(57)【要約】画像化プローブを使用して、画像化プローブ及び／又はそれらに結合し得る分子を識別できる画像を取得する、蛍光光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、相関顕微鏡法などの顕微鏡法を使用した生体試料の画像化方法。本発明はまた、ＣＬＥＭ実験及び免疫細胞化学実験の両方で使用可能な、機能化され得る画像化プローブに関する。
2020528557.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
顕微鏡法を使用して生体試料を画像化する方法であって、白金のナノ粒子の周りに局在化した電子密度の高いオスミウム親和性の沈殿物を得るための、白金のナノ粒子、酸化剤、及び、被酸化性基質の前記生体試料における使用を提供することを特徴とし、前記オスミウム親和性の沈殿物は、前記白金のナノ粒子によって、及び前記酸化剤によって活性化された前記被酸化性基質の酸化段階によって得られる方法。
【請求項２】
前記被酸化性基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｐ−フェニレンジアミン−ピロカテコール、及びホモバニリン酸からなる群から選択される少なくとも１つの化学化合物を含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記酸化剤は、過酸化水素、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、過酢酸、過酸化ベンゾイル、イソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、アラキドン酸５−ヒドロペルオキシド及びドデシル２−メトキシプロパン−２イルペルオキシドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記酸化剤は過酸化水素であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記白金のナノ粒子は、前記生体試料中に存在する特定の物質と結合することができる少なくとも１つの関連分子と直接又は間接的に結合され、前記関連分子は、抗体、タンパク質、アプタマー、ペプチド、糖、多糖類、生物学的分子、及び化学化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
白金のナノ粒子と結合した前記関連分子の少なくとも１つとは異なる少なくとも関連分子と直接又は間接的に結合した、前記生体試料における金及び／又は銀のナノ粒子の使用を提供することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
白金のナノ粒子は１００ｎｍ以下のサイズを有することを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
顕微鏡法は、蛍光光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、相関顕微鏡法、イオンビーム顕微鏡法、電磁放射線顕微鏡法、及びそれらの組合せからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の画像化する方法を実行するために、生体試料において顕微鏡による検出が可能な画像化プローブであって、白金のナノ粒子、酸化剤及び被酸化性基質を含み、前記白金のナノ粒子及び前記酸化剤は、前記白金のナノ粒子の周囲に局在する電子密度の高いオスミウム親和性の沈殿物を得るために、前記被酸化性基質の酸化を活性化するように構成されていることを特徴とするプローブ。
【請求項１０】
前記被酸化性基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｐ−フェニレンジアミン−ピロカテコール、及びホモバニリン酸からなる群から選択される少なくとも１つの化学化合物を含むことを特徴とする、請求項９に記載のプローブ。
【請求項１１】
前記酸化剤は、過酸化水素、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、過酢酸、過酸化ベンゾイル、イソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、アラキドン酸５−ヒドロペルオキシド及びドデシル２−メトキシプロパン−２イルペルオキシドからなる群から選択されることを特徴とする、請求項９又は１０に記載のプローブ。
【請求項１２】
前記酸化剤は過酸化水素であることを特徴とする、請求項９又は１０に記載のプローブ。
【請求項１３】
