(57)【要約】  本発明は、遺伝性ミオパチーの治療における使用のための２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体に関する。【選択図】図１Ｂ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変に起因するミオパチーの治療における使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項２】
遺伝性ミオパチーによって引き起こされる筋機能障害に起因する病態の治療のための、請求項１に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項３】
前記筋機能は横紋のある骨格筋または心筋の機能である、請求項２に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項４】
前記筋機能の障害は心筋肥大である、請求項３に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項５】
前記筋機能は、線維症の進行性の発症により少なくとも部分的に損なわれる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項６】
前記遺伝子改変はジストロフィン遺伝子突然変異を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項７】
遺伝子改変に起因する前記ミオパチーは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）および／またはベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項８】
筋細胞のミトコンドリア呼吸を増加させる、請求項１〜７のいずれか一項に従って使用されることが意図される、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項９】
筋線維当たりの血管数を増加させる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項１０】
筋芽細胞の筋管への分化を増加させる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項１１】
前記２０−ヒドロキシエクジソンは式（Ｉ）の化合物：
【化１】
2020517712.tif 000007
である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項１２】
前記２０−ヒドロキシエクジソンは、植物抽出物または植物の一部からの抽出物であり、前記植物は、前記植物の乾燥重量で少なくとも０．５％の式（Ｉ）の２０−ヒドロキシエクジソンを含有する植物から選択され、前記抽出物は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の式（Ｉ）の２０−ヒドロキシエクジソンを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項１３】
前記抽出物は、前記抽出物の安全性、利用可能性または薬学的適用の有効性に影響を与える可能性がある夾雑物を、前記抽出物の乾燥重量で０〜０．０５％含む、請求項１２に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項１４】
前記植物は、ステマカンサ・カルタモイデス、シアノチス・アラクノイデアおよびシアノチス・ヴァガから選択される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項１５】
前記２０−ヒドロキシエクジソンは、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の式（Ｉ）の２０−ヒドロキシエクジソンを含むステマカンサ・カルタモイデス根抽出物である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項１６】
誘導体は一般式（ＩＩ）の化合物：
【化２】
2020517712.tif 000008
［式中、
Ｖ−Ｕは、炭素−炭素単結合であり、Ｙは、ヒドロキシル基もしくは水素であり、またはＶ−Ｕは、Ｃ＝Ｃエチレン結合であり；
Ｘは、酸素であり、
Ｑは、カルボニル基であり；
Ｒ1は、基（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）；基（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）；基（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）ＣＯ2（Ｃ1−Ｃ6）；基（Ｃ1−Ｃ6）Ａ、Ａは、タイプＯＨ、ＯＭｅ、（Ｃ1−Ｃ6）、Ｎ（Ｃ1−Ｃ6）、ＣＯ2（Ｃ1−Ｃ6）の基により置換されていてよい複素環を表す；ＣＨ2Ｂｒ基から選択され；
Ｗは、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子である］
である、
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項１７】
式（ＩＩ）中：
Ｙは、ヒドロキシル基であり；
Ｒ1は、基（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）；基（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）；基（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）ＣＯ2（Ｃ1−Ｃ6）；基（Ｃ1−Ｃ6）Ａ、Ａは、タイプＯＨ、ＯＭｅ、（Ｃ1−Ｃ6）、Ｎ（Ｃ1−Ｃ6）、ＣＯ2（Ｃ1−Ｃ6）の基により置換されていてよい複素環を表す、から選択され
Ｗは、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子である、
請求項１６に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項１８】
・Ｎｏ．１：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−１７−（２−モルホリノアセチル）−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン、
・Ｎｏ．２：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１７−［２−（３−ヒドロキシピロリジン−１−イル）アセチル］−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；
・Ｎｏ．３：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１７−［２−（４−ヒドロキシ−１−ピペリジル）アセチル］−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；
・Ｎｏ．４：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１７−［２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペリジル］アセチル］−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；
・Ｎｏ．５：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−［２−（３−ジメチルアミノプロピル（メチル）アミノ）アセチル］−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；
・Ｎｏ．６： ２−［２−オキソ−２−［（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−６−オキソ−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル］エチル］エチルスルファニルアセテート；
・Ｎｏ．７：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（２−エチルスルファニルアセチル）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；
・Ｎｏ．８：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１７−［２−（２−ヒドロキシエチルスルファニル）アセチル］−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン
