(57)【要約】  本発明は、目的タンパク質の全体的な電荷を調節してｐＩを低めた目的タンパク質とＬＡＲＤ３が連結された融合タンパク質を製造して、細菌のタイプ１分泌システム（Ｔｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｔ１ＳＳ）のＡＢＣ輸送体を用いて目的タンパク質を効果的に細胞外分泌させる方法に関するものである。前記方法を使用して特別な精製過程を経なくても簡単且つ効率的にタンパク質を大量生産することができる。
2020533980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リパーゼＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体認識ドメイン（Ｌｉｐａｓｅ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ、ＬＡＲＤ）をコードする核酸配列および目的タンパク質をコードする核酸配列が作動可能に連結された発現カセットを含み、
前記ＬＡＲＤと目的タンパク質は、酸性ｐＩ値を有し細胞外に分泌される融合タンパク質として発現されるものである、細菌で目的タンパク質の発現および細胞外分泌用発現ベクター。
【請求項２】
前記発現ベクターは、細菌のタイプ１分泌システム（Ｔｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｔ１ＳＳ）のＡＢＣ輸送体をコードする核酸配列を含むものである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項３】
前記細菌は、タイプ１分泌システム（Ｔｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｔ１ＳＳ）のＡＢＣ輸送体を含む細菌である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項４】
前記細菌は、グラム陰性菌である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項５】
前記細菌は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌株、ディッケヤ（Ｄｉｃｋｅｙａ）属菌株、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌株からなる群より選択された一つ以上である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項６】
前記細菌のタイプ１分泌システムのＡＢＣ輸送体は、シュードモナス・フルオレセンスのＴｌｉＤＥＦ輸送体（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＴｌｉＤＥＦ）と２０％以上の塩基配列同一性を有する輸送体である、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項７】
前記細菌のタイプ１分泌システムのＡＢＣ輸送体は、シュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）のＴｌｉＤＥＦ、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＡｐｒＤＥＦ（ＰａＡｐｒＤＥＦ）、ディッケヤ・ダダンティー（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ）のＰｒｔＤＥＦ（ＤｄＰｒｔＤＥＦ）、または大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のＨｌｙＢＤ＋ＴｏｌＣである、請求項２に記載の発現ベクター。
【請求項８】
前記目的タンパク質をコードする核酸配列は、６〜２０個のアミノ酸からなる酸性ペプチドをコードする核酸配列を追加的に含むものである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項９】
前記酸性ペプチドは、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択された１種以上のアミノ酸からなるものである、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１０】
前記酸性ペプチドは、配列番号３３（アスパラギン酸  １０個；Ｄ１０）のアミノ酸配列を含むものである、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１１】
前記酸性ペプチドをコードする核酸配列は、目的タンパク質をコードする核酸配列の３’−末端または５’−末端に位置するものである、請求項８に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
前記目的タンパク質をコードする核酸配列は、目的タンパク質に含まれている塩基性アミノ酸を１つ以上除去したものである、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項１３】
前記塩基性アミノ酸は、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）およびアルギニン（ａｒｇｉｎｉｎｅ）からなる群より選択される１種以上である、請求項１２に記載の発現ベクター。
【請求項１４】
前記目的タンパク質は、過負電荷化（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ）された目的タンパク質である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項１５】
前記目的タンパク質は、下記の段階を経て過負電荷化された目的タンパク質である、請求項１４に記載の発現ベクター：
目的タンパク質の３次元構造で官能基が外部に突出していて置換されても目的タンパク質の構造に影響を与えないアミノ酸を選別する段階、および
前記選別されたアミノ酸が塩基性アミノ酸である場合、アスパラギン酸およびグルタミン酸からなる群より選択されたいずれか一つ以上のアミノ酸で置換するか、
前記選別されたアミノ酸が酸性アミノ酸である場合、ライシンおよびアルギニンからなる群より選択されたいずれか一つ以上のアミノ酸で置換する手動過電荷化（Ｍａｎｕａｌ  Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ）技法を使用して過負電荷化する段階。
【請求項１６】
前記リパーゼＡＢＣ輸送体認識ドメインは、ＬＡＲＤ１、ＬＡＲＤ２、またはＬＡＲＤ３である、請求項１に記載の発現ベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１６のうちのいずれか一項による発現ベクターを含む、細胞。
【請求項１８】
前記細胞は、細菌のタイプ１分泌システム（Ｔｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｔ１ＳＳ）のＡＢＣ輸送体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを追加的に含むものである、請求項１７に記載の細胞。
【請求項１９】
前記細胞は、タイプ１分泌システム（Ｔｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｔ１ＳＳ）のＡＢＣ輸送体を含む細菌である、請求項１８に記載の細胞。
【請求項２０】
前記細胞は、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌株、ディッケヤ（Ｄｉｃｋｅｙａ）属菌株、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌株からなる群より選択されたいずれか一つ以上である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
請求項１〜１６のうちのいずれか一項によるベクターで形質転換された細胞を製造する段階、
前記細胞を培養して分泌用タンパク質を生産する段階、および
前記生産された分泌用タンパク質を分離または精製する段階を含む、細胞で目的タンパク質を生産する方法。
【請求項２２】
前記細胞は、Ｔｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔ１ＳＳ）のＡＢＣ輸送体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを追加的に含むものである、請求項２１に記載の細胞で目的タンパク質を生産する方法。
【請求項２３】
請求項１〜１６のうちのいずれか一項のベクターを細胞に挿入する段階を含む、細胞で目的タンパク質の細胞外分泌を増加させる方法。
【請求項２４】
前記細胞は、Ｔｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔ１ＳＳ）のＡＢＣ輸送体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを追加的に含むものである、請求項２３に記載の細胞で目的タンパク質の細胞外分泌を増加させる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細菌のＴｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔ１ＳＳ）を用いて、目的タンパク質の細胞外分泌で目的タンパク質のｐＩ等電点を低めることによって、リパーゼＡＢＣ輸送体認識ドメイン３（Ｌｉｐａｓｅ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ、ＬＡＲＤ３）と連結された目的タンパク質の分泌を増加させる方法および目的タンパク質を効率的に生産する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質の大量生産は多様な産業において重要な問題になっている。通常の組換えタンパク質の大量生産方法は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）のような原核細胞（ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ）で組換えタンパク質を合成した後、細胞を溶解し生化学的な方法で得られた細胞抽出物を精製して組換えタンパク質を大量生産した。
【０００３】
このような通常の方法に比べて、細胞内で組換えタンパク質の発現と分泌を同時に行うことができるタンパク質生産システムの場合、多くの費用がかかる抽出と精製過程の必要性が減少するので、はるかに効率的且つ経済的な方法である。
【０００４】
臨床、産業および学術分野でタンパク質製品に対する需要が増加するにつれて微生物からタンパク質を効率的に大量生産する方法が開発されている。タンパク質大量生産方法中の一部は微生物を操作して生産されたタンパク質をリフォールドする（ｒｅｆｏｌｄ）過程と細胞から抽出されたタンパク質から目的タンパク質を分離するために集中的にタンパク質を精製する必要がないようにするために、微生物が培養液で目的タンパク質を生産し細胞外に分泌するようにする。
【０００５】
微生物を操作して生産しようとするタンパク質を培養液に分泌するようにすれば所望のタンパク質を微生物を破壊せずに得ることができるので、遺伝子操作微生物を用いた現在商用化されたタンパク質生産システムと比較してこのような方法は微生物を破壊しないため微生物の固有タンパク質によるタンパク質生産品汚染を最小化することができ、これにより精製過程で消耗される費用を画期的に減らすことができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、細菌のＴｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔ１ＳＳ）を用いたタンパク質の分泌有無を決定する要素を新しく明らかにすることによって、ＬＡＲＤ３と組換えられた目的タンパク質のｐＩおよび全体的な電荷を調節して目的タンパク質の細胞外分泌を向上させる方法および目的タンパク質を効率的に生産する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明者らはタンパク質を効率的に大量生産する方法において、一歩進んで、細菌のＴ１ＳＳ（Ｔｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）を通じて細胞外部に分泌されなかったタンパク質まで細胞外に分泌させることができる新たなタンパク質分泌および大量生産方法を明らかにして、これに基づいて本発明を完成した。また、本発明者らは、細胞外に分泌しようとする目的タンパク質にリパーゼＡＢＣ輸送体認識ドメイン（Ｌｉｐａｓｅ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ；ＬＡＲＤ３）を結合させた分泌用タンパク質のうち、分泌が可能なタンパク質と分泌されないタンパク質間の差異点を明らかにするための実験を行った。
【０００８】
具体的に、大部分植物の表面に住んでいるシュードモナス・フルオレセンスは長い間人間によって消費されてきたため生物学的安定性が立証されており、シュードモナス・フルオレセンスは高濃度の細胞培養条件で多様な発酵条件に耐えることができ、多量の組換えタンパク質を生産することができる。また、シュードモナス・フルオレセンスは自然にタイプ１分泌システム（ｔｙｐｅ  Ｉ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｔ１ＳＳ）からタイプ６分泌システム（Ｔ６ＳＳ）まで多数の分泌システムを有し、特にシュードモナス・フルオレセンスはＡＴＰ−結合カセット（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｓｓｅｔｔｅ、ＡＢＣ）運搬体であるＴｌｉＤＥＦを通じて耐熱性リパーゼ（ＴｌｉＡ）を輸送する分泌システム類型１を有している。シュードモナス・フルオレセンスはこのような組換えタンパク質分泌の応用の可能性のため、いくつかの他の組換えタンパク質の輸送能力が証明され、分泌信号も研究されてきた。
【０００９】
以前のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを用いたタンパク質大量生産研究の結果、多数のタンパク質の場合、リパーゼＡＢＣ輸送体認識ドメイン３（Ｌｉｐａｓｅ−ＡＢＣ−ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ３；ＬＡＲＤ３）を接合させて組換えタンパク質を製造した時、ＴｌｉＤＥＦ輸送体を通じて細胞外分泌が向上するのを確認した。しかし、一部タンパク質の場合、ＬＡＲＤ３を付着しても細胞外部に大部分タンパク質が分泌されず、細胞質のみに限定されて存在した。
【００１０】
よって、ＬＡＲＤ３を付着したタンパク質がＡＢＣ輸送体によって分泌され得るか否かを決定する基準を明らかにし、ＬＡＲＤ３を付着してもタンパク質の分泌が増加しなかったタンパク質のＡＢＣ輸送体を通じた細胞外分泌を可能にする方法に関する研究が必要であるのが実情である。
【００１１】
このために、ＬＡＲＤ３と結合された多様なタンパク質遺伝子をＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに導入し、多様なタンパク質を培養したそれぞれの培養液の上清と細胞ペレットでそれぞれの該当タンパク質の濃度を分析した。その結果、タンパク質のＰＩがＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＴｌＳＳ輸送体であるＴｌｉＤＥＦを用いた分泌に重要な役割を有するのを確認し、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ以外の他の微生物に由来した多様なＴ１ＳＳ輸送体でも特定ＰＩを有するタンパク質が分泌が促進されるのを明らかにすることによって本発明を完成した。
【００１２】
具体的に、本発明者らはタンパク質にＬＡＲＤ３を便利に付着するために以前の研究で開発したｐＤＡＲＴプラスミドベクターを活用した（Ｒｙｕ、Ｊ．、Ｌｅｅ、Ｕ．、Ｐａｒｋ、Ｊ．、Ｙｏｏ、Ｄ．Ｈ．、ａｎｄ  Ａｈｎ、Ｊ．Ｈ．（２０１５）Ａ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８１、１７４４−１７５３）。ｐＤＡＲＴプラスミドはｉｎ−ｆｒａｍｅ  ＬＡＲＤ３遺伝子が直接後続する多重クローニング部位（ＭＣＳ）を有し、ｐＤＡＲＴの多重クローニング部位に挿入された遺伝子はそのカルボキシル末端にＬＡＲＤ３を付着したまま発現される。
【００１３】
前記ＬＡＲＤ３配列は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＴｌｉＤＥＦ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡｐｒＤＥＦ（ＰａＡｐｒＤＥＦ）、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ  ＰｒｔＤＥＦ（ＤｄＰｒｔＤＥＦ）、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨｌｙＢＤ＋ＴｏｌＣなどの細菌のＴｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔ１ＳＳ）のＡＢＣ輸送体によって認識されて、組換えタンパク質がＴ１ＳＳのＡＢＣ輸送体によって分泌されるようにする配列である。
【００１４】
