(57)【要約】本開示は、インスリン様成長因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）に対するアンチセンス（ＡＳ）核酸を用いて癌を治療するための組成物及び方法に関する。ＡＳは、患者に全身投与しうるか、又は自己由来癌細胞ワクチンを製造するために使用しうる。実施形態では、ＡＳは、腫瘍細胞と有効量のＡＳとを含む植込み型照射バイオ拡散チャンバーで提供される。チャンバーは、照射され、対象の腹部に植え込まれ、そして免疫反応を刺激して腫瘍を遠位から攻撃する。本明細書に開示された組成物及び方法は、多種多様な癌たとえば膠芽細胞腫を治療するために使用しうる。
2020510021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌を有する対象に植え込むためのバイオ拡散チャンバーを作製する方法であって、
（ａ）前記対象から得た腫瘍細胞をＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの存在下で前記バイオ拡散チャンバーに封入することであって、前記チャンバー内の腫瘍細胞とＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮとの比が約３．７５×１０５：１μｇ〜約６．２５×１０５：１μｇの範囲内であり、前記腫瘍細胞が組織モルセレータを用いて前記対象から得られる、封入することと、
（ｂ）前記バイオ拡散チャンバーに照射することと、
を含む方法。
【請求項２】
前記チャンバーに前記腫瘍細胞を封入する前に前記腫瘍細胞が分散される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が前記対象からの取出し時に体温を超える温度に暴露されない、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が前記対象からの取出し時に３７℃を超える温度に暴露されない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記組織モルセレータが無菌トラップを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組織モルセレータが静置外側カニューレ内に高速往復内側カニューレを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記外側カニューレがサイドアパーチャを含み、且つさらに前記腫瘍細胞が電子制御可変吸引により前記サイドアパーチャに吸い込まれる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオ拡散チャンバーに配置される前に前記腫瘍細胞がネスチン発現に関して富化される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記チャンバー内の前記腫瘍細胞が前記対象から得られた前記腫瘍細胞と比較して接着細胞に関して富化される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍細胞が接着細胞から本質的になる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が前記チャンバーへの封入前にＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮで処理される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮが封入前の前記処理時に約２ｍｇ〜約６ｍｇ／１００万細胞で存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮが封入前の前記処理時に約４ｍｇ／１００万細胞で存在する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
封入前のＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮによる前記処理が約１８時間までにわたる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
封入前のＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮによる前記処理が約１２時間〜約１８時間にわたる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮが配列番号１の配列を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記チャンバー内の前記ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮが約２μｇで存在する、請求項１に記載のチャンバー。
【請求項１８】
前記照射腫瘍細胞が約７５０，０００〜約１，２５０，０００／チャンバーの範囲内で存在する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記照射腫瘍細胞が約１，０００，０００／チャンバーで存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１に記載の２つ以上のバイオ拡散チャンバーを前記対象に植え込むことを含む、癌を有する対象を治療する方法。
【請求項２１】
約１０〜約３０個のバイオ拡散チャンバーが前記対象に植え込まれる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
約１０〜約２０個のバイオ拡散チャンバーが前記対象に植え込まれる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記拡散チャンバーが前記対象に約４８時間植え込まれる、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が脳癌である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記脳癌が、グレードＩＩ星状細胞腫、グレードＡＩＩＩ星状細胞腫、グレードＡＩＩＩ−Ｇ星状細胞腫、及びグレードＩＶ星状細胞腫（多形膠芽細胞腫）から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記脳癌がグレードＩＶ星状細胞腫（多形膠芽細胞腫）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記方法が、化学療法を用いずに、放射線療法を用いずに、又は両方を用いずに実施される、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
第１の植込みに続いてチャンバーの第２の植込みを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２の植込みが、前記第１の投与から得られた細胞と同時に前記対象から得られた腫瘍細胞を使用する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２の植込みが、前記第１の治療が終了した後で前記対象から得られた腫瘍細胞を使用し、前記腫瘍は、再発したものであるか又は前記第１の治療に反応しなかったものである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
脳癌を有する対象にワクチン接種する方法であって、
（ｉ）前記対象から細切腫瘍組織を得ることと、
（ｉｉ）前記細切組織を無菌トラップに採取することと、
（ｉｉｉ）前記細切組織から接着細胞を捕集することと、
（ｉｖ）配列番号１の配列を有するインスリン様成長因子レセプター１アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ）と一緒に、前記捕集された細胞をバイオ拡散チャンバーに封入することであって、前記チャンバーが約７５０，０００〜約１，２５０，０００腫瘍細胞を含有する、封入することと、
（ｖ）前記チャンバーに照射することと、
（ｖｉ）前記チャンバーを前記対象に植え込むことと、を含み、
前記脳癌に対する免疫反応が得られる、方法。
【請求項３２】
封入前に１８時間までにわたりＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮで前記接着細胞を処理するステップを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が約４８時間にわたり２０個のチャンバーでワクチン接種される、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記チャンバー内の腫瘍細胞とＡＳ  ＯＤＮとの比が、約３．７５×１０５細胞：１μｇＡＳ  ＯＤＮ〜約６．２５×１０５細胞：１μｇＡＳ  ＯＤＮの範囲内である、請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮが約１μｇ〜約５μｇで存在する、請求項３１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮが約２μｇで存在する、請求項３１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記腫瘍細胞が体温を超える温度に暴露されない、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
約１０６腫瘍細胞が前記チャンバー内に存在する、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記脳癌が、グレードＩＩ星状細胞腫、グレードＡＩＩＩ星状細胞腫、グレードＡＩＩＩ−Ｇ星状細胞腫、及びグレードＩＶ星状細胞腫（多形膠芽細胞腫）から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項４０】
前記脳癌がグレードＩＶ星状細胞腫（多形膠芽細胞腫）である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
脳癌を有する対象に植え込むためのバイオ拡散チャンバーであって、
（ａ）照射された腫瘍細胞であって、
前記腫瘍細胞が、前記対象の腫瘍組織から得られた接着細胞を含み、
前記腫瘍細胞が、前記チャンバー内への封入前にインスリン様成長因子レセプター１アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ）と共にプレインキュベートされる、照射された腫瘍細胞と、
（ｂ）照射されたＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮであって、
前記ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮが配列番号１の配列を有する、照射されたＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮとを含み、
前記チャンバー内の腫瘍細胞とＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮとの比が、約３．７５×１０５細胞：１μｇＡＳ  ＯＤＮ〜約６．２５×１０５細胞：１μｇＡＳ  ＯＤＮの範囲内である、バイオ拡散チャンバー。
【請求項４２】
前記ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮが約１〜約５μｇで存在する、請求項４１に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項４３】
前記ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮが約２μｇで存在する、請求項４１に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項４４】
前記チャンバー内の前記腫瘍細胞が、前記対象から得られた前記腫瘍組織と比較してネスチン陽性細胞に関して富化されている、請求項４１〜４３のいずれか一項に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項４５】
約１０６腫瘍細胞が前記チャンバー内に存在する、請求項４１〜４４のいずれか一項に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項４６】
前記腫瘍細胞が組織モルセレータを用いて前記対象から得られるものである、請求項４１〜４５のいずれか一項に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項４７】
前記組織モルセレータが静置外側カニューレ内に高速往復内側カニューレを含む、請求項４６に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項４８】
前記外側カニューレがサイドアパーチャを含み、且つさらに前記腫瘍細胞が電子制御可変吸引により前記サイドアパーチャに吸い込まれるものである、請求項４７に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項４９】
前記対象から前記腫瘍組織を得るとき、前記組織モルセレータが熱を生成しない、請求項４６に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項５０】
前記腫瘍細胞が前記チャンバー内に約７５０，０００〜約１，２５０，０００の範囲内で存在する、請求項４１〜４８のいずれか一項に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項５１】
前記チャンバー内の腫瘍細胞とＡＳ  ＯＤＮとの比が約５．０×１０５細胞：１μｇである、請求項４１〜４９のいずれか一項に記載のバイオ拡散チャンバー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、インスリン様成長因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）に対するアンチセンス核酸を用いて癌を治療するための組成物及び方法に関する。本開示はまた、腫瘍細胞とＩＧＦ−１Ｒに対するアンチセンス核酸とを含む少なくとも１つの植込み型照射バイオ拡散チャンバー（米国特許第６，５４１，０３６号明細書及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０２６９７０号パンフレット（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）を用いて対象を治療することにより癌を治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌療法の進歩にもかかわらず、悪性神経膠腫とくに多形膠芽細胞腫及び多くの他の癌の予後は、依然として不良である。標準的治療、たとえば、化学療法、外部ビーム放射線療法、ブラキ療法などに修正を加えても、無進行生存及び全生存の両方でごくわずかずつ改善されるにすぎない。免疫療法試験は、理論上有望であるが、固形腫瘍によりもたらされる難題に対処していない。神経膠腫の治療に関して、国立癌研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）は、年間発生数を毎年約２８，０００症例と推定しており、再発神経膠腫の患者を含めると５０，０００症例超に増加する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
したがって、癌とくに脳癌の新しい改善された治療を達成する必要性が当技術分野に存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、インスリン様成長因子レセプター１（ＩＧＦ−１Ｒ）を標的とするアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ）が、本明細書に記載の治療法で使用されたとき、癌を治療する対象における反応を効果的に刺激することを実証する。特定の態様では、方法は、患者において自己由来癌細胞ワクチンの一部として単独で又は任意選択的に全身投与と共に癌を治療するのに有効である。好ましい方法では、本明細書に開示される方法は、単独療法として、すなわち、化学療法の不在下且つ放射線療法の不在下で有効な癌療法を提供する。
【０００５】
実施形態では、本開示は、腫瘍に罹患している対象に植え込むためのバイオ拡散チャンバーを提供する。このバイオ拡散チャンバーは、照射腫瘍細胞と照射インスリン様成長因子レセプター１アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ）とを含む。実施形態では、腫瘍細胞は、対象の切除部位から取り出される。
【０００６】
実施形態では、本開示は、照射ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮと照射接着強化細切腫瘍細胞とを含む拡散チャンバーを提供する。このバイオ拡散チャンバーは、細胞に対して不透過性且つＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮに対して透過性の細胞膜を含む。
【０００７】
実施形態では、腫瘍細胞は、内視鏡デバイスを用いて切除部位から取り出される。さらなる実施形態では、腫瘍細胞は、組織モルセレータを用いて切除部位から取り出される。他の実施形態では、組織モルセレータは、静置外側カニューレ内に高速往復内側カニューレを含む。外側カニューレは、サイドアパーチャを含みうるとともに、さらに腫瘍細胞は、電子制御可変吸引によりサイドアパーチャに吸い込まれる。実施形態では、組織モルセレータは、切除部位で熱を生成しない。そのほかのさらなる実施形態では、腫瘍細胞は、バイオ拡散チャンバーに配置される前にネスチン発現に関して富化される。いくつかの実施形態では、チャンバーの植込みは、対象において腫瘍の再成長を阻害する。いくつかの実施形態では、チャンバーの植込みは、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、又は少なくとも３６ヵ月間にわたり腫瘍の再成長を阻害する。
【０００８】
そのほかの実施形態では、本開示は、腫瘍に罹患している対象に植え込むためのバイオ拡散チャンバーの作製方法を提供する。この方法は、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの存在下でバイオ拡散チャンバーに腫瘍細胞を配置することと、バイオ拡散チャンバーに照射することと、を含み、腫瘍細胞は、対象において、切除部位で熱を生成しない組織モルセレータを用いて切除部位から取り出される。典型的には、複数のチャンバーが使用される。たとえば、約１０個のチャンバー又は約２０個のチャンバー。有利には、最適抗腫瘍反応は、チャンバー内の細胞数が約７５０，０００〜約１，２５０，０００のときに達成される。たとえば、２０個のチャンバーが植え込まれる場合、約１，０００，０００／チャンバーである。
【０００９】
いくつかの実施形態では、組織モルセレータは内視鏡デバイスである。さらなる実施形態では、組織モルセレータは、静置外側カニューレ内に高速往復内側カニューレを含む。そのほかの実施形態では、外側カニューレは、サイドアパーチャを含み、且つ腫瘍細胞は、電子制御可変吸引によりサイドアパーチャに吸い込まれる。
【００１０】
実施形態では、本開示は、腫瘍に罹患している対象の治療方法を提供する。この方法は、１つ以上のバイオ拡散チャンバーを対象に植え込むことを含み、１つ以上のバイオ拡散チャンバーは、照射腫瘍細胞と照射インスリン様成長因子レセプター１アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ）とを含み、腫瘍細胞は、対象において、切除部位で熱を生成しない組織モルセレータを用いて切除部位から取り出される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１−１】図１ａ〜１ｇは、代表的バイオ拡散チャンバーを示す。図１ａ．コンポーネントパーツ、図１ｂ．アセンブルされたチャンバー、図１ｃ．チャンバーをシールするＰＭＭＡポートプラグ。
【図１−２】図１ａ〜１ｇは、代表的バイオ拡散チャンバーを示す。図１ｄ．ポリビニリジンフルオライドデュラポア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）メンブレンの顕微鏡写真、図１ｅ．実際のチャンバーの俯瞰視及び側面視、図１ｆ．及び図１ｇ．外植後のデュラポア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）メンブレンのＨ＆Ｅ染色パラフィン切片、図１ｆ．ヒト試験１４３７９−１０１の外植リン酸緩衝生理食塩水対照チャンバー、図１ｇ．ヒト試験１４３７９−１０１の外植ワクチンチャンバー。
【図２ａ】図２ａ〜２ｃは、第Ｉ相試験（ＩＮＤ１４３７９−１０１、ＮＣＴ０１５５０５２３）における対象の生存メトリックを示す。図２ａ．試験における患者の全生存。
【図２ｂ】図２ａ〜２ｃは、第Ｉ相試験（ＩＮＤ１４３７９−１０１、ＮＣＴ０１５５０５２３）における対象の生存メトリックを示す。図２ｂ．２つの生存コホートのプロトコル生存。９名の患者は疾患進行で死亡し、一方、１名は脳内出血で、２名は敗血症で死亡した。全プロトコル生存は、より長い（Ｎ＝４）及びより短い（Ｎ＝８）生存コホートのそれぞれに対して、４８．２週間及び９．２週間であった（ログランク＝．０１４）。
【図２ｃ】図２ａ〜２ｃは、第Ｉ相試験（ＩＮＤ１４３７９−１０１、ＮＣＴ０１５５０５２３）における対象の生存メトリックを示す。図２ｃ．１名の重度のリンパ球減少の外れ値及び３名の非疾患関連死亡を除いて、線形回帰は、プロトコル生存と登録時のリンパ球数との間に高い相関を呈した（Ｒ２＝．８、ｐ＝．００２８）。
【図３−１】図３ａ〜３ｄは、関連する生理学的測定によるラジオグラフィー反応を示す。図３ａ．短い生存コホートの患者イメージングの例。患者ＴＪ１１：Ａ〜Ｄ、患者ＴＪ１０：Ｅ〜Ｈ。Ａ、Ｅ：術前Ｔ１ガドリニウム増強アキシャル像、Ｇ：Ｔ１ガドリニウム増強コロナル像、Ｃ：術前アキシャルＦＬＡＩＲ像。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ：それぞれ術後３ヶ月像。図３ｂ．より長い生存コホートの患者イメージングの例。患者ＴＪ０６：Ａ〜Ｄ、患者ＴＪ０９：Ｅ〜Ｈ。Ａ、Ｅ：術前Ｔ１ガドリニウム増強アキシャル像、Ｃ、Ｆ：術前アキシャルＦＬＡＩＲ像。Ｂ、Ｄ、Ｆ、Ｈ：それぞれ術後３ヶ月像。
【図３−２】図３ａ〜３ｄは、関連する生理学的測定によるラジオグラフィー反応を示す。図３ｃ．より長い生存コホートにおける腫瘍の相対脳血液量と見掛けの拡散係数との関係、ＡＤＣとｒＣＢＶとの間には高い相関が存在する（Ｒ２＝．９６、ｐ＝．０００５）。図３ｄ．短い生存コホートにおける腫瘍の相対脳血液量と見掛けの拡散係数との関係。
【図４ａ】図４ａ〜４ｃは、生存コホート別に外植チャンバーの検査を示す。図４ａ．外植チャンバーは、生存細胞がなく構造的にインタクトであった。Ｃ−ｐ及びＣ−ｖチャンバーの両方のメンブレンの外表面は、ＣＤ１５＋及びＣＤ１６３＋細胞で被覆され、Ｃ−ｖメンブレン上の数は劇的に増加した。
