(57)【要約】  本発明は、ＡＩＢＤを治療または予防する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象に、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはこのタンパク質の機能的等価物である薬剤の治療または予防有効量を投与することを含む、対象におけるＡＩＢＤを治療または予防する方法。
【請求項２】
対象におけるＡＩＢＤを治療または予防する方法における使用のための、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはこのタンパク質の機能的等価物である薬剤。
【請求項３】
対象に、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはこのタンパク質の機能的等価物をコードする核酸分子である薬剤の治療または予防有効量を投与することを含む、対象におけるＡＩＢＤを治療または予防する方法。
【請求項４】
対象におけるＡＩＢＤを治療または予防する方法における使用のための、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはこのタンパク質の機能的等価物をコードする核酸分子である薬剤。
【請求項５】
薬剤が、配列番号２のアミノ酸１９〜１６８の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質であるか、またはそれをコードし、
前記タンパク質が、Ｃ５と結合して、コンバターゼによる補体Ｃ５の補体Ｃ５ａおよび補体Ｃ５ｂへの開裂を防止し、および／またはＬＴＢ４に結合する、
請求項１もしくは３のいずれか一項に記載の方法または請求項２もしくは４のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項６】
薬剤が、配列番号２のアミノ酸１９〜１６８の配列と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むタンパク質であるか、またはそれをコードし、
前記タンパク質が、Ｃ５と結合して、コンバターゼによる補体Ｃ５の補体Ｃ５ａおよび補体Ｃ５ｂへの開裂を防止し、および／またはＬＴＢ４に結合する、
請求項１、３もしくは５のいずれか一項に記載の方法または請求項２、４もしくは５のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項７】
薬剤が、配列番号２のアミノ酸１９〜１６８の配列を含むか、またはそれからなるタンパク質であるか、またはそれをコードする、請求項１、３もしくは５から６のいずれか一項に記載の方法、または請求項２、４もしくは５から６のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項８】
薬剤が、最大で１０のアミノ酸置換、挿入または欠失がなされた、配列番号２のアミノ酸１９〜１６８の配列を含むタンパク質であるか、またはそれをコードし、
タンパク質が、Ｃ５と結合して、コンバターゼによる補体Ｃ５の補体Ｃ５ａおよび補体Ｃ５ｂへの開裂を防止し、および／またはＬＴＢ４に結合する、
請求項１もしくは３のいずれか一項に記載の方法、または請求項２もしくは４のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項９】
薬剤が、請求項４から７のいずれかに記載のタンパク質の断片であるか、またはそれをコードし、
タンパク質が、Ｃ５と結合して、コンバターゼによる補体Ｃ５の補体Ｃ５ａおよび補体Ｃ５ｂへの開裂を防止し、および／またはＬＴＢ４に結合する、
請求項１もしくは３のいずれか一項に記載の方法、または請求項２もしくは４のいずれか一項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１０】
薬剤が、皮下投与される、前記請求項のいずれかに記載の方法または使用のための薬剤。
【請求項１１】
対象が、ヒトである、前記請求項のいずれかに記載の方法または使用のための薬剤。
【請求項１２】
薬剤が、対象において可能な限り多くの利用可能なＣ５および／またはＬＴＢ４、好ましくは、全ての利用可能なＣ５と結合するために十分な用量で投与される、前記請求項のいずれかに記載の方法または使用のための薬剤。
【請求項１３】
薬剤が、対象において全ての利用可能なＣ５および／またはＬＴＢ４と結合するために必要なモル用量の１．５倍の用量で投与される、前記請求項のいずれかに記載の方法または使用のための薬剤。
【請求項１４】
方法が、対象に、薬剤の初回負荷用量を投与すること、および次にその維持用量を投与することを含む、前記請求項のいずれかに記載の方法または使用のための薬剤。
【請求項１５】
初回維持用量および１または２以上のさらなる維持用量がある、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
方法が、第２のＡＩＢＤ治療の投与をさらに含む、前記請求項のいずれかに記載の方法または使用のための薬剤。
【請求項１７】
第２のＡＩＢＤ治療が、全身コルチコステロイド療法、局所コルチコステロイド療法、免疫抑制療法および免疫抑制生物学的療法から選択される、請求項１６に記載の方法または使用のための薬剤。
【請求項１８】
コルチコステロイドが、プレドニゾンおよびプレドニゾロンから選択され、免疫抑制療法が、メチルプレドニゾロン、ミコフェノレート、アザチオプリン、ダプソンおよびシクロホスファミドから選択され、免疫抑制生物学的療法が、リツキシマブおよび静脈内免疫グロブリンＧ（ＩＶＩＧ）から選択される、請求項１７に記載の方法または使用のための薬剤。
【請求項１９】
ＡＩＢＤが、水疱性類天疱瘡またはＥＢＡ、好ましくは水疱性類天疱瘡である、前記請求項のいずれかに記載の方法または使用のための薬剤。
【請求項２０】
配列番号２のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質の機能的等価物が、（ａ）配列番号２のアミノ酸１９〜１６８の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、および（ｂ）第２の配列を含む融合タンパク質であり、
前記融合タンパク質が、Ｃ５と結合して、コンバターゼによる補体Ｃ５の補体Ｃ５ａおよび補体Ｃ５ｂへの開裂を防止し、および／またはＬＴＢ４と結合する、
前記請求項のいずれかに記載の方法または使用のための薬剤。
【請求項２１】
前記第２の配列が、ＰＡＳ配列である、請求項２０に記載の方法または使用のための薬剤。
【請求項２２】
前記融合タンパク質が、（ａ）配列番号１５の３０コピーからなるＰＡＳ配列および（ｂ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸１９〜１６８を含み、（ａ）が、（ｂ）のＮ末端と融合されている、請求項２０または２１に記載の方法または使用のための薬剤。
【請求項２３】
タンパク質または融合タンパク質が、Ｃ５と結合して、コンバターゼによる補体Ｃ５の補体Ｃ５ａおよび補体Ｃ５ｂへの開裂を防止し、かつＬＴＢ４と結合する、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法または使用のための薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、自己免疫性水疱症を治療および予防する方法に関する。
【０００２】
本文中に言及され、本明細書の最後に記載される全ての文献は、参照により本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００３】
補体
補体系は、外敵の侵入に対抗する身体の自然防御メカニズムの欠くことのできない一部であり、炎症過程にも関与する。血清中および細胞表面の３０種を超えるタンパク質が補体系の機能発揮および調節に関与している。近年、有益な過程および病的過程の両方に関連し得る補体系の約３５の公知の成分だけでなく、補体系自体が、血管新生、血小板活性化、グルコース代謝および精子形成のように多様な機能を有する少なくとも８５の生物学的経路と相互作用することが明らかになった。
【０００４】
補体系は、外来抗原の存在によって活性化される。（１）ＩｇＭおよびＩｇＧ複合体によって、または糖質の認識によって活性化される古典的経路；（２）非自己表面（特異的調節分子を欠如する）および細菌エンドトキシンによって活性化される第二経路；ならびに（３）病原体表面のマンノース残基へのマンナン結合性レクチン（ＭＢＬ）の結合によって活性化されるレクチン経路という３つの活性化経路が存在する。これら３つの経路は、細胞表面の類似のＣ３１コンバターゼおよびＣ５コンバターゼの形成による補体活性化の産生を招く、平行する連鎖的なイベントを含み、その結果、急性期炎症メディエーター（Ｃ３ａおよびＣ５ａ）の放出および膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成を生じる。古典的経路および第二経路に関与する、平行する連鎖を図１に示す。（１補体経路の成分を文字「Ｃ」に続く「３」などの数字で表し、それにより「Ｃ３」が補体系の第三成分を表すようにすることが慣例である。これらの成分の一部は、補体系の活性化時に切断され、切断産物は数字の後に小文字で示される。したがって、Ｃ５は、慣例的にＣ５ａおよびＣ５ｂと呼ばれる断片に切断される。補体タンパク質は、必ずしも数字の順番で作用するわけでないので、数字は、必ずしも作用の順番を示すわけではない。この呼称の慣例が、本出願に使用される。）
【０００５】
古典的補体経路、第二補体経路およびレクチン補体経路は、本明細書においてまとめて補体経路と呼ばれる。Ｃ５ｂは、補体活性化の「後期」イベントを開始する。これらは、最終補体成分が相互作用してＭＡＣを形成する一連の重合反応を含み、ＭＡＣは、一部の病原体の細胞膜に孔を開け、そのことが病原体の死に繋がる可能性がある。最終補体成分には、Ｃ５ｂ（膜侵襲システムの集合を開始する）、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９が含まれる。
【０００６】
ＬＴＢ４
ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）は、記載された、最も強力な走化性および化学運動性エイコサノイドであり、インテグリンのアップレギュレーションを介して好中球の血管内皮への接着を促進する［１］。ＬＴＢ４は、また、好中球に関する完全な分泌促進物質であり、その凝集を誘導し、微小血管透過性を増加させる。ＬＴＢ４は、ナチュラルキラー細胞、単球および好酸球を動員および活性化する。ＬＴＢ４は、スーパーオキシドラジカルの形成を増加させ［２］、組織の炎症を増強および延長するおそれがある、いくつかの炎症促進性サイトカインおよびメディエーターの産生を含む遺伝子発現をモジュレートする［３、４］。ＬＴＢ４は、また、適応免疫応答の誘導および管理に役割を果たす。例えば、流入領域リンパ節への樹状細胞の輸送の調節［５、６］、肺Ｔ細胞からのＴｈ２サイトカインＩＬ−１３の産生［７］、抗原特異的エフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞の動員［８］ならびにヒトＢリンパ球の活性化および増殖［９］である。
【０００７】
ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）およびヒドロキシエイコサノイドは、ＢＬＴ１およびＢＬＴ２  Ｇタンパク質共役受容体を経由してそれらの効果を媒介する［１０、１１］。ヒトＢＬＴ１は、ＬＴＢ４に特異的な高親和性受容体であり（Ｋｄ  ０．３９〜１．５ｎＭ；［１２］）、競合結合研究で２０−ヒドロキシＬＴＢ４および１２−エピＬＴＢ４だけがＬＴＢ４と置き換わることができる［１３］。ヒトＢＬＴ２は、ＢＬＴ１と比べてＬＴＢ４に対して２０分の１の親和性（Ｋｄ  ２３ｎＭ）を有し、１２−エピＬＴＢ４、２０−ヒドロキシＬＴＢ４、１２（Ｓ）−ＨＥＴＥ、１５（Ｓ）−ＨＥＴＥ、１２（Ｓ）−ＨＰＥＴＥおよび１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥを含む、より広い範囲のエイコサノイドと結合することによって活性化される［１３］。ヒトＢＬＴ２は、ヒトおよびマウスＢＬＴ１と４５．２および４４．６％のアミノ酸同一性を有し、一方で、ヒトＢＬＴ２とマウスＢＬＴ２とは、９２．７％の同一性を有する［１１］。
【０００８】
ヒトＢＬＴ１は、内皮細胞および血管平滑筋細胞で発現すると最近記載されたものの、主として白血球の表面で発現する。ヒトＢＬＴ２は、より広い範囲の組織および細胞型で発現する。ヒト好中球の活性化、血管外遊出およびアポトーシスを阻害し［１４］、炎症性関節炎［１５］および腎虚血再灌流［１６］のマウスモデルにおいて好中球浸潤によって起こる徴候（ｓｙｍｐｔｏｍ）を軽減する、ＢＬＴ１およびＢＬＴ２のいくつかの特異的アンタゴニストが記載されている。ＢＬＴ１およびＢＬＴ２の両方は、ＬＴＢ４およびヒドロキシエイコサノイドを経由して病的作用を媒介することができるが［１７］、ＢＬＴ１が、マウスにおけるコラーゲン誘発関節炎などのいくつかの病状に疑いなく優位な役割を果たすことが、ますます多くの研究によって示されている［１８］。ＢＬＴ１−／−欠損マウスは、また、炎症応答において好中球の遊走を方向づけることにＢＬＴ１が重要であることを強調した。特に、５ＬＯ欠損マウス系統を使用して、好中球上のＢＬＴ１のオートクリン活性化が、関節炎を起こした関節への好中球の動員に必要であることが示された［１９］。
【０００９】
いくつかの市販薬が、エイコサノイドを標的とする。これらには、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）をモジュレートし、それにより、エイコサノイド前駆体であるアラキドン酸（ＡＡ）の放出を阻害するグルココルチコイド［２０］、ならびにプロスタグランジンおよびトロンボキサンの合成を防止する非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）および他のＣＯＸ２阻害剤が含まれる［２１］。ＬＴＢ４合成に必要な５−ＬＯ酵素を阻害する（ジロートン；［２２］）か、またはシステイニルロイコトリエンの効果を媒介するＣｙｓＬＴ１受容体と拮抗する（ザフィルルカストおよびモンテルカスト）［２３］かのいずれかの、いくつかのＬＫ調節物質もある。ＬＫ調節物質は、経口的に利用可能であり、例えば喘息の治療に使用するためにＦＤＡによって承認されている。ＬＴＢ４またはその受容体に特異的に作用する薬物は、まだ販売されていない。
【００１０】
自己免疫性水疱症（ＡＩＢＤ）
身体の最大の器官である皮膚は、異なる５層からできている。表皮は、皮膚の最も外側の保護層であり、これは、表皮（これと真皮が外皮を構成する）と皮下組織との間の真皮に接着している。真皮は、密で不規則な結合組織から主としてなり、基底膜を経由して表皮と堅固に結合している。真皮と表皮とが接着するために特殊なタンパク質および構造が必要であり、これらの層の分離が、水疱またはブラ（ｂｕｌｌａ）を発生させる。
【００１１】
通常の状況で、水疱は、皮膚の刺激または傷害に応答して発生するが、自己免疫性水疱症（ＡＩＢＤ）では、水疱は、デスモソームまたはヘミデスモソーム構造タンパク質を攻撃する自己抗体の結果として生じる。これらのタンパク質は、基底膜部の適正な機能に必須である。ＡＩＢＤでは、特異的構造またはタンパク質に対する自己抗体に起因する攻撃の結果として、表皮と真皮との接着が損傷され、その結果、最終的に表皮と真皮とが分離し、水疱が形成される。
【００１２】
したがって、ＡＩＢＤは、主として皮膚を冒す水疱病変が、皮膚抗原に対する自己抗体の結果として生じる一群の自己免疫障害である。一部のＡＩＢＤでは、水疱は、粘膜上（例えば、食道、肛門、口腔、鼻腔、生殖器および咽頭における）にも形成される可能性がある。
【００１３】
ＡＩＢＤ発生の危険因子には、高齢、薬物治療、ウイルス感染およびＵＶ照射またはＸ線への曝露が含まれる。
【００１４】
水疱疾患の特異的徴候および重症度は、個体間で異なり、場合により、水疱病変は、皮膚のかなりの部分に及ぶ可能性がある。ＡＩＢＤの治癒法はないが、治療法は存在する。このような治療なしでは、疾患は、生命にかかわる合併症を引き起こす可能性がある。
【００１５】
天疱瘡、類天疱瘡、ＩｇＡ介在皮膚疾患および後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）を含む、いくつかの異なる部類のＡＩＢＤがある。天疱瘡、類天疱瘡およびＩｇＡ介在皮膚疾患は、追加的なサブタイプにさらに分類することができる。
【００１６】
「天疱瘡」は、デスモグレインに対する抗体介在性自己免疫反応によって起こる一群の関連ＡＩＢＤに関する一般用語である。天疱瘡の２つの主な種類は、尋常性天疱瘡および落葉状天疱瘡である。
【００１７】
尋常性天疱瘡は、Ｄｓｇ３に対する自己抗体（患者の約５０％は、Ｄｓｇ１に対する自己抗体も有する）および容易に破れ、痛みのあるびらんを引き起こす水疱によって特徴づけられる最もよく見られる形態の天疱瘡である。ほとんどの場合に、尋常性天疱瘡は、口腔に初発し、皮膚の水疱形成が続くが、いかなる領域も潜在的に冒され得る。
【００１８】
落葉状天疱瘡は、速やかに破れて、皮膚の最上層を冒す、痒い、うろこ状の痂皮病変を形成する多数の小さな水疱によって特徴づけられる。通常、頭皮および顔が最初に冒される。ついには、胸、上背部が冒され得る。病変は、通常、痛まない。粘膜は、通常、冒されない。これらの患者は、Ｄｓｇ１に対する自己抗体を有する。
【００１９】
追加的な障害が、腫瘍随伴性天疱瘡（腫瘍から生じる、例えばＤｓｇ１およびＤｓｇ３に対する自己抗体を有するＡＩＢＤ）およびＩｇＡ天疱瘡（デスモコリンに対する自己抗体を有する）を含む、天疱瘡の亜型として分類されるときがある。
【００２０】
「類天疱瘡」は、水疱形成性の皮疹によって特徴づけられる関連疾患群を表すために使用される。類天疱瘡の主な形態は、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、および妊娠性類天疱瘡である。
【００２１】
水疱性類天疱瘡は、そう痒および緊満性の表皮下水疱によって特徴づけられる慢性皮膚疾患である。抗原ＢＰ１８０（ジストニンとも呼ばれる）およびそのＮＣ１６Ａドメイン（コラーゲンＸＶＩＩに局在）に対する自己抗体が観察される。この標的抗原は、ヘミデスモソーム抗原である。水疱は、数週間以内に鼠径部、腋窩、腹部、および屈筋の皮膚に広がることが多く、病変が皮膚のかなりの部分に広がるようになり、水疱が口腔内に形成され得る。ほとんど場合に、粘膜は冒されず、冒された場合も水疱は速やかに治癒する傾向にある。水疱性類天疱瘡の病変は、激しい痒みを伴うことが多い。
【００２２】
