(57)【要約】  本発明は、細菌毒素、例えばリポ多糖及びリポタイコ酸を生体液から除去するための方法に関する。このような方法では、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ及びＲＫＩＲＶＲＬＳＡのリストから選択されるペプチドは、場合によりリンカーの介在を伴って、そのＣ末端を介して固体支持体に共有結合され、毒素を捕捉するために使用される。本発明はまた、このような誘導体化固体支持体、並びにこのような誘導体化固体支持体を含むカートリッジ、カラム及び医療器具に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＰＳ及びＬＴＡのリストから選択される細菌毒素を生体液から除去するための方法であって、前記生体液を、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ及びＲＫＩＲＶＲＬＳＡのリストから選択されるペプチドであって、場合によりリンカーの介在を伴って、そのＣ末端を介して固体支持体に共有結合されたペプチドと接触させることを含み、前記リンカーの介在を伴うことにより、リンカー−ペプチド部分を形成し、前記ペプチドの全てのアミノ酸がＬ型又はＤ型のいずれかである、方法。
【請求項２】
前記ペプチド−リンカー部分が以下の式
【化４】
2020517329.tif 000007
（式中、
Ｒ１−、Ｒ２−、Ｒ３−、Ｒ４−、Ｒ５−、Ｒ６−、Ｒ７−及びＲ８−は同じもの又は異なるものであり得、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ−、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ−、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ−及びＲＫＩＲＶＲＬＳＡ−から選択され；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は同じもの又は異なるものであり、少なくとも二官能性残基であり；
ｎ、ｍ、ｐ、ｑ、ｔ、ｖ及びｗは同じもの又は異なるものであり得、ゼロ又は１であり得、ｍ、ｎ、ｐ及びｑの少なくとも１つは１であり、ただし、ｔがゼロである場合、ｎ及びｍはゼロであり、ｐ及びｑの少なくとも１つは１であり、ｖがゼロである場合、ｐ及びｑはゼロであり、ｍ及びｎの少なくとも１つは１であり、ｗがゼロである場合、ｖはゼロであり、ｍ及びｎの少なくとも１つは１であり；
Ｙは、結合又はスペーサーである）のラジカルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７が同じもの又は異なるものであり、少なくとも２つの官能性アミノ基をそれぞれ含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７が同じもの又は異なるものであり、リジン残基、オルニチン残基、ノルリジン残基、アミノアラニン残基及びジアミノプロピオン酸残基から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ｒ１−、Ｒ２−、Ｒ３−、Ｒ４−、Ｒ５−、Ｒ６−、Ｒ７−及びＲ８−の少なくとも１つがＫＫＩＲＶＲＬＳＡ−である、請求項２〜４に記載の方法。
【請求項６】
Ｙがアミノ酸残基又はペプチドである、請求項２〜５に記載の方法。
【請求項７】
Ｙが、β−アラニン残基、Ｎ−（ＰＥＧ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−残基（１≦ｙ≦１１）、システイン残基及びこのような残基を含むペプチドのリストから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ｗがゼロであり、ｖがゼロであり、ｔが１であり、ｍが１であり、ｎが１である、請求項２〜７に記載の方法。
【請求項９】
Ｘ１、Ｘ２及びＸ５がそれぞれリジン残基である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｒ１−、Ｒ２−、Ｒ３−及びＲ４−の少なくとも１つがＫＫＩＲＶＲＬＳＡ−である、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項１１】
