(57)【要約】マイクロ流体デバイスを使用した、ユーザー定義された配列制御されるバイオポリマーの自動化された鋳型なしの合成のための方法が、記載される。これらの方法は、マイクロ流体およびＥＷＯＤベースのシステムを使用した、流体液滴としての試薬の制御された移動および合わせることからの、最大で数千の独自にアドレス指定されたバイオポリマーの同時の合成を促進する。一部の形態では、核酸、ペプチド、炭水化物および脂質を含むバイオポリマーは、液滴移動のユーザー定義された配列に基づいた、構築ブロックの段階的アセンブリから合成される。一部の形態では、これらの方法は、最大で１，０００ヌクレオチド長の独自にアドレス指定された核酸を合成する。バイオポリマー上のバーコードを付加、除去および変化させるための方法もまた、提供される。
2020523997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
鋳型の非存在下で所望のサイズおよび配列を有するバイオポリマーを合成するための方法であって、
（ａ）マイクロ流体デバイス上で、コンポーネント始動配列を含む液滴を、コンポーネント構築ブロックおよび結合触媒を集合的に含む１つまたは複数の液滴と合わせて、合わせた液滴を形成するステップであって、
前記合わせるステップの前に、コンポーネント始動配列を含む前記液滴と、前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含む前記液滴の各々とが、前記マイクロ流体デバイス上の異なる位置にあり、
さらなるコンポーネント構築ブロックを各々が含む１つまたは複数のさらなる液滴が、前記マイクロ流体デバイス上で、前記コンポーネント配列を含む前記液滴、前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含む前記液滴、または前記合わせた液滴とは異なる位置にあり、
前記合わせるステップが、前記結合触媒が前記コンポーネント始動配列を前記コンポーネント構築ブロックに結合させてバイオポリマーを形成するのに適切な条件を含む、ステップ；ならびに
（ｂ）ステップ（ａ）を必要に応じて反復して、前記バイオポリマーへのコンポーネント構築ブロックの段階的付加を実施して、予め選択された所望のポリマー配列および長さを有するバイオポリマーを形成するステップ
を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の、前記コンポーネント始動配列を前記コンポーネント構築ブロックと結合させてバイオポリマーを形成するのに適切な前記条件が、前記合わせた液滴を、洗浄試薬、遮断試薬および停止試薬からなる群から選択される１つまたは複数の試薬と接触させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記洗浄試薬、遮断試薬および停止試薬の各々が、前記マイクロ流体デバイス上の独立した液滴として提供される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）の液滴を合わせるステップが、光ファイバーによって提供される電荷を使用して、前記マイクロ流体デバイス上の前記液滴のうち１つまたは複数を移動させることによって達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記所望のポリマー配列を産生するための前記マイクロ流体デバイス上の各液滴の移動のシークエンスが、コンピューター可読プログラムの形態で提供される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
２つまたはそれよりも多くのバイオポリマーが、同じマイクロ流体デバイスの異なる位置において同時にまたは連続的に合成される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記２つまたはそれよりも多くのバイオポリマーが、異なる配列、異なるサイズ、または異なる配列および異なるサイズの両方を有する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記２つまたはそれよりも多くの合成されたバイオポリマーの各々が、同じマイクロ流体デバイス上の明確に異なる位置において合成および精製される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記２つまたはそれよりも多くのバイオポリマーの各々が、独自のアドレスタグを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記コンポーネント始動配列が、安定な支持体マトリックスにカップリングされる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記支持体マトリックスがビーズである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ビーズが磁性ビーズである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記液滴が、１フェムトリットル（ｆｌ）と１００マイクロリットル（μｌ）との間、好ましくは１ピコリットル（ｐｌ）と１ナノリットル（ｎｌ）との間の体積を有する水性液滴である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記マイクロ流体デバイス上での前記液滴の創出、移動および合わせることが、コンピュータープログラムによって制御される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
（ｃ）前記マイクロ流体デバイス上で前記合成されたバイオポリマーを、操作、精製または単離するステップ
をさらに含む、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｃ）の、前記合成されたバイオポリマーを操作するステップが、前記バイオポリマーにおいて１つまたは複数の構造的または機能的変化を誘導することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｃ）の、前記合成されたバイオポリマーを単離するステップが、複雑度を低減するステップを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記複雑度を低減するステップが、質量、サイズ、電気化学的電荷、疎水性、ｐＨ、融解温度、コンフォメーション、および１つまたは複数のリガンドに対する親和性からなる群から選択される１つまたは複数の特性に基づいて、前記合成されたバイオポリマーを単離するステップを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｃ）の、前記合成されたバイオポリマーを操作するステップが、色素、蛍光分子、放射能標識、親和性タグおよびバーコードからなる群から選択される１つまたは複数の標識を、前記バイオポリマー中に取り込むことを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ａ）の前に、前記コンポーネント始動配列、前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含むレザバから前記液滴を分割することによって、１つまたは複数の、前記コンポーネント始動配列を含む前記液滴ならびに前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含む前記液滴を形成することをさらに含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ａ）の前に、さらなるコンポーネント構築ブロックを集合的に含むレザバから、さらなる液滴を分割することによって、１つまたは複数の前記さらなる液滴を形成するステップをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記バイオポリマーが核酸である、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸が、１００塩基長と１００，０００塩基長との間、２００塩基長と１０，０００塩基長との間、５００塩基長と５，０００塩基長との間、または１，０００塩基長と３，０００塩基長との間の長さを有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記コンポーネント構築ブロックのうち１つまたは複数が、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、ウリジン、イノシン、ウリジン、キサントシンおよびプソイドウリジンからなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸が一本鎖ＤＮＡである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記結合触媒が、ＴｄＴ、Ｑベータレプリカーゼおよびテロメラーゼからなる群から選択されるポリメラーゼ酵素である、請求項２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｃ）が、前記合成された核酸を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記合成された核酸を配列決定するステップをさらに含む、請求項２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
１つまたは複数の液滴が、制限エンドヌクレアーゼ、および前記制限エンドヌクレアーゼの効率的な機能のための１つまたは複数の適切な緩衝液を含む、請求項２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
核酸配列の自動化された操作のための方法であって、マイクロ流体デバイス上で、前記核酸配列および１つまたは複数のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ酵素を合わせるステップを含み、
前記合わせるステップが、前記１つまたは複数のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ酵素が前記核酸配列から１つまたは複数のヌクレオチドを除去または分解して分解された核酸を産生する条件を含む、方法。
【請求項３１】
前記核酸が、固体支持体または表面上に固定化される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記分解された核酸を精製するステップをさらに含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記分解された核酸を精製するステップが、前記マイクロ流体デバイス上の前記分解された核酸を洗浄して、前記１つまたは複数のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ酵素を除去するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記マイクロ流体デバイス上で前記分解された核酸に１つまたは複数のヌクレオチドを付加して、改変された核酸を形成するステップをさらに含む、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記分解された核酸に１つまたは複数のヌクレオチドを付加するステップが、
（ａ）前記マイクロ流体デバイス上で、前記分解された核酸を含む液滴を、コンポーネント構築ブロックおよび結合触媒を集合的に含む１つまたは複数の液滴と合わせて、合わせた液滴を形成するステップであって、
ここで、前記合わせるステップの前に、前記分解された核酸を含む前記液滴、ならびに前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含む前記液滴の各々が、前記マイクロ流体デバイス上の異なる位置にあり、
前記合わせるステップが、前記結合触媒が前記分解された核酸を前記コンポーネント構築ブロックに結合させて改変された核酸を形成するのに適切な条件を含む、ステップ；ならびに
（ｂ）ステップ（ａ）を、必要に応じて１または複数回反復するステップ
を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記核酸が、ビットストリームデータをコードする、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記操作が、バーコードである前記核酸中の領域において実施される、請求項３０から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記マイクロ流体デバイスが、誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）デバイスである、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記核酸がバーコードである、請求項２２または２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記バーコードが、核酸メモリ物体に結合されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記バーコードが、コンセプトまたはメタデータと関連付けられた前記バーコードの正確な配列ではなく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個の変異、または２５個よりも多い変異だけ、前記バーコードから変異されている、請求項３９または４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記変異されたバーコードが、前記核酸メモリ物体内に含まれるメタデータと関連付けられたバーコードハッシュテーブル中に保持される最も近いバーコードのメタデータまたはコンセプトと関連付けられる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記変異されたバーコードが、バーコードハッシュテーブル中に保持される最も近いバーコードのメタデータまたはコンセプトのバリエーションと関連付けられる、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記バーコードが、前記核酸メモリ物体中に含まれる前記核酸配列の生物学的情報を記述するメタデータと関連付けられる、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸配列が、核酸メモリ物体内にカプセル化され、ここで、前記核酸メモリ物体は、遺伝子をコードし、前記バーコード配列は、遺伝子名、前記遺伝子の変異、供給源生物、遺伝子長さ、前記遺伝子によってコードされるタンパク質、および前記コードされたタンパク質の１つまたは複数のリガンドからなる群から選択される１つまたは複数の特色を記述する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記バーコードが、前記核酸メモリ物体中に含まれるＤＮＡ配列中に含まれるデジタル情報を記述するメタデータと関連付けられる、請求項３９から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記核酸配列が、１つまたは複数の画像についての情報をコードし、前記メタデータバーコードが、前記画像中の任意の所与の特徴の量を含み、前記バーコードの１つまたは複数の点変異が、変動する量のその特徴と関連付けられる、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記画像の前記特徴が、１つまたは複数の色の強度である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＤＮＡ配列が、１つまたは複数の画像のデジタル表示をコードし、前記メタデータバーコードが、前記１つまたは複数の画像中の物体の記述を含み、請求項４２に記載の前記バーコードの前記変異が、前記物体との類似性と関連付けられる、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、２０１７年６月１９日出願の米国特許出願第６２／５２１，６１２号に対する優先権の利益を主張し、その内容は、その全体が参照によって組み込まれる。
政府支援による研究に関する陳述
【０００２】
本発明は、Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｎａｖａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈによって授与された助成金番号Ｎ０００１４−１６−１２１９５３および助成金番号Ｎ０００１４−１７−１−２６０９、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓによって授与された助成金番号ＤＥ−ＳＣ０００１０８８、ならびにＮａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって授与された助成金番号ＣＣＦ−１５６４０２５の下で、政府の援助を得て行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
配列表に対する言及
【０００３】
２０１８年６月１９日に作成され、５，０００バイトのサイズを有する、名称「ＭＩＴ＿１９６２０  ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のテキストファイルとして２０１８年６月１９日に提出された配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従って、参照によって本明細書に組み込まれる。
発明の分野
【０００４】
本発明は、核酸および他のバイオポリマーの自動化されたｄｅ  ｎｏｖｏ合成に関し、特に、バイオポリマーのハイスループットな動的産生のための、誘電体エレクトロウェッティング（ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ  ｏｎ  ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ）、マイクロ流体および液体ハンドリングテクノロジーの使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
ＤＮＡ合成は、しばしば、ＤＮＡ配列決定の成功に続いて起こる次世代の問題とみなされる。この全体的な見通しは、その目的が合成ヒトゲノムの合成であるＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｗｒｉｔｅなどの最近の試みによって具体化されている。ＤＮＡの長い鎖（即ち、２，０００塩基よりも大きい）の合成の必要性は、Ｙｅａｓｔ  ２．０、ｍｉｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｊｅｃｔｓによってさらに示されており、合成生物学の基礎的な実現テクノロジーである。
【０００６】
ＤＮＡ合成のための２つの主要なアプローチは、ホスホラミダイト（化学的）合成および酵素的合成である。オリゴヌクレオチド（オリゴ）の合成は、溶液ベースの合成を使用して、Ｔｏｄｄ、Ｋｈｏｒａｎａおよび共同研究者によって１９５０年代に最初に達成された（Ｔｏｄｄ，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ｐｐ．  ２６３２−２６３８  （１９５５）；Ｋｈｏｒａｎａ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ７９  （４）：  ｐｐ．１００２−１００３  （１９５７））。１９８０年代には、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓが、ホスホラミダイトシントンを使用した不溶性支持体上でのオリゴヌクレオチド合成を開発し、これは現在、オリゴヌクレオチド鎖を合成するための優勢な方法である（Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ．  Ｌｅｔｔ．  ２２：１８５９−１８６２（１９８１））。ホスホラミダイト前駆体を使用してオリゴヌクレオチドを合成するための最初のステップは、制御された細孔ガラス（不溶性支持体）に共有結合した２’−デオキシヌクレオシドから、５’−ジメトキシトリチル保護基を切断することである。次いで、保護された２’−デオキシヌクレオシド−３’−ホスホラミダイトが、添加されたホスホラミダイトを活性化するテトラゾールを用いて、支持体に付加される。共有結合的亜リン酸トリエステル連結の形成が、３０秒以内に生じる。次に、ピリジンと共に無水酢酸を使用するアセチル化ステップが、全ての未反応の２’−デオキシヌクレオシドをキャップし、核酸塩基から亜リン酸付加物を除去する。最後に、ヨウ素を用いた酸化ステップが、亜リン酸連結をリン酸基に変換する。このサイクルは、所望のオリゴ配列が合成されるまで反復され、次いで、オリゴは、固体支持体から切断される。このカラムベースのアプローチを使用した９６〜７６８個のオリゴヌクレオチドの同時の合成が、現在実行可能である。しかし、カラムベースのアプローチを使用して合成できるオリゴの長さは、最大で僅か２００ヌクレオチドに制限される（Ｋｏｓｕｒｉ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １１（５）：  ４９９：５０７（２０１４））。他のハイスループットオリゴ合成アプローチは、近年急速に普及している。これもまたホスホラミダイトシントンを利用するマイクロアレイベースのアプローチが、短いオリゴヌクレオチド鎖の大規模合成にとって魅力的である（Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５１：  ｐｐ．７６７−７７３  （１９９１）；  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９１：  ｐｐ．５０２２−５０２６  （１９９４））。フォトリソグラフィー技術は、ホスホラミダイト前駆体を選択的に脱保護するためのアレイベースのオリゴ合成アプローチにおいて利用される。マイクロアレイ表面上でのヌクレオチドのインクジェットベースの印刷は、オリゴ合成のスループットを大きく増加させる（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９：  ３４２：３４７  （２００１））。
【０００７】
ＤＮＡの鋳型なしの合成は、生化学において非常に初期に発見され、Ａｒｔｈｕｒ  Ｋｏｒｎｂｅｒｇによって指摘された。他の初期の例には、Ｑベータレプリカーゼを用いた、鋳型なしのＲＮＡ重合が含まれる。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ；ターミナルトランスフェラーゼ）およびテロメラーゼは、生物学における２つのさらなる例であり、ここで、デオキシ核酸（ＤＮＡ）合成は、ＤＮＡ鋳型の非存在下で生じ得、このことは、第一鎖が必要とされないことを意味している（例えば、米国特許第８，８０８，９８９号および同第８，０７１，７５５号、ならびに米国特許出願公開第２００９／０１８６７７１号および同第２０１１／００８１６４７号および同第２０１３／０１８９７４３号を参照のこと）。ＴｄＴの場合、合成は、始動因子プライマーから、５’から３’の方向で生じ、周辺の溶液中の入手可能なデオキシリボ核酸三リン酸（ｄＮＴＰ）を付け足す。ＴｄＴは、１回または数回の取り込み後に鋳型から遊離し、新たなポリメラーゼが登場して、新たなヌクレオチドを取り付け続ける。現在、ヌクレオチドの取り込みの配列制御は、ホモポリマーの付加のサイクルにおいて、溶液への単一のヌクレオチドの添加、洗浄、および次のヌクレオチドの付加によって達成される。
【０００８】
一本鎖結合タンパク質（ＳＳＢ）は、多くの生物系において見出されるタンパク質であり、一本鎖ＤＮＡに非特異的に結合できる。これは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ）から市販されている。例えば、ＮＥＢは、核酸の増幅および配列決定にとって理想的な、高度に熱安定性のｓｓＤＮＡ結合タンパク質を提供している（Ｔｔｈ  ＲｅｃＡ、ＮＥＢ  ＃Ｍ２４０２；およびＥＴ  ＳＳＢ、ＮＥＢ  ＃Ｍ２４０１）。ＮＥＢは、電子顕微鏡を用いたＤＮＡ構造の可視化、およびＤＮＡライブラリーのスクリーニングにおける使用のためのｓｓＤＮＡタンパク質（Ｅ．ｃｏｌｉ  ＲｅｃＡ、ＮＥＢ  ＃Ｍ０２４９、ＮＥＢ  ＃Ｍ０３５５）、ならびに制限酵素消化を改善し、ＰＣＲ生成物の収量を増強するためのｓｓＤＮＡタンパク質（Ｔ４  Ｇｅｎｅ  ３２  Ｐｒｏｔｅｉｎ、ＮＥＢ  ＃Ｍ０３００）もまた提供する。
【０００９】
Ｒｏｂｅｒｔ  Ｂｒｕｃｅ  Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ８５（１４）：  ｐｐ．  ２１４９：２１５４  （１９６３））が先鞭をつけた不溶性固体支持体上でのペプチド合成は、ペプチドを合成するための標準的な方法である。遊離Ｎ末端アミンは、Ｎ−保護されたアミノ酸単位にカップリングされる。次いで、保護基は、別のＮ−保護されたアミノ酸が連結され得る遊離アミノ基を導入するために切断される。ペプチドは、固体支持体上で成長し、次いで最後に、遊離の合成されたペプチドを得るために切断される。必要に応じた洗浄ステップが、カラムから過剰な試薬を除去するために、サイクル中の各ステップに追加され得る。カラムアプローチを使用して合成できるペプチドの長さは、３０〜７０アミノ酸残基に制限される。より長いポリペプチドは、２つまたはそれよりも多くのポリペプチドを一緒に「縫い合わせる」ために、ネイティブケミカルライゲーションを使用することによって実現される。
【００１０】
ビオチンは、５’末端もしくは３’末端においてＤＮＡに共有結合され得る、またはタンパク質に共有結合的に付加され得る、小さい化学的付加物である。ストレプトアビジンは、約１０〜１４ｍｏｌ／ＬのＫｄでビオチンと堅固に結合するタンパク質であり、このシステムは、表面から構成される固相に、または物理的相互作用を介して操作され得るビーズ、例えば、磁気的に活性なビーズに、タンパク質またはＤＮＡを結合させるために使用される場合が多い。固相または表面支持体への共有結合または非共有結合の多くの他の方法は、当該分野で公知である。酵素は、プログラムされた合成などの機能的適用のために、それらの活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害する、減速させる、加速させるまたは他の方法で制御するために、温度、およびマグネシウムなどの二価イオンまたは薬物分子を含む小分子を使用して制御することもできる。標準的な制限酵素は、実用的な場合には配列特異的様式で、例えば、基材から核酸を切断および放出させるなどのために、合成されたＤＮＡを操作する方法もまた提供する。
【００１１】
種々の手段によって発動される流体移動の自動化された制御のためのマイクロ流体力学テクノロジーが存在する。例えば、誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）は、移動を見る、誘発電位による原動力を介して制御される、単一ピコリットル〜ナノリットルの液滴の移動を制御するための方法である（Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ａ：  Ｐｈｙｓｉｃａｌ，  ９５（２−３），  ｐｐ．  ２５９−２６８  （２００２））。典型的には、水溶液の液滴は、誘電体に対する誘発電位によって、ある位置において保持される。この液滴は、第２の隣接する位置に電位を移動させることによって、移動され得る。等しい電位を適用することによって、液滴は、分割または統合され得、液滴の移動は、混合を誘導し得る。あるいは、ＥＷＯＤデバイス中の液滴は、液滴運動を誘導する電位を創出する電極の光学的励起によって操縦される。光源は、異なる方向で液滴を発動させるために電位勾配を創出するような形状にされ得る。しかし、ＥＷＯＤを使用する現在の方法は、ＥＷＯＤ表面の面積および小滴の体積によって制限される。
【００１２】
核酸の配列としてのデジタル情報ストレージは、アーカイブメモリストレージのためのストレージ市場において目的とされている（Ｃｈｕｒｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ；Ｖ．  ３３７，  （６１０２），  ｐｐ．  １６２８  （２０１２）；Ｇｏｌｄｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ｖ．  ４９４，  ｐｐ  ７７−８０  （２０１３）；Ｚｈｉｒｎｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，  Ｖ．１５，  ｐｐ  ３６６−３７０  （２０１６））。プールからの特定のメモリの抽出の方法もまた以前に実行されており（Ｙａｚｄｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｖ．５，  Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：  １４１３８  （２０１５）；Ｂｏｒｎｈｏｌｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＩＥＥＥ  Ｍｉｃｒｏ  ３７  （３）；ｐｐ．  ９８−１０４  （２０１７）；およびＯｒｇａｎｉｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｖ３６，  ｐｐ．  ２４２−２４８  （２０１８））、プールから特定の配列を増幅するために、バーコードのハッシュテーブルセットと併せた、ポリメラーゼ連鎖反応の使用を具体的に示している。このアプローチは、ＰＣＲ交差反応性、および標的化された配列から外れる偽の配列の増幅に起因して、使用できるプールサイズによって制限される。さらに、ＰＣＲベースのアプローチを使用した各データ選択は、試料全体を最終的に再合成する必要がある、元の試料からのアリコートの抽出を必要とし、または酵素の導入によって元の試料を汚染する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第８８０８９８９号明細書
【特許文献２】米国特許第８０７１７５５号明細書
【特許文献３】米国特許出願公開第２００９／０１８６７７１号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１１／００８１６４７号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１３／０１８９７４３号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｔｏｄｄ，  Ｊ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ｐｐ．  ２６３２−２６３８  （１９５５）
【非特許文献２】Ｋｈｏｒａｎａ，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  ７９  （４）：  ｐｐ．１００２−１００３  （１９５７）
【非特許文献３】Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒ．  Ｌｅｔｔ．  ２２：１８５９−１８６２（１９８１）
【非特許文献４】Ｋｏｓｕｒｉ，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １１（５）：  ４９９：５０７（２０１４）
【非特許文献５】Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２５１：  ｐｐ．７６７−７７３  （１９９１）
【非特許文献６】Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ９１：  ｐｐ．５０２２−５０２６  （１９９４）
【非特許文献７】Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １９：  ３４２：３４７  （２００１）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
より効率的でより自動化可能な、より長いバイオポリマー鎖を産生する、またはこれらの特色の組合せを有する、バイオポリマー合成の方法が必要とされている。
スケーラブルで分離可能なアーカイブストレージのためのバイオポリマーの自動化されたカプセル化の方法もまた必要とされている。
カプセル化された生成物（例えば、保護されたバイオポリマー）を改変することなしに、動的に割り付けられ書き換えられ得るカプセル化された生成物を検索するためのバーコード合成の方法もまた必要とされている。
【００１６】
したがって、ユーザー定義された配列制御されるバイオポリマーの自動化された合成のためのシステムおよび方法を提供することが、本発明の目的である。
【００１７】
カッティング酵素または化学的に特異的な光分解とその後のｄｅ  ｎｏｖｏ酵素的合成を使用して、バイオポリマー配列を動的に変更するための方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１８】
明確に異なる配列およびサイズを有する複数の明確に異なってアドレス指定された配列制御されるバイオポリマーを同時に産生するための方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００１９】
ユーザー定義された配列およびサイズを有するアドレス指定されたバイオポリマーの大規模合成のための完全に自動化されたシステムおよび方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００２０】
ユーザー定義された配列およびサイズの独自にアドレス指定された合成されたバイオポリマーを提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００２１】
配列制御されるバイオポリマーのカプセル化の方法を提供することが、本発明の目的である。
【００２２】
配列制御されるバイオポリマーをプールし、このプールをカプセル化されたブロックへとカプセル化するための、完全にまたは部分的に自動化されたシステムおよび方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００２３】
カプセル化されたブロックにバーコード付加し、バーコードを除去し、および／または反復される方法で同じもしくは異なる配列のバーコードを再結合させるための、完全にまたは部分的に自動化されたシステムおよび方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００２４】
バイオポリマーの選択的改変のための方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００２５】
規定された調整可能な融解温度のバーコード核酸配列の生成のための完全にまたは部分的に自動化された方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００２６】
蛍光または他の光学的シグネチャーを使用して、カプセル化されたブロックを同定するための、バーコード配列に対して相補的な蛍光プローブ配列を使用する方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００２７】
カプセル化されたブロックを選別するために蛍光プローブ配列を使用する方法を提供することもまた、本発明の目的である。
【００２８】
検索およびコンピューテーションのために、カプセル化されたブロックに動的にバーコード付加する方法を提供することが、本発明のさらなる目的である。
【００２９】
マイクロ流体力学システムを使用した、バイオポリマーのスケーラブルな自動化された鋳型なしの合成および／または改変のための方法が開発された。これらの方法は、必要に応じて、プログラムされた配列およびサイズを有する核酸および他のバイオポリマーのカプセル化および動的分子バーコード付加を含む。マイクロ流体システムを使用した流体の移動を介した、コードされたデータのアーカイブストレージ、検索、改変、組織化および再組織化のために、合成されたバイオポリマーを使用する方法もまた、提供される。
【００３０】
これらの方法は、核酸などのバイオポリマーの鋳型なしの合成および操作のために、マイクロ流体液体ハンドリングテクノロジーを利用する。一部の形態では、これらの方法は、成長中の核酸の３’末端中に順次取り込まれるヌクレオチドを含む液滴のプログラムされた移動によって、独立した幾何学的にアドレス指定された長い一本鎖核酸を成長させるマイクロ流体プラットフォーム上の各位置を用いた超並列化された核酸合成を可能にする。これらの方法は、酵素的ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチド合成のための付加／脱保護ステップで必要とされる液滴サイクリングを達成する。これらの方法は、合成に対するさらなる制御を可能にするために、マイクロ流体プラットフォーム上での包括的または局所的な磁気および／または温度制御を必要に応じて取り込む。類似の方法は、異なるコンポーネント構築ブロック（例えば、モノマー）を使用して、多数の型のバイオポリマーの配列を産生および／または改変できる。
【００３１】
これらの方法のために使用され得る例示的なマイクロ流体および液体ハンドリングシステムには、誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）デバイス、音響液滴分配デバイス、行程容積（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）分配デバイス、インクジェット型流体分配器、または例えばマイクロウェルもしくは合成区画を使用してチップを横断するマイクロ流体フローを発動させる任意の他のデバイスが含まれる。好ましいマイクロ流体デバイスは、ＥＷＯＤチップである。
【００３２】
一部の形態では、これらの方法は、鋳型配列の非存在下で、プログラムされた配列および長さのバイオポリマーを生成する。例示的なバイオポリマーは、２００ヌクレオチド長よりも大きい、例えば、５００ヌクレオチド長、１，０００ヌクレオチド長もしくは１０，０００ヌクレオチド長の、または１０，０００ヌクレオチド長よりも大きい、例えば、最大で１００，０００ヌクレオチド長の、一本鎖核酸である。これらの方法は、必要に応じて、合成されたバイオポリマーを、精製する、増幅する、カプセル化する、配列決定する、官能化するおよび／または他の方法で操作するステップを含む。一部の形態では、これらの方法は、バイオポリマー内の１つまたは複数の分子配列タグまたはバーコードを付加、除去または改変する。一部の形態では、これらの方法は、カプセル化されたバイオポリマー上の１つまたは複数の分子配列タグまたはバーコードを付加、除去または改変する。これらの方法ステップの一部または全ては、コンピューター制御されたＥＷＯＤチップを使用して実施され得る。
【００３３】
典型的には、バイオポリマーを合成するための方法は、（ａ）マイクロ流体デバイス上で、コンポーネント始動配列を含む液滴を、コンポーネント構築ブロックおよび結合触媒を集合的に含む１つまたは複数の液滴と合わせて、合わせた液滴を形成するステップ；ならびに（ｂ）ステップ（ａ）を反復して、バイオポリマーへのコンポーネント構築ブロックの段階的付加を実施して、予め選択された所望のバイオポリマー配列および長さを有するバイオポリマーを形成するステップを含む。
【００３４】
例示的な方法では、合成は、誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）マイクロ流体チップによって発動される液滴の移動を使用して実施される。一般に、合わせるステップの前に、コンポーネント始動配列を含む液滴、ならびにコンポーネント構築ブロックおよび結合触媒を集合的に含む液滴の各々は、ＥＷＯＤチップ上の異なる位置にある。一般に、さらなるコンポーネント構築ブロックを各々が含む１つまたは複数のさらなる液滴は、ＥＷＯＤチップ上で、コンポーネント始動配列を含む液滴、コンポーネント構築ブロックおよび結合触媒を集合的に含む液滴、または合わせた液滴とは異なる位置にある。一般に、合わせるステップは、結合触媒にとってコンポーネント始動配列をコンポーネント構築ブロックに結合させてバイオポリマーを形成するのに適切な条件を含む。
【００３５】
一部の形態では、これらの方法は、（ａ）所望のバイオポリマー配列を選択するステップ；（ｂ）コンポーネント構築ブロック、結合触媒、コンポーネント始動配列、洗浄試薬および停止試薬を、マイクロ流体デバイス上に、別個の液滴として提供するステップ；（ｃ）所望のバイオポリマー配列を有するポリマーを形成するための構築ブロックの段階的付加、除去または改変を実施するための、各液滴を他の液滴と合わせるための経路および条件を同定するステップ；ならびに（ｄ）（ｃ）において同定された経路に従って、所望のバイオポリマー配列を有するポリマーを形成するための構築ブロックの段階的付加、除去または改変を実施するステップを含む。
【００３６】
一部の形態では、これらの方法は、必要に応じて、マイクロ流体デバイスから、所望の配列を有するバイオポリマーを単離するステップを含む。例示的な結合触媒／薬剤には、ＴｄＴ、Ｑ−ベータレプリカーゼおよびテロメラーゼを含むポリメラーゼ酵素が含まれる。
【００３７】
一部の形態では、これらの方法は、コンポーネント始動配列、コンポーネント構築ブロックおよび結合触媒を集合的に含むレザバから液滴を分割することによって、１つまたは複数の、コンポーネント始動配列を含む液滴ならびにコンポーネント構築ブロックおよび結合触媒を集合的に含む液滴を形成するステップを含む。一部の形態では、これらの方法は、さらなるコンポーネント構築ブロックを集合的に含むレザバからさらなる液滴を分割することによって、１つまたは複数のさらなる液滴を形成するステップを含む。
【００３８】
既存のバイオポリマーを改変する方法もまた提供される。例えば、一部の形態では、これらの方法は、１つまたは複数のセクションを、バイオポリマーの１つまたは複数の領域に付加するために、コンポーネント構築ブロックをバイオポリマーに結合させる。他の形態では、これらの方法は、例えば、バイオポリマーから１つまたは複数のセクションを除去するために、バイオポリマーからコンポーネント構築ブロックを除去する。一部の形態では、これらの方法は、バイオポリマーに、分子バーコードであるセクションを結合させるまたはかかるセクションを除去する。１つまたは複数の分子バーコードは、バイオポリマーの１つもしくは複数の位置において合成され得、またはそこに結合され得る。
【００３９】
一部の形態では、これらの方法は、合成された一本鎖核酸配列の化学的または構造的特性を変更するための、１つまたは複数のステップを含む。したがって、マイクロ流体システムを使用して一本鎖核酸配列を官能化するための方法もまた提供される。一部の形態では、方法は、バイオポリマーの化学的または構造的特性を変更する１つまたは複数のプロセスによって、新たに合成されたバイオポリマーを官能化するステップを含む。一部の形態では、新たに合成された一本鎖核酸の化学的または構造的特性は、例えば、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドアドレス配列の付加を介して改変される。例示的な形態では、一本鎖核酸を官能化する方法は、ＥＷＯＤデバイスから核酸を放出させるまたは精製する前に、官能化された核酸を、新たに合成された核酸へとコンジュゲートするステップを含む。
【００４０】
一部の形態では、これらの方法は、１つまたは複数のコンポーネントを動的に除去、改変および／または結合させるために、バイオポリマーを操作する。一部の形態では、これらの方法は、分子バーコードとして機能する、バイオポリマーのセクションを操作する。例えば、一部の形態では、これらの方法は、カッティング酵素または標的化された光分解または他の標的化された切断を使用してバーコードを部位特異的に分解し、その後、ポリマーをｄｅ  ｎｏｖｏで伸長させて新たなバーコード配列を生成する。
【００４１】
一部の形態では、これらの方法は、バイオポリマーをカプセル化するための１つまたは複数のステップを含む。カプセル化は、バイオポリマーのカプセル化に適切な材料を使用して実施され得る。好ましくは、カプセル化プロセスは、ポリマー合成後および精製前に行われる。一部の実施形態では、２つまたはそれよりも多くのバイオポリマーが、一緒にカプセル化される。したがって、バイオポリマーをカプセル化するステップは、カプセル化のためにバイオポリマーを組織化、選別および選択する、１つまたは複数のステップを含み得る。一部の形態では、２つまたはそれよりも多くのバイオポリマーは、共通の特色の同定に従って、一緒にカプセル化される。例示的な共通の特色は、２つまたはそれよりも多くのバイオポリマー中の分子バーコードに共通する１つまたは複数のコンポーネント（例えば、配列）である。
【００４２】
一部の形態では、当該分野で公知の光学的に切断可能な官能基を含むヌクレオチド前駆体の光学的活性化が、酵素によって取り込まれるヌクレオチド前駆体を制御するために使用される（Ｍａｔｈｅｗｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｒｇ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｃｈｅｍ．  １４（３５），  ｐｐ．  ８２７８−８８  （２０１６））。一部の形態では、これらの方法は、さらなる部分の取り込みを改善するため、または配列決定を促進するために、ヌクレオチドまたは他のバイオポリマーサブユニットを改変する。例えば、一部の形態では、これらの方法は、バイオポリマーへの疎水性部分または伝導性部分の付加を含む。
【００４３】