前記白金のナノ粒子は、前記生体試料中に存在する特定の物質と結合することができる少なくとも１つの関連分子と直接又は間接的に結合され、前記関連分子は、抗体、タンパク質、アプタマー、ペプチド、糖、多糖類、生物学的分子、及び化学化合物からなる群から選択されることを特徴とする、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のプローブ。
【請求項１４】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の顕微鏡法を使用して生体試料を画像化する方法を実行するために、白金のナノ粒子の周りに局在化した電子密度の高いオスミウム親和性の沈殿物を得るための、白金のナノ粒子、酸化剤及び被酸化性基質の、請求項９〜１３のいずれか一項に記載の画像化プローブとしての使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微鏡法、特に蛍光光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、又は相関顕微鏡法（ＣＬＥＭ相関光電子顕微鏡法）で使用可能な画像化プローブを使用して生体試料を画像化する方法に関する。
【０００２】
本願において、画像化とは、生体試料又はその一部、例えば細胞の画像の取得を意味し、画像化プローブ及び／又はそれらに結合し得る分子を特定することが可能である。
本発明はまた、例えば免疫細胞化学実験、又は関心のある特定の分子を同定する実験など、顕微鏡法による生体試料に対する実験を行うために使用される画像化プローブに関する。
【背景技術】
【０００３】
生物学分野の主要な顕微鏡技術の１つはＣＬＥＭである。これは、通常数十ミクロンから数ナノメートルで画定される空間スケールで、生体試料中の特定の分子の動きを視覚化、識別、及び追跡できるためである。
【０００４】
この手法は、蛍光光学顕微鏡（ＦＯＭ）の利点と透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）の利点を組み合わせて、生体試料中の特定の対象分子を高精度で特定できるようにする。
他の電子顕微鏡技術は、この特定の分野では免疫金とも呼ばれる免疫細胞化学実験を実行して、生体試料中の特定の抗原をナノメートルスケールで局在決定することを可能にする。
【０００５】
これらの実験では、通常、特定の抗原を認識して結合できる抗体又はタンパク質と結合したコロイド金ナノ粒子からなるプローブが使用される。
これに関連して、ＣＬＥＭ及び免疫細胞化学実験の両方に使用可能なプローブを利用できるようにする必要があり、これにより、生体試料にアーチファクトや変更を生じさせることなく、特定の分子を高精度で検出できるようになる。
【０００６】
量子ドット又は量子ロッドからなるプローブ、又はこの特定の分野では「ナノゴールド」とも呼ばれる直径約１ｎｍの金のナノ粒子などの電子密度の高いナノ粒子と結合したフルオロフォアからなる組み合わせプローブが知られている。
【０００７】
このようなプローブは、生体試料に存在する可能性のある個々の細胞の中に入ることができるが、ＴＥＭを使用して検出することは難しく、銀又は金増感として知られる付着通過（ａｃｃｒｅｔｉｏｎ  ｐａｓｓａｇｅ）が必要である。
【０００８】
この付着通過は、得られた画像の解釈を困難にする特定の寄与の追加を伴う１つ以上の還元剤の存在下で銀又は金の塩の溶液を使用することを必要とする。
他のＣＬＥＭプローブは、ベンジジンの誘導体であるジアミノベンジジン（ＤＡＢ）をＴＥＭで明確に見えるオスミウム親和性沈殿物を形成するＤＡＢポリマーに光変換するために、それに関連付けられた分子の蛍光を利用する。
【０００９】
しかし、電子顕微鏡による二重免疫学的局在決定を実施する場合、これらのプローブには、アビジンとビオチン化ペルオキシダーゼからなる複合体を使用する必要がある。これは一次抗体と結合することにより、ＤＡＢを酸化することでオスミウム親和性にし、それによりＴＥＭで見えるようにする。
【００１０】
これは、長い実施時間を必要とするため、エネルギーの観点及びコストの観点の両方から高価である。
光変換の代替法として、ＤＡＢオスミウム親和性ポリマーは、ペルオキシダーゼ結合プローブ、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）によっても生成できる。
【００１１】
「ナノゴールド」とは異なり、ＨＲＰ酵素はそのサイズを変化させずに維持するだけでなく、ｐＨ、温度、圧力条件の影響を受けやすい。
これは、ＨＲＰ酵素が個々の細胞内に浸透できず、それが見られる環境の条件に応じて変性しやすいことを意味する。
【００１２】
このため、ＨＲＰ酵素と結合したプローブは、制御された環境で常に維持する必要がある。
