(57)【要約】  個別患者における炎症性病態の治療に使用される、たとえば、ＲｖＴ１（７，１３，２０−トリヒドロキシ−８，１０，１４，１６Ｚ，１８−ドコサペンタエン酸）、ＲｖＴ２（７，１２，１３−トリヒドロキシ−８，１０，１４，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエン酸）、ＲｖＴ３（７，８，１３−トリヒドロキシ−９，１１，１４，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエン酸）、およびＲｖＴ４（７，１３−ジヒドロキシ−８，１０，１４，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエン酸）から選択されるスタチンの有効性を評価するための、方法、デバイス、コンピュータープログラム、および関連イムノアッセイが開示されている。  これらは、スタチンの投与前および投与後に患者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルを測定することを含み、スタチン投与後のレゾルビンのレベルの増加がスタチンの有効性の指標となる。  また、サンプル中の脂質メディエーターが保存されるように生物学的サンプルを貯蔵する方法が開示されている。  この方法は、サンプルを有機溶媒中に配置することと、≦−７５℃の温度でサンプルを貯蔵することと、を含む。図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
個別の患者において炎症性病態の治療において使用されるスタチンの有効性を評価する方法であって、前記スタチンの投与前および投与後に前記患者から得られた生物学的サンプル中の、少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルを測定することを含み、前記スタチンの投与後の前記レゾルビンの前記レベルの増加が前記スタチンの有効性の指標となる、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンが、
ＲｖＴ１（７，１３，２０−トリヒドロキシ−８，１０，１４，１６Ｚ，１８−ドコサペンタエン酸）、
ＲｖＴ２（７，１２，１３−トリヒドロキシ−８，１０，１４，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエン酸）、
ＲｖＴ３（７，８，１３−トリヒドロキシ−９，１１，１４，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエン酸）、および
ＲｖＴ４（７，１３−ジヒドロキシ−８，１０，１４，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエン酸）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記生物学的サンプル中の２つ以上の前記１３シリーズレゾルビンの前記レベルが測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的サンプル中の３つまたは４つすべての前記１３シリーズレゾルビンの前記レベルが測定される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが血液、血清、または血漿のサンプルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプル中の前記少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンの前記レベルが、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて測定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
１つ以上の内部標識標準が前記サンプルに添加され、且つ定量が前記１つ以上の標識標準を用いて構築された線形回帰曲線を用いて行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記サンプル中の前記少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンの前記レベルが、イムノアッセイを用いて測定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記イムノアッセイが酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記イムノアッセイが競合的または非競合的である、請求項８または請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記スタチンが、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチンから選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２のサンプルが、前記スタチンの投与の少なくとも３０分間後、好ましくは、少なくとも１時間後、より好ましくは、少なくとも２時間後に採取しうる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記炎症性病態が心血管疾患（ＣＶＤ）または関節リウマチである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
生物学的サンプル中の１３シリーズレゾルビンのレベルを測定するためのイムノアッセイであって、
前記イムノアッセイが、前記サンプル中の前記１３シリーズレゾルビンをキャプチャーするために表面上にコーティングされた、および／または
前記サンプル中の前記１３シリーズレゾルビンへの結合により検出可能に変化する標識でタグ付けされた、
前記１３シリーズレゾルビンに対する抗体；あるいは
前記サンプルとの混合後に、前記１３シリーズレゾルビンに対する抗体をキャプチャーするために表面上に固定された、前記サンプル中の定量されるものと同一のある量の１３シリーズレゾルビンを含む、方法。 
【請求項１５】
競合アッセイであり、
検出可能標識でタグ付けされた前記サンプル中の定量されるものと同一の、既知量の前記１３シリーズレゾルビンをさらに含み、
前記標識された１３シリーズレゾルビンが、前記１３シリーズレゾルビンに対する抗体により表面に親和性結合される、請求項１４に記載のイムノアッセイ。
【請求項１６】
前記イムノアッセイが、前記サンプル中の定量される前記１３シリーズレゾルビンと同一の表面結合１３シリーズレゾルビンと、前記１３シリーズレゾルビンに対する溶液中の過剰の既知量の抗体とを含む、請求項１４に記載のイムノアッセイ。
【請求項１７】
前記イムノアッセイが、
前記１３シリーズレゾルビンに対する表面結合抗体に結合された前記１３シリーズレゾルビンの量または表面上に固定された前記１３シリーズレゾルビンに結合された一次抗体の量を定量するために、前記１３シリーズレゾルビンまたは前記１３シリーズレゾルビンに対する前記一次抗体に対する標識二次抗体を含む、請求項１４に記載のイムノアッセイ。
【請求項１８】
サンプル採取デバイスと請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のイムノアッセイとを含む、サンプル中の特異的１３シリーズレゾルビンの前記レベルを測定する装置。
【請求項１９】
前記イムノアッセイにおいて標識された１３シリーズレゾルビンまたは前記１３シリーズレゾルビンに対する標識抗体を検出する検出器ををさらに含む、請求項１８に記載の装置。
【請求項２０】
患者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルを測定するためのデバイスであって、前記デバイスが、入口ポートと反応ゾーンとを有する内部チャネルを規定する１つ以上の部分を含み、
サンプル中の前記１３シリーズレゾルビンの量を、直接的または間接的に定量するために、
前記サンプル中の１３シリーズレゾルビンと、前記１３シリーズレゾルビンをキャプチャーするために、前記１３シリーズレゾルビンに対する固定化一次抗体とを反応させるか、または前記反応ゾーンの上流で前記サンプルと混合された後の前記１３シリーズレゾルビンに対する溶液中の過剰の一次抗体と、前記反応ゾーン内の表面上に固定されている、前記サンプル中の測定されるものと同一の前記１３シリーズレゾルビンと、を反応させる、デバイス。
【請求項２１】
前記デバイスが、前記サンプル中の複数の異なる１３シリーズレゾルビンのレベルを並行して測定するために、各々それ自体の入口ポートを備えた複数のチャネルを含む、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２２】
個別の患者において炎症性病態の治療に使用される、スタチンの有効性を評価するコンピューター実装方法であって、前記方法が、前記スタチンの投与前および投与後に前記患者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルを表すサンプルデータをコンピューターで受け取ることと、
前記サンプル中の前記少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルを比較（前記スタチンの投与後の前記少なくとも１つのレゾルビンのレベルの増加が、前記スタチンの有効性の指標となる）し、、そして、前記比較に基づいて、前記スタチンの有効性を表す有効性データを出力するために、ソフトウェアを前記コンピューターで実行することと、を含む、方法。
【請求項２３】
コンピューターによる実行時に、請求項２２に記載の方法を前記コンピューターに行わせる命令を含むコンピュータープログラム。
【請求項２４】
個別の患者において、炎症性病態の治療に使用されるスタチンの有効性を評価するコンピューター装置であって、前記装置が、コンピューターが組み込まれた第１のデバイスと、第２のコンピューターと、それらの間でデータを送信する前記第１のデバイスと前記第２のコンピューターとの間の通信チャネルと、を含み、前記第１のデバイスが、前記スタチンの投与前および投与後に前記患者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルを表すサンプルデータを受け取って、前記通信チャネルを介して前記サンプルデータを前記第２のコンピューターに送信するように配置され、且つ前記第２のコンピューターが、前記サンプル中の前記少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルを比較して、前記個別の患者に対する前記スタチンの有効性を決定し、前記スタチンの投与後の前記少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルの増加が有効性の指標となり、前記スタチンの有効性を表す有効性データを出力するソフトウェアを実行するように配置される、コンピューター装置。
【請求項２５】
前記第２のコンピューターが、前記通信チャネルを介して、前記有効性データを前記第１のデバイスにまたは第３のコンピューターに送信するように配置される、請求項２４に記載のコンピューター装置。
【請求項２６】
前記第１のデバイスが、生物学的サンプル中の少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルを測定するために、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載のイムノアッセイと、請求項１８若しくは１９に記載の装置または請求項２０若しくは２１に記載のデバイスと、を含む、請求項１５に記載のコンピューター装置。
【請求項２７】
サンプル中の脂質メディエーターが保存されるように、生物学的サンプルを貯蔵する方法であって、前記サンプルを有機溶媒中に配置すること、および前記サンプルを、≦−７５℃またはー８０℃の温度で貯蔵することとを含む、方法。
【請求項２８】
前記有機溶媒が、Ｃ１〜３有機アルコール、たとえばＣ１〜３アルカノールなど、たとえばメタノールまたは２つ以上のかかる溶媒の混合物を含むかまたは本質的にそれらからなる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
凍結前に前記サンプルに標識標準を添加することをさらに含む、請求項２７または請求項２８に記載の貯蔵方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個別患者における炎症性疾患、たとえば、心血管疾患や関節リウマチなどの治療に対するスタチンの有効性を決定する方法に関する。
本発明はまた、本発明の方法を実施するコンピューターソフトウェア、装置、イムノアッセイ、およびデバイスを提供する。
【背景技術】
【０００２】
急性炎症は、宿主を保護するとともに、内因性組織傷害または侵入微生物に反応して増加する。
消散機序（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ）に関与できないことが、関節リウマチ、歯周病、喘息、糖尿病、および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、さらには神経障害たとえばアルツハイマー病をはじめとする多くの慢性疾患に伴う持続性軽度炎症の根底にありうると、現在認識されている。
【０００３】
自己限定炎症の消散は、局所ケミカルメディエーターおよびそのレセプターによりレギュレートされる活性プロセスであることが現在分かっている。
レゾルビン、プロテクチン、およびマレシンと称される特殊消散促進性メディエーター（ｓｐｅｃｉａｌｉｓｅｄ  ｐｒｏ−ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ）（ＳＰＭ）のファミリーが発見されており、各々、自己限定炎症性白血球リッチ滲出物（ｓｅｌｆ−ｌｉｍｉｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ｒｉｃｈ  ｅｘｕｄａｔｅｓ）中に産生される。
それらの生合成メタボローム（ｍｅｔａｂｏｌｏｍｅｓ）は、急性炎症の消散期（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｈａｓｅ）に一時的にレギュレートされる。
【０００４】
ＳＰＭおよびそのそれぞれのメタボロームは、強力な白血球指向作用（ｐｏｔｅｎｔ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ａｃｔｉｏｎｓ）を発揮して、消散の主要な徴候を刺激する。
すなわち、部位へのさらなる多形核白血球（ＰＭＮ）動員を制限して（停止シグナルとして中止）、デブリ、細菌、およびアポトーシス細胞のマクロファージ取込みを増強する。
そのほか、各個別ＳＰＭは、プログラムされた消散内でさらなる特徴的性質を引き起しうる。
