(57)【要約】  本発明は、ロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイド結合活性を示し、かつ未改変コバーシンポリペプチドと比べて減少したＣ５結合性を示す、またはＣ５結合性を示さない改変コバーシンポリペプチド；前記改変コバーシンポリペプチドをコードする核酸分子；前記核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞；ならびに対象におけるロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイドによって媒介される疾患または症状を治療または予防する方法であって、前記改変ポリペプチドまたは核酸を対象に投与することを含む方法を対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイド結合活性を示し、かつ減少したＣ５結合性を示すか、またはＣ５結合性を示さない改変コバーシンポリペプチドであって、前記改変コバーシンポリペプチドが、配列番号３において１〜３０のアミノ酸置換がなされた配列を含み、ここで
（ｉ）配列番号３の１１４〜１２４位に以下の置換（ａ）〜（ｊ）の１または２以上がなされている：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；
ｂ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；
ｃ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＰｒｏで置換されている；
ｄ．  Ａｓｐ１１８が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ  Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；
ｅ．  Ａｌａ１１９が、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
ｆ．  Ｇｌｙ１２０が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
ｇ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
ｈ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
ｉ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；
ｊ．  Ｖａｌ１２４が、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；または／および
（ｉｉ）配列番号３中のＡｌａ４４が、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
改変コバーシンポリペプチド、または改変コバーシンポリペプチドのＮ末端から最大で５つのアミノ酸が欠失されているその断片。
【請求項２】
（ｉ）配列番号３の１１４〜１２４位に以下の置換（ａ）〜（ｊ）の１または２以上がなされている：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｃ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒで置換されている；
ｄ．  Ａｓｐ１１８が、Ａｓｎで置換されている；
ｅ．  Ａｌａ１１９が、Ｇｌｙで置換されている；
ｆ．  Ｇｌｙ１２０が、Ｓｅｒで置換されている；
ｇ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａで置換されている；
ｈ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている；
ｉ．  Ｇｌｕ１２３が、ＡｓｐまたはＡｌａで置換されている；
ｊ．  Ｖａｌ１２４が、Ｌｙｓで置換されている；または／および
（ｉｉ）配列番号３中のＡｌａ４４が、Ａｓｎ４４で置換されている、
請求項１に記載の改変コバーシンポリペプチド、または改変コバーシンポリペプチドのＮ末端から最大で５つのアミノ酸が欠失されているその断片。
【請求項３】
配列番号３の１１４〜１２４位に置換（ａ）〜（ｊ）の１または２以上が存在する、請求項１または２に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項４】
置換（ａ）〜（ｊ）の２以上が存在する、請求項３に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項５】
置換（ａ）〜（ｊ）の５以上が存在する、請求項４に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項６】
置換（ａ）〜（ｊ）のそれぞれが存在し、必要に応じて、Ｔｒｐ１１５が置換されていない、請求項５に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項７】
請求項２に記載の置換（ａ）〜（ｊ）のそれぞれが存在し、必要に応じて、Ｔｒｐ１１５が、置換されていない、請求項５に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項８】
Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐで置換されている、請求項７に記載の改変ポリペプチドまたはその断片。
【請求項９】
配列番号１０に示される、配列番号３のアミノ酸位置１１４〜１２４間のループ配列を有し、配列番号５に示される置換以外に、配列番号３と比較して１〜１５の追加的な置換を有する、請求項１から８のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項１０】
配列番号５に示される置換以外に、配列番号３と比較して２〜１０の追加的な置換を有する、請求項９に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項１１】
配列番号５に示される置換以外に、配列番号３と比較して３〜５の追加的な置換を有する、請求項９または１０に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項１２】
配列番号５からなるまたはそれを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチド。
【請求項１３】
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＰｒｏ、好ましくはＳｅｒで置換されている；
ｃ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｌａで置換されている；
ｄ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｓｐで置換されている；および
ｅ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＡｌａまたはＡｓｐで置換されている、
請求項１から５のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項１４】
配列番号３の１１４〜１２４位において
ａ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒで置換されている；
ｃ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａで置換されている；
ｄ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている；および
ｅ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｌａで置換されている、
請求項１３に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項１５】
Ｔｒｐ１１５が置換されていない、請求項１３または１４に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項１６】
Ｍｅｔ１１４、Ｔｒｐ１１５、Ａｓｐ１１８、Ａｌａ１１９、Ｇｌｙ１２０およびＶａｌ１２４が置換されていない、請求項１３、１４または１５に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項１７】
配列番号１１に示される、配列番号３のアミノ酸位置１１４〜１２４間のループ配列を有し、配列番号６に示される置換以外に、配列番号３と比較して１〜２０の追加的な置換を有する、請求項１から５または１３から１６のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項１８】
配列番号６に示される置換以外に、配列番号３と比較して２〜１５の追加的な置換を有する、請求項１７に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項１９】
配列番号６に示される置換以外に、配列番号３と比較して３〜１０の追加的な置換を有する、請求項１７または１８に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項２０】
配列番号６からなるまたはそれを含む、請求項１から５または１３から１６のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチド。
【請求項２１】
ａ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎで置換されており；
ｂ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｓｐで置換されている、
請求項１から４のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項２２】
ａ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されており；
ｂ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている、
請求項２１に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項２３】
Ｔｒｐ１１５が置換されていない、請求項２１または２２に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項２４】
Ｍｅｔ１１４、Ｔｒｐ１１５、Ｌｅｕ１１７、Ａｓｐ１１８、Ａｌａ１１９、Ｇｌｙ１２０、Ｇｌｙ１２１、Ｇｌｕ１２３およびＶａｌ１２４が置換されていない、
請求項２１、２２または２３に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項２５】
配列番号１２に示される、配列番号３のアミノ酸位置１１４から１２４間のループ配列を有し、配列番号７に示される置換以外に、配列番号３と比較して１〜２５の追加的な置換を有する、請求項１から４または２１から２４のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項２６】
配列番号７に示される置換以外に、配列番号３と比較して２〜１２の追加的な置換を有する、請求項２５に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項２７】
配列番号７に示される置換以外に、配列番号３と比較して３〜１５の追加的な置換を有する、請求項２５または２６に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項２８】
配列番号７からなるまたはそれを含む、請求項１から４または２１から２４のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチド。
【請求項２９】
配列番号３中のＡｌａ４４が、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている、請求項１から１１または１３から２８のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項３０】
配列番号３中のＡｌａ４４がＡｓｎで置換されている、請求項２９に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項３１】
配列番号３中のＡｓｐ１４９が、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている、請求項１から１１または１３から３０のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項３２】
配列番号３中のＡｌａ４４がＡｓｎで置換されており、配列番号３中のＡｓｐ１４９がＧｌｙで置換されている、請求項３０または３１に記載の改変コバーシンポリペプチド。
【請求項３３】
配列番号３の６、３８、１００、１２８、１２９、１５０位の６つのシステインアミノ酸が、未改変形態で保持されている、前記請求項のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項３４】
Ａｓｎ６０およびＡｓｎ８４が、それぞれＧｌｎで置換されている、請求項１から１１、１３から１９または２１から２７のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチド。
【請求項３５】
以下のアミノ酸：Ｐｈｅ１８、Ｔｙｒ２５、Ａｒｇ３６、Ｌｅｕ３９、Ｇｌｙ４１、Ｐｒｏ４３、Ｌｅｕ５２、Ｖａｌ５４、Ｍｅｔ５６、Ｐｈｅ５８、Ｔｈｒ６７、Ｔｒｐ６９、Ｐｈｅ７１、Ｇｌｎ８７、Ａｒｇ８９、Ｈｉｓ９９、Ｈｉｓ１０１、Ａｓｐ１０３、およびＴｒｐ１１５の１または２以上が置換されていない、前記請求項のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項３６】
以下のアミノ酸：Ｐｈｅ１８、Ｔｙｒ２５、Ａｒｇ３６、Ｌｅｕ３９、Ｇｌｙ４１、Ｐｒｏ４３、Ｌｅｕ５２、Ｖａｌ５４、Ｍｅｔ５６、Ｐｈｅ５８、Ｔｈｒ６７、Ｔｒｐ６９、Ｐｈｅ７１、Ｇｌｎ８７、Ａｒｇ８９、Ｈｉｓ９９、Ｈｉｓ１０１、Ａｓｐ１０３、およびＴｒｐ１１５の全てが置換されていない、請求項３５に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項３７】
ａ．  配列番号３中のアミノ酸５、６、１１、１３〜１５、２０〜２１、２４〜２７、２９〜３２、３５〜４１、４５、４７〜４８、５０、５２〜６０、６４、６６、６９〜８１、８３、８４、８６、９０〜９４、９７〜１０４、１１２〜１１３、１１５、１２５〜１２９、１３２〜１３９、１４５、１４８、および１５０のどれも置換されていない；または
ｂ．  配列番号３中のアミノ酸５、６、１１、１３〜１５、１８、２０〜２１、２４〜２７、２９〜３２、３５〜４１、４３、４５、４７〜４８、５０、５２〜６０、６４、６６、６７、６９〜８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０〜９４、９７〜１０４、１１２〜１１３、１１５、１２５〜１２９、１３２〜１３９、１４５、１４８、および１５０のどれも置換されていない；または
ｃ．  配列番号３中のアミノ酸５、６、１１、１３〜１５、１８、２０〜２１、２４〜２５、２７、３０〜３２、３５〜４１、４３、４７〜４８、５０、５２〜６０、６４、６６、６７、６９〜８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０〜９４、９８、１００、１０２〜１０４、１１２〜１１３、１１５、１２６、１２８〜１２９、１３２〜１３９、１４５、１４８、および１５０のどれも置換されていない、
請求項１から３６のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項３８】
配列番号８の配列を含むまたはそれからなる、請求項１または２に記載の改変コバーシンポリペプチド。
【請求項３９】
ＬＴＢ４に結合する、前記請求項のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドまたはその断片。
