(57)【要約】ＰＨＦ５Ａ及びＳＦ３Ｂ１サブユニット中の変異を含む、スプライセオソーム変異が本明細書において記載される。本出願はまた、スプライセオソーム中の変異の有無を検出すること並びにスプライスモジュレーター治療に対する応答性を診断する方法、腫瘍性疾患を治療する方法及び変異状態に基づいて治療をモニタリング又は変更する方法も記載する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象を治療する方法であって、
ａ）前記対象においてＰＨＦ５Ａ中の変異がないことを検出すること及び、
ｂ）ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠く前記対象にスプライシングモジュレーターを投与すること
を含む、方法。
【請求項２】
腫瘍性疾患を有する対象を治療する方法であって、
ａ）ＰＨＦ５Ａ中の変異を検出すること及び
ｂ）前記対象においてスプライセオソームを標的としない前記腫瘍性疾患の代替治療を投与すること
を含む、方法。
【請求項３】
腫瘍性疾患を有する対象を治療する方法であって、
ａ）前記対象から生体サンプルを得ること、
ｂ）前記サンプルにおいてＰＨＦ５Ａ中の変異を有さない対象を決定すること及び、
ｃ）前記対象に治療上有効な量のスプライシングモジュレーターを投与すること
を含む、方法。
【請求項４】
スプライシングモジュレーターに対して耐性の腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる患者を同定する方法であって、
ａ）対象からサンプルを得ること及び、
ｂ）前記サンプルにおいてＰＨＦ５Ａ中の変異を検出すること
を含み、
前記サンプルにおいてＰＨＦ５Ａ中の変異が検出される場合に、前記患者が、治療耐性腫瘍性疾患を有すると同定される、方法。
【請求項５】
スプライシングモジュレーターに対して応答性である腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる患者を同定する方法であって、
ａ）対象からサンプルを得ること及び、
ｂ）前記サンプルにおいてＰＨＦ５Ａ中の変異の有無を検出すること
を含み、
前記サンプルにおいてＰＨＦ５Ａ中の変異が検出されない場合に、前記患者が、治療応答性腫瘍性疾患を有すると同定される、方法。
【請求項６】
腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象の治療計画を決定する方法であって、ＰＨＦ５Ａ中の変異の有無を同定すること及び、変異がない場合にスプライシングモジュレーターを用いて、変異が存在する場合にはスプライセオソームを標的としない代替治療を用いて治療することを決定することを含む、方法。
【請求項７】
スプライシングモジュレーターを用いる治療に適した腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象を同定する方法であって、
ａ）前記対象からサンプルを得ること、
ｂ）前記サンプルにおいてＰＨＦ５Ａ中の変異の有無を検出すること及び、
ｃ）ＰＨＦ５Ａ変異がない場合に、前記対象を前記スプライシングモジュレーターを用いる治療に適していると同定すること
を含む、方法。
【請求項８】
腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象においてスプライシングモジュレーター治療有効性をモニタリングする方法であって、
ａ）前記対象にスプライシングモジュレーターを投与すること、
ｂ）前記スプライシングモジュレーターを投与した後に、ＰＨＦ５Ａ中の変異の有無を検出すること、
ｃ）変異がない場合に、さらなる用量のスプライシングモジュレーターを投与すること及び、
ｄ）ＰＨＦ５Ａ中の変異が検出されるまで、ステップａ）〜ｃ）を反復することを継続すること
を含む、方法。
【請求項９】
腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象を治療する方法であって、
ａ）対象においてＰＨＦ５Ａ中の変異がないことを検出すること、
ｂ）ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠く対象にスプライシングモジュレーターを投与すること、
ｃ）前記スプライシングモジュレーターを投与した後に、ＰＨＦ５Ａ中の変異の有無を決定すること及び、
ｄ）変異がない場合に、さらなる用量のスプライシングモジュレーターを投与すること
を含む、方法。
【請求項１０】
腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象においてＰＨＦ５Ａ中の変異を検出する方法であって、
ａ）前記対象から腫瘍サンプルを得ること、
ｂ）前記サンプルをスプライシングモジュレーターと接触させること、
ｃ）前記スプライシングモジュレーターとの接触後に前記腫瘍の成長又は体積を測定すること及び、
ｄ）既知ＰＨＦ５Ａ状態の対照腫瘍サンプルに対して比較すること
を含み、
前記対照サンプルと比較して、腫瘍成長又は体積の変化又は変化がないことが、変異の存在を示す、方法。
【請求項１１】
変異を欠く対象にスプライスモジュレーターを投与することをさらに含む、請求項５〜７及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
変異を有する対象に、スプライセオソームを標的としない代替化合物を投与することをさらに含む、請求項４〜６及び１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記対照腫瘍サンプルが、ＰＨＦ５Ａ変異を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記対照腫瘍サンプルが、ＰＨＦ５Ａ変異を有さない、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象から生体サンプルを得ることをさらに含む、請求項１、２、６、８又は９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記スプライシングモジュレーターが、ＳＦ３ｂ複合体モジュレーターを含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記スプライシングモジュレーターが、ＳＦ３Ｂ１複合体モジュレーターを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記スプライシングモジュレーターが、ＰＨＦ５Ａモジュレーターを含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＳＦ３ｂ複合体モジュレーターが、プラジエノライド又は誘導体である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記プラジエノライド又は誘導体が、Ｅ７１０７、プラジエノライドＢ又はプラジエノライドＤを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＳＦ３ｂ複合体モジュレーターが、ハーボキシジエン又は誘導体である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ハーボキシジエン又は誘導体が、６−ノルハーボキシジエンを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＳＦ３ｂ複合体モジュレーターが、スプライセオスタチン又は誘導体である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＳＦ３ｂ複合体モジュレーターが、スデマイシン又は誘導体である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＨＦ５Ａ変異が、ＰＨＦ５Ａ−ＳＦ３Ｂ１境界面中又はその付近に位置する、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記ＰＨＦ５Ａ変異が、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６変異を含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記ＰＨＦ５Ａ変異が、Ｙ３６Ｃ変異又はＹ３６Ａ、Ｙ３６Ｃ、Ｙ３６Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｙ３６Ｗ、Ｙ３６Ｅ又はＹ３６Ｒ変異から選択されるＰＨＦ５Ａ中のＹ３６変異を含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｙ３６変異が、ＰＨＦ５Ａ−ＳＦ３Ｂ１境界面中又はその付近に位置する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＰＨＦ５Ａ変異を欠く前記対象が、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン、スデマイシン、それらの誘導体又は組合せを投与される、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤又はプロテアソーム阻害剤を投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項３１】
Ｙ３６変異は、前記対象が、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン又はスデマイシン、その誘導体又はその組合せに対して耐性であるであることを示す、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が、ＳＦ３Ｂ１中に変異を有するか否かを決定することをさらに含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記対象が、ＳＦ３Ｂ１中の変異及びＰＨＦ５Ａを欠き、前記対象が、プラジエノライド又は誘導体を投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記プラジエノライド又は誘導体が、Ｅ７１０７を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
Ｅ６２２Ｄ、Ｅ６２２Ｋ、Ｅ６２２Ｑ、Ｅ６２２Ｖ、Ｙ６２３Ｃ、Ｙ６２３Ｈ、Ｙ６２３Ｓ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｒ６２５Ｐ、Ｒ６２５Ｓ、Ｒ１０７４Ｈ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｉ、Ｎ６２６Ｓ、Ｎ６２６Ｙ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｌ、Ｈ６６２Ｑ、Ｈ６６２Ｒ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ｉ、Ｔ６６３Ｐ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｋ６６６Ｓ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、Ｖ７０１Ａ、Ｖ７０１Ｆ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｆ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｓ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｅ、Ｇ７４０Ｋ、Ｇ７４０Ｒ、Ｇ７４０Ｖ、Ｋ７４１Ｎ、Ｋ７４１Ｑ、Ｋ７４１Ｔ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ７８１Ｅ、Ｄ７８１Ｇ及びＤ７８１Ｎのうち１つ又は複数から選択されるＳＦ３Ｂ１変異を同定することによって、前記対象が、腫瘍性疾患を有するか否かを決定することをさらに含む、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象が、Ｒ１０７４ＨにＳＦ３Ｂ１変異をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記腫瘍性疾患が、血液悪性腫瘍、固形腫瘍又は軟部組織肉腫である、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記腫瘍性疾患が、血液悪性腫瘍である、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記血液悪性腫瘍が、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄単球性白血病又は急性骨髄性白血病である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
対象から、血液、血液画分又は前記血液若しくは血液画分から得られた細胞から選択されるサンプルを得ることを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項４１】
野生型核酸又はタンパク質配列に対して比較することによって変異の有無を検出することを含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
ＰＨＦ５Ａ中の変異を決定又は同定することが、前記患者から得たサンプルにおいてＰＨＦ５Ａをコードする遺伝子をシーケンシングすることを含み、及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異を決定又は同定することが、前記患者から得たサンプルにおいてＳＦ３Ｂ１をコードする遺伝子をシーケンシングすることを含む、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
シーケンシングが、サンプル中の前記ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１遺伝子のＰＣＲ増幅、サンプル中のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、サンガーシーケンシング、全エキソームシーケンシング、単一ヌクレオチド多型解析、ディープシーケンシング、標的化遺伝子シーケンシング又はそれらの任意の組合せを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
シーケンシングが、前記ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１遺伝子のＰＣＲ増幅、リアルタイム−ＰＣＲ又は標的化遺伝子シーケンシングを含む、請求項４２又は４３に記載の方法。
【請求項４５】
ａ）ＰＨＦ５Ａ中の変異を検出する試薬及び、
ｂ）変異を検出するために使用するための使用説明書
を含む、キット。
【請求項４６】
ＳＦ３Ｂ１中の変異を検出するための試薬をさらに含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
前記変異が、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異及び／又はＳＦ３Ｂ１中のＫ１０７１、Ｒ１０７４又はＶ１０７８変異である、請求項４６に記載のキット。
【請求項４８】
前記スプライセオスタチンが、ＦＲ９０１４６４又はスプライセオスタチンＡを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項４９】
前記スデマイシンが、スデマイシンＤ６を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＰＨＦ５Ａ変異が、Ｙ３６Ｃ変異を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項５１】
前記対象が、スプライセオスタチンＡを投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象が、スデマイシンＤを投与される、請求項２９に記載の方法。
【請求項５３】
前記代替治療が、プロテアソーム阻害剤である、請求項３０に記載の方法。
【請求項５４】
前記プロテアソーム阻害剤が、ボルテゾミブである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が、ＳＦ３Ｂ１及びＰＨＦ５Ａ中の変異を欠き、前記対象が、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン、スデマイシン、それらの誘導体又は組合せを投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項５６】
前記対象が、ＳＦ３Ｂ１及び／又はＰＨＦ５Ａ中の変異を有し、前記対象が、スプライセオソームを標的としない腫瘍性疾患の治療を投与される、請求項３２に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が、ＳＦ３Ｂ１中の位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８のうち１つ又は複数に変異を含む癌を有する、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５８】
前記対象が、ＳＦ３Ｂ１中のＫ１０７１Ｅ変異、Ｒ１０７４Ｈ変異及びＶ１０７８Ａ又はＶ１０７８Ｉ変異のうち１つ又は複数を含む癌を有する、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記対象が、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異並びにＳＦ３Ｂ１中のＫ１０７１Ｅ変異、Ｒ１０７４Ｈ変異及びＶ１０７８Ａ又はＶ１０７８Ｉ変異のうち１つ又は複数を含む癌を有する、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６０】
前記スデマイシンが、スデマイシンＤ６を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記対象がＫ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８変異から選択されるＳＦ３Ｂ１中の１つ又は複数の変異を含まず、前記対象がＰＨＦ５Ａ中の変異含まず、前記対象が、スプライセオソーム阻害剤を投与される、前記の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
ＰＨＦ５Ａ中の前記変異が、Ｙ３６変異である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記のＰＨＦ５Ａ中のＹ３６変異が、Ｙ３６Ａ、Ｙ３６Ｃ、Ｙ３６Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｙ３６Ｗ、Ｙ３６Ｅ又はＹ３６Ｒ変異から選択される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象が、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン、スデマイシン、それらの誘導体又は組合せを投与される、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＳＦ３Ｂ１変異が、ＳＦ３Ｂ１中のＫ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８変異から選択される１つ又は複数の変異を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項６６】
前記対象が、スプライセオソームを標的としない新生物のための治療を投与される、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象を治療する方法であって、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠く対象にスプライシングモジュレーターを投与することを含む、方法。
【請求項６８】
前記対象が、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６変異を有さない、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記対象が、ＳＦ３Ｂ１変異を有さない、請求項６７又は６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記対象が、ＳＦ３Ｂ１中のＫ１０７１、Ｒ１０７４又はＶ１０７８変異を有さない、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記対象が、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン、スデマイシン、それらの誘導体又は組合せを投与される、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
腫瘍性疾患を有する対象を治療する方法であって、
ａ）前記対象から生体サンプルを得ること、
ｂ）前記サンプルにおいてＰＨＦ５Ａ中の変異の有無を決定すること及び、
ｃ）ＰＨＦ５Ａ変異がない場合に、前記対象に治療上有効な量のスプライシングモジュレーター又はＰＨＦ５Ａ変異が存在する場合にスプライセオソームを標的としない前記腫瘍性疾患の代替治療を投与すること
を含む、方法。
【請求項７３】
腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象を治療する方法であって、
ａ）前記対象においてＳＦ３Ｂ１中の変異がないことを検出すること及び、
ｂ）ＳＦ３Ｂ１中の変異を欠く前記対象にスプライシングモジュレーターを投与すること
を含む、方法。
【請求項７４】
腫瘍性疾患を有する対象を治療する方法であって、
ａ）前記対象から生体サンプルを得ること、
ｂ）前記サンプルにおいて前記対象がＳＦ３Ｂ１中の変異を有さないことを決定すること及び
ｃ）前記対象に治療上有効な量のスプライシングモジュレーターを投与すること
を含む、方法。
【請求項７５】
スプライシングモジュレーターを用いる治療に適した腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象を同定する方法であって、
ａ）前記対象からサンプルを得ること、
ｂ）前記サンプルにおいてＳＦ３Ｂ１中の変異の有無を検出すること及び、
ｃ）ＳＦ３Ｂ１変異がない場合に、前記対象を前記スプライシングモジュレーターを用いる治療に適していると同定すること、
を含む、方法。
【請求項７６】
腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象を治療する方法であって、ＳＦ３Ｂ１中の変異を欠く前記対象にスプライシングモジュレーターを投与することを含む、方法。
【請求項７７】
腫瘍性疾患を有する対象を治療する方法であって、
ａ）前記対象から生体サンプルを得ること、
ｂ）前記サンプルにおいてＳＦ３Ｂ１中の変異の有無を決定すること及び、
ｃ）ＳＦ３Ｂ１変異がない場合に前記対象に治療上有効な量のスプライシングモジュレーター又はＳＦ３Ｂ１変異が存在する場合にスプライセオソームを標的としない前記腫瘍性疾患の代替治療を投与すること
を含む、方法。
【請求項７８】
前記ＳＦ３Ｂ１変異が、ＳＦ３Ｂ１中のＫ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８変異から選択される１つ又は複数の変異を含む、請求項７３〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記対象がＰＨＦ５Ａ変異を有さない、請求項７３〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記対象がＰＨＦ５Ａ中のＹ３６変異を有さない、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記スプライシングモジュレーターが、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン、スデマイシン、それらの誘導体又は組合せを含む、請求項７３〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[01]本出願は、２０１７年３月１５日に出願された米国特許仮出願番号第６２／４７１，９０３号の優先権の利益を主張し、その全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
[02]本開示は、腫瘍性疾患を有する対象を診断、予測、モニタリング、治療する方法を提供する。具体的には、本明細書において開示される方法は、腫瘍性疾患を有する対象においてスプライセオソーム変異、例えばＰＨＦ５Ａ変異の存在及び／又は不在を検出すること及びそれによって適当な治療計画を選択する方法を含む。腫瘍性疾患を有する対象を、その変異状態に基づいて治療する方法並びに変異状態に基づいて治療有効性をモニタリングする方法も本明細書において記載される。
【背景技術】
【０００３】
[03]ＲＮＡスプライシングは、スプライセオソーム、５つの小さい核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡＵ１、Ｕ２、Ｕ４、Ｕ５及びＵ６）及び関連タンパク質から構成される動的多タンパク質−ＲＮＡ複合体によって触媒される。スプライセオソームは、プレｍＲＮＡで組み立てられて、イントロンの切り出し及びエキソンの連結を触媒する、複数のＲＮＡ及びタンパク質相互作用の動的カスケードを確立する（Ｍａｔｅｒａ及びＷａｎｇ、Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第１５巻、１０８〜２１頁（２０１４年））。証拠を蓄積することによって、ヒト疾患が、多数の遺伝子に影響を及ぼすＲＮＡスプライシングの調節不全と関連付けられてきた（Ｓｃｏｔｔｉ及びＳｗａｎｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  第１７巻、１９〜３２頁（２０１６年））。
【０００４】
[04]スプライセオソームの多タンパク質−ＲＮＡ複合体は、５つのｓｎＲＮＡに加えて、ＳＦ１〜ＳＦ３複合体、Ｕ２ＡＦ１及びＳＲＳＦ２などのさまざまなタンパク質サブユニットを含む。１つのこのようなユニットであるスプライシング因子ＳＦ３ｂは、それ自体、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ３及びＰＨＦ５Ａなどのサブユニットを含む多タンパク質複合体である。ＳＦ３ｂ複合体は、Ｕ２  ｓｎＲＮＡ、スプライシング因子ＳＦ３ａ及びＳＦ３ｂ並びにその他の関連タンパク質によって組み立てられたＵ２  ｓｎＲＮＡ−タンパク質複合体（ｓｎＲＮＰ）の一部である。これらは、一緒になって、１７Ｓ  Ｕ２  ｓｎＲＮＰを形成し、イントロンの３’側でＡＴＰ依存性に組み立てられてＡ複合体を形成する（Ｂｏｎｎａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  第１１巻、８４７〜５９頁（２０１２年））。ＳＦ３ｂコア複合体は、ＳＦ３Ｂ１／ＳＡＰ１５５、ＳＦ３Ｂ２／ＳＡＰ１４５、ＳＦ３Ｂ３／ＳＡＰ１３０、ＳＦ３Ｂ４／ＳＡＰ４９、ＳＦ３Ｂ５／ＳＡＰ１０、ＳＦ３Ｂ６／ＳＡＰ１４ａ及びＰＨＦ５Ａ／ＳＡＰ１４ｂを含むいくつかのスプライセオソーム関連タンパク質（ＳＡＰ）を含有する。
【０００５】
[05]最近の研究によって、ＳＦ３Ｂ１、Ｕ２ＡＦ１及びＳＲＳＦ２などのスプライシング因子が、慢性リンパ性白血病及び骨髄異形成症候群を含む血液悪性腫瘍と関連付けられた（Ｂｏｎｎａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．  Ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  第１１巻、８４７〜５９頁（２０１２年））。したがって、最近の努力は、これらの疾患を治療するための治療アプローチとしてスプライシング調節性小分子又はオリゴヌクレオチドを開発することにささげられてきた。これらのうちいくつかは、癌及び重症神経筋疾患の臨床治験において試験されてきた、又は試験されている（Ｅｓｋｅｎｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  第１９巻、６２９６〜３０４頁（２０１３年）；Ｈｏｎｇら、Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ  ｎｅｗ  ｄｒｕｇｓ  第３２巻、４３６〜４４頁（２０１４年）；Ｎａｒｙｓｈｋｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第３４５巻、６８８〜９３頁（２０１４年）；Ｐａｌａｃｉｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第１１巻、５１１〜７頁（２０１５年））。それにもかかわらず、これらのスプライシング調節性物質に対する患者の応答性は、一致していなかった。Ｋａｉｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第３巻、５７０〜５頁（２００７年）；Ｋｏｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第３巻、５７０〜５頁（２００７年）；Ｈａｓｅｇａｗａら、ＡＣＳ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第６巻、２２９〜３３頁（２０１１年）。
【０００６】
[06]プラジエノライドＢ及びＥ７１０７の、スプライシング調節性効果及び抗増殖性効果をほぼ完全に消失させるＳＦ３Ｂ１における単一アミノ酸置換（Ｒ１０７４Ｈ）を同定するために、表現型耐性クローンプロファイリングが利用されてきた（Ｙｏｋｏｉら、Ｔｈｅ  ＦＥＢＳ  ｊｏｕｒｎａｌ  第２７８巻、４８７０〜８０頁（２０１１年））。しかし、ＳＦ３ｂ複合体の阻害の正確な機序及びその他の構成成分の役割は未だ不明確である。ＳＦ３ｂ複合体及びその構成成分の機能及び分子機構を理解することは、次世代スプライセオソーム阻害剤の開発を導き、スプライシング調節性化合物に対して又はその他の腫瘍介入戦略に対して応答する可能性がより高い患者の標的化治療を可能にするのに役立ち得る。
【発明の概要】
【０００７】
[07]したがって、本開示は、幾分かは、特定のスプライセオソーム変異、特に、スプライシング調節に対する耐性を付与するＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中のものに基づいて、患者において治療有効性を検出、診断、予後判定、治療及びモニタリングするための新規アプローチを提供する。さらに、変異状態を使用して腫瘍性疾患を治療及び同定する方法も本明細書において開示される。
【０００８】
[08]種々の実施形態では、腫瘍性疾患を有する、又は腫瘍性疾患を有すると疑われる対象を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象においてＰＨＦ５Ａ中の変異の有無を検出することを含む。いくつかの実施形態では、方法はまた、対象においてＳＦ３Ｂ１中の変異の有無を検出することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異を欠く対象にスプライシングモジュレーターを投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象においてＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異の存在を検出すること並びにスプライセオソームを標的としない代替療法を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、対象から生体サンプルを得ることを含み得る。
【０００９】
[09]種々の実施形態では、スプライシングモジュレーターに対して耐性又は応答性の腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象を同定する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象からサンプルを得ること及びＰＨＦ５Ａ中の変異の有無を検出することを含む。いくつかの実施形態では、方法はまた、対象からサンプルを得ること及びＳＦ３Ｂ１中の変異の有無を検出することを含む。いくつかの実施形態では、患者は、サンプルにおいてＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中に変異が検出される場合に、治療耐性腫瘍性疾患を有すると同定される。いくつかの実施形態では、患者は、サンプルにおいてＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中に変異が検出されない場合に、治療応答性腫瘍性疾患を有すると同定される。
【００１０】
[010]種々の実施形態では、腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象の治療計画を決定する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異の有無を同定することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、変異が存在しない場合にスプライシングモジュレーターを用いて治療される。いくつかの実施形態では、対象は、変異が存在する場合にスプライセオソームを標的としない代替治療を用いて治療される。いくつかの実施形態では、方法は、対象から生体サンプルを得ることを含み得る。
【００１１】
[011]種々の実施形態では、スプライシングモジュレーターを用いる治療にとって適している腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象を同定する方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象からサンプルを得ること及びＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異の有無を検出することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中に変異が存在しない場合に、スプライシングモジュレーターを用いる治療にとって適していると同定される。いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーターを用いる治療にとって適している腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象を同定する方法であって、対象からサンプルを得ることと、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異の有無を検出することと、変異が存在しない場合に、スプライシングモジュレーターを用いる治療にとって適していると、対象を同定することとを含む方法が本明細書において提供される。