【図４ｂ】図４ａ〜４ｃは、生存コホート別に外植チャンバーの検査を示す。図４ｂ．より長いコホートでは、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−α、ＩＬ−１１、ＣＣＬ５、ＭＣＰ−３、及びＭＩＰ−１ｄが有意にチャンバー上昇し、一方、短いコホートでは、ＮＳＥ、オステオネクチン、及びＹＫＬ４０をはじめとするいくつかの可溶性癌マーカが有意に上昇することが、生存コホート間のチャンバー因子分析から明らかにされた。混合判別分析により独立してこれらのコホート差が同定された。
【図４ｃ】図４ａ〜４ｃは、生存コホート別に外植チャンバーの検査を示す。図４ｃ．両方のコホートで、神経膠腫マクロファージリクルートメントに関連する２つのケモカインは、Ｃ−ｖにおいて他の測定可能な供給源よりも有意に低かった。ペリオスチン及びＣＣＬ２のレベルは両方とも、血清又はＳＮ（腫瘍細胞上清）の値よりも有意に低かったことから、チャンバー内においてこれらのケモカインの細胞産生が排除されたことが示唆される。
【図５】図５ａ〜５ｅは、ワクチン接種後のＰＢＭＣ及びサイトカインのレベルを示す。治療後の期間におけるワクチン接種後の免疫エフェクター細胞シフト及びサイトカイン／ケモカインシフトの逐次測定、より長い生存コホート（患者ＴＪ０３、ＴＪ１４、ＴＪ０６、ＴＪ０９）、短い生存コホート例の患者ＴＪ１３（すべての他の短い生存コホートについては、図６を参照されたい）。行：図５ａ．ワクチン接種後の逐次ＰＢＭＣ数。図５ｂ．ワクチン接種後のＰＢＭＣサブ集団パーセントの逐次評価。図５ｃ．ＣＣＬ２１及びＣＸＣＬ１２の逐次レベル。図５ｄ．絶対ＣＤ１４＋ＣＤ１６−マクロファージ数とＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）との関係。図５ｂのマクロファージレベル及び術後ＣＣＬ２スパイクとの相関に留意されたい。ＣＣｌ２レベルは、短い生存コホートでは有意により高く維持された（図６参照）。図５ｅ．ワクチン接種後の推定ＴＨ−１サイトカイン反応のスケール調整比較（ＴＮＦ−α×２、ＣＸＣＬ９×３５０、ＣＸＣＬ１０×８０）。次のような有意な相関が特筆すべきであった。すなわち、ＴＮＦ−αスパイクは、両方のコホートでＣＣＬ２スパイクと高い相関があった（Ｒ２＝．９９、ｐ＝．００３）。ＣＤ１４＋１６−細胞の有意な即時周術期減少（ｐ＝．００８）は、短いコホートでは見られなかった（ｐ＝．７８）。より長いコホートでのみ、ＣＤ４とＣＸＣＬ１２との間に有意な相関があった（Ｒ２＝．６２、ｐ＜．０００１）。また、全単球数とＣＤ１４＋１６−単球レベルとの間に高い相関があり（図５Ｂ及び５Ｄ、Ｒ２＝．８、ｐ＜．０００１）、且つより長い生存コホートでは循環Ｔ細胞数と単球数との間の逆相関（Ｒ２＝．６６、ｐ＜．０００１）が特筆すべきであり（図５）、短い生存コホートでは有意差がなかった（図６参照）。
【図６】図６ａ〜６ｅは、短いコホート患者（患者ＴＪ０１、ＴＪ０１、ＴＪ０７、ＴＪ０８、ＴＪ１０、ＴＪ１１、ＴＪ１２）においてワクチン接種後のＰＢＭＣ及びサイトカインのレベルを示す。行：図６ａ．ワクチン接種後の逐次ＰＢＭＣ数。図６ｂ．ワクチン接種後のＰＢＭＣサブ集団パーセントの逐次評価（Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球）。図６ｃ．ＣＣＬ２１及びＣＸＣＬ１２の逐次レベル。図６ｄ．絶対ＣＤ１４＋ＣＤ１６−マクロファージ数とＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）との関係。ＣＣｌ２レベルは、短い生存コホートでは長い生存コホートと比較して有意に高く維持された。図６ｅ．ワクチン接種後の推定ＴＨ−１サイトカイン反応のスケール調整比較（ＴＮＦ−α×２、ＣＸＣＬ９×３５０、ＣＸＣＬ１０×８０）。ＩＦＮ−ｇも示される。
【図７−１】図７ａ〜７ｈは、ワクチン接種後の特異的腫瘍促進単球細胞集団の低下を示す。実質的腫瘍退縮は、３ヶ月間にわたり観測された。図７ａ．ＴＭＥ  ＩＧＦ−１Ｒ＋細胞に関して一相性傾向であり（順序尺度）、初期診断からワクチン接種までのマッチドペアの症例（Ｎ＝５）では有意差はなく、ワクチンから剖検までのマッチドペア（Ｎ＝４）ではＩＧＦ−１Ｒ＋細胞の有意な減少を呈する（ｐ＝．００３）。図７ｂ．初期診断からワクチン及び剖検までの評価可能なパラフィン切片を有する２名の患者（患者ＴＪ０６及びＴＪ１０）のＩＧＦ−１Ｒ陽性細胞。図７ｃ．ＴＭＥ  ＣＤ１６３  Ｍ２マクロファージに関して二相性傾向であり、診断から再発まで有意に増加し（アペリオ（Ａｐｅｒｉｏ）４００倍５視野／治療相／患者、左側プロット、マッチドペア＊ｐ＜．０００１、Ｎ＝６）、続いて、再発からワクチン接種後の剖検まで有意に低下する（右側プロット、マッチドペア＊ｐ＜．０００１、Ｎ＝４）。
【図７−２】図７ａ〜７ｈは、ワクチン接種後の特異的腫瘍促進単球細胞集団の低下を示す。図７ｄ．初期診断からワクチン及び剖検までの評価可能なパラフィン切片を有する同一の２名の患者（患者ＴＪ０６及びＴＪ１０）のＣＤ１６３＋細胞は、再発時に対してワクチン時にＣＤ１６３が増加し（マッチドペア、ｐ＝．０５２）、続いて、ワクチン時に対して剖検時にＴＭＥ  ＣＤ１６３  Ｍ２マクロファージが有意に減少する（マッチドペア、＊ｐ＝．００１）。図７ｅ．短い生存コホートにおける末梢ＣＤ１６３単球と術時に記録したＣＤ１６３  ＴＡＭレベルとの有意な相関（Ｒ２＝．８０、ｐ＝．０２）。図７ｆ．より長いコホートにおける末梢ＣＤ１６３細胞とＴＡＭ  ＣＤ１６３細胞との有意でない相関。
【図７−３】図７ａ〜７ｈは、ワクチン接種後の特異的腫瘍促進単球細胞集団の低下を示す。図７ｇ．パラフィン切片の蛍光免疫組織化学顕微鏡写真。Ａ、Ｃ：ワクチン接種前の２回目の外科切除時及びＢ、Ｄ：剖検時の患者ＴＪ１０。Ｅ〜Ｈ：標準ケア後に再切除を受けた膠芽細胞腫患者から得られた剖検検体。Ｉ、Ｊ：未治療で偶発的に見いだされた死後の膠芽細胞腫。
【図７−４】図７ａ〜７ｈは、ワクチン接種後の特異的腫瘍促進単球細胞集団の低下を示す。図７ｈ．ＴＪ０６における初期診断から剖検までの治療反応の経時変化。ＴＭＥではＣＤ１６３細胞の発生は二相性であり、標準的治療後に増加し、ワクチン接種後から剖検まで減少する。ＣＤ１６３  ＴＡＭの低下は、腫瘍内のｒＣＢＶ及びＡＤＣの値の両方の増加に関連する。血清中ニトレートレベルは、各ワクチン接種後にスパイクし、付随的ｒＣＢＶ／ＡＤＣ増加に関連する。
【図８−１】図８ａ〜８ｄは、研究対象のサイトカイン又は血清による未成熟単球の分化を示す。図８ａ．Ｍ２サイトカインによる単球の分極化後のＩＧＦ−１Ｒのアップレギュレーション。Ｍ１マクロファージは、ＩＧＦ−１Ｒをアップレギュレートしない（＊＊＊ｐ＝．０００４）。図８ｂ．材料及び方法に記載のマクロファージ分極化プロトコルに従ってＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮで処理した後の単球サブセット分布の差。フローサイトメトリーは、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮがＭ２マクロファージの除去を選択的に標的とすることを明らかにする。
【図８−２】図８ａ〜８ｄは、研究対象のサイトカイン又は血清による未成熟単球の分化を示す。図８ｃ．プロトコル患者血清は、ＩＧＦ−１ＲとＰＤ−Ｌ１とを共発現するＣＤ１６３＋表現型に未成熟単球を分化させる。ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、このマクロファージ集団を１００倍濃度領域にわたり用量依存的にノックダウンする。値はすべて、平均蛍光強度である。各患者血清の共インキュベーションのデュプリケート測定による平均の比較。＊＊＊ｐ＜．０００１、＊＊ｐ＝．０００１、＊ｐ＝．０００２、◆◆◆ｐ＝．０００３、◆◆ｐ＝．０００９、◆ｐ＝．００９、
【００１２】
【数１】
2020510021.tif 000003
図８ｄ．図８ｃの平均のまとめ。
【図９】図９ａ〜９ｄは、第１の中間解析の標準ケアと比較して無進行生存及び全生存の両方で有意な改善があったことを示す。図９ａ．標準ケア（ＳＯＣ）と比較した全研究コホートの無進行生存（ＰＦＳ）。黒点線は９５％信頼区間である。図９ｂ．全生存（ＯＳ）。いずれの場合も、ＳＯＣではより低い９５％ＣＩに低下するので、有意な改善が示される。図９ｃ．中間解析時の生存コホート別のＰＦＳ。図９ｄ．中間解析時の生存コホート別のＯＳ。
【図１０】図１０ａ〜１０ｄは、第１ｂ相試験のまとめ並びに先行試験との及び試験内コホート間でのインターフェロンγレベルの比較を示す。図１０ａ．新たに診断されたワクチンコホートにおけるワクチン接種後のＩＦＮ−γの増加傾向（ｐ＝．０６）。図１０ｂ．新たに診断されたワクチンコホートにおけるメジアンＩＦＮ−γの有意な増加（ｐ＝．０２）。図１０ｃ．２０チャンバーコホートにおけるＩＦＮ−γレベルの有意な増加＊＊＊ｐ＜．０００１、＊＊ｐ＜．００６、＊ｐ＜．０２。図１０ｄ．バイオ拡散チャンバーからの標識ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの経時的拡散率。
【図１１−１】図１１ａ〜１１ｊは、ナイーブマウスモデルにおいて炎症誘発性サイトカイン産生に及ぼす完全製剤化バイオ拡散チャンバー（照射と外因的に添加されたＡＳ  ＯＤＮとの両方）の影響を示す。ＧＬ２６１細胞が単独で充填された外植マウスチャンバー内容物、２μｇのＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの添加若しくは５ＧｙのＸ線照射によるＧＬ２６１細胞の照射のどちらかの部分製剤、又は完全製剤化自己由来ワクチン（ＧＬ２６１、２μｇのＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ、及び５Ｇｙのγ線照射）の植込み２４時間後のルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）分析。図１１ａ．Ｇ−ＣＳＦ、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．０１１７。図１１ｂ．ＩＬ−１ａ、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．００８。図１１ｃ．ＩＬ−１ｂ、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．００６７。図１１ｄ．ＩＬ−２、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．０００２。図１１ｅ．ＩＬ−９、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．０４１３。
【図１１−２】図１１ａ〜１１ｊは、ナイーブマウスモデルにおいて炎症誘発性サイトカイン産生に及ぼす完全製剤化バイオ拡散チャンバー（照射と外因的に添加されたＡＳ  ＯＤＮとの両方）の影響を示す。ＧＬ２６１細胞が単独で充填された外植マウスチャンバー内容物、２μｇのＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの添加若しくは５ＧｙのＸ線照射によるＧＬ２６１細胞の照射のどちらかの部分製剤、又は完全製剤化自己由来ワクチン（ＧＬ２６１、２μｇのＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ、及び５Ｇｙのγ線照射）の植込み２４時間後のルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）分析。図１１ｆ．ＩＬ−１０、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．０００１。図１１ｇ．ＩＬ−１２（ｐ４０）、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．００１。図１１ｈ．ＩＬ−１３、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．００６５。図１１ｉ．ＩＬ−１５、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．００１３。図１１ｊ．Ｍ−ＣＳＦ、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＰＢＳ  ｐ＝．００７。図示されていないが、他に試験したのは次の通りである。ＩＬ−６、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．０８３６。ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．０８５４。ｌｉｘ、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．０００１。ｋｃ、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．０１１２。ＴＮＦ−ａ、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．００８２。ＶＥＧＦ、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．０００４。ｌｉｆ、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．０１４０。ＩＬ−７、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．００３８。ＩＬ−１２（ｐ７０）、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．０１２０。ＩＦＮ−γ、ＧＬ２６１−ＡＳ−ｉｒｒ対ＧＬ２６１−ｉｒｒ  ｐ＜．０２９０。
【図１２】図１２は、ＮＯＢＥＬアンチセンス７５０μｇと、ＮＯＢＥＬセンス７５μｇ、７．５μｇ、ＤＷＡアンチセンス７５０μｇ、７．５μｇ、対照と、を対比して＊＊＊ｐ＜．０００９、ＮＯＢＥＬアンチセンス７５μｇと、ＮＯＢＥＬセンス、ＤＷＡアンチセンス７．５μｇと、を対比して、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮによる２名の正常対象（暗色及び明色）の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の樹状細胞（ＤＣ）活性化に関する漸増曲線を示す。
【図１３】図１３ａ〜１３ｂは、ワクチン接種マウスに由来するＴ細胞を利用した完全製剤化チャンバーの内容物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞反応を示す。図１３ａ．チャンバーから回収された抗原でプライミングされたＤＣによる炎症誘発性Ｔ細胞反応、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ完全製剤と無抗原との対比では＊＊ｐ＜．０１、完全製剤とエキソソームとの対比では＊ｐ＜．０３。図１３ｂ．チャンバーから回収された抗原でパルスされたＤＣによる炎症誘発性Ｔ細胞反応、完全製剤と無抗原との対比では＊＊ｐ＜．００５、完全製剤とエキソソームとの対比では＊ｐ＜．００７。
【図１４】図１４ａ〜１４ｄは、ＮＯＢＥＬアンチセンス用量漸増に対する二相性反応の模式図である。
【図１５】図１５ａ〜１５ｂは、６名の異なる神経膠腫患者に由来する血清の一晩インキュベーションを併用したときの３名の正常対象の同種異系単球のＭ２分極化を示す。対照は、血清と共にインキュベートしなかった。１００ｐｇのＮＯＢＥＬアンチセンスから１μｇの有意なノックダウンまで図１５ａのＰＤＬ−１及び図１５ｂのＣＤ１６３を共発現するＭ２マクロファージの減少を呈することが、１０００倍希釈曲線から明らかにされた。各グラフのラインは総平均である。１μｇのＮＯＢＥＬと未治療との対比では＊＊＊ｐ＜．０００２。
【図１６】図１６は、外植ＰＢＳ対照チャンバーに対する外植ワクチンチャンバーのサイトカインレベルの比較を示す。＊＊＊ｐ，．００５、＊＊＊ｐ＜．０１、＊＊＊ｐ＜．０２、＊＊ｐ＜．０３、＊ｐ＜．０５。
【図１７】図１７は、側腹神経膠腫腫瘍成長の阻害に及ぼす全身性ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮの二相性反応を示す用量−反応曲線である。１０６ＧＬ２６１細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹に植え込み、２０日後、循環ＣＤ１６３陽性細胞の上昇が典型的に観測される期間前に０．７５ｍｇ（四角）又は０．０７５ｍｇ（三角）の単回用量でＮＯＢＥＬ  ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮをマウスの腹腔内に注射した。次いで、マウスの腫瘍発生を続けた。未ワクチン接種マウス（丸）を対照として使用した。
【図１８】図１８は、全身性ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮ治療が循環Ｍ２単球の蓄積を阻害したことを示すフローサイトメトリーデータである。データは、ＣＤ１６３を発現する細胞数のヒストグラムとして表され（右側ピーク）、「媒体」と表示されたラインは、ＰＢＳ（媒体）で治療された腫瘍植込みマウスを表し、「ＡＳ−ＯＤＮ」と表示された他のラインは、ＮＯＢＥＬ  ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮで治療された植込みマウスを表す。これらのラインは、図中でアノテートされる。
【図１９】図１９は、側腹に神経膠腫細胞が植え込まれたマウスをＮＯＢＥＬ  ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮ又はＰＢＳ（媒体）で治療したときの腫瘍発生率を示す。治療群と未治療群との間で腫瘍発生率に有意差がある（＊＝ｐ＜０．０５）。
【図２０】図２０は、側腹に神経膠腫細胞が植え込まれた且つＮＯＢＥＬ  ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮを用いて又は用いずに治療されたＴｂｅｔ欠損マウスにおける腫瘍発生率を示す。群間の腫瘍発生率に有意差があった（＊＝ｐ＜０．０５）。
【図２１】図２１ａ、２１ｂ、及び２１ｃは、経時的逐次採血（術後１４〜４２日目）からプールされたワクチン接種後の患者血清中の炎症誘発性サイトカインレベル（ｐｇ／ｍｌ）を示す。炎症誘発性サイトカインの有意な用量依存的増加が患者血清で観測された。図２１ｄ、２１ｅ、及び２１ｆは、腫瘍組織の湿潤重量収量とサイトカイン収量との関係（多項式最良当てはめ）を対象別に示す。処理後、細胞を２０個のチャンバーに分配したとき、３グラムの組織の湿潤重量収量で最も高いサイトカイン収量を生成した。
【図２２】図２２は、代表的な完全製剤化バイオ拡散チャンバーの模式図である。チャンバーを患者に植え込むと、アンチセンス分子及び腫瘍抗原は、チャンバーの多孔性膜を介して拡散し、腫瘍特異的免疫反応、Ｍ２分極化減少、及びＭ２＋細胞数低下をもたらす。
【図２３】図２３は、代表的な免疫化方法の模式図である。患者が第１ラウンドのワクチン接種に適正に反応しなければ、手順は、ときには他の治療との組合せで、任意選択的に必要な回数だけ繰り返される。
【図２４】図２４ａ及び２５ｂは、脳腫瘍を有するヒト患者において治療意図群（Ｎ＝３０）のメジアン無進行生存（Ｐ−ＦＳ）及びメジアン全生存（ＯＳ）をそれぞれ例示するカプラン・マイヤー曲線である。（中間解析は以上の図９に示される。）「ワクチン接種」集団は、各チャンバーに２μｇのＮＯＢＥＬを入れて植え込まれた２０個のチャンバーで治療される。「ＳｏＣ」集団は、病歴データを用いて表される（Ｎ＝７６）。データは、癌の全生存及び無進行生存の両方の実質的増加を示す。
【図２５】図２５ａ及び２５ｂは、ワクチン接種群及び標準ケア（ＳｏＣ）群においてそれぞれ同一の性別及びメジアン年齢を比較した無進行生存及び全生存を例示するカプラン・マイヤー曲線である。データは、癌の全生存及び無進行生存の両方の実質的増加を示す。
【図２６】図２６ａ及び２６ｂは、治療から離脱した及び他の原因で死亡した５名の患者を除外したときの無進行生存及び全生存を例示するカプラン・マイヤー曲線である。
【図２７】図２７ａ及び２７ｂは、標準ケア（ＳＯＣ）プロトコルを終了しなかった９名の患者を除外したときの無進行生存及び全生存を例示するカプラン・マイヤー曲線である。
【図２８−１】図２８ａ、２８ｂ、２８ｃ、２８ｄは、高ワクチンコホートにおいて誘発されたＩＦＮ−γ反応を細胞収量に基づいて例示する。データは、チャンバー内の細胞数に基づいて最適ＩＦＮ−γ放出を示す。図２８ａ及び２８ｂでは、細胞収量は百万細胞単位で示される。ＩＦＮ−γは、平均蛍光強度（ＭＦＩ）として示される。これらのデータは、各チャンバーが２μｇのＮＯＢＥＬを含有する２０チャンバーコホートのものである。データは、多項式当てはめ（三次）として示される。
【図２８−２】図２８ａ、２８ｂ、２８ｃ、２８ｄは、高ワクチンコホートにおいて誘発されたＩＦＮ−γ反応を細胞収量に基づいて例示する。データは、チャンバー内の細胞数に基づいて最適ＩＦＮ−γ放出を示す。図２８ｃ及び２０ｄｂは、２０００万細胞まで図２８ａ及びｂのデータから抽出したものであり、それぞれ、細胞数収量と平均ＩＦＮγ反応との間及びピークＩＦＮγ反応との間の実質的に線形の関係を示す。データは、ｐｇ／ｍｌ単位で示される。
【図２９−１】図２９ａ、２９ｂ、及び２９ｃは、封入前のＩＧＦ−１Ｒアンチセンスのプレインキュベーションに関してチャンバー製剤に対するＩＦＮ−γＴ細胞反応を例示する。図２９ａは、腫瘍抗原に対するＴ細胞反応を評価するためのプロトコルを示す。
【図２９−２】図２９ａ、２９ｂ、及び２９ｃは、封入前のＩＧＦ−１Ｒアンチセンスのプレインキュベーションに関してチャンバー製剤に対するＩＦＮ−γＴ細胞反応を例示する。図２９ｂでは、抗原は、ｉｎ−ｖｉｖｏ臨床チャンバーパラダイムに従って調製した。約１００万ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＧＬ２６１腫瘍細胞を単独で又は指定アンチセンス濃度との併用でチャンバーに注入し、チャンバー内で一晩インキュベートした（ＰＢＳ中に配置した）。翌日、チャンバー内容物を抽出し、ナイーブ樹状細胞をパルスするために使用した。アンチセンスで一晩処理しなかったチャンバー内容物は、指示量のＮＯＢＥＬと共に樹状細胞に添加した。対照用として樹状細胞をナイーブ状態のままにした。抗原による一晩パルスの後、樹状細胞を採取し、サイトカインＩＦＮγに対するＥＬＩＰＳＰＯＴ検出抗体で被覆された細胞培養プレートで免疫動物からのＴ細胞と共に一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、被覆プレートを処理して発色させ、各抗原に反応したＩＦＮγ産生Ｔ細胞の数を計数した。ＧＬ２６１細胞＋アンチセンスを含有するチャンバーから取り出された物質では腫瘍抗原が検出されたが、細胞単独で培養されたチャンバーからの物質では、樹状細胞（ＤＣ）をパルスするときにアンチセンスを物質に添加したとしても、検出されなかったことが、図２９ｂのデータから示される。免疫刺激性腫瘍抗原を産生するためにはチャンバー内でのアンチセンスと神経膠腫細胞との併用が必要とされることが、データから例示される。図２９ｃでは、ペトリ皿にＧＬ２６１細胞をプレーティングし、１００万細胞当たり４ｍｇ  ＮＯＢＥＬで一晩処理したか又は未処理のままにした。次いで、細胞を採取し、チャンバー１つ当たり１００万細胞及び２μｇ  ＮＯＢＥＬをチャンバーに配置した。次いで、チャンバーをＰＢＳ中で一晩インキュベートし、翌日、内容物を抽出した。次いで、樹状細胞をチャンバー内容物でパルスし、以上に記載したようにＩＦＮγ分泌を測定した。アンチセンスとの併用でＧＬ２６１細胞を一晩処理すると、ＩＦＮγを産生する腫瘍免疫Ｔ細胞の数の増加により検出される細胞により産生される抗原の量が増強されることが、データから例示される。
