(57)【要約】  本願は、弱毒化した肺炎球菌菌株を含む薬剤学的組成物およびその炎症性疾患、呼吸器ウイルス感染、細菌感染性疾患またはアレルギー性疾患の予防または治療のための用途に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
弱毒化した肺炎球菌菌株を含む、炎症性疾患、呼吸器ウイルス感染疾患、肺炎球菌を除いた細菌感染性疾患またはアレルギー性疾患の予防または治療用薬剤学的組成物。
【請求項２】
前記弱毒化した肺炎球菌菌株は、配列番号１で表示されるｐｅｐ２７遺伝子核酸配列の１番〜５３番が欠失されたものである、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項３】
前記炎症性疾患は、喘息、気管支炎、肺炎、敗血症、鼻炎、炎症性腸疾患、胃腸炎、大腸炎、クローン病、すい臓炎、粥状動脈硬化症および関節炎から選択されるものである、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項４】
前記呼吸器ウイルスは、メタニューモウイルス、コロナウイルス、エンテロウイルス、呼吸器細胞融合ウイルス、アデノウイルス、ボカウイルス、ライノウイルスおよびインフルエンザウイルスから選択されるものである、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項５】
前記細菌感染性疾患は、グラム陽性菌感染性疾患およびグラム陰性菌感染性疾患から選択されるものである、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項６】
前記グラム陽性菌は、ブドウ球菌、連鎖球菌、破傷風菌および炭疽菌から選択され、前記グラム陰性菌は、サルモネラ菌、疫痢菌、肺炎桿菌、大腸菌およびコレラ菌から選択されるものである、請求項５に記載の薬剤学的組成物。
【請求項７】
前記アレルギー性疾患は、喘息、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、および慢性閉塞性肺疾患から選択されるアレルギー性呼吸器疾患である、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項８】
前記アレルギー性疾患は、じんましん、アレルギー性結膜炎、花粉症、アトピー、食品アレルギー、アレルギー性中耳炎、アナフィラキシーショック、接触性過敏症、アレルギー性接触性皮膚炎、細菌アレルギー、真菌アレルギー、ウイルスアレルギー、薬物アレルギーおよびアレルギー性脳炎から選択されるものである、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項９】
血清型−非依存的に免疫化させるものである、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１０】
前記弱毒化した肺炎球菌菌株は、Ｔｈ１サイトカインまたはＴｈ２サイトカインの生成を抑制する、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１１】
前記Ｔｈ１サイトカインは、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）から選択されるものであり、前記Ｔｈ２サイトカインは、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）から選択されるものである、請求項１０に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１２】
肺、脾臓、血液または脳に非侵襲性である、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１３】
腹腔内または粘膜内に投与するための、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１４】
咽喉粘膜内に投与するための、請求項１３に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１５】
薬剤学的に許容可能な担体または免疫補助剤をさらに含む、請求項１に記載の薬剤学的組成物。
【請求項１６】
弱毒化した肺炎球菌菌株を含む組成物を個体に投与する段階を含む炎症性疾患、呼吸器ウイルス感染疾患、肺炎球菌を除いた細菌感染性疾患またはアレルギー性疾患を治療する方法。
【請求項１７】
前記弱毒化した肺炎球菌菌株は、配列番号１で表示されるｐｅｐ２７遺伝子核酸配列の１番〜５３番が欠失されたものる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
弱毒化した肺炎球菌菌株の炎症性疾患、呼吸器ウイルス感染疾患、肺炎球菌を除いた細菌感染性疾患またはアレルギー性疾患治療用薬剤の製造に使用するための用途。
【請求項１９】
前記弱毒化した肺炎球菌菌株は、配列番号１で表示されるｐｅｐ２７遺伝子核酸配列の１番〜５３番が欠失されたものである、請求項１８に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、弱毒化した肺炎球菌菌株を含む薬剤学的組成物、およびその炎症性疾患、呼吸器ウイルス感染または細菌感染性疾患の予防または治療のための用途に関する。
【０００２】
また、本願は、弱毒化した肺炎球菌菌株を含む薬剤学的組成物、およびそのアレルギー性疾患の予防または治療のための用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
抗原を経鼻（ｎａｓａｌ）または経口（ｏｒａｌ）投与すると、調節Ｔ（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ；Ｔｒｅｇ）細胞が誘導され、これによって、標的臓器で粘膜免疫寛容が誘導されるという事実が知られている（Ｆａｒｉａ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，２００５）。マウスで粘膜免疫寛容が誘導されると、粥状動脈硬化症（Ｍａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ，２００２）を含む多様な自己免疫疾患が抑制されると報告された（Ｆａｒｉａ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，２００５）。したがって、粘膜免疫寛容原理は、動物およびヒトに適用され得る。抗原を複数回投与して粘膜を刺激すると、Ｔ細胞がＩＬ−１０やＴＧＦ−β１のような抗炎症性サイトカイン分泌を誘導して組織を防御して粘膜免疫寛容を誘導する（Ｆａｒｉａ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，２００５；Ｗｅｉｎｅｒ，２００１）。粘膜表面の免疫寛容を維持するために、特定類型のＴｒｅｇ細胞が優先的に誘導されるが、誘導機序は、まだ明確に知られていない。
【０００４】
ただし、現在の粘膜ワクチンは、免疫増加剤なしには十分な粘膜免疫反応を誘導するほど効能が強くないのが現状である。粘膜免疫増加剤（Ｍｕｃｏｓａｌ  ａｄｊｕｖａｎｔｓ）は、抗原投与だけでは免疫寛容誘導効率が低い場合に使用され、例えばコレラ毒素Ｂサブユニット（ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  Ｂ  ｓｕｂｕｎｉｔ；ＣＴＢ）がその例である（Ｆａｒｉａ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ，２００５）。しかしながら、咽喉接種後に現れるコレラ毒素の免疫増加効果は、細菌を認識して媒介され（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１６）、微生物系が必須の役割をすることを示すので、必要に応じて弱毒化した細菌を免疫増加剤として使用することが好ましいことを示す。すなわち、免疫増加剤のない粘膜ワクチンの概念は、まだ立証されていない。
【０００５】
また、粘膜ワクチンがワクチンの製造に使用された抗原と直接的に関連した病気外の多様な病気にも効果を示すことができるかについても、まだ報告されたことがなく、現在使用される免疫療法は、予防接種に使用される抗原のみに対して防御される。特に、肺炎球菌病気の予防のためには、２３価多糖類ワクチンや１３価接合ワクチンが使用されるが、２３価多糖類ワクチンは記憶反応がなく、１３価接合ワクチンは、９０種類以上の血清型のうち１３種類の血清型だけを防御することができる（Ｋａｌｉｎ，１９９８）。
【０００６】
喘息は、全世界的に子供と大人のいずれらにおいて最もありふれた慢性疾患の一つであり（Ａｎａｎｄａｎなど、２０１０）、全世界喘息患者の数は、概略３億人であって、これによって、莫大な医療費用が支出されている（ＷＨＯ，２００７）。全世界的に喘息患者の数は、毎年増加して、２０２５年まで１億人以上がさらに増加すると予測される。米国病気管理本部の統計によれば、米国喘息患者の比率は、１９８０年３．１％から２０１０年８．４％まで増加し、継続して増加する傾向にある（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ａｓｔｈｍａ）。また、７０％の喘息患者がアレルギーを持っている［ＧＩＮＡ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，２０１６］。２０１５年韓国での喘息患者は、１６６万人（健康保険審査評価院２０１５年統計）であり、韓国人の１０大慢性疾患のうち病気負担順位６位に該当する。
【０００７】
喘息およびその他アレルギー性疾患の発病は、西欧生活様式から始まった環境変化および都市化の増加と密接な関連がある（ＧＩＮＡ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，２０１６）。喘息は、発病原因が多様な異質な病気であるが、主に炎症により引き起こされる。喘息患者は、類似した症状を示すが、その作用機序はそれぞれ異なる（ＧＩＮＡ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，２０１６；Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｓｔｈｍａ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ，２００７）。また、気道の炎症様相は、喘息種類によって異なる（ＧＩＮＡ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，２０１６）。喘息の典型的な病因機序は、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）が媒介されて現れる好酸球気道炎症であり、病理学および喘息研究の多くの研究結果がＴｈ２関連後天的免疫反応に焦点を合わせてきた（ＧＩＮＡ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，２０１６）。しかしながら、最近の研究は、先天免疫とマイクロバイオーム、および体内の微生物などに集中している（Ｂｊｏｒｋｓｔｅｎなど、２００１；Ｋａｌｌｉｏｍａｋｉなど、２００１；Ｐｅｎｄｅｒｓなど、２００７；Ｈｉｌｔｙなど、２０１０；Ｇｒｅｅｎなど、２０１４；Ｏｚｔｕｒｋなど、２０１７）。
【０００８】
米国喘息およびアレルギー財団（Ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａａｆａ．ｏｒｇ／）によれば、現在使用される喘息関連薬物は、症状を軽減させて管理することができるだけであり、喘息を完治させることはできない。喘息の特徴は、アレルギー性過敏反応（ａｉｒｗａｙ  ｈｙｐｅｒ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ；ＡＨＲ）で過度な気管支収縮反応が起こることである。たとえ吸入グルココルチコイドステロイドを規則的に使用して死亡率が去る数年の間顕著に減少したが、まだ毎年約２５０，０００人が喘息で死亡していて、世界的に喘息による負担が非常に大きい（Ｓｕｉｓｓａなど、２０００）。喘息は、発病回数によって軽症（一ヶ月に１〜２回発生）、重軽症（毎週１〜２回発生）、および重症（毎日喘息発生）に分類され、重症の場合、３〜４個の薬を毎日服用しなければならず、軽症の場合にも、定期的な薬の服用が要求される。喘息は、呼吸器炎症で気管支が収縮して、呼吸が困るときには、気道拡張用吸入剤を直ちに噴霧しなければならない。また、喘息患者および重症喘息患者の一部は、副腎皮質ホルモンに対して全く反応がなくて、臨床的効果を経験せずに、疾患で苦労したり死亡することもある（Ｄｕｒｈａｍなど、２０１１）。最近発売された抗ＩＬ−５製剤は、４週に一回注射して喘息症状を緩和させることができる。しかしながら、喘息を完治させることができるかまたは予防することができる薬物は、まだ開発されたり報告されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
腸疾患、感染、粥状動脈硬化症および上皮病変のような炎症性因子を含む炎症性疾患に対する予防および治療方法が開発されたことがあるが、これは、依然として炎症を起こしたり病気を誘発する特定のマーカーを利用することに限定されてきた。これと関連して、粘膜免疫は、粘膜関連疾患および炎症性疾患を抑制すると予想されたので、本願では、肺炎球菌全菌ワクチンの粘膜免疫を利用した多様な病気に対する抗炎症療法およびその他疾患に対する防御方法を新しく提示しようとした。また、粘膜免疫の免疫寛容特性を利用した粘膜投与ワクチンが、腸炎症および感染疾患などを予防または治療する新しい方法になり得るを立証しようとした。
【００１０】
また、本願では、粘膜に肺炎球菌全菌ワクチンを接種することによって、広範囲な炎症性疾患、例えば腸の炎症、呼吸器感染および炎症で誘発される病変はもちろん、呼吸器ウイルスおよび細菌感染性疾患に対しても保護できる新しい方法を開発しようとした。
