(57)【要約】  本発明は、神経組織、特に脳に由来する組織のインビトロ3Dモデリングの分野に関する。神経組織の生理学的態様を反映する、神経組織の細胞培養モデルの開発が必要とされている。本発明は、神経ネットワークを形成する生物工学的に作製された神経オルガノイド（BENO）を提供する。本発明は、作成されたBENOを、例えば、薬剤スクリーニングおよび個別化医療の分野における使用および応用にも関係する。
2020523013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多能性幹細胞（PSC）から生物工学的に作製された神経オルガノイド（BENO）を生産する方法であって：
（A）PSCの供給源を提供する工程；
（B）工程（A）の前記PSCを培養し、細胞培養培地に浸漬したマトリックスに埋め込む工程；
（C）Rho関連キナーゼ阻害剤（ROCKi）およびFGF−2を含む細胞培養培地で工程（B）の前記マトリックス内の前記PSCを培養する工程；
（D）レチノイン酸およびSMADシグナル伝達の1つ以上の阻害剤を含む細胞培養培地で工程（C）のPSCとマトリックスに由来する形成中のBENOを培養して、神経発生を誘導する工程；
（E）TGF−βおよびFGF−2を含む細胞培養培地で工程（D）の前記形成中のBENOを培養して、間質細胞の発生および神経発生を促進する工程；
（F）TGF−βおよびノッチシグナル伝達の1つ以上の阻害剤を含む細胞培養培地で工程（E）の前記形成中のBENOを培養して、間質細胞の発生および神経分化を促進する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記マトリックスがマトリゲルを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記マトリックスが、マトリゲルまたは定義されていない組成物を有する天然起源の他の成分を含まない、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
前記マトリックスが、コラーゲン、好ましくはI型コラーゲンを含む、請求項１〜３いずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記BENOが3D環境内で生産され、好ましくは前記3D環境が前記マトリックスによって定義される、請求項１〜４いずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記間質細胞がグリア細胞を含む、請求項１〜５いずれかに記載の方法。
【請求項７】
工程（D）の前記培地が少なくとも2つのSMADシグナル伝達の阻害剤を含み、好ましくは前記SMADシグナル伝達の阻害剤がノギンおよびSB 431542を含む、請求項１〜６いずれかに記載の方法。
【請求項８】
工程Fの前記ノッチシグナル伝達の阻害剤がDAPTである、請求項１〜７いずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記PSCがヒトPSCである、請求項１〜８いずれかに記載の方法。
【請求項１０】
工程（A）および工程（B）が−1日目に実施され、
工程（C）が−1日目から0日目まで実施され、
工程（D）が0日目から10日目まで実施され、
工程（E）が10日目から15日目まで実施され、
工程（F）が15日目から少なくとも28日目まで実施される、
請求項1〜9に記載の方法。
【請求項１１】
神経細胞が機能的神経ネットワークで組織化されていることを特徴とする、神経オルガノイド。
【請求項１２】
請求項１〜１１いずれかに記載の方法によって生産される生物工学的に作製された神経オルガノイド（BENO）。
【請求項１３】
疾患および/または薬剤スクリーニングのモデルとしての請求項１１または１２に記載のBENOの使用。
【請求項１４】
前記BENOが別の組織工学プラットフォームと共培養される、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
請求項１〜９いずれかに記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
神経組織、特にヒトの脳などの哺乳動物の脳に由来する組織のインビトロ3Dモデリングは、複雑なニューロン細胞系の試験を可能にする強力な組織生物工学ツールである。一般に、3D細胞培養系は、それぞれの2D培養系と比較して、より迅速な細胞分化、より高い細胞の複雑性および寿命を提供する。神経組織のインビトロ3Dモデリングの有望なアプローチには、様々なヒト組織および臓器のモデリングに使用されている、多能性幹細胞（PSC）の使用が含まれる。例えば、患者の線維芽細胞を誘導PSCにリプログラミングする際に使用される最近の技術と組み合わせた3Dモデリング手法のそのような利点は、集合的に、様々なヒトニューロンに基づく疾患の原因となる分子機構を解明するための新たな視野を提供する。
【０００２】
文献には、ヒト幹細胞の神経分化を誘導するための多数のプロトコルが存在する。そのような方法の1つは、培養下で約8〜12日間の二重のSMAD（SmaおよびMad関連ファミリー）シグナル伝達経路阻害による（すなわちBMPおよびTGFβの阻害による）神経外胚葉の誘導を含む（Chambers, Fasano et al., Nat. Biotechnol., 2009）。この時点で、幹細胞の大部分は神経前駆細胞（NPC）に変換される。12日目以降、いくつかのプロトコル（Lancaster and Knoblich,Science,2014）は、細胞を様々なニューロン細胞およびグリア細胞に自発的に分化させるが、他のプロトコル（Qian, Nguyen et al., Cell,2016; Birey, Andersen et al., Nature,2017）は、様々なパターン化因子を適用して組織をパターン化するか、または神経栄養因子（BDNF、GDNF）を適用してニューロンの生存を増強する。さらに、DAPTによるdbcAMPの添加またはノッチ阻害は、そのような多能性細胞の神経分化を促進できることが観察されている（Crawford and Roelink,Dev.Dyn.,2007;Kriks,Shim et al.,Nature,2011）。神経の誘導と分化に使用される因子の違い、および治療のタイミングが、これらの手順によってもたらされる分化の可能性を定義する。別の報告では、ヒト脳オルガノイドは、マウスモデルを使用して容易に再現することができない疾患である小頭症のモデルとして作製された（Lancaster et al., Nature,2013,Qian,Nguyen et al., Cell,2016）。
【０００３】
ヒト神経オルガノイド生成における進歩にもかかわらず、既存の神経オルガノイドの有用性を制限する多くの欠陥が依然として存在する。例えば、公知の方法は神経オルガノイドの正確な定義を欠く；したがって、そのようなオルガノイドは一般に高い表現型変動性を示す。これは、一部には、神経発生を支持する基質としてマトリゲルを慣例的に使用することに起因する。
【０００４】
公知の方法に関連する別の欠点は、生成されたオルガノイドの神経ネットワーク機能の欠如であり、それにより、ニューロンの機能性および可塑性の検討が有意に制限される。また、正常な脳組織と比較して、公知の生成された神経オルガノイド構造のかけ離れた表現型類似性のために、疾患モデリングおよび薬剤開発も制限される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、生成される構造の一貫性を可能にするために、化学的に定義された成分の使用に基づいて神経オルガノイドを生成する方法が必要である。さらに、自然の神経構造を意味のあるように模倣するために、機能的な神経回路網を形成することができる神経オルガノイドを生成する必要がある。
【０００６】
本発明は、明確に定義された3D細胞培養系において堅固で再現可能な神経分化を可能にする方法を提供し、機能的神経回路網の形成および可塑性特性の検討のための確かな基盤をさらに提供する。
【０００７】
本発明のオルガノイドはさらに、薬剤開発における価値あるツールを提供する。例えば、そのようなオルガノイドは、少なくとも動物ベースの実験の必要性を低減し、市販後の結果を予測する際に臨床試験で必要とされる患者数を減少させるため、前臨床および臨床の両方の薬剤開発に関連する、典型的には法外なコストを有意に削減することができる。さらに、新規生物学的製剤（例えば非コードRNA治療薬）およびゲノム編集（例えばCRISPRに基づくプラットフォームの使用）を、ヒトモデルで効率的に試験することができる。したがって、この分野における急速な発展は、本発明によって提供されるような高度に予測的なヒトオルガノイドモデルの利用可能性から恩恵を受ける。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、多能性幹細胞（PSC）から生物工学的に作製された神経オルガノイド（BENO）を生産する方法であって：
（A）PSCの供給源を提供する工程；
（B）工程（A）のPSCを培養し、細胞培養培地に浸漬したマトリックスに埋め込む工程；
（C）Rho関連キナーゼ阻害剤（ROCKi）およびＦＧＦ−２を含む細胞培養培地で工程（B）の前記マトリックス内のPSCを培養する工程；
（D）レチノイン酸およびSMADシグナル伝達の1つ以上の阻害剤を含む細胞培養培地で工程（C）のPSCとマトリックスに由来する形成中のBENOを培養して、神経発生を誘導する工程；
（E）TGF−βおよびＦＧＦ−２を含む細胞培養培地で工程（D）の形成中のBENOを培養して、間質細胞の発生および神経発生を促進する工程；
（F）TGF−βおよびノッチシグナル伝達1つ以上の阻害剤を含む細胞培養培地で工程（E）の形成中のBENOを培養して、間質細胞の発生および神経分化を促進する工程
を含む方法に関する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、マトリックスはマトリゲルを含まない。他の実施形態では、マトリックスは、マトリゲルまたは定義されていない組成物を有する天然起源の他の成分を含まない。好ましい実施形態では、マトリックスはコラーゲンを含む。最も好ましい実施形態では、マトリックスはI型コラーゲンを含む。いくつかの実施形態では、マトリックスはコラーゲンである。いくつかの実施形態では、マトリックスはI型コラーゲンである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、BENOは3D環境内で生成され、好ましくは、3D環境はマトリックスによって定義される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、間質細胞はグリア細胞を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、工程（D）の培地は、少なくとも2つのSMADシグナル伝達の阻害剤を含み、好ましくは、SMADシグナル伝達の阻害剤はノギンおよびSB 431542を含む。いくつかの実施形態では、SMADシグナル伝達の阻害剤はノギンおよびSB 431542である。