たとえば、レゾルビンＲｖＥ１は、歯周炎患者のヒトマクロファージの食細胞活性不全（ｆａｉｌｅｄ  ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）をレスキューし、Ｄシリーズレゾルビン（すなわち、ＲｖＤ１、ＲｖＤ２、およびＲｖＤ５）は、宿主による細菌封込め（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ）を増強することにより、細菌の死滅およびクリアランスに必要とされる抗生物質の用量を低減する。
一方、マレシン（ＭａＲ）経路のマレシン１（ＭａＲ１）は、消散さらには組織再生を刺激し、そして、プロテクチンは、マウスにおいてウイルス複製を直接阻害することによりインフルエンザ感染症を改善する。
【０００５】
こうした消散期ＳＰＭおよびそのメタボロームには、レゾルビン、プロテクチン、およびマレシン、さらにはリポキシンが含まれる。これらのメディエーターは、古典的炎症促進性イニシエーターのプロスタグランジン（ＰＧ）およびロイコトリエン（ＬＴ）の作用をカウンターレギュレートする。
【０００６】
これらの脂質メディエーターの構造は、被嚢動物、マウス、およびヒヒ、さらにはヒトを含めて、進化全体を通して保存されることが判明しているので、実験系でなされた知見をヒトに直接翻訳すること、およびその逆は容易である。
【０００７】
Ｄａｌｌｉ  Ｊ，Ｃｈｉａｎｇ  Ｎ  ａｎｄ  Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ．Ｅｌｕｃｉｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  １３−ｓｅｒｉｅｓ  ｒｅｓｏｌｖｉｎｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｎ−３  ｄｏｃｏｓａｐｅｎｔａｅｎｏｉｃ  ａｃｉｄ（ｎ−３  ＤＰＡ）  ｔｈａｔ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ  ａｎｄ  ｃｌｅａｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５；２１：１０７１−１０７５および国際公開第２０１７／０１５２７１Ａ１号パンフレットには、好中球−内皮共培養物中に産生されるとともに、無菌性の炎症または感染症の後にヒトおよびマウスの組織に存在する、１３シリーズレゾルビン（ＲｖＴ）と称される４つの新たな宿主保護分子の構造が開示されている。
好中球−内皮細胞相互作用時におけるそれらの生合成は、内皮シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）により開始され、ＣＯＸ−２のＳ−ニトロシル化を介して、アトルバスタチンにより増加され、且つＣＯＸ−２阻害剤により低減された。
アトルバスタチンおよびＲｖＴの作用は、マウスのＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）感染症において相加的であり、それらは、炎症の消散を加速して生存率を＞６０％増加させた。
これらの分子は、感染性炎症の消散において主要な先天性保護反応をレギュレートする。
【０００８】
関節リウマチは、徐々に関節破壊をもたらして最終的に消耗させうる衰えない炎症反応により特徴付けられる。
この持続性炎症反応は、関節炎患者において心血管疾患（ＣＶＤ）の発症リスクが増加する根本的原因であるとも考えられる。
これとの関連では、スタチンはＣＶＤから保護し、最近の研究によれば、関節リウマチ患者において疾患活動性を低減することが示唆される。
【０００９】
スタチンは、脂質低下剤の１つのクラスであり、そして、本明細書の執筆時点では、西洋諸国において最も広く使用されている薬剤である。スタチン薬剤を使用している４５歳以上の成人のパーセントは、１９８８年から１９９４年までに２．４％、２００５年から２００８年までに２５．１％増加した。
【００１０】
スタチンは、高リスク者において、ＣＶＤおよび死亡率を低減することが判明している。
【００１１】
国際公開第０２／２４１９４Ａ２号パンフレットには、かかる治療を必要とする哺乳動物において、ＭＨＣクラスＩＩ媒介イムノモジュレーションを達成する方法が開示されている。
この方法は、哺乳動物においてＭＨＣクラスＩＩ発現をモジュレートするのに有効な量で、少なくとも１つのスタチンまたは機能的若しくは構造的に等価な分子を哺乳動物に投与することを含む。
哺乳動物は、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、クローン病、または紅斑性狼瘡から選択される自己免疫疾患に罹患していてもよい。
【００１２】
スタチンは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤であるが、スタチンのこうした多面発現作用は、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ活性の阻害にユニークに割り当てることができないことは明らかである。
【００１３】
スタチンにより低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）が効果的に低減されるにもかかわらず、スタチン治療患者には依然として多くの残存リスクがある。
たとえば、ランダム化プラセボ対照試験では、平均２７％の相対リスク低減は３．４％の絶対リスク低減に等しい。
スタチン療法後の大きな残存リスクに対する可能な説明の１つは、ヒト集団内のスタチン反応性の不均一性でありうる。患者は、
（１）リポタンパク質代謝、主にＬＤＬ−Ｃ低減に及ぼすスタチンの効果、
（２）リポタンパク質反応に依存しないこともありうる、臨床イベント効果に関するスタチン療法に対する反応、および
（３）スタチンの使用に起因する有害作用、
の３つの点で異なりうる。
血中脂質レベルは、脂質およびコレステロールの経路において、分子の機能および活性を変化させる遺伝子変異体によりモジュレートされることが予想される。
スタチンの薬動学に影響を及ぼす、こうした遺伝子変異体などは、スタチンの反応性にも影響を及ぼしうる（Ｓｕｐｅｒｋｏ  ＨＲ，Ｍｏｍａｒｙ  ＫＭ，Ｌｉ  Ｙら．Ｓｔａｔｉｎｓ  Ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ．Ｍｅｄ．Ｃｌｉｎｉｃｓ  ｏｆ  Ｎ．Ａｍ．２０１２；９６（１）：１２３−１３９）。
【００１４】
スタチンが関与しうる潜在的機序を調べた試験では、アトルバスタチンおよびロバスタチンは、それぞれ、心血管保護および粘膜保護においてそれらの保護作用を媒介する消散促進性メディエーター１５−ｅｐｉ−ＬＸＡ４の形成をアップレギュレートすることが判明した（Ｂｉｒｎｂａｕｍ  Ｙ，Ｙｅ  Ｙ，Ｌｉｎ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  １５−ｅｐｉｌｉｐｏｘｉｎ−ａ４  ｂｙ  ｐｉｏｇｌｉｔａｚｏｎｅ  ａｎｄ  ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．２００６；１１４（９）：９２９−９３５．Ｐｌａｎａｇｕｍａ  Ａ，Ｐｆｅｆｆｅｒ  ＭＡ，Ｒｕｂｉｎ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｌｏｖａｓｔａｔｉｎ  ｄｅｃｒｅａｓｅｓ  ａｃｕｔｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｖｉａ  １５−ｅｐｉ−ｌｉｐｏｘｉｎ  Ａ４．Ｍｕｃｏｓａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；３（３）：２７０−２７９）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
個別の患者にある程度のスタチン個別化治療を提供するために、ＣＶＤ、関節リウマチ、または他の炎症性病態を有するさまざまな患者の治療に、どのスタチンがより有効でありうるかを確認する必要性が存在する。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、所与のスタチンが個別の患者において、炎症性病態の治療に使用するのに有効でありうるかを評価する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
したがって、本発明の第１の態様によれば、個別の患者において、炎症性病態の治療に使用されるスタチンの有効性を評価する方法が提供される。
本方法は、スタチンの投与前および投与後に、患者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルを測定することを含み、スタチン投与後のレゾルビンのレベルの増加がスタチンの有効性の指標となる。
【００１８】
以下の実施例に記載されるように、２つの臨床関連スタチンのアトルバスタチンまたはプラバスタチンを炎症性関節炎（ＩＡ）のマウスに投与すると、全身および組織の１３シリーズレゾルビン量がアップレギュレートされて、関節疾患が有意に低減されることを、本発明者らは発見した。
一方、シンバスタチンを投与しても、有意なＲｖＴのアップレギュレーションおよび関節炎症の低減はなかった。
また、アトルバスタチンおよびプラバスタチンは各々、血小板−単球凝集体を含めた、全身性白血球活性化の低減（約２５〜６０％）を起こすことも判明した。
これらのスタチンは、関節への好中球の輸送、さらには関節の単球マクロファージ数を減少させた。
アトルバスタチンおよびプラバスタチンは、関節において、単球および単球由来マクロファージの両方で、ＣＤ１１ｂおよび主要組織適合性複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）の発現において、著しい低減（〜３０〜５０％）を起こした。
ＲｖＴ経路の開始酵素である、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）−２の阻害剤を投与したところ、関節炎症および全身性炎症の両方に対するこれらのスタチンの保護作用が逆転した。
【００１９】
全体として、１３シリーズレゾルビンは、スタチンの抗炎症作用の測定に有用でありうることが、これらの知見から示唆される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの、１３シリーズレゾルビンは、
ＲｖＴ１（７，１３，２０−トリヒドロキシ−８，１０，１４，１６Ｚ，１８−ドコサペンタエン酸）、
ＲｖＴ２（７，１２，１３−トリヒドロキシ−８，１０，１４，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエン酸）、
ＲｖＴ３（７，８，１３−トリヒドロキシ−９，１１，１４，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエン酸）、および
ＲｖＴ４（７，１３−ジヒドロキシ−８，１０，１４，１６Ｚ，１９Ｚ−ドコサペンタエン酸）から選択しうる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、生物学的サンプル中の２つ以上の、１３シリーズレゾルビンのレベルを測定しうる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、生物学的サンプル中の３つまたは４つすべての、１３シリーズレゾルビンのレベルを測定しうる。
【００２３】
Ｃ１３位にヒドロキシル基があることから「１３シリーズ」と呼ばれるｎ−３ＤＰＡ由来の１３シリーズレゾルビンの構造は、以下の通りである。
【化１】
2020517955.tif 000003
【００２４】
便宜上、サンプルは、血液、血清、または血漿のサンプルでありうる。
【００２５】
好適には、サンプルは、凝固を予防するために、たとえば、ヘパリンなどの抗凝固剤を用いて採取した直後に処理しうる。
【００２６】
分析前に、サンプル（たとえば、ヒト血清サンプル）を貯蔵する必要がある場合、有機溶媒中に配置して、−７５℃以下（たとえば−８０℃）の温度で貯蔵しうる。
好適には、有機溶媒は、メタノールを含みうるかまたはそれからなりうる。
脂質メディエーターは、凍結サンプルで長期貯蔵したとき不安定であり、いくつかのメディエーターのレベルは、３ヶ月間の貯蔵後に有意に（＞５０％）低減することが判明しているが、驚くべきことに、メタノールおよび任意選択的に他の有機溶媒を用いることにより、−７５℃以下の温度で長期貯蔵したとき、これらの分子の安定性を改善しうることを見いだした。
好適には、サンプルは約−８０℃以下の温度で貯蔵しうる。サンプルは少なくとも約１ヶ月間、いくつかの実施形態では少なくとも約３ヵ月間から約９ヶ月間以上まで貯蔵しうる。
【００２７】
以下に記載されるようなジュウテリウム標識標準を、凍結前のサンプルに添加しうる。
【００２８】
血液や組織などの生物学的サンプル中の、１３シリーズレゾルビンのレベルを測定する方法は、当業者であれば利用可能であるので、本明細書に詳細に記載する必要はない。
【００２９】
好適な方法は、たとえば、Ｙａｎｇ  Ｒ，Ｃｈｉａｎｇ  Ｎ，Ｏｈ  ＳＦ  ａｎｄ  Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ．２０１１．“Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ−Ｌｉｐｉｄｏｍｉｃｓ  ｏｆ  Ｅｉｃｏｓａｎｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｏｃｏｓａｎｏｉｄｓ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ”．Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９５：１４．２６：１４．２６．１−１４．２６．２６、およびＤａｌｌｉ  Ｊ  ａｎｄ  Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ．２０１２．“Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅｓ：ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｅｆｆｅｒｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏ−ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ”．Ｂｌｏｏｄ．２０１２；１２０：ｅ６０−ｅ７２（両方ともその内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００３０】
簡潔に述べると、いくつかの実施形態では、サンプル中の少なくとも１つの、１３シリーズレゾルビンのレベルは、サンプルからＳＰＭを抽出した後に、液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を用いて測定しうる。
