(57)【要約】  本発明は、ヒトの身体を療法により治療するための方法に使用するための、より詳細には、細胞浄化機構の少なくとも１種の保護及び／又は活性化に使用するための、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）種植物の抽出物を含む組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの身体を療法により治療する方法に使用するための、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）種植物の抽出物を含む組成物。
【請求項２】
ヒトの身体を療法により治療する方法において、細胞の浄化機構の少なくとも１種の保護及び／又は活性化に使用するための、ヘディキウム属（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ）植物の抽出物を含む組成物。
【請求項３】
前記浄化機構が、ミトコンドリアの保護及び／又は活性化、リソソームの保護及び／又は活性化、細胞のＩＬ−８放出の阻害、細胞のβ−エンドルフィンの産生、不規則なメラニン放出の阻害、並びにクローディン修復による細胞膜透過機構の保護及び／又は活性化から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）種植物の抽出物は、前記植物の花、種子、果実、葉、茎、根、及び／又は根茎に由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）種植物の抽出物は、前記植物の根及び／又は根茎に由来する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
請求項５に記載のヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物を調製するための方法であって、次に示すステップ：
−  抽出すべきヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の特定量の根片及び／又は根茎片を準備することから構成される、ステップａ）と；
−  ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の前記根片及び／又は根茎片を、好適な溶媒又は溶媒混合物で抽出し、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の根片及び／又は根茎片の抽出混合物を得る、ステップｂ）と；
−  ステップｂ）で得られた前記ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の根片及び／又は根茎片の抽出混合物を濾過することにより、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の根片及び／又は根茎片の抽出混合物の濾液を得る、ステップｃ）と；
−  ステップｃ）で得られたヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の根片及び／又は根茎片の抽出混合物の前記濾液を沈降させることにより、固体残渣を上清から分離する、ステップｄ）と；
−  ステップｄ）で得られた前記上清を濾過することにより、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の根及び／又は根茎の抽出物を透明な溶液として得る、ステップｅ）と；
−  ステップｅ）で得られた前記透明な溶液を、好適な溶媒を用いて所望の濃度に調整することにより、所望のヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）の根及び／又は根茎の抽出物を得る、ステップｆ）と；
を含む、方法。
【請求項７】
ステップｆ）に使用される前記好適な溶媒は、水及びグリセロールの混合物であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
水／グリセロール（体積／体積）比は３０／７０である、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、有害環境の作用により影響を受けた皮膚を治療するための用途における、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）種植物の抽出物の使用に関する。更に本発明は、前記抽出物を調製するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヘディキウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ）は、ショウガ科（Ｚｉｎｇｉｂｅｒａｃｅａｅ）の顕花植物が属する属である。東南アジア（タイ、マレーシア、インドネシア、フィリピン等）、中国南部、ヒマラヤ、マダガスカルを原産とする約７０〜８０の種が知られている。一部の種は他の地域（南アフリカ、南アメリカ、中央アメリカ、西インド諸島、及び太平洋、インド洋、大西洋の多くの島々）に広く帰化している。ヘディキウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ）という属名は古代ギリシャ語の「甘い」を意味するｈｅｄｙｓ及び「雪」を意味するｃｈｉｏｓの２つの語に由来している。これはヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）の基準種が香りの良い白い花を持つことを表している。ガーランドフラワー、ジンジャーリリー、及びカヒリジンジャーという一般名がある。
【０００３】
ヘディキウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ）属を構成する種は根茎のある多年生植物であり、一般に１２０ｃｍ〜１８０ｃｍの高さまで成長する。一部の種は、変わった葉と、白、黄色、及びオレンジ色の香りのよい穂状の花とを持つという理由で栽培されている。庭園用として多くの栽培品種が開発されている。選択された種には、例えば、ヘディキウム・アウランティアクム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ａｕｒａｎｔｉａｃｕｍ）、ヘディキウム・コッキネウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｍ）、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）、ヘディキウム・デンシフロラム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｄｅｎｓｉｆｌｏｒｕｍ）、ヘディキウム・エリプティクム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｅｌｌｉｐｔｉｃｕｍ）（シェービングブラシジンジャー（ｓｈａｖｉｎｇ  ｂｒｕｓｈ  ｇｉｎｇｅｒ）、ヘディキウム・フラベスセンス（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ヘディキウム・ガルドゥネリアヌム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｇａｒｄｎｅｒｉａｎｕｍ）（ジンジャーリリー）、ヘディキウム・サムイエンス（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｓａｍｕｉｅｎｓｅ）、及びヒンディー語でカプール・カチャリ（ｋａｐｕｒ  ｋａｃｈａｒｉ）と呼ばれるヘディキウム・スピカタム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｓｐｉｃａｔｕｍ）が含まれる。
【０００４】
それぞれの種は、生物学的分類においてはそれぞれ互いに異なっており、その起源も異なるものもある。
【０００５】
ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）種（「ジンジャーバタフライ（ｇｉｎｇｅｒ  ｂｕｔｔｅｒｆｌｙ）」としても知られる）は、１７８３年にＪｏｈａｎｎ  Ｇｅｒｈａｒｄ  Ｋｏｅｎｉｇによって、Ａｎｄｒｅａ  Ｊｏｈａｎ  Ｒｅｔｚｉｕｓの著書である“Ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｅｓ  Ｂｏｔａｎｉｃａｅ”ｔ．３  ｐｐ．７３−７４に初めて記載された。
【０００６】
ヘディキウム・スピカタム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｓｐｉｃａｔｕｍ）種（「ワイルドヘッデッドジンジャー（ｗｉｌｄ−ｈｅａｄｅｄ  ｇｉｎｇｅｒ）」としても知られる）は、Ｊａｍｅｓ  Ｅｄｗａｒｄ  Ｓｍｉｔｈ（１８１１）によって最初に記録され、次いで１８１９年にＦｒａｎｃｉｓ  Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｈａｍｉｌｔｏｎにより、Ａｂｒａｈａｍ  ＲＥＥＳ編纂による“ｔｈｅ  Ｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ；ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  Ａｒｔｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ”ｔ．１７  ｐ．５２１−５２２に記載された。
【０００７】
伝統薬としての使用するためのヘディキウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ）属植物が、例えば、“Ｅｄｉｂｌｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｎｄ  ｎｏｎ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｐｌａｎｔｓ”，Ｖｏｌ．８  Ｆｌｏｗｅｒｓ，ｐｐ．８５３−８６０又は“Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｐｌａｎｔｓ  ｕｓｅｄ  ｂｙ  ｗｏｍｅｎ  ｆｒｏｍ  Ａｇｎａｌａｚａｈａ  ｌｉｔｔｏｒａｌ  ｆｏｒｅｓｔ（Ｓｏｕｔｈ−ｅａｓｔｅｒｎ  Ｍａｄａｇａｓｃａｒ）”，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｔｈｎｏ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｔｈｎｏ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１３、並びにＸ．Ｙａｎら著、“Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ，Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｏｕｒｃｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，１９９９又はＳｈａｒｍａら著、“Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，１４：５７８，１９７５に広く記載されている。
【０００８】
国際公開第２００２／０５６８５９Ａ２号パンフレットには、ヘディキウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ）属植物の抽出物を含む組成物及びその化粧料としての使用に関して開示されている。しかしながら、前記国際出願は、特にヘディキウム・スピカタム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｓｐｉｃａｔｕｍ）種の使用について記載している。一態様においては、その、皮膚のハリ、色味、又はキメ（ｔｅｘｔｕｒｅ）を整える作用について記載されており、他の態様においては、ＵＶにより誘発されるメタロプロテアーゼ−１（ＭＭＰ−１）分泌の阻害、生体内の細胞抗酸化防御系の一部となるグルタチオンを保護することを目的とした、喫煙により誘起されるチオール喪失の防止、及び有害な活性酸素種（ＲＯＳ）を生成させる前駆体である一酸化窒素の産生阻害、という作用機序に基づく、環境により損傷した皮膚の治療におけるその使用が記載されている。
【０００９】
ブラジル国特許第ＢＲ  ＰＩ０９０５５８６−０Ａ２号明細書には、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の花から得られる抽出物を、皮膚に潤いを与え、活性を取り戻し（ｒｅｖｉｔａｌｉｚｉｎｇ）、且つ再生するための化粧料として使用することが記載されている。更に、花に含まれる高濃度のフラボノイドに由来する抗老化作用に加えて、抗炎症作用及び抗過酸化物作用、並びに微小血管及び毛細血管の強化、並びに浮腫及び光に惹起される紅斑を抑制する性質が述べられている。
【００１０】
国際公開第２００６／０５３４１５Ａ１号パンフレットには、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−９、ＨＬＥ（ヒト白血球エラスターゼ）を阻害する機序を利用する用途を含む、数種の植物抽出物の化粧用途への適合性が述べられている。しかしながら、当該明細書において、ヘディキウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ）属植物の植物抽出物は、可能性のある植物の広範な一覧に非常に一般的に述べられているに過ぎず、ヘディキウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ）属植物のいずれかの種に関する特定の効果が記載されたり示されたりしている訳ではない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
第１の実施形態によれば、本発明は、ヒトの身体を療法により治療する方法において、特に皮膚を環境による損傷から保護及び／又は治療することなどに使用するための、より詳細には、ヒトの身体を療法により治療する方法において、細胞浄化機構の少なくとも１種の保護及び／又は活性化に使用するための、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）種の植物抽出物を含む組成物に関する。
【００１２】
環境による損傷とは、任意の有害環境による作用、例えば、排気、産業汚染物質、農業汚染物質、及びタバコの煙に加えて、例えば、太陽又はＵＶランプ及びソーラーシミュレータを含む非天然光源からのＵＶ放射等の有害な放射、及びオゾンを含む、毒素及び／又は汚染物質の有害な作用等を意味する。
【００１３】
本明細書において用いられる、「環境による損傷からの保護」とは、有害環境の作用に起因する症状又は有害作用を予防及び／又は低減することを意味する。
【００１４】
本明細書において用いられる、「環境による損傷の治療」とは、有害環境の作用に起因する症状又は損傷を低減、回復、改善、及び／又は解消することを意味する。
【００１５】
本明細書において用いられる細胞浄化機構には、細胞代謝（以後、「細胞代謝機構」とも称する）の細胞システム及び細胞内バリア機構の細胞システムが含まれる。これらは無傷の生存（ｖｉａｂｌｅ  ａｎｄ  ｉｎｔａｃｔ）細胞を供給するために不可欠であり、活力のある生存（ｖｉａｂｌｅ  ａｎｄ  ｖｉｔａｌ）細胞を提供するため、及び有害環境の作用に対抗する細胞の防御機構を機能させるための更なる重要な要素を構成する。その中でも、細胞代謝機構の細胞システム及び細胞内バリア機構の細胞システムは、特に、次に示す機構を含む：
