(57)【要約】  本開示は、腫瘍細胞に対する治療薬の能動的移動および細胞毒性、例えば、免疫細胞ならびに／または薬物ホーミング、移動、および腫瘍細胞毒性、についてアッセイを実施するための方法に関する。方法は、免疫細胞または薬物などの治療薬が、３Ｄ楕円体コンフォメーションで成長する腫瘍細胞を含む腫瘍細胞へ移動する機会を提供する実験機器中で実施される。方法は、他の使用のなかでも、免疫細胞または薬物などの治療薬の腫瘍細胞に対する効果の調査を可能にし、またよりインビボ様の試験のための単一の使いやすい高スループットシステムにおいてホーミング、腫瘍細胞毒性、および腫瘍免疫回避の調査を可能にする。
2020510414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するためのアッセイ法であって：
ａ）腫瘍細胞を３Ｄ楕円体コンフォメーションに成長させるような構造のチャンバーを含む細胞培養製品中で腫瘍細胞を培養して楕円体を形成し、
ｂ）多孔質膜を含むインサートを前記細胞培養製品に入れ、治療薬を該インサート中に導入し、
ｃ）前記インサートから前記細胞培養製品チャンバーへの前記治療薬の能動的移動を検出し、そして
ｄ）腫瘍細胞応答を検出すること
を含む、アッセイ法。
【請求項２】
前記チャンバーが、
側壁、
上部開口部、および
少なくとも１つの陥凹面を含む液体不透過性底部であって、該底部の少なくとも一部が該少なくとも１つの陥凹面中または上に低接着性または非接着性材料を含む、液体不透過性底部
を含む、請求項１に記載のアッセイ法。
【請求項３】
少なくとも１つの陥凹面を含む前記液体不透過性底部がガス透過性である、請求項１または２に記載のアッセイ法。
【請求項４】
前記側壁が不透明である、請求項２に記載のアッセイ法。
【請求項５】
前記底部の少なくとも一部が透明である、請求項２から４のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項６】
前記細胞培養製品が、１から２０００の前記チャンバーを含み、各チャンバーは互いに物理的に離間されている、請求項２から５のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの陥凹面が前記同じチャンバー内で複数の陥凹面を含む、請求項２から６のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項８】
前記少なくとも１つの陥凹面が、半球状面と、前記側壁から前記底面へと３０から６０度のテーパーを有する円錐面、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２から７のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項９】
前記側壁面が垂直円筒と、前記チャンバーの頂部から底面へと直径が減少する垂直円錐の一部と、前記少なくとも１つの陥凹底面への円錐形遷移部を有する垂直方形シャフト、またはそれらの組み合わせとを含む、請求項２に記載のアッセイ法。
【請求項１０】
前記製品が吸引のためにピペットチップを受容するためのチャンバー付属物をさらに含み、該チャンバー付属物は、前記チャンバーに隣接し前記チャンバーと流体連通した表面を含み、該チャンバー付属物は前記底面より上方に離間した第二底部を有し、該第二底部はピペットから分配された流体を該底面からそれさせる、請求項２に記載のアッセイ法。
【請求項１１】
前記インサートがインサートプレートを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項１２】
前記多孔質膜の少なくとも一部が血液脳関門をシミュレートするように構成される、請求項１から１１のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項１３】
前記多孔質膜の少なくとも一部が微小血管内皮細胞の本質的にコンフルエントな単層を含む、請求項１２に記載のアッセイ法。
【請求項１４】
前記治療薬の能動的移動および腫瘍細胞応答の両方がフローサイトメトリーによって検出される、請求項１から１３のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項１５】
腫瘍細胞応答の検出が、前記治療薬の前記腫瘍細胞楕円体への浸透を検出することを含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項１６】
腫瘍細胞応答の検出が、腫瘍細胞溶解を測定することを含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項１７】
前記治療薬が薬物または細胞治療薬を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【請求項１８】
前記治療薬が白血球またはリンパ球を含む、請求項１７に記載のアッセイ法。
【請求項１９】
前記治療薬が薬物である、請求項１０から１８のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１７年２月７日に出願された米国特許仮出願第６２／４５５，８８１号を引用し、優先権を主張し、その内容全体が参照により本明細書中に援用される。
【技術分野】
【０００２】
本開示は概して、腫瘍細胞対する、治療薬の能動的移動および細胞毒性、例えば免疫細胞にならびに／または薬物ホーミング、移動、および腫瘍細胞毒性、についてアッセイを実施するための方法に関する。この方法は、免疫細胞または薬物などの治療薬が、３Ｄ楕円体コンフォメーションに成長する腫瘍細胞を含む腫瘍細胞へ向かって移動する機会を提供する実験機器中で実施される。この方法は、他の使用の中でも、免疫細胞または薬物などの治療薬の腫瘍細胞に対する効果の調査を可能にし、またよりインビボ様な試験のための単一で使いやすい高スループットシステムにおけるホーミング、腫瘍細胞毒性、および腫瘍免疫回避の調査を可能にする。
【背景技術】
【０００３】
伝統的に、治療薬のホーミングおよび殺腫瘍活性ならびに腫瘍の免疫回避を調査するインビトロモデルは、三次元（３Ｄ）腫瘍の複雑さを正確に反映していない可能性がある、腫瘍細胞の二次元システム（２Ｄ）を利用することによって、または３Ｄ腫瘍細胞モデルを用いるが、移動成分を用いないで細胞毒性を研究することによって、別々に研究されてきた。重要なことに、免疫細胞および薬物が３Ｄ腫瘍細胞システムにおいて克服する必要がある障壁は、２Ｄ腫瘍細胞システムのものよりもはるかに大きい。例えば、免疫細胞は腫瘍部位に移動する必要があるだけでなく、標的腫瘍細胞を攻撃するために３Ｄ腫瘍構造に浸潤する必要もある。２Ｄシステムと３Ｄシステムとの物理的違いを越えて、腫瘍細胞を３Ｄで培養する場合は表現型の違いも生じ、これらの表現型の違いによって細胞毒性に対するより高い抵抗性が可能になることが示されている。したがって、がん治療のために免疫細胞を利用することへの関心が高まりつつあるが、患者自身の免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞など）を活性化して、自身の腫瘍を攻撃することを含む治療では、免疫療法の有効性は、全ての患者またはがん型について同等というわけではなく、そのため科学者や研究者にとってさらに良好なモデルが必要となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、よりインビボ様な試験のための単一で使いやすい高スループットシステムにおいて、免疫細胞および薬物ホーミング、腫瘍細胞毒性、ならびに腫瘍免疫回避の調査を可能にするための代替的モデルおよび方法が引き続き必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示の様々な実施形態によると、免疫細胞および薬物を含む治療薬、ならびに培養において３Ｄ楕円体コンフォメーションに成長する腫瘍細胞に対するそれらの効果を分析するための方法および実験機器が本明細書中で開示されている。この方法は、他の使用の中でも、免疫細胞または薬物などの治療薬の腫瘍細胞に対する効果の調査を可能にし、またよりインビボ様な試験のための単一で使いやすい高スループットシステムにおけるホーミング、腫瘍細胞毒性、および腫瘍免疫回避の調査を可能にする。
【０００６】
様々な実施形態において、治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するためのアッセイ法が開示されている。このアッセイ法には、細胞培養製品中で腫瘍細胞を培養して楕円体を形成することが含まれ、ここで、細胞培養製品は、腫瘍細胞を３Ｄ楕円体コンフォメーションに成長させる構造のチャンバーを含む。アッセイ法はさらに、多孔質膜を含むインサートを細胞培養製品に入れ、治療薬をこのインサートに導入することを含む。このアッセイ法はまた、インサートから細胞培養製品チャンバーへの治療薬の能動的移動を検出し、腫瘍細胞応答を検出することも含む。実施形態において、腫瘍細胞応答は、腫瘍細胞溶解、腫瘍細胞楕円体への治療薬の浸透、または腫瘍細胞生理学における変化の測定であり得る。
【０００７】
いくつかの実施形態において、治療薬の能動的移動および腫瘍細胞溶解はどちらもフローサイトメトリーによって検出される。いくつかの実施形態において、アッセイ法はさらに、免疫細胞などの治療薬の腫瘍細胞楕円体への浸透を検出することを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、治療薬は細胞治療薬および／または薬物である。いくつかの実施形態において、この細胞治療薬は免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は白血球である。いくつかの実施形態において、この免疫細胞はリンパ球である。
【０００９】
治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するためのアッセイ法のいくつかの実施形態において、細胞培養製品のチャンバーは、側壁と、上部開口部と、少なくとも１つの陥凹面を含む液体不透過性底部とを含む。実施形態において、底面の少なくとも一部は少なくとも１つの陥凹面中または少なくとも１つの陥凹面上に低接着性または非接着性材料を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの陥凹面を含む液体不透過性底部はガス透過性である。いくつかの実施形態において、側壁は不透明である。いくつかの実施形態において、底部の少なくとも一部は透明である。
【００１０】
治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するためのアッセイ法のいくつかの実施形態において、細胞培養製品は１から約２，０００までの前記チャンバーを含み、各チャンバーは任意の他のチャンバーから物理的に分離されている。いくつかの実施形態において、チャンバーの少なくとも１つの陥凹面は同じチャンバー内で複数の陥凹面を含む。
【００１１】
治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するためのアッセイ法のいくつかの実施形態において、細胞培養製品のチャンバーの少なくとも１つの陥凹面は、半球状面、側壁から底面へと３０から約６０度のテーパーを有する円錐面、またはその組み合わせを含む。
【００１２】
治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するためのアッセイ法のいくつかの実施形態において、細胞培養製品のチャンバーの側壁面は、垂直円筒、チャンバーの頂部から底面へと直径が減少する垂直円錐（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｃｏｎｉｃ）の一部、少なくとも１つの陥凹底面への円錐形遷移部（ｃｏｎｉｃａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を有する垂直方形シャフト（ｖｅｒｔｉｃａｌ  ｓｑｕａｒｅ  ｓｈａｆｔ）、またはその組み合わせを包含する。
【００１３】
治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するためのアッセイ法のいくつかの実施形態において、細胞培養製品はさらに、吸引のためにピペットチップを受容するチャンバー付属物を包含し、このチャンバー付属物は、チャンバーに隣接し、チャンバーと流体連通した表面を包含し、このチャンバー付属物は、底面の上方に離間した第二の底部を有し、この第二の底部はピペットから分配された流体を底面からそらせる。
【００１４】
治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するためのアッセイ法のいくつかの実施形態において、インサートはインサートプレートを包含する。
【００１５】
治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するためのアッセイ法のいくつかの実施形態において、多孔質膜の少なくとも一部は生物学的障壁をシミュレートするように構成される。いくつかの実施形態では、この生物学的障壁は血液脳関門である。いくつかの実施形態において、多孔質膜の少なくとも一部は、微小血管内皮細胞の本質的にコンフルエントな単層を包含する。
【００１６】
本開示の主題のさらなる特徴および利益は、以下の詳細な説明に記載され、その記載から当業者には容易に明らかになるか、または後述する詳細な説明、特許請求の範囲、ならびに添付の図面を包含する本明細書中で記載するような本開示の主題を実施することによって認識されるであろう。
【００１７】