から選択される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【請求項１９】
前記誘導体は式（ＩＩＩ）：
【化３】
2020517712.tif 000009
のものである、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の使用のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ミオパチー、特に遺伝的起源の筋ジストロフィーの治療のための精製天然２０−ヒドロキシエクジソン（２０Ｅ）または合成誘導体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミオパチーは、筋肉に直接影響を及ぼす疾患である。これには、症状および筋肉の関与の機構に応じて種々の型がある。遺伝性ミオパチーおよび後天性ミオパチーの２つの分類がある。
【０００３】
遺伝性ミオパチーは、以下に細分される：
・進行性筋ジストロフィー（デュシェンヌ型およびベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィーならびに顔面肩甲上腕型ジストロフィー）、または先天性筋ジストロフィー、
・糖原病およびリピドーシスなどの代謝性ミオパチー、ならびにミトコンドリアミオパチー、
・スタイナートミオパチー（Ｓｔｅｉｎｅｒｔ  ｍｙｏｐａｔｈｙ）などの筋強直性ジストロフィー（ＭＤ１）、
・セントラルコア、ネマリン、マルチミニコア先天性ミオパチーまたは中心核および筋細管ミオパチー。
【０００４】
後天性ミオパチーには以下が含まれる：
・中毒性ミオパチー、
・炎症性ミオパチー、
・内分泌性ミオパチー。
【０００５】
ミオパチーは、進行性または一定の筋力低下として現れる。ミオパチーは、一般的に、筋肉量の損失（萎縮）を特徴とする。疾患進行中に、筋肉組織は線維組織に次第に置き換えられる（線維症）。
【０００６】
特に、影響を受けた筋肉の種類によって異なる、３０を超える筋ジストロフィー型がある。これらは、程度の差はあれ早期に発症し、体の種々の部位の骨格筋に影響を与える。場合によっては、呼吸器系および心筋の進行性損傷により患者の平均寿命は低下する。
【０００７】
数十種の異なる遺伝子が筋ジストロフィーに関与している。ほとんどの場合、これらは 、筋細胞の膜に存在するかまたはそれと結合するタンパク質の合成に関与する、構造維持および筋機能に不可欠の遺伝子である。例として、
・ジストロフィンは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）およびベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）に関与し、
・カルパイン、ジスフェリンおよびサルコグリカンは、肢帯型筋ジストロフィーに関与し、
・メロシン、α−ジストログリカンまたはセレノタンパク質Ｎは、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）の症例に関与している。
【０００８】
ＤＭＤは、筋ジストロフィーの最も多い型である。ＤＭＤは、男児３，５００人に１人が罹患しており、Ｘ染色体に位置するジストロフィン遺伝子に影響を及ぼす突然変異の結果である。重症度の低い型であるＢＭＤもまた、ジストロフィン遺伝子に関係し、男児１８，０００人に１人が罹患している。ＤＭＤは、筋肉構造全体に影響を及ぼす深刻な遺伝的病態である。この疾患では、筋線維の脆弱性はそれらの破壊につながり、筋肉組織の壊死を誘導する。再生機構に過度の負担がかかると、変性が優勢になり、筋力低下および労作不耐性を誘導する（Ｂａｒｎａｂｅｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。その後、筋線維は結合組織に取って代わられる（線維症）。３歳を超えると、筋力低下は次第に子どもの下肢に達する。この疾患は、続いて、背中、上肢の筋肉、最終的には呼吸筋で発症する。
【０００９】
現在、ＤＭＤおよびＢＭＤのための治癒的処置はないが、整形外科および呼吸器系の緩和的処置は生活の質および生命にかかわるリスクを改善する。患者の処置は、現在、筋肉の能力の最適化ならびに心臓および呼吸器系の合併症の予防および治療に基づいている。コルチコステロイドの使用は、平均して２年歩行期間を延長する一助となる。しかしながら、一部の子どもはこの処置に応答せず、この処置が悪影響、特に著しい骨の脆弱化をさらに引き起こす。部分的な心臓保護は、変換酵素阻害薬とβ遮断薬の組合せによって得られる。
【００１０】
新しい処置が臨床開発中である。エキソンスキッピングは、通常のタンパク質より短いがそれでも機能を果たせる種類のジストロフィンを細胞が生産するように強制することからなる。同じタイプのさらなるアプローチは、ジストロフィン合成を早期に中断する突然変異を優先することからなる。しかしながら、このタイプの療法は、疾患を引き起こす突然変異の正確な性質に応じて、少数の患者にしか向けられていない。最後に、遺伝子療法は、患者に短い種類のジストロフィン（ミニ−ジストロフィンまたはマイクロ−ジストロフィン）を合成する可能性を提供するが、体内に対して外来と考えられるこれらのタンパク質に対する免疫応答の主要な問題に直面している。
【００１１】
付属肢筋力の不可逆的低下および労作不耐性の発現に加えて、この疾患の主な合併症の１つが線維症の発症であり、この線維症は、特に心臓に影響を及ぼし、心不全（拡張性肥大を伴う）に至る。この損傷は、患者の生命にかかわる。従って、線維症の発症は不可逆的発生であり、筋機能を保存するためにはこの発生を妨げるべきである。この意味で、治療的アプローチは以下に焦点を当てる必要がある：
・労作耐性の維持
・筋力の維持
・および線維症の発症の予防。
【００１２】
フィトエクジステロイドは、ポリヒドロキシル化ステロールの主要なファミリーである。これらの分子は、様々な植物種（シダ、裸子植物、被子植物）によって生産され、これらの植物の害虫防御に関与している。
【００１３】
仏国特許第３０２１３１８号明細書（特許文献１）には、フィトエクジステロイド、より詳しくは２０−ヒドロキシエクジソン（２０Ｅ）は、数多くの薬理学的研究の対象であったことが開示されている。これらの研究では、この分子の抗糖尿病特性および同化特性（ａｎａｂｏｌｉｓｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ)が強調された。筋肉におけるタンパク質合成に対する刺激効果は、ｉｎ  ｖｉｖｏではラットで観察され（Ｓｙｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；Ｔｏｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏではＣ２Ｃ１２マウス筋管において観察されている（Ｇｏｒｅｌｉｃｋ−Ｆｅｌｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。これは、翻訳レベルでの効果からなり、リボゾームタンパク質ｐ７０Ｓ６Ｋのリン酸化を必要とし、タンパク質合成を刺激するためにＩＧＦ−１によっても使用される経路である、プロテインキナーゼＡｋｔ/ＰｋＢを必要とするカスケードに従う。
【００１４】
動物モデルにおける上記効果のいくつかは、さらに少ない臨床研究で観察された。従って、２０−ヒドロキシエクジソンは、若い運動選手で筋肉量を増加させる（Ｓｉｍａｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）。
【００１５】
最後に、特許文献１には、サルコペニアおよびサルコペニア肥満の治療および予防のための、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体の使用が記載されている（Ｌａｆｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】仏国特許第３０２１３１８
【発明の概要】
【００１７】
本発明者らは、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体がミオパチーに罹患している哺乳動物のｉｎ−ｔｏｔｏ身体能力ならびにｉｎ−ｓｉｔｕ筋力を大幅に向上させることを発見した。ｉｎ−ｔｏｔｏ身体能力およびｉｎ  ｓｉｔｕ筋力はそれぞれ、最大移動距離の測定および前脛骨筋の最大絶対等尺性筋力によって決定される。これらの効果は、ミオパチー、特に筋ジストロフィーに罹患している哺乳動物の可動性を向上させることが可能である。
【００１８】