前記固体支持体が、架橋アガロース樹脂及び架橋ヒドロキシエチルポリスチレンとポリエチレングリコールとの複合樹脂のリストから選択される、請求項１〜１０に記載の方法。
【請求項１２】
固体支持体であって、場合によりリンカーの介在を伴って、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ及びＲＫＩＲＶＲＬＳＡのリストから選択されるペプチドのＣ末端に共有結合され、それにより、ペプチド−リンカー部分が形成される、固体支持体。
【請求項１３】
前記ペプチド−リンカー部分が請求項２〜１１で定義されるとおりである、請求項１２に記載の固体支持体。
【請求項１４】
ＬＰＳ及びＬＴＡのリストから選択される細菌毒素を生体液から除去するための医療器具、例えば、請求項１２又は１３に記載の固体支持体を含む医療器具。
【請求項１５】
ＬＰＳ及びＬＴＡから選択される細菌毒素を生体液から除去するための、請求項１２又は１３に記載の固体支持体を含む医療器具の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体液から細菌毒素、例えばリポ多糖及びリポタイコ酸を除去するための方法に関する。このような方法では、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ及びＲＫＩＲＶＲＬＳＡのリストから選択されるペプチドは、場合によりリンカーの介在を伴って、そのＣ末端を介して固体支持体に共有結合され、毒素を捕捉するために使用される。
【０００２】
本発明はまた、このような誘導体化固体支持体、並びにこのような誘導体化固体支持体を含むカートリッジ、カラム及び医療器具に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
敗血症は、体の免疫系及び凝固系により引き起こされる臨床症候群である。敗血症性ショックは、適切な輸液にもかかわらず低い血圧及び臓器の機能障害又は不全を特徴とする致命的な症状である。全年齢の人々において、敗血症は重要な死因である(Perner et al, 2017)。
【０００４】
２０年間超にわたり、敗血症は、発熱（又は低体温）、頻脈、頻呼吸、及び白血球変化を生じさせる微生物感染として定義されていた。現在、敗血症は、無秩序な全身性炎症、及び臓器傷害を生じさせる微生物侵入に対する免疫反応と考えられている。敗血症性ショックは、高乳酸血症と、昇圧剤治療を必要とする併発低血圧とを伴う敗血症として定義され、院内死亡率は３０〜５０％に迫っている。
【０００５】
敗血症及び関連障害は世界中で主要死因であり、毎年１９００万件の症例及び毎日１，４００件の死亡を占めている。米国のような先進国のみでは、敗血症の発生率は毎年１，６５５，０００件であり、２５０，０００件超の死亡が生じると推定される。これは米国にとって大きな経済的負担となっており、ヘルスケアに対して合計１６７億ドルを占めている(Lakshmikanth et al, 2016)。
【０００６】
敗血症を患っている患者は、通常、心臓を刺激し、許容し得る血圧レベルを維持するために、静脈内抗生物質、酸素、液体及び薬物で処置される。いくつかの場合では、透析が使用される。
【０００７】
この分野では集中的な研究が行われているが、敗血症の特定の医療処置は見出されていない。より早期の認識及びベストプラクティスのコンプライアンス向上により、敗血症は、それほど即時の致命的障害ではなくなっており、むしろ、長期炎症、免疫抑制、臓器傷害及び除脂肪組織消耗に関連することが多い長期慢性重病になっている。さらに、敗血症を生き抜く患者は、退院後の死亡並びに長期認知障害及び機能障害のリスクを継続している。より早期の認識及びベストプラクティスの実施改善は院内死亡率を減少させたが、これまでの免疫モジュレーターの使用による結果は期待外れであった。同様に、敗血症を確定診断するか又は臨床転帰を予測するバイオマーカーはない。その複雑性により、敗血症転帰の改善は、遅く漸進的であり続ける可能性が高い(Hotchkiss et al, 2016)。
【０００８】
リポ多糖（ＬＰＳ）又はエンドトキシン（グラム陰性細菌の外膜の主要成分）は、敗血症の臨床症候群の原因となる主要な細菌産物である。宿主レセプターＴｏｌｌ様レセプター４（ＴＬＲ４）へのＬＰＳ結合は、宿主が侵入病原体に反応することを可能にする多数の炎症メディエーターの放出を特徴とする炎症反応を惹起する。この産生がコントロール不能かつ過剰になると、それは、敗血症性ショックの発症につながる(Ianaro et al, 2009)。
