(57)【要約】  本明細書では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する第２の結合性ドメインとを含む多特異性（例えば、二特異性）結合性分子が提供される。さらに、本明細書では、このような結合性分子を作るための方法、ならびにアルファ−ジストログリカノパチーを処置および／または防止するための、このような結合性分子の使用が提供される。
2020510416.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも第１の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する少なくとも第２の結合性ドメインとを含む多特異性結合性分子。
【請求項２】
１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖を含む多特異性結合性タンパク質である、請求項１に記載の多特異性結合性分子。
【請求項３】
結合性タンパク質は、４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ  ［Ｉ］
により表される構造を含み、第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ［ＩＩ］
により表される構造を含み、第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ［ＩＩＩ］
により表される構造を含み、第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ  ［ＩＶ］
により表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、該ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、交差軽鎖−重鎖対を形成し；
ＶＨ１とＶＬ１は抗原結合性部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２は抗原結合性部位を形成し、ＶＨ３とＶＬ３は抗原結合性部位を形成し、合計で３つの抗原結合性部位となり、該３つの抗原結合性部位は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位と、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位とを含む、請求項２に記載の多特異性結合性分子。
【請求項４】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する１つの抗原結合性部位と、ラミニン２に結合する２つの抗原結合性部位とを含む、請求項３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項５】
ラミニン２に結合する２つの抗原結合性部位は、ラミニン２の異なるエピトープに結合する、請求項４に記載の多特異性結合性分子。
【請求項６】
ラミニン２に結合する２つの抗原結合性部位は、ラミニン２の同じエピトープに結合する、請求項４に記載の多特異性結合性分子。
【請求項７】
ＶＨ１とＶＬ１は、ラミニン２に結合する第１の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２は、ラミニン２に結合する第２の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ３とＶＬ３は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第３の抗原結合性部位を形成する、請求項４〜６のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項８】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する２つの抗原結合性部位と、ラミニン２に結合する１つの抗原結合性部位とを含む、請求項３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項９】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する２つの抗原結合性部位は、ジストログリカンの細胞外部分の異なるエピトープに結合する、請求項８に記載の多特異性結合性分子。
【請求項１０】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する２つの抗原結合性部位は、ジストログリカンの細胞外部分の同じエピトープに結合する、請求項８に記載の多特異性結合性分子。
【請求項１１】
ＶＨ１とＶＬ１は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第２の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ３とＶＬ３は、ラミニン２に結合する第３の抗原結合性部位を形成する、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項１２】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、多特異性結合性タンパク質の一部としてアッセイされた場合、ジストログリカンの細胞外部分に約１μＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合する、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項１３】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒトジストログリカンおよびマウスジストログリカンの細胞外部分に結合する、請求項３〜１２のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項１４】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ベータ−ジストログリカンに結合する、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項１５】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列ＳＩＶＶＥＷＴＮＮ  ＴＬＰＬＥＰＣＰＫＥ  ＱＩＩＧＬＳＲＲＩＡ  ＤＥＮＧＫＰＲＰＡＦ  ＳＮＡＬＥＰＤＦＫＡ  ＬＳＩＡＶＴＧＳＧＳ  ＣＲＨＬＱＦＩＰＶＡ  ＰＰＳＰＧＳＳＡＡＰ  ＡＴＥＶＰＤＲＤＰＥ  ＫＳＳＥＤＤ（配列番号２９０）を含むポリペプチドに結合する、請求項１４に記載の多特異性結合性分子。
【請求項１６】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列ＳＩＶＶＥＷＴ  ＮＮＴＬＰＬＥＰＣＰ  ＫＥＱＩＡＧＬＳＲＲ  ＩＡＥＤＤＧＫＰＲＰ  ＡＦＳＮＡＬＥＰＤＦ  ＫＡＴＳＩＴＶＴＧＳ  ＧＳＣＲＨＬＱＦＩＰ  ＶＶＰＰＲＲＶＰＳＥ  ＡＰＰＴＥＶＰＤＲＤ  ＰＥＫＳＳＥＤＤＶ（配列番号２９１）を含むポリペプチドに結合する、請求項１４または請求項１５に記載の多特異性結合性分子。
【請求項１７】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、アルファ−ジストログリカンに結合する、請求項３〜１３のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項１８】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列ＳＩＶＶＥＷＴ  ＮＮＴＬＰＬＥＰＣＰ  ＫＥＱＩＡＧＬＳＲＲ  ＩＡＥＤＤＧＫＰＲＰ  ＡＦＳＮＡＬＥＰＤＦ  ＫＡＴＳＩＴＶＴＧＳ  ＧＳＣＲＨＬＱＦＩＰ  ＶＶＰＰＲＲＶＰＳＥ  ＡＰＰＴＥＶＰＤＲＤ  ＰＥＫＳＳＥＤＤＶ（配列番号２９１）を含むポリペプチドに結合する、請求項１７に記載の多特異性結合性分子。
【請求項１９】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒトラミニン２に結合する、請求項３〜１８のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項２０】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、多特異性結合性タンパク質の一部としてアッセイされた場合、ヒトラミニン２に約１μＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合する、請求項１９に記載の多特異性結合性分子。
【請求項２１】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、マウスラミニン２およびヒトラミニン２に結合する、請求項３〜２０のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項２２】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン４、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５、または両方を含むポリペプチドに結合する、請求項３〜２１のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項２３】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン４およびラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５を含むポリペプチドに結合する、請求項２２に記載の多特異性結合性分子。
【請求項２４】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列ＶＱＰＱＰＶ  ＰＴＰＡＦＰＦＰＡＰ  ＴＭＶＨＧＰＣＶＡＥ  ＳＥＰＡＬＬＴＧＳＫ  ＱＦＧＬＳＲＮＳＨＩ  ＡＩＡＦＤＤＴＫＶＫ  ＮＲＬＴＩＥＬＥＶＲ  ＴＥＡＥＳＧＬＬＦＹ  ＭＡＲＩＮＨＡＤＦＡ  ＴＶＱＬＲＮＧＦＰＹ  ＦＳＹＤＬＧＳＧＤＴ  ＳＴＭＩＰＴＫＩＮＤ  ＧＱＷＨＫＩＫＩＶＲ  ＶＫＱＥＧＩＬＹＶＤ  ＤＡＳＳＱＴＩＳＰＫ  ＫＡＤＩＬＤＶＶＧＩ  ＬＹＶＧＧＬＰＩＮＹ  ＴＴＲＲＩＧＰＶＴＹ  ＳＬＤＧＣＶＲＮＬＨ  ＭＥＱＡＰＶＤＬＤＱ  ＰＴＳＳＦＨＶＧＴＣ  ＦＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号３００）を含むポリペプチドに結合する、請求項２３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項２５】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列Ｑ  ＰＥＰＶＰＴＰＡＦＰ  ＴＰＴＰＶＬＴＨＧＰ  ＣＡＡＥＳＥＰＡＬＬ  ＩＧＳＫＱＦＧＬＳＲ  ＮＳＨＩＡＩＡＦＤＤ  ＴＫＶＫＮＲＬＴＩＥ  ＬＥＶＲＴＥＡＥＳＧ  ＬＬＦＹＭＡＲＩＮＨ  ＡＤＦＡＴＶＱＬＲＮ  ＧＬＰＹＦＳＹＤＬＧ  ＳＧＤＴＨＴＭＩＰＴ  ＫＩＮＤＧＱＷＨＫＩ  ＫＩＭＲＳＫＱＥＧＩ  ＬＹＶＤＧＡＳＮＲＴ  ＩＳＰＫＫＡＤＩＬＤ  ＶＶＧＭＬＹＶＧＧＬ  ＰＩＮＹＴＴＲＲＩＧ  ＰＶＴＹＳＩＤＧＣＶ  ＲＮＬＨＭＡＥＡＰＡ  ＤＬＥＱＰＴＳＳＦＨ  ＶＧＴＣＦＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号３０１）を含むポリペプチドに結合する、請求項２３または請求項２４に記載の多特異性結合性分子。
【請求項２６】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５を含むポリペプチドに結合する、請求項２２に記載の多特異性結合性分子。
【請求項２７】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列ＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号２９２）を含むポリペプチドに結合する、請求項２６に記載の多特異性結合性分子。
【請求項２８】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列ＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号２９３）を含むポリペプチドに結合する、請求項２６または請求項２７に記載の多特異性結合性分子。
【請求項２９】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、
（ａ）配列番号１〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１８〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；
（ｂ）配列番号２８〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４３〜５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項３０】
（ａ）ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、および１８８からなる群から選択される配列を含み；
（ｂ）ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、および１８９からなる群から選択される配列を含む、
請求項２９に記載の多特異性結合性分子。
【請求項３１】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、
（ａ）配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；
（ｂ）配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む、請求項３〜１１のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項３２】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインを含む、請求項３１に記載の多特異性結合性分子。
【請求項３３】
（ａ）ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号３１４の配列を含み；
（ｂ）ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号３３０の配列を含む、
請求項３１または請求項３２に記載の多特異性結合性分子。
【請求項３４】
（ａ）ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号３４６の配列を含み；
（ｂ）ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号３６２の配列を含む、
請求項３１または請求項３２に記載の多特異性結合性分子。
【請求項３５】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、
（ａ）配列番号５１〜５５および８１〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６〜６０および９６〜１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６１〜６５および１１１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；
（ｂ）配列番号６６〜７０および１２６〜１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８、７１〜７５、および１４１〜１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号７６〜８０および１５５〜１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む、請求項３〜１１または請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項３６】
（ａ）ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、および２２８からなる群から選択される配列を含み；
（ｂ）ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、および２２９からなる群から選択される配列を含む、
請求項３５に記載の多特異性結合性タンパク質。
【請求項３７】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、
（ａ）配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；
（ｂ）配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む、請求項３〜１１または請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項３８】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインを含む、請求項３７に記載の多特異性結合性分子。
【請求項３９】
（ａ）ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号３７８の配列を含み；
（ｂ）ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号３９４の配列を含む、
請求項３７または請求項３８に記載の多特異性結合性分子。
【請求項４０】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、
（ａ）配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；
（ｂ）配列番号４２８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む、請求項３〜１１または請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項４１】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインを含む、請求項４０に記載の多特異性結合性分子。
【請求項４２】
（ａ）ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号４１０の配列を含み；
（ｂ）ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号４２６の配列を含む、
請求項４０または請求項４１に記載の多特異性結合性分子。
【請求項４３】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、
（ａ）配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；
（ｂ）配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む、請求項３〜１１または請求項２９〜３４のいずれか１項いずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項４４】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインを含む、請求項４３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項４５】
（ａ）ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号４４２の配列を含み；
（ｂ）ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号４５８の配列を含む、
請求項４３または請求項４４に記載の多特異性結合性分子。
【請求項４６】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、
（ａ）配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；
（ｂ）配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と
を含む、請求項３〜１１または請求項２９〜３４のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項４７】
ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインを含む、請求項４６に記載の多特異性結合性分子。
【請求項４８】
（ａ）ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号４７４の配列を含み；
（ｂ）ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号４９０の配列を含む、
請求項４６または請求項４７に記載の多特異性結合性分子。
【請求項４９】
ＶＨ１は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；
ＶＨ２は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；
ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、
請求項３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項５０】
ＶＨ１は配列番号３７８の配列を含み、ＶＬ１は配列番号３９４の配列を含み；
ＶＨ２は配列番号３７８の配列を含み、ＶＬ２は配列番号３９４の配列を含み；
ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む、
請求項４９に記載の多特異性結合性分子。
【請求項５１】
ＶＨ１は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；
ＶＨ２は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ２は、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；
ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、
請求項３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項５２】
ＶＨ１は配列番号３７８の配列を含み、ＶＬ１は配列番号３９４の配列を含み；
ＶＨ２は配列番号４４２の配列を含み、ＶＬ２は配列番号４５８の配列を含み；
ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む、
請求項５１に記載の多特異性結合性分子。
【請求項５３】
ＶＨ１は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号４２８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；
ＶＨ２は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ２は、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；
ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、
請求項３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項５４】
ＶＨ１は配列番号４１０の配列を含み、ＶＬ１は配列番号４２６の配列を含み；
ＶＨ２は配列番号４７４の配列を含み、ＶＬ２は配列番号４９０の配列を含み；
ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む、
請求項５３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項５５】
ＶＨ１は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；
ＶＨ２は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ２は、配列番号４２８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；
ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、
請求項３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項５６】
ＶＨ１は配列番号４４２の配列を含み、ＶＬ１は配列番号４５８の配列を含み；
ＶＨ２は配列番号４１０の配列を含み、ＶＬ２は配列番号４２６の配列を含み；
ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む、
請求項５５に記載の多特異性結合性分子。
【請求項５７】
ＶＨ１は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；
ＶＨ２は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ２は、配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；
ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、
請求項３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項５８】
ＶＨ１は配列番号４７４の配列を含み、ＶＬ１は配列番号４９０の配列を含み；
ＶＨ２は配列番号３７８の配列を含み、ＶＬ２は配列番号３９４の配列を含み；
ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む、
請求項５７に記載の多特異性結合性分子。
【請求項５９】
Ｌ１およびＬ２は、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む、請求項３〜５８のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項６０】
Ｌ３およびＬ４は、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む、請求項３〜５８のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項６１】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む、請求項３〜５８のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項６２】
第２のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである、請求項３〜６１のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項６３】
第２のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである、請求項３〜６１のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項６４】
第２および第３のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ３ドメインであり、該ＣＨ３ドメインのうちの１つだけが、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４３５および４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、該アミノ酸置換は、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである、請求項３〜６３のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項６５】
第２および第３のポリペプチド鎖のＣＨ２ドメインは、ＥＵインデックスに従って番号付けして、２９７位にアスパラギン残基、２９８位にアスパラギン残基、２９９位にアラニン残基、および３００位にセリン残基またはトレオニン残基を含む、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２ドメインである、請求項３〜６４のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項６６】
第２および第３のポリペプチド鎖のＣＨ２ドメインは、ＥＵインデックスに従って番号付けして、２５２位にチロシン残基、２５４位にトレオニン残基、および２５６位にグルタミン酸残基を含む、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２ドメインである、請求項３〜６５のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子。
【請求項６７】
第１のポリペプチド鎖は配列番号５００の配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号４９８の配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号４９９の配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号５０１の配列を含む、請求項３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項６８】
第１のポリペプチド鎖は配列番号５０４の配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号５０２の配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号５０３の配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号５０５の配列を含む、請求項３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項６９】
第１のポリペプチド鎖は配列番号５０８の配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号５０６の配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号５０７の配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号５０９の配列を含む、請求項３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項７０】
第１のポリペプチド鎖は配列番号５１２の配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号５１０の配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号５１１の配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号５１３の配列を含む、請求項３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項７１】
第１のポリペプチド鎖は配列番号５１６の配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号５１４の配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号５１５の配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号５１７の配列を含む、請求項３に記載の多特異性結合性分子。
【請求項７２】
（ａ）第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、第１のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンの第１のＦｃ領域とを含む第１の抗体重鎖、および第１の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む第１の抗体軽鎖であって、該第１のＶＨおよびＶＬドメインは、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の抗原結合性ドメインを形成する、第１の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖と、
（ｂ）第２の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、第２のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンの第２のＦｃ領域とを含む第２の抗体重鎖、および第２の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む第２の抗体軽鎖であって、該第２のＶＨおよびＶＬドメインは、ラミニン２に結合する第２の抗原結合性ドメインを形成する、第２の抗体重鎖および第２の抗体軽鎖と
を含み、
前記第１と第２のＣＨ３領域の配列は異なり、前記第１と第２のＣＨ３領域の間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１と第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々より強くなるような配列であり、前記第１のホモ二量体タンパク質は、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ、またはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、前記第２のホモ二量体タンパク質は、３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、および４０７からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、かつ／または前記第１および第２のＣＨ３領域の配列は、該ＣＨ３領域の各々のホモ二量体相互作用の解離定数が、０．０１〜１０マイクロモルの間であるような配列である、
請求項１または請求項２に記載の多特異性結合性分子。
【請求項７３】
第１の抗体重鎖は配列番号５１８の配列を含み、第２の抗体重鎖は配列番号５１９の配列を含み、第１の抗体軽鎖は配列番号５２０の配列を含み、第２の抗体軽鎖は配列番号５２１の配列を含む、請求項７２に記載の多特異性結合性分子。
【請求項７４】
請求項１〜７３のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項７５】
請求項７４に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項７６】
請求項７４に記載の核酸分子を含む単離宿主細胞。
【請求項７７】
請求項７５に記載の発現ベクターを含む単離宿主細胞。
【請求項７８】
請求項３に記載の多特異性結合性分子の第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖をコードする１つまたはそれ以上のベクターを含むベクター系。
【請求項７９】
請求項７８に記載のベクター系を含む単離宿主細胞。
【請求項８０】
多特異性結合性分子を作製する方法であって、
ａ）請求項７６、７７、および７９のいずれか１項に記載の宿主細胞を、該宿主細胞が該多特異性結合性分子を発現するような条件下で培養する工程と；
ｂ）該多特異性結合性分子を該宿主細胞から単離する工程と
を含む前記方法。
【請求項８１】
個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーを処置または防止するための方法であって、該個体に、請求項１〜７３のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子を投与する工程を含む前記方法。
【請求項８２】
個体におけるラミニン２とジストログリカンの細胞外部分との連結をもたらすための方法であって、該個体に、請求項１〜７３のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子を投与する工程を含む前記方法。
【請求項８３】
個体は、アルファ−ジストログリカンの発現が低減されている、請求項８１または請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
個体において発現するアルファ−ジストログリカンは、Ｏ−グリコシル化が、損なわれているか、または異常である、請求項８１または請求項８２に記載の方法。
【請求項８５】
個体は、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＴ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＰＯＭＴ２）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，２−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット１（ＰＯＭＧＮＴ１）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，４−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット２（ＰＯＭＧＮＴ２）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ１（ＬＡＲＧＥ１）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ２（ＬＡＲＧＥ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット１（ＤＰＭ１）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット２（ＤＰＭ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット３（ＤＰＭ３）、フクチン、フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）、イソプレノイドシンターゼドメイン含有（ＩＳＰＤ）、タンパク質Ｏ−マンノースキナーゼ（ＰＯＭＫ）、ベータ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ３ＧＡＬＮＴ２）、ベータ−１，４−グルクロニルトランスフェラーゼ１（Ｂ４ＧＡＴ１）、ドリコールキナーゼ（ＤＯＬＫ）、膜貫通タンパク質５（ＴＭＥＭ５）、およびＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼＢ（ＧＭＰＰＢ）からなる群から選択される遺伝子内に、突然変異を有する、請求項８１または請求項８２に記載の方法。
【請求項８６】
多特異性結合性分子は、静脈内注入を介して投与される、請求項８１〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
多特異性結合性分子は、筋内注射、腹腔内注射、または皮下注射を介して投与される、請求項８１〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８８】
個体は、ヒトである、請求項８１〜８７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８９】
請求項１〜７３のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項９０】
請求項１〜７３のいずれか１項に記載の多特異性結合性分子と、個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーの処置または防止における使用のための指示書とを含むキット。
【請求項９１】
個体は、アルファ−ジストログリカンの発現が低減されている、請求項９０に記載のキット。
【請求項９２】
個体において発現するアルファ−ジストログリカンは、Ｏ−グリコシル化が損なわれているか、または異常である、請求項９０に記載のキット。
【請求項９３】
個体は、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＴ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＰＯＭＴ２）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，２−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット１（ＰＯＭＧＮＴ１）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，４−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット２（ＰＯＭＧＮＴ２）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ１（ＬＡＲＧＥ１）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ２（ＬＡＲＧＥ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット１（ＤＰＭ１）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット２（ＤＰＭ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット３（ＤＰＭ３）、フクチン、フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）、イソプレノイドシンターゼドメイン含有（ＩＳＰＤ）、タンパク質Ｏ−マンノースキナーゼ（ＰＯＭＫ）、ベータ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ３ＧＡＬＮＴ２）、ベータ−１，４−グルクロニルトランスフェラーゼ１（Ｂ４ＧＡＴ１）、ドリコールキナーゼ（ＤＯＬＫ）、膜貫通タンパク質５（ＴＭＥＭ５）、およびＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼＢ（ＧＭＰＰＢ）からなる群から選択される遺伝子内に突然変異を有する、請求項９０に記載のキット。
【請求項９４】
個体は、ヒトである、請求項９０〜９３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項９５】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する第２の結合性ドメインとを含む二特異性結合性分子であって、該二特異性結合性分子は、１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖を含む二特異性結合性タンパク質であり、該二特異性結合性分子は、４つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、２つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−Ｌ２−ＣＬ  ［Ｉ］
により表される構造を含み、２つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ２−Ｌ３−ＶＨ１−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ［ＩＩ］
により表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、該ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
該ＶＨ１ドメインおよびＶＬ１ドメインは、ＶＨ１／ＶＬ１結合対を形成し、該ＶＨ２ドメインおよびＶＬ２ドメインは、ＶＨ２を形成する、前記二特異性結合性分子。
【請求項９６】
ＶＨ１ドメインとＶＬ１ドメインは、交差してＶＨ１／ＶＬ１結合対を形成する、請求項９５に記載の二特異性結合性分子。
【請求項９７】
ＶＨ２ドメインとＶＬ２ドメインは、交差してＶＨ２／ＶＬ２結合対を形成する、請求項９５に記載の二特異性結合性分子。
【請求項９８】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は各々、０〜５０アミノ酸残基の長さである、請求項９５〜９７のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項９９】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は各々、０〜２５アミノ酸残基の長さである、請求項９８に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１００】
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は各々、０〜１４アミノ酸残基の長さである、請求項９８または請求項９９に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１０１】
Ｌ１は、５アミノ酸残基の長さであり；
Ｌ２は、５アミノ酸残基の長さであり；
Ｌ３は、５アミノ酸残基の長さであり；
Ｌ４は、５アミノ酸残基の長さである、
請求項９８〜１００のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１０２】
Ｌ１は、１４アミノ酸残基の長さであり；
Ｌ２は、２アミノ酸残基の長さであり；
Ｌ３は、１４アミノ酸残基の長さであり；
Ｌ４は、２アミノ酸残基の長さである、
請求項９８〜１００のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１０３】
Ｌ１およびＬ３は各々、配列ＥＰＫＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ（配列番号２９６）を含み、Ｌ２およびＬ４は各々、配列ＧＧを含む、請求項１０２に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１０４】
Ｌ１は、７アミノ酸残基の長さであり；
Ｌ２は、５アミノ酸残基の長さであり；
Ｌ３は、１アミノ酸残基の長さであり；
Ｌ４は、２アミノ酸残基の長さである、
請求項９８〜１００のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１０５】
Ｌ１は、配列ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号２９７）を含み；
Ｌ２は、配列ＴＫＧＰＳ（配列番号２９８）を含み；
Ｌ３は、セリン残基を含み；
Ｌ４は、配列ＲＴを含む、
請求項１０４に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１０６】
Ｌ１は、１０アミノ酸残基の長さであり；
Ｌ２は、１０アミノ酸残基の長さであり；
Ｌ３は、０アミノ酸残基の長さであり；
Ｌ４は、０アミノ酸残基の長さである、
請求項９８〜１００のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１０７】
Ｌ１およびＬ２は各々、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号２９９）を含む、請求項１０６に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１０８】
式Ｉおよび／または式ＩＩのポリペプチドの可変ドメインの一方または両方は、ヒト可変ドメイン、ヒト化可変ドメイン、またはマウス可変ドメインである、請求項９５〜１０７のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１０９】
ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する第２の結合性ドメインとを含む二特異性結合性分子であって、該二特異性結合性分子は、１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖を含む二特異性結合性タンパク質であり、該二特異性結合性分子は、式：
ＶＬ１−Ｌ５−ＶＬ２−Ｌ６−ＣＬ  ［ＩＩＩ］
により表される構造を含む２つの軽鎖と、式：
ＶＨ１−Ｌ７−ＶＨ２−Ｌ８−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ［ＩＶ］
により表される構造を含む２つの重鎖とを含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、該ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、およびＬ８は、アミノ酸リンカーであり；
該ＶＨ１ドメインおよびＶＬ１ドメインは、ＶＨ１／ＶＬ１結合対を形成し、該ＶＨ２ドメインおよびＶＬ２ドメインは、ＶＨ２を形成する、前記二特異性結合性分子。
【請求項１１０】
Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、およびＬ８は各々、０〜５０アミノ酸残基の長さである、請求項１０９に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１１１】
Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、およびＬ８は各々、０〜２５アミノ酸残基の長さである、請求項１０９または請求項１１０に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１１２】
Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、およびＬ８は各々、０〜１４アミノ酸残基の長さである、請求項１０９〜１１１のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１１３】
Ｌ５およびＬ７リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのアミノ酸配列（配列番号）を含み、Ｌ６およびＬ８リンカーは各々、０アミノ酸残基の長さである、請求項１０９〜１１２のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１１４】
式ＩＩおよび／または式ＩＶのポリペプチドの可変ドメインの一方または両方は、ヒト可変ドメイン、ヒト化可変ドメイン、またはマウス可変ドメインである、請求項１０９〜１１３のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１１５】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２に結合する、請求項９５〜１１４のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１１６】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ヒトジストログリカンの細胞外部分に結合する、請求項１１５に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１１７】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ヒトジストログリカンの細胞外部分に約１μＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合する、請求項１１６に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１１８】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ヒトジストログリカンおよびマウスジストログリカンの細胞外部分に結合する、請求項１１５〜１１７のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１１９】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ベータ−ジストログリカンに結合する、請求項１１５〜１１８のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１２０】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、配列ＳＩＶＶＥＷＴＮＮ  ＴＬＰＬＥＰＣＰＫＥ  ＱＩＩＧＬＳＲＲＩＡ  ＤＥＮＧＫＰＲＰＡＦ  ＳＮＡＬＥＰＤＦＫＡ  ＬＳＩＡＶＴＧＳＧＳ  ＣＲＨＬＱＦＩＰＶＡ  ＰＰＳＰＧＳＳＡＡＰ  ＡＴＥＶＰＤＲＤＰＥ  ＫＳＳＥＤＤ（配列番号２９０）を含むポリペプチドに結合する、請求項１１９に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１２１】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、配列ＳＩＶＶＥＷＴ  ＮＮＴＬＰＬＥＰＣＰ  ＫＥＱＩＡＧＬＳＲＲ  ＩＡＥＤＤＧＫＰＲＰ  ＡＦＳＮＡＬＥＰＤＦ  ＫＡＴＳＩＴＶＴＧＳ  ＧＳＣＲＨＬＱＦＩＰ  ＶＶＰＰＲＲＶＰＳＥ  ＡＰＰＴＥＶＰＤＲＤ  ＰＥＫＳＳＥＤＤＶ（配列番号２９１）を含むポリペプチドに結合する、請求項１１９または請求項１２０に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１２２】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、アルファ−ジストログリカンに結合する、請求項１１５〜１１８のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１２３】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ヒトラミニン２に結合する、請求項１１５〜１２２のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１２４】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ヒトラミニン２に約１μＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合する、請求項１２３に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１２５】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、マウスラミニン２およびヒトラミニン２に結合する、請求項１１５〜１２４のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１２６】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン４、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５、または両方を含むポリペプチドに結合する、請求項１１５〜１２５のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１２７】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン４およびラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５を含むポリペプチドに結合する、請求項１２６に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１２８】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、配列ＶＱＰＱＰＶ  ＰＴＰＡＦＰＦＰＡＰ  ＴＭＶＨＧＰＣＶＡＥ  ＳＥＰＡＬＬＴＧＳＫ  ＱＦＧＬＳＲＮＳＨＩ  ＡＩＡＦＤＤＴＫＶＫ  ＮＲＬＴＩＥＬＥＶＲ  ＴＥＡＥＳＧＬＬＦＹ  ＭＡＲＩＮＨＡＤＦＡ  ＴＶＱＬＲＮＧＦＰＹ  ＦＳＹＤＬＧＳＧＤＴ  ＳＴＭＩＰＴＫＩＮＤ  ＧＱＷＨＫＩＫＩＶＲ  ＶＫＱＥＧＩＬＹＶＤ  ＤＡＳＳＱＴＩＳＰＫ  ＫＡＤＩＬＤＶＶＧＩ  ＬＹＶＧＧＬＰＩＮＹ  ＴＴＲＲＩＧＰＶＴＹ  ＳＬＤＧＣＶＲＮＬＨ  ＭＥＱＡＰＶＤＬＤＱ  ＰＴＳＳＦＨＶＧＴＣ  ＦＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号３００）を含むポリペプチドに結合する、請求項１２６に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１２９】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、配列Ｑ  ＰＥＰＶＰＴＰＡＦＰ  ＴＰＴＰＶＬＴＨＧＰ  ＣＡＡＥＳＥＰＡＬＬ  ＩＧＳＫＱＦＧＬＳＲ  ＮＳＨＩＡＩＡＦＤＤ  ＴＫＶＫＮＲＬＴＩＥ  ＬＥＶＲＴＥＡＥＳＧ  ＬＬＦＹＭＡＲＩＮＨ  ＡＤＦＡＴＶＱＬＲＮ  ＧＬＰＹＦＳＹＤＬＧ  ＳＧＤＴＨＴＭＩＰＴ  ＫＩＮＤＧＱＷＨＫＩ  ＫＩＭＲＳＫＱＥＧＩ  ＬＹＶＤＧＡＳＮＲＴ  ＩＳＰＫＫＡＤＩＬＤ  ＶＶＧＭＬＹＶＧＧＬ  ＰＩＮＹＴＴＲＲＩＧ  ＰＶＴＹＳＩＤＧＣＶ  ＲＮＬＨＭＡＥＡＰＡ  ＤＬＥＱＰＴＳＳＦＨ  ＶＧＴＣＦＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号３０１）を含むポリペプチドに結合する、請求項１２７または請求項１２８に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１３０】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５を含むポリペプチドに結合する、請求項１２６に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１３１】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、配列ＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号２９２）を含むポリペプチドに結合する、請求項１３０に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１３２】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、配列ＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号２９３）を含むポリペプチドに結合する、請求項１３０または請求項１３１に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１３３】