一部の形態では、これらの方法は、固体支持体または表面上に固定化された基質を含む。例えば、一部の形態では、これらの方法は、固体支持体上に固定化された１つまたは複数のコンポーネント始動配列、触媒酵素および／またはバイオポリマーを含む。一部の形態では、固体支持体システムが使用される場合、これらの方法は、基質の移動を発動させるために、連続フローシステムを使用する。例えば、成長中のバイオポリマーは、例えば、脂質または他の化学的マトリックスによって形成されるカバー材料内に含まれる液滴において連続フローから単離され得る。固定化された始動因子配列、触媒酵素またはバイオポリマーを含む液滴へのアクセスは、例えば、カバー材料を通るチャネルを開放もしくは閉鎖することによって、またはカバー材料を通る直接的貫通によって、制御される。
【００４４】
一部の形態では、これらの方法は、カプセル化剤内にバイオポリマーをカプセル化するステップを含む。他の形態では、これらの方法は、バイオポリマーの１つまたは複数の領域から、既存のカプセル化剤を分解するステップまたは他の方法で除去するステップを含む。例えば、一部の形態では、これらの方法は、カプセル化剤を除去し、次いで、バイオポリマーの１つまたは複数の配列または他のコンポーネントを除去し、付加しまたは置換し、次いで、同じまたは異なるカプセル化剤中に、改変されたバイオポリマーを再カプセル化する。
【００４５】
一部の形態では、マイクロ流体デバイスから合成された核酸を精製するステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む。例えば、足場として所望の配列を使用するＰＣＲは、ＥＷＯＤチップから所望の配列を増幅および／または精製するために使用され得る。一部の形態では、足場の長さは、１００もしくはそれよりも大きいヌクレオチド長、例えば、１，０００ヌクレオチド長；１，５００ヌクレオチド長；２，０００ヌクレオチド長；２，５００ヌクレオチド長；３，２８１ヌクレオチド長；１０，０００ヌクレオチド長；１２，０００ヌクレオチド長である；または１２，０００ヌクレオチドよりも大きい。
【００４６】
一部の形態では、バイオポリマーは、溶液中への官能化されたコンポーネント構築ブロックの導入によって官能化される。例示的な機能的コンポーネントには、蛍光部分、放射能標識された部分および磁性部分が含まれる。例示的な形態では、改変されたヌクレオチドは、核酸ポリマー合成のためのコンポーネント構築ブロックとして使用される。例示的な改変されたヌクレオチドには、Ｃｙ５フルオロフォア改変されたヌクレオチド、ホスホロチオエート改変されたヌクレオチド、およびデオキシウリジンが含まれる。
【００４７】
複数の異なるバイオポリマーの平行な同時合成のためにＥＷＯＤベースの鋳型なしの合成を使用する方法が提供される。例えば、一部の形態では、事前プログラムされた長さおよび配列を有する個々のバイオポリマーは、複数の独立した幾何学的にアドレス指定されたバイオポリマーを同時に産生するために、同じＥＷＯＤチップ上の個々の位置において調製される。例示的な方法では、長い一本鎖ＤＮＡは、３’位置へと次に取り込まれるヌクレオチドを含む液滴のプログラムされた移動によって合成される。このテクノロジーは、化学的ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチド合成の付加／脱保護ステップにおいて必要とされる同じ液滴サイクリングに、広く適用可能である。誘電体チップ上での包括的または局所的な磁気および／または温度制御の取り込みは、合成を制御するためのさらなる有用性を提供する。記載される方法に従って合成されたバイオポリマーの組成物もまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、並列化されたＤＮＡ合成のための試薬レザバおよび試薬のチャネルアドレス指定を示すＥＷＯＤデバイスの模式図である。例示目的として、チャネルは、液滴の通路を示すように描かれている。他の形態では、チャネルは、完全に除去され、液滴は、光源によって創出および移動される。チャネルは、酵素、ヌクレオチド前駆体、反応始動因子、キャップ試薬、洗浄試薬、および酵素活性を停止させるための化学物質を含み得るが、これらに限定されない。チャネルは、ＤＮＡが引き続く使用のために捕捉される収集レザバに結合される。
【００４９】
【図２】図２は、配列ＡＴＣＧのＤＮＡ断片を合成するために必要な液滴の移動の模式図である。移動のこのシークエンスは、任意の核酸配列取り込みに対して一般化され得る。これは、ｄＡＴＰ（「Ａ」）、ｄＴＴＰ（「Ｔ」）、ｄＣＴＰ（「Ｃ」）およびｄＧＴＰ（「Ｇ」）を含む４つのウェル、２つの緩衝液ウェル、放出溶液ウェル、収集機アウトプットポート、ならびに廃棄ポートを伴って示される。ビオチン化された始動因子鎖に結合したストレプトアビジンを有する磁性ビーズは、Ｂ−３にある。Ａ、Ｔ、ＣおよびＧの各々は、緩衝液、塩、および鋳型なしのポリメラーゼ（例えば、ＴｄＴ）もまた含む。ポリマー「ＡＴＣＧ」を構築するためのグリッドレイアウトおよび一連の指示が示される。構築され得る配列の普遍性に加えて、これは、ＥＷＯＤチップを横断して並列化可能であり、チップサイズ当たりの利用可能な多くのアドレスにおける異なる配列の同時の成長を可能にする。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
一部の形態では、これらの方法は、核酸バーコードを合成および／または操作する。例えば、一部の形態では、これらの方法は、類似のタームについてバーコード中に変異を含む分子同定のためのスキームを実行する。一部の形態では、バーコードである核酸配列内の複数の点変異が、バーコードの分子データベースを提供するために組み合わされる。したがって、一部の形態では、配列制御されるバイオポリマーのブロックは、それら自体が「分子ハッシュ」と類似のメモリ物体によってコードされるメタデータを示す別々の配列制御されるバイオポリマーである異なる同定性バーコードによって、アドレス指定され得る。一部の形態では、これらの方法は、バーコード中に点変異のセットを導入する。したがって、一部の形態では、これらの方法は、類似していない配列よりも容易に、より多くの類似のポリマーブロックが溶液から抽出されるのを可能にする。例えば、例示的な一形態では、２５マーのバーコード配列が、「赤色」を示すように選択され、別々の２５マーのバーコード配列が、「青色」を示すように選択される（例示的なバーコードは、Ｘｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  １０６  （７）  ２２８９−２２９４  （２００９）による表題”Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ２４０，０００  ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  ２５ｍｅｒ  ＤＮＡ  ｂａｒｃｏｄｅ  ｐｒｏｂｅｓ”の論文に記載されている）。点変異が、バーコードを、元のバーコードとあまり類似しないものにするために行われ、各々の逆相補体が得られる。融解温度は、それぞれ「赤色」、「赤色様」、「青色」および「青色様」のメタデータに対応する各プライマー対について、（例えば、定量ＰＣＲによって）決定される。高い融解温度は、完全な相補性を示すが、近傍の近隣者は、選択が、対応するメタデータの非特異的（即ち、「ファジー」または「ノイズの多い」）検索を含み得ることを示す。
発明の詳細な説明
【００５１】
Ｉ．定義
用語「ヌクレオチド」は、塩基部分、糖部分およびリン酸部分を含む分子を指す。ヌクレオチドは、典型的には、それらのリン酸部分および糖部分を介して一緒に連結されて、ヌクレオシド間連結を創出する。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は、五価リン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
【００５２】
化学的種の「残基」という用語は、その部分が化学的種から実際に得られるかどうかにかかわらず、特定の反応スキームもしくは引き続く形成における化学的種の得られた生成物、または化学的生成物である部分を指す。したがって、ポリマー中のエチレングリコール残基は、エチレングリコールがポリエステルを調製するために使用されたかどうかにかかわらず、ポリマー中の１つまたは複数の−ＯＣＨ２ＣＨ２Ｏ−単位を指す。別の例として、モノマーサブユニットのポリマーでは、取り込まれたモノマーサブユニットは、未重合のモノマーの残基と呼ばれ得る。
【００５３】
用語「ヌクレオチドアナログ」は、塩基、糖またはリン酸部分への一部の型の改変を含むヌクレオチドを指す。ヌクレオチドへの改変は、当該分野で周知であり、これには、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチンおよび２−アミノアデニン、ならびに糖またはリン酸部分における改変が含まれる。当該分野で入手可能であり、本明細書で利用可能な多くの多様なこれらの型の分子が存在する。
【００５４】
用語「ヌクレオチド代用品」は、ヌクレオチドと類似の機能的特性を有するが、リン酸部分を含まないヌクレオチド分子を指す。例示的なヌクレオチド代用品は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ヌクレオチド代用品は、ワトソン−クリックまたはフーグスティーン様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して一緒に連結される分子である。ヌクレオチド代用品は、適切な標的核酸と相互作用する場合、二重らせん型構造に従うことができる。例えば、ＤＮＡとの相互作用を増強するために、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに他の型の分子（コンジュゲート）を連結させることも可能である。コンジュゲートは、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに化学的に連結され得る。例示的なコンジュゲートには、コレステロール部分などの脂質部分が含まれるがこれに限定されない。
【００５５】
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、相互交換可能であり、直鎖または環状コンフォメーションにあり、一本鎖または二本鎖形態のいずれかである、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドバイオポリマーを指す。本開示の目的のために、これらの用語は、バイオポリマーの長さに関する制限として解釈すべきではない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知のアナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分が改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格、ロックト核酸）を包含し得る。一般に、特記しない限り、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対合特異性を有する；即ち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対合する。二本鎖ＤＮＡが記載される場合、ＤＮＡは、らせん状ＤＮＡが取るコンフォメーションに従って、Ａ−ＤＮＡ、Ｂ−ＤＮＡまたはＺ−ＤＮＡのいずれかとして記載され得る。Ｊａｍｅｓ  ＷａｔｓｏｎおよびＦｒａｎｃｉｓ  Ｃｒｉｃｋによって記載されたＢ−ＤＮＡは、細胞中で優勢であると考えられ、１０ｂｐの配列につき約３４Å延び；Ａ−ＤＮＡは、１０ｂｐの配列につき約２３Å延び、Ｚ−ＤＮＡは、１０ｂｐの配列につき約３８Å延びる。
【００５６】
一部の場合には、ヌクレオチド配列は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｕｒｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＩＵＰＡＣ）によって推奨される文字表示またはそれらのサブセットを使用して提供される。ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードには、以下が含まれる：Ａ＝アデニン；Ｃ＝シトシン；Ｇ＝グアニン；Ｔ＝チミン（Ｔｈｙｍｉｎ）；Ｕ＝ウラシル；Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｙ＝ＣまたはＴ；Ｓ＝ＧまたはＣ；Ｗ＝ＡまたはＴ；Ｋ＝ＧまたはＴ；Ｍ＝ＡまたはＣ；Ｂ＝ＣまたはＧまたはＴ；Ｄ＝ＡまたはＧまたはＴ；Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ；Ｖ＝ＡまたはＣまたはＧ；Ｎ＝任意の塩基；「．」または「−」＝ギャップ。一部の形態では、文字のセットは、それぞれアデノシン、シチジン、グアノシン、チミジンおよびウリジンについて、（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ）である。一部の形態では、文字のセットは、それぞれアデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、ウリジン、イノシン、ウリジン、キサントシン、プソイドウリジンについて、（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ、Ｉ、Ｘ、Ψ）である。一部の形態では、文字のセットは、それぞれアデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、ウリジン、イノシン、ウリジン、キサントシン、プソイドウリジン、未特定のプリン、未特定のピリミジンおよび未特定のヌクレオチドについて、（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ、Ｉ、Ｘ、Ψ、Ｒ、Ｙ、Ｎ）である。
【００５７】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、相互交換可能に使用される。この用語は、１つまたは複数のアミノ酸が対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変された誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００５８】
核酸の「切断」および「切断する」という用語は、核酸分子の共有結合的骨格の破断を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が含まれるがこれらに限定されない、種々の方法によって始動され得る。一本鎖切断および二本鎖切断が共に可能であり、二本鎖切断は、２つの明確に異なる一本鎖切断事象の結果として生じ得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または互い違いの「粘着」末端のいずれかの産生を生じ得る。ある特定の形態では、切断は、二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖内の核酸間の二本鎖切断を指す。
【００５９】
ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列同一性パーセント（％）は、２つの配列がアラインされる場合の、参照配列と比較した、候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基と同一であるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の百分率として理解される。パーセント同一性を決定するために、配列がアラインされ、必要に応じて、最大のパーセント配列同一性を達成するためにギャップが導入される。パーセント同一性を決定するための配列アラインメント手順は、当業者に周知である。しばしば、公に入手可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＡＬＩＧＮ２またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアが、配列をアラインするために使用される。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意の公式を含む、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定できる。配列がアラインされる場合、所与の配列Ａの、所与の配列Ｂに対する（ｔｏ）、所与の配列Ｂとの（ｗｉｔｈ）、所与の配列Ｂに対する（ａｇａｉｎｓｔ）パーセント配列同一性（これは、あるいは、所与の配列Ｂに対する（ｔｏ）、所与の配列Ｂとの（ｗｉｔｈ）、所与の配列Ｂに対する（ａｇａｉｎｓｔ）ある特定のパーセント配列同一性を有するまたは含む、所与の配列Ａと表現され得る）は、以下のように計算することができる：パーセント配列同一性＝Ｘ／Ｙ１００、式中、Ｘは、ＡおよびＢの、配列アラインメントプログラムのまたは公式のアラインメントによって同一なマッチとしてスコアリングされた残基の数であり、Ｙは、Ｂ中の残基の総数である。配列Ａの長さが配列Ｂの長さと等しくない場合、ＡのＢに対するパーセント配列同一性は、ＢのＡに対するパーセント配列同一性と等しくならない。ミスマッチは、ヌクレオチドの天然の結合パートナー間の差異として、同様に定義され得る。ミスマッチの数、位置および型は、計算することができ、同定またはランキング目的で使用され得る。
【００６０】
用語「エンドヌクレアーゼ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子内の核酸間の結合の加水分解（切断）を触媒することが可能な、任意の野生型またはバリアント酵素を指す。エンドヌクレアーゼの非限定的な例には、ＩＩ型制限エンドヌクレアーゼ、例えば、ＦｏｋＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｏｔＩ、ＢｂｖＣｌ、ＥｃｏＲＩ、ＢｇｌＩＩおよびＡｌｗＩが含まれる。エンドヌクレアーゼは、約１２〜４５塩基対（ｂｐ）長、より好ましくは、１４〜４５ｂｐのポリヌクレオチド認識部位を典型的に有する場合、レアカットエンドヌクレアーゼもまた含む。レアカットエンドヌクレアーゼは、規定された遺伝子座において、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導する。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、それぞれ工学操作（ｅｎｇｉｎｅｅｒ）されたジンクフィンガードメインまたはＴＡＬエフェクタードメインと、ＦｏｋＩなどの制限酵素の触媒ドメインとの融合から生じるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）またはＴＡＬエフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９または他のバリアントおよびガイドＲＮＡを含む、他のヌクレアーゼまたは化学的エンドヌクレアーゼであり得る。
【００６１】
用語「エキソヌクレアーゼ」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子、好ましくはＤＮＡ分子の末端から核酸を除去することが可能な、任意の野生型またはバリアント酵素を指す。エキソヌクレアーゼの非限定的な例としては、エキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＩＶ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩ、Ｘｍ１およびＲａｔ１が含まれる。一部の形態では、酵素は、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの両方として機能することが可能である。用語「ヌクレアーゼ」は一般に、エンドヌクレアーゼおよびエキソヌクレアーゼの両方を包含するが、一部の形態では、用語「ヌクレアーゼ」および「エンドヌクレアーゼ」は、エンドヌクレアーゼを指すために、即ち、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内の結合切断を触媒する酵素を指すために、本明細書で相互交換可能に使用される。
【００６２】
用語「ライゲーションする」は、２つの二本鎖ＤＮＡ分子が、例えば、リガーゼ酵素によって触媒されるような、共有結合的に接続される酵素的反応を指す。
【００６３】
用語「アラインさせる」および「アラインメント」は、同一または類似のヌクレオチドの短いまたは長いストレッチの存在に基づいた、２つまたはそれよりも多くのヌクレオチド配列の比較を指す。ヌクレオチド配列のアラインメントのためのいくつかの方法が、以下にさらに説明されるように、当該分野で公知である。
【００６４】
用語「核酸捕捉」は、別々の核酸と関連付けられた対応する配列に対する相補的核酸配列を有する、または使用される配列に対する親和性を有し、固体支持体マトリックスに固定化もしくは結合されている、目的の任意の核酸分子の結合を指す。例えば、「ＲＮＡ捕捉」は、固体支持体マトリックスにカップリングされた核酸上の相補的配列に対する目的の任意のリボ核酸分子の結合を指す。
【００６５】
分子が標的に「特異的に結合する」という語句は、他の生物製剤の不均一な集団の存在下でのその分子の存在を決定する結合反応を指す。したがって、指定されたイムノアッセイ条件下で、特定された分子は、特定の標識に優先的に結合し、試料中に存在する他の生物製剤には、顕著な量では結合しない。かかる条件下での標的への抗体の特異的結合は、標的に対するその特異性について抗体が選択されることを必要とする。種々のイムノアッセイフォーマットが、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性の抗体を選択するために使用され得る。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイは、タンパク質と特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体を選択するために慣用的に使用される。特異的免疫反応性を決定するために使用され得るイムノアッセイフォーマットおよび条件の記述については、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  （１９８８）  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照のこと。例えば、２つの実体間での「特異的結合」という用語は、少なくとも１０６、１０７、１０８、１０９または１０１０Ｍ−１の親和性を意味する。１０８Ｍ−１よりも高い親和性が好ましい。
【００６６】
用語「標的化分子」は、選択された細胞または組織型上の受容体部位へと合成されたバイオポリマーを指向させることができ、結合分子として機能できるまたは別の分子をカップリングもしくは結合させるように機能できる、物質を指す。用語「指向させる」は、選択された細胞または組織型に、分子を優先的に結合させることを指す。これは、以下に議論されるように、細胞性材料、分子または薬物を指向させるために使用され得る。
【００６７】
用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、インタクトな抗体およびその結合性断片を含む。典型的には、別々の重鎖、軽鎖Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦａｂｃおよびＦｖが含まれる断片は、抗原断片への特異的結合のためにこれらの断片がそこから誘導体化されたインタクトな抗体と競合する。断片は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的分離によって、産生される。用語「抗体」は、他のタンパク質に化学的にコンジュゲートされた、または他のタンパク質との融合タンパク質として発現される、１つまたは複数の免疫グロブリン鎖もまた含む。用語「抗体」は、二重特異性抗体もまた含む。二重特異性または二機能性抗体は、２つの異なる重鎖／軽鎖対および２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結を含む、種々の方法によって産生され得る。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，  Ｃｌｉｎ．  Ｅｘｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ７９：３１５−３２１  （１９９０）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １４８，  １５４７−１５５３  （１９９２）を参照のこと。
【００６８】
用語「エピトープ」および「抗原決定基」は、Ｂおよび／またはＴ細胞がそれに対して応答する抗原上の部位を指す。Ｂ細胞エピトープは、連続するアミノ酸、またはタンパク質の三次フォールディングによって隣り合う、連続しないアミノ酸の両方から形成され得る。連続するアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理の際に失われる。エピトープは、典型的には、独自の空間的コンフォメーションで、少なくとも３アミノ酸、より通常は、少なくとも５または８〜１０アミノ酸を含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法には、例えば、ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴が含まれる。
【００６９】
用語「小分子」は、本明細書で使用する場合、一般に、分子量が約２，０００ｇ／ｍｏｌ未満、約１，５００ｇ／ｍｏｌ未満、約１，０００ｇ／ｍｏｌ未満、約８００ｇ／ｍｏｌ未満または約５００ｇ／ｍｏｌ未満である有機分子を指す。小分子は、非ポリマー性および／または非オリゴマー性である。
【００７０】
用語「液滴」は、明確に異なる別々の形態であり、他の液滴から独立して移動可能である、流体の明確に異なる体積を指す。流体液滴は、一般に、より大きい体積の同じ流体を含むレザバから、ある体積の流体を分割することによって形成される。
【００７１】
用語「結合試薬」、「結合触媒／薬剤」、「アセンブリ試薬」、「触媒」、「アセンブリ触媒」、「結合触媒」および「触媒試薬」は、始動因子配列上へのまたは成長中のバイオポリマー上へのコンポーネント構築ブロックの付加を発動させる、増強する、増加させるまたは他の方法で可能にする試薬を指す。典型的には、触媒によるコンポーネント構築ブロックの結合は、ＥＷＯＤデバイスに従った１つまたは複数の流体液滴の移動によって制御される。成長中の核酸バイオポリマーへの１つまたは複数のヌクレオチド構築ブロックの付加を特異的に増強する例示的な分子は、鋳型なしのポリメラーゼである。例示的な結合剤には、ＴｄＴ、Ｑベータレプリカーゼおよびテロメラーゼ酵素が含まれる。
【００７２】
用語「構築ブロック」および「コンポーネント構築ブロック」は、始動因子への段階的付加によって形成されるバイオポリマーの別個のコンポーネントを指す。構築ブロックは、典型的には、バイオポリマーが構築ブロックの段階的アセンブリから生じるような、バイオポリマーの基礎構造単位である。例示的な構築ブロックには、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖およびポリペプチドが含まれる。一部の形態では、構築ブロックは、モノマーである。他の形態では、構築ブロックは、マルチマー、例えば、ダイマー、ホモダイマー、ヘテロダイマー、オリゴマーなどである。基礎構造単位の例示的なマルチマーには、短い核酸配列、ジペプチド、トリペプチドおよびオリゴ糖が含まれる。
【００７３】
用語「始動因子」、「始動因子配列」、「コンポーネント始動配列」および「開始オリゴマー」は、ユーザー定義されたバイオポリマーの合成のためのコンポーネント構築ブロックの段階的な鋳型なしのアセンブリのための始動分子として作用する、コンポーネント構築ブロックの別個の配列を指す。一部の形態では、始動因子分子は、結合触媒の１つまたは複数の認識配列を含む。例示的な始動因子配列は、ＴｄＴ酵素の認識配列である核酸配列を含むオリゴヌクレオチドである。
【００７４】
用語「配列」は、開示されたバイオポリマーに関して、バイオポリマー中のヌクレオチドなどの構築ブロックの順序を指す。例えば、一般的なＤＮＡは、Ａ、Ｃ、ＧおよびＴから選択されるヌクレオチド構築ブロックの配列を有する。他の型の構築ブロックから作製されるバイオポリマーは、バイオポリマー中の構築ブロックの順序によって定義される配列を有する。
【００７５】
用語「ビーズ」または「磁性ビーズ」は、バイオポリマーの合成のための方法において使用される場合、１つまたは複数の試薬のための支持体マトリックスとして使用される固体構造を指す。ビーズは、任意の適切なビーズであり得る。
【００７６】
用語「洗浄試薬」、「洗浄緩衝液」、「洗浄液」および「リンス溶液」は、バイオポリマー、始動因子または触媒から、１つまたは複数の試薬を精製または除去するために使用される溶液を指す。典型的には、洗浄緩衝液は、固定化された分子、例えば、固定化されたバイオポリマーを溶媒和させる、およびそこから試薬を除去するのに有効な溶媒である。洗浄緩衝液は、溶液の液滴と接触され得、または例えば、試薬の活性を低減もしくは防止するために、１つまたは複数の試薬を溶解させるために使用される溶媒であり得る。
【００７７】
用語「洗浄条件」は、洗浄試薬（即ち、明確に異なる「洗浄ステップ」）と合わせることが実施される環境的／外部条件を指す。例えば、洗浄は、１つまたは複数の洗浄試薬を、バイオポリマーまたは始動因子を含む溶液または固定化された支持体と合わせること、および１つまたは複数の環境的／外部条件への合わせた溶液の引き続く曝露によって、実施され得る。例示的な条件には、合わせる時間、各洗浄試薬の量および濃度、撹拌への曝露、熱への曝露、光、蒸気、圧力における変化、電荷における変化などが含まれる。
【００７８】
用語「停止試薬」は、活性薬剤の活性を選択的または非選択的に低減または防止する試薬を指す。例えば、停止試薬は、酵素の活性を妨害するｐＨを有し得、またはそのような分子を含み得る。典型的には、停止試薬は、それらが混合される溶液のパラメーターを変化させる、例えば、ｐＨを変化させる、温度を変化させる、イオン濃度を変化させる、活性薬剤上の活性な部位に競合的に結合する、など。一部の形態では、停止試薬は、酵素機能のために必要な補因子を選択的に結合および／または封鎖する。例示的な停止試薬には、酸、塩基、イオン溶液およびグリセロールが含まれる。一部の形態では、停止試薬は、例えば、触媒酵素の活性を阻害することによって、または付加のために利用可能なコンポーネント構築ブロックを封鎖するもしくはその濃度を他の方法で低減／変更させることによって、１つまたは複数の結合反応を即座に防止または邪魔する。
【００７９】
用語「停止条件」は、停止試薬（即ち、明確に異なる「停止ステップ」）と合わせることが実施される環境的／外部条件を指す。例えば、停止条件は、１つまたは複数の停止試薬を、バイオポリマーまたは始動因子を含む溶液または固定化された支持体と合わせること、および１つまたは複数の環境的／外部条件への合わせた溶液の引き続く曝露を含み得る。例示的な条件には、合わせる時間、各洗浄試薬の量および濃度、撹拌への曝露、熱への曝露、光、蒸気、圧力における変化、電荷における変化などが含まれる。
【００８０】
用語「遮断試薬」は、例えば、成長中のポリペプチドバイオポリマーへのアミノ酸の付加を防止するために、化学反応を特異的に遮断する試薬を指す。典型的には、遮断試薬は、バイオポリマー「鎖」中の末端コンポーネント構築ブロックに、化学的「キャップ」または他の分子を付加する。キャップは、バイオポリマー上のそれぞれの位置における引き続くコンポーネント構築ブロックの付加を、選択的に防止する。用語「遮断解除試薬」は、遮断試薬の効果を逆転させる、低減させるまたは他の方法で抑止する任意の薬剤を指す。遮断解除剤は、典型的には、洗浄試薬ではない。むしろ、遮断解除剤は、以前に遮断された部位におけるコンポーネント構築ブロックの結合を可能にする、誘導するまたは増強するために、バイオポリマーを能動的に改変する。
【００８１】
用語「結合条件」は、始動因子への、またはバイオポリマーの末端コンポーネント構築ブロックへの、コンポーネント構築ブロックのユーザー定義された結合（即ち、明確に異なる「結合ステップ」）が実施される条件を指す。例えば、結合は、触媒の機能に適した条件下で、結合剤を、始動因子またはバイオポリマーおよび１つまたは複数のコンポーネント構築ブロックと合わせることによって実施され得る。例示的な条件には、合わせる時間、各試薬の量および濃度、イオン濃度、任意の必要な補因子の存在、停止試薬の非存在、撹拌への曝露、熱への曝露、光、蒸気、圧力における変化、電荷における変化などが含まれる。
【００８２】
用語「カプセル化する」、「包む」、「コートする」、「カバーする」および「シェル形成する（ｓｈｅｌｌｉｎｇ）」は、バイオポリマー、および必要に応じてさらなる薬剤が、カプセル化剤によって完全にまたは部分的に包囲されるプロセスを指すために、相互交換可能に使用される。用語「カプセル化剤」は、分子実体、例えば、ポリマーまたは他のマトリックスを指す。
【００８３】
用語「マイクロ流体デバイス」、「マイクロ流体力学」、「マイクロ流体チップ」および「マイクロ流体プラットフォーム」は、マイクロリットル未満の体積の流体の、例えば、別個の液滴としての移動を支持するおよび／または可能にするもしくは発動させる、任意のデバイスまたはシステムを指す。典型的には、マイクロ流体デバイスは、制御された様式で、別個の流体液滴のユーザー定義された分割、移動および合わせるを制御するため、ならびに、１つまたは複数の物理化学的特性、例えば、温度、電荷、光、磁力などを改変または変更するための、コンポーネントおよび手段を実行する。一部の形態では、マイクロ流体デバイスは、流体移動を発動させるための１つまたは複数の手段を介して、流体の移動、挙動および操作を制御する。例示的なマイクロ流体デバイスは、連続フロー、流体分注、ＥＷＯＤ、圧力、光学またはそれらの組合せを含む機構を介して、流体移動を発動させる。マイクロ流体デバイスは、「開放型」（即ち、流体が、単一の表面上に含まれ、移動され、操作される）または「閉鎖型」（即ち、流体が、２つの表面間に含まれ、移動され、操作される）であり得る。一部の形態では、用語「マイクロ流体デバイス」は、「マイクロ流体システム」と相互交換可能に使用され、（例えば、デバイス内の流体の移動を制御するためにコンピューターソフトウェアを使用する一般ユーザーインターフェースを介して）流体操作のユーザー定義された制御をインプットするための手段を含む。用語「マイクロ流体システム」はまた、さらなる装置、例えば、流体移動を制御するための器具に対して外部にある装置、例えば、温度、光、圧力、湿度などのパラメーターを制御するためのデバイスを指す。一部の形態では、「マイクロ流体デバイス」は、データインプットの部位の近くに位置するまたはデータインプットの部位から離れて位置するマイクロ流体プラットフォーム上の液滴の移動または操作の制御のためのデータをインプットするためのデバイスおよびシステムを含む。一部の形態では、データインプットデバイスは、コンピューターである、またはコンピューターを取り込む。一部の形態では、システムまたはデバイスは、制御システムに情報を提供するための１つまたは複数のシステム、例えば、フィードバックを提供するためのデバイスを含む。一部の形態では、データインプットは、自律的である（例えば、コンピュータータスクは、従来のシリコンコンピューター上で動作するプログラムなど、自律的に実施され得るが、本明細書では液体状態で実施される）。
【００８４】
用語「ＥＷＯＤ」または「エレクトロウェッティング」は、移動を見る、例えば、誘発電位による原動力を介した、単一ピコリットル〜ナノリットルの液滴の移動を制御するための、誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）の技術を指す（Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ａ：  Ｐｈｙｓｉｃａｌ，  ９５（２−３），  ｐｐ．  ２５９−２６８  （２００２））。用語「ＥＷＯＤチップ」、「ＥＷＯＤプラットフォーム」または「ＥＷＯＤデバイス」は、ＥＷＯＤ現象によって流体の移動を発動させるための、プラットフォームまたは類似の装置を指す。例示的なＥＷＯＤチップは、マイクロ流体チップ、例えば、デジタルマイクロ流体チップである。ＥＷＯＤチップは、「開放型」（即ち、流体液滴が、流体上の層を伴わない表面を横断して移動する）または「閉鎖型」（即ち、流体液滴が、流体の上に第２の層を伴う表面を横断して移動する）であり得る。
【００８５】
ＩＩ．バイオポリマーの自動化された合成および操作のための方法
ユーザー定義された配列／構造およびサイズを有するバイオポリマーの、自動化された段階的な合成および／または操作のためのシステムおよび方法は、確立されている。これらのシステムおよび方法は、既存の鋳型配列または構造を必要としない。これらの方法には、一般に、マイクロ流体プラットフォーム上の１つまたは複数の別個の位置における液滴としての、コンポーネント始動配列上への、明確に異なるコンポーネント構築ブロック（例えば、ヌクレオチド、アミノ酸、単糖など）の段階的アセンブリが関与する。
【００８６】
一部の形態では、これらの方法は、誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）チップ上で鋳型の非存在下で、配列特定された様式で、グリッドアドレス指定可能な位置を使用して、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）のユーザー定義された配列を合成および／または操作する。
【００８７】
成長中のポリマー鎖のアドレス指定された位置は、ＥＷＯＤチップなどのマイクロ流体プラットフォーム上の位置によって決定される。一部の形態では、成長中のバイオポリマーは、アドレス指定された位置においてコンポーネント始動配列を表面に固定すること、またはコンポーネント始動配列を磁性ビーズに固定し、強い磁石によってそれを適所に保持することによって、マイクロ流体プラットフォーム上に固定で保持される。動作温度は、合成の要求に従って変動され得る。コンポーネント構築ブロック、緩衝液および結合触媒を含む液滴の（例えば、ＥＷＯＤチップによって誘導される電位を介した）ユーザー定義された移動は、移動され、成長中のバイオポリマー配列鎖を含む液滴と合わせ混合される。
【００８８】
例示的な触媒は、核酸のアセンブリのための鋳型なしのポリメラーゼ酵素である。適切な液滴を合わせると、酵素は、利用可能なヌクレオチドを、ポリマーの３’末端に結合させる（例えば、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，  １８０４（５）：  ｐｐ．１１５１−１１６６  （２０１０）を参照のこと）。１つまたは複数のコンポーネント構築ブロックを含む液滴は、酵素溶液と合わせられ、成長中のバイオポリマー鎖上に順次取り込まれる。反応１回当たり利用可能な核酸数を制限すること、またはそのアドレス指定されたグリッド位置において配列を固定されたままにして液滴を除去し、水だけもしくは緩衝液および塩だけを含む液滴で１、２、３回、もしくは３回よりも多く洗浄することによって、ヌクレオチドおよび溶液を除去することのいずれかによって、反応の、プログラムされた時間の停止が可能になる。
【００８９】
マイクロ流体プラットフォーム、例えば、ＥＷＯＤチップは、典型的には、グリッドサイズが小さく、統合、混合および分離するステップを事前にプログラムすることによって同時に移動および制御できるので、予め定義されたプログラムされた配列を有するバイオポリマーは、アドレス指定された位置で成長され得る。液滴の移動、分割および統合は、電気的動作（例えば、ＥＷＯＤデバイスを介して実行される場合）に制限されず、液滴を使用して動作を実施するために光学的制御を利用して発動させることもできる。したがって、より多くのグリッドポイントを含むようにチップのサイズを増加させることによって、１個の鎖、１，０００個の鎖、１，０００，０００個の鎖またはそれよりも多くが、同時に合成され得る。ＴｄＴ酵素は、一本鎖ＤＮＡによる３’末端からの排除によってのみ制限されるので、成長中のポリマーは、１００ｎｔ、１，０００ｎｔ、最大で１０，０００ヌクレオチド、または１０，０００ｎｔよりも大きいサイズのものであり得る。
【００９０】
好ましい形態では、アセンブリプロセスは、１つまたは複数の結合触媒の活性によって媒介される。したがって、アセンブリプロセスの制御は、結合触媒の速度および活性によって媒介される。結合触媒は、合成の所望の最終生成物であるバイオポリマーの性質に従って選択される。例示的な結合触媒には、酵素（例えば、ポリメラーゼ、ホスファターゼ、エステラーゼ、リパーゼ、グリコシルトランスフェラーゼおよびプロテアーゼ）、酸、ならびに外部条件、例えば、光（例えば、光スイッチされるアセンブリ）、空気および熱が含まれる。他の形態では、アセンブリプロセスは、結合触媒の非存在下で生じる。例えば、コンポーネント構築ブロックが、ポリペプチド、タンパク質およびナノ構造などである場合、アセンブリは、始動因子エレメントとコンポーネント構築ブロックとの間での特異的相互作用または非特異的相互作用を介して生じ得る。例示的な非触媒型のアセンブリは、２つのＧアクチンタンパク質間での相互作用後のダイマー化である。
【００９１】
一部の形態では、これらの方法は、１つまたは複数の固体支持体マトリックス上にポリマーを合成する。一部の形態では、コンポーネント始動配列は、段階的アセンブリプロセスを促進するために、磁性ビーズにカップリングされる。固体支持体は、マイクロ流体デバイス上のユーザー決定されるアドレス位置において始動因子配列をアンカリングし、最適なアセンブリを達成するために必要に応じて、始動因子配列上へのおよびそこから離れる、試薬の段階的移動を可能にする。コンポーネント始動配列が固体支持体にカップリングされる場合、バイオポリマーをアセンブルするための方法は、コンポーネント始動配列を、異なる試薬を含む液滴と順次合わせるために、水性液滴のマイクロ流体デバイス媒介性の移動の反復を含み得る。したがって、一部の形態では、始動因子配列と１つまたは複数のコンポーネント構築ブロックとを合わせるステップは、固定化された始動因子配列と、洗浄緩衝液、コンポーネント構築ブロック、アセンブリ触媒、緩衝液、遮断試薬および／または停止試薬を含む１つまたは複数の試薬を含む１つまたは複数の液滴とを連続的に合わせることを含む。各マイクロ流体デバイス媒介性に合わせることおよび分離事象は、試薬を選択的に合わせ／混合するため、または１つの試薬を別の試薬から選択的に分離／排除するために、１または複数回反復され得る。例えば、各構築ブロックの段階的アセンブリは、引き続いて分離される固定化された始動因子配列を、（１）洗浄緩衝液；（２）コンポーネント構築ブロックおよびアセンブリ触媒、ならびに必要に応じて、コンポーネント構築ブロックを始動因子配列と合わせるためのアセンブリ触媒のために必要とされる１つまたは複数の緩衝液；（３）アセンブリ触媒の活性を防止するための遮断試薬および／または停止試薬、ならびに（４）洗浄緩衝液と合わせるために、液滴のマイクロ流体デバイス媒介性の移動を含むサイクルとして実施され得る。このサイクルは、各コンポーネント構築ブロックを、成長中のバイオポリマーに順次付加するために反復され得る。液滴の各マイクロ流体デバイス媒介性の移動の間のタイミング、および外部条件などの因子は、各バイオポリマーの要求に従って最適化され得る。バイオポリマーは、周期的なアセンブリプロセスを通じて固体支持体マトリックスに結合したままであり、最後のコンポーネント構築ブロックの付加後に、支持体マトリックスから切断され得る。
【００９２】
一部の形態では、ソフトウェアプログラムが、液滴のマイクロ流体デバイス媒介性の移動を調和させるために使用される。
典型的には、これらの方法は、以下のステップのうち１つまたは複数を含む：
（ａ）標的ポリマーを選択するステップ；
（ｂ）マイクロ流体デバイス上の液滴として試薬を提供するステップであって、試薬が、
（ｉ）コンポーネント始動配列；
（ｉｉ）１つまたは複数のコンポーネント構築ブロック；および
（ｉｉｉ）結合触媒；
を含み、コンポーネント始動配列が、コンポーネント構築ブロックとは別の液滴として提供される、ステップ；
（ｃ）コンポーネント始動配列を含む液滴を、コンポーネント構築ブロックおよび結合触媒を含む１つまたは複数の液滴と合わせて、合わせた液滴を形成するステップであって、
合わせるステップが、結合触媒にとってコンポーネント始動配列をコンポーネント構築ブロックに結合させてバイオポリマーを形成するのに適切な条件を含む、ステップ。
【００９３】
一部の形態では、これらの方法は、
（ｉ）コンポーネント構築ブロックのバイオポリマーへの結合を、遮断する、または他の方法で低減、停止もしくは防止するステップ；
（ｉｉ）バイオポリマーを１つまたは複数の洗浄緩衝液で洗浄して、発達中のまたは完了したバイオポリマーから、１つまたは複数の試薬を低減または除去するステップ；および
（ｉｉｉ）例えば、１つまたは複数の機能的モチーフの付加または除去によって、バイオポリマーを改変するステップ
をさらに含む。
一部の形態では、これらの方法は、
（ｄ）バイオポリマーをＥＷＯＤチップから精製するまたは他の方法で単離するステップ。
（ｅ）マイクロ流体デバイス−合成されたバイオポリマーを確認または評価するステップ
をさらに含む。バイオポリマーを確認するステップは、完了したバイオポリマーを配列決定または増幅するステップを含み得る。
【００９４】
Ａ．標的バイオポリマーを選択する
これらの方法は、マイクロ流体デバイスのアドレス指定された位置を使用して、ユーザー定義された配列およびサイズを有する、配列制御される「標的」バイオポリマーを合成する。対応するコンポーネント構築ブロックからの標的バイオポリマーの、マイクロ流体デバイスベースの鋳型なしの合成のための方法は、同じマイクロ流体デバイスを使用して、同じまたは異なる配列を有する複数のバイオポリマーを同時に合成する能力を提供する。自動化された合成は、チップ上の独自にアドレス指定された位置に対応する液滴移動の配列としての指示インプットから、同じマイクロ流体デバイス上で同時に１つまたは複数のバイオポリマーについて実施され得る。
