(57)【要約】開示されているのは、非自己認識の直接的な経路を介して同種Ｔ細胞を活性化する能力が改善された炎症促進性樹状細胞である。樹状細胞は、アデノウイルスで感染する。さらに、炎症促進性樹状細胞は、−未成熟樹状細胞を提供すること；−樹状細胞をアデノウイルスで感染させること；および−未成熟樹状細胞を、未成熟樹状細胞の成熟を誘導するために、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）−リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、ＴＬＲ７／８−リガンド、例えばレシキモド、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を添加することにより、炎症促進性樹状細胞に成熟させることによって得られている。【選択図】図２Ｂ
2020533977.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非自己認識の直接的な経路を介して同種Ｔ細胞を活性化する能力を有する炎症促進性樹状細胞であって、前記樹状細胞がアデノウイルスに感染しており、前記炎症促進性樹状細胞が以下：
−  未成熟樹状細胞を提供するステップ；
−  前記樹状細胞をアデノウイルスで感染させるステップ；および
−  前記未成熟樹状細胞を炎症促進性樹状細胞に成熟させるステップ
によって得られており、
前記成熟は、未成熟樹状細胞の成熟を誘導するためにＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）−リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、ＴＬＲ７／８−リガンド、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の添加によって行われる、炎症促進性樹状細胞。
【請求項２】
前記アデノウイルスが、Ａｄ５繊維軸および／またはノブの代わりにアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）由来の繊維軸および／またはノブを有するアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）である、請求項１に記載の炎症促進性樹状細胞。
【請求項３】
前記アデノウイルスのヘキソンタンパク質が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）からの転写のトランス活性化因子（ＴＡＴ）の少なくとも１つのタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含むように修飾されている、請求項１または２に記載の炎症促進性樹状細胞。
【請求項４】
前記アデノウイルスがＥ１欠失アデノウイルスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の炎症促進性樹状細胞。
【請求項５】
前記アデノウイルスが腫瘍抗原をコードするいずれの遺伝子も含んでおらず、それによって前記炎症促進性樹状細胞が感染しているが形質導入されていない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の炎症促進性樹状細胞。
【請求項６】
前記アデノウイルスが、腫瘍関連抗原または腫瘍特異性抗原コードする少なくとも１つの遺伝子を含み、それによって前記感染した樹状細胞が前記腫瘍関連抗原または特異性抗原を発現するように形質導入され；好ましくは、前記腫瘍抗原が、腫瘍ウイルス抗原、例えばヒトパピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、カポジ肉腫ウイルス、またはメルケル細胞ポリオーマウイルス、および突然変異由来新抗原からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の炎症促進性樹状細胞。
【請求項７】
前記成熟および前記アデノウイルスによる前記感染がそれぞれ同時に行われる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の炎症促進性樹状細胞。
【請求項８】
前記ＴＬＲ７／８−リガンドがレシキモドである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の炎症促進性樹状細胞。
【請求項９】
−  前記未成熟樹状細胞を前記炎症促進性樹状細胞に成熟させる前記ステップは、さらに、活性化を誘導するために、ＴＬＲ２−リガンド、ＴＬＲ４−リガンド、ＴＬＲ９−リガンド、インターフェロンα（ＩＦＮ−ａ）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−ａ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の添加を含み；かつ／または
−  前記未成熟樹状細胞を前記炎症促進性樹状細胞に成熟させる前記ステップは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の添加を含まない、
請求項１〜８のいずれか一項に記載の炎症促進性樹状細胞。
【請求項１０】
前記未成熟樹状細胞が、インターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の使用により単球を未成熟樹状細胞に分化させることによって提供され、前記単球が末梢血液白血球から単離されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の炎症促進性樹状細胞。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の炎症促進性樹状細胞および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
対象におけるがんの処置または予防に使用するためであり、前記炎症促進性樹状細胞は、前記対象に対して同種である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の炎症促進性樹状細胞、または請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記炎症促進性樹状細胞が腫瘍内に投与される、請求項１２に記載の使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の炎症促進性樹状細胞。
【請求項１４】
前記使用が、免疫抑制性腫瘍環境を減少させるか、または免疫系を活性化する薬物の投与をさらに含み；好ましくは、前記薬物は、スニチニブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピジリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、ゲムシタビンおよび５−フルオロウラシルからなる群より選択され；より好ましくは、前記薬物は、スニチニブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびピジリズマブからなる群より選択され；さらにより好ましくは、前記薬物は、スニチニブである、請求項１２または１３に記載の使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の炎症促進性樹状細胞。
【請求項１５】
前記アデノウイルスは、腫瘍関連抗原または腫瘍特異性抗原をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、それによって前記感染した樹状細胞は、前記腫瘍関連抗原または特異性抗原を発現するよう形質導入され；好ましくは、腫瘍抗原は、腫瘍ウイルス抗原、例えばヒトパピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、カポジ肉腫ウイルス、またはメルケル細胞ポリオーマウイルス、および突然変異由来新抗原からなる群から選択され；前記炎症促進性樹状細胞は、皮内、皮下または節内に投与される、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用のための、請求項１〜４および７〜１０のいずれか一項に記載の炎症促進性樹状細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の炎症促進性樹状細胞を提供する方法であって、前記炎症促進性樹状細胞が、非自己認識の直接的な経路を介して同種Ｔ細胞を活性化する能力を有し、かつ前記樹状細胞がアデノウイルスに感染しており、前記方法が以下のステップ：
−  未成熟樹状細胞を提供するステップ；
−  前記樹状細胞をアデノウイルスで感染させるステップ；および
−  前記未成熟樹状細胞を炎症促進性樹状細胞に成熟させるステップ
を含み、
前記成熟は、未成熟樹状細胞の成熟を誘導するためにＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）−リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、ＴＬＲ７／８−リガンド、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の添加によって行われる、方法。
【請求項１７】
前記アデノウイルスが、Ａｄ５繊維軸および／またはノブの代わりにアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）由来の繊維軸および／またはノブを有するアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アデノウイルスの前記ヘキソンタンパク質が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）からの転写のトランス活性化因子（ＴＡＴ）の少なくとも１つのタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含むように修飾されている、請求項１６または１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記アデノウイルスがＥ１欠失アデノウイルスである、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記アデノウイルスが、腫瘍抗原をコードするいずれの遺伝子も含まず、それによって前記炎症性樹状細胞が感染しているが形質導入されていない、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記アデノウイルスが、腫瘍関連抗原または腫瘍特異性抗原をコードする少なくとも１つの遺伝子を含み、それによって前記感染した樹状細胞が前記腫瘍関連抗原または特異性抗原を発現するように形質導入され；好ましくは、前記腫瘍抗原は、腫瘍ウイルス抗原、例えばヒトパピローマウイルス、エプスタイン−バーウイルス、カポジ肉腫ウイルス、またはメルケル細胞ポリオーマウイルス、および突然変異由来新抗原からなる群から選択される、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記成熟および前記アデノウイルスによる前記感染がそれぞれ同時に行われる、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＴＬＲ７／８リガンドがレシキモドである、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
−  前記未成熟樹状細胞を前記炎症促進性樹状細胞に成熟させる前記ステップは、さらに、活性化を誘導するために、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、ＴＬＲ９リガンド、インターフェロンα（ＩＦＮ−α）、インターロイキン１β（ＩＬ−１β）、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−ａ）からなる群から選択される少なくとも１つの物質の添加を含み；かつ／または
−  前記未成熟樹状細胞を前記炎症促進性樹状細胞に成熟させる前記ステップは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の添加を含まない、
請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記未成熟樹状細胞が、インターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の使用により単球を未成熟樹状細胞に分化させることによって提供され、前記単球が末梢血液白血球から単離されている、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非自己認識の直接的な経路を介して同種Ｔ細胞を活性化する能力を有する炎症促進性樹状細胞、ならびにがん処置におけるこのような炎症促進性樹状細胞の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
伝統的ながん療法、例えば手術、放射線、および化学療法は、がん患者の処置には不十分なことが多く、通常は重度の副作用を引き起こす。免疫療法は、負の副作用の少ない代替的な処置法として有望であることが示されている。
【０００３】
がん免疫療法は、チェックポイント遮断抗体、特にＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）およびＰＤ−１リガンド（ＰＤ−Ｌ１）相互作用を遮断する抗体の導入のおかげで、最近、非常に大きな進歩を遂げた。しかしながら、この種の処置から恩恵を受けるがん患者はごく一部に過ぎない。さらに、ある形態のがんに対してのみ有効である。当該分野においてまだ改善の余地があるため、がん免疫療法はより効率的で強固なものとなるように進化している。
【０００４】
免疫系が細胞、特にＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を有し、それが腫瘍細胞を認識し、潜在的に死滅させることができることは、今や十分に確立されている。それにもかかわらず、主要な問題は、これらのＴ細胞の死滅させる能力が、がん患者において誘導されないか、または弱く誘導されるだけであるということである。１つの可能性は、がん患者において機能的および腫瘍特異性Ｔ細胞免疫を誘発するための不十分な腫瘍抗原提示および樹状細胞（ＤＣ）による同時刺激が存在することである。このように、腫瘍細胞を認識し、死滅させる免疫系を「オンにする」ための免疫療法戦略を開発することは興味深い。
【０００５】
ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化を含む既存のがん免疫療法戦略は、主に、分化し、ｅｘ  ｖｉｖｏで抗原負荷された抗原負荷自己、患者由来ＤＣに焦点を当てている。このアプローチの根底にある前提は、ＤＣのｅｘ  ｖｉｖｏ操作によってもたらされる効率および制御が、強い抗原提示能および同時刺激能を有するＤＣを生成するということである。Ｔ細胞応答の質は、これらの自己ＤＣが流入領域リンパ節においてＭＨＣに限定された様式でＴ細胞に腫瘍抗原を提示する能力（ＤＣおよびＴ細胞は同じ個体、すなわち自己由来でなければならない）に依存し、したがって腫瘍特異性Ｔ細胞応答を作り出す。
【０００６】
