(57)【要約】  本発明は、代謝物分析を利用したベーチェット病の診断方法に関し、メタボロミクスを利用してベーチェット病を効果的に診断できるバイオマーカーを提供し、これは、ベーチェット病の治療剤の開発にも適用することができる。
2020517935.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｌ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）、イノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）、ガラクトネート（ｇａｌａｃｔｏｎａｔｅ）、グリコレート（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）よりなる群から選ばれた一つ以上の血液代謝物に対する定量装置を含むベーチェット病の診断キット。
【請求項２】
前記血液代謝物のうちデカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）およびリノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）よりなる群から選ばれた一つ以上を含む、請求項１に記載のベーチェット病の診断キット。
【請求項３】
定量装置は、クロマトグラフィー／質量分析器である、請求項１に記載のベーチェット病の診断キット。
【請求項４】
デカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、Ｌ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）、イノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）、ガラクトネート（ｇａｌａｃｔｏｎａｔｅ）およびグリコレート（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）よりなる群から選ばれた一つ以上の濃度が増加する場合、ベーチェット病を示す、請求項１に記載のベーチェット病の診断キット。
【請求項５】
オレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）よりなる群から選ばれた一つ以上の濃度が減少する場合、ベーチェット病を示す、請求項１に記載のベーチェット病の診断キット。
【請求項６】
正常対照群とベーチェット病から得られた血液間の代謝物差別性を検出する方法であって、
（１）ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ（ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を利用した代謝物分析段階；
（２）ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳで同定された代謝物に対して部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を利用して代謝物プロファイルの差異を確認する段階；
（３）ＰＬＳ−ＤＡで導き出された代謝物のＶＩＰ（Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）値が１．５以上である値を代謝物バイオマーカーの候補物質として選定し、ＰＬＳ−ＤＡのローディング値を通じて代謝物バイオマーカーの候補物質の増減を確認する段階；
（４）ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ）を利用して代謝物バイオマーカーを検証する段階
を順次に適用して、血液から代謝物バイオマーカーを分析することを含む正常対照群とベーチェット病から得られた血液間の代謝物差別性の分析方法。
【請求項７】
ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳを利用した代謝物分析方法は、血液試料をＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ機器で分析し、分析結果を統計処理可能な数値に変換した後、変換した数値を利用して統計学的に正常対照群とベーチェット病から得られた血液間の代謝物の差別性を検証するものである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ分析結果を統計処理可能な数値に変換することは、総分析時間を単位時間間隔に分けて単位時間の間に示されたクロマトグラムピークの面積または高さのうち最も大きい数値を単位時間の間の代表値として定めることである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＰＬＳ−ＤＡのローディング値が正数であることは、代謝物の増加傾向を、ローディング値が負数であることは、代謝物の減少傾向を示すことである、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
代謝物バイオマーカーは、デカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｌ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）、イノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）、ガラクトネート（ｇａｌａｃｔｏｎａｔｅ）、グリコレート（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）よりなる群から選ばれた一つ以上である、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、代謝物分析を利用してベーチェット病を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ベーチェット病は、原因が明らかにされていない全身的な血管炎であって、口腔、性器および肛門の潰瘍、ブドウ膜炎、関節炎、胃腸管、血管および中枢神経系などの重要臓器の侵犯など多様な症状を特徴とする疾患である。ベーチェット病は、地中海沿岸から極東アジアに達する地域、特に韓国、中国、日本国、そしてトルコ地域で発病頻度が高いと報告されている。