いくつかの既知の解決策は、特定の分子と結合できる発光性イオンでドープされた格子を含む無機ナノ粒子の使用し、それらを生体試料中で検出できるようにすることである。
【００１３】
例えば、特許文献１は、発光を活性化する希土類カチオン又は遷移金属を捕捉した無機塩、酸化物又は半導体の格子などの複雑な無機ナノ粒子の使用を提供する。
生体試料の成分の典型的なサイズと比較して、これらの既知の格子はサイズが大きいため、それらが結合する特定の分子及び生体試料自体の両方に潜在的に干渉する可能性がある。
【００１４】
さらに、これらの既知の格子は、通常、高レベルの毒性を持っているため、生体試料の挙動を大きく変える可能性がある。
生体試料の既知の画像化法のいくつかには、使用するプローブのサイズ、電子密度、毒性に密接に関連する多くの欠点がある。
【００１５】
数ナノメートルの範囲のサイズ又は低電子密度のプローブは、ＴＥＭで検出するのが困難である。一方、より大きなプローブは、抗原−タンパク質活性を著しく妨害してアーチファクト及び／又は変更のない画像の取得を不能にする可能性がある。
【００１６】
これらの問題は、サイズの大きいプローブのペア又は特定の複合体を使用して２つの異なるタンパク質を同時に検出する場合にさらに顕著になる。
したがって、最新技術の欠点の少なくとも１つを克服する生体試料の画像化方法を完成させ、利用可能にする必要がある。
【００１７】
また、最新技術の欠点の少なくとも１つを克服する生体試料の画像を取得するために使用可能な画像化プローブを完成させ、利用可能にする必要もある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１８０１５９３号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、銀又は金増感を行う必要なく、又は複合体を使用する必要なく、細胞より小さいスケールであっても生体試料において特定の分子を容易に識別できる画像を得ることができる画像化方法を提供することを目的とする。
【００２０】
また、本発明の目的は、ＣＬＥＭ及び免疫細胞化学実験を行うことのどちらによっても、変更されていない及び／又はアーチファクトのない画像を得ることを可能にする画像化プローブを提供することでもある。
【００２１】
本発明の別の目的は、制御された環境に保たれなくても、毒性が低く、広範囲のｐＨ、温度及び圧力にわたって安定な画像化プローブを提供することである。
出願人は、最新技術の欠点を克服し、これら及び他の目的及び利点を得るために、本発明を創案、試験及び具体化した。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、独立請求項に記載され、特徴付けられており、従属請求項は、本発明の他の特徴又は主要な発明思想の変形を記載している。
本明細書で説明する実施形態は、優先的な例として、蛍光光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、相関顕微鏡法、イオンビーム顕微鏡法、電磁放射線顕微鏡法、及びそれらの組合せなどの顕微鏡法を使用して生体試料を画像化する方法に関する。
【００２３】
本発明の一態様によれば、本方法は、白金のナノ粒子、酸化剤、及び、白金のナノ粒子の周りに局在化した電子密度の高いオスミウム親和性の沈殿物を生成することができる被酸化性基質の生体試料での使用を提供する。
【００２４】
本発明によれば、オスミウム親和性の沈殿物は、白金のナノ粒子及び酸化剤によって活性化された被酸化性基質を酸化することにより得られる。
この解決手段により、ＣＬＥＭ及び免疫細胞化学実験の両方の実施が可能になり、白金のナノ粒子を生物学的分子及び／又は蛍光を発する分子、つまり蛍光マーカーで機能化し得る。
【００２５】
出願人は、白金のナノ粒子が、例えば過酸化水素などの被酸化性基質及び酸化剤の存在下で、被酸化性基質の酸化を活性化し、白金のナノ粒子の周りにオスミウム親和性の沈殿物を生成させる固有の高いペルオキシダーゼ活性を有することを発見した。
【００２６】
オスミウム親和性の沈殿物は電子密度が高く、電子顕微鏡でシグナルを増幅できるため、低倍率でも十分な視野で白金のナノ粒子をはっきりと見ることができる。
出願人は、白金のナノ粒子に関する電子顕微鏡法でのシグナルの増幅が、同じサイズの、既知のように電子密度がより高い金ナノ粒子で得られるシグナルよりも約１桁大きいことを発見した。
【００２７】
これにより、電子顕微鏡画像と対応する蛍光画像との相関が大幅に単純化される。これは現在、相関顕微鏡の分野で重要なポイントである。
シグナルの増幅のおかげで、銀や金の富化によってナノ粒子の付着を実施する必要なく、生体試料に存在する可能性のある細胞の内部にある約１ｎｍのサイズの白金のナノ粒子でも検出することができる。