【００１６】
−  細胞に供給されるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の大部分を産生するミトコンドリアは、化学的エネルギーの供給源として使用されており、したがって、細胞のいわゆる電力供給源である。細胞エネルギーの供給以外にも、ミトコンドリアは、他の非常に重要な様々な細胞プロセス、例えば、シグナル伝達、熱発生、細胞分化、細胞分裂周期及び細胞増殖の制御、細胞死（アポトーシス）、酸化的代謝、糖、脂質、カルシウム、鉄（ヘム合成）の恒常性維持、その他多くの細胞プロセスに関与している。
【００１７】
−  リソソームは、生存期間を超えているか又はそれ以外の形でもはや利用することができない細胞物質を再利用することを可能にする細胞質の細胞小器官である。これらの主要な機能は、あらゆる真核細胞内で内因性又は外因性物質を消化（いわゆるオートファジー又はヘテロファジー）することにある。リソソームは、細胞の老廃物、脂肪、炭水化物、タンパク質、及び他の巨大分子を単純な化合物に分解し、次いでこれを、新たな細胞構築材料として細胞質に送り返す。実際、その脂質膜は多くの酵素（約４０種の異なる加水分解酵素）、プロトンポンプ、及び輸送タンパク質を含む。ｐＨは、酸性ヒドロラーゼの活性を最適化するように酸性に調整される（したがって、リソソームは細胞の胃のようなものである）。オートファジーは、細胞の貯蔵エネルギーを移動し、損傷を受けた細胞小器官を防御及び破壊し、深刻な影響を回避する重要な機構である。このプロセスによりタンパク質及び機能していない細胞小器官を排除及び交換することが可能になり、それによって恒常性が確保される。これは、寿命制御及び癌や糖尿病等の病態の発生に関与している。
【００１８】
−  特に細胞膜透過機構（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ）を含む細胞内バリア機構は、細胞の細胞浄化機構において重要な役割を果たしている。その理由は、細胞膜透過機構は、ミトコンドリアの代謝により生じたエネルギー及びリソソームからの代謝老廃物の輸送を制御及び実行し、したがって、無傷の生存細胞を供給するために不可欠である効果的且つ機能的な細胞代謝において重要な役割を果たしていることにある。強力且つ健全な細胞膜透過機構は、いわゆる「タイトジャンクション」、即ち、細胞間に構築された結合部（細胞−細胞結合）を含む。これらの結合部は、クローディン、オクルディン、及び接着分子（ＺＯ−１、ＺＯ−２、ＺＯ−３等）等の数種の膜貫通タンパク質ファミリーから構成されている。タイトジャンクションは、表皮層等の皮膚組織に存在する。クローディン１及び４は表皮の上層（角化細胞が分化する場所）に見られるタンパク質である。免疫染色試験により、これらのマーカーの存在が示され、また、これらのタンパク質が、上皮細胞間の細胞間隙における分子の流れを制御することと、小分子の侵入を阻止することと、表皮上層の完全性（強化された角質細胞間の接着）を維持することとによって、皮膚の傍細胞バリアに参加することが示された。更にクローディンは、角質層の恒常性を維持すると共にカルシウム勾配を調節する役割を果たす。タイトジャンクションが損傷を受けると、カルシウム流束が増加し、勾配が乱れた結果として分化が変化し、最終的に皮膚バリアの防御が損なわれることにより、皮膚バリアが損なわれる。
【００１９】
−  細胞代謝機構の他の重要な面は、マクロファージ並びに上皮細胞及び血管内皮細胞等の他の種類の細胞により産生されるケモカインであるインターロイキン８（ＩＬ−８）の産生に関するものである。血管内皮細胞は、その格納用小胞であるバイベル・パラーデ小体にＩＬ−８を貯蔵する。ＩＬ−８は、まずアミノ酸９９個の鎖長を有する前駆体ペプチドとして産生された後、活性を持つ幾つかのＩＬ−８アイソフォームへと切断される。ＩＬ−８が分泌されると、自然免疫系の応答における免疫反応の重要なメディエーターとなる。好中球走化性因子としても知られるＩＬ−８は２つの主要な機能を有する。これは標的細胞（主に好中球であるが、他の顆粒球も）の走化性を誘導し、これらを感染部位に向かって遊走させる。ＩＬ−８は、到着後のファゴサイトーシスも誘導する。ＩＬ−８は血管新生の強力なプロモーターとしても知られている。標的細胞において、ＩＬ−８は、遊走及びファゴサイトーシスに必要な、細胞内Ｃａ２＋の増加、エキソサイトーシス（例えば、ヒスタミン放出）、及び呼吸バースト等の一連の生理的反応を誘導する。ＩＬ−８は、ｔｏｌｌ様受容体を有する任意の細胞から分泌されることができ、自然免疫応答に関与している。通常、最初に抗原を見つけるのがマクロファージである、つまり、他の細胞を動員するため最初にＩＬ−８を放出する細胞である。ＩＬ−８の単量体及びホモ二量体はどちらもケモカイン受容体ＣＸＣＲ１とＣＸＣＲ２の強力な誘導因子であると報告されている。
【００２０】
−  細胞代謝機構の他の重要な面は、β−エンドルフィンの産生に関するものである。β−エンドルフィンは、プロオピオメラノコルチン（ｐｒｏｐｉｏｍｅｌａｎｏｃｏｒｔｉｎ）（ＰＯＭＣ）から作られる内因性オピオイドである神経メディエーターであり、皮膚生理学及び恒常性維持、神経栄養作用、痛み、免疫による防御、内分泌、感情、及びストレス応答等の様々な生物現象に関与している。皮膚内では、β−エンドルフィンは角化細胞から分泌され、その受容体は主要な皮膚細胞（角化細胞、線維芽細胞、及びメラニン細胞）に存在している。それと共に、β−エンドルフィンは、角化細胞遊走刺激、創傷治癒及び細胞分化への関与、表皮及び毛包のメラニン形成の誘発、並びに発毛制御を含む様々な皮膚代謝及び皮膚防御プロセスにおいて重要な役割を果たすと言われている。更に、β−エンドルフィンが増加すると、毛包メラニン細胞の樹状突起の数が調節される。これらのことから、細胞代謝機構が機能するためには、β−エンドルフィン産生系が機能を果たすことが更に必要であり、細胞の細胞浄化機構において更なる重要な役割を果たし、したがって、活力のある生存細胞を提供すると共に、有害環境の作用に対し細胞防御機構を機能させるための更なる不可欠な面となることは明らかである。
【００２１】
−  加えて、代謝機構の上に述べた面は、細胞のメラニン形成、即ち、細胞内でのメラニン細胞によるメラニン産生に関係している。メラニンは、皮膚、眼、及び毛髪に見られる色素であり、したがって、皮膚の色の原因である。メラニン細胞は表皮の基底層にある。メラニン細胞は角化細胞に結合している樹状細胞であり、その内部で、メラニンを含む特殊な細胞小器官であるメラノソームを輸送する。メラニン形成は２つの段階：メラニン合成と、それに続く角化細胞への輸送と、を含む。メラニンは、ゴルジ体及び粗面小胞体に由来する細胞小器官であるメラニン細胞のメラノソーム内で合成される。メラニンの合成は、アミノ酸であるチロシンにチロシナーゼ酵素が働きかけることにより起こる。チロシンはジヒドロフェニルアラニン（ＤＯＰＡ）と反応し、次いで酸化されることにより、ドーパキノンとなる。更に幾つかの化学反応ステップを経た後、最終的にメラニンが形成される。メラニン細胞内では、メラニン色素がメラノソームの「袋」に貯蔵され、その後、表面に輸送される。メラニン細胞は樹状に伸び、数個の角化細胞と接触することが可能になる。メラノソームは、それらを産生した細胞体から樹状突起の先端へと輸送されてそこに蓄積され、近接する角化細胞へと移動し、メラニンはその中で分散する。通常、メラニン形成により、持続性の色素沈着が起こり、これは、既に存在するメラニンの酸化に由来する色素沈着とは異なる。メラニン形成には基底レベル及び活性化レベルの両方がある。一般に、皮膚の色が明るい人はメラニン形成の基底レベルが低い。ＵＶ−Ｂ放射に曝されるとメラニン形成が増加する。メラニン形成の目的は皮膚の下層にある皮下組織を、それを損傷（ＤＮＡの光による損傷）させ得るＵＶ−Ｂ光から保護することにある。メラニンは暗色をしているため、ＵＶ−Ｂ光の大部分を吸収し、皮膚層への通過を阻止することができる。培養したメラニン細胞によるメラニン形成又はメラニンの産生は、多くの刺激により変化させることができるが、それを機能させる方法は完全には理解されていない。有毒な汚染物質及びＵＶ放射等の有害環境による作用もメラニン形成を誘発する可能性があり、続いて色素沈着が起こる。保護機能の観点からは、メラニン形成が機能することによって、皮膚に望ましい定常的且つ均一な色素沈着がもたらされる。生活細胞のメラニン形成は、有害環境による作用によって損なわれ、その結果として、望ましくない斑点状の色素沈着に加えて、色素を含むメラニン細胞から発生する、皮膚癌の中で最も危険性の高い型である黒色腫（悪性黒色腫としても知られる）も発生する可能性がある。黒色腫の主な原因は、皮膚色素の少ないメラニン細胞が紫外光（ＵＶ）に曝されることにある。これらのことから、細胞代謝機構を機能させるには、メラニン形成機構が活発に機能することが更に必要であり、その結果として、皮膚を保護する定常的且つ均一な色素沈着がもたらされ、望ましくない斑点様の色素沈着及び、特に黒色腫の発生が回避されることが明らかである。したがって、メラニン形成が機能することは、細胞の細胞浄化機構において更なる重要な役割を果たし、つまり、活力のある生存細胞を提供すると共に、有害環境による作用に対し細���防御機構を機能させるための更なる不可欠な面である。
【００２２】
上の説明から、特に、細胞を活発に機能させるためには、有害環境の作用に対抗する、活発に機能する細胞防御機構を得るための、強力な細胞浄化機構が必要なことが明らかであり、このような細胞浄化機構は、特に、重要な要素である、ミトコンドリア、リソソーム、ＩＬ−８産生、β−エンドルフィン産生、メラニン形成、及び強力且つ完全な膜透過機構の機能が最適に相互作用し、細胞代謝機構が活発に機能することが基礎となっており、これらが本発明により一緒になって細胞の細胞浄化機構を構成する。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
したがって本発明は、上に定義した組成物に関するものであり、前記浄化系は、ミトコンドリアの保護及び／又は活性化、リソソームの保護及び／又は活性化、細胞からのＩＬ−８放出の阻害、細胞のβ−エンドルフィン産生、不規則なメラニン放出の抑制、並びにクローディン修復による細胞膜透過系の保護及び／又は活性化から選択される。
【００２４】
本発明に関連する「抽出物」という語は、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）種植物の植物体の同一又は異なる部分から抽出された作用物質（ａｇｅｎｔ）を意味する。本発明による抽出物は、植物の被抽出部分から単離された化合物のブレンド物である。
【００２５】
特定の実施形態によれば、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）種の前記植物抽出物は、植物の花、種子、果実、葉、茎、根、及び／又は根茎に由来し、より詳細には、植物の根及び／又は根茎に由来する。
【００２６】
本発明の組成物は、少なくとも１種の溶媒及び／又は少なくとも１種の局所用として許容される補助物質を更に含むことができる。
【００２７】
好適な溶媒としては、例えば、低級Ｃ１−Ｃ８アルコール、Ｃ１−Ｃ８アルキルポリオール、Ｃ１−Ｃ８アルキルケトン、Ｃ１−Ｃ８アルキルエーテル、酢酸、Ｃ１−Ｃ８アルキルエステル、クロロホルム、及び／又は無機溶媒、例えば、水、無機酸、例えば、塩酸、及び無機塩基、例えば、水酸化ナトリウム、並びにこれらの混合物が挙げられる。
【００２８】
好ましい溶媒としては、エタノール、１−プロパノール、イソプロピルアルコール、酢酸エチル、酢酸ブチル、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等、及びこれらの混合物が挙げられる。エタノール、水、及びグリセロール、並びにこれらの混合物が最も好ましい。
【００２９】
ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）種の植物抽出物は、本明細書において上に定義したように、０．０５％〜５．０％（重量／体積）、より好ましくは０．１％〜３．０％（重量／体積）、一層好ましくは０．２〜２．０％（重量／体積）の範囲の濃度を有する。
【００３０】
化粧的に許容される補助物質としては：
−  ｐＨ調整剤、例えば、緩衝物質；
−  当業者に知られている、化粧的に許容可能なあらゆる無機及び有機酸を含む無機及び有機酸又は塩基；
−  脂肪質物質、例えば、鉱物油、例えば、パラフィン油又はワセリン油、シリコーン油、並びに植物性油、例えば、ヤシ油、アーモンド油、杏子油、トウモロコシ油、ホホバ油、オリーブ油、アボカド油、ごま油、パーム油、ユーカリ油、ローズマリー油、ラベンダー油、ダイオウショウ油、タイム油、ハッカ油、ショウズク油、オレンジ花油、大豆油、糠油（ｂｒａｎ  ｏｉｌ）、米油（ｒｉｃｅ  ｏｉｌ）、菜種油、ヒマシ油、小麦胚芽油及びそこから単離されたビタミンＥ、月見草油、動物性油脂、例えば、牛脂、羊毛脂、澄ましバター、並びに中性油（Ｍｉｇｌｙｃｏｌ  ８１２）、スクアラン、脂肪酸エステル、脂肪族アルコールのエステル、例えば、トリグリセリド、並びに独国医薬品コーデックス（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃｏｄｅｘ  ｆｏｒ  ｍｅｄｉｃａｍｅｎｔｓ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ  Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌ  Ｃｏｄｅｘ））に準拠する重要な基本組成物である、グリセロールモノステアレート（ｇｌｙｃｅｒｏｌｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔ）、セチルアルコール、中鎖トリグリセリド、白色ワセリン、マクロゴール−１０００−グリセロールモノステアレート（ｇｌｙｃｅｒｏｌｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔ）、プロピレングリコール、及び精製水を含む、いわゆるクリーム基剤（ｂａｓｉｃ  ｃｒｅａｍ）（「Ｂａｓｉｓｃｒｅｍｅ」）ＤＡＣ、
−  植物性レシチン（例えば、大豆レシチン）、植物から単離されたスフィンゴ脂質／セラミド、
−  融点が皮膚温度に相当するロウ状物質、例えば、ミツロウ、カルナウバロウ、及びキャンデリラ、ミクロクリスタリンワックス、ポリエチレン又はシリコーンワックス、特に、局所適用に適したあらゆる油及びワックス、例えば、ＣＴＦＡ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，１ｓｔ  ｅｄ．，１９８８，Ｔｈｅ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ，Ｔｏｉｌｅｔｒｙ  ａｎｄ  Ｆｒａｇｒａｎｃｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎに述べられているもの等；
−  表面活性剤、例えば、分散剤、湿潤剤、乳化剤等；
−  フィラー；
−  安定剤；
−  共溶媒；
−  染料及び顔料；
−  防腐剤；
−  保湿剤；
−  酸化防止剤；
−  ＵＶ防御剤；
−  軟化剤；
−  潤滑剤又は滑り性向上剤（ｓｌｉｐ  ａｇｅｎｔ）；
−  スキンコンディショニング剤；
が挙げられる。
【００３１】
好ましい補助剤は、酸化防止剤、保湿剤、軟化剤、スキンコンディショニング剤、脂肪質物質、例えば、特に化粧用油脂、及びＵＶ防御剤の群から選択される。
