体をノズルシッパーの中に包含し、方法は、ある量の試薬混合物をノズルシッパーに吸引する前に、空気をノズルシッパー内に導入して、バッファ流体とノズルシッパーに吸引される試薬混合物との間にエアギャップを定めて、バッファ流体と試薬混合物との間の混合を妨げるステップを更に含む。
【０００８】
方法の一実施例では、試薬を、順序付けられるシーケンスで１度に１つ、キャッシュチャネル内へ吸引する。この実施例では、試薬をキャッシュチャネル内に吸引するステップに応じて、キャッシュチャネルは、それぞれ指定量の異なる試薬からなり、キャッシュチャネルの丈に沿う交互のパターンを含む。
【０００９】
方法の他の実施例では、キャッシュチャネル内の試薬が混合容器内に排出される前に、試薬を、少なくとも１度繰り返され順序付けられるシーケンスで１度に１つ、異なる試薬容器からキャッシュチャネル内に吸引する。
【００１０】
一実施例では、第１体積の試薬をキャッシュチャネル内に吸引し、より小さな第２体積の試薬を混合容器に排出して、試薬を混合容器内に排出した後に、上流バッファゾーンを定める試薬の残余体積がキャッシュチャネルに残る。
【００１１】
方法の一実施例では、対応する試薬容器内へ延在するシッパーを用いて、試薬を対応する試薬容器から吸引し、シッパーは、流体マニホールド上の対応するポート及び流体チャネルを通じて、キャッシュチャネルに流体的に接続される。
【００１２】
方法の一実施例は、界面活性剤を試薬に導入して試薬間の混和性の差を低減するステップを更に含む。
【００１３】
一実施例では、試薬の少なくとも一部が互いに対して異なる比重を有する。
【００１４】
方法の他の実施例は、１０，０００ダルトン未満の分子量を有する密集剤を試薬に導入して、試薬の粘度を低減するステップを更に含む。
【００１５】
方法の任意の構成を、任意の好ましい方法及び／又は構成で一緒に組み合わせることができることを理解できる。
【００１６】
他の実施例では、複数シッパーと、キャッシュチャネルと、制御回路とを含むシステム（例えば試薬を混合するシステム）が提供される。複数シッパーはノズルシッパー及び複数試薬シッパーを含む。複数試薬シッパーは、異なる試薬を複数試薬シッパー内に包含する、異なる対応試薬容器内に延在して、複数試薬シッパーのそれぞれの先端チップが試薬容器の試薬に接触する。ノズルシッパーは混合容器内へ延在する。キャッシュチャネルはポンプ端部及び容器端部の間に延在する。キャッシュチャネルのポンプ端部はポンプに動作可能に接続される。キャッシュチャネルの容器端部は試薬セレクタバルブ及び対応流体チャネルを通じてシッパーに流体的に接続される。制御回路はポンプ及び試薬セレクタバルブに動作可能に接続される。制御回路は、ポンプ及び試薬セレクタバルブを制御して、対応試薬シッパーを通じて混合プロトコルに基づく指定量の試薬をキャッシュチャネルに自動的に吸引することで混合プロトコルを実施する。制御回路は続いて、ポンプ及び試薬セレクタバルブを制御して試薬をキャッシュチャネルからノズルシッパーを通じて混合容器内に排出するとともに、混合容器内で試薬を混合して試薬混合物を構成する。
【００１７】
システムの一実施例では、制御回路はポンプを制御して、ある量の試薬混合物をノズルシッパー内に吸引し、その後ある体積の試薬混合物をノズルシッパーから混合容器に排出して戻すことによって、混合容器で試薬を混合する。この実施例では、制御回路はポンプ及び試薬セレクタバルブを制御して、試薬混合物を混合容器内に吸引しその後排出することを複数回行って試薬を混合する。この実施例では、ノズルシッパーはノズルシッパー内にバッファ流体を包含し、試薬混合物をノズルシッパー内に吸引する前に、制御回路はポンプを制御して空気をノズルシッパー内に導入して、バッファ流体とノズルシッパー内に吸引される試薬混合物との間にエアギャップを定めてバッファ流体と試薬混合物との間の混合を妨げる。
【００１８】
システムの一実施例では、ノズルシッパーの内径が、試薬シッパーのそれぞれの内径よりも小さい。
【００１９】
システムの一実施例では、制御回路はポンプ及び試薬セレクタバルブを更に制御して、試薬混合物を、ノズルシッパー及び試薬セレクタバルブを通じて混合容器に流体的に接続されるフローセルに送達し、試薬混合物はフローセル上の試料テンプレートと反応してＤＮＡ分子のクローン集団をフローセル上に生成する。
【００２０】
システムの一実施例では、制御回路はポンプ及び試薬セレクタバルブを制御して、異なる試薬を順序付けられるシーケンスで１度に１つキャッシュチャネル内に吸引するとともに、キャッシュチャネルの試薬が混合容器内に排出される前に、順序付けられるシーケンスを少なくとも１度繰り返す。
【００２１】
システムの他の実施例では、制御回路はポンプ及び試薬セレクタバルブを制御して、第１体積の試薬をキャッシュチャネル内に吸引し、その後より小さい第２体積の試薬をキャッシュチャネルから混合容器内に排出して、試薬を混合容器内に排出した後に、上流バッファゾーンを定める試薬の残余体積がキャッシュチャネルに残る。
【００２２】
システムの任意の構成を、任意の好ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解できる。さらに、システム及び／若しくは方法の構成の任意の組み合わせを一緒に用いることができることを理解でき、並びに／又はこれらの態様の一方若しくは両方からの任意の構成を、本明細書で開示する実施例のいずれかと組み合わせることができることを理解できる。
【００２３】
他の実施例では、流体マニホールドと、試薬セレクタバルブと、ポンプとを備えるシステム（例えば試薬を混合するシステム）が提供される。流体マニホールドは、複数シッパー、及びキャッシュチャネルを含む。複数シッパーは、複数試薬シッパー及びノズルシッパーを含む。複数試薬シッパーは、異なる試薬を中に包含する異なる対応試薬容器内へ延在して、複数試薬シッパーの先端チップは試薬に接触する。ノズルシッパーは混合容器内へ延在する。キャッシュチャネルはポンプ端部及び容器端部の間に延在する。容器端部は流体マニホールドに沿う対応流体チャネルを通じてシッパーに流体的に接続される。試薬セレクタバルブは、キャッシュチャネル及びシッパーの間に動作可能に接続される。ポンプは、キャッシュチャネルのポンプ端部に動作可能に接続される。ポンプ及び試薬セレクタバルブは混合プロトコルに従って自動的に制御されて、混合プロトコルに基づく指定量の試薬を、試薬容器から対応試薬シッパーを通じてキャッシュチャネル内へ吸引する。ポンプ及び試薬セレクタバルブは続いて自動的に制御されて、試薬をキャッシュチャネルからノズルシッパーを通じて混合容器内へ排出し、ある体積の試薬混合物を混合容器からノズルシッパー内へ吸引するとともにその後ある体積の試薬混合物をノズルシッパーから混合容器内へ排出して戻すことによって、混合容器で試薬を混合して試薬混合物を構成する。
【００２４】
このシステムの一実施例では、ポンプ及び試薬セレクタバルブは自動的に制御されて、試薬を、順序付けられるシーケンスで１度に１つ、試薬容器からキャッシュチャネルに吸引し、試薬をキャッシュチャネルから混合容器内に排出する前に、順序付けられるシーケンスを少なくとも１度繰り返す。
【００２５】
このシステムの一実施例では、流体マニホールド、試薬セレクタバルブ及びポンプは器械のハウジング内に共通して配置される。
【００２６】
この実施例のシステムの任意の構成を、任意の好ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解できる。さらに、この実施例のシステム及び／若しくは他の実施例のシステム並びに／若しくは方法の構成の任意の組み合わせを一緒に用いることができることを理解でき、並びに／又はこれらの態様の一方若しくは両方からの任意の構成を、本明細書で開示する実施例のいずれかと組み合わせることができることを理解できる。
【００２７】
他の実施例では、ハウジングと、流体マニホールドと、ポンプと、試薬セレクタバルブと、フローセルとを備える器械（例えば試薬を混合する器械）が提供される。流体マニホールドは、ハウジング内に配置されるとともに、異なる対応容器内へ延在するシッパーに流体的に接続される複数チャネルを含む。ポンプは、ハウジング内に配置されるとともに、流体マニホールドの複数チャネルの少なくとも１つに動作可能に接続される。試薬セレクタバルブは、ハウジング内に配置されるとともに、流体マニホールドの複数チャネルの少なくとも２つに動作可能に接続される。フローセルは、ハウジング内に配置されるとともに、流体マニホールドの複数チャネルの少なくとも１つに流体的に接続される。ポンプ及び試薬セレクタバルブが混合プロトコルに従って自動的に制御されて、容器の少なくとも一部の中に包含される試薬を、混合プロトコルに基づく指定量だけ、対応容器からシッパーを通じて流体マニホールドの複数チャネルに輸送する。ポンプ及び試薬セレクタバルブは自動的に制御されて、流体マニホールドに輸送された試薬を混合して試薬混合物を構成し、その後試薬混合物をマニホールドからフローセルに送達する。
【００２８】
器械の任意の構成を、任意の好ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解できる。さらに、器械及び／若しくは実施例のシステム及び／若しくは方法の構成の任意の組み合わせを一緒に用いることができることを理解でき、並びに／又はこれらの態様の一方若しくは両方からの任意の構成を、本明細書で開示する実施例のいずれかと組み合わせることができることを理解できる。
【００２９】
以下の詳細な説明及び図面を参照することによって、本開示の実施例の構成が明白になるであろう。図面において、同様の符号は、ことによると同一ではないが類似する構成要素に対応する。簡潔にするために、前述した機能を有する符号又は構成は、これら符号又は構成が現れる他の図面に関して、説明されることも説明されないこともある。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】開示される技術を用いることができるシーケンシングシステムの実施例の概略図である。
【図２】図１のシーケンシングシステムの流体システムの実施例の概略図である。
【図３】図１のシーケンシングシステムの処理及び制御システムの実施例の概略図である。
