(57)【要約】  本発明は、ビルトイン型６ヘリックスバンドルタンパク質を有する自己集合タンパク質ナノ粒子に関する。ループ領域を含むタンパク質またはペプチドは、６ヘリックスバンドル（ＳＨＢ）タンパク質に結合し、自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）に統合されることによって安定化される。【選択図】図１
2020514382.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、ドメインＳＨＢ２、ならびに更なる置換基Ｘ１およびＹ１を含む連続鎖からなる式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ１    （Ｉａ）または
Ｙ１−ＳＨＢ２−Ｌ３−Ｂ−Ｌ２−ＳＨＢ１−Ｌ１−ＮＤ１−Ｘ１    （Ｉｂ）
の複数のビルディングブロックからなる自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）であって、上式中、
ＮＤ１は、ｍ個のサブユニットＮＤ１のオリゴマー（ＮＤ１）ｍを含むペプチドまたはタンパク質であり、
ＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、互いに独立に、６ヘリックスバンドルペプチドまたはタンパク質のヘリックスであり、
ｍは、２から１０の間の数であり、ただしｍは３ではなく、３の倍数でもなく、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、互いに独立に、ペプチド結合またはペプチド鎖であるリンカーであり、
Ｂは、ループ領域を含むペプチドまたはタンパク質であり、
Ｘ１は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
Ｙ１は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
ここで式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の複数のビルディングブロックは、オリゴマー化ドメインＮＤ２、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、ドメインＳＨＢ２、ならびに更なる置換基Ｘ２およびＹ２を含む連続鎖からなる式（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）：
Ｘ２−ＮＤ２−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ２    （ＩＩａ）または
Ｙ２−ＳＨＢ２−Ｌ３−Ｂ１−Ｌ２−ＳＨＢ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｘ２    （ＩＩｂ）の複数のビルディングブロックと共集合していてもよく、上式中、
ＮＤ２は、ｍ個のサブユニットＮＤ２のオリゴマー（ＮＤ２）ｍを含むペプチドまたはタンパク質であり、
ＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、互いに独立に、６ヘリックスバンドルペプチドまたはタンパク質のヘリックスであり、
ｍは、２から１０の間の数であり、ただしｍは３ではなく、３の倍数でもなく、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、互いに独立に、ペプチド結合またはペプチド鎖であるリンカーであり、
Ｂは、ループ領域を含むペプチドまたはタンパク質であり、
Ｘ２は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
Ｙ２は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
式（ＩＩａ）および／または式（ＩＩｂ）のＸ２およびＹ２の少なくとも一方は、式（Ｉａ）および／または式（Ｉｂ）のＸ１およびＹ１と異なっている、自己集合タンパク質ナノ粒子。
【請求項２】
式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）のオリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、およびドメインＳＨＢ２が、式（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）のオリゴマー化ドメインＮＤ２、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、およびドメインＳＨＢ２と同一である、請求項１に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項３】
ＮＤ１および／またはＮＤ２が、コイルドコイルである、請求項１に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項４】
ＮＤ１および／またはＮＤ２が、五量体コイルドコイルである、請求項３に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項５】
ＮＤ１および／またはＮＤ２が、４ＰＮ８、４ＰＮＤ、４ＷＢＡ、３Ｖ２Ｎ、３Ｖ２Ｐ、３Ｖ２Ｑ、３Ｖ２Ｒ、４ＥＥＢ、４ＥＥＤ、３ＭＩＷ、１ＭＺ９、１ＦＢＭ、１ＶＤＦ、２ＧＵＶ、２ＨＹＮ、１ＺＬＬ、および１Ｔ８Ｚからなる群から選択される五量体コイルドコイルであるか、またはＮＤ１および／またはＮＤ２が、アミノ酸改変を含有し、かつ／または片方もしくは両方の端が短縮された、４ＰＮ８、４ＰＮＤ、４ＷＢＡ、３Ｖ２Ｎ、３Ｖ２Ｐ、３Ｖ２Ｑ、３Ｖ２Ｒ、４ＥＥＢ、４ＥＥＤ、３ＭＩＷ、１ＭＺ９、１ＦＢＭ、１ＶＤＦ、２ＧＵＶ、２ＨＹＮ、１ＺＬＬ、および１Ｔ８Ｚからなる群から選択される五量体コイルドコイルであり、各コイルドコイルがＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリーナンバーによって示されている、請求項４に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項６】
ＮＤ１および／またはＮＤ２が四量体コイルドコイルである、請求項３に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項７】
ＮＤ１および／またはＮＤ２が、テトラブラキオン（１ＦＥ６）由来の四量体コイルドコイル、またはアミノ酸改変を含有し、かつ／または片方もしくは両方の端が短縮されたテトラブラキオン（１ＦＥ６）由来の四量体コイルドコイルであり、テトラブラキオン由来の四量体コイルドコイルがＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリーナンバーによって示されている、請求項６に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項８】
ドメインＳＨＢ１および／またはＳＨＢ２が、４Ｉ２Ｌ、３Ｗ１９、３ＶＴＱ、３ＶＵ５、３ＶＵ６、３ＶＴＰ、３ＶＧＹ、３ＶＨ７、３ＶＧＸ、３ＶＩＥ、３ＲＲＲ、３ＲＲＴ、３ＫＰＥ、３Ｇ７Ａ、３Ｆ４Ｙ、３Ｆ５０、１ＺＶ８、４ＮＪＬ、４ＮＳＭ、４ＪＦ３、４ＪＧＳ、４ＪＰＲ、２ＯＴ５、３ＣＰ１、３ＣＹＯ、２ＩＥＱ、１ＪＰＸ、１ＪＱ０、１Ｋ３３、１Ｋ３４、５Ｊ０Ｊ、５Ｊ０Ｉ、５Ｊ０Ｈ、５ＩＺＳ、５Ｊ７３、５Ｊ２Ｌ、５Ｊ０Ｌ、５Ｊ０Ｋ、および５Ｊ１０からなる群からそれぞれ独立に選択されるか、またはドメインＳＨＢ１および／またはＳＨＢ２が、アミノ酸改変を含有し、かつ／または片方もしくは両方の端が短縮された、４Ｉ２Ｌ、３Ｗ１９、３ＶＴＱ、３ＶＵ５、３ＶＵ６、３ＶＴＰ、３ＶＧＹ、３ＶＨ７、３ＶＧＸ、３ＶＩＥ、３ＲＲＲ、３ＲＲＴ、３ＫＰＥ、３Ｇ７Ａ、３Ｆ４Ｙ、３Ｆ５０、１ＺＶ８、４ＮＪＬ、４ＮＳＭ、４ＪＦ３、４ＪＧＳ、４ＪＰＲ、２ＯＴ５、３ＣＰ１、３ＣＹＯ、２ＩＥＱ、１ＪＰＸ、１ＪＱ０、１Ｋ３３、１Ｋ３４、５Ｊ０Ｊ、５Ｊ０Ｉ、５Ｊ０Ｈ、５ＩＺＳ、５Ｊ７３、５Ｊ２Ｌ、５Ｊ０Ｌ、５Ｊ０Ｋ、および５Ｊ１０からなる群からそれぞれ独立に選択され、各ＳＨＢがＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリーナンバーによって示されている、請求項１から７のいずれか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項９】
Ｂが、がん細胞に対する免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチド、感染性疾患に対する免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチド、アレルゲンに対する免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチド、ヒト疾患の治療のための免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチドから選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項１０】
Ｂが、クラスＩのエンベロープウイルスの三量体表面糖タンパク質の群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項１１】
Ｂが、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス（ＨＡ）、ＨＩＶ（ｇｐ１６０）、エボラ（ＧＰ）、マールブルグ（ＧＰ）、ＲＳＶ（Ｆタンパク質）、ＣＭＶ（ｇＢタンパク質）、ＨＳＶ（ｇＢタンパク質）、ＳＡＲＳ（Ｓタンパク質）、ならびにＭＥＲＳ（Ｓタンパク質）の三量体表面糖タンパク質からなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項１２】
式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の複数のビルディングブロックが、式（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）の複数のビルディングブロックと共集合しており、ここで式（ＩＩａ）および／または式（ＩＩｂ）のＸ２およびＹ２の少なくとも一方が、完全長フラジェリンであるか、または２つもしくは３つのドメインのみを含むフラジェリンである、請求項１から１１のいずれか一項に記載のタンパク質ナノ粒子。
【請求項１３】
請求項１から１２のいずれか一項に記載のタンパク質ナノ粒子を含む、組成物。
【請求項１４】
オリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、ドメインＳＨＢ２、ならびに更なる置換基Ｘ１およびＹ１を含む連続鎖からなる式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ１    （Ｉａ）または
Ｙ１−ＳＨＢ２−Ｌ３−Ｂ−Ｌ２−ＳＨＢ１−Ｌ１−ＮＤ１−Ｘ１    （Ｉｂ）
（上式中、
ＮＤ１は、ｍ個のサブユニットＮＤ１のオリゴマー（ＮＤ１）ｍを含むペプチドまたはタンパク質であり、
ＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、互いに独立に、６ヘリックスバンドルペプチドまたはタンパク質のヘリックスであり、
ｍは、２から１０の間の数であり、ただしｍは３ではなく、３の倍数でもなく、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、互いに独立に、ペプチド結合またはペプチド鎖であるリンカーであり、
Ｂは、ループ領域を含むペプチドまたはタンパク質であり、
Ｘ１は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
Ｙ１は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列である）
の単量体ビルディングブロック、または、
オリゴマー化ドメインＮＤ２、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、ドメインＳＨＢ２、ならびに更なる置換基Ｘ２およびＹ２を含む連続鎖からなる式（ＩＩａ）もまたは（ＩＩｂ）：
Ｘ２−ＮＤ２−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ２    （ＩＩａ）または
Ｙ２−ＳＨＢ２−Ｌ３−Ｂ１−Ｌ２−ＳＨＢ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｘ２    （ＩＩｂ）（上式中、
ＮＤ２は、ｍ個のサブユニットＮＤ２のオリゴマー（ＮＤ２）ｍを含むペプチドまたはタンパク質であり、
ＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、互いに独立に、６ヘリックスバンドルペプチドまたはタンパク質のヘリックスであり、
ｍは、２から１０の間の数であり、ただしｍは３ではなく、３の倍数でもなく、
Ｌ１、Ｌ２およびＬ３は、互いに独立に、ペプチド結合またはペプチド鎖であるリンカーであり、
Ｂは、ループ領域を含むペプチドまたはタンパク質であり、
Ｘ２は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
Ｙ２は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列である）
の単量体ビルディングブロック。
【請求項１５】
ヒトまたは非ヒト動物にワクチン接種する方法における使用のための、請求項１から１２のいずれか一項に記載のタンパク質ナノ粒子であって、そのようなワクチン接種を必要とする対象に有効量の前記タンパク質ナノ粒子を投与することを含む、タンパク質ナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビルトイン型６ヘリックスバンドルタンパク質を有する自己集合タンパク質ナノ粒子に関する。ループ領域を含むタンパク質またはペプチドは、６ヘリックスバンドル（ＳＨＢ）タンパク質と結合し、自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）に統合されることによって安定化される。
【背景技術】
【０００２】
エンベロープウイルスの表面タンパク質は、ウイルス感染の初期状態においてきわめて重要である。例えば、免疫不全ウイルス（ヒトではＨＩＶ、サルではＳＩＶ）において、それらは、ウイルスが細胞表面にドッキングした後、ウイルスエンベロープの細胞膜との直接融合を媒介する。同様の構造的変化がインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質で起きており、インフルエンザのＨＡまたはＨＩＶの糖タンパク質１６０（ｇｐ１６０）の大規模な構造的再構成が、多くのエンベロープウイルスタンパク質が準安定な天然（膜融合前）状態から安定な融合活性（膜融合）状態へ遷移する理由であると仮定されている。これらのタンパク質の細胞外ドメインは、特有の幾つかの特徴を有するドメイン構成を示し、そのような特長が、レトロウイルスの膜融合活性化中におけるそれらの機能を決定する可能性が高い。これらのタンパク質は、通常、２つの７アミノ酸繰り返しを伴い、ループ構造を含有する、ジスルフィドによって分けられてＮ末端域からなる。これらのループ構造は、非常に大きく、例えばＨＡの頭部ドメインのような完全に折りたたまれたドメインを含有することもある。Ｎ末端近傍に、疎水性域が位置しており（融合ペプチド）、これは、融合過程の初期段階で細胞膜中へ挿入されると考えられている。これらのタンパク質は、コイルドコイル構造の主要なシグネチャーである７つのアミノ酸の疎水性反復（７アミノ酸繰り返し）を有する２つの領域を含有する。
【０００３】
ＨＩＶの場合、膜融合過程の初期段階では、三量体のエンベロープ糖タンパク質は、その膜融合前のコンフォメーション中に（ｇｐ１６０の一部としての）ｇｐ４１を含有する。受容体ＣＤ４へ結合し、続いて共同受容体ＣＸＣＲ５／ＣＣＲ４へ結合した後、ｇｐ４１の一過性の種、いわゆるプレヘアピン中間体が形成されて融合ペプチド領域が露出され、同時に、Ｎ末端コイルドコイル三量体が形成される。Ｃ末端７アミノ酸繰り返し領域と三量体Ｎ末端コイルドコイルとの会合によって、次いで、融合活性ヘアピン構造が形成され、ウイルスの膜と細胞膜との付着をもたらす（Ｐａｎｃｅｒａ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４年、５１４（７５２３）：４５５〜４６１頁）。
【０００４】
Ｂ細胞エピトープのコンフォメーション特異的な提示が、防御免疫応答の誘導に非常に重要であることは公知である。このような免疫応答は、高い特異性で目的の抗原を容易に認識するコンフォメーション特異的抗体の産生を特徴としている。
【０００５】
Ｂ細胞エピトープの適切なコンフォメーションは、タンパク質の適切なフォールディングまたはリフォールディングに依存する。それらの天然のコンフォメーションにおいて表面糖タンパク質を提示するために、様々な方法が使用されている。主に、コイルドコイルまたはフィブリチンのフォルドンドメインなどの三量体タンパク質ドメインを対象の分子に結合させることによって、糖タンパク質三量体を安定化することが試みられている（Ｇｕｔｈｅ，Ｓ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００４年、３３７（４）：９０５〜９１５頁）。これは、フォルドンドメインへＨＡを結合することによって、適切なフォールディングと、これによるＨＡステムドメインのコンフォメーション特異性の提示とが達成されたインフルエンザのＨＡ分子で示されている（Ｌｕ，Ｙ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０１４年、１１１（１）：１２５〜１３０頁）。
【０００６】
Ｋａｎｅｋｉｙｏらは、フェリチンナノ粒子の固有の三量体対称性を使用して、ＨＡが、このナノ粒子系の上へと操作されると適切にフォールディングすることを実証している（Ｋａｎｅｋｉｙｏ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３年、４９９（７４５６）：１０２〜１０６頁）。精巧な実験手法において、ＨＩＶのＳＨＢを使用して、ＨＡ中間体を設計して、ＨＡの最良のステム設計を考案している。この手法では、ＨＡ中間体の構造は、Ｂ１−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−ＳＨＢ２−Ｌ３−Ｂ２と記述することができ、すなわち、Ｂ細胞エピトープはループ構造を形成せず、ＳＨＢがＢ細胞エピトープ中に組み込まれており、したがって、Ｂ細胞エピトープは２つの別々の断片Ｂ１およびＢ２に分割されている。また、ＳＨＢは、ワクチン接種に使用されるＨＡ免疫原の最終的なステム設計の一部ではない（Ｙａｓｓｉｎｅ，Ｈ．Ｍ．ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２０１５年、２１（９）：１０６５〜１０７０頁）。
【０００７】
更に、ＳＨＢによるＲＳＶ  Ｆタンパク質の安定化が実証されている（国際公開第２０１４／０７９８４２号）。この手法では、ＳＨＢの２つのヘリックスは別々のポリペプチド鎖上にある。
【０００８】
ウイルス三量体糖タンパク質の適切なリフォールディングは、通常、真核生物タンパク質発現系でしか達成することができない。リフォールディングの間のループ形成は、エンベロープウイルスの準安定な糖タンパク質の正確なコンフォメーションのためにきわめて重要であり、このことはＨＡで実証されている（Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｒ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２００３年、１１（１）：７９〜９０頁）。ループ形成は真核生物タンパク質が発現される間にＥＲ膜上で自然に得られ、ここで、ＨＡは、タンパク質合成およびタンパク質フォールディングの間、ループコンフォメーション中に保持されている（Ｄａｎｉｅｌｓ，Ｒ．ら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２００３年、１１（１）：７９〜９０頁）。
【０００９】
ここで驚くべきことに、例えば三量体タンパク質などのオリゴマータンパク質がループ構造を形成する場合、すなわち、タンパク質のＮ末端とＣ末端とが近傍にある場合、次いで、単純なオリゴマードメインを使用する代わりにＳＨＢを使用して、ループ形成タンパク質の安定化を改善できることが明らかとなった。したがって、１つの末端だけで単純な三量体コイルドコイルドメインまたはフィブリチンのフォルドンドメインを使用する代わりに、その両末端（すなわちＮ末端およびＣ末端）をＳＨＢの２つのヘリックスの末端に結合させることによって、ループ形成タンパク質を安定化させることができる。一例として、インフルエンザＨＡをそのＮおよびＣ末端でＨＩＶ  ｇｐ４１のＳＨＢに結合させることができ、これによって、インフルエンザＨＡをその準安定な融合前コンフォメーションの中に固定する。次いで、そのようなビルトイン型三量体Ｂ細胞エピトープを有するＳＨＢを、ＳＡＰＮ構造中へと操作し、これによって、新規のタイプのＳＡＰＮ骨格を生成することができる。
【００１０】