また、ｐＤＡＲＴはクローン選択のためのカナマイシン耐性遺伝子を含み、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉおよびＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ間のシャトルベクターとして機能するための広範囲宿主対象複製原点を有しており、ＴｌｉＤＥＦ複合体の遺伝子を発現するｔｌｉＤ、ｔｌｉＥ、ｔｌｉＦ遺伝子を含んでいる。
【００１５】
その次に、本発明者らは人為的にｐＩ値を低め負電荷を追加するためにオリゴペプチド（ｏｌｉｇｏｐｅｐｔｉｄｅ）配列をこれらタンパク質に付着した。この作業を行うために、本発明者らはアスパラギン酸ポリペプチド（ｏｌｉｇｏ−ａｓｐａｒｔａｔｅ）配列を貨物タンパク質に付着させる二つのプラスミドを作った。実験後、本発明者らは目的タンパク質に正電荷を帯びたアミノ酸を添加した時の効果を調査するためにアルギニンポリペプチドを付着させるプラスミドを作った。
【００１６】
最後に、本発明者らは以前の研究で開発された緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の過電荷化された（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ）変種の分泌を実験して、タンパク質の過電荷化された変種が元来のタンパク質と異なる分泌様相を示すか否かを確認した。
【００１７】
タイプ１分泌システム（Ｔｙｐｅ  Ｉ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｔ１ＳＳ）は、細菌に存在するＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒを使用したポリペプチド分泌体系を意味し、ＨｌｙおよびＴｏｌ遺伝子クラスターを使用するシャペロン（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）非依存性分泌システムである。前記分泌過程は、ＨｌｙＡリーダー配列が認識され、膜にＨｌｙＢが結合することによって始まる。この信号配列は、ＡＢＣ輸送体（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）に非常に特異的である。具体的に、ＨｌｙＡＢ複合体は、ＨｌｙＤを刺激してコイルを解き始め、ＴｏｌＣがＨｌｙＤの末端分子または信号を認識する外部膜に到着する。ＨｌｙＤは内部膜にＴｏｌＣを引き込み、ＨｌｙＡは長い−トンネルタンパク質チャネルを通じて外部膜の外に排出される。
【００１８】
細菌のＴ１ＳＳは、イオン、薬物、多様な大きさ（２０〜９００ｋＤａ）のタンパク質まで多様な分子を運搬する。分泌される分子は、ｓｍａｌｌ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｃｏｌｉｃｉｍＶ（１０ｋＤａ）から５２０ｋＤａのシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）細胞付着タンパク質に至るまでその大きさが多様である。最も特徴がよく分析されたものは、ＲＴＸ毒素とリパーゼ（ｌｉｐａｓｅｓ）である。Ｔｙｐｅ１分泌はまた、ｃｙｃｌｉｎ  β−ｇｌｕｃａｎｓおよびｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓのような非−タンパク質性基質の分泌にも関与する。
【００１９】
ＴｌＳＳは主にグラム陰性菌に存在し、Ｔ１ＳＳを有する細菌としてはシュードモナス属菌株、ディッケヤ属菌株、または大腸菌などを含み、さらに好ましくはシュードモナス・フルオレセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、ディッケヤ・ダダンティー（Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉまたはＥｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シュードモナス・エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）などがある。
【００２０】
グラム陰性細菌であるシュードモナス・フルオレセンスは、酢酸を蓄積しないため発酵条件によって引き起こされる高い細胞濃度に耐性を有し、一般に人間を相手に非病原性を帯びるので分泌を通じたタンパク質の生産技術に適した候補である。また、シュードモナス・フルオレセンスは、グラム−陰性低温バクテリア（ｐｓｙｃｈｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）であり、組換えタンパク質生産のための様々な優れた特徴を有している。
【００２１】
本発明者らはタイプＩ分泌システム（Ｔ１ＳＳ）に属するポリペプチドＡＢＣ輸送体が認識する信号配列（Ｓｉｇｎａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と目的タンパク質を融合して微生物のＡＢＣ輸送体が目的タンパク質を培養液上に分泌するようにする研究を行い、その結果、タイプＩ分泌システム（Ｔ１ＳＳ）に属するポリペプチドＡＢＣ輸送体が輸送タンパク質の等電点（ｐＩ）、即ち、ｐＨ７での電荷属性に比例する組換えタンパク質分泌効率を示すという事実を明らかにした。即ち、生産しようとする目的タンパク質のｐＩを低めるように製造した過負電荷化された組換えタンパク質の場合、タイプＩ分泌システムのＡＢＣ輸送体を用いた分泌の効率を高めることができ、実験的にｐＩはタンパク質の電荷量と密接な関係を有するのを確認した（図６参照）。
【００２２】
また、本発明は、シュードモナス・フルオレセンスのＴｌｉＤＥＦ輸送体以外のタイプ１分泌システムでも過負電荷化の効果があるのを確認した（図１９、２０、２１参照）。Ｔ１ＳＳはＡＢＣ輸送体を使用したポリペプチド分泌体系を意味し、ＴｌｉＤＥＦ輸送体も典型的なＴ１ＳＳである。
【００２３】
本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ微生物以外の他の微生物から様々なＴ１ＳＳ輸送体の遺伝子を分離し、具体的にＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡｐｒＤＥＦ（ＰａＡｐｒＤＥＦ）、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉと呼ぶこともある）ＰｒｔＤＥＦ（ＤｄＰｒｔＤＥＦ）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨｌｙＢＤ＋ＴｏｌＣ（大腸菌が本来ＴｏｌＣタンパク質を発現させる）の三つのＴ１ＳＳ輸送体を追加的に分離した。前記三つのＴ１ＳＳ輸送体は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓのＴｌｉＤＥＦ輸送体とそれぞれ６０％、５９％、２７％の塩基配列同一性を有している。本実施形態を通じて、ＬＡＲＤ３信号配列が付着された分泌用組換えタンパク質が前記三種類の輸送体を通じてそれぞれ分泌されることを確認した（図１９参照）。よって、タンパク質過負電荷化の分泌増進技術がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ微生物ＴｌｉＤＥＦ輸送体に限定されず、ＴｌｉＤＥＦと塩基配列同一性が２７％程度に達するＴ１ＳＳ輸送体でも広範囲に適用できるのを確認した（図２０、図２１、図２２、図２３参照）。
【００２４】
本発明は、リパーゼＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体ー認識ドメイン（Ｌｉｐａｓｅ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｄｏｍａｉｎ、ＬＡＲＤ）をコードする核酸配列および目的タンパク質をコードする核酸配列が作動可能に連結された発現カセットを含み、前記ＬＡＲＤと目的タンパク質は酸性ｐＩ値を有し細胞外に分泌される融合タンパク質として発現されるものである、細菌で目的タンパク質の発現および細胞外分泌用発現ベクターを提供する。
本発明の一例によれば、前記発現ベクターは、細菌のＴ１ＳＳのＡＢＣ輸送体をコードする核酸配列を追加的に含むことができる。
【００２５】
前記用語“目的タンパク質”は、生物学的に細菌で生産し細胞外部に分泌させて大量生産しようとする目的タンパク質を意味する。前記目的タンパク質は、その種類を特に限定せず、サイトカイン、成長ホルモン、 産業用酵素、免疫関連タンパク質、結合タンパク質などであってもよく、例えば、Ｍａｎｎａｎａｓｅ、ＭＢＰ、ＮＫＣ−ＴｌｉＡ、Ｅｇ１Ｖ、ＧＦＰ、ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ、ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐａｓｅ  Ａ１、ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ、ＥＧＦ、ＴｌｉＡ．ＭＡＰ、Ｃａｐｓｉｄ、Ｈｓｐ４０、Ｍ３７  ｌｉｐａｓｅ、Ｃｕｔｉｎａｓｅ、Ｃｈｉｔｉｎａｓｅ、およびＣＴＰ−ＴｌｉＡからなる群より選択されたいずれか一つ以上であってもよい。
【００２６】
前記ＬＡＲＤと目的タンパク質のｐＩを７未満の酸性ｐＩを有するようにするために多様な方法を使用することができる。例えば、目的タンパク質に酸性アミノ酸を追加するか、目的タンパク質から塩基性アミノ酸を除去するか他のアミノ酸で置換する方法を使用することができ、タンパク質アミノ酸配列中のタンパク質の３次元構造で外部に突出したアミノ酸であってタンパク質の構造に影響を与えないアミノ酸を選別して酸性アミノ酸で置換して過電荷化して手動過電荷化（Ｍａｎｕａｌ  Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ）するか、Ａｖｅｒａｇｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ  Ａｔｏｍｓ  Ｐｅｒ  Ｓｉｄｅｃｈａｉｎ  Ａｔｏｍ（ＡｖＮＡＰＳＡ）（１．Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＭＳ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＫＪ、Ｌｉｕ  ＤＲ．Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｃａｎ  Ｉｍｐａｒｔ  Ｕｎｕｓｕａｌ  Ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ。Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００７；１２９：１０１１０−１０１１２．）アルゴリズムを用いてタンパク質を過電荷化する方法を使用することができる。但し、この場合、タンパク質の構造と機能に影響を与えないように組み換えることが好ましい。
【００２７】
前記用語“融合タンパク質”は、ＬＡＲＤをコードする塩基配列と目的タンパク質をコードする塩基配列が連結されて発現されるタンパク質であって、酸性ｐＩ値を有する細胞外に分泌されるタンパク質を意味する。
【００２８】
本発明の一例によれば、前記融合タンパク質のｐＩ値は７未満であってもよく、好ましくは１〜６、さらに好ましくは２〜５．５、最も好ましくは３．０〜５．５、例えば４．０〜５．５であってもよい。
【００２９】
前記融合タンパク質のｐＩ値が７を超過する場合、ＬＡＲＤを付着したタンパク質でもＴ１ＳＳ  ＡＢＣ輸送体を通じて細胞外部に分泌されるタンパク質の量が顕著に少なく、大部分細胞内部に存在するようになる。前記融合タンパク質のｐＩ値が１未満であるタンパク質はその構造が非常に不安定であるため、前記範囲のｐＩ値を有するのが好ましい。
【００３０】
本発明のまた他の一例によれば、前記Ｔ１ＳＳのＡＢＣ輸送体は、通常の塩基配列同一性計算法によってＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＴｌｉＤＥＦと塩基配列が類似した部分に限って計算した時、２０％以上の塩基配列同一性または同一性を有するＴ１ＳＳ輸送体に属するタンパク質複合体であってもよい（図２３参照）。一例によれば、前記２０％以上の塩基配列同一性を有するＴ１ＳＳ輸送体は、例えば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓのＨａｓＤＥＦ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓのＣｙａＢＤＥ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのＣｖａＢＡ＋ＴｏｌＣ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓのＲｓａＤＥＦなどがあり得るが、これに限定されない。好ましくは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡｐｒＤＥＦ（ＰａＡｐｒＤＥＦ）、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ  ＰｒｔＤＥＦ（ＤｄＰｒｔＤＥＦ）、およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨｌｙＢＤ＋ＴｏｌＣであってもよく、さらに好ましくはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＴｌｉＤＥＦ自体であってもよい。
【００３１】
前記ＴｌｉＤＥＦは、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）、膜融合タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＭＦＰ）、外膜因子（ＯＭＦ）であるＴｌｉＤ、ＴｌｉＥ、ＴｌｉＦの三つのタンパク質多量体から構成されている。ＡＢＣタンパク質は、選択的に目的タンパク質のＣ−末端部分の分泌ドメインを認識しＡＴＰを加水分解して目的タンパク質を分泌する。膜融合タンパク質は、細胞膜（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に刺さっており、ＡＢＣタンパク質と外膜タンパク質を連結する。外膜タンパク質は、外膜（ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ）に位置し、目的タンパク質が分泌されるチャネルを形成する大部分の細胞間隙（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）にかかっている。
【００３２】
シュードモナス・フルオレセンスでＡＢＣタンパク質、膜形成タンパク質、および外膜タンパク質は、耐熱性リパーゼオペロン内ｔｌｉＡのアップストリーム（ｕｐｓｔｒｅａｍ）に位置したｔｌｉＤ、ｔｌｉＥ、およびｔｌｉＦによってそれぞれコーディングされる。ｔｌｉＡのＣ−末端に位置する分泌／シャペロン（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ／ｃｈａｐｅｒｏｎｅ）ドメインは、リパーゼＡＢＣ運搬体認識ドメイン（Ｌｉｐａｓｅ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  Ｄｏｍａｉｎ、ＬＡＲＤ）と定義されている。今まで長さの異なるＬＡＲＤの五つの断片が機能的に比較され、４個のＲＴＸ（ｒｅｐｅａｔｓ−ｉｎ−ｔｏｘｉｎ）モチーフを含んでいるＬＡＲＤ３がＡＢＣ運搬体を通じた分泌で最も効果的なＣ−末端信号と確認されてきた。ｔｌｉＤＥＦとＬＡＲＤ３融合タンパク質コンストラクトを含むシュードモナス・フルオレセンスはＬＡＲＤ３融合タンパク質を効率的に分泌し、分泌されたＬＡＲＤ３融合タンパク質を培養液（ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂｒｏｔｈ）から直ぐ得ることができる。
【００３３】
本発明の一例によれば、前記発現ベクターの目的タンパク質をコードする核酸配列は、酸性ペプチドをコードする核酸配列を追加的に含むものであってもよい。
【００３４】
前記追加される酸性ペプチドの個数は特に限定しないが、本発明の一例によれば、前記酸性ペプチドを成すアミノ酸の個数は６〜２０、好ましくは７〜１５個、例えば１０個であってもよい。ペプチドを成すアミノ酸の個数が６個未満である場合、融合タンパク質のｐＨが十分な酸性を示さないためタイプ１分泌システム（ｔｙｐｅ  Ｉ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｔ１ＳＳ）を通じた分泌が円滑に起こらないことがある。
【００３５】
前記酸性ペプチドは、アスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ）およびグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群より選択された１種以上のアミノ酸であってもよく、好ましくは前記酸性ペプチドをコードする核酸配列は、配列番号３３（Ａｓｐａｒａｔｉｃ  ａｃｉｄ  １０個；Ｄ１０）のアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであってもよい。前記酸性ペプチドをコードする核酸配列は、目的タンパク質をコードする核酸配列の３’−末端または５’−末端に位置するものであってもよく、好ましくは３’−末端に付着するものであってもよい。
【００３６】
また、前記ベクターは、リンカーをコードする核酸配列を追加的に含むことができる。前記リンカーは、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸配列からなるペプチドが１個〜３個連結されたものであってよい。
