(57)【要約】  遺伝子調節の単純化されたモデルは、哺乳動物の合成生物学にとって基本的な要件である。しかしながら、転写レベルでは、これは、プロモーター活性動態を統御し、ユーザー定義の機能性を有する調節エレメントの新規の設計を妨げる複雑な設計規則によって妨げられてきた。本明細書で実証されるとおり、複合性の転写因子結合部位が相乗的に機能しないとき、哺乳動物のプロモーターは、単純な設計規則に従って構築され得る。宿主細胞の転写機構の成分をインシリコで分析して、所望の発現動態を有する転写因子を同定した。次に、同種の結合部位を、ホモタイプ及びヘテロタイプの構造において包括的に試験してモジュール性を評価し、各部位の単一コピーによって呈される転写活性を決定した。エレメントを、組み合わせの相互作用を防止するために特別に選択したとき、ヘテロタイプのプロモーター活性を、単に成分結合部位のコピー数の関数として正確にモデル化できた。結合部位の順序、スペーシング、及び配向がプロモーター活性に最小の影響を及ぼしたため、文脈特異的な設計基準に従って、ブロックをインシリコで最適に組み合わせ、配置することができた。これを実証するために、設計された活性レベル及び長期間の発現安定性をインビトロで呈したＣＨＯ細胞のプロモーターを新規に作製した。この知見により、真核生物の転写調節機構への新たな洞察が明らかになり、哺乳動物の合成生物学のための新規のツールが提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）４〜２０個の転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）を含むヌクレオチド配列及び（ｂ）プロモーターコアを含む合成プロモーターであって、前記ＴＲＦＥを含む前記ヌクレオチド配列が前記プロモーターコアの上流にあり、且つ少なくとも３分の１の前記ＴＦＲＥが、抗酸化ＲＥ（ＡＲＥ）、ＥＴＳ結合部位１（ＥＢＳ１）、小胞体ストレスＲＥ（ＥＲＳＥ）、及びダイオキシンＲＥ（ＤＲＥ）のＴＦＲＥからなる群から個別に選択される、合成プロモーター。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列が、前記ＴＦＲＥ間にスペーサーを含み、前記スペーサーが５０個以下のヌクレオチドである、請求項１に記載の合成プロモーター。
【請求項３】
前記スペーサーが、２５個以下のヌクレオチドである、請求項２に記載の合成プロモーター。
【請求項４】
前記スペーサーが、１２個以下のヌクレオチドである、請求項３に記載の合成プロモーター。
【請求項５】
前記スペーサーが、約６個のヌクレオチドである、請求項４に記載の合成プロモーター。
【請求項６】
前記コアプロモーターが、ＣＭＶコアプロモーターであり、任意選択により前記ＣＭＶコアプロモーターが、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項７】
前記合成プロモーターが、配列番号３７〜５０のいずれか１つの前記ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の合成プロモーター。
【請求項８】
合成プロモーターを設計する方法であって：（ｉ）転写因子（ＴＦ）発現をプロファイリングしてＴＦを選択すること、（ｉｉ）ホモタイプのプロモーターにおいて転写的に活性な選択されたＴＦと相互作用する転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）を同定すること、及び（ｉｉｉ）ヘテロタイプのプロモーター内のＴＦ−ＴＦＲＥ相互作用の相対的な転写活性を決定することを含む、方法。
【請求項９】
（ｉｖ）所望の転写活性を有するＴＦＲＥを選択することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
（ｖ）（ａ）前記所望の転写活性を有する選択された前記ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列及び（ｂ）プロモーターコアを含む合成プロモーターを生成することをさらに含む請求項９に記載の方法であって、前記ＴＲＦＥを含む前記ヌクレオチド配列が前記プロモーターコアの上流にある、方法。
【請求項１１】
前記ＴＦ発現をプロファイリングすることが、前記ＴＦの存在量を決定することを含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＴＦの存在量を決定することが、前記ＴＦのＲＮＡ又はタンパク質レベルを測定することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＴＦ発現をプロファイリングすることが、少なくとも２種の細胞型におけるＴＦ発現をプロファイリングすることを含む、請求項８〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも２種の細胞型が、哺乳動物の細胞型である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記少なくとも２種の哺乳動物の細胞型が、ＣＨＯ細胞である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも２種の細胞株が、組換えタンパク質を発現する細胞株及びその親細胞株を含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも２種の細胞型が、同じ生物由来の２種の細胞型であり、任意選択により、前記生物がヒトである、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１８】
高度に発現されるＴＦが選択される、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
上位５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％又は１０％内の発現レベルを有するＴＦが選択される、請求項８〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＴＦ発現をプロファイリングすることが、少なくとも２種の細胞型、少なくとも２期の細胞培養、及び／又は少なくとも２種の培養条件にわたってＴＦの安定性を決定することを含む、請求項８〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法がさらに、前記少なくとも２種の細胞型、少なくとも２期の細胞培養、及び／又は少なくとも２種の培養条件にわたって発現レベルにおける２、又は１．５、又は１以下の最大倍率変化を有するＴＦを選択することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＴＦ発現をプロファイリングすることが、少なくとも２期の細胞培養におけるＴＦ発現をプロファイリングすることを含む、請求項８〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記少なくとも２期の細胞培養が、定常期及び指数増殖期を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
目的の宿主細胞において優先的に上方制御され、且つ／又はオフターゲットの宿主細胞において優先的に下方制御されるＴＦが選択される、請求項８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
目的の細胞周期において優先的に上方制御され、且つ／又はオフターゲットの細胞周期において下方制御されるＴＦが選択される、請求項８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも１００種のＴＦの発現がプロファイリングされる、請求項８〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ホモタイプのプロモーターが、２〜２０個のＴＦＲＥのコピーを含む、請求項８〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ホモタイプのプロモーターが、４〜１０個のＴＦＲＥのコピーを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記相対的な転写活性を決定することが、ＴＦＲＥのコピー数の関数として前記ヘテロタイプのプロモーター活性をモデル化することを含む、請求項８〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ヘテロタイプのプロモーターが、２〜２０個のＴＦＲＥを含む、請求項８〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
請求項８〜３０のいずれか一項に記載の方法に従って生成される合成プロモーター。
【請求項３２】
前記合成プロモーターが、４〜２０個のＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列及びプロモーターコアを含み、前記ＴＲＦＥを含む前記ヌクレオチド配列が前記プロモーターコアの上流にある、請求項３１に記載の合成プロモーター。
【請求項３３】
抗酸化ＲＥ（ＡＲＥ）、ＥＴＳ結合部位１（ＥＢＳ１）、小胞体ストレスＲＥ（ＥＲＳＥ）、及びダイオキシンＲＥ（ＤＲＥ）のＴＦＲＥからなる群から選択される少なくとも１つのＴＦＲＥを含む、請求項３２に記載の合成プロモーター。
【請求項３４】
前記ヌクレオチド配列が、前記ＴＦＲＥ間にスペーサーを含み、前記スペーサーが５０個以下のヌクレオチドである、請求項３２又は３３に記載の合成プロモーター。
【請求項３５】
前記スペーサーが、２５個以下のヌクレオチドである、請求項３４に記載の合成プロモーター。
【請求項３６】
前記スペーサーが、１２個以下のヌクレオチドである、請求項３５に記載の合成プロモーター。
【請求項３７】
前記スペーサーが、約６個のヌクレオチドである、請求項３６に記載の合成プロモーター。
【請求項３８】
前記コアプロモーターが、ＣＭＶコアプロモーターであり、任意選択により前記ＣＭＶコアプロモーターが、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む、請求項３２〜３７のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項３９】
前記ＴＦＲＥを含む前記ヌクレオチド配列が、１０個以下のＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項１〜６及び３２〜３８のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項４０】
前記ＴＦＲＥを含む前記ヌクレオチド配列が、５個以下のＣｐＧジヌクレオチドを含む、請求項３９に記載の合成プロモーター。
【請求項４１】
前記ＴＦＲＥを含む前記ヌクレオチド配列が、２０個よりも大きいヌクレオチド長の任意の反復配列を含有しない、請求項１〜６及び３２〜４０のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項４２】
前記ＴＦＲＥを含む前記ヌクレオチド配列が、いずれのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＴａｑＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＰｖｕＩ、又はＰａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位も含有しない、請求項１〜６及び３２〜４１のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項４３】
前記ＴＦＲＥの順序が、前記合成プロモーターの活性に著しくは影響を及ぼさない、請求項１〜６及び３２〜４２のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項４４】
前記ＴＦＲＥの配向が、前記合成プロモーターの活性に著しくは影響を及ぼさない、請求項１〜６及び３２〜４３のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項４５】
前記プロモーターの活性が、各ＴＦＲＥのコピーの数と相関する、請求項１〜６及び３２〜４４のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項４６】
前記合成プロモーターが、細胞増殖に著しい影響を及ぼさない、請求項１〜６及び３１〜４５のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項４７】
前記合成プロモーターが、細胞生存率に著しい影響を及ぼさない、請求項１〜６及び３１〜４６のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項４８】
前記合成プロモーターが、ヘテロタイプのプロモーターにおいて転写的に不活性なＴＦＲＥを含有しない、請求項１〜６及び３１〜４７のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項４９】
前記合成プロモーターが、ヘテロタイプのプロモーターにおいて転写的に抑制されているＴＦＲＥを含有しない、請求項１〜６及び３１〜４８のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項５０】
前記ＡＲＥ  ＴＦＲＥが、配列番号７のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜６及び３３〜４９のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項５１】
前記ＥＢＳ１  ＴＦＲＥが、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜６及び３３〜５０のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項５２】
前記ＥＲＳＥ  ＴＦＲＥが、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜６及び３３〜５０のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項５３】
前記ＤＲＥ  ＴＦＲＥが、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜６及び３３〜５０のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項５４】
追加のＣＨＯ細胞ＴＦＲＥをさらに含む、請求項１〜６及び３３〜５３のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項５５】
少なくとも１つの前記追加のＣＨＯ細胞ＴＦＲＥが、配列番号６、９、及び２３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項５４に記載の合成プロモーター。
【請求項５６】
ＴＦＲＥを含む前記ヌクレオチド配列が、少なくとも２コピーの同じＴＲＦＥを含む、請求項１〜６及び３２〜５５のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項５７】
ＴＦＲＥを含む前記ヌクレオチド配列が、少なくとも３コピーの同じＴＲＦＥを含む、請求項１〜６及び３２〜５６のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項５８】
前記合成プロモーターがプロモーターサイレンシングを回避する、請求項１〜６及び３１〜５７のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項５９】
前記合成プロモーターが、タンパク質産生を支える重要な細胞プロセスに対するオフターゲット作用を最小化する、請求項１〜６及び３１〜５８のいずれか一項に記載の合成プロモーター。
【請求項６０】
請求項１〜７及び３１〜５９のいずれか一項に記載の合成プロモーターを含むベクター。
【請求項６１】
前記合成プロモーターが、タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結される、請求項５０に記載のベクター。
【請求項６２】
前記タンパク質が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、又は酵素である、請求項６１に記載のベクター。
【請求項６３】
請求項１〜７及び３１〜５９のいずれか一項に記載の合成プロモーター又は請求項６０〜６２のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項６４】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項６３に記載の細胞。
【請求項６５】
前記哺乳動物細胞がＣＨＯ細胞である、請求項６４に記載の細胞。
【請求項６６】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項６４に記載の細胞。
【請求項６７】
請求項１〜６及び３１〜５９のいずれか一項に記載の合成プロモーターを含むライブラリー。
【請求項６８】
少なくとも１００種の異なる合成プロモーターを含む、請求項６７に記載のライブラリー。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
文脈特異的なプロモーターの性能は、プロモーター活性動態、長期間の遺伝子発現カセットの挙動（例えば、サイレンシングに関する性質、他の遺伝的成分との適合性（１））、及びプロモーター−細胞相互作用（例えば、細胞プロセスに対するオフターゲット作用、例えば、転写装置成分の隔離による（２、３））の関数である。自然に進化した配列の固有の制限、例えば、望ましくないサイズ及び予測不可能な発現動態を考慮して、合成プロモーターは通常、大部分の用途のために好ましい。合成プロモーター構築の最も単純な方法は、配列エレメントを除去（４、５）、挿入（６、７）、又は変異（８、９）することによって既存のプロモーターの機能を強化することを伴う（合成プロモーターの構築法の包括的な総説については（１０）を参照のこと）。しかしながら、この戦略により、内在性／ウイルスプロモーター性能において増加性の改善が可能である一方で、準最適の開始配列が、再設計を介して機能に関して十分に最適化され得る可能性は低い。反対に、完全に合成的な構築物のボトムアップの構築は、プロモーター設計空間の広範囲の拡張を可能にする。
