(57)【要約】本開示は、改変カプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンであって、野生型ＡＡＶと比較して、より高い硝子体内液と網膜細胞との間のバリアを横断する能力を示し、そのためより高い網膜細胞の感染力を示し、また、異種核酸を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。本開示は、個体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法を提供する。
2020528734.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、
ａ）式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つの異種ペプチドの挿入を含み、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、前記網膜細胞の感染力の増大を付与する、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質と、
ｂ）異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸と
を含む、ｒＡＡＶビリオン。
【請求項２】
前記対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項３】
前記対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも１０倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項４】
前記異種ペプチドの挿入が、前記親ＡＡＶカプシドタンパク質の隣接したひと続きの５アミノ酸〜２０アミノ酸を置き換える、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項５】
挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０及びアミノ酸６１１に対応するアミノ酸の間であるか、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、請求項１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項６】
挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７及びアミノ酸５８８に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、または、挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８５及びアミノ酸５９８に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、請求項４に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項７】
前記異種遺伝子産物は、干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項８】
前記異種遺伝子産物は、ポリペプチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項９】
前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、請求項８に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１０】
前記ポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドから選択されるＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、請求項８に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１１】
前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、酵素的に不活性なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドである、請求項１０に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１２】
前記異種遺伝子産物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡである、請求項１０に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１３】
前記異種ペプチドは、式Ｉ：ＬＡ（Ｌ／Ｎ）（Ｉ／Ｑ）（Ｑ／Ｅ）（Ｄ／Ｈ）（Ｓ／Ｖ）（Ｍ／Ｋ）（Ｒ／Ｎ）Ａ（配列番号１３６）のペプチドである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１４】
前記異種ペプチドは、（２１）ＬＡＬＩＱＤＳＭＲＡ（配列番号３５）または（２２）ＬＡＮＱＥＨＶＫＮＡ（配列番号２）を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１５】
前記異種ペプチドは、式ＩＩ：ＴＸ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7 Ｘ8 ＧＬＸ9 （配列番号１３７）のペプチドであって、
式中、Ｘ1 が、Ｇ、Ｖ、またはＳであり、Ｘ2 が、Ｖ、Ｅ、Ｐ、Ｇ、Ｄ、Ｍ、Ａ、またはＳであり、Ｘ3 が、Ｍ、Ｖ、Ｙ、Ｈ、Ｇ、Ｓ、またはＤであり、Ｘ4 が、Ｒ、Ｄ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、またはＭであり、Ｘ5 が、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、またはＡであり、Ｘ6 が、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｄ、Ｑ、またはＨであり、Ｘ7 が、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｇ、またはＡであり、Ｘ8 が、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ａ、Ｉ、Ｐ、またはＴであり、Ｘ9 が、ＳまたはＮである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１６】
前記異種ペプチドは、（１）ＴＧＶＭＲＳＴＮＳＧＬＮ（配列番号６）、（２）ＴＧＥＶＤＬＡＧＧＧＬＳ（配列番号７）、（３）ＴＳＰＹＳＧＳＳＤＧＬＳ（配列番号８）、（４）ＴＧＧＨＤＳＳＬＤＧＬＳ（配列番号９）、（５）ＴＧＤＧＧＴＴＭＮＧＬＳ（配列番号９８）、（６）ＴＧＧＨＧＳＡＰＤＧＬＳ（配列番号９９）、（７）ＴＧＭＨＶＴＭＭＡＧＬＮ（配列番号１００）、（８）ＴＧＡＳＹＬＤＮＳＧＬＳ（配列番号１０１）、（９）ＴＶＶＳＴＱＡＧＩＧＬＳ（配列番号２０）、（１０）ＴＧＶＭＨＳＱＡＳＧＬＳ（配列番号２１）、（１１）ＴＧＤＧＳＰＡＡＰＧＬＳ（配列番号２２）、または（１２）ＴＧＳＤＭＡＨＧＴＧＬＳ（配列番号２３）を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１７】
前記異種ペプチドは、式ＩＩＩ：ＴＧＸ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7 ＧＬＳ（配列番号１３８）のペプチドであって、
式中、Ｘ1 が、Ｖ、Ｅ、Ｐ、Ｇ、Ｄ、Ｍ、Ａ、またはＳであり、Ｘ2 が、Ｍ、Ｖ、Ｙ、Ｈ、Ｇ、Ｓ、またはＤであり、Ｘ3 が、Ｒ、Ｄ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、またはＭであり、Ｘ4 が、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、またはＡであり、Ｘ5 が、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｄ、Ｑ、またはＨであり、Ｘ6 が、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｇ、またはＡであり、Ｘ7 が、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ａ、Ｉ、Ｐ、またはＴである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１８】
前記異種ペプチドは、（２）ＴＧＥＶＤＬＡＧＧＧＬＳ（配列番号７）、（４）ＴＧＧＨＤＳＳＬＤＧＬＳ（配列番号９）、（５）ＴＧＤＧＧＴＴＭＮＧＬＳ（配列番号９８）、（６）ＴＧＧＨＧＳＡＰＤＧＬＳ（配列番号９９）、（８）ＴＧＡＳＹＬＤＮＳＧＬＳ（配列番号１０１）、（１０）ＴＧＶＭＨＳＱＡＳＧＬＳ（配列番号２１）、（１１）ＴＧＤＧＳＰＡＡＰＧＬＳ（配列番号２２）、または（１２）ＴＧＳＤＭＡＨＧＴＧＬＳ（配列番号２３）を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項１９】
前記異種ペプチドは、式ＩＶ：Ｘ1 ＧＸ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7 Ｘ8 ＧＬＳＰＸ9 ＴＸ10Ｘ11（配列番号１３９）のペプチドであって、
式中、Ｘ1 が、ＴまたはＮであり、Ｘ2 が、Ｌ、Ｓ、Ａ、またはＧであり、Ｘ3 が、ＤまたはＶであり、Ｘ4 が、Ａ、Ｇ、またはＰであり、Ｘ5 が、ＴまたはＤであり、Ｘ6 が、ＲまたはＹであり、Ｘ7 が、Ｄ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ8 が、Ｈ、Ｒ、またはＴであり、Ｘ9 が、ＶまたはＡであり、Ｘ10が、ＧまたはＷであり、Ｘ11が、ＴまたはＡである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項２０】
前記異種ペプチドは、（１３）ＴＧＬＤＡＴＲＤＨＧＬＳＰＶＴＧＴ（配列番号２４）、（１４）ＴＧＳＤＧＴＲＤＨＧＬＳＰＶＴＷＴ（配列番号２５）、（１５）ＮＧＡＶＡＤＹＴＲＧＬＳＰＡＴＧＴ（配列番号２６）、または（１６）ＴＧＧＤＰＴＲＧＴＧＬＳＰＶＴＧＡ（配列番号２７）を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項２１】
前記異種ペプチドは、式Ｖ：ＴＧＸ1 ＤＸ2 ＴＲＸ3 Ｘ4 ＧＬＳＰＶＴＧＴ（配列番号１４０）のペプチドであって、
式中、Ｘ1 が、Ｌ、Ｓ、Ａ、またはＧであり、Ｘ2 が、Ａ、Ｇ、またはＰであり、Ｘ8 が、Ｄ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ4 が、Ｈ、Ｒ、またはＴである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項２２】
前記異種ペプチドは、式ＶＩ：ＬＱＸ1 Ｘ2 Ｘ3 ＲＸ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7 Ｘ8 Ｘ9 ＶＮＸ10Ｑ（配列番号１４１）のペプチドであって、
式中、Ｘ1 が、ＫまたはＲであり、Ｘ2 が、Ｎ、Ｇ、またはＡであり、Ｘ3 が、Ａ、Ｖ、Ｎ、またはＤであり、Ｘ4 が、Ｐ、Ｉ、またはＱであり、Ｘ5 が、Ａ、Ｐ、またはＶであり、Ｘ6 が、Ｓ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ7 が、ＴまたはＶであり、Ｘ8 が、Ｅ、Ｌ、Ａ、またはＶであり、Ｘ9 が、Ｓ、Ｅ、Ｄ、またはＶであり、Ｘ10が、Ｆ、Ｇ、Ｔ、またはＣである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項２３】
前記異種ペプチドは、（１７）ＬＱＫＮＡＲＰＡＳＴＥＳＶＮＦＱ（配列番号２８）、（１８）ＬＱＲＧＶＲＩＰＳＶＬＥＶＮＧＱ（配列番号２９）、（１９）ＬＱＲＧＮＲＰＶＴＴＡＤＶＮＴＱ（配列番号３０）、または（２０）ＬＱＫＡＤＲＱＰＧＶＶＶＶＮＣＱ（配列番号３１）を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項２４】
ａ）請求項１〜２３のいずれか１項に記載の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンと、
ｂ）薬学的に許容される賦形剤と
を含む、薬学的組成物。
【請求項２５】
個体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法であって、
前記個体に、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンまたは請求項２４に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２６】
前記遺伝子産物は、ポリペプチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記遺伝子産物は、短鎖干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドは、神経保護因子、抗血管新生ポリペプチド、抗アポトーシス因子、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリペプチドは、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞成長因子２、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、上皮成長因子、ロドプシン、Ｘ連鎖アポトーシス阻害物質、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ相互作用タンパク質１、ペリフェリン、ペリフェリン−２、ロドプシン、ＲｄＣＶＦ、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御物質（ＲＰＧＲ）、またはソニックヘッジホッグである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ポリペプチドは、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
眼疾患を処置する方法であって、
処置を必要とする個体に対して、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンまたは請求項２４に記載の薬学的組成物を有効量で投与することを含む、方法。
【請求項３２】
投与は、眼内注射によるものである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
投与は、硝子体内注射または脈絡膜上注射によるものである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記眼疾患は、緑内障、網膜色素変性、黄斑変性、網膜分離、レーバー先天黒内障、糖尿病性網膜症、１色覚、または色覚異常である、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、
前記バリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で、カプシドタンパク質ＧＨループ内の約５アミノ酸〜約２０アミノ酸の挿入を含み、バリアントカプシドタンパク質が、ＡＡＶビリオン内に存在するときに、網膜細胞のＡＡＶビリオンの感染力の増大をもたらし、アミノ酸の挿入が、ネイティブＡＡＶカプシドのＧＨループ内であり、この挿入は、式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つのペプチドである、核酸。
【請求項３６】
挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７とアミノ酸５８８との間、ＡＡＶ２のアミノ酸５８５とアミノ酸５９８との間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１との間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５とアミノ酸５７６との間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１との間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９とアミノ酸５９０との間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１との間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９との間、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９との間である、請求項３５に記載の核酸。
【請求項３７】
請求項３５または３６に記載の核酸を含む、単離された遺伝子修飾宿主細胞。
【請求項３８】
約５アミノ酸〜約２０アミノ酸の挿入を含むバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、
アミノ酸の挿入が、ネイティブＡＡＶカプシドのＧＨループ内であり、この挿入は、式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つのペプチドである、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質。
【請求項３９】
ａ）式ＶＩの異種ペプチドの挿入を含み、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、前記網膜細胞の感染力の増大を付与する、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質と、
ｂ）異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸と
を含む、ｒＡＡＶビリオン。
【請求項４０】
前記対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、請求項３９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項４１】
前記対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも１０倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、請求項３９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項４２】
前記異種ペプチドの挿入が、前記親ＡＡＶカプシドタンパク質の隣接したひと続きの５アミノ酸〜２０アミノ酸を置き換える、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項４３】
挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０及びアミノ酸６１１に対応するアミノ酸の間であるか、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、請求項３９〜４２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項４４】
挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７及びアミノ酸５８８に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、または、挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８５及びアミノ酸５９８に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のＡＡＶ血清型の前記カプシドタンパク質における対応する位置である、請求項４３に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項４５】
前記異種遺伝子産物は、干渉ＲＮＡである、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項４６】
前記異種遺伝子産物は、アプタマーである、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項４７】
前記異種遺伝子産物は、ポリペプチドである、請求項３９〜４４のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項４８】
前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、請求項４７に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項４９】
前記ポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドから選択されるＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、請求項４７に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項５０】
前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、酵素的に不活性なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドである、請求項４９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項５１】
前記異種遺伝子産物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡである、請求項３９〜４４の１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項５２】
前記異種ペプチドは、（１７）ＬＱＫＮＡＲＰＡＳＴＥＳＶＮＦＱ（配列番号２８）、（１８）ＬＱＲＧＶＲＩＰＳＶＬＥＶＮＧＱ（配列番号２９）、（１９）ＬＱＲＧＮＲＰＶＴＴＡＤＶＮＴＱ（配列番号３０）、または（２０）ＬＱＫＡＤＲＱＰＧＶＶＶＶＮＣＱ（配列番号３１）を含む、請求項３９〜５１のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオン。
【請求項５３】
ａ）請求項３９〜５２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンと、
ｂ）薬学的に許容される賦形剤と
を含む、薬学的組成物。
【請求項５４】
個体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法であって、
前記個体に、請求項３９〜５２のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンまたは請求項５３に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５５】
前記遺伝子産物は、ポリペプチドである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記遺伝子産物は、短鎖干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記ポリペプチドは、神経保護因子、抗血管新生ポリペプチド、抗アポトーシス因子、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポリペプチドは、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞成長因子２、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、上皮成長因子、ロドプシン、Ｘ連鎖アポトーシス阻害物質、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ相互作用タンパク質１、ペリフェリン、ペリフェリン−２、ロドプシン、ＲｄＣＶＦ、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御物質（ＲＰＧＲ）、またはソニックヘッジホッグである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ポリペプチドは、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
眼疾患を処置する方法であって、
処置を必要とする個体に対して、請求項３９〜５２のいずれか１項に記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンまたは請求項５３に記載の薬学的組成物を有効量で投与することを含む、方法。
【請求項６１】
投与は、眼内注射によるものである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
投与は、硝子体内注射または脈絡膜上注射によるものである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
前記眼疾患は、緑内障、網膜色素変性、黄斑変性、網膜分離、レーバー先天黒内障、糖尿病性網膜症、１色覚、または色覚異常である、請求項６０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
視覚は、眼の裏側を覆う薄い層状構造の網膜にある細胞によって媒介される。網膜の裏にある光受容体は、光子の吸収に応答して、双極細胞、水平細胞、及びアマクリン細胞を含めた網膜内の二次及び三次ニューロンを通過する信号処理の流れを開始する。光受容体の下にある網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞は、視覚サイクル経路を介して光子検出分子１１−シスレチナールの再生を促進するため、この光受容体機能を促進するために不可欠である。網膜内層内の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）は、三次ニューロンからの視覚信号を受信し、この視覚信号を活動電位の形態で脳に伝える。
【０００２】
光受容体、ＲＰＥ、双極細胞、及びその他の細胞における転写物を含めた網膜細胞内で発現される遺伝子変異は、視覚信号処理の破綻及び網膜変性をもたらす。網膜変性疾患の根底にある変異の多くは、光受容体及びＲＰＥ細胞の死をもたらす。
【０００３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）はＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科Ｄｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属し、この科及び属のメンバーが複製を促進するにはアデノウイルスのようなヘルパーウイルスとの同時感染が必要であり、ＡＡＶはヘルパーの不在下では潜伏感染を確立する。ビリオンは２５ｎｍの正二十面体のカプシドから構成され、このカプシドは、２つのオープンリーディングフレーム：ｒｅｐ及びｃａｐを有する４．７ｋｂの１本鎖ＤＮＡゲノムを包含する。非構造的なｒｅｐ遺伝子は、ウイルス複製に不可欠な４つの制御タンパク質をコードし、一方ｃａｐは、集合して６０−ｍｅｒのカプシドシェルを形成する３つの構造タンパク質（ＶＰ１〜３）をコードする。このウイルスカプシドは、ウイルス形質導入の生物学的バリアの多く（細胞表面受容体結合、エンドサイトーシス、細胞内トラフィッキング、及び核内のアンパッケージングを含む）を克服するためのＡＡＶベクターの能力を媒介する。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、改変カプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンであって、野生型ＡＡＶと比較して、より高い硝子体内液と網膜細胞との間のバリアを横断する能力を示し、そのためより高い網膜細胞の感染力を示し、また、異種核酸を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。本開示は、個体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】霊長類網膜ＡＡＶバリアントの発生に使用する定向進化法の概略図を示す。
【図２】バリアントＡＡＶカプシドにおけるペプチド挿入及びペプチド置換えの表を示す。
【図３Ａ】例示的なガイドＲＮＡ指向エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【図３Ｂ】例示的なガイドＲＮＡ指向エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【図３Ｃ】例示的なガイドＲＮＡ指向エンドヌクレアーゼのアミノ酸配列を示す。
【図４】ＡＡＶ２カプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸配列を示す。アミノ酸５８７及び５８８（ＮＰ）が太字及び下線で示されている。
【図５】様々なＡＡＶ血清型のＡＡＶカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０〜６１０に対応するアミノ酸配列を示す。
【図６Ａ】ＡＡＶカプシドタンパク質ループＩＶ（ＧＨループ）領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。挿入部位は、太字及び下線で示されている。
【図６Ｂ】ＡＡＶカプシドタンパク質ループＩＶ（ＧＨループ）領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。挿入部位は、太字及び下線で示されている。
【図６Ｃ】ＡＡＶカプシドタンパク質ループＩＶ（ＧＨループ）領域のアミノ酸配列のアラインメントを示す。挿入部位は、太字及び下線で示されている。
【図７−１】Ａ及びＢは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−２】Ｃ及びＤは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−３】Ｅは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−４】Ｆは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−５】Ｇは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−６】Ｈ〜Ｊは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−７】Ｋは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−８】Ｌは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−９】Ｍは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−１０】Ｎ及びＯは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−１１】Ｐは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−１２】Ｑ及びＲは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−１３】Ｓは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−１４】Ｔは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−１５】Ｕは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図７−１６】Ｖは、例示的な異種遺伝子産物のアミノ酸配列を示す。
