(57)【要約】【課題】イメージング深度または画質に影響を与えることなく大きい試料をイメージングする能力を有する光シート（ＬＳ−θ）顕微鏡を提供する。【解決手段】光学配置は、試料表面に対して垂直に検出用対物レンズを配置する一方で、光シートを生成する照明用対物レンズを９０度よりもかなり狭い角度（シータ）で配置する。この構成では、光シートは、検出用対物レンズと同じ側から試料に入る。光シートと検出焦点面とが交差することによって、カメラによって識別されるライン照明−検出プロフィールが生じる。【代表図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
イメージング構成部品と、試料支持体とを備える顕微鏡であって、
前記イメージング構成部品は、試料領域の同じ側に配置されたイメージング用対物レンズと、第１の光シートプロジェクタとを有し、
前記イメージング用対物レンズおよび前記第１の光シートプロジェクタのそれぞれは、前記試料領域で交差する光学軸を有し、
前記試料支持体に試料が配置されたとき、前記イメージング用対物レンズの光学軸が前記試料の表面に垂直になるよう、前記試料支持体は、前記イメージング用対物レンズに対して位置決めされかつ配向される、
顕微鏡。
【請求項２】
前記試料支持体は、主平面を有する略平坦要素であり、スラブ形状の試料を保持するよう成形されており、
前記イメージング用対物レンズの光学軸は、前記主平面に垂直である、
請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項３】
第２の光シートプロジェクタをさらに備え、
前記第２の光シートプロジェクタの光学軸と前記イメージング用対物レンズの光学軸とによって形成される角度は、前記第１の光シートプロジェクタの光学軸と前記イメージング用対物レンズの光学軸とによって形成される角度と同じである、
請求項１に記載の顕微鏡。
【請求項４】
イメージング構成部品と、試料支持体と、コントローラとを備える顕微鏡であって、
前記イメージング構成部品は、試料領域の同じ側に配置されたイメージング用対物レンズと、第１の光シートプロジェクタとを有し、
前記イメージング用対物レンズ、および、前記第１の光シートプロジェクタのそれぞれは、前記試料領域内で交差する光学軸を有し、
前記試料支持体は、前記試料領域で試料を保持するよう位置決めされ、
前記光シートプロジェクタは、光シートのビームウエストの軸位置を選択し、かつ、前記光シートの伝搬方向に垂直な軸に沿って前記光シートの位置を選択することを可能にする光走査・合焦光学部品を有し、
前記コントローラは、前記ビームウエストを線形経路に沿って移動させるよう、前記光走査・合焦光学部品を制御するために接続され、
前記イメージング用対物レンズの光学軸は、前記線形経路に垂直である、
顕微鏡。
【請求項５】
前記光走査・合焦光学部品は、電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）を含む、請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項６】
前記試料支持体は、スラブ形状の試料を保持するために略平坦要素に成形される、請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項７】
第２の光シートプロジェクタをさらに備え、
前記第２の光シートプロジェクタの光学軸と前記イメージング用対物レンズの光学軸とによって形成される角度は、前記第１の光シートプロジェクタの光学軸と前記イメージング用対物レンズの光学軸とによって形成される角度と同じである、
請求項４に記載の顕微鏡。
【請求項８】
試料の２つの対向面が走査されるよう、前記試料領域の反対側に配置された１つ以上のさらなる光シートプロジェクタと、イメージング構成部品とをさらに備える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項９】
試料の複数の部分を連続的に走査できるよう前記試料支持体を移動させるために接続された移動ステージをさらに備える、請求項１〜７のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１０】
イメージング用対物レンズと、第１の光シートプロジェクタと、試料支持体とを備える顕微鏡であって、
前記イメージング用対物レンズと、前記第１の光シートプロジェクタとは試料領域の同じ側に配置され、
前記イメージング用対物レンズ、および、前記第１の光シートプロジェクタのそれぞれは、前記試料領域内で交差する光学軸を有し、
前記試料支持体は、前記試料支持体を少なくとも１つの線形軸に沿って移動させる移動ステージに設けられ、
前記移動ステージは、前記イメージング用対物レンズの光学軸が前記少なくとも１つの線形軸に垂直になるよう、前記イメージング用対物レンズに対して位置決めされかつ配向される、
顕微鏡。
【請求項１１】
前記試料支持体は、主平面を有する略平坦要素であり、スラブ形状の試料を保持するよう成形されており、
前記イメージング用対物レンズの光学軸は、前記主平面に垂直である、
請求項８に記載の顕微鏡。
【請求項１２】
第２の光シートプロジェクタをさらに備え、
前記第２の光シートプロジェクタの光学軸と前記イメージング用対物レンズの光学軸とによって形成される角度は、前記第１の光シートプロジェクタの光学軸と前記イメージング用対物レンズの光学軸とによって形成される角度と同じである、
請求項８に記載の顕微鏡。
【請求項１３】
試料の２つの対向面が走査されるよう、前記試料領域の反対側に配置された１つ以上のさらなる光シートプロジェクタと、イメージング構成部品とをさらに備える、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１４】
試料の複数の部分を連続的に走査できるよう前記試料支持体を移動させるために接続された移動ステージをさらに備える、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の顕微鏡。
【請求項１５】
光学軸を有する対物レンズを含む顕微鏡と、
前記光学軸と交差する光ビームを向けるよう位置決めされた、前記顕微鏡から分離したイメージング光学部品を有する第１の光ビームプロジェクタと、を含み、
前記第１の光ビームプロジェクタは、最大強度のライン状のビームウエストを有するシートを形成し、
前記第１の光ビームプロジェクタは、前記最大強度のラインに垂直な走査方向に沿った位置の範囲を通じて前記最大強度のラインを走査する走査機構を有し、
前記対物レンズの光学軸は、前記走査方向に垂直である、
イメージング機器。
【請求項１６】
前記対物レンズおよび前記第１の光ビームプロジェクタに対して試料を動かすことによって伸張されたスラブ状の前記試料が走査されるよう、前記対物レンズおよび前記第１の光ビームプロジェクタは、試料体積の同じ側に配置される、請求項１５に記載のイメージング機器。
【請求項１７】
スラブ状の試料が走査されるように前記顕微鏡および試料支持体を動かすため、前記顕微鏡および前記試料支持体の１つまたは両方に接続された移動システムをさらに備える、請求項１５に記載のイメージング機器。
【請求項１８】
前記移動システムは、Ｘ−Ｙ移動システムである、請求項１７に記載のイメージング機器。
【請求項１９】
前記移動システムは、Ｘ−Ｙ移動システムであり、
ＸおよびＹ軸は、前記光学軸に垂直である、
請求項１７に記載のイメージング機器。
【請求項２０】
前記走査機構を用いて試料の複数のタイルセグメントのそれぞれを走査し、さらなるタイルセグメントを走査するために顕微鏡に対して前記試料支持体を移動させるよう、前記移動システムおよび前記走査機構に接続されたコントローラをさらに備える、請求項１７に記載のイメージング機器。
【請求項２１】
前記走査機構は、電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）を含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のイメージング機器。
【請求項２２】
前記電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）は、前記最大強度のラインの位置を、前記シートの伝搬方向における前記シートの長さに沿って変更する、請求項２１に記載のイメージング機器。
【請求項２３】
前記走査機構は、前記最大強度のラインが前記シートの伝搬方向に垂直な軸を横切るよう、前記シートを走査する光リダイレクタを含む、請求項２１に記載のイメージング機器。
【請求項２４】
前記走査機構は、前記最大強度のラインが前記シートの伝搬方向に垂直な軸を横切るよう、前記シートを走査する光リダイレクタを含む、請求項２２に記載のイメージング機器。
【請求項２５】
前記走査機構は、前記最大強度のラインが前記シートの伝搬方向に垂直な軸を横切るよう、前記シートを走査する光リダイレクタを含む、請求項２３に記載のイメージング機器。
【請求項２６】
前記光リダイレクタは、ガルバノモータを含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のイメージング機器。
【請求項２７】
前記光リダイレクタは、ガルバノミラーを含む、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載のイメージング機器。
【請求項２８】
前記走査機構は、前記シートの伝搬方向における前記シートの長さに沿って前記最大強度のラインの位置を変更するための軸と、前記シートの伝搬方向に垂直な軸に沿って前記最大強度のラインの位置を変更するための軸との２つの軸で走査を行う、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のイメージング機器。
【請求項２９】
前記走査機構は、前記シートの伝搬方向における前記シートの長さに沿って前記最大強度のラインの位置を変更するための軸と、前記シートの前記伝搬方向に垂直な軸に沿って前記最大強度のラインの位置を変更するための軸との２つの軸で走査を行う、請求項２６または２７に記載のイメージング機器。
【請求項３０】
前記走査機構は、前記シートの伝搬方向における前記シートの長さに沿って前記最大強度のラインの位置を変更するための電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）を含む、請求項２８または２９に記載のイメージング機器。
【請求項３１】
光学軸を有する対物レンズを含む顕微鏡と、
前記光学軸と交差する光ビームを向けるよう位置決めされた、前記顕微鏡から分離したイメージング光学部品を有する第１の光ビームプロジェクタと、を含み、
前記第１の光ビームプロジェクタは、最大強度のライン状のビームウエストを有するシートを形成し、
前記第１の光ビームプロジェクタは、前記最大強度のラインに垂直な走査方向に沿った位置の範囲を通じて前記最大強度のラインを走査する走査機構を有する、イメージング機器。
【請求項３２】
前記対物レンズおよび前記第１の光ビームプロジェクタに対して試料を動かすことによって伸張されたスラブ状の試料が走査されるよう、前記対物レンズおよび前記光ビームプロジェクタは、試料体積の同じ側に配置される、請求項３１に記載のイメージング機器。
【請求項３３】
スラブ状の試料が走査されるように前記顕微鏡および試料支持体を動かすため、前記顕微鏡および前記試料支持体のいずれかまたは両方に接続される移動システムをさらに備える、請求項３１に記載のイメージング機器。
【請求項３４】
前記移動システムは、Ｘ−Ｙ移動システムである、請求項３３に記載のイメージング機器。
【請求項３５】
前記移動システムは、Ｘ−Ｙ−Ｚ移動システムであり、
ＸおよびＹ軸は、試料体積の主平面に平行であり、
Ｚ軸は、前記試料体積の主平面に垂直である、
請求項３３に記載のイメージング機器。
【請求項３６】
前記走査機構を用いて試料の複数のタイルセグメントのそれぞれを走査し、さらなるタイルセグメントを走査するために顕微鏡に対して前記試料支持体を移動させるよう、前記移動システムおよび前記走査機構に接続されたコントローラをさらに備える、請求項３３に記載のイメージング機器。
【請求項３７】
前記走査機構は、電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）を含む、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載のイメージング機器。
【請求項３８】
前記電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）は、前記最大強度のラインの位置を、前記シートの伝搬方向における前記シートの長さに沿って変更する、請求項３７に記載のイメージング機器。
【請求項３９】
前記走査機構は、前記最大強度のラインが前記シートの伝搬方向に垂直な軸を横切るよう、前記シートを走査する光リダイレクタを含む、請求項３７に記載のイメージング機器。
【請求項４０】
前記走査機構は、前記最大強度のラインが前記シートの伝搬方向に垂直な軸を横切るよう、前記シートを走査する光リダイレクタを含む、請求項３８に記載のイメージング機器。
【請求項４１】
前記走査機構は、前記最大強度のラインが前記シートの伝搬方向に垂直な軸を横切るよう、前記シートを走査する光リダイレクタを含む、請求項３９に記載のイメージング機器。
【請求項４２】
前記光リダイレクタは、ガルバノモータを含む、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のイメージング機器。
【請求項４３】
前記光リダイレクタは、ガルバノミラーを含む、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載のイメージング機器。
【請求項４４】
前記走査機構は、前記シートの伝搬方向における前記シートの長さに沿って前記最大強度のラインの位置を変更するための軸と、前記シートの伝搬方向に垂直な軸に沿って前記最大強度のラインの位置を変更するための軸との２つの軸で走査を行う、請求項３１〜３６のいずれか一項に記載のイメージング機器。
【請求項４５】