【００１３】
いくつかの実施形態では、工程Fのノッチシグナル伝達の阻害剤はDAPTである。
【００１４】
一実施形態では、SMADシグナル伝達の阻害剤はノギンおよびSB 431542であり、工程Fのノッチシグナル伝達の阻害剤はDAPTである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、マトリックスは、0．05mg／ml〜50mg／ml、好ましくは0．1mg／ml〜10mg／ml、より好ましくは0．5mg／ml〜5mg／ml、最も好ましくは1mg／mlの濃度で使用されるコラーゲンである。
【００１６】
いくつかの実施形態では、レチノイン酸は、0．01μM〜100μM、好ましくは0．1μM〜10μM、より好ましくは0．5μM〜5μMの有効濃度で、最も好ましくは1μMの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ノギンは、0．1ng／ml〜1μg／ml、好ましくは1ng／ml〜500ng／ml、より好ましくは10ng／ml〜200ng／ml、最も好ましくは50ng／mlの有効濃度で使用される。いくつかの実施形態では、SB 431542は、0．1μM〜1mM、好ましくは1μM〜100μM、より好ましくは5μM〜50μM、最も好ましくは10μMの有効濃度で使用される。いくつかの実施形態では、TGF−βは、0．1ng／ml〜100ng／ml、好ましくは0．3ng／ml〜30ng／ml、より好ましくは1ng／ml〜10ng／mlの有効濃度で、最も好ましくは5ng／mlの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−２は、0．1ng／ml〜1μg／ml、好ましくは1ng／ml〜100ng／ml、より好ましくは5ng／ml〜50ng／mlの有効濃度で、最も好ましくは10ng／mlの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、DAPTは、0．01μM〜100μM、好ましくは0．1μM〜10μM、より好ましくは0．5μM〜5μMの有効濃度で、最も好ましくは2．5μMの濃度で使用される。
【００１７】
いくつかの実施形態では、レチノイン酸は0．5μΜ〜5μΜの濃度で使用され、ノギンは10ng／ml〜200ng／mlの濃度で使用され、SB 431542は5μΜ〜50μΜの濃度で使用され、TGF−βは1ng／ml〜10ng／mlの濃度で使用され、ＦＧＦ−２は5ng／ml〜50ng／mlの濃度で使用され、およびDAPTは0．5μΜ〜5μΜの濃度で使用される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、レチノイン酸は0．5μΜ〜5μΜの濃度で使用され、ノギンは10ng／ml〜200ng／mlの濃度で使用され、SB 431542は5μΜ〜50μΜの濃度で使用され、TGF−βは1ng／ml〜10ng／mlの濃度で使用され、ＦＧＦ−２は5ng／ml〜50ng／mlの濃度で使用され、DAPTは0．5μΜ〜5μΜの濃度で使用され、およびマトリックスは、0．1mg／ml〜10mg／mlの濃度で使用されるコラーゲンである。
【００１９】
いくつかの実施形態では、レチノイン酸は1μΜの濃度で使用され、ノギンは50ng／mlの濃度で使用され、SB 431542は10μΜの濃度で使用され、TGF−βは5ng／mlの濃度で使用され、ＦＧＦ−２は10ng／mlの濃度で使用され、およびDAPTは2．5μΜの濃度で使用される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、レチノイン酸は1μΜの濃度で使用され、ノギンは50ng／mlの濃度で使用され、SB 431542は10μΜの濃度で使用され、TGF−βは5ng／mlの濃度で使用され、ＦＧＦ−２は10ng／mlの濃度で使用され、DAPTは2．5μΜの濃度で使用され、およびマトリックスは、0．5mg／ml〜5mg／mlの濃度で使用されるコラーゲンである。
【００２１】
いくつかの実施形態では、PSCは動物細胞である。いくつかの実施形態では、PSCは哺乳動物細胞である。いくつかの実施形態では、PSCはげっ歯動物（例えばマウスもしくはラット）細胞またはヒト細胞である。好ましい実施形態では、PSCはヒトPSCである。本発明のPSCは、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性への改変を含む、または工業的もしくは商業的目的のためのヒト胚の使用を含むプロセスを使用して生産されない。
【００２２】
本発明の異なる工程は、様々な期間にわたって実施される。一実施形態では、工程（A）および工程（B）は−1日目に実施される。一実施形態では、工程（C）は−1日目から0日目まで実施される。一実施形態では、工程（D）は、0日目から8日目まで実施される。一実施形態では、工程（E）は8日目から15日目まで実施される。一実施形態では、工程（F）は15日目から少なくとも28日目まで実施される。一実施形態では、工程（A）および工程（B）は−1日目に実施され、工程（C）は−1日目から0日目まで実施される。一実施形態では、工程（A）および工程（B）は−1日目に実施され、工程（C）は−1日目から0日目まで実施され、工程（D）は0日目から8日目まで実施される。一実施形態では、工程（A）および工程（B）は−1日目に実施され、工程（C）は−1日目から0日目まで実施され、工程（D）は0日目から8日目まで実施され、工程（E）は8日目から15日目まで実施される。一実施形態では、工程（A）および工程（B）は−1日目に実施され、工程（C）は−1日目から0日目まで実施され、工程（D）は0日目から8日目まで実施され、工程（E）は8日目から15日目まで実施され、工程（F）は15日目から少なくとも28日目まで実施される。一実施形態では、工程（A）および工程（B）は−1日目に実施され、工程（C）は−1日目から0日目まで実施され、工程（D）は0日目から10日目まで実施され、工程（E）は10日目から15日目まで実施され、工程（F）は15日目から少なくとも28日目まで実施される。
【００２３】
一態様では、本発明は、神経オルガノイドの神経細胞が機能的神経ネットワークで組織化されることを特徴とする神経オルガノイド、例えば生物工学的に作製された神経オルガノイド（BENO）を提供する。一態様では、本発明は、本発明の方法によって生成される生物工学的に作製された神経オルガノイド（BENO）を提供する。
【００２４】
いくつかの態様では、本発明は、疾患のモデルとしての、本発明の方法によって生成されるBENOの使用を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、神経組織に関連する疾患のモデルとしての、本発明の方法によって生成されるBENOの使用を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、脳卒中、脳炎症障害、神経変性疾患、神経炎症性疾患、外傷、イオンチャネル疾患、および精神疾患からなる群より選択される疾患のモデルとしての、本発明の方法によって生成されるBENOの使用を対象とする。いくつかの実施形態では、本発明は、神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病など）、神経炎症性疾患（例えば多発性硬化症）、外傷性損傷（例えば脳外科手術による損傷）、イオンチャネル疾患（例えばてんかん）、および精神疾患（例えば自閉症、統合失調症）からなる群より選択される疾患のモデルとしての、本発明の方法によって生成されるBENOの使用を対象とする。
【００２５】
他の態様では、本発明は、疾患のモデルとしての本発明の方法によって生成されるBENOの使用を対象とし、BENOは、別の組織工学プラットフォームと共培養される。いくつかの実施形態では、他の組織工学プラットフォームは、EHM（人工心筋）、BSM（バイオ人工骨格筋）、ESM（人工骨格筋）、ELT（人工肝組織）、およびECT（人工結合組織）からなる群より選択される。他の実施形態では、他の組織工学プラットフォームは、腫瘍モデル（例えば腫瘍脳浸潤、転移の拡大）および白血球浸潤モデル（例えば自己免疫疾患）からなる群より選択される。
【００２６】
いくつかの態様では、本発明は、表現型薬剤スクリーニングによる薬剤発見および薬剤改良などの薬剤スクリーニングにおける、本発明の方法によって生成されるBENOの使用を対象とする。このBENOの使用には、脳および神経組織の修復、再生、保護、および疾患予防を誘導または増強し得る薬剤の発見および改良が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
他の態様では、本発明は、本発明の方法を実施するためのキットを対象とする。いくつかの実施形態では、キットは、PSC、マトリックス、適切な培地、ならびに必要な補助物質（ROCKi、ＦＧＦ−２、レチノイン酸、SMADシグナル伝達の1つ以上の阻害剤、TGF−β、およびノッチシグナル伝達の1つ以上の阻害剤）を含む。他の実施形態では、キットは、マトリックス、適切な培地、ならびに必要な補助物質（ROCKi、ＦＧＦ−２、レチノイン酸、SMADシグナル伝達の1つ以上の阻害剤、TGF−β、およびノッチシグナル伝達の1つ以上の阻害剤）を含む。他の実施形態では、キットは、マトリックスならびに必要な補助物質（ROCKi、ＦＧＦ−２、レチノイン酸、SMADシグナル伝達の1つ以上の阻害剤、TGF−β、およびノッチシグナル伝達の1つ以上の阻害剤）を含む。他の実施形態では、キットは、マトリックスならびに必要な補助物質（ROCKi、ＦＧＦ−２、レチノイン酸、SMADシグナル伝達の1つ以上の阻害剤、TGF−β、およびノッチシグナル伝達の1つ以上の阻害剤）の少なくとも4つを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】幹細胞からの典型的な神経分化のスキーム。
【００２９】
【図２】二重のSMADシグナル伝達経路阻害下での神経発生の増強。