【０００２】
同種の結合部位（転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ））を含有する合成プロモーターをトランス活性化する合成転写因子（すなわち、ジンクフィンガー（１１）、転写活性化因子様エフェクター（１２）、キメラ（１３）、及びＣＲＩＳＰＲ転写因子（１４））を含む完全に合成的な系は、最小限の宿主細胞−プロモーター相互作用を課す。しかしながら、関連する代謝的負荷及び他の外来性組換えタンパク質の導入は、遺伝子治療及び生物学的製剤の生産などの、いくつかの用途においてこれらの系の魅力を制限し得る。宿主細胞の既存のレパートリーの転写因子（ＴＦ）と相互作用する人工プロモーターを構築することは、補助的なＴＦの必要を除去するが、合成プロモーター−内在性ＴＦ−内在性プロモーターのインタラクトームは、合成及び内在性プロモーターの両方の活性動態に負の影響を及ぼす可能性がある（２、３、１５）。したがって、現在利用可能なプロモーター構築法を使用する場合、プロモーター、発現カセット及び宿主細胞性能を同時に最適化することは困難である。これらの相互に関係のある機能性の同時の最適化は、インシリコでのプロモーター（相補的な合成ＴＦを必要としない）のカスタム設計を介してのみ可能となり得る。実際に、遺伝子部分の新規の合成設計に向けた動きは、哺乳動物の合成生物学にとって重要な目標である。
【０００３】
インシリコプロモーター設計は、複合性ＴＦＲＥの配向、空間配置、及び順序、並びにそれらの同種のＴＦの機能、発現レベル、及び活性を含むプロモーター活性を統御する複雑な規則によって制限される（１６、１７）。しかしながら、Ｓｍｉｔｈらは近年、数千個の人工配列においてＴＦＲＥ機構の規則を体系的に試験し、プロモーター活性の大部分が単に、関連しているＴＦＲＥのコピー数の関数であることを見出した（１８）。これらの知見は、ＴＦＲＥ機構のビルボードモデルを支持し、ここで結合部位の配置、順序、及び配向は大部分が無視され得る（１９、２０）。しかしながら、Ｓｍｉｔｈらによって構築されたプロモーターにおいて（１８）、活性は、種々のＴＦＲＥペアの間の組み合わせの相互作用によって影響された。複合性のＴＦＲＥが相乗作用し、且つ／又は相互作用を妨害できるとき、相対的なＴＦＲＥの順序は、プロモーター活性に著しく影響を及ぼす場合があり、インシリコプロモーター設計の複雑性を実質的に増大させる。しかしながら、研究により、ＴＦ間の組み合わせの相互作用が、比較的まれであることが示されている（２１）。さらに、Ｓｍｉｔｈらは、プロモーター構築のために使用された１２種のＴＦＲＥの間の（考えられる６６種のうち）８種の組み合わせのＴＦＲＥ相互作用のみを同定した（１８）。比較的単純な設計規則を有するプロモーターを構築するための協同的に機能しないＴＦＲＥを選択する方法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本明細書で提供される方法は、協同的に機能しないモジュラーＴＦＲＥの組み合わせを特異的に選択し、且つ比較的単純な設計規則を有するプロモーターを構築するためにそれらを利用することが可能であることを実証する。ＴＦ濃度レベルが、同種の結合部位活性と十分に相関すると仮定すると（２２、２３）、インシリコプロモーター設計は、ｉ）宿主細胞におけるＴＦ発現をプロファイリングすること、ｉｉ）相乗的に機能しないＴＦＲＥを同定すること、及びｉｉｉ）ヘテロタイプのエレメント内のＴＦ−ＴＦＲＥ相互作用の相対的な転写活性（すなわち、各ＴＦＲＥの単一コピーにより提供される全体的なプロモーター活性への寄与）を決定することによって達成され得る。この測定モデルを操作する規範を適用することによって、この研究は、初めて、インビトロで設計された機能性を呈するインシリコでの合成プロモーターのモデルに従う設計を報告する。ヘテロタイプのプロモーター活性の単純化されたモデルにより、合成エレメントの新規の設計が可能になったが、ここで、モジュラーＴＦＲＥブロックの組成及び順序は、長期間の発現安定性及び所望の活性動態などの文脈特異的な要求に従って最適化され得る。プロモーターが単純な設計規則に従って合成的に設計され得ることを実証することによって、この研究は、真核生物の転写調節機構に新たな洞察示し、且つ哺乳動物の合成生物学を可能にする重要なツールを提供する。
【０００５】
したがって、本明細書では、合成プロモーターが提供される。一態様では、合成プロモーターは、（ａ）４〜２０個の転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）を含むヌクレオチド配列及び（ｂ）プロモーターコアを含み、ここで、ＴＲＦＥを含むヌクレオチド配列はプロモーターコアの上流にあり、且つ少なくとも３分の１のＴＦＲＥは、抗酸化ＲＥ（ＡＲＥ）、ＥＴＳ結合部位１（ＥＢＳ１）、小胞体ストレスＲＥ（ＥＲＳＥ）、及びダイオキシンＲＥ（ＤＲＥ）のＴＦＲＥからなる群から個別に選択される。一態様では、ヌクレオチド配列は、ＴＦＲＥ間のスペーサーを含み、スペーサーは、５０個以下のヌクレオチド、２５個以下のヌクレオチド、又は１２個以下のヌクレオチドである。一態様では、スペーサーは、約６個のヌクレオチドである。一態様では、コアプロモーターは、ＣＭＶコアプロモーターであり、任意選択によりＣＭＶコアプロモーターは、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。
【０００６】
本明細書で提供されるとおり、合成プロモーターは、配列番号３７〜５０のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み得る。
【０００７】
本明細書では又、合成プロモーターを設計する方法が提供される。一態様では、合成プロモーターを設計する方法は、（ｉ）転写因子（ＴＦ）発現をプロファイリングしてＴＦを選択すること、（ｉｉ）ホモタイプのプロモーターにおいて転写的に活性な選択されたＴＦと相互作用する転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）を同定すること、及び（ｉｉｉ）ヘテロタイプのプロモーター内のＴＦ−ＴＦＲＥ相互作用の相対的な転写活性を決定することを含む。一態様では、本方法はさらに、（ｉｖ）所望の転写活性を有するＴＦＲＥを選択することを含む。一態様では、本方法はさらに、（ｖ）（ａ）所望の転写活性を有する選択されたＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列及び（ｂ）プロモーターコアを含む合成プロモーターを生成することを含み、ここで、ＴＲＦＥを含むヌクレオチド配列はプロモーターコアの上流にある。
【０００８】
一態様では、ＴＦ発現をプロファイリングすることは、ＴＦの存在量を決定することを含む。一態様では、ＴＦの存在量を決定することは、ＴＦのＲＮＡ又はタンパク質レベルを測定することを含む。一態様では、ＴＦ発現をプロファイリングすることは、少なくとも２種の細胞型におけるＴＦ発現をプロファイリングすることを含む。一態様では、少なくとも２種の細胞型は、哺乳動物の細胞型である。一態様では、少なくとも２種の哺乳動物の細胞型は、ＣＨＯ細胞である。一態様では、少なくとも２種の細胞株は、組換えタンパク質を発現する細胞株及びその親細胞株を含む。一態様では、少なくとも２種の細胞型は、同じ生物由来の２種の細胞型であり、任意選択により、生物はヒトである。
【０００９】
一態様では、高度に発現されるＴＦが選択される。一態様では、上位５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％又は１０％内の発現レベルを有するＴＦが選択される。
【００１０】
一態様では、ＴＦ発現をプロファイリングすることは、少なくとも２種の細胞型、少なくとも２期の細胞培養、及び／又は少なくとも２種の培養条件にわたってＴＦの安定性を決定することを含む。一態様では、本方法はさらに、少なくとも２種の細胞型、少なくとも２期の細胞培養、及び／又は少なくとも２種の培養条件にわたって発現レベルにおける２、又は１．５、又は１以下の最大倍率変化を有するＴＦを選択することを含む。
【００１１】
一態様では、ＴＦ発現をプロファイリングすることは、少なくとも２期の細胞培養においてＴＦ発現をプロファイリングすることを含む。一態様では、少なくとも２期の細胞培養は、定常期及び指数増殖期を含む。一態様では、目的の宿主細胞において優先的に上方制御され、且つ／又はオフターゲットの宿主細胞において優先的に下方制御されるＴＦが選択される。一態様では、目的の細胞周期において優先的に上方制御され、且つ／又はオフターゲットの細胞周期において下方制御されるＴＦが選択される。
【００１２】
一態様では、少なくとも１００種のＴＦの発現がプロファイリングされる。
【００１３】
一態様では、ホモタイプのプロモーターは、２〜２０コピーのＴＦＲＥを含む。一態様では、ホモタイプのプロモーターは、４〜１０コピーのＴＦＲＥを含む。
【００１４】
一態様では、相対的な転写活性を決定することは、ＴＦＲＥのコピー数の関数としてヘテロタイプのプロモーター活性をモデル化することを含む。一態様では、ヘテロタイプのプロモーターは、２〜２０コピーのＴＦＲＥを含む。
【００１５】
本明細書では又、本明細書で提供される方法に従って生成される合成プロモーターが提供される。一態様では、合成プロモーターは、４〜２０個のＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列及びプロモーターコアを含み、ここで、ＴＲＦＥを含むヌクレオチド配列はプロモーターコアの上流にある。一態様では、少なくとも１つのＴＦＲＥは、抗酸化ＲＥ（ＡＲＥ）、ＥＴＳ結合部位１（ＥＢＳ１）、小胞体ストレスＲＥ（ＥＲＳＥ）、及びダイオキシンＲＥ（ＤＲＥ）のＴＦＲＥからなる群から選択される。一態様では、ヌクレオチド配列は、ＴＦＲＥ間のスペーサーを含み、スペーサーは、５０個以下のヌクレオチド、２５個以下のヌクレオチド、又は１２個以下のヌクレオチドである。一態様では、スペーサーは、約６個のヌクレオチドである。一態様では、コアプロモーターは、ＣＭＶコアプロモーターであり、任意選択によりＣＭＶコアプロモーターは、配列番号３３のヌクレオチド配列を含む。
【００１６】
本明細書で提供され、且つ／又は本明細書で提供される方法に従って生成されるプロモーターの一態様では、ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列は、１０個以下のＣｐＧジヌクレオチドを含む。一態様では、ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列は、５個以下のＣｐＧジヌクレオチドを含む。一態様では、ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列は、２０個よりも大きいヌクレオチド長の任意の反復配列を含有しない。一態様では、ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列は、いずれのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＴａｑＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＰｖｕＩ、又はＰａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位も含有しない。一態様では、ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列は、いずれのＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＴａｑＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＰｖｕＩ、ＰａｃＩ、ＸｈｏＩ、又はＫｐｎＩ制限エンドヌクレアーゼ部位も含有しない。一態様では、ＴＦＲＥの順序は、合成プロモーターの活性に著しくは影響を及ぼさない。
【００１７】
一態様では、ＴＦＲＥの配向は、合成プロモーターの活性に著しくは影響を及ぼさない。一態様では、プロモーターの活性は、各ＴＦＲＥのコピーの数と相関する。
【００１８】
一態様では、合成プロモーターは、細胞増殖に著しい影響を及ぼさない。一態様では、合成プロモーターは、細胞生存率に著しい影響を及ぼさない。一態様では、合成プロモーターは、ヘテロタイプのプロモーターにおいて転写的に不活性なＴＦＲＥを含有しない。一態様では、合成プロモーターは、ヘテロタイプのプロモーターにおいて転写的に抑制されているＴＦＲＥを含有しない。
【００１９】
一態様では、ＡＲＥ  ＴＦＲＥは、配列番号７のヌクレオチド配列を含む。一態様では、ＥＢＳ１  ＴＦＲＥは、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む。一態様では、ＥＲＳＥ  ＴＦＲＥは、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む。一態様では、ＤＲＥ  ＴＦＲＥは、配列番号３１のヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
一態様では、合成プロモーターはさらに、追加のＣＨＯ細胞ＴＦＲＥを含む。一態様では、少なくとも１つの追加のＣＨＯ細胞ＴＦＲＥは、配列番号６、９、及び２３のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
一態様では、ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列は、少なくとも２コピーの同じＴＲＦＥを含む。一態様では、ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列は、少なくとも３コピーの同じＴＲＦＥを含む。
【００２２】
一態様では、合成プロモーターは、プロモーターサイレンシングを回避する。一態様では、合成プロモーターは、タンパク質産生を支える重要な細胞プロセスに対するオフターゲット作用を最小化する。
【００２３】
本明細書では又、本明細書で提供される合成プロモーターを含むベクターが提供される。一態様では、そのベクターの合成プロモーターは、タンパク質をコードする遺伝子に作動可能に連結される。一態様では、タンパク質は、レポータータンパク質、治療用タンパク質、又は酵素である。
【００２４】
本明細書では又、本明細書で提供される合成プロモーター又は本明細書で提供されるベクターを含む細胞が提供される。一態様では、細胞は、哺乳動物細胞である。一態様では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。一態様では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。
【００２５】
本明細書では又、本明細書で提供される合成プロモーターを含むライブラリーが提供される。一態様では、ライブラリーは、少なくとも１００種の異なる合成プロモーターを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１Ａ及び１Ｂ：比較的豊富な宿主細胞成分に結合するモジュラーの転写的に活性なＴＦＲＥの同定。図１Ａ）ＣＨＯ細胞トランスクリプトームのＲＮＡ−ｓｅｑ分析により、宿主細胞転写因子（ＴＦ）の相対的な発現レベルを決定した。点は、対数期及び定常期の培養液（ｎ＝６）で採取された、３種の別々のＣＨＯ細胞株における各ＴＦの平均発現レベルを表す。挿入されたグラフは、各種ＣＨＯ細胞株及び増殖期にわたる高い発現（ＴＦのｍＲＮＡ発現レベルの上位３０％に位置する）及び安定な発現を呈する、６７種のＴＦの発現レベルを示す（最大倍率変化＜１．５）。ＦＰＫＭ＝マッピングされた１００万個の断片当たりのキロベース転写物当たりの断片図１Ｂ）適切な発現動態を有するＴＦの同種の結合部位が、ＳＥＡＰレポーターベクターにおける最小ＣＭＶコアプロモーターの上流のシリーズ（６×コピー）において同定及びクローン化された。ＣＨＯ細胞を、各ＴＦＲＥレポーターで一過的にトランスフェクトし、ＳＥＡＰ活性をトランスフェクション後２４時間測定した。データを、最も強力なホモタイプのプロモーターによって呈される産生のパーセンテージとして表した。バーは、それぞれ三つ組で実施された３回の独立した実験の平均値＋ＳＤを表す。
【図２】図２Ａ及び２Ｂ：モジュラーＴＦＲＥブロックのヘテロタイプの集合体は、２桁を超える転写活性を呈する。図２Ａ）ホモタイプ構造において転写的に活性であったＴＦＲＥ（図１を参照のこと）を様々な組み合わせで組み合わせて、ヘテロタイプのプロモーターのライブラリーを構築した。およそ２０個の構築物が各ライブラリー内で作製されたが、複合性ＴＦＲＥの順序、配向、空間配置及びコピー数は異なった。図２Ｂ）ヘテロタイプのエレメントが、ＳＥＡＰレポーターベクターにおける最小ＣＭＶコアプロモーターの上流に挿入され、且つＣＨＯ細胞に一過的にトランスフェクトされた。ＳＥＡＰ発現は、トランスフェクション後２４時間定量化された。データを、最も強力なヘテロタイプのプロモーターによって呈される産生のパーセンテージとして表した。制御ｈＣＭＶ−ＩＥ１−ＳＥＡＰレポーターからのＳＥＡＰ産生は、水平の黒線（「ＣＭＶ」）として示される。各バーは、２つのトランスフェクションの平均を表し；各プロモーターについて、ＳＥＡＰ産生における１０％未満の変動が観察された。細胞培養液の上清における相対的なタンパク質活性を確認したＳＥＡＰ転写物存在量の定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）分析は、ＳＥＡＰのｍＲＮＡレベルと直線的に相関した（図６を参照のこと）。
【図３】図３Ａ、３Ｂ及び３Ｃ：ヘテロタイプのプロモーター構造におけるモジュラーＴＦＲＥブロックの機能は、結合部位の順序及びスペーシングに依存しない。図３Ａ）ヘテロタイプのエレメント内の別々のＴＦＲＥの機能は、複数の「規則」によって影響され得る。本発明者らは、唯一の予測変数としてＴＦＲＥのコピー数を使用してヘテロタイプのプロモーター活性（図２を参照のこと）をモデル化した。図３Ｂ）線形回帰モデルの予測能を、１個抜き及び５倍交差検定（ＣＶ）を用いて分析した。図３Ｃ）ヘテロタイプのプロモーター内各モジュラーＴＦＲＥブロックの単一コピーの相対的な転写活性を、モデル係数を分析することによって決定した。
