(57)【要約】  ｉ）生物学的に活性なポリペプチド；およびｉｉ）配列番号１：  Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｄ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号１）によるアミノ酸配列から独立に選択された２〜８０ユニットを含む半減期延長ポリペプチド部分を含み、式中、独立に、Ｘ１はＰであるか、または存在せず；Ｘ２はＶであるか、または存在せず；Ｘ３はＰまたはＴであり；Ｘ４はＰまたはＴであり；Ｘ５はＴまたはＶであり；Ｘ６はＤ、ＧまたはＴであり；Ｘ８はＡ、ＱまたはＳであり；Ｘ９はＥ、ＧまたはＫであり；Ｘ１０はＡ、Ｅ、ＰまたはＴであり；およびＸ１１はＡ、ＰまたはＴ、である、融合タンパク質が提供される。半減期延長ポリペプチド部分は通常、アンフォールド構造を有し、腎クリアランスを回避し得る大きな流体力学半径を有する融合タンパク質を提供する。その結果、融合タンパク質の生物学的半減期は増大し、それにより、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的作用が延長され得る。【選択図】図５ｃ
2020523987.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
ｉ）生物学的に活性なポリペプチド；および
ｉｉ）２〜８０ユニットを含む半減期延長ポリペプチド部分であって、それぞれのユニットが、配列番号１：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｄ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号１）
による全てのアミノ酸配列からなる群より独立に選択され、式中、独立に、
Ｘ１はＰであるか、または存在せず；
Ｘ２はＶであるか、または存在せず；
Ｘ３はＰまたはＴであり；
Ｘ４はＰまたはＴであり；
Ｘ５はＴまたはＶであり；
Ｘ６はＤ、ＧまたはＴであり；
Ｘ８はＡ、ＱまたはＳであり；
Ｘ９はＥ、ＧまたはＫであり；
Ｘ１０はＡ、Ｅ、ＰまたはＴであり；
Ｘ１１はＡ、ＰまたはＴであり；
全体的にみて、胆汁酸塩刺激リパーゼと一致しない、融合タンパク質。
【請求項２】
前記半減期延長ペプチド部分が、２〜８０ユニット、例えば、４〜８０ユニットのコンティグ配列を形成する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
複数の半減期延長ポリペプチド部分を含み、それぞれのポリペプチド部分が２〜８０ユニットを含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記半減期延長ポリペプチド部分、または少なくとも１つの前記複数の半減期延長部分が、前記生物学的に活性なポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に配置される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記半減期延長ポリペプチド部分、または少なくとも１つの前記複数の半減期延長ポリペプチド部分が、前記生物学的に活性なポリペプチドのアミノ酸配列中への挿入、またはそのアミノ酸配列の一部の置換を構成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号２〜１１からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸配列の２〜８０ユニットを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号１２〜２１および５７〜６６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号１２〜２１および５７〜６６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号１００〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号１００〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、１０〜５１ユニットなどの６〜７０ユニット、例えば、７〜１８ユニットを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
少なくとも３．８ｎｍの流体力学半径を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
サイズ排除クロマトグラフィーにより測定して、少なくとも６０ｋＤａの溶液中の見かけのサイズを有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
配列番号１による前記アミノ酸配列がヒト起源である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、天然ヒトアミノ酸配列に一致する、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
各ユニットが、最大で１つのＯ−グリコシル化を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
複数の生物学的に活性なポリペプチドを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
生物学的に活性なポリペプチドの前記生物学的半減期を延長する方法であって、
ａ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用意するステップ；
ｂ）前記ポリヌクレオチドを細胞中に導入するステップ；
ｃ）前記細胞を前記融合タンパク質の発現を可能とする条件下で維持するステップ；および
ｄ）前記融合タンパク質を単離するステップ、を含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含み、任意選択で、皮下または静脈内投与用に処方された医薬組成物。
【請求項２３】
薬物としての使用のための、任意選択で、対象の皮下または静脈内に投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
生物学的に活性なポリペプチドのバイオアベイラビリティを高めるための、請求項１〜１７のいずれか１項で定義の半減期延長ポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質、およびこのような半減期延長ポリペプチドおよび融合タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療用タンパク質およびペプチドは、多くの場合、短いインビボ半減期により妨害される。特に、より小さいタンパク質およびペプチドは、腎臓の濾過により循環から容易に排出される。生物製剤はほとんどの場合、静脈内（ｉ．ｖ．、ｉｖ）または皮下（ｓ．ｃ．、ｓｃ）注射により投与され、各投与の間の時間の長さが極めて重要である。一方、これらの投与経路、特に、静脈内注射は通常、医療専門家の手助けが必要であり、また、患者にとって不愉快でもあり、痛みを与える場合もあり、従って、高頻度の投与は患者の不快感および不自由さを増し、医療資源を必要とする。これは、手間や不愉快さがはるかに軽減される、経口、鼻腔内または局所などのより侵襲性の少ない経路により必要に応じて投与できる場合が多い小分子薬物の投与とは大きく対象をなすものである。
【０００３】
生物製剤またはバイオ医薬品の循環からの急速排出の問題への最も早期の対処の試みの１つは、タンパク質またはペプチドへポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー鎖を化学的に結合して、薬物の流体力学半径を増大させることであり、これは、溶液中の増大した見かけのサイズに変換され、それにより、その薬物は腎臓により容易には排出されないサイズに達する。ペグ化と命名されたこの技術は、うまくいくことを示し、現在、承認医薬品で使用されている。しかし、化学的結合のステップは、製造に対し追加の工程ステップを加え、製造された薬物のコストを高める。さらに、ＰＥＧ部分の結合は、タンパク質またはペプチドの種々の部位で起こり得るので、ＰＥＧ鎖の位置が個々の分子内で変動する不均質性の大きく増大した生成物が得られる。ＰＥＧポリマーそれ自体の性質はまた、そのポリマーが単分散ではなく、類似であるが同じでない長さのＰＥＧポリマーの集合体であるため、ある程度の不均質性を付与する。
【０００４】
ＰＥＧは非免疫原性であり、結合した分子に対して免疫原性を低減さえできるという元々の考えとは逆に、ＰＥＧは、後で、免疫原性があることが判明した。一例では、ＰＥＧは、結合した薬物の排出を大きく増大させるに至った（ＰＥＧ−ｕｒｉｃａｓｅ；Ｇａｎｓｏｎ  ＮＪ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。
【０００５】
追加の製造ステップを取り除き、単分散生成物を作製することを目的として、Ａｍｕｎｉｘ  ＩｎｃおよびＸＬ−Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＧｍｂＨなどの会社は、治療用タンパク質およびペプチドの生物学的半減期を延長する融合パートナーとして使用できる、無作為に非反復性のタンパク質配列をベースにした半減期延長技術を開発した（Ｐｏｄｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１６  Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１３  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ）。
【０００６】
生物製剤の生物学的半減期を延長する別の方法は、長い半減期を有する血清タンパク質の形態のパートナーへの融合である。最もよく使われる融合パートナーの内の２種は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびヒト抗体のＦｃ部分である。特に、Ｆｃドメインは、半減期延長融合パートナーとして広範囲に使用されてきた。ＨＳＡおよびＦｃの両方は、腎クリアランスを回避するのに十分な大きさであり、また、新生児のＦｃ受容体が関与する再循環経路の恩恵も受ける。新生児のＦｃ受容に対し、これらのタンパク質が結合することにより、低減した腎クリアランスのみにより達成されるものを超えてそれらの半減期がさらに延長される（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ＲＥ．Ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１６）。ヒト起源のこのような融合パートナーはまた、ヒト患者中での低い免疫原性応答を意味する。
【０００７】
しかし、上記の進歩にもかかわらず、当該技術分野において、生物製剤の半減期を延長する新規手段に対する必要性がまだ残されている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の目的は、先行技術の問題点を少なくとも部分的に低減または回避し、タンパク質およびペプチドの生物学的半減期を延長する新規手段を提供することである。
【０００９】
当業者には本開示から明らかであると思われるこれらのおよび他の目的は、添付の特許請求の範囲で定められたおよび一般に本明細書で開示された本発明の種々の態様により実現される。
【００１０】
一態様では、本発明は、下記を含む融合タンパク質に関する：
ｉ）生物学的に活性なポリペプチド；および
ｉｉ）２〜８０ユニットを含む半減期延長ポリペプチド部分であって、それぞれのユニットが、配列番号１：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｄ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号１）
による全てのアミノ酸配列からなる群より独立に選択され、式中、独立に、
Ｘ１はＰであるか、または存在せず；
Ｘ２はＶであるか、または存在せず；
Ｘ３はＰまたはＴであり；
Ｘ４はＰまたはＴであり；
Ｘ５はＴまたはＶであり；
Ｘ６はＤ、ＧまたはＴであり；
Ｘ８はＡ、ＱまたはＳであり；
Ｘ９はＥ、ＧまたはＫであり；
Ｘ１０はＡ、Ｅ、ＰまたはＴであり；
Ｘ１１はＡ、ＰまたはＴ、であるペプチド部分。
【００１１】
上記の２〜８０ユニットは、上述の配列番号１の定義の範囲内で同一でも異なっていてもよい。言い方を変えれば、半減期延長ポリペプチド部分は、２〜８０ユニットを含み、各ユニットは、配列番号１の定義内に入る個々の配列からなる群より独立に選択されるアミノ酸配列である。好ましくは、各ユニットは、配列番号２〜１１からなる群より独立に選択されるアミノ酸配列であり得る。
【００１２】
本発明者らは、意外にも、ヒト胆汁酸塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）のＣ末端ドメインに基づくまたはそれ由来の、上記で定義のポリペプチド部分が、治療薬として使用されるタンパク質またはペプチドに融合されると、優れた半減期延長部分を提供できることを発見した。半減期延長ポリペプチド部分は通常、生理的条件下ではアンフォールド構造を有し、大きな流体力学半径を有する融合タンパク質を提供し、従って、生物学的に活性なポリペプチドの腎クリアランスを回避するか、または少なくとも腎クリアランス速度を遅くする。従って、半減期延長ポリペプチド部分を含む融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチド単独の生物学的半減期に比べて、延長された生物学的半減期を有し得る。
【００１３】
本発明では、融合タンパク質は、全体的にみて、胆汁酸塩刺激リパーゼではなく、生物学的に活性なポリペプチドは、塩刺激リパーゼの触媒ドメインと一致しない。
【００１４】
本明細書で使用される場合、表現の「融合した」および「融合」は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸配列などの同じ種類の化学物質の２つ以上の部分の人為的結合を意味する。本明細書において参照される場合、融合タンパク質は通常、少なくとも２つの異なる起源のポリペプチド部分、例えば、ＢＳＳＬ由来であり得る、半減期延長ポリペプチド部分、およびＢＳＳＬではない、生物学的に活性なポリペプチドを含む。本発明の融合タンパク質は通常、非天然物質であり、ヒトＢＳＳＬに相当するものではない。本発明の融合タンパク質はまた、キメラタンパク質とも呼ばれ得る。「キメラタンパク質」は、元々別々のタンパク質のためにコードされた、同じまたは異なる種であり得る２つ以上の完全なまたは部分的遺伝子からなるヌクレオチド配列によりコードされるハイブリッドタンパク質を意味すると理解される。本発明の融合タンパク質、またはキメラタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により生成される。
【００１５】
表現の「生物学的半減期」は、血液、血清または血漿中の当該物質の濃度が初期濃度の半分に低減するのに要する時間を意味する。生物学的半減期は、当業者に既知の従来の方法に従って決定し得る。例えば、生物学的半減期は、血清、血漿または全血中の濃度に基づいて決定できる。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「生物学的に活性なポリペプチド」という用語は、インビボで所望の生物活性を働かせるポリペプチドを意味する。これに関して、「生物活性」は、インビボで治療効果につながり、結合活性として例示され得るポリペプチドのいずれかの活性を意味する。非限定的例には、酵素活性、アゴニスト活性、およびアンタゴニスト活性が挙げられる。通常、生物学的に活性なポリペプチドは、生物製剤とも呼ばれるバイオ医薬品である。生物学的に活性なポリペプチドは通常、部分的にまたは全体的にヒトＢＳＳＬでもまたいずれか他の種のＢＳＳＬでもなく、それらに相当するものでもない。
【００１７】
好ましくは、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期を、少なくとも１つの種、通常ヒトで、少なくとも１．５倍延長する。換言すれば、融合タンパク質は、好ましくは、生物学的に活性なポリペプチド単独の場合の少なくとも１．５倍の生物学的半減期を有する。例えば、融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期を、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、延長し得る。増大した生物学的半減期の結果、生物学的に活性なポリペプチドの効果は、延長され得る。
【００１８】
投与の観点からは、本明細書で開示の半減期延長ポリペプチド部分の使用は、より少ない頻度の投与を可能とし、これは、患者にとって有益であり、加えて、経済的な観点からも有益である。例えば、薬物の週２日の投与でなく、週１回のみの投与で、同じまたは類似の生物学的または治療的効果を達成し得る。このような違いは、患者にとって、特に、病院または医院に来診して治療を受けることが必要な患者、および／または投与で身体的に不快感があり、さらには痛みさえある患者の場合に大きな改善を意味する。さらに、より少ない投与および／またはより長い投与間の期間により、投与法により生ずる有害反応を回避し得、例えば、皮下注射の場合の痛み、湿疹および発疹などの注射部位の反応を低減または回避でき、および静脈内投与の場合では、例えば、発熱または悪心を伴う注入反応を低減または回避できる。
【００１９】
本発明で使用される半減期延長ポリペプチドの他の利益は、半減期延長ポリペプチド中の多数の親水性残基に起因する融合タンパク質の増大した親水性にある。増大した親水性は、融合タンパク質のバイオアベイラビリティを改善し（生物学的に活性なポリペプチドそのままのバイオアベイラビリティと比較して）、全身的な濃度を高め、より少量および／またはより少ない頻度の投与量を可能にし得る。本明細書で使用される場合、「バイオアベイラビリティ」は、静脈内投与とは異なる経路を介して投与後に、体循環に到達する物質の投与量分率を意味する。