【０００３】
ベーチェット病の臨床様相は、非常に多様であり、反復的な口腔潰瘍のような軽微な症状から眼球、胃腸管、血管および中枢神経系などを侵して、失明、腸潰瘍および穿孔、動脈瘤による喀血、深部静脈血栓症、片側マヒのような致命的な後遺症を残すことがある。ベーチェット病の多様な症状は、２０代から４０代において最もひどい病気の活性度を示して、経済的、社会的損失が非常に大きいと予想される病気である。
【０００４】
ベーチェット病は、多様な器官の侵犯による多様な臨床様相と予後を示すので、これに応じた診断および治療に相当な困難を経験している。したがって、ベーチェット病において合併症と障害を最小化するために、ベーチェット病を早期に正確に診断することは、非常に重要である。
【０００５】
このようなベーチェット病の診断は、ベーチェット病患者と健康なヒトを区分できる客観的な診断的生体標識がないので、主に臨床的な症状に依存している。しかしながら、実際にベーチェット病は、遺伝的、環境的、免疫学的異常によって様々な臓器を侵して多様な臨床症状が現れることになり、このような理由から、従来知られた単一の生体標識は、低い敏感度および特異性を示す。したがって、多様な臨床症状と従来の生体標識の不正確性によって正確な診断が難しいので、発病後に確診まで長時間がかかるという問題点がある。これを克服するために、客観的な診断的生体標識を発明することは、非常に重要である。
【０００６】
したがって、ベーチェット病を診断できる客観的な診断的生体標識を発掘することは、ベーチェット病を早期診断して、ベーチェット病の確診にかかる時間を減らし、発病に適切な治療をすることができるようにして、患者の症状悪化による合併症を最小化させることができる。また、これは、高価の不要な治療を避け、患者にオーダーメード治療、そして疾患と関連した予後に関する正確な情報を提供することによって、さらに良好な治療成績を得ることができるものと考えられる。最近、関節リウマチ、骨関節炎、乾癬関節炎、全身性エリテマトーデスのようなリウマチ疾患において生体標識の発掘のためにメタボロミクス技術が大きな脚光を浴びている［Ｍａｄｓｅｎ  ＲＫ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（２０１１）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．１３（１）：Ｒ１９；Ｋａｐｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｓ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒαｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ（２０１３）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６５：１４４８−６５；Ｋｉｍ  ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｏｂａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｆｒｏｍ  ｏｔｈｅｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．（２０１４）ＰＬｏｓ  ｏｎｅ  ９：ｅ９７５０１］
【０００７】
ベーチェット病において生体標識の発掘のために現在まで報告された技術は、主にゲノミクスまたはプロテオミクス接近であったが、その結果が明確でないか、または実際にベーチェット病の診断に使用されることが困難であり［Ｙｕｋｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｏｆ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｕｖｅｉｔｉｓ：ｓｅｌｅｎｉｕｍ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．（２００７）Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ８４：８２３−８３１；Ｓｅｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｏｆ  ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｂｙ  ａ  ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈ．（２０１０）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５４：３５４−３６１］、ベーチェット病においてメタボロミクスを利用した診断および予後の予測に適切な生体標識の発掘のための研究は、報告されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
これより、本発明者らは、ベーチェット病の迅速かつ便利な診断のための血液サンプル内で特異的な生体標識を探すために、ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ（ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）技法を適用して、検体多様な症状のベーチェット病患者と健康な対照群を鑑別できる血液内代謝物質の代謝物プロファイリングおよび特異的代謝物を探すために研究努力した結果、血液にメタボロミクス技法を適用して、ベーチェット病の正確な診断のための新しい生体標識を発掘することによって、本発明を完成することになった。
【０００９】