本発明は、遺伝子改変に起因するミオパチーの治療において使用されることが意図される２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体に関する。
【００１９】
本明細書において、以下、用語２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体とは、２０−ヒドロキシエクジソン、その誘導体、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体を豊富に含む植物抽出物、ならびに活性薬剤として、２０−ヒドロキシエクジソン、その誘導体および／または２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体を豊富に含む植物抽出物を含有する組成物を示す。
【００２０】
２０−ヒドロキシエクジソンの誘導体は半合成によって得られる。
【００２１】
２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体は、有利には、製薬等級に精製される。
【００２２】
より詳しくは、本発明は、遺伝性ミオパチーによって引き起こされる筋機能障害に起因する病態の治療において使用されることが意図される２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体に関する。
【００２３】
上記筋機能は、横紋のある骨格筋または心筋の機能である。
【００２４】
より詳しくは、上記筋機能障害は心筋肥大である。
【００２５】
さらに詳しくは、本発明は、前記筋機能が線維症の進行性の発症により少なくとも部分的に損なわれる任意のミオパチーの治療において使用されることが意図される２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体に関する。
【００２６】
本発明は、遺伝子改変に起因するミオパチーの治療において使用されることが意図される２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体に関する。
【００２７】
遺伝子改変とは、突然変異、ヌクレオチド挿入またはヌクレオチド欠失と理解される。
【００２８】
本発明は、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）および／またはベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）の治療において使用されることが意図される２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体に関する。
【００２９】
本発明によれば、２０−ヒドロキシエクジソンおよびその誘導体は、ジストロフィン遺伝子突然変異に起因する任意のミオパチーの治療において使用されることが意図される。
【００３０】
１つの特徴によれば、２０−ヒドロキシエクジソンは式（Ｉ）の化合物である：
【００３１】
【化１】
2020517712.tif 000003
【００３２】
有利には、式（Ｉ）の化合物は製薬等級に精製される。
【００３３】
具体的には、上記２０−ヒドロキシエクジソンは、植物の抽出物または植物の一部からの抽出物であり、上記植物は、上記植物の乾燥重量で少なくとも０．５％の式（Ｉ）の２０−ヒドロキシエクジソンを含有する植物から選択され、上記抽出物は、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の式（Ｉ）の２０−ヒドロキシエクジソンを含む。
【００３４】
製薬等級への精製について言及する。
【００３５】
上記抽出物は、以下、ＢＩＯ１０１と呼ぶ。上記抽出物は、注目すべきことに、上記抽出物の安全性、利用可能性または薬学的適用の有効性に影響を与える可能性がある、微量化合物などの夾雑物を、上記抽出物の乾燥重量で０〜０．０５％含む。
【００３６】
本発明のある特徴によれば、上記夾雑物は、ルブロステロン、ジヒドロルブロステロンまたはポストステロンなどの１９個または２１個の炭素原子を有する化合物である。
【００３７】
ＢＩＯ１０１が生産される植物は、有利には、ステマカンサ・カルタモイデス（Ｓｔｅｍｍａｃａｎｔｈａ  ｃａｒｔｈａｍｏｉｄｅｓ）（ルージァ・カルタモイデス（Ｌｅｕｚｅａ  ｃａｒｔｈａｍｏｉｄｅｓ）とも呼ばれる）、シアノチス・アラクノイデア（Ｃｙａｎｏｔｉｓ  ａｒａｃｈｎｏｉｄｅａ）およびシアノチス・ヴァガ（Ｃｙａｎｏｔｉｓ  ｖａｇａ）から選択される。
【００３８】
本発明は、とりわけ、少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％の式（Ｉ）の２０−ヒドロキシエクジソンを含むステマカンサ・カルタモイデス根抽出物の使用に向けられる。
【００３９】
この抽出物では、２０−ヒドロキシエクジソンは製薬等級に精製される。
【００４０】
より詳しくは、この抽出物は、３〜１５ｍｇ／ｋｇ*日の割合で投与される。
【００４１】
特に、この抽出物は、成人患者の場合、１回または複数回用量で２００〜１０００ｍｇ／日の割合で、小児の場合、１回または複数回用量で７０〜３５０ｍｇ／日の用量で投与される。
【００４２】
さらに、本発明は、活性薬剤としてＢＩＯ１０１を含む組成物に関する。
【００４３】
その組成物は、好ましくは、２００〜１０００ｍｇの活性薬剤（ＢＩＯ１０１）を含有する。
【００４４】
さらなる特徴によれば、２０−ヒドロキシエクジソンの誘導体は、一般式（ＩＩ）の化合物：
【００４５】
【化２】
2020517712.tif 000004
【００４６】
［式中、
Ｖ−Ｕは、炭素−炭素単結合であり、Ｙは、ヒドロキシル基もしくは水素であり、またはＶ−Ｕは、Ｃ＝Ｃエチレン結合であり；
Ｘは、酸素であり、
Ｑは、カルボニル基であり；
Ｒ1は、基（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）；基（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）；基（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）ＣＯ2（Ｃ1−Ｃ6）；基（Ｃ1−Ｃ6）Ａ、Ａは、タイプＯＨ、ＯＭｅ、（Ｃ1−Ｃ6）、Ｎ（Ｃ1−Ｃ6）、ＣＯ2（Ｃ1−Ｃ6）の基により置換されていてよい複素環を表す；ＣＨ2Ｂｒ基から選択され；
Ｗは、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子、好ましくはＯ、さらに選好的にはＳである］
である。
【００４７】
より詳しくは、式（ＩＩ）中：
Ｙは、ヒドロキシル基であり；
Ｒ1は、基（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）；基（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）；基（Ｃ1−Ｃ6）Ｗ（Ｃ1−Ｃ6）ＣＯ2（Ｃ1−Ｃ6）；基（Ｃ1−Ｃ6）Ａ、Ａは、タイプＯＨ、ＯＭｅ、（Ｃ1−Ｃ6）、Ｎ（Ｃ1−Ｃ6）、ＣＯ2（Ｃ1−Ｃ6）の基により置換されていてよい複素環を表す、から選択され；
Ｗは、Ｎ、ＯおよびＳから選択されるヘテロ原子、好ましくはＯ、さらに選好的にはＳである。
【００４８】
具体的には、式（ＩＩ）の化合物は、
・Ｎｏ．１：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−１７−（２−モルホリノアセチル）−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン、
・Ｎｏ．２：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１７−［２−（３−ヒドロキシピロリジン−１−イル）アセチル］−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；
・Ｎｏ．３：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１７−［２−（４−ヒドロキシ−１−ピペリジル）アセチル］−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；
・Ｎｏ．４：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１７−［２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペリジル］アセチル］−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；