この新規のタイプのナノ粒子骨格は、ナノ粒子の表面で、ループ構造に折りたたまれている（すなわち、タンパク質のＮおよびＣ末端が互いに近傍にある）タンパク質を呈する足場として、理想的に好適である。そのようなナノ粒子の足場は、ループ構造化タンパク質がその天然のコンフォメーションで安定化することを可能にする。特に対象となるのは、三量体を形成するループ構造化タンパク質である。多くのエンベロープウイルスの表面タンパク質がそのような三量体ループ構造を正確に有することは、非常に興味深い。例としては、インフルエンザＨＡ、ＣＭＶのｇＢタンパク質、ＲＳＶのＦタンパク質、ＨＩＶのｇｐ１６０など多数がある。エンベロープウイルスのこれらの三量体表面タンパク質は、自身が本発明のナノ粒子内のＳＨＢのヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフ上で操作されることにより安定することができる、準安定な膜融合前状態にある。別法として、三量体タンパク質の下部構造を、足場としてＳＨＢ−ＳＡＰＮを使用して三量体コンフォメーションの中にまとめることができる。また、単純なループ構造は、特定の三量体コンフォメーションを形成する必要性および重要性がなく、単にループ構造の中に拘束するだけで、ＳＨＢ−ＳＡＰＮ上にループとして提示することができる。
【００１１】
本発明のＳＨＢ−ＳＡＰＮは、ループ形成ペプチドおよびタンパク質をそれらの天然のコンフォメーションで提示する、非常に簡潔な方法を提供する。ループ形成ペプチドおよびタンパク質としてのＢ細胞エピトープは、β−ターンペプチドのように非常に単純であってもよいが、またエンベロープウイルスの三量体表面糖タンパク質のように非常に複雑な構造であってもよい。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、オリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、ドメインＳＨＢ２、ならびに更なる置換基Ｘ１およびＹ１を含む連続鎖からなる式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ１    （Ｉａ）または
Ｙ１−ＳＨＢ２−Ｌ３−Ｂ−Ｌ２−ＳＨＢ１−Ｌ１−ＮＤ１−Ｘ１    （Ｉｂ）
の複数のビルディングブロックからなる自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）であって、式中、
ＮＤ１は、ｍ個のサブユニットＮＤ１のオリゴマー（ＮＤ１）ｍを含むペプチドまたはタンパク質であり、
ＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、互いに独立に、６ヘリックスバンドルペプチドまたはタンパク質のヘリックスであり、
ｍは、２から１０の間の数であり、ただしｍは３ではなく、３の倍数ではなく、
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、互いに独立に、ペプチド結合またはペプチド鎖であるリンカーであり、
Ｂは、ループ領域を含むペプチドまたはタンパク質であり、
Ｘ１は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
Ｙ１は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
ここで式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の複数のビルディングブロックは、オリゴマー化ドメインＮＤ２、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、ドメインＳＨＢ２、ならびに更なる置換基Ｘ２およびＹ２を含む連続鎖からなる式（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）：
Ｘ２−ＮＤ２−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ２    （ＩＩａ）または
Ｙ２−ＳＨＢ２−Ｌ３−Ｂ１−Ｌ２−ＳＨＢ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｘ２    （ＩＩｂ）の複数のビルディングブロックと任意選択で共集合しており、式中、
ＮＤ２は、ｍ個のサブユニットＮＤ２のオリゴマー（ＮＤ２）ｍを含むペプチドまたはタンパク質であり、
ＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、互いに独立に、６ヘリックスバンドルペプチドまたはタンパク質のヘリックスであり、
ｍは、２から１０の間の数であり、ただしｍは３ではなく、３の倍数ではなく、
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、互いに独立に、ペプチド結合またはペプチド鎖であるリンカーであり、
Ｂは、ループ領域を含むペプチドまたはタンパク質であり、
Ｘ２は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
Ｙ２は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
式（ＩＩａ）および／または式（ＩＩｂ）のＸ２およびＹ２のうちの少なくとも１つは、式（Ｉａ）および／または式（Ｉｂ）のＸ１およびＹ１と異なっている、自己集合タンパク質ナノ粒子に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】ＳＨＢナノ粒子を形成する単量体の概略図である。  以下が単量体のビルディングブロックである。・ＳＨＢ１は、ＳＨＢを形成する２つのペプチドまたはタンパク質のうちの一方、・Ｂは、ループ領域を含む、優先的には三量体の単量体を含むタンパク質、・ＳＨＢ２は、ＳＨＢタンパク質を形成する２つのペプチドまたはタンパク質のうちのもう一方、・ＮＤ１は、ｍ個のサブユニットＮＤ１のオリゴマー（ＮＤ１）ｍを形成するタンパク質、・Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、ＮＤ１、ＳＨＢ１、Ｂ、およびＳＨＢ２を接続するリンカー、・Ｘ１およびＹ１は、単量体の片方の末端のペプチドまたはタンパク質配列。
【図２】ＨＣ＿ＡＤ１ｇの分子モデルを示す図である。  Ｙ１が存在しない構造Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２を有するタンパク質の連なりによって形成された、単量体（Ａ）、三量体（Ｂ）、および二十面体粒子（Ｃ）の分子モデル。６ヘリックスバンドルを形成するＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、本文で示している。ループ形成タンパク質は、ｇＢの三量体の表面に露出した突起を形成するＣＭＶのｇＢタンパク質の一部であり、一方ＳＨＢは、ＨＩＶ由来のｇｐ４１タンパク質の一部である。
【図３】ＨＣ＿ＡＤ１ｇの透過型電子顕微鏡写真である。  組換えによって発現させたタンパク質のリフォールディングおよび共集合の後、試料を炭素被覆グリッド上に吸着させ、２％ウラニル酢酸でネガティブ染色した。ナノ粒子は、実施例１に記載の配列番号１の配列を有する。バーは、２００ｎｍを表す。
【図４】ｐＰＥＰ−Ｔのベクターマップを示す図である。  「ｐｒｏｍ」：プロモーター；「ｔｅｒｍ」：ターミネーター；「ｏｒｉ」：複製起点；「ｂｐ」：塩基対；「ａｍｐ」：アンピシリン耐性遺伝子。
【図５】コンストラクトＨＣ＿ＡＤ１ｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。このコンストラクトは、３６．０ｋＤａの理論的分子量を有する。Ａ）様々な細胞株における発現レベル  ＵＩ−非誘導  Ｉ−誘導  Ｂ）Ｎｉ−アフィニティ精製後の純度
【図６】Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇのコンピューターモデルを示す図である。  構造Ｙ１−ＳＨＢ２−Ｌ３−Ｂ−Ｌ２−ＳＨＢ１−Ｌ１−ＮＤ１−Ｘ１を有するタンパク質の連なりによって形成された、単量体（Ａ）、三量体（Ｂ）、および二十面体粒子（Ｃ）の分子モデル。６ヘリックスバンドルを形成するＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、本文で示している。ループ形成タンパク質は、三量体の表面に露出した糖タンパク質を形成するインフルエンザ由来のＨＡであり、一方ＳＨＢは、ＨＩＶ由来のｇｐ４１タンパク質の一部である。Ｃは、二十面体の５回対称軸を見下ろした図である。
【図７】コンストラクトＦ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。このコンストラクトは、７７．９ｋＤａの理論的分子量を有する。Ａ）誘導前後の発現レベル  ｕｉ−非誘導  ｉ−誘導  Ｂ）Ｎｉ−アフィニティ精製後の純度
【図８】Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇの透過型電子顕微鏡写真である。  組換えによって発現させたタンパク質のリフォールディングおよび共集合の後、試料を、炭素被覆グリッド上に吸着させ、２％ウラニル酢酸でネガティブ染色した。ナノ粒子は、実施例５に記載の配列番号１５の配列を有する。バーは、１００ｎｍを表す。
【図９Ａ】Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇ粒子上のＨＡ分子コンフォメーションのＥＬＩＳＡ分析を示す図である。  ｍＡｂ  ＩＣ５−４Ｆ８によるＦ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇおよび不活性化ＰＲ８／３４ウイルスの認識。Ｙ軸：様々なＥＬＩＳＡ測定値からの相対的ＯＤ値。
【図９Ｂ】Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇ粒子上のＨＡ分子コンフォメーションのＥＬＩＳＡ分析を示す図である。  ポリクローナル高度免疫血清によるＦ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇおよび不活性化ＰＲ８／３４ウイルスの認識。Ｙ軸：様々なＥＬＩＳＡ測定値からの相対的ＯＤ値。
【図９Ｃ】Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇ粒子上のＨＡ分子コンフォメーションのＥＬＩＳＡ分析を示す図である。  ｍＡｂ  ＩＣ５−４Ｆ８の、８０ｎｇのＦ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇとのプレインキュベーションによるＰＲ８／３４認識の喪失。Ｙ軸：様々なＥＬＩＳＡ測定値からの相対的ＯＤ値。
【図９Ｄ】Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇ粒子上のＨＡ分子コンフォメーションのＥＬＩＳＡ分析を示す図である。  ポリクローナル高度免疫血清の、８０ｎｇのＦ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇとのプレインキュベーションによるＰＲ８／３４認識の喪失。Ｙ軸：様々なＥＬＩＳＡ測定値からの相対的ＯＤ値。
【図１０】ＥＬＩＳＡによるＦ３−ＨＡＰＲ三量体上のＨＡ分子のコンフォメーションの分析を示す図である。  それぞれ５μｇ／ｍｌ（黒色）、１．７μｇ／ｍｌ（ドット）、０．５６μｇ／ｍｌ（破線）、および０．１９μｇ／ｍｌ（白色）の様々なタンパク質濃度での、Ｆ３−ＨＡＰＲおよび不活性化ＰＲ８／３４ウイルス上でのポリクローナル高度免疫血清によるＨＡの認識。Ｆ３−ＨＡＰＲは、様々な温度条件で保管した。ＲＴ：室温。
【図１１】免疫化されたマウスの、致死量の１００ＰＦＵ（１０ＬＤ９０）のＡ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）投与後の生存率を示す図である。  △Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇ  ×不活性化ウイルスＰＲ８／３４  □ＰＢＳバッファー
【図１２】ＰＲ８／３４投与後の免疫応答の解析を示す図である。Ａ）Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇによる免疫化後の体重。  △マウス１  ■マウス２  ●マウス３  ×マウス４  ◇マウス５  Ｂ）Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇによる免疫化後の不活性化ウイルスＰＲ８／３４に対する抗体価。  △マウス１  ■マウス２  ●マウス３  ×マウス４  ◇マウス５
【図１３】ＰＲ８／３４投与後の免疫応答の解析を示す図である。Ａ）不活性化ウイルスＰＲ８／３４による免疫化後の体重。  △マウス６  ■マウス７  ●マウス８  ×マウス９  ◇マウス１０  Ｂ）不活性化されたウイルスＰＲ８／３４による免疫化後の、不活性化ウイルスＰＲ８／３４に対する抗体価。  △マウス６  ■マウス７  ●マウス８  ×マウス９  ◇マウス１０
【図１４】４ＴＶＰ−１ＥＮＶの分子モデルを示す図である。  Ｌ２およびＬ３はペプチド結合であり、Ｙ１は存在しない構造Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２を有するタンパク質の連なりによって形成された、単量体（Ａ）、三量体（Ｂ）、および二十面体粒子（Ｃ）の分子モデル。６ヘリックスバンドルを形成するＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、本文で示している。ループ形成タンパク質は、ｇｐ１２０の三量体の表面に露出した突起を形成する、ＨＩＶのｇｐ１２０タンパク質のＶ１／Ｖ２−ループであり、一方ＳＨＢは、ＨＩＶ由来のｇｐ４１タンパク質の一部である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明において、ＳＨＢは、ビルトイン型であると記載され、すなわち、例えば、Ｒａｍａｎ  Ｓ．Ｋ．ら、Ｎａｎｏｍｅｄ  ２００６年、２（２）：９５〜１０２頁；Ｐｉｍｅｎｔｅｌ  Ｔ．Ａ．ら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．２００９年．７３（１）：５３〜６１頁；Ｉｎｄｅｌｉｃａｔｏ，Ｇ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．２０１６年、１１０（３）：６４６〜６６０頁；Ｋａｒｃｈ，Ｃ．Ｐ．ら、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１６年、１３（１）：２４１〜２５１頁によって記載されているＳＡＰＮのような公知のＳＡＰＮの構造に組み込まれていると記載される。ループ形成するペプチドまたはタンパク質を安定化するために、好ましくは３つのオリゴマー化状態を有するタンパク質が本明細書で使用される。本発明のＳＡＰＮのコンストラクトに対する基本として使用することができるＳＡＰＮはまた、国際公開第２００４０７１４９３号、国際公開第２００９１０９４２８号および国際公開第２０１５１０４３５２号にも記載されている。
【００１５】
本発明は、オリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、ドメインＳＨＢ２、ならびに更なる置換基Ｘ１およびＹ１を含む連続鎖からなる式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ１    （Ｉａ）または
Ｙ１−ＳＨＢ２−Ｌ３−Ｂ−Ｌ２−ＳＨＢ１−Ｌ１−ＮＤ１−Ｘ１    （Ｉｂ）
の複数のビルディングブロックからなる自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）であって、式中、
ＮＤ１は、ｍ個のサブユニットＮＤ１のオリゴマー（ＮＤ１）ｍを含むペプチドまたはタンパク質であり、
ＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、互いに独立に、６ヘリックスバンドルペプチドまたはタンパク質のヘリックスであり、
ｍは、２から１０の間の数であり、ただしｍは３ではなく、３の倍数ではなく、
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、互いに独立に、ペプチド結合またはペプチド鎖であるリンカーであり、
Ｂは、ループ領域を含むペプチドまたはタンパク質であり、
Ｘ１は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
Ｙ１は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
ここで式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の複数のビルディングブロックは、オリゴマー化ドメインＮＤ２、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、ドメインＳＨＢ２、ならびに更なる置換基Ｘ２およびＹ２を含む連続鎖からなる式（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）：
Ｘ２−ＮＤ２−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ２    （ＩＩａ）または
Ｙ２−ＳＨＢ２−Ｌ３−Ｂ１−Ｌ２−ＳＨＢ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｘ２    （ＩＩｂ）の複数のビルディングブロックと任意選択で共集合しており、式中、
ＮＤ２は、ｍ個のサブユニットＮＤ２のオリゴマー（ＮＤ２）ｍを含むペプチドまたはタンパク質であり、
ＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、互いに独立に、６ヘリックスバンドルペプチドまたはタンパク質のヘリックスであり、
ｍは、２から１０の間の数であり、ただしｍは３ではなく、３の倍数ではなく、
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、互いに独立に、ペプチド結合またはペプチド鎖であるリンカーであり、
Ｂは、ループ領域を含むペプチドまたはタンパク質であり、
Ｘ２は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
Ｙ２は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
式（ＩＩａ）および／または式（ＩＩｂ）のＸ２およびＹ２の少なくとも１つは、式（Ｉａ）および／または式（Ｉｂ）のＸ１およびＹ１と異なっている、自己集合タンパク質ナノ粒子に関する。
【００１６】
好ましい実施形態において、本発明は、オリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、ドメインＳＨＢ２、ならびに更なる置換基ＸおよびＹを含む連続鎖からなる式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ１    （Ｉａ）または
Ｙ１−ＳＨＢ２−Ｌ３−Ｂ−Ｌ２−ＳＨＢ１−Ｌ１−ＮＤ１−Ｘ１    （Ｉｂ）
（式中、
ＮＤ１は、ｍ個のサブユニットＮＤ１のオリゴマー（ＮＤ１）ｍを含むペプチドまたはタンパク質であり、
ＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、互いに独立に、６ヘリックスバンドルペプチドまたはタンパク質のヘリックスであり、
ｍは、２から１０の間の数であり、ただしｍは３ではなく、３の倍数ではなく、
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、互いに独立に、ペプチド結合またはペプチド鎖であるリンカーであり、
Ｂは、ループ領域を含むペプチドまたはタンパク質であり、
Ｘ１は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
Ｙ１は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列である）
の複数のビルディングブロックからなる、自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）に関する。
【００１７】
更に好ましい実施形態において、本発明は、オリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、ドメインＳＨＢ２、ならびに更なる置換基Ｘ１およびＹ１を含む連続鎖からなる式（Ｉａ）または（Ｉｂ）：
Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ１    （Ｉａ）または
Ｙ１−ＳＨＢ２−Ｌ３−Ｂ−Ｌ２−ＳＨＢ１−Ｌ１−ＮＤ１−Ｘ１    （Ｉｂ）
の複数のビルディングブロックからなる自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）であって、式中、
ＮＤ１は、ｍ個のサブユニットＮＤ１のオリゴマー（ＮＤ１）ｍを含むペプチドまたはタンパク質であり、
ＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、互いに独立に、６ヘリックスバンドルペプチドまたはタンパク質のヘリックスであり、