【０００９】
また、リポタイコ酸（ＬＴＡ）（グラム陽性菌の主要な細胞壁成分）は、軽度皮膚疾患から重度敗血症に至る様々な炎症性疾患に関連する。Ｔｏｌｌ様レセプター２（ＴＬＲ２）によりＬＴＡが認識されると、自然免疫反応が開始し、適応免疫がさらに発生することが公知である。しかしながら、過剰な免疫反応は、敗血症などの重度疾患に関与する炎症性後遺症をもたらし得る(Kang et al, 2016)。
【００１０】
ＴＯＲＡＹＭＹＸＩＮ(Rocco and Klein 2014; Shoji et al, 1998)は、ポリミキシンＢ（ＰＭＸ）（臨床において既に使用されている典型的な抗菌ペプチド(Roscia et al, 2013)）を、循環ＬＰＳを除去するために使用される血液灌流デバイス中のポリスチレン系線維に固定化する治療戦略である。ＰＭＸをポリスチレン系線維に共有結合的に固定化することにより、ＰＭＸカートリッジを作ることができ、次いでこれを、体外循環路を外部使用した血液濾過に使用し、それにより、ＰＭＸカートリッジへのその吸着を介して循環ＬＰＳを除去することができる。
【００１１】
異なる戦略では、ポリミキシンＢ（ＰＭＸ）は固相(Sepharose（登録商標）4B)に固定化され、PMX-Sepharoseカラムによるエンドトキシンの特定のオンライン血漿吸着を用いて、覚醒ラットにおいてプラズマフェレシスのシステムが開発された(Cohen et al, 1987)。
【００１２】
Alteco（登録商標）LPS Adsorber (Ala-Kokko et al, 2011)は、血液灌流中のＬＰＳの体外除去のための医療デバイスである。この製品のバイオテクノロジーは、敗血症患者の循環中に見られるＬＰＳに選択的に結合する合成特注ペプチドに基づく。
【００１３】
しかしながら、敗血症患者において、血液からＬＰＳ及び可能であればさらにＴＬＡを枯渇させる代替方法が必要である。
【００１４】
先行技術
国際公開公報第２０１００３８２２０号には、単量体、樹状構造及び多重抗原ペプチド（ＭＡＰ）形態、特に以下の化合物Ａの形態で提供される抗菌ペプチド配列ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ（Ｍ３３）並びにその機能的類似体ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ及びＲＫＩＲＶＲＬＳＡが開示されており、ＬＰＳを中和するＭ３３の能力が開示されている。上記に列挙されている国際公開公報第２０１００３８２２０号の４つの抗菌ペプチド配列では、全てのアミノ酸がＬ型である。
【化１】
2020517329.tif 000002
【００１５】
国際公開公報第２０１２０１０２６６号には、Ｍ３３のＬ−アミノ酸及びその機能的類似体をそれらの相対的Ｄ−アミノ酸カウンターパートで置換した場合、得られるペプチドは依然として抗菌活性を有することが開示されている。
【００１６】
Ｍ３３が全てＬ型又は全てＤ型であるＭ３３由来四分枝ペプチドは、それらのビオチニル化誘導体をストレプトアビジンコーティング細胞上に固定化する（すなわち、固体支持体に非共有結合的に付着する）アッセイにおいて、ＬＴＡ及びＬＰＳの両方に結合することがFalciani et al. (2012)から公知である。
【００１７】
欧州特許出願公開第１７８９４３６号には、本発明のＭ３３ペプチド及びＭ３３機能的類似体と類似するが同一ではない配列を有するＭＰＡペプチド、固相合成によるそれらの合成（固体支持体に結合されると、ペプチドは完全に側鎖保護される）、並びにbiacoreアッセイにおけるＬＰＳに対するそれらの活性（固体支持体に結合された部分はＬＰＳであるが、抗菌ペプチドではない）が開示されている。
【００１８】
Gustafsson et al. (2010)には、様々な抗菌ペプチド、及び固体支持体上に固定化された場合のそれらのＬＰＳ結合活性が開示されている。同様に、Costa et al. (2011)には、抗菌ペプチドを固体支持体上に共有結合的に付着し得る方法が開示されている。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、架橋ヒドロキシエチルポリスチレンとポリエチレングリコールとの複合樹脂を示す。