ＶＨ１ドメインは、配列番号１〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１８〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ１ドメインは、配列番号２８〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４３〜５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、請求項１１５に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１３４】
ＶＨ１ドメインは、配列番号１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、および１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３３に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１３５】
ＶＬ１ドメインは、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、および１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３３または請求項１３４に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１３６】
ＶＨ１ドメインは、配列番号２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、および２４８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、請求項１３３に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１３７】
ＶＬ１ドメインは、配列番号２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、および２４９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、請求項１３３または請求項１３６に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１３８】
ＶＨ２ドメインは、配列番号５１〜５５および８１〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６〜６０および９６〜１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６１〜６５および１１１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ２ドメインは、配列番号６６〜７０および１２６〜１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８、７１〜７５、および１４１〜１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号７６〜８０および１５５〜１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、請求項１１５および１３３〜１３７のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１３９】
ＶＨ２ドメインは、配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、および２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３８に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１４０】
ＶＬ２ドメインは、配列番号１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、および２２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１３８または請求項１３９に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１４１】
ＶＨ２ドメインは、配列番号２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、および２８８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、請求項１３８に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１４２】
ＶＬ２ドメインは、配列番号２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、および２８９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、請求項１３８または請求項１４１に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１４３】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２に結合し、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する、請求項９５〜１１４のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１４４】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ヒトジストログリカンの細胞外部分に結合する、請求項１４３に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１４５】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ヒトジストログリカンの細胞外部分に約１μＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合する、請求項１４４に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１４６】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ヒトジストログリカンおよびマウスジストログリカンの細胞外部分に結合する、請求項１４３〜１４５のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１４７】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ベータ−ジストログリカンに結合する、請求項１４３〜１４６のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１４８】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、配列ＳＩＶＶＥＷＴＮＮ  ＴＬＰＬＥＰＣＰＫＥ  ＱＩＩＧＬＳＲＲＩＡ  ＤＥＮＧＫＰＲＰＡＦ  ＳＮＡＬＥＰＤＦＫＡ  ＬＳＩＡＶＴＧＳＧＳ  ＣＲＨＬＱＦＩＰＶＡ  ＰＰＳＰＧＳＳＡＡＰ  ＡＴＥＶＰＤＲＤＰＥ  ＫＳＳＥＤＤ（配列番号２９０）を含むポリペプチドに結合する、請求項１４７に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１４９】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、配列ＳＩＶＶＥＷＴ  ＮＮＴＬＰＬＥＰＣＰ  ＫＥＱＩＡＧＬＳＲＲ  ＩＡＥＤＤＧＫＰＲＰ  ＡＦＳＮＡＬＥＰＤＦ  ＫＡＴＳＩＴＶＴＧＳ  ＧＳＣＲＨＬＱＦＩＰ  ＶＶＰＰＲＲＶＰＳＥ  ＡＰＰＴＥＶＰＤＲＤ  ＰＥＫＳＳＥＤＤＶ（配列番号２９１）を含むポリペプチドに結合する、請求項１４７または請求項１４８に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１５０】
ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、アルファ−ジストログリカンに結合する、請求項１４３〜１４６のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１５１】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ヒトラミニン２に結合する、請求項１４３〜１５０のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１５２】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ヒトラミニン２に約１μＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合する、請求項１５１に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１５３】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、マウスラミニン２およびヒトラミニン２に結合する、請求項１４３〜１５２のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１５４】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン４、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５、または両方を含むポリペプチドに結合する、請求項１４３〜１５３のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１５５】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン４およびラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５を含むポリペプチドに結合する、請求項１５４に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１５６】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、配列ＶＱＰＱＰＶ  ＰＴＰＡＦＰＦＰＡＰ  ＴＭＶＨＧＰＣＶＡＥ  ＳＥＰＡＬＬＴＧＳＫ  ＱＦＧＬＳＲＮＳＨＩ  ＡＩＡＦＤＤＴＫＶＫ  ＮＲＬＴＩＥＬＥＶＲ  ＴＥＡＥＳＧＬＬＦＹ  ＭＡＲＩＮＨＡＤＦＡ  ＴＶＱＬＲＮＧＦＰＹ  ＦＳＹＤＬＧＳＧＤＴ  ＳＴＭＩＰＴＫＩＮＤ  ＧＱＷＨＫＩＫＩＶＲ  ＶＫＱＥＧＩＬＹＶＤ  ＤＡＳＳＱＴＩＳＰＫ  ＫＡＤＩＬＤＶＶＧＩ  ＬＹＶＧＧＬＰＩＮＹ  ＴＴＲＲＩＧＰＶＴＹ  ＳＬＤＧＣＶＲＮＬＨ  ＭＥＱＡＰＶＤＬＤＱ  ＰＴＳＳＦＨＶＧＴＣ  ＦＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号３００）を含むポリペプチドに結合する、請求項１５５に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１５７】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、配列Ｑ  ＰＥＰＶＰＴＰＡＦＰ  ＴＰＴＰＶＬＴＨＧＰ  ＣＡＡＥＳＥＰＡＬＬ  ＩＧＳＫＱＦＧＬＳＲ  ＮＳＨＩＡＩＡＦＤＤ  ＴＫＶＫＮＲＬＴＩＥ  ＬＥＶＲＴＥＡＥＳＧ  ＬＬＦＹＭＡＲＩＮＨ  ＡＤＦＡＴＶＱＬＲＮ  ＧＬＰＹＦＳＹＤＬＧ  ＳＧＤＴＨＴＭＩＰＴ  ＫＩＮＤＧＱＷＨＫＩ  ＫＩＭＲＳＫＱＥＧＩ  ＬＹＶＤＧＡＳＮＲＴ  ＩＳＰＫＫＡＤＩＬＤ  ＶＶＧＭＬＹＶＧＧＬ  ＰＩＮＹＴＴＲＲＩＧ  ＰＶＴＹＳＩＤＧＣＶ  ＲＮＬＨＭＡＥＡＰＡ  ＤＬＥＱＰＴＳＳＦＨ  ＶＧＴＣＦＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号３０１）を含むポリペプチドに結合する、請求項１５５または請求項１５６に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１５８】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５を含むポリペプチドに結合する、請求項１５４に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１５９】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、配列ＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号２９２）を含むポリペプチドに結合する、請求項１５８に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１６０】
ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、配列ＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号２９３）を含むポリペプチドに結合する、請求項１５８または請求項１５９に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１６１】
ＶＨ２ドメインは、配列番号１〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１８〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ２ドメインは、配列番号２８〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４３〜５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、請求項１４３に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１６２】
ＶＨ２ドメインは、配列番号１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、および１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６１に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１６３】
ＶＬ２ドメインは、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、および１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６１または請求項１６２に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１６４】
ＶＨ２ドメインは、配列番号２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、および２４８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、請求項１６１に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１６５】
ＶＬ２ドメインは、配列番号２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、および２４９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、請求項１６１または請求項１６４に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１６６】
ＶＨ１ドメインは、配列番号５１〜５５および８１〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６〜６０および９６〜１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６１〜６５および１１１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ１ドメインは、配列番号６６〜７０および１２６〜１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８、７１〜７５、および１４１〜１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号７６〜８０および１５５〜１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、請求項１４３および１６１〜１６５のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１６７】
ＶＨ２ドメインは、配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、および２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６６に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１６８】
ＶＬ２ドメインは、配列番号１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、および２２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６６または請求項１６７に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１６９】
ＶＨ２ドメインは、配列番号２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、および２８８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、請求項１６６に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１７０】
ＶＬ２ドメインは、配列番号２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、および２８９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる、請求項１６６または請求項１６９に記載の二特異性結合性分子。
【請求項１７１】
請求項９５〜１７０のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子。
【請求項１７２】
請求項１７１に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項１７３】
請求項１７１に記載の核酸分子を含む単離宿主細胞。
【請求項１７４】
請求項１７２に記載の発現ベクターを含む単離宿主細胞。
【請求項１７５】
請求項９５に記載の二特異性結合性分子の第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖をコードする１つまたはそれ以上のベクターを含むベクター系。
【請求項１７６】
請求項１０９に記載の二特異性結合性分子の２つの軽鎖および２つの重鎖をコードする１つまたはそれ以上のベクターを含むベクター系。
【請求項１７７】
請求項１７５または請求項１７６に記載のベクター系を含む単離宿主細胞。
【請求項１７８】
二特異性結合性分子を作製する方法であって、
ａ）請求項１７３、１７４、および１７７のいずれか１項に記載の宿主細胞を、該宿主細胞が該二特異性結合性分子を発現するような条件下で培養する工程と；
ｂ）該二特異性結合性分子を該宿主細胞から単離する工程と
を含む前記方法。
【請求項１７９】
個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーを処置または防止するための方法であって、該個体に、請求項９５〜１７０のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子を投与する工程を含む前記方法。
【請求項１８０】
個体におけるラミニン２とジストログリカンの細胞外部分との連結をもたらすための方法であって、該個体に、請求項９５〜１７０のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子を投与する工程を含む前記方法。
【請求項１８１】
個体は、アルファ−ジストログリカンの発現が低減されている、請求項１７９または請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８２】
個体において発現するアルファ−ジストログリカンは、Ｏ−グリコシル化が損なわれているか、または異常である、請求項１７９または請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８３】
個体は、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＴ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＰＯＭＴ２）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，２−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット１（ＰＯＭＧＮＴ１）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，４−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット２（ＰＯＭＧＮＴ２）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ１（ＬＡＲＧＥ１）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ２（ＬＡＲＧＥ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット１（ＤＰＭ１）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット２（ＤＰＭ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット３（ＤＰＭ３）、フクチン、フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）、イソプレノイドシンターゼドメイン含有（ＩＳＰＤ）、タンパク質Ｏ−マンノースキナーゼ（ＰＯＭＫ）、ベータ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ３ＧＡＬＮＴ２）、ベータ−１，４−グルクロニルトランスフェラーゼ１（Ｂ４ＧＡＴ１）、ドリコールキナーゼ（ＤＯＬＫ）、膜貫通タンパク質５（ＴＭＥＭ５）、およびＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼＢ（ＧＭＰＰＢ）からなる群から選択される遺伝子内に突然変異を有する、請求項１７９または請求項１８０に記載の方法。
【請求項１８４】
二特異性結合性分子は、静脈内注入を介して投与される、請求項１７９〜１８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８５】
二特異性結合性分子は、筋内注射、腹腔内注射、または皮下注射を介して投与される、請求項１７９〜１８３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８６】
個体は、ヒトである、請求項１７９〜１８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８７】
請求項９５〜１７０のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１８８】
請求項９５〜１７０のいずれか１項に記載の二特異性結合性分子と、個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーの処置または防止における使用のための指示書とを含むキット。
【請求項１８９】
個体は、アルファ−ジストログリカンの発現が低減されている、請求項１８８に記載のキット。
【請求項１９０】
個体において発現するアルファ−ジストログリカンは、Ｏ−グリコシル化が損なわれているか、または異常である、請求項１８８に記載のキット。
【請求項１９１】
個体は、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＴ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＰＯＭＴ２）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，２−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット１（ＰＯＭＧＮＴ１）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，４−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット２（ＰＯＭＧＮＴ２）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ１（ＬＡＲＧＥ１）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ２（ＬＡＲＧＥ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット１（ＤＰＭ１）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット２（ＤＰＭ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット３（ＤＰＭ３）、フクチン、フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）、イソプレノイドシンターゼドメイン含有（ＩＳＰＤ）、タンパク質Ｏ−マンノースキナーゼ（ＰＯＭＫ）、ベータ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ３ＧＡＬＮＴ２）、ベータ−１，４−グルクロニルトランスフェラーゼ１（Ｂ４ＧＡＴ１）、ドリコールキナーゼ（ＤＯＬＫ）、膜貫通タンパク質５（ＴＭＥＭ５）、およびＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼＢ（ＧＭＰＰＢ）からなる群から選択される遺伝子内に突然変異を有する、請求項１８８に記載のキット。
【請求項１９２】
個体は、ヒトである、請求項１８８〜１９１のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体において本明細書に組み入れられる、２０１７年２月１７日に出願された米国特許仮出願第６２／４６０，６６３号、および２０１８年２月１６日に出願された欧州特許出願第１８３０５１６８．９号の優先性の利益を主張する。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる、以下の提出の内容：配列表（ファイル名：１８３９５２０２８１４０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ、記録日：２０１８年２月１６日、サイズ：３１５ＫＢ）のコンピュータ読取り可能形態（ＣＲＦ）は、参照によりその全体において本明細書に組み入れられる。
【０００３】
本開示は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する第２の結合性ドメインとを含む多特異性（例えば、多特異性および三価、または二特異性および二価または四価）結合性分子に関する。本開示はまた、このような結合性分子を作るための方法、ならびにアルファ−ジストログリカノパチーを処置および／または防止するための、このような結合性分子の使用にも関する。
【背景技術】
【０００４】
アルファ−ジストログリカノパチーは、アルファ−ジストログリカン（アルファ−ＤＧ）内のムチン様ドメイン内のＯ−グリコシル化の低減または非存在により特徴づけられる、先天性筋ジストロフィー（ＣＭＤ）の亜群である（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。アルファ−ジストログリカン上のグリコシル化の欠如または低グリコシル化は、骨格筋内のラミニン２、アグリンおよびパーレカン、脳内のニューレキシン、ならびに眼内のピカチュリンを含む、そのリガンドの結合の喪失または減少をもたらす。アルファ−ジストログリカンとは、全ての筋肉および心臓に一般的な、ジストロフィン−糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の、表在性膜構成要素（図１Ａ）である（非特許文献６）。これらの組織では、ＤＧＣ複合体は、ジストロフィンを介してフィラメント性アクチン（Ｆ−アクチン）と会合した、筋肉線維の細胞骨格を、ラミニン２を介して細胞外マトリックス（ＥＣＭ、基底膜ともまた呼ばれる）に連結するように機能する（図１Ｂ）。
【０００５】
アルファ−ジストログリカノパチーでは、現在までに同定されている、少なくとも１８の遺伝子内の突然変異は、アルファ−ＤＧ上の、Ｏ−グリコシル化の、異常なプロセシング、およびそのリガンドへの結合の欠如と連関し、疾患をもたらす。例えば、非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４を参照されたい。これらの遺伝子は、例えば、キシロースグルクロン酸リピートを、グリカンに付加して、リガンド結合を容易とする一因となる、キシロシルおよびグルクロニル二重トランスフェラーゼをコードするＬＡＲＧＥのような、多くのグリコシルトランスフェラーゼを含む（非特許文献２５；非特許文献２６）。この経路内のグリコシルトランスフェラーゼ（例えば、ＬＡＲＧＥ）の、主要な生物学的機能は、筋肉基底膜内のラミニン２、神経筋接合部におけるアグリンおよびパーレカン、ＣＮＳにおけるニューレキシン、および眼内のピカチュリンへの緊密な結合に必要な、アルファ−ＤＧにおける、ムチン様ドメイン内の、Ｏ−グリコシル化を、適正にアセンブルすることである（非特許文献２７；非特許文献２８）。前述の遺伝子のうちのいずれかにおける欠損に起因する、適正なＯ−グリコシル化の非存在下で、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内の、アルファ−ＤＧの、ラミニン２への結合は、損なわれるか、または失われ（図１Ｃ）、筋線維鞘の完全性に必要な、機械的連結の破断を引き起こす。これは、筋肉に、収縮誘導性損傷を受けやすくする結果として、筋線維の筋線維鞘の損傷、および帰結としての筋ジストロフィーをもたらす（非特許文献２９）。
【０００６】
遺伝子異質性のために、アルファ−ジストログリカノパチーは、中枢神経系（ＣＮＳ）および眼の異常を伴う極めて重度の筋ジストロフィーから、ＣＮＳ症状または眼問題を伴わない比較的軽度の筋ジストロフィー性表現型まで多様であるが、重複する臨床症状を示す多くの疾患亜型を含む。アルファ−ジストログリカノパチーの異なる亜型間には、遺伝子および表現型の厳密な相関が見られない。１つの遺伝子内の突然変異が、臨床症状が重複する、疾患の異なる亜型を引き起こす場合もあるが、異なる遺伝子内の突然変異が、同じ疾患または類似の疾患をもたらす場合もある（非特許文献３０）。この異質性のために、個別の遺伝子内の突然変異により引き起こされる、個別のアルファ−ジストログリカノパチーを処置する戦略は、費用効果が小さいために、薬物開発にとって魅力的ではなかった。
【０００７】
アルファ−ジストログリカンおよびベータ−ジストログリカンは、同じ遺伝子であるＤＡＧ１によりコードされ、単一のｍＲＮＡから、無傷の１型膜貫通タンパク質であるジストログリカンとして翻訳される。細胞表面への途中で、ジストログリカンは、タンパク質分解により切断されて、膜貫通スタッドであるベータ−ジストログリカンと、非共有結合によって会合するアルファ−ジストログリカンとを生成する（非特許文献３１）。理論的には、適正なＯ−グリコシル化を伴う組換えアルファ−ジストログリカンが、アルファ−ジストログリカノパチーのためのタンパク質補充療法として提起されている。しかし、組換えアルファ−ジストログリカンの全身送達は、このタンパク質が筋肉の間質腔に到達して、筋線維鞘に組み込まれることに失敗することを指し示した（非特許文献３２）。したがって、組換えアルファ−ジストログリカンをアルファ−ジストログリカノパチーのためのタンパク質補充療法として活用することは、技術的に実用的ではないと考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｕｎｔｏｎｉ，Ｆ．（２００４）、Ａｃｔａ．Ｍｙｏｌ．、２３（２）、７９〜８４頁
【非特許文献２】Ｔｏｄａ，Ｔ．（２００５）、Ｒｉｎｓｈｏ  Ｓｈｉｎｋｅｉｇａｋｕ、４５（１１）、９３２〜９３４頁
【非特許文献３】Ｍｕｎｔｏｎｉ，Ｆ．ら（２００７）、Ａｃｔａ．Ｍｙｏｌ．、２６（３）、１２９〜１３５頁
【非特許文献４】Ｈｅｗｉｔｔ，Ｊ．Ｅ．（２００９）、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１７９２（９）、８５３〜８６１頁
【非特許文献５】Ｇｏｄｆｒｅｙ，Ｃ．ら（２０１１）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．、２１（３）、２７８〜２８５頁
【非特許文献６】Ｍａｔｓｕｍｕｒａ，Ｋ．ら（１９９３）、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．、３（５〜６）、５３３〜５３５頁
【非特許文献７】Ｈａｒａ，Ｙ．ら（２０１１）、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３６４（１０）、９３９〜９４６頁
【非特許文献８】Ｋｉｍ，Ｄ．Ｓ．ら（２００４）、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、６２（６）、１００９〜１０１１頁
【非特許文献９】ｖａｎ  Ｒｅｅｕｗｉｊｋ，Ｊ．ら（２００５）、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．、４２（１２）、９０７〜９１２頁
【非特許文献１０】Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｔ．ら（２００９）、Ｂｒａｉｎ  Ｄｅｖ．、３１（６）、４６５〜４６８頁
【非特許文献１１】Ｙａｎａｇｉｓａｗａ，Ａ．ら（２００９）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．、５２（４）、２０１〜２０６頁
【非特許文献１２】Ｃｌｅｍｅｎｔ，Ｅ．Ｍ．ら（２００８）、Ａｒｃｈ．Ｎｅｕｒｏｌ．６５（１）、１３７〜１４１頁
【非特許文献１３】Ｅｎｄｏ，Ｔ．ら（２０１０）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、４７９、３４３〜３５２頁
【非特許文献１４】Ｓａｒｅｄｉ，Ｓ．ら（２０１２）、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃｉ．、３１８（１〜２）、４５〜５０頁
【非特許文献１５】Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｃ．ら（２００３）、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１２（２１）、２８５３〜２８６１頁
【非特許文献１６】Ｌｅｆｅｂｅｒ，Ｄ．Ｊ．ら（２００９）、Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．、８５（１）、７６〜８６頁
【非特許文献１７】Ｂａｒｏｎｅ，Ｒ．ら（２０１２）、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、７２（４）、５５０〜５５８頁
【非特許文献１８】Ｔｏｄａ，Ｔ．ら（２００３）、Ｃｏｎｇｅｎｉｔ．Ａｎｏｍ．（Ｋｙｏｔｏ）、４３（２）、９７〜１０４頁
【非特許文献１９】Ｔｏｄａ，Ｔ．（２００７）、Ｒｉｎｓｈｏ  Ｓｈｉｎｋｅｉｇａｋｕ、４７（１１）、７４３〜７４８頁
【非特許文献２０】Ｐｕｃｋｅｔｔ，Ｒ．Ｌ．ら（２００９）、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ．Ｄｉｓｏｒｄ．、１９（５）、３５２〜３５６頁
【非特許文献２１】Ｔｏｄａ，Ｔ．（２００９）、．Ｒｉｎｓｈｏ  Ｓｈｉｎｋｅｉｇａｋｕ、４９（１１）、８５９〜８６２頁
【非特許文献２２】Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｔ．ら（２０１０）、Ｃｅｎｔ．Ｎｅｒｖ．Ｓｙｓｔ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、１０（２）、１６９〜１７９頁
【非特許文献２３】Ｋａｎａｇａｗａ，Ｍ．ら（２０１６）、Ｃｅｌｌ．Ｒｅｐ．、１４（９）、２２０９〜２２２３頁
【非特許文献２４】Ｙｏｓｈｉｄａ−Ｍｏｒｉｇｕｃｈｉ，Ｔ．ら（２０１３）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３４１（６１４８）、８９６〜８９９頁
【非特許文献２５】Ｉｎａｍｏｒｉ，Ｋ．ら（２０１２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３３５（６０６４）、９３〜９６頁
【非特許文献２６】Ｌｏｎｇｍａｎ，Ｃ．ら（２００３）、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、１２（２１）、２８５３〜２８６１頁
【非特許文献２７】Ｍｉｃｈｅｌｅ，Ｄ．Ｅ．ら（２００２）、Ｎａｔｕｒｅ、４１８（６８９６）、４１７〜４２２頁
【非特許文献２８】Ｍｕｎｔｏｎｉ，Ｆ．ら（２００２）、Ｌａｎｃｅｔ、３６０（９３４３）、１４１９〜１４２１頁
【非特許文献２９】Ｂａｒｒｅｓｉ，Ｒ．およびＣａｍｐｂｅｌｌ．Ｋ．Ｐ．（２００６）、Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．、１１９、１９９〜２０７頁
【非特許文献３０】Ｇｏｄｆｒｅｙ，Ｃ．ら（２００７）、Ｂｒａｉｎ、１３０、２７２５〜２７３５頁
【非特許文献３１】Ｈｏｌｔ，Ｋ．Ｈ．ら（２０００）、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、４６８（１）、７９〜８３頁
【非特許文献３２】Ｈａｎ，Ｒ．ら（２００９）、ＰＮＡＳ、１０６（３１）、１２５７３〜１２５７９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、アルファ−ジストログリカノパチーおよびそれらの関連する病態を防止および／または処置するための治療用分子に対する必要が存在する。
【００１０】
特許出願、特許公開、およびＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号を含む、本明細書で引用される全ての参考文献は、各個別の参考文献が、参照により、具体的かつ個別に組み入れられることが指し示された場合と同様に、参照によりそれらの全体において本明細書に組み入れられる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この必要および他の必要を満たすために、本明細書では、とりわけ、ラミニン２およびジストログリカンに、同時に結合しうる、多特異性および二特異性結合性分子（例えば、二特異性抗体）、ならびに二官能性バイオ医薬品が提供される。このような多特異性／二特異性抗体または二官能性バイオ医薬品を、アルファ−ジストログリカノパチーを伴う患者に投与する場合、基底膜内のラミニン２および筋線維鞘上のジストログリカン（アルファ−またはベータ−）へのその同時の結合は、失われた連結を回復しうる（図１Ｄおよび１Ｅ）。本開示は、このような手法が、ｉｎ  ｖｉｖｏの動物モデル系におけるアルファ−ジストログリカノパチーの特徴的症状を改善しうることを裏付ける。特に、抗体は、抗体のリサイクリングを媒介する、新生児Ｆｃ受容体へのそれらの結合のために、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける循環半減期が延長されている（長い薬物動態）ことが公知である。したがって、この多特異性／二特異性抗体戦略（または代替的に、二官能性バイオ医薬品戦略）は、アルファ−ジストログリカノパチーを処置するための、新規の治療的手法を表す。
【００１２】
一部の実施形態では、本開示は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも第１の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する少なくとも第２の結合性ドメインとを含む多特異性結合性分子を提供する。一部の実施形態では、多特異性結合性分子は、１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖を含む多特異性結合性タンパク質である。
【００１３】
一部の実施形態では、多特異性結合性分子は、３つの抗原結合性部位を含む、多特異性で三価の結合性タンパク質である。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ  ［Ｉ］
により表される構造を含み、第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ［ＩＩ］
により表される構造を含み、第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ［ＩＩＩ］
により表される構造を含み、第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ  ［ＩＶ］
により表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；
式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、交差軽鎖−重鎖対を形成し；ＶＨ１とＶＬ１は抗原結合性部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２は抗原結合性部位を形成し、ＶＨ３とＶＬ３は抗原結合性部位を形成し、合計で３つの抗原結合性部位となり、３つの抗原結合性部位は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの結合性部位と、ラミニン２に結合する少なくとも１つの結合性部位とを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、多特異性結合性分子は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する１つの抗原結合性部位と、ラミニン２に結合する２つの抗原結合性部位とを含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する２つの抗原結合性部位は、ラミニン２の異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する２つの抗原結合性部位は、ラミニン２の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１とＶＬ１は、ラミニン２に結合する第１の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２は、ラミニン２に結合する第２の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ３とＶＬ３は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第３の抗原結合性部位を形成する。
【００１５】
一部の実施形態では、多特異性結合性分子は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する２つの抗原結合性部位と、ラミニン２に結合する１つの抗原結合性部位とを含む。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する２つの抗原結合性部位は、ジストログリカンの細胞外部分の異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する２つの抗原結合性部位は、ジストログリカンの細胞外部分の同じエピトープに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１とＶＬ１は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第２の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ３とＶＬ３は、ラミニン２に結合する第３の抗原結合性部位を形成する。
【００１６】
一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、多特異性結合性タンパク質の一部としてアッセイされた場合、ジストログリカンの細胞外部分に約１μＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合する。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒトおよびマウスジストログリカンの細胞外部分に結合する。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ベータ−ジストログリカンに結合する。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列ＳＩＶＶＥＷＴＮＮ  ＴＬＰＬＥＰＣＰＫＥ  ＱＩＩＧＬＳＲＲＩＡ  ＤＥＮＧＫＰＲＰＡＦ  ＳＮＡＬＥＰＤＦＫＡ  ＬＳＩＡＶＴＧＳＧＳ  ＣＲＨＬＱＦＩＰＶＡ  ＰＰＳＰＧＳＳＡＡＰ  ＡＴＥＶＰＤＲＤＰＥ  ＫＳＳＥＤＤ（配列番号２９０）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列ＳＩＶＶＥＷＴ  ＮＮＴＬＰＬＥＰＣＰ  ＫＥＱＩＡＧＬＳＲＲ  ＩＡＥＤＤＧＫＰＲＰ  ＡＦＳＮＡＬＥＰＤＦ  ＫＡＴＳＩＴＶＴＧＳ  ＧＳＣＲＨＬＱＦＩＰ  ＶＶＰＰＲＲＶＰＳＥ  ＡＰＰＴＥＶＰＤＲＤ  ＰＥＫＳＳＥＤＤＶ（配列番号２９１）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、アルファ−ジストログリカンに結合する。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列ＳＩＶＶＥＷＴ  ＮＮＴＬＰＬＥＰＣＰ  ＫＥＱＩＡＧＬＳＲＲ  ＩＡＥＤＤＧＫＰＲＰ  ＡＦＳＮＡＬＥＰＤＦ  ＫＡＴＳＩＴＶＴＧＳ  ＧＳＣＲＨＬＱＦＩＰ  ＶＶＰＰＲＲＶＰＳＥ  ＡＰＰＴＥＶＰＤＲＤ  ＰＥＫＳＳＥＤＤＶ（配列番号２９１）を含むポリペプチドに結合する。
【００１７】
一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒトラミニン２に結合する。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、多特異性結合性タンパク質の一部としてアッセイされた場合、ヒトラミニン２に約１μＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合する。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、マウスおよびヒトラミニン２に結合する。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン４、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５、または両方を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン４およびラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列ＶＱＰＱＰＶ  ＰＴＰＡＦＰＦＰＡＰ  ＴＭＶＨＧＰＣＶＡＥ  ＳＥＰＡＬＬＴＧＳＫ  ＱＦＧＬＳＲＮＳＨＩ  ＡＩＡＦＤＤＴＫＶＫ  ＮＲＬＴＩＥＬＥＶＲ  ＴＥＡＥＳＧＬＬＦＹ  ＭＡＲＩＮＨＡＤＦＡ  ＴＶＱＬＲＮＧＦＰＹ  ＦＳＹＤＬＧＳＧＤＴ  ＳＴＭＩＰＴＫＩＮＤ  ＧＱＷＨＫＩＫＩＶＲ  ＶＫＱＥＧＩＬＹＶＤ  ＤＡＳＳＱＴＩＳＰＫ  ＫＡＤＩＬＤＶＶＧＩ  ＬＹＶＧＧＬＰＩＮＹ  ＴＴＲＲＩＧＰＶＴＹ  ＳＬＤＧＣＶＲＮＬＨ  ＭＥＱＡＰＶＤＬＤＱ  ＰＴＳＳＦＨＶＧＴＣ  ＦＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号３００）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列Ｑ  ＰＥＰＶＰＴＰＡＦＰ  ＴＰＴＰＶＬＴＨＧＰ  ＣＡＡＥＳＥＰＡＬＬ  ＩＧＳＫＱＦＧＬＳＲ  ＮＳＨＩＡＩＡＦＤＤ  ＴＫＶＫＮＲＬＴＩＥ  ＬＥＶＲＴＥＡＥＳＧ  ＬＬＦＹＭＡＲＩＮＨ  ＡＤＦＡＴＶＱＬＲＮ  ＧＬＰＹＦＳＹＤＬＧ  ＳＧＤＴＨＴＭＩＰＴ  ＫＩＮＤＧＱＷＨＫＩ  ＫＩＭＲＳＫＱＥＧＩ  ＬＹＶＤＧＡＳＮＲＴ  ＩＳＰＫＫＡＤＩＬＤ  ＶＶＧＭＬＹＶＧＧＬ  ＰＩＮＹＴＴＲＲＩＧ  ＰＶＴＹＳＩＤＧＣＶ  ＲＮＬＨＭＡＥＡＰＡ  ＤＬＥＱＰＴＳＳＦＨ  ＶＧＴＣＦＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号３０１）を含むポリペプチドに結合する。一部の実��形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列ＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号２９２）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、配列ＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号２９３）を含むポリペプチドに結合する。
【００１８】
一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、（ａ）配列番号１〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１８〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；（ｂ）配列番号２８〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４３〜５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、および１８８からなる群から選択される配列を含み；ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、および１８９からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、（ａ）配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；（ｂ）配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号３１４の配列を含み；ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号３３０の配列を含む。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号３４６の配列を含み；ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号３６２の配列を含む。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、（ａ）表Ａ２、Ｄ２、またはＩ４に示される、ＡＳ３０ＳＳ＿Ｈｕ６またはＡＳ３０ＳＳ＿Ｈｕ９のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；（ｂ）表Ａ２、Ｄ２、またはＩ４に示される、ＡＳ３０ＳＳ＿Ｈｕ６またはＡＳ３０ＳＳ＿Ｈｕ９のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、表Ｄ２またはＩ４に示される、ＡＳ３０ＳＳ＿Ｈｕ６またはＡＳ３０ＳＳ＿Ｈｕ９のＶＨドメインの配列を含み、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、表Ｄ２またはＩ４に示される、ＡＳ３０ＳＳ＿Ｈｕ６またはＡＳ３０ＳＳ＿Ｈｕ９のＶＬドメインの配列を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、（ａ）配列番号５１〜５５および８１〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６〜６０および９６〜１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６１〜６５および１１１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；（ｂ）配列番号６６〜７０および１２６〜１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８、７１〜７５、および１４１〜１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号７６〜８０および１５５〜１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、および２２８からなる群から選択される配列を含み；ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、および２２９からなる群から選択される配列を含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、（ａ）配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；（ｂ）配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号３７８の配列を含み；ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号３９４の配列を含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、（ａ）配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；（ｂ）配列番号４２８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号４１０の配列を含み；ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号４２６の配列を含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、（ａ）配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；（ｂ）配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号４４２の配列を含み；ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号４５８の配列を含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、（ａ）配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；（ｂ）配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、ヒト化ＶＨドメインおよびヒト化ＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、配列番号４７４の配列を含み；ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、配列番号４９０の配列を含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位は、（ａ）表Ａ２、Ｄ２、またはＩ４に示される、Ｃ３＿Ｈｕ１０、Ｃ３＿Ｈｕ１１、Ｃ２１＿Ｈｕ１１、またはＣ２１＿Ｈｕ２１のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；（ｂ）表Ａ２、Ｄ２、またはＩ４に示される、Ｃ３＿Ｈｕ１０、Ｃ３＿Ｈｕ１１、Ｃ２１＿Ｈｕ１１、またはＣ２１＿Ｈｕ２１のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＨドメインは、表Ｄ２またはＩ４に示される、Ｃ３＿Ｈｕ１０、Ｃ３＿Ｈｕ１１、Ｃ２１＿Ｈｕ１１、またはＣ２１＿Ｈｕ２１のＶＨドメインの配列の配列を含み、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位のＶＬドメインは、表Ｄ２またはＩ４に示される、Ｃ３＿Ｈｕ１０、Ｃ３＿Ｈｕ１１、Ｃ２１＿Ｈｕ１１、またはＣ２１＿Ｈｕ２１のＶＬドメインの配列を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、ＶＨ１は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ２は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は配列番号３７８の配列を含み、ＶＬ１は配列番号３９４の配列を含み；ＶＨ２は配列番号３７８の配列を含み、ＶＬ２は配列番号３９４の配列を含み；ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ２は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ２は、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は配列番号３７８の配列を含み、ＶＬ１は配列番号３９４の配列を含み；ＶＨ２は配列番号４４２の配列を含み、ＶＬ２は配列番号４５８の配列を含み；ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号４２８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ２は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ２は、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は配列番号４１０の配列を含み、ＶＬ１は配列番号４２６の配列を含み；ＶＨ２は配列番号４７４の配列を含み、ＶＬ２は配列番号４９０の配列を含み；ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ２は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ２は、配列番号４２８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は配列番号４４２の配列を含み、ＶＬ１は配列番号４５８の配列を含み；ＶＨ２は配列番号４１０の配列を含み、ＶＬ２は配列番号４２６の配列を含み；ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ２は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ２は、配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は配列番号４７４の配列を含み、ＶＬ１は配列番号４９０の配列を含み；ＶＨ２は配列番号３７８の配列を含み、ＶＬ２は配列番号３９４の配列を含み；ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む。
