(57)【要約】変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質（又はその変異体）、それをコードする配列、及びその製造方法、並びにそれを含むウイルス様粒子が提供される。タンパク質（又はその変異体）及びウイルス様粒子は、少なくとも二つの型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５、又はＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５、及びＨＰＶ３１）に対する中和抗体を誘導することができ、したがって、上記の少なくとも２つのＨＰＶ型による感染、及び上記感染、例えば子宮頸がんや尖圭コンジローマにより引き起こされる疾患を予防するために使用することができる。また、前記少なくとも２つのＨＰＶ型による感染、及び前記感染により引き起こされる疾患、例えば子宮頸癌や尖圭コンジローマを予防するための医薬組成物又はワクチンの製造における上記のタンパク質及びウイルス様粒子の使用もまた、提供される。
2020526223.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体であって、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質が野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパクと比較して以下の変異を有する変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体：
（１）４〜５０個の、例えば４、６、８、１０、２０、３０、又は４０個のアミノ酸のＮ末端切断；及び
（２）野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２９２〜３１６のアミノ酸残基の、第二の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
任意選択で、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質にはさらに以下の変異がある：
（３）野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置７６〜８７のアミノ酸残基の、第三の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（４）野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置１５２〜１６７のアミノ酸残基の、第三の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；又は
（５）野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２０２〜２０７のアミノ酸残基の、第三の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
及び、変異体は変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質とは、１つ又はいくつか（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加又は欠失によってのみ異なり、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の機能を維持する、すなわち、少なくとも２つの型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５、又はＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１）に対して中和抗体を誘導する能力を維持する；
好ましくは、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質と比較して、３０又は４０個のアミノ酸のＮ末端切断を有する；
好ましくは、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質と比較して、３０個のアミノ酸のＮ末端切断を有する；
好ましくは、第二の型の野生型ＨＰＶはＨＰＶ３５である；好ましくは、（２）に記載される対応する位置のアミノ酸残基は野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基である；
好ましくは、第三の型の野生型ＨＰＶがＨＰＶ３１である；好ましくは、（３）に記載される対応する位置のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置５０〜６２のアミノ酸残基である；好ましくは、（４）に記載される対応する位置のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１２７〜１４２のアミノ酸残基である；好ましくは、（５）に記載される対応する位置のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１７７〜１８２のアミノ酸残基である；
好ましくは、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する；
好ましくは、野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質は配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する；
好ましくは、野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する；
好ましくは、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質は配列番号７、９、１０、１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【請求項２】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体をコードする単離された核酸。
【請求項３】
請求項２に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の単離された核酸及び／又は請求項３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を含む又はからなる、ＨＰＶウイルス様粒子。
【請求項６】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体、又は請求項２に記載の単離された核酸、又は請求項３に記載のベクター、又は請求項４に記載の宿主細胞、又は請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物。
【請求項７】
請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子、及び必要に応じてさらに薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物又はワクチンであって、
好ましくは、ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在する；
好ましくは、ＨＰＶ感染は、一つ以上のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染、及び／又はＨＰＶ３１感染）である；
好ましくは、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジローマからなる群から選択される、上記医薬組成物又はワクチン。
【請求項８】
請求項１に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を調製する方法であって、宿主細胞内で変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を発現させ、次いで宿主細胞の培養物から変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を回収することを含み；
好ましくは、宿主細胞は大腸菌であり；
好ましくは、この方法は、変異ＨＰＶ発現１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を大腸菌で発現させ、次いで大腸菌の溶解物上清を精製することによって変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を得るステップを含み；好ましくは、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体が大腸菌の溶解物上清からクロマトグラフィー（例えば、カチオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー）により回収される、上記方法。
【請求項９】
請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子を薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と組み合わせることを含む、ワクチンの調製方法。
【請求項１０】
ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するための方法であって、被験体に予防的に有効な量の請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子又は請求項７に記載の医薬組成物又はワクチンを投与することを含み、
好ましくは、ＨＰＶ感染は、一つ以上のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染、及び／又はＨＰＶ３１感染）であり、
好ましくは、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジローマからなる群から選択される、上記方法。
【請求項１１】
ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物又はワクチンの製造における、請求項１に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体、又は請求項５に記載のＨＰＶウイルス様粒子の使用であって、
好ましくは、ＨＰＶ感染は、一つ以上のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染、及び／又はＨＰＶ３１感染）であり；
好ましくは、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジローマからなる群から選択される、上記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子ウイルス学及び免疫学の分野に関する。特に、本発明は、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質（又はその変異体）、それをコードする配列、それを調製する方法、並びにそれを含むウイルス様粒子に関し、タンパク質（又はその変異体）及びウイルス様粒子は、少なくとも２つの型のＨＰＶ（たとえば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ  ３５；又はＨＰＶ  １６、ＨＰＶ  ３５及びＨＰＶ  ３１）に対する中和抗体を誘導することができ、したがって、上記の少なくとも２つのＨＰＶ型による感染、及び子宮頸がんや尖圭コンジローマなどの前記感染によって引き起こされる疾患を予防するために使用することができる。本発明はさらに、前記少なくとも２つのＨＰＶ型による感染、及び子宮頸癌及び尖圭コンジローマなどの前記感染によって引き起こされる疾患を予防するための医薬組成物又はワクチンの製造における上記のタンパク質及びウイルス様粒子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、主に皮膚と粘膜に疣贅を引き起こす。腫瘍形成との関係によると、ＨＰＶは高リスク型と低リスク型に分類できる。その中で、高リスクＨＰＶ型による感染は、女性の子宮頸がんを含む生殖器がんの主な原因であることが確認されている。一方、低リスクＨＰＶ型による感染は、主に尖圭コンジローマを引き起こす。ＨＰＶ感染を予防及び制御する最も効果的な方法は、ＨＰＶワクチン、特に子宮頸がんを引き起こす可能性のある高リスクＨＰＶ型に対するワクチンを投与することである。
【０００３】
ＨＰＶの主要カプシドタンパク質Ｌ１は、中空のウイルス様粒子（ＶＬＰ）への自己組織化の特性を有する。ＨＰＶ  ＶＬＰは、主要カプシドタンパク質Ｌ１の７２個の五量体で構成される対称二十面体構造を有する（Ｄｏｏｒｂａｒ，Ｊ．及びＰ．Ｈ．Ｇａｌｌｉｍｏｒｅ．１９８７．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ，６１（９）：２７９３‐９）。ＨＰＶ  ＶＬＰの構造は、本来のＨＰＶの構造と非常に類似しており、本来のウイルスの中和エピトープのほとんどを保持し、高力価中和抗体を誘導することができる（Ｋｉｒｎｂａｕｅｒ，Ｒ．，Ｆ．Ｂｏｏｙ，ｅｔ  ａｌ．１９９２  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９（２４）：１２１８０‐４）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかし、既存の研究は、ＨＰＶ  ＶＬＰが主に同じＨＰＶ型に対する中和抗体を誘導し、同一のＨＰＶ型に対する防御免疫を生成し、少数の高度に相同な型の間で低交差防御効果のみを有することを示した（Ｓａｒａ  Ｌ．  Ｂｉｓｓｅｔｔ，Ｇｉａｄａ  Ｍａｔｔｉｕｚｚｏ，ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｖａｃｃｉｎｅ．  ３２：６５４８−６５５５）。したがって、既存のＨＰＶワクチンの防御の範囲は非常に限られている。一般に、１つのＨＰＶ型のＶＬＰは、同じＨＰＶ型による感染を防ぐためにのみ使用できる。この場合、ＨＰＶワクチンの防御の範囲を拡張する必要がある場合、唯一の方法は、ワクチンにより多くのＨＰＶ型のＶＬＰを追加することである。現在利用可能なＨＰＶワクチンには、メルクのＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）（これはＨＰＶ１６、１８、６及び１１に対する４価ワクチンである）、ＧＳＫのＣｅｒｖａｒｉｘ（登録商標）（これはＨＰＶ  １６、１８に対する二価ワクチンである）、及びＭｅｒｃｋのＧａｒｄａｓｉｌ（登録商標）９（これは９価ワクチンである）、これらはすべて、複数の型のＨＰＶのＶＬＰを混合することによって作成される。ただし、このアプローチはＨＰＶワクチンの生産コストを大幅に増加させ、免疫化用量の増加により潜在的な安全性の問題につながる可能性がある。
【０００５】
したがって、複数のＨＰＶ型による感染及びそれにより引き起こされる子宮頸癌及び尖圭コンジローマなどの疾患をより経済的かつ効果的に防止するために、複数の型のＨＰＶに対する防御中和抗体を誘導できるＨＰＶウイルス様粒子を開発する必要性が当技術分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の内容
本発明は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型のＬ１タンパク質の特定のセグメントを、第二の型のＨＰＶ（例えばＨＰＶ３５）のＬ１タンパク質の対応するセグメントで置き換えた後に、得られた変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質が、体内でＨＰＶ１６及び第二の型のＨＰＶ（例えばＨＰＶ３５）に対する高力価の中和抗体の産生を、ＨＰＶ１６  ＶＬＰと第二の型のＨＰＶのＶＬＰの混合物と同等の防御効果でもって誘導することができ；さらに、ＨＰＶ１６に対するその防御効果が、ＨＰＶ１６  ＶＬＰ単独と同等であり、第二の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３５）に対するその防御効果が第二の型のＨＰＶ単独と同等であるという、発明者の予期せぬ発見に少なくとも部分的に基づいている。
【０００７】
また、上記置換に基づいて、ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の別の特定のセグメントが、第三の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３１）のＬ１タンパク質の対応するセグメントとさらに置換されることができ、二重置換を有する得られた変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質は、体内で、ＨＰＶ１６、第二の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３５）及び第三の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３１）に対する高力価の中和抗体の生成を、ＨＰＶ１６  ＶＬＰと、第二の型及び第三の型のＨＰＶのＶＬＰの混合物と同等の防御効果でもって誘導することができ；さらに、ＨＰＶ１６に対するその防御効果は、ＨＰＶ１６  ＶＬＰ単独と同等であり、第二の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３５）に対するその防御効果は第二の型のＨＰＶ単独のＶＬＰと同等であり、第三の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３１）に対するその防御効果は、第三の型のＨＰＶ単独のＶＬＰと同等である。
【０００８】
したがって、一つの態様において、本発明は、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を提供し、ここで該変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質は野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質に比べ以下の変異を有する：
（１）４、６、８、１０、２０、３０、又は４０個のアミノ酸などの、４〜５０個のアミノ酸のＮ末端切断；