【図４】図４Ａ及び４Ｂ：合成的に設計されたプロモーターは、インビトロにおいて予測可能な活性を呈する。図４Ａ）同一のＴＦＲＥ組成を有するが様々なＴＦＲＥ順序を有するプロモーターを、インシリコで設計した。各合成エレメントのインビトロ活性を、ヘテロタイプのプロモーター活性の本発明者らのモデルを用いて予測した（図３を参照のこと）。図４Ｂ）合成プロモーターが、ＳＥＡＰレポーターベクターにおける最小ＣＭＶコアエレメントの上流に化学的に合成され、挿入され、且つＣＨＯ細胞に一過的にトランスフェクトされた。ＳＥＡＰ発現は、トランスフェクション後２４時間定量化された。データを、インビトロで構築された最も強力なヘテロタイプのプロモーターであるＩＶＣ１（１００に等しい相対プロモーター単位（ＲＰＵ）；図２を参照のこと）によって呈される産生のパーセンテージとして表した。値は、三つ組で実施された３つの独立した実験の平均値＋ＳＤを表す。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ及び５Ｄ：インシリコで設計された配列は、インビトロでカスタム定義の機能性を呈する。図５Ａ）数百万のＴＦＲＥの組み合わせを、ヘテロタイプのエレメント活性の本発明者らのモデルを用いてインシリコで構築し、試験した（図３を参照のこと）。選択基準を適用して、ＣＨＯ細胞における生物学的製剤の生産の文脈に最適な組み合わせを同定した。次に、各プロモーター内の成分ＴＦＲＥを特異的に配置して、プロモーターサイレンシングに寄与する可能性のある配列の特徴の出現を防止した。図５Ｂ）様々に設計された活性を有する合成プロモーターが、ＳＥＡＰレポーターベクターにおける最小ＣＭＶコアエレメントの上流に化学的に合成され、挿入され、且つＣＨＯ細胞に一過的にトランスフェクトされた。ＳＥＡＰ発現は、トランスフェクション後２４時間定量化された。データを、最も強力なプロモーターによって呈される産生のパーセンテージとして表した。図５Ｃ）ＣＨＯ細胞を、グルタミンシンターゼの選択マーカー遺伝子を共発現する合成プロモーター−レポータープラスミドで安定的にトランスフェクトした。メチオニンスルホキシイミンを含有する培地中での選択後、プロモーター活性を、７日間のバッチ産生プロセスの間測定した。ＳＥＡＰ力価及びｍＲＮＡ存在量を、増殖の対数期中期及び定常期において決定した。データを、最も強力なプロモーターによって呈される発現のパーセンテージとして表した。図５Ｄ）安定的なプールを、６０世代間選択培地中で継代培養した。ＳＥＡＰ発現を、７日間のバッチ産生プロセスの最後に定量化した。データを、１５世代目の各プールによって呈される産生のパーセンテージとして表した。値は、三つ組で実施された３回の独立した実験の平均値＋ＳＤを表す。
【図６】細胞培養液の上清におけるＳＥＡＰ活性は、ＳＥＡＰのｍＲＮＡレベルと直線的に相関した。インビトロで構築されたヘテロタイプのプロモーターが、ＳＥＡＰレポーターベクターにおける最小ＣＭＶコアプロモーターの上流に挿入され、且つＣＨＯ細胞に一過的にトランスフェクトされた（図２を参照のこと）。ＳＥＡＰ発現は、トランスフェクション後２４時間定量化された。データを、最も強力なヘテロタイプのプロモーターによって呈される産生のパーセンテージとして表した。バーは、それぞれ三つ組で実施された３回の独立した実験の平均値＋ＳＤを表す。
【図７】一過的なトランスフェクション力価。種々のプロモーターの制御下での免疫活性化タンパク質の発現レベルは、ＣＨＯ細胞における一過的なトランスフェクションの後に示される。
【図８】安定的なプールの力価。種々のプロモーターの制御下での免疫活性化タンパク質のフェドバッチ発現レベルは、安定的なＣＨＯプールにおいて示される。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼを指示してＤＮＡに結合させ、且つＲＮＡ合成を開始することによって転写の開始を媒介する制御性のＤＮＡ配列を定義する。プロモーターは、一般に、遺伝子の上流に位置する。プロモーターは、例えば、コアプロモーター及び転写因子調節エレメントを含み得る。
【００２８】
「合成プロモーター」は、転写因子調節エレメントを含む人工的であり、操作され、且つ／又は組み立てられたプロモーターを指す。
【００２９】
「転写因子調節エレメント」（ＴＦＲＥ）は、転写因子のための結合部位であるヌクレオチド配列である。例示的なＴＦＲＥは、表１において提供される。
【００３０】
「転写因子」（ＴＦ）は、ＴＦＲＥに結合するタンパク質であり、遺伝子の転写速度に影響を及ぼす（正又は負のいずれか）。
【００３１】
「コアプロモーター」は、転写を開始するのに必要なプロモーターの最小の部分であるヌクレオチド配列を指す。コアプロモーター配列は、例えばＣＭＶ最初期遺伝子プロモーター又はＳＶ４０を含む原核生物遺伝子又は真核生物遺伝子に由来し得る。コアプロモーターは、例えば、ＴＡＴＡボックスを含み得る。コアプロモーターは、例えば、イニシエーターエレメントを含み得る。コアプロモーターは、例えば、ＴＡＴＡボックス及びイニシエーターエレメントを含み得る。
【００３２】
本明細書で使用する場合、用語「エンハンサー」は、遺伝子の転写、遺伝子の同一性に依存しないこと、遺伝子に関連した配列の位置、及び配列の配向を増強するために作用するヌクレオチド配列を定義する。
【００３３】
用語「機能上連結した」及び「作動可能に連結した」は互換的に使用され、２種以上のＤＮＡセグメント（例えば、発現される遺伝子及び遺伝子の発現を制御する配列）間の機能的関係性を指す。例えば、シス作用性転写調節エレメントの任意の組み合わせを含むプロモーター及び／又はエンハンサー配列は、適切な宿主細胞又は他の発現系におけるコード配列の転写を刺激するか、又は調節する場合、コード配列に作動可能に連結される。転写される遺伝子配列に作動可能に連結されるプロモーター調節配列は、転写される配列に物理的に隣接している。
【００３４】
「配向」は、所与のＤＮＡ配列におけるヌクレオチドの順序を指す。例えば、別のＤＮＡ配列に対して逆方向にあるＤＮＡ配列の配向とは、別の配列に対して配列の５’〜３’の順序が、配列が得られたＤＮＡ中の基準点と比較するときに反転される配向である。このような基準点には、供給源であるＤＮＡの他の指定されたＤＮＡ配列の転写方向、及び／又はこの配列を含有する複製可能なベクターの複製起点が含まれ得る。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「発現ベクター」は、適切な宿主細胞へとトランスフェクションされると、宿主細胞内で組換え遺伝子産物の発現をもたらす単離ＤＮＡ分子及び精製ＤＮＡ分子を含む。組換え体又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に加えて、発現ベクターは、宿主細胞株における、ＤＮＡコード配列のｍＲＮＡへの効率的な転写及び任意選択によりｍＲＮＡのタンパク質への効率的な翻訳に必要となる制御性ＤＮＡ配列を含む。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「宿主細胞」又は「宿主細胞株」は、任意の細胞、特に、培養物中で成長し、所望の組換え産物タンパク質を発現することが可能な哺乳動物細胞を含む。
【００３７】
本明細書で使用する場合、用語「ＣｐＧ部位」は、直鎖状の塩基配列中のその全長にわたってグアニンヌクレオチドの隣にシトシンヌクレオチドが現れるＤＮＡの領域を含む。「ＣｐＧ」とは、「−Ｃ−リン酸−Ｇ−」、すなわち１つのリン酸のみで隔てられたシトシン及びグアニンの略称であり；リン酸により、任意の２つのヌクレオシドが、ＤＮＡ中で一体に連結されている。「ＣｐＧ」という表記は、この直鎖状配列を、シトシンとグアニンとによるＣＧ塩基対合から識別するのに使用される。
【００３８】
本明細書で使用する場合、用語「発現カセット」は、発現されるポリペプチドと、シス作用性転写調節エレメントの任意の組み合わせを含む、プロモーター、及び任意選択により、エンハンサー配列などのその発現を制御する配列とをコードするポリヌクレオチド配列を含む。遺伝子の発現、すなわち、その転写及び転写産物の翻訳を制御する配列は一般に、調節単位と呼ばれる。調節単位の大部分は、遺伝子のコード配列の上流に位置し、それへと作動可能に連結されている。発現カセットは又、ポリアデニル化部位を含む下流の３’側非翻訳領域も含有し得る。本発明の調節単位は、発現される遺伝子、すなわち、転写単位に作動可能に連結されているか、又は、例えば、異種遺伝子の５’非翻訳領域によるなど、介在するＤＮＡによりそこから隔てられている。発現カセットのベクターへの挿入及び／又はベクターからのその切出しを可能にするために、発現カセットは、好適な１つ以上の制限部位に隣接されることが好ましい。したがって、本発明による発現カセットは、発現ベクター、特に、哺乳動物の発現ベクターを構築するために使用され得る。本発明の発現カセットは、プロモーターの下流に１種以上、例えば、２種、３種又はそれ以上の非翻訳ゲノムＤＮＡ配列を含み得る。
【００３９】
用語「ポリヌクレオチド」及び「ヌクレオチド配列」は、細胞から単離され得る天然に存在する核酸分子又は組換えで発現される核酸分子、及び、例えば、化学合成又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの酵素的方法によって調製され得る合成分子を含む。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列」は、ポリペプチドを発現する遺伝子、好ましくは、異種遺伝子をコードするＤＮＡを含む。
【００４１】
用語「異種コード配列」、「異種遺伝子配列」、「異種遺伝子」、「組換え遺伝子」、又は「遺伝子」は、互換的に用いられる。これらの用語は、宿主細胞において、好ましくは、哺乳動物細胞において発現され、採取することが求められる組換え体、特に、組換え異種タンパク質産物をコードするＤＮＡ配列を指す。遺伝子産物は、ポリペプチドであり得る。異種遺伝子配列は、天然では宿主細胞内に存在せず、同じ種又は異なる種の生物に由来し、遺伝的に改変されている場合がある。
【００４２】
用語「タンパク質」及び「ポリペプチド」は互換的に使用されて、隣接残基のα−アミノ基及びカルボキシ基間のペプチド結合によって他方に連結される一連のアミノ酸残基を含む。
【００４３】
ＩＩ．合成プロモーターを作製する方法
本明細書で提供される方法を使用して、プロモーターは、特定の機能性、例えば、所望の発現レベル、細胞増殖の所望の期における発現、及び／又は所望の細胞型における発現を有するように設計され得る。プロモーターを設計するための方法は、（ｉ）転写因子（ＴＦ）発現をプロファイリングしてＴＦを選択すること、（ｉｉ）ホモタイプのプロモーターにおいて転写的に活性な選択されたＴＦと相互作用する転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）を同定すること、及び（ｉｉｉ）ヘテロタイプのプロモーター内のＴＦ−ＴＦＲＥ相互作用の相対的な転写活性を決定することを含み得る。任意選択により、方法はさらに、（ｉｖ）所望の転写活性を有するＴＦＲＥを選択すること、及び（ｖ）選択されるＴＦＲＥを含む合成プロモーターを生成することを含み得る。
【００４４】
ＴＦ発現のプロファイリングは、実験的に（例えば、ＴＦのＲＮＡ及び／又はタンパク質レベル（例えば、本明細書の実施例１において例示される））達成され得るか、又はＴＦ発現パターンのデータを精査することによって達成され得る。このようなプロファイリングは、個々の細胞型、増殖期、若しくは培養条件におけるＴＦ（ＲＮＡ又はタンパク質）の量又は存在量、及び／又は複数の細胞型、増殖期、又は培養条件にわたるＴＦ（ＲＮＡ又はタンパク質）の量又は存在量の変動性を決定することを含み得る。したがって、本明細書で提供される方法は、少なくとも２種の細胞型、少なくとも２種の増殖期（例えば、定常期及び指数増殖期）、及び／又は少なくとも２種の培養条件における発現を比較することによってＴＦ発現をプロファイリングすることを含み得る。本明細書で提供される方法は、少なくとも３種の細胞型、少なくとも３種の増殖期、及び／又は少なくとも３種の培養条件における発現を比較することによってＴＦ発現をプロファイリングすることを含み得る。本明細書で提供される方法は、少なくとも２種の増殖期における少なくとも２種の細胞型、又は少なくとも２種の培養条件における少なくとも２種の細胞型における発現を比較することによってＴＦ発現をプロファイリングすることを含み得る。本明細書で提供される方法は、少なくとも２種の増殖期における少なくとも３種の細胞型、又は少なくとも２種の培養条件における少なくとも３種の細胞型における発現を比較することによってＴＦ発現をプロファイリングすることを含み得る。本明細書で提供される方法は、少なくとも３種の増殖期における少なくとも２種の細胞型、又は少なくとも３種の培養条件における少なくとも２種の細胞型における発現（例えば、ＲＮＡ又はタンパク質発現レベル、例えば、本明細書の実施例１において例示される）を比較することによってＴＦ発現をプロファイリングすることを含み得る。
【００４５】
本明細書で実証されるとおり、ＴＦ発現は、１種の哺乳動物の細胞型又は複数種の哺乳動物の細胞型においてプロファイリングされ得る。ＴＦ発現は、１種のＣＨＯ細胞型又は複数種のＣＨＯ細胞型（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４及び／又はＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞）においてプロファイリングされ得る。ＴＦ発現は、組換えタンパク質を発現する細胞株及びその親細胞株（すなわち、組換えタンパク質を発現しない細胞株）においてプロファイリングされ得る。ＴＦ発現は、同じ生物に由来する２種以上の異なる細胞型においてプロファイリングされ得る。
【００４６】
発現プロファイルに基づいて、ＴＦは、所望の目的を達成するために選択され得る。例えば、特定の細胞型、増殖期、及び／又は培養条件において高度に発現されるＴＦが選択され得る。複数の細胞型、増殖期、及び／又は培養条件にわたって高度に発現されるＴＦが選択され得る。特定の細胞型、増殖期、及び／又は培養条件において中間のレベルで発現されるＴＦが選択され得る。
【００４７】
本明細書で提供されるいくつかの方法に従って、複数の条件（例えば、複数の細胞株及び／又は複数の増殖条件）にわたって安定的に発現されるＴＦが選択される。発現の安定性は、複数の条件にわたる発現レベル（タンパク質又はＲＮＡ（例えば、本明細書の実施例１において例示される））における最大の倍率変化（ＭＦＣ）を測定することによって決定され得る。ＭＦＣは、複数の条件にわたる最大及び最小の発現レベル間の比である。ある種の態様では、安定的に発現される転写因子のＭＦＣは、３以下、２．５以下、２以下、１．５以下、１以下、又は０．５以下である。
【００４８】
あるいは、特定の所望の細胞型、増殖期、及び／又は培養条件において高度に発現されるのみのＴＦが選択され得る。したがって、いくつかの方法において、目的の宿主細胞において優先的に上方制御され、且つ／又はオフターゲットの宿主細胞において優先的に下方制御されるＴＦが選択される。いくつかの方法では、目的の細胞周期において優先的に上方制御され、且つ／又はオフターゲットの細胞周期において下方制御されるＴＦが選択される。
【００４９】
本明細書で提供される方法に従って、少なくとも２５種、少なくとも５０種、少なくとも１５０種、少なくとも２００種、少なくとも２５０種、少なくとも５００種、又は少なくとも１０００種のＴＦの発現がプロファイリングされ得る。
【００５０】
選択されたＴＦ（すなわち、選択されたＴＦと相互作用する転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ））のための同種の結合部位が、例えば、公開されている研究及びオンラインデータベースの精査によって決定され得る。次に、選択されたＴＦと相互作用するＴＦＲＥは、ホモタイプのプロモーターにおいて転写的に活性であるものを選択するためにスクリーニングされ得る。ホモタイプのプロモーターは、連続して特定のＴＦＲＥの反復コピーを含む。例えば、ホモタイプのプロモーターは、２〜２０コピーのＴＦＲＥを含み得る。ホモタイプのプロモーターは、４〜１０コピーのＴＦＲＥを含み得る。ホモタイプのプロモーターは、約５、約６、約７、又は約８コピーのＴＦＲＥを含み得る。ホモタイプのプロモーターは、５、６、７、又は８コピーのＴＦＲＥを含み得る。
【００５１】
ホモタイプのプロモーターにおけるＴＦＲＥは、スペーサーによって隔てられ得る。スペーサーは、例えば、５０個以下のヌクレオチド、２５個以下、又は１２個以下のヌクレオチドであり得る。スペーサーは、例えば、４〜５０個のヌクレオチド、４〜２５個のヌクレオチド、又は４〜１２個のヌクレオチドであり得る。スペーサーは、約６個のヌクレオチドであり得る。スペーサーは、６個のヌクレオチドであり得る。ホモタイプのプロモーターにおけるＴＦＲＥは、同じスペーサーによって隔てられ得るか、又は異なるスペーサーによって隔てられ得る。
【００５２】
ホモタイプのプロモーターにおいて転写的に活性であるＴＦＲＥは、ＴＦＲＥの複数の上流のコピーを有するコアプロモーターに作動可能に連結されたレポーター遺伝子を含有する構築物を作製することによって同定され得る。レポーターの発現レベル（ＲＮＡ又はタンパク質）は、例えば、目的の細胞（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、及び／又はＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞などのＣＨＯ細胞）における一過的なトランスフェクションの後に評価され得る。レポーターの発現は、ＴＦＲＥがホモタイプのプロモーターにおいて活性であることを示す。
【００５３】
続いて、選択されたＴＦと相互作用し、且つホモタイプのプロモーターにおいて活性であるＴＦＲＥの活性は、ヘテロタイプのプロモーターの文脈において評価され得る。ヘテロタイプのプロモーターは、連続してＴＦＲＥの組み合わせを連結することによって作製され得る。
【００５４】
ヘテロタイプのプロモーターは、例えば、少なくとも２種、少なくとも３種、又は少なくとも４種の異なるＴＦＲＥを含む、合計で２〜２０個のＴＦＲＥを含み得る。ヘテロタイプのプロモーターは、例えば、２〜１０種、３〜９種、又は４〜８種の異なるＴＦＲＥを含む、合計で２〜２０個のＴＦＲＥを含み得る。
【００５５】
ヘテロタイプのプロモーターにおけるＴＦＲＥは、スペーサーによって隔てられ得る。スペーサーは、例えば、５０個以下のヌクレオチド、２５個以下、又は１２個以下のヌクレオチドであり得る。スペーサーは、例えば、４〜５０個のヌクレオチド、４〜２５個のヌクレオチド、又は４〜１２個のヌクレオチドであり得る。スペーサーは、約６個のヌクレオチドであり得る。スペーサーは、６個のヌクレオチドであり得る。ヘテロタイプのプロモーターにおけるＴＦＲＥは、同じスペーサーによって隔てられ得るか、又は異なるスペーサーによって隔てられ得る。ヘテロタイプのプロモーターは、例えば、ＴＦＲＥブロックの組み合わせを、例えば様々な量又は濃度において混合することによって作製され得る。
【００５６】