【００３１】
ＳＰＭは、固相抽出を用いて、たとえばＣ１８カラムを用いてサンプルから抽出しうる。好適な方法は、Ｃｏｌａｓ  ＲＡ，Ｓｈｉｎｏｈａｒａ  Ｍ，  Ｄａｌｌｉ  Ｊ，Ｃｈｉａｎｇ  Ｎ  ａｎｄ  Ｓｅｒｈａｎ  ＣＮ．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏ−ｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｄｉａｔｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ”．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１４；３０７：Ｃ３９−５４（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００３２】
サンプル中の、１３シリーズレゾルビンの定量を促進するために、ＳＰＭ抽出前のサンプルに１つ以上の内部標識標準を添加しうる。
好適な標識標準は、
ジュウテリウム標識５Ｓ−ＨＥＴＥ（５Ｓ−ＨＥＴＥ−ｄ８）、
ジュウテリウム標識ロイコトリエンＢ４（ＬＴＢ４−ｄ４）、
ジュウテリウム標識リポキシンＡ４（ＬＸＡ４−ｄ５）、
ジュウテリウム標識レゾルビンＤ２（ＲｖＤ２−ｄ５）、および
ジュウテリウム標識プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２−ｄ４）である。
【００３３】
サンプル中の、１３シリーズレゾルビンのアイデンティティーは、その保持時間（ＲＴ）およびそのＭＳ−ＭＳスペクトルの少なくとも６つの診断イオンとＳＰＭの合成標準または基準標準のものとのマッチングを行うことにより確認しうる。
液体クロマトグラフィーを用いて測定される分子の保持時間は、機器固有であることが多いが、いくつかの実施形態では、上述した、１３シリーズレゾルビンの保持時間は以下の表１に示される通りでありうる。
【００３４】
【表１】
2020517955.tif 000004
【００３５】
定量は、メディエーターの合成標準または基準標準を用いて構築される、線形回帰曲線を用いて達成しうる。
【００３６】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、たとえば病院検査室などで必要とされる装置にアクセスして使用するのに好適でありうる。
しかしながら、より便利には、サンプル中の、少なくとも１つの、１３シリーズレゾルビンのレベルは、イムノアッセイを用いて測定しうる。
イムノアッセイは、マイクロ流体デバイスまたは試験ストリップで実施するように小型化しうる潜在能力を有するので、臨床現場即時検査（ポイントオブケア）用途により適しうる。
したがって、イムノアッセイが組み込まれた本発明の実施形態は、個別の患者にスタチンを処方する助けとなるようにプライマリーヘルスケア提供者によりｉｎ  ｓｉｔｕで使用しうる。
【００３７】
少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルは、ホモジニアスまたはヘテロジニアスなイムノアッセイを用いて測定しうる。
【００３８】
そのため、いくつかの実施形態では、溶液中の、このまたは各１３シリーズレゾルビンのレベルは、過剰に存在する標識抗体に結合し、その結合により標識の検出可能な性質を変化させることにより測定しうる。
したがって、存在する特異的ＳＰＭの量は、特定の検出可能な性質を備えた標識の量に影響を及ぼすであろう。
当技術分野で周知のように、標識は、放射性標識、蛍光標識、または酵素を作用させたときに着色したり、蛍光を発したり、若しくは蛍光を許容したりする色素原性若しくは化学発光性の基質を有する酵素を含みうる。
【００３９】
抗体は、１３シリーズレゾルビンに対する特異性を有して、ポリクローナルまたはモノクローナルでありうる。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体を使用しうる。
【００４０】
代替的に、分離および定量のために表面結合抗体により少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンをキャプチャーするヘテロジニアス方式を使用しうる。
いくつかの実施形態では、標識二次抗体を結合させることにより表面で結合した、１３シリーズレゾルビンを定量するサンドイッチアッセイを使用しうる。
【００４１】
好適には、イムノアッセイは、標識が、たとえば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などの酵素である酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）を含みうる。
ＨＲＰに対する好適な基質は、当技術分野で周知であり、例としては、ＡＢＴＳ、ＯＰＤ、ＡｍｐｌｅｘＲｅｄ、ＤＡＢ、ＡＥＣ、ＴＭＢ、ホモバニリン酸、およびルミノールが挙げられる。
いくつかの実施形態では、ＥＬＩＳＡイムノアッセイを使用しえ、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイがとくに好ましいこともある。
【００４２】
イムノアッセイは競合的または非競合的でありうる。
そのため、いくつかの実施形態では、少なくとも１つの、１３シリーズレゾルビンの量は、以上に記載したように、ホモジニアスまたはヘテロジニアスな方法により直接測定しうる。
代替的に、過剰に存在する既知量の抗体を用いて、サンプル中の、１３シリーズレゾルビンを溶液中で捕捉し、次いで、表面に結合したＳＰＭへの結合により残留抗体の量を決定して、元のサンプル中の１３シリーズレゾルビンの量の間接リードアウトを与える。
他の一変形形態では、少なくとも１つの、１３シリーズレゾルビンと既知量の標識ＳＰＭとを表面結合抗体への結合に関して競合させうる。
【００４３】
表面結合抗体またはＳＰＭは、当技術分野で公知のようないずれかの好適な表面上に固定しうる。
たとえば、抗体またはＳＰＭは、ウェル若しくはプレートの表面上また複数の磁気若しくは非磁気ビーズの表面上に固定しうる。
【００４４】
したがって、本発明の第２の態様では、生物学的サンプル中の、１３シリーズレゾルビンのレベルを測定するイムノアッセイが提供される。
このイムノアッセイは、サンプル中の１３シリーズレゾルビンをキャプチャーするために、表面上にコーティングされた、および／または、サンプル中の１３シリーズレゾルビンへの結合により、検出可能に変化する標識でタグ付けされた、１３シリーズレゾルビンに対する抗体、またはサンプルとの混合後に、１３シリーズレゾルビンに対する抗体をキャプチャーするために、表面上に固定された、サンプル中の定量されるものと同一のある量の１３シリーズレゾルビンを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、イムノアッセイは、サンプル中の定量されるものと同一であるが、検出可能標識でタグ付けされている、既知量の１３シリーズレゾルビンをさらに含む、競合アッセイでありうる。
標識された１３シリーズレゾルビンは、１３シリーズレゾルビンに対する抗体により、好適な表面に親和性結合させうる。
サンプルを添加すると、ある割合の標識１３シリーズレゾルビンは、表面結合抗体から変位することにより、サンプル中の１３シリーズレゾルビンのレベルの尺度を提供しうる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、イムノアッセイは、サンプル中の定量される１３シリーズレゾルビンと同一の表面結合１３シリーズレゾルビンと、１３シリーズレゾルビンに対する溶液中の過剰の既知量の抗体と、を含みうる。
最初に、ある割合の抗体が、サンプル中の１３シリーズレゾルビンに結合するように、溶液中でサンプルと抗体とを混合する。
次いで、表面結合１３シリーズレゾルビンへの結合により、残留する非結合抗体の量を測定可能である。
【００４７】
いくつかの実施形態では、イムノアッセイは、表面結合抗体に結合された１３シリーズレゾルビンの量または表面上に固定された１３シリーズレゾルビンに結合された一次抗体の量を定量するために、１３シリーズレゾルビンに対する標識二次抗体または１３シリーズレゾルビンに対する一次抗体を含みうる。
【００４８】
本発明の第３の態様では、サンプル採取デバイスと本発明の第２の態様に係るイムノアッセイとを含む、サンプル中の特異的１３シリーズレゾルビンのレベルを測定する装置が提供される。
【００４９】
好適には、装置は、イムノアッセイで、標識１３シリーズレゾルビンまたは１３シリーズレゾルビンに対する標識抗体を検出するための検出器をさらに含みうる。
好適な標識は上述されているが、好ましい実施形態では、標識は、酵素を作用させたときに、着色したり、蛍光を発したり、または蛍光を許容したりする色素原性または化学発光性の基質を有する酵素でありうる。
【００５０】
いくつかの実施形態では、本発明のイムノアッセイまたは装置は、生物学的サンプル中の少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルを測定するための、小型デバイスに組み込みうる。
好適には、デバイスはラボオンチップ（ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）を含みうる。
【００５１】
したがって、本発明の第４の態様によれば、患者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルを測定するためのデバイスが提供される。このデバイスは、入口ポートと反応ゾーンとを有する内部チャネルを規定する１つ以上の部分を含み、サンプル中の１３シリーズレゾルビンの量を直接的または間接的に定量するために、サンプル中の１３シリーズレゾルビンと、１３シリーズレゾルビンをキャプチャーする１３シリーズレゾルビンに対する固定化一次抗体と、を反応させうるか、または反応ゾーンの上流でサンプルと混合された後の１３シリーズレゾルビンに対する溶液中の過剰の一次抗体と、サンプル中の測定されるものと同一であるが反応ゾーン内の表面上に固定されている１３シリーズレゾルビンと、を反応させうる。
【００５２】
次いで、酵素でタグ付けされている、１３シリーズレゾルビンに対する二次抗体または一次抗体を用いて、キャプチャーされた１３シリーズレゾルビンまたは一次抗体を検出しうる。
【００５３】
以上に記載したように、酵素は、酵素を作用させたときに着色したり、蛍光を発したり、または蛍光を許容したりする色素原性または化学発光性の基質を有しうる。
好適には、少なくとも反応ゾーンに隣接してチャネルを規定するデバイスの１つ以上の部分は、そのチャネルまたはさらなるチャネルの外部に配置された、好適な検出器、たとえば、フォトダイオードなどを用いて、１３シリーズレゾルビンまたは一次抗体と二次抗体との反応の検出を可能にするために、少なくとも基質の色または蛍光を包含する波長の範囲内で光透明性でありうる。
【００５４】
いくつかの実施形態では、デバイスは、サンプル中の複数の異なる、１３シリーズレゾルビンのレベルを並行して測定するために、各々それ自体の入口ポートを備えた複数のチャネルを含みうる。
したがって、各チャネルは、異なるそれぞれの固定化一次抗体または１３シリーズレゾルビンを含みうる。
【００５５】
好適には、デバイスは、一連の異なる試薬、たとえば、サンプル、洗浄溶液、一次抗体、二次抗体、酵素基質などのチャネルへの導入を制御するために、１つ以上の入口ポートに関連付けられた１つ以上の選択的に操作可能なバルブを含みうる。
【００５６】
したがって、デバイスはマイクロ流体デバイスを含みうる。
チャネルは反応ゾーンを含みうる。マイクロ流体デバイスは当業者に公知である。
マイクロ流体イムノアッセイまたはタンパク質診断チップマイクロアレイのレビューは、Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１２．Ｌａｂ  ｏｎ  ａ  Ｃｈｉｐ．２０１２；１２：２１１８−２１３４に提供される。
臨床現場即時検査（ポイントオブケア）で、ＥＬＩＳＡイムノアッセイを行うのに好適なマイクロ流体デバイスは、Ｃｈａｎ  ＣＤ，Ｌａｋｓａｎａｓｏｐｉｎ  Ｔ，Ｃｈｅｕｎｇ  ＹＫ，Ｓｔｅｉｎｍｉｌｌｅｒ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ−ｂａｓｅｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｗｏｒｌｄ”．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１１；１７（８）：１０１５−１０１９（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、スタチンは、アトルバスタチン、セリバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、メバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチンから選択しうる。
【００５８】
好適には、スタチンは、通常の初期用量または維持用量で患者に投与しうる。
【００５９】
したがって、アトルバスタチンは、約５〜８０ｍｇ、好ましくは１０〜４０ｍｇの用量で患者に投与しうる。
セリバスタチンは、約０．２〜０．８ｍｇの用量で患者に投与しうる。
フルバスタチンは、約１０〜８０ｍｇ、好ましくは２０〜８０ｍｇの用量で患者に投与しうる。
ロバスタチンは、約５〜６０ｍｇ、好ましくは１０〜６０ｍｇまたは２０〜６０ｍｇの用量で患者に投与しうる。
メバスタチンは、約２５ｍｇまでの用量で患者に投与しうる。
ピタバスタチンは、約０．５〜４ｍｇ、好ましくは約１ｍｇまたは２ｍｇの用量で患者に投与しうる。
プラバスタチンは、約２０〜８０ｍｇ、好ましくは４０〜８０ｍｇの用量で患者に投与しうる。
ロスバスタチンは、約２．５〜４０ｍｇ、好ましくは約５〜２０ｍｇまたは１０〜２０ｍｇの用量で患者に投与しうる。
シンバスタチンは、約２．５〜４０ｍｇ、好ましくは約５〜２０ｍｇまたは１０〜２０ｍｇの用量で患者に投与しうる。
【００６０】
好適には、第２のサンプルは、スタチン投与の少なくとも３０分後、好ましくは、少なくとも１時間後、より好ましくは少なくとも２時間後に採取しうる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、炎症性病態は心血管疾患（ＣＶＤ）でありうる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、炎症性病態は関節リウマチでありうる。
【００６３】
したがって、本発明は、個別の患者において、炎症性病態の治療に使用されるスタチンの有効性を評価する方法を提供する。本方法は、スタチンの投与前および投与後に患者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つの、１３シリーズレゾルビンのレベルを比較することを含み、スタチン投与後の少なくとも１つのレゾルビンのレベルの増加がスタチンの有効性の指標となる。