【００９５】
標的バイオポリマーを選択するステップは、一般に、（１）合成されるバイオポリマーの数および組成を決定するステップ；（２）マイクロ流体プラットフォームをグリッドネットワークとして提供するステップ；および（３）ネットワーク上のグリッドラインを交差させることによって同定される各ノードに、独自のアドレスを割り当てるステップを含む。一部の形態では、バイオポリマーは、マイクロ流体デバイスグリッド上の単一の位置において合成される。バイオポリマーは、グリッドネットワーク上の合成のノード／位置に従ってアドレス指定され得る。したがって、一部の形態では、これらの方法は、各バイオポリマーに、独自のアドレスを割り当てるステップを含む。
【００９６】
１．バイオポリマーの数および組成を選択する
ユーザー定義されたバイオポリマーの、プログラム可能なマイクロ流体デバイス媒介性の鋳型なしの合成のための方法は、所望のバイオポリマーの配列およびサイズの、ユーザー定義されたインプットを必要とする。一部の形態では、バイオポリマー配列は、１つまたは複数の設計基準に基づいて選択される。他の形態では、バイオポリマー配列は、ランダムに選択される。
【００９７】
各コンポーネント構築ブロックの相対的位置が、液滴の適切な調和された移動を可能にするために、マイクロ流体デバイス上の１つまたは複数の明確に異なる流体レザバにおいて決定される場合、始動因子配列上へのコンポーネント構築ブロックの段階的アセンブリが補助される。したがって、一部の形態では、これらの方法は、合成される標的配列を定義するインプットパラメーターを必要とする。インプットは、コンピューター可読プログラムの形態であり得る。したがって、一部の形態では、合成プロセスの出発点は、標的配列の同定である。同じまたは異なる配列を有する複数のポリマーが必要とされる場合、ユーザーは、合成が生じるようにマイクロ流体デバイス上の特定の位置を有するとして、各配列を指定しなければならない。
【００９８】
例示的な形態では、ユーザー定義された配列は、核酸であり、アドレス指定されるコンポーネント構築ブロックのレザバは、バイオポリマー中に取り込まれる異なるヌクレオチド塩基の数に従って選択される。例えば、ＤＮＡ配列の合成は、典型的には、ＤＮＡ中で見出される主要な核酸塩基の各々について１つずつの、コンポーネント構築ブロックの少なくとも４つの明確に異なるレザバ（即ち、アデニン、シトシン、チミンおよびグアニンの各々について１つのレザバ）、ならびに適切なアセンブリ触媒（即ち、鋳型なしのポリメラーゼ酵素）、反応緩衝液、１つまたは複数の洗浄緩衝液（例えば、水）ならびに停止緩衝液（例えば、ポリメラーゼ酵素を非活性化するため）の各々のための１つまたは複数のレザバを必要とする。これらの方法において使用される一部の試薬は、同じレザバ中で合わせられ得、または別々のレザバ中に維持され得る。一部の試薬、例えば、特定の配列順序で付加される個々のヌクレオチドは、互いに別々のレザバ中にあるべきである。
【００９９】
合成される異なるバイオポリマーの数もまた検討される。これらの方法は、マイクロ流体デバイス上での最大で１，０００，０００個の異なるポリマーの自動化された合成を可能にする。例示的な形態では、これらの方法は、各々が最大で４つの異なる核酸塩基を含み、異なるサイズ／長さを有する、１０個の異なる核酸を合成する。異なるポリマーの各々には、独自にアドレス指定されたレザバが割り当てられ（例えば、各レザバには、１と１０との間の数（包摂的）が割り当てられ、各整数は、単一の始動因子配列に対応する）、試薬の各々には、独自の整数が割り当てられる（例えば、それぞれ、各核酸塩基について１〜４、ポリメラーゼ酵素および２つの緩衝液の各々について５〜７、２つの洗浄緩衝液の各々について８〜９、ならびに停止緩衝液について１０）。したがって、例示的な方法では、少なくとも２０個のノードが、マイクロ流体デバイス上の明確に異なる試薬レザバとして必要とされる。
【０１００】
マイクロ流体デバイス、例えば、ＥＷＯＤチップ中の特定の位置またはレザバに試薬をロードするための方法は、当該分野で公知であり、当業者は、ローディングプロトコールが、使用されるマイクロ流体デバイスの型およびサイズ、ならびに液滴の単離および移動がそれを介して発動される力に従って変動し得ることを理解する。
【０１０１】
ａ．バイオポリマー配列へのデータの変換
一部の形態では、これらの方法は、所望の情報のピース、例えば、ビットストリームデータをコードするバイオポリマー配列を提供するステップを含む。ビットストリームデータとして情報をコードする例示的な配列制御されるポリマーは、核酸、例えば、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。例えば、一部の形態では、ユーザー定義されたビットストリームデータをコードする一本鎖核酸配列は、核酸の設計のためにインプットされる。一部の形態では、デジタルフォーマットの情報の一部分（単数または複数）、例えば、ｈｔｍｌフォーマットの情報、または任意の他のデジタルフォーマット、例えば、ブック・ウィズ・テキスト（ｂｏｏｋ  ｗｉｔｈ  ｔｅｘｔ）および／または画像、音声もしくはムービーデータは、ビット、即ち、ゼロおよび１に変換される。一部の形態では、情報は、１つのフォーマット（例えば、テキスト）から他のフォーマットへと、例えば、Ｌｅｍｐｅｌ−Ｚｉｚ−Ｍａｒｋｏｖチェーンアルゴリズム（ＬＺＭＡ）による圧縮もしくは他の方法の圧縮を介して、または例えばＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｎｃｒｙｐｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＡＥＳ）による暗号化もしくは他の方法の暗号化を介して、他の方法で変換され得る。ビットに変換され得る他のフォーマットの情報は、当業者に公知である。
【０１０２】
配列、例えばバイオポリマーの形態でデータをコードするためのスキームおよびシステムは、当該分野で公知である。したがって、記載される方法は、１つもしくは複数のバイオポリマーの配列にデータを変換するステップ、または１つもしくは複数のバイオポリマーの配列内のデータを暗号化するステップを含み得る。例えば、一部の形態では、データをインプットするステップは、データをバイオポリマー配列に変換するステップを含む。対応する配列は、引き続いて、バイオポリマーの合成のために必要とされる液滴の移動を調和させるためのインプットとして使用される。
【０１０３】
２．マイクロ流体デバイスをグリッドネットワークとして提供する
これらの方法は、ポリマー合成を媒介するために、独立した液滴としてマイクロリットル未満の体積の流体の移動を発動させることができる、マイクロ流体デバイス上の液滴の適切な移動を調和させるためのデータインプットを必要とする。好ましい形態では、マイクロ流体デバイスは、ＥＷＯＤを介したマイクロリットル未満の液滴の移動を発動させるためのデバイスである。例示的なＥＷＯＤデバイスは、ＥＷＯＤチップである。このプロセスにおける初期ステップは、アセンブリプロセスを含み、それによって、チップは、チップ上のチャネルおよびレザバの相対的位置を示すネットワークグリッドとして提供される。
【０１０４】
段階的アセンブリプロセスを調和させるために、チップは、チップ上のチャネルおよびレザバの相対的位置を示すネットワークグリッドとして提供される。例えば、ネットワークの各頂点（ノード）は、交差する／重複するグリッドライン（相互作用エッジ）の点によって示される。例えば、ネットワークの各頂点（ノード）には、対応するグリッドラインの交差に基づいてアドレスが割り当てられる。各ノードは、液滴の潜在的位置または目的地を示す。各ライン即ち「エッジ」は、そのエッジによって接続されたノード間を移動する際の液滴の潜在的通路を示す。マイクロ流体デバイスチップのための例示的なグリッドネットワークは、図１に示される。図１の模式図は、流体移動のための各チャネルを、グリッド上のエッジとして示す。各ノードは、その相対的位置に従ってアドレス指定される。一般に、チップ上のノードの総数の一部が、試薬のためのレザバとしてアドレス指定される。図１に示される模式的グリッドは、最外側のノードを、試薬のためのレザバとして示す。一部の形態では、各ノードのアドレスは、インプットパラメーター、例えば、マイクロ流体デバイスの各側のチャネルの総数から決定され、自動的に割り当てられる。各頂点のための例示的なアドレス指定スキームには、英数字（例えば、ａ、ｂ、ｃおよび１、２、３など）が含まれる。
【０１０５】
マイクロ流体デバイス上の液滴界面のために利用可能なノードの数は、チャネルの数（チップのグリッドグラフによって規定されるノード−エッジネットワーク中の「エッジ」）と比例する。１つの軸上にａ個のノードを有し、別の軸上にｂ個のノードを有するグリッドネットワーク（ａ×ｂグリッドグラフ）は、頂点セット［ａ］×［ｂ］、ならびに２つの型のエッジ：水平エッジ（ｉ，ｊ），（ｉ＋１，ｊ）（そこに（ａ−１）ｂ個が存在する）；および垂直エッジ（ｉ，ｊ），（ｉ，ｊ＋１）（そこにａ（ｂ−１）個が存在する）を有し、合計ａｂ個の頂点および（ａ−１）ｂ＋ａ（ｂ−１）＝２ａｂ−ａ−ｂ個のエッジとなる。一部の形態では、各ノードには、単一の整数値が割り当てられ、例えば、１０×１０グリッド中の各ノードには、１〜１００の数（包摂的）が割り当てられる。一部の形態では、各ノードには、二重整数アドレスが割り当てられ、例えば、１０×１０グリッド中の各ノードには、アドレス、例えば、（ａ，１）または（ｊ，１０）などが割り当てられる。
【０１０６】
３．ネットワーク中の交差するグリッドラインにおけるノードに、独自のアドレスを割り当てる
一部の形態では、チップ上のグリッドネットワークのエッジを規定するチャネルは、物理的チャネル（例えば、マイクロ流体デバイス内のレザバ間の溝または陥凹）である。他の形態では、チャネルは、例えば、グリッドのノード間での液滴の移動が光学的力によって発動される、「バーチャル」チャネルである。
【０１０７】
マイクロ流体デバイスグリッド表面上での液滴の光学的移動のためにバーチャルチャネルを使用することは、等しい寸法のマイクロ流体デバイス上の物理的チャネルの潜在的な最大数と比較して、規定された寸法を有するマイクロ流体デバイス上に提示することができるアドレス指定されたノードの数を、大きく増加させることができる。したがって、一部の形態では、液滴の光学的移動によって発動される、マイクロ流体デバイス上での液滴の分離および移動は、液滴が物理的力によって発動される場合の等しいサイズのマイクロ流体デバイス（例えば、ＥＷＯＤチップ）上のノードおよびチャネルの数と比較して、グリッド上の「チャネル」およびノードの数を増加させる。したがって、一部の形態では、これらの方法は、マイクロ流体デバイスに、４個と１０，０００，０００個との間のノード（包摂的）を有するグリッドネットワークを割り当てる。グリッドネットワーク上のノードの数は、マイクロ流体デバイス上のアドレス指定されたノードの数と相関する。マイクロ流体デバイス上のアドレス指定されたノードの数は、マイクロ流体デバイス上で同時に合成することができるバイオポリマーの数と正比例する。したがって、一部の形態では、これらの方法は、同じマイクロ流体デバイス上の独立した位置において、最大で１，０００，０００個のノード、例えば、１個と１０個の間のノード、１個と１００個の間のノード、１個と１，０００個の間のノード、１００個と１０，０００個の間のノード、１，０００個と１００，０００個の間のノードのアドレスを提供するステップを含む。
【０１０８】
マイクロ流体デバイス上のノードが、試薬レザバの位置である場合、ノードのアドレスは、対応するレザバからの試薬を含む液滴の自動化された分割および移動を指示するためのインプットとして使用される。したがって、ノードのアドレスは、１つまたは複数の試薬と関連付けられ得る。一部の形態では、ノードが、１つまたは複数の固定化されたコンポーネント始動配列を含む場合、ノードのアドレスは、対応する合成されたバイオポリマーのアドレスである。一部の形態では、マイクロ流体デバイスのグリッドネットワーク上の各位置について、別個のアドレスを割り当てるステップ。
【０１０９】
Ｂ．別個の流体液滴として試薬を提供する
これらの方法は、マイクロ流体デバイス上での、溶液として試薬を含む流体液滴のマイクロ流体分割および移動（例えば、ＥＷＯＤチップ上でＥＷＯＤによって発動される）を利用することを必要とする。したがって、これらの方法は、マイクロ流体デバイス上のアドレス指定された位置において基質のレザバを提供することを必要とする。
【０１１０】
一部の形態では、成長中のバイオポリマーは、マイクロ流体デバイス上のアドレス指定された位置に固定化される。例えば、一部の形態では、コンポーネント始動配列または触媒は、固定相物体、例えば、磁性ビーズ、表面、アガロースまたは他のポリマービーズにハイブリダイズするまたは他の方法で結合するように設計された１つまたは複数の配列を含む。他の例では、コンポーネント始動配列または触媒は、分子へのコンジュゲーションのための１つまたは複数の部位を含む。例えば、コンポーネント始動配列または触媒は、例えば、コンポーネント始動配列もしくは触媒の、または合成されたポリマーの親和性結合を可能にするために、タンパク質または非タンパク質分子にコンジュゲートされ得る。
【０１１１】
１．アドレス指定された試薬を提供する
これらの方法は、マイクロ流体デバイス上のより大きい流体レザバから分割された液滴として、試薬を提供するステップを含む。流体レザバのサイズ、濃度および位置は、試薬、合成プロトコール、およびマイクロ流体デバイスの寸法に従って変動される。
【０１１２】
ａ．流体レザバを提供する
これらの方法は、マイクロ流体デバイス上のより大きい流体レザバから分割された液滴としての試薬の制御を含む。マイクロ流体デバイス上の各流体レザバは、１つまたは複数の試薬を含み得る。レザバは、典型的には、マイクロ流体デバイスのグリッドに従ってアドレス指定され、レザバの相対的位置（アドレス）は、マイクロ流体デバイスベースの合成を制御および指示するために使用されるインプットデータの一部を形成する。液滴のパラメーター、例えば、各レザバ内の流体体積および試薬の濃度は、所望される合成の具体的な要求に従って選択され得る。典型的には、マイクロ流体デバイス媒介性の流体移動に使用される試薬レザバの体積および濃度は、合成が完了するまでにレザバから分割される必要がある液滴の数、体積および濃度と比例する。例示的な流体レザバ体積は、１ナノリットル（１ｎｌ）と１００ミリリットル（１００ｍｌ）との間、例えば、約１マイクロリットル（１μｌ）と約１００マイクロリットル（１００μｌ）との間である。典型的な合成は、異なるレザバ中に、例えば、８μＭ濃度の各モノマー構築ブロックを含む１０μｌレザバ、および１００μｌの緩衝液を含むレザバ、ならびに１μＭの始動因子配列を含む他の１０μｌレザバ、および１０μＭの鋳型なしのポリメラーゼ、例えばＴｄＴを含む他の１０μｌレザバを有する。
【０１１３】
ｂ．流体液滴を提供する
これらの方法は、液滴としての試薬の移動および合わせることを含む。液滴のパラメーター、例えば、体積および濃度は、所望される合成の具体的な要求に従って選択され得る。典型的には、マイクロ流体デバイス媒介性の流体移動に使用される液滴の体積は、約０．１ピコリットル（ｐｌ）と約１００マイクロリットル（μｌ）との間、例えば、約１ｐｌと約５０ナノリットル（ｎｌ）との間である。例示的な形態では、各液滴サイズは、約０．５ｎｌと５ｎｌとの間である。各液滴内の試薬の濃度は、約０．１フェムトモル濃度（１ｆＭ）と約１００マイクロモル濃度（１００μＭ）との間である。例示的な形態では、液滴は、ユーザー定義されたアドレス指定された核酸のマイクロ流体デバイスベースの合成のための試薬を含む。液滴中の始動因子配列核酸の量は、１ピコリットル（１ｐＬ）の液滴サイズ、最大で５ナノリットル（５ｎＬ）の液滴サイズ、およびそれを越える液滴サイズ当たり、約１フェムトモル（１ｆモル；１０−５モル）と１，０００ピコモル（１，０００ｐモル；１０−９モル）との間である。典型的な合成は、レザバから誘導されたまたはレザバから希釈された始動因子の濃度、一例として、ポリメラーゼについておよそ１０μＭ、始動因子について１μＭ、ヌクレオチドについて８μＭを有する、５０ｐＬまたは１ｎＬのいずれかの液滴を有する。
【０１１４】
Ｃ．バイオポリマー合成を調和させるために液滴を合わせる
これらの方法は、バイオポリマーの流体ベースの鋳型なしの合成を達成するために必要な試薬についての移動の配列を同定するステップを含む。典型的には、移動は、対応するグリッドネットワーク中に提供されるアドレス情報に基づいた、バイオポリマー配列全体の段階的アセンブリを達成するための、液滴の分割、再配置および合わせることを可能にする。したがって、これらの方法は、各バイオポリマーの段階的アセンブリを完了するための、液滴の各々についてのルーティング情報を提供する。
【０１１５】
別個のマイクロリットル未満の量の流体の調和された移動の制御を提供する任意のシステムが、記載される方法に従ってバイオポリマーを合成するために使用され得る。例示的なシステムは、マイクロ流体システムおよびデバイスである。記載される方法に従う、独立した液滴としての小さい流体体積の分配および移動のために使用され得る例示的なシステムには、ＥＷＯＤデバイス、音響液滴分配デバイス、例えば、市販のＥｃｈｏ  ５５５、行程容積分配デバイス、例えば、Ｍｏｓｑｕｉｔｏピペットロボット、またはインクジェット型流体分配器が含まれる。さらに、合成は、合成に使用されるマイクロウェルまたは合成区画による、チップを横断するフローによって生じ得る。好ましい形態では、マイクロリットル未満の流体液滴の、誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）発動される移動を使用するマイクロ流体デバイス／システムが、記載される方法に従うバイオポリマーの合成に使用される。
【０１１６】
光学的流体運動のための方法は、当該分野で公知である。一部の形態では、これらの方法は、粘度の勾配における、動的熱膨張から生じる流体運動を使用する。例えば、所与のスポットにおける流体の粘度は、その増強された温度によって低減される。これは、スポット前方の熱膨張とスポット後方の熱収縮との間での対称性の破れをもたらす。結果として、流体は、スポット前方の非対称な熱膨張およびスポット後方の非対称な熱収縮の両方に起因して、スポット方向と反対に移動する。
【０１１７】
１．誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）技術
一部の形態では、ユーザー定義された構築ブロックコンポーネントの段階的付加を介したバイオポリマーのアセンブリは、基質、酵素、洗浄緩衝液および他の試薬を含む液滴の、ＥＷＯＤ媒介性の移動を介して生じる。各液滴の移動の程度および方向は、ＥＷＯＤチップ上の任意の所与の位置において、２つまたはそれよりも多くの液滴を合わせることを調和させる。これらの方法は、１つまたは複数のグリッドラインの交差地点における各別個の位置を、チップ上の明確に異なってアドレス指定された位置として、ＥＷＯＤチップをグリッドとして提供する。したがって、ＥＷＯＤチップ上の１つの別個のアドレス指定された位置から、チップ上の別の別個のアドレス指定された位置への液滴の移動は、プログラム可能なユーザー定義された組成を有するバイオポリマーを合成するためのコンピューター可読プログラムとして実施され得る。
【０１１８】
エレクトロウェッティングは、電気的に荷電した固体表面上に液体がある場合の、液体の接触角の電気機械的低減を記述する。電場が、固体と水液滴との間の界面を横断して適用される場合、界面の表面張力は変化し、液滴の接触角における変化を生じる。油環境（即ち、水液滴が、空気ではなく油によって取り囲まれる場合）では、エレクトロウェッティング効果は、速い速度（＞１０ｃｍ／ｓ）および低い電気的エネルギー（スイッチ１回当たり約１００〜１０２ｍＪ／ｍ２）で、＞１００°の可逆的な接触角変化を提供できる。
【０１１９】
エレクトロウェッティングは、表面上の小さい量の流体を操作するための最も広く使用されるツールの１つになっている。ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐデバイス、オプティクスおよびディスプレイを含む、エレクトロウェッティングに基づいた多数の適用が、現在実証されている。
【０１２０】
エレクトロウェッティング研究における重要なパラメーターは、以下のように定義されるヤング角（Ｙｏｕｎｇ’ｓ  ａｎｇｌｅ）（θＹ）である：
ｃｏｓθＹ＝（γｏｄ−γａｄ）／γａｏ      （１）
式中、γｏｄは、エレクトロウェッティング液体（ａ、典型的には水性）とエレクトロウェッティングされる液体の周辺の油（ｏ）との間の界面張力であり；γａｄは、（ａ）と誘電体層（ｄ）との間の界面張力であり；γａｏは、（ａ）と（ｏ）との間の界面張力である。
【０１２１】
ほとんどのエレクトロウェッティング適用について、ヤング角からエレクトロウェッティングされた接触角（θＶ）にスイッチするために、低い電圧（Ｖ）を使用することが一般に望ましい。低電圧動作は、非常に大きいアレイ（数千または数百万）の電極を必要とする特定のディスプレイ、例えば、電子ペーパーディスプレイにとって、特に重要である。これらのデバイスは、アクティブマトリックス電極制御を必要とする。アクティブマトリックス制御は、ピクセル状態の各々を独立してアドレス指定する薄膜トランジスタ（ＴＦＴ）を使用する。ＴＦＴは、典型的には、最大でも約１５Ｖの信頼できる動作しか提供しない。しかし、≦１５Ｖにおいて動作する信頼できるエレクトロウェッティングデバイスを達成することは、かなりの困難であった。
【０１２２】
エレクトロウェッティングシステムでは、ヤング角は、エレクトロウェッティング方程式、
ｃｏｓθＶ＝（γｏｄ−γａｄ）／γａｏ＋εＶ２／（２ｄγａｏ）      （２）
によって予測されるように、エレクトロウェッティングされた接触角（θＶ）まで低減され、
式中、εは、誘電率であり、ｄは、誘電体の厚さであり；γは、上記方程式１に記載されたように、エレクトロウェッティング液体と油と誘電体との間の界面張力を示す項のために使用され；Ｖは、適用されたＤＣまたはＡＣ  ＲＭＳ電圧である。
【０１２３】
表面張力が、高いヤング角（θＹ）のために最適化されると、エレクトロウェッティング方程式は、誘電体の厚さを低減させること、またはより高い誘電率を有する誘電体を使用することのみによって、より低い電圧が得られ得ることを予測する。１００度のオーダーでの接触角における変化は、良好なエレクトロウェッティングデバイス機能にとって望ましい。
【０１２４】
これらの方法は、ＥＷＯＤチップ上の大きい流体レザバから分割された液滴としての、試薬の移動の制御を必要とする。ＥＷＯＤテクノロジーを使用して液滴の移動の程度および方向を制御するための機構は、当該分野で公知である。液滴の移動を発動させるための例示的な機構には、電荷および光学的制御システムが含まれる。
【０１２５】
ａ．光学エレクトロウェッティング（Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ）技術
一部の形態では、ＥＷＯＤ上での液滴の移動は、光学的力によって発動される。半導体の空間電荷領域中のキャリアの数を光学的にモジュレートすることによって、液体液滴の接触角は、連続した方法で変更され得る。この効果は、Ｙｏｕｎｇ−Ｌｉｐｐｍａｎｎ方程式の改変によって説明できる。液滴の光学的移動のための例示的な方法には、オプトエレクトロウェッティング（ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ）および光エレクトロウェッティング（ｐｈｏｔｏ−ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ）が含まれる。光学（光操作される）ＥＷＯＤテクノロジーは、最大で数百万個の液滴について同時かつ即座に、単一液滴レベルでの液滴移動の完全なプログラム可能性を提供する。例示的なテクノロジーは、ＯＰＴＯＳＥＬＥＣＴ（商標）テクノロジーであり、これは、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  Ｌｉｇｈｔｓから市販される細胞、ビーズおよび試薬を正確に操作するために、低強度の可視光を使用する。ＯＰＴＯＳＥＬＥＣＴ（商標）消耗品チップは、数千個のナノリットルペンを含み、個々の液滴のアノテーションおよび特徴付けを可能にする。
【０１２６】
ｉ．オプトエレクトロウェッティング
オプトエレクトロウェッティング（ＯＥＷ）には、光伝導体の使用が関与する。しかし、伝統的なエレクトロウェッティングが、複数の液滴の同時操作などにおけるような課題に直面する場合には、ＯＥＷは、産生がより単純かつ安価な、利益のあがる代替法を提示する。ＯＥＷ表面は、リソグラフィーを必要とせず、光強度に対するその反応に起因して、リアルタイムの再構成可能な大規模操作制御ができるので、製造が容易である。
【０１２７】
液体液滴の１つの縁を光学ビームで照らすことによって、低減された接触角は、液滴にわたって圧力差を創出し、照射された側に向かって、液滴の重心を押す。光学ビームの制御は、液滴の移動の制御を生じる。
【０１２８】
４ｍＷのレーザービームを使用すると、ＯＥＷは、７ｍｍ／ｓの速度で脱イオン水の液滴を移動させることが証明されている。伝統的なエレクトロウェッティングは、液滴発動のために、電極の二次元アレイを必要とする。多数の電極は、特に、より小さい規模の液滴サイズについて、これらのチップの制御およびパッケージングの両方について複雑度をもたらす。この問題は、電子デコーダーの組み込みを介して解決できるが、チップのコストは顕著に増加する。
【０１２９】
ｉｉ．光エレクトロウェッティング
光エレクトロウェッティング（ＰＥＷ）は、フォトキャパシタンスを使用し、エレクトロウェッティングに使用される液体／絶縁体／導体スタック中の導体が半導体によって置き換えられる場合に、観察され得る。
【０１３０】
液体−絶縁体−半導体接合部におけるフォトキャパシタンスを使用する光エレクトロウェッティングは、金属酸化物半導体に基づく電荷結合素子と類似の、フォトダイオードとして作用する絶縁体−半導体接合部における空間電荷領域中のキャリアの光学的モジュレーションを介して達成される。液滴輸送は、液滴の前縁にレーザーを集中させることによって達成される。１０ｍｍ／ｓよりも速い液滴速度が、基礎をなすパターン化された電極を必要とせずに、達成され得る。
【０１３１】
一部の形態では、ＥＷＯＤ上でのバイオポリマーの合成のための方法は、液滴の、光活性化されたエレクトロウェッティング発動される移動を使用する。典型的には、これらの方法は、付着液滴の移動を可能にするために、疎水性表面を使用する。ＰＥＷのための例示的なシステムは、液滴を発動させる誘電体でカバーされた、電場を誘導するために光活性化され得る光活性ウエハーを含む。
【０１３２】
ｂ．固体支持体上でのＥＷＯＤ合成
一部の形態では、バイオポリマーの移動がＥＷＯＤによって媒介されないように、成長中のバイオポリマーは、ＥＷＯＤチップ上のアドレス指定された位置に固定化される。例えば、一部の形態では、コンポーネント始動配列または触媒は、固体支持体または固定相物体、例えば、磁性ビーズ、表面、アガロースまたは他のポリマービーズにハイブリダイズするまたは他の方法で結合するように設計された１つまたは複数の配列を含む。他の例では、コンポーネント始動配列または触媒は、分子へのコンジュゲーションのための１つまたは複数の部位を含む。例えば、コンポーネント始動配列または触媒は、例えば、コンポーネント始動配列もしくは触媒の、または合成されたポリマーの親和性結合を可能にするために、タンパク質または非タンパク質分子にコンジュゲートされ得る。
【０１３３】
固体支持体または固定相物体が使用される場合、液滴が、固定化された試薬上に移動され得、または固定化された試薬から分割され得るように、液滴を移動させるための機構は、固体支持体または固定相物体の移動とは明確に異なり、固体支持体の移動も固定相物体の移動も誘導しない。
【０１３４】
２．マイクロ流体ベースの合成のためのインプットを提供する
一部の形態では、これらの方法は、コンピューターベースのインターフェースを使用して、各ユーザー定義されたポリマーをアセンブルするために、マイクロ流体デバイスの予め規定されたネットワークグリッド上での液滴の移動のための指示をインプットするステップを含む。例えば、一部の形態では、ネットワークのアドレス指定されたノードに対応するデータは、マイクロ流体デバイス上での１つまたは複数のバイオポリマーの自動化された合成のために、コンピューターにインプットされる。
【０１３５】
コンピューター可読形態でグリッドネットワークの座標をインプットするための方法は、当該分野で公知である。例えば、一部の形態では、これらの方法は、マイクロ流体デバイス上のグリッドネットワークおよび／または各バイオポリマーの合成のために必要とされる試薬の各レザバのアドレスを規定する幾何学的パラメーターを提供するステップを含む。幾何学的パラメーターには、全ての頂点の空間座標、頂点間のエッジ接続性、および頂点が属する面が含まれる。
【０１３６】
液滴のマイクロ流体デバイス媒介性の移動の制御の自動化の程度は、完全な自動化（例えば、標準的な体積の各試薬を有する事前アドレス指定されたレザバを有するマイクロ流体デバイスについての所定のグリッド座標に基づいた、標的配列およびサイズのランダム選択）から、自動化なし（液滴分割、および液滴のノードからノードへの移動の各ステップが、ユーザー補充される試薬を含むようにカスタム設計されたユーザー定義されたグリッドについてユーザー定義される）まで変動し得る。一部の形態では、インプットデータは、各固定化されたコンポーネント始動配列のアドレス（即ち、各バイオポリマーが合成される位置）、および所望の標的配列のみを含む。各コンポーネント構築ブロックを付加するサイクル（例えば、調和された洗浄、コンポーネント構築ブロック、触媒の添加、触媒の遮断）を達成するために液滴の移動を制御するインプットデータ、必要とされるサイクルの数などは、事前プログラムされ、または他の方法で独立して提供される。他の形態では、合成プロセス全体にわたる、液滴のノードからノードへの各移動を制御するインプットデータもまた、各バイオポリマーについてインプットされる。
【０１３７】
記載される方法に従うバイオポリマーのマイクロ流体デバイスベースの合成に必要な、配列設計、グリッド決定、および指示のインプットの後、アドレス指定されたバイオポリマー配列は、マイクロ流体デバイス上で合成され、必要に応じて官能化され、精製される。したがって、ユーザー定義された配列を有するバイオポリマーのマイクロ流体デバイスベースの鋳型なしの合成のための方法は、バイオポリマーを産生するステップを含む。一部の形態では、これらの方法は、同じマイクロ流体デバイス上の独立してアドレス指定された位置において、最大で１，０００，０００個のバイオポリマー、例えば、１個と１０個との間のポリマー、１個と１００個との間のポリマー、１個と１，０００個との間のポリマー、１００個と１０，０００個との間のポリマー、１，０００個と１００，０００個との間のポリマーを同時に合成する。
【０１３８】
典型的には、パラメーターは、各合成のためのインプットデータとして決定される。例示的なパラメーターには、（ａ）所望のバイオポリマー配列の合成のための適切な順序で、始動因子配列を各試薬と接触させるための、液滴の移動のシークエンス、ならびに（ｂ）合成の各ステップにおける試薬の最適な活性のために必要とされる条件、が含まれる。
【０１３９】
典型的には、これらの方法は、コンポーネント構築ブロックのユーザー定義された配列を有するバイオポリマーを合成するために、コンポーネント構築ブロックを始動因子に結合させる。成長中のバイオポリマーに結合されるコンポーネント構築ブロックの数は、各個々の分子のレベルでは制御できないので、各完全な合成によって産生される得られるバイオポリマーは、典型的には、各サイクルの間にバイオポリマー分子に結合されるコンポーネント構築ブロックの数について、釣鐘曲線を含む。例えば、一部の形態では、各結合反応は、ゼロ個と１００個との間のコンポーネント構築ブロックを、始動因子またはバイオポリマーに結合させ得る。典型的には、各段階において結合されるコンポーネント構築ブロックの平均数は、１または２である。一部の実験では、各段階において結合されるコンポーネント構築ブロックの平均数は８であり、およそ８回の付加のポアソン分布に従う。典型的には、ホモポリマー付加の数は、利用可能な前駆体の量、および成長中のポリマーと利用可能なヌクレオチドとの間の比率、および動作の温度、および使用される緩衝液、および使用される酵素によって制御される。一部の形態では、各段階において結合される構築ブロックの数の分布は、例えば、結合プロセスを増強する因子を制限することによって制御される。制御され得る例示的な因子には、基質、触媒、イオンおよび他の試薬の濃度、ならびにインキュベーション時間、および光、撹拌、温度、圧力、電荷などを含む他の因子のバリエーションが含まれる。
【０１４０】
一部の実施形態では、各反応ステップの時間は、ヌクレオチド使用を推定するためにミカエリスメンテン方程式をシミュレートすることによって決定される。さらなる実施形態では、１つの配列制御されるポリマーを別の配列制御されるポリマーから識別するために必要な付加の数の推定は、ポアソン分布を仮定して付加の数をシミュレートすることによって決定される。
【０１４１】
一部の実施形態では、ヌクレオチドの付加は、光学的に活性化可能なヌクレオチドアナログによって遮断される。１つの実行では、ヌクレオチドまたはアドレス指定された鎖は、ＤＬＰチップ（Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）などからの光の特異的な投影によって、次の取り込みを可能にするために活性化される。一部の実行では、一部のポリマーまたはヌクレオチドが、例えば、青色光を使用した場合にのみ活性になるように、特定のヌクレオチドまたはポリマーは、使用される光の波長に基づいて活性化可能である。
【０１４２】
ａ．液滴移動のシークエンスおよびサイクル
アセンブリは、適切なマイクロ流体デバイス表面上での流体液滴の段階的移動によって実施される。好ましい形態では、液滴の移動は、ＥＷＯＤデバイスを使用して実施される。ＥＷＯＤデバイス上での液滴の移動は、電荷の適用によって、または光学的力によって、発動され得る。移動は、例えば、結合およびバイオポリマー合成を制御するために適切な反応体積中に適切な量で混合される試薬の別個の体積を提供するために、より大きい体積から液滴を分割するステップを含む。好ましい形態では、試薬は、バイオポリマーの収量および正確なアセンブリを最大化するために有効な量で、分割および合わせられる。
【０１４３】
ＤＮＡポリマー合成の例は、一般に、代替的酵素、例えば、テロメラーゼまたはＱベータレプリカーゼを使用するＤＮＡまたはＲＮＡ合成に適用され得る。さらに、本明細書の例は、ＥＷＯＤを使用した液滴ベースの移動を記載するが、例えば、レーザー走査顕微鏡によって移動される流体を使用して、光学的制御などを介した他のデバイスによって提供される、液滴の統合、分離および混合に、一般に適用可能である。
【０１４４】
一部の形態では、これらの方法は、マイクロ流体デバイス上の単一の位置に維持される始動因子配列への試薬の段階的添加によるバイオポリマーの合成を始動および完了させる。他の形態では、始動因子配列への試薬の段階的添加によるバイオポリマーの合成の始動および完了は、始動因子配列および成長中のバイオポリマーを含む液滴の、マイクロ流体デバイスベースの移動を含む。合成は、固体支持体もマトリックスもなしに水溶液中で実施され得、または固体支持体もしくはマトリックス上に固定化された１つもしくは複数の試薬を含み得る。
【０１４５】
他の形態では、成長中のバイオポリマーは、マイクロ流体デバイス上のアドレス指定された位置において固定化される。例えば、一部の形態では、コンポーネント始動配列または触媒は、固体支持体または固定相物体、例えば、磁性ビーズ、表面、アガロースまたは他のポリマービーズにハイブリダイズするまたは他の方法で結合するように設計された１つまたは複数の配列を含む。他の例では、コンポーネント始動配列または触媒は、分子へのコンジュゲーションのための１つまたは複数の部位を含む。例えば、コンポーネント始動配列または触媒は、例えば、コンポーネント始動配列もしくは触媒の、または合成されたポリマーの親和性結合を可能にするために、タンパク質または非タンパク質分子にコンジュゲートされ得る。
【０１４６】
固体支持体または固定相物体が使用される場合、液滴が、固定化された試薬上に移動され得、または固定化された試薬から分割され得るように、液滴を移動させるための機構は、固体支持体または固定相物体の移動とは明確に異なり、固体支持体の移動も固定相物体の移動も誘導しない。
【０１４７】
例示的な形態では、液滴の、マイクロ流体デバイス媒介性の分割、移動および合わせることのシークエンスは、それぞれ、酵素触媒、コンポーネント構築ブロック（例えば、ヌクレオチド）およびコンポーネント始動配列（例えば、オリゴヌクレオチド）を含む流体レザバからの核酸のアセンブリを可能にする。１回目の移動では、液滴は、酵素（Ｅ＋Ｉ）および１つまたは複数のヌクレオチド（Ｎ１Ｔ、Ｎ２Ｔなど）レザバから、同時に分割される。２回目の移動では、液滴は、合わせた液滴を形成するように統合される。合わせた液滴は、生成物（「Ｎ１」）を形成する反応を達成するために、１分間インキュベートされる。３回目の移動では、Ｎ１を含む液滴は、次のヌクレオチド試薬を含む次の液滴に移動される。流体を分割、操縦および統合するための液滴の移動は、電位（例えば、ＥＷＯＤデバイスなどでは）によって、または光学的励起によって、発動され得る。
【０１４８】
典型的には、インプットパラメーターには、電気的または光学的な発動された始動（レザバからの液滴の分割）、および液滴のノード−ノード移動の方向についての指示が含まれる。インプットパラメーターには、任意の所与のノード（グリッド上のアドレス）における引き続く移動または分割事象間の時間の量も含まれる。したがって、パラメーター、例えば、インキュベーション時間、添加または除去される試薬の量、および各位置における液滴の総体積は、直接、または各マイクロ流体デバイスのための指示の事前プログラムされたテンプレートとして、制御され得る。
【０１４９】
ｉ．固体支持体ベースの合成
一部の形態では、これらの方法は、固体支持体にカップリングされる始動因子配列からのコンポーネント構築ブロックの段階的アセンブリの複数の連続的サイクルから、バイオポリマーを合成する。固体支持体は、マイクロ流体デバイス上にロードされるもしくは他の方法でその上に存在するビーズなどの粒子であり得、またはマイクロ流体デバイスの表面であり得る。始動因子配列は、分子を一緒にコンジュゲートするために、当該分野で公知の任意の結合、材料またはシステムを使用して、固体支持体にカップリングされ得る。好ましい形態では、始動因子配列は、例えば、始動因子タグの５’領域におけるビオチン配列を介して（即ち、５’−ビオチン化された始動因子配列）、ビオチン／ストレプトアビジンコンジュゲーションシステムを使用して固体支持体にカップリングされる。
【０１５０】
移動の例示的なシークエンスは、（１）コンポーネント構築ブロックを、始動因子配列と合わせるステップ；（２）結合試薬を、始動因子配列と共にコンポーネント構築ブロックを含む液滴と合わせて、結合反応液滴を形成するステップ；（３）緩衝液を結合反応液滴と必要に応じて合わせて、結合を始動、増強または他の方法で制御するステップ；（４）停止試薬を結合反応液滴と合わせて、結合を停止させるステップ；（５）洗浄試薬を反応液滴と必要に応じて合わせて、洗浄された反応液滴を創出するステップ；（６）洗浄された反応液滴の大部分を分割して、廃棄液滴および洗浄されたバイオポリマー液滴を創出するステップ；ならびにステップ（５）を１または複数回反復して、バイオポリマーを徹底的に洗浄するステップを含む。一般に、上記ステップ（１）〜（６）の各々を含むサイクルは、発達中のバイオポリマーへの各コンポーネント構築ブロックの付加のために反復される。
【０１５１】
したがって、一部の形態では、バイオポリマーを構成するために必要とされるサイクルの数は、合成される配列のサイズに等しい。
【０１５２】
上記移動ステップ（１）〜（６）の各々は、（ｉ）対応するレザバからの、流体を含む液滴の分割；（ｉｉ）液滴の、標的液滴の位置への移動；および（ｉｉｉ）液滴を標的液滴と合わせること、のシークエンスによってさらに特徴付けられ得る。一部の形態では、標的液滴は、バイオポリマーまたは始動因子を含む。他の形態では、標的液滴は、バイオポリマーも始動因子も含まない。したがって、一部の形態では、各移動ステップには、例えば、バイオポリマーまたは始動因子と合わせる前に所望の組成を有する液滴を調製するための、分割、移動および合わせることの複数のステップが関与し得る。
【０１５３】
触媒酵素および／または始動因子配列のうち１つまたは複数は、１つまたは複数の固体支持体マトリックスに固定化または結合され得る。一部の形態では、アドレス指定された合成は、不動態化された表面またはスライド、例えば、表面上に始動因子およびポリマーを有するスライド上で、またはスライドにエッチングされたピコリットルスケールのウェル中で、実施される。一部の形態では、始動因子配列または結合酵素は、例えば、ビオチン、または当該分野で公知の他の方法によって、表面またはウェルに結合される。一部の形態では、始動因子配列および酵素は、洗浄溶液またはコンポーネント構築ブロック（例えば、ヌクレオチド）のラテラルフローにアクセス可能である。かかる場合には、アドレス指定された成長中の鎖は、例えば、４ｋ  ＤＬＰチップを使用して表面上に集中させた光によって、次の取り込みのためにプログラムされる。
【０１５４】
一部の実施形態では、ポリマーの合成は、ウェル、または脂質二重層もしくはポリマーメッシュの存在によって外部環境から分離されたマイクロメートルスケールの小胞内で生じる。かかる実施形態では、メッシュまたは層は、外部原動力による、例えば、エレクトロポレーションまたは電気泳動による、構築ブロックの横断を可能にしても可能にしなくてもよい。これは再び、カプセル化された領域中への進入に対する障壁を横断することを可能にするために必要な電位を創出する、回路ベースの設計によってアドレス指定され得る。かかる場合には、カプセル化された領域は、１〜１０マイクロメートルであり、合成細胞と類似である。かかる場合には、成長中のポリマーは、ＤＮＡまたはタンパク質またはＲＮＡであり得、遺伝エレメントまたは情報エレメントをコードし得る。
【０１５５】
ｉｉ．連続フローベースの合成
ポリメラーゼもしくは触媒またはコンポーネント始動配列を、当該分野で公知の技術を使用してチップを不動態化することによってチップの表面に結合させることは、成長中のポリマーへのコンポーネント構築ブロック（例えば、ヌクレオチド）の連続フロー取り込みをさらに可能にする。一部の形態では、始動因子配列および酵素は、ウェル内に単一のポリメラーゼおよび始動因子で、マイクロメートルまたはナノメートル寸法を有する異なるウェル中に隔離される。個々のモノマーのフローは、電子的スイッチ、加熱を使用して、またはリソグラフィープレートを介して、または包埋されたタンパク質チャネルありもしくはなしの脂質二重層によるカバーを介して、制御または転用され得る。酵素を含むウェル／溶液へのアクセスは、バイオポリマーの合成を指示するために、制御される。酵素を含むウェル／溶液へのアクセスを制御するための例示的な方法には、メンブレン、もしくはウェルのカバーを介した、またはカバーもしくはメンブレンを介して１つもしくは複数のチャネルを活性化することによる、直接的貫通が含まれる。
【０１５６】
一部の形態では、単一または複数のコンポーネント構築ブロックを、酵素を含むウェル／溶液と合わせることは、例えば、流れるヌクレオチドが表面を通過するのを可能にするために、メンブレンを横断する電位を使用することによって（周知のエレクトロポレーションと類似であるが、マイクロスケールまたはナノスケールのウェル中である）、あるいはタンパク質チャネルを活性化するための電気的シグナル、あるいはヌクレオチドまたは負に荷電したモノマーもしくは正に荷電したモノマーに、他の点では閉鎖された表面の内側を通過させる電位を誘導すること、例えば、アガロース、アクリルアミドもしくは他のポリマーを介したエレクトロポレーションによって、電位を活性化することを介して達成される。したがって、一部の形態では、ウェルは、二重層または化学的メッシュによる遮断に起因してウェルから排出できない始動因子または成長中のポリマーおよびポリメラーゼを含む。一部の形態では、チャネルのうち１つまたは複数は、光学的パターン化を使用して、ヌクレオチドまたはポリマー層横断のために光学的に制御され得る。
【０１５７】
ｉｉｉ．溶液ベースの合成
一部の形態では、成長中のポリマーは、ビーズにも表面にも取り付けられず、溶液中で遊離である。例えば、一部の形態では、始動因子配列を含む液滴は、合成プロセスを通じた各試薬液滴の添加と共に、体積が順次増加する。
【０１５８】
ｂ．インキュベーション条件
これらの方法は、バイオポリマーの合成を達成するために、異なる条件を使用する。好ましい形態では、流体液滴を分割、移動および合わせることのシークエンスには、上記ステップ（１）〜（６）のサイクルを介してバイオポリマーを合成するために、インキュベーション期間が組み入れられる。インキュベーション条件は、１つまたは複数のパラメーターに対する変化を含み得る。したがって、一部の形態では、インキュベーション期間は、１つまたは複数の物理的または化学的パラメーター、例えば、温度、イオン濃度、ｐＨ、圧力、電荷、光への曝露などを、変化または操作することを含む。好ましい形態では、インキュベーション条件は、例えば、結合を増強もしくは最適化、または低減もしくは防止するために、始動因子へのコンポーネント構築ブロックの結合を制御するために使用される。
【０１５９】
一部の形態では、これらの方法は、各コンポーネント構築ブロックの結合にとって最適な条件を特定するステップを含む。したがって、体積、濃度などを含む液滴のパラメーターは、変動され得、インキュベーション時間、温度などを含む外部パラメーターは、アセンブリプロセスの１つまたは複数の態様を制御、最適化または最小化するために変動され得る。