【００１１】
また、現在使用される喘息薬は、狭くなった気管支を拡張させる症状緩和剤（気管支拡張剤）と気管支炎症を抑制して喘息発作を予防する病気調節剤（抗炎症剤）に区分されるが、これらは、喘息を完治したり予防することはできない。したがって、本願では、喘息を含むアレルギー性疾患を予防または治療できる新規の手段として肺炎球菌を含む薬剤学的組成物を提供しようとした。特に、肺炎球菌をワクチンなどの薬剤学的組成物に使用時に毒性が強くて不活性化した菌を使用したり、菌の特定成分だけを分離精製して使用した短所を改善するために、十分に弱毒化して、咽喉感染、腹腔内注入および血液内注入時にも安全性を確保することができる弱毒化肺炎球菌菌株を含む薬剤学的組成物を提供しようとした。
【００１２】
しかしながら、本願が解決しようとする課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から通常の技術者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本願は、弱毒化した肺炎球菌菌株を含む、炎症性疾患、呼吸器ウイルス感染疾患、または肺炎球菌を除いた細菌感染性疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供しようとする。
【００１４】
また、本願では、ｐｅｐ２７遺伝子の変異で弱毒化した肺炎球菌菌株の、アレルギー性呼吸器疾患を含む多様なアレルギー性疾患の予防または治療のための用途、およびそのために薬剤学的組成物を提供しようとする。
【００１５】
上述した課題解決手段は、単に例示的なものであって、本発明を制限しようとする意図と解すべきものではない。上述した例示的な具現例の他にも、図面および発明の詳細な説明に記載された追加的な具現例および実施例が存在することができる。
【発明の効果】
【００１６】
本願発明によれば、肺炎球菌全菌ワクチンを粘膜に接種することによって、肺および脾臓で免疫化により誘導される遺伝子によって炎症関連疾患を予防および／または治療することができる。
【００１７】
特に、既存のワクチンは、特定の抗原成分に対する防御だけを提供することができるが、本願発明によって肺炎球菌粘膜ワクチンを使用する場合、ウイルスおよび細菌感染性疾患だけでなく、他の臓器の炎症疾患の防御能を含む広範囲な病気の予防および／または治療効果を期待することができる。また、本願発明による肺炎球菌全菌ワクチンは、粘膜に投与時に既存の粘膜ワクチンとは異なって、免疫補助剤（ａｄｊｕｖａｎｔ）を使わずとも、多様な疾患に対して防御効果を提供することができる。
【００１８】
本願発明は、肺炎球菌ｐｅｐ２７変異株を利用して喘息をはじめとするアレルギー疾患の予防ないし治療方法を提供することができる。特に、肺炎球菌ｐｅｐ２７変異株の接種によって喘息、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、および慢性閉塞性肺疾患などを含むアレルギー性呼吸器疾患の他にも、じんましん、結膜炎、花粉症およびアトピーなどのような他のアレルギー性疾患を予防したり治療することができる。
【００１９】
さらに、本願発明による肺炎球菌ｐｅｐ２７変異株は、十分に弱毒化していて、咽喉感染、腹腔内注入および血液内注入時にも安全性が確保されるという長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本願の一実施例による肺（図１）および脾臓（図２）でのシステム生物学分析による肺炎球菌ワクチン機能分析結果の概略図である。マウスをＴＨｐｅｐ２７突然変異体（Δｐｅｐ２７）で２週間隔で３回免疫化し、最終免疫化２週後、肺および脾臓を収穫した後、トータルＲＮＡを抽出して高速大量シーケンシングを実施し、次に、遺伝子発現をＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓで分析した。図１で、免疫化した肺組織の遺伝子は、胃腸炎および大腸の異常を抑制することを提示し、図２で、脾臓の遺伝子は、インフルエンザウイルス感染に対する保護効果を示す。
【図２】本願の一実施例による肺（図１）および脾臓（図２）でのシステム生物学分析による肺炎球菌ワクチン機能分析結果の概略図である。マウスをＴＨｐｅｐ２７突然変異体（Δｐｅｐ２７）で２週間隔で３回免疫化し、最終免疫化２週後、肺および脾臓を収穫した後、トータルＲＮＡを抽出して高速大量シーケンシングを実施し、次に、遺伝子発現をＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓで分析した。図１で、免疫化した肺組織の遺伝子は、胃腸炎および大腸の異常を抑制することを提示し、図２で、脾臓の遺伝子は、インフルエンザウイルス感染に対する保護効果を示す。
【図３】本願の一実施例による肺でのシステム生物学分析結果の概略図である。マウスに２週間隔でΔｐｅｐ２７変異株を咽喉で３回接種し、最後のワクチン接種後７日目に、ｍＲＮＡを肺から分離し、高速大量シーケンシングを実施した。肺の配列データに対するＩＰＡネットワーク分析を示したものであり、ＩＬ−６、ＩＬ−２３Ｒ、ＭＵＣ２、ＩＦＮ  ｔｙｐｅ  １、ＴＧＦ  ｂｅｔａなどが誘導されるが、ＣＣＲ３は抑制されることを意味する。
【図４】本願の一実施例によってマウスにΔｐｅｐ２７を接種してＴｒｅｇ細胞が誘導されるかを確認した実験結果である。図４は、マウス（ｎ＝３）に２週間隔でΔｐｅｐ２７を咽喉で３回接種し、最後のワクチン接種後７日目に脾臓細胞を分離し、Ｔｈ１（ＣＤ４，Ｔｂｅｔ）、Ｔｈ２（ＣＤ４，ＧＡＴＡ３）、Ｔｈ１７（ＣＤ４，ＲＯＲγｔ）およびＴｒｅｇ（ＣＤ４，Ｆｏｘｐ３）に対する蛍光細胞マーカーで標識したものである。その後、マーカーを流動細胞計測法で検出した。図５および図６は、最後のワクチン接種後７日目に、脾臓細胞（図５）または血清（図６）のサイトカインをＥＬＩＳＡで測定した結果である。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡで分析した；＊、Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図５】本願の一実施例によってマウスにΔｐｅｐ２７を接種してＴｒｅｇ細胞が誘導されるかを確認した実験結果である。図４は、マウス（ｎ＝３）に２週間隔でΔｐｅｐ２７を咽喉で３回接種し、最後のワクチン接種後７日目に脾臓細胞を分離し、Ｔｈ１（ＣＤ４，Ｔｂｅｔ）、Ｔｈ２（ＣＤ４，ＧＡＴＡ３）、Ｔｈ１７（ＣＤ４，ＲＯＲγｔ）およびＴｒｅｇ（ＣＤ４，Ｆｏｘｐ３）に対する蛍光細胞マーカーで標識したものである。その後、マーカーを流動細胞計測法で検出した。図５および図６は、最後のワクチン接種後７日目に、脾臓細胞（図５）または血清（図６）のサイトカインをＥＬＩＳＡで測定した結果である。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡで分析した；＊、Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図６】本願の一実施例によってマウスにΔｐｅｐ２７を接種してＴｒｅｇ細胞が誘導されるかを確認した実験結果である。図４は、マウス（ｎ＝３）に２週間隔でΔｐｅｐ２７を咽喉で３回接種し、最後のワクチン接種後７日目に脾臓細胞を分離し、Ｔｈ１（ＣＤ４，Ｔｂｅｔ）、Ｔｈ２（ＣＤ４，ＧＡＴＡ３）、Ｔｈ１７（ＣＤ４，ＲＯＲγｔ）およびＴｒｅｇ（ＣＤ４，Ｆｏｘｐ３）に対する蛍光細胞マーカーで標識したものである。その後、マーカーを流動細胞計測法で検出した。図５および図６は、最後のワクチン接種後７日目に、脾臓細胞（図５）または血清（図６）のサイトカインをＥＬＩＳＡで測定した結果である。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡで分析した；＊、Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図７】本願の一実施例によってマウスにΔｐｅｐ２７を接種してＩＬ−１０およびＩＬ−１７を誘導した実験結果である。マウス（ｎ＝３）に２週間隔でΔｐｅｐ２７を咽喉に３回ワクチン接種し、最後のワクチン接種後７日目にｍＲＮＡを肺から分離してｑＰＣＲを利用してＩＬ−１７（図７）とＩＬ−１０（図８）遺伝子水準発現の測定に使用した。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡで分析した；＊、Ｐ＜０．０５。
【図８】本願の一実施例によってマウスにΔｐｅｐ２７を接種してＩＬ−１０およびＩＬ−１７を誘導した実験結果である。マウス（ｎ＝３）に２週間隔でΔｐｅｐ２７を咽喉に３回ワクチン接種し、最後のワクチン接種後７日目にｍＲＮＡを肺から分離してｑＰＣＲを利用してＩＬ−１７（図７）とＩＬ−１０（図８）遺伝子水準発現の測定に使用した。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡで分析した；＊、Ｐ＜０．０５。
【図９】本願の一実施例によってマウスにΔｐｅｐ２７を接種して脾臓で中央記憶Ｔ細胞とメモリＴｆｈ細胞を活性化した実験結果である。マウス（ｎ＝３）に２週間隔でΔｐｅｐ２７を咽喉に３回接種し、最後の予防接種７日後脾臓細胞を分離して中心記憶Ｔ細胞（ＣＤ４、ＣＣＲ７、ＣＤ６２Ｌ）および記憶Ｔｆｈ細胞（ＣＤ４、ＣＸＣＲ５、ＣＣＲ７）に対する蛍光細胞マーカーで標識した。以後、蛍光マーカーを流動細胞計測法で検出した。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡで分析した；＊、Ｐ＜０．０５。
【図１０】本願の一実施例によってマウスにΔｐｅｐ２７を接種して多様な免疫グロブリンと亜型を誘導した実験結果である。マウス（ｎ＝６）に２週間隔でΔｐｅｐ２７を咽喉に３回接種し、最後のワクチン接種後７日目に血清（図１０）と気管支肺胞洗浄液ＢＡＬ（図１１）で三つの類型の肺炎球菌全体細胞に対する抗体力価を測定した。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡで分析した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図１１】本願の一実施例によってマウスにΔｐｅｐ２７を接種して多様な免疫グロブリンと亜型を誘導した実験結果である。マウス（ｎ＝６）に２週間隔でΔｐｅｐ２７を咽喉に３回接種し、最後のワクチン接種後７日目に血清（図１０）と気管支肺胞洗浄液ＢＡＬ（図１１）で三つの類型の肺炎球菌全体細胞に対する抗体力価を測定した。統計的有意性は、ＡＮＯＶＡで分析した；＊Ｐ＜０．０５、＊＊、Ｐ＜０．０１。
【図１２】本願の一実施例によってΔｐｅｐ２７接種がインフルエンザ感染後の２次肺炎球菌感染を防御することができるかを確認した実験結果である。マウス（９〜１０／グループ）を１週間隔でΔｐｅｐ２７で３回咽喉接種し、最終免疫化１週間後、マウスの咽喉にインフルエンザウイルスを感染させた後、眼窩採血してサイトカインを分析したり（図１２）、最終免疫化１週後にマウスから血清を回収して特定抗原（図１３）に対するＩｇＧ水準をＥＬＩＳＡで測定した。二つの群間の有意な差異は、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔで分析した；＊＊＊ｐ＜０．００１。インフルエンザ感染１０日後、肺炎球菌Ｄ３９を鼻腔内経路を介して感染させた後、生存を１４日間モニタリングした（図１４）。統計的有意性は、Ｍｅｎｔｅｌ−ｃｏｘ  ｔｅｓｔで分析した；＊＊ｐ＜０．００５。肺炎球菌Ｄ３９感染２４時間後、肺均質物を血清で培養して細菌数（図１５）を測定した。統計的有意性は、Ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで分析した。
【図１３】本願の一実施例によってΔｐｅｐ２７接種がインフルエンザ感染後の２次肺炎球菌感染を防御することができるかを確認した実験結果である。マウス（９〜１０／グループ）を１週間隔でΔｐｅｐ２７で３回咽喉接種し、最終免疫化１週間後、マウスの咽喉にインフルエンザウイルスを感染させた後、眼窩採血してサイトカインを分析したり（図１２）、最終免疫化１週後にマウスから血清を回収して特定抗原（図１３）に対するＩｇＧ水準をＥＬＩＳＡで測定した。二つの群間の有意な差異は、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔで分析した；＊＊＊ｐ＜０．００１。インフルエンザ感染１０日後、肺炎球菌Ｄ３９を鼻腔内経路を介して感染させた後、生存を１４日間モニタリングした（図１４）。統計的有意性は、Ｍｅｎｔｅｌ−ｃｏｘ  ｔｅｓｔで分析した；＊＊ｐ＜０．００５。肺炎球菌Ｄ３９感染２４時間後、肺均質物を血清で培養して細菌数（図１５）を測定した。統計的有意性は、Ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで分析した。
【図１４】本願の一実施例によってΔｐｅｐ２７接種がインフルエンザ感染後の２次肺炎球菌感染を防御することができるかを確認した実験結果である。マウス（９〜１０／グループ）を１週間隔でΔｐｅｐ２７で３回咽喉接種し、最終免疫化１週間後、マウスの咽喉にインフルエンザウイルスを感染させた後、眼窩採血してサイトカインを分析したり（図１２）、最終免疫化１週後にマウスから血清を回収して特定抗原（図１３）に対するＩｇＧ水準をＥＬＩＳＡで測定した。二つの群間の有意な差異は、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔで分析した；＊＊＊ｐ＜０．００１。インフルエンザ感染１０日後、肺炎球菌Ｄ３９を鼻腔内経路を介して感染させた後、生存を１４日間モニタリングした（図１４）。統計的有意性は、Ｍｅｎｔｅｌ−ｃｏｘ  ｔｅｓｔで分析した；＊＊ｐ＜０．００５。肺炎球菌Ｄ３９感染２４時間後、肺均質物を血清で培養して細菌数（図１５）を測定した。統計的有意性は、Ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで分析した。
