(57)【要約】  本発明は、細菌株に導入されて、固形腫瘍において増殖するが非腫瘍組織においては増殖しない遺伝子操作された細菌株を生成する核酸システムを提供し、前記核酸システムは、前記遺伝子操作された細菌株を死滅させる毒素を発現する毒素遺伝子をコードする第１のＤＮＡ断片と、前記毒素を無効にする解毒剤を発現する解毒剤遺伝子をコードする第２のＤＮＡ断片と、グルコースが前記解毒剤遺伝子の転写を抑制するように、前記解毒剤遺伝子の前記転写を制御する第１のプロモーターと、前記毒素遺伝子の構成的発現を引き起こす第１の構成的プロモーターと、を含み、前記第２のＤＮＡ断片は、前記固形腫瘍において転写されるが、前記非腫瘍組織においては転写されない。
2020533978.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌株に導入されて、固形腫瘍において増殖するが非腫瘍組織においては増殖しない遺伝子操作された細菌株を生成する核酸システムであって、
前記遺伝子操作された細菌株を死滅させる毒素を発現する毒素遺伝子をコードする第１のＤＮＡ断片と、
前記毒素を無効にする解毒剤を発現する解毒剤遺伝子をコードする第２のＤＮＡ断片と、
グルコースが前記解毒剤遺伝子の転写を抑制するように、前記解毒剤遺伝子の前記転写を制御する第１のプロモーターと、
前記毒素遺伝子の構成的発現を引き起こす第１の構成的プロモーターと、を含み、
前記第２のＤＮＡ断片は、前記固形腫瘍において転写されるが、前記非腫瘍組織においては転写されない、核酸システム。
【請求項２】
前記固形腫瘍は、０．４２４ｍＭよりも低いグルコース濃度で特徴付けられる、請求項１に記載の核酸システム。
【請求項３】
前記非腫瘍組織は、１．２２ｍＭよりも高いグルコース濃度で特徴付けられる、請求項１〜２のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項４】
前記第１のプロモーターは、前記第２のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項５】
前記第１の構成的プロモーターは、前記第１のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項６】
前記第１のプロモーターは、ｌａｃプロモーター、ｇｌｔＡプロモーター、ｓｄｈＡＤＣプロモーター及びｔｎａＢプロモーターからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項７】
一対の前記毒素と前記解毒剤は、ＣｃｄＢ−ＣｃｄＡ対、ＡｖｒＲｘｏ１−Ａｒｃ１対、Ｈｈａ−ＴｏｍＢ対、及びＰａａＡ２−ＰａｒＥ２対からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項８】
前記第１のＤＮＡ断片は、配列番号１に示され、前記第２のＤＮＡ断片は、配列番号２に示される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項９】
前記第１のプロモーターは、配列番号３に示される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項１０】
５〜６個のヌクレオチドからなり、前記第２のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する前記遺伝子操作された細菌株の元の５〜６個のヌクレオチドを置き換えるランダム配列をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項１１】
前記ランダム配列は、ＧＣＣＴＴ又はＴＧＴＣＴである、請求項１０に記載の核酸システム。
【請求項１２】
クロラムフェニコール耐性カセットをコードする第３のＤＮＡ断片をさらに含み、
前記第３のＤＮＡ断片は、配列番号４に示される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項１３】
前記細菌株は、大腸菌、サルモネラ菌及び赤痢菌からなる群から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項１４】
前記細菌株は、大腸菌ＭＧ１６５５である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項１５】
配列番号７又は配列番号８に示される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項１６】
細菌株に導入されて、固形腫瘍において増殖するが非腫瘍組織においては増殖しない遺伝子操作された細菌株を生成する核酸システムであって、
前記遺伝子操作された細菌株を死滅させる毒素を発現する毒素遺伝子をコードする第１のＤＮＡ断片と、
前記毒素を無効にする解毒剤を発現する解毒剤遺伝子をコードする第２のＤＮＡ断片と、
グルコースが前記毒素遺伝子の転写を誘導するように、前記毒素遺伝子の前記転写を制御する第２のプロモーターと、
前記解毒剤遺伝子の構成的発現を引き起こす第２の構成的プロモーターと、を含み、
前記第１のＤＮＡ断片は、前記非腫瘍組織において転写されるが、前記固形腫瘍においては転写されない、核酸システム。
【請求項１７】
前記固形腫瘍は、０．４２４ｍＭよりも低いグルコース濃度で特徴付けられる、請求項１６に記載の核酸システム。
【請求項１８】
前記非腫瘍組織は、１．２２ｍＭよりも高いグルコース濃度で特徴付けられる、請求項１６〜１７のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項１９】
前記第２のプロモーターは、前記第１のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項２０】
前記第２の構成的プロモーターは、前記第２のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項２１】
前記第２のプロモーターは、ｐｔｓＧのプロモーター、ｆｒｕＢのプロモーター、及びａｃｋＡのプロモーターからなる群から選択される、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項２２】
一対の前記毒素と前記解毒剤は、ＣｃｄＢ−ＣｃｄＡ対、ＡｖｒＲｘｏ１−Ａｒｃ１対、Ｈｈａ−ＴｏｍＢ対、及びＰａａＡ２−ＰａｒＥ２対からなる群から選択される、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項２３】
前記第１のＤＮＡ断片は、配列番号１に示され、前記第２のＤＮＡ断片は、配列番号２に示される、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項２４】
５〜６個のヌクレオチドからなり、前記第１のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する前記遺伝子操作された細菌株の元の５〜６個のヌクレオチドを置き換えるランダム配列をさらに含む、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項２５】
クロラムフェニコール耐性カセットをコードする第３のＤＮＡ断片をさらに含み、
前記第３のＤＮＡ断片は、配列番号４に示される、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項２６】
前記細菌株は、大腸菌、サルモネラ菌及び赤痢菌からなる群から選択される、請求項１６〜２５のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項２７】