【００１２】
[012]種々の実施形態では、腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象において、スプライシングモジュレーター治療有効性をモニタリングする方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象にスプライシングモジュレーターを投与することと、スプライシングモジュレーターを投与した後にＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異の有無を検出することと、変異が存在しない場合にはさらなる用量のスプライシングモジュレーターを投与することとを含む。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中に変異が検出されるまで、方法を反復してもよい。
【００１３】
[013]種々の実施形態では、腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象においてＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中に変異を検出する方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象から腫瘍サンプルを得ることと、サンプルをスプライシングモジュレーターと接触させることと、スプライシングモジュレーターとの接触後に腫瘍の成長又は体積を測定することとを含む。
【００１４】
[014]種々の実施形態では、本明細書において提供される方法は、変異を欠く対象にスプライシングモジュレーターを投与することをさらに含み得る。種々の実施形態では、変異を欠く対象に、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン、スデマイシン又はその誘導体又は組合せを投与してもよい。いくつかの実施形態では、対象に、スプライセオスタチンＡを投与する。いくつかの実施形態では、対象に、スデマイシンＤを投与する。
【００１５】
[015]いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーターは、ＳＦ３ｂ複合体モジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーターは、ＳＦ３Ｂ１モジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーターは、ＰＨＦ５Ａモジュレーターを含む。いくつかの実施形態では、ＳＦ３ｂモジュレーターは、プラジエノライド又は誘導体である。いくつかの実施形態では、プラジエノライド又は誘導体は、Ｅ７１０７、プラジエノライドＢ又はプラジエノライドＤを含む。いくつかの実施形態では、ＳＦ３ｂモジュレーターは、ハーボキシジエン又は誘導体である。いくつかの実施形態では、ＳＦ３ｂモジュレーターは、スプライセオスタチン又は誘導体である。いくつかの実施形態では、スプライセオスタチンは、ＦＲ９０１４６４又はスプライセオスタチンＡを含む。いくつかの実施形態では、ＳＦ３ｂモジュレーターは、スデマイシン又は誘導体を含む。いくつかの実施形態では、スデマイシンは、スデマイシンＤ６を含む。
【００１６】
[016]種々の実施形態では、本明細書において提供される方法は、スプライセオソームを標的としない代替治療を投与することを含み得る。いくつかの実施形態では、治療は、細胞傷害性薬剤、細胞増殖抑制剤又はプロテアソーム阻害剤を含み得る。いくつかの実施形態では、代替治療は、プロテアソーム阻害剤である。いくつかの実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、ボルテゾミブである。
【００１７】
[017]種々の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異は、ＰＨＦ５Ａ−ＳＦ３Ｂ１境界面中又はその付近に位置する。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ−ＳＦ３Ｂ１境界面中又はその付近の変異は、ＰＨＦ５Ａ中の位置Ｙ３６の変異並びに／又はＳＦ３Ｂ１中のＫ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８から選択される位置の１つ又は複数の変異である。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異は、Ｙ３６Ｃ変異又はＹ３６Ａ、Ｙ３６Ｃ、Ｙ３６Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｙ３６Ｗ、Ｙ３６Ｅ若しくはＹ３６Ｒ変異を含む。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異は、Ｙ３６Ｃ変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＦ３Ｂ１中の変異は、Ｋ１０７１Ｅ変異、Ｒ１０７４Ｈ変異及び／又はＶ１０７８Ａ若しくはＶ１０７８Ｉ変異のうち１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６変異並びに／又はＳＦ３Ｂ１中のＫ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８変異は、対象が、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン又はスデマイシン又はその誘導体又は組合せを用いる治療に対して耐性であることを示す。いくつかの実施形態では、変異を欠くことは、対象が、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン又はスデマイシン又はその誘導体又は組合せを有する治療に対して応答性であり得ることを示す。
【００１８】
[018]いくつかの実施形態では、方法は、Ｅ６２２Ｄ、Ｅ６２２Ｋ、Ｅ６２２Ｑ、Ｅ６２２Ｖ、Ｙ６２３Ｃ、Ｙ６２３Ｈ、Ｙ６２３Ｓ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｒ６２５Ｐ、Ｒ６２５Ｓ、Ｒ１０７４Ｈ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｉ、Ｎ６２６Ｓ、Ｎ６２６Ｙ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｌ、Ｈ６６２Ｑ、Ｈ６６２Ｒ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ｉ、Ｔ６６３Ｐ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｋ６６６Ｓ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、Ｖ７０１Ａ、Ｖ７０１Ｆ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｆ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｓ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｅ、Ｇ７４０Ｋ、Ｇ７４０Ｒ、Ｇ７４０Ｖ、Ｋ７４１Ｎ、Ｋ７４１Ｑ、Ｋ７４１Ｔ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ７８１Ｅ、Ｄ７８１Ｇ及びＤ７８１Ｎのうち１つ又は複数から選択されるＳＦ３Ｂ１変異を同定することによって、対象が腫瘍性疾患を有するか否かを決定することをさらに含み得る。
【００１９】
[019]種々の実施形態では、腫瘍性疾患は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍又は軟部組織肉腫であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は、血液悪性腫瘍である。いくつかの実施形態では、血液悪性腫瘍は、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄単球性白血病又は急性骨髄性白血病である。
【００２０】
[020]いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、対象からサンプルを得ることを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、血液、血液画分に由来し得る、又は血液若しくは血液画分から得られた細胞であり得る。いくつかの実施形態では、サンプルは、固形腫瘍サンプルであり得る。
【００２１】
[021]種々の実施形態では、本明細書において提供される方法は、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１の野生型タンパク質又は核酸配列に対して比較することによって変異の有無を検出することを含む。いくつかの実施形態では、例えば、ＰＣＲ増幅、サンプルにおけるｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、サンガーシーケンシング、全エキソームシーケンシング、単一ヌクレオチド多型解析、ディープシーケンシング、標的化遺伝子シーケンシング又はそれらの任意の組合せのうち１つ又は複数を使用して核酸をシーケンシングして変異を決定又は同定すること。いくつかの実施形態では、シーケンシングは、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１遺伝子のＰＣＲ増幅、リアルタイム−ＰＣＲ又は標的化遺伝子シーケンシングを含む。
【００２２】
[022]種々の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異を検出する試薬を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、変異を検出するために使用するための使用説明書をさらに含み得る。
【００２３】
配列表の簡単な説明
[023]配列番号１：ヒトＳＦ３Ｂ１タンパク質のアミノ酸配列。
[024]配列番号２：ヒトＰＨＦ５Ａタンパク質のアミノ酸配列。
[025]配列番号３：Ａｄ２由来核酸配列。
[026]配列番号４：Ａｄ２フォワードプライマー。
[027]配列番号５：Ａｄ２リバースプライマー。
[028]配列番号６：Ａｄ２リバースプローブ。
[029]配列番号７：Ｆｔｚフォワードプライマー。
[030]配列番号８：Ｆｔｚリバースプライマー。
[031]配列番号９：Ｆｔｚプローブ。
[032]配列番号１０：ＭＣＬ１−Ｌフォワードプライマー。
[033]配列番号１１：ＭＣＬ１−Ｌプローブ。
[034]配列番号１２：ＭＣＬ１−Ｌリバースプライマー。
[035]配列番号１３：ＭＣＬ１−Ｓフォワードプライマー。
[036]配列番号１４：ＭＣＬ１−Ｓプローブ。
[037]配列番号１５：ＭＣＬ１−Ｓリバースプライマー。
[038]配列番号１６：ＭＣＬ１イントロン１フォワードプライマー。
[039]配列番号１７：ＭＣＬ１イントロン１プローブ。
[040]配列番号１８：ＭＣＬ１イントロン１リバースプライマー。
[041]配列番号１９：ＭＣＬ１イントロン２フォワードプライマー。
[042]配列番号２０：ＭＣＬ１イントロン２プローブ。
[043]配列番号２１：ＭＣＬ１イントロン２リバースプライマー。
[044]配列番号２２：汎ＭＣＬ１フォワードプライマー。
[045]配列番号２３：汎ＭＣＬ１プローブ。
[046]配列番号２４：汎ＭＣＬ１リバースプライマー。
[047]配列番号２５：ヒトＳＦ３Ｂ１タンパク質の核酸配列。
[048]配列番号２６：ヒトＰＨＦ５Ａタンパク質の核酸配列。
【００２４】
[049]図面は必ずしも縮尺通りではなく、網羅的なものでもない。代わりに、全般的に、本明細書において記載される発明の原理を例示することに強調が置かれている。本明細書の一部を構成する添付の図面は、本開示内容と一致するいくつかの実施形態を、説明とともに例示し、本開示内容の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｅ７１０７及びハーボキシジエン耐性クローン作製及び全エキソームシーケンシング（ＷＸＳ）解析を表す図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｅ７１０７及びハーボキシジエン耐性クローンにおける再発性変異を表す図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、示された化合物に対する代表的な耐性クローン応答の７２時間の成長阻害プロファイリング（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存力アッセイ）を示す図である。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｅ７１０７、ハーボキシジエン及びボルテゾミブについて、ｎ＝４；スプライセオスタチンＡ及びスデマイシンＤ６について、ｎ＝２。
【図１Ｄ】図１Ｄは、示された化合物に対する代表的な耐性クローン応答の７２時間の成長阻害プロファイリング（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存力アッセイ）を示す図である。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｅ７１０７、ハーボキシジエン及びボルテゾミブについて、ｎ＝４；スプライセオスタチンＡ及びスデマイシンＤ６について、ｎ＝２。
【図１Ｅ】図１Ｅは、示された化合物に対する代表的な耐性クローン応答の７２時間の成長阻害プロファイリング（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存力アッセイ）を示す図である。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｅ７１０７、ハーボキシジエン及びボルテゾミブについて、ｎ＝４；スプライセオスタチンＡ及びスデマイシンＤ６について、ｎ＝２。
【図１Ｆ】図１Ｆは、示された化合物に対する代表的な耐性クローン応答の７２時間の成長阻害プロファイリング（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存力アッセイ）を示す図である。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｅ７１０７、ハーボキシジエン及びボルテゾミブについて、ｎ＝４；スプライセオスタチンＡ及びスデマイシンＤ６について、ｎ＝２。
【図１Ｇ】図１Ｇは、示された化合物に対する代表的な耐性クローン応答の７２時間の成長阻害プロファイリング（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存力アッセイ）を示す図である。エラーバーは、標準偏差を示す。Ｅ７１０７、ハーボキシジエン及びボルテゾミブについて、ｎ＝４；スプライセオスタチンＡ及びスデマイシンＤ６について、ｎ＝２。
【図２Ａ】図２Ａは、親の、ＰＨＦ５Ａ  ＷＴ発現性及びＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ発現性ＨＣＴ１１６細胞におけるＰＨＦ５Ａレベルのウエスタンブロット解析を示す図である。ＧＡＰＤＨは、ローディングコントロールとして示されている。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｉｎｃｕｃｙｔｅイメージングシステムによって測定されるような、親の、ＷＴ  ＰＨＦ５Ａ発現性又はＹ３６Ｃ  ＰＨＦ５Ａ発現性ＨＣＴ１１６細胞の増殖を示す図である。Ｘ軸は、播種後時間を示し、ｙ軸は、コンフルエンシーのパーセントを示す。エラーバーは、標準偏差を示す、ｎ＝５。
【図２Ｃ】図２Ｃは、ＷＴ又はＹ３６Ｃ  ＰＨＦ５Ａを含有する核抽出物からの抗ＳＦ３Ｂ１プルダウン後の示されたＳＦ３ｂ複合体タンパク質レベルのウエスタンブロット解析を示す図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、示されたスプライシングモジュレーターに応じた親のＰＨＦ５Ａ  ＷＴ発現性及びＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ発現性ＨＣＴ１１６細胞の７２時間成長阻害プロファイリング（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存力アッセイ）を表す図である。エラーバーは、標準偏差を示す、ｎ＝２。
【図３Ａ】図３Ａは、ＷＴ又はＹ３６Ｃ  ＰＨＦ５Ａを含有する核抽出物における、示されたスプライシングモジュレーターの存在下でのｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシングアッセイを表す図である。エラーバーは、標準偏差を示す、ｎ＝４。
【図３Ｂ】図３Ｂは、示されたスプライシングモジュレーターを用いて処置されたＷＴ又はＹ３６Ｃ  ＰＨＦ５Ａ発現性細胞のいずれかにおける、成熟ＳＬＣ２５Ａ１９  ｍＲＮＡレベル及びＥＩＦ４Ａ１プレｍＲＮＡレベルのＴａｑｍａｎ遺伝子発現解析を示す図である。すべてのデータ点は、対応するＤＭＳＯ処置された対照サンプルに対して正規化し、ｙ軸で対数目盛で示した。エラーバーは、標準偏差を示す、ｎ＝２。
【図４Ａ】図４Ａは、ＤＭＳＯ対照と比較した、示された処置群各々における種々のスプライシング事象のカウント（左パネル）及び割合（右パネル）の積み重ね棒グラフを示す図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＤＭＳＯ対照と比較した、示された処置群における種々のスプライシング事象のカウント及びｌｏｇ２変化倍数のまとめを表す図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、保持されたイントロン及びＥ７１０７誘導性イントロン保持接合部から下流エキソン内の平均ＧＣ含量のプロットを示す図である。各イントロンを１００ビンに対して正規化したのに対し、各エキソンは５０ビンに対して正規化した。濃い線は、各ビンの平均ＧＣ含量を表し、影を付けた領域は、９５％信頼区間を示す。
【図４Ｄ】図４Ｄは、スキップされたエキソン及びＥ７１０７誘導性エキソンスキッピング接合部から上流（左）と下流（右）イントロン内の平均ＧＣ含量のプロットを表す図である。各イントロンを１００ビンに対して正規化したのに対し、各エキソンは５０ビンに対して正規化した（詳細については方法を参照のこと）。濃い線は、各ビンの平均ＧＣ含量を表し、影を付けた領域は、９５％信頼区間を示す。
【図４Ｅ】図４Ｅは、Ｅ７１０７処置ＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ（上部）及びＷＴ（下部）細胞における３８８３接合部の３’接合部使用のウォーターフォールプロットを示す図である。両パネルのｘ軸は、Ｅ７１０７処置Ｙ３６Ｃ株における各接合部のＥＳ  ＰＳＩ（スプライスされるパーセンテージ）値（大から小）に基づいて並べられている。ｙ軸では、同一３’接合部のエキソンスキッピング（ＥＳ）又はイントロン保持（ＩＲ）のいずれかのＰＳＩが示された。各接合部のエキソンスキッピング事象、イントロン保持事象及びエキソンインクルージョン事象（グラフには示されていない）のＰＳＩを、各接合部について１００まで加えた。ＰＳＩ算出のスキームは、ウォーターフォールプロットの下に示されている。
【図５Ａ】図５Ａは、ＷＴ又はＹ３６Ｃ  ＰＨＦ５Ａ過剰発現細胞のいずれかからの示された処置下での種々のＭＣＬ１アイソフォームの生成の代表的なｓａｓｈｉｍｉプロットを示す図である。各トラックの総読み取りが左に示されている。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＷＴ（左パネル）又はＹ３６Ｃ（右パネル）のいずれかにおける示されたＭＣＬ１アイソフォームのＴａｑｍａｎ遺伝子発現解析を表す図である。スプライシングモジュレーターを用いて処置されたＰＨＦ５Ａ発現性細胞。エラーバーは、標準偏差を示す、ｎ＝２。
【図６Ａ】図６Ａは、ＰＨＦ５Ａ（ＰＤＢ：５ＳＹＢ）のリボンダイヤグラムを示す図である。亜鉛原子は、灰色の球として示されており、ほぼ正三角形の頂点を形成する。トレフォイルノットの側面を形成する二次構造要素（α：ヘリックス、η：３１０ヘリックス、β：鎖）は、その一次配列によって配置される。Ｎ及びＣ末端は標識される。システイン残基は、Ｙ３６残基と同様に細枝として示されている。
【図６Ｂ】図６Ｂは、酵母Ｂａｃｔ複合体におけるＰＨＦ５Ａのモデルを示す図である。酵母ＰＨＦ５Ａ、ＳＦ３Ｂ５及びＳＦ３Ｂ１は、Ｕ２  ｓｎＲＮＡによって塩基対形成されたＲＮＡ二本鎖及び分岐点配列（ＢＰＳ）並びにＢＰＳの下流の一本鎖イントロンＲＮＡと接触した複合体を形成した。
【図６Ｃ】図６Ｃは、ＨＥＡＴリピート１５及び１６の配列アラインメントを示す図であり、これでは、Ｈｓｈ１５５のこの部分が、Ｒｄｓ３とのアデニン結合部位を形成した。
【図６Ｄ】図６Ｄは、Ｒｄｓ３とのＰＨＦ５Ａの配列アラインメントを示す。配列同一性は５６％である。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ＰＨＦ５Ａ、ＳＦ３Ｂ１及びイントロンＲＮＡの間の相互作用を示す、ヒトアデニン結合部位の潜在的な立体配置を表す図である。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ＳＦ３Ｂ１、ＰＨＦ５Ａ及びＳＦ３Ｂ３によって構成される潜在的なモジュレーター結合部位の表面図を示す図である。薬物耐性残基が示されている。
【図７Ａ】図７Ａは、シンチレーション近接アッセイのために使用される、ＰＨＦ５Ａ−ＷＴ又はＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃを含有する組換え４タンパク質ミニ複合体のクマシー染色を示す図である。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＷＴ４タンパク質複合体との３Ｈ標識プラジエノライドアナログ（１０ｎＭ）結合に対する非放射性スプライシングモジュレーターの競合滴定曲線を表す図である。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＷＴ（Ｙ３６は、シアンの細枝で示す）上に重ねられたモデル化されたＣ３６の全体的な表面図を示し、Ｙ３６及びＣ３６でのＰＨＦ５Ａ表面図を拡大表示する図である。赤：−８ｋＢＴ／ｅ、青：＋８ｋＢＴ／ｅ及び白：０ｋＢＴ／ｅで着色された表面電位を、ＡＰＢＳによって算出した。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＷＴ又はＹ３６Ｃ  ＰＨＦ５Ａを含有するタンパク質複合体との３Ｈ標識プラジエノライドアナログ（１０ｎＭ及び１ｎＭ）結合のシンチレーション近接アッセイを表す図である。エラーバーは、標準偏差を示す、ｎ＝２。
【図７Ｅ】図７Ｅは、親の、及び示されたＰＨＦ５Ａバリアント発現性ＨＣＴ１１６細胞におけるＰＨＦ５Ａレベルのウエスタンブロット解析を示す図である。ＧＡＰＤＨは、ローディングコントロールとして示されている。
【図７Ｆ】図７Ｆは、ＷＴ細胞株と比較した、示されたＰＨＦ５Ａバリアント発現性細胞株間のＩＣ５０シフトの教師なしクラスタリングヒートマップを表す。シフトは、変化倍数として示されており、図７Ｇにおける用量応答曲線から抽出されたＩＣ５０値から算出される。各行は、示されたＰＨＦ５Ａバリアントに相当し、各列は、示された化合物に対応する。カラーキーは、図７Ｇの上部右角に示されている。示された化合物に対する、親の、及び示されたＰＨＦ５Ａバリアント発現性ＨＣＴ１１６細胞の応答の７２時間成長阻害プロファイリング（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存力アッセイ）。エラーバーは、標準偏差を示す、ｎ＝３。
【図７Ｇ】図７Ｆは、ＷＴ細胞株と比較した、示されたＰＨＦ５Ａバリアント発現性細胞株間のＩＣ５０シフトの教師なしクラスタリングヒートマップを表す。シフトは、変化倍数として示されており、図７Ｇにおける用量応答曲線から抽出されたＩＣ５０値から算出される。各行は、示されたＰＨＦ５Ａバリアントに相当し、各列は、示された化合物に対応する。カラーキーは、図７Ｇの上部右角に示されている。示された化合物に対する、親の、及び示されたＰＨＦ５Ａバリアント発現性ＨＣＴ１１６細胞の応答の７２時間成長阻害プロファイリング（ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ細胞生存力アッセイ）。エラーバーは、標準偏差を示す、ｎ＝３。
【図８】図８は、タンパク質複合体ＳＦ３Ｂ１、ＰＨＦ５Ａ及びＳＦ３Ｂ３の分子表面表現を表す。イントロンＲＮＡ及び分岐点アデノシン（ＢＰＡ）が標識されている。一般的なスプライシングモジュレーター結合部位は、耐性変異が同定された周囲の残基のおよその位置を有する星印によって示されている。図は、酵母Ｂａｃｔ複合体座標を使用して作製した。模式的モデルは、イントロン配列のＧＣ含量と、スプライシング調節に対するその耐性の間の逆相関を示す。具体的には、高ＧＣ含量イントロン基質は、スプライシングモジュレーターに対してより感受性を示し、それに対してあまり耐性ではないより弱い基質である。
【図９】図９は、ＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ及びＲ１０７４ＨクローンにおけるＧＩ５０シフトを示すグラフである。ｘ軸は、対数目盛りで同一化合物のＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ変異を保持するクローン対親株の間のＧＩ５０比である。ｙ軸は、ＳＦ３Ｂ１  Ｒ１０７４Ｈ変異を保持するクローン対親株の間のＧＩ５０比である。４５°対角の線は、親株と比較した、両耐性クローンにおける同一化合物の等しいＧＩ５０シフトを表す。
【図１０】図１０は、ＰＡＮＣ０５０４細胞におけるＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ過剰発現が、スプライシングモジュレーターＥ７１０７に対する部分耐性表現型をもたらすが、プロテアソーム阻害剤ボルテゾミブに対してはもたらさないことを示すグラフを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａは、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）を示す図である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、抗ＳＦ３Ｂ１又はＷＴ又はＹ３６Ｃ  ＰＨＦ５Ａを含有する核抽出物からの偽免疫沈降ＳＦ３ｂ複合体との３Ｈ標識プラジエノライドアナログ（１０ｎＭ）結合のシンチレーション近接アッセイのグラフである。非標識化合物（１０μＭ）の前処理は、示された場合に含まれた。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
[061]本開示の例として詳述された説明が本明細書において提供される。本明細書内の実施形態は、本開示の範囲を限定すると解釈されてはならない。
【００２７】
[062]本開示において引用されたすべての刊行物及び特許は、参照によりその全文が組み込まれる。参照により組み込まれた材料が、本明細書と矛盾する、又は一致しない範囲で、本明細書が任意のこのような材料に優先する。本明細書における任意の参考文献の引例は、このような参考文献が本開示の先行技術であるという承認ではない。値の範囲が表される場合には、範囲内の任意の特定の値を使用する実施形態を含む。さらに、範囲で示される値への言及は、その範囲内のありとあらゆる値を含む。すべての範囲は、その終点を含み、組合せ可能である。先行詞「約」の使用によって値が近似として表される場合には、特定の値は別の実施形態を形成すると理解されるであろう。特定の数値への言及は、文脈が明確に別に示さない限り、少なくともその特定の値を含む。「又は」の使用は、その使用の特定の文脈が別に示さない限り、「及び／又は」を意味する。
【００２８】
[063]本明細書及び特許請求の範囲を通じて、説明の態様に関する種々の用語が使用される。このような用語は、特に断りのない限り、当技術分野におけるその通常の意味が与えられるものとする。その他の具体的に定義される用語は、本明細書において提供される定義と一致する方法で解釈されるものとする。
【００２９】
[064]本明細書において、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明確に別に示さない限り、複数形を含む。
【００３０】
[065]特に断りのない限り、用語「少なくとも」、「未満」及び「約」又は一連の要素若しくは範囲に先行する同様の用語は、一連のもの若しくは範囲中のどの要素も指すと理解されるものとする。当業者ならば、日常的な実験のみを使用して、本明細書において記載される本発明の特定の実施形態の多数の等価物を理解する、又は確認できるであろう。このような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されるように意図される。
【００３１】
[066]用語「対象」及び「患者」は、任意の動物、例えば、それだけには限らないが、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類などを含む任意の哺乳動物を指すように本明細書において同義的に使用される。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、マウスである。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００３２】
[067]用語「腫瘍性疾患」及び「癌」は、癌を引き起こす細胞に特有の特徴、例えば、制御されない増殖、不死、転移能、急速な成長及び増殖速度並びに／又は特定の形態的特徴を有する細胞の存在を指すように本明細書において同義的に使用される。癌細胞は、腫瘍又は塊の形態であり得ることが多いが、このような細胞は、対象内に単独で存在することもあり、又は白血病細胞若しくはリンパ腫細胞などの独立細胞として血流中を循環することもある。用語「腫瘍性疾患」及び「癌」は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍、肉腫、癌腫並びにその他の固形及び非固形腫瘍癌を含む、すべての種類の癌及び癌転移を含む。
【００３３】
[068]用語「有効量」及び「治療上有効な量」とは、本明細書において、それだけには限らないが、以下に例示されるような疾患治療を含む意図される結果を達成するのに十分である、本明細書において記載される化合物（例えば、スプライシングモジュレーター又は代替治療）の量を指す。いくつかの実施形態では、「治療上有効な量」とは、腫瘍細胞の増殖若しくは蔓延、腫瘍の大きさ若しくは数、並びに／又は癌のレベル、ステージ、進行及び／若しくは重症度のその他の尺度の検出可能な死滅、低減及び／又は阻害のために有効である量である。いくつかの実施形態では、「治療上有効な量」とは、全身に、局所に、又はｉｎ  ｓｉｔｕで投与される量（例えば、対象においてｉｎ  ｓｉｔｕで生成される化合物の量）を指す。治療上有効な量は、意図される適用（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏ）又は治療されている対象及び疾患状態、例えば、対象の体重及び年齢、疾患状態の重症度、投与方法などに応じて変わる場合があり、これは、当業者によって容易に決定できる。用語はまた、標的細胞における特定の応答、例えば、細胞遊走の低減を誘導する用量に当てはまる。具体的な用量は、例えば、特定の医薬組成物、対象及びその年齢及び既存の健康状態又は健康状態のリスク、従われるべき投薬計画、疾患の重症度、その他の薬剤と組み合わせて投与されるか否か、投与のタイミング、投与される組織及び運ばれる物理的送達系に応じて変わり得る。
【００３４】
[069]本明細書において、用語「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療している（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」及び文法上関連する用語は、任意の徴候、症状又は疾患の結果の任意の改善、例えば、生存の延長、より少ない罹病率並びに／又は腫瘍細胞成長、癌細胞増殖及び／若しくは転移などの代替治療様式の副産物である副作用の減少を指す。当技術分野では容易に理解されるであろうが、疾患の完全根絶は好ましいが、治療の必要条件ではない。種々の実施形態では、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔ）」とは、本明細書において、腫瘍性疾患を有する対象、例えば、患者へのスプライシングモジュレーター又は代替治療の投与を指す。治療は、障害、障害の症状又は障害への素因、例えば、腫瘍性疾患を、完治する、治癒する、軽減する、緩和する、低減する、変更する、治療する、寛解させる、和らげる、改善する、又は影響を及ぼすことであり得る。
【００３５】
[070]本明細書において、用語「スプライスモジュレーター」又は「スプライシングモジュレーター」とは、スプライセオソームの構成成分と相互作用することによって抗腫瘍活性を有する化合物を指す。いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーターは、標的細胞におけるスプライシングの速度又は形態を変更する。阻害物質として機能するスプライシングモジュレーターは、例えば、制御されない細胞増殖を減少させることが可能である。特に、いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーターは、スプライセオソームのＳＦ３ｂサブユニットを阻害することによって、例えば、ＳＦ３Ｂ１及び／又はＰＨＦ５Ａサブユニットを標的化することによって作用し得る。このようなモジュレーターは、天然化合物又は合成化合物であり得る。スプライシングモジュレーターの限定されない例及びこのようなモジュレーターのカテゴリーは、プラジエノライド、プラジエノライド誘導体、ハーボキシジエン、ハーボキシジエン誘導体、スプライセオスタチン、スプライセオスタチン誘導体、スデマイシン又はスデマイシン誘導体を含む。本明細書において、用語「誘導体」及び「アナログ」とは、スプライシングモジュレーターなどに言及する場合には、元の化合物と本質的に同一の、類似の又は増強された生物学的機能又は活性を保持するが、変更された化学的又は生物学的構造を保持する任意のこのような化合物を意味する。