【図２Ａ】ノギンのみまたはノギンとSB431542のみで処理された組織のIF分析。ニューロフィラメントに対する抗体（FITC−緑色）およびDAPIによる核（青色）を使用してニューロンを可視化した。棒グラフは10μmを表す。組織全体からの平均蛍光比の定量化を右側のグラフに提示する。
【図２Ｂ】ニューロンマーカーPAX6およびMAP2のqPCR分析は、SB431542処理後に両方のマーカーの21倍の増加を示す（n＝4組織/群）。
【００３０】
【図３】ＦＧＦ−２は神経分化を促進する。
【図３Ａ】多能性幹細胞のインプットの増加は、BENO培養28日目にニューロフィラメント染色の増強をもたらした。
【図３Ｂ】幹細胞およびNPCに対するＦＧＦ−２の増殖作用。ニューロフィラメント染色で可視化した組織内のニューロンの量とネットワークの複雑さは、8〜15日目にＦＧＦ−２で処理した組織においてより高い。
【００３１】
【図４】BDNFおよびGDNF処理時のニューロン転写物分析。10日目から28日目までの培養下でBDNFおよびGDNFを添加しても、PAX6またはMAP2のどちらの発現も増強されなかった。28日目にBENOを分析した。
【００３２】
【図５】ノッチ阻害による神経発生の増強。15日目から28日目までのDAPT処理はPAX6転写物の存在率を増加させ、したがってより多くの神経細胞の関与を示唆した。
【００３３】
【図６】種々のプロトコルの神経原性および神経膠原性の可能性の評価。
【図６Ａ】実施例1の個々のプロトコルで実施された処理のスキームを要約する。
【図６Ｂ】BENO生成のトランスクリプトーム時間経過分析。OCT4を幹細胞マーカーとして、GFAPをグリアマーカーとして、PAX6をNPCおよびニューロンマーカーとして、最後にMAP2、GRIN1およびGABBR2を成熟ニューロンマーカーとして使用した。データをGAPDHに正規化した。
【図６Ｃ】60日目のBENOの全載IF分析。ニューロフィラメント、MAP2、シナプトフィジンおよびGFAPを使用して、ニューロン、成熟ニューロン、シナプスおよびグリアをそれぞれ染色した。
【図６Ｄ】組織の5つの領域で記録されたカルシウム活性の検出によって計算されたBENO活性。
【００３４】
【図７】BENOにおける神経発生と成熟に関するRNAseqデータを表示する、発生の時間経過中のRNAseq分析からのヒートマップ。
【図７Ａ】幹細胞のニューロンおよびグリアへの異なる分化状態を示すマーカー。
【図７Ｂ】種々のニューロンアイデンティティのマーカー。
【図７Ｃ】皮質層マーカー。
【図７Ｄ】受容体、イオンチャネル、およびシナプス関連タンパク質としての種々の成熟タンパク質。Dr．Rashi Haider／Prof．A．Fischer（DZNE）との協力で実施された。
【００３５】
【図８】BENOの皮質層の発生。TBR2＋脳室下帯前駆細胞は、オルガノイドの中央から周辺へと同心円状に移動している。ここで、CTIP2は深層部ニューロンを印付けている。
【００３６】
【図９】BENOは抑制性および興奮性ニューロンを含む。
【図９Ａ】GABAは、核周囲部（中心）およびGABA作動性ニューロンの軸索のシナプスボタン（周辺）で強く発現される。
【図９Ｂ】GABBR2受容体は、ニューロンの核周囲部（中心）で発現されることが認められた。
【図９Ｃ】ドーパミン作動性ニューロンを印付けるチロシンヒドロキシラーゼ（TH）は、GABA局在化と同様にオルガノイドの中心および周辺で認められた。
【図９Ｄ】シナプトフィジン染色は、オルガノイドの周辺に存在する非常に密なシナプスネットワークを示した。ニューロフィラメント、MAP2およびDAPIを使用して、それぞれ軸索、成熟ニューロンおよび核を染色した。棒グラフ：特に指定のない限り、10μm。
【００３７】
【図１０】BENOの神経ネットワーク機能は、統合された階層的なシナプス機能を示唆する。Fura−4染色されたニューロンを左のパネルに示す。様々な関心領域（ROI）のMatlab分析は、右側のパネルに示されている12の異なるトレースを示した。GABAR阻害の前にROI（2，3）、ROI（4，5）、ROI（6，7）およびROI（11，12）を同期させた。GABAR阻害は細胞の脱同期を引き起こし、10分間のウォッシュアウト時に細胞は再び同期した。Dr．Guobin Bao／Prof．D．Schild（UMG）との協力で実施された。
【００３８】
【図１１】NCMおよびNPEMとの最適なインキュベーション期間。
【図１１Ａ】スキームに示されているプロトコルを使用したBENO生成の15日後の相対的PAX6転写物発現のqPCR分析。
【図１１Ｂ】NCMによるBENO処理（工程D）の最大期間の定義。スキームに示されているプロトコルを使用したBENO生成の15日後の相対的PAX6転写物発現のqPCR分析。
【図１１Ｃ】増殖中のニューロン前駆細胞を印付けるためのPAX6／ki67陽性細胞の免疫蛍光分析。
【発明の詳細な説明】
【００３９】
定義
【００４０】
本明細書で使用される場合、「オルガノイド」という用語は、ヒト臓器などの臓器の構造および/または機能を少なくとも部分的に模倣する三次元集合体を形成する組織培養物を指す。オルガノイドは、例えば三次元（3D）環境で、多能性幹細胞から生成することができる。オルガノイドのそのような3D環境の1つは、回転楕円体状の3D環境である。オルガノイドはさらに、小型化および単純化されたバージョンの臓器と見なされ得る。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「生物工学的に作製された神経オルガノイド」（BENO）という用語は、本発明の方法に従って生産された神経組織に由来するオルガノイドである。BENOは、脳を含む神経器官、または器官内に存在するもしくは器官を制御する神経組織、例えば心臓内（例えば交感神経系）および骨格筋内に存在する神経組織（例えば骨格神経筋接合部のニコチン作動性神経終末）の小型化および単純化されたモデルと見なされ得る。
【００４２】
本明細書で使用される「形成中のBENO」は、BENOへと発達する過程にある細胞およびマトリックスの組成物である。形成中のBENOは、その細胞およびマトリックス材料が本発明の方法の工程Cに供されているが、本発明の方法の工程Fにはまだ供されていないかまたは工程Fがまだ終了していないことを特徴とする。
【００４３】
本明細書で使用される「3D環境」という用語は、空間の三次元すべてに広がる構造を表す。細胞培養物に関連して、3D環境は、細胞が相互に関連して三次元空間に配置されている構造に対応する。3D環境の一例は球状配置である。2D環境は3D環境と異なり、細胞が単層に配置されており、例えば細胞間の空間関係の次元の1つに違いはない。
【００４４】
本明細書で使用される「3D細胞培養系」という用語は、少なくとも最初は3Dマトリックスによって規定される3D環境での細胞培養を指す。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」（PSC）という用語は、自己複製の性質、ならびに3つの胚葉（内胚葉、外胚葉および中胚葉）中に認められる細胞へと分化する傾向を有する細胞である。PSCは未分化状態で存在し、Oct−3／4、SSEA−4、およびTRA1−60などの幹細胞性因子の豊富な発現、自己複製の性質、ならびに3つの胚葉（内胚葉、外胚葉および中胚葉）の細胞へと分化する傾向を特徴とする。PSCは、人工多能性幹細胞（iPSC）、単為生殖幹細胞、核移植によって生成された幹細胞、胚性幹細胞（ESC）、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない数多くの供給源に由来し得る。ESCは、既存のESC株に由来し得る。本発明のPSCは、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性への改変を含む、または工業的もしくは商業的目的のためのヒト胚の使用を含むプロセスを使用して生産されない。PSCはPSC細胞株をさらに含む。本明細書で使用されるPSCの起源は特に限定されないが、哺乳動物由来の細胞が好ましく、より好ましくは、細胞はヒト起源のものである。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「リプログラミング」という用語は、より特殊化した細胞または発達の進んだ段階の他の何らかの形態の細胞を多能性細胞に変換することができる方法を指す。
【００４７】
本明細書で使用される「分化細胞」という用語は、特殊化していない前駆細胞表現型から特殊化した表現型に発達した細胞を指す。例えば、胚細胞は、腸の上皮細胞の内層に分化することができる。例えば、分化細胞は、胎児または生きている動物から単離することができる。
【００４８】
本明細書で使用される「人工多能性幹細胞」（iPSC）は、非多能性細胞、典型的には成体体細胞から人為的に誘導される多能性幹細胞の種類を表す。人工多能性幹細胞は、例えばある特定の幹細胞遺伝子およびタンパク質の発現、クロマチンメチル化パターン、倍加時間、胚様体形成、奇形腫形成、生存可能なキメラ形成、ならびに発生能および分化可能性に関して、胚性幹細胞を含む天然多能性幹細胞と、同一ではないにしても類似すると考えられている。
【００４９】
本明細書で使用される「神経前駆細胞」（NPC）という用語は、細胞増殖を受ける能力、自身の正確なコピーを再生する（自己再生する）能力、および独自に分化した細胞の細胞子孫を生成する能力を有する、PSC由来の細胞を指す。NPCの子孫は、ニューロン細胞（ニューロン前駆細胞もしくは成熟ニューロンなど）またはグリア細胞（グリア前駆細胞、成熟星状細胞もしくは成熟乏突起膠細胞など）のいずれかであり得る。NPCは、例えば、何らかの方法で脱分化またはリプログラミングされない限り、インビトロで単独で培養された場合、通常は他の胚性胚葉の子孫を生成しない。PSCのような幹細胞とは異なり、NPCの増殖能力は限られているため、自己維持能力を示さない。
【００５０】
本明細書で使用される「マトリゲル」という用語は、Engelbreth-Holm-Swarmマウス肉腫に由来する組成物である（Kleinman et al., Biochemistry,1982）。マトリゲルは、化学的に正確に定義されていない混合物であるが、一般にラミニン、IV型コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、および増殖因子を含む。マトリゲルは、一般的に細胞培養のマトリックスとして使用される。
【００５１】
本明細書で使用される「化学的に明確に定義された」または「明確に定義された」という用語は、化学組成が十分な程度の正確さで知られている組成物を指す。
例えば、組成物の総含有量の多くても10％、好ましくは多くても5％が、組成物の異なる試料において化学的に特徴付けられていないかまたは異なっている。