（２）野生型ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質の位置２９２〜３１６のアミノ酸残基の、第二の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置でのアミノ酸残基による置換；
任意選択で、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質はさらに以下の変異を有する：
（３）野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置７６〜８７のアミノ酸残基の、第三の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置でのアミノ酸残基による置換
（４）野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置１５２〜１６７でのアミノ酸残基の、第三の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置でのアミノ酸残基による置換；又は
（５）野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２０２〜２０７のアミノ酸残基の、第三の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置でのアミノ酸残基による置換；
及び、変異体は変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質とは、１つ又はいくつか（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加又は欠失によってのみ異なり、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の機能を維持する、すなわち、少なくとも２つの型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５、又はＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１）に対して中和抗体を誘導する能力を維持する。
【０００９】
特定の好ましい実施形態では、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質と比較して、３０又は４０個のアミノ酸のＮ末端切断を有する。
【００１０】
特定の好ましい実施形態では、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質と比較して、３０個のアミノ酸のＮ末端切断を有する。
【００１１】
特定の好ましい実施形態では、第二の型の野生型ＨＰＶはＨＰＶ３５である。特定の好ましい実施形態では、（２）に記載されている対応する位置のアミノ酸残基は野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基である。
【００１２】
特定の好ましい実施形態において、第三の型の野生型ＨＰＶはＨＰＶ３１である。特定の好ましい実施形態では、（３）に記載されている対応する位置のアミノ酸残基は野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置５０〜６２のアミノ酸残基である。特定の好ましい実施形態では、（４）に記載されている対応する位置のアミノ酸残基は野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１２７〜１４２のアミノ酸残基である。特定の好ましい実施形態では、（５）に記載されている対応する位置のアミノ酸残基は野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１７７‐１８２のアミノ酸残基である。
【００１３】
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１４】
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質は、配列番号２に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１５】
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質は、配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する。
【００１６】
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基の配列は、配列番号２５に記載されている。
【００１７】
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置５０〜６２のアミノ酸残基の配列は、配列番号２６に記載されている。
【００１８】
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１２７〜１４２のアミノ酸残基の配列は、配列番号２７に記載されている。
【００１９】
特定の好ましい実施形態では、野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１７７〜１８２のアミノ酸残基の配列は、配列番号２８に記載されている。
【００２０】
特定の好ましい実施形態では、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質は、配列番号７、９、１０、１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、上記の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体をコードする単離された核酸を提供する。別の態様では、本発明は、単離された核酸を含むベクターを提供する。特定の好ましい実施形態において、本発明の単離された核酸は、配列番号１９、２１、２２、２３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を有する。
【００２２】
目的のポリヌクレオチドの挿入に有用なベクターは当技術分野で周知であり、クローニングベクター及び発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ファージなどである。
【００２３】
別の態様において、本発明はまた、上述のような単離された核酸又はベクターを含む宿主細胞に関する。そのような宿主細胞には、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞のような原核細胞、及び酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞、及び動物細胞（例えば、マウス細胞、ヒト細胞などのような哺乳動物細胞）のような真核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の宿主細胞は、２９３Ｔ細胞などの細胞株であってもよい。
【００２４】
別の態様において、本発明は、ＨＰＶウイルス様粒子に関し、ここで該ウイルス様粒子は本発明の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を含むか、又は本発明の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体からなるか、若しくは本発明の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体により形成される。
【００２５】
特定の好ましい実施形態において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質と比較して、４、６、８、１０、２０、３０又は４０個のアミノ酸などの４〜５０個のアミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２９２〜３１６のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基による置換を有する変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質を含む。
【００２６】
特定の好ましい実施形態において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質に比べ、４、６、８、１０、２０、３０又は４０個のアミノ酸などの４〜５０個のアミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２９２〜３１６のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置７６〜８７のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置５０〜６２のアミノ酸残基による置換を有する変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質を含む。
【００２７】
特定の好ましい実施形態において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質に比べ、４、６、８、１０、２０、３０又は４０個のアミノ酸などの４〜５０個のアミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２９２〜３１６のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置１５２〜１６７のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１２７〜１４２のアミノ酸残基による置換を有する変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質を含む。
【００２８】
特定の好ましい実施形態において、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質に比べ、４、６、８、１０、２０、３０又は４０個のアミノ酸などの４〜５０個のアミノ酸のＮ末端切断を有し、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２９２〜３１６のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基による置換、及び野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２０２〜２０７のアミノ酸残基の、野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１７７〜１８２のアミノ酸残基による置換を有する変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質を含む。
【００２９】
特に好ましい実施形態では、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、配列番号７、９、１０又は１１に記載の配列を有する変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質を含む。
【００３０】
別の態様において、本発明はまた、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体、又は単離された核酸又はベクター又は宿主細胞、又はＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物に関する。特定の好ましい実施形態では、組成物は、本発明の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を含む。特定の好ましい実施形態では、組成物は、本発明のＨＰＶウイルス様粒子を含む。
【００３１】
別の態様では、本発明はまた、本発明のＨＰＶウイルス様粒子を含む医薬組成物又はワクチンにも関し、場合により薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤をさらに含む。本発明の医薬組成物又はワクチンは、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染により引き起こされる疾患、例えば子宮頸癌、尖圭コンジローマを予防するために使用することができる。
【００３２】
特定の好ましい実施形態では、ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在する。特定の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染は一つ以上のＨＰＶ型による感染である（例えば、ＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染、及び／又はＨＰＶ３１感染）。特定の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染により引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジローマからなる群から選択される。
【００３３】
本発明の医薬組成物又はワクチンは当技術分野で周知の方法、例えば、経口又は注射により投与することができるが、これらに限定されない。本発明において、特に好ましい投与様式は注射である。
【００３４】
特定の好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物又はワクチンは単位用量の形で投与される。例えば、本発明を限定することを意図するものではないが、各単位用量に含まれるＨＰＶウイルス様粒子の量は５μｇ〜８０μｇ、好ましくは２０μｇ〜４０μｇである。
【００３５】
別の態様において、本発明は上記の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又は変異体を調製するための方法に関し、これは変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を宿主細胞において発現させ、次いで変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はそれらの変異体を宿主細胞の培養物から回収することを含む。
【００３６】
特定の好ましい実施形態では、宿主細胞は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
【００３７】
特定の好ましい実施形態において、この方法は、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）において発現させるステップ、次いで変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を大腸菌の溶解物上清を精製することにより得るステップを含む。特定の好ましい実施形態では、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体は大腸菌の溶解物上清からクロマトグラフィー（例えば、カチオン交換クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィー）により回収される。
【００３８】
別の態様において、本発明はワクチンを調製する方法に関し、これは本発明のＨＰＶウイルス様粒子を薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と組み合わせることを含む。
【００３９】
別の態様において、本発明はＨＰＶ感染やＨＰＶ感染により引き起こされる疾患を予防する方法に関し、これは被験体に本発明による予防的に有効な量のＨＰＶウイルス様粒子又は医薬組成物又はワクチンを投与することを含む。好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染が一つ以上のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染、及び／又はＨＰＶ３１感染）である。別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患には、子宮頸癌及び尖圭コンジローマが挙げられるが、これらには限定されない。別の好ましい実施形態では、被験体はヒトなどの哺乳動物である。
【００４０】
別の態様において、本発明は本発明による変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体又はＨＰＶウイルス様粒子の、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染により引き起こされる疾患の予防のための医薬組成物又はワクチンの製造における使用に関する。好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染が一つ以上のＨＰＶ型による感染（例えば、ＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染、及び／又はＨＰＶ３１感染）である。別の好ましい実施形態では、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患には、子宮頸癌及び尖圭コンジローマが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
本発明における関連用語の記載及び説明
本発明において、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、特に明記しない限り、当業者によって一般に理解される意味を有する。また、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学の実験室手順は、対応分野で広く使用されるすべてのルーチンのステップである。また、本発明のより良い理解のために、関連用語の定義及び説明を以下に提供する。
【００４２】
本発明によれば、用語「第二の型の野生型ＨＰＶ」は、ＨＰＶ１６とは異なる別の型の野生型ＨＰＶを意味する。本発明においては、第二の型の野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ３５である。本発明によれば、用語「第三の型の野生型ＨＰＶ」は、ＨＰＶ１６及び第二の型の野生型ＨＰＶとは異なる別の型の野生型ＨＰＶを指す。本発明においては、第三の型の野生型ＨＰＶは、好ましくは野生型ＨＰＶ３１である。
【００４３】