【請求項４０】
１または２以上のペプチドまたはポリペプチドと遺伝的または化学的に融合されている、請求項１から３９のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドを含む融合タンパク質。
【請求項４１】
ＰＡＳ配列を含む、請求項４０に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
改変コバーシンポリペプチドのＮ末端に融合された、配列番号１３の３０コピーからなるＰＡＳ配列を含む、請求項４０または４１に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
前記融合タンパク質が、（ａ）配列番号１３の３０コピーからなるＰＡＳ配列および（ｂ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸１９〜１６８を含み、（ａ）が、（ｂ）のＮ末端に融合されている、請求項４０または４１に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
請求項１から３９のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドもしくはその断片または請求項４０から４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項４５】
請求項４４に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項４６】
請求項４４に記載の核酸分子または請求項４５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項４７】
請求項１から３９のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチドもしくはその断片、または請求項４０から４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質を調製する方法であって、請求項４６に記載の宿主細胞を前記タンパク質が発現する条件で培養すること、およびそのように産生された前記タンパク質を回収することを含む方法。
【請求項４８】
請求項１から３９のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチド、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項４４に記載の核酸分子を、薬学的に許容される担体と共に含む組成物。
【請求項４９】
治療における使用のための、請求項１から３９のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチド、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４４に記載の核酸分子、または請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
ロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイドによって媒介される疾患または症状の治療における使用のための、請求項１から３９のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチド、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４４に記載の核酸分子、または請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
対象におけるロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイドによって媒介される疾患または症状を治療または予防する方法であって、前記対象に、請求項１から３９のいずれか一項に記載の改変コバーシンポリペプチド、請求項４０から４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質、請求項４４に記載の核酸分子、または請求項４８に記載の組成物を投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エイコサノイドによって媒介される疾患および症状（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）の治療に有用な組成物、特に、ロイコトリエンおよびヒドロキシエイコサノイド、特にＬＴＢ４によって媒介される疾患および症状の治療のためのロイコトリエン／ヒドロキシエイコサノイド（ＬＫ／Ｅ）結合活性を有する改変マダニ由来化合物に関する。
【背景技術】
【０００２】
エイコサノイドは、炭素数２０の脂肪酸であるアラキドン酸（ＡＡ）から３つの主要酵素経路：シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）、リポキシゲナーゼ（ＬＯ）、およびチトクロームＰ４５０モノオキシゲナーゼ（ＣＹＰ４５０）を経由して誘導される、酸化生物学的活性脂質メディエーターのファミリーである。エイコサノイドには、ＣＯＸ経路由来のプロスタノイド（プロスタグランジン、ＰＧ、およびトロンボキサン、ＴＸＢを含む）、ＬＯ経路由来のロイコトリエン（ＬＫ）ならびにＬＯおよびＰ４５０モノオキシゲナーゼ経路由来のヒドロキシエイコサテトラエン酸（ＨＥＴＥ）およびエポキシエイコサトリエン酸（ＥＥＴ）が含まれる（Ｃｕｒｔｉｓ−Ｐｒｉｏｒ、２００４；Ｐｅｔｅｒｓ−Ｇｏｌｄｅｎ  ＆  Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  Ｊｒ．、２００７）。エイコサノイドは、多種多様な細胞型および器官に対する多数の効果を媒介する。これらの効果には、血管緊張ならびに毛細血管および細静脈の透過性の調節（ＰＧ、ＴＢＸ、ＬＫ）、筋肉の収縮または弛緩（ＰＧ、ＴＢＸ、システイニルＬＫ）、血小板機能の刺激または阻害（ＴＢＸ、ＰＧ、ＬＫ）、腎血流および無機質代謝の調節（Ｉｍｉｇ、２０００；ＨａｏおよびＢｒｅｙｅｒ、２００７）、悪性細胞の増殖および／または蔓延の制御（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、２００５；Ａｙａ、２００６）、ならびに特に自己免疫および炎症症状における白血球の活性化（ＬＫ、ＨＥＴＥ）（Ｓａｍｕｅｌｓｓｏｎ、１９８３；Ｋｉｍ  ＆  Ｌｕｓｔｅｒ、２００７）が含まれる。
【０００３】
ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）は、記載された、最も強力な走化性および化学運動性のエイコサノイドであり、インテグリンのアップレギュレーションを介して好中球の血管内皮への接着を促進する（Ｈｏｏｖｅｒら、１９８４）。ＬＴＢ４は、また、好中球に関する完全な分泌促進物質であり、その凝集を誘導し、微小血管透過性を増加させる。ＬＴＢ４は、ナチュラルキラー細胞、単球および好酸球を動員および活性化する。ＬＴＢ４は、スーパーオキシドラジカルの形成を増加させ（ＨａｒｒｉｓｏｎおよびＭｕｒｐｈｙ、１９９５）、組織の炎症を増強および延長するおそれがある、いくつかの炎症性サイトカインおよびメディエーターの産生を含む遺伝子発現をモジュレートする（Ｆｏｒｄ−Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ、１９９０；Ｓｈｏｗｅｌｌら、１９９５）。ＬＴＢ４は、また、適応免疫応答の誘導および管理において役割を果たす。例えば、流入領域リンパ節への樹状細胞の輸送の調節（Ｋｌａａｓら、２００５；Ｄｅｌ  Ｐｒｅｔｅら、２００７）、肺Ｔ細胞からのＴｈ２サイトカインＩＬ−１３の産生（Ｍｉｙａｈａｒａら、２００６）、抗原特異的エフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞の動員（Ｔａｕｂｅら、２００６）ならびにヒトＢリンパ球の活性化および増殖（Ｙａｍａｏｋａら、１９８９）である。
【０００４】
ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４）およびヒドロキシエイコサノイドは、ＢＬＴ１およびＢＬＴ２  Ｇタンパク質共役受容体を介してその効果を媒介する（Ｙｏｋｏｍｉｚｏら、１９９７、２０００）。ヒトＢＬＴ１は、ＬＴＢ４に特異的な高親和性受容体であり（ＫＤ  ０．３９〜１．５ｎＭ；ＴａｇｅｒおよびＬｕｓｔｅｒ、２００３）、競合結合研究において２０−ヒドロキシＬＴＢ４および１２−エピＬＴＢ４だけがＬＴＢ４に代替しうる（Ｙｏｋｏｍｉｚｏら、２００１）。ヒトＢＬＴ２は、ＢＬＴ１と比較してＬＴＢ４に対して２０分の１の親和性（ＫＤ  ２３ｎＭ）を有し、１２−エピＬＴＢ４、２０−ヒドロキシＬＴＢ４、１２（Ｓ）−ＨＥＴＥ、１５（Ｓ）−ＨＥＴＥ、１２（Ｓ）−ＨＰＥＴＥおよび１５（Ｓ）−ＨＰＥＴＥを含む、より広範囲のエイコサノイドと結合することによって活性化される（Ｙｏｋｏｍｉｚｏら、２００１）。ヒトＢＬＴ２は、ヒトおよびマウスＢＬＴ１と４５．２および４４．６％のアミノ酸同一性を有するが、一方で、ヒトＢＬＴ２とマウスＢＬＴ２とは、９２．７％の同一性を有する（Ｙｏｋｏｍｉｚｏら、２０００）。
【０００５】
ヒトＢＬＴ１は、内皮細胞および血管平滑筋細胞で発現することが最近報告されたが、主として白血球の表面で発現する。ヒトＢＬＴ２は、より広範囲の組織および細胞型で発現する。ヒト好中球の活性化、血管外遊出およびアポトーシスを阻害し（ＫｉｍおよびＬｕｓｔｅｒ、２００７）、炎症性関節炎（Ｋｉｍら、２００６）および腎虚血再灌流（Ｎｏｉｒｉら、２０００）のマウスモデルにおいて好中球浸潤によって起きる症状を軽減する、ＢＬＴ１およびＢＬＴ２のいくつかの特異的アンタゴニストが記載されている。ＢＬＴ１およびＢＬＴ２のいずれも、ＬＴＢ４およびヒドロキシエイコサノイドを介して病的作用を媒介することができるが（Ｌｕｎｄｅｅｎら、２００６）、ＢＬＴ１が、マウスにおけるコラーゲン誘発関節炎などのいくつかの病状に疑いなく優位な役割を果たすことが、ますます多くの研究によって示されている（Ｓｈａｏら、２００６）。ＢＬＴ１−／−欠損マウスも、炎症応答において好中球の遊走を方向づけることにＢＬＴ１が重要であることを明らかにした。特に、５ＬＯ欠損マウス系統を使用して、好中球上のＢＬＴ１のオートクリン活性化が、関節炎を起こした関節への好中球の動員に必要であることが示された（Ｃｈｅｎら、２００６）。
【０００６】
Ｂ４イソロイコトリエンなどのＬＴＢ４の酸化異性誘導体も、生物学的に活性である（Ｈａｒｒｉｓｏｎら、１９９５）。ヒドロキシエイコサノイドのように、例えば５（Ｓ）−ＨＥＴＥは、好酸球に対する高度に強力な走化性因子である（ＰｏｗｅｌｌおよびＲｏｋａｃｈ、２００５）。ＬＴＡ４から誘導されるシステイニルＬＫは、気道を覆う平滑筋の収縮によって起きる気管支収縮；血管漏出によって起きる粘膜浮腫；粘液の分泌増加；および好酸球が豊富な炎症細胞浸潤物の存在を含む、喘息の病態生理と相関する（Ｂｉｓｇａａｒｄら、１９８５；Ｄｒａｚｅｎら、１９８８）。
【０００７】
いくつかの市販薬が、エイコサノイドを標的とする。これらには、ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）をモジュレートし、それにより、エイコサノイド前駆体ＡＡの放出を阻害するグルココルチコイド（Ｓｅｂａｌｄｔら、１９９０）、ならびにＰＧおよびＴＸＢの合成を防止する非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）および他のＣＯＸ２阻害剤が含まれる（Ｃｕｒｒｙら、２００５）。ＬＴＢ４合成に必要な５−ＬＯ酵素を阻害する（ジロートン；Ｄｕｂｅら、１９９８）か、またはシステイニルロイコトリエンの効果を媒介するＣｙｓＬＴ１受容体と拮抗する（ザフィルルカストおよびモンテルカスト）（ＳｈａｒｍａおよびＭｏｈａｍｍｅｄ、２００６）、いくつかのＬＫ調節物質もある。ＬＫ調節物質は、経口的に利用可能であり、例えば喘息の治療に使用するためにＦＤＡによって承認されている。ＬＴＢ４またはその受容体に特異的に作用する薬物は、まだ販売されていない。
【０００８】
ＷＯ２００４／１０６３６９は、補体成分Ｃ５に直接結合することによって古典的補体経路、レクチン補体経路および第二補体経路のいずれも阻害するヒメダニ由来補体（Ｃ）阻害剤コバーシンを記載している（Ｎｕｎｎら、２００５）。コバーシンは、吸血節足動物の唾液腺から得られる。コバーシンは、治療可能性も証明されている（Ｈｅｐｂｕｒｎら、２００７）。コバーシンは、ヒトを含む広範囲な哺乳動物種において補体（Ｃ）成分５（Ｃ５）のＣ介在性活性化を防止する（Ｂａｒｒａｔｔ−Ｄｕｅ、Ａ．ら（２０１１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８７、４９１３〜４９１９））。ＣＵＢ、Ｃ５ｄおよびＣ５−Ｃ３４５Ｃ  Ｃ５ドメインに直接結合することによって、コバーシンは、Ｃ５補体コンバターゼによるＣ５開裂を防止し、それにより、アナフィラトキシンＣ５ａの放出および補体成分Ｃ５ｂ−９複合体を含む膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成の中核となるＣ５ｂの形成を防止する（例えば、Ｊｏｒｅら、２０１６を参照されたい）。コバーシンは、エイコサノイド、特にＬＫ、とりわけＬＴＢ４に結合し（Ｒｏｖｅｒｓｉ、Ｐ．ら、（２０１３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３、２８８：１８７８９〜１８８０２）、それらをタンパク質内に封入することも示されている。コバーシンは、ＬＴＢ４およびＣ５と同時に結合することができ、その結合部位は、コバーシンの対面に位置し、ＬＴＢ４結合ポケットは、Ｃ５−コバーシン複合体において完全にアクセス可能であることが、知られている（Ｊｏｒｅら、２０１６）。
【発明の概要】
【０００９】
コバーシンポリペプチドは、そのＣ５結合活性（したがって、その補体阻害剤活性）を減少または除去する一方で、ロイコトリエン／ヒドロキシエイコサノイド（ＬＫ／Ｅ）結合活性（例えばＬＴＢ４結合活性）を保持するように改変できることが見出されている。特に、本発明者らは、配列番号３を含むコバーシンポリペプチドを特定の残基で改変することで、Ｃ５結合性を減少または除去できることを示した。
【００１０】
したがって、本発明は、減少したＣ５結合性を示すか、またはＣ５結合性を示さないが、ＬＫ／Ｅに結合する、配列番号３を含むコバーシンポリペプチドの改変バージョン、およびこのような改変コバーシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。
【００１１】
このような改変コバーシンポリペプチド、またはこのような改変コバーシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ＬＫ／Ｅ阻害剤として作用し、ＬＫ／Ｅによって媒介される疾患および症状の予防および治療に使用することができる。これらの改変分子は、減少したＣ５結合性を示すか、またはＣ５結合性を示さず、その結果、Ｃ５コンバターゼ阻害が減少、またはＣ５コンバターゼ阻害がなく、補体活性への干渉が減少、または干渉がないであろうことが分かる。
【００１２】
本発明は、また、ロイコトリエン、特にＬＴＢ４およびヒドロキシエイコサノイドがその病理に関与することが示唆されている疾患の治療および予防における、本発明の改変コバーシンポリペプチドおよびコードするヌクレオチドの使用に関する。本発明の改変コバーシンポリペプチドは、ＬＫおよびヒドロキシエイコサノイドに結合し、それを包み込む（ｃａｇｅ）ことができる。これは、リガンドがＢＬＴ１受容体およびＢＬＴ２受容体の両方と相互作用することを防止する場合があり、両方の受容体を経由するシグナル伝達に依存することがしばしば示されている脂肪酸の炎症促進作用を緩和する。したがって、本発明の一態様により、ロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイドによって媒介される疾患または症状の治療のための、本発明の改変コバーシンポリペプチドおよびコードするヌクレオチドが、提供される。