【０１６０】
例示的なインキュベーション条件には、液滴を移動させるステップ、２つもしくはそれよりも多くの液滴を合わせるステップ、または液滴を分割するステップの目的によって決定される、最も有効な結果を生じさせる条件が含まれる。例示的な形態では、結合試薬を、始動因子またはバイオポリマーおよびコンポーネント構築ブロックと合わせるという目的は、始動因子またはバイオポリマーへの単一のコンポーネント構築ブロックの結合を増強することによって最適化される。したがって、最適な条件には、結合を最も効率的に達成する条件が含まれる。最適化され得る例示的なステップは、結合の触媒作用に最適な条件（「結合条件」）、反応を停止または遮断するのに最適な条件（「停止条件」および「遮断条件」）、および試薬をリンス、溶解または洗浄するのに最適な条件（「洗浄条件」）を含む。典型的には、条件の各セットについて変動され得るパラメーターには、（ｉ）インキュベーション体積、（ｉｉ）インキュベーション時間、および（ｉｉｉ）他の条件、例えば、液滴から外部の条件または液滴から独立した条件、が含まれる。これらのパラメーターの各々は、当業者によって最適化され得る。
【０１６１】
ｉ．インキュベーション体積
これらの方法は、異なるサイズまたは同じサイズの液滴の混合を含む。したがって、これらの方法は、２つまたはそれよりも多くの液滴を合わせた後の、試薬の量および濃度（即ち、「最終」濃度）を変動させ得る。
【０１６２】
例示的な形態では、ある体積の緩衝液または結合試薬は、対応するレザバから分割され、得られた液滴中に所望の濃度を生じさせるのに十分な量で、始動因子配列もしくはバイオポリマー、またはそれに結合した始動因子配列もしくはバイオポリマーを有するビーズを含む液滴と合わせるために移動される。例えば、液滴は、試薬の所望の濃度が達成されるまで、サイズが増加され得る。一部の形態では、活性薬剤を含む液滴は、活性薬剤を溶解させるためおよび／または濃度を所望の値まで低減させるために、活性薬剤を含まない液滴、例えば、緩衝液または水液滴と合わせられる。この液滴は、引き続いて、始動因子配列またはバイオポリマーを含む液滴と合わせられる。この様式では、これらの方法は、特定された濃度の試薬、ｐＨ、イオン強度などを有する特定された体積の液滴の、ユーザー定義された創出を可能にする。したがって、一部の形態では、これらの方法は、始動因子配列またはバイオポリマーを含む液滴と合わせる前に、規定された濃度、ｐＨ、塩濃度、量の活性薬剤などを有する液滴を創出するステップを含む。この様式では、特定の濃度の試薬が、例えば、所与の構築ブロックの結合の速度および程度を制御するため、または酵素活性を遮断するために、アセンブリプロセスを通じて、アドレス指定されたバイオポリマーと合わせられ得る。
【０１６３】
例示的な形態では、１サイクル当たり、１つまたは複数のかかるコンポーネント構築ブロックのみが、始動因子配列、またはバイオポリマーの末端に付加されるように、液滴内のコンポーネント構築ブロックの濃度は低減される。したがって、一部の形態では、合わせた液滴中のコンポーネント構築ブロックの濃度は、１サイクル当たりの、バイオポリマーに付加されるコンポーネント構築ブロックの数を決定する。
【０１６４】
別の形態では、合わせた液滴中の塩の濃度またはｐＨは、酵素活性を制御するために使用される。例えば、液滴中の塩の量およびｐＨは、酵素触媒される付加反応の速度および忠実度をもたらし得る。したがって、一部の形態では、酵素触媒の活性が低減、増加、防止または始動されるように、触媒を含む液滴は、合わせた液滴中の塩濃度を低減または増加させるのに十分な量の、塩または無塩緩衝液を含む液滴と合わせられる。例えば、一部の形態では、合わせた液滴内の塩の濃度は、触媒の活性を始動させるのに有効な量まで増加される。他の形態では、合わせた液滴内の塩の濃度は、触媒の活性を防止するのに有効な量まで低減される。
【０１６５】
典型的なインキュベーション体積は、約０．１ピコリットル（ｐｌ）と約１００マイクロリットル（μｌ）（より大きくてもよい）との間、例えば、約１ｐｌと約５０ナノリットル（ｎｌ）との間の体積である。例示的な形態では、各液滴サイズは、約０．５ｎｌと５ｎｌとの間である。
【０１６６】
ｉｉ．インキュベーション時間
これらの方法は、所定の位置でより大きい合わせた液滴を形成するために、特定の期間にわたって液滴を合わせるステップを含む。２つまたはそれよりも多くの液滴を合わせた後、これらは、例えば、結合試薬からバイオポリマーを単離するために、ある特定の期間の後、例えば、溶媒の大きい液滴、および固定化されたバイオポリマーを含むより小さい体積を生じるように、分割され得る。
【０１６７】
したがって、一部の形態では、これらの方法は、例えば、結合させるステップの目的を達成するために十分な特定の期間にわたって、試薬を合わせる。例示的なインキュベーション時間には、１または複数ミリ秒間（ｍｓ）、１または複数秒間、例えば、５秒間、１０秒間、３０秒間、４０秒間、５０秒間、１分間、２分間、３分間、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４５分間、１時間、９０分間、２時間、３時間、６時間、１２時間、２４時間、または２４時間よりも長い時間が含まれる。一部の形態では、インキュベーション時間は、必要とされる酵素、試薬または触媒の比反応性に従って決定される。例えば、一部の形態では、結合剤が始動因子またはバイオポリマーおよび１つもしくは複数のコンポーネント構築ブロックと共にインキュベートされる時間の量は、結合されるコンポーネント構築ブロックの数を制限するために変動される。例示的な形態では、試薬の２つまたはそれよりも多くの液滴は、３０秒間と５分間との間の期間にわたって合わせられる。ＴｄＴ酵素による核酸へのヌクレオチドコンポーネント構築ブロックの結合の触媒作用のための例示的なインキュベーション時間は、３７℃で１０分間である。
【０１６８】
ｉｉｉ．他の条件
これらの方法は、最適なインキュベーションパラメーターを達成するための、異なる条件下での液滴の混合を含む。したがって、これらの方法は、例えば、異なる量の熱、光、気体、電荷などを提供するために、試薬が合わせられる条件を変動させ得る。一部の形態では、インキュベーションは、例えば、支持体表面の撹拌によって、合わせた液滴を混合することによって増強される。酵素的結合のための液滴のインキュベーションのための例示的な温度は、２０℃と４０℃との間、例えば、３７℃である。触媒酵素の活性を低減または防止するための例示的な温度は、４０℃よりも高い温度、例えば、６０℃と８０℃との間の温度である。バイオポリマーの合成の間の所与の位置における温度は、例えば、Ｐｅｌｔｉｅｒ温度制御システムによって制御され得る。一部の実行では、液滴は、１秒間から３０分間、または例えば１０分間にわたって３７℃で保持され得るグリッド上の位置に移動される。別の実行では、可搬性ヒートブロックは移動され得、マイクロ流体チャネルの底部にあって、チャネルを３７℃または所望の動作温度まで加熱する。別の実行では、デバイスは、３７℃または所望の動作温度で動作する室内に置かれる。
【０１６９】
ｃ．触媒活性の阻害
一部の形態では、これらの方法は、触媒活性を阻害するステップを含む。触媒を阻害するステップは、バイオポリマー上へのコンポーネント構築ブロックの付加を低減または防止するプロセスを含み得る。触媒活性を阻害するステップは、触媒酵素の能動的な阻害；１つまたは複数の重要な酵素補因子の除去、またはその量における低減；１つまたは複数のコンポーネント構築ブロックの除去、またはその量における低減；触媒酵素の破壊または分解；触媒酵素からのバイオポリマーの物理的分離；およびこれらの組合せを含む手段によって、達成され得る。したがって、一部の形態では、これらの方法は、バイオポリマーを含む液滴を、酵素の活性を阻害するまたは酵素の存在を低減させる試薬または分子を含む１つまたは複数の液滴と合わせることによって、触媒の活性を阻害する。
【０１７０】
一部の形態では、これらの方法は、１つまたは複数の阻害性分子をバイオポリマー中に合わせることによって、触媒の活性を阻害する。阻害性分子は、バイオポリマー上への引き続くコンポーネント構築ブロックの取り込みを可逆的に遮断できる。したがって、一部の実施形態では、これらの方法は、触媒酵素を（ｉ）活性化するまたは合わせるステップ、（ｉｉ）阻害するまたは除去するステップ、および（ｉｉｉ）再活性化するまたは再び合わせるステップのシークエンスを使用することによって、バイオポリマーの配列特異的合成を調和させる。一部の形態では、（例えば、第１のコンポーネント構築ブロックの存在下で）触媒を活性化するステップは、酵素補因子、緩衝液、または触媒機能に必要な他の試薬を含む液滴を合わせるなどの、１つまたは複数のプロセスを含む。一部の形態では、活性化ステップは、例えば、特定された時間にわたって、特定された温度においてなど、合わせた液滴をインキュベートするステップを含む。一部の形態では、触媒を阻害するステップは、液滴を、酵素補因子、緩衝液、または触媒機能に必要な他の試薬をキレートする、封鎖するまたは他の方法で除去する試薬と合わせるなどの、１つまたは複数のプロセスを含む。一部の形態では、阻害ステップは、触媒の活性が阻害されることを確実にするために、例えば、特定された時間にわたって、特定された温度においてなど、合わせた液滴をインキュベートするステップを含む。一部の形態では、（例えば、第２のコンポーネント構築ブロックの存在下で）触媒を再活性化するステップは、液滴を、酵素補因子、緩衝液、または触媒機能に必要な他の試薬を含む試薬と合わせるなどの、１つまたは複数のプロセスを含む。
【０１７１】
一部の形態では、阻害ステップは、バイオポリマーへの、１つまたは複数の阻害性コンポーネント構築ブロック、例えば、触媒酵素の活性を立体障害する荷電した部分を含む阻害性核酸の付加を含む。したがって、一部の形態では、触媒活性を再活性化するステップは、阻害性ヌクレオチドからの荷電した部分の除去を含む。
【０１７２】
一部の形態では、（ｉ）触媒を活性化または合わせること、（ｉｉ）触媒を阻害するまたは除去すること、および（ｉｉｉ）触媒を再活性化または再び合わせること、のシークエンスは、１つまたは複数の洗浄ステップを含む。例えば、一部の形態では、１つまたは複数の洗浄ステップは、（ｉ）と（ｉｉ）との間、（ｉｉ）と（ｉｉｉ）との間、（ｉ）と（ｉｉｉ）との間、または（ｉ）、（ｉｉ）および（ｉｉｉ）の各々の間で、実施される。
【０１７３】
例示的な形態では、コンポーネント構築ブロックは、全て阻害性核酸である。したがって、一部の形態では、バイオポリマーへのコンポーネント構築ブロックの付加のための全てのステップは、上記（ｉ）および（ｉｉｉ）を含む。例えば、触媒を再活性化するステップは、以前に付加された核酸からの阻害性部分の除去を含む。
【０１７４】
例示的な形態では、この方法は、触媒酵素を含む溶液からカチオンを除去するキレート剤である停止試薬を使用する。したがって、一部の形態では、これらの方法は、例えば、成長中のバイオポリマー中に１、２、３または４つのコンポーネント構築ブロックを取り込むために、各「サイクル」においてバイオポリマーに付加されるコンポーネント構築ブロックの数に対する正確な制御を提供するために、限界濃度の触媒および／またはコンポーネント構築ブロックの使用を、キレート剤と合わせる。したがって、一部の形態では、これらの方法は、合成されるバイオポリマーの長さおよび配列に対する正確な制御を提供する停止試薬を含む。したがって、一部の形態では、これらの方法は、二項分布に従う範囲のサイズおよび配列を有するバイオポリマーを産生しない。
【０１７５】
３．例示的な方法
ユーザー定義された核酸のマイクロ流体デバイスベースの合成のための例示的な方法が提供される。例示的な方法は、液滴ベースのマイクロ流体デバイステクノロジーによるプログラムされた移動を介したヌクレオチド、酵素、洗浄溶液および遮断溶液の添加を使用することによる、ＤＮＡの鋳型なしの酵素的合成を使用して、高度に平行な様式で核酸を合成する。例示的な方法は、結合剤としてＴｄＴ酵素を使用した核酸の鋳型なしのアセンブリに必要とされる移動のシークエンスおよびパラメーターを規定する。例示的な方法は、液滴テクノロジーの１つの方法としてグリッドベースのＥＷＯＤを使用するが、任意の適用された電位による、例えば、回路を介したもしくはオプティクスを介した、またはかかるシステムからの液滴の任意の連続した誘導された移動による、液滴の別個のグリッドベースの移動に対して一般化され得る。したがって、例示的な方法は、分割、統合または混合される、１ｐＬ、最大で１μＬの液滴を使用する任意のシステムとの使用のために一般化され得る。例示的な方法は、ユーザー定義された核酸配列のためのコンポーネント構築ブロックとして、ｄＮＴＰ（例えば、ＡＴＰ、ＵＴＰ、ＧＴＰおよびＣＴＰ）を使用する。これらの方法は、認識されており、ＴｄＴポリメラーゼによって結合され得る、当該分野で公知の任意の塩基を結合させるために使用され得る。
【０１７６】
例示的な方法は、以下に提供される、（ａ）固体支持体上での、核酸のＥＷＯＤベースの合成；（ｂ）固定化されたＴｄＴ酵素を使用した、核酸のＥＷＯＤベースの合成；（ｃ）溶液中での、核酸のＥＷＯＤベースの合成；および（ｄ）バイオポリマー配列内でのデータのコードを含む。
【０１７７】
ａ．固体支持体上での、核酸のＥＷＯＤベースの合成
例示的な方法では、ＥＷＯＤベースの合成は、磁性ビーズにカップリングされたターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）ポリメラーゼ酵素に対して特異的な始動因子配列を使用した、ユーザー定義された核酸の鋳型なしの合成のために使用される。
【０１７８】
デオキシリボヌクレオチドが重合してＤＮＡを形成する場合、１つのヌクレオチド由来のリン酸基は、別のヌクレオチド上の３’炭素に結合して、脱水合成を介してホスホジエステル結合を形成する。新たなヌクレオチドは通常、最後のヌクレオチドの３’炭素に付加され、そのような合成は通常、５’から３’へと進行する。ＴｄＴ酵素のための始動因子配列は、磁気的に活性なビーズに結合され、またはストレプトアビジンで改変されたビーズもしくは表面に結合することによって、表面に直接結合される。濃度は、一般に、１ｐＬの液滴サイズ、最大で５ｎＬの液滴サイズ、またはそれよりも大きい液滴サイズ、例えば、最大で１，０００ｎＬの液滴サイズ当たり、約１ｆｍｏｌと１００ピコモルとの間である。
【０１７９】
磁性ビーズは、ＥＷＯＤチップの表面に対して外部の磁石の存在によって、適所で維持される。取り付けられたＤＮＡ始動因子配列は、合成を通じて水溶液中で維持される。水溶液は、合成された核酸を維持するのに適切な任意の水溶液であり得る。ＥＷＯＤによって提供されるプログラムされた液滴移動を使用すると、コンポーネント構築ブロックは、所望のヌクレオチドを含む液滴の移動によって、固定化された始動因子配列に順次付加される。例示的なｄＮＴＰには、カノニカルｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰまたはｄＣＴＰ、および非カノニカルｄＮＴＰが含まれる。選択されたコンポーネント構築ブロックを含む液滴は、対応するレザバから分割され、次いで、固定された鎖液滴の位置（アドレス）へと、グリッドネットワークを横断して移動される。固定された鎖を含む液滴との接触の際に、合わせた液滴は混合される。一部の形態では、ｄＮＴＰコンポーネント構築ブロックを含む入ってくる液滴は、反応のための緩衝化コンポーネントおよび塩コンポーネントもまた含み得、ＴｄＴ酵素をさらに含み得る。あるいは、ＴｄＴ酵素は、ヌクレオチドの付加の前または後に、固定液滴と、別々に混合され得る。
【０１８０】
ヌクレオチドを成長中のＤＮＡポリマーと混合し、緩衝液および酵素を添加した後、成長中の取り付けられたポリマーへのヌクレオチドの付加が始まる。取り込みのための時間は、一般に、１秒間から１分間であり、取り付けられたポリマーへの、ホモポリマーとしてのヌクレオチドの付加の数は、（１）温度、（２）総溶液中での時間、（３）添加されたｄＮＴＰ上の遮断部分の存在、および（４）総溶液に添加されたｄＮＴＰの量、によって決定される。ケース１では、温度は、４℃から９８℃で改変され得、酵素取り込み速度に対する影響を有する。現在の標準的な動作温度は、３７℃である。取り付けられた成長中のポリマーがｄＮＴＰおよび／または酵素に供される時間もまた、取り込みの数に関する因子である。ポリマーを、酵素およびｄＡＴＰ（例えば）と、３７℃で１分間インキュベートすることによって、１個から１０個から１００個のホモポリマーＡの取り込みが、取り付けられたポリマーへとアセンブルする。取り付けられた鎖がｄＮＴＰに供される時間は、固定された位置のポリマーをｄＮＴＰから除去および洗浄することによって、制御され得る。例えば、それらの２’位置または３’位置において改変され得る遮断ヌクレオチドの存在は、成長中のポリマーの長さを制限するためにさらに使用され得、これは、ｄＮＴＰミックス自体中にこれらの改変されたヌクレオチドを有すること、または溶液中に移動されそれと混合される外部液滴中に高い濃度でそれらを有することによって、達成され得る。最後に、ｄＮＴＰのホモポリマー付加は、ｄＮＴＰの濃度によって制限され得、ここで、液滴は、１ｐｍｏｌの取り付けられたポリマーを含む液滴に添加される、１ｐｍｏｌのｄＡＴＰ（例えば）を含み得る。したがって、ヌクレオチドの付加は、それらが取り込まれるにつれて、なくなるまで減少し、ホモポリマー１つ当たりの付加の数は、およそ単一ヌクレオチド取り込みのポアソン分布を有する。
【０１８１】
選択された長さの配列は、低塩、加熱、もしくはコンポーネント始動配列の５’側に取り込まれたヌクレアーゼ特異的カット部位を用いた切断（例えば、ＰｓｔＩ）によって最後に放出され、またはチップなしのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅される。あるいは、ＤＮＡポリマーは、ビーズまたは表面から放出されず、さらなる処理のために結合したままである。
【０１８２】
ｓｓＤＮＡの引き続く配列決定の容易さは、ＳＭＲＴｂｅｌｌ（ＰａｃＢｉｏ）ポリメラーゼ配列を、成長中のＤＮＡ鎖の５’側もしくは３’側に、またはナノポア配列決定（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ）のためのコンポーネント始動配列に、先頭に追加することまたは付け足すことによって、達成され得る。これは、配列決定の既に発見された方法への適応を介した、直接的配列決定を可能にする。
【０１８３】
ｂ．固定化されたＴｄＴ酵素を使用した、核酸のＥＷＯＤベースの合成のための例示的な方法
一部の形態では、鋳型なしのポリメラーゼ（例えば、ＴｄＴ）は、ビオチン部分によって、またはストレプトアビジンを用いたクローニングによって、または当業者に公知の固定の他の方法によって、固体支持体に取り付けられる。さらに、酵素（例えば、ＴｄＴ）は、例えば、Ｎ末端またはＣ末端において、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、例えば、ＳＳＢまたはジンクフィンガードメインをクローニングすることによって、成長中の一本鎖ポリマーへの結合を増強するために、さらに改変される。したがって、ポリメラーゼは、固体支持体（ビーズ、表面）に取り付けられ、鋳型は、第２のドメインとの相互作用によって、鋳型なしのポリメラーゼに非共有結合される。次いで、ヌクレオチドの添加は、付加を触媒し、実施例１で適用される全ての方法は、成長中のポリマーの配列制御のために、本明細書で適用され得る。
【０１８４】
ｃ．溶液中での、核酸のＥＷＯＤベースの合成のための例示的な方法
低体積で高濃度の酵素および始動因子配列で出発すると、ｄＮＴＰの付加は、配列特定され、枯渇が各付加を制限するような濃度である。したがって、ｄＡＴＰ（例えば）を、１：１の濃度で酵素およびポリマーミックスに添加した場合、ｄＡＴＰは、ポリマー１つ当たり１つのＡが付加されるポアソン分布で、付加の間にわたって枯渇される。例えば３７℃で１分間の反応枯渇の後、次のヌクレオチドは、これもまた１：１の量で、溶液に添加され混合される。したがって、成長中の配列制御されるＤＮＡポリマーは、固体支持体に取り付けることなく、ｄＮＴＰの洗浄も除去も必要とせずに、作製され得る。
【０１８５】
図２に示されるデバイス上でＥＷＯＤテクノロジーを使用して、固体支持体（例えば、磁性ビーズ）上で核酸配列「Ａ−Ｔ−Ｃ−Ｇ」を合成するために、流体液滴のＥＷＯＤベースのローディング、移動およびインキュベーションのシークエンスに必要なステップの例は、以下の表１に示される。
【０１８６】
表１に記載される移動のシークエンスについて、図２に示されるチップは、以下のように構成される：「Ａ」は、緩衝液、塩（例えば、ＮａＣｌ）、ｄＡＴＰおよびＴｄＴを含み；「Ｔ」は、緩衝液、塩（例えば、ＮａＣｌ）、ｄＴＴＰおよびＴｄＴを含み；「Ｃ」は、緩衝液、塩（例えば、ＮａＣｌ）、ｄＣＴＰおよびＴｄＴを含み；「Ｇ」は、緩衝液、塩（例えば、ＮａＣｌ）、ｄＧＴＰおよびＴｄＴを含み；「緩衝液１」は、洗浄緩衝液を含み；「緩衝液２」は、第２の洗浄緩衝液を含み；「放出」は、支持体からポリマーを放出させるための緩衝液および／またはコンポーネントを含む。ポリマーを検索するための収集ポート、および廃棄ポートもまた存在する。典型的には、システムは、３７℃である。ステップの多くは、ＥＷＯＤテクノロジーによって可能にされるように、効率のために並列化され得る。
【０１８７】
【表１−１】
2020523997.tif 000003
【表１−２】
2020523997.tif 000004
【０１８８】
一部の形態では、表１に示される、固定された成長中のポリマーに液滴をロードしそこから移動させる６１個のステップのシークエンスは、コンピューター可読プログラムとしてインプットされる。
【０１８９】
ｄ．デジタル情報のコード
例示的な形態では、ＤＮＡのマイクロ流体デバイスベースの鋳型なしの合成のための方法は、ある塩基型から別の塩基型へのスイッチとしての、デジタル情報のコードを含む。例えば、５が、任意の数１、２、３、または３よりも大きい数を示し、Ａが任意の塩基を示す、一連の５Ａ（「ＡＡＡＡＡ」）は、０を示し、６が、任意の数１、２、３、または３よりも大きい数を示し、Ｔが任意の他の塩基を示す、引き続く一連の６Ｔ（「ＴＴＴＴＴＴ」）は、１を示す。したがって、この具体的な例では、「ＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴ」は、「０１」のデジタル等価物を示す。
【０１９０】
４．バイオポリマーの操作
一部の形態では、これらの方法は、既存のバイオポリマー内のコンポーネント構築ブロックのサブセットを付加、除去または改変する。例えば、一部の形態では、これらの方法は、バイオポリマー上にさらなるコンポーネント構築ブロックを結合させる。他の形態では、これらの方法は、例えば、１つまたは複数のコンポーネント構築ブロックを分解することによって、バイオポリマーのコンポーネントのうち１つまたは複数を除去する。他の形態では、これらの方法は、例えば、既存の残基の１つもしくは複数の化学的部分の改変によって、または、１つのコンポーネント構築ブロックの、別のコンポーネント構築ブロックへの置換によって、バイオポリマー内の既存の配列を改変する。一部の形態では、バイオポリマーは、バイオポリマーの１つまたは複数のコンポーネントの付加とバイオポリマーの１つまたは複数のコンポーネントの除去との組合せによって、操作される。
【０１９１】
バイオポリマーの操作は、操作されるバイオポリマーを含む液滴を含む、液滴のマイクロ流体ベースの移動のための記載される方法に従って実施される。一部の形態では、バイオポリマーは、マイクロ流体システム上に固定化される。他の形態では、バイオポリマーは、溶液中に存在する、例えば、マイクロ流体デバイス（例えば、ＥＷＯＤチップ）上の１つまたは複数の流体レザバ中に存在する。一部の形態では、バイオポリマーは、分子または配列バーコードに対応する１つまたは複数の配列の置換、除去または付加によって操作される。
【０１９２】
ａ．分子バーコード付加
分子または配列バーコード付加は、他の分子のプール内から分子を同定する方法である。バーコード付加は、例えば、ＤＮＡ鎖の複雑なプールを用いた次世代配列決定における配列決定同定のために、使用される。バーコード付加は、溶液中での細胞ベースの同定およびＲＮＡ同定のためにも実行され得、ここで、配列および試料の構文解析は、下流での試料の分離のために重要である。バーコード付加のためのＤＮＡの合成は、典型的には、当該分野で公知の方法を使用した配列の事前合成によって達成され、次いで、ＤＮＡリガーゼによって、目的の試料にライゲーションされる。
【０１９３】
ｉ．バイオポリマーにバーコードを付加する
一部の例では、合成された配列制御されるポリマーは、ビーズ、またはビーズ内の材料の認識のためのバーコードである。一部の例では、バーコード配列は、情報のアクセスのためにｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで維持される情報を示す。一部の例では、ＤＮＡ配列は、アルゴリズムで生成され、外部コンピューター上に維持されない。例示的な方法では、事前設計された直交性バーコードのセットは、（ｉ）元のバーコードセットと類似の直交性を維持する、または（２）単一変異、二重変異、もしくは二重よりも多い変異で、１つの直交性バーコードから別の直交性バーコードへと変動する、点変異についての基礎セットとして使用される。例示的な方法では、１０個のバーコードの近隣が、元のバーコードの周辺に生成される。バーコードの最も近い各近隣者では、変異したバーコードと捕捉逆相補体との間の融解温度が、事前特定された量（例えば、５度）変動するように、単一の点変異または多くの点変異が導入される。したがって、より多くの変異の各段階的追加では、捕捉の温度は、例えば、５度（あるいは１度もしくは２０度、または２０度よりも大きく）低下する。こうして、バーコードの配列は変化し、捕捉は、バーコードまたは捕捉鎖の配列を変動させることによって制御され得る。
【０１９４】
一部の形態では、配列の近隣において変動される分子バーコードは、カプセル化されるＤＮＡ配列によってコードされる、ピクチャー中に存在する赤色の量などの、基礎をなすデータの記述を示す。例えば、一部の実験では、赤色のフェラーリのピクチャーは、当該分野で公知の方法を介してＤＮＡ配列に変換される。次いで、ＤＮＡ鎖は、シリカ中にカプセル化され、ビーズは、ピクチャーが赤色の車を含むことを示すようにバーコード付加される。しかし、他の画像は、時々しか赤色と呼ばれないピンク色のドレスのピクチャーなど、部分的にのみ赤色の物体を含み、したがって、赤色の近隣のバーコードを有するが、真の赤色と比較すると、いくつかの点変異を含む。他の場合には、青空のピクチャーなど、ピクチャーは、赤色を含まない場合がある。かかる場合には、ビーズは、赤色のバーコードを有さなくてもよく、またはそれを「赤色でなく」するのに十分な変異を有するバーコードを有してもよい。その場合、そのピクチャーは、「１００％青色」のバーコードを含んでもよい。対応する核酸バーコードを使用して同定することができる例示的な値は、以下の表２に示される。表２中の配列は、核酸配列ＣＧＧＣＣＣＡＴＣＴＧＧＴＧＴＧＡＴＧＣＡＴＴＡＣ（配列番号１）の周囲に点変異の「近隣」を形成する２０個の配列を示す。一部の形態では、表２中の配列番号２〜２１の配列は、配列番号１についての例示的なバーコード「ハッシュ」を示す。
【表２】
2020523997.tif 000005
【０１９５】
ｉｉ．バイオポリマーのバーコードを除去する
一部の形態では、バーコードは、バイオポリマーから除去される。例えば、バイオポリマーまたはビーズがバーコードを含む場合、バーコードの１つまたは複数のコンポーネントを含む配列は、バイオポリマーまたはビーズから除去され得る。一部の形態では、これらの方法は、引き続いて、同じバイオポリマーまたはビーズ上で新たなバーコードを再合成する。一部の形態では、これらの方法は、バイオポリマーまたはビーズの再バーコード付加のためのステップのシークエンスを含む。したがって、バイオポリマーまたはビーズに再バーコード付加するための自動化されたマイクロ流体ベースの方法が提供される。かかる場合には、１つまたは複数のバーコードが、バイオポリマーまたはビーズから除去される。
【０１９６】
バイオポリマーからの１つまたは複数のコンポーネント構築ブロックの除去のための例示的なステップは、好ましくは、バイオポリマー内の１つまたは複数の配列特異的部位における、酵素的切断または分解を含む。例示的な形態では、１つまたは複数のヌクレオチドは、ヌクレアーゼ酵素、例えばエキソヌクレアーゼ、または制限酵素、またはバーコードの材料を分解するＲＮａｓｅの活性によって、バイオポリマーから除去される。一部の形態では、１つまたは複数のアミノ酸は、プロテアーゼ酵素によって、ポリペプチド配列から除去される。一部の形態では、１つまたは複数のコンポーネント構築ブロックは、例えば、ＲＮＡタグを除去するために、分子を不安定化する化学、例えば、高いｐＨ（＞１０）を使用して、バイオポリマーから除去される。一部の形態では、これらの方法は、分解酵素もしくは切断酵素を洗浄して除くため、または化学的に破壊性の因子をバイオポリマーから除去するための、１つまたは複数のステップを含む。一部の形態では、これらの方法は、バイオポリマー上に新たなバーコードを合成するための１つまたは複数のステップを含む。
【０１９７】
一部の形態では、これらの方法は、さらなるヌクレオチド取り込みを促進するために、インヒビターを除去または中和するステップをさらに含む。最後に、バイオポリマー中に取り込まれるヌクレオチドは、取り込みをモニタリングするために、検出可能に標識され得る。
【０１９８】
ｂ．カプセル化
一部の形態では、これらの方法は、バイオポリマーをカプセル化する。例えば、一部の形態では、これらの方法は、１つまたは複数の外部層中に、バイオポリマーをカプセル化するまたは他の方法でカバーする、さらなるステップを含む。外部層は、バイオポリマーのカプセル化のために有用な任意の材料であり得る。例示的なカプセル化材料には、ゲル、ケイ酸塩、脂質、タンパク質、油、ポリマー、およびこれらの組合せが含まれる。シリカ中での核酸の可逆的なカプセル化は、Ｐａｕｎｅｓｃｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｖｏｌｕｍｅ  ８，  ｐａｇｅｓ  ２４４０−２４４８  （２０１３）に記載されている。
【０１９９】
カプセル化ステップを含むバイオポリマーの合成は、バイオポリマーの安定性を増強させることができる。例示的な形態では、バイオポリマーは、別個のデータ、例えば、ビットストリームデータの１つまたは複数のピースをコードする核酸配列である。データ配列のカプセル化は、ＤＮＡに熱的および化学的保護を与えることに加えて、他のＤＮＡ配列によるインタロゲーション（ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ）から、データ配列を保護する。
【０２００】
一部の形態では、カプセル化されたバイオポリマーは、カプセル化後に操作される。例えば、一部の形態では、保護されたＤＮＡは、分子認識配列、例えば、生化学的タグおよび光学的シグネチャーを使用してバーコード付加される。これらの同定性バーコードは、検索および引き続く読み出しおよびデジタル情報へ戻す変換のために、カプセル化されたデータを隔離するために使用され得る。
【０２０１】
バイオポリマーのカプセル化または再カプセル化は、当該分野で公知の方法および材料を使用して実施され得る。一部の方法では、ウェルまたは溶液または合成細胞様区画は、量子ドットを用いた光学的バーコード付加のためのシリカおよび全ての前駆体、またはアルギン酸カルシウム、またはポリアクリルアミド、またはＰＥＧもしくはＰＥＩ、あるいは無機化されたまたはヒドロゲルカプセル化の形成において典型的には使用される他のポリマーを含む。次いで、カプセル化のための触媒が、合成細胞区画もしくはウェルの内部内容物を、またはマイクロ流体デバイスにおいて実行されるように、油中の液滴をカプセル化する、ナノスケール〜マイクロスケールの無機化されたまたはヒドロゲルビーズの形成のために、さらに添加される。
【０２０２】
典型的には、任意の所望の長さの配列を有するバイオポリマーは、本明細書で「配列制御されるポリマー物体」と呼ばれる、ゲルベースのビーズ、タンパク質ウイルスパッケージ、ミセル、無機化された構造、シリコン処理された構造、またはポリマーパッケージング中に、パッケージングされる、カプセル化される、包まれる、またはケース封入（ｅｎｃａｓｅ）される。一部の形態では、合成されたバイオポリマーは、ナノメートル寸法を有するカプセル化粒子内に含まれる、単一の連続したポリマーからなる。一部の形態では、バイオポリマーは、単一のカプセル化粒子内に一緒に含まれるように合わせられた、多くのかかるポリマーからなる。これらの別個のバイオポリマー「パッケージ」は、構造の表面上での１つまたは複数の特異的分子「タグ」（例えば、バーコード）の取り込みを可能にする。一部の例示的なタグには、核酸配列タグ、タンパク質タグ、炭水化物タグおよび任意の親和性タグが含まれる。
【０２０３】
一部の形態では、カプセル化された粒子は、分子識別子、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ロックト核酸、ペプチド核酸、あるいはペプチドもしくはタンパク質または糖、あるいは分子インタロゲーションによって粒子を同定するために使用され得る他の認識ポリマーによって、バーコード付加またはタグ化される。一部の例では、この識別子は、抗体であり得る。他の例では、この識別子は、配列特異的ポリマー、例えば、ＤＮＡの配列であり得る。一部の実行では、これは、核酸バーコードの能動的な合成のために、鋳型なしのポリメラーゼおよび配列制御される付加を使用することによって、上記技術を使用して合成され得る。一部の実行では、これは、リガーゼもしくは鋳型なしのポリメラーゼを使用した事前合成されたプライマーの付加によって、または当該分野で公知の方法を介した粒子への事前合成されたプライマーの化学的付加によって、合成され得る。一部の場合には、バーコードは、配列制御され得るが、例えば、ＲＮＡアプタマーもしくは蛍光ＲＮＡアプタマー、例えばＳｐｉｎａｃｈアプタマーについての、または他のタンパク質もしくはＲＮＡとの相互作用によって同定され得る他のＲＮＡアプタマーによる分子認識のために、特異的に生成され得る。
【０２０４】
カプセル化剤が、１つまたは複数のバイオポリマーを完全にケース封入するために使用される場合、この１つまたは複数のバイオポリマー配列は、粒子コア内に存在し得る、またはコア周辺の１つもしくは複数のカプセル化層と関連付けられ得る、例えば、カプセル化材料内に包埋され得る。任意のインデックス／親和性／バーコードタグが、典型的には、粒子の表面に露出され、アクセス可能である。例えば、一部の形態では、インデックス／親和性タグは、粒子内に包埋されるまたは粒子の外部表面に他の方法で結合されるような様式で、付加される。
【０２０５】
一部の形態では、分子タグまたはバーコードは、自動化され予め定義された方法で、または動的メモリ割り付けおよび再割り付けのためのユーザーもしくはコンピューターからのフィードバックを用いる能動的な方法で、除去される、または動的に変更される必要があり得る。一部の実行では、バーコードは、ＤＮａｓｅ、エキソヌクレアーゼまたは制限酵素によって消化され得る。バーコードがＲＮＡである一部の例では、ＲＮａｓｅ  ＡもしくはＲＮａｓｅ  Ｔ１または他のＲＮａｓｅが、バーコード除去のために使用され得、または高いｐＨの存在によって除去され得る。バーコードが、ペプチドまたはタンパク質または抗体またはタンパク質タグ、例えば、ポリヒスチジンタグである一部の例では、バーコードは、ペプチダーゼもしくはプロテイナーゼ酵素によって、またはｐＨを介して、除去され得る。別の実行では、標的化された光／ＵＶ分解が、使用され得る。各場合において、カプセル化された生成物は、後の使用のために、除去溶液および残渣デブリから、必要に応じて精製され得る。
【０２０６】
ポリマーまたは化合物、例えば、二酸化ケイ素などから合成される、ナノメートル〜マイクロメートルスケールのビーズは、フロー化学およびマイクロ流体力学アプローチによって合成され得る。シリカ前駆体ならびに光学的バーコード、例えば、色素、量子ドット、ランタニドおよび／または色中心は、溶媒および触媒と混合され、シリカ粒子が形成するまで、撹拌される。別の実行では、色素および／または量子ドット、ランタニドエミッターまたは色中心と共にシラン前駆体を含むレザバは、フロー化学設定における流体接合部を介したフロー注入を介して、他の化学物質前駆体、例えば、触媒および溶媒と共に、ＤＮＡメモリと混合される。混合された前駆体は、シリカ形成を可能にするために、ヒーターを通過させられる。
【０２０７】
一部の形態では、シリカコアは、シリカ前駆体、光学的バーコードおよびＤＮＡメモリを界面活性剤と混合して油中水液滴を形成することによって、ＤＮＡメモリおよび光学的バーコードを用いて合成される。得られた液滴は、シリカが形成するまで、６５℃でインキュベートされる。粒子の正確なサイズ制御は、油中水エマルジョンのサイズを制御することによって達成され得る。
【０２０８】
他の形態では、シリカ前駆体、ＤＮＡメモリおよび光学的バーコードは、自動化された液体ハンドリングデバイスを使用して混合され、ここで、特定の体積が、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレート中の特定のウェル中に分注される。前駆体をウェルプレート中に添加した後、ウェルプレートは、シリカ粒子を産生するために、撹拌によって混合される。
【０２０９】
別の形態では、シリカ前駆体、ＤＮＡメモリおよび光学的バーコードは、マイクロ流体デバイス上の液滴を使用して、例えば、液滴のＥＷＯＤ発動される移動を使用して、混合される。
【０２１０】
一部の形態では、本明細書で定義されるアプローチを使用して、または別のアプローチを使用して合成された、配列制御されるポリマーは、ＥＷＯＤまたは他のマイクロ流体力学デバイス上で一緒にグループ分けされる。一部の形態では、配列制御されるポリマーは、合成された鎖もしくは付加された鎖を混合することによって一緒にグループ分けされ、または別々に維持される。典型的なワークフローでは、混合された鎖は、それらの配列について、または類似のデータ、もしくは同じビットストリーム配列の一部をコードする目的のために、関連付けられる。
【０２１１】
一部の例では、混合された鎖は、カプセル化される。核酸メモリシステムにおける使用のためのバイオポリマーのカプセル化は、国際公開番号ＷＯ２０１７／１８９９１４に記載されている。一部の形態では、シリカナノ粒子は、事前製造され得る、またはマイクロ流体力学デバイス上で製造され得る。バイオポリマー、例えばＤＮＡは、リン酸骨格と、シリカ粒子のアンモニウム官能化表面とのイオン対形成によって、シリカ中に添加され得る。したがって、一部の形態では、これらの方法は、シリカ内にバイオポリマーをカプセル化するステップを含む。一部の形態では、これらの方法は、光学的バーコード付加のための特定の濃度で、１つまたは複数の薬剤、例えば、色素、量子ドット、ランタニドエミッターまたは色中心を含むシリカコアを調製することによって、アンモニウム官能化粒子を産生する。一部の形態では、光学的にバーコード付加されたシリカコアは、例えば、３−（トリメトキシシリル）プロピル−トリメチルアンモニウムクロリドの添加によって官能化される。これらの方法は、バイオポリマーをシリカコアと合わせることによって、バイオポリマーをシリカコア中に吸着する。これらの方法は、必要に応じて、テトラエトキシシランを使用したカプセル化のために、シリカのさらなる層を追加する（例えば、シリカ「シェル」が追加される）。
【０２１２】
シリカコアは、フロー化学およびマイクロ流体力学アプローチを介して、大規模に調製され得る。したがって、一部の形態では、色素および／または量子ドット、ランタニドエミッターまたは色中心と共にシラン前駆体を含むレザバは、連続フローマイクロ流体システムにおける流体接合部を介したフロー注入を介して、バイオポリマー（例えば、ビットストリームコード核酸）と、および他の化学物質前駆体、例えば、触媒および溶媒と、混合される。
【０２１３】
一部の形態では、合わせられた前駆体を含む流体は、シリカ形成を可能にするために、ヒーターを通過させられる。これらの方法は、シリカコアを精製し、これは次いで、シリカのＤＮＡバーコード付加のために別のチューブを通過させられる。
【０２１４】
一部の形態では、シリカコアは、例えば、シリカ前駆体、光学的バーコードおよびＤＮＡメモリを界面活性剤と合わせて、油中水液滴を形成することによって、バイオポリマー（例えば、ビットストリームコードＤＮＡ）および光学的バーコードを用いて合成される。これらの方法は、シリカを形成させるのに十分な時間にわたって、得られた液滴を適切な温度（例えば、６５℃）でインキュベートするステップを含む。
【０２１５】
一部の形態では、シリカ前駆体、ＤＮＡメモリおよび光学的バーコードは、エレクトロウェッティングデバイス上の液滴を使用して混合される。
【０２１６】
一部の例では、固体支持体は、配列制御されるポリマー、例えばＤＮＡから全てまたは一部がそれ自体構成されるビーズ上にある。１つのかかる例では、固体支持体は、以前のランにおいてシステムによって生成された、または当該分野で公知の方法を使用して外部で生成されたＤＮＡ配列を含むビーズである。一部の場合には、固体支持体ビーズへのヌクレオチドの付加は、本明細書に記載される方法の全てを使用している。他の場合には、ビーズは、固体支持体であり、さらなるヌクレオチドは、リガーゼもしくは他の鋳型なしのポリメラーゼとのインキュベーションによって付加され、または核酸もしくは他の配列を適所で生成するための標準的な公知の化学を使用して化学的に合成される。
【０２１７】
ＤＮＡバーコードは、共有結合的アプローチ、例えば（それらに限定されないが）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを使用するアミド結合連結、硫黄基を介したマイケル付加、アジド−アルキン環化付加、ひずみ解放環化付加（ｓｔｒａｉｎ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）、または当該分野で公知の他の共有結合化学を介して、表面に結合される。一例では、ＤＮＡメモリを含むシリカは、３−アミノプロピルトリエトキシシラン（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ）、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、または当該分野で公知の、アミン官能基を導入する他の化学物質誘導体を使用して、アミン官能基でコートされる。アミノ官能化シリカに対するグルタル酸無水物、無水コハク酸、または当該分野で公知の他の環無水物（ｒｉｎｇ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）による処理は、カルボン酸官能基を導入する。次いで、アミノ改変されたＤＮＡが、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン（ＨＯＯＢｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、２−シアノ−２−（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル、４−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）、または当該分野で公知の他の活性化試薬を使用して結合される。別の例では、二機能性クロスリンカーである４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸スクシンイミジル（ＳＭＣＣ）が、マレイミド官能基を導入するために、アミノ官能化シリカに付加される。次いで、ＤＮＡバーコードは、ＤＮＡ上のスルフヒドリル基を使用するマイケル付加を介して導入される。別の例では、アミノ官能化シリカは、シリカの表面上にアルキニル基を導入するために、１−アルキン（１−ａｋｙｎｅ）ＮＨＳエステルまたはジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣ）ＮＨＳエステルで処理される。アジド含有ＤＮＡは、Ｃｕ触媒される環化付加またはひずみ解放環化付加を使用して結合される。当該分野で公知の任意の「クリック」型官能基が、シリカ上にＤＮＡバーコードを結合させるために使用され得る。
【０２１８】
一部の形態では、カプセル化された生成物は、同じまたは異なるバーコード配列によって再びバーコード付加され得る。新たなバーコードのこの付加は、上に列挙した方法によって合成される。この新たな合成は、システム、または単一の物体、もしくは２つの物体、もしくは２つよりも多くの物体の再バーコード付加を可能にする。
【０２１９】
バーコード付加、バーコード除去および再バーコード付加の各々の場合は、マイクロ流体デバイス上で達成され得、このとき、溶液は、洗浄、または生成物へのモノマー付加を可能にするために、ビーズもしくはカプセル化された生成物、または表面を横断して移動している。
【０２２０】
一部の実行では、粒子に対する識別子として使用されるバーコードは、同じまたは異なるセットの配列を含む他の粒子に対して直交性である。一部の場合には、バーコードは、それらと他のバーコードおよび他のバーコード相補的配列との間での最小のクロストークを有するように設計される。
【０２２１】
一部の例では、バーコードは、エラープローンであり、ユーザー特定されたバーコードから、１、２、３、４ヌクレオチド、または４ヌクレオチドよりも多く変動し得る。一部の例では、バーコードは、初期バーコードから、１、２、３、４つの変異、または４つよりも多い変異を有するように特定され得る。一部の実行では、バーコードは、赤色もしくは青色、または年、または地理的位置などを示す意味と同一視される。一部の例では、バーコード配列が、元のシステム直交性配列に対してどの程度正確かに関して、特定された点変異は、１から１０までの赤色の表示の計測のような、バーコード表示の尺度を示す。一部の例では、赤色を示すバーコードおよび青色を示すバーコードは、赤色バーコードを青色バーコードとより類似させるために、１、２、３、４つの点変異、または４つよりも多くの点変異によって変異され得る。したがって、基礎をなすポリマーは、純粋な赤色または純粋な青色に関連付けられるバーコードからの変異の量に基づいて、赤色から青色までのスペクトルのバリエーションとして記載され得る。
