(57)【要約】本発明は、ＮＫ細胞ベースの免疫療法で使用するための抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質に関し、ここで、抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質は、サイトカインと組み合わせて間欠投与されることになる。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、４価の二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫ細胞ベースの免疫療法で使用するための、ＣＤ１６Ａに対する少なくとも１つの抗原結合部位を含む抗原結合タンパク質および少なくとも１つのサイトカインであって、前記抗原結合タンパク質が以下の工程を含む投薬サイクルで間欠投与される、抗原結合タンパク質およびサイトカイン：
（ａ）前記抗原結合タンパク質の初回服用量を投与する工程と；
（ｂ）工程（ａ）に続いて、前記抗原結合タンパク質の半減期の少なくとも３倍が経過した後に、前記抗原結合タンパク質の２回目の服用量を投与する工程と、（ｃ）工程（ａ）から工程（ｂ）の間隔の間に、少なくとも１つのサイトカインの服用量を投与する工程。
【請求項２】
工程（ａ）から（ｂ）の間に間隔を含む前記投薬サイクルが、少なくとも１回繰り返される、請求項１に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項３】
工程（ａ）に続いて、前記抗原結合タンパク質の半減期の少なくとも１倍が経過した後に、前記サイトカインが投与される、請求項１または２に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項４】
前記抗原結合タンパク質が、１週間未満、好ましくは２４時間未満の半減期を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項５】
前記抗原結合タンパク質が、ＣＤ１６Ａに対する少なくとも２つの抗原結合部位を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項６】
前記抗原結合タンパク質が多重特異性であり、ＣＤ１６Ａとは異なる標的抗原に対する少なくとも１つの追加的抗原結合部位を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項７】
前記標的抗原が腫瘍抗原またはウイルス抗原である、請求項６に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項８】
前記サイトカインが、インターロイキン２（ＩＬ―２）、インターロイキン６（ＩＬ―６）、インターロイキン１２（ＩＬ―１２）、インターロイキン１５（ＩＬ―１５）およびインターロイキン１８（ＩＬ―１８）、インターロイキン２１（ＩＬ―２１）またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項９】
インターロイキン２（ＩＬ―２）またはインターロイキン１５（ＩＬ―１５）が投与される、請求項８に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項１０】
前記抗原結合タンパク質が、前記標的抗原に対する少なくとも２つの抗原結合部位を含む、請求項６に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項１１】
前記抗原結合タンパク質が、二重特異性で４価のタンデムダイアボディである、請求項１０に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項１２】
前記腫瘍抗原が、ＣＤ３０、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＢＣＭＡからなる群より選択される、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項１３】
前記抗原結合タンパク質がタンデムダイアボディである、請求項１２に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項１４】
前記ＮＫ細胞ベースの免疫療法が、サイトカインによるｉｎ  ｖｉｖｏ刺激およびｅｘ  ｖｉｖｏ刺激からなる群より選択される、ＮＫ細胞を刺激する工程を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項１５】
前記ＮＫ細胞ベースの免疫療法が、ＮＫ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ刺激の工程を含み、ここで自己または同種異系ＮＫ細胞のいずれかをサイトカインと接触させてｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させ、その後、治療を受ける被験体に注入する、請求項１４に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【請求項１６】
前記抗原結合タンパク質を、ｅｘ  ｖｉｖｏで前記ＮＫ細胞に投与し、その後、前記ＮＫ細胞とともに治療を受ける前記被験体に注入する、請求項１５に記載の抗原結合タンパク質およびサイトカイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＫ細胞ベースの免疫療法のためにサイトカインと共に間欠投与されるＣＤ１６Ａエンゲージング抗原結合タンパク質に関する。特定の実施形態では、本発明は、がんまたは（ウイルス）感染症の治療で使用される、ＮＫ細胞に会合するためのＣＤ１６Ａ抗原結合部位を有する二重特異性で４価のタンデムダイアボディに関し、ここでタンデムダイアボディはサイトカインと組み合わせて間欠投与される。例としては、ＣＤ３０／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディＡＦＭ１３、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディＡＦＭ２４、およびＢＣＭＡ／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディＡＦＭ２６などの、ＣＤ１６Ａエンゲージングタンデムダイアボディが含まれる。
【背景技術】
【０００２】
ＷＯ２００６／１２５６６８は、抗原結合タンパク質、すなわちＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ二重特異性タンデムダイアボディ、およびＮＫ細胞ベースの免疫療法でのその使用を記載している。
【０００３】
ＷＯ２０１６／１７７８４６は、ホジキンリンパ腫の治療で使用するためのＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ二重特異性タンデムダイアボディとＰＤ―１アンタゴニストとの組み合わせを記載している。
【０００４】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ウイルス感染細胞およびがん細胞に対する防御の最前線を構成すると考えられている、細胞傷害性の、ＩＦＮ―γ産生リンパ球である（Ｃｅｒｗｅｎｋａ  ａｎｄ  Ｌａｎｉｅｒ、２００１；Ｓｐｉｔｓ、ｅｔ  ａｌ．、２０１３）。
【０００５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞とは対照的に、ＮＫ細胞は、抑制性ＫＩＲおよびＮＫＧ２Ａ受容体ならびに活性化ＮＫＧ２Ｄ、ＤＮＡＭ―１およびＮＣＲ受容体などの生殖細胞系列にコードされた受容体の定義されたセットを通して異常細胞を識別する（Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ、２０１３；Ｐａｈｌ  ａｎｄ  Ｃｅｒｗｅｎｋａ、２０１７）。ＮＫ細胞は、抑制性ＭＨＣクラスＩ分子のレベルの低下または適合性のないレパートリーを示す細胞に応答し、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を回避した可能性のある特定のがん細胞の認識を可能にする。標的細胞上の高レベルの活性化リガンドと組み合わせた抑制性リガンドの低発現は、ＮＫ細胞の活性化とパーフォリンおよびグランザイムＢの放出とをもたらし、標的細胞死を媒介する（Ｇａｓｓｅｒ  ａｎｄ  Ｒａｕｌｅｔ、２００６；Ｍｏｒｅｔｔａ、ｅｔ  ａｌ．、２００６）。さらに、ＮＫ細胞の活性化は、標的細胞に対するＮＫ細胞の反応性を高めるＩＬ―２またはＩＬ―１５などのサイトカインによって引き起こされる（Ｋｏｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ、２０１６）。
【０００６】
それらの直接的な抗腫瘍活性に加えて、ＮＫ細胞は、適応抗がん反応の誘導に寄与し、免疫調節機能を実行することができる（Ｓｃｈｕｓｔｅｒ、ｅｔ  ａｌ．、２０１６）。蓄積された証拠は、ＮＫ細胞サブセットが広範な表現型および機能的多様性を包含することができるという概念を支持している（Ｒｏｅｌｌｅ  ａｎｄ  Ｂｒｏｄｉｎ、２０１６；Ｔｅｓｉ、ｅｔ  ａｌ．、２０１６）。さらに、ＮＫ細胞は、特定のサブセットの増殖および抗原特異的応答など、適応免疫および免疫記憶の特性を獲得することができる（Ｓｕｎ、ｅｔ  ａｌ．、２０１４）。これに関連して、ＩＬ―１２／１５／１８によるＮＫ細胞の事前活性化は、ＩＦＮ―γ遺伝子座のエピジェネティックリモデリングに関連した腫瘍細胞およびサイトカインに対するＮＫ細胞の反応性を増幅および延長することが示されている（Ｃｅｒｗｅｎｋａ  ａｎｄ  Ｌａｎｉｅｒ、２０１６；Ｌｕｅｔｋｅ―Ｅｖｅｒｓｌｏｈ、ｅｔ  ａｌ．、２０１４；Ｎｉ、ｅｔ  ａｌ．、２０１６；Ｒｏｍｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）。
【０００７】
ＮＫ細胞は、定義上、事前感作を必要としないが、さらなる活性化なしの新鮮分離された（すなわち「ナイーブ」）ヒトＮＫ細胞は、プロトタイプの標的細胞株Ｋ５６２などの限られた数の腫瘍細胞にのみ反応する（Ｖｉｖｉｅｒ、２０１１  ）。特に、がん患者のＮＫ細胞は、サイトカインでｅｘ  ｖｉｖｏで活性化されない限り、自己腫瘍細胞に対して低い反応性を示す（Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ、ｅｔ  ａｌ．、２０１１、Ｒｅｉｎｅｒｓ、ｅｔ  ａｌ．、２０１３）。これは、不十分な腫瘍細胞認識、免疫抑制性がん微小環境の抑制効果、およびｉｎ  ｖｉｖｏでのＮＫ細胞反応性の継続的な調節を反映し得る。
【０００８】
腫瘍反応性治療抗体は、自己ＭＨＣクラスＩの存在下であっても、ナイーブＮＫ細胞の腫瘍細胞に対する細胞傷害性を大幅に改善できる（Ｈａｒｒｉｓ、２００４；Ｐａｈｌ、ｅｔ  ａｌ．、２０１２；Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ、ｅｔ  ａｌ．、２０１１；Ｒｅｉｎｅｒｓ、ｅｔ  ａｌ．、２０１３）。この抗体を介した細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、ＩＴＡＭ結合ＮＫ細胞活性化受容体ＣＤ１６Ａ（ＦｃγＲＩＩＩＡ）によるヒト化キメラＩｇＧ１抗体のヒトＦｃ部分の認識によって媒介される（ｄｅ  Ｌａｎｄａｚｕｒｉ、ｅｔ  ａｌ．、１９７９；Ｌａｎｉｅｒ、ｅｔ  ａｌ．、１９８８；Ｖｉｖｉｅｒ、ｅｔ  ａｌ．、１９９１）。治療抗体の臨床反応におけるＮＫ細胞およびＡＤＣＣの役割は、高アフィニティーＣＤ１６Ａアロタイプ（１５８Ｖ対１５８Ｆ遺伝子多型）を有する患者の予後がより良好であるという観察から推測されている（Ｂｉｂｅａｕ、ｅｔ  ａｌ．、２００９；Ｄａｌｌ  ´Ｏｚｚｏ、ｅｔ  ａｌ．、２００４；Ｍｕｓｏｌｉｎｏ、ｅｔ  ａｌ．、２００８）。
【０００９】
しかしながら、多発性骨髄腫患者は、他のがん患者や健康な人と比較して血清ＩｇＧレベルが高く、骨髄腫患者のＣＤ１６Ａアフィニティーの不均衡、ならびにそのような病態生理学的血清濃度でのヒトＩｇＧと従来の治療抗体とのＣＤ１６Ａ結合の潜在的な競合は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＤＣＣおよびＮＫ細胞の全潜在能力を妨げる可能性がある（Ｌｉ、ｅｔ  ａｌ．、２０１６）。ＣＤ１６Ａエンゲージメントを改善するために、高いアフィニティーでＦｃ非依存的にＣＤ１６Ａに結合する抗体フォーマットが開発された（Ｒｏｔｈｅ、ｅｔ  ａｌ．、２０１５；Ｗｉｅｒｎｉｋ、ｅｔ  ａｌ．、２０１３）。ＡＦＭ１３は、高いアフィニティーと特異性でＣＤ３０とＣＤ１６Ａの両方に２価結合する４価の二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））である（Ｒｅｕｓｃｈ、ｅｔ  ａｌ．、２０１４）。ＡＦＭ１３は、第２相単剤療法において、ならびにＣＤ３０＋の古典的および非古典的ホジキンリンパ腫患者を被験体とした第１ｂ相臨床試験において、ペンブロリズマブとの併用で試験されている（ＷＯ２０１６／１７７８４６）。
【発明の概要】
【００１０】
ＣＤ１６Ａは、ヒトＮＫ細胞の強力な活性化受容体であり、抗体オプソニン化がん細胞に対するＮＫ細胞の細胞傷害性を媒介するが、抗原結合タンパク質によるＣＤ１６Ａエンゲージメントを通じてＮＫ細胞の細胞傷害性を活性化する効率と効力をさらに高めることが望まれる。
【００１１】
本発明者らは、二重特異性ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ（ＡＦＭ１３）などの多重特異性抗体によるＣＤ１６Ａエンゲージメントにより、初代ＮＫ細胞の表現型および機能が変化することを発見した。最初にＮＫ細胞の機能を改善した後、抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質へのばく露（タンデムダイアボディを介した）は、細胞傷害性効力の一過性の選択的低下をもたらす。ただし、この損なわれたＮＫ細胞傷害性は、サイトカイン刺激によって元に戻すことができる。実施例では、ＮＫ細胞を、ＩＬ―２の存在下で抗原結合タンパク質にばく露させずに一定期間培養した後、これらのＣＤ１６Ａばく露歴のあるＮＫ細胞は、サイトカインで再刺激するとより強力な細胞傷害性とＩＦＮ―γ産生を実証し、そうでなければメモリー様機能を示す耐性腫瘍細胞を実証することが示された。
【００１２】
したがって、本明細書で提示される本発明は、サイトカインおよびその後の腫瘍細胞による再刺激に対するＮＫ細胞応答のプライミングおよび増幅におけるＣＤ１６Ａトリガリングのまだ評価されていない役割を明らかにする。本発明は、抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質、例えば、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ（ＡＦＭ１３）、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディＡＦＭ２４、またはＢＣＭＡ／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディＡＦＭ２６のいずれかの間欠投与レジメンを、抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質へのばく露のない一定期間のＮＫ細胞活性化サイトカインによる、ＮＫ細胞応答を改善する治療と組み合わせて提供する。
【００１３】
本発明は、サイトカインおよびその後の腫瘍細胞による再刺激に対するＮＫ細胞応答のプライミングおよび増幅におけるＣＤ１６Ａの新規の追加の役割を明らかにする。つまり、実施例のＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディでの刺激は、非オプソニン化ＣＤ３０＋腫瘍細胞だけでなく、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディの直接の標的ではないＣＤ３０-腫瘍細胞の殺傷を可能にし得る。これらの知見は、サイトカインと組み合わせた抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の間欠的レジメンを保証する。この間欠的かつ組み合わせ治療レジメンは、腫瘍反応性ＮＫ細胞の量を拡大し、患者の機能を向上させる。
【００１４】
ＣＤ１６Ａは、共刺激シグナルがない場合でもナイーブヒトＮＫ細胞の細胞傷害活性を引き起こす唯一の活性化受容体である（Ｂｒｙｃｅｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．、２００９；Ｂｒｙｃｅｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．、２００６）。実施例において、二重特異性４価ＣＤ３０／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディによるＣＤ１６Ａ活性化は、ＮＫ細胞耐性ＣＤ３０＋リンパ腫細胞に応答して強力なＮＫ細胞の細胞傷害性を誘発することが実証されている。重要なことに、ＣＤ３０／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディによるＣＤ１６Ａエンゲージメントは、ＩＬ―１５または低服用量ＩＬ―２に対するＮＫ細胞の感受性を高めることが実施例に示されている。これにより、ＩＬ―１５およびＩＬ―２依存性ＮＫ細胞増殖が拡大され、高機能ＮＫ細胞数が大幅に増加する。ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディオプソニン化腫瘍細胞に対する最初の優れたＮＫ細胞活性に続いて、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディへのばく露時間の増加は、ＮＫ細胞の細胞傷害性の低下とＩＦＮ―γ産生の減少をもたらす。しかしながら、このような効力の低下は一過性のものであり、そのようなＮＫ細胞をＩＬ―２またはＩＬ―１５とともに培養した後に回復する可能性がある。驚くべきことに、ＣＤ１６Ａを介してＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディによって事前に活性化されると、これらのサイトカイン培養ＮＫ細胞は、再刺激後に、ほとんど耐性であるはずのＣＤ３０＋リンパ腫細胞に対して、さらにはＣＤ３０-リンパ腫細胞に対して細胞傷害性およびＩＦＮ―γ産生を増強する。後続のサイトカイン治療によって再刺激することができるそのようなＮＫ細胞の細胞傷害性は、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６ＡまたはＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａのような二重特異性タンデム抗体などの他のＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質からも生じる。したがって、本発明は、サイトカインおよび腫瘍細胞の活性化に応答して、ＮＫ細胞機能のプライミングおよび増幅におけるＣＤ１６Ａトリガリングの評価されていない役割を明らかにする。
【００１５】