【図１５】本願の一実施例によってΔｐｅｐ２７接種がインフルエンザ感染後の２次肺炎球菌感染を防御することができるかを確認した実験結果である。マウス（９〜１０／グループ）を１週間隔でΔｐｅｐ２７で３回咽喉接種し、最終免疫化１週間後、マウスの咽喉にインフルエンザウイルスを感染させた後、眼窩採血してサイトカインを分析したり（図１２）、最終免疫化１週後にマウスから血清を回収して特定抗原（図１３）に対するＩｇＧ水準をＥＬＩＳＡで測定した。二つの群間の有意な差異は、ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔで分析した；＊＊＊ｐ＜０．００１。インフルエンザ感染１０日後、肺炎球菌Ｄ３９を鼻腔内経路を介して感染させた後、生存を１４日間モニタリングした（図１４）。統計的有意性は、Ｍｅｎｔｅｌ−ｃｏｘ  ｔｅｓｔで分析した；＊＊ｐ＜０．００５。肺炎球菌Ｄ３９感染２４時間後、肺均質物を血清で培養して細菌数（図１５）を測定した。統計的有意性は、Ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで分析した。
【図１６】本願の一実施例によってΔｐｅｐ２７ワクチンのインフルエンザウイルス複製抑制による防御効果を実験したものである。マウス（１０匹／群）咽喉にインフルエンザウイルスを感染させた後、マウスの体重を１１日間観察した（図１６）。統計的有意性はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで分析した；＊＊＊ｐ＜０．００１。インフルエンザ感染５日後、肺均質物の上澄み液を収穫した後、各群のウイルス力価をＴＣＩＤ５０／ｍｌで測定した（図１７）。有意性は、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで分析した；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１７】本願の一実施例によってΔｐｅｐ２７ワクチンのインフルエンザウイルス複製抑制による防御効果を実験したものである。マウス（１０匹／群）咽喉にインフルエンザウイルスを感染させた後、マウスの体重を１１日間観察した（図１６）。統計的有意性はｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで分析した；＊＊＊ｐ＜０．００１。インフルエンザ感染５日後、肺均質物の上澄み液を収穫した後、各群のウイルス力価をＴＣＩＤ５０／ｍｌで測定した（図１７）。有意性は、ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡで分析した；＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１８】本願の一実施例によってΔｐｅｐ２７接種がグラム陰性細菌感染を予防することができるかを実験した結果である。マウス（３匹／群）鼻腔経路を通じてΔｐｅｐ２７を３回接種し、最終免疫化１０日後、マウスに肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を感染させた。肺炎桿菌感染２４時間後、各臓器の菌数は、血液寒天に塗抹培養して決定した；＊＊Ｐ＜０．０１。
【図１９】本願の一実施例によってΔｐｅｐ２７接種がグラム陽性細菌感染を予防することができるかを実験した結果である。マウス（３匹／群）鼻腔でΔｐｅｐ２７を３回免疫化させ、最終免疫化１０日後、マウスに黄色葡萄状球菌を感染させた。黄色葡萄状球菌感染２４時間後、各臓器の菌数を血液寒天に塗抹、培養して測定した；＊Ｐ＜０．０５。
【図２０】本願の一実施例によってΔｐｅｐ２７接種がデキストランサルフェートナトリウム（ＤＳＳ）で誘導される炎症性腸疾患で体重減少を抑制するかを実験した結果である。Δｐｅｐ２７変異体をマウス（ｎ＝５匹／群）鼻腔に３回接種した後、経口経路を通じて飲用水に５％ＤＳＳを投与して誘導される大腸炎（炎症性腸疾患）で体重減少が緩和された（図２０）。基礎体重減少百分率の時間経過をＤＳＳで処理して９日間観察した。統計的有意性は、ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ分析後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｔｅｓｔを行った。臨床病気活動指数は、９日目に治療が中断されるまで毎日評価した（図２１）。大腸炎の進行は、体重減少、便の一貫性、直腸出血および／または便での血液量を測定して評価した。マウスの病的状態（立毛［ｐｉｌｏｅｒｅｃｔｉｏｎ］、昏睡状態）に対しても毎日観察した。
【図２１】本願の一実施例によってΔｐｅｐ２７接種がデキストランサルフェートナトリウム（ＤＳＳ）で誘導される炎症性腸疾患で体重減少を抑制するかを実験した結果である。Δｐｅｐ２７変異体をマウス（ｎ＝５匹／群）鼻腔に３回接種した後、経口経路を通じて飲用水に５％ＤＳＳを投与して誘導される大腸炎（炎症性腸疾患）で体重減少が緩和された（図２０）。基礎体重減少百分率の時間経過をＤＳＳで処理して９日間観察した。統計的有意性は、ｏｎｅ  ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ分析後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｔｅｓｔを行った。臨床病気活動指数は、９日目に治療が中断されるまで毎日評価した（図２１）。大腸炎の進行は、体重減少、便の一貫性、直腸出血および／または便での血液量を測定して評価した。マウスの病的状態（立毛［ｐｉｌｏｅｒｅｃｔｉｏｎ］、昏睡状態）に対しても毎日観察した。
【図２２】本願の一実施例によってΔｐｅｐ２７接種がデキストランサルフェートナトリウム（ＤＳＳ）で誘導される結腸炎症を予防することができるかを実験した結果である。Δｐｅｐ２７変異体をマウス（ｎ＝５匹／群）鼻腔で３回接種した後、経口経路を介して飲用水に５％ＤＳＳを添加して投与することによって誘導される大腸炎（炎症性腸疾患）で体重減少が緩和された（図２０）。ＤＳＳ処理９日目に結腸を検査した。ＤＳＳ処理９日目には、結腸の長さ（図２２）および重さ（図２３）を測定した。
【図２３】本願の一実施例によってΔｐｅｐ２７接種がデキストランサルフェートナトリウム（ＤＳＳ）で誘導される結腸炎症を予防することができるかを実験した結果である。Δｐｅｐ２７変異体をマウス（ｎ＝５匹／群）鼻腔で３回接種した後、経口経路を介して飲用水に５％ＤＳＳを添加して投与することによって誘導される大腸炎（炎症性腸疾患）で体重減少が緩和された（図２０）。ＤＳＳ処理９日目に結腸を検査した。ＤＳＳ処理９日目には、結腸の長さ（図２２）および重さ（図２３）を測定した。
【図２４】本願の一実施例によってΔｐｅｐ２７接種が大腸で炎症性サイトカイン遺伝子発現を抑制するかを実験した結果である。Ｂａｌｂ  ｃマウスに１４日間飲用水に５％ＤＳＳを添加して炎症性腸疾患を誘導した。ＰＢＳ＋水は、陰性対照群に使用した。ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−１７ＡおよびＴＮＦ−αのｍＲＮＡ発現をリアルタイム定量的ＰＣＲを使用して測定した。実験値は、平均±ＳＥＭで表示され、Ｐ＜０．０５は、有意性があるものと見なした。
【図２５】本願の一実施例によるΔｐｅｐ２７変異株のアレルギー疾患予防効果実験のフローチャート（Ａ）および多様なアレルギー誘発サイトカイン分泌抑制効果を示す実験結果（Ｂ）である。
【図２６】本願の一実施例によるΔｐｅｐ２７変異株のアレルギー疾患予防効果を見せる組織化学的染色結果である。
【図２７】本願の一実施例によるΔｐｅｐ２７変異株のアレルギー疾患治療効果実験のフローチャート（Ａ）および多様なアレルギー誘発サイトカイン分泌抑制効果を示す実験結果（Ｂ）である。
【図２８】本願の一実施例によるΔｐｅｐ２７変異株のアレルギー疾患治療効果を示す組織化学的染色結果である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下では、添付の図面を参照して本願の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施することができるように本願の実施例を詳細に説明する。しかしながら、本願は、様々な異なる形態で具現され得、ここで説明する実施例に限定されない。そして、図面において本願を明確に説明するために説明と関係ない部分は省略した。
【００２２】
本願明細書の全体のおいて、任意の部分が或る構成要素を「含む」というとき、これは、特に反対される記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。
【００２３】
本願明細書の全体で使用される程度の用語「約」、「実質的に」等は、言及された意味に固有な製造および物質許容誤差が提示されるとき、その数値でまたはその数値に近接した意味として使用され、本願の理解を助けるために正確または絶対的な数値が言及された開示内容を非良心的な侵害者が不当に利用するのを防止するために使用される。本願明細書の全体で使用される程度の用語「〜（する）段階」または「〜の段階」は、「〜のための段階」を意味しない。
【００２４】
本願明細書の全体において、マーカッシュ形式の表現に含まれた「これらの組合せ」の用語は、マーカッシュ形式の表現に記載された構成要素よりなる群から選択される一つ以上の混合または組合せを意味するものであって、前記構成要素よりなる群から選択される一つ以上を含むことを意味する。
【００２５】
本願明細書の全体において、「Ａおよび／またはＢ」の記載は、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢ」を意味する。
【００２６】
本願明細書の全体において、「肺炎球菌」は、肺球菌または肺炎双球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）とも命名されるグラム陽性（Ｇｒａｍ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細菌であって、時間が過ぎて分裂するにつれて菌が継続して連なって鎖状になることが観察されて、連鎖球菌科に分類され、肺炎の主な原因と知られている。
【００２７】
本願明細書の全体において、「ｐｅｐ２７」は、２７個のポリペプチドから構成されており、ｖｅｘ伝達体（ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ）により分泌されて、生長抑制および細胞死滅（ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）を誘導するが、具体的には、膜−結合ヒスチジンタンパク質キナーゼ（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）であるｖｎｃＳおよび細胞質エフェクター（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ）である反応調節子（ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ）ｖｎｃＲにより発現が調節されて、細胞死滅を誘導するものと知られている（Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。ｐｅｐ２７遺伝子またはそれからコーディングされるタンパク質は、肺炎球菌の血清型ごとに異なる名前と命名され、ｐｅｐ２７の遺伝子配列またはそのペプチド配列の微差が存在することができるが、前記記述したように、本発明のｐｅｐ２７遺伝子は、実質的にｐｅｐ２７と同じ機能を行う遺伝子であれば、血清型に制限されず、これを損傷させることによって、本発明の弱毒化した肺炎球菌菌株を製造することができる。好ましくは、前記ｐｅｐ２７遺伝子と実質的に同じ機能を行う肺炎球菌の遺伝子を全部含む。より好ましくは、本発明のｐｅｐ２７遺伝子は、配列番号１で表示されるｐｅｐ２７ペプチドのアミノ酸をコーディングする遺伝子が突然変異されることによって損傷することがある。
【００２８】
本願明細書の全体において、「弱毒化」とは、毒性のある菌株が変形前より少なく毒性のある菌株であるか、弱い病原菌になる方式で変形することを意味し、このような菌株は、宿主内で依然として複製分裂することができる間、臨床的病気を誘発することができる能力が顕著に減少したことをいう。好ましくは、本発明の弱毒化した菌株は、毒性または病原性がワクチン用に投与を許容できるほど減少した菌株であり、より好ましくは、菌株が宿主内で依然として複製することができながらも、臨床的病気を誘発することができない程度まで弱毒化させることを意味する。また、弱毒化突然変異は、本発明の弱毒化突然変異を製造するための多様な方法、例えば点突然変異、関連したウイルス間の配列交換、またはヌクレオチド欠失により達成され得る。
【００２９】
本願明細書の全体において、「突然変異」は、遺伝子の遺伝的機能を変化させるすべての行為を意味し、具体的には、遺伝子の突然変異は、生物の様々な変異のうち遺伝子の量的または質的な変化によりできた変異をいう。
【００３０】