【００３６】
[071]本明細書において、「スプライセオソーム」とは、プレｍＲＮＡセグメントなどの１つ又は複数のＲＮＡセグメントからイントロンを除去するリボヌクレオタンパク質複合体を指す。
【００３７】
[072]本明細書において、用語「治療耐性腫瘍性疾患」とは、スプライシングモジュレーターに応答しない腫瘍性疾患（すなわち、癌）を指す。
【００３８】
[073]用語「検出すること」は、ＳＦ３ｂ複合体中、例えばＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異の有無を決定することを含む。さらに、「評価すること」は、スプライシングモジュレーターを用いて成功裏に治療され得る患者を、成功裏に治療されないであろうものから区別することを含む。
【００３９】
Ａ．ＳＦ３Ｂ１及びＰＨＦ５Ａ及びその中の変異
[074]本開示は、幾分かは、欠陥スプライシングをもたらす、スプライセオソームの構成成分をコードする遺伝子に影響を及ぼす変異に関する。種々の実施形態では、変異は、ＰＨＦ５Ａサブユニット中にある。種々の実施形態では、変異は、ＳＦ３Ｂ１サブユニット中にある。スプライセオソーム中の変異の存在は、スプライシングモジュレーターに対する対象の応答性又はそれがないことを示し得る。例えば、特定のＰＨＦ５Ａ遺伝子変異を有する対象は、スプライシングモジュレーターに対して低下した感受性を有し得る。
【００４０】
[075]２つの独特なスプライセオソームは、ほとんどの真核生物中に共存する：Ｕ２型イントロンの除去を触媒するＵ２依存性スプライセオソーム及び真核生物のサブセットのみにおいて存在し、稀なＵ１２型クラスのイントロンをスプライシングするあまり大量にはないＵ１２依存性スプライセオソームである。独立性スプライセオソームは、Ｕ１、Ｕ２、Ｕ５及びＵ４／Ｕ６  ｓｎＲＮＰ並びに多数の非ｓｎＲＮＰタンパク質から組み立てられる。Ｕ２  ｓｎＲＮＰは、スプライセオソーム組み立てにおける第１のＡＴＰ依存性ステップの際に、２種の弱く結合しているタンパク質サブユニット、ＳＦ３ａ及びＳＦ３ｂで補充される。ＳＦ３ｂは、ＰＨＦ５Ａ、ＳＦ３Ｍ５５、ＳＦ３Ｍ４５、ＳＦ３ｂＩ３０、ＳＦ３ｂ４９、ＳＦ３ｂｌ４ａ及びＳＦ３Ｍ０を含む７種の保存されたタンパク質から構成される（Ｗｉｌｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  第２７巻、４９７８頁、２００２年）。
【００４１】
[076]ＰＨＤフィンガー様ドメイン含有タンパク質５Ａ（ＰＨＦ５Ａとも呼ばれる）は、高度塩基性アミノ末端及びカルボキシ末端と隣接しているＰｌａｎｔ  Ｈｏｍｅｏドメイン（ＰＨＤ）−フィンガー様ドメインを含有し、したがって、ＰＨＦ５Ａは、ＰＨＤフィンガースーパーファミリーに属するが、クロマチン関連タンパク質としても作用し得る。ＰＨＦ５Ａタンパク質は、イントロンの３’末端と会合しているＵ２ＡＦ１（Ｕ２ＡＦ６５−Ｕ２ＡＦ３５ヘテロ二量体）を有するＵ２  ｓｎＲＮＰと、ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ１を架橋する（Ｒｚｙｍｓｋｉら、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  第１２１巻、２３２頁、２００８年）。安定なＵ２  ｓｎＲＮＰ付加は、選択的プレｍＲＮＡスプライシングにおいて調節されたステップであることが多い。特定の実施形態では、野生型ヒトＰＨＦ５Ａタンパク質は、配列番号２（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３２７５８、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ＮＰ＿０３２７５８．３において示されるとおりである。特定の実施形態では、ＰＨＦ５Ａにおける変異は、配列番号２において提供されるヒト野生型ＰＨＦ５Ａタンパク質のアミノ酸配列又は配列番号２６（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＮＭ＿０３２７５８  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ＮＭ＿０３２７５８．３）において示されるようなコーディング核酸から異なることによって、及び得られる癌表現型（すなわち、それらは、対象において癌と相関しない天然対立遺伝子バリアントではない）によって同定される。
【００４２】
[077]ＳＦ３Ｂ１は、スプライセオソームの構成成分であり、分岐点部位を含有する領域でプレｍＲＮＡと結合し、３’スプライシング部位（３’ｓｓ）でのスプライセオソームの初期認識及び安定化に関与するＵ２  ｓｎＲＮＰ複合体の一部を形成する。特定の実施形態では、野生型ヒトＳＦ３Ｂ１タンパク質は、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿０３６５６５、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ＮＰ＿０３６５６５．２）（Ｂｏｎｎａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  第１１巻、８４７〜５９頁（２０１２年））又は配列番号２５（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿０１２４３３、Ｖｅｒｓｉｏｎ  ＮＭ＿０１２４３３．３）に示されるとおりである。ＳＦ３Ｂ１タンパク質をコードする遺伝子における変異は、血液悪性腫瘍及び固形腫瘍などのいくつかの癌に関わっている（Ｓｃｏｔｔら、ＪＮＣＩ  第１０５巻、２０号、１５４０〜１５４９頁（２０１３年）。特定の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１における変異は、配列番号１において提供されるヒト野生型ＳＦ３Ｂ１タンパク質のアミノ酸配列又は配列番号２５において示されるようなコーディング核酸から異なっていることによって、及び得られた癌表現型（すなわち、それらは、対象において癌と相関しない天然対立遺伝子バリアントではない）によって同定される。
【００４３】
[078]いくつかの実施形態では、対象は、１つ若しくは複数のＰＨＦ５Ａ変異及び／又は１つ若しくは複数のＳＦ３Ｂ１変異を有する腫瘍又は癌細胞を有するか、或いは、対象は、このような変異（複数可）の有無について試験される。
【００４４】
[079]いくつかの実施形態では、１つ若しくは複数のＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１変異は、点変異（例えば、ミスセンス又はナンセンス変異）、挿入及び／又は欠失を含み得る。その他の実施形態では、１つ若しくは複数のＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１変異は、体細胞変異を含み得る。さらにその他の実施形態では、１つ若しくは複数のＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１変異は、ヘテロ接合性変異又はホモ接合性変異を含み得る。特定の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異は、ＳＦ３Ｂ１変異と組み合わせて存在する。その他の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異及び／又はＳＦ３Ｂ１変異は、相いれない。
【００４５】
[080]種々の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中に存在する１つ又は複数の変異は、対象から得られる腫瘍若しくは癌細胞中にあるか、又は対象は、このような変異（複数可）の有無について試験される。特定の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異は、ＰＨＦ５Ａ−ＳＦ３Ｂ１境界面に、又はその付近に位置し得る。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異は、ＰＨＦ５Ａ−ＳＦ３Ｂ１境界面中に位置し得る。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異は、ＰＨＦ５Ａ−ＳＦ３Ｂ１境界面付近に位置し得る。
【００４６】
[081]種々の実施形態では、１つ又は複数のＰＨＦ５Ａ変異は、ＰＨＦ５Ａの位置Ｙ３６に変異を含む。いくつかの実施形態では、位置Ｙ３６の変異は、ＰＨＦ５Ａ中の唯一の変異であるが、その他の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中にさらなる変異が存在する。いくつかの実施形態では、位置Ｙ３６の変異は、ＳＦ３Ｂ１中の１つ又は複数の変異（例えば、位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８のうち１つ又は複数の変異）を伴う。いくつかの実施形態では、位置Ｙ３６の変異は、ＳＦ３Ｂ１中の変異を全く伴わない。
【００４７】
[082]種々の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６変異は、Ｙ３６Ｃ、Ｙ３６Ａ、Ｙ３６Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｙ３６Ｗ、Ｙ３６Ｅ及びＹ３６Ｒ変異から選択される。特定の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異は、Ｙ３６Ｃである。
【００４８】
[083]特定の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１中の１つ又は複数の変異は、Ｋ１０７１Ｅ変異、Ｒ１０７４Ｈ変異及び／又はＶ１０７８Ａ若しくはＶ１０７８Ｉ変異のうち１つ又は複数から選択される。種々の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１中にさらなる変異が存在する。特定の実施形態では、位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及び／又はＶ１０７８に変異は存在しない。特定の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１中に、Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８の外側に代替変異が存在する。
【００４９】
[084]いくつかの実施形態では、ＳＦ３Ｂ１中に１つ又は複数のさらなる変異が存在する。いくつかの実施形態では、さらなる変異は、Ｅ６２２Ｄ、Ｅ６２２Ｋ、Ｅ６２２Ｑ、Ｅ６２２Ｖ、Ｙ６２３Ｃ、Ｙ６２３Ｈ、Ｙ６２３Ｓ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｒ６２５Ｐ、Ｒ６２５Ｓ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｉ、Ｎ６２６Ｓ、Ｎ６２６Ｙ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｌ、Ｈ６６２Ｑ、Ｈ６６２Ｒ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ｉ、Ｔ６６３Ｐ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｋ６６６Ｓ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、Ｖ７０１Ａ、Ｖ７０１Ｆ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｆ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｓ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｅ、Ｇ７４０Ｋ、Ｇ７４０Ｒ、Ｇ７４０Ｖ、Ｋ７４１Ｎ、Ｋ７４１Ｑ、Ｋ７４１Ｔ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ７８１Ｅ、Ｄ７８１Ｇ又はＤ７８１Ｎ変異のうち１つ又は複数である。いくつかの実施形態では、これらの変異は、癌を有する患者を同定するために使用される。特定の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１変異は、Ｋ７００Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｒ６２５Ｃ、Ｇ７４２Ｄ、Ｒ６２５Ｈ、Ｅ６２２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｒ、Ｇ７４０Ｅ、Ｙ６２３Ｃ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ７４１Ｎ、Ｎ６２６Ｙ、Ｔ６６３Ｐ、Ｈ６６２Ｒ、Ｇ７４０Ｖ、Ｄ７８１Ｅ又はＲ６２５Ｌのうち１つ又は複数を含み得る。いくつかの実施形態では、ＳＦ３Ｂ１内の変異は、Ｅ６２２Ｄ、Ｒ６２５Ｈ、Ｈ６６２Ｄ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ７００Ｅ、Ｇ７４２Ｄ及び／又はＫ７００Ｅを含み得る。さらなるＳＦ３Ｂ１変異として、限定するものではないが、例えば、Ｐａｐａｅｍｍａｎｕｉｌら、Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  第３６５巻：１３８４〜１３９５頁（２０１１年）及びＦｕｒｎｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．、第３巻（１０号）：１１２２〜１１２９頁（２０１３年）に記載されるものが挙げられる。
【００５０】
[085]スプライセオソームモジュレーターは、一般に、遺伝子／変異特異的に腫瘍細胞に対して優先的に作用する（Ｆａｎら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  第６巻、５８２〜５８９頁（２０１１年））。種々の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異及び／又はＳＦ３Ｂ１変異は、スプライシングモジュレーターを用いる癌治療に対する耐性を付与する。その他の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１における変異は、スプライシングモジュレーターの活性の低減又は活性の変更をもたらす。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異単独が、スプライシングモジュレーターを用いる治療に対する耐性を付与する。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａにおける変異及びＳＦ３Ｂ１における変異が、スプライシングモジュレーターを用いる治療に対する耐性を付与する。
【００５１】
[086]特定の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異は、その変異を欠く癌を有する対象と比較して、プラジエノライド若しくはプラジエノライド誘導体、ハーボキシジエン若しくはハーボキシジエン誘導体、スプライセオスタチン若しくはスプライセオスタチン誘導体及び／又はスデマイシン若しくはスデマイシン誘導体に対する耐性を付与又は増大し得る。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の位置Ｙ３６の変異は、プラジエノライド又はプラジエノライド誘導体、ハーボキシジエン又はハーボキシジエン誘導体、スプライセオスタチン又はスプライセオスタチン誘導体及びスデマイシン又はスデマイシン誘導体に対する耐性を付与又は向上できる。特定の実施形態では、変異は、Ｙ３６Ｃ変異である。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異は、Ｅ７１０７、ＦＲ９０１４６４、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチンＡ及び／又はスデマイシンＤに対する耐性を付与又は向上できる。
【００５２】
[087]いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異は、Ｅ７１０７に対する耐性を付与又は向上できる。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異は、ハーボキシジエンに対する耐性を付与又は向上できる。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異は、ＦＲ９０１４６４に対する耐性を付与又は向上できる。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異は、プラジエノライドに対する耐性を付与又は向上できる。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異は、スプライセオスタチンＡに対する耐性を付与又は向上できる。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異は、スデマイシンＤに対する耐性を付与又は向上できる。
【００５３】
[088]種々の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１中の１つ又は複数の変異と組み合わせたＰＨＦ５Ａ中の変異は、その変異の組合せを欠く癌を有する対象と比較して、プラジエノライド若しくはプラジエノライド誘導体、ハーボキシジエン若しくはハーボキシジエン誘導体、スプライセオスタチン若しくはスプライセオスタチン誘導体及び／又はスデマイシン若しくはスデマイシン誘導体に対する耐性を付与又は増大し得る。特定の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異は、位置Ｙ３６の変異を含み、ＳＦ３Ｂ１変異は、位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８のうち１つ又は複数の変異を含む。いくつかの実施形態では、位置Ｙ３６の変異は、Ｙ３６Ｃ、Ｙ３６Ａ、Ｙ３６Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｙ３６Ｗ、Ｙ３６Ｅ又はＹ３６Ｒ変異である。いくつかの実施形態では、位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８のうち１つ又は複数の変異は、Ｋ１０７１Ｅ変異、Ｒ１０７４Ｈ変異及び／又はＶ１０７８Ａ若しくはＶ１０７８Ｉ変異を含む。
【００５４】
[089]特定の実施形態では、対象における癌は、ＰＨＦ５Ａ中にＹ３６変異を有さないが、位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８のうち１つ又は複数にＳＦ３Ｂ１中の１つ又は複数の変異を有する。いくつかの実施形態では、位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８のうち１つ又は複数の変異は、Ｋ１０７１Ｅ変異、Ｒ１０７４Ｈ変異及び／又はＶ１０７８Ａ若しくはＶ１０７８Ｉ変異を含む。いくつかの実施形態では、ＳＦ３Ｂ１中の変異は、このような変異を欠く癌を有する対象と比較して、プラジエノライド若しくはプラジエノライド誘導体、ハーボキシジエン若しくはハーボキシジエン誘導体、スプライセオスタチン若しくはスプライセオスタチン誘導体及び／又はスデマイシン若しくはスデマイシン誘導体に対する耐性を付与又は増大し得る。
【００５５】
Ｂ．スプライシングモジュレーター
[090]種々のスプライシングモジュレーター化合物は、当技術分野で公知であり（例えば、Ｌｅｅ及びＡｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  第７巻、９７６〜８６頁（２０１６年）を参照のこと）、本明細書において記載される方法に従って使用できる（例えば、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中にすべての又はある特定の変異を含む又は欠く癌を有する患者に投与できる）。例えば、細菌由来産物及びそのアナログは、ＳＦ３ｂ複合体を標的化することがわかっている。これらの化合物は、腫瘍性疾患の治療において有用であり得る。いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーターは、ＳＦ３Ｂ１モジュレーターである。いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーターは、ＰＨＦ５Ａモジュレーターである。いくつかの実施形態では、モジュレーターの組合せを使用してもよい。
【００５６】
[091]いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、プラジエノライド又はプラジエノライド誘導体である。「プラジエノライド誘導体」とは、プラジエノライドとして知られる天然物のファミリーのメンバーと構造的に関連し、出発化合物の１つ又は複数の生物学的機能を保持する化合物を指す。プラジエノライドは、強力に細胞傷害性であり、細胞周期のＧ１及びＧ２／Ｍ相において細胞周期停止をもたらすと（例えば、Ｂｏｎｎａｌら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  第１１巻、８４７〜５９頁（２０１２年））、ストレプトマイセス・プラテンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｌａｔｅｎｓｉｓ）において最初に同定された（Ｍｉｚｕｉら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．  第５７巻、１８８〜９６頁（２００４年））。７種の天然に存在するプラジエノライド、プラジエノライドＡ〜Ｇがある（Ｍｉｚｕｉら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ．  第５７巻、１８８〜９６頁（２００４年）；Ｓａｋａｉら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、第５７巻、１８０〜７頁（２００４年））。
【００５７】
[092]これらの化合物のうちの１種であるプラジエノライドＢは、ＳＦ３ｂスプライセオソームを標的化して、スプライシングを阻害し、遺伝子発現のパターンを変更するとわかっている（Ｋｏｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  第３巻：５７０〜５７５頁（２００７年））。ある特定のプラジエノライドＢアナログは、例えば、国際公開第２００２／０６０８９０号、同２００４／０１１４５９号、同２００４／０１１６６１号、同２００４／０５０８９０号、同２００５／０５２１５２号、同２００６／００９２７６号及び同２００８／１２６９１８号に記載されている。
【００５８】
[093]米国特許第７，８８４，１２８号及び同７，８１６，４０１号には、プラジエノライドＢ及びＤを合成する方法が記載されている。プラジエノライドＢ及びＤの合成は、Ｋａｎａｄａら、Ａｎｇｅｗ．  Ｃｈｅｍ．  Ｉｎｔ．  Ｅｄ．、第４６巻、４３５０〜４３５５頁（２００７年）、米国特許第７，５５０，５０３号及び国際公開第２００３／０９９８１３号（プラジエノライドＤ（１１１０７Ｄ）からＥ７１０７（化合物４５、プラジエノライドＢの合成ウレタン誘導体）を合成する方法を記載する）に記載される方法を使用して実施してもよい。
【００５９】
[094]いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、プラジエノライドＢ、プラジエノライドＤ又はＥ７１０７である。いくつかの実施形態では、調節性化合物は、プラジエノライドＢである。その他の実施形態では、調節性化合物は、プラジエノライドＤである。さらなる実施形態では、ＳＦ３Ｂ１モジュレーターは、Ｅ７１０７である。
【００６０】
[095]いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、以下に示されるような構造を有するプラジエノライド化合物である：
【化１】
2020514348.tif 000002
【００６１】
[096]いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、米国特許出願公開第２０１５０３２９５２８号に記載される化合物である。いくつかの実施形態では、調節性化合物は、表１に示されるような式１〜４のいずれか１つを有するプラジエノライド化合物である。
【００６２】
【表１】
2020514348.tif 000003
【００６３】
[097]いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、ＦＤ−８９５であり得る。ＦＤ−８９５は、プラジエノライド様メンバー（Ｋａｓｈｙａｐら、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ、第１００巻、９４５〜９５４頁（２０１５年））であり、ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）Ａ−９５６１に由来する（例えば、Ｓｅｋｉ−Ａｓａｎｏら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ、第４７巻、１３９５〜４０１頁（１９９４年）を参照のこと）。
【００６４】
[098]いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、以下に示されるような構造を有するＦＤ−８９５化合物である：
【化２】
2020514348.tif 000004
【００６５】
[099]いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、ハーボキシジエン又はハーボキシジエン誘導体である。ハーボキシジエンは、ＧＥＸ１Ａの形態である。「ハーボキシジエン誘導体」とは、ハーボキシジエン又はＧＥＸ１Ａファミリーのメンバーと構造的に関連し、出発化合物の１つ又は複数の生物学的機能を保持する化合物を指す。ハーボキシジエンアナログはまた、その他のＧＥＸファミリーメンバーも含む。ハーボキシジエンは、ストレプトマイセス・クロモフスカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｈｒｏｍｏｆｕｓｃｕｓ）Ａ７８４７において最初に同定された（Ｓａｋａｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ  （Ｔｏｋｙｏ）、第５５巻、８５５〜６２頁（２００２年）；Ｈａｓｅｇａｗａら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第１８巻、２２９〜３３頁（２０１１年））。ハーボキシジエン及び誘導体は、ＳＦ３ｂ複合体を標的化することによって、例えば、プレｍＲＮＡのスプライシングを干渉することによって抗腫瘍活性を提供する。同文献。ハーボキシジエンの合成は、Ｌａｇｉｓｅｔｔｉら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第９巻、６４３〜６４８頁（２０１４年）に記載される方法を使用して実施してもよい。米国特許第５，７１９，１７９号にはまた、ハーボキシジエンを調製する方法が記載されている。ハーボキシジエン又はハーボキシジエン誘導体を合成するためのその他の技術は、当業者によって容易に認識されるであろう。
【００６６】
[0100]いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、以下に示されるような構造を有するハーボキシジエン化合物である：
【化３】
2020514348.tif 000005
【００６７】
[0101]その他の実施形態では、ハーボキシジエン誘導体は、６−ノルハーボキシジエンである（Ｌａｇｉｓｅｔｔｉら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第９巻、６４３〜６４８頁（２０１４年））。
【００６８】
[0102]いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、スプライセオスタチン又はスプライセオスタチン誘導体である。「スプライセオスタチン誘導体」とは、既知スプライセオスタチンのファミリーのメンバーと構造的に関連し、出発化合物の１つ又は複数の生物学的機能を保持する化合物を指す。スプライセオスタチンは、元々、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）属種  番号２６６３に由来し、ＳＦ３ｂを標的化する強力な細胞傷害性薬剤であると報告されている（Ｌｅｅ及びＡｂｄｅｌ−Ｗａｈａｂ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  第７巻、９７６〜８６頁（２０１６年））。米国特許第９，５０４，６６９号は、スプライセオスタチン及び誘導体の調製を提供する。スプライセオスタチン及び誘導体を合成するその他の技術は、当業者によって容易に認識されるであろう。
【００６９】
[0103]例示的スプライセオスタチン化合物として、それだけには限らないが、ＦＲ９０１４６３、ＦＲ９０１４６４、ＦＲ９０１４６５、メアヤマイシン（ｍｅａｙａｍｙｃｉｎ）、メアヤマイシンＢ、スプライセオスタチンＡ（ＦＲ９０１４６４のメチル化誘導体）及びタイランスタチン（ｔｈａｉｌａｎｓｔａｔｉｎ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、ＦＲ９０１４６３である。いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、ＦＲ９０１４６４である。その他の実施形態では、スプライシング調節性化合物は、ＦＲ９０１４６５である。いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、メアヤマイシンである。別の実施形態では、スプライシング調節性化合物は、メアヤマイシンＢである。さらなる実施形態では、スプライシング調節性化合物は、スプライセオスタチンＡである。
【００７０】
[0104]いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、以下に示されるような構造を有するスプライセオスタチン化合物である：
【化４】
2020514348.tif 000006
【００７１】
[0105]種々の実施形態では、スプライシング調節性化合物は、タイランスタチン又はタイランスタチン誘導体である。「タイランスタチン誘導体」とは、既知タイランスタチンのファミリーのメンバーと構造的に関連する化合物を指す。タイランスタチンは、バークホルデリア・タイランデンシス（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｔｈａｉｌａｎｄｅｎｓｉｓ）ＭＳＭＢ４３において最初に同定された。タイランスタチンから３種のタイランスタチンが単離されている（Ｌｉｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、第７６巻、６８５〜９３頁（２０１３年）。いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、タイランスタチンＡ、タイランスタチンＢ又はタイランスタチンＣである。その他の実施形態では、スプライシング調節性化合物は、タイランスタチンＡである。いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、タイランスタチンＢである。いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、タイランスタチンＣである。
【００７２】
[0106]いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、以下に示されるような構造を有するスプライセオスタチン化合物である：
【化５】
2020514348.tif 000007
【００７３】
[0107]いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、スデマイシン又はスデマイシン誘導体である。「スデマイシン誘導体」とは、既知スデマイシンのファミリーのメンバーと構造的に関連し、出発化合物の１つ又は複数の生物学的機能を保持する化合物を指す。スデマイシンは、プラジエノライドＢの誘導体及びＦＲ９０１４６４から合成できる（例えば、Ｆａｎら、ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．、第６巻  ５８２〜９頁（２０１１年）を参照のこと）。スデマイシンは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ無細胞スプライシングアッセイにおけるスプライシングの阻害、細胞ベースの二重リポーターアッセイにおけるスプライシングの阻害、細胞周期停止及びＳＦ３ｂスプライシング因子の細胞局在性の変更を含む、その他の天然スプライセオソームモジュレーターについて報告されているものと同一の効果を示す。同文献。スデマイシンは、Ｌａｇｉｓｅｔｔｉら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、第５２巻、６９７９〜９０頁、（２００９年）；及びＬａｇｉｓｅｔｔｉら、Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．、第５１巻：６２２０〜２４頁（２００８年）によって記載されたように合成できる。スデマイシン及び誘導体を合成するためのその他の技術は、当業者によって容易に理解されるであろう。
【００７４】
[0108]例示的スプライシング調節性化合物として、それだけには限らないが、スデマイシンＣ、スデマイシンＣ１、スデマイシンＤ１、スデマイシンＤ６、スデマイシンＥ及びスデマイシンＦ１が挙げられる。種々の実施形態では、スプライシング調節性化合物は、スデマイシンＣである。特定の実施形態では、スプライシング調節性化合物は、スデマイシンＣ１である。種々の実施形態では、スプライシング調節性化合物は、スデマイシンＤ１である。その他の実施形態では、スプライシング調節性化合物は、スデマイシンＤ６である。いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、スデマイシンＥである。その他の実施形態では、スプライシング調節性化合物は、スデマイシンＦ１である。