【図３０−１】図３０ａ、３０ｂ、３０ｃ、及び３０ｄは、マウスモデルにおいて有効性に及ぼすネスチン発現レベルの影響を例示する。図３０ａは、高レベルのネスチンがＩＧＦ−１Ｒアンチセンス治療後の生存の改善に関連することを示す。高レベル又は低レベルのネスチンタンパク質を発現するＧＬ２６１細胞とさらには４ｍｇのアンチセンスとを含有するチャンバーをマウスの側腹に植え込んだ。対照群は、アンチセンスを添加せずに高ネスチン発現細胞のみを収容した。チャンバーは、側腹に２４時間残存させた。次いで、数週間にわたり免疫反応を発生させ、チャンバー植込み後３５日目にマウスの頭蓋内にチャレンジした。チャレンジ後の生存に関して非免疫対照さらには免疫マウスをモニターした。
【図３０−２】図３０ａ、３０ｂ、３０ｃ、及び３０ｄは、マウスモデルにおいて有効性に及ぼすネスチン発現レベルの影響を例示する。図３０ｂは、高レベルのネスチンがより良好な臨床疾患スコアに関連することを示す。データは、完全製剤化チャンバーを用いたワクチン接種後の正所性モデルにおける脳腫瘍進行に関連するスコア罹患率を治療コホート別に示す。
【図３０−３】図３０ａ、３０ｂ、３０ｃ、及び３０ｄは、マウスモデルにおいて有効性に及ぼすネスチン発現レベルの影響を例示する。図３０ｃ及び図３０ｄは、高レベルのネスチン発現に関連するＧＬ２６１細胞に対する抗体の産生の増加を示す。図３０ｃは、実験マウスの血清を用いて実施し、ＧＬ２６１細胞に対する抗体反応性に関して試験した、チャンバー植込み後２８日目／頭蓋内植込み前の細胞ＥＬＩＳＡアッセイのデータを示す。マウスから採取した全血から血清を単離した。血清は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いてＧＬ２６１細胞に対する全ＩｇＧ反応性に関して試験した。図３０ｄは、実験マウスの血清を用いてＧＬ２６１細胞に対する抗体反応性に関して試験した、頭蓋内チャレンジ後３５日目／チャンバー外植７１日後の細胞ＥＬＩＳＡのデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
定義
本明細書に定義されていない用語はすべて、当技術分野で認識されているそれらの通常の意味を有する。
【００１４】
本明細書で用いられる場合、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」などの用語は、とくに文脈上明確な要件がない限り、単数及び複数の参照対象を含む。
本明細書で用いられる場合、数値の前に付くときの「ａｂｏｕｔ（約）」という用語は、その値±１０％の範囲内を表す。たとえば、「約１００」は、９０及び１１０を包含する。
【００１５】
本明細書で用いられる場合、「自己由来」という用語は、同一個体から得られる細胞又は組織を意味する。
本明細書で用いられる場合、「自己由来癌細胞ワクチン」という用語は、部分的には、個体から腫瘍細胞を単離してこの腫瘍細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで処理することにより生成される治療剤を意味する。次いで、細胞は、腫瘍細胞が単離された個体に再投与される。実施形態では、自己由来癌細胞ワクチンは、腫瘍細胞のほか、追加の成分、たとえば、緩衝剤及び／又はアンチセンス核酸を含みうる。実施形態では、「自己由来癌細胞ワクチン」は、腫瘍細胞と１つ以上の追加の成分とを含有するバイオ拡散チャンバーを意味しうる。ある特定の態様では、「自己由来癌細胞ワクチン」は、本明細書では「完全製剤化バイオ拡散チャンバー」ともいう「完全製剤化チャンバー」でありうる。
【００１６】
本明細書で用いられる場合、「完全製剤化チャンバー」又は「完全製剤化バイオ拡散チャンバー」という用語は、第１の量のＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮと共にチャンバーに封入する前に処理してもしなくてもよい、自己由来腫瘍細胞と腫瘍マイクロ環境（ＴＭＥ）に含まれる他の細胞とを含むバイオ拡散チャンバーである。細胞に第２の量たとえば少なくとも２μｇのＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの外因的添加を行って封入し、次いで、５Ｇｙのγ線照射でチャンバーに照射する。
【００１７】
本明細書で用いられる場合、「低分子」という用語は、核酸、ペプチド、タンパク質、及び他の化学物質（たとえば、細胞により産生されるサイトカイン、成長ホルモンなど）を含むが、細胞、エキソソーム、マイクロベシクルを含まない。
【００１８】
本明細書で用いられる「ＩＧＦ−１Ｒ発現を標的とする」という用語は、ＩＧＦ−１Ｒに結合するように設計された配列を有するアンチセンス核酸を投与することを意味する。
本明細書で用いられる場合、「全身投与」という用語は、対象の体全体にわたり物質の送達を達成することを意味する。典型的な全身投与経路としては、非経口投与、経真皮投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、及び筋肉内投与が挙げられる。
【００１９】
他の投与経路としては、経口投与、鼻投与、局所投与、眼内投与、頬腔内投与、舌下投与、膣投与、肝内投与、心内投与、膵内投与、吸入投与、及び植込みポンプ投与が挙げられる。
【００２０】
アンチセンス分子
アンチセンス分子とは、ワトソン・クリック塩基対合則によりｍＲＮＡの相補的標的配列に結合することにより機能する核酸のことである。標的ｍＲＮＡの翻訳は、相補的ヘリックス間でハイブリダイゼーションが行われるとき、活性機序及び／又は受動的機序により阻害される。受動的機序では、ｍＲＮＡと外因性ヌクレオチド配列とのハイブリダイゼーションは、リボソーム複合体によるメッセージの読取りを防止する二本鎖の形成をもたらす。活性機序では、ハイブリダイゼーションは、ＲｎａｓｅＨの結合を促進し、これによりＲＮＡを破壊するが、アンチセンスをインタクトな状態で残して、他方の相補的ｍＲＮＡ標的にハイブリダイズする。一方又は両方の機序は、悪性表現型に寄与する又はそれを持続するタンパク質の翻訳を阻害する。治療剤として、アンチセンス分子は、はるかに選択的であるので、従来の薬剤よりも有効で且つ毒性が低い。
【００２１】
本明細書に開示される方法及び組成物は、癌を治療するためのアンチセンス分子の使用を含む。典型的には、アンチセンス分子は、アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ）である。いくつかの実施形態では、アンチセンス分子は修飾リン酸骨格を含む。ある特定の態様では、リン酸骨格修飾は、ヌクレアーゼ分解に対するアンチセンスの耐性を増加させる。ある特定の実施形態では、修飾はロックドアンチセンスである。他の実施形態では、修飾はホスホロチオエート結合である。ある特定の態様では、アンチセンスは１つ以上のホスホロチオエート結合を含有する。ある特定の実施形態では、ホスホロチオエート結合は、ヌクレアーゼ耐性を付与することによりアンチセンス分子を安定化させ、それによりその半減期を増加させる。いくつかの実施形態では、アンチセンスは部分的にホスホロチオエート結合しうる。たとえば、アンチセンスの約１％まで、約３％まで、約５％まで、約１０％まで、約２０％まで、約３０％まで、約４０％まで、約５０％まで、約６０％まで、約７０％まで、約８０％まで、約９０％まで、約９５％まで、又は約９９％までホスホロチオエート結合されうる。いくつかの実施形態では、アンチセンスは完全にホスホロチオエート結合される。他の実施形態では、ホスホロチオエート結合はホスホジエステル結合と交互でありうる。ある特定の実施形態では、アンチセンスは少なくとも１つの末端ホスホロチオエートモノホスフェートを有する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、アンチセンス分子は１つ以上のＣｐＧモチーフを含む。他の実施形態では、アンチセンス分子はＣｐＧモチーフを含まない。ある特定の態様では、１つ以上のＣｐＧモチーフはメチル化される。他の態様では、１つ以上のＣｐＧモチーフはメチル化されない。ある特定の実施形態では、アンチセンス分子が対象に投与されるとき、１つ以上の非メチル化ＣｐＧモチーフは先天性免疫反応を誘発する。いくつかの態様では、先天性免疫反応は、Ｔｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）への非メチル化ＣｐＧ含有アンチセンス分子の結合により媒介される。
【００２３】
ある特定の実施形態では、アンチセンス分子は、少なくとも１つの末端修飾又は「キャップ」を含む。キャップは、５’及び／又は３’キャップ構造でありうる。「キャップ」又は「エンドキャップ」という用語は、オリゴヌクレオチドのどちらかの末端の化学修飾を含むとともに（末端リボヌクレオチドに対して）、５’末端の最後の２つのヌクレオチド間及び３’末端の最後の２つヌクレオチドの間の結合の修飾を含む。キャップ構造は、標的配列との分子相互作用や細胞機構を損なうことなくエキソヌクレアーゼに対するアンチセンス分子の耐性を増加させうる。かかる修飾は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏにおけるその効力の増加に基づいて選択しうる。キャップは、５’末端（５’キャップ）若しくは３’末端（３’キャップ）に存在しうるか、又は両方の末端に存在しうる。ある特定の実施形態では、５’及び／又は３’キャップは、ホスホロチオエート一リン酸、脱塩基残基（部分）、ホスホロチオエート結合、４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド、ホスホロジチオエート結合、反転ヌクレオチド又は反転脱塩基部分（２’−３’又は３’−３’）、ホスホロジチオエート一リン酸、及びメチルホスホネート部分から独立して選択される。ホスホロチオエート結合又はホスホロジチオエート結合は、キャップ構造の一部のとき、一般に５’末端の２つの末端ヌクレオチド間及び３’末端の２つの末端ヌクレオチド間に配置される。
【００２４】
好ましい実施形態では、アンチセンス分子は、インスリン様成長因子１レセプター（ＩＧＦ−１Ｒ）の発現を標的とする。ＩＧＦ−１Ｒは、インスリン受容体と７０％の相同性を共有するチロシンキナーゼ細胞表面レセプターである。そのリガンド（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、及びインスリン）による活性化時、それは増殖、トランスフォーメーション、及び細胞生存をはじめとする広範な細胞機能をレギュレートする。ＩＧＦ−１Ｒは、正常成長の絶対条件ではないが、悪性組織に生じうる足場非依存条件における成長に不可欠である。腫瘍におけるＩＧＦ−１Ｒの役割のレビューは、バサーガ（Ｂａｓｅｒｇａ）ら著、「ビタミンとホルモン（Ｖｉｔａｍｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅｓ）」、第５３巻、ｐ．６５〜９８、１９９７年（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に提供される。
【００２５】
ある特定の実施形態では、アンチセンス分子は、成長因子又は成長因子レセプター、たとえば、ＩＧＦ−１ＲなどのＤＮＡ又はＲＮＡに対するオリゴヌクレオチドである。
ある特定の実施形態では、アンチセンスは、ＩＧＦ−１Ｒを指向するデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ）である。ＩＧＦ−１Ｒの全長コード配列は、配列番号１９として提供される（たとえば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／２６９７０号パンフレット（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。
【００２６】
ある特定の実施形態では、アンチセンス分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡのどちらかを含んで、ＩＧＦ−１Ｒシグナル配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。ＩＧＦ−１Ｒのシグナル配列は３０アミノ酸配列である。他の実施形態では、アンチセンス分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡのどちらかを含んで、ＩＧＦ−１Ｒシグナル配列の一部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、アンチセンス分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡのどちらかを含んで、ＩＧＦ−１Ｒのコドン１〜３０９に相補的なヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、アンチセンス分子は、ＲＮＡ又はＤＮＡのどちらかを含んで、ＩＧＦ−１Ｒのコドン１〜３０９の部分に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００２７】
ある特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、約１５ヌクレオチド〜約２２ヌクレオチドの長さである。ある特定の態様では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、約１８ヌクレオチドの長さである。
【００２８】
ある特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、１８℃では二次構造を形成するが、約３７℃では二次構造を形成しない。他の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、約１８℃でも約３７℃でも二次構造を形成しない。さらに他の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、いずれの温度でも二次構造を形成しない。他の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、３７℃で二次構造を形成しない。特定の実施形態では、二次構造は、ヘアピンループ構造である。
【００２９】
いくつかの態様では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、配列番号１のヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む。ある特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、配列番号１又はそのフラグメントに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、又は１００％の同一性を有しうる。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、１つ以上のホスホロチオエート結合を含む。
【００３０】
ある特定の態様では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは配列番号１からなる。ＮＯＢＥＬは、ホスホロチオエート骨格とＩＧＦ−１Ｒ遺伝子のコドン２〜７に相補的な配列とを有する１８マーのオリゴデオキシヌクレオチドである。したがって、ＮＯＢＥＬは、ＩＧＦ−１Ｒを指向するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ）である。５’末端でＩＧＦ−１Ｒ遺伝子の相補的配列として誘導されるＮＯＢＥＬ配列は、
５’−ＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴ−３’
である。
【００３１】
ＮＯＢＥＬは安定な貯蔵寿命を有し、ヌクレアーゼ分解に耐えてそのホスホロチオエート骨格による。ＮＯＢＥＬの投与は、当業者に公知のオリゴデオキシヌクレオチドの導入に関連する標準的方法のいずれかで提供可能である。有利には、ＮＯＢＥＬを含めて本明細書に開示されるＡＳ  ＯＤＮは、毒性をほとんど／まったく伴うことなく投与しうる。マウス試験（尾静脈中４０μｇ）に基づく約２ｇ／ｋｇ（スケール調整）のレベルでさえも、毒性問題を示さなかった。ＮＯＢＥＬは、当業者に公知の通常の手順に従って製造可能である。
【００３２】
アンチセンス分子、たとえば、配列番号１のＮＯＢＥＬ配列はまた、米国特許第９，７４４，１８７号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるように、１つ以上のｐ−エトキシ骨格修飾を含みうる。いくつかの実施形態では、アンチセンス分子の核酸骨格は、少なくとも１つのｐ−エトキシ骨格結合を含む。たとえば、アンチセンス分子の約１％まで、約３％まで、約５％まで、約１０％まで、約２０％まで、約３０％まで、約４０％まで、約５０％まで、約６０％まで、約７０％まで、約８０％まで、約９０％まで、約９５％まで、又は約９９％までｐ−エトキシ結合されうる。結合の残りの部分は、ホスホジエステル結合又はホスホロチオエート結合又はそれらの組合せでありうる。好ましい実施形態では、各オリゴヌクレオチド中のリン酸骨格結合の５０％〜８０％は  ｐ−エトキシ骨格結合であり、各オリゴヌクレオチド中のリン酸骨格結合の２０％〜５０％は、ホスホジエステル骨格結合である。
【００３３】
各種ＩＧＦ−１Ｒアンチセンス配列は、ＮＯＢＥＬ配列のマルチモダリティー作用のいくつか又はすべてでバイオ活性である。１８マーのＮＯＢＥＬ配列は、ＩＧＦ−１Ｒレセプターダウンレギュレーション活性とさらにはＴＬＲアゴニスト活性との両方を有し、マウスにおけるさらなる実験から、両方の活性がｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍免疫活性に必要であることが示唆される。ＡＳ  ＯＤＮ分子は抗腫瘍活性を有するが、相補的センス配列は、同様にＣｐＧモチーフを有するにもかかわらずそうした活性を有していない。
【００３４】
ある特定の実施形態では、アンチセンス配列は、表１に示される配列番号１〜１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、アンチセンスは、配列番号１〜１４の１つ以上に対して９０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、アンチセンスは、配列番号１〜１４の１つ以上に対して８０％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、アンチセンスは、配列番号１〜１４の１つ以上に対して７０％の配列同一性を有する。
【００３５】
【表１】
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ある特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、配列番号１〜１４のいずれか１つのヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む。ある特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、配列番号１〜１４のいずれか１つ又はそのフラグメントに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、又は１００％の同一性を有しうる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、アンチセンス分子は、細胞内でＩＧＦ−１Ｒ経路の下流の遺伝子の発現をダウンレギュレートする。ある特定の態様では、下流遺伝子はヘキソキナーゼ（ＨｅｘＩＩ）である。いくつかの実施形態では、アンチセンス分子は、細胞内でハウスキーピング遺伝子の発現をダウンレギュレートする。いくつかの態様では、ハウスキーピング遺伝子はＬ１３である。
【００３７】
ある特定の態様では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、化学合成される。ある特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、固相有機合成により製造される。いくつかの態様では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの合成は、フロースルー技術を用いて密閉ケミカルカラムリアクターを備えたシンセサイザーで行われる。いくつかの実施形態では、固体担体上の各合成サイクルシーケンスは、全長ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮが得られるまで逐次行われる複数のステップからなる。ある特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、液状形態で貯蔵される。他の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、貯蔵前に凍結乾燥される。いくつかの実施形態では、凍結乾燥ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、使用前に水に溶解される。他の実施形態では、凍結乾燥ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、使用前に有機溶媒に溶解される。さらに他の実施形態では、凍結乾燥ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、医薬組成物として製剤化される。いくつかの態様では、医薬組成物は液状医薬組成物である。他の態様では、医薬組成物は固形医薬組成物である。追加のアンチセンス核酸は、米国特許出願公開第２０１７／００５６４３０号明細書（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）にも記載されている。
【００３８】
自己由来癌細胞ワクチン
緒言
免疫療法は、現在、１つの共通の細胞性抗原を用いて血液学的悪性腫瘍を標的とするように使用されている。残念ながら、固形腫瘍は、はるかに複雑であり、同定不能な数の腫瘍特異的標的を有して悪性状態への遺伝子変化のエピジェネティック進行を示す。さらに厄介なことに、ＷＨＯ診断の癌群内には腫瘍表現型の顕著な変動が存在する。自己由来細胞ワクチンは、すべてのかかる変動及びすべてかかる標的を包含して固形腫瘍癌に理想的な対象特異的免疫療法になるであろう。しかしながら、自己由来癌細胞ワクチンは、連続継代により腫瘍表現型が変化して一連の腫瘍特異的抗原が減少するため、初代細胞培養から誘導することができない。このため、実現しがたいロットリリース認定が各継代で必要となるであろう。本開示は、図２２に示されるように、新たに切除された細切腫瘍細胞をプレーティングして２４時間以内にデポ抗原としてそれを再植込みすることにより、こうした懸念を排除する。ある特定の態様では、本明細書で達成される優れた結果は、本明細書に記載の具体例の中でもとくに、適切な数の細胞がチャンバー内に存在することを保証することにより得られる。
【００３９】