【０２２２】
一部の実行では、代表的なバーコードは、アルゴリズムで生成され得、または外部の表もしくはデータベースによって関連付けられ得る。
【０２２３】
一部の実行では、代表的なバーコードは、元のバーコードと比較した正確さに基づいて抽出またはプルダウンされ得る。したがって、赤色とより類似したバーコード配列は、赤色の相補的配列によってプルダウンされ、「より青色の」バーコードは、青色の相補的配列によってプルダウンされ得る。
【０２２４】
バーコードの直交性のアルゴリズム制御は、一般に、配列決定、ポリメラーゼ連鎖反応、単一細胞配列決定、または分子データに対するファジーサーチが適用可能な任意の適用のために使用される任意の分子にバーコード付加するために、適用可能である。
【０２２５】
一部の形態では、バーコードに対して相補的な配列は、５’側、３’側または内部で、蛍光部分、例えば、Ｃｙ５、Ｃｙ３、ＲＯＸ、Ａｔｔｏまたは他の蛍光分子で標識される。これらの場合には、目的のバーコードに対して相補的な配列は、ワトソン−クリック塩基対合によって相互作用する。ＥＷＯＤデバイスによって、または他のマイクロ流体力学デバイスおよびチャネルによって上記方法を使用して、バーコード付加された粒子のプールは、洗浄され得、粒子は、ＦＡＣＳ、または顕微鏡画像化、または選別を引き続いて可能にする他の画像化プラットフォームによって、選別され得る。一形態では、カメラからの蛍光読み取りは、ある特定のタグ化された粒子を追跡するために使用され得、これは次いで、光学的に制御されるＥＷＯＤデバイスによって、または粒子のＦＡＣＳベースの選別による分離によって、集団から隔離され得る。全ての場合において、バーコードは、上述の戦略を使用して、外部要求に基づいてバーコードを再標識または変更するための、動的に変更されたオンザフライであり得る。
【０２２６】
Ｄ．バイオポリマーの精製
これらの方法は、アセンブルされたバイオポリマーの精製を含む。精製は、アセンブルされたバイオポリマー／カプセル化されたバイオポリマーを、アセンブリプロセスの間に必要とされる基質および緩衝液から分離する。典型的には、精製は、バイオポリマーの物理的特徴に従って実施される。例えば、フィルターおよび／またはクロマトグラフィープロセス（ＦＰＬＣなど）の使用は、バイオポリマーのサイズおよび構造的特性に従って実施される。
【０２２７】
１．バイオポリマーをマイクロ流体デバイスから単離する
一部の形態では、バイオポリマーは、親和性クロマトグラフィーを使用して、または濾過によって、例えば、遠心濾過もしくは重力濾過によって、合成デバイスから精製される。一部の形態では、濾過は、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−０．５ｍＬ遠心フィルター（ＭＷＣＯ  １００ｋＤａ）を使用して実施される。
【０２２８】
一部の形態では、バイオポリマーを単離および／または精製することは、新たに合成されたバイオポリマーの、固体支持体マトリックスからの分離を含む。固体支持体マトリックスが、合成にわたって始動因子配列をアンカリングまたは他の方法で制御するために使用される場合、バイオポリマーは、合成の完了後に固体支持体から切断されるまたは他の方法で分離される。固体支持体からバイオポリマーを除去することは、当該分野で一般に公知の方法に従って実施され得る。例えば、一部の形態では、バイオポリマーは、合成後のバイオポリマーの切断のための１つまたは複数の切断酵素認識配列を含むように設計される。バイオポリマーは、合成の間もしくはその後に、または精製後に、またはバイオポリマーの精製後改変のための１つもしくは複数のステップの後に、固体支持体から除去され得る。
【０２２９】
固体支持体マトリックスからバイオポリマーを切断するために酵素が使用される場合、バイオポリマーは、所望のカット部位またはその近傍に、特異的切断酵素認識配列を含むように設計され得る。例示的な形態では、切断認識配列は、始動因子配列の内部またはその近傍にある。例えば、一部の形態では、バイオポリマーは核酸であり、切断酵素は、核酸配列の認識の際に核酸を特異的にカットする酵素である。これらの方法における使用のための例示的な酵素には、制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）酵素、例えば、平滑カッティングＲＥおよびオーバーハング産生性ＲＥが含まれる。
【０２３０】
精製後、バイオポリマーは、貯蔵ならびに／または引き続く構造的分析および検証のために、適切な緩衝液中に配置され得る。貯蔵は、室温（即ち、２５℃）で、４℃で、４℃未満で、例えば−２０℃で、実施され得る。適切な貯蔵緩衝液には、ＰＢＳ、ＴＡＥ−Ｍｇ２＋またはＤＭＥＭが含まれる。
【０２３１】
２．合成されたバイオポリマーの検証
一部の形態では、これらの方法は、合成されたバイオポリマーの検証のためのステップを含む。
【０２３２】
ａ．配列の決定
バイオポリマーを検証するための方法は、バイオポリマーの配列決定を含む。配列決定は、１つまたは複数の精製ステップの前またはその後に、実施され得る。バイオポリマーの配列決定のための組成物および方法は、当該分野で公知である。一部の形態では、バイオポリマーは、配列決定を促進するために、１つまたは複数の試薬または機能的分子を含むように、合成の間またはその後のいずれかに工学操作される。例えば、平滑カッティングＲＥによって産生される平滑末端は、ユニバーサル配列アダプターと適合性である。一部の形態では、記載される方法における使用のための配列決定アダプターは、任意の平滑カッティング制限エンドヌクレアーゼ酵素によって産生されるＤＮＡ断片に結合するユニバーサルアダプターである。ユニバーサルアダプターは、全ての平滑カッティングＲＥ酵素によって創出される平滑末端化されたＤＮＡ断片と適合性である。一部の形態では、アダプターは、単一塩基オーバーハングを有する任意の二本鎖ＤＮＡ断片と適合性である。例えば、ユニバーサルアダプターは、二本鎖ＤＮＡ断片のプールに共通する単一塩基オーバーハングに対して相補的な単一塩基オーバーハングを有し得る。一部の形態では、ユニバーサルアダプターは、単一のアデニンを有する全てのＤＮＡ断片と適合性である。
【０２３３】
好ましいユニバーサル配列決定アダプターは、「Ｙ型」アダプター（Ｙ−アダプター）である。Ｙアダプターは、異なる配列が、ライブラリー中の各核酸の５’末端および３’末端にアニーリングされるのを可能にする（Ｓｈｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  １７，  １４６３−１４７５  （２０１４））。
【０２３４】
一部の形態では、配列決定アダプターは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）Ｙ−アダプターであり、ｄＡテーリングステップとペアになり、コンカテマー形成を防止し、ライブラリーの配列決定可能な画分を増加させ、ペアードエンド配列決定を可能にする。ＩＬＬＵＭＩＮＡ（登録商標）Ｙ−アダプターの使用はまた、大規模で安価な多重化を促進する、ライブラリー増幅の間のデュアルインデックス化されたバーコードの取り込みを可能にする。一部の形態では、アダプターは、アダプターライゲーションしたＤＮＡ断片の選択的ＰＣＲ富化を可能にする。好ましくは、配列アダプターは、フローセルに結合できる。したがって、配列アダプターは、関連付けられたＤＮＡ断片が、次世代配列決定のために、複数の適用を介して操作されることを可能にする。
【０２３５】
一部の形態では、これらの方法は、核酸配列の決定のステップを含む。バイオポリマーは、当該分野で公知の配列決定方法に従って、例えば、米国特許出願公開第２００７／０１１７１０２号および米国特許出願公開第２００３／０１３８８０号に記載される技術を使用して、配列決定され得る。一般に、核酸配列の決定のための方法は、プライマーを標的核酸にハイブリダイズさせて鋳型／プライマー二重鎖を形成するのに適切な条件下で、標的核酸の少なくとも一部分に対して相補的なプライマーに、標的核酸を曝露させるステップを含む。
【０２３６】
ｂ．標識の検出
一部の形態では、これらの方法は、バイオポリマー中に取り込まれた１つまたは複数の標識または検出可能な部分を検出するステップを含む。例えば、放射性検出、光学的吸収検出、例えば、ＵＶ−可視吸収検出、光学的発光検出、例えば、蛍光または化学発光を含む、任意の適当／適切な検出方法が、取り込まれた標識（例えば、標識されたヌクレオチドアナログ）を同定するために使用され得る。単一分子蛍光は、全反射（ＴＩＲ）対物レンズを備えた従来の顕微鏡を使用して実施され得る。検出可能な部分は、使用される走査方法に依存して、各基材の全てまたは一部を同時にまたは連続的に走査することによって、基材上で検出され得る。蛍光標識化のために、基材上の選択された領域は、蛍光顕微鏡器具を使用して、１つずつまたは列ごとに、連続的に走査され得る（米国特許第５，４４５，９３４号；および米国特許第５，０９１，６５２号を参照のこと）。単一分子からの蛍光を感知することが可能なデバイスには、走査トンネル顕微鏡（ＳＴＭ）および原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）が含まれる。ハイブリダイゼーションパターンもまた、例えば、Ｙｅｒｓｈｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａ．  Ｓｃｉ．  ９３：４９１３  （１９９６）に記載されるような、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｎｄ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍａｓｏｎ，  Ｔ．  Ｇ．  Ｅｄ．，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｌａｎｄｏｎ，  ｐｐ．  １−１１  （１９９３）の適切なオプティクス（Ｐｌｏｅｍ、ＣＣＤ（Ｃｈａｓｅ−Ｃｏｍｐｌｅｔｅｄ−Ｄｅｖｉｃｅ））を有するＣＣＤカメラ（例えば、Ｍｏｄｅｌ  ＴＥ／ＣＣＤ５１２ＳＦ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｔｒｅｎｔｏｎ、Ｎ．Ｊ．）を使用して走査され得、またはＴＶモニタリングによって画像化され得る。放射性シグナルについては、ホスフォイメージャーデバイスが使用され得る（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  １３５６６，  １９９０；Ｄｒｍａｎａｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，  １３：５６６，  １９９２；  １９９３）。画像化機器の他の供給業者には、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｃａｎｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ、Ｍａｓｓ．、ｇｅｎｓｃａｎ．ｃｏｍにおいてワールドワイドウェブ上）、Ｇｅｎｉｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗａｔｅｒｌｏｏ、Ｏｎｔａｒｉｏ、Ｃａｎａｄａ；ｃｏｎｆｏｃａｌ．ｃｏｍにおいてワールドワイドウェブ上）およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｃ．が含まれる。かかる検出方法は、複数の結合された標的核酸の同時の走査を達成するために、特に有用である。
【０２３７】
ＩＩＩ．バイオポリマーの合成のためのシステム
Ａ．コンピューター実行されるシステム
本明細書で提供されるシステムおよび方法は、一般に、ユーザー定義された配列を有するバイオポリマーを産生する設計パラメーターを予測するために有用である。一部の形態では、所望の形態および所望の配列に対応するパラメーターは、完全にｉｎ−ｓｉｌｉｃｏの様式で配列インプットプロセスが実施されるのを可能にするコンピューターベースのインターフェースを使用してインプットされる。例えば、ある特定の形態では、これらの方法は、コンピューターソフトウェアにおいて、またはホストコンピューターを使用してアクセスおよび作動されるコンピュータープログラムの一部として、実行される。他の形態では、これらの方法は、１つまたは複数のコンピューターネットワークにアクセス可能なコンピューターサーバー上で実行される。
【０２３８】
図１は、実行され得る方法のワークフローを示す。一部の形態では、ユーザーは、ネットワーク、即ち、インターネット、または一部の場合には、プライベートネットワークもしくはローカルイントラネットを介して、サーバーコンピューターシステムに連絡したコンピューターシステムにアクセスする。ネットワークへの接続の一方または両方が、ワイヤレスであり得る。好ましい形態では、サーバーは、ネットワークを通じて多数のクライアントと、好ましくは、パーソナルコンピューターおよび他のコンピューターサーバーならびに携帯用デバイス、例えば、スマートフォンまたはタブレットコンピューターを含む異機種環境にある多数のクライアントと連絡する。一部の形態では、サーバーコンピューターは、連絡している、即ち、１つまたは複数の実験室自動化システム、即ち、記載される方法に従うバイオポリマーの合成を自動化するように構成された、１つまたは複数の自動化された実験室システムまたは自動化ロボット工学からインプットクエリーを受信し、またはアウトプット結果をそこに指向させることができる。
【０２３９】
これらの方法が実行されるコンピューターサーバーは、原則として、コンピューテーションを実施することが可能であり、必要なデータを記憶することが可能な、任意のコンピューティングシステムまたはアーキテクチャであり得る。かかるシステムの正確な仕様は、テクノロジーの成長およびペースと共に変化し、したがって、例示的なコンピューターシステムおよびコンポーネントは、限定と解釈すべきではない。これらのシステムは、典型的には、ストレージスペース、メモリ、１つまたは複数のプロセッサ、および１つまたは複数のインプット／アウトプットデバイスを含む。用語「プロセッサ」は、本明細書で使用する場合、任意の処理デバイス、例えば、ＣＰＵ（中央処理装置）を含むデバイスなどを含む意図であることを理解すべきである。用語「メモリ」は、本明細書で使用する場合、プロセッサまたはＣＰＵ、例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭなどと関連付けられたメモリを含む意図である。さらに、用語「インプット／アウトプットデバイス」または「Ｉ／Ｏデバイス」は、本明細書で使用する場合、例えば、１つもしくは複数のインプットデバイス、例えば、クエリーを行うためおよび／もしくはデータを処理装置にインプットするためのキーボード、ならびに／または１つもしくは複数のアウトプットデバイス、例えば、クエリー結果および／もしくは処理装置と関連付けられた他の結果を表示するためのディスプレイおよび／またはプリンターを含む意図である。Ｉ／Ｏデバイスはまた、クエリーが１つまたは複数のクライアントコンピューターから受信され、結果が１つまたは複数のクライアントコンピューターに指向される、ネットワークへの接続であり得る。用語「プロセッサ」は、１つよりも多い処理デバイスを指し得ることも理解すべきである。コンピュータークラスター上またはマルチプロセッサコンピューターサーバー中の他の処理デバイスは、処理デバイスと関連付けられたエレメントを共有し得る。したがって、本発明の方法論を実施するための指示またはコードを含むソフトウェアコンポーネントは、本明細書に記載される場合、関連付けられたメモリまたはストレージデバイス（例えば、ＲＯＭ、固定されたまたは除去可能なメモリ）のうち１つまたは複数中に記憶され得、すぐに利用できる状態にある場合、メモリ中に（例えば、ＲＡＭ中に）一部または全てがロードされ得、ＣＰＵによって実行され得る。ストレージは、プログラムコード、ゲノム配列のデータベースなどを記憶するためにさらに利用され得る。ストレージは、伝統的なハードディスクドライブ、半導体ドライブまたは超高速ディスクアレイを含む、任意の適切な形態のコンピューターストレージであり得る。一部の形態では、ストレージには、コンピューティングクラスターを含む複数の類似のコンピューターサーバーに動作可能に接続され得る、ネットワークに繋がれたストレージが含まれる。
【０２４０】
１．アドレス指定されたバイオポリマーのライブラリーの調製
一部の形態では、バイオポリマーライブラリーは、自動化された方法によって設計される。独自にアドレス指定されたバイオポリマーを生成するための自動化された設計プログラムは、多様な適用のためのバイオポリマーのライブラリーの合成に向けて、配列の多様なセットが作製されるのを可能にする。例示的な形態では、多様な配列を有するバイオポリマーのライブラリーは、メモリストレージにおける適用のため、またはゲノムの分析のための適用のために、有用である。例えば、一部の形態では、バイオポリマーのライブラリー（単数または複数）は、同じまたは異なる標識、例えば、１つまたは複数の標的分子に対して相補的な捕捉タグまたは標的配列を用いて構成され得る。
【０２４１】
ａ．バイオポリマーのハイスループット産生、および改変
異なる改変を含むバイオポリマーのライブラリーの自動化された合成のためのシステムは、自動化された方法を使用して実行され得る。典型的には、コンピューターによるシステムは、独自にアドレス指定されたバイオポリマー、例えば核酸の多様なセットの配列設計を自動化するために適用される。一般に、ユーザー定義されたバイオポリマーのハイスループットライブラリー生成は、複数の自動化されたステップを介して達成される。数百〜数千のバイオポリマー配列、例えば核酸配列を合成するための自動化された設計プログラムは、多様な適用のための配列のライブラリーの合成に向けて、分子の多様なセットが作製されるのを可能にする。
【０２４２】
一部の形態では、合成されるバイオポリマーの配列は、例えば、ライブラリーまたはデータベースからの、配列のバッチまたはセットとしてインプットされる。他の形態では、バイオポリマーの配列は、インプットされる時点の前またはインプット時に、例えば、コンピューターによるアルゴリズムによって生成される。例示的なコンピューターによるアプローチは、特定の配列、サイズ、構造的または機能的特性を有するバイオポリマーのセットを生成する。例えば、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで生成されるバイオポリマー配列の数は、約１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１０６、１０７個、または１０７個よりも多くである。
【０２４３】
好ましい形態では、数十、数百または数千のバイオポリマーの生成のためのハイスループット方法は、自動化された液体ハンドラーを使用する。例えば、ハイスループット方法は、自動化された液滴の分割、移動および合わせることのために、表面にレザバとして試薬を提供するための液体分注器を使用する。方法の自動化は、適切なマイクロ流体デバイス表面、例えばＥＷＯＤチップ上の指定された位置に、レザバとして試薬を提供することを含み得る。一般に、自動化は、バイオポリマーのライブラリーを合成するために好ましい。ＥＷＯＤ媒介性の自動化された液滴移動と合わせて、コンポーネント構築ブロックのストックを使用すると、バイオポリマーのハイスループットコンビナトリアルライブラリーが、容易に生成される。一部の形態では、試薬レザバの体積および濃度は、プレートフォーマットを決定する場合に考慮される。
【０２４４】
好ましい形態では、自動化された方法は、所与の時点において１０個よりも多いバイオポリマーを合成するように、液体の移動を同時に調和させる。ハイスループット方法は、ライブラリーのために所望される任意の数のバイオポリマー、例えば、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、１０００００、１００００００個、および１００００００個よりも多くの、ユーザー定義された配列制御されるバイオポリマーの迅速な生成を可能にする。一部の形態では、バイオポリマーのコンビナトリアルライブラリーは、サイズ、配列、および必要に応じて改変においてバリエーションを含み、自動化された方法に従って合成されるライブラリー中の１０００個、１００００００個、または１００００００個よりも多くの配列を許容する。
【０２４５】
一部の形態では、これらの方法は、カスタム設計されたマイクロ流体デバイスプラットフォーム、例えば、カスタム設計された数のチャネルおよびウェルを含むチップを使用する。典型的には濾過および緩衝液交換を介した、単一の構造について記述されるバイオポリマーの単離、精製または改変のための技術は、ハイスループットシステムに適用可能である。さらなる形態では、迅速泳動ゲルベースのアッセイ、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）および配列決定などの技術は、増幅、構造的分析および検証に使用される。
【０２４６】
一部の形態では、合成プロセスのための全てのパラメーターは、例えば、コンピュータープログラムによって、インプット配列から決定される。プログラムは、グリッドネットワークを提供し、グリッド上の対応するアドレスに配列を割り当てる。例えば、各独自の配列は、流体移動のためのコンピューター生成されたグリッド上の独自のアドレスに割り当てられる。一部の形態では、プログラムは、配列、ならびに各始動因子、対応する触媒、洗浄および遮断緩衝液についての他のパラメーターもまた提供する。各試薬レザバの量、濃度およびアドレス、ならびに各バイオポリマーを合成するために必要とされる移動のシークエンスが、決定される。
【０２４７】
Ｂ．グラフィカルユーザーインターフェース
好ましいセットの形態では、コンピューターサーバーは、グラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）を介して送信されたインプットを受信する。ＧＵＩは、付属のモニターまたはディスプレイ上に表示され得、タッチスクリーン、付属のマウスもしくはポインティングデバイスを介して、または付属のキーボードから、インプットを受け入れ得る。一部の形態では、ＧＵＩは、クライアントコンピューターに付属するモニターまたはディスプレイ上に提供される受け入れられた標準を使用してネットワークを横断して連絡され、クライアントコンピューターに付属する１つまたは複数のインプットデバイスからのインプットを受け入れることが可能である。他の形態では、電話インターフェースが、入力された配列を同定、読み取りおよびまたは実行することができる。
【０２４８】
例示的な形態では、ＧＵＩは、インプットされるパラメーターをユーザーが選択する、標的配列選択領域を含む。この例示的なシステムでは、標的配列は、列挙された配列のうち１つ、または配列のサブセットを、クリック、タッチ、強調または選択することによって示される。好ましい形態では、標的配列は、ユーザー選択されたライブラリーから選択される。一部の形態では、標的配列は、ユーザー定義された特色を含むように、選択され、次いでカスタマイズされる。カスタマイズは、かかる機能が可能な任意のコンピュータープログラムを使用することを含み得る。標的配列に関連する他のパラメーター、例えば、長さ、分子量、全体的サイズ、電荷、構造など。
【０２４９】
一部の形態では、ＧＵＩは、１つまたは複数の配列、例えば、核酸配列のライブラリーを入力またはアップロードすることが可能である。例えば、ＧＵＩは、典型的には、ユーザーが１つまたは複数の配列をインプットするためのテキストボックスを含む。ＧＵＩは、さらにまたはあるいは、１つまたは複数のクエリー配列を含むテキストファイルをアップロードするためのインターフェースを含み得る。
【０２５０】
両方の選択肢を含む形態では、ＧＵＩは、標的配列がテキストボックスに入力されるかどうか、またはテキストファイルからアップロードされるかどうかをユーザーに選択させる無線ボタンもまた含み得る。ＧＵＩは、ファイルを選択するためのボタンを含み得、意図したファイルをユーザーにドラッグおよびドロップさせ得、またはアップロードされたファイルを他の方法で取得する。パラメーターのいずれかは、さらにカスタマイズするために、手書きで入力され得る。
【０２５１】
ＧＵＩは、典型的には、リクエストされる配列または他のパラメーターに基づいてこれらの方法を始動させるための、ユーザー用のインターフェースもまた含む。例示的なＧＵＩ形態は、選択された場合に、ユーザーが入力したまたはデフォルトの基準に従ってサーチを始動する、送信ボタンまたはタブを含む。ＧＵＩは、選択された場合に、ユーザーインプットを除去しおよび／またはデフォルト設定を回復させる、リセットボタンまたはタブもまた含み得る。
【０２５２】
ＧＵＩは、一部の形態では、ユーザーによって選択された場合に、インプットフィールドの全てにデフォルト値を投入する模範（ｅｘａｍｐｌｅ）ボタンを有する。模範値によって選択される選択肢は、一部の形態では、チュートリアル、マニュアルまたはヘルプセクションに詳細に記載される例と一致し得る。ＧＵＩは、一部の形態では、上記エレメントの全てまたは一部のみを含む。ＧＵＩは、任意のグラフィカルユーザーインプットエレメント、または１つもしくは複数のメニューバー、テキストボックス、ボタン、ハイパーリンク、ドロップダウンリスト、リストボックス、コンボボックス、チェックボックス、無線ボタン、サイクルボタン、データグリッドもしくはタブを含むそれらの組合せを含み得る。
【０２５３】
一部の形態では、マイクロ流体デバイスを使用したバイオポリマーの自動化されたプログラムされた酵素的合成のための記載されるシステムおよび方法は、クラウドコンピューティング内で実行される１つまたは複数のシステム、データベースまたは他のリソースを介して制御される。クラウドコンピューティングは、構成可能なシステムリソースの共有されたプールへのユビキタスアクセス、および例えばインターネット上で最小の管理努力が迅速に提供され得る、より高いレベルのサービスを可能にする、情報テクノロジーパラダイムである。例えば、一部の形態では、１つまたは複数のバイオポリマーの配列は、クラウドベースのコンピューティングを介してアクセスされる１つまたは複数のデータベースから選択される。他の形態では、一般的なユーザーインターフェースは、例えば、所与のバイオポリマーのための合成または操作配列を設計するために、クラウドベースのコンピューティングを介して実行される１つまたは複数のデータベースとインターフェースする。例えば、一部の形態では、データは、１つまたは複数のバイオポリマー配列を特定するクラウドベースのＧＵＩにおいてインプットされ、アウトプットは、コンポーネント始動配列、各コンポーネント構築ブロック、酵素触媒、緩衝液、停止または遮断試薬の位置および量（各々、ＥＷＯＤチップなどのマイクロ流体デバイス上の独自にアドレス指定された位置として）、ならびに合成に必要とされる移動および他の中間のステップ（インキュベーション、温度、光など）のシークエンスのうち、１つまたは複数を含む。液滴についての移動のシークエンスまたは流体フローパラメーターは、任意の適切なフォーマット、例えば、コンピューター可読コードでアウトプットされ得る。アウトプットは、１つまたは数個のバイオポリマーの合成または操作に必要とされる情報の一部または全てを含み得る。一部の形態では、アウトプットは、１つまたは複数のマイクロ流体システム上での数十、数百、数千または数万個のバイオポリマーの同時の合成または操作のための移動のシークエンスを提供する。データベース（例えば、クラウドベースのデータベース）として提供され得る例示的な情報には、例えば、核酸メモリシステムにおいて実行されるような、標的バイオポリマー配列、バーコード配列、コンポーネント始動配列およびコードされたビットストリームデータが含まれる。
【０２５４】
一部の形態では、クラウドベースのリソースは、バーコード付加された核酸および／またはメモリ物体の操作を指示するために、アクセスおよび実行される。したがって、一部の形態では、これらの方法は、核酸メモリストレージシステムの調製およびアクセスにおける使用のためにバーコードを設計、合成および変更するために、クラウドベースのシステムを使用する。一部の形態では、これらの方法は、グラフィカルユーザーインターフェースを介して入力された１つまたは複数のコマンドに従って、核酸またはメモリ物体上に存在する１つまたは複数の配列バーコードを構成および／または分解する。例えば、コンピューターベースのシステムは、核酸メモリ物体のデータベースを調製するために必要とされる移動のシークエンスおよび他のパラメーターを提供するために使用され得る。したがって、一部の形態では、このシステムおよび方法は、データベースにアクセスしそれを組織化するために、グラフィカルユーザーインターフェースを実行する。一部の形態では、ユーザーインプットは、データベース内に記憶されたデータの１つまたは複数のピースへのアクセスをリクエストする。データリクエストは、任意のフォーマット、例えば、１つもしくは複数の画像、または文献もしくはデータの１つもしくは複数のピースに対するリクエストであり得る。このシステムおよび方法は、ユーザーの要求に従って、例えば、核酸メモリ物体の対応するライブラリーおよび他の試薬をロードしたマイクロ流体デバイスを発動させるために必要な移動のシークエンスおよび他のパラメーターを提供することによって、データの１つもしくは複数のピースの選択、選択されなかったデータの分解、および／または選択されたデータの複製を指示できる。
【０２５５】
ＩＶ．マイクロ流体デバイス媒介性のバイオポリマー合成のための組成物
記載される方法に従って合成された、ユーザー定義された配列を有するバイオポリマーが提供される。バイオポリマーの鋳型なしの合成のための方法は、始動因子配列、コンポーネント構築ブロック、アセンブリ触媒、アセンブリ緩衝液、洗浄緩衝液、停止緩衝液および遮断緩衝液、ならびにバイオポリマーの切断、配列決定および増幅のための試薬を含む、アセンブルされたバイオポリマーの操作および精製のための試薬を含む試薬を必要とする。
【０２５６】
改変されたバイオポリマーを合成するための組成物もまた記載される。記載される方法に従ってバイオポリマーをアセンブルするためのマイクロ流体デバイスベースの合成は、１つまたは複数の改変されたコンポーネント構築ブロック、例えば、天然に存在しない誘導体およびアナログを含み得る。一部の形態では、バイオポリマーは、１つまたは複数の改変されたコンポーネント構築ブロックを含むように合成される。他の形態では、バイオポリマーは、合成後の、マイクロ流体デバイス上での機能的部分の付加によって改変される。例えば、一部の形態では、バイオポリマーは、１つまたは複数の標的分子と結合するまたは他の方法で相互作用することが可能な１つまたは複数の分子を含むように官能化される。バイオポリマーのマイクロ流体デバイスベースの合成、操作、および精製または増幅のための組成物は、以下にさらに詳細に記載される。
【０２５７】
Ａ．バイオポリマー合成のためのマイクロ流体デバイス
合成に必要とされる小さい体積の分配および移動のためのマイクロ流体デバイスおよびシステムが提供される。マイクロリットル未満の体積の流体の、独立した液滴としての分割、移動および合わせることを発動させるためのプラットフォームが、記載される方法のために使用され得る。例示的なシステムおよびデバイスには、音響液滴分配、例えば、市販のＥＣＨＯ（登録商標）５５５液体ハンドリングデバイス、行程容積分配、例えば、Ｍｏｓｑｕｉｔｏピペットロボット、またはインクジェット型流体分配器が含まれる。さらに、合成は、合成に使用されるマイクロウェルまたは合成区画による、チップを横断するフローによって生じ得る。
【０２５８】
一部の形態では、マイクロ流体デバイスは、流体の移動を発動させるために、音響液滴噴出（ａｃｏｕｓｔｉｃ  ｄｒｏｐｌｅｔ  ｅｊｅｃｔｉｏｎ）（ＡＤＥ）を使用する。他の形態では、マイクロ流体デバイスは、流体移動を発動させるために、誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）を使用する。さらなる形態では、マイクロ流体デバイスは、移動を発動させるために、光エレクトロウェッティングを利用する。一部の形態では、マイクロ流体力学デバイスは、流体ハンドリング／制御された流体移動のために、異なる機構の組合せを利用する。典型的には、マイクロ流体デバイスは、デバイスの自動化されたプログラムされた制御を可能にするために、コンピューターと統合される。マイクロ流体デバイスのコンピューター媒介性の制御のためのシステムおよびソフトウェアは、当該分野で公知である（例えば、Ｌａｂｃｙｔｅから市販されるＥＣＨＯ（登録商標）Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓを参照のこと）。
【０２５９】
１．誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）デバイス
一部の形態では、成長中のバイオポリマーは、ＥＷＯＤチップ上のアドレス指定された位置に固定化される。例えば、一部の形態では、コンポーネント始動配列または触媒は、固定相物体、例えば、磁性ビーズ、表面、アガロースまたは他のポリマービーズにハイブリダイズするまたは他の方法で結合するように設計された１つまたは複数の配列を含む。他の例では、コンポーネント始動配列または触媒は、分子へのコンジュゲーションのための１つまたは複数の部位を含む。例えば、コンポーネント始動配列または触媒は、例えば、始動配列もしくは触媒の、または合成されたポリマーの親和性結合を可能にするために、タンパク質または非タンパク質分子にコンジュゲートされ得る。誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）発動は、液体の小さいパケットが二次元表面上で操作される、デジタル（または液滴）マイクロ流体力学を可能にする。例示的なＥＷＯＤプラットフォームは、マイクロ流体チップなどのチップである。ＥＷＯＤチップ液体液滴駆動システムは、バイオポリマーのＥＷＯＤベースの合成のための方法における使用について記載される。
【０２６０】
ＥＷＯＤチップは、例えば、標的位置への液体液滴の移動を指示するために、１つまたは複数の駆動電極に電気を流すことによって、流体液滴の移動を発動させる。したがって、ＥＷＯＤチップは、近隣する位置における電位の適用によって、１つのアドレス指定された位置から別のアドレス指定された位置へと液滴を移動させる能力を有する。
【０２６１】
一部の形態では、エレクトロウェッティングデバイスは、チップのチャネルに沿った、レザバからの流体の制御された移動および合わせることのための、チャネルおよびウェルを使用する。
【０２６２】
一部の形態では、エレクトロウェッティングデバイスは、オンチップ液滴生成の全電子的な（即ち、補助的ポンピングなしの）リアルタイムフィードバック制御を使用するチップである。したがって、キャリアフローなしに、好ましくはいずれのマイクロチャネルもなしに動作するデジタルマイクロ流体システムが、記載される方法との使用のために記載される。典型的には、流体の移動は、液滴に対して局所的に、即ち、個々の液滴に対して作用する駆動機構によって発動される。ＥＷＯＤデバイスおよびその使用の方法は、例えば、ＷＯ２００６／００５８８０、ＷＯ２０１３／１０２０１１、ＷＯ２０１６／１１１２５１、米国特許出願公開第２０１７／０３２６５２４Ａ１号、米国特許第８，３０４，２５３Ｂ２号、米国特許第８，８８３，０１４Ｂ２号、米国特許第８，４５９，２９５Ｂ２号、米国特許第８，８３４，６９５Ｂ２号、米国特許第９，２６６，０７６Ｂ２号、米国特許第９，１６９，５７３Ｂ２号、米国特許第９，５３９，５７３Ｂ１号、米国特許第９，００５，５４４Ｂ２号、米国特許第９，８０８，８００Ｂ２号およびＧｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ．；  ８（６）：  ８９８−９０６  （２００８）に記載されるように、当該分野で公知である。ポリメラーゼ連鎖反応、ライゲーション、クローニング、より小さいプライマーからのより大きいＤＮＡの生成を含むＤＮＡ操作のためのＥＷＯＤデバイスは、Ｌｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ２６  （１２−１７）：  ｐｐ．  １７８９−１８０４；  ＰＭＣＩＤ：  ＰＭＣ４７７０２０１  （２０１２）；およびＣｈｏｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ５，  ｐｐ．  ４１３−４０  （２０１２））に記載されている。ハイスループットＥＷＯＤ適用のためのチップを使用する誘電体エレクトロウェッティングマイクロ流体力学のためのシステムは、Ｆａｉｒによってｔｈｅ  ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  １４ｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｍｉｎｉａｔｕｒｉｚｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  ｐｐ．  ２０９５−２０９７  （２０１０）において公開された、Ｐａｒａｌｌｅｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ，  ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ  ｂｉｏ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｅｌｅｃｔｒｏｗｅｔｔｉｎｇ  ｃｈｉｐｓという表題の総説に記載されている。
【０２６３】
Ｆａｉｒが記載したシステムおよびデバイスは、電場が液滴の一部分のみに適用されてそれが液滴を移動させる場合に界面張力の不均衡を創出するために、誘電体層において確立された電場を利用する。液滴は通常、フィラー媒体、例えばシリコーン油と共に、２つの平行なプレート間にサンドイッチされる。
【０２６４】
生の生理的試料を処理できるハイスループットのポイントオブケアマイクロ流体チップについての要求には、以下が含まれる：１）少ない数のインプット／アウトプット（Ｉ／Ｏ）ポートおよびオンチップ試薬貯蔵；２）流体処理エレメントの効率的な使用のための、柔軟性のあるチップアーキテクチャ；３）プログラム可能な電子的制御；４）平行なまたは多重化された動作；５）資源共有を可能にするための低い交差汚染；ならびに６）スケーラビリティ。
【０２６５】
Ｂ．アドレス指定されたバイオポリマー
記載される方法に従うバイオポリマーの鋳型なしの合成は、ユーザー定義された配列を有する、１個から数万個までのアドレス指定されたバイオポリマーを同時に産生できる。自動化された方法を使用して合成され得るバイオポリマーの例示的なクラスには、核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）、ポリペプチド（例えば、タンパク質、ペプチド模倣物）、オリゴ糖（例えば、炭水化物）、脂質、ブロックコポリマー、およびこれらの組合せ（グリコール−ペプチド、リポ−ペプチド、糖脂質など）が含まれる。
【０２６６】
これらの方法は、鋳型配列の非存在下でバイオポリマーを合成する。むしろ、バイオポリマーの所望の配列は、所望の分子をアセンブルするために液滴の連続的な移動を調和させるために、例えば、コンピューター可読データとして提供される。一部の形態では、インプット配列は、ユーザー定義される。他の形態では、ユーザーは、ランダムに生成されるバイオポリマーの配列およびサイズを選択できる。
【０２６７】
ポリマー配列についてのインプットデータは、典型的には、非コンピューター可読フォーマットを形成するように変換されるコンピューター可読フォーマットで提供される。一部の形態では、インプットデータは、インプット配列とは明確に異なるコードされたバイオポリマー配列のマイクロ流体デバイスベースの合成のために液滴の移動を制御するように（例えば、コンピューターソフトウェアによって）変換されるバイオポリマー配列の形態である。例えば、一部の形態では、インプットデータは、ゲノムＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の１つまたは複数の配列を含む核酸配列の形態であり、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列は、翻訳されたゲノムＤＮＡまたはｍＲＮＡ配列に対応するポリペプチド配列のマイクロ流体デバイスベースの合成のために液滴の移動を制御するように変換される。他の形態では、インプットデータは、対応する核酸コード配列の合成を発動させるために液滴の移動を制御するように変換されるポリペプチド配列の形態である。一部の形態では、インプットは、ビットストリームデータをコードする対応するバイオポリマー配列の合成を発動させるために液滴の移動を制御するように変換されるビットストリームデータの形態である。
【０２６８】
配列、例えばバイオポリマーの形態でデータをコードするためのスキーム、技術およびシステムは、当該分野で公知である。記載される方法は、１つもしくは複数のバイオポリマーの配列へとデータを変換するステップ、または１つもしくは複数のバイオポリマーの配列内のデータを暗号化するステップを含み得る。
【０２６９】
配列制御されるバイオポリマーの非限定的なリストは、天然に存在する核酸、天然に存在しない核酸、天然に存在するアミノ酸、天然に存在しないアミノ酸、ペプチド模倣物、例えば、アルファペプチド、ベータペプチド、デルタペプチド、ガンマペプチドおよび組合せから形成されるポリペプチド、炭水化物、ブロックコポリマー、ならびにそれらの組合せを含む。配列定義される非天然のポリマーは、バイオポリマー、例えば、非カノニカルアミノ酸を取り込むポリマー、例えば、ペプチド模倣物、例えば、β−ペプチド（Ｇｅｌｌｍａｎ，  ＳＨ．  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．，  ３１，  １７３−１８０  （１９９８））、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ペプトイドまたはポリ−Ｎ−置換されたグリシン（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．，  １  １４，  １０６４６−１０６４７（１９９２））、オリゴカルバメート（Ｃｈｏ，  ＣＹ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６１，  １３０３−１３０５（１９９３））、グリコマクロ分子（ｇｌｙｃｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ナイロン型ポリアミドおよびビニルコポリマーと酷似している。
【０２７０】
一部の形態では、これらの方法は、核酸の独自にアドレス指定された配列の合成のために、液滴のマイクロ流体デバイス媒介性の移動を使用する。一部の形態では、これらの方法は、ポリペプチドの独自にアドレス指定された配列の合成のために、液滴のマイクロ流体デバイス媒介性の移動を使用する。一部の形態では、これらの方法は、炭水化物の独自にアドレス指定された配列の合成のために、液滴のマイクロ流体デバイス媒介性の移動を使用する。他の形態では、これらの方法は、２つまたはそれよりも多くのクラスの分子、例えば、グリコペプチド、糖脂質、リポペプチドなど、または核酸、ペプチドもしくは炭水化物の改変されたバリアントを含む、独自にアドレス指定されたバイオポリマーの合成のために、液滴のマイクロ流体デバイス媒介性の移動を使用する。例示的な改変されたペプチドは、ペプチド模倣物、例えば、α−ペプチドペプチド模倣物、β−ペプチドペプチド模倣物、δ−ペプチドペプチド模倣物もしくはγ−ペプチドペプチド模倣物、またはこれらの組合せである。
【０２７１】
一部の形態では、これらの方法は、多様な類似のまたは異なる配列を含むプールからバイオポリマー配列を提供するステップを含む。一部の形態では、プールは、公知の配列のデータベースである。
【０２７２】
１．核酸バイオポリマー
好ましい形態では、これらの方法は、独自にアドレス指定された核酸の合成のために、液滴のマイクロ流体デバイス媒介性の移動を使用する。ヌクレオチド配列、サイズ、融解温度、電荷、コンフォメーションなどを含む核酸のパラメーターのうち１つまたは複数は、ユーザー定義される。記載されるマイクロ流体デバイスベースの方法に従って合成された核酸は、２ヌクレオチド長から１００，０００ヌクレオチド長までであり得る。好ましい形態では、合成された核酸は、１００ヌクレオチド長よりも大きく、１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００または１０，０００ヌクレオチド長までの、配列を有する。一部の形態では、マイクロ流体デバイスベースの方法は、１０，０００ヌクレオチド長よりも大きい１つまたは複数の核酸を合成する。一部の形態では、これらの方法は、複数の異なる核酸を同時に合成し、例えば、同じまたは異なる配列を有する、１個と１０，０００個との間の、独自にアドレス指定された核酸が、任意の所与の時点において合成され得る。一部の形態では、これらの方法は、例えば、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００ヌクレオチド長まで、１００，０００ヌクレオチド長までの、同じまたは異なる配列を有する、１０，０００個よりも多い独自にアドレス指定された核酸を、同時に合成する。
【０２７３】
ある特定の形態では、情報は、提供される核酸配列内に含まれる。したがって、一部の形態では、別個のセットのデータは、例えば、核酸のプールまたはライブラリー中の核酸の配列として提供される。一部の形態では、サイズが約１００〜１，０００，０００塩基の範囲の核酸配列のプールが提供される。一部の形態では、複数の核酸配列のプール内の核酸配列は、１つまたは複数の共通配列を共有する。提供される核酸が配列のプールから選択される場合、選択プロセスは、例えば、ユーザー優先度に基づく選択によって手動で、または自動的に、実施され得る。
【０２７４】
