(57)【要約】  ＤＮＡ二本鎖切断の誘導および薬物治療と組み合わせてエンドスタチンを使用する治療スキームの手段によって腫瘍または癌を治療するための方法。この方法および組成物は、ｐ５３機能の欠損に関連する腫瘍もしくは癌、またはｐ５３機能が正常である場合に生じる腫瘍もしくは癌を治療するために使用される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドスタチンと化学療法薬とを含んでなり、前記化学療法薬がＤＮＡ二本鎖切断を誘導する化学療法薬である、医薬組成物。
【請求項２】
薬学上許容される担体をさらに含んでなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
腫瘍または癌の治療において使用するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能を欠損している、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能が正常である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記エンドスタチンが
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
エンドスタチンと化学療法薬とを含み、前記化学療法薬がＤＮＡ二本鎖切断を誘導する化学療法薬である、薬物の組合せ。
【請求項１０】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項９に記載の薬物の組合せ。
【請求項１１】
腫瘍または癌の治療において使用するための請求項９または１０に記載の薬物の組合せ。
【請求項１２】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能を欠損している、請求項１１に記載の薬物の組合せ。
【請求項１３】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能が正常である、請求項１１に記載の薬物の組合せ。
【請求項１４】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項１２または１３に記載の薬物の組合せ。
【請求項１５】
前記エンドスタチンおよび化学療法薬が同時にまたは逐次に投与される、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の薬物の組合せ。
【請求項１６】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の薬物の組合せ。
【請求項１７】
ａ）エンドスタチンまたはエンドスタチンを含有する医薬組成物である第１の薬剤と；ｂ）化学療法薬である第２の薬剤（ここで、前記化学療法薬は、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導する化学療法薬である）とを含んでなるキット。
【請求項１８】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
腫瘍または癌の治療において使用するための請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能を欠損している、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能が正常である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画に対して細胞の感受性を増強するための方法であって、前記細胞をエンドスタチンと接触させる工程を含んでなり、前記細胞はＰ５３機能を欠損している、方法。
【請求項２５】
前記細胞が腫瘍細胞または癌細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記腫瘍細胞または癌細胞が非小細胞肺癌細胞または黒色腫細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
イン・ビボまたはイン・ビトロで行われる、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記の細胞をエンドスタチと接触させる工程が、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画と同時にまたは逐次に行われる、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の前にエンドスタチンと接触される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の後にエンドスタチンと接触される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画が放射線療法および／または化学療法薬の投与である、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
腫瘍または癌の治療のための、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画との併用薬の製造におけるエンドスタチンの使用。
【請求項３５】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能を欠損している、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能が正常である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３７】
前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の治療用量が単独で使用される場合の治療計画の治療用量よりも少ない、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３９】
前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画が放射線療法および／または化学療法薬である、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４２】
対象において腫瘍または癌を治療する方法であって、
ａ）前記対象においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画を行うこと；および
ｂ）前記対象にエンドスタチンを投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項４３】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能を欠損している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能が正常である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の治療用量が、単独で使用される場合の治療計画の治療用量よりも少ない、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記の細胞をエンドスタチンと接触させる工程が、前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画と同時にまたは逐次に行われる、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
エンドスタチンが前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の前に前記対象に投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
エンドセリンがＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の後に前記対象に投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画が放射線療法および／または化学療法薬である、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象がヒトである、請求項４２〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項４２〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
ａ）細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導すること；および
ｂ）前記細胞をエンドスタチンと接触させること
を含む、アポトーシスを誘導するための方法。
【請求項５５】
前記細胞が腫瘍細胞または癌細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記腫瘍細胞または癌細胞はＰ５３機能を欠損している、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記腫瘍細胞または癌細胞はＰ５３機能が正常である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導する工程において適用される用量が、その治療計画が単独で使用される場合に適用される用量よりも少ない、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導する工程が、前記細胞をエンドスタチンと接触させる工程と同時にまたは逐次に行われる、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が、前記細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導する前にエンドスタチンと接触される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞が、前記細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導された後にエンドスタチンと接触される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＤＮＡ二本鎖切断が、前記細胞に照射を行うことまたは前記細胞を化学療法薬と接触させることにより誘導される、請求項５４〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
イン・ビトロまたはイン・ビボで行われる、請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項４２〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
細胞においてアポトーシスを誘導するための薬剤の製造におけるエンドスタチンの使用であって、前記細胞はＤＮＡ二本鎖切断を生じさせられる、使用。
【請求項６８】
前記細胞が腫瘍細胞または癌細胞である、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
前記腫瘍細胞または癌細胞はＰ５３機能を欠損している、請求項６８に記載の使用。
【請求項７０】
前記腫瘍細胞または癌細胞はＰ５３機能が正常である、請求項６８に記載の使用。
【請求項７１】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７２】
前記細胞は放射線照射または化学療法薬への曝露によりＤＮＡ二本鎖切断を生じさせられる、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７３】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項６７〜７３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７５】
生体サンプルにおいてＤＮＡ−ＰＫｃｓ活性を阻害する方法であって、前記生体サンプルをエンドスタチンと接触させることを含んでなる、方法。
【請求項７６】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項７５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、腫瘍または癌を治療するための方法および薬剤、特に、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニット(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit)（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）を阻害することにより腫瘍または癌を治療するための方法および薬剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腫瘍は、複数の因子が役割を果たし、関与し、多段階で発症する疾患である。化学療法は、腫瘍の治療に重要な役割を果たす。しかしながら、腫瘍細胞は、化学療法薬に対して耐性を生じやすく、これが癌患者の治療に重大な影響を及ぼす。アルキル化剤、白金錯体およびトポイソメラーゼ阻害剤などの慣用化学療法薬は、標的としてＤＮＡを用い、ＤＮＡ損傷を引き起こしてアポトーシスを誘導することにより腫瘍細胞を死滅させる。従って、ＤＮＡ損傷の修復は、化学療法薬に対する腫瘍細胞の耐性の重要な理由となると考えられる。化学療法薬により引き起こされるＤＮＡ損傷には、塩基の損傷、一本鎖切断(single-strand break)（ＳＳＢ）、二本鎖切断(double-strand break)（ＤＳＢ）などを含む多くの形態があるが、このうち、ＤＳＢ傷害が最も深刻である。哺乳動物細胞では、ＤＳＢ損傷の修復には、相同組換え(Homologous Recombination)（ＨＲ）と非相同末端結合(Nonhomologous End Joining)（ＮＨＥＪ）の２つの主要な形態がある。ＨＲ修復プロセスは、鋳型として姉妹染色分体を用いて損傷したＤＮＡ二本鎖を正確に修復するが、細胞周期のＳ期およびＧ２期においてのみである。ＨＲに比べ、ＮＨＥＪは、細胞周期のいずれのステージでも実行可能なより保存的な修復機構である。この修復は相同鋳型を必要とせず、タンパク質の相互作用を用いて損傷した末端を直接接続するものであり、哺乳動物細胞におけるＤＳＢ修復の主要な機構である。ＮＨＥＪの基本プロセスは二本鎖切断後に起こるものであり、Ｋｕ７０／Ｋｕ８０がＤＳＢ傷害部位の末端に結合し、次いで、ＫｕがＤＮＡ−ＰＫｃｓを動員してＤＮＡ−ＰＫ複合体を形成し、この複合体がＮＨＥＪ修復機構を開始する。ＤＮＡ−ＰＫｃｓは、自己リン酸化と下流タンパク質のリン酸化を介して修復シグナルを伝達する。ＤＮＡ末端処理タンパク質（ヌクレアーゼ、ポリメラーゼなど）は、崩れた末端を連結に適した構造へと処理し、最後に、リガーゼＩＶ−ＸＲＣＣ４−ＸＬＦ複合体が連結機能を遂行する。それらの中で、ＤＮＡ−ＰＫｃｓは、ＤＮＡ−ＰＫ複合体の触媒サブユニットであり、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ様キナーゼ（phosphatidylinositol-3-kinase-like kinase）（ＰＩＫＫ）ファミリーのメンバーであり、ＮＨＥＪ修復に中枢的役割を果たす。ＤＮＡ−ＰＫｃｓの阻害がＤＮＡ傷害薬に対する腫瘍細胞の感受性を著しく高め得ることを示した研究がある(Elaine Willmore, et al. Blood. 2004;103: 4659-4665, Yan Zhao, et al. Cancer Res 2006; 66(10): 5354-62)。ＤＮＡ−ＰＫ阻害剤もまた継続的に開発され、いくつかのＤＮＡ−ＰＫ阻害剤は臨床試験に入っている。腫瘍を治療するための、化学療法薬と組み合わせたＤＮＡ修復阻害剤の使用は有望な分野である。