前記走査機構は、前記シートの伝搬方向における前記シートの長さに沿って前記最大強度のラインの位置を変更するための軸と、前記シートの伝搬方向に垂直な軸に沿って前記最大強度のラインの位置を変更するための軸との２つの軸で走査を行う、請求項４２または４３に記載のイメージング機器。
【請求項４６】
前記走査機構は、前記シートの伝搬方向における前記シートの長さに沿って前記最大強度のラインの位置を変更するための電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）を含む、請求項４４または４５に記載のイメージング機器。
【請求項４７】
試料の三次元画像を取得する方法であって、
光ビームの伝搬方向に垂直な最大強度のラインを有する前記光ビームを試料内に投影するステップと、
前記光ビームの伝搬方向および前記光ビームの伝搬方向に垂直な方向の両方に対して斜めの経路に沿って前記最大強度のラインを走査するよう、前記光ビームを走査するステップと、
イメージングトランスデューサのそれぞれの部分における前記ラインの画像をキャプチャするステップと、
を含む方法。
【請求項４８】
前記イメージングトランスデューサは、カメラセンサを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記キャプチャするステップは、顕微鏡を用いて、前記ラインからの光をイメージングするステップを含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記キャプチャするステップは、前記最大強度のラインによって誘発される二次光を受光してイメージングするステップを含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記キャプチャするステップは、前記最大強度のラインによって誘発される蛍光を受光し、前記蛍光の領域をイメージングするステップを含む、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記走査するステップは、導波管の端部を機械的に動かすステップを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記顕微鏡および前記光ビームに対して前記試料を動かすステップと、
前記走査およびキャプチャするステップを前記試料の異なる領域に対して再度実行するステップと、
をさらに含む請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記キャプチャするステップから二次元画像を生成するステップと、
前記二次元画像をつぎ合せ、前記二次元画像のエッジの特徴を一致させることによって、大きい合成画像を形成するステップと、
をさらに含む請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記動かすステップは、３つの直交する方向の１つまたはすべてで動かすステップを含む、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記動かすステップは、位置の三次元体積を横切るよう、前記３つの直交する方向のすべてで動かすステップを含む、請求項５３または５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記走査するステップの各走査後に、前記試料の複数の深度を光学的に識別するため、イメージングデバイスの焦点を変更するステップをさらに含む、請求項４７〜５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記光シートプロジェクタは、対物レンズとしてのＧＲＩＮレンズを含む、請求項１〜４６に記載の顕微鏡またはイメージング機器。
【請求項５９】
検出用対物レンズを、その光学軸がスラブ状試料の対向面に垂直になるよう位置決めするステップと、
前記検出用対物レンズの光学軸に対して鋭角を成すよう配向された励起用対物レンズを位置決めするステップと、
前記検出用対物レンズを位置決めするステップと、前記励起用対物レンズを位置決めするステップとは、前記検出用対物レンズと前記励起用対物レンズとが前記スラブ状試料の同じ側にあるように行われる、顕微鏡法。
前記励起用対物レンズの光学軸に対して角度を成し、前記鋭角より大きい角度を成すビーム伝搬方向に平行な主軸を有するビームが出現するよう、前記励起用対物レンズの背面開口に、中心を外して光を当てるステップと、
を含み、
【請求項６０】
前記光を当てるステップは、前記背面開口を一部遮光するステップを含む、請求項５９に記載の顕微鏡法。
【請求項６１】
前記主軸の前記対向面との角度は、前記検出用対物レンズの光学軸との角度より鋭い、請求項５９に記載の顕微鏡法。
【請求項６２】
顕微鏡の検出用対物レンズを、その光学軸がスラブ状試料の表面に対して垂直になるよう配置するステップと、
前記検出用対物レンズの光学軸と同じ角度および反対の角度を形成する方向に沿って光を投入するステップと、
前記投入ステップによる光を、前記顕微鏡を用いてイメージングするステップと、
を含む顕微鏡法。
【請求項６３】
前記光を投入するステップによる光は、蛍光を含む、請求項６２に記載の顕微鏡法。
【請求項６４】
前記光を投入するステップは、前記スラブ状試料内に最大強度の単一の線形領域を形成する、請求項６２に記載の顕微鏡法。
【請求項６５】
前記光を投入するステップによる光を、光センサを用いてサンプリングする間に、前記線形領域をその主軸に対して垂直に走査することによって、前記スラブ状試料の平らなセグメントをトレースするステップをさらに含む、請求項６４に記載の顕微鏡法。
【請求項６６】
前記光センサは、カメラを含む、請求項６５に記載の顕微鏡法。
【請求項６７】
前記イメージングするステップは、前記光を投入するステップによる光を、顕微鏡を介して受光するステップを含む、請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の顕微鏡法。
【請求項６８】
前記検出用対物レンズは、顕微鏡の対物レンズである、請求項６２〜６６のいずれか一項に記載の顕微鏡法。
【請求項６９】
前記光を投入するステップによる光を、光センサを用いてサンプリングする間に、前記線形領域をその主軸に対して垂直に走査することによって、前記スラブ状試料の表面に平行な前記スラブ状試料の平らなセグメントをトレースするステップをさらに含む、請求項６４に記載の顕微鏡法。
【請求項７０】
少なくとも２つの励起光学素子と、検出光学素子とを含む顕微鏡であって、
前記少なくとも２つの励起光学素子は、光シートを形成し、前記光シートが交差することにより、試料領域において照明された交線が形成されるよう前記光シートのそれぞれを導くよう配置され、
前記光シートは、少なくとも７５度の角度を成す主平面を有し、
前記検出光学素子は、光学軸が前記光シートの前記主平面との角度と等しい角度を成すよう、前記励起光学素子に対して配置される、
顕微鏡。
【請求項７１】
前記少なくとも２つの励起光学素子は、対物レンズを含む、請求項７０に記載の顕微鏡。
【請求項７２】
前記少なくとも２つの励起光学素子は、対物レンズを含み、
前記対物レンズのそれぞれは、前記シートビームを前記対物レンズの側部から出現させる可変部分ビームブロックを有する、請求項７０に記載の顕微鏡。
【請求項７３】
前記少なくとも２つの励起光学素子は、ＧＲＩＮレンズを含む、請求項７０に記載の顕微鏡。
【請求項７４】
前記少なくとも２つの励起光学素子は、前記照明された交線が前記試料領域を横切るように配置された走査光学素子を含む、請求項７０に記載の顕微鏡。
【請求項７５】
前記少なくとも２つの励起光学素子は、前記照明された交線が、前記検出光学素子の焦点面に沿って前記試料領域を横切るように配置された走査光学素子を含む、請求項７０に記載の顕微鏡。
【請求項７６】
移動システムをさらに備え、
前記コントローラは、走査光学部品を制御し、前記試料領域を連続的に検出することによってスライス画像を形成する、請求項７０に記載の顕微鏡。
【請求項７７】
第１のシートビームを形成するよう配置された光学部品を有する第１の照明アームと、
前焦点面を有する第１の検出アームと、を備え、
前記第１の検出アームは、前記第１のシートビームが前記前焦点面と交差する線形体積をイメージングするための光学部品を有し、
前記第１の照明アームの前記光学部品は、照明用対物レンズを含み、前記第１の検出アームの前記光学部品は、検出用対物レンズを含み、
前記第１のシートビームは、前記検出用対物レンズの光学軸に対して傾いており、
前記第１の検出アームの前記前焦点面は、前記検出用対物レンズに垂直である、
光学イメージング装置。
【請求項７８】
前記第１の照明アームの前記光学部品は、前記シートビームのビームウエストが前記第１の検出アームの前記前焦点面を横切るようにする走査構成部品を含む、
請求項７７に記載の光学イメージング装置。
【請求項７９】
第１のカメラから画像データを読み取るために前記第１のカメラに接続されたコントローラをさらに備え、  前記第１の検出アームは、前記第１のカメラの二次元画像検出器を含み、
前記コントローラは、前記ビームウエストの位置に応じて前記二次元画像検出器の選択された画素を読み取って記憶することにより、前記選択された画素が前記ウエストの移動に追従できるようにする、
請求項７７に記載の光学イメージング装置。
【請求項８０】
前記コントローラは、走査構成部品を制御する、請求項７９に記載の光学イメージング装置。
【請求項８１】
前記走査構成部品は、前記照明用対物レンズの軸に沿って前記ビームウエストを動かす機構を含む、請求項７７または８０に記載の光学イメージング装置。
【請求項８２】
移動システムをさらに備え、
前記コントローラは、走査構成部品を制御し、前記線形体積を連続的に検出することによってスライス画像を形成する、
請求項７７または１２に記載の光学イメージング装置。
【請求項８３】
前記第１の照明アームと同一であり、前記第１のシートビームと交差する第２のシートビームを形成する第２の照明アームをさらに備える、請求項７７に記載の光学イメージング装置。
【請求項８４】
前記第１および第２の照明アームの照明用対物レンズの光学軸のそれぞれは、前記第１の検出アームの前焦点面に対して角度を成す、請求項８３に記載の光学イメージング装置。
【請求項８５】
前記第１および第２の照明アームのそれぞれは、前記照明用対物レンズの側部を用いてシートビームを形成させる可変部分ビームブロックを含む、請求項８４に記載の光学イメージング装置。
【請求項８６】
前記シートビームの前記角度は、前記ビームブロックの位置に対応する、請求項８５に記載の光学イメージング装置。
【請求項８７】
移動システムに接続されたコントローラをさらに備え、
前記コントローラは、光学式走査の寸法より大きい試料をキャプチャするために、前記移動システムが前記光学式走査の寸法に応じた自由度の大きさに対応する軸に沿って徐々に移動できるように、前記移動システムの自由度のある部分を光学的に走査するようプログラムされている、
請求項７７に記載の光学イメージング装置。
【請求項８８】
前記第１の照明アームおよび前記第１の検出アームとそれぞれ同一の第２の照明アームおよび第２の検出アームをさらに備え、
前記第２の照明アームおよび前記第２の検出アームは、可動ステージの対向する側に位置決めされる、
請求項７７に記載の光学イメージング装置。
【請求項８９】
前記第１および第２の検出アームのそれぞれに配置されたカメラと、
第１および第２の画像検出器から画像データを読み取るために前記第１および第２の画像検出器に接続されたコントローラと、
をさらに備え、
前記第１の検出アームおよび前記第２の検出アームのそれぞれは、前記カメラの二次元画像検出器を含み、
前記コントローラは、前記ビームウエストの位置に応じて前記画像検出器の選択された画素を読み取って記憶することにより、前記選択された画素が前記ビームウエストの移動に追従できるようにする、
請求項８８に記載の光学イメージング装置。
【請求項９０】
前記コントローラは、前記第１および第２の照明アームの前記シートビームと、前記第１および第２の検出アームの前記前焦点面との交点の間の距離を維持するよう、前記第１および第２の照明アームの前記シートビームを制御する、請求項８９に記載の光学イメージング装置。
【請求項９１】
前記コントローラは、２つの前記シートビームの走査サイクル間の位相差を維持することによって、前記第１および第２の照明アームの前記シートビームと、前記第１および第２の検出アームの前記前焦点面とのそれぞれの交点の間の距離を維持するよう、前記第１および第２の照明アームの前記シートビームを制御する、請求項８９に記載の光学イメージング装置。
【請求項９２】
前記第１の照明アームは、レーザ光源、コリメータ、電気式焦点可変レンズ、円柱レンズ、ガルバノスキャナ、走査レンズ、チューブレンズ、および、照明用対物レンズを含む、請求項７７に記載の光学イメージング装置。
【請求項９３】
前記コリメータの後ろに組み込まれた第１のアイリスと、
前記円柱レンズの前に組み込まれた一次元スリットと、
前記走査レンズと前記チューブレンズとの間の共役面に組み込まれた第２のアイリスと、
をさらに備える、請求項９２に記載の光学イメージング装置。
【請求項９４】
試料内の長尺体積をイメージングする方法であって、
光ビームの通過を一部阻止して前記光ビームが第１の対物レンズの光学軸の一方側だけに届くようシートビームを形成するステップと、
前記シートビームが前記第１の対物レンズまたは第２の対物レンズの焦点面と交差する位置で前記シートビームによって照明された線形体積からの光を検出するステップと、を含み、
前記形成するステップは、前記線形体積が前記線形体積の軸に垂直な軸を横切るよう、前記シートビームを走査するステップを含む、
方法。
【請求項９５】
前記検出するステップは、カメラの二次元画像平面の画素ラインをサンプリングするステップを含み、
前記画素ラインは、前記線形体積の画像と一致する、
請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１の対物レンズまたは第２の対物レンズは、前記第１の対物レンズである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記第１の対物レンズまたは第２の対物レンズは、前記第２の対物レンズである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記走査するステップは、前記第１の対物レンズの軸に沿って前記線形体積の軸位置を移動するステップを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９９】