前記一般的記載および以下の詳細な説明はどちらも本開示の主題の実施形態を提示し、請求されるとおりの本開示の主題の特質および性質を理解するための概観または構想を提供することが意図されると理解すべきである。添付の図面は本開示の主題をさらに理解するために包含され、本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する。図面は本開示の主題の様々な実施形態を示し、説明と併せて本開示の主題の原理および作用を説明する役割を果たす。さらに、図面および説明は単なる例示に過ぎず、特許請求の範囲をなんら限定することを意図しない。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本開示の具体的な実施形態の以下の詳細な説明は、以下の図面とあわせて読むと最もよく理解でき、図中、同様の構造は同様の参照番号で示される。
【図１Ａ】マルチウェルマイクロプレートの実施形態、この場合は、各ウェルの底面上にマイクロキャビティのアレイを有して９６ウェルの各々において複数の楕円体を提供する９６ウェル楕円体マイクロプレートを示し、特にマルチウェルマイクロプレートを示す。
【図１Ｂ】マルチウェルマイクロプレートの実施形態、この場合は、各ウェルの底面上にマイクロキャビティのアレイを有して９６ウェルの各々において複数の楕円体を提供する９６ウェル楕円体マイクロプレートを示し、特にマルチウェルプレートの単一のウェルを示す。
【図１Ｃ】マルチウェルマイクロプレートの実施形態、この場合は、各ウェルの底面上にマイクロキャビティのアレイを有して９６ウェルの各々において複数の楕円体を提供する９６ウェル楕円体マイクロプレートを示し、特に図１Ｂ中のボックスＣ中に示す単一のウェルの底面の部分の分解組立図を示す。
【図２】マイクロキャビティのアレイの図。
【図３Ａ】楕円体マイクロプレートの実施形態、この場合は、９６ウェルの各々において単一の楕円体を含むように構成された丸底を有する９６ウェルプレートを示す。
【図３Ｂ】楕円体マイクロプレートの実施形態、この場合は、９６ウェルの各々において単一の楕円体を含むように構成された丸底を有する９６ウェルプレートを示す
【図４Ａ】インサートの斜視図。
【図４Ｂ】インサートの斜視図。
【図４Ｃ】インサートプレートおよび関連するマルチウェルプレートの図。
【図５Ａ】本明細書中で開示する方法の実施形態を示す。
【図５Ｂ】本明細書中で開示する方法の実施形態を示す。
【図５Ｃ】本明細書中で開示する方法の実施形態を示す。
【図６】図４Ｂに示す実施形態にしたがって、３Ｄで培養されたＡ５４９／ＧＦＰ腫瘍細胞に向かうＮＫ細胞移動を示すグラフ。
【図７】図４Ｂに示す実施形態にしたがって、３Ｄで培養されたＡ５４９／ＧＦＰ腫瘍細胞のＮＫ誘発性細胞毒性を示すグラフ。
【図８Ａ】本明細書中で開示する方法の図。
【図８Ｂ】本明細書中で開示する方法の図。
【図８Ｃ】本明細書中で開示する方法の図。
【図８Ｄ】本明細書中で開示する方法の図。
【図８Ｅ】本明細書中で開示する方法の図。
【図８Ｆ】本明細書中で開示する方法の図。
【図８Ｇ】本明細書中で開示する方法の図。
【図９】化合物シスプラチンおよびピペロングミンを用いた直接培養の４８時間後のＬＮ２２９楕円体の用量依存性細胞毒性を示すグラフ。２回の独立した研究からＮ＝１２ウェル／濃度。
【図１０Ａ】ルシファーイエロー透過性を示すグラフ。
【図１０Ｂ】血液脳関門（ＢＢＢ）モデルにおいて９６ＨＴＳ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ上での培養５日後のローダミン１２３（Ｒｈ１２３）透過性データを示すグラフ。３回の独立した研究からＮ＝１２０。
【図１１】図１１は、血液脳関門サロゲートの有無でのＬＮ２２９細胞毒性を示すグラフ。ＢＢＢの有無でのＴｒａｎｓｗｅｌｌによる２時間の薬物曝露後４８時間のＬＮ２２９楕円体の生存百分率。薬物なしの対照を１００％生存率に標準化することによって生存率を評価した。データは３回の独立した研究の平均として示され、ボンフェローニポストテストを伴う一元配置分散分析でＮ＝３０。＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図１２Ａ】血液脳関門サロゲートなしでのＬＮ２２９細胞毒性を示すグラフ。ＢＢＢなしでのＴｒａｎｓｗｅｌｌによる２時間の薬物曝露後４８時間のＬＮ２２９楕円体の生存百分率。生存率は、薬物なしの対照を１００％生存率に標準化することによって評価した。データは３回の独立した研究の平均として示され、ボンフェローニポストテストを伴う一元配置分散分析でＮ＝３０。＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図１２Ｂ】血液脳関門サロゲートありでのＬＮ２２９細胞毒性を示すグラフ。ＢＢＢありでのＴｒａｎｓｗｅｌｌによる２時間の薬物曝露後４８時間のＬＮ２２９楕円体の生存百分率。生存率は、薬物なしの対照を１００％生存率に標準化することによって評価した。データは３回の独立した研究の平均として示され、ボンフェローニポストテストを伴う一元配置分散分析でＮ＝３０。＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。
【図１３Ａ】ＢＢＢの有無で見出されるヒットのコンピレーションを示す図１２Ａおよび図１２Ｂのスクリーンサマリーのグラフ。結果は、３つの独立したスクリーンのうち少なくとも２つにおいて緩衝応答よりも３シグマ低い場合は「ヒット」とみなした。横縞のハッチングの四角（緩衝液のみ以外）はＢＢＢがない場合にのみ見られるヒットである。斜線のハッチングの四角はＢＢＢの存在下および非存在下で見られるヒットである。
【図１３Ｂ】ＢＢＢの有無で見出されるヒットのコンピレーションを示す図１２Ａおよび図１２Ｂのスクリーンサマリーのグラフ。結果は、３つの独立したスクリーンのうち少なくとも２つにおいて緩衝応答よりも３シグマ低い場合は「ヒット」とみなした。横縞のハッチングの四角（緩衝液のみ以外）はＢＢＢがない場合にのみ見られるヒットである。斜線のハッチングの四角はＢＢＢの存在下および非存在下で見られるヒットである。
【発明の詳細な説明】
【００１９】
ここで、本開示の主題の様々な実施形態をさらに詳細に参照するが、そのいくつかの実施形態を添付の図面に示す。図で用いられている同様の番号は、同様の成分、ステップなどを指す。しかしながら、所与の図中の成分を指すための数字の使用は、同じ数字で表示された別の図中の成分を限定することを意図しないと理解される。加えて、成分を指し示すための異なる数字の使用は、その異なる数字を付した成分が他の数字を付した成分と同じまたは類似したものであり得ないことを示すことを意図するものではない。
【００２０】
特定の実施形態の以下の説明は本質的に例示に過ぎず、本発明の範囲、その適用、または使用を何ら限定することを意図するものではなく、これらはもちろん様々であり得る。本発明を本明細書中に包含される非限定的定義および用語に関連して記載する。これらの定義および用語は本発明の範囲または実施に対する制限として機能するようにデザインされたものではなく、例示および説明の目的でのみ提示されている。別段の定めのない限り、本明細書中で使用されるすべての用語（技術用語および科学用語を包含する）は本開示が属する分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。通常使用される辞書で定義されるような用語は、関連する技術分野および本開示に関連したそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書中でそのように明示されていない限り、理想化されたまたは過度に形式的な意味で解釈されない。
【００２１】
定義
本明細書で使用する場合、文脈でそうでないことが明示されていない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は複数の指示対象を包含する。したがって、例えば「〜の構造の底面」に対する言及は、文脈でそうでないことが明示されていない限り、２つ以上のそのような「構造の底面」を有する例を包含する。
【００２２】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用する場合、「または」という語は、文脈でそうでないことが明示されていない限り、概して、「および／または」を含む意味で使用される。「および／または」という語は、列挙された要素の１つまたは全部または列挙された要素のいずれか２つ以上の組み合わせを意味する。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、「有する（ｈａｖｅ、ｈａｓ、ｈａｖｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ、ｉｎｃｌｕｄｅｓ、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語は、それらのオープンエンドで包括的な意味で使用され、概して、「限定されるものではないが包含する」ことを意味する。
【００２４】
「任意」または「任意に」とは、その後に記載された事象、状況、または成分が起こる可能性があるかまたは起こらない可能性があり、その記載が、その事象、状況、または成分が起こる場合と、起こらない場合とを包含することを意味する。
【００２５】
「好ましい」および「好ましくは」という語は、ある特定の状況下である特定の利益をもたらし得る本開示の実施形態を指す。しかしながら、同じ状況または他の状況下で他の実施形態も好ましい場合がある。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の記載は、他の実施形態が有用でないことを意味するのではなく、本発明の技術範囲から他の実施形態を排除することを意図しない。
【００２６】
範囲は、本明細書では、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲が表される場合、例は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値までを包含する。同様に、先行詞「約」の使用によって値が近似値として表される場合、特定の値が別の態様を形成すると理解される。さらに、範囲の各々の端点は、他の端点に関連してと、他の端点とは無関係との両方で有意であると理解される。
【００２７】
また本明細書中では、端点による数値範囲の列挙には、その範囲内に組み込まれる全ての数を包含する（例えば、１から５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５などを包含する）。さらに、本明細書全体にわたって記載される全ての数値範囲はそのようなより狭い数値範囲がすべて本明細書中で明らかに記載されているかのように、そのようなより広い数値範囲内にある全てのより狭い数値範囲を包含すると理解すべきである。値の範囲が特定の値「よりも大きい」、「よりも小さい」などである場合、その値はその範囲内に包含される。
【００２８】
本明細書中で言及される任意の方向、例えば「頂部」、「底部」、「左」、「右」、「上」、「下」、「上方」、「下方」、および他の方向ならびに方位は図に関連して明確にするために本明細書中で記載し、実際のデバイスもしくはシステム、またはそのデバイスもしくはシステムの使用を限定しない。本明細書中に記載するデバイス、製品またはシステムの多くは、多くの方向および方位で使用することができる。本明細書中で細胞培養装置に関して使用される方向の記述子は、多くの場合、その装置の中で細胞を培養する目的でその装置が向けられる場合の方向を指す。
【００２９】
本明細書中での記述は、ある成分が特定の方法で機能するように「構成」または「適用」されていることを指すことにも留意されたい。これに関して、そのような成分は、特定の特性を具現化するように、または特定の方法で機能するように「構成」または「適用」され、そのような記述は、使用目的の記述とは対照的な構造的記述である。さらに具体的には、ある成分が「構成」または「適用」される方法についての本明細書中での言及は、その成分の既存の物理的状態を示し、したがって、その成分の構造的特徴の明らかな記述と解釈されるべきである。
【００３０】
本明細書中で用いられる場合、「細胞培養」という語は、細胞をインビトロで生き続けさせることを指す。この用語に包含されるのは、連続細胞株（例えば、不死表現型を有するもの）、初代細胞培養、有限細胞株（例えば、非形質転換細胞）、ならびに卵母細胞および胚をはじめとするインビトロで維持される任意の他の細胞集団である。
【００３１】
本明細書中で用いられる場合、「インビトロ」という語は、人工環境および人工環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。インビトロ環境は、限定されるものではないが、試験管および細胞培養から構成され得る。「インビボ」という語は、自然環境（例えば、動物または細胞）および自然環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。
【００３２】
本明細書中で使用する場合、「細胞培養製品」という語は、細胞を培養するために有用な任意の容器を意味し、細胞培養のための環境を提供する、プレート、ウェル、フラスコ、マルチウェルプレート、多層式フラスコ、灌流システムを包含する。
【００３３】
実施形態において、「ウェル」は、マルチウェルプレート様式において提供される個別の細胞培養環境である。実施形態において、ウェルは、４ウェルプレート、５ウェルプレート、６ウェルプレート、１２ウェルプレート、２４ウェルプレート、９６ウェルプレート、１５３６ウェルプレート、または任意の他のマルチウェルプレート形態であり得る。
【００３４】
本明細書中で使用する場合、「関心対象の細胞を３Ｄコンフォメーションで成長させるよう構造の」チャンバーまたはウェル等とは、培養において細胞の２次元シートとしてではなく３Ｄもしくは楕円体コンフォメーションでの細胞の成長を促進する、次元もしくは処理、または次元と処理の組み合わせを有するウェルを意味する。処理には、例えば低結合溶液での処理、表面を低疎水性にする処理、または滅菌処理が包含される。