【０００３】
Ｐ５３タンパク質は、これまでに最も著明な腫瘍抑制因子の１つであると考えられている。このタンパク質は、腫瘍形成および発症に重要な調節的役割を果たし、細胞周期の休止、細胞老化、ＤＮＡ損傷の修復およびアポトーシスなどの複数の生命活動プロセスに関与している。化学療法薬の刺激下で、野生型Ｐ５３はカスパーゼファミリーのタンパク質を活性化し、一連の下流標的遺伝子を調節することによって腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こし得ることを示した研究がある(Liz J Valente, et al. BioDiscovery 2013; 8: 3)が、遺伝子欠失または突然変異を含むｐ５３遺伝子異常の発生率は腫瘍で高い。異常なｐ５３遺伝子は、多くの場合、正常な機能の欠損を招き、続いて、化学療法薬に対する腫瘍細胞の感受性を低下させる。正常なＰ５３機能を有する腫瘍は、Ｐ５３機能の欠損を有する腫瘍よりも化学療法薬に良好に応答することを示した研究がある(Toshiyuki Harada, et al. Cancer Sci 2003; 94: 394-399)。
【０００４】
エンドスタチン（ＥＳ）は、１９９７年ハーバード大学のＦｏｌｋｍａｎ教授が率いる研究グループによって発見された内因性新生血管形成阻害剤である。エンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩのＣ末端断片として同定された。エンドスタチンは、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）試験およびイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）試験で、細胞傷害性および薬剤耐性の発達なく、活性化された血管内皮細胞の増殖の阻害、新血管の形成の阻害、ならびに腫瘍の発生および転移の阻害などの活性を示した(O'Reilly MS et al. Cell 1997; 88:277-285; Boehm T. et al. Nature 1997; 390: 404-407)。続いての研究では、エンドスタチンはまた、リンパ内皮細胞の増殖、遊走およびリンパ管形成の阻害、脂肪細胞分化およびインスリン抵抗性の阻害などを含む様々な生物活性を有することが判明した(Zhuo W et al. J Pathol 2010; 222, 249-260, Wang H et al. Diabetes 2015; 64, 2442-2456)。しかし、これまでのところ、エンドスタチンがＤＮＡ損傷修復経路を調節することを示す報告は無かった。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画と組み合わせてエンドスタチンを使用することによって腫瘍または癌を治療するための方法および薬剤を提供する。本発明の方法および組成物は、Ｐ５３機能の欠損を有する腫瘍もしくは癌、または正常なＰ５３機能を有する腫瘍もしくは癌を治療するために使用することができる。
【０００６】
本発明の１つの態様によれば、エンドスタチンと化学療法薬とを含んでなり、前記化学療法薬がＤＮＡ二本鎖切断を誘導する化学療法薬である、医薬組成物が提供される。
【０００７】
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、薬学上許容される担体をさらに含んでなる。
【０００８】
いくつかの実施形態では、前記化学療法薬は、エトポシドまたはドキソルビシンである。
【０００９】
いくつかの実施形態では、前記医薬組成物は、腫瘍または癌を治療するために使用される。
【００１０】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、Ｐ５３機能を欠損している。
【００１１】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、Ｐ５３機能が正常である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、非小細胞肺癌または黒色腫である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【００１４】
本発明の別の態様によれば、エンドスタチンと化学療法薬とを含み、前記化学療法薬がＤＮＡ二本鎖切断を誘導する化学療法薬である、薬物の組合せが提供される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、前記化学療法薬は、エトポシドまたはドキソルビシンである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、前記薬物の組合せは、腫瘍または癌を治療するために使用される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、Ｐ５３機能を欠損している。
【００１８】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、Ｐ５３機能が正常である。
【００１９】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、非小細胞肺癌または黒色腫である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンと化学療法薬は、同時にまたは逐次に投与すされる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【００２２】
本発明の別の態様によれば、ａ）エンドスタチンまたはエンドスタチンを含有する医薬組成物である第１の薬剤と；ｂ）化学療法薬である第２の薬剤（ここで、前記化学療法薬は、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導する化学療法薬である）とを含んでなるキットが提供される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、前記化学療法薬は、エトポシドまたはドキソルビシンである。
【００２４】
いくつかの実施形態では、前記キットは、腫瘍または癌を治療するために使用される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、Ｐ５３機能を欠損している。
【００２６】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、Ｐ５３機能が正常である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、非小細胞肺癌または黒色腫である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、  ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画に対して細胞の感受性を増強するための方法が提供され、前記細胞をエンドスタチンと接触させる工程を含んでなり、前記細胞はＰ５３機能を欠損している。
【００３０】
いくつかの実施形態では、前記細胞は、腫瘍細胞または癌細胞である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍細胞または癌細胞は、非小細胞肺癌細胞または黒色腫細胞である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、前記方法は、イン・ビボまたはイン・ビトロで行われる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、前記細胞をエンドスタチンと接触させる工程は、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画と同時にまたは逐次に行われる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、前記細胞は、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の前にエンドスタチンと接触される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、前記細胞は、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の後にエンドスタチンと接触される。
【００３６】
いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画は、放射線療法および／または化学療法薬の投与である。
【００３７】
いくつかの実施形態では、前記化学療法薬は、エトポシドまたはドキソルビシンである。
【００３８】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【００３９】
本発明の別の態様によれば、腫瘍または癌の治療のための、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画との併用薬の製造におけるエンドスタチンの使用が提供される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、Ｐ５３機能を欠損している。
【００４１】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、Ｐ５３機能が正常である。
【００４２】
いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の治療用量は、単独で使用される場合の治療計画の治療用量よりも少ない。
【００４３】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、非小細胞肺癌または黒色腫である。
【００４４】
いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画は、放射線療法および／または化学療法薬である。
【００４５】
いくつかの実施形態では、前記化学療法薬は、エトポシドまたはドキソルビシンである。
【００４６】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【００４７】
本発明の別の態様によれば、
対象において腫瘍または癌を治療する方法であって、
ａ）対象においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画を行うこと；および
ｂ）前記対象にエンドスタチンを投与すること
を含んでなる方法が提供される。
【００４８】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、Ｐ５３機能を欠損している。
【００４９】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、Ｐ５３機能が正常である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の治療用量は、単独で使用される場合の治療計画の治療用量おりも少ない。
【００５１】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、非小細胞肺癌または黒色腫である。
【００５２】
いくつかの実施形態では、前記の細胞をエンドスタチンと接触させる工程は、前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画と同時にまたは逐次に行われる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、エンドスタチンは、前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の前に前記対象に投与される。
【００５４】
いくつかの実施形態では、エンドセリンは、前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の後に前記対象に投与される。
【００５５】
いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画は、放射線療法および／または化学療法薬である。
【００５６】
いくつかの実施形態では、前記化学療法薬は、エトポシドまたはドキソルビシンである。
【００５７】
いくつかの実施形態では、前記対象はヒトである。
【００５８】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【００５９】
本発明の別の態様によれば、アポトーシスを誘導するための方法であって、
ａ）細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導すること；および
ｂ）前記細胞をエンドスタチンと接触させること
を含んでなる方法が提供される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、前記細胞は、腫瘍細胞または癌細胞である。
【００６１】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍細胞または癌細胞は、Ｐ５３機能を欠損している。
【００６２】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍細胞または癌細胞は、Ｐ５３機能が正常である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導する工程において適用される用量は、その治療計画が単独で使用される場合に適用される用量よりも少ない。
【００６４】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、非小細胞肺癌または黒色腫である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導する工程は、前記細胞をエンドスタチンと接触させる工程と同時にまたは逐次に行われる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、前記細胞は、前記細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導する前にエンドスタチンと接触される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、前記細胞は、前記細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導した後にエンドスタチンと接触される。
【００６８】
いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ二本鎖切断は、前記細胞に照射を行うことまたは前記細胞を化学療法薬と接触させることにより誘導される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、前記化学療法薬は、エトポシドまたはドキソルビシンである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、前記方法は、イン・ビトロまたはイン・ビボで行われる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【００７２】
本発明の別の態様によれば、アポトーシスを誘導するための薬剤の製造におけるエンドスタチンの使用が提供され、前記細胞はＤＮＡ二本鎖切断を生じさせられる。
【００７３】
いくつかの実施形態では、前記細胞は、腫瘍細胞または癌細胞である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍細胞または癌細胞は、Ｐ５３機能を欠損している。