【００２８】
したがって、本発明によれば、生体試料の画像化を行うために、金のナノ粒子よりも電子密度の低い白金のナノ粒子を使用することが可能である。
可能な解決手段によれば、被酸化性基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｐ−フェニレンジアミン−ピロカテコール及びホモバニリン酸からなる群から選択される少なくとも１つの化学化合物を含む。
【００２９】
可能な実施形態によれば、酸化剤は、過酸化水素、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、過酢酸、過酸化ベンゾイル、イソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、アラキドン酸５−ヒドロペルオキシド、及びドデシル２−メトキシプロパン−２イルペルオキシドからなる群から選択される。
【００３０】
可能な実施形態によれば、酸化剤は過酸化水素である。
選択した酸化剤に応じて、酸化時間及び必要な酸化度をそれぞれの場合の特定の必要性に関して決定できる。
【００３１】
可能な実施形態によれば、白金のナノ粒子は、生体試料中に存在する特定の物質と結合することができる少なくとも１つの関連分子と直接又は間接的に結合され、前記関連分子は、抗体、タンパク質、アプタマー、ペプチド、糖、多糖類、生物学的分子、及び化学化合物からなる群から選択される。
【００３２】
出願人は、白金のナノ粒子のペルオキシダーゼ活性を損なうことなく、白金のナノ粒子を特定の関連分子又は蛍光色素で機能化できることを発見した。
白金のナノ粒子は、細胞毒性が低いだけでなく、複雑な表面機能化やバイオコンジュゲーション手順を必要としないという利点もある。
【００３３】
さらに、ＨＲＰ酵素とは異なり、機能化された白金のナノ粒子は、広範囲のｐＨ、温度及び圧力において高い安定性を有する。
これにより、周囲温度でもナノ粒子を保存でき、決められた環境条件を維持するためのシステムに頼る必要がない。
【００３４】
可能な実施形態によれば、この方法は、白金のナノ粒子と結合した関連分子の少なくとも１つとは異なる少なくとも関連分子と直接又は間接的に結合した、生体試料における金及び／又は銀のナノ粒子の使用を提供する。
【００３５】
ペルオキシダーゼ活性の有無にかかわらず、白金のナノ粒子と金及び／又は銀のナノ粒子をそれぞれ使用すると、それらに結合した２つの関連分子、例えば２つのタンパク質を、生成される互いに異なる信号によって認識することができる。
【００３６】
目的のタンパク質に対するプローブの干渉の可能性のリスクがかなり低減されるため、本発明の文脈において、生体試料中の２つの関連分子の同時二重局在決定を実施する可能性は、小さいプローブを使用できることを意味する。
【００３７】
本発明はまた、優先的な例として、蛍光光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、相関顕微鏡法、イオンビーム顕微鏡法、電磁放射線顕微鏡法、及びそれらの組合せなどの顕微鏡法によって生体試料において検出可能な画像化プローブに関する。
【００３８】
本発明の一態様によれば、プローブは、白金のナノ粒子、酸化剤、及び被酸化性基質を含む。
白金のナノ粒子及び酸化剤は、白金のナノ粒子の周囲に局在する電子密度の高いオスミウム親和性の沈殿物を得るために、被酸化性基質の酸化を活性化するように構成されている。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本発明のこれら及び他の特徴は、添付の図面を参照して非限定的な例として与えられるいくつかの実施形態の以下の説明から明らかになるであろう。
【図１】本発明による画像化方法の記載された可能な実施形態の１つに従って得られた２つの生体試料の２つの画像グループを示し（文字「ａ」から「ｃ」で表示された四角は第１のグループを示し、文字「ｄ」から「ｆ」で表示された四角は第２のグループを示す）、拡大率を順に大きくしている。
【図２】本発明による画像化方法の記載された可能な実施形態の１つに従って得られ生体試料の一連のＣＬＥＭ画像を示し（文字「ａ」で表示された四角はＦＯＭ画像を示し、文字「ｂ」から「ｇ」で表示された四角はＴＥＭ画像を示す）、拡大率を順に大きくしている。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
本明細書に記載の実施形態は、生体試料を画像化して、その都度特定の目的分子を検出することが可能な生体試料の少なくとも一部の少なくとも画像を取得する方法に関する。
この画像化方法は、生体試料において顕微鏡による検出が可能な画像化プローブの使用を提供する。
【００４１】