ＩＬ―１５および低服用量ＩＬ―２に対する感度の向上は、ＣＤ２５（高アフィニティーＩＬ―２受容体α鎖）の誘導、ならびにＩＬ―２およびＩＬ―１５受容体の両方の一部であるＣＤ１３２（低アフィニティーγ鎖）のアップレギュレーションと一致する。ＣＤ３０／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディによるＣＤ２５誘導は、抗ＣＤ１６  ３Ｇ８を使用する二次抗体とのＣＤ１６Ａ架橋で以前に示されたものよりも著しく強力である（Ｍａｒｑｕｅｚ、ｅｔ  ａｌ．、２０１０）。同様に、ＩＬ―１２／１５／１８によるＮＫ細胞の活性化は、安定したＣＤ２５発現を誘導し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび担がんマウスでのｉｎ  ｖｉｖｏのＩＬ―２依存性増殖を促進することが示されている（Ｎｉ、ｅｔ  ａｌ．、２０１２）。したがって、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディばく露後のＣＤ２５の誘導により、ＮＫ細胞が低量のＩＬ―２を求めて、本来なら構成的ＣＤ２５発現のためにＮＫ細胞に対するＩＬ―２の利用可能性を制限する制御性Ｔ細胞と競合することを可能にする（Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ、ｅｔ  ａｌ．、２０１３；Ｋｉｍ、ｅｔ  ａｌ．、２０１７）。ＣＤ１６Ａエンゲージングタンデムダイアボディに加えて、リツキシマブによるＣＤ１６ＡのＦｃを介したエンゲージメントは、増強された増殖能ならびに効力の一過性の低下を繰り返し、ＣＤ１６Ａ活性化のより包括的な現象を示す。しかしながら、ＣＤ１６Ａエンゲージングタンデムダイアボディに応じるＣＤ２５およびＣＤ１６の調節は、リツキシマブと比較して異種性が低く、健康なドナー間でより顕著である。ＣＤ１６Ａエンゲージングタンデムダイアボディの大いな活性化能は、Ｆｃエンゲージングリツキシマブと比較したＣＤ１６Ａ多型（ＩｇＧ抗体のＦｃドメインに対する低アフィニティーまたは高アフィニティー）に関係なく、ＣＤ１６Ａへのその長期にわたる高アフィニティー２価結合に起因し得る（Ｒｅｕｓｃｈ、ｅｔ  ａｌ．、２０１４）。
【００１６】
ＣＤ１６Ａエンゲージングタンデムダイアボディへのばく露に続いて、腫瘍細胞に対する２回目の応答で、ＣＤ１６Ａ依存性、さらには「天然の」ＮＫ細胞の細胞傷害性、脱顆粒、およびＩＦＮ―γの効力の一過性の選択的な低下が観察される。ＣＤ１６Ａ依存性活性の低下は、少なくとも部分的にＭＭＰを介した切断を伴うＣＤ１６ＡエンゲージメントでのＣＤ１６発現のほぼ完全な損失、または追加の記載のような受容体の内在化によって説明され得る（Ｃａｐｕａｎｏ、ｅｔ  ａｌ．、２０１５；Ｌａｊｏｉｅ、ｅｔ  ａｌ．、２０１４；Ｍｏｔａ、ｅｔ  ａｌ．、２００４；Ｒｏｍｅｅ、ｅｔ  ａｌ．、２０１３；Ｗｉｅｒｎｉｋ、ｅｔ  ａｌ．、２０１３）。加えて、「ナイーブ」ＮＫ細胞の効力、抗腫瘍反応性の一過性の低下は、Ｋ５６２溶解に関与することが示されているＮＫｐ３０およびＮＫＧ２Ｄなどの他のＮＫ細胞活性化受容体の脱感作を示唆した（Ｂｒａｎｄｔ、ｅｔ  ａｌ．、２００９  ；Ｋｕｙｌｅｎｓｔｉｅｒｎａ、ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。ＰＭＡ／イオノマイシンへの応答においてでも脱顆粒およびＩＦＮ―γ産生が減少することは、ＰＭＡ／イオノマイシンによって直接活性化されるＰＫＣ活性化および／またはＣａ２＋動員にも明らかに影響している効力の広範な一過性の低下を示している（Ｃｈａｔｉｌａら。、１９８９）。Ｃａ２＋動員は、ＣＤ１６Ａおよび他の活性化受容体の末端シグナル伝達に決定的に関与している（Ｂｒｙｃｅｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．、２００６；Ｃａｓｓａｔｅｌｌａ、ｅｔ  ａｌ．、１９８９）。ＰＫＣ活性化はＩＦＮ―γの産生を媒介することができ、Ｋ５６２溶解には重要であるが、ＰＩ３Ｋ活性化をその後必要とするＡＤＣＣには必要ない（Ｂｏｎｎｅｍａ、ｅｔ  ａｌ．、１９９４；Ｈａｒａ、ｅｔ  ａｌ．、２００８）。
【００１７】
したがって、２０時間のタンデムダイアボディ、例えば、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディのばく露後に観察された初代ＮＫ細胞の効力の一過性の低下は、短期（１．５時間）のＣＤ１６Ａエンゲージメントの結果として以前に発見されたより限定的な阻害効果を超える場合がある；この阻害は、ＳＨＰ―１補充およびＰＬＣγ２／Ｖａｖ―１／ＳＬＰ―７６リン酸化の阻害を伴い、一方でＩＦＮ―γの産生およびＰＭＡ／イオノマイシンに対する反応性が変化しないままであることが報告されている（Ｃａｐｕａｎｏ、ｅｔ  ａｌ．、２０１５  ；Ｇａｌａｎｄｒｉｎｉ、ｅｔ  ａｌ．、２００２）。
【００１８】
ＣＤ１６Ａエンゲージメント後のＩＬ―１２／１５／１８に対するＩＦＮ―γ応答は保存されるか、さらにはいっそう強化され、ＣＤ１６Ａエンゲージングタンデムダイアボディ、例えばＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディばく露後のＮＫ細胞は、腫瘍細胞による活性化に対するＩＦＮ―γを選択的に減少するのみであることを示している。これは、ＩＦＮ―γを強力に誘導する高アフィニティーＩＬ―１２およびＩＬ―１８受容体のアップレギュレーションによって説明できる。ＣＤ１６ＡおよびＩＬ―１２受容体の活性化が相乗的にＩＦＮ―γ産生を促進することができると報告されている（Ｋｏｎｄａｄａｓｕｌａ、ｅｔ  ａｌ．、２００８）。
【００１９】
全体として、ＣＤ１６Ａエンゲージングタンデムダイアボディ、例えばＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディばく露によるＮＫ細胞機能の一過性の低下は、ＩＬ―２またはＩＬ―１５でのその後の培養後に完全に復元できる。重要なのは、本来弱い感受性のリンパ腫細胞での再刺激に対する細胞傷害活性およびＩＦＮ―γ産生が実質的に促進されるため、これらのＣＤ１６Ａばく露歴のあるサイトカイン培養ＮＫ細胞は、メモリー様機能を持つということである。興味深いことに、「ＣＤ１６Ａ誘導メモリー様ＮＫ細胞」のこの新しい機能は、前述のＩＬ―１２／１５／１８誘導メモリー様ＮＫ細胞の抗腫瘍活性およびＩＦＮ―γ応答の促進と類似している可能性がある（Ｃｏｏｐｅｒ、ｅｔ  ａｌ．、２００９；Ｎｉ、ｅｔ  ａｌ．、２０１６；Ｎｉ、ｅｔ  ａｌ．、２０１２；Ｒｏｍｅｅ、ｅｔ  ａｌ．、２０１２；Ｒｏｍｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）。
【００２０】
これは、抗原結合タンパク質へのばく露のない期間を含む、抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質、例えばタンデムダイアボディの間欠投与スキームが、抗体オプソニン化腫瘍細胞との繰り返しの遭遇に対する個々のＮＫ細胞の反応性を向上させることを示している。さらに、本発明による、ＩＬ―２またはＩＬ―１５のようなＮＫ細胞活性化サイトカインとの、ＣＤ１６Ａエンゲージング抗原結合分子の間欠投与は、ＮＫ細胞の抗腫瘍活性を持続させるだけでなく、その増幅を可能にし、リンパ腫患者の腫瘍反応性ＮＫ細胞の量を拡大する。
【００２１】
（参照による組み込み）
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、および特許出願は、個々の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】ＮＫ細胞の細胞傷害性、ＩＦＮ―γ産生および受容体活性化を誘導するＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディオプソニン化腫瘍細胞を示している：Ａ．  ＣＤ３０＋ＣＤ１９―Ｋａｒｐａｓ―２９９およびＬ４２８細胞、ならびにＣＤ３０-ＣＤ１９＋Ｄａｕｄｉ細胞の、新鮮分離した初代ＮＫ細胞による特異的溶解を、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて、ＣＤ１６ＡｘＣＤ３０タンデムダイアボディＡＦＭ１３（丸形）、ＣＤ１６ＡｘＣＤ１９タンデムダイアボディＡＦＭ１２（菱形）（すべて１０μｇ／ｍＬ）の存在下で測定し、エフェクター―標的（Ｅ：Ｔ）比の増加時の抗体添加なし（四角形）と比較した；データは、少なくとも３つの実験の代表である。Ｂ．  ＡＦＭ１３あり／なしでのＫａｒｐａｓ―２９９、Ｌ４２８およびＤａｕｄｉ細胞の累積特異的溶解（Ｅ：Ｔ  ６：１）。Ｃ．  ＮＫ細胞によるＫａｒｐａｓ―２９９およびＬ４２８細胞のＡＦＭ１３誘導溶解（丸形）を、親キメラ抗ＣＤ３０  ＩｇＧ抗体（三角形）によって誘導された溶解と、１０―５〜１０μｇ／ｍＬの抗体濃度範囲で比較した（Ｅ：Ｔ  ２５：１）。ＡＦＭ１２を陰性対照（菱形）として使用した。Ｄ．  ＡＦＭ１３（１μｇ／ｍＬ）の存在下でのＫａｒｐａｓ―２９９およびＬ４２８の特異的溶解を、精製ＮＫ細胞（丸形）と全ＰＢＭＣ（四角形）との間で、一致したＥ：Ｔ比で比較した。ＮＫ細胞除去ＰＢＭＣ（ＰＢＭＣΔＮＫ）（三角形）による溶解は、ＮＫ細胞の不在に対して補正した；データは２つの実験の代表である。Ｅ．  ＮＫ細胞ＣＤ１０７ａ発現（脱顆粒マーカー）および細胞内ＩＦＮ―γ発現を、表示されているように、精製ＮＫ細胞およびＬ４２８細胞（Ｅ：Ｔ  １：１）のＡＦＭ１３（０．４μｇ／ｍＬ）あり／なしでの４時間の共培養後のフローサイトメトリーにより測定した。ＩＦＮ―γの産生は、２０時間の共培養後、ＥＬＩＳＡによって定量化した；４つの実験の累積データ。
【図２】ＣＤ３０／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディによるＣＤ１６Ａを介した事前活性化が、ＩＬ―１５または低服用量ＩＬ―２に応答してＮＫ細胞の増殖および拡大を増加させることを示している：Ａ．  実験準備のスキーム。Ｂ．  代表的なヒストグラムとして描かれた、培地中またはプラスチックコーティング（コーティング）ＡＦＭ１３（１μｇ／ウェル）（ＡＦＭ１３事前活性化と呼ぶ）でのＮＫ細胞の２０時間の培養後のＣＤ２５、ＣＤ１２２およびＣＤ１３２の発現、ならびに培地と比較した倍数変化（５回の実験の累積データ）。コーティングされたマウスＩｇＧ１を、陰性対照（コーティング対照）として使用した。Ｃ．  培地またはコーティングＡＦＭ１３で培養した後、ＣＦＳＥ標識ＮＫ細胞を回収して再播種し、ＩＬ―２（４００Ｕ／ｍＬ）と３〜７日間インキュベートした；その後、ＣＦＳＥ発現をフローサイトメトリーにより測定した；２つの実験の代表的データ（ＭＦＩ値が示されている）。Ｄ．  ＡＦＭ１３事前活性化または培地に続く、ＩＬ―２（４００Ｕ／ｍＬ）での５日間の培養後に評価した、少なくとも４つの分裂（ＣＦＳＥ希釈により計算）を受けたＮＫ細胞の割合；５回の実験の累積データ。Ｅ．  増加する濃度のＩＬ―２（１２．５〜４００Ｕ／ｍＬ）またはＦ．  ＩＬ―１５（０．６〜１０ｎｇ／ｍＬ）で、ＡＦＭ１３で事前に活性化されたＮＫ細胞または対照ＮＫ細胞を５日間培養した後のＣＦＳＥ発現およびＮＫ細胞絶対数；２つの実験のデータ。
【図３】ＡＦＭ１３ばく露に続く一過性機能障害後におけるＮＫ細胞の細胞傷害性の回復を示している：Ａ．実験準備のスキーム。Ｂ．  ＣＤ１６発現を、ＮＫ細胞について、Ｋａｒｐａｓ―２９９細胞とのＡＦＭ１３での２０時間共培養後、またはコーティングＡＦＭ１３（もしくは図２、Ｂの対照）での培養後に測定した；６つの実験の代表的ヒストグラム。Ｃ．  （ａ）コーティングＡＦＭ１３へのばく露後もしくは（ｂ）培地でのＮＫ細胞のＣＤ１６発現、またはコーティングＡＦＭ１３へのばく露に続くもしくは（ｄ）事前ばく露なし（ＩＬ―２のみ）の５日間のＩＬ―２（４００Ｕ／ｍＬ）での培養後のＮＫ細胞のＣＤ１６発現；９つの実験のＭＦＩデータ。Ｄ．  Ｃに記載されているように培養されたＮＫ細胞によるＡＦＭ１３オプソニン化Ｋａｒｐａｓ―２９９細胞の溶解およびＥ  脱顆粒；２〜５回の実験の累積データ（Ｅ：Ｔ  ２．５：１）。Ｆ．  Ｃに記載されているように培養されたＮＫ細胞によるＫ５６２細胞への自然溶解およびＧ．脱顆粒；２〜６回の実験の累積データ（Ｅ：Ｔ  ２．５：１）。
【図４】ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディばく露に続く一過性選択的機能障害後のＮＫ細胞ＩＦＮ―γの回復を示している：Ａ．  ＡＦＭ１３オプソニン化Ｋａｒｐａｓ―２９９細胞、Ｂ．  Ｋ５６２細胞およびＣ．  ＩＬ―１２／１５／１８に応答する、図３、Ｃに記載されているように培養されたＮＫ細胞による細胞内ＩＦＮ―γの発現；２〜４回の実験の累積データ。Ｄ．コーティングＡＦＭ１３によって事前活性化された、または培地で培養されたＮＫ細胞での高アフィニティーＩＬ―１２Ｒβ２およびＩＬ―１８Ｒαの発現（左対ヒストグラム）；ならびに、ＡＦＭ１３ばく露に続いて５日間ＩＬ―２で培養されたＮＫ細胞、または事前ばく露なしでＩＬ―２で培養されたＮＫ細胞（右対ヒストグラム）による発現；４つの実験の代表的データ。
【図５】ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディによる事前活性化が、ＮＫ細胞のメモリー様ＩＦＮ―γ産生および細胞傷害性をプライミングすることを示している：Ａ．  コーティングＡＦＭ１３へのばく露後５日間ＩＬ―２で培養したＮＫ細胞、または事前ばく露なしでＩＬ―２のみで培養したＮＫ細胞による、ＩＬ―１２／１５、Ｋ５６２、Ｌ４２８での２４時間の再刺激に応答するＩＦＮ―γ産生；５回の実験の累積データ。Ｂ．  新鮮分離したＮＫ細胞による、またはコーティングＡＦＭ１３へのばく露後５日間ＩＬ―２で培養したＮＫ細胞、または事前ばく露なしでＩＬ―２のみで培養したＮＫ細胞による、非オプソニン化ＣＤ３０＋Ｋａｒｐａｓ―２９９細胞およびＨＤＬＭ―２細胞、ならびにＣＤ３０?Ｄａｕｄｉ細胞およびＣＤ３０＋Ｌ１２３６細胞の溶解；２〜６回の実験の累積データ。
【図６】サイトカイン刺激にもかかわらず、ＡＦＭ１３への繰り返しばく露後のＮＫ細胞の標的細胞殺傷能力の一過性の低下を示している：Ａ．  実験準備のスキーム：コーティングＡＦＭ１３への２０時間の最初のばく露に続く５日間のＩＬ―２（４００Ｕ／ｍＬ）での培養、およびコーティングＡＦＭ１３へのさらに２日間の２回目のばく露、Ｂ．  Ａに記載のように培養されたＮＫ細胞による、ＡＦＭ１３オプソニン化Ｋａｒｐａｓ―２９９細胞の溶解；（Ｅ：Ｔ  ２．５：１）。
【図７】ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ（ＡＦＭ２４）およびＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ（ＡＦＭ２６）が、それぞれＥＧＦＲ＋標的細胞およびＢＣＭＡ＋標的細胞に応答してＮＫ細胞の機能的活性化を誘導することを示している。ＥＧＦＲ＋Ａ―４３１標的細胞およびＢＣＭＡ＋ＭＭ．１Ｓ標的細胞に対する、ＡＦＭ２４（ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ）およびＡＦＭ２６（ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ）の存在下でのＮＫ細胞の細胞傷害活性が示されている。Ｅ：Ｔ比２．５：１でのエフェクター細胞としてのＯ／Ｎ培養ＮＫ細胞による４時間のカルセイン放出。Ｎ＝２の独立した実験。
【図８】ＡＦＭ２４（ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ）およびＡＦＭ２６（ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ）それぞれへのばく露後の、ＣＤ１６Ａを介したＮＫ細胞機能の回復を示している。Ａ．  ＡＦＭ２４およびＡＦＭ２６にそれぞればく露した後の表現型および機能的ＮＫ細胞回復を評価するための実験スキーム。Ｂ．  ＰＢＳまたは１０μｇ／ｍＬのコーティングＡＦＭ２４およびＡＦＭ２６にそれぞれ２４時間ばく露したＮＫ細胞表面上のＣＤ１６のフローサイトメトリー分析。回復期間中（１日目〜６日目）の提示のサイトカインの非存在下および存在下におけるＣＤ１６の細胞表面発現が示されている。ＮＫ細胞は、フローサイトメトリーでＣＤ４５＋ＣＤ５６＋生存細胞として同定した。Ｃ．  プレートに結合したＡＦＭ２４およびＡＦＭ２６へのばく露時のＮＫ細胞表面でのＣＤ１６発現の定量。Ｎ＝２の独立した実験。Ｄ．  Ｅ：Ｔ比２．５：１でのＡＦＭ２４標的細胞Ａ―４３１およびＡＦＭ２６標的細胞ＭＭ．１Ｓの存在下における特定の細胞傷害性ＮＫ細胞機能の評価。それぞれのタンデムダイアボディを、適用した４時間のカルセイン放出アッセイに補足した（ｃ＝１μｇ／ｍＬ）。ＮＫ細胞を、指示があれば４００Ｕ／ｍＬのＩＬ―２で処理した。Ｎ＝２の独立した実験。
【図９】ＡＦＭ２４（ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ）およびＡＦＭ２６（ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ）それぞれへのばく露後のＣＤ１６Ａを介したＮＫ細胞機能の回復を示している。Ａ．  ＡＦＭ２４およびＡＦＭ２６へのばく露時のＮＫ細胞表面でのＣＤ１６発現の定量。Ｎ＝２の独立した実験。Ｂ．  Ｅ：Ｔ比２．５：１でのＡＦＭ２４標的細胞Ａ―４３１およびＡＦＭ２６標的細胞ＭＭ．１Ｓの存在下における、特定の細胞傷害性ＮＫ細胞機能の評価。それぞれのタンデムダイアボディを、適用した４時間のカルセイン放出アッセイに補足した（ｃ＝１μｇ／ｍＬ）。ＮＫ細胞を、指示があれば１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ―１５で処理した。Ｎ＝２の独立した実験。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本発明は、ＮＫ細胞ベースの免疫療法で使用するための、ＣＤ１６Ａに対する少なくとも１つの抗原結合部位を含む抗原結合タンパク質を提供し、ここで、抗原結合タンパク質は間欠投与され、２つの間欠的、すなわち連続的服用量の間に抗原結合タンパク質へのばく露のない期間を含み、必要に応じて、サイトカインと組み合わされる。
【００２４】
ＮＫ細胞ベースの免疫療法は、ｉｎ  ｖｉｖｏであり得、および／またはｅｘ  ｖｉｖｏ工程、例えば、養子ＮＫ細胞移植または造血幹細胞移植（ＨＣＴ）を含み得、そこでは自己ＮＫ細胞または同種異系ＮＫ細胞のいずれかをサイトカインによって活性化し、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖してから患者に移すことができる。
【００２５】
特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は多価であり、ＣＤ１６Ａ受容体を介したＮＫ細胞への２価結合をもたらす少なくとも２つのＣＤ１６Ａ特異的抗原結合部位を含み、それによりＮＫ細胞の細胞傷害性活性化のアビディティーおよび効力を増加させる。
【００２６】
特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は多重特異性であり、標的、例えば腫瘍細胞またはウイルスに向かってＮＫ細胞をエンゲージさせるために、ＣＤ１６Ａとは異なる標的抗原に特異的な少なくとも１つのさらなる抗原結合部位を含む。
【００２７】
特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａに対する２つの抗原結合部位と、標的抗原、例えば腫瘍抗原またはウイルス抗原に対する２つの抗原結合部位とを含む４価の二重特異性タンデムダイアボディである。