【００２１】
上記の実施形態のうちの、一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む。一部の実施形態では、Ｌ３およびＬ４は、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む。
【００２２】
上記の実施形態のうちの、一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗであり；第３のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖであり；第３のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ３ドメインであり、ＣＨ３ドメインのうちの１つだけが、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４３５および４３６位に対応する位置にアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換は、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＣＨ２ドメインは、ＥＵインデックスに従って番号付けして、２９７位にアスパラギン残基、２９８位にアスパラギン残基、２９９位にアラニン残基、および３００位にセリンまたはトレオニン残基を含む、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２ドメインである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＣＨ２ドメインは、ＥＵインデックスに従って番号付けして、２５２位にチロシン残基、２５４位にトレオニン残基、および２５６位にグルタミン酸残基を含む、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２ドメインである。
【００２３】
一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は配列番号５００の配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号４９８の配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号４９９の配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号５０１の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は配列番号５０４の配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号５０２の配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号５０３の配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号５０５の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は配列番号５０８の配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号５０６の配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号５０７の配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号５０９の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は配列番号５１２の配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号５１０の配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号５１１の配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号５１３の配列を含む。一部の実施形態では、第１のポリペプチド鎖は配列番号５１６の配列を含み、第２のポリペプチド鎖は配列番号５１４の配列を含み、第３のポリペプチド鎖は配列番号５１５の配列を含み、第４のポリペプチド鎖は配列番号５１７の配列を含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、表Ｉ２またはＩ４において示されるｔｒｉＡｂ  ３４０７、３４２３、３４２９、３４３７、または３４３９の１つ、２つ、３つ、または４つのポリペプチドを含む。
【００２４】
一部の実施形態では、結合性タンパク質は、（ａ）第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、第１のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンの第１のＦｃ領域とを含む第１の抗体重鎖、および第１の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む第１の抗体軽鎖であって、第１のＶＨおよびＶＬドメインは、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の抗原結合性ドメインを形成する、第１の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖と、（ｂ）第２の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、第２のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンの第２のＦｃ領域とを含む第２の抗体重鎖、および第２の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む第２の抗体軽鎖であって、第２のＶＨおよびＶＬドメインは、ラミニン２に結合する第２の抗原結合性ドメインを形成する、第２の抗体重鎖および第２の抗体軽鎖とを含み；前記第１と第２のＣＨ３領域の配列は異なり、前記第１と第２のＣＨ３領域の間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１と第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々より強くなるような配列であり、前記第１のホモ二量体タンパク質は、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ、またはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、前記第２のホモ二量体タンパク質は、３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、および４０７からなる群から選択される位置にアミノ酸置換を有し、かつ／または前記第１および第２のＣＨ３領域の配列は、ＣＨ３領域の各々のホモ二量体相互作用の解離定数が０．０１〜１０マイクロモルの間であるような配列である。一部の実施形態では、第１の抗体重鎖は配列番号５１８の配列を含み、第２の抗体重鎖は配列番号５１９の配列を含み、第１の抗体軽鎖は配列番号５２０の配列を含み、第２の抗体軽鎖は配列番号５２１の配列を含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、表Ｉ３またはＩ４において示される、ＡＳ３０＿Ｈｕ６×Ｃ３＿Ｈｕ１０デュオボディー（Ｄｕｏｂｏｄｙ）、ＡＳ３０＿Ｈｕ６×Ｃ２１＿Ｈｕ１１デュエットマブ（Ｄｕｅｔｍａｂ）、ＡＳ３０＿Ｈｕ６×Ｃ３＿Ｈｕ１０  ＴＢＴＩ、ＡＳ３０＿Ｈｕ６×Ｃ２１＿Ｈｕ１１  ＴＢＴＩ、ＡＳ３０＿Ｈｕ９×Ｃ３＿Ｈｕ１１  ＣＯＤＶ、またはＡＳ３０＿Ｈｕ９×Ｃ２１＿Ｈｕ２１  ＣＯＤＶの１つ、２つ、３つ、または４つのポリペプチドを含む。
【００２５】
さらに、本明細書では、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる多特異性結合性分子をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子が提供される。また、表Ｇ２またはＩ４のヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供される。また、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる核酸分子を含む発現ベクターも提供される。また、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる核酸分子または発現ベクターを含む宿主細胞（例えば、単離宿主細胞）も提供される。また、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる多特異性結合性分子の第１、第２、第３、および第４のポリペプチド鎖をコードする１つまたはそれ以上のベクターを含むベクター系も提供される。また、上記の実施形態のうちのいずれか１つによるベクター系を含む宿主細胞（例えば、単離宿主細胞）も提供される。また、多特異性結合性分子を作製する方法であって、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる宿主細胞を、宿主細胞が多特異性結合性分子を発現するような条件下で培養する工程と；多特異性結合性分子を宿主細胞から単離する工程とを含む方法も提供される。
【００２６】
さらに、本明細書では、個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーを処置または防止するための方法であって、個体に、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる多特異性結合性分子を投与する工程を含む方法が提供される。本明細書ではまた、個体におけるラミニン２とジストログリカンの細胞外部分との間の連結をもたらすための方法であって、個体に、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる多特異性結合性分子を投与する工程を含む方法も提供される。本明細書ではまた、個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーを処置または防止するための、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる多特異性結合性分子の使用も提供される。本明細書ではまた、個体におけるラミニン２とジストログリカンの細胞外部分との間の連結をもたらすための、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる多特異性結合性分子の使用も提供される。本明細書ではまた、個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーを処置または防止するための医薬の製造における、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる多特異性結合性分子の使用も提供される。本明細書ではまた、個体におけるラミニン２とジストログリカンの細胞外部分との間の連結をもたらすための医薬の製造における、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる多特異性結合性分子の使用も提供される。
【００２７】
上記の実施形態のうちのいずれかによる一部の実施形態では、個体は、アルファ−ジストログリカンの発現が低減されている。一部の実施形態では、個体において発現するアルファ−ジストログリカンは、Ｏ−グリコシル化が損なわれているか、または異常である。一部の実施形態では、個体は、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＴ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＰＯＭＴ２）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，２−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット１（ＰＯＭＧＮＴ１）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，４−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット２（ＰＯＭＧＮＴ２）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ１（ＬＡＲＧＥ１）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ２（ＬＡＲＧＥ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット１（ＤＰＭ１）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット２（ＤＰＭ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット３（ＤＰＭ３）、フクチン、フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）、イソプレノイドシンターゼドメイン含有（ＩＳＰＤ）、タンパク質Ｏ−マンノースキナーゼ（ＰＯＭＫ）、ベータ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ３ＧＡＬＮＴ２）、ベータ−１，４−グルクロニルトランスフェラーゼ１（Ｂ４ＧＡＴ１）、ドリコールキナーゼ（ＤＯＬＫ）、膜貫通タンパク質５（ＴＭＥＭ５）、およびＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼＢ（ＧＭＰＰＢ）からなる群から選択される遺伝子内に突然変異を有する。一部の実施形態では、多特異性結合性分子は、静脈内注入を介して投与される。一部の実施形態では、多特異性結合性分子は、筋内、腹腔内、または皮下注射を介して投与される。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
【００２８】
さらに、本明細書では、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる多特異性結合性分子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。また、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる多特異性結合性分子と、個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーの処置または防止における使用のための指示書とを含むキットも提供される。一部の実施形態では、個体は、アルファ−ジストログリカンの発現が低減されている。一部の実施形態では、個体において発現するアルファ−ジストログリカンは、Ｏ−グリコシル化が、損なわれているか、または異常である。一部の実施形態では、個体は、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＴ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＰＯＭＴ２）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，２−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット１（ＰＯＭＧＮＴ１）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，４−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット２（ＰＯＭＧＮＴ２）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ１（ＬＡＲＧＥ１）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ２（ＬＡＲＧＥ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット１（ＤＰＭ１）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット２（ＤＰＭ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット３（ＤＰＭ３）、フクチン、フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）、イソプレノイドシンターゼドメイン含有（ＩＳＰＤ）、タンパク質Ｏ−マンノースキナーゼ（ＰＯＭＫ）、ベータ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ３ＧＡＬＮＴ２）、ベータ−１，４−グルクロニルトランスフェラーゼ１（Ｂ４ＧＡＴ１）、ドリコールキナーゼ（ＤＯＬＫ）、膜貫通タンパク質５（ＴＭＥＭ５）、およびＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼＢ（ＧＭＰＰＢ）からなる群から選択される遺伝子内に、突然変異を有する。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
【００２９】
さらに、本明細書では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する抗体であって、（ａ）配列番号１〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１８〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体重鎖と；（ｂ）配列番号２８〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４３〜５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖とを含む抗体が提供される。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、および１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、および１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、表Ａ２、Ｄ２、もしくはＩ４に示された結合性ドメイン、または表Ｄ２もしくはＩ４に示されるか、もしくは表Ｇ２に示されたポリヌクレオチド配列によりコードされる、結合性ドメインのＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン配列のうちの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列を含む。
【００３０】
さらに、本明細書では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体重鎖と；（ｂ）配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖とを含む抗体が提供される。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３１４のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３３０のアミノ酸配列を含むか；またはＶＨドメインは、配列番号３４６のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、表Ａ２、Ｄ２、もしくはＩ４に示された結合性ドメイン、または表Ｄ２もしくはＩ４に示されるか、もしくは表Ｇ２に示されたポリヌクレオチド配列によりコードされる、結合性ドメインのＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン配列のうちの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列を含む。
【００３１】
さらに、本明細書では、ラミニン２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号５１〜５５および８１〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６〜６０および９６〜１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６１〜６５および１１１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む抗体重鎖と；（ｂ）配列番号６６〜７０および１２６〜１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８、７１〜７５、および１４１〜１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号７６〜８０および１５５〜１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖とを含む抗体が提供される。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、および２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、および２２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、表Ａ２、Ｄ２、もしくはＩ４に示された結合性ドメイン、または表Ｄ２もしくはＩ４に示されるか、もしくは表Ｇ２に示されたポリヌクレオチド配列によりコードされる、結合性ドメインのＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン配列のうちの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列を含む。
【００３２】
さらに、本明細書では、ラミニン２に結合する抗体であって、（ａ）配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体重鎖、ならびに配列番号４２８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖；（ｂ）配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体重鎖、ならびに配列番号４２８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖；（ｃ）配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体重鎖、ならびに配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖；または（ｄ）配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体重鎖、ならびに配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖を含む抗体が提供される。一部の実施形態では、（ａ）ＶＨドメインは配列番号３７８のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは配列番号３９４のアミノ酸配列を含むか；（ｂ）ＶＨドメインは配列番号４１０のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは配列番号４２６のアミノ酸配列を含むか；（ｃ）ＶＨドメインは配列番号４４２のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは配列番号４５８のアミノ酸配列を含むか；または（ｄ）ＶＨドメインは配列番号４７４のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは配列番号４９０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、表Ａ２、Ｄ２、もしくはＩ４に示された結合性ドメイン、または表Ｄ２もしくはＩ４に示されるか、もしくは表Ｇ２に示されたポリヌクレオチド配列によりコードされる、結合性ドメインのＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン配列のうちの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列を含む。
【００３３】
さらに、本明細書では、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子が提供される。また、上記の実施形態のうちのいずれか１つの核酸分子を含む発現ベクターも提供される。また、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる核酸分子または発現ベクターを含む宿主細胞（例えば、単離宿主細胞）も提供される。また、抗体を作製する方法であって、上記の実施形態のうちのいずれか１つによる宿主細胞を、宿主細胞が抗体を発現するような条件下で培養する工程と；抗体を宿主細胞から単離する工程とを含む方法も提供される。
【００３４】
一実施形態では、本開示は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する第２の結合性ドメインとを含む二特異性結合性分子を提供する。一部の実施形態では、二特異性結合性分子は、１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖を含む二特異性結合性タンパク質である。
【００３５】
一部の実施形態では、二特異性結合性分子は、２つまたは４つの抗原結合性部位を含む、二特異性で二価または四価の結合性タンパク質である。一部の実施形態では、二特異性結合性タンパク質は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の結合性ドメインであって、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）を含む第１の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する第２の結合性ドメインであって、第２の結合性ドメインを含む第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）および第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）とを含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、表Ａに示された抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つのＣＤＲ配列を含み、かつ／またはＶＬ１ドメインは、表Ａに示された抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つのＣＤＲ配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、表Ｂもしくは表Ｃに示された抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つのＣＤＲ配列を含み、かつ／またはＶＬ２ドメインは、表Ｂもしくは表Ｃに示された抗体の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つのＣＤＲ配列を含む。
【００３６】
一部の実施形態では、二特異性結合性分子は、４つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、２つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−Ｌ２−ＣＬ  ［Ｉ］
により表される構造を含み、２つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ２−Ｌ３−ＶＨ１−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ［ＩＩ］
により表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーであり；ＶＨ１およびＶＬ１ドメインは、ＶＨ１／ＶＬ１結合対を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２ドメインは、ＶＨ２／ＶＬ２結合対を形成する。
【００３７】
一部の実施形態では、ＶＨ１とＶＬ１ドメインは、交差してＶＨ１／ＶＬ１結合対を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ２とＶＬ２ドメインは、交差してＶＨ２／ＶＬ２結合対を形成する。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は各々、０〜５０アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は各々、０〜２５アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は各々、０〜１４アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１は５アミノ酸残基の長さであり；Ｌ２は５アミノ酸残基の長さであり；Ｌ３は５アミノ酸残基の長さであり；Ｌ４は５アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１は１４アミノ酸残基の長さであり；Ｌ２は２アミノ酸残基の長さであり；Ｌ３は１４アミノ酸残基の長さであり；Ｌ４は２アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ３は各々、配列ＥＰＫＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ（配列番号２９６）を含み、Ｌ２およびＬ４は各々、配列ＧＧを含む。一部の実施形態では、Ｌ１は７アミノ酸残基の長さであり；Ｌ２は５アミノ酸残基の長さであり；Ｌ３は１アミノ酸残基の長さであり；Ｌ４は２アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１は配列ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号２９７）を含み；Ｌ２は配列ＴＫＧＰＳ（配列番号２９８）を含み；Ｌ３はセリン残基を含み；Ｌ４は配列ＲＴを含む。一部の実施形態では、Ｌ１は１０アミノ酸残基の長さであり；Ｌ２は、１０アミノ酸残基の長さであり；Ｌ３は０アミノ酸残基の長さであり；Ｌ４は０アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は各々、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号２９９）を含む。一部の実施形態では、式Ｉおよび／または式ＩＩのポリペプチドの可変ドメインの一方または両方は、ヒト、ヒト化、またはマウス可変ドメインである。
【００３８】
一部の実施形態では、二特異性結合性分子は、式：
ＶＬ１−Ｌ５−ＶＬ２−Ｌ６−ＣＬ  ［ＩＩＩ］
により表される構造を含む２つの軽鎖と、式：
ＶＨ１−Ｌ７−ＶＨ２−Ｌ８−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ［ＩＶ］
により表される構造を含む２つの重鎖とを含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１とＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、およびＬ８は、アミノ酸リンカーであり；ＶＨ１およびＶＬ１ドメインは、ＶＨ１／ＶＬ１結合対を形成し、ＶＨ２ドメインおよびＶＬ２ドメインは、ＶＨ２／ＶＬ２を形成する。
【００３９】
一部の実施形態では、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、およびＬ８は、各々、０〜５０アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、およびＬ８は、各々、０〜２５アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、およびＬ８は、各々、０〜１４アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ５リンカーおよびＬ７リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのアミノ酸配列（配列番号）を含み、Ｌ６およびＬ８リンカーは、各々、０アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、式ＩＩＩおよび／または式ＩＶのポリペプチドの可変ドメインの一方または両方は、ヒト、ヒト化、またはマウス可変ドメインである。
【００４０】
上記の実施形態のうちの、一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２に結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ヒトジストログリカンの細胞外部分に結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ヒトジストログリカンの細胞外部分に、約１μＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ヒトおよびマウスジストログリカンの細胞外部分に結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ベータ−ジストログリカンに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、配列ＳＩＶＶＥＷＴＮＮ  ＴＬＰＬＥＰＣＰＫＥ  ＱＩＩＧＬＳＲＲＩＡ  ＤＥＮＧＫＰＲＰＡＦ  ＳＮＡＬＥＰＤＦＫＡ  ＬＳＩＡＶＴＧＳＧＳ  ＣＲＨＬＱＦＩＰＶＡ  ＰＰＳＰＧＳＳＡＡＰ  ＡＴＥＶＰＤＲＤＰＥ  ＫＳＳＥＤＤ（配列番号２９０）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、配列ＳＩＶＶＥＷＴ  ＮＮＴＬＰＬＥＰＣＰ  ＫＥＱＩＡＧＬＳＲＲ  ＩＡＥＤＤＧＫＰＲＰ  ＡＦＳＮＡＬＥＰＤＦ  ＫＡＴＳＩＴＶＴＧＳ  ＧＳＣＲＨＬＱＦＩＰ  ＶＶＰＰＲＲＶＰＳＥ  ＡＰＰＴＥＶＰＤＲＤ  ＰＥＫＳＳＥＤＤＶ（配列番号２９１）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、アルファ−ジストログリカンに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ヒトラミニン２に結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ヒトラミニン２に、約１μＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、マウスおよびヒトラミニン２に結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン４、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５、または両方を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン４およびラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、配列ＶＱＰＱＰＶ  ＰＴＰＡＦＰＦＰＡＰ  ＴＭＶＨＧＰＣＶＡＥ  ＳＥＰＡＬＬＴＧＳＫ  ＱＦＧＬＳＲＮＳＨＩ  ＡＩＡＦＤＤＴＫＶＫ  ＮＲＬＴＩＥＬＥＶＲ  ＴＥＡＥＳＧＬＬＦＹ  ＭＡＲＩＮＨＡＤＦＡ  ＴＶＱＬＲＮＧＦＰＹ  ＦＳＹＤＬＧＳＧＤＴ  ＳＴＭＩＰＴＫＩＮＤ  ＧＱＷＨＫＩＫＩＶＲ  ＶＫＱＥＧＩＬＹＶＤ  ＤＡＳＳＱＴＩＳＰＫ  ＫＡＤＩＬＤＶＶＧＩ  ＬＹＶＧＧＬＰＩＮＹ  ＴＴＲＲＩＧＰＶＴＹ  ＳＬＤＧＣＶＲＮＬＨ  ＭＥＱＡＰＶＤＬＤＱ  ＰＴＳＳＦＨＶＧＴＣ  ＦＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号３００）を含むポリ��プチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、配列Ｑ  ＰＥＰＶＰＴＰＡＦＰ  ＴＰＴＰＶＬＴＨＧＰ  ＣＡＡＥＳＥＰＡＬＬ  ＩＧＳＫＱＦＧＬＳＲ  ＮＳＨＩＡＩＡＦＤＤ  ＴＫＶＫＮＲＬＴＩＥ  ＬＥＶＲＴＥＡＥＳＧ  ＬＬＦＹＭＡＲＩＮＨ  ＡＤＦＡＴＶＱＬＲＮ  ＧＬＰＹＦＳＹＤＬＧ  ＳＧＤＴＨＴＭＩＰＴ  ＫＩＮＤＧＱＷＨＫＩ  ＫＩＭＲＳＫＱＥＧＩ  ＬＹＶＤＧＡＳＮＲＴ  ＩＳＰＫＫＡＤＩＬＤ  ＶＶＧＭＬＹＶＧＧＬ  ＰＩＮＹＴＴＲＲＩＧ  ＰＶＴＹＳＩＤＧＣＶ  ＲＮＬＨＭＡＥＡＰＡ  ＤＬＥＱＰＴＳＳＦＨ  ＶＧＴＣＦＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号３０１）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、配列ＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号２９２）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、配列ＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号２９３）を含むポリペプチドに結合する。
【００４１】
一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号１〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１８〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ１ドメインは、配列番号２８〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４３〜５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、および１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬ１ドメインは、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、および１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、および２４８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＶＬ１ドメインは、配列番号２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、および２４９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号５１〜５５および８１〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６〜６０および９６〜１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６１〜６５および１１１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ２ドメインは、配列番号６６〜７０および１２６〜１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８、７１〜７５、および１４１〜１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号７６〜８０および１５５〜１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、および２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、および２２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、および２８８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、および２８９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。
【００４２】
上記の実施形態のうちの、一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２に結合し、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ヒトジストログリカンの細胞外部分に結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ヒトジストログリカンの細胞外部分に、約１μＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ヒトジストログリカンおよびマウスジストログリカンの細胞外部分に結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ベータ−ジストログリカンに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、配列ＳＩＶＶＥＷＴＮＮ  ＴＬＰＬＥＰＣＰＫＥ  ＱＩＩＧＬＳＲＲＩＡ  ＤＥＮＧＫＰＲＰＡＦ  ＳＮＡＬＥＰＤＦＫＡ  ＬＳＩＡＶＴＧＳＧＳ  ＣＲＨＬＱＦＩＰＶＡ  ＰＰＳＰＧＳＳＡＡＰ  ＡＴＥＶＰＤＲＤＰＥ  ＫＳＳＥＤＤ（配列番号２９０）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、配列ＳＩＶＶＥＷＴ  ＮＮＴＬＰＬＥＰＣＰ  ＫＥＱＩＡＧＬＳＲＲ  ＩＡＥＤＤＧＫＰＲＰ  ＡＦＳＮＡＬＥＰＤＦ  ＫＡＴＳＩＴＶＴＧＳ  ＧＳＣＲＨＬＱＦＩＰ  ＶＶＰＰＲＲＶＰＳＥ  ＡＰＰＴＥＶＰＤＲＤ  ＰＥＫＳＳＥＤＤＶ（配列番号２９１）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、アルファ−ジストログリカンに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ヒトラミニン２に結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ヒトラミニン２に、約１μＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、マウスおよびヒトラミニン２に結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン４、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５、または両方を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン４およびラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、配列ＶＱＰＱＰＶ  ＰＴＰＡＦＰＦＰＡＰ  ＴＭＶＨＧＰＣＶＡＥ  ＳＥＰＡＬＬＴＧＳＫ  ＱＦＧＬＳＲＮＳＨＩ  ＡＩＡＦＤＤＴＫＶＫ  ＮＲＬＴＩＥＬＥＶＲ  ＴＥＡＥＳＧＬＬＦＹ  ＭＡＲＩＮＨＡＤＦＡ  ＴＶＱＬＲＮＧＦＰＹ  ＦＳＹＤＬＧＳＧＤＴ  ＳＴＭＩＰＴＫＩＮＤ  ＧＱＷＨＫＩＫＩＶＲ  ＶＫＱＥＧＩＬＹＶＤ  ＤＡＳＳＱＴＩＳＰＫ  ＫＡＤＩＬＤＶＶＧＩ  ＬＹＶＧＧＬＰＩＮＹ  ＴＴＲＲＩＧＰＶＴＹ  ＳＬＤＧＣＶＲＮＬＨ  ＭＥＱＡＰＶＤＬＤＱ  ＰＴＳＳＦＨＶＧＴＣ  ＦＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号３��０）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、配列Ｑ  ＰＥＰＶＰＴＰＡＦＰ  ＴＰＴＰＶＬＴＨＧＰ  ＣＡＡＥＳＥＰＡＬＬ  ＩＧＳＫＱＦＧＬＳＲ  ＮＳＨＩＡＩＡＦＤＤ  ＴＫＶＫＮＲＬＴＩＥ  ＬＥＶＲＴＥＡＥＳＧ  ＬＬＦＹＭＡＲＩＮＨ  ＡＤＦＡＴＶＱＬＲＮ  ＧＬＰＹＦＳＹＤＬＧ  ＳＧＤＴＨＴＭＩＰＴ  ＫＩＮＤＧＱＷＨＫＩ  ＫＩＭＲＳＫＱＥＧＩ  ＬＹＶＤＧＡＳＮＲＴ  ＩＳＰＫＫＡＤＩＬＤ  ＶＶＧＭＬＹＶＧＧＬ  ＰＩＮＹＴＴＲＲＩＧ  ＰＶＴＹＳＩＤＧＣＶ  ＲＮＬＨＭＡＥＡＰＡ  ＤＬＥＱＰＴＳＳＦＨ  ＶＧＴＣＦＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号３０１）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、配列ＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号２９２）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、配列ＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号２９３）を含むポリペプチドに結合する。
【００４３】
一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号１〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１８〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ２ドメインは、配列番号２８〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４３〜５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、および１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、および１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、および２４８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、および２４９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号５１〜５５および８１〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６〜６０および９６〜１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６１〜６５および１１１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ１ドメインは、配列番号６６〜７０および１２６〜１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８、７１〜７５、および１４１〜１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号７６〜８０および１５５〜１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、および２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、および２２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、および２８８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、および２８９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。
【００４４】
一実施形態では、本開示は、上記の実施形態のうちのいずれか１つに従う二特異性結合性分子をコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。一実施形態では、本開示は、上記の実施形態のうちのいずれか１つに従う二特異性結合性分子をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。一実施形態では、本開示は、上記の実施形態のうちのいずれか１つに従う二特異性結合性分子をコードするヌクレオチド配列を含むか、または上記の実施形態のうちのいずれか１つに従う二特異性結合性分子をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを含む単離宿主細胞を提供する。一実施形態では、本開示は、上記の実施形態のうちのいずれか１つに従う二特異性結合性分子の、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖、および第４のポリペプチド鎖をコードする、１つまたはそれ以上のベクターを含むベクター系を提供する。一実施形態では、本開示は、上記の実施形態のうちのいずれか１つに従う二特異性結合性分子の、２つの軽鎖および２つの重鎖をコードする、１つまたはそれ以上のベクターを含むベクター系を提供する。一実施形態では、本開示は、上記の実施形態のうちのいずれか１つに従うベクター系を含む単離宿主細胞を提供する。
【００４５】
一実施形態では、本開示は、二特異性結合性分子を作製する方法であって、ａ）上記の実施形態のうちのいずれか１つに従う宿主細胞を、宿主細胞が二特異性結合性分子を発現するような条件下で培養する工程と；ｂ）二特異性結合性分子を宿主細胞から単離する工程とを含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の結合性ドメイン、およびラミニン２に結合する第２の結合性ドメインを含む二特異性結合性タンパク質を作製する方法であって、ａ）第１の結合性ドメインを含む第１のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含む、第１の宿主細胞を、宿主細胞が、第１のＣＨ３ドメインを伴う、第１の単一特異性結合性タンパク質の一部としての、第１のポリペプチド鎖を発現するような条件下で培養する工程と；ｂ）第２の結合性ドメインを含む、第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含む、第２の宿主細胞を、宿主細胞が、第２のＣＨ３ドメインを伴う、第２の単一特異性結合性タンパク質の一部としての、第２のポリペプチド鎖を発現するような条件下で培養する工程と；ｃ）第１の単一特異性結合性タンパク質を、第１の宿主細胞から単離する工程と；ｄ）第２の単一特異性結合性タンパク質を、第２の宿主細胞から単離する工程と；ｅ）単離された第１および第２の単一特異性結合性タンパク質を、ヒンジ領域内のシステインが、ジスルフィド結合の異性化を経ることを可能とするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程と；ｆ）二特異性結合性タンパク質を得る工程とを含み、第１と第２のＣＨ３ドメインは異なり、前記第１と第２のＣＨ３ドメインのヘテロ二量体相互作用が、前記第１と第２のＣＨ３ドメインのホモ二量体相互作用の各々より強くなるような方法を提供する。
【００４６】
一実施形態では、本開示は、個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーを処置または防止するための方法であって、個体に、上記の実施形態のうちのいずれか１つに従う二特異性結合性分子を投与する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、本開示は、個体におけるラミニン２とジストログリカンの細胞外部分との間の連結をもたらすための方法であって、個体に、上記の実施形態のうちのいずれか１つに従う二特異性結合性分子を投与する工程を含む方法を提供する。一部の実施形態では、個体は、アルファ−ジストログリカンの発現が低減されている。一部の実施形態では、個体において発現するアルファ−ジストログリカンは、Ｏ−グリコシル化が、損なわれているか、または異常である。一部の実施形態では、個体は、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＴ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＰＯＭＴ２）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，２−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット１（ＰＯＭＧＮＴ１）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，４−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット２（ＰＯＭＧＮＴ２）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ１（ＬＡＲＧＥ１）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ２（ＬＡＲＧＥ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット１（ＤＰＭ１）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット２（ＤＰＭ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット３（ＤＰＭ３）、フクチン、フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）、イソプレノイドシンターゼドメイン含有（ＩＳＰＤ）、タンパク質Ｏ−マンノースキナーゼ（ＰＯＭＫ）、ベータ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ３ＧＡＬＮＴ２）、ベータ−１，４−グルクロニルトランスフェラーゼ１（Ｂ４ＧＡＴ１）、ドリコールキナーゼ（ＤＯＬＫ）、膜貫通タンパク質５（ＴＭＥＭ５）、およびＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼＢ（ＧＭＰＰＢ）からなる群から選択される遺伝子内に、突然変異を有する。一部の実施形態では、二特異結合性分子は、静脈内注入を介して投与される。一部の実施形態では、二特異結合性分子は、筋内、腹腔内、または皮下注射を介して投与される。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
【００４７】