【００３２】
一般に、上述の物質の、本発明に関連する補助物質のカテゴリーへの分類は、これらの補助物質が更なる特定の活性も示す可能性を排除するものではなく、このことは特に、油並びに保湿及び脂質補給作用を有する他の補助剤にある程度適用される。
【００３３】
本発明の組成物は、少なくとも１種の更なる化粧活性剤を更に含むことができる。本発明に関連する、化粧剤又は化粧活性組成物を用いて調製された剤とは、基本的に、Ｇｅｒｍａｎ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｆｅｅｄ  Ｃｏｄｅ［独語：ＬＦＧＢ］に説明されている意味を持つ剤、即ち、疾患、苦痛、身体の損傷、又は病理学的な徴候を軽減又は解消することを主に意図したもの以外では、スキンケア、清浄化、手入れ、又は外見若しくは体臭の修正、又は芳香による印象付けを目的として、ヒトに外用することを意図した物質又は物質の配合物である。化粧活性剤の例としては、一般に：抗ざ瘡剤、抗菌剤、制汗剤、収斂剤、防臭剤、脱毛剤、スキンコンディショニング剤、皮膚を滑らかにする剤、皮膚の水和状態を向上する剤、例えば、グリセロール又は尿素等、サンスクリーン剤、角質溶解剤、フリーラジカル捕捉剤、抗脂漏剤、フケ防止剤、殺菌活性化合物、皮膚の老化徴候を治療するための活性化合物、並びに／又は皮膚の分化及び／若しくは増殖及び／若しくは皮膚の色素沈着を調節する剤、ビタミン類、例えば、ビタミンＣ（アスコルビン酸）及びその誘導体、例えば、グリコシド、例えば、アスコルビルグルコシド等、又はアスコルビン酸のエステル、例えば、リン酸アスコルビルナトリウム若しくはマグネシウム、又はパルミチン酸及びステアリン酸アスコルビル、リン酸Ｌ−アスコルビン酸エステル、アルカリ金属塩、例えば、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルのナトリウム及びカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えば、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルのマグネシウム及びカルシウム塩；三価金属塩、例えば、Ｌ−アスコルビン酸リン酸エステルのアルミニウム塩；Ｌ−アスコルビン酸硫酸エステルのアルカリ金属塩、例えば、Ｌ−アスコルビン酸硫酸エステルのナトリウム及びカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えば、Ｌ−アスコルビン酸硫酸エステルのマグネシウム及びカルシウム塩；三価金属塩、例えば、Ｌ−アスコルビン酸硫酸エステルのアルミニウム塩；アルカリ金属塩、例えば、Ｌ−アスコルビン酸エステルのナトリウム及びカリウム塩；アルカリ土類金属塩、例えば、Ｌ−アスコルビン酸エステルのマグネシウム及びカルシウム塩；並びに三価金属塩、例えば、Ｌ−アスコルビン酸エステルのアルミニウム塩、レチノイド（レチノール、レチナール、レチック酸（ｒｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）、アントラリン（ジオキシアントラノール）、アントラノイド（ａｎｔｈｒａｎｏｉｄ）、過酸化物（特に過酸化ベンゾイル）、ミノキシジル、リチウム塩、代謝拮抗剤、ビタミンＤ及びその誘導体；カテコール、フラボノイド、セラミド、多価不飽和脂肪酸、必須脂肪酸（例えば、ガンマ−リノレン酸）、酵素、補酵素、酵素阻害剤、水和剤、皮膚鎮静剤、洗剤若しくは起泡剤、及び無機若しくは合成艶消しフィラー、又は装飾用物質、例えば、ファンデーション用の顔料若しくは染料及び着色粒子、メーキャップ用配合物、並びに目、唇、顔等の化粧装飾用及び着色モデル製作（ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）用の他の剤、並びに研磨剤が挙げられる。更に、植物由来の活性化合物抽出物又はそれから得られる抽出物若しくは個々の物質（本発明のヘディキウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ）属植物抽出物以外）も��げることができる。一般に、植物性の活性化合物抽出物は、固体植物抽出物、液体植物抽出物、親水性植物抽出物、親油性植物抽出物、個々の植物構成成分、及びこれらの混合物、例えば、フラボノイド及びそのアグリコン：ルチン、ケルセチン、ジオスミン、ヒペロシド、（ネオ）ヘスペリジン、ヘスペリチン、イチョウ（例えば、イチョウフラボン配糖体）、クラテグス抽出物（例えば、プロシアニジン低重合体）、ソバ（例えば、ルチン）、エンジュ（例えば、ルチン）、カバノキの葉（例えば、ケルセチン配糖体、ヒペロシド、及びルチン）、ニワトコの花（例えば、ルチン）、シナノキの花（例えば、ケルセチンを含む精油、及びファルネソール）、セイヨウオトギリソウ油（例えば、オリーブ油抽出物）、キンセンカ、アルニカ（例えば、精油を含む花の油性抽出物、フラボノイドを含む極性抽出物）、メリッサ（例えば、フラボン、精油）；免疫賦活剤：ムラサキバレンギク（例えば、アルコール性抽出物、採取直後の樹液（ｆｒｅｓｈ  ｓａｐ）、圧搾汁）、エゾウコギ；アルカロイド：ラウオルフィア（Ｒａｕｗｏｌｆｉａ）属植物（例えば、プラジマリン（ｐｒａｊｍａｌｉｎ））、ニチニチソウ（例えば、ビンカミン）；他の植物性医薬：アロエ、セイヨウトチノキ（例えば、エスシン）、ニンニク（例えば、ニンニク油）、パイナップル（例えば、ブロメライン）、朝鮮人参（例えば、ジンセノシド）、マリアアザミ果実（例えば、シリマリンを標準化した抽出物）、ナギイカダ根（例えば、ルスコゲニン）、カノコソウ（例えば、バルトラート、カノコソウチンキ剤（ｔｃｔ．Ｖａｌｅｒｉａｎａｅ））、カヴァ（例えば、カヴァラクトン）、ホップの花（例えば、ホップ苦味物質（ｈｏｐ  ｂｉｔｔｅｒ））、トウケイソウ属植物（Ｐａｓｓｉｆｌｏｒａｅ）、リンドウ（例えば、エタノール抽出物）、アントラキノン含有薬物抽出物、例えば、アロイン含有アロエベラ汁、花粉抽出物、藻類抽出物、甘草抽出物、パームヤシ抽出物、キントラノオ属（Ｇａｌｐｈｉｍｉａ）植物（例えば、チンキ原液（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｔｉｎｃｔｕｒｅ））、ヤドリギ（例えば、水性エタノール抽出物）、フィトステロール（例えば、ベータ−シトステロール）、モウズイカ属植物（例えば、水性アルコール抽出物）、モウセンゴケ属（Ｄｒｏｓｅｒａ）植物（例えば、酒精強化ワイン（ｖｉｎｕｍ  ｌｉｑｕｏｒｏｓｕｍ）抽出物）、シーバックソーン果実（例えば、そこから得られた汁又はシーバックソーン油）、ウスベニタチアオイ根、プリムラ根抽出物、ゼニアオイ属（ｍａｌｌｏｗ）植物の新鮮な植物抽出物、ヒレハリソウ、セイヨウキヅタ、トクサ、セイヨウノコギリソウ、ヘラオオバコ（例えば、圧搾汁）、ニセホウレンソウ、クサノオウ、パセリ；ノロラエナ・ロバタ（Ｎｏｒｏｌａｅｎａ  ｌｏｂａｔａ）の植物抽出物、ミントマリーゴールド、テーオマシームス（Ｔｅｅｏｍａ  ｓｉｅｍｓ）、ツルレイシ、及びアロエベラ抽出物からなる群から選択することができる。
【００３４】
好ましい化粧活性化合物は、本発明に従う使用において活性を示すもの、例えば、特に、スキンケア剤、スキンコンディショニング剤、皮膚を滑らかにする剤、皮膚の水和状態を向上する剤、例えば、グリセロール又は尿素、サンスクリーン剤、角質溶解剤、フリーラジカル捕捉剤、抗脂漏剤、皮膚老化の徴候を治療する活性化合物、並びに／又は皮膚の分化及び／若しくは増殖及び／若しくは色素沈着を調節する剤である。
【００３５】
本発明による植物抽出物であるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）種植物抽出物を含む化粧料組成物は局所用である。したがって、皮膚に局所適用するのに適しており、幅広い種類の製品に製造することができるものとして、これらに限定されるものではないが、ローション、クリーム、ジェル、乳液、スティック、スプレー、軟膏、液体洗浄料（ｃｌｅａｎｓｉｎｇ  ｌｉｑｕｉｄ  ｗａｓｈ）及び固形石鹸（ｓｏｌｉｄ  ｂａｒ）、シャンプー、ペースト、ムース、ワイプシート（ｗｉｐｅ）、パッチ、美容用ドレッシング材（ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ｄｒｅｓｓｉｎｇ）又はパック及び絆創膏、ヒドロゲル、並びにフィルム又はリポソーム製剤が挙げられる。
【００３６】
ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）種植物抽出物は、本発明による組成物中に、約０．００１重量％〜約２０重量％の量、特に約０．０１％〜約１０％の量、好ましくは約０．１重量％〜約５．０重量％の量、より詳細には約０．１５重量％〜約３．０重量％の量、一層好ましくは約０．２重量％〜約２．０重量％の量で存在する（それぞれ、組成物の総重量を基準とする）。
【００３７】
更に本発明は、請求項５に従うヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）の根及び／又は根茎の抽出物を調製するための方法であって、次に示すステップ：
−  抽出すべきヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の特定量の根片及び／又は根茎片を準備することから構成される、ステップａ）と；
−  ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の前記根片及び／又は根茎片を、好適な溶媒又は溶媒混合物で抽出し、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の根片及び／又は根茎片の抽出混合物を得る、ステップｂ）と；
−  ステップｂ）で得られた前記ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物根片及び／又は根茎片の抽出混合物を濾過することにより、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の根片及び／又は根茎片の抽出混合物の濾液を得る、ステップｃ）と；
−  ステップｃ）で得られたヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の根片及び／又は根茎片の抽出混合物の前記濾液を沈降させることにより、固体残渣を上清から分離する、ステップｄ）と；
−  ステップｄ）で得られた前記上清を濾過することにより、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）植物の根及び／又は根茎の抽出物を透明な溶液として得る、ステップｅ）と；
−  ステップｅ）で得られた前記透明な溶液を、好適な溶媒又は溶媒混合物を用いて所望の濃度に調整することにより、所望のヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）の根及び／又は根茎の抽出物を得る、ステップｆ）と；
を含む、方法に関する。
【００３８】
上に定義した方法のステップａ）において、ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）種の植物片抽出物は、好ましくは、破砕（ｃｒｕｓｈｅｄ）、細断（ｃｕｔ）、又は、粉砕した根及び／又は根茎から選択され；ステップｂ）において、溶媒又は溶媒混合物は、好ましくは、親水性又は水混和性溶媒、例えば、好ましくは上述の溶媒から選択される。好ましくは、ステップｂ）のヘディキウム属（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ）植物片の抽出にはエタノールが使用される。好ましくは、１種又は２種以上の水性アルコールによる抽出（好ましくはエタノールを使用）が実施される。好ましくは、抽出は、植物片及び水性アルコール性溶媒を１／１０の比で使用して実施される（例えば、植物片、例えば、特に根／根茎片１ｋｇを、５０％（ｗ／ｗ）エタノール１０ｄｍ３で抽出）。ステップｃ）において、当業者に知られている従来の濾過技法が適用される。ステップｄ）において、固体残渣及び上清の分離は当業者に知られている従来法を用いて実施される。ステップｅ）において、上清を更に清澄化及び精製するために上清の濾過を実施することにより、ヘディキウム属（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ）植物抽出物を透明な溶液の形態で得る。ステップｆ）において、透明な溶液を、好適な溶媒又は溶媒混合物、好ましくは上述の溶媒から選択されるもの、より好ましくは、水及びグリセロールの、１０／９０〜９０／１０、好ましくは２０／８０〜８０／２０の体積比の混合物を用いて、所望の濃度に調整する。
【００３９】
特定の一実施形態によれば、上に定義した方法のステップｆ）において、透明な溶液の所望の濃度への調整は、（体積／体積）比が３０／７０の水／グリセロール混合物を用いて達成される。
【００４０】
本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物は、経口的、局所的、又は非経口的に投与することができる更なる製剤に導入することができる。
【００４１】
局所用製剤は、少なくとも１種の化粧的に許容可能な賦形剤と、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物を有効量と、を含むことを特徴とする。
【００４２】
上に述べた製剤の定義における「局所用」という表現は、直接適用するか、又は例えば、皮膚に接触させることが意図された繊維若しくは紙製ワイプシートの形態にあるボディケア製品若しくは衛生製品で間接的に適用するかに関わらず、前記製剤が皮膚に適用することにより使用されることを意味する。
【００４３】
上述の局所用製剤の定義において使用される「化粧的に許容可能な」という表現は、１９７６年７月２７日付欧州経済共同体理事会指令（ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｕｎｃｉｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ）Ｎｏ７６／７６８／ＣＥＥ（１９９３年６月１４日付指令Ｎｏ９３／３５／ＣＥＥにより改正）に準拠し、製剤が、ヒトの身体の様々な部位（表皮、毛髪、又は毛包系（ｐｉｌｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ）、爪、口唇、及び生殖器）又は歯及び口腔粘膜に、それらの清浄化、それらへの芳香付与、それらの外観の修正、及び／又はそれらの体臭の矯正、及び／又はそれらの良い状態を保護若しくは維持することを唯一の及び主要な目的として接触させることが意図された任意の物質又は調合物を含むことを意味する。
【００４４】
少なくとも１種の化粧的に許容可能な賦形剤と、本発明の主題である方法により得られる有効量のヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物とを含む局所用製剤は、一般に、希薄水溶液又は水／アルコール溶液の形態、単相若しくは複合エマルジョン、例えば、油が植物性又は無機的性質を有する、油中水（Ｗ／Ｏ）型、水中油（Ｏ／Ｗ）型、若しくは水中油中水（Ｗ／Ｏ／Ｗ）型エマルジョン、又は粉末形態にある。これらは、ワイプシート、ペーパータオル、又は衣類のいずれであってもよい、織物又は不織物材料に分散又は含浸させることもできる。
【００４５】