ヘテロタイプのプロモーターにおけるＴＦＲＥの相対的な転写活性（すなわち、各ＴＦＲＥの単一コピーによって提供される全体的なプロモーター活性への寄与）は、例えば、ＴＦＲＥのコピー数の関数としてヘテロタイプのプロモーター活性をモデル化することによって決定され得る。
【００５７】
次に、プロモーターは、例えば、特定の発現レベルなどの所望の活性をもたらすＴＦＲＥの組み合わせを（例えば、様々な細胞型、増殖期、及び／若しくは培養条件にわたって、又は特定の細胞型、増殖期、及び／若しくは培養条件において）選択することによって設計され得る。
【００５８】
次に、ＴＦＲＥの選択された組み合わせを含有する合成プロモーターは、例えば、化学合成によるか、組換えヌクレオチド技術を用いるか、又はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの酵素的方法を用いることによって生成され得る。
【００５９】
ＩＩＩ．合成プロモーター
本明細書で提供されるとおり、プロモーターは、特定の機能性、例えば、所望の発現レベル、細胞増殖の所望の期における発現、及び／又は所望の細胞型における発現を有するように設計され得る。
【００６０】
本明細書で提供されるプロモーターは、転写因子調節エレメント（ＴＦＲＥ）及びプロモーターコアを含むヌクレオチド配列を含み得る。ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列は、プロモーターコアの上流にあり得る。
【００６１】
本明細書で提供されるプロモーターは、複数のＴＦＲＥ、例えば、２〜２０、２〜１８、２〜１６、２〜１５、２〜１４、３〜２０、３〜１８、３〜１６、３〜１５、３〜１４、４〜２０、４〜１８、４〜１６、４〜１５、４〜１４、５〜２０、５〜１８、５〜１６、５〜１５、５〜１４、６〜２０、６〜１８、６〜１６、６〜１５、又は６〜１４個のＴＦＲＥを含み得る。
【００６２】
ＴＦＲＥは、４〜１００個のヌクレオチド、４〜７５個のヌクレオチド、４〜５０個のヌクレオチド、４〜３０個のヌクレオチド、４〜２５個のヌクレオチド、４〜２０個のヌクレオチド、４〜１５個のヌクレオチド、又は４〜１２個のヌクレオチドを含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。ＴＦＲＥは、６〜１００個のヌクレオチド、６〜７５個のヌクレオチド、６〜５０個のヌクレオチド、６〜３０個のヌクレオチド、６〜２５個のヌクレオチド、６〜２０個のヌクレオチド、６〜１５個のヌクレオチド、又は６〜１２個のヌクレオチドを含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。ＴＦＲＥは、８〜１００個のヌクレオチド、８〜７５個のヌクレオチド、８〜５０個のヌクレオチド、８〜３０個のヌクレオチド、８〜２５個のヌクレオチド、８〜２０個のヌクレオチド、８〜１５個のヌクレオチド、又は８〜１２個のヌクレオチドを含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。ＴＦＲＥは、４〜３０個のヌクレオチドを含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。
【００６３】
ＴＦＲＥは、哺乳動物のＴＦＲＥであり得る。ＴＦＲＥは、ＣＨＯ細胞のＴＦＲＥであり得る。ＴＦＲＥは、配列番号１〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み得る。ＴＦＲＥは、抗酸化ＲＥ（ＡＲＥ）（任意選択により配列番号７のヌクレオチド配列を含む）、ＥＴＳ結合部位１（ＥＢＳ１）（任意選択により配列番号１０のヌクレオチド配列を含む）、小胞体ストレスＲＥ（ＥＲＳＥ）（任意選択により配列番号１５のヌクレオチド配列を含む）、及びダイオキシンＲＥ（ＤＲＥ）（任意選択により配列番号３１のヌクレオチド配列を含む）のＴＲＦＥからなる群から選択され得る。ＴＦＲＥは、抗酸化ＲＥ（ＡＲＥ）、ＥＴＳ結合部位１（ＥＢＳ１）、及びダイオキシンＲＥ（ＤＲＥ）からなる群から選択され得る。任意選択により、本明細書で提供されるプロモーターはさらに、核因子ＲＥ（ＮＦ１−ＲＥ）（任意選択により配列番号６のヌクレオチド配列を含む）、ＧＣ−ボックス（任意選択により配列番号９のヌクレオチド配列を含む）、及び／又はＣＣＡＡＴエンハンサー結合ＲＥ（Ｃ／ＥＢＰ−ＲＥ）（任意選択により配列番号２３のヌクレオチド配列を含む）のＴＦＲＥを含み得る。
【００６４】
本明細書で提供されるある種のプロモーターは、小胞体ストレスＲＥ（ＥＲＳＥ）のＴＦＲＥを含まない。
【００６５】
本明細書で提供されるある種のプロモーターは、核因子１ＲＥ（ＮＦ１−ＲＥ）のＴＦＲＥを含まない。本明細書で提供されるある種のプロモーターは、ＧＣ−ボックスのＴＦＲＥを含まない。本明細書で提供されるある種のプロモーターは、ＣＣＡＡＴエンハンサー結合タンパク質ＲＥ（Ｃ／ＥＢＰ−ＲＥ）のＴＦＲＥを含まない。本明細書で提供されるある種のプロモーターは、ＮＦ１−ＲＥ、ＧＣ−ボックス、又はＣ／ＥＢＰ−ＲＥのＴＦＲＥを含まない。
【００６６】
本明細書で提供されるとおり、プロモーターは、ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列を含み得るが、少なくとも２つのＴＦＲＥは同じであり、例えば、少なくとも２つのＴＦＲＥはＡＲＥのＴＦＲＥであり、少なくとも２つのＴＦＲＥはＥＢＳ１のＴＦＲＥであり、少なくとも２つのＴＦＲＥはＥＲＳＥのＴＦＲＥであり、且つ／又は少なくとも２つのＴＦＲＥはＤＲＥのＴＦＲＥである。本明細書で提供されるとおり、プロモーターは、ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列を含み得るが、少なくとも３つのＴＦＲＥは同じであり、例えば、少なくとも３つのＴＦＲＥはＡＲＥのＴＦＲＥであり、少なくとも３つのＴＦＲＥはＥＢＳ１のＴＦＲＥであり、少なくとも３つのＴＦＲＥはＥＲＳＥのＴＦＲＥであり、且つ／又は少なくとも３つのＴＦＲＥはＤＲＥのＴＦＲＥである。
【００６７】
本明細書で提供されるプロモーターは又、例えば、ＴＦＲＥ間にスペーサーを含み得る。スペーサーは、例えば、５０個以下のヌクレオチド、２５個以下、又は１２個以下のヌクレオチドであり得る。スペーサーは、例えば、４〜５０個のヌクレオチド、４〜２５個のヌクレオチド、又は４〜１２個のヌクレオチドであり得る。スペーサーは、約６個のヌクレオチドであり得る。スペーサーは、６個のヌクレオチドであり得る。
【００６８】
本明細書で提供されるプロモーターは、同じスペーサー（すなわち、指定された配列及び長さのスペーサー）の複数のコピーを含み得るか、又は異なるスペーサー（すなわち、異なる配列及び／又は様々な長さのスペーサー）の組み合わせを含み得る。したがって、プロモーターは、各ＴＦＲＥ間で同じスペーサーを含み得るか、又はＴＦＲＥ間で異なるスペーサーを含有し得る。
【００６９】
ＴＲＦＥ（及び任意選択によりスペーサー）を含むヌクレオチド配列は、最大１５００個のヌクレオチド、最大１０００個のヌクレオチド、最大７５０個のヌクレオチド、最大５００個のヌクレオチド、又は最大２５０個のヌクレオチドであり得る。ＴＲＦＥ（及び任意選択によりスペーサー）を含むヌクレオチド配列は、少なくとも２０個のヌクレオチドであり得る。
【００７０】
ＴＲＦＥ（及び任意選択によりスペーサー）を含むヌクレオチド配列はＴＦＲＥを含み得るが、ＴＦＲＥは２５個のヌクレオチドを超えず、且つスペーサーは５０個のヌクレオチドを超えない。ＴＲＦＥ（及び任意選択によりスペーサー）を含むヌクレオチド配列はＴＦＲＥを含み得るが、ＴＦＲＥは２５個のヌクレオチドを超えず、且つスペーサーは２５個のヌクレオチドを超えない。ＴＲＦＥ（及び任意選択によりスペーサー）を含むヌクレオチド配列はＴＦＲＥを含み得るが、ＴＦＲＥは２５個のヌクレオチドを超えず、且つスペーサーは２０個のヌクレオチドを超えない。ＴＲＦＥ（及び任意選択によりスペーサー）を含むヌクレオチド配列はＴＦＲＥを含み得るが、ＴＦＲＥは２５個のヌクレオチドを超えず、且つスペーサーは１５個のヌクレオチドを超えない。ＴＲＦＥ（及び任意選択によりスペーサー）を含むヌクレオチド配列はＴＦＲＥを含み得るが、ＴＦＲＥは２５個のヌクレオチドを超えず、且つスペーサーは１０個のヌクレオチドを超えない。本明細書で提供されるとおり、このようなヌクレオチド配列は、少なくともお４つのＴＲＦＥを含み得る。
【００７１】
ＴＲＦＥ（及び任意選択によりスペーサー）を含むヌクレオチド配列はＴＦＲＥを含み得るが、各ＴＦＲＥは６〜２０個のヌクレオチドであり、且つ各スペーサーは５０個超のヌクレオチドである。ＴＲＦＥ（及び任意選択によりスペーサー）を含むヌクレオチド配列はＴＦＲＥを含み得るが、各ＴＦＲＥは６〜２０個のヌクレオチドであり、且つ各スペーサーは２５個超のヌクレオチドである。ＴＲＦＥ（及び任意選択によりスペーサー）を含むヌクレオチド配列はＴＦＲＥを含み得るが、各ＴＦＲＥは６〜２０個のヌクレオチドであり、且つ各スペーサーは２０個超のヌクレオチドである。ＴＲＦＥ（及び任意選択によりスペーサー）を含むヌクレオチド配列はＴＦＲＥを含み得るが、各ＴＦＲＥは６〜２０個のヌクレオチドであり、且つ各スペーサーは１５個超のヌクレオチドである。ＴＲＦＥ（及び任意選択によりスペーサー）を含むヌクレオチド配列はＴＦＲＥを含み得るが、各ＴＦＲＥは６〜２０個のヌクレオチドであり、且つ各スペーサーは１０個超のヌクレオチドである。本明細書で提供されるとおり、このようなヌクレオチド配列は、少なくともお４つのＴＲＦＥを含み得る。
【００７２】
本明細書で提供されるとおり、コアプロモーターは、ＴＡＴＡボックス及び／又はイニシエーターエレメントを含み得るが、任意選択によりコアプロモーターは２５〜１００個のヌクレオチドである。本明細書で提供されるとおり、コアプロモーターは、細胞、例えばＣＨＯ細胞において高度に発現される内在性遺伝子の転写開始部位を取り囲むヌクレオチド配列であり得る。コアプロモーターは、本明細書で提供されるとおり、ＣＭＶコアプロモーターであり得る。したがって、コアプロモーターは、配列番号３３のヌクレオチド配列を含み得るか、それから本質的になり得るか、又はそれからなり得る。
【００７３】
本明細書で提供されるプロモーターを設計して、ＣｐＧジヌクレオチドの数を制限することができる。ＣｐＧジヌクレオチドにおけるシトシンのメチル化は、不安定性をもたらし得る。したがって、ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列は、２０個未満、１５個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、又は６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを有し得る。ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列は、２０個以下、１５個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、又は５個以下のＣｐＧジヌクレオチドを有し得る。同様に、本明細書で提供されるプロモーターは、２０個未満、１５個未満、１０個未満、９個未満、８個未満、７個未満、又は６個未満のＣｐＧジヌクレオチドを有し得る。本明細書で提供されるプロモーターは、２０個以下、１５個以下、１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、又は５個以下のＣｐＧジヌクレオチドを有し得る。
【００７４】
本明細書で提供されるプロモーターを設計して、反復配列の数を制限することができる。したがって、ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列は、２０個超のヌクレオチド、２５個超のヌクレオチド、３０個超のヌクレオチド、３５個超のヌクレオチド、又は４０個超のヌクレオチドの反復配列を有し得ない。同様に、本明細書で提供されるプロモーターは、２０個超のヌクレオチド、２５個超のヌクレオチド、３０個超のヌクレオチド、３５個超のヌクレオチド、又は４０個超のヌクレオチドの反復配列を有し得ない。ＴＦＲＥを含むヌクレオチド配列は、１個超の反復配列、例えば、２０個超のヌクレオチド、２５個超のヌクレオチド、３０個超のヌクレオチド、３５個超のヌクレオチド、又は４０個超のヌクレオチドの反復配列を有し得ない。本明細書で提供されるプロモーターは、１個超の反復配列、例えば、２０個超のヌクレオチド、２５個超のヌクレオチド、３０個超のヌクレオチド、３５個超のヌクレオチド、又は４０個超のヌクレオチドの反復配列を有し得ない。
【００７５】
本明細書で提供されるプロモーターを設計して、制限エンドヌクレアーゼ部位の数を制限することができる。例えば、本明細書で提供されるＴＦＲＥ又はプロモーターを含むヌクレオチド配列は、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＴａｑＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＰｖｕＩ、ＰａｃＩ、ＫｐｎＩ、及び／又はＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を欠き得る。例えば、本明細書で提供されるＴＦＲＥ又はプロモーターを含むヌクレオチド配列は、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＴａｑＩ、ＮｏｔＩ、ＳｍａＩ、ＰｖｕＩ、及び／又はＰａｃＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を欠き得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＴＦＲＥ又はプロモーターを含むヌクレオチド配列は、ＴＦＲＥ間及び／又はスペーサー間に制限部位（例えば、ＫｐｎＩ又はＸｈｏＩ制限部位）を含み得る。
【００７６】
本明細書で実証されるとおり、ＴＦＲＥの順序、スペーシング、及び配向がプロモーター活性に最小の影響及ぼすプロモーターを設計することができる。したがって、プロモーターの活性は、プロモーター内に含有される各ＴＦＲＥのコピーの数と相関し得る。したがって、プロモーターの活性は、プロモーター内に含有される各ＴＦＲＥのコピーの数に基づいて予測され得る。
【００７７】
本明細書で実証されるとおり、プロモーターを設計して、細胞増殖、及び／又は細胞生存率に対する著しい影響を回避することもできる。本明細書で提供されるプロモーターは、プロモーターサイレンシングを回避することができ、且つ／又はタンパク質産生を支える重要な細胞プロセスに対するオフターゲット作用を最小化することができる。
【００７８】
ＩＶ．ベクター、細胞、及びライブラリー
本明細書では又、本明細書で提供されるプロモーターを含むベクター、細胞、及びライブラリーが提供される。
【００７９】
ベクターは、例えば、発現される遺伝子に作動可能に連結された本明細書で提供されるプロモーター又は転写可能なポリヌクレオチドを含み得る。発現される遺伝子は、例えば、分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＣ）、又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などのレポーター遺伝子であり得る。発現される遺伝子は又、抗体（又はその重鎖若しくは軽鎖、又はその重鎖可変領域若しくは軽鎖可変領域）、抗体の抗原結合断片（例えば、ＳｃＦｖ）、又はＦｃ融合タンパク質などの治療用タンパク質であり得る。発現される遺伝子は又、酵素であり得る。転写可能なポリヌクレオチドは、例えば、ＲＮＡｉ又はｓｈＲＮＡであり得る。
【００８０】
細胞は、本明細書で提供されるプロモーター又は本明細書で提供されるベクターを含み得る。細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞であり得る。ＣＨＯ細胞は、例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、又はＣＨＯ−ＤＸＢ１１細胞であり得る。細胞は、例えば、ヒト細胞であり得る。細胞は又、例えば、非ヒト細胞、例えば、非ヒト哺乳動物細胞であり得る。本明細書で提供されるプロモーター又はベクターを含む細胞は、一過的にトランスフェクトされ得るか、又は安定的にトランスフェクトされ得る。
【００８１】
本明細書で提供される細胞は、単離細胞（すなわち、生物内に含有されない細胞）又は培養細胞（すなわち、培養物中の細胞）であり得る。
【００８２】
ライブラリーは、本明細書で提供されるプロモーター、本明細書で提供されるベクター、又は本明細書で提供される細胞を含み得る。ライブラリーは、少なくとも５０種、少なくとも１００種、少なくとも１５０種、少なくとも２００種、少なくとも２５０種、又は少なくとも５００種の異なるプロモーター、ベクター、又は細胞を含み得る。
【実施例】
【００８３】
Ｖ．実施例
実施例１：材料及び方法
宿主細胞転写因子発現動態の分析
全ＲＮＡを、ＲＮＡｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｒａｗｌｅｙ、ＵＫ）を使用して、増殖の対数期及び定常期中に３つのＣＨＯ−Ｋ１由来細胞株（親宿主株、並びにグルタミンシンターゼ（ＧＳ）又はＧＳ及びＩｇＧ抗体のいずれかを発現する宿主）から抽出した。ＲＮＡの純度及び完全性を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）及び２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｗｏｋｉｎｇｈａｍ、ＵＫ）を使用して確認した。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを、ＴｒｕＳｅｑ  ＲＮＡライブラリー調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｅｓｓｅｘ、ＵＫ）を使用して調製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００システム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して配列決定した。シークエンスリードを、Ｔｏｐｈａｔを使用してＣＨＯ−Ｋ１基準ゲノムにマッピングし（２４、２５）、各転写物の相対的存在量を、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓを使用して計算した（２６）。実験的に検証されたマウス転写因子（ＴＦ）の精選されたデータベースを、ＴＦｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔから得た（２７、２８）。６つ全ての実験条件にわたる各ＴＦ遺伝子の平均転写物存在量を決定し、７０番目のパーセンタイル以上の発現レベルを有する遺伝子を、さらなる分析のために選択した。遺伝子発現安定性を、全トランスクリプトームにわたる転写物存在量における最大倍率変化（ＭＦＣ）を計算することによって測定した。安定に発現されるＴＦ（ＭＦＣ＜１．５）の同種の結合部位を、以前に公開された研究及びオンラインデータベースから得た（（２９）；表１を参照のこと）。