【００３７】
本発明の一例によれば、前記目的タンパク質をコードする核酸配列は、目的タンパク質に含まれている塩基性アミノ酸を１つ以上を除去したものであってもよい。前記塩基性アミノ酸は、リシン（ｌｙｓｉｎｅ）またはアルギニン（Ａｒｇｉｎｉｎｅ）である。
【００３８】
また他の本発明の一例によれば、前記目的タンパク質は、過電荷化（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅ）された目的タンパク質、好ましくは過負電荷化（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ）された目的タンパク質であってもよい。本発明は、既存にグラム陰性菌細胞外に分泌されなかった目的タンパク質の電荷（ｃｈａｒｇｅ）を過負電荷化することによって目的タンパク質の細胞外分泌を増加させることができる。
【００３９】
例えば、ソフトウェアレンダリングを使用して目的タンパク質の３次元構造を肉眼で観測し、これを通じて、相対的にタンパク質の外郭に存在し、官能基が溶媒方向に突出していて変化されても構造に大きな影響を与えないアミノ酸を選別した後、前記アミノ酸が塩基性アミノ酸である場合、アスパラギン酸とグルタミン酸で置換し、前記アミノ酸が酸性アミノ酸である場合、ライシンとアルギニンで置換する手動過電荷化（Ｍａｎｕａｌ  Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ）技法を使用して目的タンパク質を過負電荷化することができる。また他の例示として、前記過負電荷化された目的タンパク質は、ＡｖＮＡＰＳＡ（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ａｔｏｍｓ  ｐｅｒ  Ｓｉｄｅｃｈａｉｎ  Ａｔｏｍ）アルゴリズムを用いてタンパク質表面をリモデリングして製造したものであってもよい。ＡｖＮＡＰＳＡのプロトコルは知られており（ＷＯ２００７／１４３５７４  Ａ１）、具体的に前記アルゴリズムはタンパク質の各アミノ酸が該当タンパク質の他の原子とどれだけ近いか程度を数値化して示すアルゴリズムである。
【００４０】
本発明者らは以下の実験例に示されているように、ＡｖＮＡＰＳＡ点数が１００点以下であるアミノ酸（即ち、相対的にタンパク質の外郭に存在し、官能基が溶媒方向に突出していて変化されても構造に大きな影響を与えないアミノ酸）を公開されたプロトコルによって一括的にアスパラギン酸とグルタミン酸に交替したタンパク質（過負電荷化（ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ  ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ）されたタンパク質）配列を収得し、該当タンパク質配列に対応するＤＮＡ配列を合成し、合成されたＤＮＡ配列をｐＤＡＲＴプラスミドに入れて分泌用タンパク質を発現させた。その結果、過負電荷化されていないタンパク質と比較して過負電荷化したタンパク質の細胞外分泌の効率が非常に増加するのを確認した。
【００４１】
本発明の一例によれば、前記リパーゼＡＢＣ輸送体認識ドメインは、ＬＡＲＤ１、ＬＡＲＤ２、またはＬＡＲＤ３であってもよい。前記ＬＡＲＤは、シュードモナス・フルオレセンスの耐熱性リパーゼオペロン内ｔｌｉＡのＣ−末端に位置する分泌／シャペロン（ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ／ｃｈａｐｅｒｏｎ）ドメインを意味することができる。具体的に、ＬＡＲＤペプチドはその配列によってＬＡＲＤ１〜ＬＡＲＤ５ペプチドに分けられ、本発明で使用するＬＡＲＤはＬＡＲＤ３であってもよく、好ましくは配列番号２２のアミノ酸配列からなるＬＡＲＤ−３ペプチドであってもよい。
【００４２】
ＬＡＲＤペプチドは機能的に疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて精製を行うことができる精製配列を含んでおり、この精製配列はＶＬＳＦＧＡＤＳＶＴＬＶＧＶＧＬＧＧＬＷＳＥＧＶＬＩＳ（配列番号２９）であって、本発明者らの以前登録特許ＫＲ１０−１６７７０９０で明らかにしたことがある。前記精製配列を含むタンパク質は、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて容易に精製できる。したがって、前記精製配列を含んでいるＬＡＲＤ３ペプチドは、目的タンパク質の精製用途として使用できる。
【００４３】
また、ＬＡＲＤペプチドは機能的に細胞内から細胞外に分泌を誘導する信号配列も含んでおり、この分泌信号配列はＧＳＤＧＮＤＬＩＱＧＧＫＧＡＤＦＩＥＧＧＫＧＮＤＴＩＲＤＮＳＧＨＮＴＦＬＦＳＧＨＦＧＱＤ（配列番号３０）であって、これも本発明者らの以前登録特許ＫＲ１０−１６７７０９０で明らかにしたことがある。前記分泌信号配列を含むタンパク質は細胞内から細胞外への分泌が行われ得る。ＬＡＲＤの中でも、ＬＡＲＤ１〜ＬＡＲＤ３ペプチドは本発明の分泌信号配列および精製配列を全て含んでいるので、目的タンパク質の細胞内から細胞外への分泌および精製の用途として使用できる。好ましくは、分泌信号配列はＬＡＲＤ３ペプチド（配列番号２２）を使用することができる。
【００４４】
前記ＬＡＲＤをコードする塩基配列は、組換え目的タンパク質をコードする塩基配列の３’−末端に位置するものであって、組換え目的タンパク質のＣ−末端に融合されたタンパク質をコードする形態であってもよい。前記組換え目的タンパク質のＣ−末端に融合される場合、細胞外分泌によって加水分解されるＮ−末端の信号配列と対照的に、Ｃ−末端信号配列は加水分解されない長所を有することができる。
【００４５】
【表１】
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本発明の具体的一例によれば、前述の発現ベクターを含む細胞を提供する。
【００４６】
具体的に、前記細胞に含まれている発現ベクターは、組換え目的タンパク質をコードする核酸配列、およびリパーゼＡＢＣ輸送体認識ドメイン（ＬＡＲＤ）をコードする核酸配列が作動可能に連結された発現カセットを含み、酸性ｐＩ値を有する分泌用タンパク質を発現することを特徴とする、細菌で目的タンパク質を発現し分泌するための発現ベクターであってもよい。
前記細胞は、追加的に細菌のＴ１ＳＳのＡＢＣ輸送体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。
【００４７】
前記細胞はグラム陰性菌であってもよく、例えば、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属菌株、ディッケヤ（Ｄｉｃｋｅｙａ）属菌株、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属菌株、キサントモナス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）属菌株またはバークホルデリア（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）属菌株であってもよいが、これに制限されない。例えば、本発明で目的タンパク質の細胞外分泌はＡＢＣ輸送体の機能によって行われ、ＡＢＣ輸送体は二重膜を有するグラム陰性菌で作動するため、グラム陰性菌に該当する場合、制限なく本発明の範囲に含まれ得る。
【００４８】
前記シュードモナス属菌株は、シュードモナス属に該当する菌株であれば全て含まれ得るが、例えば、シュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・フラギ、シュードモナス・プチダ、シュードモナス・シリンガエまたはシュードモナス・エルギノーザであってもよく、好ましくはシュードモナス・フルオレセンス、シュードモナス・エルギノーザであってもよい。
【００４９】
前記細胞がシュードモナス・フルオレセンスである場合、シュードモナス・フルオレセンスに導入された目的タンパク質はＴｌｉＡのＣ−末端信号伝達部位に結合して融合タンパク質形態で細胞外部に分泌され得るが、シュードモナス・フルオレセンスの内在的リパーゼおよびプロテアーゼもＡＢＣ運搬体の媒介として細胞外部に分泌される。これによって、野生型シュードモナス・フルオレセンス、または完全なリパーゼまたはプロテアーゼを生産する菌株を用いて目的タンパク質を発現する場合、前記目的タンパク質が細胞外部に分泌されてもリパーゼおよびプロテアーゼが不純物として混入されて以後精製工程を複雑にするだけでなく、プロテアーゼは生産された目的タンパク質を加水分解するようになる問題点がある。
【００５０】
したがって、前記シュードモナス属菌株はシュードモナス・フルオレセンスのリパーゼ遺伝子（ｔｌｉＡ）およびプロテアーゼ遺伝子（ｐｒｔＡ）からなる群より選択された一つ以上の遺伝子の一部領域が欠失され、前記遺伝子の一部欠失は遺伝子の少なくとも一つの末端に少なくとも１００ｂｐ以上大きさの断片を残すように遺伝子領域を欠失させたものであり、機能的リパーゼおよび機能的プロテアーゼからなる群より選択された１種以上の機能的タンパク質を生成しないシュードモナス・フルオレセンス変異菌株であってもよい。前記変異菌株の例としては、リパーゼ単独欠失（変異菌株ΔｔｌｉＡ）、プロテアーゼ単独欠失（変異菌株ΔｐｒｔＡ）およびリパーゼ／プロテアーゼ二重欠失変異菌株（変異菌株ΔｔｌｉＡΔｐｒｔＡ）であってもよい。これら変異菌株に関する内容は、韓国特許公開１０−２０１４−００４１１５９に詳しく記述されている。
【００５１】
前記シュードモナス・フルオレセンス変異菌株が機能的プロテアーゼタンパク質を生成しないことは、プロテアーゼ遺伝子の全部または一部欠失、またはプロテアーゼ阻害剤遺伝子（ｉｎｈ）の全部または一部欠失によってなされたことであり得る。
【００５２】
前記シュードモナス・フルオレセンス変異菌株は例えば、寄託番号ＫＣＴＣ１２２７６ＢＰ、ＫＣＴＣ１２２７７ＢＰ、またはＫＣＴＣ１２２７８ＢＰを有するシュードモナスフルオレセンス変異菌株であってもよいが、これに制限されない。
【００５３】
本発明の具体的一例によれば、本発明は前記前述のベクターで形質転換された細胞を製造する段階、前記細胞を培養して分泌用タンパク質を生産する段階、および前記生産された分泌用タンパク質を分離または精製する段階を含む、細胞で目的タンパク質を生産する方法を提供する。
前記細胞は、追加的に細菌のＴ１ＳＳのＡＢＣ輸送体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。
【００５４】
前記細胞はグラム陰性菌であってもよく、前記細胞で目的タンパク質を生産する方法で、前記発現ベクターで形質転換されたグラム陰性菌細胞を製造する方法は通常の遺伝子導入方法を使用することができ、例えば、目的タンパク質をコーディングする遺伝子をベクターに導入した組換えベクターをグラム陰性菌内部に導入するか、導入されたベクターに挿入された目的タンパク質をコーディングする遺伝子がゲノム内部に相同組換えによってゲノム内に挿入され得る。
【００５５】
前記ベクターはプラスミドベクター、コスミドベクター、バクテリオファージベクターおよびウイルスベクターなどを含む通常の全てのベクターを含み、特にこれに限定されない。前記グラム陰性菌へのベクター導入は、電気衝撃遺伝子伝達法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ4）沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ2）沈殿、ＰＥＧ、デキストランスルフェート、リポフェクタミンなどの公知された方法で行うことができる。
【００５６】
前記細胞の培養において、培地性分、培養温度および培養時間などの条件は適切に調節でき、具体的に培養培地は炭素源、窒素源、微量元素成分などのような微生物の成長と生存に必須の全ての栄養素を含むことができる。また、培地のｐＨを適切に調整することができ、抗生剤などの成分を含むことができる。また、誘導剤（ｉｎｄｕｃｅｒ）を処理してタンパク質の発現を誘導することができ、処理される誘導剤の種類はベクターシステムによって決定でき、誘導剤投与時間および投与量などの条件は適切に調節できる。
【００５７】
野生型菌株および変異株ΔｔｌｉＡで目的タンパク質を効果的に発現するためには２ｘＬＢ培地を使用しなければならないが、変異株ΔｐｒｔＡおよび変異株ΔｔｌｉＡΔｐｒｔＡでＬＢ培地を使用することができるため、培地濃度を緩和することができる。また、前記変異株ΔｔｌｉＡΔｐｒｔＡは細胞外でＴｌｉＡの妨害がなくＰｒｔＡ加水分解から保護される目的タンパク質を生産し、リパーゼまたはプロテアーゼ−由来信号配列とＡＢＣ運搬体と競争をせず、ＬＢ培地を使用することができる長所があるため、外来タンパク質の生産、分泌および精製を簡便に行うことができ、タンパク質生産量をさらに高めることができるので、目的タンパク質大量生産に有用に使用することができる。
【００５８】
前記目的タンパク質は、精製配列を含むＬＡＲＤを用いて疎水性相互作用クロマトグラフィーを行うことを除いては通常の方法で回収および精製できる。例えば、遠心分離方法で回収した細胞を、フレンチプレス、超音波破砕機などを用いて破砕することができる。培養液にタンパク質が分泌される場合には培養上澄み液を収集することができる。過発現によって凝集される場合、適切な溶液でタンパク質を溶解および変成させリフォールディングさせて得ることができる。グルタチオン、ジチオトレイトール、β−メルカプトエタノール、シスチンおよびシスタミンの酸化および還元システムを使用し、尿素、グアニジン、アルギニンなどのリフォールディング剤などを用いることもでき、リフォールディン剤と共に塩の一部を使用することができる。
【００５９】
一例として、前記グラム陰性菌で目的タンパク質を生産する方法で、目的タンパク質を分離または精製する段階以後に、Ｆａｃｔｏｒ  ＸａあるいはＴｏｂａｃｃｏ  Ｅｔｃｈ  Ｖｉｒｕｓ（ＴＥＶ）ｐｒｏｔｅａｓｅ、Ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ（ＥＫ）などのタンパク質分解酵素認識部位を挿入して前記目的タンパク質に結合された酸性ペプチドとＬＡＲＤを切断する段階を追加的に含むことができる。
【００６０】
本発明の一例として、目的タンパク質の精製は疎水性相互作用を用いることができる。この時、本発明の精製配列は精製タグとして使用できる。例えば、前記疎水性相互作用クロマトグラフィーはアルキルセファロースを用いた疎水性相互作用クロマトグラフィー法であり、前記アルキル基はメチル、エチル、プロピルまたはブチル基であってもよい。好ましく、前記アルキル基はメチル基であってもよい。アルキル基としてメチル基を使用する場合、他のアルキル基を使用する場合に比べて精製配列を含むタンパク質を優秀に精製することができる。
【００６１】
一般に、カラムを用いたタンパク質の精製においてはＨｉｓ−ｔａｇを用いた精製を多く行い、Ｈｉｓ−ｔａｇ精製のためのカラム（ｃｏｌｕｍｎ）は高価なだけでなく、大容量を精製を行うためには適合しない面がある。また、ＮＴＡカラムを多く使用するが、再使用すればＮｉ2+あるいはＮＴＡが脱落するため反復的な使用に制限が発生するという問題点がある。これに反し、疎水性相互作用クロマトグラフィーに使用される疎水性カラム（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｌｕｍｎ）は低価のカラムであって、経済性が高く大容量分離に使用するに適しており、再使用率が高いという長所がある。
【００６２】
本発明のまた他の一例は、前記前述の本発明のベクターを細胞に挿入する段階を含む、グラム陰性菌で分泌用タンパク質の細胞外分泌を増加させる方法を提供する。
【００６３】
前記細胞は、追加的に細菌のＴｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔ１ＳＳ）のＡＢＣ輸送体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含むことができる。
【００６４】
本発明者らは細菌のＴｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔ１ＳＳ）のＡＢＣ輸送体を通じた目的タンパク質の分泌率は負電荷に荷電された目的タンパク質で上昇し、よって、タンパク質のｐＩとＴ１ＳＳ  ＡＢＣ輸送体による分泌が可能かどうかの間には質的相関関係があるのを確認した。
【００６５】
即ち、強い酸性ｐＩおよび強い負電荷を帯びるタンパク質はＴ１ＳＳ  ＡＢＣ輸送体によって分泌された反面、負電荷が少なくｐＩが高いタンパク質はほとんど分泌されなかった。一例として、遺伝子がｐＦＤ１０に導入された時、一部タンパク質は分泌が増加し、ｐＢＤ１０の場合、発現減少なく分泌が増加した。
【００６６】
本発明で下記の実施例および実験例で行ったｐＦＤ１０、ｐＢＤ１０実験および過電荷化されたタンパク質の分泌パターン比較の結果を総合してみた時、結局、より多い負電荷を運搬するように操作されたタンパク質の分泌効率が増加したのを確認した。これは細胞質と細胞外空間の間の電位エネルギー障壁を克服するに必要なエネルギーを減少させるためである。
【００６７】
一般にグラム陰性バクテリアは内膜の膜電位を約１５０ｍＶ程度に維持し、細胞質側は膜間空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）よりさらに負に帯電される。この分極された電荷分布は膜を横切る能動的陽子輸送を含んで多様な細胞メカニズムによって維持される。外膜の電位も負の値を有し、膜間空間（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）はそこに分布する負に荷電された膜由来オリゴ糖によって細胞外空間よりさらに負に帯電される。しかし、外部膜の多少孔が多いという特性によって外膜の膜電荷はその大きさが相対的に小さくて一般に３０ｍＶ未満である。