本発明によれば、表現「対応する位置」は、配列が最適に整列される場合、すなわち、配列が最大の同一性割合を得るように整列される場合に比較される配列の等価位置を指す。
【００４４】
本発明によれば、「野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス１６型（ＨＰＶ１６）に天然に存在する主要カプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の配列は、当技術分野で周知であり、様々な公的データベース（例えば、ＮＣＢＩデータベース登録番号ＡＮＡ０５４９６．１、ＡＮＡ０５５３９．１、ＡＧＣ６５５２５．１、ＡＡＶ９１６５９．１及びＡＡＤ３３２５９．１）で見つけることができる。
【００４５】
本発明において、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列に言及する場合、それは配列番号１に示される配列を参照して記載される。例えば、「野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の２９２〜３１６位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号１に示すポリペプチドの２９２〜３１６の位置のアミノ酸残基を指す。しかし、野生型ＨＰＶ１６が複数の分離株を含み得ること、及び様々な分離株がそのＬ１タンパク質のアミノ酸配列において相違を有し得ることが、当業者によって理解されるであろう。さらに、当業者であれば、配列に相違があるものの、ＨＰＶ１６の様々な分離株のＬ１タンパク質が、非常に高いアミノ酸配列同一性（通常９５％を超える、例えば９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、又は９９％を超える）を有すること、実質的に同じ生物学的機能を持っていることを理解するであろう。したがって、本発明では、「野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質」という用語は、配列番号１で表されるタンパク質だけでなく、様々なＨＰＶ１６分離株のＬ１タンパク質も含む（例えば、ＡＮＡ０５４９６．１、ＡＮＡ０５５３９．１、ＡＧＣ６５５２５．１、ＡＡＶ９１６５９．１、及びＡＡＤ３３２５９．１に示されるようなＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質）。また、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、それは配列番号１の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ１６分離株のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、表現「野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２９２の３１６のアミノ酸残基」には、配列番号１の位置２９２〜３１６のアミノ酸残基、及び様々なＨＰＶ１６分離株のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
【００４６】
本発明によれば、「野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質」という用語は、ヒトパピローマウイルス３５型（ＨＰＶ３５）に天然に存在する主要カプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の配列は、当技術分野で周知であり、様々な公的データベース（例えば、ＮＣＢＩデータベース登録番号Ｐ２７２３２．２、ＡＣＶ８４０２２．１、ＡＥＩ６１３６５．１、ＡＥＩ６１４２９．１、及びＡＣＶ８４０２９．１）で見つけることができる。
【００４７】
本発明では、野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列に言及する場合、それは配列番号２に示す配列を参照して記載される。例えば、表現「野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基」は、配列番号２で表されるポリペプチドの位置２６６〜２８８のアミノ酸残基を指す。しかし、野生型ＨＰＶ３５は、様々な単離株を含み得ること、及び様々な分離株がそれらのＬ１タンパク質のアミノ酸配列に相違を有し得ることが当業者に理解されるであろう。さらに、当業者であれば、配列に相違があるものの、ＨＰＶ３５の様々な分離株のＬ１タンパク質が非常に高いアミノ酸配列同一性（通常は９５％を超える、例えば９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、又は９９％を超える）を有すること、実質的に同じ生物学的機能を有することを理解するであろう。したがって、本発明では、用語「野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質」は、配列番号２で表されるタンパク質だけでなく、様々なＨＰＶ３５分離株のＬ１タンパク質（例えば、Ｐ２７２３２．２、ＡＣＶ８４０２２．１、ＡＥＩ６１３６５．１、ＡＥＩ６１４２９．１及びＡＣＶ８４０２９．１に示されるＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質）も含む。また、野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、それは配列番号２の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ３５分離株のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、表現「野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基」には、配列番号２の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基、及び様々なＨＰＶ３５分離株のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
【００４８】
本発明によれば、用語「野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質」は、ヒトパピローマウイルス３１型（ＨＰＶ３１）に天然に存在する主要カプシドタンパク質Ｌ１を指す。野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の配列は、当技術分野で周知であり、様々な公的データベース（例えば、ＮＣＢＩデータベース登録番号Ｐ１７３８８．１、ＡＥＩ６０９６５．１、ＡＮＢ４９６５５．１、及びＡＥＩ６１０２１．１）で見つけることができる。
【００４９】
本発明において、野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列に言及する場合、それは配列番号３に示される配列を参照して記載される。例えば、「野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１７７〜１７７のアミノ酸残基」という表現は、配列番号３で表されるポリペプチドの位置１７７〜１８２のアミノ酸残基」を指す。しかし、野生型ＨＰＶ３１が複数の分離株を含み得ること、種々の分離株がそれらのＬ１タンパク質のアミノ酸配列において相違を有し得ることが当業者により理解される。さらに、当業者であれば、配列に相違はあるものの、ＨＰＶ３１の様々な分離株のＬ１タンパク質が非常に高いアミノ酸配列同一性（通常は９５％を超える、例えば９６％を超える、９７％を超える、９８％を超える、又は９９％を超える）を有すること、及び実質的に同じ生物学的機能を有することを理解するであろう。したがって、本発明では、用語「野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質」は、配列番号３で表されるタンパク質だけでなく、様々なＨＰＶ３１分離株のＬ１タンパク質（例えば、Ｐ１７３８８．１、ＡＥＩ６０９６５．１、ＡＮＢ４９６５５．１及びＡＥＩ６１０２１．１に示されるＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質）も含む。また、野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の配列断片が記載される場合、それは配列番号３の配列断片だけでなく、様々なＨＰＶ３１単離株のＬ１タンパク質の対応する配列断片も含む。例えば、表現「野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１７７〜１８２のアミノ酸残基」は、配列番号３の位置１７７〜１８２のアミノ酸残基、及び様々なＨＰＶ３１分離株のＬ１タンパク質の対応する断片を含む。
【００５０】
本発明によれば、表現「対応する配列断片」又は「対応する断片」とは、配列が最適に整列された場合、すなわち配列が最も高い同一性のパーセントを得るように整列された場合と比較して、配列の同等の位置に配置されている断片を指す。
【００５１】
本発明によれば、表現「Ｘ個のアミノ酸のＮ末端切断」は、タンパク質のＮ末端の位置１〜Ｘのアミノ酸残基が（タンパク質翻訳の開始のための）開始コドンによりコードされているメチオニン残基で置換されていることを指す。例えば、３０個のアミノ酸のＮ末端切断を有するＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質のＮ末端の位置１〜３０のアミノ酸残基を開始コドンによってコードされるメチオニン残基で置換することにより得られるタンパク質を指す。
【００５２】
本発明によれば、「変異体」という用語は、そのアミノ酸配列が１つ又はいくつか（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８又は９個）のアミノ酸の置換（好ましくは保存的置換）、付加又は欠失を有するか、又は本発明による変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質（例えば、配列番号７、９、１０及び１１に示されるタンパク質）と比較して、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有し、及び変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の機能を維持するタンパク質を指す。本発明において、用語「変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の機能」とは、身体において少なくとも二つのＨＰＶ型（例えば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５、又はＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１）に対する中和抗体の生成を誘導する能力を意味する。「同一性」という用語は、ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の類似性の尺度である。一般に、配列は最大一致を得るように整列される。「同一性」自体には、当技術分野で周知の意味があり、ＢＬＡＳＴなどの公開されたアルゴリズムを使用して計算することができる。
【００５３】
本発明によれば、用語「同一性」は、２つのポリペプチド間又は２つの核酸間の一致度を指す。比較のための２つの配列が特定の部位に塩基又はアミノ酸の同じモノマーサブユニットを持っている場合（例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれが特定の部位にアデニンを持っている、又は２つのポリペプチドのそれぞれが特定の部位にリジンを持っている）、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列間の同一性パーセントは、比較対象部位の総数に対する２つの配列が共有する同一部位の数ｘ１００の関数である。例えば、２つの配列の１０の部位のうち６つが一致する場合、これらの２つの配列は６０％の同一性を有する。たとえば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴは５０％の同一性を共有する（６つの部位のうち３つが一致する）。一般に、２つの配列の比較は、最大の同一性が得られるように行われる。そのような整列は、例えば、ニードルマンらの方法に基づく整列プログラム（ＤＮＡｓｔａｒ，  Ｉｎｃ．）のようなコンピュータープログラムを使用することにより行うことができる（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３‐４５３，１９７０）。２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセントは、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓとＷ．  Ｍｉｌｌｅｒのアルゴリズム（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１‐１７（１９８８））を使用し、ＰＡＭ１２０重み残余テーブルを用いて、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４で決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｃｇ．ｃｏｍで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれているＮｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４４‐４５３（１９７０））により、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックス又はＰＡＭ２５０マトリックスを使用し、１６、１４、１２、１０、８、６、又は４のギャップウェイトと１、２、３、４、５、又は６の長さウェイトで決定できる。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に不利な影響又は変化を与えないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発などの当技術分野で知られている標準的な技法によって導入することができる。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、対応するアミノ酸残基に対して、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、物理的又は機能的に類似する（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合又は水素結合等を形成する能力を含む化学的性質を有する）残基で置換されるという置換が含まれる。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を持つアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を持つアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を持つアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を持つアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、一般的に保存的置換とは、対応するアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーの別のアミノ酸残基で置換することを指す。アミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野で周知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０‐１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９‐８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：４１２‐４１７（１９９７）を参照されたい。これらは参照により本明細書に組み込まれる）。
【００５５】
本発明によれば、用語「大腸菌発現系」は、大腸菌（株）及びベクターからなる発現系を指し、ここで、大腸菌（株）は、ＥＲ２５６６、ＢＬ２１（ＤＥ３）、Ｂ８３４（ＤＥ３）、及びＢＬＲ（ＤＥ３）を含む市販の株に由来するが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明によれば、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドを挿入することができる核酸運搬ツールを指す。ベクターが、その中に挿入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の発現を可能にする場合、そのベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターは、宿主細胞への形質転換、形質導入、又はトランスフェクションにより、宿主細胞において担持された遺伝物質要素を発現させることができる。ベクターは、当業者に周知であり、プラスミド、ファージ、コスミドなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
本発明によれば、「薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤」という用語は、当技術分野で周知の、被験体及び活性成分に薬理学的及び／又は生理学的に適合する担体及び／又は賦形剤を指し（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ＡＲ編、１９版、ペンシルベニア：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５参照）、これはｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ｐＨ調整剤には、リン酸緩衝液が含まれるが、これに限定されない。界面活性剤には、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤、又は非イオン界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ‐８０が含まれるが、これらに限定されない。アジュバントには、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及びフロイントアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント）が含まれるが、これらに限定されない。イオン強度増強剤には、ＮａＣｌが含まれるが、これに限定されない。
