(57)【要約】本出願書に示される様々な実施例は、油組成物の重量で５０ｍｇ／ｋｇ超の量の少なくとも１つのカロテノイドと、油組成物中に存在する脂肪酸の全重量の約２５％超のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含量と、８０ｐｐｂ未満のトランス−２−ペンタナール（ｔ−２−Ｐ）、３０ｐｐｂ未満のヘキサナール、１５ｐｐｂ未満のヘプタナール、または１５００ｐｐｂ未満のジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）を含む、油組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
油組成物であって、
ｉ）前記油組成物の重量で５０ｍｇ／ｋｇ超の量の少なくとも１つのカロテノイドと、
ｉｉ）前記油組成物中に存在する脂肪酸の全重量の約２５％超のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含量と、
ｉｉｉ）８０ｐｐｂ未満のトランス−２−ペンタナール（ｔ−２−Ｐ）、３０ｐｐｂ未満のヘキサナール、１５００ｐｐｂ未満のジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）、または１５００ｐｐｂ未満の２−メチルシクロペンタノン（２−ＭＣＰ）と、を含む、前記油組成物。
【請求項２】
前記組成物が、３０ｐｐｂ未満のトランス−２−ペンタナール（ｔ−２−Ｐ）、１０ｐｐｂ未満のヘキサナール、１００ｐｐｂ未満のジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）、または１００ｐｐｂ未満の２−メチルシクロペンタノン（２−ＭＣＰ）を含む、請求項１に記載の油組成物。
【請求項３】
前記組成物が、前記油組成物の重量で７５ｍｇ／ｋｇ超の量の少なくとも１つのカロテノイドを含む、請求項２に記載の油組成物。
【請求項４】
前記組成物が、約４０％超のＤＨＡ含量を含む、請求項１に記載の油組成物。
【請求項５】
前記組成物が、２．５ｐｐｂ未満のトランス−２−ペンタナール（ｔ−２−Ｐ）、２．５ｐｐｂ未満のヘキサナール、２．５ｐｐｂ未満のジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）、または２．５ｐｐｂ未満の２−メチルシクロペンタノン（２−ＭＣＰ）を含む、請求項４に記載の油組成物。
【請求項６】
前記組成物が、２．５ｐｐｂ未満のトランス−２−ペンタナール（ｔ−２−Ｐ）、２．５ｐｐｂ未満のヘキサナール、２．５ｐｐｂ未満のジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）、及び２．５ｐｐｂ未満の２−メチルシクロペンタノン（２−ＭＣＰ）を含む、請求項４に記載の油組成物。
【請求項７】
前記組成物が、バイオマスから単離された油から得られる、請求項１に記載の油組成物。
【請求項８】
前記バイオマスが、海洋微生物を含む、請求項７に記載の油組成物。
【請求項９】
前記海洋微生物が、藻類、細菌、菌類、及び原生生物のうちの少なくとも１つである、請求項８に記載の油組成物。
【請求項１０】
前記海洋微生物が、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属のうちの少なくとも１つの海洋微生物である、請求項９に記載の油組成物。
【請求項１１】
前記少なくとも１つのカロテノイドが、β−カロチンまたはカンタキサンチンを含む、請求項１に記載の油組成物。
【請求項１２】
食物、餌、または栄養補助食品である、請求項１に記載の油を含む食用生成物。
【請求項１３】
栄養補助食品である、請求項１２に記載の生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、表題「ＩＭＰＲＯＶＥＤ  ＲＥＦＩＮＩＮＧ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＡＬ  ＯＩＬＳ」の２０１７年２月２２に出願された米国仮特許出願公開第６２／４６２，０１５号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
長連鎖ポリ不飽和脂肪酸ＬＣ−ＰＵＦＡを含有する油は、精製するのは困難であり得る。これらの油は、酸化の影響を非常に受けやすく、油にオフフレーバー（ｏｆｆ  ｆｌａｖｏｒｓ）及びオフアロマ（ｏｆｆ  ａｒｏｍａｓ）をもたらす酸化副生成物を容易に含有するであろう。典型的な植物油精製は、これらの油を精製するために使用される。例えば、藻類で生成された粗ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含有する油は、典型的には、脱ガム化して、ホスファチドを除去し、続いて、精製して、遊離脂肪酸を除去する。次いで、かかる油を漂白し、脱臭し、最終的に精製し、漂白し、脱臭した油（ＲＢＤ油）を得る。しかしながら、高温及びこれらの処理条件の持続により、これらの手順の間でも生じ得る場合、酸化副生成物をある特定のレベルまで除去することは唯一可能である。さらに、ＲＢＤ油を作製するための処理工程は、トコフェロール、ステロール、ならびβ−カロチン及びカンタキサンチンを含むカロテノイドが挙げられるが、これらに限定されない、有益な成分を除去する。
【発明を実施するための形態】
【０００３】
本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、従来のＲＢＤ油ではなく、これに、有益な成分（例えば、カロテノイド）が再度添加される。その代わりに、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、軽く精製されている粗ＤＨＡ含有油から得られる。この結果は、ｉ）典型的には、粗ＤＨＡ含有油中でのみ見出され、ＲＢＤ油中の最小量／ごく少量である、かなりの量の有益な成分を含有し、ｉｉ）粗ＤＨＡ含有油中で概して見出される、ごく少量の望ましくない悪臭原因成分も含有する、油組成物である。有益な成分としては、キサントフィル（例えば、カンタキサンチン）及びカロチン（例えば、β−カロチン）などのカロテノイドが挙げられるが、これらに限定されない。カロテノイドなどの有益な成分は、ＲＢＤ油中で除去されるか、またはＲＢＤプロセスにおいて破壊／分解される。望ましい悪臭原因成分としては、アルデヒド（例えば、トランス−２−ペンタナール（ｔ−２−Ｐ）、ヘキサナール）、ケトン（例えば、２−メチルシクロペンタノン（２−ＭＣＰ））、及び硫黄化合物（例えば、ＤＭＤＳとしても知られている、ジメチルジスルフィド）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００４】
本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、本明細書で使用される新規の処理のため、高度に着色され得る。したがって、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、ＲＢＤ油と比較して、そのような油に、それらの着色及びより高度な栄養的価値を与える、カロテノイドを含む、かなりの量の有益な成分を含有する。当業者が、概して、ほとんど着色しないヒト栄養物のためにＲＢＤ油を捜索するため、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、直観的な生成物ではない。さらに、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、添加されたＲＢＤ油を欠いているものよりもさらに安定であり得、外部の酸化防止剤は、過剰な量のそのような酸化防止剤を添加する必要はない。いかなる特定の理論によって拘束されることを望むものではないが、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、生来の酸化防止剤の役割を果たすカロテノイドなどの成分が除去されているため、増加量の外部の酸化防止剤を必要とし得るＲＢＤ油よりもさらに安定である。