【００７５】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍細胞または癌細胞は、Ｐ５３機能が正常である。
【００７６】
いくつかの実施形態では、前記腫瘍または癌は、非小細胞肺癌または黒色腫である。
【００７７】
いくつかの実施形態では、前記細胞は、放射線照射または化学療法薬への曝露によりＤＮＡ二本鎖切断を生じさせられる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、前記化学療法薬は、エトポシドまたはドキソルビシンである。
【００７９】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【００８０】
本発明の別の態様によれば、生体サンプルにおいてＤＮＡ−ＰＫｃｓ活性を阻害する方法であって、前記生体サンプルをエンドスタチンと接触させることを含んでなる方法が提供される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨを付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】図１Ａ：クーマシーブルー染色は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出した場合、腫瘍細胞においてエンドスタチン結合タンパク質を示した。ＣＮＢｒは、臭化水素活性化アガロースゲル４Ｂアフィニティー媒体を表す。図１Ｂ：免疫ブロットアッセイにより検出される、腫瘍細胞におけるエンドスタチン結合タンパク質。図１Ｃ：共免疫沈降アッセイにより検出される、腫瘍細胞におけるエンドスタチンとＤＮＡ−ＰＫｃｓの相互作用。
【図２】図２Ａ：免疫ブロットアッセイは、エンドスタチンが、化学療法薬により誘導されるＨ１２９９細胞におけるＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路の活性化を阻害したことを示した。図２Ｂ：免疫ブロットアッセイは、エンドスタチンが、化学療法薬により誘導されるＡ５４９細胞におけるＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路の活性化を阻害したことを示した。
【図３】図３Ａ：免疫ブロットアッセイは、エンドスタチンが、Ｈ１２９９細胞においてＤＮＡ−ＰＫｃｓにより媒介されるＤＮＡ損傷の修復を遅延させたことを示した。図３Ｂ：免疫ブロットアッセイは、エンドスタチンが、Ａ５４９細胞においてＤＮＡ−ＰＫｃｓにより媒介されるＤＮＡ損傷の修復を遅延させたことを示した。
【図４】図４Ａ：エトポシドと共同したエンドスタチンはＨ１２９９細胞のアポトーシスを促進し、これはＤＮＡ−ＰＫｃｓの存在に依存した。＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す；ｎｓは、有意差無し。図４Ｂ：エトポシドと共同したエンドスタチンはＡ５４９細胞のアポトーシスを促進し、これはＤＮＡ−ＰＫｃｓの存在に依存した。＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す；ｎｓは、有意差無し。
【図５】図５Ａ：エトポシドと共同したエンドスタチンは、Ｈ１２９９−ＮＣ細胞の活性を阻害した。＊は、Ｐ＜０．０５を表し；＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す。図５Ｂ：エンドスタチンは、Ｈ１２９９−Ｐ５３細胞の活性に対するエトポシドの阻害効果を増強できない。図５Ｃ：エンドスタチンは、Ａ５４９−ＮＣ細胞の活性に対するエトポシドの阻害効果を増強できない。図５Ｄ：エトポシドと共同したエンドスタチンは、Ａ５４９−ｓｈＰ５３細胞の活性を阻害した。＊は、Ｐ＜０．０５を表し；＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す。
【図６】図６Ａ：エトポシドと共同したエンドスタチンは、Ｈ１２９９−ＮＣ細胞の生存を阻害した。＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す。図６Ｂ：エンドスタチンは、Ｈ１２９９−Ｐ５３細胞の生存に対するエトポシドの阻害効果を増強できない。ｎｓは、有意差無し。図６Ｃ：エンドスタチンは、Ａ５４９−ＮＣ細胞の生存に対するエトポシドの阻害効果を増強できない。ｎｓは、有意差無し。図６Ｄ：エトポシドと共同したエンドスタチンは、Ａ５４９−ｓｈＰ５３細胞の生存を阻害した。＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す。
【図７】図７Ａ：エトポシドと共同したエンドスタチンは、Ｈ１２９９−ＮＣ細胞のアポトーシスを促進した。＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す。図７Ｂ：エンドスタチンは、Ｈ１２９９−Ｐ５３細胞のアポトーシスを促進するようにエトポシドを増強できない。ｎｓは、有意差無し。図７Ｃ：エンドスタチンは、Ａ５４９−ＮＣ細胞のアポトーシスを促進するようにエトポシドを増強できない。ｎｓは、有意差無し。図７Ｄ：エトポシドと共同したエンドスタチンは、Ａ５４９−ｓｈＰ５３細胞のアポトーシスを阻害した。＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す。
【図８】図８Ａ：ドキソルビシンと共同したエンドスタチンは、Ｈ１２９９−ＮＣ細胞の活性を阻害した。＊は、Ｐ＜０．０５を表し；＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す。図８Ｂ：エンドスタチンは、Ｈ１２９９−Ｐ５３細胞の活性に対するドキソルビシンの阻害効果を増強できない。図８Ｃ：エンドスタチンは、Ａ５４９−ＮＣ細胞の活性に対するドキソルビシンの阻害効果を増強できない。図８Ｄ：ドキソルビシンと共同したエンドスタチンは、Ａ５４９−ｓｈＰ５３細胞の活性を阻害した。＊は、Ｐ＜０．０５を表し；＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す。
【図９】図９Ａ：エトポシドと共同したエンドスタチンは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞の活性を阻害した。＊は、Ｐ＜０．０５を表し；＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す。図９Ｂ：エンドスタチンは、Ａ３７５細胞の活性に対するエトポシドの阻害効果を増強できない。
【図１０】図１０Ａ：免疫ブロットアッセイは、エンドスタチンが、Ｈ１２９９−ＮＣ細胞において、ＤＮＡ−ＰＫｃｓによる細胞損傷の修復を阻害し、アポトーシス経路の活性化およびＤＮＡ−ＰＫｃｓの分解を促進したことを示した。図１０Ｂ：免疫ブロットアッセイは、エンドスタチンが、Ｈ１２９９−Ｐ５３細胞において、エトポシドにより誘導されたＤＮＡ損傷、アポトーシス経路の活性化、およびＤＮＡ−ＰＫｃｓの分解に効果を及ぼさなかったことを示した。図１０Ｃ：免疫ブロットアッセイは、エンドスタチンが、Ａ５４９−ＮＣ細胞において、エトポシドにより誘導されたＤＮＡ損傷、アポトーシス経路の活性化、およびＤＮＡ−ＰＫｃｓの分解に効果を及ぼさなかったことを示した。図１０Ｄ：免疫ブロットアッセイは、エンドスタチンが、Ａ５４９−ｓｈＰ５３細胞において、ＤＮＡ−ＰＫｃｓによる細胞損傷の修復を阻害し、アポトーシス経路の活性化およびＤＮＡ−ＰＫｃｓの分解を促進したことを示した。
【図１１】図１１Ａ：エトポシドと共同したエンドスタチンは、Ｈ１２９９−ＮＣ細胞において、アポトーシス誘導分子ＢＡＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、Ｐ２１のｍＲＮＡ発現レベルを上方調節した。＊は、Ｐ＜０．０５を表し；＊＊は、Ｐ＜０．０１を表し；＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す。図１１Ｂ：エンドスタチンは、Ｈ１２９９−Ｐ５３細胞において、エトポシドにより上方調節されたアポトーシス誘導分子ＢＡＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、Ｐ２１のｍＲＮＡ発現レベルに効果を及ぼさなかった。ｎｓは、有意差無し。図１１Ｃ：エンドスタチンは、Ａ５４９−ＮＣ細胞において、エトポシドにより上方調節されたアポトーシス誘導分子ＢＡＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、Ｐ２１のｍＲＮＡ発現レベルに効果を及ぼさなかった。ｎｓは、有意差無し。図１１Ｄ：エトポシドと共同したエンドスタチンは、Ａ５４９−ｓｈＰ５３細胞において、アポトーシス誘導分子ＢＡＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、Ｐ２１のｍＲＮＡ発現レベルを上方調節した。＊は、Ｐ＜０．０５を表し；＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す。
【図１２】図１２Ａ：エンドスタチンは、Ｈ１２９９−ＮＣ腫瘍増殖に対するエトポシドの阻害効果を増強した。＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す。図１２Ｂ：エンドスタチンは、Ｈ１２９９−Ｐ５３腫瘍増殖に対するエトポシドの阻害効果を増強できない。ｎｓは、有意差無し。図１２Ｃ：エンドスタチンは、Ａ５４９−ＮＣ腫瘍増殖に対するエトポシドの阻害効果を増強できない。ｎｓは、有意差無し。図１２Ｄ：エンドスタチンは、Ａ５４９−ｓｈＰ５３腫瘍増殖に対するエトポシドの阻害効果を増強した。＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す。
【図１３】図１３Ａ：エンドスタチンとエトポシドの併用は、Ｈ１２９９担癌マウスの生存期間の延長に共同作用を示した。＊は、Ｐ＜０．０５を表す。図１３Ｂ：エンドスタチンとエトポシドの併用は、エトポシド単独で処置した群では、Ａ５４９担癌マウスの生存期間をさらに延長することができない。ｎｓは、有意差無し。
【図１４】図１４Ａ：免疫蛍光法は、エトポシドと共同したエンドスタチンがＨ１２９９−ＮＣ腫瘍の増殖およびＤＮＡ−ＰＫｃｓの発現レベルを阻害したことを示した。＊は、Ｐ＜０．０５を表し；＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す。図１４Ｂ：免疫蛍光法は、エンドスタチンがＨ１２９９−Ｐ５３腫瘍の増殖およびＤＮＡ−ＰＫｃｓの発現レベルに対するエトポシドの阻害効果を増強できなかったことを示した。ｎｓは、有意差無し。図１４Ｃ：免疫蛍光法は、エンドスタチンが５４９−ＮＣ腫瘍の増殖およびＤＮＡ−ＰＫｃｓの発現レベルに対するエトポシドの阻害効果を増強できなかったことを示した。ｎｓは、有意差無し。図１４Ｄ：免疫蛍光法は、エトポシドと共同したエンドスタチンは、Ａ５４９−ｓｈＰ５３腫瘍の増殖およびＤＮＡ−ＰＫｃｓの発現レベルを阻害したことを示した。＊は、Ｐ＜０．０５を表し；＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す。
【図１５】図１５Ａ：免疫ブロットアッセイは、ＺＢＰ−エンドスタチンおよびＰＥＧ−エンドスタチンが、Ｈ１２９９細胞において、化学療法薬により誘導されたＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路の活性化を阻害したことを示した。図１５Ｂ：免疫ブロットアッセイは、ＺＢＰ−エンドスタチンおよびＰＥＧ−エンドスタチンが、Ａ５４９細胞において、化学療法薬により誘導されたＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路の活性化を阻害したことを示した。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
発明の詳細な説明
本発明において、エンドスタチンは、腫瘍細胞に直接作用し、化学療法薬に対する腫瘍細胞の感受性を調節し得ることが分かる。イン・ビトロ細胞学試験において、エンドスタチンは、Ｐ５３欠損腫瘍細胞の活性および細胞コロニー形成能に対する化学療法薬の阻害効果を有意に増強し、かつ、化学療法薬により引き起こされる腫瘍細胞のアポトーシスを促進し得ることが分かる。一方、マウス異種移植腫瘍モデルでは、エンドスタチンは、Ｐ５３欠損非小細胞肺癌異種移植片に対する化学療法薬の増殖阻害効果を有意に増強し、担癌マウスの生存を延長し得る。
【００８４】
本発明において、エンドスタチンが化学療法に対する腫瘍細胞の感受性を調節する機構を、腫瘍細胞においてエンドスタチンと相互作用するタンパク質をスクリーニングすることにより探究するために、エンドスタチンがＤＮＡ−ＰＫｃｓと特異的に相互作用し得ることが判明した。ＤＮＡ−ＰＫｃｓは、哺乳動物細胞の非相同末端結合経路における重要なタンパク質であり、細胞におけるＤＮＡ二本鎖切断の修復に関与する。エンドスタチンとＤＮＡ−ＰＫｃｓの間の相互作用は、その活性を阻害し、さらにＤＮＡ損傷の修復も阻害し得る。Ｐ５３欠損腫瘍細胞は、化学療法薬に対して耐性を示し、細胞の生存は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓにより媒介されるＤＮＡ修復プロセスに依存する。こうした状況のもと、エンドスタチンは、ＤＮＡ−ＰＫｃｓの活性を阻害することによって細胞内にＤＮＡ損傷の蓄積を招き、次いで、アポトーシスを誘導し、化学療法薬の治療効果を増強する。正常なＰ５３機能を有する細胞は、化学療法薬により感受性が大きい。Ｐ５３は、化学療法薬単独の処置下で、カスパーゼ−３により媒介されるアポトーシスを活性化し、カスパーゼ−３の基質としてのＤＮＡ−ＰＫｃｓは、この過程でまた切断されて量が減る。従って、ＤＮＡ−ＰＫｃｓを阻害するためにエンドスタチンを使用する効果は決めて限定される。
【００８５】
Ｐ５３欠損腫瘍細胞におけるエンドスタチンの作用機序は、次のように理解することができる。Ｐ５３はカスパーゼファミリータンパク質を活性化することができ、一連の下流標的遺伝子を調節することによって腫瘍細胞のアポトーシスを引き起こすことができるので、Ｐ５３欠損腫瘍細胞は、より高いアポトーシス閾値を有し、エトポシドなどのＤＮＡ損傷誘導剤による刺激があれば、ＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路は活性化され、非相同末端結合経路を介してＤＮＡ損傷の修復を媒介する。このような場合、エンドスタチンは、ＤＮＡ−ＰＫｃｓと直接結合してその活性を阻害し、細胞においてＤＮＡ損傷の蓄積を引き起こすことができ、これらの細胞はＤＮＡ修復からアポトーシスへと進行する。この時、カスパーゼ経路の活性化は次にＤＮＡ−ＰＫｃｓの分解をもたらし、さらにＤＮＡ修復を遮断し、細胞死を促進する。これに対し、ＤＮＡ損傷の際に、正常なＰ５３機能を有する腫瘍細胞は、より低いアポトーシス閾値を有し、Ｐ５３は、アポトーシス関連エフェクターの活性化を誘発する。このような場合、アポトーシスの初期段階では、ＤＮＡ−ＰＫｃｓは、Ｐ５３経路により活性化されたカスパーゼ−３によって分解され、これがさらにＤＮＡ修復を減弱する。従って、Ｐ５３シグナル経路はそれ自体、フィードバック調節ループを形成し得る。正常なＰ５３機能を有する腫瘍細胞では、エンドセリンをＤＮＡ−ＰＫｃｓ標的化することによる化学療法感受性の増強効果は理想的でない。
【００８６】
よって、本発明は、エンドスタチンがＤＮＡ−ＰＫｃｓに直接結合してその活性を阻害し得る、すなわち、エンドスタチンはＤＮＡ−ＰＫｃｓの阻害剤であるという発見に本質的に基づく。Ｐ５３欠損細胞の場合、いずれかの治療方法（例えば、化学療法薬または放射線療法）によりＤＮＡ損傷が誘導されると、エンドスタチンは上記の機構を介して細胞のアポトーシスを促進し、それにより、その治療方法に対する細胞の感受性を増強することができる。正常なＰ５３機能を有する細胞であっても、エンドスタチンの使用は、化学療法薬の用量または放射線療法の線量を低減し得る。この時、細胞のＤＮＡ損傷は化学療法薬の用量または放射線療法の線量の低減のために低減されるが、エンドスタチンは、ＤＮＡ−ＰＫｃｓの活性を阻害し、それにより、細胞内のＤＮＡ損傷の蓄積を促進し、アポトーシスを促進し得る。従って、化学療法薬の用量または放射線療法の線量が低減されても元の用量の効果がなお達成され、それにより、化学療法薬または放射線療法の副作用が軽減され、そのコンプライアンスも改善される。