したがって、本発明は、代謝物分析を利用してベーチェット病を診断するためのキットを提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、ベーチェット病を診断するための代謝物差別性を分析する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、デカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｌ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）、イノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）、ガラクトネート（ｇａｌａｃｔｏｎａｔｅ）、グリコレート（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）よりなる群から選ばれた一つ以上の血液代謝物に対する定量装置を含むベーチェット病の診断キットを提供する。
【００１２】
また、本発明は、正常対照群とベーチェット病から得られた血液間の代謝物差別性を検出する方法であって、
（１）ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ（ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を利用した代謝物分析段階；
（２）ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳで同定された代謝物に対して部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を利用して代謝物プロファイルの差異を確認する段階；
（３）ＰＬＳ−ＤＡで導き出された代謝物のＶＩＰ（Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）値が１．５以上である値を代謝物バイオマーカーの候補物質として選定し、ＰＬＳ−ＤＡのローディング値を通じて代謝物バイオマーカーの候補物質の増減を確認する段階；
（４）ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ）を利用して代謝物バイオマーカーを検証する段階
を順次に適用して、血液から代謝物バイオマーカーを分析することを含む正常対照群とベーチェット病から得られた血液間の代謝物差別性の分析方法を提供する。
【発明の効果】
【００１３】
本発明は、ベーチェット病患者を特異的に鑑別診断するために、メタボロミクス接近を通じて迅速かつ正確にベーチェット病を診断できる生体標識を発掘した。ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳを利用してベーチェット病患者と一般人の血液内代謝物分析を利用して１０４個の代謝物を検出した。部分的最小二乗回帰法（ＰＬＳ−ＤＡ）とＶＩＰ（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）値、ＲＯＣ（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線のＡＵＣ（ａｒｅａ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｕｒｖｅ）の値、倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）、ｐ値（ｐ−ｖａｌｕｅ）などを算出して、１３個の強力な代謝物質の生体標識を提示した。また、最終的に５個（デカン酸、フルクトース、タガトース、オレイン酸、リノール酸）の生体標識を利用したベーチェット病の診断パネルを製作し、これを外部検体（ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｓｅｔ）を利用して臨床的妥当性を検証した。本発明を通じてメタボロミクスを血液分析に利用してベーチェット病を特異的に診断できる生体標識を最初に糾明した。これは、いまだに完全に明らかにされていないベーチェット病の発病機序を明らかにする研究の基盤になり得る。また、多様な臨床症状に最適化された治療剤の開発にも応用され得る。ベーチェット病の診断を容易にする生体標識の発見は、ベーチェット病患者を迅速かつ正確に診断し、臨床的診断にかかる長い時間を大きく減らして、オーダーメード治療を迅速に提供して、日常生活への復帰を迅速にするなどの社会経済的波及効果も相当であると期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＰＬＳ−ＤＡを利用してベーチェット病患者と健康な対照群の血液内代謝物プロファイリングの差異を示す結果である［ベーチェット病患者と健康な対照群の代謝物が明確な差異を示して区分される。ＢＤ：ベーチェット病；ＨＣ：健康な対照群］。
【図２】ベーチェット病において有意に増加した上位９個の代謝物質（Ａ）と有意に減少した上位４個の代謝物質（Ｂ）の水準比較グラフである［ＢＤ：ベーチェット病；ＨＣ：健康な対照群］。
【図３ａ−３ｃ】ベーチェット病患者内ステロイド、コルヒチン、アザチオプリンの投与グループと非投与グループ間の代謝物的差異をＰＬＳ−ＤＡで示す結果である［それぞれの薬物投与グループと非投与グループ間の差異が、Ｑ２値が非常に低くて再現性がなく、統計学的にグループ間の代謝物的差異がないことを示す］。
【図４】ベーチェット病において有意に増加した上位３個の代謝物質（デカン酸、フルクトース、タガトース）と有意に減少した上位２個の代謝物質（オレイン酸、リノール酸）を利用してベーチェット病を診断する代謝物的生体標識パネルを製作するためにＰＣＡを通じて生成した多変量分析モデルである［ＰＣ１一つの軸を利用したとき、Ｒ２Ｘ値が０．７２１と適切に区分されることを示し、Ｑ２値が０．５１５とモデルが再現性のあることを確認する、ＢＤ：ベーチェット病；ＨＣ：健康な対照群］。
【図５】血液検体を利用したベーチェット病の診断のための代謝物的診断パネルのＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ）結果である［５個の代謝物の組合せを利用した生体標識パネルがベーチェット病の診断において敏感度１００％、特異度９７．１％、ＡＵＣ  ０．９９３の結果を示す］。
【図６】血液サンプルを利用したベーチェット病の診断のための代謝物的診断パネルの外部検体検証結果である［主成分の分析において１０個のベーチェット病患者の血液および１０個の健康な対照群のうち９個のベーチェット病患者および１０個の健康な対照群を正確に予測することができることを示す、ＢＤ：ベーチェット病；ＨＣ：健康な対照群］。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下、本発明の構成を具体的に説明する。