【図４】一実施例に従って、図２に表す流体システムのバルブアセンブリを示す図である。
【図５】図４に示すバルブアセンブリの平面図である。
【図６】一実施例に従う試薬混合システムを示す図である。
【図７】一実施例に従う試薬混合システムの模式図である。
【図８】試薬混合物の一部をテンプレート容器内に排出した後の、図７に表す試薬混合システムの模式図である。
【図９】一実施例に従う、混合ステージ中の試薬混合システムの模式図である。
【図１０】一実施例に従う、混合容器内のノズルシッパーのクローズアップ部分を示す図である。
【図１１】一実施例に従う、試薬及び試料テンプレートの吸引及び混合の例示的サイクルのグラフ表示である。
【図１２】一実施例に従い、試薬及び試料テンプレートを吸引及び混合する方法及び例示的ロジックを示すフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
図１は、シーケンシングしてその成分、成分の順序及び試料の一般的構造を決定することができる、分子試料を処理するシーケンシングシステム１０の例を示す。システム１０は、シークされ測定される配列の対象分子を含む試料１６を受け取って処理する器械１２を含む。試料１６は、有機体からの有機分子又は実験室で生成される合成分子を含み得る。対象分子は、最終的対象の特定機能を有するその遺伝子及び変異体を決定できる配列のデオキシリボ核酸、リボ核酸又は塩基対を有する他の分子を含み得る。試料源１４によって試料１６を提供し、又は試料１６は試料源１４から生じる。試料源１４は、例えば人間、動物、微生物、植物又は他のドナー（環境試料を含む）の個人又は被検体等を含み得る。
【００３２】
試料１６を試料／ライブラリ調製システム１８に導入する。システム１８は、分析用試料１６を調製する。調整は、分析用試料１６の分離、切断及び調整を含み得る。結果として生じるライブラリは、シーケンシング作業を促進する長さの対象分子を含み得る。結果として生じるライブラリはその後器械１２に供給され、器械１２においてシーケンシング作業が行われる。本明細書では試料テンプレートと呼ばれるライブラリを、自動的プロセス又は半自動的プロセスで試薬と結合し、その後、シーケンシング前にフローセル２０に導入する。ある実施例では、ライブラリをフローセルに送る前に試薬と予混合でき、例えば後述するようにセレクタバルブシステムを通じてライブラリを送り、フローセルに輸送される前に行先容器で試薬と混合することができる。
【００３３】
図１に示す実施例では、器械１２は、試料テンプレートを受けるフローセル２０を含む。フローセル２０は、ライブラリの分子の付着とシーケンシング作業中に検出できる位置又は部位での増幅とを含む、発生ケミストリーをシーケンシングできる１つ以上の流体チャネル又はレーンを含む。例えば、フローセル２０は、増幅位置又は部位の１つ以上の表面に固定されるシーケンシングテンプレートを含み得る。フローセル２０は、パターン化されたアレイ、例えば増幅部位のマイクロアレイ及びナノアレイ等を含み得る。実際問題として、増幅部位を、支持部の１つ以上の表面上に、規則的な繰り返しパターン、複雑な非繰り返しパターン又はランダム配置で配置できる。発生ケミストリーをシーケンシングできるように、フローセル２０はまた、物質を導入でき、当該物質は例えば、反応及びフラッシング等に用いる、様々な試薬、バッファ及び他の反応媒体である。物質は、フローセル２０を通って流れ、個々の増幅部位で対象分子と接触できる。
【００３４】
器械１２において、フローセル２０を、この実施例では符号２４で示す１つ以上の方向で移動できる、可動ステージ２２上に装着できる。フローセル２０を例えば、試薬及び他の流体をフローセル２０から又はフローセル２０へ搬送できるために、可動ステージ２２上のポート又はシステム１０の他の要素とのインタフェースとできる、取外し可能かつ交換可能なカートリッジの形態で設けることができる。ステージ２２を、シーケンシング中に放射又は光２８をフローセル２０に向けることができる光学検出システム２６と関連付ける。光学検出システム２６は、フローセル２０の部位に配置される分析物を検出するために蛍光顕微鏡法等の様々な方法を使用できる。例として、光学検出システム２６は、共焦点線走査を使用して、プログレッシブピクセル化画像データを生み出すことができる。プログレッシブピクセル化画像を分析して、フローセル２０に個々の部位を配置して、各部位に直近に付着又は結合したヌクレオチドの種類を決定することができる。試料に沿って１つ以上の放射地点を走査する技術又は「ステップアンドシュート」撮像アプローチを使用する技術等の他の撮像技術も適切に使用できる。光学検出システム２６及びステージ２２は、領域の画像を取得する間又は説明するようにフローセル２０を任意の適切なモード（例えば点走査、線走査、「ステップアンドシュート」走査）で走査できつつ、フローセル２０及び検出システム２６の静的関係を維持するように協働することができる。
【００３５】
撮像するため、より一般的には部位で分子を検出するために多数の技術を使用できる一方、現在考えられる実施例は、蛍光タグを励起させる波長での共焦点光学撮像を使用できる。自らの吸収スペクトルによって励起されるタグは、自らの発光スペクトルによって蛍光シグナルを戻す。光学検出システム２６は、このようなシグナルを捕捉して、信号発生部位を分析できる解像度でピクセル化画像データを処理し、結果として生じる画像データ（すなわちピクセル化画像データから得られるデータ）を処理及び保存するように構成される。
【００３６】
シークエンシング作業において、例えば単一のヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドに関する反応を促進する、周期的かつ自動的な又は半自動的な作業又は処理が実装される。当該反応に続いて、その後のサイクルに備えるフラッシング、撮像及びデブロッキングが行われる。シーケンシングしフローセル２０上に固定するために調製される試料テンプレートは、あらゆる有用な情報を試料テンプレートから引き出す前に、多数のこのようなサイクルを経ることができる。光学検出システム２６は、電子検出回路（例えばカメラ又は撮像電子回路又はチップ）を使用することで、シーケンシング作業の各サイクル中に、フローセル２０（及びその部位）の走査から画像データを生成できる。その後、結果として生じる画像データを分析して、撮像データで個々の部位を配置し、部位に存在する分子を、部位の画像データにおけるピクセルの群又はクラスタが示す、特定の位置で検出された具体的な色又は光の波長（特定の蛍光タグの特徴的な発光スペクトル）等に関して分析及び特徴付けできる。デオキシリボ核酸又はリボ核酸のシーケンシングを適用する際に、例えば、４つの共通ヌクレオチドを、識別可能な蛍光発光スペクトル（光の波長又は波長範囲）によって表すことができる。それぞれの発光スペクトルをその後、当該ヌクレオチドに対応する値に割り当てることができる。この分析及び周期的に決定される各部位に対する値の追跡に基づいて、各部位に対して個々のヌクレオチド及びヌクレオチドの順序を決定することができる。その後当該配列を更に処理して、遺伝子及び染色体等を含むより長いセグメントをアセンブルすることができる。本明細書で使用される用語「自動的」及び「半自動的」は、作業を開始した後又は作業を含むプロセスを開始した後、人間による干渉がほとんど無い状態又は全く無い状態で、システムのプログラミング又は設定によって作業を行うことを意味する。
【００３７】
図示した実施例では、バルブ３２を通じて試薬３０をフローセル２０に引き込み又は吸引する。バルブ３２は、容器又は導管から、例えばピペッター又はシッパー（図１には示されていない）によって、容器又は導管が保管する試薬３０にアクセスすることができる。バルブ３２は、メモリに記憶されるプロトコルにおける、実施される作業の規定のシーケンスに基づいて試薬３０を選択できる。バルブ３２は、流路３４を通じて試薬３０をフローセル内に向けるコマンドを更に受け取ることができる。出口又は排出流路３６は、フローセル２０から使用された試薬３０を導く。図示した実施例では、ポンプ３８はシステム１０によって試薬３０を移動させて供給する。ポンプ３８は他の有益な機能を、例えばシステム１０を通る試薬３０又は他の流体の測定、及び空気又は他の流体の吸引等を提供することもできる。ポンプ３８の下流の追加的なバルブ４０は、使用された試薬３０を廃棄導管又は容器４２に適切に導くことができる。
【００３８】
器械１２は、様々なシステム構成要素を作動させ、センサからのフィードバックによって当該システム構成要素の動作を監視し、画像データを収集し及び画像データを少なくとも部分的に処理する命令に役立つ、ある範囲の回路を更に含む。図１に示す実施例では、制御／管理システム４４は、制御回路４６と、データ取得及び分析システム４８と、メモリ回路５０と、インタフェース５２とを含む。制御回路４６とデータ取得及び分析システム４８との両方は、メモリ回路５０（例えばソリッドステートメモリ装置、ダイナミックメモリ装置並びにオンボード及び／又はオフボードのメモリ装置等）に動作可能に接続される１つ以上のプロセッサ（例えば図３に表すプロセッサ１００であり、プロセッサ１００の例はマイクロプロセッサ、マルチコアプロセッサ、フィールドプログラマブルゲートアレイ等のデジタル処理回路又は他の任意の適切な処理回路を含む）を含む。メモリ回路５０は、機械が実行可能な、例えば１つ以上のコンピュータ、プロセッサ又は他の類似する論理装置を制御してある機能を提供するための命令を記憶できる。特定用途向け又は汎用コンピュータは、少なくとも部分的に制御回路４６並びにデータ取得及び分析システム４８を構成することができる。制御回路４６は、例えば流体制御、光学制御、ステージ制御及び器械１２の他の任意の有益な機能のためのコマンドを処理するように構成される（例えばプログラムされる）回路を含み得る。データ取得及び分析システム４８は、光学検出システムとインタフェースを取って、光学検出システム２６及び／又はステージ２４の移動、周期的検出のための発光、並びに戻った信号の受け取り及び処理等を命じる。器械１２は、器械１２の制御及び監視、試料の移送、自動化又は半自動化されたシーケンシング作業の起動及びレポートの生成等を可能にするオペレータインタフェース等の様々なインタフェース５２（例えばインタフェース装置）を含むこともできる。最終的に、図１の実施例では、外部ネットワーク又はシステム５４を、分析、制御、監視、サービス及び／又は他の作業のために、器械１２と接続し、器械１２と協働することができる。