従来の研究では、自己由来腫瘍細胞の代わりに抗原提示細胞を用いて自己由来細胞ワクチンを設計してきた。このパラダイムでは、治療前の血漿白血球分離（ｐｌａｓｍａ  ｌｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）から対象の単球を集めて、ｅｘ  ｖｉｖｏで自己由来樹状細胞（ＤＣ）に分化させる。次いで、対象の腫瘍粗ライセートに樹状細胞を提示してＤＣ活性化／成熟を誘発し、より後の時点で、今度は腫瘍抗原でクロスプライミングされた成熟樹状細胞をＤＣワクチンとして対象に注射する。しかしながら、ｅｘ  ｖｉｖｏ分化は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのみ生じるいくつかの主要な刺激性成分が欠けている。そのほか、造血前駆体からのＤＣの分化は、高価な設備で多くの労力を要する細胞処理を行う大規模なｉｎ  ｖｉｔｒｏ操作を必要とする。本開示は、内因的ＤＣ成熟プロセスと、適切な免疫反応の発生を促進する免疫モジュレート性及び免疫刺激性のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＡＳ−ＯＤＮ）と、を提供することにより、こうした懸念を回避する。より具体的には、本開示は、患者に由来する分散腫瘍細胞と照射アンチセンス分子とを含むバイオ拡散チャンバーを提供する。これは治療有効期間にわたり患者に植え込まれる。いかなる理論にも拘束されるものではないが、照射腫瘍細胞とアンチセンスとバイオ拡散チャンバーとの組合せは、局所免疫反応をシミュレートするように協奏的に作用するとともに、Ｍ２細胞を低減又は排除して免疫系の減衰を防止することにより反応を増強すると考えられる。
【００４０】
そのため、本開示は、新たに切除された腫瘍細胞とＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮとを含む照射植込み型バイオ拡散チャンバーが癌免疫療法に有効な対象特異的自己由来細胞ワクチンとして安全に機能することを示す。したがって、対象において腫瘍細胞を選択的に標的とする免疫反応を開始するための特許請求された植込み型バイオ拡散チャンバーの使用は、癌とくにＧＢＭを治療するための新しい有意な方法を提供する。
【００４１】
バイオ拡散チャンバー
代表的な拡散チャンバーは、第１の端部及び第２の端部の２つの端部を有するチャンバーバレルを含む。実施形態では、バイオ拡散チャンバーは、ミリポア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により製造されるデュロポア（Ｄｕｒｏｐｏｒｅ）メンブレンなどの多孔性細胞不透過性メンブレンにより片側がキャップされた小リングである。任意選択的に、多孔性メンブレンを用いてシールするように１つの端部のみを開口した状態で残して、チャンバー本体の一部として端部の１つを密閉しうる。メンブレンは、強くて可撓性のある化学処理に耐えうるプラスチック、テフロン（登録商標）、ポリエステル、又はいずれかの不活性材料で作製可能である。チャンバーは、いずれかの物質、たとえば、限定されるものではないが、プラスチック、テフロン（登録商標）、ルーサイト、チタン、プレキシガラス、又はヒトに対して非毒性で耐容性が良好ないずれかの不活性材料で作製可能である。そのほか、チャンバーは、滅菌処理に耐えられるようにすべきである。いくつかの態様では、拡散チャンバーは、使用前にエチレンオキシドで滅菌される。他の好適なチャンバーは、２０１８年１月２４日出願の米国仮特許出願第６２／６２１，２９５号明細書、米国特許第６，５４１，０３６号明細書、ＰＣＴ／ＵＳ１６／２６９７０号パンフレット、及び米国特許第５，７１４，１７０号明細書（各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【００４２】
ある特定の実施形態では、メンブレンは、低分子の通過を可能にするが、細胞の通過を可能にしない（すなわち、細胞は、チャンバーから出ることもそこに入ることもできない）。いくつかの態様では、メンブレンの細孔の直径は、チャンバーからの核酸及び他の化学物質（たとえば、細胞により産生されたサイトカインなど）の拡散を可能にし、チャンバーと植え込まれた対象との間の細胞の通過を不能にする。本開示に有用なバイオ拡散チャンバーは、チャンバーと植え込まれた対象との間の細胞の通過を不能にするいずれのチャンバーも含むが、ただし、チャンバーは、チャンバーと対象との間の因子の交換及び通過を可能にするものでなければならない。そのため、ある特定の態様では、細孔サイズは、チャンバーに出入りする１００μｍ３超の体積の物質の通過を防止するカットオフを有する。いくつかの実施形態では、メンブレンの細孔は、約０．２５μｍ以下の直径を有する。たとえば、細孔は、約０．１μｍの直径を有しうる（図１参照）。特定の態様では、細孔は、直径０．１μｍ〜０．２５μｍの範囲内である。また、ランゲ（Ｌａｎｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）、１９９４年、第１５３巻、ｐ．２０５〜２１１、及びランザ（Ｌａｎｚａ）ら著、トランスプランテーション（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）、１９９４年、第５７巻、ｐ．１３７１〜１３７５（各々その全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。この細孔直径は、チャンバーに出入りする細胞の通過を防止する。ある特定の実施形態では、拡散チャンバーは、０．１μｍの細孔サイズの親水性デュラポア（Ｄｕｒａｐｏｒｅ）メンブレン（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ベッドフォード、マサチューセッツ州）を有する１４ｍｍルーサイトリングから構築される。
【００４３】
ある特定の実施形態では、バイオ拡散チャンバーは、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮが拡散してチャンバーから送出されうるメンブレンを含む。いくつかの実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの約５０％は拡散して約１２時間でチャンバーから送出され、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの約６０％は拡散して約２４時間でチャンバーから送出され、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの約８０％は拡散して約４８時間でチャンバーから送出され、且つ／又はＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの約１００％は拡散して約５０時間でチャンバーから送出される。
【００４４】
模範的方法では、バイオ拡散チャンバーをアセンブルするために、第１の多孔性メンブレンは、耐密シールを形成するように接着物質（ｇｌｕｅ）及び圧力を用いて第１の拡散チャンバーの片側に装着されている。第２の多孔性メンブレンは、第２の拡散チャンバーリングに同様に装着される。メンブレンは、より耐密なシールを同様に提供しうるゴムガスケットを用いて所定の位置に固定可能である。拡散チャンバーリングは、乾燥させるために一晩放置される（少なくとも８時間）。次いで、第１の拡散チャンバーリング及び第２の拡散チャンバーリングは、接着物質を用いて互いに装着され、そして乾燥させるために一晩放置される（少なくとも８時間）。好ましい実施形態では、第１のチャンバーリングと第２のチャンバーリングとの接合プロセスは、２つのリング間の接着を促進するために溶媒として２ジクロロエタンを使用することを含む。たとえば、２つの多孔性メンブレンを示す図２２を参照されたい。代替法では、チャンバーは、多孔性メンブレンを含有する側を１つのみ有しうる。
【００４５】
チャンバーのバレル部分には、チャンバーが植え込まれた後で対象の身体の外側からアクセスして拡散チャンバーに補充できるようにするキャップによりカバー可能な１つ以上の開口（たとえばポート）が提供される。開口は、汚染を伴うことなく且つ対象に害を加えることなく内容物の多数回の逐次サンプリングを可能にするので、対象で実施される植込み手順の回数を有意に低減する。患者への植込み前に、ボーンワックス、ポートプラグ、又はＰＭＭＡなどで作製されたキャップを用いて１つ以上の開口をシールしうる。キャップは、ネジ込み型のセルフシーリングゴムにして開口に取付け可能である。いくつかの構成では、拡散チャンバーは、２つ以上の注入開口又はポートを含有しうる。チャンバー内容物のサンプリングは、対象の身体の外側でキャップを取り外して通常の針及びシリンジを挿入するように開口にアクセスすることにより、実施可能である。いくつかの実施形態では、チャンバーは、取出しデバイスをさらに含みうる。かかるデバイスは、患者からのチャンバーの取出しを容易にする。
【００４６】
実施形態では、チャンバーは、治療的宿主免疫反応を促進する目的で腫瘍抗原が拡散してチャンバーから送出されるように設計された抗原デポとして機能する。外因性ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ及びｅｘ  ｖｉｖｏ照射は、炎症誘発反応を促進する。この製剤は、臨床上及びラジオグラフィー上の改善、プロトコルによる長期生存に関連し、外因性活性医薬成分（ＡＰＩ）と腫瘍免疫作用を誘発又は増強すると解釈される照射とを含む新規な自己由来細胞ワクチンとなる。さらに、低濃度のＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの添加は、炎症誘発反応にきわめて重要である（図１２）。
【００４７】
ある特定の実施形態では、本開示は、（ａ）腫瘍細胞と（ｂ）有効量のアンチセンス分子とを含む、癌に罹患している対象に植え込むためのバイオ拡散チャンバーを提供する。他の実施形態では、（ａ）腫瘍細胞と有効量のアンチセンス核酸とを含むバイオ拡散チャンバーを得ることと、（ｂ）バイオ拡散チャンバー及び内容物に照射することと、（ｃ）治療有効期間にわたり照射バイオ拡散チャンバーを対象に植え込むことと、を含む、対象において癌を治療する方法が提供される。
【００４８】
ある特定の実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、約０．５μｇ〜約１０μｇの範囲内の量でバイオ拡散チャンバー内に存在する。ある特定の態様では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、約１μｇ〜約５μｇ／チャンバー又は約２μｇ〜４μｇ／チャンバーの範囲内の量で存在する。特定の態様では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、約２μｇ／チャンバーの量で存在する。特定の態様では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、約４μｇ／チャンバーの量で存在する。理論により拘束されるものではないが、これらのレベルは、対象においてＭ２免疫刺激反応を回避しつつ対象においてＴｈ１反応増強を促進すると考えられる。
【００４９】
ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、チャンバーへの封入前にＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮで処理されない。しかしながら、典型的には、腫瘍細胞は、チャンバーへの封入前にＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮで処理される。封入前に細胞を処理する時間は、さまざまでありうる。たとえば、腫瘍細胞は、最大約４時間、最大約６時間、最大約８時間、最大約１２時間、又は最大約１８時間にわたり、封入直前にｅｘ  ｖｉｖｏでＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮを用いて処理しうる。典型的には、腫瘍組織は、約１２時間〜約１８時間にわたり封入前にｅｘ  ｖｉｖｏで処理しうる。便宜上、細胞は、一晩まで前処理を継続した後で封入しうる。理論により拘束されるものではないが、封入前の処理は、腫瘍抗原の刺激生成に望ましい役割を果たすと考えられる。
【００５０】
封入前の処理に使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの量は、約１ｍｇ〜８ｍｇ／１００万細胞、たとえば、約２ｍｇ〜約６ｍｇ／１００万細胞、約３ｍｇ〜約５ｍｇ／１００万細胞の範囲内でありうる。典型的には、封入前の処理に使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの量は、約４ｍｇ／１００万細胞である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ処理のＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、少なくとも約２ｍｇ／ｍｌ〜少なくとも約５ｍｇ／ｍｌの範囲内の濃度で使用される。ある特定の態様では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、少なくとも４ｍｇ／ｍｌの濃度で使用される。具体的な実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、４ｍｇ／ｍｌの濃度で使用される。
【００５２】
ある特定の実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ及びチャンバーに存在するＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、同一である。他の実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ及びチャンバーに存在するＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、異なる。ある特定の実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、少なくとも約５ヌクレオチド、少なくとも約１０ヌクレオチド、少なくとも約１５ヌクレオチド、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約２５ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約３５ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約４５ヌクレオチド、又は少なくとも約５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、約１５ヌクレオチド〜約２２ヌクレオチドの長さである。ある特定の態様では、腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、約１８ヌクレオチドの長さである。
【００５３】
ある特定の実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、１８℃では二次構造を形成するが、約３７℃では二次構造を形成しない。他の実施形態では、腫瘍細胞を治療するために使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、約１８℃でも約３７℃でも二次構造を形成しない。さらに他の実施形態では、ｅｘ  ｖｉｖｏで腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、いずれの温度でも二次構造を形成しない。他の実施形態では、腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、３７℃で二次構造を形成しない。特定の実施形態では、二次構造は、ヘアピンループ構造である。
【００５４】
いくつかの態様では、腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、配列番号１のヌクレオチド配列又はそのフラグメントを含む。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、配列番号１又はそのフラグメントに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、又は１００％の同一性を有しうる。ある特定の態様では、腫瘍細胞を処理するために使用されるＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、配列番号１である。
【００５５】
ある時間にわたり腫瘍細胞をＡＳ−ＯＤＮで処理した後、ＡＳ−ＯＤＮを除去して新たなＡＳ−ＯＤＮをチャンバーに添加し、次いで、対象への植込み前に照射する。ある特定の態様では、バイオ拡散チャンバーは、約１Ｇｙ、約２Ｇｙ、約４Ｇｙ、約５Ｇｙ、約６Ｇｙ、約１０Ｇｙ、又は最大約１５Ｇｙの量でγ線照射により処理される。ある特定の態様では、照射線量は約５Ｇｙ以下である。他の態様では、照射線量は少なくとも約５Ｇｙである。いくつかの態様では、照射線量は５Ｇｙである。ある特定の実施形態では、バイオ拡散チャンバーは、少なくとも１回、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、又は少なくとも５回照射しうる。いくつかの実施形態では、チャンバーは、対象への植込み前に約２４時間未満で照射される。他の実施形態では、チャンバーは、対象への植込み前に約２４時間照射される。さらに他の実施形態では、チャンバーは、対象への植込み前に少なくとも約２４時間照射される。さらに他の実施形態では、チャンバーは、対象への植込み前に約４８時間以下で照射される。さらに他の実施形態では、チャンバーは、対象への植込み前に少なくとも約４８時間照射される。
【００５６】
腫瘍細胞は、典型的には、植込み前に照射などにより死滅させるが、細胞を死滅させる必要はなく、実際には、抗原の放出を促進するために細胞を生存状態で維持することが有利なこともある。そのため、ある特定の実施形態では、植込み前に細胞に照射しないこともある。しかしながら、安全上の目的で、対象への腫瘍生細胞の放出を防止することが望ましい。
【００５７】
腫瘍細胞は、さまざまな数で拡散チャンバーに配置可能である。ある特定の実施形態では、約１×１０４〜約５×１０６腫瘍細胞が各拡散チャンバーに配置される。他の実施形態では、約１×１０５〜約１．５×１０６腫瘍細胞が拡散チャンバーに配置される。さらに他の実施形態では、約５×１０５〜１×１０６腫瘍細胞がチャンバーに配置される。対象を有することは使用しうる。我々は、腫瘍細胞の数が対象の抗腫瘍反応に影響を及ぼしうること及び所望の結果を得る機会を増加させるために適切な範囲を選択すべきであることを発見した。図２８は、２０個のチャンバーが植え込まれた患者のデータを示し、免疫反応に対応する細胞収量（何百万もの細胞）を示す。抗腫瘍免疫反応は、１つのチャンバーに約７５０，０００〜約１，２５０，０００細胞の範囲内が最適であり、約１００万細胞／チャンバーにピークを有する。照射腫瘍細胞を含有する複数のチャンバーが投与され、最適免疫反応を維持するために、細胞数／チャンバーは好ましくはその範囲内に維持される。好ましくは、腫瘍細胞はインタクトであり、本明細書に記載されるように自己分解したり損傷したりもしない。
【００５８】
ある特定の実施形態では、チャンバー内の細胞とＡＳ  ＯＤＮとの比を維持することが好ましいこともある。そのため、ある特定の態様では、チャンバーは、約２μｇのＡＳ  ＯＤＮと、７５０，０００〜１，２５０，０００細胞たとえば１，０００，０００細胞と、を含有しうる。そのため、細胞とＡＳ  ＯＤＮとの比は、約３．７５×１０５〜約６．２５×１０５／μｇ  ＡＳ  ＯＤＮの範囲内、たとえば、約５．０×１０５細胞／μｇでありうる。そのため、２０個のチャンバーを収容する典型的患者では、ＡＳ  ＯＤＮの全用量は約４０μｇである。
【００５９】
典型的には、投与は、本明細書に記載されるようにチャンバーで行われるであろうが、ある特定の態様では、照射細胞及びＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、チャンバーや他の容器に物理的に一緒に閉じ込めることなく対象に共投与しうる。そのため、この方式を用いるある特定の方法では、照射細胞及びＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、対象の生理機能により制限される体内で、分散、拡散、又は代謝される。そのため、ある特定の態様では、たとえば、使用に供される腫瘍細胞は、チャンバー用として本明細書に記載したように調製してＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮと共に投与しうるが、投与は、物理的容器内に閉じ込めなくてもよい。かかる投与は、典型的には筋肉内である。
【００６０】
チャンバー用腫瘍組織調製物
自己由来ワクチン接種に使用される腫瘍細胞は、対象から外科的に取り出される。実施形態では、腫瘍細胞は、組織モルセレータを用いて患者から取り出される。抽出デバイスは、好ましくは、静置外側カニューレ内の高速往復内側カニューレと電子制御可変吸引とを組み合わせる。外側カニューレは、１．１ｍｍ、１．９ｍｍ、２．５ｍｍ、又は３．０ｍｍの直径と、１０ｃｍ、１３ｃｍ、又は２５ｃｍの長さと、を有する。装置はまた、サイドマウスカッティングとブラントデシケーター端部から０．６ｍｍに位置するアスピレーションアパーチャとに依拠する。除去される組織内へのアパーチャの弱い前進圧力と吸引との組合せによりサイドアパーチャ内に所望の組織を引き込んで、内側カニューレの往復カッティング動作を介して制御された正確な組織切除を可能にする。重要な特徴は、回転ブレードが存在しないことであり、これにより、意図されない組織がアパーチャに引き込まれないようにする。好適なデバイスの例は、ミリアド（Ｍｙｒｉａｄ）（登録商標）組織アスピレータ（ニコ・コーポレーション（ＮＩＣＯ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）（登録商標）、インディアナポリス、インディアナ州）であり、これは直接的、微視的、又は内視鏡的な可視化を併用して軟組織の取出しに使用しうる侵襲を最小限に抑えた外科システムである。剃毛組織を吸引し、採取チャンバーに収集し、そして無菌組織トラップに採取する。無菌組織トラップへの組織の採取時、血液は調製物から除去される。好ましくは、無菌トラップは、トラップの底部の採取ディッシュと、トラップへのアクセスを提供するステムと、を含有する。トラップ構造はまた、トラップからの組織の取出しを容易にするためにトラップから取出し可能な内側レードル形構造を含有しうる。
【００６１】
好ましくは、モルセレータは、切除部位でもそのシャフトに沿っても熱を発生することがなく、組織取出しのために超音波エネルギーを必要としない。そのため、特定の実施形態では、腫瘍組織は、細切腫瘍組織（すなわち、熱の不在下で且つ任意選択的に超音波処理の不在下でサイドマウスカッティングにより得られた腫瘍剃毛組織）である。有利には、アスピレータ抽出物及び細切組織は、他の方法により取り出された組織よりも高い生存能を有する。抽出プロセスは、部分的には取出し時に高温への腫瘍細胞の暴露が制限されるため、より高い腫瘍細胞生存能を維持すると考えられる。たとえば、本明細書の方法は、取出し時に２５℃超に腫瘍細胞を暴露しない。そのため、細胞は、体温すなわち約３７℃を超える温度に暴露されない。
【００６２】