・Ｎｏ．５：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−［２−（３−ジメチルアミノプロピル（メチル）アミノ）アセチル］−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；
・Ｎｏ．６： ２−［２−オキソ−２−［（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−６−オキソ−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−１７−イル］エチル］エチルスルファニルアセテート；
・Ｎｏ．７：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−１７−（２−エチルスルファニルアセチル）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン；
・Ｎｏ．８：（２Ｓ，３Ｒ，５Ｒ，１０Ｒ，１３Ｒ，１４Ｓ，１７Ｓ）−２，３，１４−トリヒドロキシ−１７−［２−（２−ヒドロキシエチルスルファニル）アセチル］−１０，１３−ジメチル−２，３，４，５，９，１１，１２，１５，１６，１７−デカヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［ａ］フェナントレン−６−オン
から選択される。
【００４９】
特に、フィトエクジステロイドは、式（ＩＩＩ）の化合物である。
【００５０】
【化３】
2020517712.tif 000005
【００５１】
この化合物は以下ＢＩＯ１０３と呼ぶ。
【００５２】
本発明のさらなる利点、目的および特定の特徴は、添付の図面を参照して、本発明によるデバイスの少なくとも１つの特定の実施形態の以下の限定されない説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ】図１Ａは、Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールからのマウス群の労作耐性の代表的な図である：健常（Ｃ５７）および未処置のｍｄｘ（ジストロフィン遺伝子での突然変異）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、マウス群の労作耐性の代表的な図である：２ヶ月の処置後の未処置のｍｄｘ、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘおよびＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘ。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールからのマウス群の前脛骨筋の最大絶対等尺性筋力の代表的な図である：健常（Ｃ５７）および未処置のｍｄｘ。
【図２Ｂ】図２Ｂは、マウス群の前脛骨筋の最大絶対等尺性筋力の代表的な図である：２ヶ月の処置後の未処置のｍｄｘ、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘおよびＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘ。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールからの様々なマウス群の心臓からの線維症マーカーＣＴＧＦ（結合組織増殖因子）およびＣｏｌ１ａ１（コラーゲン１）の遺伝子発現（ｍＲＮＡ）の代表的な図である：２ヶ月の処置後の健常（Ｃ５７）、未処置のｍｄｘ、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘおよびＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘ。
【図３Ｂ】図３Ｂは、Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールからの様々なマウス群の心臓からの線維症マーカーＣＴＧＦ（結合組織増殖因子）およびＣｏｌ１ａ１（コラーゲン１）の遺伝子発現（ｍＲＮＡ）の代表的な図である：２ヶ月の処置後の健常（Ｃ５７）、未処置のｍｄｘ、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘおよびＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘ。
【図３Ｃ】図３Ｃは、Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールからの様々なマウス群の心臓からの肥大マーカーｍｙｈ７（βミオシン重鎖）およびＢＭＰ４（骨形成因子４）の遺伝子発現（ｍＲＮＡ）の代表的な図である：２ヶ月の処置後の健常（Ｃ５７）、未処置のｍｄｘ、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘおよびＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘ。
【図３Ｄ】図３Ｄは、Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールからの様々なマウス群の心臓からの肥大マーカーｍｙｈ７（βミオシン重鎖）およびＢＭＰ４（骨形成因子４）の遺伝子発現（ｍＲＮＡ）の代表的な図である：２ヶ月の処置後の健常（Ｃ５７）、未処置のｍｄｘ、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘおよびＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘ。
【図４Ａ】図４Ａは、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色された、健常Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールマウス（Ｃ５７）の前脛骨筋の組織学的切片の代表的な画像である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色された、未処置のｍｄｘ  Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールマウス（ｍｄｘ）の前脛骨筋の組織学的切片の代表的な画像である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色された、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘ  Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールマウス（ｍｄｘ＋ＢＩＯ１０１）の前脛骨筋の組織学的切片の代表的な画像である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）で染色された、ＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘ  Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールマウス（ｍｄｘ＋ＢＩＯ１０３）の前脛骨筋の組織学的切片の代表的な画像である。
【図５Ａ】図５Ａは、Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールからの健常（Ｃ５７）および未処置のｍｄｘ（ｍｄｘ）マウス群それぞれの、シリウスレッド（ＳＲ）で染色された、前脛骨筋の代表的な組織学的切片である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールからの健常（Ｃ５７）および未処置のｍｄｘ（ｍｄｘ）マウス群それぞれの、シリウスレッド（ＳＲ）で染色された、前脛骨筋の代表的な組織学的切片である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールからの健常（Ｃ５７）および未処置のｍｄｘ（ｍｄｘ）マウス群の線維化領域の定量の代表的な図である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘマウス（ｍｄｘ  ＢＩＯ１０１）およびＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘマウス（ｍｄｘ  ＢＩＯ１０３）の群の、シリウスレッド（ＳＲ）で染色された、前脛骨筋の代表的な組織学的切片である。