患者由来のｅｘ  ｖｉｖｏ修飾樹状細胞（ＤＣ）は、腫瘍関連抗原または腫瘍特異性抗原に対するＴ細胞の直接的な技能により腫瘍特異性Ｔ細胞免疫を誘導することを目的とする。原理証明は、自己ＤＣワクチンについては、いくつかの臨床試験で観察されているが、臨床的反応はまだ最適以下である（非特許文献１）。さらに、様々な臨床転帰は、ワクチンＤＣの活性化状態と相関するようであり、従って、現時点での現場でのコンセンサスは、ＤＣ媒介Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）極性化免疫反応を誘導することができる免疫エンハンサーの製造のための最適化および標準化プロセスを推進する。
【０００７】
興味深いことに、しかし、最近の知見は、ｅｘ  ｖｉｖｏ修飾ワクチンＤＣは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞特異的免疫をプライミングするために、内因性バイスタンダー−ＤＣからの援助を実際に必要とすることを示している（非特許文献２；非特許文献３）。バイスタンダーＤＣのこの間接的なプライミングは、投与されたＤＣによる免疫細胞獲得および免疫細胞活性化炎症促進因子の能動的分泌に依存していることが多くによって見出されている。
【０００８】
未成熟単球由来ヒトＤＣは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）リガンドおよびＩＦＮ−γのような刺激のカクテルによって刺激されると、かなりの量のＴ−ヘルパー（Ｔｈ）−ｌサイトカインおよびケモカインを分泌することができる（非特許文献４；非特許文献５）。さらに、内因性バイスタンダーＤＣの間接プライミングの役割は、同種ＤＣ（ａｌｌｏＤＣ）の局所投与が、いわゆる「非自己認識の直接的な経路」を介して炎症促進性因子の豊富化された環境を作り出すことができ、その後、獲得され活性化されたアロ反応性Ｔ細胞によって放出される炎症促進性因子による内因性バイスタンダーＤＣの獲得と活性化の亢進をもたらすことを暗示している（非特許文献６）。非自己認識のこの直接的な経路、移植されたレシピエント由来のＴ細胞の最大１０％が、グラフト由来の同種ＤＣ上に存在する無傷の同種ＭＨＣ／ペプチド複合体の直接認識によって活性化されるようになり得る現象（非特許文献７を参照）は、活発な応答であり、自己ＭＨＣ制限の規則に違反するようであり、主として抗原模倣によって駆動される（非特許文献８を参照）。
【０００９】
同種ＤＣ（ａｌｌｏＤＣ）の使用は、当技術分野において以前に記載されている（特許文献１および特許文献２を参照）。さらに、Ｌａｕｒｅｌｌ，Ａら（非特許文献９を参照）が報告したように、転移性腎細胞がん（ｍＲＣＣ）を有する患者における第Ｉ／ＩＩ相臨床試験において、腫瘍内注射された炎症促進性ａｌｌｏＤＣを用いたａｌｌｏＤＣアプローチの検証に成功しており、現在、ｍＲＣＣと診断された患者における無作為化多施設第ＩＩ相試験（ＮＣＴ０２４３２８４６）において、さらなる臨床試験の対象となっている。ｍＲＣＣ患者における第Ｉ／ＩＩ相臨床試験からのデータによって、ａｌｌｏＤＣの腫瘍内投与は、処置を受けた患者の大半において、ＣＤ８＋Ｔ細胞の強い／塊状の腫瘍内浸潤を伴う腫瘍特異性Ｔ細胞の活性化を誘導することが示された。さらに、スニチニブとの併用で相乗的な抗腫瘍効果が認められた。スニチニブが骨髄由来サプレッサー細胞および制御性Ｔ細胞の数に影響を及ぼし、減少させることが示されていることから、ａｌｌｏＤＣは腫瘍特異性Ｔ細胞応答を誘発し、スニチニブの添加は腫瘍特異性Ｔ細胞応答に対して腫瘍をより感受性にするという仮説が立てられている。抗がん免疫プライマーとして使用するための同種ＤＣの概要は、最近Ｋａｒｌｓｓｏｎ−Ｐａｒｒａらにより発表されている（非特許文献１０）。
【００１０】
当技術分野におけるａｌｌｏＤＣの使用は、一見有望な免疫療法戦略を提供すると思われるが、腫瘍細胞に影響を及ぼす腫瘍特異性ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の数および機能の改善におけるａｌｌｏＤＣの能力をさらに改善することができることは、依然として興味深い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】欧州特許第１  ５０９  ２４４  Ｂｌ号
【特許文献２】欧州特許第２  ５３４  ２４２  Ｂｌ号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ａｎｇｕｉｌｌｅ，Ｓ．，ら、２０１４、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １５：ｅ２５７−２６７
【非特許文献２】Ｙｅｗｄａｌｌ，Ａ．Ｗ．，ら、２０１０、ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｔｏ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ５：ｅｌ  １１４４
【非特許文献３】Ｌｉｕ，Ｃ，ら、２００８、Ｐｌａｓｍａｃｙｔｏｉｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ＮＫ  ｃｅｌｌ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，ｔｕｍｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｒｏｓｓ−ｐｒｉｍｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１８：１１６５−１１７５
【非特許文献４】Ｎａｐｏｌｉｔａｎｉ，Ｇ．，Ａ．ら、２００５、Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ａ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  １−ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：７６９−７７６
【非特許文献５】Ｌｏｖｇｒｅｎ，Ｔ．，Ｄ．ら、２０１７．Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｍａｔｕｒｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．
【非特許文献６】Ｗａｌｌｇｒｅｎ，Ａ．Ｃら、２００５、Ｄｉｒｅｃｔ  ａｌｌｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｌｉｃｅｎｓｅｓ  ｔｈｅｍ  ｆｏｒ  Ｔｈ１  ｐｒｉｍｉｎｇ：ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｉｒｅｃｔ  ａｎｄ  ｉｎｄｉｒｅｃｔ  ａｌｌｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６２：２３４−２４２
【非特許文献７】Ｌｏｍｂａｒｄｉ  Ｇ，ら、Ａｌｌｏｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＤＲ１  ｂｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａ  ＤＲ４／ＤＲｗｌ３  ｒｅｓｐｏｎｄｅｒ  ｍｉｍｉｃｓ  ｓｅｌｆｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８９；８６：４１９０−４
【非特許文献８】Ｌｅｃｈｌｅｒ  Ｒ，ら、Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  −  ｆｒｉｅｎｄ  ｏｒ  ｆｏｅ？Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００１；１４：３５７−６８
【非特許文献９】Ｌａｕｒｅｌｌ，Ａら、Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ：ａ  ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｕｎｆａｖｏｕｒａｂｌｅ  ｒｉｓｋ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  ＩｍｍｕｎｏＴｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１７，５：５２
【非特許文献１０】Ｋａｒｌｓｓｏｎ−Ｐａｒｒａら、Ｉｌｉｘａｄｅｎｃｅｌ  −  ａｎ  Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ（２０１８）３５：１５６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
結果として、本発明は、本発明の第一の態様に従い、非自己認識の直接的な経路を介して同種Ｔ細胞を活性化する能力が改善された炎症促進性樹状細胞を提供することにより、単独または任意の組み合わせで、当該分野における上記の潜在的欠陥および欠点の１つ以上を緩和、軽減、除去または回避しようとする。樹状細胞は、アデノウイルスで感染している。さらに、樹状細胞は、以下：
−  未成熟樹状細胞を提供するステップ；
−  樹状細胞をアデノウイルスベクターで形質導入するステップ；および
−  未成熟樹状細胞を炎症促進性樹状細胞に成熟させるステップ
によって得られている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
未成熟樹状細胞を炎症促進性樹状細胞に成熟させる際に、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）−リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、ＴＬＲ７／８−リガンド、例えばレシキモド、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を含む成熟因子の混合物を加えて、未成熟樹状細胞の成熟を誘導する。
【００１５】
炎症促進性樹状細胞がアデノウイルスで感染し、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、ＴＬＲ７／８リガンド、例えばレシキモド、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の添加により成熟することは、一般的な所見とは対照的に、混合白血球反応（ＭＬＲ）中にｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定されるように、アデノウイルスで感染していない対応する炎症促進性樹状細胞と比較して、同種Ｔ細胞の非自己認識の直接的な経路を刺激する能力を改善した。重要なことに、このような炎症促進性樹状細胞は、それによって、抗原負荷バイスタンダーＤＣの活性化／成熟を介して、腫瘍細胞を特異的に認識することができる自己（バイスタンダーＤＣに関して）ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の数および機能を最終的に増加させる増加した能力も有する。したがって、これらのアデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞は、がんの処置または予防において、改良された細胞ベースの同種免疫エンハンサーとして有用である。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、非自己認識の直接的な経路を介して同種Ｔ細胞を活性化する改良された能力を有し、アデノウイルスで感染した炎症促進性樹状細胞を提供する方法が提供される。そのような方法は、以下：
−  未成熟樹状細胞を提供するステップ；
−  樹状細胞をアデノウイルスで感染させるステップ；および
−  未成熟樹状細胞を炎症促進性樹状細胞に成熟させるステップ
のステップを含み、
前記成熟は、未成熟樹状細胞の成熟を誘導するためにＴｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）−リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、ＴＬＲ７／８−リガンド、例えばレシキモド、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の添加によって行われる。
【００１７】
本発明のさらなる態様によれば、このようなアデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が提供される。同様に、このような組成物もまた、がんを処置または予防する際の改良された細胞ベースの同種免疫エンハンサーとして有用である。
【００１８】
本発明のさらなる態様によれば、アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞、またはそのようなアデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む、対象におけるがんの処置または予防に使用するための医薬組成物が提供され、炎症促進性樹状細胞は、対象に対して同種である。
【００１９】
本発明のさらなる態様によれば、それを必要とする対象におけるがんを処置または予防する方法が提供される。本方法は、アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞、またはそのようなアデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞、および少なくとも１つの薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物の、それを必要とする対象への投与を含む。さらに、炎症促進性樹状細胞は、対象と同種である。
【００２０】
本発明のさらなる有利な特徴は、従属請求項において定義される。さらに、本発明の有利な特徴は、本明細書に開示される実施形態において詳述される。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
患者由来、すなわち、自己に基づく免疫療法では、樹状細胞（ＤＣ）は、典型的には、腫瘍抗原（腫瘍関連または腫瘍特異性抗原）を発現するかまたは含むようにｅｘ  ｖｉｖｏで修飾される。当技術分野で認識されているように、腫瘍抗原を発現するかまたは含むようにＤＣを修飾するための種々の手段が利用可能である。これらの手段には、腫瘍抗原をコードする遺伝子を有するウイルスベクター、例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルスおよびレトロウイルスベクターでの感染が含まれる。
【００２２】
上述したように、炎症促進性同種ＤＣも、バイスタンダーＤＣを活性化することが見出されているので、免疫療法において使用することができる。活性化された内因性バイスタンダーＤＣによるプロセシングのための腫瘍抗原が何らかの形で投与部位に存在するので、腫瘍内に投与された同種ＤＣは、抗原負荷される必要はない（すなわち、腫瘍抗原を発現するかまたは含む）。がん免疫療法における細胞ベースの免疫エンハンサーとしての同種ＤＣの使用は、混合白血球反応（ＭＬＲ）における同種Ｔ細胞による非自己認識の直接的な経路の刺激に依存し、その結果、炎症促進性因子が追加的に製造される（Ｗａｌｌｇｒｅｎら、２００５、Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６２：２３４−２４２）。
【００２３】