【００７５】
[0109]いくつかの実施形態では、スプライシング調節性化合物は、以下に示されるような構造を有するスデマイシン化合物である：
【化６】
2020514348.tif 000008
[0110]また、本明細書において記載される方法を使用して、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１変異状態に依存して使用するための、さらなる公知のもの及び新規スプライシング調節性化合物、例えば、スプライス複合体を標的化する化合物を評価及び同定してもよい。これらとして、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチンＡ及びスデマイシンの代替誘導体及びアナログが挙げられる。
【００７６】
Ｃ．シーケンシング法及びサンプル
[0111]本明細書において記載される方法のある特定の実施形態は、ＰＨＦ５Ａ変異及び／又はＳＦ３Ｂ１変異の存在を同定すること、検出すること及び／又は決定することを含む。核酸又はそれによってコードされるタンパク質を検出、定量及びシーケンシングするための種々の方法が存在し、各々を、本明細書において開示される実施形態におけるＰＨＦ５Ａ変異及び／又はＳＦ３Ｂ１変異の検出に適応させることができる。例示的方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、マイクロアレイ、核酸シーケンシング、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を含むＰＣＲベースの方法、全エキソームシーケンシング、単一ヌクレオチド多型解析、ディープシーケンシング、標的化遺伝子シーケンシング又はそれらの任意の組合せなどの核酸を定量化するアッセイを含む。いくつかの実施形態では、前記の技術及び手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．  （２０００年））に記載される方法に従って実施される。Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ｅｄ．、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−ｌｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９２年（定期的に更新される）も参照のこと。
【００７７】
[0112]例示的なＰＣＲベースの方法では、特定のＰＨＦ５Ａ変異及び／又はＳＦ３Ｂ１変異を、変異を含有する、又は含有すると疑われる配列を特異的に増幅することによって検出できる。例えば、方法は、患者から腫瘍又は癌細胞サンプルを得ること、ゲノムＤＮＡを単離すること並びにＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１遺伝子又は疑われる変異の周囲のその一部（例えば、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６を含む領域）を増幅することを含み得る。
【００７８】
[0113]種々の実施形態では、ＰＣＲベースの方法は、腫瘍サンプル由来のＰＨＦ５Ａ又はＳＦ３Ｂ１遺伝子の第１の部分とハイブリダイズするように特異的に設計された第１のプライマーを使用してもよい。方法は、ＰＨＦ５Ａ若しくはＳＦ３Ｂ１遺伝子中の他の場所及び／又は遺伝子中の別の配列、例えば、上流若しくは下流位置の配列に対応する第１のプライマーのＰＣＲ伸長産物のセグメントとハイブリダイズする第２の反対のプライマーをさらに使用してもよい。いくつかの実施形態では、ＰＣＲプライマーは、疑われる変異を含有する領域（例えば、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６を含む領域）又は疑われる変異位置を含まない領域とハイブリダイズし得る。種々の実施形態では、ＰＣＲ検出法は、定量的（又はリアルタイム）ＰＣＲであり得る。定量的ＰＣＲのいくつかの実施形態では、増幅されたＰＣＲ産物は、核酸プローブを使用して検出され、プローブは、１つ又は複数の検出可能な標識を含有し得る。
【００７９】
[0114]特定の実施形態では、それだけには限らないが、全ゲノムシーケンシング（ＷＧＳ）及び全エキソームシーケンシング（ＷＥＳ）を含むシーケンシング技術を使用して、ＰＨＦ５Ａ変異及び／又はＳＦ３Ｂ１変異の有無についてサンプルを検出、測定又は解析してもよい。ＷＧＳ（全（ｆｕｌｌ）ゲノムシーケンシング、完全ゲノムシーケンシング又は全（ｅｎｔｉｒｅ）ゲノムシーケンシングとしても知られる）は、対象又は細胞サンプルの完全ＤＮＡ配列を決定する。サンプルにおいてＰＨＦ５Ａ変異及び／又はＳＦ３Ｂ１変異を検出するためのＷＧＳのための例示的方法は、Ｎｇ及びＫｉｒｋｎｅｓｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  第６２８巻、２１５〜２６頁（２０１０年）によって記載されるものを含み得る。
【００８０】
[0115]ＷＥＳ（エキソームシーケンシング又は標的化エキソーム捕獲としても知られる）によって、唯一のエキソンではなく多数の遺伝子の解析が可能となる。ＷＥＳの例示的方法は、Ｇｎｉｒｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第２７巻、１８２〜１８９頁（２００９年）によって記載されるものを含み得る。
【００８１】
[0116]種々の実施形態では、サンプルは、癌細胞又は腫瘍組織を含有するヒト又は非ヒト動物対象から得る。「サンプル」は、対象から得た任意の生物学的試料である。この用語は、種々の生物学的供給源から得られたサンプルを含む。例示的サンプルとして、それだけには限らないが、細胞培養物、組織、生検、口腔組織、胃腸組織、臓器、オルガネラ、生物学的流体、血液サンプル、尿サンプル、皮膚サンプルなどが挙げられる。血液サンプルは、全血、部分精製血液又は完全若しくは部分精製血液の画分、例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。サンプルの供給源は、腫瘍組織生検などの固体組織サンプルであり得る。組織生検サンプルは、例えば、乳房組織、皮膚、肺又はリンパ節から得た生検であり得る。サンプルはまた、例えば、骨髄吸引液及び骨髄生検を含む骨髄のサンプルであり得る。サンプルはまた、液体生検、例えば、循環腫瘍細胞、循環無細胞腫瘍ＤＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ  ｔｕｍｏｒ  ＤＮＡ）又はエキソソームであり得る。
【００８２】
[0117]特定の実施形態では、サンプルは、ヒトサンプルである。特定の実施形態では、ヒトサンプルは、血液癌細胞又は固形腫瘍細胞を含む。例示的血液癌として、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫が挙げられる。例示的固形腫瘍として、腺癌などの癌腫が挙げられ、乳癌、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、膵臓癌、結腸癌、結腸直腸癌、皮膚癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌又は腎癌から選択され得る。腫瘍サンプルは、患者から直接得てもよい、又は患者から得られたサンプルから導いてもよい、例えば、生物学的流体又は組織サンプルに由来する培養細胞。サンプルは、対象から直接得た細胞の、又は患者から得た細胞から導いた細胞の保管サンプル、例えば、凍結保存サンプルであり得る。
【００８３】
Ｄ．診断法
[0118]種々の実施形態では、スプライシングモジュレーターを用いる治療に適した腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象を同定する方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーターを用いる治療から恩恵を受けるであろう腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象を同定する方法は、対象から生体サンプルを得ること及び単独又はＳＦ３Ｂ１中の１つ又は複数の変異と組み合わせた、ＰＨＦ５Ａ中の変異（タンパク質中又はタンパク質をコードする核酸中のいずれか）の有無を検出することを含み得る。
【００８４】
[0119]いくつかの実施形態では、対象は、ＰＨＦ５Ａ変異の不在下での、特に、位置Ｙ３６の変異の不在下での、スプライシングモジュレーターを用いる治療の適した候補として同定される。いくつかの実施形態では、対象は、Ｙ３６Ａ、Ｙ３６Ｃ、Ｙ３６Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｙ３６Ｗ、Ｙ３６Ｅ又はＹ３６Ｒ変異を有さない。いくつかの実施形態では、対象は、Ｙ３６Ｃ変異を有さない。ＰＨＦ５Ａ変異がないことは、対象が、スプライシングモジュレーターを用いる治療に対して耐性ではないことを示し得る。ＰＨＦ５Ａ変異がないことは、対象が、スプライシングモジュレーターを用いる治療から恩恵を受ける可能性が高い可能性があることを示し得る。また、ＰＨＦ５Ａ変異がないことを使用して、スプライシングモジュレーターを用いる治療に対して最初に感受性である腫瘍が、変異されて治療に対して耐性にならなかったこと（例えば、位置Ｙ３６の変異を発生することによって）を確認できる。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａの変異状態を使用して、治療の経過にわたって治療有効性をモニタリングし、スプライスモジュレーター療法を用いて継続するか否かを決定できる。
【００８５】
[0120]いくつかの実施形態では、対象は、ＳＦ３Ｂ１中の変異の不在下で、スプライシングモジュレーターを用いる治療に適した候補と同定される。例えば、位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８のうち１つ又は複数の変異（例えば、Ｋ１０７１Ｅ変異、Ｒ１０７４Ｈ変異及び／又はＶ１０７８Ａ若しくはＶ１０７８Ｉ変異）について対象を調べてもよい。
【００８６】
[0121]いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１の変異状態を使用して、治療の経過にわたって治療有効性をモニタリングし、スプライスモジュレーター療法を用いて継続するか否かを決定できる（例えば、対象が、治療の間に、ＰＨＦ５Ａ中の位置Ｙ３６で癌細胞において変異を発生していなかったことを確認することによって）。
【００８７】
[0122]その他の実施形態では、対象における癌サンプルが、ＰＨＦ５Ａ変異、特に、位置Ｙ３６の変異を、単独で、又は１つ若しくは複数のＳＦ３Ｂ１変異（例えば、Ｋ１０７１Ｅ変異、Ｒ１０７４Ｈ変異及び／又はＶ１０７８Ａ若しくはＶ１０７８Ｉ変異）と組み合わせて含有する場合には、対象は、スプライシングモジュレーターを用いる治療の適した候補ではないと同定される。いくつかの実施形態では、対象は、Ｙ３６Ａ、Ｙ３６Ｃ、Ｙ３６Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｙ３６Ｗ、Ｙ３６Ｅ又はＹ３６Ｒ変異を有する。いくつかの実施形態では、対象は、Ｙ３６Ｃ変異を有する。ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１変異の存在は、対象が、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン及びスデマイシンを含む、スプライシングモジュレーターを用いる治療に対して耐性であることを示し得る。ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１変異の存在は、対象が、このようなスプライシングモジュレーターを用いる治療から恩恵を受ける可能性が低いことを示し得る。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１変異の存在は、対象が、スプライセオソームを標的化しない癌の代替治療から恩恵を受ける可能性がより高いことを示し得る。
【００８８】
[0123]腫瘍性疾患を有する対象を治療する方法の詳細な説明は、セクションＥ（以下）に提供されている。
【００８９】
[0124]種々の実施形態では、本明細書において記載される変異のうち１つ又は複数の有無を検出することによって、スプライシングモジュレーターに対して耐性である腫瘍性疾患を有する対象を診断する方法が本明細書において提供される。特定の実施形態では、本明細書において記載される変異のうち１つ又は複数がないことを検出することによって、対象を、スプライシングモジュレーターに対して応答性の腫瘍性疾患を有すると診断する方法が本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、診断は、対象から生体サンプルを得ること及び単独、又はＳＦ３Ｂ１変異と組み合わせたＰＨＦ５Ａ変異の有無を検出することを含む。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異は、Ｙ３６変異である。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異の存在は、対象がスプライシングモジュレーターに対して耐性である腫瘍性疾患を有するという診断をもたらす。その他の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異がないことは、対象がスプライシングモジュレーターに対して応答性の腫瘍性疾患を有するという診断をもたらす。いくつかの実施形態では、ＳＦ３Ｂ１変異は、位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８のうち１つ又は複数の変異（例えば、Ｋ１０７１Ｅ変異、Ｒ１０７４Ｈ変異及び／又はＶ１０７８Ａ若しくはＶ１０７８Ｉ変異）を含む。
【００９０】
[0125]特定の実施形態では、腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象においてＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異を検出する方法が、本明細書において提供される。このような方法は、対象から腫瘍サンプルを得ることと、腫瘍サンプルをスプライシングモジュレーターと接触させることと、スプライシングモジュレーターと接触させた後に腫瘍の成長、体積又は大きさを測定することとを含み得る。いくつかの実施形態では、同一対象から得た未治療対照サンプルと比較した、腫瘍サンプルの成長、体積又は大きさの減少は、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１変異がないことを示す。その他の場合には、成長、体積又は大きさの減少又は増大がないことは、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１変異の存在を示す。
【００９１】
[0126]いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、変異の有無に基づいて腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象に治療を提供することをさらに含む。治療の方法は、セクションＥ（以下）に記載されている。
【００９２】
[0127]特定の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異を決定又は同定することは、患者から得たサンプルにおいてＰＨＦ５Ａタンパク質又はＰＨＦ５Ａをコードする遺伝子をシーケンシングすることを含み得る。いくつかの実施形態では、ＳＦ３Ｂ１中の変異を決定又は同定することは、患者から得たサンプルにおいてＳＦ３Ｂ１タンパク質又はＳＦ３Ｂ１をコードする遺伝子をシーケンシングすることを含む。
【００９３】
[0128]いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１変異を克服可能なスプライスモジュレーターを同定する方法が提供され、ＰＨＦ５Ａ中の変異（特に、位置Ｙ３６の変異）及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異（特に、Ｋ１０７１Ｅ変異、Ｒ１０７４Ｈ変異及び／又はＶ１０７８Ａ若しくはＶ１０７８Ｉ変異）を有すると同定された対象から腫瘍サンプルを提供することと、サンプルを、推定スプライスモジュレーターと接触させることと、腫瘍サンプルの成長を測定することとを含む。腫瘍サンプルが、未治療サンプルに対して低減された成長を有する場合には、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１変異を克服可能なスプライスモジュレーターが同定されている。
【００９４】
Ｅ．治療の方法
[0129]種々の実施形態では、腫瘍性疾患を有する、又は腫瘍性疾患を有すると疑われる対象を治療する方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、腫瘍性疾患を有すると診断された対象を治療する方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は、血液悪性腫瘍、固形腫瘍又は軟部組織肉腫であり得る。いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は、スプライセオソーム中の１つ又は複数の変異と関連する癌である。
【００９５】
[0130]いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は、血液悪性腫瘍である。本明細書において、用語「血液悪性腫瘍」とは、循環系、例えば、血液、骨髄及び／又はリンパ節に影響を及ぼす癌などの増殖性障害を指す。血液悪性腫瘍の例として、それだけには限らないが、骨髄異形成症候群、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、慢性骨髄単球性白血病及び急性骨髄性白血病が挙げられる。
【００９６】
[0131]いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患は、固形腫瘍である。本明細書において、用語「固形腫瘍」とは、増殖性障害、例えば、普通、嚢胞又は液体領域を含有しない組織において異常な腫瘍塊を形成する癌、例えば、肉腫、癌腫及び／又はリンパ腫を指す。例示的状態として、それだけには限らないが、結腸癌、膵臓癌、子宮内膜癌、卵巣癌、乳癌、ブドウ膜黒色腫、胃癌、胆管癌及び肺癌又はそれらの任意のサブセットが挙げられる。
【００９７】
[0132]いくつかの実施形態では、治療されている状態は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）又は別の異形成症候群である。
【００９８】
[0133]特定の実施形態では、腫瘍性疾患は、軟部組織肉腫である。本明細書において、用語「軟部組織肉腫」とは、対象の身体の軟部組織において始まる癌の種類を指す。軟部組織として、筋肉、脂肪、血管、神経、線維組織、腱又は深部皮膚組織を含む周囲関節を挙げることができる。多種多様な肉腫は、これらの領域において生じることがあり、身体の任意の部分で生じ得る。限定されない例として、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、線維芽細胞肉腫、横紋筋肉腫及び滑膜肉腫又はそれらの任意の変種を挙げることができる。
【００９９】
[0134]種々の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠く新生物形成性障害を有する、又は有すると疑われる対象を治療する方法並びにＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異を有する、新生物形成性障害を有する、又は有すると疑われる対象を治療する方法が、本明細書において提供される。
【０１００】
[0135]ＰＨＦ５Ａ及びＳＦ３Ｂ１中の変異及びタンパク質又はそれらをコードする遺伝子中の変異を検出する方法の詳細な説明が、上記で提供されている。
【０１０１】
[0136]種々の実施形態では、治療の方法は、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異又は変異がないことを検出することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＨＦ５Ａ中に変異を欠く対象にスプライシングモジュレーターを投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ＰＨＦ５Ａ中及びＳＦ３Ｂ１中に変異を欠く対象にスプライシングモジュレーターを投与することを含む。
【０１０２】
[0137]いくつかの実施形態では、腫瘍性疾患を有すると診断された対象は、スプライシングモジュレーターを使用して治療される。その他の実施形態では、新生物形成性障害を有する、又は有すると疑われる対象を治療する方法が、本明細書において提供され、対象においてＰＨＦ５Ａ中の変異がないことを検出することと、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠く対象にスプライシングモジュレーターを投与することとを含む。その他の実施形態では、腫瘍性疾患を有する対象を治療する方法が、本明細書において提供され、対象から生体サンプルを得ることと、対象から得たサンプルがＰＨＦ５Ａ中の変異を含有しないことを決定することと、対象にスプライシングモジュレーターの治療上有効な量を投与することとを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは、位置Ｙ３６に変異を有さないと決定される。いくつかの実施形態では、サンプルは、Ｙ３６Ａ、Ｙ３６Ｃ、Ｙ３６Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｙ３６Ｗ、Ｙ３６Ｅ又はＹ３６Ｒ変異を有さない。いくつかの実施形態では、次いで、対象に、スプライシングモジュレーターを投与する。いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーターは、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン、スデマイシン又はそれらの誘導体又はアナログである。
【０１０３】
[0138]いくつかの実施形態では、対象から得たサンプルをさらに評価して、治療の前にＳＦ３Ｂ１中に変異を含有するか否かを決定する。例えば、サンプルを評価して、ＳＦ３Ｂ１中に位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８のうち１つ又は複数の変異が存在するか否かを決定してもよい。いくつかの実施形態では、変異は、位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８のうち１つ又は複数で存在しない。いくつかの実施形態では、次いで、対象にスプライシングモジュレーターを投与する。いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーターは、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン、スデマイシン又はそれらの誘導体又はアナログである。
【０１０４】
[0139]いくつかの実施形態では、対象から得たサンプルを、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６変異並びに／又はＳＦ３Ｂ１中の位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８のうち１つ又は複数の変異を有すると決定する。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異は、Ｙ３６Ａ、Ｙ３６Ｃ、Ｙ３６Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｙ３６Ｗ、Ｙ３６Ｅ又はＹ３６Ｒ変異であり、ＳＦ３Ｂ１中の変異は、Ｋ１０７１Ｅ変異、Ｒ１０７４Ｈ変異及び／又はＶ１０７８Ａ若しくはＶ１０７８Ｉ変異のうち１つ又は複数から選択される。いくつかの実施形態では、少なくともこの変異パターンを含む対象に、スプライシングモジュレーターを投与しない。いくつかの実施形態では、対象に、代替癌治療（代替抗腫瘍、抗新生物剤とも呼ばれる）、例えば、細胞傷害性薬剤、抗体、細胞周期調節剤、アポトーシス薬、壊死剤又はスプライセオソームを標的化しないその他の薬剤を投与する。
【０１０５】
[0140]いくつかの実施形態では、新生物形成性障害を有する、又は有すると疑われる対象を治療する、その治療をモニタリング及び／又は調整する方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、方法は、対象から得た第１のサンプルにおいてＰＨＦ５Ａ中の変異がないことを検出することと、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠く対象にスプライシングモジュレーターを投与することと、第１の治療後又は数ラウンドの治療後に対象からさらなるサンプルを得ることと、第２のサンプルにおいてＰＨＦ５Ａ中の変異の有無を決定することと、変異が依然として存在しない場合には、さらなる用量のスプライシングモジュレーターを投与することとを含む。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異は、位置Ｙ３６にある。いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーターは、ハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン、スデマイシン又はそれらの誘導体又はアナログから選択される。
【０１０６】
[0141]いくつかの実施形態では、サンプルをまた、ＳＦ３Ｂ１中の変異について調べてもよい。いくつかの実施形態では、サンプルを、ＳＦ３Ｂ１中の位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８のうちの１つ又は複数の変異について調べる。いくつかの実施形態では、変異は、ＳＦ３Ｂ１中のこれらの位置のうち１つ又は複数に（ＰＨＦ５Ａ中の位置Ｙ３６にも）存在せず、対象にハーボキシジエン、プラジエノライド、スプライセオスタチン、スデマイシン又はそれらの誘導体又はアナログから選択されるスプライシングモジュレーターを投与する。
【０１０７】
[0142]さらなる実施形態では、スプライシングモジュレーターを投与した後に第２のサンプルにおいてＰＨＦ５Ａ中の変異を検出する。いくつかの実施形態では、変異は、位置Ｙ３６にある。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異は、Ｙ３６Ａ、Ｙ３６Ｃ、Ｙ３６Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｙ３６Ｗ、Ｙ３６Ｅ又はＹ３６Ｒ変異である。いくつかの実施形態では、第２のサンプルにおいて位置Ｋ１０７１、Ｒ１０７４及びＶ１０７８のうち１つ又は複数で変異を検出する。これらの実施形態では、スプライセオソーム治療を中断し、対象にさらなる用量のスプライシングモジュレーターを投与しない。いくつかの実施形態では、スプライシングモジュレーターを投与した後にＰＨＦ５Ａ中の変異が検出される場合には、対象にスプライセオソームを標的化しない代替癌治療を投与する。
【０１０８】
[0143]種々の実施形態では、サンプルを得、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異についてスクリーニングするプロセスを、治療計画を通じて１回又は複数のさらなる回数反復する。いくつかの実施形態では、継続治療は、上記のプロトコールに従うさらなるサンプルにおいて同定される変異の有無次第である。
【０１０９】
[0144]特定の実施形態では、スプライシングモジュレーターに応答性である腫瘍性疾患を有する対象を同定する方法が、本明細書において提供される。その他の実施形態では、スプライシングモジュレーターに応答性である腫瘍性疾患を有する対象を同定する方法が、本明細書において提供され、対象からサンプルを得ることと、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異がないことを検出することとを含む。さらなる実施形態では、ＰＨＦ５Ａ及び／又は中の変異が、検出されない場合に、対象を治療応答性腫瘍性疾患を有すると同定する。さらなる実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異を欠く対象に、スプライシングモジュレーターを投与する。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ及びＳＦ３Ｂ１変異を欠く対象に、スプライシングモジュレーターを投与する。特定の実施形態では、スプライシングモジュレーターに対して応答性である腫瘍性疾患を有する対象を同定する方法が、本明細書において提供され、対象からサンプルを得ることと、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異がないことを検出することとを含み、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異が検出されない場合に、対象を、治療応答性腫瘍性疾患を有すると同定する。方法は、対象にスプライシングモジュレーターを投与することをさらに含み得る。
【０１１０】
[0145]種々の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠く対象に、１種又は複数種のスプライシングモジュレーターを、単独又はスプライセオソームを標的化しない別の癌治療と組み合わせて投与する。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠く対象に、１種、２種、３種、４種、５種又はそれより多いスプライシングモジュレーターを投与する。当業者ならば、治療されるべき患者及び腫瘍学状態（ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）並びに当技術分野で認識されるその他の因子に応じて、適した治療上有効な投与量及び投薬計画を選択することができる。
【０１１１】
[0146]いくつかの実施形態では、変異を欠く対象に、ＳＦ３Ｂ１モジュレーターを投与する。その他の実施形態では、変異を欠く対象に、ＰＨＦ５Ａモジュレーターを投与する。スプライシングモジュレーターのより詳細な説明については、上記のセクションＢを参照のこと。
【０１１２】
[0147]特定の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠く対象に、プラジエノライド又は誘導体、スプライセオスタチン又は誘導体、ハーボキシジエン又は誘導体、タイランスタチン又は誘導体又はそれらの任意の組合せを投与できる。いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠くと決定された対象に、プラジエノライド及び／又はスプライセオスタチン又はハーボキシジエン又はタイランスタチンを投与できる。その他の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠くと決定された対象に、スプライセオスタチン及び／又はプラジエノライド又はハーボキシジエン又はタイランスタチンを投与できる。別の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠くと決定された対象に、ハーボキシジエン及び／又はスプライセオスタチン又はプラジエノライド又はタイランスタチンを投与できる。
【０１１３】
[0148]いくつかの実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠くと決定された対象に、プラジエノライドＢ、プラジエノライドＤ、Ｅ７１０７又は表１に示されるプラジエノライドモジュレーター又はそれらの組合せを投与できる。その他の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠くと決定された対象に、ＦＲ９０１４６３、ＦＲ９０１４６４、ＦＲ９０１４６５、メアヤマイシン、メアヤマイシンＢ、スプライセオスタチンＡ、スデマイシンＣ、スデマイシンＣ１、スデマイシンＤ１、スデマイシンＤ６、スデマイシンＥ又はスデマイシンＦ又はそれらの組合せを投与できる。さらなる実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠くと決定された対象に、ハーボキシジエン又は誘導体を投与できる。
【０１１４】
[0149]その他の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ中の変異を欠く対象に、スプライシングモジュレーターを、１種又は複数のその他の腫瘍学治療（ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）と同時投与する。
【０１１５】
[0150]種々の実施形態では、本明細書において提供される方法は、ＰＨＦ５Ａ中の変異を検出することを含む。いくつかの実施形態では、対象は、ＰＨＦ５Ａ中の変異を有すると決定されている。いくつかの実施形態では、対象は、ＰＨＦ５Ａ−ＳＦ３Ｂ１境界面中又はその付近に変異を有すると決定されている。いくつかの実施形態では、特定のＰＨＦ５Ａ変異は、Ｙ３６変異を含む。特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６変異を検出する。特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、Ｙ３６Ａ、Ｙ３６Ｃ、Ｙ３６Ｓ、Ｙ３６Ｆ、Ｙ３６Ｗ、Ｙ３６Ｅ又はＹ３６Ｒ変異を検出する。特定の実施形態では、本明細書において提供される方法は、Ｙ３６Ｃ変異を検出する。
【０１１６】
[0151]種々の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ変異（例えば、Ｙ３６変異）及び／又はＳＦ３Ｂ１変異が検出される場合には、スプライセオソームを標的化しない任意の抗腫瘍、抗新生物剤を、腫瘍性疾患の代替治療として使用してもよい。さらに、このような治療を、ＰＨＦ５Ａ変異を欠く対象においてスプライスモジュレーターを用いる治療の補助として使用してもよい。