対象から得られる腫瘍組織の量は、さまざまでありうる。好ましくは、量は、患者から得られる湿潤腫瘍組織換算で少なくとも１グラム、少なくとも２グラム、少なくとも３グラム、又は少なくとも４グラムである。組織は、無菌組織トラップから取り出され、大きな組織片を破壊するために無菌ピペットを用いてピペッティングすることにより脱凝集される。次いで、脱凝集された細胞懸濁物は、無菌組織培養プレート上の血清含有媒体中に配置され、組織培養インキュベーターでインキュベートされる。このプレーティングステップは、接着により所望の機能細胞を富化するように機能し、調製物からデブリを除去するのに役立つ。そのため、本明細書に記載の治療に使用される腫瘍細胞は、好ましくは、腫瘍組織由来の接着細胞から本質的になるか又はそれからなる。
【００６３】
あらかじめ決められたインキュベーション時間後（たとえば、６、１２、２４、又は４８時間後）、細胞はプレートから取り出される。細胞は、擦取により、化学的方法（たとえばＥＤＴＡ）により、又は酵素処理（たとえばトリプシン）により、取り出しうる。細胞は、１つ以上の拡散チャンバーに配置される。いくつかの実施形態では、細胞は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又はそれ以上の拡散チャンバーに分割される。多くの場合、２０個のチャンバーが使用される。いくつかの実施形態では、各拡散チャンバーは、等しい細胞数を含有する。いくつかの実施形態では、第１の拡散チャンバーは、第２のチャンバーよりも多くの細胞を含有する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、細胞は、チャンバー内に配置される前に選別される。いくつかの実施形態では、細胞は、チャンバー内に配置される前に１つ以上の細胞マーカに関して選択することにより富化される。選択は、たとえば、ビーズを用いて又は当業者に公知の細胞選別技術により実施しうる。いくつかの実施形態では、チャンバー内に配置された細胞は、１つ以上のマーカに関して富化される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、治療有効期間にわたるバイオ拡散チャンバーの植込みは、対象において癌の再発を低減又は排除する。ある特定の態様では、バイオ拡散チャンバーの植込みは、対象において癌に関連する腫瘍体積の低減を引き起こす。さらに他の実施形態では、治療有効期間にわたるバイオ拡散チャンバーの植込みは、対象において腫瘍の排除を誘発する。いくつかの実施形態では、チャンバーの植込みは、少なくとも３ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも３６ヶ月間にわたり、又は無期限に腫瘍の再成長を阻害する。
【００６６】
バイオ拡散チャンバーは、次のように、すなわち、対象の皮下、腹腔内、及び頭蓋内に、植込み可能であるが、これらに限定されるものではない。ある特定の実施形態では、拡散チャンバーは、良好なリンパ液排出及び／又は血管供給を有する身体の受容部位、たとえば、腹直筋鞘に植え込まれる。他の実施形態では、治療後に拡散チャンバーを空にして治療に再使用できるように、補充可能なチャンバーを利用しうる。ある特定の態様では、複数、好ましくは５〜２０の拡散チャンバーを単一対象で使用可能である。
【００６７】
ある特定の実施形態では、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約１０、少なくとも約１５、少なくとも約２０、少なくとも約２５、少なくとも約３０、少なくとも約３５、少なくとも約４０、少なくとも約４５、又は少なくとも約５０のチャンバーが対象に植え込まれる。いくつかの実施形態では、１０〜２０個のチャンバーが対象に植え込まれる。好ましくは、約２０個のチャンバーが対象に植え込まれる。ある特定の実施形態では、腫瘍細胞は、各チャンバーに等しく分配される。
【００６８】
典型的には、チャンバーは、ある時間後に取り出される。たとえば、チャンバーは、約２４時間、約４８時間、約７２時間、又は約、９６時間にわたり対象に植え込みうる。約４８時間にわたる植込みは、有益な治療アウトカムに関連する。したがって、好ましい植込み時間は約４８時間である。ある特定の実施形態では、ワクチン接種手順は、１回／患者で実施される。他の実施形態では、ワクチン接種手順は、複数回／患者で実施される。実施形態では、ワクチン接種手順は、単一患者で２回、３回、４回、５回、６回、７回、又は８回実施される。実施形態では、ワクチン接種は、所与の期間にわたり７日ごと、１４日ごと、２８日ごと、又は１ヶ月ごと、３ヶ月ごと、又は６ヶ月ごとに繰り返される。さらなる実施形態では、ワクチン接種手順は、患者の癌がなくなるまで定期的に繰り返される。
【００６９】
理論により拘束されるものではないが、バイオ拡散チャンバーの植込みは、チャンバーから拡散して送出された腫瘍抗原に対する免疫反応が達成されるように植込み部位又はその近傍でＭ２細胞の排除又は低減を引き起こすと考えられる。ある特定の態様では、植込み部位におけるＭ２細胞の排除又は低減は、ＣＤ４  Ｔ細胞への抗原提示細胞（ＡＰＣ）による自己由来腫瘍抗原の提示増強をもたらし、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）の産生及び１型腫瘍免疫の誘導をもたらす。ある特定の態様では、腫瘍抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生及びＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの抗Ｍ２効果は、１型抗腫瘍免疫並びに循環系及び腫瘍マイクロ環境からの抗炎症性Ｍ２細胞の減少を駆動し、腫瘍成長を間接的に妨害する。いくつかの態様では、腫瘍抗原特異的ＣＤ４  Ｔ細胞によるＩＦＮγの産生及びＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの抗Ｍ２効果は、腫瘍細胞及び腫瘍マイクロ環境（Ｍ２細胞）に対するエフェクター媒介損傷の抑制を解いて、腫瘍抗原を認識するメモリーＴ細胞をプログラムするより長いプロセスを開始する。ある特定の実施形態では、抗腫瘍適応免疫反応は、腫瘍退縮の継続を維持する。
【００７０】
任意選択的に、チャンバーに導入される細胞は、ある特定の細胞型が富化されうる。細胞骨格関連クラスＶＩ中間径フィラメント（ＩＦ）タンパク質のネスチンは、神経幹細胞マーカとしてのその重要性が従来から有名である。我々は、ある特定の脳腫瘍サンプルでネスチン陽性細胞（ネスチン＋細胞）が良性組織と比較して富化されること及びこの関連物質が治療反応の改善に対応することを発見した。そのため、ある特定の態様では、ネスチン発現の程度を評価するように対象の腫瘍の生検を行うことが可能であり、したがって、ある特定の態様では、チャンバー細胞は、良性組織と比較してネスチン陽性（「＋」）細胞が富化される。理論により拘束されるものではないが、ネスチンは、抗腫瘍免疫反応を起こすのに有用な好適な抗原に関連するマーカを提供すると考えられる。したがって、チャンバーに植え込まれる細胞は、対象から抽出したとき全体として腫瘍細胞集団と比較してネスチン＋細胞が富化されうる。図３０は、ネスチンが富化された腫瘍サンプルを反応の刺激に使用したときに得られた免疫反応の増強を例示する。
【００７１】
全身投与
チャンバーの植込みの代わりとして又は補足として、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、全身投与しうる。そのため、実施形態では、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、全身投与用医薬組成物で提供される。ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮのほか、医薬組成物は、たとえば生理食塩水（０．９％塩化ナトリウム）を含みうる。組成物はリン脂質を含みうる。いくつかの態様では、リン脂質は、生理学的ｐＨで非荷電であるか又は中性電荷を有する。いくつかの態様では、リン脂質は中性リン脂質である。ある特定の態様では、中性リン脂質はホスファチジルコリンである。ある特定の態様では、中性リン脂質はジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）である。いくつかの態様では、リン脂質は本質的にコレステロールフリーである。
【００７２】
いくつかの態様では、リン脂質及びオリゴヌクレオチドは、約５：１〜約１００：１のモル比又はそれから演繹しうるいずれかの比で存在する。各種態様では、リン脂質及びオリゴヌクレオチドは、約５：１、１０：１、１５：１、２０：１、２５：１、３０：１、３５：１、４０：１、４５：１、５０：１、５５：１、６０：１、６５：１、７０：１、７５：１、８０：１、８５：１、９０：１、９５：１、又は１００：１のモル比で存在する。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチド及びリン脂質は、オリゴヌクレオチド−脂質複合体たとえばリポソーム複合体などを形成する。いくつかの態様では、リポソームの少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％は、５ミクロン未満の直径である。各種態様では、組成物は、少なくとも１種の界面活性剤たとえばポリソルベート２０などをさらに含む。いくつかの態様では、全リポソームアンチセンス製剤の少なくとも約５％は界面活性剤からなり、且つリポソームの少なくとも約９０％は５ミクロン未満の直径である。いくつかの態様では、全リポソームアンチセンス製剤の少なくとも約１５％は界面活性剤からなり、且つリポソームの少なくとも約９０％は３ミクロン未満の直径である。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドの集団はリポソームの集団に組み込まれる。
【００７３】
いくつかの態様では、医薬組成物は液状医薬組成物である。他の態様では、医薬組成物は固形医薬組成物である。
ヒト対象におけるアンチセンスの全身投与の投与量は、約０．０２５ｇ／ｋｇ、約０．０５ｇ／ｋｇ、約０．１ｇ／ｋｇ、約０．１５ｇ／ｋｇ、又は約０．２ｇ／ｋｇでありうる。ある特定の実施形態では、全身投与の投与量は、０．０２５ｇ／ｋｇ〜０．２  ｇ／ｋｇでありうる。いくつかの実施形態では、投与量は約０．２ｇ／ｋｇである。他の実施形態では、投与量は０．００４ｇ／ｋｇ〜０．０１ｇ／ｋｇである。他の実施形態では、投与量は０．０１ｇ／ｋｇ未満である。さらなる実施形態では、投与量は０．０１ｇ／ｋｇ〜０．２ｇ／ｋｇではない。ある特定の態様では、アンチセンスは凍結乾燥粉末として供給され、投与前に再懸濁される。再懸濁されある場合、アンチセンスの濃度は、約５０ｍｇ／ｍｌ、約１００ｍｇ／ｍｌ、約２００ｍｇ／ｍｌ、約５００ｍｇ／ｍｌ、約１０００ｍｇ／ｍｌ、又はそれらの量の間の範囲でありうる。
【００７４】
ある特定の実施形態では、ＡＳ  ＯＤＮは、たとえば、術前に腫瘍負荷を低減するために、術前に全身投与しうる。たとえば、ＡＳ  ＯＤＮは、術前２４時間まで、３６時間まで、４８時間まで、又は７２時間までに投与しうる。特定の態様では、医薬組成物は、術前約４８〜約７２時間で投与しうる。典型的には、かかる状況では、投与は静脈内ボーラスによる。
【００７５】
組合せ療法
歴史的には、癌療法は、放射線療法、化学療法、又はその両方を併用して対象を治療することを含むものである。かかる方法の取組みは、数多く報告されている。しかしながら、有利には、本明細書に開示されるチャンバー植込み方法は、癌を有する対象を単独療法として治療するために使用しうる。そのため、本明細書に開示される方法は化学療法も放射線療法も含まないことが好ましい。しかしながら、本明細書の単独療法により達成される優れた効果にもかかわらず、ある特定の状況下では、チャンバー法を他の療法たとえば放射線療法と組み合わせることが有益なこともある。ある特定の実施形態では、放射線療法としては、限定されるものではないが、内部線源放射線療法、外部ビーム放射線療法、及び全身放射性同位体放射線療法が挙げられる。ある特定の態様では、放射線療法は外部ビーム放射線療法である。いくつかの実施形態では、外部ビーム放射線療法としては、限定されるものではないが、γ線療法、Ｘ線療法、強度変調放射線療法（ＩＧＲＴ）、及び画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）が挙げられる。ある特定の実施形態では、外部ビーム放射線療法はγ線療法である。照射は、チャンバー植込み前又は植込み後にたとえばサルベージ療法として施しうる。典型的には、かかるサルベージ療法は、癌が再発したと判定されるまで実施されない。
【００７６】
そのため、ある特定の組合せ法では、本明細書に記載のチャンバー法及び全身法及び組成物はいずれも、単独で又は放射線療法若しくは化学療法との組合せで同一対象において使用しうる。本明細書に記載の組合せ法では、チャンバー植込みは、好ましくは第一選択の療法として使用される。対象の免疫系は、他の療法により阻害されてチャンバー植込みの治療効果を低減する可能性があるので、最初にチャンバー植込みを使用することが望ましい。
【００７７】
任意選択的に、チャンバー植込み前に全身投与を実施しうる。かかる方法は、プライミング法として対象免疫系を増強するために使用可能である。プライミング法は、先行療法の結果として対象の免疫系が損なわれた場合にとりわけ有利でありうる。
【００７８】
全身投与を組合せで使用する場合、ＡＳ  ＯＤＮは、自己由来癌細胞ワクチンを用いた患者の治療の少なくとも２週間前、少なくとも１週間前、少なくとも３日間前、又は少なくとも１日前に全身投与しうる。他の実施形態では、ＡＳ  ＯＤＮは、自己由来癌細胞ワクチンすなわちチャンバーを用いた患者の治療の少なくとも１日後、少なくとも３日後、少なくとも１週間後、又は少なくとも２週間後に全身投与しうる。
【００７９】
任意選択的に、対象は、１回目のワクチン接種後に記載の方法を用いてチャンバーにより再ワクチン接種しうる。２回目以降の追加のワクチン接種では、組織取出し時に対象から採取して貯蔵した腫瘍細胞を使用しうる。任意選択的に、２回目以降の追加のワクチン接種では、対象から取り出して本明細書に記載されるように処理した新たな腫瘍組織を使用しうる。対象に残留するいずれの腫瘍も、同一抗原を発現しうるので、デポ剤として作用して再刺激を提供しうる。しかしながら、再発腫瘍は、新たな抗原を発生しうるので、抗腫瘍反応を刺激する追加の選択肢を提供しうる。後続のワクチン接種は、１回目の治療が終了し且つ腫瘍が再発した後又は対象が１回目の治療に反応しなくなった場合でありうる。
【００８０】
ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮで治療される対象
好適な対象は、癌を有する動物であり、典型的には、対象はヒトである。膠芽細胞腫などの脳癌は本明細書に開示される方法がとくに奏効するが、本方法は癌一般に適用される。したがって、本開示は、神経膠腫、星状細胞腫、肝癌、乳癌、頭頸部扁平上皮細胞癌、肺癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆嚢癌、古典的ホジキンリンパ腫、食道癌、子宮癌、直腸癌、甲状腺癌、黒色腫、結腸直腸癌、前立腺癌、卵巣癌、及び膵癌からなる群から選択されるものを含めて癌の治療方法を提供する。具体的な実施形態では、癌は神経膠腫である。ある特定の態様では、神経膠腫は再発悪性神経膠腫である。いくつかの実施形態では、癌は星状細胞腫である。ある特定の実施形態では、治療の候補となる対象は、ＷＨＯグレードＩＩ、ＷＨＯグレードＩＩＩ、又はＷＨＯグレードＩＶの腫瘍に罹患している。いくつかの態様では、腫瘍は星状細胞腫である。ある特定の実施形態では、腫瘍は、グレードＩＩ星状細胞腫、ＡＩＩＩ（ＩＤＨ１  Ｒ１３２Ｈ突然変異グレードＩＩＩ星状細胞腫）、ＡＩＩＩ−Ｇ（多形膠芽細胞腫の星状細胞腫の特性を有するＩＤＨ１野生型グレードＩＩＩ）、又はグレードＩＶ星状細胞腫から選択される。
【００８１】
グレードＩＶ星状細胞腫は、最高グレード神経膠腫であり、膠芽細胞腫（ＧＢＭ）と同義である。３又は４／１００，０００の年間発生率で、ＧＢＭは成人において最も一般的な悪性原発脳腫瘍である。標準ケア療法（典型的には、放射線療法とテモゾロミドを用いた化学療法との組合せ）は十分に機能せず、ＧＢＭ患者のアウトカムは依然として不良であり、メジアン寿命予想値は１５〜１７ヶ月である。有利には、本明細書の方法は、新たに診断された脳癌を治療するために使用しうるとともに、たとえば標準ケア療法で以前に治療された患者で再発膠芽細胞腫を治療するためにも使用しうる。そのため、ある特定の態様では、対象は、新たに診断されたＧＢＭ対象又は再発ＧＢＭ対象でありうる。対象は、好ましくは、免疫抑制的ないずれの治療法でも以前に治療されていない者である。特定の態様では、適格対象は、１８歳超の年齢であり、且つ６０以上のカルノフスキースコアを有する。任意選択的に、対象は、両半球疾患を有しておらず、且つ／又は自己免疫疾患を有していない。
【００８２】
任意選択的に、治療の候補となる対象は、対象で腫瘍生検を実施することによる同定しうる。いくつかの実施形態では、単球の存在に関して対象の腫瘍がアッセイされる。ある特定の態様では、単球としては、限定されるものではないが、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１４＋、ＣＤ１５＋、ＣＤ２３＋、ＣＤ６４＋、ＣＤ６８＋、ＣＤ１６３＋、ＣＤ２０４＋、又はＣＤ２０６＋の単球が挙げられる。腫瘍における単球の存在は、免疫組織化学を用いてアッセイしうる。ある特定の実施形態では、治療の候補となる対象は、対象の全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、又は約５０％を超えるＣＤ１６３＋Ｍ２細胞を示す。ある特定の態様では、対象は、対象の全ＰＢＭＣの約２０％を超えるＣＤ１６３＋Ｍ２細胞を示す。
【００８３】
さらに他の実施形態では、治療の候補となる対象は、対象の血清中の１種以上のサイトカインの存在により同定される。こうしたサイトカインとしては、限定されるものではないが、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ６、及びＣＸＣＬ７、ＩＬ６、ＩＬ７、ＩＬ８、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＦＮ−γ、並びにＨＳＰ−７０が挙げられる。
【００８４】
さらに他の実施形態では、治療の候補となる対象は、対象の血清中の１種以上の成長因子の存在により同定される。こうした成長因子としては、限定されるものではないが、ＦＧＦ−２、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＭ−ＣＳＦが挙げられる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、バイオ拡散チャンバーによる治療の候補となる対象は、サイトカインの特定のセットのレベルを測定することにより同定される。いくつかの実施形態では、対象は、健常対象と比較してこれらのサイトカインのレベルの上昇を有する。本明細書で用いられる場合、「健常対象」という用語は、癌やいずれの他の疾患にも罹患していない且つバイオ拡散チャンバーによる治療を必要としない対象を意味する。
【００８６】
特定の実施形態では、サイトカインは、抗腫瘍免疫反応を補うためにチャンバーに添加しうる。たとえば、チャンバーに添加されるサイトカインは、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２１、及びＣＸＣＬ１２及びそれらの組合せからなる群から選択しうる。
【００８７】
ある特定の実施形態では、循環ＣＤ１４＋単球は、健常対象と比較して上昇したＣＤ１６３レベルを有する。いくつかの態様では、循環ＣＤ１４＋単球上のＣＤ１６３レベルは、健常対象と比較して、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、又は少なくとも約１００倍に上昇する。特定の実施形態では、循環ＣＤ１４＋単球上のＣＤ１６３レベルは、健常対象と比較して約２倍に上昇する。
【００８８】
他の実施形態では、治療の候補となる対象は、Ｍ２細胞の方向に未分化単球を分極化する血清を有する。ある特定の態様では、未分化単球を併用した対象の血清のインキュベーションは、限定されるものではないが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４、及び／又はＣＤ２０６をはじめとする単球上の１種以上の細胞表面マーカの発現を誘発する。他の態様では、未分化単球を併用した対象の血清のインキュベーションは、対象の血清を併用してインキュベートされない単球と比較して単球上の１種以上の細胞表面マーカの発現を上昇させる。ある特定の態様では、細胞表面マーカとしては、限定されるものではないが、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ２３、ＣＤ６４、ＣＤ６８、ＣＤ１６３、ＣＤ２０４、及び／又はＣＤ２０６が挙げられる。いくつかの態様では、１種以上の表面マーカのレベルは、対象の血清を併用してインキュベートされない未分化単球と比較して、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約９０倍、又は少なくとも約１００倍に上昇する。特定の実施形態では、１種以上の表面マーカのレベルは、対象の血清を併用してインキュベートされない未分化単球と比較して約２倍に上昇する。対象の血清により分極化された単球は、ＦＡＣＳを用いて測定しうる。
【００８９】
標的細胞
理論により拘束されるものではないが、ＡＳ  ＯＤＮは、ＩＧＦ−１Ｒ発現をダウンレギュレートすることにより、対象のＭ２細胞の低減及び／又はＭ２細胞への細胞の分極化の阻害を行うと考えられる。いくつかの実施形態では、Ｍ２細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ発現は、アンチセンスで処理されていない細胞と比較して、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％ダウンレギュレートされる。Ｍ２細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ発現は、定量ＲＴ−ＰＣＲにより測定しうる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、Ｍ２細胞におけるＩＧＦ−１Ｒ発現は、アンチセンスの単回投与を受けた後、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、又は少なくとも約６週間にわたり、対象においてダウンレギュレートされた状態を維持する。
【００９１】