【００６４】
本発明の方法はコンピューターにより実施しうる。
【００６５】
したがって、本発明の第５の態様によれば、個別の患者において炎症性病態の治療に使用されるスタチンの有効性を評価するコンピューター実装方法（ｃｏｍｐｕｔｅｒ−ｉｍｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ）が提供される。
本方法は、スタチンの投与前および投与後に患者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つの、１３シリーズレゾルビンのレベルを表すサンプルデータを、コンピューターで受け取ること、および、サンプル中の少なくとも１つの、１３シリーズレゾルビンのレベルを比較し、スタチン投与後の少なくとも１つのレゾルビンのレベルの増加がスタチンの有効性の指標となり、比較に基づいてスタチンの有効性を表す有効性データを出力するためにソフトウェアをコンピューターで実行することを含む。
【００６６】
第６の態様では、本発明は、コンピューターによる実行時に、本発明の第５の態様の方法をコンピューターに行わせる命令を含むコンピュータープログラムを提供する。
【００６７】
サンプル中の少なくとも１つの、１３シリーズレゾルビンのレベルを比較する工程は、サンプル中の１３シリーズレゾルビンのレベルを表すデータを初期に受け取るコンピューターと異なるコンピューターで行いうることが理解されよう。
【００６８】
したがって、本発明の第７の態様では、個別の患者において、炎症性病態の治療に使用されるスタチンの有効性を評価するコンピューター装置が提供される。
この装置は、コンピューターが組み込まれた第１のデバイスと、第２のコンピューターと、それらの間でデータを送信する第１のデバイスと第２のコンピューターとの間の通信チャネルとを含み、第１のデバイスは、スタチンの投与前および投与後に患者から得られた生物学的サンプル中の少なくとも１つの、１３シリーズレゾルビンのレベルを表すサンプルデータを受け取って、通信チャネルを介してサンプルデータを第２のコンピューターに送信するように配置され、且つ第２のコンピューターは、サンプル中の少なくとも１つの１３シリーズレゾルビンのレベルを比較して、個別の患者に対するスタチンの有効性を決定し（スタチン投与後の少なくとも１つの、１３シリーズレゾルビンのレベルの増加が有効性の指標となる）スタチンの有効性を表す有効性データを出力するソフトウェアを実行するように配置される。
【００６９】
第２のコンピューターは、通信チャネルを介して第１のデバイスにまたは第３のコンピューターに有効性のデータを送信するように配置しうる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、第１のデバイスは、生物学的サンプル中の少なくとも１つの、１３シリーズレゾルビンのレベルを測定する本発明の第２、第３、または第４の態様に係るイムノアッセイ、装置、またはデバイスを含みうる。
【００７１】
以下は、単なる例にすぎないが本発明の実施形態の添付の図面を参照した説明である。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
下図において、
【図１Ａ】炎症性関節炎時にアトルバスタチンおよびプラバスタチンが与えられたマウスの足におけるＲｖＴの増加。関節炎誘発原性Ｋ／ＢｘＮ血清（１００μＬ、ｉ．ｐ．）をマウスに与えて、疾患を惹起し、そして、（Ａ）臨床スコアを用いて、疾患進行を毎日モニターした。矢印は、マウスにスタチンまたは媒体が与えられた日を表す。（Ｂ〜Ｄ）疾患発生の３日後、５日後、および７日後に、０．２ｍｇ／Ｋｇのアトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）をｉ．ｖ．で与えた。８日目に足を採取し、そして、脂質メディエータープロファイリングを用いて、脂質メディエーターの同定および定量を行った。（Ｂ）ドコサヘキサエン酸、ｎ−３ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、およびアラキドン酸に由来する、同定された脂質メディエーターの代表的なＭＲＭ（多重反応モニタリング）クロマトグラム。（Ｃ）ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４の同定で利用した、ＭＳ／ＭＳスペクトル。（Ｄ）媒体と比較した、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４のパーセントレギュレーション。（Ｅ）同定されたＲｖＴの代表的なＭＲＭクロマトグラム。（Ｆ）媒体と比較した、全ＲｖＴ、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４の定量。Ａ、Ｂ、およびＥの結果は、ｎ＝１２匹のマウスに対応し、ＣおよびＦは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４匹のマウス／群である。一元配置ＡＮＯＶＡと事後ダネット多重比較検定とを用いて、媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。４つの独立した実験で処置したマウスについて、媒体ではｎ＝９、アトルバスタチンでは１１、プラバスタチンでは１１、およびシンバスタチンでは９である。媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｂ】炎症性関節炎時にアトルバスタチンおよびプラバスタチンが与えられたマウスの足におけるＲｖＴの増加。関節炎誘発原性Ｋ／ＢｘＮ血清（１００μＬ、ｉ．ｐ．）をマウスに与えて、疾患を惹起し、そして、（Ａ）臨床スコアを用いて、疾患進行を毎日モニターした。矢印は、マウスにスタチンまたは媒体が与えられた日を表す。（Ｂ〜Ｄ）疾患発生の３日後、５日後、および７日後に、０．２ｍｇ／Ｋｇのアトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）をｉ．ｖ．で与えた。８日目に足を採取し、そして、脂質メディエータープロファイリングを用いて、脂質メディエーターの同定および定量を行った。（Ｂ）ドコサヘキサエン酸、ｎ−３ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、およびアラキドン酸に由来する、同定された脂質メディエーターの代表的なＭＲＭ（多重反応モニタリング）クロマトグラム。（Ｃ）ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４の同定で利用した、ＭＳ／ＭＳスペクトル。（Ｄ）媒体と比較した、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４のパーセントレギュレーション。（Ｅ）同定されたＲｖＴの代表的なＭＲＭクロマトグラム。（Ｆ）媒体と比較した、全ＲｖＴ、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４の定量。Ａ、Ｂ、およびＥの結果は、ｎ＝１２匹のマウスに対応し、ＣおよびＦは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４匹のマウス／群である。一元配置ＡＮＯＶＡと事後ダネット多重比較検定とを用いて、媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。４つの独立した実験で処置したマウスについて、媒体ではｎ＝９、アトルバスタチンでは１１、プラバスタチンでは１１、およびシンバスタチンでは９である。媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｃ】炎症性関節炎時にアトルバスタチンおよびプラバスタチンが与えられたマウスの足におけるＲｖＴの増加。関節炎誘発原性Ｋ／ＢｘＮ血清（１００μＬ、ｉ．ｐ．）をマウスに与えて、疾患を惹起し、そして、（Ａ）臨床スコアを用いて、疾患進行を毎日モニターした。矢印は、マウスにスタチンまたは媒体が与えられた日を表す。（Ｂ〜Ｄ）疾患発生の３日後、５日後、および７日後に、０．２ｍｇ／Ｋｇのアトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）をｉ．ｖ．で与えた。８日目に足を採取し、そして、脂質メディエータープロファイリングを用いて、脂質メディエーターの同定および定量を行った。（Ｂ）ドコサヘキサエン酸、ｎ−３ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、およびアラキドン酸に由来する、同定された脂質メディエーターの代表的なＭＲＭ（多重反応モニタリング）クロマトグラム。（Ｃ）ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４の同定で利用した、ＭＳ／ＭＳスペクトル。（Ｄ）媒体と比較した、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４のパーセントレギュレーション。（Ｅ）同定されたＲｖＴの代表的なＭＲＭクロマトグラム。（Ｆ）媒体と比較した、全ＲｖＴ、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４の定量。Ａ、Ｂ、およびＥの結果は、ｎ＝１２匹のマウスに対応し、ＣおよびＦは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４匹のマウス／群である。一元配置ＡＮＯＶＡと事後ダネット多重比較検定とを用いて、媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。４つの独立した実験で処置したマウスについて、媒体ではｎ＝９、アトルバスタチンでは１１、プラバスタチンでは１１、およびシンバスタチンでは９である。媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｄ−１Ｅ】炎症性関節炎時にアトルバスタチンおよびプラバスタチンが与えられたマウスの足におけるＲｖＴの増加。関節炎誘発原性Ｋ／ＢｘＮ血清（１００μＬ、ｉ．ｐ．）をマウスに与えて、疾患を惹起し、そして、（Ａ）臨床スコアを用いて、疾患進行を毎日モニターした。矢印は、マウスにスタチンまたは媒体が与えられた日を表す。（Ｂ〜Ｄ）疾患発生の３日後、５日後、および７日後に、０．２ｍｇ／Ｋｇのアトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）をｉ．ｖ．で与えた。８日目に足を採取し、そして、脂質メディエータープロファイリングを用いて、脂質メディエーターの同定および定量を行った。（Ｂ）ドコサヘキサエン酸、ｎ−３ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、およびアラキドン酸に由来する、同定された脂質メディエーターの代表的なＭＲＭ（多重反応モニタリング）クロマトグラム。（Ｃ）ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４の同定で利用した、ＭＳ／ＭＳスペクトル。（Ｄ）媒体と比較した、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４のパーセントレギュレーション。（Ｅ）同定されたＲｖＴの代表的なＭＲＭクロマトグラム。（Ｆ）媒体と比較した、全ＲｖＴ、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４の定量。Ａ、Ｂ、およびＥの結果は、ｎ＝１２匹のマウスに対応し、ＣおよびＦは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４匹のマウス／群である。一元配置ＡＮＯＶＡと事後ダネット多重比較検定とを用いて、媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。４つの独立した実験で処置したマウスについて、媒体ではｎ＝９、アトルバスタチンでは１１、プラバスタチンでは１１、およびシンバスタチンでは９である。媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｆ】炎症性関節炎時にアトルバスタチンおよびプラバスタチンが与えられたマウスの足におけるＲｖＴの増加。関節炎誘発原性Ｋ／ＢｘＮ血清（１００μＬ、ｉ．ｐ．）をマウスに与えて、疾患を惹起し、そして、（Ａ）臨床スコアを用いて、疾患進行を毎日モニターした。矢印は、マウスにスタチンまたは媒体が与えられた日を表す。（Ｂ〜Ｄ）疾患発生の３日後、５日後、および７日後に、０．２ｍｇ／Ｋｇのアトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン、または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）をｉ．ｖ．で与えた。８日目に足を採取し、そして、脂質メディエータープロファイリングを用いて、脂質メディエーターの同定および定量を行った。（Ｂ）ドコサヘキサエン酸、ｎ−３ドコサペンタエン酸、エイコサペンタエン酸、およびアラキドン酸に由来する、同定された脂質メディエーターの代表的なＭＲＭ（多重反応モニタリング）クロマトグラム。（Ｃ）ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４の同定で利用した、ＭＳ／ＭＳスペクトル。（Ｄ）媒体と比較した、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４のパーセントレギュレーション。（Ｅ）同定されたＲｖＴの代表的なＭＲＭクロマトグラム。（Ｆ）媒体と比較した、全ＲｖＴ、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４の定量。Ａ、Ｂ、およびＥの結果は、ｎ＝１２匹のマウスに対応し、ＣおよびＦは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．、ｎ＝４匹のマウス／群である。一元配置ＡＮＯＶＡと事後ダネット多重比較検定とを用いて、媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。４つの独立した実験で処置したマウスについて、媒体ではｎ＝９、アトルバスタチンでは１１、プラバスタチンでは１１、およびシンバスタチンでは９である。媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５。