【００２８】
「組み合わせ」という用語は、組み合わせの化合物、すなわちＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質とサイトカインとの同時、個別または連続投与を指す。
【００２９】
本明細書で使用される「被験体」という用語は、ＮＫ細胞ベースの免疫療法によって治療される障害、例えばがんまたはがんに伴う任意の障害に苦しんでいるまたは悩まされている個人、例えば患者を含む。ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の実施形態では、障害は、ＣＤ３０陽性悪性腫瘍、特に、例えば、ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫（ＡＬＣＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）などのＣＤ３０＋リンパ腫である。
【００３０】
「抗原結合タンパク質」という用語は、抗原結合特性を持つ免疫グロブリン誘導体を意味する。本発明の抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａへの結合を介してＮＫ細胞にエンゲージする。抗原結合タンパク質は、免疫グロブリンポリペプチド、その断片、コンジュゲートまたは抗原結合部位を含む免疫学的に機能的な免疫グロブリン部位の融合ペプチドを含み得る。結合タンパク質は、抗原に結合する結合タンパク質の領域、部位またはドメインである少なくとも１つの抗原結合部位を含む。特定の実施形態では、各抗原結合部位は、同じ抗原エピトープに特異的に結合する免疫グロブリンの可変重鎖ドメイン（ＶＨ）および可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）によって形成される。可変重鎖ドメインは、３つの重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。可変軽鎖ドメインは、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）：ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。代替実施形態では、抗原結合部位は重鎖または軽鎖のみからなり得る。例えば、そのような抗原結合部位は、重鎖のみからなり、軽鎖の非存在下でＣＤ１６Ａに結合できるナノボディに由来し得る。ラマまたはラクダに由来するナノボディが発表されている。ＶＬドメインを含まず、ＣＤ１６Ａに対する特異性を有するＶＨベースの抗原結合部位が発表されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）。結合タンパク質は、追加の定常ドメインの有無にかかわらず、ＦｖドメインベースのＩｇＧ様または非ＩｇＧ様融合ペプチドであり得る。本発明の特定の実施形態では、結合タンパク質は免疫グロブリン定常ドメインを欠いている。抗原結合部位の可変重鎖および軽鎖ドメインは、互いに共有結合し、例えばペプチドリンカーによって、または互いに非共有結合し、抗原結合部位を形成することができる。
【００３１】
特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａには結合するがＣＤ１６Ｂには結合しない抗原結合部位を含む。ＣＤ１６Ａに結合するがＣＤ１６Ｂには結合しない重鎖および軽鎖可変ドメインを含む抗原結合部位は、ＣＤ１６Ｂには存在しないＣＤ１６ＡのＣ末端配列ＳＦＦＰＰＧＹＱのアミノ酸残基（配列番号１１）ならびに／または残基Ｇ１３０および／もしくはＹ１４１（配列番号２０）を含むＣＤ１６Ａのエピトープに特異的に結合する抗原結合部位によって提供され得る。ＣＤ１６Ａには結合するがＣＤ１６Ｂには結合しない重鎖および軽鎖可変鎖ドメインを含む抗原結合部位の例は、ＷＯ２００６／１２５６６８に記載されている。
【００３２】
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａに特異的な重鎖および軽鎖可変鎖ドメインを含み、ここで（ｉ）ＣＤ１６Ａに特異的な重鎖可変ドメイン（ＶＨ＿ＣＤ１６Ａ）は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ１；配列番号２または７に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ２；配列番号３に示されるアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲ３を含み、ＣＤ１６Ａに特異的な軽鎖可変ドメインは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ１；配列番号５に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ２；および配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲ３を含む。さらなる実施形態では、抗原結合タンパク質は、（ａ）配列番号８または１０に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ１６Ａに特異的な重鎖可変ドメイン（ＶＨ＿ＣＤ１６Ａ）および／または（ｂ）配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するＣＤ１６Ａに特異的な軽鎖可変ドメイン（ＶＬ＿ＣＤ１６Ａ）を含む。
【００３３】
別の実施形態では、重鎖および軽鎖ドメインは、本明細書に記載のＣＤＲまたはフレームワーク配列の免疫学的に活性な相同体または変異体を組み込む。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＤ１６Ａに結合する重鎖または軽鎖ドメインのＣＤＲ配列は、配列番号１〜７に示されるアミノ酸配列と類似しているが同一ではない。特定の例では、ＣＤＲ変異配列は、免疫学的に活性な配列番号１〜７の配列と比較して、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有する。
【００３４】
さらなる例において、ＣＤＲ変異配列は、１、２、３、４、または５つの保存されたアミノ酸置換を組み込む。保存置換には、所与のアミノ酸を同様の特性の別のアミノ酸で置換するアミノ酸置換が含まれ、さらに脂肪族アミノ酸の中ではアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの交換；ヒドロキシル残基セリンとトレオニンの交換、酸性残基アスパラギン酸とグルタミン酸の交換、アミド残基アスパラギンとグルタミンの置換、塩基性残基リジンとアルギニンの交換、芳香族残基の中ではフェニルアラニンとチロシンの置換が含まれる。
【００３５】
他の例では、ＣＤＲ変異配列を修正し、重要でない残基または重要でない領域の残基を変更する。重要でないアミノ酸は、アフィニティー成熟、ＣＤＲウォーキング変異誘発、部位特異的変異誘発、結晶化、核磁気共鳴、光アフィニティー標識、またはアラニンスキャニング変異誘発などの既知方法で特定することができる。
【００３６】
さらなる代替実施形態では、抗原結合タンパク質は、本明細書で提供される重鎖および軽鎖ドメイン配列の免疫学的に活性な相同体または変異体である重鎖および軽鎖ドメインを含む。したがって、いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、配列番号８〜１０に示されるアミノ酸配列に類似しているが同一ではない重鎖または軽鎖ドメイン配列を含む。特定の例では、変異重鎖または軽鎖ドメイン配列は、免疫学的に活性な配列番号８〜１０の配列と比較して、９９％、９８％、９７％、９６％、９５％、９４％、９３％、９２％、９１％、９０％、８９％、８８％、８７％、８６％、８５％、８４％、８３％、８２％、８１％、または８０％の配列同一性を有する。
【００３７】
さらなる例では、変異重鎖または軽鎖ドメイン配列は、１、２、３、４、または５つの保存されたアミノ酸置換を組み込む。保存置換には、所与のアミノ酸を同様の特性の別のアミノ酸で置換するアミノ酸置換が含まれ、さらに脂肪族アミノ酸の中ではアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンの交換；ヒドロキシル残基セリンとトレオニンの交換、酸性残基アスパラギン酸とグルタミン酸の交換、アミド残基アスパラギンとグルタミンの置換、塩基性残基リジンとアルギニンの交換、芳香族残基の中ではフェニルアラニンとチロシンの置換が含まれる。
【００３８】
さらなる例では、変異重鎖または軽鎖ドメイン配列は、安定性、プロテアーゼに対する耐性、および／またはＣＤ１６Ａに対する結合アフィニティーの増加などのＣＤＲの特性を強化する置換を組み込む。
【００３９】
他の例では、変異重鎖または軽鎖ドメイン配列を修正し、重要でない残基または重要でない領域の残基を変更する。重要でないアミノ酸は、アフィニティー成熟、ＣＤＲウォーキング変異誘発、部位特異的変異誘発、結晶化、核磁気共鳴、光アフィニティー標識、またはアラニンスキャニング変異誘発などの既知方法で特定することができる。
【００４０】
本発明の抗原結合タンパク質は、ＩｇＧ等価ドメインを使用してＩｇＧと同等の半減期を達成するモノクローナル抗体または任意の他の抗体フォーマット、ならびにＨＳＡ結合を使用してその半減期を延長する構築物、特にＩｇＧよりも短い半減期を有する。
【００４１】
「半減期」は排出半減期を指し、適用される投与経路について、ヒトの末梢血で測定される抗原結合タンパク質（すなわち、限定されないが静脈注射または点滴または皮下投与などの血清中の遊離抗体）の濃度がその初期量の半分に達するのに必要な期間である。
【００４２】
特定の実施形態では、抗原結合タンパク質の半減期は、１週間未満、特に７２時間、４８時間、４２時間、３６時間、２４時間、２０時間、１２時間または６時間未満である。そのような短い半減期は、本発明のばく露のない期間またはばく露低減期間を含む間欠投与を採用するのに有利であり、なぜなら、抗原結合タンパク質の２回の結果的および間欠的服用量の間の間隔のばく露のない期間が短いままとなるためである。
【００４３】
モノクローナル抗体の半減期よりも著しく短いそのような短い半減期は、本発明の間欠投与レジメンを可能し、なぜなら、それが抗原結合タンパク質の２回の連続した服用量の間に抗原結合タンパク質を除去した後のばく露低減期間またはばく露のない期間の提供を可能にするためである。そのような抗原結合タンパク質のばく露低減期間またはばく露のない期間は、ＮＫ細胞の回復に重要である。本明細書で使用される用語「ばく露低減」は、上記のように測定された抗原結合タンパク質の初期量の半分未満である抗原結合タンパク質の量、すなわち血漿濃度を指す。したがって、「低ばく露」という用語は、投与後の抗原結合タンパク質の半減期後に達する抗原結合タンパク質の量を指す。例えば、用語「ばく露低減」は、最初に投与された抗原結合タンパク質の服用量の４０％、３０％、２０％、および１５％未満、例えば１５―４０％、１５―３０％または１５―２０％などの量を指し得る。
【００４４】
本明細書で使用する「ばく露のない」という用語は、抗原結合タンパク質の服用量の１５％以下に相当する抗原結合タンパク質の少なくとも３半減期後の量よりも少ない抗原結合タンパク質の量、すなわち血漿濃度を指す。好ましくは、「ばく露のない」とは、抗原結合タンパク質の少なくとも４〜５半減期後の量よりも少ない抗原結合タンパク質の量、すなわち血漿濃度を指す。好ましくは、「ばく露のない」とは、抗原結合タンパク質の服用量の１０％、１％または０．１％未満である抗原結合タンパク質の量、すなわち血漿濃度を指す。
【００４５】
モノクローナル抗体よりも著しく短い半減期を有する本発明の抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体と比較して分子量が低い組み換え抗体誘導体により提供され得る。
【００４６】
本発明の短い半減期を有する抗原結合タンパク質の例には、非ＩｇＧ様抗体断片、または、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片などの免疫学的に機能的な免疫グロブリン部位の融合ペプチド、例えば単鎖Ｆｖ、タンデム単鎖Ｆｖ（（ｓｃＦｖ）２）、二重特異性キラーエンゲージャー（ＢｉＫＥ）、三重特異性キラーエンゲージャー（ＴｒｉＫＥ）、二重アフィニティー再標的化抗体（ＤＡＲＴ（商標））、ダイアボディ、ダイアボディ（Ｄｂ）、単鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）およびタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、およびドックアンドロック（ＤＮＬ）法によって生成されたナノボディまたは抗原結合タンパク質；トライアボディ、トライボディが含まれる。抗原結合タンパク質は、本質的にＦｖドメインをベースにしていてもよく、あるいは、１つ以上の定常抗体ドメインも含んでいてもよい。価数、多重特異性、薬物動態および薬力学的特性などの所望の機能に応じて、Ｆｖおよび／または定常ドメインおよび／または追加の機能ドメインは、例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ、ｍＡｂｓ、２０１７、９（２）：１８２−１９２もしくはＳｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６７：９５−１０６に記載されているように、異なるフォーマットまたは足場でモジュール式に組み立てられてもよい。例えば、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ、ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａ、またはＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディなどのタンデムダイアボディは２４時間、２２時間、または２０時間未満の半減期を有するが、タンデム単鎖Ｆｖ（（ｓｃＦｖ）２）は約５時間、４時間、３時間、または特に２時間未満の半減期を有する。
【００４７】
さらに、結合タンパク質は多価であってもよく、すなわち２つ以上の抗原結合部位を含んでいてもよい。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａに対する少なくとも２つの抗原結合部位を含み、すなわち２価ＣＤ１６Ａに結合する。いくつかの実施形態では、結合タンパク質は、精製用にタグアミノ酸配列を含む。
【００４８】
特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は多重特異性であり、ＣＤ１６Ａとは異なる標的抗原に結合する少なくとも１つのさらなる抗原結合部位を含み、すなわち第２の異なる抗原特異性を有する。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、標的抗原に対する少なくとも２つの抗原結合部位を含み得る。
【００４９】
「標的抗原」は、典型的には、ＮＫ細胞の細胞傷害性を引き起こすように、抗原結合タンパク質によってＮＫ細胞が向けられる部位に関連する抗原、例えば細胞またはウイルスを指す。標的部位の例は、腫瘍細胞またはウイルスもしくは細菌病原体もしくは寄生虫などの感染性病原体、例えばデングウイルス、単純ヘルペス、インフルエンザウイルス、ＨＩＶ、または自己免疫標的、自己免疫マーカーもしくは自己免疫抗原を運ぶ細胞であり得る。
【００５０】
ＣＤ１６Ａとは異なる標的抗原は、細菌物質、ウイルスタンパク質、自己免疫マーカーまたは腫瘍抗原から選択され得る。
【００５１】
標的抗原が腫瘍抗原である実施形態では、腫瘍抗原は、腫瘍細胞表面抗原、例えば特定の腫瘍マーカー、またはＭＨＣクラス分子によって提示されるＭＨＣ制限ペプチドから選択され得る。本明細書で使用される「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を含む。「腫瘍細胞表面抗原」という用語は、腫瘍細胞の表面上の抗体によって認識されることができる任意の抗原またはその断片を指す。
【００５２】
腫瘍細胞の標的抗原の例には、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、マトリックスメタロプロテイナーゼ１（ＭＭＰ１）、ラミニン受容体前駆体タンパク質、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、Ｅｐ―ＣＡＭ、ＰＬＡＰ、Ｔｈｏｍｓｅｎ―Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ（ＴＦ）抗原、ＭＵＣ―１（ムチン）、ＩＧＦＲ、ＩＬ４―Ｒアルファ、ＩＬ１３―Ｒ、ＦｃεＲＩ、ＩｇＥ、ＶＧＥＦ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＰＳＭＡ、ＣＥＡ、ＴＡＧ―７２、ＨＰＶ  Ｅ６、ＨＰＶ  Ｅ７、ＢＩＮＧ―４、サイクリン―Ｂ１、９Ｄ７、ＥｐｈＡ３、テロメラーゼ、メソセリン、ＳＡＰ―１、サバイビン、がん精巣抗原（ＢＡＧＥファミリー、ＣＡＧＥファミリー、ＧＡＧＥファミリー、ＭＡＧＥファミリー、ＳＡＧＥファミリー、ＸＡＧＥファミリー）、ＮＹ―ＥＳＯ―１／ＬＡＧＥ―１、ＰＲＡＭＥ、ＳＳＸ―２、Ｍｅｌａｎ―Ａ／ＭＡＲＴ―１、Ｇｐ１００／ｐｍｅｌ１７、チロシナーゼ、ＴＲＰ―１／―２、ＭＣ１Ｒ、β―カテニン、ＢＲＣＡ１／２、ＣＤＫ４、ＣＭＬ６６、ＭＡＲＴ―２、ｐ５３、Ｒａｓ、ＴＧＦ―βＲＩＩおよびＴＣＲ（Ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ、Ｈｏｌｌａｎｄ−Ｆｒｅｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００３より）が含まれるが、これらに限定されない。さらなる腫瘍抗原については、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、Ｒ．、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ、２０１３に記載されている。
【００５３】
特定の実施形態では、多重特異性である抗原結合タンパク質は、標的抗原に対する少なくとも２つの抗原結合部位を含む。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、ＣＤ１６Ａに対する少なくとも２つの抗原結合部位と、標的抗原に対する少なくとも２つの抗原結合部位とを含む。そのような抗原結合タンパク質は、少なくとも４価である。
【００５４】
特定の実施形態では、二重特異性で４価のタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））が提供される。タンデムダイアボディは、２つ以上の異なるＦｖドメインからの重鎖および軽鎖の４つの可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ）を単一のポリペプチドで連結することにより構築される。これらのドメインは、ポリペプチドの２つの分子が頭尾の形で整列するときに、対応するＶＨとＶＬとが対になるように配置される。ドメイン間の短いリンカー（１２個以下のアミノ酸）は、Ｆｖの分子内対合を防ぐ。タンデムダイアボディおよびその製造については、Ｗｅｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１５；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ、２００９またはＫｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ、２００３に記載されている。