【００２０】
増大した親水性の別の実用的な意味は、静脈内投与ではなく、皮下投与が現実的な選択肢であり得ることである。可能であれば、皮下注射は、静脈内投与に比べて、一般的により迅速で、不快感が少なく、また、実施するための医学的訓練が少なくてすむので、皮下投与は多くの場合、静脈内注入よりも好ましい。
【００２１】
さらに、本発明による融合タンパク質の増大した親水性はまた、粗製発現産物の精製中に有利な場合がある。本発明の実施形態による融合タンパク質は、勾配溶出を使って疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を用いることにより、生物学的に活性なポリペプチドそのままの場合より早期に溶出されることが明らかになった。これは、生物学的に活性なポリペプチドと同時に溶出される望ましくない宿主細胞タンパク質に関連する問題に対する解決策となり得る非常に有用な効果の可能性があると考えられる。従って、高純度の融合タンパク質を得るために必要なクロマトグラフィーの単位操作の数を減らすことが可能である。
【００２２】
本明細書で記載の半減期延長ポリペプチド使用の別の利点は、融合タンパク質の増大した生物学的半減期は、もっぱら、または少なくとも主としてそのポリペプチドのサイズ増大に依存し得ることから、そのポリペプチドが、溶液中の流体力学半径（または見かけのサイズ）の観点でのサイズに基づいて、得られる融合タンパク質の生物学的半減期のより正確な予測を可能とすることである。実際に、本発明の実施形態で使用される半減期延長ポリペプチド部分は、大部分の再利用受容体の新生児のＦｃ受容体への結合を欠き、従って、タンパク質サイズと受容体相互作用による再利用との間の複雑な相互作用を回避し得る。この相互作用が回避できない場合には、生物学的半減期の予測および微調整を極めて不確実なものにする。
【００２３】
半減期延長ペプチド部分は、配列番号１で定義の１つまたは複数の配列の４〜８０ユニットなどの２〜８０ユニットのコンティグ配列を形成し得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、複数の半減期延長ポリペプチド部分を含み、それぞれのポリペプチド部分が上記で定義の２〜８０ユニットを含み得る。このような複数の半減期延長ポリペプチドは、同じ長さ（同じ数のユニットを有する）であってもよく、または異なった長さであってもよい。あるいは、融合タンパク質は、１つの半減期延長ポリペプチドのみを含み、通常、上記で定義の４〜８０ユニットを有し得る。
【００２４】
いくつかの実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、前記生物学的に活性なポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）またはカルボキシ端末（Ｃ末端）に配置され得る。複数の半減期延長ポリペプチドの場合には、少なくとも１つの前記半減期延長ポリペプチド部分は、前記生物学的に活性なポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に配置され得る。
【００２５】
代わりにまたは追加して、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドのアミノ酸配列中への挿入、またはその一部の置換を構成し得る。複数の半減期延長ポリペプチドの場合には、少なくとも１つの前記半減期延長ポリペプチド部分は、任意選択で、生物学的に活性なポリペプチドのアミノ酸配列中への挿入、またはその一部の置換として配置され得る。挿入または置換は、生物学的に活性なポリペプチドのアミノ酸配列中への挿入、またはその一部への置換を構成する半減期延長ポリペプチド部分が、融合タンパク質の表面上に露出されるように、生物学的に活性なポリペプチドの三次構造の表面露出ループ中でなされ得る。
【００２６】
本発明の実施形態では、配列番号１の残基Ｘ３およびＸ４の少なくとも１つがＰであり得る。いくつかの実施形態では、配列番号１のＸ４およびＸ５の少なくとも１つがＴであり得る。いくつかの実施形態では、配列番号１のＸ１０およびＸ１１の少なくとも１つがＡまたはＰであり得る。いくつかの実施形態では、Ｘ１はＰであり、Ｘ２はＶである。
【００２７】
本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号２〜１１からなる群より独立に選択される１つまたは複数のアミノ酸配列の２〜８０ユニットを含み得る。これらの配列は、配列番号１のヒトバリアントを表す。インビトロおよびインシリコで評価された配列番号２〜１１から選択される反復ユニットに基づくアミノ酸配列は、低い免疫原性の可能性を有することが明らかになった。このようなユニットからなる半減期延長ポリペプチド部分は、免疫応答の観点から、ヒト対象で耐容性良好であることが予測される。
【００２８】
いくつかの実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、ヒト起源の天然配列が通常そうであるように、そのＮ末端に配列番号２を有し得る。例えば、半減期延長ポリペプチド部分は、次の順番で、少なくとも４つの近接ユニットを含み得る：任意選択で配列番号２が先行して、［配列番号３］−［配列番号４］−［配列番号５］−［配列番号５］。
【００２９】
本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号１２〜２１または５７〜６６から選択される少なくとも１つの配列を含み得る。例えば、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号１２〜２１および５７〜６６からなるアミノ酸配列の群から選択され得る。あるいは、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号１２〜２１および５７〜６６からなる群より選択される配列の複数のコピー、例えば、２個、または３個の、任意選択で、近接したコピーを含み得る。
【００３０】
いくつかの実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号１００〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなり得る。
【００３１】
本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号１による１つまたは複数のアミノ酸配列の少なくとも４、少なくとも６、少なくとも８、少なくとも１０、または少なくとも１７ユニットを含み得る。さらに、本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号１による１つまたは複数のアミノ酸配列の最大８、最大１０、最大１８、最大３４、最大５１、最大６８、最大７０ユニットを含み得る。従って、例えば、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号１による１つまたは複数のアミノ酸配列の７〜１８ユニット、例えば、配列番号２〜１１からなる群より独立に選択される７〜１８ユニットを含み得る。
【００３２】
通常、半減期延長ポリペプチドは、または融合タンパク質が複数の半減期延長ポリペプチドを含む場合では、少なくとも１つの半減期延長ポリペプチドは、配列番号１による少なくとも２個の異なるアミノ酸配列を含む。
【００３３】
本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチドは、溶液中、単独で少なくとも５ｋＤａの見かけのサイズを有する、生物学的に活性なポリペプチドに融合され得る。特に、小さい生物学的に活性なポリペプチドの場合には、存在する半減期延長ポリペプチドは、腎クリアランスを回避するのに十分なサイズに増大させ得るので、大きなメリットがあり得る。全体的にみて、サイズ排除クロマトグラフィーにより測定して、融合タンパク質は通常、溶液中で少なくとも６０ｋＤａの見かけのサイズを有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の溶液中の見かけのサイズは、生物学的に活性なポリペプチド単独の溶液中の見かけのサイズより、少なくとも１．５倍、最大で３００倍、大きい。流体力学半径に換算すると、融合タンパク質は、全体的にみて、少なくとも３．８ｎｍの流体力学半径を示し得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の流体力学半径は生物学的に活性なポリペプチド単独の流体力学半径の、少なくとも１．２５倍の大きさ、例えば、２倍の大きさであり得る。
【００３４】
半減期延長ポリペプチドにより提供される見かけのサイズの増大は、半減期延長ポリペプチドの不定形のまたはアンフォールド構造により、少なくとも一部は説明され得る。例えば、半減期延長ポリペプチドは、αヘリックスおよびβシートなどの二次構造要素を欠き、そのため、半減期延長ポリペプチドは、融合タンパク質のαヘリックスおよび／またはβシート含量に寄与しないとして特徴付けされ得る。
【００３５】
本発明の実施形態では、配列番号１によるアミノ酸配列は、ヒト起源であり得る。例えば、半減期延長ポリペプチド部分は、天然ヒトアミノ酸配列に一致し得る。ヒト対象でのより低い免疫原性の一因となることが予測されるので、ヒト起源の配列の使用は有利であり得る。実際に、下記の実施例１４は、配列番号２〜１１から選択される反復ユニットからなる半減期延長ポリペプチド部分は、ヒトにおける低い免疫原性の可能性を有することを確証する。それにもかかわらず、他の種の天然反復ユニットを含むまたはそれに相当する配列もまた、半減期延長ポリペプチドにおいて、単独またはヒト起源の反復ユニットと組み合わせた使用が意図されている。このような他の種には、特に、非ヒト霊長類、例えば、ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、ボノボおよびマカクが含まれる。
【００３６】
本発明の実施形態では、配列番号１による各反復ユニットは、１つの、または最大で１つの可能なＯ−グリコシル化部位を有する。さらに、半減期延長ポリペプチド部分が哺乳動物発現系で生成された場合、各ユニットは、最大で１つのＯ−グリコシル化を含み得、および通常、全部ではないが、大部分の前記ユニットが１つのＯ−グリコシル化をそれぞれ含む。例えば、前記ユニットの特定の数または部分は、グリコシル化を欠き得る。いくつかのグリコシル化は、それがサイズ増大にさらに寄与し得るので有益であり得るが、非特異的または未知のグリコシル化パターンは、タンパク質の特性評価中に実際的な問題を提起する場合がある。従って、本発明の実施形態による限られたおよび比較的明確な半減期延長ポリペプチド部分のグリコシル化パターンは、この点では有利である。しかし、いくつかの実施形態では、特に、融合タンパク質が非哺乳動物細胞中で産生される場合には、半減期延長ポリペプチド部分は、グリコシル化を完全に欠き得る。
【００３７】
融合タンパク質は、少なくとも１つの生物学的に活性なポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、複数の生物学的に活性なポリペプチド、例えば、２つの生物学的に活性なポリペプチドを含み得る。
【００３８】
半減期延長ポリペプチド部分との融合による半減期の延長が望ましい融合タンパク質の生物学的に活性なポリペプチドは、ホルモン、成長因子、サイトカイン、酵素、リガンド、結合剤、補助因子、抗体および抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）などの抗体フラグメントからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドは受容体アゴニストであり得る。他の実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドは、受容体アンタゴニストであり得る。
【００３９】
融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチド単独の生物学的半減期に比べて、少なくとも１．５倍延長される生物学的半減期を有し得る。
【００４０】
別の態様では、本発明は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期を延長する方法、または上記本発明の第１の態様による融合タンパク質を生成する方法を提供し、該方法は、
ａ）生物学的に活性なポリペプチドおよび半減期延長ポリペプチド部分を含む、上述の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、通常、ＤＮＡ構築物を用意するステップ；
ｂ）前記ポリヌクレオチドを細胞中に導入するステップ；
ｃ）前記細胞を前記融合タンパク質の発現を可能とする条件下で維持するステップ；および
ｄ）前記融合タンパク質を単離するステップ、を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。哺乳動物発現系での発現は、融合タンパク質のグリコシル化を提供し得るので、有益であり得る。他の実施形態では、細胞は、酵母細胞、植物細胞または非哺乳動物細胞などの非哺乳動物真核細胞であり得る。さらに他の実施形態では、細胞は、大腸菌などの原核細胞であり得る。
【００４２】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、α２，６−シアル酸転移酵素（ＥＣ：２．４．９９．１；別名はＢ細胞抗原ＣＤ７５である）と共発現され得る。このような方法は、
ｉ）α２，６−シアル酸転移酵素をコードするポリヌクレオチド、通常ＤＮＡ構築物を用意するステップまたは内因性α２，６−シアル酸転移酵素の発現を推進するステップ、
ｉｉ）本発明の実施形態による融合タンパク質の発現のために、前記ポリヌクレオチドを、上記ステップｂ）で使用したものと同じ細胞であってもよい細胞中に導入するステップ、および
ｉｉｉ）前記細胞を前記α２，６−シアル酸転移酵素の発現も可能とする条件下で維持するステップ、を含み得る。
【００４３】
ポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードする上記ステップａ）と同じ構築物であり得る。あるいは、それは、異なるＤＮＡ構築物であってもよい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードし、およびそれぞれ、α２，６−シアル酸転移酵素をコードするか、またはその発現を推進する異なるＤＮＡ構築物を用いて、ＤＮＡ構築物は、同時にまたは異なる時点で、同じ細胞中に導入され得る。あるいは、異なる細胞を用いてもよく、この場合には、細胞は一緒に培養され、従って、同時にまたは順次に、融合タンパク質およびα２，６−シアル酸転移酵素の発現を可能とする条件下で一緒に維持され得る。
【００４４】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、このようなポリヌクレオチド含む発現ベクター、および哺乳動物細胞または非哺乳動物細胞であってよい、このような発現ベクターを含む細胞を提供する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の融合タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮下投与、および／または静脈内投与用として処方され得る。
【００４６】
さらに別の態様では、本発明は、薬物として使用するための、特に、対象の皮下に投与することが意図される薬物として使用するための融合タンパク質を提供する。
【００４７】
さらなる態様では、本発明は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期を増大するための本明細書で定義の半減期延長ポリペプチドの使用、ならびに生物学的に活性なポリペプチドのバイオアベイラビリティを高めるための本明細書で定義の半減期延長ポリペプチドの使用に関する。前述のように、本明細書で記載の半減期延長ポリペプチド部分の別の利益は、半減期延長ポリペプチド中の多数の親水性残基に起因して得られた融合タンパク質の増大した親水性にある。増大した親水性は、バイオアベイラビリティを改善し得、また、全身的濃度（例えば、血清濃度）を高め、潜在的により少ない投与量またはより少ない頻度の投与量を可能とする。増大した親水性の別の実用的な意味は、特定の生物学的に活性なポリペプチドにとって、静脈内投与ではなく、皮下投与が現実的な選択肢であり得ることである。
【００４８】
本発明は、特許請求の範囲中に記述された特徴の全ての可能な組み合わせに関することに留意されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の実施形態による、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子（白）および半減期延長ポリペプチド部分をコードする１つまたは複数の遺伝子（陰影）の図式表現である。
【図２】本発明の実施形態による融合タンパク質のコンピューター生成表現である。
【図３】図３ａ−図３ｂ。本発明の実施形態による異なる融合タンパク質に対する半減期延長部分のサイズと反復ユニットの数との間の関係を、生物学的に活性なポリペプチド単独でのサイズと比較して示すグラフである。図３ａは、反復ユニットの数（Ｘ軸）に対する溶液中の見掛けの分子量（Ｙ軸）の関係を示す。図３ｂは、反復ユニットの数（Ｘ軸）に対する流体力学半径（Ｙ軸）の関係を示す。
【図４】本発明の実施形態に従って、大腸菌中で作製された融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示す画像である。
【図５】図５ａ−図５ｃ。本発明の実施形態による融合タンパク質（Ｙ軸）の終末相半減期を、融合タンパク質の溶液中の見かけのサイズ（図５ａ）、融合タンパク質の流体力学半径（図５ｂ）、および半減期延長ポリペプチド部分の反復ユニットの数（図ｃ）によりそれぞれ表されるサイズの関数として示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