【図２】図２は、Sulfolink（商標）樹脂と遊離チオールとの間で、共有結合がどのようにして形成されるかを示す。
【図３】図３は、Sulfolink（商標）樹脂へのカップリング前（Ａ）及び後（Ｂ）における化合物Ｂを含有する溶液のＨＰＬＣプロファイルを示す。
【図４】図４は、化合物Ｂで誘導体化した樹脂（Ａ）及び同じ非誘導体化樹脂（Ｂ）に曝露した前後の生体液のＬＰＳ含有量を示す。
【図５】図５は、化合物Ｂで誘導体化した樹脂（Ａ）及び同じ非誘導体化樹脂（Ｂ）に曝露した前後の生体液のＬＰＳ含有量を示す。
【図６】図６は、血清サンプル（Ａ）、化合物Ｂで誘導体化した樹脂と接触させた後の血清サンプル（Ｂ）、化合物Ａで誘導体化した樹脂と接触させた後の血清サンプル（Ｃ）のタンパク質電気泳動プロファイル、及びこのようなタンパク質の参照値（Ｄ）を示す。
【図７】図７は、化合物Ｂで誘導体化した樹脂（Ａ）及び同じ非誘導体化樹脂（Ｂ）に曝露した前後の生体液のＬＴＡ含有量を示す。
【発明の概要】
【００２０】
発明の詳細な説明
驚くべきことに、本発明者らは、Ｃ末端を介してＭ３３を固体支持体に共有結合した場合、特に、以下の化合物Ａ又は化合物Ｂのいずれかとの共有結合の形成によりこのような構造に結合した場合、生体液のタンパク質含有量を変化させずに生体液からのＬＰＳの選択的除去が可能になることを決定した。
【００２１】
このような誘導体化固体支持体はまた、生体液からＬＴＡを除去するために使用され得る。
【化２】
2020517329.tif 000003
【００２２】
したがって、本発明の第１の態様では、ＬＰＳ及びＬＴＡのリストから選択される細菌毒素を生体液から除去するための方法であって、前記生体液を、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ及びＲＫＩＲＶＲＬＳＡのリストから選択されるペプチドであって、場合によりリンカーの介在を伴って、そのＣ末端を介して固体支持体に共有結合されたペプチドと接触させることを含み、前記ペプチドの全てのアミノ酸がＬ型又はＤ型のいずれかである方法が提供される。
【００２３】
一実施態様では、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ及びＲＫＩＲＶＲＬＳＡのリストから選択されるペプチドの全てのアミノ酸はＬ型である。
【００２４】
別の実施態様では、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ及びＲＫＩＲＶＲＬＳＡのリストから選択されるペプチドの全てのアミノ酸はＤ型である。
【００２５】
一実施態様では、ペプチドリンカー部分は、以下の式
【化３】
2020517329.tif 000004
（式中、
Ｒ１−、Ｒ２−、Ｒ３−、Ｒ４−、Ｒ５−、Ｒ６−、Ｒ７−及びＲ８−は同じもの又は異なるものであり得、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ−、ＲＲＩＲＶＲＬＳＡ−、ＫＲＩＲＶＲＬＳＡ−及びＲＫＩＲＶＲＬＳＡ−から選択され；
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は同じもの又は異なるものであり、少なくとも二官能性残基であり；
ｎ、ｍ、ｐ、ｑ、ｔ、ｖ及びｗは同じもの又は異なるものであり得、ゼロ又は１であり得、ｍ、ｎ、ｐ及びｑの少なくとも１つは１であり、ただし、ｔがゼロである場合、ｎ及びｍはゼロであり、ｐ及びｑの少なくとも１つは１であり、ｖがゼロである場合、ｐ及びｑはゼロであり、ｍ及びｎの少なくとも１つは１であり、ｗがゼロである場合、ｖはゼロであり、ｍ及びｎの少なくとも１つは１であり；
Ｙは、結合又はスペーサーである）のラジカルである。
【００２６】
一実施態様では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は同じもの又は異なるものであり、少なくとも２つの官能性アミノ基をそれぞれ含む。
【００２７】
別の実施態様では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ５、Ｘ６及びＸ７は同じもの又は異なるものであり、リジン残基、オルニチン残基、ノルリジン残基、アミノアラニン残基及びジアミノプロピオン酸残基から選択される。
【００２８】