粘膜類天疱瘡（ＭＭＰ）（瘢痕性類天疱瘡（ＣＰ）とも呼ばれる）も、主として粘膜を冒す（主に口腔および眼であるが、鼻、咽頭、生殖器、および肛門も冒され得る）、表皮下水疱形成を伴う。ＭＭＰの徴候は、関与する特定の部位および疾患の進行に応じて罹患個体の間で様々である。自己抗原は、同じくＢＰ１８０に対するものであるが、様々な他の自己抗原が同定されている。
【００２３】
後天性表皮水疱症は、比較的稀である。この症状（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）では、ＢＰで見られるような表皮と真皮との分離が同様に見られる。ＶＩＩ型コラーゲン（表皮およびＢＭＺを真皮乳頭層と結合する係留線維を形成する）に対する自己抗体が、典型的には中年および高齢者を冒すこの自己免疫性皮膚障害に特徴的である。
【００２４】
大部分の形態は、中年の個体、通常は５０代および６０代の人々に発生する。しかし、自己免疫性水疱症は、小児を含むあらゆる年齢の個体を冒す可能性がある。これらの症状の全発病率および有病率は、特定の被験集団に応じて様々である。例えば、水疱性類天疱瘡は、西ヨーロッパで最もよく見られる免疫水疱性疾患であり、イギリスで毎年１００万人あたり４３人およびヨーロッパの他の地域で毎年１００万人あたり７〜１３人の発病率が報告されている［２４］。
【００２５】
ＡＩＢＤの診断は、臨床評価、および患者の詳細な病歴、ならびに例えば血中または皮膚生検での特徴的な自己抗体の同定に基づく。免疫蛍光アッセイが、好ましい診断方法である。
【００２６】
現在のところ、これらの障害の治癒法はないが、これらの障害は、例えばプレドニゾンなどのコルチコステロイドを用いて管理することができる。治療は、認容性良好ではなく、毒性を伴い得る［２４］。例えば、全身コルチコステロイド療法（例えば、プレドニゾンおよびプレドニゾロン）が有効であり得るが、これは、全ての症例で有効なわけではなく、高用量のコルチコステロイドによる長期治療が重篤な副作用を引き起こす可能性がある。ステロイドは、一般的で非特異的な抗炎症剤である。対象は、長期高用量ステロイドを続けられないので、このような症状の多くで、他の免疫抑制剤が「橋渡し」として使用される。
【００２７】
局所コルチコステロイドも使用されるが、広範囲の疾患におけるその使用は、現実的な要因（患者が治療を適用できること）により限定される場合があり、それらは、全身吸収および有害事象と関連し得る。免疫抑制薬（例えば、ダプソン、メチルプレドニゾロン、ミコフェノレート、アザチオプリンまたはシクロホスファミド）および免疫抑制生物学的療法（例えば、リツキシマブおよび静脈内免疫グロブリンＧ（ＩＶＩＧ））も使用されているが、有害作用を有し得る。
【００２８】
したがって、ＡＩＢＤを治療および予防する新しい治療法が、必要とされている。
【００２９】
補体阻害剤
ＷＯ２００４／１０６３６９（Ｅｖｏｌｕｔｅｃ  Ｌｉｍｉｔｅｄ［２５］）は、補体阻害剤に関する。開示される補体阻害剤の特定のサブセットは、Ｃ５に方向づけられ、補体活性化経路のいずれかによりＣ５がＣ５ａおよびＣ５ｂに開裂されるのを防止する。このようなＣ５開裂阻害剤の特定の例は、Ｏｒｎｉｔｈｄｏｒｏｓ  ｍｏｕｂａｔａ種のマダニによって産生されるタンパク質であり、このタンパク質は、ＷＯ２００４／１０６３６９の図４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１９〜１６８からなるタンパク質である。ＷＯ２００４／１０６３６９では、このタンパク質は、名称「ＥＶ５７６」および「ＯｍＣＩタンパク質」で知られており、より最近には、「コバーシン（Ｃｏｖｅｒｓｉｎ）」として知られている（例えば、２０１６年３月２８日にオンラインで公表された、Ｊｏｒｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｃ５  −  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｓｍｂ．３１９６を参照されたい）。このタンパク質は、本明細書において「コバーシン」と称される。
【００３０】
マダニにおいて、コバーシンは、成熟コバーシンタンパク質のＮ末端に、ＷＯ２００４／１０６３６９の図４に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１〜１８を含むリーダー配列を有するプレタンパク質として発現する。リーダー配列は、発現後に開裂除去される。成熟タンパク質は、ＷＯ２００４／１０６３６９の図４および本出願の図２に示されるアミノ酸配列のアミノ酸１９〜１６８からなる配列を有する。
【００３１】
コバーシンは、また、ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）活性を阻害する能力を有する。ＬＴＢ４と結合する能力は、当技術分野において公知の標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって、例えば、標識ＬＴＢ４への結合を競合するコバーシンと抗ＬＴＢ４抗体との間の競合ＥＬＩＳＡによって、等温滴定熱量測定によって、または蛍光滴定によって、実証され得る。
【００３２】
ＷＯ２００７／０２８９６８、ＷＯ２００８／０２９１６７、ＷＯ２００８／０２９１６９、ＷＯ２０１１／０８３３１７およびＷＯ２０１６／１９８１３３などの、様々な適用におけるコバーシンまたはその機能的等価物の使用に関するいくつかのさらなる特許出願がある。ＷＯ２０１５／１８５７６０は、コバーシンおよびその構造等価物が、例えば、市販のＣ５補体阻害剤エクリズマブの治療的有効性を減少させる、Ｃ５多型の開裂を防止するのに有効であることを開示している。これらの出願には、ＡＩＢＤの治療におけるコバーシンまたはその任意の機能的等価物の使用は、開示されていない。
【００３３】
ＡＩＢＤに関連して補体経路の潜在的役割が議論されているが、補体を標的化するＡＩＢＤの現在の治療はなく、これらの疾患の病態生理は、完全には理解されていない。そのうえ、水疱形成を直接に、かつ補体活性化なしに誘導できるという証拠もあり［２６］、これに基づき、補体活性化の防止ではなく、むしろ自己抗体の結合遮断を標的化する新しい治療法が、当技術分野において示唆されている［２６］。そのうえ、外因性Ｃ５ａまたはＩＬ−１７Ａは、Ｌｔｂ４ｒ１−／−マウスにおける類天疱瘡疾患様皮膚炎症に対する抵抗性を克服することができない［２７］。
【００３４】
同様に、ＬＴＢ４の役割が、ＡＩＢＤにおいて、具体的には当該疾患における好中球動員に関連して論じられているが、また、これらの症状のために現在承認されている治療は、この分子を標的としていない。
【００３５】
対照的に、本発明に至る研究では、上記のようにＬＴＢ４と結合し、また、Ｃ５に結合することにより補体経路を阻害する分子コバーシンは、ＡＩＢＤのマウスモデルにおいて水疱の罹患体表面積（ＡＢＳＡ）を減少させることが示された。コバーシンは、補体（Ｃ５を阻害することによる）およびまたＬＴＢ４の両方を阻害する能力を有し、したがって、単独または他のＡＩＢＤ治療との組合せにおいて、ＡＩＢＤの予防および治療に特に有利である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３６】
コバーシンは、ＥＢＡのマウスモデルにおいて罹患体表面積（ＡＢＳＡ）のパーセンテージを減少させることが示された。実施例１では、疾患の誘導前および誘導途中のコバーシンの投与が、コバーシンで治療されなかったマウスと比較して、ＡＢＳＡパーセンテージ（紅斑、水疱、びらん、痂皮、または脱毛を示す皮膚面積を決定すること、および皮膚病変（ＡＢＳＡ）に冒された総体表面のパーセンテージを計算することによって評価）の減少に繋がることが示された。他の薬剤（ジロートンおよびメチルプレドニゾロン）を使用した類似の実験と比較することにより、コバーシンの投与ではより大きい効果が観察でき、これは、より高い濃度（例えば２．５ｍｇ／ｋｇおよび０．２５ｍｇ／ｋｇ）で特に明白であった。したがって、コバーシンは、ＡＩＢＤの治療に現在使用されている全身免疫抑制薬（メチルプレドニゾロン）よりも有効であり、ＬＴＢ４阻害剤（ジロートン）よりも有効であるように見える。疾患の誘導後のコバーシンの投与が、また、ＡＢＳＡのパーセンテージの減少に繋がり得ることも示された（実施例２）。したがって、Ｃ５およびＬＴＢ４の両方を標的化するコバーシンの二重阻害活性は、ＡＩＢＤの治療に特に有利であるように見える。
【００３７】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する改変コバーシンポリペプチドを使用して、予防実験が行われた。この薬剤を使用して、ＡＢＳＡのパーセンテージにおける減少も観察された。Ｃ５結合活性およびＬＴＢ４結合活性の両方を有する薬剤が好ましいが、減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持するか、または減少したＬＴＢ４結合活性を有するか、またはＬＴＢ４結合活性を有さないが、Ｃ５結合能を保持する薬剤を、本発明に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００３８】
本発明者らは、それゆえ、マダニタンパク質コバーシン（当技術分野および本明細書においてＥＶ５７６およびＯｍＣＩとも称される［２５］）の投与が、ＡＩＢＤを治療または予防するために使用できることを実証した。
【００３９】
本発明は、それゆえ、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはこのタンパク質の機能的等価物である薬剤の治療または予防有効量を投与することを含む、ＡＩＢＤを治療または予防する方法を提供する。
【００４０】
本発明は、また、ＡＩＢＤを治療または予防する方法における使用のための、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはこのタンパク質の機能的等価物である薬剤を提供する。
【００４１】
本発明は、また、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはこのタンパク質の機能的等価物をコードする核酸分子である薬剤の治療または予防有効量を投与することを含む、ＡＩＢＤを治療または予防する方法を提供する。
【００４２】
本発明は、また、ＡＩＢＤを治療または予防する方法における使用のための、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはこのタンパク質の機能的等価物をコードする核酸分子である薬剤を提供する。
【００４３】
本発明は、また、（ａ）図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはこのタンパク質の機能的等価物である薬剤の治療または予防有効量、および（ｂ）第２のＡＩＢＤ治療を投与することを含む、ＡＩＢＤを治療または予防する方法を提供する。
【００４４】
本発明は、また、ＡＩＢＤを治療または予防する方法における使用のための、（ａ）図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはこのタンパク質の機能的等価物である薬剤、および（ｂ）第２のＡＩＢＤ治療を提供する。
【００４５】
本発明は、また、（ａ）図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはこのタンパク質の機能的等価物をコードする核酸分子である薬剤の治療または予防有効量、および（ｂ）第２のＡＩＢＤ治療を投与することを含む、ＡＩＢＤを治療または予防する方法を提供する。
【００４６】
本発明は、また、ＡＩＢＤを治療または予防する方法における使用のための、（ａ）図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはこのタンパク質の機能的等価物をコードする核酸分子である薬剤、および（ｂ）第２のＡＩＢＤ治療を提供する。
【００４７】
本発明は、また、ＡＩＢＤを治療もしくは予防するために必要とされる第２のＡＩＢＤ治療の量を減少させるか、またはＡＩＢＤを治療もしくは予防するために必要とされる第２のＡＩＢＤ治療による治療期間を減少させる方法であって、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質もしくはこのタンパク質の機能的等価物である薬剤または前記薬剤をコードする核酸分子の治療または予防有効量および前記第２のＡＩＢＤ治療を投与することを含む方法を提供する。
【００４８】
本発明は、また、ＡＩＢＤを有する対象における自己抗体力価を減少させる方法であって、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質もしくはこのタンパク質の機能的等価物である薬剤、または前記薬剤をコードする核酸分子の治療または予防有効量を投与することを含む方法を提供し、前記方法は、必要に応じて、第２のＡＩＢＤ治療を投与することを含み得る。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
疾患
対象は、ＡＩＢＤを有し得る、有する疑いがあり得る、または発生する危険があり得る。
【００５０】
ＡＩＢＤは、好ましくは、天疱瘡、類天疱瘡、ＩｇＡ介在性皮膚疾患および後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）から選択される。天疱瘡は、尋常性天疱瘡または落葉状天疱瘡であり得る。「類天疱瘡」は、水疱性類天疱瘡、粘膜類天疱瘡、および／または妊娠性類天疱瘡であり得る。好ましくは、ＡＩＢＤは、ＥＢＡまたは水疱性類天疱瘡である。実施例に使用されるマウスモデルは、ＥＢＡについてのモデルであるが、他のＡＩＢＤ、特に水疱性類天疱瘡に関しても有益である。原因メカニズムは、全てのＡＩＢＤについて類似であり、すなわち、免疫複合体の形成ならびに特に好中球および／または好酸球が強く関与する免疫応答の同化である。
【００５１】
これらの疾患の存在は、当技術分野において十分に理解されている日常的な診断によって決定され得る（例えば、［２８］を参照されたい）。
【００５２】
ＡＩＢＤを発生する危険がある対象は、ＡＩＢＤを予防するために本明細書において言及される薬剤の投与から利益を受け得る。ＡＩＢＤ、特に水疱性類天疱瘡についての危険因子には、遺伝因子および他の誘導因子が含まれる［２９］。ＢＰおよび粘膜類天疱瘡を有する患者における主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ  ＩＩ）遺伝子ＨＬＡ−ＤＱＢ１＊０３０１の存在に関する遺伝的素因の報告がある。ミトコンドリアにコードされるＡＴＰシンターゼ８遺伝子（ＭＴ−ＡＴＰ８）における多型は、ＢＰの病原性と関連性を有し得る。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子多型およびＦＣガンマＲＩＩＩａの多型も含まれる。
【００５３】
他の誘導因子には、
１．  薬物：大部分のＢＰ誘導医薬は、スルフヒドリル基を含有または遊離する（ペニシラミン、カプトプリル、ペニシリンおよびその誘導体、フロセミド、ならびにいくつかのセファロスポリン）。フェノール環含有薬物（一部のセファロスポリンおよびアセチルサリチル酸）、カプトプリル以外のアンジオテンシン変換酵素阻害剤、大部分の非ステロイド系抗炎症薬、ワクチンなどの免疫調節薬、ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ阻害剤（グリプチン）、特にビルダグリプチン、およびＴＮＦ−α遮断薬も、ＢＰを誘導すると報告されている。
２．  ウイルス：ワクチン接種後
３．  ＵＶまたはＸ線照射
が含まれる。
【００５４】
ＢＰ患者の約３分の１が、神経精神疾患；脳卒中、認知症、パーキンソン病などを有する。
【００５５】
これらの危険因子のうち１または２以上を有する対象は、ＡＩＢＤの治療または予防に関して好ましい。
【００５６】
投与成績
対象は、治療の結果として、徴候の発生率の減少、徴候の軽減、徴候の発生もしくは再発生の阻害もしくは遅延、またはその組合せを有し得る。好ましくは、治療は、典型的な疾患症状の徴候の減少を生じる。例えば、これは、水疱のサイズの減少、水疱の数の減少、罹患した体表面のパーセンテージの減少、水疱の滲出度の減少、そう痒症の減少、または水疱に起因する感染症の発生率および／または重症度の減少に現れ得る。一部の対象は、徴候の完全消散を有し、さらなる再発を有さない。
【００５７】
臨床スコア付けは、類天疱瘡疾患活動度指数（Ｂｕｌｌｏｕｓ  Ｐｅｍｐｈｉｇｏｉｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）（ＢＰＤＡＩ）［３０］を使用して実施し得る。総合ＢＰＤＡＩは、２つのスコア：総ＢＰＤＡＩ活動度およびＢＰＤＡＩ損傷から構成される。総ＢＰＤＡＩ活動度スコアは、皮膚の水疱／びらん、皮膚の膨疹／紅斑、および粘膜の水疱／びらんという３つの下位成分の算術合計である。
【００５８】
ＢＰＤＡＩ損傷スコアは、炎症後の色素沈着過剰、瘢痕化およびその他などのより永続的な特徴によって起こる損傷について領域的に評価した項目の算術合計である。ＢＰＤＡＩは、病変数およびサイズ閾値を定量する。病変は、罹患領域に基づき等級づけされる。ＢＰＤＡＩは、四肢などの、ＢＰにおいて主として冒される皮膚部位に追加的に重みづけし、ＢＰにおける臨床応答をより十分に識別するために、頭皮および顔面にあまり重きをおかない。
【００５９】
総合ＢＰＤＡＩスコアは、０〜３７２の範囲であり得る。ＢＰＤＡＩ活動度について最大３６０（総皮膚活動度について最大２４０［びらん／水疱について１２０、膨疹／紅斑について１２０］および粘膜活動度について１２０）、ならびにＢＰＤＡＩ損傷について０〜１２であり、スコアが高いほど疾患の活性またはダメージが大きいことを示す。総合ＢＰＤＡＩスコアは、対象の組み入れを判断するために使用される。
【００６０】
ＢＰＤＡＩは、また、ＢＰＤＡＩ−そう痒指数として公知の別の主観的尺度を有する。ＢＰＤＡＩそう痒成分は、過去２４時間（０〜１０）、過去１週間（０〜１０）および過去１ヶ月（０〜１０）の痒みの激しさを合計スコア３０で測定する視覚的アナログ尺度に基づく。
【００６１】
好ましくは、治療は、類天疱瘡疾患活動度指数（ＢＰＤＡＩ）によって測定される１または２以上の所見のスコアの減少を生じる。好ましくは、治療は、皮膚水疱／びらん、皮膚膨疹／紅斑および粘膜水疱／びらんのうち任意の１または２以上（例えば２または３つ）のスコアに減少を生じる。
【００６２】
一実施形態では、治療は、皮膚の水疱／びらんにのスコアに減少を生じる。一実施形態では、治療は、皮膚の膨疹／紅斑にのスコアに減少を生じる。一実施形態では、治療は、粘膜の水疱／びらんにのスコアに減少を生じる。一実施形態では、治療は、皮膚の水疱／びらんおよび皮膚の膨疹／紅斑にのスコアに減少を生じる。一実施形態では、治療は、皮膚の膨疹／紅斑および粘膜の水疱／びらんにのスコアに減少を生じる。一実施形態では、治療は、皮膚の水疱／びらんおよび粘膜の水疱／びらんにのスコアに減少を生じる。一実施形態では、治療は、ＢＰＤＡＩ−そう痒指数に関するスコアに減少を生じる。