【００８７】
本明細書に記載する「エンドスタチン（ＥＳ）」は、その最も広い意味を有し、イン・ビボにおいて血管内皮細胞の増殖、遊走および血管新生を阻害する活性などの天然のエンドスタチン活性を有する様々なタンパク質を含む。
【００８８】
本明細書に記載する「エンドスタチン」は、天然エンドスタチン、好ましくは、天然ヒトエンドスタチンであり得るが、これに限定されない。例えば、エンドスタチンは、マウス、ラット、ブタ、イヌ、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ネコなどの他の哺乳動物由来の天然エンドスタチンであってもよい。エンドスタチンは、天然源から精製されてもよいし、または組換えタンパク質であってもよい。
【００８９】
本発明で使用される天然ヒトエンドスタチンの配列は、例えば、下記であり得る。
【化１】
2020528457.tif 000002
配列中、Ｎ末端のＭｅｔは、大腸菌(E. coli)により発現される場合、部分的に欠失されていることがある。
【００９０】
本明細書に記載する「エンドスタチン」は、天然エンドスタチンに比べて１または複数のアミノ酸の置換、欠失または付加を有する、天然エンドスタチンの機能的変異体、例えば、操作された機能的変異体であってもよく、血管内皮細胞の増殖、遊走およびイン・ビボ血管新生を阻害する活性など、基本的に同じ生体機能を有する。
【００９１】
本明細書において、用語「機能的変異体」は、アミノ酸配列内に１以上の（例えば、１〜５、１〜１０、または１〜１５、特に、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれを超える）アミノ酸の置換、欠失または付加を含むエンドスタチンの変異株を含み、これらの変異株は、血管内皮細胞の増殖、遊走およびイン・ビボ血管新生を阻害するエンドスタチンの活性と同等の生物活性を有する。エンドスタチンの「機能的変異体」の生物活性は、天然エンドスタチン、例えば、天然ヒトエンドスタチンの活性の、例えば、３０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上または９０％以上であり得る。「機能的変異体」は、天然変異株または人工変異株、例えば、部位特異的突然変異誘発により得られた突然変異体、または遺伝子組換え法により作出された突然変異体であり得る。
【００９２】
「機能的変異体」の生物活性は、エンドスタチン活性を検出するために当技術分野で周知の方法によって検出することができる。例えば、ＨＭＥＣ細胞を選択することができ、機能的変異体によるＨＭＥＣ細胞遊走の阻害率が遊走（トランスウェルアッセイ）法を用いて分析され、タンパク質活性を表すために細胞数が計数される（Luo yongzhang et al., Endostatin inhibits tumourlymphangiogenesis and lymphatic metastasis via cell surface nucleolin on lymphangiogenic endothelial cells (J Pathol 2010; 222: 249-260)参照）。
【００９３】
本発明のいくつかの実施形態では、「エンドスタチン」は、可溶性発現を増し、精製を容易にするために、天然ヒトＥＳのＮ末端に９個の付加的アミノ酸（ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ）を付加することにより得られたＥＳ変異体であるＺＢＰ−エンドスタチン（商標Ｅｎｄｏｓｔａｒ）などの天然ヒトエンドスタチンの機能的変異体であり得る。ＺＢＰ−エンドスタチンのアミノ酸配列は下記である。
【化２】
2020528457.tif 000003
配列中、Ｎ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある。
【００９４】
エンドスタチン機能的変異体の他の例としては、ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１２／０８１２１０に開示されているエンドスタチン突然変異体、例えば、ＥＳ００６、ＥＳ００８、ＥＳ０１１、Ｓ０２、Ｓ０９、Ｚ００６、Ｚ００８、ＺＮ１などが含まれる（これらは総て、それらの全内容が引用することにより本明細書の一部とされる）。
【００９５】
本明細書に記載する「エンドスタチン」はまた、血管内皮細胞の増殖、遊走およびイン・ビボ血管新生を阻害する活性など、天然エンドスタチンと実質的に同じ生体機能を有する、天然エンドスタチンまたはその機能的変異体の誘導体または修飾生成物（例えば、ポリエチレングリコール修飾生成物）であってもよい。
【００９６】
本発明のいくつかの実施形態では、「エンドスタチン」は、天然ヒトエンドスタチンの誘導体、例えば、分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）による天然ヒトＥＳの修飾から得られた生成物であってよく、その結合部位は、活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基とＮ末端α−アミノである。
【００９７】
「ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニット（ＤＮＡ−ＰＫｃｓ）」は、本明細書に記載する場合、ＤＮＡ−ＰＫ複合体の触媒サブユニットであり、ホスファチジルイノシトール−３−キナーゼ様キナーゼファミリー（ＰＩＫＫ）のメンバーであり、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復に中枢的役割を果たす。
【００９８】
「ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画」は、本明細書に記載する場合、治療計画が最終的にＤＮＡ二本鎖切断を生じ得る限り、いずれの形態の治療計画であってもよい。治療計画は、例えば、ＤＮＡに二本鎖切断を直接引き起こす治療計画であってよい。治療計画はまた、例えば、ＤＮＡに一本鎖切断を引き起こし、それにより、最終的にＤＮＡに二本鎖切断をもたらす治療計画であってもよい。治療計画はまた、例えば、染色体損傷を引き起こし、それにより、最終的にＤＮＡ二本鎖切断をもたらす治療計画であってもよい。治療計画はまた、例えば、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害により、ＤＮＡ二本鎖切断を引き起こす治療計画であってもよい。治療計画は、放射線療法または化学療法薬であってよく、１つの化学療法薬またはより多くの異なる化学療法薬の組合せであってよく、あるいは１以上の化学療法薬および放射線療法の併用治療計画であってもよい。
【００９９】
ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための放射線療法計画は、当技術分野で周知である。放射線療法は、限定されるものではないが、電磁放射線または電離放射線を含むいずれの好適な技術によって行うこともできる。電磁放射線は、例えば、Ｘ線、γ線であってよく、電離放射線は、例えば、電子ビームなどであってよい。放射線療法の線量測定も当技術分野で周知である。
【０１００】
本明細書に記載する用語「化学療法薬」は、腫瘍または癌に対して治療効果を有する化合物を指す。本発明で使用可能な化学療法薬は、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導し得る化学療法薬である。例えば、その化学療法薬は、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤、アルキル化剤、白金錯体、ブレオマイシン、またはドキソルビシン、例えば、限定されるものではないが、エトポシドまたはドキソルビシンであり得る。
【０１０１】
本発明において、エンドスタチンは、腫瘍または癌を治療するためにＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画と併用可能である。腫瘍または癌は、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画による処置に好適な腫瘍または癌である。
【０１０２】
本明細書に記載する「ｐ５３」は、Ｐ５３と呼ばれる分子量５３ｋＤａのタンパク質をコードする腫瘍抑制因子遺伝子である。正常なＰ５３の生体機能は、「ゲノムの守護神」の機能と同様であり、Ｇ１期にＤＮＡ損傷部位をチェックし、ゲノムの完全性を監視する。損傷があれば、Ｐ５３タンパク質は、損傷したＤＮＡが修復するために十分な時間を与えるためにＤＮＡ複製を妨げる。修復が上手くいかなければ、Ｐ５３タンパク質はアポトーシスを誘導する。２コピーのｐ５３遺伝子が変異し、これによりＰ５３タンパク質がその正常な機能が失われれば、細胞の増殖は制御を欠くようになり、これらの細胞は癌化する。
【０１０３】
本明細書に記載の薬剤または治療計画を用いて治療可能な腫瘍または癌は、Ｐ５３機能が欠損していてもよい。Ｐ５３機能が欠損した腫瘍または癌には、一部の細胞または総ての細胞にＰ５３機能が欠損した腫瘍または癌が含まれる。Ｐ５３機能が欠損した細胞は、Ｐ５３機能が完全に欠損した細胞または細胞Ｐ５３機能が部分的に欠損した細胞であり得る。Ｐ５３機能の完全な欠損は、例えば、Ｐ５３が野生型である細胞に比べてのＰ５３の生体機能の完全な欠損であり得る。Ｐ５３機能の部分的欠損は、例えば、Ｐ５３が野生型である細胞に比べてのＰ５３の生体機能の部分的欠損または減弱であり得る。Ｐ５３機能が欠損した細胞は、例えば、正常細胞に比べてＰ５３タンパク質の発現および／または活性の低下または混乱を示してもよく、これは、例えば、そのコード核酸の突然変異によるか、またはそのレギュレーターをコードする核酸の突然変異により生じ得る。Ｐ５３タンパク質の発現および／または活性の低下または混乱は、Ｐ５３タンパク質の不在、Ｐ５３タンパク質の完全な不活性化、Ｐ５３タンパク質量の減少、またはＰ５３タンパク質機能の低下として現れ得る。「突然変異」とは、１以上のヌクレオチドの挿入、欠失または置換を含み得る。
【０１０４】
Ｐ５３機能が完全に欠損した細胞では、細胞は放射線療法または化学療法薬に感受性がない。これは、放射線療法または化学療法薬は細胞においてＤＮＡ損傷を引き起こし、これがＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路を活性化し、非相同末端結合経路を介してＤＮＡ損傷修復を媒介するが、Ｐ５３機能の損失のために、カスパーゼは容易には活性化されないからである。ＤＮＡ−ＰＫｃｓの存在下では、損傷は時間内に修復可能であり、これにより細胞はある程度治療計画に耐性となり、容易にはアポトーシスに至らない。エンドスタチンは、ＤＮＡ−ＰＫｃｓの活性を阻害し、細胞内のＤＮＡ損傷の蓄積を促進し、アポトーシスを促進し得る。従って、Ｐ５３機能が欠損した細胞、特に、腫瘍細胞または癌細胞では、放射線療法または化学療法薬などのＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画で処置される場合、エンドスタチンは、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画に対するこれらの細胞の感受性を増強し、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の治療効果を促進し得る。
【０１０５】
Ｐ５３機能の欠損がない（すなわち、Ｐ５３機能が正常に機能する）細胞では、これらの細胞は、放射線療法または化学療法薬により感受性が高い。アポトーシスの初期段階では、ＤＮＡ−ＰＫｃｓは、Ｐ５３経路により活性化されたカスパーゼ−３により分解され、エンドスタチンはその感受性を有意に高めることはない。しかしながら、エンドスタチンはＤＮＡ−ＰＫｃｓ活性を阻害し得るので、エンドスタチンの使用は、放射線療法または化学療法薬などのＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の用量を低減し得る。「ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の用量を低減する」とは、単独で使用されるＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の用量と比較した際に、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の用量が、エンドスタチンと併用される場合に少なくなり得るが、同じ治療効果を達成し得ることを指す。言い換えれば、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画がエンドスタチンと併用される場合に、適用されるその用量は、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画が単独で使用される場合に通常適用される用量を超えない。
【０１０６】
ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画が放射線療法である場合、用量は放射線量を指す。放射線療法が単独で行われる場合に通常適用される用量は、例えば、１〜１００Ｇｙであり得る。放射線療法がエンドスタチンと併用される場合、放射線量は、その放射線療法が単独で適用される場合の線量に比べて１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらには９０％低減され得る。
【０１０７】
ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画が化学療法薬である場合、用量は、化学療法薬の投与量を指す。化学療法薬がエンドスタチンと併用される場合、化学療法薬の用量は、その化学療法薬が単独投与される場合の用量に比べて１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらには９０％低減され得る。
【０１０８】
Ｐ５３機能が部分的に欠損した細胞では、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画で処置される場合、血管内皮阻害が上記効果の両方を有する可能性があり、これはＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画に対するこれらの細胞の感受性を高め、そのＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の治療効果を促進し得るだけでなく、そのＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の用量も低減し得る。
【０１０９】
本発明の医薬組成物、組合せ薬物もしくはキットにおけるエンドスタチンの量、または本発明の使用もしくは方法におけるエンドスタチンの量は、腫瘍細胞においてＤＮＡ−ＰＫｃｓを有効に阻害し得る量である。
【０１１０】
本明細書に記載の腫瘍には、良性および悪性腫瘍が含まれ、腫瘍細胞の倍加とは、制御を欠いた、また進行性の組織学的細胞増殖を指す。これらの増殖のあるものは良性であるが、またあるものは「悪性」であり、生物の死をもたらし得る。侵襲性の細胞増殖の顕在化に加え、悪性腫瘍は周囲の組織に浸潤し、転移する。本明細書に記載の癌には一般に、悪性固形腫瘍、ならびに白血病、リンパ腫、および通常腫瘍塊としては存在しないが血管またはリンパ細網系に分布するその他の癌が含まれる。
【０１１１】