一般用語における、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物は、上に定義した局所用製剤に使用される脂肪、有機溶媒、増粘剤、ゲル化剤、軟化剤、起泡性界面活性剤及び／又は洗剤、過脂剤、増粘及び／又はゲル化界面活性剤、酸化防止剤、乳白剤、安定剤、起泡剤、香料、乳化性界面活性剤、ヒドロトロープ剤、可塑剤、過脂剤、キメ改善剤（ｔｅｘｔｕｒｅ  ａｇｅｎｔ）、顔料、金属イオン封鎖剤、キレート剤、防腐剤、精油、染料、親水性若しくは親油性活性剤、保湿剤、香料、無機若しくは有機日光遮蔽剤、無機フィラー、又は化粧料に通常使用される他の任意の成分のいずれかの、多くの種類の補助剤又は活性成分が併用される。
【００４６】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用される油の例としては、鉱物油、例えば、パラフィン油、ワセリン油、イソパラフィン、又はホワイトミネラルオイル、動物性油、例えば、スクアレン若しくはスクアラン、植物性油、例えば、アーモンド油、コプラ油、ヒマシ油、ホホバ油、オリーブ油、菜種油、落花生油、ヒマワリ油、小麦胚芽油、トウモロコシ胚芽油、大豆油、綿油、アルファルファ油、ケシ油、パンプキン油（ｐｕｍｐｋｉｎ  ｏｉｌ）、月見草油、キビ油、オオムギ油、ライムギ油、紅花油、ククイ油、トウケイソウ油、ヘーゼルナッツ油、パーム油、シヤ脂、杏仁油、テリハボク油（ｃａｌｏｐｈｙｌｌｕｍ  ｏｉｌ）、シシンブリウム（ｓｙｓｙｍｂｒｉｕｍ）油、アボカド油、カレンデュラ（ｃａｌｅｎｄｕｌａ）油；エトキシ化植物油；合成油、例えば、脂肪酸エステル、例えば、ミリスチン酸ブチル、ミリスチン酸プロピル、ミリスチン酸セチル、パルミチン酸イソプロピル、ステアリン酸ブチル（ｂｕｔｙｌｅ）、ステアリン酸ヘキサデシル、ステアリン酸イソプロピル、ステアリン酸オクチル、ステアリン酸イソセチル、オレイン酸ドデシル、ラウリン酸ヘキシル、ジカプリル酸プロピレングリコール、ラノリン脂肪酸のエステル誘導体、例えば、ラノリン脂肪酸イソプロピル、ラノリン脂肪酸イソセチル、脂肪酸のモノグリセリド、ジグリセリド、及びトリグリセリド、例えば、グリセロールトリヘプタノエート（ｔｒｉｈｅｐｔｏｎｏａｔｅ）、安息香酸アルキル、ポリアルファオレフィン、ポリオレフィン、例えば、ポリイソブテン、合成イソアルカン、例えば、イソヘキサデカン、イソドデカン、全フッ素置換油、及びシリコーン油が挙げられる。後者としては、より詳細には、ジメチルポリシロキサン、メチルフェニルポリシロキサン、アミン変性されたシリコーン、脂肪酸変性されたシリコーン、アルコール変性されたシリコーン、アルコール及び脂肪酸で変性されたシリコーン、ポリエーテル基で変性されたシリコーン、変性エポキシシリコーン、含フッ素基で変性されたシリコーン、環状シリコーン、及びアルキル基で変性されたシリコーンが挙げられる。
【００４７】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができる他の脂肪としては、脂肪族アルコール及び脂肪酸が挙げられる。
【００４８】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができるロウの例として、ミツロウ；カルナウバロウ；キャンデリラロウ；オウリキュリー（ｏｕｒｉｃｏｕｒｙ）ロウ；モクロウ；コルク繊維（ｃｏｒｋ  ｆｉｂｒｅ）ロウ、又はサトウキビロウ；パラフィンロウ、モンタンロウ（ｌｉｇｎｉｔｅ  ｗａｘ）；ミクロクリスタリン（ｍｉｃｒｏｃｒｉｓｔａｌｌｉｎｅ）ロウ；ラノリンロウ；オゾケライト；ポリエチレンロウ；硬化油；シリコーンワックス；植物ロウ；周囲温度で固体の脂肪族アルコール及び脂肪酸；周囲温度で固体のグリセリド；が挙げられる。
【００４９】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができる増粘性及び／又は乳化性ポリマーとしては、アクリル酸又はアクリル酸の誘導体の単独重合体又は共重合体、アクリルアミドの単独重合体又は共重合体、アクリルアミド誘導体の単独重合体又は共重合体、アクリルアミドメチルプロパンスルホン酸の単独重合体又は共重合体、ビニルモノマー、トリメチルアミノエチルアクリル酸塩化物、植物由来又は生合成由来の親水コロイド、例えば、キサンタンガム、カラヤガム、カラギーナン（ｃａｒｒａｇｈｅｎａｔｅ）、アルギン酸塩；ケイ酸塩；セルロース及びその誘導体；デンプン及びその親水性誘導体；ポリウレタンが挙げられる。
【００５０】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができる高分子電解質型のポリマーとしては、例えば、アクリル酸と２−メチル−［（１−オキソ−２−プロペニル）アミノ］１−プロパンスルホン酸（ＭＰＳＡ）との共重合体、アクリルアミンと２−メチル−［（１−オキソ−２−プロペニル）アミノ］１−プロパンスルホン酸との共重合体、２−メチル−［（１−オキソ−２−プロペニル）アミノ］１−プロパンスルホン酸と（２−ヒドロキシエチル）アクリレートとの共重合体、２−メチル−［（１−オキソ−２−プロペニル）アミノ］１−プロパンスルホン酸の単独重合体、アクリル酸の単独重合体、アクリロイルエチルトリメチルアンモニウムクロリドとアクリルアミドとの共重合体、ＭＰＳＡとビニルピロリドンとの共重合体、アクリル酸と、その炭素鎖が１０〜３０個の炭素原子を含むアクリル酸アルキルとの共重合体、ＭＰＳＡと、その炭素鎖が１０〜３０個の炭素原子を含むアクリル酸アルキルとの共重合体が挙げられる。この種のポリマーは、本願出願人により、それぞれＳＩＭＵＬＧＥＬ（登録商標）ＥＧ、ＳＥＰＩＧＥＬ（登録商標）３０５、ＳＩＭＵＬＧＥＬ（登録商標）ＮＳ、ＳＩＭＵＬＧＥＬ（登録商標）ＩＮＳ  １００、ＳＩＭＵＬＧＥＬ（登録商標）ＦＬ、ＳＩＭＵＬＧＥＬ（登録商標）８００、ＳＩＭＵＬＧＥＬ（登録商標）Ａの名称で販売されている。
【００５１】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができる乳化剤の例としては、仏国特許出願第２６６８０８０号明細書、仏国特許出願第２７３４４９６号明細書、仏国特許出願第２７５６１９５号明細書、仏国特許出願第２７６２３１７号明細書、仏国特許出願第２７８４６８０号明細書、仏国特許出願第２７８４９０４号明細書、仏国特許出願第２７９１５６５号明細書、仏国特許出願第２７９０９７７号明細書、仏国特許出願第２８０７４３５号明細書、及び仏国特許出願第２８０４４３２号明細書に記載されている、脂肪酸塩、エトキシル化脂肪酸、脂肪酸及びソルビトールのエステル、エトキシル化脂肪酸のエステル、ポリソルベート、ポリグリセロールエステル、エトキシル化脂肪族アルコール、ショ糖エステル、アルキルポリグリコシド、硫酸化及びリン酸化脂肪族アルコール、又はアルキルポリグリコシド及び脂肪族アルコールの混合物が挙げられる。
【００５２】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができる起泡性界面活性剤及び／又は洗剤の例としては、この活動分野において通常使用されている、局所用として許容される、アニオン性、カチオン性、両性、又は非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【００５３】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができるアニオン性界面活性剤としては、特に、次に示す化合物のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、アミン塩、アミノアルコール塩が挙げられる：アルキルエーテル硫酸エステル、アルキル硫酸エステル、アルキルアミドエーテル硫酸エステル、アルキルアリールポリエーテル硫酸エステル、モノグリセリド硫酸エステル、アルファ−オレフィン硫酸エステル、パラフィンスルホン酸、アルキルリン酸エステル、アルキルエーテルリン酸エステル、アルキルスルホン酸、アルキルアミドスルホン酸、アルキルアリールスルホン酸、アルキルカルボン酸、アルキルスルホコハク酸エステル、アルキルエーテルスルホコハク酸エステル、アルキルアミドスルホコハク酸エステル、アルキルスルホ酢酸、アルキルサルコシン、アシル化チオン酸、Ｎ−アシルタウリン、及びアシル乳酸。
【００５４】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができるアニオン性界面活性剤として、アミノ酸のＮ−アシル化誘導体、ペプチド、そのアシル鎖が８〜１６個の炭素原子を有するタンパク質；脂肪酸塩、任意選択で水素化されているコプラ油のコプラ油脂肪酸塩が挙げられる。
【００５５】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができる両性界面活性剤として、特に、アルキルベタイン（ａｌｋｙｂｅｔａｉｎｅ）、アルキルアミドベタイン、スルタイン、アルキルアミドアルキルスルホベタイン、イミダゾリン誘導体、ホスホベタイン、アンホポリ酢酸塩（ａｍｐｈｏｐｏｌｙａｃｅｔａｔｅ）、及びアンホプロピオン酸塩が挙げられる。
【００５６】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができるカチオン性界面活性剤として、特に、４級アンモニウム誘導体が挙げられる。
【００５７】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができる非イオン性界面活性剤として、特に、そのアルキル（ａｌｋｙｌｅ）鎖が８〜１６個の炭素原子を含むアルキルポリグリコシド、ヒマシ油誘導体、ポリソルベート、コプラアミド、Ｎ−アルキルアミン、及びアミンオキシドが挙げられる。
【００５８】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができるキメ改善剤の例として、アミノ酸のＮ−アシル化誘導体、例えば、味の素株式会社（ＡＪＩＮＯＭＯＴＯ）からアミノホープ（ＡＭＩＮＯＨＯＰＥ）（登録商標）ＬＬの名称で販売されているラウロイルリシン、ＮＡＴＩＯＮＡＬＳＴＡＲＣＨ社からＤＲＹＦＬＯ（登録商標）の名称で販売されているオクテニルコハク酸デンプン塩（ｏｃｔｅｎｙｌ  ｓｔａｒｃｈ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ）、ＳＥＰＰＩＣからＭＯＮＴＡＮＯＶ  １４の名称で販売されているミリスチルポリグルコシド、セルロース繊維、綿繊維、キトサン繊維、タルク、絹雲母、又は雲母等が挙げられる。
【００５９】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができる乳白剤及び／又はパール化剤の例として、パルミチン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ヒドロキシステアリン酸ナトリウム、パルミチン酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシステアリン酸マグネシウム、エチレングリコールモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、ポリエチレングリコールモノステアレート、ポリエチレングリコールジステアレート、及び脂肪族アルコールが挙げられる。
【００６０】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができる増粘及び／又はゲル化界面活性剤の例として：
−アルキルポリグリコシドの脂肪酸エステル、任意選択でアルコキシル化、特にエトキシ化されたメチルポリグリコシドエステル、例えば、それぞれＧＬＵＣＡＭＡＴＥ（登録商標）ＬＴ及びＧＬＵＭＡＴＥ（登録商標）ＤＯＥ１２０の名称で販売されている、ＰＥＧ  １２０メチルグルコーストリオレエート及びＰＥＧ  １２０メチルグルコースジオレエート；
−アルコキシル化された脂肪酸エステル、例えばＣＲＯＴＨＩＸ（登録商標）ＤＳ５３の名称で販売されているＰＥＧ  １５０テトラステアリン酸ペンタエリスリチル、ＡＮＴＩＬ（登録商標）１４１の名称で販売されているＰＥＧ  ５５オレイン酸プロピレングリコール；
−脂肪鎖ポリアルキレングリコールカルバミン酸エステル、例えば、ＥＦＬＡＣＯＳ（登録商標）Ｔ２１１の名称で販売されているジカルバミン酸ＰＰＧ  １４ラウレスイソフォリル、ＥＬＦＡＣＯＳ（登録商標）ＧＴ２１２５の名称で販売されているジカルバミン酸ＰＰＧ  １４パルメス６０ヘキシル；
が挙げられる。
【００６１】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができる日光遮蔽剤の例として、改正された化粧品指令（ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ）７６／７６８／ＥＥＣ付属書ＶＩＩに記載されている全てのものが挙げられる。
【００６２】
局所用製剤において、本発明の主題である方法により得られるヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根及び／又は根茎抽出物と併用することができる有効成分の例として、明色化又は脱色素作用を有する化合物、例えば、アルブチン、コウジ酸、ヒドロキノン、エラグ酸、ビタミンＣ、マグネシウムリン酸アスコルビル等、ポリフェノールの抽出物、グリコシル化ポリフェノールの誘導体、例えば、ロスマリニルグルコシド、ブドウ抽出物、マツ抽出物、ワイン抽出物、オリーブの抽出物、池（ｐｏｎｄ）抽出物、Ｎ−アシル化タンパク質、Ｎ−アシル化ペプチド、Ｎ−アシル化アミノ酸、Ｎ−アシル化タンパク質の部分加水分解物、アミノ酸、ペプチド、タンパク質の完全加水分解物、タンパク質の部分加水分解物、ポリオール（例えば、グリセリン又はブチレングリコール）、尿素、ピロリドンカルボン酸又はこの酸の誘導体、グリチルレチン酸、アルファ−ビサボロール、糖又は糖の誘導体、多糖類又はその誘導体、ヒドロキシ酸、例えば、乳酸、ビタミン類、レチノール等のビタミン誘導体、ビタミンＥ及びその誘導体、鉱物、酵素、コエンザイムＱ１０等の補酵素、ホルモン又はホルモン様物質、大豆抽出物、例えば、Ｒａｆｆｅｒｍｉｎｅ（登録商標）、コムギ抽出物、例えば、Ｔｅｎｓｉｎｅ（登録商標）又はＧｌｉａｄｉｎｅ（登録商標）、植物抽出物、例えば、タンニンに富む抽出物、イソフラボンに富む抽出物、又はテルペンに富む抽出物、淡水又は海水藻類の抽出物、エッセンシャルワックス（ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｗａｘ）、細菌抽出物、鉱物、一般的な脂質、セラミド又はリン脂質等の脂質、カフェイン又はその誘導体等の痩身作用を有する活性剤、例えばＡＤＩＰＯＬＥＳＳ（登録商標）の名称で販売されているキヌア抽出物、例えば、ＳＥＲＥＮＩＫＳ（登録商標）２０７の名称で販売されているイースタンヘムロック抽出物、例えば、ＡＤＩＰＯＳＬＩＭ（登録商標）の名称で販売されているラウロイルプロリンを含む組成物、油性肌に対し抗菌活性又は清浄作用を有する活性物質、例えば、ＬＩＰＡＣＩＤＥ（登録商標）ＰＶＢ、活力付与（ｅｎｅｒｇｉｓｉｎｇ）又は刺激性を有する活性剤、例えば、ＳＥＰＩＴＯＮＩＣ（登録商標）Ｍ３又はＰｈｙｓｉｏｇｅｎｙｌ（登録商標）、パンテノール及びその誘導体、例えば、ＳＥＰＩＣＡＰ（登録商標）ＭＰ、抗老化活性剤、例えば、ＳＥＰＩＬＩＦＴ（登録商標）ＤＰＨＰ、ＬＩＰＩＣＩＤＥ（登録商標）ＰＶＢ、ＳＥＰＩＶＩＮＯＬ（登録商標）、ＳＥＰＩＶＩＴＡＬ（登録商標）、水和活性化剤（ｈｙｄｒａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）、例えば、ＳＥＰＩＣＡＬＭ（登録商標）Ｓ、ＳＥＰＩＣＡＬＭ（登録商標）ＶＧ、及びＳＥＰＩＬＩＦＴ（登録商標）ＤＰＨＰ、「抗光老化性」抗老化活性剤、真皮表皮接合部の健全性を保護する活性剤、細胞外基質成分の合成を増加させる活性剤、痩身作用を有するカフェイン、テオフィリン等の活性剤、ＡＭＰｃ、緑茶、セージ、イチョウ（ｇｉｎｋｏ  ｂｉｌｏｂａ）、セイヨウキヅタ、セイヨウトチノキ（ｈｏｒｓｅ  ｃｈｅｓｎｕｔ）、竹、ナギイカダ属植物（ｒｕｓｃｕｓ）、ナギイカダ、ツボクサ、ギョリウモドキ、ウルマリア（ｕｌｍａｒｉａ）、ヒバマタ属（ｆｕｃｕｓ）藻類、ローズマリー、ヤナギ、皮膚に「温」感を生じさせる活性剤、例えば、皮膚微小循環活性化剤（例えば、ニコチン酸塩）又は皮膚に「冷」感を生じさせる製品（例えば、メントール及びその誘導体）が挙げられる。