【００６３】
一部の実施形態では、効果は、好中球および／または好酸球の関与の減少または防止によって媒介され得る。
【００６４】
治療は、また、疾患の１または２以上のステージの開始前、または疾患ステージの進行の間の潜在期間の増加を招き得る。一部の実施形態では、水疱形成が予防され得る。
【００６５】
治療は、また、自己免疫抗体力価の減少を招き得る。
【００６６】
治療は、また、必要とされる第２のＡＩＢＤ治療の量または期間の減少を招き得る。
【００６７】
したがって、本発明のさらなる実施形態では、ＡＩＢＤを有する対象における水疱のサイズおよび／または数を減少させるか、またはＡＩＢＤを有する対象における罹患体表面のパーセンテージを減少させる方法であって、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質もしくはこのタンパク質の機能的等価物である薬剤、または前記薬剤をコードする核酸分子の治療または予防有効量を投与することを含む方法が、提供される。これは、単独の場合または第２のＡＩＢＤ治療を伴い得る。
【００６８】
本発明は、また、ＡＩＢＤを有する対象における水疱のサイズおよび／または数を減少させるか、またはＡＩＢＤを有する対象における罹患体表面のパーセンテージを減少させる方法における使用のための、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質もしくはこのタンパク質の機能的等価物である薬剤、または前記薬剤をコードする核酸分子を提供する。これは、単独の場合または第２のＡＩＢＤ治療を伴い得る。
【００６９】
本発明の薬剤は、上述のように、他のＡＩＢＤ治療と組み合わせて使用することができる。本発明の薬剤と他の（本明細書において「第２の」と称されるＡＩＢＤ治療との組合せは、本発明の薬剤による治療の非存在下で使用される量と比較して、第２のＡＩＢＤの量が減少するか、または本発明の薬剤による治療の非存在下で使用される治療期間と比較して、第２のＡＩＢＤによる治療期間が減少するようなものであり得る。これは、ステロイド、例えば感染症、糖尿病、骨粗鬆症、血栓症、および消化管潰瘍などのある特定の公知の治療の副作用を考慮すると有利である。したがって、上記に詳述されるような、治療のために使用される第２のＡＩＢＤ治療の量を減少させるか、または第２のＡＩＢＤによる治療期間を減少させる方法も、提供される。
【００７０】
好ましくは、第２のＡＩＢＤ治療は、全身コルチコステロイド療法、局所コルチコステロイド療法、免疫抑制療法および免疫抑制生物学的療法から選択される。
【００７１】
好ましくは、コルチコステロイドは、プレドニゾンおよびプレドニゾロンから選択される。好ましくは、免疫抑制療法は、メチルプレドニゾロン、ミコフェノレート、アザチオプリン、抗炎症性抗生物質（例えばダプソン）およびシクロホスファミドから選択される。好ましくは、免疫抑制生物学的療法は、リツキシマブ、および静脈内免疫グロブリンＧ（ＩＶＩＧ）から選択される。
【００７２】
本発明の薬剤および第２のＡＩＢＤ治療が使用される場合、それらは、一緒または別々に投与され得る。本発明の薬剤は、最初に投与されてもよく、第２のＡＩＢＤ治療が２番目に投与されてもよい、またはその逆である。
【００７３】
したがって、例えば上記の方法において、本発明の薬剤が１または２以上の他のＡＩＢＤ治療と組み合わせて使用される場合、これは、第２のＡＩＢＤ治療によりＡＩＢＤを治療もしくは予防する方法における使用のための、または図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質もしくはこのタンパク質の機能的等価物である薬剤によりＡＩＢＤを治療もしくは予防する方法における使用のための第２のＡＩＢＤ治療としての、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはこのタンパク質の機能的等価物である薬剤として記載することができる。
【００７４】
治療が、第２のＡＩＢＤ治療の量、または第２のＡＩＢＤによる治療期間における減少を生じる場合、減少は、本発明の薬剤の非存在下で使用される第２のＡＩＢＤ治療の量と比較して、最大でまたは少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０％であり得る。
【００７５】
対象
好ましい対象、薬剤、用量およびその他は、本明細書に開示される通りである。
【００７６】
任意の減少または増加への任意の参照は、処置の非存在下での前記対象と比較される疾患パラメーターにおける減少または増加である。好ましくは、パラメーターは、定量でき、この場合、増加または減少は、好ましくは統計的に有意である。例えば、増加または減少は、治療の非存在下（例えば、前記治療が開始される前）のパラメーターと比較して、少なくとも３、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０％またはそれよりも大きくてもよい。
【００７７】
本発明の実施において薬剤が投与される対象は、好ましくは哺乳動物であり、好ましくはヒトである。薬剤が投与される対象は、ＡＩＢＤの危険があるか、またはＡＩＢＤを有する対象である。
【００７８】
本発明の方法は、また、（ｉ）対象がＡＩＢＤの危険を有するか、またはＡＩＢＤを有するかどうかを判定すること、（ｉｉ）コバーシンの投与前および／または後に実施され得る、ＡＩＢＤの重症度を決定することの、１または２以上の追加的なステップを含み得る。
【００７９】
本発明に使用すべき薬剤
本発明の一実施形態により、薬剤は、コバーシン自体またはその機能的等価物である。以下において、「コバーシン型タンパク質」という用語は、「図２に示されるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８を含むタンパク質またはその機能的等価物」についての略記として使用される。
【００８０】
コバーシンは、マダニＯｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｍｏｕｂａｔａの唾液腺から単離された。コバーシンは、リポカリンファミリーの遠いメンバーであり、補体活性化を阻害することが示された最初のリポカリンファミリーのメンバーである。コバーシンは、Ｃ５に結合し、Ｃ５コンバターゼによるＣ５のＣ５ａおよびＣ５ｂへの開裂を防止することによって、古典的補体経路、第二補体経路、およびレクチン補体経路を阻害することで、活性（例えば炎症促進性）ペプチドであるＣ５ａの産生およびＭＡＣの形成の両方を阻害する。コバーシンは、ラット、マウスおよびヒト血清中でＣ５に結合し、Ｃ５コンバターゼによるＣ５の開裂を約０．０２ｍｇ／ｍｌのＩＣ５０で防止することが実証されている。
【００８１】
したがって、コバーシン型タンパク質は、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１９〜１６８または図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１〜１６８を含むか、またはそれからなっていてもよい。図２に示されるタンパク質配列の最初の１８アミノ酸は、Ｃ５の結合またはＬＴＢ４結合活性に必要とされないシグナル配列を形成するので、これは、必要に応じて、例えば組換えタンパク質産生の効率のために、省かれ得る。
【００８２】
コバーシンタンパク質は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して決定された１ｎＭのＫｄでＣ５に結合することが実証されている［３１］。コバーシン型ペプチド（例えば、コバーシンタンパク質の機能的等価物）は、好ましくは、好適には３６０ｎＭ未満、より好適には３００ｎＭ未満、最も好適には２５０ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１５０ｎＭ未満、最も好ましくは１００ｎＭ未満、さらにより好ましくは５０、４０、３０、２０、または１０ｎＭ未満、有利には５ｎＭ未満のＫｄでＣ５と結合する能力を保持し、その際、前記Ｋｄは、好ましくは［３１］に記載された方法により、表面プラズモン共鳴を使用して決定される。
【００８３】
コバーシンは、古典的補体経路、第二補体経路およびレクチン補体経路を阻害する。好ましくは、コバーシン型タンパク質は、Ｃ５の全体的コンフォメーションを安定化するが、３つの活性化経路のＣ５コンバターゼによって標的化されるＣ５開裂部位を直接には遮断しないように、Ｃ５に結合する。Ｃ５へのコバーシンの結合は、Ｃ５の全体的コンフォメーションの安定化を招くが、コンバターゼ開裂部位を遮断しない。コバーシンの機能的等価物も、好ましくはこれらの特性を共有する。
【００８４】
Ｃ５は、Ｃ５コンバターゼ酵素によって開裂される（図１）。この開裂の産物は、アナフィラトキシンＣ５ａおよび溶解複合体Ｃ５ｂを含み、Ｃ５ｂは、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）としても公知の、Ｃ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８およびＣ９の複合体の形成を促進する。Ｃ５ａは、好中球および好酸球の走化性、好中球の活性化、毛細血管の透過性増加および好中球アポトーシスの阻害を含む多くの病的炎症過程に意味づけられている高度に炎症促進性のペプチドである［３２］。
【００８５】
Ｃ５と結合してそれを阻害するモノクローナル抗体および小分子が、様々な疾患、特に、ＰＮＨ、乾癬、関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよび移植片拒絶を治療するために開発されている［３３］。しかし、これらのモノクローナル抗体の一部は、Ｃ５多型を有する対象からのある特定のＣ５タンパク質に結合せず、したがって、これらの対象には無効である［３４］。好ましくは、コバーシン型タンパク質は、野生型Ｃ５だけでなく、Ｃ５多型（例えば、エクリズマブによる治療を無効にするか、またはエクリズマブによる治療の効力を減少させるＣ５多型）を有する対象からのＣ５にも結合し、その開裂を阻害する。「Ｃ５多型」という用語は、野生型Ｃ５と比較して、どれも１または２以上であり得る挿入、欠失、アミノ酸置換、フレームシフト、短縮化、またはこれらの変化の１または２以上の組合せによって変化された任意のバージョンのＣ５を含む。ヒト対象において、野生型Ｃ５は、受託番号ＮＰ＿００１７２６．２；バージョンＧＩ：３８０１６９４７を有するＣ５タンパク質と考えられている。Ｃ５多型の例には、ｍＡｂエクリズマブの有効性を減少させる、アミノ酸位置８８５での多型、例えば、Ａｒｇ８８５Ｃｙｓ（ｃ．２６５３Ｃ＞Ｔによってコードされる）、ｐ．Ａｒｇ８８５Ｈｉｓ（ｃ．２６５４Ｇ＞Ａによってコードされる）およびＡｒｇ８８５Ｓｅｒが含まれる［３４］。
【００８６】
Ｃ５多型、例えば、エクリズマブによる治療を無効にするか、またはエクリズマブによる治療の有効性を減少させるＣ５多型を有する対象からのＣ５を含むＣ５と結合する薬剤の能力は、当技術分野において公知の標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴、またはタンパク質をゲル上で標識Ｃ５と共にインキュベーションした後のウエスタンブロットにより決定され得る。好ましくは、コバーシン型タンパク質は、野生型Ｃ５および／またはＣ５多型、例えば、エクリズマブによる治療を無効にする、もしくはエクリズマブによる治療の有効性を減少させるＣ５多型を有する対象からのＣ５のいずれかであるＣ５と、３６０ｎＭ未満、より好適には３００ｎＭ未満、最も好適には２５０ｎＭ未満、好ましくは２００ｎＭ未満、より好ましくは１５０ｎＭ未満、最も好ましくは１００ｎＭ未満、さらにより好ましくは５０、４０、３０、２０、または１０ｎＭ未満、有利には５ｎＭ未満のＫｄで結合し、その際、前記Ｋｄは、表面プラズモン共鳴を使用して、好ましくは［３１］に記載される方法により決定される。
【００８７】
これは、野生型Ｃ５およびＣ５多型、例えばエクリズマブによる治療を無効にするか、またはエクリズマブによる治療の有効性を減少させるＣ５多型を有する対象からのＣ５に対して、より高い、より低いまたは同じ親和性を示し得る。
【００８８】
コバーシン型タンパク質が補体活性化を阻害する能力は、また、薬剤が血清中で補体活性化を阻害する能力を測定することによって決定され得る。例えば、血清中の補体の活性は、当技術分野において公知または本明細書に記載される任意の手段によって測定することができる。
【００８９】
コバーシン型タンパク質は、また、エイコサノイド活性を阻害する機能を有すると定義され得る。コバーシンは、また、ＬＴＢ４と結合すると実証されている。コバーシンタンパク質の機能的等価物もまた、コバーシンタンパク質と類似の親和性でＬＴＢ４と結合する能力を保持し得る。コバーシン型タンパク質が、Ｃ５結合能を保持しない場合、このようなコバーシン型タンパク質は、顕著なＬＴＢ−４結合能を保持するはずである。
【００９０】
コバーシン型タンパク質がＬＴＢ４と結合する能力は、当技術分野において公知の標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば、標識ＬＴＢ４への結合を競合するコバーシンと抗ＬＴＢ４抗体との間の競合ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定または蛍光滴定によって決定され得る。蛍光滴定を使用して得られるデータは、コバーシンがＬＴＢ４に、２００から３００ｐＭの間のＫｄで結合することを示している。例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のＬＴＢ４（Ｃａｙｍｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）に対する結合活性は、分光蛍光計、例えば、ＬＳ  ５０  Ｂ分光蛍光計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ、ＵＳＡ）で定量することができる。これは、以下のように実施され得る。
【００９１】
ＰＢＳ２ｍＬ中の１００ｎＭ精製コバーシン溶液を、磁器スターラーを備える石英キュベット（１０ｍｍ経路長；Ｈｅｌｌｍａ、Ｍｕｈｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中に加えた。温度を２０℃に調整し、平衡に達した後、タンパク質のＴｙｒ／Ｔｒｐの蛍光を２８０ｎｍで励起させた（スリット幅：１５ｎｍ）。最大発光に対応する蛍光発光を３４０ｎｍで測定した（スリット幅：１６ｎｍ）。ＰＢＳ中の３０μＭ  ＬＴＢ４リガンド溶液を、最大体積２０μＬ（全試料体積の１％）まで段階的に添加し、３０秒インキュベーション後に定常状態の蛍光を測定した。ＫＤ値の計算のために、初期蛍光強度１００％に対してデータを規準化し、３μＭ  Ｎ−アセチル−トリプトファンアミド溶液の滴定を使用してインナーフィルター効果を補正し、対応するリガンド濃度に対してデータをプロットした。次に、二分子複合体の形成に関する質量作用の法則に基づく非線形最小二乗回帰を使用して、公表された式（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔら、２００６）［３５］を用いてＯｒｉｇｉｎソフトウェアバージョン８．５（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）によりデータをフィットした。
【００９２】
コバーシンは、１ｎＭ未満、より好適には０．９ｎＭ未満、最も好適には０．８ｎＭ未満、好ましくは０．７ｎＭ未満、より好ましくは０．６ｎＭ未満、最も好ましくは０．５ｎＭ未満、さらにより好ましくは０．４ｎＭ未満、有利には０．３ｎＭ未満のＫｄでＬＴＢ４と結合し得、その際、前記Ｋｄは、蛍光滴定を使用して、好ましくは上記方法により決定される。コバーシン型タンパク質は、好ましくはこれらの特性を共有する。
【００９３】
コバーシン型タンパク質（例えば、減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する改変コバーシンポリペプチド）は、例えば、５ｎＭ未満、２ｎＭ未満または１ｎＭ未満、より好適には０．９ｎＭ未満、最も好適には０．８ｎＭ未満、好ましくは０．７ｎＭ未満、より好ましくは０．６ｎＭ未満、最も好ましくは０．５ｎＭ未満、さらにより好ましくは０．４ｎＭ未満、有利には０．３ｎＭ未満のＫｄでＬＴＢ４と結合し得、その際、前記Ｋｄは、蛍光滴定を使用して、好ましくは上記方法により決定される。
【００９４】
本発明の一実施形態により、コバーシン型タンパク質は、野生型Ｃ５およびＣ５多型、例えばエクリズマブによる治療を無効にするか、またはエクリズマブによる治療の有効性を減少させるＣ５多型を有する対象からのＣ５の両方、ならびにＬＴＢ４に結合し得る。
【００９５】
したがって、コバーシン型タンパク質は、Ｃ５コンバターゼによる補体Ｃ５の補体Ｃ５ａおよび補体Ｃ５ｂへの開裂を防止するように、ならびにまたＬＴＢ４活性を阻害するように作用し得る。Ｃ５およびＬＴＢ４の両方に結合する薬剤を使用することが特に有利である。Ｃ５およびエイコサノイド経路は、いずれも、ＡＩＢＤで観察される病理であり得る。したがって、ＡＩＢＤに関与する複数の経路を阻害する単一薬剤を使用することによって、補体介在性疾患および障害の炎症作用に関与する単一の経路だけを阻害する薬剤を使用することと比較して、増強した効果を達成することができる。そのうえ、単一の分子を投与することに関連する実用上の利点がある。
【００９６】
好ましくは、本発明の薬剤は、吸血性節足動物に由来する。「吸血性節足動物」という用語は、適切な宿主から餌として血を吸う、昆虫、マダニ、シラミ、ノミおよびダニなどの全ての節足動物を含む。好ましくは、本薬剤は、マダニ、好ましくは、マダニＯｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｍｏｕｂａｔａに由来する。
【００９７】
コバーシンの機能的等価物は、それが野生型Ｃ５もしくはＣ５多型を有する対象からのＣ５のいずれかのＣ５に結合する能力およびＣ５コンバターゼによるＣ５のＣ５ａおよびＣ５ｂへの開裂を防止する能力を保持する、コバーシンの相同体または断片であり得る。その相同体または断片は、また、ＬＴＢ４と結合する能力を保持し得る。
【００９８】