【００１３】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、ロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイドによって媒介される疾患および症状の治療に使用され得る。本発明により治療できる疾患および障害の例には、接触過敏症、潰瘍性大腸炎、食道腺がん、膵臓腺がん、乳がん、ざ瘡、動脈瘤、歯周病、嚢胞性線維症、喘息、および細気管支炎が含まれる。
【００１４】
さらなる例には、好ましくは、アルファ−１アンチトリプシン疾患（ＡＡＴＤ）、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）、特発性肺疾患（ＩＰＤ）、重症持続性喘息、運動およびアスピリン誘発喘息、アレルギー性鼻炎、および珪肺症から選択される肺および気道の症状；好ましくは自己免疫性水疱症、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、乾癬、およびチャーグ−ストラウス症候群から選択される皮膚症状；好ましくは膵臓がん、卵巣がん、結腸がん、前立腺がん、肺がん、食道がん、およびがん転移から選択されるがん；自己免疫性ぶどう膜炎、アレルギー性結膜炎、および本出願で後記するその他の症状などの眼の症状が含まれる。関心対象となる他の一般的な全身症状には、関節リウマチ、骨破壊性関節炎、閉経後骨粗鬆症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、グッドパスチャー症候群および糸球体腎炎を含む血管炎、全身性硬化症、２型糖尿病、糖尿病性腎症、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、マラリア、外傷、心筋梗塞、閉塞性睡眠時無呼吸症候群、アテローム動脈硬化症、冠動脈形成術後の再狭窄、多発性硬化症（ＭＳ）、認知症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、および神経障害が含まれる。
【００１５】
最も好ましくは、本発明は、ＡＡＴＤ、ＣＯＰＤ、ＰＡＨ、喘息、例えば重症持続性喘息、ＧＶＨＤ、水疱形成皮膚疾患および乾癬の治療に使用される。
【００１６】
本発明の別の態様では、対象に、本発明による改変コバーシンポリペプチドまたは改変コバーシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの治療有効量を投与することを含む、ロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイドによって媒介される疾患または症状を、その治療または予防を必要とする対象において治療または予防する方法が提供される。
【００１７】
本発明のさらなる態様では、改変コバーシンポリペプチドおよび脂肪酸を含む組成物が、提供される。脂肪酸は、好ましくは治療用脂肪酸であり、個体への送達のために提供される。
【００１８】
本発明のさらなる態様では、ＰＡＳ配列および本発明の改変コバーシンポリペプチドを含む融合タンパク質が、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】補体活性化の古典的経路および第二経路の模式図を示す。酵素成分は、濃い灰色。アナフィラトキシンを星形で囲む。
【図１Ｂ】エイコサノイド経路の模式図を示す。
【図２Ａ】コバーシンの一次配列を示す図である。シグナル配列に下線を付ける。システイン残基を太字で示す。ヌクレオチド番号およびアミノ酸番号を右に示す。
【図２Ｂ】コバーシンバリアントの例を示す図である。
【図３】大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から発現および精製したコバーシン野生型（レーン１）、コバーシンバリアント１（レーン２）およびコバーシンバリアント２（レーン３）の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図である。
【図４Ａ】Ｃ５に結合する野生型コバーシンおよびコバーシンバリアント１およびコバーシンバリアント２についての表面プラズモン共鳴のトレースを示す図である。
【図４Ｂ】Ｃ５に結合する野生型コバーシンおよびコバーシンバリアント１およびコバーシンバリアント２のＰＡＳ化（ＰＡＳｙｌａｔｅｄ）バージョンについての表面プラズモン共鳴のトレースを示す図である。
【図５Ａ】ＬＴＢ４に結合する、様々な濃度での、野生型コバーシンおよびコバーシンバリアント１およびコバーシンバリアント２についての蛍光滴定曲線を示す図である。
【図５Ｂ−１】ＬＴＢ４に結合する、様々な濃度での、野生型コバーシンおよびコバーシンバリアント１およびコバーシンバリアント２のＰＡＳ化バージョンについての蛍光滴定曲線を示す図である。
【図５Ｂ−２】ＬＴＢ４に結合する、様々な濃度での、野生型コバーシンおよびコバーシンバリアント１およびコバーシンバリアント２のＰＡＳ化バージョンについての蛍光滴定曲線を示す図である。
【図６】円二色性分光法により測定したときの野生型コバーシンならびにコバーシンバリアント１および２についての熱変性曲線を示す図である。各タンパク質の融解温度に関する値の表も示す。
【図７】ＣＨ５０アッセイによって測定したときのＣ５介在性ヒツジ赤血球溶解に対する野生型コバーシンならびにコバーシンバリアント１および２の作用を示す図である。図７に示すこのアッセイの結果は、野生型コバーシンならびにバリアント１および２がＣ５を阻害する能力の間接的尺度として使用される。
【図８】喘息のマウスモデルの気管支肺胞洗浄液および肺中の好酸球数および好中球数に対するＬ−コバーシンの作用を示す図である。Ｌ−コバーシンの投与前に喘息マウスをチリダニ（ＨＤＭ）に曝露した。対照群のマウスにＨＤＭ曝露の代わりにリン酸緩衝食塩水を導入した。
【図９Ａ】ＥＢＡのマウスモデルに対する長時間作用型Ｌ−コバーシン（ＰＡＳ−Ｌ−コバーシン）の作用を示す図である（Ａ：実験１）。
【図９Ｂ】ＥＢＡのマウスモデルに対する長時間作用型Ｌ−コバーシン（ＰＡＳ−Ｌ−コバーシン）の作用を示す図である（Ｂ：実験２）。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
配列の説明
配列番号１は、Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｍｏｕｂａｔａのコバーシンのポリヌクレオチド配列である。
配列番号２は、Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｍｏｕｂａｔａのコバーシンのアミノ酸配列（すなわち、アミノ酸１〜１６８）である。配列は、アミノ酸１３２〜１４２のベータＨとアルファ２との間のループを特徴とする。
配列番号３は、配列番号２に示されるアミノ酸１９〜１６８のアミノ酸配列であり、シグナル配列である、配列番号２のタンパク質の最初の１８アミノ酸の配列を有さないＯｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｍｏｕｂａｔａのコバーシンのアミノ酸配列である。配列は、アミノ酸１１４〜１２４のベータＨとアルファ２との間のループを特徴とする。
配列番号４は、配列番号３のポリヌクレオチド配列である。
配列番号５は、配列番号３が、Ｍｅｔ１１４をＧｌｎに、Ｍｅｔ１１６をＧｌｎに、Ｌｅｕ１１７をＳｅｒに、Ａｓｐ１１８をＡｓｎに、Ａｌａ１１９をＧｌｙに、Ｇｌｙ１２０をＳｅｒに、Ｇｌｙ１２１をＡｌａに、Ｌｅｕ１２２をＡｓｐに、Ｇｌｕ１２３をＡｓｐにおよびＶａｌ１２４をＬｙｓに変更するように改変された、本発明による改変コバーシンのアミノ酸配列である。（コバーシンバリアント１）
配列番号６は、配列番号３が、Ａｌａ４４をＡｓｎに、Ｍｅｔ１１６をＧｌｎに、Ｌｅｕ１１７をＳｅｒに、Ｇｌｙ１２１をＡｌａに、Ｌｅｕ１２２をＡｓｐに、Ｇｌｕ１２３をＡｌａにおよびＡｓｐ１４９をＧｌｙに変更するように改変された、本発明による改変コバーシンのアミノ酸配列である。（コバーシンバリアント２）
配列番号７は、Ａｌａ４４をＡｓｎに、Ｍｅｔ１１６をＧｌｎに、Ｌｅｕ１２２をＡｓｐにおよびＡｓｐ１４９をＧｌｙに変更するように改変された、本発明による改変コバーシンのアミノ酸配列である。（コバーシンバリアント３）
配列番号８は、Ａｌａ４４をＡｓｎに変更するように改変された、本発明による改変コバーシンのアミノ酸配列である。（コバーシンバリアント４）
配列番号９は、配列番号３のアミノ酸位置１１４〜１２４（配列番号２のアミノ酸位置１３２〜１４２）のベータＨとアルファ２との間のループのアミノ酸配列である。
配列番号１０は、コバーシンバリアント１における配列番号３（配列番号５）のアミノ酸位置１１４〜１２４のベータＨとアルファ２との間のループのアミノ酸配列である。
配列番号１１は、コバーシンバリアント２における配列番号３（配列番号６）のアミノ酸位置１１４〜１２４のベータＨとアルファ２との間のループのアミノ酸配列である。
配列番号１２は、コバーシンバリアント３における配列番号３（配列番号７）のアミノ酸位置１１４〜１２４のベータＨとアルファ２との間のループのアミノ酸配列である。
配列番号１３〜１９は、ＰＡＳ配列である。
【００２１】
発明の詳細な説明
一態様では、本発明は、ロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイド結合活性を示し、かつ減少したＣ５結合性を示すか、またはＣ５結合性を示さない改変コバーシンポリペプチドであって、前記改変コバーシンポリペプチドが、配列番号３において１〜３０のアミノ酸置換がなされた配列を含み、ここで
（ｉ）配列番号３の１１４〜１２４位に以下の置換（ａ）〜（ｊ）の１または２以上がなされている：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；
ｂ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；
ｃ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＰｒｏで置換されている；
ｄ．  Ａｓｐ１１８が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；
ｅ．  Ａｌａ１１９が、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
ｆ．  Ｇｌｙ１２０が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
ｇ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
ｈ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
ｉ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；
ｊ．  Ｖａｌ１２４が、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されている；または／および
（ｉｉ）配列番号３中のＡｌａ４４が、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されている；
改変コバーシンポリペプチド、または改変コバーシンポリペプチドのＮ末端から最大で５つのアミノ酸が欠失されているその断片を提供する。
【００２２】
本発明による改変コバーシンポリペプチドまたはその断片を含む融合タンパク質も、提供される。
【００２３】
本発明による改変コバーシンポリペプチドまたはその断片をコードする核酸分子、ならびに本発明による核酸分子を含むベクターおよび本発明による核酸分子または本発明によるベクターを含む宿主細胞も、提供される。
【００２４】
本発明による改変コバーシンポリペプチドもしくはその断片、または本発明による融合タンパク質を調製する方法であって、前記タンパク質が発現する条件で本発明による宿主細胞を培養すること、およびそのように産生された前記タンパク質を回収することを含む方法も、提供される。
【００２５】
本発明による改変コバーシンポリペプチド、本発明による融合タンパク質、または本発明による核酸分子を薬学的に許容される担体と共に含む組成物も、提供される。
【００２６】
治療における使用のための、本発明による改変コバーシンポリペプチド、本発明による融合タンパク質、本発明による核酸分子または本発明による組成物が、さらに提供される。
【００２７】
ロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイドによって媒介される疾患または症状の治療における使用のための、本発明による改変コバーシンポリペプチド、本発明による融合タンパク質、本発明による核酸分子または本発明による組成物も提供され、対象におけるロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイドによって媒介される疾患または症状を治療または予防する方法であって、本発明により前記対象に本発明による融合タンパク質、本発明による核酸分子または本発明による組成物を投与することを含む方法も、同様である。
【００２８】
一態様では、本発明は、ロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイドによって媒介される疾患または症状の治療のための改変コバーシンポリペプチドまたは前記改変コバーシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００２９】
改変コバーシンポリペプチド
本発明の改変コバーシンポリペプチドは、Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｍｏｕｂａｔａの唾液から単離されたマダニ由来補体阻害剤に基づく。このタンパク質は、最初にマダニの唾液腺から単離されたが、古典的補体経路および第二補体経路ならびにロイコトリエンおよびヒドロキシエイコサノイド（特にＬＴＢ４）を阻害することが見出されている。このタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２に示される。一部の実施形態では、本発明による改変コバーシンポリペプチドは、配列番号２に示される完全配列の改変バージョンであり得る。
【００３０】
代替的な実施形態では、タンパク質配列の最初の１８アミノ酸（シグナル配列）を含まない形態のコバーシンポリペプチドが、提供される。したがって、本発明による改変コバーシンポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列のアミノ酸１９〜１６８である配列番号３の改変バージョンであり得る。
【００３１】
本出願全体にわたり、「改変コバーシンポリペプチド」への言及は、配列番号２または配列番号３のいずれかの改変バージョン、すなわち、配列番号２のＮ末端に見られる１８アミノ酸のシグナル配列を有するまたは有さないコバーシンポリペプチドへの言及と理解されたい。
【００３２】
配列番号３内の特定のアミノ酸が、配列番号３中のその位置番号への言及により定義される場合、このアミノ酸は、配列番号２中のその位置番号への言及によっても定義することができ、この番号は、配列番号２のＮ末端に１８アミノ酸のシグナル配列が存在するせいで、配列番号３よりも１８大きい。
【００３３】
本発明の改変コバーシンポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２または配列番号３における配列と１〜３０のアミノ酸だけ異なるが、未改変コバーシンポリペプチドで見られるようなＬＫ／Ｅ結合活性をある程度保持する。本発明の改変コバーシンポリペプチドは、また、配列番号２および配列番号３における未改変コバーシンポリペプチドと比較して、減少したＣ５結合性を示す、またはＣ５結合性を示さない。本明細書に使用されるＬＫ／Ｅ結合活性は、ＬＴＢ４、Ｂ４イソロイコトリエンおよびその任意のヒドロキシル化誘導体、ＨＥＴＥ、ＨＰＥＴＥならびにＥＥＴを含むが、それに限定されないロイコトリエンおよびヒドロキシエイコサノイドに結合する能力を表す。ＬＴＢ４結合性が、特に関心対象である。
【００３４】
本発明の改変コバーシンポリペプチドは、下の説明により改変された配列番号２もしくは３からなるか、または下の説明により改変された配列番号２もしくは３を含み得る。
【００３５】
配列番号２および配列番号３における未改変コバーシンポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸位置１１４〜１２４（配列番号２のアミノ酸位置１３２〜１４２）のベータＨとアルファ２との間のループを特徴とする。このループは、以下に示される配列を有する：
−Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−      （配列番号９）
最初のＭｅｔは、配列番号３の１１４位および配列番号２の１３２位にある。
【００３６】
本発明の一態様では、配列番号２または配列番号３におけるコバーシンポリペプチドは、配列番号３の１１４〜１２４位に以下の置換（ａ）〜（ｊ）：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎまたはＡｌａで置換されている；
ｂ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎまたはＡｌａで置換されている；
ｃ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＰｒｏ、好ましくはＳｅｒまたはＡｌａで置換されている；
ｄ．  Ａｓｐ１１８が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ  Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＡｓｎで置換されている；
ｅ．  Ａｌａ１１９が、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＧｌｙまたはＡｓｎで置換されている；
ｆ．  Ｇｌｙ１２０が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＳｅｒまたはＡｓｎで置換されている；
ｇ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｌａまたはＡｓｎで置換されている；
ｈ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｓｐまたはＡｌａで置換されている；
ｉ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＡｓｐ、Ａｌａ、ＧｌｎまたはＡｓｎで置換されている；
ｊ．  Ｖａｌ１２４が、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＬｙｓまたはＡｌａで置換されている
の１または２以上がなされるように改変されている。
【００３７】
本発明の実施形態では、配列番号２または配列番号３におけるコバーシンポリペプチドは、配列番号３の１１４〜１２４位に以下の置換（ａ）〜（ｊ）：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｃ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒで置換されている；
ｄ．  Ａｓｐ１１８が、Ａｓｎで置換されている；
ｅ．  Ａｌａ１１９が、Ｇｌｙで置換されている；
ｆ．  Ｇｌｙ１２０が、Ｓｅｒで置換されている；
ｇ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａで置換されている；
ｈ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている；
ｉ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐ、またはＡｌａで置換されている；
ｊ．  Ｖａｌ１２４が、Ｌｙｓで置換されている
の１または２以上がなされるように改変されている。
【００３８】
本発明の実施形態では、配列番号２または配列番号３におけるコバーシンポリペプチドは、配列番号３の１１４〜１２４位に以下の置換（ａ）〜（ｊ）：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ａｌａで置換されている；
ｂ．  Ｍｅｔ１１６が、Ａｌａで置換されている；
ｃ．  Ｌｅｕ１１７が、Ａｌａで置換されている；
ｄ．  Ａｓｐ１１８が、Ａｓｎで置換されている；
ｅ．  Ａｌａ１１９が、Ａｓｎで置換されている；
ｆ．  Ｇｌｙ１２０が、Ａｓｎで置換されている；
ｇ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｓｎで置換されている；
ｈ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｌａで置換されている；
ｉ．  Ｇｌｕ１２３が、Ｇｌｎ、またはＡｓｎで置換されている；
ｊ．  Ｖａｌ１２４が、Ａｌａで置換されている
の１または２以上がなされるように改変されている。
【００３９】
本発明の実施形態では、置換（ａ）〜（ｊ）の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０が存在する。好ましくは置換（ａ）〜（ｊ）の２つ以上、５つ以上、または８つ以上が存在する。
【００４０】
一部の実施形態では、配列番号２または配列番号３におけるコバーシンポリペプチドは、配列番号３の１１４〜１２４位に以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｃ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒで置換されている；
ｄ．  Ａｓｐ１１８が、Ａｓｎで置換されている；
ｅ．  Ａｌａ１１９が、Ｇｌｙで置換されている；
ｆ．  Ｇｌｙ１２０が、Ｓｅｒで置換されている；
ｇ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａで置換されている；
ｈ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている；
ｉ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐで置換されている；
ｊ．  Ｖａｌ１２４が、Ｌｙｓで置換されている
が存在するように改変されている。
【００４１】
必要に応じて、上述の改変コバーシンポリペプチドにおいて、Ｔｒｐ１１５は置換されていない。好ましい改変コバーシンポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸位置１１４〜１２４のベータＨとアルファ２との間に、配列Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（配列番号１０）を有するループを有する。
【００４２】
一部の実施形態では、コバーシンポリペプチドは、配列番号３の１１４〜１２４位に以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＰｒｏ、好ましくはＳｅｒで置換されている；
ｃ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｌａで置換されている；
ｄ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｓｐで置換されている；
ｅ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＡｓｐまたはＡｌａ、より好ましくはＡｌａで置換されている
が存在するように改変されている。
【００４３】
より詳細な実施形態では；
ａ．  Ｍｅｔ１１６は、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１１７は、Ｓｅｒで置換されている；
ｃ．  Ｇｌｙ１２１は、Ａｌａで置換されている；
ｄ．  Ｌｅｕ１２２は、Ａｓｐで置換されている；
ｅ．  Ｇｌｕ１２３は、Ａｌａで置換されている。
【００４４】
必要に応じて、上述のこの改変コバーシンポリペプチドでは、Ｔｒｐ１１５は置換されていない。必要に応じて、この実施形態では、Ｍｅｔ１１４、Ｔｒｐ１１５、Ａｓｐ１１８、Ａｌａ１１９、Ｇｌｙ１２０およびＶａｌ１２４は、置換されていない、または本明細書の他で言及されたように保存的置換で置換されている。好ましい改変コバーシンポリペプチドは、配列番号３のアミノ酸位置１１４〜１２４のベータＨとアルファ２との間に、配列Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｖａｌ（配列番号１１）を有するループを有する。
【００４５】
一部の実施形態では、コバーシンポリペプチドは、配列番号３の１１４〜１２４位で以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｓｐで置換されている
が存在するように改変されている。
【００４６】
より詳細な実施形態では；
ａ．  Ｍｅｔ１１６は、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１２２は、Ａｓｐで置換されている。
【００４７】
必要に応じて、上述のこの改変コバーシンポリペプチドにおいて、Ｔｒｐ１１５は、置換されていない。必要に応じて、この実施形態では、Ｍｅｔ１１４、Ｔｒｐ１１５、Ｌｅｕ１１７、Ａｓｐ１１８、Ａｌａ１１９、Ｇｌｙ１２０、Ｇｌｙ１２１、Ｇｌｕ１２３およびＶａｌ１２４は、置換されていない。好ましい改変コバーシンポリペプチドは、配列Ｍｅｔ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｖａｌを有する配列番号３のアミノ酸位置１１４〜１２４（配列番号１２）のベータＨとアルファ２との間にループを有する。
【００４８】
本発明の別の態様では、コバーシンポリペプチドは、配列番号３中のＡｌａ４４（配列番号２中のＡｌａ６２）が、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓで置換されるように改変されている。
【００４９】
好ましい実施形態では、配列番号３中のＡｌａ４４は、Ａｓｎで置換されている。
【００５０】
配列番号３の４４位（または配列番号２の６２位）でのこの置換は、本明細書に記載される他の置換のいずれかと組み合わせてなされ得る。
【００５１】
本発明の別の態様では、コバーシンポリペプチドは、配列番号３の１１４〜１２４位に以下の置換（ａ）〜（ｊ）：
ａ．  Ｍｅｔ１１４が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎまたはＡｌａ、例えばＧｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＧｌｎまたはＡｌａ  例えばＧｌｎで置換されている；
ｃ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、またはＰｒｏ、好ましくはＳｅｒまたはＡｌａ、例えばＳｅｒで置換されている；
ｄ．  Ａｓｐ１１８が、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ  Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＡｓｎで置換されている；
ｅ．  Ａｌａ１１９が、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＧｌｙまたはＡｓｎ、例えばＧｌｙで置換されている；
ｆ．  Ｇｌｙ１２０が、Ｓｅｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＳｅｒまたはＡｓｎ、例えばＳｅｒで置換されている；
ｇ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｌａまたはＡｓｎ、例えばＡｌａで置換されている；
ｈ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｓｐまたはＡｌａ、例えばＡｓｐで置換されている；
ｉ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｓｐ、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＡｓｐ、Ａｌａ、ＧｌｎまたはＡｓｎ、例えばＡｓｐまたはＡｌａで置換されている；
ｊ．  Ｖａｌ１２４が、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒ、好ましくはＬｙｓまたはＡｌａ、例えばＬｙｓで置換されている
の１または２以上が存在し、かつ追加的に、配列番号３中のＡｌａ４４（配列番号２中のＡｌａ６２）が、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、またはＨｉｓ、好ましくはＡｓｎで置換されるように改変されている。
【００５２】
一部の実施形態では、コバーシンポリペプチドは、配列番号３の１１４〜１２４位に以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒで置換されている；
ｃ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａで置換されている；
ｄ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている；
ｅ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｌａで置換されている
が存在し、かつ配列番号３中のＡｌａ４４が、Ａｓｎで置換されるように改変されている。
【００５３】
本実施形態の好ましい態様では、配列番号３の１１４〜１２４位に対応するアミノ酸残基は、配列番号１１に示される通りである。
【００５４】
一部の実施形態では、コバーシンポリペプチドは、配列番号３の１１４〜１２４位に以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている
が存在し、かつ配列番号３中のＡｌａ４４が、Ａｓｎで置換されるように改変されている。
【００５５】
本実施形態の好ましい態様では、配列番号３の１１４〜１２４位に対応するアミノ酸残基は、配列番号１２に示される通りである。
【００５６】
一部の実施形態では、コバーシンポリペプチドは、配列番号３中のＡｓｐ１４９が、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｍｅｔ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ、Ｈｉｓ、またはＴｈｒで置換されるように改変されている。一部の実施形態では、コバーシンポリペプチドは、配列番号３のＡｓｐ１４９がＧｌｙで置換されるように改変される。配列番号３の１４９位（配列番号２の１６７位）でのこの置換は、本明細書に記載される他の置換のいずれかと組み合わされ得る。
【００５７】
一部の実施形態では、コバーシンポリペプチドは、配列番号３の１１４〜１２４位に以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１１７が、Ｓｅｒで置換されている；
ｃ．  Ｇｌｙ１２１が、Ａｌａで置換されている；
ｄ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている；
ｅ．  Ｇｌｕ１２３が、Ａｌａで置換されている
が存在し、配列番号３中のＡｌａ４４が、Ａｓｎで置換され、配列番号３のＡｓｐ１４９が、Ｇｌｙ１４９で置換されるように改変されている。
【００５８】
本実施形態の好ましい態様では、配列番号３の１１４〜１２４位に対応するアミノ酸残基は、配列番号１１に示される通りである。
【００５９】
一部の実施形態では、コバーシンポリペプチドは、配列番号３の１１４〜１２４位に以下の置換：
ａ．  Ｍｅｔ１１６が、Ｇｌｎで置換されている；
ｂ．  Ｌｅｕ１２２が、Ａｓｐで置換されている
が存在し、配列番号３中のＡｌａ４４が、Ａｓｎで置換され、配列番号３のＡｓｐ１４９が、Ｇｌｙ１４９で置換されるように改変されている。
【００６０】
本実施形態の好ましい態様では、配列番号３の１１４〜１２４位に対応するアミノ酸残基は、配列番号１２に示される通りである。
【００６１】
本開示の様々な態様および実施形態では、本発明の改変コバーシンポリペプチドは、配列番号２および配列番号３における未改変コバーシンポリペプチドと１〜３０のアミノ酸が異なる。配列番号２および配列番号３におけるコバーシンポリペプチドに任意の修復がなされ得るが、但し、結果として生じる改変コバーシンポリペプチドが、未改変コバーシンポリペプチドと比較して、ＬＫ／Ｅ結合活性を示し、減少したＣ５結合性を示すか、またはＣ５結合性を示さない。