【０００５】
したがって、本開示のいくつかの実施形態は、油組成物の重量で約５０ｍｇ／ｋｇ超の量の少なくとも１つのカロテノイドと、油組成物中に存在する脂肪酸の全重量の約２５％超のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含量と、約８０ｐｐｂ未満のｔ−２−Ｐ、約３０ｐｐｂ未満のヘキサナール、約１００ｐｐｂ未満の２−ＭＣＰ、または約１５００ｐｐｂ未満のＤＭＤＳを含む、油組成物に関する。
【０００６】
本明細書で使用されるとき、「カロテノイド」という用語は、概して、植物及び藻類、ならびにいくつかの細菌及び真菌によって生成されるテトラテルペノイドを指す。カロテノイドは、すべてのこれらの生物によって脂肪及び他の塩基性の有機代謝構築ブロックから生成され得る。カロテノイドは、６００超の知られているカロテノイドを指すために使用される一般用語である。カロテノイドは、キサントフィル及びカロチンの２つのクラスに分割され得る。カロテノイドの例としては、β−カロチン、カンタキサンチン、アスタキサンチン、リコペルセン（７，８，１１，１２，１５，７’，８’，１１’，１２’，１５’−デカヒドロ−γ，γ−カロチン）、フィトフルエン、ヘキサヒドロリコピン（１５−シス−７，８，１１，１２，７’，８’−ヘキサヒドロ−γ，γ−カロチン）、トルレン（３’，４’−ジデヒドロ−β，γ−カロチン）、α−ゼアカロチン（７’，８’−ジヒドロ−ε，γ−カロチン）、アロキサンチン、シンシアキサンチン、ペクテノキサンチン、クリプトモナキサンチン（（３Ｒ，３’Ｒ）−７，８，７’，８’−テトラデヒドロ−β，β−カロチン−３，３’−ジオール）、クラスタキサンチン（β，−カロチン−３，４，３’，４’−テトラオール）、ガザニアキサンチン（（３Ｒ）−５’−       シス−β，γ−カロチン−３−オール）、ＯＨ−クロロバクテン（１’，２’−ジヒドロ−ｆ，γ−カロチン−１’−オール）、ロロキサンチン（β，ε−カロチン−３，１９，３’−トリオール、ルテイン（（３Ｒ，３’Ｒ，６’Ｒ）−β，ε−カロチン−３，３’−ジオール）、リコキサンチン（γ，γ−カロチン−１６−オール）、ロドピン（１，２−ジヒドロ−γ，γ−カロチン−ｌ−オール）、ロドピノール（別名ワルミンゴール／１３−シス−１，２−ジヒドロ−γ，γ−カロチン−１，２０−ジオール）、サプロキサンチン（３’，４’−ジデヒドロ−１’，２’−ジヒドロ−β，γ−カロチン−３，１’−ジオール）、及びゼアキサンチンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０００７】
本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、約５０ｍｇ／ｋｇ超、約５５ｍｇ／ｋｇ超、約６０ｍｇ／ｋｇ超、約６５ｍｇ／ｋｇ超、約７０ｍｇ／ｋｇ超、約７５ｍｇ／ｋｇ超、約８０ｍｇ／ｋｇ超、約８５ｍｇ／ｋｇ超、約９０ｍｇ／ｋｇ超、約９５ｍｇ／ｋｇ超、約１００ｍｇ／ｋｇ超、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ〜約８０ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇ、または約８０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの量の少なくとも１つのカロテノイドを含む。少なくとも１つのカロテノイドの量が、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物中に存在するすべてのカロテノイドの合計であることを理解されたい。いつかの生物は、１００ｍｇ／ｋｇをはるかに超えるカロテノイドを有する油をさらに生成し得、本発明の範囲内でもある。
【０００８】
代替として、カロテノイド含量は、全体に占める割合、または揮発性成分が還元された後に、油中に残留する個々のカロテノイドとして表され得る。いくつかの実施形態では、全体の５０、６０、７０、８０、もしくは９０％超、または粗油中に存在する個々のカロテノイドは、揮発性成分が還元された後に保持される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、または少なくとも５つのカロテノイドを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、少なくともβ−カロチン及びカンタキサンチンを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約６０ｍｇ／ｋｇのβ−カロチン及び約２０ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇのカンタキサンチンの量で少なくともβ−カロチン及びカンタキサンチンを含む。
【００１０】
本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物はまた、油組成物中に存在する脂肪酸の全重量の、約２５％超、約３０％超、約３５％超、約４０％超、約４５％超、約５０％超、約５５％超、約３０％〜約５０％、または約２５％〜約６０％、または２５％〜約７０％、または約４０％〜約５０％のドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含量も有する。いくつかの実施形態では、ＤＨＡは、実質的には、トリグリセリドの形態である。油のＤＨＡ含量は、当該技術分野で公知の方法によって容易に決定することができる。例えば、ＡＯＣＳ方法Ｃｅ−２ｂ−１１及びＣｅ１ｉ−０７及びＣｅ−１ｂ−８９が、本明細書で使用された。
【００１１】
本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、トランス−２−ペンタナール（ｔ−２−Ｐ）、ヘプタナール、ＤＭＤＳ、及び２−メチルシクロペンタノン（２−ＭＣＰ）などの比較的に低い含量の悪臭原因成分を有し得る。
【００１２】
例えば、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、約１００ｐｐｂ未満、約９０ｐｐｂ未満、約８０ｐｐｂ未満、約７０ｐｐｂ未満、約６０ｐｐｂ未満、約５０ｐｐｂ未満、約４０ｐｐｂ未満、約３０ｐｐｂ未満、約２０ｐｐｂ未満、約１０ｐｐｂ未満、約５ｐｐｂ未満、約２．５ｐｐｂ未満のｔ−２−Ｐ含量、約２．５ｐｐｂ〜約２０ｐｐｂ、または約２．５ｐｐｂ〜約１０ｐｐｂのｔ−２−Ｐを有し得る。様々な実施形態はまた、本明細書で使用される方法の、検出の限界を下回るまたは定量化の限界を下回るレベルも有し得る。
【００１３】
本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、約３０ｐｐｂ未満、約５０ｐｐｂ未満、約４０ｐｐｂ未満、約３０ｐｐｂ未満、約２０ｐｐｂ未満、約１０ｐｐｂ未満、約５ｐｐｂ未満、約２．５ｐｐｂ未満のヘキサナール含量、約２．５ｐｐｂ〜約２０ｐｐｂ、または２．５ｐｐｂ〜約１０ｐｐｂのヘキサナールを有し得る。様々な実施形態はまた、本明細書で使用される方法の、検出の限界を下回るまたは定量化の限界を下回るレベルも有し得る。
【００１４】
本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、約２０００ｐｐｂ未満、１５００ｐｐｂ未満、１０００ｐｐｂ未満、約５００ｐｐｂ未満、約４００未満、約２００ｐｐｂ未満、約１００ｐｐｂ未満、約９０ｐｐｂ未満、約８０ｐｐｂ未満、約７０ｐｐｂ未満、約６０ｐｐｂ未満、約５０ｐｐｂ未満、約４０ｐｐｂ未満、約３０ｐｐｂ未満、約２０ｐｐｂ未満、約１０ｐｐｂ未満、約５ｐｐｂ未満、約２．５ｐｐｂ未満のＤＭＤＳ含量、約２．５ｐｐｂ〜約２０ｐｐｂ、または約２．５ｐｐｂ〜約１０ｐｐｂのＤＭＤＳを有し得る。様々な実施形態はまた、本明細書で使用される方法の、検出の限界を下回るまたは定量化の限界を下回るレベルも有し得る。