【００５２】
本明細書で使用される「定義されていない組成物を有する天然起源の成分」は、化学的に正確に定義されていない自然源（動物、植物、真菌からの細胞もしくは組織、および原生生物の細胞またはウイルス）から単離された組成物に関する。例えば、組成物の総含有量の少なくとも10％が、組成物の異なる試料において特徴付けられていないかまたは異なっていなければならない。「定義されていない組成物」を有する天然起源の成分の例には、血清およびマトリゲルが含まれる。
【００５３】
本明細書で使用される「線維芽細胞増殖因子2」（ＦＧＦ−２）という用語は、線維芽細胞増殖因子ファミリーのメンバーである。ＦＧＦ−２はFGF2遺伝子によってコードされる。ＦＧＦ−２は、「塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF）」とも称される。ＦＧＦ−２およびbFGFという用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００５４】
本明細書で使用される「神経ネットワーク」は、1つ以上の相互接続されたニューロンの群を表す。神経ネットワーク内のニューロン間の接続は、1つのニューロンから他のニューロン（1または複数）への情報の伝達を可能にする。神経ネットワークでは、ニューロン間の接続はシナプスを介して行われ得る。神経ネットワークの存在は、例えばニューロンのカルシウムイメージングの使用によって容易に確認することができる。
【００５５】
本明細書で使用される「神経ネットワーク組織化」は、神経ネットワークとしてのニューロン群の組織化を指す。この神経ネットワークとしてのニューロンの組織化は、階層ネットワークを作製することができる。
【００５６】
本明細書で使用される「機能的神経ネットワーク」は、1つのニューロンから他のニューロンへの電気化学情報の伝達を表示する神経ネットワークを指す。機能的神経ネットワークは、機能的シナプスの形成を必要とする。機能的神経ネットワークは、ネットワークの複数のニューロンの同期電気活動、またはニューロンの活性化もしくは抑制パターンを含むネットワークのニューロン間の機能的相互依存性を示すパターンを含み得る、ネットワークの活動パターンによって特徴付けられる。神経ネットワークの存在は、例えばニューロンのカルシウムイメージングによって確認できる。特に、シグナル伝達分子に対するニューロン群の反応、またはシグナル伝達分子の受容体（例えばGABA受容体）の阻害は、機能的神経ネットワークの存在を確認することができる。機能的神経ネットワークを証明する一例は、ネットワーク内のニューロンが同期したカルシウムシグナル（例えばカルシウムスパイク）を示す場合であり、これは、ニューロンシグナル伝達分子を阻害する受容体阻害剤を添加すると同期しなくなり、その後阻害剤を除去すると再同期する。
本明細書で使用される「神経ネットワーク機能」は、1つのニューロンから他のニューロンへの電気化学情報の伝達である。
【００５７】
本明細書で使用される「誘導する」という用語は、細胞増殖または細胞分化などの特定の生理学的作用を開始および/または増強することを意味する。
【００５８】
本明細書で使用される「神経発生」は、さらに分化することができない完全に分化した神経細胞への細胞の分化および/または増殖を指す。そのため、神経発生には、PSCからNPCへの分化、NPCの増殖、NPCからより分化した神経細胞、例えばニューロン細胞（ニューロン前駆細胞もしくは成熟ニューロンなど）またはグリア細胞（グリア前駆細胞、成熟星状細胞もしくは成熟乏突起膠細胞など）のいずれかへの分化、またはより分化した神経細胞の増殖が含まれる。
【００５９】
本明細書で使用される「神経分化」という用語は、神経細胞の、さらに分化することができない完全に分化した神経細胞への分化を意味する。そのため、神経分化には、NPCからより分化した神経細胞、例えばニューロン細胞（ニューロン前駆細胞もしくは成熟ニューロンなど）またはグリア細胞（グリア前駆細胞、成熟星状細胞もしくは成熟乏突起膠細胞など）のいずれかへの分化、またはより分化した神経細胞のさらにより分化した神経細胞への分化、例えばニューロン前駆細胞から成熟ニューロンへの分化が含まれる。
【００６０】
本明細書で使用される「マトリックスへの細胞の埋め込み」は、細胞とマトリックスとの相互作用、および/または細胞のマトリックスへの付着を指す。この工程は、例えばインテグリンを含む細胞受容体を介した細胞−マトリックス相互作用によって調節される。
【００６１】
本明細書で使用される「マトリックス」という用語は、細胞を埋め込むのに適した3D環境を創出できる物質を意味する。好ましくは、本発明のマトリックスはヒドロゲル構造を形成する。例示的な適切なマトリックスには、コラーゲンまたは合成コラーゲン模倣物が含まれる。
【００６２】
本明細書で使用される「ヒドロゲル」は、水を含むが水溶性ではない親水性ポリマーのネットワークを指す。ヒドロゲル分子は、例えば共有結合またはイオン結合または絡み合いによって化学的および/または物理的に結合され、それによって3D環境を形成する。ヒドロゲルネットワークは、天然または合成ポリマーネットワークでもあり得る。
【００６３】
本明細書で使用される「間質細胞」という用語は、ニューロン細胞ではない神経細胞を指す。
特に、例示的な間質細胞には、グリア前駆細胞、成熟星状細胞、または成熟乏突起膠細胞などのグリア細胞が含まれる。
【００６４】
本明細書で使用される「シグナル伝達」という用語は、細胞内または2つ以上の細胞間の情報（シグナル）の伝達を指す。シグナル伝達は、化学反応手段（リン酸化、タンパク質切断など）によって、シグナル伝達分子（イオン、神経伝達物質を含む）の放出を介して、あるいは即時の電気化学ポテンシャルの変化を介して起こり得る。
【００６５】
本明細書で使用される「組織工学プラットフォーム」とは、組織、好ましくはヒト組織の構造的および/または機能的特徴を模倣するように設計された細胞のインビトロアセンブリを意味する。
【００６６】
本明細書で使用される「表現型薬剤スクリーニング」という用語は、モデル系の表現型に対する作用に基づく新規または既存の薬剤の適用可能性のスクリーニングを指す。
【００６７】
本明細書で使用される「生物工学」および「生物工学的に作製された」という用語は、生物学的系および生物学的物質を操作する方法を指す。生物工学の例は、分子クローニング、トランスフェクション、形質導入、および化学物質またはその他の材料を使用して細胞に影響を及ぼすことである。
【００６８】
本明細書で使用される「疾患モデリング」という用語は、疾患の一部またはすべての特徴を少なくとも部分的に模倣する疾患のモデルを生成する工程を指す。疾患モデルは、疾患または疾患のいくつかの特徴に対する薬剤などの化合物の影響を評価するために使用できる。例示的な疾患モデルは、細胞培養物、オルガノイドおよびマウスモデルである。
【００６９】
本明細書で特に定義されていないすべての用語は、生物学および医学の分野、特に幹細胞およびオルガノイド研究の分野における慣例的な意味に従って理解されるものとする。
【００７０】
発明の原理
【００７１】
本発明は、再現可能であり、一貫した製品をもたらす化学的に規定された条件下で生物工学的に作製された神経オルガノイド（BENO）を生産する方法を提供する。グリア新生を支持するためのTGF−βによる、神経発生促進のためのレチノイン酸およびＦＧＦ−２の存在下での段階的SMADおよびノッチ阻害は、マトリックス環境における神経発生の生物学的活性のユニークな組み合わせであり、機能的神経ネットワークの形成をもたらす。本発明の1つの例示的な適切なマトリックスは、コラーゲンヒドロゲルである。本発明の時点では、例えば1990年代にKleinmanと同僚らによって導入されて以来、神経発生を誘導することが公知のマトリゲルマトリックスとは対照的に（例えばJucker et al., J Neurosci Res.1991）、それ自体が神経発生を誘導していないマトリックス環境で、定義された因子を使用して神経発生およびグリア新生を制御できるかどうかを予測することはできなかった。
【００７２】
本発明の方法は、例えば実施例1に開示されているように、いくつかの反復を通じて開発され、グリアなどの同時発生中の間質細胞によって支持される顕著な神経ネットワーク組織化および機能を示す構造をもたらした。本明細書に開示される神経オルガノイドのネットワーク組織化および機能、例えば異なるニューロン細胞間での機能的シナプスの形成（したがって、実施例5に記載されている機能的階層）は、従来のオルガノイド構造に比べて多くの利点を提供する。特に、生成され得る本明細書に開示される神経オルガノイドは、定義された培養条件に起因して高い一貫性を示し、機能的神経ネットワークを含み、短い時間枠（例えばPSCとマトリックスの混合から29日）で生成され得る。
【００７３】
本明細書で開示される本発明の方法は、実施のための多数の工程を含む。これらの工程は：
（A）PSCの供給源を提供する工程；
（B）工程（A）のPSCを培養し、細胞培養培地に浸漬したマトリックスに埋め込む工程；
（C）Rho関連キナーゼ阻害剤（ROCKi）およびＦＧＦ−２を含む細胞培養培地で工程（B）の前記マトリックス内のPSCを培養する工程；
（D）レチノイン酸およびSMADシグナル伝達の1つ以上の阻害剤を含む細胞培養培地で工程（C）のPSCとマトリックスに由来する形成中のBENOを培養して、神経発生を誘導する工程；
（E）TGF−βおよびＦＧＦ−２を含む細胞培養培地で工程（D）の形成中のBENOを培養して、間質細胞の発生および神経発生を促進する工程；
（F）TGF−βおよびノッチシグナル伝達の1つ以上の阻害剤を含む細胞培養培地で工程（E）の形成中のBENOを培養して、間質細胞の発生および神経分化を促進する工程
である。
【００７４】
多能性幹細胞（PSC）の提供（工程A）
【００７５】
本発明は、多能性幹細胞（PSC）からの生物工学的に作製された神経オルガノイド（BENO）の生産に関する。多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（iPSC）（線維芽細胞、ケラチノサイト、骨髄由来細胞もしくは臍帯血由来細胞などの血液由来細胞を含む細胞型のリプログラミングによって生成され得る）、単為生殖幹細胞、核移植によって生成された幹細胞、胚性幹細胞および/またはそれらの混合物を含むがこれらに限定されない、様々な供給源から得ることができる。本発明のPSCは、ヒトの生殖系列の遺伝的同一性の改変を含む、または工業的もしくは商業的目的のためのヒト胚の使用を含むプロセスでは生産されない。本発明の方法は、PSC細胞株、例えばTibury et al．，Circulation，2017に記載されているiPSC−G1細胞株を使用して実施することもできる。