本発明の治療計画を使用することによる腫瘍または癌の治療は、アポトーシスを誘導することにより達成される。従って、腫瘍または癌に対する本発明の治療計画の治療効果は、腫瘍細胞または癌細胞の起源と密接な関連があるわけではなく、細胞の分子タイピングに関連する。例えば、本発明の方法による治療に好適な腫瘍または癌は、Ｐ５３欠損であり得る。本発明の治療計画で治療可能な腫瘍または癌としては、限定されるものではないが、固形腫瘍／悪性腫瘍、粘液性および円形細胞癌、局所進行腫瘍、転移性癌、ヒト軟組織肉腫（ユーイング肉腫を含む）、癌転移（リンパ転移を含む）、扁平上皮癌（特に、頭頸部扁平上皮癌、食道扁平上皮癌）、口腔癌、血液性悪性腫瘍（多発性骨髄腫を含む）、白血病（急性リンパ球性白血病、急性非リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、および有毛細胞白血病を含む）、滲出性リンパ腫（体腔性リンパ腫）、胸腺リンパ腫、肺癌（小細胞癌を含む）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、副腎皮質癌、ＡＣＴＨ産生腫瘍、非小細胞肺癌、乳癌（小細胞および乳管癌を含む）、消化器癌（胃癌、結腸癌、結腸直腸癌を含む）、結腸直腸腫瘍形成を伴うポリープ、膵臓癌、肝臓癌、泌尿器癌（原発性表在性膀胱腫瘍、膀胱の浸潤性移行上皮癌および筋層浸潤性膀胱癌を含む膀胱癌を含む）、前立腺癌、女性生殖管の悪性腫瘍（卵巣癌、原発性腹膜上皮細胞腫瘍、子宮頸癌、子宮内膜癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、および濾胞性固形癌を含む）、男性生殖管の悪性腫瘍（精巣癌および陰茎癌を含む）、腎臓癌（腎細胞癌を含む）、脳癌（内因性脳腫瘍、神経芽腫、星状細胞系脳腫瘍、神経膠腫、中枢神経系における転移性腫瘍細胞浸潤を含む）、骨癌（骨腫および骨肉腫を含む）、皮膚癌（黒色腫、ヒト皮膚ケラチノサイトの進行性腫瘍、扁平上皮癌を含む）、甲状腺癌、網膜芽細胞腫、神経芽腫、腹膜漏出、悪性胸膜漏出、中皮腫、ビルムス腫瘍、胆嚢癌、栄養膜腫瘍、血管外皮腫、およびカポジ肉腫が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明の治療計画は、非小細胞肺癌または黒色腫を治療するために好適である。
【０１１２】
本発明に記載の「治療」または「治療効果」には、例えば、腫瘍細胞または癌細胞の増殖、浸潤もしくは転移の阻害もしくは軽減など、または症状の軽減、生存期間の延長などが含まれる。
【０１１３】
本明細書に記載の対象は、限定されるものではないが、脊椎動物、哺乳動物、齧歯類（例えば、ハムスター、ラット、マウス）、イヌ科（例えば、イヌ）、ネコ科（例えば、ネコ）、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、霊長類（例えば、チンパンジー、類人猿もしくはサル）、またはヒトを含み得る。本明細書に記載の細胞には、限定されるものではないが、脊椎動物、哺乳動物、齧歯類（例えば、ハムスター、ラット、マウス）、イヌ科（例えば、イヌ）、ネコ科（例えば、ネコ）、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、霊長類（例えば、チンパンジー、類人猿もしくはサル）、またはヒトの細胞を含み得る。
【０１１４】
本発明において、エンドスタチンおよびＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の投与は、同時にまたは逐次に行うことができる。逐次に行う場合、まずエンドスタチンを投与し、次いで、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画を行うこともできるし、またはまずＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画を行い、次いで、エンドスタチンを投与することもできる。
【０１１５】
本発明はまた、生体サンプルにおいてＤＮＡ−ＰＫｃｓ活性を阻害する方法であって、前記生体サンプルをエンドスタチンと接触させることを含んでなる方法を提供する。本明細書に記載の「生体サンプル」とは、限定されるものではないが、細胞培養物またはその抽出物；哺乳動物から得られた生検材料またはその抽出物；および血液、唾液、尿、糞便、精液、涙もしくはその他の体液またはそれらの抽出物を含む生きている生物のイン・ビトロサンプルを指す。生体サンプルにおけるＤＮＡ−ＰＫｃｓ活性の阻害は、当業者に知られた様々な目的のために使用可能である。例としては、限定されるものではないが、バイオアッセイにおけるＤＮＡ−ＰＫｃｓの阻害が挙げられる。一実施形態では、生体サンプルにおいてＤＮＡ−ＰＫｃｓ活性を阻害する方法は、非治療的方法に限定される。
【０１１６】
本明細書において、用語「薬学上許容される担体」とは、固体または液体希釈剤、増量剤、酸化防止剤、および安定剤など、安全に投与可能な物質を指す。投与経路に応じて、限定されるものではないが、糖類、デンプン、セルロースおよびそれらの誘導体、マルトース、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸バッファー、乳化剤、等張性生理食塩水、および／または発熱性物質除去水を含む、当技術分野で周知の様々な異なる担体が投与可能である。
【０１１７】
本明細書において、用語「薬物の組合せ」または「組合せ」は、併用される種々の薬物または治療計画の種々の特定の組合せを含む。例えば、異なる薬物が併用される場合、併用される種々の薬物は、混合物もしくは複合体の形態で存在してもよいし、またはそれぞれ別個の実体中に存在し、同時にもしくは逐次に対象に投与されてもよい。薬物と非薬物的治療計画が併用される場合には、その薬物と治療計画は同時にまたは逐次に対象に投与可能である。
【０１１８】
本明細書に記載の医薬組成物、エンドスタチン、および／またはＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画は、治療上有効な量で投与することができる。本明細書において、「治療上有効な量」は、対象において臨床家が望む生物学的応答または医学的応答を生じるのに十分な有効化合物の量を指す。本発明において、エンドスタチンの治療上有効な量は、例えば、腫瘍細胞においてＤＮＡ−ＰＫｃｓを有効に阻害し得る量であり得る。本発明において、医薬組成物、エンドスタチン、および／またはＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の「治療上有効な量」は、投与経路、対象の体重、齢、および状態などの因子に従って当業者により決定することができる。例えば、医薬組成物、エンドスタチンおよび／または化学療法薬に関して、典型的な一日用量は有効成分０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲であり得、放射線療法に関して、典型的な一日用量は１〜５Ｇｙの範囲であり得る。
【０１１９】
本発明により提供される薬物は、散剤および注射剤などの臨床上許容される投与形として処方することができる。対象には、本発明の医薬組成物、エンドスタチン、および／または化学療法薬を任意の好適な経路、例えば、経口投与、静脈内注入、筋肉内注射、皮下注射、腹膜下投与、直腸投与、舌下投与、または吸入、経皮投与によって投与可能である。
【０１２０】
本発明で言及した種々の方法はイン・ビボまたはイン・ビトロで実施可能である。
【０１２１】
本発明で言及した種々の方法は、非治療的であってもよい。
【０１２２】
特に断りのない限り、本明細書で使用される科学用語および技術用語は、当業者に一般に理解されている意味を有するものとする。一般に、本明細書に使用される細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、およびタンパク質および核酸化学に関連する命名法および技術は、当技術分野で周知かつ慣用のものである。
【０１２３】
特に断りのない限り、本明細書で使用される方法および技術は一般に、当技術分野で周知かつ慣例の方法に従って、また、本明細書に示されるもしくは引用される種々の参照文献に記載されている様式で実施される。
【実施例】
【０１２４】
以下の実施例では、使用されるエンドスタチンは、Beijing Protgen Biotechnology Development Co., Ltd. (Protgen)からの、大腸菌により発現された組換え天然ヒトエンドスタチンであり、下記のアミノ酸配列を有する。
【化３】
2020528457.tif 000004
配列中、Ｎ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある。
【０１２５】
使用されるＺＢＰ−エンドスタチンは、Beijing Protgen Biotechnology Development Co., Ltd. (Protgen)により提供された、天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸（ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ）を付加することにより得られたエンドスタチン変異体であり(Fu Y et al. Biochemistry 2010, 49, 6420-6429)、そのアミノ酸配列は下記の通りである。
【化４】
2020528457.tif 000005
配列中、Ｎ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある。
【０１２６】
使用されるＰＥＧ−エンドスタチンは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により修飾された天然ヒトエンドスタチン、すなわち、天然ヒトエンドスタチン分子を分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られた産物であり、その結合部位は、活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基とエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である。これはBeijing Protgen Biotechnology Development Co., Ltd. (Protgen)により提供された。
【０１２７】
非小細胞肺癌Ｈ１２９９細胞株（Ｐ５３欠損）、Ａ５４９細胞株（Ｐ５３野生型）、および黒色腫ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞株（Ｐ５３変異型）およびＡ３７５細胞株（Ｐ５３野生型）は、National Experimental Cell Resource Sharing Platform (China Infrastructure of Cell Line Resource)から購入した。Ｐ５３安定過剰発現Ｈ１２９９細胞株（Ｈ１２９９−Ｐ５３）およびＰ５３安定ノックダウンＡ５４９細胞株（Ａ５４９−ＮＣ）は、レンチウイルスキット（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｇｅｎｅｐｈａｒｍａ社から購入）を用いて構築し、この場合、Ａ５４９細胞においてＰ５３をノックダンするために使用したｓｈＲＮＡにより標的化されるＰ５３配列は、５’−ＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣ−３’であった。ウイルストランスフェクションおよび安定細胞株の構築は、キットの説明書に従って行った。Ｈ１２９９−ＮＣおよびＡ５４９−ＮＣは、Ｈ１２９９細胞およびＡ５４９細胞をそれぞれブランクレンチウイルスでトランスフェクトすることにより得られた安定細胞株であった。
【０１２８】
実施例１  エンドスタチンはＤＮＡ−ＰＫｃｓと直接相互作用した
本実施例で使用したＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂは、Ｓｉｇｍａ社から購入した。まず、説明書に従い、エンドスタチンおよびウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をそれぞれＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂに結合させ、Ａ５４９細胞溶解液とともにインキュベートした。プルダウンされたタンパク質に対してＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、クーマシーブルーで染色した。質量分析により、ＤＮＡ−ＰＫｃｓを、エンドスタチンと相互作用したタンパク質として同定した（図１Ａ）。次に、免疫ブロット試験により、Ｈ１２９９細胞およびＡ５４９細胞の両溶解液中のＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質が、エンドスタチンが結合したＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂによって沈降可能であることが実証された（図１Ｂ）。この２者間の相互作用をさらに確認するために、Ｈ１２９９細胞およびＡ５４９細胞を、エンドサイトーシスのためにエンドスタチンとともに２時間インキュベートした。細胞溶解液にＤＮＡ−ＰＫｃｓの抗体を混合した後、プロテインＡ／Ｇビーズと同時インキュベートした。免疫ブロットアッセイにより、エンドスタチンはＤＮＡ−ＰＫｃｓによって共沈降し得ることが確認され、これにより、２者間の相互作用が証明された（図１Ｃ）。
【０１２９】
実施例２  エンドスタチンは腫瘍細胞において化学療法薬により誘導されたＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路の活性化を阻害した
本実施例では、ＤＮＡ−ＰＫｃｓの既知の基質であるＡＫＴおよびＰ５３を、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ経路に対するエンドスタチンの阻害効果を確認するための検出指標として使用した。腫瘍細胞（非小細胞肺癌Ｈ１２９９細胞およびＡ５４９細胞を含む）を６つの処理群に分けた。第１群：陰性対照；第２群：エトポシド（１０μＭ、１時間）処理；第３群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、１時間）処理；第４群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、エトポシドの１時間前に添加）とエトポシド（１０μＭ、１時間）による併用処理；第５群：ＮＵ７０２６（１０μＭ、１時間）処理；第６群：ＮＵ７０２６（１０μＭ、エトポシドの１時間前に添加）とエトポシド（１０μＭ、１時間）による併用処理、なお、ＮＵ７０２６はＤＮＡ−ＰＫｃｓ阻害剤であった。免疫ブロットアッセイ結果（図２、ｐ−ＤＮＡ−ＰＫｃｓ（Ｓ２０５６）は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓのリン酸化レベルを表し、Ｓ２０５６は、そのリン酸化部位を表し；ｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）は、ＡＫＴのリン酸化レベルを表し、Ｓ４７３は、そのリン酸化部位を表し；ｐ−Ｐ５３（Ｓ１５）は、Ｐ５３のリン酸化レベルを表し、Ｓ１５は、そのリン酸化部位を表す）は、対照群に比べて、エトポシド処理は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路のレベルを活性化し；エンドスタチン処理は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路のレベルに影響を及ぼさず；エンドスタチンとエトポシドの組合せは、エトポシドによるＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路の活性化を阻害したことを示した。ＮＵ７０２６処理は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路のレベルに影響を及ぼさず；ＮＵ７０２６とエトポシドの組合せは、エトポシドによるＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路の活性化を阻害した。