いくつかの態様では、Ｍ２細胞におけるＩＧＦ−１Ｒの発現のダウンレギュレーションは、ＩＧＦ−１Ｒを発現しない細胞と比較して対象のＭ２細胞の選択的低減を引き起こす。ある特定の実施形態では、対象のＭ２細胞は、アンチセンスで治療されていない対象と比較して、少なくとも約２％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％低減される。他の実施形態では、Ｍ２細胞集団は排除される。たとえば、バイオ拡散チャンバーの植込み後、Ｍ２細胞集団は、バイオ拡散チャンバーの植込み前の集団の約１％、約２％、約５％、又は約１０％でありうる。対象のＭ２細胞は、ＦＡＣＳを用いて測定しうる。ある特定の態様では、治療後、Ｍ２細胞は排除される。すなわち、ＦＡＣＳにより検出不能である。他の態様では、Ｍ２細胞の減少は、プロキシアッセイを用いて測定しうる。たとえば、処理の前後で対象から血清を得てＭ２細胞に分極化するその能力を評価しうる。本明細書に開示される方法で処理した後、Ｍ２細胞に分極化する血清の能力は、約８０％〜約１００％、約２０％〜約６０％、又は約１０％〜約５０％低減される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、Ｍ２細胞におけるＩＧＦ−１Ｒの発現を標的としてＭ２細胞に細胞死を引き起こす。ある特定の実施形態では、細胞死は壊死である。他の実施形態では、細胞死はアポトーシスである。アポトーシスは、本開示の目的では、プログラム細胞死として定義され、限定されるものではないが、原発腫瘍及び転移腫瘍の退縮を含む。アポトーシスは、膨大な数の生理学的及び病理学的プロセスにおいてきわめて重要な役割を果たす広範にわたる現象であるプログラム細胞死である。壊死は、これとは対照的に、さまざまな有害条件及び毒性物質に対する細胞の反応である偶発的細胞死である。さらに他の実施形態では、Ｍ２細胞におけるＩＧＦ−１Ｒの発現を標的としてＭ２細胞に細胞周期停止を引き起こす。
【００９３】
キット
完成チャンバーの作製には、複数のコンポーネント及び複数のステップが必要とされる。本開示の他の一態様では、本明細書に開示される方法を実施するためのコンポーネントを含有するキットが提供される。ある特定の態様では、キットは、一方の部分又は２つの半体に存在しうるチャンバー本体を含む。また、１つ以上のメンブレン、接着物質、及び溶媒（たとえば、アルコール又は２ジクロロエタン）を含めて、チャンバーをシールするアイテムも含まれうる。任意選択的に、メンブレンは、シールを形成するようにチャンバーに超音波溶接しうる。キットはアンチセンスＯＤＮを含む。任意選択的に、ＯＤＮは２つの部分に分配しうる。対象から外科的に取り出した後で細胞を処理するための第１の部分及び対象に導入する時に細胞と組み合わせるための第２の部分。他の任意選択的キットアイテムとしては、細胞を培養するための培地及び培地における細菌成長を防止するための抗生物質が挙げられる。
【００９４】
任意選択的に、キットのチャンバーは、アイレット又はチャンバーに装着されて接続材料を受け取るように適合化された他のデバイスを用いて、互いにあらかじめ接続しうる（たとえば、縫合糸により）。有利には、複数のチャンバーをあらかじめ接続することにより、外科医により所望の数のチャンバーを容易に導入したり取り出したりしうる。
【実施例】
【００９５】
実施例１
再発膠芽細胞腫を有する患者における自己由来腫瘍細胞及びＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮによるワクチン接種
判定基準及び研究目的
標準的療法に失敗した後の１２名の対象を治療のために登録した。各患者は、次の判定基準：年齢＞１８歳、６０又はそれよりも良好なカルノフスキーパフォーマンススコア、且つ、待機的外科的再切除を妨げる併存症がないことを満たした。対象は、腫瘍免疫を刺激する目的で照射自己由来腫瘍細胞とＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮとを含有する１０個のバイオ拡散チャンバーを腹直筋鞘に２４時間植え込むことにより治療した。臨床上及びラジオグラフィー上の安全性さらには免疫反応に関して患者をモニターした。研究目的には、安全性及びラジオグラフィー反応の評価さらには免疫機能及び免疫反応を調べる探索目的が含まれていた。
【００９６】
【表２】
2020510021.tif 000005
実験プロトコル
組織アスピレータ（ニコ・ミリアド（ＮＩＣＯ  Ｍｙｒｉａｄ）（登録商標））を用いて患者から腫瘍組織を外科的に取り出して無菌組織トラップに配置した。指定ＢＳＬ−２設備に無菌組織トラップを移し、そこで腫瘍組織を処理してバイオ拡散チャンバーに配置した。植込み前にバイオ拡散チャンバーに照射した。
【００９７】
腫瘍組織を取り出す手術の翌日、１０個の照射バイオ拡散チャンバーを対象の腹直筋鞘に植え込んだ。２４時間後、それらは取り出した。
バイオ拡散チャンバーは、術時に取り出した自己由来腫瘍細胞を含有していた。バイオ拡散チャンバーに添加する前、配列５’−ＴＣＣＴＣＣＧＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴＴ−３’（ＮＯＢＥＬ）を有する第１の量（４ｍｇ／ｍｌ）の１８マーＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮで細胞を一晩（約１２〜１８時間）前処理した。ＡＳ  ＯＤＮが免疫モジュレート性を有することを示すデータに基づいて、第２の量（２μｇ）の外因性ＮＯＢＥＬアンチセンスをチャンバーに添加し（Ｃ−ｖ）、続いてチャンバーに照射した。各患者に１０個のチャンバーを植え込んだ。ＰＢＳを含有する１１番目の対照チャンバー（Ｃ−ｐ）も植え込んだ。
【００９８】
放射線学的評価
フィリップス（Ｐｈｉｌｉｐｓ）１．５Ｔ及び３Ｔ  ＭＲＩスキャナー及びＧＥ  １．５Ｔ  ＭＲＩスキャナーを用いて、逐次イメージング評価を実施した。１２名の全患者においてルーチン解剖学的ＭＲＩ特性を２名の神経放射線科医により評価した。動的磁化率強調（ＤＳＣ）ＭＲ灌流及び１５方向拡散テンソルイメージング（ＤＴＩ）の生理学的ＭＲＩ技術も利用した。オンノルディック・アイス（Ｎｏｒｄｉｃ  Ｉｃｅ）ワークステーション（バージョン２．３．１４）でＭＲ灌流及びＤＴＩ後処理を実施した。対側正常白質と対比してｒＣＢＶを計算した。ＤＴＩデータから平均拡散係数（平均拡散率）を計算した。
【００９９】
免疫学的評価
免疫機能のベースラインを評価するために、術前１週間で血漿白血球分離を実施した。術後７、１４、２８、４２、５６日目及びワクチン接種後３ヶ月ごとに血液を得た。遠心分離により血清画分と細胞画分とを分離し、赤血球溶解緩衝液で細胞を処理した。フローサイトメトリーにより白血球を定量するか又は−８０℃のＤＭＳＯ中に貯蔵するかのどちらかを行った。血清試料も−８０℃で貯蔵した。イージーサイト８ＨＴ（ＥａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴ）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））と、ヒトＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ２０、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、及びＣＤ８６（すべてＢＤバイオサイエンシズ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）製）並びにＣＤ１６３（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ））に特異的な蛍光コンジュゲートｍＡｂと、を用いて、フローサイトメトリーを実施した。フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ）ソフトウェア（ツリー・スター・インコーポレーテッド（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ  Ｉｎｃ）、アシュランド、オレゴン州）を用いて、採取後分析を実施した。ルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）ビーズアレイ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製のヒトサイトカイン／ケモカインパネルＩ、ＩＩ、及びＩＩＩ）と、ＨＣＭＢＭＡＧ／  ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ  Ｍａｇキャンサーマルチプレックスアッセイ（ｅｍｄｍｉｌｌｉｐｏｒｅ．ｃｏｍ）と、を用いて、血清中サイトカイン因子を定量した。これはＤＫＫ−１、ＮＳＥ、オステオネクチン、ペリオスチン、ＹＫＬ−４０、及びＴＷＥＡＫを含めて幹細胞機能に関連する神経膠腫に対する６種の血清中マーカを含んでいた。グリース（Ｇｒｅｉｓｓ）法（グリーンＬ．Ｃ．（Ｇｒｅｅｎ  Ｌ．Ｃ．）ら著、１９８２年、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）、第１２６巻、ｐ．１３１−８）に従って、血清中ニトレートレベルをアッセイした。すでに記載されているように、ホルボール１２−ミリステート，１３アセテート（ＰＭＡ）とイオノマイシンとを用いてＴ細胞刺激を実施した（フェアブルッヘ，Ｉ．（Ｖｅｒｂｒｕｇｇｅ，Ｉ．）ら著、２０１２年、キャンサー・リサーチ（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ）、第７２巻、ｐ．３１６３〜７４）。
【０１００】
以上に示されたルミネックス（Ｌｕｍｉｎｅｘ）キットにより、腫瘍細胞上清（ＳＮ）中及び外植チャンバー内容物中のサイトカイン／ケモカインレベルを分析した。標準的免疫組織病理学的検査のために、対をなすワクチンチャンバー及び対照チャンバーのメンブレンをパラフィンに包埋した。
【０１０１】
ＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）、ＩＧＦ−１Ｒ、ＣＤ１６３、ＣＤ１４、ｖＷＦ（フォンウィルブランド因子）、ＣＤ４、及びＣＤ８に対する免疫組織化学又はエモト，Ｋ．（Ｅｍｏｔｏ，Ｋ．）ら著、２００５年、ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトケミストリー（Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ）、第５３巻、ｐ．１３１１〜２１に記載の方法に適合する蛍光免疫組織化学により、腫瘍組織セクションを評価した。低、中、及び強と等級付けされる染色強度及び限局的又は瀰漫的として記述される染色パターンと共に０（染色なし）〜６（強い拡散染色）の順序尺度を用いて、アペリオ（Ａｐｅｒｉｏ）により定量的に又は経験を積んだ神経病理学者（ＬＣＫ）により定性的に、免疫陽性細胞を計数した。死後の剖検は、脳の検査に限定し、知見は、剖検時に診断された処理済み又は未処理の膠芽細胞腫のアーカイブパラフィンブロックと比較した。ナイーブ単球のカノニカルｉｎ  ｖｉｔｒｏ分極化又は登録時のトライアル対象に由来する血清と共に共インキュベートされたナイーブ単球を含む混合実験は両方とも、すでに記載されているように実施した（ハーシャイン，ＬＡ（Ｈａｒｓｈｙｎｅ，ＬＡ）ら著、２０１５年、ニューロ・オンコロジー（Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ）、第１８巻、第２号、ｐ．２０６〜１５、ソリナス，Ｇ．（Ｓｏｌｉｎａｓ，Ｇ．）ら著、２０１０年、ジャーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ）、第１８５巻、ｐ．６４２〜５２）。
【０１０２】
統計解析
ｐ＜０．０５で対応のない両側ｔ検定又はマッチドペアｔ検定により、異なるサンプルの定量的尺度間の統計的有意水準を決定した。カプラン・マイヤー分析及びログランク比較により確証される有意性により、生存分析を実施した。混合判別分析を含めて統計解析はすべて、ＪＭＰバージョン１１ソフトウェア（ＳＡＳ、ノースカロライナ州）を用いて実施した。
【０１０３】
安全性評価及び臨床経過
１つの重篤有害イベント（ＳＡＥ）のみ、プロトコルに関連した（白血球分離後の大腿静脈血栓症）。９名の患者は腫瘍進行に屈し、一方、３名の患者は他の原因で死亡した。５名の剖検を実施した。
【０１０４】
初期診断からのメジアン全生存は９１．４週間であり、他の再発神経膠腫免疫療法試験と比較して優れていた（図２ａ）。４８．２週間及び１０週間という有意差のある２つのプロトコル生存コホートが、それぞれ、より長い生存コホート及びより短い生存コホートとして同定された（図２ｂ）。１つの外れ値（患者ＴＪ０３）を除いて、我々は、プロトコル生存と登録時のリンパ球減少の程度との間の有意な相関を実証した（図２ｃ）。初期診断時及びプロトコル登録時のＣＢＣ値の比較から、標準的療法後の平均リンパ球数の有意な低下（６５％）が示唆された（Ｎ＝８、ｐ＝．０１２、対応のあるｔ検定）。
【０１０５】
ラジオグラフィー反応
２名の神経放射線科医（Ｋ．Ｓ．Ｔ．及びＡ．Ｅ．Ｆ．）により、ルーチンＭＲＩ特性を評価して等級付けした。より長いコホートでは、原発腫瘍部位の増強サイズ及びＦＬＡＩＲエンベロープの減少が、より遅い進行と共に観測された。両方のコホートの解剖学的反応の例は、図３ａ及び３ｂに示される。生理学的ＭＲＩ測定は、こうした解剖学的観測を補った。臨床的に改善しつつ相対脳血液量（ｒＣＢＶ）の逆説的増加を有していた３名のより長期の生存者（患者ＴＪ０３、ＴＪ０６、及びＴＪ０９）を含めて７名の患者で逐次ＤＳＣ  ＭＲ灌流を実施したが、この効果は一過的であり、より持続的なｒＣＢＶの減少が見られた。逐次１５方向ＤＴＩデータには、疾患退縮に関連する腫瘍細胞性の低下を反映して罹患半球で見掛けの拡散係数（ＡＤＣ）値の増加を示した２名の長期生存者（患者ＴＪ０３及びＴＪ０６）が含まれていた。我々は、短いコホートでは見られない、逆説的ｒＣＢＶ反応とＡＤＣ増加との間の高い相関に注目した（図３ｃ及び３ｄ）。より長いコホートの対応する血清中ニトレートレベルは、炎症反応が開始される可能性を反映した（データは示されていない）。
【０１０６】
生存コホート別に周術期血清と対比した外植チャンバーの検査
外植チャンバーは、生存細胞がなく構造的にインタクトであった。Ｃ−ｐ及びＣ−ｖチャンバーの両方のメンブレンの外表面は、ＣＤ１５＋及びＣＤ１６３＋細胞で被覆されたが、Ｃ−ｖメンブレン上の数は劇的に増加した（図４ａ）。
【０１０７】
全研究コホートでは、チャンバーの可溶性内容物の分析から、対応する周術期血清中レベルを超えるいくつかの成長因子及びサイトカイン／ケモカインの有意な上昇が明らかにされた。その多くは、神経膠腫腫瘍マイクロ環境（ＴＭＥ）で数多く報告されている。試験した７８種のサイトカイン／ケモカインのうち３２種は、血清を超えて有意に上昇し、マッチドペア分析から、以下の表２に記されるようにサイトカインの有意な上昇が明らかにされた。
【０１０８】
【表３−１】
2020510021.tif 000006
【０１０９】
【表３−２】
2020510021.tif 000007
これらの上昇は、封入腫瘍細胞により産生されたサイトカイン／ケモカイン又はチャンバー内に拡散した局所先天性免疫反応により産生された因子のどちらかであると解釈された。
【０１１０】
より長いコホートでは、ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ−α、ＩＬ−１１、ＣＣＬ５、ＭＣＰ−３、及びＭＩＰ−１ｄが有意にチャンバー上昇し、一方、短いコホートでは、ＮＳＥ、オステオネクチン、及びＹＫＬ４０をはじめとするいくつかの可溶性癌マーカが有意に上昇することが、生存コホート間のチャンバー因子分析から明らかにされた。混合判別分析では、独立して、これらのコホート差が同定された（図４ｂ）。
【０１１１】
いずれのコホートでも、ペリオスチン及びＣＣＬ２のレベルは両方とも、チャンバー（Ｃ−ｖ）内の方が血清値又はＳＮ値よりも有意に低かったことから、チャンバー内ではこれらのケモカインを産生する細胞が排除されることが示唆される（図４ｃ）。
【０１１２】
生存コホート別のワクチン接種後の血清中サイトカイン／ケモカイン及びＰＢＭＣ
評価された７８種のサイトカイン／ケモカインのうち２４種のレベルは、以下の表３に示されるように、より長いコホートの血清では短いコホートと比較して有意に高かった。
【０１１３】
【表４】
2020510021.tif 000008
術後に血清中ＣＣＬ２のスパイクが起こったが、２名の患者では再手術時に不在であった。ＣＣＬ２レベルは、短いコホートでは術後の全期間にわたり有意により高い状態を維持した。こうした術後のスパイクは、ＴＮＦ−αスパイクと高い相関があった（図５及び６）。
【０１１４】
短いコホートと比較してより長いコホートでは、実際のＣＤ４及びＣＤ８のＴ細胞数さらには樹状細胞（ＤＣ）数は有意により多く、周術期ＣＤ１４＋１６−数は有意により少かった。より長いコホートでのみ、ＣＤ４細胞とＤＣ細胞との間及びＣＤ４とＣＸＣＬ１２との間に有意な相関が存在した。ＰＭＡ及びイオノマイシンによる刺激後にＩＦＮγをはじめとするＴｈ−１サイトカインの産生が短いコホートよりも有意により高くなることが、より長い生存対象の１４日目のＰＢＭＣから明らかにされた（データは示されていない）。ワクチン接種後のＴ細胞、単球、及び炎症誘発性ケモカイン／サイトカインの循環レベル間の協調変化は、４名の対象のうち３名で見られた。全単球数とＣＤ１４＋１６−単球レベルとの間の最も高い相関は特筆すべきであった（図５ｂ及び５ｄ）。より長いコホートでは循環Ｔ細胞数と循環単球数との間の逆相関もまた特筆すべきであり（図５）、短いコホートでは有意差はなかった（図６）。免疫抑制性細胞集団と炎症誘発性細胞集団との間の予測可能な相互関係さらには単球−ケモカインの関係から、より長いコホートでより高い免疫適応性が示唆された。
【０１１５】
パラフィン切片の検査
外科的介入から剖検までのパラフィン切片を４つの症例で分析に利用可能であったので、我々はワクチン接種後のＴＭＥを調べることができた。我々は、再手術及び未治療のＧＢＭ患者のトライアル剖検と剖検とを比較した（図７）。マッチドペアでワクチン接種後のＩＧＦ−１Ｒ陽性細胞の有意な減少が免疫染色により明らかにされた。これは蛍光免疫組織化学により確証された（図７ａ及び７ｇ）。豊富なＣＤ１６３ＴＡＭ及びＩＧＦ−１Ｒ＋細胞が両方とも、再発又は未治療の神経膠腫剖検のどちらとの定性的比較によっても明らかにされたので、剖検アーチファクトとして細胞が失われるといういずれの懸念も低減された（図７ｇ）。
【０１１６】
ＣＤ１６３ＴＡＭは、初期手術及び剖検の両方とのマッチド比較で再発時にピークとなった（図７ｃ及び７ｇ）。患者ＴＪ０６及びＴＪ１０は、すべての治療相を通じて評価可能なサンプルでこうした傾向を裏付けた（図７ｂ及び７ｄ）。ＴＪ０６の場合には、ＣＤ１６３細胞は、２回目のワクチン接種後に減少し、剖検まで存続した。この減少は、各ワクチン後にいずれも増加したｒＣＢＶ及びＡＤＣの値さらには血清中ニトレートレベルに逆相関した（図７ｆ参照）。
【０１１７】
末梢単球との関連を探究したところ、短いコホートでは末梢ＣＤ１６３＋単球とＣＤ１６３ＴＡＭとの間に強い相関が見られたが（図７ｅ）、より長いコホートでは見られなかったことが（図７ｆ）、特筆すべきことであった。
【０１１８】
我々は、どちらのコホートでもワクチン接種後にＴＭＥにＴ細胞集団の出現を見なかった。
対象の血清と未分化単球との共インキュベーション
患者の循環ＣＤ１６３＋単球の起源を探究するために、我々は、最初に、カノニカルＭ１及びＭ２サイトカインのＩＦＮ−γ及びＩＬ−４をそれぞれ用いてナイーブ単球を分極化した。我々は、Ｍ２分極化のみを用いてＩＧＦ−１Ｒのアップレギュレーションを観測した（図８ａ）。Ｍ２分極化ＣＤ１６３＋集団は、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮと共にインキュベートしたときに選択的にノックダウンされた（図８ｂ）。
【０１１９】
続いて、我々は、ナイーブ単球とすべての研究対象から得られた血清とを共インキュベートして、ＩＧＦ−１ＲとＰＤＬ−１との両方を共発現したＣＤ１６３＋細胞の出現を実証した（図８ｃ）。ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮで処理すると、ＩＧＦ−１Ｒ、ＰＤ−Ｌ１、及びＣＤ１６３を発現する細胞は、図８ｄにまとめられた平行的且つ用量依存的な方式で有意にノックダウンされた（図８ｃ）。
【０１２０】
考察
改訂された自己由来細胞／チャンバーベース多形膠芽細胞腫（ＧＢＭ）ワクチン接種試験は、有意な安全上の問題をなんら引き起こさなかった。
【０１２１】
我々は、このワクチンパラダイムに対している異なる反応を示す有意差のある２つの生存コホートを同定した。図５及び６を参照されたい。より長いコホートの対象は、典型的には、術後及びワクチン接種後、腫瘍特異的抗体アイソタイプと、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩＬ１２、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１９、及びＣＣＬ２１をはじめとするＴｈ１免疫に一般に関連したサイトカイン／ケモカインと、のレベルの上昇を呈した。これらのサイトカイン／ケモカインのレベルの上昇は、短いコホートでは見られなかった。したがって、Ｔｈ１免疫に一般に関連したサイトカイン／ケモカイン（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、ＩＬ１２、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ７、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１）のレベルは、術後／ワクチン接種後、生存を予測するために及びさらなる治療ストラテジーを通知するために評価しうる。興味深いことに、ＣＣＬ２１及びＣＸＣＬ１２は、ＣｐＧアジュバントと相乗作用し、ワクチン接種パラダイムにおいてＤＣの遊走能及びＴ細胞刺激能を増強する。また、より長いコホートにおけるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−６、Ｆｌｔ３Ｌ、及びＳＣＦの特筆すべき上昇は、ＤＣ増殖を増強可能であり、ワクチン接種後のｐＤＣの有意な７６％増加に寄与しうる。また、ＣＤ４細胞の有意な上昇、さらにはＣＤ４細胞、ｐＤＣ、及びサイトカインＣＸＣＬ１２の間の相関から、Ｔ細胞増殖の誘導の成功は、免疫シナプス時にＣＸＣＬ１２により促進されることが示唆される。
【０１２２】
短い生存コホートの患者は、典型的には、ワクチン接種前により長い治療コースに付されてリンパ球減少症を生じていた。したがって、ワクチン接種は、正常リンパ球レベルの患者すなわち非リンパ球減少症の患者に投与したときに最も有効である。また、治療誘発リンパ球減少症及びより低いＣＤ４：ＣＤ８比は、テモゾラミドが原因であるみなしうる。（標準ケアには、テモゾラミドを伴う原体放射線照射と、術後６週間で開始された維持テモゾラミドと、が含まれた）。より長い全生存の帰趨には、腫瘍抗原への慢性暴露及び持続的神経膠腫阻害シグナルによるＴ細胞枯渇が含まれるであろう。同様に、単球／マクロファージは、ワクチン接種後にごく限られた変動を伴って反応性の明らかな欠如を有していたが、末梢ＣＤ１４＋１６−細胞とＴＡＭとの間には識別可能相関があった。ＴＡＭは、ＣＣＬ２産生に関連付けられており、この相関は、腫瘍成長を促進する閉ループ増幅となって現れうる。これを裏付けるように、短いコホートに見いだされる血清中ＣＣＬ２レベルの上昇は、神経膠腫患者において間葉遺伝子発現プロファイル及び予後不良に関連付けられている。
【０１２３】
外植チャンバーは、封入ＴＭＥのユニークなスナップショット及び初期免疫反応との関わりを提供した。より長いコホートのチャンバーのサイトカイン上昇は、総括すると、ワクチン接種がＴｈ１反応を誘発してこのコホートの血清がＴｈ１免疫に関連した腫瘍特異的抗体アイソタイプを含むことを示唆した。混合判別分析は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びＩＬ１２の産生との関連を確立した。