【００１６】
本発明は、デカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｌ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）、イノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）、ガラクトネート（ｇａｌａｃｔｏｎａｔｅ）、グリコレート（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）よりなる群から選ばれた一つ以上の血液代謝物に対する定量装置を含むベーチェット病の診断キットに関する。
【００１７】
本発明者らは、ベーチェット病のバイオマーカーを探すために、患者の血液からサンプルを採取してメタノールを抽出し、ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳを利用してベーチェット病患者と正常ヒトの代謝物プロファイルの差異を比較分析し、この差異を利用してベーチェット病患者を診断できるバイオマーカーの発掘研究を行った。
【００１８】
その結果、アミン類、アミノ酸類、脂肪酸類、有機酸類、リン酸類、糖類などに区分できる１０４種の代謝物を同定した。このうち、アミノ酸類が最も多く検出され、その次に有機酸類、脂肪酸類、糖類、アミン類、リン酸類などの順に検出された。
【００１９】
３５人のベーチェット病患者（ＢＤ）と３５人の健康な対照群（ＨＣ）の血液を比較したとき、部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を通じてベーチェット病患者と健康な対照群の血液内代謝物プロファイルの明確な差異を確認し、それぞれの代謝物質に対して、ＶＩＰ値が１．５以上、倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）が１．２、ＡＵＣが０．８００以上、ｐ値（ｐ−ｖａｌｕｅｓ）が０．０１未満を基準として選定し、１３種の代謝物を新規バイオマーカー候補物質として選定した。それぞれの代謝物質は、ベーチェット病と健康な対照群において統計的に明確な差異を示して、適切な候補生体標識であることを確認した。また、ベーチェット病の特異的代謝物プロファイルと候補生体標識がベーチェット病の治療のために投与した薬物による影響でないことを確認するために、ベーチェット病で投与した薬物によってグループを分けてＰＬＳ−ＤＡ分析を施行した。その結果、ベーチェット病において投与した薬物による代謝物的差異がないことを確認した。
【００２０】
また、候補生体標識に選定された１３個の代謝物質のうちベーチェット病患者の血液において有意に増加した代謝物質３個（デカン酸、フルクトース、タガトース）と、ベーチェット病患者の血液において有意に減少した代謝物質２個（オレイン酸、リノール酸）を選定して、５個の代謝物質から構成されたベーチェット病を鑑別する代謝物的生体標識パネルを生成した。５個の代謝物の生体標識パネルがベーチェット病の診断的目的の利用可能性を確認するために、ＲＯＣ曲線を利用して検証し、敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が１００％、特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）が９７．１％、ＡＵＣ値が０．９９３とベーチェット病を診断するのに非常に優れた結果を示した。また、このモデルの適正性を確認するために、さらに、外部から受けた１０個のベーチェット病患者と１０個の健康な対照群の血液を利用して主成分の分析を施行した。その結果、本発明者らが発見した５個の代謝物質を利用した生体標識パネルがベーチェット病の診断に適切であることを検証することができた。
【００２１】
ひいては、本発明者らにより新しく糾明されたベーチェット病の指標代謝物であるデカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）およびリノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）よりなる群から選ばれた一つ以上以外にも、Ｌ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）、イノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）、ガラクトネート（ｇａｌａｃｔｏｎａｔｅ）、グリコレート（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）よりなる群から選ばれた一つ以上に対する定量情報をさらに含むことによって、より一貫性あり、かつ信頼度の高い正確なベーチェット病の診断が可能である。
【００２２】
本明細書において用語「診断」は、特定の病気または疾患に対する一つの客体の感受性（ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ）を判定すること、一つの客体が特定の病気または疾患を現在持っているか否かを判定すること（例えば、ベーチェット病の同定）、特定の病気または疾患にかかった一つの客体の予後（ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ）を判定すること、またはテラメトリクス（ｔｈｅｒａｍｅｔｒｉｃｓ）（例えば、治療効能に関する情報を提供するために客体の状態をモニタリングすること）を含む。
【００２３】
本発明の診断キットに含まれた定量装置は、クロマトグラフィー／質量分析器であり得る。
【００２４】