ｍは、２から１０の間の数であり、ただしｍは３ではなく、３の倍数ではなく、
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、互いに独立に、ペプチド結合またはペプチド鎖であるリンカーであり、
Ｂは、ループ領域を含むペプチドまたはタンパク質であり、
Ｘ１は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
Ｙ１は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
ここで式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の複数のビルディングブロックは、オリゴマー化ドメインＮＤ２、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、ドメインＳＨＢ２、ならびに更なる置換基Ｘ２およびＹ２を含む連続鎖からなる式（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）：
Ｘ２−ＮＤ２−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ２    （ＩＩａ）または
Ｙ２−ＳＨＢ２−Ｌ３−Ｂ１−Ｌ２−ＳＨＢ１−Ｌ１−ＮＤ２−Ｘ２    （ＩＩｂ）の複数のビルディングブロックと共集合しており、式中、
ＮＤ２は、ｍ個のサブユニットＮＤ２のオリゴマー（ＮＤ２）ｍを含むペプチドまたはタンパク質であり、
ＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、互いに独立に、６ヘリックスバンドルペプチドまたはタンパク質のヘリックスであり、
ｍは、２から１０の間の数であり、ただしｍは３ではなく、３の倍数ではなく、
Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３は、互いに独立に、ペプチド結合またはペプチド鎖であるリンカーであり、
Ｂは、ループ領域を含むペプチドまたはタンパク質であり、
Ｘ２は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
Ｙ２は、存在しないか、または更に置換されていてもよい１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドもしくはタンパク質配列であり、
式（ＩＩａ）および／または式（ＩＩｂ）のＸ２およびＹ２の少なくとも１つは、式（Ｉａ）および／または式（Ｉｂ）のＸ１およびＹ１と異なっている、自己集合タンパク質ナノ粒子に関する。
【００１８】
式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の複数のビルディングブロックが、式（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）の複数のビルディングブロックと共集合する場合、通常は、式（Ｉａ）のビルディングブロックは式（ＩＩａ）のビルディングブロックと共集合し、式（Ｉｂ）のビルディングブロックは式（ＩＩｂ）のビルディングブロックと共集合する。
【００１９】
好ましい実施形態において、式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）のオリゴマー化ドメインＮＤ１、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、およびドメインＳＨＢ２は、式（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）のオリゴマー化ドメインＮＤ２、リンカーＬ１、ドメインＳＨＢ１、リンカーＬ２、ループ領域を含むドメインＢ、リンカーＬ３、およびドメインＳＨＢ２に同一である。
【００２０】
本発明において、ＳＡＰＮ構造の一部であるＳＨＢの２つのヘリックス上の、糖タンパク質などのタンパク質のＮおよびＣ末端を操作することによって、リフォールディングの間、Ｂ細胞エピトープをループコンフォメーション中へ拘束する。これは、きわめて重要なことであり、驚くべきことに原核生物発現系における産生の後でさえも、タンパク質を変性状態から正しくリフォールディングさせうる。したがって、真核生物発現は、タンパク質の適切なリフォールディングのために必ずしも必要ではない。リフォールディングのためには、本発明のＳＨＢ−ＳＡＰＮによって示されるように、ループが、近傍にタンパク質のＮ末端およびＣ末端を保持して形成されることが重要である。本発明を使用した、細菌で発現させたＨＡの変性状態からの適切なリフォールディングは、ＳＨＢ−ＳＡＰＮベースのＨＡ免疫原への、ｍＡｂおよび高度免疫血清によるコンフォメーション特異的な認識および結合により実証されている（図９および１０）。
【００２１】
単量体ビルディングブロック
ペプチド（もしくはポリペプチドまたはタンパク質）は、アミド結合によって共有結合的に連結されているアミノ酸の鎖または配列である。ペプチドは、天然の、修飾された天然の、部分的に合成された、または完全に合成されたものであってもよい。修飾された天然の、部分的に合成された、または完全に合成されたとは、天然に存在しないことを意味すると理解される。アミノ酸という用語は、２０種の必須天然α−Ｌ−アミノ酸から選択される天然に存在するアミノ酸、α−Ｄ−アミノ酸、６−アミノヘキサン酸、ノルロイシン、ホモシステインなど合成アミノ酸、ならびにホスホセリン（ｐｈｏｓｈｏｓｅｒｉｎｅ）もしくはホスホチロシン、またはｎ−オクタノイル−セリンなどのその他の修飾体など、何らかの方法で修飾されて電荷などの特定の特性が変化している天然に存在するアミノ酸の両方を包含する。アミノ酸の誘導体は、例えばアミド結合を形成するアミノ基がアルキル化されている、または側鎖アミノ、ヒドロキシル、もしくはチオ基がアルキル化もしくはアシル化されている、または側鎖カルボキシ基がアミド化もしくはエステル化されているアミノ酸である。好ましくは、本発明のペプチドまたはタンパク質は、２０種の必須天然α−Ｌ−アミノ酸から選択されるアミノ酸を含む。
【００２２】
概算で、ペプチドは、それらのサイズに基づいてタンパク質と区別することができ、すなわちおよそ５０個以下のアミノ酸の鎖はペプチドであるとみなすことができ、一方、これより長い鎖はタンパク質であるとみなすことができる。したがって、本明細書で使用する「ペプチド」という用語は、５０個以下のアミノ酸のアミノ酸鎖、好ましくは２〜５０個のアミノ酸のアミノ酸鎖を指し、本明細書で使用する「タンパク質」という用語は、５０個を超えるアミノ酸のアミノ酸鎖、好ましくは５１〜１００００個のアミノ酸のアミノ酸鎖を指す。ジペプチドは、最も短いペプチドであり、１つのペプチド結合によって連結された２つのアミノ酸からなる。同様に、トリペプチドは３つのアミノ酸からなり、テトラペプチドは４つのアミノ酸からなる、などである。ポリペプチドは、長く、連続した、非分枝のペプチド鎖である。文献においては、ペプチドをタンパク質と区別するサイズの境界は、やや曖昧である。アミロイドベータなどの長い「ペプチド」はタンパク質とみなされていることもあり、逆もまた同様で、インスリンなどのより小さいタンパク質がペプチドと呼ばれていることもある。
【００２３】
本発明によるオリゴマー化ドメインは、好ましくはコイルドコイルである。コイルドコイルは、本明細書下記にて更に詳しく説明するように、３および４残基の間隔をあけて近接して配置する主に疎水性残基のパターンを有するタンパク質配列であり、集合して多量体のヘリックスバンドルを形成する。
【００２４】
単量体ビルディングブロックのすべての成分（Ｘ１、Ｘ２、ＮＤ１、ＮＤ２、Ｌ１、ＳＨＢ１、Ｌ２、Ｂ、Ｌ３、ＳＨＢ２、Ｙ１、およびＹ２）は、任意選択で、標的化物質、またはナノ粒子のアジュバント特性を増強する置換基によって更に置換されていてもよい。置換されたとは、単量体ビルディングブロック上のある化学基の、単量体ビルディングブロックに共有結合的に連結される置換基を産する別の化学基による置換を意味する。このような置換基は、免疫賦活性核酸、好ましくはデオキシイノシンを含有するオリゴデオキシヌクレオチド、デオキシウリジンを含有するオリゴデオキシヌクレオチド、ＣＧモチーフを含有するオリゴデオキシヌクレオチド、ＣｐＧ、イミキモド、レシキモド、ガーディキモド、イノシンおよびシチジン含有核酸分子などであってもよい。置換基としてみなされる具体的な標的化物質は、ＥＲ標的化シグナル、すなわち小胞体（ＥＲ）へのタンパク質またはペプチドの輸送を誘導するシグナルペプチドである。
【００２５】
好ましい実施形態において、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）のビルディングブロックは、置換基Ｘ１または置換基Ｙ１のいずれかを含み、および／または式（ＩＩａ）または（ＩＩｂ）のビルディングブロックは、置換基Ｘ２または置換基Ｙ２のいずれかを含む。
【００２６】
別の好ましい実施形態において、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）のビルディングブロックは、置換基Ｘ１およびＹ１を含み、および／または式（ＩＩａ）もしくは（ＩＩｂ）のビルディングブロックは、置換基Ｘ２およびＹ２を含む。したがって、最も好ましい実施形態において、置換基は、ペプチドまたはタンパク質置換基であり、Ｘ１、Ｘ２、Ｙ１、またはＹ２と名付けられて、例えば、通常は片方の末端において、好ましくは両方の末端において、Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ１またはＸ２−ＮＤ２−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ２のようなタンパク質鎖の延長を表し、結合された一連のタンパク質配列を生成する。簡便には、そのような一連のタンパク質鎖は、１つの単一分子として組換えタンパク質発現系において発現されてもよい。互いに独立している置換基Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２、およびＹ２は、免疫応答を増強させるために、Ｂ細胞エピトープとして、または国際公開第２０１５１０４３５２号に記載されているようなフラジェリンまたはその４つのドメインのサブセットとしてのいずれかで使用される、１〜１０００個のアミノ酸を含むペプチドまたはタンパク質配列、好ましくは完全に折りたたまれたタンパク質またはタンパク質ドメインに一致する配列である。
【００２７】
フラジェリンは、４つのドメインＤ０、Ｄ１、Ｄ２、およびＤ３から構成される分子構造を有する。このタンパク質鎖は、Ｄ０ドメインのＮ末端から始まって、他のドメインＤ１、Ｄ２、およびＤ３にわたる大きなループの中を経て分子の突起に達し、ここで折り返し、Ｄ３、Ｄ２、およびＤ１を逆戻りして、Ｄ０ドメインの中のそのＣ末端をＮ末端のきわめて近傍に配置している。フラジェリンは、先天免疫系の活性化の２つの様式を有する。第１の様式は、主としてそのＤ１ドメインの高度に保存された部分を介してＴＬＲ５受容体に結合することによるものである（Ｙｏｏｎ  Ｓ．Ｉ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１２年、３３５：８５９〜６４頁）。活性化の別の様式は、主としてそのＤ０ドメインの高度に保存されたＣ末端部分を介してインフラマソームと相互作用することによるものである（Ｌｉｇｈｔｆｉｅｌｄ  Ｋ．Ｌ．ら、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８年、９：１１７１〜８頁）。
【００２８】
したがって、好ましい実施形態において、置換基Ｘ１、Ｙ１、Ｘ２、およびＹ２の少なくとも１つは、完全長フラジェリン、例えば、完全長のネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）フラジェリン、または２つまたは３つのドメインのみを含むフラジェリン、好ましくは少なくともＴＬＲ５結合ドメインＤ１を含むフラジェリン、より好ましくはＤ０およびＤ１ドメインを含むフラジェリン、特に、配列ＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＫＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＫＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＫＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＫＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＳＬＮＶＨＧＡＰＶＤＰＡＳＰＷＴＥＮＰＬＱＫＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号３７）もしくは配列ＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号３８）を含むフラジェリンである。
【００２９】
欠落ドメインは、残留するフラジェリン配列の２つの末端を連結する１〜２０個のアミノ酸の柔軟なリンカーセグメントによって置換されていてもよく、または欠落ドメインは、完全に折りたたまれたタンパク質抗原によって置換されていてもよい。好ましい実施形態において、欠落ドメインは、アミノ酸配列、ＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱ（配列番号３９）を含む柔軟なリンカーによって置換される。柔軟なリンカー領域は、抗原の共有結合のための好適な結合部位を含有していてもよい。したがって、フラジェリンのＤ２およびＤ３ドメインを欠失しているフラジェリン誘導体コンストラクトは、単にタンパク質鎖をＤ１およびＤ２ドメインの接触面で接続させることにより、容易に操作することができる。同様に、この突起ドメイン（Ｄ３か、Ｄ２およびＤ３一緒のいずれか）は、タンパク質抗原によって置換することができるが、ただし、ＮおよびＣ末端を有する、このタンパク質抗原がＤ１とＤ２の接触面でＮおよびＣ末端に接続することができれば、である。突起ドメインＤ２およびＤ３はまた、抗原分子の共有結合に好適な残基を有するペプチド配列によって置換することができる。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、互いに独立しているＸ１、Ｙ１、Ｘ２、およびＹ２はまた、一連の１つまたは複数のＣＤ４および／またはＣＤ８エピトープを含んでいてもよい。別の好ましい実施形態において、互いに独立しているＸ１、Ｙ１、Ｘ２、およびＹ２は、免疫学に関連するＣＤ４／ＣＤ８ペプチドおよびタンパク質配列のこれらの種類の１つまたは複数の組合せを含んでいてもよい。
【００３１】
別の好ましい実施形態において、式（Ｉａ）または式（Ｉｂ）の複数のビルディングブロックは、式（ＩＩａ）または式（ＩＩｂ）の複数のビルディングブロックと共集合しており、ここで式（ＩＩａ）および／または式（ＩＩｂ）のＸ２およびＹ２のうちの少なくとも１つ、好ましくは式（ＩＩａ）および／または式（ＩＩｂ）のＸ２およびＹ２の１つが、完全長フラジェリン、または２つもしくは３つのドメインのみを含むフラジェリン、好ましくはＤ０およびＤ１ドメインを含むフラジェリン、特に配列番号３７および／もしくは配列番号３８に示されるようなフラジェリン（ｆｌａｇｇｅｌｌｉｎ）である。
【００３２】
Ｙ１およびＹ２がＳＨＢドメインに結合される場合、ＳＨＢのこの結合部位は、ＳＡＰＮのコア方向を指しており（図１および２を参照されたい）、フラジェリンは、好ましくは、ＮＤ１および／またはＮＤ２ドメインに結合される。したがって、好ましい実施形態において、Ｘ１および／またはＸ２は、完全長フラジェリン、例えば完全長ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）フラジェリン、または２つもしくは３つのドメインのみを含むフラジェリン、好ましくは少なくともＴＬＲ５結合ドメインＤ１を含むフラジェリン、より好ましくはＤ０およびＤ１ドメインを含むフラジェリン、特に、配列、ＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＫＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＫＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＫＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＫＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＫＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＳＬＮＶＨＧＡＰＶＤＰＡＳＰＷＴＥＮＰＬＱＫＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号３７）または配列ＭＡＱＶＩＮＴＮＳＬＳＬＬＴＱＮＮＬＮＲＳＱＳＡＬＧＴＡＩＥＲＬＳＳＧＬＲＩＮＳＡＲＤＤＡＡＧＱＡＩＡＮＲＦＴＡＮＩＲＧＬＴＱＡＳＲＮＡＮＤＧＩＳＩＡＱＴＴＥＧＡＬＮＥＩＮＮＮＬＱＲＶＲＥＬＡＶＱＳＡＮＳＴＮＳＱＳＤＬＤＳＩＱＡＥＩＴＱＲＬＮＥＩＤＲＶＳＧＱＴＱＦＮＧＶＲＶＬＡＱＤＮＴＬＴＩＱＶＧＡＮＤＧＥＴＩＤＩＤＬＲＱＩＮＳＱＴＬＧＬＤＱＬＮＶＱＱＫＹＫＤＧＤＫＧＤＤＫＴＥＮＰＬＱＲＩＤＡＡＬＡＱＶＤＡＬＲＳＤＬＧＡＶＱＮＲＦＮＳＡＩＴＮＬＧＮＴＶＮＮＬＳＥＡＲＳＲＩＥＤＳＤＹＡＴＥＶＳＮＭＳＲＡＱＩＬＱＱＡＧＴＳＶＬＡＱＡＮＱＶＰＱＮＶＬＳＬＬＲ（配列番号３８）を含むフラジェリンである。
【００３３】
オリゴマーを形成する傾向は、そのようなタンパク質が条件によってオリゴマーを形成しうることを意味し、例えば、変性条件下ではそれらは単量体であるが、生理的条件下ではそれらは、例えば、二量体、三量体、四量体、または五量体を形成することがある。所定の条件下で、それらは、ナノ粒子の形成に必要な１つの単一オリゴマー化状態をとる。ただし、それらのオリゴマー化状態は、条件の変化により、例えば、塩濃度の低下により三量体から二量体に（Ｂｕｒｋｈａｒｄ  Ｐ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０００年、９：２２９４〜２３０１頁）、またはｐＨの低下により五量体から単量体に変化することがある。
【００３４】
式（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）および／または式（ＩＩａ）もしくは（ＩＩｂ）によるビルディングブロック構造は、ウイルスカプシドタンパク質と明らかに異なる。ウイルスカプシドは、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス粒子のような６０個またはその倍数のオリゴマーを形成する１つの単一タンパク質（欧州特許第１２６２５５５号、欧州特許第０２０１４１６号）、または共集合して、ウイルスの種類によって二十面体以外の他の形状もとりうるウイルスカプシド構造を形成する複数のタンパク質（Ｆｅｎｄｅｒ  Ｐ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １９９７年、１５：５２〜５６頁）から構成される。本発明のＳＡＰＮはまた、それらが（ａ）ウイルスカプシドタンパク質以外から構築されており、（ｂ）ナノ粒子の中心の空洞が非常に小さく、全ウイルスゲノムのＤＮＡ／ＲＮＡを収容することができない、という理由から、ウイルス様粒子と明らかに異なっている。
【００３５】
タンパク質オリゴマー化ドメインは、よく知られている（Ｂｕｒｋｈａｒｄ  Ｐ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２００１年、１１：８２〜８８頁）。本発明において、オリゴマー化ドメインＮＤ１またはＮＤ２は、好ましくはコイルドコイルドメインである。コイルドコイルは、３および４残基の間隔をあけて近接する、通常、７個のアミノ酸（７アミノ酸繰り返し）または１１個のアミノ酸（１１アミノ酸繰り返し）の配列の主に疎水性残基のパターンを有するタンパク質配列であり、集合して（折りたたまれて）多量体のヘリックスバンドルを形成する。３および４残基の間隔が多少不規則に分布する配列を有するコイルドコイルもまた企図される。疎水性残基は、特に疎水性アミノ酸Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、およびＴｒｐである。主に、疎水性とは、残基のうちの少なくとも５０％が上述の疎水性アミノ酸から選択されなければならないことを意味する。
【００３６】
７アミノ酸繰り返しおよびコイルドコイル
例えば、好ましい式（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）および／または式（ＩＩａ）もしくは（ＩＩｂ）の単量体ビルディングブロックにおいて、ＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、７アミノ酸繰り返しまたは１１アミノ酸繰り返し、より好ましくは７アミノ酸繰り返し、特に、次式、
［ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）］Ｘ    （ＩＩＩａ）、
［ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）］Ｘ    （ＩＩＩｂ）、
［ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）］Ｘ    （ＩＩＩｃ）、
［ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）］Ｘ    （ＩＩＩｄ）、
［ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）］Ｘ    （ＩＩＩｅ）、
［ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）］Ｘ    （ＩＩＩｆ）、
［ａａ（ｇ）−ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）］Ｘ    （ＩＩＩｇ）、
（式中、ａａは、アミノ酸またはそれらの誘導体を意味し、ａａ（ａ）、ａａ（ｂ）、ａａ（ｃ）、ａａ（ｄ）、ａａ（ｅ）、ａａ（ｆ）、およびａａ（ｇ）は、同じまたは異なるアミノ酸もしくはそれらの誘導体であり、好ましくはａａ（ａ）およびａａ（ｄ）は、同じまたは異なる疎水性アミノ酸もしくはそれらの誘導体であり、ｘは、２から２０の間の数、好ましくは３から１０の間の数である）のいずれかのタンパク質を含む。
【００３７】
７アミノ酸は、式ａａ（ａ）−ａａ（ｂ）−ａａ（ｃ）−ａａ（ｄ）−ａａ（ｅ）−ａａ（ｆ）−ａａ（ｇ）（ＩＩＩａ）のヘプタペプチド、または式（ＩＩＩｂ）〜（ＩＩＩｇ）のその並べ替えのいずれかである。
【００３８】
好ましいのは、タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２が、
（１）ｘが３であり、これらの６個のアミノ酸の表１のスコアの合計が少なくとも１４であるようにａａ（ａ）およびａａ（ｄ）が２０種の天然α−Ｌ−アミノ酸から選択される式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質、ならびに更なる７アミノ酸を１７個まで含むそのようなタンパク質；または
（２）１つのアミノ酸ａａ（ａ）が、隣接する７アミノ酸のアミノ酸ａａ（ｄ）もしくはａａ（ｇ）へのらせん間塩橋を形成することができる荷電アミノ酸であるという条件で、または１つのアミノ酸ａａ（ｄ）が、隣接する７アミノ酸のアミノ酸ａａ（ａ）もしくはａａ（ｅ）へのらせん間塩橋を形成することができる荷電アミノ酸であるという条件で、ｘが３であり、これらの６個のアミノ酸の表１のスコアの合計が少なくとも１２であるようにａａ（ａ）およびａａ（ｄ）が２０種の天然α−Ｌ−アミノ酸から選択される式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質であり、更なる７アミノ酸を２個まで含むそのようなタンパク質を含む式（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）および／または式（ＩＩａ）もしくは（ＩＩｂ）である。隣接する７アミノ酸のアミノ酸へのらせん間塩橋を形成することができる荷電アミノ酸は、例えば、他方のアミノ酸がＬｙｓ、Ａｒｇ、またはＨｉｓである場合にはＡｓｐまたはＧｌｕであり、またはその逆も同様である。
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【００３９】
また、タンパク質オリゴマー化ドメインＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、以下の好ましいタンパク質から選択されるタンパク質を含む、式（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）および／または式（ＩＩａ）もしくは（ＩＩｂ）の単量体ビルディングブロックであることが好ましい。
（１１）ａａ（ａ）がＶａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、およびＭｅｔ、ならびにそれらの誘導体から選択され、
ａａ（ｄ）がＬｅｕ、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、およびＩｌｅ、ならびにそれらの誘導体から選択される、式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質。
（１２）１つのａａ（ａ）がＡｓｎであり、他のａａ（ａ）がＡｓｎ、Ｉｌｅ、およびＬｅｕから選択され、ａａ（ｄ）がＬｅｕである、式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常、二量体化ドメインである。
（１３）ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）の両方がＴｒｐである、式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常、五量体化ドメインである。
（１４）ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）の両方がＰｈｅである、式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常、四量体化ドメインである。
（１５）ａａ（ａ）およびａａ（ｄ）の両方がＴｒｐまたはＰｈｅである、式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質。そのようなタンパク質は、通常、五量体化ドメインである。
（１６）ａａ（ａ）がＬｅｕかＩｌｅのいずれかであり、１つのａａ（ｄ）がＧｌｎであり、他のａａ（ｄ）がＧｌｎ、Ｌｅｕ、およびＭｅｔから選択される、式（ＩＩＩａ）〜（ＩＩＩｇ）のいずれかのタンパク質。そのようなタンパク質は、五量体化ドメインである可能性を有する。
【００４０】
その他の好ましいタンパク質は、上記で定義したようなタンパク質（１）、（２）、（１１）、（１２）、（１３）、（１４）、（１５）、および（１６）であり、
ここで、更に、
（１７）少なくとも１つのａａ（ｇ）がＡｓｐおよびＧｌｕから選択され、後続の７アミノ酸のａａ（ｅ）がＬｙｓ、Ａｒｇ、もしくはＨｉｓであり；および／または
（１８）少なくとも１つのａａ（ｇ）がＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓから選択され、後続の７アミノ酸のａａ（ｅ）がＡｓｐもしくはＧｌｕであり、および／または
（１９）少なくとも１つのａａ（ａ〜ｇ）がＬｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓから選択され、配列において３もしくは４アミノ酸離れたａａ（ａ〜ｇ）がＡｓｐもしくはＧｌｕである。アミノ酸ａａ（ａ〜ｇ）のそのような組合せは、例えば、ａａ（ｂ）と、ａａ（ｅ）またはａａ（ｆ）である。
【００４１】
ＰＣＯＩＬＳ（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｋｉｔ．ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｍｐｇ．ｄｅ／ｐｃｏｉｌｓ；Ｇｒｕｂｅｒ  Ｍ．ら、Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２００６年、１５５（２）：１４０〜５頁）またはＭＵＬＴＩＣＯＩＬ（ｈｔｔｐ：／／ｇｒｏｕｐｓ．ｃｓａｉｌ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｃｂ／ｍｕｌｔｉｃｏｉｌ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｍｕｌｔｉｃｏｉｌ．ｃｇｉ）などのコイルドコイル予測プログラムは、コイルドコイル形成タンパク質配列を予測することができる。したがって、式（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）および／または式（ＩＩａ）もしくは（ＩＩｂ）の単量体ビルディングブロックにおいて、ＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、コイルドコイル予測プログラムＰＣＯＩＬＳによって１４、２１、または２８のウィンドウサイズの少なくとも１つでそのアミノ酸すべてで０．９より高い確率でコイルドコイルを形成すると予測される２７アミノ酸繰り返し長の配列を少なくとも含有するタンパク質を含む。
【００４２】
式（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）および／または式（ＩＩａ）もしくは（ＩＩｂ）のより好ましい単量体ビルディングブロックにおいて、ＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、コイルドコイル予測プログラムＰＣＯＩＬＳによって１４、２１、または２８のウィンドウサイズの少なくとも１つでそのアミノ酸すべてで０．９より高い確率でコイルドコイルを形成することが予測される３７アミノ酸繰り返し長の配列を少なくとも１つ含有するタンパク質を含む。
【００４３】
式（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）および／または式（ＩＩａ）もしくは（ＩＩｂ）の別のより好ましい単量体ビルディングブロックにおいて、ＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、コイルドコイル予測プログラムＰＣＯＩＬＳによって１４、２１、または２８のウィンドウサイズの少なくとも１つでそのアミノ酸すべてで０．９より高い確率でコイルドコイルを形成することが予測される２７アミノ酸繰り返し長の少なくとも２つの別々の配列を含有するタンパク質を含む。
【００４４】
ＲＣＳＢ構造的データベース
公知のコイルドコイル配列を、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ）などのデータバンクから検索してもよい。
【００４５】
五量体コイルドコイル
五量体コイルドコイルは、ＲＣＳＢデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）から、識別するものとして「タンパク質対称性がＣ５回転である」を、「コイルド」もしくは「ジッパー」のテキスト検索と組み合わせてまたは「コイルドコイルタンパク質のＳｃｏｐＴｒｅｅ  Ｓｅａｒｃｈ」のようなＳＣＯＰ検索と組み合わせて使用して、生物学的集合体における対称性を調べることによって探し出すことができる。好適なエントリーのリストは、配列番号４０で示される４ＰＮ８、配列番号４１で示される４ＰＮＤ、配列番号４２で示される４ＷＢＡ、配列番号４３で示される３Ｖ２Ｎ、配列番号４４で示される３Ｖ２Ｐ、配列番号４５で示される３Ｖ２Ｑ、配列番号４６で示される３Ｖ２Ｒ、配列番号４７で示される４ＥＥＢ、配列番号４８で示される４ＥＥＤ、配列番号４９で示される３ＭＩＷ、配列番号５０で示される１ＭＺ９、配列番号５１で示される１ＦＢＭ、配列番号５２で示される１ＶＤＦ、配列番号５３で示される２ＧＵＶ、配列番号５４で示される２ＨＹＮ、配列番号５５で示される１ＺＬＬ、配列番号５６で示される１Ｔ８Ｚを含有する。
【００４６】
四量体コイルドコイル
同様に、四量体コイルドコイルは、「タンパク質対称性が「Ｃ４回転」である」を、「コイルド」のテキスト検索と組み合わせてまたは「コイルドコイルタンパク質のＳｃｏｐＴｒｅｅ  Ｓｅａｒｃｈ」のようなＳＣＯＰ検索と組み合わせて使用して、探し出すことができる。
【００４７】
四量体コイルドコイルについては、これによって、以下の好適なエントリーが得られる：５Ｄ６０、５Ｄ５Ｙ、５ＡＬ６、４ＷＢ４、４ＢＨＶ、４Ｃ５Ｑ、４ＧＪＷ、４Ｈ７Ｒ、４Ｈ８Ｆ、４ＢＸＴ、４ＬＴＯ、４ＬＴＰ、４ＬＴＱ、４ＬＴＲ、３ＺＤＯ、３ＲＱＡ、３Ｒ４Ａ、３Ｒ４Ｈ、３ＴＳＩ、３Ｋ４Ｔ、３Ｆ６Ｎ、２Ｏ６Ｎ、２ＯＶＣ、２Ｏ１Ｊ、２Ｏ１Ｋ、２ＡＧ３、２ＣＣＥ、１ＹＢＫ、１Ｕ９Ｆ、１Ｕ９Ｇ、１Ｕ９Ｈ、１ＵＳＤ、１ＵＳＥ、１ＵＮＴ、１ＵＮＵ、１ＵＮＶ、１ＵＮＷ、１ＵＮＸ、１ＵＮＹ、１ＵＮＺ、１ＵＯ０、１ＵＯ１、１ＵＯ２、１ＵＯ３、１ＵＯ４、１ＵＯ５、１Ｗ５Ｉ、１Ｗ５Ｌ、１ＦＥ６、１Ｇ１Ｉ、１Ｇ１Ｊ、１ＥＺＪ、１ＲＨ４、１ＧＣＬ。
【００４８】
二量体コイルドコイル
同様に、二量体コイルドコイルは、「タンパク質対称性が「Ｃ２回転」である」を、「コイルド」のテキスト検索と組み合わせてまたは「コイルドコイルタンパク質のＳｃｏｐＴｒｅｅ  Ｓｅａｒｃｈ」のようなＳＣＯＰ検索と組み合わせて使用して、探し出すことができる。
【００４９】
二量体コイルドコイルについては、これによって、以下の好適なエントリーが得られる：５Ｍ９７、５Ｍ９Ｅ、５ＦＩＹ、５Ｆ４Ｙ、５Ｄ３Ａ、５ＨＭＯ、５ＥＹＡ、５ＩＸ１、５ＩＸ２、５ＪＨＦ、５ＪＶＭ、５ＪＶＰ、５ＪＶＲ、５ＪＶＳ、５ＪＶＵ、５ＪＸ１、５ＦＣＮ、５ＨＨＥ、２Ｎ９Ｂ、４ＺＲＹ、４Ｚ６Ｙ、４ＹＴＯ、４ＺＩ３、５ＡＪＳ、５Ｆ３Ｋ、５Ｆ５Ｒ、５ＨＵＺ、５ＤＪＮ、５ＤＪＯ、５ＣＨＸ、５ＣＪ０、５ＣＪ１、５ＣＪ４、５Ｃ９Ｎ、５ＣＦＦ、４ＷＨＶ、３ＷＵＴ、３ＷＵＵ、３ＷＵＶ、４ＺＱＡ、４ＸＡ３、４ＸＡ４、４ＰＸＪ、４ＹＶＣ、４ＹＶＥ、５ＢＭＬ、５ＡＬ７、４ＷＯＴ、４ＣＧ４、５ＡＭＯ、４ＷＩＩ、４ＷＩＫ、４ＲＳＪ、４ＣＦＧ、４Ｒ３Ｑ、４ＷＩＤ、４ＣＫＧ、４ＣＫＨ、４ＮＳＷ、４Ｗ７Ｐ、４ＱＱ４、４ＯＪＫ、４ＴＬ１、４ＯＨ９、４ＬＰＺ、４Ｑ６２、４Ｌ２Ｗ、４Ｍ３Ｌ、４ＣＫＭ、４ＣＫＮ、４Ｎ６Ｊ、４ＬＴＢ、４ＬＲＺ、２ＭＡＪ、２ＭＡＫ、４ＮＡＤ、４ＨＷ０、４ＢＴ８、４ＢＴ９、４ＢＴＡ、４ＨＨＤ、４Ｍ８Ｍ、４Ｊ３Ｎ、４Ｌ６Ｑ、４Ｃ１Ａ、４Ｃ１Ｂ、４ＧＤＯ、４ＢＷＫ、４ＢＷＰ、４ＢＷＸ、４ＨＵ５、４ＨＵ６、４Ｌ９Ｕ、４Ｇ０Ｕ、４Ｇ０Ｖ、４Ｇ０Ｗ、４Ｌ３Ｉ、４Ｇ７９、４ＧＥＵ、４ＧＥＸ、４ＧＦＡ、４ＧＦＣ、４ＢＬ６、４ＪＭＲ、４ＪＮＨ、２ＹＭＹ、４ＨＡＮ、３ＶＭＹ、３ＶＭＺ、３ＶＮ０、４ＡＢＸ、３Ｗ０３、２ＬＷ９、４ＤＺＭ、４ＥＴＯ、３ＴＮＵ、３ＴＨＦ、４Ｅ８Ｕ、３ＶＭＸ、４Ｅ６１、３ＶＥＭ、３ＶＢＢ、４ＤＪＧ、３ＴＶ７、３ＳＴＱ、３Ｖ８Ｓ、３Ｑ８Ｔ、３Ｕ１Ｃ、３ＱＨ９、３ＡＺＤ、３ＯＮＸ、３ＯＫＱ、３ＱＸ３、３ＳＪＡ、３ＳＪＢ、３ＳＪＣ、２Ｌ２Ｌ、３ＱＦＬ、３ＱＫＴ、２ＸＶ５、２Ｙ３Ｗ、３Ｑ０Ｘ、３ＡＪＷ、３ＮＣＺ、３ＮＩ０、２ＸＵ６、３Ｍ９１、３ＮＭＤ、３ＬＬＬ、３ＬＸ７、３ＭＥ９、３ＭＥＵ、３ＭＥＶ、３ＡＢＨ、３ＡＣＯ、３ＩＡＯ、３ＨＬＳ、２ＷＭＭ、３Ａ６Ｍ、３Ａ７Ｏ、２ＷＶＲ、３ＩＣＸ、３ＩＤ５、３ＩＤ６、３ＨＮＷ、３Ｉ１Ｇ、２Ｋ６Ｓ、３ＧＨＧ、３Ｇ１Ｅ、２Ｗ６Ａ、２Ｖ５１、３ＥＲＲ、３Ｅ１Ｒ、２ＶＹ２、２ＺＲ２、２ＺＲ３、３ＣＬ３、３Ｄ９Ｖ、２Ｚ１７、２ＪＥＥ、３ＢＢＰ、３ＢＡＳ、３ＢＡＴ、２ＱＭ４、２Ｖ７１、２ＮＯ２、２ＰＯＮ、２Ｖ０Ｏ、２ＤＱ０、２ＤＱ３、２Ｑ２Ｆ、２ＮＲＮ、２Ｅ７Ｓ、２Ｈ９Ｖ、２ＦＸＭ、２ＨＪＤ、２ＧＺＤ、２ＧＺＨ、２ＦＶ４、２Ｆ２Ｕ、２ＥＵＬ、２ＥＳＭ、２ＥＴＫ、２ＥＴＲ、１ＺＸＡ、１ＹＩＢ、１ＹＩＧ、１ＸＳＸ、１ＲＦＹ、１Ｕ０Ｉ、１ＸＪＡ、１Ｔ３Ｊ、１Ｔ６Ｆ、１Ｒ７Ｊ、１ＵＩＩ、１ＰＬ５、１Ｓ１Ｃ、１Ｐ９Ｉ、１Ｒ４８、１ＵＲＵ、１ＯＶ９、１ＵＩＸ、１ＮＯ４、１ＮＹＨ、１ＭＶ４、１ＬＲ１、１Ｌ８Ｄ、１ＬＪ２、１ＫＱＬ、１ＧＸＫ、１ＧＸＬ、１ＧＫ６、１ＪＲ５、１ＧＭＪ、１ＪＡＤ、１ＪＣＨ、１ＪＢＧ、１ＪＴＨ、１ＪＹ２、１ＪＹ３、１ＩＣ２、１ＨＣＩ、１ＨＦ９、１ＨＢＷ、１ＦＸＫ、１Ｄ７Ｍ、１ＱＵＵ、１ＣＥ９、２Ａ９３、１ＢＭ９、１Ａ９３、１ＴＭＺ、２ＡＡＣ、１ＺＩＩ、１ＺＩＫ、１ＺＩＬ、２ＡＲＡ、２ＡＲＣ、１ＪＵＮ、１ＹＳＡ、２ＺＴＡ。ただし、２回回転対称性を有する二量体コイルドコイルは並行および逆平行コイルドコイルを選択するため、二量体構造のこのリストは、逆平行コイルドコイルも含有する。構造を目視で確認することによって、並行二量体コイルドコイルを逆平行二量体コイルドコイルと容易に区別することができる。
【００５０】
五量体、四量体、および二量体コイルドコイルのこれらのエントリーの一部は、付加されたタンパク質ドメインも含有するが、目視で確認することによって、これらの付加されたドメインを容易に検出でき、除去することができる。
【００５１】
別法として、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｃｏｉｌｅｄｃｏｉｌｓ．ｃｈｍ．ｂｒｉｓ．ａｃ．ｕｋ／ｃｃｐｌｕｓ／ｓｅａｒｃｈ／ｐｅｒｉｏｄｉｃ＿ｔａｂｌｅ／からは、二量体、三量体、四量体、および五量体（２ＧＵＶなどの）コイルドコイルだけでなく、（２ＥＢＯなどの）６ヘリックスバンドルなどのより複雑なコイルドコイル集合体も選択することができるコイルドコイル構造の周期表が得られる。
【００５２】
本明細書で使用される五量体、四量体、および二量体コイルドコイルドメインのアミノ酸改変もまた想定される。そのような改変は、例えば、位置ａａ（ｅ）、ａａ（ｇ）、ａａ（ｂ）、ａａ（ｃ）、またはａａ（ｆ）での、好ましくは位置ａａ（ｂ）、ａａ（ｃ）、またはａａ（ｆ）での、最も好ましくは位置ａａ（ｆ）における、オリゴマーの外側の非コア残基（ａａ（ａ）およびａａ（ｄ））であるアミノ酸の置換であってもよい。可能な改変は、これらのオリゴマーをより可溶型にする荷電残基への置換である。また、これらのドメインのより短いコンストラクトが想定される。
【００５３】
その他のアミノ酸改変は、例えば、オリゴマーを安定化する目的のための、すなわち、より好都合な残基によってより好都合でないコア残基を置換することによる、コア位置（ａａ（ａ）およびａａ（ｄ））のアミノ酸の置換であってもよく、すなわち、原則として、表１によるより低いコイルドコイル傾向を有するコア位置の残基がコイルドコイルのオリゴマー化状態を変えないならば、それらをより高いコイルドコイル傾向を有する残基で置換することができる。
【００５４】
本明細書で使用される「アミノ酸改変」という用語は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入、および／または欠失を含み、好ましくはアミノ酸置換である。本明細書において「アミノ酸置換」または「置換」とは、別のアミノ酸による、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の置換を意味する。例えば、置換Ｒ９４Ｋは、９４位のアルギニンがリジンで置換されている変異体ポリペプチドを指す。本明細書における目的のために、複数の置換は、典型的にはスラッシュで区分している。通常、１〜１５個の、好ましくは１〜１０個の、より好ましくは１〜５個の、更により好ましくは１〜４個の、特に１〜３個の、より具体的には１〜２個の、最も具体的には１個のアミノ酸が置換される。例えば、Ｒ９４Ｋ／Ｌ７８Ｖは、置換Ｒ９４ＫおよびＬ７８Ｖを含む二重変異体を指す。本明細書において使用される「アミノ酸挿入」または「挿入」とは、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の付加を意味する。例えば、挿入９４は、９４位での挿入を示す。本明細書において使用される「アミノ酸欠失」または「欠失」とは、親ポリペプチド配列における特定の位置でのアミノ酸の除去を意味する。例えば、Ｒ９４−は、９４位でのアルギニンの欠失を示す。
【００５５】
本明細書に記載のようなアミノ酸改変を含有するペプチドまたはタンパク質は、親（非改変の）ペプチドまたはタンパク質と、好ましくは少なくとも約８０％の、最も好ましくは少なくとも約９０％の、より好ましくは少なくとも約９５％の、特に９９％のアミノ酸配列同一性を持つこととなる。好ましくは、アミノ酸改変は、保存的改変である。
【００５６】
本明細書において使用している場合、「保存的改変」または「保存的配列改変」という用語は、アミノ酸配列の生物物理学的特性を有意に変更しないアミノ酸改変を指すことを意図する。改変は、部位特異的突然変異導入法およびＰＣＲ介在突然変異導入法などの当該技術分野で公知の標準技術によって、本発明のタンパク質の中へ導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分枝側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。
【００５７】