【図８】Ａは、ＡＡＶ４カプシドのアミノ酸配列を示し、Ｂは、祖先ＡＡＶカプシドのアミノ酸配列を示す。。
【図９】表１を示す。表１は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）バーコードライブラリー注射後に光受容体から回収した霊長類由来バリアント及び対照のランキングを示している。
【図１０】表２を示す。表２は、ＧＦＰバーコードライブラリー注射後にＲＰＥ細胞から回収した霊長類由来バリアント及び対照のランキングを示している。
【図１１】霊長類網膜におけるＧＦＰバーコードライブラリーのＧＦＰ発現を示す。
【図１２−１】Ａ及びＢは、霊長類網膜におけるＡＡＶの定向進化を示す。
【図１２−２】Ｃは、霊長類網膜におけるＡＡＶの定向進化を示す。
【図１２−３】Ｃは、霊長類網膜におけるＡＡＶの定向進化を示す。
【図１２−４】Ｃ及びＤは、霊長類網膜におけるＡＡＶの定向進化を示す。
【図１２−５】Ｅ及びＦは、霊長類網膜におけるＡＡＶの定向進化を示す。Ｆにおける上から下までの配列は、配列番号１１７〜１３５に記載されている。
【図１３−１】Ａ〜Ｆは、霊長類網膜における進化したＡＡＶの検証を示す。
【図１３−２】Ｇ〜Ｌは、霊長類網膜における進化したＡＡＶの検証を示す。
【図１３−３】Ｍ〜Ｏは、霊長類網膜における進化したＡＡＶの検証を示す。
【図１３−４】Ｐ及びＱは、霊長類網膜における進化したＡＡＶの検証を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
「網膜細胞」という用語は、本明細書では、網膜を構成する任意の細胞タイプ、例えば、網膜神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、光受容細胞（桿体及び錐体を含む）、ミュラーグリア細胞、星状細胞（例えば、網膜星状細胞）、ならびに網膜色素上皮を指すことができる。
【０００７】
「ＡＡＶ」とはアデノ随伴ウイルス（ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）の省略形であり、このウイルス自体またはその派生物を指すために使用することができる。この用語は、別段の要求がある場合を除き、全てのサブタイプと、天然存在形態及び組換え形態の両方とを網羅する。「ｒＡＡＶ」という省略形は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｉｒｕｓ）を指し、これは組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる。「ＡＡＶ」という用語は、１型ＡＡＶ（ＡＡＶ−１）、２型ＡＡＶ（ＡＡＶ−２）、３型ＡＡＶ（ＡＡＶ−３）、４型ＡＡＶ（ＡＡＶ−４）、５型ＡＡＶ（ＡＡＶ−５）、６型ＡＡＶ（ＡＡＶ−６）、７型ＡＡＶ（ＡＡＶ−７）、８型ＡＡＶ（ＡＡＶ−８）、９型ＡＡＶ（ＡＡＶ−９）、１０型ＡＡＶ（ＡＡＶ−１０）、１１型ＡＡＶ（ＡＡＶ−１１）、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、霊長類ＡＡＶ、非霊長類ＡＡＶ、及びヒツジＡＡＶを含む。例えば、Ｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３３０：３７５を参照。「ＡＡＶ」という用語は、キメラＡＡＶも含む。「霊長類ＡＡＶ」とは霊長類から単離されたＡＡＶを指し、「非霊長類ＡＡＶ」とは非霊長類哺乳類から単離されたＡＡＶを指し、「ウシＡＡＶ」とはウシ哺乳類（例えば、乳牛）から単離されたＡＡＶを指すなどとなる。
【０００８】
本明細書で使用する「ｒＡＡＶベクター」は、ＡＡＶ由来ではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに対し異種のポリヌクレオチド）、典型的には、細胞の遺伝子形質転換のための関心対象配列を含むＡＡＶベクターを指す。概して、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも１つの、概して２つの、ＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接している。ｒＡＡＶベクターという用語は、ｒＡＡＶベクター粒子及びｒＡＡＶベクタープラスミドの両方を包含する。
【０００９】
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」または「ｒＡＡＶベクター粒子」とは、（典型的には野生型ＡＡＶの全てのカプシドタンパク質による）少なくとも１つのＡＡＶカプシドタンパク質及びカプシド形成されたポリヌクレオチドｒＡＡＶベクターから構成されたウイルス粒子を指す。この粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子）を含む場合、当該粒子は、典型的には「ｒＡＡＶベクター粒子」または単に「ｒＡＡＶベクター」と呼ばれる。したがって、ｒＡＡＶ粒子の産生は必然的にｒＡＡＶベクターの産生を含み、そのため、ベクターがｒＡＡＶ粒子内に含まれる。
【００１０】
「パッケージング」とは、ＡＡＶ粒子の集成及びカプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。
【００１１】
ＡＡＶの「ｒｅｐ」及び「ｃａｐ」遺伝子とは、アデノ随伴ウイルスの複製及びカプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐは、本明細書ではＡＡＶ「パッケージング遺伝子」と呼ばれる。
【００１２】
ＡＡＶのための「ヘルパーウイルス」とは、ＡＡＶ（例えば、野生型ＡＡＶ）が哺乳類細胞により複製及びパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。様々なこのようなヘルパーウイルスが当技術分野で知られており、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、及びワクシニアのようなポックスウイルスがこれに含まれる。アデノウイルスは複数の異なるサブグループを包含するが、サブグループＣの５型アデノウイルスが最も一般的に使用されている。ヒト、非ヒト哺乳類、及びトリ由来の多数のアデノウイルスが知られており、ＡＴＣＣのような寄託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスとしては、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が挙げられ、これらもＡＴＣＣのような寄託機関から入手可能である。
【００１３】
「ヘルパーウイルス機能（複数可）」とは、（本明細書に記載の他の複製及びパッケージング要件と共に）ＡＡＶの複製及びパッケージングを可能にする、ヘルパーウイルスゲノム内でコードされる機能（複数可）を指す。本明細書に記載されているように、「ヘルパーウイルス機能」は、ヘルパーウイルスを提供すること、または、例えば必須機能（複数可）をコードするポリヌクレオチド配列を途中で産生細胞に提供することによるものを含めた複数の方法で提供され得る。
【００１４】
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子は、当該ウイルス種が向性である細胞に送達が可能なポリヌクレオチド構成要素を含む、ウイルスまたはウイルス粒子である。この用語は、必ずしもウイルスの任意の複製能力を意味するとは限らない。本明細書で使用する「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子とは、標的細胞にアクセスできる、標的細胞に感染できる、及び標的細胞内で異種核酸を発現できるウイルスまたはウイルス粒子である。したがって、「感染力」とは、ウイルス粒子が標的細胞にアクセスする、標的細胞に感染する、及び標的細胞内で異種核酸を発現する能力を指す。感染力は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ感染力を指す場合もｉｎ  ｖｉｖｏ感染力を指す場合もある。感染性ウイルス粒子を計数するアッセイは、本開示の他の箇所及び当技術分野で説明されている。ウイルス感染力は、感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比として表現することができる。総ウイルス粒子は、ウイルスゲノム（ｖｇ）コピー数として表現することができる。ウイルス粒子が細胞内で異種核酸を発現する能力は、「形質導入」と呼ぶことができる。ウイルス粒子が細胞内で異種核酸を発現する能力は、複数の技法を用いてアッセイすることができ、このような技法としては、マーカー遺伝子の評価、例えば、（例えば、ウイルスが、ＧＦＰをコードするヌクレオチド配列を含む場合）緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）アッセイ（ＧＦＰは、ウイルス粒子に感染した細胞内で産生され、そして検出及び／または測定される）、あるいは産生されたタンパク質の測定（例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）による測定）が挙げられる。ウイルス感染力は、感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比として表現することができる。感染性ウイルス粒子の総ウイルス粒子に対する比を決定する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Ｇｒａｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：Ｓ３３７（ＴＣＩＤ５０感染力価アッセイを説明）、及びＺｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：９７３を参照。
【００１５】
「複製可能」ウイルス（例えば、複製可能ＡＡＶ）とは、感染性であり、かつ感染細胞内で（すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製されることも可能である、表現型的に野生型のウイルスを指す。ＡＡＶの場合には、複製能は、概して、機能的なＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。概して、本明細書に記載のｒＡＡＶベクターは、１つ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子が欠如しているために哺乳類細胞内（特に、ヒト細胞内）では複製不可能である。典型的には、このようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング遺伝子と入ってくるｒＡＡＶベクターとの間の組換えにより複製可能ＡＡＶが生成される可能性を最小化するため、任意のＡＡＶパッケージング遺伝子配列が欠如している。多くの実施形態において、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター調製物は、存在するとしても少量の複製可能ＡＡＶ（ｒｃＡＡＶ、別名ＲＣＡ）を含有する（例えば、１０2 ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０4 ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０8 ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、１０12ｒＡＡＶ粒子当たり約１ｒｃＡＡＶ未満、またはｒｃＡＡＶが存在しない）調製物である。
【００１６】
「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはこれらのアナログがこれに含まれる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチドアナログのような修飾ヌクレオチドを含むことができ、また非ヌクレオチド構成要素により遮断され得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの集成の前に付与されても後に付与されてもよい。本明細書で使用するポリヌクレオチドとは、互換的に２本鎖及び１本鎖の分子を指す。別段の指定または要求がない限り、本明細書に記載されている、ポリヌクレオチドである本発明の任意の実施形態は、２本鎖形態と、２本鎖形態を形成することが知られているまたは予測される２つの相補的な１本鎖形態の各々との両方を包含する。
【００１７】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する一定の「配列同一性」パーセントを有し、これは、アラインメントした場合に、２つの配列を比較すると、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが同じであることを意味する。配列類似性は、複数の異なる方式で決定することができる。配列同一性を決定するために、配列は、方法及びコンピュータープログラムを用いてアラインメントすることができ、コンピュータープログラムとしては、ワールドワイドウェブｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で入手可能なＢＬＡＳＴが挙げられる。もう１つのアラインメントアルゴリズムは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の完全所有子会社Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡからＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージで入手可能なＦＡＳＴＡである。その他のアラインメント技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡの一部門）で説明されている。特に関心対象となるものは、配列中のギャップを許容するアラインメントプログラムである。スミス・ウォーターマンは、配列アラインメントにおけるギャップを許容するアルゴリズムの１タイプである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照。また、ニードルマン及びウンシュのアラインメント法を用いたＧＡＰプログラムも、配列のアラインメントに利用することができる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）を参照。
【００１８】
関心対象は、スミス・ウォーターマンの局所ホモロジーアルゴリズム（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ  ２：４８２−４８９（１９８１））を用いて配列同一性を決定するＢｅｓｔＦｉｔプログラムである。ギャップ生成ペナルティーは、概して１〜５、通常は２〜４の範囲となり、多くの実施形態において３となる。ギャップ延長ペナルティーは、概して約０．０１〜０．２０の範囲となり、多くの場合において０．１０となる。当該プログラムは、比較対象となる入力された配列により決定されるデフォルトパラメーターを有する。配列同一性は、当該プログラムにより決定されるデフォルトパラメーターを用いて決定されることが好ましい。このプログラムは、Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ製のＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージからも入手可能である。
【００１９】
もう１つの関心対象プログラムは、ＦａｓｔＤＢアルゴリズムである。ＦａｓｔＤＢは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．１２７−１４９，１９８８，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．で説明されている。配列同一性パーセントは、以下のパラメーターに基づいてＦａｓｔＤＢにより計算される。
ミスマッチペナルティー：１．００、
ギャップペナルティー：１．００、
ギャップサイズペナルティー：０．３３、及び
連結ペナルティー：３０．０。
【００２０】
「遺伝子」とは、転写及び翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることが可能な少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。
【００２１】
本明細書で使用する「ガイドＲＮＡ」という用語は、ｉ）ガイドＲＮＡ指向エンドヌクレアーゼ（例えば、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ、例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）に結合する「アクチベーター」ヌクレオチド配列、及びｉｉ）標的核酸とハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む「ターゲッター」ヌクレオチド配列を含むＲＮＡを指す。「アクチベーター」ヌクレオチド配列及び「ターゲッター」ヌクレオチド配列は、別々のＲＮＡ分子（例えば、「デュアルガイドＲＮＡ」）上にあってもよく、同じＲＮＡ分子（「シングルガイドＲＮＡ」）上にあってもよい。
【００２２】
「低分子干渉」または「短鎖干渉ＲＮＡ」またはｓｉＲＮＡは、目的遺伝子（「標的遺伝子」）に対し標的化されたヌクレオチドのＲＮＡデュプレックスである。「ＲＮＡデュプレックス」とは、ＲＮＡ分子の２つの領域間の相補的対合により形成された構造を指す。ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのデュプレックス部分のヌクレオチド配列が標的遺伝子のヌクレオチド配列に対し相補的である点において、遺伝子に対し「標的化」されている。一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡのデュプレックスの長さは、３０ヌクレオチド未満である。一部の実施形態において、デュプレックスは、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、または１０ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、デュプレックスの長さは、１９〜２５ヌクレオチド長である。ｓｉＲＮＡのＲＮＡデュプレックス部分は、ヘアピン構造の一部であり得る。デュプレックス部分に加えて、ヘアピン構造は、デュプレックスを形成する２つの配列間に位置するループ部分を含有し得る。ループの長さは変動し得る。一部の実施形態において、ループは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３ヌクレオチド長である。ヘアピン構造は、３′または５′オーバーハング部分も含有し得る。一部の実施形態において、オーバーハングは、０、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長の３′または５′オーバーハングである。
【００２３】
本明細書で使用する「マイクロＲＮＡ」という用語は、任意のタイプの干渉ＲＮＡを指し、限定されないが、内在的なマイクロＲＮＡ及び人工的なマイクロＲＮＡ（例えば、合成ｍｉＲＮＡ）がこれに含まれる。内在的なマイクロＲＮＡは、ゲノム内で天然にコードされる、ｍＲＮＡの生産的利用を調節可能な低分子ＲＮＡである。人工的なマイクロＲＮＡは、内在的なマイクロＲＮＡ以外の、ｍＲＮＡの活性を調節可能な任意のタイプのＲＮＡ配列であり得る。マイクロＲＮＡ配列は、これらの配列のいずれか１つ以上から構成されたＲＮＡ分子であり得る。マイクロＲＮＡ（または「ｍｉＲＮＡ」）は、Ｌｉｍ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１７，９９１−１００８、Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９９，１５４０、Ｌｅｅ  ａｎｄ  Ａｍｂｒｏｓｅ，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８６２、Ｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９４，８５８−８６１、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１２，７３５−７３９、Ｌａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９４，８５３−８５７、及びＬａｇｏｓ−Ｑｕｉｎｔａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，ＲＮＡ，９，１７５−１７９のような刊行物で説明されている。マイクロＲＮＡの例としては、より大きなＲＮＡの断片である任意のＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｔＲＮＡ、ｓｎｃＲＮＡ、ｔｎｃＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、もしくは他の低分子非コードＲＮＡである任意のＲＮＡが挙げられる。例えば、米国特許出願第２００５０２７２９２３号、第２００５０２６６５５２号、第２００５０１４２５８１号、及び第２００５００７５４９２号を参照。「マイクロＲＮＡ前駆体」（または「プレｍｉＲＮＡ」）とは、マイクロＲＮＡ配列が中に組み込まれたステムループ構造を有する核酸を指す。「成熟マイクロＲＮＡ」（または「成熟ｍｉＲＮＡ」）には、マイクロＲＮＡ前駆体（「プレｍｉＲＮＡ」）から切断されたマイクロＲＮＡ、または合成された（例えば、実験室でセルフリー合成により合成された）マイクロＲＮＡが含まれ、約１９ヌクレオチド〜約２７ヌクレオチドの長さを有し、例えば、成熟マイクロＲＮＡは、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ、２６ｎｔ、または２７ｎｔの長さを有する。成熟マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡに結合し、標的ｍＲＮＡの翻訳を阻害することができる。
【００２４】
ポリヌクレオチドに適用される「組換え」とは、そのポリヌクレオチドが、クローニング、制限またはライゲーションステップ、及び天然に見いだされるポリヌクレオチドとは異なるコンストラクトをもたらす他の手順の様々な組合せの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。この用語は、元のポリヌクレオチドコンストラクトの複製物及び元のウイルスコンストラクトの後代をそれぞれ含む。
【００２５】
「調節エレメント」または「調節配列」とは、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含めたポリヌクレオチドの機能的制御に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。この制御は、プロセスの頻度、スピード、または特異性に影響を及ぼし得、また本質的に強化的でも阻害的でもあり得る。当技術分野で公知の調節エレメントとしては、例えば、プロモーター及びエンハンサーのような転写制御配列が挙げられる。プロモーターは、ある特定の条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合し、通常はプロモーターの下流（３′方向）に位置するコード領域の転写を開始することが可能なＤＮＡ領域である。
【００２６】
「作用的に結合した」または「作用可能に結合した」とは、期待される方式で作用することが許容される関係にある遺伝子エレメントの並列を指す。例えば、プロモーターがコード配列の転写を開始することを助ける場合、プロモーターはコード領域に対し作用可能に結合している。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在してもよい。
【００２７】
「発現ベクター」とは、関心対象ポリペプチドをコードする領域を含むベクターであり、意図された標的細胞内でタンパク質の発現をもたらすために使用される。また、発現ベクターは、コード領域に対し作用可能に結合して標的内のタンパク質発現を促進する調節エレメントも含む。調節エレメントと、調節エレメントが発現のために作用可能に結合している１つまたは複数の遺伝子との組合せは、「発現カセット」と呼ばれることがあり、多数の発現カセットが当技術分野で公知及び入手可能であり、または当技術分野で入手可能な構成要素から容易に構築することができる。
【００２８】
「異種」とは、比較対象の実体の残りのものとは遺伝子型的に異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技法により、異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されたポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。ネイティブなコード配列から取り出され、天然には結合が見いだされないコード配列に作用可能に結合しているプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶは、天然存在の野生型ＡＡＶに通常は含まれない核酸を含むｒＡＡＶであり、コードされる異種遺伝子産物は、天然存在の野生型ＡＡＶによって通常はコードされない遺伝子産物である。別の例として、カプシドタンパク質のＧＨループ内に挿入された異種ペプチドを含むバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、天然存在の野生型ＡＡＶに通常は含まれないペプチドの挿入を含むバリアントＡＡＶカプシドタンパク質である。
【００２９】
「遺伝子改変」及び「遺伝子修飾」（ならびにこれらの文法的バリアント）という用語は、本明細書では互換的に使用され、遺伝子エレメント（例えば、ポリヌクレオチド）が有糸分裂または減数分裂以外によって細胞に導入されるプロセスを指す。エレメントは、細胞に対し異種であってもよく、または細胞内に既に存在するエレメントの追加コピーもしくは改良バージョンであってもよい。遺伝子改変は、例えば、組換えプラスミドもしくは他のポリヌクレオチドを用いて、当技術分野で公知の任意のプロセス、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法を通じて細胞にトランスフェクションすることにより、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体に接触させることにより、もたらされ得る。また、遺伝子改変は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡのウイルスまたはウイルスベクターによる形質導入または感染によってももたらされ得る。概して、遺伝子エレメントは、細胞内の染色体またはミニ染色体に導入されるが、細胞及びその後代の表現型及び／または遺伝子型を変化させる任意の改変もこの用語に含まれる。
【００３０】
細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ延長培養中に、遺伝子配列がその機能を実施するように利用可能である場合、細胞は、遺伝子配列で「安定的に」改変、形質導入、遺伝子修飾、または形質転換されたと言われる。概して、このような細胞は、改変された細胞の後代にも遺伝する遺伝子改変が導入されたという点において、「遺伝的に」改変（遺伝子修飾）されている。
【００３１】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。また、これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質付加、リン酸化、または標識構成要素とのコンジュゲートも含む。哺乳類対象に遺伝子産物を送達する文脈で論じられる場合、抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチドなどのようなポリペプチド及びポリペプチドのための組成物は、インタクトなタンパク質の所望の生化学的機能を保持する、それぞれのインタクトなポリペプチド、またはその任意の断片もしくは遺伝子操作された派生物を指す。同様に、抗血管新生ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、及び哺乳類対象への遺伝子産物送達で使用するための他のこのような核酸（レシピエント細胞への送達対象となる「導入遺伝子」と呼ばれ得る）への言及は、インタクトなポリペプチドまたは所望の生化学的機能を有する任意の断片もしくは遺伝子操作された派生物をコードするポリヌクレオチドを含む。
【００３２】
「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、または他の物質とは、物質または同様の物質が天然に存在するまたは最初に調製される場合に共に存在し得る他の構成要素の少なくとも一部を欠いた物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、原料混合物から当該物質を濃縮する精製技法を使用することにより調製することができる。濃縮は、絶対的尺度、例えば、溶液の体積当たりの重量に基づいて測定することができ、または原料混合物中に存在する第２の潜在的妨害物質に対して測定することもできる。本発明の実施形態の濃縮を高めることは、さらにより単離されているということである。単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、または他の物質は、一部の実施形態において、例えば、約８０％〜約９０％の純度、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、少なくとも約９８％の純度、または少なくとも約９９％の純度、またはそれ以上の純度に精製される。
【００３３】
本明細書で使用する「処置」「処置すること」などの用語は、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に防止するという観点で予防的であってもよく、及び／または、疾患、もしくはその疾患に起因し得る有害作用を部分的もしくは完全に治癒するという観点で治療的であってもよい。本明細書で使用する「処置」は、哺乳類、特にヒトにおける任意の疾患処置を網羅し、（ａ）疾患の素因がある、または疾患にかかるリスクを有する可能性があるがまだ疾患を有すると診断されていない対象における疾患の発生を防止すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発生を抑止すること、及び（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の後退を引き起こすことを含む。