【００５５】
実施例では、とりわけ、ＣＤ３０およびＣＤ１６Ａに対して特異性を有する二重特異性で４価のＣＤ３０／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディＡＦＭ１３（ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ）が例示されており、Ｒｅｕｓｃｈ、ｅｔ  ａｌ．、２０１４に記載されている。このＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、アイソフォームＣＤ１６Ａのみに結合することにより、ＮＫ細胞を特異的に動員する。本明細書に記載のＣＤ３０およびＣＤ１６Ａ二重特異性タンデムダイアボディは、細胞傷害性ＮＫ細胞を動員することによりＣＤ３０＋腫瘍細胞の特異的標的化を可能にするように設計されている。そのようなタンデムダイアボディでは、リンカー長は、可変ドメインの分子内対合を防止するほどのものであるため、分子は折り返されて単鎖ダイアボディを形成することはできず、別の鎖の相補的ドメインと対合せざるを得ない。ドメインはまた、この二量体化中に対応するＶＨおよびＶＬドメインが対になるように配置される。単一の遺伝子構築物からの発現に続いて、２つの同一のポリペプチド鎖が頭尾に折りたたまれ、約１０５ｋＤａの機能的非共有ホモ二量体を形成する。分子間共有結合が存在しないにもかかわらず、ホモ二量体は一度形成されると非常に安定であり、無傷に保たれ、単量体の形には戻らない。
【００５６】
タンデムダイアボディは抗体可変ドメインのみを含み、したがって、Ｆｃ部位に関連し得る副作用または非特異的相互作用がないと考えられている。例えば、Ｆｃ受容体は、Ｆｃガンマに結合できる白血球またはクッパー細胞などの多くの細胞型に見られる。タンデムダイアボディは、標的抗原のそれぞれ、例えば、ＣＤ３０、およびＣＤ１６Ａへの２価結合を可能にするため、アビディティーはＩｇＧのアビディティーと同じである。約１０５ｋＤａであるタンデムダイアボディのサイズは、ＩｇＧのサイズよりも小さく、腫瘍浸透を促進する可能性がある。しかしながら、このサイズは初回通過腎クリアランスの閾値を大きく上回っており、抗体結合ドメインまたは非抗体足場ベースのより小さな二重特異性フォーマットと比較して薬物動態上の利点がある。ＣＤ３０／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディＡＦＭ１３などのタンデムダイアボディの半減期は、約１９時間である。タンデムダイアボディは、例えば哺乳動物ＣＨＯ細胞などの宿主細胞でよく発現している。タンデムダイアボディには、安定した上流および下流の製造プロセスが利用可能であると考えられる。
【００５７】
本明細書で使用される「間欠」投与は、抗原結合タンパク質を間隔をあけて、特に規則的間隔で投与する方法である。したがって、抗原結合タンパク質の初回服用量が投与され、抗原タンパク質の２回目の服用量が初回服用量に続いて投与される。好ましくは、第１および第２服用量の投与間隔は、１治療サイクルについて数回繰り返される。抗原結合タンパク質の２回の連続した服用量の間の間隔は、抗原結合分子へのばく露が、抗原結合タンパク質の薬物動態学的特徴、例えば半減期に基づいて間欠的であるように選択され、それにより、少なくともばく露低減、または、好ましくは、２回の連続した服用量の間のばく露のない期間が可能になる。抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質のばく露は、ＮＫ細胞の効力を一時的に低下させる可能性がある。ＮＫ細胞の細胞傷害性を効率的に回復させるためには、抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質のばく露、すなわち濃度を低く保つか、回復フェーズ中に存在させないことが重要である。したがって、その間隔は、抗原結合タンパク質がほとんど除去された後にばく露低減期間またはばく露のない期間をその間隔が含むことを確実にするために、その期間が抗原結合タンパク質の半減期よりも長くなるように選択される。
【００５８】
したがって、間欠投与の間隔は、抗原結合タンパク質の半減期の倍数である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、その間隔は、抗原結合タンパク質の半減期より少なくとも１日長くてもよい。
【００６０】
特定の実施形態では、その間隔は、抗原結合タンパク質の半減期の少なくとも３倍である。例えば、その間隔は、抗原結合タンパク質の半減期の少なくとも３倍〜少なくとも５倍、例えば少なくとも３、３．５、４、４．５または５倍であり得る。本発明の文脈において、ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質は、その半減期の少なくとも３倍、好ましくは４〜５倍後に希釈されているまたは非存在とみなされる。
【００６１】
特定の実施形態では、ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の２回の連続した服用量の間の間隔は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０日であり得、ここでその間隔は抗原結合タンパク質の半減期に依存し、抗原結合タンパク質のばく露低減期間またはばく露のない期間を含むように選択される。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、連続服用量、すなわち初回服用量とその後の２回目の服用量の投与サイクルで間欠投与され、ここで２回の連続した服用量の間の間隔は、少なくとも３日である。
【００６２】
好ましくは、抗原結合タンパク質の初回服用量およびその後の２回目の服用量を含む投与サイクルは、複数回、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０回以上、所望の治療サイクルが完了するまで、および／または疾患の進行が診断されている間、および／または事前に定義した臨床的エンドポイントが達成されるまで、例えば４週間または８週間または６か月間、繰り返される。
【００６３】
本発明は、本明細書に記載の抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質を間欠投与する工程と、少なくとも１つのサイトカインを投与するさらなる工程とを含む方法を提供する。したがって、本発明は、ＮＫ細胞ベースの免疫療法で使用するための、本明細書に記載の抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質を提供し、ここで抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質が間欠投与され、さらに、少なくとも１つのサイトカインが投与される。
【００６４】
サイトカインは、ＮＫ細胞活性化サイトカインであり、インターロイキンのファミリーから選択することができる。本明細書で使用される「サイトカイン」という用語は、単一種類のサイトカインまたは異なる種類のサイトカインの組み合わせとして理解されるべきであり、ここでサイトカインの組み合わせは、同時に、別々に、または連続して投与され得る。したがって、サイトカインは、抗原結合タンパク質の服用量の前に、同時にまたは後に投与され得る。これには、抗原結合タンパク質の投与前または投与後のサイトカインの複数回の反復服用量が含まれる。抗原結合タンパク質は間欠投与されるが、サイトカインは連続的または間欠的に投与されてもよい。後者の実施形態では、抗原結合タンパク質およびサイトカインは間欠投与され得る。抗原結合タンパク質およびサイトカインが間欠投与される実施形態では、抗原結合タンパク質およびサイトカインの投与の時間および間隔は異なり得る；したがって、抗原結合タンパク質とサイトカインとは同時投与されない。
【００６５】
したがって、サイトカインは、抗原結合タンパク質の各投与に続いて投与されてもよく、またはサイトカインの２回以上のその後の投与のサイクルは抗原結合タンパク質の投与に続いてもよい。例えば、活性化ＮＫ細胞の量は、抗原結合タンパク質による前処理の後に低服用量のＩＬ―２を投与することにより増加させることができる。
【００６６】
例えば、サイトカインは、インターロイキン２（ＩＬ―２）、インターロイキン６（ＩＬ―６）、インターロイキン１２（ＩＬ―１２）、インターロイキン１５（ＩＬ―１５）、インターロイキン１８（ＩＬ―１８）、インターロイキン２１（ＩＬ―２１）またはそれらの組み合わせからなる群より選択され得る。特定の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ―２またはＩＬ―１５またはＩＬ―１２、ＩＬ―１５およびＩＬ―１８の組み合わせ、特にＩＬ―２およびＩＬ―１５の組み合わせである。好ましくは、ＩＬ―２は「低服用量」として投与される。ＩＬ―２の適切な低服用量は、皮下で約６００万ユニット／ｍ２／日未満の量である（Ｌｉｓｓｏｎｉ  Ｐ；１９９３；Ｒｏｍｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）。
【００６７】
ＩＬ―２の低服用量の投与は、Ｔｒｅｇの活性化など、ＩＬ―２の望ましくない副作用のリスクを減らし、活性ＮＫ細胞の数を増やし、それによって患者の治療効果を高める。ＮＫ細胞を活性化するためのインターロイキンは、Ｒｏｍｅｅ、Ｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０１４で報告されている。
【００６８】
「サイトカイン」という用語は、サイトカインを介した免疫機能の強化をもたらすためのサイトカインを含む組成物および／または薬剤も指す。そのような薬剤は、副作用をさらに低減し、サイトカイン投与の分布および／または薬物動態を調節するように開発されてきた。例えば、サイトカインは、生物活性が増加し、半減期が延長された複合体で提供される。そのような複合体は、抗体で、例えば週に１回の投与レジメンなどで投与することができる。本発明のサイトカインとして使用できるそのようなサイトカイン複合体の例は、ＰＥＧ鎖に結合したＩＬ―２を含む生物学的プロドラッグであるＮＫＴＲ―２１４（Ｃｈａｒｙｃｈ、Ｄ．、ｅｔ  ａｌ．、２０１６）、ＰＥＧ鎖に結合したＩＬ―１５を含む生物学的プロドラッグであるＮＫＴＲ―２５５（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＵＳＡ）またはＩＬ―１５スーパーアンタゴニスト（ＩＬ―１５Ｎ７２Ｄ）を細胞外ＩＬ―１５Ｒα  ｓｕｓｈｉドメイン（ＩＬ―１５ＲαＳｕ）に融合させることにより構築された多量体複合体であるＡＬＴ―８０３（Ｌｉｕ、Ｂ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）である。
【００６９】
特定の実施形態では、多重特異性抗原結合タンパク質、例えば、免疫療法、例えばＮＫ細胞ベースの免疫療法で使用するための、ＣＤ１６Ａに２価結合する二重特異性抗原結合タンパク質が提供され、ここで抗原結合タンパク質は、被験体に間欠投与される。例えば、その抗原結合タンパク質は、例えばＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６ＡまたはＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディなどのタンデムダイアボディであってもよい。
【００７０】
さらなる実施形態では、ＣＤ１６Ａに結合する抗原結合タンパク質は、間欠的かつサイトカインと組み合わせて、被験体に投与されることになる。サイトカインは、抗原結合タンパク質と交互に、または抗原結合タンパク質の反復服用量、すなわち間欠服用量とともに連続的に投与され得る。特定の実施形態では、抗原結合性タンパク質の初回服用量とその後のサイトカインの服用量との間の期間または間隔は、抗原結合性タンパク質の排出（半減期）に合わせて調整され得る。したがって、そのような実施形態では、サイトカインの服用量は、抗原結合タンパク質の大部分が除去され、抗原結合タンパク質の半減期が経過した後に投与されることになる。サイトカインの投与は、抗原結合タンパク質へのばく露後にＮＫ細胞を再刺激することを目的としている。したがって、抗原結合タンパク質が大幅に除去された後に、サイトカインの服用量を投与する必要がある。
【００７１】
したがって、ＮＫ細胞ベースの免疫療法で使用するための、ＣＤ１６Ａに対する少なくとも１つの抗原結合部位を含む抗原結合タンパク質は、以下の工程を含む投薬サイクルで間欠投与することができる：
（ａ）ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の初回服用量を投与する工程と；
（ｂ）ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の２回目の服用量を投与する工程、
投薬サイクルは、少なくとも１つのサイトカインの投与、すなわち、工程（ａ）から工程（ｂ）の間隔の間に、少なくとも１つのサイトカインの服用量を投与する工程（ｃ）をさらに含む。好ましくは、ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の２回目の服用量は、抗原結合タンパク質の半減期の少なくとも３倍後に、工程（ａ）に続いて投与される。
【００７２】
特定の実施形態では、抗原結合タンパク質の服用量に続いてサイトカインが投与される場合、サイトカインは、抗原結合タンパク質の初回服用量の少なくとも２０時間後に投与される。したがって、サイトカインは  ―  抗原結合タンパク質の半減期に応じて  ―  抗原結合タンパク質の初回服用量の少なくとも２０時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、７０時間、８０時間、９０時間または１００時間後に投与され得る。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質がタンデムダイアボディであり、ばく露のない期間が望まれる場合、サイトカインは、タンデムダイアボディの初回服用量の少なくとも約８０〜１００時間後に投与され得る。他の実施形態では、サイトカインは、この時点ですでにばく露が低減されているタンデムダイアボディの初回服用量の約２０〜３６時間後に投与され得る。
【００７３】
例えば、抗原結合タンパク質およびサイトカインは、以下の工程を含む投薬サイクルで投与されることになる：
（ａ）抗原結合タンパク質の初回服用量を投与する工程と；
（ｂ）工程（ａ）に続いて、少なくとも１つのサイトカインを投与する工程と；
（ｃ）工程（ｂ）に続いて、抗原結合タンパク質の２回目の服用量を投与する工程。
【００７４】
この投薬サイクルは、好ましくは少なくとも進行性疾患が診断されるまで、および／または所望の臨床的エンドポイントが達成されるまで繰り返すことができる。
【００７５】
抗原結合タンパク質の２回の連続投与（工程（ａ）および（ｃ））の間隔は、ＮＫ細胞の効力を再刺激するためのものである。特定の実施形態では、工程（ｂ）でサイトカインを投与する時間は、少なくとも工程（ａ）の抗原結合タンパク質の初回服用量の半減期後である。
【００７６】
本発明の抗原結合タンパク質の短い半減期は、間欠投与レジメンの適用を保証する。サイトカインの後続する服用量によるＮＫ細胞の再刺激のために、前の服用量の抗原結合タンパク質を大幅に除去し、ＮＫ細胞が抗原結合タンパク質にさらされないようにする必要がある。その結果、４８時間未満、特に２４時間未満の半減期を有する抗原結合タンパク質の使用により、本明細書に記載の間欠投与レジメンが確実になる。本明細書に記載のＣＤ３０／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディＡＦＭ１３などのタンデムダイアボディの半減期は、ヒトで約１９時間である（Ｒｏｔｈｅ、ｅｔ  ａｌ．、２０１５）。したがって、本発明によれば、サイトカインの服用量は、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディの初回服用量の少なくとも１９時間後、例えば２０時間後に投与することができる。あるいは、１９時間未満の半減期を有する他の抗原結合フォーマット、例えば抗体フラグメントまたは単鎖もしくは多鎖Ｆｖ構築物などを使用することができる。あるいは、サイトカインは、抗原結合タンパク質の服用量の前にまたは同時に投与されてもよく、またはサイトカインは連続的に投与されてもよい。したがって、ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質へのばく露中に、サイトカインがバックグラウンドに存在する可能性がある。しかしながら、ＮＫ細胞の細胞傷害性の回復のためには、（ａ）抗原結合タンパク質の初回服用量と（ｂ）抗原結合タンパク質の２回目の服用量との間の投薬サイクルが、それぞれのばく露低減期間、または、好ましくは、抗原結合タンパク質を本質的に含まないばく露のない期間も含むことが必要である。
【００７７】
特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、二重特異性で４価のタンデムダイアボディ、すなわちＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ、例えばＡＦＭ１３である（Ｒｅｕｓｃｈ、ｅｔ  ａｌ．、２０１４）。これらの実施形態では、ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、ＣＤ３０＋がん、例えばホジキンリンパ腫の治療に使用される。
【００７８】
したがって、本明細書で提供されるのは、特定の医療用途および方法において、
ＣＤ３０およびＣＤ１６Ａに特異的な抗原結合タンパク質、例えばＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディであり、本明細書で上述したように、ＣＤ３０＋がん、例えばホジキンリンパ腫などの治療のために、有効服用量で被験体に投与される。ホジキンリンパ腫には、新たに診断された、再発した、再発性または難治性のホジキンリンパ腫が含まれる。
【００７９】
本明細書に記載の新規間欠投薬レジメンは、ＮＫ細胞の抗体を介したエンゲージメントの免疫療法的アプローチで使用される。そのようなＮＫ細胞ベースの免疫療法は、腫瘍、自己免疫疾患またはウイルス感染の治療に使用することができる。
【００８０】
本発明によるＮＫ細胞療法は、ＮＫ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ刺激の工程を含み得る。この工程では、自己ＮＫ細胞は、治療を受ける被験体から採取され得るか、または同種異系ＮＫ細胞をドナーから採取され得る。同種異系ＮＫ細胞の由来は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、臍帯血、幹細胞分化、または「既製」系統ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫ―９２細胞株およびその誘導体）であり得る。
【００８１】