【００８４】
【表１】
2020517245.tif 000003
【００８５】
ホモタイプ及びヘテロタイプのプロモーターのインビトロ構築
最小ＣＭＶコアプロモーター（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ６０３２１．１、ヌクレオチド１１０９−１１９３：
【化１】
2020517245.tif 000004
）を合成し（Ｓｉｇｍａ、Ｐｏｏｌｅ、ＵＫ）、以前に記載されたプロモーターを持たないレポーターベクターにおける分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）遺伝子の上流に挿入した（３０）。ホモタイプのＴＦＲＥレポーターを構築するために、連続した特定のＴＦＲＥの６個の反復コピーを含有する合成オリゴヌクレオチド（表１を参照のこと）を、ＣＭＶコアプロモーターの上流に挿入した。ヘテロタイプのプロモーターのライブラリーを作製するために、別々のＴＦ結合配列の単一のコピーを含有するブロックを構築するＴＦＲＥを、以前に記載されたとおりに構築し（３１）、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により様々な組み合わせにおいて結合した。ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を含有する「クローニングブロック」は、ＴＦＲＥブロックに対して１：２０のモル比でのライゲーション混合物に含まれた。ランダムＴＦＲＥブロック構築物を、ＫｐｎＩ及びＸｈｏＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、ＵＫ）で消化し、ゲル抽出し（Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キット、Ｑｉａｇｅｎ）、ＳＥＡＰレポーターベクターにおけるＣＭＶコアプロモーターの上流に挿入した。プラスミドを配列決定して、インビトロで構築された各合成プロモーターのＴＦＲＥ組成を決定した。
【００８６】
ヘテロタイプのプロモーター活性のモデル化
インビトロで構築されたヘテロタイプのプロモーター活性を、成分ＴＦ結合部位のコピー数の関数としてモデル化した。各種モデル化手法（線形回帰、一般化線形、一般化加法、ガウス過程）の比較により、全てのモデルが等価な予測能を有することが判明した。したがって、複雑性を最小化するために、本発明者らは、多重線形回帰モデル
【数１】
2020517245.tif 000005
を使用したが、ここで、
【数２】
2020517245.tif 000006
は、プロモーター活性を表し、ｘ１〜ｘ１２は、１２種の個々のＴＦＲＥブロックである。回帰係数（β１〜β１２；最小二乗推定を使用して計算される、
【数３】
2020517245.tif 000007
）を分析して、ヘテロタイプのプロモーター構造内の各ＴＦＲＥブロックの単一コピーの相対的な転写活性を決定した。モデルの予測能、及び過剰適合の可能性を、１個抜き及び５倍交差検定を用いて評価した。
【００８７】
ヘテロタイプのプロモーターのインシリコ設計
１２種の別々のＴＦ結合部位の全ての可能な１〜１４ブロックの組み合わせ（ｎ＝９，６５７，６９９）を、Ｒの「ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ」関数を用いて生成した。各ＴＦＲＥの組み合わせの相対的な転写活性を、インビトロで構築されたヘテロタイプのプロモーター活性の発明者らのモデルを用いて決定した。所望の設計基準を有するＴＦＲＥの組み合わせを、連続的なフィルタリングステップを適用することによってライブラリーから選択した（実施例２〜５において記載される）。成分ＴＦＲＥを配置して、ＣｐＧジヌクレオチド、反復配列、及び制限エンドヌクレアーゼ部位の出現を最小化した。このプロセスを支援するために、結合部位を、特別に設計された６塩基対（ｂｐ）のスペーサー配列で隔てた。設計されたプロモーター配列を、ＦＡＩＲ（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｓｅｒｖｅｒ１．ｐｈｙｓｉｃｓ．ｉｉｓｃ．ｅｒｎｅｔ．ｉｎ／ｆａｉｒ／）及びＷｅｂｃｕｔｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｌｕｎｄｂｅｒｇ．ｇｕ．ｓｅ／ｃｕｔｔｅｒ２／）を用いて、反復配列及びエンドヌクレアーゼ部位の存在について分析した。意図的でない、追加のＴＦ結合部位が、ＴＦＲＥスペーサー接合点で作製されなかったことを確認するために、プロモーターを、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ／ｍａｔｉｎｓｐｅｃｔｏｒ．ｈｔｍｌ）及びＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎツール（ＴＲＡＰ：ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｐ．ｍｏｌｇｅｎ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｔｒａｐ＿ｆｏｒｍ．ｃｇｉ）を使用して分析した（３３、３４）。設計された配列を分析し（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＳＥＡＰレポーターベクターにおける最小ＣＭＶコアプロモーターの上流にクローン化した。
【００８８】
ＣＨＯ細胞培養液及びトランスフェクション
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＣＨＯ−Ｋ１由来）を、通気エルレンマイヤーフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＫ）中のＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２中３７℃にて１４０ｒｐｍで振盪させながら通常どおりに培養し、２×１０５細胞／ｍｌの播種密度で３〜４日毎に継代培養した。細胞濃度及び生存率を、Ｖｉ−Ｃｅｌｌ細胞生存率分析機器（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｈｉｇｈ  Ｗｙｃｏｍｂｅ、ＵＫ）を用いて自動化されたトリパンブルー排除アッセイによって決定した。一過的なトランスフェクションの２時間前に、対数期中期の培養液から２×１０５細胞を、２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、Ｓｔａｆｆｏｒｄ、ＵＫ）の個々のウェルに播種した。細胞を、製造業者の指示書に従って調製された、ＤＮＡ及びリポフェクタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＤＮＡ−脂質複合体でトランスフェクトした。内部標準（ｈＣＭＶ−ＩＥ１−ＳＥＡＰ、ＳＶ４０−ＳＥＡＰ、ＮＦｋＢ−ＲＥ−ＳＥＡＰ）が、各プレートに含まれて、再現可能なトランスフェクション性能を確認し、且つ合成プロモーター活性を標準化した。トランスフェクト細胞を、Ｓｅｎｓｏｌｙｔｅ  ｐＮＰＰ  ＳＥＡＰ比色分析レポーター遺伝子アッセイキット（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）を用いるＳＥＡＰタンパク質発現の定量化の前に２４時間インキュベートした。細胞培養液の上清におけるＳＥＡＰ活性が、ＳＥＡＰのｍＲＮＡレベルと相関したことを確認するために、全ＲＮＡを選択されたトランスフェクト細胞から抽出し、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により分析した。
【００８９】
安定的なプールを構築するために、グルタミンシンターゼ選択マーカーを共発現する合成プロモーター−ＳＥＡＰレポータープラスミド（５μｇ）を、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒシステム（Ｌｏｎｚａ、Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）を使用するエレクトロポレーションによって、ＣＨＯ細胞にトランスフェクトした（１×１０７；三つ組のトランスフェクション）。安定的なトランスフェクタントを、５０μＭメチオニンスルホキシイミン（Ｓｉｇｍａ）中で選択した。バッチ産生プロセスのために、対数期中期の培養液から６×１０６個の細胞を、通気エルレンマイヤーフラスコ中の３０ｍＬのＣＤ−ＣＨＯ培地に播種した。細胞濃度、培養生存率及びＳＥＡＰ発現（ｍＲＮＡ及びタンパク質レベル）を、対数増殖期（４日目）及び定常増殖期（７日目）中に測定した。長期間の発現安定性を検証するために、７日のバッチ産生プロセスを、高産生株及び低産生株の安定的なプールが８週間（６０細胞世代）ＭＳＸ含有培地において継代培養された後に繰り返した。
【００９０】
ＲＮＡ抽出、逆転写、及びｑＰＣＲ分析
全ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ、ＵＫ）を使用して細胞から抽出した。ＲＮＡの純度及び完全性を、ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して確認した。８００ｎｇの抽出ＲＮＡを、製造業者の指示書に従ってＱｕａｎｔｉｔｅｃｔ逆転写キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して逆転写した（ゲノムＤＮＡはこの手順の間に除去された）。ｃＤＮＡを、７５００  ｆａｓｔ  リアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、ＵＫ）を用いるｑＰＣＲ分析の前にヌクレアーゼフリー水中において１：１０で希釈した。１２．５μｌのＱｕａｎｔｉＦａｓｔ  ＳＹＢＲグリーンＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ）、２μｌのｃＤＮＡ、２．５μｌのプライマーミックス（プライマー当たりの最終濃度２００ｎＭ）、及び８μｌのヌクレアーゼフリー水を含有する反応混合物を、ＭｉｃｒｏＡｍｐ  ｆａｓｔ光学９６ウェルプレート（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中において調製した。増幅条件は以下のとおりであった：９５℃で５分間、その後９５℃で１５秒及び６０℃で６０秒を４０サイクル。融解曲線分析を６０〜９５℃で実施した。Ｇｎｂ１及びＦｋｂｐ１ａを、内部標準の基準遺伝子として使用した（Ｂｒｏｗｎ  ＡＪ  ｅ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ−ｂａｓｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｐｔｉｍａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ＣＨＯ  ｇｅｎｅｓ  ｆｏｒ  ｎｏｒｍａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑＰＣＲ  ｄａｔａ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １３：１７００２５９（２０１７））。鋳型を含有しないか、又は逆転写酵素の非存在下で実施された逆転写反応に由来する産物を含有する反応混合物を、陰性対照として使用した。全ての試料を三つ組で実施し、平均Ｃｔ（サイクル閾値）値をさらなる分析のために使用した。プライマー配列は、表２において列記される。増幅効率は、式Ｅ＝１０（−１／勾配）を用いて標準曲線（プールされたｃＤＮＡ試料の１０倍の段階希釈）から決定した。
【００９１】
【表２】
2020517245.tif 000008
【００９２】
実施例２：宿主細胞ＴＦ発現動態の分析により、文脈特異的な機能性を有するモジュラー結合部位の同定を容易にする
カスタムプロモーター設計のプロセスを実証するために、生物学的製剤の製造に最も有力な宿主であるＣＨＯ細胞における使用のための配列を作製した。転写調節は以前にＣＨＯ細胞において実証されているが、インビトロでの構築方法は、プロモーターサイレンシングを防止し、且つタンパク質産生を支える重要な細胞プロセスに対するオフターゲット作用を最小化するための、配列の特徴のカスタマイズ可能な仕様を可能にしていない（３１、３５、５６）。ＣＨＯ細胞のＴＦレパートリーをプロファイリングするために、培養液の対数期及び定常期で採取される３つの別々のＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ−Ｋ１由来の親宿主細胞株、及びＧＳ、又はＧＳ及びＩｇＧ抗体のいずれかを発現する宿主）においてＴＦ発現レベルを分析した。効果的なＴＦ濃度（すなわち、核において適切に修飾され、且つ局在化されるＴＦ）を直接的に測定する困難さを考慮して、ＴＦ発現は、ｍＲＮＡレベルで決定された。これは、活性のＴＦレベルの正確な定量化を可能にしないが、それは全体的なＴＦ発現パターン（例えば、なし／低／高／特異的な発現）の情報を提供し、対応する活性動態を有する同種のＴＦＲＥの同定を可能にする（２２、２３、３７）。さらに、この方法は、大部分の哺乳動物細胞型に関するプロモーター設計に容易に適用可能であり、そのためにトランスクリプトームのデータセットが通常は利用可能である（３８）。
【００９３】
哺乳動物ゲノムは、約２，０００種のＴＦをコード化する遺伝子を含有すると推定されているが、これらのうちごく一部のみが、ＤＮＡ結合ＴＦとして実験的に検証されている（３９、４０）。したがって、分析は、配列特異的ＤＮＡ結合を呈し、且つＲＮＡポリメラーゼＩＩ依存的転写を調節することの両方が示されている７７４種のＴＦに限定された（２７）。６つ全ての実験条件にわたって、各ＴＦの平均発現レベルが決定された。図１に示されるとおり、３８８／７７４のＴＦがＣＨＯ細胞で発現され、ここで発現レベルは３桁超に及ぶ。必要となる機能性に応じて、利用可能な宿主細胞のＴＦ部分の任意の組み合わせと相互作用するように合成プロモーターを設計することができる。例えば、細胞型特異性は、目的の宿主細胞において優先的に上方制御され、且つオフターゲット活性が望ましくない細胞型において特異的に下方制御されるＴＦに結合するプロモーターを設計することによって達成することができた。本実施例では、プロモーターは、増殖及び細胞生存などのタンパク質産生を支えるＣＨＯ細胞プロセスに対して最小の影響有するように設計された。したがって、ＣＨＯ細胞において比較的高度に発現されるＴＦ（ＴＦのｍＲＮＡ発現レベルの上位３０％に位置する）は、異種プロモーターが、宿主細胞トランスクリプトームに影響を及ぼさずにこれらの豊富な細胞成分と相互作用することができるという推論に基づいて標的化された（すなわち、これらのＴＦは、核におけるそれらの同種の結合部位のコピーが適度に増加する場合、制限される可能性は低い）。さらに、プロモーターは、１．５未満の最大倍率変化（最高及び最低の発現レベルの間の比率）として測定される６つ全てのＣＨＯ細胞トランスクリプトームにわたる高い発現安定性を示したＴＦの探索に着目することによって、各種ＣＨＯ細胞株及び増殖期の文脈において安定的な活性を呈するように設計された。最後に、サイレンシングのリスクを最小化するために、プロモーターは、主としてリプレッサーとして機能するＴＦと相互作用しないように設計された（４２、４３）。これらの選択基準の適用により、必須の発現プロファイル及び機能性を有する６７種のＣＨＯ細胞のＴＦが同定された（図１Ａ）。
【００９４】
図１Ｂに示されるとおり、結合部位の冗長性（重複）によって、６７個の同定されたＴＦが、３２個の別々の調節エレメントと理論的に相互作用する。ホモタイプのプロモーターの文脈において転写的に活性であるＴＦＲＥは、ヘテロタイプ構造において合わせて組み合わされるときに相乗的に機能する可能性は低い（１８）。したがって、協同的に相互作用しないモジュラーＴＦＲＥを同定するために、本発明者らは、最小の哺乳動物コアプロモーター（ＴＡＴＡボックス及びイニシエーターエレメントを含有するｈＣＭＶ−ＩＥ１コア；ｈＣＭＶ−ＩＥ１コアプロモーター及びＴＦＲＥコンセンサス配列は、それぞれ配列番号３３及び表１において示される）の上流の連続した特定のＴＦＲＥの６つの反復コピーをそれぞれ含有したＳＥＡＰレポーター構築物を作製した。各ＴＦＲＥレポータープラスミドによるＣＨＯ細胞の一過的なトランスフェクション後のＳＥＡＰレポーターベクターの産生の測定は、１２／３２のＴＦＲＥが、組換え遺伝子転写（Ｅ−ボックス、ＣＲＥ、ＡＡＲＥ、ＮＦｋＢ−ＲＥ、ＡＲＥ、ＧＣ−ボックス、ＥＢＳ１、ＥＲＳＥ、Ｃ／ＥＢＰ−ＲＥ、Ｄ−ボックス、ＨＲＥ、ＤＲＥ）の活性化を独立して媒介することができることを示した。図１Ｂに示されるとおり、関連しているＴＦＲＥの活性は、同種のＴＦの発現レベルに比例しなかった。これは、ｍＲＮＡの発現レベルと効果的なＴＦ濃度との間に相関がないことによって説明され得る。加えて、転写を推進するために、一部のＴＦは、組み合わせの相互作用、又はＣＨＯ細胞において十分に発現されないコアクチベーターを必要とし得る。
【００９５】
実施例３：ヘテロタイプのプロモーター構造におけるモジュラーＴＦＲＥブロックの機能は、結合部位の順序及びスペーシングに依存しない