本発明において利用されるクロマトグラフィーは、ガスクロマトグラフィー（Ｇａｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、液体−固体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ−Ｓｏｌｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＬＳＣ）、紙クロマトグラフィー（Ｐａｐｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＰＣ）、薄層クロマトグラフィー（Ｔｈｉｎ−Ｌａｙｅｒ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＴＬＣ）、気体−固体クロマトグラフィー（Ｇａｓ−Ｓｏｌｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＧＳＣ）、液体−液体クロマトグラフィー（Ｌｉｑｕｉｄ−Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＬＬＣ）、泡沫クロマトグラフィー（Ｆｏａｍ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＦＣ）、乳化クロマトグラフィー（Ｅｍｕｌｓｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＥＣ）、気体−液体クロマトグラフィー（Ｇａｓ−Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＧＬＣ）、イオンクロマトグラフィー（Ｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＩＣ）、ゲル濾過クロマトグラフィー（Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｈｙ，ＧＦＣ）またはゲル浸透クロマトグラフィー（Ｇｅｌ  Ｐｅｒｍｅａｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，ＧＰＣ）を含むが、これに制限されず、当業界において通常使用されるすべての定量用クロマトグラフィーを使用することができる。好ましくは、本発明において利用されるクロマトグラフィーは、ガスクロマトグラフィーである。なお、本発明において利用される質量分析器は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳまたはＴＯＦ  ＭＳであり、より好ましくはＴＯＦ  ＭＳである。
【００２５】
本発明の血液代謝物は、ガスクロマトグラフィーで各成分が分離され、Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳを経て得られた情報を利用して正確な分子量情報だけでなく、構造情報（ｅｌｅｍｅｎｔａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）を通じて構成成分を確認する。
【００２６】
本発明の好ましい具現例によれば、デカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、Ｌ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）、イノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）、ガラクトネート（ｇａｌａｃｔｏｎａｔｅ）およびグリコレート（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）よりなる群から選ばれた一つ以上の濃度が増加する場合、ベーチェット病を示し、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）よりなる群から選ばれた一つ以上の濃度が減少する場合、ベーチェット病を示す。
【００２７】
本明細書において、用語「血液代謝物濃度の増加」は、健康な正常ヒトに比べてベーチェット病患者の血液代謝物の濃度が測定可能な程度に有意に増加したことを意味し、好ましくは７０％以上増加したことを意味し、より好ましくは３０％以上増加したことを意味する。
【００２８】
本明細書において、用語「血液代謝物の濃度の減少」は、健康な正常ヒトに比べてベーチェット病患者の血液代謝物の濃度が測定可能な程度に有意に減少したことを意味し、好ましくは４０％以上減少したことを意味し、より好ましくは２０％以上減少したことを意味する。
【００２９】
本発明によれば、デカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、Ｌ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）、イノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）、ガラクトネート（ｇａｌａｃｔｏｎａｔｅ）およびグリコレート（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）よりなる群から選ばれた一つ以上は、健康な正常ヒトに比べてベーチェット病患者において有意に増加した濃度を示し、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）よりなる群から選ばれた一つ以上は、健康な正常ヒトに比べてベーチェット病患者において有意に減少した濃度を示す（第１表）。
【００３０】
また、本発明は、正常対照群とベーチェット病から得られた血液間の代謝物差別性を検出する方法であって、
（１）ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ（ｇａｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ／ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）を利用した代謝物分析段階；
（２）ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳで同定された代謝物に対して部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を利用して代謝物プロファイルの差異を確認する段階；
（３）ＰＬＳ−ＤＡで導き出された代謝物のＶＩＰ（Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）値が１．５以上である値を代謝物バイオマーカーの候補物質として選定し、ＰＬＳ−ＤＡのローディング値を通じて代謝物バイオマーカーの候補物質の増減を確認する段階；
（４）ＲＯＣ曲線（Ｒｅｃｅｉｖｅｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｃｕｒｖｅ）を利用して代謝物バイオマーカーを検証する段階