本願明細書の全体において、「アレルギー」は、人体の或る物質に対する過敏症、すなわち外部から入ってきた物質に対する身体免疫系の過度な反応により誘発される多様な疾患、病気または異常事態を意味する。本願の組成物に適用されるアレルギー疾患としては、好ましくは、第Ｉ型即時型過敏反応および第ＩＶ型遅延型過敏反応である。第Ｉ型即時型過敏反応は、気管支喘息、鼻炎、アトピー性皮膚炎、結膜炎、中耳炎、じんましんおよびアナフィラキシーショック（ａｎａｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ｓｈｏｃｋ）を含むことができ、第ＩＶ型遅延型過敏反応は、接触性過敏症、接触性皮膚炎、細菌アレルギー、真菌アレルギー、ウイルスアレルギー、薬物アレルギー、甲状腺炎およびアレルギー性脳炎を含むことができる。第Ｉ型即時型過敏反応は、２段階に分けられ、第１段階は、アレルゲンの体内侵入によってＩｇＥおよびＩｇＧ１の分泌を抑制し、ＩｇＧ２ａの分泌を増加させるＩＬ−１２およびＩＦＮ−γを生産するＴｈ１細胞反応とＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３等を生産するＴｈ２細胞反応の均衡がＴｈ２側に偏ると、Ｔｈ２の過度な免疫反応によりＩＬ−４およびＩＬ−１３等が分泌され、その影響によってＢ細胞が生産したＩｇＥ特異抗体が肥満細胞（ｍａｓｔ  ｃｅｌｌ）および好塩基球（ｂａｓｏｐｈｉｌ）の表面に付着することによって、アレルギー発症が準備された段階である。これをアレルゲンに減作（ｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）されたという。アレルギー発症の第２段階は、初期反応と後期反応に分けられ、初期反応は、アレルゲンが体内に再侵入して肥満細胞を刺激し、脱顆粒反応を誘発し、この際、放出された、ヒスタミン、脂質代謝物、サイトカインなどによる血管拡張などが起こるものであり、後期反応は、当該組織に好中球、好酸球、大食細胞、Ｔｈ２細胞、好塩基球などが浸潤して活性化することによって、炎症が誘発されて、アトピー皮膚炎、鼻炎、喘息などを起こすものである。
【００３１】
本願明細書の全体において、「予防」とは、組成物の投与によって疾患の発病を抑制または遅延させるすべての行為を意味する。
【００３２】
本願明細書の全体において、「治療」とは、組成物の投与によってすでに誘発された疾患の症状が好転されるか、有利になるすべての行為を意味する。
【００３３】
本願明細書の全体において、「ワクチン」とは、感染疾患を予防するための免疫のために使用される抗原であって、弱毒化させた微生物またはウイルスとして製造され、特定の感染症に対して人工的に免疫原性を収穫するために弱化させたり死滅させた病原微生物を個体内に投与することを意味する。ワクチンによって刺激を受ければ、個体内の免疫システムが作動して抗体を生成することになり、その感受性を維持する間、再感染が起こる場合、はやい時間内に抗体を効果的に生成することによって疾患を克服できることになる。ただし、本願発明による弱毒化した肺炎球菌を含むワクチンは、免疫寛容原理によって既存のワクチンとは異なって、特定抗原成分に対する防御だけでなく、ウイルスおよび細菌感染性疾患を含む広範囲な病気の予防および治療効果を有することができる。
【００３４】
本願明細書の全体において、「ｅｒｍＢ」は、マクロライド（ｍａｃｒｏｌｉｄｅ）に耐性を有することができるようにする遺伝子を意味し、マクロライドは、肺炎球菌の治療においてペニシリンの代替薬剤として使用されてきたものであって、エリスロマイシン（ｅｒｙｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、クラリスロマイシン（ｃｌａｒｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）、アジスロマイシン（ａｚｉｔｈｒｏｍｙｃｉｎ）等がこれに属する。
【００３５】
以下、本願の弱毒化した肺炎球菌菌株を含む薬剤学的組成物、およびその炎症性疾患、呼吸器ウイルス感染または細菌感染性疾患の予防または治療のための用途に対して具現例および実施例と図面を参照して具体的に説明することとする。しかしながら、本願がこのような具現例および実施例と図面に制限されるものではない。
【００３６】
本願の第１態様は、弱毒化した肺炎球菌菌株を含む、炎症性疾患、呼吸器ウイルス感染疾患、または肺炎球菌を除いた細菌感染性疾患の予防または治療用薬剤学的組成物を提供することができる。例えば、前記薬剤学的組成物はワクチン組成物を含むことができる。
【００３７】
本願の一具現例によれば、前記弱毒化した肺炎球菌菌株は、ｐｅｐ２７遺伝子の一部または全部が欠失されたものであってもよく、例えば、配列番号１で表示されるｐｅｐ２７遺伝子核酸配列の１番〜５３番が欠失されたものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００３８】
本願の一具現例によれば、前記弱毒化した肺炎球菌菌株は、配列番号１で表示されるｐｅｐ２７遺伝子核酸配列の１番〜５３番の欠失およびｅｒｍＢカセットで置換した突然変異を含む弱毒化した肺炎球菌菌株であってもよいが、これに制限されるものではない。例えば、前記弱毒化した肺炎球菌菌株は、韓国特許登録第１０−１２５２９１１号に開示されたｐｅｐ２７突然変異を含む弱毒化した肺炎球菌菌株であってもよい。
【００３９】
本願の一具現例によれば、前記炎症性疾患は、喘息、気管支炎、鼻炎、炎症性腸疾患、胃腸炎、大腸炎、クローン病、すい臓炎、粥状動脈硬化症および関節炎から選択されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。例えば、炎症性疾患の予防または治療は、大腸炎症遺伝子のような炎症関連遺伝子の発現抑制による効果であってもよい。例えば、前記炎症性疾患は、腸および呼吸器感染疾患に関連したものであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００４０】
例えば、前記呼吸器ウイルスは、メタニューモウイルス、コロナウイルス、エンテロウイルス、呼吸器細胞融合ウイルス、アデノウイルス、ボカウイルス、ライノウイルスおよびインフルエンザウイルスから選択されるものであってもよい。前記呼吸器ウイルス感染疾患の予防または治療は、ウイルスの複製抑制による効果であってもよい。
【００４１】
例えば、前記インフルエンザウイルスは、インフルエンザＡ型、Ｂ型またはＣ型であってもよく、具体的な亜型の種類に制限されない。
【００４２】
また、本願の薬剤学的組成物は、ウイルス非特異的防御機能も提供することができるが、この場合、インフルエンザだけでなく、他のウイルス、例えば、これに制限されないが、呼吸器細胞融合ウイルス（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）および鼻風邪ウイルス（Ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）を含むウイルスに対する防御機能も提供することができる。
【００４３】
本願の一具現例によれば、前記細菌感染性疾患は、グラム陽性菌感染性疾患、グラム陰性菌感染性疾患およびその他感染性細菌疾患から選択されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。例えば、細菌感染性疾患の予防または治療は、グラム陽性菌および／またはグラム陰性菌の感染抑制による効果であってもよい。
【００４４】
本願の一具現例によれば、前記グラム陽性菌は、ブドウ球菌、連鎖球菌、破傷風菌および炭疽菌から選択され、前記グラム陰性菌は、サルモネラ菌、疫痢菌、肺炎桿菌、大腸菌およびコレラ菌から選択されるものであってもよいが、これに制限されるものではない。
例えば、前記グラム陽性菌は、黄色ブドウ球菌であってもよい。
【００４５】
本願の一具現例によれば、前記薬剤学的組成物は、血清型−非依存的に免疫化させるものであってもよいが、これに制限されるものではない。前記血清型−非依存的に免疫化させる薬剤学的組成物は、抗原に特異的に抗体を生産するものではなく、抗原に関係なく抗体を生産して免疫反応を起こす薬剤学的組成物を意味する。
【００４６】
本願の一具現例によれば、前記アレルギー性疾患は、喘息、アレルギー性鼻炎、副鼻腔炎、および慢性閉塞性肺疾患から選択されるアレルギー性呼吸器疾患であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００４７】
本願の一具現例によれば、前記アレルギー性疾患は、じんましん、結膜炎、花粉症およびアトピーから選択されるアレルギー性疾患の他にも、食品アレルギー、アレルギー性中耳炎、アナフィラキシーショック、接触性過敏症、アレルギー性接触性皮膚炎、細菌アレルギー、真菌アレルギー、ウイルスアレルギー、薬物アレルギーおよびアレルギー性脳炎なども含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００４８】
本願の薬剤学的組成物は、免疫過敏反応と関連したＴｈ１サイトカインおよび／またはＴｈ２サイトカインの生成を抑制することができる。ここで、前記Ｔｈ１サイトカインは、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）およびインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）から選択され得、前記Ｔｈ２サイトカインは、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）およびインターロイキン−１３（ＩＬ−１３）から選択され得るが、これに制限されるものではない。
【００４９】
前記Ｔｈ１サイトカインおよび／またはＴｈ２サイトカインの水準は、肺気管支洗浄液（肺胞液）または血清のような体液から測定され得るが、これに制限されるものではない。
【００５０】
本願の一具現例によれば、前記薬剤学的組成物は、肺、脾臓、血液または脳に非侵襲性であってもよいが、これに制限されるものではない。前記「非侵襲性」とは、直接的に薬剤学的組成物が投与される器官、組織、および細胞以外に全身の他の領域に薬剤学的組成物が浸透しないか、あるいは浸透しても早く除去されることを意味し、これは、薬剤学的組成物が投与される器官、組織、および細胞以外に全身の他のの領域に浸透して、人体に損傷を及ぼす浸透性と反対になる意味である。
【００５１】
用語「投与」とは、任意の適切な方法で対象に本願発明の組成物を導入することを意味し、本願発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達できる限り、いかなる一般的な経路を介して投与され得る。経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与、腔内投与、硬膜内、粘膜内投与が行われ得るが、これに制限されるものではない。
【００５２】
本願の一具現例によれば、前記薬剤学的組成物は、腹腔内または粘膜内に投与するためのものであってもよいが、これに制限されるものではない。前記粘膜の位置は、特に制限されず、当業界で粘膜投与のために使用される身体位置のうち当業者が適切に選択して投与することができる。
【００５３】
本願の一具現例によれば、前記薬剤学的組成物は、咽喉粘膜内に投与するためのものであってもよいが、これに制限されるものではない。咽喉粘膜を通したワクチン化は、例えばエアロゾールまたは点滴伝達システム形態を使用することができるが、これに制限されるものではない。
【００５４】
本願発明による薬剤学的組成物を利用する場合、粘膜で投与することでも個体内で有効な免疫原性を示すので、従来に注射剤として皮下に投与しなければならなかった不便をなくすことができると共に、注射剤を介した投入に特に苦痛を味わっている幼児に投与するのに有利になり得るが、これに制限されるものではない。本願発明による薬剤学的組成物を投与できる個体は、制限がなく、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物を含むことができるが、これに制限されるものではない。本願発明による組成物の有効投与量の範囲は、性別、体表面積、疾患の種類および重症度、年齢、薬物に対する敏感度、投与経路および排出比率、投与時間、治療期間、標的細胞、発現水準などその他医学分野によく知られた多様な要因によって変わることができ、当該分野の専門家により容易に決定され得る。
【００５５】
本願の一具現例によれば、前記薬剤学的組成物は、薬剤学的に許容可能な担体または免疫補助剤をさらに含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００５６】
本願発明の薬剤学的組成物に含まれ得る担体としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリスリトール、マルチトール、デンプン、アカシアガム、アルギネート、ゼラチン、カルシウムホスフェート、カルシウムシリケート、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、マグネシウムステアレートおよび鉱物油が挙げられるが、これに制限されるものではない。
【００５７】
本願発明で使用され得る免疫補助剤としては、当業界で通常的に使用される免疫補助剤が制限なしに使用され得、前記免疫補助剤は、ｃｈｏｌｅｒａ  ｔｏｘｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｕｎｉｔ，ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｓａｌｔｓ，ｌｉｐｉｄ  ｅｍｕｌｓｉｏｎ（ＭＦ−５９）、ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ（Ｔｗｅｅｎ）、ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ，ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ，ｍｕｃｏａｄｈｅｓｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒｓなどが挙げが、これに制限されるものではなく、この分野の新しい剤形が開発されているところ、これらも使用され得る。
【００５８】
本願発明による薬剤学的組成物は、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾールなどの経口型剤形、外用剤、坐剤または滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用され得るが、これに制限されるものではない。詳細には、剤形化する場合、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調製され得るが、これに制限されるものではない。