【００６２】
本発明の一部の実施形態では、配列番号３の６、３８、１００、１２８、１２９、１５０位の６つのシステインアミノ酸は、本発明の改変コバーシンポリペプチドに保持されている。
【００６３】
一部の実施形態では、配列番号３中のＡｓｎ６０およびＡｓｎ８４は、それぞれＧｌｎで置換されている。この改変は、ポリペプチドを真核細胞（例えば酵母、植物、哺乳動物）において発現させた場合における、Ｎ結合型高グリコシル化を防止するために、部位特異的変異誘発により実施することができる。
【００６４】
一部の実施形態では、配列番号３中の以下のアミノ酸：Ｐｈｅ１８、Ｔｙｒ２５、Ａｒｇ３６、Ｌｅｕ３９、Ｇｌｙ４１、Ｐｒｏ４３、Ｌｅｕ５２、Ｖａｌ５４、Ｍｅｔ５６、Ｐｈｅ５８、Ｔｈｒ６７、Ｔｒｐ６９、Ｐｈｅ７１、Ｇｌｎ８７、Ａｒｇ８９、Ｈｉｓ９９、Ｈｉｓ１０１、Ａｓｐ１０３、およびＴｒｐ１１５の１または２以上が、ＬＴＢ４との結合に関与すると考えられ、したがって、未改変形態で保持され得る。一部の実施形態では、これらのアミノ酸の少なくとも５、１０もしくは１５、または全てが、本発明の改変コバーシンポリペプチドにおいて未改変形態で保持され得る。一部の実施形態では、これらのアミノ酸の１または２以上が、保存的に置換され得る。一部の実施形態では、これらのアミノ酸の最大で５、１０もしくは１５、または全てが、本発明の改変コバーシンポリペプチドにおいて保存的に置換されている。
【００６５】
配列番号３中の以下の位置：５、６、１１、１３〜１５、２０〜２１、２４〜２７、２９〜３２、３５〜４１、４５、４７〜４８、５０、５２〜６０、６４、６６、６９〜８１、８３、８４、８６、９０〜９４、９７〜１０４、１１２〜１１３、１１５、１２５〜１２９、１３２〜１３９、１４５、１４８、および１５０のアミノ酸は、コバーシンとＴＳＧＰ２およびＴＳＧＰ３との間で高度に保存されている。
【００６６】
配列番号３中の以下の位置：５、６、１１、１３〜１５、１８、２０〜２１、２４〜２７、２９〜３２、３５〜４１、４３、４５、４７〜４８、５０、５２〜６０、６４、６６、６７、６９〜８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０〜９４、９７〜１０４、１１２〜１１３、１１５、１２５〜１２９、１３２〜１３９、１４５、１４８、および１５０のアミノ酸は、ＬＴＢ４への結合に関与すると考えられ、かつ／またはコバーシンとＴＳＧＰ２およびＴＳＧＰ３との間で高度に保存されている。
【００６７】
配列番号３中の以下の位置：５、６、１１、１３〜１５、１８、２０〜２１、２４〜２５、２７、３０〜３２、３５〜４１、４３、４７〜４８、５０、５２〜６０、６４、６６、６７、６９〜８１、８３、８４、８６、８７、８９、９０〜９４、９８、１００、１０２〜１０４、１１２〜１１３、１１５、１２６、１２８〜１２９、１３２〜１３９、１４５、１４８、および１５０のアミノ酸は、ＬＴＢ４への結合に関与すると考えられ、かつ／またはコバーシンとＴＳＧＰ２およびＴＳＧＰ３との間で高度に保存されている。
【００６８】
したがって、一部の実施形態では、上記アミノ酸は、未改変形態で保持されている。一部の実施形態では、これらのアミノ酸の少なくとも５、１０もしくは１５、または全てが、本発明の改変コバーシンポリペプチドにおいて未改変形態で保持されている。一部の実施形態では、これらのアミノ酸の１または２以上が、保存的に置換され得る。一部の実施形態では、これらのアミノ酸の最大で５、１０もしくは１５、２０、２５、３０、４０、５０または全てが、本発明の改変コバーシンポリペプチドにおいて保存的に置換されている。
【００６９】
本発明の改変コバーシンポリペプチドは、典型的には、配列番号２または配列番号３と１〜３０、好ましくは２〜２５、より好ましくは３〜２０、さらにより好ましくは４〜１５のアミノ酸が異なる。典型的には、差異は、５〜１２、または６〜１０のアミノ酸変化である。例えば、１〜３０、または２〜２５、３〜３０、４〜１５、５〜１２、または６〜１０のアミノ酸置換が、配列番号２または配列番号３になされ得る。
【００７０】
配列番号３のアミノ酸位置１１４〜１２４（配列番号２のアミノ酸位置１３２〜１４２）のベータＨとアルファ２との間に配列番号１０に示されるようなループを有する改変コバーシンポリペプチドは、このループが存在する結果として、配列番号３と比較して１０のアミノ酸置換を有する。したがって、一部の実施形態では、本発明の改変コバーシンポリペプチドは、好ましくは、配列番号５に示される置換以外に配列番号３と比較して（例えば配列番号１０のループ中に）１〜１５、２〜１０、３〜５、または最大で２、３、４または５の追加的な置換を有する。
【００７１】
配列番号１１に示されるような、配列番号３のアミノ酸位置１１４〜１２４（配列番号２のアミノ酸位置１３２〜１４２）のベータＨとアルファ２との間にループを有する改変コバーシンポリペプチドは、このループが存在する結果として、配列番号３と比較して５のアミノ酸置換を有する。したがって、一部の実施形態では、本発明の改変コバーシンポリペプチドは、好ましくは、配列番号６に示される置換以外に配列番号３と比較して（例えば配列番号１１のループ中に）１〜２０、２〜１５、３〜１０、または最大で２、３、４、５、６、７、８、９、１０の追加的な置換を有する。追加的な置換には、好ましくは、本明細書の他の箇所に示されるような４４位および１４９位の置換が含まれる。
【００７２】
配列番号１２に示されるように配列番号３のアミノ酸位置１１４〜１２４（配列番号２のアミノ酸位置１３２〜１４２）のベータＨとアルファ２との間にループを有する改変コバーシンポリペプチドは、このループが存在する結果として、配列番号３と比較して２のアミノ酸置換を有する。したがって、一部の実施形態では、本発明の改変コバーシンポリペプチドは、好ましくは、配列番号７に示される置換以外に配列番号３と比較して１〜２５、２〜１２、３〜１５、または最大で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の追加的な置換（例えば配列番号１２のループ中の置換）を有する。追加的な置換には、好ましくは、本明細書の他の箇所に示されるような４４位および１４９位の置換が含まれる。
【００７３】
本明細書の他の箇所に示されるように配列番号３の４４位に置換を有する改変コバーシンポリペプチドは、好ましくは、配列番号３と比較して、１〜２５、２〜１２、３〜１５、または最大で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５の追加的な置換を有する。
【００７４】
上記で明確に述べられる置換以外の置換は、好ましくは、例えば次の表による保存的置換である。第２列の同じブロック内にあり、好ましくは第３列の同じ行にあるアミノ酸は、相互に置換され得る。
【００７５】
【表１】
2020517260.tif 000002
【００７６】
置換は、また、Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｍｏｕｂａｔａから得られるコバーシンタンパク質の相同体などのバリアント中に見出される残基に基づき選択され得る。このような相同体は、例えば、Ｒｈｉｐｉｃｅｐｈａｌｕｓ  ａｐｐｅｎｄｉｃｕｌａｔｕｓ、Ｒ．ｓａｎｇｕｉｎｅｕｓ、Ｒ．ｂｕｒｓａ、Ａ．ａｍｅｒｉｃａｎｕｍ、Ａ．ｃａｊｅｎｎｅｎｓｅ、Ａ．ｈｅｂｒａｅｕｍ、Ｂｏｏｐｈｉｌｕｓ  ｍｉｃｒｏｐｌｕｓ、Ｂ．ａｎｎｕｌａｔｕｓ、Ｂ．ｄｅｃｏｌｏｒａｔｕｓ、Ｄｅｒｍａｃｅｎｔｏｒ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓ、Ｄ．ａｎｄｅｒｓｏｎｉ、Ｄ．ｍａｒｇｉｎａｔｕｓ、Ｄ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ、Ｈａｅｍａｐｈｙｓａｌｉｓ  ｉｎｅｒｍｉｓ、Ｈａ．ｌｅａｃｈｉｉ、Ｈａ．ｐｕｎｃｔａｔａ、Ｈｙａｌｏｍｍａ  ａｎａｔｏｌｉｃｕｍ  ａｎａｔｏｌｉｃｕｍ、Ｈｙ．ｄｒｏｍｅｄａｒｉｉ、Ｈｙ．ｍａｒｇｉｎａｔｕｍ  ｍａｒｇｉｎａｔｕｍ、Ｉｘｏｄｅｓ  ｒｉｃｉｎｕｓ、Ｉ．ｐｅｒｓｕｌｃａｔｕｓ、Ｉ．ｓｃａｐｕｌａｒｉｓ、Ｉ．ｈｅｘａｇｏｎｕｓ、Ａｒｇａｓ  ｐｅｒｓｉｃｕｓ、Ａ．ｒｅｆｌｅｘｕｓ、Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ  ｅｒｒａｔｉｃｕｓ、Ｏ．ｍｏｕｂａｔａ  ｍｏｕｂａｔａ、Ｏ．ｍ．ｐｏｒｃｉｎｕｓ、およびＯ．ｓａｖｉｇｎｙｉを含む他のマダニ種からのコバーシンタンパク質配列を含む、配列番号２または３に示されるコバーシン配列のパラログおよびオルソログを含み得る。
【００７７】
本発明は、また、改変コバーシンポリペプチドのＮ末端から最大で５つのアミノ酸が欠失している、配列番号３の改変コバーシンポリペプチドの断片を包含する。前記断片は、改変コバーシンポリペプチドのＮ末端からの１、２、３、４または５つの欠失に対応し得る。配列番号２または配列番号３のアミノ酸配列における他の位置からの欠失は、また、結果として生じるポリペプチドが改変コバーシンのＬＫ／Ｅ結合活性（例えば、改変ポリペプチドに関連して本明細書に記載されるもの）を保持し、減少した補体阻害剤活性（例えば、改変ポリペプチドに関連して本明細書に記載されるもの）を有するか、または補体阻害剤活性を有さない限り、本発明の一部を構成すると考えられる。
【００７８】
本発明の改変コバーシンポリペプチドは、また、別のペプチドと遺伝的または化学的に融合された改変コバーシンポリペプチドを含む融合タンパク質として提供され得る。融合タンパク質は、例えば、異種タンパク質配列についてのコード配列のフレーム内に、改変コバーシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをクローニングすることによって取得し得る。本明細書に使用される「異種」という用語は、本発明の改変コバーシンポリペプチド以外の任意のポリペプチドを呼ぶことが意図される。可溶性融合タンパク質のＮ末端またはＣ末端のいずれかに含まれ得る異種配列としては、下記：膜結合タンパク質の細胞外ドメイン、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ領域）、ＰＡＳもしくはＸＴＥＮもしくは他の類似の構造不定のポリペプチド、多量体化ドメイン、細胞外タンパク質のドメイン、シグナル配列、搬出配列、またはアフィニティークロマトグラフィーによる精製を可能にする配列である。これらの異種配列の多くは、発現プラスミドに挿入されて市販されており、それは、これらの配列と融合されたタンパク質の特異的生物学的活性を顕著に損なわずに追加的特性を提供するために、一般的に融合タンパク質に含まれるからである。このような追加的特性としては、体液中でより長く持続する半減期（例えば、Ｆｃ領域の付加またはＰａｓ化（Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  Ｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２０１３  Ａｕｇ；２６（８）：４８９〜５０１）の結果として生じる）、細胞外局在、またはヒスチジン、ＧＳＴ、ＦＬＡＧ、アビジンもしくはＨＡタグなどのタグによって可能になるような、より簡単な精製手順である。融合タンパク質は、追加的に、リンカー配列（例えば１〜５０、２〜３０、３〜２０、５〜１０アミノ酸長）を含有してもよく、それにより、構成成分がこのリンカーによって分離される。
【００７９】
したがって、融合タンパク質は、改変コバーシンポリペプチドを含むタンパク質の例であり、これらには、具体例としてＰＡＳ配列および改変コバーシンポリペプチド配列を含むタンパク質が含まれる。ＰＡＳ配列は、例えば、Ｓｃｈｌａｐｓｃｈｙ  Ｍら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２０１３  Ａｕｇ；２６（８）：４８９〜５０１、およびＥＰ０８７７３５６７．６に記載されており、ＰＡＳ化コバーシン分子は、Ｋｕｈｎら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２０１６、２７（１０）、２３５９〜２３７１ページに記載されている。ＰＡＳ化は、タンパク質と、アミノ酸Ｐｒｏ、Ａｌａ、および／またはＳｅｒから構成されるコンフォメーション的には無秩序なポリペプチド配列との遺伝子融合を説明している。これは、ＸＬ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ｈｔｔｐ：／／ｘｌ−ｐｒｏｔｅｉｎ．ｃｏｍ／）によって開発された技法であり、溶媒和したランダム鎖を大きな流体力学的体積で、それと融合されるタンパク質に結合させる簡便な方法を提供する。ポリペプチド配列は、かさ高いランダムコイル構造をとる。したがって、結果として生じる融合タンパク質のサイズは、それが融合されるタンパク質よりもずっと大きい。これにより、生体システム中のクリアランスが減少することが示されている。適切なＰＡＳ配列は、ＥＰ０８７７３５６７．６および上記のＳｃｈｌａｐｓｃｈｙの参考文献に記載されている。任意の適切なＰＡＳ配列が、融合タンパク質に使用され得る。例えば、ランダムコイルコンフォメーションを形成し、アラニン、セリンおよびプロリン残基からなる（またはプロリンおよびアラニン残基からなる）少なくとも約１００のアミノ酸残基からなるアミノ酸配列が含まれる。これは、複数のアミノ酸リピートを含んでもよく、その際、前記リピートは、Ａｌａ、Ｓｅｒ、およびＰｒｏ残基（またはプロリンおよびアラニン残基）からなり、同一アミノ酸残基の連続は、６つ以下である。プロリン残基は、配列のアミノ酸の４％よりも大きく４０％未満を構成し得る。配列は、
ＡＳＰＡＡＰＡＰＡＳＰＡＡＰＡＰＳＡＰＡ（配列番号１３）；
ＡＡＰＡＳＰＡＰＡＡＰＳＡＰＡＰＡＡＰＳ（配列番号１４）；
ＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳＳ（配列番号１５）、
ＳＡＰＳＳＰＳＰＳＡＰＳＳＰＳＰＡＳＰＳ（配列番号１６）、
ＳＳＰＳＡＰＳＰＳＳＰＡＳＰＳＰＳＳＰＡ（配列番号１７）、
ＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡＡＡＳＰＡＡＰＳＡＰＰＡ（配列番号１８）および
ＡＳＡＡＡＰＡＡＡＳＡＡＡＳＡＰＳＡＡＡ（配列番号１９）
または、これらの配列の全体もしくは部分としての当該配列の環状置換（circular permuted）バージョンもしくは多量体から選択されるアミノ酸配列を含み得る。例えば、ＰＡＳ配列中に存在するリピートの１つの５〜４０、１０〜３０、１５〜２５、１８〜２０、好ましくは、２０〜３０または３０コピー、すなわち配列番号１３〜１９の１つ、好ましくは１３が存在し得る。好ましくは、ＰＡＳ配列は、配列番号１３の３０コピーを含むまたはそれからなる。好ましくは、ＰＡＳ配列は、コバーシン型タンパク質のＮ末端と（直接またはリンカー配列を介して）融合され、ある特定の好ましい実施形態では、コバーシン型タンパク質は、配列番号５もしくは配列番号６、または配列番号７もしくは配列番号８を含むか、またはそれからなってもよく、例えば、融合タンパク質は、（ａ）配列番号１３の３０コピーからなるＰＡＳ配列および（ｂ）（ｉ）配列番号５、または（ｉｉｉ）配列番号６、または（ｉｉｉ）配列番号７、または（ｉｖ）配列番号８を含み、その際、（ａ）は、（ｂ）のＮ末端に直接またはリンカー配列を介して融合されている。
【００８０】
一部の実施形態では、リンカーは、１または２以上のアラニン残基、例えば１〜５つのアラニン残基、例えば単一のアラニン残基を含む。
【００８１】
本発明の改変コバーシンポリペプチドは、化学改変、例えば翻訳後改変し得る。例えば、それらは、グリコシル化、ペグ化、リン酸化であり得、または改変アミノ酸残基を含み得る。このような改変ポリペプチドは、本明細書に使用される「ポリペプチド」という用語の範囲内である。他の実施形態では、本発明の改変コバーシンポリペプチドは、化学改変、例えば翻訳後改変されていない（例えば、グリコシル化、ペグ化、リン酸化されていない）。
【００８２】