可能な解決手段によれば、顕微鏡法は、蛍光光学顕微鏡法、電子顕微鏡法、相関顕微鏡法、イオンビーム顕微鏡法、電磁放射線顕微鏡法、及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【００４２】
非限定的な例として、本発明による画像化プローブは、ＣＬＥＭ及び免疫細胞化学実験又は免疫金実験の両方に使用することができる。
本発明によれば、画像化方法は、白金のナノ粒子、酸化剤及び被酸化性基質からなる画像化プローブの生体試料における使用を提供する。
【００４３】
可能な解決手段によれば、被酸化性基質は、１つ以上の発色性及び／又は酸化性分子を含むことができる。
白金のナノ粒子は、本質的に蛍光性であるか、又はフルオロフォア及び／又は蛍光マーカーなどの蛍光を発することができる分子と結合させることができる。
【００４４】
白金のナノ粒子は、特定の定義されたサイズに応じて蛍光による電磁放射を放出できるため、白金のナノ粒子の固有の蛍光は、粒子のサイズに関連している。
可能な解決手段によれば、白金のナノ粒子は１００ｎｍ以下のサイズを有する。
【００４５】
可能な解決手段によれば、白金のナノ粒子は０．５ｎｍ〜２０ｎｍのサイズを有する。
可能な解決手段によれば、白金のナノ粒子は２ｎｍ〜１０ｎｍのサイズを有する。
これらのサイズの範囲は、白金のナノ粒子が本質的に蛍光を発する特定のサイズを含むだけでなく、白金のナノ粒子が生体試料に存在する可能性のある細胞に浸透することができる範囲でもある。
【００４６】
以下で明らかになるように、これは、銀又は金増感の助けを借りずに細胞より小さいスケールで画像を得ることができるため、空間解像度及びコストの点で有利である。
本発明によれば、画像化プローブは、特にそのようなサイズを有する白金のナノ粒子に特有な固有のペルオキシダーゼ活性に基づいている。
【００４７】
可能な変形実施形態によれば、白金のナノ粒子は、ナノ粒子のナノクラスター、すなわち白金のナノ粒子の凝集体を構成することができる。
出願人は、白金のナノ粒子が、被酸化性基質を用いて、例えば水中の過酸化水素などの酸化剤の還元を触媒し、白金のナノ粒子の周囲に局在するオスミウム親和性の沈殿物の生成を促進できることを発見した。
【００４８】
このオスミウム親和性の沈殿物は、電子密度が高いため、電子顕微鏡ではっきりと見ることができる。
白金のナノ粒子の表面のペルオキシダーゼ活性によって誘導されるオスミウム親和性の沈殿物の局在化のおかげで、オスミウム親和性の沈殿物の電子密度の高さを活用して、生体試料において白金のナノ粒子を局在化させることができる。
【００４９】
出願人は、白金のナノ粒子のペルオキシダーゼ活性は、モル換算で天然のペルオキシダーゼ酵素の活性よりもはるかに高く、後者とは異なり、白金のナノ粒子は広範囲のｐＨ、温度及び圧力で極めて安定であることを発見した。
【００５０】
可能な実施形態によれば、被酸化性基質は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ｐ−フェニレンジアミン−ピロカテコール、及びホモバニリン酸からなる群から選択される少なくとも１つの化学化合物を含む。
【００５１】
可能な解決手段によれば、基質は他のベンジジン誘導体を含むことができる。
可能な実施形態によれば、酸化剤は、過酸化水素、ｔｅｒｔ−ブチルペルオキシド、ｔｅｒｔ−ブチルヒドロペルオキシド、過酢酸、過酸化ベンゾイル、イソプロピルベンゼンヒドロペルオキシド、アラキドン酸５−ヒドロペルオキシド及びドデシル２−メトキシプロパン−２−イルペルオキシドからなる群から選択される。
【００５２】
可能な優先的解決手段によれば、酸化剤は過酸化水素である。
可能な実施形態によれば、白金のナノ粒子は表面官能化することもでき、すなわち、少なくとも１つの関連分子と直接又は間接的に結合することができる。
【００５３】
関連分子とは、生体試料に存在する特定の物質と結合できる分子を意味する。
可能な解決手段によれば、関連分子は、抗体、タンパク質、アプタマー、ペプチド、糖、多糖類、生体分子、及び化学化合物からなる群から選択される。
【００５４】
この特性はペルオキシダーゼ活性に影響を与えず、例えばＦＯＭ及び／又はＴＥＭを使用して特定の抗原を識別するために使用可能な抗体及び／又はタンパク質で外部から官能化されたナノ粒子からなる複合系の形成を可能にする。
【００５５】
これにより、ＣＬＥＭ実験及び免疫細胞化学実験の両方で画像化プローブを使用することが可能になる。
本発明による画像化プローブにより提供される別の可能性は、生体試料内部で、今日では電子顕微鏡技術により視覚化することが困難な１０ｎｍよりもさらに小さい白金のナノ粒子の動態をモニタリングすることである。
【００５６】
ＣＬＥＭ及び免疫細胞化学実験の両方の画像化プローブとしての白金ナノ粒子の実際の有効性は、出願人によって実験で試験されている。