【図５Ｅ】図５Ｅは、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘマウス（ｍｄｘ  ＢＩＯ１０１）およびＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘマウス（ｍｄｘ  ＢＩＯ１０３）の群の、シリウスレッド（ＳＲ）で染色された、前脛骨筋の代表的な組織学的切片である。
【図５Ｆ】図５Ｆは、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘマウス（ｍｄｘ  ＢＩＯ１０１）およびＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘマウス（ｍｄｘ  ＢＩＯ１０３）の群の、線維化領域の定量の代表的な図である。
【図６Ａ】図６Ａは、Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールのマウス群の腓腹筋の線維症マーカーコラーゲン１（Ｃｏｌ１ａ１）の、ウエスタンブロットによって検出されたタンパク質発現を示す：健常（Ｃ５７）、未処置のｍｄｘ（ｍｄｘ）。
【図６Ｂ】図６Ｂは、Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールのマウス群の腓腹筋の同じ線維症マーカーの、ウエスタンブロットによって検出されたタンパク質発現を示す：２ヶ月の処置後の未処置のｍｄｘ（ｍｄｘ）、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘおよびＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘ。
【図７Ａ】図７Ａは、筋芽細胞の筋管への融合指数の代表的な図である。使用したヒト筋芽細胞は、ＤＭＤに罹患している患者から得た。分化筋芽細胞は、ＢＩＯ１０１またはビヒクルで３日間処置した。
【図７Ｂ】図７Ｂは、筋管当たりの核の数の代表的な図である。使用したヒト筋芽細胞は、ＤＭＤに罹患している患者から得た。分化筋芽細胞は、ＢＩＯ１０１またはビヒクルで３日間処置した。
【図７Ｃ】図７Ｃは、筋管の直径の代表的な図である。使用したヒト筋芽細胞は、ＤＭＤに罹患している患者から得た。分化筋芽細胞は、ＢＩＯ１０１またはビヒクルで３日間処置した。
【図８Ａ】図８Ａは、ＤＭＤに罹患している患者からのヒト筋芽細胞におけるＡＫＴおよびＥＲＫ１／２タンパク質のリン酸化形態の、ウエスタンブロットによって検出されたタンパク質発現を示す。分化筋芽細胞は、ＢＩＯ１０１で１０分〜２４時間の期間処置した。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＤＭＤに罹患している患者からのヒト筋芽細胞におけるＡＫＴおよびＥＲＫ１/２タンパク質のリン酸化形態の、ウエスタンブロットによって検出されたタンパク質発現を示す。分化筋芽細胞は、ＢＩＯ１０１で１０分〜２４時間の期間処置した。
【図９Ａ】図９Ａはそれぞれ、ＤＭＤに罹患している患者から得られたヒト筋芽細胞の基礎および最大の呼吸を示す。分化筋芽細胞は、ビヒクルまたは異なる用量のＢＩＯ１０１で３日間処置した。細胞呼吸は、酸素消費速度を測定することにより決定される。
【図９Ｂ】図９Ｂはそれぞれ、ＤＭＤに罹患している患者から得られたヒト筋芽細胞の基礎および最大の呼吸を示す。分化筋芽細胞は、ビヒクルまたは異なる用量のＢＩＯ１０１で３日間処置した。細胞呼吸は、酸素消費速度を測定することにより決定される。
【図１０Ａ】図１０Ａは、健常（Ｃ５７）および未処置のｍｄｘ  Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子マウス群の各筋線維を取り囲む血管の定量の代表的な図である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、ビヒクルで処置されたｍｄｘマウス（ｍｄｘ）、ＢＩＯ１０１（ｍｄｘ  ＢＩＯ１０１）で処置されたｍｄｘマウスおよびＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘマウス（ｍｄｘ  ＢＩＯ１０３）の群の各筋線維を取り囲む血管の定量の代表的な図である。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
この説明は、限定されるものではない。
【００５５】
１．ＢＩＯ１０１精製方法
ＢＩＯ１０１は、以下の工程に従って、およそ９０％純粋の２０−ヒドロキシエクジソンの調製物から調製される：
ａ）およそ９０％純粋の２０−ヒドロキシエクジソンのメタノールへの熱溶解、濾過および部分濃縮、
ｂ）３容量のアセトンの添加、
ｃ）撹拌しながら０〜５℃の温度へ冷却、
ｄ）得られた沈殿物の濾過、
ｅ）アセトンおよび水での連続したすすぎ、および
ｆ）乾燥。
【００５６】
この精製は、産業規模で実施可能なこの分子に好適な再結晶方法を必要とする。
【００５７】
工程ａ）の濾過は、０．２μｍ（マイクロメートル）粒子フィルターによって実施される。
【００５８】
工程ａ）の部分濃縮は、有利には、ＭｅＯＨの存在下、５０℃のオーダーの温度で、真空蒸留によって行われる。
【００５９】
乾燥工程ｆ）は、５０℃のオーダーの温度で、真空で行われる。
【００６０】
２．ＢＩＯ１０３合成方法
ＢＩＯ１０３は、２０−ヒドロキシエクジソンからの半合成によって得られ、続いて、以下の調製方法に従って製薬等級への精製を行う：
【００６１】
【化４】
2020517712.tif 000006
【００６２】
３段階でのＢＩＯ１０３合成図：
１）ポストステロンを得るための炭素Ｃ２０とＣ２２との間の２０−ヒドロキシエクジソンの側鎖の酸化的開裂（当業者に公知のプロトコール）、
２）Ｃ２１位への臭素原子の導入、
３）臭素化誘導体とエタン−チオールとの反応。
【００６３】
３．ＢＩＯ１０１およびＢＩＯ１０３の生物活性
市販の調製物中に存在する２０Ｅの同化効果（ａｎａｂｏｌｉｓｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ）は若い動物ですでに実証されているが、線維症の進行性の発症が筋機能障害の一因となるミオパチーに罹患している哺乳動物の状況での２０Ｅの効果は知られていない。ジストロフィン遺伝子に突然変異を呈する、Ｃ５７ＢＬ１０遺伝子プールからのｍｄｘマウスを用いたデュシェンヌ型ミオパチーの動物モードを使用した（Ｂｕｌｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８４；Ｓｉｃｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８９）。
【００６４】
Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓで生産された、１２週齢のＣ５７ＢＬ１０遺伝子プール（図において「Ｃ５７」と示した野生マウス）およびＣ５７ＢＬ１０  ｍｄｘ（デュシェンヌ型筋ジストロフィーのマウスモデル、図において「ｍｄｘ」と示した）雄マウスを使用した。２群のｍｄｘを、ＢＩＯ１０１（マウスの数  ｎ＝９）またはＢＩＯ１０３（マウスの数  ｎ＝９）のいずれかに５０ｍｇ／ｋｇ*日の用量で慢性的に経口曝露させた。Ｃ５７マウス群（マウスの数  ｎ＝５）およびｍｄｘマウス群（マウスの数  ｎ＝１５）はビヒクルを受けた、すなわち、処置を受けなかった。全ての群の動物を、２ヶ月の処置後に運動耐用能について試験した（労作耐性試験）。労作耐性試験は、最大移動距離を測定することからなる（ｉｎ−ｔｏｔｏ活動；図１Ａおよび１Ｂ）。さらに、２ヶ月の処置後に前脛骨筋の最大絶対等尺性筋力を測定した（ｉｎ−ｓｉｔｕ活動；図２Ａおよび２Ｂ）。
【００６５】
２ヶ月の経口処置は、週５日間の強制給餌と週２日の飲水からなる。
【００６６】
労作耐性試験（ｉｎ−ｔｏｔｏ機能研究：図１Ａおよび１Ｂ）
労作耐性試験は、強制的モーター駆動トレッドミル運動である。これは、ｉｎ−ｔｏｔｏ骨格機能を評価するための非侵襲的方法である。これは当技術分野での至適規準法である（Ｆｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，１９９３；Ｈａｄｊ−Ｓａｉｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
【００６７】
動物の順化期間は、最大走行距離を測定するセッションの前の少なくとも４８時間である。試験中、マウスは、試験実施者によってその強度および持続時間が制御された運動を可能にする電動化トレッドミル上の走行帯に配置される。トレッドミルは先端が水平グリッドになっており、動物がそのグリッドと１秒を超えて接触している場合、電気ショック（０．４ｍＡ）が与えられる。
【００６８】