本発明の改変コバーシンポリペプチドは、実質的に単離された形態であり得る。本発明のポリペプチドは、宿主細胞中に発現させた場合、その中に発現させた宿主細胞および／または増殖培地の少なくとも１つの成分から分離されたものであり得る。改変コバーシンポリペプチドは、ポリペプチドの意図される目的を妨害しない担体または希釈剤と混合されてもよく、その場合も実質的に単離されていると見なされ得ることが理解されよう。本発明における使用のためのポリペプチドは、また、実質的に精製された形態でもよく、その場合、一般的に、調製物中に５０重量％よりも多い、例えば８０重量％、９０重量％、９５重量％または９９重量％よりも多いポリペプチドが、本発明のポリペプチドである調製物中に、ポリペプチドが含まれる。これは、例えば、電気泳動またはクロマトグラフィーによって決定され得る。
【００８３】
改変コバーシンポリペプチドは、また、合成的に、または組換えにより製造され得る。例えば、組換えコバーシンポリペプチドは、哺乳動物細胞、真菌細胞、細菌細胞または昆虫細胞を、適切な制御配列に作動可能に連結した改変コバーシンポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターと培養して形質移入し、前記細胞を培養し、前記細胞により産生される改変コバーシンポリペプチドを抽出および精製することによって産生され得る。ポリペプチドは、また、合成または組換え生産後に改変され得る。本発明における使用のためのポリペプチドは、Ｄ−アミノ酸を使用して産生され得る。このような場合、アミノ酸は、ＣからＮ方向に逆配列で連結される。これは、このようなポリペプチドを産生するために当技術分野において慣例的である。
【００８４】
多くの側鎖改変が当技術分野で公知であり、改変コバーシンポリペプチドがＬＫ／Ｅ結合活性を保持し、かつ、減少した補体阻害剤活性（例えば補体Ｃ５結合活性）を示すか、または補体阻害剤活性を示さない限り、当該改変が改変コバーシンポリペプチドの側鎖になされ得る。
【００８５】
ポリヌクレオチド
本発明の一態様により、本発明の改変コバーシンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、提供される。本発明による改変コバーシンポリペプチドまたはその断片をコードするポリヌクレオチドは、ロイコトリエンまたはエイコサノイドによって媒介される疾患または症状を治療または予防するために使用され得る。
【００８６】
特に、ポリヌクレオチドは、（ａ）本発明の改変コバーシンポリペプチド中の配列番号２もしくは配列番号３になされる改変を反映するために必要な変化を有する、配列番号１（もしくはそのヌクレオチド５５〜５０７）の配列に対応するコード配列；（ｂ）（ａ）に定義される配列に対する遺伝子コードの結果としての縮重配列；または（ｃ）ＬＫ／Ｅ結合活性（例えば、改変ポリペプチドに関連して本明細書に記載されるもの）および減少した補体阻害剤活性（例えば、改変ポリペプチドに関連して本明細書に記載されるもの）を有するか、もしくは補体阻害剤活性を有さない本発明による改変ポリペプチドをコードする、（ａ）もしくは（ｂ）に定義される配列の任意の１つの断片を含むか、またはそれからなっていてもよい。典型的には、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えばｃＤＮＡである。しかし、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリヌクレオチドでもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖でもよく、その中に合成または改変ヌクレオチドを含み得る。
【００８７】
一部の実施形態では、配列番号１の配列に対応するコード配列の代わりに、コード配列は、図２におけるヌクレオチド配列（配列番号１）のヌクレオチド５５〜５０７の配列に対応する。このヌクレオチド配列は、シグナル配列を有さない、図２におけるコバーシンタンパク質をコードし、すなわち、配列番号３をコードする。図２におけるヌクレオチド配列の最初の５４塩基は、補体阻害活性またはＬＴＢ４結合活性に必要とされないシグナル配列をコードする。したがって、本発明のポリヌクレオチドは、図２におけるヌクレオチド配列（配列番号１）のヌクレオチド５５〜５０７の改変バージョンを含むか、またはそれからなっていてもよい。
【００８８】
本発明のポリヌクレオチドは、典型的には、本発明の改変コバーシンポリペプチドにおいて配列番号２または配列番号３になされた改変を反映するために必要な変化を有する、配列番号１（またはそのヌクレオチド５５〜５０７）のコード配列またはコード配列の相補配列と、バックグラウンドをはるかに上回るレベルでハイブリダイズしうる。バックグラウンドハイブリダイゼーションは、例えば、ＤＮＡライブラリーに存在する他のＤＮＡのために生じ得る。本発明のポリヌクレオチドと、本発明の改変コバーシンポリペプチドにおいて配列番号２または配列番号３になされた改変を反映するために必要な変化を有する配列番号１（またはそのヌクレオチド５５〜５０７）のコード配列またはコード配列の補体との相互作用によって発生するシグナルレベルは、典型的には、他のポリヌクレオチドと配列番号１（またはそのヌクレオチド５５〜５０７）のコード配列との間の相互作用より少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍強い。相互作用の強度は、例えばプローブを、例えば３２Ｐで放射標識することによって測定され得る。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には、中〜高ストリンジェンシーの条件を使用して達成され得る。しかし、このようなハイブリダイゼーションは、当技術分野において公知の任意の適切な条件で実施され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、１９８９を参照されたい）。例えば、高ストリンジェンシーが必要な場合、適切な条件には、６０℃、最大で６５℃で０．１〜０．２×ＳＳＣが含まれる。より低いストリンジェンシーが必要な場合、適切な条件には、６０℃で２×ＳＳＣが含まれる。
【００８９】
上述のポリヌクレオチドは、代替的または追加的に、ポリペプチドのループ領域の末端または内部のいずれかまたは両方に伸長部をコードする配列を含むように改変され得る。シグナル配列、またはタンパク質の検出、発現、分離もしくは精製を助ける別のペプチドもしくはタンパク質をコードする配列、または上述のようにタンパク質の循環半減期を増加させるための本明細書の他の箇所に言及されるＦｃペプチド、ＰＡＳもしくは他の分子などのペプチドをコードする配列などの追加的な配列を含み得る。他の融合パートナーの例には、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、またはルシフェラーゼが含まれる。
【００９０】
改変ポリヌクレオチドは、一般的に、ＬＫ／Ｅ結合活性を有するポリペプチドをコードする。縮重置換がなされてもよく、および／または例えば上の表に示されるように、改変配列が翻訳された場合に保存的アミノ酸置換をもたらす置換がなされてもよい。本発明の改変コバーシンポリペプチドにおいて配列番号２または配列番号３になされる改変を反映するために必要な変化を有する、配列番号１のＤＮＡコード配列の補体と選択的にハイブリダイズすることができるヌクレオチド配列は、一般的に、配列番号１（本発明の改変コバーシンポリペプチドにおける配列番号２または配列番号３になされる改変を反映するために必要な変化を有する）の少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、少なくとも６０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも４２０の領域にわたり、または最も好ましくは全長もしくは本発明によるこれらの配列になされる改変に供される、配列番号２または配列番号３に示される配列を有するポリペプチドをコードする配列番号１（本発明の改変コバーシンポリペプチドにおける配列番号２または配列番号３になされる改変を反映するために必要な変化を有する）の長さにわたり、本発明の改変コバーシンポリペプチドにおいて配列番号２または配列番号３になされる改変を反映するために必要な変化を有する、配列番号１のコード配列（またはそのヌクレオチド５５〜５０７）と少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有する。配列同一性は、任意の適切な方法によって決定され得る（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｗ．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．２０１３  Ｊｕｎｅ；０  ３、ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１２５０９５３．ｂｉ０３０１ｓ４２に記載）。
【００９１】
本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、組換え的に、合成的に、または当業者に利用可能な任意の手段によって産生され得る。それらは、また、標準的な技法によってクローニングされ得る。ポリヌクレオチドは、典型的には、単離および／または精製された形態で提供される。
【００９２】
本明細書に記載されるポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施され得る、本発明における使用のためのポリペプチドの産生に有用である。ポリヌクレオチドは、それ自体で治療剤として使用され、または組換えタンパク質合成に関与し得る。本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、典型的には、組換え複製可能なベクターに組み込まれる。ベクターは、適合する宿主細胞中で核酸を複製させるために使用され得る。したがって、本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、コバーシンポリヌクレオチドを複製可能なベクターに導入すること、ベクターを適合性の宿主細胞に導入し、ベクターの複製をもたらす条件で宿主細胞を増殖させることにより作製され得る。宿主細胞は、例えば、大腸菌細胞であり得る。
【００９３】
ベクター
本発明は、また、本発明のこの態様の核酸分子を含む発現ベクターをクローニングすることを含む。このような発現ベクターは、本発明の核酸分子とフレーム内に連結された適切な転写および翻訳制御配列、例えばエンハンサーエレメント、プロモーター−オペレーター領域、終止終結配列（ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｏｐ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ｍＲＮＡ安定性配列、開始および終止コドンまたはリボソーム結合部位を組み込み得る。
【００９４】
好ましくは、ベクターは、本明細書に定義される改変コバーシンポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターである。コード配列は、また、使用すべき宿主生物に適した好ましいコドン使用頻度を提供するように選択され得る。他の適切なベクターは、当業者に明らかであろう。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照されたい。好ましくは、ベクター中への本発明における使用のためのポリヌクレオチドは、宿主細胞によるコード配列の発現させうる制御配列に作動可能に連結しており、すなわち、ベクターは発現ベクターである。「作動可能に連結した」という用語は、記載された構成成分が、それらを意図されるように機能させる関係にある並置を表す。コード配列に「作動可能に連結した」プロモーターなどの調節配列は、調節配列と適合する条件でコード配列の発現が達成されるように配置される。
【００９５】
本発明によるベクターには、プラスミドおよびウイルス（バクテリオファージおよび真核生物ウイルスの両方を含む）、ならびに他の直鎖または環状ＤＮＡ担体、例えば転位因子または相同組換え技法を使用するＤＮＡ担体が含まれる。
【００９６】
多くのこのようなベクターおよび発現系が、当技術分野において公知であり、記載されている（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ＆  Ｈｏｅｆｆｌｅｒ、１９９８）。特に適切なウイルスベクターには、バキュロウイルスベース、アデノウイルスベースおよびワクシニアウイルスベースのベクターが含まれる。
【００９７】
組換え発現に適した宿主には、高レベルの組換えタンパク質を発現させることができ、容易に大量増殖させることができる大腸菌などの通常使用される原核生物種または真核性酵母が含まれる。好ましくは、宿主細胞は、真核性酵母細胞である。特にウイルス駆動発現系を使用する場合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖した哺乳動物細胞株も適している。別の適切な発現系は、宿主として昆虫細胞の使用を伴うバキュロウイルス発現系である。発現系は、また、ＤＮＡがゲノムに組み込まれた宿主細胞を構成し得る。
【００９８】
タンパク質またはタンパク質断片は、また、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば昆虫の幼虫または哺乳動物組織中に発現させ得る。
【００９９】
本発明によるベクターを原核細胞または真核細胞に導入するために多様な技法が使用され得る。適切な形質転換または形質移入技法は、文献に詳細に記載されている（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９１；Ｓｐｅｃｔｏｒ、Ｇｏｌｄｍａｎ  ＆  Ｌｅｉｎｗａｌｄ、１９９８）。真核細胞では、発現系は、系の必要性に応じて一過性（例えばエピソーム）または永続性（染色体組込み）であり得る。
【０１００】
宿主細胞
本発明には、また、上記で定義される核酸分子、アンチセンス核酸分子またはベクターを含む、形質転換または形質移入原核または真核宿主細胞が含まれる。宿主細胞が原核細胞の場合、それらは、好ましくは大腸菌細胞である。
【０１０１】
好ましい真核宿主細胞には、真核酵母細胞および哺乳動物細胞が含まれる。
【０１０２】
本発明は、また、上記で定義される改変コバーシンポリペプチドを調製する方法であって、本発明による核酸分子を含有する宿主細胞を、タンパク質が発現する条件で培養すること、およびそのように産生されたタンパク質を回収することを含む方法を提供する。好ましくは、宿主細胞は、酵母細胞または大腸菌細胞である。
【０１０３】
組成物
本発明のさらなる態様により、本発明の上記態様による改変コバーシンポリペプチド、改変コバーシンポリペプチドを含む融合タンパク質、または改変コバーシンポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を薬学的に許容される担体と共に含む組成物が提供される。
【０１０４】
本明細書に使用される「薬学的に許容される担体」という用語には、賦形剤が、それ自体、毒性作用を誘導せず、医薬組成物を受け入れる個体に有害な抗体の産生も引き起こさない限り、遺伝子、ポリペプチド、抗体、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸および不活性ウイルス粒子または実際に任意の他の薬剤が含まれる。薬学的に許容される担体は、追加的に、水、食塩水、グリセロール、エタノールなどの液体または湿潤剤もしくは乳化剤などの補助物質、ｐＨ緩衝物質およびその他を含有し得る。例えば、水またはＰＢＳ中への溶液が使用され得る。
【０１０５】
賦形剤は、患者による摂取を助けるために医薬組成物を錠剤、丸剤（メカニカルピルを含む）、糖衣錠、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー、懸濁剤、乳剤、軟膏剤、クリーム剤、エアロゾル噴霧剤に製剤化することを可能にし得る。治療用物質の送達またはイオン泳動用のナノ粒子も使用し得る。薬学的に許容される担体の詳細な説明は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎ．Ｊ．１９９１）から入手可能である。
【０１０６】
さらなる態様により、本発明は、治療における使用のための、本発明の上記態様による改変コバーシンポリペプチド、改変コバーシンポリペプチドを含む融合タンパク質、または改変コバーシンポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。