一実施形態において、オリゴマー化ドメインＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、コイルドコイルドメインである。好ましい実施形態において、オリゴマー化ドメインＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、二量体、四量体、または五量体ドメイン、より好ましくは四量体または五量体ドメインである。より好ましい実施形態において、オリゴマー化ドメインＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、４ＰＮ８、４ＰＮＤ、４ＷＢＡ、３Ｖ２Ｎ、３Ｖ２Ｐ、３Ｖ２Ｑ、３Ｖ２Ｒ、４ＥＥＢ、４ＥＥＤ、３ＭＩＷ、１ＭＺ９、１ＦＢＭ、１ＶＤＦ、２ＧＵＶ、２ＨＹＮ、１ＺＬＬ、１Ｔ８Ｚからなる群から選択される五量体コイルドコイルであるか、またはアミノ酸改変を含有し、かつ／または片方または両方の端が短縮された、ｐｄｂエントリー４ＰＮ８、４ＰＮＤ、４ＷＢＡ、３Ｖ２Ｎ、３Ｖ２Ｐ、３Ｖ２Ｑ、３Ｖ２Ｒ、４ＥＥＢ、４ＥＥＤ、３ＭＩＷ、１ＭＺ９、１ＦＢＭ、１ＶＤＦ、２ＧＵＶ、２ＨＹＮ、１ＺＬＬ、１Ｔ８Ｚからなる群から選択される五量体コイルドコイルであり、ここで、各五量体コイルドコイルは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリーナンバーによって示されている。更により好ましい実施形態において、オリゴマー化ドメインＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、配列番号４０で示される４ＰＮ８、配列番号４１で示される４ＰＮＤ、配列番号４２で示される４ＷＢＡ、配列番号４３で示される３Ｖ２Ｎ、配列番号４４で示される３Ｖ２Ｐ、配列番号４５で示される３Ｖ２Ｑ、配列番号４６で示される３Ｖ２Ｒ、配列番号４７で示される４ＥＥＢ、配列番号４８で示される４ＥＥＤ、配列番号４９で示される３ＭＩＷ、配列番号５０で示される１ＭＺ９、配列番号５１で示される１ＦＢＭ、配列番号５２で示される１ＶＤＦ、配列番号５３で示される２ＧＵＶ、配列番号５４で示される２ＨＹＮ、配列番号５５で示される１ＺＬＬ、配列番号５６で示される１Ｔ８Ｚからなる群から選択される五量体コイルドコイルであるか、またはアミノ酸改変を含有し、かつ／または片方または両方の端が短縮された、ｐｄｂエントリー、配列番号４０で示される４ＰＮ８、配列番号４１で示される４ＰＮＤ、配列番号４２で示される４ＷＢＡ、配列番号４３で示される３Ｖ２Ｎ、配列番号４４で示される３Ｖ２Ｐ、配列番号４５で示される３Ｖ２Ｑ、配列番号４６で示される３Ｖ２Ｒ、配列番号４７で示される４ＥＥＢ、配列番号４８で示される４ＥＥＤ、配列番号４９で示される３ＭＩＷ、配列番号５０で示される１ＭＺ９、配列番号５１で示される１ＦＢＭ、配列番号５２で示される１ＶＤＦ、配列番号５３で示される２ＧＵＶ、配列番号５４で示される２ＨＹＮ、配列番号５５で示される１ＺＬＬ、配列番号５６で示される１Ｔ８Ｚからなる群から選択される五量体コイルドコイルであり、ここで、各五量体コイルドコイルは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリーナンバーによって示されている。更により好ましいＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、トリプトファンジッパー五量体化ドメ��ン（ｐｄｂエントリー：１Ｔ８Ｚ）であるか、またはアミノ酸改変を含有し、かつ／または片方または両方の端が短縮されたトリプトファンジッパー五量体化ドメイン（ｐｄｂエントリー：１Ｔ８Ｚ）からなる群から選択される五量体コイルドコイルであり、特に配列番号３、配列番号８、または配列番号２６を含む五量体コイルドコイルである。更により好ましいＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、トリプトファンジッパー五量体化ドメイン（ｐｄｂエントリー：配列番号５６で示される１Ｔ８Ｚ）であるか、またはアミノ酸改変を含有し、かつ／または片方または両方の端が短縮されたトリプトファンジッパー五量体化ドメイン（ｐｄｂエントリー：配列番号５６で示される１Ｔ８Ｚ）からなる群から選択される五量体コイルドコイルであり、特に配列番号３、配列番号８、または配列番号２６）を含む五量体コイルドコイルである。
【００５８】
別のより好ましい実施形態において、オリゴマー化ドメインＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、５Ｄ６０、５Ｄ５Ｙ、５ＡＬ６、４ＷＢ４、４ＢＨＶ、４Ｃ５Ｑ、４ＧＪＷ、４Ｈ７Ｒ、４Ｈ８Ｆ、４ＢＸＴ、４ＬＴＯ、４ＬＴＰ、４ＬＴＱ、４ＬＴＲ、３ＺＤＯ、３ＲＱＡ、３Ｒ４Ａ、３Ｒ４Ｈ、３ＴＳＩ、３Ｋ４Ｔ、３Ｆ６Ｎ、２Ｏ６Ｎ、２ＯＶＣ、２Ｏ１Ｊ、２Ｏ１Ｋ、２ＡＧ３、２ＣＣＥ、１ＹＢＫ、１Ｕ９Ｆ、１Ｕ９Ｇ、１Ｕ９Ｈ、１ＵＳＤ、１ＵＳＥ、１ＵＮＴ、１ＵＮＵ、１ＵＮＶ、１ＵＮＷ、１ＵＮＸ、１ＵＮＹ、１ＵＮＺ、１ＵＯ０、１ＵＯ１、１ＵＯ２、１ＵＯ３、１ＵＯ４、１ＵＯ５、１Ｗ５Ｉ、１Ｗ５Ｌ、１ＦＥ６、１Ｇ１Ｉ、１Ｇ１Ｊ、１ＥＺＪ、１ＲＨ４、１ＧＣＬからなる群から選択される四量体コイルドコイルであるか、またはアミノ酸改変を含有し、かつ／または片方または両方の端が短縮された、ｐｄｂエントリー５Ｄ６０、５Ｄ５Ｙ、５ＡＬ６、４ＷＢ４、４ＢＨＶ、４Ｃ５Ｑ、４ＧＪＷ、４Ｈ７Ｒ、４Ｈ８Ｆ、４ＢＸＴ、４ＬＴＯ、４ＬＴＰ、４ＬＴＱ、４ＬＴＲ、３ＺＤＯ、３ＲＱＡ、３Ｒ４Ａ、３Ｒ４Ｈ、３ＴＳＩ、３Ｋ４Ｔ、３Ｆ６Ｎ、２Ｏ６Ｎ、２ＯＶＣ、２Ｏ１Ｊ、２Ｏ１Ｋ、２ＡＧ３、２ＣＣＥ、１ＹＢＫ、１Ｕ９Ｆ、１Ｕ９Ｇ、１Ｕ９Ｈ、１ＵＳＤ、１ＵＳＥ、１ＵＮＴ、１ＵＮＵ、１ＵＮＶ、１ＵＮＷ、１ＵＮＸ、１ＵＮＹ、１ＵＮＺ、１ＵＯ０、１ＵＯ１、１ＵＯ２、１ＵＯ３、１ＵＯ４、１ＵＯ５、１Ｗ５Ｉ、１Ｗ５Ｌ、１ＦＥ６、１Ｇ１Ｉ、１Ｇ１Ｊ、１ＥＺＪ、１ＲＨ４、１ＧＣＬからなる群から選択される四量体コイルドコイルであり、ここで、各四量体コイルドコイルは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリーナンバーによって示されている。
【００５９】
別のより好ましい実施形態において、オリゴマー化ドメインＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、配列番号３、配列番号１９、および配列番号２３を含むコイルドコイルの群から選択される。
【００６０】
最も好ましい実施形態において、四量体コイルドコイルは、テトラブラキオン由来であり、好ましくはテトラブラキオン（１ＦＥ６）由来またはアミノ酸改変を含有し、かつ／または片方または両方の端が短縮されたテトラブラキオン（１ＦＥ６）由来の四量体コイルドコイルであり、ここで、各テトラブラキオンは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリーナンバーによって示されており、特に、四量体コイルドコイルは、配列番号１９を含む四量体コイルドコイルである。
【００６１】
更に最も好ましい実施形態において、四量体コイルドコイルは、テトラブラキオン由来であり、好ましくはテトラブラキオン（配列番号５７で示される１ＦＥ６）由来またはアミノ酸改変を含有し、かつ／または片方または両方の端が短縮されたテトラブラキオン（配列番号５７で示される１ＦＥ６）由来の四量体コイルドコイルであり、ここで、各テトラブラキオンは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリーナンバーによって示されており、特に、四量体コイルドコイルは配列番号１９を含む四量体コイルドコイルである。
【００６２】
特異的コイルドコイル
最も好ましいのは、実施例に記載のコイルドコイル配列および単量体ビルディングブロックである。
【００６３】
ＳＨＢ
本明細書において使用されるＳＨＢペプチドまたはタンパク質は、通常、中心の三量体コイルドコイルの配列に束ねられている６つのヘリックスからなるバンドルを形成するペプチドまたはタンパク質を指す。本明細書において使用されるＳＨＢヘリックスは、通常は、他の５つのＳＨＢヘリックスと一緒に６ヘリックスバンドルを形成するヘリックスであるペプチドまたはタンパク質を指す。ＳＨＢヘリックスは、通常、アルファヘリックスである。通常、１つの本発明による単量体ビルディングブロックのドメインＳＨＢ１およびＳＨＢ２は、例えば図２Ｂ）、６Ｂ）、および１４Ｂ）に示したように、２つの更なる本発明による単量体ビルディングブロックのドメインＳＨＢ１およびＳＨＢ２と一緒に、６ヘリックスバンドルを形成する。
【００６４】
本明細書において使用されるＳＨＢは、通常、コイルドコイルタンパク質である。ＳＨＢタンパク質は、通常、中心の三量体コイルドコイルドメインに対して逆平行に走る３つの別のヘリックスと集合してＳＨＢを形成する、中心の三量体コイルドコイルドメインから構成される。アミノ酸配列によってこのコイルドコイルヘリックスを逆平行ヘリックスと接続させることによって、ＳＨＢの構造上にこの配列のループ構造が生じる。ＳＨＢのオリゴマー化状態は三量体であるため、したがって、三量体ループ形成タンパク質を使用してＳＨＢの２つのヘリックスを接続させることによって、三量体ループ形成タンパク質をそれらの天然コンフォメーションで安定化させることができる（図１）。
【００６５】
コイルドコイルＳＨＢは、２つのヘリックスが別々の鎖上にある場合、識別するものとして「化学量論はＡ３Ｂ３である」と、「バンドル」のテキスト検索を組み合わせて使用して、生物学的集合体における化学量論に関して検索することによって、ＲＣＳＢデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ／）から探し出すことができる。ＳＨＢを含有する好適なエントリーは、ＨＩＶ、ＲＳＶ、ＳＡＲＳ、およびパラミクソウイルス由来のＳＨＢを表す、４Ｉ２Ｌ、３Ｗ１９、３ＶＴＱ、３ＶＵ５、３ＶＵ６、３ＶＴＰ、３ＶＧＹ、３ＶＨ７、３ＶＧＸ、３ＶＩＥ、３ＲＲＲ、３ＲＲＴ、３ＫＰＥ、３Ｇ７Ａ、３Ｆ４Ｙ、３Ｆ５０、１ＺＶ８である。２つのヘリックスが同じタンパク質鎖の一部である場合、次いで、化学量論「Ａ３」または対称性は「Ｃ３回転」であることを選択しなければならない。「バンドル」および「６」のテキスト検索を組み合わせることによって、次の好適なｐｄｂエントリーのリストが得られる：４ＮＪＬ、４ＮＳＭ、４ＪＦ３、４ＪＧＳ、４ＪＰＲ、２ＯＴ５、３ＣＰ１、３ＣＹＯ、２ＩＥＱ、１ＪＰＸ、１ＪＱ０、１Ｋ３３、１Ｋ３４。
【００６６】
ＳＨＢタンパク質のデノボ設計もまた記載されている（Ｂｏｙｋｅｎ、Ｓ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０１６年、３５２（６２８６）：６８０〜６８７頁）。これらの構造のためのｐｄｂエントリーは、５Ｊ０Ｊ、５Ｊ０Ｉ、５Ｊ０Ｈ、５ＩＺＳ、５Ｊ７３、５Ｊ２Ｌ、５Ｊ０Ｌ、５Ｊ０Ｋ、５Ｊ１０である。
【００６７】
本明細書で使用されるＳＨＢのアミノ酸改変もまた想定される。そのような改変は、例えば、位置ａａ（ｅ）、ａａ（ｇ）、ａａ（ｂ）、ａａ（ｃ）、またはａａ（ｆ）での、好ましくは位置ａａ（ｂ）、ａａ（ｃ）、またはａａ（ｆ）での、最も好ましくは位置ａａ（ｆ）における、コア三量体の外側の非コア残基（ａａ（ａ）およびａａ（ｄ））であるアミノ酸の置換であってもよい。他の残基は、逆平行ヘリックスの表面露出残基である。ただし、これらの改変は、ＳＨＢ１のＳＨＢ２と６ヘリックスバンドル複合体を形成する能力を妨害してはいけない。可能な改変は、ＳＨＢをより可溶型にする荷電残基への置換である。これらのドメインのより短いコンストラクトもまた本発明に含まれる。これらのドメインのより短いコンストラクトは、通常、中心のコイルドコイルドメイン中に少なくとも３つの７アミノ酸繰り返し（すなわち、少なくとも２１個のアミノ酸）を含み、理論によって束縛されるものではないが、ＳＨＢ１とＳＨＢ２との相互作用は、通常、十分に特異的である、少なくとも６つのヘリックスターン、すなわち中心の三量体コイルドコイルの３つの７アミノ酸繰り返しに相当するヘリックスターンを必要とする。より好ましくは、中心のコイルドコイルドメインは、少なくとも４７アミノ酸繰り返し長である。その他の改変は、コア三量体を安定化する目的のための、すなわち、より好都合な残基でより好都合でないコア残基を置換することによる、コア位置（ａａ（ａ）およびａａ（ｄ））のアミノ酸の置換であってもよく、すなわち、原則として、表１によるより低いコイルドコイル傾向を有するコア位置の残基がコイルドコイルのオリゴマー化状態を変えないならば、これらをより高いコイルドコイル傾向を有する残基で置換することができる。実施例５）において、改変Ｔ５６０Ｖは、ａａ（ｄ）位置のスレオニンをバリンと置換し、したがって、コア位置ａａ（ｄ）で、−１．２のコイルドコイル傾向を有するスレオニンを１．１のより高い傾向を有するバリンで置換する。同様に、Ｔ５６４Ｖは、ａａ（ａ）位置のスレオニンをバリンと置換し、したがって、コア位置ａａ（ａ）で、０．２のコイルドコイル傾向を有するスレオニンを４．１のはるかに高い傾向を有するバリンで置換する。
【００６８】
好ましい実施形態において、ドメインＳＨＢ１および／またはＳＨＢ２は、４Ｉ２Ｌ、３Ｗ１９、３ＶＴＱ、３ＶＵ５、３ＶＵ６、３ＶＴＰ、３ＶＧＹ、３ＶＨ７、３ＶＧＸ、３ＶＩＥ、３ＲＲＲ、３ＲＲＴ、３ＫＰＥ、３Ｇ７Ａ、３Ｆ４Ｙ、３Ｆ５０、１ＺＶ８、４ＮＪＬ、４ＮＳＭ、４ＪＦ３、４ＪＧＳ、４ＪＰＲ、２ＯＴ５、３ＣＰ１、３ＣＹＯ、２ＩＥＱ、１ＪＰＸ、１ＪＱ０、１Ｋ３３、１Ｋ３４、５Ｊ０Ｊ、５Ｊ０Ｉ、５Ｊ０Ｈ、５ＩＺＳ、５Ｊ７３、５Ｊ２Ｌ、５Ｊ０Ｌ、５Ｊ０Ｋ、および５Ｊ１０からなる群からそれぞれ独立に選択されるか、またはアミノ酸改変を含有し、かつ／または片方または両方の端が短縮された、４Ｉ２Ｌ、３Ｗ１９、３ＶＴＱ、３ＶＵ５、３ＶＵ６、３ＶＴＰ、３ＶＧＹ、３ＶＨ７、３ＶＧＸ、３ＶＩＥ、３ＲＲＲ、３ＲＲＴ、３ＫＰＥ、３Ｇ７Ａ、３Ｆ４Ｙ、３Ｆ５０、１ＺＶ８、４ＮＪＬ、４ＮＳＭ、４ＪＦ３、４ＪＧＳ、４ＪＰＲ、２ＯＴ５、３ＣＰ１、３ＣＹＯ、２ＩＥＱ、１ＪＰＸ、１ＪＱ０、１Ｋ３３、１Ｋ３４、５Ｊ０Ｊ、５Ｊ０Ｉ、５Ｊ０Ｈ、５ＩＺＳ、５Ｊ７３、５Ｊ２Ｌ、５Ｊ０Ｌ、５Ｊ０Ｋ、および５Ｊ１０からなる群からから独立に選択され、ここで、各ＳＨＢは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリーナンバーによって示されている。
【００６９】
更に好ましい実施形態において、ドメインＳＨＢ１および／またはＳＨＢ２は、配列番号５８で示される４Ｉ２Ｌ、配列番号５９で示される３Ｗ１９、配列番号６０で示される３ＶＴＱ、配列番号６１で示される３ＶＵ５、配列番号６２で示される３ＶＵ６、配列番号６３で示される３ＶＴＰ、配列番号６４で示される３ＶＧＹ、配列番号６５で示される３ＶＨ７、配列番号６６で示される３ＶＧＸ、配列番号６７で示される３ＶＩＥ、配列番号６８で示される３ＲＲＲ、配列番号６９で示される３ＲＲＴ、配列番号７０で示される３ＫＰＥ、配列番号７１で示される３Ｇ７Ａ、配列番号７２で示される３Ｆ４Ｙ、配列番号７３で示される３Ｆ５０、配列番号７４で示される１ＺＶ８、配列番号７５で示される４ＮＪＬ配列番号７６で示される４ＮＳＭ、配列番号７７で示される４ＪＦ３、配列番号７８で示される４ＪＧＳ、配列番号７９で示される４ＪＰＲ、配列番号８０で示される２ＯＴ５、配列番号８１で示される３ＣＰ１、配列番号８２で示される３ＣＹＯ、配列番号８３で示される２ＩＥＱ、配列番号８４で示される１ＪＰＸ、配列番号８５で示される１ＪＱ０、配列番号８６で示される１Ｋ３３、配列番号８７で示される１Ｋ３４、配列番号８８で示される５Ｊ０Ｊ、配列番号８９で示される５Ｊ０Ｉ、配列番号９０で示される５Ｊ０Ｈ、配列番号９１で示される５ＩＺＳ、配列番号９２で示される５Ｊ７３、配列番号９３で示される５Ｊ２Ｌ、配列番号９４で示される５Ｊ０Ｌ、配列番号９５で示される５Ｊ０Ｋ、および配列番号９６で示される５Ｊ１０からなる群からそれぞれ独立に選択されるか、またはアミノ酸改変を含有し、かつ／または片方または両方の端が短縮された、配列番号５８で示される４Ｉ２Ｌ、配列番号５９で示される３Ｗ１９、配列番号６０で示される３ＶＴＱ、配列番号６１で示される３ＶＵ５、配列番号６２で示される３ＶＵ６、配列番号６３で示される３ＶＴＰ、配列番号６４で示される３ＶＧＹ、配列番号６５で示される３ＶＨ７、配列番号６６で示される３ＶＧＸ、配列番号６７で示される３ＶＩＥ、配列番号６８で示される３ＲＲＲ、配列番号６９で示される３ＲＲＴ、配列番号７０で示される３ＫＰＥ、配列番号７１で示される３Ｇ７Ａ、配列番号７２で示される３Ｆ４Ｙ、配列番号７３で示される３Ｆ５０、配列番号７４で示される１ＺＶ８、配列番号７５で示される４ＮＪＬ、配列番号７６で示される４ＮＳＭ、配列番号７７で示される４ＪＦ３、配列番号７８で示される４ＪＧＳ、配列番号７９で示される４ＪＰＲ、配列番号８０で示される２ＯＴ５、配列番号８１で示される３ＣＰ１、配列番号８２で示される３ＣＹＯ、配列番号８３で示される２ＩＥＱ、配列番号８４で示される１ＪＰＸ、配列番号８５で示される１ＪＱ０、配列番号８６で示される１Ｋ３３、配列番号８７で示される１Ｋ３４、配列番号８８で示される５Ｊ０Ｊ、配列番号８９で示される５Ｊ０Ｉ、配列番号９０で示される５Ｊ０Ｈ、配列番号９１で示される５ＩＺＳ、配列番号９２で示される５Ｊ７３、配列番号９３で示される５Ｊ２Ｌ、配列番号９４で示される５Ｊ０Ｌ、配列番号９５で示される５Ｊ０Ｋ、および配列番号９６で示される５Ｊ１０からなる群から独立に選択され、ここで、各ＳＨＢは、ＲＣＳＢタンパク質データバンク（ＲＣＳＢ  ＰＤＢ）のｐｄｂエントリーナンバーによって示されている。
【００７０】
より好ましい実施形態において、ＳＨＢ１および／またはＳＨＢ２は、配列番号５、配列番号７、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、および配列番号３５からなる群から選択されるペプチドである。
【００７１】
ドメインＢ
ドメインＢは、ループ領域を含むペプチドまたはタンパク質である。通常、ドメインＢは、ループ領域を含むペプチドまたはタンパク質であり、このドメインは抗原を含む。本発明のドメインＢに含まれる抗原は、Ｂ細胞エピトープおよび／またはＴ細胞エピトープのどちらでもよく、（ａ）がん細胞に対する免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチド；（ｂ）感染性疾患に対する免疫応答を誘導するタンパク質、ペプチド、または炭水化物；（ｃ）アレルゲンに対する免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチド；および（ｄ）ヒト疾患の治療のための免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチドホルモンからなる群から選択される。そのようなタンパク質またはそれらのペプチド断片を含むＳＡＰＮは、ヒトにおいて、または家畜および愛玩動物でさえも免疫応答を誘導することに好適でありうる。ドメインＢに含まれる特に有用な抗原は、がん細胞に対する免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチド、感染性疾患に対する免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチド、アレルゲンに対する免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチド、ヒト疾患の治療のために免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチドである。
【００７２】
最も好ましくは、本発明のドメインＢに含まれ、ＳＡＰＮ上のループコンフォメーション中で提示される抗原は、エンベロープウイルスの三量体表面糖タンパク質からなる群から選択される。ウイルスについては、多様な分類スキームがある。典型的には、ウイルス性膜融合因子は、３つの異なるクラスの１つに属する（Ｐｏｄｂｉｌｅｗｉｃｚ、Ｂ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ．２０１４年、３０：１１１〜１３９頁）。特に対象となるクラスはクラスＩであり、その周知のメンバーとしては、表面タンパク質ＨＡを有するインフルエンザがある。このクラスＩには、少し例を挙げただけでもパラミクソウイルス、フィロウイルス、レトロウイルス、およびコロナウイルスなどの実に様々な科のウイルス由来の膜融合因子が含まれる。クラスＩ膜融合因子の注目の構造的特徴は、三重ヘリックスの融合前糖タンパク質であり、これは、６ヘリックスバンドルの中へ再配置して、いわゆる融合後コンフォメーションを形成する。それらの三量体表面糖タンパク質を有する対象となる最も重要なウイルス種には、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス（ＨＡ、実施例５を参照されたい）、ＨＩＶ（ｇｐ１６０、実施例１２を参照されたい）、エボラ（ＧＰ）、マールブルグ（ＧＰ）、ＲＳＶ（Ｆタンパク質）、ＣＭＶ（ｇＢタンパク質、実施例１を参照されたい）、ＨＳＶ（ｇＢタンパク質）、ＳＡＲＳ（Ｓタンパク質）、およびＭＥＲＳ（Ｓタンパク質）が含まれる。これらの表面糖タンパク質の断片もまた、ループ形成タンパク質として三量体オリゴマー化状態において提示することができる（実施例１および実施例１２を参照されたい）。
【００７３】
特に対象となるのは、そのような三量体ループ構造を提示する、多くのエンベロープウイルスの表面タンパク質などの、三量体を形成するループ構造化タンパク質である。例としては、インフルエンザＨＡ、ＣＭＶのｇＢタンパク質、ＲＳＶのＦタンパク質、ＨＩＶのｇｐ１６０など多数が挙げられる。これらの三量体エンベロープウイルスの表面タンパク質は、本発明のナノ粒子のＳＨＢのヘリックス−ループ−ヘリックスモチーフ上でそれを操作することによって安定化することができる準安定な膜融合前状態にある。別法として、足場としてＳＨＢを使用して、三量体タンパク質の下部構造を三量体コンフォメーションの中に結合させることができる。下部構造のある一例を、実施例１２に、ＨＩＶのｇｐ１６０の突起のＶ１Ｖ２ループ構造の形態で示す。また、単純なループ構造は、特定の三量体コンフォメーションを形成する必要性および重要性がなく、単にループ構造中に拘束してＳＨＢ−ＳＡＰＮ上のループとして提示することができる。したがって、好ましい実施形態において、ドメインＢは、三量体ループ構造を有する。
【００７４】