【００３４】
「個体」、「宿主」、「対象」、及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、限定されないが、ヒト及び非ヒト霊長類（サル及びヒトを含む）、哺乳類の競技用動物（例えば、ウマ、ラクダ等）、哺乳類の家畜（例えば、ヒツジ、ヤギ、乳牛等）、哺乳類のペット（イヌ、ネコ等）、ならびにげっ歯類（例えば、マウス、ラット等）を含めた哺乳類を指す。一部の場合において、個体はヒトである。
【００３５】
本発明についてさらに説明する前に、本発明が、説明する特定の実施形態に限定されず、当然ながらそれ自体が変動し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、このような用語が限定的であるようには意図されていないことも理解されたい。
【００３６】
値の範囲が示されている場合、その間に存在する各値（その範囲の上限と下限との間において、文脈による別段の明確な指示がない限り、下限の１０分の１の単位まで）、及びその記述された値または間に存在する値は、本発明に含まれることを理解されたい。これらのより小さな範囲における上限及び下限は、その小さな範囲に独立的に含めることができ、これらは本発明にも包含され、記述範囲における任意の特定的に除外された制限を受ける。記述範囲が上限下限の一方または両方を含む場合、この含まれた上限下限の一方または両方を除外する範囲も、本発明に含まれる。
【００３７】
別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。本発明の実施または試験を行う際には、本明細書に記載の方法及び材料に類似したまたは同等の、任意の方法及び材料を使用することもできるが、ここでは好ましい方法及び材料について説明する。本明細書で言及する全ての刊行物は、これらの刊行物の引用に関連した方法及び／または材料を開示及び説明するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３８】
本明細書及び添付の請求項で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈による別段の明確な定めがない限り、複数の指示対象を含むことに注意されなければならない。したがって、例えば、「１つのｒＡＡＶビリオン」という言及には複数のこのようなビリオンが含まれ、「当該カプシドタンパク質」という言及には、１つ以上のバリアントカプシドタンパク質及び当業者に公知のその等価物への言及が含まれる、などとなる。さらに、請求項がいかなる任意選択の要素も除外するように立案され得ることにも留意されたい。そのため、本記載は、請求項の要素の列挙に関連して、「単に（ｓｏｌｅｌｙ）」、「〜のみ（ｏｎｌｙ）」のような排他的用語の使用、または「否定的な」限定の使用のための先行的記載としての役目を果たすよう意図されている。
【００３９】
明快性のために別々の実施形態の文脈で記載されている本発明のあるいくつかの特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供されてもよいことを理解されたい。逆に、簡潔性のために単一の実施形態の文脈で記載されている本発明の様々な特徴は、別々に提供されても任意の好適な部分組合せで提供されてもよい。本発明に関係する実施形態における全ての組合せは、本発明によって明確に包含され、また、この全ての組合せは、あらゆる組合せが個別かつ明示的に開示されているかのごとく、本明細書で開示されている。加えて、様々な実施形態及びその要素における全ての部分組合せも、本発明によって明確に包含され、また、この全ての部分組合せは、あらゆるこのような組合せが個別かつ明示的に本明細書で開示されているかのごとく、本明細書で開示されている。
【００４０】
本明細書で論じられている刊行物は、単に本出願の出願日より前にそれらが開示されていたために提供されている。本明細書のいかなる内容も、本発明が先発明によってこのような刊行物に先行する権利を有しないことを承認するものとして解釈すべきではない。さらに、示される公開日は実際の公開日と異なる可能性があり、実際の公開日は各別に確認する必要があり得る。
【００４１】
本開示は、改変カプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンであって、野生型ＡＡＶと比較して、より高い硝子体内液と網膜細胞との間のバリアを横断する能力を示し、そのためより高い網膜細胞の感染力を示し、また、異種核酸を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。本開示は、個体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法を提供する。また、本開示は、網膜細胞内に存在する標的核酸を修飾する方法も提供する。
【００４２】
本開示は、改変されたカプシドタンパク質を有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ビリオンであって、野生型ＡＡＶと比較して、より高い網膜細胞の感染力を示し、また、異種核酸を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内液と網膜細胞との間のバリアを横断する能力の増大を示す。ｒＡＡＶビリオンは、対応する網膜細胞向け野生型ＡＡＶの感染力と比較して、より高い網膜細胞の感染力を示す。網膜細胞は、光受容体（例えば、桿体、錐体）、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）、ミュラー細胞（ミュラーグリア細胞）、星状細胞（例えば、網膜星状細胞）、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞であり得る。本開示はさらに、個体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法及び眼疾患を処置する方法を提供する。本開示は、改変カプシドタンパク質を有するｒＡＡＶビリオンであって、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節層、または網膜色素上皮に対する局在化の程度と比較して、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮のうちの１つ以上に対する少なくとも５倍の局在化の増大を示し、かつ異種核酸を含む、ｒＡＡＶビリオンを提供する。
【００４３】
バリアントＡＡＶカプシドポリペプチド
本開示は、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質を提供する。上述したように、本開示のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、野生型または他の参照ＡＡＶカプシドタンパク質との比較で改変されている。改変には、挿入及びスワップ（例えば、隣接したひと続きのアミノ酸を異なる隣接したひと続きのアミノ酸で置き換えること）が含まれる。
【００４４】
一部の場合において、本開示のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶカプシドタンパク質の表面アクセス可能（例えば、溶媒アクセス可能）部分内の挿入部位における５アミノ酸〜２０アミノ酸長の異種ペプチドの挿入を含み、これにより、バリアントカプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン内に存在するときに、特にＡＡＶビリオンが硝子体内に注射されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の感染力の増大を付与する。したがって、本開示のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン内に存在するときに、ＡＡＶビリオンにおける硝子体内液（「硝子体液」）と網膜細胞との間のバリアを横断する能力の増大を付与する。このようなバリアとしては、例えば、内境界膜（ＩＬＭ）、網膜の細胞外マトリックス、網膜細胞自体の細胞膜、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮が挙げられる。一部の場合において、網膜細胞は、ミュラー細胞である。他の網膜細胞としては、アマクリン細胞、双極細胞、及び水平細胞が挙げられる。「約５アミノ酸〜約２０アミノ酸の挿入」は、本明細書では「ペプチド挿入」（例えば、異種ペプチド挿入）とも呼ばれる。「対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質」とは、異種ペプチド挿入を伴わない同じＡＡＶ血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を指す。一部の場合において、バリアントＡＡＶカプシドは、５アミノ酸〜２０アミノ酸（例えば、５〜７、７〜１０、１０〜１２、１２〜１５、または１５〜２０アミノ酸）長の単一の異種ペプチド挿入物を含む。
【００４５】
ＡＡＶカプシドにおける改変は、スワップ（例えば、隣接したひと続きのアミノ酸を異種ペプチドで置き換えること）である場合もある。したがって、置換えとは、隣接したひと続きのアミノ酸の代わりに異種ペプチドを挿入することである。一部の場合において、本開示のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶカプシドタンパク質の表面アクセス可能（例えば、溶媒アクセス可能）部分内のある部位において隣接したひと続きのアミノ酸を５アミノ酸〜２０アミノ酸長の異種ペプチドで置き換えることを含み、これにより、バリアントカプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン内に存在するときに、特にＡＡＶビリオンが硝子体内に注射されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の感染力の増大を付与する。したがって、本開示のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン内に存在するときに、ＡＡＶビリオンにおける硝子体内液（「硝子体液」）と網膜細胞との間のバリアを横断する能力の増大を付与する。このようなバリアとしては、例えば、ＩＬＭ、網膜の細胞外マトリックス、網膜細胞自体の細胞膜、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮が挙げられる。一部の場合において、網膜細胞は、ミュラー細胞である。他の網膜細胞としては、アマクリン細胞、双極細胞、及び水平細胞が挙げられる。「約５アミノ酸〜約２０アミノ酸の置換え」は、本明細書では「ペプチドスワップ」（例えば、隣接したひと続きのアミノ酸を異種ペプチドで置き換えること）とも呼ばれる。「対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質」とは、異種ペプチドを伴わない同じＡＡＶ血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を指す。一部の場合において、バリアントＡＡＶカプシドは、５アミノ酸〜２０アミノ酸（例えば、５〜７、７〜１０、１０〜１２、１２〜１５、または１５〜２０アミノ酸）長の単一の異種ペプチド置換えを含む。
【００４６】
以下の説明の目的において、「挿入」とは、隣接したひと続きのアミノ酸の置換えを伴わない異種ペプチドの挿入及び隣接したひと続きのアミノ酸を置き換える異種ペプチドの挿入の両方を指す。
【００４７】
挿入部位は、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶ内にあり、例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶの溶媒アクセス可能部分にある。ＡＡＶカプシドタンパク質のＧＨループ／ループＩＶについては、例えば、ｖａｎ  Ｖｌｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：８０９、Ｐａｄｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：５０４７、及びＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：１９５５を参照。例えば、挿入部位は、図６Ａ〜６Ｃに示されているように、ＡＡＶカプシドタンパク質のアミノ酸４１１〜６５０内であり得る。例えば、挿入部位は、図５に示されているように、ＡＡＶ２のアミノ酸５７０〜６１１内、ＡＡＶ１のアミノ酸５７１〜６１２内、ＡＡＶ５のアミノ酸５６０〜６０１内、ＡＡＶ６のアミノ酸５７１〜６１２内、ＡＡＶ７のアミノ酸５７２〜６１３内、ＡＡＶ８のアミノ酸５７３〜６１４内、ＡＡＶ９のアミノ酸５７１〜６１２内、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５７３〜６１４内であり得る。一部の場合において、挿入部位は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸５８８と５８９との間、または異なる血清型のＡＡＶ内の対応する挿入部位である。一部の場合において、挿入部位は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸５８７と５８８との間、または異なる血清型のＡＡＶ内の対応する挿入部位である。一部の場合において、挿入部位は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸５７５と５７６との間、または異なる血清型のＡＡＶ内の対応する挿入部位である。一部の場合において、挿入部位は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸５８４と５８５との間、または異なる血清型のＡＡＶ内の対応する挿入部位である。一部の場合において、挿入部位は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸５９０と５９１との間、または異なる血清型のＡＡＶ内の対応する挿入部位である。一部の場合において、挿入部位は、ＡＡＶ４カプシドタンパク質のアミノ酸５８４と５８５との間、または異なる血清型のＡＡＶ内の対応する挿入部位である。一部の場合において、挿入部位は、ＡＡＶ５カプシドタンパク質のアミノ酸５７５と５７６との間、または異なる血清型のＡＡＶ内の対応する挿入部位である。一部の場合において、置換えの部位は、ＡＡＶ２カプシドタンパク質のアミノ酸５８４と５９８との間、または異なる血清型のＡＡＶ内の対応する部位である。
【００４８】
一部の場合において、約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５〜７、７〜１０、１０〜１２、１２〜１５、または１５〜２０アミノ酸）長の異種ペプチドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で、カプシドタンパク質のＧＨループまたはループＩＶ内の挿入部位に挿入される。例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７と５８８との間、またはＡＡＶ２のアミノ酸５８８と５８９との間、または別のＡＡＶ血清型のカプシドサブユニットの対応する位置であり得る。挿入部位５８７／５８８はＡＡＶ２カプシドタンパク質に基づくことに留意されたい。約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５〜７、７〜１０、１０〜１２、１２〜１５、または１５〜２０アミノ酸）長の異種ペプチドは、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）内の対応する部位に挿入されてもよい。当業者であれば、様々なＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づき、任意の所与のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質において、どこがＡＡＶ２のアミノ酸５８７〜５８８に対応する挿入部位であるかが分かる。様々なＡＡＶ血清型における、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５７０〜６１１（図４参照）に対応する配列を図５に示す。例えば、ＡＡＶ１についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４９５４２、ＡＡＶ４についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４４９２７、ＡＡＶ５についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ１３７５６、ＡＡＶ６についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ９５４５９、ＡＡＶ７についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１７８、ＡＡＶ８についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１８０、ＡＡＶ９についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ９９２６４、ＡＡＶ１０についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ４６３３７、及びＡＡＶｒｈ１０についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ８８２０８を参照。祖先ＡＡＶカプシドに関しては、例えば、Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｏｒｔｉｚ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２２：９３４を参照。
【００４９】
例えば、挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７と５８８との間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５と５７６との間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９と５９０との間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０と５９１との間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８と５８９との間、ＡＡＶ１０のアミノ酸５８８と５８９との間、またはＡＡＶ４のアミノ酸５８５と５８６との間であり得る。挿入部位は、図５に下線で示されている。アミノ酸ナンバリングは、図５に示すナンバリングに基づいている。
【００５０】
一部の場合において、主題カプシドタンパク質は、図６Ａ〜６Ｃに記載のアミノ酸配列に対し少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、かつ約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５〜７、７〜１０、１０〜１２、１２〜１５、または１５〜２０アミノ酸）長の異種ペプチドの挿入を有する、アミノ酸配列を含むＧＨループを含む。
【００５１】
一部の場合において、本開示のバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、親ＡＡＶカプシドの表面アクセス可能（例えば、溶媒アクセス可能）部分内における連続したアミノ酸のセグメント（または配列）の置換え（または置換）を含み、これにより、バリアントカプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン内に存在するときに、特にＡＡＶビリオンが硝子体内に注射されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の感染力の増大を付与する。したがって、配列置換を含む主題バリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、ＡＡＶビリオン内に存在するときに、ＡＡＶビリオンにおける硝子体液と網膜細胞との間のバリアを横断する能力の増大を付与する。このようなバリアとしては、例えば、内境界膜、網膜の細胞外マトリックス、及び網膜細胞自体の細胞膜が挙げられる。「連続した約５アミノ酸〜連続した約２５アミノ酸の置換え」は、本明細書では「ループスワップ」（すなわち、異種ペプチド置換）とも呼ばれる。このような場合における「対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質」とは、主題ループスワップを伴わない同じＡＡＶ血清型のＡＡＶカプシドタンパク質を指す。一部の場合において、バリアントＡＡＶカプシドは、隣接した５アミノ酸〜隣接した２５アミノ酸長、例えば、５〜９、９〜１１、１０〜１５、１５〜２０、または２０〜２５アミノ酸長の異種ペプチド置換を含む。
【００５２】
一部の場合において、約５アミノ酸〜約２５アミノ酸（例えば、５〜９、９〜１０、１０〜１５、１５〜２０、または２０〜２５アミノ酸）長の異種ペプチドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質内の相当数の連続したアミノ酸に対し置換される。一部の実施形態において、置換は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８８前後、または別のＡＡＶ血清型のカプシドサブユニットの対応する位置で開始し、ＡＡＶ２のアミノ酸５９８前後、または別のＡＡＶ血清型のカプシドサブユニットの対応する位置で終了する。残基５８８〜５９８はＡＡＶ２  ＶＰ１カプシドタンパク質に基づくことに留意されたい。約５アミノ酸〜約２５アミノ酸長の異種ペプチドは、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）内の対応する部位に置換されてもよい。当業者であれば、様々なＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づき、任意の所与のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質において、どこがＡＡＶ２のアミノ酸５８８〜５９８に対応する置換部位であるかが分かる。様々なＡＡＶ血清型における、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５８８〜５９８（図４参照）に対応するアミノ酸残基を図５に示す。例えば、ＡＡＶ１についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４９５４２、ＡＡＶ４についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４４９２７、ＡＡＶ５についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ１３７５６、ＡＡＶ６についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ９５４５９、ＡＡＶ７についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１７８、ＡＡＶ８についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１８０、ＡＡＶ９についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ９９２６４、ＡＡＶ１０についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ４６３３７、及びＡＡＶｒｈ１０についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ８８２０８を参照。
【００５３】
一部の場合において、約５アミノ酸〜約２５アミノ酸（例えば、５〜９、９〜１０、１０〜１５、１５〜２０、または２０〜２５アミノ酸）長の異種ペプチドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質内の相当数の連続したアミノ酸に対し置換される。一部の実施形態において、置換は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８５前後、または別のＡＡＶ血清型のカプシドサブユニットの対応する位置で開始し、ＡＡＶ２のアミノ酸５９８前後、または別のＡＡＶ血清型のカプシドサブユニットの対応する位置で終了する。残基５８５〜５９８はＡＡＶ２  ＶＰ１カプシドタンパク質に基づくことに留意されたい。約５アミノ酸〜約２５アミノ酸長の異種ペプチドは、ＡＡＶ２以外のＡＡＶ血清型（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９等）内の対応する部位に置換されてもよい。当業者であれば、様々なＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づき、任意の所与のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質において、どこがＡＡＶ２のアミノ酸５８５〜５９８に対応する置換部位であるかが分かる。様々なＡＡＶ血清型における、ＡＡＶ２のカプシドタンパク質ＶＰ１のアミノ酸５８５〜５９８（図４参照）に対応するアミノ酸残基を図５に示す。例えば、ＡＡＶ１についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４９５４２、ＡＡＶ４についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０４４９２７、ＡＡＶ５についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＤ１３７５６、ＡＡＶ６についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＢ９５４５９、ＡＡＶ７についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１７８、ＡＡＶ８についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０７７１８０、ＡＡＶ９についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＳ９９２６４、ＡＡＶ１０についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＴ４６３３７、及びＡＡＶｒｈ１０についてはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＯ８８２０８を参照。
【００５４】
挿入／置換えペプチド
上述したように、約５アミノ酸〜約２０アミノ酸長の異種ペプチドは、ＡＡＶカプシドのＧＨループ内に挿入されるか、またはＡＡＶカプシドのＧＨループ内の相当数の連続したアミノ酸を置き換える。簡潔さのため、「挿入ペプチド」という用語は、以下、親ＡＡＶカプシド内に挿入されるペプチド及び、ＡＡＶカプシドのＧＨループ内の隣接したアミノ酸のセグメントを置き換えるペプチドの両方を説明するために使用される。一部の場合において、挿入ペプチドは、５アミノ酸〜２０アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、７アミノ酸〜１５アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、９アミノ酸〜１５アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、９アミノ酸〜１２アミノ酸の長さを有する。挿入ペプチドは、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、７アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、８アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、９アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、１０アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、１１アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、１２アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、１３アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、１４アミノ酸の長さを有する。一部の場合において、挿入ペプチドは、１５アミノ酸の長さを有する。
【００５５】
一部の場合において、ペプチド挿入物は、式Ｉのペプチド：ＬＡ（Ｌ／Ｎ）（Ｉ／Ｑ）（Ｑ／Ｅ）（Ｄ／Ｈ）（Ｓ／Ｖ）（Ｍ／Ｋ）（Ｒ／Ｎ）Ａ（配列番号１３６）である。
【００５６】
一部の場合において、式Ｉのペプチドは、（２１）ＬＡＬＩＱＤＳＭＲＡ（配列番号３５）のアミノ酸配列を含む。一部の場合において、式Ｉのペプチドは、（２２）ＬＡＮＱＥＨＶＫＮＡ（配列番号２）のアミノ酸配列を含む。
【００５７】
一部の場合において、ペプチド挿入物は、式ＩＩのペプチド：ＴＸ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7 Ｘ8 ＧＬＸ9 （配列番号１３７）である。式中、Ｘ1 が、Ｇ、Ｖ、またはＳであり、Ｘ2 が、Ｖ、Ｅ、Ｐ、Ｇ、Ｄ、Ｍ、Ａ、またはＳであり、Ｘ3 が、Ｍ、Ｖ、Ｙ、Ｈ、Ｇ、Ｓ、またはＤであり、Ｘ4 が、Ｒ、Ｄ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、またはＭであり、Ｘ5 が、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、またはＡであり、Ｘ6 が、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｄ、Ｑ、またはＨであり、Ｘ7 が、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｇ、またはＡであり、Ｘ8 が、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ａ、Ｉ、Ｐ、またはＴであり、Ｘ9 が、ＳまたはＮである。
【００５８】