【０１２４】
これとは対照的に、短いコホートのチャンバーは、標準的療法後、神経膠腫幹細胞（ＧＳＣ）に関連する耐性の出現を表す癌マーカのより大きな上昇を有していた。１つの目立った例外は、対応のある血清値と比較してすべてのチャンバーで劇的に低下したペリオスチンレベルであった。神経膠腫の腫瘍促進細胞集団は、ＴＡＭとＧＳＣとを含み、前者は、同一の血管周囲ニッチで後者を支持し（シュウ，Ｗ（Ｚｈｏｕ，Ｗ）ら著、２０１５年、ネイチャー・セル・バイオロジー（Ｎａｔ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ）、第１７巻、ｐ．１７０〜８２）、且つ両方とも治療ストラテジーの標的となる。ＧＳＣ分泌ペリオスチンによりリクルートされるＭ２マクロファージは、腫瘍成長に重要な役割を果たすので、その排除は治療上の利点を有するであろう。処理された腫瘍細胞を含有するチャンバー内のペリオスチンレベルの低減から、この因子自体を分泌するＧＳＣがＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの標的であることが示唆される。
【０１２５】
とくに、既存の免疫抑制（標準ケアに係る前治療に基づく）にもかかわらず、我々は、１２名の患者のうち４名でワクチン接種後に炎症誘発反応により裏付けられたラジオグラフィー上及び臨床上の改善を確証した。これらの患者はまた、プロトコルで有意な生存優位性を有していた。この生存差をさらに探究して、我々は、より長いコホートにおけるより高レベルの免疫適応性に注目した。
【０１２６】
ワクチン接種後のＩＧＦ−１Ｒの低減は、幾人かの対象においてより長いプロトコル生存に関連付けられた。特定の理論になんら拘束されるものではないが、ワクチン接種パラダイムによりこれらの個体において促進された１型免疫機序の結果としてＩＧＦ−１Ｒ＋細胞集団がノックダウンされる可能性がある。
【０１２７】
我々がｉｎ  ｖｉｔｒｏで示してきたように、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、ワクチン調製物に含まれるＣＤ１６３＋細胞を不活性化することにより、その免疫モジュレート性因子を排除して１型免疫を促進する。さらに、ワクチンチャンバーから拡散して送出されるいずれのＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮも、それらが到達するＭ２マクロファージに対して類似の効果を有する。これは、ＰＤＬ−１、他の免疫モジュレート性因子、血管形成因子、栄養補助物、及び腫瘍浸潤物をはじめとするさまざまな腫瘍促進リガンド及び因子を発現する細胞が標的となる新規なプラットフォームに相当する。
【０１２８】
より長い生存患者コホートと短い生存患者コホートとのラジオグラフィー観測差は、ワクチン接種パラダイムがより広範な神経膠腫ＴＭＥに影響を及ぼすという考え方のさらなる裏付けを提供する。より高いｒＣＢＶ値は、典型的には、腫瘍進行に関連付けられ、ＭＲ灌流は、より長いコホートで一過的な増加を有するにすぎない（これまで記載されていない知見）。ＡＤＣ測定は、腫瘍進行（より低い値）と細胞損失として我々が解釈したもの（より高い値）とを区別した。このワクチン接種パラダイムは、ＩＧＦ−１Ｒ細胞とＣＤ１６３＋ＴＡＭ集団との両方の低下に関連付けられるので、ＡＤＣ値の上昇は、これを反映したものである。
【０１２９】
まとめると、我々は、改善された組合せ神経膠腫ワクチン製剤の安全性プロファイルを確立し、臨床上及びラジオグラフィー上の改善に関連付けられる免疫パラメーターの変化を実証した。腫瘍成長を促進する特異的単球細胞集団（たとえば、ＩＧＦ−１Ｒを共発現するＣＤ１６３＋細胞）をノックダウンすることが約束されるので、このパラダイムは、免疫無防備を生じない治療スキームを提供する。
【０１３０】
結果のまとめ
プロトコル治療に関連するグレード３毒性は存在せず、初期診断からのメジアン全生存は９１．４週間であった（図２ａ）。４８．２週間（「長い」）及び１０週間（「短い」）のメジアン生存を有する２つのプロトコル生存コホートが同定された（図２ｂ）。より長い生存対象は、脳血液量（ｒＣＢＶ）の一過的上昇と、一過性充血及び細胞損失として解釈される見掛けの拡散係数（ＡＤＣ）値の持続的上昇と、を含むイメージング所見を有していた。ワクチン療法は、腫瘍マイクロ環境（ＴＭＥ）からの腫瘍促進ＣＤ１６３＋Ｍ２及びＩＧＦ−１Ｒ＋細胞集団の持続的損失をもたらした。ＣＤ１６３＋Ｔ細胞の起源を探究するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験を実施したところ、こうした実験から、対象の血清が未成熟単球をＩＧＦ−１ＲとＰＤＬ−１との両方のアップレギュレーションを有するＣＤ１６３＋細胞に分化させることが確認された。ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮを用いた後続のインキュベーションは、このＭ２集団の用量依存ノックダウンをもたらした。これは、ワクチンチャンバー内でＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮにより処理された封入ＴＭＥ（腫瘍マイクロ環境）の免疫原性を示唆する。ワクチンパラダイムは、耐容性が良好で有利なメジアン生存を有する。
【０１３１】
実施例２
膠芽細胞腫を有する新たに診断された対象へのワクチン接種
我々は、標準的治療に失敗した再発悪性神経膠腫を有する患者に植え込まれるバイオ拡散チャンバーを含む製剤化組合せ物の一部として送達される自己由来細胞ワクチンを含むワクチンプロトコルの生物学的有効性を実証した。
【０１３２】
実施例２には、２０個のチャンバーを２４又は４８時間及び１０個のチャンバーを２４又は４８時間植え込むことを含む、新たに診断された神経膠腫患者へのワクチン投与に対する反応を記載する。いずれの場合も２μｇのＮＯＢＥＬをいずれの場合も照射前にチャンバーに添加した。１回目の中間解析で標準ケアと比較したとき、無進行生存及び全生存の両方で有意な改善が見られた（図９）。このことは、ワクチン接種後のより高用量のコホートの性能に起因して最も顕著に現われた。我々は、最初に、再発時に治療された患者と比較して新たに診断された患者におけるワクチン接種後の有意に高いピーク及び平均のインターフェロンγレベルに注目した。新たに診断された神経膠腫患者を登録する試験では、我々は、全血清測定の測定時の各ワクチン用量漸増に伴うＩＦＮ−γの顕著で有意な増加に注目した。より長い植込みを行ったときのより高いインターフェロンγレベルは、アンチセンスがバイオ拡散チャンバーから拡散して送出される速度にほぼ相関する。
【０１３３】
これらのデータは図１０にまとめられており、自己由来チャンバーワクチンが新たに診断された膠芽細胞腫患者において抗腫瘍反応を誘発することを例示する。我々は、ＩＦＮγレベルの増加が腫瘍抗原に対する患者の反応を表しうることにさらに注目した。そうであれば、抗腫瘍免疫及びアウトカムの改善の予測因子となりうる。最後に、再発患者と対比して新たに診断されたＧＢＭ患者で得られたよりロバストな反応は、対象の免疫系の影響を例示しており、第一選択の療法としての患者へのワクチン接種を支持する。
【０１３４】
実施例３
完全製剤化チャンバーはより大きなアジュバント活性を有する
完全製剤化チャンバーは、自己由来腫瘍細胞と腫瘍マイクロ環境（ＴＭＥ）に含まれる他の細胞とを含み、植込み前に４ｍｇ／ｍｌのＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮで６時間処理される。次いで、処理されたＴＭＥに少なくとも２μｇのＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの外因的添加を行って封入し、次いで、５Ｇｙのγ線照射でチャンバーに照射する。
【０１３５】
我々は、チャンバーの数を増加させた。つまり、各患者が摂取するＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの用量を前の研究と比較して増加させた。たとえば、植え込まれるチャンバーの数を２倍にすると、植え込まれてチャンバーから拡散して送出可能なアンチセンスの量は２倍になる。つまり、ＡＳ  ＯＤＮの用量は、２０個のチャンバーに分割されて約４０μｇであった。
【０１３６】
アンチセンス配列とくにそのパリンドロームＣｐＧモチーフ及び神経膠腫細胞との直接的混合物は、ｉｎ  ｓｉｔｕで抗腫瘍免疫を有効に開始する。注目すべきことに、同一のパリンドロームＣｐＧモチーフを有するセンス配列は、ワクチンパラダイムにおいて無効である。そのほか、アンチセンス配列は、満足な反応を得るために腫瘍接種物と直接混和しなければならない。Ｍ２単球分極化を阻害するＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの用量は、ＩＧＦ−１Ｒの発現をダウンレギュレートするのに必要な用量よりも少なくとも１桁少ない。
【０１３７】
前臨床動物モデリングでは、我々は、ワクチン接種後に大脳皮質に植え込まれた同種同系ＧＬ２６１神経膠腫細胞を拒絶したＣ５７  ＢＬ６マウス由来の治療用ＩＦＮ−γ産生ＣＤ４Ｔ細胞を再刺激する各種抗原調製物の有効性を評価した。従来法を用いてこれらの動物の脾臓からＣＤ４Ｔ細胞を単離し、各種ＧＬ２６１抗原調製物と共にインキュベートされた抗原ナイーブマウス由来の骨髄由来樹状細胞に添加した。自己由来腫瘍細胞を含む完全製剤化ワクチンチャンバーの可溶性画分から回収された抗原、外因性アンチセンス、及び照射は、不完全製剤よりも多数のＩＦＮ−γ産生ＣＤ４Ｔ細胞を有意に誘導した。
【０１３８】
２４時間にわたりＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹に植え込まれたさまざまなＧＬ２６１調製物を含有するチャンバーの分析でも、完全製剤化チャンバーが最も免疫原性であることを示す証拠が提供される。ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ及び照射は各々単独でＰＢＳ対照を超えるサイトカインの上昇を引き起こすが、３２種のサイトカインのうち１６種は、ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮと組み合わせたときに照射のみを含めてすべての他の変動要因を超えて有意に上昇した。放射線誘導炎症誘発性サイトカインネットワークにより一般に産生されるＩＬ−１β、ＩＬ−６、及びＴＮＦ−αを含めて、これらのうち少なくとも１１種のサイトカインは炎症反応に関連付けられる。
【０１３９】
完全製剤化チャンバーに対する炎症誘発反応は、再発膠芽細胞腫の患者に対する我々の２回目の第１相ヒト試験で検証された。我々は、ワクチン接種後の２つの明確に異なる生存コホートに注目し、免疫適応性、ワクチン接種後の炎症誘発反応、及びより長い生存（未公開観測）との関連性を確立した。とくに、我々は、チャンバー内の腫瘍細胞への照射によりおそらくさらに補われる、Ｔｈ１表現型の方向にＣＤ４＋細胞をダイレクトする局所ＴＬＲ９ＤＣ活性化として我々が解釈したより長いコホートにおけるワクチン接種後の高いＣＤ４：ＣＤ８比に注目した。
【０１４０】
実施例４
ナイーブマウスにおける完全製剤化チャンバー
ナイーブＣ５７Ｂ６マウスでは、完全製剤化ワクチンチャンバーの植込みは、部分製剤化チャンバーよりも初期免疫反応の誘発に有意により有効であった。１チャンバーを用いて２４時間にわたりマウスの側腹にワクチン接種した。チャンバー内容物は、内容物なし（ＰＢＳ）から部分製剤化チャンバー（ＧＬ２６１神経膠腫細胞単独、ＡＳ  ＯＤＮを併用したＧＬ２６１、又はＧＬ２６１と５Ｇｙ照射）及び完全製剤化チャンバー（ＧＬ２６１、ＡＳ  ＯＤＮ、及び照射）まで変化させた。
【０１４１】
図１１に示されるように、部分製剤化ワクチンチャンバー（すなわち、腫瘍細胞を含有するがアンチセンス分子を含有しないワクチンチャンバー）が植え込まれたマウスと比較して完全製剤化ワクチンチャンバーが植え込まれたマウスにおいてより多くの炎症誘発性サイトカインの産生が見られた。
【０１４２】
実施例５
ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮによる正常サンプルにおける用量依存樹状細胞活性化
２つの正常ドナー源由来のＰＢＭＣを用いて、ＮＯＢＥＬアンチセンスさらにはすでに使用された配列（ＮＯＢＥＬ配列の２コドン上流の１８マーＤＷＡであり、アンドリュース（Ａｎｄｒｅｗｓ）ら著、２００１年、「悪性星状細胞腫におけるインスリン様成長因子Ｉ型レセプターに対するアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドの使用を含むパイロット研究の結果（Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｏｆ  ａ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ）」、ジャーナル・オブ・クリニカル・オンコロジー（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ）、第１９巻、ｐ．２１８９〜２２００に記載されている）による用量依存ＤＣ活性化を評価した。
【０１４３】
ＮＯＢＥＬアンチセンスに対するセンス配列も一緒に、ＰＢＭＣをアンチセンス配列と共に一晩インキュベートし、次いで、ＣＤ１２３＋、ＣＤ６８＋活性化ＤＣ集団をゲーティングしてフローサイトメトリーにより分析した。図１２に示されるように、ＮＯＢＥＬアンチセンスは、非刺激対照又はＮＯＢＥＬセンス配列と有意差のある且つＤＷＡ配列よりも有効な用量依存ＤＣ活性化を生じた。これらのデータは、ＮＯＢＥＬ配列が他のＩＧＦ−１  ＡＳと比較してもとりわけ有効であることを例示する。
【０１４４】
実施例６
ワクチン接種マウスに由来するＴ細胞を利用した完全製剤化チャンバーの内容物に基づくｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔ細胞反応
我々は、拡散チャンバーの小細孔サイズ（１００ｎｍ）を考慮して、エキソソームが植込み時のチャンバーメンブレンを介して拡散する腫瘍抗原源である可能性が高いという仮説を立てた。ＧＬ２６１神経膠腫細胞とＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮとを含む側腹注射によりＣ５７Ｂ６マウスにワクチン接種したところ、後続の脳実質内腫瘍チャレンジから完全に保護された。我々は、次の抗原源：１／ＧＬ２６１細胞とＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮとがロードされ、照射され、そしてマウスの側腹に２４時間植え込まれたチャンバーの遠心分離上清、２／３７℃の等張ＰＢＳ培地で一晩インキュベートして同様に調製されたチャンバーの遠心分離上清、３／ＧＬ２６１細胞から調製されたエキソソームを用いてＩＦＮγ用Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイにより完全製剤化チャンバーの内容物に対するこれらのマウスに由来するワクチン接種腫瘍治療Ｔ細胞免疫反応性を評価した。これらの抗原調製物を腫瘍抗原ナイーブマウス由来の樹状細胞に添加し、次いで、ＧＬ２６１免疫マウスの脾臓から単離されたＣＤ４Ｔ細胞に添加するか、又はＴ細胞への添加前に一晩インキュベートして抗原処理及び提示を行った。Ｔ細胞と抗原と樹状細胞との２４時間共培養の後、ＥｌｉｓｐｏｔアッセイでＩＦＮγ産生ＣＤ４Ｔ細胞の数を定量した。チャンバー内容物と各種希釈倍率のＧＬ２６１エキソソームとを比較した。２４時間ＰＢＳインキュベーションから回収されたチャンバー内容物を用いたときのみロバストなＩＦＮ−γ反応が抗原提示によりアッセイされることが、Ｅｌｉｓｐｏｔの結果から明らかにされた。植え込まれたチャンバーでもプレインキュベーションなしで樹状細胞が含まれる対照Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイでも、エキソソームとの有意差を生じなかった。ＴＭＥに由来する抗原は、本質的にエキソソームのものではなく、腫瘍細胞とＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮとを含有する照射チャンバーで最も豊富に産生され、それらは植込み時に消費され、且つＤＣによる抗原提示を必要とすること、が、データから明らかにされる。結果を図１３にまとめる。
【０１４５】
実施例７
Ｍ２単球／マクロファージ分極化への二相性用量反応
ｉｎ  ｖｉｖｏでＭ２分極化を阻害するＮＯＢＥＬ  ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮの最適用量を決定するために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスの側腹に１０６ＧＬ２６１細胞を注射した。２０日後、単回０．７５又は０．０７５ｍｇ用量のＮＯＢＥＬ  ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮをマウスの腹腔内に与えた。次いで、マウスの腫瘍発生を続けた。
【０１４６】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＭ２発生に関してＮＯＢＥＬアンチセンスの用量漸増は、逆説的二相性反応を生じた。用量探求漸増のどちらの極限用量でもＭ２単球のノックダウンを生じたが、中間用量では実際にはＭ２単球発生を刺激する。米国特許出願公開第２０１７／００５６４３０号明細書には、４ｍｇの単回用量は類似の実験できわめて有効であることが示された。本実験では、０．０７５ｍｇの単回用量はきわめて有効であったが、０．７５ｍｇの中間用量は予想外なことにそれほど有効でなかった。（図１７）。いずれの特定の理論又は作用機序にも限定、束縛、又は拘束されるものではないが、我々は、二相性作用がＮＯＢＥＬ配列の免疫刺激属性の帰趨でありうるという仮説を立てる。
【０１４７】
ＡＳ  ＯＤＮによる単球分極化の阻害に有効な用量は、ワトソン・クリック塩基対合則に従ってＩＧＦ−１Ｒ翻訳をダウンレギュレートするのに必要な用量よりもかなり少ない。注目すべきことに、０．０７５ｍｇ用量／マウスと等価なｉｎ  ｖｉｔｒｏ用量は、ＩＧＦ−１Ｒをすでに発現している細胞にはまったく影響を及ぼさない。ヒト単球を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ漸増実験から、分極化Ｍ２単球の表現型又は機能に影響を及ぼすこととはとは対照的に、分極化を防止するＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮ処理の能力には実質的な差が明らかにされる。
【０１４８】
図１４に示されるように、最低用量は、最高用量と同一の有効性を達成することから、ＮＯＢＥＬアンチセンスとＭ２発生との間の複雑なダイナミクスが示唆される。ＤＣ活性化に対する一相性反応に基づいて、理想的チャンバー用量は最大ＤＣ活性化のポイントになるであろう。
【０１４９】
実施例８
ＮＯＢＥＬにより単球分極化を阻害するための用量反応曲線
我々は、植え込まれたチャンバーから実現可能に局所的に拡散して送出される全濃度範囲内のレベルまでＮＯＢＥＬアンチセンス漸増を実施した。
【０１５０】
図１５に示されるように、さまざまな濃度のＩＧＦ−１Ｒ特異的ＡＳ−ＯＤＮ（ＮＯＢＥＬ）の存在下又は不在下で、膠芽細胞腫の患者から得られた６つの異なる血清と共に、３つの正常ＰＢＭＣ採取物由来の同種異系ナイーブ単球を一晩インキュベートした。各々着色ドットは、個別膠芽細胞腫患者由来の血清を表す。ＣＤ１６３を含むマーカの発現は、フローサイトメトリーにより評価した。ＣＤ１６３発現レベルは、蛍光コンジュゲートＣＤ１６３抗体で染色された細胞の平均蛍光指数として表される。
【０１５１】
各患者の血清は、ＩＧＦ−１Ｒ及びＰＤＬ−１の両方のアップレギュレーションを伴ってＭ０単球からＭ２ＣＤ１６３表現型への分化を引き起こした。患者血清を用いずに培養されたＭ０細胞（対照）は、非常に低レベルのＣＤ１６３を維持したが、血清中一晩インキュベーションは、このＭ２マーカの発現を強く誘発した（未処理）。培養培地へのＩＧＦ−１Ｒ特異的ＡＳ−ＯＤＮの添加は、用量依存的なＣＤ１６３発現の上昇により示唆されるようにＭ０−Ｍ２分極化を阻害した。我々は、１００ｐｇから始めて１μｇの有意阻害レベルに達するまでの衰微傾向に注目した。こうしたデータから、チャンバーから拡散して送出される過剰のアンチセンスは、先天性免疫の初期段階でＴｈ１反応の開始を促進可能であることが確認される。
【０１５２】
実施例９
ＣＬ２６１神経膠腫細胞が植え込まれたマウスにおける抗炎症性Ｍ２単球の出現の防止
ＧＬ２６１神経膠腫細胞が植え込まれたＣ５７ＢＬ／６マウスは、Ｍ２単球を発現する循環ＣＤ１６３の数の上昇と並行して腫瘍を発生する。我々は、神経膠腫細胞が単球のリクルートメント及びＭ２への分極化を引き起こす因子を産生するという仮説を立てた。これらの細胞は、次いで、そうした産物が腫瘍進行を促進する腫瘍組織に浸潤する。ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮによる全身治療は、Ｍ２細胞の出現を防止することにより腫瘍形成を阻害しうる。
【０１５３】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの側腹に１０６ＧＬ２６１細胞を植え込み、２０日後、単回用量の４ｍｇ  ＮＯＢＥＬ  ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮを腹腔内又は静脈内に与えた。
１４日後、動物から末梢血を得て、ＣＤ１６３発現に関してフローサイトメトリーにより循環単球を評価した。図１８は、ＣＤ１６３を発現する細胞数のヒストグラムを示し（右側ピーク）、「媒体」と記されたラインは、ＰＢＳ媒体で処置された植え込まれたマウスを表し、「ＡＳ−ＯＤＮ」と記されたラインは、ＡＳ−ＯＤＮで処置された植え込まれたマウスを表す。データは、ＣＤ１６３＋細胞が有意に減少することを示す。ＣＤ２０４又はＣＤ２０６を発現する細胞の出現は、同様に阻害された（データは示されていない）。植え込まれなかった正常マウス由来の末梢血は、高レベルのＣＤ１６３、ＣＤ２０４、又はＣＤ２０６を有する細胞を含有していなかった（データは示されていない）。
【０１５４】
実施例１０
側腹に神経膠腫細胞が植え込まれたマウスの全身ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮ治療は腫瘍の発生を予防する。
【０１５５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスの側腹に１０６ＧＬ２６１細胞を植え込み、２０日後、循環ＣＤ１６３陽性単球の出現の前に、単回４ｍｇ用量のＮＯＢＥＬ  ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮを腹腔内又は静脈内に与えた。他の群のＣ５７ＢＬ／６マウスには対照としてＰＢＳを注射した。次いで、両群のマウスの腫瘍発生を続けた。図１９に示されるように、治療群と未治療群との間の腫瘍発生率には有意差があり、ＮＯＢＥＬ治療マウスは、腫瘍フリー状態を維持する可能性がかなり高かった（＊＝ｐ＜０．０５）。
【０１５６】
実施例１１
側腹神経膠腫腫瘍成長の全身ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮ阻害は抗腫瘍免疫に依存しない。
【０１５７】