【０１３０】
実施例３  エンドスタチンはＤＮＡ−ＰＫｃｓにより媒介されるＤＮＡ損傷修復を遅延させた
本実施例では、ＤＳＢｓ損傷の程度を表すためにγＨ２ＡＸのレベルを使用した。腫瘍細胞（Ｈ１２９９細胞およびＡ５４９細胞を含む）を８つの処理群に分けた。第１群：陰性対照、細胞を０時間で回収した；第２群：細胞をエトポシド（１０μＭ）処理１時間の後に回収した；第３群：エトポシド（１０μＭ）処理１時間後に、それを新鮮培地に置き換え、細胞を２時間後に回収した；第４群、エトポシド（１０μＭ）処理１時間後に、それを新鮮培地に置き換え、細胞を５時間後に回収した；第５〜第８群はまずエンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ）で１時間前処理し、その後、処理はそれぞれ第１〜第４群に相当した。免疫ブロットアッセイ結果は、エトポシド処理細胞によりもたらされたＤＮＡ損傷が第１〜第４群において培地から薬物を除去した後に徐々に修復され、γＨ２ＡＸレベルは５時間にベースラインに戻ったことを示した。第５〜第８群では、エンドスタチンの併用はγＨ２ＡＸレベルの低下を遅延させ、これは細胞におけるＤＳＢｓ損傷の修復が遅延されたことを証明した（図３）。
【０１３１】
実施例４  エンドスタチンはＤＮＡ−ＰＫｃｓの存在に依存して化学療法に対する腫瘍細胞の感受性を調節した
本実施例では、腫瘍細胞（Ｈ１２９９細胞およびＡ５４９細胞を含む）を８つの処理群に分けた。第１〜第４群では、細胞を対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、最後の４群では、細胞を、ＤＮＡ−ＰＫｃｓを特異的にノックダウンしたｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＤＮＡ−ＰＫｃｓのｓｉＲＮＡ配列は：フォワード５’−ＣＡＧＧＧＵＵＵＡＡＵＣＡＧＡＡＵＡＵＴＴ−３’、リバース５’−ＡＵＡＵＵＣＵＧＡＵＵＡＡＡＣＣＣＵＧＴＴ−３’である。ｓｉＲＮＡトランスフェクション法は、トランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００の説明書に従って行った。次に、第８群では、細胞を薬物で処理した。第１群および第４群：対照群；第２群および第５群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、１６時間）処理；第３群および第６群：エトポシド（Ｈ１２９９では１０μＭ、Ａ５４９では１μＭ、１６時間）処理；第４群および第８群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、エトポシドの１時間前に添加）とエトポシド（Ｈ１２９９では１０μＭ、Ａ５４９では１μＭ、１６時間）の併用。細胞を回収し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩアポトーシス検出キットの説明書に従って操作を行った。アポトーシスはフローサイトメトリーにより検出した。Ａ５４９細胞はＰ５３野生型細胞であり、Ｈ１２９９細胞はＰ５３欠損細胞であった。結果は、Ａ５４９細胞は化学療法薬に対する感受性がより高く、同程度のアポトーシスが生じた場合、Ｈ１２９９細胞のエトポシド濃度はＡ５４９細胞のエトポシド濃度よりはるかに高かったことを示した。これに基づけば、エンドスタチンの付加は、エトポシドにより誘導されるアポトーシスをさらに促進すると考えられる（図４）。ＤＮＡ−ＰＫｃｓをノックダウンした後には、このエトポシドにより誘導されるアポトーシス促進におけるエンドスタチンの役割は減弱した。
【０１３２】
実施例５  エトポシドと共同したエンドスタチンはＰ５３欠損腫瘍細胞の活性を阻害した
まず、レンチウイルスキット（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｇｅｎｅｐｈａｒｍａ社から購入）を用いてＰ５３安定過剰発現Ｈ１２９９細胞株（Ｈ１２９９−Ｐ５３）およびＰ５３安定ノックダウンＡ５４９細胞株（Ａ５４９−ＮＣ）を構築した。Ａ５４９細胞においてＰ５３をノックダウンするために使用したｓｈＲＮＡにより標的化されるＰ５３配列は、５’−ＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣ−３’であった。ウイルストランスフェクションおよび安定細胞株の構築はキットの説明書に従って行った。構築された腫瘍細胞（Ｈ１２９９−ＮＣ、Ｈ１２９９−Ｐ５３、Ａ５４９−ＮＣ、Ａ５４９−ｓｈＰ５３）を９６ウェルプレート（１０００細胞／ウェル）に播種し、８つの処理群に分けた。第１群〜第４群では、種々の濃度のエトポシド（０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）を含有する培地を各ウェルに加えた。第５群〜第８群は、まず、１０μｇ／ｍｌのエンドスタチンを含有する培地で１時間前処理し、次に、種々のエトポシド濃度を含有する培地を、第５群〜第８群のエトポシド終濃度がそれぞれ０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭとなるように加えた。１２時間の処理後、薬物含有培地を通常培地に置き換え、細胞をさらに７２時間培養した。細胞活性を、ＣＣＫ８キットの説明書（同仁堂、東京、日本）に従って測定した。結果は、Ｐ５３欠損腫瘍細胞では（図５ＡおよびＤ）、エンドスタチンは腫瘍細胞に対するエトポシドの毒性を増強し得ることを示した。正常なＰ５３機能を有する腫瘍細胞では（図５ＢおよびＣ）、エトポシドは、腫瘍細胞の活性を有意に阻害することができ、エンドスタチンは、エトポシドの阻害効果を有意には増強しなかった。
【０１３３】
実施例６  エトポシドと共同したエンドスタチンはＰ５３欠損腫瘍細胞の生存を阻害した
腫瘍細胞（Ｈ１２９９−ＮＣ、Ｈ１２９９−Ｐ５３、Ａ５４９−ＮＣ、Ａ５４９−ｓｈＰ５３）を４つの処理群に分けた。第１群：陰性対照；第２群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、１６時間）処理；第３群：エトポシド（１μＭ、１６時間）処理；第４群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、エトポシドの１時間前に添加）とエトポシド（１μＭ、１６時間）による併用処理。処理後、細胞をトリプシンで消化し、計数し、６ウェルプレートに１０００細胞／ウェルで再播種した。細胞を通常培地で１４日間培養して細胞コロニーを形成させた。細胞コロニー計数値の結果は、Ｐ５３欠損腫瘍細胞では（図６ＡおよびＤ）、エンドスタチンが腫瘍細胞コロニー形成能に対するエトポシドの阻害効果を増強し、腫瘍細胞の生存力を低下させ得ることを示した。正常なＰ５３機能を有する腫瘍細胞では（図６ＢおよびＣ）、エトポシドは、腫瘍細胞のコロニー形成能を有意に阻害することができ、エンドスタチンは、エトポシドの阻害効果を有意には増強しなかった。
【０１３４】
実施例７  エトポシドと共同したエンドスタチンはＰ５３欠損腫瘍細胞のアポトーシスを促進した
腫瘍細胞（Ｈ１２９９−ＮＣ、Ｈ１２９９−Ｐ５３、Ａ５４９−ＮＣ、Ａ５４９−ｓｈＰ５３）を４つの処理群に分けた。第１群：陰性対照；第２群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、１６時間）処理；第３群：エトポシド（１μＭ、１６時間）処理；第４群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、エトポシドの１時間前に添加）とエトポシド（１μＭ、１６時間）による併用処理。培養培地に浮遊しているアポトーシス細胞および接着細胞を回収し、これらの細胞を、０．０５ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する５００μｌのＰＢＳに懸濁させ、室温、暗所で１５分間染色し、フローサイトメトリー（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）により検出した。ＰＩ陽性細胞がアポトーシス細胞を表す。結果は、Ｐ５３欠損腫瘍細胞では（図７ＡおよびＤ）、エンドスタチンは、腫瘍細胞のアポトーシスを促進するエトポシドの能力を増強し得ることを示した。正常なＰ５３機能を有する腫瘍細胞では（図７ＢおよびＣ）、エトポシドは、腫瘍細胞のアポトーシスを有意に促進することができ、エンドスタチンは、エトポシドのアポトーシス誘導効果を有意には増強しなかった。
【０１３５】
実施例８  ドキソルビシンと共同したエンドスタチンはＰ５３欠損腫瘍細胞の活性を阻害した
本実施例では、エンドスタチンが化学療法に対するＰ５３欠損腫瘍細胞の感受性を高め得ることを確認するために別の化学薬剤ドキソルビシンを使用した。操作プロセスは実施例５と同じであった。結果は、Ｐ５３欠損腫瘍細胞（Ｈ１２９９−ＮＣおよびＡ５４９−ｓｈＰ５３）では（図８ＡおよびＤ）、エンドスタチンは、腫瘍細胞に対するドキソルビシンの毒性を増強し得ることを示した。正常なＰ５３機能を有する腫瘍細胞（Ｈ１２９９−Ｐ５３およびＡ５４９−ＮＣ）では（図８ＢおよびＣ）、ドキソルビシンは、腫瘍細胞の活性を有意に阻害することができ、エンドスタチンは、ドキソルビシンの阻害効果を有意には増強しなかった。
【０１３６】
実施例９  エンドスタチンと共同したエトポシドの阻害効果は他種の腫瘍細胞にも適用可能であった
本実施例では、Ｐ５３状態の異なる他種の腫瘍細胞の化学療法薬感受性に対するエンドスタチンの調節機能を確認するために、別の腫瘍種（黒色腫）の２つの細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞株（Ｐ５３変異型）およびＡ３７５細胞株（Ｐ５３野生型）を使用した。操作プロセスは実施例５と同じであった。結果は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞では（図９ＡおよびＤ）、エンドスタチンは、腫瘍細胞に対するエトポシドの毒性を増強し得ることを示した。Ａ３７５細胞では（図９ＢおよびＣ）、エトポシドは、腫瘍細胞の活性を有意に阻害することができ、エンドスタチンは、エトポシドの阻害効果を有意には増強しなかった。
【０１３７】
実施例１０  エンドスタチンは、Ｐ５３欠損腫瘍細胞において細胞損傷を修復するためのＤＮＡ−ＰＫｃｓを阻害し、アポトーシス経路の活性化およびＤＮＡ−ＰＫｃｓの分解を誘導した
ＤＮＡ−ＰＫｃｓはカスパーゼ−３の基質であり、活性化されたカスパーゼ−３はＤＮＡ−ＰＫｃｓを切断してそれを分解することを示した研究がある(T. Itoh et al. Journal of dermatological science, 2001; 25, 72-77, K. M. Henkels et al. Cancer research, 1997; 57, 4488-4492)。本実施例では、腫瘍細胞（Ｈ１２９９−ＮＣ、Ｈ１２９９−Ｐ５３、Ａ５４９−ＮＣ、Ａ５４９−ｓｈＰ５３）を６つの処理群に分けた。第１群：陰性対照；第２群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、１６時間）処理；第３群：エトポシド（１０μＭ、１６時間）処理；第４群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、エトポシドの１時間前に添加）とエトポシド（１０μＭ、１６時間）による併用処理；第５群：ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ（１０μＭ、エトポシドの１時間前に添加）とエトポシド（１０μＭ、１６時間）による併用処理；第６群：ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋ（１０μＭ）とエンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ）（エトポシドの１時間前に添加）、次いで、エトポシド（１０μＭ、１６時間）による併用処理、なお、ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋは、カスパーゼ−３阻害剤であった。免疫ブロットアッセイは、ＤＮＡ−ＰＫｃｓ、ＰＡＲＰ、γＨ２ＡＸおよびカスパーゼ−３シグナル伝達経路を検出した。結果（図１０に示されるように、ｐ−ＤＮＡ−ＰＫｃｓ（Ｓ２０５６）は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓのリン酸化レベルを表し、Ｓ２０５６は、そのリン酸化部位を表す）は、対照群に比べて、Ｐ５３欠損腫瘍細胞（図１０ＡおよびＤ）および正常なＰ５３機能を有する腫瘍細胞（図１０ＢおよびＣ）の両方で、エンドスタチンは、上記のシグナル伝達経路レベルに影響を及ぼさず；Ｐ５３欠損腫瘍細胞では、エトポシドは、上記のシグナル伝達経路に有意な効果を示さず；エトポシドに比べて、エンドスタチンとエトポシドの組合せは、γＨ２ＡＸの有意な増大を伴って、カスパーゼ−３の活性化ならびにＤＮＡ−ＰＫｃｓおよびＰＡＲＰの分解を有意に促進し；ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋとエトポシドの組合せは、上記のシグナルレベルに有意な効果を示さず；ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋは、エンドスタチンとエトポシドの共同作用をある程度逆転させ得ることを示した。正常なＰ５３機能を有する腫瘍細胞では、エトポシド単独により処理およびエンドスタチンとエトポシドによる併用処理はどちらも有意なカスパーゼ−３の活性化、ＤＮＡ−ＰＫｃｓおよびＰＡＲＰの分解、ならびにγＨ２ＡＸの増大を示し；ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋとびエトポシドの組合せは、エトポシドの効果をある程度逆転させ；ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋとエンドスタチンとエトポシドの組合せは、ｚ−ＤＥＶＤ−ｆｍｋがエトポシドの効果を逆転させ、ＤＮＡ−ＰＫｃｓのタンパク質レベルを回復させ、エンドスタチンとエトポシドの共同作用をある程度反映したことを示した。
【０１３８】
実施例１１  エトポシドと共同したエンドスタチンはＰ５３欠損腫瘍細胞においてアポトーシス誘導分子の発現を上方調節した
腫瘍細胞（Ｈ１２９９−ＮＣ、Ｈ１２９９−Ｐ５３、Ａ５４９−ＮＣ、Ａ５４９−ｓｈＰ５３）を４つの処理群に分けた。第１群：陰性対照；第２群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、１６時間）処理；第３群：エトポシド（１μＭ、１６時間）処理；第４群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、エトポシドの１時間前に添加）とエトポシド（１μＭ、１６時間）による併用処理。細胞を上記のように処理した後、それらの細胞の全ＲＮＡを抽出し、それらの細胞のＢＡＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、およびＰ２１のｍＲＮＡレベルでの相対的変化をリアルタイムＰＣＲにより検出した。使用したプライマーは下表に示す。
【０１３９】
【表１】
2020528457.tif 000006
【０１４０】
結果は、Ｐ５３欠損腫瘍細胞では（図１１ＡおよびＤ）、エンドスタチンは、エトポシドを増強してアポトーシス誘導分子を上方調節し得ることを示した。正常なＰ５３機能を有する腫瘍細胞では（図１１ＢおよびＣ）、エトポシドは、上記のアポトーシス誘導分子を有意に上方調節することができ、エンドスタチンは、エトポシドのアポトーシス誘導効果を有意には増強しなかった。
【０１４１】