前記軸位置を移動するステップは、電気式焦点可変レンズを起動するステップを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記形成するステップおよび前記検出するステップを単一の試料の反対側で再び行うステップをさらに含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０１】
前記走査するステップと、前記形成するステップおよび検出するステップを再び行うステップとのそれぞれの後に、それぞれの位置で試料を機械的に移動するステップと、
各走査に対応する画像を合成して前記試料の三次元画像を形成するステップと、をさらに含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項１０２】
移動システムの２つの軸によって定義される所定の平面に垂直な光学軸を有する検出用対物レンズと、
前記検出用対物レンズの、前記所定の平面と同じ側から光が試料に入射するよう、１つ以上の光シートを前記光学軸に対して斜めの角度で生成するよう位置決めされかつ配向された１つ以上の照明用対物レンズと、
を備える顕微鏡。
【請求項１０３】
前記検出用対物レンズから二次元画像センサへと光を伝達する検出アームをさらに備える、請求項１０２に記載の顕微鏡。
【請求項１０４】
前記画像センサは、ｓＣＭＯＳセンサである、請求項１０３に記載の顕微鏡。
【請求項１０５】
前記照明用対物レンズを通過するビームを形成する照明アームをさらに備える、請求項１０２に記載の顕微鏡。
【請求項１０６】
前記照明アームは、前記光シートが前記照明用対物レンズの光学軸に対して角度を成すよう、光が前記照明用対物レンズを非対称に通過するように構成される、請求項１０５に記載の顕微鏡。
【請求項１０７】
前記照明アームのそれぞれは、前記照明用対物レンズのそれぞれに当てられるビームを遮断する、請求項１０４に記載の顕微鏡。
【請求項１０８】
コントローラと、
前記光シートと、前記検出用対物レンズの前焦点面との交点が前記前焦点面を横切るように前記照明アーム内で前記コントローラによって制御される走査光学部品と、
をさらに備える、請求項１０４に記載の顕微鏡。
【請求項１０９】
前記コントローラは、前記交点に位置する照明された領域の画像に対応するイメージングデバイスの画素ラインをキャプチャする、請求項１０８に記載の顕微鏡。
【請求項１１０】
第１および第２のイメージング構成部品と、
第１および第２の光シートプロジェクタと、
試料支持体と、
コントローラと、を備える顕微鏡であって、
前記第１および第２のイメージング構成部品のそれぞれは、イメージング用対物レンズを有し、
前記第１および第２の光シートプロジェクタは、試料領域の前記第１および第２のイメージング構成備品と同じ側にそれぞれ配置され、
前記イメージング用対物レンズ、および、前記光シートプロジェクタのそれぞれは、前記試料領域で交差する軸を有し、
前記試料支持体は、前記試料領域で試料を保持するよう位置決めされ、
前記第１および第２の光シートプロジェクタのそれぞれは、光シートのビームウエストの軸位置を選択し、前記光シートの伝搬方向に垂直な軸に沿って前記光シートの位置を選択することを可能にする光走査・合焦光学部品を有し、
前記コントローラは、前記第１および第２の光シートプロジェクタのそれぞれのビームウエストをそれぞれの線形経路に沿って別々に移動させるよう、前記光走査・合焦光学部品を制御するよう接続される、
顕微鏡。
【請求項１１１】
前記イメージング用対物レンズの光学軸は、前記線形経路のそれぞれに垂直である、請求項１０に記載の顕微鏡。
【請求項１１２】
前記イメージング用対物レンズの光学軸は、前記線形経路の両方に垂直である、請求項１１０に記載の顕微鏡。
【請求項１１３】
前記光走査・合焦光学部品は、電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）を含む、請求項１１０に記載の顕微鏡。
【請求項１１４】
前記試料支持体は、スラブ形状の試料を保持するために略平坦要素に成形される、請求項１１９に記載の顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
例えば、かなり厚みのある幅広いスラブ、特に、生物組織の大切片といった完全に無傷の生体試料などの大型三次元物体の構造および機能を高速・高解像度でイメージングできる方法および装置の需要が高まっている。脳組織は１つの例であり、神経科学の研究にとってのその重要性は、ニューロテクノロジーを構築するためのホワイトハウス主導のブレインイニシアチブなどの注目を集める構想が発表されたことによっても明らかとなっている。
【０００２】
周知の光シート顕微鏡（ＬＳＭ）技術では、薄い光のシートが横から試料を照らし、直交配列された対物レンズが受照面から放射された信号を検出する。図１Ａは、光シート顕微鏡を示す図である。検出光学系１００は、イメージングレンズ１０８、および、比較的厚い試料１１５の特徴を識別するための高開口数（ＮＡ）を有する対物レンズ１０４を介して画像の光信号を受信するカメラ１１０を有する。試料１１５は、イメージングシステムの前焦点面で焦点を結ぶように照明用対物レンズ１０２および１０６から試料１１５へと投影される一対の光シート１１４および１１２によって照明される。試料１１５の三次元体積は、試料１１５を段階的に動かして平面ごとに試料をイメージングするか、または、位置合わせした光シートと検出用対物レンズとを同時に、静止した試料を介して段階的に動かすことによって獲得される。獲得された画像“スタック”（すなわち、２次元平面の集まり）は、試料に関する三次元情報を提供する。顕微鏡の視野よりも大きい試料（すなわち、ある位置で見えるのは試料の一部になる）は、つぎ合わされるタイルのスタックを獲得することによってイメージングされる。このような体積を、時間をずらして繰り返し獲得することによって、生きた試料の動態をキャプチャできる。
【０００３】
光シート顕微鏡の構成は、試料への考えられるエネルギー負荷が最小になること（したがって光褪色および光毒性を最小限にできる）、および、イメージング速度が非常に速いこと、という２つの重要な利点をもたらす。イメージング深度（すなわち、イメージング軸に沿った試料の寸法）は、一般的に、物理的限界を課す検出用対物レンズの作動距離と、イメージングされている生物組織の光散乱特性とによって決定される。光シートは、照明のために組織を貫通する必要があるので、イメージングされ得る無傷の試料全体の大きさは、試料の他の２つの寸法の１つ（すなわち、図１Ａの１１７“試料の大きさへの制限”に示された光シートの伝搬方向に沿った寸法）で制限される。
【０００４】
このような制限に対処することができる一般的に用いられている構成（図１Ｂ）としては、試料のサーフェス法線に対して４５度の光軸を有する検出用対物レンズ１３０および照明用対物レンズ１３０がある。この構成では、角度のせいで検出用対物レンズの有効作動距離が制限されるので、試料におけるイメージング深度が低下する。また、検出用対物レンズ１３０の物理的大きさの形状的制約もある（すなわち、対物レンズが試料に物理的に押し込まれる可能性もある）。作動距離は、矢印で示すような悪影響を受ける。さらに、傾斜した検出用対物レンズを用いると、特に、高解像度の検出用対物レンズには収差が生じる。例えば、特許文献１（ダンズビー）に記載された斜面顕微鏡法のように、光シートは、検出用対物レンズ自体（すなわち、照明用と検出用に同じ対物レンズを用いる）を介しても生成される。しかしながら、これは、（本来のイメージング面を外れて信号が検出されたときのような）画質およびイメージング深度が低下し、光損傷がひどくなるという犠牲をともなう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第８５８２２０３号
【発明の概要】
【０００６】
光シートシータ顕微鏡法（以下ＬＳＴＭと称す）として認定され得る顕微鏡の実施形態が記載される。ＬＳＴＭ顕微鏡は、面積の大きい試料を走査する能力を発揮しつつ、光シート顕微鏡のように、十分な深度を有する画像を解像できる能力を有する。変形例は、試料の両側をイメージングすることによってより速い走査を提供する。
【０００７】
本開示の実施形態の目的および利点は、以下の記載を添付の図面と関連付ながら考慮することで明らかになるであろう。
【０００８】
以下、添付の図面を参照して実施形態が詳細に説明される。同じ参照番号は、同じ構成部品を示す。添付の図面は、必ずしも縮尺通りに描かれていない。その下にある特徴を示すため、いくつかの特徴が描かれていない場合もある。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ−Ｂ】従来の光シート顕微鏡の実施形態を示す。
【図２】本開示の実施形態によるＬＳＴＭの特定の特徴を示す。
【図３Ａ】本開示の実施形態による、単一の線形領域を照明する単一の光シートを用いるＬＳＴＭ顕微鏡を示す。
【図３Ｂ】本開示の実施形態による、２つの光シートを用いて単一の線形領域を照明するＬＳＴＭ顕微鏡を示す。
【図３Ｃ】本開示の実施形態による、２つの光シートを用いてそれぞれの線形領域を照明するＬＳＴＭ顕微鏡を示す。
【図３Ｄ】本開示の実施形態による、焦点、イメージングデバイスの画素の選択、および、焦点面と交差する光シートを組み合わせて検出アームによって識別される試料体積を示す。
【図４Ａ】本開示の実施形態による、（試料の表面に対して）斜めの光軸に垂直な単一の軸で光シートを走査する第１の走査モードを示す。
【図４Ｂ】本開示の実施形態による、試料表面に対して斜めかつ平行な二重軸で光シートを走査する第２の走査モードを示す。
【図５Ａ】本開示のさまざまな特徴を例示するＬＳＴＭ顕微鏡を示す。
【図５Ｂ−５Ｄ】本開示の実施形態による、さまざまな特徴を提供するさまざまな光学部品を用いるオプションの照明アームを示す。
【図６】本開示の実施形態による、照明されたラインと垂直であり、試料の表面と平行な軸の独立座標における別々の平面内で照明された線形領域の同時取得を示す。
【図７Ａ−７Ｅ】本開示の実施形態による、スラブを位置決めするＸＹＺシータステージの位置のマトリックスの１つに対して光学式走査が実行される大き目のスラブの単一の“タイル”の走査の段階を示す。カメラにおけるラインの読み出し、および、照明が逆方向に同時に走査できることに注目されたい。
【図８】本開示の実施形態による、ＬＳＴＭシステムの自動操作を許容するさまざまな実施形態のアクチュエータに接続されたコントローラを示す。
【図９】本開示の実施形態による、スラブの三次元画像を生成する複数のタイル画像の合成を示す。
【図１０】ＬＳＴＭを実装する他の実施形態のブロック図である。
【図１１Ａ−Ｂ】図１０に示す実施形態における対物レンズの物理的形状の制約を示す。
【図１２Ａ−Ｄ】同じ厚みおよび幅を有する試料に対する、図１０に示す実施形態と、ＬＳＭとの間の照明路長の比較を示す。
【図１３Ａ−Ｂ】図１０に示す実施形態に有効な光シートの厚みを示す。
【図１４Ａ−Ｄ】ＬＳＭおよび１０に示す実施形態の間の試料へのエネルギー負荷の比較を示す。
【図１５Ａ】照明用対物レンズの有効作動距離の計算を示す。
【図１５Ｂ】図１０に示す実施形態における対物レンズの許容角度位置の範囲を示す。
【図１６】血管系に染色した幅約２ｃｍ、厚さ約５ｍｍのラット脳切片のイメージングのＬＳＴＭとＬＳＭとでの比較を示す。
【図１７Ａ−Ｂ】本開示の一実施形態による、一体型ミクロトーム装置を備えたＬＳＴＭシステムを示す。
【図１８】特定の実施形態の特徴間の角度の関係を示す。
【図１９】光シートを形成するＧＲＩＮレンズの実施形態を示す。
【図２０Ａ−Ｄ】図４ＡおよびＢに関して説明されたような一次元または二次元走査に適した代替走査機構を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
以下、光シートシータ（ＬＳ−θ）顕微鏡法（ＬＳＴＭとも称する）として認定され得る顕微鏡の実施形態を説明する。ＬＳＴＭは、検出用対物レンズと同じ側から試料に入る斜めに配置された照明光シートを用いることによって二次元イメージングを実現する。この構成は、試料の横寸法への制限を緩和しつつ、より大きな試料に対して同様またはより優れたイメージング深度、品質、速度を提供するとともに光褪色を抑制する。ＬＳＴＭは、より大きな試料全体を高く均一の解像度でイメージングすることを可能にする。さらに、ＬＳＴＭは、ＬＳＭで一般的に用いられている不均一なガウス照明とは異なり、イメージング視野全体を均一に照明することができるので、試料全体の定量的イメージングが可能になる。ＬＳＴＭは、ラットや霊長類の脳を含む、大型動物の無傷の脳のイメージングだけでなく、透明化されてラベルを貼られた死後の人間の健康な脳および病気の脳の厚いスラブを含む大型試料のイメージングを可能にする。さらに、ＬＳＴＭは、伸張した組織試料における何千もの転写産物のインサイチュ検出を容易にする。
【００１１】
図２に一実施形態を例示的に示す。照明ビームは、従来の光学部品と組み合わせた照明用対物レンズ１４２を介して形成され、光シート１４４を形成する。従来の光学部品は、走査用の走査ミラーおよび電気式焦点可変レンズ、円柱レンズを含み得るシート形成光学素子、および、不完全ブロック１４０を含み、それらの複合効果により、それぞれの光軸を横切る所望の位置およびそれぞれの光軸に沿った所望の位置に光シート１４４が形成される。ブロック１４０は、光シートが検出用対物レンズによって遮られないように光シートを形成する効果をもたらすことに留意されたい。照明用対物レンズの側部を介して光シートを形成することによって、光シートの中心軸が照明用対物レンズの光軸に対し斜めになり、かつ、試料表面と平行に近くなり、サーフェス法線から遠くなる。この構成により、光シートの角度を従来の実施形態を示す図１ＡおよびＢの光シートの角度の間に設定することができる。
【００１２】