【０１０７】
本発明は、また、ＬＫ／Ｅ（特にＬＴＢ４）媒介疾患もしくは障害を患う動物を治療する方法または動物がＬＫ／Ｅ（特にＬＴＢ４）媒介疾患もしくは障害を発生するのを予防する方法であって、前記動物に、本発明の上記態様による改変コバーシンポリペプチド、改変コバーシンポリペプチドを含む融合タンパク質、または改変コバーシンポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子、または本発明の上記態様による医薬組成物を治療または予防有効量で投与することを含む方法を提供する。
【０１０８】
本発明は、また、ＬＫ／Ｅ（特にＬＴＢ４）媒介疾患もしくは障害を患う動物を治療するまたは動物がＬＫ／Ｅ（特にＬＴＢ４）媒介疾患もしくは障害を発生するのを予防する方法における使用のための、本発明の上記態様による改変コバーシンポリペプチド、改変コバーシンポリペプチドを含む融合タンパク質、または改変コバーシンポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子を提供する。
【０１０９】
好ましくは、前記動物は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。
【０１１０】
「治療有効量」という用語は、標的となる疾患または症状を治療または回復させるために必要な化合物の量を表す。本明細書に使用される「予防有効量」という用語は、標的となる疾患または症状を予防するために必要な化合物の量を表す。正確な投薬量は、一般的に、投与時の患者の状況に依存する。投薬量を決定する場合に考慮され得る要因には、患者における病状の重症度、患者の全身の健康状態、年齢、体重、性別、食事、時間および投与回数、薬物の組合せ、反応感受性および患者の治療に対する抵抗性または反応が含まれる。
【０１１１】
正確な量は、日常的な実験により決定することができるが、最終的に医師の判断であり得る。好ましくは、薬剤の用量は、対象において可能な限り多くの利用可能なＬＫ／Ｅ、例えばＬＴＢ４、より好ましくは、全ての利用可能なＬＫ／Ｅ、例えばＬＴＢ４と結合するために十分である。
【０１１２】
用量を投与する必要がある回数は、関与する薬剤の半減期に依存する。改変コバーシンポリペプチドは、連続注入として、大量瞬時投与で、または毎日ベース、１日２回ベース、もしくは２、３、４日、５、６、７、１０、１５もしくは２０日以上毎に投与され得る。改変コバーシンポリペプチドの特定の利点は、それらを投与することができる相対的な容易さおよび迅速性、ならびに医療従事者がタンパク質を投与する必要がないという事実である。
【０１１３】
単回または多回用量が投与され得る。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、または８用量が投与され得る。単回用量は、一実施形態である。用量の正確な投薬量および回数は、また、投与時での患者の症状に依存し得る。投薬量を決定する場合に考慮され得る要因には、治療または予防の必要性、患者における病状の重症度、患者の全身の健康状態、年齢、体重、性別、食事、投与の時間および回数、薬物の組合せ、反応の感受性および治療に対する患者の抵抗性または応答が含まれる。正確な量は、日常的な実験により決定できるが、最終的には医師の判断であり得る。
【０１１４】
投薬レジメンは、また、初回「負荷用量」に続く１または２以上の後続する「維持用量」の形態でもよい。一般に、負荷用量は、維持用量よりも大きい。負荷用量は、維持用量の２、５、１０倍またはより大きくてもよい。負荷用量は、単回用量として、または特定の時間枠内の１または２以上の用量として投与され得る。典型的には、負荷用量は、単一の２４時間中に投与される１、２、３、４または５用量である。維持用量は、規則的な間隔で繰り返される、より低い用量でもよい。維持用量は、３、４、６、８、１２、２４、または４８時間毎などの間隔で繰り返されてもよい。正確なレジメンは、日常的な実験により決定できるが、最終的に医師の判断であり得る。維持用量は、初回負荷用量の少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００％、または初回負荷用量の最大２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０もしくは１００％であり得る。
【０１１５】
さらなる実施形態では、治療経過にわたり同じ用量が使用される（例えば毎日）。
【０１１６】
改変コバーシンポリペプチド、改変コバーシンポリペプチドを含む融合タンパク質、または改変コバーシンポリペプチドをコードする核酸配列を含む核酸分子は、任意の公知の投与経路により送達され得る。それは、部分的または全身的に送達され得る。それは、非経口経路で送達され得る（例えば、皮下、腹腔内、静脈内もしくは筋肉内のいずれかの注射により、または組織の間質腔に送達される）。組成物は、また、病変内に投与することができる。他の投与様式には、経口および肺投与、坐剤、および経真皮または経皮適用、針、ならびにハイポスプレーが含まれる。部分的な投与は、局所投与を含み得る。好ましくは、皮下注射を介して送達される。
【０１１７】
疾患および症状
本発明者らは、本出願および請求項に定義される改変コバーシンポリペプチドが、Ｅ／ＬＫ、例えばＬＴＢ４に結合する能力を有するが、Ｃ５結合性を示さないか、または減少したＣ５結合性を示すことを見出した。ＬＴＢ４は、記載された、最も強力な走化性および化学運動性エイコサノイドであり、インテグリンのアップレギュレーションを介して血管内皮への好中球の接着を促進する。ＬＴＢ４は、好中球の凝集を誘導し、多様な過程により炎症に役割を果たす。ＬＴＢ４は、適応免疫応答の誘導および管理に役割を果たすことが示されている。したがって、ロイコトリエンおよびヒドロキシエイコサノイドに結合し、包み込む能力を有する改変コバーシンポリペプチドは、これらのリガンドがＢＬＴ１およびＢＬＴ２受容体と相互作用するのを防止することができ、脂肪酸の炎症促進作用を緩和するために使用できる。
【０１１８】
本発明の改変コバーシンポリペプチドを使用して治療できる疾患および障害の例を以下に示す。
【０１１９】
アルファ−１アンチトリプシン疾患（ＡＡＴＤ）、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）、特発性肺疾患（ＩＰＤ）、重症持続性喘息、運動およびアスピリン誘発喘息、アレルギー性鼻炎、珪肺症。
【０１２０】
自己免疫性水疱症、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、乾癬、チャーグ−ストラウス症候群。
【０１２１】
関節リウマチ、骨破壊性関節炎、閉経後骨粗鬆症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、炎症性腸疾患、グッドパスチャー症候群および糸球体腎炎を含む血管炎、全身性硬化症、２型糖尿病、糖尿病性腎症、鎌状赤血球症（ＳＣＤ）、マラリア、外傷、心筋梗塞、閉塞性睡眠時無呼吸症候群、アテローム動脈硬化症、冠動脈形成術後の再狭窄、多発性硬化症（ＭＳ）、神経障害。
【０１２２】
膵臓がん、卵巣がん、結腸がん、前立腺がん、肺がん、食道がん、がん転移。
【０１２３】
シェーグレン性ドライアイ、移植片対宿主症候群性ドライアイ、乾性角結膜炎、アトピー性角結膜炎、粘膜類天疱瘡、春季カタル、眼瞼角結膜炎、通年性角結膜炎、眼性エリテマトーデス（Ｏｃｕｌａｒ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、眼型酒さ、トラコーマ、細菌性、ウイルス性または真菌性角膜炎、眼単純ヘルペスまたは帯状疱疹、遺伝性、外傷性、網膜色素変性症、未熟児網膜炎、ダウン症候群、骨形成不全症、アジソン病、レーバー先天黒内障、およびエーラス−ダンロス症候群の種類を含むが、それに限定されない円錐角膜、地図状斑点状指紋角膜変性症、フックス角膜変性症、格子状角膜変性症、光線角膜炎、前部ぶどう膜炎、翼状片、自己免疫性ぶどう膜炎、アレルギー性結膜炎。
【０１２４】
本発明により治療することができるいくつかの特異的障害の例には、ぶどう膜炎、アトピー性皮膚炎、接触過敏症、潰瘍性大腸炎、食道腺がん、膵臓腺がん、乳がん、卵巣がん、結腸がん、肺がん、ざ瘡、閉塞性細気管支炎、動脈瘤、歯周病、嚢胞性線維症、前立腺がん、炎症後色素沈着、線維筋痛症、全身性エリテマトーデス、腫瘍転移、強皮症、多発性硬化症、サルコイドーシス、放射線誘発胃腸炎、および痛風が含まれる。
【０１２５】
本発明により治療することができるさらなる症状および障害には、喘息、気管支炎、アテローム動脈硬化症、乾癬、乾癬性関節炎、炎症性腸疾患（クローン病を含む）、敗血症、動脈炎、心筋梗塞、脳卒中、および冠動脈疾患、虚血再灌流傷害、腎炎ならびに関節リウマチ、脊椎関節症、骨関節炎、および若年性関節炎を含む関節炎が含まれる。本発明により治療することができる、ＬＴＢ４によって媒介されることが公知の症状には、閉塞性細気管支炎、強皮症、間質性肺疾患、歯周病、慢性Ｂ細胞性白血病、前立腺がんおよびアテローム動脈硬化症が含まれる。本発明により治療することができる、ＬＴＢ４および補体によって媒介されることが公知の症状には、腎炎、様々な種類の関節炎、ぶどう膜炎、がん、敗血症、虚血再灌流傷害、脳卒中および心筋梗塞が含まれる。
【０１２６】
最も好ましくは、本発明は、ＡＡＴＤ、ＣＯＰＤ、ＰＡＨ、重症持続性喘息、ＧＶＨＤ、水疱形成皮膚疾患および乾癬の治療に使用される。
【０１２７】
補体およびＬＫ／Ｅ活性
本発明の改変コバーシンポリペプチドは、ロイコトリエンまたはヒドロキシエイコサノイド結合活性を示す。配列番号２または３におけるアミノ酸配列への改変の結果として、改変コバーシンポリペプチドは、また、減少した補体Ｃ５結合活性を（配列番号２または配列番号３における未改変コバーシンアミノ酸配列と比較して）示すか、または補体Ｃ５結合活性を示さない。
【０１２８】
減少したＣ５結合性／Ｃ５結合性の欠如
本発明の改変ポリペプチドが、Ｃ５多型を有する対象からのＣ５を含む補体Ｃ５タンパク質に結合する能力は、当技術分野において公知の標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば、タンパク質をゲル上で標識Ｃ５と共にインキュベーションした後のウエスタンブロットまたは表面プラズモン共鳴によって決定され得る（例えば実施例２を参照されたい）。
【０１２９】
野生型コバーシンは、ラット、マウスおよびヒト血清中でＣ５に結合し、Ｃ５コンバターゼによるＣ５の開裂を約０．０２ｍｇ／ｍｌのＩＣ５０で防止する。コバーシンタンパク質は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を使用して決定された１ｎＭのＫＤでＣ５に結合することが実証されている（例えば、実施例２を参照されたい）。
【０１３０】
改変コバーシンポリペプチドは、好ましくは、未改変コバーシンポリペプチドと比較してＣ５に減少した結合能を示す。好ましい実施形態では、改変コバーシンポリペプチドは、Ｃ５に検出可能な結合性を示さなくてもよい。
【０１３１】
本発明の一部の実施形態では、Ｃ５結合性は、例えば、配列番号２または３における未改変コバーシンポリペプチドによって示される結合性と比べて少なくとも２分の１、５分の１、１０分の１、１５分の１、２０分の１、５０分の１、１００分の１に減少する、または消失する。
【０１３２】
一部の実施形態では、Ｃ５結合性は、配列番号２または３における未改変コバーシンポリペプチドと比べて少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％減少する。
【０１３３】
一部の実施形態では、改変コバーシンポリペプチドは、Ｒｏｖｅｒｓｉら（２０１３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８８、１８７８９〜１８８０２に記載される方法により、または実施例２に示されるように表面プラズマ共鳴によって決定されるとき、１マイクロモル濃度よりも大きいＫＤでＣ５と結合する。
【０１３４】
一部の実施形態では、改変コバーシンポリペプチドは、全プール正常血清中に０．０２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する場合、Ｇｉｃｌａｓ  １９９４によりまたはそれと同様になされたＣＨ５０溶血アッセイでヒツジ赤血球の溶解を１０％未満阻害する。
【０１３５】
本発明の改変ポリペプチドがＣ５に結合する能力は、薬剤が血清中で補体活性化を阻害する能力を測定することによって決定され得る。例えば、血清中の補体活性は、当技術分野において公知の任意の手段によって測定することができる。
【０１３６】
影響を受けないＬＫ／Ｅ結合性
本発明の改変コバーシンポリペプチドは、ＬＫ／Ｅ（例えばロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４））の活性を阻害し得る。特に、本発明の改変コバーシンポリペプチドは、このような分子と結合し得る。薬剤がこれらの分子と結合する能力は、当技術分野において公知の標準的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって、例えば、コバーシンと、標識ＬＫ／Ｅ（例えばＬＴＢ４）への結合を競合する抗ＬＫ／Ｅ（例えば抗ＬＴＢ４）抗体との間の競合ＥＬＩＳＡによって決定され得る。このようなアッセイは、Ｒｏｖｅｒｓｉら、２０１３に示される。
【０１３７】
本発明による改変コバーシンポリペプチドは、野生型コバーシンと同じか、またはより大きい親和性でＬＫ／Ｅと結合し得る。結合のいくらかの減少も許容され得る。
【０１３８】
コバーシンのＬＴＢ４結合性は、また、蛍光滴定によって決定されたＫＤによって表現され得る。蛍光滴定を使用して得られるデータは、野生型コバーシンが、ＬＴＢ４と２００〜３００ｐＭのＫＤで結合することを示している。本発明による改変コバーシンポリペプチドは、好ましくは、ＬＴＢ４と５ｎＭ、２ｎＭ、または１ｎＭ未満、より好適には０．９ｎＭ未満、最も好適には０．８ｎＭ未満、好ましくは０．７ｎＭ未満、より好ましくは０．６ｎＭ未満、好ましくは０．５ｎＭ未満、さらにより好ましくは０．４ｎＭ未満、有利には０．３ｎＭ未満のＫＤで結合し、その際、前記ＫＤは、例えば実施例３に記載される方法により蛍光滴定を使用して決定される。
【０１３９】
一部の実施形態では、改変コバーシンポリペプチドは、Ｒｏｖｅｒｓｉら（２０１３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８８、１８７８９〜１８８０２に記載されるＥＬＩＳＡ方法論に従ってＬＴＢ４への結合を抗体と競合する。
【実施例１】
【０１４０】
大腸菌におけるコバーシンバリアントの発現
コバーシンバリアント１（配列番号５）および２（配列番号６）をコードする遺伝子構築物を大腸菌発現ベクターにクローニングし、次いでそれを大腸菌発現株内に形質転換した。次に、確立された発酵プロトコールを使用して、複合培地を用いて細菌培養物の発酵を行った。
【０１４１】
結果として生じる清澄な細胞培養液を２０ｍＭビストリス緩衝液、ｐＨ６．０中で濃縮し、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用し、次いで同緩衝液中ＮａＣｌ段階的勾配をかけて溶出した。次に、Ｐｈｅｎｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰカラムを用いて、２０ｍＭビストリス緩衝液中で（ＮＨ４）２ＳＯ４の直線勾配を使用して精製画分を泳動した。クロマトグラフィー画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、プールした。コバーシンバリアント１について、プールしたタンパク質画分をＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５ゲル濾過カラムに適用するさらなる精製ステップを行った。コバーシンバリアント２について、プールしたタンパク質画分をＱ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅイオン交換カラムに適用するさらなる精製ステップを実施した。
【０１４２】
次に、野生型コバーシンと一緒に、バリアント１および２の精製画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで泳動した。結果を図３に示すが、これは両方のコバーシンバリアントが大腸菌において十分に発現することを実証している。