【００１５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、約２０００ｐｐｂ未満、１５００ｐｐｂ未満、１０００ｐｐｂ未満、約５００ｐｐｂ未満、約４００未満、約２００ｐｐｂ未満、約１００ｐｐｂ未満、約９０ｐｐｂ未満、約８０ｐｐｂ未満、約７０ｐｐｂ未満、約６０ｐｐｂ未満、約５０ｐｐｂ未満、約４０ｐｐｂ未満、約３０ｐｐｂ未満、約２０ｐｐｂ未満、約１０ｐｐｂ未満、約５ｐｐｂ未満、約２．５ｐｐｂ未満の２−ＭＣＰ含量、約２．５ｐｐｂ〜約２０ｐｐｂ、または約２．５ｐｐｂ〜約１０ｐｐｂの２−ＭＣＰを有し得る。様々な実施形態はまた、本明細書で使用される方法の、検出の限界を下回るまたは定量化の限界を下回るレベルも有し得る。
【００１６】
本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、約１重量％未満、約０．５重量％未満、約０．２重量％未満、約０．１重量％未満、約０．０１重量％〜約０．５重量％、約０．０１重量％〜約０．２重量％、または約０．０１重量％〜約０．０３重量％の全揮発性成分を有し得る。本明細書で使用される、「全揮発性」は、ヘキサナール、ｔ−２−Ｐ、ＤＭＤＳ、及び２−ＭＣＰの重量パーセントの合計を意味する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、ＤＨＡ、カロテノイド含量、ｔ−２−Ｐ含量、ヘキサナール含量、ＤＭＤＳ含量、及び２−ＭＣＰ含量の本明細書に記載される値のうちの１つ以上またはすべての組み合わせを有し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、約０．０１重量％〜約０．５重量％の全揮発性含量、約２５％〜約６０％のＤＨＡ含量、約７０ｍｇ／ｋｇ〜約９０ｍｇ／ｋｇの本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物中に存在するすべてのカロテノイドの合計、約２．５ｐｐｂ未満のｔ−２−Ｐ含量、約２．５ｐｐｂ未満のヘキサナール含量、約２．５ｐｐｂ未満のＤＭＤＳ含量、または約２．５ｐｐｂ〜約３ｐｐｂの２−ＭＣＰ含量を有し得る。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、ＤＨＡ、カロテノイド含量、ｔ−２−Ｐ含量、ヘキサナール含量、ＤＭＤＳ含量、及び２−ＭＣＰ含量の本明細書に記載される値のうちの１つ以上またはすべての組み合わせを有し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、約２５％〜約５０％のＤＨＡ含量、約５０ｍｇ／ｋｇ超の本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物中に存在するすべてのカロテノイドの合計、約２．５ｐｐｂ未満のｔ−２−Ｐ含量、約２．５ｐｐｂ未満のヘキサナール含量、約２．５ｐｐｂ未満のＤＭＤＳ含量、または約２．５ｐｐｂ〜約３ｐｐｂの２−ＭＣＰ含量を有し得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、ＤＨＡ、カロテノイド含量、ｔ−２−Ｐ含量、ヘキサナール含量、ＤＭＤＳ含量、及び２−ＭＣＰ含量の本明細書に記載される値のうちの１つ以上またはすべての組み合わせを有し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、約２５％〜約６０％のＤＨＡ含量、約５０ｍｇ／ｋｇ超の油組成物中に存在するすべてのカロテノイドの合計、検出もしくは定量化の限界を下回るｔ−２−Ｐ含量、検出もしくは定量化の限界を下回るヘキサナール含量、検出もしくは定量化の限界を下回るＤＭＤＳ含量、または検出もしくは定量化の限界を下回る２−ＭＣＰ含量を有し得る。
【００２０】
本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、バイオマスから単離された油から得られ、当該技術分野で既知の方法を用いて生成され得る。そのような方法は、海洋微生物を含むバイオマスから油を単離することを含む。好適な海洋微生物の例としては、藻類、細菌、菌類、及び原生生物のうちの少なくとも１つが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物の生成及び単離のために有用な海洋微生物のいくつかの特定の例は、公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／２８９１３号（本明細書に完全に記載されているかのように、参照により組み込まれる）に記載される、微細藻類及びｃｈｒｏｍｏｐｈｙｔｉｃ藻類を含む。公開ＰＣＴ出願第ＷＯ９４／００８４６７号、米国特許第５，９０８，６２２号、米国特許第５，６８８，５００号、米国特許第５，５１８，９１８号、米国特許第５，３４０，７４２号、米国特許第５，３４０，５９４号、米国特許第８，１６３，５１５号、米国特許第９，０２３，６１６号、公開欧州出願第５１２９９７号及び同第６６９８０９号も参照されたく、これらのすべては、本明細書に完全に記載されているかのように、参照により組み込まれる。
【００２１】
ＤＨＡ含有油を生成するために知られている任意の生物は、真核生物、例えば、Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｉｂａｎａ及びｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｄｓ（例えば、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ属の海洋微生物）、例えば、Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ．及びＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍが挙げられるが、これらに限定されない、本明細書に記載される油の発酵において使用され得る。例えば、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄ  ａｎｄ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｌｉｐｉｄｓ  ３７６（Ｆｒａｎｋ  Ｄ．  Ｇｕｎｓｔｏｎｅ  ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃ．２００１）を参照されたく、これは、本明細書に完全に記載されているかのように、参照により組み込まれる。当業者は、発酵を介して海洋生物からのＤＨＡの生成が、１９８０年代後半以来文献において広範に記載されていることを理解するだろう。多くの生成生物及び方法は、公知である。有用な生物の特定の例としては、以下のＴｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ  ＡＴＣＣ  ２６１８５及び  Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ｓｐ  ＡＴＣＣ  ２０８８８が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
発酵が完全した後、収穫された細胞は、好適な含水量（例えば、約４％の含水量）になるまで乾燥させることができる。次いで、好適な非極性溶媒（例えば、ペンタン、ヘキサンなど）は、好適な容器（例えば、ガラス製やかん）中で乾燥させたバイオマスに添加し、好適な時間及び温度（例えば、２５℃で２時間）撹拌し得る。バイオマスの濾過後、濾液中の溶媒を、任意の好適な手段（例えば、回転蒸発器）によって除去して、粗ＤＨＡ含有油を生成し得る。代替として、粗油は、当該技術分野で公知の無溶媒プロセスを介して単離されてもよい。例えば、米国特許第９，７４５，５３８号または同第９，７４５，５３９号を参照されたく、これらの両方が、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２３】