精製後、ＮＫ細胞を、フィーダー細胞刺激、例えばＩＬ―２、ＩＬ―１２、ＩＬ―１５、ＩＬ―１８、ＩＬ―２１およびそれらの組み合わせを含むサイトカインカクテルを含む報告されているプロトコルに従い、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖する。注入後、これらの増殖した細胞を、支持的な低服用量のＩＬ―２、ＩＬ―１５（Ｋｏｅｈｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６およびＲｏｍｅｅ  ｅｔ  ａｌ．、２０１６）またはＡｌｔｏｒ―８０３などのスーパーアゴニストで処理する。同様の手順は自己ＮＫ細胞にも適用される。ＮＫ細胞のそのような養子移植の臨床的成果は、標的特異的ＮＫ細胞抗原結合タンパク質による腫瘍標的化の恩恵を受ける可能性がある。抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の効果は、内因性および養子移植（自己および同種異系）ＮＫ細胞と同等であると予想される。
【００８２】
投与はさまざまな方法で行われ、例えば静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所または皮内投与で行われる。結合タンパク質およびインターロイキンの服用量は、担当医および他の臨床的要因により決定される。任意の１人の被験者への投薬量は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与する特定の化合物、投与の時間と経路、治療の種類、全体的な健康状態および同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依存する。「有効服用量」とは、疾患の経過および重症度に影響を与え、そのような病状の軽減または寛解をもたらすのに十分な活性成分の量を指す。ホジキンリンパ腫の治療および／または予防に有用な「有効服用量」は、既知方法を使用して決定することができる。
【実施例】
【００８３】
以下の実施例は、本発明の範囲を限定することなく、記載の実施形態をさらに説明するものである：
【００８４】
（実施例１）
（ＮＫ細胞の分離および培養）
ＰＢＭＣを、健康な成人ドナーの軟膜（Ｂｌｕｔｂａｎｋ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）から、Ｆｉｃｏｌｌ―Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配（密度１．０７７、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、ＶＷＲ）またはＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度勾配（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ：０７８６１）遠心分離により分離した。ＮＫ細胞を、ＰＢＭＣから、ＬＳ分離カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用する「ヒトＮＫ細胞分離キット」（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）または「ＭｏｊｏＳｏｒｔ（商標）ヒトＮＫ細胞分離キット」（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用するネガティブセレクションにより精製した。ＰＢＭＣからＮＫ細胞を枯渇させるために（ＰＢＭＣ  ΔＮＫ）、ＣＤ５６マイクロビーズをポジティブセレクション（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）に使用した。新鮮分離されたＮＫ細胞（以降「ナイーブ」と呼ぶ）を、１０％ヒト血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＳＣＧＭ培地（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）で一晩維持した；完全ＲＰＭＩ培地中のＰＢＭＣおよびＰＢＭＣ  ΔＮＫ。
【００８５】
あるいは、分離したＰＢＭＣを、１０％ＦＣＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０２７０―１０６）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地で一晩培養した。ＮＫ細胞の濃縮のために、ＰＢＭＣを一晩培養物から回収し、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ヒトＮＫ細胞濃縮キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ：１７９５５）を使用する１回のネガティブセレクションに使用した。
【００８６】
（タンデムダイアボディ（ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６ＡまたはＢＣＭＡ／ＣＤ１６ＡによるＮＫ細胞の活性化）
ＮＫ細胞を、２４ウェルプレートにおいてＣＤ３０＋Ｋａｒｐａｓ―２９９またはＬ４２８細胞と１：１の比率（各１ｘ１０６細胞）で、０．１〜１μｇ／ｍＬのＡＦＭ１３（ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ）またはＡＦＭ１２（ＣＤ１９／ＣＤ１６Ａ）の存在下で、２０時間完全ＲＰＭＩ培地で共培養した。あるいは、ＮＫ細胞を、０．５μｇ／ウェル（一晩コーティングした０．５ｍＬのＰＢＳあたり１０μｇ／ｍＬ）のＰＢＳ中ＡＦＭ１３、リツキシマブ（ＭａｂＴｈｅｒａ；Ｒｏｃｈｅ）、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ、ＢＣＭＡ／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディまたはマウスＩｇＧ１（ヒトＣＤ１６Ａにエンゲージしない；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）でコーティングした２４ウェルプレート（組織培養用の処理なし）で２０時間培養した。指示された場合、ＮＫ細胞を、ＩＬ―２（１２．５〜４００Ｕ／ｍＬ、ＮＩＨまたはＳｉｇｍａ）、ＩＬ―１５（０．６〜１０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）またはＩＬ―１２（１０ｎｇ／ｍＬ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、ＩＬ―１５（２０ｎｇ／ｍＬ）およびＩＬ―１８（１００ｎｇ／ｍＬ、ＭＢＬ）の組み合わせ（以降ＩＬ―１２／１５／１８と呼ぶ）で処理し、完全ＳＣＧＭ培地で２〜５日間培養した。
【００８７】
（ＮＫ細胞の増殖および数）
ＮＫ細胞培養液に２μＭのＣＦＳＥ（Ｓｉｇｍａ―Ａｌｄｒｉｃｈ）を入れ、室温で１５分間暗所でインキュベートし、その後５ｍＬの純粋なＦＣＳおよび５ｍＬのＲＰＭＩ培地で洗浄した。次いで、ＮＫ細胞を、単回服用量のＩＬ―２（１２．５〜４００Ｕ／ｍＬ）またはＩＬ―１５（０．６〜１０ｎｇ／ｍＬ）とともに、０．５ｘ１０６／ｍＬの低細胞密度で、２４ウェルプレート中完全ＳＣＧＭ培地で３〜７日培養した。ＣＦＳＥ発現を、フローサイトメトリーにより測定した。ＣＦＳＥ希釈ピークから導き出されるように、４回以上の分裂を経たＮＫ細胞の割合を計算することにより、ＣＦＳＥ希釈を定量化した。ＮＫ細胞の増殖を評価するためのＮＫ細胞絶対数は、トリパンブルー陰性細胞およびライフゲーティング細胞をそれぞれ顕微鏡検査およびフローサイトメトリー（ビーズのカウントと比較）でカウントすることによって得た。
【００８８】
（５１Ｃｒ放出アッセイ、脱顆粒およびＩＦＮ―γ）
５１Ｃｒ放出アッセイでは、ＮＫ細胞を、ＡＦＭ１３、ＡＦＭ１２、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ、ＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディまたはキメラ抗ＣＤ３０  ＩｇＧ抗体の存在下で５１Ｃｒ標識標的細胞とともに４時間共培養した。脱顆粒および細胞内ＩＦＮ―γ発現では、ＮＫ細胞を、１：１比の標的細胞（各５ｘ１０４細胞）なし／ありで、イオノマイシン（１ｍＭ）とともに抗体、ＩＬ―１２／１５／１８またはＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）と、丸底９６ウェルプレートで４時間、抗ＣＤ１０７ａ-ＰＥ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＧｏｌｇｉＰｌｕｇ（１／１００ｖ／ｖ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）の存在下で共培養した。細胞外ＣＤ１０７ａ（脱顆粒のマーカー）および細胞内ＩＦＮ―γの発現を、フローサイトメトリーで測定した。
【００８９】
細胞上清へのＩＦＮ―γの分泌を、ＮＫ細胞の腫瘍細胞（１：１比）またはＩＬ―１２／１５との２４時間の共培養後に、ヒトＩＦＮ―γ「ＥＬＩＳＡ  ＭＡＸ」キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して分析した。
【００９０】
（４時間のカルセイン放出細胞傷害性アッセイ）
カルセイン放出細胞傷害性アッセイでは、指示された標的細胞を培養物から回収し、ＦＣＳを含まないＲＰＭＩ  １６４０培地で洗浄し、１０μＭカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ：  Ｃ３１００ＭＰ）で３０分間、ＦＣＳを含まない３７℃のＲＰＭＩ培地において標識した。洗浄後、標識細胞を、完全ＲＰＭＩ培地（１０％熱不活性化ＦＣＳ、４ｍＭのＬ―グルタミン、１００μＵ／ｍＬのペニシリンＧナトリウム、１００μｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ  １６４０培地）に再懸濁した。１ｘ１０４の標的細胞を、Ｅ：Ｔ比２，５：１での初代ヒトＮＫ細胞および指示された抗体とともに、丸底９６ウェルマイクロプレートの個々のウェルに総量２００μＬ／ウェルで２連で播種した。抗体の非存在下でのエフェクターによる自然放出、最大放出および標的の殺傷を、各プレート上で４連で決定した。
【００９１】
２００ｇで２分間の遠心分離後、アッセイを、４時間３７℃で５％ＣＯ２の加湿雰囲気においてインキュベートした。５００ｇで５分間の追加の遠心分離後、各ウェルから１００μＬの細胞培養上清を回収し、放出されたカルセインの蛍光を、５２０ｎｍで、蛍光プレートリーダー（ＥｎＳｉｇｈｔ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して測定した。測定されたカウントに基づいて、次の式に従って特定の細胞溶解を計算した：［蛍光（試料）―蛍光（自然）］／［蛍光（最大）―蛍光（自然）］ｘ１００％。蛍光（自然）は、エフェクター細胞および抗体の非存在下での標的細胞からの蛍光カウントを表し、蛍光（最大）は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ―１００の添加により誘導される全細胞溶解を表す。
【００９２】
（フローサイトメトリー）
ＩＦＮ―γおよびパーフォリン／グランザイムＢの細胞内染色は、「ＦｏｘＰ３染色バッファーセット」（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および「Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ」キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をそれぞれ使用した細胞外染色後に実施した。試料をＦＡＣＳ  ＣａｌｉｂｕｒまたはＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で取得し、ＦｌｏｗＪｏ  １０ソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ  ＬＬＣ）で分析した。
【００９３】
ＮＫ細胞の表面マーカー発現は、ＣＤ４５  ＰｅｒＣｐＣｙ５．５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；５５８４１１）、ＣＤ１６  ＢＶ４２１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ；３０２０３８）、ＣＤ５６  ＰＣ７（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ；Ａ２１６９２）、および固定可能な生死判別色素ｅＦ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；６５―０８６４―１４）を使用して決定した。ＣｙｔｏＦＬＥＸ  Ｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で試料を取得し、ＣｙｔＥｘｐｅｒｔ  ２．１ソフトウェアを使用して分析した。
【００９４】
（実施例２）
（ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ（ＡＦＭ１３）は、ＣＤ３０＋リンパ腫細胞に応答するＮＫ細胞の機能的および表現型の活性化を誘導する）
二重特異性４価タンデムダイアボディＡＦＭ１３（ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ）の存在は、古典的ホジキンリンパ腫、未分化大細胞リンパ腫、および非ホジキンリンパ腫のＣＤ３０＋がん細胞株に対する新鮮分離されたＮＫ細胞の細胞傷害活性を、４時間の５１Ｃｒ放出アッセイにおいて有意に改善した（図１、Ａ）。これは、ナイーブＮＫ細胞に耐性を示すＣＤ３０＋腫瘍細胞に対して特に顕著であった。対照的に、ＣＤ３０?細胞の溶解はＡＦＭ１３タンデムダイアボディによって変化しなかったが、一方でＣＤ１９＋ＣＤ３０-Ｄａｕｄｉ細胞の溶解は、ＡＦＭ１２タンデムダイアボディ（ＣＤ１９／ＣＤ１６Ａ）によって増加させることができた。ＡＦＭ１３タンデムダイアボディは１０―３μｇ／ｍＬの低濃度で効果的であり、従来の抗ＣＤ３０  ＩｇＧ１抗体よりも桁違いに強力であった（図１、Ｃ）。全体として、ＡＦＭ１３を介した溶解の割合は、精製ＮＫ細胞と一致したＮＫ細胞―標的比のＰＢＭＣとの間で同等であったが、一方でＮＫ細胞枯渇ＰＢＭＣは腫瘍細胞溶解を誘導できなかった（図１、Ｄ）。
【００９５】
ＡＦＭ１３を介したＮＫ細胞の細胞傷害性は、ＩＬ―２、ＩＬ―１５またはＩＬ１２／１５／１８によるＮＫ細胞の２日間の事前活性化によって、特にサイトカイン活性化ＮＫ細胞への感受性が弱い腫瘍細胞に対して増強される可能性がある。興味深いことに、ＮＫ細胞のＡＦＭ１３オプソニン化標的細胞との相互作用は、バイスタンダー非オプソニン化ＣＤ３０＋（しかしＣＤ３０-ではない）腫瘍細胞の溶解を誘導し、これは、ＮＫ細胞を強力に活性化するＫ５６２またはセツキシマブオプソニン化標的細胞との相互作用後には観察されなかった。
【００９６】
したがって、バイスタンダーＣＤ３０＋腫瘍細胞の溶解にはＡＦＭ１３タンデムダイアボディが厳密に必要とされ、ＮＫ細胞上のＣＤ１６Ａに結合した残留ＡＦＭ１３タンデムダイアボディに起因するとみられた。
【００９７】
（実施例３）
（ＣＤ１６Ａを介したＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ（ＡＦＭ１３）?事前活性化は、ＩＬ―１５または低服用量ＩＬ―２に応答するＮＫ細胞の増殖を拡大する）
ＡＦＭ１３オプソニン化腫瘍細胞に応答して、ＮＫ細胞上のＣＤ２５（ＩＬ―２Ｒα）およびＣＤ１３２（ＩＬ―２Ｒγ）のアップレギュレーションは、ＩＬ―２依存性機能の改善を示唆した。したがって、ＡＦＭ１３による事前活性化によりＩＬ―２依存性ＮＫ細胞の増殖が促進されることを調査した。ＣＦＳＥ標識ＮＫ細胞を、コーティングＡＦＭ１３上の腫瘍のない系で２０時間インキュベートし、再播種し、ＩＬ―２と３〜７日間インキュベートした（図２、Ａ）。適用された低細胞密度では、サイトカインのみがＮＫ細胞増殖の弱い刺激である。ＡＦＭ１３オプソニン化腫瘍細胞への応答と同様に、コーティングＡＦＭ１３へのばく露は、ＮＫ細胞上のＣＤ２５およびＣＤ１３２のアップレギュレーションをもたらしたが、ＣＤ１２２（ＩＬ―２Ｒβ）の発現は変化しなかった（図２、Ｂ）。驚くべきことに、ＡＦＭ１３タンデムダイアボディの事前活性化ＮＫ細胞は、ＩＬ―２での培養後にＣＦＳＥの顕著な希釈を示し、これは５日目に最も顕著になり、７日目までさらに増加した（図２、Ｃ）。対照的に、事前にＡＦＭ１３タンデムダイアボディまたは可溶性ＡＦＭ１３タンデムダイアボディにさらされていなかったＮＫ細胞は、かなり弱いＣＦＳＥ希釈を示した（図２、Ｃ；データは示していない）。少なくとも４つの分裂を経たＮＫ細胞の割合は、ＡＦＭ１３で事前に活性化されたＮＫ細胞で有意に高く、ＡＦＭ１３タンデムダイアボディばく露後のＩＬ―２を介した増殖の促進を示した（図２、Ｄ）。同様の結果がリツキシマブへのばく露後に得られ、そのヒトＦｃ部位を介してＣＤ１６Ａに結合した。
【００９８】
次に、ＡＦＭ１３を介した事前活性化が低服用量のＩＬ―２に対する感受性を変化させるかどうかを評価した。実際、５０Ｕ／ｍＬの低濃度でも、ＡＦＭ１３で事前に活性化されたＮＫ細胞は、４００Ｕ／ｍＬの高服用量と同等の顕著なＣＦＳＥの希釈を示したが、増殖を拡大する最小濃度は２５Ｕ／ｍＬであった（図２、Ｅ）。さらに、低および高服用量のＩＬ―２で培養した後、ＮＫ細胞絶対数は大幅に増加し、ＮＫ細胞数は最大で４倍にまで拡大した。同様に、ＩＬ―１５を介したＮＫ細胞増殖およびＮＫ細胞絶対数は、ＡＦＭ１３事前活性化後に強化された；しかし、この効果は、試験した最高服用量のＩＬ―１５（１０ｎｇ／ｍＬ）で主に観察された（図２、Ｆ）。
【００９９】
したがって、ＡＦＭ１３タンデムダイアボディまたはリツキシマブによるナイーブＮＫ細胞のＣＤ１６Ａエンゲージメントは、ＣＤ２５およびＣＤ１３２のアップレギュレーションをもたらし、ＩＬ―１５および低服用量のＩＬ―２に対するＮＫ細胞の反応性を高め、ＩＬ―２およびＩＬ―１５を介したＮＫ細胞の増殖を拡大させた。
【０１００】
（実施例４）
（ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ（ＡＦＭ１３）ばく露後のＣＤ１６Ａを介したＮＫ細胞機能の回復）
活性化マーカーの誘導と同時に、ＡＦＭ１３オプソニン化標的細胞またはコーティングＡＦＭ１３で２０時間培養した後にＮＫ細胞でのＣＤ１６発現のほぼ完全な消失が観察された（図３、Ａ―Ｃ）。重要なことは、この効果が一過性のものであったことであり、なぜならＡＦＭ１３タンデムダイアボディばく露後にＮＫ細胞を再播種し、続いて低もしくは高服用量のＩＬ―２またはＩＬ―１５で５日間培養すると、ＣＤ１６発現を回復させることができたためである（図３、Ｃ）。抗ＣＤ１６  ３Ｇ８によるＣＤ１６の検出がＡＦＭ１３の存在下では変化しなかったため、フローサイトメトリーで観察されるＣＤ１６ダウンレギュレーションはエピトープマスキングによるものではなかった。代わりに、ＣＤ１６ダウンレギュレーションは、抗ＣＤ１６  ３Ｇ８、リツキシマブおよびＢｉＫＥによるＣＤ１６ダウンレギュレーションについて以前に報告されたように、メタロプロテイナーゼを介した切断に少なくとも部分的に依存していた（Ｂｏｒｒｅｇｏ、ｅｔ  ａｌ．、１９９４、Ｍｏｔａ、ｅｔ  ａｌ．、２００４、Ｒｏｍｅｅ、ｅｔ  ａｌ．、２０１３、Ｗｉｅｒｎｉｋ、ｅｔ  ａｌ．、２０１３）。
【０１０１】