イメージング深度または画質に影響を与えることなく大きい試料をイメージングする能力と共に、大きい試料を走査する能力を有する。図２は、光学配置の概要を示す。基本概念は、試料表面に対して垂直に検出用対物レンズを配置する一方で、光シートを生成する照明用対物レンズを９０度よりもかなり狭い角度（シータ）で配置することである。この構成では、光シートは、検出用対物レンズと同じ側から試料に入る。形成された光シートは、検出平面に対して角度をもって配置される。光シートと検出焦点面とが交差することによって、検出アームによって識別される、図３Ａにおいて２１９で示す照明された線形体積が生じる。
【００１３】
図３Ｄを参照すると、照明された線形体積２１９は、実際には小さい体積であり、これは、前焦点面を定義する高開口数の検出用対物レンズ（および他の検出光学部品）だけでなく、スリットと同様な方法で面外光を除外し、対象となる線形体積２１９に隣接した光も除外するｓＣＭＯＳカメラ１１０のセンサにおける画素の選択を通じて識別される。この検出された線形体積２１９は、ｓＣＭＯＳカメラ（または他の科学カメラ）センサにおいて検出される部分（すなわち画素の細長い領域）を同時に選択する一方で、光シートが前焦点面を横切る領域を動かすことによって線形体積２１９を移動させる照明走査光学部品を用いて選択されることができる。これをラインごとの検出と呼ぶ。これによって、照明光学部品と同時に検出光学部品を効率よく走査できる。つまり、ｓＣＭＯＳカメラのラインごとの検出をラインの照明と同期させることによって、特定の照明された線形体積２１９からの信号のみが検出されて他の散乱光または照明源からの干渉を受けないことが保証される。
【００１４】
この照明された線形体積２１９を走査することによって、前焦点面全体が照明されかつキャプチャされてよい。照明側の走査は、後ほど説明するが、１つ以上のミラー、電気式焦点可変レンズ、または、その代替物（例えば回転プリズム、回折光学部品、ＭＥＭＳピコプロジェクタ、電気的に制御可能な光空間変調器、可変音響レンズ（例えばＴＡＧレンズ）、および、この目的のための他の最先端の技術によって実行されてよい。また、照明側の走査は、光シート伝搬方向に沿って、他の走査機構と交互に、または、同時に、照明用対物レンズを走査することにより行われ得る。光シートの走査をｓＣＭＯＳカメラのイメージング面におけるラインの選択的なサンプリングと組み合わせることによって、イメージングされるより大きい試料の“タイル”部分全体をキャプチャできる。照明された線形体積２１９とｓＣＭＯＳカメラ１１０のラインごとの検出とを同期させることによって、平面の高品質な画像が得られる。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、３つの異なる検出モードは、それぞれの実施形態によって実行されるか、または、ユーザが選択可能な複数のモードを有する単一の実施形態によって実行されてよい。図３Ａを参照すると、第１のモードでは、照明された線形体積２１９を生成するために単一の光シート２１０が用いられている。露光された画素ライン２０４が概略的に示されている。露光された画素ライン２０４は、１列の画素（または、複数の列、もしくは、所望の光信号を選択し、かつ、照明された線形体積２１９の外側の領域からの散乱光などの不要な光信号を除外するのに有効な複数の列からの信号の数値合成）に対応する。照明された線形体積２１９からキャプチャされてイメージングされた光円錐が、高開口数の検出用対物レンズを示す２１８に示されている。
【００１６】
第２のモードが図２に示され、図３Ｂでさらに説明されている。図において、単一の検出アームおよび２つの光シート２１２によって単一の照明された線形体積２１９が生成されている。図３Ｃに示された第３のモードでは、２つの光シート２１２は、検出用対物レンズの各側に、１つずつ提供される。２つの光シートは、２つの異なる部分、例えば、２つの画像光円錐２２０Ａおよび２２０Ｂによって示されるような平面の片割れを別々に走査してよい（光シートの検出では、用語“円錐形”よりも“くさび形”のほうがより好ましいが、“円錐形”という用語によって識別される場合は文脈から明らかであろう）。上記のように、それぞれ固定位置に配置された試料、検出アーム、および、照明アームによって走査が行われる間に、走査光学部品が照明された線形体積２１９を動かし、それと同時に露光された画素ライン２０５がカメラチップ２０６の画像平面のサンプリングによって選択される。図中では、検出光学部品が光軸に関して画像を反転させた場合、左の画素ライン２０５は、右側の光円錐２２０Ｂに対応し、右の画素ライン２０５は、左の光円錐２２０Ａに対応してよいことに留意されたい。
【００１７】
上記モードのそれぞれについては、他の変形走査モードも可能である。例えば、平面照明では、照明された線形体積２１９を走査する２つの走査モードがある。図４Ａは、これらの走査モードのうち第１の走査モードを示し、光シートは、横にのみ（すなわち、光シートの伝搬方向に対して垂直に）ずらされる。これは、照明された線形体積２４０Ａおよび２４０Ｂ（２４１で示された平面を横切る光シートの焦点面（ビームエスト）に沿った位置）を定義する横にずらされた光シート２３７および２３９によって示される。これは、例えば、ガルバノミラーを用いて実現され得る。本願明細書中で１軸走査（１−ＡＳ）と称されるこの走査モードでは、光シート内の異なる位置で光シートと焦点面とが交差する。
【００１８】
図４Ｂを参照すると、本願明細書では２軸走査（２−ＡＳ）と称する第２の走査モードでは、照明光学部品の前焦点面は、横方向だけでなく軸方向にも移動される。光シートの合焦位置（すなわちビームウエスト）が横方向だけでなく光シートの伝搬方向に沿って、特に、横方向の走査（第１のモードのように）と同時に走査されるようにすることで光シートの最も細い部分が検出平面と交差することによって、照明光学部品の前焦点面は、検出光学部品の前焦点面と交差できるので、その結果、画質が非常に高くなる。このモードでは、高開口数の照明用対物レンズは、さらに細い光シートを生じる。
【００１９】
これらの照明および検出モードを特徴付けて比較すべく、ミクロンスケールの蛍光ビーズ、および、核染色（ＤＡＰＩ）で染色したＣＬＡＲＩＴＹ透明化ヒト脳組織をイメージングした。結果として生じた画像体積は、２軸走査では視野全体にわたり軸方向の解像度をより均一にする一方で、１軸走査および従来のＬＳＭイメージングでは、視野周辺で画質の低下が見られることを示した。対称的に配列された２つの照明アームから同時に両側を照明することによって（図３Ｂ参照）、信号強度をより高め、照明路の不透明物体によって生じる照明アーチファクトを減少させるので、量的に正確なイメージングを実現するための必須条件である均一な平面照明および検出を向上させる。
【００２０】
三次元体積は、照明シートを段階的に（または、イメージング中に低速で連続的に）動かすことによって、または、有効な照明光シートと、検出アームによって分解された露光画素ラインとを同時に動かすことによって得られる。試料のそれぞれの対向する面の対向する検出アームから試料を同時にイメージングすることによって、イメージング速度をさらに高めることができる。また、露光画素ラインを動かす代わりに試料を横に動かすために試料の連続移動を用いてもよい。線形ステージのような段階的な動作では、開始と停止にかなり時間がかかるのに比べて、連続的な横断では速くなる。
【００２１】
さまざまなＬＳＴＭシステムの実施形態は、大型試料のイメージング実験を、光シート顕微鏡と同様の極めて高い解像度で可能にする。ＬＳＴＭ顕微鏡では、検出用対物レンズは、試料表面に対して垂直のままであり、照明用対物レンズは、角度をもって配置される（９０度とはかなり異なるが、形状的に許容される範囲で９０度に近づける）、これによって、図１Ａおよび１Ｂに示される制限を取り除くことができる。光シートは、直線形状の対物レンズの検出平面と交差し、その後水平方向に走査されることによって、有効な平面照明を生じる。直線形状の検出平面とｓＣＭＯＳカメラのラインごとの検出とを同期させることによって、直線形状以外のいかなる信号も拒絶する。上記１つの光シートを使用するモードおよび２つの光シートを用いるモードを含む３つのモードがある。また、実施形態は、平面を二等分したものを同時にイメージングするために２つのシートを別々に用いることを可能にする（その結果、イメージング速度は２倍速くなる）。照明の輪郭を交差させる方法は２つある。１つは、光シートを図４Ａのように横に（すなわち、その伝搬方向と垂直に）にのみ移動させる方法であり、もう１つは、光シートを横に移動させると共に、軸方向（すなわち伝搬方向）にも移動させてより細い光シートを生成させる方法である。
【００２２】
いくつかの用途の例を以下に挙げる。
【００２３】
ＣＬＡＲＩＴＹ、ｉＤＩＳＣＯ、ｕＤＩＳＣＯ、ＳｅｅＤＢ、Ｃｌｅａｒ  Ｔ  ａｎｄ  Ｓｃａｌｅなどの任意の組織透明化手順を用いて透明化された人間の脳または他の臓器のイメージング。
これらの手順は、構造および分子含有量は保ちつつ、化学薬品の混合物を用いて組織を透明化する。これらの組織は、正常な状態、または、これらに限定されないが、さまざまなタイプのがん、神経障害、および、他の病変した生体組織を含む病的状態の組織であってよい。
【００２４】
ラットおよび霊長類の脳を含む大型動物の無傷の脳のイメージング。
現在の最新技術では、試料のイメージングは、マウスの脳の大きさまでに制限される。
【００２５】
マウスの脳の機能的活動をイメージングするライブイメージング用途。
【００２６】
三次元細胞培養のライブイメージング。
図５Ａおよび５Ｂを参照すると、スラブの両側の画像を同時にイメージングするＬＳＴＭシステムは、４つの照明アーム３０３Ａ、３０３Ｂ、３０３Ｃ、および、３０３Ｄを有する。本実施形態の１つの照明アームを図５Ｂに拡大して示している。照明アーム３０３Ａ、３０３Ｂ、３０３Ｃ、および、３０３Ｄのそれぞれでは、対のレンズ３０４および３０６によって表されるビームエキスパンダ（ＢＥ）によって直径が伸張される入力レーザが光源３０２から適用される。伸張されたビームの低明度の周辺部は、アイリス３０７によって除去される。ビームは、対のフリップミラー３１０および３１６を用いて選択的に向きを変えられるか、または、円柱レンズ３１８まで直接進んでよい。ビームが円柱レンズ３１８を通過すると、一方向に圧縮されてシート状の輪郭が形成される。その後、ビームは、例えば、一次元または二次元のガルバノミラースキャナなどの光学式走査装置３２０によって走査される。スキャナの第１の寸法は、シート平面に概ね垂直な経路に出現するシートビームを走査し、第２の寸法は（もしあれば）、アライメントに自由度を与え得る。合焦されたシートは、走査レンズ３２２（ガルバノミラーの角運動を側方運動に変換するｆθレンズ）、チューブレンズ３２４、および、照明用対物レンズ３３０を介して試料をイメージングし、ストッパ３２６は、図２のブロック１４０に関して先に記載した機能を果たす。電動式であり得るフリップミラーが方向変換された位置にある場合、ビームは、ミラー３０８、３１４、および、リレーレンズシステム３１０によってＵ字形経路を介して反射されて経路を定められる。電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）３１２は、高速で電気的に制御されることによって、図１Ｅに関して記載した軸移動を可能にする。ＥＴＬは、リレーレンズシステム２１０を用いて共役焦点面に配置される。この選択可能な経路設定は、電動式フリップミラー３１０、３１６によって制御されてよい。光学式走査装置３２０は、図４Ａおよび４Ｂに示すような、最終的なシートの高速横移動を可能にする。検出アームは、図２に関して記載された構成部品を含み、ここでは、検出用対物レンズ３３８、チューブレンズ３２８、および、ｓＣＭＯＳカメラ３３０などである。試料の異なる層を走査するためにサブシステム３００Ａおよび３００Ｂが配置されているが、それらによって同じ層を同時にイメージングし、キャプチャ画像データを結合して解像度を高めることもできることに留意されたい。例えば、試料の一方の側に照明アーム、他方の側に検出アームを配置するという変形例もあり得る。さらに、ブロック１４０を取り除いて移動可能にすることによって、照明用対物レンズの開口を０％の遮断から大部分の遮断までに調節できる。追加の実施形態がゼロまたは調節可能な遮断を提供するように実施形態のいずれをも修正してよい。
【００２７】
ミラー、または、光学式走査装置３２０などの他の偏向器を等価な光リダイレクタと置き換えてもよいことは明らかであろう。これは、反射だけでなく屈折させる構成部品、または、他のタイプの光操作装置も含み得る。レンズは、いかなる適切なタイプであってよい。光ファイバを含む導波装置をビーム反射器と置き換えてもよい。ＥＴＬ以外の他の装置を照明アームの前焦点面の軸位置を操作するために用いてもよく、これに限定されないが、軸方向の移動プロフィールのために、高速圧電モータに照明用対物レンズを取り付けてよい。カメラ３３０は、例えば、走査可能なラインセンサと置き換えてもよい。シートビームの代わりに、走査されたペンシルビームを照明されたターゲットの線形体積２１９上に投影してもよいが、このような代替物は、例示された上記実施形態によって提供される機能（速度）に有害である特徴を有するかもしれない。
【００２８】
試料３３６は、平行移動および回転運動のために、例えば、電動ＸＹＺθステージに装着されてよい。これによって、試料３３６を複数のタイルにわたって走査することが可能になる。図５Ｂに示す照明アームと同じものが図５Ａに示されるように４つある。これによって、照明および画像検出の複数のモードが可能になる。図５Ａは、２つの同一のＬＳＴＭサブシステム３００Ａおよび３００Ｂを含むＬＳＴＭシステム３００を示す。ＬＳＴＭサブシステム３００Ａおよび３００Ｂは、試料３３６の各面を検出するための検出アーム３０１Ａおよび３０１Ｂをそれぞれ有する。検出アーム３０１Ａおよび３０１Ｂのそれぞれは、一対の照明アームを有している。検出アーム３０１Ａは、照明アーム３０３Ａおよび３０３Ｂを有し、検出アーム３０１Ｂは、照明アーム３０３Ｃおよび３０３Ｄを有する。試料３３６は、いかなる関連技術による浸液で囲まれてよい。４つのＬＳＴＭサブシステムは、移動システムの複数の別々のタイル固有位置のそれぞれにおいて走査を行ってよい。各走査によって３３２で示される層がイメージングされる。各タイルのための層がつぎ合わされて合成されることによって試料の完全な層が形成されてよい。また、各タイルのために複数の層が取得され、各層がつぎ合わされて合成されることによって完全な層が形成されてもよい。つまり、移動システムの各タイルに固有の位置によって複数の層が得られる。