【０１１７】
[0152]適した代替治療を、単独で又は組み合わせて使用してもよい。いくつかの実施形態では、代替抗腫瘍、抗新生物剤は、細胞傷害性薬剤及び／又は細胞増殖抑制剤であり得る。細胞傷害性及び／又は細胞増殖抑制剤の限定されない例として、アナストロゾール、アザチオプリン、Ｂｃｇ、ビカルタミド、クロラムフェニコール、シクロスポリン、シドホビル、コールタール含有製品、コルヒチン、ダナゾール、ジエチルスチルベストロール、ジノプロストン、ジトラノール含有製品、デュタステリド、エストラジオール、エキセメスタン、フィナステリド、フルタミド、ガンシクロビル、ゴナドトロピン、絨毛性ゴセレリン、インターフェロン含有製品（ペグインターフェロンを含む）、レフルノミド、レトロゾール、酢酸リュープロレリン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メノトロピン、ミフェプリストン、ミコフェノール酸モフェチル、ナファレリン、エストロゲン含有製品、オキシトシン（シントシノン及びシントメトリンを含む）、ポドフィリン、プロゲステロン含有製品、ラロキシフェン、リババリン（Ｒｉｂａｖａｒｉｎ）、シロリムス、ストレプトゾシン、タクロリムス、タモキシフェン、テストステロン、サリドマイド、トレミフェン、トリフルリジン、トリプトレリン、バルガンシクロビル及びジドブジンが挙げられる。
【０１１８】
[0153]いくつかの実施形態では、代替抗腫瘍、抗新生物剤は、プロテアソーム阻害剤であり得る。いくつかの実施形態では、プロテアソーム阻害剤は、汎細胞傷害性阻害剤であり得る。プロテアーゼ阻害剤の限定されない例として、ボルテゾミブ（ベルケード（登録商標））、カルフィルゾミブ（カイプロリス（登録商標））、イキサゾミブ（ニンラーロ（登録商標））、サリドマイド（サロミド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）（登録商標））、ポマリドミド（ポマリスト（登録商標））、ジスルフィラム、エピガロカテキン−３−ガレート、マリゾミブ（サリノスポラミドＡ）、オプロゾミブ（ＯＮＸ−０９１２）、デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）、エポキソミシン、ＭＧ１３２及びβ−ヒドロキシβ−メチルブチレートが挙げられる。
【０１１９】
[0154]特定の実施形態では、本明細書において開示される方法は、治療に先立って対象が癌を有するか否かを決定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、この決定は、以下のＳＦ３Ｂ１変異のうち１つ又は複数を同定することによって行う：Ｅ６２２Ｄ、Ｅ６２２Ｋ、Ｅ６２２Ｑ、Ｅ６２２Ｖ、Ｙ６２３Ｃ、Ｙ６２３Ｈ、Ｙ６２３Ｓ、Ｒ６２５Ｃ、Ｒ６２５Ｇ、Ｒ６２５Ｈ、Ｒ６２５Ｌ、Ｒ６２５Ｐ、Ｒ６２５Ｓ、Ｎ６２６Ｄ、Ｎ６２６Ｈ、Ｎ６２６Ｉ、Ｎ６２６Ｓ、Ｎ６２６Ｙ、Ｈ６６２Ｄ、Ｈ６６２Ｌ、Ｈ６６２Ｑ、Ｈ６６２Ｒ、Ｈ６６２Ｙ、Ｔ６６３Ｉ、Ｔ６６３Ｐ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｍ、Ｋ６６６Ｎ、Ｋ６６６Ｑ、Ｋ６６６Ｒ、Ｋ６６６Ｓ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ７００Ｅ、Ｖ７０１Ａ、Ｖ７０１Ｆ、Ｖ７０１Ｉ、Ｉ７０４Ｆ、Ｉ７０４Ｎ、Ｉ７０４Ｓ、Ｉ７０４Ｖ、Ｇ７４０Ｅ、Ｇ７４０Ｋ、Ｇ７４０Ｒ、Ｇ７４０Ｖ、Ｋ７４１Ｎ、Ｋ７４１Ｑ、Ｋ７４１Ｔ、Ｇ７４２Ｄ、Ｄ７８１Ｅ、Ｄ７８１Ｇ及び／又はＤ７８１Ｎ。特定の実施形態では、ＳＦ３Ｂ１変異は、Ｋ７００Ｅ、Ｋ６６６Ｎ、Ｒ６２５Ｃ、Ｇ７４２Ｄ、Ｒ６２５Ｈ、Ｅ６２２Ｄ、Ｈ６６２Ｑ、Ｋ６６６Ｔ、Ｋ６６６Ｅ、Ｋ６６６Ｒ、Ｇ７４０Ｅ、Ｙ６２３Ｃ、Ｔ６６３Ｉ、Ｋ７４１Ｎ、Ｎ６２６Ｙ、Ｔ６６３Ｐ、Ｈ６６２Ｒ、Ｇ７４０Ｖ、Ｄ７８１Ｅ及び／又はＲ６２５Ｌを含む。特定の実施形態では、上記の方法に従う治療に先立って、癌を有すると同定された対象を、スプライシング調節剤に対する耐性についてスクリーニングする。いくつかの実施形態では、癌を有する及びスプライシング調節剤を用いる治療に対して応答性である癌を有すると同定された対象を、次いで上記の方法に従って治療する。
【０１２０】
[0155]種々の実施形態では、腫瘍性疾患を有する、又は有すると疑われる対象のための治療計画を決定する方法が、本明細書において提供される。特定の実施形態では、方法は、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異の有無を同定することを含む。いくつかの実施形態では、変異が存在しない場合に、スプライシングモジュレーターを含む治療計画が示される。その他の実施形態では、変異が存在する場合には、代替癌治療が指示される。
【０１２１】
[0156]種々の実施形態では、腫瘍性疾患の治療の間に、対象における変異状態をモニタリング方法が、本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、方法は、治療の前又は治療の間に対象においてＰＨＦ５Ａ中の変異がないことを検出することを含む。例えば、いくつかの実施形態では、治療の前及び／又は治療の間にＰＨＦ５Ａ中の変異がないことは、対象がスプライシングモジュレーターに対して応答性であり得ることを示す。その他の実施形態では、治療の前及び／又は治療の間の変異の存在は、スプライセオソームを標的化しない代替治療が必要であることを示し得る。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、治療の前にＰＨＦ５Ａ中の変異がないことを検出することと、対象にスプライシングモジュレーターを投与することと、治療の間に変異状態をモニタリングすることとを含む。いくつかの実施形態では、方法は、スプライシングモジュレーターを用いる治療の間にＰＨＦ５Ａ中の変異がないことを検出することと、治療を継続すると決定することとをさらに含む。ＰＨＦ５Ａ中の変異がないことは、対象にスプライシングモジュレーターのさらなる用量を投与してもよいことを示す。いくつかの実施形態では、方法は、スプライシングモジュレーターを用いる治療の間にＰＨＦ５Ａ中の変異の存在を検出することと、治療を中断する及び／又は代替癌治療に切り替えるように決定することとをさらに含む。例えば、ＰＨＦ５Ａ中の変異の存在は、スプライシングモジュレーターを用いる治療を終結すべきであり、本明細書において記載されるような代替治療を投与するべきであることを示し得る。
【０１２２】
[0157]いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、治療を通じてＰＨＦ５Ａ中の変異の有無についてモニタリングすることを含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、治療を通じてＳＦ３Ｂ１中の変異の有無についてモニタリングすることもさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される方法は、スプライシングモジュレーターを用いる各治療サイクル後にＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異の有無について調べることを含む。
【０１２３】
[0158]種々の実施形態では、本明細書における開示内容は、腫瘍性疾患の治療において使用するためのスプライスモジュレーターを提供し、スプライスモジュレーターは、これまでに示されたように、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異が存在する又は存在しない場合に使用するために示される。種々の実施形態では、本明細書における開示内容は、腫瘍性疾患を治療するための医薬の製造において使用するためのスプライスモジュレーターを提供し、スプライスモジュレーターは、これまでに示されたように、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異が存在する又は存在しない場合に使用するために示される。種々の実施形態では、本明細書における開示内容は、腫瘍性疾患の治療において治療するためにＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異を提供し、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異の有無に応じて治療のためにスプライスモジュレーターが示される。
【０１２４】
Ｆ．キット
[0159]種々の実施形態では、ＰＨＦ５Ａ及び／又はＳＦ３Ｂ１中の変異を検出する試薬を含むキットも本明細書において開示される。当業者ならば、本開示の方法（単数又は複数）を実施するのに適したキットの構成成分を認識するであろう。例えば、キットは、各々が１種又は複数の試薬を含有するのに適している１つ又は複数の容器、ＰＨＦ５Ａ及び／若しくはＳＦ３Ｂ１中の変異を検出するためのその他の手段、キットを使用してＰＨＦ５Ａ及び／若しくはＳＦ３Ｂ１中の変異を検出するための使用説明書並びに任意選択で、このような変異の有無を同定した後に本明細書において記載される方法のうち１つ又は複数を実施するための使用説明書を含んでもよい。
【０１２５】
[0160]いくつかの例では、キットはまた、本開示を実施するために必要とされる１種又は複数の試薬を保持可能である、１つ又は複数のバイアル、チューブ、ボトル、ディスペンサーなどを含み得る。
【０１２６】
[0161]本開示のキットのための使用説明書は、包装材料に添付してもよく、添付文書として含めてもよく、及び／又はウェブサイトへのリンクによって特定してもよい。使用説明書は、通常書面又は印刷材料であるが、それらはそのようなものに限定されない。このような使用説明書を、保管可能な、それらをエンドユーザーに伝達可能な任意の媒体が、本開示によって考慮される。このような媒体として、それだけには限らないが、電子的ストレージ媒体（例えば、磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（例えば、ＣＤ  ＲＯＭ）などが挙げられる。本明細書において、用語「使用説明書」は、使用説明書を提供するインターネットサイトのアドレスを含み得る。この例として、使用説明書を見ることができる、及び／又は使用説明書をダウンロードできるウェブアドレスを提供するキットを挙げることができる。その他の例では、本開示のキットは、本開示の方法の実施において使用してもよい１つ又は複数のコンピュータプログラムを含み得る。例えば、マイクロプレートリーダー又はリアルタイムＰＣＲゲル又は読み取り値からのアウトプットを受け取り、ウェル、キャピラリー又はゲルにおいて観察された光学濃度から較正曲線を調製し、これらの濃度測定読み取り値又はその他の定量的読み取り値を、試験サンプルを有するウェル、キャピラリー又はゲルにおける光学濃度読み取り値又はその他の定量的読み取り値と比較するコンピュータプログラムを提供してもよい。
【０１２７】
[0162]いくつかの実施形態では、キットは、変異を検出するために使用するための使用説明書を含み得る。その他の実施形態では、キットは、ＰＨＦ５Ａ中の変異を検出する試薬、変異を検出するために使用するための使用説明書を含み得る。キットは、ＳＦ３Ｂ１中の変異を検出するための試薬をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異及び／又はＳＦ３Ｂ１中のＫ１０７１、Ｒ１０７４若しくはＶ１０７８変異又はそれらの組合せを検出するために使用される。特定の実施形態では、本明細書において記載されるキットは、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異及び／又はＳＦ３Ｂ１中のＫ１０７１変異の有無を検出するために使用される。別の特定の実施形態では、本明細書において記載されるキットは、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異及び／又はＳＦ３Ｂ１中のＲ１０７４変異の有無を検出するために使用される。なお別の特定の実施形態では、本明細書において記載されるキットは、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異及び／又はＳＦ３Ｂ１中のＶ１０７８変異の有無を検出するために使用される。その他の実施形態では、キットは、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ変異の有無を検出するために使用される。いくつかの実施形態では、キットは、ＳＦ３Ｂ１中のＫ１０７１変異の有無を検出するために使用される。その他の実施形態では、キットは、ＳＦ３Ｂ１中のＲ１０７４変異の有無を検出するために使用される。その他の実施形態では、キットは、ＳＦ３Ｂ１中のＶ１０７８変異の有無を検出するために使用される。
【０１２８】
等価物
[0163]本明細書において記載される本発明の方法のその他の適した改変及び適応は明らかであり、本開示又は実施形態の範囲から逸脱することなく、適した等価物を使用して行うことができるということは、当業者には容易に理解されるであろう。特定の化合物及び方法をここで詳細に記載したが、これは、例示目的で含まれ、限定であるようには意図されない以下の実施例を参照することによって、より明確に理解されるであろう。
【実施例】
【０１２９】
[0164]以下の実施例は、本開示を例示するのに役立ち、決して限定しない。
【０１３０】
１．方法
１．１．材料
[0165]親のＨＣＴ１１６細胞は、ＡＴＣＣから入手し、１０％  ＦＢＳを補給したＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ＧＩＢＣＯ番号１１８７５）で培養した。親のＰａｎｃ０５０４細胞は、ＡＴＣＣから入手し、グルコース（４．５ｇ／Ｌ最終まで）、ＨＥＰＥＳ（１０ｍＭ最終）、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ最終）、ヒトインスリン（１０μｇ／ｍｌ最終）及び１５％  ＦＢＳを補給したＧＩＢＣＯ  ＲＰＭＩ  １６４０培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ＧＩＢＣＯ番号１１８７５）で培養した。細胞株確証は、多型ショートタンデムリピート（ＳＴＲ）遺伝子座（ＡＴＣＣ）を使用する遺伝子プロファイリングによって達成した。すべての細胞株が、マイコプラズマ混入がなかった。Ｌｅｎｔｉ−Ｘ−２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．カタログ番号６３２１８０）、レンチウイルスのパッケージングのための細胞株は、１０％ウシ胎児血清及び４ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有する「ダルベッコ改変イーグル培地」（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ＧＩＢＣＯ番号１１９６５）で維持した。ＷＴ  ＰＨＦ５Ａ  ｃＤＮＡは、Ｇｅｎｅｃｏｐｏｅｉａから入手し、ｐＤＯＮＲ  ２２１ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中にクローニングした。配列が確認された陽性クローンを、ＬＲ組換えによってｐＬｅｎｔｉ６．３／Ｖ５  ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中にクローニングした。Ｙ３６及びＶ３７の変異誘発は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ  ＩＩキットを使用し、ＰＨＦ５Ａ  ＷＴプラスミドを使用して製造業者の推奨に従って使用して実施した。変異誘発のために使用したすべてのプライマーを、Ａｇｉｌｅｎｔ製のＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｄｅｓｉｇｎツールを使用して設計した。ＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６又はＶ３７バリアントの確認された陽性クローンを、Ｘ２９３Ｔ細胞を使用するレンチウイルス製造のために使用した。次いで、親のＨＣＴ１１６細胞及びＰａｎｃ０５０４細胞にウイルス含有培地を用いて感染させ、１０μｇ／ｍｌのブラストサイジンＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて１週間選択した。遺伝子操作された細胞株を、抗生物質を含まない同一培地で維持した。以下の一次抗体を、ＬＩ−ＣＯＲバッファー（ＬＩ−ＣＯＲ）中でウエスタンブロット解析のために１：１０００希釈で使用した：α−ＳＦ３Ｂ１マウスモノクローナル抗体（ＭＢＬ、Ｄ２２１−３）、α−ＳＦ３Ｂ３ウサギポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈ、１４５７７−１−ＡＰ）、α−ＳＦ３Ｂ４ヤギポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、１４２７６）、α−ＳＦ３Ｂ６／ｐ１４ウサギポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈ、１２３７９−１−ＡＰ）、α−ＰＨＦ５Ａウサギポリクローナル抗体（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈ、１５５５４−１−ＡＰ）。α−ＧＡＰＤＨウサギポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｇ９５４５）は、１：１０，０００で使用した。抗ウサギ及び抗ヤギＩＲＤｙｅ−８００ＣＷ二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ）は、１：５０００希釈で使用し、抗マウスＩＲＤｙｅ−６８０ＬＴ二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ）は、１：２０，０００希釈で使用した。ウエスタンブロットは、Ｏｄｙｓｓｅ��  Ｖ３．０イメージャー（ＬＩ−ＣＯＲ）を使用して画像化した。
【０１３１】
[0166]図５は、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃが、ＭＣＬ１スプライシングに向けたスプライシングモジュレーター効果を変更することを示す。図５Ａは、ＷＴ又はＹ３６Ｃ  ＰＨＦ５Ａ過剰発現細胞のいずれかからの示された処置下での種々のＭＣＬ１アイソフォームの生成の代表的なｓａｓｈｉｍｉプロットを表す。図５Ｂは、ＷＴ（左パネル）又はＹ３６Ｃ（右パネル）のいずれかにおける示されたＭＣＬ１アイソフォームのｔａｑｍａｎ遺伝子発現解析を示す。スプライシングモジュレーターを用いて処置されたＰＨＦ５Ａ過剰発現細胞。エラーバーは、標準偏差を示す、ｎ＝４。
【０１３２】
１．２．化合物
[0167]ボルテゾミブ（ＰＳ−３４１）は、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カタログ番号Ｂ−１４０８、ロット：ＢＢＺ−１１２）から購入した。Ｅ７１０７及び３Ｈ標識プラジエノライドプローブは、Ｅｉｓａｉ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．によって提供され、その合成は、これまでに報告されていた（Ｋｏｔａｋｅら、Ｔｈｅ  ＦＥＢＳ  ｊｏｕｒｎａｌ  第２７８巻、４８７０〜８０頁（２０１１年））。ハーボキシジエンも、Ｅｉｓａｉ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．によって提供された。スプライセオスタチンＡ及びスデマイシンＤ６は、確立した手順に従って社内で合成した（Ｇｈｏｓｈ及びＣｈｅｎ、Ｏｒｇａｎｉｃ  ｌｅｔｔｅｒｓ  第１５巻、５０８８〜９１頁（２０１３年）；Ｌａｇｉｓｅｔｔｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第５６巻、１００３３〜４４頁（２０１３年））。スプライシングモジュレーターについて、化合物同一性及び純度を、ＬＣ／ＭＳ及びプロトンＮＭＲによって評価した。純度は、ＸＳｅｌｅｃｔ  ＣＳＨ  Ｃ１８、１．７μｍ  ２．１×５０ｍｍカラム、０．８ｍＬ／分の流速を用いて２０℃でＷａｔｅｒｓ  ＨクラスＡｃｑｕｉｔｙ超高速液体クロマトグラフィーシステムを使用して決定した。注入は、５％アセトニトリル及び０．１％ギ酸〜９０％アセトニトリル及び０．１％ギ酸の勾配にわたって、２．５分の期間にわたって、１μＬのＤＭＳＯ中１ｍＭのサンプルからなっていた。各化合物の純度は、統合されたＵＶ吸光度ピークから決定した。質量は陽イオンスキャンで検出され、その式量によって予測されたものに対応する。検出器条件は、キャピラリー電圧３．２５ｋＶ、コーン電圧３０Ｖ、ソース温度１５０℃、脱溶媒和温度５００℃、脱溶媒和ガス１０００Ｌ／時間、コーンガス１００Ｌ／時間とした。単一イオン記録を使用して、サンプルの定量化を決定した。データは、０．２秒でｍ／ｚ＝１００〜１０００のスキャンレンジにわたって獲得し、ＱｕａｎＬｙｎｘソフトウェアを使用して処理した。各化合物のプロトンＮＭＲスペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｓｃｅｎｄ  ４００ＭＨｚスペクトロメーターで獲得し、サンプルの同一性及び純度をさらに評価した。示された溶媒は、これまでの刊行物において使用されたものに対応する（Ｅ７１０７のためのピリジン（Ｋｏｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第３巻、５７０〜５頁（２００７年））、スプライセオスタチンＡのためのクロロホルム（Ｇｈｏｓｈ及びＣｈｅｎ、Ｏｒｇａｎｉｃ  ｌｅｔｔｅｒｓ  第１５巻、５０８８〜９１頁（２０１３年））及びスデマイシンＤ６（Ｌａｇｉｓｅｔｔｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  第５６巻、１００３３〜４４頁（２０１３年））及びハーボキシジエンのためのメタノール（Ｇｈｏｓｈ及びＬｉ、Ｏｒｇａｎｉｃ  ｌｅｔｔｅｒｓ  第１５巻、５０８８〜９１頁（２０１３年））。得られたスペクトルは、これらの化合物について報告されたこれまでのデータに対応する。
【０１３３】
１．３．耐性クローン作製、全エキソームシーケンシングサンプル調製、データプロセス及び候補変異の同定
[0168]２５０万個のＨＣＴ１１６細胞を、各１０ｃｍのディッシュに播種し、示された投与量のスプライシングモジュレーターを用いて２週間処置した。化合物を４日毎に再び加えた。必要とされる場合には、コンフルエントディッシュを１：３にわけ、細胞を、再播種後にスプライシングモジュレーター処置を用いずに一晩回復させた。化合物選択期間の最後に、生存している個々のクローンを選びとり、１２ウェルプレートに移した。個々の耐性クローンを、スプライシングモジュレーター処置を用いずにさらに拡大し、各クローンから１００万個の細胞を、Ｑｉａｇｅｎ製のＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ＆  Ｔｉｓｓｕｅキットを使用してゲノムＤＮＡ抽出のためにペレットにした。全エキソームシーケンシング（ＷＸＳ）ライブラリーは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔヒト全エキソンＶ６キットを使用してＮｏｖｏｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって作製され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑプラットフォームでシーケンシングした。各サンプルの１２Ｇ生データを集めた。次いで、ＷＸＳリードを、ＢＷＡ−ＭＥＭによってｈｇ１９に対してアラインし（Ｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第３３巻、６６１〜７頁（２０１５年））、耐性クローンを親細胞株と対形成することによって、Ｓｅｎｔｉｅｏｎパイプライン（Ｗａｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第８巻、２３５〜７頁（２０１２年））によってＭｕＴｅｃｔ２を用いて体細胞変異を同定した（Ｓｃｈｅｎｏｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第９巻、２３２〜４０頁（２０１３年））。ＷＸＳについて耐性クローンが選択されたので、耐性に関与する変異の対立遺伝子頻度は高いはずである。０．２より高い対立遺伝子頻度を有する非サイレント変異（Ｈ３精選されたスプライセオソーム遺伝子の中）に焦点を当てた。
【０１３４】
１．４．成長阻害解析のためのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存力アッセイ
[0169]Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ解析のために、化合物添加の前日に、５００個の細胞を３８４ウェルプレートの各ウェルに播種した。１０のさらなる用量のために、１０μＭの最上最終投与量を用いて出発して、１１部の段階希釈を使用した。ＤＭＳＯパーセンテージを全体にわたって維持し、ＤＭＳＯのみの対照を含めた。化合物添加の７２時間後、培地にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ試薬を添加し、インキュベートし、ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）でアッセイした。各処置サンプルからの発光値を、それぞれのＤＭＳＯ対照の平均値に対して正規化した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用して投与量応答曲線プロットを作成し、非線形回帰分析及び対数（阻害剤）対応答−可変傾斜（４パラメータ）を使用してフィッティングした。ＴＩＢＣＯ  Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェアを使用して、ＩＣ５０シフトのヒートマップ概要のために、投与量応答曲線からＩＣ５０値を抽出し、ＷＴ株のものを上回るＰＨＦ５Ａバリアント発現株におけるＩＣ５０値の変化倍数を算出し、プロットした。最上投与量よりも大きいＩＣ５０について、１０μＭに値を任意に設定した。以下のデフォルトパラメータを使用してＴＩＢＣＯ  Ｓｐｏｔｆｉｒｅで教師なしクラスタリング解析を実施した：クラスタリング法：ＵＰＧＭＡ、距離測定：Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ、オーダリング重量：平均値、正規化：（なし）、空値置換：一定値：０。
【０１３５】
１．５．細胞増殖アッセイ
[0170]示された遺伝子型の１０００個細胞を、９６ウェルの透明底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、番号３９０４）に播種し、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭシステム（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を使用し、４×対物レンズを用いて４時間毎にＨＤ位相差画像を獲得した。ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭソフトウェア（２０１６Ａ）（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）を用いて集めた画像を解析して、コンフルエンシーパーセンテージを算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６、ｎ＝５を用いて解析したデータをグラフ化した。
【０１３６】
１．６．免疫蛍光
[0171]示された遺伝子型の１００万個の細胞を、６ウェルプレート中でＣｏｒｎｉｎｇ  ＢｉｏＣｏａｔフィブロネクチン２２ｍｍカバースリップ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ０８−７７４−３８６）上に播種した。２日後、細胞を、４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳを用いて室温（ＲＴ）で２０分間固定化した。３×ＰＢＳ洗浄後、細胞を０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００／ＰＢＳを用いてＲＴで２０分間透明化した。３×ＰＢＳ洗浄後、細胞を５％  ＦＢＳ／ＰＢＳを用いてＲＴで１時間ブロッキングし、５％  ＦＢＳ／ＰＢＳで１：５０希釈のα−ＳＦ３Ｂ１マウスモノクローナル抗体（ＭＢＬ、Ｄ２２１−３）又はα−ＳＣ３５マウスモノクローナル抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１８２６）とともに冷温室中で一晩インキュベートした。２日目に、カバースリップをＰＢＳで３回洗浄し、５％  ＦＢＳ／ＰＢＳで１：５００希釈のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８抗マウス二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒカタログ番号Ａ−１１０２９）とともに、暗所、ＲＴで１時間インキュベートした。次いで、カバースリップをＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩを有するＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐ３６９３５）を使用してマウントした。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−８１倒立蛍光顕微鏡で１０×対物レンズを用いてスライドを画像化し、Ｏｌｙｍｐｕｓ用Ｍｅｔａｍｏｒｐｈを用いて画像化し、捕獲し、処理した。
【０１３７】
１．７．細胞溶解及び核抽出物調製
[0172]ウエスタンブロット解析のために、プロテアソーム完全プロテアーゼ阻害剤カクテル及びＰｈｏｓＳｔｏｐホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を補給したＲＩＰＡバッファーを使用して細胞ペレットを抽出した。次いで、溶解物を最高速度で１０分間遠心分離し、上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。核抽出物調製のために、細胞をまず洗浄し、次いで、ＰＢＳ中に掻きとって入れた。遠心分離後、細胞ペレットを５充填細胞容積（ＰＣＶ）の低張バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁し、３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。細胞ペレットを３ＰＣＶの低張バッファーに再懸濁し、氷上で１０分間膨潤させた。次いで、ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを使用して膨潤した細胞を溶解し、４℃、４０００ｒｐｍで１５分間遠心させた。ペレットは、核を含有し、半充填核容積（ＰＮＶ）の低塩バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５％グリセロール、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ）を用いて穏やかに懸濁した。次いで、半ＰＮＶの高塩バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．４Ｍ  ＫＣｌ、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２５％グリセロール、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ）を添加し、穏やかに混合した。溶解物を冷温室で３０分間振盪し、その後、４℃、１０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清は核抽出物を含有し、透析バッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ．  ２０％グリセロール、０．２ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ）中で３０，０００ＭＷＣＯカットオフを有するＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセットを使用して４時間透析し、２時間後にバッファーを交換した。次いで、核抽出物をアリコートにわけ、急速凍結した。
【０１３８】
１．８．ｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシングアッセイ
[0173]以下のＡｄ２由来（Ｐｅｌｌｉｚｚｏｎｉら、Ｃｅｌｌ  第９５巻、６１５〜２４頁（１９９８年））、続いて修飾された（Ｃｏｒｒｉｏｎｅｒｏら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第２５巻、４４５〜５９頁（２０１１年））配列actctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcatgacttctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgcggtgatgcctttgagggtggccgcgtccatctggtcagaaaagacaatctttttgttgtcaagctttgcacgtctagggcgcagtagtccagggtttccttgatgatgtcatactaatcctgtcccttttttttccacagctcgcggttgaggacaaactcttcgcggtctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacg（配列番号３）（イタリック体で下線が引かれたイントロン）を、５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＸｂａＩ制限部位を使用してｐＧＥＭ−３Ｚベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングした。ＦｔｚΔｉプラスミド（Ｌｕｏ  ＆  Ｒｅｅｄ、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  第９６巻、１４９３７〜４２頁（１９９９年））は、Ｒｏｂｉｎ  Ｒｅｅｄから入手した。ｐＧＥＭ−３Ｚ−Ａｄ２．１及びＦｔｚΔｉプラスミドを、それぞれＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩを使用して線形化し、精製し、ＴＥバッファーに再懸濁し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応においてＤＮＡ鋳型として使用した。Ａｄ２．１プレｍＲＮＡ及びＦｔｚ  ｍＲＮＡを作製し、それぞれ、ＭＥＧＡＳｃｒｉｐｔ  Ｔ７及びＭｅｇａＣｌｅａｒキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製した。８０μｇの核抽出物、２０Ｕ  ＲＮＡｓｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２０ｎｇ  Ａｄ２．１プレｍＲＮＡ及び２ｎｇ  Ｆｔｚ  ｍＲＮＡ（内部対照）を使用して、２０μＬのスプライシング反応物を調製した。示された化合物とともに１５分のプレインキュベーションした後、活性化バッファー（０．５ｍＭ  ＡＴＰ、２０ｍＭリン酸クレアチン、１．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を添加してスプライシングを開始し、反応物を３０℃で９０分間インキュベートした。ＲＮｅａｓｙ  ９６キット（Ｑｉａｇｅｎ）由来の改変されたプロトコールを使用してＲＮＡを抽出した。３５０μＬのＢｕｆｆｅｒ  ＲＬＴ  Ｐｌｕｓ（Ｑｉａｇｅｎ）中でスプライシング反応をクエンチし、１．５容量のエタノールを添加した。混合物をＲＮｅａｓｙ  ９６プレートに移し、サンプルをキットプロトコールに記載されるように処理した。ＲＮＡをｄＨ２Ｏを用いて１／１００希釈した。１０μＬのＲＴ−ｑＰＣＲ反応物を、ＴａｑＭａｎ  ＲＮＡ−ｔｏ−ＣＴ  １ステップキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２μＬの希釈スプライシング反応物、０．５μＬ  Ａｄ２（フォワード：ACTCTCTTCCGCATCGCTGT（配列番号４）、リバース：CCGACGGGTTTCCGATCCAA（配列番号５）、プローブ：CTGTTGGGCTCGCGGTTG（配列番号６））及び０．５μＬ  Ｆｔｚ（フォワード：TGGCATCAGATTGCAAAGAC（配列番号７）、リバース：ACGCCGGGTGATGTATCTAT（配列番号８）、プローブ：CGAAACGCACCCGTCAGACG（配列番号９））ｍＲＮＡプライマー／プローブセットを使用して調製した。Ａｄ２  Ｆｔｚプローブは、ＩＤＴ製であり、ＺＥＮクエンチャーを有するＦＡＭアクセプターを用いて標識され、Ｆｔｚプローブは、Ｈｅｘ及びＺＥＮクエンチャーを用いて標識されている。
【０１３９】
１．９．シンチレーション近接アッセイ
[0174]抗マウスＰＶＴ  ＳＰＡシンチレーションビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）への抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ）のバッチ固定化を以下のとおりに調製した。１．５ｍｇのビーズごとに、１５０μＬ  ＰＢＳ中で１０μｇの抗体を調製した。抗体−ビーズ混合物を室温で３０分間インキュベートし、１５，０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。１５０μＬのＰＢＳを使用して、１．５ｍｇの抗体−ビーズ混合物ごとに再懸濁した。上記のミニＳＦ３ｂ複合体を３Ｈ標識プラジエノライドプローブ（Ｋｏｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ、５７０〜５頁（２００７年））結合について試験した。５０μＬのビーズスラリー及びバッファー（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８、２００ｍＭ  ＫＣｌ、５％グリセロール）中、０又は５０ｎＭタンパク質を用いて、１００μＬの結合反応物を調製した。混合物を３０分間インキュベートし、種々の濃度の３Ｈ標識プラジエノライドプローブを添加した。混合物を３０分間インキュベートし、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２プレートカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光シグナルを読み取った。ＷＴミニ−ＳＦ３ｂ複合体を用いて化合物競合研究を実施した。５０μＬビーズスラリー、バッファー中、２５ｎＭタンパク質及び種々の濃度の化合物を用いて１００μＬ結合反応物を調製した。３０分のプレインキュベーション後、１ｎＭの３Ｈ標識プラジエノライドプローブを添加した。反応物を３０分間インキュベートし、発光シグナルを読み取った。
【０１４０】
[0175]これまでに調製した核抽出物を、２．５ｍｇアリコートとして保存した。各アリコートは、３つのＳＰＡサンプルにとって十分であり、１ｍＬの総容量のホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤を有するＰＢＳに希釈した。十分量のアリコートを、４℃、１５，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。上清を清潔なチューブに回収し、氷上で維持した。ＷＴ又はＹ３６Ｃ  ＰＨＦ５Ａを含有する組換えタンパク質複合体を、上記のように調製した。抗マウスＰＶＴ  ＳＰＡシンチレーションビーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）への抗ＳＦ３Ｂ１（ＭＢＬ）抗体のバッチ固定化を以下のとおりに調製した。２．５ｍｇのビーズごとに、１５０μＬ  ＰＢＳ中で５μｇの抗ＳＦ３Ｂ１抗体及び１．５ｍｇのビーズを混合した。抗体−ビーズ混合物を室温で３０分間にインキュベートし、１５，０００ＲＰＭで５分間遠心分離した。ビーズを懸濁し、調製した核抽出物に添加した。スラリーを穏やかに混合しながら４℃で２時間インキュベートした。１５，０００ＲＰＭで５分間遠心分離することによってビーズを集め、ＰＢＳ＋０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて２回洗浄した。最後の遠心分離ステップ後、１．５ｍｇごとのビーズを１５０μＬのＰＢＳを用いて懸濁した。１００μＬの結合反応物を以下のとおりに調製した。５０μＬのビーズスラリー、２５μＬの、１０μＭのコールド競合化合物、３０分のプレインキュベーション後に１０ｎＭ  ３Ｈ標識プラジエノライドプローブを添加した。混合物を３０分間インキュベートし、ＭｉｃｒｏＢｅｔａ２プレートカウンター（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用して発光シグナルを読み取った。
【０１４１】
１．１０．質量分析解析
[0176]濃縮サンプルを、５６℃で５ｍＭ  ＤＴＴを用いて４５分間還元し、室温で２０ｍＭヨードアセトアミドを用いて３０分間アルキル化した。サンプルを４〜１５％  Ｔｒｉｓグリシンゲルで流し、ゲルを切り出し、脱染し、３０℃で一晩トリプシン消化した。５０μｌのバッファーＡ、Ｂ及びＣを逐次用いてペプチドを抽出した（バッファーＡ−１％ギ酸及び５０％アセトニトリル、Ｂ−１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、Ｃ−１００％アセトニトリル）。サンプルを凍結乾燥機を使用して乾燥させ、３０μｌのランニングバッファーＡ（水中、０．１％  ギ酸）に再懸濁した。サンプルを、Ｃ１８  ｅａｓｙ  ｓｐｒａｙカラム粒径：３μｍ；１５０×０．０７５ｍｍ  Ｉ．Ｄ．を使用するＱＥｘａｃｔｉｖｅマススペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接続されたｅａｓｙ−ｎＬＣ  １０００  ＨＰＬＣシステムでナノキャピラリー液体クロマトグラフィータンデム質量分析によって解析し、データをＰｒｏｔｅｏｍｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  １．４を使用して解析した。
【０１４２】
１．１１．ＰＨＦ５Ａのクローニング、タンパク質精製及び結晶化
[0177]タンパク質安定性の増強のためにＣ４０Ｓ変異を含有する全長ヒトＰＨＦ５Ａを合成し、Ｎ末端Ｈｉｓ−ＭＢＰ−ＴＥＶ切断可能タグを有するｐＥＴ−２８ａのＮｄｅＩ及びＥｃｏＲＩ部位の間にサブクローニングした。タンパク質を、ＬＢ培地で増殖させたＢＬ２１（ＤＥ３）ｓｔａｒ細胞において発現させた。細胞を、ＯＤ６００＝１．０で、１００μＭ  ＺｎＣｌ２を補給した０．５Ｍ  ＩＰＴＧを用いて１６℃で一晩誘導した。ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＴＣＥＰ中で溶解物を調製し、ＮＴＡカラムにロードし、５００ｍＭイミダゾールまでの勾配にわたって溶出した。ピーク画分をプールし、ＭＢＰタグをＴＥＶプロテアーゼによって４℃で一晩切断した。切断されたＭＢＰ及び過剰なＴＥＶを、リバースＮＴＡカラムによって除去した。ＰＨ５Ａを含有するフロースルー画分を濃縮し、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＴＣＥＰ中で平衡化した１６／６０  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−１００カラムにロードした。ゲル濾過バッファー中で平衡化したＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラムで、イオン交換によってピーク画分をさらに精製し、１Ｍ  ＮａＣｌまでの勾配で溶出した。ＰＨＦ５Ａは、およそ３００ｍＭ  ＮａＣｌで溶出され、１０ｍｇ／ｍｌに濃縮し、−８０℃での保存のために液体Ｎ２中で急速凍結した。得られたタンパク質は、結晶化できなかったが、キモトリプシン（１：１０００モル比）を用いる室温で２時間の限定消化によってタンパク質分解に安定なドメインが得られた。立方体の形状の結晶が、１００ｍＭ  ＣＨＥＳ  ｐＨ９．５、８００ｍＭクエン酸ナトリウム及び０．５％オクチル−β−グルコシドを含有するリザーバーにわたって平衡化された２μＬ＋２μＬ懸滴から１週間後に５０×５０×５０ミクロンの最終寸法に成長した。２０％エチレングリコールを補給したリザーバー溶液中で結晶を凍結した。
【０１４３】
１．１２．構造決定
[0178]亜鉛エッジでの単波長異常分散（ＳＡＤ）データを、ＡＰＳビームライン２１ＤでＳｈａｍｒｏｃｋ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ＬＬＣによって集めた。結晶は２．０Åに回折し、データを立方空間グループＰ２１３（ａ＝ｂ＝ｃ＝８２．２Å及びα＝β＝γ＝９０°）においてｉＭｏｓｆｌｍ及びｘｉａ２を用いて処理し（Ｗｉｎｔｅｒら、Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ第６９巻、１２６０〜７３頁（２０１３年）；Ｂａｔｔｙｅら、ｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ第６７巻、２７１〜８１頁（２０１１年））、４７％の溶媒含量を示し、２つの分子が非対称単位で推定された。異常なシグナルは、およそ２．０Åに拡大し、これを使用して、ＳＨＥＬＸ  Ｃ／Ｄ／Ｅを使用して６つの高い占有率の亜鉛異常部位を位置付け（Ｓｋｕｂａｋ  ＆  Ｐａｎｎｕら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  第４巻、２７７７頁（２０１３年）；Ｓｈｅｌｄｒｉｃｋ、Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ第６６巻、４７９〜８５頁（２０１０年））、２つの分子が非対称単位で確認された。この最初の部分構造解からのＦＯＭは、０．４０４であり、密度改変及び手動での決定後に、ＦＯＭは０．７６に改善した。Ｂｕｃｃａｎｅｅｒ及びＲＥＦＭＡＣ５（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら、Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ第５３巻、２４０〜５５頁（１９９７年））は、各モノマーの７６残基を自動追跡し、さらなる１３残基をＣｏｏｔを使用して構築した。このモデルを使用して、１．８Åに設定されたネイティブデータに対して洗練し、再構築及び洗練の数回の反復ラウンド後に、分子Ａ中の残基２〜９１及び分子Ｂ中の３〜９２からなる最終モデルを得た、最終統計値Ｒ＝０．１７、Ｒｆｒｅｅ＝０．２０及びＦＯＭ＝０．８６（Ｍｕｒｓｈｕｄｏｖら、Ａｃｔａ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ第５３巻、２４０〜５５頁（１９９７年）；Ｅｍｓｌｅｙら、Ａｃｔａ  ｃｒｙｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ．  Ｓｅｃｔｉｏｎ  Ｄ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ第６６巻、４８６〜５０１頁（２０１０年））。洗練された座標をタンパク質データバンク（ＰＤＢ：５ＳＹＢ）に寄託した。
【０１４４】
１．１３．組換えタンパク質複合体のクローニング及び精製
[0179]モジュレーター結合部位を再組み立てするために、酵母ｃｒｙｏ−ＥＭ構造に基づいてＳＦ３ｂ複合体から４種のタンパク質を選択した。末端切断型ＳＦ３Ｂ１、全長ＳＦ３Ｂ３、ＰＨＦ５Ａ及びＳＦ３Ｂ５を合成し、ｐＦａｓｔＢａｃ１ベクターのＥｃｏＲＩとＮｃｏＩ部位の間にサブクローニングした。ＳＦ３Ｂ１の残基４５４〜１３０４から唯一のＨＥＡＴリピートドメインを、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを付加してクローニングした。ＳＦ３Ｂ３及びＳＦ３Ｂ５は、Ｎ末端Ｈｉｓ−タグを用いた。４種のウイルスを作製し、約１０：１の比でＳＦ２１細胞に同時感染させるために使用した。７２時間後に細胞を回収し、４０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール及び１ｍＭ  ＴＣＥＰに溶解した。複合体を、ニッケルビーズ及びＦＬＡＧビーズを使用してバッチ法によって精製した。溶出物を濃縮し、バッファー２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール及び１ｍＭ  ＴＣＥＰ中でゲル濾過カラム（ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）に流した。画分を集め、４ｍｇ／ｍＬに濃縮し、−８０℃での保存のために液体Ｎ２中で急速凍結した。ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃ変異を含有する組換え複合体の製造は、ＷＴ組換え複合体と同一である。
【０１４５】
１．１４．ＲＮＡ−Ｓｅｑサンプル調製、データプロセス及び差次的スプライスジャンクションの同定及び遺伝子レベルベン図作製及び遺伝子セット濃縮
[0180]ＰＨＦ５Ａ  ＷＴ又はＹ３６Ｃ変異体のいずれかを過剰発現する細胞を、ＤＭＳＯ又はＥ７１０７（１００ｎＭ及び１０μＭ）のいずれかを用いて５連で６時間処置し、その後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に溶解した。相分離後、上部の水相を、ＲＮＡ抽出のためにＭａｇＭＡＸ（商標）−９６全ＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、ＡＭ１８３０）を使用してさらに処理した。ＲＮＡ品質は、ＲＮＡスクリーンテープを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  ｔａｐｅｓｔａｔｉｏｎを使用して評価した。Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＢＧＩ）によってＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを調製し、サンプルあたりの６ＧクリーンリードのためにＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｈｉｓｅｑ  ４０００でシーケンシングした。ＲＮＡ−ｓｅｑリードを、ＳＴＡＲによってｈｇ１９に対してアラインし（Ｄｏｂｉｎら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ第２９巻、１５〜２１頁（２０１３年））、ＳＴＡＲによって作製された生ジャンクションカウントを、スプライシングされたパーセント（ＰＳＩ）を算出するために使用して、先に記載されたような同一スプライス部位を共有するすべてのその他のスプライスジャンクションに対するスプライスジャンクション使用を定量化した（Ｄａｒｍａｎら、Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  第１３巻、１０３３〜４５頁（２０１５年））。Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ中のｌｉｍｍａパッケージ（Ｓｍｙｔｈ、Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第３巻、論文３（２００４年））において定義される調整ｔ検定を使用して、サンプルグループの対の間で差次的ＰＳＩを評価した。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇ手順を使用して統計的ｐ値を補正し、０．０５以下のｑ値を統計的に有意と考えた。ＰＨＦ５Ａ  ＷＴ又はＹ３６Ｃ細胞のいずれかにおける、ＤＭＳＯと比較したＥ７１０７処置の際の有意なスプライシング変化と関連する遺伝子番号を、オンラインツールを使用するベン図の作製に使用した（ｈｔｔｐ：／／ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｐｓｂ．ｕｇｅｎｔ．ｂｅ／ｗｅｂｔｏｏｌｓ／Ｖｅｎｎ／）。ベン図解析から同定されたＰＨＦ５Ａ  ＷＴ又はＹ３６Ｃ特異的遺伝子を、京都遺伝子ゲノム百科事典（Ｋｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ）（ＫＥＧＧ）経路データベースを使用して遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）に付した（ｈｔｔｐ：／／ｓｏｆｔｗａｒｅ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｍｓｉｇｄｂ／ａｎｎｏｔａｔｅ．ｊｓｐ）。
【０１４６】
１．１５．  ３３８３のジャンクションのエキソンスキッピング対イントロン保持ＰＳＩ比較
[0181]所与のカセットエキソンを排除するスプライスジャンクションをカバーするリード（エキソンスキッピングリード）の数を、カセットエキソンと境を接する、その３’スプライス部位を共有するが、選択的５’スプライス部位を有するスプライシングされたリード（エキソンインクルージョンリード）の数及びその同一３’スプライス部位でエキソン−イントロン境界をまたぐリード（イントロン保持リード）の数の両方と比較した。これらのカウントをまとめ、並びにそれぞれ、その遺伝子座でのエキソンスキッピング事象、エキソンインクルージョン事象及びイントロン保持事象の、スプライシングされたパーセント（ＰＳＩ）から得られるその割合をまとめた。ＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ細胞における１００ｎＭ  Ｅ７１０７処置と、それぞれのＤＭＳＯ対照（３８８３事象）の間の比較に由来するすべての有意なエキソンスキッピング事象のＰＳＩ並びに同一遺伝子座でのイントロン保持ジャンクションのＰＳＩをプロットした。すべてのその他の治療のために、各遺伝子座のエキソンスキッピングジャンクション及びイントロン保持ジャンクションのＰＳＩを、同一順序でプロットした。ＰＳＩは、５連のサンプルにわたって平均化されている。
【０１４７】
１．１６．有意に保持されたイントロンジャンクションのＧＣ含量算出
[0182]すべての有意な処置によって誘導されたエキソンスキッピングジャンクションのセットは、少なくとも１００の配列長を有し、「エキソンインクルージョン」事象として未処置のサンプルにおいて大幅に濃縮され、ｑ＜０．０５を有するそれらのイントロン（それぞれ、その３’及び５’末端でカセットエキソンと境を接するもの）に低減され、その３’及び５’末端の境界によって形成された介入配列空間が、長さ少なくとも５０のＲｅｆＳｅｑトランスクリプトームアノテーションにおいてエキソンであるとわかり、複数のエキソンをスキップする事象によって引き起こされるアンビギュイティが避けられた。各イントロン及びエキソンの配列を、それぞれ、同じ長さのストリングの１００及び５０ビンにわけ、次いで、各ストリングのＧＣ含量（塩基「Ｇ」又は「Ｃ」いずれかの割合）を評価した。すべてのイントロン／エキソン対がこのようにビンにわけられたその配列内容物を有すると、各ビンの得られた平均及び９５％信頼区間を、データの１００ブートストラップ（イントロン／エキソン対の数まで、置換を有する）を使用して評価し、それぞれ、実線及び透明な間隔を使用して描いた。同一の長さ及び境界必要条件を満たした、ＲｅｆＳｅｑからの１０，０００のランダムイントロン／エキソン対からバックグラウンドを描いた。
【０１４８】
１．１７．Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現アッセイ
[0183]示された遺伝子型の８０００個の細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種し、一晩沈降させた。２日目に、１０μＭ最終の最上投与量を有する示された化合物の１１点段階希釈（全体で１：４倍希釈）を、培養培地に添加した。化合物添加の４時間後、培養培地をデカントし、ＰＢＳを用いて１回洗浄した。次いで、プレートからＰＢＳを完全にデカントし、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号ＡＭ１７２９）から得た溶解バッファー（及びＤＮアーゼＩ）を、マニュアルに従って添加した。シェーカー上で室温で５分インキュベートした後、各ウェルに停止溶液を添加し、２分間インキュベートした。Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−ＣＴキットを使用して逆転写を直ちに設定し、Ｖｉｉａ７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用する定量的リアルタイムＰＣＲ解析のためにｃＤＮＡを使用した。各反応を、ＦＡＭ特異的標的遺伝子スプライシングアイソフォームを標的化する標識プローブ及びローディングコントロールとしてＶＩＣ標識プローブによって標的化される１８Ｓ  ｒＲＮＡを用いてマルチプレックス化する。したがって、各ウェルにおけるＦＡＭ  Ｃｔ値を、同一ウェルにおけるＶＩＣ  Ｃｔ値に対してまず正規化し、その後、ＤＭＳＯ処置された対照サンプルのＦＡＭ／ＶＩＣ比に対してさらに正規化して、ＤＭＳＯを上回る変化倍数を算出した。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６、ｎ＝２を使用してグラフを作製した。これらのアッセイにおいて使用されるＴａｑｍａｎ遺伝子発現プローブは以下である：
【０１４９】
【表２】
2020514348.tif 000009
【０１５０】
１．１８．統計学
[0184]適当な統計的手法及び統計的有意性の決定を、上記の節において記載したとおりに実施した。
【０１５１】
２．結果
２．１．ケモゲノム解析は、スプライシングモジュレーターに対する、ＰＨＦ５Ａ及びＳＦ３Ｂ１中の新規耐性変異を同定する。
【０１５２】
[0185]ＳＦ３ｂ複合体を標的化するスプライシングモジュレーターの機序をさらに調べるために、より低いストレスレベルの化合物を用いた場合の耐性クローン生成の可能性を、ＨＣＴ１１６細胞において、より低い投与量のＥ７１０７（４ｎＭ、およそ３×ＧＩ５０）、プラジエノライド誘導体又はあまり強力ではない構造的に異なるスプライシングモジュレーター、２０ｎＭのハーボキシジエン（およそ３×ＧＩ５０）のいずれかの継続投与によって調査した（図１Ａ）。対照的に、これまでのアプローチは、１００ｎＭ（ＷｉＤＲ細胞においておよそ１３０×ＧＩ５０）までのプラジエノライドＢ又はＥ７１０７用量の段階的な誘導を使用して、耐性クローンを単離した（Ｙｏｋｏｉら、Ｔｈｅ  ＦＥＢＳ  ｊｏｕｒｎａｌ第２７８巻、４８７０〜８０頁（２０１１年））。このアプローチは、高濃度でオフターゲット活性を軽減する可能性があり、並びにスプライシングモジュレーターのわずかではあるが一般的な機序を同定する可能性を増強する。２週間の選択後、各処置から６つの耐性クローンを拡大し、全エキソームシーケンシング（ＷＸＳ）に付して、スプライシングモジュレーターに対する耐性の候補原因遺伝子を同定した。親株と比較して、合計約１１，０００の単一ヌクレオチドバリアント（ＳＮＶ）及び２０％よりも大きい対立遺伝子頻度を有するインデルが同定された。しかし、精選されたスプライシング関連遺伝子リストと相互参照し、少なくとも３つの個々のクローンにおいて影響を受けた遺伝子に集中した後、わずか２つの遺伝子中の変異が一貫してスコア化された。６つのＥ７１０７耐性クローンのうち５つ及び６つのハーボキシジエン耐性クローンのうち２つが、ＳＦ３Ｂ１中に変異を保持し（図１Ｂ）、これまでに同定されたＲ１０７４Ｈ変異及び２つの新規変異、Ｖ１０７８Ａ及びＶ１０７８Ｉを含み、ＳＦ３Ｂ１のこの領域が、スプライスモジュレーター作用に関与しているという証拠を強固にした。興味深いことに、残りのＥ７１０７耐性クローン及び４つのハーボキシジエン耐性クローンは、ＰＨＦ５Ａ中にＹ３６Ｃ変異を保持していた（図１Ｂ）。ＰＨＦ５Ａ及びＳＦ３Ｂ１中のすべての同定された変異を、標的化されたサンガーシーケンシングによってさらに確認した。さらに、サンガーシーケンシングは、２０ｎＭハーボキシジエン処理から得た１つの独立クローンは、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃ及びＳＦ３Ｂ１中の新規Ｋ１０７１Ｅ変異の両方を有する２つの個々の集団のプールであるようであるということを示した。耐性クローン中のＳＦ３Ｂ１又はＰＨＦ５Ａのいずれかにおける変異出現における明らかなバイアス（図１Ｂ）が、プラジエノライド及びハーボキシジエン足場がＳＦ３ｂ複合体と相互作用する方法の相違を意味する可能性があるが、これらのデータは、両タンパク質が、スプライシングモジュレーターの一般的な細胞標的であることを示唆する。
【０１５３】
[0186]種々の耐性クローンの成長阻害プロファイリングは、ＳＦ３Ｂ１−Ｒ１０７４Ｈ変異が、Ｅ７１０７に対する最も頑強な耐性を付与することを示したが、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃ及びＳＦ３Ｂ１−Ｖ１０７８変異は、より弱かった（図１Ｃ）。興味深いことに、ＳＦ３Ｂ１−Ｒ１０７４Ｈ変異はまた、スプライセオスタチンＡ及びスデマイシンＤ６に対するより良好な耐性も付与し、両方とも、プラジエノライドとは構造的に異なっているＦＲ９０１４６４と化学的に関連する（図１Ｄ及び１Ｅ）。対照的に、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃ変異は、ハーボキシジエン選択後にこの変異を有するクローンのパーセンテージがより高い株において（図１Ｂ）、ハーボキシジエン処置に応じてより耐性にした（図１Ｆ）。ＳＦ３Ｂ１又はＰＨＦ５Ａ中の変異は、ボルテゾミブ、汎細胞傷害性プロテアソーム阻害剤に対する細胞株感受性に影響を及ぼさず、これは、スプライシングモジュレーターに向けた変異の特異性を強調した（図１Ｇ）。異なる足場の見かけの優先度を検証するために、さらなる化合物に対するＣＴＧプロファイリングを拡大し、ＳＦ３Ｂ１  Ｒ１０７４ＨクローンにおけるＧＩ５０シフトを、親株を上回るＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６ＣクローンにおけるＧＩ５０シフトに対して直接比較した。両耐性変異は、すべての調べたスプライシングモジュレーターに対する耐性を付与した。また、化合物は、その足場に基づいてクラスター形成すると思われ、ＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃは、ハーボキシジエンアナログに対してより良好な耐性を示し、ＳＦ３Ｂ１  Ｒ１０７４Ｈは、プラジエノライド及びスプライセオスタチンアナログに対してより良好な耐性を示した（図９）。
【０１５４】
２．２．ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃは、基本的な細胞機能に影響を及ぼさないが、スプライシングモジュレーターに対する耐性を付与する
[0187]スプライシング調節に対する耐性の根底にある機序としてＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃをさらに検証するために、野生型（ＷＴ）ＰＨＦ５Ａ又はＹ３６Ｃ  ＰＨＦ５Ａいずれかを、親のＨＣＴ１１６細胞株において同様のレベルで発現させた（図２Ａ）。進化の間のこのチロシン残基の配列保存にもかかわらず（ｖａｎ  Ｒｏｏｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  第１０５巻、９６２１〜６頁（２００８年））、ＰＨＦ５Ａ−ＷＴ又はＹ３６Ｃいずれかの発現は、細胞成長、ＳＦ３Ｂ１タンパク質の局在性又は核スペックルの形成に対して見かけの効果がない（図２Ｂ）。ＰＨＦ５Ａは、ＳＦ３ｂ複合体中の７種のタンパク質のうち１種であるということを考慮して、変異がコア構成成分のいずれかとの相互作用を破壊し得る、複合体の全体的な組成を変更し得るか否かを調べた。ＷＴ及び変異体細胞株由来の抗ＳＦ３Ｂ１抗体によって免疫沈降（ＩＰ処理）されたサンプルを、ウエスタンブロット及びマススペクトロメトリー解析に付し、組成を定性的に評価した（図２Ｃ）。ＷＴ又はＹ３６Ｃ  ＰＨＦ５Ａを含有する複合体の全体的な組成において有意差は観察されず、これは、この変異は別として、他の点では無傷であり機能的であることを示唆した。全トランスクリプトームＲＮＡ−ｓｅｑ解析によって、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃの発現は、遺伝子操作された細胞株中の全ＰＨＦ５Ａ  ｍＲＮＡのおよそ９２％を占めるが、ＷＴと比較した場合に全体的なスプライシング又は遺伝子発現に対して最小の作用しか有さないということが確認された（図８）。親細胞及びＷＴ  ＰＨＦ５Ａを発現する細胞は、スプライシングモジュレーター処置に対して感受性であったが、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃの発現は、スプライシングモジュレーターのパネルに対する耐性を付与し（図２Ｄ）、自発性のＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ耐性クローンをフェノコピーした（図１Ｃ〜１Ｆ）。この耐性表現型は、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃが別の細胞株に導入された場合にも観察されたので、一般的であると思われる（図１０）。
【０１５５】
[0188]次いで、生化学的レベルでのＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃ変異の挙動を調べた。細胞データと一致して（図２Ｄ）、外因性プレｍＲＮＡ基質を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシングアッセイは、Ｙ３６Ｃ変異体は、種々の足場のスプライシングモジュレーターによる阻害から保護することを示した（図３Ａ）。同様のレベルの保護がｉｎ  ｖｉｖｏでも存在するか否かを検証するために、定量的リアルタイムＰＣＲ解析を使用して、Ｅ７１０７の第Ｉ相臨床治験においてこれまでに使用された２種の内因性薬力学的マーカー遺伝子のスプライシングをアッセイした（Ｅｓｋｅｎｓら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、第１９巻、６２９６〜３０４頁（２０１３年））（図３Ｂ）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシングアッセイにおいて観察された効果と一致して、Ｙ３６Ｃ変異はまた、スプライシングされた成熟ＳＬＣ２５Ａ１９  ｍＲＮＡの生成に対する阻害及びスプライシングモジュレーターによって誘発される、スプライシングされていない未成熟ＥＩＦ４Ａ１プレｍＲＮＡの蓄積を低減した（図３Ｂ）。ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃは、スプライシングモジュレーター誘導性ミススプライシングから保護すると思われる。
【０１５６】
２．３．ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃは、Ｅ７１０７によって誘導された異常なスプライシングを全体的なレベルで変更する。
【０１５７】
[0189]スプライシングモジュレーターによって全体的なスプライシングが影響を受ける方法を調べるために、１００ｎＭ  Ｅ７１０７を用いて処置したＷＴ及びＹ３６Ｃ  ＰＨＦ５Ａ発現細胞に、全トランスクリプトームＲＮＡ−ｓｅｑ解析を適用した。遺伝子発現及びスプライシングジャンクション使用の主成分分析に基づく教師なしクラスタリングによって、Ｅ７１０７を用いて処置されたＹ３６Ｃ細胞は、そのＷＴ対応物から離れてであるが、ＤＭＳＯ処置対照の付近でクラスター形成することが確認され、これは、Ｙ３６Ｃ変異がＥ７１０７活性を弱めたことを示唆した。詳細な差次的スプライシング解析によって、Ｙ３６Ｃ変異によって強いられた定量的及び定性的効果がさらに明らかにされた（図４Ａ及び４Ｂ）。具体的には、それぞれのＤＭＳＯ処置対照と比較して、イントロン保持（ＩＲ）事象は、事象の数及び平均変化倍数の両方によって測定されるように、Ｅ７１０７を用いて処置されたＷＴ細胞において優勢であった（図４Ａ及び４Ｂ左パネル）。Ｙ３６Ｃの保護効果と一致して、ＩＲ事象の全体量及びその平均変化倍数は、Ｅ７１０７を用いて処置された変異体細胞において大きく低減された（図４Ａ及び４Ｂ右パネル）。驚くべきことに、化合物によって誘導されたエキソンスキッピング（ＥＳ）事象の数は、Ｅ７１０７処置の際にＷＴと比較して変異体細胞において増大し（図４Ａ及び４Ｂ）、これは、スプライシング阻害に対するＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃ媒介性耐性が、全体的なレベルで差次的応答を含むことを示唆した。