【００６８】
このような全ての事実を考慮する時、負に荷電されたタンパク質を分泌することがエネルギーの面から見た時一般に有利であり、これは分泌反応の平衡に影響を与える。膜電位は生化学的水準で非常に強力であり、ＡＢＣ輸送体を通じて輸送される間の自由エネルギーの変化に重要な影響を与える。−１５０ｍＶ電位を帯びた内膜を横切ってポリペプチドを移動させることは、ポリペプチドが運搬する電荷当り約３．５ｋｃａｌ／ｍｏｌのエネルギーを必要とする。一定の圧力、温度および濃度での計算は以下の通りである。
ｗ＝−ｎＦＶ＝１４．４７ｎ  ｋＪ／ｍｏｌ＝３．５ｎ  ｋｃａｌ／ｍｏｌ
【００６９】
ここで、ｎはポリペプチドの総電荷であり、Ｆはファラデー定数である。総電荷が＋１０であるタンパク質（Ｎ＝＋１０）を分泌させる状況ではｗ＝３５ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、分泌はそれだけさらに不利になる。生体の濃度下でＡＴＰ加水分解の自由エネルギー変化（ΔＧ）の一般的な値は１１．４ｋｃａｌ／ｍｏｌである。ＡＢＣ輸送体のメカニズムに関して提案されたモデルはＡＢＣタンパク質がＡＴＰ加水分解と結合された“内向”形態と“外向”形態間の連続的な転換を通じて作用すると分析する。このモデルによれば、ＡＢＣ輸送体の主要動力源の一つはこの過程で起こる“駆動打撃（ｐｏｗｅｒ  ｓｔｒｏｋｅ）”の力である。負電荷を帯びた膜電位は帯電されたポリペプチドに静電気力を加えてこの駆動打撃によって加えられる力を相殺させるか、甚だしくは逆転してしまって窮極的に分泌平衡に影響を与える。
【００７０】
この“膜電位”仮説は、多様な分泌類型にわたる多くの以前の研究によって裏付けられた。Ｅ．ｃｏｌｉ脂質タンパク質（ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）に突然変異を誘発する正の電荷を追加する変異が原核生物および真核生物の両方で膜付近のタンパク質の折りたたみを妨害することによって分泌を減少すると報告され、またＥ．ｃｏｌｉ  ａｕｔｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ（タイプＶａ輸送システム）のパッセンジャードメインの正味負電荷を中和または逆転させる時、同様に内側がさらに負電荷を帯びる外膜を通過する過程が中断されるのが明らかになった。
【００７１】
Ｔ１ＳＳ輸送体の一例のうちのＴｌｉＤＥＦの場合、考慮しなければならない他の要素はＴｌｉＤの荷電状態である。ＴｌｉＤはＴｌｉＤＥＦ運搬体の内膜部分の構成要素であるＡＢＣタンパク質である。このタンパク質は、短いドメイン間配列によって連結されたヌクレオチド結合ドメイン（ＮＢＤ）および膜横断ドメイン（ＴＭＤ）を有している。特に、ＴｌｉＤ  ＡＢＣタンパク質が特にＴＭＤ（ｐＩ  ９．４３）とドメイン間配列（ｐＩ  ８．１４）周囲で理論的なｐＩが非常に高い。
【００７２】
次いで行ったＴｌｉＤの相同性基盤構造予測モデルで、このタンパク質の二量体（ｄｉｍｅｒ）はその通路内部面に正電荷分布を有することが確認された（図９ＡおよびＢ）。この予測モデルは、配列同一性が４０．９８％に達するＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＰｒｔＤ（ＰＤＢ  ＩＤ５ｌ２２）を鋳型にして製作された。また、ＴｌｉＤのＣｏｎＳｕｒｆ同族体保存性分析はチャネルの中間部分にあるこの正電荷分布が実際に進化的に保存されたものであるのを示した（図９ＣおよびＤ、黄色円）。また、ＴｌｉＤの基質進入入口を形成する折れたアルファ螺旋には、入口の孔側に突出してＴｌｉＤのＡＤＰ結合状態で基質進入入口を遮断する正に帯電された残基があり、ＣｏｎＳｕｒｆ結果から見る時、同様に５０個の全ての同族体でこの位置にアルギニンまたはライシンがあったためこの残基の正電荷が保存されるのを確認することができた（図９Ｃ、黒い矢印）。本発明者らはこの正電荷を帯びた通路の内部表面がタンパク質輸送中に貨物タンパク質の負電荷残基と相互作用して分泌を促進すると推定する（図９Ｅ）。
【００７３】
また、チャネルの内部表面および基質進入入口上の正電荷は（アルギニンポリペプチド付着した下記実験の結果から分かるように）ポリペプチドの正電荷セクションを押し出して通路に入ることを防止し窮極的に分泌されるのを遮断することができる。ここで、本発明者らはタンパク質が輸送過程で（少なくとも部分的でも）折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）状態が解かれると仮定し、これはＥ．ｃｏｌｉ  ＴｏｌＣ（ＰＤＢ  ＩＤの１ｔＱＱ）と非常に類似の構造を有すると予想されるＴｌｉＦの孔が１９．８Åの平均内部直径を有するためである。これは確か２４ÅのＧＦＰバレルを含む大部分の球形タンパク質の平均直径である２０−３０Åより小さい。ＴｌｉＦは比較的に固いβ−バレル形態の膜貫通構造を有しているため輸送中に孔が拡大されることがほとんど不可能であると推定される。
【００７４】
また他のＴ１ＳＳのＡＢＣ輸送体も同様にこれらのＡＢＣタンパク質が正電荷を帯びるＴＭＤを有している。Ｅ．ｃｏｌｉ  ｈａｅｍｏｌｙｓｉｎ輸送複合体であるＨｌｙＢ−ＨｌｙＤ−ＴｏｌＣもＴｌｉＤの相同体であるＡＢＣタンパク質ＨｌｙＢのＴＭＤにおいて相当な正電荷分布を有している。Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ  ＰｒｔＤも同様である。この事実は、Ｔ１ＳＳ  ＡＢＣ輸送体分泌機序の電荷依存性を強力に裏付ける。
【００７５】
結論的に、本発明者らは高度に酸性であるタンパク質のみがＡＢＣ輸送体を通じて輸送され、塩基性であるか弱い酸性であるタンパク質はＡＢＣ運搬体を通じて分泌できないのを新しく明らかにし、目的タンパク質にアスパラギン酸ポリペプチドを付着するか負電荷に過電荷化することによってｐＩを人為的に低めることによって細胞外部への目的タンパク質の分泌を向上させる方法を提供する。また、簡単なｐＩ確認を通じてＡＢＣ輸送体が関心タンパク質を分泌できるか否かを確認する方法を提供することができ、窮極的にＡＢＣ伝達体依存性分泌を通じて効率的に生産可能なタンパク質種類の範囲を該当タンパク質の過電荷化を通じて広げることができる。
【発明の効果】
【００７６】
本発明は、酸性ｐＩ値を有する分泌用タンパク質を製造して、細菌のＴｙｐｅ  １  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｔ１ＳＳ）のＡＢＣ輸送体を通じて目的タンパク質を効果的に細胞外に分泌させる方法を提供する。前記方法を使用して特別な精製過程を経なくても簡単且つ効率的にタンパク質を大量生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１ａ】実施例６によって選択されたタンパク質の分泌を確認したものであって、目的タンパク質の発現および分泌を示すウェスタンブロットイメージを示す。
【図１ｂ】実施例６によって選択されたタンパク質の分泌を確認したものであって、目的タンパク質の発現および分泌を示すウェスタンブロットイメージを示す。
【図２ａ】実施例６によって目的タンパク質の分泌率およびこれらの等電点の間の相関関係を示す。目的タンパク質のｐＩ値は、付着されたＬＡＲＤ３を含む配列から計算した。
【図２ｂ】実施例６によって目的タンパク質の分泌率およびこれらの等電点の間の相関関係を示す。目的タンパク質のｐＩ値は、付着されたＬＡＲＤ３を含む配列から計算した。
【図３ａ】実施例７によってＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ発現と分泌システム内でｏｌｉｇｏ−アスパラギン酸配列の最適長さを決定するために、Ｌｕｎａｓｉｎとｏｌｉｇｏ−アスパラギン酸尾の長さが互いに異なるＬｕｎａｓｉｎの誘導体をＬＡＲＤ３付着を経由して発現し分泌を確認した結果である。
【図３ｂ】実施例７によってＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ発現と分泌システム内でｏｌｉｇｏ−アスパラギン酸配列の最適長さを決定するために、Ｌｕｎａｓｉｎとｏｌｉｇｏ−アスパラギン酸尾の長さが互いに異なるＬｕｎａｓｉｎの誘導体をＬＡＲＤ３付着を経由して発現し分泌を確認した結果である。
【図４】実施例８によって本発明に使用したプラスミドの構造を示し、ＭＣＳを含むｐＤＡＲＴプラスミドの構造を示す。ｔｌｉＤ、ｔｌｉＥ、ｔｌｉＦ、およびＬＡＲＤ３が融合されたタンパク質は単一オペロンで制御される。（Ａ）の場合、ＭＣＳ直後にＬＡＲＤ３遺伝子があるため、挿入された目的遺伝子はＣ−末端に付着されているＬＡＲＤ３と共に発現される。（Ｂ）Ｎ−末端にＤ１０配列が付着されているプラスミドであるｐＦＤ１０の構造を示す。Ｄ１０遺伝子は開始コドンに直接後続し、ＭＣＳとＬＡＲＤ３の直ぐ以前に位置する。（Ｃ）Ｃ末端に位置するが、ＬＡＲＤ３以前にＤ１０配列を付着させるｐＢＤ１０プラスミドの構造を示す。Ｄ１０遺伝子はＭＣＳとＬＡＲＤ３の間に位置する。
【図５】実施例９によってＮＫＣとＣＴＰ配列がそれぞれ付着されたＴｌｉＡリパーゼ二種類（ＮＫＣ−ＴｌｉＡ、ＣＴＰ−ＴｌｉＡ）のＮ−末端部（ＦＤ１０）とＣ−末端部（ＢＤ１０）にアスパラギン酸１０個（Ｄ１０）を追加してｐＤＡＲＴプラスミドを通じて発現させた後、ウェスタンブロットおよびリパーゼ活性度を測定培地で検出した結果を示す。
【図６】実施例１０によって緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、マンナナーゼ（Ｍａｎｎａｎａｓｅ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）のＮ−末端部（ＦＤ１０）とＣ−末端部（ＢＤ１０）にアスパラギン酸１０個（Ｄ１０）を追加してｐＤＡＲＴプラスミドを通じて発現させた後、ウェスタンブロットで検出した結果を示す。
【図７】実施例１１によってＴｌｉＡリパーゼと緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＣ−末端部にそれぞれアスパラギン酸１０個（Ｄ１０）またはアルギニン１０個（Ｒ１０）を追加した後、ウェスタンブロットとリパーゼ活性培地で検出した結果を示す。
【図８】実施例１２によってＡｖＮＡＰＳＡ方式で過電荷化（Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ）させた緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をｐＤＡＲＴに入れて発現させウェスタンブロットで検出した結果を示す。
【図９】実施例５によってＴｌｉＤＥＦ複合体のＡＢＣタンパク質であるＴｌｉＤ構造の電荷分布を示す。図９のＡ、Ｂ、Ｃで円形で表示された部分は正電荷を帯びる部分を示し、図９のＤに円形で表示された部分は輸送体内部空洞を示したものであり、円形内部の白色矢印は相対的に負電荷を帯びる原子を、黒色矢印は相対的に正電荷を帯びる原子を表示したものである。
【図１０ａ】実施例９によってＴｌｉＡ、ＣＴＰ−ＴｌｉＡ、およびＮＫＣ−ＴｌｉＡの分泌比較を示し、図１０ａはＴｌｉＡ、ＣＴＰ−ＴｌｉＡ、およびＮＫＣ−ＴｌｉＡの酵素プレート分析結果であり、図１０ｂはＴｌｉＡ、ＣＴＰ−ＴｌｉＡ、ＮＫＣ−ＴｌｉＡのウェスタンブロット結果を示す。
【図１０ｂ】実施例９によってＴｌｉＡ、ＣＴＰ−ＴｌｉＡ、およびＮＫＣ−ＴｌｉＡの分泌比較を示し、図１０ａはＴｌｉＡ、ＣＴＰ−ＴｌｉＡ、およびＮＫＣ−ＴｌｉＡの酵素プレート分析結果であり、図１０ｂはＴｌｉＡ、ＣＴＰ−ＴｌｉＡ、ＮＫＣ−ＴｌｉＡのウェスタンブロット結果を示す。
【図１１】実施例５によってｐＨ７．０でタンパク質ｐＩと電荷の関係を示す。
【図１２】実施例５によってＴｌｉＤの構造予測結果を示す。
【図１３】実施例５によってモデル化されたＴｌｉＤの膜横断螺旋（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｃｅｓ）の予測結果を示す。四角形箱部分がサーバーを通じて予測された膜通過部分に該当する。
【図１４】実施例５によってモデリングされたＴｌｉＤのＣｏｎＳｕｒｆ相同体保存分析結果を示す。濃い黒色で表示された部分はよく保存された部分であり、色が浅くなるほどよく保存されていない部分である。
【図１５】実施例１３によってｐＤＡＲ−ＴｌｉＡ、−ＮＫＣ（−）、ＮＫＣ−Ｌ１、−ＮＫＣ−Ｌ２、ＮＫＣ−Ｌ３、−ＮＫＣ−ＴｌｉＡでタンパク質分泌を示す。（Ａ）ＴｌｉＡのウェスタンブロット。（Ｂ）他のｐｌａｓｍｉｄｓでＴｌｉＡの酵素プレート分析結果を示す。
【図１６】実施例１４によって−１０ＳＡＶ、ｗｔＳＡＶ、＋１３ＳＡＶおよび２−１０ＧＳＴ、ｗｔＧＳＴ、＋１９ＧＳＴの分泌有無の分析結果を示す（ＳＡＶ：ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ／ＧＳＴ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）。
【図１７】実施例１４によってＡｖＮＡＰＳＡ（Ａｖｅｒａｇｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ  Ａｔｏｍｓ  Ｐｅｒ  Ｓｉｄｅｃｈａｉｎ  Ａｔｏｍ）方式を使用せず、任意に構造を見ながら突出したアミノ酸をアスパラギン酸またはアルギニンに交替して過電荷化させたグルタチオンＳ−伝達酵素（ＧＳＴ）とストレプトアビジン（ＳＡｖ）をｐＤＡＲＴに入れて発現させウェスタンブロットで検出した結果を示す。
【図１８】実施例１５によってＭｅｌＣ2チロシナーゼ、クチナーゼ（Ｃｕｔｉ）、キチナーゼ（Ｃｈｉ）、そしてＭ３７リパーゼをＡｖＮＡＰＳＡ方法で過負電荷化させた後、過負電荷化がされたタンパク質（赤色）とそれに対応する過電荷化されていない自然タンパク質（黒色）をそれぞれｐＤＡＲＴプラスミドに入れて発現させウェスタンブロットで検出した結果を示す。
【図１９】実施例１６によってＴｌｉＡタンパク質（ＴｌｉＤＥＦ輸送体の本来の基質）と三種類の互いに異なる細菌から分離されたＴ１ＳＳ輸送体を大腸菌で同時発現させた後、酵素活性測定培地でタンパク質分泌程度をコロニー周辺部培地の色変化を通じて測定した実験結果を示す。
【図２０】実施例１７によってクチナーゼ（Ｃｕｔｉｎａｓｅ）タンパク質（Ｃｕｔｉ）と過負電荷化されたクチナーゼタンパク質（Ｃｕｔｉ（−））にＬＡＲＤ３信号配列を付着した後、三種類の互いに異なるＴ１ＳＳ輸送体タンパク質と共に大腸菌で発現させて酵素活性測定培地で分泌程度をコロニー周辺部培地の色変化を通じて測定した実験結果を示す。
【図２１】実施例１８によってクチナーゼタンパク質（Ｃｕｔｉｎａｓｅ、Ｃｕｔｉ）と過負電荷化されたクチナーゼタンパク質（Ｃｕｔｉ（−））にＬＡＲＤ３信号配列を付着した後、三種類の互いに異なるＴ１ＳＳ輸送体タンパク質と共に大腸菌で発現させて液体培養した後、ウェスタンブロットで細胞内および細胞外の該当タンパク質濃度を検出した実験結果を示す。
【図２２】実施例１９によってＭ３７リパーゼタンパク質（ｍ３７  Ｌｉｐａｓｅ、Ｍ３７）と過負電荷化されたＭ３７リパーゼタンパク質（Ｍ３７（−））にＬＡＲＤ３信号配列を付着した後、三種類の互いに異なるＴ１ＳＳ輸送体タンパク質と共に大腸菌で発現させて液体培養した後、ウェスタンブロットで細胞内および細胞外の該当タンパク質濃度を検出した実験結果を示す。
【図２３】ＴｌｉＤＥＦ輸送体と多様なＴ１ＳＳ輸送体間の塩基配列同一性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）および全体塩基配列で配列類似部分が占める比重を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。但し、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明が下記実施例によって限定されるのではない。
【実施例】
【００７９】
［実施例１］バクテリア菌株および成長培地