【実施例２】
【０１４３】
コバーシンバリアント１および２は、野生型コバーシンと比べてＣ５結合活性を失っている
野生型コバーシンのＣ５への結合活性をコバーシンバリアント１および２の結合活性と比較して測定するために、Ｂｉａｃｏｒｅ装置（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するＳＰＲ実験を実施した。０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を有するＨＥＰＥＳ緩衝食塩水を流動緩衝液として流速３０μｌ／分で使用し、ヒトＣ５を合計４８００ＲＵまでＣＭ３センサーチップ上に固定化した。
【０１４４】
ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてリアルタイム親和性測定を２５℃で行った。最初に、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、ＣＭ３センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にヒトＣ５（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｔｙｌｅｒ、ＴＸ、ＵＳＡ）を１０ｍＭ  酢酸Ｎａ、ｐＨ５．０中に濃度２５μｇ／ｍＬで固定化し、４２００〜４８００共鳴ユニット（ＲＵ）のリガンド密度にした。精製コバーシンバリアント２およびバリアント１を、希釈系列（コバーシンについて０〜９６ｎＭ）またはバリアントの場合は１μＭで、流動緩衝液として０．０５％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ２０含有ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水（ＨＢＳ；１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）（ＨＢＳＴ−０．０５）の存在下で注入した。補体の形成を、３０μｌ／分の連続流速で２４０秒かけて観察した。続いて、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  Ｇｅｎｔｌｅ  Ａｇ／Ａｂ溶出緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）８μｌで再生するまえに、解離を９００秒間進行させて、コバーシンとＣ５との間の強い静電相互作用を破壊し、その後、１ｍＭ  ＥＤＴＡ含有ＨＢＳＴ−０．０５  １２０μｌおよびＨＢＳＴ−０．０５  １２０μｌを注入してフローセルを洗浄した。インラインの対照ブランクチャネルについて測定した対応シグナル、および以前に報告された３回の緩衝液ブランク注入から決定した平均ベースライン（Ｍｙｓｚｋａ  Ｄ．Ｇ．（１９９９）Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２（５）：２７９〜２８４）の２つを差し引くことによって、センサーグラムを補正した。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、二分子複合体形成についてのラングミュア結合モデルへのデータのグローバルフィットを行うことによって、速度パラメーターを決定した。
【０１４５】
図４ａに示すように、コバーシンは、１．４５ｎＭのＫＤで固定化Ｃ５に結合した。対照的に、１μＭのコバーシンバリアント１および２の単回測定を用いて同じ実験を実施した場合、どちらも有意な反応を生じなかったが、これは、どちらのバリアントもＣ５に結合しないことを実証している。コバーシンバリアント１および２のＰＡＳ化バージョンも試験し、類似の結果が得られた（図４Ｂ）。
【実施例３】
【０１４６】
コバーシン／バリアントは、ＬＴＢ４とピコモル濃度範囲で結合する
野生型コバーシンおよびバリアント１およびバリアント２ならびにそのＰＡＳ化バージョンについて、ＬＴＢ４へのコバーシン結合性の蛍光滴定を実施した。
【０１４７】
リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中のコバーシン、バリアント１およびバリアント２ならびにそのＰＡＳ化バージョンのＬＴＢ４（Ｃａｙｍｅｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、ＵＳＡ）に対する結合活性をＬＳ５０Ｂ分光蛍光計（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ、ＵＳＡ）で定量した。ＰＢＳ  ２ｍＬ中のタンパク質の精製１００ｎＭ溶液を、磁器スターラーを備える石英キュベット（経路長１０ｍｍ；Ｈｅｌｌｍａ、Ｍｕｈｌｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に適用した。温度を２０℃に調整し、平衡に達した後、タンパク質のＴｙｒ／Ｔｒｐの蛍光を２８０ｎｍで励起させた（スリット幅：１５ｎｍ）。最大発光に対応する蛍光発光を３４０ｎｍで測定した（スリット幅：１６ｎｍ）。ＰＢＳ中の３０μＭ  ＬＴＢ４リガンド溶液を、最大体積２０μＬ（全試料体積の１％）まで段階的に添加し、３０秒インキュベーション後に定常状態の蛍光を測定した。ＫＤ値の計算のために、初期蛍光強度１００％に対してデータを規準化し、３μＭ  Ｎ−アセチル−トリプトファンアミド溶液の滴定を使用してインナーフィルター効果を補正し、対応するリガンド濃度に対してデータをプロットした。次に、二分子複合体の形成についての質量作用の法則に基づく非線形最小二乗回帰を使用して、公表された式（Ｂｒｅｕｓｔｅｄｔら、２００６  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｌｉｇａｎｄ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｅｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎｓ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７６４（２）：１６１〜１７３）を用いてＯｒｉｇｉｎソフトウェアバージョン８．５（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ、Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）によりデータをフィットした。
【０１４８】
図５ＡおよびＢは、コバーシンバリアントと、そのＰＡＳ化バージョンとの両方がＬＴＢ４結合活性を保持し、ＬＴＢ４とピコモル濃度範囲のＫＤで結合することを示す。
【実施例４】
【０１４９】
ＣＤ分光法を使用する熱安定性の分析
円二色性を使用して、熱変性の結果としてのタンパク質アンフォールディングを検出した。この方法を使用して、野生型コバーシン、コバーシンバリアント１およびコバーシンバリアント２の融解温度を得た。
【０１５０】
両方ともＳｐｅｃｔｒａ  Ｍａｎａｇｅｒバージョン１．５３．０５装置ソフトウェアによって制御されるペルチェ素子ＰＴ−４２３Ｓを備えるＪ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）で熱アンフォールディングを測定した。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ＬｙｚｅｒＴＭミニ透析装置（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用して、４℃で一晩透析することによりタンパク質溶液を２０ｍＭ  ＫＰｉ  ｐＨ７．５、５０ｍＭ  Ｋ２ＳＯ４に緩衝液交換し、石英キュベット（１ｍｍ経路長；Ｈｅｌｌｍａ）中タンパク質濃度１２．５μＭで、２０℃および９４℃、１９０ｎｍ〜２５０ｎｍでスペクトルを記録した。このようにして、変性研究のために最適なシグナル変化を２１７ｎｍで特定した。タンパク質溶液を用いて２０℃から９４℃に勾配６０Ｋ／ｈで加熱して融解温度（Ｔｍ）を決定した。データを２１７ｎｍで記録し、公表された式（ＳｃｈｌｅｈｕｂｅｒおよびＳｋｅｒｒａ、２００２  Ｔｕｎｉｎｇ  ｌｉｇａｎｄ  ａｆｆｉｎｉｔｙ、ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ、ａｎｄ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ａｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｌｉｐｏｃａｌｉｎ  ｖａｒｉａｎｔ  −−  ａ  ｓｏ−ｃａｌｌｅｄ  ’ａｎｔｉｃａｌｉｎ’  −−  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｒａｎｄｏｍ  ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｃｈｅｍ．９６（２〜３）：２１３〜２２８）を使用して、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェア（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｒｅａｄｉｎｇ、ＰＡ、ＵＳＡ）でタンパク質フォールディングの二状態モデルにより評価した。
【０１５１】
アンフォールディングしたタンパク質画分を温度に対してプロットして、図６の融解曲線、ならびに野生型コバーシン、バリアント１およびバリアント２の融解温度についての値を得た。図６に示すように、野生型コバーシンは、融解温度６１．０６℃±０．０３℃を有し、バリアント２は、融解温度５７．８３℃±０．０４℃を有し、バリアント１は、融解温度５０．１６℃±０．０６℃を有する。
【実施例５】
【０１５２】
コバーシンバリアントはＣ５阻害活性を示さない
Ｃ５に対するコバーシン／コバーシンバリアント１および２の阻害効果を評価するために、精製コバーシンタンパク質を用いて、下記プロトコールを使用してＣＨ５０アッセイを実施した。
【０１５３】
Ｇｉｃｌａｓら、１９９４の方法により、ウサギ溶血素（Ｓｉｇｍａ）を使用してヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を感作した。プールした正常ヒト血清（ＮＨＳ）をカルシウムおよびマグネシウム補充ゼラチンベロナール緩衝食塩水で１：８０希釈したもの２５μｌおよび感作ＳＲＢＣ  ２５μｌを使用する合計体積５０μｌでアッセイを行った。全ての溶解アッセイ物を氷上に配置した。コバーシン、コバーシンバリアント１およびコバーシンバリアント２の系列希釈物を希釈ＮＨＳ中に調合した。アッセイ物を３５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。４０００ｇで５秒間マイクロ遠心して反応を停止させ、上清を平底９６ウェルプレートに取り出した。ｄｄＨ２Ｏ  １００μｌを各ウェルに添加し、タンパク質の存在下の溶解パーセンテージを、希釈ＮＨＳの代わりに水２５μｌを反応物に添加することによって誘導された総溶解に対するパーセンテージとして計算した。
【０１５４】
Ｃ５に対する各タンパク質の阻害効果を、各コバーシンタンパク質の存在下で細胞の溶解パーセンテージにより評価した。一連のコバーシンタンパク質濃度に沿って細胞溶解の尺度として４０５ｎｍでの吸光度の測定値を取得した。
【０１５５】
図７は、異なる濃度の野生型コバーシンを含有する試料中の細胞溶解のパーセンテージが各濃度で１０％未満に維持されたことを示し、これは、野生型コバーシンによるＣ５の公知の阻害効果を実証している。対照的に、両方のコバーシンバリアントを異なる濃度で含有する試料中の細胞のほぼ全てが溶解したが、これは、どちらのバリアントもＣ５に対して検出可能な阻害活性を全く有さないことを示している。
【実施例６】
【０１５６】
Ｌ−コバーシンは喘息のＨＤＭマウスモデルにおいて顆粒球の浸潤を減少させる
コバーシンバリアントのｉｎ  ｖｉｖｏ効果を試験するために、チリダニ（ＨＤＭ）アレルゲンによって誘発される喘息のマウスモデルにバリアント２を導入した（Ｇｒｅｇｏｒｙ、Ｌ．Ｇら、２００９を参照されたい）。以下に概略を示すように６群のマウスを試験した：
１．  ＰＢＳ（ｎ＝４）
２．  Ｌ−コバーシン（ｎ＝４）
３．  ＨＤＭ（ｎ＝６）
４．  ＨＤＭ／Ｌ−コバーシン（ｎ＝６）
【０１５７】
マウス４〜６匹の群に、ＰＢＳ  ５０μｌ中のＨＤＭ  ２５μｇを１週間に３回、３週間、気管内（ｉ．ｔ．）投与した。ＰＢＳ  ５０μｌ中のＬ−コバーシン１００μｇを毎日３週間投与した。同じ投薬レジメンでＰＢＳを対照に投与した（群１）。
【０１５８】
次に、気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好酸球および好中球のレベルを各群について試験した。結果を図８に示す。図８は、Ｌ−コバーシンがＨＤＭのみの対照と比べて気管支肺胞洗浄液中の好中球数に有意な減少を引き起こし、好酸球数に有意に近い減少を引き起こすことを示す。
【実施例７】
【０１５９】
ＥＢＡ導入モデルにおけるＰＡＳ化Ｌ−コバーシン
Ｓｉｔａｒｕら、２００５によって記載されたプロトコールの修正版を使用して、抗体導入後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）を誘導した。簡潔に言うと、マウスにアフィニティー精製抗Ｃｏｌ７  ＩｇＧ、５０μｇを０、２、および４日目に皮下注射した。抗Ｃｏｌ７  ＩｇＧの最初の注射の４日前（−２日目）から開始して、コバーシンまたはＰＡＳ化Ｌ−コバーシン（ＰＡＳ化バリアント２）をマウスに１日２回皮下注射した。この適用を１１日目の実験最終日まで実験全体にわたり継続した。対照群では、マウスに皮下のビヒクルのみ投与した。
【０１６０】
マウスＶＩＩ型コラーゲン（「抗ＣＯＬ７」）に対する抗体を生成するために、ニュージーランドホワイトウサギに、コラーゲンＶＩＩの非コラーゲン１（ＮＣ１）ドメイン由来の３種の異なる組換えタンパク質（「Ｃｏｌ７Ａ、Ｂ、およびＣ」）を含有するタンパク質混合物２００μｇをフロイント不完全アジュバントと一緒に免疫処置した。免疫処置されたウサギの血清から、プロテインＧの使用によりＩｇＧを単離し、その後、ｈｉｓ−Ｃｏｌ７を用いてＩｇＧをアフィニティー精製して、特異的にウサギ抗Ｃｏｌ７  ＩｇＧを得た。凍結切片アッセイで力価および効力を決定することによって抗体の品質をチェックした。
【０１６１】
４日目に開始して、１日おきに各個別のマウスにおける皮膚病変の程度をスコア付けした。紅斑、水疱、びらん、痂皮、または脱毛を示している皮膚領域を、熟練の観察者が「罹患」または「非罹患」として分類した［Ｓｉｔａｒｕら、２００５］。皮膚病変に冒された総体表面（ＡＢＳＡ）のパーセンテージを計算した。
【０１６２】
実験結果を図９に示す。コバーシンで処置されたマウスにおけるＡＢＳＡのパーセンテージが減少し、ＰＡＳ化Ｌ−コバーシンバリアント２  １０ｍｇ／ｋｇで処置されたマウスにおけるＡＢＳＡも減少したことが分かる。使用したＰＡＳ−Ｌ−コバーシン配列は、ＰＡＳ配列がバリアント２のＮ末端に融合したものであった。ＰＡＳ−Ｌ−Ｃｏｖの分子量がより高いせいで、１０ｍｇ／ｋｇ  ＰＡＳ−Ｌ−Ｃｏｖが２．５ｍｇ／ｋｇコバーシンに相当する。
【０１６３】
参考文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2020517260.tif 000004
【図２Ａ】
2020517260.tif 000005
【図２Ｂ】
2020517260.tif 000006
【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2020517260.tif 000009
【図５Ａ】
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【図５Ｂ−１】
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【図５Ｂ−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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