次に、ＡＦＭ１３タンデムダイアボディばく露がＮＫ細胞の細胞傷害性に影響を与えた後のＣＤ１６の一過性の減少を、その後の２回目のばく露で試験した。実際、ＡＦＭ１３タンデムダイアボディの存在下でのＬ４２８細胞との共培養の後では、事前に共培養されなかったＮＫ細胞による溶解と比較して、ＡＦＭ１３オプソニン化標的細胞（２回目のばく露）の新しい一巡の溶解は弱められた。ＮＫ細胞の細胞傷害性は、ＡＦＭ１２タンデムダイアボディの存在下でのＬ４２８細胞との共培養後も変化しなかった。腫瘍細胞を含まない系でのこの細胞傷害機能の障害を分析するために、コーティングＡＦＭ１３タンデムダイアボディへのばく露後にＮＫ細胞の細胞傷害性を評価した。ＮＫ細胞の細胞傷害性、脱顆粒、およびＡＦＭ１３オプソニン化Ｋａｒｐａｓ―２９９細胞に応答する細胞内ＩＦＮ―γの発現は、パーフォリンおよびグランザイムＢのレベルが損なわれていないにもかかわらず、コーティングＡＦＭ１３タンデムダイアボディでの２０時間の培養後に有意に減少した（図３、Ｄ―Ｅ；図４、Ａ）。同様に、ＡＦＭ１３オプソニン化Ｌ４２８およびＡＦＭ１２オプソニン化Ｄａｕｄｉ細胞の溶解は弱められた（図Ｓ４、Ｃ）。それでも、残留ＡＦＭ１３を介した溶解は、非オプソニン化腫瘍細胞の溶解よりも高かった。重要なことは、ＡＦＭ１３タンデムダイアボディばく露後のＮＫ細胞の細胞傷害性の低下は、ＩＬ―２またはＩＬ―１５での５日間の培養後に完全に回復させることができたことである（図３、Ｄ）。同様に、コーティングリツキシマブは、ＣＤ１６発現とＮＫ細胞の細胞傷害性を損ない、ＩＬ―２での培養後に回復させることができた。
【０１０２】
ＰＭＡ／イオノマイシンによって誘導される脱顆粒および細胞内ＩＦＮ―γ発現の最大レベルも、ＡＦＭ１３タンデムダイアボディへのばく露後に減少し、より広範な機能障害が示唆された。実際、ＨｕＴ―７８細胞だけでなく、プロトタイプの標的細胞株Ｋ５６２に応答するＣＤ１６Ａ非依存的な「天然の」ＮＫ細胞の細胞傷害性、脱顆粒および細胞内ＩＦＮ―γ発現も、ＡＦＭ１３タンデムダイアボディばく露後に阻害された。（図３、Ｆ、図４、Ｂ）。この阻害は、その後のＩＬ―２での５日間の培養によって元に戻すことができた。特に、ＩＬ―１２／１５／１８に応答するＩＦＮ―γ発現は損なわれずに保たれ、ＡＦＭ１３タンデムダイアボディばく露後に適度に増加し、これは、高アフィニティーＩＬ―１２Ｒβ２およびＩＬ―１８Ｒα受容体の発現増加と一致した（図４、Ｃ―Ｄ）。したがって、ＡＦＭ１３で事前に活性化されたＮＫ細胞は、ＩＬ―２とＩＬ―１５に対してだけでなく、ＩＬ―１２とＩＬ―１８に対しても感受性が高いようであった。
【０１０３】
したがって、ＮＫ細胞の機能はＡＦＭ１３オプソニン化標的細胞への直接応答で強化されたが、ＡＦＭ１３タンデムダイアボディばく露はその後、腫瘍細胞への２回目のばく露に対する選択的一過性機能障害をもたらし、これはＩＬ―２またはＩＬ―１５刺激によって奪回することができた。
【０１０４】
図６は、ＮＫ細胞の細胞傷害能のサイトカイン回復後、ＡＦＭ１３への２回目のばく露が再びＮＫ細胞の細胞傷害性を損なうことを示している。ＡＦＭ１３への２回目のばく露後の細胞傷害性効力の低下は、初回ばく露後の低下に匹敵する。このデータは、ＡＦＭ１３の存在下では、サイトカイン刺激は、ＡＦＭ１３によって誘導されたＮＫ細胞の効力の一過性の喪失を（少なくとも完全には）元に戻すことができないことを示している。したがって、ＮＫ細胞の細胞傷害性をサイトカイン刺激により効率的に回復させるには、回復期の間、抗ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質の濃度を低く保つか、または存在させないことが重要である。
【０１０５】
（実施例５）
（ＣＤ１６Ａを介したＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ（ＡＦＭ１３）-事前活性化は、強力なＮＫ細胞ＩＦＮ―γ産生をプライミングする）
ＡＦＭ１３タンデムダイアボディによる事前活性化が、ＡＦＭ１３タンデムダイアボディの非存在下で再刺激した場合にＩＬ―２培養ＮＫ細胞のＩＦＮ―γ産生を調節できるかどうかを判定した。ＩＬ―２で培養したＮＫ細胞が最初にＡＦＭ１３にばく露された場合、ＩＬ―１２／１５に応答して、ＩＦＮ―γ産生は大幅に改善された（図５、Ａ）。さらに驚くべきことに、ＩＦＮ―γ産生は、Ｋ５６２またはＬ４２８細胞による再刺激に応答してさらに増幅され（図５、Ａ）、ＡＦＭ１３タンデムダイアボディによる事前活性化により、サイトカインおよびリンパ腫細胞に対するＩＦＮ−γ反応が増幅されたことを示した。
【０１０６】
（ＣＤ１６Ａを介したＣＤ３０／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディ（ＡＦＭ１３）?事前活性化は、ＣＤ３０＋およびＣＤ３０-リンパ腫細胞の溶解をプライミングする）
ＡＦＭ１３タンデムダイアボディばく露後のＩＬ―２での培養により、ＮＫ細胞の細胞傷害性が完全に回復したことが示されている（図３、Ｄ＋Ｆ）。したがって、ＡＦＭ１３ばく露歴のあるＮＫ細胞は、ＩＬ―２のみで培養したＮＫ細胞よりも、ＡＦＭ１３オプソニン化標的への２回目のばく露に応答して同等に強力であった。次の工程では、ＡＦＭ１３タンデムダイアボディによる事前活性化が、５日間のＩＬ―２培養ＮＫ細胞にほぼ耐性である（非オプソニン化）ＣＤ３０＋またはＣＤ３０-リンパ腫細胞への２回目のばく露に応答する「天然の」溶解に影響するかどうかを調査した。驚くべきことに、ＣＤ３０＋Ｋａｒｐａｓ―２９９およびＨＤＬＭ―２細胞の溶解は、ＩＬ―２またはＩＬ―１５培養ＮＫ細胞が最初にＡＦＭ１３にさらされていた場合に増幅された；これらの細胞はナイーブＮＫ細胞に耐性があり、ＩＬ―２またはＩＬ―１５培養ＮＫ細胞にほぼ耐性であった（図５、Ｂ。さらに重要なことに、ＣＤ３０-リンパ腫細胞株Ｌ１２３６およびＤａｕｄｉの溶解でさえ、初期のＡＦＭ１３タンデムダイアボディばく露により増幅された（図５、Ｂ）。この増幅は、ＩＬ―２培養ＮＫ細胞に対して弱い感受性を示す標的細胞で特に顕著であったが、一方でＩＬ―２培養ＮＫ細胞による感受性の高いＫ５６２標的細胞の強力な溶解は、それ以上向上されなかった。強化された細胞傷害機能は、ＡＦＭ１２タンデムダイアボディまたはリツキシマブで事前活性化されたＮＫ細胞でも観察された。
【０１０７】
したがって、ＡＦＭ１３ばく露歴のあるサイトカイン活性化ＮＫ細胞は、サイトカインによってのみ活性化されたＮＫ細胞と比較して、ＣＤ３０＋およびＣＤ３０-リンパ腫細胞に応答する細胞傷害性の増幅を示した。
【０１０８】
（実施例６）
（ＥＧＦＲ／ＣＤ１６Ａ（ＡＦＭ２４）タンデムダイアボディおよびＢＣＭＡｘＣＤ１６Ａ（ＡＦＭ２６）タンデムダイアボディへのばく露後のＣＤ１６Ａを介したＮＫ細胞機能の回復。）
実施例２に示すＡＦＭ１３と同様に、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディおよびＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディは、それぞれＥＧＦＲ＋およびＢＣＭＡ＋標的細胞に応答するＮＫ細胞の機能的活性化を誘導する（図７）。
【０１０９】
実施例４に示すＡＦＭ１３と同様に、ＣＤ１６発現およびＣＤ１６Ａを介したＮＫ細胞機能の回復は、実施例４（図８および９）で説明されているように、ＥＧＦＲ／ＣＤ１６ＡタンデムダイアボディおよびＢＣＭＡ／ＣＤ１６Ａタンデムダイアボディそれぞれへのばく露後５日間のＩＬ―２またはＩＬ―１５での処理により達成される。
【０１１０】
したがって、本明細書に記載の間欠投薬レジメンを、標的抗原領域とは無関係に、多重特異性、すなわち二重特異性ＣＤ１６Ａ抗原結合タンパク質に採用することができる。
［配列表］
2020510657.tif 000002
［先行技術文献］
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Ｂｏｎｎｅｍａ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｋａｒｎｉｔｚ，  Ｌ．Ｍ．，  Ｓｃｈｏｏｎ，  Ｒ．Ａ．，  Ａｂｒａｈａｍ，  Ｒ．Ｔ．，  Ｌｅｉｂｓｏｎ，  Ｐ．Ｊ．  １９９４．  Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ３-ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ-ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ-ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８０，  １４２７-１４３５．
Ｂｏｒｒｅｇｏ，  Ｆ．，  Ｌｏｐｅｚ-Ｂｅｌｔｒａｎ，  Ａ．，  Ｐｅｎａ，  Ｊ．，  Ｓｏｌａｎａ，  Ｒ．  １９９４．  Ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＩＩＩＡ  ａｌｐｈａ  （ＣＤ１６-ＩＩ）  ｏｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｉ-ＣＤ１６  ｍＡｂ  ｉｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃ．  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８，  ２０８-２１７．
Ｂｒａｎｄｔ，  Ｃ．Ｓ．，  Ｂａｒａｔｉｎ，  Ｍ．，  Ｙｉ，  Ｅ．Ｃ．，  Ｋｅｎｎｅｄｙ，  Ｊ．，  Ｇａｏ，  Ｚ．，  Ｆｏｘ，  Ｂ．，  Ｈａｌｄｅｍａｎ，  Ｂ．，  Ｏｓｔｒａｎｄｅｒ，  Ｃ．Ｄ．，  Ｋａｉｆｕ，  Ｔ．，  Ｃｈａｂａｎｎｏｎ，  Ｃ．，  Ｍｏｒｅｔｔａ，  Ａ．，  Ｗｅｓｔ，  Ｒ．，  Ｘｕ，  Ｗ．，  Ｖｉｖｉｅｒ，  Ｅ．，  Ｌｅｖｉｎ，  Ｓ．Ｄ．  ２００９．  Ｔｈｅ  Ｂ７  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  Ｂ７-Ｈ６  ｉｓ  ａ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｇａｎｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＮＫｐ３０  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２０６，  １４９５-１５０３．
Ｂｒｙｃｅｓｏｎ，  Ｙ．Ｔ．，  Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ，  Ｈ．Ｇ．，  Ｌｏｎｇ，  Ｅ．Ｏ．  ２００９．  Ｍｉｎｉｍａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １１４，  ２６５７-２６６６．
Ｂｒｙｃｅｓｏｎ，  Ｙ．Ｔ．，  Ｍａｒｃｈ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ，  Ｈ．Ｇ．，  Ｌｏｎｇ，  Ｅ．Ｏ．  ２００６．  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ａｍｏｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｎ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  １０７，  １５９-１６６．
Ｃａｐｕａｎｏ，  Ｃ．，  Ｒｏｍａｎｅｌｌｉ，  Ｍ．，  Ｐｉｇｈｉ，  Ｃ．，  Ｃｉｍｉｎｏ，  Ｇ．，  Ｒａｇｏ，  Ａ．，  Ｍｏｌｆｅｔｔａ，  Ｒ．，  Ｐａｏｌｉｎｉ，  Ｒ．，  Ｓａｎｔｏｎｉ，  Ａ．，  Ｇａｌａｎｄｒｉｎｉ，  Ｒ．  ２０１５．  Ａｎｔｉ-ＣＤ２０  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ａｃｔｓ  ｖｉａ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩＡ  ｔｏ  Ｄｉｍｉｎｉｓｈ  Ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ７５，  ４０９７-４１０８．
Ｃａｓｓａｔｅｌｌａ，  Ｍ．Ａ．，  Ａｎｅｇｏｎ，  Ｉ．，  Ｃｕｔｕｒｉ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｇｒｉｓｋｅｙ，  Ｐ．，  Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ，  Ｇ．，  Ｐｅｒｕｓｓｉａ，  Ｂ．  １９８９．  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  Ｒ（ＣＤ１６）  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｃａ２＋  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃａ２＋  ｉｎ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  Ｒ（ＣＤ１６）-ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  ｇｅｎｅｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６９，  ５４９-５６７．
Ｃｅｒｗｅｎｋａ，  Ａ．，  Ｌａｎｉｅｒ，  Ｌ．Ｌ．  ２００１．  Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ，  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １，  ４１-４９．
Ｃｅｒｗｅｎｋａ，  Ａ．，  Ｌａｎｉｅｒ，  Ｌ．Ｌ．  ２０１６．  Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６，  １１２-１２３．
Ｃｈａｒｙｃｈ  Ｄ．，  Ｋｈａｌｉｌｉ，  Ｓ．，  Ｄｉｘｉｔ，  Ｖ．，  Ｋｉｒｋ，  Ｐ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｔ．，  Ｌａｎｇｏｗｓｋｉ，  Ｊ．，  Ｒｕｂａｓ，  Ｗ．，  Ｄｏｂｅｒｓｔｅｉｎ，  Ｋ．，  Ｅｌｄｏｎ，  Ｍ．，  Ｈｏｃｈ，  Ｕ．，  Ｚａｌｅｖｓｋｙ，  Ｊ．，  ２０１７，  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ＮＫＴＲ-２１４，  ａ  ｋｉｎｅｔｉｃａｌｌｙ-ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ-２  （ＩＬ２）  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｓｉｔ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  ＰＬｏｓ  ＯＮＥ  １２（７）：ｅ０１７９４３１．
Ｃｈａｔｉｌａ，  Ｔ．，  Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，  Ｌ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｒ．，  Ｇｅｈａ，  Ｒ．  １９８９．  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｃａｌｃｉｕｍ  ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ  ｉｏｎｏｍｙｃｉｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４３，  １２８３-１２８９．
Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｍ．Ａ．，  Ｅｌｌｉｏｔｔ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｋｅｙｅｌ，  Ｐ．Ａ．，  Ｙａｎｇ，  Ｌ．，  Ｃａｒｒｅｒｏ，  Ｊ．Ａ．，  Ｙｏｋｏｙａｍａ，  Ｗ．Ｍ．  ２００９．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ-ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｍｏｒｙ-ｌｉｋｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０６，  １９１５-１９１９．
Ｄａｌｌ´Ｏｚｚｏ，  Ｓ．，  Ｔａｒｔａｓ，  Ｓ．，  Ｐａｉｎｔａｕｄ，  Ｇ．，  Ｃａｒｔｒｏｎ，  Ｇ．，  Ｃｏｌｏｍｂａｔ，  Ｐ．，  Ｂａｒｄｏｓ，  Ｐ．，  Ｗａｔｉｅｒ，  Ｈ．，  Ｔｈｉｂａｕｌｔ，  Ｇ．  ２００４．  Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ＦＣＧＲ３Ａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ-ｅｆｆｅｃｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６４，  ４６６４-４６６９．
ｄｅ  Ｌａｎｄａｚｕｒｉ，  Ｍ．Ｏ．，  Ｓｉｌｖａ，  Ａ．，  Ａｌｖａｒｅｚ，  Ｊ．，  Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ，  Ｒ．Ｂ．  １９７９．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ａｒｅ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｃｅｌｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２３，  ２５２-２５８．
Ｇａｌａｎｄｒｉｎｉ，  Ｒ．，  Ｔａｓｓｉ，  Ｉ．，  Ｍａｔｔｉａ，  Ｇ．，  Ｌｅｎｔｉ，  Ｌ．，  Ｐｉｃｃｏｌｉ，  Ｍ．，  Ｆｒａｔｉ，  Ｌ．，  Ｓａｎｔｏｎｉ，  Ａ．  ２００２．  ＳＨ２-ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  （ＳＨＩＰ-１）  ｔｒａｎｓｉｅｎｔｌｙ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ｔｏ  ｒａｆｔ  ｄｏｍａｉｎｓ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ＣＤ１６-ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １００，  ４５８１-４５８９．
Ｇａｓｓｅｒ，  Ｓ．，  Ｒａｕｌｅｔ，  Ｄ．Ｈ．  ２００６．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｆ-ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２１４，  １３０-１４２．
Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ，  Ｇ．，  Ｈｅｍｍｅｒｓ，  Ｓ．，  Ｆｉｒｔｈ，  Ｍ．Ａ．，  Ｌｅ  Ｆｌｏｃ´ｈ，  Ａ．，  Ｈｕｓｅ，  Ｍ．，  Ｓｕｎ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｒｕｄｅｎｓｋｙ，  Ａ．Ｙ．  ２０１３．  ＩＬ-２-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔｕｎｉｎｇ  ｏｆ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｂｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１０，  １１６７-１１７８．
Ｈａｒａ，  Ｈ．，  Ｉｓｈｉｈａｒａ，  Ｃ．，  Ｔａｋｅｕｃｈｉ，  Ａ．，  Ｘｕｅ，  Ｌ．，  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｓ．Ｗ．，  Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｙｏｓｈｉｄａ，  Ｈ．，  Ｓａｉｔｏ，  Ｔ．  ２００８．  Ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ-ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＴＡＭ-ｍｅｄｉａｔｅｄ  ＮＦ-ｋａｐｐａＢ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ａｄａｐｔｏｒｓ，  ＣＡＲＭＡ１  ａｎｄ  ＣＡＲＤ９．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８１，  ９１８-９３０．
Ｈａｒｒｉｓ，  Ｍ．  ２００４．  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  ５，  ２９２-３０２．
Ｋｉｍ，  Ｍ．，  Ｋｉｍ，  Ｔ．Ｊ．，  Ｋｉｍ，  Ｈ．Ｍ．，  Ｄｏｈ，  Ｊ．，  Ｌｅｅ，  Ｋ．Ｍ．  ２０１７．  Ｍｕｌｔｉ-ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  （ＮＫ）  ｃｅｌｌ  ｃｌｕｓｔｅｒｓ  ｅｎｈａｎｃｅ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｌｏｃａｌｉｚｉｎｇ  ＩＬ-２  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ．  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ７，  ４０６２３．
Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３；２０７：３２３-３３
Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ＳＭ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２００９；  ５６２：１７７-９３
Ｋｏｃｈ，  Ｊ．，  Ｓｔｅｉｎｌｅ，  Ａ．，  Ｗａｔｚｌ，  Ｃ．，  Ｍａｎｄｅｌｂｏｉｍ，  Ｏ．，  ２０１３，  Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｔｒｅｎｄｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ３４（４）：１９２-９１
Ｋｏｅｈｌ，  Ｕ．，  Ｋａｌｂｅｒｅｒ，  Ｃ．，  Ｓｐａｎｈｏｌｔｚ，  Ｊ．，  Ｌｅｅ，  Ｄ．Ａ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｊ．Ｓ．，  Ｃｏｏｌｅｙ，  Ｓ．，  Ｌｏｗｄｅｌｌ，  Ｍ．，  Ｕｈａｒｅｋ，  Ｌ．，  Ｋｌｉｎｇｅｍａｎｎ，  Ｈ．，  Ｃｕｒｔｉ，  Ａ．，  Ｌｅｕｎｇ，  Ｗ．  ａｎｄ  Ａｌｉｃｉ，  Ｅ．，  ２０１６，  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ＮＫ  ｃｅｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ：Ｄｏｎｏｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ，  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ５（４）  ｅ１１１５１７８．
Ｋｏｎｄａｄａｓｕｌａ，  Ｓ．Ｖ．，  Ｒｏｄａ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｐａｒｉｈａｒ，  Ｒ．，  Ｙｕ，  Ｊ．，  Ｌｅｈｍａｎ，  Ａ．，  Ｃａｌｉｇｉｕｒｉ，  Ｍ．Ａ．，  Ｔｒｉｄａｎｄａｐａｎｉ，  Ｓ．，  Ｂｕｒｒｙ，  Ｒ．Ｗ．，  Ｃａｒｓｏｎ，  Ｗ．Ｅ．，  ３ｒｄ．  ２００８．  Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＬ-１２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩａ  ｔｏ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｐｉｄ  ｒａｆｔｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＲＫ  ａｎｄ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ-ｇａｍｍａ．  Ｂｌｏｏｄ  １１１，  ４１７３-４１８３．
Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，  Ｒ．Ｅ．  Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，  Ｕ．  Ｔｈｅ  ｍａｋｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ          ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  ２０１７  ｍＡｂｓ，  ９（２）：１８２-２１２）．
Ｋｕｆｅ  ＤＷ，  Ｐｏｌｌｏｃｋ  ＲＥ，  Ｗｅｉｃｈｓｅｌｂａｕｍ  ＲＲ．  ｅｔ  ａｌ．  ２００３，  Ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｕｍｏｒ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，  Ｈｏｌｌａｎｄ-Ｆｒｅｉ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．  ６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．，  ｅｄｉｔｏｒｓ  Ｈａｍｉｌｔｏｎ  （ＯＮ）：Ｂｅｃｋｅｒ
Ｋｕｙｌｅｎｓｔｉｅｒｎａ，  Ｃ．，  Ｂｊｏｒｋｓｔｒｏｍ，  Ｎ．Ｋ．，  Ａｎｄｅｒｓｓｏｎ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｓａｈｌｓｔｒｏｍ，  Ｐ．，  Ｂｏｓｎｊａｋ，  Ｌ．，  Ｐａｑｕｉｎ-Ｐｒｏｕｌｘ，  Ｄ．，  Ｍａｌｍｂｅｒｇ，  Ｋ．Ｊ．，  Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ，  Ｈ．Ｇ．，  Ｍｏｌｌ，  Ｍ．，  Ｓａｎｄｂｅｒｇ，  Ｊ．Ｋ．  ２０１１．  ＮＫＧ２Ｄ  ｐｅｒｆｏｒｍｓ  ｔｗｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ：  ｄｉｒｅｃｔ  ＴＣＲ-ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫ-ｌｉｋｅ  ｃｙｔｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｏ-ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ＣＤ１ｄ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４１，  １９１３-１９２３．
Ｌａｊｏｉｅ，  Ｌ．，  Ｃｏｎｇｙ-Ｊｏｌｉｖｅｔ，  Ｎ．，  Ｂｏｌｚｅｃ，  Ａ．，  Ｇｏｕｉｌｌｅｕｘ-Ｇｒｕａｒｔ，  Ｖ．，  Ｓｉｃａｒｄ，  Ｅ．，  Ｓｕｎｇ，  Ｈ．Ｃ．，  Ｐｅｉｒｅｔｔｉ，  Ｆ．，  Ｍｏｒｅａｕ，  Ｔ．，  Ｖｉｅ，  Ｈ．，  Ｃｌｅｍｅｎｃｅａｕ，  Ｂ．，  Ｔｈｉｂａｕｌｔ，  Ｇ．  ２０１４．  ＡＤＡＭ１７-ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｏｆ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩＡ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｗｉｔｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９２，  ７４１-７５１．
Ｌａｎｉｅｒ，  Ｌ．Ｌ．，  Ｒｕｉｔｅｎｂｅｒｇ，  Ｊ．Ｊ．，  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，  Ｊ．Ｈ．  １９８８．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣＤ１６  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４１，  ３４７８-３４８５．
Ｌｉ，  Ｗ．，  Ｙａｎｇ，  Ｈ．，  Ｄｉｍｉｔｒｏｖ，  Ｄ．Ｓ．  ２０１６．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ-ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉ-ＣＤ１６Ａ  ａｌｌｏｔｙｐｅ-ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｏｍａｉｎｓ．  Ｅｘｐ  Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  １０１，  ２８１-２８９．
Ｌｉｕ，  Ｂ．，  Ｋｏｎｇ，  Ｌ．，  Ｈａｎ  Ｋ．，  Ｈｏｎｇ，  Ｈ，  Ｍａｒｃｕｓ，  Ｗ．Ｄ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｘ．，  Ｌｅｎｇ，  Ｅ．Ｋ．，  Ａｌｔｅｒ，  Ｓ．，  Ｚｈｕ，  Ｘ．，  Ｒｕｂｉｎｓｅｉｎ  Ｍ．Ｒ．，  Ｓｈｉ，  Ｓ．，  Ｒｈｏｄｅ，  Ｐ．ｒ．，  Ｃａｉ，  Ｗ．  Ｗｏｎｇ，  Ｈ．Ｃ．；  ２０１６  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ＡＬＴ-８０３  （ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  （ＩＬ）-１５  ｓｕｐｅｒａｇｏｎｉｓｔ）  ｗｉｔｈ  ａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ  ａｎｔｉｇｅｎ-ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．  ２９１  （４６），  ｐｐ．２３８６９-２３８８１  
Ｌｉｓｓｏｎｉ  Ｐ，  Ｂａｒｎｉ  Ｓ，  Ａｒｄｉｚｚｏｉａ  Ａ，  Ｏｌｉｖｉｎｉ  Ｇ，  Ｂｒｉｖｉｏ  Ｆ，  Ｔｉｓｉ  Ｅ，  Ｔａｎｃｉｎｉ  Ｇ，  Ｃｈａｒａｃｉｅｊｕｓ  Ｄ，  Ｋｏｔｈａｒｉ  Ｌ．  １９９３  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ-ｄｏｓｅ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ-２  ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ：  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｍｏｓｔ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒ  ｈｉｓｔｏｔｙｐｅｓ  ｂｙ  ａ  ｃｏｎｃｏｍｉｔａｎｔ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｐｉｎｅａｌ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｍｅｌａｔｏｎｉｎ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｈｏｍｅｏｓｔ  Ａｇｅｎｔｓ．  １９９３  Ｏｃｔ-Ｄｅｃ；７（４）：１２１-５
Ｌｕｅｔｋｅ-Ｅｖｅｒｓｌｏｈ，  Ｍ．，  Ｈａｍｍｅｒ，  Ｑ．，  Ｄｕｒｅｋ，  Ｐ．，  Ｎｏｒｄｓｔｒｏｍ，  Ｋ．，  Ｇａｓｐａｒｏｎｉ，  Ｇ．，  Ｐｉｎｋ，  Ｍ．，  Ｈａｍａｎｎ，  Ａ．，  Ｗａｌｔｅｒ，  Ｊ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｈ．Ｄ．，  Ｄｏｎｇ，  Ｊ．，  Ｒｏｍａｇｎａｎｉ，  Ｃ．  ２０１４．  Ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｄｒｉｖｅｓ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＦＮＧ  ｌｏｃｕｓ  ｉｎ  ＮＫＧ２Ｃｈｉ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  １０，  ｅ１００４４４１．
Ｍａｒｑｕｅｚ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｍｉｌｌｅｔ，  Ｃ．，  Ｓｔｅｋｍａｎ，  Ｈ．，  Ｃｏｎｅｓａ，  Ａ．，  Ｄｅｇｌｅｓｎｅ，  Ｐ．Ａ．，  Ｔｏｒｏ，  Ｆ．，  Ｓａｎｃｔｉｓ，  Ｊ．Ｄ．，  Ｂｌａｎｃａ，  Ｉ．  ２０１０．  ＣＤ１６  ｃｒｏｓｓ-ｌｉｎｋｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ５６  ａｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ-１２  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２６４，  ８６-９２．
Ｍｏｒｅｔｔａ，  Ｌ．，  Ｂｏｔｔｉｎｏ，  Ｃ．，  Ｐｅｎｄｅ，  Ｄ．，  Ｃａｓｔｒｉｃｏｎｉ，  Ｒ．，  Ｍｉｎｇａｒｉ，  Ｍ．Ｃ．，  Ｍｏｒｅｔｔａ，  Ａ．  ２００６．  Ｓｕｒｆａｃｅ  ＮＫ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８，  １５１-１５８．
Ｍｏｔａ，  Ｇ．，  Ｍｏｌｄｏｖａｎ，  Ｉ．，  Ｃａｌｕｇａｒｕ，  Ａ．，  Ｈｉｒｔ，  Ｍ．，  Ｋｏｚｍａ，  Ｅ．，  Ｇａｌａｔｉｕｃ，  Ｃ．，  Ｂｒａｓｏｖｅａｎｕ，  Ｌ．，  Ｂｏｌｔｚ-Ｎｉｔｕｌｅｓｃｕ，  Ｇ．  ２００４．  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｗｉｔｈ  ＣＤ１６  ｏｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ：  ｌｉｇａｎｄ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ，  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩＡ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ  ｏｎ  ＦｃｇａｍｍａＲＩＩＩＡ-ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ，  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｋｉｌｌｉｎｇ．  Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ５９，  ２７８-２８４．
Ｍｕｓｏｌｉｎｏ，  Ａ．，  Ｎａｌｄｉ，  Ｎ．，  Ｂｏｒｔｅｓｉ，  Ｂ．，  Ｐｅｚｚｕｏｌｏ，  Ｄ．，  Ｃａｐｅｌｌｅｔｔｉ，  Ｍ．，  Ｍｉｓｓａｌｅ，  Ｇ．，  Ｌａｃｃａｂｕｅ，  Ｄ．，  Ｚｅｒｂｉｎｉ，  Ａ．，  Ｃａｍｉｓａ，  Ｒ．，  Ｂｉｓａｇｎｉ，  Ｇ．，  Ｎｅｒｉ，  Ｔ．Ｍ．，  Ａｒｄｉｚｚｏｎｉ，  Ａ．  ２００８．  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ-ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＨＥＲ-２／ｎｅｕ-ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．  ２６，  １７８９-１７９６．
Ｎａｋａｈｉｒａ，  Ｍ．，  Ａｈｎ，  Ｈ．Ｊ．，  Ｐａｒｋ，  Ｗ．Ｒ．，  Ｇａｏ，  Ｐ．，  Ｔｏｍｕｒａ，  Ｍ．，  Ｐａｒｋ，  Ｃ．Ｓ．，  Ｈａｍａｏｋａ，  Ｔ．，  Ｏｈｔａ，  Ｔ．，  Ｋｕｒｉｍｏｔｏ，  Ｍ．，  Ｆｕｊｉｗａｒａ，  Ｈ．  ２００２．  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ｏｆ  ＩＬ-１２  ａｎｄ  ＩＬ-１８  ｆｏｒ  ＩＦＮ-ｇａｍｍａ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：  ＩＬ-１２-ｉｎｄｕｃｅｄ  ＳＴＡＴ４  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ  ｔｏ  ＩＦＮ-ｇａｍｍａ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｕｐ-ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＩＬ-１８-ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８，  １１４６-１１５３．
Ｎｉ，  Ｊ．，  Ｈｏｌｓｋｅｎ，  Ｏ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｍ．，  Ｈａｍｍｅｒ，  Ｑ．，  Ｌｕｅｔｋｅ-Ｅｖｅｒｓｌｏｈ，  Ｍ．，  Ｒｏｍａｇｎａｎｉ，  Ｃ．，  Ｃｅｒｗｅｎｋａ，  Ａ．  ２０１６．  Ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｌｏｎｇ-ｔｅｒｍ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｉｍｐｒｉｎｔｉｎｇ  ａｎｄ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｈｅｌｐ．  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５，  ｅ１２１９００９．