【００６３】
本発明を、本発明の特定の具体的な実施形態に関する以下の実施例により更に説明する。実施例は、特段の指定がない限り、当業者の日常的な作業の範囲内にある当業者に知られている標準的な技法を用いて実施した。以下の実施例は例示のみを目的とするものであって、本発明の条件又は範囲を何ら決定するものではない。そのようなものとして、これらは、本発明の範囲をいかなる形でも制限するものと見なすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】実施例２における、ＨＣＲ抽出物で４８時間処理した線維芽細胞（照射又は未照射）のＡＴＰ測定による、ミトコンドリア保護に関する結果を示したものである。
【図２】実施例２における、ＨＣＲ抽出物で４８時間処理した線維芽細胞（照射又は未照射）のＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ測定による、ミトコンドリア保護に関する結果を示したものである。
【図３】実施例３における、ＨＣＲ抽出物で４８時間処理した線維芽細胞（照射又は未照射）をＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒで染色して定量化することによる、リソソーム保護に関する結果を示したものである。
【図４】実施例４における、ＨＣＲ抽出物で２４時間前処理するか又は前処理せずに、ＢａＰで汚染し、再び２４時間処理した皮膚外植片からのＩＬ−８放出に関する結果を示したものである。
【図５】実施例５における、ＨＣＲ抽出物で４０時間処理した後の角化細胞から放出されたβ−エンドルフィンの測定結果を示したものである。
【図６】実施例５における、ＨＣＲ抽出物で４０時間処理した後の角化細胞から放出された総タンパク質量の測定結果を示したものである。
【図７】実施例５における、ＨＣＲ抽出物で４０時間処理した後の角化細胞から放出されたβ−エンドルフィンの測定量を総タンパク質量に対し正規化した結果を示したものである。
【図８】実施例６における、ＤＥ濃度０．００１、０．００５、及び０．０１％のＨＣＲ抽出物で７２時間処理した後のＢ１６メラニン細胞から放出されたメラニンの測定結果を示したものである。
【図９】実施例６における、ＤＥ濃度０．０１、０．０５、及び０．１％のＨＣＲ抽出物で７２時間処理した後のＢ１６メラニン細胞から放出されたメラニンの測定結果を示したものである。
【図１０】実施例６における、ＤＥ濃度０．００１、０．００５、及び０．０１％のＨＣＲ抽出物で７２時間処理した後のＢ１６メラニン細胞中の総タンパク質量の測定結果を示したものである。
【図１１】実施例６における、ＤＥ濃度０．０１、０．０５、及び０．１％のＨＣＲ抽出物で７２時間処理した後のＢ１６メラニン細胞中の総タンパク質量の測定結果を示したものである。
【図１２】実施例６における、ＤＥ濃度０．００１％、０．００５％、及び０．０１％のＨＣＲ抽出物で７２時間処理した後のＢ１６メラニン細胞から放出されたメラニンの測定結果を示したものである。
【図１３】実施例６における、ＤＥ濃度０．０１％、０．０５％、及び０．１％のＨＣＲ抽出物で７２時間処理した後のＢ１６メラニン細胞から放出されたメラニンの測定結果を示したものである。
【図１４】実施例７における、ＲＯＳ産生刺激を行わずに２４時間処理した角化細胞中のＲＯＳ遊離に対しＨＣＲ抽出物が与える効果に関する結果を示したものである。
【図１５】実施例７における、ＲＯＳ産生刺激を行い２４時間処理した角化細胞中のＲＯＳ遊離に対しＨＣＲ抽出物が与える効果に関する結果を示したものである。
【実施例】
【００６５】
実施例１：ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根抽出物の調製
ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根抽出物を本発明の方法に従い調製する。
【００６６】
ステップ（ａ）において、長さ１０ｃｍ以下のサイズのヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）の根（根茎）を破砕し、好適な抽出槽に供給する。
【００６７】
ステップ（ｂ）において、水／エタノール混合物［５０／５０（ｗ／ｗ）］を抽出溶媒として破砕した根に加え、２回抽出を行う。
【００６８】
ステップ（ｃ）において、従来の濾過技法を用いて抽出混合物を濾過する。
【００６９】
ステップ（ｄ）において、ステップ（ｃ）の濾液を、固体残渣を沈降させることにより濃縮した後、上清をデカンテーションする。
【００７０】
ステップ（ｅ）において、ステップ（ｄ）の上清を従来の濾過技法を用いて濾過する。
【００７１】
ステップ（ｆ）において、ステップ（ｅ）の透明な溶液を、水及びグリセロールの３０／７０（ｖ／ｖ）比の混合物中で２０ｇ／Ｌ溶液となるように調整した後、更に精製するために最終濾過を行うことにより、所望濃度２．０％（ｗ／ｖ）の最終抽出物を得る。
【００７２】
実施例２：ＵＶＡを照射した線維芽細胞のミトコンドリアネットワークにヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根抽出物（ＨＣＲ抽出物）が与える効果の評価（ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色、ＡＴＰ及びＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ測定）
１）背景情報
ａ）本試験の目的は、ＵＶＡ照射後の線維芽細胞のミトコンドリアの分布及び細胞のエネルギー代謝にＨＣＲ抽出物が与える効果を評価することにあった。
ｂ）形成術を受けた４１歳の提供者（白人女性）から摘出した乳房皮膚真皮から採取した正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）を初代単層培養した。
ｃ）次いで被験抽出物を２４時間適用した。
ｄ）細胞を照射し（処理は行わない）、再び被験化合物を更に２４時間適用した。
ｅ）ミトコンドリアを染色するか、又はＡＴＰ（アデノシン三リン酸）及びＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）測定を行うために細胞を回収した。
【００７３】
２）用量決定（Ｄｏｓｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ）（ＸＴＴアッセイによる細胞毒性／生存率確認）及び評価した被験化合物
ａ）細胞の生存率／細胞毒性をＸＴＴアッセイにより確認し、作用用量（ｗｏｒｋｉｎｇ  ｄｏｓｅ）を評価することにより、試験濃度を、ＨＣＲ乾燥抽出物２％（ＨＣＲを培地で１／２０希釈して最終的に０．１％ＨＣＲとすることに相当）に選択した。
【００７４】
ｂ）処理の２４時間前に、ダルベッコ改変イーグル培地、又は抗生物質（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）１５１４０）及び１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）１０２７０）を添加したＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（登録商標）４１９６６）のいずれかを加えた９６ウェルマイクロプレートに細胞を播種した（細胞密度５，０００細胞／ウェル、即ち１５，０００ＮＨＦ／ｃｍ２（後の測定に用いた密度））（３７℃、５％ＣＯ２でインキュベート）。処理はＦＢＳ不含培地で行った（４８時間、３７℃、５％ＣＯ２）。
【００７５】
ｃ）４８時間処理した後、ウェルを空にし、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で穏やかに洗浄した。次いでＸＴＴ溶液（０．３ｍｇ／ｍｌ）を細胞に適用した後、プレートを暗所でインキュベートした（３時間、３７℃、５％ＣＯ２）。３時間インキュベートした後、４５０ｎｍの吸光度を測定し、６５０ｎｍを基準とした。ＸＴＴ分子が抽出物と相互作用（結果にバイアスが生じることになる）しないことを確認するために、細胞を添加しないウェル（但し、抽出物（ｐｒｏｄｕｃｔ）を含むか又は含まない）にＸＴＴ溶液を加えてブランクも作製した。ＸＴＴ試験は“Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＩＩ（ＸＴＴ）”キット（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ（登録商標）１１４６５０１５００１）を用いて実施した。比色分析法であるＸＴＴ系は、ミトコンドリアの活性を定量する試験であり、生存率試験として用いた。この試験は、細胞のミトコンドリア呼吸鎖に存在する「コハク酸塩テトラゾリウム還元酵素」系が黄色のテトラゾリウム塩であるＸＴＴをオレンジ色のホルマザンに切断することに基づいている。したがってこの変換は、代謝活性を有する細胞、即ち生細胞のみで起こる。誘導体であるホルマザンを、分光測定法により、６５０ｎｍを基準として４５０ｎｍで測定する。
【００７６】
ｄ）光学密度データ（ＯＤ又は吸光度）の平均値を各場合について求めた。処理した細胞の生存率を未処理の対照に対する百分率として表す：
【００７７】
【数１】
2020514279.tif 000002
【００７８】
細胞生存率が、未処理の対照と比較して、ミトコンドリア活性に関する下限値である８０％未満に低下した処理は、細胞毒性があると見なした。一方、検出されたデータが上昇している場合はミトコンドリアが活性化している。
【００７９】
３）ミトコンドリアネットワーク保護の評価
ａ）処理を行う１日前に、線維芽細胞を、上に記載した培地と同一の培地（完全培地、即ちＦＢＳ含有）を含むペトリ皿に播種した（細胞密度：直径６０ｍｍの皿１枚当たり１５０，０００細胞、即ち７，７００ＮＨＦ／ｃｍ２）（３７℃；５％ＣＯ２でインキュベート）。次いで各濃度／用量（皿１枚当たり）の被験化合物を２４時間適用した（無血清培地；３７℃／５％ＣＯ２でインキュベート）。次いで細胞に緩衝生理食塩水中でＵＶＡを照射するか又は照射せず（８Ｊ／ｃｍ２、Ｖｉｌｂｅｒ  Ｌｏｕｒｍａｔ  ＲＭＸ３Ｗ（登録商標）装置）、最後に再び被験化合物で更に２４時間処理した（培地中）。
【００８０】
ｂ）ミトコンドリア染色を評価するために、細胞を蛍光プローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標））と一緒にインキュベートした。細胞を４０倍対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫ４０（登録商標）顕微鏡及びＡｒｃｈｉｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア）で適切な蛍光フィルタを取り付けて又は取り付けずに観察し、撮影した。写真から、ミトコンドリアネットワーク又は細胞全体の可視化がそれぞれ可能になる。
【００８１】
４）代謝活性に与える効果の評価（ＡＴＰ＆ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ測定）
ａ）ＵＶ及び被験生成物が細胞代謝に与える効果を確認するために、ＡＴＰ及びＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ測定を実施した。
（ｉ）処理を行う１日前に、細胞を、上に記載した培地と同一の培地を加えた９６ウェルプレートに播種した（細胞密度５，０００細胞／ウェル、即ち１５，０００ＮＨＦ／ｃｍ２）。次いで、同一時点で処理及び照射を行った：最初の適用を２４時間行い（無血清培地中）、次いでＵＶＡを照射するか又は照射せず（同一線量）、最後に２回目の処理を更に２４時間行った。上と同様に、実験全体を通して細胞を３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。この場合、各用量について５連（ＡＴＰの場合）又は６連で（ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの場合）試験を実施した。
（ｉｉ）測定に進むために、細胞溶解物又はペレットを処理終了後に回収した。細胞の総ＡＴＰ量を測定するために、細胞及び上清（生成物を含む培地）を含むウェルに界面活性剤を添加することにより細胞を溶解し、細胞溶解物を得た。細胞内ＮＡＤ＋及びＮＡＤＨ測定を行うために上清を除き、細胞を透過可能にすることにより透過性細胞ペレットを得た。
（ｉｉｉ）次いで市販のキット：発光ＡＴＰ検出アッセイキット（Ａｂｃａｍ（登録商標）ａｂ１１３８４９）及びＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ細胞ベースアッセイキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（登録商標）６００４８０）を用いて測定を行った。
（ｉｖ）ＮＡＤアッセイキットは２種類の取り得る形態（酸化型ＮＡＤ＋及び還元型ＮＡＤＨ）を検出する（ｄｏｓｅ）。まずエタノール及びアルコールデヒドロゲナーゼを添加することにより、試料に含まれるＮＡＤ＋を還元してＮＡＤＨにすることができ、それに伴い、エタノールが酸化される。次いで、全ＮＡＤＨが酸化されると同時にテトラゾリウム塩基質（ＷＳＴ−１）が還元され、有色のホルマザンになる。この生成物の量の測定値（吸光度）は各試料の全ＮＡＤ（ＮＡＤ＋及びＮＡＤＨ）に比例する。
（ｖ）ＡＴＰアッセイキットは、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼに基づくＡＴＰ監視系である。添加されたルシフェラーゼ及びＤ−ルシフェリンが試料中のＡＴＰと反応することにより光が発生する。この測定値（発光）はＡＴＰ濃度に比例する。
【００８２】
ｂ）各標準物質に関し得られたＡＴＰ及びＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ測定の両方の生データ、即ち、発光単位（ＲＬＵ）又はＯＤ測定値をグラフにプロットし、検量線を決定した。次いで、試料中で測定されたＡＴＰ又はＮＡＤ＋／ＮＡＤＨの濃度を求めた。各条件毎に定量された値を平均した。データを濃度としてグラフに示す（ＡＴＰ又はＮＡＤ＋／ＮＡＤＨのｎＭ）。各条件毎に得られた結果を、未処理の対照（照射あり又は照射なし）（１００％に設定）に対し相対的に表すことができ、又は、未照射の、各条件と同一の条件に対し相対的に表すこともできる（ＵＶＡの影響の評価）。
％≪試料≫＝（平均ＲＬＵ又はＯＤ≪試料≫／平均ＲＬＵ又はＯＤ≪照射あり又は照射なしの対照≫）×１００
【００８３】
スチューデントのｔ検定を行い、ＸＴＴアッセイに関し記載したものと同じ基準で（照射なし若しくは照射ありの対照と比較、又はそれぞれ照射なしの同一条件と比較）、結果の統計的な有意性を判定した。
【００８４】
５）結果
ａ）用量決定（ＸＴＴアッセイによる細胞毒性／生存率確認）
試験濃度である０．０００５％〜０．０１％ＨＣＲ（乾燥抽出物（ＤＥ））では線維芽細胞に対する細胞毒性は認められなかった：