【００３５】
本明細書中で用いられる場合、「〜を提供するような構造の」または「〜を提供するように構成された」とは、その製品が記載された結果を提供する特徴を有することを意味する。
【００３６】
実施形態において、単一の「楕円体ウェル」は、その単一楕円体ウェル中で、関心対象の細胞を単一の３Ｄ細胞塊として、または単一の楕円体として成長させるような構造のマルチウェルプレートのウェルであり得る。例えば、９６ウェルプレートのウェル（伝統的な９６ウェルプレートのウェルは、深さ約１０．６７ｍｍであり、約６．８６ｍｍの上部開口部と約６．３５ｍｍのウェル底部直径を有する。
【００３７】
実施形態において、「楕円体プレート」とは、単一楕円体ウェルのアレイを有するマルチウェルプレートを意味する。
【００３８】
実施形態において、ウェルは「マイクロキャビティ」のアレイを有していてもよい。実施形態において、「マイクロキャビティ」は、例えば、上部開口部および最下点と、上部開口部の中心と、最下点と上部開口部の中心との間の中心軸とを画定するマイクロウェルであり得る。実施形態において、ウェルはその軸の周りに回転対称である（すなわち、側壁は円筒状である）。あるいは実施形態において、ウェルは図１Ｃに示すような六角形、または他の形状であってよい。いくつかの実施形態において、上部開口部は、２５０μｍから１ｍｍ、またはそれらの測定値内の任意の範囲の上部開口部の直径を画定する。いくつかの実施形態において、上部開口部から最下点までの距離（深さ「ｄ」）は２００μｍと９００μｍの間、または４００と６００μｍの間である。マイクロキャビティのアレイは、異なる形状、例えば、放物型、双曲型、山型、および断面形状、またはそれらの組み合わせを有していてもよい。
【００３９】
実施形態において、「マイクロキャビティ楕円体プレート」とは、ウェルのアレイを有するマルチウェルプレートであって、各ウェルがマイクロキャビティのアレイを有するものを意味する。
【００４０】
実施形態において、ウェルまたはマイクロキャビティウェルの「丸底」は、例えば、半球、またはウェルもしくはマイクロキャビティの底部を形成する半球の水平断面もしくはスライスなどの半球の一部であり得る。
【００４１】
実施形態において、「３Ｄ楕円体」または「楕円体」という語は、例えば、細胞の平坦な二次元シートではない、培養における細胞のボールであり得る。「３Ｄ楕円体」および「楕円体」という語はここでは交換可能に用いられる。実施形態において、楕円体は、例えば楕円体中の細胞の種類に応じて、例えば、約１００から約５００マイクロメートル、さらに好ましくは約１５０から約４００マイクロメートル、なおいっそう好ましくは約１５０から約３００マイクロメートル、そして最も好ましくは約２００から約２５０マイクロメートルで、その間の値および範囲を含む直径を有する、単一の細胞型または複数の細胞型から構成される。楕円体直径は、例えば、約２００から約４００マイクロメートルであり得る。楕円体の最大サイズは、一般に、拡散の検討事項によって制約を受ける（例えば、楕円体及び楕円体容器の概説については、Ａｃｈｉｌｌｉ，Ｔ−Ｍ，ｅｔ．ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．（２０１２）１２（１０）を参照のこと）。
【００４２】
本明細書中で使用する場合、「腫瘍細胞」とは、腫瘍から単離されるか、腫瘍に由来するか、または動物に注射された場合に腫瘍を引き起こすか、または動物に注射された場合に腫瘍を引き起こす細胞に由来する、任意の細胞を意味する。腫瘍細胞は、ヒトをはじめとする動物から得られる原発腫瘍細胞であり得るか、または腫瘍細胞は細胞株もしくは遺伝子操作された細胞であり得る。
【００４３】
本明細書中で使用する場合、「インサート」とは、楕円体プレートまたはマイクロキャビティ楕円体プレートのウェル中にぴったりとはまる細胞培養ウェルを意味する。このインサートは細胞を培養するためのキャビティを画定する側壁と底面とを有する。底面は多孔性であり、細胞または化学薬品が多孔性底面を通って移動し、３Ｄコンフォメーションに成長している関心対象の細胞に作用するのを可能にする。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、「インサートプレート」とは、マルチウェルプレートのウェルのアレイにぴったりとはまるような構造のインサートのアレイを含むインサートプレートを意味する。
【００４５】
本明細書中で使用する場合、「治療薬」とは、所望の、そして通常は有益であるかまたは治療的な効果から選択される任意の生体活性材料を意味する。治療薬としては、例えば、限定されるものではないが：抗腫瘍薬、免疫抑制剤、免疫刺激剤（ｉｍｍｕｎｅ−ｓｔｉｍｕｌａｎｔ）、抗増殖剤、アンチトロンビン、抗血小板物質、抗脂質、抗炎症剤、抗生物質、血管新生、抗血管新生、ビタミン類、ＡＣＥ阻害剤、血管作動性物質、抗有糸分裂薬、メタロプロテイナーゼ阻害剤、ＮＯドナー、エストラジオール、抗硬化薬（ａｎｔｉ−ｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、ホルモン、フリーラジカルスカベンジャー、毒素、アルキル化剤を単独または組み合わせで包含するがこれらに限定されないあらゆるクラスを包含する「薬物」と通常称される低分子量治療薬を含み得る。治療薬は、例えば、限定されるものではないが、ペプチド、脂質、タンパク質薬物、タンパク質複合体薬物、酵素、オリゴヌクレオチド、リボザイム、遺伝物質、プリオン、ウイルス、および細菌を含む生物剤も含み得る。
【００４６】
本明細書中で使用する場合、「細胞治療薬」とは、別の細胞に対して影響を及ぼし得る任意の細胞を意味する。細胞治療薬は、関心対象の細胞を接触させる、関心対象の細胞に影響を及ぼす環境を提供する、関心対象の細胞を飲み込む（貪食作用）、関心対象の細胞に影響を及ぼす化学物質を排出または他の方法で提供する、３Ｄ細胞集団を破壊することによって作用することができるか、または他の方法で関心対象の細胞に影響を及ぼす。
【００４７】
特に明示されない限り、本明細書中で記載するいずれの方法もそのステップを特定の順序で実施することを必要とすると解釈されることを何ら意図しない。したがって、ある方法クレームが、そのステップがしたがうべき順序を実際に記載していないか、また特定の順序に限定されることをクレームまたは明細書で他の方法で具体的に記載していない場合、任意の特定の順序が推測されることを何ら意図しない。いずれか１つのクレームにおける単一または複数の記載された特徴または態様はいずれも、任意の他のクレームにおける任意の他の記載された特徴または態様と組み合わせるかまたは置換することができる。
【００４８】
特定の実施形態の様々な特徴、要素またはステップは移行句「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を用いて開示することができるが、移行句「〜からなる」または「〜から実質的になる」を使用して記載することができるものを包含する別の実施形態を暗示すると理解されるべきである。
【００４９】
本開示は、他のものの中でも、免疫細胞および薬物を含む治療薬、ならびに培養において３Ｄ楕円体コンフォメーションで成長する腫瘍細胞に対するそれらの効果を分析するための方法および実験機器を記載する。方法は、他の使用のなかでも、免疫細胞または薬物などの治療薬の、腫瘍細胞に対する効果の調査を可能にし、よりインビボ様の試験のために、単一の、使いやすい高スループットシステムにおけるホーミング、腫瘍細胞毒性、および腫瘍免疫回避の調査を可能にする。２Ｄで培養された腫瘍細胞を利用する、免疫細胞移動および侵襲性アッセイのためのほとんどの現行の高スループットモデルとは異なり、このモデルはよりインビボ様の試験のための３Ｄ腫瘍楕円体成分を可能にする。
【００５０】
様々な実施形態において、治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するためのアッセイ法を開示する。アッセイ法は、細胞培養製品中で腫瘍細胞を培養して楕円体を形成することを含み、この細胞培養製品は、腫瘍細胞を３Ｄ楕円体コンフォメーションで成長させる構造のチャンバー、例えばウェルを含む。アッセイ法は、多孔質膜を含むインサートをこの細胞培養製品に入れ、そしてこのインサート中に治療薬を導入することをさらに含む。アッセイ法は、ある期間の後、インサートから細胞培養製品チャンバー中への治療薬の能動的移動を検出し、そして腫瘍細胞溶解を検出することをさらに含む。そのような細胞培養製品と多孔質膜を含むインサートとを組み合わせることによって、単一の高スループットアッセイにおける３Ｄがんおよび免疫細胞相互作用を研究するためのモデルを作製する。２Ｄにおいて培養された腫瘍細胞を利用する、免疫細胞移動および侵襲性アッセイのためのほとんどの現行の高スループットモデルとは異なり、このモデルはよりインビボ様の試験のための３Ｄ腫瘍楕円体成分を可能にする。高スループット３Ｄ腫瘍楕円体形成および細胞毒性アッセイのための別のモデルは、これらのアッセイの移動および侵襲成分の透過性支持体と互換性がない。結果として、このモデルは、単一の使いやすい高スループットシステムにおいて免疫細胞および／または薬物ホーミング、腫瘍細胞毒性、および腫瘍免疫回避の調査を可能にする。
【００５１】
楕円体などの三次元で培養された細胞は、単層として二次元で培養されたそれらのカウンターパートよりもインビボ様の機能性を示し得る。二次元細胞培養システムにおいて、細胞は培養される基体上に付着し得る。しかしながら、細胞を楕円体などの三次元で成長させる場合、その細胞は基体に付着するのではなく、互いに相互作用する。三次元に培養された細胞は、細胞連通および細胞外マトリックスの発生の点でインビボ組織により密接に類似している。例えば、伝統的には、殺腫瘍活性と免疫回避は、３Ｄシステムにおける腫瘍の複雑さを正確に反映していない可能性がある二次元（２Ｄ）で成長させた細胞を利用することによって独立して研究されてきた。免疫細胞が３Ｄシステム、およびインビボシステムにおいて克服する必要がある障壁は３Ｄシステムであり、２Ｄシステムにおける障壁よりもはるかに大きい。免疫細胞は腫瘍部位に移動する必要があるだけでなく、標的細胞を攻撃するために３Ｄ構造に浸潤する必要がある。さらに、２Ｄシステムと３Ｄシステムとの間の物理的違いを越えて、腫瘍細胞が３Ｄにおいて培養される場合に表現型の違いが生じ、これによって細胞毒性に対するより高い抵抗性が可能になることが示された。腫瘍細胞楕円体はしたがって細胞移動、分化、生存、および成長のより優れたモデルを提供し、したがって、薬効、薬効薬理、および毒性試験をはじめとする診断に関連する研究のためのより良好なシステムを提供する。
【００５２】
ここで、図３Ａおよび図３Ｂを参照すると、腫瘍細胞を３Ｄ楕円体コンフォメーションで成長させる構造のチャンバーを含む細胞培養製品の実施形態、例えば、楕円体プレートが示されている。図３Ａは、楕円体プレート１１の実施形態、この場合は、９６ウェルの各々に単一の楕円体を含むように構成された丸みを帯びた底部１１９を有する９６ウェルプレートを示す。通常、これらのプレートは、ウェル１０１の上部開口部１１８が上向きで使用されるが、図３Ａでは、プレートは、ウェル１０１の底部の構造を示すために上下逆で示されている。図３Ｂは、フレーム１３０、複数のウェル１０１であって、各々が上部開口部１１８、側壁１２１、および液体不透過性陥凹弓状底面１１９を有する楕円体マイクロプレートの実施形態の図である。３Ｄ腫瘍細胞楕円体２５はそれぞれ個別のウェル１０１の底部に示されている。実施形態において、フレーム１３０は、実験台またはテーブルなどの表面の上方でウェルの底部を保持し得る。いくつかの実施形態において、ウェルの底部１１９とプレートの下の表面との間に空間が設けられていてもよい。実施形態において、その空間は、外部環境と連通していてもよいし、または閉じられていてもよい。
【００５３】
実施形態において、チャンバーの少なくとも１つの陥凹弓状底面は、例えば、同じウェル内に複数の隣接する陥凹弓状底面を有し得る。または、図１に示すように、マルチウェルプレートは、同じウェル内に隣接する陥凹弓状底面またはマイクロキャビティのアレイを有する平坦な底面を有するウェルを有し得る。実施形態において、細胞培養製品は、例えば、各ウェルの底部または基部に複数のディンプルまたはピットなどの多くの「楕円体ウェル」を有する単一のウェルまたはマルチウェルプレート構造、例えば、マイクロキャビティ楕円体プレートであり得る。チャンバー当たりの複数の楕円体または楕円体ウェルは、好ましくは、例えば、楕円体ウェルあたり単一または１つの楕円体を収容し得る。
【００５４】
次に図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃを参照すると、マイクロキャビティ楕円体プレートの一実施形態、この場合は、各ウェルの底面上にマイクロキャビティのアレイを有して、９６ウェルの各々において複数の楕円体を提供している、９６ウェルマイクロキャビティ楕円体プレートが示されている。図１Ａは、ウェル１０１のアレイを有するマルチウェルプレート１０を示す。図１Ｂは、図１Ａのマルチウェルプレート１０の単一のウェル１０１を示す。単一のウェル１０１は、上部開口部１１８と、底面１０６と、側壁１１３とを有する。図１Ｃは、図１Ｂに示す単一のウェルの底面におけるマイクロキャビティ１１２のアレイを示す図１Ｂ中のボックスＣ中に示されるウェル１０１の底面１０６の部分の分解組立図である。マイクロキャビティ１１２のアレイにおける各マイクロキャビティ１１５は側壁１２１と底面１１６とを有する。各個別のウェル１０１の底部においてマイクロキャビティ１１２のアレイを提供する図１Ａ、図１Ｂおよび図１Ｃに示されるマイクロキャビティ楕円体プレートは、マルチウェルプレートの各個別のウェルの各マイクロキャビティにおいて３Ｄ楕円体を成長させるために使用することができる。このタイプの容器を使用することによって、ユーザーは、マルチウェルプレートの各ウェル中で多数の楕円体を成長させることができ、それによって、本明細書中で提供するようなアッセイにおいて使用するために同じ培養および実験条件下で処理することができる多数の楕円体を提供することができる。