【００７６】
PSCは、未分化状態のOct−3／4、SSEA−4、およびTRA1−60などの幹細胞性因子の豊富な発現、自己複製の性質、ならびに3つの胚葉（内胚葉、外胚葉および中胚葉）の細胞に分化する傾向を特徴とする。PSCはまた、誘導PSC（iPSC）であり得る。
【００７７】
本明細書で特許請求されている方法での使用の前に、PSCは、当技術分野で公知の適切な条件下で培養される。PSCは、必要に応じて、標準的な維持手順、例えばマトリゲルなどの維持サポートでの増殖に従って培養され得る。PSCは、当技術分野で公知の任意の適切な細胞培養培地で増殖される。例示的な細胞培養培地は、例えば5μΜまたは10μΜの濃度の、場合によりRho関連タンパク質キナーゼ阻害剤（ROCKi）を含むTeSR−E8基礎培地（Stemcell）である。PSCの例示的な培養方法は、Stover and Schwartz，Methods Mol Biol．2011に報告されている。
【００７８】
本発明のためにPSCを使用する際に、PSCは、例えばEDTA処理を介して、維持サポート、例えばマトリゲルから切り離される。EDTAは、0．1〜10mM、好ましくは0．5〜2mMの濃度で使用することができる。EDTA処理は1〜10分間、好ましくは4〜6分間行われる。好ましいEDTA処理条件は、室温で5〜10分間の0．5mM EDTAおよび室温で5〜8分間の2mM EDTAである。
【００７９】
細胞培養培地に浸漬したマトリックスに埋め込まれたPSCの培養（「工程B」）
【００８０】
上記の提供されたPSCは、その後マトリックスと共に培養され、これにより、マトリックスによって規定される3D環境にPSCを埋め込むことが可能になる。そのような3D環境内でのPSCの埋め込みおよび自己組織化は、本発明のオルガノイドが生成される基盤を提供する。好ましくは、細胞は均質な方法でマトリックスに埋め込まれるべきである。
【００８１】
本発明のマトリックスは、PSCおよびPSCに由来する細胞の自己組織化および分化を促進する3D環境を構成する。マトリックスの構造は、個々のマトリックス分子の相互作用、例えばタンパク質間相互作用によって安定化される。最も好ましくは、本発明のマトリックスはヒドロゲル構造を形成する。
【００８２】
本発明の例示的な適切なマトリックスは、コラーゲン、コラーゲン模倣物、アルギン酸塩、フィブリン、マトリゲル、およびキトサンである。好ましいマトリックスは、コラーゲンおよびコラーゲン模倣物である。最も好ましいマトリックスは、I型コラーゲンに基づく。I型コラーゲンに基づくマトリックスは、微量のIII型コラーゲンなどの他のコラーゲンを含み得る。好ましくは、I型コラーゲンに基づくマトリックスは、I型コラーゲンを80％超、85％超、90％超、95％超、または100％超含む。
【００８３】
好ましい実施形態では、本発明のマトリックスはマトリゲルを含まない。より好ましい実施形態では、本マトリックスは、マトリゲルまたは1つ以上の成分の定義されていないもしくは明確でない組成物を有する天然起源の他の成分を含まない。マトリゲルなどの定義されていないまたは明確でない化学混合物の使用は、必然的に生成されるオルガノイドのより大きな表現型バリエーションをもたらすので、これは特に重要である。この観察は、例えばTiburcy et al., Circulation,2017によって確認されている。マトリゲルが、ラミニン、IV型コラーゲン、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン、およびEngelbreth−Holm−Swarmマウス肉腫に由来する増殖因子成分を含む定義されていない混合物であることは周知であり、ロットごとの成分割合は高い変動性を示す（Kleinman et al., Biochemistry, 1982）。
【００８４】
PSCとマトリックス要素は、PSC培養に適した細胞培養培地で混合される。そのような細胞培養培地の例は、TeSR−E8基礎培地（Stemcell）およびStemFlex培地（Gibco）である。細胞培養培地には、ＦＧＦ−２およびROCKiなどの追加成分を補充することができる。これらの成分は、マトリックス内の細胞の生存と増殖を促進し得る。1つの例示的な培地は、20ng／ml ＦＧＦ−２および10μM ROCKiを補充したTeSR−E8基礎培地である。細胞培養培地に添加され得る他の成分には、DMEM細胞培養培地またはpH中和のためのNaOHが含まれる。
【００８５】
マトリックス（コラーゲンマトリックスなど）は有効濃度で使用される。いくつかの実施形態では、マトリックスの濃度は0．05mg／ml〜50mg／mlである。他の好ましい実施形態では、マトリックスの濃度は0．1mg／ml〜10mg／mlである。より好ましい実施形態では、マトリックスの濃度は0．5mg／ml〜5mg／mlである。最も好ましい実施形態では、マトリックスの濃度は1mg／mlである。
【００８６】
培地およびマトリックスとの混合後のPSCの密度は、0．1〜10x106細胞／mlの範囲であり得る。好ましい範囲は、0．5〜6×106細胞／mlである。より好ましい範囲は、1〜4×106細胞／mlである。1つの例示的な適切な値は、3×106細胞／mlである。
【００８７】
本培養工程は、以下の項で開示される培養工程の前に実施される。この培養工程（PSCがマトリックスに埋め込まれる；「工程B」）は、Rho関連キナーゼ阻害剤（ROCKi）およびＦＧＦ−２を含む細胞培養培地で細胞を培養する培養工程（「工程C」）の前に実施される。工程Bから工程Cへの移行は、典型的には、既存の細胞培養培地への工程Cの成分の添加によって特徴付けられる。
【００８８】
いくつかの実施形態では、この培養工程Bは、1分から1日の期間にわたって実施される。好ましい実施形態では、工程Bは5分〜5時間実施される。より好ましい実施形態では、工程Bは10分〜1時間実施される。さらにより好ましい実施形態では、工程Bは15分〜30分間実施される。最も好ましい実施形態では、工程Bは20分間実施される。
【００８９】
工程Bの時点は、本発明のオルガノイドの生成に関する本プロトコルによって「−1日目」と称される。
【００９０】
工程Bは、適切な細胞培養容器で実施される。例示的な適切な細胞培養容器は、U底および低付着特性を備えた96ウェルプレートである。
【００９１】
工程Bは、PSCの生存に適した条件下で実施される。例示的な適切な条件は、例えば細胞培養インキュベータにおける、37℃、5％CO2である。
【００９２】
Rho関連キナーゼ阻害剤（ROCKi）およびＦＧＦ−２を含む細胞培養培地での工程（B）の前記マトリックス内のPSCの培養（「工程C」）
【００９３】
工程Bのマトリックス内のPSCは、Rho関連キナーゼ阻害剤（ROCKi）および線維芽細胞増殖因子2（ＦＧＦ−２）を含む培地で培養される。
【００９４】
適切なROCKi変異体には、Y27632（Stemgent）、Fasudil、Ripasudil、RKI−1447、GSK429286A、Y−30141、およびFeng et al．， J Med Chem．， 2016に総説されている他の成分が含まれる。ROCKiは有効濃度で使用される。好ましいROCKiはY27632である。いくつかの実施形態では、Y27632の濃度は0．1μM〜1mMである。好ましい実施形態では、Y27632の濃度は1μΜ〜100μΜである。より好ましい実施形態では、Y27632の濃度は5μΜ〜50μΜである。最も好ましい実施形態では、Y27632の濃度は10μMである。
【００９５】
ＦＧＦ−２（bFGFとしても知られる）は有効濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−２の濃度は0．1ng／ml〜1μg／mlである。好ましい実施形態では、ＦＧＦ−２の濃度は1ng／ml〜100ng／mlである。より好ましい実施形態では、ＦＧＦ−２の濃度は5ng／ml〜50ng／mlである。最も好ましい実施形態では、ＦＧＦ−２の濃度は10ng／mlである。本発明は、好ましくはＦＧＦ−２を使用するが、本発明はまた、FGF受容体に結合し、それによってFGF受容体媒介シグナル伝達を引き起こすことを特徴とする、ＦＧＦ−２と同等または類似のシグナル伝達活性を有するＦＧＦ−２模倣物を使用して実施することもでき、そのような活性は、各FGF受容体でのＦＧＦ−２のシグナル伝達活性の少なくとも10％である。
【００９６】
この培養工程Cでは、PSCは、PSCの培養に適した細胞培養培地で培養される。適切な細胞培養培地の例には、TeSR−E8基礎培地（Stemcell）およびStemFlex培地（Gibco）が含まれる。
【００９７】
この培養工程は、上記で開示された工程Bに続いて実施される。工程Bから工程Cへの移行は、典型的には、工程BのPSCとマトリックスを含む既存の細胞培養培地への工程Cの成分の添加によって特徴付けられる。工程Cは、以下で説明される工程Dの前に実施される。工程Cから工程Dへの移行は、細胞培養培地の部分的または完全な交換、あるいは既存の細胞培養培地への工程Dの成分の添加によって特徴付けられる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、工程Cは、6時間から4日の期間にわたって実施される。いくつかの好ましい実施形態では、工程Cは12時間〜3日間実施される。より好ましい実施形態では、工程Cは1日〜2日間実施される。最も好ましい実施形態では、工程Cは1日間実施される。
【００９９】
工程Cは、オルガノイドを生産するためのプロトコルの−1日目に開始されるべきである。期間に応じて、この手順は本プロトコルの0、1、2、または3日目まで延長し得る。最も好ましい実施形態では、工程Cはプロトコルの0日目まで延長される。
【０１００】
工程Cは、適切な細胞培養容器で実施される。例示的な適切な細胞培養容器は、U底および低付着特性を備えた96ウェルプレートである。一般的に、細胞培養容器は、本明細書に開示される工程BおよびCを実施するときに交換しない。
【０１０１】
工程Cは、PSCの生存に適した条件下で実施される。例示的な適切な条件には、例えば細胞培養インキュベータにおける、37℃、5％CO2が含まれる。
【０１０２】
神経発生を誘導するための、レチノイン酸およびSMADシグナル伝達の1つ以上の阻害剤を含む細胞培養培地での工程（C）のPSCとマトリックスに由来する形成中のBENOの培養（「工程D」）
【０１０３】
マトリックス内の工程Cに従って処理されたPSCは、形成中のBENOを構成する。工程CのPSCとマトリックスに由来するこの形成中のBENOは、レチノイン酸およびSMADシグナル伝達経路の1つ以上の阻害剤を含む培地で培養される。そのような処理は神経発生を誘導する。