【００５８】
本発明によれば、「有効量」という用語は、意図された目的を効果的に達成できる量を指す。例えば、疾患（ＨＰＶ感染など）の予防に有効な量とは、疾患（ＨＰＶ感染など）の発生を予防、抑制、又は遅延させるのに有効な量を指す。そのような有効量の決定は、当業者の能力の範囲内である。
【００５９】
本発明によれば、「クロマトグラフィー」という用語には、イオン交換クロマトグラフィー（カチオン交換クロマトグラフィーなど）、疎水性相互作用クロマトグラフィー、吸収クロマトグラフィー（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーなど）、ゲル濾過クロマトグラフィー（ゲル排除クロマトグラフィー）、及びアフィニティークロマトグラフィーが含まれるが、これらに限定されない。
【００６０】
本発明によれば、「溶解物上清」という用語は、以下のステップにより生成される溶液を指す：宿主細胞（大腸菌など）を溶解緩衝液中で破壊し、その後、不溶性物質を、破壊された宿主細胞を含有する溶解溶液から除去する。様々な溶解緩衝液が当技術分野で周知であり、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液などが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、宿主細胞の破壊は、当業者に周知の方法によって達成することができ、ホモジナイザー破壊、超音波処理、粉砕、高圧押出、リゾチーム処理などが挙げられるが、これらに限定されない。不溶性物質を除去する方法も当業者に周知であり、濾過及び遠心分離が挙げられるが、これらに限定されない。
【発明の効果】
【００６１】
本発明の有益な効果
研究によれば、ＨＰＶ１６及び他の型のＨＰＶ（例えばＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１など）との間の特定の交差防御があるものの、このような交差防御は、それ自身の型のＶＬＰの防御効力の、通常百分の一未満、さらには千分の一未満の乏しい効力を有する。したがって、ＨＰＶ１６ワクチンを接種した被験体は他の型のＨＰＶ（例えばＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１など）に感染する高いリスクが依然としてあることが示されている。
【００６２】
本発明は、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質及びそれにより形成されたＨＰＶウイルス様粒子を提供する。本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ１６と他の型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１）との間に有意な交差防御を提供することができる。具体的には、同じ免疫化用量で、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は、体内で少なくとも２つの型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５、又はＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１）に対して高力価の中和抗体の生成を誘導することができ、その効果は、複数の型のＨＰＶのＶＬＰの混合物（例えば、ＨＰＶ１６ＶＬＰ及びＨＰＶ３５ＶＬＰの混合物、又はＨＰＶ１６ＶＬＰ、ＨＰＶ３５ＶＬＰ、及びＨＰＶ３１ＶＬＰの混合物）と同等である。したがって、本発明のＨＰＶウイルス様粒子は少なくとも２つの型のＨＰＶ（例えば、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５、又はＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５、及びＨＰＶ３１）による感染及びそれに伴う疾患を同時に防止するために使用することができ、有意に有利な技術的効果を有する。これは、ＨＰＶワクチンの防御の範囲を拡大し、ＨＰＶワクチンの生産コストを削減する上で特に重要な利点がある。
【００６３】
以下、本発明の実施形態を添付の図面及び実施形態を参照して詳細に説明する。しかし、当業者は、以下の図面及び実施例が本発明の単なる例示であり、本発明の範囲を限定することを意図していないことを理解するであろう。以下の図面及び好ましい実施形態の詳細な説明によれば、本発明の様々な目的及び有利な態様が当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１は実施例１の精製変異タンパク質のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動の結果を示す。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＨＰＶ１６Ｎ３０（３０個のアミノ酸のＮ末端切断を有するＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質）；レーン２：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１；レーン３：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２；レーン４：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３；レーン５：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４；レーン６：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５；レーン７：ＨＰＶ１６Ｎ３０；レーン８：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１；レーン９：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２；レーン１０：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３；レーン１１：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５。結果は、クロマトグラフィーによる精製後、タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５が９５％以上の純度を有することを示した。
【００６５】
【図２】図２は、広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用して、実施例１で調製されたＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５のウエスタンブロット検出の結果を示す。レーンＭ：タンパク質分子量マーカー；レーン１：ＨＰＶ１６Ｎ３０；レーン２：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１；レーン３：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２；レーン４：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３；レーン５：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４；レーン６：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５；レーン７：ＨＰＶ１６Ｎ３０；レーン８：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１；レーン９：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２；レーン１０：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３；レーン１１：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５。結果は、変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５が広域スペクトル抗体４Ｂ３によって特異的に認識できることを示した。
【００６６】
【図３】図３Ａ‐３Ｌは、タンパク質ＨＰＶ１６Ｎ３０、ＨＰＶ３５  Ｌ１、ＨＰＶ３１  Ｌ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５を含むサンプルの分子ふるいクロマトグラフィー分析の結果を示す。図３Ａ：ＨＰＶ１６Ｎ３０；図３Ｂ：ＨＰＶ３５  Ｌ１；図３Ｃ：ＨＰＶ３１  Ｌ１；図３Ｄ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１；図３Ｅ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２；図３Ｆ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３；図３Ｇ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４；図３Ｈ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５；図３Ｉ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１；図３Ｊ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２；図３Ｋ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３；図３Ｌ：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５。結果は、各試料の第１のタンパク質ピークが約１２分間で出現し、これらがＨＰＶ１６Ｎ３０タンパク質から組織化されたＶＬＰ（ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ）、ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質から組織化されたＶＬＰ（ＨＰＶ３５  ＶＬＰ）、及びＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質から組織化されたＶＬＰ（ＨＰＶ３１  ＶＬＰ）と同等であることを示した。これは、上記変異タンパク質の全てがＶＬＰに組織化され得ることを示す。
【００６７】
【図４】図４Ａ‐４Ｌは、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５  ＶＬＰについての沈降速度分析の結果を示す。図４Ａ、Ｈ１６Ｎ３０  ＶＬＰ；図４Ｂ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ；図４Ｃ、ＨＰＶ３１  ＶＬＰ；図４Ｄ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１  ＶＬＰ；図４Ｅ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２  ＶＬＰ；図４Ｆ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３  ＶＬＰ；図４Ｇ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰ；図４Ｈ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５  ＶＬＰ；図４Ｉ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１  ＶＬＰ；図４Ｊ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２  ＶＬＰ；図４Ｋ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰ；図４Ｌ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数が、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ、及びＨＰＶ３１  ＶＬＰの沈降係数に類似していることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５がサイズと形態の点で野生型ＶＬＰと類似のウイルス様粒子に組織化されることを示す。
【００６８】
【図５】図５Ａ〜５Ｌは、様々なＶＬＰサンプルについての透過型電子顕微鏡観察の結果を示す（１００，０００倍の倍率、バー＝０．１μｍ）。図５Ａ、ＨＰＶ１６Ｎ３０によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｂ、ＨＰＶ３５  Ｌ１によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｃ、ＨＰＶ３１  Ｌ１によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｄ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｅ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｆ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｇ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｈ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｉ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１によって組織化されたＶＬＰ；図５Ｊ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２から組織化されたＶＬＰ；図５Ｋ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３から組織化されたＶＬＰ；図５Ｌ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５から組織化されたＶＬＰ。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５がＨＰＶ１６Ｎ３０、ＨＰＶ３５  Ｌ１及びＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質に類似し、約３０ｎｍの半径のＶＬＰに組織化され得ることを示した。
【００６９】
【図６】図６Ａ‐６Ｌは、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５  ＶＬＰについての熱安定性評価の結果を示す。図６Ａ、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ；図６Ｂ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ；図６Ｃ、ＨＰＶ３１  ＶＬＰ；図６Ｄ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１  ＶＬＰ；図６Ｅ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２  ＶＬＰ；図６Ｆ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３  ＶＬＰ；図６Ｇ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰ；図６Ｈ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５  ＶＬＰ；図６Ｉ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１  ＶＬＰ；図６Ｊ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２  ＶＬＰ；図６Ｋ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰ；図６Ｌ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５  ＶＬＰ。結果は、各タンパク質によって形成されたＶＬＰの熱安定性が非常に高いことを示す。
【００７０】
【図７Ａ】図７Ａは、マウスにおける実験群のＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５  ＶＬＰ及び対照群のＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰの免疫防御の評価結果を示す。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰがマウスにおいてＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５に対する高力価中和抗体を誘導したことを示し；ＨＰＶ１６に対するその防御効果はＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰと同程度であり、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独よりも有意に高く；また、ＨＰＶ３５に対するその防御効果はＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独、混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰと同程度であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独よりも有意に高いことを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰがＨＰＶ１６感染及びＨＰＶ３５感染に対する効果的なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ１６  ＶＬＰ及びＨＰＶ３５  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることを示す。