【００５９】
例えば、経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート、スクロース、ラクトース、ゼラチンなどを混ぜて調製され得る。また、単純な賦形剤以外に、マグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も使用され得、液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、頻繁に使用される単純希釈剤である水、液体パラフィン以外に様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれ得るが、これに制限されるものではない。
【００６０】
非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤および坐剤が含まれ得、非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性オイル、エチルオレートのような注射可能なエステルなどが使用され得るが、これに制限されるものではない。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明しようとするが、下記の実施例は、単に説明の目的のためのものであり、本願の範囲を限定しようとするものではない。
【００６２】
［実施例１］弱毒化した肺炎球菌菌株ＴＨｐｅｐ２７の炎症性疾患、呼吸器ウイルス感染疾患、または肺炎球菌を除いた細菌感染性疾患の抑制能分析
【００６３】
１．材料および方法
弱毒化した肺炎球菌菌株ＴＨｐｅｐ２７の製造
本願の実施例で使用された肺炎球菌菌株であるＴＨｐｅｐ２７変異株は、Ｃｈｏｉ  ＳＹなど（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｅｐ２７  ｍｕｔａｎｔ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｌｅｔｈａｌ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．
Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓ．２０１３）の文献で報告された菌株であり、韓国特許登録第１０−１２５２９１１号に開示されたｐｅｐ２７突然変異肺炎球菌菌株で選別のためのエリスロマイシン耐性マーカー（ｅｒｍＡＭ）を有しないことを除いては同じ菌株である。
【００６４】
選択のための一時的マーカーとして使用できるエリスロマイシン耐性マーカー（ｅｒｍＡＭ）を有するＣｈｅｓｈｉｒｅカセット（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＦＪ９８１６４５）をＤｏｎａｌｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ）から得られたプライマー（５’−ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＣＧＴ  ＡＴＡ  Ｇ−３’（配列番号２）と５’−ＴＣＧ  ＡＴＡ  ＣＣＧ  ＴＴＣ  ＧＴＡ  ＴＡＡ  ＴＧＴ−３’（配列番号３））を利用して、上流および下流配列を増幅するプライマー（５’−ＴＣＴ  ＣＴＡ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧ−３’（配列番号４）と５’−ＣＴＡ  ＴＡＣ  ＧＡＡ  ＣＧＧ  ＴＡＡ  ＧＣＣ  Ａ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＣＧ−３’（配列番号５）および５’−ＡＣＡ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＧＡＡ  ＣＧＧ  ＴＡＴ  ＣＧＡ  ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＣＴＡ−３’（配列番号６）と５’−ＣＴＧ  ＣＧＡ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＡＧ−３’（配列番号７）でＤ３９ゲノムＤＮＡを鋳型として利用してＰＣＲによる重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）で連結した。次に、連結された生成物をＤ３９で形質転換させてｐｅｐ２７突然変異体を生成させた。
【００６５】
チェシャー（Ｃｈｅｓｈｉｒｅ）カセット切断は、１％Ｌ−フコース（ｆｕｃｏｓｅ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加して誘導した。フコース−処理された培養物をＴＨＹ血液寒天培地に塗抹して単一コロニーを得た。各コロニーにおいてチェシャーカセットの存在は、次のプライマーを使用してＰＣＲで確認した：５’−ＴＣＴ  ＣＴＡ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧ−３’（配列番号８）と５’−ＣＴＧ  ＣＧＡ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＡＧ−３’（配列番号９）。突然変異体（ＴＨｐｅｐ２７）配列は、Ｐｅｐ２７抗体で免疫ブロット分析だけでなく、ヌクレオチドシーケンシング（Ｃｏｓｍｏ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）で確認した（不図示）。
【００６６】
ＲＮＡ水準でＴＨｐｅｐ２７突然変異体を確認するために、初期対数期にある細菌からＲＮＡを以前に記述された熱いフェノール方法を使用して分離した。ＤＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｔａｋａｒａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で除去した後、無作為プライマー（Ｔａｋａｒａ）を使用して１マイクログラムの細菌ＲＮＡをｃＤＮＡで逆転写させた。逆転写ＰＣＲは、推奨プライマーを使用して製造者の指針（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｉｏ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）によって行った。
【００６７】
その他細菌菌株の準備
本願で試験された肺炎球菌菌株は、下記の表１に提示されている。
【００６８】
【表１】
2020517744.tif 000003
【００６９】
肺炎球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）血清型２番（Ｄ３９）野生型菌株、血清型３番（Ａ６６．１）、血清型６Ｂ（ＢＧ７３２２）およびＴＨｐｅｐ２７変異株（Ｄ３９Δｐｅｐ２７）を実験室で使用した方法で培養して使用した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。肺炎球菌は、３７℃で血液寒天平板で一晩中培養した後、０．５％酵母抽出物（ＴＨＹ；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加したＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロスで３７℃で３時間の間培養した。各細菌培養液を適切に希釈し、ＣＤ１マウスに１０μｌの肺炎球菌菌株を咽喉（ｉ．ｎ．）感染させた。
【００７０】
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２５９２３）と肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ，ＡＴＣＣ  ９９９７）は、韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ、ソウル）で購入してヒツジの脱線維素血液を添加した脳心臓抽出（ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｔ  ｉｎｆｕｓｉｏｎ；ＢＨＩ）培地で３７℃で一晩中培養した後、ＢＨＩ培養液に接種してＯＤ５５０＝０．５になるまで３７℃で培養した。
【００７１】
インフルエンザウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９（Ｈ１Ｎ１）菌株は、以前に使用された方法で卵で培養した（Ｓｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。
【００７２】
生体内感染研究
４週齢の雄性ＣＤ１、ＢＡＬＢ／ｃマウス（オリエント、韓国）を感染実験に使用した。本実施例で動物使用は、韓国成均館大学校動物倫理委員会で韓国動物保護法の指針によって承認された。
【００７３】
ワクチン有効性の評価において生存日数測定実験には、マウスに１×１０７〜１×１０８個のΔｐｅｐ２７菌株を２週または１週ごとに咽喉（ｉ．ｎ．）に３回接種した。最終免疫化１〜２週後に、マウス咽喉に１×１０７〜１×１０８個の毒性菌株Ｄ３９または６Ｂで感染させた。このように感染したマウスの生存は、初めて５日間は毎日４回、その後５日間は１日２回、その後には毎日観察して感染後１４日までモニタリングした。
【００７４】
集落形成抑制能を評価するために、マウスに約１×１０７〜１×１０８個のΔｐｅｐ２７を２週ごとに３回咽喉接種し、最終接種１〜２週後に、マウスに約５×１０６〜１×１０７個の肺炎球菌を感染させた。マウスを指示された時間に犠牲にさせて、咽喉部を無菌的に除去した後、ホモジナイザー（ＰＲＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｏｘｆｏｒｄ，ＣＴ，ＵＳＡ，Ｍｏｄｅｌ  ２００  Ｄｏｕｂｌｅ  ｉｎｓｕｌａｔｅｄ）を使用して１ｍｌのＰＢＳ（血液を除いて）で氷の上で最大速度で均質化させ、滅菌ＰＢＳで連続希釈して５〜１０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（ｇｅｎｔａｍｙｃｉｎ）を含有する血液寒天培地に接種して肺炎球菌を選別した。次に、プレートを３７℃、９５％空気−５％ＣＯ２を含有する状態で約１８時間の間培養して集落数を数える実験を２回繰り返して平均値を使用した。
【００７５】
Δｐｅｐ２７ワクチンによって黄色ブドウ球菌および肺炎桿菌（Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）感染を防御することができるかを調査するために、マウスにΔｐｅｐ２７を３回咽喉接種し、最終Δｐｅｐ２７接種１０日後、黄色ブドウ球菌または肺炎桿菌をそれぞれ１×１０８個または２×１０６個をＰＢＳ  ５０μｌに懸濁して咽喉で感染させた。次に、感染２４時間および４８時間後に肺および鼻腔洗浄物を収集し均質化して適切に連続希釈した後、ＢＨＩ血液寒天培地に塗抹して３７℃で一晩中培養して菌数を数えた。
【００７６】
ウイルスおよび肺炎球菌感染実験
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ雌性、６〜８週齢、Ｋｏａｔｅｃｈ，Ｋｏｒｅａ）に約１×１０８個のΔｐｅｐ２７を５０μｌ  ＰＢＳに懸濁して１週間隔で３回接種し、最後の接種１０日後で、５０μｌ  ＰＢＳに０．０２致死量（ＬＤ）になるようにＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスを準備して、咽喉で感染させて、毎日体重をモニタリングした。インフルエンザ感染後、１０〜１２日後に、１×１０８個のＤ３９を５０μｌ  ＰＢＳに懸濁してマウス咽喉に感染させた後、生存率を測定した。
【００７７】
脾臓細胞分離
マウス咽喉にΔｐｅｐ２７（ＴＨｐｅｐ２７変異株）を１×１０７〜１×１０８個で２週ごとに３回接種した。最終接種１週間後に脾臓を取り出し、Ｔリンパ球を刺激するために分離した脾臓細胞に抗−ＣＤ３ｅ（５μｌ／ｍｌ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）および抗−ＣＤ２８（３μｌ／ｍｌ；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）抗体処理した（Ｂａｓｈｏｕｒなど、２０１４）。２４時間培養後に収穫して、培養培地のサイトカイン水準を測定した。
【００７８】
サイトカイン測定
気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ；ＢＡＬ）、血清および脾臓細胞でインターロイキン（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ：ＩＬ）−１７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＬ−４およびＩＬ−１０の濃度は、市販中の酵素結合免疫吸着分析（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して製造社の指示に基づいて測定した。
【００７９】
ＩｇＧ抗体力価およびＩｇサブタイプ決定
マウス咽喉に１×１０７〜１×１０８個のΔｐｅｐ２７を２週ごとに３回接種した。最終接種７日後、眼窩採血で血清を得て、−８０℃でＥＬＩＳＡするまで保管した。以前に記述されたように、抗体を滴定し（Ｒｏｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）Ｉｇ亜型は、マウスＩｇイソタイピングＥＬＩＳＡキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＳＡ）を利用して測定した。
【００８０】