ヘテロタイプ構造の文脈において合わせて組み合わされるとき、ホモタイプのプロモーターにおいて転写的に活性であるＴＦＲＥは相乗的に機能しないという仮説を試験するために、プロモーターを様々なＴＦＲＥ組成により構築した。ホモタイプのプロモーターにおいて活性であると同定された１２種のＴＦＲＥの各々のために、ブロックを構築するオリゴヌクレオチドを、ＴＦ結合配列の単一コピーを含有するように合成した。ＴＦＲＥブロックを結合して、ＳＥＡＰレポータープラスミドにおける最小ＣＭＶコアプロモーターの上流に挿入されたＴＦ結合部位のランダムな連なりを組み立てた。図２Ａに示されるとおり、７種の別々のプロモーターライブラリーを、ＴＦＲＥブロックの様々な組み合わせを混合することによって構築した。ライブラリーのＴＦＲＥ組成を設計して、様々なプロモーター（例えば、異なる強度、様々なＴＦＲＥの組み合わせ）及び結合部位（例えば、様々なコピー数、配向、及び空間配置）の文脈における各個別のＴＦＲＥの活性を試験した。１４０種の別々の合成プロモーター−レポータープラスミドによるＣＨＯ細胞のトランスフェクション後のＳＥＡＰ産生の測定は、図２Ｂにおいて示される。これらのデータは、プロモーター活性が２桁に及ぶことを示し、大部分の活性プロモーターは、強力なヒトサイトメガロウイルス最初期１プロモーター（ｈＣＭＶ−ＩＥ１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ６０３２１．１、ヌクレオチド５１７〜１１９３）を含有する対照ベクターから得られるものと比較して、ＳＥＡＰ産生において２．３倍の増加を呈した。ライブラリー５を除いて、各ライブラリー内のプロモーター活性は、少なくとも１桁異なったが、ここで、各ライブラリーの平均活性は、５．２〜６１．５の相対プロモーター単位（ＲＰＵ）の範囲であった。細胞培養液の上清におけるＳＥＡＰ活性が、ＳＥＡＰのｍＲＮＡレベルと直線的に相関したことを確認するために、ｍＲＮＡを、トランスフェクト細胞から抽出し、ｑＰＣＲにより分析した。この分析により、各プラスミドからのＳＥＡＰ産生が、相対的なプロモーター活性に正比例することを確認した（図６）。
【００９６】
ＴＦＲＥがヘテロタイプ構造におけるそれらの推定上のモジュラー機能に関して特異的に選択されたとすれば、プロモーター活性は単に、ＴＦＲＥの配向、スペーシング、又は順序に依存せずに各ＴＦ結合部位によってもたらされた相対的な転写活性の関数であろうと仮定された。この仮定を試験し、且つヘテロタイプ構造における各ＴＦＲＥの活性を決定するために、プロモーターを配列決定してそれらのＴＦＲＥ組成を明らかにし、プロモーター活性をＴＦＲＥのコピー数の関数としてモデル化した（プロモーターの長さは、４〜１８個のＴＦ結合部位の間で変動した（平均＝９））。得られた線形回帰モデルは高い予測能を有し、プロモーター活性に関して、観察された値と予測された値が高く相関した（１個抜きの交差検定  ｒ２＝０．９０）（図３Ｂ）。過剰適合の可能性を評価するために、モデルを、５倍交差検定を用いて分析した（図３Ｂ）。観察されたプロモーター活性と予想されたプロモーター活性の間の相関は同様に高く（ｒ２＝０．８７）、モデルの予測能が実証された。これらのデータは、プロモーター活性が主として成分ＴＦＲＥの種類及び量の関数であったことを示す。したがって、これらの構築された配列は「ビルボードプロモーター」として機能し、複合性のＴＦ結合部位の相対編成はプロモーター活性に対して最小限の影響を及ぼす（１９、２０）。したがって、当初の仮説が確認され、組み合わせ的に相互作用しないモジュラーＴＦＲＥを同定し、且つ単純なインシリコプロモーター設計のための方法を容易にする発明者らの方法が実証された。
【００９７】
モデルにおける唯一の予測変数は、各ＴＦ結合部位のコピーの数であるため、モデル係数は、全体的なプロモーター活性に対する各ＴＦＲＥ型の単一のコピーの寄与を表す。モデル係数の分析により、ヘテロタイプのプロモーターの文脈において、７／１２のみのＴＦＲＥが転写的に活性であることが同定され（ＮＦｋＢ−ＲＥ、ＡＲＥ、ＤＲＥ、ＥＲＳＥ、ＧＣ−ボックス、Ｃ／ＥＢＰ−ＲＥ、ＥＢＳ１；ｐ≦０．０１）、ここで、残りの５種は、転写的に不活性であるか（ＡＡＲＥ、ＨＲＥ、Ｅ−ボックス）、又は転写的に抑制されている（Ｄ−ボックス、ＣＲＥ；ｐ≦０．０１）かのいずれかであった。図３Ｃに示されるとおり、ヘテロタイプ構造におけるＴＦＲＥの転写活性は、−３５〜１００の相対的なＴＦＲＥ活性単位の範囲であった。したがって、ホモタイプのプロモーターの文脈における活性は、ヘテロタイプのプロモーターにおけるＴＦＲＥ活性を予測するものではなかった。ＴＦＲＥは、連鎖状の結合部位の量に応じて差次的な機能を呈し得ることがよく知られている（１６、１８、４４、４５）。ＴＦＲＥがホモタイプのプロモーターにおいて６×反復コピー、又ヘテロタイプのプロモーターにおいては通常１×反復コピーで存在するとすれば、いくつかは前者において活性であり、後者において不活性／抑制的であったことは驚くべきことではない。したがって、単一部位コピーのホモタイプのプロモーターにおけるＴＦＲＥ活性を評価することが理想的であろうが、単一のＴＦ結合部位からの転写出力は、検出可能なレベルの組換え遺伝子発現を十分に推進することはまれである（１６、１８）。したがって、単一コピーの反復において転写的に活性であるモジュラーＴＦＲＥの同定のために、ｉ）多部位コピーのホモタイプのプロモーターを作製して組み合わせ的に相互作用しないＴＦＲＥを同定し、且つｉｉ）複数のＴＦＲＥ合成エレメントを構築して、ヘテロタイプのプロモーターにおける各ＴＦＲＥの相対的な活性を決定する、本明細書で開発された２段階のスクリーニング方法が推奨される。
【００９８】
実施例４：文脈特異的な機能性を有するプロモーターのインシリコ設計
プロモーター活性のモデルが、高い予測能及び単純な説明変数（すなわち、ＴＦＲＥのコピー数）の両方を有したとすれば、インビトロで予測可能な活性を呈する哺乳動物プロモーターのインシリコ設計を初めて実証することが可能であろうと仮定された。これを試験するために、ヘテロタイプ構造において転写的に活性であった各ＴＦＲＥの単一コピーを含有する７種のプロモーター（ＮＦｋＢ−ＲＥ、ＡＲＥ、ＤＲＥ、ＥＲＳＥ、ＧＣ−ボックス、Ｃ／ＥＢＰ−ＲＥ、ＥＢＳ１）を設計した。ＴＦＲＥの順序及びスペーシングがプロモーター活性に最小の影響及ぼすことをさらに確認するために、７つの成分ＴＦ結合部位を、各構築物内に完全に異なる順序で配置した（図４Ａ）。モデルによれば、これらのプロモーターは同一のＴＦＲＥ組成を共有するため、それらはインビトロで同じレベルの活性を呈するはずである（３７．３ＲＰＵ）。合成プロモーターが、化学的に合成され、且つＳＥＡＰレポーターベクターにおける最小ＣＭＶコアプロモーターの上流に挿入された。各レポータープラスミドによるＣＨＯ細胞の一過的なトランスフェクション後のＳＥＡＰ産生の測定は、プロモーター活性が３０．２〜４３．３ＲＰＵ（変動係数＝９．８％）の範囲であることを示した（図４Ｂ）。したがって、全ての設計されたプロモーターのインビトロ活性は、予測された活性の７ＲＰＵ内であり、±１８％の誤差範囲に相当したが、ここで、最も強力なプロモーターと最も弱いプロモーターの間の発現は１．４倍の差にすぎなかった。同じＴＦＲＥ組成であるが異なるＴＦＲＥ順序を有するプロモーターは、成分結合部位が組み合わせの相互作用を呈するときに、活性において５倍も変動し得ることが以前に示されている（１８）。したがって、本明細書で提供されるデータはさらに、推定上のモジュラー機能（すなわち、ホモタイプ構造において転写的に活性）に関して特異的に選択されたＴＦＲＥが、ヘテロタイプのプロモーターと合わせて組み合わされるときに協同的に相互作用しないという結論を支持する。さらに、それらは、プロモーターが予測可能な活性を呈するために合成的に設計され得るという当初の仮説を確証している。
【００９９】
カスタマイズ可能な組み合わせ及び順序においてＴＦＲＥを組み合わせる能力により、文脈特異的な機能性を有するプロモーターの設計が可能になる。これを実証するために、ＣＨＯ細胞における組換えタンパク質産生の文脈において機能するように特別に最適化されているプロモーターを設計した。プロモーター内に存在し得るＴＦ結合部位の総数は、最も強力なインビトロで構築されたヘテロタイプのプロモーターにおいて含有される量である１４個に制限された。ＣＨＯ細胞における転写活性の以前の研究は、１００ＲＰＵを超えてプロモーター活性を著しく増加させることができないことを示唆している（ｈＣＭＶ−ＩＥ１より２．３倍高い）（３１））。したがって、１４個を超える結合部位量の増加は、不必要に細胞機構の負担の増大を課すことになり、ＣＨＯ細胞トランスクリプトームに対するオフターゲット作用についての可能性を増大させると仮定された（２、３）。
【０１００】
１２個のモジュラーＴＦＲＥ部分を利用して、９，６５７，６９９個のＴＦＲＥの組み合わせを、１〜１４の範囲の全結合部位のコピー数で作製することができる。これらの組み合わせの各々は、相対的な合成プロモーター強度を決定するためにヘテロタイプのプロモーター活性のモデルを使用して、インシリコで構築され、且つ試験された。次に、ＣＨＯ細胞における生物学的製剤の産生に必要となる特定のプロモーターの設計基準に従って、組み合わせが選択された。例えば、プロモーターサイレンシングのリスクを最小化するために、ヘテロタイプのプロモーター（ＣＲＥ、Ｄ−ボックス；図３Ｃ）（４２、４３）において転写抑制機能を呈すると示されたＴＦＲＥを含有する任意の組み合わせは無視された。さらに、ＣＨＯ細胞における組換えタンパク質の過剰発現が、小胞体ストレス応答を誘導し得ると仮定すると（４６）、ＥＲストレス応答エレメント（ＥＲＳＥ）を含有する全てのプロモーターも又、タンパク質恒常性の回復を阻害し得るＥＲストレス組換え遺伝子発現の正のフィードバックループの形成を阻害するために考慮されなかった（４７、４８）。さらに、重要なＣＨＯ細胞プロセスにオフターゲット作用を引き起こす合成エレメントの可能性を低減するために、ｉ）ヘテロタイプ構造において不活性であったＴＦＲＥを含有するプロモーターは無視され（ＡＡＲＥ、ＨＲＥ、Ｅ−ボックス；図３Ｃ）、且つｉｉ）各ＴＦＲＥのコピー数が最小化された組み合わせが選択された（２、３、１５）。後者に関して、各ＴＦＲＥに関して閾値の部位コピー数があり、それを超えてさらにコピーを追加することにより、内在性遺伝子の発現プロファイルに変化を引き起こすのに十分なＴＦの隔離のレベルをもたらすことになると仮定された。しかしながら、ＴＦＲＥは、ＣＨＯ細胞におけるそれらの同種のＴＦの高発現に従って特異的に選択されたため、この「最大量」は各結合部位について比較的高いであろう結論づけられた。したがって、最も豊富な成分ＴＦＲＥのコピー数を制限するためにプロモーターが選択された（例えば、４つの異なるＴＦＲＥのうちの１つのコピーを含有するプロモーターが、２つの異なるＴＦＲＥのうちの２つのコピーを含有する構築物に好ましかった）。最後に、最適の転写率は、ポリペプチド特異的フォールディング及び構築率に応じて各組換え遺伝子について異なるため、複数の別々のＴＦＲＥの組み合わせが、広範囲の異なる転写出力を可能にするために選択された（５、１０、２０、４０、６０、８０、及び１００ＲＰＵ）。例として、ＴＦＲＥ組成２×ＡＲＥ：１×Ｃ／ＥＢＰ−ＲＥ：１×ＧＣ−ボックス：１×ＥＢＳ１：１×ＤＲＥ：１×ＮＦｋＢを有するプロモーターは、それが全ての必須の設計基準を満たし、且つ４０．２ＲＰＵの予測された活性を有したため選択された。
【０１０１】
ＴＦＲＥの順序、スペーシング、及び配向がプロモーター活性に最小の影響及ぼすとき、成分ＴＦ結合部位は、任意選択により望ましくない配列の特徴の出現を最小化するように配置され得る。さらに、インシリコ構築により、配列の特徴をさらに向上させるために利用され得るスペーサー配列の組み込みが容易になる。したがって、成分ＴＦＲＥは、組換え遺伝子の発現安定性を最大化するために、各プロモーター内で配置され、且つ特別に設計された６ｂｐのスペーサーにより隔てられた。例えば、プロモーターのメチル化に媒介されるエピジェネティックなサイレンシングが、ＣＨＯ細胞において産生の不安定性を引き起こすと示されているという状況から、各々の中のＣｐＧジヌクレオチドの数は最小化された（３５、４９）。さらに、遺伝子サイレンシングは又、相同組換えを介するＤＮＡセグメントの欠失によって引き起こされ得るため（５０、５１）、反復配列の出現は特に防止された。真核生物の機構が４０ｂｐより長い同一の配列を組み換えることができると仮定して、２０ｂｐより大きなプロモーター内反復を防止し、且つ任意の２つが連なったＴＦＲＥブロック（例えば、ＡＲＥ−ＤＲＥ）の反復を回避することにより、相同組換えに媒介されるサイレンシングに対して強固な保護をもたらすことになると結論づけられた（５２）。さらに、複数のプロモーターが組み合わされて使用されるとき（例えば、モノクローナル抗体の発現）に組換えに媒介される遺伝子欠失から保護するために、３５ｂｐより大きいプロモーター間の反復配列は、特に排除された（５３〜５５）。ＴＦＲＥ及びスペーサーのインシリコ配置を利用して、合成的に設計されたプロモーターは、平均で５．２個のＣｐＧジヌクレオチド及び０個の２０ｂｐより大きいプロモーター内リピートを含有した。平均で２０．７個のＣｐＧジヌクレオチド及び３．８個の２０ｂｐより大きいプロモーター内反復、並びにｈＣＭＶ−ＩＥ１プロモーター（３４個のＣｐＧジヌクレオチド、１個の２０ｂｐより大きい反復）を含有したインビトロで構築されたヘテロタイプのプロモーターとの比較は、インシリコでのプロモーター設計の利点を強調している。さらに、種々の発現ベクターへのクローニングを容易にするために、プロモーターを設計して、制限エンドヌクレアーゼ部位の出現を最小化した（２６３／３０８の分析された制限部位は、いずれのプロモーターにおいても出現しない）。最後に、プロモーター活性の不適当な調節を防止するために、全ての配列を確認して、追加の「偶発的なＴＦ結合部位」がＴＦＲＥスペーサー接合点で作製されなかったことを保証した。
【０１０２】
実施例５：カスタム設計された配列は、インビトロにおいて予測可能な機能性を呈する
各所望のプロモーター活性レベルのために、２つの合成配列を、異なるＴＦＲＥ組成を用いて設計した（表３）（図５Ａ）。
【０１０３】
【表３】
2020517245.tif 000009
【０１０４】
【表４】
2020517245.tif 000010
【０１０５】
合成プロモーターが、化学的に合成され、且つＳＥＡＰレポーターベクターにおける最小ＣＭＶコアプロモーターの上流に挿入された。各レポータープラスミドによるＣＨＯ細胞の一過的なトランスフェクション後のＳＥＡＰ産生の測定は、設計された活性及び観察された活性が高く相関することを示した（ｒ２＝０．９２；図５Ｂ）。非常に低レベル〜高レベルの転写（５〜６０ＲＰＵ）で、全てのプロモーターのインビトロ活性は、予測された活性の５ＲＰＵ以内であった。しかしながら、転写出力が非常に高かったとき（８０〜１００ＲＰＵ）、観察された活性と予測された活性の間の差は、１０〜２２ＲＰＵ（１１〜２２％）で変動した。転写ノイズは、プロモーター活性及びＴＦ結合部位のコピー数の両方に付随して増大することが以前に示されている（５６、５７）。これは、４つの最も強力なプロモーター（最も大きいＴＦＲＥのコピー数を有する）が、観察された活性と予測された活性の間で最も大きな偏差を呈した理由を説明し得る。しかしながら、８０以上の設計された活性を有する全てのプロモーターはインビトロで７８以上の活性を呈したため、非常に強力なプロモーターをインシリコで通常どおりに作製することができるが、この発現レベルでは、非常に正確な転写の調節は困難である場合があると結論づけられた。
【０１０６】
ゲノム内の文脈において設計された配列の機能を試験するために、ＣＨＯ細胞を、グルタミンシンターゼ選択マーカー遺伝子を共発現する合成プロモーター−レポータープラスミドで安定的にトランスフェクトした（５８）。全範囲の転写調節を分析するために、５、１０、２０、８０、及び１００のＲＰＵの活性を有するプロモーターを評価した。安定的にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞のプールを、メチオニンスルホキシミンを含有し、懸濁培養液に再適応した培地中で選択した。工業的に妥当なバイオプロダクションの文脈におけるプロモーター性能を評価するために、プロモーター活性を、７日のバッチ産生プロセスの間に測定した。図５Ｃに示されるとおり、一過的な発現系において観察されるプロモーター活性を、染色体の文脈において維持した。ＳＥＡＰのｍＲＮＡ存在量のｑＰＣＲ分析により、安定的な発現系における相対的なプロモーター強度の比（１００：７２：２８：１６：８）が、当初設計されたプロモーター活性の比（１００：８０：２０：１０：５）と非常に類似することが明らかになった。さらに、相対的なプロモーター活性は、増殖の対数期（４日目）と定常期（７日目）の間で維持された。これらのデータは、プロモーター活性動態が、同調的な発現プロファイルを有するＴＦに結合する配列を設計することによって特異的に調整され得るという仮定を確証している。さらに、細胞増殖又は生存率に著しい影響を及ぼす合成プロモーターはなく（生存細胞濃度及び培養生存率は、４日目と７日目の全ての細胞プールの間で２０％未満変動した；データは示さず）、細胞の性能に対するオフターゲット作用を最小化するように特別に設計されたＴＦＲＥの組み合わせの選択が実証された。最後に、遺伝子発現の安定性を評価するために、高産生株及び低産生株の安定的なプールを、６０世代の間ＭＳＸ含有培地中で継代培養した。図５Ｄに示されるとおり、ＳＥＡＰの産生は、長期間の培養後に著しく減少しなかったが、これは、合成配列がプロモーターサイレンシングを防止するように首尾良く設計されたことを確証している。
【０１０７】
実施例６：結論
結論として、インビトロでカスタム設計の機能性を呈する哺乳動物プロモーターのインシリコモデルに従う構築が、初めて実証された。記載された設計プロセスを適用して、任意の特定の宿主細胞型又は遺伝子発現の文脈のための最適化されたプロモーター配列を作製することができる。ヘテロタイプのエレメント活性を説明する本明細書で提供されるモデルは、哺乳動物のプロモーター活性の以前に公開されたいずれかのモデルよりも高い予測能を有し、真核生物の転写調節機構に新たな洞察を提供する。記載されたプロモーター調節の単純化されたモデルは、ＯＭＩＣＳデータセットからのインシリコでのプロモーターの設計を全体的に容易にし、例えば、ヘテロタイプ構造の文脈内における別々のＴＦ−ＴＦＲＥ相互作用機能の数の詳細な理解を用いて、インビトロスクリーニングの必要性を取り除く。実際に、新規のヘテロタイププロモーター設計のためのモジュラーＴＦＲＥブロックの組み合わせは、複数の合成ＴＦを使用する遺伝的回路を構築する際に、特に適用可能であり得る。比較的単純な設計規則に従ってプロモーターをインシリコで作製できることを実証することによって、本研究は、哺乳動物の合成生物学について新たなツールを提供する。
【０１０８】
実施例７：合成プロモーターは、安定的なトランスフェクト細胞株における組換えタンパク質の発現において予測可能な活性を呈する