一部の形態では、インプット核酸配列は、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡまたは原核生物ＤＮＡと同じ配列ではない。例えば、一部の形態では、この配列は、天然に存在する核酸配列に対して２０％未満の配列同一性、例えば、１０％未満の同一性、または５％未満の同一性、または１％未満の同一性、最大で０．００１％の同一性を有する。したがって、一部の形態では、インプットとして提供される核酸配列は、遺伝子全体または完全なｍＲＮＡの核酸配列ではない。例えば、一部の形態では、インプット配列は、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）と同じ配列ではない。一部の形態では、インプット配列は、クローニングベクターなどのプラスミドと同じ核酸配列ではない。したがって、一部の形態では、インプット配列は、遺伝子の転写の開始と関連付けられた１つまたは複数の配列モチーフ、例えば、プロモーター配列、オペレーター配列、応答エレメント、アクチベーターなどを含まない。一部の形態では、インプット配列は、ウイルスゲノム、例えば、一本鎖ＲＮＡまたは一本鎖ＤＮＡウイルスの核酸配列ではない。他の形態では、インプット配列は、ｃＤＮＡ、遺伝子、タンパク質配列、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの配列、またはプール中で一緒になって生物学的配列のデータベースを形成する生物学的配列から構成される。
【０２７５】
２．カプセル化されたバイオポリマー
マイクロ流体ベースのアセンブリのための記載される方法は、ある範囲の異なる構造を有する別個の「物体」または「単位」を産生するように、バイオポリマーをカプセル化できる。例えば、一部の形態では、バイオポリマー物体は、１つまたは複数の配列コードされたバイオポリマーが結合するコア粒子を含む。
【０２７６】
粒子コアへの配列コードされたバイオポリマーの結合は、共有結合的または非共有結合的連結を使用して達成され得る。一部の形態では、コア分子は、中間の受容体である分子、例えば、配列コードされたバイオポリマーと関連付けられる１つまたは複数のリガンドによって認識される結合部位に、コートされるまたはカップリングされる。配列コードされたバイオポリマーは、受容体コートされたコア分子にカップリングまたはハイブリダイズされ得る。一部の形態では、ポリマー／コア下位構造は次いで、コートされたバイオポリマー／コア構造を産生するために、１つまたは複数のカプセル化剤でコートされ（即ち、「分子シェル形成」）、これは次いで、１つまたは複数のアドレス標識に、必要に応じてカップリングされる。コートされたバイオポリマー／コア粒子へのアドレス標識の結合は、共有結合的もしくは非共有結合的連結、または相補的核酸のハイブリダイゼーションを使用して達成され得る。遺伝的特色に関連付けられたＤＮＡバーコードは、マイクロアレイハイブリダイゼーションを使用して、プールされたフォーマットでこれらの特色をスクリーニングすることを大いに促進し、新たなツールが、大きいバーコード付加された哺乳動物ライブラリー、例えばｓｈＲＮＡライブラリーの構成を可能にするために、大きいセットのバーコードを設計するために必要である。大きいセットの直交性バーコードプローブを設計するためのフレームワークは、本明細書に記載されている。このフレームワークの有用性は、２４０，０００個のバーコードプローブを設計し、ハイブリダイゼーションによってそれらの性能を試験することによって実証された。試験ハイブリダイゼーションから、アルゴリズムのフレームワーク中へのそれらの導入後にクロスハイブリダイゼーションを顕著に低減させる新たなプローブ設計規則が発見された。これらの規則は、多くの適用について、ＤＮＡマイクロアレイプローブ設計の性能を改善するはずである。
【０２７７】
３．バーコードおよび標識
一部の形態では、これらの方法に従って合成されたバイオポリマーは、バーコードまたは標識として作用する１つまたは複数のコンポーネントを含み得る。バーコードおよび／または標識は、それらが関連付けられたバイオポリマー、またはバイオポリマーのプールを、同定する、単離する、選別する、組織化する、分解する、維持する、貯蔵する、精製するまたは他の方法で特徴付けもしくは操作するために使用され得る。バーコードおよび標識は、広範な種々の検出可能な、選別可能なまたは他の方法でスコアリング可能な分子から選択され得る。例示的なバーコードおよび標識には、配列識別子、例えば、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列；捕捉タグ；および色素または他の検出可能な分子が含まれる。一部の形態では、１つのバイオポリマーは、１つまたは複数のバーコードまたは標識を含む。類似のバイオポリマーのプールについてバーコード付加されたバイオポリマーを捕捉するために使用され得るバーコードまたは標識が提供される。バイオポリマーの存在または非存在を検出する、定量するまたは他の方法でアッセイするために使用され得るバーコードまたは標識が提供される。関連付けられたバイオポリマーの選別または操作を可能にするバーコードまたは標識もまた提供される。一部の形態では、バーコードは、マイクロ流体システムを使用した関連付けられたバイオポリマーの選別、選択、順序付け、分解、合成および操作を許容する。
【０２７８】
ａ．配列識別子
一部の形態では、バイオポリマーは、配列識別子（即ち、インデックス化または「バーコード付加」領域）を含む。配列識別子は、さらなる処理の際にバイオポリマーを同定できる。例えば、バイオポリマーを組み合わせる場合、異なる配列は、異なるタグを使用して同定され得る。例示的な配列識別子には、１つまたは複数の特異的核酸の同定のために独自に使用される、変動するが規定された長さのヌクレオチド配列が含まれる。
【０２７９】
ある特定の形態では、各バイオポリマーは、各バイオポリマーの同定を可能にする、コンポーネント構築ブロックの１つまたは複数の独自の配列を含む。一部の形態では、バイオポリマーは、デュアルインデックスシステムを使用する同定のために、２つまたはそれよりも多くの配列識別子を含む。
【０２８０】
配列識別子の長さは、ユーザーの要求に従って調整され得る。例えば、４コンポーネント構築ブロックの長さが、最大で２５６個の異なる配列を産生するのに十分である。例示的なバーコード配列は、４ヌクレオチド長と１０ヌクレオチド長との間（包摂的）の核酸配列である。好ましくは、タグ配列識別子は、全ての異なる試料の間で、少なくとも１ヌクレオチド異なる。例示的な配列識別子は、６ヌクレオチド長である。
【０２８１】
例示的なバーコード付加されたバイオポリマーは、コードされたデータを同定するためのバーコードとして作用するヌクレオチド配列を含む、ビットストリームデータをコードする核酸である。ＤＮＡバーコードは、ある特定の関連する特色、例えば、１つまたは複数の遺伝子をコードする核酸配列、またはメタデータのピースを独自に同定する短いＤＮＡ配列である。均一な長さおよび融解温度（Ｔｍ）のＤＮＡバーコードに特色を関連付けることは、ＰＣＲとその後のマイクロアレイハイブリダイゼーションまたはハイスループット配列決定による引き続くデコンボリューションを用いた実験が、プールされたフォーマットでこれらの特色に対して実施されるのを可能にする。ＤＮＡバーコードテクノロジーは、遺伝子スクリーニングのスループットを大いに改善し、さもなければかなり時間がかかるまたは労力を要する実験を可能にする。多数のリソースおよびソフトウェアツールが、ＤＮＡマイクロアレイバーコード／プローブを設計するために現在利用可能である（例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：３４９１−３４９６  （２００３）；Ｒｏｕｉｌｌａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３１：３０５７−３０６２  （２００３）；Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １９：７９６−８０２  （２００３）；Ｈｕ，  ｅｔ  ａｌ．  ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ８：３５０  （２００７）；およびＭａｒｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４５３：３−３１  （２００８）を参照のこと）。
【０２８２】
遺伝的特色に関連付けられたＤＮＡバーコードは、マイクロアレイハイブリダイゼーションを使用して、プールされたフォーマットでこれらの特色をスクリーニングすることを大いに促進する。明確に異なる検出可能な特性を有する核酸バーコードの組成は、当該分野で公知である。Ｘｕらは、２４０，０００個のバーコードプローブの生成および特徴付け、ならびにハイブリダイゼーションによるそれらの性能の試験を記載している。試験ハイブリダイゼーションは、アルゴリズムのフレームワーク中へのそれらの導入後にクロスハイブリダイゼーションを顕著に低減させる新たなプローブ設計規則を同定した。これらの規則は、多くの適用について、ＤＮＡマイクロアレイプローブ設計の性能を改善するはずである（Ｘｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  １０６  （７）  ２２８９−２２９４  （２００９））。したがって、バイオポリマーのマイクロ流体ベースの合成のための記載される方法は、バーコードの配列特徴のうち１つまたは複数に基づいて、明確に異なるバイオポリマー、またはバイオポリマーのプールを選択するために使用され得る１つまたは複数のバーコードを含むバーコード付加された核酸を産生することができる。選択および単離に適し得る例示的な特徴には、熱的ハイブリダイゼーションおよび融解温度が含まれる。融解およびハイブリダイゼーション特徴に基づいてバイオポリマーのプールを選択および単離するための融解温度の適用は、実施例に提示される。
【０２８３】
一部の形態では、配列識別子（即ち、バーコード）は、始動因子配列内に含まれる。他の形態では、識別子は、合成の間に、始動因子または成長中のバイオポリマーに結合される。例示的な形態では、配列識別子は、単一の事前アセンブルされた単位として、始動因子または成長中のバイオポリマーに結合される。
【０２８４】
分子または配列バーコード付加は、他の分子のプール内から分子を同定する方法である。バーコード付加は、ＤＮＡ鎖の複雑なプールを用いた次世代配列決定における配列決定同定のために使用される。バーコード付加は、溶液中での細胞ベースの同定およびＲＮＡ同定のためにも実行され得、ここで、配列および試料の構文解析は、下流での試料の分離のために重要である。バーコード付加のためのＤＮＡの合成は、典型的には、当該分野で公知の方法を使用した配列の事前合成によって達成され、次いで、ＤＮＡリガーゼによって、目的の試料にライゲーションされる。
【０２８５】
ポリマーまたは化合物、例えば、二酸化ケイ素などから合成される、ナノメートル〜マイクロメートルスケールのビーズは、フロー化学およびマイクロ流体力学アプローチによって合成され得る。シリカ前駆体ならびに光学的バーコード、例えば、色素、量子ドット、ランタニドおよび／または色中心は、溶媒および触媒と混合され、シリカ粒子が形成するまで、撹拌される。別の実行では、色素および／または量子ドット、ランタニドエミッターまたは色中心と共にシラン前駆体を含むレザバは、フロー化学設定における流体接合部を介したフロー注入を介して、他の化学物質前駆体、例えば、触媒および溶媒と共に、ＤＮＡメモリと混合される。混合された前駆体は、シリカ形成を可能にするために、ヒーターを通過させられる。
【０２８６】
別の実行では、シリカコアは、シリカ前駆体、光学的バーコードおよびＤＮＡメモリを界面活性剤と混合して油中水液滴を形成することによって、ＤＮＡメモリおよび光学的バーコードを用いて合成される。得られた液滴は、シリカが形成するまで、６５℃でインキュベートされる。粒子の正確なサイズ制御は、油中水エマルジョンのサイズを制御することによって達成され得る。
【０２８７】
別の実行では、シリカ前駆体、ＤＮＡメモリおよび光学的バーコードは、自動化された液体ハンドリングデバイスを使用して混合され、ここで、特定の体積が、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレート中の特定のウェル中に分注される。前駆体をウェルプレート中に添加した後、ウェルプレートは、シリカ粒子を産生するために、撹拌によって混合される。
【０２８８】
別の実行では、シリカ前駆体、ＤＮＡメモリおよび光学的バーコードは、エレクトロウェッティングデバイス上の液滴を使用して混合される。例えば、核酸は、公知の機能を有するタンパク質またはＲＮＡ、例えば、１つまたは複数の標的分子に対する親和性を有する抗体またはＲＮＡアプタマーを含むように改変され得る。したがって、記載されるマイクロ流体デバイスベースの方法に従って設計および合成されるバイオポリマーは、官能化バイオポリマーであり得る。
【０２８９】
記載されるマイクロ流体デバイス方法に従って合成されるバイオポリマーは、ポリマー上またはポリマー内の１つまたは複数の位置において１つまたは複数の機能的分子を含み得る。一部の形態では、官能基は、１つまたは複数の末端に位置する。他の形態では、機能的部分は、いずれかの末端から離れて、バイオポリマー配列内に位置する。他の形態では、バイオポリマーは、配列内に位置する、および一方または両方の末端内に位置する、１つまたは複数の機能的部分を含む。バイオポリマーが、２つまたはそれよりも多くの機能的部分を含むように改変される場合、それらの機能的部分は、同じでも異なってもよい。
【０２９０】
典型的には、バイオポリマーは、１つまたは複数の機能的分子との化学的または物理的関連付けによって改変される。コンジュゲーションの例示的な方法には、バイオポリマーと機能的分子との間での共有結合的または非共有結合的連結が含まれる。一部の形態では、機能的分子とのコンジュゲーションは、クリックケミストリーを介してである。一部の形態では、機能的分子とのコンジュゲーションは、バイオポリマー上に存在する１つまたは複数の核酸配列とのハイブリダイゼーションを介してである。
【０２９１】
ｂ．捕捉タグ
一部の形態では、バイオポリマーの配列は、捕捉タグを含む。捕捉タグは、捕捉タグを有する化合物または複合体を、捕捉タグを有さない化合物または複合体から分離するために使用される任意の化合物である。好ましくは、捕捉タグは、別の化合物、例えば、リガンド結合分子または抗体に結合するまたはそれと相互作用する化合物、例えば、リガンドまたはハプテンである。捕捉タグと捕捉性コンポーネントとの間、例えば、ハプテンと抗体との間またはリガンドとリガンド結合分子との間のかかる相互作用が、特異的相互作用であることもまた好ましい。
【０２９２】
好ましい捕捉タグは、ビオチンである。一部の形態では、バイオポリマーは、１つまたは複数の標的化された分子に特異的に結合する捕捉タグまたは「ベイト」配列として作用する、コンポーネント構築ブロックの１つまたは複数の配列を含む。例えば、一部の形態では、オーバーハング配列は、任意の標的ヌクレオチド配列、例えば、ＨＩＶ−１  ＲＮＡウイルスゲノムに対して相補的なヌクレオチド「ベイト」配列を含む。
【０２９３】
典型的には、標的化部分は、標的化される細胞の一群に特異的な表面マーカーを活用する。例示的な標的化エレメントには、細胞、または細胞外マトリックス、または特定の型の腫瘍もしくは感染細胞と関連付けられた１つまたは複数の標的に結合するタンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖類または多糖が含まれる。標的化分子は、所望の物理的特性、例えば、標的に対する適切な親和性および特異性に基づいて選択され得る。高い特異性および親和性を有する例示的な標的化分子には、抗体またはそれらの抗原結合性断片が含まれる。したがって、一部の形態では、バイオポリマーは、エピトープに対して特異的な１つまたは複数の抗体または抗原結合性断片を含む。エピトープは、直鎖エピトープであり得る。エピトープは、１つの細胞型に特異的であり得る、または複数の異なる細胞型によって発現され得る。他の形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、標的細胞の表面における３−Ｄ表面特色、形状または三次構造を含むコンフォメーションエピトープに結合できる。
【０２９４】
バイオポリマーおよびカプセル化されたバイオポリマー物体は、シングルガイドＲＮＡまたはｃｒｉｓｐｒ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、アンチセンスＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ならびにタンパク質をコードするＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ、ＤＮＡ相互作用性タンパク質、例えば、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬエフェクタータンパク質またはジンクフィンガータンパク質、脂質、ならびに炭水化物が含まれるがこれらに限定されない１つまたは複数の機能的部分を捕捉できる１つまたは複数の機能的配列を含み得る。他の形態では、合成されたバイオポリマーは、公知の生物学的機能を有する天然に存在するヌクレオチドまたは天然に存在しないヌクレオチドで改変される。例示的な官能基には、標的化エレメント、免疫調節性エレメント、化学的基、生物学的高分子、およびそれらの組合せが含まれる。
【０２９５】
一部の形態では、官能化された合成されたバイオポリマーは、ｍＲＮＡなどのＲＮＡのループ領域に対して相補的な１つまたは複数のＤＮＡ配列を含む。１つまたは複数のタンパク質をコードするｍＲＮＡで官能化された合成された核酸が記載される。１つの例示的な例では、合成されたバイオポリマーは、ｍＲＮＡ、例えば、タンパク質を発現するｍＲＮＡなどのＲＮＡのループ領域に対して相補的な１つまたは２つまたはそれよりも多くの核酸配列で官能化され得る。
【０２９６】
一部の形態では、バイオポリマーは、例えば、１つもしくは複数の細胞、組織への合成されたバイオポリマーの標的化を増強するために、またはタンパク質、脂質、多糖、核酸などへの特異的結合を媒介するために、１つまたは複数の標的化エレメントを含む。例えば、バイオセンサーとしての使用のために、さらなるヌクレオチド配列が、合成されたバイオポリマー中に含まれる。
【０２９７】
例示的な標的化エレメントには、臓器、組織、細胞、または細胞外マトリックス、または特定の型の腫瘍もしくは感染細胞と関連付けられた１つまたは複数の標的に結合するタンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖類または多糖が含まれる。合成されたバイオポリマーが標的化される特異性の程度は、適切な親和性および特異性を有する標的化分子の選択を介してモジュレートされ得る。例えば、抗体またはそれらの抗原結合性断片は、非常に特異的である。
【０２９８】
典型的には、標的化部分は、生物学的に機能的なクラスの細胞、例えば、抗原提示細胞に特異的な表面マーカーを活用する。樹状細胞は、エンドサイトーシスを媒介できるいくつかの細胞表面受容体を発現する。一部の形態では、合成されたバイオポリマーは、目的のヌクレオチド配列、例えば、ＨＩＶ−１  ＲＮＡウイルスゲノムに対して相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０２９９】
さらなる官能基は、例えば、ビオチン化されたヌクレオチドを、合成されたバイオポリマー中に取り込むことによって、合成されたバイオポリマーに導入され得る。したがって、任意のストレプトアビジンコートされた標的化分子が、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して導入される。他の形態では、天然に存在しないヌクレオチドが、さらなる改変のための所望の官能基として含まれる。例示的な官能基には、標的化エレメント、免疫調節性エレメント、化学的基、生物学的高分子、およびそれらの組合せが含まれる。
【０３００】
典型的には、標的化部分は、標的化される細胞の一群に特異的な表面マーカーを活用する。例示的な標的化エレメントには、細胞、または細胞外マトリックス、または特定の型の腫瘍もしくは感染細胞と関連付けられた１つまたは複数の標的に結合するタンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖類または多糖が含まれる。合成されたバイオポリマーが標的化される特異性の程度は、適切な親和性および特異性を有する標的化分子の選択を介してモジュレートされ得る。例えば、抗体またはそれらの抗原結合性断片は、非常に特異的である。
【０３０１】
一部の形態では、バイオポリマーは、１つまたは複数の抗体を含むように改変される。細胞の表面にある１つまたは複数のエピトープ、他のリガンドまたはアクセサリー分子に直接結合することによって機能する抗体は、バイオポリマーに直接的または間接的にカップリングされ得る。一部の形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、特定の細胞型の表面にある受容体、例えば、マクロファージ細胞、樹状細胞または上皮裏打ち細胞の表面において発現される受容体に対する親和性を有する。一部の形態では、抗体は、抗体結合したバイオポリマーの細胞取込みもしくは抗体結合したバイオポリマーの細胞内転位、またはその両方を可能にする、増強するまたは他の方法で媒介する細胞の表面における１つまたは複数の標的受容体に結合する。
【０３０２】
任意の特異的抗体が、核酸バイオポリマーを改変するために使用され得る。例えば、抗体は、標的細胞上のエピトープに結合する抗原結合部位を含み得る。「標的」細胞への抗体の結合は、１つまたは複数の明確に異なる機構を介した、標的細胞タンパク質による、関連付けられた核酸バイオポリマーの取込みを増強または誘導し得る。
【０３０３】
一部の形態では、抗体または抗原結合性断片は、エピトープに特異的に結合する。エピトープは、直鎖エピトープであり得る。エピトープは、１つの細胞型に特異的であり得る、または複数の異なる細胞型によって発現され得る。他の形態では、抗体またはその抗原結合性断片は、標的細胞の表面における３−Ｄ表面特色、形状または三次構造を含むコンフォメーションエピトープに結合できる。
【０３０４】
一部の形態では、標的細胞上のエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片は、タンパク質エピトープにリガンドも小分子も結合しない場合にのみ、結合できる。
【０３０５】
任意のクラスの免疫グロブリン全体、その断片、および抗体の抗原結合性可変ドメインを少なくとも含む合成タンパク質を含む、種々の型の抗体および抗体断片が、核酸バイオポリマーを改変するために使用され得る。抗体は、ＩｇＧ抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプであり得る。抗体は、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、単鎖可変領域などを含む、抗原結合性断片の形態であり得る。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル（ｍＡｂ）であり得る。モノクローナル抗体には、それらが標的抗原に特異的に結合するおよび／または所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列に対して同一または相同であるが、鎖の残部が、別の種に由来する、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列に対して同一または相同である、「キメラ」抗体、ならびにかかる抗体の断片が含まれる（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：  ６８５１−６８５５  （１９８４））。抗体はまた、所望の機能を媒介する際の抗体の効力を増加させるために、組換え技術によって、例えば、アミノ酸の欠失、付加または置換によって、改変され得る。置換は、保存的置換であり得る。例えば、抗体の定常領域中の少なくとも１つのアミノ酸は、異なる残基で置き換えられ得る（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；米国特許第６，１９４，５５１号；ＷＯ９９５８５７２；およびＡｎｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ３０：１０５−０８  （１９９３）を参照のこと）。一部の場合には、変化が、所望されない活性、例えば、補体依存的細胞傷害を低減させるためになされる。抗体は、少なくとも２つの異なる抗原性エピトープに対する結合特異性を有する二重特異性抗体であり得る。一形態では、エピトープは、同じ抗原由来である。別の形態では、エピトープは、２つの異なる抗原由来である。二重特異性抗体は、二重特異性抗体断片を含み得る（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９０：６４４４−４８  （１９９３）；Ｇｒｕｂｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５２：５３６８  （１９９４）を参照のこと）。
【０３０６】
バイオポリマーを特異的エピトープに標的化する抗体は、当該分野で公知の任意の技術によって生成され得る。抗体の生成および産生のための技術の例示的な記載には、Ｄｅｌｖｅｓ，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｗｉｌｅｙ，  １９９７）；Ｓｈｅｐｈａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０００）；Ｇｏｄｉｎｇ，  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  １９９３）；およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  （Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、最新の版）が含まれる。インタクトなＩｇ分子の断片は、酵素的消化および組換え技術が含まれる、当該分野で周知の方法を使用して生成され得る。
【０３０７】
ｃ．色素または他の検出可能な標識
一部の形態では、バイオポリマーは、検出可能な標識または色素として作用する１つまたは複数の分子を含む。
【０３０８】
一部の形態では、標識は、光学的に検出可能な部分（例えば、フルオロフォア）である。光学的に検出可能な標識の型の非限定的な例には、蛍光、化学発光、または電気化学的に発光する標識が含まれる。蛍光標識の例には、４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’ジスルホン酸；アクリジンおよびその誘導体、例えば、アクリジン、アクリジンイソチオシアネート；５−（２’−アミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸（ＥＤＡＮＳ）；４−アミノ−Ｎ−［３−ビニルスルホニル）フェニル］ナフタルイミド−３，５ジスルホネート；Ｎ−（４−アニリノ−１−ナフチル）マレイミド；アントラニルアミド；ＢＯＤＩＰＹ；Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｙｅｌｌｏｗ；クマリンおよび誘導体；クマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ、クマリン１２０）、７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（７−ａｍｉｎｏ−４−ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌｃｏｕｌｕａｒｉｎ）（Ｃｏｕｍａｒａｎ  １５  １）；シアニン色素；シアノシン（ｃｙａｎｏｓｉｎｅ）；４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（４’，６−ｄｉａｍｉｎｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ）（ＤＡＰＩ）；５’，５”−ジブロモピロガロール−スルホナフタレイン（５’，５”−ｄｉｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ−ｓｕｌｆｏｎａｐｈｔｈａｌｅｉｎ）（Ｂｒｏｍｏｐｙｒｏｇａｌｌｏｌ  Ｒｅｄ）；７−ジエチルアミノ−３−（４’−イソチオシアナトフェニル）−４−メチルクマリン；ジエチレントリアミン五酢酸；４，４’−ジイソチオシアナトジヒドロ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸；４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸；５−［ジメチルアミノ］ナフタレン−１−スルホニルクロリド（５−［ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｌｎａｐｈｔｈａｌｅｎｅ−１−ｓｕｌｆｏｎｙｌ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）（ＤＮＳ、ダンシルクロリド）；４−ジメチルアミノフェニルアゾフェニル−４’−イソチオシアネート（ＤＡＢＩＴＣ）；エオシンおよび誘導体；エオシン、エオシンイソチオシアネート、エリスロシンおよび誘導体；エリスロシンＢ、エリスロシン、イソチオシアネート；エチジウム；フルオレセインおよび誘導体；５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）、５−（４，６−ジクロロトリアジン−２−イル）アミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ＱＦＩＴＣ、（ＸＲＩＴＣ）；フルオレスカミン；ＩＲ１４４；ＩＲ１４４６；Ｍａｌａｃｈｉｔｅ  Ｇｒｅｅｎイソチオシアネート；４−メチルウンベリフェロンオルトクレゾールフタレイン；ニトロチロシン；パラローズアニリン；Ｐｈｅｎｏｌ  Ｒｅｄ；Ｂ−フィコエリトリン；ｏ−フタルジアルデヒド；ピレンおよび誘導体：ピレン、ピレン酪酸塩、スクシンイミジル１−ピレン；酪酸量子ドット；Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｒｅｄ  ４（Ｃｉｂａｃｒｏｎ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｒｅｄ  ３Ｂ−Ａ）ローダミンおよび誘導体：６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、６−カルボキシローダミン（Ｒ６Ｇ）、リサミンローダミンＢスルホ��ルクロリドローダミン（Ｒｈｏｄ）、ローダミンＢ、ローダミン１２３、ローダミンＸイソチオシアネート、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）；リボフラビン；ロゾール酸（ｒｏｓｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）；テルビウムキレート誘導体；Ｃｙ３；Ｃｙ５；Ｃｙ５．５；Ｃｙ７；ＩＲＤ  ７００；ＩＲＤ  ８００；Ｌａ  Ｊｏｌｔａ  Ｂｌｕｅ；フタロシアニン；ナフタロシアニン；Ａｔｔｏ−Ｔｅｃから入手可能な蛍光標識のいずれか、例えば、Ａｔｔｏ  ３９０、Ａｔｔｏ  ４２５、Ａｔｔｏ  ４６５、Ａｔｔｏ  ４８８、Ａｔｔｏ  ４９５、Ａｔｔｏ  ５２０、Ａｔｔｏ  ５３２、Ａｔｔｏ  ５５０、Ａｔｔｏ  ５６５、Ａｔｔｏ  ５９０、Ａｔｔｏ  ５９４、Ａｔｔｏ  ６１０、Ａｔｔｏ  ６１１Ｘ、Ａｔｔｏ  ６２０、Ａｔｔｏ  ６３３、Ａｔｔｏ  ６３５、Ａｔｔｏ  ６３７、Ａｔｔｏ  ６４７、Ａｔｔｏ  ６４７Ｎ、Ａｔｔｏ  ６５５、Ａｔｔｏ  ６８０、Ａｔｔｏ  ７００、Ａｔｔｏ  ７２５、Ａｔｔｏ  ７４０など；Ｄｙｏｍｉｃｓから入手可能な蛍光標識のいずれか、例えば、ＤＹ−６３０、ＤＹ−６３１、ＤＹ−６３２、ＤＹ−６３３、ＤＹ−６３４、ＤＹ−６３５、ＤＹ−６３６、Ｄｙ−６４７、Ｄｙ−６４８、ＤＹ−６４９、Ｄｙ−６５０、Ｄｙ−６５１、ＤＹ−６５２など；Ｐｉｅｒｃｅから入手可能な蛍光標識のいずれか、例えば、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ８００など；ＡｎａＳｐｅｃから入手可能な蛍光標識のいずれか、例えば、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８色素、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（商標）５５５色素、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７色素、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（商標）６８０色素、ＨｉＬｙｔｅ  Ｆｌｕｏｒ（商標）７５０色素、ＨｉＬｙｔｅＰｌｕｓ（商標）５５５色素、ＨｉＬｙｔｅＰｌｕｓ（商標）６４７色素、ＨｉＬｙｔｅＰｉｕｓ（商標）７５０色素など；Ｄｅｎｏｖｏ  Ｂｉｏｌａｂｌｅｓから入手可能な蛍光標識のいずれか、例えば、Ｏｙｓｔｅｒ  ５００、Ｏｙｓｔｅｒ  ５５０  Ｐ、Ｏｙｓｔｅｒ  ５５０  Ｄ、Ｏｙｓｔｅｒ  ５５６、Ｏｙｓｔｅｒ  ６４５、Ｏｙｓｔｅｒ  ６５０  Ｐ、Ｏｙｓｔｅｒ  ６５０  Ｄ、Ｏｙｓｔｅｒ  ６５６など；ＩＲＤｙｅ（登録商標）６８０、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）７００ＤＸ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００  ＲＳ、ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００  ＣＷなど；ＳＥＴＡ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓから入手可能な蛍光標識のいずれか、例えば、Ｓｅｔａ  Ｋ１−２０４、Ｓｅｔａ  Ｋ５−３２１２、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１３４２、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１３５２、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１３５７、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１４０７、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１６４２、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１６４４、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１６６３、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１６６４、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１６６９、Ｓ��ｔａ  Ｋ８−３００２、Ｓｅｔａ  Ｋ４−１０８２、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１６６９、Ｓｅｔａ  Ｋ７−５４５、Ｓｅｔａ  Ｋ７−５４７、Ｓｅｔａ  Ｋ７−５４９、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１２５２、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１２６１、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１２６２、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１３２０、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１３４４、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１３６７、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１３７７、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１３８２、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１４４６、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１６６７、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１７５２、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１７６２、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１７６７、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１７７７、Ｓｅｔａ  Ｋ８−１７８２などが含まれるがこれらに限定されない。
【０３０９】
Ｃ．固体支持体ベースの合成のための基材
バイオポリマーの鋳型なしの合成のための方法における固体支持体マトリックスとしての使用のための基材が記載される。一部の形態では、始動因子配列中に取り込まれた捕捉タグは、始動因子配列および成長中のバイオポリマーが、基材によって捕捉されること、基材に接着またはカップリングされることを可能にする。かかる捕捉は、バイオポリマーの単純化された洗浄およびハンドリングを可能にし、この方法の全てまたは一部の自動化を可能にする。
【０３１０】
基材上にバイオポリマーを捕捉することは、いくつかの方法で達成され得る。一部の形態では、捕捉ドックが、基材に接着またはカップリングされる。捕捉ドックは、断片上の捕捉タグに結合することまたはそれと相互作用することによって、バイオポリマーの接着を媒介する化合物または部分である。基材上に固定化された捕捉ドックは、基材上でのバイオポリマーの捕捉を可能にする。かかる捕捉は、引き続くステップを妨害し得る反応コンポーネントを洗浄して除去する、簡便な方法を提供する。
【０３１１】
開示された方法における使用のための固体支持体基材は、アッセイのコンポーネントが接着またはカップリングされ得る任意の固体材料を含み得る。基材の例には、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフメレート（ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｆｕｍｅｒａｔｅ）、コラーゲン、グリコサミノグリカンおよびポリアミノ酸などの材料が含まれるがこれらに限定されない。基材は、薄膜またはメンブレン、ビーズ、ボトル、ディッシュ、繊維、織り繊維、成形ポリマー、粒子およびマイクロ粒子を含む任意の有用な形態を有し得る。基材の一部の形態は、プレートおよびビーズである。ビーズの有用な形態は、磁性ビーズである。
【０３１２】
一部の形態では、捕捉ドックは、オリゴヌクレオチドである。オリゴヌクレオチドを基材に固定化およびカップリングするための方法は、十分に確立されている。例えば、適切な結合方法は、Ｐｅａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１（１１）：５０２２−５０２６  （１９９４）およびＫｈｒａｐｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  （Ｍｏｓｋ）  （ＵＳＳＲ）  ２５：７１８−７３０  （１９９１）によって記載されている。カゼインコートされたスライド上への３’−アミンオリゴヌクレオチドの固定化のための方法は、Ｓｔｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：６３７９−６３８３  （１９９５）によって記載されている。オリゴヌクレオチドを固体状態基材に結合させる好ましい方法は、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２：５４５６−５４６５  （１９９４）によって記載されている。
【０３１３】
一部の形態では、捕捉ドックは、抗ハイブリッド抗体である。抗体を基材に固定化するための方法は、十分に確立されている。固定化は、標準的な固定化化学を使用した、例えば、アミノ化された表面、カルボキシル化された表面またはヒドロキシル化された表面への結合によって、達成され得る。結合剤の例は、臭化シアン、スクシンイミド、アルデヒド、トシルクロリド、アビジン−ビオチン、光架橋可能な薬剤、エポキシドおよびマレイミドである。好ましい結合剤は、グルタルアルデヒドである。これらおよび他の結合剤、ならびに結合におけるそれらの使用のための方法は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ：  ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｆ．  Ｔａｙｌｏｒ，  ｅｄ．  （Ｍ．  Ｄｅｋｋｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９１）、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｐｅ，  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  （Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，  Ｏｘｆｏｒｄ，  Ｅｎｇｌａｎｄ，  １９８７）  ｐａｇｅｓ  ２０９−２１６  ａｎｄ  ２４１−２４２、およびＩｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄｓ，  Ｃｒａｉｇ  Ｔ．  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．  （Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９９２）に記載されている。抗体は、抗体上の遊離アミノ基を、基材内に存在する反応性側基に化学的に架橋することによって、基材に結合され得る。例えば、抗体は、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドをクロスリンカー剤として使用して、遊離アミノまたはカルボキシル基を含む基材に、化学的に架橋され得る。この方法では、遊離抗体を含む水溶液が、グルタルアルデヒドまたはカルボジイミドの存在下で固体状態基材と共にインキュベートされる。グルタルアルデヒドを用いた架橋について、反応物は、０．１Ｍカコジル酸ナトリウムなどの緩衝溶液中で、２体積％のグルタルアルデヒドと共にｐＨ７．４でインキュベートされ得る。他の標準的な固定化化学は、当業者に公知である。
【０３１４】
Ｄ．コンポーネント始動配列
バイオポリマーのマイクロ流体デバイスベースの合成のための方法は、始動因子配列を使用する。バイオポリマーのマイクロ流体デバイスベースの合成における使用のための始動因子配列は、触媒の認識部位を含む。始動因子配列は、合成されるバイオポリマーのクラスおよび組成に従って選択される。
【０３１５】
一部の形態では、始動因子配列は、ユーザー定義されたバイオポリマーのコンポーネントである。他の形態では、始動因子配列は、ユーザー定義されたポリマーのコンポーネントではなく、例えば、１つまたは複数の特異的カッティング酵素への曝露によって、合成の後またはその間に除去される。
【０３１６】
一部の形態では、コンポーネント始動配列は、固体支持体または固定相物体、例えば、磁性ビーズ、表面、アガロースまたは他のポリマービーズにハイブリダイズするまたは他の方法で結合するように設計された１つまたは複数の配列を含む。他の例では、コンポーネント始動配列は、分子へのコンジュゲーションのための１つまたは複数の部位を含む。例えば、コンポーネント始動配列は、例えば、コンポーネント始動配列の、または合成されたポリマーの親和性結合を可能にするために、タンパク質または非タンパク質分子にコンジュゲートされ得る。
【０３１７】
一部の例では、始動因子は、ストレプトアビジンコートされたビーズ上にバイオポリマーを捕捉するためにビオチン化される。一部の例では、始動因子配列は、化学的部分で改変される。非限定的な例には、クリックケミストリー基（例えば、アジド基、アルキン基、ＤＩＢＯ／ＤＢＣＯ）、アミン基およびチオール基が含まれる。一部の例では、核酸始動因子配列の内側に位置する一部の塩基は、機能的部分（例えば、脂質、タンパク質）を結合させるためのリンカーとして機能するように、塩基アナログを使用して改変される（例えば、２−アミノプリン、ロックト核酸、例えば、２’酸素および４’炭素を接続する余分なブリッジで改変されたもの）。あるいは、ＤＮＡ結合タンパク質またはガイドＲＮＡは、二次分子を始動因子配列に結合させるために使用され得る。
【０３１８】
例示的なコンポーネント始動配列には、２、３、４ヌクレオチドよりも長い、または４ヌクレオチドを超えて長い、ほぼ任意の一本鎖ＤＮＡ配列が含まれる。一例では、配列ＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴ（配列番号２２）を、始動のために使用した。別の例では、Ｔ７プロモーター配列を使用した（ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧ；配列番号２３）。別の可能性では、配列決定アダプターに使用される配列、例えば、ＳｍｒｔＢｅｌｌ  ＰａｃＢｉｏ配列（ＡＴＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＡＧＡＧＡＧＡＴ；配列番号２４）、またはＯｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ配列決定デバイスのための始動因子配列などが、始動に使用され得る。さらに、ＰｓｔＩカット部位（ＣＴＧＣＡＧ）またはＥｃｏＲＩカット部位（ＧＡＡＴＴＣ）などを含む、ヌクレアーゼおよび制限酵素が機能するための部位を含む他の配列が使用され得る。