【００２９】
図５Ｃおよび５Ｄは、図５Ａの照明アームと置き換え可能な照明アームの他の変形例を示す。図５Ｃは、Ｕ字形偏向経路、フリップミラー、および、リレーレンズを除いた図５Ｂの照明アームを示す。この照明アームは、図５Ａに関して説明した走査機能を提供するものの、照明アームの内外にＥＴＬを切り替える柔軟性はない。図５Ｄは、図４Ａで説明した走査モードに適した照明アームを示し、光シートの前焦点面２４１の軸方向移動がないものである。図５Ｄの照明アームは、光路内にＥＴＬがない。
【００３０】
図６は、発せられた信号を同時にキャプチャするための脱同期化されたラインごとの検出モードを示す。この動作モードは、例えば、図５ＡのＬＳＴＭシステム３００によって実行され得る。照明シートビーム３５３および３５４は、試料の第１の表面に向けられ、照明シートビーム３６６および３６２は、試料の反対側の表面に向けられる。それぞれの画素列３５０および３６０を識別するカメラ画像検出器を含む検出アーム（図示せず）と協働する二対の照明ビームは、側方の異なる位置で照明された線形体積２１９Ａおよび２１９Ｂをキャプチャする。これによって、２つのオフセットのターゲット間の光干渉を最小限にする。したがって、２つの検出アーム間に位相差のある走査によって、試料の両側を最小限の相互干渉で同時に走査することができる。
【００３１】
ＬＳＴＭシステムは、試料の複数の位置でイメージング平面を自動的に低密度にサンプリングすることによって、自動キャリブレーション機能を実行するコントローラを有してよい。一実施例によれば、ＬＳＴＭシステムは、例えば、表面変化や屈折率のばらつきなど、照明された線形体積２１９の位置に影響を及ぼすパラメータを抜き出すために、大型試料をまばらに横断するよう制御されてよい。したがって、これらの変化に対して試料の疎行列がキャプチャされて分析され、精密な横断道程を作成するために保存される。これによって、大型試料において光学データを獲得するイメージングの速度および品質が向上し得る。横断道程は、検出されたパラメータの適応修正と、まばらな間隔からのパラメータの補間とを用いてよい。適応修正は、適切な、例えば、検出焦点面に対する光シートのずれを正してよい。
【００３２】
図７Ａ〜７Ｅは、本開示の実施形態による、大き目のスラブの単一の“タイル”の走査のステージを示す。この走査は、スラブを位置決めするＸＹＺθステージの位置の行列の１つに対して行われる光学式走査である。図８は、本開示の実施形態による、ＬＳＴＭシステムの自動操作を可能にする様々な実施形態のアクチュエータに接続されたコントローラを示す。図７Ａは、スラブ３７２の定位置でイメージングされるタイル３７０の右手の初期位置で線形体積２１９を照明する照明シートビーム３５３を示す。スラブは、例えば、コントローラ４１０の制御下で、ＸＹＺθステージを移動する移動システム４０６（図８）によって移動されてよい。図７Ａ〜７Ｅに図示されたシーケンスでは、スラブのタイルアレイをサンプリングするために全体積が走査されてステージが異なる座標（図９）に移動するまではステージのＺ位置が段階的に変更されてよく、その後、ステージは定位置を保ってよい。データが合成されて、先に述べたようなスラブの画像が形成されてよい。図７Ａ〜７Ｅのシーケンスでは、光学式走査装置３２０をコントローラ４１０で制御することによって照明ビームを横断させる。コントローラは、照明光が電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）３１２を通過するよう、電動フリップミラー３１０、３１６を位置決めしてよい。このようにして、シートビーム３５３は、徐々にまたは段階的に移動することになるが、そのいくつかが図７Ａ〜７Ｅに示されている。（漸進的かつ連続的な、または、離散した）それぞれの位置で、露光された画素ライン２０４をサンプリングすることによって、照明された線形体積２１９のその当時のライン画像が選択される。カメラの画像データの選択、格納、および、合成やサンプリングもカメラ３３０に接続されたコントローラ４１０によって自動的に実行されてよい。
【００３３】
図２０Ａ〜２０Ｄは、走査中に何が起きているのかをさらに示す。図２０Ａおよび２０Ｂは、光学軸に対して画像の位置を反転させない顕微鏡のカメラセンサに対する、光学軸が交差する一端と、他端までの走査に沿った任意の中間点とにおける、照明されたラインの投影を示している。
【００３４】
図７Ａ〜７Ｅは、一般的に顕微鏡で起こるように、検出アームが画像を軸に対して反転させないことを示唆していることに留意されたい。この状況では、光学軸の一方の側のライン光源が反対側でイメージングされる実施形態も考えられる。図９は、本開示の実施形態による、スラブの三次元画像を生成するための複数のタイル画像の合成を示す。各タイルは、図７Ａ〜７Ｅに示されるシーケンスによって形成され、スライスされてｚ軸方向に並んでよい。それぞれが深度を有する複数のタイルのアレイが得られることによってスラブの体積がイメージングされてよい。図５Ａを参照して説明したようなシステムを用いて試料の２か所の深度を同時に取得することによって、速度は倍になり得る。
【００３５】
図１０は、ＬＳＴＭを実装する他の実施形態を示す。本実施形態の照明アーム５００のそれぞれは、レーザ光源５０２、コリメータ５０４（例えば、出力ビームの直径約１０ｍｍ）、ＥＴＬ５０８、円柱レンズ５１２、ガルバノスキャナ５１４、走査レンズ５１６、チューブレンズ５２０、および、照明用対物レンズ５３０（例えば、オリンパスＭａｃｒｏ４×／０．２８ＮＡ）を含む。本実施形態では、コリメータ５０４の後ろにアイリス５０６を組み込んでガウスビームの周縁の広がりを取り除き、円柱レンズ５１２の前に一次元スリット５１０を組み込んで照明の有効開口数を制御し、共役平面の走査レンズ５１６とチューブレンズ５２０との間に第２のアイリス５１８を組み込んで不要な照明を最小限にするよう光シートの高さを制御する。いくつかの実施形態では、ストッパ（図示しないが、図５Ａに示すストッパ３２６と同様）を照明用対物レンズ５３０の直前に設けてよい。
【００３６】
いくつかの実施形態では、照明アーム５００は、光学テーブルに固定された検出アーム５５０に対して約６０度の角度で取り付けられる。別の実施形態では、この角度は、図１５Ｂに関して記載されたパラメータの範囲内で変化してよい。任意で、システムの光学アライメントを容易にすべく、３つの光学アーム５００、５５０のすべてを２つの手動移動ステージに装着してよい。任意で、液浸油（例えば屈折率１．４５４）で満たした蓋のない試料室が用いられてよい。任意で、試料室の底面に取り付けられた石英キュベットに試料を装着してもよい。
【００３７】
本実施形態では、２つの照明光学アーム５００を用いて２つの薄い光シートが生成される。照明用対物レンズが空気対物レンズである場合、カバースリップ（例えば直径１インチの石英カバースリップ）付きの３Ｄプリントによるキャップを用いて対物レンズを密封し、油浸を防いでよい。
【００３８】
本実施形態の検出アーム５００は、検出用対物レンズ５５２（例えば、オリンパス１０×０．６ＮＡ／８ｍｍＷＤ、または、２５×／１．０ＮＡ／８ｍｍＷＤ）、チューブレンズ５５６、および、ｓＣＭＯＳカメラ５５８（例えば、浜松ホトニクス  Ｏｒｃａ  Ｆｌａｓｈ  ４．０  Ｖ３）を含む。いくつかの好適な実施形態では、検出用対物レンズ５５２とチューブレンズ５５６との間に発光フィルタ（図示せず）を配置する。
【００３９】
本実施形態で用いられる適切な部品およびそれらの供給元を表１に示す。
【表１】
2020502558.tif 000003
2020502558.tif 000004
2020502558.tif 000005
【００４０】
ＬＳＴＭは、光シートと検出平面とが交差することによって生成されるライン照明−検出プロフィールを走査するので、いくつかの好適な実施形態では、イメージング速度を最高にするために、（ペンシルビームを高速走査することによって生成される）動的シートではなく、（円柱レンズおよび関連する光学部品を用いることによって生成される）静止シートを用いる。しかしながら、動的シートを用いる別の実施形態もあり得る。
【００４１】
ガルバノスキャナ５１４は、光シートの伝搬方向に対して垂直に光シートを高速移動させるために用いられる。２軸走査モードでは、光シートの最も細い部分を光シートの伝搬方向に沿って高速移動させることが要求される。これを実現するにはさまざまなアプローチが用いられ、これらに限定されないが、照明用対物レンズを移動するために高速圧電モータを用いる；平行ビームの広がりおよび収束を誘導するためにホログラフィック空間光変調器または電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）５０８を用いることを含む。対物レンズを高速走査するために圧電モータを用いると、しばしば振動が起き、追加の整定時間が必要になる。また、空間光変調器は、リフレッシュレートが遅いため、変調速度に限界がある。他方、電気式焦点可変レンズは、光学部品をそれほど動かす必要もなく焦点面の位置の高周波変調を実現できる。したがって、いくつかの好適な実施形態では、電気式焦点可変レンズ５０８が用いられる。電気式焦点可変レンズに基づくアプローチは、均一かつ２軸同期走査を実現するために非常に有効であることが実際に証明されている。
【００４２】
ＬＳＴＭアセンブリを光学的に位置合わせするための１つの方法は、検出用光学部品の焦点面内に（例えば中心に細かい傷のある）プリズムミラーを配置することによって、検出焦点面に対する光シートの位置および断面を可視化することである。そして、光シートの最も細い部分が検出平面の視野の中心と位置合わせされるように、光シート位置決めパラメータが最適化され得る。２つ目の方法では、ミラーを、蛍光ビーズを含む高濃度（＞２％）アガロースゲルと置き換える（位置合わせを最適化する間にアガロースゲルの表面が確実に見えるようにするために、高濃度のアガロースゲルを用いてよい）。表面に位置する照明されたビーズの大きさおよび品質を調べることにより、視野全体にわたって平面を均一に照明するための最適なガルバノスキャナおよび電気式焦点可変レンズのパラメータが識別され得る。
【００４３】
一連の計算を用いて、図１０に示す実施形態のさまざまな特性を評価し、比較した。これらの計算の結果の概要を図１５Ａおよび図１５Ｂに示す。まず、検出用対物レンズと照明用対物レンズとの所定のセットを非直交状に配列する物理的な幾何学的制約を計算した（図１５Ａおよび１５Ｂ）。計算に用いられる主要な物理的パラメータは、照明用対物レンズ５３０および検出用対物レンズ５５２両方の作動距離および直径である。次に、照明用対物レンズが検出用対物レンズの物理的範囲より上にあることを確保しつつ、光シートの最も細い部分が検出焦点面と交差することを可能にする物理的に許容できる相対角度設定の範囲を計算した。例えば、オリンパスＭａｃｒｏ４×０．２８ＮＡ／作動距離２９．５ｍｍを照明用対物レンズとして用い、オリンパス１０×０．６ＮＡ／作動距離８ｍｍを検出用対物レンズとして用いる場合、角度設定は、４３．３度から６２．３度まで可能である。これは、照明用対物レンズ５３０が検出用対物レンズ５５２に接しない（図１１Ａ）、照明用対物レンズ５３０が検出用対物レンズ５５２の物理的範囲より下にならない（図１１Ｂ）上下限（図１１Ａ、Ｂ、および図１５Ｂ）を分析することによって、照明用対物レンズの配置上の幾何学的制約から計算され得る。許容できる角度位置の範囲は、図１５Ｂに示されるような有効作動距離および対物レンズの直径を考慮に入れることによって計算され、以下の関係が得られる。
【式１】
【００４４】
2020502558.tif 000006
Ｗ１は、検出用対物レンズの作動距離、Ｗ２は、照明用対物レンズの作動距離；Ｄ１は、検出用対物レンズの直径、Ｄ２は、照明用対物レンズの直径；θｉおよびθｆは、境界の角度位置である。対物レンズが空気中で用いられるよう設計されている場合、（例えば、図１５Ａに示されるような屈折率１．４５４の液体中の）略有効作動距離を計算するためにスネルの法則が用いられてよく、結果として約４４ｍｍになり、対物レンズの直径（先細りした端部の最下部）は約２８ｍｍと測定された。多くの実験で値Ｗ１＝８、および、Ｄ１＝４０が用いられた。
【００４５】
図１５Ａは、屈折率１．４５４の浸液中で用いられた場合の、照明用空気対物レンズであるオリンパスＭａｃｒｏ４×０．２８ＮＡ／作動距離２９．５の有効作動距離（ＥＷＤ）の概算を示す。本来の作動距離（ＯＷＤ）は、対物レンズの仕様書に従う空気中の作動距離である。薄い石英カバースリップおよび３Ｄプリントキャップを用いて照明用対物レンズを密閉した。有効作動距離は、４３．８４ｍｍと推定された。
【００４６】
図１２は、結果として生じた画像体積への、図１０の実施形態に示された照明アーム５００と検出アーム５５０との角距離の影響、および、照明経路の長さのＬＳＴＭとＬＳＭとの間の比較を示す。ＬＳＭでは、照明光シートは、試料の全幅（ｗ）を貫通する必要がある（図１２Ｂ）。一方、ＬＳＴＭでは、有効照明経路長は、角度設定および組織厚（ｔ）：ｔ／ｃｏｓ（θ）に依存する。ｔは、イメージングされる試料の厚みであり、θは、照明伝搬方向と検出軸との間の角度である（図１２Ａ）。したがって、照明経路長の点からみると、角距離を最小限にすることによって照明深度を高めることができるだろう。
【００４７】
図１２Ｃのグラフは、θに依存するＬＳＴＭの照明深度を示す。各曲線は、異なる組織厚（ｔ）を示し、矢印は、深度が増す方向を示している。軸方向の解像度を決定する光シートの有効厚さ（約ｂ／ｓｉｎ（θ））へのθの影響を測定すると、θが大きくなると、軸方向の解像度が向上するという反比例関係がみられた。光の散乱効果が照明側でより小さくなる開口数の小さい対物レンズを介して照明されるので、いくつかの実施形態では、約６０度で角距離が最大になることによって軸方向の解像度がより高まる。この構成を用いて本明細書中の実験を実行した。
【００４８】