ヒト授乳中乳腺および膵臓は、脂肪分解酵素の、胆汁酸塩活性化リパーゼ（ＢＡＬ）またはカルボン酸エステルリパーゼ（ＣＥＬ）とも呼ばれる胆汁酸塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）（ＥＣ３．１．１．１３）を産生する。タンパク質は、２つのドメイン、大きな球状アミノ末端ドメインおよびより小さいが延長されたカルボキシ端末（Ｃ末端）ドメイン中に配置されている（概説は、例えば、Ｗａｎｇ  ＆  Ｈａｒｔｓｕｃｋ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １１６６：１−１９を参照）。本発明者らは、以下の実施例で示すように、意外にも、ヒトＢＳＳＬのＣ末端ドメインに基づくまたはそれから誘導された反復配列が、生物学的に活性なタンパク質またはペプチドにうまく融合でき、融合パートナーの増大した生物学的半減期を付与し、それにより、そのインビボでの生物学的または治療的効果を延長することを見出した。
【００５１】
ヒトＢＳＳＬのＣ末端ドメインは、式「ＰＶＰＰＴＧＤＳＧＡＰ」の、またはそれに類似の、反復ユニットからなる。以下の実施例１の表２は、ヒトＢＳＳＬバリアント由来の反復ユニットを示す。最もよくある形態のＣ末端ドメインは、１８反復ユニットを含む（ＵｎｉＰｒｏｔ  ｅｎｔｒｙ  Ｐ１９８３５）。しかし、ヒト集団では、反復ユニットの数に関する変化、および個々の反復ユニットのアミノ酸配列の変化の両方の変化が存在する。さらに、各反復ユニットは、Ｏ−グリコシル化され得る１つの部位を有し、この領域の親水性およびサイズを増大する（Ｓｔｒｏｍｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９９７）。しかし、ドメインのＣ末端は疎水性であり、ＢＳＳＬの活性部位に結合して、酵素の自己抑制をもたらすことが示された。この疎水性の部分の最も高頻度のヒト配列は、「ＱＭＰＡＶＩＲＦ」である（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９８）。
【００５２】
以前に、Ｃ末端ドメインは、インビボでＢＳＳＬの安定性、例えば、酸による変性および生理的条件下の凝集に対する抵抗性、に関与し得ることが推測された（Ｌｏｏｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９９，２６６，１０５−１１１）。対照的に、別のコレステロールエステラーゼ構造の研究では、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＳｅｒおよびＴｈｒ残基が富化されたＣ末端ドメインは、短寿命タンパク質中のＰＥＳＴリッチ配列を想起させ、このタンパク質が、Ｃ末端ドメインの反復配列に起因して、インビボで短い半減期を有し得ることを示した（Ｋｉｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １９８９，１００６）。
【００５３】
本発明では、本明細書で定義のヒトＢＳＳＬのＣ末端ドメインに基づくまたはそれ由来の半減期延長ポリペプチド部分を含む融合タンパク質の延長された生物学的半減期は、主に、タンパク質の増大した流体力学半径に起因すると考えられている。しかし、その他の機序が増大した生物学的半減期に寄与し得ることも想定される。
【００５４】
本明細書で使用される場合、表現の「融合した」および「融合」は、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、または核酸配列などの同じ種類の化学物質の２つ以上の部分の人為的結合を意味する。本明細書において参照される融合タンパク質は通常、少なくとも２つの異なる起源であり得るポリペプチド部分、例えば、ＢＳＳＬではない生物学的に活性なポリペプチド、およびＢＳＳＬ由来であり得る半減期延長ポリペプチド部分を含む。一般に、融合は、任意の順序、任意の位置での縮合部分を含み得るが、しかし、当業者なら理解するように、遺伝子の融合は通常、縮合遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が維持されるように、インフレーム（インライン）で行われる。
【００５５】
図１は、本発明の実施形態による融合タンパク質をコードする核酸構築物を模式的に示し、該核酸構築物は、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子（白色バー）、および半減期延長ポリペプチド部分をコードする遺伝子（破線のバー）を含む。単純化のために、プロモーターまたはエンハンサー配列などの他の要素は表示していないが、当業者なら、このような要素が必要に応じて含まれ得ることを理解するであろう。例えば、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子は、哺乳動物細胞では、発現のためのシグナル伝達ペプチドが先行し得る、または大腸菌中では、発現のためのシグナルペプチドもしくはメチオニン残基が先行し得る。
【００５６】
図１に示すように、半減期延長ポリペプチド部分をコードする遺伝子は、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子に対し、Ｃ末端に（図１ｂ）、Ｎ末端に（図１ｃ）またはＮ末端およびＣ末端の両方に（図１ｄ）配置され得る。あるいは、半減期延長ポリペプチド部分をコードする配列は、生物学的に活性なポリペプチドをコードする遺伝子の境界内に配置され得る（インライン位置決め）。このような実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分をコードする配列は、挿入が生物学的に活性なポリペプチドの三次または折り畳み構造を破壊しない限り、複数の部位、例えば、図１ｆに示す３つの位置に、またはさらに多くの所望の部位に、任意選択で存在し得る。１つまたは複数の半減期延長部分のインライン位置決めは、Ｎ末端および／またはＣ末端融合と組み合わせ得る。
【００５７】
半減期延長ポリペプチド部分の融合パートナーを構成する生物学的に活性なポリペプチドは、生物学的機能が生物学的に活性なポリペプチドの特定の全身的濃度を必要とする、いずれかの状態または障害の治療または予防での使用に好適し得る、任意の生物学的に活性なポリペプチド、または生物学的に活性なポリペプチドの組み合わせであり得る。
【００５８】
通常、生物学的に活性なポリペプチドは、生物製剤とも呼ばれるバイオ医薬品である。好適な生物学的に活性なポリペプチドの例には、ペプチドホルモン、成長因子、サイトカイン、酵素、補助因子、リガンド、結合剤（天然および人口の結合剤を含む）、ならびに抗体および抗体フラグメントが挙げられる。本発明の実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドは、受容体アゴニストであり得る。他の実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドは、受容体アンタゴニストであり得る。
【００５９】
生物学的に活性なポリペプチドそれ自体は、天然ポリペプチドであってもよく、または非天然ポリペプチドであってもよい。しかし、半減期延長ポリペプチド部分に融合されると、得られた融合タンパク質は常に、非天然物質である。生物学的に活性なポリペプチドは、融合タンパク質が天然のＢＳＳＬタンパク質に相当するようなヒトＢＳＳＬの一部ではない。天然のまたは非天然のポリペプチドを含む融合タンパク質は、組換えで産生され得るか、または例えば、下記の実施例で示すように化学的に合成され得る。
【００６０】
図２は、本発明の実施形態による融合タンパク質（下記実施例のＰＳＩ０５４０、配列番号３８で表される融合タンパク質）を示し、生物学的に活性なポリペプチドは、この実施例ではＩＬ−１Ｒａである、球状の折り畳みドメイン、および生物学的に活性なポリペプチドのＣ末端の位置で尾部を形成する半減期延長ポリペプチド部分により表され、この実施例の半減期延長ポリペプチドは、配列番号５７による１７反復ユニットにより表される。生物学的に活性なポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドのＣ末端を半減期延長ポリペプチドのＮ末端に結合するペプチドリンカー、ここでは［Ｇ４Ｓ］３を介して、そのＣ末端部で半減期延長ポリペプチドに結合され、従って尾部の近位部分を形成する。
【００６１】
しかし、上記で図１に関連して説明したように、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドのＣ末端に配置されるとは限らない。本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドのＮ末端（図１ｃ）に配置され得るか、または半減期延長部分はＮ末端およびＣ末端にそれぞれ配置され得る（図１ｄ）。他の実施形態では、１つまたは複数の半減期延長ポリペプチドが、生物学的に活性なポリペプチド内の位置（図１ｅ）に、例えば、生物学的に活性なポリペプチドの表面露出ループ中の位置に、挿入され得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドの特異的配列セグメントを置換し得る。例えば、インサートとして配置される場合、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチド上の表面露出ループの一部を置換し得る。あるいは、半減期延長ポリペプチドは、生物学的に活性なポリペプチドのＮ末端またはＣ末端ドメイン、または内部ドメインなどの全体ドメインを置換し得る。
【００６３】
さらに他の実施形態では、インライン挿入半減期延長ポリペプチド部分は、Ｎ末端部分、Ｃ末端部分、またはＮ末端およびＣ末端両方の半減期延長ポリペプチド部分の内のいずれかと組み合わせ得る（図１ｆ）。特に、異なる位置に配置された、複数の半減期延長部分を含む本発明の実施形態では、それぞれのこのような半減期延長部分は本明細書に記載のように独立に定義され得る。別義が示されない限り、それぞれのこのような半減期延長部分は、配列番号１によるアミノ酸配列の４〜８０ユニットを含み得る。
【００６４】
最後に、本発明は、融合パートナーとして、単一の生物学的に活性なポリペプチドの使用に限定されず、むしろ、図１ｇに示されるように、いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、リンカーにより、および／または図１ｇの例におけるように、半減期延長ポリペプチドにより、分離された複数の生物学的に活性なポリペプチドを含み得ることが想定されている。代わりにまたは追加して、１つまたは複数の半減期延長ポリペプチド部分または複数部分は、融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端の位置にも配置され得る。
【００６５】
複数の生物学的に活性なポリペプチドの場合には、これらは、同一でも異なっていてもよい。例えば、融合タンパク質は、任意選択で、リンカーまたはスペーサー配列および／または半減期延長ポリペプチド部分により分離された、２つの異なる生物学的に活性なポリペプチドを含み得る。あるいは、融合タンパク質は、３つの異なる生物学的に活性なポリペプチドを含み得る。複数の生物学的に活性なポリペプチドを含む融合タンパク質の実施形態では、これらの１つは、成長因子、サイトカイン、酵素およびリガンドからなる群から選択されてよく、および残りの生物学的に活性なポリペプチドは、抗体または抗体フラグメントから選択されてよい。一例として、半減期延長ポリペプチド部分は、異なる抗原結合領域の間のリンカーとして配置され得る。
【００６６】
本発明では、生物学的に活性なポリペプチドとの融合のために使用される半減期延長ポリペプチド部分は、２〜８０反復ユニットを含むアミノ酸配列を含み、それぞれのユニットは、配列番号１：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｄ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号１）
により定義されるアミノ酸配列の群から独立に選択され、式中、独立に、
Ｘ１はＰであるか、または存在せず；
Ｘ２はＶであるか、または存在せず；
Ｘ３はＰまたはＴであり；
Ｘ４はＰまたはＴであり；
Ｘ５はＴまたはＶであり；
Ｘ６はＤ、ＧまたはＴであり；
Ｘ８はＡ、ＱまたはＳであり；
Ｘ９はＥ、ＧまたはＫであり；
Ｘ１０はＡ、Ｅ、ＰまたはＴであり；
Ｘ１１はＡ、ＰまたはＴ、である。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ユニット」は、例えば、配列番号２〜１１によるいずれかの配列を含む、上記で定義の配列番号１による一般式のアミノ酸配列の発生を意味する。半減期延長ポリペプチドは、このような２〜８０ユニットを含み、これは、上述の定義の範囲内で、同一でも異なっていてもよい。半減期延長ポリペプチドのユニットはまた、「反復ユニット」とも呼ばれ得るが、個々のユニット間である程度のアミノ酸配列の変化が存在し、従って、「反復ユニット」は、１つの、同じ配列の反復のみとして理解されるべきではない。言い方を変えれば、半減期延長ポリペプチド部分は、２〜８０ユニットを含み、各ユニットは、配列番号１の定義内に入る個々の配列からなる群より独立に選択されるアミノ酸配列である。
【００６８】
半減期延長ポリペプチド部分は、少なくとも１８個のアミノ酸（配列番号１の両方とも９マー型である２ユニットに相当）、および通常、８８０個までのアミノ酸（配列番号１の全て１１マー型である８０ユニットに相当）のコンティグ配列を含み得る。反復ユニットは、相互に隣接し得るが、反復ユニットは、短いスペーシング配列（ｓｐａｃｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により分離することも可能である。例えば、２反復ユニットは、配列番号１に一致しない最大１０アミノ酸残基により分離され得、例えば、短いスペーシング配列が式（Ｇ４Ｓ）２のペプチドリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、スペーシング配列が最大５アミノ酸残基であり得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のアミノ酸残基が、例えば、Ｎ−グリコシル化部位などの所望の機能を付与するために、または別のタイプの修飾のための部位を提供するために、例えば、単一Ｃｙｓ残基を用いて、２つの反復ユニット間に配置され得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のＧ４Ｓリンカーなどのリンカーを隣接する反復ユニット間のスペーシング配列として用い得る。従って、この可能性を考慮すると、最大８０反復ユニットを含むコンティグ配列は、８８０アミノ酸、例えば、最大９００アミノ酸または最大１０００アミノ酸より長くなる場合もある。
【００６９】
半減期延長ポリペプチド部分の反復ユニットは、配列番号１により定義され、これは、ＢＳＳＬ  Ｃ末端ドメインのヒトバリアントの反復ユニットをベースにしており、また、位置Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６、Ｘ８、Ｘ９、Ｘ１０およびＸ１１のアミノ酸残基のいくつかの変化を可能とする。その一方で、位置Ｘ１、Ｘ２およびＸ７の残基は固定されるが、位置Ｘ１およびＸ２は存在しなくてもよい。いくつかの実施形態では、Ｘ１およびＸ２の両方が存在せず、このような実施形態では、反復ユニットは９アミノ酸のみからなる。
【００７０】
２〜８０ユニット（反復ユニット）を含む半減期延長ポリペプチド部分は通常、いくつかの配列番号１により通常定義されるアミノ酸配列モチーフの、配列番号１による少なくとも２つの異なるバリアントなどのバリアントを含む。例えば、半減期延長ポリペプチド部分が少なくとも４ユニットを含む、本発明の実施形態では、それは、配列番号３、配列番号４および配列番号５のそれぞれの少なくとも１つのユニットを含み得る。半減期延長ポリペプチド部分が少なくとも２ユニットを含む、本発明の実施形態では、これらは、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群より独立に選択され得る。好都合にも、半減期延長ポリペプチド部分は、任意選択で、配列番号２により先行されて、配列番号３〜５をこの順に含み得る。配列番号２によるユニットは、特に、半減期延長ポリペプチド部分のＮ末端に配置され得、半減期延長ポリペプチド部分の第１のユニットとなる。反復ユニットの他の特異的変化（例えば、配列番号３〜１１によるユニット）は、繰り返して出現し得るが、配列番号２は、存在する場合、通常、半減期延長ポリペプチド部分の第１の反復ユニットとして、１回のみ出現する。
【００７１】
半減期延長ポリペプチド部分の構造は通常、不定形である。例えば、本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチドは、円偏光二色性またはＦＴＩＲ（フーリエ変換赤外分光法）で測定して、融合タンパク質のαヘリックスおよび／またはβシート含量に寄与しない。
【００７２】
本発明の実施形態では、配列番号１により規定される反復ユニットは、ヒト起源であり、好ましくは、半減期延長ポリペプチド部分の全ての反復ユニットは、ヒトＢＳＳＬのＣ末端ドメインの天然の反復ユニットのバリアントに相当する。このような反復ユニットは、配列番号２〜１１で表される（実施例中の表２も参照）。本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分の全ての反復ユニットは、配列番号２〜１１、例えば、配列番号３〜１１からなる群より選択される。すなわち、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号２〜１１、例えば、配列番号３〜１１からなる群よりそれぞれ独立に選択される２〜８０ユニットを含み得る。先行技術で使用されたように、ポリペプチドベースであるか、その他であるかにかかわらず、非ヒトまたは部分的ヒト起源の反復ユニットを有する半減期延長部分に比べて、ヒト対象でのより低い免疫原性の一因となることが予測されるので、ヒト起源の配列の使用は有利であり得る。下記の実施例１４でより詳細に記載のように、代表的なヒト起源の半減期延長ポリペプチド由来のどのペプチドも、ヒト健康ドナー由来の抗原提示細胞上に提示されなかった。これは、配列番号２〜１１から選択される反復ユニットからなる半減期延長ポリペプチド部分は、ヒトにおける低い免疫原性の可能性を有することを示す。