ｈＣＭＶ−ＩＥ１、及びＧＳ選択マーカーを含有するベクター骨格において３種の異なる設計された活性レベル（ＲＰＵ１００、ＲＰＵ６０、及びＲＰＵ１０）を有する合成プロモーターを含有する発現ベクターを構築した。プロモーターは、免疫活性化タンパク質の上流に挿入された。各構築物は三つ組で試験され、生産性のデータを３回の繰り返しから平均した。発現レベルを、一過的なトランスフェクション（図７）及びフェドバッチ条件における安定的なプール（図８）において比較した。免疫活性化タンパク質の定量化を、八つ組のアッセイによって測定した。一過的なトランスフェクション実験において、ＲＰＵ１００のプロモーターの制御下での免疫活性化タンパク質の発現レベルは、ｈＣＭＶ−ＩＥ１の制御下と比較して１．３３倍に増加した。ＲＰＵ６０のプロモーターの制御下での発現レベルは向上せず、ＲＰＵ１０のプロモーターの制御下での発現レベルは、ｈＣＭＶ−ＩＥ１の制御下と比較して６倍減少した。安定的なプールでは、免疫活性化タンパク質の発現レベルは、１３日を通して徐々に増加した。最大の生産性は、ＲＰＵ１００のプロモーターの制御下での１．８ｇ／Ｌであった。ＲＰＵ１００のプロモーターの制御下での発現レベルは、ｈＣＭＶ−ＩＥ１の制御下よりも１．１倍高かったが、ＲＰＵ６０及びＲＰＵ１０のプロモーターの制御下では、ｈＣＭＶ−ＩＥ１と比較して、それぞれ２．８倍及び１８倍減少した。これらの結果は、発現レベルが、異なる強度を有するように設計されたプロモーターを用いて変えることができることを実証し、それらは、一過的なトランスフェクション及び安定的なプールの両方において一貫性を示す。力価は、ｈＣＭＶ−ＩＥ１と比較して、ＲＰＵ１００の合成プロモーターを使用する場合、９、１１、及び１３日目において、それぞれ１．５１倍、１．５６倍、及び１．１倍高かった。９日目及び１１日目において著しく増加した力価を考慮すると、ＲＰＵ１００のプロモーターは、より短い産生プロセスの使用を推進することができる。
【０１０９】
さらなる一貫性は、異なる宿主細胞、ＣＨＯ−Ｓで以下のＴＦＲＥを有する合成プロモーターを試験することによって実証された：
１００ＲＰＵ  構築物Ａ：
（ＧＣ−ボックス）−（ＡＲＥ）−（ＮＦｋＢ−ＲＥ）−（ＤＲＥ）−（ＥＢＳ１）−（ＡＲＥ）−（ＤＲＥ）−（ＮＦｋＢ−ＲＥ）−（ＧＣ−ボックス）−（ＮＦｋＢ−ＲＥ）−（ＡＲＥ）
１００ＲＰＵ  構築物Ｂ：
（ＮＦｋＢ−ＲＥ）−（ＤＲＥ）−（ＧＣ−ボックス）−（ＡＲＥ）−（ＮＦｋＢ−ＲＥ）−（Ｃ／ＥＢＰ−ＲＥ）−（ＤＲＥ）−（ＮＦｋＢ−ＲＥ）−（ＥＢＳ１）−（ＮＦｋＢ−ＲＥ）−（ＡＲＥ）
【０１１０】
試験されたプロモーターの活性は、ＣＨＯ−Ｓ細胞において維持された。
【０１１１】
ｈＣＭＶ−ＩＥ１と比較して、１００ＲＰＵを使用することによって促進された生産性の増加は、特定の発現の文脈において減少した（ＳＥＡＰの生産性において見られる作用と比較して）。これは、利用される特定の組換えタンパク質、産生プロセス、又はベクターによってもたらすことができた。実際に、合成プロモーターによって可能になった生産性の相対的な増加（ｈＣＭＶ−ＩＥ１と比較して）及び発現レベルの正確な比は、様々な文脈において変動することになる。しかしながら、これらの結果は、合成プロモーターの機能の頑強性を強調し、最小数の構築物を試験することによって、実質的に異なる発現の文脈において、収量の著しい増加（ｈＣＭＶ−ＩＥ１と比較して）、及びタンパク質発現の予測可能で適正量を決めることができる調節の両方が可能になった。合成プロモーターがｈＣＭＶ−ＩＥ１に対して著しい生産性の増加を提供しない状況においてさえ、それらの使用は依然として好ましい場合があるが、その理由は、ｉ）それらがプロモーターサイレンシングを最小化するように設計され、且つｉｉ）それらは、サイズが著しく低減されるためである。
【０１１２】
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
１．Ｍｕｔａｌｉｋ，Ｖ．Ｋ．，Ｇｕｉｍａｒａｅｓ，Ｊ．Ｃ．，Ｃａｍｂｒａｙ，Ｇ．，Ｌａｍ，Ｃ．，Ｃｈｒｉｓｔｏｆｆｅｒｓｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｍａｉ，Ｑ．−Ａ．，Ｔｒａｎ，Ａ．Ｂ．，Ｐａｕｌｌ，Ｍ．，Ｋｅａｓｌｉｎｇ，Ｊ．Ｄ．ａｎｄ  Ａｒｋｉｎ，Ａ．Ｐ．（２０１３）Ｐｒｅｃｉｓｅ  ａｎｄ  ｒｅｌｉａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｉａ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０，３５４−３６０．
２．Ｂｒｅｗｓｔｅｒ，Ｒ．Ｃ．，Ｗｅｉｎｅｒｔ，Ｆ．Ｍ．，Ｇａｒｃｉａ，Ｈ．Ｇ．，Ｓｏｎｇ，Ｄ．，Ｒｙｄｅｎｆｅｌｔ，Ｍ．ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｒ．（２０１４）Ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｅｆｆｅｃｔ  ｄｉｃｔａｔｅｓ  ｌｅｖｅｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，１５６，１３１２−１３２３．
３．Ｋａｒｒｅｔｈ，Ｆ．Ａ．，Ｔａｙ，Ｙ．ａｎｄ  Ｐａｎｄｏｌｆｉ，Ｐ．Ｐ．（２０１４）Ｔａｒｇｅｔ  ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｅｎｔｅｒ  ｔｈｅ  ｌｉｍｅｌｉｇｈｔ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．，１５，１１４．
４．Ｆａｎ，Ｌ．，Ｋａｄｕｒａ，Ｉ．，Ｋｒｅｂｓ，Ｌ．Ｅ．，Ｌａｒｓｏｎ，Ｊ．Ｌ．，Ｂｏｗｄｅｎ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｆｒｙｅ，Ｃ．Ｃ．（２０１３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａＨｉｇｈｌｙ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｗｉｔｈ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＳＶ４０Ｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６８，６５２−６５８．
５．Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｈａｖｅｒｔｙ，Ｊ．，Ｄｅｎｇ，Ｌ．，Ｌｉ，Ｇ．，Ｑｉｕ，Ｐ．，Ｌｉｕ，Ｚ．ａｎｄ  Ｓｈｉ，Ｓ．（２０１３）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｔｒａｐ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６７，２５５−２６１．
６．Ｓｕｍｉｔｏｍｏ，Ｙ．，Ｈｉｇａｓｈｉｔｓｕｊｉ，Ｈ．，Ｈｉｇａｓｈｉｔｓｕｊｉ，Ｈ．，Ｌｉｕ，Ｙ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｔ．，Ｓａｋｕｒａｉ，Ｔ．，Ｃａｎｄｅｉａｓ，Ｍ．Ｍ．，Ｉｔｏｈ，Ｋ．，Ｃｈｉｂａ，Ｔ．ａｎｄ  Ｆｕｊｉｔａ，Ｊ．（２０１２）Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄｓ  Ｓｐ１  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｃｉｒｐ）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１２，７２．
７．Ｍａｒｉａｔｉ，Ｙｅｏ，Ｊ．Ｈ．，Ｋｏｈ，Ｅ．Ｙ．，Ｈｏ，Ｓ．Ｃ．ａｎｄ  Ｙａｎｇ，Ｙ．（２０１４）Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒｅ  ＣｐＧ  ｉｓｌａｎｄ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎｔｏＨｕｍａｎ  ＣＭＶ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｆｏｒ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．，３０，５２３−５３４．
８．Ｆｅｒｒｅｉｒａ，Ｊ．Ｐ．，Ｐｅａｃｏｃｋ，Ｒ．Ｗ．，Ｌａｗｈｏｒｎ，Ｉ．Ｅ．ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｃ．Ｌ．（２０１１）Ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｅｃｔｏｐｉｃ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｑｕｉｐｐｅｄ  ｗｉｔｈ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｓｙｓｔ．Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，５，１３１−１３８．
９．Ｋｗａｓｎｉｅｓｋｉ，Ｊ．Ｃ．，Ｍｏｇｎｏ，Ｉ．，Ｍｙｅｒｓ，Ｃ．Ａ．，Ｃｏｒｂｏ，Ｊ．Ｃ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｂ．Ａ．（２０１２）Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｉｎ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０９，１９４９８−１９５０３．
１０．Ｂｒｏｗｎ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ，Ｄ．Ｃ．（２０１５）Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｄｖ．，３４（５），４９２−５０３
１１．Ｇａｊ，Ｔ．，Ｇｅｒｓｂａｃｈ，Ｃ．Ａ．ａｎｄ  Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．（２０１３）ＺＦＮ，ＴＡＬＥＮ，ａｎｄ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｂａｓｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３１，３９７−４０５．
１２．Ｐｅｒｅｚ−Ｐｉｎｅｒａ，Ｐ．，Ｏｕｓｔｅｒｏｕｔ，Ｄ．Ｇ．，Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ｊ．Ｍ．，Ｆａｒｉｎ，Ａ．Ｍ．，Ｇｌａｓｓ，Ｋ．Ａ．，Ｇｕｉｌａｋ，Ｆ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ，Ｇ．Ｅ．，Ｈａｒｔｅｍｉｎｋ，Ａ．Ｊ．ａｎｄ  Ｇｅｒｓｂａｃｈ，Ｃ．Ａ．（２０１３）Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｕｎａｂｌｅＨｕｍａｎ  ｇｅｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１０，２３９−２４２．
１３．Ｒｏｅｓｓｇｅｒ，Ｋ．，Ｃｈａｒｐｉｎ−Ｅｌ−Ｈａｍｒｉ，Ｇ．ａｎｄ  Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｍ．（２０１４）Ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｅ．Ｍｅｔａｂ．Ｅｎｇ．，２１，８１−９０．
１４．Ｃｈａｖｅｚ，Ａ．，Ｓｃｈｅｉｍａｎ，Ｊ．，Ｖｏｒａ，Ｓ．，Ｐｒｕｉｔｔ，Ｂ．Ｗ．，Ｔｕｔｔｌｅ，Ｍ．，Ｉｙｅｒ，Ｅ．Ｐ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｋｉａｎｉ，Ｓ．，Ｇｕｚｍａｎ，Ｃ．Ｄ．ａｎｄ  Ｗｉｅｇａｎｄ，Ｄ．Ｊ．（２０１５）Ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１２，３２６−３２８．
１５．Ｈａｎｓｅｎ，Ａ．Ｓ．ａｎｄ  Ｏ’Ｓｈｅａ，Ｅ．Ｋ．（２０１３）Ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｄｅｃｏｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ａ  ｔｒａｄｅ−ｏｆｆ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｎｏｉｓｅ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．，９，７０４．
１６．Ｓｈａｒｏｎ，Ｅ．，Ｋａｌｍａ，Ｙ．，Ｓｈａｒｐ，Ａ．，Ｒａｖｅｈ−Ｓａｄｋａ，Ｔ．，Ｌｅｖｏ，Ｍ．，Ｚｅｅｖｉ，Ｄ．，Ｋｅｒｅｎ，Ｌ．，Ｙａｋｈｉｎｉ，Ｚ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｓｅｇａｌ，Ｅ．（２０１２）Ｉｎｆｅｒｒｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｏｇｉｃ  ｆｒｏｍＨｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ  ｏｆ  ｔｈｏｕｓａｎｄｓ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３０，５２１−５３０．
１７．Ｗｅｉｎｇａｒｔｅｎ−Ｇａｂｂａｙ，Ｓ．ａｎｄ  Ｓｅｇａｌ，Ｅ．（２０１４）Ｔｈｅ  ｇｒａｍｍａｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，１３３，７０１−７１１．
１８．Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｐ．，Ｔａｈｅｒ，Ｌ．，Ｐａｔｗａｒｄｈａｎ，Ｒ．Ｐ．，Ｋｉｍ，Ｍ．Ｊ．，Ｉｎｏｕｅ，Ｆ．，Ｓｈｅｎｄｕｒｅ，Ｊ．，Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ，Ｉ．ａｎｄ  Ａｈｉｔｕｖ，Ｎ．（２０１３）Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｄｅｃｏｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ａ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｅｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，４５，１０２１−１０２８．
１９．Ａｒｎｏｓｔｉ，Ｄ．Ｎ．ａｎｄ  Ｋｕｌｋａｒｎｉ，Ｍ．Ｍ．（２００５）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ：Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  ｅｎｈａｎｃｅｏｓｏｍｅｓ  ｏｒ  ｆｌｅｘｉｂｌｅ  ｂｉｌｌｂｏａｒｄｓ？  Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９４，８９０−８９８．
２０．Ｒａｓｔｅｇａｒ，Ｓ．，Ｈｅｓｓ，Ｉ．，Ｄｉｃｋｍｅｉｓ，Ｔ．，Ｎｉｃｏｄ，Ｊ．Ｃ．，Ｅｒｔｚｅｒ，Ｒ．，Ｈａｄｚｈｉｅｖ，Ｙ．，Ｔｈｉｅｓ，Ｗ．−Ｇ．，Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｓｔｒａｈｌｅ，Ｕ．（２００８）Ｔｈｅ  ｗｏｒｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃｏｄｅ  ａｒｅ  ａｒｒａｎｇｅｄ  ｉｎ  ａ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍａｎｎｅｒ  ｉｎＨｉｇｈｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，３１８，３６６−３７７．
２１．Ｒａｖａｓｉ，Ｔ．，Ｓｕｚｕｋｉ，Ｈ．，Ｃａｎｎｉｓｔｒａｃｉ，Ｃ．Ｖ．，Ｋａｔａｙａｍａ，Ｓ．，Ｂａｊｉｃ，Ｖ．Ｂ．，Ｔａｎ，Ｋ．，Ａｋａｌｉｎ，Ａ．，Ｓｃｈｍｅｉｅｒ，Ｓ．，Ｋａｎａｍｏｒｉ−Ｋａｔａｙａｍａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｂｅｒｔｉｎ，Ｎ．（２０１０）Ａｎ  ａｔｌａｓ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄ  ｍａｎ．Ｃｅｌｌ，１４０，７４４−７５２．
２２．Ｇｅｒｔｚ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｂ．Ａ．（２００９）Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｍｏｌ．Ｓｙｓｔ．Ｂｉｏｌ．，５，２４４．
２３．Ｓｅｇａｌ，Ｅ．，Ｒａｖｅｈ−Ｓａｄｋａ，Ｔ．，Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｍ．，Ｕｎｎｅｒｓｔａｌｌ，Ｕ．ａｎｄ  Ｇａｕｌ，Ｕ．（２００８）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｆｒｏｍ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｉｎ  Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ，４５１，５３５−５４０．
２４．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｌ．ａｎｄ  Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．（２００９）ＴｏｐＨａｔ：ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｓｐｌｉｃｅ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２５，１１０５−１１１１．
２５．Ｘｕ，Ｘ．，Ｎａｇａｒａｊａｎ，Ｈ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｎ．Ｅ．，Ｐａｎ，Ｓ．，Ｃａｉ，Ｚ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｃｈｅｎ，Ｗ．，Ｘｉｅ，Ｍ．，Ｗａｎｇ，Ｗ．ａｎｄＨａｍｍｏｎｄ，Ｓ．（２０１１）Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）−Ｋ１  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２９，７３５−７４１．