プラスミド製作および遺伝子クローニングは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１−ＢＬＵＥで行った。タンパク質発現および分泌は、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ＳＩＫ−Ｗ１（Ｓｏｎ、Ｍ．、Ｍｏｏｎ、Ｙ．、Ｏｈ、Ｍ．Ｊ．、Ｈａｎ、Ｓ．Ｂ．、Ｐａｒｋ、Ｋ．Ｈ．、Ｋｉｍ、Ｊ．Ｇ．、ａｎｄ  Ａｈｎ、Ｊ．Ｈ．（２０１２）  Ｌｉｐａｓｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｄｏｕｂｌｅ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ７８、８４５４−８４６２）の二重遺伝子削除誘導体（ｄｏｕｂｌｅ−ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）であるΔｔｌｉＡΔｐｒｔＡ菌株で観察された。微生物は、３０μｇ／ｍＬのカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を含んでいるＬＢ培地（ｌｙｓｏｇｅｎｙ  ｂｒｏｔｈ）で培養した。リパーゼ活性を有する目的遺伝子（ＴｌｉＡ、ＮＫＣ−ＴｌｉＡ、ＣＴＰ−ＴｌｉＡ）に対する酵素プレートアッセイ（ｅｎｚｙｍｅ  ｐｌａｔｅ  ａｓｓａｙ）はミキサーで混合された０．５％コロイド性グリセリルトリブチレート（ｇｌｙｃｅｒｙｌ  ｔｒｉｂｕｔｙｌａｔｅ）を含有するＬＢ寒天培地で製造した。Ｅ．ｃｏｌｉとＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは、それぞれ３７℃と２５℃で培養した。Ｅ．ｃｏｌｉの形質転換は標準熱ショック（ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ）方法に沿って行い、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは電気穿孔互換性（ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞を作って標準電気穿孔（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）プロトコルを使用し、２．５ｋＶの１２５Ω、５０μＦで（Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｍ．Ｆ．（２０１４）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｐｌａｓｍｉｄｓ、ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｐｈａｇｅｓ．ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｉｎｃ．ｐｐ）電気穿孔で変換した。形質転換されたＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは６０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ液体培地５ｍｌを含む試験管で静止期（ｓｔａｔｉｏｎａｒｙ  ｐｈａｓｅ）に到達するまで２５℃１８０ｒｐｍの振盪培養機で培養した。上記条件で形質転換された細胞を液体ＬＢに播種するか、または固体プレート活性アッセイにストリーキング（ｓｔｒｅａｋｉｎｇ）することによって、目標タンパク質の発現および分泌の両方に対して分析した。
【００８０】
［実施例２］プラスミドベクター製作
プラスミドｐＤＡＲＴは、本発明者らの以前に他のタンパク質の分泌生産に使用したプラスミドを使用した（Ｒｙｕ、Ｊ．、Ｌｅｅ、Ｕ．、Ｐａｒｋ、Ｊ．、Ｙｏｏ、Ｄ．Ｈ．、ａｎｄ  Ａｈｎ、Ｊ．Ｈ．（２０１５）Ａ  ｖｅｃｔｏｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＡＢＣ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｅｃｉｅｓ．Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ８１、１７４４−１７５３）。プラスミドベクターｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０は、前記ｐＤＡＲＴのＭＣＳの上流または下流位置に目的タンパク質に１０個のアスパラギン酸コドンを付加して製造した、ｐＤＡＲＴの誘導体である。十個のアスパラギン酸のＤＮＡ配列は合成されたＧｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ  ｌｕｎａｓｉｎ遺伝子（Ｇａｌｖｅｚ、Ａ．Ｆ．、Ｃｈｅｎ、Ｎ．、Ｍａｃａｓｉｅｂ、Ｊ．、ａｎｄ  ｄｅ  Ｌｕｍｅｎ、Ｂ．Ｏ．（２００１）Ｃｈｅｍｏｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｓｏｙｂｅａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｌｕｎａｓｉｎ）Ｔｈａｔ  Ｂｉｎｄｓ  ｔｏ  Ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  Ｈｉｓｔｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６１、７４７３−７４７８）を鋳型として使用してＰＣＲを通じて増幅した。ｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０に対してそれぞれ２個の異なるＰＣＲ産物を収得し、この時、それぞれ一つまたは二つの任意の塩基がプライマーの上流または下流に挿入されて翻訳フレームを維持させたためｐＦＤ１０−とｐＢＤ１０−に挿入されたタンパク質間に若干の大きさおよびｐＩ差が存在する。
【００８１】
その後、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＤ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｐｌｕｓ  ＣＥ）を使用してｐＤＡＲＴにＰＣＲ産物を組み換えてｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０を製作した。ｐＤＡＲＴを線状化するために、ＸｂａＩ（ｐＦＤ１０構造）またはＳａｃＩ（ｐＢＤ１０）で消化させた。次いで、線状化されたｐＤＡＲＴと相応するＰＣＲ産物をＩｎ−Ｆｕｓｉｏｎ  ３’−５’エキソデオキシリボヌクレアーゼ（ｅｘｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ）で分解し、Ｉｎ−Ｆｕｓｉｏｎキットの標準プロトコルによって組み換えた。これらＤＮＡ断片と相補的な〜１５塩基５’突出部を連結して目的遺伝子挿入が可能なｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０プラスミドを完成した。ｐＤＡＲＴ、ｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０のＭＣＳ付近の配列は表２に明示されている。
【００８２】
下記表２で下線で表示したアミノ酸配列はＬＡＲＤ３信号配列を示し、太字で表示した“ＩＥＧＲ”は目的タンパク質とＬＡＲＤ３信号配列を連結する残基であって、Ｆａｃｔｏｒ  Ｘａが認識して切断する部分である。
目的タンパク質は、Ｈｉｓ−ｔａｇのような精製ｔａｇによってＦａｃｔｏｒ  ＸａおよびＬＡＲＤ３から追加的に精製できる。
【００８３】
下記表２の塩基配列の各部分に関する説明は、図１９ａ〜図１９ｇに開示した。図１９ａ〜図１９ｆはＦＡＳＴＡフォーマット内でターゲットタンパク質の全体配列を示し、図１９ｇは酵素部位およびポリペプチド特徴を表示するための色コードを示す。
【表２】
2020533980.tif 000004
2020533980.tif 000005
2020533980.tif 000006
2020533980.tif 000007
2020533980.tif 000008
2020533980.tif 000009
2020533980.tif 000010
【００８４】
【表３】
2020533980.tif 000011
【００８５】
［実施例３］目的遺伝子が挿入されたプラスミドの製作
ｐＤＡＲＴに挿入するために１３個の目的遺伝子を選択した。抽出されたゲノムＤＮＡサンプル（ＴｌｉＡ、ＭＢＰ、ＴｒｘおよびＨｓｐ４０）、全体ｃＤＮＡ（ＥｇｌＶ）、合成されたＤＮＡ生成物（ＮＫＣ−ＴｌｉＡ、ＣＴＰ−ＴｌｉＡ、ＭＡＰ、ｌｕｎａｓｉｎ、ｌｕｎａｓｉｎ誘導体、ＧＦＰおよび過電荷化されたＧＦＰ）、他のプラスミド（この他のタンパク質）などからＰＣＲで遺伝子を増幅させた。
【００８６】
これらのＮ−末端信号ペプチドをＳｉｇｎａｌＰ４．１ウェブ基盤予測アルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＳｉｇｎａｌＰ／）（Ｐｅｔｅｒｓｅｎ、Ｔ．Ｎ．、Ｂｒｕｎａｋ、Ｓ．、ｖｏｎ  Ｈｅｉｊｎｅ、Ｇ．、ａｎｄ  Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｈ．（２０１１）ＳｉｇｎａｌＰ  ４．０：ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ８、７８５−７８６）で予測した後、クローニングおよび発現過程から除外させた。合成遺伝子のコドンはＥ．ｃｏｌｉ（過電荷化ＧＦＰ）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＴｌｉＡ誘導体）での発現のために最適化させた。
【００８７】
ｌｕｎａｓｉｎ遺伝子は、合成された後、ｐＤＡＲＴ挿入のためのＰＣＲで増幅させた。ｌｕｎａｓｉｎ−Ｄ０、ｌｕｎａｓｉｎ−Ｄ５、ｌｕｎａｓｉｎ−Ｄ１５およびｌｕｎａｓｉｎ−Ｄ２０などＣ−末端のＡｓｐポリペプチド尾の長さが異なる誘導体を多様なプライマーで増幅し、分泌生産のためにｐＤＡＲＴと組み換えた（図３Ｂ）。ＮＫＣ−ＴｌｉＡおよびＣＴＰ−ＴｌｉＡは、ＴｌｉＡの誘導体である。ＮＫＣは以前に開発された抗生剤ポリペプチドであり、ＣＴＰは以前に細胞質輸入タグとして開発された細胞質伝達ペプチドである。この二つの遺伝子をＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓでの発現に最適化されたコドンを有するように合成した。
【００８８】
以前に、ＧＦＰの溶媒に露出された残基を負電荷または正電荷を帯びたアミノ酸に交替して負に過電荷化されたＧＦＰ（−３０）および陽性で過電荷化されたＧＦＰ（＋３６）を開発したことがある。本発明者らは二つの過電荷化タンパク質をコーディングする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ発現に最適化されたコドンを有するように合成した。
【００８９】
ＰＣＲに使用されたプライマーは、プラスミドのＭＣＳ（ｐＤＡＲＴ、ｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０）に目的遺伝子を挿入するために使用された制限酵素部位を有している。ＰＣＲ産物およびプラスミドベクターをＸｂａＩ、ＫｐｎＩ、ＳａｃＩまたはＳｐｅＩ（これはＸｂａＩと互換可能）のうちの二つの制限酵素で二重分解させた。各遺伝子に使用された酵素の特定対は、表２に提供された全体配列から直接確認することができる。
【００９０】
その後、Ｔ４  ｌｉｇａｓｅを用いて制限酵素処理されたプラスミドと遺伝子を連結した。構築されたプラスミドをクローニングのためにＥ．ｃｏｌｉに導入し、クローニングされたプラスミドを標準プラスミド精製方法を使用して得た。精製されたプラスミドは、発現と分泌を分析するために、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに導入した。
【００９１】
［実施例４］ウェスタンブロット条件
４８時間細胞を成長（分泌は成長過程全体で起こる）させれば、液体培養物が固定成長期に到達し、細胞密度が約１．５×１０9細胞／ｍｌ（ＯＤ６００）＝〜３）程度に到達する。この時、液体培養液４００μＬを取って１８，０００ｒｃｆで１０分間遠心分離して上清と細胞ペレットを分離した。その次に細胞ペレット抽出物と上清１６μＬ−培養液（〜０．０４８ＯＤ）をそれぞれ１０％ポリアクリルアミドゲルにローディングした。大きさによってタンパク質を分離するためにＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した。
【００９２】
次いで、タンパク質をウェスタンブロットするためにニトロセルロースメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）に移した。一次抗体としてはＰｏｌｙｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−ＬＡＲＤ３  ｒａｂｂｉｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ）とａｎｔｉ−ｎｅｏｍｙｃｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ２（Ａｂｃａｍ、ａｂ３３５９５）をそれぞれ１：３０００と１：５００に希釈して使用し、抗ウサギ組換え塩素ＩｇＧ−ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  ｒＩｇＧ塩素ＩｇＧ−ペルオキシダーゼ）を１：１０００希釈して２次抗体として使用した。その次にバンドを化学発光製剤（Ａｄｖａｎｓｔａ  ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｉｇｈｔ  Ｐｉｃｏ）を使用して検出し、最後にＡｚｕｒｅ  Ｃ６００自動感知システムを使用してＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔイメージを獲得した。全ての含まれているウェスタンブロットイメージは、独立的なＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓコロニーと共に細胞培養から少なくとも三つの互いに異なる反復実験から得られた大目的の結果である。
【００９３】
イメージを得た後、その次にＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実験１（図１）の結果を定量化した。その後、この実験の目的タンパク質の％分泌を計算した。％分泌量は次の通り計算した。
％ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ＝Ｓsupernatant／（Ｓsupernatant＋Ｓcell）×１００％
ここで、Ｓはウェスタンブロットイメージの各帯域の標準化された信号の強度であり、下付き添え字はレーンのサンプルタイプを示す。
【００９４】
［実施例５］ポリペプチド特性およびタンパク質構造の分析
目的タンパク質の理論的なｐＩ値は、ＥｘＰＡＳｙ  Ｃｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ／Ｍｗツール（Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｍ．Ｒ．、Ｇａｓｔｅｉｇｅｒ、Ｅ．、Ｂａｉｒｏｃｈ、Ａ．、Ｓａｎｃｈｅｚ、Ｊ．Ｃ．、Ｗｉｌｌｉａｍｓ、Ｋ．Ｌ．、Ａｐｐｅｌ、Ｒ．Ｄ．、ａｎｄ  Ｈｏｃｈｓｔｒａｓｓｅｒ、Ｄ．Ｆ．（１９９９）Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＥｘＰＡＳｙ  ｓｅｒｖｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １１２、５３１−５５２）を使用して計算した。全体配列を使用し、ＬＡＲＤ３と酵素部位から追加された任意の残基も含ませた。タンパク質のＰＩ値とタンパク質の残基当り電荷密度の強い相関関係を分析した相関度を図１１に示した。
【００９５】
図１１は、ｐＨ７．０でタンパク質ｐＩと電荷の関係を示す。等電点およびＬＡＲＤ３付着組換えタンパク質の１００残基当り電荷が高い線形相関関係を示す。野生型ＴｌｉＡは青色で表わし、細胞外培養に対する分泌が観察されなかったタンパク質は赤色で表わした。その結果、明確な線状相関関係が観察され、ｐＨ７．０で測定された折りたたまれなかったタンパク質電荷はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ  ｖ３．４（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｔｃａｌｃ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｐｒｏｔｃａｌｃ）で計算した。
【００９６】
その次に、ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ構造的相同性モデリング（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／）（Ａｒｎｏｌｄ、Ｋ．、Ｂｏｒｄｏｌｉ、Ｌ．、Ｋｏｐｐ、Ｊ．、ａｎｄ  Ｓｃｈｗｅｄｅ、Ｔ．（２００６）Ｔｈｅ  ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ  ｗｏｒｋｓｐａｃｅ：ａ  ｗｅｂ−ｂａｓｅｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ  ｍｏｄｅｌｌｉｎｇ。Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２２、１９５−２０１）を用いてＡＢＣ輸送タンパク質構造を研究した。
【００９７】
本発明者らはＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓのＰｒｔＤ（ＰＤＢ  ＩＤ  ５ｌ２２）（Ｍｏｒｇａｎ、Ｊ．Ｌ．Ｗ．、Ａｃｈｅｓｏｎ、Ｊ．Ｆ．、ａｎｄ  Ｚｉｍｍｅｒ、Ｊ．（２０１７）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  Ｔｙｐｅ−１  Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＡＢＣ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２５、５２２−５２９）を鋳型として使用し、鋳型とＴｌｉＤの配列同一性は４０．９８％に達した。ＴｌｉＤの構造予測結果を図１２に示した。
【００９８】
図１２は、ＱＭＥＡＮ４点数によって彩色されたテンプレートと整列（ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）を基準にして、ＴｌｉＤの構造予測結果を示す。ＱＭＥＡＮ４点数によって低い品質の予測（図１２の明るい色部分）される残基は主に外面に位置し、一般にランダムコイル（ｒａｎｄｏｍ  ｃｏｉｌ）および突出部に位置する。ＱＭＥＡＮ４点数と着色の計算はＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬを使用した。
【００９９】