【図２Ａ】プラバスタチンは、ヒト好中球−内皮細胞共インキュベーションにおいて用量依存的にＲｖＴを増加させた。ＨＵＶＥＣ（８．５×１０５細胞／ｃｍ２）を、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）と共に１６時間インキュベートした。次いで、これらを、指示濃度のアトルバスタチン、プラバスタチン、または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）と共に３０分間インキュベートし、その後、好中球（４×１０６細胞／ウェル）を添加した。１時間後、インキュベーションを、２体積の氷冷メタノールでクエンチし、脂質メディエータープロファイリングを用いてＲｖＴの同定および定量を行った。（Ａ）同定されたＲｖＴの代表的なＭＲＭクロマトグラム。（Ｂ）媒体処置インキュベーションと比較した、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４レギュレーション。結果は、４つの独立した実験の４名の健常ドナーの平均である。二元配置ＡＮＯＶＡ（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）と事後テューキー多重比較検定（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｅｓｔ）とを用いて、媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。
【図２Ｂ】プラバスタチンは、ヒト好中球−内皮細胞共インキュベーションにおいて用量依存的にＲｖＴを増加させた。  ＨＵＶＥＣ（８．５×１０５細胞／ｃｍ２）を、ＩＬ−１β（１０ｎｇ／ｍＬ）およびＴＮＦ−α（１０ｎｇ／ｍＬ）と共に１６時間インキュベートした。次いで、これらを、指示濃度のアトルバスタチン、プラバスタチン、または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）と共に３０分間インキュベートし、その後、好中球（４×１０６細胞／ウェル）を添加した。１時間後、インキュベーションを、２体積の氷冷メタノールでクエンチし、脂質メディエータープロファイリングを用いてＲｖＴの同定および定量を行った。（Ａ）同定されたＲｖＴの代表的なＭＲＭクロマトグラム。（Ｂ）媒体処置インキュベーションと比較した、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４レギュレーション。結果は、４つの独立した実験の４名の健常ドナーの平均である。二元配置ＡＮＯＶＡ（ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）と事後テューキー多重比較検定（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｔｕｋｅｙ’ｓ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｔｅｓｔ）とを用いて、媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。
【図３Ａ−３Ｄ】アトルバスタチンおよびプラバスタチンは、疾患重症度を低減して関節構造を保護した。  ０および２日目に、関節炎誘発原性Ｋ／ＢｘＮ血清をマウス与えた。  ３、５、および７日目に、（Ａ）アトルバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）、（Ｂ）プラバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）、（Ｃ）シンバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）、または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）を与えたマウスにおいて、２６ポイント臨床スコアを用いて疾患進行をモニターした。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。３つの独立した実験で処置したマウスに対して、媒体ではｎ＝８、アトルバスタチンでは１０、プラバスタチンでは１０、およびシンバスタチンでは６である。通常の二元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）を用いて、媒体と対比して、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００５。（Ｄ）中足蹠厚さの最大パーセント増加。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。３つの独立した実験で、処置したマウスに対して、媒体ではｎ＝８、アトルバスタチンでは１０、プラバスタチンでは１０、およびシンバスタチンでは６である。一元配置ＡＮＯＶＡと事後ダネット多重比較検定とを用いて、媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５。（Ｅ）ＥＶＯＳ  ＦＬイメージングシステムを用いて、８日目に、採取したマウスの代表的なＨ＆Ｅ染色膝切片（倍率４倍）。結果は、３つの独立した実験で処置したマウスに対して、媒体ではｎ＝８、アトルバスタチンでは１０、プラバスタチンでは１０、およびシンバスタチンでは６に対応する。Ｆは、ｆｅｍｕｒ（大腿骨）、Ｔは、脛骨、ｍは、半月板、ＩＦＰは、膝蓋下脂肪パッド、ＰＦは、パンヌス形成。矢印は白血球浸潤を表す。
【図３Ｅ】アトルバスタチンおよびプラバスタチンは、疾患重症度を低減して関節構造を保護した。０および２日目に、関節炎誘発原性Ｋ／ＢｘＮ血清をマウス与えた。３、５、および７日目に、（Ａ）アトルバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）、（Ｂ）プラバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）、（Ｃ）シンバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）、または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）を与えたマウスにおいて、２６ポイント臨床スコアを用いて疾患進行をモニターした。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。３つの独立した実験で処置したマウスに対して、媒体ではｎ＝８、アトルバスタチンでは１０、プラバスタチンでは１０、およびシンバスタチンでは６である。通常の二元配置ＡＮＯＶＡ（分散分析）を用いて、媒体と対比して、＊＊ｐ＜０．０１および＊＊＊ｐ＜０．００５。（Ｄ）中足蹠厚さの最大パーセント増加。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。３つの独立した実験で、処置したマウスに対して、媒体ではｎ＝８、アトルバスタチンでは１０、プラバスタチンでは１０、およびシンバスタチンでは６である。一元配置ＡＮＯＶＡと事後ダネット多重比較検定とを用いて、媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５。（Ｅ）ＥＶＯＳ  ＦＬイメージングシステムを用いて、８日目に、採取したマウスの代表的なＨ＆Ｅ染色膝切片（倍率４倍）。結果は、３つの独立した実験で処置したマウスに対して、媒体ではｎ＝８、アトルバスタチンでは１０、プラバスタチンでは１０、およびシンバスタチンでは６に対応する。Ｆは、ｆｅｍｕｒ（大腿骨）、Ｔは、脛骨、ｍは、半月板、ＩＦＰは、膝蓋下脂肪パッド、ＰＦは、パンヌス形成。矢印は白血球浸潤を表す。
【図４Ａ−４Ｄ】炎症性関節炎における各スタチンによる、循環白血球および血小板活性化の示差的レギュレーション（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）。マウスにおいて血清誘発関節炎を惹起し、３、５、および７日目に、アトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン（各０．２ｍｇ／Ｋｇ）または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）を与えた。８日目に、血液を採取した。蛍光標識抗体およびフローサイトメトリーを用いて、白血球サブセットおよび活性化を同定した。（Ａ）非古典的単球、（Ｂ）古典的単球、（Ｃ）好中球、および（Ｄ）血小板の活性化マーカーを、媒体からのパーセント減少として評価した。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。４つの独立した実験で処置したマウスに対して、媒体ではｎ＝９、アトルバスタチンでは１１、プラバスタチンでは１１、およびシンバスタチンでは９である。一元配置ＡＮＯＶＡと事後ダネット多重比較検定とを用いて、媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５。
【図５Ａ−５Ｃ】炎症性関節炎における、アトルバスタチンおよびプラバスタチンによる、単球、好中球、およびマクロファージ活性化さらには関節への輸送の低減。マウスにおいて血清誘発関節炎を惹起し、そして、３、５、および７日目に、アトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン（各０．２ｍｇ／Ｋｇ）または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）を与えた。８日目に前足を採取し、消化させて浸潤性白血球を遊離させた。特異的マーカーに対する抗体およびフローサイトメトリーを用いて、白血球サブセットを規定した。（Ａ）非古典的単球、（Ｂ）好中球、（Ｃ）単球由来マクロファージの輸送および活性化を評価した。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。４つの独立した実験で処置したマウスに対して、媒体ではｎ＝９、アトルバスタチンでは１１、プラバスタチンでは１１、およびシンバスタチンでは９である。一元配置ＡＮＯＶＡと事後ダネット多重比較検定とを用いて、媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５。
【図６Ａ−６Ｃ】セレコキシブによるＲｖＴ産生の阻害は、アトルバスタチンおよびプラバスタチンの関節保護作用を逆転させる。関節炎誘発原性血清を用いて炎症性関節炎を惹起した（詳細については方法を参照されたい）。３、５、および７日目に、マウスに、セレコキシブ（１０ｍｇ／Ｋｇ）または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）を投与し、そして、１時間後、（Ａ）アトルバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）、（Ｂ）プラバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）、または媒体（０．０５％エタノールを含有するＰＢＳ）を与えた。疾患活動性を毎日評価し、通常の二元配置ＡＮＯＶＡを用いて、媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５であった。（Ｃ）８日目、足を採取し、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳベースの脂質メディエータープロファイリングを用いて、ＲｖＴの同定および定量を行った。一元配置ＡＮＯＶＡと事後シダック多重比較検定とを用いて、アトルバスタチンまたはプラバスタチンの単独と対比して、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）ＥＶＯＳ  ＦＬイメージングシステムを用いて、８日目に採取したマウスの代表的なＨ＆Ｅ染色膝部（倍率４倍）。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。２〜３つの独立した実験で各群について処置したマウスに対して、媒体ではｎ＝９、アトルバスタチンでは１１、プラバスタチンでは１１、セレコキシブ＋アトルバスタチンでは７、およびセレコキシブ＋プラバスタチンでは６である。
【図６Ｄ】セレコキシブによるＲｖＴ産生の阻害は、アトルバスタチンおよびプラバスタチンの関節保護作用を逆転させる。関節炎誘発原性血清を用いて炎症性関節炎を惹起した（詳細については方法を参照されたい）。３、５、および７日目に、マウスに、セレコキシブ（１０ｍｇ／Ｋｇ）または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）を投与し、そして、１時間後、（Ａ）アトルバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）、（Ｂ）プラバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）、または媒体（０．０５％エタノールを含有するＰＢＳ）を与えた。疾患活動性を毎日評価し、通常の二元配置ＡＮＯＶＡを用いて、媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５であった。（Ｃ）８日目、足を採取し、ＬＣ−ＭＳ−ＭＳベースの脂質メディエータープロファイリングを用いて、ＲｖＴの同定および定量を行った。一元配置ＡＮＯＶＡと事後シダック多重比較検定とを用いて、アトルバスタチンまたはプラバスタチンの単独と対比して、＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）ＥＶＯＳ  ＦＬイメージングシステムを用いて、８日目に採取したマウスの代表的なＨ＆Ｅ染色膝部（倍率４倍）。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。２〜３つの独立した実験で各群について処置したマウスに対して、媒体ではｎ＝９、アトルバスタチンでは１１、プラバスタチンでは１１、セレコキシブ＋アトルバスタチンでは７、およびセレコキシブ＋プラバスタチンでは６である。
【図７Ａ−７Ｆ】ＣＯＸ−２阻害は、全身および関節の両方の白血球に対するアトルバスタチンの保護作用を逆転する。血清誘発関節炎を惹起し、３、５、および７日目、そして、マウスにセレコキシブ（１０ｍｇ／Ｋｇ）または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）を投与し、そして、１時間後、アトルバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ）を与えた。８日目、血液を採取し、そして、蛍光標識抗体およびフローサイトメトリーを用いて、白血球サブセットおよび活性化を同定した。循環する（Ａ）非古典的単球、（Ｂ）好中球、および（Ｃ）血小板の活性化マーカー（Ａ〜Ｃ）。結果は、媒体からのパーセント減少として表される。（Ｄ〜Ｆ）白血球は、８日目、炎症を起こした足（詳細については方法を見る）から回収された。フローサイトメトリーを用いて、（Ｄ）非古典的単球、（Ｅ）好中球、および（Ｆ）単球由来マクロファージの輸送および活性化プロファイルを評価した。結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．。２つの独立した実験で処置したマウスに対して、媒体ではｎ＝９、アトルバスタチンでは１１、プラバスタチンでは１１、セレコキシブ＋アトルバスタチンでは７である。媒体と対比して、＊ｐ＜０．０５、一元配置ＡＮＯＶＡと事後ダネット多重比較検定とを用いてアトルバスタチンと対比して、＃ｐ＜０．０５。