【０３１９】
１．捕捉タグ
一部の形態では、始動因子配列は、例えば、始動因子／成長中のバイオポリマーを固体支持体マトリックスまたは別の分子にカップリングさせるために、１つまたは複数の捕捉タグを含む。好ましくは、捕捉タグは、別の化合物、例えば、リガンド結合分子または抗体に結合するまたはそれと相互作用する化合物、例えば、リガンドまたはハプテンである。捕捉タグと捕捉性コンポーネントとの間、例えば、ハプテンと抗体との間またはリガンドとリガンド結合分子との間のかかる相互作用が、特異的相互作用であることもまた好ましい。
【０３２０】
好ましい捕捉タグは、ビオチンである。例示的な形態では、始動因子は、ビオチン化された始動因子である。好ましい形態では、ビオチン化された始動因子は、ビオチン化された核酸始動因子である。
【０３２１】
開示された方法では、始動因子配列中に取り込まれた捕捉タグは、始動因子が、磁性ビーズなどの基材によって捕捉されること、基材に接着またはカップリングされることを可能にする。
【０３２２】
Ｅ．コンポーネント構築ブロック
バイオポリマーへとアセンブルされ得るコンポーネント構築ブロックが記載される。コンポーネント構築ブロックは、バイオポリマーのマイクロ流体デバイスベースの合成における使用のための始動因子配列が触媒の認識部位を含む、任意の一次構造単位であり得る。
【０３２３】
例示的な認識配列には、天然に存在するヌクレオチド、アミノ酸、単糖、脂質、ならびにそれらの天然に存在しない誘導体が含まれる。
【０３２４】
１．ヌクレオチドコンポーネント構築ブロック
一部の形態では、コンポーネント構築ブロックは、デオキシリボヌクレオチドモノマー（「ヌクレオチド」）である。ヌクレオチドコンポーネント構築ブロックは、天然に存在するヌクレオチド、または天然に存在しない誘導体であり得る。例えば、核酸配列が合成される場合、マイクロ流体デバイスには、適切な緩衝液中に１つまたは複数の核酸を含む１つまたは複数のレザバがロードされる。例示的な緩衝液には、滅菌濾過水および生理的食塩水が含まれる。
【０３２５】
例示的なヌクレオチドコンポーネント構築ブロックには、４つの標準的な核酸塩基であるアデニン、グアニン、シトシンおよびチミン、ならびにウラシル、ならびにそれらの改変されたバリアントが含まれるがこれらに限定されない。
【０３２６】
ヌクレオチドコンポーネント構築ブロックのレザバは、単一のヌクレオチド種、または２つもしくはそれよりも多くのヌクレオチドの混合物を含み得る。ヌクレオチドのレザバが混合物を含む場合、各ヌクレオチド種の相対的な量および／またはモル比は、合成されるユーザー定義された配列の所望の組成に従って変動され得る。一部の形態では、ヌクレオチドのレザバは、ホスホジエステル結合によって共有結合的に連結された２つまたはそれよりも多くの核酸のオリゴマーを含む。コンポーネント構築ブロックとしてのヌクレオチドの所定のオリゴマーの取り込みは、マイクロ流体デバイスベースの核酸合成の速度および効力を増強でき、エラーを低減でき、特異的な官能化分子を含むことなどができる。
【０３２７】
一部の形態では、レザバウェルは、１つもしくは複数の型の天然に存在するヌクレオチド、または１つもしくは複数の型の官能化ヌクレオチド、あるいは混合物を、約１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１ｍＭの濃度、または１ｍＭよりも高い濃度で含む。例えば、ある特定の形態では、１ｎＬのヌクレオチドコンポーネント構築ブロックの液滴は、１ｍＭよりも高い濃度でヌクレオチドコンポーネント構築ブロックを含む供給源ウェルから分割される。
【０３２８】
ａ．改変されたヌクレオチド
一部の形態では、ヌクレオチドコンポーネント構築ブロックは、「改変された」ヌクレオチドである。改変されたヌクレオチドには、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドの任意の天然に存在しない誘導体が含まれる。改変されたヌクレオチドが成長中の核酸バイオポリマー中に取り込まれる場合、改変されたヌクレオチドは、独立してアドレス指定されたレザバとしての、マイクロ流体デバイス（例えば、ＥＷＯＤチップ）上のレザバ中に存在し得、またはネイティブの（改変されていない）ヌクレオチドを含むレザバ中に混合され得る。例えば、改変されたヌクレオチドは、レザバ内の総ヌクレオチドのある百分率または比率として混合される。一部の形態では、改変されたヌクレオチドは、レザバ中のヌクレオチドの総数の０．１％または０．１％よりも多くから、レザバ中の総ヌクレオチドの１００％までまたは１００％に接近するまで、０．１％と１００％との間（包摂的）、例えば、総数の０．１％〜０．５％、１％〜２％、１％〜５％、１％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、または５０％よりも多く、例えば、総数の６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％を占める。
【０３２９】
改変されたヌクレオチドが使用される場合、それらは、２つまたはそれよりも多くの同時に合成されたバイオポリマーの同じまたは異なる領域中に存在し得る。一部の形態では、合成されたバイオポリマーは、同じまたは異なる数の改変されたヌクレオチドを含む。一部の形態では、改変されたヌクレオチドは、同時に合成された全てのバイオポリマー中の等価な位置に存在する。したがって、一部の形態では、同時に合成された核酸の集団は、インプット配列によって決定されるように、正確な位置において、特定の数または割合で、改変されたヌクレオチドを含む。一部の形態では、合成された核酸は、合成されたバイオポリマー内の特定された位置において、規定された数または百分率の改変されたヌクレオチドを含む。一部の形態では、記載されるマイクロ流体デバイスベースの方法に従って産生される合成された核酸は、単一よりも多くの型の改変された核酸を含む。
【０３３０】
改変された核酸構築ブロックは、等価な改変されていない形態と比較して、合成された核酸において構造的および／または機能的変化を生じさせるために、含まれ得る。一部の形態では、核酸コンポーネント構築ブロックは、塩基部分（例えば、相補的ヌクレオチドとの水素結合を形成するために典型的には利用可能な１つもしくは複数の原子において、および／または相補的ヌクレオチドとの水素結合を形成することが典型的には可能でない１つもしくは複数の原子において）、糖部分またはリン酸骨格において改変される。
【０３３１】
一部の形態では、核酸コンポーネント構築ブロックは、アミン反応性部分、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＮＨＳ）の共有結合を可能にするために、アミン改変された基、例えば、アミノアリル−ｄＵＴＰ（ａａ−ｄＵＴＰ）およびアミノヘキシルアクリルアミド（ａｍｉｎｏｈｅｘｈｙｌａｃｒｙｌａｍｉｄｅ）−ｄＣＴＰ（ａｈａ−ｄＣＴＰ）を含む。
【０３３２】
他の形態では、ヌクレオチドコンポーネント構築ブロックは、例えば、エキソヌクレアーゼによる分解に対して保護するためまたはそのような分解を低減させるために、改変されていない核酸と比較して、合成された核酸の安定性を増加させるために、ホスホロチオエート改変された骨格を含む。
【０３３３】
例示的な改変されたヌクレオチドコンポーネント構築ブロックには、ジアミノプリン、Ｓ２Ｔ、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン（ｘａｎｔｉｎｅ）、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルケオシン（ｍａｎｎｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｄ４６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、ウィブトキソシン（ｗｙｂｕｔｏｘｏｓｉｎｅ）、シュードウラシル（ｐｓｅｕｄｏｕｒａｃｉｌ）、ケオシン（ｑｕｅｏｓｉｎｅ）、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−５−オキシ酢酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２−カルボキシプロピル）ウラシル、（ａｃｐ３）ｗ、および２，６−ジアミノプリン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシン、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ（例えば、８−ブロモ）、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換されたアデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に、５−ブロモ、５−トリフルオロメチルならびに他の５−置換されたウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、デアザグアニン、７−デアザグアニン、３−デアザグアニン、デアザアデニン、７−デアザアデニン、３−デアザアデニン、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン、イミダゾ［１，５−ａ］１，３，５トリアジノン（ｔｒｉａｚｉｎｏｎｅ）、９−デアザプリン、イミダゾ［４，５−ｄ］ピラジン、チアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン、ピラジン−２−オン、１，２，４−トリアジン、ピリダジン；ならびに１，３，５トリアジンが含まれるがこれらに限定されない。
【０３３４】
一部の形態では、ヌクレオチドコンポーネント構築ブロックは、ロックト核酸（ＬＮＡ）またはペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
【０３３５】
ｉ．ロックト核酸
一部の形態では、コンポーネント構築ブロックは、ロックト核酸（ＬＮＡ）である。ＬＮＡは、他の利益のうち、ＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドに、真に先例のない親和性および非常に高いヌクレアーゼ耐性を付与する、コンフォメーション的にロックされたヌクレオチドアナログのファミリーである（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９７５６３３−５６３８  （２０００）；Ｂｒａａｓｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．  ８１−７  （２００１）；Ｋｕｒｒｅｃｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０１９１１−１９１８  （２００２））。一部の形態では、核酸は、合成ＲＮＡ様高親和性ヌクレオチドアナログ、ロックト核酸である。一部の形態では、ヌクレオチドは、ロックト核酸である。
【０３３６】
ｉｉ．ペプチド核酸（ＰＮＡ）
一部の形態では、コンポーネント構築ブロックは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡは、天然の核酸の糖リン酸骨格が、Ｎ−（２−アミノ−エチル）−グリシン単位から通常は形成される合成ペプチド骨格によって置き換えられて、光学不活性で非荷電の模倣物を生じている、核酸アナログである（Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＰＥ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，  １４９７−１５００  （１９９１））。これは、加水分解的（酵素的）切断に対して化学的に安定かつ耐性である。一部の形態では、足場形成されたＤＮＡは、ＰＮＡである。他の形態では、ヌクレオチドコンポーネント構築ブロックは、ＰＮＡである。一部の形態では、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＬＮＡは、捕捉のために、または目的のタンパク質もしくは他の小分子が、構造化されたＲＮＡもしくはＤＮＡ上の相補的結合部位を標的化するもしくは他の方法でそれと相互作用するために、使用される。他の形態では、ＰＮＡ、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはＬＮＡの組合せが、核酸のマイクロ流体デバイスベースの合成において使用される。
【０３３７】
一部の形態では、ＰＮＡ、ＤＮＡおよび／またはＬＮＡの組合せは、核酸のマイクロ流体デバイスベースの合成のために使用される。一部の形態では、記載される方法に従って産生される核酸は、蛍光分子を取り込むように改変される。例示的な蛍光分子には、蛍光色素および染色、例えば、Ｃｙ５改変されたＣＴＰが含まれる。
【０３３８】
ｂ．ヌクレオチドインヒビター
一部の形態では、コンポーネント構築ブロックは、成長中の核酸への引き続くヌクレオチドの付加を阻害もしくは防止するヌクレオチドアナログ、例えば、「阻害性ヌクレオチドアナログ」を含む。例示的な阻害性ヌクレオチドアナログは、成長中の核酸中に取り込まれると、阻害性基が除去されるまで引き続くヌクレオチド取り込みを防止する、荷電した阻害性基を含む。したがって、一部の形態では、阻害性ヌクレオチドアナログは、ヌクレオチド三リン酸、リンカー（またはテザー）、検出可能な標識および荷電した阻害性基を含み、ここで、標識および阻害性基は、除去可能である。
【０３３９】
一部の形態では、インヒビター基は、立体障害なしに、引き続くヌクレオチド取り込みの阻害を引き起こし得る。例えば、阻害は、酵素との化学的または電荷相互作用によって引き起こされるのであって、酵素の物理的遮断ではない。他の形態では、荷電したインヒビターは、酵素活性の立体阻害もまた提供する。したがって、一部の形態では、コンポーネント構築ブロックは、立体障害を提供するまたは立体障害を提供しない荷電したインヒビター基を含む１つまたは複数の阻害性ヌクレオチドアナログを含む。
【０３４０】
一部の形態では、インヒビター部分は、負に荷電している、または負に荷電することが可能である。他の形態では、インヒビター部分は、正に荷電している、または正に荷電することが可能である。一部の形態では、インヒビターは、荷電した部分（例えば、負に荷電した部分、正に荷電した部分、またはその両方）、または荷電することが可能な部分を含む。インヒビターは、２つまたはそれよりも多くの荷電した基を含み得る。一部の形態では、インヒビターは、−ＣＯＯＨ、−ＰＯ４、−ＳＯ４、−ＳＯ３、−ＳＯ２、−ＮＲｗＲｖからなる群から選択される荷電した基を含み、式中、ＲｗおよびＲｖは独立して、Ｈ、アルキルまたはアリール基である。一部の形態では、インヒビター部分は、−ＰＯ４基を含まない。一部の他の形態では、インヒビター部分は、アリール基を含まない。ある特定の他の形態では、インヒビターは、ヌクレオチドもヌクレオシドも、それらのアナログも含まない。
【０３４１】
２．アミノ酸コンポーネント構築ブロック
一部の形態では、コンポーネント構築ブロックは、天然に存在するアミノ酸、またはそれらの誘導体である。例えば、ポリペプチド配列が合成される場合、マイクロ流体デバイス（例えば、ＥＷＯＤチップ）には、適切な緩衝液中に１つまたは複数のアミノ酸を含む１つまたは複数のレザバがロードされる。例示的な緩衝液には、滅菌濾過水および生理的食塩水が含まれる。
【０３４２】
例示的なアミノ酸コンポーネント構築ブロックには、Ｌ−形態またはＤ−形態の、２０種の標準的なアミノ酸（アラニン、グリシン、システイン、アルギニン、アスパラギン酸、アスパラギン、ヒスチジン、リシン、グルタミン、メチオニン、グルタミン酸、スレオニン、プロリン、ロイシン、セリン、バリン、イソロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）、およびそれらの改変されたバリアントが含まれるがこれらに限定されない。
【０３４３】
ａ．改変されたアミノ酸
一部の形態では、アミノ酸コンポーネント構築ブロックは、改変されたアミノ酸である。例えば、２０種の標準的なアミノ酸のいずれもが、化学的実体、例えば、炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーションのためのリンカーの付加、官能化、または他の改変などによって改変され得る。さらなる改変には、アミノ酸に１つまたは複数のアセチル、メチル、ミリストイルまたはパルミトイル基を付加するための、アセチル化、プロピオニル化、メチル化、ミリストイル化、パルミトイル化が含まれる。例示的な改変されたアミノ酸には、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、Ｏ−ホスホセリン、β−アラニン、α−アミノ酪酸、γ−アミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、ε−アミノカプロン酸、７−アミノヘプタン酸、β−アスパラギン酸、ε−グルタミン酸、システイン（ＡＣＭ）、ε−リシン、ε−リシン（Ａ−Ｆｍｏｃ）、メチオニンスルホン、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、ｄ−オルニチン、ｐ−ニトロ−フェニルアラニン、ヒドロキシプロリンおよびチオプロリンが含まれる。
【０３４４】
ｂ．アミノ酸インヒビター
一部の形態では、コンポーネント構築ブロックは、成長中のポリペプチドへの引き続くアミノ酸の付加を阻害もしくは防止するアミノ酸アナログ、例えば、「阻害性アミノ酸アナログ」を含む。例示的な阻害性アミノ酸アナログは、成長中のポリペプチド中に取り込まれると、阻害性基が除去されるまで引き続くアミノ酸取り込みを防止する、荷電した阻害性基を含む。したがって、一部の形態では、阻害性アミノ酸は、リンカー（またはテザー）、検出可能な標識および荷電した阻害性基を含み、ここで、標識および阻害性基は、除去可能である。
【０３４５】
一部の形態では、コンポーネント構築ブロックは、２〜２０単位のアミノ酸またはアナログのペプチド、２〜１０単位のアミノ酸またはアナログのペプチド、３〜７単位のアミノ酸またはアナログのペプチド、３〜５単位のアミノ酸またはアナログのペプチドを含む。一部の実施形態では、インヒビターは、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｒｇ、ＨｉｓおよびＬｙｓ、ならびにそれらの組合せ（例えば、Ａｒｇ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−ＧｌｕまたはＡｓｐＡｓｐＡｓｐＡｓｐ）からなる群から選択される基を含む。ペプチドまたは基は、同じまたは異なるアミノ酸またはアナログの組合せであり得る。
【０３４６】
３．炭水化物コンポーネント構築ブロック
一部の形態では、コンポーネント構築ブロックは、天然に存在する単糖、またはそれらの誘導体である。例えば、オリゴ糖配列が合成される場合、マイクロ流体デバイス（例えば、ＥＷＯＤチップ）には、適切な緩衝液中に１つまたは複数の単糖を含む１つまたは複数のレザバがロードされる。例示的な緩衝液には、滅菌濾過水および生理的食塩水が含まれる。
【０３４７】
例示的な単糖コンポーネント構築ブロックには、グルコース（デキストロース）、フルクトース、ガラクトース、リボース、キシロース、アロース、ノイラミン酸のＮ−またはＯ−置換された誘導体、およびそれらの改変されたバリアントが含まれるがこれらに限定されない。一部の形態では、単糖コンポーネント構築ブロックは、Ｄ−異性体、Ｌ−異性体のα−アノマーもしくはβ−アノマー、またはそれらの組合せであり得る。
一部の形態では、単糖コンポーネント構築ブロックは、脂質で改変される。
【０３４８】
４．他のポリマー構築ブロック
例えば、マイクロ流体デバイスベースの方法を使用して調製される合成核酸にカップリングされ得るポリマー構築ブロックの非限定的なリストは、ポリ（ベータ−アミノエステル）；脂肪族ポリエステル；ポリリン酸エステル；ジスルフィド連結含有ポリ（Ｌ−リシン）；ＳＯＭＡＭＥＲＳ（登録商標）（Ｈｅｎｓｌｅｙ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ：  ＪＢＴ．  ２０１３；２４（Ｓｕｐｐｌ）：Ｓ５を参照のこと）；ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）；ジスルフィド含有ポリマー、例えば、ＤＴＳＰまたはＤＴＢＰ架橋されたＰＥＩ；ＤＴＳＰで架橋されたＰＥＧ化ＰＥＩ；ＤＳＰで架橋されたＰＥＩ；直鎖ＳＳ−ＰＥＩ；ＤＴＳＰ架橋された直鎖ＰＥＩ；分岐鎖ポリ（エチレンイミンスルフィド）（ｂ−ＰＥＩＳ）を含む。典型的には、ポリマーは、５００Ｄａと２０，０００Ｄａとの間（包摂的）、例えば、およそ１，０００Ｄａ〜１０，０００Ｄａ（包摂的）の分子量を有する。一部の形態では、ポリマーは、エチレングリコールである。一部の形態では、ポリマーは、ポリエチレングリコールである。例示的な形態では、１つまたは複数のポリマーは、配列中の１つまたは複数の位置において、改変された核酸にコンジュゲートされる。
【０３４９】
Ｆ．酵素触媒
バイオポリマーの鋳型なしの合成のための方法は、始動因子配列上への各コンポーネント構築ブロックの付加を可能にするために触媒を必要とする。有用な触媒は、バイオポリマー上へのコンポーネント構築ブロックの取り込みを可能にする、またはその速度を増加させる。
【０３５０】
例示的な触媒酵素は、対応する始動因子配列と一致する。例えば、一部の形態では、始動因子配列は、合成に使用される触媒のクラスおよび組成に従って選択される。
【０３５１】
一部の形態では、触媒は、固体支持体または固定相物体、例えば、磁性ビーズ、表面、アガロースまたは他のポリマービーズにハイブリダイズするまたは他の方法で結合するように設計された１つまたは複数の配列を含む。他の例では、触媒は、分子へのコンジュゲーションのための１つまたは複数の部位を含む。例えば、触媒は、例えば、触媒の親和性結合を可能にするために、例えば、合成されたポリマーから触媒を除去するために、タンパク質または非タンパク質分子にコンジュゲートされ得る。
【０３５２】
１．核酸合成のための酵素触媒
核酸の鋳型なしの酵素的合成に有用な例示的な触媒には、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、テロメラーゼおよびＱベータレプリカーゼが含まれる。
【０３５３】
ａ．ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）は、ＤＮＡヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ（ＤＮＴＴ）またはターミナルトランスフェラーゼとしても公知であり、特殊化したＤＮＡポリメラーゼである。
【０３５４】
ＴｄＴは、ＤＮＡ分子の３’ヒドロキシル末端へのデオキシヌクレオチドの付加を触媒する鋳型非依存的ポリメラーゼである。ＴｄＴは、Ｐｏｌ  Ｘファミリーのメンバーである。ＴｄＴは、ＤＮＡ分子の３’末端へのヌクレオチドの鋳型なしの付加を触媒する。この酵素の好ましい基質は、３’−オーバーハングであるが、この酵素は、平滑または凹型３’末端にもヌクレオチドを付加することができる。コバルトは必要な補因子であるが、この酵素は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではＭｇおよびＭｎ投与の際に反応を触媒する。ＴｄＴは、Ｎ−ヌクレオチドセグメントにそれらを付加する場合には４つの塩基対を差別しないが、グアニンおよびシトシン塩基対への偏りが示されている。
【０３５５】
ＴｄＴは、標識されたヌクレオチドを、放射能標識化、クローニングおよび他の標識化戦略のために、核酸（例えば、ＤＮＡ）の１つまたは複数の末端に付加するために使用される。ＴｄＴ酵素の商業的供給源は、当該分野で公知である（例えば、ＮＥＢカタログ番号Ｍ０３１５）。
【０３５６】
一部の形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼｍｕ（Ｐｏｌμ）である。Ｐｏｌμは、固有のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性、および活性化性のＭｎ２＋イオンに対する強い優先度を示す。
【０３５７】
いくつかのエラープローンＤＮＡポリメラーゼは、鋳型情報が欠落しているＤＮＡ損傷中に、ヌクレオチドを効率的に取り込む（Ｇｏｏｄｍａｎ，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７１：１７−５０  （２００２））。一部の形態では、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｙ−ファミリーのＤＮＡポリメラーゼである。そのＵＶ誘導される発現、およびその非存在下でのＵＶ感受性に起因して元々同定および単離されたＲｅｖ１は、真核生物間に普遍的に存在する。Ｒｅｖ１は、鋳型非依存的デオキシシチジルトランスフェラーゼである（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＣＷ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １２２（１），  １−２１（１９７８））。突出、凹型または平滑末端化された二本鎖または一本鎖ＤＮＡ分子が、ＴｄＴの基質として機能する。５８．３ｋＤａ酵素は、５’エキソヌクレアーゼ活性も３’エキソヌクレアーゼ活性も有さない。反応におけるＣｏ２＋の添加は、テーリングをより効率的にする。
ＴｄＴのための例示的な反応緩衝液は、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸および１０ｍＭ酢酸マグネシウムを含む（２５℃でｐＨ７．９）。
【０３５８】
ｂ．テロメラーゼ
テロメラーゼは、ＤＮＡ鋳型なしのポリメラーゼの別の例である。テロメラーゼは、ＲＮＡサブユニット中に包埋された鋳型を使用することによって、テロメアリピートの一方の鎖を伸長させる特別な逆転写酵素である。しかし、マンガンの存在下では、酵母およびヒトのテロメラーゼは共に、ターミナルトランスフェラーゼとしての効果で作用する、鋳型非依存的かつＲＮＡ非依存的様式のＤＮＡ合成にスイッチすることができる（Ｌｕｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＮＡＳ．  １０２  （２８）  ９７７８−９７８３  （２００５））。
【０３５９】
ｃ．Ｑ−ベータレプリカーゼ
Ｑベータレプリカーゼは、核酸、特にＲＮＡのための、鋳型なしのポリメラーゼの別の例である（Ｂｉｅｂｒｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ．  ３２１（６０６５）：８９−９１（１９８６）；Ｂｉｅｂｒｉｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＥＭＢＯ  Ｊ，  １５（１３）：  ３４５８−３４６５  （１９９６））。
【０３６０】
ＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、（ＲＤＲ）またはＲＮＡレプリカーゼは、ＲＮＡ鋳型からのＲＮＡの複製を触媒する酵素である。これは、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡの転写を触媒する典型的なＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼとは対照的である。
【０３６１】
Ｇ．緩衝液および洗浄試薬
一部の形態では、バイオポリマーのマイクロ流体デバイスベースの合成のための方法は、緩衝液および洗浄試薬を使用する。洗浄緩衝液は、別のコンポーネント、例えば酵素の局所的な濃縮を除去するまたは低減させるために使用される任意の溶液であり得る。
【０３６２】
例示的な緩衝液および洗浄試薬には、水、生理的塩溶液、例えば、ＰＢＳおよびＤＭＥＭが含まれる。
【０３６３】
１．停止試薬および遮断緩衝液
一部の形態では、バイオポリマーのマイクロ流体デバイスベースの合成のための方法は、遮断緩衝液および停止試薬を使用する。遮断緩衝液は、触媒、例えばポリメラーゼ酵素の活性を防止するまたは低減させるために使用される。一部の形態では、停止または遮断試薬は、コンポーネント構築ブロックを成長中のバイオポリマー鎖上に取り込む酵素的触媒作用をクエンチする。典型的には、これらの方法は、使用される触媒酵素の活性を停止させる、低減させるまたは他の方法で媒介するのに特異的または効率的である、停止試薬および／または遮断試薬を含む。特異的触媒酵素に対して有効な遮断緩衝液および停止試薬は、当該分野で公知である。
【０３６４】
一部の形態では、これらの方法は、核酸バイオポリマーへの核酸の付加のための触媒として、酵素ＴｄＴを含む。したがって、これらの方法は、ＴｄＴの阻害のためのインヒビターを提供する。ＴｄＴの例示的なインヒビターには、金属キレーター（例えば、ＥＤＴＡ）、ナトリウム、アンモニウム、塩化物、ヨウ化物、リン酸イオンおよびＴＲＩＳ緩衝液が含まれる。したがって、一部の形態では、ＴｄＴに対する停止緩衝液は、ＥＤＴＡ、ナトリウム、アンモニウム、塩化物、ヨウ化物、リン酸イオンおよびＴＲＩＳ緩衝液のうち１つまたは複数を含む。ＴｄＴポリメラーゼの例示的なインヒビターには、ゲニスチン（Ｇｅｎｉｓｔｉｎ）およびヘプテリジン酸（Ｈｅｐｔｅｌｉｄｉｃ  ａｃｉｄ）が含まれる。
【０３６５】
テロメラーゼ酵素の例示的なインヒビターには、ＢＩＢＲ  １５３２、ＢＲＡＣＯ  １９三塩酸塩、コスツノリド、ＲＨＰＳ  ４メトサルフェート、ＴＭＰｙＰ４トシレートが含まれる。ＤＮＡポリメラーゼの例示的なインヒビターには、アミケリン（ａｍｉｋｈｅｌｌｉｎｅ）、アクチノマイシンＤ、アフィディコリン、シタラビン、ミスラマイシンＡ、７−アミノアクチノマイシンＤ、リファマイシンＳＶ一ナトリウム塩、１−ベータ−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、アクリジンオレンジヘミ（塩化亜鉛）塩、デアセチルコルヒチン（ｄｅａｃｅｔｙｌｃｏｌｃｈｉｃｅｉｎｅ）、ホスカルネットナトリウム、ルブロフサリン（ｒｕｂｒｏｆｕｓａｒｉｎ）、ルグロシン（ｒｕｇｕｌｏｓｉｎ）、レジストマイシン（ｒｅｓｉｓｔｏｍｙｃｉｎ）、ジュグロン、アルファ−アマニチン、リファペンチンおよびベルノレピンが含まれる。ＲＮＡポリメラーゼの例示的なインヒビターには、アマトキシン（１０  Ｐ）、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩインヒビター、およびリファマイシン抗生物質、オーレオスリシン（ａｕｒｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）、２’−Ｃ−メチルシチジン、ならびにチオルチン（Ｔｈｉｏｌｕｔｉｎ）が含まれる。
【０３６６】
一部の形態では、停止試薬は、１つもしくは複数の阻害性コンポーネント構築ブロック、例えば、１つもしくは複数の阻害性ヌクレオチドアナログ、または１つもしくは複数の阻害性アミノ酸を含む。
【０３６７】
一部の形態では、停止試薬は、触媒酵素の活性を即座に防止する分子を含む。触媒酵素の活性を即座に防止する例示的な薬剤は、１つまたは複数の酵素補因子を封鎖および／またはキレートする分子である。封鎖され得る例示的な補因子には、金属イオンなどのイオンが含まれる。
【０３６８】
一部の形態では、停止試薬は、イオンをキレートする１つまたは複数の分子を含む。一部の形態では、これらの方法は、Ｍｇ２＋イオンをキレートするキレート剤を含む。酵素補因子をキレートするキレート剤は、当該分野で公知である。例示的なキレート剤には、ＥＤＴＡ、ＢＡＰＴＡおよびＥＧＴＡが含まれる。
【０３６９】
ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）は、アミノポリカルボン酸および無色の水溶性固体である。そのコンジュゲート塩基は、エチレンジアミン四酢酸塩である。これは、金属イオン、例えば、Ｃａ２＋およびＦｅ３＋を封鎖するための広く使用されるキレート剤である。ＥＤＴＡが結合して金属錯体になった後、金属イオンは、溶液中に残存するが、減少した反応性を示す。ＥＤＴＡは、いくつかの塩、特に二ナトリウムＥＤＴＡおよびカルシウム二ナトリウムＥＤＴＡとして産生される。
【０３７０】
エグタズ酸（ＩＮＮ、ＵＳＡＮ）としても公知のＥＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸）は、アミノポリカルボン酸キレート剤である。これは、よりよく知られたＥＤＴＡと関連する無色の固体である。ＥＤＴＡと比較して、これは、マグネシウムに対するより低い親和性を有し、それにより、カルシウムイオンに対してより選択的になっている。
【０３７１】
一部の形態では、１つまたは複数の停止または遮断試薬の活性は、１つまたは複数の外部因子によって増強されるまたは可能にされる。例えば、一部の形態では、ＴｄＴ酵素は、７０℃で１０分間加熱することによって不活性化される。加熱は、ＥＤＴＡなどの１つまたは複数の停止試薬の存在下で行われ得る。
【０３７２】
Ｈ．カプセル化剤
一部の形態では、配列コードされたポリマーは、カプセル化を介して、別個のＳＭＯへとパッケージングされる。適切なカプセル化剤には、ゲルベースのビーズ、タンパク質ウイルスパッケージ、ミセル、無機化された構造、シリコン処理された構造、またはポリマーパッケージングが含まれる。
【０３７３】
一部の形態では、カプセル化剤は、ウイルスカプシドまたはそれらの機能的部分、誘導体および／もしくはアナログである。一部の形態では、カプセル化剤は、情報のフォーマットをコードする核酸の周辺にミセルまたはリポソームを形成する脂質である。一部の形態では、カプセル化剤は、天然または合成ポリマーである。一部の形態では、カプセル化剤は、アルジネートビーズまたは多糖のリン酸カルシウム無機化など、無機化される。他の形態では、カプセル化剤は、シリコン処理される。メモリブロックへのビットストリームポリマー配列のパッケージングは、分子識別子または「アドレス」の使用による選択および超構造化を可能にする。核酸オーバーハングに加えて、他の精製タグが、精製（即ち、データ検索）のために、任意のＳＭＯ中でオーバーハング核酸配列中に取り込まれ得る。一部の形態では、オーバーハングは、１つまたは複数の精製タグを含む。一部の形態では、オーバーハングは、親和性精製のための精製タグを含む。一部の形態では、オーバーハングは、核酸または非核酸分子へのコンジュゲーションのための１つまたは複数の部位を含む。例えば、オーバーハングタグは、例えば、ＳＭＯの親和性結合を可能にするために、タンパク質または非タンパク質分子にコンジュゲートされ得る。オーバーハングタグにコンジュゲートするための例示的なタンパク質には、ビオチン、抗体、または抗体の抗原結合性断片が含まれる。
【０３７４】
Ｉ．バイオポリマーの改変のための試薬
記載されるマイクロ流体デバイスベースの方法に従って設計および合成されたバイオポリマーは、公知の機能を有する分子を付加する、除去する、改変する、または他の方法でそれと相互作用するように改変され得る。
【０３７５】
例示的な改変部分は、バイオポリマーに従って選択され得、これには、小分子、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、糖類または多糖が含まれ得る。
【０３７６】
ａ．核酸を改変するための酵素
核酸バイオポリマーの１つまたは複数のコンポーネントを改変する酵素が、記載される方法との使用のために記載される。核酸内の１つまたは複数の部位において１つまたは複数のヌクレオチドを分解する、切断するまたは他の方法で除去する酵素が提供される。
【０３７７】
ｉ．エキソヌクレアーゼ
一部の形態では、これらの方法は、核酸バイオポリマーのいずれかの末端から１つまたは複数の核酸を除去するために、１つまたは複数のエキソヌクレアーゼを使用する。エキソヌクレアーゼ酵素、および最適なエキソヌクレアーゼ活性のために適切な緩衝液条件は、当該分野で公知である。例示的なエキソヌクレアーゼ酵素には、ラムダエキソヌクレアーゼ、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩ、エキソヌクレアーゼＩＩ、Ｅ．ｃｏｌｉエキソヌクレアーゼＩＩＩ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩ、エキソヌクレアーゼＶＩＩおよびエキソヌクレアーゼＴが含まれる。
【０３７８】
ｉｉ．エンドヌクレアーゼ
一部の形態では、これらの方法は、核酸バイオポリマー内から１つまたは複数の核酸を除去するために、１つまたは複数のエンドヌクレアーゼを使用する。エンドヌクレアーゼ酵素、および最適なエキソヌクレアーゼ活性のために適切な緩衝液条件は、当該分野で公知である。例示的なエンドヌクレアーゼ酵素には、マングビーンヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、小球菌ヌクレアーゼ、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ、熱安定性ＦＥＮ１およびヌクレアーゼＢＡＬ−３１が含まれる。
【０３７９】
ｉｉｉ．制限エンドヌクレアーゼ
一部の形態では、これらの方法は、バイオポリマーの配列制御される領域において１つまたは複数の核酸をカット、切断または除去するために、１つまたは複数の制限エンドヌクレアーゼを使用する。制限エンドヌクレアーゼ（ＲＥ）は、ＤＮＡ二重らせん内の相補的核酸の糖−リン酸骨格をカットして、平滑末端化された（即ち、両方の鎖が塩基対で終わる）核酸断片を産生する酵素である。ヌクレオチドの特異的配列を認識し、ＤＮＡの両方の鎖をカットして平滑末端化されたＤＮＡ断片を生じる制限エンドヌクレアーゼ酵素は、当該分野で周知である。制限エンドヌクレアーゼ酵素の認識配列は、一般に、４塩基と８塩基との間である。二本鎖ＤＮＡを消化して平滑末端化されたＤＮＡ断片を産生する制限エンドヌクレアーゼ酵素（即ち、平滑カッティングＲＥ）は、パリンドロームまたは非パリンドローム配列を認識できる。カット部位は、認識配列内にあり得、または認識配列と連続していても、認識配列から離れていてもよい。平滑末端制限エンドヌクレアーゼ酵素の非限定的なリストは、ＡａｎＩ、Ａｃｃ１６Ｉ、ＡｃｃＢＳＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｖＩ、ＡｆａＩ、ＡｆｅＩ、ＡｈａＩＩＩ、ＡｊｉＩ、ＡｌｅＩ、ＡｌｕＢＩ、ＡｌｕＩ、Ａｏｒ５１ＨＩ、Ａｓｐ７００Ｉ、ＡｓｓＩ、ＢａｌＩ、ＢｂｒＰＩ、ＢｍｃＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｉＩ、ＢｏｘＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、Ｂｓｅ８Ｉ、ＢｓｅＪＩ、Ｂｓｈ１２３６Ｉ、ＢｓｈＦＩ、ＢｓｎＩ、Ｂｓｐ６８Ｉ、ＢｓｐＦＮＩ、ＢｓｐＬＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｓＮＡＩ、Ｂｓｔ１１０７Ｉ、ＢｓｔＢＡＩ、ＢｓｔＣ８Ｉ、ＢｓｔＦＮＩ、ＢｓｔＰＡＩ、ＢｓｔＳＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢｓｕＲＩ、ＢｔｒＩ、ＢｔｕＭＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｄｉＩ、ＣｖｉＪＩ、ＣｖｉＫＩ＿１、ＣｖｉＲＩ、ＤｉｎＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ、Ｅｃｌ１３６ＩＩ、Ｅｃｏ１０５Ｉ、Ｅｃｏ１４７Ｉ、Ｅｃｏ３２Ｉ、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、Ｅｃｏ７２Ｉ、ＥｃｏＩＣＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｇｅＩ、ＥｈｅＩ、ＥｓａＢＣ３Ｉ、ＦａｉＩ、ＦｎｕＤＩＩ、ＦｓｐＡＩ、ＦｓｐＩ、ＧｌａＩ、ＨａｅＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｐａＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｈｐｙ８Ｉ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＫｓｐＡＩ、ＬｐｎＩ、ＭａｌＩ、ＭｂｉＩ、ＭｌｓＩ、ＭｌｕＮＩ、ＭｌｙＩ、ＭｒｏＸＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｌＩ、Ｍｓｐ２０Ｉ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｓＩ、ＭｓｔＩ、ＭｖｎＩ、ＮａｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｒｕＩ、ＮｓｂＩ、ＮｓｐＢＩＩ、ＯｌｉＩ、ＰｃｅＩ、ＰｄｉＩ、ＰｄｍＩ、ＰｍａＣＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、Ｐｐｕ２１Ｉ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、ＰｓｐＣＩ、ＰｓｐＮ４Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＲｒｕＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｅＩ、ＳｃａＩ、ＳｃｈＩ、ＳｃｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｉＩ、ＳｍｉＭＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｒｆＩ、ＳｓｅＢＩ、ＳｓｐＤ５Ｉ、ＳｓｐＩ、Ｓｔｈ３０２ＩＩ、ＳｔｕＩ、ＳｗａＩ、ＸｍｎＩ、ＺｒａＩ、およびＺｒｍＩを含む。
【０３８０】
Ｖ．使用
配列制御されるバイオポリマーの自動化された鋳型なしの合成および操作のための記載される方法および組成物は、広範な適用のために使用され得る。例示的な適用には、バイオポリマーベースのメモリシステムの調製および組織化が含まれる。
【０３８１】
Ａ．核酸メモリのためのマイクロ流体合成
マイクロ流体デバイスを使用したバイオポリマーの設計、合成および／または操作のための記載される方法は、多様な独自にアドレス指定されたユーザー定義されたバイオポリマーの、自動化された大規模な同時産生のために実行され得る。
【０３８２】
これらの方法は、バイオポリマーベースのメモリストレージを含む、広範な種々の適用における使用のためにバイオポリマーを合成できる。一部の形態では、これらの方法は、マイクロ流体力学プラットフォームを介して発動される液滴の移動を介して、メモリストレージユニット、例えば核酸、またはポリペプチドカプセル化ユニット内の情報を組織化するステップを含む。さらなる形態では、これらの方法は、バイオポリマーメモリストレージユニットから、ビットストリームコード配列を検索するステップを含む。
【０３８３】
１．核酸メモリストレージ
メモリストレージのためにユーザー定義された核酸を合成および操作する方法が提供される。一部の形態では、マイクロ流体システムは、天然または合成材料の層内にカプセル化されるデータのフォーマットをコードするデータ配列核酸を合成および操作するために実行される。任意の無作為の形態の核酸、例えば、直鎖、一本鎖、塩基対合した二本鎖、または足場形成された核酸が、カプセル化され得る。例示的なカプセル化剤には、タンパク質、脂質、糖類、多糖、核酸、およびそれらの任意の誘導体、ならびにヒドロゲル、およびポリスチレンを含む合成ポリマー、またはシリカ、ガラス、ならびに常磁性材料が含まれる。これらのカプセル化された核酸は、情報のブロックの制御された隔離を可能にする別個のメモリストレージユニットを形成する。一部の形態では、これらの方法は、必要に応じて、核酸メモリストレージユニット内の情報を組織化するステップもまた含む。一部の形態では、これらの方法は、必要に応じて、データコード配列にアクセスするステップ、例えば、包囲された核酸配列からの、ビットストリームコードデータにアクセスするステップもまた含む。一部の形態では、これらの方法は、バイオポリマーメモリストレージユニットから、ビットストリームコード配列を検索するステップもまた含む。
【０３８４】
バイオポリマー、およびバイオポリマーをカプセル化する粒子のマイクロ流体ベースの産生のための方法は、任意の長さの核酸を使用した情報のストレージのための核酸メモリ物体の創出に適用され得、または任意の形態も開発されている。典型的には、任意の所望の長さの核酸は、ゲルベースのビーズ、タンパク質ウイルスパッケージ、ミセル、無機化された構造、シリコン処理された構造、またはポリマーパッケージング中に、パッケージングされ、カプセル化され、包まれ、またはケース封入され、これは、本明細書で「核酸パッケージ」と呼ばれる。一部の形態では、情報のビットストリームをコードする直鎖核酸は、塩基対合した二本鎖である。他の形態では、直鎖核酸は、長い連続した一本鎖核酸ポリマーまたは多くのかかるポリマーからなる。これらの別個の核酸パッケージは、核酸メモリ物体（ＮＭＯ）として機能し、構造の表面上への１つまたは複数の特異的タグの取り込みを可能にする。一部の例示的なタグには、核酸配列タグ、タンパク質タグ、炭水化物タグ、および任意の親和性タグが含まれる。
【０３８５】
インデックス／バーコードがコア粒子の外部表面および／またはバイオポリマー配列に結合される様式は、情報をプールする、選別する、組織化する、および情報にアクセスするための所望の様式に従って変動され得る。他の形態では、「シェル形成」の生成物である「シェル」がコードされたデータを含む、カプセル化された粒子が形成される。