走行セッションは２分のウォームアップ期間から始まり、その間に速度は０から２０ｃｍ/秒まで増加させる。続いて、走行速度は、マウスの最大能力の限界まで１０分ごとに５ｃｍ／秒ずつ増加させる。１０秒未満で５回のショックを受けた場合、試験を停止する。移動距離が記録される。
【００６９】
予想どおり、ジストロフィン遺伝子に突然変異を提示する動物（ｍｄｘ）の走行は、健常動物（Ｃ５７）よりも有意に少ない（−８０．４％、ｐ＜０．００１、マン・ホイットニー検定）ことが観察される（図１Ａ）。２ヶ月の毎日の曝露の後（図１Ｂ）、ＢＩＯ１０１またはＢＩＯ１０３を受けたｍｄｘ動物の走行は、ビヒクルを受けたｍｄｘ動物よりも有意に多い。ＢＩＯ１０１およびＢＩＯ１０３は、未処置のｍｄｘ動物（ビヒクル）の移動距離と比較して、それぞれ＋１３６％および＋６７％だけ移動距離を有意に改善する（それぞれ、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）。重要なことには、本発明者らは本明細書において、ＢＩＯ１０１またはＢＩＯ１０３でｍｄｘ動物を処置することにより、ジストロフィン遺伝子突然変異を有する動物（ｍｄｘ）で観察される著しい機能損失が部分的に補償されることを実証している。ミオパチーに罹患している動物の全体的な身体能力（Ｔｈｅ  ｏｖｅｒａｌｌ  ｐｈｙｓｉｃａｌ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｓ  ｐｈｙｓｉｑｕｅｓ）（ｉｎ−ｔｏｔｏ活動）はＢＩＯ１０１（２．４倍）およびＢＩＯ１０３（１．７倍）によりかなり大幅に改善される。
【００７０】
この研究は、ＢＩＯ１０１またはＢＩＯ１０３での処置が、動物ミオパチーモデルにおける労作耐性の大幅な改善を特徴とする機能改善をもたらすことを実証している（図１Ａおよび１Ｂ）。
【００７１】
前脛骨筋の最大絶対等尺性筋力（ｉｎ−ｓｉｔｕ機能研究：図２）
前脛骨筋のｉｎ−ｓｉｔｕ収縮性の評価は、プロトコールの最後に、すなわち、２ヶ月の処置後に実施される。
【００７２】
犠牲当日、前脛骨筋（ＴＡ）のｉｎ−ｓｉｔｕ筋力の測定前に、ペントバルビタール（５５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍＬ／１０ｇ体重）の腹腔内注射によりマウスに麻酔をかける。足の上部の皮膚を切開し、その遠位端で切断した腱を露出させる。ＴＡの遠位の腱をサーボモーターレバー（３０５Ｂ  Ｄｕａｌ−Ｍｏｄｅ Ｌｅｖｅｒ、Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に取り付ける。大腿部の側面の皮膚を切開し、２つの筋肉群間の坐骨神経を露出させる。坐骨神経を双極電極で刺激する（１０Ｖの超最大矩形波パルス、０．１ｍ秒）。筋力を、電気刺激（周波数７５〜１５０Ｈｚ、持続時間５００ｍ秒）に応答した収縮中に測定する。ラジアントランプを使用して、マウスの温度を３７℃に保つ。最大絶対等尺性強縮筋力を測定する。
【００７３】
予想どおり、ｍｄｘ動物の最大絶対等尺性収縮は、健常Ｃ５７動物よりも有意に低い（ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）ことが観察される（図２Ａ）。２ヶ月の処置の後、ＢＩＯ１０１（＋１５．３％、ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）およびＢＩＯ１０３（＋２２．５％、ｐ＜０．００１、対応のないｔ検定）で５０ｍｇ／ｋｇ*日の用量で処置されたｍｄｘ動物では、ビヒクルを受けたｍｄｘ動物と比較して、前脛骨筋の最大絶対等尺性筋力の有意な増加が観察される（図２Ｂ）。
【００７４】
この研究は、ＢＩＯ１０１またはＢＩＯ１０３での処置が、動物ミオパチーモデルにおける前脛骨筋の最大絶対等尺性筋力の大幅な増加を特徴とする機能改善をもたらすことを実証している（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００７５】
心筋線維症および心臓肥大（分子研究：図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、３Ｄ）
線維症および心臓肥大のマーカーの評価は、プロトコールの最後に、すなわち、２ヶ月の処置後に実施される。犠牲当日、マウスを断頭により安楽死させ、心臓を摘出し、直ちに液体窒素で凍結する。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）溶解試薬（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および組織ホモジナイザー（Ｂｉｏ−Ｇｅｎ  ＰＲＯ２００）により全ＲＮＡを抽出する。抽出物ＲＮＡを分光光度法により定量し、その品質をＥｘｐｅｒｉｏｎ  ＲＮＡ  ＳｔｄＳｅｎｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）により検証・確認する。次に、ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりｃＤＮＡを合成する。最後に、３８４ウェルプレートでＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ（Ｒｏｃｈｅ）、ＤＮＡインターカレート剤およびＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０  Ｒｅａｌ  Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ（Ｒｏｃｈｅ）装置を使用して、半定量的ＰＣＲ分析を実施した。測定した分子マーカーは以下のとおりである：
・ＣＴＧＦおよびコラーゲンＩ：結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）は、治癒およびＤＭＤを含む多くの病理学的線維化プロセスと関連している（Ｂｒｉｇｓｔｏｃｋ  ２０１０；Ｓｏｎｇ  Ｙ．２０１７）。ＣＴＧＦの遺伝子発現の増加は、ｍｄｘマウスにおける心臓線維症と関連している（Ａｕ  ２０１１）。ＣＴＧＦは、心臓線維芽細胞でのコラーゲン合成（コラーゲンＩ）を刺激し、心筋線維症の一因となる（Ｗａｎｇ  ２０１０）、
・ｍｙｈ７：βミオシン重鎖（ｍｙｈ７）のｍＲＮＡ発現の増加は心臓肥大と関連している。この胚型アイソフォームは、心不全の発症に応答して、成人の心筋で発現される（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４）。さらに、ｍｙｈ７発現の増加は、特に、ＤＭＤ（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）および不整脈惹起性心筋症で実証されており、これらは両方とも心筋細胞喪失と心筋線維症の発症を特徴としている（Ｇｅｒｃｅｋ  ２０１７）。
・ＢＭＰ４：骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）は、筋性分化の重要なリプレッサーである。これは、ＤＭＤにおける筋肉再生プロセスを妨害する（Ｓｈｉ  ２０１１）。
【００７６】
ＤＭＤにおける心臓線維症の発症に関連する分子マーカーの分析により、ｍｄｘ動物でのＣＴＧＦおよびコラーゲンＩ（Ｃｏｌ１ａ１）の遺伝子発現が、健常動物と比較して有意に増加することが確認される（それぞれ、ｐ＜０．００１およびｐ＜０．０５、対応のないｔ検定、図３Ａ）。ＢＩＯ１０１での５０ｍｇ／ｋｇ*日の用量での２ヶ月の処置は、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘ動物でのＣＴＧＦの遺伝子発現を、ビヒクルを受けた対照ｍｄｘ動物と比較して妨げている（ｐ＝０，０５０６、対応のないｔ検定）（図３Ｂ）。ＢＩＯ１０３で同じ用量でｍｄｘ動物を処置することにより、Ｃｏｌ１ａ１の遺伝子発現は、対照ｍｄｘ動物と比較して妨げられる傾向がある（図３Ｂ）。
【００７７】
ｍｙｈ７の遺伝子発現は、野生Ｃ５７動物と比較してｍｄｘ動物において有意に増加している（ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）（図３Ｃ）。ＢＩＯ１０１およびＢＩＯ１０３で５０ｍｇ／ｋｇ*日の用量でｍｄｘ動物を処置することにより、ビヒクルを受けたｍｄｘ動物と比較してｍｙｈ７の発現は有意に低下する（ｐ＜０．０１、対応のないｔ検定）（図３Ｄ）。さらに、ＢＩＯ１０１は、ＢＭＰ４の遺伝子発現を、ビヒクルを受けた対照ｍｄｘ動物と比較して低下させる（ｐ＝０．０５２９、対応のないｔ検定）（図３Ｄ）。
【００７８】
骨格筋線維症（組織学的研究：図４および５）
組織学的研究による筋線維症の評価は、前脛骨筋（ＴＡと略す）で実施される。組織学的切片（７μｍ）を作出し、ヘマトキシリン・エオジン（ＨＥ）またはシリウスレッド（ＳＲ）のいずれかで染色する。