【０１０４】
レチノイン酸は、シグナル伝達活性化分子として使用される。好ましくは、オールトランスレチノイン酸［（2E，4E，6E，8E）−3，7−ジメチル−9−（2，6，6−トリメチルシクロヘキセン−1−イル）ノナ−2，4，6，8−テトラエン酸］が使用される。しかしながら、本発明はまた、典型的にはレチノイン酸受容体に結合し、それによってレチノイン酸受容体媒介シグナル伝達を引き起こすことを特徴とする、オールトランスレチノイン酸と同等または類似のシグナル伝達活性を有するレチノイン酸誘導体を使用して実施することもでき、そのような活性は、オールトランスレチノイン酸のシグナル伝達活性の少なくとも10％である。レチノイン酸は有効濃度で使用される。いくつかの実施形態では、レチノイン酸の濃度は0．01μΜ〜100μΜである。好ましい実施形態では、レチノイン酸の濃度は0．1μΜ〜10μΜである。より好ましい実施形態では、レチノイン酸の濃度は0．5μΜ〜5μΜである。最も好ましい実施形態では、レチノイン酸の濃度は1μΜである。
【０１０５】
SMAD阻害剤は、Mothers against decapentaplegic homologue（SMAD）タンパク質（例えばSMAD−1〜SMAD−9）によって媒介されるシグナル伝達を阻害するために使用される。SMADを介したシグナル伝達の阻害は神経発生を誘導する。適切なSMAD阻害剤には、タンパク質ノギン、SB 431542（Tocris）、ドルソモルフィン、およびLDN−193189（Tocris）が含まれる。SMAD阻害剤は有効濃度で使用される。例えば、ノギンは、0．1ng／ml〜1μg／ml、好ましくは1ng／ml〜500ng／ml、より好ましくは10ng／ml〜200ng／ml、最も好ましくは50ng／mlの濃度で使用することができる。SB 431542は、0．1μM〜1mM、好ましくは1μM〜100μM、より好ましくは5μM〜50μM、最も好ましくは10μMの濃度で使用することができる。複数のSMAD阻害剤の使用は、神経発生の誘導にプラスの作用を及ぼし得る（実施例1）。SMAD阻害剤の1つの好ましい組合せは、ノギンとSB 431542を含む。SMAD阻害剤のより好ましい組合せは、ノギンとSB 431542からなる。SMAD阻害剤の最も好ましい組合せは、ノギン（50ng／ml）とSB 431542（10μM）からなる。
【０１０６】
形成中のBENOは、PSC培養に適した任意の細胞培養培地で培養される。例示的な細胞培養培地には、Stemdiffニューロン分化培地（Stemcell）、Neurobasal培地（Gibco）、および実施例2で使用される培地が含まれる。
【０１０７】
開示される方法の工程Dは、典型的には工程Cの後に実施される。工程Cから工程Dへの移行は、細胞培養培地の部分的または完全な交換、あるいは既存の細胞培養培地への工程Dの成分の添加によって特徴付けられる。本明細書で説明するように、工程Dは、典型的には工程Eの前に実施される。工程Dから工程Eへの移行は、細胞培養培地の部分的または完全な交換、あるいは既存の細胞培養培地への工程Eの成分の添加によって特徴付けられる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、工程Dは、2日から16日の期間にわたって実施される。いくつかの好ましい実施形態では、工程Dは4日〜12日間実施される。より好ましい実施形態では、工程Dは6日〜10日間実施される。最も好ましい実施形態では、工程Dは8日間実施される。工程Dを8日間実施することは、3日間または6日間と比較して有利であることが認められた（実施例8参照）。工程Dを10日間実施すると、8日間よりもさらに一層有利であるが、工程Dのさらなる延長は結果を有意に改善しなかった（実施例8参照）。したがって、別の特に好ましい実施形態では、工程Dは少なくとも8日間または10日間実施される。
【０１０９】
この工程を実施する際の「指定」日は、先に実施される工程B、C、およびDの期間に依存する。一般に、工程Dの開始時点は、0日目から3日目の間である。工程Dの終了は、一般に2日目から19日目の間である。最も好ましい実施形態では、工程Dは0日目から8日目までに及ぶ。別の特に好ましい実施形態では、工程Dは0日目から10日目までに及ぶ。
【０１１０】
工程Dは、任意の適切な細胞培養容器を使用して実施される。例示的な適切な細胞培養容器には、単一または複数のオルガノイド培養のためのU底および低付着特性を備えた96ウェルプレート、または6ウェルプレート、または特注の3D印刷されたもしくはキャスト成形された容器が含まれる。細胞培養容器は、典型的には工程CとDの間で変わらない。細胞培養容器は、工程Dを実施するときに交換してもよい。そのような例示的な容器交換の1つは、96ウェルプレートから6ウェルプレートへの拡張である。
【０１１１】
工程Dは、形成中のBENOの生存に適した条件下で実施される。例示的な適切な条件は、例えば細胞培養インキュベータにおける、37℃、5％CO2である。
【０１１２】
間質細胞の発生および神経発生を促進するための、TGF−βおよびＦＧＦ−２を含む細胞培養培地での工程Dの形成中のBENOの培養（「工程E」）
【０１１３】
工程Dの後に提供される形成中のBENOは、トランスフォーミング増殖因子（TGF）βおよび線維芽細胞増殖因子2（ＦＧＦ−２）を含む培地で培養される。TGF−βでの処理は間質細胞の発生を促進し、ＦＧＦ−２は神経発生を促進する。
【０１１４】
TGF−βでの処理は、新たなオルガノイドにおける間質細胞の発生と機能性を増強する。間質細胞は、神経組織の間質細胞である。例示的な間質細胞には、グリア細胞が含まれる。本発明で使用されるTGF−βは、TGF−β1、TGF−β2、TGF−β3、またはそれらの混合物であり得る。本発明はまた、TGF−β受容体に結合し、それによってTGF−β受容体媒介シグナル伝達を引き起こすことを特徴とする、TGF−βと同等または類似のシグナル伝達活性を有するTGF−β模倣物を使用して実施することもでき、そのような活性は、TGF−β1のシグナル伝達活性の少なくとも10％である。好ましくは、本発明で使用されるTGF−βはTGF−β1である。TGF−βは有効濃度で使用される。いくつかの実施形態では、TGF−βの濃度は0．1ng／ml〜100ng／mlである。好ましい実施形態では、TGF−βの濃度は0．3ng／ml〜30ng／mlである。より好ましい実施形態では、TGF−βの濃度は1ng／ml〜10ng／mlである。最も好ましい実施形態では、TGF−βの濃度は5ng／mlである。
【０１１５】
ＦＧＦ−２（bFGFとしても知られる）は有効濃度で使用される。いくつかの実施形態では、ＦＧＦ−２の濃度は0．1ng／ml〜1μg／mlである。いくつかの好ましい実施形態では、ＦＧＦ−２の濃度は1ng／ml〜100ng／mlである。より好ましい実施形態では、ＦＧＦ−２の濃度は5ng／ml〜50ng／mlである。最も好ましい実施形態では、ＦＧＦ−２の濃度は10ng／mlである。本発明は、好ましくはＦＧＦ-２を使用するが、本発明はまた、FGF受容体に結合し、それによってFGF受容体媒介シグナル伝達を引き起こすことを特徴とする、ＦＧＦ−２と同等または類似のシグナル伝達活性を有するＦＧＦ−２模倣物を使用して実施することもでき、そのような活性は、各FGF受容体でのＦＧＦ−２のシグナル伝達活性の少なくとも10％である。
【０１１６】
開示される方法のこの工程では、形成中のBENOは、PSCの培養に適した細胞培養培地で培養される。例示的な細胞培養培地には、Stemdiffニューロン分化培地（Stemcell）、Neurobasal培地（Gibco）、および実施例2で使用される培地が含まれる。
【０１１７】
工程Eは、典型的には工程Dに続いて実施される。工程Dから工程Eへの移行は、細胞培養培地の部分的または完全な交換、あるいは既存の細胞培養培地への工程Eの成分の添加によって特徴付けられる。工程Eは、典型的には以下で説明される工程Fの前に実施される。工程Eから工程Fへの移行は、細胞培養培地の部分的または完全な交換、あるいは既存の細胞培養培地への工程Fの成分の添加によって特徴付けられる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、工程Eは、2日から16日の期間にわたって実施される。好ましい実施形態では、工程Eは4日〜12日間実施される。より好ましい実施形態では、工程Eは6日〜10日間実施される。最も好ましい実施形態では、工程Eは7日間実施される。工程Eを5日間実施することは、7日間と比較して有意に劣ることはないと認められた；逆に、工程Eを2日間実施すると、劣悪なBENO凝縮が生じた（実施例8参照）。したがって、別の特に好ましい実施形態では、工程Eは多くても7日間または5日間実施される。
【０１１９】
この工程を実施する際の「指定」日は、先に実施される工程B、C、D、およびEの期間に依存する。一般に、工程Eの開始時点は、3日目から15日目の間である。工程Eの終了は5日目から20日目の間である。最も好ましい実施形態では、工程Eは8日目から15日目までに及ぶ。別の特に好ましい実施形態では、工程Eは10日目から15日目まで実施される。
【０１２０】
工程Eは、任意の適切な細胞培養容器を使用して実施される。例示的な適切な細胞培養容器には、単一または複数のオルガノイド培養のための6ウェルまたは特注の3D印刷されたもしくはキャスト成形された容器が含まれる。細胞培養容器は、典型的には工程DとEの間で変わらない。細胞培養容器は、工程Eを実施するときに交換してもよい。
【０１２１】
工程Eは、形成中のBENOの生存に適した条件下で実施される。例示的な適切な条件は、例えば細胞培養インキュベータにおける、37℃、5％CO2である。
【０１２２】
間質細胞の発生および神経分化を促進するための、TGF−βおよびノッチシグナル伝達の1つ以上の阻害剤を含む細胞培養培地での工程Eの形成中のBENOの培養（「工程F」）
【０１２３】
工程Eの後に提供される形成中のBENOは、トランスフォーミング増殖因子β（TGF‐β）およびノッチシグナル伝達の1つ以上の阻害剤を含む培地で培養される。TGF−βによる処理は間質細胞の発生を促進し、ノッチシグナル伝達の阻害は神経分化を促進する。
【０１２４】