ＤＨＡのレベル、カロテノイド、ならびに粗油中に存在する様々な揮発性化合物及び不純物のレベルが、発酵、単離、及び精製において使用される特定の生産パラメータの要因であることを当業者にはよく理解されている。そのため、これらの様々な成分の出発値は、たくさんの粗油によって異なるであろう。
【００２４】
本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、粗ＤＨＡ含有油などのバイオマスから単離された油から得られる。次いで、粗ＤＨＡ含有油を、穏やかに精製して、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物を得る。本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、従来のＲＢＤ油ではなく、これに、有益な成分（例えば、カロテノイド）が再度添加される。その代わりに、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、軽く精製されている粗ＤＨＡ含有油から得られる。
【００２５】
本明細書に使用される、「穏やかに精製された」という用語は、粗ＤＨＡ含有油がＲＢＤ油を得る程度まで精製されないことを意味する。その代わりに、粗ＤＨＡ含有油は、ｉ）典型的には、粗ＤＨＡ含有油中でのみ見出され、ＲＢＤ油中で最小量／ごく少量である、かなりの量の有益な成分を保持し、ｉｉ）実質的には除去される粗ＤＨＡ含有油中で概して見出される望ましくない臭気またはフレーバーの原因となる成分を有する、油組成物を得るのに必要な範囲内で精製される。
【００２６】
前処理
天然源から単離された粗油は、時々、「ガム」を含有し、主に、リン脂質からなり、遊離脂肪酸、ステロール、ステロールエステル、微量金属、炭水化物、及びタンパク質、ならびに固体粒子も含有する。場合によっては、油はまた、酸化防止剤、例えば、トコフェロール及びカロテノイドも含有する。油からのリン脂質の除去は、精製プロセスにおいてさらに下流へのガムの堆積物の形成を防ぎ、保存時のオフフレーバー及び退色の発生を防ぐ。代替として、粗油は、後の処理において問題を集約し、引き起こす小分子を含有し得る。任意に、本明細書に記載される目的のためであるが、脱ガムまたは濾過などの前処理ステップは、さらなる処理において問題を回避するために使用することができる。
【００２７】
水脱ガムは、一般に、油からリン脂質及び他の水溶性成分を除去するために使用される。一般のプロセスは、撹拌しながら６０〜９０℃で２５０〜２０００ｐｐｍのリン酸またはクエン酸で、粗油（例えば、粗ＤＨＡ含有油）を処理することを含む。次いで、水（例えば、１〜５％）を、撹拌しながら６０〜７５℃で、酸で処理した粗油に添加して、粗油中のリン脂質の水和に役立つ。次いで、油を、さらに１５〜６０分間穏やかに混合する。水相は、いくつかの同伴油と共に、水和したリン脂質及び他の水溶性化合物の乳剤からなり形成される。２つの相は、沈降及びデカンテーションによって、または遠心分離によって互いから分離され、酸脱ガム油の流れ及び湿式ガムの流れを得る。塩基の水溶液を用いた中和ステップは、残留酸を除去するために使用することができ、脱イオン水を用いた１つ以上の抽出ステップは、可溶性塩から油を取り除くために使用することができる。
【００２８】
いくつかの実施形態では、粗ＤＨＡ含有油は、任意に、リン酸またはクエン酸などの好適な水性酸を用いた穏やかな脱臭前に脱ガムされる。他の実施形態では、粗ＤＨＡ含有油は、初めに、穏やかな脱臭前に水で洗浄される。しかしながら、本明細書に記載される様々な実施形態の油は、植物油を処理する従来の条件下で漂白しない。
【００２９】
さらに、粗油は、任意に、穏やかな脱臭前に、粒子状物質を除去するために濾過され得る。一般の方法による濾過は、公知である。それは、バッチ様式において、または統合プロセスの一部として連続して行われ得る。濾過助剤（セルロース、珪藻土、市販の粘度、またはシリカゲルが挙げられるが、これらに限定されない）または他の処理助剤は、望ましくない粒子または溶解材料を除去するために使用され得る。これらの助剤は、濾過の容易さ及び有効性を増大させるためにさらに使用され得る。濾過は、昇温で行われ得、油は、濾過助剤上への粒子の吸着または付着に役立つように濾過助剤と長期間接触され得る。
【００３０】
脱臭
簡潔に言えば、穏やかな脱臭は、「オフフレーバー及び臭気」に関与する揮発性化合物を除去するが、プロセスはまた、遊離脂肪酸、トコフェロール及びステロールの一部を除去し得る。プロセスは、しばしば、真空下で、特定の揮発性化合物の除去に役立ち、油を酸化から保護するように行われる。蒸気、窒素、または別の不活性ガスは、剥離剤として使用することができる。
【００３１】
プロセスは、温度、時間、及び圧力によって完全に定義される。工業規模において行われるとき、脱通気、多段階加熱、脱臭−脱酸、及び油の多段階冷却を含む、多段階プロセスを含み得る。脱通気が行われる場合、真空システム（例えば、３０〜５０ｍｍ  Ｈｇ）に接続される別個の容器中で、または脱臭装置においてさらに低い圧力で達成され得る。スパージ蒸気（または任意の他の不活性ガス）は、脱通気を改善するために使用され得る。
【００３２】
プロセスは、バッチ式、半連続システム、または連続システムで行われ得る。剥離効率は、連続システムで良好であり得、概して、高表面積を提供する構造化包装で充填されたカラムを有する。構造化包装にわたる剥離剤による油の向流接触は、効率的な剥離を短い接触時間提供し得る。装置の様々な配置は、使用することができる（水平容器または垂直容器、トレイ型カラム、充填カラムまたは薄膜／ワイパー式薄膜蒸発装置／蒸留装置）。
【００３３】
本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、本明細書に記載される、好適な装置を使用する穏やかな脱臭プロセス下で、粗ＤＨＡ含有油を処理することによって得られる。
【００３４】
本発明のさらなる態様は、ＰＵＦＡ含有油の精製のために充填カラムの使用である。このタイプの脱臭カラムは、当該技術分野で周知であり、植物油の物理的精製において使用される。
【００３５】
充填カラムを介して粗ＰＵＦＡ油を通過することを含む精製したＰＵＦＡ油の生成のためのプロセス：カラムを１４０〜２００℃に加熱し、蒸気を、粗ＰＵＦＡ油の流れに向流のカラムに供給し、精製した油は、カラムから収集される。
【００３６】
油組成物
最終的に、本明細書に記載される穏やかな精製プロセスによってバイオマスから単離された油から得られる、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、全揮発性含量、ＤＨＡ、カロテノイド含量、ｔ−２−Ｐ含量、ヘキサナール含量、ＤＭＤＳ含量、及び２−ＭＣＰ含量の本明細書に記載される値のうちの１つ以上またはすべての組み合わせを有するものである。したがって、いくつかの実施形態では、バイオマスから単離された穏やかに精製された油は、約０．０１重量％〜約０．５重量％の全揮発性含量、約２５％〜約６０％のＤＨＡ含量、約７０ｍｇ／ｋｇ超のバイオマスから単離された穏やかに精製された油中の全カロテノイド含量、約０．５ｐｐｂ〜約３ｐｐｂのｔ−２−Ｐ含量、約０．５ｐｐｂ〜約３ｐｐｂのヘキサナール含量、約０．５ｐｐｂ〜約３ｐｐｂのヘプタナール含量、約０．５ｐｐｂ〜約３ｐｐｂのＤＭＤＳ含量、及び約０．５ｐｐｂ〜約３ｐｐｂの２−ＭＣＰ含量を有し得る。
【００３７】