式ＩＩのペプチド挿入物としては、限定されないが、（１）ＴＧＶＭＲＳＴＮＳＧＬＮ（配列番号６）、（２）ＴＧＥＶＤＬＡＧＧＧＬＳ（配列番号７）、（３）ＴＳＰＹＳＧＳＳＤＧＬＳ（配列番号８）、（４）ＴＧＧＨＤＳＳＬＤＧＬＳ（配列番号９）、（５）ＴＧＤＧＧＴＴＭＮＧＬＳ（配列番号９８）、（６）ＴＧＧＨＧＳＡＰＤＧＬＳ（配列番号９９）、（７）ＴＧＭＨＶＴＭＭＡＧＬＮ（配列番号１００）、（８）ＴＧＡＳＹＬＤＮＳＧＬＳ（配列番号１０１）、（９）ＴＶＶＳＴＱＡＧＩＧＬＳ（配列番号１３５）、（１０）ＴＧＶＭＨＳＱＡＳＧＬＳ（配列番号２１）、（１１）ＴＧＤＧＳＰＡＡＰＧＬＳ（配列番号２２）、及び（１２）ＴＧＳＤＭＡＨＧＴＧＬＳ（配列番号２３）が挙げられる。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（１）ＴＧＶＭＲＳＴＮＳＧＬＮ（配列番号６）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（２）ＴＧＥＶＤＬＡＧＧＧＬＳ（配列番号７）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（３）ＴＳＰＹＳＧＳＳＤＧＬＳ（配列番号８）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（４）ＴＧＧＨＤＳＳＬＤＧＬＳ（配列番号９）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（５）ＴＧＤＧＧＴＴＭＮＧＬＳ（配列番号９８）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（６）ＴＧＧＨＧＳＡＰＤＧＬＳ（配列番号９９）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（７）ＴＧＭＨＶＴＭＭＡＧＬＮ（配列番号１００）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（８）ＴＧＡＳＹＬＤＮＳＧＬＳ（配列番号１０１）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（９）ＴＶＶＳＴＱＡＧＩＧＬＳ（配列番号２０）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（１０）ＴＧＶＭＨＳＱＡＳＧＬＳ（配列番号２１）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（１１）ＴＧＤＧＳＰＡＡＰＧＬＳ（配列番号２２）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（１２）ＴＧＳＤＭＡＨＧＴＧＬＳ（配列番号２３）である。
【００５９】
一部の場合において、ペプチド挿入物は、式ＩＩＩのペプチド：ＴＧＸ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7 ＧＬＳ（配列番号１３８）である。式中、Ｘ1 が、Ｖ、Ｅ、Ｐ、Ｇ、Ｄ、Ｍ、Ａ、またはＳであり、Ｘ2 が、Ｍ、Ｖ、Ｙ、Ｈ、Ｇ、Ｓ、またはＤであり、Ｘ3 が、Ｒ、Ｄ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、またはＭであり、Ｘ4 が、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、またはＡであり、Ｘ5 が、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｄ、Ｑ、またはＨであり、Ｘ6 が、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｇ、またはＡであり、Ｘ7 が、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ａ、Ｉ、Ｐ、またはＴである。
【００６０】
式ＩＩＩのペプチド挿入物としては、限定されないが、（２）ＴＧＥＶＤＬＡＧＧＧＬＳ（配列番号７）、（４）ＴＧＧＨＤＳＳＬＤＧＬＳ（配列番号９）、（５）ＴＧＤＧＧＴＴＭＮＧＬＳ（配列番号９８）、（６）ＴＧＧＨＧＳＡＰＤＧＬＳ（配列番号９９）、（８）ＴＧＡＳＹＬＤＮＳＧＬＳ（配列番号１０１）、（１０）ＴＧＶＭＨＳＱＡＳＧＬＳ（配列番号２１）、（１１）ＴＧＤＧＳＰＡＡＰＧＬＳ（配列番号２２）、及び（１２）ＴＧＳＤＭＡＨＧＴＧＬＳ（配列番号２３）が挙げられる。
【００６１】
一部の場合において、ペプチド挿入物は、式ＩＶのペプチド：Ｘ1 ＧＸ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7 Ｘ8 ＧＬＳＰＸ9 ＴＸ10Ｘ11（配列番号１３９）である。式中、Ｘ1 が、ＴまたはＮであり、Ｘ2 が、Ｌ、Ｓ、Ａ、またはＧであり、Ｘ3 が、ＤまたはＶであり、Ｘ4 が、Ａ、Ｇ、またはＰであり、Ｘ5 が、ＴまたはＤであり、Ｘ6 が、ＲまたはＹであり、Ｘ7 が、Ｄ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ8 が、Ｈ、Ｒ、またはＴであり、Ｘ9 が、ＶまたはＡであり、Ｘ10が、ＧまたはＷであり、Ｘ11が、ＴまたはＡである。
【００６２】
式ＩＶのペプチド挿入物としては、限定されないが、（１３）ＴＧＬＤＡＴＲＤＨＧＬＳＰＶＴＧＴ（配列番号２４）、（１４）ＴＧＳＤＧＴＲＤＨＧＬＳＰＶＴＷＴ（配列番号２５）、（１５）ＮＧＡＶＡＤＹＴＲＧＬＳＰＡＴＧＴ（配列番号２６）、及び（１６）ＴＧＧＤＰＴＲＧＴＧＬＳＰＶＴＧＡ（配列番号２７）が挙げられる。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（１３）ＴＧＬＤＡＴＲＤＨＧＬＳＰＶＴＧＴ（配列番号２４）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（１４）ＴＧＳＤＧＴＲＤＨＧＬＳＰＶＴＷＴ（配列番号２５）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（１５）ＮＧＡＶＡＤＹＴＲＧＬＳＰＡＴＧＴ（配列番号２６）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（１６）ＴＧＧＤＰＴＲＧＴＧＬＳＰＶＴＧＡ（配列番号２７）である。
【００６３】
一部の場合において、ペプチド挿入物は、式Ｖのペプチド：ＴＧＸ1 ＤＸ2 ＴＲＸ3 Ｘ4 ＧＬＳＰＶＴＧＴ（配列番号１４０）のペプチドである。式中、Ｘ1 が、Ｌ、Ｓ、Ａ、またはＧであり、Ｘ2 が、Ａ、Ｇ、またはＰであり、Ｘ8 が、Ｄ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ4 が、Ｈ、Ｒ、またはＴである。
【００６４】
式Ｖのペプチド挿入物としては、限定されないが、（１３）ＴＧＬＤＡＴＲＤＨＧＬＳＰＶＴＧＴ（配列番号２４）、（１４）ＴＧＳＤＧＴＲＤＨＧＬＳＰＶＴＷＴ（配列番号２５）、及び（１６）ＴＧＧＤＰＴＲＧＴＧＬＳＰＶＴＧＡ（配列番号２７）が挙げられる。
【００６５】
一部の場合において、ペプチド挿入物は、式ＶＩのペプチド：ＬＱＸ1 Ｘ2 Ｘ3 ＲＸ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7 Ｘ8 Ｘ9 ＶＮＸ10Ｑ（配列番号１４１）である。式中、Ｘ1 が、ＫまたはＲであり、Ｘ2 が、Ｎ、Ｇ、またはＡであり、Ｘ3 が、Ａ、Ｖ、Ｎ、またはＤであり、Ｘ4 が、Ｐ、Ｉ、またはＱであり、Ｘ5 が、Ａ、Ｐ、またはＶであり、Ｘ6 が、Ｓ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ7 が、ＴまたはＶであり、Ｘ8 が、Ｅ、Ｌ、Ａ、またはＶであり、Ｘ9 が、Ｓ、Ｅ、Ｄ、またはＶであり、Ｘ10が、Ｆ、Ｇ、Ｔ、またはＣである。
【００６６】
式ＶＩのペプチドとしては、限定されないが、（１７）ＬＱＫＮＡＲＰＡＳＴＥＳＶＮＦＱ（配列番号２８）、（１８）ＬＱＲＧＶＲＩＰＳＶＬＥＶＮＧＱ（配列番号２９）、（１９）ＬＱＲＧＮＲＰＶＴＴＡＤＶＮＴＱ（配列番号３０）、及び（２０）ＬＱＫＡＤＲＱＰＧＶＶＶＶＮＣＱ（配列番号３１）が挙げられる。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（１７）ＬＱＫＮＡＲＰＡＳＴＥＳＶＮＦＱ（配列番号２８）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（１８）ＬＱＲＧＶＲＩＰＳＶＬＥＶＮＧＱ（配列番号２９）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（１９）ＬＱＲＧＮＲＰＶＴＴＡＤＶＮＴＱ（配列番号３０）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（２０）ＬＱＫＡＤＲＱＰＧＶＶＶＶＮＣＱ（配列番号３１）である。
【００６７】
上述したペプチド挿入物のいずれも、ＡＡＶカプシドポリペプチドのＧＨループ内の同じ数の隣接したアミノ酸を置き換えることができる。例えば、一部の場合において、式ＶＩのペプチド：ＬＱＸ1 Ｘ2 Ｘ3 ＲＸ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7 Ｘ8 Ｘ9 ＶＮＸ10Ｑ（配列番号１４１）（式中、Ｘ1 が、ＫまたはＲであり、Ｘ2 が、Ｎ、Ｇ、またはＡであり、Ｘ3 が、Ａ、Ｖ、Ｎ、またはＤであり、Ｘ4 が、Ｐ、Ｉ、またはＱであり、Ｘ5 が、Ａ、Ｐ、またはＶであり、Ｘ6 が、Ｓ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ7 が、ＴまたはＶであり、Ｘ8 が、Ｅ、Ｌ、Ａ、またはＶであり、Ｘ9 が、Ｓ、Ｅ、Ｄ、またはＶであり、Ｘ10が、Ｆ、Ｇ、Ｔ、またはＣである）は、ＡＡＶカプシドポリペプチドのＧＨループ内の隣接したひと続きの５アミノ酸〜２０アミノ酸を置き換える。言い換えれば、一部の場合において、「挿入ペプチド」は、ＡＡＶカプシドポリペプチドのＧＨループ内に存在する内在的なペプチド（例えば、隣接したひと続きの５アミノ酸〜２０アミノ酸）を置き換えて、ＧＨループ内に異種ペプチドを含むバリアントＡＡＶカプシドをもたらす。一部の場合において、「挿入ペプチド」は、挿入ペプチドと同じ長さの内在的な隣接したひと続きのアミノ酸を置き換える。したがって、例えば「挿入ペプチド」が１６アミノ酸長を有するとき、一部の場合において、内在的な隣接したひと続きの１６アミノ酸は、この挿入ペプチドで置き換えられる。
【００６８】
式ＶＩのペプチドとしては、限定されないが、（１７）ＬＱＫＮＡＲＰＡＳＴＥＳＶＮＦＱ（配列番号２８）、（１８）ＬＱＲＧＶＲＩＰＳＶＬＥＶＮＧＱ（配列番号２９）、（１９）ＬＱＲＧＮＲＰＶＴＴＡＤＶＮＴＱ（配列番号３０）、及び（２０）ＬＱＫＡＤＲＱＰＧＶＶＶＶＮＣＱ（配列番号３１）が挙げられる。一部の場合において、ＡＡＶカプシドのＧＨループ内の内在的なアミノ酸配列を置き換えるペプチドは、（１７）ＬＱＫＮＡＲＰＡＳＴＥＳＶＮＦＱ（配列番号２８）である。一部の場合において、ペプチド挿入物は、（１８）ＬＱＲＧＶＲＩＰＳＶＬＥＶＮＧＱ（配列番号２９）である。一部の場合において、ＡＡＶカプシドのＧＨループ内の内在的なアミノ酸配列を置き換えるペプチドは、（１９）ＬＱＲＧＮＲＰＶＴＴＡＤＶＮＴＱ（配列番号３０）である。一部の場合において、ＡＡＶカプシドのＧＨループ内の内在的なアミノ酸配列を置き換えるペプチドは、（２０）ＬＱＫＡＤＲＱＰＧＶＶＶＶＮＣＱ（配列番号３１）である。
【００６９】
一部の場合において、式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つのペプチド挿入物はさらに、ペプチドのＮ末端に１つまたは２つのリンカーアミノ酸を、及び／またはペプチドのＣ末端に１つ以上のアミノ酸を含む。例えば、一部の場合において、ペプチド挿入物は、Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−［式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つのペプチド］−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（配列番号１４２）を含む。別の例として、一部の場合において、ペプチド挿入物は、Ｌｅｕ−Ａｌａ−［式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つのペプチド］−Ａｌａ（配列番号１４３）を含む。別の例として、一部の場合において、ペプチド挿入物は、Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−［式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つのペプチド］−Ｇｌｎを含む。一部の場合において、ペプチド挿入物は、いかなるリンカーアミノ酸も含まない。
【００７０】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンカプシドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で、ＧＨループまたはループＩＶ内における約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸、例えば、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、または１２アミノ酸）の挿入以外には、他のいかなるアミノ酸の置換、挿入、または欠失も含まない。他の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンカプシドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で、ＧＨループまたはループＩＶ内における約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸、例えば、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、または１２アミノ酸）の挿入に加えて、親ＡＡＶカプシドタンパク質との比較で１〜約２５アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む。例えば、一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンカプシドは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で、ＧＨループまたはループＩＶ内における約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸、例えば、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、または１２アミノ酸）の挿入に加えて、親ＡＡＶカプシドタンパク質との比較で１〜約５、約５〜約１０、約１０〜約１５、約１５〜約２０、または約２０〜約２５アミノ酸の挿入、欠失、または置換を含む。ある特定の実施形態において、親ＡＡＶカプシドタンパク質との比較で１つ以上のアミノ酸（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸）の欠失は、ペプチド挿入の部位で生じる。
【００７１】
一部の場合において、本開示のバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、アミノ酸置換：Ｙ２７３Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、及びＹ７３０Ｆのうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含まない。
【００７２】
一部の場合において、本開示のバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドは、上述した挿入ペプチドに加えて、アミノ酸置換：Ｙ２７３Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、及びＹ７３０Ｆのうちの１つ、２つ、３つ、または４つを含む。
【００７３】
一部の場合において、本開示のバリアントｒＡＡＶカプシドポリペプチドは、キメラカプシドであり、例えば、カプシドは、第１のＡＡＶ血清型のＡＡＶカプシドの一部分と第２の血清型のＡＡＶカプシドの一部分とを含み、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で、ＧＨループまたはループＩＶ内における約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸、例えば、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、または１２アミノ酸）の挿入を含む。
【００７４】
組換えＡＡＶビリオン
本開示は、ｉ）本開示のバリアントＡＡＶカプシドポリペプチドと、ｉｉ）異種ポリペプチド（すなわち、非ＡＡＶポリペプチド）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンを提供する。
【００７５】
一部の場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、図４に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で、ＧＨループまたはループＩＶ内における約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸、例えば、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、または１２アミノ酸）の挿入とを含む。一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、図４に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、図４に示されるアミノ酸配列との対比でアミノ酸５８７と５８８との間、または対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で対応する部位における約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸、例えば、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、または１２アミノ酸）の挿入とを含む。
【００７６】
一部の場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、図４に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で、ＧＨループまたはループＩＶ内における約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸、例えば、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、または１２アミノ酸）の挿入とを含む。一部の場合において、主題ｒＡＡＶビリオンは、図４に示されるアミノ酸配列に対し少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、図４に示されるアミノ酸配列との対比でアミノ酸５８５と５９８との間、または対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で対応する部位における約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸、例えば、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、または１２アミノ酸）の挿入とを含む。
【００７７】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、図５に記載のアミノ酸配列に対し少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むＧＨループを含むカプシドタンパク質と、太字及び下線で示されたアミノ酸間における約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸、例えば、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、または１２アミノ酸）の挿入とを含む。
【００７８】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、図６Ａ〜６Ｃに示されるアミノ酸配列のいずれか１つに対し少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質と、アミノ酸５８７と５８８との間、または別のＡＡＶ遺伝子型との対比で対応する部位における約５アミノ酸〜約２０アミノ酸（例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸、例えば、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、または１２アミノ酸）の挿入とを含む。一部の場合において、対応する挿入部位は、図６Ｂで太字テキスト及び下線で示されている部位である。
【００７９】
本開示のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の網膜細胞の感染力の増大を示す。
【００８０】
所与のｒＡＡＶビリオンが網膜細胞の感染力の増大を示すかどうかは、ｒＡＡＶビリオンの硝子体内投与の後に、網膜細胞におけるｒＡＡＶビリオンによりコードされる異種遺伝子産物の発現を検出することにより決定することができる。例えば、ａ）上述したペプチド挿入物またはペプチド置換えを含む本開示のバリアントカプシドと、ｂ）異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む、本開示のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に投与されたときに、ａ）ペプチド挿入物もペプチド置換えも含まない対照ＡＡＶカプシドと、ｂ）異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む、対照ｒＡＡＶビリオンが、硝子体内に投与されたときにもたらす網膜細胞における遺伝子産物レベルよりも、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超である網膜細胞における異種遺伝子産物レベルをもたらす。
【００８１】
所与のｒＡＡＶビリオンが網膜細胞の感染力の増大を示すかどうかは、網膜細胞におけるｒＡＡＶビリオンによりコードされる治療用遺伝子産物の治療効果を評価することにより決定することができる。治療効果としては、例えば、ａ）視覚機能（例えば、視野、視力）の喪失速度の低下、ｂ）視覚機能の改善（例えば、視野または視力の改善）、ｃ）光に対する敏感性（すなわち、羞明）の低下、眼球振とうの低下等が挙げられ得る。例えば、ａ）上述したペプチド挿入物またはペプチド置換えを含む本開示のバリアントカプシドと、ｂ）異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む、本開示のｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に投与されたときに、ａ）ペプチド挿入物もペプチド置換えも含まない対照ＡＡＶカプシドと、ｂ）治療用異種遺伝子産物をコードする異種ヌクレオチド配列とを含む、対照ｒＡＡＶビリオンが、硝子体内に投与されたときにもたらす網膜細胞における治療効果よりも、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超である網膜細胞における治療効果をもたらす。視覚機能の試験は当技術分野において公知であり、任意のこのような試験が、本開示のｒＡＡＶビリオンが網膜細胞の感染力の増大を示すかどうかを決定するために使用することができる。
【００８２】
本開示のｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質（すなわち、挿入ペプチドも置換えペプチドも伴わないＡＡＶカプシドタンパク質）を含む対照ＡＡＶビリオンの能力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の、硝子体内液と網膜細胞との間のバリアを横断する能力の増大を示す。
【００８３】
一部の場合において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の網膜細胞の感染力の増大を示す。
【００８４】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる光受容体（桿体または錐体）細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超増大した光受容体細胞の感染力を示す。
【００８５】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのＡＡＶビリオンによる光受容体（桿体または錐体）細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の光受容体細胞の感染力の増大を示す。
【００８６】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＧＣの感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のＲＧＣの感染力の増大を示す。
【００８７】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのＡＡＶビリオンによるＲＧＣの感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のＲＧＣの感染力の増大を示す。
【００８８】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＲＰＥ細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のＲＰＥ細胞の感染力の増大を示す。
【００８９】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのＡＡＶビリオン細胞によるＲＰＥ細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のＲＰＥ細胞の感染力の増大を示す。
【００９０】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるミュラー細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のミュラー細胞の感染力の増大を示す。
【００９１】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのＡＡＶビリオン細胞によるミュラー細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のミュラー細胞の感染力の増大を示す。
【００９２】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる双極細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の双極細胞の感染力の増大を示す。
【００９３】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのＡＡＶビリオン細胞による双極細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の双極細胞の感染力の増大を示す。
【００９４】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるアマクリン細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のアマクリン細胞の感染力の増大を示す。
【００９５】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのＡＡＶビリオン細胞によるアマクリン細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のアマクリン細胞の感染力の増大を示す。
【００９６】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる水平細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の水平細胞の感染力の増大を示す。
【００９７】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのＡＡＶビリオン細胞による水平細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の水平細胞の感染力の増大を示す。
【００９８】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜星状細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の網膜星状細胞の感染力の増大を示す。
【００９９】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのＡＡＶビリオンによる網膜星状細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の網膜星状細胞の感染力の増大を示す。
【０１００】
一部の場合において、主題ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンにおける網膜細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を横断する能力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の網膜ＥＣＭを横断する能力の増大を示す。
【０１０１】
一部の場合において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのＡＡＶビリオンにおける網膜細胞外マトリックス（ＥＣＭ）を横断する能力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のＥＣＭを横断する能力の増大を示す。
【０１０２】
一部の場合において、主題ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンにおける内境界膜（ＩＬＭ）を横断する能力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のＩＬＭを横断する能力の増大を示す。
【０１０３】
一部の場合において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのＡＡＶビリオンにおけるＩＬＭを横断する能力と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のＩＬＭを横断する能力の増大を示す。
【０１０４】
主題ｒＡＡＶビリオンは、ＩＬＭを横断することができ、また、ミュラー細胞、アマクリン細胞等を含めた細胞層を通過して、光受容体細胞及びまたはＲＰＥ細胞に到達することもできる。例えば、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、ＩＬＭを横断することができ、また、ミュラー細胞、アマクリン細胞等を含めた細胞層を通過して、光受容体細胞及びまたはＲＰＥ細胞に到達することもできる。
【０１０５】