【００３９】
本明細書で説明する１つ以上の実施例において、器械１２は、クラスタを生成するために結合される試薬及び試料テンプレート混合物をフローセル２０上に流す前に、試薬３０のオンボードかつ自動化された輸送及び混合を提供することができる。器械１２は、混ぜ合わされる試薬３０の量、試薬３０を対応する試薬容器から引き出す順序、温度及びタイミング（例えば、試薬３０を試料テンプレートと混合する前の試薬３０が予混合状態である期間）を含む、様々な試薬要因を制御して、手作業で試薬３０の輸送及び混合を行った場合よりも得られる精度及び再現性を高めることができる。器械１２は試薬３０及び試料テンプレートを付加的に混合して、本明細書ではクラスタリング混合物と呼ばれる成果混合物が十分に均質になり、望ましいシーケンシング性能に対するフローセル２０上の分子クラスタの品質しきい値及び量を達成する。
【００４０】
なお、図１では単一のフローセル２０及び流体通路並びに単一の光学検出システム２６を図示している一方、ある器械１２には複数のフローセル２０及び流体通路を収容できる。例えば、このような２つ以上の構造体を設けて、シーケンシング及びスループットを向上させることができる。実際問題として、任意の数のフローセル２０及び通路を設けることができる。これらは、同じ又は異なる試薬容器、廃棄容器、制御システム及び画像分析システム等を利用できる。複数のフローセル２０及び複数の流路を別個に制御することができ、又は調和させて制御することができる。本明細書では、表現「流体的に接続される」を用いて、互いに流体的に連通するように配置する２つ以上の構成要素間の接続を説明でき、同様に、表現「電気的に接続される」を用いて、２つ以上の構成要素間の電気接続を説明できることが理解される。表現「流体的に挿入される」を用いて、例えば構成要素の特定の順序を説明できる。例えば、構成要素Ｂが構成要素Ａと構成要素Ｃとの間に流体的に挿入される場合、構成要素Ａから構成要素Ｃまで流れる流体は、構成要素Ｃに到達する前に構成要素Ｂを通って流れることができる。
【００４１】
図２は、図１のシーケンシングシステム１０の流体システム５５の実施例を示す。流体システム５５を、図１に表す器械１２にオンボードに配置することができる。図示した実施例では、フローセル２０は、シーケンシング作業の間、流動物質（例えば試薬、バッファ、反応媒体）を受け取るために、組として集められ得る一連の経路又はレーン５６Ａ及び５６Ｂを含む。レーン５６Ａは第１共通レーン５８に接続される一方、レーン５６Ｂは第２共通レーン６０に接続される。流体をフローセル２０に入らずに迂回させ得るバイパスライン６２も設ける。図示した実施形態では、バイパスライン６２は、バイパスライン６２の丈に沿うキャッシュチャネル１１８を含む。本明細書でより詳細に説明するように、試薬を一時的に保管するとともに試薬を初期に混合するために、キャッシュチャネル１１８を用いることができる。上述したように、一連の導管又は容器６４は、シーケンシング作業の間に利用することができる試薬（例えば図１の試薬３０）及び他の流体を保管できる。
【００４２】
試薬セレクタ／選択バルブ６６は、モータ又はアクチュエータ（図示せず）に接続されて、フローセル２０に導入される対応する容器６４の１つ以上の試薬を選択できる。その後選択される試薬を、同様にモータ（図示せず）を含む共通ラインセレクタ／選択バルブ６８に進める。共通ラインセレクタバルブ６８に、共通ライン５８及び６０の１つ以上又は両共通ラインを選択して、試薬をレーン５６Ａ及び／又は５６Ｂに制御して流すよう命令できる。共通ラインセレクタバルブ６８に、バイパスライン６２を通じてキャッシュチャネル１１８内に試薬を流すように命令できる。なお、バイパスライン６２によって、例えば、フローセル２０を通じて空気を引き出すこと無くすべての試薬（及び液体）を試薬セレクタバルブ６６（及び共通ラインセレクタバルブ６８）に準備する能力、フローセル２０とは無関係に様々な流路３４を洗浄（例えば自動的又は半自動的洗浄）する能力、システム５５上で診断機能（例えば圧力及び送達量テスト）を実施する能力等によって、他の有益な作業も可能である。
【００４３】
流体システム５５の構成要素の少なくとも一部を、構造マニホールド１０４に包含し又は構造マニホールド１０４上に配置できる。例えば、マニホールド１０４は、試薬セレクタバルブ６６、共通ラインセレクタバルブ６８、共通ライン５８，６０及び／又はキャッシュチャネル１１８を含むバイパスライン６２等を含み又は保持することができる。一実施例に従うマニホールド１０４を、図４及び５に表す。
【００４４】
使用済み試薬は、フローセル２０を出て、フローセル２０とポンプ３８との間に接続される流路３６を通る。図示した実施例では、ポンプ３８は、一対のシリンジ７０を有するシリンジポンプである。アクチュエータ７２は、試験、検査及びシーケンシングサイクルの様々な作業中に、一対のシリンジ７０を制御し移動させて試薬及び他の流体を吸引し、試薬及び流体を排出する。ポンプ３８は、バルブ、器械及びアクチュエータ等（図示せず）を含む他の様々な部品及び構成要素を含み得る。図示した実施例において、圧力センサ７４Ａ及び７４Ｂはポンプ３８の入口ラインにかかる圧力を感知する一方、圧力センサ７４Ｃを設けてポンプ３８が出力する圧力を感知する。
【００４５】
システム５５が使用する流体は、ポンプ３８から使用済み試薬セレクタ／選択バルブ７６に入る。バルブ７６は、使用済み試薬及び他の流体に対する複数流路の１つを選択できる。図示した実施例において、第１流路は第１使用済み試薬容器７８につながる一方、第２流路は流量計８０を通って第２使用済み試薬容器８２につながる。使用される試薬によっては、試薬を収集すること、又は特定の試薬を廃棄用の別個の容器に置くことが有利となり得て、使用済み試薬セレクタバルブ７６はこのような制御ができる。
【００４６】
なお、ポンプ３８内のバルブは、ポンプ３８に、試薬、溶剤、クリーナ及び空気等を含む様々な流体を吸引させることができ、共通ライン５８，６０、バイパスライン６２及びフローセル２０の１つ以上を通って注入又は循環させることができる。
【００４７】
流体システム５５は、混合、試験、検証及びシーケンシング等の規定のプロトコルを実装する制御回路４６のコマンドの下で動作する。規定のプロトコルを予め制定し、規定のプロトコルは、試薬の吸引、混合容器への試薬の輸送、試薬の混合、フローセル２０上に試薬混合物を流すこと、フローセル２０上の分子のシーケンシング、シーケンシングに関するデータの取得及びデータの分析等の様々な動作に対する一連のイベント及び作業を含む。プロトコルは、（図１に表す）メモリ回路５０に記憶され、試薬の輸送及び混合等の流体作業を、フローセル２０で起こる反応並びにフローセル２０及びその部位の撮像等の、器械１２の他の作業とともに調和させることができる。図示した実施例において、制御回路４６は、バルブ６６，６８に対するコマンド信号を提供するように構成される１つ以上のバルブインタフェース８４と、（例えばアクチュエータ７２による）ポンプ３８の作業を命令するように構成されるポンプインタフェース８６とを含む。メモリ回路５０からの特定のプロコトルに従ってバルブインタフェース８４及びポンプインタフェース８６が指令信号を生成し、制御回路４６は当該プロトコルを実施する。圧力センサ７４Ａ−Ｃ及び流量計８０等からのフィードバックを受け取って当該フィードバックを処理する、様々な入力／出力回路８８も設けられる。
【００４８】
図３は、制御管理システム４４の特定の機能的要素を示す。図示するように、メモリ回路５０はプロトコルを記憶する。当該プロトコルは、混合中、試験中、試運転中、トラブルシューティング中、サービス中及びシーケンシング作業中に実行される規定の手順である。このような多数のプロトコルをメモリ回路５０に実装でき記憶でき、当該プロトコルを時々更新又は変更することができる。図３に示すように、当該プロトコルは、様々なバルブ（例えばバルブ６６及び６８）、ポンプ（例えばポンプ３８）並びに器械１２の他の任意の流体アクチュエータを自動的に制御する流体制御プロトコル９０を含み得る。流体制御プロトコル９０は、試薬のキャッシュへの吸引、試薬の混合容器内への排出、混合容器での試薬の試料テンプレートとの混合及び結合される試薬と試料との混合物をフローセル２０に流すことを自動的に制御する様々な手順を表すことができる。流体制御プロトコル９０は、バルブ６６及び６８並びにポンプ３８の動作を指示して、試薬の輸送及び混合を制御する。流体制御プロトコル９０は、様々な事前設定される手順に従って試薬の選択、吸引、輸送及び混合を制御する（混合プロトコルと呼ばれる）複数プロトコル９０Ａ−Ｃを含み得る。例えば、プロトコル９０Ａ−Ｃは、複数の異なる試薬容器から試薬をキャッシュチャネルに、指定された量及び／又は指定されたシーケンスで吸引し、その後キャッシュチャネルから試薬を混合容器に排出し、混合容器内で試薬を試料テンプレートと混合してクラスタリング混合物を構成する手順を含み得る。
【００４９】
複数プロトコル９０Ａ−Ｃは、吸引される特定の試薬、各吸引サイクル中に吸引される試薬の特定量、様々な対応する試薬容器から吸引される試薬の指定順序シーケンス、吸引される試薬を混合容器に排出する前に実施される吸引サイクルの特定数、混合するために試薬を排出する特定容器（例えばテンプレート容器又は異なる容器）、試薬の吸引及び排出の間の特定経過時間、試薬を試料テンプレートと混合する吸引混合サイクルの特定数、並びに試薬の輸送及び混合作業の間のポンプ３８の特定圧力出力等を指定することができる。上記の１つ以上の態様において、第１混合プロトコル９０Ａは、第２混合プロトコル９０Ｂ及び第３混合プロトコル９０Ｃと、例えば吸引する試薬の種類、タイミング及び／又はポンプ圧力出力が異なることがある。メモリ回路５０に記憶される他のプルコトルの代わりに、使用される試料テンプレートの種類、使用されるフローセル２０の種類又は特定の望ましい試薬−試料混合物（本明細書ではクラスタリング混合物と呼ばれる）等に基づいて、実装される流体制御プロトコル９０を選択することができる。３つの流体制御（又は混合）プロトコル９０Ａ−Ｃを図３に表すが、メモリ回路５０は４つ以上又は２つ以下の混合プロトコルを記憶できる。流体制御プロトコル９０は、バルブセンサ、流れセンサ及び／又は圧力センサ（例えば７４Ａ−Ｃ）等の流体センサからのフィードバックを受け取り処理する手順又は作業を含むこともできる。