【００７９】
ＨＥで染色された前脛骨筋切片の解剖病理学的研究により、筋線維の関与の程度を評価することが可能になる。Ｃ５７動物（図４Ａ）、ｍｄｘ動物（図４Ｂ）、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘ動物（図４Ｃ）およびＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘ動物（図４Ｄ）から得られた、ＨＥで染色された前脛骨筋切片の代表的な画像を示す。スケールバーは２００μｍに相当する。Ｃ５７マウスのＴＡ筋では筋肉病変は見られない（図４Ａ）。未処置のｍｄｘマウスのＴＡ筋は、多種多様な病変プロフィールを示している：数多くの壊死線維を伴う中等度の赤血球大小不同症。一部の筋肉は、それらに関する限り、大部分の筋細胞の萎縮を伴う顕著〜重度の多巣性赤血球大小不同症、ならびに関連する線維症（図４Ｂ）および単核細胞浸潤物（本質的にはマクロファージ）を伴う大きな慢性炎症性病巣を示す。Δ記号は、線維症が関連する炎症性病巣を示す。最後に、一部の筋肉は、大きな急性壊死プラークを示す。ＢＩＯ１０１で処置されたマウスの筋肉は、２種類の病変プロフィールのみを示す：赤血球大小不同症、壊死または炎症がほとんどない軽症の病変プロフィール（３７．５％、８つのＴＡ筋のうち３つ）と、赤血球大小不同症、散在性壊死線維および様々な炎症を伴う顕著な病変プロフィール（６２．５％、８つのＴＡ筋のうち５つ）（図４Ｃ）。興味深いことに、ＢＩＯ１０３で処置されたマウスの筋肉は、軽症の病変プロフィールを有する筋肉病変がより少ない。実際には、ＢＩＯ１０３で処置された筋肉の６７％（９つのＴＡ筋のうち６つ）は、このカテゴリーに分類することができる。組織学的には、筋細胞の大部分は、中心核（壊死−再生現象の指標）、最小限から軽微までの大きさの変化（赤血球大小不同症）、いくつかの稀な極めて委縮した壊死筋細胞（壊死の初期段階；黒色矢印、図４Ｄ）、および筋内膜のいくつかの稀な炎症細胞を示す。ＢＩＯ１０３で処置された他の筋肉は、赤血球大小不同症、散在性壊死線維を伴うやや壊死傾向を有する顕著な病変プロフィール（ＴＡ筋の１１％、９つのＴＡ筋のうち１つ）、および急性壊死、すなわち、重大な赤血球大小不同症を伴うが壊死線維を伴わない萎縮の傾向にある顕著な病変プロフィール（１１％、９つのＴＡ筋のうち１つ）を示す。最後に、ＴＡ筋のうちの１つは、再生しない大きな急性壊死プラークを伴う重度の病変プロフィールを示す（１１％、９つのＴＡ筋のうち１つ）。
【００８０】
ＳＲで染色された前脛骨筋切片の解剖病理学的分析により、線維化面積を定量することが可能になる。ＳＲ染色により、組織学的切片上の線維化領域を可視化することが可能になる（Ｒｉｔｔｉｅ  ２０１７）。Ｃ５７動物（図５Ａ）、ｍｄｘ動物（図５Ｂ）、ＢＩＯ１０１で処置されたｍｄｘ動物（図５Ｄ）およびＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘ  Ｃ５７動物（図５Ｅ）から得られた、ＳＲで染色された前脛骨筋切片の代表的な画像を示す。スケールバーは２００μｍを表す。ｍｄｘ群での線維症に相当する面積パーセンテージは、Ｃ５７群と比較して有意に増加している（ｐ＜０．００１、マン・ホイットニー検定）（図５Ｃ）。黒色矢印は、重大な筋線維症を示す領域を示す。ｍｄｘ動物をＢＩＯ１０３で処置することにより、線維症の発症は、ビヒクルを受けた対照ｍｄｘ群と比較して、明らかに妨げられる傾向がある（ｐ＝０．０７０９、対応のないｔ検定）（図５Ｆ）。
【００８１】
骨格筋線維症（生化学的研究：図６）
前脛骨筋で行われた観察と一緒に、腓腹筋で筋線維症のマーカーの評価を実施する。筋肉は、ＲＩＰＡ溶解バッファー中４℃で１６時間穏やかに撹拌して解離する。タンパク質をアッセイし、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで分離した後、ＰＶＤＦ膜に転写する。コラーゲンＩを、ウエスタンブロットにより検出し、化学発光により検出し、次いで、ＧＡＰＤＨ検出を基準にして正規化した後にデンシトメトリーで定量する。予想どおり、ｍｄｘマウスの腓腹筋でのコラーゲンＩのタンパク質発現は、健常マウスの筋肉（Ｃ５７）と比較して有意に増加している（ｐ＜０．０１；対応のないｔ検定）。コラーゲンＩのタンパク質発現は２７倍増加している（図６Ａ）。ｍｄｘマウスをＢＩＯ１０３で処置することにより、コラーゲンＩのタンパク質発現が未処置のｍｄｘマウス（ビヒクル）と比較して有意に低下することを観察することが可能になる（ｐ＜０．０１； 対応のないｔ検定）（図６Ｂ）。
【００８２】
ＢＩＯ１０１およびＢＩＯ１０３の生物活性に関するさらなる実験結果は、本明細書の以下のセクション５に示されている。
【００８３】
４．ＢＩＯ１０１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物活性
筋管への筋芽細胞の分化
Ｓｔｅｒｒｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ.は、ＤＭＤ細胞における無益な筋肉再生が、筋芽細胞分化障害および筋管維持不全によって起こることを実証した（Ｔｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。ＤＭＤ筋管の増殖減少、融合障害および維持不全の組合せが、無益な筋肉再生をもたらし、ＤＭＤ患者の重度の表現型の一因となりうる。
【００８４】
筋管分化を評価するために様々なパラメーターが測定されている。ヒトＤＭＤ骨格筋細胞（ＫＭ５７１ＤＭＤ１０ＦＬ  Ｃｌ１）を３日間分化させた後、１０μＭのＢＩＯ１０１の存在または不在下でインキュベートした。融合指数および筋管当たりの核の数を、関連のある感度の高い筋管分化指標として確認した。
【００８５】
図７Ａに示す融合指数は、細胞全体に対する分化した細胞核の割合を表す。
【００８６】
筋管当たりの核の数を図７Ｂに示し、３００の筋管を計数した。
【００８７】
筋管の直径を図７Ｃに示し、条件ごとに１５０の筋管を測定した。
【００８８】
ＢＩＯ１０１の存在下で筋管へのヒトＤＭＤ筋芽細胞の分化の増強が観察される（図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃ）。融合指数の＋７％（ｐ＜０．００１）の有意な上昇が観察される。
【００８９】
これと同時に、筋管当たりの核の数の３４％増加（ｐ＜０．０１）および筋管の直径の２１％増加（ｐ＜０．００１）が起こる。
【００９０】
図７Ａ、７Ｂおよび７Ｃの結果は、３回の独立した実験中に測定された平均データ±標準誤差（ＳＥＭ）を示す。マン・ホイットニー検定を使用した統計分析では、１０μＭ（マイクロモル）の濃度のＢＩＯ１０１で処置された細胞と、未処置の対照細胞（図７では「ＣＴＬ」と表記）とで有意差を示している、ｐ＜０．０１（**）； ｐ＜０．００１（***）。
【００９１】
シグナル伝達経路
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ シグナル伝達経路は、細胞成長、増殖、運動性、生存、アポトーシス、自己貪食および血管新生において重要な役割を果たす（Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。
【００９２】
ＥＲＫ１およびＥＲＫ２を含むＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化プロテインキナーゼから省略）は、筋肉再生、再構築および収縮などの様々な機能に関与する。ｍｄｘマウスでは、筋細胞でのＰＩ３Ｋ／ＡｋｔおよびＭＡＰＫ経路の活性化が有益な効果に特に関連することが実証されている（Ｒｏｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）（Ｔｕｒｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｈｕｅｂｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。
【００９３】
ヒトＤＭＤ骨格筋細胞（ＫＭ５７１ＤＭＤ１０ＦＬ  Ｃｌ１）を５日間分化させた後、所望により、１０μＭのＢＩＯ１０１とともに１０分〜２４時間の期間にわたってインキュベートした。
【００９４】
ＡＫＴ（図８Ａ）およびＥＲＫ１／２（図８Ｂ）のリン酸化に対するＢＩＯ１０１の効果を記載した少なくとも６回の独立したウエスタンブロット実験の結果のデンシトメトリー分析を示す、*ｐ＜０．０５  対未処置の対照。
【００９５】
ＢＩＯ１０１がｐ−ＡＫＴおよびｐ−ＥＲＫ１／２の大幅な増加を誘導することが観察される。
【００９６】
示された結果を読み取ると、ＢＩＯ１０１はヒトＤＭＤ筋細胞においてＡＫＴおよびＭＡＰＫシグナル伝達経路の重大な早期活性化を誘導することが観察される。