前記細菌株は、大腸菌ＭＧ１６５５である、請求項１６〜２６のいずれか１項に記載の核酸システム。
【請求項２８】
腫瘍を標的とする遺伝子操作された細菌株を構築する方法であって、
前記遺伝子操作された細菌株を死滅させる毒素を発現する毒素遺伝子をコードする第１のＤＮＡ断片と、
前記毒素を無効にする解毒剤を発現する解毒剤遺伝子をコードする第２のＤＮＡ断片と、
グルコースが前記解毒剤遺伝子の転写を抑制するように、前記解毒剤遺伝子の前記転写を制御する第１のプロモーターと、
前記毒素遺伝子の構成的発現を引き起こす第１の構成的プロモーターと、
を含む核酸システムを、細菌株に挿入することと、
前記核酸システムを含む前記遺伝子操作された細菌株のクローンを培養することと、
グルコースの非存在下で増殖するがグルコースの存在下では増殖しない前記クローンを選択することにより、前記腫瘍を標的とする前記遺伝子操作された細菌株を取得することと、を含み、
前記第２のＤＮＡ断片は、前記固形腫瘍において転写されるが、前記非腫瘍組織においては転写されない、方法。
【請求項２９】
５〜６個のヌクレオチドからなるランダム配列を挿入して、前記第２のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する天然ヌクレオチドを置き換えることによって、前記核酸システムのランダムライブラリを生成することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
０ｍＭのグルコース濃度で増殖するが、５ｍＭのグルコース濃度では増殖しない前記クローンは、前記腫瘍を標的とする前記遺伝子操作された細菌株として選択される、請求項２８〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸システムは、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の核酸システムである、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
腫瘍を標的とする遺伝子操作された細菌株を構築する方法であって、
前記遺伝子操作された細菌株を死滅させる毒素を発現する毒素遺伝子をコードする第１のＤＮＡ断片と、
前記毒素を無効にする解毒剤を発現する解毒剤遺伝子をコードする第２のＤＮＡ断片と、
グルコースが前記毒素遺伝子の転写を誘導するように、前記毒素遺伝子の前記転写を制御する第２のプロモーターと、
前記解毒剤遺伝子の構成的発現を引き起こす第２の構成的プロモーターと、
を含む核酸システムを、細菌株に挿入することと、
前記核酸システムを含む前記遺伝子操作された細菌株のクローンを培養することと、
グルコースの非存在下で増殖するがグルコースの存在下では増殖しない前記クローンを選択することにより、前記腫瘍を標的とする前記遺伝子操作された細菌株を取得することと、を含み、
前記第１のＤＮＡ断片は、前記非腫瘍組織において転写されるが、前記固形腫瘍においては転写されない、方法。
【請求項３３】
５〜６個のヌクレオチドからなるランダム配列を挿入して、前記第１のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する天然ヌクレオチドを置き換えることによって、前記核酸システムのランダムライブラリを生成することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
０ｍＭのグルコース濃度で増殖するが、５ｍＭのグルコース濃度では増殖しない前記クローンは、前記腫瘍を標的とする前記遺伝子操作された細菌株として選択される、請求項３２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記核酸システムは、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の核酸システムである、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸システムに関する。特に、本発明は、固形腫瘍を標的とする能力を細菌に与える核酸システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
ほとんどの抗腫瘍薬は、活発に分裂するすべての細胞に対して作用し、深刻な、ひいては致死的な副作用さえもたらす。原発性腫瘍と播種性腫瘍の両方を治療するために、標的療法は、全身投与時に腫瘍と非腫瘍組織とを識別することができなければならない。
【０００３】
以前の標的療法は、非生物学的薬物に依存してきた。全身的に送達されるとき、非生物学的薬物は血流中で激しく希釈され、腫瘍に利用できるのはわずかな部分のみである。さらに、非生物学的薬物は、送達が腫瘍血管系に依存するため、血管新生が不十分な低酸素腫瘍組織に効果的に拡散することができない。したがって、伝達後の繁殖が可能であり、血管新生が不十分な腫瘍組織を好む様々な偏性又は通気性嫌気性菌が、過去数十年間にわたって、腫瘍の標的化における安全性及び有効性について評価されてきた。クロストリジウム及びサルモネラなどのこれらの腫瘍標的化嫌気性菌は、腫瘍殺傷剤の担体として機能し、標的腫瘍治療を達成することができる。いくつかの場合、操作された偏性嫌気性菌は、腫瘍選択性の向上を示すことが明らかになった。これらの進歩にもかかわらず、腫瘍標的化細菌の臨床使用は、腫瘍特異性が不十分であるため、依然として実現には程遠い。
【０００４】
腫瘍特異性の改善を伴う標的療法に対する需要を考慮すると、腫瘍を破壊するが正常組織を無傷のままにする腫瘍標的化システム、薬剤、及び方法が、非常に望まれている。
【発明の概要】
【０００５】
１つの例示的な実施形態は、細菌株に導入されて、遺伝子操作された細菌株を生成する核酸システムである。得られた遺伝子操作された細菌株は、固形腫瘍において増殖するが、非腫瘍組織においては増殖しない。核酸システムは、第１のＤＮＡ断片と、第２のＤＮＡ断片と、第１のプロモーターと、第１の構成的プロモーターとを含む。第１のＤＮＡ断片は、遺伝子操作された細菌株を死滅させる毒素を発現する毒素遺伝子をコードする。第２のＤＮＡ断片は、毒素を無効にする解毒剤を発現する解毒剤遺伝子をコードする。第１のプロモーターは、グルコースが解毒剤遺伝子の転写を抑制するように、解毒剤遺伝子の転写を制御する。第１の構成的プロモーターは、毒素遺伝子の構成的発現を引き起こす。第２のＤＮＡ断片は、固形腫瘍において転写されるが、非腫瘍組織においては転写されない。
【０００６】
他の例示的な実施形態は、本明細書で説明される。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】例示的な実施形態に係る、細菌に低グルコース環境を標的とさせる毒素−解毒剤遺伝システムを示す。
【図１Ｂ】例示的な実施形態に係る、毒素としてＣｃｄＢを用いて、解毒剤としてＣｃｄＡを用いて、大腸菌に低グルコース環境を標的とさせる核酸システムを構築する概略図を示す。
【図１Ｃ】例示的な実施形態に係る、抗癌薬を固形腫瘍に送達する遺伝子操作された細菌を含む薬物送達システムを示す。抗癌薬は、操作された細菌によって生成される抗癌分子又は化合物、又は細菌によって発現され抗癌免疫応答を誘発できる抗原を含むが、これらに限定されない。
【図１Ｄ】例示的な実施形態に係る、グルコースの存在下で増殖しないがグルコースの非存在下では増殖するクローンを検索するために、０ｍＭ〜４ｍＭの異なる濃度のグルコースを含むＭ６３寒天培地上にストリークされたクローンを示す。
【図２Ａ】例示的な実施形態に係る、細菌（１０７／マウス）の静脈内注射から１５日後の、Ｂａｇｇ  ａｌｂｉｎｏ／ｃ（ＢＡＬＢ／ｃ）マウスのＣＴ２６（マウス結腸直腸癌細胞株）腫瘍における、遺伝子操作された細菌株ＪＹ１及びＪＹ６、ならびにＭＧ１６５５と命名された未修飾野生型大腸菌株のコロニー形成を示す。