一実施形態では、本開示は、上記の実施形態のうちのいずれか１つに従う二特異性結合性分子と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。一実施形態では、本開示は、上記の実施形態のうちのいずれか１つに従う二特異性結合性分子と、個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーの処置または防止における使用のための指示書とを含むキットを提供する。一部の実施形態では、個体は、アルファ−ジストログリカンの発現が低減されている。一部の実施形態では、個体において発現するアルファ−ジストログリカンは、Ｏ−グリコシル化が、損なわれているか、または異常である。一部の実施形態では、個体は、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＴ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＰＯＭＴ２）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，２−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット１（ＰＯＭＧＮＴ１）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，４−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット２（ＰＯＭＧＮＴ２）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ１（ＬＡＲＧＥ１）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ２（ＬＡＲＧＥ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット１（ＤＰＭ１）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット２（ＤＰＭ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット３（ＤＰＭ３）、フクチン、フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）、イソプレノイドシンターゼドメイン含有（ＩＳＰＤ）、タンパク質Ｏ−マンノースキナーゼ（ＰＯＭＫ）、ベータ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ３ＧＡＬＮＴ２）、ベータ−１，４−グルクロニルトランスフェラーゼ１（Ｂ４ＧＡＴ１）、ドリコールキナーゼ（ＤＯＬＫ）、膜貫通タンパク質５（ＴＭＥＭ５）、およびＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼＢ（ＧＭＰＰＢ）からなる群から選択される遺伝子内に、突然変異を有する。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
【００４８】
本発明の具体的な実施形態は、ある特定の実施形態および特許請求の範囲についての、以下の、より詳細な記載から明らかとなるであろう。
【００４９】
本明細書で記載される、多様な実施形態の特性のうちの１つ、一部、または全部を組み合わせて、本発明の他の実施形態を形成しうることを理解されたい。当業者には、本発明の、これらの態様および他の態様が明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１Ａ】ジストロフィン関連糖タンパク質複合体の、正常なタンパク質の相互作用および機能を示す図である。アルファ−ジストログリカンのムチン様ドメイン内のＯ結合型グリカンは、筋肉内のラミニン２を含む、いくつかのリガンドに対する受容体として用いられる。図１Ａは、ジストログリカンが、正常にＯ−グリコシル化された、ジストロフィン関連糖タンパク質複合体を示す。
【図１Ｂ】ジストロフィン関連糖タンパク質複合体の、正常なタンパク質の相互作用および機能を示す図である。アルファ−ジストログリカンのムチン様ドメイン内のＯ結合型グリカンは、筋肉内のラミニン２を含む、いくつかのリガンドに対する受容体として用いられる。図１Ｂは、Ｏ−グリコシル化アルファ−ジストログリカンと相互作用する基底膜内のラミニン２を示す。ベータ−ジストログリカンは、ジストロフィンと相互作用し、ジストロフィンは、細胞膜内のフィラメント性アクチンと会合する。
【図１Ｃ】アルファ−ジストログリカノパチーの病因を示す図である。アルファ−ジストログリカン上のＯ結合型グリコシル化の非存在下では、ラミニン２と、アルファ−ジストログリカンとの結合が失われる結果として、筋線維鞘からの基底膜の剥離がもたらされることから、身体運動時の膜損傷および筋ジストロフィーがもたらされる。
【図１Ｄ】二特異性抗体の多特異性を援用して、アルファ−ジストログリカノパチーを処置する戦略を示す図である。二特異性および多特異性抗体は、１つまたはそれ以上のアームにより、ラミニン２を特異的に認識し、これに結合し、１つまたはそれ以上の他のアームにより、アルファ−ジストログリカン（図１Ｄ）またはベータ−ジストログリカン（図１Ｅ）を特異的に認識し、これに結合し、これにより、アルファ−ジストログリカノパチーを処置するために、ラミニン２とジストログリカンとの連結を回復する。
【図１Ｅ】二特異性抗体の多特異性を援用して、アルファ−ジストログリカノパチーを処置する戦略を示す図である。二特異性および多特異性抗体は、１つまたはそれ以上のアームにより、ラミニン２を特異的に認識し、これに結合し、１つまたはそれ以上の他のアームにより、アルファ−ジストログリカン（図１Ｄ）またはベータ−ジストログリカン（図１Ｅ）を特異的に認識し、これに結合し、これにより、アルファ−ジストログリカノパチーを処置するために、ラミニン２とジストログリカンとの連結を回復する。
【図２Ａ】ヒトおよびマウスのラミニン球状（ＬＧ）４／５ドメインの配列アライメントを示す図である。ヒトＬＧ−５とマウスＬＧ−５は、８８％の同一性を伴う顕著な相同性を有する。ヒトおよびマウスラミニン２のアルファ−２サブユニット内の枠で囲まれた配列を、タンパク質の発現および抗体の生成のために使用した。配列番号３０５（上）および３００（下）が示される。
【図２Ｂ】ヒトおよびマウスのベータ−ジストログリカン（ＤＧ）細胞外ドメインの配列アライメントを示す図である。ヒトベータ−ＤＧ細胞外ドメインのタンパク質配列とマウスベータ−ＤＧ細胞外ドメインのタンパク質配列は、８８．４％の同一性を伴う相同性を有する。ヒトベータ−ＤＧおよびマウスベータ−ＤＧの枠で囲まれた配列を、タンパク質の発現および抗体の生成のために使用した。配列番号３０３（上）および３０４（下）が示される。
【図３Ａ】ヒトＬＧ−４／５（図３Ａ）およびマウスＬＧ−４／５（図３Ｂ）に結合するハイブリドーマクローンであるＣ２１に由来する抗ラミニン２抗体についての、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）反応速度アッセイデータを示す図である。
【図３Ｂ】ヒトＬＧ−４／５（図３Ａ）およびマウスＬＧ−４／５（図３Ｂ）に結合するハイブリドーマクローンであるＣ２１に由来する抗ラミニン２抗体についての、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）反応速度アッセイデータを示す図である。
【図３Ｃ】ＨＥＫ２９３細胞上で発現する、ヒトおよびマウスＬＧ−４／５に結合するハイブリドーマクローンであるＣ２１に由来する抗ラミニン２抗体についての、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）解析を示す図である。
【図３Ｄ】ニトロセルロース上にドットされ、次いで、ハイブリドーマクローンであるＣ２１に由来する抗ラミニン２抗体によりプローブされた、多様な量の組換えヒトラミニン２、マウスＬＧ−５（ｍＬＧ５）、ヒトＬＧ−５（ｈＬＧ５）、およびヒトＬＧ−４／５（ｈＬＧ４／ＬＧ５）についてのドットブロットを示す図である。Ｃ２Ｃ１２細胞溶解物中のラミニン２の量は、検出限界を下回った。
【図３Ｅ】ヒトＬＧ−４／５（図３Ｆ）およびマウスＬＧ−４／５（図３Ｇ）に結合するハイブリドーマクローンであるＣ３に由来する抗ラミニン２抗体についての、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）反応速度アッセイデータを示す図である。
【図３Ｆ】ヒトＬＧ−４／５（図３Ｆ）およびマウスＬＧ−４／５（図３Ｇ）に結合するハイブリドーマクローンであるＣ３に由来する抗ラミニン２抗体についての、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）反応速度アッセイデータを示す図である。
【図３Ｇ】ＨＥＫ２９３細胞上で発現する、ヒトおよびマウスＬＧ−４／５に結合するハイブリドーマクローンであるＣ３に由来する抗ラミニン２抗体についての、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）解析を示す図である。
【図３Ｈ】ニトロセルロース上にドットされ、次いで、ハイブリドーマクローンであるＣ３に由来する抗ラミニン２抗体によりプローブされた、多様な量の組換えヒトラミニン２（Ｈｕ２１１）、マウスＬＧ−５（ｍＬＧ５）、ヒトＬＧ−５（ｈＬＧ５）、およびヒトＬＧ−４／５（ｈＬＧ４／ＬＧ５）についてのドットブロットを示す図である。Ｃ２Ｃ１２細胞溶解物中のラミニン２の量は、検出限界を下回った。
【図３Ｉ】ヒトベータ−ＤＧ（図３Ｉ）およびマウスベータ−ＤＧ（図３Ｊ）に結合するハイブリドーマクローンであるＡＳ３０に由来する抗ベータ−ＤＧ抗体についての、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）反応速度アッセイデータを示す図である。
【図３Ｊ】ヒトベータ−ＤＧ（図３Ｉ）およびマウスベータ−ＤＧ（図３Ｊ）に結合するハイブリドーマクローンであるＡＳ３０に由来する抗ベータ−ＤＧ抗体についての、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）反応速度アッセイデータを示す図である。
【図３Ｋ】ニトロセルロース上にドットされ、次いで、ハイブリドーマクローンであるＡＳ３０に由来する抗ベータ−ＤＧ抗体によりプローブされた、多様な量の組換えマウスベータ−ＤＧ  ＥＣＤ（ｍβＤＧ）、ヒトベータ−ＤＧ  ＥＣＤ（ＨｕβＤＧ）、または組換えジストログリカン（ｒｈＤＧ）についてのドットブロットを示す図である。Ｃ２Ｃ１２細胞溶解物中および前脛骨筋細胞溶解物（ＴＡ溶解物）中のβＤＧの量は、検出限界を下回った。ファブラザイム（アガルシダーゼベータ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）を、陰性対照として使用した。
【図３Ｌ】ハイブリドーマクローンであるＡＳ３０に由来する抗ベータ−ＤＧ抗体を使用する、Ｃ２Ｃ１２細胞溶解物からの、ベータ−ＤＧの免疫沈降を介して作出された試料についてのウェスタンブロットを示す図である。第１のレーンは、陽性対照を示し、第２のレーンは、ファージディスプレイクローンであるＢ０６（これは、βＤＧに対するアフィニティーが小さいので、βＤＧおよびアルファ−ＤＧに対するプルダウンが最小限である）に由来する抗ベータ−ＤＧ抗体でプローブされた免疫沈降試料を示し、第３のレーンは、ハイブリドーマクローンであるＡＳ３０に由来する高アフィニティーの抗ベータ−ＤＧ抗体でプローブされた免疫沈降試料（この場合、夥多なβＤＧおよびアルファ−ＤＧは、免疫沈降した）を示す。
【図３Ｍ】ヒトベータ−ＤＧ（図３Ｍ）およびマウス（図３Ｎ）に結合するハイブリドーマクローンであるＡＳ１９に由来する抗ベータ−ＤＧ抗体についての、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）反応速度アッセイデータを示す図である。
【図３Ｎ】ヒトベータ−ＤＧ（図３Ｍ）およびマウス（図３Ｎ）に結合するハイブリドーマクローンであるＡＳ１９に由来する抗ベータ−ＤＧ抗体についての、表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）反応速度アッセイデータを示す図である。
【図３Ｏ】ニトロセルロース上にドットされ、次いで、ハイブリドーマクローンであるＡＳ１９に由来する抗ベータ−ＤＧ抗体によりプローブされた、多様な量の組換えマウスベータ−ＤＧ  ＥＣＤ、ヒトベータ−ＤＧ  ＥＣＤ、または組換えジストログリカンについてのドットブロットを示す図である。Ｃ２Ｃ１２細胞溶解物、前脛骨筋細胞溶解物（ＴＡ溶解物）である。ファブラザイム（アガルシダーゼベータ、Ｇｅｎｚｙｍｅ）を、陰性対照として使用した。
【図３Ｐ】ハイブリドーマクローンであるＡＳ１９に由来する抗ベータ−ＤＧ抗体を使用する、Ｃ２Ｃ１２細胞溶解物からの、ベータ−ＤＧの免疫沈降を介して作出された試料についてのウェスタンブロットを示す図である。第１のレーンは、陽性対照を示し、第２のレーンは、ファージディスプレイクローンであるＢ０６（これは、βＤＧに対するアフィニティーが小さいので、βＤＧおよびアルファ−ＤＧに対するプルダウンが最小限である）に由来する抗ベータ−ＤＧ抗体でプローブされた免疫沈降試料を示し、第３のレーンは、ハイブリドーマクローンであるＡＳ１９に由来する抗ベータ−ＤＧ抗体でプローブされた免疫沈降試料を示す。
【図４−１】ハイブリドーマクローンであるＣ２１（図４Ａ）およびＣ３（図４Ｂ）に由来する抗ラミニン２抗体で染色され、次いで、蛍光標識化された抗マウスＩｇＧ二次抗体で検出された、固定されていない、凍結させた、ヒトおよびマウスの筋組織切片を示す図である。二次抗体のみでは、染色を明らかにしなかった（図示しない）。
【図４−２】ハイブリドーマクローンであるＡＳ３０（図４Ｃ）およびＡＳ１９（図４Ｄ）に由来する抗ベータ−ＤＧ抗体で染色され、次いで、蛍光標識化された抗マウスＩｇＧ二次抗体で検出された、固定されていない、凍結させた、ヒトおよびマウスの筋組織切片を示す図である。二次抗体のみでは、染色を明らかにしなかった（図示しない）。
【図５Ａ】一部の実施形態に従う、ベータ−ＤＧおよびラミニン２に特異的な、四価二特異性タンデムＩｇＧフォーマット抗体（ＴＢＴＩ抗体）についての概略的デザインを示す図である。
【図５Ｂ】一部の実施形態に従う、ベータ−ＤＧおよびラミニン２に特異的な、交差二重可変ドメインＩｇＧフォーマット（ＣＯＤＶ）二特異性抗体についての概略的デザインを示す図である。
【図６Ａ】ヒトＬＧ−４／５およびヒトベータ−ＤＧ（図６Ａ）、またはマウスＬＧ−４／５およびマウスベータ−ＤＧ（図６Ｂ）に対する、親モノクローナル抗体（ＡＳ１９、Ｃ３、およびＣ２１）および二特異性抗体（Ｔ１Ｔ２、Ｃ５Ｃ６、およびＴ５Ｔ６）についての、逐次的表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による結合解析データを示す図である。
【図６Ｂ】ヒトＬＧ−４／５およびヒトベータ−ＤＧ（図６Ａ）、またはマウスＬＧ−４／５およびマウスベータ−ＤＧ（図６Ｂ）に対する、親モノクローナル抗体（ＡＳ１９、Ｃ３、およびＣ２１）および二特異性抗体（Ｔ１Ｔ２、Ｃ５Ｃ６、およびＴ５Ｔ６）についての、逐次的表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）による結合解析データを示す図である。
【図７】二特異性抗体に対する、ＬＧ−４／５およびベータ−ＤＧの同時的な結合についての、二段型サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す図である。ベータ−ＤＧを添加した、親モノクローナル抗体（ＡＳ１９、Ｃ３、およびＣ２１）、およびベータ−ＤＧを添加するか、または添加していない二特異性抗体（Ｔ１Ｔ２、Ｃ５Ｃ６、またはＴ５Ｔ６）を、結合についてアッセイした。二特異性抗体である、Ｔ１Ｔ２、Ｔ５Ｔ６、およびＣ５Ｃ６だけが、ＬＧ−４／５およびベータ−ＤＧへの顕著な結合を、同時に示した。
【図８Ａ】親モノクローナル抗体（ＡＳ１９、Ｃ３、およびＣ２１）または二特異性抗体（Ｔ１Ｔ２、Ｃ５Ｃ６、またはＴ５Ｔ６）で染色され、蛍光標識化された抗マウスＩｇＧ二次抗体で検出された、固定されていない、凍結させた、野生型マウスの筋組織切片（図８Ａ）またはＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスの筋組織切片（図８Ｂ）を示す図である。
【図８Ｂ】親モノクローナル抗体（ＡＳ１９、Ｃ３、およびＣ２１）または二特異性抗体（Ｔ１Ｔ２、Ｃ５Ｃ６、またはＴ５Ｔ６）で染色され、蛍光標識化された抗マウスＩｇＧ二次抗体で検出された、固定されていない、凍結させた、野生型マウスの筋組織切片（図８Ａ）またはＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスの筋組織切片（図８Ｂ）を示す図である。
【図８Ｃ】二特異性抗体の、身体運動誘導性筋損傷に対する効果について調べるための、二特異性剤の筋内注射研究を概括する図である。二特異性抗体を、実験の１日目および４日目において、ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスの前脛骨筋（ＴＡ）に筋内注射した。エバンスブルー色素（ＥＢ）を、筋線維損傷を追跡するように、５日目に注射した。マウスは、強制走行型トレッドミル身体運動を経、６日目に屠殺された。
【図８Ｄ】親モノクローナル抗体（ＡＳ１９およびＣ３）の混合物と対比された、二特異性抗体であるＴ１Ｔ２による処置についての、エバンスブルー陽性（すなわち、損傷した）筋線維の平均数を示す図である。二特異性抗体処置では、対照の親抗体処置より少ない損傷が見られた。
【図８Ｅ】二特異性抗体であるＴ１Ｔ２、または親モノクローナル抗体（ＡＳ１９およびＣ３）の混合物で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスの、染色された筋組織を示す図である。エバンスブルー色素による染色（矢印）は、二特異性抗体であるＴ１Ｔ２より、親モノクローナル抗体で処置された組織内で、はるかに顕著である。蛍光二次抗体を使用する、二特異性抗体であるＴ１Ｔ２または親モノクローナル抗体（ＡＳ１９およびＣ３）の混合物による染色を示す。
【図８Ｆ】全身送達後における、二特異性抗体であるＴ１Ｔ２（尾静脈注射により投与されるか、または腹腔内投与された）、およびハイブリドーマクローンであるＡＳ１９またはＣ３に由来する親抗体の薬物動態および生体内分布を示す図である。二特異性抗体は、投薬の４日後においてもなお、血液中で検出可能である。
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、野生型マウス（上向き三角）、対照モノクローナル親抗体で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウス（下向き三角）、および二特異性抗体で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウス（四角）についての行動試験を示す図である。図９Ａは、二特異性抗体で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスが、握力試験において、非処置ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスと比較した改善を示したことを示す。図９Ｂは、二特異性抗体で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスが、ワイヤーハング試験において、非処置ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスと比較した改善を示したことを示す。図９Ｃは、二特異性抗体で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスが、走行時間試験において、非処置ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスを上回る改善を示したことを示す。図９Ｄは、二特異性抗体で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスが、クレアチンキナーゼレベルを、非処置ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスと比較して低下させていることから、筋肉損傷の軽減が示唆されることを示す図である。
【図１０】親モノクローナル抗体であるＡＳ１９とＣ３との混合物（群２  対照）と対比された、二特異性抗体であるＴ１Ｔ２（群１  Ｔ１Ｔ２）により処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスに由来する組織内の、エバンスブルー陽性（すなわち、損傷した）筋線維の平均数を示す図である。野生型非処置マウス（群３  ＷＴ）を、対照として使用した。ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスにおいて、二特異性抗体であるＴ１Ｔ２処置により、対照親抗体処置より軽度の損傷が見られた。
【図１１】二特異性抗体であるＴ１Ｔ２、親モノクローナル抗体であるＡＳ１９もしくはＣ３、または陰性対照としてのＰＢＳによる注射の４日後における、ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウス組織についての免疫蛍光染色を示す図である。スライドを洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用してマウントした。ＩＶ：静脈内注射；ＩＰ：腹腔内注射である。
【図１２Ａ】抗原であるヒトベータ−ＤＧに結合したＡＳ３０  Ｆａｂ全体構造を示す図であり、抗原は、重鎖と軽鎖との間に示される。
【図１２Ｂ】ＡＳ３０  ＦａｂのＣＤＲと、抗原であるベータ−ＤＧとの間の相互作用の詳密図を示す。相互作用に関与する残基を、スティックとして示し；ＣＤＲ内の矢印は、Ｎ末端から、Ｃ末端への配向性を指し示す。
【図１２Ｃ】抗原であるヒトラミニン２  ＬＧ−５ドメインに結合したＣ２１  Ｆａｂ全体構造を示す図であり、抗原は、重鎖と軽鎖との間に示される。
【図１２Ｄ】Ｃ２１  ＦａｂのＣＤＲと、抗原であるラミニン２  ＬＧ−５ドメインとの間の相互作用の詳密図を示す。相互作用に関与する残基を、スティックとして示し；ＣＤＲ内の矢印は、Ｎ末端から、Ｃ末端への配向性を指し示す。
【図１３】一部の実施形態に従う、ラミニン２またはベータ−ＤＧへの結合のために、３つの抗原結合性部位を形成する、４つのポリペプチド鎖を含む、三価の結合性タンパク質（ｔｒｉＡｂ）についての概略表示を示す図である。
【図１４Ａ】ヒトＬＧ４／５またはベータ−ＤＧへのｔｒｉＡｂの結合について検討する、二重結合サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。図１４Ａでは、プレートを、ビオチニル化Ｎ’Ａｖｉ−ＨＰＣ４−ヒトＬＧ４／５でコーティングし、ヒトベータ−ＤＧへの結合を検出した。図１４Ｂでは、プレートを、ヒト−ベータＤＧ−ＨＰＣ４−Ａｖｉ−Ｃ’でコーティングし、ヒトＬＧ４／５への結合を検出した。
【図１４Ｂ】ヒトＬＧ４／５またはベータ−ＤＧへのｔｒｉＡｂの結合について検討する、二重結合サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイの結果を示す図である。図１４Ａでは、プレートを、ビオチニル化Ｎ’Ａｖｉ−ＨＰＣ４−ヒトＬＧ４／５でコーティングし、ヒトベータ−ＤＧへの結合を検出した。図１４Ｂでは、プレートを、ヒト−ベータＤＧ−ＨＰＣ４−Ａｖｉ−Ｃ’でコーティングし、ヒトＬＧ４／５への結合を検出した。
【図１４Ｃ】ｔｒｉＡｂ  ３４０７、３４３７、または３４３９の、ヒトＬＧ４／５、次いで、ヒトベータ−ＤＧへの逐次的結合を示す図である。これに対し、一価抗ＬＧ４／５抗体である、Ｃ３＿Ｈｕ１１、Ｃ２１＿Ｈｕ１１、Ｃ２１＿Ｈｕ２１、およびＣ３＿Ｈｕ１０のみが、ＬＧ４／５に結合する一方、一価抗ベータ−ＤＧ抗体であるＡＳ３０＿Ｈｕ６のみが、ベータ−ＤＧに結合し、陰性対照であるｔｒｉＡｂは、結合を示さなかった。
【図１５】握力アッセイを使用する、ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスにおける、ｔｒｉＡｂ  ３４０７、３４３７、または３４３９による処置の、筋肉機能に対する効果を示す図である。表示のｔｒｉＡｂの投与を、生理食塩液または陰性対照ｔｒｉＡｂの投与と比較した。アッセイにおける野生型マウスの動作もまた、測定した。
【図１６】ワイヤーハングアッセイを使用する、ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスにおける、ｔｒｉＡｂ  ３４０７、３４３７、または３４３９による処置の、筋肉機能に対する効果を示す図である。表示のｔｒｉＡｂの投与を、生理食塩液または陰性対照ｔｒｉＡｂの投与と比較した。アッセイにおける野生型マウスの動作もまた、測定した。
【図１７】トレッドミルアッセイを使用する、ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスにおける、ｔｒｉＡｂ  ３４０７、ｔｒｉＡｂ  ３４３７、またはｔｒｉＡｂ  ３４３９による処置の、筋肉機能に対する効果を示す図である。表示のｔｒｉＡｂの投与を、生理食塩液または陰性対照ｔｒｉＡｂの投与と比較した。アッセイにおける野生型マウスの動作もまた、測定した。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本開示は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する第２の結合性ドメインとを含む、多特異性結合性分子および二特異性結合性分子を提供する。一部の実施形態では、結合性分子は、二特異性であり、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する第２の結合性ドメインとを含む。一部の実施形態では、結合性分子は、多特異性であり、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する第２の結合性ドメインと、１つまたはそれ以上のさらなる標的に結合する、１つまたはそれ以上のさらなる結合性ドメインとを含む。本開示は、ジストログリカンおよびラミニン２に同時に結合し、ｉｎ  ｖｉｖｏモデル系における、アルファ−ジストログリカノパチーの症状を改善することが可能な、多特異性／二特異性結合性分子の複数の構成を提供する。
【００５２】
以下の記載は、例示的方法、パラメータなどを明示する。しかし、このような記載は、本開示の範囲に対する限定として意図されるものではなく、例示的実施形態の記載として提供されるものであることを認識されたい。
【００５３】
定義
本開示に従い活用される通り、以下の用語は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、以下の意味を有することが理解されるものとする。文脈によりそうでないことが要求されない限りにおいて、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含むものとする。
【００５４】
本明細書で使用される「抗原」または「標的抗原」または「抗原標的」という用語は、結合性タンパク質が結合することが可能であり、加えて、この抗原へのエピトープに結合することが可能な抗体を作製するのに、動物において使用することが可能な分子または分子の部分を指す。標的抗原は、１つまたはそれ以上のエピトープを有しうる。結合性タンパク質により認識される各標的抗原に関して、結合性タンパク質は、標的抗原を認識する無傷抗体と競合することが可能である。本明細書で記載される例示的な標的抗原は、ジストログリカン（例えば、その細胞外部分）およびラミニン２を含む。
【００５５】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に特異的に結合することが可能な、任意の決定基、例えば、ポリペプチド決定基を含む。ある特定の実施形態では、エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基のような、分子の、化学的活性表面の群分けを含み、ある特定の実施形態では、特異的三次元構造的特徴および／または特異的電荷特徴を有しうる。エピトープとは、抗体または結合性タンパク質が結合する抗原の領域である。ある特定の実施形態では、結合性タンパク質は、それが、タンパク質および／または高分子の複合体混合物中で、その標的抗原を、優先的に認識する場合に、抗原に特異的に結合するという。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、平衡解離定数が、≦１０−６Ｍである場合、例えば、平衡解離定数が、≦１０−９Ｍである場合であり、例えば、解離定数が、≦１０−１０Ｍである場合に、抗原に特異的に結合するという。
【００５６】
結合性タンパク質の解離定数（ＫＤ）は、例えば、表面プラズモン共鳴により決定することができる。一般に、表面プラズモン共鳴解析は、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ；Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により、リガンド（バイオセンサーマトリックス上の標的抗原）と解析物（溶液中の結合性タンパク質）との間の、リアルタイムの結合相互作用を測定する。表面プラズモン解析はまた、解析物（結合性タンパク質上のバイオセンサーマトリックス）を固定化し、リガンド（標的抗原）を提示することにより実施される。本明細書で使用される「ＫＤ」という用語は、特定の結合性タンパク質と、標的抗原との間の相互作用についての解離定数を指す。
【００５７】
本明細書で使用される「〜に特異的に結合する」という用語は、結合性タンパク質またはその抗原結合性断片が、エピトープを含有する抗原に、少なくとも約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍまたはそれ以上のＫＤで結合し、かつ／またはエピトープに、非特異的抗原に対するそのアフィニティーの、少なくとも２倍のアフィニティーで結合する能力を指す。
【００５８】
本明細書で使用される「結合性タンパク質」という用語は、少なくとも１つの標的抗原に特異的に結合する、非天然の（または組換えまたは操作された）分子を指す。
【００５９】
「単一特異性結合性タンパク質」という用語は、１つの抗原標的に特異的に結合する結合性タンパク質を指す。
【００６０】
「一価の結合性タンパク質」という用語は、１つの抗原結合性部位を有する結合性タンパク質を指す。
【００６１】
「二特異性結合性タンパク質」という用語は、２つの異なる抗原標的に特異的に結合する結合性タンパク質を指す。二特異性抗体または二官能性抗体は、典型的に、２つの異なる重鎖／軽鎖対、および２つの異なる結合性部位またはエピトープを有する人工ハイブリッド抗体である。二特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦ（ａｂ’）断片の連結を含むがこれらに限定されない、様々な方法により作製することができる。
【００６２】
「二価結合性タンパク質」という用語は、２つの結合性部位またはドメインを有する結合性タンパク質を指す。
【００６３】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも１０ヌクレオチドの長さの一本鎖または二本鎖の核酸ポリマーを指す。ある特定の実施形態では、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾形態でありうる。このような修飾は、ブロムリジンのような塩基修飾、アラビノシドおよび２’，３’−ジデオキシリボースのようなリボース修飾、ならびにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホロアニラデート、およびホスホロアミデートのようなヌクレオチド間連結修飾を含む。「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的に、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を含む。
【００６４】
「単離ポリヌクレオチド」とは、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成由来、またはこれらの一部の組合せによるポリヌクレオチドであって、（１）単離ポリヌクレオチドが天然で見出されるポリヌクレオチドの全部または一部と会合しないポリヌクレオチド、（２）単離ポリヌクレオチドが天然で連関しないポリヌクレオチドと連関するポリヌクレオチド、または（３）天然で、より大きな配列の一部として生じないポリヌクレオチドである。
【００６５】
「単離ポリペプチド」とは、（１）通常共に見出される、少なくとも一部の他のポリペプチドを含まないポリペプチド、（２）同じ供給源、例えば、同じ種に由来する、他のポリペプチドを本質的に含まないポリペプチド、（３）異なる種に由来する細胞が発現させるポリペプチド、（４）天然では会合する、ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、または他の材料のうちの、少なくとも約５０パーセントから分離されたポリペプチド、（５）天然では「単離ポリペプチド」が会合するポリペプチドの部分と会合しない（共有結合または非共有結合による相互作用により）ポリペプチド、（６）天然では会合しないポリペプチドと作動可能に会合する（共有結合または非共有結合による相互作用により）ポリペプチド、または（７）天然では生じないポリペプチドである。このような単離ポリペプチドは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは合成由来の他のＲＮＡ、またはこれらの任意の組合せによりコードされる。一部の実施形態では、単離ポリペプチドは、その天然の環境において見出されるポリペプチドまたは他の夾雑物であって、その使用（治療、診断、予防、研究、または他の形）に干渉するポリペプチドまたは他の夾雑物を実質的に含まない。
【００６６】
自然発生の抗体は、典型的に、四量体を含む。このような各四量体は、典型的に、各対が、１つの全長「軽」鎖（典型的に、約２５ｋＤａ分子量を有する）と、１つの全長「重」鎖（典型的に、約５０〜７０ｋＤａの分子量を有する）とを有する、２つの同一のポリペプチド鎖の対から構成される。本明細書で使用される「重鎖」および「軽鎖」という用語は、標的抗原に対する特異性を付与するのに十分な可変ドメイン配列を有する、任意の免疫グロブリンポリペプチドを指す。各軽鎖および重鎖のアミノ末端部分は、典型的に抗原認識の一因となる、約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変ドメインを、典型的に含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、典型的に、エフェクター機能の一因となる定常ドメインを規定する。したがって、自然発生の抗体では、全長重鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＨ）および３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を含み、ＶＨドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＨ３ドメインは、カルボキシル末端にあり、全長軽鎖免疫グロブリンポリペプチドは、可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含み、ＶＬドメインは、ポリペプチドのアミノ末端にあり、ＣＬドメインは、カルボキシル末端にある。
【００６７】
ヒト軽鎖は、典型的に、カッパおよびラムダ軽鎖と分類され、ヒト重鎖は、典型的に、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、またはイプシロンと分類され、抗体のアイソタイプを、それぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥと規定する。ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＭは、ＩｇＭ１およびＩｇＭ２を含むがこれらに限定されない、いくつかのサブクラスを有する。ＩｇＡも同様に、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含むがこれらに限定されないサブクラスに細分される。全長軽鎖内および重鎖内では、可変ドメインと定常ドメインとは、典型的に、約１２またはそれ以上のアミノ酸の「Ｊ」領域により接合されており、重鎖もまた、さらに約１０アミノ酸の「Ｄ」領域を含む。例えば、参照により、その全体において、全ての目的で組み入れられる、「ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ」（ＰＡＵＬ，Ｗ．編、ＲＡＶＥＮ  ＰＲＥＳＳ、２版、１９８９）を参照されたい。各軽／重鎖対の可変領域は、典型的に、抗原結合性部位を形成する。自然発生の抗体の可変ドメインは、典型的に、相補性決定領域またはＣＤＲともまた呼ばれる、３つの超可変領域により接合された、比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）の、同じ一般的構造を示す。各対の２つの鎖に由来するＣＤＲは、典型的に、特異的エピトープへの結合を可能としうる、フレームワーク領域によりアライメントされる。アミノ末端からカルボキシル末端に、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインのいずれも、典型的に、ドメインである、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４を含む。
【００６８】
「ＣＤＲセット」という用語は、抗原に結合することが可能な、単一の可変領域内で生じる、３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、異なるシステムに従い、異なる形で規定されている。Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔら、ＳＥＱＵＥＮＣＥＳ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＩＮＴＥＲＥＳＴ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７）および（１９９１））により記載されるシステムは、抗体の任意の可変領域に適用可能な、明確な残基番号付けシステムを提示するだけではなく、また、３つのＣＤＲを規定する、正確な残基境界も提示する。これらのＣＤＲを、ＫａｂａｔによるＣＤＲと称することができる。Ｃｈｏｔｈｉａおよび共同作業者（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、１９８７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８３）は、ＫａｂａｔによるＣＤＲ内のある特定の部分が、アミノ酸配列のレベルで、大きな多様性を有するにもかかわらず、ほぼ同一のペプチド骨格コンフォメーションを採用することを見出した。これらの部分は、Ｌ１、Ｌ２、およびＬ３、またはＨ１、Ｈ２、およびＨ３と呼ばれ、この場合、「Ｌ」および「Ｈ」は、それぞれ、軽鎖および重鎖領域を指示する。これらの領域を、ＫａｂａｔによるＣＤＲと重複する境界を有する、ＣｈｏｔｈｉａによるＣＤＲと称することができる。ＫａｂａｔによるＣＤＲと重複するＣＤＲを規定する他の境界は、Ｐａｄｌａｎ、１９９５、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９：１３３〜３９；ＭａｃＣａｌｌｕｍ、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２６２（５）：７３２〜４５；およびＬｅｆｒａｎｃ、２００３、Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２７：５５〜７７により記載されている。さらに他のＣＤＲ境界の定義は、厳密には、本明細書におけるシステムのうちの１つには従わず、特定の残基もしくは残基群、なおまたは全ＣＤＲが、抗原への結合にそれほど影響しないという、予測または実験による知見に照らして、狭められる場合もあり、広げられる場合もあるが、にもかかわらず、ＫａｂａｔによるＣＤＲと重複する。本明細書で使用される方法は、これらのシステムのうちのいずれかに従い規定されるＣＤＲを活用しうるが、ある特定の実施形態は、ＫａｂａｔまたはＣｈｏｔｈｉａにより規定されたＣＤＲを使用する。アミノ酸配列を使用して予測されたＣＤＲの同定は、Ｍａｒｔｉｎ，Ａ．Ｃ．「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ」、「Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ」、２巻、ＫｏｎｔｅｒｍａｎｎＲ．，ＤｕｂｅｌＳ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｂｅｒｌｉｎ、３３〜５１頁（２０１０）におけるように、当技術分野で周知である。重鎖および／または軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列はまた、従来の他の方法により、例えば、配列の超可変領域を決定することが公知である、他の重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列との比較により、ＣＤＲの配列を同定するように、検討することもできる。番号付けされた配列は、目視によりアライメントすることもでき、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ、１９９４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２２：４６７３〜８０において記載されている、ＣＬＵＳＴＡＬシリーズのプログラムのうちの１つのようなアライメントプログラムを援用することによりアライメントすることもできる。従来、フレームワーク領域およびＣＤＲ領域を適正に画定し、これにより、配列ベースの割当てを是正するのに、分子モデルが使用されている。
【００６９】
本明細書で使用される「Ｆｃ」という用語は、単量体形態であれ、多量体形態であれ、抗体の消化から生じるか、または他の手段により作製される、非抗原結合性断片の配列を含む分子を指し、ヒンジ領域を含有しうる。一部の実施形態では、天然のＦｃの、元の免疫グロブリン供給源は、ヒト由来であり、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２のうちのいずれかでありうる。Ｆｃ分子は、共有結合による会合（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合による会合により、二量体形態または多量体形態に連結される単量体ポリペプチドから作られる。天然のＦｃ分子単量体のサブユニットの間の、分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、およびＩｇＧＡ２）に応じて、１つ〜４つの範囲である。Ｆｃの１つの例は、ＩｇＧのパパイン消化から生じる、ジスルフィド結合した二量体である。本明細書で使用される「Ｆｃ」という用語は、単量体形態、二量体形態、および多量体形態に対して総称的である。
【００７０】
Ｆ（ａｂ）断片は、典型的に、１つの軽鎖と、１つの重鎖のＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインとを含み、Ｆ（ａｂ）断片のＶＨ−ＣＨ１重鎖部分は、別の重鎖ポリペプチドと、ジスルフィド結合を形成することができない。本明細書で使用されるＦ（ａｂ）断片はまた、アミノ酸リンカーにより隔てられた、２つの可変ドメインを含有する、１つの軽鎖と、アミノ酸リンカーおよびＣＨ１ドメインにより隔てられた、２つの可変ドメインを含有する、１つの重鎖とも含みうる。
【００７１】
Ｆ（ａｂ’）断片は、鎖間ジスルフィド結合が、２つの重鎖の間で形成されて、Ｆ（ａｂ’）２分子を形成するように、典型的に、１つの軽鎖と、定常領域（ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとの間）の多くを含有する、１つの重鎖部分とを含む。
【００７２】
「組換え」分子とは、組換え手段により調製されるか、発現させられるか、創出されるか、または単離された分子である。
【００７３】
本開示の一実施形態は、１つ〜３つの間の標的抗原に対する生物学的特異性および免疫学的特異性を有する結合性タンパク質を提供する。本開示の別の実施形態は、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本開示の別の実施形態は、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む発現ベクターを提供する。本開示の、さらに別の実施形態は、このような結合性タンパク質（すなわち、このような結合タンパク質を形成するポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む）を発現する宿主細胞を提供する。
【００７４】
本明細書で使用される「スワッパビリティー（ｓｗａｐａｂｉｌｉｔｙ）」という用語は、結合性タンパク質フォーマット内の可変ドメインの互換性であり、フォールディングおよび最終的な結合アフィニティーを保持した互換性を指す。「完全なスワッパビリティー（ｓｗａｐａｂｉｌｉｔｙ）」は、結合アフィニティーの保持により証拠立てられる、結合性タンパク質の完全な機能性を維持しながら、式Ｉのポリペプチド鎖内または式ＩＩのポリペプチド鎖内の、ＶＨ１ドメインおよびＶＨ２ドメインの両方の順序をスワップし（すなわち、順序を逆にし）、これにより、ＶＬ１ドメインおよびＶＬ２ドメインの順序をスワップする能力を指す。さらに、ＶＨおよびＶＬという呼称は、最終的なフォーマット内の、特定のタンパク質鎖上の、ドメインの位置だけを指すことに注意すべきである。例えば、ＶＨ１およびＶＨ２は、親抗体内のＶＬ１ドメインおよびＶＬ２ドメインに由来し、結合性タンパク質内のＶＨ１およびＶＨ２の位置に置かれうるであろう。同様に、ＶＬ１およびＶＬ２は、親抗体内のＶＨ１ドメインおよびＶＨ２ドメインに由来し、結合性タンパク質内のＶＨ１およびＶＨ２の位置に置かれうるであろう。したがって、ＶＨおよびＶＬという呼称は、現在の位置を指すものであり、親抗体内の元の位置を指すわけではない。したがって、ＶＨドメインと、ＶＬドメインとは、「スワッパブル」である。
【００７５】
「単離」結合性分子またはタンパク質とは、その天然環境の構成要素から同定および分離ならびに／または回収されたものである。その天然環境の夾雑構成要素は、結合性タンパク質の診断的使用または治療的使用に干渉する物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質を含みうる。一実施形態では、結合性分子またはタンパク質を、（１）ローリー法により決定される通り、抗体の重量で９５％以上まで精製し、一部の実施形態では、重量で９９％以上まで精製するか、（２）スピニングカップ型シーケネーターを使用することにより、Ｎ末端のアミノ酸配列もしくは内部アミノ酸配列のうちの、少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで精製するか、または（３）クーマシーブルー染色もしくは銀染色を使用して、還元条件下もしくは非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、均質性まで精製する。天然環境の、少なくとも１つの構成要素が存在しないので、単離結合性分子または単離タンパク質は、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕにおける分子／タンパク質を含む。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製工程により調製する。
【００７６】
本明細書で使用される「実質的に純粋な」または「実質的に精製された」という用語は、存在する主要な分子種である（すなわち、モルベースで、組成物中の、他の任意の個別の分子種より夥多である）、化合物または分子種を指す。一部の実施形態では、実質的に精製された画分とは、分子種が、存在する全ての高分子種のうちの、少なくとも約５０％（モルベースで）を含む組成物である。他の実施形態では、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在する、全ての高分子種のうちの、約８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％以上を含むであろう。さらに他の実施形態では、分子種を、組成物が、単一の高分子種から本質的になる、本質的な均質性まで精製する（夾雑分子種は、従来の検出法により、組成物中で検出されない）。
【００７７】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、コード情報を、宿主細胞に移送するのに使用される、任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指す。「ベクター」という用語は、連結された別の核酸を運ぶことが可能な核酸分子を含む。ベクターの１つの種類は、さらなるＤＮＡセグメントが挿入される、環状二本鎖ＤＮＡ分子を指す「プラスミド」である。ベクターの別の種類は、さらなるＤＮＡセグメントが、ウイルスゲノムに挿入される、ウイルスベクターである。ある特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内の自己複製が可能である（例えば、細菌の複製起点と、哺乳動物エピソームベクターとを有する細菌ベクター）。他のベクター（例えば、哺乳動物の非エピソームベクター）は、宿主細胞に導入されると、宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより、宿主ゲノムと共に複製される。加えて、ある特定のベクターは、作動的に連結される遺伝子の発現を方向付けることが可能である。本明細書では、このようなベクターを、「組換え発現ベクター」（または、単に、「発現ベクター」）と称する。一般に、組換えＤＮＡ法において有用な発現ベクターは、プラスミドの形態にあることが多い。プラスミドは、一般に、ベクターの形態で使用されるので、本明細書では、「プラスミド」という用語と、「ベクター」」という用語とを、互換的に使用することができる。しかし、本開示は、ウイルスベクター（例えば、複製欠損性のレトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）のような、同等な機能を果たす、発現ベクターの他の形態を含むことを意図する。
【００７８】
本明細書で使用される「組換え宿主細胞」（または「宿主細胞」）という語句は、組換え発現ベクターが導入された細胞を指す。組換え宿主細胞または宿主細胞は、特定の対象細胞だけを指すのではなく、また、このような細胞の後代も指すことを意図する。後続の世代では、突然変異または環境的影響のために、何らかの修飾が生じうるため、このような後代は、実際には、親細胞と同一ではないが、このような細胞も、本明細書で使用される、「宿主細胞」という用語の範囲内に、やはり含まれる。細菌発現系、酵母発現系、バキュロウイルス発現系、および哺乳動物発現系（ならびにファージディスプレイ発現系）を含む、多種多様な宿主細胞発現系を使用して、結合性タンパク質を発現することができる。適切な細菌発現ベクターの例は、ｐＵＣ１９である。結合性タンパク質を、組換えにより発現させるために、ポリペプチド鎖が、宿主細胞内で発現し、宿主細胞が培養される培地であって、結合性タンパク質が回収される培地に分泌されるように、宿主細胞を、結合性タンパク質のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ断片を保有する、１つまたはそれ以上の組換え発現ベクターで形質転換するか、または宿主細胞に、これらをトランスフェクトする。
【００７９】
本明細書で使用される「形質転換」という用語は、細胞の遺伝子特徴の変化を指し、細胞は、新たなＤＮＡを含有するように改変された場合に、形質転換されている。例えば、細胞は、その天然状態から遺伝子改変される場合に、形質転換される。形質転換の後、形質転換するＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込まれることにより、細胞のＤＮＡと組み換えられる場合もあり、エピソームエレメントとして、複製されずに、一過性に維持される場合もあり、プラスミドとして、独立に複製される場合もある。ＤＮＡが、細胞分裂により複製される場合に、細胞は、安定的に形質転換されると考えられる。本明細書で使用される「トランスフェクション」という用語は、外来または外因性のＤＮＡの、細胞による取込みを指し、外因性ＤＮＡが、細胞膜内に導入された場合に、細胞は、「トランスフェクトされている」。当技術分野では、多数のトランスフェクション法が周知である。このような技法を使用して、１つまたはそれ以上の外因性ＤＮＡ分子を、適切な宿主細胞に導入することができる。
【００８０】
本明細書で使用され、対象に適用される、「自然発生の」という用語は、物体が、天然で見出され、人為により操作されていない事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）において存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドであって、天然では、供給源から単離することができ、人為により、意図的に修飾されていないポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、自然発生である。同様に、本明細書で使用される「非自然発生の」とは、天然で見出されないか、または人為により構造的に修飾されているか、もしくは合成されている物体を指す。
【００８１】
本明細書で使用される、２０の従来のアミノ酸およびそれらの略号は、従来の使用法に従う。２０の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）；α−アミノ酸、α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の非従来型アミノ酸のような、非天然アミノ酸および類似体もまた、結合性タンパク質のポリペプチド鎖に適する構成要素でありうる。非従来型アミノ酸の例は、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリシン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸、ならびにイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）を含む。本明細書で使用されるポリペプチドの表記法では、標準的な使用法および慣例に従い、左手方向は、アミノ末端方向であり、右手方向は、カルボキシル末端方向である。
【００８２】
自然発生の残基は、一般的な側鎖特性：
（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｒｏ；
（２）極性親水性：Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ ；
（３）脂肪族：Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（４）脂肪族疎水性：Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ；
（５）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（６）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（７）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（８）鎖の配向性に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（９）芳香族：Ｈｉｓ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ；および
（１０）芳香族疎水性：Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ
に基づくクラスに分けることができる。
【００８３】
保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーと、同じクラスの別のメンバーとの交換を伴いうる。非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーによる、別のクラスに由来するメンバーの交換を伴いうる。
【００８４】
当業者は、周知の技法を使用して、結合性タンパク質のポリペプチド鎖の、適切な変異体を決定することが可能であろう。例えば、当業者は、活性に重要であると考えられない領域をターゲティングすることにより、活性を破壊せずに変化させうる、ポリペプチド鎖の適切な領域を同定しうる。代替的に、当業者は、類似するポリペプチドの間で保存的な分子の残基および部分を同定しうる。加えて、生物学的活性を破壊したり、ポリペプチド構造に有害な影響を及ぼしたりしない限りにおいて、生物学的活性または構造に重要でありうる領域であってもなお、保存的アミノ酸置換にかけることができる。
【００８５】
本明細書で使用される「患者」という用語（本明細書では、「個体」という用語と、「対象」という用語とを、互換的に使用することができる）は、ヒトおよび動物対象（例えば、哺乳動物、を含むがこれらに限定されない、イヌ、ネコ、および他の愛玩動物；ウマ、ウシ、ヤギ、ウサギ、野牛、および他の家畜；ならびに非ヒト霊長動物、マウスなどのような研究用動物）を含む。
【００８６】
一部の実施形態では、本明細書で使用される「処置」または「処置する」という用語は、例えば、１つまたはそれ以上の症状の重症度または存在を軽減または緩和する治療的処置を指す。
【００８７】
他の実施形態では、本明細書で使用される「防止する」という用語は、例えば、本明細書で記載される病理学的状態を発症する危険性がある個体における、１つまたはそれ以上の症状の発症を、例えば、防止するか、または遅延させる予防的措置または防止的措置を指す場合がある。
【００８８】
本明細書で使用される「医薬組成物」または「治療用組成物」という用語は、患者に、適正に投与された場合、所望の治療的効果を誘導することが可能な化合物または組成物を指す。