【００５５】
次に図２を参照すると、マイクロキャビティ１１２のアレイの図が示されている。図２は、各々が上部開口部１１８、底面１１９、深さｄ、および側壁１２１によって画定される幅ｗを有するウェル１１５を示す。図２に示すように、マイクロキャビティのアレイは、丸みを帯びた底部１１９を有する。実施形態において、マイクロキャビティの底面は、丸みを帯びているかもしくは円錐形、角度のある、平坦な底部の、または３Ｄ腫瘍楕円体を形成するために適した任意の形状であり得る。実施形態において、マイクロキャビティは丸みを帯びた底部を有する。丸みを帯びた底部１１９は、丸みを帯びた底部１１９に移行する垂直な側壁としての遷移ゾーン１２０を有し得る。これは、平滑または傾斜した遷移ゾーンであり得る。実施形態において、「マイクロキャビティ」は、例えば、上部開口部１１８および最下点１１６と、上部開口部の中心と、最下点と上部開口部の中心との間の中心軸１０５とを画定するマイクロウェル１１５であり得る。実施形態において、ウェルは、その軸の周りに回転対称である（すなわち、側壁は円筒状である）。あるいは、ウェルは、例えば、六角形などの他の形状を有していてもよい。いくつかの実施形態において、上部開口部は、２５０μｍから１ｍｍ、またはそれらの測定値内の任意の範囲の上部開口部（幅ｗ）の直径を画定する。いくつかの実施形態において、上部開口部から最下点までの距離（深さ「ｄ」）は２００μｍから９００μｍ、または４００から６００μｍである。マイクロキャビティのアレイは、様々な形状，例えば、放物型、双曲型、山型、および断面形状、またはそれらの組み合わせを有していてもよい。実施形態において、マイクロキャビティは、それらの下に、それらが実験台またはテーブルなどの表面と直接接触することから保護する保護層１３０を有していてもよい。いくつかの実施形態において、ウェルの底部１１９と保護層との間に空間１１０が設けられていてもよい。実施形態において、空間１１０は外部環境と連通していてもよいし、または閉じられていてもよい。
【００５６】
実施形態において、少なくとも１つの陥凹弓状底面または「カップ」を有するチャンバーの底面は、例えば、半球状面、丸みを帯びた底部を有する円錐面、および同様の表面形状、またはその組み合わせであり得る。チャンバー（例えば、ウェル）およびチャンバー底部（例えば、ウェル底部またはマイクロキャビティ底部）は最終的に、ディンプル、ピット、および同様の陥凹円錐台形レリーフ面、またはそれらの組み合わせなどの楕円体の「やさしく」丸みを帯びたまたは湾曲した表面で、終結する、終端する、または底に達する。実施形態において、細胞培養製品のチャンバーの少なくとも１つの陥凹面は、半球状面、側壁から底面まで３０から約６０のテーパーを有する円錐面、またはその組み合わせを包含する。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの陥凹弓状底面は、例えば選択されたウェル形状、各ウェル内の陥凹弓状面の数、プレート中のウェルの数、および同様の検討事項に応じて、例えば中間の値および範囲を含む約２５０から約５，０００マイクロメートル（すなわち、０．０１０から０．２００インチ（２５４から５０８０マイクロメートル））の直径を有する半球の水平断面またはスライスなどの半球の一部であり得る。他の陥凹弓状面は、例えば、放物型、双曲型、山型、および同様の断面形状、またはそれらの組み合わせを有し得る。
【００５７】
実施形態において、チャンバー、例えば、楕円体プレートまたはマイクロキャビティ楕円体プレートを含む細胞培養製品は、チャンバーの一部の上、例えば少なくとも１つの陥凹面および／または１以上の側壁上に低接着性、超低接着性、または非接着性コーティングをさらに含み得る。非接着材料の例としては、パーフルオロポリマー、オレフィン、または同様のポリマー、またはそれらの混合物が挙げられる。他の例としては、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、またはポリエチレンオキシドなどのポリエーテルもしくはポリビニルアルコールなどのポリオール、または同様の材料、またはそれらの混合物が挙げられる。
【００５８】
実施形態において、側壁面（すなわち、周囲）は、例えば、垂直円筒またはシャフト、チャンバー頂部からチャンバー底部まで直径が減少する垂直円錐の一部、円錐形遷移部を有する、すなわちウェルの頂部で方形または楕円形で、円錐に遷移し、少なくとも１つの陥凹弓状面を有する、すなわち丸みを帯びたもしくは湾曲した底部で終端する垂直方形シャフトまたは垂直楕円形シャフト、またはその組み合わせであり得る。他の例示的形状例としては、有孔円筒、有孔円錐円筒、最初は円筒で後に円錐、および他の同様の形状、またはそれらの組み合わせが挙げられる。
【００５９】
例えば、低接着（ｌｏｗ−ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）基体、細胞培養製品チャンバーの本体および基部におけるウェルの湾曲、ならびに重力のうちの１つ以上によって、腫瘍細胞を自己集合させて楕円体にすることができる。腫瘍細胞は、単層で成長した細胞と比べてよりインビボ様の応答であることを示す分化した細胞機能を維持する。実施形態において、楕円体は、例えば楕円体における細胞型に応じて、例えば、約１００から約５００マイクロメートル、さらに好ましくは約１５０から約４００マイクロメートル、なお一層好ましくは約１５０から約３００マイクロメートル、そして最も好ましくは約２００から約２５０マイクロメートルであって、その間の値および範囲を含む直径を有する、例えば実質的に球であり得る。楕円体直径は、例えば、約２００から約４００マイクロメートルであり得、上側直径は拡散の検討事項によって制約を受ける。
【００６０】
実施形態において、細胞培養製品は、不透明な側壁および／または少なくとも１つの陥凹面を含むガス透過性かつ液体不透過性底部をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの陥凹面を含む底部の少なくとも一部は透明である。そのような特徴を有するウェルプレートは、腫瘍細胞楕円体を１つのマルチウェルプレート（その中で楕円体が形成され、可視化することができる）からアッセイ（例えば、治療薬の溶解および移動の測定）を実施するための別のプレートへ移す必要性を排除し、したがって、時間を節約し、楕円体のいかなる不必要な破壊も回避することをはじめとする、本開示の方法にとってのいくつかの利益を提供することができる。さらに、ガス透過性底部（例えば、特定の所与の厚さでガス透過性の特性を有するポリマーから作られたウェル底部）は、腫瘍楕円体が増大した酸素供給を受容することを可能にすることができる。例示的ガス透過性底部はある特定の厚さでパーフルオロポリマーまたはポリ４−メチルペンタンなどのポリマーから形成することができる。ガス透過性ポリマーの代表的な厚さおよび範囲は、例えば、約０．００１インチ（２５．４マイクロメートル）から約０．０２５インチ（６３５マイクロメートル）、０．００１５インチ（３８．１マイクロメートル）から約０．０３インチ（７６２マイクロメートル）であり得、中間の値および範囲を含む（ここで、１インチ＝２５，４００マイクロメートル；０．００００３９インチ＝１マイクロメートル）。付加的または代替的に、ポリジメチルシロキサンポリマーなどの高いガス透過性を有する他の材料は、例えば、約１インチ（２５，４００マイクロメートル）までの厚さで十分なガス拡散を提供することができる。
【００６１】
実施形態において、細胞培養製品は、吸引のためにピペットチップを受容するためのチャンバー付属物、チャンバー拡張領域、もしくは補助的サイドチャンバーをさらに含むことができ、このチャンバー付属物またはチャンバー拡張部（例えば、サイドポケット）は、例えば、チャンバーに隣接し、かつチャンバーと流体連通した一体型表面であり得る。チャンバー付属物は、チャンバーの液体不透過性底部から離間した第二の底部を有し得る。チャンバー付属物およびこのチャンバー付属物の第二の底部は、例えば、さらに高所にまたは相対的な高所などで、チャンバーの液体不透過性底部から離間させることができる。チャンバー付属物の第二の底部は、ピペットから分配される流体をチャンバーの液体不透過性底部からそらせて、楕円体の破壊またはかく乱を回避する。
【００６２】
治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するためのアッセイ法は、細胞培養製品中に多孔質膜を含むインサートを入れ、治療薬をインサート中に導入することをさらに含む。実施形態において、多孔質膜を含むインサートは、チャンバーの一部の中に、チャンバー付属物の一部の中に、またはチャンバーおよびチャンバー付属物部分の両方に入れることができる。多孔質膜を含むインサートは、チャンバーの上部中、多孔質膜によって形成されたチャンバーの上部中、または両チャンバーに入れた免疫細胞または薬物など治療薬の、透明底部近くの一方または両方のチャンバーの下部中の腫瘍細胞楕円体からの単離または分離（少なくとも最初に）を提供する。
【００６３】
図４Ａおよび図４Ｂはインサート４００の透視図である。図４Ａおよび図４Ｂで示すインサート４００はＣｏｒｎｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ（登録商標）インサートである。図４Ａおよび図４Ｂに示されるように、インサートは、キャビティ４２０を形成する上部開口部４１８、側壁４２１および底面４１９を有する。図４Ｃに示されるように、これらのインサート４００はインサートプレート４０１形態で提供することができ、この場合、単一のプレート４０１は複数のインサート４００を含み、マルチウェルインサートプレートは、マルチウェルプレート１１中のウェルの相補的（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）アレイ中に挿入するような構造である。インサートは多くの形態で入手可能である。実施形態において、これらのインサートは、小分子、例えば薬物、タンパク質、ベクター、または他の材料は底面１１９を通過させるが、細胞は通過させないために充分な多孔性である多孔性底面を有する。さらなる実施形態において、インサートは、免疫細胞を含む細胞治療薬などの細胞が底面を通って移動するために充分な直径の細孔を有する多孔性底面４１９を有する。
【００６４】
インサートの多孔質膜は、限定されるものではないが、トラック蝕刻（ｔｒａｃｋ  ｅｔｃｈ）された膜または製織もしくは不織多孔性材料をはじめとする様々な材料で作ることができる。多孔質膜の材料は、細胞に対してより接着性または非接着性となるように処理もしくはコーティングすることができるか、または細胞培養を支持するための任意の他の望ましいコーティングのための処理もしくはコーティングをすることができる。処理は、プラズマ放電、コロナ放電、ガスプラズマ放電、イオン衝撃、イオン化照射、および高強度ＵＶ光を含む、当該技術分野で公知の多数の方法で実施することができる。コーティングは、印刷、噴霧、凝縮、放射エネルギー、イオン化技術または浸漬をはじめとする当該技術分野で公知の任意の好適な方法によって導入することができる。コーティングは次に共有または非共有結合部位のいずれかを提供し得る。そのような部位は、細胞培養成分（例えば、成長または接着を促進するタンパク質）などの部分を結合させるために使用できる。さらに、コーティングは、細胞の付着を増進するために使用することもできる（例えば、ポリリジン）。あるいは、上記のような細胞非付着性コーティングを使用して細胞結合を防止または阻害することができる。多孔質膜はガンマ線滅菌してもよい。そのようなインサートは、Ｃｏｒｎｉｎｇ（「Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ」）またはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ（登録商標）もしくはＵｌｔｒａｃｅｌｌ（登録商標））から一般に入手可能である。
【００６５】
ある態様において、多孔質膜は、当該技術分野で公知の様に、多孔質膜の少なくとも一部が血液脳関門（ＢＢＢ）をシミュレートするような構造であるように処理またはコーティングしてもよい。いくつかの実施形態において、多孔質膜の少なくとも一部は、限定されるものではないが、微小血管内皮細胞などの内皮細胞の本質的にコンフルエントな単層を含む。いくつかの実施形態において、微小血管内皮細胞は脳内皮細胞である。いくつかの実施形態において、微小血管内皮細胞に含まれる内皮細胞は、星状細胞および／または周皮細胞と組み合わせて用いられる。そのようなモデルは、脳自体の防御システムとして作用するＢＢＢのために治療するのが最も困難ながんの１つである脳癌を研究するために有用である。脳を潜在的な毒素から保護するはずのＢＢＢは、多くの場合、化学療法などの通常の療法が脳腫瘍に到達するのを妨害する。伝統的に、放射性標識またはフルオロフォア標識化合物が透過性支持体システム上で成長する細胞単層を通過するので、インビトロでのＢＢＢによる化合物透過性高スループット試験は放射性標識またはフルオロフォア標識化合物のアッセイに限定されてきた。残念なことに、標識自体がアッセイに影響を及ぼす可能性があり、結果としての腫瘍細胞毒性を判定する能力を独立して調査しなければならない。ここで開示される方法およびデータは、治療薬（例えば、細胞治療薬、薬物、または生物剤）のＢＢＢ輸送ならびに結果としての治療薬の脳腫瘍細胞毒性を研究するための三次元（３Ｄ）モデルを示し、よりインビボ様の試験のための単一で使いやすい高スループットシステムにおけるホーミング、腫瘍細胞毒性、および腫瘍免疫回避の調査を可能にする。２Ｄで培養した腫瘍細胞を利用する免疫細胞移動および侵襲性アッセイのためのほとんどの現行の高スループットモデルとは異なり、このモデルはよりインビボ様の試験のための３Ｄ腫瘍楕円体成分を可能にする。