図１２Ｄのグラフは、所定の幅および厚みを有する試料をイメージングするために必要な照明深度のＬＳＴＭとＬＳＭとの間の比較を示す。照明経路長のＬＳＴＭとＬＳＭとの対比は、１に閾値化し、結果をヒートマップとして表示することによって２進表現に変換されて、その結果、およそのパラメータ範囲が示される。ＬＳＴＭ（右の領域）とＬＳＭ（左の領域）とは、照明深度をより低下させる必要があるので、このアプローチは、画質を向上させることになる。
【００４９】
明るい均一な分布信号を有する透明度の高い試料として、血管系に染色した透明化ラット脳の厚い切片（厚さ約５ｍｍ、幅約２ｃｍ）を用いて、ＬＳＴＭとＬＳＭとの間でイメージング性能を比較した。ＬＳＴＭは、試料全体を均一な高解像度でイメージングすることができたが、ＬＳＭでは、照明光シートが貫通しないため、組織の中心に向うにつれて次第に画質が低下していった。これらの実験、および、他の実験は、ＬＳＴＭが、横方向のサイズの制限なしに大型試料を定量的に高解像度でイメージングするのに適していることを証明するのに役立つ。  大型試料において１軸走査モードで低ＮＡのＬＳＴＭの照明を用いることについて、ＣＬＡＲＩＴＹ透明化Ｔｈｙ１−ｅＹＦＰトランスジェニックマウス脳の厚い冠状断面でテストした。広い視野を形成する（ことにより厚い光シートにする）ために低開口数の照明用対物レンズが用いられた。１軸走査モードのＬＳＴＭは、切片を高品質にイメージングすることを可能にしたが、視野の周辺部分の画質は低下した。この結果は、照明にガウスビームを用いるＬＳＭシステムのイメージング性能と同様であった。
【００５０】
次に、２軸同期走査モードのＬＳＴＭのイメージング性能を、ＣＬＡＲＩＴＹ透明化Ｔｈｙ１−ｅＹＦＰトランスジェニックマウスの脳の厚い（約９．６ｍｍ×１３．５ｍｍ×５．３４ｍｍ）冠状断面を用いて、１０×／０．６ＮＡ／作動距離８ｍｍ、および、２５×１．０ＮＡ／作動距離８ｍｍの対物レンズによって評価した。照明用対物レンズの最大開口数（０．２８）を用いるために入力ビームの直径を大きくした。この構成により、ＬＳＴＭは、これらの大型試料の寸法全体にわたって、画質を低下させずに高速かつ高解像度の定量イメージングを実現した。
【００５１】
これらの実験に続いて、Ｔｈｙ１−ｅＹＦＰトランスジェニックマウスの（脊髄に接続した）無傷の透明化した脳全体をイメージングすることに成功した。精密な高解像度の３Ｄレンダリングが行われ、均一で高品質なイメージングであることが証明された。よって、ＬＳＴＭは、大きい無傷の生物系の高解像度定量イメージングを、横寸法の制限なしに可能にすると結論付けることができる。しかしながら、イメージングできる試料の厚みは、検出用対物レンズの作動距離、組織の透明度、および、標識試薬の浸透度によって制限されたままである。
【００５２】
光シートは、検出平面に対して非直交入射するので、光シートの有効厚さは、元の厚さの光シートの検出方向における投影として概算することができ、結果としてｂ／ｓｉｎ（θ）となる（ｂは、最も焦点の合った位置での元の光シートの厚さであり、θは、検出軸に対する入射角である）。図１３Ａおよび１３Ｂにこの関係を示す。ここでは、平面照明の有効厚さは、ｂ／ｓｉｎ（θ）として概算されている。より詳細には、図１３Ａは、幾何配置を示し、図１３Ｂは、ｂの異なる値に対するθの関数としての光シートの有効厚さを示す（矢印は、ｂ値が増大する方向を指す）。
【００５３】
図１４は、試料へのエネルギー負荷のＬＳＴＭとＬＳＭとの間の比較を示す。２つの行は、単一平面（図１４Ａおよび１４Ｃ）と、タイル画像の単一のスタック（図１４Ｂおよび１４Ｄ）とをイメージングするための時間にともない蓄積されるエネルギー負荷をＬＳＴＭとＬＳＭとの間で比較した。ＬＳＴＭにおけるエネルギー負荷は、試料の厚さに依存し、ＬＳＭにおけるエネルギー負荷は、試料の幅に依存した。大型試料では、ＬＳＴＭにおけるエネルギー負荷は、ＬＳＭと同様であった。
【００５４】
図１６は、血管系に染色した幅約２ｃｍ、厚さ約５ｍｍのラット脳切片をイメージングするための正規化平均強度のＬＳＴＭとＬＳＭとの間の比較を示す。図１６が示す比較に用いられる画像は、最大強度のｚ軸への投影画像であり、１０×／０．６ＮＡの対物レンズを用いて得た。図１６は、関心領域（ＲＯＩ）にわたる平均強度（垂直方向）を表わす。光シートの照明の散乱により、ＬＳＭにおける画像信号は、試料内部に向かって劣化したが、ＬＳＴＭでは、試料全体にわたって均一な品質のイメージングを可能にした。
【００５５】
図１８は、（２つの照明用対物レンズのそれぞれの、または、単一の照明用対物レンズの）光学軸６５０、および、照明用対物レンズの光学軸６５０より浅い角度になるよう、照明用対物レンズの周辺部から発せられたときのような照明ビームの主平面または軸６５２および６５４によって形成される相対角度を示す。照明用対物レンズの光学軸６５０間の角度６５８は、主平面または軸６５２と６５４とによって形成される角度６５６より小さい。図は、検出用対物レンズ（光学軸６５１）と照明用対物レンズとの間の干渉を避けるよう制限されるそれぞれの角度の範囲を示す。
【００５６】
明細書全体を通じて、実施形態への言及は、請求項によって定義されるものを含む。したがって、実施例へのいかなる修正の提案も、対応する請求項の変更を意図し、そのような変更は、本願で開示されたものであると見なされる。
【００５７】
開示された実施形態の多くは、試料、光学部品、または、両方を担持する１つ以上の可動ステージの使用を意図する。開示された実施形態を実行するのに十分なこのような装置および技術の詳細、および、その変形例は、周知であるため、説明しない。
【００５８】
移動ステージによって駆動されるミクロトームと、開示されたＬＳＴＭ顕微鏡の実施形態とを組み合わせてもよい。ミクロトームは、外側の層が走査されて記憶された後に試料から取り除かれるべく、試料のタイルごとの走査と同期して自動的に制御されてよい。層が取り除かれると、移動システムが励起アームおよび検出アームを移動させることによって露光されたより深い層を自動的に走査できる。試料の反対側の表面にミクロトームを設けてもよく、例えば、図５Ａの実施形態において、対向する試料の表面に別々のミクロトームを設けてよい。図１７Ａは、試料６０２の外側表面を段階的に切っていくために、図５Ａに示す実施形態に、試料６０２の対向する面に対して位置決めしたミクロトーム６１０を付加したものである。可動ステージを含む移動アタッチメントは、試料６０２に対するナイフ６１１のＸ−Ｙおよび／またはＺ位置決めを提供し得る。検出および励起光学部品は、それぞれ輪郭線６１８および６１６によって定義される。主支持体は６０６として示される。ナイフ６１１の自動連続位置決めは、タイルサイズの層を一度に取り除くために非常に短い距離の横移動によってなされるか、または、複数のタイルの大きさの領域が一度に取り除かれてよい。ナイフの横移動の少なくとも一部は、走査中に光学部品６１６、６１８、および、試料６０２を相対的に位置決めするために用いられる移動システムを用いて実現されてもよい。
【００５９】
実施形態のいずれにおいても、取得したデータに対して、圧縮などのさらなる処理を走査と並行して行ってよい。例えば、タイルに関する光学データを得る際に、データ量を減らすために、例えば、ＪＰＥＧ２０００２Ｄ、または、ＪＰＥＧ２０００３Ｄなどのアルゴリズムによって前のタイルからのデータがさらに処理されてよい。さらなる処理は、画像セグメンテーション、特徴認識などの他の画像処理タスク、または、他のデータ縮小手順などを含んでよい。
【００６０】
それぞれの検出アームに対してカメラが示されているが、別の実施形態では、イメージングされるスラブの両側からの光を、適切な光学配置を有する単一のカメラによって受光することができると理解できよう。
【００６１】
電気式焦点可変レンズを用いる実施形態のいずれにおいても、照明用対物レンズの軸に沿って光シートのビームウエストを移動させるための他のいかなる適切な機構を代わりに、または、可能なら追加で用いてもよいことに留意されたい。これらは、音響光学焦点可変レンズ、空間光変調器、デジタルマイクロミラーデバイス、照明用対物レンズの圧電モータへの取付け、屈折率分布型（ＧＲＩＮ）レンズ、微小電気機械システム（ＭＥＭＥＳ）移動ファイバ、例えば、ＭＥＭＳモータによって駆動されるファイバの端部にあるＧＲＩＮレンズなどのビームリダイレクタを含むが、これらに限定されない（例えば、
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等による“多重モードファイバ：ニードルの先端における光シート顕微鏡”(http://dx.doi.org/10.1038/srep18050)を参照のこと）。他の等価または同様な機構も用いられ得ることが当業者には理解できよう。図１９は、光シート６７４を形成するＧＲＩＮ合焦素子６７２を担持するファイバ６７０を示す。図４Ａに示す走査モードを実行するために、圧電モータ、ＭＥＭＳモータ、サーボモータ、ステッピングモータなどのモータ、または、他のタイプのモータ、および、ドライブ６７８によって図に示すようなＧＲＩＮレンズを駆動してよい。光源は図示しないが、設けられているものと理解されたい。図４Ｂに示された走査モードを実行するためには、同様のタイプのモータ、および、ドライブ６７８および６８０を用いて、結果として生じたシートビームの最大強度の光のラインの動きに合わせて、図示されたようなＧＲＩＮレンズを検出用対物レンズの光学軸に垂直な経路に沿って動かすか、または、単一のモータおよびドライブ６７６を用いて同じ経路を走査してよい。モータとＧＲＩＮレンズとの間を結合する点線は、機械的結合を示す。
【００６２】
トラック上のステージ、リンケージなどの適切な機構、または、フレキシブルな複合構造を用いることによって、走査の間中ずっとＧＲＩＮレンズの向きを維持することができる。図４Ａ、４Ｂ、および、図１９に示された以外の掃引経路が取り入れられてもよく、例えば、円弧状の掃引、または、図示されたモードを組み合わせてもよい。
【００６３】
ｓＣＭＯＳカメラを含むような上記実施形態のいずれにおいても、これに限定されないが、ＣＣＤまたはライン検出器を含む他の適切なイメージングデバイスが置き換えられてよい。
【００６４】
本願明細書および請求項の範囲で用いられるような用語「対物レンズ」は、対物レンズまたはその一部として用いられることができるいかなるレンズまたはレンズセットのことを指してよい。よって、例えば、シートビームを形成するために対物レンズを用いるようないくつかの実施形態では、励起アームが記載されている。この励起アームは、画像を形成するためには用いられず、光学素子自体が開口数などを含む対物レンズの特徴を有してよい。
【００６５】
実施例のいずれにおいても、例えば、組織の試料のライブイメージングのスループットを高めるべく、顕微鏡の被写界深度を変更し、所定のタイルを走査するために多数の深度を選択するための規定が設けられてよい。被写界深度は、対物レンズターレットセレクタまたは交換可能な対物レンズなどの適切な機構によって選択されてよい。
【００６６】
第１の実施形態によれば、光学イメージング装置は、第１のシートビームを形成するよう配置された光学部品を有する第１の照明アームを含む。第１の検出アームは、前焦点面を有し、第１のシートビームが前焦点面と交差する線形体積をイメージングするための光学部品を含む。第１の照明アームの光学部品は、照明用対物レンズを含み、第１の検出アームの光学部品は、検出用対物レンズを含む。第１のシートビームは、照明用対物レンズの光学軸に対して傾いており、第１の検出アームの前焦点面は、検出用対物レンズに対して垂直である。
【００６７】
第１の実施形態の変形例では、第１の照明アームの光学部品は、シートビームのビームウエストが第１の検出アームの前焦点面を横切るようにする走査構成部品を含む。第１の実施形態の変形例は、第１のカメラから画像データを読み取るために第１のカメラに接続されたコントローラを含む。第１の検出アームは、第１のカメラの二次元画像検出器を含み、コントローラは、シートビームのビームウエストの位置に応じて二次元画像検出器の選択された画素を読み取って記憶することにより、選択された画素がビームウエストの移動に追従できるようにする。第１の実施形態の変形例では、コントローラは、走査構成部品を制御する。第１の実施形態の変形例では、走査構成部品は、照明用対物レンズの軸に沿ってビームウエストを動かす電気式焦点可変レンズを含む。第１の実施形態の変形例は、移動システムを含み、コントローラは、走査構成部品を制御し、線形体積を連続してサンプリングすることによってスライス画像を形成する。第１の実施形態の変形例は、第１のシートビームと交差する第２のシートビームを形成する第２の照明アームを含む。第１の実施形態の変形例では、第１および第２の照明アームの照明用対物レンズの光学軸のそれぞれは、第１の検出アームの前焦点面に対して角度を成す。第１の実施形態の変形例では、第１および第２の照明アームのそれぞれは、照明用対物レンズの側部を用いてシートビームを形成させる部分ビームブロックを含む。第１の実施形態の変形例では、シートビームの角度は、ビームブロックの位置に対応する。第１の実施形態の変形例は、移動システムに接続されたコントローラを含む。コントローラは、光学式走査の寸法より大きい試料をキャプチャするために、移動システムが光学式走査の寸法に応じた自由度の大きさに対応する軸に沿って徐々に移動できるように、移動システムの自由度のある部分を光学的に走査するようプログラムされている。第１の実施形態の変形例は、第１の照明アームおよび第１の検出アームとそれぞれ同一の第２の照明アームおよび第２の検出アームを含む。第２の照明アームおよび検出アームは、可動ステージの対向する側に位置決めされる。第１の実施形態の変形例は、第１および第２の検出アームのそれぞれに配置されたカメラを含む。コントローラは、第１および第２の画像検出器から画像データを読み取るために、第１および第２の画像検出器に接続される。第１の検出アームおよび第２の検出アームのそれぞれは、カメラの二次元画像検出器を含み、コントローラは、シートビームのビームウエストの位置に応じて画像検出器の選択された画素を読み取って記憶することにより、選択された画素がビームウエストの移動に追従できるようにする。第１の実施形態の変形例では、コントローラは、第１および第２の照明アームのシートビームと、第１および第２の検出アームの前焦点面とのそれぞれの交点の間の距離を維持するよう、第１および第２の照明アームのシートビームを制御する。第１の実施形態の変形例では、コントローラは、２つのシートビームの走査サイクル間の位相差を維持することによって、第１および第２の照明アームのシートビームと、第１および第２の検出アームの前焦点面とのそれぞれの交点の間の距離を維持するよう、第１および第２の照明アームのシートビームを制御する。