【００５０】
ステージ制御プロトコル９２は、例えば撮像中に、フローセル２０の所望の移動を可能とする。光学制御プロトコル９４は、撮像要素にフローセル２０の一部を照射する命令を発行できるとともに、処理を行うため戻った信号を受け取る命令を発行できる。画像取得及び処理プロトコル９６は、シーケンシングに関して有益なデータを抽出するために、画像データを少なくとも部分的に処理できる。他のプロトコル９８を、同一のメモリ回路又は異なるメモリ回路５０で提供することができる。メモリ回路５０を、ハードディスクドライブ、フラッシュ記憶装置、若しくは他の非一過性のコンピュータ読取可能記憶媒体等の１つ以上のデジタルメモリ装置として提供することができ、これらを含むことができ、又はこれらのなかに包含され得る。デジタルメモリ装置は、揮発性及び非揮発性メモリ回路の両方を含み得る。図１ではメモリ回路５０をオンボードの器械１２として表すが、代わりにメモリ回路５０の少なくとも一部をオフボードとすることができ、プロトコルを提供して回路４６を制御する制御回路４６にオンボードで通信可能に接続することができる。
【００５１】
制御回路４６の１つ以上のプロセッサ１００は、メモリ回路５０に記憶されたプロトコルにアクセスし、器械１２上で当該プロトコルを実行する。上述したように、制御回路４６を、特定用途向けコンピュータ、汎用コンピュータ又は任意の適切なハードウェア、ファームウェア及びソフトウェアプラットフォームの一部とすることができる。人間のオペレータが、オペレータインタフェース１０１を経て、プロセッサ１００及び器械１２の作業に命令することができる。オペレータインタフェース１０１によって、試験、試運転、トラブルシューティング及びサービスを行うことができ、またオペレータインタフェース１０１は器械１２で発生し得る任意の問題を報告することができる。またオペレータインタフェース１０１は、メモリ回路５０に記憶され選択される１つ以上のプロトコルに従って、器械１２の構成要素を制御する制御回路４６が自動的に実施するシーケンシング作業を起動でき監視できる。
【００５２】
図４は、一実施例に従う図２に表す流体システム５５のバルブアセンブリ１０２を示す。バルブアセンブリ１０２は、容器から試薬及び他の流体（例えばバッファ流体及び試料テンプレート等）を引き出して、試薬及び他の流体を（図２に表す）フローセル２０に送達する。バルブアセンブリ１０２は、流体チャネル１１４を画定して試薬及び他の流体に関する流路を提供するマニホールド１０４を含む。試薬セレクタバルブ６６及び共通ラインセレクタバルブ６８を流体チャネル１１４に流体接続するマニホールド１０４に接続する（例えば統合する）。図４に見られるように、モータ１０８及び１０６はそれぞれ、対応する試薬セレクタバルブ６６及び共通ラインセレクタバルブ６８を駆動し制御する。１つ以上のモータインタフェース又は接続部１１０は動力を供給し、必要に応じて、モータ１０６，１０８へ信号を供給するとともにモータ１０６，１０８から信号を受け取る。上述したように、制御回路４６は、試験中、試運転中、サービス中及びシーケンシング作業中、（例えば試薬を輸送し及び試薬を混合するために）モータ１０６，１０８を制御する（とともにモータ１０６，１０８を用いてバルブ６８，６６を制御する）。
【００５３】
マニホールド１０４内の流体チャネル１１４は、シッパー１１２に流体的に結合する。流体チャネル１１４は、シッパー１１２及びバルブ６６，６８の間で延びる。複数のシッパー１１２はマニホールド１０４からそれぞれの遠位先端１０５まで延長する。シッパー１１２は、以下より詳細に説明するように、異なる対応容器（例えば図２に表す容器６４）内に延在して、遠位先端１０５が容器の試薬又は他の流体に接触するように構成される。作業中、シッパー１１２は試薬及び他の流体をそれぞれの容器からマニホールド１０４の流体チャネル１１４に引き出す。流体チャネル１１４を、成型、エッチング又は他の適切なプロセスによって形成して、（図２に表す）ポンプ３８が試薬及び他の流体を吸引するよう（制御回路４６によって）命令されるときに、試薬及び他の流体をシッパー１１２からバルブ６６，６８へ移動させることができる。シッパー１１２の少なくとも１つを、クラスタリング混合物をフローセル２０上に流す前に、試薬及び試料テンプレート（クラスタリング混合物を一緒に定める）を混合する際に支援するノズルシッパー１１６として構成する。ノズルシッパー１１６は混合容器と位置合わせされて混合容器に延在する。他のシッパー１１２の少なくとも一部は、その中に異なる試薬が予めロードされる対応試薬容器（例えば図６に表す試薬容器１２４，１２６及び１２８）と位置合わせされて対応試薬容器に延在する試薬シッパー１１５として構成される。
【００５４】
混合容器を、試料テンプレートが予めロードされるテンプレート容器１３６（図６に表す）とすることができ、又はテンプレート容器１３６及び試薬容器から分離される（とともに試料テンプレート又は試薬が予めロードされない）他の容器とすることができる。ある実施例では、混合容器又は容積をバイパスライン６２の一部又は全部とすることができる。例えば、試薬を所望の配列でバイパスライン６２内に吸引できるが、試薬がバイパスラインの全長は通過しない（これにより、試薬を廃棄するルートで送り得る）。バイパスライン６２（またはバイパスライン６２において混合容器又は容積として役立つ部分）に試薬の所望の配列をロードすると、例えば行先容器につながる流路と流体的に接続して、その後バイパスライン６２内にロードされた試薬のセット全体をバイパスラインから行先容器に戻し排出できるように、バルブを用いて、試薬が導入されるバイパスライン６２の端部を切り替えることができる。他の実施形態では、混合容器又は容積を、例えば予め混合した流体を送達する行先容器である、行先容器等とすることができ、又は、例えば選択される試薬の送達前には完全に空である、分離した行先容器等とすることができる。
【００５５】
マニホールド１０４は、流体チャネル１１４にバルブ６６，６８を通じて流体的に接続されるキャッシュチャネル１１８も含む。キャッシュチャネル１１８は、図２に表すバイパスライン６２に沿って配置され、キャッシュチャネル１１８を用いて、バルブ６６，６８及びポンプ３８（図２に表す）が引き出してキャッシュチャネル１１８に動かす試薬を一時的に保管及び／又は少なくとも部分的に混合する。
【００５６】
図５は、図４に表すバルブアセンブリ１０２の平面図である。作業中、試薬セレクタバルブ６６は、対応する容器からシッパー１１２（図４に表す）を通じて吸引される（又は引き出される）試薬を受け取り、吸引した流体を共通ラインセレクタバルブ６８に導く。キャッシュチャネル１１８は、共通ラインセレクタバルブ６８に流体的に結合して、試薬を共通ラインセレクタバルブ６８で保管及び／又は混合できる。キャッシュチャネル１１８を、共通ラインセレクタバルブ６８とポンプ３８（図２に表す）との間に配置できる。マニホールド１０４は、マニホールド１０４（例えばマニホールド１０４の流体チャネル１１４）をシッパー１１２に結合する、ポート１２０も含む。ポート１２０の１つ（符号１２２で示す）を、ノズルシッパー１１６に接続して、試薬を行先容器（例えば混合容器、キャッシュチャネル１１８等）に注入でき、行先容器から試薬を混合するために引き出し得る。行先容器を例えば、コンテナ、チューブ又は試薬を包含するように設計される他の容器とすることができる。行先容器を例えば、一時的作業容積として使用できる。試薬及び／又は他の材料を、例えば混合によってフローセルへの搬送用に調製するために、当該一時的作業容積に送達できる。このように、試薬及び他の流体を、行先容器で調製した後、行先容器からフローセル２０に送達することができる。
【００５７】
図６は、一実施例に従う流体システム５５の一部を表す模式図である。図６に、シッパー１１２、流体チャネル１１４、キャッシュチャネル１１８、試薬セレクタバルブ６６、共通ラインセレクタバルブ６８、ポンプ３８及び制御回路４６を示す。流体システム５５は、器械１２（図１に表す）の例えばオペレータが器械１２に挿入するカートリッジ（図示せず）に追加することができる、複数の容器又は導管も含む。キャッシュチャネル１１８は、ポンプ端部２５０と容器端部２５２との間に延びる。ポンプ端部２５０は、ポンプ３８に動作可能に接続される。例えば、ポンプ端部２５０はポンプ３８に流体的に接続されて、ポンプ３８はキャッシュチャネル１１８を通じて空気の作用によって陽圧及び陰圧を加えて、試薬及び他の流体をキャッシュチャネル１１８を通じて動かすことができる。容器端部２５２は、バルブ６６，６８及び流体チャネル１１４を通じてシッパー１１２に流体的に接続される。図示する配置では、容器端部２５２を共通ラインセレクタバルブ６８に直接結合し、共通ラインセレクタバルブ６８を試薬セレクタバルブ６６の出口に結合して、共通ラインセレクタバルブ６８をキャッシュチャネル１１８と試薬セレクタバルブ６６との間に配置する。
【００５８】
キャッシュチャネル１１８は、流体チャネル１１４の直径よりも大きな直径を有するよう設計され、キャッシュチャネル１１８は流体チャネル１１４よりも大きな容積の流体を保管できる。一実施例では、キャッシュチャネル１１８は約２ mlの容積又は容量を有するが、他の実施形態は他の容積を有することができる。直径をより大きくすることで、キャッシュチャネル１１８の試薬を、混合容器に排出される前に混ぜ合わせ始めることができる。しかしながら当該直径は、本明細書でより詳細に説明するように、流体バッファを生成して、システム５５のバッファ流体がキャッシュチャネル１１８の試薬と混合して希釈することを防止できるのに十分な小ささである。図示する実施例では、キャッシュチャネル１１８は、１８０°のループすなわちスイッチバック１４４を含む蛇行形状を有する。蛇行状とすることで、比較的小さな領域において、直径を十分に小さくしてバッファ流体による希釈を低減させて、チャネル１１８からの試薬量を正確に計量する能力を維持したまま、試薬が保管される容積を比較的大きくできる。他の実施例において、キャッシュチャネル１１８は他の形状を有することできる。
【００５９】