２６．Ｔｒａｐｎｅｌｌ，Ｃ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｂ．Ａ．，Ｐｅｒｔｅａ，Ｇ．，Ｍｏｒｔａｚａｖｉ，Ａ．，Ｋｗａｎ，Ｇ．，Ｖａｎ  Ｂａｒｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｓａｌｚｂｅｒｇ，Ｓ．Ｌ．，Ｗｏｌｄ，Ｂ．Ｊ．ａｎｄ  Ｐａｃｈｔｅｒ，Ｌ．（２０１０）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｕｎａｎｎｏｔａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ  ａｎｄ  ｉｓｏｆｏｒｍ  ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  ｄｕｒｉｎｇ  ｃｅｌｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２８，５１１−５１５．
２７．Ｃｈａｗｌａ，Ｋ．，Ｔｒｉｐａｔｈｉ，Ｓ．，Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｌ．，Ｌａｅｇｒｅｉｄ，Ａ．ａｎｄ  Ｋｕｉｐｅｒ，Ｍ．（２０１３）ＴＦｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ：ａ  ｃｕｒａｔｅｄ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２９（１９），２５１９−２０．
２８．Ｔｒｉｐａｔｈｉ，Ｓ．，Ｖｅｒｃｒｕｙｓｓｅ，Ｓ．，Ｃｈａｗｌａ，Ｋ．，Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｋ．Ｒ．，Ｂｌａｋｅ，Ｊ．Ａ．，Ｈｕｎｔｌｅｙ，Ｒ．Ｐ．，Ｏｒｃｈａｒｄ，Ｓ．，Ｈｅｒｍｊａｋｏｂ，Ｈ．，Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｌ．ａｎｄ  Ｌａｅｇｒｅｉｄ，Ａ．（２０１６）Ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｃｏｍｍｏｎｓ：ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ａｃｔｉｏｎ  ｔａｋｅｓ  ｃａｒｅ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｄａｔａｂａｓｅ，２０１６，ｂａｗ０８８．
２９．Ｍａｔｈｅｌｉｅｒ，Ａ．，Ｚｈａｏ，Ｘ．，Ｚｈａｎｇ，Ａ．Ｗ．，Ｐａｒｃｙ，Ｆ．，Ｗｏｒｓｌｅｙ−Ｈｕｎｔ，Ｒ．，Ａｒｅｎｉｌｌａｓ，Ｄ．Ｊ．，Ｂｕｃｈｍａｎ，Ｓ．，Ｃｈｅｎ，Ｃ．−ｙ．，Ｃｈｏｕ，Ａ．ａｎｄ  Ｉｅｎａｓｅｓｃｕ，Ｈ．（２０１３）ＪＡＳＰＡＲ  ２０１４：ａｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ａｎｄ  ｕｐｄａｔｅｄ  ｏｐｅｎ−ａｃｃｅｓｓ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｇｋｔ９９７．
３０．Ｂｒｏｗｎ，Ａ．Ｊ．，Ｍａｉｎｗａｒｉｎｇ，Ｄ．Ｏ．，Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｂ．ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ，Ｄ．Ｃ．（２０１３）Ｂｌｏｃｋ  ｄｅｃｏｙｓ：ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｃｏｙｓ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，４４３，２０５−２１０．
３１．Ｂｒｏｗｎ，Ａ．Ｊ．，Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｂ．，Ｍａｉｎｗａｒｉｎｇ，Ｄ．Ｏ．ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ，Ｄ．Ｃ．（２０１４）Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１１１，１６３８−１６４７．
３２．Ｓｅｎｔｈｉｌｋｕｍａｒ，Ｒ．，Ｓａｂａｒｉｎａｔｈａｎ，Ｒ．，Ｈａｍｅｅｄ，Ｂ．Ｓ．，Ｂａｎｅｒｊｅｅ，Ｎ．，Ｃｈｉｄａｍｂａｒａｔｈａｎｕ，Ｎ．，Ｋａｒｔｈｉｋ，Ｒ．ａｎｄ  Ｓｅｋａｒ，Ｋ．（２０１０）ＦＡＩＲ：Ａ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｒｅｐｅａｔｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，４，２７１．
３３．Ｍａｎｋｅ，Ｔ．，Ｒｏｉｄｅｒ，Ｈ．Ｇ．ａｎｄ  Ｖｉｎｇｒｏｎ，Ｍ．（２００８）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｉｅｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．Ｂｉｏｌ．，４，ｅ１００００３９．
３４．Ｃａｒｔｈａｒｉｕｓ，Ｋ．，Ｆｒｅｃｈ，Ｋ．，Ｇｒｏｔｅ，Ｋ．，Ｋｌｏｃｋｅ，Ｂ．，Ｈａｌｔｍｅｉｅｒ，Ｍ．，Ｋｌｉｎｇｅｎｈｏｆｆ，Ａ．，Ｆｒｉｓｃｈ，Ｍ．，Ｂａｙｅｒｌｅｉｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｗｅｒｎｅｒ，Ｔ．（２００５）ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ：ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２１，２９３３−２９４２．
３５．Ｋｉｍ，Ｍ．，Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｄｒｏｍｓ，Ｋ．Ａ．ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ，Ｄ．Ｃ．（２０１１）Ａ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０８，２４３４−２４４６．
３６．Ｄａｈｏｄｗａｌａ，Ｈ．ａｎｄ  Ｓｈａｒｆｓｔｅｉｎ，Ｓ．Ｔ．（２０１４）Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｒｏｍ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ．，２，４０３−４１９．
３７．Ｇｅｒｔｚ，Ｊ．，Ｓｉｇｇｉａ，Ｅ．Ｄ．ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，Ｂ．Ａ．（２００９）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ．Ｎａｔｕｒｅ，４５７，２１５−２１８．
３８．Ｓｈｅｎｇ，Ｘ．，Ｗｕ，Ｊ．，Ｓｕｎ，Ｑ．，Ｌｉ，Ｘ．，Ｘｉａｎ，Ｆ．，Ｓｕｎ，Ｍ．，Ｆａｎｇ，Ｗ．，Ｃｈｅｎ，Ｍ．，Ｙｕ，Ｊ．ａｎｄ  Ｘｉａｏ，Ｊ．（２０１６）ＭＴＤ：ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｔｏ  ｅｘｐｌｏｒｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｂｒｉｅｆ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．，１８（１），２８−３６．
３９．Ｖａｑｕｅｒｉｚａｓ，Ｊ．Ｍ．，Ｋｕｍｍｅｒｆｅｌｄ，Ｓ．Ｋ．，Ｔｅｉｃｈｍａｎｎ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ  Ｌｕｓｃｏｍｂｅ，Ｎ．Ｍ．（２００９）Ａ  ｃｅｎｓｕｓ  ｏｆＨｕｍａｎ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１０，２５２−２６３．
４０．Ｔｒｉｐａｔｈｉ，Ｓ．，Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｋ．Ｒ．，Ｂａｌａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｒ．，Ｈｕｎｔｌｅｙ，Ｒ．，Ｈｉｌｌ，Ｄ．Ｐ．，Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｌ．，Ｂｌａｋｅ，Ｊ．Ａ．，Ｋｕｉｐｅｒ，Ｍ．ａｎｄ  Ｌａｅｇｒｅｉｄ，Ａ．（２０１３）Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｓｅｔｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔａｇｅ  ｆｏｒ  ａ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｃｕｒａｔｉｏｎ  ｅｆｆｏｒｔ．Ｄａｔａｂａｓｅ，２０１３，ｂａｔ０６２．
４１．ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｄ．，Ｓｈａｒｏｎ，Ｅ．，Ｌｏｔａｎ−Ｐｏｍｐａｎ，Ｍ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ，Ａ．，Ｓｅｇａｌ，Ｅ．ａｎｄ  Ｃａｒｅｙ，Ｌ．Ｂ．（２０１７）Ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｌｏｇｉｃ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２７，８７−９４．
４２．Ｗａｊａｐｅｙｅｅ，Ｎ．，Ｍａｌｏｎｉａ，Ｓ．Ｋ．，Ｐａｌａｋｕｒｔｈｙ，Ｒ．Ｋ．ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．（２０１３）Ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ＲＡＳ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｇｅｎｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｏｒｄｅｒｅｄ  ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２７，２２２１−２２２６．
４３．Ｓｍｉｔｈ，Ｚ．Ｄ．ａｎｄ  Ｍｅｉｓｓｎｅｒ，Ａ．（２０１３）ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１４，２０４−２２０．
４４．Ｇｒｓｋｏｖｉｃ，Ｍ．，Ｃｈａｉｖｏｒａｐｏｌ，Ｃ．，Ｇａｓｐａｒ−Ｍａｉａ，Ａ．，Ｌｉ，Ｈ．ａｎｄ  Ｒａｍａｌｈｏ−Ｓａｎｔｏｓ，Ｍ．（２００７）Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｉｓ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ａｎｄＨｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．，３，ｅ１４５．
４５．Ｇｉｎｉｇｅｒ，Ｅ．ａｎｄ  Ｐｔａｓｈｎｅ，Ｍ．（１９８８）Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｙｅａｓｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ＧＡＬ４．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８５，３８２−３８６．
４６．Ｈｕｓｓａｉｎ，Ｈ．，Ｍａｌｄｏｎａｄｏ−Ａｇｕｒｔｏ，Ｒ．ａｎｄ  Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ａ．Ｊ．（２０１４）Ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ａｎｄ  ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，３６，１５８１−１５９３．
４７．Ｇｏｒｍａｎ，Ａ．Ｍ．，Ｈｅａｌｙ，Ｓ．Ｊ．，Ｊａｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ  Ｓａｍａｌｉ，Ａ．（２０１２）Ｓｔｒｅｓｓ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ａｔ  ｔｈｅ  ＥＲ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ＥＲ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．，１３４，３０６−３１６．
４８．Ｓａｎｏ，Ｒ．ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，Ｊ．Ｃ．（２０１３）ＥＲ  ｓｔｒｅｓｓ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．ＢＢＡ−Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，１８３３，３４６０−３４７０．
４９．Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｃｈｕｓａｉｎｏｗ，Ｊ．ａｎｄ  Ｙａｐ，Ｍ．Ｇ．（２０１０）ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４７，１８０−１８５．
５０．Ｍｏｙｎａｈａｎ，Ｍ．Ｅ．ａｎｄ  Ｊａｓｉｎ，Ｍ．（２０１０）ＭｉｔｏｔｉｃＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｍａｉｎｔａｉｎｓ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ．ｒｅｖ．Ｍｏｌ．ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌ．，１１，１９６−２０７．
５１．Ｊａｓｉｎ，Ｍ．ａｎｄ  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，Ｒ．（２０１３）Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｂｙＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ．Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．Ｂｉｏｌ．，５，ａ０１２７４０．
５２．Ｂａｕｄｉｎ，Ａ．，Ｏｚｉｅｒ−Ｋａｌｏｇｅｒｏｐｏｕｌｏｓ，Ｏ．，Ｄｅｎｏｕｅｌ，Ａ．，Ｌａｃｒｏｕｔｅ，Ｆ．ａｎｄ  Ｃｕｌｌｉｎ，Ｃ．（１９９３）Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１，３３２９．
５３．Ｓｌｅｉｇｈｔ，Ｓ．Ｃ．，Ｂａｒｔｌｅｙ，Ｂ．Ａ．，Ｌｉｅｖｉａｎｔ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ｓａｕｒｏ，Ｈ．Ｍ．（２０１０）Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｒｏｂｕｓｔ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｉｒｃｕｉｔｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｅｎｇ．，４，１２．
５４．Ｌａｍｂｅｒｔ，Ｓ．，Ｓａｉｎｔｉｇｎｙ，Ｙ．，Ｄｅｌａｃｏｔｅ，Ｆ．，Ａｍｉｏｔ，Ｆ．，Ｃｈａｐｕｔ，Ｂ．，Ｌｅｃｏｍｔｅ，Ｍ．，Ｈｕｃｋ，Ｓ．，Ｂｅｒｔｒａｎｄ，Ｐ．ａｎｄ  Ｌｏｐｅｚ，Ｂ．（１９９９）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ，ｕｓｉｎｇ  ｔａｎｄｅｍ  ｒｅｐｅａｔ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．，ＤＮＡ  Ｒｅｐａｉｒ，４３３，１５９−１６８．
５５．Ｒｅａｄ，Ｌ．Ｒ．，Ｒａｙｎａｒｄ，Ｓ．Ｊ．，Ｒｕｋｓｃ，Ａ．ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，Ｍ．Ｄ．（２００４）Ｇｅｎｅ  ｒｅｐｅａｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌＨｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３２，１１８４−１１９６．
５６．Ｓｈａｒｏｎ，Ｅ．，ｖａｎ  Ｄｉｊｋ，Ｄ．，Ｋａｌｍａ，Ｙ．，Ｋｅｒｅｎ，Ｌ．，Ｍａｎｏｒ，Ｏ．，Ｙａｋｈｉｎｉ，Ｚ．ａｎｄ  Ｓｅｇａｌ，Ｅ．（２０１４）Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ  ｏｎ  ｎｏｉｓｅ  ｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｏｕｓａｎｄｓ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，２４，１６９８−１７０６．
５７．Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．Ｆ．，Ｂａｌａｚｓｉ，Ｇ．ａｎｄ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｊ．（２００７）Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｎｏｉｓｙ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０４，１２７２６−１２７３１．
５８．Ｃｏｃｋｅｔｔ，Ｍ．，Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ，Ｃ．ａｎｄ  Ｙａｒｒａｎｔｏｎ，Ｇ．（１９９０）Ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ＣｈｉｎｅｓｅＨａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，６６２−６６７．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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