一実施態様では、Ｒ１−、Ｒ２−、Ｒ３−、Ｒ４−、Ｒ５−、Ｒ６−、Ｒ７−及びＲ８−の少なくとも１つは、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ−である。
【００２９】
別の実施態様では、Ｒ１−、Ｒ２−、Ｒ３−、Ｒ４−、Ｒ５−、Ｒ６−、Ｒ７−及びＲ８−はそれぞれ、ＫＫＩＲＶＲＬＳＡ−である。
【００３０】
一実施態様では、Ｙは、アミノ酸残基及びペプチドのリストから選択される。
【００３１】
特定の実施態様では、Ｙは、アミノ酸残基、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド及びデカペプチドのリストから選択される。
【００３２】
より特定の実施態様では、Ｙは、β−アラニン残基、Ｎ−（ＰＥＧ）ｙ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）残基（１≦ｙ≦１１）、システイン残基及びこのような残基を含むペプチドのリストから選択される。
【００３３】
さらにより特定の実施態様では、前述の実施態様のペプチドは、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、オクタペプチド、ノナペプチド、デカペプチドのリストから選択される。
【００３４】
一実施態様では、ｙは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０及び１１のリストから選択される。
【００３５】
一実施態様では、ｗはゼロであり、ｖはゼロであり、ｔは１であり、ｍは１であり、ｎは１である。
【００３６】
特定の実施態様では、ｗはゼロであり、ｖはゼロであり、ｔは１であり、ｍは１であり、ｎは１であり、Ｘ１、Ｘ２及びＸ５はそれぞれリジン残基である。
【００３７】
特定の実施態様では、ｗはゼロであり、ｖはゼロであり、ｔは１であり、ｍは１であり、ｎは１であり、Ｒ１−、Ｒ２−、Ｒ３−及びＲ４−の少なくとも１つはＫＫＩＲＶＲＬＳＡ−である。
【００３８】
特定の実施態様では、ｗはゼロであり、ｖはゼロであり、ｔは１であり、ｍは１であり、ｎは１であり、Ｒ１−、Ｒ２−、Ｒ３−及びＲ４−はそれぞれＫＫＩＲＶＲＬＳＡ−である。
【００３９】
いくつかの実施態様では、固体支持体は多孔性である。
【００４０】
一実施態様では、固体支持体は架橋アガロース樹脂である。
【００４１】
別の実施態様では、固体支持体は、架橋ヒドロキシエチルポリスチレンとポリエチレングリコールとの複合樹脂である。
【００４２】
いくつかの実施態様では、生体液は、血清、血漿及び血液のリストから選択される。
【００４３】
本発明のこの第１の態様の全ての実施態様は組み合わされ得る。
【００４４】
本発明の第２の態様では、本発明の第１の態様の実施態様における上記ラジカルを有する固体支持体が提供される。
【００４５】
本発明の第３の態様では、本発明の第２の態様の固体支持体をそれぞれ含むカラム及びカートリッジのリストから選択される製品が提供される。
【００４６】
本発明の第４の態様では、本発明の第２の態様の固体支持体又は本発明の第３の態様の製品を含む医療器具が提供される。
【００４７】
特定の実施態様では、医療器具は、ＬＰＳ及びＬＴＡのリストから選択される細菌毒素を生体液から除去するための医療器具である。
【００４８】
本発明の第５の態様では、ＬＰＳ及びＬＴＡのリストから選択される細菌毒素を生体液から除去するための、本発明の第４の態様の医療器具の使用が提供される。
【実施例】
【００４９】
次に、非限定的な実施例により、本発明を説明する。
【００５０】
実施例１：樹脂結合化合物Ａの合成
NovaSyn TG樹脂（０．２４mmol/g）(Novabiochem)１００mg上で、化合物Ａを合成した。
【００５１】
この樹脂は、低架橋ヒドロキシエチルポリスチレンと、アミノ基で末端官能化されている３０００−４０００ＭＷポリエチレングリコールとの複合物である（図１）。
【００５２】