【００８５】
[表]
2020514279.tif 000003
【００８６】
ｂ）ミトコンドリアネットワーク保護の評価
画像を観察することにより、ＵＶ照射が細胞形状及び細胞内のミトコンドリア分布に与える影響を確認することができる。実際、一部のＵＶ照射された線維芽細胞はもはや紡錘形ではなく、ミトコンドリアネットワークはＵＶ照射を行わなかったものよりも組織化の程度が低いように見えた。陽性対照（ビタミンＣ、５００μＭ）を適用すると、ＵＶＡの影響は分かりにくくなった。線維芽細胞をＨＣＲ０．０１％（ＤＥ）で処理すると、ミトコンドリアネットワークがＵＶ照射による損傷から保護された。ＵＶに対抗する効果は、より低い用量である０．００５％及び０．００１％では認められなかった。
【００８７】
ｃ）代謝活性に与える効果の評価（ＡＴＰ＆ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ測定）
図１に測定結果を示す。データは濃度（ｎＭ）で表し、照射なし若しくは照射ありの対照、又は照射なしの各条件について報告する。照射なしの対照又は照射ありの対照と比較して統計学的なｐ値を求める。照射なしでは、どの処理も、ＡＴＰ産生の有意な阻害又は刺激を誘導しなかった。ＵＶを照射することにより、線維芽細胞のＡＴＰ産生の阻害が強力且つ非常に高い有意性で誘導された（−８４％＊＊＊、照射ありの対照、基準量（即ち照射なし）と比較）。陽性対照（ビタミンＣ、５００μＭ）は、ＵＶＡがこのエネルギー合成に与える作用を有意に抑制した（＋６１％＊、照射ありの対照と比較）。ＨＣＲで処理することにより、ＡＴＰ合成の有意な又は非常に有意性の高い上昇が認められた（０．０１％、０．００５％、及び０．００１％について、それぞれ＋１３６％＊＊、＋８６％＊、及び＋１４６％＊＊）。
【００８８】
ｄ）ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ測定
（ｉ）照射なしでは、どの処理も、線維芽細胞による基礎的なＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ産生を阻害する傾向にある。結果を図２に示す。
（ｉｉ）ＵＶＡを照射することにより、ＮＨＦによるこの補酵素の合成が有意に阻害された（−２１％＊、基準量と比較）。この場合、ビタミンＣは、ＵＶ照射した細胞のＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ放出に対し期待したような陽性効果を示さなかった。ＨＣＲを最も高い被験用量で適用した場合に（０．０１％）、ＵＶＡにより低下した線維芽細胞のＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ産生が回復した（＋１９％＊、照射ありの対照と比較）。他の２種の被験用量では、この効果は有意性が見られなかった（＋９％）。
【００８９】
ｅ）したがって本評価は、ＵＶＡがミトコンドリアネットワークの部分的な分解／崩壊並びにＡＴＰ及びＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ産生の阻害を誘導することを示している。ＨＣＲ抽出物は、培養及びＵＶ照射された線維芽細胞において、ＡＴＰ産生を有意に増加させると共に、ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨ合成を刺激する効果を示す。これにより、ミトコンドリアネットワークをＵＶ照射から保護することが可能になる。したがって、ＨＣＲ抽出物は、ＵＶによるミトコンドリア及びエネルギー代謝の損傷から皮膚を保護するのに有効である。
【００９０】
実施例３：ＵＶＡ照射された線維芽細胞のリソソームネットワークにＨＣＲ抽出物が与える効果の評価（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ染色）
１）背景情報
ａ）本試験の目的は、ＨＣＲ抽出物がＵＶＡ照射された線維芽細胞におけるリソソームの分布に与える効果を評価することにあった。
ｂ）形成術を受けた４１歳の提供者（白人女性）から摘出した乳房皮膚真皮から採取した正常ヒト線維芽細胞（ＮＨＦ）を初代単層培養した。
ｃ）次いで被験抽出物を２４時間適用した。
ｄ）細胞に照射し（処理は行わない）、再び被験化合物を更に２４時間適用した。
ｅ）次いでリソソームを、特定の試験化合物で染色した。
【００９１】
２）用量決定（ＸＴＴアッセイによる細胞毒性／生存率確認）及び評価した被験化合物
ＸＴＴアッセイによる用量決定を実施例２に記載した通りに実施した。
【００９２】
３）リソソームネットワーク保護の評価
ａ）線維芽細胞の播種を実施例２に記載した通りに実施した。
【００９３】
ｂ）次いで、細胞を蛍光プローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ（登録商標））と一緒にインキュベートした。これらを４０倍対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫ４０（登録商標）顕微鏡及びＡｒｃｈｉｍｅｄ  Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎソフトウェア）で適切な蛍光フィルタを取り付けて又は取り付けずに観察し、撮影した。写真から、リソソームネットワーク又は細胞全体の可視化がそれぞれ可能になる。
【００９４】
ｃ）蛍光をＨＣＳ  Ｐｈａｒｍａ（Ｒｅｎｎｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）からのＣｏｌｏｍｂｕｓソフトウェアにより、輝度の平均値として定量した（各条件につき画像３枚）。これは、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒで染色された細胞領域に含まれる染色された各画素毎の輝度の平均値である（最終的な値は画像内の全ての細胞に関する値の平均値であるため、各画像の細胞数を考慮に入れる）。
【００９５】
４）結果
ａ）用量決定（ＸＴＴアッセイによる細胞毒性／生存率確認）
０．０００５％〜０．０１％ＨＣＲ（ＤＥ）の試験濃度では線維芽細胞に対する細胞毒性は認められなかった。
【００９６】
[表]
2020514279.tif 000004
【００９７】
ｂ）リソソームネットワーク保護の評価
（ｉ）ＵＶ照射された対照画像を観察することにより、照射が細胞形状及び細胞内のリソソームの組織化に与える効果を観察することができる。実際、一部のＵＶ照射された線維芽細胞はもはや紡錘形ではなく、リソソームネットワークは未処理及び未照射の対照と比較して、組織化の程度が低いように見えた。
（ｉｉ）蛍光輝度の測定値が有意に低下していたことにより、この効果が裏付けられた（−２９％（有意性＊））。陽性対照（ビタミンＣ、５００μＭ）を適用することにより、ＵＶＡの影響が弱まった。結果を図３に示す。定量データの平均蛍光輝度が上昇したことが、この観測結果を支持している（効果が高い有意性を示す＊＊）。
（ｉｉｉ）線維芽細胞をＨＣＲ抽出物０．０１％で処理することにより、リソソームネットワークがＵＶ照射による損傷から保護された。このＵＶに対する効果は、抽出物０．００５％及び０．００１％ではさほど明確には認められなかった。このことは蛍光の定量結果により確認され、０．０１％ＨＣＲでは＋３６％の上昇が認められた（有意性＊、照射ありの対照と比較）。より低い試験用量（０．００５％及び０．００１％）では、効果はさほど明確ではなく、有意性はなかった（それぞれ＋１９％及び＋２１％）。
【００９８】
ｃ）したがって本評価から、ＵＶＡ照射により細胞のリソソームネットワークが一部損傷することが示された。被験ＨＣＲ抽出物はＵＶ照射された線維芽細胞に効果を示し、特に最大試験用量（０．０１％）でリソソームネットワークをＵＶ照射から保護することが可能であった。したがって、この評価により、ＨＣＲ抽出物が真皮細胞のリソソームをＵＶによる損傷から保護するのに有効であると結論付けることができる。
【００９９】
実施例４：ヒト皮膚外植片の汚染モデルにおけるＨＣＲ抽出物の効果の評価
１）背景情報
ａ）本試験の目的は、ヒト皮膚外植片の汚染モデルにおけるＨＣＲ抽出物の潜在的保護効果を評価することにあった。
ｂ）Ｂｉｏｐｒｅｄｉｃ（登録商標）Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ（Ｒｅｎｎｅｓ）より提供された、乳房形成術から採取した（年齢４４歳の白人女性由来）ヒト皮膚外植片（直径８ｍｍ）に、抽出物（ｐｒｏｄｕｃｔ）を全身的に（ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ）２４時間適用した。
ｃ）次いで、抽出物（ｐｒｏｄｕｃｔ）を再び、汚染の最中に、更に２４時間適用した。前記汚染は、このモデルには、環境汚染物質であるベンゾ（ａ）ピレン（３，４−ベンゾピレン／ＢａＰ）を全身処理として、即ち、培地中で適用することにより誘導した。この汚染物質は、ＩＬ−８の放出を誘導する（ＳＥＰｈＲＡの結果）。
ｄ）炎症性サイトカインであるＩＬ−８（インターロイキン８）の外植片からの放出を上清（培地）を測定することにより分析した。
ｅ）更に、クローディン１及び４の発現（ＣＬＤＮ１及びＣＬＤＮ４）を免疫染色により分析するために皮膚外植片を保存した。
【０１００】
２）ヒト皮膚外植片の汚染モデル
ａ）２％（ＤＥ）ＨＣＲ抽出物を培地で希釈してＨＣＲ抽出物０．１％（ＤＥ）とし、これを被験化合物として使用する。
ｂ）前記ＨＣＲ抽出物を２４時間の前処理として皮膚外植片に全身的に適用した。
ｃ）次いで更に２４時間かけて皮膚外植片をＢａＰ（Ｓｉｇｍａ  ＣＲＭ４００７１、４０μＭ、全身）で汚染するか又は汚染せず、その間、ＨＣＲ抽出物を再び汚染あり及び汚染なしの両方の皮膚外植片に全身的に適用した。汚染なしの条件はそれぞれ３連で試験し（外植片３片：免疫染色用２片及び組織像用１片）、汚染ありの条件については４連で試験した（外植片４片：免疫染色用３片、組織像用１片）。
ｄ）上清の測定（各条件毎に採取、汚染なし皮膚外植片３、及び汚染あり皮膚外植片４）を２連で行った。
ｅ）ＩＬ−８の測定値を検証するため、更なる条件を評価した。即ち、対照用炎症促進分子であるＰＭＡ（１３−酢酸１２−ミリスチン酸ホルボール、Ｓｉｇｍａ  Ｐ８１３９）１μｇ／ｍｌで刺激した。この製品を、最後の２４時間で、抽出物処理も汚染も行っていない１片の皮膚外植片に全身的に適用した。
【０１０１】
３）皮膚外植片の処理
ａ）次いで皮膚外植片を、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）１０２７０）及び３００μＬ／ウェル  抗生物質（ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）１５１４０）を添加したＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）３１０５３）を加えた２４ウェルプレートに配置した。皮膚外植片を３７℃／５％ＣＯ２下で４時間安定化させた。
【０１０２】
ｂ）安定化後、抽出物を外植片の培地中で全身的に適用するか又は適用せず、３７℃／５％ＣＯ２で２４時間インキュベートした。次いで使用した培地は、ＦＢＳ不含のＤＭＥＭとした。次いで皮膚外植片にＢａＰ（４０μＭ）を２４時間全身的に適用することにより汚染するか又は汚染を行わず、それと同時に、ＨＣＲ抽出物で処理するか又は処理しなかった（３７℃／５％、ＣＯ２下でインキュベート）。
【０１０３】
ｃ）この期間が終了した後、ＩＬ−８を検出（ｄｏｓｅ）するために上清（処理培地）を保存した。各条件（汚染あり又は汚染なし）につき１片の外植片を組織学的解析（Ｈ／Ｅ／Ｓ染色）を行うために４％ホルムアルデヒド中に保存した。他の皮膚外植片は後段で免疫染色試験を行うために液体窒素中で凍結保存した。
【０１０４】
ｄ）次いで炎症性サイトカインＩＬ−８を、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｅ／Ｒ＆Ｄｓｙｓｔｅｍｓから市販されているキット（Ｄ８０００Ｃ）を用いてＥＬＩＳＡ法により測定した。各場合において、測定を２回ずつ行った。波長４５０ｎｍの吸光度又は光学密度（ＯＤ）を５７０ｎｍを基準として測定することにより測定の生データを得た。
【０１０５】
ｅ）試料中で測定されたＩＬ−８の濃度を、ＩＬ−８標準物質の濃度範囲を用いて決定した。ＩＬ−８標準物質（ｐｇ／ｍｌ）に関し得られたＯＤデータを、濃度を横軸、ＯＤを縦軸として検量線にプロットし、直線の検量線（ｐｇ／ｍｌ又はｎｇ／ｍｌ）を使用して、各データからブランクの平均値を減じることにより、ＯＤデータからＩＬ−８量を決定した。
ＯＤ≪試料≫＝ＯＤ生データ−平均ＯＤ≪ブランク≫
【０１０６】
各条件毎に定量値を平均した。ＩＬ−８濃度（ｎｇ／ｍｌ）を図４に示す。
【０１０７】
４）ＣＬＤＮ１及び４の免疫染色
ａ）これらのタンパク質の発現を蛍光免疫染色により観察した。これは２種の抗体を用いた標的タンパク質の検出を含む検出法である。第１の抗体は、当該タンパク質に特異的な、したがってタンパク質を検出する一次抗体であり；次いで一次抗体に特異的な二次抗体を使用し、タンパク質−一次抗体複合体を検出して蛍光を発光させる。このようにして、標的組織（この場合は表皮）の標的タンパク質の発現プロファイルを観察することができる。
【０１０８】
ｂ）免疫染色を行う前に、凍結保存しておいた外殖片からクリオスタットで切片を作製した。凍結切片をスライドガラスに載せて凍結保存した。
【０１０９】
ｃ）免疫染色を開始するために、スライドガラスを解凍し、アセトンで固定した。次いで一次抗体の非特異的結合部位を二次抗体の種と同一種由来の血清（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）でブロック（「ブロッキング」）した。切片を、クローディン１又は４を標的とする一次抗体（それぞれＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ｓｃ−８１７９６又はｓｃ−１７６６４）と一緒に室温でインキュベートした後、蛍光色素を結合させた二次抗体（Ａｌｅｘａ  ｔｙｐｅ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、４８８又は５４６ｎｍ、緑色又は赤色）と、核を染色するためのＤＮＡに特異的な青色蛍光マーカーであるＤＡＰＩ（Ｒｏｃｈｅ（登録商標））と一緒にインキュベートした。
【０１１０】
ｄ）最後に、スライドガラスを、蛍光を保護すると共にカバーガラスをスライドガラスに接着させる封入剤（Ｄａｋｏ）で「封入」した。スライドガラスを、４０倍対物レンズを用いて蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＣＫ４０）で、蛍光色素（ＦＩＴＣ（緑色）又はＴＲＩＴＣ（赤色））又はＤＡＰＩ（青色）に適したフィルタを取り付けて観察した。画像の取得は、Ａｒｃｈｉｍｅｄ  ｌｏｇｉｃｉｅｌ（Ｍｉｃｒｏｖｉｓｉｏｎ）で行った。
【０１１１】
ｅ）これらの２種の染色のそれぞれについて、一次抗体の特異性対照として、アイソタイプの対照を使用した。補助的（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）切片スライドにおいては、一次抗体に替えて、一次抗体の種と同一種由来の血清中の非特異的免疫グロブリン（ＩｇＧ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を使用した。
【０１１２】