を順次に適用して、血液から代謝物バイオマーカーを分析することを含む正常対照群とベーチェット病から得られた血液間の代謝物差別性の分析方法に関する。
【００３１】
本発明の二つの生体試料群間の代謝物差別性の分析方法は、ベーチェット病と正常群から得られた血液試料群間の代謝物差別性を分析する方法を例にあげて具体的に説明する。
【００３２】
まず、正常ヒトとベーチェット病患者から採取した血液サンプルを１００％メタノールで抽出した後、ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ分析に使用できるように公知の技術を利用して誘導体化過程を経る。
【００３３】
前記ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳを利用した血液の代謝物分析方法は、血液抽出物をＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ機器で分析し、分析結果を統計処理可能な数値に変換した後、変換した数値を利用して統計学的に二つの生体試料群の差別性を検証することを含む。
【００３４】
ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ分析結果を統計処理可能な数値に変換することは、総分析時間を単位時間間隔に分けて単位時間の間に示されたクロマトグラムピークの面積または高さのうち最も大きい数値を単位時間の間の代表値に定めるものであり得る。
【００３５】
本発明の一具現例によれば、ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ分析結果、アミン類、アミノ酸類、脂肪酸類、有機酸類、リン酸類、糖類などに区分できる１０４種の代謝物を同定し、このうちアミノ酸類が最も多く検出され、その次に有機酸類、脂肪酸類、糖類、アミン類、リン酸類などの順に検出された。
【００３６】
前記ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ分析結果として出た代謝物の強度を総同定された代謝物の強度の合計で割って各代謝物を標準化し、ＰＬＳ−ＤＡ分析を実施する。
【００３７】
代謝物のＰＬＳ−ＤＡローディング値とＶＩＰ値から構成されたＶ−ｐｌｏｔを作成し、ＶＩＰ値が１．５以上である値を代謝物バイオマーカーの候補物質として選定し、ＰＬＳ−ＤＡのローディング値の増減を確認し、この際、ローディング値が正数であることは、代謝物の増加傾向を、ローディング値が負数であることは、代謝物の減少傾向を示すことである。
【００３８】
ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳで分析された血液の代謝物の強度を利用して代謝物の増減を確認することができる。
【００３９】
ＲＯＣ曲線を通じて前記代謝物バイオマーカーを検証する。
【００４０】
本発明の一具現例によれば、ベーチェット病を診断するためのバイオマーカーとして、デカン酸（ｄｅｃａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ）、フルクトース（ｆｒｕｃｔｏｓｅ）、タガトース（ｔａｇａｔｏｓｅ）、オレイン酸（ｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、リノール酸（ｌｉｎｏｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、Ｌ−システイン（Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）、ソルビトール（ｓｏｒｂｉｔｏｌ）、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）、イノシン（ｉｎｏｓｉｎｅ）、ガラクトネート（ｇａｌａｃｔｏｎａｔｅ）、グリコレート（ｇｌｙｃｏｌａｔｅ）、パルミチン酸（ｐａｌｍｉｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびヒスチジン（ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）よりなる群から選ばれた一つ以上を使用することができる。
【００４１】
本発明の正常群とベーチェット病から得られた血液試料群間の代謝物差別性の分析方法を通じてさらに一貫性のありかつ信頼度の高い正確なベーチェット病を診断することができ、これを治療剤の開発に適用することができる。
【００４２】
以下、本発明による実施例を通じて本発明をより詳細に説明するが、本発明の範囲が下記提示された実施例により制限されるものではない。
【実施例】
【００４３】
実施例１：ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳを利用した代謝物の同定
ベーチェット病患者および健康な対照群それぞれの血液２０μｌに純粋メタノール９８０μｌを混ぜ、遠心分離して、代謝物を抽出した。
【００４４】
ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ分析のための誘導体化過程は、次のとおりである。
抽出したサンプルをスピードバックで乾燥させた後に、５μｌの４０％（ｗ／ｖ）濃度のＯ−メチルヒドロキシルアミン塩酸塩のピリジン溶液を入れ、３０度で２００ｒｐｍで９０分間反応をさせた。そして、４５μｌのＮ−メチル−Ｎ−（トリメチルシリル）トリフルオロアセトアミドを入れ、３７度で２００ｒｐｍで３０分間反応を実施した。
【００４５】
ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ分析のための機器条件は、次のとおりである。
分析するときに使用したカラムは、ＲＴＸ−５Ｓｉｌ  ＭＳ  キャピラリーカラム（３０ｍ  長さ、０．２５ｍｍ  フィルム厚み，および  ２５ｍｍ  内径）であり、ＧＣカラムの温度条件は、まず５０度で５分間維持させた後、３３０度まで昇温させた後、１分間維持した。１μｌのサンプルを非分割法（ｓｐｌｉｔｌｅｓｓ）で注入（ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。移送ライン（Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｌｉｎｅ）の温度とイオン源（Ｉｏｎ  ｓｏｕｒｃｅ）温度は、それぞれ２８０度、２５０度に維持させた。ＧＣ／ＴＯＦ  ＭＳ結果を保有しているライブラリーで探して同定し、１０４個の代謝物を同定した（第１表）。