炎症促進性ＤＣは、典型的には、単離された単球を未成熟ＤＣにｅｘ  ｖｉｖｏで分化させ、続いてそれらをｅｘ  ｖｉｖｏで炎症促進性ＤＣに成熟させることによって提供される。当該技術分野で認識されているように、特定の成熟プロトコルは、表現型に影響を及ぼすであろう。したがって、表面マーカーの発現、ならびに例えばサイトカインおよびケモカインの分泌は、異なる成熟プロトコルによって提供される炎症促進性ＤＣ間で異なるであろう。さらに、他の特性も異なる可能性がある。一例として、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）存在下での成熟は、遊走性ＤＣを提供するために不可欠である（Ｂｏｕｌｌａｒｔ  Ｉ  Ａ  Ｃら：「Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ３  ａｎｄ  ７／８  ｌｉｇａｎｄｓ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｈｉｇｈ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ」、ＣＡＮＣＥＲ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，ＩＭＭＵＮＯＴＨＥＲＡＰＹ  ｖｏｌ．５７（１１），２００８，ｐ．１５８９−１５９７を参照）。対照的に、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）存在下での成熟は、ＤＣの遊走能を損なうことが報告されている（Ａｌｄｅｒ  Ｊら：「Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ｄｏｓｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ  Ｅ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｃｅｌｌ−ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｏｒｇａｎ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ」、ＶＡＣＣＩＮＥ，ｖｏｌ．２４（４９−５０），２００６，ｐ．７０８７−７０９４を参照）。
【００２４】
Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）−リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、レシキモド（ＴＬＲ７／８−リガンド；１−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）イミダゾ［４，５−ｃ］キノリニル−１−イル］−２−メチルプロパン−２−オール）、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の組み合わせの使用により、同種ＤＣが炎症促進性ＤＣに成熟し、がん、例えば転移性腎細胞がんの腫瘍内処置に有用な組成物を提供することが、以前に示されている（欧州特許第２  ５３４  ２４２  Ｂｌ号を参照）。
【００２５】
腫瘍抗原を担持するＤＣを提供するための様々な手段を評価する際に、予想通り、未成熟ＤＣをアデノウイルスで感染させることは、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）−リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、レシキモド（ＴＬＲ７／８−リガンド）、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）を含む混合物の、アデノウイルス感染炎症促進性ＤＣへの未成熟ＤＣの成熟を誘導する能力を損なわないことが確認された。アデノウイルス感染炎症促進性ＤＣは、感染していない炎症促進性ＤＣの１つに相当する量の炎症因子を分泌したことから、以前の報告が確認された。
【００２６】
しかしながら、アデノウイルスでの感染が、感染したＤＣがＭＬＲ中の同種Ｔ細胞を活性化する能力を損なうことが当技術分野で知られていることを考えると、これらは同種の設定においては全くまたはほとんど使用されないと考えられた。
【００２７】
特に、２００２年に戻って、Ｊｏｎｌｅｉｔら．（Ｊｏｎｕｌｅｉｔら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０００）７，２４９−２５４中を参照）は、Ｅｌ置換、Ｅ３欠失アデノウイルスでのＤＣの感染および炎症促進性因子での成熟により、得られたＤＣの、高いＤＣ対Ｔ細胞比で同種Ｔ細胞（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）の増殖を刺激する能力が損なわれることを報告した。同様に、Ｔａｎらは、成熟した（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、およびＰＧＥ２）単球由来ＤＣをアデノウイルスで感染させると、ＭＬＲにおけるＤＣの同種Ｔ細胞を活性化する能力が抑制されることを報告している（ＢＬＯＯＤ，（２００５），１０５（１０），３８２４−３８３２を参照）。さらに、Ｎｅｗｔｏｎらは、炎症促進性因子（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＰＧＥ２）で成熟したアデノウイルス感染ＤＣは、同種Ｔ細胞の増殖を促進する能力が大幅に低下することを報告している（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００８）、１２５、４６９−４７９を参照）。Ｎｅｗｔｏｎによれば、この効果はアデノウイルス感染に特異的であり、これは偽感染またはレンチウイルス感染ＤＣでは同一の効果が認められなかったためである。
【００２８】
それにもかかわらず、アデノウイルス感染炎症促進性ＤＣがＭＬＲにおいて同種Ｔ細胞を活性化する能力を評価した。非常に驚くべきことに、優勢な見解とは全く対照的に、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）−リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、ＴＬＲ７／８−リガンド、例えばレシキモド、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の組合せを用いてＤＣが成熟したならば、アデノウイルス感染はＭＬＲにおいて同種Ｔ細胞を活性化する能力を損なわないことが見出された。
【００２９】
実際、アデノウイルス感染炎症促進性ＤＣは、ＭＬＲにおける同時培養した同種Ｔ細胞の活性化およびＩＦＮ−γの産生の増加によって決定されるように、非自己認識の直接的な経路を刺激する改善された能力を有することさえ見出された。さらに、アデノウイルス感染炎症促進性ＤＣは、非自己認識の直接的な経路を刺激する能力を改善しただけでなく、同種バイスタンダーＤＣの成熟の増加も提供し、その後、これらのバイスタンダーＤＣが自己（バイスタンダーＤＣに関して）抗原特異性Ｔ細胞を活性化する能力の増強をもたらした。このように、アデノウイルス感染炎症促進性ＤＣは、作用様式が非自己認識の直接的な経路に依存する、がん治療における使用のための改良された細胞ベースの同種免疫エンハンサーとして有用である。
【００３０】
従って、本発明の実施形態は、アデノウイルスで感染した炎症促進性樹状細胞に関する。アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞は、アデノウイルスで感染していない対応する炎症促進性樹状細胞と比較して、非自己認識の直接的な経路を介して同種Ｔ細胞を活性化する能力が向上している。さらに、アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞は、以下：
−  未成熟樹状細胞を提供するステップ；
−  樹状細胞をアデノウイルスベクターで形質導入するステップ；および
−  未成熟樹状細胞を炎症促進性樹状細胞に成熟させるステップ
によって得られている。
【００３１】
未成熟樹状細胞の炎症促進性樹状細胞への成熟は、未成熟樹状細胞の成熟を誘導するために、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）−リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、ＴＬＲ７／８−リガンド、例えばレシキモド、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の添加によって行われる。
【００３２】
Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）−リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、レシキモド（ＴＬＲ７／８−リガンド）、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の組合せを含む本成熟カクテルは、国際公開第２０１１／０９８５１６号に記載されている。Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）−リガンドポリ−Ｉ：Ｃは、ポリ（Ｃ）の鎖にアニールされたポリ（Ｉ）の鎖を含むｄｓＲＮＡの合成類似体である。鎖の大きさは、さまざまであり得る。サイズは、２００塩基対から８，０００塩基対、例えば２００〜１，５００または１，５００〜８，０００塩基対であり得る。ＴＬＲ７／８−リガンドＲ８４８は、当技術分野においてもレシキモドと表記される。レシキモドの代替物として、ガルジキモド（１−（４−アミノ−２−エチルアミノメチルイミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル）−２−メチルプロパン−２−オール）またはイミキモド（１−イソブチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン）をＴＬＲ７／８−リガンドとして使用することができる。典型的には、未成熟ＤＣは、８〜２４時間、例えば１８時間活性化因子に曝露される。
【００３３】
一実施形態によると、使用される成熟因子は、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）−リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、レシキモド（ＴＬＲ７／８−リガンド）、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）である。
【００３４】
必須ではないが、代替的な実施形態によれば、活性化は、ＴＬＲ２リガンド、ＴＬＲ４リガンド、例えば細菌リポ多糖およびモノホスホリル脂質Ａ、ＴＬＲ９リガンド、例えば微生物ＤＮＡを哺乳動物ＤＮＡから区別するＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）配列、インターフェロンα（ＩＦＮ−ａ）、インターロイキン１β（ＩＬ−Ιβ）、および腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−ａ）からなる群より選択される少なくとも１つの物質の添加をさらに含み得る。さらに、活性化は、成熟ＤＣが注射部位（腫瘍）から急速に離れる遊走性ＤＣになるのを防ぐために、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の添加を含まないことが好ましく、これは本発明の文脈内では不利であろう。
【００３５】
活性化に続いて、得られたアデノウイルス感染炎症促進性ＤＣを洗浄して、本質的に全ての活性化因子を除去することができる。したがって、活性化因子は、典型的には、がん免疫療法における免疫エンハンサーとしてアデノウイルス感染炎症促進性ＤＣを使用する前に洗浄除去される。活性化因子を除去することにより、活性化因子（ｅｘ  ｖｉｖｏで炎症促進性ＤＣを誘導するために加えられる）の同時投与が回避される。活性化因子の同時投与は、腫瘍内に獲得された未成熟ＤＣの強力かつ持続的な活性化にもつながり、移動性成熟ＤＣへの望ましい分化ではなく、炎症促進性成熟ＤＣへの分化につながる可能性が最も高い。
【００３６】
混合白血球反応（ＭＬＲ）によって決定されるように、非自己認識の直接的な経路を介して同種Ｔ細胞を活性化する能力を改善するために、ＤＣをアデノウイルスで感染させる。
【００３７】
種々のアデノウイルスが、技術分野で公知である。米国特許第９，０１７，６７２号において、遺伝子送達効率を高めたヘキソンＴＡＴ（転写のトランス活性化因子）−ＰＴＤ（形質導入ドメイン）修飾アデノウイルスである好ましいタイプのアデノウイルスが、開示される。このベクターは、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ５４９５２で２０１３年に報告されているように、Ｙｕ，Ｄ．によってさらに研究されている。
【００３８】
一実施形態によると、本アデノウイルスは、アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）である。アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）は、Ａｄ５繊維軸および／またはノブの代わりにアデノウイルス血清型３５（Ａｄ３５）由来の繊維軸および／またはノブを有するアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）であり得る。当業者が認識するように、Ａｄ５およびＡｄ３５を含むアデノウイルスのいくつかの血清型が、当技術分野で公知である。Ａｄ５繊維軸および／またはノブをＡｄ３５由来の繊維軸および／またはノブで置換することにより、形質導入効率が改善される。さらに、アデノウイルスベクターのヘキソンタンパク質が、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）からの転写のトランス活性化因子（ＴＡＴ）の少なくとも１つのタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含むように修飾されている場合が、好ましい。アデノウイルスベクターのヘキソンタンパク質を修飾して、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）からの転写のトランス活性化因子（ＴＡＴ）の少なくとも１つのタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を含むことにより、形質導入効率が改善される。ＴＡＴ−ＰＴＤ配列は、ヘキソンタンパク質の超可変領域５（ＨＶ５Ｒ）に導入することができる。一実施形態によると、アデノウイルスベクターのヘキソンタンパク質は、従って、配列番号１によるアミノ酸配列（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）を含む。さらに、配列番号１によるアミノ酸配列は、短いリンカーで隣接されていてもよく、従って配列番号２（ＡＧＧＧＡＧＧＧＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧＧＧＡＧＧＧＡ）によるアミノ酸配列を含んでもよい。好ましいアデノウイルス（Ａｄ５ＰＴＤｆ３５）の例は、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ（２０１３）８（１）：ｅ５４９５２に開示されている。さらに、アデノウイルスは、Ｅ１欠失アデノウイルスであり得る。熟練者が認識するように、Ｅ１欠失は、アデノウイルスが複製欠損であることを意味する。投与される対象内のウイルスをより良好に制御するためには、アデノウイルスが複製欠損であることが好ましい。一実施形態によると、アデノウイルスは、このように複製欠損、例えばＥ１欠失である。アデノウイルスはまた、Ｅ３欠失アデノウイルス、例えばＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスであってもよい。さらに、アデノウイルスは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型Ｅ６およびＥ７タンパク質（Ａｄ−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７）をコードする遺伝子を発現するアデノウイルスであってもよい。ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６型Ｅ６およびＥ７タンパク質をコードする遺伝子を発現するアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）のアデノウイルスは、Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７と表記され得る。