TGF−βでの処理は、新たなオルガノイドにおける間質細胞の発生と機能性を増強する。間質細胞は、神経組織の間質細胞である。例示的な間質細胞には、グリア細胞が含まれる。本発明で使用されるTGF−βは、TGF‐β1、TGF‐β2、TGF‐β3、またはそれらの混合物であり得る。本発明はまた、TGF−β受容体に結合し、それによってTGF−β受容体媒介シグナル伝達を引き起こすことを特徴とする、TGF−βと同等または類似のシグナル伝達活性を有するTGF−β模倣物を使用して実施することもでき、そのような活性は、TGF−β1のシグナル伝達活性の少なくとも10％である。TGF−βは有効濃度で使用される。いくつかの実施形態では、TGF−βの濃度は0．1ng／ml〜100ng／mlである。好ましい実施形態では、TGF−βの濃度は0．3ng／ml〜30ng／mlである。より好ましい実施形態では、TGF−βの濃度は1ng／ml〜10ng／mlである。最も好ましい実施形態では、TGF−βの濃度は5ng／mlである。
【０１２５】
ノッチシグナル伝達阻害剤は、ノッチ受容体（例えばノッチ1〜ノッチ4受容体）によって媒介される細胞シグナル伝達を阻害するために使用される。ノッチシグナル伝達の阻害は神経分化を促進する。適切なノッチシグナル伝達阻害剤には、N−［（3，5−ジフルオロフェニル）アセチル］−L−アラニル−2−フェニル］グリシン−1，1−ジメチルエチルエステル（DAPT）、化合物E（幹細胞技術）、およびOlsauskas−Kuprys et al．，OncoTargets and Therapy，2013に記載されているようなγ−セクレターゼ阻害剤が含まれる。ノッチシグナル伝達阻害剤は有効濃度で使用される。本発明の好ましいノッチシグナル伝達阻害剤はDAPTである。いくつかの実施形態では、DAPTの濃度は0．01μΜ〜100μΜである。いくつかの好ましい実施形態では、DAPTの濃度は0．1μΜ〜10μΜである。より好ましい実施形態では、DAPTの濃度は0．5μΜ〜5μΜである。最も好ましい実施形態では、DAPTの濃度は2．5μΜである。
【０１２６】
開示される方法のこの工程では、形成中のBENOは、その培養に適した細胞培養培地で培養される。例示的な細胞培養培地には、Stemdiffニューロン分化培地（Stemcell）、Neurobasal培地（Gibco）、および実施例2で使用される培地が含まれる。
【０１２７】
工程Fは、典型的には工程Eに続いて実施される。工程Eから工程Fへの移行は、細胞培養培地の部分的または完全な交換、あるいは既存の細胞培養培地への工程Fの成分の添加によって特徴付けられる。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、工程Fは、5日から95日の期間にわたって実施される。好ましい実施形態では、工程Fは7日〜50日間実施される。より好ましい実施形態では、工程Fは10日〜20日間実施される。最も好ましい実施形態では、工程Fは13日間実施される。
【０１２９】
この工程を実施する際の「指定」日は、先に実施される工程B、C、D、EおよびFの期間に依存する。一般に、工程Fの開始時点は、4日目から35日目の間である。工程Fの終了は、9日目から100日目の間である。最も好ましい実施形態では、工程Fは15日目から28日目までに及ぶ。
【０１３０】
工程Fは、任意の適切な細胞培養容器を使用して実施される。1つの例示的な適切な細胞培養容器は、単一または複数のオルガノイド培養のための6ウェルプレートまたは特注の3D印刷されたもしくはキャスト成形された容器である。細胞培養容器は、典型的には工程EとFの間で変わらない。
【０１３１】
工程Fは、形成中のBENOの生存に適した条件下で実施される。例示的な適切な条件は、例えば細胞培養インキュベータにおける、37℃、5％CO2である。
【０１３２】
本明細書に開示される方法の工程Fの完了は、BENOを提供する。工程Fに続いて、BENOの所望の用途に応じて、適切な条件下でBENOをさらに培養または増殖させてもよい。さらなる培養は、BENOの付加的な特徴の開発につながり得るおよび/または神経発生を最適化し得る。
【０１３３】
本発明の方法に従って生産される神経オルガノイドの特性および利点
【０１３４】
本明細書に開示される方法によって生産される神経オルガノイド（すなわちBENO）は、皮質の発生、神経発生およびグリア新生を示す。BENOは、神経細胞と間質細胞で構成される。間質細胞（グリアなど）は、開示される方法を実施する際に創出される神経発生促進環境を提供するために重要である。本明細書に開示される定義された増殖因子および小分子を介した神経発生およびグリア新生の同時発生は、ヒト脳の多細胞の複雑さを有効に再構築する。
【０１３５】
開示される方法によって生産された神経オルガノイドは、これまでに示されていない独自の特徴を明らかにする。例えば、本明細書に記載のBENOは、機能的シナプスの形成、階層的ネットワークの形成、GABA作動性ネットワーク、およびニューロンの同期化を含む神経機能によって特徴付けられる機能的神経ネットワークを形成する（実施例5）。これらの神経機能は、従来の神経オルガノイドに比べて少なくとも1つの重要な利点を示す。特に、BENOは、興奮性および抑制性ニューロンならびに興奮性および抑制性神経ネットワークを含むことができる。
【０１３６】
さらに、本発明の方法によって生産されるBENOは、好ましくは完全に定義された条件（例えば無血清）下で生産される。これは、定義されていないまたは明確でない化学成分に起因する変動が排除されるため、BENOが確実に再現可能であることを意味する。
【０１３７】
BENOの応用
【０１３８】
本発明の方法によって生産されるBENOは、いわゆる表現型薬剤スクリーニングに使用することができる。標的特異的薬剤スクリーニング技術とは異なり、表現型薬剤スクリーニングは、特定の標的への候補分子の結合ではなく、標的分子が表現型に及ぼす影響に焦点を合わせる。そのような表現型薬剤スクリーニングの前提条件は、検討される疾患の表現型を模倣できる適切なモデルの存在である。本明細書に開示されるBENOは、神経組織に関連する様々な疾患を検討する場合にそのような疾患モデルを提供し得る。本発明が薬剤スクリーニングの適切なモデルを提供できる疾患には、脳卒中、脳炎症障害、神経変性疾患（パーキンソン病、アルツハイマー病など、実施例6による）、神経炎症性疾患（例えば多発性硬化症）、外傷性損傷（例えば脳外科手術による損傷）、イオンチャネル疾患（例えばてんかん）および精神疾患（自閉症および統合失調症を含む、実施例7による）が含まれる。
【０１３９】
BENOは、表現型薬剤スクリーニングによる発見および薬剤改良に使用することができる。このBENOの使用には、脳および神経組織の修復、再生、保護、および疾患予防を誘導または増強し得る薬剤の発見および改良が含まれる。
【０１４０】
そのようなBENOモデルに有用なPSCは、健常個体または疾患患者から得ることができる。あるいは、多能性幹細胞の遺伝子編集を適用して、関心対象の任意の遺伝的および後成的修飾を作製することができる。本明細書に開示される方法に従ってPSCからBENO組成物を生産した後、BENOは、したがって、高い予測値での表現型組織スクリーニングを可能にする。より高い成熟度、細胞の複雑さ、および神経組織の階層的ネットワーク機能により、本発明によるBENOの使用は、従来のモデルに比べて多くの利点を提供する。さらに、開示されるBENO生産の方法の単純さは、ハイスループット表現型スクリーニングを容易に可能にする。健常および疾患モデル化されたBENOは、シミュレートされた疾患（例えば脳卒中様の損傷を誘導する低酸素症）に供することができる。表現型の読み取りには、BENO内の特定の細胞型における組織形成、電気的接続性、細胞死および細胞増殖に対する作用が含まれる。表現型の薬剤スクリーニングは、様々な薬剤標的の定義と検証を可能にし得る。したがって、これは、例えば再生、修復、疾患修飾、または保護的な生物学的活性を有する化合物を同定するためのその後の化合物スクリーニングの基盤を提供することができる。
【０１４１】
本明細書に開示される方法に従って生産されるBENOはまた、例えば神経組織の電気的障害（発作）、変性、細胞死、または他の細胞異常を誘導する物質の潜在的可能性を試験するための薬剤安全性スクリーニングにも使用できる。
【０１４２】
本発明の方法によって生産されるBENOは、例えば臨床試験と並行して実施される前臨床試験において、薬剤が関与する作用機序試験にも使用することができる。
【０１４３】
本発明の方法によって生産されるBENOは、個別化医療の目的にも使用することができる。例えば、患者由来のiPSCを使用して、疾患をシミュレートし、個別化治療法を試験することができる。本発明のBENOは、神経組織に関連する疾患、例えば神経変性疾患または神経炎症性疾患の治療法を試験するのに特に有用であり得る。記載のBENOを使用して、可能性のあるすべての治療選択肢、例えば薬剤、抗体もしくは非コードRNAのような生物学的製剤、遺伝子編集、またはそれらの組合せによる治療法を研究し、試験することができる。
【０１４４】
BENOは、他の組織工学プラットフォームとBENOの共培養においてますます精巧な組織モデルを生成するのにも適用できる。いくつかの実施形態では、神経筋接合部の発生を検討するために、EHM（人工心筋）およびBSM（バイオ人工骨格筋）との共培養を使用することができる。特に、BENOとEHMの共培養は、ニューロンとペースメーカーまたはニューロンと心筋細胞の相互作用を検討するために使用できる。このモデルを使用して、不整脈の発生を検討することができる。他の実施形態では、BENOはESM（人工骨格筋）、ELT（人工肝組織）、またはECT（人工結合組織）と共培養される。他の実施形態では、BENO腫瘍モデルは、腫瘍−脳相互作用（例えば腫瘍の脳浸潤、転移の拡大）を検討するために使用され、またはBENO白血球浸潤モデルは、神経炎症（例えば自己免疫疾患）を検討するために使用される。一般に、そのような共培養モデルは、薬剤の作用と相互作用についての複数の器官の並行スクリーニングに向けた重要な工程である。共培養モデルはさらに、パーキンソン病および他の神経変性疾患などの疾患のモデルとして、例えば個別化治療としてのそれらの有効性を試験するために使用できる。
【０１４５】
本発明のBENOはまた、科学的または治療目的のための再生組織を提供し得る。例えば、BENOは、薬剤または生物物理学的（例えば、電気的コンディショニング）治療下での回復と再生を検討するために損傷させ得る。あるいは、パーキンソン病に対抗するためのドーパミンの産生と放出などの特定の脳機能を備えたBENOを構築し得る。さらに、衰弱した器官の制御（例えば骨格筋の制御）を可能にするためにBENOを器官に接続し得るか、または機械−器官インターフェースとして使用し得る。
【０１４６】
キット
【０１４７】