同時感染研究において血清でのＩｇＧ力価は、肺炎球菌の菌溶解物（Ｄ３９，Ａ６６．１，ＢＧ７３２２）、または血清型２番カプセルでコーティングされた９６ウェル免疫プレートまたはＰＢＳ溶液のうち精製されたＰｓｐＡタンパク質（１μｇ／ｍｌ）を使用してＥＬＩＳＡ方法で測定した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【００８１】
肺でウイルスおよび菌数測定
マウス（ＢＡＬＢ／ｃ  ４匹／グループ）をΔｐｅｐ２７で咽喉接種し、上記したように、Ｈ１Ｎ１またはＨ３Ｎ２インフルエンザウイルスで感染させた後、肺サンプルを収集し、すでに報告された方法に基づいて分析した（Ｓｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。
【００８２】
インフルエンザウイルス感染５日後、マウス肺を７０μｍストレーナー（ｓｔｒａｉｎｅｒ）に通過させ、遠心分離して。上澄み液を力価測定時まで−８０℃で保管した。ウイルス力価（ｔｉｔｅｒ）測定のために、ＭＤＣＫ細胞（２×１０４細胞／ウェル）をＭＥＭ（１％ＩｇＧがないＢＳＡ、１Ｘペニシリン−ストレプトマイシン）培地で９６ウェルプレートに播種した後、プレートを３７℃で４時間の間培養した。次に、培養された細胞に連続的に２倍希釈された肺均質化物上澄み液で感染させ、一晩中培養した。次に、上澄み液を捨てて、抗インフルエンザＡ抗体を利用してＴＣＩＤ５０／ｍｌを利用して測定した（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）。
【００８３】
Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ
腹腔大食細胞を分離して培養した後、ＲＮＡｉｓｏ  ｐｌｕｓ（ＴＡＫＡＲＡ，Ｊａｐａｎ）を使用してトータルＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲは、ワン−ステップＲＴ  ｑＰＣＲキット（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ，Ｋｏｒｅａ）を使用して行った。遺伝子特異プライマー配列は、次のとおりである：ＩＬ−１０遺伝子（Ｆｏｒｗａｒｄ  ［Ｆ］：５’−ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＣＴＣ  ＡＴＧ  ＣＴＡ  ＧＡＧ  Ｃ（配列番号１０）、Ｒｅｖｅｒｓｅ  ［Ｒ］：５’−ＧＣＣ  ＴＧＧ  ＴＣＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＡＣＴ  ＡＣ（配列番号１１））；ＩＬ−１βの遺伝子（Ｆ：５’−ＣＴＧ  ＧＴＧ  ＴＧＴ  ＧＡＣ  ＧＴＴ  ＣＣＣ  ＡＴ（配列番号１２）；Ｒ：５’−ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＴＧＣ  ＴＴＧ  ＧＴＴ  ＣＴＣ  ＣＴ（配列番号１３））；ＴＮＦ−ａ遺伝子（Ｆ：５’−ＣＡＣ  ＡＡＧ  ＡＴＧ  ＣＴＧ  ＧＧＡ  ＣＡＧ  ＴＧＡ（配列番号１４）；Ｒ：５’−ＴＣＣ  ＴＴＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＣＡＴ  ＧＡ（配列番号１５））。ＧＡＰＤＨ遺伝子（プライマーＦ：５’−ＴＧＣ  ＡＴＣ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＣＡＡ（配列番号１６）；Ｒ：５’−ＴＣＣ  ＡＣＧ  ＡＴＧ  ＣＣＡ  ＡＡＧ  ＴＴＧ  ＴＣ（配列番号１７））を対照群とした。
【００８４】
ＰＣＲプログラムは、次のように行った：維持（Ｈｏｌｄｉｎｇ；９５℃１０分）；４０サイクルの間毎サイクル（９５℃１５秒、５５℃３０秒、７２℃３０秒）；メルトカーブ（９５℃１５秒、６０℃１分、９５℃１５秒）。
【００８５】
Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
Δｐｅｐ２７接種後、肺および脾臓で誘導される遺伝子発現を測定するために、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ  ４週齢）に１×１０７〜１×１０８個の肺炎球菌Δｐｅｐ２７（ＴＨｐｅｐ２７：Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を麻酔せず、２週間隔で３回咽喉に接種した（ｉ．ｎ．）。肺および脾臓でＴｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出し、５００ｎｇのトータルＲＮＡを利用してシーケンシングライブラリーを構築した。以後、シーケンシングのためにＬＥＸＯＧＥＮ  Ｑｕａｎｔ−Ｓｅｑライブラリー準備キット（Ｃａｔ＃００１．２４）を利用して標準プロトコルによってＲＮＡライブラリーを構築した。遺伝子発現は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ  ５００を使用した高速大量（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）シーケンシングで測定した。
【００８６】
ＤＮＡ処理段階
ベース呼び出しにＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｃａｓａｖａ１．８ソフトウェアを使用した。配列読み取りは、アダプタ配列のために整頓され、ｆａｓｔｘ＿ｔｒｉｍｍｅｒを使用して低複雑性または低品質配列に対してはこれ以上処理しないようにした後、Ｂｏｗｔｉｅ２を使用してｍｍ１０全体ゲノムにマッピングされた。読み取り回数の抽出および正規化は、ｅｄｇｅＲを使用して行われた。Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓを利用した実験およびシステム生物学分析は、ｅ−ｂｉｏｇｅｎ（Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）で行った。
【００８７】
遺伝子発現分析データは、ＮＣＢＩ［ＧＥＯ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ  ＧＳＥ９３７１８］（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．ｐｒｏｘｙ．ｋｏｎｋｕｋ．ａｃ．ｋｒ：８０８０／ｇｅｏ／）に寄託された。
【００８８】
腸炎症性疾患からの防御能測定
マウス（Ｃ５７ＢＬ／６雄性、４週齢）にケタミン１００μｌを腹腔内注入して麻酔した後、１×１０７〜１×１０８個の△ｐｅｐ２７を１週間間隔で３回咽喉接種した。マウスの体重を測定し、無作為で実験群当たり２匹を使用して４つの実験群に分けた。それぞれの一連の実験で使用されたマウス実験群は、次のとおりである：デキストランサルフェートナトリウム（ＤＳＳ）処理をしない対照群、５％ＤＳＳだけを投与した実験対照群、Ｐｅｐ２７接種だけをした実験群、およびＰｅｐ２７＋５％ＤＳＳを投与したグループ。マウスに平均分子量５０００（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ，ＵＳＡ）のＤＳＳ（５％、ｗ／ｖ）を連続１４日間飲むようにして大腸炎を誘導した（Ｗｉｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ，２００７）。ＤＳＳ溶液は、毎日新しく準備した。対照群マウスは、水道水だけを飲むようにした。
【００８９】
すべての対照群および実験対照群は、研究期間の間ＤＳＳ投与群と同じ方式で投与された等量のビヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ；食塩水）を投与した。
【００９０】
2020517744.tif 000004
【００９１】
＜△Ｐｅｐ２７ワクチン接種によるマウスでのＤＳＳ誘導腸炎抑制実験＞
腸疾患（ＩＢＤ）試料採取
５％ＤＳＳ投与１４日後、実験動物をＣＯ２窒息で犠牲にさせ、事後開腹術を施行した。盲腸から肛門まで全体大腸を除去し、近位部、中間部および末端部に分け、選択された組織を分離してリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した後、分析するまで−８０℃に保管した。
【００９２】
結腸切片の定量組織学（病気活性指数Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ：ＤＡＩ）
大腸炎の進行は、飲用量と体重減少、便の一貫性、直腸出血および便での総血液の存在を測定して毎日評価し、臨床症状も評価した。マウスの病的状態（退屈さ、無気力）も毎日モニタリングした。
【００９３】
この媒介変数は、以下に提示された基準によって点数を付け、これは、すでに報告された論文で提示されたように、各動物の平均一日病気活性指数（ＤＡＩ）を計算した（Ｗｉｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ，２００７；Ｊａｗｈａｒａ  ａｎｄ  Ｐｏｕｌａｉｎ、２００７）。
【００９４】
また、大腸炎症は、本来状態の引かない回転型接合部から肛門境界まで結腸の長さを目視で測定して評価した。病理学的所見を各グループ別に詳細に記録し、最も炎症が激しい臓器で変化が現れた時期とその程度を評価するために、組織を視覚的に０から５点まで点数を付ける体系を使用した。
【００９５】
以前に検証された病理学的点数等級システム（Ｊａｗｈａｒａ  ａｎｄ  Ｐｏｕｌａｉｎ，２００７；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ，２００７）を変形して大腸炎の程度を評価する方法を使用した。すべての実験を少なくとも二回繰り返してすべてのグループにおいて次のように算出した。
【００９６】
１）体重減少、変化なし、０；＜５％、１；６〜１０％、２；１１〜２０％、３；＞２０％、４；
２）便の一貫性（Ｓｔｏｏｌ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）、正常または良好に形成されたペレット＝０；肛門にくっつかない練り粉形の絆創膏＝１；肛門についた状態として残っている液体便２；若干の血で粘りつく、３；完全な液体であるか、血があったり、または１０分後にも排泄されないこと；４；
３）直腸出血、血液なし、０；肛門に血液が見える、１；毛に血液が見える、２；直腸で激しい出血、４点。
４）一般的な外観、正常、０；粘液質、１；無気力であり、立毛（ｐｉｌｏｅｒｅｃｔ）、２；無気力であり、曲げた。３；動かず、痛い、４。
【００９７】
統計分析
すべてのデータは、二回の独立的な実験値の平均±標準偏差で示した。統計学的比較は、一元分散分析法を使用してＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ’ｓ  ｔｅｓｔを使用して行われた。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意であると見なされた。
【００９８】
２．結果
２−１．事例＃１：ＨＴＳとシステム生物学分析は、主な病変からの防御機能を提示した。
２−１−１．Δｐｅｐ２７接種は、多様な病変からマウスを防御した
肺でのシステム生物学分析は、Δｐｅｐ２７咽喉接種が胃腸炎および大腸が非正常に変化することを防御することを提示する（図１）。また、脾臓でのシステム生物学分析は、Δｐｅｐ２７接種によりインフルエンザウイルス感染から防御されることを示す（図２）。
【００９９】
２−１−２．Δｐｅｐ２７接種は、Ｔｒｅｇ細胞を誘導した
肺でのシステム生物学分析は、また、Δｐｅｐ２７の接種により肺でＴＧＦ−βが誘導されることを示す（図３）。図３で緑色は、遺伝子発現が抑制されたことを示し、赤色は、遺伝子が誘導されたことを意味する。Δｐｅｐ２７接種によりＴｒｅｇが誘導されることを確認するために、接種したマウスの脾臓細胞をＦＡＣＳ分析した。その結果、Δｐｅｐ２７接種をする場合、Ｔｈ２、Ｔｈ１７およびＴｒｅｇ細胞集団が増加したが、Ｔｈ１細胞は増加せず（図４）、このように誘導されたＴｒｅｇ細胞は、免疫寛容で任意の役割をすることができることを示唆する。Ｔｒｅｇが誘導されることを裏付けるために、脾臓細胞および血清のサイトカイン水準を測定した。 一貫して脾臓でインターフェロン（ＩＦＮ）−γ、ＩＬ−４，ＩＬ−１７およびＩＬ−１０が有意に誘導された（図５）。また、血清でもＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７およびＩＬ−１０が有意に誘導されたが、ＩＬ−４水準は、有意に変化しなかった（図６）。このような結果は、Ｔｒｅｇ細胞誘導により抗炎症性サイトカインＩＬ−１０の生産が誘導されて、免疫寛容を強化させることを提示する。
【０１００】
２−１−３．Δｐｅｐ２７接種によるＩＬ−１０誘導
免疫寛容反応を裏付けるために、肺および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）でＩＬ−１０およびＩＬ−１７  ｍＲＮＡ水準を測定した。一貫して、Δｐｅｐ２７接種によって肺でＩＬ−１０とＩＬ−１７  ｍＲＮＡ水準がいずれも有意に増加した（図７および図８）。
【０１０１】
２−１−４．Δｐｅｐ２７接種による記憶反応誘導
咽喉接種が記憶反応を起こすことができるかを確認するために、接種したマウスからの脾臓細胞を収穫し、記憶反応を測定した。実験結果、Δｐｅｐ２７接種によって脾臓で中央記憶Ｔ細胞（ＣＤ４，ＣＣＲ７，ＣＤ６２Ｌ）と記憶Ｔｆｈ細胞（ＣＤ４，ＣＸＣＲ５，ＣＣＲ７）が増加した（図９）。
【０１０２】
記憶反応を再び確認するために、多様な血清免疫グロブリンと亜型の抗体力価を測定した。予想通り、Δｐｅｐ２７ワクチン接種は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂおよびＩｇＧ３のような多様な免疫グロブリン亜型を誘導した（図１０）。また、三つの類型の肺炎球菌全体細胞に対するＩｇＧ抗体水準も、ワクチン接種で有意に増加した（図１１）。したがって、咽喉ワクチン接種は、記憶反応を誘導することを確認した。