【００３９】
アデノウイルスは遺伝子送達ベクターとして当技術分野で使用されるが、本発明の根底にある効果は、アデノウイルスベクター中の腫瘍抗原をコードするいかなる遺伝子の含有にも依存せず、アデノウイルス自体での感染に依存する。したがって、アデノウイルス感染炎症促進性ＤＣは、一実施形態によれば、腫瘍抗原をコードするいかなる遺伝子も含んでいない。すなわち、ＤＣはアデノウイルスで感染しているが、腫瘍抗原をコードする遺伝子では形質導入されていない。
【００４０】
同種の炎症促進性ＤＣを腫瘍内に投与する必要はないが、ある用途（例えば、腫瘍が注射によって到達することが困難である場合、または腫瘍が小さい場合）においては、腫瘍内で発現される腫瘍抗原、すなわち感染および形質導入されたＤＣをコードし、したがって腫瘍関連または腫瘍特異性抗原を発現するアデノウイルスで感染した炎症促進性ＤＣを提供することが、依然として興味深い場合がある。したがって、アデノウイルス感染炎症促進性ＤＣは、一実施形態によれば、腫瘍関連抗原または腫瘍特異性抗原をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むことができる。腫瘍関連抗原または腫瘍特異性抗原をコードする少なくとも１つの遺伝子を含むアデノウイルスで感染した炎症促進性ＤＣを提供することによって、感染した樹状細胞を形質導入して、腫瘍関連抗原または腫瘍特異性抗原を発現させる。形質導入された炎症促進性ＤＣによって発現される腫瘍抗原の例には、腫瘍ウイルス抗原、例えばヒトパピローマウイルス、例えばＨＰＶ−１６もしくはＨＰＶ−１８、エプスタイン−バーウイルス、カポジ肉腫ウイルス、またはメルケル細胞ポリオーマウイルス、および突然変異由来の新抗原が含まれる。
【００４１】
本アデノウイルス感染炎症促進性ＤＣを提供する際には、未成熟ＤＣを感染させ、かつ炎症促進性ＤＣに成熟させることになる。感染および成熟の態様は、本明細書ですでに記載されている。一実施形態によれば、感染および成熟は、それぞれ同時に行われる。代替的な実施形態によれば、未成熟ＤＣを最初に感染させて、未成熟なアデノウイルス感染ＤＣを提供し、続いてアデノウイルス感染炎症促進性ＤＣに成熟させる。
【００４２】
未成熟ＤＣの提供は、当技術分野において周知である。典型的には、単球は、まず末梢血液白血球から、例えば全血の白血球アフェレーシスによって単離される。単離された単球は、次いで、例えばインターロイキン４（ＩＬ−４）および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の使用により未成熟樹状細胞に分化され得る。単球を、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）をインターロイキン−４（ＩＬ−４）と組み合わせて補足した細胞培養培地中で、２〜７日間、例えば約５日間培養して、単球を未成熟ＤＣに分化させてもよい。さらに、国際公開第２０１４／０９６０３３号では、未成熟ＤＣを提供するプロセスが開示されている。
【００４３】
炎症促進性樹状細胞を活性化に続いて凍結することにより、それらは貯蔵され得る。典型的には、炎症促進性樹状細胞は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）および血清または血漿を含む培地中で凍結される。使用前に、凍結した細胞を解凍し、ＤＭＳＯを洗浄除去してもよい。あるいは、解凍した細胞を直接使用する。
【００４４】
がんの処置に使用するために、アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞を、医薬組成物に処方することができる。医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体、例えばリン酸緩衝生理食塩水溶液、水、またはエマルジョン、例えば油／水もしくは水／油エマルジョンを含むことができる。医薬組成物は、湿潤剤をさらに含むことができる。さらに、医薬組成物は、薬学的に許容可能なアジュバント、賦形剤、安定剤、保存剤および／または当技術分野で公知の他の成分を含み得る。
【００４５】
一例として、担体は、ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水溶液でよい。さらに、担体は、凍結細胞を保存する培地であってもよい。例として、アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞は、既に述べたように、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む熱不活性化万能ドナー血漿中で凍結して、その貯蔵を可能にすることができる。アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞を含むこのような媒体は、直接、例えば、腫瘍内に注射して、一度解凍したものを使用することができる。代わりに、このような媒体で凍結した細胞を、投与される前に、解凍し、洗浄し、ヒト血清アルブミンを含む生理食塩水中に再懸濁してもよく、例えば、腫瘍内に注射してもよい。
【００４６】
薬学的に許容される組成物は、非経口投与、例えば腫瘍内、皮内、皮下または節内投与用に処方され得る。一実施形態によると、薬学的に許容される組成物は、腫瘍内投与のために処方される。腫瘍内投与において、薬学的に許容される組成物を、腫瘍に直接注射する。既に記載されているように（国際公開第２０１１／０９８５１６号を参照）、炎症促進性樹状細胞は、患者自身のＤＣ（本明細書ではバイスタンダーＤＣと表記）を獲得し、活性化する投与の部位において、混合白血球反応（ＭＬＲ）を介して炎症誘発反応を誘発して、腫瘍負荷遊走性ＤＣに発達する可能性があるため、がんの処置に有用である。
【００４７】
さらなる実施形態は、従って、アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞、またはがんの処置もしくは予防に使用するためのこのようなアデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞を含むこのような組成物に関する。そのような使用において、アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞は、対象自身のアロ反応性Ｔ細胞を活性化し、投与されたアデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞に対して同種であるＭＬＲを誘導することができるように、対象に対して同種である。アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞によって処置されるがんの例としては、腎細胞がん、肝細胞がん、消化管間質腫瘍、胆管がん、頭頸部がん、非小細胞肺がん、胃がん、子宮頸がんおよび悪性黒色腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
がんの処置に用いる場合、アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞は、他の既存の治療法と組み合わせてもよい。好ましい代替法は、アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞の投与を、免疫抑制性腫瘍環境を減少させる薬剤または免疫系を活性化させる薬剤と組み合わせることである。一例として、本アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞は、スニチニブもしくは同様なもの、または関連する受容体チロシンキナーゼ阻害剤と組み合わせることができる。さらに、ＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）またはＰＤ−１リガンドに対する抗体も、本アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞と組み合わせることができる。ＰＤ−１は、Ｔ細胞炎症活性を抑制することにより、免疫系をダウンレギュレートし、自己寛容を促進する重要な役割を果たすことが知られている細胞表面受容体である。ＰＤ−１に対する抗体には、例えば、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびピジリズマブが含まれる。さらに、ＰＤ−１リガンドを標的とする抗体、例えば、アテゾリズマブおよびアベルマブも、本アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞による処置を補う際に用途が見出され得る。さらに、本アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞はまた、例えば、ゲムシタビンまたは５−フルオロウラシルと組み合わせてもよい。
【００４９】
同様に、一実施形態は、がんの処置のための医薬の製造に使用するための、このようなアデノウイルス感染同種炎症促進性樹状細胞の使用に関する。
【００５０】
さらなる実施形態は、がんを処置する方法に関するものであり、アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞は、そのような処置を必要とする患者に投与される。投与量は、患者自身のＤＣを活性化して腫瘍負荷遊走性ＤＣに発達させるのに十分な量とすべきである。ＭＬＲを誘導するために、投与されたアデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞は、患者と同種である。
【００５１】
アデノウイルス感染炎症促進性樹状細胞は、典型的には、いかなる腫瘍抗原も発現しない。したがって、腫瘍内に投与することが好ましい。当技術分野で認識されているように（Ｌａｕｒｅｌｌ，Ａら、Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ｐｒｏ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒｓ：ａ  ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｈｕｍａｎ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｕｎｆａｖｏｕｒａｂｌｅ  ｒｉｓｋ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１７，５：５２；Ｋａｒｌｓｓｏｎ−Ｐａｒｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｌｉｘａｄｅｎｃｅｌ  −  ａｎ  Ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  Ｃｅｌｌ−Ｂａｓｅｄ  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ（２０１８）３５：１５６）、同種炎症促進性樹状細胞の投与は、腫瘍特異性Ｔ細胞の活性化およびＣＤ８＋Ｔ細胞の腫瘍内浸潤を腫瘍内に誘導する。腫瘍抗原をコードする遺伝子を形質導入された感染炎症促進性樹状細胞は、腫瘍内に投与することができるが、好ましくは、正常な皮膚もしくは皮下組織に、またはリンパ節に投与される。
【００５２】
さらなる実施形態は、本明細書に開示されるような炎症促進性樹状細胞、すなわち、非自己認識の直接的な経路を介して同種Ｔ細胞を活性化する改良された能力を有する炎症促進性樹状細胞を提供し、アデノウイルスに感染させる方法に関する。この方法は、以下のステップ：
−  未成熟樹状細胞を提供するステップ；
−  樹状細胞をアデノウイルスで感染させるステップ；および
−  未成熟樹状細胞を炎症促進性樹状細胞に成熟させるステップ
を含み、前記成熟は、未成熟樹状細胞の成熟を誘導するために、Ｔｏｌｌ様受容体３（ＴＬＲ３）−リガンドポリ−Ｉ：Ｃ、ＴＬＲ７／８−リガンド、例えばレシキモド、およびインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の添加によって行われる。提供された炎症促進性アデノウイルス感染樹状細胞は、アデノウイルスで感染していない対応する炎症促進性樹状細胞と比較して、非自己認識の直接的な経路を介して同種Ｔ細胞を活性化する能力が改善されている。
【００５３】
アデノウイルス感染樹状細胞の提供に関するさらなる態様は、本明細書において既に記載されており、本実施形態にも同様に適用可能である。
【００５４】
さらなる詳細な説明がない限り、当業者は、先行する説明および以下の実験の部を用いて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。従って、本明細書に記載される好ましい具体的な実施形態は、単なる例示であって、いかなる方法においても、本明細書の残りを限定するものではないと解釈されるべきである。さらに、本発明は、具体的な実施形態を参考にして上述されているが、本明細書に示される特定の形態に限定されることは意図されていない。むしろ、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定され、具体的な上記以外の他の実施形態は、これらの添付の特許請求の範囲内で等しく可能であり、例えば、上述のものとは異なる。
【００５５】
特許請求の範囲において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）／含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、他の要素またはステップの存在を除外しない。さらに、個々の特徴は異なる請求項に含まれてもよいが、これらはおそらく有利に結合されてもよく、異なる請求項に含まれることは、特徴の組合せが実行不可能かつ／または有利でないことを意味しない。
【００５６】