構造モデルの膜横断螺旋はＤＡＳ−ＴＭｆｉｌｔｅｒ（ｈｔｔｐ：／／ｍｅｎｄｅｌ．ｉｍｐ．ａｃ．ａｔ／ｓａｔ／ＤＡＳ／）（Ｃｓｅｒｚｏ、Ｍ．、Ｅｉｓｅｎｈａｂｅｒ、Ｆ．、Ｅｉｓｅｎｈａｂｅｒ、Ｂ．、ａｎｄ  Ｓｉｍｏｎ、Ｉ．（２００２）Ｏｎ  ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ  ｆａｌｓｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  １５、７４５−７５２）で検証され、その結果を図１３に示した。
【０１００】
図１３は、モデル化されたＴｌｉＤの膜横断螺旋（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｃｅｓ）の予測結果を示す。前記予測は、ＤＡＳ−ＴＭｆｉｌｔｅｒウェブサーバーを使用して行った。（Ａ）ＴｌｉＤ二量体の予想構造を示し、ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｃｅｓが異なる色で表示されている。（Ｂ）（Ａ）と同一な色コードで強調表示されたＴｌｉＤシークエンスを示す。
【０１０１】
得られた３Ｄモデルの表面をＳｗｉｓｓ  ＰｄｂＶｉｅｗｅｒ（ｓｐｄｂｖ）（ｈｔｔｐ：／／ｓｐｄｂｖ．ｖｉｔａｌ−ｉｔ．ｃｈ／）で計算した後、電荷によって着色した。本発明者らはまた、ＴｌｉＤとその相同体を比較してＴｌｉＤの構造（Ａｓｈｋｅｎａｚｙ、Ｈ．、Ａｂａｄｉ、Ｓ．、Ｍａｒｔｚ、Ｅ．、Ｃｈａｙ、Ｏ．、Ｍａｙｒｏｓｅ、Ｉ．、Ｐｕｐｋｏ、Ｔ．、ａｎｄ  Ｂｅｎ−Ｔａｌ、Ｎ．（２０１６）ＣｏｎＳｕｒｆ  ２０１６：ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ｔｏ  ｅｓｔｉｍａｔｅ  ａｎｄ  ｖｉｓｕａｌｉｚｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４、Ｗ３４４−Ｗ３５０）を確認するために、ＣｏｎＳｕｒｆウェブサーバー（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｎｓｕｒｆ．ｔａｕ．ａｃ．ｉｌ／２０１６／）を使用した。図１４がＴｌｉＤの保存された残基に関する情報を含んでいる。
【０１０２】
図１４は、モデリングされたＴｌｉＤのＣｏｎＳｕｒｆ相同体保存分析結果を示す。本発明者らはＴｌｉＤに対するＣｏｎＳｕｒｆ相同体保存分析を実施した。多重配列整列（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）はＭＡＦＦＴを使用して作成し、同族体（ｈｏｍｏｌｏｇｕｅｓ）はＵｎｉＰｒｏｔ、相同検索アルゴリズムＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ  Ｅ−ｖａｌｕｅ  ０．００１、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ反復回数５、配列の間のＩＤ２５−９５％順に収集した。１９７個の独特のタンパク質がスキャンされ、そのうちのｑｕｅｒｙに最も近い５０個の配列を使用した。系統隣（Ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｃ  ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ）をＭＬ距離でスキャンし、保全点数はＢａｙｅｓｉａｎアルゴリズムで計算した。（Ａ）ＴｌｉＤ二量体はＢａｙｅｓｉａｎ  ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｓｃｏｒｅによって着色された。図１４は、保全点数が高ければ濃く、保全点数が低ければ浅く着色された。ＴｌｉＤのｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｈｅｌｉｃｅｓは同族体間に保存されている。具体的に、ＴｌｉＤの中心チャネル内部に直面する残基は高度に保存され、中央チャネル外部にある残基（燐脂質または細胞質に向かった）は非常に可変的であった。
【０１０３】
ＣｏｎＳｕｒｆ相同性分析はまた、横断螺旋の残基のうちの通路内面に向かっている残基が高い保存度を有しているということを示し、これは私たちの構造予測の説得力をさらに高める。最後に、本発明者らは潜在的に重要な位置で高度に保存されたアルギニンとライシン残基の側鎖（ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）のｐＫａ値をウェブ基盤サーバーＰＤＢ２ＰＱＲ（ｈｔｔｐ：／／ｎｂｃｒ−２２２．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／ｐｄｂ２ｐｑｒ＿２．０．０／）を用いて予測し、これらが実際に当該構造内で正電荷を帯びているという事実を検証した（図９のＣ、ＤおよびＦ）。
【０１０４】
次いで行ったＴｌｉＤの相同性基盤構造予測モデルで、このタンパク質の二量体（ｄｉｍｅｒ）はその通路内部面に正電荷分布を有することが確認された（図９のＡおよび図９のＢ）。この予測モデルは、配列同一性が４０．９８％に達するＡｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ  ＰｒｔＤ（ＰＤＢ  ＩＤ  ５ｌ２２）を鋳型にして製作された。また、ＴｌｉＤのＣｏｎＳｕｒｆ同族体保存性分析は、チャネルの中間部分にあるこの正電荷分布が実際に進化的に保存されたものであるのを示した（図９のＣおよびＤ）。また、ＴｌｉＤの基質進入入口を形成する折れたアルファ螺旋には、入口の孔側に突出してＴｌｉＤのＡＤＰ結合状態で基質進入入口を遮断する正に帯電された残基があり、ＣｏｎＳｕｒｆ結果から見る時、また５０個の全ての同族体でこの位置にアルギニンまたはライシンがあったため、この残基の正電荷が保存されるのを確認することができた（図９のＣ、黒い矢印）。本発明者らは、この正電荷を帯びた通路の内部表面がタンパク質輸送中に貨物タンパク質の負電荷残基と相互作用して分泌を促進すると推定する（図９のＥ）。
【０１０５】
図９は、ＴｌｉＤＥＦ複合体のＡＢＣタンパク質であるＴｌｉＤ構造の電荷分布を示す。（Ａ）ＴｌｉＤ単量体の電子反発表面（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  ｒｅｐｕｌｓｉｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅ）を示し、表面電位によって青色（＋７ｋＢＴ／ｅ）から赤色（−７ｋＢＴ／ｅ）まで色を指定した。高度の正電荷を帯びている中心通路（ｃｈａｎｎｅｌ）の内部表面は上段の円で表示された。（Ｂ）リボンモデル（ｒｉｂｂｏｎ  ｍｏｄｅｌ）で提示された単量体のうちの一つである、ＴｌｉＤ同種二量体（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）を示す。中心通路の正電荷を帯びた内部表面は上段の円で、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｅｎｔｒｙ  ｗｉｎｄｏｗは下段の円で表示された。（Ｃ）Ｔｌｉｄ、チャネルの内部表面の中間地点にある保存された正電荷クラスター（ｃｌｕｓｔｅｒ）は円で表示した。また、Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｅｎｔｒｙ  ｗｉｎｄｏｗを形成する二つのα−螺旋は楕円で表示した。当該螺旋に含まれている二つの保存された正電荷残基の中で、Ａｒｇ３１６（黒い矢印）は気孔の外に突出している。（Ｄ）周辺細胞質側から見たＴｌｉＤ二量体を示す。負電荷がチャネル（ｃｈａｎｎｅｌ）の外にある反面、正電荷はチャネル（黄色円）の中間に位置する。（Ｅ）ＬＡＲＤ３が付着された高度の負電荷に荷電された組換えポリペプチドを運搬するＴｌｉＤ二量体の図式モデルを示す。ＮＢＤ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ）およびＴｉＤのｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ（ＴＭＤ）をこれによって分類した。内膜（ＯＭ）を貫通する電位は−１５０ｍＶであり、細胞質（ＣＰ）は周辺細胞質（ＰＰ）よりさらに負電荷を帯びた。この電位差は、正電荷を帯びるタンパク質よりさらに外側に運搬された負に荷電されたタンパク質を輸送することをさらに有利にする。
本発明者らはパイモルソフトウェアで結果を視覚化し、分析に使用した全てのシークエンスは表２および表３に示した。
【０１０６】
［実施例６］組換えタンパク質の分泌およびｐＩの交差分析
多様な大きさ、柔軟性、体積、重量などを有する１３個の目標タンパク質の遺伝子（表４）にｐＤＡＲＴを通じてＣ−末端ＬＡＲＤ３信号配列を付着してＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓΔｔｌｉＡΔｐｒｔＡに導入した。表４は遺伝子のリストとこれらの出所を示し、＊で表示した遺伝子は本実験では使用しなかったが、以前の研究で分泌された遺伝子を示す。その後、当該細胞を液体培養した後、上清と細胞ペレットをウェスタンブロットで分析した（図１ａおよび図１ｂ）。
【０１０７】
【表４】
2020533980.tif 000012
2020533980.tif 000013
【０１０８】
図１ａおよび１ｂに示したように、この中のＭａｎｎａｎａｓｅ、ＭＢＰ、ＮＫＣ−ＴｌｉＡ、ＥｇｌＶ、ＧＦＰおよびｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎは細胞ペレットと上清の両方で検出可能であって、細胞外培地で成功的な発現および分泌を示した。しかし、ＭＡＰ、ｃｕｔｉｎａｓｅ、ｃｈｉｔｉｎａｓｅ、ｃａｐｓｉｄ、Ｈｓｐ４０およびＣＴＰ−ＴｌｉＡは細胞ペレットでは検出されたが、上清では検出されず、これはこれらが分泌されなかったということを意味する。
【０１０９】
図１ａおよび図１ｂは、選択されたタンパク質の分泌を確認したものであって、目的タンパク質の発現および分泌を示すウェスタンブロットイメージを示す。細胞サンプルは、細胞質と上清サンプルに残っているタンパク質の量が細胞外空間に限定されるタンパク質の量を示す。比較のために、細胞抽出物と培養上清の当量（１６ｍＬ）をゲルにローディングし、ウェスタンブロットを通じて分析した。５０ＮＧ  ＴｌｉＡは基準としてゲルの中間に積載した。他の二つの互いに異なるウェスタンブロットは、異なる培養サンプルから収得した。その他提示していない結果の全てが類似のパターンを示した。下記イメージは、ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  Ｎｅｏ、ｔｈｅ  ｎｅｏｍｙｃｉｎ／ｋａｎａｍｙｃｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ２  ｐｒｏｔｅｉｎに対する一次抗体を有する同一なサンプルのウェスタンブロット結果である。カプシド（ｃａｐｓｉｄ）を除いた全てのサンプル内で非特異的な溶解または漏出を最少化した。
【０１１０】
前記分泌されなかったタンパク質は比較的に高い理論的ｐＩを有した。これら全ては（一つの例外はＣＴＰ−ＴｌｉＡ）ｐＩが〜５．５以上であり、正電荷を帯びているか、微細な負電荷を帯びた。一方、分泌タンパク質は相対的に非常に強い酸性ｐＩを有しており、そのｐＩも５．５（図２ａおよび２ｂ）を超過しなかった。
【０１１１】
図２ａおよび２ｂは、ターゲットタンパク質の分泌率およびこれらの等電点の間の相関関係を示す。目的タンパク質のｐＩ値は付着されたＬＡＲＤ３を含む配列から計算した。分泌されなかったタンパク質は赤色棒で示した。ＡＰ、ＥＧＦおよびＰＬＡ１以前の研究で分泌されると明らかになったものである。図２ｂはＳｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅをｐＩに追加した。百分率値は、上澄み液信号を上澄み液と細胞信号の合計で割ることによって計算した。図１の実験の三つの互いに異なる生物学的複製（独立培養サンプル）は定量分析に使用した。二つの分泌されない二つの高度に特異な特異タンパク質であるＭＡＰ（ＰＩ＝９．６１）およびカプシド（＝９．２５）はプロットから除外した。タンパク質等電点とこれらの％分泌の間には負の相関関係があった。
【０１１２】
図１ｂと図２ｂから分かるように、ＮＫＣ−ＴｌｉＡおよびＣＴＰ−ＴｌｉＡの分泌は本来のＴｌｉＡの分泌と比較した時、劇的に減少した。これらはＴｌｉＡの誘導体であって、Ｎ−末端に短いながらも非常に強い正電荷を帯びた配列が付着されている（表２）。ＣＴＰ−ＴｌｉＡは全く分泌されなかった。ＣＴＰは、表２に示したように、中間にアラニン一つが入ったことを除けばひたすらアルギニンのみから構成された、非常に正電荷を帯びる短い配列（ＲＲＡＲＲＲＲＲＲ）を有しているという事実を留意しておく必要がある。
【０１１３】
次いで、タンパク質のウェスタン信号の強度を定量した後、本発明者らはタンパク質の分泌量対発現されたタンパク質の総量の百分率をｐＩと対比してプロット（ｐｌｏｔ）し、その結果を図２ｂに示した。
図２ｂに示したように、タンパク質ｐＩと分泌効率間には弱い否定的相関関係があると見られるが、いくつかの例外もあることが確認された。
【０１１４】
［実施例７］ｌｕｎａｓｉｎとその誘導体分析
ｌｕｎａｓｉｎは、大豆Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘから分離された抗癌ペプチドである。このタンパク質は、カルボキシル末端に９個の連続したアスパラギン酸（ａｓｐａｒｔｉｃ  ａｃｉｄ、Ａｓｐ）配列があるという独特の特徴を有している。本発明者らはこれに霊感を受けて、アスパラギン酸ポリペプチド尾の長さが互いに異なるｌｕｎａｓｉｎの誘導体を複数個製造した。
【０１１５】
その後、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓにｐＤＡＲＴを使用してｌｕｎａｓｉｎおよびその誘導体を導入し、これらの発現および分泌をウェスタンブロットを通じて観察し、その結果を図３ａおよび図３ｂに示した。
【０１１６】
図３ａおよび図３ｂは、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ発現と分泌システム内でｏｌｉｇｏ−アスパラギン酸配列の最適長さを決定するために、Ｌｕｎａｓｉｎとｏｌｉｇｏ−アスパラギン酸尾の長さが互いに異なるＬｕｎａｓｉｎの誘導体をＬＡＲＤ３付着を経由して発現し分泌を確認した結果である。
【０１１７】
図３ａは、細胞と上清でＬｕｎａｓｉｎとその誘導体の発現はウェスタンブロッティングを通じて検出し、具体的に細胞抽出物および上清３６μＬ当量をゲルにローディングし、ウェスタンブロットを通じて分析した。図３ｂは、アスパラギン酸尾の長さが変形されたｌｕｎａｓｉｎおよびその誘導体のタンパク質配列およびドメイン構造を示し、それぞれをｌｕｎａｓｉｎ−Ｄ０、ｌｕｎａｓｉｎ−Ｄ５、ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｌｕｎａｓｉｎ（Ｄ９）、ｌｕｎａｓｉｎ−Ｄ１５およびｌｕｎａｓｉｎ−Ｄ２０と命名した。
【０１１８】
図３ａに示したように、本来のｌｕｎａｓｉｎが最も分泌効率が高く、アスパラギン酸ポリペプチド尾の長さが減少するに連れて、分泌されたタンパク質の相対的比率が減少した。本発明者らはまた、ｌｕｎｎａｓｉｎ−Ｄ１５で分泌および発現水準の減少するのを観察した。Ｌｕｎａｓｉｎ−Ｄ２０は、細胞または上清で観察されなかった。ｌｕｎａｓｉｎポリペプチドおよびその誘導体の正確な配列は図３ｂに示した。
【０１１９】
この実験に基づいて、本発明者らはＡＢＣ輸送体を通じた分泌においてアスパラギン酸ポリペプチド配列の最適長さが約９程度であろうと決定し、下記追加実験を行った。
【０１２０】
［実施例８］アスパラギン酸ポリペプチドを添加したｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０の製作
２０個の最も普遍的なアミノ酸の中で、アスパラギン酸は最低ｐＫａ値を有する（Ｍａｔｈｅｗｓ、Ｃ．Ｋ．（２０１３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４ｔｈ  ｅｄ．、Ｐｅａｒｓｏｎ、Ｔｏｒｏｎｔｏ）。前記実施例７でのｌｕｎａｓｉｎタンパク質配列によって霊感を受けて、本発明者らはＬＡＲＤ３信号配列だけでなくアスパラギン酸ポリペプチド配列も共に付着させる二つのプラスミドを開発した。
【０１２１】
本発明者らは、ｌｕｎａｓｉｎ遺伝子のアスパラギン酸ポリペプチド尾のＤＮＡ配列に基づいてアスパラギン酸１０個重合体（ｄｅｃａｍｅｒ）をコーディングするＤＮＡ配列を合成した後、Ｄ１０（ＤＤＤＤＤＤＤＤＤＤ：配列番号３３）と命名した。その後、本発明者らはこのＤ１０遺伝子をｐＤＡＲＴプラスミドに挿入してそれぞれＭＣＳに挿入された遺伝子のＮ末端とＣ末端側にＤ１０を付着する二つのプラスミド（それぞれｐＦＤ１０とｐＢＤ１０と命名）を製造し、これを図４に示した。
【０１２２】
図４は、使用したプラスミドの構造を示し、ＭＣＳを含むｐＤＡＲＴプラスミドの構造を示す。ｔｌｉＤ、ｔｌｉＥ、ｔｌｉＦおよびＬＡＲＤ３が融合されたタンパク質は単一オペロンに制御される。（Ａ）の場合、ＭＣＳ直後にＬＡＲＤ３遺伝子が位置するため、挿入された目的遺伝子はＣ−末端に付着されているＬＡＲＤ３と共に発現される。（Ｂ）Ｎ−末端にＤ１０配列が付着されているプラスミドであるｐＦＤ１０の構造を示す。Ｄ１０遺伝子は、開始コドンに直接後続し、ＭＣＳとＬＡＲＤ３の直前に位置する。（Ｃ）Ｃ末端に位置するが、ＬＡＲＤ３以前にＤ１０配列を付着させるｐＢＤ１０プラスミドの構造を示す。Ｄ１０遺伝子は、ＭＣＳとＬＡＲＤ３の間に位置する。
【０１２３】