【０３８６】
典型的には、配列制御されるポリマーメモリ物体（ＳＭＯ）として所望の媒体をアセンブルおよび記憶するための方法は、以下のステップのうち１つまたは複数を含む：
（Ａ）所望の媒体を含む、ビットストリームコード配列を提供するステップ；
（Ｂ）ビットストリームコード配列を含む配列制御されるポリマーメモリ物体（ＳＭＯ）を創出するステップ；および
（Ｃ）コードされたビットストリームを含むＳＭＯを記憶するステップ。
【０３８７】
一部の形態では、これらの方法は、以下のステップのうち１つまたは複数もまた含む：
（Ｄ）２つまたはそれよりも多くのＳＭＯ内の情報を組織化するまたは組み合わせるステップ；
（Ｅ）１つまたは複数の選択されたＳＭＯ内の、ビットストリームコード配列を検索するステップ；および
（Ｆ）選択されたＳＭＯ内のコードされた媒体にアクセスするステップ。
【０３８８】
これらのステップの各々は、コードされた情報の合成、操作、記憶および検索を組織化するために液滴または流体フローの移動を制御するために、マイクロ流体デバイス内で実行され得る。
【０３８９】
ａ．バイオポリマー配列へのデータの変換
典型的には、これらの方法は、所望の情報、例えば、ビットストリームデータのピースをコードするポリマー配列を提供することを必要とする。適切なポリマーには、配列制御されるポリマー、例えば、別個のモノマーの非ランダム配列から構成される高分子が含まれる。例示的な配列制御されるポリマーは、核酸、例えば、一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡである。例えば、一部の形態では、ビットストリームデータをコードする一本鎖核酸配列は、ユーザー定義された形状およびサイズを有する核酸ナノ構造の設計のためにインプットされる。
【０３９０】
一部の形態では、デジタルフォーマットの情報の一部分（単数または複数）、例えば、ｈｔｍｌフォーマットの情報、あるいは任意の他のデジタルフォーマット、例えば、ブック・ウィズ・テキストおよび／または画像、音声もしくはムービーデータは、ビット、即ち、ゼロおよび１に変換される。一部の形態では、情報は、１つのフォーマット（例えば、テキスト）から他のフォーマットへと、例えば、Ｌｅｍｐｅｌ−Ｚｉｚ−Ｍａｒｋｏｖチェーンアルゴリズム（ＬＺＭＡ）による圧縮もしくは他の方法の圧縮を介して、または例えばＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｅｎｃｒｙｐｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＡＥＳ）による暗号化もしくは他の方法の暗号化を介して、他の方法で変換され得る。ビットに変換され得る他のフォーマットの情報は、当業者に公知である。
【０３９１】
したがって、一部の形態では、これらの方法は、情報のフォーマットを、ビットストリームの１つまたは複数のビット配列へと変換するステップを含む。１つまたは複数のビット配列は、１つまたは複数の対応するポリマーサブユニットへと変換され得る。例示的な形態では、ビット配列は、核酸配列へと変換される。ビット配列を１つまたは複数の配列制御されるポリマーへと変換するための方法は、当該分野で公知である。
【０３９２】
例示的な形態では、コンピューター上で０および１のビットストリームとしてコードされたデジタルファイルは、当該分野で公知の方法のいずれかを使用して、核酸配列配列に可逆的に変換される。一部の形態では、対応するコードされたオリゴヌクレオチド配列を形成するために、コードする塩基１つ当たり１ビット（ＡまたはＣ＝０；ＴまたはＧ＝１）を使用したオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ、即ち、オリゴヌクレオチド配列は、ビット配列に対応し、ビット配列をコードする。一部の形態では、デジタルフォーマット、例えば暗号化塩の選択、および等価な核酸配列に対するビットストリームの選択、例えば、ＣではなくＡの選択は、当該分野で公知の方法によって同定される配列反復および配列自己相補性が回避されるように、最適化される。
【０３９３】
所望の媒体のビットストリームデータから生成された核酸配列は、「ビットストリームコード配列」と呼ばれる。長い足場配列内のコードされたビットストリームデータは、典型的には、断片へと「分割される（ｂｒｏｋｅｎ−ｕｐ）」。例えば、データは、例えば、物体１つ当たり、約１００〜約１，０００，０００ヌクレオチド、例えば、約３７５〜約５１，０００塩基（包摂的）、５００ｂｐから５０，０００ｂｐまでの、任意のサイズ範囲へと断片化され得る。デジタルストレージの分野では、これは、「ページ」または「ブロック」と概念的に同義である。ビットストリームをコードした核酸配列は、マイクロ流体デバイスを使用する記載される鋳型なしの合成方法に従って合成され、種々の公知の技術（即ち、非対称ＰＣＲ、ビーズベースの精製および分離、クローニングおよび精製）を使用して、必要に応じて増幅または精製される。
【０３９４】
一部の形態では、メモリページは、ファイルフォーマットシグネチャー、暗号化塩をコードする配列、独自の同定性ページ数、メモリブロック長さ、およびＤＮＡ増幅のための配列を含む同定性情報を、各配列の一部として有する。
【０３９５】
例示的な形態では、デジタルファイルは、例えばＬＺＭＡ方法を使用して圧縮され、またはファイルは、例えば、供給されたパスワードを使用するＡＥＳ１２８暗号化を使用して、暗号化される。
【０３９６】
一部の形態では、これらの方法は、多様な類似のまたは異なる配列を含むプールから核酸配列を合成するまたは他の方法で提供するステップを含む。一部の形態では、プールは、公知の配列のデータベースである。例えば、ある特定の形態では、情報の別個の「ブロック」は、サイズが約１００〜１，０００，０００塩基の範囲の核酸配列のプール内に含まれるが、この上限は、理論的には無制限である。一部の形態では、複数の核酸配列のプール内の核酸配列は、１つまたは複数の共通配列を共有する。提供される核酸が配列のプールから選択される場合、選択プロセスは、例えば、ユーザー優先度に基づく選択によって手動で、または自動的に、実施され得る。
【０３９７】
ｂ．メモリ物体のアセンブリ
カプセル化によるメモリ物体のアセンブリ、または配列コードされたバイオポリマーおよびアドレスタグ／バーコードの直接的アセンブリは、ある範囲の異なる構造を有するメモリ物体を生成するために、記載されるマイクロ流体ベースの方法に従って実施され得る。例えば、一部の形態では、メモリ物体は、１つまたは複数の配列コードされたバイオポリマーがその上に結合されるコア粒子を含む。粒子コアへの配列コードされたバイオポリマーの結合は、例えば、共有結合的または非共有結合的連結を触媒するために酵素を使用して、マイクロ流体方法に従って達成され得る。一部の形態では、コア分子は、中間の受容体である分子、例えば、配列コードされたバイオポリマーと関連付けられた１つまたは複数のリガンドによって認識される結合部位に、コートされるまたはカップリングされる。
【０３９８】
一部の形態では、配列コードされたバイオポリマーは、受容体コートされたコア分子にカップリングまたはハイブリダイズされる。一部の形態では、ポリマー／コア下位構造は次いで、コートされたポリマー／コア構造を産生するために、１つまたは複数のカプセル化剤でコートされ（即ち、「分子シェル形成」）、これは次いで、１つまたは複数のアドレス標識またはバーコードにカップリングされる。
【０３９９】
コートされたポリマー／コア粒子へのアドレス標識の結合は、共有結合的もしくは非共有結合的連結、または相補的核酸のハイブリダイゼーションを使用して達成され得る。一部の形態では、メモリ物体のアセンブリは、多孔質の、または他の方法でアクセス可能なポリマーコア分子または構造の内部空間内に、１つまたは複数の配列コードされたバイオポリマーをロードするステップまたはそれを複合体化するステップを含む。一部の形態では、メモリ物体のアセンブリは、１つまたは複数のアドレスタグまたはバーコードと次いで複合体化される、カプセル化されたポリマーロードされた粒子を創出するために、ポリマーロードされたコアをカプセル化するステップまたはシェル形成するステップを含む。
【０４００】
一部の形態では、メモリ物体は、配列コードされたポリマー、ならびに必要に応じて、複数の異なる型のアドレスタグまたはバーコードでコートされるコア分子および／またはカプセル化剤を含む。例えば、一部の形態では、メモリ物体は、多重分子ロジック動作およびデータ選択を可能にするためにアセンブルされる。例えば、一部の形態では、ビットストリームコードデータの複数のピースを含む、１つまたは複数の配列コードされたバイオポリマーのカプセル化または分子シェル形成は、複数のアドレスタグまたはバーコードで標識される。アドレスタグまたはバーコードは、分子コアに直接結合され得、または分子コアによって吸収され得、分子コアは、分子シェルによってさらに取り囲まれ、多重コンピューテーションのためにアドレス指定／特異性タグで官能化される。
【０４０１】
一部の形態では、液滴のマイクロ流体発動される移動のための記載される方法は、以下を含むメモリ物体へと、バイオポリマーを合成する：
（ｉ）１つまたは複数の配列コードされたバイオポリマー；
（ｉｉ）必要に応じて、アドレスタグまたはバーコードでコートされるコア分子またはカプセル化剤；および
（ｉｉｉ）それ自体がシグナルを生成する、または読み出しを生成するために検出および測定され得る別の特性を有する、シェルまたはコア。
【０４０２】
したがって、メモリ粒子の外部「シェル」または内部「コア」は、メモリ物体をアドレス指定または標識するために使用され得る。検出および測定され得る例示的な物理的または化学的特性には、光学的、磁気的、電気的または物理的特性が含まれる。
【０４０３】
したがって、一部の形態では、メモリ物体の外部シェルまたは内部コアは、シェル／コアの光学的、磁気的、電気的または物理的特性に基づいた読み出しを生成する。したがって、一部の形態では、データストリームは、コアの光学的、磁気的、電気的または物理的特性に基づく読み出しを有する分子コア上で直接コードされる。分子コアは、分子ロジックおよびデータ検索動作のためのアドレス／特異性タグもまた含む。一部の形態では、データストリームは、分子コアの周辺の分子シェル上でコードされる。シェル／コアは、シェル／コアの光学的、磁気的、電気的または物理的特性に基づく読み出しを有する。シェルは、分子ロジックおよびデータ検索動作のためにアドレス指定／特異性タグで官能化される。
【０４０４】
記載されるマイクロ流体方法に従って調製された合成されたバイオポリマーメモリ物体は、多くの適用のために適切である。一部の例示的な使用には、メモリストレージ、ナノ電子回路などにおける使用が含まれる。天然または合成材料内にカプセル化されたデータのフォーマットをコードする核酸または他の配列制御されるバイオポリマーを含む配列制御されるバイオポリマーメモリ物体もまた提供される。一部の形態では、任意の無作為の形態の核酸または他のバイオポリマーが、カプセル化され得る。例えば、一部の形態では、直鎖、一本鎖、塩基対合した二本鎖、または足場形成された核酸が、カプセル化される。例示的なカプセル化剤には、タンパク質、脂質、糖類、多糖、核酸、合成ポリマー、ヒドロゲルポリマー、シリカ、常磁性材料および金属、ならびにそれらの任意の誘導体が含まれる。これらのカプセル化された核酸または他のバイオポリマーは、アドレスおよび／または精製タグを付加するために使用される１つまたは複数のオーバーハング核酸配列と関連付けられている。一部の形態では、複数の層のカプセル化およびオーバーハング核酸が、情報のフォーマットのさらなる選別およびタグ化のために設計される。
【０４０５】
一部の形態では、ビットストリームコード核酸配列は、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡまたは原核生物ＤＮＡと同じ配列ではない。例えば、一部の形態では、ビットストリームコード配列全体は、天然に存在する核酸配列に対して２０％未満の配列同一性、例えば、１０％未満の同一性、または５％未満の同一性、または１％未満の同一性、最大で０．００１％の同一性を有する。他の形態では、ビットストリーム配列は、ｃＤＮＡ、遺伝子、タンパク質配列、タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの配列、またはプール中で一緒になって生物学的配列のデータベースを形成する生物学的配列から構成される。
【０４０６】
開示された組成物および方法は、以下のテキストを介してさらに理解され得る。
【０４０７】
一部の形態では、この方法は、液滴の誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）移動を使用した、水性液滴中のヌクレオチド、酵素、緩衝液、塩および水の移動によってプログラムされる、特定の核酸配列の合成のための方法である。一部の形態では、この方法は、成長中の合成されたポリマーを含む小滴中に添加される、次の核酸を含む小滴の移動による、核酸ポリマーのアドレス指定された位置合成の方法である。一部の形態では、マイクロ流体デバイスは、成長中のポリマーへの付加のための、制御された体積でのＥＷＯＤチップ上での液滴中の核酸の添加を可能にするチップ設計である。一部の形態では、マイクロ流体デバイスは、ＥＷＯＤ液滴移動において使用されるチップ上の規定されたアドレス指定された位置への、成長中の核酸ポリマーの安定な固定のためのチップ設計である。一部の形態では、この方法は、チップを横断する多くの異なるアドレス指定された位置における多くの異なる配列の合成を超並列化するために、指示を同時に並行して実施する方法である。
【０４０８】
鋳型の非存在下で所望のサイズおよび配列を有するバイオポリマーを合成するための方法が開示され、この方法は、（ａ）マイクロ流体デバイス上で、コンポーネント始動配列を含む液滴を、コンポーネント構築ブロックおよび結合触媒を集合的に含む１つまたは複数の液滴と合わせて、合わせた液滴を形成するステップ、および（ｂ）ステップ（ａ）を必要に応じて反復して、前記バイオポリマーへのコンポーネント構築ブロックの段階的付加を実施して、予め選択された所望のポリマー配列および長さを有するバイオポリマーを形成するステップを含む。前記合わせるステップの前に、コンポーネント始動配列を含む前記液滴と、前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含む前記液滴の各々とが、前記マイクロ流体デバイス上の異なる位置にある。さらなるコンポーネント構築ブロックを各々が含む１つまたは複数のさらなる液滴が、前記マイクロ流体デバイス上で、前記コンポーネント配列を含む前記液滴、前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含む前記液滴、または前記合わせた液滴とは異なる位置にある。前記合わせるステップは、前記結合触媒が前記コンポーネント始動配列を前記コンポーネント構築ブロックに結合させてバイオポリマーを形成するのに適切な条件を含む。
【０４０９】
一部の形態では、ステップ（ａ）の、前記コンポーネント始動配列を前記コンポーネント構築ブロックと結合させてバイオポリマーを形成するのに適切な前記条件は、前記合わせた液滴を、洗浄試薬、遮断試薬および停止試薬からなる群から選択される１つまたは複数の試薬と接触させることを含む。一部の形態では、前記洗浄試薬、遮断試薬および停止試薬の各々が、前記マイクロ流体デバイス上の独立した液滴として提供される。一部の形態では、ステップ（ａ）の液滴を合わせるステップが、光ファイバーによって提供される電荷を使用して、前記マイクロ流体デバイス上の前記液滴のうち１つまたは複数を移動させることによって達成される。
【０４１０】
一部の形態では、前記所望のポリマー配列を産生するための前記マイクロ流体デバイス上の各液滴の移動のシークエンスは、コンピューター可読プログラムの形態で提供される。一部の形態では、２つまたはそれよりも多くのバイオポリマーは、同じマイクロ流体デバイスの異なる位置において同時にまたは連続的に合成される。一部の形態では、前記２つまたはそれよりも多くのバイオポリマーは、異なる配列、異なるサイズ、または異なる配列および異なるサイズの両方を有する。一部の形態では、前記２つまたはそれよりも多くの合成されたバイオポリマーの各々は、同じマイクロ流体デバイス上の明確に異なる位置において合成および精製される。一部の形態では、前記２つまたはそれよりも多くのバイオポリマーの各々が、独自のアドレスタグを含む。
【０４１１】
一部の形態では、前記コンポーネント始動配列は、安定な支持体マトリックスにカップリングされる。一部の形態では、前記支持体マトリックスはビーズである。一部の形態では、前記ビーズは磁性ビーズである。
【０４１２】
一部の形態では、前記液滴は、１フェムトリットル（ｆｌ）と１００マイクロリットル（μｌ）との間、好ましくは１ピコリットル（ｐｌ）と１ナノリットル（ｎｌ）との間の体積を有する水性液滴である。一部の形態では、前記マイクロ流体デバイス上での前記液滴の創出、移動および合わせることは、コンピュータープログラムによって制御される。
【０４１３】
一部の形態では、方法は、（ｃ）前記マイクロ流体デバイス上で前記合成されたバイオポリマーを、操作、精製または単離するステップをさらに含む。一部の形態では、ステップ（ｃ）の、前記合成されたバイオポリマーを操作するステップは、前記バイオポリマーにおいて１つまたは複数の構造的または機能的変化を誘導することを含む。一部の形態では、ステップ（ｃ）の、前記合成されたバイオポリマーを単離するステップは、複雑度を低減するステップを含む。一部の形態では、前記複雑度を低減するステップは、質量、サイズ、電気化学的電荷、疎水性、ｐＨ、融解温度、コンフォメーション、および１つまたは複数のリガンドに対する親和性からなる群から選択される１つまたは複数の特性に基づいて、前記合成されたバイオポリマーを単離するステップを含む。一部の形態では、ステップ（ｃ）の、前記合成されたバイオポリマーを操作するステップが、色素、蛍光分子、放射能標識、親和性タグおよびバーコードからなる群から選択される１つまたは複数の標識を、前記バイオポリマー中に取り込むことを含む。
【０４１４】
一部の形態では、方法は、ステップ（ａ）の前に、前記コンポーネント始動配列、前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含むレザバから前記液滴を分割することによって、１つまたは複数の、前記コンポーネント始動配列を含む前記液滴ならびに前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含む前記液滴を形成することをさらに含む。
【０４１５】
一部の形態では、方法は、ステップ（ａ）の前に、さらなるコンポーネント構築ブロックを集合的に含むレザバから、さらなる液滴を分割することによって、１つまたは複数の前記さらなる液滴を形成するステップをさらに含む。
【０４１６】
一部の形態では、前記バイオポリマーは核酸である。一部の形態では、前記核酸は、１００塩基長と１００，０００塩基長との間、２００塩基長と１０，０００塩基長との間、５００塩基長と５，０００塩基長との間、または１，０００塩基長と３，０００塩基長との間の長さを有する。一部の形態では、前記コンポーネント構築ブロックのうち１つまたは複数は、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、ウリジン、イノシン、ウリジン、キサントシンおよびプソイドウリジンからなる群から選択される。一部の形態では、前記核酸は一本鎖ＤＮＡである。
【０４１７】
一部の形態では、前記結合触媒は、ＴｄＴ、Ｑベータレプリカーゼおよびテロメラーゼからなる群から選択されるポリメラーゼ酵素である。
【０４１８】
一部の形態では、ステップ（ｃ）は、前記合成された核酸を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応を含む。
【０４１９】
一部の形態では、方法は、前記合成された核酸を配列決定するステップをさらに含む。
【０４２０】
一部の形態では、１つまたは複数の液滴は、制限エンドヌクレアーゼ、および前記制限エンドヌクレアーゼの効率的な機能のための１つまたは複数の適切な緩衝液を含む。
【０４２１】
核酸配列の自動化された操作のための方法であって、マイクロ流体デバイス上で、前記核酸配列および１つまたは複数のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ酵素を合わせるステップを含み、前記合わせるステップが、前記１つまたは複数のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ酵素が前記核酸配列から１つまたは複数のヌクレオチドを除去または分解して分解された核酸を産生する条件を含む、方法もまた開示される。
【０４２２】
一部の形態では、前記核酸は、固体支持体または表面上に固定化される。一部の形態では、方法は、前記分解された核酸を精製するステップをさらに含む。一部の形態では、前記分解された核酸を精製するステップは、前記マイクロ流体デバイス上の前記分解された核酸を洗浄して、前記１つまたは複数のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ酵素を除去するステップを含む。
【０４２３】
一部の形態では、方法は、前記マイクロ流体デバイス上で前記分解された核酸に１つまたは複数のヌクレオチドを付加して、改変された核酸を形成するステップをさらに含む。一部の形態では、前記分解された核酸に１つまたは複数のヌクレオチドを付加するステップは、（ａ）前記マイクロ流体デバイス上で、前記分解された核酸を含む液滴を、コンポーネント構築ブロックおよび結合触媒を集合的に含む１つまたは複数の液滴と合わせて、合わせた液滴を形成するステップ、ならびに（ｂ）ステップ（ａ）を、必要に応じて１または複数回反復するステップを含む。前記合わせるステップの前に、前記分解された核酸を含む前記液滴、ならびに前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含む前記液滴の各々が、前記マイクロ流体デバイス上の異なる位置にある。前記合わせるステップは、前記結合触媒が前記分解された核酸を前記コンポーネント構築ブロックに結合させて改変された核酸を形成するのに適切な条件を含む。
【０４２４】
一部の形態では、前記核酸は、ビットストリームデータをコードする。一部の形態では、前記操作は、バーコードである前記核酸中の領域において実施される。一部の形態では、前記マイクロ流体デバイスは、誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）デバイスである。一部の形態では、前記核酸はバーコードである。
【０４２５】
一部の形態では、前記バーコードは、核酸メモリ物体に結合されている。一部の形態では、前記バーコードは、コンセプトまたはメタデータと関連付けられた前記バーコードの正確な配列ではなく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個の変異、または２５個よりも多い変異だけ、前記バーコードから変異されている。
【０４２６】
一部の形態では、前記変異されたバーコードは、前記核酸メモリ物体内に含まれるメタデータと関連付けられたバーコードハッシュテーブル中に保持される最も近いバーコードのメタデータまたはコンセプトと関連付けられる。一部の形態では、前記変異されたバーコードは、バーコードハッシュテーブル中に保持される最も近いバーコードのメタデータまたはコンセプトのバリエーションと関連付けられる。一部の形態では、前記バーコードは、前記核酸メモリ物体中に含まれる前記核酸配列の生物学的情報を記述するメタデータと関連付けられる。一部の形態では、前記核酸配列は、核酸メモリ物体内にカプセル化され、ここで、前記核酸メモリ物体は、遺伝子をコードし、前記バーコード配列は、遺伝子名、前記遺伝子の変異、供給源生物、遺伝子長さ、前記遺伝子によってコードされるタンパク質、および前記コードされたタンパク質の１つまたは複数のリガンドからなる群から選択される１つまたは複数の特色を記述する。
【０４２７】
一部の形態では、前記バーコードは、前記核酸メモリ物体中に含まれるＤＮＡ配列中に含まれるデジタル情報を記述するメタデータと関連付けられる。一部の形態では、前記核酸配列は、１つまたは複数の画像についての情報をコードし、前記メタデータバーコードが、前記画像中の任意の所与の特徴の量を含み、前記バーコードの１つまたは複数の点変異が、変動する量のその特徴と関連付けられる。一部の形態では、前記画像の前記特徴は、１つまたは複数の色の強度である。一部の形態では、前記ＤＮＡ配列は、１つまたは複数の画像のデジタル表示をコードし、前記メタデータバーコードが、前記１つまたは複数の画像中の物体の記述を含み、請求項４２に記載の前記バーコードの前記変異が、前記物体との類似性と関連付けられる、請求項４６に記載の方法。
【０４２８】
開示された組成物および方法は、以下の番号付きの段落を通じてさらに理解され得る。
【０４２９】
１．鋳型の非存在下で所望のサイズおよび配列を有するバイオポリマーを合成するための方法であって、
（ａ）マイクロ流体デバイス上で、コンポーネント始動配列を含む液滴を、コンポーネント構築ブロックおよび結合触媒を集合的に含む１つまたは複数の液滴と合わせて、合わせた液滴を形成するステップであって、
前記合わせるステップの前に、コンポーネント始動配列を含む前記液滴と、前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含む前記液滴の各々とが、前記マイクロ流体デバイス上の異なる位置にあり、
さらなるコンポーネント構築ブロックを各々が含む１つまたは複数のさらなる液滴が、前記マイクロ流体デバイス上で、前記コンポーネント配列を含む前記液滴、前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含む前記液滴、または前記合わせた液滴とは異なる位置にあり、
前記合わせるステップが、前記結合触媒が前記コンポーネント始動配列を前記コンポーネント構築ブロックに結合させてバイオポリマーを形成するのに適切な条件を含む、ステップ；ならびに
（ｂ）ステップ（ａ）を必要に応じて反復して、前記バイオポリマーへのコンポーネント構築ブロックの段階的付加を実施して、予め選択された所望のポリマー配列および長さを有するバイオポリマーを形成するステップ
を含む、方法。
【０４３０】
２．ステップ（ａ）の、前記コンポーネント始動配列を前記コンポーネント構築ブロックと結合させてバイオポリマーを形成するのに適切な前記条件が、前記合わせた液滴を、洗浄試薬、遮断試薬および停止試薬からなる群から選択される１つまたは複数の試薬と接触させることを含む、段落１に記載の方法。
【０４３１】
３．前記洗浄試薬、遮断試薬および停止試薬の各々が、前記マイクロ流体デバイス上の独立した液滴として提供される、段落２に記載の方法。
【０４３２】
４．ステップ（ａ）の液滴を合わせるステップが、光ファイバーによって提供される電荷を使用して、前記マイクロ流体デバイス上の前記液滴のうち１つまたは複数を移動させることによって達成される、段落１に記載の方法。
【０４３３】
５．前記所望のポリマー配列を産生するための前記マイクロ流体デバイス上の各液滴の移動のシークエンスが、コンピューター可読プログラムの形態で提供される、段落１から４のいずれか一項に記載の方法。
【０４３４】
６．２つまたはそれよりも多くのバイオポリマーが、同じマイクロ流体デバイスの異なる位置において同時にまたは連続的に合成される、段落１に記載の方法。
【０４３５】
７．前記２つまたはそれよりも多くのバイオポリマーが、異なる配列、異なるサイズ、または異なる配列および異なるサイズの両方を有する、段落６に記載の方法。
【０４３６】
８．前記２つまたはそれよりも多くの合成されたバイオポリマーの各々が、同じマイクロ流体デバイス上の明確に異なる位置において合成および精製される、段落７に記載の方法。
【０４３７】
９．前記２つまたはそれよりも多くのバイオポリマーの各々が、独自のアドレスタグを含む、段落８に記載の方法。
【０４３８】
１０．前記コンポーネント始動配列が、安定な支持体マトリックスにカップリングされる、段落１から９のいずれか一項に記載の方法。
【０４３９】
１１．前記支持体マトリックスがビーズである、段落１０に記載の方法。
【０４４０】
１２．前記ビーズが磁性ビーズである、段落１１に記載の方法。
【０４４１】
１３．前記液滴が、１フェムトリットル（ｆｌ）と１００マイクロリットル（μｌ）との間、好ましくは１ピコリットル（ｐｌ）と１ナノリットル（ｎｌ）との間の体積を有する水性液滴である、段落１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【０４４２】
１４．前記マイクロ流体デバイス上での前記液滴の創出、移動および合わせることが、コンピュータープログラムによって制御される、段落１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【０４４３】
１５．（ｃ）前記マイクロ流体デバイス上で前記合成されたバイオポリマーを、操作、精製または単離するステップ
をさらに含む、段落１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【０４４４】
１６．ステップ（ｃ）の、前記合成されたバイオポリマーを操作するステップが、前記バイオポリマーにおいて１つまたは複数の構造的または機能的変化を誘導することを含む、段落１５に記載の方法。
【０４４５】
１７．ステップ（ｃ）の、前記合成されたバイオポリマーを単離するステップが、複雑度を低減するステップを含む、段落１６に記載の方法。
【０４４６】
１８．前記複雑度を低減するステップが、質量、サイズ、電気化学的電荷、疎水性、ｐＨ、融解温度、コンフォメーション、および１つまたは複数のリガンドに対する親和性からなる群から選択される１つまたは複数の特性に基づいて、前記合成されたバイオポリマーを単離するステップを含む、段落１７に記載の方法。
【０４４７】
１９．ステップ（ｃ）の、前記合成されたバイオポリマーを操作するステップが、色素、蛍光分子、放射能標識、親和性タグおよびバーコードからなる群から選択される１つまたは複数の標識を、前記バイオポリマー中に取り込むことを含む、段落１６に記載の方法。
【０４４８】
２０．ステップ（ａ）の前に、前記コンポーネント始動配列、前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含むレザバから前記液滴を分割することによって、１つまたは複数の、前記コンポーネント始動配列を含む前記液滴ならびに前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含む前記液滴を形成することをさらに含む、段落１から１９のいずれか一項に記載の方法。
【０４４９】
２１．ステップ（ａ）の前に、さらなるコンポーネント構築ブロックを集合的に含むレザバから、さらなる液滴を分割することによって、１つまたは複数の前記さらなる液滴を形成するステップをさらに含む、段落２０に記載の方法。
【０４５０】
２２．前記バイオポリマーが核酸である、段落１から２１のいずれか一項に記載の方法。
【０４５１】
２３．前記核酸が、１００塩基長と１００，０００塩基長との間、２００塩基長と１０，０００塩基長との間、５００塩基長と５，０００塩基長との間、または１，０００塩基長と３，０００塩基長との間の長さを有する、段落２２に記載の方法。
【０４５２】
２４．前記コンポーネント構築ブロックのうち１つまたは複数が、アデノシン、シチジン、グアノシン、チミジン、ウリジン、イノシン、ウリジン、キサントシンおよびプソイドウリジンからなる群から選択される、段落２２または２３に記載の方法。
【０４５３】
２５．前記核酸が一本鎖ＤＮＡである、段落２３に記載の方法。
【０４５４】
２６．前記結合触媒が、ＴｄＴ、Ｑベータレプリカーゼおよびテロメラーゼからなる群から選択されるポリメラーゼ酵素である、段落２２から２５のいずれか一項に記載の方法。
【０４５５】
２７．ステップ（ｃ）が、前記合成された核酸を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応を含む、段落２２から２６のいずれか一項に記載の方法。
【０４５６】
２８．前記合成された核酸を配列決定するステップをさらに含む、段落２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【０４５７】
２９．１つまたは複数の液滴が、制限エンドヌクレアーゼ、および前記制限エンドヌクレアーゼの効率的な機能のための１つまたは複数の適切な緩衝液を含む、段落２２から２７のいずれか一項に記載の方法。
【０４５８】
３０．核酸配列の自動化された操作のための方法であって、マイクロ流体デバイス上で、前記核酸配列および１つまたは複数のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ酵素を合わせるステップを含み、
前記合わせるステップが、前記１つまたは複数のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ酵素が前記核酸配列から１つまたは複数のヌクレオチドを除去または分解して分解された核酸を産生する条件を含む、方法。
【０４５９】
３１．前記核酸が、固体支持体または表面上に固定化される、段落３０に記載の方法。
【０４６０】
３２．前記分解された核酸を精製するステップをさらに含む、段落３０または３１に記載の方法。
【０４６１】
３３．前記分解された核酸を精製するステップが、前記マイクロ流体デバイス上の前記分解された核酸を洗浄して、前記１つまたは複数のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼ酵素を除去するステップを含む、段落３２に記載の方法。
【０４６２】
３４．前記マイクロ流体デバイス上で前記分解された核酸に１つまたは複数のヌクレオチドを付加して、改変された核酸を形成するステップをさらに含む、段落３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【０４６３】
３５．前記分解された核酸に１つまたは複数のヌクレオチドを付加するステップが、
（ａ）前記マイクロ流体デバイス上で、前記分解された核酸を含む液滴を、コンポーネント構築ブロックおよび結合触媒を集合的に含む１つまたは複数の液滴と合わせて、合わせた液滴を形成するステップであって、
ここで、前記合わせるステップの前に、前記分解された核酸を含む前記液滴、ならびに前記コンポーネント構築ブロックおよび前記結合触媒を集合的に含む前記液滴の各々が、前記マイクロ流体デバイス上の異なる位置にあり、
前記合わせるステップが、前記結合触媒が前記分解された核酸を前記コンポーネント構築ブロックに結合させて改変された核酸を形成するのに適切な条件を含む、ステップ；ならびに
（ｂ）ステップ（ａ）を、必要に応じて１または複数回反復するステップ
を含む、段落３４に記載の方法。
【０４６４】
３６．前記核酸が、ビットストリームデータをコードする、段落３０から３５のいずれか一項に記載の方法。
【０４６５】
３７．前記操作が、バーコードである前記核酸中の領域において実施される、段落３０から３６のいずれか一項に記載の方法。
【０４６６】
３８．前記マイクロ流体デバイスが、誘電体エレクトロウェッティング（ＥＷＯＤ）デバイスである、段落１から３７のいずれか一項に記載の方法。
【０４６７】
３９．前記核酸がバーコードである、段落２２または２３のいずれか一項に記載の方法。
【０４６８】
４０．前記バーコードが、核酸メモリ物体に結合されている、段落３９に記載の方法。
【０４６９】
４１．前記バーコードが、コンセプトまたはメタデータと関連付けられた前記バーコードの正確な配列ではなく、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５個の変異、または２５個よりも多い変異だけ、前記バーコードから変異されている、段落３９または４０のいずれか一項に記載の方法。
【０４７０】
４２．前記変異されたバーコードが、前記核酸メモリ物体内に含まれるメタデータと関連付けられたバーコードハッシュテーブル中に保持される最も近いバーコードのメタデータまたはコンセプトと関連付けられる、段落４１に記載の方法。
【０４７１】
４３．前記変異されたバーコードが、バーコードハッシュテーブル中に保持される最も近いバーコードのメタデータまたはコンセプトのバリエーションと関連付けられる、段落４１に記載の方法。
【０４７２】
４４．前記バーコードが、前記核酸メモリ物体中に含まれる前記核酸配列の生物学的情報を記述するメタデータと関連付けられる、段落３９から４３のいずれか一項に記載の方法。
【０４７３】
４５．前記核酸配列が、核酸メモリ物体内にカプセル化され、ここで、前記核酸メモリ物体は、遺伝子をコードし、前記バーコード配列は、遺伝子名、前記遺伝子の変異、供給源生物、遺伝子長さ、前記遺伝子によってコードされるタンパク質、および前記コードされたタンパク質の１つまたは複数のリガンドからなる群から選択される１つまたは複数の特色を記述する、段落４４に記載の方法。
【０４７４】
４６．前記バーコードが、前記核酸メモリ物体中に含まれるＤＮＡ配列中に含まれるデジタル情報を記述するメタデータと関連付けられる、段落３９から４３のいずれか一項に記載の方法。
【０４７５】
４７．前記核酸配列が、１つまたは複数の画像についての情報をコードし、前記メタデータバーコードが、前記画像中の任意の所与の特徴の量を含み、前記バーコードの１つまたは複数の点変異が、変動する量のその特徴と関連付けられる、段落４６に記載の方法。
【０４７６】
４８．前記画像の前記特徴が、１つまたは複数の色の強度である、段落４７に記載の方法。
【０４７７】
４９．前記ＤＮＡ配列が、１つまたは複数の画像のデジタル表示をコードし、前記メタデータバーコードが、前記１つまたは複数の画像中の物体の記述を含み、段落４２に記載の前記バーコードの前記変異が、前記物体との類似性と関連付けられる、段落４６に記載の方法。
【０４７８】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照して、さらに理解される。
【実施例】
【０４７９】
（実施例１）
溶液中の核酸の、Ｅｃｈｏベースの合成
デスティネーション９６ウェルプレートに、試薬および１μＭの始動因子配列（ＧＴＣＧＴＣＧＴＣＣＣＣＴＣＡＡＡＣＴ）（配列番号２２）を補充した１×ｔｄｔ緩衝液中の、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓの１０μＭ  ｔｄｔポリメラーゼを含む３×１６のウェルをロードした。１６の数を、単精度ＩＥＥＥ７５４バイナリコード（パイ、ｅ、重力定数、アボガドロ数、プランク定数、ＳＩ電子ボルト、電子質量、陽子質量、黄金比、真空の誘電率、２の平方根、微細構造定数、水素周波数（ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）、ボルツマン定数、１，０００，０００番目の素数、および試験配列）を使用することによって、ヌクレオチド配列への変換のために選択した。次いで、Ａ＞Ｔ、Ｔ＞ＣおよびＣ＞Ａホモポリマーストレッチが１とコードされ、Ａ＞Ｃ、Ｔ＞ＡおよびＣ＞Ｔホモポリマーストレッチが０とコードされるように、バイナリ表示を、ハフマン符号スキームによってヌクレオチド配列に変換して、データがヌクレオチドスイッチ中にコードされるのを可能にした。
【０４８０】
次いで、配列を、Ｅｃｈｏ  ５５５（ＬａｂＣｙｔｅ）の供給源プレート中にロードされるヌクレオチドを有するチェリーピックリストに変換し、数をコードする配列を含むウェルに三連で分配した。ウェルへの各分配の後、デスティネーションプレートを取り出し、高い湿度中で１５分間にわたり、３７℃のインキュベータ中に置いた。４回のホモポリマー伸長の後毎に、試料を取り出し、ＳｙｂｒＧｏｌｄ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で染色した１０％ポリアクリルアミドゲル上でのゲル分析のために採取した。配列を、最終ヌクレオチドとしてのｄＡＴＰの付加によって、ポリ（Ａ）テーリングした。第二鎖を、ポリ（Ｔ）オリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲで４サイクル目までに完了させ、サイズ精製して、およそ５００ヌクレオチド長の生成物を富化した。
【０４８１】
生成物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ  ５００×２配列決定のために調製し、配列をコンパイルして、コードされた数を読み出した。
【０４８２】
（実施例２）
近隣分子ハッシュバーコードを開発する
２つのオリゴヌクレオチドプライマーを、２４０，０００個の公知の直交性プライマーのリストから選択した（Ｘｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  １０６  （７）  ２２８９−２２９４  （２００９））。既知の場合にΔＨおよびΔＳによって計算を行って、変異が結合エネルギーをおよそ２０ｋＪ／ｍｏｌまたはおよそ５℃上昇させると予測されるように、偽ランダム変異を、プライマーの各々について生成した。
【０４８３】
低すぎたまたは十分でなかった偽ランダム変異は、除去した。プライマーとそれらの正確な相補体との間の結合エネルギーと比較して２０ｋＪ／ｍｏｌ不安定化された隣接するプライマー間の結合エネルギーを有する１１個のプライマーの順序付きリストまでリストが削減されるまで、同じ結合エネルギー拘束を有する残ったプライマーを再度変異させた。バーコード−相補体対間のこれらの結合エネルギーを、全ての可能な適格なプライマーのリスト中の互いからの距離に比例する量だけ不安定化させると選択した。２つの元のプライマーの各々が、１０個のプライマー変異体＋元のプライマーの順序付きリストを生成した。これらのプライマー近隣を、ＤＮＡ配列中にコードされる画像の記述のために、２つの無作為のメタデータターム（「赤色」および「青色」）と関連付けた。指示された結合親和性関係を、融解温度アッセイで実験的に立証した。３８４ウェルプレートを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．１、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ならびに「赤色」プライマーと「赤色」および「青色」相補体との間の各可能なプライマー−相補体対のオリゴ１つ当たり２μＭを用いて生成した。１×ＳｙｂｒＧｒｅｅｎを添加し、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ６を使用して、温度傾斜（９５℃から２５℃へのアニーリングおよび２５℃から９５℃への融解、ならびに反復）の間の画像化によって、融解温度をアッセイした。
【０４８４】
融解温度を、融解曲線の屈曲点に基づいて計算し、これらのデータを、ヒートマップとしてプロットした。完全な捕捉は、高い融解温度として示されたが、不完全な捕捉は、低い融解温度として観察された。融解の各温度を、マトリックス中のバーコード対と関連付け、ヒートマップを生成した。
【０４８５】
ヒートマップは、赤色様対赤色様相補鎖の対角線に沿った高い融解温度、および両方の軸に沿った各連続変異と共に低下する融解温度といった、予測された結果を示したが、赤色バーコードと青色バーコードとの間には、特異的結合は示されなかった。比較のために、コンピューターによるヒートマップを、実験結果との高い相関を示すＳａｎｔａ−Ｌｕｃｉａ熱力学値を使用することによって生成した。
【０４８６】
定量ＰＣＲ融解実験を検証するために、同じ温度範囲にわたって２６０ｎｍでの吸収をモニタリングするＵＶ／Ｖｉｓを使用して、融解温度を決定した。これを、他の「赤色」様相補鎖に対して中央の鎖（５０％「赤色」様バーコード）に適用した。融解実験の結果は、定量ＰＣＲ融解プログラムからの値と優れた一致を示した。したがって、プログラムされたノイズの多いクロストークを有する直交性バーコード付加について、制御された配列の「近隣」を予測することが可能であった。
【０４８７】
（実施例３）
蛍光ベイト配列によるバーコード選択
「ネコ」、「野生」および「オレンジ」をコードする、外部表において関連付けた２４０，０００個の直交性バーコード（Ｘｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，  １０６  （７）  ２２８９−２２９４  （２００９））のリストから選択した３つのバーコードに対して相補的な配列を有する蛍光バーコードを、ＩＤＴから購入した。飼いネコの３つの画像（１匹は黒色および白色、１匹は茶色、１匹はオレンジ色）、ならびにトラおよびライオン、ならびに２匹の飼いイヌ（１匹はレトリーバー、１匹はグレーハウンド）およびオオカミを、２７×２７の黒色および白色の画像としてコードし、ビットマップ画像の圧縮（ランレングス圧縮）および暗号化後に、ＤＮＡコードに変換した。
【０４８８】
ＤＮＡ配列を、プラスミド形態中に置き、国際公開番号ＷＯ２０１７／１８９９１４の方法を用いて、上記のようにシリカ中にカプセル化した。
【０４８９】
およそ１，０００個の冗長バーコードオーバーハングが、画像をコードするブロックの各々上に存在するように、プラスミドに、メタデータタグを用いてバーコード付加した。
【０４９０】
１０×モル濃度過剰の蛍光鎖を、バーコード付加された材料に添加し、予測された融解温度でアニーリングさせた。未結合の画分を、複数の洗浄ステップにおいて３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ８．１および１５０ｍＭ  ＮａＣｌを使用して洗浄した。
【０４９１】
バーコード付加された画像は、蛍光顕微鏡および蛍光選別によって試験され得、プラスミドおよびまたデジタル情報の生化学的バーコード付加を使用する迅速な選別を可能にする。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月20日(2020.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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