白金のナノ粒子のペルオキシダーゼ活性によって生成される電子密度シグナルの実際の増幅を試験するために、出願人は、ＤＡＢ基質及び過酸化水素の存在下、生体試料において様々なサイズの白金のナノ粒子を使用した。
【００５７】
本発明の分野から逸脱することなく、これまでに説明した画像化方法及び画像化プローブに対して、パーツの変更及び／又は追加を行うことができることは明らかである。
記載された実施形態のいずれかに従って、白金のナノ粒子、酸化剤及び被酸化性基質を使用して、前記白金のナノ粒子の周囲に局在する電子密度の高いオスミウム親和性の沈殿物を画像化プローブとして取得し、記載された実施形態のいずれかにおけるような顕微鏡法を用いて生体試料のための画像化方法を実施することが、本発明の保護の範囲に含まれることも明らかである。
【００５８】
また、いくつかの具体的な例を参照して本発明を説明したが、当業者は、特許請求の範囲に記載の特徴を有する画像化方法及び画像化プローブの多くの他の同等の形態を確実に達成でき、したがって、すべてが特許請求の範囲で定められた保護の範囲内に入ることも明らかである。
【００５９】
ここで、本説明に従う画像化方法を実施するいくつかの例及び非限定的な実施形態を説明する。
実施例１
図１に示す例では、細胞内の生体試料中の白金のナノ粒子のペルオキシダーゼ活性によって生成される電子密度の高いシグナルの実際の増幅を試験するために、腫瘍細胞株（ＨｅＬａ）を含む生体試料を、４ｎｍ及び１０ｎｍの白金のナノ粒子を有する画像化プローブとともにインキュベートした。
【００６０】
図１の四角に示されている画像は、電子顕微鏡、特にＨＡＡＤＦ（高角度環状暗視野検出）走査型ＴＥＭ（ＳＴＥＭ）によって取得されたものであり、四角「ｂ」及び「ｃ」は四角「ａ」で強調された領域１を拡大したものであり、四角「ｅ」及び「ｆ」は四角「ｄ」で強調された領域２を拡大したものである。
【００６１】
図１を参照して、出願人は、使用した白金のナノ粒子のすべての次元のクラスについて、電子密度の高いシグナルのかなりの増加を観察した。これにより、これらを低拡大率（四角「ａ」及び「ｄ」）でも識別することができた。
【００６２】
取得した図１の画像は、４ｎｍ（四角「ａ」）及び１０ｎｍ（四角「ｄ」）の白金のナノ粒子とともにインキュベートされた細胞の細胞質で、電子密度の高いコンパートメントを特定することが、既に低倍率でどのように可能であるかを明確に示している。
【００６３】
これは、被酸化性基質の酸化の活性化に続く被酸化性物質を伴う白金のナノ粒子が、ＤＡＢポリマーからなるこの場合のオスミウム親和性の沈殿物のシグナルに対応する大きな電子密度の高い領域に囲まれていることを証明している。
【００６４】
電子顕微鏡のパラメータに作用することにより、白金の個々のナノ粒子を強調するためにコントラストを最適化することが可能である（四角「ｃ」及び「ｆ」）。
実施例２
図２の例では、細胞内のトランスフェリンのエンドソーム経路を視覚化するために、ＣＬＥＭによって画像化プローブの有効性を試験した。
【００６５】
示されている例では、白金のナノ粒子は特定のタンパク質、すなわち蛍光トランスフェリンとバイオコンジュゲーションされており、白金のナノ粒子の表面を適切に官能化している。
【００６６】
特に、これにより、タンパク質の表面に存在するアミノ基と白金のナノ粒子の表面に存在するカルボキシル基との間にアミド結合を作成することが可能となった。
図２において文字「ａ」で表示された四角を参照して、蛍光トランスフェリンとバイオコンジュゲーションした白金のナノ粒子の蛍光シグナルは、ＦＯＭで明確に認識可能であり、黒色と符号「Ｔ」で示され、ミトコンドリアは灰色と符号「Ｍ」で示される。
【００６７】
ＦＯＭを使用して観察された局在化は、上記の増幅手順を使用してＴＥＭで確認された。
領域３は拡大され、ＴＥＭを使用して及び視覚化され、四角「ｂ」で示されていることを考慮すべきである。
【００６８】
四角「ｃ」は領域４の拡大図であり、四角「ｄ」及び「ｆ」はそれぞれ領域５及び領域６の２つの拡大図である。四角「ｅ」及び「ｇ」は、それぞれ領域７及び領域８の２つの拡大図である。
【００６９】
実際、ＦＯＭによって特定された関心領域のＴＥＭ分析は、低拡大率でも認識可能な電子密度の高い強いシグナルの存在を明らかにする（図２の四角「ｂ」及び「ｃ」）。
高倍率のＴＥＭ画像は、電子密度の高い領域内に白金の個々のナノ粒子が存在することを示している（四角の「ｅ」及び「ｇ」で矢印で示されている）。
【図１】
2020528557.tif 000003
【図２】
2020528557.tif 000004
【国際調査報告】
2020528557.tif 000005
2020528557.tif 000006