【００８９】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」または「生理学的に許容される担体」という用語は、結合性タンパク質の送達を達するか、または増強するのに適する、１つまたはそれ以上の製剤材料を指す。
【００９０】
１つまたはそれ以上の結合性タンパク質を含む医薬組成物に言及して使用される場合の、「有効量」および「治療有効量」という用語は、所望の治療結果をもたらすのに十分な量または投与量を指す。より具体的には、治療有効量は、ある期間にわたり、処置される状態と関連する、臨床的に規定された病理学的過程のうちの１つまたはそれ以上を阻害するのに十分な量の結合性タンパク質である。有効量は、使用される特異的結合性タンパク質に応じて変動する場合があり、また、処置される患者と関連する、様々な因子および条件、ならびに障害の重症度にも依存する。例えば、結合性タンパク質を、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて投与する場合、考えられる因子には、患者の年齢、体重、および健康のほか、前臨床動物研究において得られる、用量応答曲線および毒性データのような因子があろう。医薬組成物が施される有効量または治療有効量の決定は、十分に、当業者の能力の範囲内にある。
【００９１】
本開示の一実施形態は、薬学的に許容される担体と、治療有効量の結合性分子とを含む医薬組成物を提供する。
【００９２】
結合性分子
本開示のある特定の態様は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する、１つまたはそれ以上の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する、１つまたはそれ以上の結合性ドメインとを含む多特異性結合性分子に関する。一部の実施形態では、多特異性結合性分子は、１つまたはそれ以上のポリペプチド鎖を含む多特異性結合性タンパク質である。一部の実施形態では、多特異性結合性分子は、２つまたは４つの抗原結合性部位を含む、二価または四価の二特異性結合性分子である。一部の実施形態では、多特異性結合性分子は、３つの抗原結合性部位を含む、三価の多特異性結合性分子である。本明細書では、「結合性ドメイン」という用語と、「結合性部位」という用語とを、互換的に使用する。
【００９３】
当技術分野ででは、多特異性結合性タンパク質のための、多様なフォーマットおよび構成が公知であり、本明細書で記載される使用に適する。例示的かつ非限定的フォーマットについての記載を下記に提示する。国際公開第２０１７／１８０９１３号において記載されている、任意選択のそのフォーマットおよび特色のうちのいずれかを、本明細書で記載される結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）内で使用することができる。
【００９４】
多特異性で、三価の結合性タンパク質
一部の実施形態では、結合性タンパク質は、多特異性結合性タンパク質である。一部の実施形態では、多特異性結合性タンパク質は、３つの抗原結合性部位を含み、総体として、２つまたはそれ以上の標的抗原をターゲティングする三価結合性タンパク質である。一部の実施形態では、結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、４つのポリペプチド鎖を含み、第１のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ２−Ｌ１−ＶＬ１−Ｌ２−ＣＬ  ［Ｉ］
により表される構造を含み、第２のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ１−Ｌ３−ＶＨ２−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ［ＩＩ］
により表される構造を含み、第３のポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ３−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ［ＩＩＩ］
により表される構造を含み、第４のポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ３−ＣＬ  ［ＩＶ］
により表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ３は、第３の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ３は、第３の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーである。
【００９５】
一部の実施形態では、式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、交差軽鎖−重鎖対を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ１とＶＬ１は抗原結合性部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２は抗原結合性部位を形成し、ＶＨ３とＶＬ３は抗原結合性部位を形成し、合計で３つの抗原結合性部位を形成する。一部の実施形態では、３つの抗原結合性部位は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位と、ラミニン２に結合する少なくとも１つの抗原結合性部位（例えば、ジストログリカンの細胞外部分に結合する１つの抗原結合性部位と、ラミニン２に結合する２つの抗原結合性部位と、またはジストログリカンの細胞外部分に結合する２つの抗原結合性部位と、ラミニン２に結合する１つの抗原結合性部位と）を含む。
【００９６】
一部の実施形態では、ラミニン２に結合する２つの抗原結合性部位は、ラミニン２の異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する２つの抗原結合性部位は、ラミニン２の同じエピトープまたは重複するエピトープに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１とＶＬ１とは、ラミニン２に結合する第１の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とは、ラミニン２に結合する第２の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ３とＶＬ３とは、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第３の抗原結合性部位を形成する。
【００９７】
一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する２つの抗原結合性部位は、ジストログリカンの細胞外部分の異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する２つの抗原結合性部位は、ジストログリカンの細胞外部分の同じエピトープまたは重複するエピトープに結合する。一部の実施形態では、ＶＨ１とＶＬ１とは、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ２とＶＬ２とは、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第２の抗原結合性部位を形成し、ＶＨ３とＶＬ３とは、ラミニン２に結合する第３の抗原結合性部位を形成する。
【００９８】
本明細書で記載される抗原結合性部位のうちのいずれかは、例えば、上記で記載された、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、および／またはＩＶに従うポリペプチドを含む結合性タンパク質を含むがこれらに限定されない、本明細書で記載される結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）内で使用される。
【００９９】
一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、ＧＦＴＦＴＤＳＶ（配列番号３１６）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、ＩＹＰＧＳＧＮＦ（配列番号３１８）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、およびＡＭＲＲＳＳ（配列番号３２０）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；配列ＱＴＩＶＨＳＮＳＫＴＹ（配列番号３３２）を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列ＫＶＳ（配列番号３３４）を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列ＦＱＧＳＨＶＰＬＴ（配列番号３３６）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、ジストログリカンの細胞外部分に結合する抗原結合性部位（例えば、ＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、またはＶＨ３およびＶＬ３）を形成する。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、表Ａ２に示された抗体ＡＳ３０ＳＳ＿Ｈｕ６またはＡＳ３０ＳＳ＿Ｈｕ９の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列を含む。
【０１００】
一部の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、ヒト化である。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号３１４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号３３０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号３４６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号３６２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、表Ｄ２に示された抗体ＡＳ３０ＳＳ＿Ｈｕ６またはＡＳ３０ＳＳ＿Ｈｕ９の、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号３０６のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン、および／または配列番号３２２のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号３３８のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン、および／または配列番号３５４のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメインを含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、ＧＦＴＦＳＳＹＴ（配列番号３８０）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、ＩＳＳＳＧＳＮＴ（配列番号３８２）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、およびＡＲＦＤＹＧＳＳＬＤＳ（配列番号３８４）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；配列ＱＳＩＳＮＮ（配列番号３９６）を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列ＹＡＳ（配列番号３９８）を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列ＱＱＳＫＳＷＰＲＴ（配列番号４００）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、ラミニン２に結合する抗原結合性部位（例えば、ＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、またはＶＨ３およびＶＬ３）を形成する。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、表Ａ２に示された抗体Ｃ３＿Ｈｕ１０の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列を含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、ヒト化である。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号３７８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号３９４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、表Ｄ２に示された抗体Ｃ３＿Ｈｕ１０の、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号３７０のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン、および／または配列番号３８６のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメインを含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、ＧＦＴＦＳＳＹＴ（配列番号３８０）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、ＩＳＳＳＧＳＮＴ（配列番号３８２）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、およびＡＲＦＤＹＧＳＳＬＤＳ（配列番号３８４）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；配列ＱＳＩＧＮＮ（配列番号４２８）を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列ＹＡＳ（配列番号３９８）を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列ＱＱＳＫＳＷＰＲＴ（配列番号４００）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、ラミニン２に結合する抗原結合性部位（例えば、ＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、またはＶＨ３およびＶＬ３）を形成する。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、表Ａ２に示された抗体Ｃ３＿Ｈｕ１１の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列を含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、ヒト化である。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号４１０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号４２６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、表Ｄ２に示された抗体Ｃ３＿Ｈｕ１１の、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号４０２のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン、および／または配列番号４１８のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメインを含む。
【０１０５】
一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、ＧＦＴＦＳＳＹＴ（配列番号４４４）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、ＩＳＳＳＧＳＮＴ（配列番号４４６）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、およびＡＲＦＤＹＧＳＳＬＤＳ（配列番号４４８）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；配列ＱＳＩＳＮＹ（配列番号４６０）を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列ＹＡＳ（配列番号４６２）を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列ＱＱＳＫＳＷＰＲＴ（配列番号４６４）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、ラミニン２に結合する抗原結合性部位（例えば、ＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、またはＶＨ３およびＶＬ３）を形成する。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、表Ａ２に示された抗体Ｃ２１＿Ｈｕ１１の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列を含む。
【０１０６】
一部の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、ヒト化である。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号４４２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号４５８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、表Ｄ２に示された抗体Ｃ２１＿Ｈｕ１１の、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号４３４のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン、および／または配列番号４５０のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメインを含む。
【０１０７】
一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、ＧＦＴＦＳＳＹＴ（配列番号４４４）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、ＩＳＳＳＧＤＮＴ（配列番号４７８）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、およびＡＲＦＤＹＧＳＳＬＤＳ（配列番号４４８）の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と；配列ＱＳＩＳＮＹ（配列番号４６０）を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列ＹＡＳ（配列番号４６２）を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列ＱＱＳＫＳＷＰＲＴ（配列番号４６４）を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインは、ラミニン２に結合する抗原結合性部位（例えば、ＶＨ１およびＶＬ１、ＶＨ２およびＶＬ２、またはＶＨ３およびＶＬ３）を形成する。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、表Ａ２に示された抗体Ｃ２１＿Ｈｕ２１の、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列を含む。
【０１０８】
一部の実施形態では、ＶＨおよび／またはＶＬドメインは、ヒト化である。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号４７４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号４９０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、表Ｄ２に示された抗体Ｃ２１＿Ｈｕ２１の、ＶＨおよび／またはＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号４６６のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン、および／または配列番号４８２のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメインを含む。
【０１０９】
一部の実施形態では、ＶＨ１は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ２は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は配列番号３７８の配列を含み、ＶＬ１は配列番号３９４の配列を含み；ＶＨ２は配列番号３７８の配列を含み、ＶＬ２は配列番号３９４の配列を含み；ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号５００の配列を含む、第１のポリペプチド鎖、配列番号４９８の配列を含む、第２のポリペプチド鎖、配列番号４９９の配列を含む、第３のポリペプチド鎖、および配列番号５０１の配列を含む、第４のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、例えば、表Ｉ２またはＩ４に示される、ｔｒｉＡｂ  ３４０７の１つ、２つ、３つ、または４つのポリペプチド鎖を含む。
【０１１０】
一部の実施形態では、ＶＨ１は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ２は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ２は、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は配列番号３７８の配列を含み、ＶＬ１は配列番号３９４の配列を含み；ＶＨ２は配列番号４４２の配列を含み、ＶＬ２は配列番号４５８の配列を含み；ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号５０４の配列を含む、第１のポリペプチド鎖、配列番号５０２の配列を含む、第２のポリペプチド鎖、配列番号５０３の配列を含む、第３のポリペプチド鎖、および配列番号５０５の配列を含む、第４のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、例えば、表Ｉ２またはＩ４に示される、ｔｒｉＡｂ  ３４２３の１つ、２つ、３つ、または４つのポリペプチド鎖を含む。
【０１１１】
一部の実施形態では、ＶＨ１は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号４２８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ２は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ２は、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は配列番号４１０の配列を含み、ＶＬ１は配列番号４２６の配列を含み；ＶＨ２は配列番号４７４の配列を含み、ＶＬ２は配列番号４９０の配列を含み；ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号５０８の配列を含む、第１のポリペプチド鎖、配列番号５０６の配列を含む、第２のポリペプチド鎖、配列番号５０７の配列を含む、第３のポリペプチド鎖、および配列番号５０９の配列を含む、第４のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、例えば、表Ｉ２またはＩ４に示される、ｔｒｉＡｂ  ３４２９の１つ、２つ、３つ、または４つのポリペプチド鎖を含む。
【０１１２】
一部の実施形態では、ＶＨ１は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ２は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ２は、配列番号４２８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は配列番号４４２の配列を含み、ＶＬ１は配列番号４５８の配列を含み；ＶＨ２は配列番号４１０の配列を含み、ＶＬ２は配列番号４２６の配列を含み；ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号５１２の配列を含む、第１のポリペプチド鎖、配列番号５１０の配列を含む、第２のポリペプチド鎖、配列番号５１１の配列を含む、第３のポリペプチド鎖、および配列番号５１３の配列を含む、第４のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、例えば、表Ｉ２またはＩ４に示される、ｔｒｉＡｂ  ３４３７の１つ、２つ、３つ、または４つのポリペプチド鎖を含む。
【０１１３】
一部の実施形態では、ＶＨ１は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ１は、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ２は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ２は、配列番号３９６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含み；ＶＨ３は、配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＬ３は、配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１は配列番号４７４の配列を含み、ＶＬ１は配列番号４９０の配列を含み；ＶＨ２は配列番号３７８の配列を含み、ＶＬ２は配列番号３９４の配列を含み；ＶＨ３は配列番号３１４の配列を含み、ＶＬ３は配列番号３３０の配列を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、配列番号５１６の配列を含む、第１のポリペプチド鎖、配列番号５１４の配列を含む、第２のポリペプチド鎖、配列番号５１５の配列を含む、第３のポリペプチド鎖、および配列番号５１７の配列を含む、第４のポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、例えば、表Ｉ２またはＩ４に示される、ｔｒｉＡｂ  ３４３９の１つ、２つ、３つ、または４つのポリペプチド鎖を含む。
【０１１４】
二特異性結合性タンパク質
一部の実施形態では、結合性タンパク質は、二特異性結合性タンパク質である。一部の実施形態では、二特異性結合性タンパク質は、２つの抗原結合性部位を含み、総体として、２つの標的抗原をターゲティングする二価結合性タンパク質である。一部の実施形態では、二特異性結合性タンパク質は、４つの抗原結合性部位を含み、総体として、２つの標的抗原をターゲティングする四価結合性タンパク質である。
【０１１５】
一部の実施形態では、二特異性結合性分子は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の結合性ドメインであって、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ１）および第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ１）を含む第１の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する第２の結合性ドメインであって、第２の合性ドメインを含む第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメイン（ＶＨ２）および第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメイン（ＶＬ２）とを含む。一部の実施形態では、二特異性結合性分子は、二特異性抗体のような二特異性結合性タンパク質である。
【０１１６】
一部の実施形態では、二特異性結合性分子は、４つの抗原結合性部位を形成する４つのポリペプチド鎖を含み、２つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＬ１−Ｌ１−ＶＬ２−Ｌ２−ＣＬ  ［Ｉ］
により表される構造を含み、２つのポリペプチド鎖は、式：
ＶＨ２−Ｌ３−ＶＨ１−Ｌ４−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ［ＩＩ］
により表される構造を含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸リンカーである］；
ＶＨ１およびＶＬ１ドメインは、ＶＨ１／ＶＬ１結合対を形成し、ＶＨ２およびＶＬ２ドメインは、ＶＨ２／ＶＬ２結合対を形成する。
【０１１７】
一部の実施形態では、式ＩおよびＩＩは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、それぞれのポリペプチド鎖内のドメインの配置について記載している。一部の実施形態では、のうちの１つまたはそれ以上 ポリペプチド鎖は、例えば、Ｎ末端またはＣ末端において、さらなる配列を含みうる。
【０１１８】
このフォーマットの例示的記載については、例えば、国際公開第２０１２／１３５３４５号、米国特許第９，２２１，９１７号、および欧州特許第２６９１４１６Ｂ１号を参照されたい。
【０１１９】
一部の実施形態では、二特異性結合性分子は、配列番号５３０の配列を含む式ＩＩに従う２つのポリペプチド鎖と、配列番号５３１の配列を含む式Ｉに従う２つのポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、二特異性結合性分子は、配列番号５３２の配列を含む式ＩＩに従う２つのポリペプチド鎖と、配列番号５３３の配列を含む式Ｉに従う２つのポリペプチド鎖とを含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、表Ｉ３またはＩ４において、ＡＳ３０＿Ｈｕ９×Ｃ３＿Ｈｕ１１  ＣＯＤＶまたはＡＳ３０＿Ｈｕ９×Ｃ２１＿Ｈｕ２１  ＣＯＤＶについて示された２つのポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、表Ａ２に示される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列を含む可変ドメインを含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、表Ｄ２、Ｉ３、またはＩ４に示される１つ、２つ、３つ、または４つの可変ドメインを含む。
【０１２０】
一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２に結合する。他の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２に結合する。
【０１２１】
上記で記載された多特異性結合性分子および／または二特異性結合性分子のうちのいずれかについての、一部の実施形態では、式Ｉのポリペプチドと式ＩＩのポリペプチドは、交差軽鎖−重鎖対を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインとＶＬ１ドメインは、交差してＶＨ１／ＶＬ１結合対を形成する。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインとＶＬ２ドメインは、交差してＶＨ２／ＶＬ２結合対を形成する。一部の実施形態では、上記のフォーマットに言及して本明細書で使用されるリンカーという用語は、軽鎖および重鎖のドメインが、免疫グロブリンの交差二重可変領域にフォールディングするのに十分な可動性をもたらすように、免疫グロブリンドメインの間に挿入される、１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を指す。リンカーは、可変ドメイン間の移行部、または可変ドメインと定常ドメインとの間の移行部に、それぞれ、配列レベルで挿入される。免疫グロブリンドメインの近似的サイズは、十分に理解されているため、ドメイン間の移行部を同定することができる。ドメイン移行部の正確な位置は、実験データにより裏付けられるか、またはモデル化もしくは二次構造予測の技法により仮定される、ベータ−シートまたはアルファ−ヘリックスのような二次構造要素を形成しないペプチドの連なりを位置特定することにより決定することができる。リンカーであるＬ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、独立であるが、一部の場合には、同じ配列および／または長さを有しうる。
【０１２２】
一部の実施形態では、本開示のリンカーは、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む。一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む。一部の実施形態では、Ｌ３およびＬ４は、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む。国際公開第２０１７／１８０９１３号において記載されているリンカーおよびリンカーの組合せを、本明細書で記載される結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）内で使用することができる。
【０１２３】
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、各々、０〜５０アミノ酸残基の長さ、０〜４０アミノ酸残基の長さ、０〜３０アミノ酸残基の長さ、０〜２５アミノ酸残基の長さ、０〜２０アミノ酸残基の長さ、０〜１８アミノ酸残基の長さ、０〜１６アミノ酸残基の長さ、または０〜１４アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸を伴わない（長さ＝０）〜約１００アミノ酸の長さ、または１００、５０、４０、３０、２０、もしくは１５アミノ酸、もしくはこれより少ないアミノ酸未満の長さの範囲である。リンカーはまた、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸の長さでもありうる。１つの結合性タンパク質内のＬ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は全て、同じアミノ酸配列を有する場合もあり、全て、異なるアミノ酸配列を有する場合もある。
【０１２４】
ある特定の実施形態では、Ｌ１は５アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は５アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は５アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は５アミノ酸残基の長さである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は１４アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は２アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は１４アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は２アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ３は各々、配列ＥＰＫＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ（配列番号２９６）を含み、かつ／またはＬ２およびＬ４は各々、配列ＧＧを含む。ある特定の実施形態では、Ｌ１は７アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は５アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は１アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は２アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１は配列ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号２９７）を含み、Ｌ２は配列ＴＫＧＰＳ（配列番号２９８）を含み、Ｌ３はセリン残基（例えば、配列Ｓ）を含み、Ｌ４は配列ＲＴを含む。ある特定の実施形態では、Ｌ１は１０アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は１０アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は０アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は０アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は各々、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号２９９）を含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、式Ｉおよび／または式ＩＩのポリペプチドの可変ドメインの一方または両方は、ヒト、ヒト化、またはマウス可変ドメインである。
【０１２６】
一部の実施形態では、二特異性結合性分子は、式：
ＶＬ１−Ｌ５−ＶＬ２−Ｌ６−ＣＬ  ［ＩＩＩ］
により表される構造を含む２つの軽鎖と、式：
ＶＨ１−Ｌ７−ＶＨ２−Ｌ８−ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３  ［ＩＶ］
により表される構造を含む２つの重鎖とを含み、
式中、
ＶＬ１は、第１の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＬ２は、第２の免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨ１は、第１の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＶＨ２は、第２の免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは、免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨ１は、免疫グロブリンＣＨ１重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ２は、免疫グロブリンＣＨ２重鎖定常ドメインであり；
ＣＨ３は、免疫グロブリンＣＨ３重鎖定常ドメインであり；
ヒンジは、ＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインとを接続する免疫グロブリンヒンジ領域であり；
Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、およびＬ８は、アミノ酸リンカーであり；
ＶＨ１およびＶＬ１ドメインは、ＶＨ１／ＶＬ１結合対を形成し、ＶＨ２ドメインおよびＶＬ２ドメインは、ＶＨ２／ＶＬ２結合対を形成する。
【０１２７】
一部の実施形態では、式ＩＩＩおよびＩＶは、Ｎ末端からＣ末端の順序で、それぞれのポリペプチド鎖内のドメインの配置について記載している。一部の実施形態では、ポリペプチド鎖のうちの１つまたはそれ以上は、例えば、Ｎ末端またはＣ末端において、さらなる配列を含みうる。
【０１２８】
このフォーマットの例示的記載については、例えば、米国付与前公開第２０１３０２０９４６９号を参照されたい。
【０１２９】
一部の実施形態では、二特異性結合性分子は、配列番号５２２の配列を含む２つの重鎖と、配列番号５２３の配列を含む２つの軽鎖とを含む。一部の実施形態では、二特異性結合性分子は、配列番号５２８の配列を含む２つの重鎖と、配列番号５２９の配列を含む２つの軽鎖とを含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、表Ｉ３またはＩ４において、ＡＳ３０＿Ｈｕ６×Ｃ３＿Ｈｕ１０またはＡＳ３０＿Ｈｕ６×Ｃ２１＿Ｈｕ１１について示された、２つのポリペプチド鎖を含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、表Ａ２に示される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列を含む可変ドメインを含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、表Ｄ２、Ｉ３、またはＩ４に示される１つ、２つ、３つ、または４つの可変ドメインを含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２に結合する。他の実施形態では、ＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、ＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２に結合する。
【０１３１】
一部の実施形態では、式ＩＩおよび／または式ＩＶのポリペプチドの可変ドメインの一方または両方は、ヒト、ヒト化、またはマウス可変ドメインである。
【０１３２】
リンカー
一部の実施形態では、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、およびＬ８は、各々、０〜５０アミノ酸残基の長さ、０〜４０アミノ酸残基の長さ、０〜３０アミノ酸残基の長さ、０〜２５アミノ酸残基の長さ、０〜２０アミノ酸残基の長さ、０〜１８アミノ酸残基の長さ、０〜１６アミノ酸残基の長さ、または０〜１４アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、リンカーＬ５、Ｌ６、Ｌ７、およびＬ８は、アミノ酸を伴わない（長さ＝０）〜約１００アミノ酸の長さ、または１００、５０、４０、３０、２０、もしくは１５アミノ酸、もしくはこれより少ないアミノ酸未満の長さの範囲である。リンカーはまた、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸の長さでもありうる。１つの結合性タンパク質内のＬ５、Ｌ６、Ｌ７、およびＬ８は全て、同じアミノ酸配列を有する場合もあり、全て、異なるアミノ酸配列を有する場合もある。
【０１３３】
一部の実施形態では、本開示のリンカーは、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む。一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む。一部の実施形態では、Ｌ３およびＬ４は、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む。一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、配列ＤＫＴＨＴ（配列番号５３４）を含む。国際公開第２０１７／１８０９１３号において記載されているリンカーおよびリンカーの組合せを、本明細書で記載される結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）内で使用することができる。
【０１３４】
一部の実施形態では、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、各々、０〜５０アミノ酸残基の長さ、０〜４０アミノ酸残基の長さ、０〜３０アミノ酸残基の長さ、０〜２５アミノ酸残基の長さ、０〜２０アミノ酸残基の長さ、０〜１８アミノ酸残基の長さ、０〜１６アミノ酸残基の長さ、または０〜１４アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、リンカーＬ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は、アミノ酸を伴わない（長さ＝０）〜約１００アミノ酸の長さ、または１００、５０、４０、３０、２０、もしくは１５アミノ酸、もしくはこれより少ないアミノ酸未満の長さの範囲である。リンカーはまた、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１アミノ酸の長さでもありうる。１つの結合性タンパク質内のＬ１、Ｌ２、Ｌ３、およびＬ４は全て、同じアミノ酸配列を有する場合もあり、全て、異なるアミノ酸配列を有する場合もある。
【０１３５】
ある特定の実施形態では、Ｌ１は５アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は５アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は５アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は５アミノ酸残基の長さである。ある特定の実施形態では、Ｌ１は１４アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は２アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は１４アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は２アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ３は各々、配列ＥＰＫＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ（配列番号２９６）を含み、かつ／またはＬ２およびＬ４は各々、配列ＧＧを含む。ある特定の実施形態では、Ｌ１は７アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は５アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は１アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は２アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１は配列ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号２９７）を含み、Ｌ２は配列ＴＫＧＰＳ（配列番号２９８）を含み、Ｌ３はセリン残基（例えば、配列Ｓ）を含み、Ｌ４は配列ＲＴを含む。ある特定の実施形態では、Ｌ１は１０アミノ酸残基の長さであり、Ｌ２は１０アミノ酸残基の長さであり、Ｌ３は０アミノ酸残基の長さであり、Ｌ４は０アミノ酸残基の長さである。一部の実施形態では、Ｌ１およびＬ２は各々、配列ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号２９９）を含む。
【０１３６】
ある特定の実施形態では、Ｌ５およびＬ７リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳのアミノ酸配列（配列番号２９４）を含み、かつ／またはＬ６およびＬ８リンカーは各々、０アミノ酸残基の長さである。
【０１３７】
上記で列挙された例（例えば、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６、Ｌ７、またはＬ８について）は、いかなる形でも、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、リシン、アルギニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、グリシン、およびプロリンからなる群から選択される、無作為に選択されたアミノ酸を含むリンカーは、結合性タンパク質内で適切である。
【０１３８】
リンカー内のアミノ酸残基の識別および配列は、リンカー内で達成するのに必要な二次構造エレメントの種類に応じて変動させうる。例えば、グリシン、セリン、およびアラニンを、可撓性リンカーのために使用する。グリシン、プロリン、トレオニン、およびセリンの一部の組合せは、可撓性が小さく、伸長されたリンカーが必要な場合に有用である。任意のアミノ酸残基を、所望の特性に依存する必要に応じた、大型のペプチドリンカーを構築するのに、他のアミノ酸残基と組み合わせられるリンカーとして考えることができる。
【０１３９】
定常／Ｆｃ領域
一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、第２のポリペプチド鎖上の「ノブ」突然変異と、第３のポリペプチド鎖上の「ホール」突然変異とを含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質は、第３のポリペプチド鎖上の「ノブ」突然変異と、第２のポリペプチド鎖上の「ホール」突然変異とを含む。一部の実施形態では、「ノブ」突然変異は、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および／または３６６位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ、またはＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｙである。一部の実施形態では、「ノブ」突然変異は、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである。一部の実施形態では、「ホール」突然変異は、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４０７位に対応し、場合によって、３４９、３６６、および／または３６８位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ４０７ＶまたはＹ４０７Ｔであり、場合によって、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、および／またはＬ３６８Ａである。一部の実施形態では、「ホール」突然変異は、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである。
【０１４０】
一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ）を含み；第３のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ）を含む。一部の実施形態では、第２のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置にアミノ酸置換（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ）を含み；第３のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の３５４および３６６位に対応する位置にアミノ酸置換（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ）を含む。
【０１４１】
一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、例えば、精製試薬に対するアフィニティーをモジュレートすることにより、精製を改善するように、１カ所またはそれ以上の突然変異を含む。例えば、ヘテロ二量体形態の、２つのＦｃ領域のうちの１つが、プロテインＡに対する結合を低減するかまたは消失させる突然変異を含有する場合、ヘテロ二量体形態は、プロテインＡベースの精製に対して、それぞれのホモ二量体形態の中間のアフィニティーを有し、例えば、異なるｐＨを使用することにより、プロテインＡから、選択的に溶離されるため、ヘテロ二量体の結合性タンパク質は、それらのホモ二量体形態から、選択的に精製しうることが公知である（例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｅ．Ｊ．ら（２０１５）、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．５：１７９４３を参照されたい）。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、第１および／または第２のＦｃ領域は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域である。一部の実施形態では、突然変異は、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４３５および４３６位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆである。一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ３ドメインであり、ＣＨ３ドメインのうちの１つだけが、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４の４３５および４３６位に対応する位置にアミノ酸置換（例えば、Ｈ４３５ＲおよびＹ４３６Ｆ）を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質は、ノブおよびホール突然変異を含み、精製を改善するように、１カ所またはそれ以上の突然変異を含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、半減期、例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増大させるように、１カ所またはそれ以上の突然変異を含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、米国特許第７，０８３，７８４号において記載されている突然変異のうちの、１カ所またはそれ以上を含む。例えば、一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＣＨ２ドメインは、ＥＵインデックスに従って番号付けして、２５２位にチロシン残基、２５４位にトレオニン残基、および２５６位にグルタミン酸残基を含む、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２ドメインである。
【０１４３】
一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、グリコシル化が変更され、かつ／またはエフェクター機能が低減したＦｃ領域を結果としてもたらす、１カ所またはそれ以上の突然変異を含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、米国特許第９，７９０，２６８号において記載されている突然変異のうちの１カ所またはそれ以上を含む。例えば、一部の実施形態では、第２および第３のポリペプチド鎖のＣＨ２ドメインは、ＥＵインデックスに従って番号付けして、２９７位にアスパラギン残基、２９８位にアスパラギン残基、２９９位にアラニン残基、および３００位にセリン残基またはトレオニン残基を含む、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４のＣＨ２ドメインである。
【０１４４】
本明細書における使用のために想定される、別の二特異性結合性タンパク質のプラットフォームについては、米国付与前公開第２０１３／００３９９１３号およびＬａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．ら（２０１３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１０：５１４５〜５１５０において記載されている。この手法では、各結合性ドメインを、ホモ二量体形態で作製し、次いで、ヘテロ二量体の二特異性結合性タンパク質を形成するように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてアセンブルする。この手法は、特異的突然変異（例えば、抗体のＣＨ３ドメインにおける）を援用して、Ｆａｂアーム交換を促進し、いずれのホモ二量体形態よりも安定的な、ヘテロ二量体の結合性タンパク質をもたらす。一部の実施形態では、これらの突然変異は、例えば、Ｋａｂａｔらにおいて記載されているＥＵインデックスに従って、３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、４０７、および／または４０９位に生じる。具体的な突然変異については、米国付与前公開第２０１３／００３９９１３号およびＬａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．ら（２０１３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１０：５１４５〜５１５０において、詳細に記載されている。
【０１４５】
本明細書における使用に想定される、さらなる二特異性結合性タンパク質プラットフォームについて、下記に簡略に記載する。Ｃａｒｔｅｒら（Ｒｉｄｇｗａｙら、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９（７）：６１７〜２１；Ｃａｒｔｅｒ、２０１１、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２４８（１〜２）：７〜１５）により、ＦｃのＣＨ３ドメイン内の、「ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」突然変異を使用して、Ｆｃヘテロ二量体をもたらす、１つの戦略が提起された。これらの突然変異は、ホモ二量体と比較して、ヘテロ二量体の形成が優先され、これにより、哺乳動物細胞培養物からの、ヘテロ二量体の良好な発現が達成されるように、構造的に保存的な疎水性コア内の、ＣＨ３ドメインの界面間の、残基充填相補性の変更をもたらす。戦略は、ヘテロ二量体の収量を増大させたが、ホモ二量体も、完全には抑制されなかった（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６（７）：６７７〜８１）。