【図２Ｂ】例示的な実施形態に係る、細菌（１０７／マウス）の静脈内注射から１５日後の、ＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓における細菌株ＪＹ１及びＪＹ６ならびにＭＧ１６５５のコロニー形成を示す。
【図２Ｃ】例示的な実施形態に係る、細菌（１０７／マウス）の静脈内注射から１５日後の、ＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、細菌株ＪＹ１及びＪＹ６ならびにＭＧ１６５５によってコロニー形成された肝臓の割合を示す。
【図２Ｄ】例示的な実施形態に係る、細菌（１０７／マウス）の静脈内注射から７日後の、ＨＣＴ１１６（ヒト結腸直腸癌細胞株）腫瘍を有するヌードマウスの腫瘍における、細菌株ＪＹ１及びＪＹ６ならびにＭＧ１６５５のコロニー形成を示す。
【図２Ｅ】例示的な実施形態に係る、細菌（１０７／マウス）の静脈内注射から７日後の、ＨＣＴ１１６腫瘍を有するヌードマウスの肝臓における、細菌株ＪＹ１及びＪＹ６ならびにＭＧ１６５５のコロニー形成を示す。
【図２Ｆ】例示的な実施形態に係る、細菌（１０７／マウス）の静脈内注射から７日後の、ＨＣＴ１１６腫瘍を有するヌードマウスにおける、細菌株ＪＹ１及びＪＹ６ならびにＭＧ１６５５によってコロニー形成された肝臓の割合を示す。
【図３Ａ】例示的な実施形態に係る、皮下ＳＷ４８０（ヒト結腸直腸癌細胞株）腫瘍を保有するヌードマウスの肝臓及び脾臓における細菌株ＪＹＨ１及びＳＨ１  ｈｌｙのコロニー形成を示す。
【図３Ｂ】例示的な実施形態に係る、皮下ＳＷ４８０腫瘍を保有するヌードマウスにおける細菌株ＪＹＨ１及びＳＨ１  ｈｌｙに感染した肝臓及び脾臓の割合を示す。
【図３Ｃ】例示的な実施形態に係る、細菌株ＳＨ１  ｈｌｙで処置されたマウスにおいて発現された肝膿瘍を示す。
【図３Ｄ】例示的な実施形態に係る、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＳＨ１  ｈｌｙ株、及びＪＹＨ１株で処置された皮下ＳＷ４８０腫瘍を保有するヌードマウスからのヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色肝臓切片の顕微鏡画像を示す。
【図４】例示的な実施形態に係る、免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６腫瘍に対する静脈内注射株ＪＹＨ１の標的効力を示す。
【図５】例示的な実施形態に係る、グルコース欠乏領域において選択的に生存し増殖することによって固形腫瘍を標的とする遺伝子操作された細菌株を構築する方法を示す。
【図６Ａ】例示的な実施形態に係る、ＳＷ４８０及びＨＣＴ１１６細胞に対する大腸菌ＳＨ１及び大腸菌ＭＧ１６５５のインビトロ細胞毒性効果を示す。
【図６Ｂ】例示的な実施形態に係る、ＡＳＰＣ−１、Ｍｉａ−ｃａｐａ−２、及びｐａｎｃ−１細胞に対する大腸菌ＳＨ１及び大腸菌ＭＧ１６５５のインビトロ細胞毒性効果を示す。
【図７Ａ】例示的な実施形態に係る、ヌードマウスのＨＣＴ１１６腫瘍の増殖に対する静脈内注射された大腸菌ＪＹＨ１の阻害効果を示す。
【図７Ｂ】例示的な実施形態に係る、ヌードマウスのＳＷ４８０腫瘍の増殖に対する静脈内注射された大腸菌ＪＹＨ１の阻害効果を示す。
【図７Ｃ】例示的な実施形態に係る、０〜５５日齢のマウスにＰＢＳを静脈内注射して処置されたＳＷ４８０腫瘍の代表的な写真を示す。
【図７Ｄ】例示的な実施形態に係る、０〜９０日齢のマウスにＪＹＨ１を静脈内注射して処置されたＳＷ４８０腫瘍の代表的な写真を示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
例示的な実施形態は、核酸システムに関する。核酸システムは、遺伝子操作された細菌株が固形腫瘍を標的とするが正常組織を無傷のままにするように、細菌株に導入される。
【０００９】
低酸素は、細菌を固形腫瘍に標的化する腫瘍微小環境の最も一般的に利用される特徴である。しかし、厳密に低酸素を標的とする偏性嫌気性菌は、固形腫瘍の壊死領域に限定され、一方、通気性嫌気性菌は、固形腫瘍全体にコロニーを形成するが、低酸素標的化の制御が緩やかであるため、正常組織に感染する。本発明に係る例示的な実施形態は、細菌のグルコース依存性の生存率を調節することによって細菌の腫瘍特異性を改善する核酸システムを細菌に導入することにより、これらの技術的課題を解決する。
【００１０】
図１Ａは、構成的に発現される毒素コード遺伝子と、グルコースに抑制されるプロモーターの制御下での解毒剤コード遺伝子とを含む核酸システム１００を示す。例示的な実施形態に従って、核酸システムは、低グルコース環境を標的とする能力を細菌に与える。
【００１１】
毒素−解毒剤遺伝システムは、細菌がグルコース欠乏環境で選択的に増殖するが、グルコースの存在下で死滅することを可能にする。グルコース欠乏は固形腫瘍微小環境の特徴であるため、核酸システムを備えた細菌は、全身に適用されるときに固形腫瘍を特異的に標的とすることができる。腫瘍細胞は、一般に、急速な細胞増殖、過剰なグルコース消費、及び不十分な血液供給のために、グルコースを奪われる。腫瘍組織のグルコース濃度は０．１２３〜０．４２４ｍＭであり、正常組織のグルコース濃度は１．２２〜１．２９ｍＭであり、１ｇの組織が１ｍｌであると仮定する。毒素−解毒剤核酸システムは、細菌が低グルコース環境下で選択的に増殖することを可能にする。
【００１２】
核酸システムは、腫瘍微小環境の特徴である低グルコース条件下で選択的に増殖する能力を細菌に与える。大腸菌などの細菌は、腫瘍の微小環境において免疫が強く抑制されるため、固形腫瘍に優先的に増殖し、正常組織にあまりコロニーを形成しない固有の能力を有する。低グルコース環境を標的とする核酸システムは、腫瘍特異性が単独で使用するのに不十分な大腸菌などの細菌に高い腫瘍選択性を与え、細菌媒介腫瘍治療の安全性を改善する。
【００１３】
例示的な実施形態では、腫瘍標的化システムである核酸システムが細菌の染色体に組み込まれ、それによって細菌は腫瘍を標的とする固有の能力だけに依存せず、その結果、細菌の安全性が改善される。例示的な実施形態では、核酸システムは、プラスミドに挿入される。例示的な実施形態では、核酸システムは、グルコース感知システム又はモジュールである。
【００１４】
例示的な実施形態では、核酸システムを保有する細菌は、低グルコース環境を標的とすることによって厳密に固形腫瘍においてコロニー形成する。
【００１５】
例示的な実施形態では、核酸システムは、毒素コード遺伝子と、解毒剤コード遺伝子と、解毒剤コード遺伝子の転写を制御するグルコースに抑制されるプロモーターと、毒素コード遺伝子の構成的発現を引き起こす構成的プロモーターとを含む。
【００１６】
例示的な実施形態では、生理学的レベルのグルコースを有する環境では、毒素は構成的に発現され、一方、解毒剤の発現はグルコースに抑制されるプロモーターの制御下でグルコースによって抑制される。解毒剤が毒素を無効にするように発現されないため、核酸システムを保有する細菌は、生理学的レベルのグルコースを有する環境で増殖しない。低グルコース環境では、毒素と解毒剤の両方が発現される。解毒剤が毒素を無効にするため、核酸システムを保有する細菌は、低グルコース環境で増殖する。
【００１７】
例示的な実施形態では、核酸システムは、毒素コード遺伝子と、解毒剤コード遺伝子と、毒素コード遺伝子の転写を制御するグルコース誘導プロモーターと、解毒剤コード遺伝子の構成的発現を引き起こす構成的プロモーターとを含む。
【００１８】