ｆ）汚染あり又は汚染なしの、処理あり又は処理なしの皮膚外殖片の組織の健全性を検証するために、組織像用対照を作製した（受領した皮膚の品質及び処理による組織構造の劣化がないことを確認）。処理終了後に外殖片を４％ホルムアルデヒド中で固定及び保存した（各条件につき１片）。次いで外殖片をパラフィンに包理し、切片をスライドガラスに載せ、ヘマトリキシン／エオジン／サフラン（又はＨＥＳ）で染色した。
【０１１３】
５）結果
ａ）組織学的解析
（ｉ）ＢａＰ汚染物質を全身的に適用することにより、クローディン１の分解（発現の阻害及び網目の不完全性（ｍｅｓｈｉｎｇ  ｆａｉｌｕｒｅ））が観察された。
（ｉｉ）ＨＣＲ抽出物により、汚染物質により引き起こされる分解が回復した。
（ｉｉｉ）ＢａＰ汚染物質を適用することにより、クローディン４の発現も低下し（構造の損傷、蛍光輝度の低下：密度及び厚みが低下した領域）。
（ｉｖ）ＨＣＲ抽出物を全身的に適用することにより、汚染物質により引き起こされた網目の不完全性が回復した。
【０１１４】
ｂ）皮膚外殖片から放出されたＩＬ−８の測定
（ｉ）汚染あり又は汚染なしのＩＬ−８の測定結果を図４に示す。ここでは、データをＩＬ−８濃度として表す。汚染なしの対照（黒星印）と比較した場合の、又は汚染ありの対照（赤星印）と比較した場合の有意性を示す。
（ｉｉ）汚染後は、サイトカインの放出が刺激された：＋５９％、有意性あり（＊）（処理なし／汚染なし対照と比較した場合の汚染あり対照）。汚染なしでＰＭＡ（炎症促進性を有する対照分子）で刺激すると、サイトカインの放出が刺激された：＋２２４％、非常に高度な有意性あり（＊＊＊）（処理なし／汚染なし対照と比較）。
（ｉｉｉ）ＨＣＲ抽出物を全身的に適用すると、ＩＬ−８の放出が両方の条件（汚染あり又は汚染なし）で阻害された。汚染なしでは、この効果は−６９％であり、非常に高い有意性が認められた（＊＊＊、処理なし／汚染なし対照と比較）。汚染ありでは、汚染物質により誘導されるＩＬ−８の産生がＨＣＲ抽出物の適用により阻害され：−６９％、非常に高い有意性が認められた（＊＊＊、汚染あり対照と比較）。
【０１１５】
ｃ）この結果は、ＨＣＲ抽出物が汚染により誘導される炎症ストレスメディエーターに対抗する有効性を実証するものである。したがってＨＣＲ抽出物は、汚染物質により誘導される炎症ストレスから、並びに組織の健全性、恒常性、及び表皮バリア機能の維持に関与するタンパク質が受ける劣化から皮膚を保護するのに有効であると結論付けることができる。
【０１１６】
実施例５：ＨＣＲ抽出物が正常ヒト角化細胞のβ−エンドルフィン産生に与える効果の評価
１）背景情報
本試験の目的は、４種のＨＣＲ抽出物が３０歳の提供者（白人女性）の腹部の表皮から採取した正常ヒト角化細胞（ＮＨＫ）のβ−エンドルフィン（β−ＥＰ）に与えるｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果を評価することにあった。β−エンドルフィンは神経ペプチドであり、４０時間処理した後、培地の上清をＥＬＩＳＡ法で測定した。実施例２に記載したように、試験濃度を求めるためにＸＴＴアッセイを予め実施することにより細胞生存率を確認した。
【０１１７】
２）用量決定（ＸＴＴアッセイによる細胞毒性／生存率の確認）及び被験化合物の評価
ａ）ＸＴＴアッセイによる用量決定を、２４時間後に実施した（実施例§ｃの４８時間後に替えて）ことを除いて実施例２に記載した通りに実施した。
ｂ）細胞播種及び処理
処理を行う２４時間前に、細胞を、完全ＫＳＦＭ（角化細胞用無血清培地（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ  Ｓｅｒｕｍ  Ｆｒｅｅ  Ｍｅｄｉｕｍ）、抗生物質及び増殖用添加因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）添加）を加えた９６ウェルマイクロプレートに１２，５００角化細胞／ウェルで播種した（３７，５００細胞／ｃｍ２に相当、後段の試験に使用する細胞密度）（３７℃／５％ＣＯ２下でインキュベート）。基礎、即ち非添加培地（ＫＳＦＭ、増殖用添加因子非添加）中で被験化合物を各濃度で３連で試験した。インキュベート時間は２４時間とした（３７℃／５％ＣＯ２下）。
【０１１８】
３）角化細胞によるβ−エンドルフィン産生
ａ）ＮＨＫを２４ウェルプレートに播種し、異なる濃度の被験化合物で４０時間処理した。培地上清中のβ−ＥＰを、ＵＳＣＮ  Ｌｉｆｅ  ＳｃｉｅｎｃｅからのＥＬＩＳＡアッセイ（ＣＥＡ８０６Ｈｕ）により測定した。β−ＥＰ測定値を総タンパク質量に正規化するために細胞ペレットの総タンパク質量も測定した。ｄｂＡＭＰｃ（Ｎ−６，２’−Ｏ−ジブチリルアデノシン３’，３’−環状モノリン酸塩、Ｓｉｇｍａ  Ｄ０６２７）を陽性対照として２ｍＭで使用した。
【０１１９】
ｂ）細胞処理及びβ−ＥＰアッセイ
処理を行う４８時間前に、細胞を、完全ＫＳＦＭを加えた２４ウェルプレートに７５０００細胞／ウェル（３７５００細胞／ｃｍ２）で播種した（３７℃／５％ＣＯ２下でインキュベート）。抗プロテアーゼ分子カクテル（ロイペプチン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎｅ）、アプロチニン、及びフッ化フェニルメタンスルホニル又はＰＭＳＦ、それぞれＳｉｇｍａ  Ｌ８５１１、Ａ１１５３、及びＰ７６２６）を添加した基礎ＫＳＦＭ中、被験化合物の各濃度について３連で試験した。このカクテルにより、β−ＥＰタンパク質を測定時まで保護することができる。インキュベート時間は４０時間とする（３７℃／５％ＣＯ２下）。培地上清及び細胞ペレットを回収し、試験を行うまで−２０℃で保管した。
【０１２０】
ｃ）吸光度データ（又は光学密度ＯＤ）を４５０ｎｍで測定した。各試料を２連でアッセイした。したがって、各試料につき６個の値が得られた（それぞれ８個及び２個の値が得られる未処理の対照及び対照分子を除く）。
【０１２１】
ｄ）タンパク質測定（Ｂｃａアッセイ）
ビシンコニン酸に基づく比色定量法により、細胞ペレット中の総タンパク質量測定を平行して実施した。ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイの原理はローリー法と類似しており、どちらも、アルカリ性条件下にタンパク質−Ｃｕ２＋複合体を形成した後、Ｃｕ２＋がＣｕ＋に還元されることに基づいている。ＢＣＡはＣｕ＋イオンに非常に特異的であり、アルカリ性環境下にＣｕ＋と青紫色の複合体を形成し、したがって、アルカリ性Ｃｕ２＋のタンパク質による還元を監視することが基礎となる。還元量及びＢＣＡ−Ｃｕ＋複合体の量は存在するタンパク質に比例し、分光測定値をレクチャーする（波長５７０ｎｍ）ことにより定量化する。使用されるタンパク質測定キット（Ｓｉｇｍａ  ＢＣＡ１）は、ビシンコニン酸溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｂ９６４３）及び硫酸銅五水和物溶液（ＣｕＳＯ４−ＳｉｇｍａＣ２２８４）から構成される。ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン−Ｓｉｇｍａ  Ａ９４１８）を用いて検量線（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｒａｎｇｅ）を作製する。
【０１２２】
ｅ）細胞ペレットを、細胞溶解及び測定まで−２０℃で乾燥保存した。細胞を溶解して反応環境をアルカリ性にし、細胞ペレットを室温で平衡化した後、アルカリ性溶液中で３０分間溶解した。可溶化液（溶解した細胞ペレット）を分注して試薬混合物（ビシンコニン酸＋ＣｕＳＯ４）を加えることにより測定を実施した。プレートを３７℃でインキュベートした後、プレートを４℃で数分間静置して反応を停止した後、波長５７０ｎｍでレクチャーした。
【０１２３】
ｆ）結果の表現
β−ＥＰ及びタンパク質測定の両方について、各標準物質から得られたＯＤデータを検量線を求めるためにグラフにプロットした。次いで、試料中で測定されたタンパク質又はβ−ＥＰの量／濃度を決定することができる。定量した値を各条件毎に平均した。結果を図５、６、及び７に量／濃度（β−ＥＰはｐｇ／ｍｌ、総タンパク質はμｇ／ウェル）を示す。
【０１２４】
４）結果
ａ）用量決定（ＸＴＴアッセイによる細胞毒性／生存率確認）
０．０００５％〜０．０１％ＨＣＲ（ＤＥ）の間の試験濃度では線維芽細胞に細胞毒性は認められなかった。
【０１２５】
[表]
2020514279.tif 000005
【０１２６】
ｂ）β−エンドルフィン測定
２種類の試験濃度で誘導されることが分かった（０．００１％で＋１０２％＊＊＊、０．００５％で＋２５９％＊＊）、したがって、ＨＣＲ抽出物で処理することにより、角化細胞からのβ−ＥＰ放出に関し有利な効果が得られる。結果を図５に示す。
【０１２７】
ｃ）総タンパク質量測定
総タンパク質量に対し正規化すると、２種類の試験濃度で刺激作用が強調され（０．００１％で＋１２０％＊＊＊、０．００５％で＋４０２％＊＊）、ＨＣＲ抽出物で処理された角化細胞に認められるβ−ＥＰ放出に有利に作用することが裏付けられる。
【０１２８】
正常ヒト角化細胞は、測定を行った培地上清中にβ−エンドルフィン（β−ＥＰ）を産生し放出した。正常ヒト角化細胞をＨＣＲ抽出物（０．００１及び０．００５％）で処理することによりβ−ＥＰ放出刺激が誘導された。
【０１２９】
実施例６：Ｂ１６細胞におけるメラニン形成にＨＣＲ抽出物が与える効果の評価（メラニン測定）
１）背景情報
本試験の目的は、マウスのＢ１６メラニン細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいてＨＣＲ抽出物がメラニン形成に与える効果を評価することにある。この試験に使用した細胞は、マウス皮膚から採取したマウスメラニン細胞（Ｂ１６−Ｆ０  ｌｉｎｅ、ＬＧＣ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ、ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−６３２２）とした。この細胞株は多量のメラニンを合成して培地（いわゆる上清）中に放出するので、分光測定法による測定が容易である。これらのメラニン細胞を単層培養した。被験化合物を７２時間適用し、次いで上清中に放出された合成されたメラニンを測定した。実施例２に記載したように、試験濃度を決定するためにＸＴＴアッセイを予め実施しておき、細胞生存率を確認した。
【０１３０】
２）用量決定（ＸＴＴアッセイによる細胞毒性／生存率確認）及び評価した被験化合物
ａ）ＸＴＴアッセイによる用量決定を、処理を７２時間実施したことを除いて（実施例§ｃの４８時間に替えて）、実施例２に記載した通りに実施した。
【０１３１】
ｂ）細胞播種及び処理
処理を行う２４時間前に細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種した（細胞密度１０，５００細胞／ウェル、即ち３１，２５０  Ｂ１６／ｃｍ２、後段の試験で使用する密度）（３７℃／５％ＣＯ２でインキュベート）。被験化合物の各濃度について６連で試験した。インキュベート／処理時間は７２時間とした（３７℃／５％ＣＯ２下で）。フェノールレッド不含ダルベッコ改変イーグル培地、即ちＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  １１８８０）に、抗生物質（Ｇｉｂｃｏ  １５１４０）を添加し、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ２５０３０）を添加し、１０％ウシ胎児血清即ちＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  １０２７０）を添加して、細胞を播種した。
【０１３２】
３）メラニン形成に与える効果の評価
ａ）アッセイの原理
Ｂ１６メラニン細胞を２４ウェルプレートに播種した。次いで細胞を被験化合物（３種の濃度）で７２時間処理した。最後に、メラニン及び総タンパク質量測定を実施した。細胞培養液の写真を２４時間毎に撮影することにより、抽出物を適用している時間全体を通して（７２時間）メラニン放出の観察を行うことができた。本試験には陽性対照を使用した。
−  メラニン形成を阻害する対照分子（チロシナーゼ阻害剤）であるコウジ酸（Ｓｉｇｍａ  Ｋ３１２５）１ｍＭ、及びその逆の作用を有する、
−  色素形成を刺激する対照分子（ｃＡＭＰ刺激剤）であるαＭＳＨ類縁体、いわゆるメラノタン（Ｓｉｇｍａ  Ｍ８７６４、［Ｎｌｅ４，Ｄ−Ｐｈｅ７］−α−メラニン細胞刺激ホルモントリフルオロアセタート塩）１００ｎＭ。
【０１３３】
これらの対照物質の効果は、両方共、４８時間処理した後すぐに、またコウジ酸の場合は７２時間後に視認できるようになった。抽出物を３種の濃度で試験した（乾燥抽出物、即ちＤＥの重量／体積％）。ＸＴＴアッセイの結果に従い、これらを非細胞毒性用量で試験した。
【０１３４】
ｂ）細胞処理及びメラニン測定
処理を行う１日前に、上述の培地と同じ培地を加えた２４ウェルプレートに細胞を播種した（細胞密度６０，０００細胞／ウェル、即ち３１，２５０  Ｂ１６／ｃｍ２）（３７℃／５％ＣＯ２下でインキュベート）。次いで、被験化合物の各濃度／用量を３連で７２時間試験した（３７℃／５％ＣＯ２下でインキュベート）。培地の着色を２４時間毎に観察し、ブランク（細胞を含まない処理培地のみのウェル）と比較した。処理から４８又は７２時間後に上清を均質化し、９６ウェルプレートに分注して分光測定を行い波長４９２ｎｍで読み取った（２連で読み取り）。この測定により、Ｂ１６細胞から遊離したメラニンを合成メラニン（Ｍ０４１８）の検量線（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｒａｎｇｅ）に対し定量することが可能となった。
【０１３５】
ｃ）総タンパク質量測定（Ｂｃａアッセイ）
実施例５に記載したように、ビシンコニン酸に基づく比色定量法により細胞ペレットの総タンパク質量測定を平行して実施した。
【０１３６】
ｄ）結果の表現
メラニン測定及びタンパク量測定の両方について、それぞれの標準物質に関し得られたＯＤ測定値をグラフにプロットすることにより検量線を得た。次いで、測定された試料中のタンパク質又はメラニンの量／濃度を決定することができる。各条件毎に定量値を平均した。異なる濃度のＨＣＲ抽出物に関する結果を図８〜１３に示す。
【０１３７】
４）結果
ａ）用量決定（ＸＴＴアッセイによる細胞毒性／生存率確認）
０．０００５％〜０．０１％ＨＣＲ（ＤＥ）の試験濃度では線維芽細胞に細胞毒性は認められなかった。
【０１３８】
[表]
2020514279.tif 000006
【０１３９】
ｂ）メラニン測定
これらの実験において、色素形成阻害（ｄｅｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）の陽性対照であるコウジ酸（１ｍＭ）により、非常に強力且つ非常に高い有意性で（＊＊＊）培地中へのメラニン放出の阻害が誘導された（９０％超）。４８時間処理後、色素形成を誘発する陽性対照であるメラノタン（１００ｎＭ）は、強力且つ高い有意性で（＊＊）培地中へのメラニン放出を刺激した（２倍超）（結果の詳細は示さず）。７２時間後、メラニン放出は４８時間後よりも明確になった（ＯＤは２０倍超）。これは正常であり、４８時間後には強力な色素形成誘発を認めることができる。このモデルを７２時間処理すると、２種の最も濃度の高い被験ＨＣＲ抽出物は明確な色素形成阻害効果を示した。このモデルにＨＣＲ抽出物を７２時間適用すると、それぞれ、ＤＥ０．１％及び０．０５％（乾燥抽出物１ｍｇ／ｍｌ及び０．５ｍｇ／ｍｌに相当）で、用量反応関係で（ｄｏｓｅ  ｅｆｆｅｃｔ）、統計的に非常に高い有意性で（＊＊＊）メラニン放出が阻害された（−８６％及び−４５％）。メラニン形成の優れたモデルである本評価において、ＨＣＲ抽出物でＢ１６メラニン細胞を７２時間処理することにより、メラニン合成を阻害することができた。したがって、ＨＣＲ抽出物はメラニン遊離の低減に有効であり、したがって、日光により誘発される色素斑、即ちムラのある不均一な色素沈着を防ぐことが可能であることが見出された。