【００６８】
第２の実施形態によれば、本開示は、試料内の長尺体積をイメージングする方法を含む。方法は、光ビームの通過を一部阻止して光ビームが第１の対物レンズの光学軸の一方側だけに届くようシートビームを形成するステップを含む。方法は、シートビームが第１の対物レンズまたは第２の対物レンズと交差する位置でシートビームによって照明された線形体積からの光を検出するステップを含む。形成するステップは、線形体積が、線形体積の軸に垂直な軸を横切るよう、シートビームを走査するステップを含む。
【００６９】
第２の実施形態の変形例では、検出するステップは、カメラの二次元画像平面の画素ラインをサンプリングするステップを含む。画素ラインは、線形体積の画像と一致する。第２の実施形態の変形例では、第１の対物レンズまたは第２の対物レンズは、第１の対物レンズである。第２の実施形態の変形例では、第１の対物レンズまたは第２の対物レンズは、第２の対物レンズである。第２の実施形態の変形例では、走査するステップは、第１の対物レンズの軸に沿って線形体積の軸位置を移動するステップを含む。第２の実施形態の変形例では、軸位置を移動するステップは、電気式焦点可変レンズを起動するステップを含む。第２の実施形態の変形例は、形成するステップおよび検出するステップを単一の試料の反対側で再び行うステップを含む。第２の実施形態の変形例は、走査するステップと、形成するステップおよび検出するステップを再び行うステップとのそれぞれの後に、それぞれの位置で試料を機械的に移動するステップと、各走査に対応する画像を合成して試料の三次元画像を形成するステップと、を含む。
【００７０】
第３の実施形態によれば、本開示は、顕微鏡を含む。検出用対物レンズの光学軸は、移動システムの２つの軸によって定義される所定の平面に垂直である。検出用対物レンズの所定の平面と同じ側から光が試料に入射するよう、１つ以上の光シートを光学軸に対して斜めの角度で生成するよう、１つ以上の照明用対物レンズが位置決めされかつ配向される。
【００７１】
第３の実施形態の変形例は、検出用対物レンズから二次元画像センサへと光を伝達する検出アームを含む。第３の実施形態の変形例では、画像センサは、ｓＣＭＯＳセンサである。第３の実施形態の変形例は、照明用対物レンズを通過するビームを形成する照明アームを含む。第３の実施形態の変形例では、照明アームは、光シートが照明用対物レンズの光学軸に対して角度を成すよう、光が照明用対物レンズを非対称に通過するように構成される。第３の実施形態の変形例では、照明アームのそれぞれは、照明用対物レンズのそれぞれに当てられるビームを遮断する。第３の実施形態の変形例は、コントローラ、および、走査光学部品を含む。走査光学部品は、光シートと、検出用対物レンズの前焦点面との交点が前焦点面を横切るよう、照明アーム内でコントローラによって制御される。第３の実施形態の変形例では、コントローラは、交点に位置する照明された領域の画像に対応するイメージングデバイスの画素ラインをキャプチャする。
【００７２】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、顕微鏡を含む。イメージング構成部品は、イメージング用対物レンズを含む。第１の光シートプロジェクタは、試料領域のイメージング構成部品と同じ側に配置される。イメージング構成部品自体は、例えば、従来の顕微鏡のすべての部品を含んでよい。イメージング用対物レンズ、および、第１の光シートプロジェクタのそれぞれは、試料領域で交差する光学軸を有する。これは、イメージング用対物レンズ、および、第１の光シートプロジェクタが顕微鏡と共通のマウント内に配置されかつ配向されているからである。試料が試料支持体に配置されているとき、イメージング用対物レンズの光学軸が試料の表面に垂直になるように、試料支持体は、イメージング用対物レンズに対して配置されかつ配向される。
【００７３】
上記顕微鏡の変形例では、試料支持体は、主平面を有する略平坦要素であり、スラブ形状の試料を保持するよう成形される。イメージング用対物レンズの光学軸は、主平面に対して垂直である。さらなる変形例を上記の変形例と組み合わせてよく、第２の光シートプロジェクタが設けられてもよい。第２の光シートプロジェクタは、第１の光シートプロジェクタの光学軸とイメージング用対物レンズの光学軸とによって形成される角度に等しい角度をイメージング用対物レンズの光学軸との間に形成する光学軸を有する。
【００７４】
さらなる実施形態によれば、本開示は、イメージング構成部品を有する顕微鏡を含み、イメージング構成部品は、試料領域の同じ側に配置されたイメージング用対物レンズと、第１の光シートプロジェクタとを有する。イメージング用対物レンズ、および、第１の光シートプロジェクタのそれぞれは、試料領域で交差する光学軸を有する。試料支持体は、試料領域で試料を保持するよう位置決めされる。光シートプロジェクタは、光シートのビームウエストの軸位置を選択し、かつ、光シートの伝搬方向に垂直な軸に沿って光シートの位置を選択することを可能にする光走査・合焦光学部品を有する。コントローラは、ビームウエストを線形経路に沿って移動させるよう、光走査・合焦光学部品を制御するために接続される。イメージング用対物レンズの光学軸は、線形経路に対して垂直である。
【００７５】
上記顕微鏡の変形例では、光走査・合焦光学部品は、電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）を含む。さらなる変形例では、試料支持体は、スラブ形状の試料を保持するために略平坦要素に成形される。さらなる変形例では、第２の光シートプロジェクタは、第１の光シートプロジェクタの光学軸とイメージング用対物レンズの光学軸とによって形成される角度に等しい角度をイメージング用対物レンズの光学軸との間に形成する光学軸を有する。
【００７６】
さらなる変形例では、試料の２つの対向面が走査されるよう、１つ以上のさらなる光シートプロジェクタおよびイメージング構成部品が試料の反対側に配置される。さらなる変形例では、試料の複数の部分を連続的に走査できるよう試料支持体を移動させるために移動ステージが接続される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本開示は、試料領域の同じ側に配置されたイメージング用対物レンズと第１の光シートプロジェクタとを含む。イメージング用対物レンズ、および、第１の光シートプロジェクタのそれぞれは、試料領域内で交差する光学軸を有する。試料支持体は、試料支持体を少なくとも１つの線形軸に沿って移動させる移動ステージに設けられる。移動ステージは、イメージング用対物レンズの光学軸が少なくとも１つの線形軸に対して垂直になるよう、イメージング用対物レンズに対して位置決めされかつ配向される。
【００７８】
試料支持体は、主平面を有する略平坦要素であり、スラブ形状の試料を保持するよう成形される。イメージング用対物レンズの光学軸は、主平面に対して垂直である。第２の光シートプロジェクタは、第１の光シートプロジェクタの光学軸とイメージング用対物レンズの光学軸とによって形成される角度に等しい角度をイメージング用対物レンズの光学軸との間に形成する光学軸を有する。
【００７９】
顕微鏡の実施形態のいずれも、試料の２つの対向面が走査されるよう、試料領域の反対側に配置された１つ以上のさらなる光シートプロジェクタおよびイメージング構成部品、および／または、試料の複数の部分を連続的に走査できるように試料支持体を動かすために接続された移動ステージを含んでよい。
【００８０】
いくつかの実施形態では、本開示は、顕微鏡を含むイメージング機器を含み、顕微鏡の対物レンズは、光学軸を有する。第１の光ビームプロジェクタは、光学軸と交差する光ビームを向けるよう位置決めされた、顕微鏡から分離したイメージング光学部品を有する。第１の光ビームプロジェクタは、最大強度のライン状のビームウエストを有するシートを形成する。第１の光ビームプロジェクタは、最大強度のラインに垂直な走査方向に沿った位置の範囲を通じて最大強度のラインを走査する走査機構を有する。顕微鏡の対物レンズの光学軸は、走査方向に対して垂直である。
【００８１】
イメージング機器において、対物レンズおよび光ビームプロジェクタに対して試料を動かすことよって伸張されたスラブ状の試料が走査されるよう、対物レンズおよび光ビームプロジェクタは、試料体積の同じ側に配置される。イメージング機器およびそのいかなる変形物において、移動システムは、スラブ状の試料が走査されるように顕微鏡および試料支持体のいずれかまたは両方に接続されてよい。イメージング機器およびそのいかなる変形物において、移動システムは、Ｘ−Ｙ移動システムである。イメージング機器およびそのいかなる変形物において、移動システムは、Ｘ−Ｙ移動システムであり、ＸおよびＹ軸は、光学軸に対して垂直である。イメージング機器およびそのいかなる変形物において、走査機構を用いて試料の複数のタイルセグメントのそれぞれを走査し、さらなるタイルセグメントを走査するために顕微鏡に対して試料支持体を移動させるよう、移動システムおよび走査機構にコントローラが接続されてよい。イメージング機器およびそのいかなる変形物において、走査機構は、電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）を含む。イメージング機器およびそのいかなる変形物において、電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）は、シート伝搬方向におけるシートの長さに沿って最大強度のラインの位置を変更してよい。
【００８２】
イメージング機器およびそのいかなる変形物において、走査機構は、最大強度のラインがシートの伝搬方向に垂直な軸を横切るよう、シートを走査する光リダイレクタを含む。イメージング機器およびそのいかなる変形物において、走査機構は、最大強度のラインがシートの伝搬方向に垂直な軸を横切るよう、シートを走査する光リダイレクタを含んでよい。イメージング機器およびそのいかなる変形物において、走査機構は、最大強度のラインがシートの伝搬方向に垂直な軸を横切るよう、シートを走査する光リダイレクタを含んでよい。
【００８３】
イメージング機器およびそのいかなる変形物において、光リダイレクタは、ガルバノモータを含んでよい。イメージング機器およびそのいかなる変形物において、光リダイレクタは、ガルバノミラーを含んでよい。イメージング機器およびそのいかなる変形物において、走査機構は、シートの伝搬方向におけるシートの長さに沿って最大強度のラインの位置を変更するための軸と、シートの伝搬方向に垂直な軸に沿って最大強度のラインの位置を変更するための軸との２つの軸で走査してよい。イメージング機器およびそのいかなる変形物において、走査機構は、シート伝搬方向におけるシートの長さに沿って最大強度のラインの位置を変更するための軸と、シートの伝搬方向に垂直な軸に沿って最大強度のラインの位置を変更するための軸との２つの軸で走査してよい。イメージング機器およびそのいかなる変形物において、走査機構は、シートの伝搬方向におけるシートの長さに沿って最大強度のラインの位置を変更するための電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）を含んでよい。
【００８４】
いくつかの実施例によれば、本開示は、対物レンズを有する顕微鏡を含むイメージング機器を含む。第１の光ビームプロジェクタは、光学軸と交差する光ビームを向けるよう位置決めされた、顕微鏡から分離したイメージング光学部品を有する。第１の光ビームプロジェクタは、最大強度のライン状のビームウエストを有するシートを形成する。第１の光ビームプロジェクタは、最大強度のラインに垂直な走査方向に沿った位置の範囲を通じて最大強度のラインを走査する走査機構を有する。
【００８５】
変形例において、対物レンズおよび光ビームプロジェクタに対して試料を動かすことよって伸張されたスラブ状の試料が走査できるよう、対物レンズおよび光ビームプロジェクタは、試料体積の同じ側に配置される。いくつかの実施形態によれば、本開示は、顕微鏡を含む。顕微鏡は、スラブ状の試料が走査されるように顕微鏡および試料支持体を動かすため、顕微鏡および試料支持体のいずれかまたは両方に接続された移動システムを含む。変形例では、移動システムは、Ｘ−Ｙ移動システムである。変形例では、移動システムは、Ｘ−Ｙ−Ｚ移動システムである。ＸおよびＹ軸は、試料体積の主平面に平行であり、Ｚ軸は、試料体積の主平面に垂直である。変形例では、走査機構を用いて試料の複数のタイルセグメントのそれぞれを走査し、さらなるタイルセグメントを走査するために顕微鏡に対して試料支持体を移動させるよう、移動システムおよび走査機構にコントローラが接続される。変形例では、走査機構は、電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）を含む。変形例では、ＥＴＬは、最大強度のラインの位置を、シートの伝搬方向におけるシートの長さに沿って変更してよい。変形例では、走査機構は、最大強度のラインがシートの伝搬方向に垂直な軸を横切るよう、シートを走査する光リダイレクタを含む。変形例では、走査機構は、最大強度のラインがシートの伝搬方向に垂直な軸を横切るよう、シートを走査する光リダイレクタを含む。変形例では、走査機構は、最大強度のラインがシートの伝搬方向に垂直な軸を横切るよう、シートを走査する光リダイレクタを含む。変形例では、光リダイレクタは、ガルバノモータを含む。変形例では、光リダイレクタは、ガルバノミラーを含む。変形例では、走査機構は、シートの伝搬方向におけるシートの長さに沿って最大強度のラインの位置を変更するための軸と、シート伝搬方向に垂直な軸に沿って最大強度のラインの位置を変更するための軸との２つの軸で走査する。変形例では、走査機構は、シートの伝搬方向におけるシートの長さに沿って最大強度のラインの位置を変更するための軸と、シート伝搬方向に垂直な軸に沿って最大強度のラインの位置を変更するための軸との２つの軸で走査する。変形例では、走査機構は、シートの伝搬方向におけるシートの長さに沿って最大強度のラインの位置を変更するための電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）を含む。