例示的な実施形態では、生理学的レベルのグルコースを有する環境では、解毒剤は構成的に発現され、一方、毒素の発現はグルコース誘導プロモーターの制御下でグルコースによって誘導される。毒素が解毒剤の発現よりも高いレベルで発現されることによって細菌を死滅させるため、核酸システムを保有する細菌は、生理学的レベルのグルコースを有する環境で増殖しない。低グルコース環境では、細菌が生存し増殖するように、毒素は発現されない。
【００１９】
例示的な実施形態では、低グルコース環境は、０．４２４ｍＭよりも低い濃度のグルコースを含む。例示的な実施形態では、高グルコース環境は、１．２２ｍＭよりも高い濃度のグルコースを含む。例示的な実施形態では、低グルコース環境は、０．１２３〜０．４２４ｍＭの濃度のグルコースを有する。例示的な実施形態では、高グルコース環境は、１．２２〜１．２９ｍＭの濃度のグルコースを有する。
【００２０】
例示的な実施形態では、固形腫瘍において、毒素の毒性が解毒剤によって拮抗されるように、発現された解毒剤のレベルは、発現された毒素のレベル以上である。
【００２１】
例示的な実施形態では、腫瘍標的化核酸システムは、毒素を発現する毒素遺伝子をコードする第１のＤＮＡ断片と、毒素を無効にする解毒剤を発現する解毒剤遺伝子をコードする第２のＤＮＡ断片と、第１のプロモーターと、第１の構成的プロモーターとを含む核酸システムである。第１の構成的プロモーターは、毒素遺伝子の構成的発現を引き起こす。第１のプロモーターは、第２のＤＮＡ断片が低グルコース環境下又はグルコースの非存在下で転写されるが、グルコースの存在下又は高グルコース環境下では転写されないように、グルコース濃度の制御下で第２のＤＮＡ断片の転写を調節する。例示的な実施形態では、第２のＤＮＡ断片は、グルコースの非存在下で転写されるが、Ｍ６３培地中で濃度が１ｍＭ以上の高グルコース環境下では転写されない。
【００２２】
例示的な実施形態では、第１のプロモーターは、グルコースが解毒剤遺伝子の転写を抑制するように、解毒剤遺伝子の転写を制御する。第２のＤＮＡ断片は、固形腫瘍において転写されるが、非腫瘍組織においては転写されない。
【００２３】
例示的な実施形態では、腫瘍標的化核酸システムは、毒素を発現する毒素遺伝子をコードする第１のＤＮＡ断片と、毒素を無効にする解毒剤を発現する解毒剤遺伝子をコードする第２のＤＮＡ断片と、第２のプロモーターと、第２の構成的プロモーターとを含む核酸システムである。第２の構成的プロモーターは、解毒剤遺伝子の構成的発現を引き起こす。第２のプロモーターは、第１のＤＮＡ断片が高グルコース環境下又は生理学的レベルのグルコースの存在下で転写されるが、グルコースの非存在下又は低グルコース環境下では転写されないように、グルコース濃度の制御下で第１のＤＮＡ断片の転写を調節する。例示的な実施形態では、第１のＤＮＡ断片は、グルコースの非存在下で転写されないが、Ｍ６３培地中で濃度が１ｍＭ以上の高グルコース環境下では転写される。
【００２４】
例示的な実施形態では、第２のプロモーターは、グルコースが毒素遺伝子の転写を誘導するように、毒素遺伝子の転写を制御する。第１のＤＮＡ断片は、非腫瘍組織において転写されるが、固形腫瘍においては転写されない。
【００２５】
例示的な実施形態では、第１のＤＮＡ断片は、配列番号１に示される。例示的な実施形態では、第２のＤＮＡ断片は、配列番号２に示される。
【００２６】
例示的な実施形態では、第１のＤＮＡ断片は、第２のＤＮＡ断片の上流に位置する。例示的な実施形態では、第１のＤＮＡ断片は、第１のプロモーターの上流に位置する。例示的な実施形態では、第１のＤＮＡ断片は、第２のＤＮＡ断片の下流に位置する。例示的な実施形態では、第２のプロモーターは、第１のＤＮＡ断片の上流に位置する。例示的な実施形態では、第１の構成的プロモーターは、第１のＤＮＡ断片の上流に位置する。例示的な実施形態では、第２の構成的プロモーターは、第２のＤＮＡ断片の上流に位置する。例示的な実施形態では、第１のプロモーターは、配列番号３に示される。
【００２７】
例示的な実施形態では、核酸システムは、５〜６個のヌクレオチドからなり、第２のＤＮＡ断片のすぐ上流かつ第１のプロモーターの下流に位置するランダム配列を含む。例示的な実施形態では、ランダム配列は、ＧＣＣＴＴ又はＴＧＴＣＴである。
【００２８】
例示的な実施形態では、核酸システムは、５〜６個のヌクレオチドからなり、第１のＤＮＡ断片のすぐ上流かつ第２のプロモーターの下流に位置するランダム配列を含む。
【００２９】
例示的な実施形態では、核酸システムは、５〜６個のヌクレオチドからなり、第２のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する細菌の元の又は天然の５〜６個のヌクレオチドを置き換えるランダム配列を含む。
【００３０】
例示的な実施形態では、核酸システムは、５〜６個のヌクレオチドからなり、第１のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する細菌の元の又は天然の５〜６個のヌクレオチドを置き換えるランダム配列を含む。
【００３１】
例示的な実施形態では、核酸システムは、５〜６個のヌクレオチドからなり、第１のプロモーターの元の又は天然の５〜６個のヌクレオチドを置き換えるランダム配列を含む。例示的な実施形態では、核酸システムは、５〜６個のヌクレオチドからなり、第２のプロモーターの元の又は天然の５〜６個のヌクレオチドを置き換えるランダム配列を含む。
【００３２】
例示的な実施形態では、ランダム配列は、第１のプロモーターの下流に位置する。例示的な実施形態では、ランダム配列は、第２のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する。
【００３３】
例示的な実施形態では、ランダム配列は、第２のプロモーターの下流に位置する。例示的な実施形態では、ランダム配列は、第１のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する。
【００３４】
例示的な実施形態では、核酸システムは、選択可能なマーカーをコードする第３のＤＮＡ断片を含む。例示的な実施形態では、マーカーは、クロラムフェニコール選択マーカー（ＣｍＲ）である。例示的な実施形態では、選択可能なマーカーは、クロラムフェニコール耐性カセットである。例示的な実施形態では、第３のＤＮＡ断片は、配列番号４に示される。
【００３５】
例示的な実施形態では、第３のＤＮＡ断片は、第１のＤＮＡ断片の下流かつ第１のプロモーターの上流に位置する。例示的な実施形態では、第３の断片は、第２のＤＮＡ断片の下流かつ第２のプロモーターの上流に位置する。
【００３６】
例示的な実施形態では、核酸システムは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４を含む。例示的な実施形態では、核酸システムは、配列番号５に示される、ｃｃｄＢの発現を駆動する構成的プロモーターを含む。例示的な実施形態では、核酸システムは、配列番号６に示されるｒｒｎＢ転写終結領域を含む。例示的な実施形態では、核酸システムは、配列番号７に示される。例示的な実施形態では、核酸システムは、配列番号８に示される。
【００３７】
例示的な実施形態では、核酸システムは、毒素遺伝子と、解毒剤遺伝子と、解毒剤遺伝子の転写を制御する第１のプロモーターと、毒素遺伝子の構成的プロモーターとを含む。例示的な実施形態では、核酸システムは、毒素遺伝子と、解毒剤遺伝子と、毒素遺伝子の転写を制御する第２のプロモーターと、解毒剤遺伝子の構成的プロモーターとを含む。
【００３８】
例示的な実施形態では、細菌株は、グラム陽性細菌株である。例示的な実施形態では、細菌株は、グラム陰性細菌株である。
【００３９】
例示的な実施形態では、細菌株は、大腸菌である。例示的な実施形態では、細菌株は、大腸菌ＭＧ１６５５及び大腸菌ＳＨ１からなる群から選択される。
【００４０】