さらに、単数形の参照は、複数形を除外しない。用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「第１の」、「第２の」等は、複数形を排除しない。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】図１。ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ成熟ＤＣは、成熟した表現型およびＴｈ１分極性サイトカイン分泌プロファイルを発現する。（データを、平均値±ＳＥＭとして示す（ｎ．ｓ．ｐ≧０．０５、＊  Ｐ＜０．０５、＊＊  Ｐ＜０．０１、＊＊＊  Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊  Ｐ＜０．０００１））。（Ａ）ＣＤ１４＋単球を健康ドナーＰＢＭＣから単離し、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４によりｉｍＤＣに５日間分化させ、異なる条件下で１８時間成熟させ、洗浄し、さらに２４時間培養し、分析した。
【図１Ｂ】図１。ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ成熟ＤＣは、成熟した表現型およびＴｈ１分極性サイトカイン分泌プロファイルを発現する。（データを、平均値±ＳＥＭとして示す（ｎ．ｓ．ｐ≧０．０５、＊  Ｐ＜０．０５、＊＊  Ｐ＜０．０１、＊＊＊  Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊  Ｐ＜０．０００１））。（Ｂ）ＤＣは、フローサイトメトリーにより、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ８３発現について特徴付けした。８人のドナーから産生されたＤＣ（ＣＤ１４−ＣＤ１ａ＋）上の各マーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図１Ｃ】図１。ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ成熟ＤＣは、成熟した表現型およびＴｈ１分極性サイトカイン分泌プロファイルを発現する。（データを、平均値±ＳＥＭとして示す（ｎ．ｓ．ｐ≧０．０５、＊  Ｐ＜０．０５、＊＊  Ｐ＜０．０１、＊＊＊  Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊  Ｐ＜０．０００１））。（Ｃ）ＥＬＩＳＡを用いて、各ＰＢＭＣドナーのＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−６およびＣＸＣＬ１０分泌を測定した。
【図２Ａ】図２。Ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで自然免疫細胞および適応免疫細胞を活性化する。（データを、平均値±ＳＥＭとして示す（ｎ．ｓ．ｐ≧０．０５、＊  Ｐ＜０．０５、＊＊  Ｐ＜０．０１、＊＊＊  Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊  Ｐ＜０．０００１））。（Ａ）１８時間の成熟および洗浄（図１Ａに記載のサンプル）の後、ここではａｌｌｏＤＣと呼ばれるＤＣを、同種ＰＢＭＣと共培養した（異なるドナーからの意味）。共培養２４時間後、ＰＢＭＣプールにおけるＴ細胞の活性化は、ＣＤ６９の発現によって特徴づけられた。
【図２Ｂ】図２。Ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで自然免疫細胞および適応免疫細胞を活性化する。（データを、平均値±ＳＥＭとして示す（ｎ．ｓ．ｐ≧０．０５、＊  Ｐ＜０．０５、＊＊  Ｐ＜０．０１、＊＊＊  Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊  Ｐ＜０．０００１））。（Ｂ）８人の非血縁ドナーの１６の個々の組合せからのＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６−）上のＣＤ６９に対する平均蛍光強度を示す。
【図２Ｃ】図２。Ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで自然免疫細胞および適応免疫細胞を活性化する。（データを、平均値±ＳＥＭとして示す（ｎ．ｓ．ｐ≧０．０５、＊  Ｐ＜０．０５、＊＊  Ｐ＜０．０１、＊＊＊  Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊  Ｐ＜０．０００１））。（Ｃ）ａｌｌｏＤＣ−ＰＢＭＣ共培養からのＭＬＲ（混合白血球反応）上清（ａｌｌｏ−ＳＮ）を、宿主「バイスタンダー」ｉｍＤＣのシナリオを模倣するために、バイスタンダー未成熟（ｉｍ）ＤＣ（ＰＢＭＣと同じドナーからのＤＣ）の成熟刺激として使用した。バイスタンダーＤＣ成熟は、バイスタンダーＤＣ（ＣＤ１４−ＣＤ１ａ＋）上の各マーカーについてのＭＦＩ散布図に示されるように、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ８３のアップレギュレーションによって評価した。３名の非血縁ドナーからの６つの個別の組み合わせを評価した。
【図３Ａ】図３。ＰＭＢＣ  ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣ共培養由来のＭＬＲ上清（ａｌｌｏ−ＳＮ）によって成熟した自己バイスタンダーＤＣによる抗原の交差提示によって誘導される抗原特異性Ｔ細胞の活性化および膨張。（Ａ）ＨＬＡ−Ａ２＋ドナー（バイスタンダーＤＣ）由来のバイスタンダーｉｍ  ＤＣを、ＣＭＶ−ｐｐ６５抗原（Ａ５４９（ｐｐ６５））を発現する腫瘍細胞由来の溶解物で２時間パルスし、各種共培養からのａｌｌｏ−ＳＮにより３８時間成熟させた（図２Ａ）。次に、交差提示バイスタンダーＤＣを自己Ｔ細胞と１８時間混合し、ＨＬＡ−Ａ２制限ＣＭＶ−ｐｐ６５４９５−５０３ペプチドに対するＴＣＲで操作した。
【図３Ｂ】図３。ＰＭＢＣ  ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣ共培養由来のＭＬＲ上清（ａｌｌｏ−ＳＮ）によって成熟した自己バイスタンダーＤＣによる抗原の交差提示によって誘導される抗原特異性Ｔ細胞の活性化および膨張。（Ｂ）ＥＬＩＳＡを用いて、遺伝子操作された抗原特異性Ｔ細胞が上清中に放出するＩＦＮ−γの濃度を測定した。３人の非血縁ドナーからの６つの個々の組み合わせを試験した。
【図３Ｃ】図３。ＰＭＢＣ  ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣ共培養由来のＭＬＲ上清（ａｌｌｏ−ＳＮ）によって成熟した自己バイスタンダーＤＣによる抗原の交差提示によって誘導される抗原特異性Ｔ細胞の活性化および膨張。（Ｃ）ＣＭＶ血清陽性、ＨＬＡ−Ａ２＋ドナー由来のバイスタンダーＤＣを、上記のように調製し、低用量ＩＬ−２（２０ＩＵ／ｍｌ）の存在下で１２日間、自己（バイスタンダーＤＣに関して）、非遺伝子操作、Ｔ細胞を刺激するために使用する。
【図３Ｄ】図３。ＰＭＢＣ  ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣ共培養由来のＭＬＲ上清（ａｌｌｏ−ＳＮ）によって成熟した自己バイスタンダーＤＣによる抗原の交差提示によって誘導される抗原特異性Ｔ細胞の活性化および膨張。（Ｄ）ＰＥ結合ＨＬＡ−Ａ＊０２０１／ｐｐ６５４９５−５０３四量体を用いたフローサイトメトリーにより、非遺伝子操作Ｔ細胞のＣＭＶ−ｐｐ６５特異性膨張を定量した。成熟刺激としてＰＢＭＣ  ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣ共培養からのａｌｌｏ−ＳＮを用いた４つのうち１つの代表的な個体組み合わせからのＦＡＣＳプロットを示す。
【図３Ｅ】図３。ＰＭＢＣ  ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣ共培養由来のＭＬＲ上清（ａｌｌｏ−ＳＮ）によって成熟した自己バイスタンダーＤＣによる抗原の交差提示によって誘導される抗原特異性Ｔ細胞の活性化および膨張。（Ｅ）次に、ＣＭＶ−ｐｐ６５４９５−５０３ペプチド（関連標的）またはＴＡＲＰ４−１３ペプチド（不関連標的）のいずれかを負荷したＴ２細胞への曝露によって、膨張した非操作Ｔ細胞を再刺激した。ＥＬＩＳＡを用いて、再刺激後１８時間に採取した上清中のＩＦＮ−γの濃度を測定した。点線は未成熟なバイスタンダーＤＣによって刺激されたＴ細胞からの背景ＩＦＮ−γ放出を示す。データを、平均値±ＳＥＭとして示す（＊  Ｐ＜０．０５、＊＊  Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊  Ｐ＜０．０００１）。
【図４Ａ】図４。ｇｐ−１００をコードするＡｄ５Ｍベクターで形質導入したＣＯＭＢＩＧ−ＤＣによる予防的ワクチン接種は、間接的にｇｐ−１００特異性Ｔ細胞をプライミングする。（Ａ）腫瘍抗原ｐｇ１００（Ａｄ５Ｍ（ｇｐ１００）−ａｌｌｏＤＣ）をコードするＡｄ５Ｍベクターで形質導入したＣＯＭＢＩＧ  ＤＣ（ａｌｌｏＤＣ）が非腫瘍保有マウスのｇｐ１００特異性Ｔ細胞を間接的に刺激する能力を、Ａｄ５Ｍ（ｇｐ１００）−ａｌｌｏＤＣ（０日目）のｓ．ｃ．注射をｇｐ１００特異性Ｔｈｙ１．１＋  ｐｍｅｌ−１脾細胞の静脈内（ｉ．ｖ．）養子細胞移入（２日目）と組み合わせることによって評価した。５日後にＴｈｙ  １．１染色によってＴ細胞の読み出しを行った（７日目）。
【図４Ｂ】図４。ｇｐ−１００をコードするＡｄ５Ｍベクターで形質導入したＣＯＭＢＩＧ−ＤＣによる予防的ワクチン接種は、間接的にｇｐ−１００特異性Ｔ細胞をプライミングする。（Ｂ）２匹のマウス由来のａｌｌｏＤＣまたはＡｄ５Ｍ（ｇｐ１００）−ａｌｌｏＤＣに応答したＴｈｙ  １．１＋  ｐｍｅｌ−１Ｔ細胞（Ｔｈｙ  １．１＋）の特異的増殖の代表的散布図を示す。
【図５Ａ】図５。ｇｐ−１００をコードするＡｄ５Ｍベクターで形質導入したＣＯＭＢＩＧ−ＤＣでの治療的ワクチン接種は、腫瘍成長を低下させ、生存期間を延長する。（Ａ）治療状況において、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＲｊマウスを、最初に１×１０５  Ｂ  １６−Ｆ  １０細胞（０日目）で後側腹部に皮下注射し、１×１０７  ｐｍｅｌ−１脾細胞を静脈内に施与した（８日目）。処置は、１×１０６  Ａｄ５Ｍ（ｇｐ１００）−ａｌｌｏＤＣｓ（８および１４日目）または陰性対照としてのＰＢＳのｉ．ｔ．注射と組み合わせた。腫瘍成長は、キャリパー測定によりモニターした。
【図５Ｂ】図５。ｇｐ−１００をコードするＡｄ５Ｍベクターで形質導入したＣＯＭＢＩＧ−ＤＣでの治療的ワクチン接種は、腫瘍成長を低下させ、生存期間を延長する。（Ｂ）各処置（群あたりｎ＝８）について平均腫瘍成長を提示する。
【図５Ｃ】図５。ｇｐ−１００をコードするＡｄ５Ｍベクターで形質導入したＣＯＭＢＩＧ−ＤＣでの治療的ワクチン接種は、腫瘍成長を低下させ、生存期間を延長する。（Ｃ）マウス生存率は、Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線で示し、ログランク検定で比較した（群あたりｎ＝８）（＊  Ｐ＜０．０５）。
【図６Ａ】図６。ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７成熟ＤＣは、成熟表現型を発現する。（Ａ）ＣＤ１４＋単球を健康ドナーＰＢＭＣから単離し、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−４によりｉｍＤＣに５日間分化させ、異なる条件下で１８時間成熟させ、洗浄し、さらに２４時間培養し、分析した。
【図６Ｂ】図６。ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７成熟ＤＣは、成熟表現型を発現する。（Ｂ）ＤＣは、フローサイトメトリーにより、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲ発現について特徴付けした。８人のドナーから産生されたＤＣ（ＣＤ１４−ＣＤ１ａ＋）上の各マーカーの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【図７Ａ】図７。Ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７−ＤＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏで自然免疫細胞および適応免疫細胞を活性化する。（Ａ）１８時間の成熟および洗浄（図６Ａに記載のサンプル）の後、ここではａｌｌｏＤＣと呼ばれるＤＣを、同種ＰＢＭＣ（各ドナーからの意味）と共培養した。共培養２４時間後、ＰＢＭＣプールにおけるＴ細胞の活性化は、ＣＤ６９の発現によって特徴づけられた。
【図７Ｂ】図７。Ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７−ＤＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏで自然免疫細胞および適応免疫細胞を活性化する。（Ｂ）８人の非血縁ドナーの１６の個々の組合せからのＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ５６−）上のＣＤ６９についての平均蛍光強度を示す。
【図７Ｃ】図７。Ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７−ＤＣはｉｎ  ｖｉｔｒｏで自然免疫細胞および適応免疫細胞を活性化する。（Ｃ）ａｌｌｏＤＣ−ＰＢＭＣ共培養からのＭＬＲ  （混合白血球反応）上清（ａｌｌｏ−ＳＮ）を、バイスタンダー未成熟（ｉｍ）  ＤＣ（ＰＢＭＣと同じドナーからのＤＣ）の成熟刺激として使用して、宿主「バイスタンダー」ｉｍＤＣのシナリオを模倣した。バイスタンダーＤＣ成熟は、バイスタンダーＤＣ（ＣＤ１４−ＣＤ１ａ＋）上の各マーカーについてのＭＦＩ散布図に示されるように、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲのアップレギュレーションによって評価した。３名の非血縁ドナーからの６つの個別の組み合わせを評価した。
【実施例】
【００５８】
実験
以下の実施例は単なる例であり、いかなる意味によっても本発明の範囲を限定するために解釈すべきではない。むしろ、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【００５９】
実施例１−いかなる導入遺伝子も持たないアデノウイルスベクターで形質導入したＣＯＭＢＩＧ−ＤＣ
実施例１では、Ｃｏｍｂｉｇカクテル（ポリ−Ｉ：Ｃ、Ｒ８４８およびＩＦＮ−γ）単独により誘導される活性化／成熟に対する空のアデノウイルスベクター（Ａｄ５Ｍ）で未成熟ＤＣを感染させる影響を評価した（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＣＸＣＬ１０などの炎症性因子の表現型成熟および分泌を検討した）。手短に言えば、Ａｄ５Ｍ感染は、炎症促進性ＤＣの成熟を誘導するＣｏｍｂｉｇカクテルの能力を損なわないことが見出された（図１を参照）。これらのデータは、一般的な見解と一致している。しかし、一般的な見方とは対照的に、Ａｄ５Ｍでの感染は、予想されるように（例えば、Ｊｏｎｕｌｅｉｔら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２０００）７，２４９−２５４中；Ｔａｎら、ＢＬＯＯＤ，（２００５），１０５（１０），３８２４−３８３２中；およびＮｅｗｔｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１２５，４６９−４７９中を参照）、混合白血球反応（ＭＬＲ）の間の同種Ｔ細胞の活性化（ＣＤ６９発現）によって測定されるように、非自己認識の直接的な経路を刺激するＣｏｍｂｉｇ−ＤＣの能力を改善し、損なわないことが見出された（図２Ｂを参照）。
【００６０】