【００４６】
下記第１表（ベーチェット病患者と健康な対照群の血液検体を利用して代謝物分析結果として確認された１０４個の代謝物）のように、それぞれの代謝物群別に分類したとき、アミノ酸２６％、有機酸１９％、脂肪酸１７％、糖１５％、アミン１１％、リン５％、その他７％であることが示された。
【００４７】
第１表
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【００４８】
実施例２：ＰＬＳ−ＤＡを利用したベーチェット病患者と健康な対照群の血液内代謝物プロファイルの差異
実施例１から得られた代謝物の強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を総同定された代謝物の強度の合計で割って各代謝物を標準化した。その後、ＳＩＭＣＡ−Ｐ＋（ｖｅｒ．１２．０）を利用してＰＬＳ−ＤＡ分析を実施した。
【００４９】
図１に示されたように、ベーチェット病患者と健康な対照群の血液内代謝物プロファイリングが明確に違いがあることを確認した。
【００５０】
下記第２表は、図１のＰＬＳ−ＤＡモデルに使用された１０４個の代謝物がモデルに影響を及ぼす程度および方向性を示すＶＩＰ値およびローディング（ｌｏａｄｉｎｇ）値を示す結果である。
【００５１】
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【００５２】
実施例３：ベーチェット病患者に特異的な生体標識代謝物質の選別
ベーチェット病患者において特異的に増減した生体標識を探すために、それぞれの代謝物質から実施例２から導き出された代謝物プロファイリングの差異に影響を及ぼすＶＩＰ値、倍率変化（ｆｏｌｄ  ｃｈａｎｇｅ）、ＡＵＣ、ｐ値（ｐ−ｖａｌｕｅ）を求めた。ＶＩＰ値が１．５以上、倍率変化が１．２、ＡＵＣが０．８００以上、ｐ値が０．０１未満の基準をそれぞれの代謝物質に対して求め、１３個の代謝物質がベーチェット病の診断に適切であることを示した（第３表）。また、この代謝物質の絶対的強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）をグループ別に比較した（図２）。
【００５３】
下記第３表は、ベーチェット病の診断のための潜在的生体標識に選ばれた１３個の代謝物質のＶＩＰ、ＡＵＣ、倍率変化、ｐ値［ＢＤ、ベーチェット病患者；ｃｏｎｔｒｏｌ、健康な対照群］を示すものである。
【００５４】
第３表
【表８】
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AUC, ROC曲線下面積; BD, ベーチェット病; VIP, 変数重要性
【００５５】
実施例４：ＰＬＳ−ＤＡを利用したベーチェット病患者において増減した代謝物質に薬物効果存在有無の検証
ベーチェット病患者において特異的に増減した生体標識が薬物により増減した物質でないことを示すために、それぞれの薬物投与グループｖｓ．薬物非投与グループをＰＬＳ−ＤＡを利用して比較した結果、分離水準が適切でなく、再現性のないことが示された。３個の投与された薬物グループであるステロイド、コルヒチン、アザチオプリンにおいてそれぞれ再現性のない結果を示し、薬物による差異が統計的に有意でなかった。
【００５６】
したがって、実施例３に示されたベーチェット病において増減した代謝物質が病気自体による変化であるから、生体標識として適切であることを確認した（図３ａ〜図３ｃ）。
【００５７】
実施例５：血液検体を通したベーチェット病の診断のために５個の代謝物質を利用した代謝物的診断パネルの生成
実施例３から選定されたベーチェット病の診断のための生体標識１３個のうちベーチェット病において特異的に増加した物質上位３個（デカン酸、フルクトース、タガトース）、ベーチェット病において特異的に減少した物質上位２個（オレイン酸、リノール酸）を選定して、ベーチェット病を診断できる代謝物的診断パネルを製作しようとした。したがって、５個の代謝物質をベースにＢＤとＨＣを区分できる多変量区分モデルを主成分分析をベースに生成した。ＰＣ１の一つの軸を利用したとき、ＢＤとＨＣが完全に区分されることを示すことができ、モデルの数値は、Ｒ２Ｘ値が０．７２１、Ｑ２値が０．５１５であって、ベーチェット病患者と健康な対照群を適切にかつ再現性のあるように区分した（図４）。
【００５８】
実施例６：血液検体を利用したベーチェット病の診断のための代謝物的診断パネルのＲＯＣおよび外部検体検証を通したモデル検証
実施例５を通じて生成された血液検体を通したベーチェット病の診断用代謝物的生体標識パネルが診断に適切であるか否かを調べるために、モデル内の各検体のＰＣ１スコアを利用してＲＯＣ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ  ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）曲線を描いた。その結果、敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）が１００％、特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）が９７．１％、ＡＵＣ値が０．９９３であって、モデルがベーチェット病の診断に非常に適していることを示した（図５）。また、このパネルが外部検体を利用してベーチェット疾患の診断を予測することができるか否かを調べるために、ベーチェット病患者および健康な対照群の血液検体を各１０個ずつ、合計２０個の検体を利用した。その結果、合計２０個の検体のうち１９個の検体を正確にベーチェット病患者あるいは健康な対照群と予測することができることを示して、５個の代謝物生体標識パネルが外部検体のベーチェット病の診断にも適切であることを示した（図６）。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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