【００７３】
さらに、本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、天然のヒト配列の反復ユニットに相当する反復ユニットの配列を含む、またはそれからなる。このような天然のヒト配列の反復ユニットの例は、配列番号１２〜２１および５７〜６６に提供されている。通常、このような配列は、第１の５反復ユニットとして、この順に：［配列番号２］−［配列番号３］−［配列番号４］−［配列番号５］−［配列番号５］を含む、あるいは、第１の４反復ユニットとして、この順に：［配列番号３］−［配列番号４］−［配列番号５］−［配列番号５］を含む。
【００７４】
従って、本発明の実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号１２〜２１または５７〜６６中のいずれか１つによるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号１２〜２１または５７〜６６のいずれか１つの反復からなる。例えば、半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号１２〜２１または５７〜６６のいずれか１つ、例えば、配列番号５７によるアミノ酸配列の、３つの連続反復、またはコピーからなり得る。配列番号５７は、配列番号１による１７ユニットのアミノ酸配列を含み、従って、配列番号１の３コピーの反復は、少なくとも５１ユニットを含む。しかし、半減期延長ポリペプチド部分の反復ユニットは、配列番号１による全てのユニットから独立して選択することができ、本発明は従って、反復されるユニットの特定の配列に限定されないことに留意されたい。したがって、例えば、５１ユニットの半減期延長ポリペプチド部分は、３コピーの１７ユニット配列から形成されるとは限らず、配列番号１によるユニットの任意の組み合わせ、特に、配列番号２〜１１から選択される反復ユニットの任意の組み合わせから形成され得る。
【００７５】
いくつかの実施形態では、少なくとも３４ユニットを有する半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号１００〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなり得る。例えば、３４ユニットの半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号１００または配列番号１０１による配列からなり得；５１ユニットの半減期延長ポリペプチドは、配列番号１０２または配列番号１０３による配列からなり得；および６８ユニットの半減期延長ポリペプチド部分は、配列番号１０４または配列番号１０５による配列からなり得る。
【００７６】
上記で定義の各反復ユニットは、１つの可能なＯ−グリコシル化部位を保持することが見出された。すなわち、グリコシル化を可能とする哺乳動物環境中での発現時に、各反復ユニットは、最大で１つの所定の位置、通常は、トレオニン（Ｔ、Ｔｈｒ）残基の位置でグリコシル化され得る。配列番号２〜１１の反復ユニットに関しては、Ｏ−グリコシル化の可能な位置は、表２に示されている（実施例１参照）。グリカンの数に上限値が存在し得、これは、ユニットの総数より小さい。すなわち、通常、半減期延長ポリペプチド部分のユニットの全てより少ない数がグリコシル化される。例えば、１７ユニットの配列（例えば、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１９）から、通常、１０ユニットのみがグリコシル化される。従って、いくつかの実施形態では、ユニットの大部分はグリコシル化されるが、一方、少量のユニットがグリコシル化され得ない。さらに、グリコシル化の程度（例えば、非グリコシル化ユニットに対するグリコシル化ユニットの比率、など）は、既知の手段により、例えば、発現系を適切に選択することにより、および／または産生細胞の培養または発現状態を制御することにより、調節可能である。
【００７７】
前述のように、本発明による半減期延長ポリペプチド部分を含む融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチド単独に比べて、増大した生物学的半減期から利益が得られる。増大した生物学的半減期は、主に、生物学的に活性なポリペプチド単独に対して、融合タンパク質の増大したサイズに起因する。本発明による融合タンパク質のサイズは、腎臓による循環からの排出（腎クリアランス）を低減するのに十分に大きい。
【００７８】
糸球体の膜の大部分細孔の半径は、４．５〜５ｎｍである。膜は負に帯電しており、従って、負に帯電しているタンパク質は腎臓により排出される傾向が少ない。例えば、負に帯電している分子は、２．５ｎｍの流体力学半径で既に、腎クリアランスから顕著に保護され得るが、一方で、中性の分子は、腎クリアランスから類似の保護を得るために、３．５ｎｍのサイズが必要である（Ｈａｒａｌｄｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ８８（２）４５１−４８７）。非荷電球状タンパク質に対しては、腎クリアランスのサイズ限界（これより小さいとタンパク質が分泌される）は、分子量約６０ｋＤａである。
【００７９】
例えば、多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）により測定して、実際のタンパク質の分子量は、アミノ酸組成、および任意のグリカン結合に基づく理論分子量と一致する。その一方で、タンパク質の溶液中の見かけのサイズ（または見掛けの分子量）は、例えば、下記の実施例４に記載されているように、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定して、球状タンパク質の実際の分子量に相当するタンパク質の見掛けの分子量、または見かけのサイズが得られる。球状構造を持たないタンパク質およびペプチドに対しては、実際の分子量は、溶液の見掛けの分子量、または見かけのサイズとは異なり得る。
【００８０】
通常、非球状タンパク質またはポリペプチドは、その実際の分子量よりも大きい溶液中の見かけのサイズを示し得る。通常、不定形のアンフォールド構造を有する、本発明の半減期延長ポリペプチド部分の場合には、発明者らは、ＳＥＣにより測定して、実際の分子量が約１ｋＤａに過ぎない場合であっても、各反復ユニットは約９ｋＤａを示すことを見出した（図３ａ、以降でさらに詳細に記載する）。従って、溶液中での融合タンパク質の見かけのサイズは、本発明の実施形態による融合タンパク質で得られる各ユニットに対して、約９ｋＤだけ増加され得る。
【００８１】
全体として、融合タンパク質は、ＳＥＣにより測定して、生物学的に活性なポリペプチド単独のサイズより、少なくとも１．５、少なくとも１．８、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、または少なくとも５０、および最大で１０、最大で２０、最大で４０、最大で６０、最大で８０、最大で１００、最大で２００、最大で２５０、最大で２７０倍、およびさらには最大で、３００倍大きい、溶液中の見かけのサイズを有し得る。増大因子は、本来、当該の生物学的に活性なポリペプチドのサイズに依存するであろう。しかし、６ｋＤａ〜６０ｋＤａの範囲の見かけのサイズの生物学的に活性なポリペプチドに対して、融合タンパク質は、少なくとも１．５倍、および最大で約２５０倍だけ大きい見かけのサイズを有し得る。より小さい、例えば、約３ｋＤａの生物学的に活性なペプチドに対して、それでも、２５０倍を超えないサイズの増加、例えば、約２４０倍のサイズの増加を目標にするのが好ましいであろう。
【００８２】
半減期延長ポリペプチド部分および融合タンパク質のサイズはそれぞれ、流体力学半径によっても決定され得、ストークス半径とも呼ばれ、ナノメートル（ｎｍ）で測定される。溶液中の見かけのサイズおよび流体力学半径の両方は、例えば、下記の実施例４に記載されているように、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により測定される。
【００８３】
溶液中の見かけのサイズに関して上記で述べたことと一致して、融合タンパク質の流体力学半径は通常、腎クリアランスを回避するのに十分な大きさである。比較のために、腎クリアランスの限界を超えるサイズを有するヒト血清アルブミンは、３．８ｎｍの流体力学半径を有する。融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチド単独の流体力学半径の少なくとも１．２５倍の大きさ、または少なくとも１．５倍の大きさである流体力学半径を有し得る。例えば、融合タンパク質の流体力学半径は、生物学的に活性なポリペプチド単独の流体力学半径の、少なくとも２、３、５、１０、２０または５０倍の増加を示し得る。融合タンパク質の流体力学半径は、生物学的に活性なポリペプチドの流体力学半径より、最大で８、最大で１０、最大で１２、または最大で３０、またはさらに最大で１００倍増大し得る。半減期延長ポリペプチド部分の各反復ユニットは、一般に、０．１１ｎｍの流体力学半径の増加に寄与することが明らかになった。
【００８４】
半減期延長ポリペプチド部分中の反復ユニットの数に加えて、融合タンパク質内のポリペプチド部分の位置もサイズ増大に影響し得る。例えば、半減期延長ポリペプチド部分のＮ末端またはＣ末端の位置は、生物学的に活性なポリペプチド（例えば、表面ループを形成する）のアミノ酸配列内のインサートとして配置された半減期延長部分に比べて、より大きな流体力学半径を与えることが予測される。
【００８５】
さらに、半減期延長部分のアンフォールド構造は、そのままで大きな流体力学半径を与えるのみではなく、反復ユニットの多くのアミノ酸の親水性特性のために、水分子の半減期延長ポリペプチド部分へ結合して、流体力学半径をさらに増大させることにより、サイズ増大にも寄与し得る。
【００８６】
最後に、下記の実施例４で示すように、いくつかの反復ユニットのグリコシル化が、より大きなサイズにさらに寄与し得る。１７反復ユニットの半減期延長ポリペプチド部分が、グリコシル化のない反復ユニットの同じ配列に比べて、さらに、６０〜７０ｋＤａの見かけのサイズを示すことを見出した。
【００８７】
図３は、本発明の種々の実施形態による反復ユニットの数と、溶液中の見かけのサイズとの間の関係を示す。本明細書の以降の実施例中に記載されるこれらの実施形態では、生物学的に活性なポリペプチドが種々の長さの半減期延長ポリペプチド部分に融合された（異なる数のユニット：それぞれ、１７、３４、および５１）。発明者らは、溶液中のサイズと、反復ユニットの数との間の相関は、調査した領域では、直線であることを見出した。１つのユニットの溶液中のサイズは、９ｋＤａの分子量を有する球状タンパク質に相当することも明らかになった。従って、一定数のユニットの付加により達成されるサイズ増大を予測できる。例えば、８０反復ユニットを有するポリペプチド部分は、約７２０ｋＤａの分子量の球状タンパク質に相当する溶液中の見かけのサイズを有する。さらに、融合タンパク質の終末相半減期が溶液中の見かけのサイズに対してプロットされている図５ａ〜ｃに示すように、直線関係はまた、融合タンパク質の薬物動態学的特性に変換されることが明らかになった（実施例８参照）。これらの洞察は、ポリペプチド部分が、所望のインビボ半減期を与えるようにデザインされた、本明細書に記載の半減期延長ポリペプチド部分と融合することにより、生物製剤の薬物動態学的特性、特に半減期および平均滞留時間の微調整に使用することができる。各生物学的に活性なポリペプチドに対して、反復ユニットの数に換算した半減期延長ポリペプチドのサイズを、生物学的に活性なポリペプチドそのままのサイズおよび半減期、投与経路、投与量および所望の投与間隔に関して選択し得る；それにもかかわらず、サイズ（図５ａ、５ｂ）と、ユニットの数（図５ｃ）との間の直線関係は、目的の特定の融合タンパク質のための所望の半減期延長ポリペプチドの合理的なデザインを可能にする。
【００８８】
特に、腎クリアランスに対するサイズ限界（非荷電球状タンパク質で約６０ｋＤａ）を超えても、融合タンパク質の溶液中の見かけのサイズの増加は、依然として、生物学的半減期の増加に寄与するという点で、有用であり得る（実施例８参照）。しかし、そのままで既に６０ｋＤａの溶液中の見かけのサイズを有する生物学的に活性なポリペプチドに対しては、融合タンパク質が生物学的に活性なポリペプチド単独のサイズの少なくとも２倍の見かけのサイズを有するように、見かけのサイズを少なくとも２倍だけ増加することが望ましい場合があり得る。
【００８９】
市場承認治療薬に対しては、正確な特性評価が必要な規制要件であり、グリコシル化タンパク質に対しては、任意のグリカンの正確な位置を知る必要がある。本発明の半減期延長ポリペプチド部分の各ユニットが、最大で１つのＯ−グリコシル化部位を有するという事実は、哺乳動物系中で発現した融合タンパク質の特性評価を容易にし得る。
【００９０】
本発明による半減期延長ポリペプチドの特性評価のために好適するプロテアーゼは、酸性の残基：グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）およびアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）の後ろで切断するペプシンである。しかし、ペプシンは通常、グリカンのプロテアーゼとの立体障害のために、グリコシル化された残基の近位で切断しないので、Ｏ−グリコシル化を有する反復ユニットは、非グリコシル化されたユニットと比べて、異なる切断パターンを有することになる。この知識に基づいて、また、限られたおよび比較的予測可能なグリコシル化パターンを考慮して、クロマトグラフ法および質量分析法などの確立された方法を用いた、存在する融合タンパク質の特性評価は、大量にまたは未知の程度にグリコシル化される可能性のある半減期延長部分に比べて、大きく単純化され、本発明の融合タンパク質の哺乳動物系中での発現をさらに現実的に実現可能にする。
【００９１】
半減期延長ポリペプチド部分のグリコシル化の別の潜在的利点は、グリコシル化が融合タンパク質に対する免疫寛容を高める手段を提供し得ることである。α２，６−結合末端シアル酸で終わるＯ−グリカンは、ＣＤ２２またはシグレック−１０に結合でき、これは、シアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（シグレック）ファミリーの２つの抑制性受容体である。これらの受容体は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）からのシグナルを減衰させることにより作用し、これは、融合タンパク質に対するＢ細胞寛容の発生をもたらし得る。ヒトタンパク質のグリカンは、α２，６−およびα２，３−結合末端シアル酸の両方を有する。ヒト起源の細胞中で発現された融合タンパク質中のα２，６−結合末端シアル酸のシアル酸含量を増やすために、目的の融合タンパク質は、α２，６−シアル酸転移酵素と共発現され得る。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞中で産生された融合タンパク質は、α２，６−シアル酸転移酵素発現の非存在のために、α２，３−結合のみを有する。ＣＨＯ細胞中で産生された融合タンパク質のＯ−グリカン中でα２，６−結合末端シアル酸を導入するために、目的の融合タンパク質は、α２，６−シアル酸転移酵素と共発現され得る。
【００９２】
図２に関して上記に示したように、融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチドを、本明細書に記載の１つまたは複数の半減期延長ポリペプチド部分に結合したリンカー、通常はペプチドリンカーを含み得る。従って、本発明の実施形態では、融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチドのアミノ酸配列と、半減期延長ポリペプチド部分のアミノ酸配列との間に配置されたペプチドリンカーをさらに含む。例えば、ペプチドリンカーは、−ＧＳ−および−（Ｇ４Ｓ）ｎ−から選択してよく、ここで、ｎは、１〜５の整数であり、通常、１〜３、または２〜３である。リンカーの使用は、それが、ネオエピトープの発生を低減し得る、またはｎが少なくとも２の場合には、ネオエピトープの形成およびその後のこのようなネオエピトープの免疫系の抗原提示細胞による結合を防ぐという点で好都合であり得る。
【００９３】
本明細書で記載の融合タンパク質は、哺乳動物などの原核生物または真核生物発現系を用いて、当業者に既知の従来の方法を使って、組換え技術により作製できる。下記の実施例２は、半減期延長ポリペプチド部分が生物学的に活性なポリペプチドに融合される、融合タンパク質のクローニングおよび作製について記載する。本発明は、実施例２の株および細胞型の使用に全く限定されるものではなく、むしろ、融合タンパク質の作製のための好適な細胞株は、当業者に既知であり、例には、大腸菌、ピキアパストリス、出芽酵母、藻類、蘚類細胞、ニンジン細胞などの植物細胞、およびＣＨＯ、ＨＥＫ−２９３、およびＨＴ１０８０などの哺乳動物細胞が挙げられることに留意されたい。
【００９４】
半減期延長ポリペプチド部分をコードするＤＮＡ構築物のデザインに関しては、異なる、または全てのコドンバリアントを含むことによる、コードされる各アミノ酸に対する遺伝子コードの重複性を利用する合成遺伝子の使用は有利であり得る。より可変性のＤＮＡ配列の使用は、核酸成分の特性評価を容易にし得る。理由は、高度に反復性の配列の特性解析は、問題がある場合があるためである。
【００９５】
本発明による融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチド単独のサイズに比較して、溶液中で増大した流体力学半径および見かけのサイズを有する。サイズ増大により低減した腎クリアランスの少なくとも一部の結果として、融合タンパク質の薬物動態学的特性が変化する。下記の実施例８〜１０および１５で示されるように、最も顕著には、生物学的半減期が延長される。これらの実施例はまた、半減期延長ポリペプチド部分の半減期延長効果は、その部分の長さ（ユニットの数、特に図５ｃを参照）の関数であることも示す。 