図示する実施例において、容器は、試薬１３０，１３２及び１３４をそれぞれ中に保管する、３つの試薬容器（又は導管）１２４，１２６及び１２８と、調製される試料テンプレート（又は遺伝的ライブラリ）１３８をその中に保管する１つのテンプレート容器１３６とを含む。容器１２４，１２６，１２８及び１３６を、接続される蓋を有する分離したチューブとして表すが、他の実施例では容器１２４，１２６，１２８及び１３６を異なるものとし得る。例えば、開閉可能な蓋の代わりに、チューブを、シッパー１１２が貫通するように構成される箔又は箔状材料で密封することができる。容器１２４，１２６，１２８及び１３６をカートリッジ（図示せず）内に挿入して、カートリッジがマニホールド１０４に結合しているときに、容器１２４，１２６，１２８及び１３６をマニホールド１０４（図４に表す）のシッパー１１２と位置合わせされる指定位置で保持できる。任意に、分離しているチューブ又は他の導管の代わりに、容器１２４，１２６，１２８及び１３６の少なくとも一部をカートリッジ等の構造に対して一体的な空洞として定めることができる。図は、容器１２４，１２６，１２８及び１３６がほぼ同じ寸法であり、容器１２４，１２６，１２８及び１３６に事前に満たされる流体（例えば試薬及び試料テンプレート）の量がほぼ同じことを示しているが、容器１２４，１２６，１２８及び１３６の少なくとも一部を異なる寸法とし、異なる形状とし及び／又は（容器から流体を取り出す前の）中の流体量を相違させることができる。さらに、図示される実施例では、３つの試薬１３０，１３２及び１３４を表しているが、他の実施例では、混合されて試薬混合物を形成する、２つのみの試薬又は少なくとも４つの試薬を含むことができる。
【００６０】
異なる試薬１３０，１３２及び１３４は、少なくとも一部が相互に異なる試薬成分を含む。他の試薬に長期さらされることによる安定性の課題のため、試薬を、使用する準備ができるまで、異なる試薬容器１２４，１２６及び１２８に分離して保管することで、試薬混合物の使用可能寿命及び／又はシーケンシング作業の達成可能な性能を向上できる。一実施例では、試薬を任意の適切な材料とすることができる。例えば、第１試薬を約１．０１から約１．１の比重を有する任意の混合物とすることができる。第２試薬を約１．０５から約１．１５の比重を有する任意の混合物とすることができる。第３試薬を約１．０１から約１．１の比重を有する任意の混合物とすることができる。他の実施例では、試薬を任意の適切な材料とすることができる。例えば、第１試薬を25℃で約1.5 cPから約4 cPの粘度を有する任意の混合物とすることができる。第２試薬を25℃で約5 cPから約10 cPの比粘度を有する任意の混合物とすることができる。第３試薬を25℃で約10 cPから約50 cPの粘度を有する任意の混合物とすることができる。
【００６１】
一例として、容器１２４内の第１試薬１３０は、少なくとも１つの生化学的分子を含むことができる。生体分子は、ヌクレオチド（例えばヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ））及び／又はタンパク質を含むことができる。タンパク質は、ポリメラーゼ、一本鎖タンパク質、ヘリカーゼ、トポイソメラーゼ、プライマーゼ、テロメラーゼ、リガーゼ又はリコンビナーゼ等を含み得る。タンパク質は、酵素として機能することができる。一例として、容器１２６内の第２試薬１３２は、タンパク質等の生体分子を含むことができる。第２試薬１３２内のタンパク質を、前述の１つ以上のタンパク質とすることができる。一例として、容器１２８内の第３試薬１３４は、マグネシウム及び密集剤を含むことができる。密集剤は、デキストラン、FICOLL（登録商標、GE Healthcare Life Science社から入手可能な中性、高度分岐、高質量、親水性多糖類）、ポリエチレングリコール（PEG）、ポリビニルアルコール（PVA）又はヘモグロビン若しくはオボアルブミン等のタンパク質とすることができる。密集剤の寸法及び／又は濃度によって溶液中の他の分子が利用可能な溶媒の容積が減少するため、密集剤は溶液内の分子の特性を変える。試薬１３０，１３２及び１３４を前述した分子のいずれかの組み合わせとすることができ、他の実施例では、試薬１３０，１３２及び１３４を異なる成分及び／又は列挙される成分の異なる分布とすることができる。３つの試薬１３０，１３２及び１３４は、水及び／又は界面活性剤等の１つ以上の成分を共通に有することができる。
【００６２】
製剤成分が異なるため、自動化された試薬の輸送及び混合を課題とする試薬１３０，１３２及び１３４は、異なる流体特性を有することができる。例えば、試薬１３０，１３２及び１３４は、異なる密度、粘度及び油界面張力を有して、試薬の混和性を課題とすることができる。一例として、異なる試薬の粘度は25oCで約1.5 cPから約50 cPまで及び得る一方、油界面張力は約5.0 dynes/cmから約19.2 dynes/cmまで及び得る。したがって、試薬及び試料テンプレートが混合することなく結合しているとき、混合容器１３６において異なる試薬及び試料テンプレートを明瞭な縞として可視化させることができる。
【００６３】
粘度がより高い試薬はシステム又は器械１２（図１に表す）内の圧力を上昇させるため、比較的粘度が大きい試薬は試薬の輸送の自動化を課題とする。（より小さな粘度の試薬に関連するより低い圧力に対して）より高い圧力は、ポンプ３８が試薬をシステムを通じて動かすための出力を上昇させ、これによりエネルギー使用量を増加させることがあるとともに閉システムの漏出又は損傷のリスクを高めることがある。一実施例では、従来の試薬に対して、試薬１３０，１３２及び１３４の少なくとも一部の粘度を低減することを考案する。例えば、試薬１３０，１３２及び１３４の１つ以上は、高分子量の密集剤とは対照的な、低分子量の密集剤を含むことができる。低分子量の密集剤を、約11,000 Daltons （ダルトン、Da）未満（例えば約10,000 Da、約9,000 Da、約8,000 Da、約7,000 Da）の分子量の分子とすることができる。本明細書で説明する実施例の１つ以上において、試薬１３０，１３２及び１３４の１つ以上で使用される密集剤を、デキストラン、FICOLL（登録商標）、ポリエチレングリコール又はヘモグロビン若しくはオボアルブミン等のタンパク質とすることができる。低分子量密集剤の分子量は、30,000 Da超となり得る、ある既知の試薬で使用される密集剤の分子量よりも相当に低い。低分子量密集剤を使用することで、対応する試薬の粘度を、より高い分子量密集剤を有する既知の試薬に対して低減させることができる。粘度を低減することで、器械１２のシステムの圧力を低減することができるとともに試薬１３０，１３２及び１３４の輸送及び混合を改善することができる。
【００６４】
一実施例では、界面活性剤を試薬１３０，１３２及び１３４の１つ以上に導入して、異なる流体特性を持つ試薬の混和性を高める。試薬容器１２４，１２６及び１２８の全てに界面活性剤を加えることができ、又は界面活性剤を試薬容器１２４，１２６及び１２８の全てに包含させることができる。界面活性剤は、一般にTWEEN（Croda Americas社の登録商標）20と呼ばれるポリソルベート２０及び／又は他の市販界面活性剤若しくは洗浄剤とすることができる。試薬内に界面活性剤を使用することで、試薬の混合効率を改善でき、実質的に均質な混合を、界面活性剤無しに試薬を混合する場合に対して、より少ない混合（例えばより少ない混合サイクル、より小さい混合強度、より短い混合時間、より少ないタンパク質の流れ等）で達成できる。試薬内に界面活性剤を使用することで、試薬を界面活性剤無しで構成する場合に対して、試薬の分子とシステムの様々な表面との間の摩擦を低減することもでき、これによって流体輸送をより良くし得るとともに分子−表面の相互作用を小さくし得る。
【００６５】
輸送ステージの間、流体システム５５は、予混合して試薬混合物を定めるために、試薬１３０，１３２及び１３４をそれぞれの容器１２４，１２６及び１２８から一時的な保管導管に輸送し、その後試薬混合物を試料テンプレート１３８と混合する混合容器に輸送するように構成される。制御回路４６は、コマンド又は制御信号をバルブ６６，６８及びポンプ３８に伝達して、メモリ回路５０（図３）に記憶される混合プロトコル９０（図３に表す）の選択された１つに従って、システム５５による試薬１３０，１３２及び１３４の輸送及び混合を自動的に制御する。
【００６６】
一実施例において、試薬１３０，１３２及び１３４を予混合するために使用される一時的な保管導管は、キャッシュチャネル１１８である。例えば、試薬１３０，１３２及び１３４を、それぞれの容器１２４，１２６及び１２８から、容器内に延在する対応シッパー１１５を通じてキャッシュチャネル１１８に吸引する（又は引き出す）。ポンプ３８及び試薬セレクタバルブ６６を制御して、各試薬を対応流体チャネル１１４に沿う対応シッパー１１５によって、容器端部２５２を通じてキャッシュチャネル１１８に吸引する。以下より詳細に説明するように、試薬１３０，１３２及び１３４を、試薬間で等しくすることも相違させることもできる、指定量の試薬として吸引する。試薬１３０，１３２及び１３４を、任意に一度以上繰り返すことができる、順序付けられるシーケンスで、（実装されるプロトコルに従って）キャッシュチャネル１１８から試薬を排出する前又は後に、１つずつ吸引することができる。その結果、キャッシュチャネル１１８は、キャッシュチャネル１１８の丈に沿った試薬１３０，１３２及び１３４の交互のパターンを有することができる。
【００６７】
試薬１３０，１３２及び１３４のそれぞれをキャッシュチャネル１１８内に指定容積吸引した後、キャッシュチャネル１１８から試薬混合物の少なくとも一部を混合容器に排出する。混合容器で試薬混合物を試料テンプレートと混合する。図示する実施例では、混合容器は、その中に試料テンプレートが予めロードされるテンプレート容器１３６である。しかしながら、代替的実施例では、混合容器をテンプレート容器１３６とは異なるものとすることができる。例えば、混合容器を、試薬容器１２４，１２６又は１２８の１つとして、試薬混合物を混合するためにキャッシュチャネル１１８から試料容器の１つに排出することができる。他の代替的実施形態では、混合容器を、試薬容器及びテンプレート容器とは異なる指定混合容器とすることができる。このような実施例において、試薬１３０，１３２及び１３４の吸引と同様に、テンプレート容器１３６から試料テンプレートを吸引し、その後、試薬混合物を混合容器に排出する前又は後に、指定混合容器に排出することができる。