その次に、選択されたタンパク質を新たに製造したプラスミドであるｐＦＤ１０とｐＢＤ１０に挿入した。前記ｐＦＤ１０またはｐＢＤ１０に挿入された遺伝子をｐＤＡＲＴに挿入されたバージョンと共にＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに導入し、これらの分泌効率をウェスタンブロットを通じて共に分析した。
【０１２４】
［実施例９］ＴｌｉＡ由来組換えタンパク質をｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０に挿入
ＮＫＣ−ＴｌｉＡおよびＣＴＰ−ＴｌｉＡは両方ともＴｌｉＡの誘導体であり、それぞれのＮ−末端には塩基性ペプチドが付着されている。ＴｌｉＤＥＦを通じた分泌効率は野生型ＴｌｉＡ（図１ｂおよび図１０ａ、ｂ）より顕著に低い。
【０１２５】
図１０ａはＴｌｉＡ、ＣＴＰ−ＴｌｉＡおよびＮＫＣ−ＴｌｉＡの酵素プレート分析結果を示し、ＴｌｉＡは予想通り分泌された（ＴｌｉＡは、ＴｌｉＤＥＦ運搬者に対する天然基質である）。しかし、ＣＴＰ−ＴｌｉＡの分泌は遮断され、ＮＫＣ−ＴｌｉＡの分泌はＴｌｉＡより多少弱く示された。
【０１２６】
図１０ｂはＴｌｉＡ、ＣＴＰ−ＴｌｉＡ、ＮＫＣ−ＴｌｉＡのウェスタンブロット結果を示し、酵素プレート分析から分かるように、ＴｌｉＡは強く分泌され、ＮＫＣ−ＴｌｉＡは弱く分泌され、ＣＴＰ−ＴｌｉＡは分泌されなかった。ＮＫＣは非常に大きい正電荷を有し、ＣＴＰはそれよりさらに大きい正電荷を有した。ＣＴＰは中間にただ一つの例外としてアラニンを有するだけであり、アルギニンのみから構成された連続的な９個の残基を有している。
【０１２７】
しかし、ｐＦＤ１０またはｐＢＤ１０によるアスパラギン酸ポリペプチド付着時、ＮＫＣ−ＴｌｉＡとＣＴＰ−ＴｌｉＡの分泌が再び増加した。前記実験結果を図５に示した。
【０１２８】
図５は、ＮＫＣとＣＴＰ配列がそれぞれ付着されたＴｌｉＡリパーゼ二種類（ＮＫＣ−ＴｌｉＡ、ＣＴＰ−ＴｌｉＡ）のＮ−末端部（ＦＤ１０）とＣ−末端部（ＢＤ１０）にアスパラギン酸１０個を追加してｐＤＡＲＴプラスミドを通じて発現させた後、ウェスタンブロットおよびリパーゼ活性度測定培地で検出した結果を示す。
【０１２９】
図５の（Ａ）で、分泌はｐＤＡＲＴと比較してｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０の両方で大きく向上した。（Ｂ）は他のプラスミドでのＮＫＣ−ＴｌｉＡ酵素プレート分析結果を示し、（Ｃ）はｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０でのＣＴＰ−ＴｌｉＡのウェスタンブロット結果であり、ｐＢＤ１０で分泌が大きく増加するのを確認した。（Ｄ）は他のプラスミドでのＣＴＰ−ＴｌｉＡ酵素プレート分析結果を示す。ｐＢＤ１０で分泌が大きく増加することが分かる。二つの互いに異なるウェスタンブロット結果は互いに異なる培養サンプルから得たものであるが、類似のパターンを示した。二つの異なる酵素プレート分析法は異なるコロニーから収得し、これら全てが類似のパターンを示した。
【０１３０】
分泌比率（分泌されたタンパク質ｖｅｒｓｕｓ細胞内タンパク質）の観点から、ＮＫＣ−ＴｌｉＡは図５の（Ａ）および（Ｂ）に示したように、上流または下流のうちの一つにＤ１０が付着された後、分泌が劇的に増加した。
【０１３１】
ＣＴＰ−ＴｌｉＡの場合、図５の（Ｃ）および（Ｄ）に示したように、ｐＢＤ１０によって下流にＤ１０配列が追加された時、ウェスタンブロットおよび活性分析プレートの両方で急激な分泌増加を示した。酵素プレート活性実験で、ｐＤＡＲＴまたはｐＢＤ１０に挿入されたＮＫＣ−ＴｌｉＡおよびＣＴＰ−ＴｌｉＡのハロー（ｈａｌｏ）大きさは一般にそれぞれのウェスタンブロッティング結果で上清サンプルのバンド強度と一致する。しかし、ｐＦＤ１０はこれらのバンド強度から期待されるものより若干さらに小さなハローを有し、これは酵素活性の減少可能性を示す。
【０１３２】
［実施例１０］負電荷を帯びたタンパク質のｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０挿入
緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、マンナナーゼ（Ｍａｎｎａｎａｓｅ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、およびチオレドキシン（Ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）遺伝子をｐＤＡＲＴ、ｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０に導入して得られた組換えプラスミドをＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに導入して形質転換されたタンパク質を製造した。生成されたタンパク質はＴｌｉＤＥＦ輸送体によって分泌され、前記実験結果を図６に示した。
【０１３３】
図６は、負に荷電されたタンパク質のｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０での分泌を示す。（Ａ）ＧＦＰのウェスタンブロット結果を示し、ｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０の両方とも上清でタンパク質分泌の増加を示す。（Ｂ）Ｍａｎｎａｎａｓｅのウェスタンブロット結果を示し、Ｍａｎｎａｓｅ分泌において二つのｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０の両方ともが少しずつ増加した。（Ｃ）ＭＢＰのウェスタンブロット結果を示し、分泌率の増加がｐＦＤ１０とｐＢＤ１０の両方で観察された。（Ｄ）ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎのウェスタンブロット結果を示し、信号は全体的に弱かったが、ｐＦＤ１０とｐＢＤ１０の両方で分泌が増加した。全般的にｐＢＤ１０でさらに負に荷電されたタンパク質のバンドは若干上側に移動した位置で現れた。ｐＤＡＲＴとｐＢＤ１０に対する三つの互いに異なるウェスタンブロット結果は異なる培養サンプルから得られ、反面、ｐＤＡＲＴとｐＦＤ１０に対する二つの互いに異なるウェスタンブロット結果がある。これら全ては類似のパターンを示した。
【０１３４】
図６に示したように、分泌の増加において、ＧＦＰで最も大きい増加を示した。ｐＤＡＲＴとｐＢＤ１０に挿入されたＧＦＰのバンド強度の比較は、上清対発現比率の顕著な変化を示した。ｐＦＤ１０−ＧＦＰは、上清と細胞ペレットの比率の観点から、分泌が少しだけ改善された（図６の（Ａ））。
【０１３５】
Ｍａｎｎａｎａｓｅの場合は多少曖昧であったが、ｐＢＤ１０−ＭａｎｎａｎａｓｅはｐＤＡＲＴ−Ｍａｎｎａｎａｓｅより優れた分泌を示すという結論を得ることができた。また、ｐＦＤ１０によって上流にＤ１０配列が添加された時、絶対発現量自体は低下するが、分泌比率自体は向上した（図６の（Ｂ））。
ＭＢＰの分泌もｐＤＡＲＴに比べて上清／細胞比率の観点から見る時、ｐＦＤ１０およびｐＢＤ１０で全て向上した（図６の（Ｃ））。
Ｔｒｘ（チオレドキシン）の場合、上清／細胞信号強度比率がｐＦＤ１０とｐＢＤ１０の両方で改善された（図６の（Ｄ））。
【０１３６】
結果的に、ウェスタンブロット結果、Ｎ−末端部やＣ−末端部にアスパラギン酸が追加されたタンパク質は細胞外（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）対細胞内（Ｃｅｌｌ）のタンパク質濃度比率が高まり、ＦＤ１０の場合、発現量が大幅減少するパターンを示すのを確認した。
【０１３７】
［実施例１１］正電荷を帯びたアミノ酸ポリペプチドの添加−ｐＢＲ１０の製作および分析
本発明者らは追加的に、ｐＢＤ１０と類似しているが、一つ差異点を有するプラスミドを製作した。このプラスミドは、ＭＣＳの次にアスパラギン酸ポリペプチドをコーディングするＤ１０の代わりにアルギニンポリペプチドをコーディングするＤＮＡ配列であるＲ１０が導入されている。
【０１３８】
本発明者らはＴｌｉＡとＧＦＰ遺伝子をｐＤＡＲＴ、ｐＢＤ１０、ｐＢＲ１０プラスミドに挿入し、酵素活性培地（これはＴｌｉＡのみ）とウェスタンブロットを通じて分泌を検査し、その結果を図７に示した。
【０１３９】
図７は、ＴｌｉＡリパーゼと緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＣ−末端部にそれぞれアスパラギン酸（Ｄ）１０個またはアルギニン（Ｒ）１０個を追加した後にウェスタンブロットとリパーゼ活性培地で検出した結果を示す。二つの負電荷タンパク質、ＴｌｉＡとＧＦＰを信号配列（ｐＤＡＲＴ）、ｏｌｉｇｏ−ａｓｐａｒｔａｔｅ（ｐＢＤ１０）およびｏｌｉｇｏ−ａｒｇｉｎｉｎｅ（ｐＢＲ１０）以外には何も付着しないプラスミドに挿入した。図７のＡは、前記プラスミドでのＴｌｉＡのウェスタンブロット結果を示す。ｐＤＡＲＴおよびｐＢＤ１０のＴｌｉＡは優れた分泌を示す。しかし、Ｒ１０が付着された場合、分泌が遮断された。図７のＢは、前記プラスミドでのＴｌｉＡ酵素プレート分析結果を示す。ＴｌｉＡ分泌は、ｐＢＲ１０が挿入された時、遮断された。図７のＣは、前記プラスミドでのＧＦＰのウェスタンブロット結果を示す。これと同様に、ｐＤＡＲＴとｐＢＤ１０は優れた分泌性を示した反面、Ｒ１０が付着された時の分泌が遮断された。
【０１４０】
ＴｌｉＡのウェスタンブロットで、ｐＤＡＲＴおよびｐＢＤ１０は良好な分泌効率を示したが、ｐＢＲ１０は分泌が減少した（図７のＡ）。類似のパターンがプレート酵素分析でも観察され、ｐＢＲ１０はハローを示さなかったが、他の二つは示した（図７のＢ）。ＧＦＰのウェスタンブロットで、ｐＤＡＲＴおよびｐＢＤ１０の両方とも分泌されることが確認されたが、ｐＢＲ１０はＴｌｉＡと同様にＧＦＰの分泌が遮断された（図７のＣ）。
【０１４１】
［実施例１２］過電荷化されたタンパク質のウェスタンブロット分析
緑蛍光タンパク質（ＧＦＰ）とＡｖｅｒａｇｅ  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒｉｎｇ  Ａｔｏｍｓ  Ｐｅｒ  Ｓｉｄｅｃｈａｉｎ  Ａｔｏｍ（ＡｖＮＡＰＳＡ）（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＭＳ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＫＪ、Ｌｉｕ  ＤＲ．Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｃａｎ  Ｉｍｐａｒｔ  Ｕｎｕｓｕａｌ  Ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００７；１２９：１０１１０−１０１１２）方式で前記タンパク質を過電荷化（Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ）させたＧＦＰ誘導体であるＧＦＰ（−３０）とＧＦＰ（＋３６）をｐＤＡＲＴを通じてＬＡＲＤ３と結合させ、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓΔｔｌｉＡΔｐｒｔＡに導入してタンパク質を発現させた後、サンプルをウェスタンブロットで分析し、その結果を図８に示した。
【０１４２】
図８は、ＧＦＰと過電荷化されたＧＦＰｓの分泌を示す。過負電荷化されたＧＦＰ（−３０）は細胞外（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）対細胞内（Ｃｅｌｌ）のタンパク質濃度比率が確実に高まり、本来のＧＦＰより顕著に高い分泌率を示した。
【０１４３】
反面、過正電荷化されたＧＦＰ（＋３６）は細胞内で高濃度に検出された反面、細胞外（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）には全く検出されなかった。たとえ過電荷化ＧＦＰｓのバンドは若干上側に移動したが、互いに異なる培養標本から互いに異なる二つのウェスタンブロット結果が得られ、これらは全て類似のパターンを示した。
【０１４４】
図８から分かるように、ＧＦＰとＧＦＰ（−３０）は細胞ペレットと上清で全て検出され、これは前記タンパク質が発現された後、効果的に細胞外空間に分泌されたのを意味する。ここで、ＧＦＰ（−３０）は元来のＧＦＰより上清に一層強く発現されたのを確認することができた。
【０１４５】
反面、ＧＦＰ（＋３６）は細胞ペレットに限定されて強く発現され、細胞外空間に分泌されなかった。このような組換えタンパク質のｐＩ値は、ＧＦＰ（−３０）の場合に４．６４、操作されなかったＧＦＰの場合に５．３６、ＧＦＰ（＋３６）の場合に１０．４２であった。
【０１４６】
［実施例１３］タンパク質分泌効率を高める最適リンカー長さ確
Ｍｏｄｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎとしてＮＫＣ−ＴｌｉＡ選定した。ＮＫＣは２１個のアミノ酸から構成されており、両親媒性（ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ）α−ｈｅｌｉｘを形成するｐｅｐｔｉｄｅである。２１個のアミノ酸はＬｙｓｉｎｅを多く含んでおり、ｐＩ＝１０．７８であってｐＩ＝５．０１のＴｌｉＡ  ｌｉｐａｓｅにｆｕｓｉｏｎされてＮＫＣ−ＴｌｉＡを作ればｐＩ＝５．３４になり、タンパク質の分泌が減る。
【０１４７】
本発明者らはＮＫＣタンパク質のＬｙｓｉｎｅを全てＡｓｐａｒｔａｔｅで置換（ＮＫＣ（−））して分泌程度を確認し、これと共にＮＫＣ（−）とＴｌｉＡに様々な長さのｌｉｎｋｅｒを連結させて様々なリンカー長さを通じてＮＫＣ（−）の分泌効率をウェスタンブロットと活性分析プレートを通じて比較し、その結果を図１５に示した。Ｌｉｎｋｅｒの長さは何もないＮＫＣ（−）からＧＧＧＧＳが一つ入ったＬ１、２つ入ったＬ２、３個入ったＬ３と示した。
【０１４８】
図１５は、ＴｌｉＡ、ＮＫＣ（−）、ＮＫＣ−Ｌ１、ＮＫＣ−Ｌ２、ＮＫＣ−Ｌ３、ＮＫＣ−ＴｌｉＡでのタンパク質分泌を示す。図１５の（Ａ）はＴｌｉＡのウェスタンブロット結果であり、図１５の（Ｂ）は他のｐｌａｓｍｉｄｓでのＴｌｉＡの酵素プレート分析結果を示す。
【０１４９】
図１５の（Ａ）のウェスタンブロット結果、一番右側のＮＫＣ−ＴｌｉＡの場合は全く分泌がされないが、Ｌｙｓｉｎｅを全てＡｓｐａｒｔａｔｅで置換したＮＫＣ（−）および負電荷ＮＫＣにｌｉｎｋｅｒを付着したタンパク質は分泌が顕著に増加するのを確認することができた。
【０１５０】
図１５の（Ｂ）の活性分析プレート結果によれば、既存ＮＫＣよりＮＫＣ（−）でタンパク質の分泌が増加し、リンカーが導入された時に分泌が全般的に増加し、特にリンカー３個が付着された場合に分泌が顕著に増加するのを確認することができた。この結果を通じて負電荷を帯びたＮＫＣがタンパク質の分泌を増加させることが分かった。
【０１５１】
［実施例１４］負電荷ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅのタンパク質分泌増加確認
本発明者らは、タンパク質の電荷を変えて分泌効率が変わることを確認するためにタンパク質のアミノ酸を負電荷を帯びたアミノ酸で置換してタンパク質の分泌傾向を観察した。
【０１５２】
このために、ストレプトアビジン（ＳＡＶ）ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅタンパク質から負電荷ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅ価−１０と正電荷ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅ価＋１３を作り、これと同様にグルタチオンＳ−伝達酵素（ＧＳＴ）も負電荷ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅ価−２０と正電荷ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅ価＋１９電荷を帯びたｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅタンパク質を作ってタンパク質の分泌を分析し、その結果を下記図１６に示した。
【０１５３】
図１６は、−１０ＳＡＶ、ｗｔＳＡＶ、＋１３ＳＡＶおよび−２０ＧＳＴ、ｗｔＧＳＴ、＋１９ＧＳＴの分泌有無の分析結果を示す（ＳＡＶ：ｓｔｒｅｐｔｏａｖｉｄｉｎ／ＧＳＴ：ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）。ＳＡＶ（１３５ａａ）は四量体を作り、ＧＳＴ（２１５ａａ）は二量体を作る。遺伝子合成で単量体の電荷を計算した（−１０ＳＡＶ：ｐＩ４．９６／ｗｔＳＡＶ：ｐＩ６．７６／＋１３ＳＡＶ：ｐＩ１０．２９／−２０ＧＳＴ：ｐＩ４．７３／ｗｔＧＳＴ：ｐＩ７．８６／＋１９ＧＳＴ：ｐＩ９．８７）。
【０１５４】
図１６に示したように、負電荷ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅタンパク質は細胞にも多く存在し分泌もよく行われるのを確認することができたが、ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅタンパク質と正電荷ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅタンパク質は発現および分泌が行われないことが分かり、負電荷ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅがタンパク質の分泌を高めることを確認した。
【０１５５】
これと同様に、ＡｖＮＡＰＳＡ方式を使用せず任意に構造を見ながら突出したアミノ酸をアスパラギン酸またはアルギニンに交替して過電荷化させたグルタチオンＳ−伝達酵素（ＧＳＴ）とストレプトアビジン（ＳＡｖ）をｐＤＡＲＴに入れて発現させウェスタンブロットを行い、その結果を図１７に示した。