【００９６】
好ましくは、半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期を、少なくとも１つの種、通常ヒトで、少なくとも１．５倍延長する。換言すれば、融合タンパク質は、好ましくは、生物学的に活性なポリペプチド単独の場合の少なくとも１．５倍の生物学的半減期を有する。例えば、融合タンパク質は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期を、少なくとも１．８倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、および最大で５００倍未満、例えば、６０倍、延長し得る。例えば、１時間未満の生物学的半減期を有する生物学的に活性なポリペプチドに対し、生物学的半減期を、最大で５００倍延長し得、一方、１時間以上の生物学的半減期を有する生物学的に活性なポリペプチドに対しては、生物学的半減期が最大で６０倍まで延長される場合、それで十分であり得る。
【００９７】
薬物動態学的観点から、生物学的半減期を可能な限り延長するのが望ましい場合もあり得る。しかし、半減期延長効果は、半減期延長部分のサイズに比例することが示され、非常に大きな半減期延長ポリペプチド部分は、作製の実現性または生物学的に活性なポリペプチドの生物活性の障害などの種々の理由から望ましくなく、所与の生物学的に活性なポリペプチドの半減期延長は、その他の要件に対してバランスを取る必要性があり得、従って、最適条件半減期延長は、本発明により達成され得る理論的最大半減期延長より少ない場合があり得る。例えば、わずか３つ以下のそれぞれ８０ユニット半減期延長ポリペプチド部分（すなわち、３つの部分に分配される合計２４０ユニット）またはわずか２つ以下のそれぞれ８０ユニットの半減期延長ポリペプチド部分（すなわち、２つの部分に分配される合計１６０ユニット）を使用するのが望ましい場合がある。別の想定できる半減期延長ポリペプチド部分に対する上限値は、それぞれ６８ユニットの２つの部分（例えば、１つはＮ末端に、残りはＣ末端に）であり得る。
【００９８】
さらに、半減期延長ポリペプチド部分は、融合タンパク質に対し増大した溶解度を与え得る。特に、半減期延長ポリペプチド部分の親水性は、それが、生物学的に活性なポリペプチド単独のバイオアベイラビリティに比べて、皮下に投与される融合タンパク質のバイオアベイラビリティを高め得るという点で有益であり得る。このような場合には、融合タンパク質の増大した溶解度により、注射後、組織細胞外マトリックス中に残るのではなく、血流への移行が促進され得る。これは、こうならない場合には、限られたバイオアベイラビリティのために、静脈内投与が必要であるいくつかの生物学的に活性なポリペプチドにとって、生物学的に活性なポリペプチドが本明細書に記載の半減期延長ポリペプチド部分に融合される場合に、皮下投与が現実的な選択肢となり得ることを意味し得る。
【００９９】
従って、本発明で使用される半減期延長ポリペプチド部分は、生物学的に活性なポリペプチドの生物学的半減期の延長の手段としておよびこれ以外の薬物動態学的特性を適応させる手段として使用され得る。
【０１００】
本発明の融合タンパク質は、状態、障害または疾患の治療および／または予防に使用するための医薬組成物として処方され得る。本明細書で使用される場合、用語の「組成物」は、固体および液体形態を包含すると理解されたい。組成物は、好ましくは、患者（例えば、哺乳動物）への、例えば、注射または経口による投与に好適する医薬組成物であり得る。医薬組成物は通常、本発明による融合タンパク質および少なくとも１種の薬学的に許容可能な担体または置換基を含む。医薬組成物は、例えば、塩、ｐＨ調節剤、油、保存剤、浸透圧的に活性な薬剤のいずれか１種、およびこれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０１０１】
医薬組成物は、静脈内、皮下、経鼻、経口、および局所投与を含む任意の投与経路用として処方され得る。例えば、組成物は、静脈内または皮下投与用として処方し得る。
【０１０２】
治療される状態、障害または疾患は、半減期延長ポリペプチドにより制限されるものではなく、むしろ、特定の状態、障害または疾患の治療用の融合タンパク質の適合性は、既存のバイオ医薬品であってもよい生物学的に活性なポリペプチドによってのみ決定され得る。本明細書で記載の半減期延長ポリペプチド部分との融合から恩恵を受け得る好適な生物学的に活性なポリペプチドの例には、サイトカイン、酵素、リガンド、結合剤、および抗体フラグメントが挙げられる。
【０１０３】
本発明の融合タンパク質は、状態、障害または疾患の治療方法で使用され得、該方法は、前記状態、障害または疾患を罹患している患者に、前記状態、障害または疾患の治療に有用な、本明細書に記載の半減期延長ポリペプチド部分に融合された生物学的に活性なポリペプチドを含む融合タンパク質を投与するステップを含む。患者は通常、ヒトなどの哺乳動物である。この方法では、生物学的に活性なポリペプチド単独の投与を含む治療計画に比べて、より少ない頻度で投与を行い得る。例えば、生物学的に活性なポリペプチドのアナキンラ（Ｍｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａ）を含むＫｉｎｅｒｅｔ（登録商標）は通常、皮下注射により毎日投与される。しかし、ＩＬ−１Ｒａおよび本明細書に記載の半減期延長ポリペプチド部分の融合タンパク質は、生物学的半減期を少なくとも２倍増大させ得、それにより、融合タンパク質は１日おきに投与し得、または少なくとも３倍、または少なくとも７倍増大させ得、それにより、融合タンパク質は週２回またはさらに週１回投与になり得る。成長ホルモンなどのいくつかの生物学的に活性なポリペプチドに対しては、各投与間の期間をさらに延長するのが望ましい場合があり、例えば、月１回の投与が想定される。
【０１０４】
以下の実施例により、本発明をさらに説明する。
【０１０５】
実施例
実施例１：ヒト起源の反復ユニットの特定
米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）の非冗長性タンパク質配列データベースに対し、胆汁酸塩刺激リパーゼ（ＢＳＳＬ）の触媒ドメインでｂｌａｓｔ検索を実施し、１０種の報告されたＣ末端反復不定形ドメインの全体または一部を含むヒト起源のタンパク質のタンパク質配列を特定した。
【０１０６】
材料および方法
ＮＩＨにあるｂｌａｓｔを用いて、ユニプロットＩＤ  Ｐ１９８３５（受入番号  ＣＥＬ＿ＨＵＭＡＮ）の胆汁酸塩刺激リパーゼの触媒ドメインに一致するヒト起源タンパク質を検索した。
【０１０７】
結果
ＢＬＡＳＴ検索により、触媒ドメインの重要な部分およびＣ末端反復不定形ドメインの両方を含む１０エントリー結果を得た。ドメイン中の反復ユニットの数は異なり、反復ユニットの配列間のある程度の変動が確認された。異なるヒットについては、表１を参照されたい。各反復ドメインは、９残基の短縮された配列により開始され、最も多い反復ユニットは１１残基の長さである。下表では、反復ユニットは、分かりやすくするために、「〜」記号により分離されている。不定形ドメインの最終配列ストレッチは、反復ユニットと配列類似性を共有せず、表１で下線処理されている。同封の配列表では、反復部分（すなわち、下線を引いた疎水性のモチーフを除いて）は、配列番号１２〜２１で表されている。
【表１】
2020523987.tif 000003
2020523987.tif 000004
【０１０８】
下表２は、同封配列表中の配列識別番号を基準にして、ヒト起源の反復ユニットのユニーク配列を記載する。第１の配列の非存在残基はダッシュで標識されている。Ｏ−グリコシル化の可能性のある部位は、下線を引いている。
【表２】
2020523987.tif 000005
【０１０９】
従って、ヒト集団中には、種々の長さのＣ末端ドメインが存在する。さらに、反復ユニットの順番は、ヒト集団では変えることができる。これは、反復ユニットの順番および全体ドメインモチーフの長さの変化が許容されることを意味するのであろう。各ユニットは、Ｏ−グリコシル化され得る１つの部位を有する。
【０１１０】
最も多いヒト型は、次の反復ユニット配列の組み合わせから構成される：
［配列番号２］−［配列番号３］−［配列番号４］−［配列番号５］−［配列番号５］−［配列番号５］−［配列番号５］−［配列番号５］−［配列番号５］−［配列番号５］−［配列番号５］−［配列番号６］−［配列番号５］−［配列番号５］−［配列番号７］−［配列番号５］−［配列番号８］−［配列番号９］。
【０１１１】
言い方を変えれば：
［配列番号２］−［配列番号３］−［配列番号４］−［配列番号５］ｘ８−［配列番号６］−［配列番号５］ｘ２−［配列番号７］−［配列番号５］−［配列番号８］−［配列番号９］。
【０１１２】
実施例２：融合タンパク質のクローニングおよび作製
本実施例は、以降の実施例で使用される、異なるフォーマットの融合タンパク質のクローニングおよび作製のための一般的戦略を記載する。
【０１１３】
材料および方法
ＤＮＡ構築物：半減期延長ポリペプチドを含む一連の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列（下表３参照）を、大腸菌中での発現またはヒト（Ｅｘｐｉ２９３）細胞中での発現のために、コドン最適化し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃでのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービスにより合成した。遺伝子は、その後の大腸菌またはＥｘｐｉ２９３細胞中での発現のために、発現ベクター中でクローン化された。
【表３】
2020523987.tif 000006
【０１１４】
培養および精製：組換え融合タンパク質をコードする遺伝子フラグメントを含む発現ベクターで大腸菌細胞を形質転換した後、流加バッチ技術を用いてバイオリアクター中で、または振盪フラスコ中で培養し、続けて、タンパク質発現および遠心分離による細胞の採取を行った。細胞ペレットを−２０℃で貯蔵するか、または浸透圧ショックに直接供し、放出されたタンパク質を遠心分離により清澄化し、−２０℃で貯蔵した。Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、基本的に製造業者のプロトコルに従って、組換え融合タンパク質の発現を同様に実施した。発現ベクターの遺伝子導入の６日後、上清を遠心分離により採取し、−７０℃で貯蔵した。表４にコード化タンパク質配列を示す。
【０１１５】
凍結大腸菌細胞ペレットを再懸濁した後、超音波処理により粉砕し、その後、細胞デブリを遠心分離と、その後の濾過（０．２２μｍ）により除去した。Ｅｘｐｉ２９３培養物由来の浸透圧ショック試料および上清を解凍し、濾過した（０．２２μｍ）後、精製した。組換え融合タンパク質を含む各上清を、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーなどの従来のクロマトグラフィー法を用いて精製した。動物試験に使用するための組換え融合タンパク質も、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号２０３４４）を用いて、エンドトキシン除去精製に供した。精製した融合タンパク質をＰＢＳに緩衝液交換し、別に定める場合を除き、ＰＢＳをその後の実験の処方緩衝液としても使用した。融合タンパク質の純度をクーマシーブルーで染色してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、各タンパク質の分子量を質量分析法（ＨＰＬＣ／ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）により分析した。
【０１１６】
結果
全ての融合タンパク質は、大腸菌またはＥｘｐｉ２９３細胞中で可溶性タンパク質として発現された。図４は、５１および６８反復ユニット含有Ｍｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａの大腸菌中の発現結果を示す。レーンＩ：ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２マーカー，１０ｕｌ。レーンＩＩ：Ｍ−ＩＬ１ＲＡ  ５１反復ユニット、採取細胞、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ／ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ／Ｂｅｎｓｏｎａｓｅ処理、７ｕｌ。レーンＩＩＩ：Ｍ−ＩＬ１ＲＡ  ５１反復ユニット、浸透圧ショック物質、１．５ｕｌ。レーンＩＶ：Ｍ−ＩＬ１ＲＡ  ５１反復ユニット、浸透圧ショック物質、３ｕｌ。レーンＶ：Ｍ−ＩＬ１ＲＡ  ６８反復ユニット、採取細胞、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ／ｒＬｙｓｏｚｙｍｅ／Ｂｅｎｓｏｎａｓｅ処理、７ｕｌ。レーンＶＩ：Ｍ−Ｉｌ１ＲＡ  ６８反復ユニット、浸透圧ショック物質、１．５ｕｌ。レーンＶＩＩ：Ｍ−ＩＬ１ＲＡ  ６８反復ユニット、浸透圧ショック物質、３ｕｌ。融合タンパク質の位置は、２つの短い線で標識されている。
【０１１７】
精製により、高純度のタンパク質調製物を生じ、これは、クーマシーブルーで染色してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。各融合タンパク質の正確な素性および分子量を質量分析により確認した。
【表４】
2020523987.tif 000007
【０１１８】
結論
合成遺伝子を構築し、続けて大腸菌または哺乳動物系中で発現させ、従来技術を使用して高純度に精製することにより、種々の長さの半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質を作製できる。
【０１１９】
実施例３：融合タンパク質の化学合成
この実施例は、以降の実施例でさらに使用される、化学合成による異なるフォーマットのポリペプチドを作製するための一般的戦略を説明する。
【０１２０】
材料および方法
化学合成バージョンのＧＬＰ−１（７−３７）（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ，ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｈ５１０２）、ＧＬＰ−２（１−３３）（Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ，ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｎｕｍｂｅｒ  Ｈ−７７４２）、ＧＬＰ−１（７−３７）−半減期延長ポリペプチド（各１１残基の２ユニット）、ＧＬＰ−２（１−３３）−半減期延長ポリペプチド（１ユニット）、ＧＬＰ−２（１−３３）−半減期延長ポリペプチド（２ユニット）をＢＡＣＨＥＭ  ＡＧに注文した。凍結乾燥タンパク質を２５ｍＭのＮａＰおよび１２５ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液中に１０ｍｇ／ｍＬの目標濃度で溶解した。Ｃ５結合化合物ＰＳＩ０４００およびそのペグ化バージョンＰＳＩ０４８９もＢＡＣＨＥＭ  ＡＧに注文し、ＰＳＩ０４８９を上述の緩衝液に３５ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解し、ＰＳＩ０４００を２９ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。タンパク質の詳細は、表５にまとめられている。
【表５】
2020523987.tif 000008
【０１２１】
化学的に合成したタンパク質の完全性および素性を質量分析法（ＨＰＬＣ／ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）を用いて確認した。
【０１２２】
結果
半減期延長ポリペプチドを含む化学的に合成したタンパク質は、全ての所望の濃度で溶解可能であり、一方、ＧＬＰ−１は、１０ｍｇ／ｍＬで少々の沈殿を示し、ＧＬＰ−２は、半分の濃度の５ｍｇ／ｍＬのみで溶解可能であった。これは、半減期延長ポリペプチド反復ユニットの親水性および反復ユニットの配列をそれらに融合することによりタンパク質溶解度を増大させることの有用性を示した。ＰＳＩ０４００およびＰＳＩ０４８９は、両方とも、２０ｍｇ／ｍｌを超える濃度で容易に溶解し得た。各バリアントの正確な素性および分子量を質量分析により確認した。
【０１２３】
結論
ペプチドおよび半減期延長ポリペプチドの融合は、化学合成により行うことができる。半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質は、より高い濃度の溶液を生成可能であることにより明白なように増大した溶解度を示す。
【０１２４】
実施例４：融合タンパク質の生物物理学的特性評価
この実施例は、溶液中の見かけのサイズおよび分子量などの生物物理学的特性およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ならびにカラム較正および多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）による溶液中の流体力学半径の測定に関して、非融合タンパク質またはペプチドならびにペグ化タンパク質を基準として用いて、半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質の特性評価について記載する。
【０１２５】
材料および方法