別の好ましい実施形態において、ドメインＢは、がん細胞に対する免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチド、感染性疾患に対する免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチド、アレルゲンに対する免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチド、ヒト疾患の治療のために免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチドから選択される。より好ましくは、Ｂは、がん細胞に対する免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチド、アレルゲンに対する免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチド、ヒト疾患の治療のための免疫応答を誘導するタンパク質またはペプチドから選択され、特に、Ｂは、がん細胞に対する免疫応答を誘導するタンパク質もしくはペプチドおよび／またはアレルゲンに対する免疫応答を誘導するタンパク質もしくはペプチドから選択される。
【００７５】
別の好ましい実施形態において、ドメインＢは、クラスＩのエンベロープウイルスの三量体表面糖タンパク質の群から選択される。
【００７６】
別の好ましい実施形態において、ドメインＢは、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス（ＨＡ）、ＨＩＶ（ｇｐ１６０）、エボラ（ＧＰ）、マールブルグ（ＧＰ）、ＲＳＶ（Ｆタンパク質）、ＣＭＶ（ｇＢタンパク質）、ＨＳＶ（ｇＢタンパク質）、ＳＡＲＳ（Ｓタンパク質）、ならびにＭＥＲＳ（Ｓタンパク質）の三量体表面糖タンパク質からなる群から選択される。
【００７７】
別の好ましい実施形態において、ドメインＢは、インフルエンザＨＡ、ＣＭＶのｇＢタンパク質、ＲＳＶのＦタンパク質、ＨＩＶのｇｐ１６０、およびｐｄｂエントリー４ＴＶＰを有するタンパク質からなる群から選択され、またはインフルエンザＨＡ、ＣＭＶのｇＢタンパク質、ＲＳＶのＦタンパク質、ＨＩＶのｇｐ１６０、およびアミノ酸改変を含有し、かつ／または片方または両方の端が短縮されたｐｄｂコード４ＴＶＰを有するタンパク質からなる群から選択される。特に、好ましくは、ドメインＢは、インフルエンザＨＡ、ＣＭＶのｇＢタンパク質、ＨＩＶのｇｐ１６０、およびｐｄｂエントリー４ＴＶＰを有するタンパク質からなる群から選択され、またはインフルエンザＨＡ、ＣＭＶのｇＢタンパク質、ＨＩＶのｇｐ１６０、およびアミノ酸改変を含有し、かつ／または片方または両方の端が短縮されたｐｄｂコード４ＴＶＰを有するタンパク質からなる群から選択される（実施例１２）。別の好ましい実施形態において、ドメインＢは、配列番号６、配列番号１８、および配列番号２９を含むタンパク質からなる群から選択される。
【００７８】
ループ領域は、通常、あるループのＮ末端とＣ末端とが近傍にあるため、これらをやはり近傍にあるＳＨＢの２つのヘリックス上へと操作することができるタンパク質である。リンカーＬ２およびＬ３によってループ構造が結合された、２つのヘリックスの具体的なアミノ酸位置によって、付着点の間の距離はある程度異なる。ＲＳＶ由来の６ヘリックスバンドル（ｐｄｂ−コード５Ｊ３Ｄ）にでは、ペプチド鎖のＣα位間の短いほうの距離は（ヘリックス−ヘリックス接触面で）約５Åであるのに対し、長いほうの距離は（ヘリックスの反対側で）約１５Åである。ＨＩＶ由来の６ヘリックスバンドル（ｐｄｂ−コード３Ｇ７Ａ）では、ペプチド鎖のＣａ位間の距離は、短いほうの距離および長いほうの距離はそれぞれ、５．５Åから約１５Åの間の値にきわめて等しい。最長距離までリンカーＬ２およびＬ３の長さを足すことによって、Ｂの両端が互いに離れうる最大距離が得られる。ＨＡでは、ｐｄｂ−コード３ＳＭ５の結晶構造におけるＮ末端とＣ末端との間の距離は１５．８Å（実施例５〜９）であるのに対し、実施例１２のＶ１Ｖ２ループでは、ｐｄｂ−コード４ＴＶＰの結晶構造におけるＮ末端とＣ末端との間の距離は１３．１Åである。好ましい実施形態において、ループ領域は、通常、結晶構造におけるＮ末端とＣ末端との間の距離が約３Åから約２０Åの間、好ましくは約５Åから約１７Åの間であるタンパク質である。
【００７９】
好ましい実施形態において、ＢのＮ末端かＣ末端のどちらかは、Ｂが、実施例１２のｇｐ１６０のＶ１Ｖ２ループでのような連続するα−ヘリックスによってＳＨＢ１またはＳＨＢ２に結合することができるようなα−ヘリックスコンフォメーションの中にある（図１４）。
【００８０】
ドメインＢが単純なβ−ターンである場合は、次いで、Ｎ末端とＣ末端の間の距離は約４．５Åである。ドメインＢとして使用することができる典型的なβ−ターン構造は、ＨＩＶ  ｇｐ１６０のＶ３ループである。ｐｄｂ−コード４ＴＶＰの結晶構造における可能なＮ末端とＣ末端の間の距離は、ＨＩＶ  ｇｐ１６０のＶ３ループでは、４．６Å（残基３０６〜３１８）、６．７Å（残基３００〜３２６）、または４．２Å（残基２９６〜３３１）である。好ましい実施形態において、ドメインＢは単純なβ−ターンであり、可能なＮ末端とＣ末端の間の距離は、約３Åから約８Åの間、好ましくは約４Åから約７Åの間である。
【００８１】
リンカー
リンカー鎖Ｌ１、Ｌ２、またはＬ３は、単一ペプチド結合またはペプチド鎖、好ましくは、１〜５０個のアミノ酸からなるペプチド鎖または単一ペプチド結合、より好ましくは１〜３０個のアミノ酸からなるペプチド鎖または単一ペプチド結合、更により好ましくは１〜２０個のアミノ酸からなるペプチド鎖または単一ペプチド結合、最も好ましくは１〜１５個のアミノ酸からなるペプチド鎖または単一ペプチド結合から構成される。
【００８２】
好ましい実施形態において、リンカー鎖Ｌ１、Ｌ２、またはＬ３は、ペプチド結合、ＡＡＡ、ＧＳ、ＧＧ、配列番号４、配列番号１、配列番号１５、配列番号２０、および配列番号２７からなる群から選択される。好ましくは、リンカーＬ１は、ＳＨＢ１ドメインに接続するα−ヘリックスセグメントを含有し、より好ましくは、後続のＳＨＢ１ドメインと適切な位置に配置されたコイルドコイル配列を含有する。ＳＨＢ１ドメインがＳＨＢの中心の三量体コイルドコイルである場合、Ｌ１のこのα−ヘリックスセグメントは、好ましくはコイルドコイル配列の一部である。例えば、実施例１の配列Ｌ１では、部分ＥＬＹＳＲＬＡＥＩＥ（配列番号３６）は、後続のＳＨＢ１ドメインと適切な位置に配置されたコイルドコイルである。同様に、実施例５のＬ１の残基１〜８は、上記のＳＨＢ１ドメインと適切な位置に配置されたコイルドコイル域を表す。再度、実施例１２のＬ１の残基４〜１４は、後続のＳＨＢ１ドメインと適切な位置に配置されたコイルドコイル配列を含有する。
【００８３】
自己集合タンパク質ナノ粒子：ＬＣＭ単位
ＳＡＰＮは、式（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）および／または式（ＩＩａ）もしくは（ＩＩｂ）の単量体ビルディングブロックから形成される。そのようなビルディングブロックが集合すると、それらはいわゆる「ＬＣＭ単位」を形成する。そのようなＬＣＭ単位へと集合する単量体ビルディングブロックの数は、最小公倍数（ＬＣＭ）によって定義される。したがって、例えば、単量体ビルディングブロックのオリゴマー化ドメインが五量体（ＮＤ１）５（ｍ＝５）および三量体ＳＨＢを形成する場合、１５個の単量体がＬＣＭ単位を形成することとなる。リンカーセグメントＬ２が適切な長さを有する場合、このＬＣＭ単位は球状のタンパク質ナノ粒子の形態で集合することができる。ＳＡＰＮは、１つのみまたは複数のＬＣＭ単位の集合体によって形成することができる（表２）。そのようなＳＡＰＮは、位相幾何学的に閉じた構造を表す。
【００８４】
正多面体
四面体、立方体、八面体、十二面体、および二十面体の５種類の正多面体が存在する。これらは、異なる内部回転対称要素を有する。四面体は２回および２つの３回軸を有し、立方体および八面体は２回、３回、および４回回転対称軸を有し、十二面体および二十面体は２回、３回、および５回回転対称軸を有する。立方体では、これらの軸の空間配向は八面体と正確に同じであり、十二面体および二十面体でも、互いに対してこれらの軸の空間配向は正確に同じである。したがって、本発明のＳＡＰＮの目的のために、十二面体および二十面体は同一であるとみなすことができる。十二面体／二十面体は、６０個の同一の３次元のビルディングブロックから組み立てられている（表２）。これらのビルディングブロックは、多面体の非対称単位（ＡＵ）である。これらは角錐であり、角錐の稜は回転対称軸のうちの１つに対応し、したがって、これらのＡＵは、それらの稜に２回、３回、および５回対称要素を保有することとなる。これらの対称要素がタンパク質オリゴマー化ドメインから生成される場合、そのようなＡＵは、上記のような単量体ビルディングブロックから構築される。２つのオリゴマー化ドメインＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２、ならびにＳＨＢ１／２を、ＡＵの２つの対称軸に沿って整列させるだけでよい。ＳＨＢ１およびＳＨＢ２によって形成されたＳＨＢは、必ず三量体対称性を有する。ＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２は、五量体、四量体、または二量体であってもよい。これらの２つのオリゴマー化ドメインが安定なオリゴマーを形成する場合、第３の対称軸に沿った対称接触面が自動的に生じ、それは、この接触面に沿った相互作用、例えば疎水性、親水性、もしくはイオン性相互作用、またはジスルフィド架橋などの共有結合を最適化することによって安定化させることができる。
【００８５】
正多面体対称性を有する自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）への集合
規則的形状（十二面体、二十面体、八面体、立方体、および四面体）を有する自己集合タンパク質ナノ粒子（ＳＡＰＮ）を生成するために、複数のＬＣＭ単位が必要である。例えば、三量体および五量体オリゴマー化ドメインを含有する単量体から二十面体を形成するには、それぞれ１５個の単量体ビルディングブロックから構成される４つのＬＣＭ単位が必要であり、すなわち、規則的形状を有するタンパク質ナノ粒子は、６０個の単量体ビルディングブロックから構成されることとなる。２つのオリゴマー化ドメインのオリゴマー化状態の組合せが必要であり、対応する多面体を形成するためのＬＣＭ単位の数を表２に列記する。
2020514382.tif 000004
【００８６】
ＬＣＭ単位が更に集合して複数のＬＣＭ単位から構成される正多面体を形成するかどうかは、２つのオリゴマー化ドメインＮＤ１および／またはＮＤ２、好ましくはＮＤ１およびＮＤ２、ならびにＳＨＢ１／２の相互の幾何学的整列に、特に、２つのオリゴマー化ドメインの回転対称軸間の角度に依存する。これは、主として、ｉ）ナノ粒子における隣接するドメイン間の相互作用、ｉｉ）リンカーセグメントＬ２の長さ、ｉｉｉ）個々のオリゴマー化ドメインの形状、によって決定される。この角度は、正多面体における配置と比べ、ＬＣＭ単位のほうが大きい。またこの角度は、正多面体とは対照的に、単量体ビルディングブロックでは同一ではない。
【００８７】
２つのオリゴマー化ドメイン間の角度が十分に小さい（二十面体対称性を有する正多面体よりも小さい）場合、次いで、多数（数百）のタンパク質鎖が、タンパク質ナノ粒子の中へと集合することができる。三量体五量体構造を有するＳＡＰＮの生物物理学的および数理的解析が、最近、発表されている（Ｉｎｄｅｌｉｃａｔｏ，Ｇ．ら、Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ２０１６年、１１０（３）：６４６〜６６０頁）。
【００８８】
更なる態様において、本発明は、上記で定義したような式（Ｉａ）もしくは（Ｉｂ）または式（ＩＩａ）もしくは（ＩＩｂ）の単量体ビルディングブロックに関する。
【００８９】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載したようなタンパク質ナノ粒子を含む組成物に関する。そのような組成物は、特にワクチンとして好適である。好ましいワクチン組成物は、緩衝水溶液中にタンパク質ナノ粒子を含み、更に、例えば、賦形剤由来の糖（グリセロール、トレハロース、スクロースなど）、または賦形剤由来のアミノ酸（アルギニン、プロリン、グルタミン酸など）、または陰イオン性、陽イオン性、非イオン性、もしくは双性イオン性界面活性剤（コレート、デオキシコレート、ツイーンなど）、または溶液のイオン強度を調整する任意の種類の塩（ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２など）を含んでいてもよい。
【００９０】
別の態様において、本発明は、そのようなワクチン接種を必要とする対象に有効量の上述のようなタンパク質ナノ粒子を投与することを含む、ヒトまたは非ヒト動物にワクチン接種する方法に関する。
【００９１】
本発明はまた、そのようなワクチン接種を必要とする対象に有効量の上述のようなタンパク質ナノ粒子を投与することを含むヒトまたは非ヒト動物にワクチン接種する方法において使用される、上述のようなタンパク質ナノ粒子に関する。
【００９２】
本発明はまた、そのようなワクチン接種を必要とする対象に有効量の上述のようなタンパク質ナノ粒子を投与することを含むヒトまたは非ヒト動物にワクチン接種するための医薬の製造のための、上述のようなタンパク質ナノ粒子の使用に関する。
【００９３】
ＳＨＢ−ＳＡＰＮの設計（ＳＨＢを有する自己集合タンパク質ナノ粒子）
本発明によるＳＨＢ−ＳＡＰＮの具体的な一例は、配列
ＭＧＨＨＨＨＨＨＫＲＧＳＷＲＥＷＮＡＫＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＹＷＴＬＴＷＲＹＧＥＬＹＳＲＬＡＥＩＥＴＬＬＲＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＶＶＫＲＱＱＥＭＬＲＬＶＶＷＧＴＫＮＬＱＡＲＶＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＲＳＥＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＤＧＧＥＧＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＶＣＴＧＴＤＥＤＫＱＥＷＥＨＫＩＲＦＬＥＡＮＩＳＥＳＬＥＱＡＱＩＱＱＥＫＮＭＹＥＬＱＫＬ（配列番号１）
を有する式（Ｉａ）に一致する以下のコンストラクト「ＨＣ＿ＡＤ１」である。
【００９４】
これは、以下の部分構造から構成されるコンストラクトである。
Ｘ１：ＭＧＨＨＨＨＨＨＫＲＧＳ（配列番号２）
ＮＤ１：ＷＲＥＷＮＡＫＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＹＷＴＬＴＷ（配列番号３）
Ｌ１：ＲＹＧＥＬＹＳＲＬＡＥＩＥ（配列番号４）
ＳＨＢ１：ＴＬＬＲＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＶＶＫＲＱＱＥＭＬＲＬＶＶＷＧＴＫＮＬＱＡＲＶ（配列番号５）
Ｌ２：ペプチド結合
Ｂ：ＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳ  ＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＲＳＥＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＤＧＧＥＧＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＶＣＴ（配列番号６）
Ｌ３：ＧＴＤＥＤＫ（配列番号１５）
ＳＨＢ２：ＱＥＷＥＨＫＩＲＦＬＥＡＮＩＳＥＳＬＥＱＡＱＩＱＱＥＫＮＭＹＥＬＱＫＬ（配列番号７）
Ｙ１：存在しない
【００９５】
精製しやすいように、ＨＣ＿ＡＤ１ｇは、ニッケルアフィニティ精製のためのＨｉｓ−タグ、およびＤＮＡレベルで更なるサブクローニングのための制限部位（ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩ）を含有する、式（Ｉａ）または（Ｉｂ）において定義したような配列Ｘ１から始まる。
ＭＧＨＨＨＨＨＨＫＲＧＳ（配列番号２）
【００９６】
ＮＤ１には、五量体化ドメインを選択した（ｍ＝５）。具体的な五量体コイルドコイルは、ｐｄｂエントリー１Ｔ８Ｚを有するトリプトファンジッパー五量体化ドメインの新規改変体である（Ｌｉｕ，Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００４年、１０１（４６）：１６１５６〜１６１６１頁）。
【００９７】
本来のトリプトファンジッパー五量体化ドメインは、配列
ＳＳＮＡＫＷＤＱＷＳＳＤＷＱＴＷＮＡＫＷＤＱＷＳＮＤＷＮＡＷＲＳＤＷＱＡＷＫＤＤＷＡＲＷＮＱＲＷＤＮＷＡＴ（配列番号８）
を有する。
【００９８】
ＨＣ＿ＡＤ１ｇのために使用される五量体化ドメインの改変されたコイルドコイル配列は、１３位から始まり、４９位で終了し、Ｃ末端での配列変異（ＮＱＲＷに代わってＴＬＴＷ）と、溶解度の目的のためにコイルドコイルの非コア位置での幾つかの電荷改変とを含有するが、本来の配列（配列番号８）のようにコア位置でのトリプトファン残基の７アミノ酸繰り返しパターンを保持している。
１３−ＷＲＥＷＮＡＫＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＹＷＴＬＴＷ−４８（配列番号３）
【００９９】
次いで、この配列を、短いリンカーＬ１  ＲＹＧＥＬＹＳＲＬＡＥＩＥ（配列番号４）によって延長し、次いで、ＨＩＶのｇｐ４１由来のＳＨＢ  ＳＨＢ１の第１のヘリックスと接続する。Ｌ１は、ナノ粒子の五量体部分と三量体部分との間に柔軟な残基Ｇ（グリシン）を含有し、以下の配列を有するＨＩＶのＳＨＢ中へと導くコイルドコイル域ＥＬＹＳＲＬＡＥＩＥ（配列番号３６）が続く。
ＴＬＬＲＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＶＶＫＲＱＱＥＭＬＲＬＶＶＷＧＴＫＮＬＱＡＲＶ（配列番号５）
【０１００】
このＳＨＢ１配列は、ＳＨＢのコアコイルドコイル三量体を更に安定化させる２つの点突然変異Ｆ５３６ＬおよびＴ５６０Ｖを有する配列
５３４−ＴＬＦＲＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＶＶＫＲＱＱＥＭＬＲＬＴＶＷＧＴＫＮＬＱＡＲＶ−５７１（配列番号９）
を有するＨＩＶ  ｇｐ４１タンパク質Ｐ１２４４９．１の残基５３４〜５７１に一致する。ＨＩＶのエンベロープ糖タンパク質（Ｐ１２４４９．１）内のＳＨＢの２つのヘリックスは、以下の配列（太字）を有する。
2020514382.tif 000005
【０１０１】
このＳＨＢ１の後に、次いで、隣のアミノ酸である配列
ＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＲＳＥＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＤＧＧＥＧＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＶＣＴ（配列番号６）
を有するループ形成タンパク質Ｂのアラニンに結合したペプチドが続く。
【０１０２】
このループ形成タンパク質Ｂは、幾分より複雑である。これは、ＡＤ１ドメインを有するＣＭＶのｇＢタンパク質の突起を含有する。残基５０４〜６３８（ＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＮＳＳＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤ（配列番号１１））は、ペプチド列ＤＧＧＥＧ（配列番号１３）によって、残基９０〜１１２（ＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＶＣＴ（配列番号１２））に連結される。これによって、ａｇＢタンパク質の突起領域の連続するループ形成タンパク質ドメイン（図２Ａ）が生成され、これは、次いで、ＳＨＢによって三量体コンフォメーションへまとめられる（図２Ｂ）。ループ形成タンパク質Ｂはまた、自身をより可溶型にする２つの点突然変異Ｎ５８７ＲおよびＳ５８９Ｅを含有する。完全長ｇＢタンパク質の配列は、
2020514382.tif 000006
である。
【０１０３】
このＢドメインは、次いで、配列ＧＴＤＥＤＫ（配列番号１５）を有するペプチドリンカーＬ３が続いて以下の配列のＨＩＶのｇｐ４１由来のＳＨＢ  ＳＨＢ２の第２のヘリックスと連結される。
ＱＥＷＥＨＫＩＲＦＬＥＡＮＩＳＥＳＬＥＱＡＱＩＱＱＥＫＮＭＹＥＬＱＫＬ（配列番号７）
【０１０４】
これは、ＨＩＶ  ｇｐ４１タンパク質Ｐ１２４４９．１の残基６１６〜６５０（配列番号１０）に一致する。最後に、式（Ｉａ）の断片Ｙ１は、このコンストラクトＨＣ＿ＡＤ１ｇでは存在しない。
【０１０５】
図２に、ＨＣ＿ＡＤ１ｇ単量体のモデルを、その単量体、三量体、およびＴ＝１の正二十面体様対称性と仮定する二十面体の形態で示す。ＨＣ＿ＡＤ１ｇのＥＭ写真を図３に示す。
【０１０６】
以下の実施例は、本発明を更に説明するために有用なものであるが、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１０７】
実施例１−クローニング
ナノ粒子コンストラクトをコードするＤＮＡを、標準的な分子生物学手順を使用して作製した。例えば、タンパク質配列ＨＣ＿ＡＤ１ｇ