【００６８】
ポンプ３８及び試薬セレクタバルブ６６を制御して、試薬混合物を、ノズルシッパー１１６をキャッシュチャネル１１８の容器端部２５２に接続する流体チャンネル１４２経由で、ノズルシッパー１１６に推進することで、試薬混合物を混合容器に排出する。混合ステージの間、混合容器内で試薬混合物を試料テンプレートと混合してクラスタリング混合物を構成し、続いてクラスタリング混合物をフローセル２０（図２に表す）に流す。したがって、流体システム５５は、試薬を、フローセル２０に流す前に、キャッシュチャネル１１８に自動的かつ選択的に次々吸引し、混合容器に注入し、試料テンプレートと混合できる。
【００６９】
図７は、一実施例に従う流体システム５５の模式図を示す。当該模式図では、説明の明瞭性のために、蛇行するキャッシュチャネル１１８を直線状として図示する。一実施例では、輸送（又は運送）ステージの間、流体システム５５は湿っており、キャッシュチャネル１１８に、空気を用いて試薬を操作する（例えば押圧する）ために、液体バッファ流体２５６が充填される。プライミング及び洗浄等のために液体バッファ流体２５６を用いることもできる。図２に表す制御回路４６によって、より具体的には制御回路４６のポンプインタフェース８６及びバルブインタフェース８４によって、ポンプ３８及び試薬セレクタバルブ６６を制御する。
【００７０】
吸引作業において、制御回路４６は共通ラインセレクタバルブ６８（図６に表す）を制御して、試薬１３０，１３２及び１３４をキャッシュチャネル１１８に導く。制御回路４６は試薬セレクタバルブ６６を制御して、選択される実装済み混合プロトコル９０が指定するように、異なる試薬１３０，１３２及び１３４の１つ以上を順序付けられるシーケンスで一度に選択する。ポンプ３８を制御して、選択される１つ以上の試薬を対応シッパー１１５に吸い込み又は引き出す陰圧を提供する。図示する実施例では、セレクタバルブ６６を制御して、試薬を、第１試薬１３０とその次の第２試薬１３２とその次の第３試薬１３４とを含むシーケンスにおいて、１度に１つ、指定測定容積だけ吸引する。当該シーケンスで試薬を吸引することで、キャッシュチャネル１１８に、試薬の体積のセットが生成される。
【００７１】
一実施例では、ポンプ３８及びセレクタバルブ６６を制御して、試薬の吸引を順序付けられるシーケンスで少なくとも一度繰り返し、その結果キャッシュチャネル１１８に試薬の複数セットが共に生成される。例えば図示する実施例では、符号１４６，１４８，１５０，１５２及び１５４が示すように、キャッシュチャネル１１８が５つの試薬セットを含むよう、４回追加してシーケンスを繰り返す。セット１４６は１番目に吸引されたセットであり、バッファ流体２５６とセット１４８との間に配置される。例示的混合プロトコルに従う図７では、試薬を５ラウンド又は５サイクル吸引するが、他のプロトコルに従ってポンプ３８及びセレクタバルブ６６を制御して、より多数の又はより少数の吸引サイクルを実施できる。例えば、他のプロトコルに従って、試薬を排出する前に、キャッシュチャネル１１８が試薬の７セットを共に保持するように、試薬を７ラウンド吸引できる。ポンプ３８及び試薬セレクタバルブ６６を制御して、複数試薬を指定量引き出し、当該指定量を等しくすることも相違させることもできる。例えば、セット１４６，１４８，１５０，１５２及び１５４において第１試薬１３０を表す区分（符号「１」を付す）の長さが第２試薬１３２を表す区分（符号「２」を付す）の長さと比較してより長いように、各セットにおいて第１試薬の指定量は第２試薬の指定量を超えることができる。
【００７２】
複数の吸引サイクルによって、キャッシュチャネル１１８は、キャッシュチャネル１１８の丈に沿って、試薬１３０，１３２及び１３４の交互のパターンを包含する。キャッシュチャネル１１８内の様々な試薬１３０，１３２及び１３４の分量の境界面で、試薬１３０，１３２及び１３４を混ぜ合わせ始めることができる。したがって、混合容器で混合する前に、キャッシュチャネル１１８内で試薬１３０，１３２及び１３４を予混合することができる。試薬１３０，１３２及び１３４を吸引しキャッシュチャネル１１８に保持する時間中に、混合容器（図示する実施例ではテンプレート容器１３６である）は試料テンプレート１３８のみを包含する。上述したように、試料テンプレート１３８はＤＮＡライブラリの核酸又は他の遺伝子材料を含む。テンプレート容器１３６に試料テンプレート１３８を予めロードすることができる。図７に示すように吸引されると、その後制御回路４６は試料セレクタバルブ６６を混合プロトコル９０に従って制御して、ポンプ３８にキャッシュチャネル１１８から試薬１３０，１３２及び１３４を、その中で試料テンプレート１３８と混合するために、テンプレート容器１３６内に注入又は排出させることができる。
【００７３】
図８は、試薬混合物の一部をテンプレート容器１３６内に排出した後の、図７に表す流体システム５５の模式図を示す。試薬混合物を、選択される混合プロトコル９０に従って混合するために、キャッシュチャネル１１８から容器１３６内に排出するよう、制御回路４６はポンプ３８を制御して、試薬混合物を試薬セレクタバルブ６６に向かって押圧する陽圧を生成する。試薬セレクタバルブ６６を作動させて試薬混合物を流体チャネル１４２に沿って導く。ノズルシッパー１１６を通じて試薬混合物をテンプレート容器１３６内に排出し、容器１３６で試薬混合物を試料テンプレート１３８と混合する。試薬１３０，１３２及び１３４は試料テンプレート１３８と結合して、クラスタリング混合物２６２を構成する。クラスタリング混合物２６２は、その後の混合プロセスの後に、完全に混合され少なくとも実質的に均質となる。
【００７４】
図示する実施例では、試薬１３０，１３２及び１３４の最大吸引量未満をキャッシュチャネル１１８からテンプレート容器１３６内に排出する。例えば、試薬１３０，１３２及び１３４の５つのセット１４６，１４８，１５０，１５２及び１５４をキャッシュチャネル１１８内に引き出したが、５セットの全てを容器１３６内に排出したわけではない。図８に表すように、セット１５０，１５２及び１５４を容器１３６に排出した後、２つのセット１４６及び１４８はキャッシュチャネル１１８に残り、それによって試薬１３０，１３２及び１３４の残余容積を定める。セット１４６及び１４８はキャッシュチャネル１１８に保持されて、テンプレート容器１３６内に排出される試薬１３０，１３２及び１３４が希釈されるリスクを回避する。セット１４６はバッファ流体２５６と流体境界面２５８で接触するため、バッファ流体２５６が試薬１３０，１３２及び１３４と混合してそれにより試薬１３０，１３２及び１３４を希釈することがあるリスクが存在する。容器１３６内に注入される試薬混合物の試薬１３０，１３２及び１３４の指定濃度を維持するために、流体境界面２５８に存在するセット１４６とセット１４６に隣接するセット１４８とを犠牲にして使用して、バッファ流体２５６を、容器１３６内に排出される試薬混合物のかさ（例えばセット１５０，１５２及び１５４）から分離する上流バッファゾーンを生成する。代替的実施例では、試薬１３０，１３２及び１３４の１セット又は少なくとも３つのセットを犠牲にして上流バッファゾーンを構成することができる。上流バッファゾーンを構成するために犠牲になる試薬１３０，１３２及び１３４の量を、キャッシュチャネル１１８内に吸引される試薬１３０，１３２及び１３４のセットの総数とは無関係とすることができる。例えば、試薬１３０，１３２及び１３４の７セットをキャッシュチャネル１１８内に吸引した場合、７セットのうち５セットを混合容器に排出して、２セットを残した状態で上流バッファゾーンを構成することができる。
【００７５】
任意に、様々な試薬容器から試薬を吸引し、その後吸引される試薬のかさの少なくとも一部を混合容器に排出するプロセスを、選択される混合プロトコル９０に従って繰り返すことができる。例えば一実施例では、セット１５０，１５２及び１５４内の試薬１３０，１３２及び１３４のかさをテンプレート容器１３６内に排出した後、図７に表す順序付けられるシーケンスと同じシーケンスで、ポンプ３８及び試薬セレクタバルブ６６を制御して、１つ以上の付加的な試薬のセットを吸引できる。一実施例では、さらに２つのセット（図示せず）をキャッシュチャネル１１８内に引き込んで、チャネル１１８が４つの試薬セット（例えば上流バッファゾーンに使用されるセット１４６及び１４８を含む）を保持する。その後、ポンプ３８及び試薬セレクタバルブ６６を制御して、（バッファゾーンとして使用される試薬を排出することなく、）試薬の付加的な２つのセットをテンプレート容器１３６内に排出する。代替的実施例では、試薬を吸引するプロセスを一度のみ実施して、先の単一期間中に、混合容器内に排出される試薬の全数のセットが、キャッシュチャネル１１８内に吸引される。例えば、５セットを吸引する代わりに７セットのうち５セットを混合容器に排出するために、試薬の７セットをキャッシュチャネル１１８内に吸引し、その後付加的な２セットを吸引し排出する前に、３セットを排出する。
【００７６】
各セットで吸引される試薬の体積量と吸引されるセットの数とを制御して、既定体積の試薬混合物をテンプレート容器１３６内にもたらすことができる。既定体積の試薬混合物は、テンプレート容器１３６内の様々な試薬からなる既定体積比を有する。試薬容器を混合容器に投棄する代わりに、試薬容器から試薬を吸引することで、試薬容器内に予めロードする試薬体積に依拠するのに対して、試薬混合物においてより正確な体積及び比率の試薬を得ることができる。
【００７７】
図９は、一実施例に従う、混合ステージ中の流体システム５５の模式図を示す。試薬及び試料テンプレートの流体特性が異なるため、選択される混合プロトコル９０に従ってテンプレート容器１３６内でクラスタリング混合物２６２を能動的に混合して、クラスタリング混合物２６２を均質に（又は概ね均質に）する。一実施例では、ノズルシッパー１１６を通じて、あるかさ又は量２４６のクラスタリング混合物２６２をキャッシュチャネル１１８内に吸引することで、クラスタリング混合物２６２を混合して、その後当該かさ２６４のクラスタリング混合物２６２をテンプレート容器１３６に排出して戻す。吸引及び排出プロセスは、テンプレート容器１３６の渦度を増進し、これによりクラスタリング混合物２６２を効率よく混合する。