９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学及びＯ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）／１，３−イソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）活性化を使用して、自動合成機Syro (MultiSynTech, Witten, Germany)により、ペプチド合成を行った。側鎖保護基は、Ｌｙｓの場合にはｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルであり、Ａｒｇの場合には２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルであり、Ｓｅｒの場合にはｔｅｒｔ−ブチルエーテルであった。１番目のアミノ酸はＦｍｏｃ−βＡｌａ−ＯＨであった。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨによる２連続カップリング工程を使用してリジンコアを構築し、続いて、Ｆｍｏｃアミノ酸を連続追加して、ペプチドＫＫＩＲＶＲＬＳＡを完成させた。最後に、水及びトリイソプロピルシランを含有するトリフルオロ酢酸（９５：２．５：２．５）による処理により、樹脂上の化合物Ａを側鎖脱保護した。次いで、ペプチジル樹脂をＤＣＭで４回洗浄し、ＭｅＯＨで４回洗浄し、酢酸１Ｍで３回洗浄し、Ｈ２Ｏで４回洗浄し、ＭｅＯＨで４回洗浄した。
【００５３】
実施例２：化合物Ｂの合成
Syroマルチペプチド合成機(MultiSynTech, Witten, Germany)を用いた標準Ｆｍｏｃ化学による固相合成により、化合物Ｂを生産した。Ｆｍｏｃ−ＮＨ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＣＯＯＨをＣ末端の１番目のアミノ酸としてTentaGel S RAM樹脂上でこのペプチドを合成し、第２のカップリング工程でＦｍｏｃ−ＮＨ−ＰＥＧ（４）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯＯＨを追加し、次いで、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨを２回追加して四量体コアを構築した。続いて、Ｆｍｏｃアミノ酸を９回連続で追加して、ペプチドＫＫＩＲＶＲＬＳＡを完成させた。側鎖保護基は、Ｒの場合には２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルであり、Ｋの場合にはｔ−ブトキシカルボニルであり、Ｓの場合にはｔ−ブチルであった。固体支持体から最終生成物を切断し、トリイソプロピルシラン、水を含有するＴＦＡ（９５／２．５／２．５）による処理により脱保護し、ジエチルエーテルで沈殿させた。４０分間で７５％から６５％Ａへの直線勾配（Ａは０．１％ＴＦＡ／水であり、Ｂはアセトニトリルである）の分取カラム(XBridge peptide BEH C18 Waters)による逆相クロマトグラフィーにより、粗ペプチドを精製した（ｒｔ＝２２分）。上記と同じ勾配のPhenomenex Jupiter C18分析カラム（３００Ａ°、５μm、２５０×４．６mm）による逆相クロマトグラフィーにより、及び質量分析ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ(Ultraflex III Bruker Daltonics)により、最終ペプチド純度及び同一性を確認した（Ｍ＋：実測値７７２３，５；計算値７７２４，１）。
【００５４】
実施例３：樹脂結合化合物Ｂの合成
図２に示されているように、スルフヒドリルを介して、化合物ＢをSulfolink（商標）樹脂（これは、架橋アガロース樹脂である）に結合した。
【００５５】
４mlに希釈した化合物Ｂ（１mg/ml）を再懸濁し、カップリングバッファー（５０mMトリス、５mM ＥＤＴＡ−Ｎａ；ｐＨ８．５）中、室温で３０分間インキュベーションした。
【００５６】
カートリッジ／カラム（５mlカラム、直径１cm、樹脂体積２ml）中のSulfoLink（商標）樹脂(SulfoLink（登録商標）Immobilization Kit for Peptides, Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois, USA)を混合により再懸濁し、カラムを１５mlコレクションチューブに入れて１，０００×ｇで１分間遠心分離することにより、保存バッファーを除去した。カップリングバッファー（上記）２mlを樹脂に追加し、次いで、混合物を遠心分離し、この工程を１回繰り返した。化合物Ｂ溶液２mlを追加し、室温で１５分間振盪又は転倒混合することにより混合した。次いで、カラムを垂直に置き、混合せずに室温で３０分間インキュベーションした。この工程を２回繰り返した。