【００７１】
【図７Ｂ】図７Ｂは、マウスにおける実験群のＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰ及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５  ＶＬＰ、及び対照群のＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ、ＨＰＶ３１  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰの免疫防御の評価結果を示す。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２  ＶＬＰ及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰがマウスにおいてＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１に対する高力価中和抗体を誘導し；そのＨＰＶ１６に対する防御効果がＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独と混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独よりも有意に高く；ＨＰＶ３５に対するそれらの防御効果がＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独よりも有意に高く；そのＨＰＶ３１に対する防御効果はＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり；ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独よりも有意に高いことを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２  ＶＬＰ、及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰがＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染、ＨＰＶ３１感染に対する効果的なワクチンとして使用することができ、ＨＰＶ１６  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ、及びＨＰＶ３１  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用することができることを示す。
【００７２】
【図８Ａ−８Ｃ】図８Ａ‐８Ｃは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰによるマウスの免疫化後のマウス血清における中和抗体力価の評価結果を示す。図８Ａ：１０μｇ用量群（アルミニウムアジュバントを使用した免疫化用量が１０μｇであった）。図８Ｂ：１μｇ用量群（アルミニウムアジュバントを使用した免疫化用量が１μｇであった）。図８Ｃ：０．１μｇ用量群（アルミニウムアジュバントを使用した免疫化用量が０．１μｇであった）。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰが、マウスにおいてＨＰＶ１６に対する高力価の中和抗体を誘導し、その防御効果が同用量のＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰと同等であり、同用量でＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独よりも有意に良好であり；これはまた、マウスにおいてＨＰＶ３５に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果が、同用量でＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰと同等であり、同用量でＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独よりも有意に良好であることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰがＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５に対して良好な交差免疫原性と交差防御を有していることを示す。
【００７３】
【図８Ｄ−８Ｆ】図８Ｄ〜８Ｆは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰによるマウスの免疫化後のマウス血清の中和抗体力価の評価結果を示す。図８Ｄ：１０μｇ用量群（アルミニウムアジュバントを使用した免疫化用量が１０μｇであった）。図８Ｅ：１μｇ用量群（アルミニウムアジュバントを使用した免疫化用量が１μｇであった）。図８Ｆ：０．１μｇ用量群（アルミニウムアジュバントを使用した免疫化用量が０．１μｇであった）。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰがマウスにおけるＨＰＶ１６に対する高力価の中和抗体を誘導し、その防御効果は同じ用量でＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、同じ用量でＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独又はＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独よりも有意に良好であり；それはまた、マウスにおいてＨＰＶ３５に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果は同じ用量でＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、同じ用量で、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独又はＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独よりも有意に良好であり；そしてまた、マウスにおいてＨＰＶ３１に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果がＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、同じ用量でＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独又はＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独よりも有意に良好であることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐Ｓ３  ＶＬＰが、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１に対して良好な交差免疫原性及び交差防御を有することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
配列情報
本発明に関与する配列のいくつかを以下の表１に示す。
【表１−１】
2020526223.tif 000003
【表１−２】
2020526223.tif 000004
【００７５】
配列１（配列番号１）：
【化１】
2020526223.tif 000005
【００７６】
配列２（配列番号２）：
【化２】
2020526223.tif 000006
【００７７】
配列３（配列番号３）：
【化３】
2020526223.tif 000007
【００７８】
配列４（配列番号４）：
【化４】
2020526223.tif 000008
【００７９】
配列５（配列番号５）：
【化５】
2020526223.tif 000009
【００８０】
配列６（配列番号６）：
【化６】
2020526223.tif 000010
【００８１】
配列７（配列番号７）：
【化７】
2020526223.tif 000011
【００８２】
配列８（配列番号８）：
【化８】
2020526223.tif 000012
【００８３】
配列９（配列番号９）：
【化９】
2020526223.tif 000013
【００８４】
配列１０（配列番号１０）：
【化１０】
2020526223.tif 000014
【００８５】
配列１１（配列番号１１）：
【化１１】
2020526223.tif 000015
【００８６】
配列１２（配列番号１２）：
【化１２】
2020526223.tif 000016
【００８７】
配列１３（配列番号１３）：
【化１３】
2020526223.tif 000017
【００８８】
配列１４（配列番号１４）：
【化１４】
2020526223.tif 000018
【００８９】
配列１５（配列番号１５）：
【化１５】
2020526223.tif 000019
【００９０】
配列１６（配列番号１６）：
【化１６】
2020526223.tif 000020
【００９１】
配列１７（配列番号１７）：
【化１７】
2020526223.tif 000021
【００９２】
配列１８（配列番号１８）：
【化１８】
2020526223.tif 000022
【００９３】
配列１９（配列番号１９）：
【化１９】
2020526223.tif 000023
【００９４】
配列２０（配列番号２０）：
【化２０】
2020526223.tif 000024
【００９５】
配列２１（配列番号２１）：
【化２１】
2020526223.tif 000025
【００９６】
配列２２（配列番号２２）：
【化２２】
2020526223.tif 000026
【００９７】
配列２３（配列番号２３）：
【化２３】
2020526223.tif 000027
【００９８】
配列２４（配列番号２４）：
【化２４】
2020526223.tif 000028
【００９９】
配列２５（配列番号２５）：
【化２５】
2020526223.tif 000029
【０１００】
配列２６（配列番号２６）：
【化２６】
2020526223.tif 000030
【０１０１】
配列２７（配列番号２７）：
【化２７】
2020526223.tif 000031
【０１０２】
配列２８（配列番号２８）：
【化２８】
2020526223.tif 000032
【実施例】
【０１０３】
発明を実施するための特定の形態
以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらは本発明を説明することを意図しており、限定するものではない。
【０１０４】
特に断らない限り、本発明において使用される分子生物学実験方法及びイムノアッセイは、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（分子クローニング：実験室マニュアル），第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，第３版，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９５の手順を実質的に参照することにより実施された；制限エンドヌクレアーゼは、メーカーの推奨する条件下で使用された。本発明は実施例により記載され、この実施例は本発明の範囲を限定することを意図するものではないことは、当業者によって理解されるであろう。
【０１０５】
実施例１．変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の発現及び精製
発現ベクターの構築
ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質から誘導されるセグメント３又はセグメント５を含む変異ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質をコードする発現ベクターをＰＣＲによって多部位突然変異誘発のために構築した。ここで使用された初期テンプレートはｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ１６Ｌ１Ｎ３０Ｃプラスミドであった（これは３０個のアミノ酸のＮ末端切断を有するＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質をコードした（このタンパク質はＨＰＶ１６Ｎ３０と名付けた）；表２では１６Ｌ１Ｎ３０と略す）。各ＰＣＲ反応に使用されたテンプレートとプライマーを表２に示し、ＰＣＲ反応の増幅条件を以下のように設定した：９４℃で１０分間の変性；２５サイクルの（９４℃で５０秒間の変性、一定時間の間、特定の温度でのアニーリング、７２℃で７分３０秒間の伸長）；最終的に７２℃で７分間の伸長。用いたＰＣＲプライマーの配列を表３に示す。
【０１０６】
２μｌの制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩを増幅産物（５０μＬ）に加え、３７℃で６０分間インキュベートした。１０μＬの酵素消化産物を、塩化カルシウム法で調製した４０μＬのコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入）の形質転換に使用した。形質転換された大腸菌を、カナマイシン（最終濃度：２５ｍｇ／ｍｌ、以下同じ）を含む固体ＬＢ培地（ＬＢ培地成分：１０ｇ／Ｌペプトン、５ｇ／Ｌ酵母粉末、１０ｇ／Ｌ塩化ナトリウム、以下同じ）上に広げ、単一コロニーが明確に観察されるまで、３７°Ｃで１０〜１２時間静置培養した。単一コロニーを採取し、液体ＬＢ培地（カナマイシンを含む）４ｍｌを含有する試験管に接種し、３７℃で１０時間、２２０ｒｐｍで振とう培養した。その後、細菌溶液１ｍＬを取り、−７０°Ｃで保存した。大腸菌からプラスミドを抽出し、プラスミドに挿入した標的断片のヌクレオチド配列をＴ７プライマーを用いて配列決定した。配列決定の結果は、構築されたプラスミド（発現ベクター）のそれぞれに挿入された標的断片のヌクレオチド配列がそれぞれ配列番号１８及び２０であり、それによりコードされるアミノ酸配列が配列番号６及び８であることを示した（対応するタンパク質を、それぞれ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５と名付けた）。
【０１０７】
変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置１９９〜２１０のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置１７３〜１８４のアミノ酸残基で置き換えられている点で、ＨＰＶ１６Ｎ３０と異なっていた。変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置３７４〜３８４のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置３４６〜３５６のアミノ酸残基で置き換えられている点で、ＨＰＶ１６Ｎ３０と異なっていた。
【０１０８】
ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質に由来するセグメント１、セグメント２又はセグメント４を含む変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の発現ベクターは、ギブソンアセンブリ（Ｇｉｂｓｏｎ  ＤＧ、Ｙｏｕｎｇ  Ｌ、Ｃｈｕａｎｇ  ＲＹ、Ｖｅｎｔｅｒ  ＪＣ、Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ＣＡ、Ｓｍｉｔｈ  ＨＯを使用して構築された。ＤＮＡ分子の数百キロベースまでの酵素的アセンブリ。Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２００９；６：３４３-５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．１３１８）。簡単に説明すると、突然変異を含む短い断片と突然変異を含まない長い断片を最初にＰＣＲ反応で取得し、次にギブソンアセンブリシステムを使用して２つの断片をループに連結した。使用した最初のテンプレートは、ｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ１６Ｌ１Ｎ３０Ｃプラスミド及びｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ３５Ｌ１プラスミド（ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質をコードする。表２で３５Ｌ１と略記）であった。各ＰＣＲ反応のために使用されるテンプレート及びプライマーは、表２に示した。短い断片を増幅するためのＰＣＲ反応のための増幅条件を以下のように設定した：９４℃で１０分間の変性；２５サイクルの（９４℃で５０秒間の変性、特定の温度で特定の時間のアニーリング、７２°Ｃで１分間の伸長）；最後に７２℃で１０分間の伸長。長い断片を増幅するためのＰＣＲ反応のための増幅条件を以下のように設定した：９４℃で１０分間の変性；２５サイクルの（９４℃で５０秒間の変性、一定時間、所定の温度でのアニーリング、７２℃で７分３０秒間の伸長）；最終的に７２℃で１０分間の伸長。使用したＰＣＲプライマーの配列を表３に示す。増幅産物を電気泳動に供した後、標的断片をＤＮＡ回収キットを用いて回収し、それらの濃度を決定した。増幅された短い断片及び長い断片を、２：１のモル比で混合し（３μＬの総体積）、次いで２Ｘギブソンアセンブリプレミックス（２Ｘギブソンアセンブリマスターミックス、ＮＥＢから購入した、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼを含む）の３μＬを添加し、５０°Ｃで１時間反応させた。
【０１０９】