【００６６】
治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するための本開示のアッセイ法の特定の態様において、本開示は、アッセイを行うための環境を提供するための、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９６ＨＴＳ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ透過性支持体システムと組み合わせたＣｏｒｎｉｎｇ楕円体マイクロプレートの使用を提供する。Ｃｏｒｎｉｎｇ楕円体マイクロプレートは丸底ウェル形状を有する複数ウェル細胞培養マイクロプレートであって、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ表面でコーティングされているので、各ウェルの中心に置かれた高度に再現性のある単一多細胞腫瘍楕円体を形成することができる。Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９６  ＨＴＳ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌは、高スループット薬物輸送、ならびに細胞移動および侵襲研究のために使用される透過性支持体である。
【００６７】
図５Ａから５Ｃは、治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するための本開示方法の実施形態を示す。図５Ａで示されるように、腫瘍細胞などの関心対象の細胞５２５を３Ｄコンフォメーションで成長させる構造のウェル１０１中の培地５００において関心対象の細胞５２５を成長させる。この場合ウェル１０１は、単一の単一楕円体ウェルである。実施形態において、ウェル１０１は例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ９６ウェル楕円体プレートの１つのウェルなどの、９６ウェルプレートの１つのウェルである。実施形態において、関心対象の細胞５２５、例えば腫瘍細胞は、マルチウェルプレート（図１Ｃを参照）のウェル中で成長させることができ、各ウェル１０１はマイクロキャビティ１１２のアレイを有し、各マイクロキャビティは、関心対象の細胞を３Ｄコンフォメーションで成長させる構造であり、その結果、マルチウェルプレートのウェルの底面上のマイクロキャビティのアレイ中のマイクロキャビティの各々に１つずつ、楕円体のアレイが生じる。細胞は成長して培養中で繁殖するにつれ、それらは楕円体２５として成長させられる。時間とともに、楕円体２５が発生する。図５Ａは楕円体２５の形成を示す。腫瘍細胞が楕円体２５に発達したら、図５Ｂに示すように、細胞培養インサート４００をウェル１０１に入れる。実施形態では、インサートは図４Ｂに示すようなインサートプレートであってよい。治療薬（例えば、細胞治療薬、薬物、または生物剤）、この場合では細胞治療薬３０をインサート４００のキャビティ４２０に添加する。この形態で、治療薬細胞３０などの治療薬（例えば、細胞治療薬、薬物、または生物剤）を含むインサート、および３Ｄ腫瘍楕円体などの３Ｄコンフォメーションの関心対象の細胞５２５を含むウェル１０１を一緒にインキュベートする。次に、好適な時間の後、治療薬（例えば、細胞治療薬、薬物、または生物剤）、この場合は細胞治療薬３０の、３Ｄ腫瘍楕円体などの関心対象の細胞に対する効果、ならびにインサートから細胞培養製品のアッセイチャンバーへの治療薬の移動をアッセイで測定する。このインキュベーション期間は、実施するアッセイのタイプ、このアッセイで使用する治療薬、例えば、細胞治療薬、薬物、または生物剤に応じて変わる。このインキュベーション期間はまた、インサート４００中の膜について用いられる細孔サイズによっても変わる。細孔サイズが大きいほど治療薬は迅速に分配され、したがってインキュベーション期間は短くなるが、非特異的結果となる可能性がある。インキュベーション時間の調節は、事前の実験で実施することができ、当業者の一般的な技術範囲内である。図５Ｃで示すように、治療薬３０の腫瘍楕円体２５に対する効果を次に測定することができる。例えば、図５Ｃ中、実施形態において、アッセイは楕円体２５の溶解を測定することができる。
【００６８】
図８Ａ、８Ｂ、８Ｃ、８Ｄ、８Ｅ、８Ｆおよび８Ｇは、インサート４００の一部である多孔質膜３０２上の細胞３００の層の使用を含むモデルにおいて治療薬３０の能動的移動および細胞毒性を検出するための本開示の方法の実施形態の図である。これらの実施形態において、インサート４００の多孔質膜３０２上の細胞３００の層は、血液脳関門（ＢＢＢ）をシミュレートするように構成されている。
【００６９】
まず、図８Ａに示すように、ＢＢＢをシミュレートするために使用する細胞３００を培養培地５００中の細胞培養インサート４００の多孔質膜３０２上に播種する。これらの細胞は、例えば、内皮細胞である。ある時間の後、播種した細胞３００、例えば内皮細胞は、ＢＢＢをシミュレートする細胞３０６のコンフルエントな単層（２Ｄ層）を形成する。一旦、細胞３０６のコンフルエントな単層が形成されたら、インサート４００は、図８Ｃに示すように楕円体ウェル１０１に入れることができる。
【００７０】
図５と同様に、腫瘍細胞などの関心対象の細胞はまた、図８Ｂに示すように、関心対象の細胞を３Ｄコンフォメーションで成長させて楕円体２５を形成させるような構造のウェル１０１中の培地５００中で成長させる。図８Ｂで示すように、ウェル１０１は、単一の、単一楕円体ウェルである。実施形態において、腫瘍細胞などの関心対象の細胞は、各々のマイクロキャビティが関心対象の細胞を３Ｄコンフォメーションで成長させる構造の（図１Ｃを参照）、マイクロキャビティのアレイを有するマルチウェルプレートのウェル中で成長させることができ（図１Ａ、１Ｂおよび１Ｃに示す通り）、その結果、マルチウェルプレートのウェルの底面上のマイクロキャビティのアレイのマイクロキャビティのそれぞれに１つずつ、多数の楕円体が生じる。細胞が成長し、培養中で増殖する際、図８Ｂに示すように、それらは楕円体として成長させられ、楕円体２５が生じる。腫瘍細胞が楕円体２５になり、ＢＢＢをシミュレートする内皮細胞３０６のコンフルエントな単層が形成されたら、図８Ｃに示すように細胞培養インサート４００をウェル１０１に入れる。
【００７１】
また図８Ｃを参照して、図５と同様に、治療薬（例えば、細胞治療薬、薬物、または生物剤）、この場合は薬物３１０をインサート４００のキャビティ３１２に添加する。この形態で、治療薬３１０（例えば、細胞治療薬、薬物、または生物剤）、この場合は薬物３１０を含むインサート４００と、３Ｄ腫瘍楕円体２５などの３Ｄコンフォメーションの関心対象の細胞を含むウェルを一緒にインキュベートする。これを図８Ｄおよび図８Ｅに示す。インキュベーション期間は、アッセイで使用する治療薬、例えば、細胞治療薬、薬物、または生物剤によって変わる。これはまた、インサート４００中の膜３０２に使用する細孔サイズによっても変わる。細孔サイズが大きいほど治療薬３１０の分配が迅速になり、したがってインキュベーション期間が短くなるが、非特異的結果となる可能性がある。インキュベーション時間の調節は、事前の実験で行うことができ、当業者の通常の技術範囲内である。血液脳関門（ＢＢＢ）をシミュレートするように構成された多孔質膜３０２上の細胞３０６の層を使用して、治療薬が血液脳関門を越える能力を評価することができる。
【００７２】
次に、好適な時間ののち、治療薬３１０の、３Ｄ腫瘍楕円体２５などの関心対象の細胞に対する効果を測定することができる。例えば、図８Ｆに示すように、楕円体２５の破壊または溶解が示される。この破壊は、細胞培養製品のアッセイチャンバー３１５中の楕円体２５の一体性における変化を測定することによって測定することができる。あるいは、図８Ｇに示すように楕円体２５は、インキュベーション期間後にインタクトであることが示される一方で、細胞機能の測定を行って、楕円体２５を構成する細胞の生理機能における変化を測定することができる。例えば、薬物３１０の細胞毒性効果または薬物３１０の３Ｄ腫瘍楕円体２５への浸透は、腫瘍細胞生理学における変化を測定することによって測定することができる。
【００７３】
インサート４００から細胞培養製品のアッセイチャンバー３１５への治療薬３１０の移動を測定することができる。例えば、治療薬３１０をデバイスのインサートチャンバー３１２に導入し、次いでアッセイチャンバー３１５から測定される薬物３１０の濃度に関して評価を行い、どれほど多くの薬物３１０が血液脳関門を通過するかを判定する。
【００７４】
３Ｄ腫瘍楕円体およびインサートから細胞培養製品のチャンバーへの治療薬の移動に対する効果は、細胞、細胞抽出物、または培地の可視化、蛍光測定、遺伝子、代謝またはタンパク質分析をはじめとする当該技術分野で公知の任意の手段によって測定することができる。例えば、免疫細胞の移動（治療薬細胞が免疫細胞である場合）および細胞毒性（または腫瘍細胞の生理機能における変化）を、例えば限定されるものではないが、当該技術分野で公知の様な適切な染色を使用することによるフローサイトメトリーによって評価することができ、本明細書中の実施例で使用することができる。さらに一例として、放射標識された薬物もしくは生物剤または蛍光標識された薬物もしくは生物剤などを含む標識された薬物もしくは生物剤を使用することによって薬物もしくは生物剤の移動を測定することができる。治療薬、例えば、細胞治療薬、薬物、または生物剤の、３Ｄ腫瘍楕円体への浸透または腫瘍細胞溶解は、例えば限定されるものではないが、可視化および／または蛍光測定によって検出することができる。例えば、３Ｄ腫瘍楕円体および浸潤細胞を固定し分割することができ、細胞を、当該技術分野で公知の様に従来型組織学的技術によって染色することができる。
【００７５】
様々な腫瘍細胞タイプを培養して３Ｄ腫瘍楕円体２５を形成することができる。培養して３Ｄ腫瘍楕円体２５を形成することができる腫瘍細胞タイプに用いられるがん細胞としては、腫瘍、新生物、がん、前がん状態、細胞株に由来する任意の細胞、または無制限に拡大し成長する可能性を有する任意の他の細胞源が挙げられる。がん細胞は自然発生源由来であるか、または人工的に生成される。がん細胞は動物宿主に入れられた場合に他の組織に浸潤し転移することができる。がん細胞は、他の組織を侵害し、および／または転移した任意の悪性細胞をさらに包含する。生命体の関連での１以上のがん細胞はまた、がん、腫瘍、新生物、成長、悪性腫瘍、または癌性状態の細胞を記述するために当該技術分野で使用される任意の他の用語でも呼ぶことができる。
【００７６】
培養して３Ｄ腫瘍楕円体２５を形成することができる腫瘍細胞型源としての働きをするがんとしては、限定されるものではないが、固形腫瘍、例えば線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑液腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、結腸直腸がん、腎臓がん、膵臓がん、骨がん、脳癌、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、食道がん、胃がん、口腔がん、鼻腔がん、咽喉がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん，汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支がん、腎細胞がん、肝がん、胆管がん、絨毛腫、セミノーマ、胎生期がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、小細胞肺がん、膀胱がん、肺がん、上皮がん、神経膠腫、多形成膠芽腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、皮膚がん、黒色腫、神経芽細胞腫、および網膜芽腫が挙げられる。
【００７７】
がん細胞源としての働きをするさらなるがんには、限定されるものではないが、血液感染性がん、例えば急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ芽級性Ｂ細胞白血病、急性リンパ芽級性Ｔ細胞白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄性白血病、急性単芽球性白血病、急性赤白血病性白血病（ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性巨核芽球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性非リンパ球性白血病（ｎｏｎｌｙｍｐｈｏｃｙｃｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、急性未分化白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、有毛細胞白血病、多発性骨髄腫，リンパ芽球性白血病、骨髄性白血病、リンパ性白血病、骨髄性白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、および真性赤血球増加症が含まれる。本明細書中で開示する治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するための方法のいくつかの実施形態において、３Ｄ腫瘍楕円体は１以上のがん細胞を含む。いくつかの実施形態では、がん細胞を凍結保存する。いくつかの実施形態において、１以上の細胞は活発に分裂している。
【００７８】
いくつかの実施形態において、方法は、培養培地（例えば、当該技術分野で公知の栄養素（例えば、タンパク質、ペプチド、アミノ酸）、エネルギー（例えば、炭水化物）、必須金属およびミネラル（例えば、カルシウム、マグネシウム、鉄、リン酸塩、硫酸塩）、緩衝剤（例えば、リン酸塩、酢酸塩）、ｐＨ変化の指示薬（例えば、フェノールレッド、ブロモクレゾールパープル）、選択剤（例えば、化学薬品、抗菌薬）などを含む）を含む。