さらに、バイスタンダーＤＣの、ａｌｉｏ  ＣＯＭＢＩＧ−Ａｄ５Ｍ  ＤＣおよびＰＢＭＣの共培養物由来のＭＬＲ上清での活性化／成熟が増加し（図２Ｃ）、ひいては、Ｔｈ１関連サイトカインＩＦＮ−γを産生する自己抗原特異性Ｔ細胞を活性化するバイスタンダーＤＣの能力が改善されたという知見（図３Ｂおよび３Ｄを参照）は、Ａｄ５Ｍベクターで形質導入したＣＯＭＢＩＧ−ＤＣが、作用機序が非自己認識の直接的な経路に決定的に依存する改良された細胞ベースの同種免疫エンハンサーとして有用であることを意味している。
【００６１】
材料および方法
細胞株
Ｋ５６２（Ｌｕｃ）、Ａ５４９（ｐｐ６５）およびＴ２細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％  ＰｅＳｔおよび１％  ＨＥＰＥＳを補足したＲＰＭＩ−１６４０で培養した。成分および培養培地はすべて、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃのものであった。Ｋ５６２（Ｌｕｃ）細胞を、レンチウイルスベクターで操作してホタルルシフェラーゼおよびＡ５４９（ｐｐ６５）細胞を発現させて、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）−ｐｐ６５抗原を発現させた。全ての細胞を、３７℃で５％  ＣＯ２雰囲気で加湿インキュベーター中で培養した。
【００６２】
組換えウイルスの産生
Ａｄ５Ｍベクターは、以前記載されたように構築し、生産した（Ｙｕ，Ｄ．，Ｃ．Ｊｉｎ，Ｊ．Ｌｅｊａ，Ｎ．Ｍａｊｄａｌａｎｉ，Ｂ．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｆ．Ｅｒｉｋｓｓｏｎ，ａｎｄ  Ｍ．Ｅｓｓａｎｄ．２０１１．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｘｏｎ  Ｔａｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８５：１３１１４−１３１２３）。Ａｄ５Ｍは、Ｅ１欠失ヒトアデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ベクターであり、血清型３５からの繊維軸およびノブ、ならびに形質導入効力を増強するためのヘキソン修飾を有する（Ｙｕ，Ｄ．ら、２０１３、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｔａｔ−ＰＴＤ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｅｘｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３５  ｆｉｂｅｒ  ｓｈｏｗ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ５４９５２）。Ａｄ５Ｍは、いかなる導入遺伝子もコードしない。力価は、定量的ＰＣＲ法によって、１ｍｌ当たりのキャプシド化ウイルスゲノム（ｅｖｇ）として決定した（Ｙｕ，Ｄ．ら、２０１３、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｔａｔ−ＰＴＤ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｅｘｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３５  ｆｉｂｅｒ  ｓｈｏｗ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ５４９５２）。
【００６３】
ヒトＰＢＭＣの単離およびＤＣの生成
健康なドナー由来のバフィコートは、Ｕｐｐｓａｌａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｕｐｐｓａｌａ、スウェーデンの血液バンクから入手した。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  Ｐｒｅｍｉｕｍ分離（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）により単離し、１０％熱不活性化ＦＢＳ、ｌ％ＰｅＳｔ、０．５％Ｌ−グルタミン、１％ＨＥＰＥＳおよび２０ｍＭβ−メルカプトエタノール（ＤＣ媒体）を補足したＲＰＭＩ−１６４０で培養した。
【００６４】
ＤＣの生成および処理
ＣＤ１４＋陽性磁気選択（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によりＰＢＭＣから単離した単球を、２０ｎｇ／ｍＬヒトＩＬ−４および１００ｎｇ／ｍＬ  ＧＭ−ＣＳＦ（Ｇｅｎｔａｕｒ）を用いて５日間未成熟ＤＣ（ｉｍＤＣ）に分化させた。培地は２日毎に交換した。５日目に、細胞を未処理に放置した（ｉｍＤＣ）か、または２．５ｇ／ｍＬのＲ８４８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、２０μｇ／ｍＬのポリイノシン：ポリシチジル酸（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および１０００ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γ（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）からなる成熟刺激のカクテルで１８時間成熟させた（Ｎａｐｏｌｉｔａｎｉ，Ｇ．．ら、２００５．Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ａ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  １−ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：７６９−７７６；Ｌｏｖｇｒｅｎ，Ｔ．ら、２０１７、Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｍａｔｕｒｅｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｇａｍｍａ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ）。この成熟カクテルは、「ＩＦＮ−γと組み合わせたＴｏｌｌ様受容体リガンド」（ＣＯＭＢＩＧ）と命名された。同種刺激として用いられるＣＯＭＢＩＧで成熟したＤＣを、ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ−ＤＣと呼ぶ。１８時間Ａｄ５Ｍ（２０００  ｅｖｇ／細胞）で処理した未成熟ＤＣを、ａｌｌｏ−Ａｄ５Ｍ−ＤＣと称し、一方、ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣをＣＯＭＢＩＧおよびＡｄ５Ｍの両方で１８時間処理した。洗浄後、細胞を、さらに新鮮なＤＣ媒体で培養した。
【００６５】
ヒトサイトカインアレイおよびサイトカイン放出アッセイ
ＤＣ培養からの上清（２．５〜５ｘ１０５細胞／ウェル、４８ウェルプレート中）を採取した。ＥＬＩＳＡキットを用いて、ＩＬ−１２ｐ７０（Ｍａｂｔｅｃｈ）、ＩＬ−６（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＣＸＣＬ  １０（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）の産生を検討した。
【００６６】
フローサイトメトリー
ヒトＤＣフェノタイピング。抗ＣＤ１ａ−ＢＶ５１０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ１４−ＡＰＣ／Ｃｙ７、抗ＨＬＡ−ＤＲ−ｐｅｒＣＰ  （ＭＨＣクラスＩＩ）、抗ＣＤ４０−ＦＩＴＣ、抗ＣＤ８０−ＰＥ、抗ＣＤ８３−ＡＰＣおよび抗ＣＤ８６−ＢＶ４２１を用いてＤＣを評価した。
【００６７】
同種混合白血球反応におけるＴ細胞の活性化
ａｌｌｏＤＣを、比１：５（ａｌｌｏＤＣ：ＰＢＭＣ）で非血縁ドナー（ＭＬＲ）由来のＰＢＭＣと共培養した。活性化は、２４時間後に、抗ＣＤ３−ＦＩＴＣおよび抗ＣＤ６９−ＢＶ５１０を用いたフローサイトメトリーにより評価した。同種共培養上清（ａｌｌｏ−ＳＮ）中のＩＦＮ−γ（Ｍａｂｔｅｃｈ）の検出にはＥＬＩＳＡを用いた。
【００６８】
バイスタンダー未成熟ＤＣの活性化
ａｌｌｏＤＣを、２４時間、比１：５（ａｌｌｏＤＣ：ＰＢＭＣ）でＰＢＭＣと共培養し、ａｌｌｏ−ＳＮを未成熟バイスタンダーＤＣのための成熟刺激として用いた。バイスタンダーＤＣ成熟は、以前と同様にフローサイトメトリーにより４８時間後に評価した。
【００６９】
すべての抗体は、他に明記されていない限りＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した。データ取得は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを用いて行い、解析は、Ｆｌｏｗ  Ｊｏソフトウェア（バージョン７．６．５；Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて行った。
【００７０】
ＤＣ抗原交差提示およびＴ細胞刺激アッセイ
自己ＣＭＶ−ｐｐ６５４９５−５０３ＴＣＲ修飾Ｔ細胞の特異的刺激に対するＤＣによるＣＭＶ−ｐｐ６５の交差提示
未成熟ＤＣ（ＨＬＡ−Ａ２＋）を、外因的にＤＣにＣＭＶ−ｐｐ６５タンパク質を提供する手段として、Ａ５４９（ｐｐ６５）腫瘍細胞からの凍結／解凍細胞溶解物と共に３７℃で２時間培養した。ＤＣをその後、ａｌｌｏＤＣ／ＰＢＭＣ（ａｌｌｏ−ＳＮ）からの上清で３８時間成熟させた。ＣＭＶ−ｐｐ６５４９５−５０３エピトープ（Ｈｉｌｌｅｒｄａｌ，Ｖ．，ら、２０１６、Ａｖｉｄｉｔｙ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｄ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．ＢＭＣ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７：２３）のためのＨＬＡ−  Ａ＊０２０１制限Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するように操作された自己Ｔ細胞を、次にＣＭＶ−ｐｐ６５交差提示ＤＣと、５：１（Ｔ細胞：ＤＣ）の比で混合し、新鮮な培地で１８時間培養した。ＴＣＲ特異性Ｔ細胞活性化は、ＩＦＮ−γの分泌によって評価した。
【００７１】
交差提示ＤＣによるＴ細胞の膨張および再刺激
ＣＭＶ血清陽性、ＨＬＡ−Ａ２＋ドナー由来のＴ細胞（修飾していない）を、上記のようにして調製した自己ＣＭＶ−ｐｐ６５交差提示ＤＣと、２０：１の比率（Ｔ細胞：ＤＣ）で混合し、合計１２日間新鮮な培地で培養した。３０ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）および２０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｉｔｅ）を含む培地を、７日後に交換した。ＣＭＶ−ｐｐ６５特異性Ｔ細胞膨張を、ＨＬＡ−Ａ＊  ０２０１／ｐｐ６５４９５−５０３四量体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で検出した。
【００７２】
Ｔ２細胞（ＨＬＡ−Ａ２＋）を、５μｇ／ｍｌのＣＭ  Ｖ−ｐｐ６５４９５−５０３ペプチドまたはＨＬＡ−Ａ２結合無関係ＴＡＲＰ（Ｐ５Ｌ）４−１３ペプチドでパルスした。パルスしたＴ２細胞を用いて、拡張したＣＭＶ−ｐｐ６５特異性Ｔ細胞を１８時間再刺激した。Ｔ細胞活性化の指標としてＩＦＮ−γ放出を測定した。
【００７３】
統計
データは、平均±ＳＥＭとして報告する。統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６．０１（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）によって行った。統計解析は、多重比較補正のためにＨｏｌｍ−ＳｉｄａｋテストによるパラメトリックＯｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを用いて行った。スチューデントｔ検定は、２つの群のみを評価した場合に用いた。Ｐ＜０．０５での値は、統計学的に有意であると考えられた。
【００７４】
結果および考察
ＣＯＭＢＩＧ成熟およびＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ成熟ＤＣは、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１）分極に関連する表現型およびサイトカイン分泌プロファイルを示す。
ＤＣの成熟状態は、自己ＤＣがんワクチン接種における最適なエフェクター応答の誘導に非常に重要である（Ｓａｂａｄｏ，Ｒ．Ｌ．，およびＮ．Ｂｈａｒｄｗａｊ．２０１０．Ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ２：３７−５６．）。興味深いことに、同種Ｔ細胞の活性化にも重要であることが見出されている（Ｊｏｎｕｌｅｉｔ，Ｈ．ら、２０００．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  １０−ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ，ｎｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ  ＣＤ４（＋）Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｂｙ  ｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：１２１３−１２２２．）。本発明者らの実験では、未成熟ＤＣ（ｉｍＤＣ）を、ＣＯＭＢＩＧ、Ａｄ５Ｍまたはそれらの組み合わせにより１８時間未処理または成熟させたままにした。感染増強アデノウイルスベクターＡｄ５Ｍの使用は、患者由来ＤＣを修飾するための標準的なｅｘ  ｖｉｖｏ実際である腫瘍抗原でのＤＣの負荷を容易にすることができる（Ｔａｃｋｅｎ、Ｐ．Ｊ．、およびＣ．Ｇ．Ｆｉｇｄｏｒ．２０１１．Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ：ｓｔｅｐｓ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｃｏｓｔ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３：１２−２０．）。ＤＣに対するＡｄ５Ｍの成熟効果を評価するための簡単なシステムを有するために、本研究では、Ａｄ５Ｍを導入遺伝子なしで使用した。細胞を洗浄し、いかなるサイトカインも添加することなく、新鮮なＤＣ媒体中でさらに２４時間培養した。ＤＣ表現型の変化をフローサイトメトリーによって評価し、上清（ＳＮ）を採取して分泌プロファイルをマッピングした（図１Ａ）。
【００７５】
ＣＯＭＢＩＧの成熟は、単独またはＡｄ５Ｍとの併用で、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ８３のアップレギュレーションを誘導し、成熟および活性化された表現型を意味した（図ＩＢ）。ＣＯＭＢＩＧ成熟およびＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ成熟ＤＣは、炎症促進性サイトカインおよびケモカインの分泌上昇も示した。このように、形質導入を確認しても、ｉｍＤＣの炎症促進性ＤＣへの成熟は損なわれなかった。