コバーシンの機能的等価物は、特に、野生型Ｃ５もしくはＣ５多型、例えば、エクリズマブによる治療を無効にする、もしくはエクリズマブによる治療の有効性を減少させるＣ５多型を有する対象からのＣ５のいずれかであるＣ５、および／あるいはＬＴＢ４に結合するコバーシンの１または２以上の活性部位の環境において、コバーシンと構造的に類似であるか、または類似もしくは同一の三次構造を含有する、合成分子などの分子でもあり得る。Ｃ５およびＬＴＢ４への結合に必要とされるコバーシン中の正確なアミノ酸残基は、上に示されるＪｏｒｅらの参考文献に示されている。
【００９９】
相同体は、例えば、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、Ｒ．ｂｕｒｓａ、Ａ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ、Ａ．ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ、Ａ．ｈｅｂｒａｅｕｍ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ、Ｂ．ａｎｎｕｌａｔｕｓ、Ｂ．ｄｅｃｏｌｏｒａｔｕｓ、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓ、Ｄ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉ、Ｄ．ｍａｒｇｉｎａｔｕｓ、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ、Ｈａ．ｌｅａｃｈｉｉ、Ｈａ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｈｙａｌｏｍｍａ  ａｎａｔｏｌｉｃｕｍ  ａｎａｔｏｌｉｃｕｍ、Ｈｙ．ｄｒｏｍｅｄａｒｉｉ、Ｈｙ．ｍａｒｇｉｎａｔｕｍ  ｍａｒｇｉｎａｔｕｍ、Ｉｘｏｄｅｓ  ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｉ．ｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓ、Ｉ．ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ、Ｉ．ｈｅｘａｇｏｎｕｓ、Ａｒｇａｓ  ｐｅｒｓｉｃｕｓ、Ａ．ｒｅｆｌｅｘｕｓ、Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｅｒｒａｔｉｃｕｓ、Ｏ．ｍｏｕｂａｔａ  ｍｏｕｂａｔａ、Ｏ．ｍ．ｐｏｒｃｉｎｕｓ、およびＯ．ｓａｖｉｇｎｙｉを含む他のマダニ種からのコバーシンタンパク質配列を含む、図２に明示的に特定されるコバーシン配列のパラログおよびオルソログを含む。
【０１００】
「相同体」という用語は、また、イエカ属（Ｃｕｌｅｘ）、ハマダラカ属（Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ）およびヤブカ属（Ａｅｄｅｓ）の種、特にＣｕｌｅｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉおよびＡｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅを含むカ種；ノミ種、例えばＣｔｅｎｏｃｅｐｈａｌｉｄｅｓ  ｆｅｌｉｓ（ネコノミ）；アブ；スナバエ；ブユ；ツェツェバエ；シラミ；ダニ；ヒル；および扁虫からの同等のコバーシンタンパク質配列を含むことが意味される。ネイティブなコバーシンタンパク質は、Ｏ．ｍｏｕｂａｔａにおいて約１８ｋＤａの別の３つの形態で存在すると考えられており、「相同体」という用語は、コバーシンのこれらの代替形態を含むことが意味される。
【０１０１】
図２に示されるコバーシン配列の相同体を同定する方法は、当業者に明らかであろう。例えば、相同体は、公的配列データベースおよび非公的配列データベースの両方の相同性検索によって同定され得る。好適には、公的に入手可能なデータベースが使用され得る。とはいえ、非公的または商業的に利用可能なデータベースは、特に、それらが公的データベースに表されていないデータを含むならば、等しく有用である。一次データベースは、一次ヌクレオチド配列または一次アミノ酸配列データの寄託サイトであり、公的または商業的に利用可能であり得る。公的に利用可能な一次データベースの例には、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）、ＥＭＢＬデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／）、ＤＤＢＪデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴタンパク質データベース（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｈｃｕｇｅ．ｃｈ／）、ＰＩＲ（ｈｔｔｐ：／／ｐｉｒ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ／）、ＴｒＥＭＢＬ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／）、ＴＩＧＲデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ参照）、ＮＲＬ−３Ｄデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｂｒｆａ．ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ．ｅｄｕ）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｃｓｂ．ｏｒｇ／ｐｄｂ）、ＮＲＤＢデータベース（ｆｔｐ：／／ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ｎｒｄｂ／ＲＥＡＤＭＥ）、ＯＷＬデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｃｈｅｍ．ｕｃｌ．ａｃ．ｕｋ／ｂｓｍ／ｄｂｂｒｏｗｓｅｒ／ＯＷＬ／）および二次データベースＰＲＯＳＩＴＥ（ｈｔｔｐ：／／ｅｘｐａｓｙ．ｈｃｕｇｅ．ｃｈ／ｓｐｒｏｔ／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｈｔｍｌ）、ＰＲＩＮＴＳ（ｈｔｔｐ：／／ｉｕｐａｂ．ｌｅｅｄｓ．ａｃ．ｕｋ／ｂｍｂ５ｄｐ／ｐｒｉｎｔｓ．ｈｔｍｌ）、Ｐｒｏｆｉｌｅｓ（ｈｔｔｐ：／／ｕｌｒｅｃ３．ｕｎｉｌ．ｃｈ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＰＦＳＣＡＮ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）、Ｐｆａｍ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓａｎｇｅｒ．ａｃ．ｕｋ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｆａｍ）、Ｉｄｅｎｔｉｆｙ（ｈｔｔｐ：／／ｄｎａ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｉｄｅｎｔｉｆｙ／）およびＢｌｏｃｋｓ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｌｏｃｋｓ．ｆｈｃｒｃ．ｏｒｇ）データベースが含まれる。商業的に利用可能なデータベースまたは非公的データベースの例には、ＰａｔｈｏＧｅｎｏｍｅ（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．）およびＰａｔｈｏＳｅｑ（以前はＩｎｃｙｔｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．のもの）が含まれる。
【０１０２】
典型的には、２つのポリペプチドの間の（好ましくは、活性部位などの特定領域にわたる）３０％よりも大きい同一性は、機能的等価性の指標、したがって、２つのタンパク質が相同である指標であると考えられる。好ましくは、相同体であるタンパク質は、図２で特定されるコバーシンタンパク質配列（配列番号２）と６０％よりも大きい配列同一度を有する。より好ましい相同体は、図２に示されるコバーシンタンパク質配列（配列番号２）とそれぞれ７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％よりも大きい同一度を有する。本明細書において言及される同一性パーセンテージは、ＢＬＡＳＴバージョン２．１．３を使用して、ＮＣＢＩ（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）によって明示されるデフォルトパラメーター［Ｂｌｏｓｕｍ  ６２行列；ギャップ開始ペナルティー＝１１およびギャップ伸長ペナルティー＝１］を使用して決定されるものである。％同一性は、関連参照配列（例えば配列番号２のアミノ酸１〜１６８または配列番号２のアミノ酸１９〜１６８）の完全長にわたり得る。
【０１０３】
したがって、コバーシン型タンパク質は、参照配列、例えば図２、配列番号２のアミノ酸１９〜１６８または図２、配列番号２のアミノ酸１〜１６８に対するある特定のアミノ酸配列同一性％への参照により、例えば、図２、配列番号２のアミノ酸１９〜１６８または図２、配列番号２のアミノ酸１〜１６８と少なくとも６０％，７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する配列を含むか、またはそれからなるタンパク質として記載することができる）。コバーシン型タンパク質が前記配列を含む場合、コバーシン型タンパク質は、融合タンパク質（例えば別のタンパク質、例えば異種タンパク質との）であり得る。適切な第２のタンパク質を以下に述べる。
【０１０４】
図２に示されるコバーシンタンパク質配列の機能的等価物には、野生型配列からの、例えば、１、２、３、４、５、７、１０もしくはより多くのアミノ酸、または最大で１、２、３、４、５、７もしくは１０のアミノ酸のアミノ酸置換、挿入または欠失（例えば、ＮもしくはＣ末端からの欠失）を含む変異体が含まれるが、但し、このような変異体は、野生型Ｃ５および／またはＣ５多型（例えば、エクリズマブによる治療を無効にする、もしくはエクリズマブによる治療の有効性を減少させるＣ５多型）を有する対象からのＣ５ならびに／またはＬＴＢ４と結合する能力を保持する。これは、関連する参照配列（例えば、配列番号２のアミノ酸１〜１６８または配列番号２のアミノ酸１９〜１６８）と比べたものである。したがって、変異体には、タンパク質の機能または活性に不利に影響しない保存的アミノ酸置換を含むタンパク質が含まれる。本用語は、また、天然生物学的バリアント（例えば、コバーシンタンパク質が由来する種内の対立遺伝子バリアントまたは地理的変異）を含むことが意図される。野生型Ｃ５および／またはＣ５多型（例えば、エクリズマブによる治療を無効にする、もしくはエクリズマブによる治療の有効性を減少させるＣ５多型）を有する対象からのＣ５ならびに／またはＬＴＢ４と結合する改善された能力を有する変異体は、また、タンパク質配列中の特定の残基の系統的または定方向変異により設計され得る。
【０１０５】
コバーシンの機能的等価物には、コバーシンタンパク質の断片が含まれるが、但し、このような断片は、野生型Ｃ５および／またはＣ５多型（例えば、エクリズマブによる治療を無効にする、もしくはエクリズマブによる治療の有効性を減少させるＣ５多型）を有する対象からのＣ５ならびに／またはＬＴＢ４と結合する能力を保持する。断片には、例えば、１５０アミノ酸未満、１４５アミノ酸未満である、コバーシンタンパク質配列（または相同体）由来のポリペプチドが含まれ得るが、但し、これらの断片は、補体野生型Ｃ５および／またはＣ５多型（例えば、エクリズマブによる治療を無効にする、もしくはエクリズマブによる治療の有効性を減少させるＣ５多型）を有する対象からのＣ５ならびに／またはＬＴＢ４と結合する能力を保持する。断片には、例えば、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも１４５アミノ酸であるコバーシンタンパク質配列（または相同体）に由来するポリペプチドが含まれ得るが、但し、これらの断片は、補体野生型Ｃ５および／またはＣ５多型（例えば、エクリズマブによる治療を無効にする、もしくはエクリズマブによる治療の有効性を減少させるＣ５多型）を有する対象からのＣ５ならびに／またはＬＴＢ４と結合する能力を保持する。
【０１０６】
任意の機能的等価物またはその断片は、好ましくは、コバーシン中に見出されるシステイン残基のパターンを保持する。例えば、前記機能的等価物は、図２におけるアミノ酸配列（配列番号２）のアミノ酸１〜１６８による配列のアミノ末端からカルボキシル末端に配列したときに３２アミノ酸離れた、６２アミノ酸離れた、２８アミノ酸離れた、１アミノ酸離れたおよび２１アミノ酸離れた距離で相互に間隔が空いた６つのシステイン残基を含む。コバーシンタンパク質の例示的な断片は、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４に開示されている。対応する断片をコードするＤＮＡは、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３に開示されている。
【０１０７】
本明細書の図２に明示的に特定されるＯ．ｍｏｕｂａｔａコバーシンタンパク質の断片だけでなく、上記のようなこのタンパク質の相同体の断片も、このような断片として含まれる。相同体のこのような断片は、典型的には図２におけるコバーシンタンパク質配列の断片と６０％よりも大きい同一性を有するが、相同体のより好ましい断片は、図２におけるコバーシンタンパク質配列の断片とそれぞれ７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％よりも大きい同一度を示す。好ましくは、このような断片は、上述のシステイン間隔を保持する。改善された特性を有する断片は、もちろん、野生型配列の系統的変異または断片化に続く適切な活性アッセイによって合理的に設計され得る。断片は、Ｃ５の野生型もしくは多型バリアントの一方もしく両方のＣ５および／またはＬＴＢ４に対してコバーシンと類似またはより大きい親和性を示し得る。これらの断片は、コバーシンタンパク質の断片について上記されたサイズであり得る。
【０１０８】
上記のように、コバーシン型タンパク質は、好ましくは、野生型Ｃ５および／またはＣ５多型（例えば、エクリズマブによる治療を無効にする、もしくはエクリズマブによる治療の有効性を減少させるＣ５多型）を有する対象からのＣ５ならびにＬＴＢ４の両方に結合する。減少したＣ５結合能を有するか、またはＣ５結合能を有さないが、ＬＴＢ４結合活性を保持するコバーシン型タンパク質も、また、本発明に使用され得る。
【０１０９】
Ｃ５結合能を保持しないが、ＬＴＢ−４結合活性を保持するコバーシン型タンパク質は、例えば、２０１７年４月２１日に出願された同時係属のＵＫ特許出願ＧＢ１７０６４０６．４（出願者参照番号Ｐ０７０４７５ＧＢ）および本出願が出願されたのと同じ日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１８／××××××（出願者参照番号Ｐ０７０４７５ＷＯ）に開示されており、これらの全内容は、参照により本明細書に組み込まれている。減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持するこのようなコバーシン型タンパク質は、本発明の全ての態様に使用され得る。
【０１１０】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持するこのようなコバーシン型タンパク質は、以下の配列を含むか、またはそれからなっていてもよい。
配列番号２２（ＧＢ１７０６４０６．４の配列番号５）は、配列番号４が、Ｍｅｔ１１４をＧｌｎに、Ｍｅｔ１１６をＧｌｎに、Ｌｅｕ１１７をＳｅｒに、Ａｓｐ１１８をＡｓｎに、Ａｌａ１１９をＧｌｙに、Ｇｌｙ１２０をＳｅｒに、Ｇｌｙ１２１をＡｌａに、Ｌｅｕ１２２をＡｓｐに、Ｇｌｕ１２３をＡｓｐにおよびＶａｌ１２４をＬｙｓに変更するように改変された改変コバーシンのアミノ酸配列である。（コバーシンバリアント１）
配列番号２３（ＧＢ１７０６４０６．４の配列番号６）は、配列番号４が、Ａｌａ４４をＡｓｎに、Ｍｅｔ１１６をＧｌｎに、Ｌｅｕ１１７をＳｅｒに、Ｇｌｙ１２１をＡｌａに、Ｌｅｕ１２２をＡｓｐに、Ｇｌｕ１２３をＡｌａにおよびＡｓｐ１４９をＧｌｙに変更するように改変された改変コバーシンのアミノ酸配列である。（コバーシンバリアント２）
配列番号２４（ＧＢ１７０６４０６．４の配列番号７）は、配列番号４が、Ａｌａ４４をＡｓｎに、Ｍｅｔ１１６をＧｌｎに、Ｌｅｕ１２２をＡｓｐにおよびＡｓｐ１４９をＧｌｙに変更するように改変された改変コバーシンのアミノ酸配列である。（コバーシンバリアント３）
配列番号２５（ＧＢ１７０６４０６．４の配列番号８）は、配列番号４が、Ａｌａ４４をＡｓｎに変更するように改変された改変コバーシンのアミノ酸配列である。（コバーシンバリアント４）
配列番号２６（ＧＢ１７０６４０６．４の配列番号９）は、配列番号４のアミノ酸位置１１４〜１２４（配列番号２のアミノ酸位置１３２〜１４２）のベータＨとアルファ２との間のループのアミノ酸配列である。
配列番号２７（ＧＢ１７０６４０６．４の配列番号１０）は、コバーシンバリアント１における配列番号４（配列番号２２）のアミノ酸位置１１４〜１２４のベータＨとアルファ２との間のループのアミノ酸配列である。
配列番号２８（ＧＢ１７０６４０６．４の配列番号１１）は、コバーシンバリアント２における配列番号４（配列番号２３）のアミノ酸位置１１４〜１２４のベータＨとアルファ２との間のループのアミノ酸配列である。
配列番号２９（ＧＢ１７０６４０６．４の配列番号１２）は、コバーシンバリアント３における配列番号４（配列番号２４）のアミノ酸位置１１４〜１２４のベータＨとアルファ２との間のループのアミノ酸配列である。
【０１１１】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持するコバーシン型ポリペプチドは、改変コバーシンポリペプチド（例えば、ロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイド結合活性を示し、減少したＣ５結合性を示す、またはＣ５結合性を示さない）として記載され得る。「改変コバーシンポリペプチド」への言及は、配列番号２または配列番号４のいずれかの改変バージョン、すなわち、配列番号２のＮ末端に見られる１８アミノ酸のシグナル配列を有するか、または有さないコバーシンポリペプチドへの言及として理解されたい。
【０１１２】
このようなポリペプチドは、ロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイド結合活性を示し、減少したＣ５結合性を示すか、またはＣ５結合性を示さなくてもよく、１〜３０のアミノ酸置換がなされた配列番号４、但し、