Ｔｂｅｔは、Ｔ細胞関連転写因子であり、Ｔｂｅｔ欠損マウスは、抗神経膠腫免疫を行う能力が欠如している。側腹神経膠腫腫瘍成長のＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮ阻害が抗腫瘍免疫に依存しないかを試験するために、Ｃ５７ＢＬ／６背景のＴｂｅｔ欠損マウスの側腹に１０６ＧＬ２６１細胞を植え込み、２０日後、単回４ｍｇ用量のＮＯＢＥＬ  ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮを腹腔内又は静脈内に与えた。次いで、マウスの腫瘍発生を続けた。
【０１５８】
図２０に示されるように、Ｔｂｅｔ欠損マウスには治療抗神経膠腫免疫を行う能力がないにもかかわらず、ＰＢＳで治療されたマウスとＮＯＢＥＬ  ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ−ＯＤＮで治療されたマウスとの間で腫瘍発生率に有意差があった（＊＝ｐ＜０．０５）。
【０１５９】
実施例１２
ＮＯＢＥＬを用いてチャンバー内でネスチン＋幹細胞を標的とする
我々は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＮＯＢＥＬアンチセンスによりネスチン＋幹細胞を用量依存的にノックダウン可能であることを示し、さらにこの細胞が自己由来細胞ワクチン後にＴＭＥから排除されることを示した（試験１４３７９〜１０１、未公開観測）。神経膠腫腫瘍マイクロ環境（ＴＭＥ）の一部である幹細胞として、それを選択的にノックアウトすることは明らかな治療効果を有する。胚性放射状グリア細胞を支持する形態で、この細胞は、そのデザイン及び長い突起により、脳全体にわたり神経膠腫細胞を配置可能にするスキャフォールドとして機能しうる。ＣＤ１６３ＴＡＭと共にそれを除去することにより、この腫瘍の浸潤性さらには腫瘍成長自体を逆転させうる。チャンバー内の標的となりうる細胞として、胚性起源であることから、この細胞由来の抗原は、非常に免疫原性がありうるとともに腫瘍特異的でありうる。ネスチンは、神経プロジェニター／幹細胞で主に発現され、ＶＩ型中間径フィラメントとして細胞質に位置する。また、それは、神経膠腫幹細胞の表面タンパク質及びバイオマーカとして同定されている。したがって、この集団をビーズ選択して富化することにより、チャンバーの炎症誘発力価を増加させることが可能であろう。ジン（Ｊｉｎ）ら著、「細胞表面ネスチンは神経膠腫幹細胞のバイオマーカである（Ｃｅｌｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  Ｎｅｓｔｉｎ  ｉｓ  ａ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｇｌｉｏｍａ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）」、バイオケミカル・バイオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．）、２０１３年４月１９日、第４３３巻、第４号、ｐ．４９６〜５０１を参照されたい。
【０１６０】
実施例１３
チャンバー製剤に及ぼす照射の影響
完全製剤化チャンバーの調製時、自己由来腫瘍細胞（すなわち、新たに切除された腫瘍組織）は、血清フリー培養でプレーティングされ、第１の量のＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮで任意選択的に処理され、その後、ｅｘ  ｖｉｖｏ照射で処理される（図１ｆ及び１ｇ）。第２の量のＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮは、照射前にチャンバーに添加される。
【０１６１】
自己由来ワクチン接種は、植込み前に腫瘍から離れた部位で組合せ物への照射を含み、我々のデータは、腫瘍退縮を有する免疫反応を支持するので、これらのデータは新規なアブスコパル効果を支持する。典型的には、アブスコパル効果は、標的腫瘍へのｉｎ  ｓｉｔｕ照射後の抗腫瘍免疫の活性化に起因し、それは照射から遠く離れた部位で腫瘍退縮をもたらす。この特定の製剤では、チャンバーへのＣｐＧモチーフを有する外因性アンチセンスの添加及びγ線照射による後続処理は、メモリーＴ細胞の活性化、増殖、及び生存に関与する遺伝子をアップレギュレートすることが示されている。かかる製剤はまた、Ｔｒｅｇの発生及び免疫寛容の誘発に関与する遺伝子の活性化を防止する。そのほか、ＩＧＦ−１Ｒのダウンレギュレーションは、この表面レセプターを過剰発現している細胞の放射線感受性を増強する。ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮとの共インキュベーションはまた、標的腫瘍細胞（ｉｎ  ｖｉｖｏのみ）及び腫瘍関連Ｍ２マクロファージのアポトーシスを促進する。５Ｇｙの照射は、すべての封入細胞の死をもたらし、死腫瘍細胞から放出された腫瘍抗原の提示を補う危険／損傷関連分子パターン（又はＤＡＭＰＳ）として知られる内因性危険シグナルの放出を引き起こす。
【０１６２】
実施例１４
将来的チャンバー製剤の炎症誘発剤を同定する手段としての外植チャンバー
デポ抗原デバイスとして適用した後に回収された外植バイオ拡散チャンバーはまた、前臨床マウスモデル及びヒト試験で確証された初期免疫反応を記録するリポジトリーとして機能する。適切なＰＢＳ（ダミー）チャンバー対照を用いたチャンバー内容物の特徴付けは、宿主免疫反応（ダミー対照を超えるサイトカイン／ケモカインの内方拡散）さらにはチャンバー内の細胞によるサイトカイン／ケモカイン／ＤＡＭＰＳの産生（ダミーチャンバーでは検出不能）の両方を理解する手がかりを提供する。一連のサイトカインの一貫した存在は、将来的製剤へのこうしたサイトカインの外因的添加を約束する。例として、ＣＣＬ２１及びＣＸＣＬは両方とも、ＰＢＳチャンバーを超えてワクチンチャンバーで上昇し、ＣｐＧアジュバントと相乗作用し、ワクチン接種パラダイムでＤＣの遊走能及びＴ細胞刺激能を増強する。図１６及び１７を参照されたい。チャンバー製剤へのこうしたサイトカインの外因的添加は、初期Ｔｈ−１反応を増強しうる。
【０１６３】
実施例１５
チャンバー内の細胞対ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの最適比はより高いサイトカイン値をもたらす
照射された腫瘍細胞及びＡＳ  ＮＯＢＥＬ  ＯＤＮ（２μｇ）を各々含有する２０個のチャンバーを用いて患者に４８時間ワクチン接種した。いずれの場合も、患者は、必須のトーマス・ジェファーソン大学病院（Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（ＴＪＵＨ）標準ケア（ＳＯＣ）療法を受けた。続いて、ある特定の時点で無進行生存（Ｐ−ＦＳ）（すなわち、癌の発生や寛解を示さずに生存する患者）及び全生存（ＯＳ）を決定した。図２１ａ〜ｃは、ある特定の時点で反応を例示する。図２４〜２７は、患者のアウトカムを例示し、治療（「ワクチン接種」）を受けた患者と過去の標準ケア（「ＳＯＣ」）を受けた患者とを比較する。チャンバー内の細胞対ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮの最適比を決定するために、我々は、ワクチン接種後の患者の血清中の炎症誘発性サイトカインレベルを測定し、これらのサイトカインレベルを各患者から取り出された腫瘍組織の細胞数と比較した。
【０１６４】
初期に、図２１ａ〜ｃに示されるように、炎症誘発性サイトカインの有意な用量依存的増加が患者の血清で観測された。ＩＦＮ−γの全レベルは、最大用量コホートできわめて有意に上昇した。ＩＬ１２及びＴＮＦａのレベルも、このコホートで上昇した。
【０１６５】
各患者に対する１４〜４２日目の３つのサイトカイン値の各々をプールして、ＩＦＮγ、ＩＬ１２、及びＴＮＦａの平均値に対してプロットした。４及び５の類似の当てはめ度を有する２つの多項式プロットから、ピーク炎症誘発性サイトカイン値が明らかにされた（図２１ｄ〜ｆ）。
【０１６６】
図２４ａ及び２４ｂは、全体として治療意図群の無進行生存及び全生存を例示するカプラン・マイヤー曲線を示す。ワクチン接種患者では、約３５％超は生存して２０ヶ月間無進行であった。これとは対照的に、ＳｏＣ治療患者の１０％未満は２０ヶ月間の無進行生存を示した。全生存も同様にかなり改善され、患者の約４０％は２５ヶ月間を超えて生存したが、ＳＯＣ治療はその時点で約５％生存を示す。図２４ｂ。
【０１６７】
図２５ａ及び２５ｂは、両群で女性数／男性数が１２／１８となるように対応させた６１．５歳のメジアン年齢の患者の生存データを示す。この場合も、データは各種時点で有意に改善された生存を例示する。
【０１６８】
試験時、一部の患者はプロトコルから離脱し、他の者は関連のない原因で死亡した。図２６ａ及び２６ｂは、離脱患者又は他の原因で死亡した患者のデータが不在の生存データを例示する。この場合も、ワクチン接種患者は、有意により良好な性能を示す。ある特定の患者は、標準ケアを終了できなかった。そうした患者を除くデータは、図２７ａ及び２７ｂに示される。これらのデータから、ワクチン接種法は、標準ケアプロトコルに従わないとき有効であることが確認される。
【０１６９】
図２８ａ及び２８ｂは、患者の反応に及ぼす投与細胞数の影響を例示する。ＩＦＮ−γレベルは対象の反応に対応する。より高いＩＦＮ−γレベルは、より良好な患者免疫反応ひいては抗腫瘍反応に関連付けられる。この場合、我々は、細胞の適正漸増数を決定することによるその反応を最適化した。ピーク反応は、評数２０（すなわち２０００万細胞）近傍であり、２０個のチャンバーに分配される。そのため、ピーク反応は約１００万細胞／チャンバーであるが、各々２０個のチャンバーに分配されて植え込まれる約１５００〜２５００万細胞、すなわち、７５０，０００細胞〜１，２５０，０００細胞／チャンバーの範囲で優れた反応が得られる。これらのデータから、最適化ワクチン接種プロトコルの有効性が実証される。
【０１７０】
実施例１６
ネスチン発現に関して富化された細胞集団を用いたワクチン接種により媒介される抗腫瘍反応の増強
チャンバー内のＩＧＦ−１Ｒ処理神経膠腫細胞による抗原の産生は、チャンバーパラダイムを用いて免疫された且つ抗原の存在を検出するためにコンジェニックＧＬ２６１細胞が頭蓋内にチャレンジされたＣ５７ＢＬ／６マウスから単離された神経膠腫免疫Ｔ細胞を用いてｅｘ  ｖｉｖｏで試験した。免疫Ｔ細胞のドナーとして機能するマウスを次のように免疫した。すなわち、ＧＬ２６１細胞とアンチセンスとが充填された完全製剤化チャンバーを側腹に２４時間植え込んだ。細胞のみを有するアンチセンスなしのチャンバーも、アンチセンス活性の対照として植え込んだ。実験全体を通じてマウスから採血し、ＧＬ２６１細胞に対する抗体反応性に関して血清を試験した（図３０ｃ、３０ｄ）。チャンバー植込みの３５日後、マウスの頭蓋内に定位的にＧＬ２６１細胞をチャレンジした。個別マウス群の生存及び疾患の臨床徴候をチャレンジ後少なくとも４０日間モニターした。生存及び臨床疾患スコアは、図３０ａ及び３０ｂにそれぞれ示される。
【０１７１】
磁気ビーズを用いて免疫マウスの脾臓からＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。免疫ＣＤ４Ｔ細胞に抗原を提示するために使用したナイーブ樹状細胞（ＤＣ）は、自己由来非免疫Ｃ５７ＢＬ／６マウスの骨髄から単離した。さまざまな条件下でチャンバー内で一晩培養されたＧＬ２６１細胞から回収されたＧＬ２６１抗原と共に一晩培養することによりＤＣをパルスし、類似のチャンバーが対象に植え込まれたときの抗原産生と対比して何が起こっているかを映し出した。チャンバーは、ＧＬ２６１細胞単独又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の３つの異なる用量のアンチセンスを併用したＧＬ２６１のどちらかを含有していた。アンチセンスを用いずに培養されたＧ２６１細胞由来の抗原調製物にさまざまな用量のアンチセンスを添加して、チャンバー内のアンチセンス内容物又はアンチセンスの影響が最適抗原産生に関与するかを決定した。抗腫瘍細胞免疫の主要な尺度であると考えられるＩＦＮγ産生を用いて、Ｔ細胞活性化に及ぼす各種抗原調製物の刺激作用を評価した。図２９ａに示されるように、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより定量された反応細胞の特定数が示される。
【０１７２】
抗原の産生を刺激するために、我々はｉｎ−ｖｉｖｏ臨床チャンバーパラダイムに従った。約１００万ｅｘ  ｖｉｖｏ  ＧＬ２６１腫瘍細胞を単独で又は指定アンチセンス濃度との併用でチャンバーに注入し、チャンバー内で一晩インキュベートした（ＰＢＳ中に配置した）。翌日、チャンバー内容物を抽出し、ナイーブ樹状細胞をパルスするために使用した。アンチセンスで一晩処理しなかったチャンバー内容物は、指示量のＮＯＢＥＬと共に樹状細胞に添加した。対照用として樹状細胞をナイーブ状態のままにした。抗原による一晩パルスの後、樹状細胞を採取し、サイトカインＩＦＮγに対するＥＬＩＰＳＰＯＴ検出抗体で被覆された細胞培養プレートで免疫動物からのＴ細胞と共に一晩インキュベートした。一晩のインキュベーション後、被覆プレートを処理して発色させ、各抗原に反応したＩＦＮγ産生Ｔ細胞の数を計数した。
【０１７３】
図２９ｂに示されるように、ＧＬ２６１細胞＋アンチセンスを含有するチャンバーから取り出された物質では腫瘍抗原が検出されたが、細胞単独で培養されたチャンバーからの物質では、ＤＣをパルスするときにアンチセンスを物質に添加したとしても、検出されなかった。このことから、免疫刺激性腫瘍抗原を産生するためにはチャンバー内のアンチセンスと神経膠腫細胞との存在が必要とされることが示される。
【０１７４】
アンチセンスを用いた一晩処理の影響を試験するために、我々はまた、チャンバーへの細胞の追加前に４ｍｇのアンチセンスと共に細胞を一晩インキュベートした。ペトリ皿にＧＬ２６１細胞をプレーティングし、１００万細胞当たり４ｍｇ  ＮＯＢＥＬで一晩処理したか又は未処理のままにした。次いで、細胞を採取し、チャンバー１つ当たり１００万細胞及び２μｇ  ＮＯＢＥＬをチャンバーに配置した。次いで、チャンバーをＰＢＳ中で一晩インキュベートし、翌日、内容物を抽出した。次いで、樹状細胞をチャンバー内容物でパルスし、以上に記載したようにＩＦＮγ分泌を測定した。
【０１７５】
図２９ｃに示されるように、アンチセンスによるＧＬ２６１細胞の一晩処理は、４ｍｇアンチセンスで一晩処理されたＧＬ２６１細胞でＤＣをパルスしたときＩＦＮγを産生する腫瘍免疫Ｔ細胞の数が増加することにより検出されるように、この細胞により産生される抗原の量を増強する。
【０１７６】
ネスチンを発現する神経膠腫腫瘍細胞サブセットが免疫原性の増強に関連するかを決定するために、より高レベル対より低レベルのタンパク質ネスチンを生じる条件下で成長させたＧＬ２６１細胞を含有するＩＭＶ−００１（ＮＯＢＥＬ）アンチセンスあり又はなしのチャンバーでマウスを免疫した。後続のＧＬ２６１神経膠腫細胞の頭蓋内植込みに対抗する長期保護（図３０ａ、３０ｂ）さらにはマウスによるＧＬ２６１抗体の産生（図３０ｃ、３０ｄ）を評価した。
【０１７７】
高レベルのネスチンとアンチセンスとを有するＧＬ２６１細胞を含有するチャンバーは、類似の細胞を有するアンチセンスなしのチャンバーよりも又はアンチセンスの有無にかかわらず低ネスチンＧＬ２６１を有するチャンバーよりもかなり良好に免疫保護を誘発した。また、チャンバーに入れられた高レベルのネスチンを発現するＧＬ２６１細胞は、マウスにおいてＧＬ２６１特異的抗体産生を誘発する点で、低ネスチンレベルを含有するものよりも優れていた。しかしながら、抗体産生に関して、アンチセンスが含まれていても影響は最小限に抑えられた。
【０１７８】
参照による組込み
本明細書で参照される特許及び刊行物はすべて、その全体が本出願をもって参照により組み込まれる。
【図１−１】
2020510021.tif 000009
【図１−２】
2020510021.tif 000010
【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【図６】
2020510021.tif 000020
【図７−１】
2020510021.tif 000021
【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2020510021.tif 000045
【図２７】
2020510021.tif 000046
【図２８−１】
2020510021.tif 000047
【図２８−２】
2020510021.tif 000048
【図２９−１】
2020510021.tif 000049
【図２９−２】
2020510021.tif 000050
【図３０−１】
2020510021.tif 000051
【図３０−２】
2020510021.tif 000052
【図３０−３】
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【配列表】
2020510021000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月25日(2019.12.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脳癌を有する対象にワクチン接種するためのワクチンの製造方法であって、
（ｉ）前記対象から得られた、生存細切腫瘍組織を無菌トラップに採取することと、
（ｉｉ）前記細切組織から接着細胞を捕集することと、
（ｉｉｉ）配列番号１の配列を有するインスリン様成長因子レセプター１アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ）と一緒に、前記捕集された細胞をバイオ拡散チャンバーに封入することと、
（ｉｖ）前記チャンバーに照射することと、を含み、
前記照射されたチャンバーが、自己由来細胞ワクチンであるとともに前記対象に植え込まれるものであり、前記脳癌に対する免疫反応が得られる、方法。
【請求項２】
封入前に１８時間までにわたりＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮで前記接着細胞を処理するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対象が約４８時間にわたり２０個のチャンバーでワクチン接種される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記チャンバーが、約１×１０４〜約５×１０６の腫瘍細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記チャンバーが、約１×１０５〜約１．５×１０６の腫瘍細胞を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記チャンバーが、約１０６の腫瘍細胞を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記チャンバーが、約１μｇ〜約５μｇのＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記チャンバーが、約４μｇのＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍細胞が体温を超える温度に暴露されない、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記脳癌が、グレードＩＩ星状細胞腫、グレードＡＩＩＩ星状細胞腫、グレードＡＩＩＩ−Ｇ星状細胞腫、及びグレードＩＶ星状細胞腫（多形膠芽細胞腫）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
脳癌を有する対象に植え込むためのバイオ拡散チャンバーであって、
（ａ）照射された腫瘍細胞であって、前記腫瘍細胞が、組織モルセレータを用いて前記対象の腫瘍組織から得られた接着細胞を含む、照射された腫瘍細胞と、
（ｂ）照射されたＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮであって、前記ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮが配列番号１の配列を有する、照射されたＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮとを含む、バイオ拡散チャンバー。
【請求項１２】
前記腫瘍細胞が、前記チャンバー内への封入前にインスリン様成長因子レセプター１アンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド（ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮ）と共にプレインキュベートされる、請求項１１に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項１３】
約１〜約５μｇの前記ＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮを含む、請求項１１に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項１４】
約４μｇのＩＧＦ−１Ｒ  ＡＳ  ＯＤＮを含む、請求項１３に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項１５】
前記チャンバー内の前記腫瘍細胞が、前記対象から得られた前記腫瘍組織と比較してネスチン陽性細胞に関して富化されている、請求項１１に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項１６】
前記組織モルセレータが静置外側カニューレ内に高速往復内側カニューレを含む、請求項１１に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項１７】
前記対象から前記腫瘍組織が得られるときに、前記組織モルセレータが熱を生成しない、請求項１１に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項１８】
約１×１０４〜約５×１０６の腫瘍細胞を含む、請求項１１に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項１９】
約１×１０５〜約１．５×１０６の腫瘍細胞を含む、請求項１８に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項２０】
約１０６の腫瘍細胞を含む、請求項１９に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項２１】
前記チャンバー内の腫瘍細胞とＡＳ  ＯＤＮとの比が約５．０×１０５細胞：１μｇである、請求項１１に記載のバイオ拡散チャンバー。
【請求項２２】
前記外側カニューレがサイドアパーチャを含み、且つさらに前記腫瘍細胞が電子制御可変吸引により前記サイドアパーチャに吸い込まれるものである、請求項１６に記載のバイオ拡散チャンバー。
【国際調査報告】
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2020510021.tif 000055
2020510021.tif 000056
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