一部の場合において、主題ｒＡＡＶビリオンは、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節層、または網膜色素上皮に対する局在化の程度と比較して、内顆粒層、外顆粒層、光受容体層、神経節細胞層、及び網膜色素上皮のうちの１つ以上に対する少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の局在化の増大を示す。
【０１０６】
一部の場合において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射されたときに、硝子体内に注射された対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによるＩＬＭを越えた局在化の程度と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のＩＬＭを越えた局在化の増大を示す。例えば、一部の場合において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射されたときに、硝子体内に注射された対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜色素上皮（ＲＰＥ）層に対する局在化の程度と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のＲＰＥに対する局在化の増大を示す。別の例として、一部の場合において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射されたときに、硝子体内に注射された対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる光受容体（ＰＲ）層に対する局在化と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超のＰＲ層に対する局在化の増大を示す。別の例として、一部の場合において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射されたときに、硝子体内に注射された対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる内顆粒層に対する局在化の程度と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の内顆粒層に対する局在化の増大を示す。別の例として、一部の場合において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射されたときに、硝子体内に注射された対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる外顆粒層に対する局在化の程度と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の外顆粒層に対する局在化の増大を示す。別の例として、一部の場合において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内に注射されたときに、硝子体内に注射された対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる神経節細胞層に対する局在化と比較して、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の神経節細胞層に対する局在化の増大を示す。
【０１０７】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、網膜細胞に選択的に感染し、例えば、主題ｒＡＡＶビリオンは、非網膜細胞（例えば、眼以外の細胞）に対し１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍超の特異性で網膜細胞に感染する。例えば、一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、網膜細胞に選択的に感染し、例えば、主題ｒＡＡＶビリオンは、非網膜細胞（例えば、眼以外の細胞）に対し１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍超の特異性で光受容体細胞に感染する。
【０１０８】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、光受容体細胞に選択的に感染し、例えば、主題ｒＡＡＶビリオンは、眼内に存在する非光受容体細胞（例えば、網膜神経節細胞、ミュラー細胞等）に対し１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、５０倍、または５０倍超の特異性で光受容体細胞に感染する。
【０１０９】
一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、硝子体内注射を介し投与されたときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンが硝子体内注射を介し投与されたときのＡＡＶビリオン細胞による光受容体細胞の感染力と比較して、少なくとも１０倍、少なくとも１５倍、少なくとも２０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の光受容体細胞の感染力の増大を示す。
【０１１０】
遺伝子産物
本開示のｒＡＡＶビリオンは、１つ以上の遺伝子産物（１つ以上の異種遺伝子産物）をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。一部の場合において、遺伝子産物は、ポリペプチドである。一部の場合において、遺伝子産物は、ＲＮＡである。一部の場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、異種核酸遺伝子産物及び異種ポリペプチド遺伝子産物の両方をコードする異種ヌクレオチド配列を含む。遺伝子産物がＲＮＡである場合、一部の場合において、ＲＮＡ遺伝子産物は、ポリペプチドをコードする。遺伝子産物がＲＮＡである場合、一部の場合において、ＲＮＡ遺伝子産物は、ポリペプチドをコードしない。一部の場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、１つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。一部の場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、２つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。単一の異種核酸が２つの異種遺伝子産物をコードする場合、一部の場合において、２つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、同じプロモーターに対し作用可能に結合している。単一の異種核酸が２つの異種遺伝子産物をコードする場合、一部の場合において、２つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、２つの異なるプロモーターに対し作用可能に結合している。一部の場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、３つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む単一の異種核酸を含む。単一の異種核酸が３つの異種遺伝子産物をコードする場合、一部の場合において、３つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、同じプロモーターに対し作用可能に結合している。単一の異種核酸が３つの異種遺伝子産物をコードする場合、一部の場合において、３つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、２つまたは３つの異なるプロモーターに対し作用可能に結合している。一部の場合において、本開示のｒＡＡＶビリオンは、２つの異種核酸であって、各々が１つの異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む、２つの異種核酸を含む。
【０１１１】
一部の場合において、遺伝子産物は、ポリペプチドをコードするＲＮＡである。一部の場合において、遺伝子産物は、干渉ＲＮＡである。一部の場合において、遺伝子産物は、アプタマーである。一部の場合において、遺伝子産物は、ポリペプチドである。一部の場合において、遺伝子産物は、治療用ポリペプチド、例えば、臨床的利益をもたらすポリペプチドである。一部の実施形態において、遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンをもたらす部位特異的ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、遺伝子産物は、標的核酸の修飾をもたらすＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。一部の場合において、遺伝子産物は、ｉ）標的核酸の修飾をもたらすＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）標的核酸内の標的配列に結合する第１のセグメントと、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントとを含む、ガイドＲＮＡである。一部の場合において、遺伝子産物は、ｉ）標的核酸の修飾をもたらすＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、ｉｉ）標的核酸内の第１の標的配列に結合する第１のセグメントと、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントとを含む、第１のガイドＲＮＡ、及びｉｉｉ）標的核酸内の第２の標的配列に結合する第１のセグメントと、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合する第２のセグメントとを含む、第１のガイドＲＮＡである。
【０１１２】
干渉ＲＮＡ
遺伝子産物が干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）である場合、好適なＲＮＡｉとしては、細胞におけるアポトーシス因子または血管新生因子のレベルを低下させるＲＮＡｉが挙げられる。例えば、ＲＮＡｉは、細胞におけるアポトーシスを誘導または促進する遺伝子産物のレベルを低減するｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子は、本明細書では「アポトーシス促進遺伝子」と呼ばれ、このような遺伝子の産物（ｍＲＮＡ、タンパク質）は、「アポトーシス促進遺伝子産物」と呼ばれる。アポトーシス促進遺伝子産物としては、例えば、Ｂａｘ、Ｂｉｄ、Ｂａｋ、及びＢａｄ遺伝子産物が挙げられる。例えば、米国特許第７，８４６，７３０号を参照。
【０１１３】
また、干渉ＲＮＡは、血管新生産物、例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、Ｃａｎｄ５、例えば、米国特許公開第２０１１／０１４３４００号、米国特許公開第２００８／０１８８４３７号、及びＲｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０を参照）、ＶＥＧＦ受容体１（ＶＥＧＦＲ１）（例えば、Ｓｉｒｎａ−０２７、例えば、Ｋａｉｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ａｍ．Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．１５０：３３、及びＳｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１３：２２５を参照）、またはＶＥＧＦ受容体２（ＶＥＧＦＲ２）（Ｋｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：１５０６４）に対するものでもあり得る。米国特許第６，６４９，５９６号、第６，３９９，５８６号、第５，６６１，１３５号、第５，６３９，８７２号、及び第５，６３９，７３６号、ならびに米国特許第７，９４７，６５９号及び第７，９１９，４７３号も参照。
【０１１４】
アプタマー
遺伝子産物がアプタマーである場合、例示的な関心対象アプタマーとしては、ＶＥＧＦに対するアプタマーが挙げられる。例えば、Ｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ５：１２３、及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１８９０２を参照。例えば、ＶＥＧＦアプタマーは、ヌクレオチド配列５′−ｃｇｃａａｕｃａｇｕｇａａｕｇｃｕｕａｕａｃａｕｃｃｇ−３′（配列番号３）を含むことができる。また、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）特異的アプタマー（例えば、Ｅ１００３０）も使用に好適である。例えば、Ｎｉ  ａｎｄ  Ｈｕｉ（２００９）  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃａ  ２２３：４０１、及びＡｋｉｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０７：４０７を参照。
【０１１５】
ポリペプチド
遺伝子産物がポリペプチドである場合、一部の場合において、ポリペプチドは、網膜細胞の機能、例えば、桿体または錐体光受容体細胞、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞の機能を強化するポリペプチドである。例示的なポリペプチドとしては、神経保護ポリペプチド（グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、神経成長因子（ＮＧＦ）、及びニュールツリン（ＮＴＮ））、抗血管新生ポリペプチド（例えば、可溶性ＶＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦ結合抗体、ＶＥＧＦ結合抗体断片（例えば、１本鎖抗ＶＥＧＦ抗体）、エンドスタチン、タムスタチン、アンジオスタチン、可溶性Ｆｌｔポリペプチド（Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１２：６５９）、可溶性Ｆｌｔポリペプチドを含むＦｃ融合タンパク質（例えば、Ｐｅｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．１６：１０を参照）、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）、可溶性Ｔｉｅ−２受容体等）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質３（ＴＩＭＰ−３）、光応答性オプシン、例えば、ロドプシン、抗アポトーシスポリペプチド（例えば、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−Ｘｌ、ＸＩＡＰ）などが挙げられる。好適なポリペプチドとしては、限定されないが、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、線維芽細胞成長因子、線維芽細胞成長因子２、ニュールツリン（ＮＴＮ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン４（ＮＴ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、例えば、図７Ｂに示されているアミノ酸配列（配列番号１１）の隣接したひと続きの約２００アミノ酸〜２４７アミノ酸に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、上皮成長因子、ロドプシン、Ｘ連鎖アポトーシス阻害物質、及びソニックヘッジホッグが挙げられる。
【０１１６】
好適な光応答性オプシンとしては、例えば、米国特許公開第２００７／０２６１１２７号（例えば、チャネルロドプシン２、ＣｈＲ２、Ｃｈｏｐ２）、米国特許公開第２００１／００８６４２１号、米国特許公開第２０１０／００１５０９５号、米国特許公開第２０１６／０００２３０２号、米国特許公開第２０１３／０３４７１３７号、米国特許公開第２０１３／００１９３２５号、及びＤｉｅｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１４：３８７で説明されている光応答性オプシンが挙げられる。Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３０（２６）：８７４５−８７５８、Ｌａｇａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）  Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１１（６）：６６７−６７５、Ｄｏｒｏｕｄｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１９（７）：１２２０−１２２９、Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｊ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｖｉｓ．Ｒｅｓ．９：３７４、Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２：１４３４を参照。
【０１１７】
好適なポリペプチドとしては、光ゲートイオンチャネルポリペプチドが挙げられる。例えば、Ｇａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １１１：Ｅ５５７４を参照。例えば、好適なポリペプチドは、光ゲートイオンチャネル型グルタメート受容体（ＬｉＧｌｕＲ）である。光異化性化合物の存在下での網膜神経節細胞及びＯＮ双極細胞におけるＬｉＧｌｕＲの発現は、細胞を光応答性にする。ＬｉＧｌｕＲは、Ｌ４３９Ｃ置換を含む。Ｃａｐｏｒａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．１９：１２１２−１２１９、Ｖｏｌｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）  Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２：４７−５２、及びＧｏｒｏｓｔｉｚａ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０４：１０８６５−１０８７０を参照。光異化性化合物としては、例えば、４６０ｎｍにおけるピーク効率を有するマレイミド−アゾベンゼン−グルタメート０（ＭＡＧ０460 ）が挙げられる。ＭＡＧ０460 は、以下の構造を有する。
【０１１８】
【化１】
2020528734.tif 000003
【０１１９】
また、好適なポリペプチドとしては、レチノスキシン（例えば、図７Ａに示されているアミノ酸配列（配列番号１０）の隣接したひと続きの約２００アミノ酸〜２２４アミノ酸に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）も挙げられる。好適なポリペプチドとしては、例えば、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御物質（ＲＰＧＲ）相互作用タンパク質１（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｑ９６ＫＮ７、Ｑ９ＥＰＱ２、及びＱ９ＧＬＭ３を参照）（例えば、図７Ｆに示されているアミノ酸配列（配列番号１５）の隣接したひと続きの約１１５０アミノ酸〜約１２００アミノ酸、または約１２００アミノ酸〜１２８６アミノ酸に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、ペリフェリン２（Ｐｒｐｈ２）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００３１３（例えば、図７Ｄに示されているアミノ酸配列（配列番号１３）の隣接したひと続きの約３００アミノ酸〜３４６アミノ酸に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、及びＴｒａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １０：７３３を参照）、ペリフェリン（例えば、図７Ｅに示されているアミノ酸配列（配列番号１４）の隣接したひと続きの約４００アミノ酸〜約４７０アミノ酸に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、網膜色素上皮特異的タンパク質（ＲＰＥ６５）（例えば、図７Ｃに示されているアミノ酸配列（配列番号１２）の隣接したひと続きの約２００アミノ酸〜２４７アミノ酸に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  ＡＡＣ３９６６０、及びＭｏｒｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：３０８８を参照）、桿体由来錐体生存因子（ＲｄＣＶＦ）（例えば、図７Ｈ、７Ｉ、及び７Ｊのうちのいずれか１つに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）（例えば、図７Ｇに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御物質（ＲＰＧＲ）（例えば、図７Ｓ〜７Ｖのうちの１つに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド）などが挙げられる。例えば、一部の場合において、好適なＲＰＧＲポリペプチドは、図７Ｓに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の例として、一部の場合において、好適なＲＰＧＲポリペプチドは、図７Ｔに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、一部の場合において、好適なＲＰＧＲポリペプチドは、図７Ｕに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。例えば、一部の場合において、好適なＲＰＧＲポリペプチドは、図７Ｖに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２０】
また、好適なポリペプチドとしては、欠陥があるか欠損している場合にコロイデレミアを引き起こすポリペプチドであるＣＨＭ（コロイデレミア（Ｒａｂエスコートタンパク質１（ＲＥＰ１）））（例えば、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０１７、及びｖａｎ  Ｂｏｋｈｏｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）  Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．３：１０４１を参照）、ならびに、欠陥があるか欠損している場合にレーバー先天黒内障及び網膜色素変性を引き起こすポリペプチドであるＣｒｕｍｂｓホモログ１（ＣＲＢ１）（例えば、ｄｅｎ  Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２３：２１７、及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＣＡＭ２３３２８を参照）も挙げられる。例えば、好適なＲＥＰ１ポリペプチドは、図７Ｇに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。
【０１２１】
好適なポリペプチドとしては、桿体ｃＧＭＰ特異的３′，５′−環状ホスホジエステラーゼサブユニットアルファ（ＰＤＥ６α）、桿体ｃＧＭＰ特異的３′，５′−環状ホスホジエステラーゼサブユニットベータアイソフォーム１（ＰＤＥ６βアイソフォーム１）、桿体ｃＧＭＰ特異的３′，５′−環状ホスホジエステラーゼサブユニットベータアイソフォーム２（ＰＤＥ６βアイソフォーム２）、桿体ｃＧＭＰ特異的３′，５′−環状ホスホジエステラーゼサブユニットベータアイソフォーム３（ＰＤＥ６βアイソフォーム３）が挙げられる。例えば、好適なＰＤＥ６αポリペプチドは、図７Ｋに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、好適なＰＤＥ６β６アイソフォーム１ポリペプチドは、図７Ｌに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、好適なＰＤＥ６β６アイソフォーム２ポリペプチドは、図７Ｍに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、好適なＰＤＥ６β６ポリアイソフォームペプチドは、図７Ｎに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。
【０１２２】
また、好適なポリペプチドとしては、欠陥があるか欠損している場合に１色覚をもたらすポリペプチドも挙げられ、このようなポリペプチドとしては、例えば、錐体光受容体ｃＧＭＰゲートチャネルサブユニットアルファ（ＣＮＧＡ３）（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１２８９、及びＢｏｏｉｊ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  １１８：１６０−１６７を参照）、錐体光受容体ｃＧＭＰゲートカチオンチャネルベータサブユニット（ＣＮＧＢ３）（例えば、Ｋｏｈｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ．１３（３）：３０２を参照）、グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、アルファ形質導入活性ポリペプチド２（ＧＮＡＴ２）（ＡＣＨＭ４）、ならびに、欠損があるか欠損している場合に様々な形態の色覚異常をもたらすポリペプチド（例えば、Ｌ−オプシン、Ｍ−オプシン、及びＳ−オプシン）が挙げられる。Ｍａｎｃｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）  Ｎａｔｕｒｅ  ４６１（７２６５）：７８４−７８７を参照。
【０１２３】
例えば、好適なＣＮＧＡ３（別称ＡＣＨＭ２）アイソフォーム１ポリペプチドは、図７Ｏに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、好適なＣＮＧＡ３（別称ＡＣＨＭ２）アイソフォーム２ポリペプチドは、図７Ｐに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。
【０１２４】
別の例として、好適なＣＮＧＢ３（別称ＡＣＨＭ３）ポリペプチドは、図７Ｑに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。別の例として、ＧＮＡＴ２（別称ＡＣＨＭ４）は、図７Ｒに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み得る。
【０１２５】
部位特異的エンドヌクレアーゼ
一部の場合において、関心対象遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンをもたらす部位特異的エンドヌクレアーゼであり、例えば、このエンドヌクレアーゼは網膜疾患に関連するアレルをノックアウトする。例えば、野生型であるときに、優性アレルが、網膜の構造タンパク質である及び／または正常な網膜機能をもたらす遺伝子の欠陥コピーをコードする場合、部位特異的エンドヌクレアーゼは、欠陥アレルに対し標的化され、欠陥アレルをノックアウトすることができる。一部の場合において、部位特異的エンドヌクレアーゼは、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。
【０１２６】
部位特異的ヌクレアーゼは、欠陥アレルをノックアウトすることに加えて、欠陥アレルによりコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするドナーＤＮＡを伴った相同的組換えを刺激するために使用することもできる。したがって、例えば、主題ｒＡＡＶビリオンは、欠陥アレルをノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼと、欠陥アレルの機能的コピーとを共に送達するために使用して、それにより、機能的網膜タンパク質（例えば、機能的レチノスキシン、機能的ＲＰＥ６５、機能的ペリフェリン等）の産生をもたらすことができる。例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４７５：２１７を参照。一部の実施形態において、主題ｒＡＡＶビリオンは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする異種ヌクレオチド配列と、機能的網膜タンパク質をコードする、欠陥アレルの機能的コピーをコードする異種ヌクレオチド配列とを含む。機能的網膜タンパク質としては、例えば、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御物質（ＲＧＰＲ）相互作用タンパク質１、ペリフェリン、ペリフェリン２、ＲｄＣＶＦなどが挙げられる。
【０１２７】
使用に好適な部位特異的エンドヌクレアーゼとしては、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、及び転写活性化因子用エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）が挙げられ、このような部位特異的エンドヌクレアーゼは非天然存在であり、特定の遺伝子を標的化するように修飾される。このような部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の位置をカットするように操作することができ、次に非相同末端結合が、いくつかのヌクレオチドを挿入または欠失しながら破損を修復することができる。次に、このような部位特異的ヌクレアーゼ（「インデル」とも呼ばれる）は、フレームからタンパク質を放出し、遺伝子を有効にノックアウトする。例えば、米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照。好適な部位特異的エンドヌクレアーゼとしては、操作されたメガヌクレアーゼ及び再操作されたホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられる。好適なエンドヌクレアーゼとしては、Ｉ−Ｔｅｖｌヌクレアーゼが挙げられる。好適なメガヌクレアーゼとしては、Ｉ−Ｓｃｅ１（例えば、Ｂｅｌｌａｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５２：１０３７を参照）、及びＩ−Ｃｒｅ１（Ｈｅａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：４６８）が挙げられる。
【０１２８】
ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ
一部の場合において、遺伝子産物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。一部の場合において、遺伝子産物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡである。一部の場合において、遺伝子産物は、ガイドＲＮＡ、例えば、シングルガイドＲＮＡである。一部の場合において、遺伝子産物は、１）ガイドＲＮＡ、及び２）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。ガイドＲＮＡは、ａ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼに結合するタンパク質結合領域、及びｂ）標的核酸に結合する領域を含み得る。ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、本明細書では「ゲノム編集ヌクレアーゼ」とも呼ばれる。
【０１２９】
好適なゲノム編集ヌクレアーゼの例は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼのようなクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）である。好適なゲノム編集ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、ＩＩ型、Ｖ型、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼのようなクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）である。一部の場合において、ゲノム標的化組成物は、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼを含む。一部の場合において、ゲノム標的化組成物は、クラス２  ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質）を含む。一部の場合において、ゲノム標的化組成物は、クラス２  Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃｐｆ１タンパク質、Ｃ２ｃ１タンパク質、またはＣ２ｃ３タンパク質）を含む。一部の場合において、ゲノム標的化組成物は、クラス２  ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃ２ｃ２タンパク質（Ｃａｓ１３ａタンパク質とも呼ばれる））を含む。ＣａｓＸタンパク質も、使用に好適である。ＣａｓＹタンパク質も、使用に好適である。
【０１３０】
一部の場合において、ゲノム編集ヌクレアーゼは、異種ポリペプチド（「融合パートナー」とも呼ばれる）と融合している融合タンパク質である。一部の場合において、ゲノム編集ヌクレアーゼは、細胞内局在化をもたらすアミノ酸配列（融合パートナー）と融合しており、すなわち、融合パートナーは、細胞内局在化配列である（例えば、核を標的とする１つ以上の核局在化信号（ＮＬＳ）、２つ以上のＮＬＳ、３つ以上のＮＬＳ等）。
【０１３１】
一部の場合において、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の場合において、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントとの会合により、標的核酸配列（例えば、染色体配列または染色体外配列、例えば、エピソーム配列、ミニサークル配列、ミトコンドリア配列、葉緑体配列等）内の標的部位に導かれる（例えば、標的部位で安定化される）。一部の場合において、好適なＣａｓ９ポリペプチドは、図３Ａに示されているＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９に対し少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または９９％超のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の場合において、本開示の組成物または方法で使用されるＣａｓ９ポリペプチドは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９（ｓａＣａｓ９）ポリペプチドである。一部の場合において、ｓａＣａｓ９ポリペプチドは、図３に示されているアミノ酸配列に対し少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
一部の場合において、好適なＣａｓ９ポリペプチドは、ハイフィデリティー（ＨＦ）Ｃａｓ９ポリペプチドである。Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２９：４９０を参照。例えば、図３Ａに示されているアミノ酸配列のアミノ酸Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、及びＱ９２６は、例えば、アラニンで置換される。例えば、ＨＦ  Ｃａｓ９ポリペプチドは、図３Ａに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有し、アミノ酸Ｎ４９７、Ｒ６６１、Ｑ６９５、及びＱ９２６が、例えば、アラニンで置換される、アミノ酸配列を含み得る。
【０１３３】
一部の場合において、好適なＣａｓ９ポリペプチドは、改変されたＰＡＭ特異性を示す。例えば、Ｋｌｅｉｎｓｔｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５２３：４８１を参照。
【０１３４】
一部の場合において、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、Ｖ型  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼである。一部の場合において、Ｖ型  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１タンパク質である。一部の場合において、Ｃｐｆ１タンパク質は、図３Ｃに示されているアミノ酸配列に対し少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、または１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３５】
一部の場合において、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、ＣａｓＸまたはＣａｓＹポリペプチドである。ＣａｓＸ及びＣａｓＹポリペプチドは、Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）  Ｎａｔｕｒｅ  ５４２：２３７で説明されている。
【０１３６】
酵素的に不活性なＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ
酵素活性が低減したＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼも使用に好適である。このようなＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、「死んだ」ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと呼ばれる。例えば、実質的にエンドヌクレアーゼ活性を示さず、ただしガイドＲＮＡと複合体化している場合は依然として標的核酸に結合するような、ある特定のアミノ酸置換を含むＣａｓ９ポリペプチドは、「死んだ」Ｃａｓ９または「ｄＣａｓ９」と呼ばれる。一部の場合において、「死んだ」Ｃａｓ９タンパク質は、２本鎖標的核酸の相補鎖及び非相補鎖の両方を切断する能力が低減している。例えば、「ヌクレアーゼ欠陥」Ｃａｓ９は、機能するＲｕｖＣドメインが欠如し（すなわち、２本鎖標的ＤＮＡの非相補鎖を切断しない）、かつ機能するＨＮＨドメインが欠如している（すなわち、２本鎖標的ＤＮＡの相補鎖を切断しない）。非限定的な例として、一部の場合において、ヌクレアーゼ欠陥Ｃａｓ９タンパク質は、配列番号１５の残基Ｄ１０及びＨ８４０（またはＣａｓ９のホモログの対応する残基）に対応するアミノ酸位置に変異を有し、当該ポリペプチドが、標的核酸の相補鎖及び非相補鎖の両方の切断能力が低減する（例えば、切断しない）ようにする。このようなＣａｓ９タンパク質は、標的核酸（例えば、１本鎖または２本鎖の標的核酸）を切断する能力が低減しているが、標的核酸に結合する能力を保持する。（例えばＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインの触媒ドメインにおける、例えば１つ以上の変異により）標的核酸を切断することができないＣａｓ９タンパク質は、「ヌクレアーゼ欠陥Ｃａｓ９」、「死んだＣａｓ９」、または単に「ｄＣａｓ９」と呼ばれる。他の残基も上記の効果を達成する（例えば、どれか１つの他のヌクレアーゼ部分を不活性化する）ように変異させることができる。非限定的な例として、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９の残基Ｄ１０、Ｇ１２、Ｇ１７、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、Ｈ９８２、Ｈ９８３、Ａ９８４、Ｄ９８６、及び／またはＡ９８７（あるいはＣａｓ９ホモログの対応するアミノ酸）を改変する（すなわち、置換する）ことができる。一部の場合において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９のＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、及びＤ９８６のうちの２つ以上（またはＣａｓ９ホモログの対応するアミノ酸）が置換される。一部の場合において、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９のＤ１０及びＮ８６３（またはＣａｓ９ホモログの対応するアミノ酸）がＡｌａで置換される。また、アラニン置換以外の変異も好適である。
【０１３７】
一部の場合において、ゲノム編集エンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９相乗的活性化媒介物質（Ｃａｓ９−ＳＡＭ）として知られるＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（及び対応するガイドＲＮＡ）である。Ｃａｓ９−ＳＡＭシステムのＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）は、転写活性化ドメイン（好適な転写活性化ドメインとしては、例えば、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、及びＳＥＴ７／９が挙げられる）または転写抑制ドメイン（好適な転写抑制ドメインとしては、例えば、ＫＲＡＢドメイン、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメイン、及びＳＩＤ４Ｘドメインが挙げられる）と融合している「死んだ」Ｃａｓ９である。Ｃａｓ９−ＳＡＭシステムのガイドＲＮＡは、転写活性化ドメイン（例えば、ＶＰ６４、ｐ６５、ＭｙｏＤ１、ＨＳＦ１、ＲＴＡ、またはＳＥＴ７／９）または転写抑制ドメイン（例えば、ＫＲＡＢドメイン、ＮｕＥドメイン、ＮｃｏＲドメイン、ＳＩＤドメイン、またはＳＩＤ４Ｘドメイン）と融合しているアダプタータンパク質に結合するループを含む。例えば、一部の場合において、ガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡの１つまたは２つのループに挿入されたＭＳ２  ＲＮＡアプタマーを含むシングルガイドＲＮＡであり、ｄＣａｓ９は、ＶＰ６４に融合しているｄＣａｓ９を含む融合ポリペプチドであり、アダプター／機能的タンパク質は、ｉ）ＭＳ２、ｉｉ）ｐ６５、及びｉｉｉ）ＨＳＦ１を含む融合ポリペプチドである。例えば、米国特許公開第２０１６／０３５５７９７号を参照。
【０１３８】
また、ａ）死んだＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、及びｂ）異種融合ポリペプチドを含むキメラポリペプチドも、使用に好適である。好適な異種融合ポリペプチドの例としては、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ切断活性、ＤＮＡ切断活性、ＤＮＡ組込み活性、または核酸結合活性が挙げられる。
【０１３９】
ガイドＲＮＡ
クラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、Ｖ型またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、Ｃｐｆ１タンパク質等）に結合し、複合体を標的核酸内の特定の位置に標的化する核酸は、本明細書では「ガイドＲＮＡ」または「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓガイド核酸」または「ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓガイドＲＮＡ」と呼ばれる。ガードＲＮＡは、標的核酸の配列に相補的なヌクレオチド配列であるガイド配列（本明細書では標的化配列とも呼ばれる）を含む標的化セグメントを含めることにより、複合体（ＲＮＰ複合体）に標的特異性をもたらす。
【０１４０】
一部の場合において、ガイドＲＮＡは、２つの別々の核酸分子：「アクチベーター」及び「ターゲッター」を含み、本明細書では「デュアルガイドＲＮＡ」、「二重分子ガイドＲＮＡ」、「２分子ガイドＲＮＡ」、または「ｄｇＲＮＡ」と呼ばれる。一部の場合において、ガイドＲＮＡは１つの分子であり（例えば、一部のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質については、対応するガイドＲＮＡは単一の分子であり、ある場合において、アクチベーター及びターゲッターは、例えば介在ヌクレオチドを介して、互いに共有結合している）、このガイドＲＮＡは、「シングルガイドＲＮＡ」、「単一分子ガイドＲＮＡ」、「１分子ガイドＲＮＡ」、または単に「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる。
【０１４１】
遺伝子産物がＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、またはＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡの両方である場合、遺伝子産物は、標的核酸を修飾することができる。一部の場合において、例えば、標的核酸が、欠陥アレル内に有害な変異（例えば、網膜細胞標的核酸内の有害な変異）を含む場合、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ／ガイドＲＮＡ複合体は、有害な変異を修正するヌクレオチド配列を含むドナー核酸（例えば、欠陥アレルによりコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするヌクレオチド配列を含むドナー核酸）と共に、例えば、相同組換え修復（ＨＤＲ）を介して、有害な変異を修正するために使用することができる。
【０１４２】
一部の場合において、遺伝子産物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、及び２つの別々のｓｇＲＮＡであり、この２つの別々のｓｇＲＮＡは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して標的核酸の欠失をもたらす。
【０１４３】
一部の場合において、遺伝子産物は、ｉ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）１つのガイドＲＮＡである。一部の場合において、ガイドＲＮＡは、単一分子（または「シングルガイド」）ガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」）である。一部の場合において、ガイドＲＮＡは、デュアル分子（または「デュアルガイド」）ガイドＲＮＡ（「ｄｇＲＮＡ」）である。
【０１４４】
一部の場合において、遺伝子産物は、ｉ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ、及びｉｉ）２つの別々のｓｇＲＮＡであり、この２つの別々のｓｇＲＮＡは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を介して標的核酸の欠失をもたらす。一部の場合において、ガイドＲＮＡは、ｓｇＲＮＡである。一部の場合において、ガイドＲＮＡは、ｄｇＲＮＡである。
【０１４５】
一部の場合において、遺伝子産物は、ｉ）Ｃｐｆ１ポリペプチド、及びｉｉ）ガイドＲＮＡ前駆体であり、このような場合において、当該前駆体は、Ｃｐｆ１ポリペプチドにより切断されて２つ以上のガイドＲＮＡを生成し得る。
【０１４６】
本開示は、個体内の網膜細胞内の標的核酸において、有害な変異を含む場合にこの標的核酸を修飾する方法であって、個体に（例えば、眼内、硝子体内等の投与により）本開示のｒＡＡＶビリオンを投与することを含み、ｒＡＡＶビリオンが、ｉ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）標的核酸に対し相補的なヌクレオチド配列を含むｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びｉｉｉ）有害な変異を修正するヌクレオチド配列を含むドナーＤＮＡ鋳型をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、方法を提供する。ｒＡＡＶビリオンの投与は、ＨＤＲによる標的核酸における有害な変異の修正をもたらす。
【０１４７】
本開示は、個体内の網膜細胞内の標的核酸において、有害な変異を含む場合にこの標的核酸を修飾する方法であって、個体に（例えば、眼内、硝子体内等の投与により）本開示のｒＡＡＶビリオンを投与することを含み、ｒＡＡＶビリオンが、ｉ）ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）をコードするヌクレオチド配列、ｉｉ）標的核酸内の第１の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第１のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びｉｉｉ）標的核酸内の第２の配列に対し相補的なヌクレオチド配列を含む第２のｓｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、方法を提供する。ｒＡＡＶビリオンの投与は、ＮＨＥＪによる標的核酸における有害な変異の切除をもたらす。
【０１４８】
制御配列
一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、転写調節エレメントに対し作用可能に結合している。例えば、一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに対し作用可能に結合している。他の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導的プロモーターに対し作用可能に結合している。一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、組織特異的または細胞タイプ特異的制御エレメントに対し作用可能に結合している。例えば、一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、網膜細胞特異的プロモーターに対し作用可能に結合している。例えば、一部の場合において、関心対象遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、光受容体特異的制御エレメント（例えば、光受容体特異的プロモーター）に対し作用可能に結合しており、この制御エレメントは、例えば、光受容体細胞内での作用可能に結合した遺伝子の選択的発現を付与する制御エレメントである。好適な光受容体特異的制御エレメントとしては、例えば、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．４４：４０７６）、ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーターＮｉｃｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）  Ｊ．Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．９：１０１５）、網膜色素変性遺伝子プロモーター（Ｎｉｃｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）上記参照）、光受容体間レチノイド結合タンパク質（ＩＲＢＰ）遺伝子エンハンサー（Ｎｉｃｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）上記参照）、ＩＲＢＰ遺伝子プロモーター（Ｙｏｋｏｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）  Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．５５：２２５）が挙げられる。
【０１４９】
薬学的組成物
本開示は、ａ）以下に説明する主題ｒＡＡＶビリオン、及びｂ）薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはバッファーを含む薬学的組成物を提供する。一部の実施形態において、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはバッファーは、ヒトにおける使用に好適である。
【０１５０】
このような賦形剤、担体、希釈剤、及びバッファーとしては、過度の毒性を伴わずに投与され得る任意の薬学的作用物質が挙げられる。薬学的に許容される賦形剤としては、限定されないが、水、食塩水、グリセロール、及びエタノールのような液体が挙げられる。薬学的に許容される塩、例えば、無機酸塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など）、及び有機酸塩（例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩など）がこれに含まれてもよい。加えて、湿潤剤及び乳化剤、ｐＨ緩衝物質などのような補助物質がこのようなビヒクル中に存在してもよい。幅広い種類の薬学的に許容される賦形剤が当技術分野において公知であり、これらを本明細書で詳細に論じる必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ（２０００）“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，”２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（１９９９）  Ｈ．Ｃ．Ａｎｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，７th  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ、及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２０００）  Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，３ｒｄ  ｅｄ．Ａｍｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃ．を含めた様々な刊行物で十分に説明されている。
【０１５１】
遺伝子産物を網膜細胞に送達する方法及び処置方法
本開示は、遺伝子産物を個体内の網膜細胞に送達する方法であって、個体に上述したｒＡＡＶビリオンを投与することを含む、方法を提供する。遺伝子産物は、上述したように、ポリペプチドまたは干渉ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなど）、アプタマー、または部位特異的エンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ）であり得る。遺伝子産物を網膜細胞に送達することは、網膜疾患の処置をもたらし得る。網膜細胞は、光受容体、網膜神経節細胞、ミュラー細胞、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、または網膜色素上皮細胞であり得る。一部の場合において、網膜細胞は、光受容体細胞、例えば、桿体または錐体細胞である。
【０１５２】
本開示は、網膜細胞内の標的核酸を修飾する方法であって、網膜細胞を、１）ガイドＲＮＡに結合するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む本開示のｒＡＡＶビリオン、及び２）ガイドＲＮＡに接触させることを含む、方法を提供する。本開示は、網膜細胞内の標的核酸を修飾する方法であって、網膜細胞を、ｉ）ガイドＲＮＡに結合するＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと、ｉｉ）ガイドＲＮＡとをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、本開示のｒＡＡＶビリオンに接触させることを含む、方法を提供する。一部の場合において、本方法は、網膜細胞をドナーＤＮＡ鋳型に接触させることを含む。一部の場合において、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ９ポリペプチドである。一部の場合において、ガイドＲＮＡは、シングルガイドＲＮＡである。
【０１５３】
本開示は、眼疾患（例えば、網膜疾患）を処置する方法であって、当該処置を必要とする個体に、有効量の、上述した主題ｒＡＡＶビリオンを投与することを含む、方法を提供する。主題ｒＡＡＶビリオンは、眼内注射を介して、例えば、硝子体内注射、網膜下注射、脈絡膜上注射、または他の任意の好都合な投与の様式もしくは経路により、投与することができる。他の好都合な投与の様式または経路としては、例えば、静脈内、鼻腔内等が挙げられる。
【０１５４】
「治療有効量」は、実験及び／または臨床試験を通じて決定され得る比較的広い範囲内に入る。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ注射、すなわち、眼内への直接注射については、治療有効用量は、約１０6 〜約１０15のｒＡＡＶビリオン程度、例えば、約１０8 〜約１０12のｒＡＡＶビリオンとなる。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ注射、すなわち、眼内への直接注射については、治療有効用量は、約１０6 ウイルスゲノム（ｖｇ）〜約１０15ｖｇのｒＡＡＶビリオン程度、例えば、約１０8 ｖｇ〜約１０12ｖｇとなる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入については、細胞に送達されるｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０8 〜約１０13のｒＡＡＶビリオン程度となる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入については、細胞に送達されるｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０8 〜約１０13ｖｇのｒＡＡＶビリオン程度となる。別の例として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入については、細胞に送達されるｒＡＡＶビリオンの有効量は、約１０ｖｇ／細胞〜約１０4 ｖｇ／細胞のｒＡＡＶビリオン程度となる。他の有効薬用量も、当業者により、用量反応曲線を確立する通常の試験を通じて容易に確立することができる。
【０１５５】
一部の実施形態において、所望の遺伝子発現レベルを達成するために、２回以上の投与（例えば、２、３、４回、またはそれ以上の投与）が用いられ得る。一部の場合において、２回以上の投与は、様々な間隔で、例えば、１日に１回、１週間に１回、１ヵ月に２回、１ヵ月に１回、３ヵ月に１回、６ヵ月に１回、１年に１回等、投与される。一部の場合において、複数回投与は、１ヵ月〜２ヵ月、２ヵ月〜４ヵ月、４ヵ月〜８ヵ月、８ヵ月〜１２ヵ月、１年〜２年、２年〜５年、または５年以上の間隔で、投与される。
【０１５６】
主題方法を用いて処置することができる眼疾患としては、限定されないが、急性黄斑性神経網膜症、ベーチェット症候群、脈絡膜血管新生、糖尿病性ぶどう膜炎、ヒストプラズマ症、黄斑変性、例えば、急性黄斑変性、非滲出性加齢性黄斑変性、及び滲出性加齢性黄斑変性、浮腫、例えば、黄斑浮腫、嚢胞様黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、多巣性脈絡膜炎、後部眼球の部位または位置に影響を及ぼす眼球損傷、眼球腫瘍、網膜障害、例えば、網膜中心静脈閉塞、糖尿病性網膜症（増殖性糖尿病性網膜症を含む）、増殖性硝子体網膜症（ＰＶＲ）、網膜動脈閉塞性疾患、網膜剥離、ぶどう膜炎網膜疾患、交感性眼炎、フォークト・小柳・原田症候群、びまん性ぶどう膜炎（ｕｖｅａｌ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、眼球レーザー処置により引き起こされるまたは影響される後部眼球状態、光線力学的治療により引き起こされるまたは影響される後部眼球状態、光凝固、放射線網膜症、網膜上膜障害、網膜静脈分枝閉塞、前部虚血性視神経症、非網膜症糖尿病性網膜機能不全、網膜分離、網膜色素変性、緑内障、アッシャー症候群、錐体桿体ジストロフィー、シュタルガルト病（黄色斑眼底）、遺伝性黄斑変性、脈絡網膜変性、レーバー先天黒内障、先天性非進行性夜盲症、コロイデレミア、バルデー・ビートル症候群、黄斑性毛細血管拡張、レーバー遺伝性視神経萎縮症、未熟児網膜症、色覚障害（１色覚、１型２色覚、２型３色覚、及び３型２色覚を含む）、ならびにビエッティ結晶性ジストロフィーが挙げられる。
【０１５７】
本開示は、網膜疾患を処置する方法を提供する。本方法は、概して、本開示のｒＡＡＶビリオン、または本開示のｒＡＡＶビリオンを含む組成物を、投与を必要とする個体の眼に投与することに関係する。網膜疾患の処置を評価するための非限定的な方法としては、機能的変化の測定、例えば、視力の変化の測定（例えば、ＢＣＶＡ）、視野の測定（例えば、視野測定）、明暗に対する電気生理学的応答性の測定（例えば、ＥＲＧ、ＶＥＰ）、色覚の測定、及び／またはコントラスト感度の測定、解剖学的及び／または写真的尺度（例えば、ＯＣＴ、眼底写真、及び／または自己蛍光）を用いた解剖学的構造または健康状態の変化の測定、ならびに眼球運動性（例えば、眼球振とう、固視選好、及び安定性）の測定が挙げられる。
【０１５８】