（ｉ）配列番号４の１１４〜１２４位に、以下の置換（ａ）〜（ｊ）：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；
ｂ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；
ｃ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＰｒｏで置換されている；
ｄ．  Ａｓｐ１１８が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；
ｅ．  Ａｌａ１１９が、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
ｆ．  Ｇｌｙ１２０が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
ｇ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
ｈ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
ｉ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；
ｊ．  Ｖａｌ１２４が、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている
のうち１または２以上がなされており；または／および
（ｉｉ）配列番号４中のＡｌａ４４が、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている］
または改変コバーシンポリペプチドのＮ末端から最大５つのアミノ酸が欠失されているその断片を含み得る。
【０１１３】
本明細書に使用されるＬＫ／Ｅ結合活性は、ＬＴＢ４、Ｂ４イソロイコトリエンおよびその任意のヒドロキシル化誘導体、ＨＥＴＥ、ＨＰＥＴＥならびにＥＥＴを含むが、それに限定されないロイコトリエンおよびヒドロキシエイコサノイドに結合する能力を表す。ＬＴＢ４結合性が、特に関心対象である。
【０１１４】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する改変コバーシンポリペプチドは、下の説明により改変された、配列番号２もしくは４からなっているか、または下の説明により改変された配列番号２もしくは４を含んでいてもよい。
【０１１５】
配列番号２および配列番号４における未改変コバーシンポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸位置１１４〜１２４（配列番号２のアミノ酸位置１３２〜１４２）のベータＨとアルファ２との間のループを特徴とする。このループは、以下に示される配列を有する：
−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−      （配列番号２６）
最初のＭｅｔは、配列番号４の１１４位および配列番号２の１３２位にある。
【０１１６】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないがＬＴＢ−４結合能を保持する改変コバーシンポリペプチドにおいて、配列番号２または配列番号４のコバーシンポリペプチドは、配列番号４の１１４〜１２４位に以下の置換（ａ）〜（ｊ）：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎまたはＡｌａで置換されている；
ｂ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎまたはＡｌａで置換されている；
ｃ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＰｒｏ、好ましくはＳｅｒまたはＡｌａで置換されている；
ｄ．  Ａｓｐ１１８が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ  Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＡｓｎで置換されている；
ｅ．  Ａｌａ１１９が、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＧｌｙまたはＡｓｎで置換されている；
ｆ．  Ｇｌｙ１２０が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＳｅｒまたはＡｓｎで置換されている；
ｇ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｌａまたはＡｓｎで置換されている；
ｈ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｓｐまたはＡｌａで置換されている；
ｉ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＡｓｐ、Ａｌａ、ＧｌｎまたはＡｓｎで置換されている；
ｊ．  Ｖａｌ１２４が、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＬｙｓまたはＡｌａで置換されている
のうち１または２以上がなされるように改変されている。
【０１１７】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないがＬＴＢ−４結合能を保持する改変コバーシンポリペプチドにおいて、配列番号２または配列番号４におけるコバーシンポリペプチドは、配列番号４の１１４〜１２４位に以下の置換（ａ）〜（ｊ）：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｃ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒで置換されている；
ｄ．  Ａｓｐ１１８が、Ａｓｎで置換されている；
ｅ．  Ａｌａ１１９が、Ｇｌｙで置換されている；
ｆ．  Ｇｌｙ１２０が、Ｓｅｒで置換されている；
ｇ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａで置換されている；
ｈ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている；
ｉ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐ、またはＡｌａで置換されている；
ｊ．  Ｖａｌ１２４が、Ｌｙｓで置換されている
のうち１または２以上がなされるように改変することができる。
【０１１８】
改変コバーシンポリペプチドにおいて、置換（ａ）〜（ｊ）のうち２、３、４、５、６、７、８、９、または１０が存在する。好ましくは、置換（ａ）〜（ｊ）のうち２つ以上、５つ以上または８つ以上が存在する。
【０１１９】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないがＬＴＢ−４結合能を保持する改変コバーシンポリペプチドにおいて、配列番号２または配列番号４におけるコバーシンポリペプチドは、配列番号４の１１４〜１２４位に以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｃ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒで置換されている；
ｄ．  Ａｓｐ１１８が、Ａｓｎで置換されている；
ｅ．  Ａｌａ１１９が、Ｇｌｙで置換されている；
ｆ．  Ｇｌｙ１２０が、Ｓｅｒで置換されている；
ｇ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａで置換されている；
ｈ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている；
ｉ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐで置換されている；
ｊ．  Ｖａｌ１２４が、Ｌｙｓで置換されている
が存在するように改変することができる。
【０１２０】
必要に応じて、上述の改変コバーシンポリペプチドにおいて、Ｔｒｐ１１５は置換されていない。好ましい改変コバーシンポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸位置１１４〜１２４のベータＨとアルファ２との間に、配列Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号２７）を有するループを有する。
【０１２１】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する改変コバーシンポリペプチドにおいて、コバーシンポリペプチドは、配列番号４の１１４〜１２４位に以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＰｒｏ、好ましくはＳｅｒで置換されている；
ｃ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｌａで置換されている；
ｄ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｓｐで置換されている；
ｅ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＡｓｐで置換されている
が存在するように改変することができる。
【０１２２】
より詳細な実施形態では；
ａ．  Ｍｅｔ１１６は、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１１７は、Ｓｅｒで置換されている；
ｃ．  Ｇｌｙ１２１は、Ａｌａで置換されている；
ｄ．  Ｌｅｕ１２２は、Ａｓｐで置換されている；
ｅ．  Ｇｌｕ１２３は、Ａｌａで置換されている。
【０１２３】
必要に応じて、上述のこの改変コバーシンポリペプチドでは、Ｔｒｐ１１５は置換されていない。必要に応じて、この実施形態では、Ｍｅｔ１１４、Ｔｒｐ１１５、Ａｓｐ１１８、Ａｌａ１１９、Ｇｌｙ１２０およびＶａｌ１２４は、置換されていない、または本明細書の他で言及されたように保存的置換で置換されている。減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないがＬＴＢ−４結合能を保持する好ましい改変コバーシンポリペプチドは、配列番号４のアミノ酸位置１１４〜１２４のベータＨとアルファ２との間に、配列Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ（配列番号２８）を有するループを有する。
【０１２４】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する改変コバーシンポリペプチドにおいて、コバーシンポリペプチドは、配列番号４の１１４〜１２４位で以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｓｐで置換されている；
が存在するように改変することができる。
【０１２５】
より詳細な実施形態では；
ａ．  Ｍｅｔ１１６は、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１２２は、Ａｓｐで置換されている。
【０１２６】
必要に応じて、上述のこの改変コバーシンポリペプチドにおいて、Ｔｒｐ１１５は、置換されていない。必要に応じて、この実施形態では、Ｍｅｔ１１４、Ｔｒｐ１１５、Ｌｅｕ１１７、Ａｓｐ１１８、Ａｌａ１１９、Ｇｌｙ１２０、Ｇｌｙ１２１、Ｇｌｕ１２３およびＶａｌ１２４は、置換されていない。減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する好ましい改変コバーシンポリペプチドは、配列Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌを有する配列番号４のアミノ酸位置１１４〜１２４（配列番号２９）のベータＨとアルファ２との間にループを有する。
【０１２７】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する改変コバーシンポリペプチドにおいて、コバーシンポリペプチドは、配列番号４中のＡｌａ４４（配列番号２中のＡｌａ６２）がＡｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されるように改変することができる。
【０１２８】
好ましい実施形態では、配列番号４中のＡｌａ４４は、Ａｓｎで置換されている。
【０１２９】
配列番号４の４４位（または配列番号２の６２位）でのこの置換は、本明細書に記載される他の置換のいずれかと組み合わせてなされ得る。
【０１３０】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないがＬＴＢ−４結合能を保持する別の改変コバーシンポリペプチドにおいて、コバーシンポリペプチドは、配列番号４の１１４〜１２４位に以下の置換（ａ）〜（ｊ）：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎまたはＡｌａ、例えばＧｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎまたはＡｌａ、例えばＧｌｎで置換されている；
ｃ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＰｒｏ、好ましくはＳｅｒまたはＡｌａ、例えばＳｅｒで置換されている；
ｄ．  Ａｓｐ１１８が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ  Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＡｓｎで置換されている；
ｅ．  Ａｌａ１１９が、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＧｌｙまたはＡｓｎ、例えばＧｌｙで置換されている；
ｆ．  Ｇｌｙ１２０が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＳｅｒまたはＡｓｎ、例えばＳｅｒで置換されている；
ｇ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｌａまたはＡｓｎ、例えばＡｌａで置換されている；
ｈ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｓｐまたはＡｌａ、例えばＡｓｐで置換されている；
ｉ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＡｓｐ、Ａｌａ、ＧｌｎまたはＡｓｎ、例えばＡｓｐまたはＡｌａで置換されている；
ｊ．  Ｖａｌ１２４が、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＬｙｓまたはＡｌａ、例えばＬｙｓで置換されている
のうち１または２以上が存在し、かつ追加的に、配列番号４中のＡｌａ４４（配列番号２中のＡｌａ６２）が、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｓｎで置換されるように改変することができる。
【０１３１】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する一部の改変コバーシンポリペプチドにおいて、コバーシンポリペプチドは、配列番号４の１１４〜１２４位に以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒで置換されている；
ｃ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａで置換されている；
ｄ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている；
ｅ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｌａで置換されている
が存在し、かつ配列番号４中のＡｌａ４４が、Ａｓｎで置換されるように改変することができる。
【０１３２】
本実施形態の好ましい態様では、配列番号４の１１４〜１２４位に対応するアミノ酸残基は、配列番号２８に示される通りである。
【０１３３】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する一部の改変コバーシンポリペプチドにおいて、コバーシンポリペプチドは、配列番号４の１１４〜１２４位に以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている
が存在し、かつ配列番号４中のＡｌａ４４がＡｓｎで置換されるように改変されている。
【０１３４】
本実施形態の好ましい態様では、配列番号４の１１４〜１２４位に対応するアミノ酸残基は、配列番号２９に示される通りである。
【０１３５】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する一部の改変コバーシンポリペプチドにおいて、コバーシンポリペプチドは、配列番号４中のＡｓｐ１４９が、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されるように改変することができる。一部の実施形態では、コバーシンポリペプチドは、配列番号４のＡｓｐ１４９がＧｌｙで置換されるように改変される。配列番号４の１４９位（配列番号２の１６７位）でのこの置換は、本明細書に記載される他の置換のうちいずれかと組み合わせてなされ得る。
【０１３６】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する一部の改変コバーシンポリペプチドにおいて、コバーシンポリペプチドは、配列番号４の１１４〜１２４位に以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒで置換されている；
ｃ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａで置換されている；
ｄ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている；
ｅ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｌａで置換されている
が存在し、配列番号４中のＡｌａ４４が、Ａｓｎで置換され、配列番号４のＡｓｐ１４９が、Ｇｌｙ１４９で置換されるように改変することができる。