Ｎｉ，  Ｊ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｍ．，  Ｓｔｏｊａｎｏｖｉｃ，  Ａ．，  Ｇａｒｂｉ，  Ｎ．，  Ｃｅｒｗｅｎｋａ，  Ａ．  ２０１２．  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩＬ-１２／１５／１８-ｐｒｅａｃｔｉｖａｔｅｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｔｕｍｏｒｓ．  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  ２０９，  ２３５１-２３６５．
Ｐａｈｌ，  Ｊ．，  Ｃｅｒｗｅｎｋａ，  Ａ．  ２０１７．  Ｔｒｉｃｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｂａｌａｎｃｅ：  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ａｎｔｉ-ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２２２，  １１-２０．
Ｐａｈｌ，  Ｊ．Ｈ．，  Ｒｕｓｌａｎ，  Ｓ．Ｅ．，  Ｂｕｄｄｉｎｇｈ，  Ｅ．Ｐ．，  Ｓａｎｔｏｓ，  Ｓ．Ｊ．，  Ｓｚｕｈａｉ，  Ｋ．，  Ｓｅｒｒａ，  Ｍ．，  Ｇｅｌｄｅｒｂｌｏｍ，  Ｈ．，  Ｈｏｇｅｎｄｏｏｒｎ，  Ｐ．Ｃ．，  Ｅｇｅｌｅｒ，  Ｒ．Ｍ．，  Ｓｃｈｉｌｈａｍ，  Ｍ．Ｗ．，  Ｌａｎｋｅｓｔｅｒ，  Ａ．Ｃ．  ２０１２．  Ａｎｔｉ-ＥＧＦＲ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８，  ４３２-４４１．
Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ，  Ｍ．Ｒ．，  Ｒｉｌｅｙ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｄｕｄｌｅｙ，  Ｍ．Ｅ．，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｓ．Ａ．  ２０１１．  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７，  ６２８７-６２９７．
Ｒｅｉｎｅｒｓ，  Ｋ．Ｓ．，  Ｋｅｓｓｌｅｒ，  Ｊ．，  Ｓａｕｅｒ，  Ｍ．，  Ｒｏｔｈｅ，  Ａ．，  Ｈａｎｓｅｎ，  Ｈ．Ｐ．，  Ｒｅｕｓｃｈ，  Ｕ．，  Ｈｕｃｋｅ，  Ｃ．，  Ｋｏｈｌ，  Ｕ．，  Ｄｕｒｋｏｐ，  Ｈ．，  Ｅｎｇｅｒｔ，  Ａ．，  ｖｏｎ  Ｓｔｒａｎｄｍａｎｎ，  Ｅ．Ｐ．  ２０１３．  Ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｉｍｐａｉｒｅｄ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２１，  ８９５-９０３．
Ｒｅｕｓｃｈ，  Ｕ．，  Ｂｕｒｋｈａｒｄｔ，  Ｃ．，  Ｆｕｃｅｋ，  Ｉ．，  Ｌｅ  Ｇａｌｌ，  Ｆ．，  Ｌｅ  Ｇａｌｌ，  Ｍ．，  Ｈｏｆｆｍａｎｎ，  Ｋ．，  Ｋｎａｃｋｍｕｓｓ，  Ｓ．Ｈ．，  Ｋｉｐｒｉｊａｎｏｖ，  Ｓ．，  Ｌｉｔｔｌｅ，  Ｍ．，  Ｚｈｕｋｏｖｓｋｙ，  Ｅ．Ａ．  ２０１４．  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｅｔｒａｖａｌｅｎｔ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＴａｎｄＡｂ  （ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ）  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｒｅｃｒｕｉｔｓ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＣＤ３０＋  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  ＭＡｂｓ  ６，  ７２８-７３９．
Ｒｏｌｌｅ，  Ａ．，  Ｂｒｏｄｉｎ，  Ｐ．  ２０１６．  Ｉｍｍｕｎｅ  Ａｄａｐｔａｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ：  Ｔｈｅ  Ｃａｓｅ  ｏｆ  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ＨＣＭＶ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７，  ２３３-２４３．
Ｒｏｍｅｅ，  Ｒ．，  Ｆｏｌｅｙ，  Ｂ．，  Ｌｅｎｖｉｋ，  Ｔ．，  Ｗａｎｇ，  Ｙ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｂ．，  Ａｎｋａｒｌｏ，  Ｄ．，  Ｌｕｏ，  Ｘ．，  Ｃｏｏｌｅｙ，  Ｓ．，  Ｖｅｒｎｅｒｉｓ，  Ｍ．，  Ｗａｌｃｈｅｃｋ，  Ｂ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｊ．  ２０１３．  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ＣＤ１６  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｄｉｓｉｎｔｅｇｒｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ-１７  （ＡＤＡＭ１７）．  Ｂｌｏｏｄ  １２１，  ３５９９-３６０８．
Ｒｏｍｅｅ，  Ｒ．，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，  Ｓ．Ｅ．，  Ｌｅｏｎｇ，  Ｊ．Ｗ．，  Ｃｈａｓｅ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｋｅｐｐｅｌ，  Ｃ．Ｒ．，  Ｓｕｌｌｉｖａｎ，  Ｒ．Ｐ．，  Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｍ．Ａ．，  Ｆｅｈｎｉｇｅｒ，  Ｔ．Ａ．  ２０１２．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｍｏｒｙ-ｌｉｋｅ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １２０，  ４７５１-４７６０．
Ｒｏｍｅｅ，  Ｒ，  Ｌｅｏｎｇ  Ｊ．Ｗ，  Ｆｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｔ．Ａ，  ２０１４，  Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｔｏ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ-Ｅｎａｂｌｅ  Ｈｕｍａｎ  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  Ｈｉｎｄａｗｉ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｙ  Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ２０５７９６
Ｒｏｍｅｅ  Ｒ，  Ｒｏｓａｒｉｏ  Ｍ，  Ｂｅｒｒｉｅｎ-Ｅｌｌｉｏｔｔ  ＭＭ，  Ｗａｇｎｅｒ  ＪＡ，  Ｊｅｗｅｌｌ  ＢＡ１，  Ｓｃｈａｐｐｅ  Ｔ，  Ｌｅｏｎｇ  ＪＷ，  Ａｂｄｅｌ-Ｌａｔｉｆ  Ｓ，  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ＳＥ，  Ｗｉｌｌｅｙ  Ｓ，  Ｎｅａｌ  ＣＣ，  Ｙｕ  Ｌ，  Ｏｈ  ＳＴ，  Ｌｅｅ  ＹＳ，  Ｍｕｌｄｅｒ  Ａ，  Ｃｌａａｓ  Ｆ，  Ｃｏｏｐｅｒ  ＭＡ，  Ｆｅｈｎｉｇｅｒ  ＴＡ，  ２０１６，  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ-ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｅｍｏｒｙ-ｌｉｋｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａＳｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．    Ｓｅｐ  ２１；８（３５７）：３５７ｒａ１２３．
Ｒｏｔｈｅ，  Ａ．，  Ｓａｓｓｅ，  Ｓ．，  Ｔｏｐｐ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｅｉｃｈｅｎａｕｅｒ，  Ｄ．Ａ．，  Ｈｕｍｍｅｌ，  Ｈ．，  Ｒｅｉｎｅｒｓ，  Ｋ．Ｓ．，  Ｄｉｅｔｌｅｉｎ，  Ｍ．，  Ｋｕｈｎｅｒｔ，  Ｇ．，  Ｋｅｓｓｌｅｒ，  Ｊ．，  Ｂｕｅｒｋｌｅ，  Ｃ．，  Ｒａｖｉｃ，  Ｍ．，  Ｋｎａｃｋｍｕｓｓ，  Ｓ．，  Ｍａｒｓｃｈｎｅｒ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｐｏｇｇｅ  ｖｏｎ  Ｓｔｒａｎｄｍａｎｎ，  Ｅ．，  Ｂｏｒｃｈｍａｎｎ，  Ｐ．，  Ｅｎｇｅｒｔ，  Ａ．  ２０１５．  Ａ  ｐｈａｓｅ  １  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉ-ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ＡＦＭ１３  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ．  Ｂｌｏｏｄ  １２５，  ４０２４-４０３１．
Ｓｃｈｌｕｍｓ，  Ｈ．，  Ｃｉｃｈｏｃｋｉ，  Ｆ．，  Ｔｅｓｉ，  Ｂ．，  Ｔｈｅｏｒｅｌｌ，  Ｊ．，  Ｂｅｚｉａｔ，  Ｖ．，  Ｈｏｌｍｅｓ，  Ｔ．Ｄ．，  Ｈａｎ，  Ｈ．，  Ｃｈｉａｎｇ，  Ｓ．Ｃ．，  Ｆｏｌｅｙ，  Ｂ．，  Ｍａｔｔｓｓｏｎ，  Ｋ．，  Ｌａｒｓｓｏｎ，  Ｓ．，  Ｓｃｈａｆｆｅｒ，  Ｍ．，  Ｍａｌｍｂｅｒｇ，  Ｋ．Ｊ．，  Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎ，  Ｈ．Ｇ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｊ．Ｓ．，  Ｂｒｙｃｅｓｏｎ，  Ｙ．Ｔ．  ２０１５．  Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｄｒｉｖｅｓ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ４２，  ４４３-４５６．
Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，  Ｉ．Ｓ．，  Ｃｏｕｄｅｒｔ，  Ｊ．Ｄ．，  Ａｎｄｏｎｉｏｕ，  Ｃ．Ｅ．，  Ｄｅｇｌｉ-Ｅｓｐｏｓｔｉ，  Ｍ．Ａ．  ２０１６．  “Ｎａｔｕｒａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ”：  ＮＫ  Ｃｅｌｌｓ  ａｓ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７，  ２３５．
Ｓｐｉｅｓｓ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｆｏｒｍａｔｓ  ｆｏｒ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  ２０１５，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ６７（２）：９５-１０６
Ｓｐｉｔｓ，  Ｈ．，  Ａｒｔｉｓ，  Ｄ．，  Ｃｏｌｏｎｎａ，  Ｍ．，  Ｄｉｅｆｅｎｂａｃｈ，  Ａ．，  Ｄｉ  Ｓａｎｔｏ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｅｂｅｒｌ，  Ｇ．，  Ｋｏｙａｓｕ，  Ｓ．，  Ｌｏｃｋｓｌｅｙ，  Ｒ．Ｍ．，  ＭｃＫｅｎｚｉｅ，  Ａ．Ｎ．，  Ｍｅｂｉｕｓ，  Ｒ．Ｅ．，  Ｐｏｗｒｉｅ，  Ｆ．，  Ｖｉｖｉｅｒ，  Ｅ．  ２０１３．  Ｉｎｎａｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌｓ--ａ  ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  ｕｎｉｆｏｒｍ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３，  １４５-１４９．
Ｓｕｎ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｕｇｏｌｉｎｉ，  Ｓ．，  Ｖｉｖｉｅｒ，  Ｅ．  ２０１４．  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｙｓｔｅｍ．  ＥＭＢＯ  Ｊ  ３３，  １２９５-１３０３．
Ｔｅｓｉ，  Ｂ．，  Ｓｃｈｌｕｍｓ，  Ｈ．，  Ｃｉｃｈｏｃｋｉ，  Ｆ．，  Ｂｒｙｃｅｓｏｎ，  Ｙ．Ｔ．  ２０１６．  Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄａｐｔｉｖｅ  ＮＫ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７，  ４５１-４６１．
Ｖｉｖｉｅｒ，  Ｅ．，  Ｍｏｒｉｎ，  Ｐ．，  Ｏ´Ｂｒｉｅｎ，  Ｃ．，  Ｄｒｕｋｅｒ，  Ｂ．，  Ｓｃｈｌｏｓｓｍａｎ，  Ｓ．Ｆ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｐ．  １９９１．  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｃ  ｇａｍｍａ  ＲＩＩＩ（ＣＤ１６）：  ｚｅｔａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ-ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｂｙ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｉｎｇ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４６，  ２０６-２１０．
Ｗｅｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ＴａｎｄＡｂｓ：  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｗｅｌｌ-ｍａｎｕｆａｃｔｕｒａｂｌｅ  ｂｉ-ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ２０１５，  ｖｏｌ．  ２０：２７-３２
Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｒ．Ａ．，  Ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，  ２０１３，  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｔａｙｌｏｒ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｃｉｓ
Ｗｈｅｒｒｙ，  Ｅ．Ｊ．，  Ｋｕｒａｃｈｉ，  Ｍ．  ２０１５．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５，  ４８６-４９９．
Ｗｉｅｒｎｉｋ，  Ａ．，  Ｆｏｌｅｙ，  Ｂ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｂ．，  Ｖｅｒｎｅｒｉｓ，  Ｍ．Ｒ．，  Ｗａｒｌｉｃｋ，  Ｅ．，  Ｇｌｅａｓｏｎ，  Ｍ．Ｋ．，  Ｒｏｓｓ，  Ｊ．Ａ．，  Ｌｕｏ，  Ｘ．，  Ｗｅｉｓｄｏｒｆ，  Ｄ．Ｊ．，  Ｗａｌｃｈｅｃｋ，  Ｂ．，  Ｖａｌｌｅｒａ，  Ｄ．Ａ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｊ．Ｓ．  ２０１３．  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｗｉｔｈ  ａ  ＣＤ１６  ｘ  ３３  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ  ａｎｄ  ＡＤＡＭ１７  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９，  ３８４４-３８５５．
Ｚｏｍｐｉ，  Ｓ．，  Ｃｏｌｕｃｃｉ，  Ｆ．  ２００５．  Ａｎａｔｏｍｙ  ｏｆ  ａ  ｍｕｒｄｅｒ--ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｌｅａｄｉｎｇ  ｔｏ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ９７，  ３１-３９．
【図１−１】
2020510657.tif 000003
【図１−２】
2020510657.tif 000004
【図１−３】
2020510657.tif 000005
【図２−１】
2020510657.tif 000006
【図２−２】
2020510657.tif 000007
【図２−３】
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【図２−４】
2020510657.tif 000009
【図３−１】
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【図３−２】
2020510657.tif 000011
【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
2020510657.tif 000015
【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
2020510657.tif 000019
【図８−２】
2020510657.tif 000020
【図９】
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【配列表】
2020510657000001.app
【国際調査報告】
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