【００５７】
カラムを新たな１５mlコレクションチューブに入れ、遠心分離して未結合ペプチドを収集した。ＨＰＬＣによるカップリング効率を決定するために、フロースルーを保存した。図３に記載されているように、化合物Ｂは２２．２７分に溶出し、カップリング効率は最適であった。
【００５８】
カラムを洗浄し、３回遠心分離した。次いで、カラムをカップリングバッファー２mlで洗浄し、遠心分離した。次いで、未反応結合部位を遮断するために、５０mMシステインを含むカップリングバッファーをカラムに適用し、室温で４５分間混合した。さらなる遠心分離後、カラムを排液した。
【００５９】
実施例４：樹脂結合化合物Ｂは生体液からＬＰＳを除去し、血清タンパク質含有量を有意に変化させない
実施例３の化合物Ｂロード樹脂２mlを含む５mlカラム（５mlカラム、直径１cm、樹脂体積２ml）を使用した。E. coli O111:B4由来のＬＰＳ(Sigma, St. Louis, MO)を含有するヒト血清（５ng/ml）２mlをカートリッジに入れて、一定の振盪下で樹脂と共に室温で２時間インキュベーションした。次いで、サンプルを収集し、材料及び方法に記載されているように、Limulus Amebocyte Lysate (LAL)試験により、ＬＰＳ量について測定した。
【００６０】
ネガティブコントロールとして、化合物Ｂをロードしていない同量の樹脂を同量の血清と共にインキュベーションし、そのＬＰＳ含有量を上記のように決定した。
【００６１】
別のコントロールとして、未処理血清アリコートのＬＰＳ含有量も測定した。
【００６２】
図４に記載されているように、ロード樹脂は、血清からE. coli  ＬＰＳの８５％を除去することができたが、非ロード樹脂はＬＰＳを全く除去しなかった。
【００６３】
化合物Ｂロード樹脂への通過の前後の血清のキャピラリー電気泳動プロファイルをそれぞれ示す図６Ａ及び６Ｂに記載されているように、このような通過は、血清タンパク質含有量を有意に変化させない。
【００６４】
実施例５：樹脂結合化合物Ａは生体液からＬＰＳを除去し、血清タンパク質含有量を有意に変化させない
実施例１の化合物Ａロード樹脂１mlを５mlカラム（５mlカラム、直径１cm）にロードした。実施例４に記載されているのと同じ手順を使用して、図５に記載されているようにそれを決定した。化合物Ａロード樹脂は７４％超のE.coli由来ＬＰＳを除去することができたのに対して、非ロード樹脂はＬＰＳの４３％を除去した。
【００６５】
化合物Ａロード樹脂への通過の前後の血清のキャピラリー電気泳動プロファイルをそれぞれ示す図６Ａ及び６Ｃに記載されているように、このような通過は、血清タンパク質含有量を有意に変化させない。
【００６６】
実施例６：樹脂結合化合物Ｂは、ＬＴＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水溶液からＬＴＡを除去する
実施例３の化合物Ｂロード樹脂２mlを含む５mlカラム（５mlカラム、直径１cm、樹脂体積２ml）を使用した。S. aureus由来のＬＴＡ(MyBiosource, San Diego, CA, US)を含有するリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（５００pg/ml）１mlをカートリッジに入れて、一定の振盪下で樹脂と共に室温で２時間インキュベーションした。次いで、サンプルを収集し、材料及び方法に記載されているように、ヒトＬＴＡ（リポタイコ酸）ELISAキットにより、ＬＴＡ量について測定した。
【００６７】
ネガティブコントロールとして、化合物Ｂをロードしていない同量の樹脂を同量のＰＢＳと共にインキュベーションし、そのＬＴＡ含有量を上記のように決定した。図７に記載されているように、ロード樹脂は９７％のS.aureus由来ＬＴＡを除去することができたのに対して、非ロード樹脂は１４％しか除去しなかった。
【００６８】
材料及び方法
LAL試験によるＬＰＳの測定
遊離ＬＰＳの存在のインジケーターであるLAL発色エンドトキシン定量キット(ThermoFisher Scientific, Waltham, US)を使用して、ＬＰＳ除去の分析を実施した。
【００６９】