例えば、当業者は、ｒＡＡＶビリオンの有効量を、１つ以上のパラメーター（例えば、視力、視野、明暗に対する電気生理学的応答性、色覚、コントラスト感度、解剖学的構造、網膜の健康状態及び脈管構造、眼球運動性、固視選好、及び安定性）に及ぼす効果を試験することにより、容易に決定することができると考えられる。一部の場合において、有効量の、本開示のｒＡＡＶビリオンの投与は、網膜機能、解剖学的完全性、または網膜の健康状態の喪失速度の低下、例えば、２倍、３倍、４倍、もしくは５倍、またはそれ以上の喪失速度の低下、よって疾患の進行速度の低下、例えば、１０倍またはそれ以上の喪失速度の低下、よって疾患の進行速度の低下をもたらす。一部の場合において、有効量の、本開示のｒＡＡＶビリオンの投与は、網膜機能の増加、網膜の解剖学的構造もしくは健康状態の改善、及び／または眼球運動性の安定化、例えば、２倍、３倍、４倍、もしくは５倍、またはそれ以上の網膜機能、網膜の解剖学的構造もしくは健康状態、及び／または軌道の安定性の改善、例えば、１０倍の網膜機能、網膜の解剖学的構造もしくは健康状態、及び／または軌道の安定性の改善をもたらす。
【０１５９】
核酸及び宿主細胞
本開示は、上述した主題バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸であって、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で、ＧＨループまたはループＩＶ内における約５アミノ酸〜約２０アミノ酸の挿入を含み、またはバリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で、ＧＨループまたはループＩＶ内における約５アミノ酸〜約２０アミノ酸の約５アミノ酸〜約２０アミノ酸の異種ペプチドによる置換えを含み、バリアントカプシドタンパク質が、ＡＡＶビリオン内に存在するときに、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、網膜細胞の感染力の増大をもたらす、単離された核酸を提供する。主題の単離された核酸は、ＡＡＶベクター、例えば、組換えＡＡＶベクターであり得る。
【０１６０】
挿入ペプチド
主題核酸によりコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、約５アミノ酸〜約２０アミノ酸長の挿入ペプチドを有し、これはＡＡＶカプシドのＧＨループ内に挿入される。挿入ペプチドは、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸、８アミノ酸、９アミノ酸、１０アミノ酸、１１アミノ酸、１２アミノ酸、１３アミノ酸、１４アミノ酸、１５アミノ酸、１６アミノ酸、１７アミノ酸、１８アミノ酸、１９アミノ酸、または２０アミノ酸の長さを有する。好適な挿入ペプチドは、上述した通りである。好適な挿入ペプチドとしては、上述したように、式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つのペプチドが挙げられる。挿入ペプチドの親ＡＡＶカプシド内への挿入は、一部の場合において、ＧＨループまたはループＩＶ内の内在的なひと続きの約５アミノ酸〜約２０アミノ酸を置き換える。したがって、一部の場合において、主題核酸によりコードされるバリアントＡＡＶカプシドタンパク質は、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で、ＧＨループまたはループＩＶ内における約５アミノ酸〜約２０アミノ酸の約５アミノ酸〜約２０アミノ酸の異種ペプチドによる置換えを含み、好適な異種ペプチドとしては、上述したように、式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つのペプチドが挙げられる。
【０１６１】
主題組換えＡＡＶベクターは、上述したように、主題組換えＡＡＶビリオンの生成に使用することができる。したがって、本開示は、好適な細胞に導入されたときに主題組換えＡＡＶビリオンの産生をもたらすことができる、組換えＡＡＶベクターを提供する。
【０１６２】
本発明はさらに、主題核酸を含む宿主細胞、例えば、単離された（遺伝子修飾された）宿主細胞を提供する。主題宿主細胞は、単離された細胞、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の細胞であり得る。主題宿主細胞は、後述するように、主題ｒＡＡＶビリオンの産生に有用である。主題宿主細胞が主題ｒＡＡＶビリオンの産生に使用される場合、主題宿主細胞は「パッケージング細胞」と呼ばれる。一部の実施形態において、主題宿主細胞は、主題核酸を用いて安定的に遺伝子修飾される。他の実施形態において、主題宿主細胞は、主題核酸を用いて一過性に遺伝子修飾される。
【０１６３】
主題核酸は、確立した技法を用いて、宿主細胞に安定的または一過性に導入され、このような技法としては、限定されないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム媒介トランスフェクションなどが挙げられる。安定した形質転換のため、概して、主題核酸はさらに、選択マーカー、例えば、いくつかの周知の選択マーカー（例えば、ネオマイシン抵抗性など）のいずれかを含む。
【０１６４】
主題宿主細胞は、主題核酸を様々な細胞、例えば、哺乳類細胞（例えば、マウス細胞、及び霊長類細胞（例えば、ヒト細胞））のいずれかに導入することにより、生成される。好適な哺乳類細胞としては、限定されないが、初代細胞及び細胞株が挙げられ、好適な細胞株としては、限定されないが、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、３Ｔ３線維芽細胞、Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２線維芽細胞、ＣＨＯ細胞などが挙げられる。好適な宿主細胞の非限定的な例としては、例えば、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）  Ｎｏ．ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬＩ．３）、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞などが挙げられる。また、主題宿主細胞は、バキュロウイルスを用いて、ＡＡＶを産生するＳｆ９細胞のような昆虫細胞に感染させて作成することもできる（例えば、米国特許第７，２７１，００２号、米国特許出願第１２／２９７，９５８号を参照）。
【０１６５】
一部の実施形態において、主題遺伝子修飾宿主細胞は、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、１つ以上のＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の実施形態において、主題宿主細胞はさらに、ｒＡＡＶベクターを含む。ｒＡＡＶビリオンは、主題宿主細胞を用いて生成することができる。ｒＡＡＶビリオンを生成する方法は、例えば、米国特許公開第２００５／００５３９２２号及び米国特許公開第２００９／０２０２４９０号で説明されている。
【０１６６】
本開示の非限定的態様の例
上述した本発明の主題における態様（実施形態を含む）は、単体であっても、１つ以上の他の態様または実施形態と組み合わせても、有益であり得る。上記の説明を限定することなく、以下に、１〜６３の番号が付された、本開示のある特定の非限定的な態様を示す。当業者には明らかであるように、個別に番号が付された態様の各々が使用されても、先または後にある個々に番号が付された態様のいずれかと組み合わされてもよい。これは、全てのこのような態様の組合せを支持するように意図され、以下に明示的に示される態様の組合せに限定されない。
【０１６７】
１．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンであって、ａ）式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つの異種ペプチドの挿入を含み、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、前記網膜細胞の感染力の増大を付与する、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質と、ｂ）異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、ｒＡＡＶビリオン。
２．前記対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
３．前記対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも１０倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
４．前記異種ペプチドの挿入が、前記親ＡＡＶカプシドタンパク質の隣接したひと続きの５アミノ酸〜２０アミノ酸を置き換える、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
５．挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０及びアミノ酸６１１に対応するアミノ酸の間であるか、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、態様１に記載のｒＡＡＶビリオン。
【０１６８】
６．挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７及びアミノ酸５８８に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、または、挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８５及びアミノ酸５９８に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、態様４に記載のｒＡＡＶビリオン。
７．前記異種遺伝子産物は、干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、態様１〜６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
８．前記異種遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様１〜６のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
９．前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、態様８に記載のｒＡＡＶビリオン。
１０．前記ポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドから選択されるＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、態様８に記載のｒＡＡＶビリオン。
【０１６９】
１１．前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、酵素的に不活性なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドである、態様１０に記載のｒＡＡＶビリオン。
１２．前記異種遺伝子産物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡである、態様１０に記載のｒＡＡＶビリオン。
１３．前記異種ペプチドは、式Ｉ：ＬＡ（Ｌ／Ｎ）（Ｉ／Ｑ）（Ｑ／Ｅ）（Ｄ／Ｈ）（Ｓ／Ｖ）（Ｍ／Ｋ）（Ｒ／Ｎ）Ａ（配列番号１３６）のペプチドである、態様１〜１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
１４．前記異種ペプチドは、（２１）ＬＡＬＩＱＤＳＭＲＡ（配列番号３５）または（２２）ＬＡＮＱＥＨＶＫＮＡ（配列番号２）を含む、態様１〜１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
１５．前記異種ペプチドは、式ＩＩ：ＴＸ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7 Ｘ8 ＧＬＸ9 （配列番号１３７）のペプチドであって、式中、Ｘ1 が、Ｇ、Ｖ、またはＳであり、Ｘ2 が、Ｖ、Ｅ、Ｐ、Ｇ、Ｄ、Ｍ、Ａ、またはＳであり、Ｘ3 が、Ｍ、Ｖ、Ｙ、Ｈ、Ｇ、Ｓ、またはＤであり、Ｘ4 が、Ｒ、Ｄ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、またはＭであり、Ｘ5 が、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、またはＡであり、Ｘ6 が、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｄ、Ｑ、またはＨであり、Ｘ7 が、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｇ、またはＡであり、Ｘ8 が、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ａ、Ｉ、Ｐ、またはＴであり、Ｘ9 が、ＳまたはＮである、態様１〜１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【０１７０】
１６．前記異種ペプチドは、（１）ＴＧＶＭＲＳＴＮＳＧＬＮ（配列番号６）、（２）ＴＧＥＶＤＬＡＧＧＧＬＳ（配列番号７）、（３）ＴＳＰＹＳＧＳＳＤＧＬＳ（配列番号８）、（４）ＴＧＧＨＤＳＳＬＤＧＬＳ（配列番号９）、（５）ＴＧＤＧＧＴＴＭＮＧＬＳ（配列番号９８）、（６）ＴＧＧＨＧＳＡＰＤＧＬＳ（配列番号９９）、（７）ＴＧＭＨＶＴＭＭＡＧＬＮ（配列番号１００）、（８）ＴＧＡＳＹＬＤＮＳＧＬＳ（配列番号１０１）、（９）ＴＶＶＳＴＱＡＧＩＧＬＳ（配列番号２０）、（１０）ＴＧＶＭＨＳＱＡＳＧＬＳ（配列番号２１）、（１１）ＴＧＤＧＳＰＡＡＰＧＬＳ（配列番号２２）、または（１２）ＴＧＳＤＭＡＨＧＴＧＬＳ（配列番号２３）を含む、態様１〜１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
１７．前記異種ペプチドは、式ＩＩＩ：ＴＧＸ1 Ｘ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7 ＧＬＳ（配列番号１３８）のペプチドであって、式中、Ｘ1 が、Ｖ、Ｅ、Ｐ、Ｇ、Ｄ、Ｍ、Ａ、またはＳであり、Ｘ2 が、Ｍ、Ｖ、Ｙ、Ｈ、Ｇ、Ｓ、またはＤであり、Ｘ3 が、Ｒ、Ｄ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｙ、Ｔ、Ｈ、またはＭであり、Ｘ4 が、Ｓ、Ｌ、Ｇ、Ｔ、Ｑ、Ｐ、またはＡであり、Ｘ5 が、Ｔ、Ａ、Ｓ、Ｍ、Ｄ、Ｑ、またはＨであり、Ｘ6 が、Ｎ、Ｇ、Ｓ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、Ｇ、またはＡであり、Ｘ7 が、Ｓ、Ｇ、Ｄ、Ｎ、Ａ、Ｉ、Ｐ、またはＴである、態様１〜１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
１８．前記異種ペプチドは、（２）ＴＧＥＶＤＬＡＧＧＧＬＳ（配列番号７）、（４）ＴＧＧＨＤＳＳＬＤＧＬＳ（配列番号９）、（５）ＴＧＤＧＧＴＴＭＮＧＬＳ（配列番号９８）、（６）ＴＧＧＨＧＳＡＰＤＧＬＳ（配列番号９９）、（８）ＴＧＡＳＹＬＤＮＳＧＬＳ（配列番号１０１）、（１０）ＴＧＶＭＨＳＱＡＳＧＬＳ（配列番号２１）、（１１）ＴＧＤＧＳＰＡＡＰＧＬＳ（配列番号２２）、または（１２）ＴＧＳＤＭＡＨＧＴＧＬＳ（配列番号２３）を含む、態様１〜１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
１９．前記異種ペプチドは、式ＩＶ：Ｘ1 ＧＸ2 Ｘ3 Ｘ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7 Ｘ8 ＧＬＳＰＸ9 ＴＸ10Ｘ11（配列番号１３９）のペプチドであって、式中、Ｘ1 が、ＴまたはＮであり、Ｘ2 が、Ｌ、Ｓ、Ａ、またはＧであり、Ｘ3 が、ＤまたはＶであり、Ｘ4 が、Ａ、Ｇ、またはＰであり、Ｘ5 が、ＴまたはＤであり、Ｘ6 が、ＲまたはＹであり、Ｘ7 が、Ｄ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ8 が、Ｈ、Ｒ、またはＴであり、Ｘ9 が、ＶまたはＡであり、Ｘ10が、ＧまたはＷであり、Ｘ11が、ＴまたはＡである、態様１〜１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
２０．前記異種ペプチドは、（１３）ＴＧＬＤＡＴＲＤＨＧＬＳＰＶＴＧＴ（配列番号２４）、（１４）ＴＧＳＤＧＴＲＤＨＧＬＳＰＶＴＷＴ（配列番号２５）、（１５）ＮＧＡＶＡＤＹＴＲＧＬＳＰＡＴＧＴ（配列番号２６）、または（１６）ＴＧＧＤＰＴＲＧＴＧＬＳＰＶＴＧＡ（配列番号２７）を含む、態様１〜１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【０１７１】
２１．前記異種ペプチドは、式Ｖ：ＴＧＸ1 ＤＸ2 ＴＲＸ3 Ｘ4 ＧＬＳＰＶＴＧＴ（配列番号１４０）のペプチドであって、式中、Ｘ1 が、Ｌ、Ｓ、Ａ、またはＧであり、Ｘ2 が、Ａ、Ｇ、またはＰであり、Ｘ8 が、Ｄ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ4 が、Ｈ、Ｒ、またはＴである、態様１〜１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
２２．前記異種ペプチドは、式ＶＩ：ＬＱＸ1 Ｘ2 Ｘ3 ＲＸ4 Ｘ5 Ｘ6 Ｘ7 Ｘ8 Ｘ9 ＶＮＸ10Ｑ（配列番号１４１）のペプチドであって、式中、Ｘ1 が、ＫまたはＲであり、Ｘ2 が、Ｎ、Ｇ、またはＡであり、Ｘ3 が、Ａ、Ｖ、Ｎ、またはＤであり、Ｘ4 が、Ｐ、Ｉ、またはＱであり、Ｘ5 が、Ａ、Ｐ、またはＶであり、Ｘ6 が、Ｓ、Ｔ、またはＧであり、Ｘ7 が、ＴまたはＶであり、Ｘ8 が、Ｅ、Ｌ、Ａ、またはＶであり、Ｘ9 が、Ｓ、Ｅ、Ｄ、またはＶであり、Ｘ10が、Ｆ、Ｇ、Ｔ、またはＣである、態様１〜１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
２３．前記異種ペプチドは、（１７）ＬＱＫＮＡＲＰＡＳＴＥＳＶＮＦＱ（配列番号２８）、（１８）ＬＱＲＧＶＲＩＰＳＶＬＥＶＮＧＱ（配列番号２９）、（１９）ＬＱＲＧＮＲＰＶＴＴＡＤＶＮＴＱ（配列番号３０）、または（２０）ＬＱＫＡＤＲＱＰＧＶＶＶＶＮＣＱ（配列番号３１）を含む、態様１〜１２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
２４．ａ）態様１〜２３のいずれか１つに記載の組換えアデノ随伴ウイルスビリオンと、ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
２５．体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法であって、前記個体に、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のｒＡＡＶビリオンまたは請求項２４に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
【０１７２】
２６．前記遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様２５に記載の方法。
２７．前記遺伝子産物は、短鎖干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、態様２５に記載の方法。
２８．前記ポリペプチドは、神経保護因子、抗血管新生ポリペプチド、抗アポトーシス因子、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、態様２６に記載の方法。
２９．前記ポリペプチドは、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞成長因子２、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、上皮成長因子、ロドプシン、Ｘ連鎖アポトーシス阻害物質、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ相互作用タンパク質１、ペリフェリン、ペリフェリン−２、ロドプシン、ＲｄＣＶＦ、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御物質（ＲＰＧＲ）、またはソニックヘッジホッグである、態様２６に記載の方法。
３０．前記ポリペプチドは、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、態様２６に記載の方法。
【０１７３】
３１．眼疾患を処置する方法であって、処置を必要とする個体に対して、態様１〜２３のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンまたは態様２４に記載の薬学的組成物を有効量で投与することを含む、方法。
３２．投与は、眼内注射によるものである、態様３１に記載の方法。
３３．投与は、硝子体内注射または脈絡膜上注射によるものである、態様３１に記載の方法。
３４．前記眼疾患は、緑内障、網膜色素変性、黄斑変性、網膜分離、レーバー先天黒内障、糖尿病性網膜症、１色覚、または色覚異常である、態様３１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．バリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸であって、前記バリアントＡＡＶカプシドタンパク質が、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質との対比で、カプシドタンパク質ＧＨループ内の約５アミノ酸〜約２０アミノ酸の挿入を含み、バリアントカプシドタンパク質が、ＡＡＶビリオン内に存在するときに、網膜細胞のＡＡＶビリオンの感染力の増大をもたらし、アミノ酸の挿入が、ネイティブＡＡＶカプシドのＧＨループ内であり、この挿入は、式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つのペプチドである、核酸。
【０１７４】
３６．挿入部位は、ＡＡＶ２のアミノ酸５８７とアミノ酸５８８との間、ＡＡＶ２のアミノ酸５８５とアミノ酸５９８との間、ＡＡＶ１のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１との間、ＡＡＶ５のアミノ酸５７５とアミノ酸５７６との間、ＡＡＶ６のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１との間、ＡＡＶ７のアミノ酸５８９とアミノ酸５９０との間、ＡＡＶ８のアミノ酸５９０とアミノ酸５９１との間、ＡＡＶ９のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９との間、またはＡＡＶ１０のアミノ酸５８８とアミノ酸５８９との間である、態様３５に記載の核酸。
３７．態様３５または態様３６に記載の核酸を含む、単離された遺伝子修飾宿主細胞。
３８．約５アミノ酸〜約２０アミノ酸の挿入を含むバリアントアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドタンパク質であって、アミノ酸の挿入が、ネイティブＡＡＶカプシドのＧＨループ内であり、この挿入は、式Ｉ〜ＶＩのいずれか１つのペプチドである、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質。
３９．ａ）式ＶＩの異種ペプチドの挿入を含み、対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、前記網膜細胞の感染力の増大を付与する、バリアントＡＡＶカプシドタンパク質と、ｂ）異種遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸とを含む、ｒＡＡＶビリオン。
４０．前記対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含む対照ＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも５倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、態様３９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【０１７５】
４１．前記対応する親ＡＡＶカプシドタンパク質を含むＡＡＶビリオンによる網膜細胞の感染力と比較して、少なくとも１０倍の前記網膜細胞の感染力の増大を示す、態様３９に記載のｒＡＡＶビリオン。
４２．前記異種ペプチドの挿入が、前記親ＡＡＶカプシドタンパク質の隣接したひと続きの５アミノ酸〜２０アミノ酸を置き換える、態様３９〜４１のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
４３．挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５７０及びアミノ酸６１１に対応するアミノ酸の間であるか、または別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、態様３９〜４２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
４４．挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８７及びアミノ酸５８８に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のＡＡＶ血清型のカプシドタンパク質における対応する位置である、または、挿入部位が、ＡＡＶ２のＶＰ１のアミノ酸５８５及びアミノ酸５９８に対応するアミノ酸の間であるか、もしくは別のＡＡＶ血清型の前記カプシドタンパク質における対応する位置である、態様４３に記載のｒＡＡＶビリオン。
４５．前記異種遺伝子産物は、干渉ＲＮＡである、態様３９〜４４のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
【０１７６】
４６．前記異種遺伝子産物は、アプタマーである、態様３９〜４４のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
４７．前記異種遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様３９〜４４のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
４８．前記ポリペプチドは、神経保護ポリペプチド、抗血管新生ポリペプチド、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、態様４７に記載のｒＡＡＶビリオン。
４９．前記ポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチド、またはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドから選択されるＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、態様４７に記載のｒＡＡＶビリオン。
５０．前記ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、酵素的に不活性なＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓポリペプチドである、態様４９に記載のｒＡＡＶビリオン。
【０１７７】
５１．前記異種遺伝子産物は、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡである、態様３９〜４４のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
５２．前記異種ペプチドは、（１７）ＬＱＫＮＡＲＰＡＳＴＥＳＶＮＦＱ（配列番号２８）、（１８）ＬＱＲＧＶＲＩＰＳＶＬＥＶＮＧＱ（配列番号２９）、（１９）ＬＱＲＧＮＲＰＶＴＴＡＤＶＮＴＱ（配列番号３０）、または（２０）ＬＱＫＡＤＲＱＰＧＶＶＶＶＮＣＱ（配列番号３１）を含む、態様３９〜５１のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオン。
５３．ａ）態様３９〜５２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンと、ｂ）薬学的に許容される賦形剤とを含む、薬学的組成物。
５４．個体内の網膜細胞に遺伝子産物を送達する方法であって、前記個体に、態様３９〜５２のいずれか１つに記載のｒＡＡＶビリオンまたは態様５３に記載の薬学的組成物を投与することを含む、方法。
５５．前記遺伝子産物は、ポリペプチドである、態様５４に記載の方法。
【０１７８】
５６．前記遺伝子産物は、短鎖干渉ＲＮＡまたはアプタマーである、態様５４に記載の方法。
５７．前記ポリペプチドは、神経保護因子、抗血管新生ポリペプチド、抗アポトーシス因子、または網膜細胞の機能を強化するポリペプチドである、態様５５に記載の方法。
５８．前記ポリペプチドは、グリア由来神経栄養因子、線維芽細胞成長因子２、ニュールツリン、毛様体神経栄養因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子、上皮成長因子、ロドプシン、Ｘ連鎖アポトーシス阻害物質、レチノスキシン、ＲＰＥ６５、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ相互作用タンパク質１、ペリフェリン、ペリフェリン−２、ロドプシン、ＲｄＣＶＦ、網膜色素変性ＧＴＰアーゼ制御物質（ＲＰＧＲ）、またはソニックヘッジホッグである、態様５７に記載の方法。
５９．前記ポリペプチドは、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである、態様５５に記載の方法。
６０．眼疾患を処置する方法であって、処置を必要とする個体に対して、態様３９〜５２のいずれか１つに記載の組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ビリオンまたは態様５３に記載の薬学的組成物を有効量で投与することを含む、方法。
【０１７９】
６１．投与は、眼内注射によるものである、態様６０に記載の方法。
６２．投与は、硝子体内注射または脈絡膜上注射によるものである、態様６０に記載の方法。
６３．前記眼疾患は、緑内障、網膜色素変性、黄斑変性、網膜分離、レーバー先天黒内障、糖尿病性網膜症、１色覚、または色覚異常である、態様６０〜６２のいずれか１つに記載の方法。
【実施例】
【０１８０】