融合タンパク質、非融合タンパク質およびペグ化タンパク質の溶液中のサイズを、ＡＫＴＡ  Ｍｉｃｒｏ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、較正カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ３．２／３００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、分析用ゲル濾過により評価した。カラムを、６〜６６９ｋＤａのサイズ範囲の８つの球状タンパク質およびブルーデキストラン２０００を含む、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＬＭＷ（コード番号２８−４０３８−４１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＬＭＷ（コード番号２８−４０３８−４２、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、２５ｍＭのＮａＰおよび１２５ｍＭのＮａＣｌのランニングバッファーｐＨ７．０を用いて、７５μｌ／分の流量、２５℃の温度で較正した。溶液中の対応するサイズおよび流体力学半径は、較正カラム上のタンパク質の溶出体積から、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（注文番号１８−１０２２−１８、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の補足資料１０に記載の方法により、計算できる。
【０１２６】
目的のタンパク質を較正中と同じ条件下で分析した。タンパク質の分子量は、ＡｄｖａｎｃｅＢｉｏ  ＳＥＣ  ３００Ａ  ２．７ｕｍ  ７．８ｘ３００ｍｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ部品番号：ＰＬ１１８０−５３０１、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  １１００  ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に連結されたＭＡＬＳ−ＲＩシステム：静的光散乱検出器ＤＡＷＮ  ＨＥＬＥＯＳ  ８＋および示差屈折計Ｏｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ、およびＡｓｔｒａ  ６ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により決定した。カラム温度は３０℃で、ランニングバッファーは、ＰＢＳ  ｐＨ７．０で流量０．７ｍＬ／分であった。
【０１２７】
結果
表６、７および８は、ＩＬ−１Ｒａ融合体、アフィボディ（登録商標）分子融合体、およびＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２ペプチドの結果をそれぞれ示す。
【表６】
2020523987.tif 000009
【表７】
2020523987.tif 000010
【表８】
2020523987.tif 000011
【０１２８】
さらに、図３ａおよび図３ｂは、異なる分子の、サイズと、半減期延長部分中のユニットの数との間の関係を示し：ダイヤモンドは、Ｍｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａ（値「０」は、半減期延長ポリペプチド部分の非存在を表す）および単一のＩＬ−１Ｒａと半減期延長ポリペプチド部分の融合体の半径を示し、正方形は、ＰＳＩ０４００およびそれと半減期延長ポリペプチド部分との融合体の半径を示し、三角形は、ＧＬＰ−１およびそれと半減期延長ポリペプチド部分との融合体の半径を示し、およびｘ印は、ＧＬＰ−２およびそれと半減期延長ポリペプチド部分との融合体の半径を示す。
【０１２９】
図３ａは、見掛けの分子量、すなわち、半減期延長ポリペプチド部分のユニットの数の関数として、溶出体積（ＳＥＣ）により決定された溶液中の見かけのサイズ（グラフ中では単に「ＭＷ」と表記）を示す。図３ｂは、図３ａと同じ試料の半減期延長ポリペプチド部分のユニットの数の関数として、流体力学半径を示す。
【０１３０】
結論
溶液中の半減期延長ポリペプチド融合の長さとサイズの相関を観察した：１１残基のそれぞれのユニットは、平均１ｋＤａの実際の分子量を有し、そのアンフォールド特性のために、溶液中のＭＷ  ９ｋＤａの球状タンパク質のサイズに相当する。
【０１３１】
補足すると、アルブミンの流体力学半径またはストークス半径は、３．８ｎｍであり、これは、アルブミンがそのままで腎クリアランスの限界サイズを超えるという事実を考慮すると、腎クリアランスを回避するために必要な最小限のサイズのマーカーとして機能し得る。
【０１３２】
同じアミノ酸配列を有する非グリコシル化ＰＳＩ０５４０：ＢＢ１５９５と比較して、グリコシル化されたＰＳＩ０５４０：ＢＢ１５９６の増大したサイズにより明らかなように、融合タンパク質が哺乳動物系で受けるグリコシル化は、融合タンパク質のサイズをさらに増大させる。
【０１３３】
実施例５：細胞ベースアッセイを用いたインビトロ薬理活性分析。
正常なヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）は、ＩＬ−６の産生によりＩＬ−１βに応答し、これは、インビトロでの阻害調査に活用できる特徴である。この実験では、ＩＬ−１Ｒａと半減期延長ポリペプチドとの組換え融合タンパク質のＩＬ−１βの阻止能力をＮＨＤＦアッセイにより試験した。
【０１３４】
材料および方法
細胞を３日間播種後、タンパク質で処理した。タンパク質（本発明の実施形態による組換えＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質、ペグ化Ｍｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａまたはアナキンラ／Ｍｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａ）を１００ｎＭの開始濃度に希釈し、その後、１：４の系列希釈を９回行い、９ｕＭの組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の存在下の無血清増殖培地中で１００ｎＭ〜０．３８ｐＭの濃度範囲を得た。半減期延長ポリペプチドを有する組換えＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質およびＭｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａを、３．４ｐＭの誘導投与量のＩＬ−１βの存在下で試験し、細胞を３７℃でタンパク質と共に２２時間インキュベートし、その後、培地を回収した。回収した培地を４１倍に希釈した後、ＩＬ−６含量をヒトＩＬ−６  ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、製造業者の推奨条件に従って分析した。データを、ＸＬｆｉｔを用いて分析し、ＩＣ５０値を濃度反応曲線から計算した。
【０１３５】
結果
ＮＨＤＦ細胞からのＩＬ−１β誘導ＩＬ−６放出は、ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質、ペグ化Ｍｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａにより、ならびにアナキンラ／Ｍｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａにより濃度依存的に低減した。実験により得られたデータを表９に示す。
【表９】
2020523987.tif 000012
【０１３６】
結果は、ＩＬ−１βによる誘導されたサイトカイン分泌応答は、半減期延長ポリペプチドを有する組換えＩＬ−１Ｒａ融合体のアンタゴニスト効果により濃度依存的に低減し、ＮＨＤＦからの低減したＩＬ−６放出をもたらすことを示した。
【０１３７】
結論
半減期延長ポリペプチドへの融合は、ＩＬ−１Ｒａの活性をサイズ依存的に低減させたが、生物学的機能を消滅させることはなかった。
【０１３８】
実施例６：Ｃ５欠乏血清における溶血性活性の阻害
古典的な補体経路機能およびＰＳＩ０４９３（配列番号３７）、ＰＳＩ０４８９（［配列番号５１］−ＰＥＧ３０Ｋ）、およびＰＳＩ０４００（配列番号５０）によるそれの阻害の調査のために、ヒツジ赤血球を、オルシーバー液（Ｓｗｅｄｉｓｈ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）中で新しいヒツジ全血から作製し、その後ウサギ抗ヒツジ赤血球抗血清（Ｓｉｇｍａ）で処理して抗体感作ヒツジ赤血球（ＥＡ）とした。全工程を無菌条件下で行った。その他の全ての試薬は市販品入手源から購入した。
【０１３９】
インビトロアッセイを、９６ウェルＵ型マイクロタイタープレート中で、試験タンパク質、補体血清およびＥＡ懸濁剤を順次添加して実施した。ｐＨ７．３〜７．４でのウェル当たり５０μＬ中の総反応量中の全ての試薬の最終濃度は以下の通りであった：０．１５ｍＭのＣａＣｌ２；０．５ｍＭのＭｇＣｌ２；３ｍＭのＮａＮ３；１３８ｍＭのＮａＣｌ；０．１％のゼラチン；１．８ｍＭのナトリウムバルビタール；３．１ｍＭのバルビツル酸；５百万のＥＡ；好適希釈の補体タンパク質Ｃ５血清、および所望の濃度のＣ５結合ポリペプチド。
【０１４０】
ＥＡ懸濁剤の添加による反応開始の前に、調査タンパク質を上記の補体血清と共に氷上で２０分間プレインキュベートした。溶血反応を撹拌しながら３７℃で４５分間進行させた後、０．０２％のツイーン２０含有１００μＬの氷冷生理食塩水により終了させた。細胞を底部に遠心分離し、１００μＬの上清に相当する上部を、ハーフエリアの平底ウェルを有する透明マイクロプレートに移した。反応物結果を、マイクロタイタープレートリーダーを用いて４１５ｎｍの波長での光学密度として分析した。
【０１４１】
試験したＣ５結合ポリペプチドの阻害効力（ＩＣ５０値）を、制御された濃度のＣ５枯渇血清に加えたヒトＣ５の存在下で、同じアッセイを適用することにより特定した。極めて効力の高い阻害剤（低ナノモル〜ナノモル以下）に対しては、反応混合物の最終Ｃ５濃度を０．１ｎＭに制御した。結果を表１０に示す。
【表１０】
2020523987.tif 000013
【０１４２】
結論
半減期延長ポリペプチドへの融合は、Ｃ５欠乏血清における溶血活性の阻害に影響を与えなかった。
【０１４３】
実施例７：ヒトＣ５への結合
材料および方法
ヒトＣ５に対するＣ５結合ポリペプチドの結合親和性をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて分析した。アミン結合化学を用いて、製造業者のプロトコルに従って、ヒトＣ５（Ａ４０３、Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）をＣＭ５センサーチップ（９００ＲＵ）に取り付けた。取付は、１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝５）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中の７．５μｇ／ｍＬの濃度のｈＣ５を注入することにより実施した。基準セルをヒトＣ５の注入を含まない同じ試薬で処理した。Ｃ５結合ポリペプチドの固定ｈＣ５に対する結合を、シングルサイクルカイネティクス（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｙｃｌｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）法で調査した。この方法では、５種の濃度の試料、通常、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のサーファクタントＰ２０、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）中の、２５、１２．５、６．２５、３．１２および１．５６ｎＭの試料を、３０μＬ／分の流量を用いて、注入間での再生なしで、同じサイクルを使用して、２５℃の温度で、順次注入した。基準セルからのデータを差し引いて、バルク屈折率変化を補償した。ほとんどの場合、ＨＢＳ−ＥＰの注入も、センサーグラムが二重ブランクとなるように、対照として含めた。表面をＨＢＳ−ＥＰ緩衝液中で再生した。Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１．０のラングミュア１：１分析物モデルを用いて、反応速度定数をセンサーグラムから計算した。
【０１４４】
結果
得られたＫＤ値を表１１として表にまとめている。
【表１１】
2020523987.tif 000014
【０１４５】
結論
実施例６では、溶血活性の差異は観察されなかったが、この実験で、Ｃ５への結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ装置で測定して、融合タンパク質によりわずかに影響されたペグ化分子は、結合親和性を溶血阻害に整合させることを示す。
【０１４６】
実施例８：インビボ薬物動態学
この実施例では、雄ラットでの単回投与調査により、ＩＬ−１Ｒａ融合タンパク質ＰＳＩ０５４０（配列番号３８）、ＰＳＩ０５４１（配列番号３９）、ＰＳＩ０５４２（配列番号４０）、ＰＳＩ０５４５（配列番号４３）、ＰＳＩ０５４７（配列番号４５）およびＰＳＩ０５５１（配列番号４９）の薬物動態学を評価した。
【０１４７】
材料および方法
供試品：ＰＳＩ０５４０、ＰＳＩ０５４１、ＰＳＩ０５４２、ＰＳＩ０５４５、ＰＳＩ０５４７およびＰＳＩ０５５１。６種全ての供試品を、２５ｍＭのリン酸ナトリウムおよび２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０中の溶液として構成した。
【０１４８】
生活相：静脈内および皮下への単回投与後に薬物動態学的特性を雄スプラーグドーリーラットで調査した。投与量群当たりの試験した投与レベルおよび動物の数を表１２に示す。
【表１２】
2020523987.tif 000015
【０１４９】
皮下投与は、５ｍｌ／ｋｇの投与体積で頸部に注入された。静脈内投与は、２．５ｍｌ／ｋｇの投与体積で外側（ｌａｔｅｒａｌ）尾静脈に注入された。標準的バイアルを用いて、血清凝血活性化薬なしで血液試料を舌下神経叢から収集した。ｓ．ｃ．投与後、２４ｍｇ／ｋｇの投与レベルのＰＳＩ０５４５および３０ｍｇ／ｋｇの投与レベルのＰＳＩ０５４７を除いて、血清調製用の血液試料を、投与前、および投与の２０分、および１、４、８、２４、３０、４８、７２および９６時間後に収集した。前述のＰＳＩ０５４５およびＰＳＩ０５４７については、投与前、および投与の２０分、および１、４、８、２４、４８、７２、９６および１２０時間後に収集した。静脈内投与後、１２ｍｇ／ｋｇの投与レベルのＰＳＩ０５４５および１５ｍｇ／ｋｇの投与レベルのＰＳＩ０５４７を除いて、血清調製用の血液試料を、投与前、ならびに投与の５および２０分、および１、４、８、２４、３０、４８および７２時間後に収集した。前述のＰＳＩ０５４５およびＰＳＩ０５４７については、投与前、ならびに投与の５および２０分、および１、４、８、２４、４８、７２、および９６時間後に収集した。
【０１５０】
定量ＥＬＩＳＡ：ラット血清試料中の修飾アナキンラレベルの測定を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）により実施した。ＰＢＳ（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）中の０．２５μｇ／ｍｌの濃度のウェル当たり５０μｌのポリクローナルヤギ抗ヒトＩＬ−１Ｒａ抗体（ＡＦ２８０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、マイクロプレート（９６ウェル高結合ハーフエリアプレート、Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６９０）上に２時間コートした。非結合ポリクローナル抗体を、マイクロプレート洗浄機（ＭｕｌｔｉＷａｓｈ＋、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて２ｘ１５０μｌのＰＢＳ−ツイーン（Ｍｅｄｉｃａｇｏ）で洗い流し、１５０μｌのＰＢＳ中の１％Ｃａｓｅｉｎ  Ｂｌｏｃｋｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をウェルに室温で２時間加えた。
【０１５１】
血清試料を０．５％カゼインおよび１％ラット正常血清を補充したＰＢＳ中の標準希釈に対して、１００倍希釈からそれ以上の希釈で分析した。各構築物に対し、４０ｎｇ／ｍｌ〜２０ｐｇ／ｍｌの２倍希釈系列により標準を作製した。最初に、血清試料を、０．５％カゼインを補充したＰＢＳ中で１００倍希釈し、続けて、０．５％カゼインおよび１％ラット正常血清（Ａｄｌｅｇｏ）を補充したＰＢＳ中で系列希釈を行った。液体取り扱いロボット（Ｂｉｏｍｅｋ  ４０００、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、ポリプロピレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３３６５）中で試料の１／５ステップの系列希釈を作製した。
【０１５２】
２ｘ１５０μｌのＰＢＳ−ツイーンで非結合ブロッキングタンパク質を除去し、２５μｌの試料および標準をピペットでウェルに採取し、６００ｒｐｍで振盪を加えながら、室温で１時間インキュベートし、続けて、＋４℃で一晩インキュベートした。全ての非結合物質を３ｘ１５０μｌのＰＢＳ−ツイーンで洗い流した後、５０μｌの、ヒトＩＬ−１Ｒａ（ＢＡＦ２８０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）特異的ビオチン結合ポリクローナル検出抗体をウェルに加え、室温で２時間インキュベートした。検出抗体を、０．５％カゼインを補充したＰＢＳ中で０．４μｇ／ｍｌに希釈した。非結合検出抗体を、３ｘ１５０μｌのＰＢＳ−ツイーンで洗い流し、５０μｌのＨＲＰ標識ストレプトアビジン（ＭａｂＴｅｃｈ）をウェルに加え、４００ｒｐｍで振盪を加えながら、室温で１時間インキュベートした。ＳＡ−ＨＲＰ複合体を、０．５％カゼインを補充したＰＢＳ中で１／１００００に希釈した。３ｘ１５０μｌのＰＢＳ−ツイーンで洗浄して全ての非結合ＳＡ−ＨＲＰ複合体を除去した後、５０μｌの基質溶液（Ｅａｓｙ  Ｂｌｕｅ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＴＭＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ、Ｍｅｄｉｃａｇｏ）をウェルに加え、結合アナキンラ構築物の量に比例して、発色した。２５μｌの２ＭのＨＣｌをウェルに加えることにより、約３０分後に発色を停止させ、５４０ｎｍをプレートバックグラウンドの基準波長として用いて、４５０ｎｍで色の強度をマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）により測定した。