【０１５８】
[0190]ＩＲ及びＥＳ事象の調節は、エキソン／イントロン長及びヌクレオチド含量と、並びに特異的クロマチンマークと関連していると知られている（Ｎａｆｔｅｌｂｅｒｇら、Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第８４巻、１６５〜９８頁（２０１５年）。特に、隣接するイントロン及びエキソン間のＧＣ含量の差は、スプライシング機構の認識シグナルとして進化した可能性があり得る（Ａｍｉｔら、Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第８４巻、１６５〜９８頁（２０１５年））。したがって、この実験は、スプライシング阻害下でＰＨＦ５Ａ−ＷＴ又はＹ３６Ｃ細胞において、イントロンＧＣ含量もスプライス部位認識に影響を及ぼし得るか否かを調べようとした（図４Ｃ及び４Ｄ）。ＷＴ細胞では、Ｅ７１０７誘導ＩＲイントロンは、ランダムに選択されたバックグラウンドイントロンと比較して、より高いＧＣ含量を有し、下流エキソンとの差は少なかった（図４Ｃ）。興味深いことに、Ｅ７１０７を用いて処置したＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ細胞中のＩＲイントロン／エキソンは、そのＷＴ対応物と比較して、かなり高いＧＣ組成及び影響を受けたイントロンとエキソンの間で最小の差を示した（図４Ｃ）。対照的に、化合物処置ＷＴ細胞におけるＥＳジャンクションは、バックグラウンドよりも低いＧＣ組成を示したが、Ｅ７１０７を用いて処置されたＹ３６Ｃ細胞におけるＥＳジャンクションは、より高いＧＣ含量を示した（図４Ｄ）。まとめると、これらのデータは、イントロン／エキソンＧＣ含量が、スプライシング調節のＹ３６Ｃ媒介性干渉に寄与し得るということを示唆する。
【０１５９】
[0191]興味深いことに、ＷＴ細胞におけるＩＲ事象のイントロン／エキソンＧＣ含量（図４Ｃ）は、Ｙ３６Ｃ細胞におけるＥＳ事象のものに匹敵する（図４Ｄ）。さらに、Ｅ７１０７処置は、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃ細胞においてより多くのＥＳ事象を誘導したが、より少ないＩＲ事象を誘導した（図４Ａ及び４Ｂ）。したがって、Ｙ３６Ｃ細胞由来のこれらのＥＳ関連イントロンの一部は、同一Ｅ７１０７処置下のＷＴ細胞ではＩＲに切り替えられる可能性があると仮定された。この目的で、ＰＨＦ５Ａ  ＷＴ及びＹ３６Ｃ両方におけるこれらのＥＳ事象の個々の３’イントロン−エキソンジャンクション使用のパーセンテージ（スプライシングされたパーセント、ＰＳＩ）を算出した。理論上、これらの３’ジャンクションの結果は、ＥＳ、ＩＲ又はエキソンインクルージョンのいずれかであろう（算出のスキームについては、図４Ｅ及び方法を参照のこと）。ＥＳ／ＩＲ切り替え仮説と一致して、３８８３のＹ３６Ｃ関連ＥＳジャンクションのうち２４７０（約６４％）が、Ｅ７１０７を用いて処置されたＷＴ細胞においてＥＳ  ＰＳＩの低減及びＩＲ  ＰＳＩの増大を示した（図４Ｅ）。これは、ＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃは、隣接しているイントロン／エキソンの進化的に発達した相対ＧＣ含量を利用して、特定のイントロン−エキソンジャンクションの使用を調節することによってスプライシング阻害剤の活性を定量的及び定性的の両方で弱めることができるであろうというグローバルレベルのさらなる証拠を提供した（Ａｍｉｔら、Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第８４巻、１６５〜９８頁（２０１５年））。
【０１６０】
２．４．ＭＣＬ１のＩＲ／ＥＳ切り替えは、Ｅ７１０７の存在下でＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃによって変更される
[0192]Ｅ７１０７によって誘発されたスプライシング事象の数の相違にかかわらず、ＷＴ又はＹ３６細胞由来の影響を受けた遺伝子の全体数は同等であり、大きな重複を共有していた。遺伝子セット濃縮解析（ＧＳＥＡ）も、ＷＴ又はＹ３６Ｃ特異的遺伝子のいずれかにおいて経路に関連付けられた候補遺伝子を同定した。ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃ細胞においてスプライシングモジュレーターによるＩＲ／ＥＳ切り替えを示した、全体的な差次的スプライシング解析を検証するために、ＤＭＳＯ対照と比較して、Ｅ７１０７を用いて処置されたＷＴ細胞における有意なＩＲ事象と関連していたが、化合物処置下でＹ３６Ｃにおいて有意なＥＳ事象と関連付けられた遺伝子を評価した。ＭＣＬ１、ＣＤＣ２５Ｂ、ＲＢＭ５及びＣＤＫ１０などの多数の遺伝子が群間にあり、個々のｓａｓｈｉｍｉプロットによって、Ｅ７１０７を用いて処置されたＷＴ及びＹ３６Ｃ細胞間のスプライシング挙動の差が検証された（図５Ａ）。ＭＣＬ１は、２種のアイソフォーム、ＭＣＬ１−Ｌ及びＭＣＬ１−Ｓとして存在し、メアヤマイシンＢ（Ｇａｏ  ａｎｄ  Ｋｏｉｄｅ  ＡＣＳ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第８巻、８９５〜９００頁（２０１３年）；Ｇａｏら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ  第４巻、６０９８頁（２０１４年）及びスデマイシンＤ１ （Ｘａｒｇａｙ−Ｔｏｒｒｅｎｔら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  第６巻、２２７３４〜４９頁（２０１５年））などのスプライシングモジュレーターの主要な標的としてこれまでに報告された。興味深いことに、ＭＣＬ１の第２のイントロンは、ＧＣリッチ（５１％）上流イントロンと比較して低い（３８％）ＧＣ含量を有する。ＭＣＬ１  ＲＮＡ−ｓｅｑデータのＳａｓｈｉｍｉプロットによって、ＤＭＳＯ処置された対照サンプルでは、ＷＴ及びＹ３６Ｃ細胞においてＥＳ及びＩＲ事象の両方が極めて低レベルで生じ、基準のＭＣＬ１−Ｌ形態の支配的な産生をもたらすことが確認された（図５Ａ）。Ｅ７１０７処置の際、ＩＲは、ＷＴ細胞において観察された支配的な事象であった。対照的に、ＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ発現の際には、Ｅ７１０７の効果は大幅に変更され、ＭＣＬ１−Ｓ形態をもたらす主なＥＳ事象が観察された（図５Ａ）。
【０１６１】
[0193]次いで、ＭＣＬ１を、ＥＳ／ＩＲ切り替えの解析を異なる足場及び複数投与量のさらなるスプライシングモジュレーターに拡大するバイオマーカーとして利用した。Ｔａｑｍａｎ遺伝子発現は、ＲＮＡ−ｓｅｑ解析を確認するだけでなく、スプライシングモジュレーターの効力と、ＥＳ及びＩＲ事象の誘導の相対速度の間の相関を示した。具体的には、ＰＨＦ５Ａ  ＷＴ細胞では、より強力なスプライセオスタチンＡ（ＨＣＴ１１６においてＧＩ５０＝０．７６ｎＭ）は、ＭＣＬ１  ＥＳ及びＩＲ事象の用量依存性誘導の同様の速度論につながったが、わずかにあまり強力ではないＥ７１０７（ＨＣＴ１１６においてＧＩ５０＝１．５ｎＭ）は、低用量で、ＭＣＬ１  ＥＳ事象の、ＩＲ事象よりも「より早期の」誘導を示した。より弱いハーボキシジエン（ＨＣＴ１１６においてＧＩ５０＝７．６ｎＭ）は、さらにより顕著な効果を示し、試験された最も弱い化合物、スデマイシンＤ６（ＨＣＴ１１６においてＧＩ５０＝１４９ｎＭ）を用いた場合には、最終的にＩＲ事象は観察されなかった（図５Ｂ左パネル）。これらのデータは、同一遺伝子において、ＭＣＬ１の低ＧＣ含有イントロン２は、スプライシング阻害に対して高ＧＣ含有イントロン１よりも耐性であったという観察結果を強固にした。ＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ変異の発現は、これらのスプライシングモジュレーターの存在下でのＭＣＬ１  ＩＲ事象の発生を遅延又は遮断した（図５Ｂ右パネル）。興味深いことに、ＥＳ事象を表すＭＣＬ１−Ｓ産生は、Ｅ７１０７の投与量を増大した際に、ＷＴと比較してＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃ細胞においてより高レベルに増強された（図５Ｂ第２の横列）。総合すると、これらのデータによって、ＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃは、化合物によって誘導されたＩＲ事象及びＥＳ事象間の切り替えを制御したという観察結果が確認された。
【０１６２】
２．５．ヒトＰＨＦ５Ａ、ＳＦ３ｂ複合体のコアの結晶構造
[0194]Ｙ３６Ｃ  ＰＨＦ５Ａは、基本的なスプライシングに対して効果がないが、ＲＮＡスプライシングに対するスプライシングモジュレーターの効果を隠す及び変更することにおいて役割を果たすことを考慮して、三次元構造の関連におけるＰＨＦ５Ａの役割を調べた。１．８Å解像度で結晶構造が決定されたＷＴタンパク質を精製した。最終モデルは、合計１１０のうち残基２〜９３を含有する。ＰＨＦ５Ａは、三角形の形状のカップと、Ｎ及びＣ末端からの逆平行鎖から構成される基部を有するマッシュルーム様構造を形成する（図６Ｄ）。カップは、３個の亜鉛イオン及び５つのＣＸＸＣモチーフを含有する左巻の三角形の深いトレフォイルノットによって形成され、亜鉛フィンガーの間で順序が変えられる。ＰＨＦ５Ａは、１３個のＣｙｓ残基を含有し、これらのうち１２個は、四面体の形状で３つの亜鉛イオンを配位する。残りのシステインをセリンに変異させて（Ｃ４０Ｓ）、可溶性タンパク質発現を増強する。興味深いことに、ＰＨＦ５Ａは、３つの異なる種類の亜鉛フィンガーを組み込んでいる。亜鉛フィンガー１（ＺｎＦ１）は、ギャグナックルにフォールディングし、第１から第４のＣＸＸＣモチーフまでＣ４配位を有する。これらのうち最初のものは、短いヘリックスターン（η１）を有するが、第４のものは、亜鉛ナックルを有する（Ｋｒｉｓｈｎａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  第３１巻、５３２〜５０頁（２００３年））。亜鉛フィンガー２（ＺｎＦ２）は、第２から第５のＣＸＸＣモチーフによって形成される。これらのモチーフのうち最初のものは、亜鉛ナックルであり、第２のものはヘリックス−α４に由来し、したがって、ト音記号ＧＡＴＡ様亜鉛フィンガー１８に似ている。亜鉛フィンガー３（ＺｎＦ３）は、ヘリックス−η２由来の第３のＣＸＸＣモチーフ及びマッシュルーム基部の第１及び最後のベータ鎖をつなぐループに由来する２つの個々のシステインによって形成される。この第３の亜鉛フィンガーは、短いヘリックスを有する中断された古典的なββαフィンガーに似ている（ｖａｎ  Ｒｏｏｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  第１０５巻、９６２１〜６頁（２００８年）；Ｋｒｉｓｈｎａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  第３１巻、５３２〜５０頁（２００３年））。第２の亜鉛フィンガー付近の表面上のＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６の位置及び試験された細胞活性を全く変更しないという証拠を考慮すると、Ｃｙｓへの変異が、全体的なフォールディングに対して最小効果を有し、むしろ局所的に作用して、表面トポロジーを変更するのであろうと予測される（図７Ｃ）。
【０１６３】
[0195]ＰＨＦ５Ａは、ＰＨＤフィンガーとして分類されるが、その他のＰＨＤフィンガーとは低い配列相同性しか有さず、基準のフォールディングとは異なる。多様な真核生物にわたる高レベルの配列同一性は、その特有のトレフォイルノットトポロジーが保存されている可能性が高いことを示す（図３Ｄ）。同時に、ＰＨＦ５Ａは、同一生物内のその他の配列と比較した場合に、極めて低い配列同一性を有し、これは、細胞における特有の生物学的役割を示唆する。しかし、低配列同一性を有するタンパク質は、同様の三次元構造を依然として共有し、同様の機能を有し得る。この可能性を調査するために、構造を、ＰＤＢにおけるすべてのその他の入手可能な構造と比較し、同様のフォールディングを有する唯一のその他のタンパク質、Ｒｄｓ３、酵母由来のＰＨＦ５Ａ相同体が見い出された（Ｈｏｌｍ及びＲｏｓｅｎｓｔｒｏｍ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  第３８巻、Ｗ５４５〜９頁（２０１０年））。Ｒｄｓ３構造は、ＮＭＲによって解析され、８０個の残基並びにＮ−及びＣ−末端に構造不定のコイルを含有していた。ｖａｎ  Ｒｏｏｎら、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  第１０５巻、９６２１〜６頁（２００８年））。また、３つの亜鉛フィンガー及び同一のトレフォイルノットフォールディングを有する（Ｚスコア１２．６及びＲＭＳＤ  ２．２Å）（Ｈｏｌｍ及びＲｏｓｅｎｓｔｒｏｍ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  第３８巻、Ｗ５４５〜９頁（２０１０年））。
【０１６４】
[0196]全長Ｒｄｓ３タンパク質は、３．０〜３．５Å１５の解像範囲でスプライセオソームＢａｃｔ複合体のｃｒｙｏ−ＥＭ構造で最近観察された。この構造は、Ｒｄｓ３／ＰＨＦ５Ａは、中心の足場タンパク質であり、Ｈｓｈ１５５／ＳＦ３Ｂ１、Ｒｓｅ１／ＳＦ３Ｂ３、Ｙｓｆ３／ＳＦ３Ｂ５、Ｕ２  ｓｎＲＮＡ及びイントロンＲＮＡと相互作用することを示す（図６Ｂ）。ここで、ＳＦ３Ｂ１  ＨＥＡＴリピート（ＨＲ）は、１つの完全なターンの右巻きスーパーヘリカルスパイラルを形成し、およそ３４×３９Åの中心の楕円体の空洞を形成する（図６Ｂ）。ＰＨＦ５Ａはこの空洞に埋もれ、その側面に沿ってＨＲ２〜３、６、１５及び１７〜２０と広範な接触を形成する（図６Ｂ）。ＰＨＦ５Ａ中の１１０の総残基のうち、２８がＳＦ３Ｂ１と接触を形成しており、表面積の１９％（１３３７Å２）を埋め、２つの境界面間で高度の配列保存を有する。ＳＦ３Ｂ５のＣ末端ＨＲ−２０ヘリックス及びＮ末端ヘリックスは、ＰＨＦ５Ａ（残基Ｆ６〜Ｌ１２）とさらなる相互作用を形成しながら、スーパーヘリックスターンを完了する平行ヘリックス−ヘリックス相互作用を形成する（図６Ｂ）。ＳＦ３Ｂ３は、ＳＦ３Ｂ１−ＰＨＦ５Ａ複合体の最上面に沿って位置し、両方と接触を形成し、イントロンＲＮＡは、複合体の底面に沿って位置する。これらの相互作用のほとんどは、相補的な電気陽性面によって証明されるように、ホスホジエステル骨格に対するものである。
【０１６５】
[0197]酵母及びヒトＰＨＦ５Ａ構造を重ね合わせることによって、２つの領域でのみ構造の相違が示され、両方ともイントロンＲＮＡと相互作用を形成する。Ｃ末端の最後のヘリックス（Ｇ９３〜Ｒ１１０）は、ＰＨＦ５Ａ結晶構造では失われているが、ＳＦ３Ｂ１由来のＨＲ−２と、イントロン−Ｕ２  ＲＮＡ二本鎖の間に位置する、保存された塩基性残基を含有する。これらの塩基性残基は、ＢＰＡ（位置０）の下流のイントロンヌクレオチド（＋１−ＣＡＣＡＵＵ）と複数の接触を形成する。わずかな相違は、より低い配列保存を有し、Ｒｄｓ３解構造で複数のコンホメーションをとるＺｎＦ３の付近のヘリックス（η２）−ループ−ヘリックス（η３）（Ｎ５０〜Ｒ５７）にあり、これは、分子のこの部分が可動性であり得ることを示唆する。この領域は、イントロン由来の２つのヌクレオチド（＋９−ＡＵ）と接触しており、可動性は異なるイントロンＲＮＡのコンホメーションに適応できる。
【０１６６】
２．６．ＰＨＦ５Ａ及びＳＦ３Ｂ１における耐性変異の構造解析
[0198]最近、いくつかのｃｒｙｏ−ＥＭ構造が、スプライシング反応における触媒前ステップ及び触媒ステップのスナップショットを提供した。ＳＦ３ｂ複合体は、触媒前Ｂａｃｔ複合体において唯一観察された（Ｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第３５３巻、９０４〜１１頁（２０１６年））。次のステップでは、ＳＦ３ｂ複合体の解離及びＣ複合体の形成を引き起こす再編成が生じ、これでは、ＢＰＡの２’−ＯＨと、５’−スプライス部位のグアノシンの３’ホスフェートの間にリン酸ジエステル結合が行われていた（Ｆｏｌｃｏら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第２５巻、４４０〜４頁（２０１１年）；Ｇａｌｅｊら、Ｎａｔｕｒｅ  第５３７巻、１９７〜２０１頁（２０１６年）；Ｗａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第３５３巻、８９５〜９０４頁（２０１６年））。酵母Ｂａｃｔ複合体ｃｒｙｏ−ＥＭ構造は、ＰＨＦ５ＡとＳＦ３Ｂ１の間の境界面が、分岐点アデノシン（ＢＰＡ）が結合する場所である（図６Ｅ）ことを示し、このことが際立っている。Ｓｆ３ｂ複合体に由来するこれらのタンパク質は、早発性求核攻撃から反応性基を明らかに遮蔽する。実際、このモデルでは、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６は、ＢＰＡと直接接触を形成し、分岐点認識においてＰＨＦ５Ａを明確に関連付ける。この専門化した生物学的役割は、その高い配列保存及び細胞中にその他の明らかな対応物が全くないことを説明でき、これは、神経膠芽腫幹細胞におけるスプライシング調節及びスプライシングモジュレーター感受性における役割のこれまでの知見（Ｈｕｂｅｒｔら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第２７巻、１０３２〜４５頁（２０１３年））と一致する。この結合ポケット（ＨＲ１５〜１７）を規定するＳＦ３Ｂ１のＨＥＡＴリピートも、高度に保存されている（図６Ｃ）。興味深いことに、この研究において同定された耐性変異、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃ、ＳＦ３Ｂ１−Ｋ１０７１Ｅ、ＳＦ３Ｂ１−Ｖ１０７８Ａ／Ｉ及びこれまでに報告されたＳＦ３Ｂ１−Ｒ１０７４Ｈは、すべて、このポケットの周囲でクラスター形成する（図６Ｅ及び６Ｆ）。さらに、クロスリンキングデータは、これらのスプライシングモジュレーターが、このポケットのすぐ上に位置するＳＦ３Ｂ１及びＳＦ３Ｂ３と直接相互作用することを示す（Ｋｏｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第３巻、５７０〜５頁（２００７年）；Ｈａｓｅｇａｗａら、ＡＣＳ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第６巻、２２９〜３３頁（２０１１年））（図６Ｆ）。これらの際立った一致は、このＢＰＡ結合ポケットはまた、スプライシングモジュレーターが結合する領域であるという証拠を提供する。これらの変異は、耐性を付与しながら、ＢＰＡとのその近接にもかかわらず、基本のスプライシングにとって有害ではないことは意外なことである。詳述された解析は、ＳＦ３Ｂ１−Ｋ１０７１は、保存された残基であり（図６Ｃ）、ＢＰＡリボース糖の２’−ヒドロキシルと、及びまたＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６のヒドロキシルとＨ結合を形成し、これは、境界面でこれらの残基を位置付け、配向させるのに役立つ（図６Ｅ）ことを示す。これらの残基のいずれかの変異が耐性をもたらすので、この相互作用は、モジュレーター結合に関与する可能性が高い。ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６はまた、別の保存された残基、ＳＦ３Ｂ１−Ｒ１０７５と、広範なファンデルワールス相互作用を形成し、これもまた、この側鎖を配向させ、結合ポケットを変更するのに役立つ。Ｙ３６Ｃモデルに基づいて、変異は、静電表面に有意な変化を引き起こさないが、表面トポロジーを変更する（図７Ｃ）。親和性の喪失は、この位置の芳香族側鎖が、スプライスモジュレーター結合に関与していることを示唆する。ＳＦ３Ｂ１−Ｒ１０７４Ｈは、この結合ポケットの底部に位置する（図６Ｅ）。ＲＮＡ又はＰＨＦ５Ａとの直接相互作用を全く行わないが、変異は、結合ポケットの形状を変更し、化合物結合に影響を及ぼし得るが、ＢＰＡ相互作用には影響を及ぼさない（図６Ｅ及び６Ｆ）。ＳＦ３Ｂ１−Ｖ１０７８Ａ／Ｉは、このポケットの頂部付近であり、酵母及びヒトの間で保存されていない（図６Ｃ）。酵母では、この残基は、ＢＰＡアデノシンとＨ結合を形成するが、ヒトでは、この残基は、比較的わずかな変化しかもたらさない可能性が高く、実際に最小量の全体的な耐性を付与する。
【０１６７】
２．７．ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃは、スプライシングモジュレーターの結合親和性を低減する
[0199]スプライシングモジュレーター結合部位が、ＳＦ３Ｂ１、ＰＨＦ５Ａ及びＳＦ３Ｂ３によって構成される境界面にあることを実証するために、酵母Ｂａｃｔ  ｃｒｙｏ−ＥＭ構造をベースとする組換えタンパク質複合体を遺伝子操作した（Ｙａｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  第３５３巻、９０４〜１１頁（２０１６年））。これらの３種のタンパク質を、ＳＦ３Ｂ５と同時発現させることによって、２段階で精製することができる、安定した２５０ｋＤａ複合体を再構成することが可能であった（図７Ａ）。この組換え複合体が機能的モジュレーター結合部位を再現できることを検証するために、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）ビーズで獲得し、３Ｈ標識プラジエノライドアナログとのその相互作用を探索した（Ｋｏｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第３巻、５７０〜５頁（２００７年））。ＳＰＡアッセイは、複合体と結合している３Ｈ標識プラジエノライドプローブを示し、その他の非放射性スプライシングモジュレーターは、結合しているプローブを競合除去でき、相互作用の特異性を実証した（図７Ｂ）。この競合アッセイでは、非放射性モジュレーターを滴定することから低減されたシグナルは、プラジエノライド様アナログと比較された、これら３種の化合物の複合体に対する相対親和性を示し、ＩＶＳアッセイ（図３Ａ）及び細胞アッセイ（図２Ｄ）において見られた効力及びランク序列と一致する。これは、これら４種のタンパク質がスプライシングモジュレーターの機能的結合部位を再構成することを検証する。
【０１６８】
[0200]次いで、観察された耐性変異が、スプライシングモジュレーター（複数可）と、ＳＦ３ｂ複合体の間の結合の低減の結果であるか否かを検査するために、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃを含有する対応する複合体を作製した。精製されたＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃ組換え複合体をＳＰＡビーズで獲得し、同一３Ｈ標識トレーサー化合物（Ｋｏｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第３巻、５７０〜５頁（２００７年））を２種の異なる濃度、１０ｎＭ及び１ｎＭで使用して、相互作用を探索した。ＳＰＡアッセイは、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃ複合体との結合が、バックグラウンドと同等であったのに対し、バックグラウンドを上回る、ＷＴ  ＰＨＦ５Ａを含有する複合体との１０ｎＭ３Ｈ標識プローブ結合のおよそ５倍の誘導を示す。これは、単一Ｙ３６Ｃ変異は、モジュレーター結合を有意に低減するのに十分であることを実証し（図７Ｄ）、Ｙ３６がモジュレーターと相互作用することを示唆する。親和性の低減はまた、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６Ｃ細胞核溶解物から得たＩＰ処理ＳＦ３ｂ複合体においても観察され、この変異は、生理学的に関連するタンパク質複合体において同様にモジュレーター結合を減少させることができることが確認された（図１１）。
【０１６９】
３．考察
[0201]スプライセオソームは、いくつかのｓｎＲＮＰが絡むマルチプルＡＴＰ依存性コンホメーション変化を起こし、この動的複合性が、スプライシングモジュレーターが結合する場所及び時を決定することを困難にする。プラジエノライド及びハーボキシジエンアナログを用いるこれまでのフォトクロスリンキング研究によって、ＳＦ３ｂ複合体、Ｕ２  ｓｎＲＮＰのサブユニットのうち１つとの、具体的には、個々のタンパク質ＳＦ３Ｂ３及びＳＦ３Ｂ１との相互作用点が狭められた（Ｋｏｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第３巻、５７０〜５頁（２００７年）；Ｈａｓｅｇａｗａら、ＡＣＳ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第６巻、２２９〜３３頁（２０１１年））。高用量のプラジエノライドＢ及びＥ７１０７下で作製された耐性変異ＳＦ３Ｂ１−Ｒ１０７４Ｈは、ＳＦ３Ｂ１が化合物結合に関与しているというさらなる証拠を提供した（Ｙｏｋｏｉら、Ｔｈｅ  ＦＥＢＳ  ｊｏｕｒｎａｌ  第２７８巻、４８７０〜８０頁（２０１１年））。低用量のＥ７１０７及びハーボキシジエンを用いるゲノム耐性マッピングアプローチを提供することによって、新規耐性変異が誘発された。これによって、スプライシングモジュレーター結合ポケットが評価され、潜在的に、特定のイントロン間の作用機序をさらに洗練させ、説明することが可能となる。一連の変異、ＰＨＦ５Ａ中のＹ３６Ｃ、ＳＦ３Ｂ１中のＶ１０７８Ａ／Ｉ、Ｋ１０７１Ｅ及びこれまでに同定されたＲ１０７４Ｈ（同文献）が明らかにされた。フォトクロスリンキングデータ（Ｋｏｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第３巻、５７０〜５頁（２００７年）；Ｈａｓｅｇａｗａら、ＡＣＳ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第６巻、２２９〜３３頁（２０１１年））と一緒に、モジュレーター結合ポケットをＰＨＦ５Ａ、ＳＦ３Ｂ１及びＳＦ３Ｂ３の間の境界面に特定した（図８）。その他の２種のモジュレーター、スプライセオスタチンＡ及びスデマイシンＤも、Ｙ３６Ｃクローンに対する耐性を示し、これらの化合物がこの部位と同様に相互作用することを示す（Ｋａｉｄａら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第３巻、５７６〜８３頁（２００７年）；Ｘａｒｇａｙ−Ｔｏｒｒｅｎら、Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  第６巻、２２７３４〜４９頁（２０１５年））。実際、ＰＨＦ５Ａ、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦ３Ｂ３及びＳＦ３Ｂ５からなる機能的４タンパク質複合体を再構成することによって、スプライシングモジュレーターの、この共通の結合ポケットとの結合が確認された（図７Ａ）。さらに、Ｙ３６Ｃの単一アミノ酸置換は、プラジエノライドプローブの結合をバックグラウンドレベルに低減し、これは、耐性の機序が、スプライシングモジュレーターの、結合ポケットに対する親和性の低下によることを示唆する（図７Ｃ）。Ｙ３６の詳細な部位特異的変異誘発は、Ｙ３６残基での芳香環及び電荷の両方が、スプライシングモジュレーターの活性に関与していることを示す（図７Ｅ〜７Ｇ）。さらに、Ｙ３６での変異は、種々の足場を用いるこれらのモジュレーターから種々のレベルの保護を示し、これは、これらのモジュレーターがこの共通結合ポケットでの相互作用の様式内��わずかに異なる姿勢をとることができることを示す。Ｗｅｂｂらは、Ｃ８〜Ｃ１１の間の疎水性モチーフ（ジエン基）を含む、ハーボキシジエン活性のいくつかのファルマコフォア特徴をこれまでに仮定してきた（Ｌａｇｉｓｅｔｔｉら、ＡＣＳ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第９巻、６４３〜８頁（２０１４年））。プラジエノライド及びハーボキシジエンは、このジエン部分を共有し、これがＹ３６の近位で結合できることを暗示する。
【０１７０】
[0202]ＢＰＡ結合部位の周囲の耐性変異の位置を考慮して、作用機序の１つのあり得るモデルは、スプライシングモジュレーターがＢＰＡ競合阻害剤であることである（図８）。スプライシングモジュレーター結合ポケットのＢＰＡに対するこの近接性は、スプライセオスタチン及びプラジエノライドは両方とも、ヘパリンの存在下でＵ２  ｓｎＲＮＡとプレｍＲＮＡ分岐点領域の間で基準の塩基対形成を損なうというこれまでの報告と一致する（Ｆｏｌｃｏら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第２５巻、４４０〜４頁（２０１１年）；Ｃｏｒｒｉｏｎｅｒｏら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第２５巻、４４５〜５９頁（２０１１年））。Ｃｏｒｒｉｏｎｅｒｏらは、スプライセオスタチンＡは、Ｕ２  ｓｎＲＮＰが、ヘパリン（５ｍｇ／ｍＬ）の存在下でプレｍＲＮＡとＵ２  ｓｎＲＮＡの間で基準の塩基対形成を確立するのを妨げることを示し、これは、Ｕ２  ｓｎＲＮＰをプレｍＲＮＡでの複合体Ａ組み立てから妨害する（Ｃｏｒｒｉｏｎｅｒｏら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第２５巻、４４５〜５９頁（２０１１年））。さらに、スプライシングモジュレーターＥ７１０７及びプラジエノライドＢが、Ｕ２  ｓｎＲＮＰのプレｍＲＮＡとの結合に対して同様の弱化効果を有するとわかった（Ｆｏｌｃｏら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第２５巻、４４０〜４頁（２０１１年））。これらの研究では、過剰の負電荷を有するヘパリンは、おそらくは、Ｕ２  ｓｎＲＮＡとプレｍＲＮＡ間の相互作用を、それらをタンパク質複合体に繋ぎ止めるのに役立つ協同的であるが、非特異的な相互作用を破壊することによって、さらに弱化するのに役立つ。したがって、ヘパリンの不在下で、スプライシングモジュレーターは弱化し得るが、Ｕ２  ｓｎＲＮＡとプレｍＲＮＡの間の相互作用を完全には破壊しない（Ｃｏｒｒｉｏｎｅｒｏら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第２５巻、４４５〜５９頁（２０１１年））。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスプライシング反応は、阻害は、試薬添加の順序に応じて変わる、すなわち、化合物は、基質及びＡＴＰなどに先立って核抽出物に添加しなくてはならない、さもないと反応が普通進行することを示す  （Ｆｏｌｃｏら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第２５巻、４４０〜４頁（２０１１年））。これらのデータは、化合物が、基質プレｍＲＮＡがロードされるＡＴＰ依存性転移の前に、スプライセオソーム組み立てにおいて早期にＵ２  ｓｎＲＮＰに作用することを示唆する。ひとたび、Ｕ２  ｓｎＲＮＰがプレｍＲＮＡで組み立てられると遮断できない不可逆性のコミットメントステップも指す。まとめると、これらの観察結果は、スプライシングモジュレーターが、ＳＦ３Ｂ１分枝部位認識の忠実度に直接影響を及ぼし、３’スプライス部位認識に対する結果を伴うモデルにつながった（Ｃｏｒｒｉｏｎｅｒｏら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第２５巻、４４５〜５９頁（２０１１年））。この競合結合モデルは、全体的なスプライシングレベルで調べることができるいくつかの可能性ある機能的結果を直ちに示唆する。具体的には、より弱いＧＣリッチイントロン基質は、より強いイントロン配列よりも阻��することがより容易であろう、この差は、種々の化合物の存在下でスプライシング優先度の変化によって現れ得る。
【０１７１】
[0203]阻害についてこのモデルと一致して、ここで、非線形用量応答が、個々のイントロンの「強さ」の変動のために全体的なスプライシングにおいて観察された。スプライシング調節は、ヒトゲノム中の２００，０００より多いイントロンに影響を与える全体的な現象である（Ｓａｋｈａｒｋａｒら、Ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第４巻、３８７〜９３頁（２００４年））。イントロン及び隣接するエキソン内のいくつかの保存された特徴にもかかわらず、スプライシングの間の個々のイントロンの調節は、多様で複雑である。この変動及び複雑性とは、小分子阻害がスプライスジャンクション使用に対して差次的作用を有するであろうことを意味する。ここで、ＰＨＦ５Ａにおける保護的変異によって、スプライシング調節の際にイントロンの個々の細胞応答が調べられることが可能となり、これは、イントロン保持（ＩＲ）及びエキソンスキッピング（ＥＳ）事象の間の移行を示した。
【０１７２】
[0204]進化の間に、下等真核生物における全般的に短い低ＧＣ含有イントロンは、２つの異なる経路下で進化したと提案されており（Ａｍｉｔら、Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  第１巻、５４３〜５６頁（２０１２年））、イントロンの１つの群は、短いままであったが、ＧＣパーセンテージを著しく増大し、その隣接するエキソンと比較してＧＣ組成の点であまり差はなかった。これらのイントロンのより短い長さのために、それらは、イントロンによって定義されるスプライシング機序によって認識される可能性がより高い。興味深いことに、これらのイントロンは、Ｅ７１０７処置の際にイントロン保持に対してより感受性であると思われる。また、ＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ変異の存在下でＥ７１０７の効果が弱化された場合に、イントロンと関連するＩＲ事象の平均ＧＣ組成は、著しく高く、下流エキソンからの差はほとんどない乃至全くないということが観察された（図４Ｃ）。イントロンと周囲のエキソン間のＧＣ組成の差がスプライシング機構認識に寄与し得ることを考慮すると、これらの種類のイントロンが、スプライシング機構にとって、認識することが本質的により困難であると仮定することは妥当であり、これは、順に、スプライシングモジュレーターを用いて阻害することをより容易にし得る。また、ＢＰＡ周囲のより高いＧＣ含量は、プレｍＲＮＡのより安定な二次構造につながり得るということも提案されており、したがって、ＧＣ含量が、構造的及び空間的機序によってプレｍＲＮＡとスプライシングモジュレーター間の競合の有効性に影響を及ぼし得るということも妥当である（Ｚｈａｎｇら、ＢＭＣ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  第１２巻、９０頁（２０１１年））。