【０１４０】
実施例７：正常ヒト角化細胞におけるＨＣＲ抽出物の抗酸化性の評価（Ｈ２ＤＣＦＤＡプローブによるＲＯＳ検出）
１）背景情報
本評価の目的は、腹部形成術から採取した（年齢６２歳の白人女性提供者）培養正常ヒト角化細胞の酸化ストレスに対する抽出物ＨＣＲの抗酸化効果及び抗汚染効果を、Ｈ２ＤＣＦＤＡプローブを用いて評価することにある。ジクロロジヒドロフルオレセインプローブ（Ｈ２ＤＣＦＤＡ／ジクロロフルオレセイン二酢酸）は細胞内の活性酸素種（ＲＯＳ）の指示薬であるフルオレセインを化学的に還元した形態である。これは細胞浸透性であり安定である。細胞内に浸透する際にアセテート基が細胞内エステラーゼにより切断される。結果として得られる生成物は蛍光を発しないジクロロジヒドロフルオレセイン（即ちＨ２ＤＣＦ）である。ＲＯＳ（Ｏ２−、ＯＨ、ＮＯ、ＯＮＯＯ等）が存在すると、即ち酸化されると、強力な蛍光を発する生成物であるジクロロフルオレセイン（即ちＤＣＦ）に変換される。プローブの酸化は１種類のＲＯＳに特異的な訳ではない。蛍光を波長４９０ｎｍ（励起光）及び５２５ｎｍ（放射光）で検出する。酸化ストレスは、環境中の汚染物質であるベンゾ（ａ）ピレン（３，４−ベンゾピレン／ＢａＰ）、又は活性酸素種（ＲＯＳ）を生成する対照物質である過酸化水素（酸素化された水／Ｈ２Ｏ２）により誘導される。試験濃度を決定するために、ＸＴＴアッセイを予め実施しておき、実施例２に記載したように細胞生存率を確認した。
【０１４１】
２）酸化防止効果の評価（Ｈ２ＤＣＦＤＡプローブ）
ａ）アッセイの原理
正常ヒト角化細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種し、次いで被験化合物で２４時間処理した後、ＲＯＳを検出するための蛍光プローブを添加し、汚染物質又は過酸化水素により刺激を行うか又は刺激を行わない。この試験は、検出系として、ＲＯＳと接触すると分解されて蛍光を発するプローブを使用することに基づいている。このプローブＨ２ＤＣＦ−ＤＡは、細胞内エステラーゼにより２個のＣＨ３−ＣＯＯＨ基が切断された後、プローブが細胞内に存在するＲＯＳと出会うことにより、２個の水素原子を失って蛍光性ＤＣＦとなる。
【０１４２】
ｂ）細胞処理及びメラニン測定
細胞を完全ＫＳＦＭ培地を加えた９６ウェルマイクロプレートに１０，０００角化細胞／ウェル（３０，０００細胞／ｃｍ２）で播種し、３７℃／５％ＣＯ２下で２４時間接着を促した。細胞を３種の非細胞毒性濃度の被験抽出物で２４時間処理（６連、非添加培地中）し、対照条件（未処理対照又は抗酸化性陽性対照）と平行して、３７℃／５％ＣＯ２下でインキュベートした。この試験には、内部抗酸化性陽性対照を１０μＭで使用した。
【０１４３】
[表]
2020514279.tif 000007
【０１４４】
ｃ）プローブの添加
細胞を洗浄した後、プローブ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄ３９９、非添加ＫＳＦＭで５０μＭに希釈）を適用し、プレートを３７℃／５％ＣＯ２下で４５分間インキュベートした。細胞を含まない（但しプローブ及び被験抽出物（ｐｒｏｄｕｃｔ）を含む）ブランクウェルを作製した。
【０１４５】
ｄ）ＲＯＳ刺激
細胞を洗浄した後、ＢａＰ（Ｓｉｇｍａ  ＣＲＭ４００７１）又は過酸化水素溶液（Ｓｉｇｍａ  Ｈ１００９）を予定のウェルに適用した（刺激条件、最終濃度それぞれ３６μＭ及び１ｍＭ、非添加ＫＳＦＭ中）。他のウェル（非刺激条件）には培地のみを適用した。プレートを３７℃／５％ＣＯ２下で２０分間インキュベートした。
【０１４６】
ｅ）結果の表現
インキュベート後、蛍光を波長４９０ｎｍ（励起光）及び５２５ｎｍ（放射光）で読み取った（Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ＩＩ  ｒｅａｄｅｒ）。データはＲＦＵ（蛍光単位）で表す。データを収集し、ブランクデータの平均値を減じる。
ＲＦＵ≪試料≫＝ＲＦＵ生データ−平均ＲＦＵ≪ブランク≫
【０１４７】
３）結果
ＲＯＳ刺激あり（過酸化水素又はＢａＰによる）又は刺激なしの抗酸化性アッセイの結果を図１４及び１５に示す。ここではデータを蛍光単位で表す（ＲＦＵ）。刺激なしの対照（未処理のアセトン溶媒対照：黒星印）と比較するか、又はＨ２Ｏ２若しくはＢａＰ刺激した対照（赤星印）と比較するかのいずれかによる有意性（Ｔ検定）を示す。ブランク対照（細胞なし、被験化合物あり）を用いることにより、被験抽出物又は陽性対照とＨ２ＤＣＦ−ＤＡプローブとの相互作用がないことを確認することができる。ＲＯＳ刺激がない場合は、異なる試験のいずれにおいても効果は認められなかった。過酸化水素で処理を行うと、細胞はフリーラジカルを産生し、＋８０８％（刺激なし対照と比較）となるＲＯＳ産生刺激が認められた。ＢａＰを適用すると、同じく＋１４１％の刺激が認められた（刺激なしアセトン溶媒対照と比較）。使用した対照分子に関しては、ＲＯＳ刺激を行うと、抗酸化効果が認められ、且つ有意性があり、ＲＯＳ産生が−２１％（＊、Ｈ２Ｏ２の場合）及び−３３％（＊、ＢａＰの場合）低減された。被験ＨＣＲ抽出物は０．０１％の濃度で有効性を示し、この最大試験濃度は、ＢａＰ汚染物質の刺激によるＲＯＳ産生を阻害することが可能であった（ＲＯＳの減少を検出）：−２３％、ほぼ有意（ｐ＝０．１２２）。したがって本評価から、最大試験濃度の被験ＨＣＲ抽出物（０．０１％）は抗酸化性及び抗汚染物質性を有することが示される。
【０１４８】
実施例８：青色光を照射した線維芽細胞のオートファジー活性ヘディキウム・コロナリウム（Ｈｅｄｙｃｈｉｕｍ  ｃｏｒｏｎａｒｉｕｍ）根抽出物（ＨＣＲ抽出物）が与える効果の評価（ＭＤＣアッセイ）
１）背景情報
本試験の目的は、４５３ナノメートルの青色光を照射した線維芽細胞のオートファジー活性に１種のＨＣＲ抽出物が与える効果を評価することにある。細胞（正常ヒト線維芽細胞即ち（ＮＨＦ））を初代単層培養する。被験化合物を２４時間適用した後、照射し、被験化合物を２４時間適用し、次いでオートファジー活性を測定する（ＭＤＣ）。
【０１４９】
リソソームは生存期間を超えているか又はそれ以外の形でもはや利用できない細胞物質を再利用することを可能にする細胞質の細胞小器官である。これらの主要な機能は、真核細胞内で内因性又は外因性物質を消化（いわゆるオートファジー）することにある。リソソームは、細胞の老廃物、脂肪、炭水化物、タンパク質、及び他の巨大分子を小さな化合物に分解し、次いでこれを新たな細胞構築材料として細胞質に送り返す。実際、その脂質膜は、多くの酵素、プロトンポンプ、及び輸送タンパク質を含む。ｐＨは、酸性ヒドロラーゼの活性を最適化するように酸性に調整される［１］−［２］。蛍光を発するＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒプローブは生細胞に容易に取り込まれるような構造を有している（フルオロフォアは中性ｐＨでごく一部がプロトン化される弱塩基に結合している）。この特徴により、この標識／染色が酸性細胞小器官、即ちリソソームに対し非常に高い選択性を示すようになる［３−５］。次いで、放射、例えば、青色光等がリソソーム量に及ぼす作用を評価することができる。実際、これらの放射はフリーラジカルを生成させ、正常なリソソームネットワーク、その細胞空間内の分布に影響を及ぼす。これは専用の蛍光プローブであるＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒで可視化することができる。オートファジーはリソソームと融合した液胞内で細胞質物質を消化する真核細胞プロセスである。実際、リソソームは細胞質の断片を直接（ミクロオートファジー）、又は、オートファゴソームと称されるオートファジーを行う液胞（ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｖａｃｕｏｌｅ）を介して（マクロオートファジー、リソソーム及びオートファゴソームの融合体がいわゆるオートリソソームである）取り込むことができる。オートファジーは細胞の貯蔵エネルギーの移動を可能にすると共に、損傷した細胞小器官を防御及び破壊することにより深刻な影響を回避する重要な機構である。このプロセスにより、タンパク質及び機能していない細胞小器官の除去及び置き換えが可能になり、それによって恒常性が確保される。これは栄養欠乏（飢餓）等の様々な種類のストレス又は損傷に細胞応答を適応させる、不可欠な細胞保護機構である。したがって、これは細胞の生存に必須であり、発生、免疫、細胞分化（表皮内で角化細胞が分化して角質細胞になることを含む）等の他の基本的な生理学的現象にも必須である。これは、寿命制御、老化、及び癌や糖尿病、感染性、代謝性、又は神経変性疾患等の病態の発生にも関与している［６−７］。ＭＤＣプローブはオートファジーを行う液胞に特異的であり、容易に且つ特異的にオートファジー活性を定量することが可能である［８］。
【０１５０】
２）アッセイの原理
ａ）抽出物ＨＣＲのオートファジー活性に与える効果を評価するために、線維芽細胞を９６ウェルプレートに播種し、抽出物（ｐｒｏｄｕｃｔ）で処理し、照射し、再び処理すると、ＭＤＣプローブでオートファジー活性を測定することが可能になる。２種の陽性対照として、ＵＶ照射による酸化ストレスから保護することが知られている抗酸化剤である、ビタミンＣ（Ｌ−アスコルビン酸、Ｓｉｇｍａ  Ａ４５４４）５００μＭ（８８μｇ／ｍＬ）及びビタミンＥ（α−トコフェロール酢酸エステル、Ｓｉｇｍａ  Ａ１１５７）２００μＭ（９５μｇ／ｍＬ）を本試験に使用する。抽出物ＨＣＲを３種の濃度で試験し（乾燥抽出物、即ちＤＥの重量／体積％（液体抽出物であるため））、各用量を５連で評価した（５ウェル）。４５３ｎｍ青色光の照射線量は４０Ｊ／ｃｍ２（２３ｍＷ／ｃｍ２で２９分間）とする。
【０１５１】
ｂ）処理を行う２４時間前に細胞を９６ウェルマイクロプレートに播種する（細胞密度１０，０００細胞／ウェル、即ち３０，０００ＮＨＦ／ｃｍ２）（３７℃／５％ＣＯ２下でインキュベート）。
【０１５２】
次いで細胞を抽出物で２４時間処理（予防効果）した後、照射するか（４５３ｎｍＢＬ、４０Ｊ／ｃｍ２、２３ｍＷ／ｃｍ２で２９分間）又は照射しない。次いで線維芽細胞を再び生成物で更に２４時間処理する（治療効果）（したがって合計４８時間適用）。細胞を完全培地：抗生物質（Ｇｉｂｃｏ  １５１４０）及び１０％ウシ胎児血清即ちＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  １０２７０）添加ダルベッコ改変イーグル培地、即ちＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ４１９６６）に播種する。処理はＦＢＳ不含培地で行う。照射はＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）中で行う。全てのインキュベーション／処理時間は３７℃／５％ＣＯ２下で（照射を室温で行ったことを除く）で行う。
【０１５３】
ｃ）オートファジー活性評価（ＭＤＣアッセイ）
処理の終了後、ウェルを穏やかに洗浄（ＰＢＳ）し、０．０５ｍＭ  ＭＤＣプローブを細胞に適用する（Ｓｉｇｍａ  ３０４３２）［１７］（３７℃／５％ＣＯ２）。３０分間インキュベートし、洗浄した後、蛍光を波長３８０ｎｍ（励起光）及び５２５ｎｍ（放射光）で測定する（Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ＩＩ装置）。得られたデータをＲＦＵ（実測蛍光単位（ｒｅａｌ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｕｎｉｔｓ））で表す。ブランクを作製する（プローブを含むが細胞を含まないウェル）。
【０１５４】
３）結果の表現
全てのデータからブランクの平均値を減じ、次いで各条件毎にＲＦＵの平均値を求めた。好適な対照（照射あり又は照射なし）に関し得られたデータと比較してスチューデントのｔ検定（ｔ−Ｔｅｓｔ）により有意性を計算した。
【０１５５】
４）結果
結果を次の表１に示す：
【０１５６】
【表１】
2020514279.tif 000008
【０１５７】
５）解析及び考察
この結果は、線維芽細胞に青色光（波長４５３ナノメートル）を照射するとオートファジー活性が増大することを示している。ビタミンＣ又はビタミンＥで処理し、４５３ナノメートルで照射すると、線維芽細胞のオートファジー活性はビタミンＣで１４％低下し、ビタミンＥで２２％低下する。異なる重量濃度、即ち０．００１％、０．００５％、及び０．０１％のＨＣＲ抽出物で処理すると、前記線維芽細胞のオートファジー活性はそれぞれ約１３％、１５％、及び３５％低下する。
【０１５８】
参考文献
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［３］；Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｏｆ  ８−ｈａｌｏｇｅｎａｔｅｄ  ｑｕｉｎｏｌｏｎｅｓ：ｌｏｍｅｆｌｏｘａｃｉｎ，ｃｌｉｎａｆｌｏｘａｃｉｎ  ａｎｄ  Ｂａｙ３１１８  ｉｎ  ｌｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ＨａＣａＴ  ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ．Ｋｏｋｅｒ  ＥＢ，Ｂｉｌｓｋｉ  ＰＪ，Ｍｏｔｔｅｎ  ＡＧ，Ｚｈａｏ  Ｂ，Ｃｈｉｇｎｅｌｌ  ＣＦ，Ｈｅ  ＹＹ．Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．２０１０；８６（４）：７９２−７９７．
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［７］：Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｊｉａｎｇ  Ｐ，Ｍｉｚｕｓｈｉｍａ  Ｎ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１４；２４（１）：６９−７９．
［８］：Ｍｏｎｏｄａｎｓｙｌｃａｄａｖｅｒｉｎｅ  （ＭＤＣ）  ｉｓ  ａ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｐｈａｇｉｃ  ｖａｃｕｏｌｅｓ．Ｂｉｅｄｅｒｂｉｃｋ  Ａ，Ｋｅｒｎ  ＨＦ，Ｅｌｓａｅｓｓｅｒ  ＨＰ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９９５；６６（１）：３−１４．
【図１】
2020514279.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2020514279.tif 000019
【図１２】
2020514279.tif 000020
【図１３】
2020514279.tif 000021
【図１４】
2020514279.tif 000022
【図１５】
2020514279.tif 000023
【国際調査報告】
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2020514279.tif 000025
2020514279.tif 000026
2020514279.tif 000027
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