【０１５３】
４パラメーターロジスティック関数（ＭＳエクセル用のＸＬｆｉｔを使ったｅｑｕａｔｉｏｎ  ２００）で検量線を作製した。読み取り濃度に試料の希釈因子を乗じて、未希釈血清の濃度を得た。
【０１５４】
薬物動態解析：薬物動態解析は、平均血清濃度ｖｓ各投与群由来の時間データをベースにした。観察した最大濃度（Ｃｍａｘ）および最大血清濃度までの時間（Ｔｍａｘ）を、生体分析濃度ｖｓ時間データから直接取得した。その他の薬物動態学的パラメーター：用量正規化Ｃｍａｘ（Ｃｍａｘ／投与量）、濃度ｖｓ時間曲線下面積（ＡＵＣ）、クリアランス（ＣＬ）、皮下投与後の見かけのクリアランス（ＣＬ／Ｆ）、定常状態での見かけの分布容積（ＶＳＳ）、平均滞留時間（ＭＲＴ）および終末相半減期（ｔ１／２ｚ）は、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウェアバージョン６．３（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，ＵＳＡ）を用いて、ノンコンパートメント解析により推定した。皮下バイオアベイラビリティ（Ｆ）の計算は、マイクロソフトエクセルを用いて実施した。
【０１５５】
結果
ラット中の、ＰＳＩ０５４０、ＰＳＩ０５４１、ＰＳＩ０５４２、ＰＳＩ０５４５、ＰＳＩ０５４７およびＰＳＩ０５５１の単回投与薬物動態学的パラメーター推定値は、表１３および１４に示されている。
ＰＳＩ０５５１のクリアランスおよび他の薬物動態学的パラメーターは、生体分析異常により決定しなかった。その他の５種の供試品に対しては、静脈内投与後の結果は、クリアランス（ｍｌ／ｈ・ｋｇ）が、ＰＳＩ０５４７（配列番号４５）（３．７３）＜ＰＳＩ０５４５（配列番号４３）（９．２５）＜ＰＳＩ０５４２（配列番号４０）（１２．９）＜ＰＳＩ０５４０（配列番号３８）（２１．２）＜ＰＳＩ０５４１（配列番号３９）（３０．５）のランク順に増大することを示した。見かけの分布容積（ＶＳＳ）は小さく、４１．２ｍｌ／ｋｇ（ＰＳＩ０５４７（配列番号４５））および９８．９ｍｌ／ｋｇ（ＰＳＩ０５４１（配列番号３９））であった。平均滞留時間（時間）、すなわち、ＣＬに対するＶＳＳの比、は、ＰＳＩ０５４０（配列番号３８）（３．０３）≒ＰＳＩ０５４１（配列番号３９）（３．２４）＜ＰＳＩ０５４５（配列番号４３）（５．５９）≒ＰＳＩ０５４２（配列番号４０）（６．７２）＜ＰＳＩ０５４７（配列番号４５）（１１．０）のランク順に増大した。
【０１５６】
皮下投与後の結果は、６種の供試品の内で、ＰＳＩ０５４７が最低クリアランス、最高用量正規化Ｃｍａｘ、および最長平均滞留時間を示した。ＡＵＣに反比例するクリアランスＣＬ／Ｆ（ｍｌ／ｈ・ｋｇ）は、ＰＳＩ０５４７（配列番号４５）（１２）＜ＰＳＩ０５４５（配列番号４３）（３４）＜ＰＳＩ０５５１（配列番号４９）（５０）＜ＰＳＩ０５４２（配列番号４０）（８７）＜ＰＳＩ０５４０（配列番号３８）（１２８）＜ＰＳＩ０５４１（配列番号３９）（４３９）のランク順に増大する。
【表１３】
2020523987.tif 000016
【表１４】
2020523987.tif 000017
【０１５７】
１７、３４、３４および５１ユニットの半減期延長ポリペプチド部分をそれぞれ有するＩＬ−１Ｒａを含む、融合タンパク質ＰＳＩ０５４０、ＰＳＩ０５４２、ＰＳＩ０５４５、およびＰＳＩ０５４７の静脈内注入後の推定終末相半減期、ｔ１／２ｚ（時間）を、それぞれ、球状タンパク質に対して較正した溶出体積による見かけのサイズ（図５ａ）、溶液中の流体力学半径（図５ｂ）および半減期延長ポリペプチド部分の反復ユニットの数（図５ｃ）に対してプロットした。ＰＳＩ０１６２（Ｍｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａ）を基準として含めた。
【０１５８】
結論
半減期延長ポリペプチドの半減期延長特性は、ドメインの長さの関数であることを示し、５１ユニットを有するＰＳＩ０５４７が、一貫して、最良の特性を示した。一般に、２つのＩＬ−１Ｒａ分子を含む融合タンパク質は、対応する単一融合タンパク質より短い半減期を示す。さらに、化合物のバイオアベイラビリティは、添加した半減期延長ポリペプチドの長さと共に低減することはないことも明らかになった。むしろ、それぞれ、ＰＳＩ０５４０、ＰＳＩ０５４２、ＰＳＩ０５４５、ＰＳＩ０５４７、ならびにＰＳＩ０５４１およびＰＳＩ０５５１のシリーズ中で、同じ構造を有するより小さい融合タンパク質と比較して、より大きな融合タンパク質において増大したバイオアベイラビリティの傾向が確認された。
【０１５９】
実施例９：Ｍｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａおよびそのペグ化バリアントのインビボ薬物動態学
この比較例は、Ｍｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａおよび直鎖１０ｋＤａのＰＥＧ、直鎖２０ｋＤａのＰＥＧおよび直鎖３０ｋＤａのＰＥＧでそれぞれ、Ｎ−末端でペグ化したＭｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａの、雄ラットを用いた２種の別々の試験の調査について記載する。
【０１６０】
材料および方法
２種の別々の試験は、実施例８の場合と同じ一般デザインに従った。ＰＥＧ含有または非含有のＭｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａタンパク質を雄スプラーグドーリーラットで、皮下パートに対しｎ＝３、静脈内パートに対しｎ＝１で投与した。サンプリング時点は次の通り：皮下サンプリング−０（投与前）、１５分、３０分、１、２、４、６、８、２４、４８、７２、９６、１２０および１４４時間；静脈内サンプリング−０（投与前）、５分、２０分、１、２、４、６、８、２４、４８、７２、９６、１２０および１４４時間。血清試料中のタンパク質の濃度を、標準試薬および標準的プロトコルを用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１６１】
結果
ラット中の単回投与薬物動態学的パラメーター推定値は、表１５および１６に示されている。
【表１５】
2020523987.tif 000018
【表１６】
2020523987.tif 000019
【０１６２】
結論
クリアランス（ＣＬ）は、ＰＥＧの次第に増加するサイズと共に減少する（４４２（Ｍｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａ）＞２２．２（Ｌ１０ｋ）＞９．４３（Ｌ２０ｋ）＞６．９３（Ｌ３０ｋ））。平均滞留時間は、ＰＥＧの次第に増加するサイズと共に増加する（ＩＶ：０．２０（Ｍｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａ）＜４．９（Ｌ１０ｋ）〜５．３（Ｌ２０ｋ）＜１１（Ｌ３０ｋ）；ＳＣ：２．２（Ｍｅｔ−ｈｕＩＬ−１Ｒａ）＜２６（Ｌ１０ｋ）＝２６（Ｌ２０ｋ）＜３７（Ｌ３０ｋ））。皮下投与後のバイオアベイラビリティ（Ｆ）は、ＰＥＧの次第に増加するサイズと共に低下する；このＰＥＧ複合体の性質は、より長い半減期延長ポリペプチドを有する融合タンパク質が、実際に、より高いバイオアベイラビリティを示す半減期延長ポリペプチドの効果とは対照的である。全てのＰＥＧに対し、最大血漿中濃度は２４時間で観察された。
【０１６３】
実施例１０：Ｃ５結合ポリペプチドのバリアントの薬物動態学的特性の比較調査
この比較例では、本発明の実施形態による融合タンパク質、Ｃ５結合タンパク質およびペグ化Ｃ５結合タンパク質（ＰＳＩ０４９３、ＰＳＩ０４８９およびＰＳＩ０２５７）、の薬物動態学を、雄ラットを用いた３種の単回投与試験で評価した。
【０１６４】
材料および方法
この３種の試験では、雄スプラーグドーリーラット（投与経路およびタンパク質当たりＮ＝３）による単回静脈内（ｉｖ）または皮下（ｓｃ）投与と同じ一般デザインを採用した。ＰＳＩ０２５７の濃度を測定するための血清の作製のための血液試料を、次の名目時点：０（投与前）、５分、２０分、１、２、４、８、１２、２４、４８、９６および１６８時間、で採取した。ＰＳＩ０４８９およびＰＳＩ０４９３に対しては、血液試料を、０（投与前）、および投与の５分（ＩＶのみ）、１５分（ＳＣのみ）、１、４、８、２４、４８、７２、１２０および１９２時間後に採取した。ＰＳＩ０２５７、ＰＳＩ０４８９およびＰＳＩ０４９３の血清濃度を、３種全ての融合タンパク質に共通の合成放射性同位元素標識ペプチドを用いて、ペプシン消化とそれに続くＬＣ／ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析により測定した。個々の濃度ｖｓ時間のプロファイルを実際の測定値および名目時点から収集した。最大のＰＳＩ０２５７、ＰＳＩ０４８９またはＰＳＩ０４９３の血清中濃度Ｃｍａｘ、および投与後にこの最大血清濃度に達する時間，ｔｍａｘ、を個々のデータから決定した。個々の薬物動態プロファイルをノンコンパートメント解析に供して、終末相半減期、ｔ１／２ｚ、平均滞留時間（ＭＲＴ）、時間ゼロから無限大までの血漿中濃度−時間曲線下面積、ＡＵＣ∞、およびクリアランス、ＣＬを計算した。
【０１６５】
結果
結果を表１７にまとめている。
【表１７】
2020523987.tif 000020
【０１６６】
結論
本発明の実施形態による半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質のｔ１／２ｚは、親分子単独での６時間に比べて、２０時間延長され、９倍大きいＡＵＣ∞および従って９倍のクリアランスの減少を示す。３０ｋＤａ直鎖ＰＥＧにＣ末端のＣｙｓ位置で化学的に結合された、同じ標的化分子であるＰＳＩ０４８９に比べて、終末相半減期は、４５時間に比べて、２０時間である。これは、半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質に対し標的のサイズ増大が１０ｘであるがペグ化標的に対しては２４ｘである、実施例４、表７で示したデータと一致する。
【０１６７】
実施例１１：抗体フラグメントベース融合タンパク質のクローニングおよび作製
本実施例は、本明細書で開示の半減期延長ポリペプチドと、ルプリズマブ抗体フラグメント配列の融合タンパク質のクローニングおよび作製のための一般的戦略を記載する。半減期延長ポリペプチドを抗体フラグメントの軽鎖（ＬＣ）または重鎖（ＨＣ）に融合した。この実施例で作製された融合タンパク質を、下記実施例１２〜１５で使用した。
【０１６８】
材料および方法
ＤＮＡ構築物：半減期延長ポリペプチド含有または非含有の一連の抗体フラグメントをコードするＤＮＡ配列を、大腸菌またはＣＨＯ細胞中での発現のために、コドン最適化し、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃでのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｅｎｅＡｒｔ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓサービスにより合成した（成熟タンパク質配列（シグナル伝達ペプチド不含）に対応する領域のヌクレオチド配列については、下表１８を参照されたい）。遺伝子は、その後、大腸菌またはＥｘｐｉ２９３細胞またはＥｘｐｉＣＨＯ細胞中での発現のために、発現ベクター中でクローン化された。ＰＳＩ０７１６、ＰＳＩ０７１７、ＰＳＩ０７６２およびＰＳＩ０７６１に対し、ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ  ｖｅｃｔｏｒを用いて、重鎖および軽鎖の両方のヌクレオチド配列を組み込んだ。
【表１８】
2020523987.tif 000021
2020523987.tif 000022
【０１６９】
培養および精製：組換え抗体フラグメントまたは融合タンパク質をコードする遺伝子フラグメントを含む発現ベクターで大腸菌細胞を形質転換した後、流加バッチ技術を用いてバイオリアクター中で、または振盪フラスコ中で培養し、続けて、タンパク質発現および遠心分離による細胞の採取を行った。細胞ペレットを−２０℃で貯蔵するか、または浸透圧ショックに直接供し、放出されたタンパク質を遠心分離により清澄化し、−２０℃で貯蔵した。Ｅｘｐｉ２９３およびＥｘｐｉＣＨＯ発現系（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、基本的に製造業者のプロトコルに従って、組換え抗体フラグメントまたは融合タンパク質の発現を実施した。発現ベクターの遺伝子導入の６日後、上清を遠心分離により採取し、−７０℃で貯蔵した。表１９は、コード化タンパク質配列を示す。
【０１７０】
凍結大腸菌細胞ペレットを再懸濁した後、超音波処理により粉砕し、その後、細胞デブリを遠心分離と、その後の濾過（０．２２μｍ）により除去した。ＥｘｐｉＣＨＯおよびＥｘｐｉ２９３培養物由来の浸透圧ショック試料および上清を解凍し、濾過した（０．２２μｍ）後、精製した。組換え抗体フラグメントまたは融合タンパク質を含む各上清を、従来のクロマトグラフィー法を用いて精製した。動物試験に使用するための組換え融合タンパク質も、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｉｅｒｃｅ、方ログ番号２０３４４）を用いて、エンドトキシン除去精製に供した。精製した抗体フラグメントまたは融合タンパク質をＰＢＳに緩衝液交換し、別に定める場合を除き、ＰＢＳをその後の実験の処方緩衝液としても使用した。融合タンパク質の純度をクーマシーブルーで染色してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し、各タンパク質の分子量を質量分析法（ＨＰＬＣ／ＭＳまたはＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）により分析した。
【０１７１】
結果
精製により、高純度のタンパク質調製物を生じ、これは、クーマシーブルーで染色してＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。各融合タンパク質の正確な素性および分子量を質量分析により確認した。
【０１７２】
下表１９は、作製したタンパク質のアミノ酸配列を示す。半減期延長ポリペプチドをルプリズマブＦａｂの軽鎖（下表中のＬＣ）または重鎖（下表中のＨＣ）、または軽鎖および重鎖の両方のＣ末端に融合した。
【０１７３】
結論
合成遺伝子を構築し、続けて哺乳動物系または細菌系で発現させ、従来技術を使用して高純度に精製することにより、抗体フラグメントおよび種々の長さの半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質を作製できる。
【表１９】
2020523987.tif 000023
2020523987.tif 000024
【０１７４】
実施例１２：融合タンパク質の生物物理学的特性評価
この実施例は、溶液中の見かけのサイズおよび分子量（ＭＷ）などの生物物理学的特性およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）ならびにカラム較正および多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）による溶液中の流体力学半径の測定に関して、非融合タンパク質およびペグ化タンパク質を基準として用いて、ルプリズマブＦａｂおよび半減期延長ポリペプチドを含む融合タンパク質の特性評価について記載する。
【０１７５】
材料および方法
融合タンパク質、非融合タンパク質およびペグ化タンパク質の溶液中のサイズを、ＡＫＴＡ  Ｍｉｃｒｏ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、較正カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ３．２／３００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、分析用ゲル濾過により評価した。カラムを、６〜６６９ｋＤａのサイズ範囲の８つの球状タンパク質およびブルーデキストラン２０００を含む、Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＬＭＷ（コード番号２８−４０３８−４１、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  ＬＭＷ（コード番号２８−４０３８−４２、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で、２５ｍＭのＮａＰおよび１２５ｍＭのＮａＣｌのランニングバッファーｐＨ７．０を用いて、７５μｌ／分の流量、２５℃の温度で較正した。溶液中の対応するサイズおよび流体力学半径は、較正カラム上のタンパク質の溶出体積から、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｉｚｅ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（注文番号１８−１０２２−１８、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の補足資料１０に記載の方法により、計算できる。タンパク質の分子量は、連結されたＭＡＬＳ−ＲＩシステム：静的光散乱検出器ｍｉｎｉＤａｗｎ  Ｔｒｉｓｔａｒおよび示差屈折計Ｏｐｔｉｌａｂ  ｒＥＸ、およびＡｓｔｒａ  Ｖソフトウェア（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により決定した。
【０１７６】
目的のタンパク質を較正中と同じ条件下で分析した。
【０１７７】
結果