【０１４６】
結合性タンパク質の収量を改善するために、一部の実施形態では、ＣＨ３ドメインを、例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、Ｒｉｄｇｗａｙら、１９９６、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、９：６１７〜２１；およびＭｅｒｃｈａｎｔら、１９９８、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６：６７７〜８１において、いくつかの例と共に、詳細に記載されている、「ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」技術により変更することができる。具体的には、２つのＣＨ３ドメインの相互作用界面を変更して、これらの２つのＣＨ３ドメインを含有する、両方の重鎖のヘテロ二量体化を増大させる。２つのＣＨ３ドメインの各々（２つの重鎖の）が「ノブ」でありうる一方、他のＣＨ３ドメインは、「ホール」である。ジスルフィド架橋の導入は、ヘテロ二量体を、さらに安定化させ（Ｍｅｒｃｈａｎｔら、１９９８；Ａｔｗｅｌｌら、１９９７、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２７０：２６〜３５）、収量を増大させる。特定の実施形態では、ノブは、１つのポリペプチド鎖のＣＨ３ドメイン上にある。他の実施形態では、ノブは、交差配向性を有するポリペプチドの、第１の対上にある。さらに他の実施形態では、ＣＨ３ドメインは、ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）を含まない。
【０１４７】
一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質は、１つのポリペプチド鎖上の「ノブ」突然変異と、他のポリペプチド鎖上の「ホール」突然変異とを含む。一部の実施形態では、「ノブ」突然変異は、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１の３５４および３６６位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗである。一部の実施形態では、「ホール」突然変異は、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１の３４９、３６６、３６８、および４０７位に対応する位置に置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖである。
【０１４８】
一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質は、血清半減期を改善するように、１カ所またはそれ以上の突然変異（例えば、Ｈｉｎｔｏｎ，Ｐ．Ｒ．ら（２００６）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６（１）：３４６〜５６を参照されたい）を含む。一部の実施形態では、突然変異は、ＥＵインデックスに従って、ヒトＩｇＧ１の４２８および４３４位に対応する位置に置換を含み、アミノ酸置換は、Ｍ４２８ＬおよびＮ４３４Ｓである。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質は、ノブ突然変異およびホール突然変異を含み、血清半減期を改善するように、１カ所またはそれ以上の突然変異を含む。
【０１４９】
本明細書における使用のために想定される、別の二特異性結合性タンパク質のプラットフォームは、ＷＯ２０１１１３１７４６において記載されている、ヘテロ二量体で二価の抗体Ｆｃを含有するフォーマットである。本明細書で記載される抗原結合性部位のうちのいずれかを、このヘテロ二量体の二特異性フォーマットで組み合わせることができる。一部の実施形態では、本開示の多特異性（例えば、二特異性）結合性タンパク質は、第１の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、第１のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンの第１のＦｃ領域とを含む、第１の抗体重鎖、および第１の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む第１の抗体軽鎖であって、第１のＶＨおよびＶＬドメインは、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の抗原結合性ドメインを形成する、第１の抗体重鎖および第１の抗体軽鎖と、第２の重鎖可変（ＶＨ）ドメインと、第２のＣＨ３領域を含む免疫グロブリンの第２のＦｃ領域とを含む、第２の抗体重鎖、および第２の軽鎖可変（ＶＬ）ドメインを含む第２の抗体軽鎖であって、第２のＶＨおよびＶＬドメインは、ラミニン２に結合する第２の抗原結合性ドメインを形成する、第２の抗体重鎖および第２の抗体軽鎖とを含む。一部の実施形態では、前記第１と第２のＣＨ３領域の配列は異なり、前記第１と第２のＣＨ３領域の間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１と第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々より強くなるような、第１および第２のＣＨ３領域である。一部の実施形態では、第１のホモ二量体のタンパク質は、４０９位にＬｙｓ、Ｌｅｕ、またはＭｅｔ以外のアミノ酸を有し、第２のホモ二量体のタンパク質は、３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、および４０７から選択される位置にアミノ酸置換を有し、かつ／または前記第１および第２のＣＨ３領域の配列は、ＣＨ３領域の各々のホモ二量体相互作用の解離定数が０．０１〜１０マイクロモルの間であるような配列である。一部の実施形態では、第１の抗体重鎖は配列番号５１８の配列を含み、第２の抗体重鎖は配列番号５１９の配列を含み、第１の抗体軽鎖は配列番号５２０の配列を含み、第２の抗体軽鎖は配列番号５２１の配列を含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、表Ｉ３に示されたＡＳ３０＿Ｈｕ６×Ｃ３＿Ｈｕ１０デュオボディー（ｄｕｏｂｏｄｙ）、２つの抗体軽鎖と、２つの抗体重鎖とを含む。
【０１５０】
本明細書における使用のために想定される、別の二特異性結合性タンパク質のプラットフォームは、「デュエットマブ（ＤｕｅｔＭａｂ）」デザインである（Ｍａｚｏｒ，Ｙ．ら（２０１５）、ＭＡｂｓ、７：３７７〜３８９）。略述すると、上記で記載した「ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」法を、ＣＨ１−ＣＬ界面のうちの１つにおける、天然のジスルフィド結合を、操作ジスルフィド結合で置きかえて、コグネイトの重鎖と軽鎖との対合の効率を増大させることと組み合わせる。一部の実施形態では、１つの結合性ドメインの重鎖は、Ｋａｂａｔに従い番号するときの、Ｆ１２６Ｃ突然変異を保有し、この結合性ドメインに対する、コグネイトの軽鎖は、Ｓ１２１Ｃ突然変異を保有する。例えば、一部の実施形態では、本開示の多特異性（例えば、二特異性）結合性タンパク質は、配列番号５２４の配列を含む第１の抗体重鎖、配列番号５２５の配列を含む第２の抗体重鎖、配列番号５２６の配列を含む第１の抗体軽鎖、および配列番号５２７の配列を含む第２の抗体軽鎖を含む。一部の実施形態では、結合性タンパク質は、表Ｉ３に示されたＡＳ３０＿Ｈｕ６×Ｃ２１＿Ｈｕ１１デュエットマブ（ｄｕｅｔｍａｂ）、２つの抗体軽鎖と、２つの抗体重鎖とを含む。
【０１５１】
Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎらは、ＣＨ３ドメイン界面における電荷相補性を変化させることにより、Ｆｃヘテロ二量体の形成を駆動しながら、疎水性コアの完全性を保持することの実行可能性について探索した（Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎら、２０１０、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８５（２５）：１９６３７〜４６）。静電ステアリング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ  ｓｔｅｅｒｉｎｇ）機構を利用して、これらの構築物は、周縁部に位置する帯電残基のうちの２対の突然変異を介して、ホモ二量体の夾雑を最小とする、Ｆｃヘテロ二量体の形成の効率的な促進を示した。ホモ二量体は、ノブイントゥーホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）デザインとは逆に、静電反発機構の性質に起因して、同程度に抑制されたが、完全に回避はされなかった。
【０１５２】
Ｄａｖｉｓらは、ヒトＩｇＧ  ＣＨ３ドメインのβ鎖セグメントと、ヒトＩｇＡ  ＣＨ３ドメインのβ鎖セグメントとを互いにかみ合わせることにより、さらなる鎖間ジスルフィド結合を導入せずに、Ｆｃホモ二量体を、ヘテロ二量体に転換する抗体操作法について記載している（Ｄａｖｉｓら、２０１０、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．、２３（４）：１９５〜２０２）。哺乳動物細胞によるＳＥＥＤｂｏｄｙ（Ｓｂ）融合タンパク質の発現は、少量の副産物を消失させるように、たやすく精製される、高収量のＳｂヘテロ二量体をもたらす。
【０１５３】
米国特許出願公開第２０１０／３３１５２７号は、１つの重鎖内に、ＣＨ３ドメイン内の突然変異であるＨ９５ＲおよびＹ９６Ｆを導入する、ＣＨ３ドメインのヘテロ二量体化に基づく二特異性抗体について記載している。これらのアミノ酸置換は、ＩｇＧ３亜型のＣＨ３ドメインに由来し、ＩｇＧ１骨格と共に、ヘテロ二量体化する。あらゆる重鎖と対合する傾向がある一般的な軽鎖が、ＣＨ３ドメインを介するヘテロ二量体化に基づく、全てのフォーマットに必須である。したがって、合計３種類の抗体：純粋なＩｇＧ１骨格を有する５０％、純粋なＨ９５ＲおよびＹ９６Ｆ突然変異骨格を有する３分の１、および２つの異なる重鎖（二特異性）を有する３分の１が作製される。プロテインＡに対するその結合特性が親抗体の結合特性と異なる：ＩｇＧ３由来のＣＨ３ドメインは、プロテインＡに結合しないが、ＩｇＧ１は結合するため、所望のヘテロ二量体をこの混合物から精製することができる。結果として、ヘテロ二量体は、プロテインＡに結合するが、純粋なＩｇＧ１ホモ二量体より高ｐＨで溶離し、これにより、二特異性ヘテロ二量体の選択的精製が可能となる。
【０１５４】
米国特許第７，６１２，１８１号は、米国特許第５，９８９，８３０号において記載されている、二重Ｆｖフォーマットに基づく、二重可変ドメインＩｇＧ（ＤＶＤ−ＩｇＧ）二特異性抗体について記載している。米国特許出願公開第２０１０／２０１００２２６９２３号においてもまた、同様の二特異性フォーマットが記載された。定常ドメインの、二重Ｆｖのそれぞれの鎖への付加（ＣＨ１−Ｆｃの、重鎖への付加、およびカッパまたはラムダ定常ドメインの、軽鎖への付加）は、さらなる修飾（すなわち、安定性を増強する、定常ドメインの明らかな付加）に対する必要を伴わずに、機能的な二特異性抗体をもたらした。ＤＶＤ−Ｉｇ／ＴＢＴＩフォーマットで発現させた抗体の一部は、第２の（または最も内側の）抗原結合位置（Ｆｖ２）に対する位置の効果を示す。Ｆｖ２位置により認識される抗原の配列および性質に応じて、この抗体ドメインは、その抗原に対するアフィニティーの低減（すなわち、親抗体と比較した、オン速度の低下）を示す。この観察についての、１つの可能な説明は、ＶＬ１とＶＬ２との間のリンカーが、Ｆｖ２のＣＤＲ領域に突出することから、Ｆｖ２が、大型の抗原に対して、いくぶんか接近不可能となることである。
【０１５５】
米国特許第５，９８９，８３０号において記載されている、二特異性抗体断片の、第２の立体配置は、２つの鎖上に発現させた、以下の配向性：
軽鎖について、ＶＬ１−リンカー−ＶＬ２、および
重鎖について、ＶＨ２−リンカー−ＶＨ１
の可変ドメインを有する、クロスオーバーダブルヘッド（ｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ  ｄｏｕｂｌｅ  ｈｅａｄ：ＣＯＤＨ）である。
【０１５６】
ＣＤＲ、ＶＨドメイン配列、およびＶＬドメイン配列
以下では、任意の数、組合せ、または立体配置における、本開示の多特異性結合性タンパク質または二特異性結合性タンパク質のうちのいずれかにおいて使用しうる、例示的なＣＤＲ、ＶＨドメイン配列、およびＶＬドメイン配列について記載する。
【０１５７】
本明細書で記載されるフォーマットのうちのいずれかについての、一部の実施形態では、本開示のＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、本開示のＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２に結合する。
【０１５８】
一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号１〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１８〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ１ドメインは、配列番号２８〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４３〜５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。本明細書で記載されるフォーマットのうちのいずれかについての、一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、および１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬ１ドメインは、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、および１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ１ドメインは、配列番号２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、および２４８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＶＬ１ドメインは、配列番号２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、および２４９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。
【０１５９】
本明細書で記載されるフォーマットのうちのいずれかについての、一部の実施形態では、本開示のＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、本開示のＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２（例えば、ラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５またはＬＧ−５）に結合する。本明細書で記載されるフォーマットのうちのいずれかについての、一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号５１〜５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６〜６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６１〜６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ２ドメインは、配列番号６６〜７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号７１〜７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号７６〜８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、および１９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号１９１、１９３、１９５、１９７、および１９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号２５０、２５２、２５４、２５６、および２５８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号２５１、２５３、２５５、２５７、および２５９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。
【０１６０】
本明細書で記載されるフォーマットのうちのいずれかについての、一部の実施形態では、本開示のＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、本開示のＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２（例えば、ラミニンＧ様（ＬＧ）４および／もしくは５ドメインまたはＬＧ−４）に結合する。本明細書で記載されるフォーマットのうちのいずれかについての、一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号８１〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９６〜１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１１１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ２ドメインは、配列番号１２６〜１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８および１４１〜１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１５５〜１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、および２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、および２２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、および２８８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、および２８９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。
【０１６１】
本明細書で記載されるフォーマットのうちのいずれかについての、一部の実施形態では、本開示のＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、本開示のＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２に結合する。本明細書で記載されるフォーマットのうちのいずれかについての、一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号１〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１８〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ２ドメインは、配列番号２８〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４３〜５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。本明細書で記載されるフォーマットのうちのいずれかについての、一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、および１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、および１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、および２４８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、および２４９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。
【０１６２】
本明細書で記載されるフォーマットのうちのいずれかについての、一部の実施形態では、本開示のＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、本開示のＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２（例えば、ラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５またはＬＧ−５）に結合する。本明細書で記載されるフォーマットのうちのいずれかについての、一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号５１〜５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６〜６０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６１〜６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ２ドメインは、配列番号６６〜７０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号７１〜７５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号７６〜８０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、および１９８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号１９１、１９３、１９５、１９７、および１９９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号２５０、２５２、２５４、２５６、および２５８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号２５１、２５３、２５５、２５７、および２５９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。
【０１６３】
本明細書で記載されるフォーマットのうちのいずれかについての、一部の実施形態では、本開示のＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、本開示のＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２（例えば、ラミニンＧ様（ＬＧ）４および／もしくは５ドメインまたはＬＧ−４）に結合する。本明細書で記載されるフォーマットのうちのいずれかについての、一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号８１〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９６〜１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１１１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含み；かつ／またはＶＬ２ドメインは、配列番号１２６〜１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８および１４１〜１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号１５５〜１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、および２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、および２２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨ２ドメインは、配列番号２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、および２８８からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。一部の実施形態では、ＶＬ２ドメインは、配列番号２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、および２８９からなる群から選択される核酸配列によりコードされる。
【０１６４】
本開示の結合性タンパク質における使用に適する、例示的なＣＤＲ配列を、下記の表Ａ〜Ｃに提示する。本開示の結合性タンパク質における使用に適する、例示的なＶＨ配列およびＶＬ配列（ポリペプチド配列および核酸配列）を、下記の表Ｄ〜Ｉに提示する。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する結合性部位であって、下記の表Ａに示された抗体の、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つのＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン、および／または下記の表Ａに示された抗体の、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つのＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含む結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、ラミニン２に結合する結合性ドメインであって、下記の表Ｂもしくは表Ｃに示された抗体の、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つのＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン、および／または下記の表Ｂもしくは表Ｃに示された抗体の、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、もしくは６つのＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含む結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する結合性ドメインであって、下記の表Ｄに示されたＶＨ配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むＶＨドメイン、および／または下記の表Ｄに示されたＶＬ配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むＶＬドメインを含む結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、ラミニン２に結合する結合性ドメインであって、下記の表Ｅもしくは表Ｆに示されたＶＨ配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むＶＨドメイン、および／または下記の表Ｅもしくは表Ｆに示されたＶＬ配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むＶＬドメインを含む結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する結合性ドメインであって、下記の表Ｇに示されたポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨ配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むＶＨドメイン、および／または下記の表Ｇに示されたポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬ配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むＶＬドメインを含む結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、ラミニン２に結合する結合性部位であって、下記の表Ｈもしくは表Ｉに示されたポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨ配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むＶＨドメイン、および／または下記の表Ｈもしくは表Ｉに示されたポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬ配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、もしくは１００％同一の配列を含むＶＬドメインを含む結合性ドメインを含む。
【０１６５】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１７０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１７１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２３０のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２３１のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１６６】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１７２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１７３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２３２のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２３３のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１６７】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１７４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１７５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２３４のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２３５のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１６８】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１７６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１７７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２３６のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２３７のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１６９】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１７８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１７９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２３８のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２３９のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１７０】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１８０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１８１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２４０のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２４１のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１７１】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１８２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１８３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２４２のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２４３のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１７２】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１８４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１８５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２４４のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２４５のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１７３】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１８６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１８７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２４６のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２４７のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１７４】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１８８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１８９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２４８のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２４９のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１７５】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１９０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１９１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２５０のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２５１のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１９２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１９３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２５２のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２５３のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１９４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１９５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２５４のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２５５のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１７８】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１９６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１９７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２５６のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２５７のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号１９８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号１９９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２５８のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２５９のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１８０】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２００のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２０１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２６０のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２６１のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２０２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２０３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２６２のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２６３のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号８３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２０４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２０５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２６４のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２６５のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号８４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２０６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２０７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２６６のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２６７のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号８５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１００のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２０８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２０９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２６８のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２６９のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１８５】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号８６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２１０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２１１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２７０のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２７１のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１８６】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号８７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２１２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２１３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２７２のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２７３のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１８７】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号８８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２１４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２１５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２７４のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２７５のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１８８】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号８９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２１６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２１７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２７６のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２７７のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１８９】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２１８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２１９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２７８のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２７９のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１９０】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号９１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２２０のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２２１のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２８０のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２８１のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１９１】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号９２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２２２のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２２３のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２８２のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２８３のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１９２】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号９３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２２４のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２２５のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２８４のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２８５のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１９３】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２２６のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２２７のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２８６のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２８７のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１９４】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、（ａ）（ｉ）配列番号９５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｉｉ）配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および（ｉｉｉ）配列番号１２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；ならびに／または（ｂ）（ｉ）配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、（ｉｉ）配列番号１５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および（ｉｉｉ）配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２２８のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２２９のアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性タンパク質は、配列番号２８８のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＨドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＨドメイン配列、および／または配列番号２８９のポリヌクレオチド配列によりコードされるＶＬドメイン配列に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％の配列同一性を有するＶＬドメイン配列を含む。
【０１９５】
当業者により、本明細書で記載される抗ジストログリカン抗体のうちのいずれかのＣＤＲおよび／またはＶＨ／ＶＬドメインを、二特異性結合性タンパク質内で、本明細書で記載される抗ラミニン２抗体（例えば、ラミニン２のＬＧ−４／５および／またはＬＧ−５ドメインに結合する抗体）のうちのいずれかのＣＤＲおよび／またはＶＨ／ＶＬドメインと、任意の組合せまたは立体配置で（例えば、ジストログリカンの細胞外ドメインに特異的なＶＨ１／ＶＬ１結合対と、ラミニン２に特異的なＶＨ２／ＶＬ２結合対とを有するか、またはジストログリカンの細胞外ドメインに特異的なＶＨ２／ＶＬ２結合対と、ラミニン２に特異的なＶＨ１／ＶＬ１結合対とを有する）組み合わせうることが察知されるであろう。
【０１９６】
当業者により、本明細書で記載される抗ジストログリカン抗体のうちのいずれかのＣＤＲおよび／またはＶＨ／ＶＬドメインを、多特異性結合性タンパク質内で、本明細書で記載される抗ラミニン２抗体（例えば、ラミニン２のＬＧ−４／５および／またはＬＧ−５ドメインに結合する抗体）のうちのいずれかのＣＤＲおよび／またはＶＨ／ＶＬドメインと、任意の組合せまたは立体配置で組み合わせうることが察知されるであろう。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、表Ａ２に示されるか、または表Ｄ２、Ｉ２、Ｉ３、もしくはＩ４に示される可変ドメインもしくはポリペプチド配列に由来する１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、表Ｄ２、Ｉ２、Ｉ３、もしくはＩ４に示される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの可変ドメイン配列、または表Ｇ２に示されるポリヌクレオチドによりコードされる１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、もしくは６つの可変ドメイン配列（例えば、各々が、ＶＨおよびＶＬドメインを含む、１つ、２つ、または３つのＶＨ／ＶＬ結合対）を含む。一部の実施形態では、本開示の結合性タンパク質（例えば、多特異性結合性タンパク質）は、表Ｉ４に示される１つ、２つ、３つ、または４つの可変ドメインフレームワーク配列を含む。
【０１９７】
【表１】
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【０１９８】
【表２】
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【０１９９】
【表３】
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【０２００】
【表４】
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【０２０１】
【表５】
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【０２０２】
【表６】
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【０２０３】
【表７】
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【０２０４】
【表８】
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【０２０５】
【表９】
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【０２０６】
【表１０】
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【０２０７】
【表１１】
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【０２０８】
【表１２】
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【０２０９】
【表１３】
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【０２１０】
【表１４】
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【０２１１】
【表１５】
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【０２１２】
【表１６】
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【０２１３】
【表１７】
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【０２１４】
【表１８】
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【０２１５】
【表１９】
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【０２１６】
【表２０】
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【０２１７】
【表２１】
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【０２１８】
【表２２】
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【０２１９】
【表２３】
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【０２２０】
【表２４】
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【０２２１】
【表２５】
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【０２２２】
【表２６】
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【０２２３】
【表２７】
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【０２２４】
【表２８】
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【０２２５】
【表２９】
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【０２２６】
【表３０】
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【０２２７】
【表３１】
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【０２２８】
【表３２】
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【０２２９】
【表３３】
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【０２３０】
標的タンパク質
本明細書では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する結合性ドメインと、ラミニン２に結合する結合性ドメインとを含む多特異性結合性分子（例えば、結合性タンパク質）が提供される。本明細書では、「〜に結合する」という用語と、「〜に特異的に結合する」という用語とを、互換的に使用する。一部の実施形態では、抗原（例えば、ラミニン２またはジストログリカンの細胞外部分）「に結合する」結合性ドメインは、抗原に、約１×１０−６Ｍ以下のＫＤで結合する。一部の実施形態では、一価抗体内またはその抗原結合性断片内の抗原結合性ドメインを使用して、抗原結合性ドメインの、抗原（例えば、抗原エピトープ）に対する結合アフィニティー（例えば、ＫＤ）をアッセイする。一部の実施形態では、本開示の多特異性フォーマット内の抗原結合性ドメインを使用して、抗原結合性ドメインの、抗原（例えば、抗原エピトープ）に対する結合アフィニティー（例えば、ＫＤ）をアッセイする。
【０２３１】