【図８】個別の患者における炎症治療に対するスタチン（アトルバスタチン）の有効性を評価する本発明に係る方法の例を示すフロー図である。
【図９】イムノアッセイを行うマイクロ流体デバイスを用いて、本発明の方法を実施する装置の模式図である。
【図１０】本発明のイムノアッセイが組み込まれた本発明に係るマイクロ流体デバイスの模式図である。
【図１１】窒素下およびメタノール下でそれぞれ−８０℃で貯蔵したときの、長期にわたる脂質メディエーターの安定性を比較した実験の結果を示す。
【実施例】
【００７３】
実施例１
動物
Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｋｅｎｔ，ＵＫ）から、雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１１週齢）を調達した。すべての動物に標準的検査施設の食事および水を自由に提供し、１２時間明／暗サイクルを維持した。
【００７４】
炎症性関節炎
０および２日目に、マウスに、Ｋ／ＢｘＮ血清（１００μＬ、ｉ．ｐ．）を投与して、炎症性関節炎を惹起した。
次いで、３、５、および７日目に、ｉ．ｖ．注射を介して、アトルバスタチン、プラバスタチン、シンバスタチン（各０．２ｍｇ／Ｋｇ）、または媒体（０．０５％エタノールを含有するＤＰＢＳ−／−）をマウスに与えた。
２６ポイント関節炎スコアリングシステムを用いて、臨床スコアを毎日モニターした。
Ｎｏｒｌｉｎｇ  ＬＶ，Ｈｅａｄｌａｎｄ  ＳＥ，Ｄａｌｌｉ  Ｊら．“Ｐｒｏｒｅｓｏｌｖｉｎｇ  ａｎｄ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｓｏｌｖｉｎ  Ｄ１  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ”．ＪＣＩ  Ｉｎｓｉｇｈｔ．２０１６；１（５）：ｅ８５９２２に記載のように、マウスの足首／手首、蹠、および指の腫脹および発赤を毎日検査した。
指定の時間インターバルで血液および足を採取した。
【００７５】
選ばれた実験では、スタチン注射の１時間前に、１０ｍｇ／Ｋｇのセレコキシブをマウスに与えた。関節炎発生後８日目にまたは７日目のスタチン注射の２時間後に血および足を採取した。
【００７６】
脂質メディエータープロファイリング
各５００ｐｇのジュウテリウム化（ｄ）内部標準：ｄ８−５Ｓヒドロキシエイコサテトラエン酸、ｄ４−ロイコトリエン（ＬＴ）Ｂ４、ｄ５−リポキシン（ＬＸ）Ａ４、ｄ４−プロスタグランジン（ＰＧ）Ｅ２、およびｄ５−レゾルビンＤ２を含有する氷冷メタノールを、サンプルに添加した。
Ｄａｌｌｉ  Ｊら．２０１５（ｉｂｉｄ）、Ｃｏｌａｓ  ＲＡら．２０１４（ｉｂｉｄ）、およびＲａｔｈｏｄ  ＫＳ，Ｋａｐｉｌ  Ｖ，Ｖｅｌｍｕｒｕｇａｎ  Ｓら．“Ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｄ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ｕｎｄｅｒｌｉｅｓ  ｓｅｘ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ”．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１７；１２７（１）：１６９−１８２に記載のように、脂質メディエーターを抽出し、プロファイリングを行った。
【００７７】
フローサイトメトリー
ヘパリンライニングシリンジを用いて心臓穿刺により全血を採取した。ＦｃブロッキングＩｇＧおよび蛍光標識抗体と共に、細胞を、氷上で４５分間インキュベートした。
細胞を洗浄し、０．１％Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色液と共に、氷上で、３０分間インキュベートした。
全血溶解試薬キットを用いて、赤血球細胞の溶解および固定を行った。
次いで、フローサイトメトリーアナライザーを用いて染色を評価し、好適なソフトウェアを用いて分析した。
【００７８】
Ｄａｌｌｉ  Ｊら．２０１５（ｉｂｉｄ）に記載のように、足を採取して、白血球を単離した。
簡潔に述べると、３７℃のＲＰＭＩ−１６４０（０．５μｇ／ｍＬコラゲナーゼＤおよび４０μｇ／ｍＬ  ＤＮアーゼＩを含有する）中で激しく攪拌しながら、足を３０分間インキュベートした。
単離された細胞を、７０μＭストレーナーに通して、２Ｕ／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン、および１０％ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ−１６４０中に懸濁させ、次いで、４００×ｇで１０分間遠心分離した。
単離された細胞を、０．０２％ＢＳＡおよび１％ＦｃブロッキングＩｇＧ（ｖ／ｖ）を含有するＤＰＢＳ−／−中に懸濁させ、そして、０．１％Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色液と共に氷上で２０分間インキュベートした。
ＤＰＢＳ−／−を用いて細胞を洗浄し、蛍光標識抗体と共に氷上で４５分間インキュベートした。次いで、これを洗浄し、そして、１％パラホルムアルデヒドを用いて固定した。
絶対計数ビーズ（Ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ｂｅａｄｓ）を白血球計数に使用した。
次いで、フローサイトメトリーアナライザーを用いて染色を評価し、好適なソフトウェアを用いて分析した。
【００７９】
ヒト好中球−内皮細胞単離
ロイヤルロンドン病院（Ｒｏｙａｌ  Ｌｏｎｄｏｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）産科病棟の産科スタッフにより臍帯を採取し（Ｅａｓｔ  Ｌｏｎｄｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｃｉｔｙ  Ｈｅａｌｔｈ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｎｕｍｂｅｒ：０６／Ｑ０６０５／４０により承認されたプロトコル）、Ｇｉｔｔｅｎｓ  ＢＲ，Ｗｒｉｇｈｔ  ＲＤ，Ｃｏｏｐｅｒ  Ｄ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇａｌｅｃｔｉｎｓ  ｏｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１５；１２０７：１３３−１５１に記載のようにヒト臍静脈内皮細胞を単離した。
次いで、インターロイキン（ＩＬ）−１βおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α（各１０ｎｇ／ｍＬ、１６時間、３７℃、５％ＣＯ２）と共に細胞をインキュベートした。
【００８０】
Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ  ａｎｄ  Ｑｕｅｅｎ  Ｍａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｔｈｉｃｓ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ承認プロトコル（ＱＭＲＥＣ２０１４：６１）に準拠して健常同意ドナーの血液から好中球を単離した。Ｄａｌｌｉ  Ｊら．２０１５（ｉｂｉｄ）に記載のようにインキュベーションを行った。
【００８１】
統計
結果は、平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表される。一元配置ＡＮＯＶＡと事後ダネット、シダック、またはテューキー多重比較検定とを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）により群間差を検定した。適宜、標準媒体と比較した１標本ｔ検定または二元配置ＡＮＯＶＡを使用した。
統計的有意性の基準は、ｐ＜０．０５であった。
【００８２】
結果
炎症性関節炎時のアトルバスタチン、プラバスタチン、およびシンバスタチンによる局所および全身のＲｖＴの示差的（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）レギュレーション
最初に、アトルバスタチンが、炎症性関節炎時に、ＲｖＴ形成をレギュレートするか、およびこの作用がこのスタチンに特有であるかまたは他の臨床関連スタチン、すなわち、プラバスタチンおよびシンバスタチンと共有されるかを調べた。
これを試験するために、Ｋ／ＢｘＮマウスの関節炎誘発原性血清を、０および２日目に投与した。
この血清は、急速に発生する重症の炎症性関節炎を伴うＦｃγ媒介免疫反応をもたらす。
【００８３】
次いで、血清投与後３、５、および７日目に、治療パラダイムでアトルバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）、プラバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）、シンバスタチン（０．２ｍｇ／Ｋｇ）、または媒体をマウスに与えて、その時点の疾患の臨床徴候を観察した（図１Ａ）。
【００８４】
最後のスタチン投与の２４時間後に、血漿および足を採取し、そして、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）ベースの脂質メディエータープロファイリングを用いて、脂質メディエーターの同定および定量を行った。
関節炎マウスの足において、ＤシリーズレゾルビンおよびＲｖＴを含めて、４つすべての主要バイオ活性メタボロームのメディエーターが同定された（図１Ｂ、Ｃ）。
これらのメディエーターは、基準標準または合成標準に対する保持時間（図１Ｂ）およびＣｏｌａｓ  ＲＡら．２０１４（ｉｂｉｄ）に記載のＭＳ−ＭＳの少なくとも６つのイオン（図１Ｃ）のマッチングを含めて既報の基準に従って同定された。
【００８５】
多重反応モニタリングを用いて、これらの足で同定されたメディエーターの濃度を定量した。ここで、アトルバスタチンを摂取したマウスの関節において、媒体処置マウスの足と比較したとき、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４の増加に基づく全ＲｖＴ量の増加が４３％であることが分かった（図１Ｄ）。注目すべきこととして、これらのメディエーターの濃度は、Ｄａｌｌｉ  Ｊら．２０１５の報告に記載のバイオ活性の範囲内にあった。
【００８６】
プラバスタチンもまた、関節のＲｖＴ１およびＲｖＴ２濃度の増加を伴って足のＲｖＴを約２０％増加させたが、シンバスタチンは、関節のＲｖＴ濃度を有意に増加させなかった（図１Ｄ）。
【００８７】
プラバスタチンまたはアトルバスタチンのどちらを与えたマウスにおいても、ＬＴＢ４、ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２α、およびＴｘＢ２が減少することが、血漿メディエーターレベルの評価から実証された。
これらのマウスにおいて、ＲｖＴ濃度の血漿中レベルも増加することが分かり、ＲｖＴ１は、アトルバスタチンおよびプラバスタチンの両方で増加し、一方、ＲｖＴ４は、アトルバスタチンでのみ増加した。
【００８８】
スタチンが循環系から急速にクリアランスされ、アトルバスタチンおよびプラバスタチンの半減期が、〜１４時間および〜３時間であることを考慮して、次いで、これらのスタチンによるＲｖＴ生合成の全身性レギュレーションが投与直後により顕在化するかを調べた。
この目的のために、Ｋ／ＢｘＮ血清を用いて関節炎を惹起し、そして、以上に記載のようにアトルバスタチンおよびプラバスタチンをマウスに与えた。
次いで、７日目の最後のスタチン投与の２時間後に血液を採取し、そして、ＬＭプロファイリングを用いて脂質メディエーターの同定および定量を行った。
【００８９】
アトルバスタチンが与えられたマウスの血漿において、媒体処置マウスと比較したとき、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、およびＲｖＴ３の増加を伴ってＲｖＴの有意な増加（＞２００％）が見いだされた（図１Ｅおよび１Ｆ）。
これらのマウスでは、ＰＧＤ２およびＰＧＥ２を含めて、炎症誘発性エイコサノイドの循環量の減少が見いだされた。
また、媒体処置マウスと比較したとき、末梢血ＲｖＴの顕著な増加（＞１００％）も、プラバスタチンが与えられたマウスの血漿ＬＭプロファイルの評価から実証され、ＲｖＴ１は最も高い増加を示した（図１Ｅおよび１Ｆ）。
これらのマウスでは、循環ＰＧＤ２の減少（〜４６％）および循環ＰＧＥ２の減少（〜２９％）も観測された。
【００９０】
全体として、アトルバスタチンおよびプラバスタチンは、関節および血漿の両方のＲｖＴを増加させるとともに炎症性関節炎時の全身性炎症を減少させることが、これらの結果から実証される。
【００９１】
血管系においてＲｖＴが好中球内皮相互作用時に産生されることを考慮して、次いで、ネズミ系で観測されたプラバスタチンによるＲｖＴの増加をヒトにも移行可能であるかが疑問であった。このため、プラバスタチンと共培養したヒト好中球−内皮細胞物をインキュベートして、そして、ＲｖＴをレギュレートするその能力を評価した。
【００９２】
ここで、プラバスタチンは、アトルバスタチンにより観測されたのと同程度まで、４つすべてのＲｖＴ濃度を用量依存的にアップレギュレートすることが分かった（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００９３】
アトルバスタチンおよびプラバスタチンは関節炎症を低減して、白血球媒介組織損傷から保護する
次いで、ＲｖＴを増加させる用量のアトルバスタチンおよびプラバスタチンが、関節炎症も低減するかを調べた。
関節炎を惹起し、マウスを処置し、そして、以上に記載のように、疾患進行をモニターした。
媒体が与えられたマウスにおいて、早くも２日目に疾患の徴候が観測され、疾患重症度は６日目に１１．９±０．９のスコアを有して、最大に達し、その後、７日目に疾患活動性はプラトーに達した（図３Ａ）。
【００９４】
マウスにアトルバスタチンが与えられたとき、早くも４日目（治療開始１日後）に疾患進行が弱められ、疾患スコアは、５日目に９．１±１．２の最大スコアに達した。
こうした疾患活動性の低減は７日目まで持続した（図３Ａ）。
【００９５】
同様に、マウスにプラバスタチンが与えられたとき、５日目の疾患活動性は、媒体のみが与えられたマウスと比較したとき、約２３％低下し、疾患活動性の低減は、７日目まで維持されることが見いだされた（図３Ｂ）。
【００９６】
アトルバスタチンおよびプラバスタチンと等しい用量のシンバスタチンを投与しても、疾患活動性は有意に低減されなかった（図３Ｃ）。こうした知見は、足の腫脹の程度にも反映され、アトルバスタチンおよびプラバスタチンは、中足蹠厚さの減少により測定される関節腫脹を低減した（図３Ｄ）。