表２０は、融合タンパク質および基準タンパク質の結果を示す。
【表２０】
2020523987.tif 000025
【０１７８】
結論
融合タンパク質中に包含される半減期延長ポリペプチドの全体長さと、溶液中でのそのサイズとの相関を観察した：溶液中のサイズは、半減期延長ポリペプチドの位置には依存しなかったが、その理由は、全てのユニットの半減期延長ポリペプチドが重鎖（ＨＣ）、軽鎖（ＬＣ）に融合された場合、または同じ数のユニットがＦａｂの重鎖および軽鎖の両方に分布された場合、異なる融合タンパク質のサイズが類似であったためである。
【０１７９】
アルブミンの流体力学半径またはストークス半径は、腎クリアランスの限界サイズを超える３．８ｎｍであることがわかっている。これは、腎クリアランスを回避するのに必要な最小限のサイズの限界値として機能し得る。全ての上記で試験した融合タンパク質は、アルブミンの限界値を超えるサイズを有していた。
【０１８０】
実施例１３：ヒトＣＤ４０への結合
この実施例は、ルプリズマブＦａｂおよび半減期延長ポリペプチドの融合タンパク質の結合特性について記載し、ルプリズマブ、非融合Ｆａｂタンパク質および別のＦａｂ標的化ヒトＣＤ４０Ｌを、基準タンパク質として使用した。
【０１８１】
材料および方法
ヒトＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０ＬまたはＣＤ１５４）に対するルプリズマブＦａｂおよび半減期延長ポリペプチド含有融合タンパク質の結合親和性を、ＯｃｔｅｔＲＥＤ９６装置（Ｐａｌｌ／ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて分析した。抗ヒトＦａｂ−ＣＨ１第二世代（ＦＡＢ２Ｇ、Ｐａｌｌ／ＦｏｒｔｅＢｉｏ）センサーを用いて固定したポリペプチドを、ヒトＣＤ４０Ｌ（ａａ  １０８〜２６１、大腸菌中で組換えにより作製）の細胞外部分への結合に関し、通常、１：２ステップ増分による２．５〜８０ｎＭの濃度範囲で試験した。
【０１８２】
通常、各濃度のＣＤ４０Ｌの会合を１８０秒間、続けて解離を６００秒間モニターした。センサーは、各サイクル間で、ｐＨ２で３ｘ１０秒パルスにより生成し、各センサーのデータを緩衝液曝露に対し参照した。ソフトウェア「Ｏｃｔｅｔ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、リリース１０．０−カイネティクスモジュール（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」のラングミュア１：１分析物モデル（Ｇｌｏｂａｌ  ｆｉｔ）を用いて、反応速度定数をセンサーグラムから計算した。
【０１８３】
結果
得られたＫＤ値を表２１にまとめている。解離が６００秒のモニター時間にわたり５％未満の場合（ｋｄ＜１ｅ−４）、この値をＫＤとして使用した。
【表２１】
2020523987.tif 000026
【０１８４】
結論
Ｆａｂの半減期延長ポリペプチドへの融合は、前記ＦａｂのヒトＣＤ４０Ｌの可溶性部分への親和性に対し測定できるほどの影響を与えない。全ての試験した融合タンパク質のヒトＣＤ４０Ｌに対する親和性は、対照タンパク質ルプリズマブおよびダピロリズマブＦａｂと同等であった。
【０１８５】
実施例１４：インビトロおよびインシリコ免疫原性傾向調査
この実施例は、ＰＳＩ０６９９（配列番号６９／配列番号７０）中に存在する潜在的免疫原性領域を特定することを目的とする。ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）Ａｎｔｉｇｅｎ  ＰｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎアッセイをＰｒｏＩｍｍｕｎｅ（ＵＫ）により実施した。単球由来樹状細胞により自然に処理され、その結果、ＭＨＣ抗原提示系により提示され得るペプチドを特定することにより、免疫原性領域を決定した。推定免疫原性ペプチドの検出は、質量分析法ＬＣ／ＭＳ／ＭＳベース分析を利用して実施した。
【０１８６】
材料および方法
ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ  ＰｒｏＰｒｅｓｅｎｔ（登録商標）Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎアッセイを用いて、ＰＳＩ０６９９中に存在する潜在的免疫原性領域を特定した。それらは、単球由来樹状細胞により自然に処理され、その結果、クラスＩＩ  ＭＨＣ（ＨＬＡ−ＤＲ）分子により提示されるペプチドを特定することにより決定された。このアッセイで用いられた樹状細胞は、ヒト集団中に存在するＨＬＡ型の適切な対象範囲を有する１１人の健常な血液ドナーから単離された。推定免疫原性ペプチドは、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳベース分析塩基配列決定質量分析法により特定された。
【０１８７】
インシリコ免疫原性分析をソフトウェア、ＴＥＰｒｅｄｉｃｔ（Ａｎｔｏｎｅｔｓ  ＆  Ｍａｋｓｙｕｔｏｖ  ＴＥｐｒｅｄｉｃｔ：Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｆｏｒ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１０，Ｖｏｌ．４４，Ｎｏ．１，ｐｐ．１１９−１２７）を用いて実施した。
【０１８８】
結果
全体として、４種の潜在的免疫原性ペプチドがこのアッセイで特定され、１つは、ＰＳＩ０６９９のＦａｂの重鎖から、および３つは、Ｆａｂの軽鎖からであった。これらの内、２つは、以前に、Ｔｒｅｇ１３４と命名された、潜在的Ｔｒｅｇｉｔｏｐｅ配列として発表され、これらのペプチドの両方を包含する。全てのペプチドは、分子の抗体由来部分の定常領域を起源に持つ。半減期延長ポリペプチド由来の免疫原性ペプチドはこのアッセイでは存在しなかった。
【０１８９】
さらに、インシリコ評価は、半減期延長ポリペプチド由来のどのペプチドもいずれかのＭＨＣクラスの分子に結合する傾向を有するとは予測しなかった。しかし、インシリコ分析は、Ｆａｂの標的特異性を示す可変領域由来のペプチドを含むＦａｂ部分由来のさらなるペプチドは、種々のＭＨＣ分子に結合する可能性があることを予測した。
【０１９０】
結論
現在のアッセイ設定では、半減期延長ポリペプチド由来のペプチドは提示されなかったので、半減期延長ポリペプチドの免疫原性の可能性は低いと判定される。このアッセイでは多くの抗体に共通の領域のみが提示されたので、全体の免疫原性の可能性も低いと判定される。以前に発表されたＴｒｅｇｉｔｏｐｅペプチドの提示もまた、低い応答であることを示唆する。
【０１９１】
実施例１５：Ｆａｂベース融合タンパク質の薬物動態学的特性の比較調査
この実施例では、非融合ＣＤ４０Ｌ  Ｆａｂを対照（ＰＳＩ０６９８、ルプリズマブＦａｂ、（配列番号６７／配列番号６８））として含む、ＰＳＩ０６９９（配列番号６９／配列番号７０）およびＰＳＩ０７０１（配列番号７３）の静脈内および皮下薬物動態学的特性を評価した。
【０１９２】
材料および方法
この試験では、ＰＳＩ０６９９およびＰＳＩ０７０１の両方に対し、雄スプラーグドーリーラット（投与経路およびタンパク質当たりＮ＝３）による単回静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）投与と同じ一般デザインを採用した。ＰＳＩ０６９８に対しては、実験のＩＶ部分のみを実施した。
【０１９３】
ＰＳＩ０６９９およびＰＳＩ０７０１に対しては、ＩＶ実験の投与量および時点は、次の通り：２ｍｇ／ｋｇ：５および２０分ならびに１、４、８、２４、４８、７２、９６および１２０時間。ＳＣ実験に対しては、４ｍｇ／ｋｇの投与量を用い、血液試料を次の時点で採取した：２０分および１、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０および１６８時間。ＰＳＩ０６９８のＩＶ実験に対しては、１３ｍｇ／ｋｇの投与量を用い、血液を次の時点で採取した：５および２０分ならびに１、２、４、８、２４、３０および４８時間。ＰＳＩ０６９８、ＰＳＩ０６９９およびＰＳＩ０７０１の血清濃度を、Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙプラットフォーム（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で、サンドイッチ法により測定した。活性薬物をビオチン化ＣＤ４０Ｌで捕捉し、ヤギ中で産生したルテニウム結合抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗体（Ｉ５２６０、Ｓｉｇｍａｎ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて検出した。個々の濃度ｖｓ時間のプロファイルを実際の血清濃度測定値および名目時点から収集した。最大のＰＳＩ０６９８、ＰＳＩ０６９９およびＰＳＩ０７０１の血清中濃度Ｃｍａｘ、および投与後にこの最大血清濃度に達する時間、ｔｍａｘ、を個々のデータから決定した。その他の曝露および薬物動態学的パラメーター推定値は、ノンコンパートメント解析（Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  ８．０を用いて）により決定した；すなわち、ＡＵＣ（時間０〜無限大までの血漿血清濃度−時間曲線下面積）、ＣＬ（クリアランス）、ＣＬ／Ｆ（ＳＣ投与後クリアランス）、ＶＳＳ（定常状態での見かけの分布容積）、ＭＲＴ（平均滞留時間）およびｔ１／２ｚ（終末相半減期）。皮下バイオアベイラビリティ、Ｆは、個々のＡＵＣ／投与量（ＳＣ）の中央値ＡＵＣ／投与量（ＩＶ）での除算に基づいて計算した。
【０１９４】
結果
結果をＩＶ実験について表２２に、ＳＣ実験について表２３にまとめている。
【表２２】
2020523987.tif 000027
【表２３】
2020523987.tif 000028
【０１９５】
結論
ＰＳＩ０６９９およびＰＳＩ０７０１のクリアランスは、ＣＤ４０Ｌ  ＦａｂのＣＬより１００倍低かった。ＰＳＩ０６９９およびＰＳＩ０７０１の静脈内ＰＫはそれぞれ、低クリアランスおよび少容積分布を特徴とした。ＰＳＩ０６９９およびＰＳＩ０７０１の両方は、投与の２４または４８時間後観察されたＣｍａｘレベル、およびその後の、３２〜５５時間の順に、ｔ１／２ｚと共に単層的減少を示して、比較的高いＳＣバイオアベイラビリティを示した。中央推定値に基づくと、ＰＳＩ０６９９は、ＰＳＩ０７０１に比べて、幾分高いバイオアベイラビリティ（６８ｖｓ５０％）、長い生物学的半減期（５３ｖｓ４０時間）および高いＣ１６８／投与レベル（１．６ｖｓ０．９６）を示した。
【図１（ａ）】
2020523987.tif 000029
【図１（ｂ）】
2020523987.tif 000030
【図１（ｃ）】
2020523987.tif 000031
【図１（ｄ）】
2020523987.tif 000032
【図１（ｅ）】
2020523987.tif 000033
【図１（ｆ）】
2020523987.tif 000034
【図１（ｇ）】
2020523987.tif 000035
【図２】
2020523987.tif 000036
【図３ａ】
2020523987.tif 000037
【図３ｂ】
2020523987.tif 000038
【図４】
2020523987.tif 000039
【図５ａ】
2020523987.tif 000040
【図５ｂ】
2020523987.tif 000041
【図５ｃ】
2020523987.tif 000042
【手続補正書】
【提出日】平成31年4月17日(2019.4.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合タンパク質であって、
ｉ）生物学的に活性なポリペプチド；および
ｉｉ）２〜８０ユニットを含む生物学的半減期延長ポリペプチド部分であって、それぞれのユニットが、ヒト胆汁酸塩刺激リパーゼのＣ末端ドメインの反復ユニット由来の配列である配列番号１： 
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｄ−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１（配列番号１）
による全てのアミノ酸配列からなる群より独立に選択され、式中、独立に、
Ｘ１はＰであるか、または存在せず；
Ｘ２はＶであるか、または存在せず；
Ｘ３はＰまたはＴであり；
Ｘ４はＰまたはＴであり；
Ｘ５はＴまたはＶであり；
Ｘ６はＤ、ＧまたはＴであり；
Ｘ８はＡ、ＱまたはＳであり；
Ｘ９はＥ、ＧまたはＫであり；
Ｘ１０はＡ、Ｅ、ＰまたはＴであり；
Ｘ１１はＡ、ＰまたはＴであり；
全体的にみて、胆汁酸塩刺激リパーゼではない、融合タンパク質。
【請求項２】
前記半減期延長ペプチド部分が、２〜８０ユニット、例えば、４〜８０ユニットのコンティグ配列を形成する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
複数の半減期延長ポリペプチド部分を含み、それぞれのポリペプチド部分が２〜８０ユニットを含む、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記半減期延長ポリペプチド部分、または少なくとも１つの前記複数の半減期延長部分が、前記生物学的に活性なポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に配置される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記半減期延長ポリペプチド部分、または少なくとも１つの前記複数の半減期延長ポリペプチド部分が、前記生物学的に活性なポリペプチドのアミノ酸配列中への挿入、またはそのアミノ酸配列の一部の置換を構成する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号２〜１１からなる群より選択される１つまたは複数のアミノ酸配列の２〜８０ユニットを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。  
【請求項７】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号１２〜２１および５７〜６６からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。  
【請求項８】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号１２〜２１および５７〜６６からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項６に記載の融合タンパク質。  
【請求項９】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号１００〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合タンパク質。  
【請求項１０】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、配列番号１００〜１０５からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項９に記載の融合タンパク質。  
【請求項１１】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、１０〜５１ユニットなどの６〜７０ユニット、例えば、７〜１８ユニットを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。  
【請求項１２】
少なくとも３．８ｎｍの流体力学半径を有する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
サイズ排除クロマトグラフィーにより測定して、少なくとも６０ｋＤａの溶液中の見かけのサイズを有する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
配列番号１による前記アミノ酸配列がヒト起源である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。  
【請求項１５】
前記半減期延長ポリペプチド部分が、天然ヒトアミノ酸配列に一致する、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
各ユニットが、最大で１つのＯ−グリコシル化を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
複数の生物学的に活性なポリペプチドを含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
生物学的に活性なポリペプチドの前記生物学的半減期を延長する方法であって、
ａ）請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを用意するステップ；
ｂ）前記ポリヌクレオチドを細胞中に導入するステップ；
ｃ）前記細胞を前記融合タンパク質の発現を可能とする条件下で維持するステップ；および
ｄ）前記融合タンパク質を単離するステップ、を含む方法。
【請求項１９】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項２２】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質および薬学的に許容可能な担体を含み、任意選択で、皮下または静脈内投与用に処方された医薬組成物。
【請求項２３】
薬物としての使用のための、任意選択で、対象の皮下または静脈内に投与される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
生物学的に活性なポリペプチドのバイオアベイラビリティを高めるための、請求項１〜１７のいずれか１項で定義の半減期延長ポリペプチドの使用。
【国際調査報告】
2020523987.tif 000043
2020523987.tif 000044
2020523987.tif 000045