実施例１２  エンドスタチンはＰ５３欠損腫瘍増殖に対するエトポシドの阻害効果を増強した
腫瘍細胞（Ｈ１２９９−ＮＣ、Ｈ１２９９−Ｐ５３、Ａ５４９−ＮＣ、Ａ５４９−ｓｈＰ５３）を、６〜８週齢のヌードマウス(Beijing Weitong Lihua Experimental Animal Technology Co., Ltd.)に皮下接種した。担癌ヌードマウスを各群６〜８個体として４群に無作為に分け、異なる薬物処置を行った。第１群：陰性対照；第２群：エンドスタチン（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射、１日１回）処置；第３群：エトポシド（２ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射、２日毎に１回）処置；第４群：エンドスタチン（２０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射、１日１回）とエトポシド（２ｍｇ／ｋｇ、腹腔内注射、２日毎に１回）による併用処置。腫瘍体積を１日おきに測定した。投与２〜４週間後に、マウスを犠牲にし、さらなる使用のために腫瘍組織を摘出した。結果は、Ｐ５３欠損マウス腫瘍モデルでは（図１２ＡおよびＤ）、対照群に比べて、エンドスタチンの腫瘍抑制率は１９．６％（Ｈ１２９９−ＮＣ、１９日目）および３７．１％（Ａ５４９−ｓｈＰ５３、２７日目）であり；エトポシドの腫瘍抑制率は２８．０％（Ｈ１２９９−ＮＣ、１９日目）および３９．３％（Ａ５４９−ｓｈＰ５３、２７日目）であり；エンドスタチンとエトポシドの組合せは、腫瘍増殖の阻害に共同作用を示し、腫瘍抑制率は６６．９％（Ｈ１２９９−ＮＣ、１９日目）および６５．８％（Ａ５４９−ｓｈＰ５３、２７日目）であったことを示した。正常なＰ５３機能を有するマウス腫瘍モデルでは（図１２ＢおよびＣ）、対照群に比べて、エンドスタチンの腫瘍抑制率は３３．８％（Ｈ１２９９−Ｐ５３、１９日目）および４０．９％（Ａ５４９−ＮＣ、２７日目）であり；エトポシドの腫瘍抑制率は、３０．０％（Ｈ１２９９−Ｐ５３、１９日目）および３４．０％（Ａ５４９−ＮＣ、２７日目）であり；エンドスタチンは、腫瘍増殖に対するエトポシドの阻害効果を増強できず、組合せの腫瘍抑制率は３７．７％（Ｈ１２９９−Ｐ５３、１９日目）および３２．２％（Ａ５４９−ＮＣ、２７日目）であった。
【０１４２】
実施例１３  エンドスタチンとエトポシドの併用はＰ５３欠損担癌マウスの生存の延長に共同作用を示した
Ｈ１２９９細胞およびＡ５４９細胞を活発で増殖能のある状態で培養し、腫瘍の収集、群分け、および投与方法は実施例１２と同様とした。２５日後に投与を止め、マウスの生存を毎日記録し、マウスの生存曲線をプロットした。結果は、Ｈ１２９９マウス腫瘍モデルでは（図１３Ａ）、対照群に比べて、エンドスタチン処置群の生存期間中央値は対照群よりも２４．２％長く；エトポシド処置群の生存期間中央値は対照群よりも３０．３％長く；エンドスタチンとエトポシドの組合せは、マウスの生存期間の延長に共同作用を示し、生存期間中央値は対照群よりも７２．７％長かったことを示した。正常なＰ５３機能を有するマウス腫瘍モデルでは（図１３Ｂ）、対照群に比べて、エンドスタチン処置群およびエトポシド処置群は、マウスの生存期間をある程度延長することができ、エンドスタチンとエトポシドの組合せは、マウスの生存期間の延長に共同作用を示さなかった。
【０１４３】
実施例１４  エトポシドと共同したエンドスタチンはＰ５３欠損腫瘍の増殖およびＤＮＡ−ＰＫｃｓの発現レベルを阻害した
実施例１２で摘出した腫瘍組織を固定および包埋した後に切片とした。腫瘍組織中のＰＣＮＡ（腫瘍細胞の活発な増殖状態を示すマーカー分子）およびＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質を免疫蛍光技術により染色し、レーザー共焦顕微鏡（ニコンＡ１）で観察し、画像を取得した。試験結果を図１４に示すが、青はＤＡＰＩ染色細胞の核を表し、緑はＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質を表し、赤はＰＣＮＡタンパク質を表す。図１４Ａに示すＨ１２９９−ＮＣ腫瘍組織を例に挙げれば、左の１段目はＤＮＡ−ＰＫｃｓ単一染色を表し、緑の領域はＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質の発現レベルを表す。左の２段目はＤＮＡ−ＰＫｃｓ（緑）と核（青）を重畳した結果を表し、重複部分は藍色で示す。左の３段目はＰＣＮＡ単一染色を表し、赤の領域はＰＣＮＡタンパク質の発現レベルを表し、腫瘍細胞増殖の強度を示す。左の４段目はＰＣＮＡ（赤）と核（青）を重畳した結果を表し、重複部分を紫で示す。同様に、図１４Ｂ、Ｃ、およびＤは、それぞれＨ１２９９−Ｐ５３、Ａ５４９−ＮＣ、およびＡ５４９−ｓｈＰ５３腫瘍組織におけるＰＣＮＡおよびＤＮＡ−ＰＫｃｓの発現を示す。この図のタンパク質染色および画像配置の順序は図１２Ａと一致する。定量結果は、Ｐ５３欠損マウス腫瘍モデルでは（図１４ＡおよびＤ）、対照群に比べて、エンドスタチンおよびエトポシドはどちらも腫瘍細胞の増殖をある程度減弱し、ＤＮＡ−ＰＫｃｓのタンパク質レベルを低下させることができ；エンドスタチンとエトポシドの組合せは共同作用的に働くことができ、エトポシド処置群に比べて腫瘍増殖およびＤＮＡ−ＰＫｃｓタンパク質レベルをより有意に阻害し得ることを示した。正常なＰ５３機能を有するマウス腫瘍モデルでは（図１４ＢおよびＣ）、対照群に比べて、エンドスタチン、エトポシド、およびエンドスタチンとエトポシドの組合せは、腫瘍細胞の増殖を低減し、ＤＮＡ−ＰＫｃｓのタンパク質レベルを低下させることができ、エンドスタチンは、腫瘍増殖に対するエトポシドの阻害効果およびＤＮＡ−ＰＫｃｓのタンパク質レベルに対するエトポシドの効果を増強しなかった。
【０１４４】
実施例１５  ＺＢＰ−エンドスタチンおよびＰＥＧ−エンドスタチンは腫瘍細胞において化学療法薬により誘導されたＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路の活性化を阻害した
本実施例では、ＺＢＰ−エンドスタチンおよびＰＥＧ−エンドスタチンによるＤＮＡ−ＰＫｃｓ経路の阻害を、ＤＮＡ−ＰＫｃｓおよびＡＫＴの活性化レベルを検出することにより確認した。腫瘍細胞（Ｈ１２９９細胞およびＡ５４９細胞を含む）を６つの処理群に分けた。第１群：陰性対照；第２群：エトポシド（１０μＭ、１時間）処理；第３群：ＺＢＰ−エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、１時間）処理；第４群：ＺＢＰ−エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、エトポシドの１時間前に添加）とエトポシド（１０μＭ、１時間）による併用処理；第４群：ＰＥＧ−エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、１時間）処理；第６群：ＰＥＧ−エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、エトポシドの１時間前に添加）およびエトポシド（１０μＭ、１時間）による併用処理。免疫ブロットアッセイ結果は、対照群に比べて、エトポシド処理はＨ１２９９細胞およびＡ５４９細胞においてＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路のレベルを活性化し（ｐ−ＤＮＡ−ＰＫｃｓ（Ｓ２０５６）およびｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）の免疫ブロットアッセイの結果に示されるように、ｐ−ＤＮＡ−ＰＫｃｓ（Ｓ２０５６）は、ＤＮＡ−ＰＫｃｓのリン酸化レベルを表し、Ｓ２０５６は、そのリン酸化部位を表し、ｐ−ＡＫＴは、ＡＫＴのリン酸化レベルを表し、Ｓ４７３は、そのリン酸化部位を表す）；ＺＢＰ−エンドスタチンまたはＰＥＧ−エンドスタチンとエトポシドの組合せは、エトポシドによるＤＮＡ−ＰＫｃｓシグナル伝達経路の活性化を阻害したことを示した（図１５）。
【図１】
2020528457.tif 000007
【図２】
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【図３】
2020528457.tif 000009
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2020528457.tif 000015
【図１０】
2020528457.tif 000016
【図１１】
2020528457.tif 000017
【図１２】
2020528457.tif 000018
【図１３】
2020528457.tif 000019
【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月1日(2020.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３８】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４６】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７１】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７９】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８１】
いくつかの実施形態では、前記エンドスタチンは、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８９】
本発明で使用される天然ヒトエンドスタチンの配列は、例えば、下記であり得る。
【化１】
2020528457.tif 000022
配列中、Ｎ末端のＭｅｔは、大腸菌(E. coli)により発現される場合、部分的に欠失されていることがある。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
本発明のいくつかの実施形態では、「エンドスタチン」は、可溶性発現を増し、精製を容易にするために、天然ヒトＥＳのＮ末端に９個の付加的アミノ酸（ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１））を付加することにより得られたＥＳ変異体であるＺＢＰ−エンドスタチン（商標Ｅｎｄｏｓｔａｒ）などの天然ヒトエンドスタチンの機能的変異体であり得る。ＺＢＰ−エンドスタチンのアミノ酸配列は下記である。
【化２】
2020528457.tif 000023
配列中、Ｎ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
以下の実施例では、使用されるエンドスタチンは、Beijing Protgen Biotechnology Development Co., Ltd. (Protgen)からの、大腸菌により発現された組換え天然ヒトエンドスタチンであり、下記のアミノ酸配列を有する。
【化３】
2020528457.tif 000024
配列中、Ｎ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２５】
使用されるＺＢＰ−エンドスタチンは、Beijing Protgen Biotechnology Development Co., Ltd. (Protgen)により提供された、天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸（ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１））を付加することにより得られたエンドスタチン変異体であり(Fu Y et al. Biochemistry 2010, 49, 6420-6429)、そのアミノ酸配列は下記の通りである。
【化４】
2020528457.tif 000025
配列中、Ｎ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
非小細胞肺癌Ｈ１２９９細胞株（Ｐ５３欠損）、Ａ５４９細胞株（Ｐ５３野生型）、および黒色腫ＭＤＡ−ＭＢ−４３５Ｓ細胞株（Ｐ５３変異型）およびＡ３７５細胞株（Ｐ５３野生型）は、National Experimental Cell Resource Sharing Platform (China Infrastructure of Cell Line Resource)から購入した。Ｐ５３安定過剰発現Ｈ１２９９細胞株（Ｈ１２９９−Ｐ５３）およびＰ５３安定ノックダウンＡ５４９細胞株（Ａ５４９−ＮＣ）は、レンチウイルスキット（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｇｅｎｅｐｈａｒｍａ社から購入）を用いて構築し、この場合、Ａ５４９細胞においてＰ５３をノックダンするために使用したｓｈＲＮＡにより標的化されるＰ５３配列は、５’−ＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号４）であった。ウイルストランスフェクションおよび安定細胞株の構築は、キットの説明書に従って行った。Ｈ１２９９−ＮＣおよびＡ５４９−ＮＣは、Ｈ１２９９細胞およびＡ５４９細胞をそれぞれブランクレンチウイルスでトランスフェクトすることにより得られた安定細胞株であった。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３１】
実施例４  エンドスタチンはＤＮＡ−ＰＫｃｓの存在に依存して化学療法に対する腫瘍細胞の感受性を調節した
本実施例では、腫瘍細胞（Ｈ１２９９細胞およびＡ５４９細胞を含む）を８つの処理群に分けた。第１〜第４群では、細胞を対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、最後の４群では、細胞を、ＤＮＡ−ＰＫｃｓを特異的にノックダウンしたｓｉＲＮＡでトランスフェクトした。ＤＮＡ−ＰＫｃｓのｓｉＲＮＡ配列は：フォワード５’−ＣＡＧＧＧＵＵＵＡＡＵＣＡＧＡＡＵＡＵＴＴ−３’（配列番号５）、リバース５’−ＡＵＡＵＵＣＵＧＡＵＵＡＡＡＣＣＣＵＧＴＴ−３’（配列番号６）である。ｓｉＲＮＡトランスフェクション法は、トランスフェクション試薬リポフェクタミン２０００の説明書に従って行った。次に、第８群では、細胞を薬物で処理した。第１群および第４群：対照群；第２群および第５群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、１６時間）処理；第３群および第６群：エトポシド（Ｈ１２９９では１０μＭ、Ａ５４９では１μＭ、１６時間）処理；第４群および第８群：エンドスタチン（１０μｇ／ｍｌ、エトポシドの１時間前に添加）とエトポシド（Ｈ１２９９では１０μＭ、Ａ５４９では１μＭ、１６時間）の併用。細胞を回収し、アネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩアポトーシス検出キットの説明書に従って操作を行った。アポトーシスはフローサイトメトリーにより検出した。Ａ５４９細胞はＰ５３野生型細胞であり、Ｈ１２９９細胞はＰ５３欠損細胞であった。結果は、Ａ５４９細胞は化学療法薬に対する感受性がより高く、同程度のアポトーシスが生じた場合、Ｈ１２９９細胞のエトポシド濃度はＡ５４９細胞のエトポシド濃度よりはるかに高かったことを示した。これに基づけば、エンドスタチンの付加は、エトポシドにより誘導されるアポトーシスをさらに促進すると考えられる（図４）。ＤＮＡ−ＰＫｃｓをノックダウンした後には、このエトポシドにより誘導されるアポトーシス促進におけるエンドスタチンの役割は減弱した。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
実施例５  エトポシドと共同したエンドスタチンはＰ５３欠損腫瘍細胞の活性を阻害した