【０１３７】
本実施形態の好ましい態様では、配列番号４の１１４〜１２４位に対応するアミノ酸残基は、配列番号２８に示される通りである。
【０１３８】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する一部の改変コバーシンポリペプチドにおいて、コバーシンポリペプチドは、配列番号４の１１４〜１２４位で以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている
が存在し、
配列番号４中のＡｌａ４４が、Ａｓｎで置換され、配列番号４のＡｓｐ１４９が、Ｇｌｙ１４９で置換されるように改変することができる。
【０１３９】
本実施形態の好ましい態様では、配列番号４の１１４〜１２４位に対応するアミノ酸残基は、配列番号２９に示される通りである。
【０１４０】
本開示の様々な態様および実施形態では、減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する改変コバーシンポリペプチドは、配列番号２および配列番号４における未改変コバーシンポリペプチドと１〜３０のアミノ酸が異なる。配列番号２および配列番号４におけるコバーシンポリペプチドに任意の修復がなされ得るが、但し、結果として生じる改変コバーシンポリペプチドが、未改変コバーシンポリペプチドと比較してＬＫ／Ｅ結合活性を示し、減少したＣ５結合性を示す、またはＣ５結合性を示さない。
【０１４１】
一部の実施形態では、配列番号４の６、３８、１００、１２８、１２９、１５０位にある６つのシステインアミノ酸は、本発明の改変コバーシンポリペプチドに保持されている。
【０１４２】
一部の改変コバーシンポリペプチドにおいて、配列番号４中のＡｓｎ６０およびＡｓｎ８４は、それぞれＧｌｎで置換されている。この改変は、ポリペプチドを酵母において発現させた場合に、Ｎ結合型高グリコシル化を防止するために部位特異的変異誘発により実施することができる。
【０１４３】
一部の改変コバーシンポリペプチドにおいて、配列番号４中の以下のアミノ酸：Ｐｈｅ１８、Ｔｙｒ２５、Ａｒｇ３６、Ｌｅｕ３９、Ｇｌｙ４１、Ｐｒｏ４３、Ｌｅｕ５２、Ｖａｌ５４、Ｍｅｔ５６、Ｐｈｅ５８、Ｔｈｒ６７、Ｔｒｐ６９、Ｐｈｅ７１、Ｇｌｎ８７、Ａｒｇ８９、Ｈｉｓ９９、Ｈｉｓ１０１、Ａｓｐ１０３、およびＴｒｐ１１５のうち１または２以上が、ＬＴＢ４との結合に関与すると考えられ、したがって、未改変形態で保持され得る。一部の改変コバーシンポリペプチドにおいて、これらのアミノ酸のうち少なくとも５、１０もしくは１５、または全てが、本発明の改変コバーシンポリペプチドにおいて未改変形態で保持されている。減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する一部の改変コバーシンポリペプチドにおいて、これらのアミノ酸のうち１または２以上が、保存的に置換され得る。減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する一部の改変コバーシンポリペプチドにおいて、これらのアミノ酸のうち最大で５、１０もしくは１５、または全てが、本発明の改変コバーシンポリペプチドにおいて保存的に置換されている。
【０１４４】
配列番号４中の以下の位置：５、６、１１、１３〜１５、２０〜２１、２４〜２７、２９〜３２、３５〜４１、４５、４７〜４８、５０、５２〜６０、６４、６６、６９〜８１、８３、８４、８６、９０〜９４、９７〜１０４、１１２〜１１３、１１５、１２５〜１２９、１３２〜１３９、１４５、１４８、および１５０のアミノ酸は、コバーシンとＴＳＧＰ２およびＴＳＧＰ３との間で高度に保存されている。
【０１４５】
配列番号４中の以下の位置：５、６、１１、１３〜１５、１８、２０〜２１、２４〜２７、２９〜３２、３５〜４１、４３、４５、４７〜４８、５０、５２〜６０、６４、６６、６７、６９〜８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０〜９４、９７〜１０４、１１２〜１１３、１１５、１２５〜１２９、１３２〜１３９、１４５、１４８、および１５０のアミノ酸は、ＬＴＢ４への結合に関与すると考えられ、および／またはコバーシンとＴＳＧＰ２およびＴＳＧＰ３との間で高度に保存されている。
【０１４６】
配列番号４中の以下の位置：５、６、１１、１３〜１５、１８、２０〜２１、２４〜２５、２７、３０〜３２、３５〜４１、４３、４７〜４８、５０、５２〜６０、６４、６６、６７、６９〜８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０〜９４、９８、１００、１０２〜１０４、１１２〜１１３、１１５、１２６、１２８〜１２９、１３２〜１３９、１４５、１４８、および１５０のアミノ酸は、ＬＴＢ４への結合に関与すると考えられ、および／またはコバーシンとＴＳＧＰ２およびＴＳＧＰ３との間で高度に保存されている。
【０１４７】
したがって、減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する一部の改変コバーシンポリペプチドにおいて、上記アミノ酸は、未改変形態で保持されている。一部の実施形態では、これらのアミノ酸のうち少なくとも５、１０もしくは１５、または全てが、本発明の改変コバーシンポリペプチドにおいて未改変形態で保持されている。一部の実施形態では、これらのアミノ酸のうち１または２以上が、保存的に置換され得る。一部の実施形態では、これらのアミノ酸のうち最大で５、１０もしくは１５、２０、２５、３０、４０、５０または全てが、本発明の改変コバーシンポリペプチドにおいて保存的に置換されている。
【０１４８】
本明細書に記載される改変コバーシンポリペプチドは、典型的には、配列番号２または配列番号４と１〜３０、好ましくは２〜２５、より好ましくは３〜２０、さらにより好ましくは４〜１５のアミノ酸が異なる。典型的には、差異は、５〜１２、または６〜１０のアミノ酸変化である。例えば、１〜３０、または２〜２５、３〜３０、４〜１５、５〜１２、または６〜１０のアミノ酸置換が、配列番号２または配列番号４になされ得る。
【０１４９】
配列番号４のアミノ酸位置１１４〜１２４（配列番号２のアミノ酸位置１３２〜１４２）のベータＨとアルファ２との間に配列番号２７に示されるようなループを有する改変コバーシンポリペプチドは、このループが存在する結果として配列番号４と比較して１０のアミノ酸置換を有する。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載される改変コバーシンポリペプチドは、好ましくは、配列番号２２に示される置換以外に配列番号４と比較して（例えば配列番号２７のループ中に）１〜１５、２〜１０、３〜５、または最大で２、３、４もしくは５の追加的な置換を有する。
【０１５０】
配列番号２８に示されるような、配列番号４のアミノ酸位置１１４〜１２４（配列番号２のアミノ酸位置１３２〜１４２）のベータＨとアルファ２との間にループを有する改変コバーシンポリペプチドは、このループが存在する結果として配列番号４と比較して５のアミノ酸置換を有する。したがって、一部の実施形態では、本明細書に記載される改変コバーシンポリペプチドは、好ましくは、配列番号２３に示される置換以外に配列番号４と比較して（例えば、配列番号２８のループ中に）１〜２０、２〜１５、３〜１０、または最大で２、３、４、５、６、７、８、９、１０の追加的な置換を有する。追加的な置換には、好ましくは、本明細書の他の箇所に示されるような４４位および１４９位の置換が含まれる。
【０１５１】
配列番号２９に示されるように配列番号４のアミノ酸位置１１４〜１２４（配列番号２のアミノ酸位置１３２〜１４２）のベータＨとアルファ２との間にループを有する改変コバーシンポリペプチドは、このループが存在する結果として配列番号４と比較して２のアミノ酸置換を有する。したがって、一部の実施形態では、改変コバーシンポリペプチドは、好ましくは、配列番号２４に示される置換以外に配列番号４と比較して１〜２５、２〜１２、３〜１５、または最大で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の追加的な置換（例えば、配列番号２９のループ中の置換）を有する。追加的な置換には、好ましくは、本明細書の他の箇所に示されるような４４位および１４９位の置換が含まれる。
【０１５２】
本明細書の他の箇所に示されるように配列番号４の４４位に置換を有する改変コバーシンポリペプチドは、好ましくは、配列番号４と比較して、１〜２５、２〜１２、３〜１５、または最大で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の追加的な置換を有する。
【０１５３】
上に明確に述べられる置換以外の置換は、好ましくは、例えば次の表による保存的置換である。第２列の同じブロック内にあり、好ましくは第３列の同じ行にあるアミノ酸は、相互に置換され得る。
【０１５４】
【表１】
2020517627.tif 000002
【０１５５】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する好ましい改変コバーシンポリペプチドは、配列番号２２、２３、２４、２５のうち１つに示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなっていてもよい。
【０１５６】
本発明は、また、減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、上述のＬＴＢ−４結合能を保持する改変コバーシンポリペプチドの断片であって、改変コバーシンポリペプチドのＮ末端から最大で５つのアミノ酸が欠失されている断片の使用を包含する。断片は、改変コバーシンポリペプチドのＮ末端からの１、２、３、４または５つの欠失に対応し得る。配列番号２または配列番号４のアミノ酸配列における他の位置からの欠失は、また、結果として生じるポリペプチドが改変コバーシンのＬＫ／Ｅ結合活性を保持し、減少した補体阻害剤活性を有するか、または補体阻害剤活性を有さないならば、本発明の一部を形成すると考えられる。
【０１５７】
減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する改変コバーシンポリペプチドが使用される場合、Ｃ５結合性は、例えば、配列番号２または４における未改変コバーシンポリペプチドによって示される結合性と比べて少なくとも２分の１、５分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、５０分の１、１００分の１に減少または消失し得る。Ｃ５結合性は、例えば、配列番号２または４における未改変コバーシンポリペプチドと比べて少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少し得る。改変コバーシンポリペプチドは、Ｒｏｖｅｒｓｉら（２０１３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８８、１８７８９〜１８８０２に記載される、またはＧＢ１７０６４０６．４の実施例２に示される方法に従って表面プラズマ共鳴（Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍａ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）によって決定されるとき、１マイクロモル濃度よりも大きいＫＤでＣ５と結合し得る。
【０１５８】
本発明により使用される機能的等価物は、例えば、異種タンパク質配列についてのコード配列のフレーム内に、コバーシンタンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングすることによって得られる融合タンパク質であり得る。本明細書に使用される「異種」という用語は、コバーシンタンパク質またはその機能的等価物以外の任意のポリペプチドを表すことが意図される。可溶性融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに含まれ得る異種配列の例は、以下：膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域）、ＰＡＳもしくはＸＴＥＮもしくは類似の構造不定のポリペプチド、多量体化ドメイン、細胞外タンパク質のドメイン、シグナル配列、搬出配列、またはアフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にする配列である。これらの異種配列の多くは、発現プラスミドに挿入して市販されており、それは、これらの配列と融合されたタンパク質の特異的生物学的活性を顕著に損なうことなく追加的な特性を提供するために、これらの配列が一般的に融合タンパク質に含まれるからである［３６］。このような追加的な特性の例は、体液中でより長く持続する半減期（例えば、Ｆｃ領域の付加またはＰａｓ化（Ｐａｓｙｌａｔｉｏｎ）［３７］の結果として生じる）、細胞外局在、またはヒスチジン、ＧＳＴ、ＦＬＡＧ、アビジンもしくはＨＡタグなどのタグによって可能になるような、より簡単な精製手順である。融合タンパク質は、追加的に、リンカー配列（例えば１〜５０アミノ酸長を含有し得、それにより、構成成分がこのリンカーによって分離される。
【０１５９】
したがって、融合タンパク質は、コバーシン様タンパク質を含むタンパク質の例であり、これらには、具体例としてＰＡＳ配列およびコバーシン型タンパク質配列を含むタンパク質が含まれる。ＰＡＳ配列は、例えば、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  Ｍら［３７］、およびＥＰ０８７７３５６７．６に記載されており、ＰＡＳ化コバーシン分子は、Ｋｕｈｎら［３８］に記載されている。ＰＡＳ化は、タンパク質と、アミノ酸Ｐｒｏ、Ａｌａ、および／またはＳｅｒから構成されるコンフォメーション的に無秩序なポリペプチド配列との遺伝的融合を説明している。これは、ＸＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｈｔｔｐ：／／ｘｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ．ｃｏｍ／）によって開発された技法であり、溶媒和したランダム鎖を大きな流体力学的体積で、それと融合されるタンパク質に結合させる簡単な方法を提供する。ポリペプチド配列は、かさ高いランダムコイル構造を採る。したがって、結果として生じる融合タンパク質のサイズは、それが融合されるタンパク質よりもずっと大きい。これは、生体システム中のクリアランスを減少させることが示されている。適切なＰＡＳ配列は、ＥＰ０８７７３５６７．６および上記のＳｃｈｌａｐｓｃｈｙの参考文献に記載されている。任意の適切なＰＡＳ配列が、融合タンパク質に使用され得る。例には、ランダムコイルコンフォメーションを形成し、アラニン、セリンおよびプロリン残基からなる（またはプロリンおよびアラニン残基からなる）少なくとも約１００のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列が含まれる。これは、複数のアミノ酸リピートを含んでいてもよく、その際、前記リピートは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、およびＰｒｏ残基（またはプロリンおよびアラニン残基）からなり、同一アミノ酸残基の連続は、６つ以下である。プロリン残基は、配列のアミノ酸の４％よりも大きく４０％未満を構成し得る。配列は、
ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号１５）；
ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号１６）；
ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号１７）、
ＳＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号１８）、
ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号１９）、
ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号２０）および
ＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号２１）
または、これらの配列の全体もしくは部分としてのこれらの配列の環状並び替えバージョンもしくは多量体から選択されるアミノ酸配列を含み得る。例えば、ＰＡＳ配列中に存在するリピートのうち１つの５〜４０、１０〜３０、１５〜２５、１８〜２０、好ましくは、２０〜３０または３０コピー、すなわち配列番号１５〜２１のうち１つ、好ましくは１５が存在し得る。好ましくは、ＰＡＳ配列は、配列番号１５の３０コピーを含むか、またはそれからなる。好ましくは、ＰＡＳ配列は、コバーシン型タンパク質のＮ末端と（直接またはリンカー配列を介して）融合され、ある特定の好ましい実施形態では、コバーシン型タンパク質は、配列番号２のアミノ酸１９〜１６８を含むか、またはそれからなっていてもよい（例えば、融合タンパク質は、（ａ）配列番号１５の３０コピーからなるＰＡＳ配列および（ｂ）配列番号２のアミノ酸１９〜１６８を含み、その際、（ａ）は、（ｂ）のＮ末端に直接またはリンカー配列を介して融合されている）。
【０１６０】
融合タンパク質は、追加的にリンカー配列（例えば１〜５０、２〜３０、３〜２０、５〜１０アミノ酸長）を含んでいてもよく、それにより、構成成分は、このリンカーによって分離される。一実施形態では、リンカー配列は、単一のアラニン残基であり得る。
【０１６１】
タンパク質およびその機能的等価物は、宿主細胞における発現により組換え形態として調製され得る。このような発現方法は、当業者に公知であり、［３９］および［４０］によって詳細に記載されている。コバーシンタンパク質およびその機能的等価物の組換え形態は、好ましくは、グリコシル化されていない。好ましくは、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【０１６２】
コバーシンタンパク質およびその機能的等価物は、好ましくは、例えばそれがその中で発現される宿主細胞および／または細胞増殖培地の少なくとも１つの成分から分離された、単離形態である。一部の実施形態では、コバーシンタンパク質またはその機能的等価物は、例えば、電気泳動またはクロマトグラフィーによって決定される、少なくとも９０％、９５％、または９９％の純度に精製される。本発明のタンパク質および断片は、また、タンパク質化学の通例の技法を使用して調製することができる。例えば、タンパク質断片は、化学合成によって調製され得る。融合タンパク質を生成する方法は、当技術分野において標準的であり、熟練の読者に公知である。例えば、大部分の一般分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技法および免疫学的技法は、［３９］または［４１］に見出すことができる。