【０１０３】
２−２．事例２：インフルエンザウイルスの同時感染防御
肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）とインフルエンザＡウイルス（ＩＡＶ）は、呼吸器感染の主な原因菌である（Ｂｏｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ，２０１３，Ｓｈａｋ  ｅｔ  ａｌ，２０１３）。肺炎球菌またはＩＡＶ自体が呼吸器疾患を起こすが、インフルエンザウイルス感染後、二次感染が起こって死亡率が増加する（Ｍｉｎａ  ａｎｄ  Ｋｌｕｇｍａｎ，２０１３）。しかしながら、現在利用可能な肺炎球菌多糖類接合ワクチンＰＣＶ１３は、２次肺炎球菌感染を効果的に防御しなかった（Ｍｅｔｚｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２０１５）。
【０１０４】
２−２−１．Δｐｅｐ２７接種による２次肺炎球菌感染を防御
以前の研究で、マウスにΔｐｅｐ２７を咽喉接種すると、ＩｇＧが誘導され、異種肺炎球菌感染から防御されることを確認した（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１２）。本願では、Δｐｅｐ２７接種が全菌（ｗｈｏｌｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）だけでなく、特定の抗原に対する抗体力価を増加させることができるかを確認した。実験結果、Δｐｅｐ２７咽喉接種で血清型２番（Ｄ３９）全菌だけでなく、血清型３番および６Ｂに対してもＩｇＧ力価を増加させて、同種および異種型肺炎球菌がすべて非免疫化対照群より有意に高い体液免疫が誘導されたことを示した（図１１）。また、インフルエンザ感染後のサイトカイン水準を測定したとき、免疫化された実験群は、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β水準がすべて非免疫化対照群より顕著に低くて、免疫寛容現象があることを提示した（図１２）。また、免疫化で特定の抗原、ＰｓｐＡタンパク質および血清型２番多糖類莢膜に対するＩｇＧ力価を測定したとき、Δｐｅｐ２７接種はＰｓｐＡ力価を増加させたが、多糖類莢膜に対する力価は増加させなかった（図１３）。
【０１０５】
Δｐｅｐ２７咽喉接種で２次肺炎球菌感染から防御されるかを調査するために、マウスにＨ１Ｎ１インフルエンザウイルスを０．０２致死量（ｌｅｔｈａｌ  ｄｏｓｅ，ＬＤ）で感染させた。インフルエンザウイルス感染１０日後、毒性肺炎球菌Ｄ３９菌株をマウスに感染させ、生存率を測定した。Ｄ３９感染後、ワクチンを接種しないマウス（ＰＢＳ／Ｈ１Ｎ１）は、肺炎にかかった反面、咽喉接種した大部分のマウス（ＴＨｐｅｐ２７／Ｈ１Ｎ１）は成功裏に生存し（図１４）、このような結果は、マウスにΔｐｅｐ２７を咽喉接種すると、インフルエンザウイルス感染から防御されると共に、２次肺炎球菌感染からも防御され得ることを提示する。
【０１０６】
また、咽喉接種後、肺炎球菌を感染させた後、菌数を測定した結果、ワクチン接種を受けたすべてのマウス肺では、接種しない対照群よりも極めて少ない数の菌が検出され（図１５）、これは、Δｐｅｐ２７咽喉接種によってマウスがインフルエンザ感染後に２次肺炎球菌感染からも成功裏に防御されたことを示す。
【０１０７】
２−２−２．Δｐｅｐ２７接種による肺のウイルスおよび細菌数の減少
Δｐｅｐ２７接種でインフルエンザウイルス数が減少するかを調査するために、インフルエンザウイルス感染後、体重が減少するかを測定した。興味深く、Δｐｅｐ２７ワクチンを接種したすべてのマウスは、インフルエンザ感染後にも体重が減少しなかったが、ワクチンを接種しないマウスは、体重が顕著に減少した（図１６）。Δｐｅｐ２７ワクチン接種によってインフルエンザウイルス感染による体重減少が抑制されるので、追加にΔｐｅｐ２７ワクチン接種によって肺でインフルエンザウイルス複製がどんな影響を受けるかを確認するために、インフルエンザ感染したマウス肺でのウイルス数をＴＣＩＤ５０で測定した。驚くべきことに、ワクチンを接種したマウスは、ワクチンを接種しない対照群より有意に低いウイルス数を示した（図１７）。この結果は、Δｐｅｐ２７咽喉ワクチン接種によって肺炎球菌感染だけでなく、インフルエンザウイルス感染も顕著に減少することを意味する。
【０１０８】
２−３．事例３：Δｐｅｐ２７接種による他の細菌感染防御
２−３−１．Δｐｅｐ２７接種によるグラム陰性細菌感染防御
Δｐｅｐ２７ワクチン接種で他の細菌感染の定着を防げることができるかを確認するために、マウスにΔｐｅｐ２７ワクチンを接種した後、グラム陰性菌である肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を感染させて組織内菌数を測定した。ワクチン接種群は、感染２４時間後、肺および血液内肺炎桿菌の数が、ワクチンを接種しない対照群より有意に減少したので（図１８）、Δｐｅｐ２７ワクチン接種によってグラム陰性細菌感染を予防することができることが立証された。
【０１０９】
２−３−２．Δｐｅｐ２７接種によるグラム陽性細菌感染防御
Δｐｅｐ２７ワクチン接種が他の細菌感染の定着を防げることができるかを再確認するために、マウスにΔｐｅｐ２７ワクチンを接種した後、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を感染させて組織内生存細菌数を測定した。興味深く、Δｐｅｐ２７ワクチン接種群は、マウスの肺および鼻洗浄液で細菌集落数が、ワクチンを接種しない対照群に比べて顕著に減少した（図１９）。この結果は、Δｐｅｐ２７ワクチン接種がグラム陽性細菌のような他の細菌感染を予防することができることを立証したものである。
【０１１０】
２−４．事例４：場炎症性疾患防御
経口免疫寛容現象は、ヒトで関節リウマチ（ＲＡ）、アレルギー性疾患、糖尿病、動脈硬化症、大腸炎疾患などで研究されてきた（Ｆａｒｉａ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ、２００５）。サルモネラ由来分泌タンパク質（ＳｓｅＢ）を咽喉接種して、内臓および全身ＩｇＡ、Ｔｈ１およびＴｈ１７反応が誘導され、経口で致命的な感染をさせても、腸組織および脾臓での細菌数が減少した（Ｐｉｇｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。しかしながら、腸内炎症性疾患を防御する咽喉ワクチンは報告されたことがない。
【０１１１】
２−４−１．Δｐｅｐ２７ワクチン接種による腸炎症性疾患防御
Δｐｅｐ２７ワクチン接種が腸炎症性疾患を抑制できるかを確認するために、マウスの咽喉にワクチンを接種し、ＤＳＳで大腸炎を誘導した。実験結果、５％ＤＳＳを飲用水に添加した後、９日目から病気指数が悪化し、体重も顕著に減少した。５％ＤＳＳだけを単独で処理したマウスでは、体重が顕著に減少したが、Δｐｅｐ２７を接種し、５％ＤＳＳ処理した実験群は、ＤＳＳ単独処理群より有意に体重が少し減少した（図２０）。
【０１１２】
全般的な臨床疾患活動指数点数（ｐ＜０．０５、一元分散分析後、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ検査、ＤＳＳ処理６〜９日）を比較したとき、５％ＤＳＳ単独処理群は、Δｐｅｐ２７＋５％ＤＳＳ実験群より便の一貫性の点数が有意に高かった（図２１）。すなわち、ＤＳＳで誘導された大腸炎症が悪化して、ＤＳＳ単独処理群は、臨床活動指数が高いが、ワクチン投与群は、大腸炎症が正常群と類似に低かったことを提示する。
【０１１３】
結腸の長さが短くなることは、ＤＳＳ誘発大腸炎モデルで炎症マーカーとして使用されるが、実際にＤＳＳ投与群で結腸の長さが有意に短くなった（図２２）。したがって、ＤＳＳグループは、結腸の重さ／結腸の長さの比率が有意に増加したが、Δｐｅｐ２７ワクチン接種グループは、ＤＳＳグループに比べてほぼ正常に近い比率を示した（図２３）。
【０１１４】
２−４−２．Δｐｅｐ２７ワクチン接種による炎症性サイトカイン水準抑制
Δｐｅｐ２７ワクチン接種が腸炎症を減少させることを確証するために、大腸でのサイトカインｍＲＮＡ水準を測定した。実験結果、Δｐｅｐ２７ワクチン接種群は、炎症誘発性ＩＬ−１βｍＲＮＡ水準が非免疫化された対照群に比べて有意に減少した（図２４）。また、咽喉ワクチン接種によってＩＬ−１７Ａ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６のｍＲＮＡ水準も、非免疫化された対照群より抑制されたので（図２４）、咽喉粘膜ワクチン接種がサイトカイン発現を抑制するという事実が立証された。
【０１１５】
［実施例２］弱毒化した肺炎球菌菌株ＴＨｐｅｐ２７のアレルギー性疾患の抑制能分析
１．材料および方法
１．１．弱毒化した肺炎球菌菌株ＴＨｐｅｐ２７
Δｐｅｐ２７肺炎球菌菌株（ＴＨｐｅｐ２７，Ｄ３９Δｐｅｐ２７：：Ｃｈｅｓｈｉｒｅ）は、Ｃｈｏｉ  ＳＹなど（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｅｐ２７  ｍｕｔａｎｔ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ａ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｌｅｔｈａｌ  ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃａｌ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｒｅｓ．２０１３）の文献で報告された菌株であり、韓国特許登録第１０−１２５２９１１号に開示されたｐｅｐ２７突然変異肺炎球菌菌株で選別のためのエリスロマイシン耐性マーカーを有しないことを除いては、同じ菌株である。
【０１１６】
選択のための一時的マーカーとして使用できるエリスロマイシン耐性マーカー（ｅｒｍＡＭ）を有するＣｈｅｓｈｉｒｅカセット（Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＦＪ９８１６４５）をＤｏｎａｌｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｃａｇｏ）から得られたプライマー（５’−ＴＧＧ  ＣＴＴ  ＡＣＣ  ＧＴＴ  ＣＧＴ  ＡＴＡ  Ｇ−３’（配列番号２）と５’−ＴＣＧ  ＡＴＡ  ＣＣＧ  ＴＴＣ  ＧＴＡ  ＴＡＡ  ＴＧＴ−３’（配列番号３））を利用して、上流および下流配列を増幅するプライマー（５’−ＴＣＴ  ＣＴＡ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧ−３’（配列番号４）と５’−ＣＴＡ  ＴＡＣ  ＧＡＡ  ＣＧＧ  ＴＡＡ  ＧＣＣ  Ａ  ＧＡＴ  ＴＴＴ  ＣＡＣ  ＣＡＣ  ＴＧＣ  ＴＴＴ  ＣＧ−３’（配列番号５）および５’−ＡＣＡ  ＴＴＡ  ＴＡＣ  ＧＡＡ  ＣＧＧ  ＴＡＴ  ＣＧＡ  ＡＡＧ  ＧＣＣ  ＡＧＣ  ＡＡＧ  ＡＧＡ  ＣＴＡ−３’（配列番号６）と５’−ＣＴＧ  ＣＧＡ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＡＧ−３’（配列番号７））でＤ３９ゲノムＤＮＡを鋳型として利用してＰＣＲによる重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）に連結した。次に、連結された生成物をＤ３９で形質転換させてｐｅｐ２７突然変異体を生成させた。
【０１１７】
チェシャー（Ｃｈｅｓｈｉｒｅ）カセット切断は、１％Ｌ−フコース（ｆｕｃｏｓｅ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を添加して誘導した。フコース−処理された培養物をＴＨＹ血液寒天培地に塗抹して単一コロニーを得た。各コロニーにおいてチェシャーカセットの存在は、次のプライマーを使用してＰＣＲで確認した：５’−ＴＣＴ  ＣＴＡ  ＴＣＧ  ＧＣＣ  ＴＣＡ  ＡＧＣ  ＡＧ−３’（配列番号８）と５’−ＣＴＧ  ＣＧＡ  ＧＧＣ  ＴＴＧ  ＣＡＣ  ＴＧＴ  ＡＧ−３’（配列番号９）。突然変異体（ＴＨｐｅｐ２７）配列は、Ｐｅｐ２７抗体で免疫ブロット分析だけでなく、ヌクレオチドシーケンシング（Ｃｏｓｍｏ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）で確認した（不図示）。
【０１１８】
ＲＮＡ水準でＴＨｐｅｐ２７突然変異体を確認するために、初期対数期にある細菌からＲＮＡを以前に記述された熱いフェノール方法を使用して分離した。ＤＮＡをＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｔａｋａｒａ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で除去した後、無作為プライマー（Ｔａｋａｒａ）を使用して１マイクログラムの細菌ＲＮＡをｃＤＮＡで逆転写させた。逆転写ＰＣＲは、推奨プライマーを使用して製造者の指針（Ｓｕｐｅｒ  Ｂｉｏ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）により行った。
【０１１９】
製造されたＴＨｐｅｐ２７突然変異肺炎球菌菌株は、３７℃のＴＨＹブロス（０．５％酵母抽出物を含有するＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔｔブロス；Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）でＯＤ５５０値が０．３（１×１０８  ＣＦＵ／ｍｌ）になるまで培養した。培養された菌をＰＢＳで洗浄した後、濾過されたＰＢＳを利用して最終濃度１×１０８  ＣＦＵ／５０μｌで希釈して免疫化に使用した。
【０１２０】
１．２．実験動物