塩化カルシウム法により調製された４０μＬのコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入）を、組織化された生成物（６μＬ）で形質転換した。形質転換された大腸菌を、カナマイシンを含む固体ＬＢ培地上に広げ、単一コロニーが明確に観察されるまで３７℃で１０〜１２時間静的培養した。単一コロニーを採取し、４ｍＬの液体ＬＢ培地（カナマイシンを含む）を含有する試験管に接種し、３７℃で１０時間、２２０ｒｐｍで振盪培養した。その後、細菌溶液１ｍＬを取り、−７０°Ｃで保存した。プラスミドを大腸菌から抽出し、プラスミドに挿入された標的断片のヌクレオチド配列をＴ７プライマーを用いて配列決定した。配列決定の結果は、構築されたプラスミド（発現ベクター）のそれぞれに挿入された標的断片のヌクレオチド配列はそれぞれ配列番号１６、１７、及び１９であり、それによってコードされるアミノ酸配列は配列番号４、５、及び７（対応するタンパク質は、それぞれ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４と名付けた）であることを示した。
【０１１０】
変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置７６〜８７のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置５０〜６１のアミノ酸残基で置き換えられている点でＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置１５８〜１６７のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置１３２〜１４１のアミノ酸残基で置き換えられている点でＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２９２〜３１６のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基で置き換えられている点でＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。
【０１１１】
変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質を、ＨＰＶ３５  Ｌ１に由来するセグメント及びＨＰＶ３１  Ｌ１に由来するセグメントを含有する二置置換とともにコードする発現ベクターを、ギブソンアセンブリを用いて構築した。簡単に言えば、突然変異を含む短い断片と突然変異を含まない長い断片を最初にＰＣＲ反応により取得し、次にギブソンアセンブリシステムを使用して２つの断片をループに連結した。使用した初期テンプレートは、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４プラスミド（変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４をコードする。表２でＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４と略記）、及びｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ３１Ｌ１プラスミド（ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質をコードする。表２で３１Ｌ１と略記）を含んでいた。それぞれのＰＣＲ反応のために使用されるテンプレート及びプライマーを表２に示し、短い断片を増幅するためのＰＣＲ反応のための増幅条件を以下のように設定した：９４℃で１０分間の変性、２５サイクルの（９４℃で５０秒間の変性、特定の温度で一定時間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長）；最後に７２℃で１０分間の伸長。長い断片を増幅するためのＰＣＲ反応のための増幅条件を以下のように設定した：９４℃で１０分間の伸長、２５サイクルの（９４℃で５０秒間の変性、特定の温度で一定時間のアニーリング、７２℃で７分３０秒間の伸長）；最後に７２℃で１０分間の伸長。用いたＰＣＲプライマーの配列を表３に示す。増幅産物を電気泳動に供し、次いで標的断片を、ＤＮＡ回収キットを用いて回収し、その濃度を測定した。増幅された短い断片及び長い断片を２：１のモル比で混合し（３μＬの全体積）、次いで２Ｘギブソンアセンブリプレミックスの３μＬ（２Ｘギブソン・アセンブリマスターミックス、ＮＥＢから購入した、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＴａｑＤＮＡリガーゼを含む）を追加し、５０℃で１時間反応させた。
【０１１２】
塩化カルシウム法により調製された４０μＬのコンピテント大腸菌ＥＲ２５６６（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入）を、組織化された生成物（６μＬ）で形質転換した。形質転換された大腸菌をカナマイシンを含む固体ＬＢ培地上に広げ、単一コロニーが明確に観察されるまで３７℃で１０〜１２時間静的培養した。単一コロニーを採取し、４ｍＬの液体ＬＢ培地（カナマイシンを含む）を含有する試験管に接種し、３７℃で１０時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。その後、細菌溶液１ｍＬを取り、−７０°Ｃで保存した。プラスミドを大腸菌から抽出し、プラスミドに挿入した標的断片のヌクレオチド配列をＴ７プライマーを用いて配列決定した。配列決定の結果は、構築されたプラスミド（発現ベクター）のそれぞれに挿入された所望の断片の塩基配列はそれぞれ配列番号２１、２２、２３、及び２４であり、それによりコードされたアミノ酸配列は配列番号９、１０、１１、１２（対応するタンパク質は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５と名付けた）であることを示した。
【０１１３】
変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２９２〜３１６のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基で置き換えられ、及び野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置７６‐８７のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置５０〜６２のアミノ酸残基で置き換えられている点で、ＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２９２〜３１６のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基で置き換えられ、及び野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置１５２〜１６７のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１２７〜１４２のアミノ酸残基で置き換えられている点で、ＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。変異タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２９２〜３１６のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基で置き換えられ、及び野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２０２〜２０７のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１７７〜１８２のアミノ酸残基で置きかえられている点で、ＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。変異アタンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５は、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２９２〜３１６のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基で置き換えられ、及び野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置３７５〜３８４のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置３５０〜３５９のアミノ酸残基で置き換えられている点で、ＨＰＶ１６Ｎ３０と異なった。
【０１１４】
【表２】
2020526223.tif 000033
【０１１５】
【表３−１】
2020526223.tif 000034
【表３−２】
2020526223.tif 000035
【０１１６】
変異タンパク質の大規模スケールでの発現
組換えプラスミドｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、ｐＴＯ‐Ｔ７‐Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５を担持する大腸菌の細菌液を、−７０℃の冷蔵庫から取り出し、１００ｍｌのカナマイシン含有ＬＢ液体培地に別々に接種し、３７℃で約８時間２００ｒｐｍで培養し、次に、カナマイシン含有ＬＢ培地の５００ｍｌに移して接種し（細菌液１ｍｌを接種した）、継続的に培養した。細菌濃度が約０．６のＯＤ６００に達したときに、培養温度を２５℃に下げ、ＩＰＴＧの５００μＬをそれぞれの培養フラスコに添加し、培養を８時間続けた。培養終期に、細菌細胞を遠心分離により回収した。Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５タンパク質を別個に発現する細菌細胞が得られた。
【０１１７】
変異タンパク質を発現する細菌細胞の破壊
得られた細胞を、細菌細胞１ｇと溶解物１０ｍＬ（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．２、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）の比で再懸濁した。細胞を３０分間の超超音波処理により破壊した。破壊された細胞を含有する溶解物を、１５分間１３５００ｒｐｍ（３００００ｇ）で遠心分離し、上清（すなわち、破壊された細菌細胞の上清）を取り出した。
【０１１８】
変異タンパク質のクロマトグラフィー精製
機器システム：ＡＫＴＡエクスプローラー１００分取液体クロマトグラフィーシステム、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（現、Ａｍｅｒｓｈａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）製。
【０１１９】
クロマトグラフィー媒体：ＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ＣＨＴ‐ＩＩ（Ｂｉｏ‐ＲＡＤから購入）、及びＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）。
【０１２０】
緩衝液：２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＤＴＴ；及び２０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ８．０、２０ｍＭ  ＤＴＴ、２Ｍ  ＮａＣｌ。
【０１２１】
サンプル：Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５をそれぞれ含有する破壊された細菌細胞の得られた上清。
【０１２２】
溶出手順：
（１）破壊された細菌細胞の上清のカチオン交換精製をＳＰ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて行った：サンプルをカラムにロードし、次いで４００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて望ましくないタンパク質を溶出し、８００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液を使用して標的タンパク質を溶出し、８００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液により溶出された画分を収集した。
【０１２３】
（２）前のステップで得られた溶出画分のクロマトグラフィー精製をＣＨＴ  ＩＩ（ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）を用いて行った：前のステップで得られた溶出画分を、希釈してＮａＣｌの濃度を０．５Ｍに減少させた；サンプルをカラムにロードし、次いで５００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて望ましくないタンパク質を溶出し、１０００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液を用いて標的タンパク質を溶出し、１０００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液により溶出された画分を収集した。
【０１２４】
（３）前のステップで得られた溶出画分のクロマトグラフィー精製を、ＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）を使用して実行した：サンプルをカラムにロードし、次いで１０００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液を使用して不要なタンパク質を溶出し、２００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液を使用して標的タンパク質を溶出し、２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液により溶出された画分を回収した。
【０１２５】
ステップ（３）で得られた溶出画分１５０μＬを採取し、６Ｘローディング緩衝液３０μＬに加え、混合し、８０℃の水浴で１０分間インキュベートした。次に、サンプル１０μｌを１０％ＳＤＳ‐ポリアクリルアミドゲルで１２０Ｖで１２０分間電気泳動し；電気泳動バンドを、クーマシーブルー染色により可視化した。電気泳動の結果を図１に示した。結果は、上記精製工程の後、タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５の純度はすべて９５％を超えていた。
【０１２６】
同様の方法により、大腸菌とｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ１６Ｌ１Ｎ３０Ｃプラスミドを使用してＨＰＶ１６Ｎ３０タンパク質を調製及び精製した。大腸菌及びｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ３５Ｌ１プラスミドを使用して、ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質（配列番号２）を調製及び精製した。大腸菌及びｐＴＯ‐Ｔ７‐ＨＰＶ３１Ｌ１プラスミドを使用して、ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質（配列番号３）を調製及び精製した。
【０１２７】
変異タンパク質のウェスタンブロッティング
精製したタンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５を、上記の方法により電気泳動に供した。電気泳動後、ＨＰＶ  Ｌ１タンパク質に対する広域スペクトル抗体４Ｂ３を使用してウェスタンブロット検出を実施し、結果を図２に示した。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５は、広域スペクトル抗体４Ｂ３により特異的に認識できることを示した。
【０１２８】
例２：ＨＰＶウイルス様粒子のアセンブリと粒子形態検出
ＨＰＶウイルス様粒子のアセンブリ
所与の体積（約２ｍｌ）のタンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、又はＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５を、順次、（１）２Ｌの保存緩衝液（２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．５、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）、（２）２Ｌ復元緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６．０、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５Ｍ  ＮａＣｌ）；及び（３）２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌに透析した。透析は、３つの緩衝液のそれぞれにおいて１２時間行った。
【０１２９】
同様の方法で、タンパク質ＨＰＶ１６Ｎ３０、ＨＰＶ３５  Ｌ１及びＨＰＶ３１  Ｌ１を、それぞれ、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ及びＨＰＶ３１  ＶＬＰに組織化した。
【０１３０】
分子ふるいクロマトグラフィー分析
透析されたサンプルを、ＴＳＫ  Ｇｅｌ  ＰＷ５０００ｘｌ  ７．８ｘ３００ｍｍの分析カラムを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ、ＵＳＡからの１１２０  Ｃｏｍｐａｃｔ  ＬＣ高速液体クロマトグラフィーシステムを使用した分子ふるいクロマトグラフィーで分析した。分析の結果を図３Ａ〜３Ｌに示す。結果は、タンパク質Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５を含有するサンプルについて、最初のタンパク質のピークが約１２分で現れ、これはＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ及びＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であることを示した。これは上記で調製したタンパク質がＶＬＰに組織化されたことを示した。
【０１３１】
沈降速度分析