【００７８】
クラスタリング混合物２６２を吸引する前に、ポンプ３８及び１つ以上のバルブ６６を制御して、流体システム５５で空気をデプライミングする（de-prime）。デプライミングプロセスは、ポンプ３８を使用して、空気を、キャッシュチャネル１１８、流体チャネル１４２及び／又はノズルシッパー１１６等の流体ラインに引き出すことを伴うことができる。図９に表すように、クラスタリング混合物２６２をキャッシュチャネル１１８に引き出すときに、エアギャップ２６０によってクラスタリング混合物２６２をバッファ流体２５６から間隔を空ける。エアギャップ２６０は、バッファ流体２５６をクラスタリング混合物２６２から分離し、バッファ流体２５６がクラスタリング混合物２６２と混合して希釈することを妨げる。空気をシステムに導入するデプライミングステップは、システムが特定体積の流体を正確に吸引する能力を抑制することがあるが、混合ステージ中にこのような正確な測定は必要ではない。例えば、当該体積２６４のクラスタリング混合物２６２は実質的に容器１３６内に注入されて戻るため、クラスタリング混合物２６２の体積２６４を特定の正確に測定される量とする必要はない。それゆえに、一実施例では、試薬が吸引される輸送ステージの間、システムをプライミングする（すなわち空気をなくす）ことができ、その後混合ステージの間、システムはデプライミングする（空気を導入する）ことができる。空気を使用して、エアギャップ２６０においてクラスタリング混合物２６２の希釈を妨げるバッファを提供する。体積２６４のクラスタリング混合物２６２を容器１３６に排出して戻す間、体積２６４の全量とともにエアギャップ２６０からの空気の一部を、ノズルシッパー１１６を通じて排出する。容器１３６内に注入される空気は、容器１３６の渦度を、液体混合物２６２の排出がもたらす渦度よりも高めることができる。試薬混合物の一部を犠牲にすることで試薬輸送中に使用される上流バッファゾーンを生成する代わりに、混合の誘発を伴う比較的高い流速のため、空気を用いて混合プロセス用のバッファを提供する。例えば、試薬混合物の一部をバッファとして使用することに変えて、空気をバッファとして使用することで、より高い流速を得ることができる。
【００７９】
行先容器（例えば混合容器又はキャッシュチャネル１１８）で混合するために３つ以上の試薬を選択できる他の技術では、混合するために選択される試薬の少なくとも２つを混合チャネルに１つずつに繰り返し導入することができ、混合するために選択される少なくとも１つの他の試薬を、繰り返し混合容器に１つずつ導入される試薬が完全に混合容器に搬送されるまで、保持し蓄える。蓄えられた試薬をその後、混合容器にすべて一度に加えることができる。例えば、試薬Ａ及び試薬Ｂを混合容器に繰り返し１つずつ導入し、その後試薬Ｃを導入する場合、混合容器内の試薬は全体的に、ABCABCABCABCABC（これは例えば図７に関して説明した技術に類似する技術から生じ得る）と相対して、ABABABABABCと層状になるであろう。このような技術は、ある試薬に対して、生成物による不要な反応が生じることを妨げ又は減少させるために有利であると考えられる。例えば、取っておいた試薬を分離された他の試薬の１つとある特定の方法で反応させることができ、他の試薬の２つ以上と他の方法で組み合わせて反応させることができる。後者を、試薬が徹底的に混合された後に起きる所望の反応とすることができる一方、前者を、試薬が依然として比較的層状であるときの予混合中に起こすことができるとともに直接隣接する試薬のみと混合することができる。他の実施例では、取っておいた試薬を、混合容器の構造体を形成し不要な副産物を生み出す材料と反応させることができる。試薬を混合容器に１つずつ導入することを繰り返すのには、所望の各試薬の数及び量によって数分（例えば5分、10分、15分又はそれ以上）必要となり得るため、扱いにくい可能性がある試薬の導入を他の試薬が混合容器に１つずつ搬送されるまで取っておくことで、取っておいた試薬が他の試薬及び混合チャネルの構造体と接触するのにかかる時間を著しく短縮することができ、それによって不要な反応副産物が生成される可能性を減少させることができる。当然ながら、このような実施形態では、取っておいた試薬は、他の試薬が得られる予混合の利益を得られないことがあるが、不要な反応副産物の可能性減少させることは、取っておいた試薬に対して予混合しないことよりも重大となり得る。特に、取っておく試薬がより低い粘度の液体である場合には、取っておく試薬に対して予混合しないことが結局ほとんど影響を及ぼさないことがある。
【００８０】
例えば丈が幅よりも遙かに長い（例えば長さが幅よりも少なくとも１０倍（10X）、１００倍、１５０から１７０倍、１６０倍、２００倍又は５００倍長い）、チャネル様混合容積を使用することで、試薬を連続的に搬送して、試薬の各層間の表面対表面の接触インタフェース面積を減少させることにより、チャネル内で互いが比較的層状である配置を維持し得る。（試薬は液体であり、したがって経時的に互いの境界を越えてある程度拡散しやすい。そのため本明細書で言及する境界／接触インタフェース面積は本質的に理論的なものであると理解されるが、これら理論的面積の減少によって拡散速度を減少させ得る。）また、互いにいくぶん非混合性となり得る複数試薬に関して、例えば球状であり又は幅対長さ比がより大きい混合容積によって、混合容積に搬送される様々な試薬のドーズは、混合容積内で漂うことができるとともに同じ試薬の以前のドーズと再混合することができ、それによりチャネル様混合容積で達成できる成層を失う。例えば、直径又は幅がほぼ2.25ミリメートルであり、長さがほぼ360ミリメートルである混合チャネルは、予混合プロセスの間、搬送される試薬の有利な成層をもたらし得る。混合容積を試薬の複数セットの所望量とともに込めると、混合容積の中身を行先容器に搬送できる。（混合容積内の流体の一部は流体システムのデッドボリュームへ失わることがあり、混合容積に搬送される試薬の総容積をこのような損失を埋めるように調整できる。）行先容器へ搬送した後、搬送された予混合済み試薬を、行先容器から繰り返し吸引するとともに、更なる混合を促進するために行先容器に排出して戻す。ある実施形態では、予混合済み（すなわち予混合後）試薬を行先容器から吸引し、行先容器に排出して戻す前に混合容積に引き込むことができる。したがって、このような実施形態では、吸引／排出混合動作中に繰り返し、予混合済み試薬を混合容積に移動させるとともに混合容積から外に移動させることができる。
【００８１】
ノズルシッパー１１６とともに混合容積／チャネルを使用することで、行先容器の渦度を増進するとともに、試薬の流体特性が大きく相違するにもかかわらず試薬及びテンプレートの優れた混合をもたらすことを見いだした。また、これらの構造及び技術によって、人間による干渉がほとんど無い状態又は全く無い状態で、自動化された混合を可能にする。図１０は、一実施例に従う、混合容器１７２内のノズルシッパー１１６のクローズアップ部分を示す。ノズルシッパー１１６は、その丈に沿って延びる中心ルーメン（空洞、チャネル）を含む細長い本体を有することができる。ノズルシッパー１１６を、クラスタリング混合物の混合を増強する速度で、クラスタリング混合物を混合容器１７２内に排出するように設計できる。例えば、ノズルシッパー１１６は、試薬シッパー１１５の内径と比較して、より小さな内径を有することができ、これによりノズルシッパー１１６を通る流量を（試薬シッパー１１５に対して）大きくすることができる。一実施例では、内径の減少を、ノズルシッパー１１６の中央ルーメンに先端チップ１０５でロードされてシッパー１１６を通るルーメン／チャネルの寸法を減少させるノズル挿入部１５８によって提供することができる。例えば、ノズルシッパー１１６は、約0.020インチの（0.508ミリメートル）の公称内径１６２を有することができる一方、ノズル挿入部１５８は、約0.010インチの（0.254ミリメートル）の公称内径１６４を有する。ある実施例では、ノズルシッパー１１６は約0.125インチ（3.175 ミリメートル）の公称外径と、0.020インチ±0.001インチの公称内径１６２とを有する一方、ノズル挿入部１５８は、0.010インチ（0.254 ミリメートル）±0.001インチの公称内径１６４を有する。（しかしながら、ある実施形態では、ノズルの内径１６４は0.20ミリメートルから0.28ミリメートルまでの範囲であり得る。）当然ながら、他のサイズ及び大きさを利用して所望の混合を提供することができる。代替的実施例では、ノズルシッパー１１６はその中にノズル挿入部１５８を含まない。
【００８２】
ノズル挿入部１５８は、ノズルシッパー１１６の遠位端部１０５の形状と対応する任意の適切な形状を有することができる。
【００８３】
図示した実施形態では、ノズルシッパー１１６を、容器１７２の底部から上方の高さ（例えば底部から約２ミリメートル）に位置付ける。それから、クラスタリング混合物を方向１６８に沿って容器１７２内に注入するときに、符号１６８で示すように、ノズル１５８を通る混合物の速度を上昇させることによって容器１７２内の混合物の渦度を高め、それにより矢印１７０で示すように混合を促進させる。
【００８４】
図１１は、一実施例に従う、試薬及び試料テンプレートの吸引及び混合の例示的サイクルのグラフ表示１８０である。図１２は、一実施例に従い、試薬及び試料テンプレートを吸引及び混合する方法及び制御ロジック２０４を示すフローチャートである。図１１において、ｙ軸線１８２はポンプ３８が加える重量ポンド毎平方インチ（psi）単位の圧力を表し、ｘ軸線１８４は秒単位の時間を表す。陰圧は試薬の１つ以上の吸引を示す一方、陽圧は排出を示す。サイクル１８０は以下説明するように、「送達」シーケンス１８６と、続く「混合」シーケンス１９６とを含むと考えられ得る。図１２に表す方法２０４は、メモリ回路５０に記憶される混合プロトコル９０の手順に対応することができる。器械１２の制御回路４６は、メモリ回路５０にアクセスしてメモリ回路５０から混合プロトコル９０を引き出すことができる。制御回路４６は、混合プロトコル９０を自動的に実行して、ポンプ３８、試薬セレクタバルブ６６及び共通ラインセレクタバルブ６８の動作並びに器械１２の他の構成要素間の動作を制御することによって、器械１２の機内に搭載される方法２０４を実施できる。