【００７９】
治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するための本開示の方法のいくつかの実施形態において、治療薬は細胞治療薬、薬物，および／または生物剤である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、細胞治療薬は免疫細胞を含む。いくつかの実施形態において、免疫細胞は白血球（例えば、好中球、マクロファージ、樹状細胞、または単球）である。いくつかの実施形態において、免疫細胞はリンパ球（例えば、ナチュラルキラー細胞、またはリンパ球、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、そしてさらに詳細には細胞傷害性Ｔ細胞）である。
【００８１】
公知抗がん薬または新規分子的実体もしくは新規化学物質などの潜在的な抗がん活性があると思われる物質を含む治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するための本開示の方法において、様々な薬物３１０を試験することができる。抗がん薬としては、限定されるものではないが：アシビシン；アクラルビシン；塩酸アコダゾール（ａｃｏｄａｚｏｌｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン；酢酸アメタントロン；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ（ａｚｅｔｅｐａ）；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ（ｂｅｎｚｏｄｅｐａ）；ビカルタミド；塩酸ビスアントレン；ジメシル酸ビスナフィド（ビスナフィド  ｄｉｍｅｓｙｌａｔｅ）；ビゼレシン；硫酸ブレオマイシン；ブレキナルナトリウム（ｂｒｅｑｕｉｎａｒ  ｓｏｄｉｕｍ）；ブロピリミン（ｂｒｏｐｉｒｉｍｉｎｅ）；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；塩酸カルビシン；カルゼルシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン（ｃｉｒｏｌｅｍｙｃｉｎ）；シスプラチン；クラドリビン；メシル酸クリスナトール；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；塩酸ダウノルビシン；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；メシル酸デザグアニン；ジアジクオン；ドセタキセル；ドキソルビシン；塩酸ドキソルビシン；ドロロキシフェン；クエン酸ドロロキシフェン；プロピオン酸ドロモスタノロン；デュアゾマイシン（ｄｕａｚｏｍｙｃｉｎ）；エダトレキサート；塩酸エフロミチン（ｅｆｌｏｍｉｔｈｉｎｅ）；エルサミトルシン（ｅｌｓａｍｉｔｒｕｃｉｎ）；エンロプラチン；エンプロマート；エピプロピジン；塩酸エピルビシン；エルブロゾール；塩酸エソルビシン；エストラムスチン；リン酸エストラムスチンナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；リン酸エトポシド；エトプリン；塩酸ファドラゾール（ファドロゾール）；ファザラビン；フェンレチニド（ｆｅｎｒｅｔｉｎｉｄｅ）；フロクスウリジン（ｆｌｏｘｕｒｉｄｉｎｅ）；リン酸フルダラビン；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシン（ｆｏｓｔｒｉｅｃｉｎ）ナトリウム；ゲムシタビン；塩酸ゲムシタビン；ヒドロキシウレア；塩酸イダルビシン；イホスファミド；イルモホシン；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩ、またはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンα−２ａ；インターフェロンα−２ｂ；インターフェロンα−ｎ１；インターフェロンα−ｎ３；インターフェロンβ−Ｉａ；インターフェロンγ−Ｉｂ；イプロプラチン；塩酸イリノテカン；酢酸ランレオチド；レトロゾール；酢酸リュープロレリン；塩酸リアロゾール；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；塩酸ロソキサントロン；マソプロコール；マイタンシン；塩酸メクロレタミン；酢酸メゲストロール；酢酸メレンゲストロール；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン（ｍｉｔｏｃａｒｃｉｎ）；マイトクロミン（ｍｉｔｏｃｒｏｍｉｎ）；マイトジリン；マイトマルシン（ｍｉｔｏｍａｌｃｉｎ）；マイトマイシン；マイトスパー（ｍｉｔｏｓｐｅｒ）；ミトタン；塩酸ミトキサントロン；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルカーゼ；ペリオマイシン（ｐｅｌｉｏｍｙｃｉｎ）；ペンタムスチン（ｐｅｎｔａｍｕｓｔｉｎｅ）；硫酸ペプロマイシン；ペルフォスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；塩酸ピロキサントロン（ｐｉｒｏｘａｎｔｒｏｎｅ）；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；塩酸プロカルバジン；ピューロマイシン；塩酸ピューロマイシン；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド（ｒｏｇｌｅｔｉｍｉｄｅ）；サフィンゴール；塩酸サフィンゴール；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォサーテ（ｓｐａｒｆｏｓａｔｅ）ナトリウム；スパルソマイシン；塩酸スピロゲルマニウム；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スルフェヌル；タリソマイシン；テコガランナトリウム；テガフール；塩酸テロキサントロン；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；クエン酸トレミフェン；酢酸トレストロン；リン酸トリシリビン；トリメトレキサート；グルクロン酸トリメトレキサート；トリプトレリン；塩酸ツブロゾール；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン（ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ）；硫酸ビンブラスチン；硫酸ビンクリスチン；ビンデシン；硫酸ビンデシン；硫酸ビネピジン；硫酸ビングリシナート；硫酸ビンロイロシン（ｖｉｎｌｅｕｒｏｓｉｎｅ）；酒石酸ビノレルビン；硫酸ビンロシジン（ｖｉｎｒｏｓｉｄｉｎｅ）；硫酸ビンゾリジン；ボロゾール；ゼニプラチン；ジノスタチン；塩酸ゾルビシンが挙げられる。他の抗がん薬としては、限定されるものではないが、２０−エピ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン；アミドックス；アミフォスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス；抗背側化（ａｎｔｉ−ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ）形態形成タンパク質−１；抗アンドロゲン、前立腺がん；抗エストロゲン；抗新生物薬；アンチセンスオリゴヌクレオチド；グリシン酸アフィジコリン；アポトーシス遺伝子モジュレータ；アポトーシス調節因子；アプリン酸；アラ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン（ｂｅｎｚｏｃｈｌｏｒｉｎ）；ベンゾイルスタウロスポリン；βラクタム誘導体；β−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビスアントレン；ビスアジリジニルスペルミン；ビスナフィド；ビストラテンＡ；ビゼレシン；ブレフラート；ブロピリミン；ブドチタン；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルホスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼルシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェンアナログ；クロトリマゾール；コリスマイシン（ｃｏｌｌｉｓｍｙｃｉｎ）Ａ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチンアナログ；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスタノール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタアントラキノン（ｃｙｃｌｏｐｅｎｔａｎｔｈｒａｑｕｉｎｏｎｅｓ）；シクロプラタム；シペマイシン（絨毛膜）；シタラビンオクホスファート；細胞溶解因子；シトスタチン；ダクリキシマブ；デシタビン；デヒドロジデムニンＢ；デスロレリン；デキサメタゾン；デキシホスファミド；デキソラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジクオン；ジデムニンＢ；ジドクス（ｄｉｄｏｘ）；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；９−ジヒドロタキソール；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチンアナログ；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；リン酸エトポシド；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン；フルアステロン；フルダラビン；塩酸フルオロダウノルニシン；ホルフェニメクス；フォルメスタン；ホストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテキサフィリン；硝酸ガリウム；ガロシタビン（ｇａｌｏｃｉｔａｂｉｎｅ）；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン（ｉｄｒａｍａｎｔｏｎｅ）；イルモホシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン（ｉｍｉｄａｚｏａｃｒｉｄｏｎｅｓ）；イミキモド；免疫賦活薬ペプチド；インスリン様成長因子１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；ヨーベングアン；ヨードドキソルビシン；４−イポメアナール；イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）；イルソグラ���ン；イソベンガゾール；イソホモハリコドリン（ｉｓｏｈｏｍｏｈａｌｉｃｏｎｄｒｉｎ）Ｂ；イタセトロン；ジャスプラキノリド（ｊａｓｐｌａｋｉｎｏｌｉｄｅ）；カハラリド（ｋａｈａｌａｌｉｄｅ）Ｆ；ラメラリン−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；硫酸レンチナン；レプトルスタチン；レトロゾール；白血病阻止因子；白血球αインターフェロン；リュープロレリン＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミゾール；リアロゾール；線状ポリアミンアナログ；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド（ｌｉｓｓｏｃｌｉｎａｍｉｄｅ）７；ロバプラチン；ロンブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソルビン（ｌｏｘｏｒｉｂｉｎｅ）；ラルトテカン；ルテチウムテキサフィリン；リソフィリン（ｌｙｓｏｆｙｌｌｉｎｅ）；溶解性ペプチド；マイタンシン（ｍａｉｔａｎｓｉｎｅ）；マンノスタチンＡ；マリマスタット（ｍａｒｉｍａｓｔａｔ）；マソプロコール；マスピン（ｍａｓｐｉｎ）；マトリリシン（ｍａｔｒｉｌｙｓｉｎ）阻害剤；マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシンアナログ；ミトナフィド（ｍｉｔｏｎａｆｉｄｅ）；マイトトキシン線維芽細胞成長因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン（ｍｏｆａｒｏｔｅｎｅ）；モルグラモスチム；モノクローナル抗体ヒト絨毛膜ゴナドトロピン；モノホスホリル脂質Ａ＋ミオバクテリア（ｍｙｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細胞壁抽出物；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；多腫瘍抑制因子１系療法；マスタード抗がん剤；ミカペルオキシドＢ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチップ；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン（ｎａｐａｖｉｎ）；ナフテルピン（ｎａｐｈｔｅｒｐｉｎ）；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレータ；ニトロオキシド抗酸化剤；ニトルリン（ｎｉｔｒｕｌｌｙｎ）；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキ
セノン；オリゴヌクレオチド；オナプリストン；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン（ｏｒａｃｉｎ）；口腔サイトカインインデューサー；オルマプラチン；オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセルアナログ；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン；パラバクチン；パゼリプチン（ｐａｚｅｌｌｉｐｔｉｎｅ）；ペガスパルカーゼ；ペルデシン；ペントサンポリスルフェートナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール；パーフルブロン；ペルフォスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニルアセテート；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；塩酸ピロカルピン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチンＡ；プラセチンＢ；プラスミノーゲンアクチベータ阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金−トリアミン複合体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；タンパク質Ａ系免疫モジュレータ；タンパク質キナーゼＣ阻害剤；タンパク質キナーゼＣ阻害剤、微細藻類；タンパク質チロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；脱メチル化レテリプチン；レニウムＲｅ１８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチナミド；ログレチミド；ロヒツキン（ｒｏｈｉｔｕｋｉｎｅ）；ロムルチド；ロキニメックス；ルビギノンＢ１；ルボキシル；サフィンゴール；サイントピン；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトール（ｓａｒｃｏｐｈｙｔｏｌ）Ａ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ１模倣物；セムスチン；老化由来（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ）阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル変換阻害剤；シグナル変換モジュレータ；単鎖抗原結合タンパク質；シゾフィラン；ソブゾキサン；ボロカプチン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｂｏｒｏｃａｐｔａｔｅ）；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン；スパルフォス酸；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン１；スクワラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメリシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作動性腸ペプチドアンタゴニスト；スラジスタ；スラミン；スワインソニン；合成グリコサミングリカン；タリムスチン；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロマイド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン（ｔｅｔｒａｚｏｍｉｎｅ）；タリブラスチン（ｔｈａｌｉｂｌａｓｔｉｎｅ）；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣物；チマルファシン；チモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン；甲状腺刺激ホルモ��；エチルエチオプルプリンスズ；チラパザミン；チタノセンジクロリド；トプセチン；トレミフェン；分化全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキサート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン（ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎｓ）；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来の成長阻害因子；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリン（ｖａｒｉｏｌｉｎ）Ｂ；ベクターシステム、赤血球遺伝子療法；ベラレソール（ｖｅｌａｒｅｓｏｌ）；べラミン（ｖｅｒａｍｉｎｅ）；ベルディンス（ｖｅｒｄｉｎｓ）；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン；ビタキシン（ｖｉｔａｘｉｎ）；ボロゾール；ザノテロン；ゼニプラチン；ジラスコルブ；およびジノスタチンスチマラマーが挙げられる。
【００８２】
本開示の方法および概念は、さらなる同時培養モデルに拡張することができると理解されるべきである。例えば、シミュレートされた血液脳関門を記載してきたが、多孔質膜上で成長させた細胞は、任意の生物学的障壁をシミュレートするように構成することができる。「生物学的障壁」とは生理学的保護障壁に関連する生体膜であり、限定されるものではないが、血液脳関門、肺障壁、胎盤障壁、表皮性障壁、眼障壁、嗅覚障壁、胃食道障壁、粘膜、血液−尿障壁、空気−組織障壁、血液−胆汁障壁、口腔障壁、肛門直腸障壁、膣障壁、および尿道障壁を含み得る。さらなる生物学的障壁としては、血液−乳障壁、血液−睾丸障壁、および膣粘膜、尿道粘膜、肛門粘膜、頬粘膜、舌下粘膜、直腸粘膜をはじめとする粘膜性障壁などが挙げられる。
【００８３】
さらに、細胞培養製品で培養されて楕円体２５を形成する細胞は腫瘍またはがん細胞に限定されない。様々な細胞型を培養することができる。いくつかの実施形態では、楕円体は単一の細胞型を含む。いくつかの実施形態では、楕円体は複数の細胞型を含む。複数の楕円体を成長させるいくつかの実施形態では、各楕円体は同じ型のものであり、一方、他の実施形態では、２以上の異なる型の楕円体を成長させる。楕円体で成長させた細胞は、天然の細胞であってもよいし、または改変された細胞であってもよい（例えば、１以上の非天然遺伝子改変を含む細胞）。いくつかの実施形態において、細胞は体細胞である。いくつかの実施形態において、細胞は、分化の任意の望ましい状態（例えば、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、多能性（ｍｕｌｔｉ−ｐｏｔｅｎｔ）、運命決定（ｆａｔｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）、不死化など）の幹細胞または前駆細胞（例えば、胚性幹細胞、ｉＰＳ細胞）である。いくつかの実施形態において、細胞は疾患細胞または疾患モデル細胞である。細胞は、限定されるものではないが、副腎、膀胱、血管、骨、骨髄、脳、軟骨、子宮頸部、角膜、子宮内膜、食道、胃腸、免疫系（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、白血球、マクロファージ、および樹状細胞）、肝臓、肺、リンパ管、筋肉（例えば、心筋）、神経、卵巣、膵臓（例えば、島細胞）、下垂体、前立腺、腎臓、唾液腺、皮膚、腱、精巣、および甲状腺をはじめとする任意の所望の組織または臓器タイプ由来であり得るかまたは誘導することができる。いくつかの実施形態において、細胞は哺乳動物細胞（例えば、ヒト、マウス、ネズミ、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヤギ、ウマなど）である。
【００８４】
さらに、細胞培養チャンバー中の楕円体に対する治療薬の試験した効果は、細胞毒性（ｃｙｔｏｘｉｔｙ）（例えば、細胞溶解）に限定されない。本方法および概念は、創薬、特性評価、有効性試験、および毒性試験に適用することができる。そのような試験としては、限定されるものではないが、薬理学的効果評価、発がん性評価、医学的造影剤特性評価、半減期評価、放射線安全評価、遺伝毒性試験、免疫毒性試験、繁殖および発育試験、薬物相互作用評価、線量評価、吸着評価、素質評価、代謝評価、放出研究などが挙げられる。当業者には公知の様に、特異的試験に関して（例えば、肝臓毒性に関して肝細胞、腎臓毒性に関して腎臓近位尿細管上皮細胞、血管毒性に関して血管内皮細胞、神経毒性に関してニューロンおよびグリア細胞、心臓毒性に関して心筋細胞、横紋筋融解症に関して骨格筋細胞など）特異的細胞タイプを使用することができる。楕円体細胞に対する治療薬の効果は、限定されるものではないが、膜完全性、細胞内代謝内容物、ミトコンドリア機能、リソソーム機能、アポトーシス、遺伝子変化、遺伝子発現差異などをはじめとする、任意の数の所望のパラメータについて評価することができる。
【００８５】
したがって、本開示の方法および概念を使用して、例えば、また限定するものではないが、薬物またはウイルス（治療薬が薬物またはウイルスである場合）のいずれかが血液脳関門または胎盤障壁（多孔質膜が血液脳関門または胎盤障壁をシミュレートするように構成されている場合）を横切る能力、ならびにその後の効果（例えば、細胞毒性）および細胞培養製品チャンバー中の腫瘍楕円体への浸透を研究することができる。さらに、一例として、本開示の方法および概念を使用して、楕円体細胞のウイルス感染（治療薬がウイルスである場合）または胚発生（例えば、楕円体が胚性幹細胞から構成される場合）に対する治療薬の効果を研究することができる。
【実施例】
【００８６】
以下の実施例は、本開示のある特定の好ましい実施形態および態様を説明する役割を果たし、その範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００８７】
実施例１
細胞培養
Ａ５４９／ＧＦＰ細胞（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．カタログ番号ＡＫＲ−２０９）は、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３５−０１０−ＣＶ）を追加したＩｓｃｏｖｅの修飾ＤＭＥＭ（ＩＭＤＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号１０−０１６−ＣＭ）中にウェルあたり２，０００個の細胞で９６ウェル楕円体マイクロプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号４５１５）に播種した。翌日、培地を、３０ｎｇ／ｍＬのヒトＳＤＦ−１α（ＳＤＦ−１α）／ＣＸＣＬ１２（Ｓｈｅｎａｎｄｏａｈ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ（商標）カタログ番号１００−２０）またはビヒクル対照を含む２００μＬのＩＭＤＭ１０％ＦＢＳと置換した。ＮＫ９２−ＭＩ細胞を８０μＭ細胞Ｔｒａｃｋｅｒ（商標）Ｂｌｕｅ  ＣＭＨＣ  Ｄｙｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（商標）カタログ番号Ｃ２１１０）で１時間染色し、同時に血清を含まないＩＭＤＭ中２μｇ／ｍＬのプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）（Ｔｏｃｒｉｓカタログ番号２２９６）またはビヒクル対照で１時間処理した。ＨＴＳ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ−９６Ｗｅｌｌ  Ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔを９６ウェル楕円体プレートに入れた（概略図を図１Ａおよび図４Ｃに示す）。ＮＫ−９２ＭＩ細胞を次に無血清ＩＭＤＭ中に再懸濁させ、インサートのアピカルチャンバーに５０，０００細胞／インサートで播種した。２４時間後、インサートを取り出し、楕円体マイクロプレートをフローサイトメトリーのために処理した。簡単に言うと、培地を除去し、１５０μＬのＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｓｅｌｅｃｔ  Ｅｎｚｙｍｅ（１０Ｘ）（Ｇｉｂｃｏ（商標）カタログ番号Ａ１２１７７０１）で置換し、楕円体を最小のピペッティングで単細胞に分解することができるようになるまで３７℃でインキュベートした。細胞を次にＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＭａｃｓＱｕａｎｔ（登録商標）を利用してフローサイトメトリーにより分析した。
【００８８】
ＮＫ−９２ＭＩ（ＮＫ）細胞移動の評価