ＢＡＬＢ／ｃ雌性マウス（５週齢、オリエント、韓国）を購入後、７日間動物室で純化させて安定させた後に使用した。ケタミン（ケタミン注射、柳韓洋行、韓国）とシラジン（ロムプン、Ｂａｙｅｒ  Ｋｏｒｅａ  Ｌｔｄ、韓国）を４：１で混合した後、ＰＢＳで二倍希釈した溶液１００μｌをマウスに腹腔注射して麻酔させた。チャレンジ（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）およびワクチン投与前に麻酔し、実験動物を利用した実験は、韓国成均館大学校動物倫理委員会のガイドラインに基づいて進行された。
【０１２１】
１．３．Δｐｅｐ２７突然変異体の喘息予防効果測定
（１）マウスを３群（ｎ＝７／群）に分けて、滅菌水（ＰＢＳ）を提供した正常群、ＯＶＡ（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）で喘息を誘導した後、滅菌水を提供した喘息誘導群、およびｐｅｐ２７変異株（Δｐｅｐ２７）ワクチン投与後、喘息誘導群に区分した。
【０１２２】
（２）実験開始０日、７日、１４日目にマウスを麻酔させ、１×１０８  ＣＦＵ／５０μｌのΔｐｅｐ２７を咽喉（Ｉ．Ｎ）接種して免疫化した。実験開始３８日と４９日目に５０μｇ  ＯＶＡ（Ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｇｇ  ｗｈｉｔｅ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）と２ｍｇ  Ａｌｕｍ（Ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒａｔｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）を１００μｌ（０．９％食塩水、ｐＨ４．０、ダインバイオ、韓国）に添加し、４時間の間４℃でボルテックスして溶解させて製造した減作液１００μｌを腹腔内に注入して減作させた。以後、５９日から６４日目まで６日間毎日生理食塩水にＯＶＡを０．４ｍｇ／ｍｌになるように溶かして、２５μｌを咽喉の両側にそれぞれ１２．５μｌずつ点滴してチャレンジして（最終注入量ＯＶＡ  １０μｇ／マリ）喘息を誘導した。最後のＯＶＡチャレンジ２４時間後、実験動物を犠牲にして、肺気管支洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ，ＢＡＬＦ）を採取してサイトカインを測定し、肺組織は、分離して固定させた後、ヘマトキシリン−エオシン（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ，Ｈ＆Ｅ）染色を行った（図２５および図２６）。
【０１２３】
１．４．喘息治療効果測定
（１）マウスを３群（ｎ＝７／群）に区分して滅菌水（ＰＢＳ）を提供した正常群、ＯＶＡを投与した喘息群（喘息誘導群）、およびＯＶＡ投与後、Δｐｅｐ２７変異株ワクチン投与群（喘息治療実験群）に区分した。
【０１２４】
（２）喘息誘導群：具体的に、実験開始０日および１０日目に正常群を除いたすべてのグンに５０μｇ  ＯＶＡ（Ａｌｂｕｍｉｎ  ｆｒｏｍ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｇｇ  ｗｈｉｔｅ，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）と２ｍｇ  Ａｌｕｍ（Ａｌｕｍｉｎｕｍ  ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ  ｈｙｄｒａｔｅ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｃｏ．，ＵＳＡ）を１００μｌの０．９％食塩水）ｐＨ４．０、ダインバイオ、韓国）に添加し、４時間の間４℃でボルテックスして製造した減作液を腹腔で１００μｌ注射して減作させた。以後、１０日が経過した２０日から２５日まで６日間、生理食塩水にＯＶＡを０．４ｍｇ／ｍｌになるように溶かした溶液２５μｌ（最終注入量１０μｇ／匹）を両側の咽喉（Ｉｎｔｒａｎａｓａｌ；Ｉ．Ｎ）に１２．５μｌずつチャレンジした。正常群の場合、生理食塩水だけを投与した（図２７Ａ）。
【０１２５】
（３）喘息治療実験群：前記２）のようなＯＶＡチャレンジ一週間後、毎週１回ずつ１×１０８  ＣＦＵ／５０μｌのΔｐｅｐ２７を３回咽喉接種してマウスを免疫化した。３週の治療期間の間ワクチン投与前３日からＯＶＡ  １０μｇ／２５μｌを１週間に３回（合計９回）Ｉ．Ｎ．チャレンジして喘息を誘導した。最後のワクチン投与１週間後に最後のＯＶＡチャレンジをし、２４時間後にマウスを犠牲にした（図２７Ｂ）。
【０１２６】
１．５．組織化学的検査
肺および気管支組織を分離して１０％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド溶液で固定した後、パラフィン固定（ｐａｒａｆｆｉｎ  ｂｌｏｃｋ）を行った。前記パラフィン固定された組織を４μｍの厚さで切った後、Ｈ＆Ｅ染色を実施した。Ｈ＆Ｅ染色された組織は、光学顕微鏡を利用して写真を撮影した。組織化学的検査は、ＫＮＯＴＵＳ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．（Ｋｏｒｅａ）に依頼して実施した（図２８）。
【０１２７】
１．６．サイトカイン分析
肺気管支洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ，ＢＡＬＦ）を採取してサイトカイン水準を測定した。具体的に、マウスの気道を開いて肺気管支洗浄用ＰＢＳ緩衝液が入っているカテーテルを連結した後、ＰＢＳ緩衝液１．０ｍｌを廃棄関知にゆっくり押込んで、０．９ｍｌ程度を抽出した後、そのまま再び押込んで抽出する過程を二回さらに繰り返して、総０．８ｍｌの肺気管支洗浄液を獲得した。前記採取した肺気管支洗浄液を４℃、３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄み液をサイトカイン測定用肺気管支洗浄液に分離して使用するまで−７０℃で冷凍保管した。肺気管支洗浄液のサイトカイン水準は、ＥＬＩＳＡキット（ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！，ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を利用して測定した。
【０１２８】
１．７．統計
実験データは、平均±標準偏差で示した。サイトカイン測定に対する統計処理は、Ｏｎｅ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを通じて実行された。各群の比較は、ボンフェローニ検定（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ  ｔｅｓｔ）を利用して行われた（＊，Ｐ≦０．０５；＊＊，Ｐ≦０．０１；＊＊＊，Ｐ≦０．００１）。Ｐ＜０．０５であれば、有意な差異があると判断した。
【０１２９】
２．結果
２．１．Δｐｅｐ２７突然変異体の喘息予防効能
２．１．１．Δｐｅｐ２７ワクチン接種による喘息で誘導されるサイトカイン分泌抑制
肺胞でのサイトカイン水準をＥＬＩＳＡキットを利用して測定したとき、Δｐｅｐ２７ワクチン接種群は、喘息群よりアレルギー誘発サイトカイン（Ｔｈ２  ｃｙｔｏｋｉｎｅ；Ｃｈｏなど、２００２）ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１３の水準がそれぞれ顕著に減少して正常対照群と類似した水準に減少した（図２５）。
【０１３０】
２．１．２．Δｐｅｐ２７ワクチン接種による喘息での気道浮腫抑制
気道アレルギー疾患は、アレルギー誘発物質の投与時に炎症により気道が顕著に厚くなる（図２６、喘息群）。炎症（Ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ，ＨＥ）および杯細胞（ｇｏｂｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ）（Ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ａｃｉｄ  Ｓｃｈｉｆｆ，ＰＡＳ）を組織学的免疫化学的染色して４００倍で観察したとき、Δｐｅｐ２７ワクチン投与群は、喘息群に比べて顕著に炎症が抑制されて対照群と類似した水準を示した（図２６、ワクチン投与群）。
【０１３１】
２．２．Δｐｅｐ２７突然変異体の喘息治療効能
２．２．１．Δｐｅｐ２７ワクチンの喘息関連サイトカイン抑制による治療効能
Δｐｅｐ２７ワクチンを１週間間隔で３回接種し、最終免疫化１週間後にマウスの肺胞液でのサイトカイン水準を定量したとき（図２７Ａ）、喘息群では、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−４，ＩＬ−５，ＩＬ−１３）水準が顕著に増加したが、ワクチン投与群では、正常群と類似した水準を示した（図２７Ｂ）。
【０１３２】
２．２．２．Δｐｅｐ２７ワクチン投与時に肺の炎症抑制による治療効能
実験したマウスの肺をＨｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ−ｅｏｓｉｎ（ＨＥ）染色して観察したとき、Δｐｅｐ２７ワクチン投与群（Ｃ）は、喘息誘発群（Ｂ）に比べて顕著に炎症が顕著に抑制された。特にワクチン投与群は、気管支と血管周辺の炎症細胞の浸潤および粘液分泌が抑制されて、正常対照群（Ａ）とほぼ類似した様相を示した（図２８）。
【０１３３】
３．討論
現在まで微生物を利用した喘息予防／治療に対する論文は、不活性化Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ吸入時に中等程度の子供喘息患者で気管支過敏反応が抑制され（Ｍｉｎｇなど、２０１３）、不活性化されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐｈｌｅｉ吸入でＩＬ−２３Ｒ発現が抑制されて、ＩＬ−１７生成γδＴ細胞媒介気道炎症が抑制されることによって、喘息治療に役に立ったことに関するだけであった（Ｍｉｎｇなど、２０１７）。また、弱毒化百日咳菌株ＢＰＺＥ１をマウス咽喉に接種して、アレルギー性気道炎症と接触性皮膚過敏反応を減少させて、これらの疾患の予防および治療に使用され得ることが報告されたことがあり（Ｌｉなど、２０１２）、マウスモデルでジフテリアと破傷風弱毒化毒素単独または百日咳全菌ワクチンと共に接種する場合、アレルギーによって誘導されるＴｈ２免疫反応を抑制して、気道炎症や過敏反応の抑制に利用され得ることが報告されたことがある（Grber など、２００６）。
【０１３４】
また、肺炎球菌を感染させると、調節Ｔ−細胞を誘導してアレルギー性気道疾患を抑制した（Ｐｒｅｓｔｏｎなど、２０１１）。それだけでなく、現在市販されている肺炎球菌接合ワクチンを咽喉接種すると、気道アレルギー疾患に進行されることを抑制したが、筋肉注射時には効果がなかった（Ｔｈｏｒｂｕｒｎなど、２０１０）。したがって、肺炎球菌成分である多糖類と弱毒化毒素を気道に注入したとき、アレルギー性気道疾患を抑制し、アレルギー性気道疾患の発生を抑制する調節Ｔ細胞を誘導して、アレルギー誘発物質に対する免疫反応を回避し、抑制することを明らかにした（Ｔｈｏｒｂｕｒｎなど、２０１３）。しかしながら、細菌を利用した喘息の予防および治療方法は、弱毒化した百日咳菌を除いては、大部分毒性が強くて、全部不活性化された菌を使用したり、特定の成分を使用しなければならなかった。また、咽喉接種方法が、皮下接種方法より気道アレルギー反応の抑制においてさらに効果が高いと報告されたことがある（Ｔａｋａｂａｙａｓｈｉなど、２００３）。
【０１３５】
百日咳菌感染は、マウスアレルギー気道疾患モデルでＴｈ１反応を誘導して（ＩＦＮ−γ水準増加）炎症を悪化させることもできた（Ｅｎｎｉｓなど、２００４；Ｃｈｏなど、２００２；Ｋｕｍａｒなど、２００４）。したがって、ＩＦＮ−γ水準が誘導されず、アレルギー反応を抑制することが必要である。肺炎球菌死菌を気道に注入して喘息予防効果を測定したとき、ＩＬ−５、ＩＬ−１３水準が有意的に抑制されず、Ｔｈ１反応を誘導してＩＦＮ−γ水準が有意的に増加した（Ｐｒｅｓｔｏｎなど、２００７；Ｇｉｂｓｏｎなど、２０１２；米国特許８，２２６，９５９）。すなわちＴｈ１反応を誘導してＴｈ２反応が抑制されても、炎症が悪化する可能性を排除することができなかった。したがって、Ｇｉｂｓｏｎなど（２０１２；米国特許８，２２６，９５９）は、肺炎球菌成分を分離してアレルギー性気道疾患の抑制効能に焦点を合わせた。
【０１３６】
しかしながら、本願発明の弱毒化したΔｐｅｐ２７変異株を使用する場合、Ｔｈ２サイトカイン（ＩＬ−１３およびＩＬ−４）だけでなく、Ｔｈ１サイトカイン（ＩＦＮ−γ）の水準も有意的に抑制して正常水準を示し、組織学的な所見でも正常群と類似していた。したがって、本願発明による弱毒化した肺炎球菌菌株を含む薬剤学的組成物は、従来のワクチンまたは医薬に比べてさらに安全なアレルギー疾患の予防ないし治療剤になり得るものと期待される。
【０１３７】
前述した本願の説明は、例示のためのものであり、本願の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本願の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。例えば、単一型と説明されている各構成要素は、分散して実施されてもよく、同様に、分散したものと説明されている構成要素も、結合された形態で実施されてもよい。
【０１３８】
本願の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求範囲により示され、特許請求範囲の意味および範囲そしてその均等概念から導き出されるすべての変更または変形された形態が本願の範囲に含まれるものと解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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