【０１７３】
[0205]対照的に、イントロンの別の群は、進化の間、その低ＧＣ組成及び隣接するエキソンとの大きな差を維持したが、長さの有意な増大を起こし、これによって、それらがイントロンによって定義されるスプライシングの範囲から出され、それらがエキソンによって定義されるスプライシング機序に変換された可能性が高い。興味深いことに、Ｅ７１０７処置下で、ＥＳ事象の増大と関連しているイントロンは、より低いＧＣ組成及びスキップされたエキソンとのより高いＧＣ差と関連している（図４Ｄ）。ＩＲ事象における観察結果と同様に、Ｙ３６Ｃの存在下で化合物によって誘導されたＥＳイントロンのＧＣ含量はまた、ＷＴ細胞のものよりも高かった（図４Ｄ）。イントロンとエキソン間のＧＣ組成のより高い差は、ヌクレオソーム占有率の増大及びクロマチンとのＳＦ３Ｂ１会合の濃縮と関連付けられており、これはおそらくは同時転写スプライシングのためにこれらのジャンクションを刺激する（Ａｍｉｔら、Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  第１巻、５４３〜５６頁（２０１２年）；Ｋｆｉｒら、Ｃｅｌｌ  ｒｅｐｏｒｔｓ  第１１巻、６１８〜２９頁（２０１５年））。ＥＳ事象と関連するジャンクションのゲノム構造のさらなる特性決定は、転写とスプライシングの間の複合体関連性の理解にさらなる洞察をもたらし得る。
【０１７４】
[0206]ここで、２４７０のジャンクションが、ＰＨＦ５Ａの遺伝子型に応じてＥ７１０７処置の際にＩＲとＥＳの間で切り替えられ得ることが観察され、これは、イントロンが、小分子阻害剤に対して差次的感受性を有するという仮説を強固にする（図４Ｅ）。ＩＲ及びＥＳ事象は同一３’ジャンクションに影響を及ぼすという事実は、相いれず、スプライシング調節の柔軟性及び個々のジャンクションの利用の微調整機序をさらに明らかにする。具体的には、これらのおよそ２４７０のジャンクションは、スプライシング阻害に対して中程度の感受性を示し、スプライシング阻害のレベルに応じてＩＲとＥＳ事象の間で切り替え可能である。ＰＨＦ５Ａ  ＷＴ細胞において、Ｅ７１０７は、これらの２４７０のジャンクションにおいて基準のＢＰＡとの競合において効率的であり、イントロン保持事象につながったと考えられる。しかし、ＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ発現の際に、化合物のＰＨＦ５Ａ−ＳＦ３Ｂ１境界面との会合は弱化されるが失われないので、Ｅ７１０７は、すぐ上流のイントロンとのその応答能を維持しながら、これらのジャンクションとの競合においてあまり効率的ではなくなるであろう、したがって、これは、より多くのエキソンスキッピング事象を誘導した。これは、ＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６Ｃ変異の存在下でさえＥ７１０７を用いて容易に保持され得るその他のより弱い高ＧＣ含量イントロンとは対照的である（図４Ａ〜４Ｃ）。興味深いことに、上記の３８８３のＥＳ関連ジャンクションの一部は、ＷＴ  ＰＨＦ５Ａの存在下でのＩＲ事象の増大と関連しておらず、これは、これらのジャンクションは、スプライシング調節に対してさらにより強く、より耐性であり得ることを示唆する（図４Ｅ）。さらに、Ｅ７１０７は、およそ２０，０００のイントロンにおいて、異常なスプライシングを唯一誘導し（図４Ａ）、これは、この投与量でスプライシング調節に抵抗できるさらに強いイントロンの存在を示唆し、感受性３’スプライス部位に対してスプライセオスタチンＡのみが影響を及ぼしたという、スプライシング感受性マイクロアレイを使用するこれまでの観察結果と一致する（Ｃｏｒｒｉｏｎｅｒｏら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第２５巻、４４５〜５９頁（２０１１年））。まとめると、細胞イントロンに由来するこれらの差次的感受性は、スプライシングモジュレーターが競合ＢＰＡ阻害剤として作用するモデルと一致し、差次的投与量のスプライシングモジュレーターに対する非線形応答をもたらす可能性が高い。興味深いことに、この研究において同定されたジャンクションの一部は、細胞周期調節及びＲＮＡ結合において働くもの（すなわち、ＲＢＭ５）であり、これがスプライセオスタチンＡによって優先的に調節される官能基であるとわかっている（Ｃｏｒｒｉｏｎｅｒｏら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  第２５巻、４４５〜５９頁（２０１１年））。腫瘍形成における周囲の経路の頻繁な変更を考慮すると、スプライシング機構が正常及び異常な細胞周期調節の調節に寄与する方法のさらなる解析は、癌細胞を標的化するさらなる経路を提供し得る。
【０１７５】
[0207]小分子ライブラリーの表現型スクリーニングは、可能性ある薬物を同定するための強力な方法である。しかし、ヒットをスクリーニングするための細胞標的同定は、たゆまぬ挑戦であった。細胞標的及び作用機序を同定するために、定量的手順と一体となったアフィニティー精製、遺伝子相互作用アプローチ、ＲＮＡｉスクリーニング及びドメインに焦点をあてたＣＲＩＳＰＲスクリーンなどの生化学的アプローチ並びにコンピュータによる干渉アプローチを含むいくつかの不偏のアプローチが開発された（Ｓｈｉら、Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  第３３巻、６６１〜７頁（２０１５年）；Ｓｃｈｅｎｏｎｅら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第９巻、２３２〜４０頁（２０１３年））。より最近は、表現型的に耐性の細胞集団の次世代シーケンシング（ＮＧＳ）ベースのゲノム又はトランスクリプトームプロファイリングが使用され（Ａｄａｍｓら、ＡＣＳ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第９巻、２２４７〜５４頁（２０１４年）；Ｋｏｒｐａｌら、Ｃａｎｃｅｒ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  第３巻、１０３０〜４３頁（２０１３）；Ｗａｃｋｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ  第８巻、２３５〜７頁（２０１２年））、独特の再発性一塩基多様性（ＳＮＶ）又は発現変更を同定して、化合物の可能性ある細胞標的が明らかにされている。ここで、１）高濃度で潜在的にオフターゲット活性を軽減し、２）化学プローブのわずかではあるが一般的な機序を同定する可能性を増強するために、種々の低濃度の構造的に関連しない化合物をスクリーニングすることによる方法がさらに開発された。これによって、同一複合体中に共存するタンパク質をコードする複数の変異／遺伝子が明らかにされることが可能になった。興味深いことに、これまでに報告されたＳＦ３Ｂ１−Ｒ１０７４を確認することに加えて、ＰＨＦ５Ａ−Ｙ３６、ＳＦ３Ｂ１−Ｖ１０７８及びＫ１０７１に対する耐性変異の知見は、これらの残基の、スプライシングモジュレーターの作用部位への近接性を示唆する。酵母中のこれらの残基の対応するアミノ酸は、ＢＰＳ中の不変のアデノシンを収容するポケットを形成すると最近示されたという事実は、このゲノムプロファイリング戦略が、候補化合物の作用に忠実で有益な洞察を提供できることを実証する。したがって、ゲノムプロファイリングアプローチのさらなる拡大は、「２次元」ゲノムフィンガープリント精査を使用して化合物のＭｏＡ（作用機序）を調査するための独特な方法を提供する可能性が高い。これは、複合体及び動的スプライセオソームによるこの研究によって例示されるような精製されたタンパク質を用いるタンパク質構造及び／又は生化学的アッセイが容易に利用可能ではない場合に特に価値がある。
【０１７６】
[0208]要約すると、ＰＨＦ５Ａを小分子スプライシングモジュレーターの相互作用のノードとして同定した。構造解析は、分岐点アデノシン結合ポケット周囲の共通の結合部位を正確に示した。また、結果は、ＰＨＦ５Ａ  Ｙ３６での単一アミノ酸変化が、スプライシングモジュレーターの阻害効果を弱化し、エキソンスキッピング事象とイントロン保持事象の間の全体的なスプライシングパターンを変更する方法を実証する。
【０１７７】
配列表
配列番号  配列
1
Met Ala Lys Ile Ala Lys Thr His Glu AspIle Glu Ala Gln Ile Arg 
Glu Ile Gln Gly Lys Lys Ala Ala Leu AspGlu Ala Gln Gly Val Gly 
Leu Asp Ser Thr Gly Tyr Tyr Asp Gln GluIle Tyr Gly Gly Ser Asp 
Ser Arg Phe Ala Gly Tyr Val Thr Ser IleAla Ala Thr Glu Leu Glu 
Asp Asp Asp Asp Asp Tyr Ser Ser Ser ThrSer Leu Leu Gly Gln Lys 
Lys Pro Gly Tyr His Ala Pro Val Ala LeuLeu Asn Asp Ile Pro Gln 
Ser Thr Glu Gln Tyr Asp Pro Phe Ala GluHis Arg Pro Pro Lys Ile 
Ala Asp Arg Glu Asp Glu Tyr Lys Lys HisArg Arg Thr Met Ile Ile 
Ser Pro Glu Arg Leu Asp Pro Phe Ala AspGly Gly Lys Thr Pro Asp 
Pro Lys Met Asn Ala Arg Thr Tyr Met AspVal Met Arg Glu Gln His 
Leu Thr Lys Glu Glu Arg Glu Ile Arg GlnGln Leu Ala Glu Lys Ala 
Lys Ala Gly Glu Leu Lys Val Val Asn GlyAla Ala Ala Ser Gln Pro 
Pro Ser Lys Arg Lys Arg Arg Trp Asp GlnThr Ala Asp Gln Thr Pro 
Gly Ala Thr Pro Lys Lys Leu Ser Ser TrpAsp Gln Ala Glu Thr Pro 
Gly His Thr Pro Ser Leu Arg Trp Asp GluThr Pro Gly Arg Ala Lys 
Gly Ser Glu Thr Pro Gly Ala Thr Pro GlySer Lys Ile Trp Asp Pro 
Thr Pro Ser His Thr Pro Ala Gly Ala AlaThr Pro Gly Arg Gly Asp 
Thr Pro Gly His Ala Thr Pro Gly His GlyGly Ala Thr Ser Ser Ala 
Arg Lys Asn Arg Trp Asp Glu Thr Pro LysThr Glu Arg Asp Thr Pro 
Gly His Gly Ser Gly Trp Ala Glu Thr ProArg Thr Asp Arg Gly Gly 
Asp Ser Ile Gly Glu Thr Pro Thr Pro GlyAla Ser Lys Arg Lys Ser 
Arg Trp Asp Glu Thr Pro Ala Ser Gln MetGly Gly Ser Thr Pro Val 
Leu Thr Pro Gly Lys Thr Pro Ile Gly ThrPro Ala Met Asn Met Ala 
Thr Pro Thr Pro Gly His Ile Met Ser MetThr Pro Glu Gln Leu Gln 
Ala Trp Arg Trp Glu Arg Glu Ile Asp GluArg Asn Arg Pro Leu Ser 
Asp Glu Glu Leu Asp Ala Met Phe Pro GluGly Tyr Lys Val Leu Pro 
Pro Pro Ala Gly Tyr Val Pro Ile Arg ThrPro Ala Arg Lys Leu Thr 
Ala Thr Pro Thr Pro Leu Gly Gly Met ThrGly Phe His Met Gln Thr 
Glu Asp Arg Thr Met Lys Ser Val Asn AspGln Pro Ser Gly Asn Leu 
Pro Phe Leu Lys Pro Asp Asp Ile Gln TyrPhe Asp Lys Leu Leu Val 
Asp Val Asp Glu Ser Thr Leu Ser Pro GluGlu Gln Lys Glu Arg Lys 
Ile Met Lys Leu Leu Leu Lys Ile Lys AsnGly Thr Pro Pro Met Arg 
Lys Ala Ala Leu Arg Gln Ile Thr Asp LysAla Arg Glu Phe Gly Ala 
Gly Pro Leu Phe Asn Gln Ile Leu Pro LeuLeu Met Ser Pro Thr Leu 
Glu Asp Gln Glu Arg His Leu Leu Val LysVal Ile Asp Arg Ile Leu 
Tyr Lys Leu Asp Asp Leu Val Arg Pro TyrVal His Lys Ile Leu Val 
Val Ile Glu Pro Leu Leu Ile Asp Glu AspTyr Tyr Ala Arg Val Glu 
Gly Arg Glu Ile Ile Ser Asn Leu Ala LysAla Ala Gly Leu Ala Thr 
Met Ile Ser Thr Met Arg Pro Asp Ile AspAsn Met Asp Glu Tyr Val 
Arg Asn Thr Thr Ala Arg Ala Phe Ala ValVal Ala Ser Ala Leu Gly 
Ile Pro Ser Leu Leu Pro Phe Leu Lys AlaVal Cys Lys Ser Lys Lys 
Ser Trp Gln Ala Arg His Thr Gly Ile LysIle Val Gln Gln Ile Ala 
Ile Leu Met Gly Cys Ala Ile Leu Pro HisLeu Arg Ser Leu Val Glu 
Ile Ile Glu His Gly Leu Val Asp Glu GlnGln Lys Val Arg Thr Ile 
Ser Ala Leu Ala Ile Ala Ala Leu Ala GluAla Ala Thr Pro Tyr Gly 
Ile Glu Ser Phe Asp Ser Val Leu Lys ProLeu Trp Lys Gly Ile Arg 
Gln His Arg Gly Lys Gly Leu Ala Ala PheLeu Lys Ala Ile Gly Tyr 
Leu Ile Pro Leu Met Asp Ala Glu Tyr AlaAsn Tyr Tyr Thr Arg Glu 
Val Met Leu Ile Leu Ile Arg Glu Phe GlnSer Pro Asp Glu Glu Met 
Lys Lys Ile Val Leu Lys Val Val Lys GlnCys Cys Gly Thr Asp Gly 
Val Glu Ala Asn Tyr Ile Lys Thr Glu IleLeu Pro Pro Phe Phe Lys 
His Phe Trp Gln His Arg Met Ala Leu AspArg Arg Asn Tyr Arg Gln 
Leu Val Asp Thr Thr Val Glu Leu Ala AsnLys Val Gly Ala Ala Glu 
Ile Ile Ser Arg Ile Val Asp Asp Leu LysAsp Glu Ala Glu Gln Tyr 
Arg Lys Met Val Met Glu Thr Ile Glu LysIle Met Gly Asn Leu Gly 
Ala Ala Asp Ile Asp His Lys Leu Glu GluGln Leu Ile Asp Gly Ile 
Leu Tyr Ala Phe Gln Glu Gln Thr Thr GluAsp Ser Val Met Leu Asn 
Gly Phe Gly Thr Val Val Asn Ala Leu GlyLys Arg Val Lys Pro Tyr 
Leu Pro Gln Ile Cys Gly Thr Val Leu TrpArg Leu Asn Asn Lys Ser 
Ala Lys Val Arg Gln Gln Ala Ala Asp LeuIle Ser Arg Thr Ala Val 
Val Met Lys Thr Cys Gln Glu Glu Lys LeuMet Gly His Leu Gly Val 
Val Leu Tyr Glu Tyr Leu Gly Glu Glu TyrPro Glu Val Leu Gly Ser 
Ile Leu Gly Ala Leu Lys Ala Ile Val AsnVal Ile Gly Met His Lys 
Met Thr Pro Pro Ile Lys Asp Leu Leu ProArg Leu Thr Pro Ile 
Leu Lys Asn Arg His Glu Lys Val Gln GluAsn Cys Ile Asp Leu 
Val Gly Arg Ile Ala Asp Arg Gly Ala GluTyr Val Ser Ala Arg 
Glu Trp Met Arg Ile Cys Phe Glu Leu LeuGlu Leu Leu Lys Ala 
His Lys Lys Ala Ile Arg Arg Ala Thr ValAsn Thr Phe Gly Tyr 
Ile Ala Lys Ala Ile Gly Pro His Asp ValLeu Ala Thr Leu Leu 
Asn Asn Leu Lys Val Gln Glu Arg Gln AsnArg Val Cys Thr Thr 
Val Ala Ile Ala Ile Val Ala Glu Thr CysSer Pro Phe Thr Val 
Leu Pro Ala Leu Met Asn Glu Tyr Arg ValPro Glu Leu Asn Val 
Gln Asn Gly Val Leu Lys Ser Leu Ser PheLeu Phe Glu Tyr Ile 
Gly Glu Met Gly Lys Asp Tyr Ile Tyr AlaVal Thr Pro Leu Leu 
Glu Asp Ala Leu Met Asp Arg Asp Leu ValHis Arg Gln Thr Ala 
Ser Ala Val Val Gln His Met Ser Leu GlyVal Tyr Gly Phe Gly 
Cys Glu Asp Ser Leu Asn His Leu Leu AsnTyr Val Trp Pro Asn 
Val Phe Glu Thr Ser Pro His Val Ile Gln AlaVal Met Gly Ala 
Leu Glu Gly Leu Arg Val Ala Ile Gly ProCys Arg Met Leu Gln 
Tyr Cys Leu Gln Gly Leu Phe His Pro AlaArg Lys Val Arg Asp 
Val Tyr Trp Lys Ile Tyr Asn Ser Ile TyrIle Gly Ser Gln Asp 
Ala Leu Ile Ala His Tyr Pro Arg Ile TyrAsn Asp Asp Lys Asn 
Thr Tyr Ile Arg Tyr Glu Leu Asp Tyr IleLeu 
2
MAKHHPDLIF CRKQAGVAIG RLCEKCDGKCVICDSYVRPC 
TLVRICDECN YGSYQGRCVI CGGPGVSDAYYCKECTIQEK 
DRDGCPKIVN LGSSKTDLFY ERKKYGFKKR
3
Actctcttccgcatcgctgtctgcgagggccagctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcatgactt
Ctgcgctaagattgtcagtttccaaaaacgaggaggatttgatattcacctggcccgcggtgatgcctttgagg
Gtggccgcgtccatctggtcagaaaagacaatctttttgttgtcaagctttgcacgtctagggcgcagtagtcc
Agggtttccttgatgatgtcatactaatcctgtcccttttttttccacagctcgcggttgaggacaaactcttcgcgg
tctttccagtactcttggatcggaaacccgtcggcctccgaacg
4
ACTCTCTTCCGCATCGCTGT
5
CCGACGGGTTTCCGATCCAA
6
CTGTTGGGCTCGCGGTTG
7
TGGCATCAGATTGCAAAGAC
8
ACGCCGGGTGATGTATCTAT
9
CGAAACGC ACCCGTCAGACG
10
ATATGCCAAACCAGCTCCTAC
11
AGAACTCCACAAACCCATCCCAGC
12
AAGGACAAAACGGGACTGG
13
AAAGCCAATGGGCAGGT
14
TCCACAAACCCATCTTGGAAGGCC
15
CCACCTTCTAGGTCCTCTACAT
16
GACAAAGGAGGCCGTGAGGA
17
GTTTGTTACGCCGTCGCTGAAA
18
TCAGGCATGCTTCGGAAACTGGA
19
GCCCCGGGGTGAATAATAATTGGTTTACT
20
TTTCTAGGATGGGTTTGTGGAGTT
21
CCTGATGCCACCTTCTAGGTCCTCTAC
22
GCCAAGGACACAAAGCCAAT
23
CTGGAGACCTTACGACGGGTTGGG
24
AAGGCCGTCTCGTGGTT
25
ATGGCGAAGATCGCCAAGACTCACGAAGATATTGAAGCACAGATTCGAGAAATT
CAAGGCAAGAAGGCAGCTCTTGATGAAGCTCAAGGAGTGGGCCTCGATTCTACA
GGTTATTATGACCAGGAAATTTATGGTGGAAGTGACAGCAGATTTGCTGGATACG
TGACATCAATTGCTGCAACTGAACTTGAAGATGATGACGATGACTATTCATCATC
TACGAGTTTGCTTGGTCAGAAGAAGCCAGGATATCATGCCCCTGTGGCATTGCT
TAATGATATACCACAGTCAACAGAACAGTATGATCCATTTGCTGAGCACAGACCT
CCAAAGATTGCAGACCGGGAAGATGAATACAAAAAGCATAGGCGGACCATGATA
ATTTCCCCAGAGCGTCTTGATCCTTTTGCAGATGGAGGGAAAACCCCTGATCCTA
AAATGAATGCTAGGACTTACATGGATGTAATGCGAGAACAACACTTGACTAAAG
AAGAACGAGAAATTAGGCAACAGCTAGCAGAAAAAGCTAAAGCTGGAGAACTAA
AAGTCGTCAATGGAGCAGCAGCGTCCCAGCCTCCATCAAAACGAAAACGGCGTT
GGGATCAAACAGCTGATCAGACTCCTGGTGCCACTCCCAAAAAACTATCAAGTT
GGGATCAGGCAGAGACCCCTGGGCATACTCCTTCCTTAAGATGGGATGAGACAC
CAGGTCGTGCAAAGGGAAGCGAGACTCCTGGAGCAACCCCAGGCTCAAAAATAT
GGGATCCTACACCTAGCCACACACCAGCGGGAGCTGCTACTCCTGGACGAGGT
GATACACCAGGCCATGCGACACCAGGCCATGGAGGCGCAACTTCCAGTGCTCG
TAAAAACAGATGGGATGAAACCCCCAAAACAGAGAGAGATACTCCTGGGCATGG
AAGTGGATGGGCTGAGACTCCTCGAACAGATCGAGGTGGAGATTCTATTGGTGA
AACACCGACTCCTGGAGCCAGTAAAAGAAAATCACGGTGGGATGAAACACCAGC
TAGTCAGATGGGTGGAAGCACTCCAGTTCTGACCCCTGGAAAGACACCAATTGG
CACACCAGCCATGAACATGGCTACCCCTACTCCAGGTCACATAATGAGTATGACT
CCTGAACAGCTTCAGGCTTGGCGGTGGGAAAGAGAAATTGATGAGAGAAATCG
CCCACTTTCTGATGAGGAATTAGATGCTATGTTCCCAGAAGGATATAAGGTACTT
CCTCCTCCAGCTGGTTATGTTCCTATTCGAACTCCAGCTCGAAAGCTGACAGCTA
CTCCAACACCTTTGGGTGGTATGACTGGTTTCCACATGCAAACTGAAGATCGAAC
TATGAAAAGTGTTAATGACCAGCCATCTGGAAATCTTCCATTTTTAAAACCTGATG
ATATTCAATACTTTGATAAACTATTGGTTGATGTTGATGAATCAACACTTAGTCCA
GAAGAGCAAAAAGAGAGAAAAATAATGAAGTTGCTTTTAAAAATTAAGAATGGAA
CACCACCAATGAGAAAGGCTGCATTGCGTCAGATTACTGATAAAGCTCGTGAATT
TGGAGCTGGTCCTTTGTTTAATCAGATTCTTCCTCTGCTGATGTCTCCTACACTTG
AGGATCAAGAGCGTCATTTACTTGTGAAAGTTATTGATAGGATACTGTACAAACTT
GATGACTTAGTTCGTCCATATGTGCATAAGATCCTCGTGGTCATTGAACCGCTAT
TGATTGATGAAGATTACTATGCTAGAGTGGAAGGCCGAGAGATCATTTCTAATTT
GGCAAAGGCTGCTGGTCTGGCTACTATGATCTCTACCATGAGACCTGATATAGAT
AACATGGATGAGTATGTCCGTAACACAACAGCTAGAGCTTTTGCTGTTGTAGCCT
CTGCCCTGGGCATTCCTTCTTTATTGCCCTTCTTAAAAGCTGTGTGCAAAAGCAA
GAAGTCCTGGCAAGCGAGACACACTGGTATTAAGATTGTACAACAGATAGCTATT
CTTATGGGCTGTGCCATCTTGCCACATCTTAGAAGTTTAGTTGAAATCATTGAAC
ATGGTCTTGTGGATGAGCAGCAGAAAGTTCGGACCATCAGTGCTTTGGCCATTG
CTGCCTTGGCTGAAGCAGCAACTCCTTATGGTATCGAATCTTTTGATTCTGTGTT
AAAGCCTTTATGGAAGGGTATCCGCCAACACAGAGGAAAGGGTTTGGCTGCTTT
CTTGAAGGCTATTGGGTATCTTATTCCTCTTATGGATGCAGAATATGCCAACTACT
ATACTAGAGAAGTGATGTTAATCCTTATTCGAGAATTCCAGTCTCCTGATGAGGA
AATGAAAAAAATTGTGCTGAAGGTGGTAAAACAGTGTTGTGGGACAGATGGTGTA
GAAGCAAACTACATTAAAACAGAGATTCTTCCTCCCTTTTTTAAACACTTCTGGCA
GCACAGGATGGCTTTGGATAGAAGAAATTACCGACAGTTAGTTGATACTACTGTG
GAGTTGGCAAACAAAGTAGGTGCAGCAGAAATTATATCCAGGATTGTGGATGAT
CTGAAAGATGAAGCCGAACAGTACAGAAAAATGGTGATGGAGACAATTGAGAAA
ATTATGGGTAATTTGGGAGCAGCAGATATTGATCATAAACTTGAAGAACAACTGA
TTGATGGTATTCTTTATGCTTTCCAAGAACAGACTACAGAGGACTCAGTAATGTT
GAACGGCTTTGGCACAGTGGTTAATGCTCTTGGCAAACGAGTCAAACCATACTT
GCCTCAGATCTGTGGTACAGTTTTGTGGCGTTTAAATAACAAATCTGCTAAAGTT
AGGCAACAGGCAGCTGACTTGATTTCTCGAACTGCTGTTGTCATGAAGACTTGTC
AAGAGGAAAAATTGATGGGACACTTGGGTGTTGTATTGTATGAGTATTTGGGTGA
AGAGTACCCTGAAGTATTGGGCAGCATTCTTGGAGCACTGAAGGCCATTGTAAA
TGTCATAGGTATGCATAAGATGACTCCACCAATTAAAGATCTGCTGCCTAGACTA
CCCCCATCTTAAAGAACAGACATGAAAAAGTACAAGAGAATTGTATTGATCTTGTT
GGTCGTATTGCTGACAGGGGAGCTGAATATGTATCTGCAAGAGAGTGGATGAGG
ATTTGCTTTGAGCTTTTAGAGCTCTTAAAAGCCCACAAAAAGGCTATTCGTAGAG
CCACAGTCAACACATTTGGTTATATTGCAAAGGCCATTGGCCCTCATGATGTATT
GGCTACACTTCTGAACAACCTCAAAGTTCAAGAAAGGCAGAACAGAGTTTGTACC
ACTGTAGCAATAGCTATTGTTGCAGAAACATGTTCACCCTTTACAGTACTCCCTG
CCTTAATGAATGAATACAGAGTTCCTGAACTGAATGTTCAAAATGGAGTGTTAAAA
TCGCTTTCCTTCTTGTTTGAATATATTGGTGAAATGGGAAAAGACTACATTTATGC
CGTAACACCGTTACTTGAAGATGCTTTAATGGATAGAGACCTTGTACACAGACAG
ACGGCTAGTGCAGTGGTACAGCACATGTCACTTGGGGTTTATGGATTTGGTTGT
GAAGATTCGCTGAATCACTTGTTGAACTATGTATGGCCCAATGTATTTGAGACAT
CTCCTCATGTAATTCAGGCAGTTATGGGAGCCCTAGAGGGCCTGAGAGTTGCTA
TTGGACCATGTAGAATGTTGCAATATTGTTTACAGGGTCTGTTTCACCCAGCCCG
GAAAGTCAGAGATGTATATTGGAAAATTTACAACTCCATCTACATTGGTTCCCAG
GACGCTCTCATAGCACATTACCCAAGAATCTACAACGATGATAAGAACACCTATA
TTCGTTATGAACTTGACTATATCTTATAA
26
ATGGCTAAACATCATCCTGATTTGATCTTTTGCCGCAAGCAGGCTGGTGTTGCCA
TCGGAAGACTGTGTGAAAAATGTGATGGCAAGTGTGTGATTTGTGACTCCTATGT
GCGTCCCTGCACTCTGGTGCGCATATGTGATGAGTGTAACTATGGATCTTACCA
GGGGCGCTGTGTGATCTGTGGAGGACCTGGGGTCTCTGATGCCTATTATTGTAA
GGAGTGCACCATCCAGGAGAAGGACAGAGATGGCTGCCCAAAGATTGTCAATCT
GGGGAGCTCTAAGACAGACCTCTTCTATGAACGCAAAAAATACGGCTTCAAGAA
GAGGTGA
【図１Ａ】
2020514348.tif 000010
【図１Ｂ】
2020514348.tif 000011
【図１Ｃ】
2020514348.tif 000012
【図１Ｄ】
2020514348.tif 000013
【図１Ｅ】
2020514348.tif 000014
【図１Ｆ】
2020514348.tif 000015
【図１Ｇ】
2020514348.tif 000016
【図２Ａ】
2020514348.tif 000017
【図２Ｂ】
2020514348.tif 000018
【図２Ｃ】
2020514348.tif 000019
【図２Ｄ】
2020514348.tif 000020
【図３Ａ】
2020514348.tif 000021
【図３Ｂ】
2020514348.tif 000022
【図４Ａ】
2020514348.tif 000023
【図４Ｂ】
2020514348.tif 000024
【図４Ｃ】
2020514348.tif 000025
【図４Ｄ】
2020514348.tif 000026
【図４Ｅ】
2020514348.tif 000027
【図５Ａ】
2020514348.tif 000028
【図５Ｂ】
2020514348.tif 000029
【図６Ａ】
2020514348.tif 000030
【図６Ｂ】
2020514348.tif 000031
【図６Ｃ】
2020514348.tif 000032
【図６Ｄ】
2020514348.tif 000033
【図６Ｅ】
2020514348.tif 000034
【図６Ｆ】
2020514348.tif 000035
【図７Ａ】
2020514348.tif 000036
【図７Ｂ】
2020514348.tif 000037
【図７Ｃ】
2020514348.tif 000038
【図７Ｄ】
2020514348.tif 000039
【図７Ｅ】
2020514348.tif 000040
【図７Ｆ】
2020514348.tif 000041
【図７Ｇ】
2020514348.tif 000042
【図８】
2020514348.tif 000043
【図９】
2020514348.tif 000044
【図１０】
2020514348.tif 000045
【図１１Ａ】
2020514348.tif 000046
【図１１Ｂ】
2020514348.tif 000047
【配列表】
2020514348000001.app
【国際調査報告】
2020514348.tif 000048
2020514348.tif 000049
2020514348.tif 000050