Ａ５４９／ＧＦＰ細胞のＮＫ−９２ＭＩ移動および殺腫瘍活性は、図４および図５で示すように、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ９６ウェル楕円体マイクロプレートとともに市販のＣｏｒｎｉｎｇ  ＨＴＳ  ９６Ｔｒａｎｓｗｅｌｌインサートを利用して評価した。悪性腫瘍構造中のある特定の免疫細胞の存在は、患者生存率の増加と相関することが示されている。免疫細胞毒性を研究するためにより一般的に用いられる２Ｄインビトロモデルとは異なり、腫瘍楕円体への免疫細胞浸透を観察するために３Ｄモデルを使用することができる。図６は、図５で示す実施形態にしたがって、３Ｄ中に培養されるＡ５４９／ＧＦＰ腫瘍細胞へのＮＫ細胞の移動を示すグラフである。データは２つの独立した研究の平均で示し、ボンフェローニポストテストを伴う一元配置分散分析でＮ＝２４。＊＊＊＝ｐ＜０．０００１そして＊＊＝ｐ＜０．００１。図６は、免疫細胞移動は、どのようにしてＳＤＦ−１αなどのケモカインの添加によって増強することができ、またＰＧＥ２などの阻害剤の添加によって抑制できるかを示す。ＮＫ移動は、化学誘引物質ＳＤＦ−１αが楕円体マイクロプレート中に腫瘍楕円体とともに存在する場合、有意に増大した。図７は、図４Ａ、図４Ｂ、および図５で示す実施形態にしたがって３Ｄに培養されたＡ５４９／ＧＦＰ腫瘍細胞のＮＫ誘発性細胞毒性を示すグラフである。反対に、免疫回避の形態としてがん細胞によって多くの場合分泌される免疫細胞機能の公知阻害剤であるＰＧＥ２にＮＫ細胞が曝露された場合、移動が有意に減少した。殺腫瘍活性は、移動データとよく相関し、ＰＧＥ２を含まないＳＤＦ−１αに曝露されたＮＫ細胞で観察されたＡ５４９／ＧＦＰ腫瘍細胞の生存率は最低である（図７）。
【００８９】
実施例２
血液脳関門モデル
ＭＤＣＫＩＩ／ＭＤＲ１細胞をＰｉｅｔ  Ｂｏｒｓｔ博士（Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、オランダ国アムステルダム）から入手し、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３５−０１０−ＣＶ）を追加した１００μＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号１０−０１３−ＣＭ）中で１ｃｍ２あたり１００，０００個の細胞でＨＴＳ９６−ウェルＴｒａｎｓｗｅｌｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号３３９１または３９７７）中に播種した。アッセイの２４時間前に培地を交換してそれらを５日間培養した。単層完全性をルシファーイエロー透過性（図１０Ａ）（シグマカタログ番号Ｌ０１４４）およびローダミン１２３輸送（図１０Ｂ）（シグマカタログ番号Ｒ８００４）により評価した。製造業者のプロトコル（データは不掲載）どおりに密着結合タンパク質ＺＯ１（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号３３９１８８）およびオクルディン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号３３１５８８）の存在を確認するために、ＭＤＣＫＩＩ／ＭＤＲ１単層の免疫染色を実施した。
【００９０】
神経膠腫球形成
ＬＮ２２９細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）カタログ番号ＣＲＬ−２６１１（商標））を、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中でルーチン的に培養した。細胞をＡｃｃｕｔａｓｅ（登録商標）細胞分離溶液（Ｃｏｒｎｉｎｇカタログ番号２５−０５８−ＣＩ）で収集し、９６ウェル楕円体マイクロプレートにウェルあたり１，０００細胞でアッセイ前２４時間播種した（図８Ｂ）。
【００９１】
血液脳関門／神経膠腫球モデル試験
図８Ａから８Ｇに示すように、血液脳関門／神経膠腫球モデル試験を、血液脳関門をシミュレートするように構成された多孔質膜の使用を含むモデルにおいて治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するための本開示の方法の一実施形態で実施した。まず、図８Ａに示すように、ＢＢＢをシミュレートするために使用するＭＤＣＫＩＩ／ＭＤＲ１細胞を細胞培養インサート３０４の多孔質膜３０２上に播種した。ＬＮ２２９腫瘍細胞をＣｏｒｎｉｎｇ９６ウェル楕円体プレート中で成長させた（図８Ｂに示すとおり）。楕円体に発生したＬＮ２２９腫瘍細胞（図８Ｂに示すとおり）および細胞培養インサートの多孔質膜上のＢＢＢをシミュレートするＭＤＣＫＩＩ／ＭＤＲ１内皮細胞のコンフルエントな単層（図８Ａに示すとおり）が形成されたら、細胞培養インサートをウェルに入れた。図８Ｃを参照して、薬物、シスプラチンまたはピペロングミンなどの薬物をインサートのキャビティに２時間添加した。薬物インキュベーション後、細胞培養インサートを取り出し、単層完全性について試験した（データは不掲載）。楕円体をさらに２日間培養し（図８Ｄおよび図８Ｅに示すとおり）、次いで、例えばＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）３Ｄなどの染色によって、腫瘍細胞溶解について分析した（図８Ｆに示すとおり。処理後の楕円体生理機能（図８Ｇに示すとおり）も試験した。図９は、化合物シスプラチンおよびピペロングミンとともに直接培養した４８時間後のＬＮ２２９楕円体の用量依存性細胞毒性を示すグラフである。濃度あたりＮ＝１２ウェルで２回の独立した研究を行う。図１１は血液脳関門サロゲートの有無でのシスプラチンまたはピペロングミンのＬＮ２２９  細胞毒性を示すグラフである。ＢＢＢの有無でのＴｒａｎｓｗｅｌｌによる２時間の薬物曝露後４８時間のＬＮ２２９楕円体の生存百分率を示す。薬物なしの対照を１００％生存率に標準化することによって生存率を評価した。データは３つの独立した研究の平均として示し、ボンフェローニポストテストを伴う一元配置分散分析でＮ＝３０。＊＊＊＝ｐ＜０．０００１。図１２Ａおよび図１２Ｂは、ＢＢＢ有（図１２Ｂ）およびＢＢＢ無（図１２Ａ）で見られるヒットを示すＴｏｃｒｉｓライブラリからの代表的なスクリーンを示すグラフである。上の点線は平均緩衝液対照であり、下の点線は緩衝液応答より低い３シグマを表す。図１３Ａおよび１３Ｂは、ＢＢＢの有無で見られるヒットのコンピレーションを示す図１２Ａおよび図１２Ｂのスクリーンの概要のグラフである。ヒットは、それらが３つの独立したスクリーンのうち少なくとも２つにおいて、緩衝液応答よりも低い３シグマであるか否かを考慮した。横縞のハッチングを施したボックス（緩衝液単独以外に）はＢＢＢなしでのみ見られるヒットである。斜めのハッチングを施したボックスは、ＢＢＢの存在下および非存在下で見られるヒットであった。したがって、本明細書中で提示するデータは、Ｃｏｒｎｉｎｇ楕円体マイクロプレートとＨＴＳ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ９６−ウェル透過性支持体との組み合わせを含み得る本開示の方法によって、結果として得られる神経膠腫球（または他の３Ｄ腫瘍楕円体）細胞毒性も調査しながら、ＢＢＢを通過することができる化��物と通過できない化合物とを区別することができる新規３Ｄモデルが可能になることを示す。
【００９２】
前記明細書中で言及される全ての刊行物および特許は参照により本明細書中に組み込まれる。様々な変更および変動は開示の主旨および範囲から逸脱することなく本発明技術に対してなすことができることは当業者には明らかであろう。開示を特定の好ましい実施形態に関連して記載してきたが、請求する開示はそのような特定の実施形態に必要以上に限定されるべきでないと理解すべきである。発明技術の主旨および要旨を組み入れた開示された実施形態の変更、組み合わせ、副結合および変動を当業者は思いつくことができるので、発明技術は添付の特許請求の範囲およびそれらの均等物の範囲内の全てのものを含むと解釈すべきである。
【００９３】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【００９４】
実施形態１
治療薬の能動的移動および細胞毒性を検出するためのアッセイ法であって：
ａ）腫瘍細胞を３Ｄ楕円体コンフォメーションに成長させるような構造のチャンバーを含む細胞培養製品中で腫瘍細胞を培養して楕円体を形成し、
ｂ）多孔質膜を含むインサートを前記細胞培養製品に入れ、治療薬を当該インサート中に導入し、
ｃ）前記インサートから前記細胞培養製品チャンバーへの前記治療薬の能動的移動を検出し、そして
ｄ）腫瘍細胞応答を検出すること
を含む、アッセイ法。
【００９５】
実施形態２
前記チャンバーが：
側壁、
上部開口部、および
少なくとも１つの陥凹面を含む液体不透過性底部であって、当該底部の少なくとも一部が当該少なくとも１つの陥凹面中または上に低接着性または非接着性材料を含む、液体不透過性底部
を含む、実施形態１に記載のアッセイ法。
【００９６】
実施形態３
少なくとも１つの陥凹面を含む前記液体不透過性底部がガス透過性である、実施形態１または２に記載のアッセイ法。
【００９７】
実施形態４
前記側壁が不透明である、実施形態２に記載のアッセイ法。
【００９８】
実施形態５
前記底部の少なくとも一部が透明である、実施形態２から４のいずれか１つに記載のアッセイ法。
【００９９】
実施形態６
前記細胞培養製品が、１から約２０００の前記チャンバーを含み、各チャンバーは互いに物理的に離間されている、実施形態２から５のいずれか１つに記載のアッセイ法。
【０１００】
実施形態７
前記少なくとも１つの陥凹面が同じチャンバー内で複数の陥凹面を含む、実施形態２から６のいずれか１つに記載のアッセイ法。
【０１０１】
実施形態８
前記少なくとも１つの陥凹面が半球状面、前記側壁から前記底面へと３０から約６０度のテーパーを有する円錐面、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態２から７のいずれか１つに記載のアッセイ法。
【０１０２】
実施形態９
前記側壁面が、垂直円筒、前記チャンバー頂部から底面へと直径が減少する垂直円錐の一部、前記少なくとも１つの陥凹底面に対して、円錐遷移部を有する垂直な方形シャフト、またはそれらの組み合わせを含む、実施形態２に記載のアッセイ法。
【０１０３】
実施形態１０
前記製品が吸引のためにピペットチップを受容するためのチャンバー付属物をさらに含み、当該チャンバー付属物は前記チャンバーに隣接し、前記チャンバーと流体連通した表面を含み、当該チャンバー付属物は前記底面より上方に離間した第二底部を有し、当該第二底部はピペットから分配された流体を当該底面からそれさせる、実施形態２に記載のアッセイ法。
【０１０４】
実施形態１１
前記インサートがインサートプレートを含む、実施形態１から１０のいずれか１つに記載のアッセイ法。
【０１０５】
実施形態１２
前記多孔質膜の少なくとも一部が血液脳関門をシミュレートするように構成される、実施形態１から１１のいずれか１つに記載のアッセイ法。
【０１０６】
実施形態１３
前記多孔質膜の少なくとも一部が微小血管内皮細胞の本質的にコンフルエントな単層を含む、実施形態１２に記載のアッセイ法。
【０１０７】
実施形態１４
前記治療薬の能動的移動および腫瘍細胞応答の両方がフローサイトメトリーによって検出される、実施形態１から１３のいずれか１つに記載のアッセイ法。
【０１０８】
実施形態１５
腫瘍細胞応答の検出が、前記治療薬の前記腫瘍細胞楕円体への浸透を検出することを含む、実施形態１から１４のいずれか１つに記載のアッセイ法。
【０１０９】
実施形態１６
腫瘍細胞応答の検出が、腫瘍細胞溶解を測定することを含む、実施形態１から１５のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【０１１０】
実施形態１７
前記治療薬が薬物または細胞治療薬を含む、実施形態１から１６のいずれか１つに記載のアッセイ法。
【０１１１】
実施形態１８
前記治療薬が白血球またはリンパ球を含む、実施形態１７に記載のアッセイ法。
【０１１２】
実施形態１９
前記治療薬が薬物である、実施形態１０から１８のいずれか一項に記載のアッセイ法。
【符号の説明】
【０１１３】
１０  マルチウェルプレート
１１  楕円プレート
２５  ３Ｄ腫瘍細胞楕円体
３０、３１０  治療薬
１０１  ウェル
１０５  中心軸
１０６  底面
１１０  空間
１１２  マイクロキャビティ
１１３  側壁
１１５  マイクロウェル
１１６  底面、最下点
１１８、４１８  上部開口部
１１９、４１９  底部
１２０  遷移ゾーン
１２１、４２１  側壁
１３０  フレーム、保護層
３００、３０６、５２５  細胞
３０２  多孔質膜
３０４、４００  インサート
３１２、キャビティ、インサートチェンバー
３１５  アッセイチャンバー
４０１  インサートプレート
４２０  キャビティ
５００  培地
ｗ  幅
ｄ  深さ
【図１Ａ】
2020510414.tif 000003
【図１Ｂ】
2020510414.tif 000004
【図１Ｃ】
2020510414.tif 000005
【図２】
2020510414.tif 000006
【図３Ａ】
2020510414.tif 000007
【図３Ｂ】
2020510414.tif 000008
【図４Ａ】
2020510414.tif 000009
【図４Ｂ】
2020510414.tif 000010
【図４Ｃ】
2020510414.tif 000011
【図５Ａ−５Ｃ】
2020510414.tif 000012
【図６】
2020510414.tif 000013
【図７】
2020510414.tif 000014
【図８Ａ】
2020510414.tif 000015
【図８Ｂ】
2020510414.tif 000016
【図８Ｃ−８Ｇ】
2020510414.tif 000017
【図９】
2020510414.tif 000018
【図１０Ａ】
2020510414.tif 000019
【図１０Ｂ】
2020510414.tif 000020
【図１１】
2020510414.tif 000021
【図１２Ａ】
2020510414.tif 000022
【図１２Ｂ】
2020510414.tif 000023
【図１３Ａ】
2020510414.tif 000024
【図１３Ｂ】
2020510414.tif 000025
【国際調査報告】
2020510414.tif 000026
2020510414.tif 000027
2020510414.tif 000028