【００９７】
次いで、アトルバスタチン、プラバスタチン、およびシンバスタチンが関節保護作用を呈するかを評価した。
アトルバスタチンおよびプラバスタチンが与えられたマウスの膝関節のヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色切片は、媒体処置マウスと比較したとき、白血球浸潤、パンヌス形成、および関節損傷の低減を示したが、これらのパラメーターは、シンバスタチンが与えられたマウスでは不変であるように思われた（図３Ｅ）。
【００９８】
全体として、アトルバスタチンおよびプラバスタチンは、局所炎症のレギュレーションおよび炎症性関節炎における白血球媒介関節損傷からの保護の点でシンバスタチンよりも効力があることが、これらの知見から実証される。
【００９９】
アトルバスタチンおよびプラバスタチンによる関節炎マウスの関節および血液の白血球活性化の減少
これらのスタチンが、炎症性関節炎において全身性炎症をレギュレートするか確認するために、関節炎マウスの末梢血中の血小板−白血球凝集体のレベルをこうしたヘテロタイプ凝集体および細胞活性化とＣＶＤとの関係を考慮して評価した。
【０１００】
フローサイトメトリーを用いて、アトルバスタチンは、非古典的および古典的の両方の単球上のＣＤ１１ｂの発現さらには血小板−単球凝集体をレギュレートすることが、これらの単球サブセット上のＣＤ６２Ｐ発現（図４ＡおよびＢ）およびＣＤ４１発現（ｎ＝９匹のマウス）の減少の測定から分かった。
【０１０１】
アトルバスタチン投与はまた、好中球および血小板の反応をレギュレートして、好中球ＣＤ１１ｂ発現、血小板−好中球凝集体を有意に低減するとともに（図４Ｃ）、媒体のみが与えられたマウスと比較したとき、血小板ＣＤ６２Ｐ発現を〜６０％減少させる（図４Ｄ）。
プラバスタチンが与えられたマウスの末梢血の白血球および血小板でも類似の知見が得られ、単球ＣＤ１１ｂ発現の低減（非古典的単球で〜１０％および古典的単球で〜４０％）、血小板白血球凝集体の低減（両方の単球サブセットで〜３５％および好中球で〜２５％）、およびＣＤ６２Ｐ発現の〜７０％の低減を伴う血小板活性化の低減を生じた（図４）。
シンバスタチンは、白血球ＣＤ１１ｂ発現を有意にレギュレートしなかったが、古典的単球と血小板とにより形成されるヘテロタイプ凝集体および血小板ＣＤ６２Ｐ発現を低減させた（図４）。
アトルバスタチンおよびプラバスタチンは、全身性炎症をレギュレートして、炎症性関節炎時に循環する単球、好中球、および血小板の活性化を減衰させることが、これらの結果から実証される。
【０１０２】
次いで、こうした作用が、関節における白血球の輸送および活性化のレギュレーションに移行されるかも試験した。
【０１０３】
最初に、疾患の発生およびＫ／ＢｘＮ血清惹起炎症性関節炎の伝播における役割を考慮して、炎症関節への非古典的単球の輸送を評価した。
【０１０４】
アトルバスタチンが与えられたマウスの関節から単離された白血球のフローサイトメトリー分析から、関節に動員される非古典的単球の全数の著しい減少（＞６０％）が実証された。
媒体のみが与えられたマウスと比較したとき、こうした細胞上のＣＤ１１ｂの低減およびＭＨＣＩＩ発現の著しい減少も見られた（図５Ａ）。媒体処置マウスと比較したとき、アトルバスタチンを摂取したマウスにおいて、好中球の輸送が減少することが分かった（図５Ｂ）。
こうしたマウスでは、スタチン投与は、好中球のＣＤ１１ｂ発現およびＭＨＣＩＩ発現をダウンレギュレートするが、統計的有意性に達しないことが分かった（図５Ｂ）。
単球由来のマクロファージの数、さらには活性化マーカーＣＤ１１ｂおよびＭＨＣＩＩの発現の有意な低下も、関節へのマクロファージ輸送の評価から実証さマイクロれた（図５Ｃ）。
【０１０５】
関節の単球、好中球、およびマクロファージの数、さらには活性化プロファイルを低減するプラバスタチンが与えられたマウスでも、類似の知見が得られた（図５）。
【０１０６】
注目すべきこととして、シンバスタチンは、こうした細胞サブセット上の活性化マーカーのいくつかの発現をレギュレートしたが、媒体のみが与えられたマウスと比較したとき、足において白血球の数を有意に低減しなかった（図５）。
【０１０７】
全体として、プラバスタチンおよびアトルバスタチンも、炎症性関節炎において関節の白血球の輸送および活性化をレギュレートすることを、こうした知見から実証される。
【０１０８】
ＣＯＸ−２阻害はアトルバスタチンおよびプラバスタチンの保護作用を逆転する
アトルバスタチンおよびプラバスタチンにより発揮される保護作用における、ＲｖＴの寄与を評価するために、次いで、ＲｖＴ経路の開始酵素であるＣＯＸ−２の阻害がプラバスタチンおよびアトルバスタチンの保護作用を逆転するかを調べた。
【０１０９】
アトルバスタチンの直前にＣＯＸ−２選択的阻害剤であるセレコキシブが与えられたマウスの臨床スコアは、媒体のみを摂取したマウスのそれに類似しており、アトルバスタチンを摂取したマウスのそれよりも高かった（図６Ａ）。
【０１１０】
同様に、セレコキシブも、スタチンのみを摂取したマウスと比較したとき、疾患活動の増加により測定されるプラバスタチンの抗炎症作用の鈍化した（ｂｌｕｎｔｅｄ）（図６Ｂ）。
【０１１１】
セレコキシブが与えられたマウスにおける、プラバスタチンおよびアトルバスタチンの保護作用のこうした損失は、プラバスタチンまたはアトルバスタチンのみが与えられたマウスと比較したとき、関節ＲｖＴの〜６０％の低減およびＲｖＴ１濃度の＞７５％の低減にも関連付けられた（図６Ｃ）。
【０１１２】
こうしたマウスでは、両方のスタチンの関節保護作用の有意な逆転も見いだされ、セレコキシブが与えられたマウスでは、各スタチンのみが与えられたマウスと比較したとき、パンヌス形成が増加して関節構造が損なわれた（図６Ｄ）。
【０１１３】
次いで、ＣＯＸ−２阻害がアトルバスタチンおよびプラバスタチンにより発揮される白血球指向作用も逆転するかを調べた。
【０１１４】
セレコキシブ投与は、循環する白血球および血小板に及ぼすアトルバスタチンの保護作用を鈍化させ、血中の血小板−単球および血小板−好中球の凝集体さらには両方の白血球サブセット上のＣＤ１１ｂの発現を増加させた（図７ＡおよびＢ）。
セレコキシブ投与はまた、アトルバスタチンのみを摂取したマウスと比較したとき、循環血小板上のＣＤ６２Ｐ発現を増加させた（図７Ｃ）。
ＣＯＸ−２の阻害は、関節において白血球の輸送および活性化に及ぼすアトルバスタチンの作用を逆転し、炎症関節に動員される非古典的単球（図７Ｄ）、好中球（図７Ｅ）、および単球由来マクロファージ（図７Ｆ）の数を増加させた。
こうした白血球上の活性化マーカーの発現は、アトルバスタチンのみが与えられたマウスと比較したとき、セレコキシブ阻害後に増加した（図７Ｄ〜Ｆ）。
【０１１５】
プラバスタチンと共にセレコキシブが与えられたマウスにおいて、全身および関節の白血球の反応および輸送を評価したときも類似の知見が得られた。
ここで、ＣＯＸ−２阻害は、循環する白血球および血小板の活性化プロファイルを媒体のみを摂取したマウスで観測されるものに戻すことが分かった。
同様に、関節における白血球の輸送および活性化は、媒体処置マウスに見いだされるものに類似したレベルに増加した。
【０１１６】
全体として、ＣＯＸ−２の阻害は、ＲｖＴ産生を低減し、そして、炎症性関節炎においてプラバスタチンおよびアトルバスタチンの関節および全身の保護作用を消失することが、こうした知見から実証される。
【０１１７】
アトルバスタチンおよびプラバスタチンは両方とも、炎症性関節炎においてＲｖＴ産生を増加させることが、これらの結果から実証される。
これらのＳＰＭの組織中および血中の濃度のアップレギュレーションは、関節の疾患活動性さらには関節の白血球の輸送および活性化の低減に関連付けられた。
そのほか、アトルバスタチンおよびプラバスタチンは両方とも、全身性炎症を低減し、血小板、単球、および好中球の活性化を低減した。
これらのスタチンの保護作用は、ＣＯＸ−２の阻害により逆転された。
注目すべきこととして、シンバスタチンは、ＲｖＴを増加させず、そして、関節疾患および白血球反応のレギュレーションの鈍化作用を示した。
【０１１８】
全体として、ＲｖＴレギュレーションにおける、アトルバスタチン、プラバスタチン、およびシンバスタチンのランク順効力並びにこうしたスタチンの保護作用の媒介におけるこれらの分子の役割が、こうした知見から立証される。
関節および全身におけるこれらの消散促進性メディエーターの増加は、浮腫、白血球および血小板の活性化をはじめとする局所性および全身性の炎症の各種局面を弱める、こうした３つの各スタチンの能力に関連付けられた。
そのため、これらの結果から、関節炎において炎症をレギュレートするアトルバスタチンおよびプラバスタチンの新規な作用機序が立証されるとともに、患者において局所性および血管性の炎症を制御するスタチンの有効性を測定する新規な機能的バイオマーカーが提供される。
【０１１９】
実施例２
個別の患者において炎症性病態の治療に使用されるスタチンの有効性を評価する本発明に係る方法は、図８に例示される。
【０１２０】
工程１０は本方法の開始を示す。
最初に、第１の好適な生物学的サンプルを患者から採取する（工程２０）。
本実施例では、生物学的サンプルは血漿サンプルであるが、他の実施形態では、サンプルは、患者から採取された全血若しくは血清または好適な組織サンプルでありうる。
【０１２１】
次いで、試験量のスタチンを患者に投与する（工程３０）。
本発明によれば、医薬品として市販するためまたは臨床試験において治験医薬品（ＩＭＰ）として使用するためのどちらかで使用が承認されているいずれかのスタチンを投与しうる。
その推奨された初回用量または維持用量に準拠してスタチンを投与しうる。好適には、その推奨初回用量に準拠してスタチンを投与しうる。
本実施例では、アトルバスタチンは１０ｍｇまたは２０ｍｇの用量で使用される。
しかしながら、他の実施形態では、異なるスタチンを使用しうる。
患者への投与量は、臨床診療に従って調整しうる。
【０１２２】
規定の時間後、第２の生物学的サンプルを患者から採取する（工程４０）。
本実施例では、規定の時間は２〜３時間であるが、この場合も、異なる実施形態では他の時間を使用しうる。
時間は、スタチンの薬理学的効果を顕在化させるのに十分な程度に長くすべきである。
【０１２３】
工程５０では、スタチンの投与前および投与後に、工程２０および４０で患者から採取した第１および第２のサンプルを分析して、サンプル中の少なくとも１つの１３シリーズレゾルビン（ＲｖＴ）のレベルを定量する。
本実施例では、逆相液体クロマトグラフィーエレクトロスプレータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により、第１および第２のサンプル中の４つの１３シリーズレゾルビン（ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、およびＲｖＴ４）のレベルを測定する。
本発明の異なる実施形態では、４つ未満の１３シリーズレゾルビン、すなわち１つ、２つ、または３つの１３シリーズレゾルビンを分析しうる。
第１および第２のサンプル中の１３シリーズレゾルビンのレベルを定量する本方法の詳細は、Ｃｏｌａｓ  ＲＡら．２０１４（ｉｂｉｄ）およびＤａｌｌｉら．２０１５（ｉｂｉｄ）（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０１２４】
第１および第２の血漿サンプルの各々で、患者からヘパリン中に静脈血（１０ｍＬ）を採取する。
ヘパリン処理血液の遠心分離（２０００ｇ、１０分間）により血漿を得て、以下に記載の固相抽出前に、４体積のメタノール中に配置する。
【０１２５】
定量およびサンプル回収を促進するために、４ｍＬの氷冷メタノール中の内部標識標準である、５Ｓ−ＨＥＴＥ−ｄ８、ＬＴＢ４−ｄ４、ＬＸＡ４−ｄ５、ＲｖＤ２−ｄ５、およびＰＧＥ２−ｄ４（各５００ｐｇ）を各サンプルに添加する。
次いで、サンプルを、−２０℃で４５分間保持して、タンパク質を沈殿させ、その後、遠心分離する（２０００ｇ、４℃、１０分間）。
上清を採取し、３７℃に設定された水浴および１５ｐｓｉ以下の流量の窒素供給を備えた自動蒸発システムでメタノール含有量を温和な窒素ストリーム中１ｍＬ未満にする。次いで、サンプルを遠心分離する（２０００ｇ、４℃、１０分間）。
次いで、３７℃に設定された水浴および１５ｐｓｉ以下の流量の窒素供給を備えた自動抽出システムにサンプルを配置し、以下のように産物を抽出する。
【０１２６】
固相Ｃ１８カートリッジを、３ｍＬのメタノールおよび６ｍＬのＨ２Ｏで洗浄する。
次いで、９ｍＬのＨ２Ｏ（ｐＨ３．５、ＨＣｌ）をサンプルに添加し、コンディショニングされたＣ１８カラムに酸性化溶液を急速にロードし、４ｍＬのＨ２Ｏで洗浄して酸を中和する。
次いで、５ｍＬのヘキサンを添加し、９ｍＬのメチルホルメートで産物を溶出させる。
自動蒸発システムを用いて産物を乾固させ、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ自動注入のためにメタノール−水（５０：５０ｖｏｌ／ｖｏｌ）中にただちに懸濁させる。
【０１２７】
本実施例では、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳのために、高ダイナミックレンジパルス計数システムを備えた三連四重極質量分析計（ｔｒｉｐｌｅ  ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）と組み合わせてＨＰＬＣおよびオートインジェクターを利用する。
当業者であれば代替の好適なＬＣ−ＭＳ／ＭＳ装置を利用可能である。
５０℃に維持されたカラムオーブン内にＣ１８カラムを保持し、溶媒Ａとして、０．０１％酢酸を含有する水と溶媒Ｂとして０．０１％酢酸を含有するおよびメタノールとからなる移動相を用いて、ＲｖＴ脂質メディエーターを溶出させる。
８０：２０（Ａ：Ｂ）の移動相を用いて、カラムを平衡化し、１２秒間にわたり、５０：５０（Ａ：Ｂ）にランプさせる（ｒａｍｐｅｄ）。このグラジエントを２分間維持し、次いで、続く９分間にわたり８０：２０（Ａ：Ｂ）にランプさせる（ｒａｍｐｅｄ）。
次いで、このグラジエントを、続く３．５分間にわたり維持し、その後、９８：２（Ａ：Ｂ）にランプさせる（ｒａｍｐｉｎｇ）。
最後に、このグラジエントを５．４分間維持してカラムを洗浄する。プロセス全体を通して流量を０．５ｍＬ／ｍｉｎに維持する。
【０１２８】
質量分析計は、情報依存取得およびエンハンストプロダクトラインスキャンと連動させてスケジュール化多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を用いて、負イオン化モード（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅ）で操作する。
スケジュール化ＭＲＭウィンドウは９０秒間であり、各脂質メディエーターパラメーターは個別に最適化される。
【０１２９】
各ＲｖＴ（１３シリーズレゾルビン）のアイデンティティーは、その保持時間（ＲＴ）を合成物質および基準物質（図１Ｂ）並びに各ＲｖＴの少なくとも６つの診断イオン（図１Ｃ）にマッチングさせることにより確認され、以下の表２に記載の親イオン（Ｑ１）および特徴的な娘イオン（Ｑ３）の多重反応モニタリングを用いて定量される。