【０１６３】
本発明のさらなる実施形態によると、薬剤は、コバーシン型タンパク質をコードする核酸分子であり得る。例えば、対象において関連細胞によるコバーシン型タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏのいずれかの内因性産生を引き起こすために遺伝子療法が採用され得る。別のアプローチは、治療用遺伝子が血流または筋組織中に直接注射される、「裸のＤＮＡ」の投与である。
【０１６４】
好ましくは、このような核酸分子は、図２におけるヌクレオチド配列（配列番号１）の塩基５５〜５０７を含むか、またはそれからなる。このヌクレオチド配列は、シグナル配列を有さない図２におけるコバーシンタンパク質をコードする。図２におけるヌクレオチド配列の最初の５４塩基は、補体阻害活性またはＬＴＢ４結合活性に必要とされないシグナル配列をコードする。あるいは、核酸分子は、シグナル配列を有するタンパク質をコードする、図２における核酸配列の塩基１〜５０７を含むか、またはそれからなっていてもよい。
【０１６５】
投与様式
コバーシン型タンパク質は、投与が実施されるために医療従事者を必要とせず、これらの分子は迅速に吸収される。対照的に、多くの組換え抗体は、非常にゆっくりと吸収され、結果として長時間かけて（例えば静脈内に）注入する必要がある。したがって、このような分子の投与は、また、医療従事者を必要とする。したがって、Ｃ５多型を有する対象における補体経路の活性化を阻害することに、より有効であるという利点を有するだけでなく、コバーシン型タンパク質は、また、エクリズマブのような抗体などの他の薬剤よりも投与が容易であるという利点を有する。
【０１６６】
薬剤は、治療または予防有効量で投与される。「治療有効量」という用語は、ＡＩＢＤを治療するために必要な薬剤の量を表す。これに関連して、「治療すること」は、障害の重症度を減少させることを含む。
【０１６７】
本明細書に使用される「予防有効量」という用語は、関連する症状、例えばＡＩＢＤを予防するために必要な薬剤の量を表す。これに関連して、「予防すること」は、例えば、薬剤の投与が開始される前には障害の存在が検出されない場合に、障害の重症度を減少させることを含む。障害の重症度を減少させることは、例えば、本明細書の他に述べられるように、水疱または罹患体表面のサイズまたは数を減少させることであり得る。
【０１６８】
減少または改善は、投与を行わず、本明細書に記載の薬剤もない場合の結果に対するものである。結果は、このような患者を評価するために使用される標準的な基準により評価される。これを定量できる範囲で、相対基準（例えば、水疱または罹患体表面のサイズまたは数）に少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％の減少または改善がある。
【０１６９】
好ましくは、薬剤の用量は、対象において可能な限り多くの利用可能なＣ５、より好ましくは、全ての利用可能なＣ５と結合するために十分である。あるいは、薬剤の用量は、対象において可能な限り多くの利用可能なＬＴＢ４、より好ましくは、全ての利用可能なＬＴＢ４と結合するために十分であり得る。一部の態様では、薬剤の用量は、可能な限り多くの利用可能なＣ５およびＬＴＢ４、例えば、全ての利用可能なＣ５およびＬＴＢ４と結合するために十分である。供給される薬剤の用量は、対象において全ての利用可能なＣ５および／またはＬＴＢ４と結合するために必要なモル用量の少なくとも１倍または１．５倍もしくは２倍であり得る。供給される薬剤の用量は、例えば、対象において全ての利用可能なＣ５および／またはＬＴＢ４と結合するために必要なモル用量の約または少なくとも１、１．５、２、２．５倍、３倍または４倍であり得る。
【０１７０】
好ましくは、用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ（患者の質量と比較した薬物の質量）〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ〜０．６ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ〜０．６ｍｇ／ｋｇ（例えば約０．５７ｍｇ／ｋｇ）である。
【０１７１】
治療または予防有効量は、追加的に、終末補体の阻害の点から定義することができ、例えば、終末補体活性（ＴＣＡ）が、治療の非存在下での終末補体活性と比較して少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％減少していることを意味する量であり得る。用量および回数は、終末補体活性を所望のレベルに維持するために調整されてもよく、そのレベルは、治療の非存在下での終末補体活性と比較して例えば１０％以下、例えば９、８、７、６、５、４、３、２、１％以下であり得る。
【０１７２】
用量が示されるとき、これは、タンパク質またはその機能的等価物である薬剤の用量に関するものである。核酸分子である薬剤に適した用量を使用して、これらのレベルが生じ得る。
【０１７３】
終末補体活性は、当技術分野において公知の標準的なアッセイによって、例えば、Ｑｕｉｄｅｌ  ＣＨ５０溶血アッセイおよびヒツジ赤血球溶解ＣＨ５０アッセイを使用して測定することができる。
【０１７４】
用量を投与する必要がある回数は、関与する薬剤の半減期に依存する。コバーシンタンパク質またはその機能的等価物は、例えば１日２回ベース、毎日ベース、または２、３、４日、５、６、７、１０、１５もしくは２０日もしくはより多くの日数毎に投与され得る。
【０１７５】
単回または多回用量が投与され得る。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、または８用量が投与され得る。単回用量は、一実施形態である。用量の正確な投薬量および回数は、また、投与時での患者の症状に依存し得る。投薬量を決定する場合に考慮され得る要因には、治療または予防の必要性、患者における病状の重症度、患者の全身の健康状態、年齢、体重、性別、食事、投与の時間および回数、薬物の組合せ、反応の感受性および治療に対する患者の抵抗性または応答が含まれる。正確な量は、日常的な実験により決定することができるが、最終的には医師の判断にあり得る。
【０１７６】
投薬レジメンは、また、最初の「負荷用量」に続く、１または２以上の後続「維持用量」の形態を採り得る。一般に、負荷用量は、維持用量よりも大きい。負荷用量は、維持用量の２、５、１０倍またはより大きくてもよい。負荷用量は、単回用量として、または特定の時間枠内の１または２以上の用量として投与され得る。典型的には、負荷用量は、単一の２４時間中に投与される１、２、３、４または５用量である。維持用量は、規則的な間隔で繰り返される、より低い用量であり得る。維持用量は、３、４、６、８、１２、２４、または４８時間毎などの間隔で繰り返され得る。正確なレジメンは、日常的な実験により決定することができるが、最終的に医師の判断にあり得る。維持用量は、初回負荷用量の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００％、または初回負荷用量の最大２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００％であり得る。
【０１７７】
さらなる実施形態では、治療経過にわたり同じ用量が使用される（例えば毎日または１日２回）。
【０１７８】
負荷用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ（患者の質量と比較した薬物の質量）〜２０ｍｇ／ｋｇであり得、維持用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間であり得；あるいは、負荷用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、維持用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり、あるいは、負荷用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇであり、維持用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇであり；あるいは、負荷用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであり、維持用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであり；あるいは、負荷用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであり、維持用量は、０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．５ｍｇ／ｋｇであり；あるいは、負荷用量は、０．２ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇであり、維持用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．４ｍｇ／ｋｇであり；あるいは、負荷用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ〜０．７ｍｇ／ｋｇであり、維持用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．３ｍｇ／ｋｇであり；あるいは、負荷用量は、０．４ｍｇ／ｋｇ〜０．６ｍｇ／ｋｇであり、維持用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．２ｍｇ／ｋｇであり、例えば、負荷用量が０．５７ｍｇ／ｋｇである場合、維持用量は、０．１４ｍｇ／ｋｇである。例えば、０．６ｍｇ／ｋｇ〜１．８ｍｇ／ｋｇの負荷用量に、０．２ｍｇ／ｋｇ〜０．６ｍｇ／ｋｇ（例えば０．３ｍｇ／ｋｇ）の維持用量が続く。
【０１７９】
負荷用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ（患者の質量と比較した薬物の質量）〜２０ｍｇ／ｋｇであり得、維持用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間であり得；あるいは、維持用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり得、あるいは、維持用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇであり得；あるいは、維持用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであり得；あるいは、維持用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇであり得；あるいは、維持用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．６ｍｇ／ｋｇであり得；あるいは、維持用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．４ｍｇ／ｋｇであり得；あるいは、維持用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜０．２ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１８０】
負荷用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ（患者の質量と比較した薬物の質量）〜２０ｍｇ／ｋｇであり得、維持用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間であり得；あるいは、負荷用量は、０．００１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇであり得、あるいは、負荷用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇであり得；あるいは、負荷用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであり得；あるいは、負荷用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇであり得；あるいは、負荷用量は、０．２ｍｇ／ｋｇ〜０．８ｍｇ／ｋｇであり得；あるいは、負荷用量は、０．３ｍｇ／ｋｇ〜０．６ｍｇ／ｋｇであり得；あるいは、負荷用量は、０．４ｍｇ／ｋｇ〜０．６ｍｇ／ｋｇ、または０．６ｍｇ／ｋｇ〜１．８ｍｇ／ｋｇであり得る。
【０１８１】
薬剤は、一般的に、薬学的に許容される担体と共に投与される。本明細書に使用される「薬学的に許容される担体」という用語には、担体が、それ自体、毒性作用を誘導せず、医薬組成物を受け入れる個体に有害な抗体の産生も引き起こさない限り、遺伝子、ポリペプチド、抗体、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および不活性ウイルス粒子または実際に任意の他の薬剤が含まれる。薬学的に許容される担体は、追加的に、水、食塩水、グリセロール、エタノールなどの液体または湿潤剤もしくは乳化剤などの補助物質、ｐＨ緩衝物質およびその他を含有し得る。したがって、採用される医薬担体は、投与経路に応じて様々である。患者による摂取を助けるために、担体は、医薬組成物を錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤に製剤化できるようにし得る。薬学的に許容される担体の十分な議論は、［４２］から入手可能である。好ましい実施形態では、薬剤は、水またはＰＢＳ中に入れて投与される。
【０１８２】
薬剤は、任意の公知の投与経路によって送達され得る。薬剤は、部分的または全身的に送達され得る。薬剤は、非経口経路により送達され得る（例えば、皮下、腹腔内、静脈内もしくは筋肉内のいずれかの注射による、または組織の間質腔に送達される）。組成物は、また、病変内に投与することができる。他の投与様式には、経口および肺投与、坐剤、および経真皮または経皮適用、針、ならびにハイポスプレーが含まれる。部分的投与には、局所投与、例えば、罹患領域内の例えば皮膚への適用が含まれる。これは、軽度ＡＩＢＤ、例えば軽度ＢＰにおける特定の使用であり得る。
【０１８３】
好ましくは、薬剤は、皮下注射を介して送達される。一部の実施形態では、これは、例えば、０．０００１ｍｇ／ｋｇ（患者の質量と比較した薬物の質量）から２０ｍｇ／ｋｇの間の初回負荷用量に続く、０．０００１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇの間の１日１回の維持用量、または本明細書の他の箇所に開示される他の用量を用いた１日１または２回の皮下注射による。あるいは、薬剤は、１日おきの皮下注射により送達され得る。
【０１８４】
好ましい実施形態では、薬剤は、０．６ｍｇ／ｋｇ〜１．８ｍｇ／ｋｇ（例えば０．５７ｍｇ／ｋｇ）の初回負荷用量に続く、０．２ｍｇ／ｋｇ〜０．６ｍｇ／ｋｇ（例えば０．３ｍｇ／ｋｇ）の１日１回の維持用量での１日１回の皮下注射により、または０．６ｍｇ／ｋｇ〜３．６ｍｇ／ｋｇ（例えば１．０ｍｇ／ｋｇ）の初回負荷用量に続く、０．２ｍｇ／ｋｇ〜１．２ｍｇ／ｋｇ（例えば０．６ｍｇ／ｋｇ）の１日１回の維持用量での１日１回の皮下注射により送達される。
【０１８５】
好ましくは、治療経過は、少なくとも１、２、３、４、５または６週間継続される。
【０１８６】
治療経過は、好ましくは、対象の症状が減少するまで継続される。したがって、治療経過は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０週間の薬剤の（例えば毎日）投与であり得る。
【０１８７】
維持用量（例えば、単回１日維持用量）は、治療経過全体にわたり一定を維持する場合）または維持用量（例えば、１日維持用量）は、治療経過中に改変（例えば、増加もしくは減少）され得る。維持用量は、終末補体活性を所望のレベルに、例えば、治療の非存在下の前記患者からの血清と比較して、または正常な対照血清と比較して１０％以下に維持するために、改変され得る。維持用量または各維持用量は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間、例えば少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間毎日継続され得る。維持用量は、対象の症状が改善するにつれて減少させ得る。薬剤の量または薬剤が投与される回数は、対象の症状が改善するにつれて減少させ得る。
【０１８８】
したがって、初回負荷用量に続き、上に定義された維持用量であり得る初回維持用量（例えば１日初回維持用量）および１または２以上のさらなる維持用量（例えばさらなる１日維持用量）、例えば少なくとも２、３、４、５回のさらなる維持用量があり得る。
【０１８９】
したがって本発明は、さらに、対象におけるＡＩＢＤを治療または予防する方法であって、対象に上に定義される薬剤の初回負荷用量を投与すること、および次に上に定義される薬剤の維持用量（例えば１日維持用量）を投与することを含む方法を含み、その際、初回維持用量および１または２以上のさらなる維持用量がある。
【０１９０】
したがって本発明は、さらに、対象に上に定義される薬剤の初回負荷用量を投与すること、および次に上に定義される薬剤の維持用量（例えば１日維持用量）を投与することを含む、対象におけるＡＩＢＤを治療または予防する方法における使用のための、上に定義される薬剤を含み、その際、初回維持用量および１または２以上のさらなる維持用量がある。
【０１９１】
１または２以上のさらなる維持用量は、対象における（例えば、対象からの生物学的試料中の）終末補体活性を検査すること、および終末補体活性のレベルに基づきさらなる維持用量を決定すること、ならびに／または対象の徴候を検査することおよび徴候に基づきさらなる維持用量を決定することによって決定され得る。方法は、必要に応じて、前記さらなる維持用量を投与することをさらに含み得る。前記さらなる用量は、終末補体活性を所望のレベルに維持するレベルであると計算され得る。
【０１９２】
生物学的試料が採取される場合、これは、血液、例えば全血または血清試料であり得る。方法は、必要に応じて、試料を採取するステップをさらに含み、必要に応じて、試料のＴＣＡを決定するステップをさらに含む。
【０１９３】