沈降速度分析のために使用された機器は、光学検査システム及びＡｎ‐５０Ｔｉ及びＡｎ‐６０Ｔｉローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ  ＸＬ‐Ａ分析型の超遠心であった。沈降速度法を使用して、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ、ＨＰＶ３１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数を分析した。結果を４Ａ〜４Ｌに示した。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５  ＶＬＰの沈降係数が、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ及びＨＰＶ３１  ＶＬＰと同様であることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５が大きさ及び形態の点で野生型ＶＬＰと類似のウイルス様粒子に組織化されることを示した。
【０１３２】
ウイルス様粒子の形態学的検出
ＶＬＰを含むサンプルの１００μＬを透過型電子顕微鏡観察のために採取した。使用した機器は、ＪＥＯＬ製の１００ｋＶ透過型電子顕微鏡で、倍率は１００，０００倍であった。簡単に言えば、１３．５μＬのサンプルを採取し、ｐＨ７．０の２％リンタングステン酸でネガティブ染色し、カーボンコーティングされた銅メッシュに固定し、次いで透過型電子顕微鏡で観察した。観察の結果は、図５Ａ〜５Ｌに示した。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５がすべてウイルス様粒子に組織化されることを示した。さらに、結果はまた、これらの変異タンパク質によって形成された粒子が約３０ナノメートルの半径を有し、サイズが均一であることを示した。これは、これらの変異タンパク質が、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１のＬ１タンパク質に類似し、均一なサイズのＶＬＰを形成することができることを示した。
【０１３３】
例３：ウイルス様粒子の熱安定性の評価
Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５によって形成されたＶＬＰの熱安定性は、ＧＥ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（旧ＭｉｃｒｏＣａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から購入した示差温度熱量計ＶＰキャピラリーＤＳＣを用いて評価した。ここで、タンパク質の保存緩衝液を対照として使用し、タンパク質の各々を１．５℃／分の加熱速度で１０℃〜９０℃の範囲内でスキャンした。テスト結果を図６Ａ〜６Ｌに示した。結果は、タンパク質のそれぞれにより形成されたＶＬＰが極めて高い熱安定性を有することを示した。
【０１３４】
実施例４：動物におけるウイルス様粒子の免疫防御の評価１
Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５によって形成されたＶＬＰの免疫防御特性をマウスを使用して評価した。免疫化に使用した動物は、５〜６週齢のＢａｌＢ／ｃマウス（通常グレード）（Ｓｈａｎｇｈａｉ  ＳＬＡＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．から購入）であった。
【０１３５】
上記で調製したＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５  ＶＬＰ、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ、及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰ（すなわち、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ及びＨＰＶ３５  ＶＬＰの混合物）をそれぞれアルミニウムアジュバントの上に吸着させた。マウスは、異なる免疫原に従って８つの群に分け、各群は５匹のマウスを含ませた。免疫化手順は以下のとおりであった：一次免疫を０週で実施し；追加免疫をそれぞれ２週と４週で行った。免疫化の方法は腹腔内注射とし、使用した免疫原と用量を表４に示す。一次免疫後８週で、静脈血を眼球から収集し、血清を分離した後、血清中の中和抗体の力価を測定した。試験結果を図７Ａに示す。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰが高い力価の中和抗体をマウスにおいてＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５に対して誘導し；ＨＰＶ１６に対するその防御効果は、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独よりも有意に高く；ＨＰＶ３５に対するその防御効果は、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独よりも有意に高いことを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰがＨＰＶ１６感染及びＨＰＶ３５感染に対する有効なワクチンとして使用でき、ＨＰＶ１６  ＶＬＰ及びＨＰＶ３５  ＶＬＰを含む混合ワクチンの代わりに使用できることを示した。
【０１３６】
【表４】
2020526223.tif 000036
【０１３７】
さらに、上記で調製したＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５  ＶＬＰ、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ、ＨＰＶ３１  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ、及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１（すなわち、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ及びＨＰＶ３１  ＶＬＰの混合物）を、それぞれ、アルミニウムアジュバントに吸着させた。マウスを異なる免疫原に従って８つの群に分け、各群には５匹のマウスを含ませた。免疫化手順は以下のとおりであった：一次免疫を０週で実施し；追加免疫をそれぞれ２週と４週で行った。免疫化の方法は腹腔内注射とし、使用した免疫原と用量を表５に示す。一次免疫後８週で、静脈血を眼球から収集し、血清を分離した後、血清中の中和抗体の力価を測定した。試験結果を図７Ｂに示す。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２  ＶＬＰ及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰがマウスにおいてＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１に対する高い力価の中和抗体を誘導し；そのＨＰＶ１６に対する防御効果はＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独よりも有意に高く；それらのＨＰＶ３５に対する防御効果はＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独、混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独、及びＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独よりも有意に高く；そのＨＰＶ３１に対する防御効果はＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独よりも有意に高いことを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１  ＶＬＰ、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２  ＶＬＰ及びＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰが、ＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染及びＨＰＶ３１感染に対する有効なワクチンとして使用することができ、ＨＰＶ１６  ＶＬＰ、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ及びＨＰＶ３１  ＶＬＰを含有する混合ワクチンの代わりに使用できることを示した。
【０１３８】
【表５】
2020526223.tif 000037
【０１３９】
実施例５：動物におけるウイルス様粒子の免疫防御の評価２
Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰのＥＤ５０
６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌マウス（８匹のマウス）を単回腹腔内注射によりアルミニウムアジュバントで免疫化した。ここで、実験群にはＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰ（免疫化用量は、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、及び０．００４μｇとした）を投与した、対照群はＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独とＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独（免疫化用量は、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、０．００４μｇとした）、又は混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰ（各ＶＬＰの免疫化用量は、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、０．００４μｇとした）を投与した；免疫化量は１ｍＬとした。免疫化後５週で、静脈血を眼球から回収し、血液中のＨＰＶ抗体を検出した。血清変換（seroconversion）（すなわち、マウスにおける抗体の生成の誘導）のＥＤ５０を、Ｒｅｅｄ‐Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ  ＬＪ  ＭＨ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｆｉｆｔｙ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．（５０パーセントのエンドポイントを推定する簡単な方法。）Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｇ．１９３８；２７：４９３‐７）によって、各サンプルについて計算した。結果を表６〜９に示した。
【０１４０】
【表６】
2020526223.tif 000038
【０１４１】
【表７】
2020526223.tif 000039
【０１４２】
【表８】
2020526223.tif 000040
【０１４３】
【表９】
2020526223.tif 000041
【０１４４】
結果は、マウスにおける免疫化の５週間後に、マウスにおいて抗ＨＰＶ１６抗体の生成を誘導するためのＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰのＥＤ５０は、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独よりも有意に優れており；マウスにおいて抗ＨＰＶ３５抗体の生成を誘導するためのそのＥＤ５０はＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独よりも有意に優れることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰがＨＰＶ１６とＨＰＶ３５に対する良好な交差免疫原性及び交差防御を有することを示した。
【０１４５】
Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰのＥＤ５０
６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌マウス（８匹のマウス）を、単回腹腔内注射によりアルミニウムアジュバントで免疫化した。実験群はＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬ（免疫化用量は０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、０．００４μｇとした）を投与し；対照群はＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独、ＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独（免疫化用量は０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、０．００４μｇとした）、及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰ（各ＶＬＰの免疫化用量は、０．３００μｇ、０．１００μｇ、０．０３３μｇ、０．０１１μｇ、０．００４μｇとした）を投与し；免疫体積は１ｍＬとした。免疫化後５週で、静脈血を眼球から回収し、血液中のＨＰＶ抗体を検出した。血清変換の誘導（すなわち、マウスにおける抗体の生成の誘導）のためのＥＤ５０は、各サンプルについて、Ｒｅｅｄ‐Ｍｕｅｎｃｈ法（Ｒｅｅｄ  ＬＪ  ＭＨ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｅｓｔｉｍａｔｉｎｇ  ｆｉｆｔｙ  ｐｅｒｃｅｎｔ  ｅｎｄｐｏｉｎｔｓ．（５０パーセントのエンドポイントを推定する簡単な方法。）Ａｍ  Ｊ  Ｈｙｇ．１９３８；２７：４９３‐７）によって計算した。結果を表１０〜１４に示した。
【０１４６】
【表１０】
2020526223.tif 000042
【０１４７】
【表１１】
2020526223.tif 000043
【０１４８】
【表１２】
2020526223.tif 000044
【０１４９】
【表１３】
2020526223.tif 000045
【０１５０】
【表１４】
2020526223.tif 000046
【０１５１】
結果は、マウスの免疫化の５週間後に、マウスにおける抗ＨＰＶ１６抗体の生成を誘導するためのＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰのＥＤ５０は、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独よりも有意に優れており；マウスにおいて抗ＨＰＶ３５抗体の生成を誘導するためのそのＥＤ５０は、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独よりも有意に良好であり；マウスにおいて抗ＨＰＶ３１抗体の生成を誘導するためのそのＥＤ５０は、ＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独及び混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独よりも有意に良好であることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰが、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１に対する良好な交差免疫原性及び交差防御を有することを示した。
【０１５２】
マウスにおけるＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰでの免疫化後の血清中の中和抗体の力価の評価
この実験では、免疫化プロトコルを表１５に示した。すべてのマウス（６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌マウス）を３つの群に分けた：１０μｇ用量群（免疫化用量はアルミニウムアジュバントを使用して１０μｇであった）、１μｇ用量群（免疫化用量はアルミニウムアジュバントを使用して１μｇであった）、及び０．１μｇ用量群（免疫化用量はアルミニウムアジュバントを使用して０．１μｇであった）。各群を４つのサブグループに細分し、対照サブグループ１及び２は、それぞれ、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及び単独ＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独で免疫化し、対照サブグループ３は混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰで免疫化し、実験サブグループはＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰで免疫化した。
【０１５３】
サブグループあたり６匹のマウスを腹腔内注射により免疫化し、免疫化用量はそれぞれ１０μｇ、１μｇ、及び０．１μｇであり、注射量は１ｍｌであった。全てのマウスは最初に０週で免疫化し、追加免疫をそれぞれ２週及び４週で行った。血液サンプルは８週で眼窩出血を介してマウスから採取し、血清中のＨＰＶ１６及びＨＰＶ３５に対する抗体の力価を分析した。分析の結果を図８Ａ〜８Ｃに示した。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰは、マウスにおけるＨＰＶ１６に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果がＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及び同じ用量での混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰと同等であり、同じ用量でＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独よりも有意に良好であり、それはマウスにおけるＨＰＶ３５に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果は、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独と同じ用量での混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５  ＶＬＰと同等であり、同じ用量でのＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独よりも有意に良好であることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４  ＶＬＰがＨＰＶ１６とＨＰＶ３５に対する良好な交差免疫原性及び交差防御を有することを示した。