【００７６】
まとめると、本発明者らのデータは、Ａｄ５Ｍ／ＣＯＭＢＩＧ成熟がヒト単球由来ＤＣにより良好な忍容性を示し、完全に成熟した炎症促進性のＤＣ表現型の生成をもたらしたことを示す。
【００７７】
Ａｄ５Ｍ感染と組み合わせたＣＯＭＢＩＧ−カクテルで成熟したＤＣは、同種Ｔ細胞を活性化する能力を増加させる。
共培養したＣｏｍｂｉｇ−ＤＣまたはＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ  ＤＣによる同種ＰＢＭＣプールにおけるＴ細胞活性化は、早期活性化タンパク質ＣＤ６９のアップレギュレーションによって評価した。興味深いことに、優勢な所見とは著しく対照的に、Ａｄ５Ｍウイルスベクターで感染したａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧとの共培養では、感染していないａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＣ−ＤＣと比較してＴ細胞活性化が高かった。
【００７８】
ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣおよびＰＢＭＣの共培養からの上清は効率的な成熟バイスタンダーＤＣを誘導する。
ＰＢＭＣのａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ−ＤＣまたはａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣとの共培養からのＭＬＲ上清（Ａｌｌｏ−ＳＮ）は、未成熟バイスタンダーＤＣ上のＣＤ４０のアップレギュレーションを有意に誘導することが分かった。ａｌｉｏ  ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５  ＤＣが同種Ｔ細胞を活性化する能力の増大に一致して、ＰＢＭＣ  ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣ共培養由来のＭＬＲ上清は、バイスタンダーＤＣ上の成熟マーカーＣＤ８０およびＣＤ８６の有意なアップレギュレーションを追加的にもたらしたが、ＰＢＭＣ非感染ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ−ＤＣ共培養由来のＭＬＲ上清はもたらさなかった（図２Ｅ）。
【００７９】
ＰＭＢＣ  ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣ共培養からのＭＬＲ上清により成熟したバイスタンダーＤＣは、Ｔ細胞膨張のための抗原を効率的に交差提示する。
ＤＣ成熟に加えて、抗原取り込みおよび抗原提示は、適応性腫瘍免疫の誘導に重要な役割を果たす（Ｖａｎｄｅｎｂｅｒｋ，Ｌ．ら、２０１５．Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ．Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：６６３）。
【００８０】
抗原取り込みおよび抗原提示を試験するために、本発明者らは、ＨＬＡ−Ａ２＋ドナー（バイスタンダーＤＣ）由来のＤＣを、溶解した腫瘍細胞の状態を模倣して、完全長ＣＭＶ−ｐｐ６５タンパク質を発現する腫瘍細胞由来の細胞溶解物（Ａ５４９（ｐｐ６５））と共にインキュベートするｉｎ  ｖｉｔｒｏモデル系を用いた（図３Ａ、Ｃ）。次に、これらの抗原負荷未成熟バイスタンダーＤＣを、ＰＢＭＣ−ａｌｌｏＤＣ共培養由来のＭＬＲ上清で成熟させた。外因性ｐｐ６５抗原は、ＣＭＶ−ｐｐ６５４９５−５０３に特異的なＴＣＲで操作された自己Ｔ細胞を刺激するために、バイスタンダーＤＣによってｐｐ６５４９５−５０３ペプチドにプロセシングされ、ＨＬＡ−Ａ２（ＭＨＣクラスＩ）上で交差提示される必要がある。本発明者らは、ＭＬＲ上清中で成熟した抗原を負荷したバイスタンダーＤＣは、抗原を効率的に交差提示することができ、操作されたＣＭＶ−ｐｐ６５４９５−５０３ＴＣＲ特異性Ｔ細胞（図３Ａ）を刺激して、多量のＩＦＮ−γを分泌させることができ、ＰＢＭＣ  ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣ共培養からのＭＬＲ上清は、形質導入していないａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ−ＤＣと共培養したＰＢＭＣからのＭＬＲ上清と比較して有意に良好な活性化をもたらすことを見出した（図３Ｂ）。
【００８１】
本発明者らは、次に、内因性ＣＭＶ−ｐｐ６５特異性Ｔ細胞（操作していない）が活性化され、拡張され得るかどうかを検証したいと考えた。この場合において、本発明者らは、ｐｐ６５含有腫瘍細胞溶解物を負荷し、ＰＢＭＣ  ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣ共培養由来のａｌｌｏ−ＳＮで成熟させた、ＨＬＡ−Ａ２＋ＣＭＶ血清陽性ドナー由来のバイスタンダーＤＣから始めた（図３Ｃ）。これらのバイスタンダーＤＣは、ＣＭＶ血清陽性ドナー由来の自己ＣＭＶ−ｐｐ６５特異性Ｔ細胞の５倍の膨張をもたらした（図３Ｄ）。当該Ｔ細胞をこれらの標的に対して認識し、エフェクター機能を発揮する能力を、再刺激アッセイで試験した。拡張したＴ細胞を、ＨＬＡ−Ａ２制限ｐｐ６５４９５−５０３ペプチド、またはＨＬＡ−Ａ２制限ペプチドと無関係のどちらかを用いてパルスしたＴ２細胞に曝露し、ＩＦＮ−γ放出を測定した。ｐｐ６５陽性標的細胞で再刺激すると、ＰＢＭＣ  ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ−ＤＣｓ共培養由来のａｌｌｏ−ＳＮで成熟したｐｐ６５提示バイスタンダーＤＣによって膨張されたＴ細胞から高いＩＦＮ−γ放出が検出できた（図３Ｅ）。また、無関係のペプチドをパルスしたＴ２細胞への曝露はＩＦＮ−γ放出のバックグラウンド量のみをもたらしたため、拡張したＴ細胞は抗原特異的であることが確認された（図３Ｅ）。
【００８２】
要約すると、本発明者らは、アデノウイルスＡｄ５Ｍ（ａｌｉｏ  ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ  ＤＣ）で感染したａｌｉｏ  ＣＯＭＢＩＧ  ＤＣを、バイスタンダーＤＣの成熟とその後の抗原特異性Ｔ細胞のプライミングを誘導する免疫エンハンサーとして使用する理論的根拠を仮定する。非感染ＣＯＭＢＩＧ−ＤＣと比較した場合、Ａｄ５Ｍウイルス（ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ  ＤＣ）で感染したＣＯＭＢＩＧ−ＤＣは、驚くべきことに、同種ＰＢＭＣと共培養すると、バイスタンダーＤＣ成熟を誘導する能力が増強された炎症促進性環境を作り出すことがわかった。モデル抗原を外因的に提供した場合、腫瘍細胞溶解物を模倣すると、ａｌｉｏ  ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ  ＤＣおよびＰＢＭＣの共培養からのＭＬＲ上清で成熟したバイスタンダーＤＣは、モデル抗原を効率的に消化し、交差提示でき、抗原特異性細胞傷害性Ｔ細胞の膨張と活性化を誘発した。
【００８３】
実施例２−腫瘍関連抗原（糖タンパク質１００）をコードするアデノウイルスベクターで感染させ、形質導入したマウスＣＯＭＢＩＧ  ＤＣ：ｓを用いたｉｎ  ｖｉｖｏマウス試験
実施例２では、腫瘍抗原ｇｐ１００をコードする遺伝子を有するＡｄ５Ｍウイルスで感染したａｌｌｏＤＣを評価した。Ａｄ５Ｍ（ｇｐ１００）−ａｌｌｏＤＣｓの皮下投与は、予防設定において養子移入ｐｍｅｌ−１（ｇｐ−１００指向性）ＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を刺激することが分かった。さらに、治療環境におけるＡｄ５Ｍ（ｇｐ１００）−ａｌｌｏＤＣｓの腫瘍内投与は、腫瘍成長の遅延および生存期間の延長をもたらした。
【００８４】
材料および方法
組換えウイルスの産生
Ａｄ５Ｍ（ＭＯＣＫ）およびＡｄ５Ｍ（ｇｐ１００）ベクターを構築し、以前に記載したように作製した（Ｙｕ  Ｄら、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｘｏｎ  Ｔａｔ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｅｘｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１１；８５（２４）：１３１１４−２３  ｄｏｉ  １０．１１２８／ＪＶＩ．０５７５９−１１）。それらは、Ｅ１欠失アデノウイルス血清型５（Ａｄ５）ベクターであり、繊維軸およびノブが血清型３５対応物と置換されている。それらはまた、ＨＩＶ  Ｔａｔ由来の細胞浸透性ペプチドを、ヘキソンタンパク質（主要なカプシドタンパク質）の超可変ループに含んでいる。それらは、ＤＣを含むほとんどの造血細胞を形質導入する能力が改良された感染増強ベクターである（Ｙｕ  Ｄら、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｔａｔ−ＰＴＤ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｅｘｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３５  ｆｉｂｅｒ  ｓｈｏｗ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１３；８（１）：ｅ５４９５２  ｄｏｉ  １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５４９５２）。Ａｄ５Ｍ（ＭＯＣＫ）はいかなる導入遺伝子もコードせず、一方Ａｄ５Ｍ（ｇｐ１００）はヒトメラノーマ抗原糖タンパク質１００（ｇｐ１００、アミノ酸２５〜３３）をコードする。力価は、１ｍｌあたりのカプシド化ウイルスゲノム（ｅｖｇ）として定量的ポリメラーゼ連鎖反応により決定された（Ｙｕ  Ｄら、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｔａｔ−ＰＴＤ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｅｘｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３５  ｆｉｂｅｒ  ｓｈｏｗ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ２０１３；８（１）：ｅ５４９５２  ｄｏｉ  １０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５４９５２）。
【００８５】
細胞株
アデノウイルス製造に用いた９１１細胞株（Ｃｒｕｃｅｌｌ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）を、１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＰｅＳｔ）および１％ピルビン酸ナトリウムを添加したＤＭＥＭ中で培養した。マウスメラノーマ細胞株Ｂ１６−Ｆ１０（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ＰｅＳｔおよび１％ピルビン酸ナトリウムを補足したＤＭＥＭ中で培養した。マウスメラノーマ細胞株Ｈｃｍｅｌ３およびＨｃｍｅｌ１２は、原発性ＨＧＦ−ＣＤＫ４（Ｒ２４Ｃ）メラノーマモデルに由来し（Ｂａｌｄ  Ｔら、Ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ−ｒａｄｉａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ａｎｇｉｏｔｒｏｐｉｓｍ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｉｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４；５０７（７４９０）：１０９−１３；Ｌａｎｄｓｂｅｒｇ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｌａｎｏｍａｓ  ｒｅｓｉｓｔ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  ｄｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１２；４９０（７４２０）：４１２−６）、Ｔｈｏｍａｓ  Ｔｕｅｔｉｎｇ教授、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  Ｍａｇｄｅｂｕｒｇからの厚意の寄贈である。Ｈｃｍｅｌ３およびＨｃｍｅｌ１２の両方を、１０％熱不活性化ＦＢＳを補足したＲＰＭＩ−１６４０で培養した。全ての成分および培養培地は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から入手した。全ての細胞を、３７℃で５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーター中で培養した。
【００８６】
マウス骨髄由来同種ＤＣの単離と成熟
骨髄由来ＤＣは、骨髄を露出させ、滅菌シリンジで細胞をフラッシュすることにより、７〜８週齢の雌の野生型（ｗｔ）ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２Ｄｄ）（Ｔｈｅ  Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓ、フランス）の大腿骨および脛骨から発生させた。採取した細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ、１％ＰｅＳｔ、１％ＨＥＰＥＳ、５０μＭβ−メルカプトエタノールを補足したＩＭＤＭで培養した。培養培地に、２０ｎｇ／ｍＬ組換えマウスＩＬ−４および２０ｎｇ／ｍＬ組換えマウスＧＭ−ＣＳＦ（Ｎｏｒｄｉｃ  ＢｉｏＳｉｔｅ、ストックホルム、スウェーデン）を補足した。骨髄細胞を、非処理のペトリ皿（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、Ｎｕｅｍｂｒｅｃｈｔ、ドイツ）上にプレートした。培地は、３日毎に交換した。７日目に、非接着ｉｍＤＣを採取し、２．５μｇ／ｍＬ  Ｒ８４８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、Ｓａｍ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、２０μｇ／ｍＬポリイノシン酸：ポリシチジル酸（ｐｏｌｙＩ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）および１０００  ＩＵ／ｍＬのＩＦＮ−γ（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｓｉｔｅ）からなるＩＦＮ−γ（ＣＯＭＢＩＧ）との結合Ｔｏｌｌ様受容体リガンドのカクテルで１８時間処理して（Ｎａｐｏｌｉｔａｎｉ  Ｇ，Ｒｉｎａｌｄｉ  Ａ，Ｂｅｒｔｏｎｉ  Ｆ，Ｓａｌｌｕｓｔｏ  Ｆ，Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ  Ａ．Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ  ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  ｔｒｉｇｇｅｒ  ａ  Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  １−ｐｏｌａｒｉｚｉｎｇ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｉｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；６（８）：７６９−７６  ｄｏｉ  １０．１０３８／ｎｉ１２２３）、成熟ａｌｌｏＤＣを得た。Ａｄ５Ｍ（ｇｐ１００）−ａｌｌｏＤＣは、ペレット化したｉｍＤＣを２０００  ｅｖｇ／細胞Ａｄ５Ｍ（ｇｐ１００）で３７℃で２時間形質導入することによって得られ、上記のように成熟した。細胞は、３７℃で５％ＣＯ２雰囲気の加湿インキュベーターで培養した。