【０１５６】
図１７から分かるように、過負電荷化されたタンパク質（赤色で表示）は細胞外（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）対細胞内（Ｃｅｌｌ）のタンパク質濃度比率が確実に高まったのを確認することができる。反面、過正電荷化されたタンパク質は細胞内で非常に高濃度に検出された反面、細胞外（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）では全く検出されないか、低濃度のみ検出された。
【０１５７】
［実施例１５］ＡｖＮＡＰＳＡ方法を用いた過負電荷化したタンパク質の細胞外分泌増加確認
ＭｅｌＣ2チロシナーゼ、クチナーゼ（Ｃｕｔｉ）、キチナーゼ（Ｃｈｉ）、そしてＭ３７リパーゼをＡｖＮＡＰＳＡ方法で過負電荷化させた後、過負電荷化されたタンパク質（赤色）とそれに対応する過電荷化されなかった自然タンパク質（黒色）をそれぞれｐＤＡＲＴプラスミドに入れて発現させウェスタンブロットで検出し、その結果を図１８に示した。
【０１５８】
具体的に、ＡｖＮＡＰＳＡを用いた過負電荷化方法は次の通りである。まず、ＡｖＮＡＰＳＡアルゴリズム（１．Ｌａｗｒｅｎｃｅ  ＭＳ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＫＪ、Ｌｉｕ  ＤＲ．Ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｃａｎ  Ｉｍｐａｒｔ  Ｕｎｕｓｕａｌ  Ｒｅｓｉｌｉｅｎｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ２００７；１２９：１０１１０−１０１１２）でアスパラギン酸とグルタミン酸が適正な位置に置換されて入って過負電荷化が成されたタンパク質配列を得た。その後、該当タンパク質配列に対応するＤＮＡ配列を合成し、この合成されたＤＮＡ配列をｐＤＡＲＴプラスミドに入れた後、過負電荷化されたタンパク質を製造した。
【０１５９】
過負電荷化されたタンパク質は、細胞外では全く検出されなかった自然タンパク質と異なり、細胞内部（Ｃ）だけでなく細胞外部（Ｓ）でも非常に高濃度に観測され、分泌が確実に増強されたのを確認することができる。ＭｅｌＣ２チロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）タンパク質の場合、Ｈｉｓ−ｔａｇをはじめとする若干の配列差によって過電荷化されたタンパク質と自然タンパク質間に大きさの差が少量存在する。
【０１６０】
即ち、前記実験を通じて本発明者らは、既存の技術では分泌生産法が適用不可能であったチロシナーゼ（Ｔｙｒｏｓｉｎａｓｅ）、クチナーゼ（Ｃｕｔｉｎａｓｅ）などのタンパク質をＡｖＮＡＰＳＡアルゴリズムを用いて過電荷化させることによって既存の分泌されなかったタンパク質を相当な効率で細胞外分泌させることができるのを確認した。
【０１６１】
［実施例１６］三種類の互いに異なる細菌から分離したＴ１ＳＳ輸送体を発現した細胞でＴｌｉＡタンパク質分泌確認
１６−１．Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨｌｙＢＤ＋ＴｏｌＣ、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ  ＰｒｔＤＥＦ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡｐｒＤＥＦ分離
【０１６２】
本発明者らは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＣＦＴ０７３菌株の分離されたゲノム（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＥ０１４０７５）からＨｌｙＢ、ＨｌｙＤ遺伝子が含まれているオペロンの特定の部分をｈｌｙＢＤ−ｓ（配列番号３４：ＧＧＧＧＡＧＣＴＣＧＧＡＴＴＣＴＴＧＴＣＡＴＡＡＡＡＴＴＧＡＴＴ）、ｈｌｙＢＤ−ａ（配列番号３５：ＧＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＡＡＣＧＣＴＣＡＴＧＴＡＡＡＣＴＴＴＣＴ）の二つのプライマーを使用したＰＣＲを通じて増幅させ、これをｐＳＴＶプラスミド（ｐＡＣＹＣプラスミドの誘導体のうちの一つ）に各菌株のゲノムから輸送体遺伝子をそれぞれＰＣＲで増幅して開始コドン（Ｓｔａｒｔ  Ｃｏｄｏｎ）およびコザック配列（Ｋｏｚａｋ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）と共に順次に挿入したプラスミドｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤを製作した。ＨｌｙＢ、ＨｌｙＣと共に輸送体を成すＴｏｌＣは大腸菌が自主的に生産するため別途に含まなかった。
【０１６３】
また、本発明者らは、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉのＰｒｔＤ、ＰｒｔＥ、ＰｒｔＦの三つの遺伝子を発現させるプラスミドであるｐＥｃＰｒｔＤＥＦ（Ｄｅｌｅｐｅｌａｉｒｅ  Ｐ、Ｗａｎｄｅｒｓｍａｎ  Ｃ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｒａｍ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａ．Ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｂ  ｆｒｏｍ  Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ  ｃｏｎｔａｉｎｓ  ａ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ａｎａｌｏｇｏｕｓ  ｔｏ  ｔｈａｔ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｌｐｈａ−ｈｅｍｏｌｙｓｉｎ。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９０；２６５：１７１１８−１７１２５）とＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＡｐｒＤ、ＡｐｒＥ、ＡｐｒＦの三つの遺伝子を発現させるｐＡＧＳ８（Ｄｕｏｎｇ  Ｆ、Ｓｏｓｃｉａ  Ｃ、Ｌａｚｄｕｎｓｋｉ  Ａ、Ｍｕｒｇｉｅｒ  Ｍ．Ｔｈｅ  Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｌｉｐａｓｅ  ｈａｓ  ａ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌ  ａｎｄ  ｉｓ  ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｔｈｒｅｅ−ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ＡＢＣ−ｅｘｐｏｒｔｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９４；１１：１１１７−１１２６）を準備した。
【０１６４】
１６−２．三種類の互いに異なる細菌から分離したＴ１ＳＳ輸送体を発現した細胞でタンパク質分泌確認
本発明者らは、ｐＱＥ１８４プラスミドにＴｌｉＡタンパク質（ＴｌｉＤＥＦ輸送体の本来基質）の遺伝子を挿入したプラスミド一つと前記で製作した三種類の互いに異なる細菌から分離されたＴ１ＳＳ輸送体のうちの一種類を発現するプラスミド（即ち、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨｌｙＢＤを発現するｐＳＴＶ−ＨｌｙＢＤ、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ  ＰｒｔＤＥＦを発現するｐＥｃＰｒｔＤＥＦ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡｐｒＤＥＦを発現するｐＡＧＳ８）のうちの一つを大腸菌に同時に熱衝撃法（Ｈｅａｔ  Ｓｈｏｃｋ  Ｍｅｔｈｏｄ）で導入してＴｌｉＡと三つの輸送体のうちの一つを同時発現させた後、リパーゼ酵素活性測定培地で細胞外部への組換え目的タンパク質の分泌程度をコロニー周辺部培地の色変化を通じて測定し、その結果を図１９に示した。
【０１６５】
図１９に示したように、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨｌｙＢＤ＋ＴｏｌＣ（大腸菌が本来ＴｏｌＣタンパク質を発現させる）、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ  ＰｒｔＤＥＦ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡｐｒＤＥＦの三つの輸送体全てＴｌｉＡタンパク質を成功的に分泌させるのを確認することができた。これは大腸菌で輸送体タンパク質の追加発現なく（空のｐＡＣＹＣプラスミドをその代わりに入れる）ＴｌｉＡタンパク質のみを発現させた菌株（ＴｌｉＡ  ｏｎｌｙ）ではｈａｌｏが観測されないという事実から類推することができる。前記結果からシュードモナス・フルオレセンス以外のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａのＴ１ＳＳタンパク質がＴｌｉＡのＬＡＲＤ３信号配列を認識することができるということを意味する。
【０１６６】
［実施例１７］三種類の互いに異なる細菌から分離したＴ１ＳＳ輸送体を発現した細胞でクチナーゼタンパク質分泌確認
１７−１．過負電荷化したクチナーゼタンパク質製造
クチナーゼ（Ｃｕｔｉｎａｓｅ）タンパク質（Ｃｕｔｉ）にＡｖＮＡＰＳＡ方法を使用して過負電荷化されたクチナーゼタンパク質（Ｃｕｔｉ（−））を製造した。
【０１６７】
１７−２．三種類の互いに異なる細菌から分離したＴ１ＳＳ輸送体を発現した細胞でクチナーゼタンパク質分泌確認
クチナーゼ（Ｃｕｔｉｎａｓｅ）タンパク質と過負電荷化したクチナーゼタンパク質にｐＵＣ１９プラスミドを基盤として多重制限酵素部位（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）直後にＬＡＲＤ３信号配列の遺伝子を挿入したｐＬＡＲＤ３プラスミドにクチナーゼ遺伝子を挿入する方式でＬＡＲＤ３信号配列を付着した後、
【０１６８】
実施例１６の方法で得られた三種類の互いに異なるＴ１ＳＳ輸送体タンパク質（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨｌｙＢＤ＋ＴｏｌＣ、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ  ＰｒｔＤＥＦ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡｐｒＤＥＦ）を発現するプラスミドと共に実施例１６の方法と同様に二つのプラスミドを同時に大腸菌細胞内に導入して同時に発現させ、クチナーゼ酵素活性測定培地で３７℃で３日間培養した後、大腸菌外部へのタンパク質分泌程度をコロニー周辺部培地の色変化を通じて測定し、その結果を図２０に示した。
【０１６９】
図２０に示したように、三種類のＴ１ＳＳ輸送体タンパク質全てで、過負電荷化されたクチナーゼの分泌程度が過負電荷化されなかったクチナーゼに比べて確実に高いのを観察することができる。同様に、空のプラスミドを輸送体プラスミドの代わりにに入れた対照群（Ｃｕｔｉ（−）  ｏｎｌｙ、Ｃｕｔｉ  ｏｎｌｙ）との比較を通じて類推することができた。
【０１７０】
［実施例１８］ウェスタンブロットを用いたクチナーゼタンパク質の細胞外分泌確認
クチナーゼタンパク質（Ｃｕｔｉ）と過負電荷化されたクチナーゼタンパク質（Ｃｕｔｉ（−））にＬＡＲＤ３信号配列を付着した後、実施例１６の方法で得られた三種類の互いに異なるＴ１ＳＳ輸送体タンパク質と共に大腸菌で発現させて液体培養した後、ウェスタンブロットで細胞内および細胞外の該当タンパク質濃度を検出し、その結果を図２１に示した。
【０１７１】
図２１に示したように、三種類のＴ１ＳＳ輸送体タンパク質全てで、過負電荷化されたクチナーゼの分泌程度が過負電荷化されなかったクチナーゼに比べて確実に高いのを観測することができる。同様に、分泌事実は、輸送体プラスミドの代わりに空のプラスミドを入れた対照群（Ｃｕｔｉ（−）ｏｎｌｙ、Ｃｕｔｉ  ｏｎｌｙ）との比較を通じて類推することができた。
【０１７２】
［実施例１９］ウェスタンブロットを用いたＭ３７リパーゼタンパク質の細胞外分泌確認
Ｍ３７リパーゼ（Ｌｉｐａｓｅ）タンパク質と過負電荷化されたＭ３７リパーゼ（Ｍ３７（−））にＬＡＲＤ３信号配列を付着した後、実施例１６の方法で得られた三種類の互いに異なるＴ１ＳＳ輸送体タンパク質と共に大腸菌で発現させて液体培養した後、ウェスタンブロットで細胞内および細胞外の該当タンパク質濃度を検出し、その結果を図２２に示した。
【０１７３】
図２２に示したように、三種類のＴ１ＳＳ輸送体タンパク質全てで、過負電荷化されたＭ３７の分泌程度が過負電荷化されなかったＭ３７に比べて確実に高いのを観測することができる。同様に、分泌事実は、輸送体プラスミドの代わりに空のプラスミドを入れた対照群（Ｍ３７（−）ｏｎｌｙ、Ｍ３７  ｏｎｌｙ）との比較を通じて類推することができた。
【０１７４】
［実施例２０］Ｔ１ＳＳ  ＡＢＣ輸送体の配列同一性評価
シュードモナス・フルオレセンスのＴｌｉＤＥＦ輸送体のＴｌｉＤとＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＨｌｙＢＤ＋ＴｏｌＣ、Ｄｉｃｋｅｙａ  ｄａｄａｎｔｉｉ  ＰｒｔＤＥＦ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＡｐｒＤＥＦのＴ１ＳＳＡＢＣ輸送体およびその他の種類のＴ１ＳＳ輸送体のＡＢＣタンパク質と配列同一性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を測定し、その結果を図２３に示した。図２３は、ＴｌｉＤＥＦ輸送体と多様なＴ１ＳＳ輸送体間の塩基配列同一性（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ）および全体塩基配列で配列類似部分が占める比重を示す。
【０１７５】
具体的に、輸送体タンパク質の間塩基配列同一性はＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴｐアルゴリズムを用いて計算し、表示された塩基配列同一性は前記アルゴリズムの正常的な計算方式によって配列が互いに大きく異なる一部配列は省略し、残った部分（Ｑｕｅｒｙ  Ｃｏｖｅｒａｇｅ）内に限定して計算した。その結果、省略された配列部分はどの場合にも１０％に達しないので前記配列同一性計算の信頼性が非常に高かったということを示唆した。
【０１７６】
ＴｌｉＤＥＦ輸送体のＴｌｉＤと多様なＴ１ＳＳ  ＡＢＣ輸送体との配列同一性は、比較的に高いものから比較的に低いものまで多様に示された。このうちの実施例１６、１７、１８、１９で例として挙げたＡｐｒＤ、ＰｒｔＤ、ＨｌｙＢの三つのＴ１ＳＳ輸送体の配列同一性は、それぞれ６０％、５９％、２７％であった。
【０１７７】
よって、本発明者らは、タンパク質過負電荷化の分泌増進技術がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ微生物ＴｌｉＤＥＦ輸送体に限定されず、ＴｌｉＤＥＦと２７％程度の核酸配列同一性を有する多様なＴ１ＳＳ輸送体でも広範囲に適用できるのを確認した。
【図１ａ】
2020533980.tif 000014
【図１ｂ】
2020533980.tif 000015
【図２ａ】
2020533980.tif 000016
【図２ｂ】
2020533980.tif 000017
【図３ａ】
2020533980.tif 000018
【図３ｂ】
2020533980.tif 000019
【図４】
2020533980.tif 000020
【図５】
2020533980.tif 000021
【図６】
2020533980.tif 000022
【図７】
2020533980.tif 000023
【図８】
2020533980.tif 000024
【図９】
2020533980.tif 000025
【図１０ａ】
2020533980.tif 000026
【図１０ｂ】
2020533980.tif 000027
【図１１】
2020533980.tif 000028
【図１２】
2020533980.tif 000029
【図１３】
2020533980.tif 000030
【図１４】
2020533980.tif 000031
【図１５】
2020533980.tif 000032
【図１６】
2020533980.tif 000033
【図１７】
2020533980.tif 000034
【図１８】
2020533980.tif 000035
【図１９】
2020533980.tif 000036
【図２０】
2020533980.tif 000037
【図２１】
2020533980.tif 000038
【図２２】
2020533980.tif 000039
【図２３】
2020533980.tif 000040
【配列表】
2020533980000001.app
【国際調査報告】
2020533980.tif 000041
2020533980.tif 000042
2020533980.tif 000043
2020533980.tif 000044
2020533980.tif 000045
2020533980.tif 000046