ＭＧＨＨＨＨＨＨＫＲＧＳＷＲＥＷＮＡＫＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＹＷＴＬＴＷＲＹＧＥＬＹＳＲＬＡＥＩＥＴＬＬＲＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＶＶＫＲＱＱＥＭＬＲＬＶＶＷＧＴＫＮＬＱＡＲＶＡＥＡＷＣＶＤＱＲＲＴＬＥＶＦＫＥＬＳＫＩＮＰＳＡＩＬＳＡＩＹＮＫＰＩＡＡＲＦＭＧＤＶＬＧＬＡＳＣＶＴＩＮＱＴＳＶＫＶＬＲＤＭＮＶＫＥＳＰＧＲＣＹＳＲＰＶＶＩＦＮＦＡＲＳＥＹＶＱＹＧＱＬＧＥＤＮＥＩＬＬＧＮＨＲＴＥＥＣＱＬＰＳＬＫＩＦＩＡＧＮＳＡＹＥＹＶＤＹＬＦＫＲＭＩＤＤＧＧＥＧＰＹＲＶＣＳＭＡＱＧＴＤＬＩＲＦＥＲＮＩＶＣＴＧＴＤＥＤＫＱＥＷＥＨＫＩＲＦＬＥＡＮＩＳＥＳＬＥＱＡＱＩＱＱＥＫＮＭＹＥＬＱＫＬ（配列番号１）
をコードするＤＮＡを含有するプラスミドを、図４の基本のＳＡＰＮ発現コンストラクトのＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ制限部位にクローニングして構築した。
【０１０８】
式（Ｉａ）Ｘ１−ＮＤ１−Ｌ１−ＳＨＢ１−Ｌ２−Ｂ−Ｌ３−ＳＨＢ２−Ｙ１を有するこのコンストラクトを、Ｈｉｓ−タグ（Ｘ１）、五量体コイルドコイルトリプトファンジッパー（ＮＤ１）、リンカー（Ｌ１）、ＨＩＶ  ＳＨＢのｇｐ４１の三量体コイルドコイル（ＳＨＢ１）、リンカーとしてのペプチド結合（Ｌ２）、三量体ループ構造（Ｂ）を形成するＣＭＶの糖タンパク質ｇＢの突起（Ｂ）、ＢのＣ末端をＨＩＶのｇｐ４１内のＳＨＢの第２のヘリックス（ＳＨＢ２）に接続させるリンカー（Ｌ３）から構成されるが、このコンストラクトにはＹ１は存在しない。
【０１０９】
実施例２−発現
プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞中へ形質転換し、アンピシリンを含むＬｕｒｉａブロス中で、３７℃で増殖させた。ｔｕｎｅｒ  ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｏｒｉｇａｍｉ２（ＤＥ３）、およびＲｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳのような他の細胞株を使用することもできる。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクト−ピラノシドで発現を誘導した。誘導から４時間後、細胞を３７℃から取り出し、４，０００×ｇで１５分間遠心分離して収集した。細胞ペレットを−２０℃で保管した。ペレットを氷上で解凍し、９Ｍ尿素、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ８の１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、２０ｍＭイミダゾール、および０．２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−２−カルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）からなる溶解バッファーに懸濁した。
【０１１０】
別法として、ＫＲＸ細胞などのその他の細胞株もまた発現のために使用することができる。ＫＲＸ細胞において、発現は、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）およびグルコース（０．４％）を含む３７度でのＯ／Ｎ前培養液を用いて、ＫＲＸ細胞の迅速自動誘導プロトコールにより行うことができる。Ｏ／Ｎ前培養液を、Ａｍｐ（１００μｇ／ｍＬ）、グルコース（０．０５％）、およびラムノース（０．１％）を含有する発現培養液で１：１００に希釈して、２５℃で２４時間培養した。タンパク質発現レベルを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；図５Ａ）によって評価した。
【０１１１】
実施例３−精製
細胞を超音波処理によって溶解し、この溶解物を、３０，５００×ｇで４５分間遠心分離して清澄化した。清澄化した溶解物を、Ｎｉ−ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）と共に少なくとも１時間インキュベートした。溶解バッファーでカラムを洗浄し、次いで、以下の洗浄および溶出プロトコールにより精製した。
溶解バッファー：１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、９Ｍ尿素、５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０
洗浄１：溶解バッファー
洗浄２：５００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、９Ｍ尿素、５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ８．０
洗浄３：１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭクエン酸、９Ｍ尿素、５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ６．３
洗浄４：１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭクエン酸、９Ｍ尿素、５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ５．９
洗浄５：１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２０ｍＭクエン酸、９Ｍ尿素、５ｍＭ  ＤＴＴ、ｐＨ４．５
洗浄６：溶解バッファー
洗浄７：６０％イソプロパノール、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０（エンドトキシンの除去）
洗浄８：溶解バッファー
洗浄９：溶解バッファー
溶出：２５０ｍＭイミダゾールを含む溶解バッファー
【０１１２】
純度を、図５Ｂに示すように、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって評価した。
【０１１３】
実施例４−リフォールディング
リフォールディングのために、タンパク質を以下の条件に再緩衝化した：ｐＨ８．５、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロール、１ｍＭ  ＴＣＥＰ。迅速なリフォールディングのために、タンパク質６．７ｍｌ（１６．７５ｍｇ）を、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％グリセロールから構成されるリフォールディングバッファー３２８ｍｌ中でリフォールディングさせた。リフォールディング後の最終タンパク質濃度は０．０５ｍｇ／ｍＬであった。迅速なリフォールディングの後、タンパク質を２×４０００Ｌのリフォールディングバッファーで透析して、残留尿素を除去した。次いで、溶液を、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡法によって様々な分解能で解析した。リフォールディング後のＨＣ−ＡＤ１ｇのＥＭ画写真は、微細なナノ粒子構造を示している（図３）。
【０１１４】
実施例５−インフルエンザワクチンＦ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇの構造
コンピューターグラフィックス上で、以下の配列を有する「Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇ」と名付けたインフルエンザＨＡをベースとしたＳＨＢ−ＳＡＰＮを設計した。
ＭＧＮＮＭＴＷＱＥＷＥＨＫＩＲＦＬＥＡＮＩＳＥＳＬＥＱＡＱＩＱＱＥＫＮＭＹＥＬＱＫＬＮＳＷＤＶＦＧＡＡＡＤＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＲＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＫＣＮＩＡＧＷＬＬＧＮＰＥＣＤＰＬＬＰＶＲＳＷＳＹＩＶＥＴＰＮＳＥＮＧＩＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＮＴＮＧＶＴＡＡＣＳＨＥＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＥＫＥＧＳＹＰＫＬＫＮＳＹＶＮＫＫＧＫＥＶＬＶＬＷＧＩＨＨＰＰＮＳＫＥＱＱＮＬＹＱＮＥＮＡＹＶＳＶＶＴＳＮＹＮＲＲＦＴＰＥＩＡＥＲＰＫＶＲＤＱＡＧＲＭＮＹＹＷＴＬＬＫＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＭＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＳＭＨＥＣＮＴＫＣＱＴＰＬＧＡＩＮＳＳＬＰＹＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＴＶＩＥＫＭＮＩＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＫＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＥＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＧＳＴＬＳＡＱＶＲＴＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＶＶＫＲＱＱＥＭＬＲＬＶＶＷＧＶＫＮＬＱＡＲＶＴＡＩＥＫＹＬＫＲＬＲＡＡＬＱＧＧＡＩＩＮＥＴＡＤＤＩＶＹＲＬＴＶＩＩＤＤＲＹＥＳＬＫＮＬＩＴＬＲＡＤＲＬＥＭＩＩＮＤＮＶＳＴＩＬＡＳＩＧＧＤＥＧＤＥＧＤＥＡＲＥＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＧＳ（配列番号１６）
【０１１５】
Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇは、式（Ｉｂ）による構造を有するコンストラクトであり、以下の部分構造から構成される。
Ｙ１：ＭＧ
ＳＨＢ２：ＮＮＭＴＷＱＥＷＥＨＫＩＲＦＬＥＡＮＩＳＥＳＬＥＱＡＱＩＱＱＥＫＮＭＹＥＬＱＫＬＮＳＷＤＶＦＧ（配列番号１７）
Ｌ３：ＡＡＡ
Ｂ：ＤＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＲＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＫＣＮ  ＩＡＧＷＬＬＧＮＰＥＣＤＰＬＬＰＶＲＳＷＳＹＩＶＥＴＰＮＳＥＮＧＩＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＮＴＮＧＶＴＡＡＣＳＨＥＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＥＫＥＧＳＹＰＫＬＫＮＳＹＶＮＫＫＧＫＥＶＬＶＬＷＧＩＨＨＰＰＮＳＫＥＱＱＮＬＹＱＮＥＮＡＹＶＳＶＶＴＳＮＹＮＲＲＦＴＰＥＩＡＥＲＰＫＶＲＤＱＡＧＲＭＮＹＹＷＴＬＬＫＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＭＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＳＭＨＥＣＮＴＫＣＱＴＰＬＧＡＩＮＳＳＬＰＹＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＴＶＩＥＫＭＮＩＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＫＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＥＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫ（配列番号１８）
Ｌ２：ＧＳ
ＳＨＢ１：ＴＬＳＡＱＶＲＴＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＶＶＫＲＱＱＥＭＬＲＬＶＶＷＧＶＫＮＬＱＡＲＶＴＡＩＥＫＹＬ（配列番号１９）
Ｌ１：ＫＲＬＲＡＡＬＱＧＧＡ（配列番号２０）
ＮＤ１：ＩＩＮＥＴＡＤＤＩＶＹＲＬＴＶＩＩＤＤＲＹＥＳＬＫＮＬＩＴＬＲＡＤＲＬＥＭＩＩＮＤＮＶＳＴＩＬＡＳＩ（配列番号２１）
Ｘ１：ＧＧＤＥＧＤＥＧＤＥＡＲＥＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＧＳ（配列番号２２）
【０１１６】
このインフルエンザワクチンコンストラクトの区分の具体的な由来および機能は以下の通りである。Ｙ１は、ＤＮＡレベルでＮｃｏＩのクローニング部位を含有する；ＳＨＢ２は、ＨＩＶ配列Ｐ１２４４９．１のｇｐ４１  ＳＨＢの長い形態（残基６１１〜６５７）である；Ｌ３は、ＮｏｔＩの制限部位を含有する；Ｂは、Ａ型インフルエンザウイルスＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）のＨＡタンパク質Ｐ０３４５２．２の残基１６〜５１１に一致する；Ｌ２は、ＢａｍＨＩの制限部位を含有する；ＳＨＢ１は、コイルドコイル三量体を安定化させる４つの点突然変異（Ｆ５３６Ｌ、Ｒ５３７Ａ、Ｔ５６０Ｖ、およびＴ５６４Ｖ）を有するＨＩＶ配列Ｐ１２４４９．１のｇｐ４１  ＳＨＢのもう１つのヘリックスの長い形態（残基５２７〜５７８）である；Ｌ１は、短いコイルドコイル域、ＰｓｔＩの制限部位、および三量体コイルドコイルと四量体コイルドコイルとの間の柔軟なＧＧ配列を含有する；ＮＤ１は、四量体コイルドコイルを形成するｐｄｂ−コード１ＹＢＫを有するテトラブラキオンの結晶構造由来の配列の残基３〜５２を含有する；Ｘ１は、Ｈｉｓ−タグが続く一連の荷電残基を含有する。
【０１１７】
実施例６−クローニング
Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇをコードする配列を、両側に制限部位（ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ）を付して注文し、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔから得た。ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素を使用して、ｍＦ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇをｐＰＥＰ−Ｔ発現ベクター中へサブクローニングした（図４）。
【０１１８】
実施例７−タンパク質発現、精製、およびリフォールディング
Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇコンストラクトを、ＢＬ２１（ＤＥ３）発現細胞（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）へ形質転換し、Ｈｙｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ａｔｈｅｎａ）中で発現させた。新鮮な形質転換された細菌コロニーを、アンピシリン（１００ｕｇ／ｍＬ）を含む１０ｍＬのＨｙｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈへの接種に使用し、２８℃（２００ｒｐｍ）で一晩増殖させた。一晩培養した培養液の１％を、発現培養液（１００ｕｇ／ｍＬアンピシリンを含むＨｙｐｅｒ  Ｂｒｏｔｈ）への接種に使用した。この発現培養液を、３７℃、２００ｒｐｍで増殖させた。培養液を、ＯＤ６００ｎｍでの細胞密度が０．８に達した時点で、ＩＰＴＧ（１ｍＭの最終濃度）を使用して、３７℃で３時間誘導した。細胞ペレットを、遠心分離（４０００ｇ、４℃）によって収集し、氷冷した１×ＰＢＳで洗浄した。精製を、変性および還元条件下で実施した。細胞ペレットを溶解バッファー（ｐＨ８．０、８Ｍ尿素、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＴＣＥＰ）に再懸濁し、３分間超音波処理し（４０％振幅、３秒パルスオン、３秒パルスオフ）、続いて遠心分離して（１４’０００×ｇ、５０分、４℃）細胞破片をペレット化した。タンパク質を、ＡＫＴＡ  Ｐｒｉｍｅ  ＦＰＬＣ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の５ｍＬ  ＨｉｓＴｒａｐカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して精製した。タンパク質結合を０．５ｍＬ／分の流速で実施した後、洗浄１（溶解バッファー、流速２ｍＬ／分）、洗浄２（１０ｍＭイミダゾールを含有する溶解バッファー、ｐＨ８．０）、洗浄３（ｐＨ８、８Ｍ尿素、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ  ＴＣＥＰ）、洗浄４（ｐＨ４．５、８Ｍ尿素、２０ｍＭクエン酸ナトリウム、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭイミダゾール、２ｍＭ  ＴＣＥＰ）、洗浄５（ｐＨ８．０、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、６０％イソプロパノール）の後、溶出前に洗浄バッファー２に戻して平衡化した。タンパク質を、溶出バッファー（ｐＨ８．０、８Ｍ尿素、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、２ｍＭ  ＴＣＥＰ、５００ｍＭイミダゾール）で溶出した。タンパク質含有画分をプールし、最終濃度５ｍＭのＥＤＴＡと共にインキュベートして（室温での１時間のインキュベーション）、放出されたニッケルをキレートし、プレリフォールディングバッファー（６Ｍ  ＧｎｄＨＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＴＣＥＰ、１０％グリセロール、ｐＨ８．０）に対して再緩衝化した。タンパク質濃度を、ＯＤ２８０の読み取りによって測定した。リフォールディングを、リフォールディングバッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＧＳＨ、１ｍＭ  ＧＳＳＧ、２５％グリセロール、ｐＨ８．０）に、一定撹拌下で、タンパク質液滴を（９０分の間隔をあけて４×１ｍＬ）加える１００倍希釈によって実施した。リフォールディングした粒子をろ過し（０．１ｕｍ  ＰＥＳメンブレンフィルター、Ｓａｒｔｏｌａｂ、Ｓａｔｏｒｉｕｓ）、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（１００ｋＤａカットオフ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒ��）で濃縮し、再度ろ過した（０．１ｕｍシリンジフィルター、Ｍｉｎｉｓａｒｔ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）。粒子調製物は、０．３７ｍｇ／ｍＬの最終濃度を示した。リフォールディング、ろ過、濃度、および最終ろ過工程を通じて、タンパク質損失は６５％であった。
【０１１９】
発現培養液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、７７．９ｋＤａの予想分子量に移動するＦ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇ単量体の良好な発現を示した（図７Ａ）。タンパク質は、封入体の中で発現されており（データ非表示）、変性バッファー条件での可溶化後、高純度でアフィニティ精製され（図７Ｂ）、電子顕微鏡法によって明示されたようなナノ粒子を形成することができる（図８）。
【０１２０】
実施例８−球状頭部に対するｍＡＢおよびＨＡ特異的ポリクローナル高度免疫血清を使用した、Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇの特徴づけ