【００８７】
マウス免疫細胞表現型
フローサイトメトリーを用いて、抗ＣＤ３−ＰＢ、抗ＣＤ８ａ−ＡＰＣ、抗Ｔｈｙ１．１−ＰＥ、抗Ｖβ−１３−ＦＩＴＣ、Ｈ−２Ｄｂ／ｈｇｐ１００２５−３３−ＰＥ四量体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を用いてマウスＴ細胞の表現型を決定した。全ての抗体は、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から購入した。データ取得はＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターを用いて行い、解析はＦｌｏｗ  Ｊｏソフトウェア（バージョン７．６．５；Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて行った。
【００８８】
動物実験
Ｕｐｐｓａｌａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｃ２１５／１２）およびＮｏｒｔｈｅｒｎ  Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｎ  １７０／１３、Ｎ  １６４／１５）が動物試験を承認した。すべてのｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、７〜８週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃ（Ｈ−２Ｄｄ）マウスの骨髄から生成した処理した同種ＤＣ（ワクチン細胞）でワクチン接種し、上述のように処理した雌６〜７週齢のＣ５７ＢＬ／６ＮＲｊ（Ｈ−２Ｄｂ）マウスで行った。すべてのマウスは、Ｊａｎｖｉｅｒ  Ｌａｂｓから入手した。
【００８９】
ｐｍｅｌ−１（ｇｐ１００特異性）脾細胞の養子移入
マウスに１ｘ１０６ワクチン細胞を皮下注射した。４８時間後にＰｍｅｌ−１脾細胞（１０ｘ１０６／匹）を静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。トランスジェニックｐｍｅｌ−１マウスはＣ５７ＢＬ／６ＮＲｊ（Ｈ−２Ｄｂ）背景を有し、その脾細胞の約２０％は、ｇｐ１００２５−３３特異性ＴＣＲを担持するＴｈｙ１．１＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。Ｐｍｅｌ−１マウスはもともとＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ，ＵＳＡ）から入手し、本発明者らのグループによって繁殖させた。ドレーニング（鼠径）リンパ節をｐｍｅｌ−１養子脾細胞移入の７日後に採取し、単細胞懸濁液に消化した。
【００９０】
ａｌｌｏＤＣでの腫瘍内注射後のＢ１６メラノーマモデルにおける治療効果のｉｎ  ｖｉｖｏ評価
マウスに、１×１０５のＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞を後側腹部に皮下注射した。ｐｍｅｌ−１Ｔ細胞移入実験のために、マウスは８日目に１×１０８ｐｍｅｌ−１脾細胞の静脈内注射を受け、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍細胞接種後８日目と１４日目に１０６ａｌｌｏＤＣのｉ．ｔ．注射を受けた。腫瘍はノギスで測定し、腫瘍の大きさは次式で計算した：体積＝長さ×幅２×π／６。腫瘍体積が１ｃｍ３を超えた場合、または出血性潰瘍が発生した場合に、マウスを絶命させた。細胞は、Ｂ１６−Ｆ１０接種後１５日目に絶命させたマウスの脾臓、血中およびリンパ節から得られ、Ｔｈｙ１．１およびＶβ１３  ｐｍｅｌ−１Ｔ細胞マーカーの発現について染色した。
【００９１】
統計
データは平均およびＳＥＭとして報告する。統計的解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  ｐｒｉｓｍソフトウェアバージョン６．０１（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって行った。統計学的解析は、多重比較補正のためのＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ検定とＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によるパラメトリックＯｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ検定（＞２実験群）を用いて行った（２実験群のみ）。ｇｐ１００−ＴＣＲ＋Ｔ細胞と腫瘍負荷の関連は、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関を計算する線形回帰モデルにより評価した。Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線の統計的比較を、ｌｏｇ−ｒａｎｋ試験を用いて行った。Ｐ＜０．０５の値は統計学的に有意であると考えられた。
【００９２】
結果
マウスメラノーマモデルにおけるＡｄ５Ｍ（ｇｐ１００）−ａｌｌｏＤＣワクチン接種は養子移入ｐｍｅｌ−１Ｔ細胞の増殖および知覚を増大させ、腫瘍成長を遅延させ、生存期間を延長させる
本発明者らは、ｐｍｅｌ−１脾細胞からの養子Ｔ細胞移入と組み合わせたＡｄ５Ｍ（ｇｐ１００）−ａｌｌｏＤＣがメラノーマ保有マウスにおいて正の生存効果を有するかどうかを調べることを試みた。未処置のＣ５７ＢＬ／６ＮＲｊマウスに、右側後肢に１ｘ１０６のａｌｌｏＤＣまたはＡｄ５Ｍ（ｇｐ１００）−ａｌｌｏＤＣを皮下注射し、続いて１０×１０６ｐｍｅｌ−１脾細胞の静脈内（ｉ．ｖ）養子移入を行った（図４Ａ）。非トランスフェクトＣＯＭＢＩＧ−ＤＣとは対照的に、ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ（ｇｐ  １００）−ＤＣは、養子移入されたｇｐ１００特異性Ｔｈｙ１．１＋  ＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激し、その存在を移植後５日間維持することができた（図４Ｂ）。
【００９３】
ｐｍｅｌ−１Ｔ細胞はＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ（ｇｐ１００）−ＤＣ  のワクチン接種後も持続することから、本発明者らは次に、ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５Ｍ（ｇｐ  １００）−ＤＣのｉ．ｔ．注射による養子ｐｍｅｌ−１脾細胞移入の併用効果を治療状況で評価した（図５Ａ）。併用投与は腫瘍成長を遅延させ（図５Ｂ）、腫瘍保有マウスの生存期間を有意に延長させた（図５Ｃ）。
【００９４】
考察
まとめると、本実施例は、腫瘍抗原ｇｐ１００をコードするＡｄ５Ｍで感染させたＣＯＭＢＩＧ  ＤＣの使用が、マウスメラノーマモデルにおいて、全身性ｇｐ１００特異性Ｔ細胞応答を増強し、腫瘍成長を抑制し、生存を延長し得ることを実証する。免疫プライマー／ワクチンによるＴ細胞応答の効果的なプライミングには、内因性ＤＣが抗原を取り込み、成熟し、ｄＬＮに移動し、そこで未処理のＴ細胞と生産的に相互作用し得ることが必要であり（Ｄｉｅｕ−Ｎｏｓｊｅａｎ  ＭＣら、Ｔｅｒｔｉａｒｙ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｂｅｙｏｎｄ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４；３５（１１）：５７１−８０；Ｋｌｅｉｎｄｉｅｎｓｔ  Ｐ，ｅｔ  ａｌ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３；１７０（６）：２８１７−２３）、したがって、腫瘍抗原をコードするＡｄ５Ｍウイルスで感染した局所注射されたＣＯＢＭＩＧ−ＤＣが、Ａｄ５Ｍウイルスに感染したＣＯＢＭＩＧ  ＤＣおよび非コードＡｄ５Ｍウイルス（実施例１を参照のこと）に類似し、内因性バイスタンダーＤＣの成熟およびその後の腫瘍特異性Ｔ細胞の効率的なプライミングを刺激する炎症誘発応答を誘導することを示す。
【００９５】
実施例３−ＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質をコードする導入遺伝子をアデノウイルスベクターで形質導入したＣＯＭＢＩＧ−ＤＣ
実施例３では、未成熟ＤＣにＨＰＶ−１６  Ｅ６およびＥ７タンパク質をコードする導入遺伝子（Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７）を有するアデノウイルスベクター（Ａｄ５）を感染させることが、ＣＯＭＢＩＧカクテル（ポリ−Ｉ：Ｃ、Ｒ８４８およびＩＦＮ−γ）単独により誘導される表現型活性化／成熟に及ぼす影響を評価した。要約すると、空ベクターＡｄ５Ｍによる感染（実施例１を参照）と同様に、Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７感染は、ＣＯＭＢＩＧ−カクテルの表現型ＤＣ−成熟誘導能を損なわないことが認められた（図６Ａ、Ｂ参照）。さらに、混合白血球反応（ＭＬＲ）時の同種Ｔ細胞の活性化（ＣＤ６９発現）によって測定した、ＣＯＭＢＩＧ−ＤＣの非自己認識の直接的な経路刺激能が増大した（図７Ｂ参照）。同様の効果が、空ベクターＡｄ５Ｍを有する実施例１において見られた（図２Ｂ参照）。
【００９６】
さらに、ａｌｉｏ  ＣＯＭＢＩＧ−Ａｄ５Ｍ  ＤＣとＰＢＭＣの共培養物由来のＭＬＲ−上清によるバイスタンダーＤＣの活性化／成熟が増加したという知見（図７Ｃ）は、Ａｄ５−ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７ベクターで形質導入したＣＯＭＢＩＧ−ＤＣが、作用機序が非自己認識の直接的な経路に極めて依存する改良された細胞ベースの同種免疫エンハンサーとして有用であることを意味している。
【００９７】
材料および方法
Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７の製造
Ａｄ５は、Ｅ６およびＥ７導入遺伝子をコードするＥ１欠失ヒトアデノウイルス血清型−５（Ａｄ５）ベクターである。力価は、キャプシド化されたウイルスゲノム（ｅｖｇ）／ｍｌとして定量的ＰＣＲによって決定された（Ｙｕ，Ｄ．ら、２０１３．Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ５  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  Ｔａｔ−ＰＴＤ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｅｘｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ３５  ｆｉｂｅｒ  ｓｈｏｗ  ｇｒｅａｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ８：ｅ５４９５２）。
【００９８】
ヒトＰＢＭＣの単離とＤＣの生成、ＤＣの生成と処理、ｎフローサイトメトリー、ヒトＤＣフェノタイピング、同種混合白血球反応におけるＴ細胞の活性化、バイスタンダー未成熟ＤＣの活性化と統計
実施例１の「材料および方法」参照
【００９９】
結果と考察
Ｃ０ＭＢＩＧ／Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７刺激ＤＣは成熟表現型を示す
ＤＣに対するＡｄ５−ＨＰＶ−１６−Ｅ６およびＥ７の成熟効果を評価するために、表現型変化をフローサイトメトリーにより検討した（図６Ａ、Ｂ）。図６Ｂに示すように、ＣＯＭＢＩＧ単独またはＡｄ５−ＨＰＶ−１６Ｅ６Ｅ７と組み合わせた刺激は、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲのアップレギュレーションを誘導し、成熟し活性化された表現型を意味した（図６Ｂ）。まとめると、これらのデータは、Ａｄ５−ＨＰＶ−１６−Ｅ６Ｅ７／ＣＯＭＢＩＧ−成熟がヒト単球由来ＤＣにより良好に耐容され、完全に成熟したＤＣ表現型の生成をもたらしたことを示す。
【０１００】
Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７感染と組み合わせたＣＯＭＢＩＧ−カクテルで成熟したＤＣは、同種Ｔ細胞を活性化するそれらの能力を増加させる
共培養したＣＯＭＢＩＧ−ＤＣまたはＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７  ＤＣによる同種ＰＢＭＣプールにおけるＴ細胞活性化を、初期活性化タンパク質ＣＤ６９のアップレギュレーションによって評価した。興味深いことに、一般的な見解とは著しく対照的に、Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７ウイルスベクターで感染したａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧとの共培養では、感染していないａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ−ＤＣと比較してＴ細胞活性化が高かった（図７Ｂ）。
【０１０１】
ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７  ＤＣとＰＢＭＣの共培養からの上清は、効率的な成熟バイスタンダーＤＣを誘導する
ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ−ＤＣおよびａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５−ＨＰＶ１６Ｅ６Ｅ７  ＤＣとそれぞれ共培養したＰＢＭＣｓからのＭＬＲ上清（Ａｌｌｏ−ＳＮ）は、未成熟バイスタンダーＤＣｓ上の成熟マーカー（ＣＤ４０，ＣＤ８０およびＣＤ８６）のアップレギュレーションを誘導することがわかった。ａｌｉｏ  ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５−ＨＰＶ−１６Ｅ６Ｅ７  ＤＣが同種Ｔ細胞を活性化する能力を増大させることに一致して（図７Ｂ参照）、ＰＢＭＣ  ａｌｌｏ−ＣＯＭＢＩＧ／Ａｄ５−ＨＰＶ１６−Ｅ６Ｅ７−ＤＣ共培養由来のＭＬＲ上清は、ＰＢＭＣ非感染同種ＣＯＭＢＩＧ−ＤＣ共培養由来のＭＬＲ上清と比較して、成熟マーカー（ＣＤ４０、ＣＤ８０およびＣＤ８６）のアップレギュレーションを増大させた（図７Ｃ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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