【００９７】
細胞呼吸
ＤＭＤ筋線維において基礎ミトコンドリア呼吸の減少が存在することが知られている（Ｓｃｈｕｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。
【００９８】
興味深いことに、ＤＭＤ患者の筋管では、ＤＭＤ患者の筋芽細胞の分化の点からのＢＩＯ１０１の有益な特性（図７）と同時に、エネルギー代謝に対するプラスの効果が起こる。
【００９９】
ヒトＤＭＤ骨格筋細胞（ＫＭ５７１ＤＭＤ１０ＦＬ  Ｃｌ１）を４日間分化させた後、ＢＩＯ１０１（１または５μＭ）の存在下または不在下で２日間インキュベートした。ＯＣＲとしても知られる、細胞のミトコンドリア呼吸を反映する酸素消費速度は、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標、Ａｇｉｌｅｎｔ）使用して測定した。
【０１００】
基礎呼吸は直接測定するが、最大呼吸はオリゴマイシン、続いて、ＦＣＣＰを添加した後に測定する（図９Ａおよび図９Ｂ）。結果は、未処置の細胞のＯＣＲを参照し、平均±標準誤差（ＳＥＭ）の形で示している。
【０１０１】
ＢＩＯ１０１での２日間の処置後、ＤＭＤ患者の細胞は未処置の細胞と比較して基礎呼吸および最大呼吸が大幅に増加したようである。
【０１０２】
より具体的には、ＢＩＯ１０１で１μＭの用量で処置された細胞で２０％増加した基礎呼吸（ｐ＜０．０１）が観察される。ＢＩＯ１０１で５μＭの用量で処置された細胞で２１％増加した基礎呼吸（ｐ＜０．００１）が観察される。ＢＩＯ１０１で１μＭの用量で処置された細胞で５１％増加した最大呼吸（ｐ＜０．０５）が観察される。ＢＩＯ１０１で５μＭの用量で処置された細胞で２２％増加した最大呼吸（ｐ＝０．１３）が観察される。
【０１０３】
示されている結果は、少なくとも４回の独立した実験から得られたものである。
【０１０４】
マン・ホイットニー統計検定により、１および５μＭのＢＩＯ１０１で処置された細胞と未処置の細胞との間での有意差の実証が可能になった、ｐ＜０．０５（*）、＜０．０１（**）、０．００１（***）。
【０１０５】
ＢＩＯ１０１は、ＤＭＤ患者の筋細胞でのエネルギー代謝の増強に寄与する。
【０１０６】
５．ＢＩＯ１０１およびＢＩＯ１０３のｉｎ ｖｉｖｏ生物活性
横紋のある骨格筋は体の最も血管が多い組織の１つであり、内皮細胞は筋肉再生プロセスに不可欠である。ジストロフィンは血管の平滑筋細胞のレベルで存在し、その不在は血管化障害を引き起こす可能性がある。実際には、ＤＭＤ筋肉では、壊死線維が非常に多くの場合クラスター化されていること、およびこの現象はこの線維クラスターへの一般的な毛細血管の血流の減少によるものであり、虚血性線維壊死が誘導されることが実証されている（Ｒａｎｄｏ、２００１）。
【０１０７】
血流に加えて、つい最近の研究によりｍｄｘマウスでは血管密度が減少していることが実証された（Ｌｏｕｆｒａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｍａｔｓａｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。また、さらなる研究により、ｍｄｘマウスモデルでは血管新生に障害があることも実証された（Ｐａｌｌａｄｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。これらの研究は、ＤＭＤではその質、その量の点からであろうと血管新生の点からであろうと血管化不足があること、および筋肉組織が虚血状態に置かれていることを示す理論的根拠があることを示している。
【０１０８】
骨格筋血管化
定量的血管化研究は、健常Ｃ５７マウスの前脛骨筋（ＴＡと略す）の切片で実施され、同様に、ビヒクルで処置されたｍｄｘマウスおよび ＢＩＯ１０１またはＢＩＯ１０３で処置されたｍｄｘマウスでも実施された。
【０１０９】
二重免疫蛍光標識、つまり、筋線維の基底膜を確認する機能を有する抗ラミニン標識と、血管を確認する機能を有する抗ＣＤ３１標識とを実施する。筋線維当たりの血管数を定量する。
【０１１０】
予想どおり、ジストロフィン遺伝子に突然変異を示す動物（ｍｄｘ）は筋線維当たりの血管数の減少を示すことが観察される。観察された減少は、健常動物（Ｃ５７）と比較して２７．２％である（ｐ＜０．０１）（図１０Ａ）。
【０１１１】
ｍｄｘ動物は、ビヒクルまたはＢＩＯ１０１（５０ｍｇ／ｋｇ*日）またはＢＩＯ１０３（５０ｍｇ／ｋｇ*日）のいずれかを、経口的に毎日受けた。２ヶ月の毎日の曝露の後の筋線維数の定量の結果を図１０Ｂに示す。
【０１１２】
ＢＩＯ１０１またはＢＩＯ１０３を受けたｍｄｘ動物がビヒクルを受けたｍｄｘ動物よりも多数の血管化を示すことが観察される。ＢＩＯ１０１は筋線維当たりの血管数を１４．１％の増加により改善させる（ｐ＝０．１３、対応のないｔ検定）傾向があることが観察される。より顕著には、ＢＩＯ１０３は、筋肉の血管化を未処置のｍｄｘ動物（ビヒクル）と比較して有意に増加させる２８．２％（ｐ＝０．００６、対応のないｔ検定）。
【０１１３】
ＢＩＯ１０１、特にＢＩＯ１０３での処置により筋線維当たりの血管数は増加する。
【０１１４】
これらの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの様々な筋肉パラメーターに対するＢＩＯ１０１およびＢＩＯ１０３の有効性を実証する。実際には、ＤＭＤに罹患している患者の筋細胞をＢＩＯ１０１またはＢＩＯ１０３で処置することにより、それらが細胞の分化、およびエネルギー代謝（ミトコンドリア呼吸）を増強することおよびそれらがｉｎ  ｖｉｖｏでの筋肉血管化を増加させることが可能であり、そのことが適切な筋機能にとって重要であることが実証される。
【０１１５】
結論
従って、ミオパチーに罹患している哺乳類における筋機能、ならびに心筋および骨格筋の線維症の発症に対するＢＩＯ１０１およびＢＩＯ１０３の特性から考えて、ＢＩＯ１０１およびＢＩＯ１０３の使用が、筋機能、特に筋力および労作耐性を保存し、その結果として、前記筋機能の悪化をもたらすミオパチーの進行、より詳しくは、線維症の発症を遅らせるために、単独でまたは遺伝的変化の影響を修正することを目的とした処置と一緒に提案されうる。これらのミオパチーには、遺伝性ミオパチー、特にデュシェンヌ型筋ジストロフィーが含まれる。
【０１１６】
参考文献
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【図１Ａ】
2020517712.tif 000010
【図１Ｂ】
2020517712.tif 000011
【図２Ａ】
2020517712.tif 000012
【図２Ｂ】
2020517712.tif 000013
【図３Ａ】
2020517712.tif 000014
【図３Ｂ】
2020517712.tif 000015
【図３Ｃ】
2020517712.tif 000016
【図３Ｄ】
2020517712.tif 000017
【図４Ａ】
2020517712.tif 000018
【図４Ｂ】
2020517712.tif 000019
【図４Ｃ】
2020517712.tif 000020
【図４Ｄ】
2020517712.tif 000021
【図５Ａ】
2020517712.tif 000022
【図５Ｂ】
2020517712.tif 000023
【図５Ｃ】
2020517712.tif 000024
【図５Ｄ】
2020517712.tif 000025
【図５Ｅ】
2020517712.tif 000026
【図５Ｆ】
2020517712.tif 000027
【図６Ａ】
2020517712.tif 000028
【図６Ｂ】
2020517712.tif 000029
【図７Ａ】
2020517712.tif 000030
【図７Ｂ】
2020517712.tif 000031
【図７Ｃ】
2020517712.tif 000032
【図８Ａ】
2020517712.tif 000033
【図８Ｂ】
2020517712.tif 000034
【図９Ａ】
2020517712.tif 000035
【図９Ｂ】
2020517712.tif 000036
【図１０Ａ】
2020517712.tif 000037
【図１０Ｂ】
2020517712.tif 000038
【国際調査報告】
2020517712.tif 000039
2020517712.tif 000040
2020517712.tif 000041
2020517712.tif 000042
2020517712.tif 000043
2020517712.tif 000044
2020517712.tif 000045
2020517712.tif 000046