本明細書で使用されるジストログリカン（ＤＧ）は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ、基底膜としてもまた公知である）を、筋線維のＦ−アクチン関連細胞骨格に連結するジストロフィン複合体構成要素として作用するジストロフィン関連タンパク質を指す。ジストログリカンは、翻訳後切断され、互いと非共有結合によって会合する、２つのサブユニットである、アルファジストログリカンおよびベータジストログリカンを含む。一部の実施形態では、ジストログリカンは、ヒトジストログリカン（例えば、ＮＣＢＩ参照配列遺伝子番号：１６０５に明示されたヒトＤＡＧ１遺伝子によりコードされるタンパク質、またはＵｎｉＰｒｏｔ登録番号：Ｑ１４１１８に対応するタンパク質）である。一部の実施形態では、ジストログリカンは、ヒトジストログリカン（例えば、ＮＣＢＩ参照配列遺伝子番号：１３１３８に明示されたマウスＤＡＧ１遺伝子によりコードされるタンパク質、またはＵｎｉＰｒｏｔ登録番号：Ｑ６２１６５に対応するタンパク質）である。
【０２３２】
一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、アルファ−ジストログリカンに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、ベータ−ジストログリカンに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、配列ＳＩＶＶＥＷＴＮＮ  ＴＬＰＬＥＰＣＰＫＥ  ＱＩＩＧＬＳＲＲＩＡ  ＤＥＮＧＫＰＲＰＡＦ  ＳＮＡＬＥＰＤＦＫＡ  ＬＳＩＡＶＴＧＳＧＳ  ＣＲＨＬＱＦＩＰＶＡ  ＰＰＳＰＧＳＳＡＡＰ  ＡＴＥＶＰＤＲＤＰＥ  ＫＳＳＥＤＤ（配列番号２９０）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、配列ＳＩＶＶＥＷＴＮＮ  ＴＬＰＬＥＰＣＰＫＥ  ＱＩＩＧＬＳＲＲＩＡ  ＤＥＮＧＫＰＲＰＡＦ  ＳＮＡＬＥＰＤＦＫＡ  ＬＳＩＡＶＴＧＳＧＳ  ＣＲＨＬＱＦＩＰＶＡ  ＰＰＳＰＧＳＳＡＡＰ  ＡＴＥＶＰＤＲＤＰＥ  ＫＳＳＥＤＤ（配列番号２９０）内のエピトープまたは領域に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、配列ＳＩＶＶＥＷＴ  ＮＮＴＬＰＬＥＰＣＰ  ＫＥＱＩＡＧＬＳＲＲ  ＩＡＥＤＤＧＫＰＲＰ  ＡＦＳＮＡＬＥＰＤＦ  ＫＡＴＳＩＴＶＴＧＳ  ＧＳＣＲＨＬＱＦＩＰ  ＶＶＰＰＲＲＶＰＳＥ  ＡＰＰＴＥＶＰＤＲＤ  ＰＥＫＳＳＥＤＤＶ（配列番号２９１）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、配列ＳＩＶＶＥＷＴ  ＮＮＴＬＰＬＥＰＣＰ  ＫＥＱＩＡＧＬＳＲＲ  ＩＡＥＤＤＧＫＰＲＰ  ＡＦＳＮＡＬＥＰＤＦ  ＫＡＴＳＩＴＶＴＧＳ  ＧＳＣＲＨＬＱＦＩＰ  ＶＶＰＰＲＲＶＰＳＥ  ＡＰＰＴＥＶＰＤＲＤ  ＰＥＫＳＳＥＤＤＶ（配列番号２９１）内のエピトープまたは領域に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、ヒトジストログリカンの細胞外部分に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、マウスジストログリカンの細胞外部分に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、ヒトおよびマウスジストログリカンの細胞外部分に結合する。
【０２３３】
一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、約１μＭより低い、約５００ｎＭより低い、約４００ｎＭより低い、約３００ｎＭより低い、約２００ｎＭより低い、約１００ｎＭより低い、約５０ｎＭより低い、約２５ｎＭより低い、約１０ｎＭより低い、または約１ｎＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で、ヒトジストログリカンの細胞外部分に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインと、ヒトジストログリカンの細胞外部分との結合アフィニティーを、結合性ドメインが、単一特異性結合性ドメイン（単一特異性抗体のような）としてではなく、二特異性フォーマットにある場合に測定する。一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する、本開示の抗原結合性部位は、多特異性結合性タンパク質の一部としてアッセイされた場合に、約１μＭより低い、約５００ｎＭより低い、約４００ｎＭより低い、約３００ｎＭより低い、約２００ｎＭより低い、約１００ｎＭより低い、約５０ｎＭより低い、約２５ｎＭより低い、約１０ｎＭより低い、または約１ｎＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で、ヒトジストログリカンの細胞外部分に結合する。
【０２３４】
本明細書で使用されるラミニン２（メロシンとしてもまた公知である）は、ジストログリカンに結合する細胞外基底膜タンパク質を指す。ラミニン２は、３つのサブユニット：アルファ、ベータ、およびガンマから構成される。一部の実施形態では、ラミニン２は、ヒトラミニンサブユニットアルファ２（例えば、ＮＣＢＩ参照配列遺伝子番号：３９０８に明示されたヒトＬＡＭＡ２遺伝子によりコードされるタンパク質、またはＵｎｉＰｒｏｔ登録番号：Ｐ２４０４３に対応するタンパク質）である。一部の実施形態では、ジストログリカンは、マウスラミニンサブユニットアルファ２（例えば、ＮＣＢＩ参照配列遺伝子番号：１６７７３に明示されたヒトＬａｍａ２遺伝子によりコードされるタンパク質、またはＵｎｉＰｒｏｔ登録番号：Ｑ６０６７５に対応するタンパク質）である。
【０２３５】
一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、ラミニン２に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン４、ラミニン２のラミニンＧ様（ＬＧ）ドメイン５、または両方を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、配列ＶＱＰＱＰＶ  ＰＴＰＡＦＰＦＰＡＰ  ＴＭＶＨＧＰＣＶＡＥ  ＳＥＰＡＬＬＴＧＳＫ  ＱＦＧＬＳＲＮＳＨＩ  ＡＩＡＦＤＤＴＫＶＫ  ＮＲＬＴＩＥＬＥＶＲ  ＴＥＡＥＳＧＬＬＦＹ  ＭＡＲＩＮＨＡＤＦＡ  ＴＶＱＬＲＮＧＦＰＹ  ＦＳＹＤＬＧＳＧＤＴ  ＳＴＭＩＰＴＫＩＮＤ  ＧＱＷＨＫＩＫＩＶＲ  ＶＫＱＥＧＩＬＹＶＤ  ＤＡＳＳＱＴＩＳＰＫ  ＫＡＤＩＬＤＶＶＧＩ  ＬＹＶＧＧＬＰＩＮＹ  ＴＴＲＲＩＧＰＶＴＹ  ＳＬＤＧＣＶＲＮＬＨ  ＭＥＱＡＰＶＤＬＤＱ  ＰＴＳＳＦＨＶＧＴＣ  ＦＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号３００）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、配列ＶＱＰＱＰＶ  ＰＴＰＡＦＰＦＰＡＰ  ＴＭＶＨＧＰＣＶＡＥ  ＳＥＰＡＬＬＴＧＳＫ  ＱＦＧＬＳＲＮＳＨＩ  ＡＩＡＦＤＤＴＫＶＫ  ＮＲＬＴＩＥＬＥＶＲ  ＴＥＡＥＳＧＬＬＦＹ  ＭＡＲＩＮＨＡＤＦＡ  ＴＶＱＬＲＮＧＦＰＹ  ＦＳＹＤＬＧＳＧＤＴ  ＳＴＭＩＰＴＫＩＮＤ  ＧＱＷＨＫＩＫＩＶＲ  ＶＫＱＥＧＩＬＹＶＤ  ＤＡＳＳＱＴＩＳＰＫ  ＫＡＤＩＬＤＶＶＧＩ  ＬＹＶＧＧＬＰＩＮＹ  ＴＴＲＲＩＧＰＶＴＹ  ＳＬＤＧＣＶＲＮＬＨ  ＭＥＱＡＰＶＤＬＤＱ  ＰＴＳＳＦＨＶＧＴＣ  ＦＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号３００）内のエピトープまたは領域に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、配列ＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶ  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号２９２）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、配列ＡＮＡＥＳＧＴＹＦ  ＤＧＴＧＦＡＫＡＶＧ  ＧＦＫＶＧＬＤＬＬ��  ＥＦＥＦＲＴＴＲＰＴ  ＧＶＬＬＧＶＳＳＱＫ  ＭＤＧＭＧＩＥＭＩＤ  ＥＫＬＭＦＨＶＤＮＧ  ＡＧＲＦＴＡＩＹＤＡ  ＧＩＰＧＨＭＣＮＧＱ  ＷＨＫＶＴＡＫＫＩＫ  ＮＲＬＥＬＶＶＤＧＮ  ＱＶＤＡＱＳＰＮＳＡ  ＳＴＳＡＤＴＮＤＰＶ  ＦＶＧＧＦＰＧＧＬＮ  ＱＦＧＬＴＴＮＩＲＦ  ＲＧＣＩＲＳＬＫＬＴ  ＫＧＴＧＫＰＬＥＶＮ  ＦＡＫＡＬＥＬＲＧＶ  ＱＰＶＳＣＰＴＴ（配列番号２９２）内のエピトープまたは領域に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、配列Ｑ  ＰＥＰＶＰＴＰＡＦＰ  ＴＰＴＰＶＬＴＨＧＰ  ＣＡＡＥＳＥＰＡＬＬ  ＩＧＳＫＱＦＧＬＳＲ  ＮＳＨＩＡＩＡＦＤＤ  ＴＫＶＫＮＲＬＴＩＥ  ＬＥＶＲＴＥＡＥＳＧ  ＬＬＦＹＭＡＲＩＮＨ  ＡＤＦＡＴＶＱＬＲＮ  ＧＬＰＹＦＳＹＤＬＧ  ＳＧＤＴＨＴＭＩＰＴ  ＫＩＮＤＧＱＷＨＫＩ  ＫＩＭＲＳＫＱＥＧＩ  ＬＹＶＤＧＡＳＮＲＴ  ＩＳＰＫＫＡＤＩＬＤ  ＶＶＧＭＬＹＶＧＧＬ  ＰＩＮＹＴＴＲＲＩＧ  ＰＶＴＹＳＩＤＧＣＶ  ＲＮＬＨＭＡＥＡＰＡ  ＤＬＥＱＰＴＳＳＦＨ  ＶＧＴＣＦＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号３０１）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、配列Ｑ  ＰＥＰＶＰＴＰＡＦＰ  ＴＰＴＰＶＬＴＨＧＰ  ＣＡＡＥＳＥＰＡＬＬ  ＩＧＳＫＱＦＧＬＳＲ  ＮＳＨＩＡＩＡＦＤＤ  ＴＫＶＫＮＲＬＴＩＥ  ＬＥＶＲＴＥＡＥＳＧ  ＬＬＦＹＭＡＲＩＮＨ  ＡＤＦＡＴＶＱＬＲＮ  ＧＬＰＹＦＳＹＤＬＧ  ＳＧＤＴＨＴＭＩＰＴ  ＫＩＮＤＧＱＷＨＫＩ  ＫＩＭＲＳＫＱＥＧＩ  ＬＹＶＤＧＡＳＮＲＴ  ＩＳＰＫＫＡＤＩＬＤ  ＶＶＧＭＬＹＶＧＧＬ  ＰＩＮＹＴＴＲＲＩＧ  ＰＶＴＹＳＩＤＧＣＶ  ＲＮＬＨＭＡＥＡＰＡ  ＤＬＥＱＰＴＳＳＦＨ  ＶＧＴＣＦＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号３０１）内のエピトープまたは領域に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、配列ＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号２９３）を含むポリペプチドに結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、配列ＡＮＡＱＲ  ＧＴＹＦＤＧＴＧＦＡ  ＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬ  ＤＬＬＶＥＦＥＦＲＴ  ＴＴＴＴＧＶＬＬＧＩ  ＳＳＱＫＭＤＧＭＧＩ  ＥＭＩＤＥＫＬＭＦＨ  ＶＤＮＧＡＧＲＦＴＡ  ＶＹＤＡＧＶＰＧＨＬ  ＣＤＧＱＷＨＫＶＴＡ  ＮＫＩＫＨＲＩＥＬＴ  ＶＤＧＮＱＶＥＡＱＳ  ＰＮＰＡＳＴＳＡＤＴ  ＮＤＰＶＦＶＧＧＦＰ  ＤＤＬＫＱＦＧＬＴＴ  ＳＩＰＦＲＧＣＩＲＳ  ＬＫＬＴＫＧＴＧＫＰ  ＬＥＶＮＦＡＫＡＬＥ  ＬＲＧＶＱＰＶＳＣＰ  ＡＮ（配列番号２９３）内のエピトープまたは領域に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、ヒトラミニン２に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、マウスラミニン２に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、ヒトおよびマウスラミニン２に結合する。
【０２３６】
一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインは、約１μＭより低い、約５００ｎＭより低い、約４００ｎＭより低い、約３００ｎＭより低い、約２００ｎＭより低い、約１００ｎＭより低い、約５０ｎＭより低い、約２５ｎＭより低い、約１０ｎＭより低い、または約１ｎＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で、ヒトラミニン２に結合する。一部の実施形態では、本開示の結合性ドメインと、ヒトラミニン２との結合アフィニティーを、結合性ドメインが、単一特異性結合性ドメイン（単一特異性抗体のような）としてではなく、二特異性フォーマットにある場合に測定する。一部の実施形態では、ラミニン２に結合する、本開示の抗原結合性部位は、多特異性結合性タンパク質の一部としてアッセイされた場合に、約１μＭより低い、約５００ｎＭより低い、約４００ｎＭより低い、約３００ｎＭより低い、約２００ｎＭより低い、約１００ｎＭより低い、約５０ｎＭより低い、約２５ｎＭより低い、約１０ｎＭより低い、または約１ｎＭより低い平衡解離定数（ＫＤ）で、ヒトラミニン２に結合する。
【０２３７】
一部の実施形態では、本開示のＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、本開示のＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ラミニン２に結合する。一部の実施形態では、本開示のＶＨ２／ＶＬ２結合対は、ジストログリカンの細胞外部分に結合し、本開示のＶＨ１／ＶＬ１結合対は、ラミニン２に結合する。
【０２３８】
抗体
本開示はまた、表Ａ２、Ｄ２、もしくはＩ４に示された結合性ドメイン、または表Ｄ２もしくはＩ４に示されるか、もしくは表Ｇ２に示されたポリヌクレオチド配列によりコードされる、結合性ドメインのＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン配列のうちの、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つのＣＤＲ配列を含む抗体（例えば、一価抗体および／またはモノクローナル抗体）も提供する。一部の実施形態では、抗体は、ジストログリカンの細胞外部分に結合する。一部の実施形態では、抗体は、ラミニン２に結合する。一部の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１〜８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号９〜１７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号１８〜２７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体重鎖と；（ｂ）配列番号２８〜３７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８〜４２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４３〜５０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖とを含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、および１８８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、および１８９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号３１６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３１８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３２０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体重鎖と；（ｂ）配列番号３３２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３３４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号３３６の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖とを含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３１４のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３３０のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３４６のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３６２のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号５１〜５５および８１〜９５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号５６〜６０および９６〜１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号６１〜６５および１１１〜１２５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む抗体重鎖と；（ｂ）配列番号６６〜７０および１２６〜１４０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３８、７１〜７５、および１４１〜１５４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号７６〜８０および１５５〜１６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖とを含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、および２２８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；ＶＬドメインは、配列番号１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、および２２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体重鎖と、配列番号４２８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖とを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３８０の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号３８２の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号３８４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体重鎖と、配列番号４２８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号３９８の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４００の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖とを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４４６の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体重鎖と、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖とを含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号４４４の配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、配列番号４７８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、および配列番号４４８の配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗体重鎖と、配列番号４６０の配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、配列番号４６２の配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、および配列番号４６４の配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体軽鎖とを含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３７８のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号３９４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号４１０のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号４２６のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号４４２のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号４５８のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号４７４のアミノ酸配列を含み、ＶＬドメインは、配列番号４９０のアミノ酸配列を含む。
【０２３９】
核酸
本明細書では、本開示の多特異性（例えば、二特異性）結合性分子（例えば、二特異性結合性タンパク質）のうちのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子が提供される。
【０２４０】
標準的な組換えＤＮＡ法を使用して、結合性タンパク質を形成するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを構築し、これらのポリヌクレオチドを、組換え発現ベクターに組み込み、このようなベクターを、宿主細胞に導入する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１、「ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ」（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、３版）を参照されたい。酵素反応および精製技術は、製造元の仕様に従い実施することもでき、当技術分野で一般に達せられる通りに実施することもでき、本明細書で記載される通りに実施することもできる。具体的定義が提示されない限りにおいて、本明細書で記載される、分析化学、有機合成化学、ならびに創薬化学および医薬化学との関連で活用される命名法、これらの化学の実験手順および実験法は、当技術分野で周知であり、一般に使用される。同様に、従来の技術を、化学合成、化学解析、医薬の調製、製剤、送達、および患者の処置のために使用することができる。
【０２４１】
本開示の他の態様は、本明細書で記載される結合性タンパク質またはそのポリペプチド鎖のうちのいずれかをコードするヌクレオチド配列を含む単離核酸分子に関する。一部の実施形態では、単離核酸を、結合性タンパク質をコードする核酸配列の転写を方向付けるように、異種プロモーターに作動可能に連結する。プロモーターは、核酸の転写を方向付ける核酸制御配列を指す場合がある。第１の核酸配列が、第２の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結されている。例えば、プロモーターが、コード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、結合性タンパク質のコード配列に作動可能に連結されている。プロモーターの例は、ウイルス（ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（２型アデノウイルスのような）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、サルウイルス４０（ＳＶ４０）などのような）のゲノム、異種真核プロモーター（アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターに由来するプロモーターなどのような）、ＣＡＧプロモーター（Ｎｉｗａら、Ｇｅｎｅ、１０８（２）：１９３〜９、１９９１）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｍａｓｕｉら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、３３：ｅ４３、２００５）、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ｔａｃ系、ｔｒｃ系、ファージラムダの主要オペレーター領域およびプロモーター領域、３−ホスホグリセリン酸キナーゼに対するプロモーター、酵母酸ホスファターゼのプロモーター、ならびに酵母アルファ接合因子のプロモーターから得られるプロモーターを含みうるがこれらに限定されない。本開示の結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、構成的プロモーター、誘導的プロモーター、もしくは本明細書で記載される、他の任意の適切なプロモーター、または当業者によりたやすく認知される、他の適切なプロモーターの制御下にありうる。
【０２４２】
一部の実施形態では、単離核酸を、ベクターに組み込む。一部の実施形態では、ベクターは、発現ベクターである。発現ベクターは、発現させるポリヌクレオチドに作動的に連結された、１つまたはそれ以上の調節的配列を含みうる。「調節的配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。適切なエンハンサーの例は、哺乳動物遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトタンパク質、インスリンなどのような）に由来するエンハンサー配列、および真核細胞ウイルスに由来するエンハンサー配列（複製起点の後期側（ｂｐ１００〜２７０のような）におけるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス早期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側におけるポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサーなど）を含みうるがこれらに限定されない。適切なベクターの例は、例えば、プラスミド、コスミド、エピソーム、トランスポゾン、およびウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、シンドビスウイルス、麻疹、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスベクターなど）を含みうる。発現ベクターを使用して、例えば、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞のような宿主細胞にトランスフェクトすることができる。当技術分野では、宿主内の発現および複製が可能な、生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターが公知であり、任意の目的の細胞にトランスフェクトするのに使用することができる。
【０２４３】
さらに、本明細書では、複数のベクターを含むベクター系であって、複数のベクターは、総体として、本開示の二特異性結合性タンパク質をコードするベクター系が提供される。例えば、一部の実施形態では、ベクター系は、本開示の二特異性結合性分子の、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖、および第４のポリペプチド鎖をコードする、１つまたはそれ以上のベクターを含む。一部の実施形態では、ベクター系は、本開示の二特異性結合性分子の、第１のポリペプチド鎖、第２のポリペプチド鎖、第３のポリペプチド鎖、および第４のポリペプチド鎖を含む。
【０２４４】
結合性タンパク質を作製する宿主細胞および方法
本開示の他の態様は、本明細書で記載される、１つまたはそれ以上の、単離ポリヌクレオチド、ベクター、および／またはベクター系を含む宿主細胞（例えば、単離宿主細胞）に関する。一部の実施形態では、本開示の単離宿主細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養する。一部の実施形態では、宿主細胞は、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、酵母細胞（例えば、出芽酵母細胞）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、昆虫細胞である。昆虫宿主細胞の例は、例えば、ショウジョウバエ属細胞（例えば、Ｓ２細胞）、イラクサギンウワバ細胞（例えば、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標）細胞）、およびツマジロクサヨトウ細胞（例えば、Ｓｆ２１またはＳｆ９細胞）を含みうる。一部の実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞である。哺乳動物宿主細胞の例は、例えば、ヒト胎児腎臓細胞（例えば、２９３細胞、または懸濁培養液中の増殖のためにサブクローニングされた２９３細胞）、Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞、ＣＨＯ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、マウスセルトリ細胞（例えば、ＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝臓細胞（例えば、ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝臓細胞（例えば、ＨｅｐＧ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳腺腫瘍細胞（例えば、ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、ヒト肝癌細胞株（例えば、Ｈｅｐ  Ｇ２）、および骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ０およびＳｐ２／０細胞）を含みうる。
【０２４５】
本開示の他の態様は、本明細書で記載される結合性タンパク質のうちのいずれかを作製する方法に関する。一部の実施形態では、方法は、ａ）単離核酸、ベクター、および／またはベクター系（例えば、本明細書で記載される単離核酸、ベクター、および／またはベクター系のうちのいずれか）を含む宿主細胞（例えば、本明細書で記載される宿主細胞のうちのいずれか）を、宿主細胞が結合性分子を発現するような条件下で培養する工程と；ｂ）結合性分子を宿主細胞から単離する工程とを含む。
【０２４６】
一部の実施形態では、複数の宿主細胞を使用して、二特異性結合性分子（例えば、タンパク質）の構成要素を作製し、次いで、これを二特異性結合性分子にアセンブルすることができる。本明細書の、一部の実施形態では、ジストログリカンの細胞外部分に結合する第１の結合性ドメインと、ラミニン２に結合する第２の結合性ドメインとを含む二特異性結合性タンパク質を作製する方法であって、ａ）第１の結合性ドメインを含む、第１のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含む、第１の宿主細胞を、宿主細胞が、第１のＣＨ３ドメインを伴う、第１の単一特異性結合性タンパク質の一部としての、第１のポリペプチド鎖を発現するような条件下で培養する工程と；ｂ）第２の結合性ドメインを含む、第２のポリペプチド鎖をコードする核酸分子を含む、第２の宿主細胞を、宿主細胞が、第２のＣＨ３ドメインを伴う、第２の単一特異性結合性タンパク質の一部としての、第２のポリペプチド鎖を発現するような条件下で培養する工程と；ｃ）第１の単一特異性結合性タンパク質を、第１の宿主細胞から単離する工程と；ｄ）第２の単一特異性結合性タンパク質を第２の宿主細胞から単離する工程と；ｅ）単離された第１および第２の単一特異性結合性タンパク質を、ヒンジ領域内のシステインが、ジスルフィド結合の異性化を経ることを可能とするのに十分な還元条件下でインキュベートする工程と；ｆ）二特異性結合性タンパク質を得る工程とを含み、第１と第２のＣＨ３ドメインは異なり、前記第１と第２のＣＨ３ドメインのヘテロ二量体相互作用が、前記第１と第２のＣＨ３ドメインのホモ二量体相互作用の各々より強くなるような、第１および第２のＣＨ３ドメインである方法が提供される。より詳細な記載については、例えば、米国付与前公開第２０１３／００３９９１３号およびＬａｂｒｉｊｎ，Ａ．Ｆ．ら（２０１３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１１０：５１４５〜５１５０を参照されたい。
【０２４７】
当業者には、タンパク質を発現する条件下で、宿主細胞を培養する方法が周知である。当業者には、タンパク質を、培養された宿主細胞から単離する方法であって、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーに続く、サイズ除外クロマトグラフィーを含む、２工程のアフィニティークロマトグラフィー）により単離することを含む方法が周知である。
【０２４８】
結合性タンパク質の使用
さらに、本明細書では、個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーを処置または防止するための方法であって、個体に、本開示の二特異性結合性分子を投与する工程を含む方法が提供される。本明細書ではまた、個体におけるラミニン２とジストログリカンの細胞外部分との連結をもたらすための方法であって、個体に、本開示の二特異性結合性分子を投与する工程を含む方法も提供される。さらに、本明細書では、本開示の二特異性結合性分子と、個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーの処置または防止における使用のための指示書とを含むキットが提供される。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
【０２４９】
さらに、本明細書では、個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーを処置または防止するための方法であって、個体に、本開示の多特異性結合性分子を投与する工程を含む方法が提供される。本明細書ではまた、個体におけるラミニン２とジストログリカンの細胞外部分との連結をもたらすための方法であって、個体に、本開示の多特異性結合性分子を投与する工程を含む方法も提供される。さらに、本明細書では、本開示の多特異性結合性分子と、個体におけるアルファ−ジストログリカノパチーの処置または防止における使用のための指示書とを含むキットが提供される。一部の実施形態では、個体は、ヒトである。
【０２５０】
一部の実施形態では、個体は、アルファ−ジストログリカンの発現が低減されている（例えば、対照個体、または本明細書で記載される遺伝子突然変異を欠く個体における発現と比較して）。一部の実施形態では、発現は、１つまたはそれ以上の組織、例えば、筋組織における発現を指す。
【０２５１】
一部の実施形態では、個体において発現するアルファ−ジストログリカンは、Ｏ−グリコシル化が、損なわれているか、または異常である（例えば、対照個体、または本明細書で記載される遺伝子突然変異を欠く個体における発現と比較して）。
【０２５２】
一部の実施形態では、個体は、アルファ−ジストログリカノパチーを有するか、これを有すると診断されているか、またはこれを発症する傾向を有する。一部の実施形態では、個体は、ジストログリカン（ＤＡＧ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＰＯＭＴ１）、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＰＯＭＴ２）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，２−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット１（ＰＯＭＧＮＴ１）、タンパク質Ｏ結合型マンノースベータ１，４−Ｎ−アセチルグルコシルアミニルトランスフェラーゼサブユニット２（ＰＯＭＧＮＴ２）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ１（ＬＡＲＧＥ１）、キシロシルおよびグルクロニルトランスフェラーゼ２（ＬＡＲＧＥ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット１（ＤＰＭ１）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット２（ＤＰＭ２）、ドリキル−リン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット３（ＤＰＭ３）、フクチン、フクチン関連タンパク質（ＦＫＲＰ）、イソプレノイドシンターゼドメイン含有（ＩＳＰＤ）、タンパク質Ｏ−マンノースキナーゼ（ＰＯＭＫ）、ベータ−１，３−Ｎ−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ２（Ｂ３ＧＡＬＮＴ２）、ベータ−１，４−グルクロニルトランスフェラーゼ１（Ｂ４ＧＡＴ１）、ドリコールキナーゼ（ＤＯＬＫ）、膜貫通タンパク質５（ＴＭＥＭ５）、およびＧＤＰ−マンノースピロホスホリラーゼＢ（ＧＭＰＰＢ）からなる群から選択される遺伝子内に、突然変異を有する。
【０２５３】
一部の実施形態では、本開示の二特異性結合性分子を、静脈内注入、筋内注射、腹腔内注射、または皮下注射により投与する。
【０２５４】
結合性タンパク質は、１つまたはそれ以上の標的抗原を検出および定量化するための、競合的結合アッセイ、直接的および間接的サンドイッチアッセイ、ならびに免疫沈降アッセイのような、任意の公知のアッセイ法において援用される。結合性タンパク質は、援用されるアッセイ法に適切なアフィニティーで、１つまたはそれ以上の標的抗原に結合するであろう。
【０２５５】
本明細書ではまた、本開示の二特異性結合性分子と、任意選択の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供される。
【０２５６】
本明細書ではまた、本開示の多特異性結合性分子と、任意選択の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物も提供される。
【０２５７】
医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、吸着、または浸透を、修飾、維持、または保存するための製剤材料を含有しうる。適切な製剤材料は、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンのような）、抗微生物剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムのような）、緩衝液（ホウ酸、重炭酸、トリスＨＣｌ、クエン酸、リン酸、または他の有機酸のような）、増量剤（マンニトールまたはグリシンのような）、キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）のような）、複合体化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンのような）、充填剤、単糖、二糖、および他の炭水化物（ブドウ糖、マンノース、またはデキストリンのような）、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような）、着色剤、芳香剤および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンのような）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムのような）、保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素のような）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールのような）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールのような）、懸濁剤、界面活性剤または保湿剤（プルロニック；ＰＥＧ；ソルビタンエステル；ポリソルベート２０またはポリソルベート８０のようなポリソルベート；トリトン；トロメタミン；レシチン；コレステロールまたはチロキサポールのような）、安定性増強剤（スクロースまたはソルビトールのような）、張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物（例えば、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム）またはマンニトール、ソルビトールのような）、送達媒体、希釈剤、賦形剤、および／または医薬アジュバント（例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ（１８版、Ａ．Ｒ．ＧＥＮＮＡＲＯ編、ＭＡＣＫ  ＰＵＢＬＩＳＨＩＮＧ  ＣＯＭＰＡＮＹ  １９９０）、および参照により、任意の目的で本明細書に組み入れられる、同書の後続の版を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。許容可能な製剤材料は、援用される用量および濃度で、レシピエントに対して非毒性である。
【０２５８】
最適の医薬組成は、当業者により、例えば、意図される投与経路、送達フォーマット、および所望の投与量に応じて決定されるであろう。このような組成は、結合性タンパク質の物理的状態、安定性、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける放出の速度、およびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるクリアランスの速度に影響を与えうる。
【０２５９】
医薬組成物中の、主要な媒体または担体は、天然では、水性の場合もあり、非水性の場合もある。例えば、注射に適する媒体または担体は、おそらく、非経口投与のための組成物中で一般的な他の材料を補充された、水、生理食塩液、または人工脳脊髄液でありうる。中性の緩衝生理食塩液または血清アルブミンと混合された生理食塩液は、さらなる例示的媒体である。他の例示的医薬組成物は、ソルビトールまたは代替物をさらに含みうる、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含む。本開示の一実施形態では、結合性タンパク質組成物は、所望の純度を有する、選択された組成物を、任意選択の製剤と、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で混合することにより、保管のために調製することができる。さらに、結合性タンパク質は、スクロースのような、適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化することができる。
【０２６０】
製剤成分は、投与部位に許容可能な濃度で存在する。例えば、緩衝液を、使用して、組成物を、生理学的ｐＨまたはわずかに低いｐＨ、典型的に、約５〜約８の範囲内のｐＨで維持する。
【０２６１】
非経口投与を想定する場合、使用のための治療用組成物は、発熱物質非含有で、非経口的に許容可能であり、所望の結合性タンパク質を、薬学的に許容される媒体中に含む水溶液の形態でありうる。非経口注射に特に適する媒体は、結合性タンパク質が、滅菌の、等張性溶液として製剤化され、適正に保存された滅菌蒸留水である。さらに別の調製物は、注射用マイクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー性化合物（ポリ乳酸またはポリグリコール酸のような）、生成物の制御放出または持続放出をもたらし、次いで、生成物が、デポ注射を介して送達される、ビーズまたはリポソームのような薬剤を伴う所望の分子による製剤を伴いうる。ヒアルロン酸もまた、使用することができ、これは、循環中の持続的存続を促進する効果を及ぼしうる。所望の分子の導入に適する他の手段は、植込み式薬物送達デバイスを含む。
【０２６２】
ある特定の製剤を、経口投与しうることもまた想定される。本開示の一実施形態では、このようにして投与される結合性タンパク質は、錠剤およびカプセルのような固体剤形の混合に通例使用される担体を伴うか、またはこれを伴わずに製剤化することができる。例えば、バイオアベイラビリティーが最大化され、全身循環前（ｐｒｅ−ｓｙｓｔｅｍｉｃ）分解が最小化される、消化管内の地点において、製剤の活性部分を放出するように、カプセルをデザインすることができる。結合性タンパク質の吸収を容易とするように、さらなる薬剤を組み入れることができる。希釈剤、芳香剤、低融点蝋、植物油、滑沢剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤、および結合剤もまた援用することができる。
【０２６３】
別の医薬組成物は、錠剤の製造に適する、非毒性賦形剤を伴う混合物中に、有効数量の結合性タンパク質を伴いうる。錠剤を、滅菌水中または別の適切な媒体中に溶解させることにより、溶液を、単位用量形態で調製することができる。適切な賦形剤は、カルシウム炭酸、炭酸ナトリウムもしくは重炭酸ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウムのような、不活性の希釈剤；またはデンプン、ゼラチン、もしくはアカシアのような結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、もしくは滑石のような滑沢剤を含むがこれらに限定されない。
【０２６４】
当業者には、持続送達製剤中または制御送達製剤中に結合性タンパク質を伴う製剤を含む、本開示の、さらなる医薬組成物が明らかであろう。リポソーム担体、生体内分解性微粒子、または多孔性ビーズ、およびデポ注射のような、他の様々な持続送達手段または制御送達手段を製剤化する技法もまた、当業者に公知である。持続放出調製物のさらなる例は、成形粒子、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある、半透性のポリマーマトリックスを含む。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリラクチド、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、エチレン酢酸ビニル、またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含みうる。持続放出組成物はまた、当技術分野で公知のいくつかの方法のうちのいずれかにより調製されるリポソームも含みうる。
【０２６５】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおける投与のために使用される医薬組成物は、滅菌の医薬組成物でなければならない。これは、滅菌濾過膜を介する濾過によりたやすく達成される。組成物を凍結乾燥させる場合、この方法を使用する滅菌処理は、凍結乾燥および再構成の前または後に実行することができる。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態で保存することもでき、溶液中に保存することもできる。加えて、非経口組成物は一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により穿刺可能な止栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れる。
【０２６６】
医薬組成物を製剤化したら、溶液、懸濁、ゲル、エマルジョン、固体として、滅菌バイアル内に保管することもでき、脱水するか、または凍結乾燥させた粉末として滅菌バイアル内に保管することもできる。このような製剤は、ＲＴＵ（ｒｅａｄｙ−ｔｏ−ｕｓｅ）形態で保管することもでき、投与の前に再構成を要求する形態（例えば、凍結乾燥形態）で保管することもできる。
【０２６７】
本開示はまた、単回投与用量の投与単位をもたらすためのキットも包摂する。キットは各々、乾燥タンパク質を有する第１の容器、および水性製剤を有する第２の容器の両方を含有しうる。単一チャンバー型およびマルチチャンバー型の、あらかじめ充填されたシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅ））を含有するキットもまた、本開示の範囲内に含まれる。
【０２６８】
治療に援用される、結合性タンパク質による医薬組成物の有効量は、例えば、治療的文脈および治療目的に依存するであろう。したがって、当業者は、処置に適する投与量レベルが、部分的に、送達される分子、結合性タンパク質が使用される適応、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表面積、または臓器サイズ）および状態（年齢および全般的な健康状態）に応じて変動することを察知するであろう。したがって、臨床医は、最適な治療効果を得るように、投与量を滴定し、投与経路を変更することができる。
【０２６９】
投与頻度は、使用される製剤中の結合性タンパク質の薬物動態パラメータに依存するであろう。臨床医は、所望の効果を達成する投与量に到達するまで、組成物を投与することが典型的であろう。したがって、組成物は、単回投与として投与することもでき、ある時間にわたる、２回またはそれ以上の投与（同じ量の所望の分子を含有する場合もあり、これを含有しない場合もある）として投与することもでき、植込みデバイスまたはカテーテルを介する連続注入として投与することもできる。適切な投与量のさらなる精緻化は、当業者により日常的になされるものであり、当業者により日常的に実施される業務の範囲内にある。適切な投与量は、適切な用量反応データの使用により確認することができる。
【０２７０】
実施例
本開示は、以下の例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。しかし、以下の例は、本開示の範囲を限定するものとみなされるべきではない。本明細書で記載される例および実施形態は、例示だけを目的とするものであり、当業者には、これに照らした、多様な改変または変化が示唆され、本出願の精神および範囲内、ならびに付属の特許請求の範囲内に含まれるものとすることが理解される。
【実施例１】
【０２７１】
抗ベータ−ＤＧ  ＥＣＤ、抗ＬＧ−５、および抗ＬＧ−４／５抗体の同定
方法
タンパク質の発現
マウスベータ−ＤＧ細胞外ドメイン（ｍベータ−ＤＧ  ＥＣＤ）を発現させるために、Ｎ末端のマルトース結合性タンパク質、ＴＥＶ切断部位、ｍベータ−ＤＧ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ６２１６５、アミノ酸６５２〜７４６）、およびＣ末端のＨＰＣ４タグを、親ベクター骨格としてのｐＥＴ２２ｂと共にコードする大腸菌コドン最適化カセットを含有する構築物を作出した。構築物を、化学的にコンピテントのＯｒｉｇａｍｉ  Ｂ（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。発現は、３７℃、ＯＤ＝０．６で、ＩＴＰＧによる誘導を伴って実施した。細胞を、ペレット化させ、ＥＤＴＡ非含有プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）を含有する溶解緩衝液中に再懸濁させ、超音波処理により溶解させた。アミロース樹脂カラム（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）上で、細胞溶解物を処理し、マルトース結合性タンパク質を、Ｔｕｒｂｏ  ＴＥＶプロテアーゼ（Ｅｔｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で切断し、消化物を、アミロース樹脂およびＨｉｓ−Ｔｒａｐ  ＦａｓｔＦｌｏｗカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で処理して、消化されなかった融合タンパク質および切断されたマルトース結合性タンパク質を除去し、マウス抗ＨＰＣ４抗体とカップリングさせた、ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、フロースルーを処理することにより、ｍベータ−ＤＧ−ＨＰＣ４を、清明化された細胞溶解物から精製した。さらなる精製を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５サイズ除外カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で実行し、高度に精製されたｍベータ−ＤＧ−ＨＰＣ４を伴う溶離物画分（画分試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動させ、クーマシー染色にかけることにより決定される）を回収し、プールした。
【０２７２】
マウスまたはラミニンＧ様５ドメイン（ｍＬＧ−５またはｈＬＧ−５）を発現させるために、Ｎ末端のＡｖｉおよびＨＰＣ４タグと、ｍＬＧ−５（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ６０６７５、アミノ酸２９３２〜３１１８；配列番号２９２を参照されたい）またはｈＬＧ−５（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２４０４３、アミノ酸２９３６〜３１２２；配列番号２９３）とをコードする、哺乳動物用コドン最適化カセットを含有する構築物を作出した。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトするのに、構築物を使用した。７日間にわたる発現の後、可溶性のビオチニル化タンパク質を、マウス抗ＨＰＣ４抗体とカップリングさせた、ＮＨＳ活性化Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  ＦａｓｔＦｌｏｗ樹脂により、上清から精製した。
【０２７３】
マウスまたはヒトのラミニンＧ様４および５ドメイン（ｍＬＧ−４／５またはｈＬＧ−４／５）を発現させるために、Ｎ末端のｍＩｇＧ２ａ融合パートナー、ＴＥＶ切断部位、Ａｖｉタグ、ＨＰＣ４タグと、ｍＬＧ−４／５（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ６０６７５、アミノ酸２７２５〜３１１８；配列番号２９２）またはｈＬＧ−４／５（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２４０４３、アミノ酸２７２９〜３１２２；配列番号２９３）とをコードする、哺乳動物用コドン最適化カセットを含有する構築物を作出した。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞にトランスフェクトするのに、構築物を使用した。７日間にわたる発現の後、可溶性のタンパク質を、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、上清から精製した。Ｔｕｒｂｏ  ＴＥＶプロテアーゼ（Ｎａｃａｌａｉ  ＵＳＡ）を使用して、ｍＩｇＧ２ａを、ｍＬＧ−４／５タンパク質から切断し、消化物を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ樹脂（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）およびＮｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｑｉａｇｅｎ）上で処理して、ｍＩｇＧ２ａおよびＴＥＶプロテアーゼを、精製されたｍＬＧ−４／５から除去した。
【０２７４】
ファージディスプレイ
精製されたｍベータ−ＤＧ、ｍＬＧ−５、またはｍＬＧ−４／５、およびｈＬＧ−４／５（例えば、マウスペプチドの使用と、ヒトペプチドの使用との間を交代させる）を、トシル活性化磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にカップリングさせ、ｍベータ−ＤＧ、ｍＬＧ−５、またはｍＬＧ−４／５への結合剤のためのファージディスプレイライブラリーをエンリッチするのに使用した。抗体ファージディスプレイライブラリーを、ｍベータ−ＤＧの選択に使用し、Ｄｙａｘ  ＦＡＢ  ３１０抗体ファージディスプレイライブラリーを、ｈＬＧ−４／５およびｍＬＧ−４／５の選択のために使用した。非コーティングビーズおよびＨＰＣ４−６×Ｈｉｓ−Ａｖｉでタグ付けされた非類縁タンパク質を使用して、まず、ライブラリーから、非特異的結合剤を枯渇させた。次いで、各ラウンドで濃度を低下させる抗原（ラウンド１における５００ｎＭの抗原〜ラウンド３における１ｎＭの抗原）を使用して、枯渇させたライブラリーに対して、３ラウンドにわたる選択を実施した。エンリッチされたライブラリーを播種し、個体ライブラリークローンを採取し、９６ウェルフォーマット内で培養し、ファージモノクローナル抗体を、ファージＥＬＩＳＡ結合アッセイ用の各クローンのために作製した。
【０２７５】
ファージＥＬＩＳＡ結合アッセイ
１ｕｇ／ｍｌの精製された抗原（ｍベータ−ＤＧ、ｍＬＧ−５、ｈＬＧ−５、ｍＬＧ−４／５、またはｈＬＧ−４／５）で、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ  ９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をコーティングした。選択されたライブラリークローンに由来するファージモノクローナル抗体を、各ウェルに添加し、抗Ｍ１３ユーロピウム標識化二次（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒにより特注で標識化された抗体）を使用して、陽性または陰性の結合を検出した。
【０２７６】
可変領域のシーケンシング
陽性結合クローンの細菌ストックを、ＰＣＲ増幅およびシーケンシングし、固有の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）配列を同定した。