以下の実施例は、本発明を作成及び使用する方法についての完全な開示及び説明を当業者に提供するために示され、発明者らが発明とみなすものの範囲を限定するようには意図されておらず、また、以下の実験が実施された全ての実験であること、または以下の実験の他に実験が実施されていないことを表すようにも意図されていない。使用する数字（例えば、量、温度等）については正確さを保証するように努力が払われているが、ある程度の実験的誤差及び偏差は考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏度であり、圧力は大気圧前後である。標準的な省略形が使用され得る。例えば、ｂｐは塩基対（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｐｌはピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃは秒（複数可）、ｍｉｎは分（複数可）、ｈまたはｈｒは時間（複数可）、ａａはアミノ酸（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｂｐは塩基対（複数可）、ｎｔはヌクレオチド（複数可）、ｉ．ｍ．は筋肉内（に）、ｉ．ｐ．は腹腔内（に）、ｓ．ｃ．は皮下（に）などである。
【０１８１】
実施例１：バリアントＡＡＶカプシドを含むＡＡＶビリオン
定向進化アプローチを通じて、複数のＡＡＶカプシドのバリアントを導出した。バリアントＡＡＶカプシドを含むＡＡＶビリオンは、例えば、硝子体内注射を介し投与されたときに、霊長類網膜に感染する。霊長類は、高明瞭度の視覚のための中心窩を有し、ヒトの網膜疾患にとっての重要な前臨床モデルである。
【０１８２】
ＡＡＶパッケージング
バリアントＡＡＶカプシドを含むＡＡＶビリオンを、スクリーニングにより同定した。このスクリーニングのために、１）およそアミノ酸５８８に７ｍｅｒペプチド挿入を含有し、５′ＬＡリンカー及び３′Ａリンカーで囲まれているＡＡＶ２ベースの７ｍｅｒペプチドディスプレイライブラリー、２）およそアミノ酸５８４に７ｍｅｒペプチド挿入を伴い、５′ＴＧリンカー及び３′ＧＬＳリンカーを有するＡＡＶ４ベースの７ｍｅｒペプチドディスプレイライブラリー、３）およそアミノ酸５７５に７ｍｅｒペプチド挿入を伴い、５′ＴＧリンカー及び３′ＧＬＳリンカーを有するＡＡＶ５ベースの７ｍｅｒペプチドディスプレイライブラリー、４）およそアミノ酸５９１の位置に７ｍｅｒペプチドディスプレイライブラリーを含有する、５′ＴＧリンカー及び３′ＧＬＳリンカーを有する祖先ＡＡＶ配列（Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｏｒｔｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）ベースのライブラリー、ならびに５）およそアミノ酸５８８の表面露出位置にセミランダムな変異を有するＡＡＶ２ベースのライブラリー（Ｋｏｅｒｂｅｒ，Ｊａｎｇ，＆  Ｓｃｈａｆｆｅｒ，２００８）の５つのライブラリーを使用した：。ウイルスのパッケージングは、Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）（上記参照）、Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ９，２２６７−２２８４（２０１４）で過去に説明されているように、各ウイルスゲノムが、そのゲノムがコードするカプシドタンパク質シェル内に包まれるように行った。そのため、選択を通じた機能的改善は、ウイルスカプシド内に含まれたゲノム配列に関連づけられ得る。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の三重の一過性トランスフェクションによりＡＡＶベクターを産生し、イオジキサノール密度遠心処理を介して精製し、Ａｍｉｃｏｎ濾過によりバッファーをＰＢＳに交換した。ＤＮアーゼ抵抗性のウイルスゲノム力価を、ＢｉｏＲａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒを用いた定量的リアルタイムＰＣＲにより測定した。このライブラリーから、ｉｎ  ｖｉｖｏの反復スクリーニング選択プロセスを使用して、硝子体から霊長類網膜に感染する能力を有するバリアントを同定した（図１）。霊長類の眼に、各ラウンドにおいて約２５０μＬの１×１０13〜１×１０14ｖｇ／ｍＬの力価のウイルスを注射した。注射から３週間後、眼を摘出し、網膜の中心及び周辺領域から網膜パンチを採取した（図１）。様々な網膜層からのＤＮＡをアッセイし、カプシド挿入物を同定した。各ラウンドの注射の後、採取細胞から、プライマーＨｉｎｄＩＩＩ＿Ｆ１及びＮｏｔＩ＿Ｒ１、ＡｓｃＩ＿Ｒ１、またはＳｐｅＩ＿Ｒ１（リバースプライマーは固有のＡＡＶ骨格に対し特異的）を用いてＰＣＲによりカプシド配列を回収して、ライブラリーのグループの分離を維持した。次に、ＰＣＲアンプリコンを消化させ、再クローニングして骨格にした。ＲＰＥ細胞を網膜細胞から分離し、組織を凍結した。クリオスタット上で網膜細胞を包埋及び薄切りして、外顆粒層内の光受容体を単離した。次に、単離した光受容体またはＲＰＥからＤＮＡを収集し、ｃａｐ遺伝子をＰＣＲ増幅した。回収したｃａｐ遺伝子を次のＡＡＶパッケージングに使用した。
【０１８３】
図１は、霊長類網膜ＡＡＶバリアントの発生に使用する定向進化法の示している。ペプチドディスプレイライブラリーを作成し、ＡＡＶベクターにパッケージングし、硝子体内注射を介して霊長類の眼に注射した。反復的な選択ラウンドを使用して、ベクターのプールからＡＡＶバリアントをポジティブ選択した。３選択ラウンドの次にエラープローンＰＣＲを行い、その次に追加の選択ラウンドを行った。
【０１８４】
選択ラウンドからのＡＡＶライブラリーのディープシークエンシング
５選択ラウンドの次に、Ｉｌｌｕｍｉｎａディープシークエンシングを使用して、ＡＡＶバリアントのライブラリー内の相対的提示率がラウンドにわたって増大するバリアントを同定した。ウイルスライブラリー内の提示率増大は、ポジティブ選択と、硝子体から霊長類網膜に感染する能力とを示す。７ｍｅｒ挿入またはループスワップ変異部位を含有する約７５〜８５塩基対領域を、採取ＤＮＡからＰＣＲ増幅した。プライマーは、複数の選択ラウンドからのアンプリコンのマルチプレクシングを可能にする固有のバーコードを含有するＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列を含んだ。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００上での１００サイクルのシングルリードランにより、ＰＣＲアンプリコンを精製しシークエンシングした。ＤＮＡ配列をアミノ酸配列に翻訳し、固有の７ｍｅｒ挿入配列を含有するリードをカウントするためのカスタムＰｙｔｈｏｎコードを書いた。リードカウントを、ランにおけるリード総数により正規化した。Ｐｙｔｈｏｎ及びＰａｎｄａｓを使用して、定向進化の動態を解析し、プロットを作成した。
【０１８５】
ディープシークエンシング解析
ライブラリー当たり約１×１０7 のバリアントからトップバリアントを選択した。パフォーマンスが最高のバリアントは、最初のプラスミドライブラリーとの対比で、最終の選択ラウンドで倍数増大が最も大きいバリアントとして選んだ（最終ラウンドのリード数（ラウンドにおけるリード総数を基準に正規化）／ライブラリー内のリード数（ラウンドにおけるリード総数を基準に正規化））。プラスミドライブラリーのシークエンシングで出現しないバリアントの解析を可能にするため、各個別バリアントに対する正規化の前にシュードカウント１を加えた。Ｆｏｗｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）上記参照。ペプチド挿入のアミノ酸配列を図２に示す。
【０１８６】
このアプローチを通じて生成したバリアントにより、硝子体内注射を用いた霊長類網膜における非侵襲的な汎網膜遺伝子治療戦略が可能になる。このようなＡＡＶベクターは、網膜色素変性、レーバー先天黒内障、桿体錐体ジストロフィー、錐体ジストロフィー、１色覚、Ｘ連鎖性網膜分離、ＣＲＢ１、オプトジェネティック治療、栄養及び生存因子（例えば、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ、ＲｄＣＶＦ、ＲｄＣＶＦＬ、ＸＩＡＰ）、及びｓＦＬＴのような血管新生のブロッカーの発現を含めた、網膜変性疾患のための遺伝子増強治療に使用され得る。また、このようなベクターは、網膜疾患における遺伝子修正または追加モデル作成のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のような遺伝子編集ツールの送達にも使用され得る。
【０１８７】
参考文献
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Ｍａｇｕｉｒｅ，Ａ．Ｍ．，Ｓｉｍｏｎｅｌｌｉ，Ｆ．，Ｐｉｅｒｃｅ，Ｅ．Ａ．，Ｐｕｇｈ，Ｅ．Ｎ．，Ｊｒ．，Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．，Ｂｅｎｎｉｃｅｌｌｉ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００８）．  Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｆｏｒ  Ｌｅｂｅｒ’ｓ  Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ  Ａｍａｕｒｏｓｉｓ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，３５８（２１），２２４０−２２４８．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ０８０２３１５
Ｎａｋａｚａｗａ，Ｔ．，Ｍａｔｓｕｂａｒａ，Ａ．，Ｎｏｄａ，Ｋ．，Ｈｉｓａｔｏｍｉ，Ｔ．，Ｓｈｅ，Ｈ．，Ｓｋｏｎｄｒａ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．（２００６）．  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ  ｉｎ  ｒａｔｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｖｉｓｉｏｎ，１２，８６７−８７８．
Ｎａｋａｚａｗａ，Ｔ．，Ｔａｋｅｄａ，Ｍ．，Ｌｅｗｉｓ，Ｇ．Ｐ．，Ｃｈｏ，Ｋ．−Ｓ．，Ｊｉａｏ，Ｊ．，Ｗｉｌｈｅｌｍｓｓｏｎ，Ｕ．，ｅｔ  ａｌ．（２００７）．  Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｇｌｉａｌ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎ  ｇｌｉａｌ  ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ａｃｉｄｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｖｉｍｅｎｔｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ＆  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４８（６），２７６０−２７６８．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１６７／ｉｏｖｓ．０６−１３９８
Ｐｅｔｒｓ−Ｓｉｌｖａ，Ｈ．，Ｄｉｎｃｕｌｅｓｃｕ，Ａ．，Ｌｉ，Ｑ．，Ｍｉｎ，Ｓ．−Ｈ．，Ｃｈｉｏｄｏ，Ｖ．，Ｐａｎｇ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（２００９）．  Ｈｉｇｈ−ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｒｅｔｉｎａ  ｂｙ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ−ｍｕｔａｎｔ  ＡＡＶ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ：ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（３），４６３−４７１．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｍｔ．２００８．２６９
Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｏｒｔｉｚ，Ｊ．，Ｏｊａｌａ，Ｄ．Ｓ．，Ｗｅｓｔｅｓｓｏｎ，Ｏ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．Ｒ．，Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｙ．，Ｓｔｅｉｎｓａｐｉｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）．  ＡＡＶ  ａｎｃｅｓｔｒａｌ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒｏａｄｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｖｉｒａｌ  ｖａｒｉａｎｔｓ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２２（１２），９３４−９４６．ｈｔｔｐ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｇｔ．２０１５．７４
【０１８８】
実施例２：ＧＦＰバーコードライブラリーの構築及びシークエンシングの方法
ＧＦＰバーコードライブラリーの構築
ｅＧＦＰを駆動する自己相補的ＣＡＧプロモーターを含有するＡＡＶ  ＩＴＲコンストラクトの後に、固有の２５ｂｐ  ＤＮＡバーコードをクローニングした（ＣＡＧ−ＧＦＰ−バーコード−ｐＡ）。個別のバリアントを、異なるバーコードを含有するコンストラクトと別々にパッケージングした。次に、バリアントを力価一致させ等しい比率で混合し、その後にマウス、イヌ、及び霊長類に注射した。
【０１８９】
ＧＦＰバーコードライブラリーのディープシークエンシング
バーコードを、イヌまたは霊長類の網膜組織から採取したＤＮＡまたはｃＤＮＡ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素を用いてｍＲＮＡから作成）から直接的にＰＣＲ増幅した。網膜全体にわたる区域から、及びＯＮＬまたはＲＰＥから、試料を収集した。プライマーは、ＧＦＰバーコード周辺の約５０ｂｐの領域を増幅し、複数の試料のマルチプレクシングを可能にするＩｌｌｕｍｉｎａアダプター配列及びセカンダリーバーコードを含有した。ＭｉＳｅｑ上での１００サイクルのシングルリードランにより、ＰＣＲアンプリコンを精製しシークエンシングした。リードカウントを、ランにおけるリード総数により正規化した。Ｐｙｔｈｏｎで書いたカスタムコードを用いてバーコード存在量の解析を実施し、次にＰａｎｄａｓでプロットを作成した。注射したライブラリーに対する総ライブラリーの倍数増大（回収試料における合計％／注射したライブラリーにおける合計％）に基づいて、パフォーマンスが最高のバリアントを選択した。ｎ＝１の霊長類に対し解析を実施した。
【０１９０】
図９は表１を示し、図１０は表２を示している。
【０１９１】
表１は、ＧＦＰバーコードライブラリー注射後に光受容体から回収した霊長類由来バリアント及び対照のランキングを示している。表２は、ＧＦＰバーコードライブラリー注射後にＲＰＥ細胞から回収した霊長類由来バリアント及び対照のランキングを示している。ライブラリーは、固有のＤＮＡバーコードと融合しているＧＦＰと共にパッケージングされた個別のバリアントを含有した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、網膜内の特定の細胞タイプから回収したＤＮＡからバーコードを増幅した。表１及び表２の「領域」とは、ＤＮＡを回収した領域を示す。各バリアントのリードの倍数増大は、（各固有バリアントに対応する）回収細胞内の各固有バーコードに対するリード数を、注射したライブラリーにおける各バリアントに対するリード数で割ることにより算出した。この表は、網膜内の複数の位置にわたる倍数増大の平均を示す。バリアントを、バーコードの倍数増大によりランク付けした。
【０１９２】
図１１は、霊長類網膜におけるＧＦＰバーコードライブラリーのＧＦＰ発現を示している。プールされたＧＦＰバーコードライブラリー（全ての試験対象ウイルスを含有）の硝子体内注射からもたらされるＧＦＰ発現は、主に網膜外層に位置し、ＡＡＶ２４ＹＦの発現よりも網膜外層に向けられる向性を伴った。
【０１９３】
実施例３
霊長類試験
４〜１０歳のカニクイザルを全ての試験で使用し、硝子体内注射を行った。フルオロフォア発現のために使用したサルに、免疫抑制のため、毎日シクロスポリンの皮下注射を６ｍｇ／ｋｇの用量にて投与し、１５０〜２００ｎｇ／ｍｌのターゲット範囲内の血中トラフレベルに基づいて調整した。注射から３週間後、自己蛍光設定を伴って、２つの網膜から共焦点走査型レーザー検視鏡画像（Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ  ＨＲＡ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）を取得した。これにより、有効なｔｄＴｏｍａｔｏ及びＧＦＰの視覚化がもたらされる。組織診断のため、サルを安楽死させ、両方の網膜を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、共焦点顕微鏡法により組織を調べた。本実験の結びにあたり、安楽死は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎのＰａｎｅｌ  ｏｎ  Ｅｕｔｈａｎａｓｉａが推奨するように、静脈内の過量のペントバルビタールナトリウム（７５ｍｇ  ｋｇ−１）を投与することにより達成した。次に、霊長類網膜の小片を３０％スクロース中で調製し、ＯＣＴ培地に包埋し、瞬間冷凍し、ネイティブフルオロフォア発現の共焦点顕微鏡イメージング用に２０μｍに薄切りした。標識用の抗体は、抗ＧＦＰ（Ａ１１１２２、Ｔｈｅｒｍｏ、１：２５０）、抗ビメンチン（Ｄａｋｏ、１：１０００）、ピーナツアグルチニン（ＰＮＡ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、１：２００）、及び抗錐体アレスチン（７Ｇ６、１：５０）とした。手順は、ＡＲＶＯ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ及びＯｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒのガイドラインに従って行った。
【０１９４】
結果
霊長類網膜におけるＡＡＶの定向進化
非ヒト霊長類は、ヒトに最も密接に関係し、網膜の解剖学的構造がヒトのものに類似しているため、イヌに加えて、ヒトの治療開発にとってクリティカルな前臨床モデルである。詳細には、霊長類は、中心窩を有する唯一の大型動物モデルである。中心窩は、読書のような日常活動にとって最も重要であり、生活の質に対しクリティカルであり、多数の網膜変性で喪失する、網膜における特化された高明瞭度区域である。イヌの試験で観察された種特異性は、霊長類網膜における定向進化というさらなる道筋を追求する動機を発明者らに与えた。ＥＰ２、ＥＰ５、ＥＰ６、ＥＰ８、ＥＰ９、ＥＰ−祖先、ＡＡＶ２−７ｍｅｒ、祖先−７ｍｅｒ（Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｏｒｔｉｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２２，９３４−９４６（２０１５））、及びループスワップ（Ｋｏｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １７，２０８８−２０９５（２００９））の９つのライブラリーをパッケージングし、霊長類スクリーニングに含めた。経時的な５選択ラウンド（ラウンド３の後に１ラウンドのエラープローンＰＣＲを実施）のためにライブラリーを注射し、採取し、再パッケージングした。ＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子をＯＮＬからＰＣＲ増幅し、同時に上を覆うＲＰＥからもＰＣＲ増幅した。ＥＰライブラリーからのバリアントが網膜組織から回収されなかったため、ＥＰライブラリーはラウンド３で中止した。ラウンド４で、別々のＰＣＲアニーリング部位及び制限部位により他のライブラリーから単離した別々の骨格を用いて、追加ライブラリー（ＡＡＶ４−７ｍｅｒ及びＡＡＶ５−７ｍｅｒ）を選択に追加した
【０１９５】
ディープシークエンシングにより、イヌのスクリーニングからの観察と同様、ライブラリーは約１０6 〜約１０7 の個別バリアントを含有し、これらは６選択ラウンドにわたって約１０4 〜約１０5 のバリアントに収束することが明らかになった。これは、サンガーシークエンシングを通じては観察することが不可能な多様性である（図１２Ａ）。イヌのスクリーニングで観察されたように、解析した各ライブラリーにおいて、初期のプラスミドライブラリー内のごく一部のライブラリーメンバーが過剰に提示された（図１２Ｂ）。選択ラウンドにわたる高スループットシークエンシングからの結果の解析により、各ライブラリーについて、選択ラウンド中に顕著に出現が増大したバリアントのサブセットが明らかになった（図１２Ｃ）。
【０１９６】
霊長類網膜におけるセカンダリーバーコードＧＦＰライブラリーのスクリーニング
これら５つのライブラリー（図１２Ｃ）から１６個のバリアントを選択して、対照としてのＡＡＶ２、ＡＡＶ２−４ＹＦ＋ＴＶ、ＡＡＶ４、及びＡＡＶ５と共に、これらをＧＦＰバーコードライブラリーに対するセカンダリー選択ラウンドに含めた。この新たなライブラリーを霊長類の両眼に注射し、注射から３週間後、網膜全体にわたる諸位置から生検を収集した（１２Ｄ）。ＧＦＰバーコードライブラリーの注射からもたらされたＧＦＰ発現は、主に光受容体に、さらに一部の網膜内層細胞にも見いだされた。これは、より強力な網膜内層発現をもたらしたＡＡＶ２または７ｍ８からシフトしている向性である（図１２Ｅ）。
【０１９７】
図１２Ａ−１２Ｆは、霊長類網膜におけるＡＡＶの定向進化を示している。（Ａ）バリアントライブラリーのディープシークエンシングにより、選択ラウンドにわたるバリアントの収束が明らかになった。（Ｂ）評価した各ライブラリーにおいて、少ない割合のバリアントがプラスミドライブラリーで過剰に提示されている。（Ｃ）スキャッタープロットは、霊長類網膜に注射した各ライブラリーの最終選択ラウンドにおける個別のバリアントの挙動を示している。元のライブラリーで過剰に提示されたバリアントは、青色に着色されている。最終選択ラウンドで提示率の倍数増大が最も大きかったバリアントは、マゼンタで示されている。元のライブラリーで過剰に提示され、かつ選択ラウンドにわたって顕著に提示率が増大したバリアントは、オレンジ色に着色されている。（Ｄ）霊長類網膜のマップは、選択ラウンド及びＧＦＰバーコードライブラリーのために収集された試料の分布を示している。バリアントの色分けは、図２と同じである。（Ｅ）バーコードライブラリーからもたらされたＧＦＰ発現により、発現が、選択されたバリアントでは網膜外層向性にシフトしていることが明らかになった。（Ｆ）霊長類網膜外層におけるＧＦＰバーコードライブラリー注射の結果を示している。バリアントのリストは、パフォーマンス最高（上）から最低（下）のベクターの順に並べられており、付された値はバリアントが他のベクターと競合した程度を示し、ＡＡＶライブラリーにおける合計％／回収ライブラリーにおける合計％として表現されている。
【０１９８】
トップパフォーマンスの霊長類バリアントの検証
網膜外層におけるベクターのパフォーマンスの定量化により、ＡＡＶ２ベースのバリアントは他の血清型ベースのウイルスよりもパフォーマンスが優れていることが明らかになった。あるベクター、ループスワップバリアントＡＡＶ２、およそ５８８−ＬＱＲＧＶＲＩＰＳＶＬＥＶＮＧＱ（配列番号１１６）は、他のバリアントよりもパフォーマンスが優れていたが、より低いウイルス力価（約５×１０11ｖｇ／ｍＬ）をもたらした。
【０１９９】
そのため、ＧＦＰバーコードスクリーニングからのランキング２位のバリアントであり、高い力価（約５×１０13ｖｇ／ｍＬ）でパッケージングされたＡＡＶ２−ＬＡＬＩＱＤＳＭＲＡ（配列番号１１７、ＮＨＰ＃９と命名）を、網膜内層の神経節細胞及び網膜外層の錐体に対象を絞る第１ラウンドの検証試験に選択した。錐体光受容体は、成人の黄斑変性（ＡＭＤ）に関与する。黄斑変性は、先進国において２０４０年までに全世界で２億８，８００万人が発症すると予測されている失明の最も一般的な原因であるため、錐体光受容体は網膜遺伝子治療の一次標的である。ＮＨＰ＃９を、ＲＧＣ内でｔｄＴｏｍａｔｏを駆動するＳＮＣＧプロモーター及び錐体内でＧＦＰの発現を駆動するｐＲ１．７プロモーターと共にパッケージングした。この両方のコンストラクトをコードするベクターを、等しい比率（約１．５×１０12ｖｇ／コンストラクト／眼）で混合し、カニクイザルに硝子体内注射した。先に説明したバリアント、７ｍ８（Ｄａｌｋａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）上記参照）を、等しい力価の同じコンストラクトと共にパッケージングし、反対側の眼の硝子体に注射した。ＮＨＰ＃９を注射した眼において、ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターのＲＧＣでの発現は、網膜全体にわたり神経節細胞に効率的に感染した７ｍ８と比べて低かったが、中心窩錐体での発現は、７ｍ８との対比で大きく増大した。これは、網膜内層から網膜外層内の光受容体に向性がシフトしたことを示すものである。ｄｄＣＴ法を用いて実施したｑＲＴ−ＰＣＲにより、ＧＦＰ発現が７ｍ８との対比で１１．７１（１０．３７〜１３．２２）倍増大したことが明らかになった。平坦にマウントした網膜から収集した画像に対し、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアを用いて実施した標識細胞のカウントからも、形質導入された神経節細胞の数の実質的な低下と、ＮＨＰ＃９に標的化された錐体の数の増大とが確認された。
【０２００】
次に、ＧＦＰバーコードスクリーニングからのランキングトップのバリアントであるループスワップバリアント、およそ５８８−ＬＱＲＧＶＲＩＰＳＶＬＥＶＮＧＱ（配列番号１１８、ＮＨＰ＃２６と命名）についても、産生されたウイルス粒子は少数であったが、検証試験を行った。約５×１０10個の粒子のＮＨＰ＃２６−ｓｃＣＡＧ−ｅＧＦＰを、カニクイザルの片眼に硝子体内注射した。注射した粒子数は少なかったが、中心窩内及び網膜全体にわたる効率的なＧＦＰ発現が観察された（図１３Ｇ）。７ｍ８、ＮＨＰ＃９（図１３Ａ）、及び他の天然存在の血清型で観察された中心窩のスポット状及び輪状の発現パターンとは対照的に、ＮＨＰ＃２６の眼底イメージングは、小窩の中央に円盤状のＧＦＰ発現をもたらした（図１３Ｇ）。平坦にマウントした網膜の共焦点イメージングからは、非常に少数のＧＦＰ陽性の神経節細胞軸索と共に、中心窩周辺のこの円盤状の発現パターンが確認された（図１３Ｈ）。ＧＦＰ発現の点状領域は、網膜血管の周囲でしばしば最も強く（図１３Ｉ）、網膜全体にわたり位置していた。網膜から作製したクリオスタット切片のイメージングからは、ＧＦＰ＋神経節細胞軸索の欠如によって示されるように神経節細胞でのＧＦＰ発現が少ない一方で、ミュラー細胞、内顆粒層内のさらなる細胞、網膜全体にわたる中心窩錐体及び桿体において高レベルのＧＦＰ発現が見いだされたことが確認された（図１３Ｊ〜１３Ｑ）。
【０２０１】
図１３Ａ−１３Ｑは、霊長類網膜における進化したＡＡＶの検証を示している。（Ａ〜Ｆ）７ｍ８及びバリアントＮＨＰ＃９にパッケージングされた約１．５×１０12個のＳＣＮＧ−ｔｄＴｏｍａｔｏ粒子及び約１．５のｐＲ１．７−ｅＧＦＰの霊長類網膜への同時注射を行った。７ｍ８の硝子体内注射（Ａ、Ｃ、Ｅ）は、ロバストな神経節細胞でのｔｄＴｏｍａｔｏ発現及び中心窩錐体でのＧＦＰ発現をもたらした。これに対し、等しい数のＮＨＰ＃９粒子の注射は、７ｍ８との対比で、神経節細胞での発現低減及び錐体でのＧＦＰの発現増大をもたらした(Ｂ、Ｄ、Ｆ)。（Ｇ）５×１０10個のＮＨＰ＃２６−ｓｃＣＡＧ−ＧＦＰ粒子を注射した後の霊長類網膜における眼底イメージングは、小窩の中央における円盤状のＧＦＰ発現と、網膜全体にわたる点状のＧＦＰ発現パターンとをもたらした。（Ｈ）平坦にマウントした中心窩におけるネイティブＧＦＰ発現の共焦点イメージングを示している。（Ｉ）血管アーケードの外部区域におけるネイティブＧＦＰ発現の共焦点イメージングを示している。（Ｊ）中心窩を貫通したクリオスタット切片におけるネイティブＧＦＰ発現の共焦点イメージングを示している。（Ｋ）血管アーケードの外側の下網膜におけるネイティブＧＦＰ発現は、神経節細胞ではわずかなＧＦＰ発現を示すに過ぎないが、ミュラー細胞及び網膜外層内の光受容体では高レベルの発現を示している。ＲＰＥでは自己蛍光も観察された。（Ｌ）クリオスタット切片における抗ＧＦＰ標識により、光受容体でのＧＦＰ発現（外節から明白）、ミュラー細胞でのＧＦＰ発現（網膜に広がるプロセスから明白）、及び水平プロセスを伴った内顆粒層内の細胞（介在ニューロンである可能性がある）でのＧＦＰ発現が明らかになった。（Ｍ）中心窩切片における抗ＧＦＰ標識により、さらなるトランスフェクション錐体、ミュラーグリア、及び介在ニューロンが明らかになっている。（Ｎ）抗錐体アレスチン及び抗ＧＦＰによる同時標識により、視神経乳頭に隣接して作成した切片において、桿体光受容体でのＧＦＰ発現、及び内顆粒層内の細胞でのＧＦＰ発現が明らかになっている。（Ｏ）低発現区域における抗錐体アレスチン及び抗ＧＦＰ抗体による同時標識により、内顆粒層細胞でのＧＦＰ発現が明らかになっている。（Ｐ、Ｑ）血管アーケードの外側から収集したクリオスタット切片からの共焦点画像のモンタージュは、内顆粒層及び網膜外層での効率的なＧＦＰ発現を示している。
【０２０２】
本発明について、その具体的な実施形態を参照しながら説明してきたが、当業者は、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、種々の変更がなされてもよく、かつ等価物が代用されてもよいことを理解するはずである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、プロセスステップ（１つまたは複数）は、本発明の目的、趣旨、及び範囲に適合するように多くの修正が施されてもよい。このような修正は全て、添付の請求項の範囲内であるように意図されている。
【０２０３】
相互参照
本出願は、２０１７年６月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／５２７，８７１号及び２０１７年７月２０日に出願された同第６２／５３５，０４２号の恩典を主張し、これらの出願の全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０２０４】
連邦政府の助成による研究に関する記載
本発明は、国立衛生研究所の認可を受けた助成金番号１Ｒ０１ＥＹ０２２９７５−０１Ａ１の下、政府支援によって行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図７−１３】
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【図７−１４】
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【図７−１５】
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【図７−１６】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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