本明細書に言及されるように、ヒト栄養分に使用される既知のＤＨＡ含有油は、典型的な植物油技術を用いて完全に精製されて、高度に精製されたＲＢＤ油を作製する。精製は、揮発性化合物、金属、及び色素を除去する。しかし、プロセスは、カロテノイドなどのヒト栄養分に役に立つ成分を除去するだけでなく、油を保存するために高レベルの酸化防止剤が必要である。本明細書に記載される穏やかな精製プロセスによってバイオマスから単離された油から得られる、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物は、低含有量の臭気を引き起こす化合物を有し、同時にカロテノイドなどの有益な成分を保持する。酸化防止剤（例えば、ガンマトコフェロール（ビタミンＥ）、トコトリエノール、アスコルビン酸（ビタミンＣ）、レチノール（ビタミンＡ）、第３級ブチルヒドロキノン（ＴＢＨＱ）、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、及びブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ））は、本明細書に記載される様々な実施形態の油組成物に添加することができるが、カロテノイドの存在は、そのようなさらなる酸化防止剤を使用する必要なく、さらに栄養を供給するまたは安定した生成物をもたらす。
【００３８】
本明細書に記載される組成物は、食物、栄養補助食品、及び給餌用途において使用することができる。本発明のさらなる実施形態は、本明細書に記載される油を含む食物生成物である。食物は、幼児または成人を目的とし、当業者に知られている任意の様式で送達され得る。代替として、本明細書に記載される組成物は、液体、粉末、またはカプセル形態で栄養補助食品としての消費のために製剤化され得る。
【００３９】
範囲形式において表される値は、範囲の制限として明示的に言及された数値を含むだけでなく、あたかも各数値及び部分的な範囲が明示的に及されたかのように、その範囲内に包含されたすべての個々の数値または部分的な範囲を含むと柔軟な様式で解釈されるべきである。例えば、「約０．１％〜約５％」または「約０．１％〜５％」の範囲は、約０．１％〜約５％だけでなく、個々の値（例えば、１％、２％、３％、及び４％）ならびに部分的な範囲（例えば、０．１％〜０．５％、１．１％〜２．２％、３．３％〜４．４％）も指示された範囲内に包含すると解釈されるべきである。「約Ｘ〜Ｙ」という言明は、別途指示されない限り、「約Ｘ〜約Ｙ」と同じ意味を有する。同様に、「約Ｘ、Ｙ、または約Ｚ」という言明は、別途指示されない限り、「約Ｘ、約Ｙ、または約Ｚ」と同じ意味を有する。
【００４０】
この文書において、「１つの（ａ）」、「ある（ａｎ）」、または「その（ｔｈｅ）」という用語は、文脈が明らかに別途指示されない限り、１つ以上を包含するために使用される。「または」という用語は、別途指示されない限り、非排他的な「または」を指すために使用される。さらに、本明細書において使用される表現法または用語法は、別途定義がなければ、説明を目的としているに過ぎず、限定を目的としていないと理解すべきである。セクション見出しの使用はいずれも、本文書の解釈を助けることを意図しており、限定と解釈してはならない。さらに、セクション見出しに関連する情報は、その特定のセクション内にもその特定のセクション外にも見出され得る。さらに、この文書において言及される刊行物、特許、及び特許文書はすべて、個々に、参照により組み込まれたかのように、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。この文書とそのように参照により組み込まれるそれらの文書との間に矛盾した使用があった場合には、組み込まれた参考文献における使用は、この文書の使用を補うものと見なされるべきであり、両立し得ない矛盾については、この文書における使用が優先される。
【００４１】
本明細書に記載される方法において、工程は、一時的な順序または動作順序が明示的に言及される場合を除いて、本発明の原理から逸脱されることなく、任意の順序で実施することができる。さらに、特定された工程は、明確な特許請求の範囲の用語が、それらは別々に行われると言及しない限り、同時に実施することができる。例えば、Ｘを行うと特許請求された工程及びＹを行うと特許請求された工程は、単一の操作内で同時に行うことができ、結果として生じたプロセスは、特許請求されたプロセスの文字どおりの範囲内に含まれるであろう。
【００４２】
本明細書で使用される「約」という用語は、値または範囲においてある変動の程度、例えば、規定する値または規定する範囲の限界の１０％以内、５％以内、または１％以内を許容し得る。さらに、本明細書に言及されたすべての範囲は、代替として、数量詞「約」を用いることなく読み出すことができる。そのため、範囲が、「約Ｘ〜約Ｙ」と表される場合、本発明者らは、具体的には、「Ｘ〜Ｙ」の正確な範囲を企図している。
【００４３】
本明細書に使用される「実質的に」という用語は、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％、または少なくとも約９９．９９９％もしくはそれ以上などの場合、過半数または大部分を指す。
【実施例】
【００４４】
本発明は、例示として提供される、以下の実施例を参照することによりさらに良好に理解され得る。本発明は、本明細書に与えられる実施例に限定されない。
【００４５】
微細藻類及びｃｈｒｏｍｏｐｈｙｉｔｉｃ藻類からのＤＨＡ油の生成及び処理のための方法は、上記のように３０年以上にわたり当該技術分野で公知である。代替として、粗ＤＨＡ含有藻類油は、Ｃａｒｇｉｌｌ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから購入することができる。粗藻類油のさらなる商業供給者はまた、当業者に周知である。
【００４６】
実施例１：
材料
【００４７】
[表]
2020510716.tif 000002
【００４８】
クエン酸を用いて精製する粗ＤＨＡ含有油
４つのポートのヘッドピースを備えた１Ｌのジャケット付きフラスコを、直接駆動型オーバーヘッド撹拌機及び６０℃に設定した加熱した循環浴に固定した。この容器を、実験の期間中窒素下で維持した。フラスコを、７５０ｍＬの粗藻類油で充填した。機械的撹拌機のスイッチを入れ、１００ＲＰＭに設定した。油は、６０℃で３０分間平衡化した。５００ｐｐｍのクエン酸溶液を、脱気した脱イオン水で調製した。３７．５ｍＬ（藻類油の量と比較して５％）の５００ｐｐｍのクエン酸溶液を、容器に添加した。材料を、６０℃で３０分間撹拌した。撹拌機のスイッチを切り、水層を藻類油から分離させた。１５分後、水層を除去し、３７．５ｍＬの脱気した脱イオン水を、反応フラスコに添加した。材料を、６０℃で１０分間撹拌した。撹拌機のスイッチを切り、水層を藻類油から分離させた。水層を除去し、さらに３７．５ｍＬの脱気した脱イオン水を、反応フラスコに添加した。材料を、６０℃で１０分間撹拌した。撹拌機のスイッチを切り、水層を藻類油から分離させ、除去した。藻類油を、窒素下で、２５０ｍＬの遠心分離ボトルに移した。油を、３０℃、３０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、残りの水層から分離した。油を、ガラス製保存容器に移し、ヘッドスペースを窒素でフラッシュし、−９℃で冷凍庫に保存した。
【００４９】
クエン酸を用いないで精製する粗ＤＨＡ含有油
４つのポートのヘッドピースを備えた１Ｌのジャケット付きフラスコを、直接駆動型オーバーヘッド撹拌機及び６０℃に設定した加熱した循環浴に固定した。この容器を、精製工程の期間中窒素下で維持したフラスコを、７５０ｍＬの粗藻類油で充填した。機械的撹拌機のスイッチを入れ、１００ｒｐｍに設定した。油を６０℃で３０分間平衡化し、３７．５ｍＬの脱気した脱イオン水を、反応フラスコに添加した。材料を、６０℃で１０分間撹拌した。撹拌機のスイッチを切り、水層を藻類油から分離させた。水層を除去した。藻類油を除去し、窒素下で、２５０ｍＬの遠心分離ボトルに入れた。油を、３０℃、３０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、残りの水層から分離した。油を、ガラス製保存容器に移し、ヘッドスペースを窒素でフラッシュし、−９℃で冷凍庫に保存した。
【００５０】
脱臭
Ｐｏｐｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．２”ワイパー式薄膜蒸発器（部品番号４０４５０−０１）は、（ｉ）可変速駆動機構（接液部３１６ステンレス鋼）、ガラス製内部凝縮器、２０００ｍＬのガラス製目盛付き供給材料、及び栓付き脱気装置、（ｉｉ）４つの２００ｍＬの受けフラスコを含む回転可能な多受けフラスコ、（ｉｉｉ）５００ｍＬの留出受けフラスコ、ガラス製コールドトラップ、３１６ステンレス鋼ワイパーリテーナ、及びカーボンワイパーブレード、（ｉｖ）所望の温度を維持した、高温「Ｊ」熱電対アセンブリ及び断熱ジャケットを備えた金属バンドヒーターセット（部品番号４０７８２−Ｇ１）、（ｖ）供給材料の温度を維持するための、シリコーンゴムヒーター及び熱電対（部品番号４０６４５）及び断熱ジャケット（部品番号４０６６９）、（ｖｉ）実験実行中に真空を提供するためのＥｄｗａｒｄの機械的回転真空ポンプ／油拡散ポンプシステム、（ｖｉｉ）０．００１トール〜１０００トールの範囲のピラニ型ゲージ、（ｖｉｉｉ）可変速駆動の常時監視するためのデジタルＲＰＭインジケータ、ならびに（ｉｘ）内部凝縮器の温度を維持するためのＣｏｌｅ−Ｐａｌｍｅｒ冷却装置、を備える。
【００５１】
供給及び脱気装置アセンブリに、精製した粗ＤＨＡ含有油（クエン酸を用いてまたはそれを用いないで精製した）を充填した。実行期間中、システム全体を、窒素下に保った。供給アセンブリを、４５℃に保持した。純窒素を用いて、供給材料を１時間脱気した。ワイパー式薄膜蒸発装置の内部凝縮器を、すべての脱臭操作のために冷却装置を介して２℃に維持した。蒸発装置の可変速駆動機構は、４００ＲＰＭの一定速度に設定した。実験実行中の脱臭装置への供給速度は、１７５ｍＬ／時であった。カロテノイド含量を保持しながら、脱臭状態を評価するために、脱臭温度及び圧力を変動させた。所望の条件での実行中に、試料を得た。試料を、保存容器に移し、ヘッドスペースを窒素でフラッシュし、分析にかけるまで冷凍保存した。
【００５２】
精製及び脱臭のための処理条件を、表１に示す。
【００５３】
【表１】
2020510716.tif 000003
【００５４】
穏やかに精製したＤＨＡ含有油（試料１Ａ〜１Ｆ）は、表２に示される特性を有した。穏やかに精製したＤＨＡ含有油（試料１Ａ〜１Ｆ）は、ｔ−２−Ｐ含量、ヘキサナール含量、ＤＭＤＳ含量、及び２−ＭＣＰ含量に関して、表３に示される特性を有した。
【００５５】
【表２】
2020510716.tif 000004
【００５６】
【表３】
2020510716.tif 000005
【００５７】
実施例２：
精製容器−精製容器は、様々な加工助剤による粗油の前処理を実行するために使用された。粘土、シリカ、及びセルロースの異なる組み合わせを試験した。上部に取り付けられた混合器が、内容物の混合／撹拌を可能にした。供給業者：ＨＡＢ  Ｈｅｉｌａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｅｂａｕ（Ｇｅｒｍａｎｙ）。形状：のぞき窓を有する垂直円筒形、円錐形の底部。容積：５．６８Ｌ（ジャケット）を含む４０Ｌ（内部）。構築物の材料：ステンレス鋼。加熱ジャケット、変速可能な撹拌機（プロペラ型、２翼）、バッフルプレート、濾過ループから油を戻すためのスプレーノズルを備えた。
【００５８】
キャンドルフィルター−マルチフィラメント布を有するキャンドルフィルターは、精製容器からの油の濾過を行うために使用される。ケーキが、布上に堆積し、フィルターの下流の油が透明になった（のぞき窓から視覚的に観察された）とき、バッチ脱臭装置への移動操作が開始される。供給業者：Ａｍａｆｉｌｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ  Ｌｏｃｈｅｍ  Ｂ．Ｖ．（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）−Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ。形状：垂直円筒形。容積：８Ｌの濾過面積：０．０５ｍ２。構築物の材料：バイトン（ガスケット）を含むステンレス鋼、ポリエチレン（フィルター布）。
【００５９】
研磨フィルター−油が精製容器からバッチ脱臭装置に移送されるとき、研磨フィルターが、キャンドルフィルターの下流に配置される。このフィルターは、キャンドルフィルターによって保持されなかった任意の粒子を除去する。供給業者：Ａｍａｆｉｌｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ  Ｌｏｃｈｅｍ  Ｂ．Ｖ．（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）−Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ。粒子保持：１ミクロン。濾過面積：０．０９ｍ２。構築物の材料：バイトンガスケットを含むステンレス鋼。バッグフィルター（ＥＡＴＯＮ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）からのポリプロピレン針フェルト）
【００６０】
バッチ脱臭装置−バッチ脱臭操作を行うことを意図した容器。通常、約２ｍｂａｒ−ａの減圧をかけながら、蒸気（または窒素）は、油を通して連続的にスパージされ得る。供給業者：ＨＡＢ  Ｈｅｉｌａｎｄ  Ａｐｐａｒａｔｅｂａｕ（Ｇｅｒｍａｎｙ）。形状：垂直円筒形、平坦な底部。容積：３１Ｌ（内部）、５．５Ｌ（ジャケット）。構築物の材料：ステンレス鋼。加熱ジャケット、スパージ蒸気リング、及びのぞき窓を備えた。
【００６１】
充填カラム脱臭装置−充填カラム脱臭装置は、異なる種類の充填及び高さに適応することができる構造化した充填床からなる。Ｒａｓｃｈｉｇ  Ｓｕｐｅｒｐａｃｋ  ＲＳＰ  ２５０Ｘを、包装材料として使用した。油をインライン電気ヒーターで加熱し、カラムの上部で包装床にスプレーして、良好な油分配及び剥離剤による密接な接触を保証する。剥離蒸気（または窒素）を、油の流れへのカラム向流の底部に導入する。Ｃａｒｇｉｌｌによって設計され、ＶＧＭ（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）によって製造。形状：垂直円筒形。構造化した包装：Ｒａｓｃｈｉｇ  Ｓｕｐｅｒｐａｃｋ  ＲＳＰ  ２５０Ｘ；直径：２５５ｍｍ；最大高さ：７０８ｍｍ。最大容積（油プロセス）：１５〜２５ｋｇ／時。構築物の材料：ステンレス鋼。油分配ノズル付近ののぞき窓。冷却ジャケット付きの出口容器が、充填カラム脱臭装置の底部に配置される。
【００６２】
最終生成物研磨フィルター−第２の研磨フィルターは、全プロセスの下流に配置され、分析のために試料を収集する前に、バッチ脱臭装置後または充填カラム脱臭装置後に使用される。供給業者：Ａｍａｆｉｌｔｅｒ  ｇｒｏｕｐ  Ｌｏｃｈｅｍ  Ｂ．Ｖ．（Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）−Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｇｒｏｕｐ。粒子保持：１ミクロン。濾過面積：０．０９ｍ２。構築物の材料：バイトンガスケットを含むステンレス鋼。バッグフィルター（ＥＡＴＯＮ（Ｂｅｌｇｉｕｍ）からのポリプロピレン針フェルト）
【００６３】
加工助剤：シリカゲル−ＪＫＣ−５及びＪＫＣ−７（ＦＩＴ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；漂白粘土−Ｔｏｎｓｉｌ  ７７２ＦＦ（Ｃｌａｒｉａｎｔ  Ｉｂｅｒｉａ，Ｓｐａｉｎ）；セルロース−Ｆｉｌｔｒａｃｅｌ  Ａｃｔｉｖｅ  １１２（ＪＲＳ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
【００６４】
−２０℃で冷凍保存されている粗藻類油のドラム缶（１９０ｋｇ）を、Ｃａｒｇｉｌｌ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手した。粗油缶の周囲にサーマルブランケットを用いて、油を融解した。実験のために粗油を移送するときに空気との接触を最小限に抑えるために、ヘッドスペースを排気し、油を通して連続的にスパージし、窒素の陽圧を、ドラム缶内に維持した。