【００８６】
複数の実施形態によれば、本開示は、試料の三次元画像を取得する方法を含む。方法は、光ビームの伝搬方向に垂直な最大強度のラインを有する光ビームを試料内に投影するステップと、光ビームの伝搬方向および光ビームの伝搬方向に垂直な方向の両方に対して斜めの経路に沿って最大強度のラインを走査するよう、光ビームを走査するステップと、を含む。方法は、イメージングトランスデューサのそれぞれの部分におけるラインの画像をキャプチャするステップを含んでよい。方法は、追加としてまたは代替として、イメージングトランスデューサは、カメラセンサ含んでよい。方法は、追加としてまたは代替として、キャプチャするステップは、顕微鏡を用いて、ラインからの光をイメージングするステップを含んでよい。方法は、追加としてまたは代替として、キャプチャするステップは、最大強度のラインによって誘発される二次光を受光してイメージングするステップを含んでよい。方法は、追加としてまたは代替として、キャプチャするステップは、最大強度のラインによって誘発される蛍光を受光し、蛍光の領域をイメージングするステップを含んでよい。方法は、追加としてまたは代替として、走査するステップは、導波管の端部を機械的に動かすステップを含む。方法は、追加としてまたは代替として、顕微鏡および光ビームに対して試料を動かすステップと、走査するステップおよびキャプチャするステップを試料の異なる領域に対して再度実行するステップと、を含んでよい。方法は、追加としてまたは代替として、キャプチャするステップから二次元画像を生成するステップと、二次元画像をつぎ合せ、二次元画像のエッジの特徴を一致させることによって、大きい合成画像を形成するステップと、含んでよい。方法は、追加としてまたは代替として、動かすステップは、３つの直交する方向の１つまたはすべてで動かすステップを含んでよい。方法は、追加としてまたは代替として、動かすステップは、位置の三次元体積を横切るよう、３つの直交する方向のすべてで動かすステップを含む。
【００８７】
方法は、追加としてまたは代替として、走査するステップの各走査後に、試料の複数の深度を光学的に識別するため、イメージングデバイスの焦点を変更するステップを含む。方法は、追加としてまたは代替として、光シートプロジェクタが対物レンズとしてのＧＲＩＮレンズを含む。
【００８８】
複数の実施形態によれば、本開示は検出用対物レンズを、その光学軸がスラブ状試料の対向面に垂直になるよう位置決めするステップを含む顕微鏡法を含む。方法は、さらに、検出用対物レンズの光学軸に対して鋭角を成すよう配向された励起用対物レンズを位置決めするステップを含む。検出用対物レンズを位置決めするステップと、励起用対物レンズを位置決めするステップとは、検出用対物レンズと励起用対物レンズとがスラブ状試料の同じ側になるように行われる。方法は、さらに、励起用対物レンズの光学軸に対して角度を成し、上記鋭角より大きい角度を成すビーム伝搬方向に平行な主軸を有するビームが出現するよう、励起用対物レンズの背面開口に、中心を外して光を当てるステップを含む。
【００８９】
方法は、追加としてまたは代替として、光を当てるステップは、背面開口を一部遮光するステップを含む。方法は、追加としてまたは代替として、主軸の対向面との角度は、検出用対物レンズの光学軸との角度より鋭い。
【００９０】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、顕微鏡法を含み、顕微鏡法は、顕微鏡の検出用対物レンズを、その光学軸がスラブ状試料の表面に対して垂直になるよう配置するステップと、検出用対物レンズの光学軸と同じ角度および反対の角度を成す方向に沿って光を投入するステップとを含む。方法は、投入ステップによる光を、顕微鏡を用いてイメージングするステップを含む。方法は、追加としてまたは代替として、光を投入するステップによる光は、蛍光を含んでよい。方法は、追加としてまたは代替として、光を投入するステップは、スラブ状試料内に最大強度の単一の線形領域が形成してよい。方法は、追加としてまたは代替として、光を投入するステップによる光を、光センサを用いてサンプリングする間に、線形領域をその主軸に対して垂直に走査することによって、スラブ状試料の平らなセグメントをトレースするステップを含んでよい。
【００９１】
方法は、追加としてまたは代替として、センサは、カメラを含んでよい。方法は、追加としてまたは代替として、イメージングするステップは、光を投入するステップによる光を、顕微鏡を介して受光するステップを含んでよい。方法は、追加としてまたは代替として、検出用対物レンズは、顕微鏡の対物レンズであることを含んでよい。
【００９２】
方法は、追加としてまたは代替として、光を投入するステップによる光を、光センサを用いてサンプリングする間に、線形領域をその主軸に対して垂直に走査することによって、スラブ状試料の表面に平行なスラブ状試料の平らなセグメントをトレースするステップを含んでよい。  いくつかの実施形態によれば、本開示は、光シートを形成し、光シートが交差することにより、試料領域において照明された交線が形成されるよう光シートのそれぞれを導くよう配置された２つの励起光学素子を有する顕微鏡を含む。光シートは、少なくとも７５度の角度を成す主平面を有する。検出光学素子は、光学軸が光シートの主平面との角度と等しい角度を成すよう、励起光学素子に対して配置される。
【００９３】
顕微鏡の変形例では、少なくとも２つの励起光学素子は、対物レンズを含む。顕微鏡のさらなる変形例では、少なくとも２つの励起光学素子は、対物レンズを含み、これらの対物レンズのそれぞれは、シートビームを対物レンズの側部から出現させる可変部分ビームブロックを有する。顕微鏡のさらなる変形例では、少なくとも２つの励起光学素子は、ＧＲＩＮレンズを含む。顕微鏡のさらなる変形例では、少なくとも２つの励起光学素子は、照明された交線が試料領域を横切るように配置された走査光学素子を含む。顕微鏡のさらなる変形例では、少なくとも２つの励起光学素子は、照明された交線が、検出光学素子の焦点面に沿って試料領域を横切るように配置された走査光学素子を含む。顕微鏡のさらなる変形例では、移動システムが設けられ、コントローラは、走査構成部品を制御し、試料領域を連続的に検出することによってスライス画像を形成する。
【００９４】
いくつかの実施形態によれば、本開示は、顕微鏡を含む。第１および第２のイメージング構成部品のそれぞれは、イメージング用対物レンズと、第１および第２の光シートプロジェクタとを有する。第１および第２の光シートプロジェクタは、試料領域の第１および第２のイメージング構成部品と同じ側にそれぞれ配置される。イメージング用対物レンズ、および、光シートプロジェクタのそれぞれは、試料領域で交差する軸を有する。試料支持体は、試料領域で試料を保持するよう位置決めされる。各光シートプロジェクタは、光シートのビームウエストの軸位置を選択し、光シートの伝搬方向に垂直な軸に沿って光シートの位置を選択することを可能にする光走査・合焦光学部品を有する。コントローラは、各光シートプロジェクタのビームウエストをそれぞれの線形経路に沿って別々に移動させるよう、光走査・合焦光学部品を制御するために接続される。
【００９５】
いくつかの変形例では、イメージング用対物レンズの光学軸は、線形経路のそれぞれに垂直である。いくつかの変形例では、イメージング用対物レンズの光学軸は、線形経路の両方に対して垂直である。いくつかの変形例では、光走査・合焦光学部品は、電気式焦点可変レンズ（ＥＴＬ）を含む。いくつかの変形例では、試料支持体は、スラブ形状の試料を保持するために略平坦要素に成形される。上記モジュール、プロセス、システム、および、セクションは、ハードウェア、ソフトウェアによってプログラムされたハードウェア、非一時的コンピュータ可読媒体に記憶されたソフトウェア命令、または、それらの組み合わせで実装され得る。例えば、三次元光学画像をキャプチャする方法は、例えば、非一時的コンピュータ可読媒体に記憶された一連のプログラム命令を実行するプロセッサを用いて実装され得る。例えば、プロセッサは、これに限定されないが、パソコンもしくはワークステーション、または、プロセッサ、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラデバイスを含むか、または、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）などの集積回路を含む制御ロジックからなる他のコンピューティングシステムを含み得る。命令は、Ｊａｖａ、Ｃ＋＋、Ｃ＃．ｎｅｔなどのプログラミング言語に従って提供されるソースコード命令からコンパイルされ得る。また、命令は、例えば、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ（登録商標）言語、ＬａｂＶＩＥＷ、または、他の構造化もしくはオブジェクト指向プログラム言語に従って提供されるコードおよびデータオブジェクトを含み得る。一連のプログラム命令、および、それに関連するデータは、例えば、これらに限定されないが、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、プログラマブル・リードオンリーメモリ（ＰＲＯＭ）、電気的消去可能ＰＲＯＭ（ＥＥＰＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、フラッシュメモリ、ディスクドライブなどの任意の適切なメモリ装置であり得るコンピュータメモリまたは記憶装置などの非一時的コンピュータ可読媒体に記憶され得る。
【００９６】
さらに、モジュール、プロセッサ、システム、および、セクションは、シングルプロセッサ、または、分散プロセッサとして実装され得る。さらに、上記ステップは、シングルプロセッサまたは分散プロセッサ（シングルコアおよび／またはマルチコアプロセッサ）で実行されてよい。また、上記実施形態およびそのさまざまな図面で説明されたプロセス、モジュール、および、サブモジュールは、複数のコンピュータもしくはシステムに分散されるか、または、シングルプロセッサまたはシステム内に配置されてよい。本願明細書に記載されるモジュール、セクション、システム、手段、または、プロセスを実装するのに適した構造的実施形態の代替物の例を以下に挙げる。
【００９７】
上記モジュール、プロセッサ、または、システムは、プログラムされた汎用コンピュータ、マイクロコードによりプログラムされた電子デバイス、ハードワイヤードのアナログ論理回路、コンピュータ可読媒体または信号に格納されたソフトウェア、光学コンピューティングデバイス、電子および／または光学デバイスのネットワークシステム、特殊用途コンピューティングデバイス、集積回路デバイス、半導体チップ、および、例えば、コンピュータ可読媒体または信号に格納されたソフトウェアモジュールまたはオブジェクトとして実装されてよい。
【００９８】
方法およびシステム（またはそのサブコンポーネントもしくはモジュール）は、汎用コンピュータ、専用コンピュータ、プログラムされたマイクロコンピュータもしくはマイクロコントローラ、周辺集積回路素子、ＡＳＩＣもしくは他の集積回路、デジタル信号プロセッサ、分散素子回路などのハードワイヤードの電子または論理回路、および、プログラム可能論理デバイス（ＰＬＤ）、プログラマブルロジックアレイ（ＰＬＡ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、プログラマブルアレイロジック（ＰＡＬ）デバイスなどのプログラムされた論理回路に実装されてよい。一般に、本願明細書に記載の機能またはステップを実装可能なプロセスは、方法、システム、または、コンピュータプログラム製品（非一時的コンピュータ可読媒体に記憶されたソフトウエアプログラム）の実施形態を実行するために用いられ得る。
【００９９】
さらに、開示された方法、システム、および、コンピュータプログラム製品の実施形態は、例えば、さまざまなコンピュータプラットフォームで用いられ得るポータブルソースコードを提供するオブジェクト、または、オブジェクト指向ソフトウェアの開発環境を用いたソフトウェアに全体的にまたは部分的に容易に実装され得る。あるいは、開示された方法、システム、および、コンピュータプログラム製品の実施形態は、例えば、標準的な論理回路設計、または、超大規模集積回路（ＶＬＳＩ）設計を用いたハードウェアに全体的にまたは部分的に実装され得る。システムの速度および／または効率要求、特定の機能、および／または、利用されている特定のソフトウェアもしくはハードウェアシステム、マイクロプロセッサ、または、マイクロコンピュータに基づき、他のハードウェアもしくはソフトウェアが実施形態を実行するために用いられ得る。方法、システム、および、コンピュータプログラム製品の実施形態は、周知の、または、本願明細書中に記載された機能に基づき、当業者によって今後開発されるシステムもしくは構造、デバイスおよび／またはソフトウェアを用いて、運動学的設計、光学、顕微鏡学、および／または、コンピュータプログラミング技術の一般的な基礎知識によってハードウェアおよび／またはソフトウェアに実装され得る。
【０１００】
さらに、本開示の方法、システム、および、コンピュータプログラム製品は、プログラムされた汎用コンピュータ、専用コンピュータ、マイクロプロセッサなどで実行されるソフトウェアに実装され得る。
【０１０１】
このように、本開示によれば、光学イメージングシステム、デバイス、および、方法が提供される。本開示では多くの代替、変更、修正が可能である。開示された実施形態の特徴を本発明の範囲内で組み合わせる、位置を変える、除外するなどして追加の実施形態とすることも可能である。さらに、他の特徴の使用とは対応させずに特定の特徴が効果的に用いられることもある。したがって、出願人は、すべての変更、修正、等価物、変形例は、本発明の趣旨および範囲内であることを意図する。
【図１Ａ】
2020502558.tif 000008
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【国際調査報告】
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