【０１３０】
【表２】
2020517955.tif 000005
【０１３１】
検量線は、３．１２、６．２５、１２．５、２５、５０、１００、および２００ｐｇで、基準化合物混合物およびジュウテリウム標識脂質メディエーターを用いて、各々に対して得られる。線形検量線は、各ＬＭに対して得られ、０．９８〜０．９９のｒ２値を与える。内部標準回収率、マトリックス干渉、および検出限界が決定される。
【０１３２】
第１および第２のサンプルの各々でＲｖＴのレベルを定量した後、レベルを比較する（工程６０）。
【０１３３】
第１のサンプルと比較して、第２のサンプルのＲｖＴレベルの著しい増加は、患者に投与されたスタチンが炎症の抑制に有効でありうることを示唆する。
一方、第１のサンプルと比較して、第２のサンプルのＲｖＴレベルの増加がないのは、投与されたスタチンが、個別の患者に無効であることを示唆する（工程７０）。
【０１３４】
これらの結果に基づいて、有効であることが示された場合（工程８０）、スタチンは患者に処方しうる。代替的に、本方法は、たとえば翌日に異なるスタチンを用いて繰り返しうる。
【０１３５】
工程９０は、本方法の終了を示す。
【０１３６】
実施例３
図９および１０を参照して、本発明のさまざまな態様のさらなる例を以下に説明する。
この場合、マイクロ流体デバイス１１０に組み込まれたイムノアッセイは、患者Ｐから得られた血液サンプルＢ中の少なくとも１つの１３シリーズレゾルビン（ＲｖＴ）のレベルを測定するために使用される。
【０１３７】
図１０に最良の形で示されるように、マイクロ流体デバイス１１０は、当業者に公知のような一般的構成を有する。
具体的には、マイクロ流体デバイス１１０は、チャネル検査および光学シグナル取得を可能にする、透明生体適合性エラストマーのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）の少なくとも１つの層１１２を含み、ガラススライド１１４に結合する。
【０１３８】
ＰＤＭＳ層は、一方の端が、サンプルコレクターポート１２５および、他方の端が、廃液ドレイン１３０で終端する複数のマイクロチャネル１２０ａ〜ｄと共に成形される。
本実施例では、マイクロ流体デバイス１１０は、４つのマイクロチャネル１２０ａ〜ｄを有し、その１つは、血液サンプルＢ中の異なるそれぞれのＲｖＴ（ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、ＲｖＴ４）のレベルを測定する。
以上の実施例２の場合と同様に、本実施例の変形形態では、マイクロ流体デバイスは、４つ未満のマイクロチャネル、たとえば、対応する数のＲｖＴのレベルを測定するために、１、２、または３つのマイクロチャネルを有しうる。
【０１３９】
サンプルコレクターポート１２５と廃液ドレイン１３０との間に、マイクロチャネル１２０ａ〜ｄの各々は、反応ゾーン１５０ａ〜ｄを含む。
好適には、マイクロチャネル１２０ａ〜ｄは、以下に記載のように、サンプルＢおよびデバイスに添加された試薬の混合を促進するために、反応ゾーン１５０ａ〜ｄにおいてサーペンタイン（ｓｅｒｐｅｎｔｉｎｅ）でありうる。
【０１４０】
サンプル採取ポート１２５とその反応ゾーン１５０ａ〜ｄとの間に、各マイクロチャネル１２０ａ〜ｄは、サンプルＢと混合すべく、チャネル１２０ａ〜ｄに一連の異なる試薬を導入するために、それぞれの試薬入口ポート１４０ａ〜ｄを備える。
マイクロチャネル１２０ａ〜ｄおよび入口ポート１４０ａ〜ｄは、サンプルおよび試薬のフロー制御に好適なマイクロバルブを備える。
【０１４１】
各反応ゾーン１５０ａ〜ｄでは、各マイクロチャネル１２０ａ〜ｄの表面は、サンプルＢ中の定量される異なるそれぞれ１つのＲｖＴに対するモノクローナル抗体でコーティングされる。
【０１４２】
各反応ゾーン１５０ａ〜ｄに隣接して、デバイス１１０は、ガラススライド１１４上に水素化アモルファスシリコン（ａ−Ｓｉ：Ｈ）フォトダイオード１７５ａ〜ｄを含む。
フォトダイオード１７５ａ〜ｄは、第１のコンピューター２００に接続された好適なインターフェース１２０に接続される。
インターフェース１２０は、フォトダイオード１７５ａ〜ｄからシグナルを受信してそうしたシグナルを表すコンピューター可読データを第１のコンピューター２００に送信するように配置される。
インターフェース１２０は、好適なデータケーブルにより、第１のコンピューター２００に物理的に接続しうる。
代替的に、インターフェース１２０は、たとえば、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）などのいずれかの好適な無線データ転送方法により、第１のコンピューター２００に無線で接続しうる。
いくつかの実施形態では、第１のコンピューターは、ハンドヘルドデバイスを含みうる。
【０１４３】
第１のコンピューター２００は、マイクロプロセッサー、メモリー、および記憶デバイスを含み、そして、フォトダイオード１７５ａ〜ｄから受信したシグナルを表すデータを、患者のアイデンティティーデータに関連付けてデータをソートすべく、ソフトウェアを実行するように配置される。
第１のコンピューター２００がハンドヘルドデバイスである場合、ソフトウェアはアプリケーションでありうる。
【０１４４】
第１のコンピューター２００は、好適なデータ通信チャネル３００を介して、リモートの第２のコンピューター４００に接続される。
本実施形態では、データ通信チャネル３００はインターネットを含むが、他の実施形態では、第１および第２のコンピューター２００、４００は、ローカルまたはワイドエリアネットワークで相互接続しうる（図示せず）。
第１および第２のコンピューター２００、４００は、データ通信ケーブルを介して互いに物理的に接続しうるか、またはたとえばＩＥＥＥ８０２．１１ａ，ｂ，ｇ，ｎやＢｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）などの好適な無線データ通信技術を用いて、無線で相互接続しうる。
好適には、第１および第２のコンピューター２００、４００の各々は、好適なモデムを介してインターネット３００に接続される。
【０１４５】
使用時、血液サンプルＢは、たとえば、従来のランセットを用いて、患者から得られる。
サンプルＢは、マイクロ流体デバイス１１０のサンプル入口ポート１２５に配置される。
サンプルは、毛管作用によりマイクロチャネル１２０ａ〜ｄに吸い込まれる。
代替実施形態では、サンプルＢは、マイクロポンプを用いてまたは減圧下などでマイクロチャネル１２０ａ〜ｄに能動的に吸い込みうる。
【０１４６】
反応ゾーン１５０ａ〜ｄでは、サンプル中のＲｖＴは、マイクロチャネル１２０ａ〜ｄの表面にコーティングされた抗体と反応する。
異なるＲｖＴは、各反応ゾーン１５０ａ〜ｄでキャプチャーされる。
サンプルＢは、好適な時間にわたり、反応ゾーンで抗体と共にインキュベートされる。
次いで、洗浄溶液をマイクロチャネル１２０ａ〜ｄに導入して、非結合サンプルを除去する。
マイクロチャネル１２０ａ〜ｄから廃棄された物質は、ドレイン１３０を介してデバイス１１０から除去される。
【０１４７】
反応ゾーン１５０ａ〜ｄから非結合サンプルを除去した後、それぞれのＲｖＴに対する特異性を有するマイクロチャネル１２０ａ〜ｄの各々に第２のモノクローナル抗体を導入する。
第２の抗体の各々は、当業者に周知の方法により、ホースラディッシュペルオキシダーゼでタグ付けされる。
第２のモノクローナル抗体は、反応ゾーン１５０ａ〜ｄの表面にキャプチャーされたＲｖＴと共にインキュベート可能である。
次いで、マイクロチャネル１２０ａ〜ｄは、再び洗浄される。
【０１４８】
次いで、入口ポート１４０ａ〜ｄを介してホースラディッシュペルオキシダーゼの基質をマイクロチャネル１２０ａ〜ｄの各々に導入する。
好適な基質は、当業者に公知であるが、本実施例では、ホースラディッシュペルオキシダーゼを作用させたときに蛍光を発するルミノールを使用する。
蛍光は、インターフェース１８０により受信されるシグナルを発生する、フォトダイオード１７５により検出される。
蛍光の強度は、チャネル１２０ａ〜ｄの各々において固定化されたＲｖＴに結合される第２の抗体の量の指標となる。
マイクロ流体デバイス１１０は、マイクロチャネル１２０ａ〜ｄの各々のＲｖＴレベルを定量できるように当業者に公知の方法で検量しうる。
【０１４９】
各マイクロチャネル１２０ａ〜ｄの蛍光強度を表すデータは、インターフェース１８０から、以上に記載の、第１のコンピューター２００に送信される。コンピューター２００は、上述したソフトウェアを実行して、フォトダイオード１７５により測定された蛍光強度からサンプルＢ中の各ＲｖＴのレベルを計算する。
【０１５０】
次いで、マイクロ流体デバイスは、この場合も好適な洗浄剤で洗浄される。
【０１５１】
以上の実施例２に記載のように、次いで、スタチンを患者Ｐに投与する。
好適には、スタチンは、その推奨された初回用量または維持用量に準拠して投与される。
スタチンの投与の詳細は以上に記載されるので、ここでは繰り返さない。
【０１５２】
適切な時間の後（たとえば２〜３時間後）、第２のサンプルＢを患者Ｐから得て、以上に記載のものに類似した他のマイクロ流体デバイス１１０を用いて試験する。
第２のサンプル中のＲｖＴレベルを同じように測定し、レベルを表すデータを計算して第１のコンピューター２００により記憶する。
【０１５３】
次いで、第１および第２のサンプル中のＲｖＴレベルを表すデータを、患者Ｐを同定する情報に関連付けて第１のコンピューター２００により第２のコンピューター４００に送信する。
【０１５４】
第２のコンピューター４００は、マイクロプロセッサー、メモリー、および記憶デバイスを含み、第１および第２のサンプル中のＲｖＴレベルの比較を行って第２のサンプル中のＲｖＴレベルが第１のサンプル中のレベルと比較して（生物学的関連量で）増加しているか否かを決定すべくソフトウェアを実行するように配置される。
第２のサンプル中のＲｖＴレベルが第１のサンプルと比べて増加している場合、スタチンは、患者Ｐにおいて炎症性障害を治療するのに有効であると評価され、このことを示すデータは、第２のコンピューターから第１のコンピューター２００に返信され、その保存および／または試験者への表示が行われる。
第１および第２のサンプル中のＲｖＴレベルの比較の結果に基づいて、患者にスタチンを処方しうる。
一方、第２のサンプル中のＲｖＴレベルが第１のサンプル中のレベルと比べて有意に増加していない場合、スタチンは、患者Ｐにおいて炎症性病態を治療するのに有効でないと評価される。
次いで、たとえば、翌日に異なるスタチンを用いて試験を繰り返しうる。
【０１５５】
本実施例では、マイクロ流体デバイス１１０は、非競合ヘテロジニアスＥＬＩＳＡサンドイッチイムノアッセイを行うように配置される。
しかしながら、本発明の変形形態では、マイクロ流体デバイスは、ホモジニアスイムノアッセイおよび／または競合イムノアッセイを行うように配置しうる。
【０１５６】
たとえば、一変形形態では、各マイクロチャネル１２０ａ〜ｄは、それぞれの反応ゾーン１５０ａ〜ｄで分析されるサンプルＢ中のものと同一のそれぞれのＲｖＴ（すなわち、ＲｖＴ１、ＲｖＴ２、ＲｖＴ３、またはＲｖＴ４）を用いて、そのそれぞれの反応ゾーン１５０ａ〜ｄ内の表面にコーティングを施しうる。
反応ゾーン１５０ａ〜ｄとサンプル採取ポート１２５との間の各マイクロチャネル１２０ａ〜ｄでは、サンプルＢとそれぞれのＲｖＴに対する既知量の一次抗体とを混合しうる。
一次抗体は過剰に提供され、その後、続いて、残留抗体は、サンプル中の対応するＲｖＴと効果的に競合して、反応ゾーン１５０ａ〜ｄの表面結合ＲｖＴと反応するであろう。
洗浄後、それぞれの一次抗体に特異的な入口ポート１４０ａ〜ｄを介して、標識二次抗を各反応ゾーン１５０ａ〜ｄに導入する。
以上に記載したように、二次抗体は、ＥＩＡに使用するのに好適な酵素、たとえば、ホースラディッシュペルオキシダーゼなどでタグ付けされる。
次いで、ホースラディッシュペルオキシダーゼに対する好適な基質を、反応ゾーン１５０ａ〜ｄに導入して、以上に記載のように蛍光または色の強度を測定することにより、サンプルとの反応後に残留する二次抗体の量を測定可能である。
【０１５７】
本発明に係るマイクロ流体デバイス、たとえば、以上に記載のマイクロ流体デバイス１１０などは、臨床現場即時検査（ポイントオブケア）環境で、たとえば、大きな実験室にのみ見いだされるＬＣ−ＭＳ／ＭＳなどのより精巧な装置にアクセスできないヘルスケア診療所などで、本発明の方法を実施するのに便利なデバイスを提供する。
【０１５８】
実施例４：脂質メディエーターの安定性を向上させる方法
ヒト血清をスナップ凍結して窒素下で貯蔵するか（以下の方法１）またはジュウテリウム標識内部標準を含有するメタノール中に配置するか（方法２）のどちらかを行った。
図１１に示されるインターバルで、脂質メディエーターを抽出して、指定の産物の濃度を決定した。次いで、これらと追加の処理を行うことなく、サンプルをスナップ凍結したときの既報の値（参照）とを比較した。結果は、ｎ＝１つの実験および３つの決定値の平均であり、図１１に例示される。
【０１５９】
方法１
ａ）適切な方法に従って血清を調製する。
ｂ）血清を採取して適切な容器に移す。
ｃ）適切な時間にわたりチューブを窒素でパージして血清の上のヘッドスペースの空気を窒素で置き換える。注：この工程は、サンプルを室温超の温度に暴露することなくサンプル採取直後に実施する必要がある。
ｄ）凍結するまで液体窒素中に配置することによりサンプルをただちにスナップ凍結する。
ｅ）チューブを適切な容器に移して−８０℃以下で貯蔵する。注：いずれの時点でもサンプルの解凍および再凍結を行なわない。
【０１６０】
方法２
ａ）各１ｍＬの血清に対して、メタノールを調製するために、各５００ｐｇのジュウテリウム標識内部標準を、４ｍｌの質量分析グレードのメタノールに添加する。
ｂ）使用前少なくとも１時間、−２０℃で貯蔵する。
ｃ）適切な方法に従って血清を調製する。
ｄ）血清を採取して、適切な容器に移す。
ｅ）１ｍＬの血清に対してジュウテリウム標識内部標準を含有するメタノール４ｍＬを添加する。
ｆ）サンプルをただちに処理する場合、脂質メディエーター抽出前少なくとも４５分間、これらを−２０℃で置く。
ｇ）サンプルを貯蔵する場合、これらを−８０℃以下で貯蔵する。
【０１６１】
参照方法
Ｃｏｌａｓ  ＲＡら．２０１４（ｉｂｉｄ）。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ−１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図５Ａ−５Ｃ】
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【図６Ａ−６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ−７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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