まず、レンチウイルスキット（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｇｅｎｅｐｈａｒｍａ社から購入）を用いてＰ５３安定過剰発現Ｈ１２９９細胞株（Ｈ１２９９−Ｐ５３）およびＰ５３安定ノックダウンＡ５４９細胞株（Ａ５４９−ＮＣ）を構築した。Ａ５４９細胞においてＰ５３をノックダウンするために使用したｓｈＲＮＡにより標的化されるＰ５３配列は、５’−ＧＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＴＡＡＴＣＴＡＣ−３’（配列番号４）であった。ウイルストランスフェクションおよび安定細胞株の構築はキットの説明書に従って行った。構築された腫瘍細胞（Ｈ１２９９−ＮＣ、Ｈ１２９９−Ｐ５３、Ａ５４９−ＮＣ、Ａ５４９−ｓｈＰ５３）を９６ウェルプレート（１０００細胞／ウェル）に播種し、８つの処理群に分けた。第１群〜第４群では、種々の濃度のエトポシド（０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）を含有する培地を各ウェルに加えた。第５群〜第８群は、まず、１０μｇ／ｍｌのエンドスタチンを含有する培地で１時間前処理し、次に、種々のエトポシド濃度を含有する培地を、第５群〜第８群のエトポシド終濃度がそれぞれ０μＭ、０．１μＭ、１μＭ、および１０μＭとなるように加えた。１２時間の処理後、薬物含有培地を通常培地に置き換え、細胞をさらに７２時間培養した。細胞活性を、ＣＣＫ８キットの説明書（同仁堂、東京、日本）に従って測定した。結果は、Ｐ５３欠損腫瘍細胞では（図５ＡおよびＤ）、エンドスタチンは腫瘍細胞に対するエトポシドの毒性を増強し得ることを示した。正常なＰ５３機能を有する腫瘍細胞では（図５ＢおよびＣ）、エトポシドは、腫瘍細胞の活性を有意に阻害することができ、エンドスタチンは、エトポシドの阻害効果を有意には増強しなかった。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
【表１】
2020528457.tif 000026
【手続補正１８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エンドスタチンと化学療法薬とを含んでなり、前記化学療法薬がＤＮＡ二本鎖切断を誘導する化学療法薬である、医薬組成物。
【請求項２】
薬学上許容される担体をさらに含んでなる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
腫瘍または癌の治療において使用するための請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能を欠損している、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能が正常である、請求項５に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項５または６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記エンドスタチンが
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
エンドスタチンと化学療法薬とを含み、前記化学療法薬がＤＮＡ二本鎖切断を誘導する化学療法薬である、薬物の組合せ。
【請求項１０】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項９に記載の薬物の組合せ。
【請求項１１】
腫瘍または癌の治療において使用するための請求項９または１０に記載の薬物の組合せ。
【請求項１２】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能を欠損している、請求項１１に記載の薬物の組合せ。
【請求項１３】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能が正常である、請求項１１に記載の薬物の組合せ。
【請求項１４】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項１２または１３に記載の薬物の組合せ。
【請求項１５】
前記エンドスタチンおよび化学療法薬が同時にまたは逐次に投与される、請求項９〜１４のいずれか一項に記載の薬物の組合せ。
【請求項１６】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項９〜１５のいずれか一項に記載の薬物の組合せ。
【請求項１７】
ａ）エンドスタチンまたはエンドスタチンを含有する医薬組成物である第１の薬剤と；
ｂ）化学療法薬である第２の薬剤（ここで、前記化学療法薬は、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導する化学療法薬である）とを含んでなるキット。
【請求項１８】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
腫瘍または癌の治療において使用するための請求項１７または１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能を欠損している、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能が正常である、請求項１９に記載のキット。
【請求項２２】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２４】
ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画に対して細胞の感受性を増強するための方法であって、前記細胞をエンドスタチンと接触させる工程を含んでなり、前記細胞はＰ５３機能を欠損している、方法。
【請求項２５】
前記細胞が腫瘍細胞または癌細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記腫瘍細胞または癌細胞が非小細胞肺癌細胞または黒色腫細胞である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
イン・ビボまたはイン・ビトロで行われる、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記の細胞をエンドスタチと接触させる工程が、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画と同時にまたは逐次に行われる、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の前にエンドスタチンと接触される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞が、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の後にエンドスタチンと接触される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画が放射線療法および／または化学療法薬の投与である、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項２４〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
腫瘍または癌の治療のための、ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画との併用薬の製造におけるエンドスタチンの使用。
【請求項３５】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能を欠損している、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能が正常である、請求項３４に記載の使用。
【請求項３７】
前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の治療用量が単独で使用される場合の治療計画の治療用量よりも少ない、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３９】
前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画が放射線療法および／または化学療法薬である、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４０】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項３４〜４０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４２】
対象において腫瘍または癌を治療する方法であって、
ａ）前記対象においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画を行うこと；および
ｂ）前記対象にエンドスタチンを投与すること
を含んでなる、方法。
【請求項４３】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能を欠損している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記腫瘍または癌はＰ５３機能が正常である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の治療用量が、単独で使用される場合の治療計画の治療用量よりも少ない、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記の細胞をエンドスタチンと接触させる工程が、前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画と同時にまたは逐次に行われる、請求項４２〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
エンドスタチンが前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の前に前記対象に投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
エンドセリンがＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画の後に前記対象に投与される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＤＮＡ二本鎖切断を誘導するための治療計画が放射線療法および／または化学療法薬である、請求項４２〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記対象がヒトである、請求項４２〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項４２〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
ａ）細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導すること；および
ｂ）前記細胞をエンドスタチンと接触させること
を含む、アポトーシスを誘導するための方法。
【請求項５５】
前記細胞が腫瘍細胞または癌細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記腫瘍細胞または癌細胞はＰ５３機能を欠損している、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記腫瘍細胞または癌細胞はＰ５３機能が正常である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導する工程において適用される用量が、その治療計画が単独で使用される場合に適用される用量よりも少ない、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導する工程が、前記細胞をエンドスタチンと接触させる工程と同時にまたは逐次に行われる、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記細胞が、前記細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導する前にエンドスタチンと接触される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記細胞が、前記細胞においてＤＮＡ二本鎖切断を誘導された後にエンドスタチンと接触される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＤＮＡ二本鎖切断が、前記細胞に照射を行うことまたは前記細胞を化学療法薬と接触させることにより誘導される、請求項５４〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
イン・ビトロまたはイン・ビボで行われる、請求項５４〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項４２〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
細胞においてアポトーシスを誘導するための薬剤の製造におけるエンドスタチンの使用であって、前記細胞はＤＮＡ二本鎖切断を生じさせられる、使用。
【請求項６８】
前記細胞が腫瘍細胞または癌細胞である、請求項６７に記載の使用。
【請求項６９】
前記腫瘍細胞または癌細胞はＰ５３機能を欠損している、請求項６８に記載の使用。
【請求項７０】
前記腫瘍細胞または癌細胞はＰ５３機能が正常である、請求項６８に記載の使用。
【請求項７１】
前記腫瘍または癌が非小細胞肺癌または黒色腫である、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７２】
前記細胞は放射線照射または化学療法薬への曝露によりＤＮＡ二本鎖切断を生じさせられる、請求項６７〜７１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７３】
前記化学療法薬がエトポシドまたはドキソルビシンである、請求項７２に記載の使用。
【請求項７４】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項６７〜７３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７５】
生体サンプルにおいてＤＮＡ−ＰＫｃｓ活性を阻害する方法であって、前記生体サンプルをエンドスタチンと接触させることを含んでなる、方法。
【請求項７６】
前記エンドスタチンが、
天然ヒトエンドスタチン；
天然ヒトエンドスタチンのＮ末端に９個の付加的アミノ酸ＭＧＧＳＨＨＨＨＨ（配列番号１）を付加することにより得られるエンドスタチン変異体（ここで、前記エンドセリン変異体のＮ末端のＭｅｔは、大腸菌により発現される場合、部分的に欠失されていることがある）；または
天然ヒトエンドスタチンを分子量２０ｋＤａのモノメトキシポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド（ｍＰＥＧ−ＡＬＤ）で修飾することにより得られる産物（ここで、それらの結合部位は活性化されたｍＰＥＧ−ＡＬＤアルデヒド基と天然ヒトエンドスタチンのＮ末端α−アミノ基である）、
である、請求項７５に記載の方法。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020528457000001.app
【国際調査報告】
2020528457.tif 000027
2020528457.tif 000028
2020528457.tif 000029
2020528457.tif 000030
2020528457.tif 000031
2020528457.tif 000032