図１Ｂは、例示的な実施形態に係る、大腸菌を低グルコース環境に標的化する核酸システムを構築する概略図１１０を示す。図１Ｂは、ランダム化されたグルコースに抑制されるラクトースプロモーター（Ｐｌａｃ）及びＣｃｄＡ／ＣｃｄＢ毒素−解毒剤対を使用して、大腸菌を低グルコース環境に標的とする核酸システムを構築することを示す。
【００４１】
ＣｃｄＢは、宿主細菌を死滅させる毒素であり、ＣｃｄＡは、ＣｃｄＢに対抗する解毒剤である。腫瘍標的化核酸システムでは、ＣｃｄＢは、構成的に発現され、一方、ＣｃｄＡの発現は、グルコースに抑制されるラクトース（ｌａｃ）プロモーターの制御下でグルコースによって抑制される。低グルコース環境では、解毒剤ＣｃｄＡの抑制が解除され、ＣｃｄＢを無効にするため、この核酸システムを保有する細菌は良好に増殖する。生理学的レベルのグルコースの存在下で、細菌を死滅させるために、ＣｃｄＡの発現が停止し、ＣｃｄＢは解放される。
【００４２】
例示的な実施形態では、腫瘍標的化核酸システムにおいて、ＣｃｄＡは、構成的に発現され、一方、ＣｃｄＢの発現は、グルコース誘導プロモーターの制御下でグルコースによって誘導される。低グルコース環境では、毒素ＣｃｄＢが抑制されるため、この核酸システムを保有する細菌は良好に増殖する。生理学的レベルのグルコースの存在下で、細菌を死滅させるために、ＣｃｄＢの発現が開始される。
【００４３】
図１Ｂに示すように、５〜６個のヌクレオチド（ｎｎｎｎｎ）からなるランダム化断片は、ｃｃｄＡ遺伝子の開始コドンのすぐ上流に位置する元の又は天然の５〜６個のヌクレオチド（第２のＤＮＡ断片の一例）を置き換える。このランダム化断片内の異なる配列は、異なるレベルのｃｃｄＡの発現をもたらす。いくつかの配列では、腫瘍におけるグルコースレベルは、ＣｃｄＡの発現を活性化してＣｃｄＢの毒性に拮抗するのに十分に低く、正常組織におけるグルコースレベルは、ｌａｃプロモーターの制御下でＣｃｄＡの発現を遮断するのに十分に高い。クロラムフェニコール選択マーカー（ＣｍＲ）などの選択可能なマーカーも、図１Ｂの核酸システムに使用される。
【００４４】
ランダム化断片内の異なる配列（核酸システム又はＤＮＡプールのランダムライブラリ）を有する核酸システムは、大腸菌の染色体に挿入され、そして、グルコースの存在下で増殖しないがグルコースの非存在下で増殖する細菌をスクリーニングするために、細菌は、グルコースを含む（Ｇｌｃ（＋））か、又はグルコースを含まない（Ｇｌｕ（−））溶原培地（ＬＢ）寒天プレート上にストリークされる。矢印１１２は、グルコース陰性培地で増殖するがグルコースを含む培地で増殖しないクローンを示す。例示的な実施形態では、ＬＢ寒天プレート上のグルコースの濃度は、０ｍＭ又は５ｍＭである。
【００４５】
図１Ｃは、固形腫瘍を特異的に標的とするだけでなく、抗癌分子又は化合物を生成し及び／又は抗癌免疫応答を誘発する抗原を発現することによって抗癌薬１２４を固形腫瘍に送達する遺伝子操作された細菌１２２を含む薬物送達システム１２０を示す。
【００４６】
遺伝子操作された細菌１２２は、薬物１２４を固形腫瘍に送達し、腫瘍細胞を死滅させる。遺伝子操作された細菌１２２は、細菌が固形腫瘍において増殖するが非腫瘍組織においては増殖しないように、本明細書に記載の核酸システムを含む。
【００４７】
以下の実施例は、様々な実施形態を示すように提供される。
【実施例１】
【００４８】
材料及び方法
【００４９】
低グルコース環境を標的とする操作された大腸菌のランダムライブラリの構築
【００５０】
本実施例で設計された腫瘍標的化核酸システムは、構成的に発現されるｃｃｄＢ遺伝子と、ｌａｃプロモーターの制御下でグルコースに抑制されるｃｃｄＡ遺伝子とから構成された。解毒剤ＣｃｄＡは、生理学的レベルのグルコースの存在下で抑制され、その結果、毒素ＣｃｄＢが細菌を死滅させる。対照的に、ＣｃｄＡの発現の抑制が解除され、ＣｃｄＢの作用に対抗するため、細菌は低グルコース増殖条件下で生存している。低グルコース条件下でｌａｃプロモーターの制御下でＣｃｄＢに拮抗するＣｃｄＡの能力を改善するため、又はグルコースの存在下で細菌を死滅させるＣｃｄＢの能力を高めるために、ｃｃｄＡ遺伝子の開始コドンのすぐ上流に位置する５個のヌクレオチドをランダム化することによって、腫瘍標的化核酸システムのランダムライブラリを構築した。λ−Ｒｅｄ組換え技術により染色体の遺伝子操作を容易にするために、図１Ｂに示すように、選択可能なマーカー、すなわちクロラムフェニコール選択マーカー（ＣmＲ）を腫瘍標的化核酸システムに含めた。
【００５１】
具体的には、図１Ｂに示すように、構成的プロモーターの制御下でのｃｃｄＢ遺伝子と、選択可能なマーカー（ｌｏｘＰ−ｃａｔ−ｌｏｘＰカセットなど）と、５個のヌクレオチド（５ｎｔ）−ランダム化領域と、グルコースに抑制されるプロモーター（ｌａｃプロモーターなど）の制御下でのｃｃｄＡ遺伝子とを含む一組のＤＮＡ断片（つまり、腫瘍を標的とする核酸システム）を、オーバーラップポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって生成した。５ｎｔ−ランダム化領域は、核酸システムのランダムライブラリを生成することを可能にする。選択マーカーは、組み換えにより、細菌の染色体に核酸システムを挿入することを可能にする。そして、λ−Ｒｅｄ組換え技術を用いて、大腸菌の染色体に核酸システムのライブラリを挿入した。グルコース欠乏ＬＢで１時間回復した後、細菌培養物を、抗生物質（ｌｏｘＰ−ｃａｔ−ｌｏｘＰカセットを選択マーカーとして使用した場合、１２．５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールである）を補充したグルコース欠乏ＬＢ寒天に広げた。３２℃で一晩培養した後、寒天上に個々のコロニーを形成した。各コロニーは、低グルコース条件下で選択的に増殖する可能性を有する単一の大腸菌の複製に由来する。これらのコロニーは、推定腫瘍標的化細菌のランダムライブラリを形成した。ここで、ＣｃｄＢ−ＣｃｄＡ対を他の毒素−解毒剤対で置き換えることができる。
【００５２】
グルコース欠乏環境を標的とする細菌のライブラリスクリーニング：グルコース欠乏ＬＢ培地を、低グルコース条件下で選択的に増殖する細菌のライブラリスクリーニングに使用した。ランダムライブラリをスクリーニングするために、各クローンをグルコース欠乏ＬＢ寒天及び５ｍＭグルコース添加ＬＢ寒天の両方にストリークした。３７℃で一晩培養した後、グルコース欠乏ＬＢ寒天上で容易に増殖するがグルコース陽性ＬＢ寒天上では増殖しないことが判明したクローンを、最小Ｍ６３培地寒天を用いてさらに評価した。Ｍ６３寒天には、３０ｍＭグリセロールに加えて、増加する濃度のグルコースを補充した。ここで、大腸菌ＭＧ１６５５以外の細菌株は、同じストラテジーを使用して腫瘍標的化細菌のスクリーニングに使用することができる。
【００５３】
操作された細菌の腫瘍標的効力のインビボ評価：６〜８週齢のヌードマウスをヒト癌細胞株の腫瘍移植に使用し、６〜８週齢の免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスをマウス由来細胞株の腫瘍移植に使用した。１×１０７の細菌を各マウスの尾静脈に注射した。細菌注射後３日ごとに、デジタルキャリパーを用いて腫瘍サイズを測定した。実験の終わりに、コロニー形成単位の決定のために、マウスを安楽死させ、それらの腫瘍及び臓器を除去した。具体的には、１グラムの組織を１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液中で均質化した。得られた組織懸濁液を連続的に希釈し、平板培養し、希釈懸濁液のコロニー形成単位を計数した。希釈率に応じて各組織の細菌数を算出した。細菌は、腫瘍に存在するが臓器には存在しない場合、腫瘍を特異的に標的とすることができると見なされた。