ＳＨＢ−ＳＡＰＮ上でのＨＡの正確なリフォールディングを、不活性化インフルエンザＰＲ８／３４ウイルスと比較して、コンフォメーション特異的モノクローナル抗体（ＩＣ５−４Ｆ８、ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）またはポリクローナル高度免疫血清（ＮＩＢＳＣ）を用いたＥＬＩＳＡ結合アッセイによって確認した。コーティングバッファー（ｐＨ９．０、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１２ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３）中リフォールディングＦ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇ粒子（１．７μｇ／ｍＬ）または不活性化ウイルスＰＲ８／３４（１．７μｇ／ｍＬ）を、プレートに３つ組で、４℃で一晩コーティングした。ネガティブコントロールとして、コーティングバッファーのみを３個のウェルに加えた。プレートを洗浄バッファー（１×ＤＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、３００ｕＬ／ウェル）で３回洗浄し、ブロッキングバッファー（１×ＤＰＢＳ、３％ＢＳＡ、３００μＬ／ウェル）で、振盪機上で、室温で２時間ブロッキングした。ウイルス上で正しく折りたたまれた三量体球状頭部が確認されたことを示す、市販のモノクローナル抗Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ、クローンＩＣ５−４Ｆ８（１：５００；ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）を使用して、我々の粒子の表面上の球状頭部構造を解析した。粒子の表面上のリフォールディングＨＡ分子の特徴を更に明らかにするために、市販の抗インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ポリクローナル高度免疫ヒツジ血清（１：１０００、ＮＩＢＳＣ）を使用した。プレートを、洗浄バッファー（３００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ標識（１：５０００、１×ＰＢＳ／３％ＢＳＡ中、１００μＬ／ウェル、Ｓｉｇｍａ）または抗ヤギ／ヒツジＩｇＧペルオキシダーゼ標識（１：１０００、１×ＰＢＳ／３％ＢＳＡ中、１００μＬ／ウェル、Ｓｉｇｍａ）二次抗体をそれぞれ加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、ＴＭＢ現像液を添加して（１００μＬ／ウェル、Ｓｉｇｍａ）顕色した。０．５Ｍ硫酸（１００μＬ／ウェル）を使用して、それぞれ１５分または２分後に反応を停止し、４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー（Ｔｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓ  Ｐｒｏ）を使用して呈色反応を読み取った。
【０１２１】
不活性化ウイルスはホルマリンで固定されているため、不活性化ウイルスの表面のＨＡ分子が正確なコンフォメーションを示すことが期待できる。コンフォメーション特異的ｍＡｂ  ＩＣ５−４Ｆ８およびポリクローナル免疫血清のいずれによっても、Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇ粒子の強力な認識が観察され、これは、ＳＨＢ−ＳＡＰＮ上でのＨＡの正確なフォールディングを確認するものである。この認識は、両血清による不活性化ウイルスの場合と比較して若干低減したに過ぎず、これは、ＳＨＢ−ＳＡＰＮ上でＨＡ分子の画分が正しく折りたたまれていないことを示唆している（図９Ａ、Ｂ）。球状頭部特異的ｍＡｂについては、高度免疫血清によって１．６倍の低減、不活性化ウイルスの認識と比較して１．８倍の低減がみられる。
【０１２２】
実施例９−正確なＨＡコンフォメーションを分析するための競合ＥＬＩＳＡ分析
コーティングバッファー中でＦ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇのインキュベーションを行うことによって、ＨＡが、抗体に結合し、コーティングされた不活性化ウイルスへ抗体が結合するのを妨害する、正しいコンフォメーションを有することを実証することができる。したがって、阻害ＥＬＩＳＡアッセイを実施して、可溶型粒子が不活性化ウイルスの抗体認識と競合するかどうかを判定した。
【０１２３】
ＥＬＩＳＡプレートに、コーティングバッファー（ｐＨ９．０、１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１２ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３）中不活性化ウイルスＰＲ８／３４（１μｇ／ｍＬ）を、４℃で一晩コーティングした。プレートを洗浄バッファー（１×ＤＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ、３００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、ブロッキングバッファー（１×ＤＰＢＳ、３％ＢＳＡ、３００μＬ／ウェル）で、振盪機上で、室温で２時間ブロッキングした。市販のモノクローナル抗Ａ型インフルエンザウイルスＨＡ、クローンＩＣ５−４Ｆ８（１：５００；ＢＥＩ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）および市販の抗インフルエンザＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）高度免疫ポリクローナルヒツジ血清（１：１０００、ＮＩＢＳＣ）は、ＥＬＩＳＡプレートに加える前に（１００μＬ／ウェル）１時間、粒子バッファー（ｐＨ８．０、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＧＳＨ、１ｍＭ  ＧＳＳＧ、２５％グリセロール）中８０ｎｇのＦ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇとプレインキュベートした。ポジティブコントロールとして、粒子とプレインキュベートされていない抗体混合物を、同じプレート上で分析した。抗体／粒子混合物を振盪機上で室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファー（３００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ標識（１：５０００、１×ＰＢＳ／３％ＢＳＡ中、１００μＬ／ウェル、Ｓｉｇｍａ）または抗ヤギ／ヒツジＩｇＧペルオキシダーゼ標識（１：１０００、１×ＰＢＳ／３％ＢＳＡ中、１００μＬ／ウェル、Ｓｉｇｍａ）二次抗体をそれぞれ加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、ＴＭＢ現像液を添加して（１００μＬ／ウェル、Ｓｉｇｍａ）顕色した。０．５Ｍ硫酸（１００μＬ／ウェル）を使用して、それぞれ１５分または２分後に反応を停止し、４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー（Ｔｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓ  Ｐｒｏ）を使用して呈色反応を読み取った。
【０１２４】
可溶型Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇは、不活性化ウイルスＰＲ８／３４へ結合する抗体と競合することができた（図９Ｃ、Ｄ）。８０ｎｇのＦ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇによって、ｍＡｂによるＰＲ８／３４認識を１．９倍、また高度免疫血清によるＰＲ８／３４認識を４．６倍、阻害することができた。このデータは、ＳＡＰＮ上のＨＡが、コーティングしたウイルスへのコンフォメーション特異的抗体の結合と競合する、正しいコンフォメーションを有すること裏付けるものである。
【０１２５】
実施例１０−球状頭部に対するｍＡＢ、およびポリクローナルＨＡ特異的高度免疫血清を使用した、Ｆ３−ＨＡＰＲの特徴づけ
Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇに類似のコンストラクトを、テトラブラキオン由来の四量体化ドメインを欠失させて、リフォールディングで三量体上だけを形成するように操作して作製した。ＨＡ分子は、ＨＩＶのＳＨＢへの結合によってその融合前三量体コンフォメーション中で安定化しているが、第２のオリゴマー化ドメインを欠失しているため、ＳＡＰＮへの更なる集合は不可能である。このコンストラクトは、Ｆ３−ＨＡＰＲと名付け、以下の配列を有する。
ＭＧＮＮＭＴＷＱＥＷＥＨＫＩＲＦＬＥＡＮＩＳＥＳＬＥＱＡＱＩＱＱＥＫＮＭＹＥＬＱＫＬＮＳＷＤＶＦＧＡＡＡＤＡＤＴＩＣＩＧＹＨＡＮＮＳＴＤＴＶＤＴＶＬＥＫＮＶＴＶＴＨＳＶＮＬＬＥＤＳＨＮＧＫＬＣＲＬＫＧＩＡＰＬＱＬＧＫＣＮＩＡＧＷＬＬＧＮＰＥＣＤＰＬＬＰＶＲＳＷＳＹＩＶＥＴＰＮＳＥＮＧＩＣＹＰＧＤＦＩＤＹＥＥＬＲＥＱＬＳＳＶＳＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫＥＳＳＷＰＮＨＮＴＮＧＶＴＡＡＣＳＨＥＧＫＳＳＦＹＲＮＬＬＷＬＴＥＫＥＧＳＹＰＫＬＫＮＳＹＶＮＫＫＧＫＥＶＬＶＬＷＧＩＨＨＰＰＮＳＫＥＱＱＮＬＹＱＮＥＮＡＹＶＳＶＶＴＳＮＹＮＲＲＦＴＰＥＩＡＥＲＰＫＶＲＤＱＡＧＲＭＮＹＹＷＴＬＬＫＰＧＤＴＩＩＦＥＡＮＧＮＬＩＡＰＭＹＡＦＡＬＳＲＧＦＧＳＧＩＩＴＳＮＡＳＭＨＥＣＮＴＫＣＱＴＰＬＧＡＩＮＳＳＬＰＹＱＮＩＨＰＶＴＩＧＥＣＰＫＹＶＲＳＡＫＬＲＭＶＴＧＬＲＮＩＰＳＩＱＳＲＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥＧＧＷＴＧＭＩＤＧＷＹＧＹＨＨＱＮＥＱＧＳＧＹＡＡＤＱＫＳＴＱＮＡＩＮＧＩＴＮＫＶＮＴＶＩＥＫＭＮＩＱＦＴＡＶＧＫＥＦＮＫＬＥＫＲＭＥＮＬＮＫＫＶＤＤＧＦＬＤＩＷＴＹＮＡＥＬＬＶＬＬＥＮＥＲＴＬＤＦＨＤＳＮＶＫＮＬＹＥＫＶＫＳＱＬＫＮＮＡＫＥＩＧＮＧＣＦＥＦＹＨＫＣＤＮＥＣＭＥＳＶＲＮＧＴＹＤＹＰＫＹＳＥＥＳＫＧＳＴＬＳＡＱＶＲＴＬＬＡＧＩＶＱＱＱＱＱＬＬＤＶＶＫＲＱＱＥＭＬＲＬＶＶＷＧＶＫＮＬＱＡＲＶＴＡＩＥＫＹＬＫＲＬＲＡＡＬＱＧＧＧＤＥＧＤＥＧＤＥＡＲＥＧＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＧＳ（配列番号２３）
【０１２６】
実施例６および７に記載したプロトコール、ならびに不活性化インフルエンザＰＲ８／３４ウイルスでコーティングしたプレートと比較して、Ｆ３−ＨＡＰＲ上でのＨＡ分子の正しいリフォールディングのためのプローブに対するポリクローナルＨＡ特異的高度免疫血清を使用して特徴づけした対象を使用して、このコンストラクトをクローニングし、発現させ、精製し、リフォールディングさせた。具体的には、９０分の間隔をあけて２×５００ｍＬで１００倍希することによって、リフォールディングを実施した（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ、４００ｍＭ  Ｌ−アルギニン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭ  ＧＳＨ、１ｍＭ  ＧＳＳＧ、ｐＨ８．０、ならびに５％、１０％、２０％、および２０％の模索的な異なるグリセロール濃度のリフォールディングバッファー１００ｍｌ中合計１ｍＬのタンパク質。リフォールディングした物質を、約３ｍＬの量まで、またグリセロール濃度の増加に対しそれぞれ７０ｍｇ／ｍＬ、５８ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、および２６ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度まで、３０ｋＤａカットオフＡｍｉｃｏｎ濃縮器を使用して濃縮し、０．２ｍｍフィルターを使用してろ過した。
【０１２７】
Ｆ３−ＨＡＰＲ三量体上でリフォールディングしたＨＡ分子の特徴を明らかにするために、市販のインフルエンザ抗Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ポリクローナル高度免疫ツジ血清（１：１０００、ＮＩＢＳＣ）を使用した。プレートを洗浄バッファー（３００μＬ／ウェル）で３回洗浄し、抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ標識（１：５０００、１×ＰＢＳ／３％ＢＳＡ中、１００μＬ／ウェル、Ｓｉｇｍａ）または抗ヤギ／ヒツジＩｇＧペルオキシダーゼ標識（１：１０００、１×ＰＢＳ／３％ＢＳＡ中、１００μＬ／ウェル、Ｓｉｇｍａ）二次抗体をそれぞれ加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを洗浄バッファーで３回洗浄し、ＴＭＢ現像液を添加して（１００μＬ／ウェル、Ｓｉｇｍａ）顕色した。０．５Ｍ硫酸（１００μＬ／ウェル）を使用して、それぞれ１５分または２分後に反応を停止し、４５０ｎｍでＥＬＩＳＡリーダー（Ｔｅｃａｎ  ＧＥＮｉｏｓ  Ｐｒｏ）を使用して呈色反応を読み取った。図１０において、ＥＬＩＳＡからは、細菌で発現させたＦ３−ＨＡＰＲと不活性化インフルエンザＰＲ８／３４ウイルスとは、様々な温度条件で保管したポリクローナル血清に対するそれらの結合特異性のプロファイルがほぼ同一であることがわかる。これは、標準的なＢＬ２１（ＤＥ３）細菌発現系で発現させる場合でも、ＨＡがＦ３−ＨＡＰＲコンストラクト上でＳＨＢによって安定化している場合、ＨＡは正しく折りたたまれていることを示している。
【０１２８】
実施例１１−マウス免疫化およびチャレンジ実験
免疫化およびチャレンジ実験を実施した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群当たり５匹）を、３０ｕｇのＦ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇ、不活性化ウイルスＰＲ８／３４（ポジティブコントロール群）、またはＰＢＳ（ネガティブコントロール群）を筋肉内で免疫化した（０、１４、および２８日目）。採血を行った（１４、２８、４１日目）。４２日目に、マウスに、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）の１００ＰＦＵの致死量（１０ＬＤ９０）のＰＲ８／３４ウイルスをチャレンジし、チャレンジ後１４日目まで、毎日マウスをモニターした（生存、健康状態、体重）。
【０１２９】
Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇで免疫化した動物はすべて（５匹のマウスの群）、同一源のチャレンジで生存した（図１１および１２Ａ）。不活性化ウイルスＰＲ８／３４で免疫化した群では、予想した通りに１００％生存も観察された（図１１および１３Ａ）。ＰＢＳで免疫化したコントロール群のマウスはすべて、重篤な健康状態を発生して死んだ（図１１）。
【０１３０】
ＥＬＩＳＡアッセイでは、Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇ免疫化によって誘導された高い防御性を持つ抗体は、不活性化ウイルスＰＲ８／３４をわずかしか認識しなかった（図１２Ｂ）が、不活性化ウイルスＰＲ８／３４による免疫化では、非常に高い不活性化ウイルスＰＲ８／３４特異的抗体価が観察された（図１３Ｂ）。
【０１３１】
このことは、化学的に不活性化されたウイルス上では、主としてＨＡの突起が免疫系に接近できるのに対し、Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇは、ＨＡ分子の側面上の部分も表面へ接近できるため、非常に好ましいＨＡを呈することを示している。このように、ＨＡの突起が高度に可変性であるのに対しＨＡ分子の側面上ではステムドメインのより保存された領域が提示されるため、Ｆ３４−ＨＡＰＲ−ＨＩＶｌｏｎｇは、不活性化ウイルスより多様な抗体を誘導することができ、よって、より広範囲に防御できる可能性がある。
【０１３２】
実施例１２−ＨＩＶワクチン４ＴＶＰ−１ＥＮＶの構造
コンピューターグラフィックス上で、以下の配列を有する「４ＴＶＰ−１ＥＮＶ」と名付けたＨＩＶ  ｇｐ１６０をベースとしたＳＨＢ−ＳＡＰＮを設計した。
ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷＭＧＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＶＥＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＶＫＬＴＰＬＣＶＴＬＱＣＴＮＶＴＮＮＩＴＤＤＭＲＧＥＬＫＮＣＳＦＮＭＴＴＥＬＲＤＫＫＱＫＶＹＳＬＦＹＲＬＤＶＶＱＩＮＥＮＱＧＮＲＳＮＮＳＮＫＥＹＲＬＩＮＣＮＴＳＡＩＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫ（配列番号２４）
【０１３３】
４ＴＶＰ−１ＥＮＶは、式（Ｉａ）による構造を有し、以下の部分構造から構成されるコンストラクトである。
Ｘ１：ＭＧＤＫＨＨＨＨＨＨＨＨＨＨＫＤＧＳＤＫＧＳ（配列番号２５）
ＮＤ１：ＷＥＥＷＮＡＲＷＤＥＷＥＮＤＷＮＤＷＲＥＤＷＱＡＷＲＤＤＷＡＲＷＲＡＴＷ（配列番号２６）
Ｌ１：ＭＧＧＲＬＬＳＲＬＥＲＬＥＲＲＮＶ（配列番号２７）
ＳＨＢ１：ＥＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷ（配列番号２８）
Ｌ２：ペプチド結合
Ｂ：ＶＫＬＴＰＬＣＶＴＬＱＣＴＮＶＴＮＮＩＴＤＤＭＲＧＥＬＫＮＣＳＦＮＭＴＴＥＬＲＤＫＫＱＫＶＹＳＬＦＹＲＬＤＶＶＱＩＮＥＮＱＧＮＲＳＮＮＳＮＫＥＹＲＬＩＮＣＮＴＳＡＩ（配列番号２９）
Ｌ３：ペプチド結合
ＳＨＢ２：ＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫ（配列番号３０）
Ｙ１：存在しない
【０１３４】
これは、ＨＩＶのタンパク質ｇｐ１２０およびｇｐ４１のＲＣＳＢタンパク質データベースからの結晶構造４ＴＶＰおよび１ＥＮＶに基づく。４ＴＶＰは、ヒト抗体ＰＧＴ１２２および３５Ｏ２２と複合体化した、融合前のｇｐ１２０およびｇｐ４１を含む、ｈｉｖ−１  ｂｇ５０５  ｓｏｓｉｐ．６６４  ｅｎｖ三量体エクトドメインの結晶構造である（Ｐａｎｃｅｒａ，Ｍ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４年、５１４（７５２３）：４５５〜４６１頁）。１ＥＮＶは、ＨＩＶ−１ｇｐ４１由来のエクトドメインの原子構造であり（Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎ，Ｗ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７年、３８７（６６３１）：４２６〜４３０頁）、すなわちＳＨＢである。
【０１３５】
具体的には、４ＴＶＰ−１ＥＮＶは、Ｘ１中に、Ｈｉｓ−タグならびにＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩの制限部位を含有し、ＮＤ１中に、４ＴＶＰ−１ＥＮＶをより可溶型にする、非コア残基に多くの点突然変異を有する五量体コイルドコイルトリプトファンジッパーを含有する。Ｌ１は、コイルドコイル配列が続く、五量体と三量体との間に柔軟なＧＧを含有するリンカーである。ＳＨＢ１は、１ＥＮＶ由来のＡ鎖の残基３１〜６１を含有する。Ｂは、４ＴＶＰ由来のＧ鎖の残基９０〜１７０を含有する。ＳＨＢ２は、１ＥＮＶ由来のＡ鎖の残基８７〜１２３を含有する。ＢのＶ１−Ｖ２ループは、ＳＨＢ上へと最適にモデル化されているため、リンカーＬ２およびＬ３は、まさにペプチド結合である。最後に、Ｙ１は、このコンストラクト設計では存在しない。
【０１３６】
ＨＩＶは高変異性であるため、似た設計の数多くの他の組合せを想定することができる。４ＴＶＰでは、Ｖ１Ｖ２−ループは長いＶ１およびＶ２ループを有する。免疫応答をｇｐ１２０のより保存された部分に焦点を合わせるために、短いＶ１およびＶ２ループを有する配列を選択することができる。また、より程度の低いグリコシル化を有する構造を提示することによって、タンパク質骨格を十分に露出され、より広範な中和抗体反応が誘導されることも考えられる。したがって、一部のグリコシル化部位が変異を示している配列を選択することが好都合なことも考えられる。可能な選択肢は、Ｂについては、両ループが短い形態を有し、２つのグリコシル化部位が非グリコシル化に改変されている配列ＶＫＬＴＰＬＣＶＴＬＩＣＫＤＴＴＮＳＴＧＴＭＫＮＣＳＦＳＶＴＴＥＬＲＤＫＫＱＫＶＹＡＬＦＹＫＬＤＩＶＰＩＥＴＧＥＹＲＬＩＮＣＮＴＳＶＩ（配列番号３１）を産する、配列ＡＣＺ０６５１７．１、ＡＢＷ９５２３３．１、およびＡＦＵ３３８８３．１の組合せとなる。
【０１３７】
また、ＳＨＢ配列の多様性を想定することもできる。１ＥＮＶの配列は、４ＴＶＰ（ＱＡＲＮＬＬＳＧＩＶＱＱＱＳＮＬＬＲＡＰＥＡＱＱＨＬＬＫＬＴＶＷ（配列番号３２）およびＬＱＷＤＫＥＩＳＮＹＴＱＩＩＹＧＬＬＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＤＬＬＡＬＤ（配列番号３３））もしくはより可溶型形態のＳＨＢ（配列番号５および配列番号７））、または１ＥＮＶにほぼ同一であるＴ８６５／Ｔ６５１ペア（Ｂａｉ，Ｘ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００８年、４７（２５）：６６６２〜６６７０頁）（ＱＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷ（配列番号３４）およびＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬＥＬＤＫ（配列番号３５））によって置換することが可能である。これらのヘリックスのより短い形態も、ヘリックスがなお十分に安定したＳＨＢを形成する限りは、また機能することとなる（参考文献、Ｂａｉ，Ｘ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００８年、４７（２５）：６６６２〜６６７０頁を参照されたい）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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