【００８５】
図１２のフローチャートを参照して、方法及び制御ロジック２０４は、２０６で空気を吸引して、流路に存在する液体を取り除くステップで始めることができる。この流路を通じて先の試薬混合物を送ることができる。例えば、流路１４２に残る任意の液体残余物を空気とともに吸引することができる。当該液体残余物は、試薬セレクタバルブ６６を行先容器（例えばテンプレート容器又は混合容器１３６）と結合させる。すなわち、液体が空気に置き換えられる。流路１４２を経て行先容器にその後搬送される任意の新たな試薬混合物は、液体残余物と混合しない。
【００８６】
その後、送達シーケンスを、２０８におけるプライミングシーケンスで始めることができる。当該プライミングシーケンスは、図１１の符号１８８で全体的に表される一連の陰圧又は吸引イベントによって示される。一般に、プライミングシーケンスはバッファ流体、試薬及び他の流体等の流体を最初にシステムに引き込む。２１０において、バッファを吸引することができる。当該バッファは、試薬に対して非反応性又は比較的不活性となるように選択される液体を含むことができ、このバッファを、ポンプと試薬との間で少なくとも部分的に延在して、次のステップで所望により混合容積に入る試薬をより精密に計量できる非圧縮性作動液として使用し得る。その後２１２において、プライミングイベントで、第１試薬を吸引することができ、続いて任意の数の他の試薬を吸引でき、２１４で最後の試薬を吸引することができる。一実施例では、プライムイングシーケンスで３つの試薬を吸引するが、他の実施例はプライムイングシーケンス吸引される異なる数の試薬を含むことができる。
【００８７】
プライミングシーケンス２０８の後に、２１８における残りの送達シーケンスが続く。当該残りの送達シーケンス中に、混合される試薬をシステム内に吸引する。送達シーケンスは、図１１の符号１９０で全体的に表わされる陰圧イベントによって示される。試薬は、順序付けられるシーケンスで吸引される。例えば（図１２において）、２２０において第１試薬を吸引し、続いて付加的試薬のそれぞれを、２２２に示すように最後の試薬が吸引されるまで、指定シーケンスで次々に吸引する。各シーケンスで吸引されるある量の試薬はセットを構成する。一実施例では３つの試薬を吸引するが、他の実施例では異なる数の試薬を吸引することができる。試薬はキャッシュチャネル（例えばキャッシュチャネル１１８）内に吸引される。上述したように、比較的小さい分量又は少量の試薬を吸引して、キャッシュチャネルに交互の試薬パターンを生成し、それによって予混合を促進できる。２２４において、試薬の全セットが吸引されたか判定する。例えば、システムを制御して試薬の多数セット（例えば５セット）を吸引できる。第１から第４セットを吸引した後、全てのセットが吸引されたわけではないことを判定し、そこで方法２０４のフローは２２０に戻り、１つ以上の追加セットを吸引し続ける。全てのセットは、全ての試薬を包含することができ、あるいはセットの少なくとも一部は全ての試薬を含まなくてもよい。さらに、様々なセットにおいて、異なる体積又は量の試薬を吸引できる。セットの全てが吸引されると、方法２０４は２２６に進む。図１２に表すように、図１１の別個の陰圧（及び陽圧）イベントが示すように、連続的な吸引（又は排出）のそれぞれは、上述したバルブの１つ以上をポンプとともに制御することを伴う。すなわち、個々の試薬を吸引するために、試薬セレクタバルブを切り替えて、選択された試薬の対応する容器に関するシッパーに負圧を向けることができる。ポンプに試薬（又は空気又はバッファ又はテンプレート）を引き出すように同様に命令することができ、吸引した流体を規定のプロトコルに従って外に出すことができる。混合プロトコルを予め定めて上述したメモリ回路に記憶することができ、混合プロトコルを、シーケンシング作業に基づきまたメモリ回路内に定められるように、自動的に又は半自動的に実施することができる。処理及び制御回路によって、バルブ及びポンプの適切なインタフェース回路コマンド作業を通じて、これらのプロトコルを実施する。
【００８８】
図１２の２２６において、試薬混合物をキャッシュチャネルから混合容器内に放出又は排出する。図１１の陽圧イベント１９２は、混合容器内への排出を示す。試薬混合物を排出する前に、混合容器はその中に試料テンプレートを包含することができる。例えば、混合容器を任意に、試料テンプレートを予めロードするテンプレート容器とすることができ、あるいは、混合容器を異なる容器として試料テンプレートを当該容器内に輸送することができる。特定の実施例では、図１２の符号２２８に示されるように、吸引を更に実施することができる。例えば、吸引される試薬のセットの一部を混合容器に排出した後、試薬の１つ以上の付加的セットをキャッシュチャネルに引き込み、その後混合容器に排出することができる。
【００８９】
吸引が完了すると、方法／ロジック２０４のフローは２３０に続き、空気をシステム内に吸引することができる。図１１の陰圧イベント１９４は、空気の吸引（又はデプライミング）を示す。デプライミングを実施して、流体ライン（例えばバイパスライン、キャッシュチャネル及びノズルシッパー）から少なくとも一部の液体を取り除く。導入される空気は、ライン内におけるバッファ流体による試薬及び試料テンプレートの希釈を妨げるエアギャップを形成することができる。
【００９０】
上述した作業による吸引及びキャッシュチャネルにおける部分的予混合に続いて、２３４において、ノズルシッパーを通じて試薬及び試料テンプレートを混合容器に繰り返し移動させることによって混合シーケンスを実施する。このシーケンス２３４では、２３６において、クラスタリング混合物を定める、結合された試薬及びテンプレートが、ノズルシッパーを通じてクラスタリング混合物をキャッシュチャネル等の流体ラインに引き込むことによって吸引される。上述したように、エアギャップは、クラスタリング混合物がシステムのバッファ流体で希釈されることを妨げるバッファを提供することができる。２３８において、吸引されるある体積のクラスタリング混合物は、混合容器に排出されて戻る。２４０において、吸引及び排出ステップを含む別の混合サイクルを実施するかどうかを決定する。例えば、多数の混合サイクルを実施して、均質なクラスタリング混合物を提供することができる。一実施例では、混合が完了する前に総計４つの混合サイクルを行うために、混合を３度繰り返す。図１１の例において、サイクルを符号１９８で全体的に示す。それぞれの混合サイクルは、比較的短い陰圧イベントに続いて比較的短い陽圧イベントを伴う。混合プロセスの各サイクルでは任意の所望の体積を変位させ得る一方、一実施例では、各混合サイクルにおいて約２ mL（2,000 μL）のクラスタリング混合物を混合容器から吸引しまた混合容器へ排出するが、他の実施形態では使用するフローセルのサイズによって約500 μL又は1,500 μL分注できる。混合プロセスの最後に、シーケンシング作業を進めるために、２４２において、混合済みクラスタリング混合物を行先容器に排出又は送達することができる。例えば、クラスタリング混合物をフローセル２０（図２に表す）に送達して、フローセル上で試料テンプレートの核酸から生み出されるＤＮＡ分子のクローン集団を生成することができる。
【００９１】
代替的実施例では、混合容器に試料テンプレートが存在することなしに、混合容器内で試薬を混合する。したがって、少なくとも１度、混合容器で試薬混合物を吸引し排出することができる。その後、例えばフローセル上に又は他の行先容器で、試料テンプレートを混合される試薬に導入することができる。
【００９２】
＜付加的注釈＞
本明細書及び特許請求の範囲で使用される用語「備える」、「含む」、「包含する」等及びこれらのバリエーションは、記載される要素だけでなく、任意の追加的要素も更に含む、オープンエンドであることを意図する。本明細書を通して「一実施例」、「他の実施例」及び「ある実施例」等との言及は、当該実施例に関して説明される特有の要素（例えば構成、構造及び／又は特徴）が本明細書で説明する少なくとも１つの実施例に含まれることを意味し、他の実施例に存在してもしなくても良いことを意味する。さらに、別段の規定がない限り、任意の実施例に対して説明される要素を、様々な実施例において任意の適切な方法で組み合わせることができることが理解される。
【００９３】
「するような(to)」という表現、例えば「２つの流路の間で切り替えるようなバルブ」という表現を、「するように構成される」、例えば「２つの流路の間で切り替えるように構成されるバルブ」等の表現に置き換えることができることも理解できる。
【００９４】
（そのような概念が互いに矛盾しない条件下で）前述の概念及び以下より詳細に議論される付加的概念のあらゆる組み合わせが本明細書で開示される本発明の主題の一部であると考えられることが理解されるはずである。特に、本開示の最後に現れる特許請求の範囲に記載される主題のあらゆる組み合わせは、本明細書で開示される本発明の主題の一部であると考えられる。また本明細書で明白に使用され、参照として援用される任意の開示に現れ得る用語には、本明細書で開示される特定の概念と最も調和する意味が与えられるべきであることを理解されるはずである。
【００９５】
本明細書が提供する範囲は、記載範囲及び記載範囲内の任意の値又は部分範囲を含むことを理解できる。例えば、約10 cPから約50 cPまでの範囲は、約10 cPから約50 cPまでの明白に記載された境界を含むだけでなく、例えば約16 cP，37.5 cP，49 cP等の各個の値及び例えば約25 cPから約30 cPまでの部分範囲も含むと解釈するべきである。さらに、用語「約」、「ほぼ」及び／又は「実質的に」を用いてある値を説明するときに、これら用語は記載された値からの小さな変動（最大±１０％まで）を含むことを意味する。
【００９６】
いくつかの実施例を詳細に説明したが、開示される実施例を変更できることが理解される。したがって、前述の説明を非限定的であると考える。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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