【００５４】
例示的な実施形態では、腫瘍標的化核酸システムは、構成的に発現されるｃｃｄＢ遺伝子、ＣｍＲカセット、及び開始コドンのすぐ上流に位置する５ｎｔ−ランダム配列を有するｌａｃプロモーター制御ｃｃｄＡからなる。これらの要素は、必ずしも図１Ｂに示す順序で配置されるわけではない。例示的な実施形態では、腫瘍標的化核酸システムは、構成的に発現されるｃｃｄＡ遺伝子、ＣｍＲカセット、及び開始コドンのすぐ上流に位置する５ｎｔ−ランダム配列を備えたグルコース誘導プロモーター制御ｃｃｄＢからなる。ｃｃｄＢ−ｃｃｄＡ対は、他の毒素−解毒剤対で置き換えることができる。ＣｍＲは、他の選択可能なマーカーで置き換えることができる。ランダム配列中のヌクレオチドの数は５に限定されない。
【実施例２】
【００５５】
この実施例では、大腸菌ＭＧ１６５５を使用した。構成的に発現されるＣｃｄＢ、ｌａｃプロモーター制御ＣｃｄＡ、ｌａｃプロモーター、及びＣｍＲを用いて、腫瘍標的化核酸システムを構築した。ｃｃｄＢ遺伝子は、ｌａｃプロモーターの上流に位置するＣｍＲカセットの上流に位置した。ｃｃｄＡ遺伝子のすぐ上流のｌａｃプロモーターにランダム化断片（この例では５個のヌクレオチド）を挿入することによって、推定腫瘍標的化細菌のランダムライブラリを生成した。ランダムライブラリを大腸菌株ＭＧ１６５５で染色体内に確立した。このランダムライブラリでは、各大腸菌ＭＧ１６５５変異体は、ランダム化されたドメインにおいて独特の５個のヌクレオチド配列を有するｌａｃプロモーター変異体を染色体内に保有していた。ランダムライブラリをスクリーニングして、低グルコース条件下で選択的に増殖する細菌クローンを検索した。具体的には、グルコースが枯渇したＬＢ寒天上にライブラリを構築した。次に、得られた大腸菌クローンを、５ｍＭのグルコースを含むＬＢ寒天とグルコースを含まないＬＢ寒天の両方に個々にストリークして、グルコースの存在下で増殖しなかったがグルコースの非存在下では増殖した大腸菌クローンをスクリーニングした。約１５００個のクローンがスクリーニングされ、６個のクローンがグルコース陰性培地で優先的に増殖することが判明した。
【００５６】
図１Ｄは、最小培地Ｍ６３寒天上のグルコースに対する６個の大腸菌クローンの感受性についての図面１３０を示す。６個のクローンを精製し、一晩インキュベートし、連続希釈した。１０μｌの各希釈懸濁液を、０ｍＭのグルコース（Ｇｌｕ）から４ｍＭのＧｌｕに増加する濃度のＧｌｕを補充した最小培地Ｍ６３に滴下して、その表現型を確認した。６個のクローンのうち、１番目及び６番目のクローンは、グルコース陰性培地寒天上でよく増殖したが、グルコースの存在下ではあまり増殖しなかった。対照的に、２番目、３番目、４番目及び５番目のクローンは、グルコース陰性及びグルコース陽性培地寒天の両方でかなりの増殖を示した。これを考慮すると、１番目及び６番目のクローン（図１Ｄの枠内）は、腫瘍標的化細菌の候補であり、それぞれＪＹ１及びＪＹ６（ＪＹ８とも命名される）と命名された。より多くのライブラリスクリーニングを実施した場合、より多くのグルコース感知クローンを特定することができる。
【００５７】
クローンＪＹ１の染色体におけるｃｃｄＡ遺伝子の上流のランダム配列は、ＧＣＣＴＴである。ＪＹ１のヌクレオチド配列は、配列番号５に示される配列を含む。クローンＪＹ６の染色体におけるｃｃｄＡ遺伝子の上流のランダム配列は、ＴＧＴＣＴである。
【００５８】
株ＪＹ１は、寄託番号Ｎｏ．１４５７７で中国微生物菌種保蔵管理委員会普通微生物センター（ＣＧＭＣＣ）に寄託された。株ＪＹ６は、寄託番号Ｎｏ．１４５７８でＣＧＭＣＣに寄託された。
【実施例３】
【００５９】
操作された大腸菌変異体ＪＹ１及びＪＹ６は、グルコースに敏感であり、インビトロでグルコースの存在下で増殖しなかった。この実施例は、腫瘍内のグルコースレベルがＪＹ１及びＪＹ６が生存し増殖するのに十分に低いことを示すインビボ実験及びデータを提供する。ＪＹ１及びＪＹ６を、ＣＴ２６（マウス結腸直腸癌細胞株）腫瘍（１０７ｃｆｕ／マウス）を有する免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスの尾静脈に別々に注射した。親株ＭＧ１６５５を対照として使用した。尾静脈注射の１５日後、腫瘍及び肝臓における細菌の分布について分析した。肝臓は、他の臓器よりも細菌感染に対して脆弱であるため、分析のために選択された。
【００６０】
図２Ａ〜２Ｆは、マウスの腫瘍を特異的に標的とした大腸菌ＪＹ１及びＪＹ６を示す。エラーバー、ＳＥＭ．＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１。
【００６１】
図２Ａは、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６腫瘍１グラム当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）２００を示す。図２Ａに示すように、ＪＹ１、ＪＹ６、及びＭＧ１６５５は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＣＴ２６腫瘍に同等にコロニーを形成し、腫瘍におけるそれらのレベルは、１０８ｃｆｕ／ｇを超えていた。これらのデータは、ＪＹ１及びＪＹ６の両方が、免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスによって保有されるＣＴ２６腫瘍内の良好なコロニー形成因子であることを示した。
【００６２】
図２Ｂは、ＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓１グラム当たりのＣＦＵ２１０を示す。図２Ｂに示すように、ＪＹ１は、ＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓にコロニーを形成しなかった。ＪＹ６は、ＭＧ１６５５より少ない程度に、ＣＴ２６を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの肝臓にコロニーを形成した。図２Ｃは、ＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスにおける、ＪＹ１、ＪＹ６及びＭＧ１６５５がコロニー形成された肝臓の割合２２０を示す。図２Ｃに示すように、ＪＹ６はＣＴ２６腫瘍を有するＢＡＬＢ／ｃマウスの２０％（５匹中１匹）の肝臓で検出され、ＪＹ１はどのマウスの肝臓でも検出されなかったが、ＭＧ１６５５のコロニー形成はマウスの６０％（５匹中３匹）の肝臓で発生した。これらは、ＪＹ１及びＪＹ６がＭＧ１６５５よりも腫瘍に特異的であり、ＪＹ１がＪＹ６よりも腫瘍に特異的であることを示した。
【００６３】
さらなるプレーティング分析は、ＪＹ１が免疫適格性マウスの血液、及び脾臓、心臓、肺、腎臓などを含む臓器にも存在しなかったことを示した。ＪＹ１及びＪＹ６はＣＴ２６腫瘍にコロニーを形成する能力を示したが、ＪＹ１は、免疫適格性マウスにおいてＪＹ６よりも腫瘍の特異的標的化において優れていた。
【００６４】