【００６５】
窒素で事前にフラッシュし、内部プラスチックキャップを含むアルミニウムボトルを、試料を収集するために使用した。ヘッドスペースを最小限に維持しながらボトルに窒素をフラッシュし、試料を、収集し、−３０℃で保存した。
【００６６】
実施例２Ａ
粗油（４３Ｋｇ）を、ドラム缶から精製容器に移し、８０℃まで加熱した。約０．５Ｌの加熱された粗藻類油を、窒素下で、１Ｌのフラスコに精製容器から取り出し、１．０重量％のシリカ（ＪＫＣ−５）及び０．０３重量％のセルロース（Ｆｉｌｔｒａｃｅｌ  Ａｃｔｉｖｅ  １１２）（両方とも初期量の粗油に対して）を、フラスコに添加した。窒素を、フラスコ内で油を通してバブリングして、空気と油との接触を最小限に抑えた。脱塩水（初期の油質量に対して０．４重量％）を、フラスコ中のスラリーに添加した。次いで、スラリーを、窒素下で精製容器に移して空にした。精製容器中の内容物を、大気圧で、２７０ｒｐｍで２０分間撹拌し、次いで、２ｍｂａｒ−ａ未満で５分間撹拌した。
【００６７】
シリカ及びセルロースを含有する油を、のぞき窓を通して透明であることが観察されるまで、（キャンドルフィルターを介して）濾過ループを通して循環させた。次いで、それを、研磨フィルターを通して濾過し、充填カラム脱臭装置のための供給タンクとして使用された保存容器に移した。保存容器内の油を、わずかな窒素圧で、４０℃に維持した。
【００６８】
保存容器から濾過した油を、充填カラム脱臭装置に２０ｋｇ／時の流量で供給した。カラム入口ノズルの上流のインライン電気ヒーターは、油を１９０℃の温度に加熱した。カラム内の真空を、約２．０ｍｂａｒ−ａに一定に維持した。揮発性化合物の除去を促進するために、剥離蒸気（油流量に対して２．０重量％）を、向流モードで使用した。分析のための油試料を、一定の流れ及び温度によって観察されるように、定常状態に達したときのみ収集した。脱臭された油を、約５０℃に冷却された収集容器に収集し、研磨フィルターを通して抽出した。収集した試料は、２Ａである。
【００６９】
実施例２Ｂ
粗藻類油（３０Ｋｇ）を、ドラム缶から精製容器に移した。次いで、粗油を８０℃に加熱した。約２Ｌの熱い粗藻類油を、窒素をフラッシュした５Ｌのプラスチック製バケツに注ぎ入れた。窒素雰囲気を維持しながら、０．５重量％の粘土（Ｔｏｎｓｉｌ  ７７２ＦＦ）及び０．０３重量％のセルロース（Ｆｉｌｔｒａｃｅｌ  Ａｃｔｉｖｅ  １１２）（両方とも初期量の粗油に対して）を、振とうしながら、プラスチック製バケツ中の油に添加した。次いで、スラリーを、窒素下で、精製容器に移した。水（初期の粗油質量に対して０．５重量％）を、スラリーに添加した。精製容器中の混合物を、大気圧で、２７０ｒｐｍで５分間撹拌し、次いで、１５０ｍｂａｒ−ａで１５分間、２ｍｂａｒ−ａ未満でさらに５分間撹拌した。粘土の濾過が困難であったため、より多くのセルロース（初期の粗油質量に対して２重量％）を精製容器に添加し、キャンドルフィルターにおけるより迅速な濾過速度を可能にした。次いで、油を、バッチ脱臭装置に送るとき、それがのぞき窓を通して見たときに透明になるまで、キャンドルフィルターを通過させ、次いで、研磨フィルターを通過させた。
【００７０】
次いで、粘土処理油を、バッチ脱臭装置中で１５０℃の脱臭温度まで加熱し、圧力を、２．４〜２．９ｍｂａｒ−ａに低下させた。油が１００℃に達したら、スパージ蒸気（脱臭装置中で油の質量に対して、２．０重量％／時）を供給した。３時間後に加熱を止め、油を６０℃まで冷却した後、最終研磨フィルターを介して分析のための試料を収集した。収集した試料は、２Ｂである。
【００７１】
実施例２Ｃ
粗藻類油（４０Ｋｇ）を、ドラム缶から精製容器に移し、８０℃まで加熱した。初期の粗油質量に対して、２Ｌの熱い粗藻類油及び２．０重量％のセルロース（Ｆｉｌｔｒａｃｅｌ  Ａｃｔｉｖｅ  １１２）を用いて、油／セルローススラリーを、上述のように、５Ｌのプラスチック製バケツ中で調製した。空気の接触を最小限に抑えるために、窒素を、プラスチック製バケツ中の油を通してスパージした。このスラリーを精製容器に移した後に、精製容器内の混合物を、２７０ｒｐｍで５分間撹拌し、次いで、濾過を開始する前に、３０〜６０ｒｐｍに減少させた。セルロース処理油を、のぞき窓から視覚的に透明になるまでキャンドルフィルターを通して濾過し、次いで、バッチ脱臭装置に移すときに、研磨フィルターを通して濾過した。
【００７２】
セルロース処理油を、３．２〜３．５ｍｂａｒ−ａの減圧下で、バッチ脱臭装置中で１５０℃に加熱した。油が１００℃に達したときに、スパージ蒸気を開始した。１時間当たり１．０重量％（脱臭装置中で油質量に対して）のスパージ蒸気量を使用した。１時間後、油を１００℃まで冷却した後、充填カラム脱臭装置に供給したが、バッチ脱臭装置中で約１．１ｂａｒ−ａの窒素過剰圧力を維持した。バッチ脱臭装置からの油を、充填カラム脱臭装置に２０ｋｇ／時の速度で供給した。充填カラム脱臭装置を、約２．０ｍｂａｒ−ａの減圧下で運転した。カラム入口ノズルの上流のインラインヒーターを使用して、充填カラム脱臭装置に入る油を１９０℃に加熱した。剥離蒸気（油の流量に対して２．０重量％）を、油の流れに向流して供給した。プロセスが定常状態に達したとき、安定した流量及び温度によって示されるように、充填カラム脱臭装置を出る油を、６０℃未満に冷却し、収集した。次いで、カラム入口ノズルの温度設定を、２００℃に変更し、プロセスが新しい定常状態に達すると、試料を再度収集した。収集した試料は、２Ｃ（ｉ）（１９０℃）及び２Ｃ（ｉｉ）（２００℃）というラベルを付ける。
【００７３】
実施例２Ｄ
粗藻類油（４０ｋｇ）を、ドラム缶から精製容器に移した。油を、１２０℃まで加熱した。２リットルの熱い油を、窒素雰囲気下で、５Ｌのプラスチック製バケツに移し、０．５重量％のシリカ（ＪＫＣ−７）及び１．０重量％のセルロース（Ｆｉｌｔｒａｃｅｌ  Ａｃｔｉｖｅ  １１２）（両方とも初期量の粗油に対して）を、油を通して窒素をスパージしながら、プラスチック製バケツ中の油に添加した。混合物が均質になるまで、内容物を回転させた。次いで、スラリーを、窒素下で、精製容器に注ぎ入れた。精製容器中の内容物を、大気圧で、２７０ｒｐｍで３０分間撹拌し、次いで、２ｍｂａｒ−ａ未満で５分間撹拌した。
【００７４】
キャンドルフィルターでの濾過を進める前に、温度を、精製容器中で１００℃まで下げた。濾過完了後、油を、バッチ脱臭装置に移し、研磨フィルターを通過させる。バッチ脱臭装置中の濾過した油を、減圧下（約３．３ｍｂａｒ−ａ）で、３０分間１００℃で維持し、その間、スパージ蒸気（脱臭装置中で油質量に基づいて１．５重量％／時）を供給した。
【００７５】
次いで、バッチ脱臭装置からの油を、充填カラム脱臭装置に送った。カラム入口ノズルの上流のインラインヒーターが、カラムに入る油を１９０℃に加熱した。油を、１５ｋｇ／時の流量で供給した。約２．０ｍｂａｒ−ａの減圧を、充填カラム脱臭装置中で維持した。剥離蒸気（油の流量と比較して２．０重量％）を、油の流れに向流して供給した。定常状態に達すると、一定流量及び温度によって示されるように、分析のための試料を、最終研磨フィルターを通して収集した。冷却水を、充填カラム脱臭装置の底部に付着させた収集容器に供給し、そのため、試料を、６０℃未満で行われ得る。次いで、カラム入口ノズルを上流する温度を、２００℃に設定し、システムが新しい定常状態に達した後、試料を再度収集した。収集した試料は、３Ｄ（ｉ）（１９０℃）及び３Ｄ（ｉｉ）（２００℃）であった。
【００７６】
【表４】
2020510716.tif 000006
【００７７】
表４に使用される「ＮＤ」は、指定された化合物の存在が検出されず、検出の限界が２．５ｐｐｂであったことを意味する。そのため、ＮＤは、代替として、＜２．５ｐｐｂとして解釈され得る。表４に使用される「＜ＬＯＱ」は、指定された化合物の存在が定量化の限界を上回って検出されなかったことを意味する。ＬＯＱは、２．５ｐｐｂであり、そのため、＜ＬＯＱは、代替として、＜２．５ｐｐｂとして解釈され得る。すべての試料は、４２．５％〜４４．５％のＤＨＡ含量を有する。
【００７８】