【０１５４】
【表１５】
2020526223.tif 000047
【０１５５】
マウスにおけるＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰでの免疫化後の血清中の中和抗体の力価の評価
この実験では、免疫化プロトコルを表１６に示した。すべてのマウス（６週齢のＢａｌＢ／ｃ雌マウス）を３つの群に分けた：１０μｇ用量群（免疫化用量はアルミニウムアジュバントを使用して１０μｇであった）、１μｇ用量群（免疫化用量はアルミニウムアジュバントを使用して１μｇであった）、及び０．１μｇ用量群（免疫化用量はアルミニウムアジュバントを使用して０．１μｇであった）。各群は６つのサブグループに細分し、対照サブグループ１、２、及び３は、それぞれ、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独及びＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独を用いて免疫化し、対照サブグループ４は、混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰで免疫化し、実験サブグループはＨ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰ単独で免疫化した。
【０１５６】
サブグループあたり６匹のマウスを腹腔内注射により免疫化し、免疫化用量は１０μｇ、１μｇ、０．１μｇであり、注射量は１ｍｌであった。すべてのマウスは、最初０週で免疫化し、追加免疫をそれぞれ２週と４週で行った。血液サンプルをマウスから８週目で眼窩出血を介して採取し、血清中のＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１に対する抗体の力価を分析した。分析の結果を図８Ｄ〜８Ｆに示した。結果は、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰがマウスにおけるＨＰＶ１６に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果はＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独及び同じ用量での混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独又は同じ用量でＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独よりも有意に良好であり；それはマウスでＨＰＶ３５に対する中和抗体の高力価を誘導し、その防御効果はＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独及び同じ用量での混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０ＶＬＰ単独又は同じ用量でのＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独よりも有意に優れており；それはマウスにおけるＨＰＶ３１に対する中和抗体の高い力価を誘導し、その防御効果はＨＰＶ３１  ＶＬＰ単独及び同じ用量での混合ＨＰＶ１６／ＨＰＶ３５／ＨＰＶ３１  ＶＬＰと同等であり、ＨＰＶ１６Ｎ３０  ＶＬＰ単独又は同じ用量でのＨＰＶ３５  ＶＬＰ単独よりも有意に良好であることを示した。これは、Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３  ＶＬＰがＨＰＶ１６、ＨＰＶ３５及びＨＰＶ３１に対する良好な交差免疫原性及び交差防御を有することを示した。
【０１５７】
【表１６】
2020526223.tif 000048
【０１５８】
本発明の特定の実施形態を詳細に説明してきたが、当業者は、本発明の詳細の様々な修正及び変更を全ての開示の教示に照らして行うことができ、これらのすべての修正及び変更が本発明の範囲内にあることを理解するであろう。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲及びその均等物によって与えられる。
【配列表フリーテキスト】
【０１５９】
配列番号４  ＜２２３＞  Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ１
配列番号５  ＜２２３＞  Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ２
配列番号６  ＜２２３＞  Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ３
配列番号７  ＜２２３＞  Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４
配列番号８  ＜２２３＞  Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ５
配列番号９  ＜２２３＞  Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ１
配列番号１０  ＜２２３＞  Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ２
配列番号１１  ＜２２３＞  Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ３
配列番号１２  ＜２２３＞  Ｈ１６Ｎ３０‐３５Ｔ４‐３１Ｓ５
配列番号１３  ＜２２３＞  配列番号１をコードするＤＮＡ配列
配列番号１４  ＜２２３＞  配列番号２をコードするＤＮＡ配列
配列番号１５  ＜２２３＞  配列番号３をコードするＤＮＡ配列
配列番号１６  ＜２２３＞  配列番号４をコードするＤＮＡ配列
配列番号１７  ＜２２３＞  配列番号５をコードするＤＮＡ配列
配列番号１８  ＜２２３＞  配列番号６をコードするＤＮＡ配列
配列番号１９  ＜２２３＞  配列番号７をコードするＤＮＡ配列
配列番号２０  ＜２２３＞  配列番号８をコードするＤＮＡ配列
配列番号２１  ＜２２３＞  配列番号９をコードするＤＮＡ配列
配列番号２２  ＜２２３＞  配列番号１０をコードするＤＮＡ配列
配列番号２３  ＜２２３＞  配列番号１１をコードするＤＮＡ配列
配列番号２４  ＜２２３＞  配列番号１２をコードするＤＮＡ配列
配列番号２５  ＜２２３＞  野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基の配列
配列番号２６  ＜２２３＞  野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置５０〜６２のアミノ酸残基の配列
配列番号２７  ＜２２３＞  野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１２７〜１４２のアミノ酸残基の配列
配列番号２８  ＜２２３＞  野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１７７〜１８２のアミノ酸残基の配列
配列番号２９〜６０  ＜２２３＞  プライマー
【図１】
2020526223.tif 000049
【図２】
2020526223.tif 000050
【図３Ａ−３Ｈ】
2020526223.tif 000051
【図３Ｉ−３Ｌ】
2020526223.tif 000052
【図４Ａ−４Ｈ】
2020526223.tif 000053
【図４Ｉ−４Ｌ】
2020526223.tif 000054
【図５Ａ】
2020526223.tif 000055
【図５Ｂ】
2020526223.tif 000056
【図５Ｃ】
2020526223.tif 000057
【図５Ｄ】
2020526223.tif 000058
【図５Ｅ】
2020526223.tif 000059
【図５Ｆ】
2020526223.tif 000060
【図５Ｇ】
2020526223.tif 000061
【図５Ｈ】
2020526223.tif 000062
【図５Ｉ】
2020526223.tif 000063
【図５Ｊ】
2020526223.tif 000064
【図５Ｋ】
2020526223.tif 000065
【図５Ｌ】
2020526223.tif 000066
【図６Ａ−６Ｈ】
2020526223.tif 000067
【図６Ｉ−６Ｌ】
2020526223.tif 000068
【図７Ａ】
2020526223.tif 000069
【図７Ｂ】
2020526223.tif 000070
【図８Ａ−８Ｃ】
2020526223.tif 000071
【図８Ｄ−８Ｆ】
2020526223.tif 000072
【配列表】
2020526223000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月17日(2020.3.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体であって、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質が野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパクと比較して以下の変異を有する変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体：
（１）４〜５０個のアミノ酸のＮ末端切断；及び
（２）野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２９２〜３１６のアミノ酸残基の、第二の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
任意選択で、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質にはさらに以下の変異がある：
（３）野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置７６〜８７のアミノ酸残基の、第三の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
（４）野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置１５２〜１６７のアミノ酸残基の、第三の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；又は
（５）野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の位置２０２〜２０７のアミノ酸残基の、第三の型の野生型ＨＰＶのＬ１タンパク質の対応する位置のアミノ酸残基による置換；
及び、変異体は変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質とは、１、２、３、４、５、６、７、８、又は９個のアミノ酸の置換、付加又は欠失によってのみ異なり、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質の機能を維持する、すなわち、少なくとも２つの型のＨＰＶに対して中和抗体を誘導する能力を維持する。
【請求項２】
変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質が、野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパクと比較して、４、６、８、１０、２０、３０、又は４０個のアミノ酸のＮ末端切断を有する、請求項１に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体。
【請求項３】
第二の型の野生型ＨＰＶはＨＰＶ３５である；
好ましくは、（２）に記載される対応する位置のアミノ酸残基は野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質の位置２６６〜２８８のアミノ酸残基である、請求項１又は２に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体。
【請求項４】
第三の型の野生型ＨＰＶがＨＰＶ３１である；
好ましくは、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質が以下の項目：
（ａ）（３）に記載される対応する位置のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置５０〜６２のアミノ酸残基である、
（ｂ）（４）に記載される対応する位置のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１２７〜１４２のアミノ酸残基である、
（ｃ）（５）に記載される対応する位置のアミノ酸残基が野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質の位置１７７〜１８２のアミノ酸残基である、
の一つ以上を特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体。
【請求項５】
変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質が以下の項目：
１）野生型ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質は配列番号１に記載のアミノ酸配列を有する，
２）野生型ＨＰＶ３５  Ｌ１タンパク質は配列番号２に記載のアミノ酸配列を有する，
３）野生型ＨＰＶ３１  Ｌ１タンパク質は配列番号３に記載のアミノ酸配列を有する，
の一つ以上を特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体。
【請求項６】
変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質は配列番号７、９、１０、１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体をコードする単離された核酸。
【請求項８】
請求項７に記載の単離された核酸を含むベクター。
【請求項９】
請求項７に記載の単離された核酸及び／又は請求項８に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１０】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を含む又はからなる、ＨＰＶウイルス様粒子。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体、又は請求項７に記載の単離された核酸、又は請求項８に記載のベクター、又は請求項９に記載の宿主細胞、又は請求項１０に記載のＨＰＶウイルス様粒子を含む組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載のＨＰＶウイルス様粒子、及び必要に応じてさらに薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤を含む医薬組成物又はワクチンであって、
好ましくは、ＨＰＶウイルス様粒子は、ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患を予防するのに有効な量で存在する；
好ましくは、ＨＰＶ感染は、一つ以上のＨＰＶ型による感染である；
好ましくは、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジローマからなる群から選択される、上記医薬組成物又はワクチン。
【請求項１３】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を調製する方法であって、宿主細胞内で変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を発現させ、次いで宿主細胞の培養物から変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を回収することを含み；
好ましくは、宿主細胞は大腸菌であり；
好ましくは、この方法は、変異ＨＰＶ発現１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を大腸菌で発現させ、次いで大腸菌の溶解物上清を精製することによって変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体を得るステップを含み；好ましくは、変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体が大腸菌の溶解物上清からクロマトグラフィーにより回収される、上記方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載のＨＰＶウイルス様粒子を薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と組み合わせることを含む、ワクチンの調製方法。
【請求項１５】
ＨＰＶ感染又はＨＰＶ感染により引き起こされる疾患の予防に使用するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の変異ＨＰＶ１６  Ｌ１タンパク質又はその変異体、又は請求項１０に記載のＨＰＶウイルス様粒子：
好ましくは、ＨＰＶ感染は、一つ以上のＨＰＶ型による感染であり、
好ましくは、ＨＰＶ感染は、ＨＰＶ１６感染、ＨＰＶ３５感染、及びＨＰＶ３１感染のうちの一つ以上から選択され、
好ましくは、ＨＰＶ感染によって引き起こされる疾患は、子宮頸癌及び尖圭コンジローマからなる群から選択される。
【国際調査報告】
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