皮下ＨＣＴ１１６（ヒト結腸直腸癌細胞株）腫瘍を保有する免疫不全ヌードマウスにおいて同様の実験を実施した。細菌（１０７ｃｆｕ／マウス）の尾静脈注射後の７日後、腫瘍及び肝臓における細菌の分布について分析した。図２Ｄは、ヌードマウスのＨＣＴ１１６腫瘍１グラム当たりのＣＦＵ２３０を示す。図２Ｄに示すように、ＪＹ１、ＪＹ６、及びＭＧ１６５５は、ヌードマウスのＨＣＴ１１６腫瘍にコロニーを形成した。図２Ｅは、ＨＣＴ１１６腫瘍を有するヌードマウスの肝臓１グラム当たりのＣＦＵ２４０を示す。図２Ｅに示すように、ＪＹ１は、ＨＣＴ１１６腫瘍を有するヌードマウスの肝臓にコロニーを形成しなかった。ＪＹ６は、ＭＧ１６５５よりも少ない程度にＨＣＴ１１６腫瘍を有するヌードマウスの肝臓にコロニーを形成した。図２Ｆは、ＨＣＴ１１６を有するヌードマウスにおける、ＪＹ１、ＪＹ６及びＭＧ１６５５がコロニー形成された肝臓の割合２５０を示す。図２Ｆに示すように、ＪＹ６及びＭＧ１６５５は、それぞれヌードマウスの２８．５７％（７匹中２匹）及び８５．７１％（７匹中６匹）の肝臓で検出された。再び、ＪＹ１はどのマウスの肝臓にも存在しなかった（ｎ＝６）。これらは、ＪＹ１及びＪＹ６がＭＧ１６５５よりも免疫不全マウスの腫瘍に特異的であり、ＪＹ１がＪＹ６よりも免疫不全マウスの腫瘍に特異的であることを示した。
【００６５】
ＪＹ１が正常組織に感染しなかったことを確認するために、細菌処理群の各マウスの血液と脾臓、心臓、肺、腎臓の均質化懸濁液をさらに検査した。これらの全ては、ＪＹ１が除去された。ＪＹ１は、臓器への感染を回避したが、ＨＣＴ１１６腫瘍に容易にコロニーを形成し、腫瘍におけるそのレベルは３．７９×１０７ｃｆｕ／ｇに達した（図２Ｄ）。まとめると、インビボデータは、細菌ＪＹ１及びＪＹ６によって保有される腫瘍標的化核酸システムが、免疫適格性マウスと免疫不全マウスの両方の固形腫瘍を特異的に標的とすることを可能にし、ＪＹ１が固形腫瘍を標的とする能力においてＪＹ６よりも優れていることを実証する。
【実施例４】
【００６６】
次に、ＪＹ１によって保有されるグルコース標的化核酸システムを大腸菌ＳＨ１の染色体に移植し、この核酸システムが特定の細菌株に限定されないことを示した。
【００６７】
健康な女性ボランティアによって提供された糞便試料から大腸菌ＳＨ１を分離した。糞便試料をＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）及びＸ−ｇａｌ（０．０６ｍｇ／ｍｌ）を補充したＬＢ寒天上に広げた。大腸菌は、青色コロニーを形成し、他の細菌種とは区別された。ＳＨ１は、糞便大腸菌分離株の１つである。株ＳＨ１は、寄託番号Ｎｏ．１４５８０でＣＧＭＣＣに寄託された。
【００６８】
得られた組換え大腸菌株をＪＹＨ１と称した。株ＪＹＨ１は、寄託番号Ｎｏ．１４５７９でＣＧＭＣＣに寄託された。
【００６９】
その後、皮下ＳＷ４８０（ヒト結腸直腸癌細胞株）腫瘍を保有するヌードマウスにＪＹＨ１を静脈内注射した。細菌の静脈内注射の９０日後に、腫瘍及び臓器における細菌のコロニー形成についてマウスを分析した。４匹のＪＹＨ１処置マウスの腫瘍が完全に治癒したため、この群では２つの腫瘍のみが分析に利用できた。ＪＹＨ１は、２つの腫瘍のうち１つから検出され、１グラム当たり１．８×１０８ｃｆｕに達した。
【００７０】
それは、モジュール又はヌクレオチドシステムが大腸菌ＳＨ１に導入されると、得られる株は腫瘍を標的とするだけでなく、腫瘍を治療できることを示している。
【００７１】
図３Ａ及び３Ｂは、大腸菌ＪＹＨ１がＳＷ４８０腫瘍を特異的に標的とし、ヌードマウスの正常組織にコロニーを形成しなかったが、腫瘍標的化ヌクレオチドシステムによって操作されていなかった同系株ＳＨ１  ｈｌｙは、腫瘍と正常組織の両方にコロニーを形成したことを示す。＊Ｐ＜０．０５。エラーバー、ＳＥＭ。
【００７２】
図３Ａは、ＳＷ４８０を有するヌードマウスの肝臓及び脾臓組織１グラム当たりのＣＦＵ３００を示す。図３Ｂは、ＪＨ１及びＳＨ１  ｈｌｙに感染した肝臓及び脾臓の割合３１０を示す。図３Ａ及び３Ｂに示すように、ＪＹＨ１は、肝臓又は脾臓にコロニーを形成しなかった。すべてのＪＹＨ１処置ヌードマウスの肝臓、脾臓、心臓、肺、腎臓は、ＪＹＨ１が除去されたが、これは、グルコース感知モジュールがＪＹＨ１を腫瘍に限定することができ、それが離れた臓器に拡散するのを長時間防ぐことができることを示した。ＪＹＨ１とは対照的に、グルコース感知モジュールを備えていないその同系株ＳＨ１  ｈｌｙは、腫瘍（９．３５×１０８±５．９７×１０８ｃｆｕ／ｇ、平均±ＳＥＭ）だけでなく臓器にもコロニーを形成した。ＳＨ１  ｈｌｙ処置マウス４匹（８０％、５匹中４匹）の肝臓（６．０×１０１０±６．０×１０１０ｃｆｕ／ｇ、平均±ＳＥＭ）及び脾臓（１．８５×１０５±９．７４×１０４ｃｆｕ／ｇ、平均±ＳＥＭ）は、８２日目に分析したときにＳＨ１  ｈｌｙに感染していた。
【００７３】
図３Ｃに示すように、感染したマウスのうち、１匹のマウスが肝膿瘍を発症した。分析のためにマウスを安楽死させた８２日目に、写真３２０を撮影した。
【００７４】
ＪＹＨ１の腫瘍特異性及びグルコース感知、腫瘍標的化核酸システムの要件も、肝臓切片３３０のヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色によって確認され、肝臓切片３３０は、図３Ｄ（スケールバー、２００μｍ）に示すように、ＪＹＨ１処置マウスの肝臓が正常であったが、ＳＨ１  ｈｌｙ処置マウスの肝臓で大量の炎症性浸潤と膿瘍が発生したことを示した。まとめると、これらのデータは、グルコース感知腫瘍標的化核酸システムがヌードマウスにおいてＪＹＨ１の腫瘍特異性を最適化することを実証している。
【実施例５】
【００７５】
免疫適格性マウスの腫瘍に特異的にコロニーを形成するＪＹＨ１の能力を試験した。ＣＴ２６腫瘍を保有する免疫適格性ＢＡＬＢ／ｃマウスにＪＹＨ１を静脈内投与した。細菌注射の１４日後、過剰な腫瘍増殖により全てのマウスを安楽死させた。図４は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの正常組織及びＣＴ２６腫瘍１グラム当たりのＣＦＵ４００を示す。均質化組織のプレーティング分析は、静脈内注射されたＪＹＨ１が、１４日齢の免疫適格性マウスの、肝臓、脾臓、心臓、肺、及び腎臓を含む試験された任意の臓器にコロニーを形成しなかったことを示した。対照的に、図４に示すように、腫瘍におけるＪＹＨ１のレベルは１グラム当たり４．６７×１０７ｃｆｕ（±１．６２×１０７ｃｆｕ／ｇ）に達した。これらは、ヌードマウスからのデータと一緒に、ＪＹＨ１が免疫システムの完全性にかかわらず固形腫瘍を特異的に標的とすることを実証している。
【００７６】
図５は、グルコース欠乏環境において選択的に増殖することによって固形腫瘍を標的とする遺伝子操作された細菌株を構築する方法５００を示す。
【００７７】
ブロック５１０は、核酸システムを細菌株に挿入することを示す。
【００７８】
例示的な実施形態では、核酸システムは、毒素をコードする第１のＤＮＡ断片と、毒素を無効にする解毒剤をコードする第２のＤＮＡ断片とを含む。核酸システムはさらに、第２のＤＮＡ断片の転写を制御する第１のプロモーターを含む。核酸システムはさらに、第１のＤＮＡ断片の構成的発現を引き起こす第１の構成的プロモーターを含む。
【００７９】
例示的な実施形態では、核酸システムは、毒素をコードする第１のＤＮＡ断片と、毒素を無効にする解毒剤をコードする第２のＤＮＡ断片とを含む。核酸システムはさらに、第１のＤＮＡ断片の転写を制御する第２のプロモーターを含む。核酸システムはさらに、第２のＤＮＡ断片の構成的発現を引き起こす第２の構成的プロモーターを含む。
【００８０】
例示的な実施形態では、毒素−解毒剤対は、ＣｃｄＢ−ＣｃｄＡ対を含むが、これに限定されない。ＡｖｒＲｘｏ１−Ａｒｃ１、Ｈｈａ−ＴｏｍＢ、ＰａａＡ２−ＰａｒＥ２のような他の毒素−解毒剤対を使用して、ＣｃｄＢ−ＣｃｄＡ対を置き換えることができる。例示的な実施形態では、第１のプロモーターは、ｌａｃプロモーターを含むが、これに限定されない。ｌａｃプロモーターは、ｇｌｔＡ、ｓｄｈＡＤＣ、又はｔｎａＢのプロモーターのような他のグルコースに抑制されるプロモーターに置き換えることができる。例示的な実施形態では、第２のプロモーターは、ｐｓｔＧのプロモーター、ｆｒｕＢのプロモーター、及びａｃｋＡのプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００８１】