１または２以上のさらなる維持用量は、対象における（例えば生物学的試料中の）終末補体活性を検査すること、および終末補体活性のレベルに基づきさらなる維持用量を決定すること、ならびに／または対象の徴候を検査することおよび徴候に基づきさらなる維持用量決定することによって決定され得る。方法は、必要に応じて、前記さらなる維持用量を投与することをさらに含み得る。前記さらなる用量は、終末補体活性を所望のレベルに維持するレベルであると計算され得る。
【０１９４】
ある特定の態様では、所望の補体活性レベルは、治療の非存在下の前記対象からの血清または正常対照血清と比較して１０％以下である。
【０１９５】
ある特定の態様では、ＴＣＡが所望のレベルよりも高い場合、維持用量は増加され、必要に応じてＴＣＡが５、４、３、２、１％未満の場合、用量を維持するか、または減少させる。
【０１９６】
ある特定の態様では、徴候が悪化する場合、維持用量は増加され、必要に応じて、徴候が改善する場合、用量を維持するか、または減少させる。
【０１９７】
一部の実施形態では、対象は、治療の開始から１ヶ月以内、治療の開始から２週間以内、治療の開始から１週間以内に検査される。他の実施形態では、対象は、１日１回もしくは１日に少なくとも１回、１週間に１回、もしくは１週間に少なくとも１回、２週間に１回もしくは２週間に少なくとも１回、１ヶ月に１回または２ヶ月に１回検査される。
【０１９８】
好ましくは、負荷用量は、１．２ｍｇ／ｋｇまたは約１．２ｍｇ／ｋｇタンパク質または機能的等価物であり、維持用量は、少なくとも０．６ｍｇ／ｋｇ（例えば少なくとも０．７ｍｇ／ｋｇ、０．８〜１．５、０．９〜１．２もしくは１．０〜１．２５ｍｇ／ｋｇ）であるか、または最大で０．３ｍｇ／ｋｇ（例えば最大で０．２ｍｇ／ｋｇ、０．１５〜０．４、０．２〜０．３ｍｇ／ｋｇ）であり、必要に応じて、（ｉ）維持用量は、少なくとも２、３、４、５、６週間継続され、および／または（ｉｉ）治療は、少なくとも６週間継続され、および／または（ｉｉｉ）治療は、毎日少なくとも３、４、５、６週間継続される。
【０１９９】
好ましくは、負荷用量は、０．６〜１．８ｍｇ／ｋｇタンパク質または機能的等価物であり、維持用量は、０．２〜０．６ｍｇ／ｋｇ、例えば約０．３ｍｇ／ｋｇであり、（ｉ）維持用量は、少なくとも２、３、４、５、６週間継続され、および／または（ｉｉ）治療は、少なくとも６週間継続され、および／または（ｉｉｉ）治療は、毎日少なくとも３、４、５、６週間継続される。
【０２００】
投薬レジメンは、また、治療される対象の体重に依存しない固定用量の形態を採り得る。固定用量は、単回用量として、または特定の時間枠内の１または２以上の用量として投与され得る。固定用量は、典型的なヒト患者（例えば、体重５０ｋｇから１００ｋｇの間の患者）について１ｍｇ〜１００ｍｇのコバーシン（配列番号４）であり得る。コバーシン型タンパク質および改変コバーシンポリペプチドの分子量を使用して、機能的に等価の薬剤の当量の固定用量を計算することができる。一部の実施形態では、固定用量は、１ｍｇ〜８０ｍｇ、１ｍｇ〜５０ｍｇ、５ｍｇ〜８０ｍｇ、５ｍｇ〜５０ｍｇ、１０ｍｇ〜６０ｍｇ、１０ｍｇ〜５０ｍｇ、２０ｍｇ〜５０ｍｇ、２０ｍｇ〜４０ｍｇまたは２５ｍｇ〜３５ｍｇの間である。好ましくは、固定用量は、３０ｍｇのｓコバーシン（ｓＣｏｖｅｒｓｉｎ）（配列番号４）またはモル当量のコバーシン型タンパク質もしくは改変コバーシンポリペプチドである。典型的には、固定用量は、単一の２４時間中に投与された１、２、３、４または５用量である。固定用量は、３、４、６、８、１２、２４、または４８時間毎などの間隔で繰り返され得る。正確なレジメンは、日常的な実験により決定することができるが、最終的に医師の判断であり得る。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】補体活性化の古典的経路および第二経路の模式図である。酵素成分は、濃い灰色。アナフィラトキシンを星形で囲む。
【図２Ａ】コバーシンの一次配列を示す図である。シグナル配列に下線を付ける。システイン残基を太字で示す。ヌクレオチド番号およびアミノ酸番号を右に示す。
【図２Ｂ】コバーシンバリアントの例を示す図である。
【図３】ビヒクルと比べて予防的コバーシンで治療されたマウスにおける実験的ＥＢＡの臨床スコアが、ビヒクル対照群およびメチルプレドニゾロン群と比較して、全ての用量のコバーシンで治療されたマウスにおける疾患の回復を実証する、実験１を示す図である。
【図４】ビヒクルと比べた予防的コバーシンで治療されたマウスにおける実験的ＥＢＡの臨床スコアが、ビヒクル対照群およびメチルプレドニゾロン群と比較して、全ての用量のコバーシンで治療されたマウスにおける疾患の回復を実証する、実験２を示す図である。実験１と比べると、用量２．５ｍｇ／ｋｇのコバーシンだけが、ビヒクル対照群と比較して有意な効果を有した。特に本実験において、対照群のマウス数匹は、顕著なレベルの疾患を発生しなかったが、これが、実験１と比較したこの差異の原因である可能性がある。
【図５】予防的コバーシンで治療されたマウスにおけるビヒクルと比べた実験的ＥＢＡの臨床スコアが、ビヒクル対照群およびメチルプレドニゾロン群と比較して、全ての用量のコバーシンで治療されたマウスにおける疾患の回復を実証する、実験１および２を合わせた結果を示す図である。二元配置ＡＮＯＶＡ分析により、ビヒクル対照と、用量２５０および２５００μｇ／ｍｌのコバーシンとの間の統計的有意差が明らかとなる。
【図６Ａ】予防的コバーシンおよび予防的ＰＡＳ−Ｌ−コバーシンで治療されたマウスにおけるビヒクルと比べた実験的ＥＢＡの臨床スコアが、２．５ｍｇ／ｋｇコバーシンで治療されたマウスにおける疾患の回復を実証する（実施例４、実験１）ことを示す図である。
【図６Ｂ】予防的コバーシンおよび予防的ＰＡＳ−Ｌ−コバーシンで治療されたマウスにおけるビヒクルと比べた実験的ＥＢＡの臨床スコアが、２．５ｍｇ／ｋｇコバーシンで治療されたマウスにおける疾患の回復を実証する（実施例４、実験２）ことを示す図である。ここで、１０ｍｇ／ｋｇ用量のＰＡＳ−Ｌ−コバーシンおよび２．５ｍｇ／ｋｇコバーシンは、両方とも、ＡＢＳＡに関して統計的に有意な効果を示す。
【図６Ｃ】予防的コバーシンおよび予防的ＰＡＳ−Ｌ−コバーシンで治療されたマウスにおけるビヒクルと比べた実験的ＥＢＡの臨床スコアを示す図である。これは、実施例４の実験１および２を合わせた結果を示す。
【図７】受動ＥＢＡマウスモデルにおける類天疱瘡疾患様皮膚炎の経過に及ぼす、治療的に投与されたコバーシンの効果を示す図である（実施例２、実験１）。コバーシンは、皮膚炎を用量依存的に回復させた。データを平均±ＳＥＭとして表示する；Ｎ＝マウス５匹／群；統計的有意性についての二元配置ＡＮＯＶＡ検定により、ビヒクル対照と、使用された全ての用量のコバーシンとの間の有意差が確認される。実験を雌のみに行った。
【図８】受動ＥＢＡマウスモデルにおける類天疱瘡疾患様皮膚炎の経過に及ぼす、治療的に投与されたコバーシンの効果を示す図である（実施例２、実験２）。コバーシンは、皮膚炎を用量依存的に回復させた。データを平均±ＳＥＭとして表示する；Ｎ＝マウス５匹／群；統計的有意性についての二元配置ＡＮＯＶＡ検定により、ビヒクル対照と、使用された全ての用量のコバーシンとの間の有意差が確認される。実験を雄のみに行った。
【図９Ａ】水疱性類天疱瘡患者の水疱液中のＣ５ａレベルを示す図である。
【図９Ｂ】水疱性類天疱瘡患者の水疱液中のＬＴＢ４レベルを示す図である。
【図１０】減少したＣ５結合活性を有するか、またはＣ５結合活性を有さないが、ＬＴＢ−４結合能を保持する、ある特定の改変コバーシンポリペプチドの配列を示す図である。
【実施例１】
【０２０２】
予防的に投与されたコバーシンを用いたＥＢＡ導入モデルにおけるコバーシンの効果
Ｓｉｔａｒｕら、２００５［４３］によって記載されたプロトコールの修正版を使用して、抗体導入ＥＢＡを誘導した。各処置群においてマウス５匹を試験した。簡潔には、マウスにアフィニティー精製抗Ｃｏｌ７  ＩｇＧ、５０μｇを０、２、および４日目に皮下注射した。抗Ｃｏｌ７  ＩｇＧの最初の注射の４日前（−２日目）から開始して、３つの異なる用量のコバーシンをマウスに１日２回皮下注射した。１１日目の最終日まで実験全体にわたりこの適用を継続した。対照群では、マウスに皮下のビヒクルのみまたは２０ｍｇ／ｋｇメチルプレドニゾロンを１日１回投与した。
【０２０３】
マウスＶＩＩ型コラーゲン（「抗ＣＯＬ７」）に対する抗体を生成するために、ニュージーランドホワイトウサギに、コラーゲンＶＩＩの非コラーゲン１（ＮＣ１）ドメイン由来の３種の異なる組換えタンパク質（「Ｃｏｌ７Ａ、Ｂ、およびＣ」）を含有するタンパク質混合物２００μｇをフロイント不完全アジュバントと一緒に免疫処置した。免疫処置されたウサギの血清から、プロテインＧの使用によりＩｇＧを単離し、その後、ｈｉｓ−Ｃｏｌ７を用いてＩｇＧをアフィニティー精製して、特異的にウサギ抗Ｃｏｌ７  ＩｇＧを得た。凍結切片アッセイで力価および効力を決定することによって抗体の品質をチェックした。
【０２０４】
４日目に開始して、１日おきに各個別のマウスにおける皮膚病変の程度をスコア付けした。紅斑、水疱、びらん、痂皮、または脱毛を示している皮膚領域を熟練の観察者が「罹患」または「非罹患」として分類した［４３］。皮膚病変に冒された総体表面（ＡＢＳＡ）のパーセンテージを計算した。
【０２０５】
２つの独立した実験を行った。
【０２０６】
第１の実験の結果を図４に示す。コバーシン２５μｇ／ｋｇで処置されたマウスにおけるＡＢＳＡのパーセンテージが減少し、コバーシン２５００μｇ／ｋｇ、およびコバーシン２５０μｇ／ｋｇのコバーシンを用いた処置でさらに減少したことが分かる。ビヒクルと０．２５ｍｇ／ｋｇ用量との間に６３％の差があった。両型ｔ検定によるこの差についてのｐ値は、０．００２３である。１０日目のビヒクルおよび０．２５ｍｇ／ｋｇ用量についての平均ＡＢＳＡスコアは、６．２３＋１．１および２．６５＋０．４であった。平均の後の値は、ＳＤである。
【０２０７】
コバーシンは、以前に試験された分子よりもパーセンテージＡＢＳＡを大きな程度まで減少させた。例えば、以前の類似の実験では、５−リポキシゲナーゼ（アラキドン酸カスケードの重要酵素であり、生体活性ロイコトリエン（ＬＴ）の形成に関与する）阻害性（５−ＬＯ）経口阻害剤であるＮ−［１−（１−ベンゾチエン−２−イル）エチル］−Ｎ−ヒドロキシウレア（ジロートン）を、８週齢雌性Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスに予防的投薬スキームで投与した。この初期実験で、マウスを２群に分類し、飲料水中に補充した０．６〜０．８ｍｇ／マウス／日のジロートンまたはビヒクル対照を投与した。実験的ＥＢＡを誘導し、評価した［４４］。％ＡＢＳＡは減少し、「実験７日目から開始し、その終点までジロートンで処置されたマウスは、対照群と比較して有意に減少した疾患重症度を示した（７日目の臨床スコア；対照群：Ｘ−＝９．２±０．７；ジロートン処置群：Ｘ−＝５．９±０．５％の罹患体表面積）」と結論づけられた。
【０２０８】
ＥＢＡの抗体導入モデルにおいて２０ｍｇ／ｋｇ／日のメチルプレドニゾロンを投与した類似の先行実験では、実験終了時に対照マウスにおいて体表面積に対して７．５±０．１％が皮膚病変に罹患していたが、この疾患重症度は、メチルプレドニゾロン処置マウスでは４．７±０．４％に有意に減少した［４５］。
【実施例２】
【０２０９】
ＥＢＡ導入モデルにおけるコバーシンの効果
本研究は、各実験群あたりマウス５匹で以下の実験群を含んでいた：
１．  ビヒクル（ＰＢＳ）対照群
２．  １２５μｇ／ｋｇコバーシン  １日２回  ｓ．ｃ．
３．  ２５００μｇ／ｋｇコバーシン  １日２回  ｓ．ｃ．
【０２１０】
Ｓｅｚｉｎら［４６］に記載されたように抗体導入ＥＢＡ様皮膚炎を誘導した。簡潔には、０、２、および４日目にＣ５７Ｂｌ／６Ｊ  ＷＴマウスにアフィニティー精製抗Ｃｏｌ７  ＩｇＧ  ５０μｇを皮下（ｓ．ｃ．）注射した。
【０２１１】
コバーシンによるマウスの処置は、実験５日目に開始した（０日目＝抗ＣＯＬ７抗体の初回投与日）。その後、実験終了までマウスの肩甲部にコバーシンまたはビヒクル対照を１２時間毎にｓ．ｃ．注射した。
【０２１２】
疾患の重症度をスコア付けした。疾患の重症度をスコア付けするために、紅斑、水疱、びらん、痂皮、または脱毛を示している皮膚領域を、処置に関して盲検化された１人の訓練された試験官が「罹患」として分類した。皮膚病変に冒された絶対体表面（ＡＢＳＡ）のパーセンテージを計算した。疾患をスコア付けするために、実験４日目に開始して、マウスを１日おきにｉ．ｐ．投与したケタミン／キシラジンの混合物で麻酔した。
【０２１３】
このプロトコールに従って、２つの独立した実験を行った。
【０２１４】
試験品目の調製
コバーシン１８ｍｇを無菌水０．６ｍｌで復元して、濃度３０ｍｇ／ｍｌを達成し、小分けし、最終的に希釈するまで−２０℃で保存した。
【０２１５】
実験開始前に、マウスの平均体重を計算し、２．５ｍｇ／ｋｇおよび０．１２５ｍｇ／ｋｇの薬物をＰＢＳ、ｐＨ７．２中に最終体積１００μｌで新たに調製した。薬物を１日２回、マウスに最終的に注射する３０分前に新たに調製した。その後、マウスの平均体重に基づき、最終体積１００μｌ中に所要のｍｇ／ｋｇ用量を実現するために適切な濃度に、薬物をＰＢＳ、ｐＨ７．２で調整した。薬物を１日２回、動物に最終適用する３０分前に新たに調製した。ビヒクル対照として、ＰＢＳ、ｐＨ７．２、１００μｌをマウスにｓ．ｃ注射した。
【０２１６】
統計解析
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７を使用して行った二元配置ＡＮＯＶＡによって処置群間のＡＢＳＡを評価した。
【０２１７】
結果
臨床所見および処置の有効性
実験１では、コバーシンは、罹患絶対体表面積（ＡＢＳＡ）によって測定された皮膚炎を用量依存的に回復させた。２．５ｍｇ／ｋｇコバーシンは、ＡＢＳＡを減少させるのに有効であった（図６）。陰性対照（ビヒクル）群におけるＡＢＳＡは、実験１で約７％であったが、これは、このモデルで達成された典型的な値である。陰性対照群の全てのマウスは、類似の炎症応答を示した。
【０２１８】
実験２では、２．５ｍｇ／ｋｇコバーシンは、（ＡＢＳＡ）によって測定された皮膚炎を有意（Ｐ＜０．０１）に回復させた（図７）。この実験では、陰性対照（ビヒクル）群におけるＡＢＳＡは、平均約４％でピークに達したが、これは、このモデルで主として達成された値よりも少し低い。
【０２１９】
これら２つの実験で処置中にマウスの死亡はなかった。Ｃｏｌ７  ＩｇＧの受動導入の開始後１２日目にマウスを屠殺した。
【実施例３】
【０２２０】
患者の水疱液中のＣ５およびＬＴＢ４
４人の水疱性類天疱瘡患者由来の水疱液中のＣ５ａおよびＬＴＢ４のレベルを検査した。４人の患者のそれぞれの結果を図９Ａ（Ｃ５ａ）および９Ｂ（ＬＴＢ４）に示す。急性ＢＰのため入院クリニックに入院したＢＰ患者４人の水疱からシリンジで水疱液を吸引した。試料を直ちに液体窒素で凍結した。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製のＥＬＩＳＡキットを使用して液中のＬＴＢ４およびＣ５ａレベルを測定した。
【実施例４】
【０２２１】
二重作用コバーシンと単一作用コバーシンとの効果の比較
さらなる実験では、ＰＡＳ−Ｌ−コバーシンの効果を評価した。０．１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ  ＰＡＳ−Ｌ−コバーシン、または２．５ｍｇ／ｋｇコバーシンでマウスを処置し、実験を上記のように実施した。ＰＡＳ−Ｌ−コバーシンは、コバーシン配列のＮ末端に融合されたＰＡＳ配列を有し、このコバーシン配列は、ＬＴＢ４と結合するがＣ５と結合しないように変異されていた（「Ｌ−コバーシン」と呼ぶ）。Ｌ−コバーシン配列の配列は、以下の残基が改変されている、成熟コバーシン配列（配列番号４）のバリアントである：Ａｌａ４４をＡｓｎに、Ｍｅｔ１１６をＧｌｎに、Ｌｅｕ１１７をＳｅｒに、Ｇｌｙ１２１をＡｌａに、Ｌｅｕ１２２をＡｓｐに、Ｇｌｕ１２３をＡｌａに、およびＡｓｐ１４９をＧｌｙに（バリアント２と呼ばれる、配列は、ｄｓｅｓｄｃｔｇｓｅ  ｐｖｄａｆｑａｆｓｅ  ｇｋｅａｙｖｌｖｒｓ  ｔｄｐｋａｒｄｃｌｋ  ｇｅｐＮｇｅｋｑｄｎ  ｔｌｐｖｍｍｔｆｋｎ  ｇｔｄｗａｓｔｄｗｔ  ｆｔｌｄｇａｋｖｔａ  ｔｌｇｎｌｔｑｎｒｅ  ｖｖｙｄｓｑｓｈｈｃ  ｈｖｄｋｖｅｋｅｖｐ  ｄｙｅｍｗＱＳｄａｇ  ＡＤＡｖｅｖｅｃｃｒ  ｑｋｌｅｅｌａｓｇｒ  ｎｑｍｙｐｈｌｋＧｃ（配列番号２３）、配列中、配列番号４のネイティブなコバーシン配列と比べた変化を大文字で示す）。ＰＡＳ−Ｌ−Ｃｏｖの分子量の方が高いので、１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＡＳ−Ｌ−Ｃｏｖは、２．５ｍｇ／ｋｇコバーシンに相当する。第１の実験（図６Ａ）では、ＰＡＳ−Ｌ−コバーシンの１ｍｇ／ｋｇ用量でも０．１ｍｇ／ｋｇ用量でもなく、１０ｍｇ／ｋｇ用量が、対照と比較してＡＢＳＡを減少させた。第２の実験（図６Ｂ）では、ＰＡＳ−Ｌ−コバーシンの１ｍｇ／ｋｇ用量でも０．１ｍｇ／ｋｇ用量でもなく、１０ｍｇ／ｋｇ用量が、対照と比較してＡＢＳＡを減少させた。１０ｍｇ／ｋｇ用量のＰＡＳ−Ｌ−コバーシンは、モル当量の２．５ｍｇ／ｋｇ用量のコバーシンほど有効ではなかった（とはいえ、１０ｍｇ／ｋｇ用量のＰＡＳ−Ｌ−コバーシンは、第２の実験で統計的に有意な効果を示す）。これは、コバーシンの二重阻害活性（Ｃ５およびＬＴＢ４の阻害）がこのモデルにおいて改善された治療上の利益を実現することを示唆している。
【０２２２】
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【図１】
2020517627.tif 000003
【図２Ａ】
2020517627.tif 000004
【図２Ｂ】
2020517627.tif 000005
【図３】
2020517627.tif 000006
【図４】
2020517627.tif 000007
【図５】
2020517627.tif 000008
【図６Ａ】
2020517627.tif 000009
【図６Ｂ】
2020517627.tif 000010
【図６Ｃ】
2020517627.tif 000011
【図７】
2020517627.tif 000012
【図８】
2020517627.tif 000013
【図９Ａ】
2020517627.tif 000014
【図９Ｂ】
2020517627.tif 000015
【図１０】
2020517627.tif 000016
【配列表】
2020517627000001.app
【国際調査報告】
2020517627.tif 000017
2020517627.tif 000018
2020517627.tif 000019
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