上記のプロセスの穏やかな脱臭は、不純物のレベルにおける劇的効果を有し、検出限界（ＮＤ）または定量限界（ＬＯＱ）を下回るように減少させることは、表４から明らかである。しかしながら、同時に、カロテノイドのレベルは、実質的には、油がそれらの着色した見かけを維持させるように、６８．２％〜８６．９％の保持で保存される。対照的に、粗油は、表３及び４に記載される高レベルの揮発性化合物を含有し、従来通り精製、漂白、及び脱臭した油（ＲＢＤ）は、カロテノイドをほとんどまたは全く保持しない。
【００７９】
揮発性分析
藻類油の動的ヘッドスペースサンプリング
穏やかに精製したＤＨＡ含有油試料を、オートサンプラートレイ上に装填する。Ｔｅｎａｘ  ＴＡ（登録商標）（Ｇｅｒｓｔｅｌ，Ｐ／Ｎ  ０１３７４１−００５−００）を充填した熱脱離チューブを、オートサンプラー上にＧｅｒｓｔｅｌ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｕｎｉｔ（ＴＤＵ）チューブトレイに装填する。Ｇｅｒｓｔｅｌ  Ｍｕｌｔｉ−Ｐｕｒｐｏｓｅ  Ｓａｍｐｌｅｒ（ＭＰＳ）は、７５℃で１０分間の平衡のために、試料バイアルを動的ヘッドスペース（ＤＨＳ）インキュベーターに移す。試料は、この平衡中、１０００ＲＰＭで振とうする。平衡後、ＴＤＵチューブを、ＤＨＳ抽出器に充填し、試料を、試料にわたって、ＴＤＵトラップを通して流れる１リットルのガスの全流量に対して７５ｍＬ／分の流量で、ヘリウムガスでパージする（１３．３３分）。抽出温度は、７５℃であり、トラップは、抽出時に３５℃に保持される。抽出後、ＴＤＵチューブを、脱離のためにＴＤＵに移し、揮発物を極冷凍注された入口に捕捉する。ＴＤＵ温度プログラムは、スピットレス移動モードで、１２０℃／分で３５℃（０．５分）〜３００℃（５分）である。入口温度プログラムは、１２℃／秒で−１２０℃（０．２分）〜２７０℃（５分）である。ヘリウムカラム流量を１．５ｍＬ／分（一定流量）に設定して、入口を溶媒ベントモード設定に維持した。入口パージ時間は、１秒であり、パージ流量は３０ｍＬ／分である。溶媒ベント時間は３０秒に設定し、溶媒ベント流量は７５ｍＬ／分に設定し、溶媒ベント圧力設定は１２．９ｐｓｉに設定する。抽出した揮発物を分離し、ＬＥＣＯ（登録商標）Ｐｅｇａｓｕｓ（登録商標）４Ｄ  ２−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ（２ＤＧＣ−ＴＯＦＭＳ）で分析する。３０ｍのＤＢ（商標）−６２４（０．２５ｍｍ×１．４μｍ）カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐ／Ｎ１２２−１３３４）を、１次元で使用し、１．５ｍのＢＰＸ（商標）９０（０．２５ｍｍ×０．２５μｍ）カラム（ＳＧＥ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｐ／Ｎ０５４５７０）を、２次元で使用する。１次元カラムにおける温度プログラムは、５℃／分で４０℃（２分）〜１２０℃、１０℃／分で２５０℃（３分）である。２次元温度プログラムは、５度のオフセットで１次元プログラムと同じである。モジュレータは、この方法において使用されず、そのため、このシステムを１Ｄモードで動作する。移動ライン温度は、２５０℃である。質量分析計は、５０スキャン／秒で２５〜５５０ａｍｕスキャンの質量範囲をスキャンした。検出器電圧は、同調電圧に対して２００Ｖのオフセットに設定し、光源温度は、２２５℃であった。
【００８０】
藻類油からの揮発物の定量化
較正曲線は、精製、漂白、及び脱臭した（ＲＢＤ）藻類油を用いて作成した。高純度の標準物のトランス−２−ペンテナール、ヘキサナール、ジメチルジスルフィド、及び２−メチルシクロペンタノンは、Ｓｉｇｍａから購入した。ＲＢＤ油中の各標準物の濃度は、２．５ｐｐｂの定量化限界を下回る。ストック較正油は、蓋をし、混合して各標準物に対して約２５００パーツパーミリオン（１００万分の１）のストックを作製する、６．５グラムのＲＢＤ油を含有する１つの２０ｍＬのバイアルに、約１５ｍｇの各標準物を添加することによって調製された。ストック油を段階的に希釈して、０ｐｐｂ〜約４００ｐｐｂの較正曲線を作成する。２グラムの各標準物を、バイアルに計量し、分析方法に従って、抽出し、分析した。較正曲線は、注入された各化合物の量（ｘ軸）対各化合物に対するピーク下面積（ｙ軸）をプロットすることによって作成される。試料中でモニタリングされた各化合物の量（μｇ）は、回帰線方程式を用い、ｘ（注入された量）について解くことによって決定される。濃度（ｐｐｂ）は、注入された化合物の量に試料の質量を掛けて、１０００を掛けることによって決定される。非常に低いレベルを有する試料は、２つの方法のうちの１つにおいて解釈され得る。非常に低い濃度では、較正曲線の直線性は、試料日が定量化するのには十分ではない。したがって、定量化限界は、２．５ｐｐｂであると決定される。この定量化限界（ＬＯＱ）を下回るレベルを有する試料のみが、＜２．５ｐｐｂまたは＜ＬＯＱと報告され得る。代替として、試料は、分析され得、検出されたシグナルはなく、試料は検出レベル（ＬＯＤ）を下回ると見なされる。これはまた、定量化のレベルを下回り得るが、＜２．５ｐｐｂまたは検出されず（ＮＤ）と報告され得る。モニタリングされた揮発物は、トランス−２−ペンタナール（ｔ−２−Ｐ）、ヘキサナール、ジメチルジスルフィド（ＤＭＤＳ）、２−メチルシクロペンタノン（２−ＭＣＰ）である。
【００８１】
油中のカロテノイド濃度を測定するためのＵＶ−Ｖｉｓ方法
本明細書に従う全カロテノイドを測定するための方法は、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ６８４−２．２０：１９７７（脂肪及び脂肪油の分析の方法−第２部：他の方法−セクション２．２０：植物油中のカロチンの決定）であり、これは、植物油中のカロチンを測定するための光吸光方法である。
【００８２】
この研究において使用される分光光度計は、Ｇｅｎｅｓｙｓ  １０Ｓ  ＵＶ−Ｖｉｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒモデル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。この装置は、１ｃｍの経路長キュベットを使用する。ＡＣＳグレードのヘキサン（Ｆｉｓｈｅｒ）は、溶媒のために使用した。吸光を、４４５ｎｍで測定した。試験される油を、ヘキサン中で希釈した。約０．５〜１．０ｇの油を、容量フラスコを用いてヘキサンで、２５ｍｌの溶液になるまで希釈した。濃度を、ｃ（１００ｍＬの溶液当たりの油（ｇ））として記録した。油中のカロテノイドの濃度に応じて、ヘキサン中の油の希釈を調節し、そのため、４４５ｎｍで測定された吸光度は、０．１〜１の吸光度単位を含み得る。カロテノイド濃度を測定する式は、
【００８３】
濃度（ｐｐｍ）＝（３８３＊Ｅ）／（Ｌ＊ｃ）
【００８４】
式中、Ｅは、４４５ｎｍで測定された吸光度（空に対して補正した後）であり、Ｌは、キュベット（ｃｍ）の経路長であり、ｃは、油の濃度（油（ｇ）／１００ｍＬの溶液）である。
【００８５】
したがって、一例０．４７９３ｇの穏やかに精製したＤＨＡ含有油試料を、２５ｍＬに容積フラスコに添加した。フラスコを、ヘキサンで２５ｍＬの印まで充填した。フラスコを覆い、試料を混合して、均一な溶液を確保した。１ｃｍの経路キュベットを、希釈溶液で充填した。ヘキサンを別個の１ｃｍの経路キュベットに充填し、使用して、４４５ｎｍでＵＶ−Ｖｉｓ分光計を空にした。油試料を測定し、０．５２５単位の吸光度を記録した。ヘキサン中の油の濃度ｃは、（０．４７９３ｇ／２５ｍｌ）＊４＝１．９１７ｇ／１００ｍｌである。次いで、カロチン濃度は、（３８３＊０．５２５）／（１＊１．９１７）＝１０４．９ｐｐｍの油中カロテノイドである。
【００８６】
表２中に報告された個々のカロテノイドを、外部の試験施設Ｅｕｒｏｆｉｎｓによって、それらの社内での大量生産法を使用して測定した。
【国際調査報告】
2020510716.tif 000007