Escherichia coli (O111:B4)由来のコントロール標準エンドトキシンを含むエンドトキシンフリー水を使用して、標準曲線（０．１〜１EU/ml）を作成し、連続希釈した。エンドトキシンフリー水で血清サンプルを５０倍及び１００倍に希釈した。各サンプルを２回反復で処理した。
【００７０】
加熱ブロックでマイクロプレートを３７℃で１０分間平衡化した。次いで、標準及びサンプル各５０μLをマイクロプレートウェルに分注し、３７℃で５分間インキュベーションした。
【００７１】
Limulus Amebocyte Lysate (LAL)５０μLを各ウェルに追加し、プレートを３７℃で１０分間インキュベーションした。正確に１０分後、発色基質溶液１００μLを各ウェルに追加した。プレートを３７℃で６分間インキュベーションした。最後に、停止試薬（２５％酢酸）５０μLを追加した。プレートリーダー(Ascent Software)により、４０５〜４１０nmの吸光度を測定した。上記のように得た標準曲線に基づいて、EUを計算した。
【００７２】
ＥＬＩＳＡによるＬＴＡの測定
その趣旨で市販のキットを使用することにより、サンプルのＬＴＡ含有量を容易に決定することができる。このようなキットの一例は、Antibody Research Corporation (St.Charles, Missouri) LTA ELISAキットである。リポタイコ酸抗体でプレコーティングしたマイクロプレートウェルにサンプルを追加する。インキュベーション及び洗浄後、ビオチンで標識したリポタイコ酸検出抗体を追加する。適切なインキュベーション後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲートを追加し、続いて、インキュベーションし、洗浄して非複合化酵素を除去する。発色性３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液の追加後、サンプルを５分間インキュベーションする。硫酸溶液の追加により、ＨＲＰ酵素反応を停止する。発色の強度は、サンプル中に存在するリポタイコ酸の濃度に比例し、プレートリーダーを使用して４５０nMで読み取る。標準曲線の吸光度値を補間することにより、サンプル中のリポタイコ酸の濃度を決定する。
【００７３】
ヒトＬＴＡ（リポタイコ酸）ＥＬＩＳＡキット(MyBiosource, San Diego, CA, US)を使用して、ＬＴＡ除去の分析を実施した。
【００７４】
S. aureus由来のコントロール標準リポタイコ酸を含むサンプル／標準希釈バッファーを使用して標準曲線（７．８〜５００pg/ml）を作成し、連続希釈した。
【００７５】
サンプル／標準希釈バッファーでサンプルを２倍及び１０倍希釈した。各サンプルを２回反復で処理した。
【００７６】
マイクロプレートを２回洗浄してから、標準、サンプル及びコントロール（ゼロ）をウェルに追加した。次いで、標準及びサンプル各１００μLをマイクロプレートウェルに分注し、３７℃で９０分間インキュベーションした。
【００７７】
ビオチン検出抗体ワーキング溶液１００μLを上記ウェルに追加し、３７℃で６０分間インキュベーションした。
【００７８】
洗浄バッファーでプレートを３回洗浄した。
【００７９】
ＨＲＰ−ストレプトアビジンコンジュゲート（ＳＡＢＣ）ワーキング溶液１００μLを各ウェルに追加し、プレートを３７℃で３０分間インキュベーションした。正確に３０分後、洗浄バッファーでプレートを５回洗浄した。
【００８０】
ＴＭＢ基質溶液９０μLを各ウェルに追加した。プレートを暗所、３７℃で１５〜３０分間インキュベーションした。最後に、停止溶液５０μLを追加した。プレートリーダー(Ascent Software)により、４５０nmの吸光度を測定した。上記のように得た標準曲線に基づいて、ＬＴＡ濃度を計算した。
【００８１】
キャピラリー電気泳動
化合物Ａ又はＢロード樹脂への通過の前後に、製作者の指示にしたがって、臨床デバイスCapillarys (4.51ソフトウェア; Sebia)により、ヒト血清を分析した。機器は、サンプル中に存在するタンパク質の量をg/L単位で提供し、曲線上面積から計算した相対含有量により、電気泳動曲線のプロファイルも示した。
【００８２】
参考文献
【表１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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