例示的な実施形態では、５〜６個のヌクレオチドからなるランダム配列を挿入して、ｃｃｄＡ遺伝子の開始コドンのすぐ上流かつ第１のプロモーターの下流に位置する天然の５〜６個のヌクレオチドを置き換える。
【００８２】
例示的な実施形態では、５〜６個のヌクレオチドからなるランダム配列を挿入して、ｃｃｄＢ遺伝子の開始コドンのすぐ上流かつ第２のプロモーターの下流に位置する天然の５〜６個のヌクレオチドを置き換える。
【００８３】
ブロック５１２は、遺伝子操作された細菌株のクローンを培養することを示す。
【００８４】
例示的な実施形態では、核酸システムは、細菌株の染色体に移植される。例示的な実施形態では、核酸システムはプラスミドに移植され、プラスミドは細菌株に挿入される。例示的な実施形態では、細菌株は、大腸菌ＭＧ１６５５を含むが、これに限定されない。ＤＨ５αやＣＦＴ０７３などの他の大腸菌株、及びサルモネラ菌や赤痢菌などの他のグラム陰性細菌種を使用して、ＭＧ１６５５を置き換えることができる。例示的な実施形態では、核酸システムを含む細菌株のクローンは、グルコースを含むか又は含まないＬＢ寒天上で培養される。
【００８５】
ブロック５１４は、グルコースの非存在下で増殖するがグルコースの存在下では増殖しない前記クローンを選択することにより、前記腫瘍を標的とする前記遺伝子操作された細菌株を取得することを示す。
【００８６】
例示的な実施形態では、グルコースを含まないＬＢ寒天で増殖するが５ｍＭのグルコースを含むＬＢ寒天では増殖しないクローンは、腫瘍標的化細菌の潜在的候補として選択され特定される。
【００８７】
例示的な実施形態では、グルコースを含まないＭ６３寒天で増殖するが１〜４ｍＭのグルコース濃度では増殖しないクローンは、腫瘍標的化細菌の潜在的候補として確認される。
【００８８】
例示的な実施形態では、この方法は、核酸システムが第１のプロモーターを含む場合、５〜６個のヌクレオチドからなるランダム配列を挿入して、第２のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する天然ヌクレオチドを置き換えることによって、核酸システムのランダムライブラリを生成することをさらに含む。
【００８９】
例示的な実施形態では、この方法は、核酸システムが第２のプロモーターを含む場合、５〜６個のヌクレオチドからなるランダム配列を挿入して、第１のＤＮＡ断片のすぐ上流に位置する天然ヌクレオチドを置き換えることによって、核酸システムのランダムライブラリを生成することをさらに含む。
【実施例６】
【００９０】
この実施例は、大腸菌ＳＨ１が癌細胞株に対して細胞毒性があることを示す。ＳＷ４８０及びＨＣＴ１１６は結腸直腸癌細胞株である。ＡＳＰＣ−１、Ｍｉａ−ｃａｐａ−２、及びｐａｎｃ−１は膵臓癌細胞株である。各細胞株を、１００のｍｏｉで大腸菌株ＳＨ１又はＭＧ１６５５と共培養した。対照として、細胞株もＰＢＳ単独で共培養した。４時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１％クリスタルバイオレットで５分間染色した。染色した細胞を再び洗浄し、９５％エタノールで脱染色し、５７０ｎｍで測定した。共培養された細菌によって死滅させた細胞の割合を、式：（対照−処置）／対照×１００を用いて算出した。エラーバー、ＳＥＭ。＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【００９１】
ヒト癌細胞株に対する大腸菌ＳＨ１のインビトロ細胞毒性効果６００及び６０２は、図６Ａ及び６Ｂに示される。図６Ａは、大腸菌ＳＨ１がＳＷ４８０及びＨＣＴ１１６細胞に対して細胞毒性効果を有し、大腸菌ＭＧ１６５５がこれらの細胞に対して著しい細胞毒性効果を有さないことを示す。図６Ｂは、大腸菌ＳＨ１がＡＳＰＣ−１、Ｍｉａ−ｃａｐａ−２、及びｐａｎｃ−１細胞に対して細胞毒性効果を有し、大腸菌ＭＧ１６５５がこれらの細胞に対して著しい細胞毒性効果を有さないことを示す。
【実施例７】
【００９２】
本実施例では、インビボでの腫瘍増殖に対する静脈内注射された大腸菌ＪＹＨ１の阻害効果が評価された。
【００９３】
図７Ａは、ヌードマウスのＨＣＴ１１６腫瘍の増殖に対する静脈内注射された大腸菌ＪＹＨ１の阻害効果７００を示す。ＪＹＨ１の静脈内注射は、ヌードマウスのＨＣＴ１１６腫瘍の増殖を抑制した。対照的に、ＪＹ１は、ＰＢＳ対照と比較して、腫瘍増殖にほとんど影響を及ぼさなかった。ＪＹ１処置マウスのＨＣＴ１１６腫瘍はＰＢＳ処置対照の腫瘍と同様に増殖し、一方、ＪＹＨ１処置マウスのＨＣＴ１１６腫瘍は比較的ゆっくりと増殖し、かつそれらの５０％（１０匹中５匹）は細菌の静脈注射（１０７／マウス）の１８−２６日後に退縮し始めた。ＪＹＨ１は、１００％の試験されたマウス（ｎ＝１０）のＨＣＴ１１６腫瘍増殖に阻害効果を示し、ＪＹ１よりも著しく優れた抗腫瘍効果を示した（フィッシャーの正確確率検定、ｐ＜０．０００１）。
【００９４】
図７Ｂは、ヌードマウスのＳＷ４８０腫瘍の増殖に対する静脈内注射された大腸菌ＪＹＨ１の阻害効果の分析７０２を示す。図７Ｃは、０〜５５日齢のＰＢＳ処置マウスのＳＷ４８０腫瘍の代表的な写真７０４を示す。図７Ｄは、０〜９０日齢のＪＹＨ１処置マウスのＳＷ４８０腫瘍の代表的な写真７０６を示す。ＳＷ４８０腫瘍の増殖を９０日間にわたって監視した。ＪＹＨ１処置マウス（ｎ＝６）の腫瘍は、ＪＹＨ１の静脈内注射の２６〜５２日後に退縮し、有効率は１００％であった。これらのうち、６６．７％のマウス（６匹中４匹）の腫瘍は消失し、実験の終わりまで再発しなかった。残りの２匹のマウスのうち、１匹のマウスの腫瘍は治癒しなかったが、静止状態を維持した。１匹のマウスの腫瘍のみが再発した（１６．６７％、６匹中１匹）。対照的に、ＰＢＳ処置腫瘍はいずれも退縮も消失もしなかった。これらのデータは、ＪＹＨ１がインビボでの腫瘍増殖に著しい抑制効果を有することをさらに示した。
【００９５】
したがって、例示的な実施形態では、腫瘍細胞及び正常組織細胞の両方に対して毒性がある細菌は、腫瘍標的化核酸システムを備える場合、腫瘍に特異的になり、正常組織に影響を及ぼすことなく腫瘍増殖を抑制することができる。
【００９６】
本明細書で使用する場合、「処置」、「処理」又は「治療」という用語は、疾患又は疾病の症状を緩和、軽減又は改善する方法、さらなる症状を予防する方法、症状の原因となる代謝を改善又は予防する方法、疾患又は疾病を阻害する方法、疾患又は疾病の発症を阻止する方法、疾患又は疾病を緩和する方法、疾患又は疾病の退縮を引き起こす方法、疾患又は疾病によって起きる状態を緩和する方法、又は、疾患又は疾病の症状を予防的及び／又は治療的に停止する方法を指す。
【００９７】
本明細書で使用する場合、「すぐ」、「すぐ上流」、又は「すぐ下流」は、あるＤＮＡ断片と別のＤＮＡ断片との間に他のヌクレオチドがないことを意味する。
【００９８】
本明細書で使用する場合、「システム」は、毒素遺伝子、解毒剤遺伝子、及びそれらのそれぞれのプロモーターを含む組み合わせ又は遺伝子回路を指す。システムの毒素遺伝子及び解毒剤遺伝子は、任意の順序で配置することができる。システムの毒素遺伝子及び解毒剤遺伝子は、同じ分子内に、又は異なる分子内に位置することができる。例示的な実施形態では、毒素遺伝子及び解毒剤遺伝子の一方は細菌の染色体中にあってよく、他方の遺伝子は同じ細菌のプラスミド中にあってよい。
【符号の説明】
【００９９】
１００：核酸システム
１１２：矢印
１２０：薬物送達システム
１２２：細菌
１２４：抗癌薬
３３０：肝臓切片
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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