【０２７７】
結果
ベータ−ＤＧ、ＬＧ−５、およびＬＧ−４／５に対する特異的結合アフィニティーを伴う、いくつかのファージライブラリークローンを同定した：１０のクローンは、ベータ−ＤＧに特異的に結合し、１５のクローンは、ＬＧ−４／５に特異的に結合した。これらのクローンのシーケンシングは、各クローンの可変重鎖および可変軽鎖領域が、上記の表Ｄ〜Ｉに示される通り、顕著に異なることを明らかにした（例えば、クローンであるＢ０４、Ｂ０６、ＣＬ−４０９６８、ＣＬ−４０９９２、ＣＬ−４１１３６、ＣＬ−４１４００、およびＣＬ−４１５００を参照されたい）。これらのクローンの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、上記の表Ａ〜Ｃで同定される。
【実施例２】
【０２７８】
ベータ−ＤＧ、ＬＧ−５、およびＬＧ−４／５に対してターゲティングされた、ハイブリドーマ、モノクローナル抗体、およびキメラ抗体の作出
方法
細胞株の作製
ヒトまたはマウスベータ−ＤＧの表面発現を伴う安定的な細胞株を、Ｎ末端のｍｙｃタグ、ならびにベータ−ＤＧ（マウスＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ６２１６５、アミノ酸６５２〜８９３；ヒトＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ１４１１８、アミノ酸６５４〜８９５）の細胞外ドメインおよび内因性膜貫通ドメインを含有するコドン最適化構築物により創出した。リポフェクタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、接着性ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ）および接着性チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）にトランスフェクトし、細胞を、ゲネチシン（Ｇｉｂｃｏ）により選択した。単一細胞クローン性のために、生存細胞を系列希釈し、ベータ−ＤＧの表面発現を、抗ｍｙｃフローサイトメトリーにより確認した。
【０２７９】
ヒトまたはマウスＬＧ−５の表面発現を伴う安定的な細胞株を、Ｎ末端のｍｙｃタグ、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー、ＬＧ−５（マウスＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ６０６７５、アミノ酸２９３２〜３１１８；ヒトＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２４０４３、アミノ酸２９３６〜３１２２）、および哺乳動物における発現のためのＴｆｒ１膜貫通ドメインを含有するコドン最適化構築物により創出した。リポフェクタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、接着性チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）にトランスフェクトし、細胞を、ゲネチシン（Ｇｉｂｃｏ）により選択した。単一細胞クローン性のために、生存細胞を系列希釈し、ベータ−ＤＧの表面発現を、抗ｍｙｃフローサイトメトリーにより確認した。
【０２８０】
ヒトまたはマウスＬＧ−４／５の表面発現を伴う安定的な細胞株を、Ｎ末端のｍｙｃタグ、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー、ＬＧ−４／５（マウスＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ６０６７５、アミノ酸２７２５〜３１１８；ヒトＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２４０４３、アミノ酸２７２９〜３１２２）、および哺乳動物における発現のためのＴｆｒ１膜貫通ドメインを含有するコドン最適化構築物により創出した。リポフェクタミン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、接着性ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ）にトランスフェクトし、細胞を、ゲネチシン（Ｇｉｂｃｏ）により選択した。単一細胞クローン性のために、生存細胞を系列希釈し、ベータ−ＤＧの表面発現を、抗ｍｙｃフローサイトメトリーにより確認した。
【０２８１】
マウスの免疫化
Ｂａｌｂ／ｃマウスおよびＴｒｉａｎｎｉマウスを、ｈベータ−ＤＧ、ｈＬＧ−５、またはｈＬＧ−４／５で免疫化し、次いで、これらのタンパク質を、２週間ごと、３〜４回にわたり追加投与した。ｈＬＧ−４／５で免疫化されたマウスについて、マウスに、ヒトメロシンを、２週間ごと、３回にわたり追加投与し、ヒトＬＧ−５とマウスのＬＧ−５との間で同一の配列を有する合成ペプチドを、１回追加投与した（アミノ酸配列＝ＧＦＡＫＡＶＧＧＦＫＶＧＬＤＬＬＶＥＦＥ；配列番号２９５）。
【０２８２】
ハイブリドーマの作出
ハイブリドーマ細胞は、アデノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）を欠損する、マウス骨髄腫細胞（Ｂａｌｂ／ｃ  Ｂリンパ芽球細胞株に由来するＳＰ２／０であり、センダイウイルスにより融合させる）を、免疫化されたマウスに由来する脾臓細胞と融合させることにより作った。ＨＡＴ選択（ヒポキサンチン、アザセリン、およびチミジン）および系列希釈を実施して、単一細胞クローン性を達成した。
【０２８３】
ＥＬＩＳＡによる抗体結合アッセイ
ＥＬＩＳＡアッセイのために、ヒトベータ−ＤＧまたはＬＧ−４／５でコーティングされたプレートを、ＰＢＳ中に５％のウシ胎仔血清でブロッキングし、各ウェルを、顕著に異なる培養物上清と共にインキュベートした。プレートを、ＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗マウスＦｃ二次抗体と共にインキュベートし、ＰＢＳで再度洗浄し、比色測定のために現像した。
【０２８４】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）による抗体結合アッセイ
ＦＡＣＳアッセイのために、ヒトまたはマウスのベータ−ＤＧまたはＬＧ−４／５の表面発現（上記を参照されたい）を伴う安定的細胞を、抗体を含有する培養物上清と共にインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスＦｃ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）と共にインキュベートし、ＰＢＳで再度洗浄し、フローサイトメーター上で解析した。
【０２８５】
表面プラズモン共鳴（Ｂｉａｃｏｒｅ）反応速度アッセイ
製造元のプロトコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に従うＢｉａｃｏｒｅ反応速度アッセイにより、抗体／抗原結合アフィニティーおよびオン／オフ速度を測定することにより、ハイブリドーマ抗体（培養物上清中に含有される）を、さらに特徴づけた。結合に使用される抗原は、ヒトまたはマウスのベータ−ＤＧまたはＬＧ−４／５であった。
【０２８６】
モノクローナル抗体の作出
ハイブリドーマクローンを拡大し、極低ＩｇＧ胎仔ウシ血清サプリメントを伴う終端フラスコに播種した。７日後、上清を採取し、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、モノクローナル抗体を精製した。結果として得られる抗体を、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、およびＢｉａｃｏｒｅ反応速度アッセイ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により調べて、抗体結合特性を再度確認した。
【０２８７】
免疫蛍光
固定されていない、凍結させた、ヒトおよびマウスの筋組織切片による免疫蛍光染色を実施した。筋組織切片を、ベータ−ＤＧまたはＬＧ−４／５に対する精製抗体で染色し、洗浄し、蛍光標識化抗マウスＩｇＧ二次抗体で染色し、洗浄し、マウントし、蛍光顕微鏡を使用してイメージングした。
【０２８８】
可変領域のシーケンシング
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、高アフィニティー抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、総ＲＮＡを単離し、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を使用して、第１鎖であるｃＤＮＡを合成した。アイソタイプ特異的プライマーを使用して、５’−Ｒａｐｉｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  Ｅｎｄｓ（５’−ＲＡＣＥ）ＰＣＲにより、ＶＨ遺伝子セグメントおよびＶＬ遺伝子セグメントを増幅した。増幅されたＰＣＲ断片をクローニングし、シーケンシングした。例えば、クローンであるＴＤＧ−２、ＴＤＩ−１１、ＴＤＩ−２３、ＴＤＩ−３８、ＴＬＦ３９、ＴＬＦ８６、ＴＬＧ３／ＴＬＧ４、ＴＬＧ２６、ＴＬＩ−３、ＴＬＩ−７、ＴＴＬＫ７１−４−６、ＴＴＬＫ１２３−３、ＴＴＬＫ１４５−６−３、ＴＴＬＫ１７０−２、ＷＪＬ１０、およびＷＪＬ４８を参照されたい。
【０２８９】
キメラ抗体の作製
５’−ＲＡＣＥ  ＰＣＲから作出されたＶＨおよびＶＬ配列を、哺乳動物における発現のためにコドン最適化し、合成した。ＶＨ配列を、ヒトＩｇＧ１と共に、哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、ＶＬ配列を、定常ヒトカッパ鎖と共に、哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞に、これらの構築物を共トランスフェクトして、キメラ抗体を発現させた。７日間にわたる発現の後、抗体を、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ）により、上清から精製した。精製された抗体を、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、およびＢｉａｃｏｒｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により再スクリーニングして、ベータ−ＤＧ、ＬＧ−５、またはＬＧ−４／５に対する結合アフィニティーを確認した。抗体が、筋組織内の、それらのそれぞれの抗原に結合したことを確認するために、固定されていない、凍結させた、ヒトおよびマウスの筋組織切片による免疫蛍光染色を実施した。
【０２９０】
結果
ベータ−ＤＧ、ＬＧ−５、またはＬＧ−４／５に特異的な抗体を産生するハイブリドーマについてスクリーニングし、選択するために、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ解析、およびＢｉａｃｏｒｅ反応速度アッセイを使用して、抗体の結合を評価した。ＥＬＩＳＡアッセイは、抗体の、ベータ−ＤＧ、ＬＧ−５、またはＬＧ−４／５に対する結合アフィニティーの範囲を示し、いくつかの試料は、強い比色シグナル（３つの抗体についての例示的データを、下記の表Ｊに提示する）をもたらした。
【０２９１】
【表３４】
2020510416.tif 000036
【０２９２】
ベータ−ＤＧまたはＬＧ−４／５をその表面上で発現する細胞に対する結合アフィニティーについてＦＡＣＳを使用して、強い比色シグナルをもたらす試料についてアッセイした。ＦＡＣＳ解析は、クローンであるＣ２１およびＣ３に由来する抗体が、マウスＬＧ−４／５およびヒトＬＧ−４／５の両方（それぞれ、図３Ｃおよび３Ｇ）に対する結合アフィニティーを有することを明らかにした。これらの抗体は、顕著でない蛍光検出により示される通り、ベータ−ＤＧまたはＬＧ−４／５の表面発現を欠く対照細胞に結合しなかった。
【０２９３】
多様な量の組換えヒトラミニン２（Ｂｉｏｌａｍｉｎａ製）、マウスＬＧ−５、ヒトＬＧ−５、ヒトＬＧ４／５を、ニトロセルロース膜にドットブロットし、抗ラミニン２抗体でプローブした。結果は、抗体が、ＬＧ−５を含有するラミニン２またはその断片を認識することを指し示した（Ｃ２１についての図３Ｄ上）。抗体特異性を決定するために、異なるアルファ鎖を伴う、異なるラミニンアイソフォームを、ブロットにドットした。ｍＬＧ−５およびアルファ−２を含有するヒトラミニン２だけが認識されたことから、抗体の結合特異性が裏付けられる（Ｃ２１についての図３Ｄ下；Ｃ３についての図３Ｈ）。
【０２９４】
抗ジストログリカン抗体クローンもまた、特徴づけした。反応速度は、全ての被験抗体が、それらのそれぞれの抗原に対して、高アフィニティーを示し、表Ｋおよび図３Ｉおよび３Ｊ（クローンＡＳ３０）、ならびに３Ｍおよび３Ｎ（クローンＡＳ１９）において示される通り、大半のＫＤは、１０−９Ｍの範囲内にある（ナノモルの感受性である）ことを明らかにした。加えて、被験抗体についてのオン速度およびオフ速度は、オン速度およびオフ速度が極めて大きな、抗ベータ−ＤＧのクローンであるＡＳ１９を例外として、高アフィニティー抗体に典型的であった（表Ｋ）。
【０２９５】
【表３５】
2020510416.tif 000037
【０２９６】
クローンであるＡＳ３０およびＡＳ１９を特徴づけるために、多様な量の組換えジストログリカンである組換えマウスベータ−ＤＧ  ＥＣＤまたは組換えヒトベータ−ＤＧ  ＥＣＤ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）、Ｃ２Ｃ１２細胞溶解物、ＴＡ溶解物、および陰性対照としてのファブラザイムを、ニトロセルロース膜にドットブロットし、抗ベータ−ＤＧ抗体によりプローブした（ＡＳ３０については、図３Ｋ；ＡＳ１９については、図３Ｏ）。結果は、ベータ−ＤＧを含有する、全てのタンパク質が検出されたことを指し示す。シグナルは、Ｃ２Ｃ１２溶解物またはＴＡ溶解物では、おそらく、これらの試料中の、極めて低量のベータ−ＤＧのために検出されなかった。予測される通り、抗体はまた、陰性対照のファブラザイムも検出しなかった。
【０２９７】
非変性条件下で可溶化させたＣ２Ｃ１２細胞溶解物からの、ベータ−ＤＧの免疫沈降を、抗ベータ−ＤＧクローンであるＡＳ３０またはＡＳ１９により実施した。ベータ−ＤＧ／抗体複合体を、プロテインＡビーズにより捕捉し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で泳動させ、次いで、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製の抗アルファ−ＤＧおよび抗ベータ−ＤＧで再プローブした。アルファ−ＤＧおよびベータ−ＤＧのいずれもが、免疫沈降したことから、それらが、可溶化の後で、依然として複合体であり、抗ベータ−ＤＧ抗体クローンの結合が、アルファ−ＤＧの、ベータ−ＤＧへの結合に干渉しなかった（ＡＳ３０については、図３Ｌ；ＡＳ１９については、図３Ｐ）ことが指し示される。
【０２９８】
ハイブリドーマクローンを拡大し、モノクローナル抗体を精製した後で、抗体を、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、およびＢｉａｃｏｒｅにより再スクリーニングして、結合アフィニティーを確認した。結果は、培養物上清に由来する抗体についてもたらされた結果と極めて類似したことから、抗体が、増幅の後で、それらの反応速度的特徴を保持したことが確認される。
【０２９９】
抗体が、夥多なベータ−ＤＧおよびＬＧ−４／５を含有する筋組織に結合しうるのかどうかを決定するために、精製抗体を使用して、免疫蛍光染色を、マウス筋組織上およびヒト筋組織上で行った。天然の抗原コンフォメーションが保存されるように、非固定組織を使用した。特徴的な筋肉の筋線維鞘染色が、ヒト組織およびマウス組織について裏付けられたことから、Ｃ２１（図４Ａ）およびＣ３（図４Ｂ）について、特異的なＬＧ−４／５への結合、ならびにＡＳ３０（図４Ｃ）およびＡＳ１９（図４Ｄ）について、特異的なベータ−ＤＧへの結合が指し示される。二次抗体のみで染色された切片は、蛍光シグナルを明らかにしなかった。
【実施例３】
【０３００】
ベータ−ＤＧおよびラミニン２アルファサブユニットのＬＧ−４／５ドメインを認識する二特異性抗体の作出
方法
四価二特異性タンデムＩｇ（ＴＢＴＩ）抗体の作出
作出されたハイブリドーマ細胞から得られたＶＨおよびＶＬ配列を、哺乳動物における発現についてコドン最適化し、合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。軽鎖を発現する構築物を作出するために、ベータ−ＤＧに特異的な、１つのＶＬ配列、（Ｇ４Ｓ）２リンカー、ＬＧ−４／５に特異的な、１つのＶＬ配列、およびヒトカッパ鎖（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｑ５０２Ｗ４）またはマウスカッパ鎖（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＡＢ３３４０４）を、併せて融合させ、Ｄｕｒｏｃｈｅｒら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００２、３０（２）、Ｅ９）により記載されている、ｐＴＴベクターの類似体である、一過性のエピソーム性発現ベクターであるｐＸＬにクローニングした。重鎖を発現する構築物を作出するために、ベータ−ＤＧに特異的な、１つのＶＨ配列、（Ｇ４Ｓ）２リンカー、ＬＧ−４／５に特異的な、１つのＶＨ配列、およびヒトＩｇＧ１（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｑ５６９Ｆ４）またはマウスＩｇＧ１（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ７５１６３．１）を、併せて融合させ（図４Ａ）、発現ベクターであるｐＸＬにクローニングした。使用されるＶＨ配列およびＶＬ配列は、ＬＧ−４／５特異的結合のために、クローンであるＡＮ０１、Ｃ３、およびＣ２１から得、ベータ−ＤＧ特異的結合のために、クローンであるＢ６、ＡＳ１９、およびＡＳ３０から得た。
【０３０１】
これらの構築物を、ＨＥＫ２９３  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−ＦまたはＥｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に共トランスフェクトした。７日間にわたる発現の後、抗体を、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、上清から精製した。
【０３０２】
交差二重可変ドメインＩｇ（ＣＯＤＶＩｇ）抗体の作出
作出されたハイブリドーマ細胞から得られたＶＨおよびＶＬ配列を、哺乳動物における発現についてコドン最適化し、合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）。軽鎖を発現する構築物を作出するために、ＬＧ−４／５に特異的な、１つのＶＬ配列、Ｌ１リンカー、ベータ−ＤＧに特異的な、１つのＶＬ配列、Ｌ２リンカー、およびヒトカッパ鎖（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｑ５０２Ｗ４）またはマウスカッパ鎖（Ｇｅｎｂａｎｋ：ＢＡＢ３３４０４）を、併せて融合させ、発現ベクターであるｐＸＬにクローニングした。重鎖を発現する構築物を作出するために、ベータ−ＤＧに特異的な、１つのＶＨ配列、Ｌ３リンカー、ＬＧ−４／５に特異的な、１つのＶＨ配列、Ｌ４リンカー、およびヒトＩｇＧ１（Ｇｅｎｂａｎｋ：Ｑ５６９Ｆ４）またはマウスＩｇＧ１ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ７５１６３．１）を、併せて融合させ、発現ベクターであるｐＸＬにクローニングした。使用されるリンカー配列の具体的な組合せを、下記に提示する。
【０３０３】
これらの構築物を、ＨＥＫ２９３  ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３−ＦまたはＥｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）に共トランスフェクトした。７日間にわたる発現の後、抗体を、ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ（商標）ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、上清から精製した。
【０３０４】
逐次的なＢｉａｃｏｒｅ結合解析
親モノクローナル抗体（ＡＳ１９、Ｃ３、およびＣ２１）および３つの二特異性抗体（ＴＢＴＩ内のＡＳ１９×Ｃ３およびＣＯＤＶＩｇ内のＡＳ３０×Ｃ３およびＡＳ３０×Ｃ３）を、各々、個別のＣＭ５  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｂｉａｃｏｒｅチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に固定化した。ヒトまたはマウスＬＧ−４／５に続き、ヒトまたはマウスベータ−ＤＧを、各チップ上に流過させ、結合を評価した。
【０３０５】
二段型サンドイッチＥＬＩＳＡ
９６ウェルプレートを、５０ｎｇのヒトＬＧ−４／５でコーティングし、ＰＢＳ中に５％の胎仔ウシ血清でブロッキングした。各ウェルを、作出された二特異性抗体（マウスＩｇＧ骨格）１μｇと共にインキュベートした。２時間後、ウェルを、ＰＢＳで洗浄し、ウェル１つ当たり１６ｎｇ〜１μｇの、ヒトｈＩｇＧ１  Ｆｃ抗体領域に融合させたヒトベータ−ＤＧ（ｈベータ−ＤＧ−ｈＦｃ）と共に再インキュベートした。２時間後、ウェルを、ＰＢＳで洗浄し、ＨＲＰとコンジュゲートさせた抗ｈＦｃ二次抗体と共に、４５分間にわたりインキュベートし、ＰＢＳで再度洗浄し、比色測定のために現像した。
【０３０６】
結果
抗体を、上記で記載した、四価二特異性タンデムＩｇＧフォーマット（ＴＢＴＩ；図５Ａ）、ならびに交差二重可変ドメインＩｇＧフォーマット（ＣＯＤＶＩｇ；図５Ｂ）を含む、複数の二特異性フォーマットに操作した。これらのフォーマットを創出するために、各構築物のための軽鎖プラスミドおよび重鎖プラスミドを合成した。列挙されたモノクローナル配列に由来する抗βＤＧの可変軽鎖領域に続き、リンカーと、次いで、抗ＬＧ４／５モノクローナルに由来する可変軽鎖領域に続き、さらなるリンカーと、次いで、定常軽鎖ドメインとを伴う軽鎖プラスミドである。同じ原理を使用して、重鎖プラスミドを開発し、次いで、発現させるために、これらを、哺乳動物細胞内に共トランスフェクトした。複数のリンカーの組合せを試み、両方の可変領域の配向性を調べた（すなわち、抗βＤＧ可変領域ではなく、定常領域から離れて、抗ＬＧ４／５を有する配向性およびこの逆の配向性）。
【０３０７】
ベータ−ＤＧ（クローンであるＢ０６、ＡＳ１９、およびＡＳ３０を使用する）およびＬＧ−４／５（クローンであるＡＮ０１、Ｃ３、およびＣ２１を使用する）を認識する二特異性抗体（ｂｉＡｂ）を、ＴＢＴＩフォーマットまたはＣＯＤＶＩｇフォーマットで作出した。
【０３０８】
複数のリンカーの組合せを試み、両方の可変領域の配向性を調べた（すなわち、抗βＤＧ可変領域ではなく、定常領域から離れて、抗ＬＧ４／５を有する配向性およびこの逆の配向性）。ＴＢＴＩ（Ｔ１Ｔ２およびＴ５Ｔ６）では、軽鎖可変領域の間のリンカーは、グリシンまたはセリン（例えば、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号２９４）である１０の残基からなり、第２の可変領域と定常領域との間では、リンカーを使用しなかった。同じリンカー（グリシンまたはセリンである１０の残基）を重鎖可変領域の間で使用し、第２の重鎖可変領域と重鎖定常領域との間では、リンカーを使用しなかった。ＣＯＤＶＩｇフォーマットでは、リンカーの長さの２つのセット：１０−１０−０−０および７−５−１−２（Ｌ１−Ｌ２−Ｌ３−Ｌ４についての残基の数）を使用した。ＣＯＤＶＩｇ  Ｃ５Ｃ６リンカーは、可変軽鎖の間のグリシンまたはセリンである１０の残基と、第２の可変領域と、軽定常領域との間のグリシンまたはセリンである１０の残基からなった。重鎖上では、リンカーを使用しなかった。これらの組合せのためのリンカー配列は、以下（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４として描示される）：ＧＱＰＫＡＡＰ（配列番号２９７）、ＴＫＧＰＳ（配列番号２９８）、Ｓ，  ＲＴ；  ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号２９９）、ＧＧＳＧＳＳＧＳＧＧ（配列番号２９９）、０，０；およびＥＰＫＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ（配列番号２９６）、ＧＧ、ＥＰＫＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ（配列番号２９６）、ＧＧの通りであった。創出された二特異性抗体のリストを下記の表Ｌに提示する。
【０３０９】
【表３６】
2020510416.tif 000038
【０３１０】
ｂｉＡｂが、ＬＧ−４／５およびベータ−ＤＧに、同時に結合する能力を有することを確認するために、逐次的Ｂｉａｃｏｒｅ解析（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）および二段型サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを実施した。
【０３１１】
ＬＧ−４／５またはベータ−ＤＧに対する親ｍＡｂ、および抗ＬＧ４／５およびベータ−ＤＧのｂｉＡｂを、ビアコアチップに捕捉し、次いで、ヒトＬＧ４／５およびヒトベータ−ＤＧと共に、逐次的に流過させて、両方抗原へのそれらの同時の結合を決定した。逐次的なＢｉａｃｏｒｅ解析は、二特異性抗体が、まず、ヒトＬＧ−４／５（第１のピーク、図６Ａ）またはマウスＬＧ−４／５（第１のピーク、図６Ｂ）に結合し、次いで、ヒトベータ−ＤＧ（第２のピーク、図６Ａ）またはマウスベータ−ＤＧ（第２のピーク、図６Ｂ）とさらに会合することを明らかにした。これに対し、親モノクローナル抗体は、１つの標的である、ＬＧ−４／５（図６Ａおよび６ＢにおけるＣ３およびＣ２１）またはベータ−ＤＧ（図６Ａおよび６ＢにおけるＡＳ１９）に結合することだけが可能であった。
【０３１２】
二段型サンドイッチＥＬＩＳＡは、二特異性抗体が、ｈＬＧ−４／５およびｈベータ−ＤＧに同時に結合しうることを明らかにした。比色シグナルは、ｈＬＧ−４／５およびｈベータ−ＤＧ−ｈＦｃの両方を、アッセイに添加した場合に限り、検出することができた（図７）。親モノクローナル抗体を使用するか、またはｈベータ−ＤＧ−ｈＦｃを除外した場合に、シグナルは検出されなかった。３つの二特異性抗体（ｂｉＡｂ）である、Ｔ１Ｔ２、Ｔ５Ｔ６、およびＣ５Ｃ６は、両方の標的への同時的な結合を指し示す、予期されたシグナルを示した。親である、抗ＬＧ４／５もしくは抗ベータ−ＤＧｍＡｂ、または第２の工程においてベータ−ＤＧ−ｈＦｃを伴わないｂｉＡｂの全ては、このアッセイにおいて陰性であった。
【実施例４】
【０３１３】
二特異的抗体の、ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスへの筋内注射
方法
ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスモデル
ジャクソン研究所製のＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／Ｇｒｓｒ（株番号：００８５８１）マウスは、ＬＡＲＧＥ遺伝子内の突然変異により引き起こされるアルファ−ジストログリカノパチーのマウスモデルである。ＬＡＲＧＥ遺伝子の突然変異は、それぞれ、４４．４Ｍｂおよび８３．８Ｍｂにおけるマーカーである、Ｄ８Ｍｉｔ６５と、ＤＭｉｔ２４９との間にマップされ；ＬＡＲＧＥ遺伝子は、７５．７Ｍｂに位置する。ＬＡＲＧＥについてホモ接合性のマウスは、一般に、２〜３カ月齢において、筋肉変性の証拠を提示し始めるが、一部の動物は、離乳齢までの早期に症状を呈示しうる。尾を持ち上げたときに、後肢を開脚できないことが、初期の表現型であり、これは、千鳥足を含み、次いで、後肢の引きずりを含むように、月齢と共に進行する。
【０３１４】
二特異性抗体の注射
ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウス１０匹の群に、左前脛骨筋（ＴＡ）および右ＴＡへの筋内注射を施した。左ＴＡに、注射１回当たり、５０μｌの生理食塩液中に０．７μｇ／μｌずつのｂｉＡｂ（Ｔ１Ｔ２；マウスＦｃ骨格）による注射２回を施した。右ＴＡに、注射１回当たり、５０μｌの生理食塩液中に０．７μｇ／μｌずつの、重量で１：１の、親ＡＳ１９とＣ３抗体との混合物による対照注射２回を施した。２回の注射は、３日間の間隔を置いた。
【０３１５】
身体運動誘導性組織損傷
最終回の筋内注射の１日後、全てのマウスに、エバンスブルー色素（ＥＢＤ）の腹腔内注射（ＩＰ）を、体重１０ｇ当たり５０μｌを与える、１０ｍｇ／ｍｌで施した。ＥＢＤのＩＰの１日後、全てのマウスに、強制走行型トレッドミルを介して、消耗するまで身体運動させた。標準的なＩＡＣＵＣプロトコールに従い、動物を、ＣＯ２で安楽死させた。
【０３１６】
組織の調製および免疫蛍光染色
安楽死の後、ＴＡ筋肉を摘出し、切断し、ＯＣＴ（ｏｐｔｉｍｕｍ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）化合物中に入れた。次いで、組織を、２−メチルブタンドライアイス浴を介して凍結させた。組織を、クライオスタット内、１０ミクロンの厚さで低温切片化した。ＴＡから、１００ミクロンごとに、４つの異なる水準を切断した（三連で）。
【０３１７】
スライド切片を、低温ＰＢＳに、速やかに浸漬し、氷冷アセトン中、１５分間にわたり固定した。スライドを洗浄し、４℃で、一晩にわたりブロッキングした（ＰＢＳ中に２％のＢＳＡおよび１％の正常ヤギ血清）。翌日、スライドを、抗ｍＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、１：１００希釈率で、２時間（室温）にわたりインキュベートした。スライドを洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用してマウントした。適切なフィルターセットを活用する倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１）により、スライドを視覚化した。
【０３１８】
エバンスブルー色素（ＥＢＤ）による筋線維損傷の査定
組織切片を、免疫蛍光染色を伴わないことを除き、上記の通りに処理した。各切片上の、全てのＥＢＤ陽性線維を、左ＴＡ（ｂｉＡｂのＩＭ）および右ＴＡ（モノクローナル親抗体のＩＭ）の両方について、手作業でカウントした。
【０３１９】
結果
ｂｉＡｂが、マウス筋組織内の天然の抗原に結合することが可能であるのかどうかを決定するために、野生型マウス、またはアルファ−ジストログリカノパチーについてのマウスモデルであるＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスの、固定されていない凍結切片を、ｂｉＡｂ（Ｔ１Ｔ２、Ｔ５Ｔ６、Ｃ５Ｃ６）または親ｍＡｂで染色した。結果は、ｂｉＡｂが、単一特異性親ｍＡｂと同程度に良好に、野生型マウス筋組織切片（図８Ａ）およびＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウス筋組織切片（図８Ｂ）のいずれにも結合することが可能であること指し示した。
【０３２０】
次いで、二特異性抗体を、野生型マウスまたはＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスに筋内投与した（研究の概要を、図８Ｃに示す）。二特異性抗体の、身体運動誘導性組織損傷に対する効果を評価するために、免疫蛍光法およびエバンスブルー色素による筋線維染色を、身体運動させたマウスに由来する組織に対して実施した。免疫蛍光法は、二特異性抗体が、マウスの筋組織（左または右の前脛骨筋（ＴＡ））に良好に結合し、最終回の抗体注射の２日後においても検出可能であること（図８Ｅ）を明らかにした。ｂｉＡｂで処置された左ＴＡは、右対側対照ＴＡと比較して、顕著に少数のＥＢＤ陽性線維を有した（図８Ｄ）。エバンスブルー色素は、親抗体の混合物で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウス組織の、多くの筋肉線維に浸透したことから、色素は、膜損傷を伴う筋肉線維だけに浸透し、これらを染色するので、身体運動誘導性損傷が指し示される（図８Ｅ）。これに対し、エバンスブルー色素は、二特異性抗体で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウス組織のうちの、顕著に少数の筋線維に浸透した（図８Ｅ）。これは、二特異性抗体の局所注射は、筋肉を、アルファ−ジストログリカノパチーについての、ｉｎ  ｖｉｖｏの哺乳動物モデルにおける身体運動誘導性損傷から保護したが、親モノクローナル抗体は、保護しなかったことを指し示す。
【実施例５】
【０３２１】
ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスへの、二特異的抗体の全身送達
方法
抗体の送達
身体運動誘導性組織損傷試験のために、ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスの４つの異なる群に、親抗体または二特異性抗体（マウスＦｃ領域を伴う）の単回投与用量を、外側尾静脈（ＩＶ）を介して静脈内注射するか、または腹腔内（ＩＰ）注射した。各群に、以下：親抗ＬＧ−４／５（クローンＣ３、ＩＶ）、親抗ベータ−ＤＧ（クローンＡＳ１９、ＩＶ）、ｂｉＡｂ（ＡＳ１９×Ｃ３、ＩＶ）、およびｂｉＡｂ（ＡＳ１９×Ｃ３、ＩＰ）のうちの１つを施した。注射の１日後、全てのマウスに、エバンスブルー色素（ＥＢＤ）の腹腔内注射（ＩＰ）を、体重１０ｇ当たり５０μｌを与える、１０ｍｇ／ｍｌで施した。
【０３２２】
行動試験、クレアチンキナーゼの測定、および生体内分布免疫蛍光実験のために、処置の前に、ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウス（１１〜１９週齢）を、２つの群（ｎ＝１６）に無作為化した。マウスの１つの群に、マウス１ｋｇ当たり３０ｍｇのｂｉＡｂ（Ｔ１Ｔ２）で、毎週２回、７週間にわたり投与した。マウスの第２の群に、親モノクローナル抗体の混合物（ＡＳ１９およびＣ３、各マウス１ｋｇ当たり１５ｍｇの抗体）を、毎週２回、７週間にわたり投与した。アナフィラキシー反応を防止するため、抗体を投与する１０分前に、１ｋｇ当たり５ｍｇのジフェンヒドラミンを、腹腔内に前投与した。野生型マウスは、対照としての生理食塩液により処置した。
【０３２３】
身体運動誘導性組織損傷
腹腔内ＥＢＤ注射の１日後、全てのマウスに、強制走行型トレッドミルを介して、消耗するまで身体運動させた。標準的なＩＡＣＵＣプロトコールに従い、動物を、ＣＯ２で安楽死させた。
【０３２４】
行動試験およびクレアチンキナーゼの測定
握力試験のために、試験の前に、マウスを、１０分間にわたり、試験室に馴致させた。握力計（Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、ＯＨ）を、安定的表面上に、水平に載せた。その前足および後足のいずれにも、グリッドを握らせるように、被験マウスを、グリッドの上部に、静かに置いた。次いで、動物を、その尾で、後方に、静かに引き、握りを放離させた。放離点において発生した力の量を、ひずみゲージに記録した（グラム）。この手順を、各動物について、３回ずつ実施し、次いで、握力を、３回の試験の平均として計算した。
【０３２５】
ワイヤーハング試験のために、各動物を、ワイヤースクリーン上に置き、動物が、ワイヤーをつかむまで、ワイヤースクリーンを、左右に、静かに移動させた。次いで、ワイヤースクリーンを、クッションパッドの約２フィート上方に持ち上げ、上下を反転させた。最大のカットオフ時間を６０秒間として、動物がワイヤースクリーンから、クッションパッドに落下するまでの時間（待ち時間）を記録した。試験の間の休み時間を、少なくとも５分間として、各動物を、２回ずつ調べた。
【０３２６】
クレアチンキナーゼ（ＣＫ）レベルを、研究の開始時（二特異性抗体による処置の前）、および研究の終了時（二特異性抗体による処置の７週間後における、トレッドミル身体運動の１時間後）に、標準的な比色アッセイを介して測定した。
【０３２７】
組織の調製および免疫蛍光染色
標的臓器内で、二特異性抗体を検出するために、最終回の二特異性抗体の筋内注射の４日後に、動物を安楽死させた。ＴＡ筋肉を摘出し、切断し、ＯＣＴ（ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）化合物中に入れた。次いで、組織を、２−メチルブタンドライアイス浴を介して凍結させた。組織を、クライオスタット内、１０ミクロンの厚さで低温切片化した。
【０３２８】
身体運動誘導性組織損傷試料のために、身体運動の後で、ＴＡ筋肉を摘出し、切断し、ＯＣＴ（ｏｐｔｉｍａｌ  ｃｕｔｔｉｎｇ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）化合物中に入れた。次いで、組織を、２−メチルブタンドライアイス浴を介して凍結させた。組織を、クライオスタット内、１０ミクロンの厚さで低温切片化した。ＴＡから、１００ミクロンごとに、４つの異なる水準を切断した（三連で）。
【０３２９】
組織試料のいずれのセットについても、スライドを洗浄し、４℃で、一晩にわたりブロッキングした（ＰＢＳ中に２％のＢＳＡおよび１％の正常ヤギ血清）。翌日、スライドを、抗ｍＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共に、１：１００希釈率で、２時間（室温）にわたりインキュベートした。スライドを洗浄し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉａ  ｗｉｔｈ  ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用してマウントした。適切なフィルターセットを活用する倒立顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ７１）により、スライドを視覚化した。
【０３３０】
エバンスブルー色素（ＥＢＤ）による筋線維損傷の査定
組織切片を、免疫蛍光染色を伴わないことを除き、上記の通りに処理した。各切片上の、全てのＥＢＤ陽性線維を、左ＴＡ（ｂｉＡｂのＩＭ）および右ＴＡ（モノクローナル親抗体のＩＭ）の両方について、手作業でカウントした。
【０３３１】
結果
ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスに、比較のために、尾静脈注射（ＩＶ）または腹腔内（ＩＰ）により、３０ｍｇ／ｋｇのｂｉＡｂ（Ｔ１Ｔ２）および対照としての親抗体を投与した。血液試料を、投与の２４、４８、７２、および９６時間後における眼採血により回収し、抗体レベルを、ベータ−ＤＧ（図８Ｆ）またはＬＧ４／５でコーティングされたＥＬＩＳＡにより測定した（図示しない）。ｂｉＡｂは、親ｍＡｂと同様のクリアランス速度を有した。ＩＰ投与は、高濃度を結果としてもたらしたが、ｂｉＡｂの全体的な薬物動態は、ＩＶにより投与されたｂｉＡｂと同様であった。予測される通り、ベータ−ＤＧを、コーティングのために使用したところ、抗ＬＧ４／５親ｍＡｂは、シグナルをもたらさなかった。
【０３３２】
次に、二特異性抗体を、野生型マウスまたはＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスにＩＶ投与した。行動試験は、二特異性抗体を投与されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスが、筋肉機能の尺度である、握力試験およびワイヤーハング試験（図９Ａおよび９Ｂ）において、モノクローナル親抗体で処置されたマウス（図９Ａおよび９Ｂ）より好成績であったことを明らかにした。生理食塩液で処置された対照野生型マウスもまた、図９Ａおよび９Ｂに示す。これらのデータは、二特異性抗体が、筋肉機能を改善したことを裏付ける。二特異性抗体を投与されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスはまた、トレッドミル試験においても、成績を維持したのに対し、対照抗体で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスは、成績の低下を示した（図９Ｃ）。
【０３３３】
レッドミル試験における成績不良にもかかわらず、対照抗体で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスが、ＣＫレベルの上昇を示した。血清ＣＫレベルの顕著な上昇は、筋線維鞘保護を欠くことの結果としての急性筋肉損傷を指し示す。研究の終了時までに、二特異性抗体で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスでは、クレアチンキナーゼレベルが、モノクローナル親抗体で処置されたマウスと比較して、顕著に低下した（図９Ｄ）。二特異性抗体による処置が、ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスにおけるクレアチンキナーゼレベルを低下させたことから、二特異性抗体は、筋肉を、損傷から保護する一助となったことが指し示される。
【０３３４】
二特異性抗体の、身体運動誘導性組織損傷に対する効果を評価するために、エバンスブルー色素による筋線維染色を、身体運動させたマウスに由来する組織に対して実施した。エバンスブルー色素は、親抗体の混合物で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウス組織の、多くの筋肉線維に浸透したことから、色素は、膜損傷を伴う筋肉線維だけに浸透し、これらを染色するので、身体運動誘導性損傷が指し示される。これに対し、エバンスブルー色素は、二特異性抗体で処置されたＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウス組織の、親抗体で処置されたマウスの筋線維より顕著に少数の筋線維に浸透した（図１０）。これは、二特異性抗体の全身送達は、筋肉を、身体運動誘導性損傷から保護したが、親モノクローナル抗体は、保護しなかったことを指し示す。
【０３３５】
標的臓器内で、二特異性抗体を検出するために、最終回の二特異性抗体の筋内注射の４日後に、動物を安楽死させ、免疫蛍光染色を実施した。染色は、４日後であってもなお、ＩＶ投与または腹腔内投与された二特異性抗体であるＴ１Ｔ２（ＡＳ１９×Ｃ３）は、四頭筋内、ＴＡ内、横隔膜内、および心臓内の筋組織に特異的に結合したが、陰性対照として使用された脳組織は染色しなかったこと（図１１、第１行および第２行）を明らかにした。親モノクローナル抗体であるＡＳ１９は、潜在的には、抗体のオフ速度が速い（表Ｋを参照されたい）ために、筋組織を、それほど良好には染色しなかった（図１１、第３行）。しかし、親モノクローナル抗体であるＣ３は、図４Ｂと符合する通り、筋組織を良好に染色した（図１１、第４行）。
【０３３６】
抗原であるベータ−ＤＧに結合したＡＳ３０  Ｆａｂ全体構造を決定し、抗原を、重鎖と軽鎖との間に示した（図１２Ａ）。図１２Ｂは、ＣＤＲ領域および抗原についての詳密図を示す。ＡＳ３０  Ｆａｂと、ヒトβＤＧとを、１：１のモル比で混合し、氷上で、３０分間にわたりインキュベートしてから、４℃で、ＳＥＣ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にかけた。ＡＳ３０：βＤＧ複合体を結晶化させ、その構造を、分子置換法により決定し、２．５５Åに精緻化した。ＡＳ３０  Ｆａｂと、βＤＧの配列であるＤ７３８ＲＤＰＥＫＳＳＥＤＤ７４８（配列番号３０２）とは、電子密度マップ内で、可視的であった。結晶構造は、ＡＳ３０抗体が、βＤＧ内の直鎖状ペプチドであるＤ７３８ＲＤＰＥＫＳＳＥＤＤ７４８（配列番号３０２）を認識することを示す。
【０３３７】
加えて、抗原であるヒトラミニン２  ＬＧ−５ドメインに結合したＣ２１  Ｆａｂ全体構造を決定し、抗原を、重鎖と軽鎖との間に示した（図１２Ａおよび１２Ｃ）。図１２Ｄは、ＣＤＲ領域および抗原についての詳密図を示す。Ｃ２１：ＬＧ５複合体の構造は、ＡＳ３０：βＤＧと同様に得、２．７０Åに精緻化した。Ｃ２１ＦａｂおよびヒトＬＧ５は、いずれも、可視的な電子密度であり、Ｃ２１は、ＬＧ５上のコンフォメーションエピトープを認識する。
【実施例６】
【０３３８】
ベータ−ＤＧおよびラミニン２を認識する、三価の多特異性抗体の作出
方法
抗体のヒト化
リードハイブリドーマ抗体のヒト化を、ＣＤＲグラフト法および３Ｄモデル化法の両方を使用して実施した。抗体をヒト化するための方法については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２（１９８６）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４（１９８８）；Ｓｉｍｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５１：２２９６（１９９３）；ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ、１９６：９０１（１９８７）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１５１：２６２３（１９９３）；米国特許第５，５８９，２０５号；同第５，５６５，３３２号；同第６，１８０，３７０号；同第６，６３２，９２７号；同第７，２４１，８７７号；同第７，２４４，６１５号；同第７，２４４，８３２号；同第７，２６２，０５０号；および米国特許公開第２００４／０２３６０７８号（２００４年４月３０日出願）において記載されている。
【０３３９】
抗体の発現および精製
ノブイントゥーホール変異体、ＮＮＡＳ変異体、ＹＴＥ変異体、およびＲＦ変異体を含有する重鎖定常領域と、軽鎖定常領域とを伴う哺乳動物発現ベクターを創出することにより、ａＤＧ三価抗体を構築した。所望のリンカーを伴うＤＮＡ可変ドメインを合成し、所望の重鎖ベクターまたは軽鎖ベクター内に挿入した。各ｔｒｉＡｂの立体配置を、表Ｍに示す（図１３中の略図に従う抗原結合性部位の番号付け、すなわち、ＶＨ１／ＶＬ１およびＶＨ２／ＶＬ２は、ＣＯＤＶアームを形成し、ＶＨ３／ＶＬ３は、Ｆａｂアームを形成する）。ｔｒｉａｂのポリペプチド鎖のアミノ酸配列を表Ｉ２に提示する。
【０３４０】
【表３７】
2020510416.tif 000039
【０３４１】
Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１４６３５）を伴う、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞内の、４つのプラスミドの、一過性の共トランスフェクションにより、三価抗体を作製した。抗体を、ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１１００３４９４）により精製するのに続き、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７１１５２０１）によるカチオン交換を行った。次いで、全てのタンパク質を濃度、純度、および凝集について評価した。
【０３４２】
抗体の、ヒト抗原への二重結合
二重結合サンドイッチＥＬＩＳＡを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｎｕｎｃ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ＳＡ  ９６ウェルプレートを、２ｕｇ／ｍＬのビオチニル化Ｎ’Ａｖｉ−ＨＰＣ４−ヒトＬＧ４／５、またはビオチニル化ヒト−ベータＤＧ−ＨＰＣ４−Ａｖｉ−Ｃ’でコーティングすることにより実施した。４℃で一晩にわたるインキュベーションの後、プレートを、ＰＢＳ＋１％のＢＳＡ＋０．１％のＴｗｅｅｎと共に、室温で、１時間にわたりブロッキングした。ＰＢＳによる洗浄（ＢｉｏＴｅｋＥＬｘ４０５  Ｓｅｌｅｃｔ  ＣＷ）の後、三価抗体または親抗体を、８ｕｇ／ｍＬで始めて、プレートに添加し、２倍希釈を、プレートにわたり実施し、抗体を、室温で、１時間にわたりインキュベートした。洗浄の後、ベータ−ＤＧ−ｍＦｃ（図１Ａ）またはＬＧ４／５−ｍＦｃによる第２の抗原を、５ｕｇ／ｍＬで添加した。第２の抗原に続き、希釈率を１：２，０００とするロバ抗マウス二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、３０分間にわたり添加した。ＡＢＴＳを、ＡＢＴＳ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）中に再懸濁させ、検出のためにウェルに添加した。結果として得られるシグナルを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒにより、４０５ｎｍで読み取った。
【０３４３】
抗原の、三価抗体への逐次的二重結合のために、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、２９１７９３１５）を、Ｔ１００  Ｂｉａｃｏｒｅと共に使用した。このチップを、使用して、三価抗体または親抗体を、表面に固定化した（５ｕｇ／ｍＬの抗体により、６０秒間にわたり）。捕捉の後、２００ｎＭのＬＧ４／５を、チップ上に、６０秒間にわたり流過させるのに続き、２００ｎＭのベータ−ＤＧを、６０秒間にわたり流過させた。三価抗体への結合は、チップ上で検出される、相対単位（ＲＵ）による質量の変化により観察した。
【０３４４】
結合反応速度アッセイ
抗体（１０ｕｇ／ｍＬ）を、Ｓｅｎｓｏｒ  Ｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇチップに固定化し、次いで、抗原の系列希釈液を、チップ（ＬＧ４／５：８０ｎＭ〜１．２５ｎＭ、ＢＤＧ：５ｎＭ〜０．３１ｎＭ、および４ｎＭ〜０．２５ｎＭ）上で流過させることにより、三価抗体による表面プラズモン共鳴（「ＳＰＲ」；Ｔ１００  Ｂｉａｃｏｒｅ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）反応速度アッセイデータを実施した。データは、ＢＩＡ査定ソフトウェアを使用する、１：１結合モデルにより査定した。
【０３４５】
結果
三価抗体（ｔｒｉＡｂ）は、図１３に示されるフォーマットに従い作出した。これらのｔｒｉＡｂは、２つの顕著に異なる抗ラミニン２抗原結合性ドメイン（図１３におけるＶＨ−１／ＶＬ−１およびＶＨ−２／ＶＬ−２）を伴うＣＯＤＶアームと、抗ベータ−ＤＧ抗原結合性ドメインを伴うＦａｂアーム（図１３におけるＶＨ−３／ＶＬ−３）とを有した。
【０３４６】
ｔｒｉＡｂの、両方の抗原への結合を示すために、上記で記載した通りに、２ｕｇ／ｍＬのビオチニル化Ｎ’Ａｖｉ−ＨＰＣ４−ヒトＬＧ４／５（図１４Ａ）またはビオチニル化ヒト−ベータＤＧ−ＨＰＣ４−Ａｖｉ−Ｃ’（図１４Ｂ）を使用して、二重結合サンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。いずれの配向性においても、全ての被験ｔｒｉＡｂは、同時的な二重結合を示した。
【０３４７】
加えて、表面プラズモン共鳴を実施して、ヒトラミニン２およびベータ−ＤＧ抗原の逐次的結合を示した（図１Ｃ）。ｔｒｉＡｂは、両方の抗原への結合を示したが、モノクローナル抗体（ラミニン２への結合のための、ヒト化Ｃ３変異体およびＣ２１変異体、およびベータ−ＤＧへの結合のための、ヒト化ＡＳ３０変異体）は、それらのそれぞれの抗原だけに結合した。
【０３４８】
上記で記載した通りに、ＳＰＲを使用して、ｔｒｉＡｂの、ラミニン２（表Ｎ）またはベータ−ＤＧ（表Ｏ）への結合反応速度を解析した。
【０３４９】
【表３８】
2020510416.tif 000040
【０３５０】
【表３９】
2020510416.tif 000041
【０３５１】
表Ｎに示される通り、５つのｔｒｉＡｂは、ヒトベータ−ＤＧに、一価抗体フォーマットにおいて使用される、ヒト化ＡＳ３０抗原結合性ドメインのアフィニティー（０．８ｎＭ）と同等な、ナノモル単位のアフィニティー（１．３〜２．１ｎＭの間のＫＤ）で結合することが可能であった。同様に、表Ｏは、ヒトラミニン２に、一価抗体フォーマットにおいて使用される、ヒト化Ｃ３およびＣ２１の抗原結合性ドメインのアフィニティー（それぞれ、９．８ｎＭおよび９．０ｎＭ）と同等な、ナノモル単位のアフィニティー（１０．２〜１４．９ｎＭの間のＫＤ）で結合することが可能であることを示す。
【０３５２】
これらのデータは、図１３に例示される、三価フォーマットの、二特異性抗ラミニン２／ベータ−ＤＧ抗体が、それらの標的への、従来の一価抗体フォーマットと比較した、同様の結合アフィニティーによる、同時的な二重結合が可能であることを裏付ける。
【実施例７】
【０３５３】
ベータ−ＤＧおよびラミニン２を認識する、三価の多特異性抗体よる処置後の行動試験における、ＬＡＲＧＥｍｙｄ−３Ｊ／ＧｒｓｒＪマウスの筋肉機能の改善
方法
抗体の投与
実施例４で記載されたＬＡＲＧＥ／ｍｙｄ−３ｊマウス（８〜１６週齢）を、それらの後肢開脚スコア、ワイヤーハングスコア、握力、およびトレッドミルに基づいて、５つの群に無作為化して、これらのスコアが、処置前に、群（ｎ＝１１）間で同様であることを確認した。次いで、マウスに、尾静脈注射（月曜日および木曜日）を介して、３０ｍｇ／ｋｇずつ、毎週２回、最大で３．５週間にわたり、７回の投与により、ＴｒｉＡｂ（３４０７、３４３７、および３４３９）、および非類縁タンパク質標的を認識する対照ＴｒｉＡｂのほか、対照としての生理食塩液群を投与した。加えて、野生型マウス群（ｎ＝６）を、行動試験のための基準として組み入れた。アナフィラキシー反応を防止するため、５ｍｇ／ｋｇのジフェンヒドラミンを、抗体投与の１０分前に、ＩＰに前投与した。握力およびワイヤーハングを、２週目から始めて、毎週調べた。野生型は、多様な行動試験のための基準として、生理食塩液で処置した。
【０３５４】
行動試験
後肢開脚試験のために、マウスを、それらの尾で持ち上げ、後肢の、胴体と比べた位置を記録し、評定した。
【０３５５】
ワイヤーハング試験は、マウスを、ワイヤーグリッド上に置き、１分間にわたり馴致させることにより行い；次いで、マウスがつかむワイヤーグリッドを、規定の速度で、ゆっくりと、２秒間にわたり、上下に反転させ、最大のカットオフ時間を６０秒間として、動物がワイヤースクリーンから、クッションパッドに落下するまでの時間（待ち時間）を記録した。試験を、各マウスについて、３回ずつ繰り返し、結果を平均した。
【０３５６】
マウスを、握力計（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上に置き、マウスに、金属グリッドを固くつかませ、マウスが手放すまで、尾を水平に引き；次いで、力を記録して、握力を評価した。間に１分間の休みを入れて、試験を、５回にわたり繰り返した。各マウスについて、最高および最低の読取りを除外し、残る３回の読取りの平均を結果とした。
【０３５７】
トレッドミル走行時間のために、マウスを、電気ショックグリッドを装備したトレッドミルの個別のレーンに置いた（Ｍｏｄｅｌ  １０５５ＳＲＭ  Ｅｘｅｒ−３／６、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。動物を、５分間にわたり、トレッドミルに馴致させ、次いで、速度を増大させる、規定のプロトコールにより、マウスを調べた。マウスが、ショックグリッド上で、走ることが不可能な状態で、３秒間以上を費やした場合は、ショックグリッドをオフにして、のべ走行時間を記録した。
【０３５８】
全ての行動試験は、マウスの識別および処置に対して盲検化して実施し、結果は、試験の後で非盲検化した。
【０３５９】
結果
実施例６で作出したｔｒｉＡｂを、ＬＡＲＧＥ／ｍｙｄ−３ｊマウスにおける筋肉機能に対する、それらの効果について調べた。
【０３６０】
Ｌａｒｇｅ／ｍｙｄ−３ｊマウスは、既に記載されたｂｉＡｂ処置に関して観察された通り、ＴｒｉＡｂ  ３４０７、ＴｒｉＡｂ  ３４３７、またはＴｒｉＡｂ  ３４３９による、２週間にわたる処置の後で、握力（図１５）およびワイヤーハング（図１６）において、成績の顕著な改善を示した（実施例５を参照されたい）。トレッドミルの成績は、ＴｒｉＡｂ処置により、維持されるか、またはわずかに改善された（図１７）が、わずかな低下を裏付けた対照と比較して、統計学的有意性を伴わなかった。トレッドミル走行時間における、統計学的に有意な改善は、より長期間にわたる処置を要求することが典型的である。
【０３６１】
まとめると、複数の機能的アッセイの結果は、三価の、二特異性抗ラミニン２／ベータ−ＤＧ抗体による処置が、アルファ−ジストログリカノパチーについてのマウスモデルにおいて、改善された筋肉機能をもたらすことを裏付けた。
【０３６２】
本開示は、多様な実施形態を含むが、当業者は、変動および改変に想到することが理解される。したがって、付属の特許請求の範囲は、本開示の範囲内に収まる、全てのこのような同等な変動を対象とすることが意図される。加えて、本明細書で使用される節の見出しは、構成だけを目的とするものであり、記載される対象物を限定するものとはみなさないものとする。
【０３６３】
逆のことが明確に指し示されない限りにおいて、本明細書の各実施形態を、他の任意の、１つまたはそれ以上の実施形態と組み合わせることができる。特に、逆のことが明確に指し示されない限りにおいて、好ましいか、または有利であると指し示された、任意の特色または実施形態を、好ましいか、または有利であると指し示された、他の任意の、１つまたはそれ以上の特色または実施形態と組み合わせることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図３Ｋ】
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【図３Ｌ】
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【図３Ｍ】
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【図３Ｎ】
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【図３Ｏ】
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【図３Ｐ】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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