本発明のキットは、本明細書に開示される方法を実施するための構成要素を含む。いくつかの実施形態では、キットは、PSC、マトリックス、適切な培地、ならびに必要な補助物質（ROCKi、ＦＧＦ−２、レチノイン酸、SMADシグナル伝達の1つ以上の阻害剤、TGF−β、およびノッチシグナル伝達の1つ以上の阻害剤）を含む。他の実施形態では、キットは、マトリックス、適切な培地、ならびに必要な補助物質（ROCKi、ＦＧＦ−２、レチノイン酸、SMADシグナル伝達の1つ以上の阻害剤、TGF−β、およびノッチシグナル伝達の1つ以上の阻害剤）を含む。他の実施形態では、キットは、マトリックスならびに必要な補助物質（ROCKi、ＦＧＦ−２、レチノイン酸、SMADシグナル伝達の1つ以上の阻害剤、TGF−β、およびノッチシグナル伝達の1つ以上の阻害剤）を含む。他の実施形態では、キットは、マトリックスならびに必要な補助物質（ROCKi、ＦＧＦ−２、レチノイン酸、SMADシグナル伝達の1つ以上の阻害剤、TGF−β、およびノッチシグナル伝達の1つ以上の阻害剤）の少なくとも4つを含む。
【実施例】
【０１４８】
BENOの生産のための一般的なプロトコル
【０１４９】
以下のプロトコルは、PSCの供給源からBENOを生成するのに有用な工程を提供する。
【０１５０】
材料
【０１５１】
以下の材料のリストは、実施例で具体化される実験において使用された：
−TeSR（商標）−E8（商標）キット、Stemcell Technologies No．05940
−EDTA溶液0．5M、pH8、AppliChem No．A4892．0500
−マトリゲル（増殖因子が低減されている）、BD Bioscience No．354230
−Neurobasal−A、Thermofischer No．10888−022
−100Xペニシリン/ストレプトマイシン（P／S）、Thermofischer No．15140−122
−100xグルタミン、Thermofischer No．25030−024
−ＦＧＦ−２、Miltenyi Biotech No．130−093−841
−B27、Thermofischer No．17504−044
−N2、Thermoscientific No．17502−048
−DMSO、Sigma、No．276855
−ノギン、R＆D systems No．6057−NG−025
−L−アスコルビン酸2リン酸セスキマグネシウム塩水和物（ASC−2−P）、Sigma No．A8960−5G
−オールトランスレチノイン酸、Sigma、R2625−50MG
−TGF−β1（TGFβ1）、Peprotech、No．100−21
−ROCKi（Y27632）、Stemgent、No．04−0012
−SB 431542、Tocris、No．1614
−DAPT、Tocris、No．2634
−96ウェルプレート（U底、低付着性）、Sarstedt No．83．1837．500
−T25フラスコ、Sarstedt No．83．3910．002
−6ウェルプレート、Greiner No．657160
【０１５２】
保存溶液（−20℃）
製造元の指示に従って調製した10μg／mlのＦＧＦ−２ストック
製造元の指示に従って調製した250μg／mlのノギンストック
−水中200mMのASC−2−Pストック
−製造元の指示に従って調製した10μg／mlのTGFβ1ストック
−DMSO中の10mM ROCKiストック
−DMSO中の10mM SB 431542ストック
−DMSO中の100mM DAPTストック
−DMSO中の10mMレチノイン酸
【０１５３】
作業溶液（4℃）
【０１５４】
EDTA 0．5mM溶液
【０１５５】
0．5M EDTA保存溶液（pH 8．0）500μlを、NaCl 0．45gを含むカルシウム/マグネシウム不含PBS 500mlに添加する。滅菌ろ過（0．22μm）し、アリコートに分け、4℃で6ヶ月間保存する。
【０１５６】
マトリゲル1：30溶液
【０１５７】
マトリゲルを重合から保護するために、事前に冷却したチップを使用してマトリゲル1mlを氷冷PBS 29mlに希釈する。溶液が透明でない場合は、冷蔵庫で一晩保存し、再度混合する。
【０１５８】
TeSR（商標）−E8（商標）培地
【０１５９】
製造元の指示に従って調製し、1％P／Sを添加する
【０１６０】
基礎培地
【０１６１】
以下のものを補充したNeurobasal−A：
【０１６２】
100Xグルタミン1％、100XP／S 1％、B27 2％、N2 1％、200μΜ、ASC−2−P
【０１６３】
神経拘束培地（NCM）
【０１６４】
以下のものを補充した基礎培地（50ml）：
【０１６５】
50ng／mlノギン（10μl）；一部の実験では、10μΜ  SB 431542（50μl）、1μΜ  RA（5μl）を使用した。
【０１６６】
神経前駆細胞増殖培地（NPEM）
【０１６７】
以下のものを補充した基礎培地（50ml）：
【０１６８】
10ng／ml ＦＧＦ−２（50μl）；一部の実験では、5ng／ml TGFβ1を使用した；一部の実験では、BDNF（20ng／ml）およびGDNF（10ng／ml）を使用した。
【０１６９】
神経分化培地（NDM）
【０１７０】
以下のものを補充した基礎培地（50ml）：
【０１７１】
一部の実験では、2．5μΜ  DAPT（1．25μl）；一部の実験では、5ng／ml TGFβ1（25μl）；一部の実験では、2．5μΜ  DAPT（1．25μl）および5ng／ml TGFβ1（25μl）
【０１７２】
実験方法
【０１７３】
−4日目（細胞の調製の例として使用される多能性幹細胞の標準的な維持培養）
【０１７４】
マトリゲル被覆
【０１７５】
増殖因子を低減したマトリゲルを氷冷PBSで1：120希釈し、直ちにプレートを被覆した（150μl／cm2）。その後、被覆したプレートを冷蔵庫で最大2週間保存した。使用する前に、被覆したプレートをエタノールで消毒し、インキュベータ内で30〜60分間37℃に置いた。
【０１７６】
EDTA継代（T−25フラスコの容量）
【０１７７】
細胞を0．5mM EDTA 2ml（80μl／cm2）で2回洗浄した後、0．5mM EDTA 3ml（120μl／cm2）を添加した。細胞を室温で5〜10分間インキュベートした。一部の細胞株は、マトリゲルで増殖させる場合、5〜8分間の2mM EDTA処理を必要とし得る。インキュベーション後、EDTA溶液を慎重に吸引した。次に、10μM ROCKiを含む新鮮E8培養培地3mlを細胞に添加し、その後、5μM ROCKiを含む培地5mlが入った適切な新しいフラスコに播種した（50，000／cm2）。翌日、培地をROCKiなしの培地に交換した。
【０１７８】
−1日目（BENOの成形）
【０１７９】
以下は、各々30μl容量（ピペッティングの予備分として20％の容量を加えたもの）の10個のBENOの処方を示す：
【０１８０】
900，000個の未分化多能性幹細胞（例えばiPSC−G1株；Tiburcy et al．，Circulation，2017）を含有する、20ng／ml FGFおよび10μΜ  ROCKiを補足したE8培地中の2X DMEM 50μl、0．1M NaOH 9．5μl、ならびに細胞懸濁液238μlを含むI型コラーゲン50μl（6．9mg／mlストックから、最終濃度1mg／ml）から開始する。上述したように、EDTAインキュベーションによって細胞を分離した。次に、懸濁液30μlを96ウェルプレート（U底、低付着性）のウェルにピペットで分注し、コラーゲンの硬化（均質な細胞捕捉）を促進するために37℃のインキュベータに20分間入れた。20分後、10ng／ml FGFおよび10μl ROCKiを含むE8 250μlを各ウェルに添加し、インキュベータに戻した。
【０１８１】
0、1および2日目（培地の交換）
【０１８２】
培地200μlを除去し、ウェルあたりNCM 200μlを添加する。
【０１８３】
3日目（培地の交換およびBENOの移動）
【０１８４】
10個のBENOを、ワイドボアチップピペットを使用してNCM 5mlを含む6ウェルプレートに移す。
【０１８５】
6日目（培地の交換）
【０１８６】
培地4mlを除去し、ウェルあたり新鮮NCM 5mlを添加する。
【０１８７】
8、10および13日目（培地の交換）
【０１８８】
選択した実験プロトコルでNPEMを使用する場合は、培地4mlを除去し、ウェルあたり新鮮NPEM 5mlを添加する。NPEMを使用しない場合は、細胞を基礎培地で維持する。
【０１８９】
15、17、20、22、24および27日目（培地の交換）
【０１９０】
選択した実験プロトコルでNDMを使用する場合は、培地4mlを除去し、ウェルあたり新鮮NDM 5mlを添加する。NPEMを使用しない場合は、細胞を基礎培地で維持する。28日目に細胞を評価する。培養を延長する場合は、細胞を基礎培地で維持し、培地を上記のように2日ごとに交換する。
【０１９１】
［実施例１］
BENO生産のためのプロトコルの最適化
【０１９２】
神経誘導、NPCの量、および神経分化について開示されているプロトコルを最適化するために、以下の試験を実施した。結果として得られたデータは、BENOを生産するための最適なプロトコルを確立することを可能にした（実施例2）。
【０１９３】
神経誘導の最適化
【０１９４】
最初の試みでは、レチノイン酸（RA）の添加と共に、単一のSMAD経路阻害（ノギンを使用）を用いて神経誘導を誘発した。本試験では、神経誘導期（0〜8日目）にノギンとSB431542を使用した二重のSMADシグナル伝達経路の阻害が、例えば28日目に、神経発生をさらに促進し得るかどうかを試験した。したがって、ノギンのみを含むNCM、またはノギンとSB431542を含むNCMをそれぞれ検討した。免疫蛍光分析（図2A）ならびにPAX6およびMAP2の転写物分析（図2B）によって示されるように、二重のSMAD阻害は、結果として得られる成熟ニューロンの量に関して有利であることが明らかに観察された。
【０１９５】
NPC数の増加
【０１９６】
組織成形の時点で出発インプット多能性幹細胞（PSC）の量を増やすと、有意により多い量のニューロンが生じた（図3A）。その結果として、オルガノイドをＦＧＦ−２で処理することによって（8〜15日目）組織内の神経前駆細胞（NPC）の量を増加させることは有利であると考えられる。これは、上記のプロトコルでのNPEMの使用に対応する。ＦＧＦ−２の使用が有益であるかどうかを試験するために、2つの異なる時点で、すなわち−2日目から0日目（幹細胞段階での神経誘導の前）、およびNPC段階での8日目から15日目に、組織（3000細胞／μl）を10ng／ml ＦＧＦ−２で処理した（図3B）。−2〜0日目のＦＧＦ−２処理は、未処理の組織と比較して利点を提供しないようであった。しかし、8〜15日目のＦＧＦ−２での細胞の処理（すなわちNPEMの使用）は、NPCを含む細胞の増殖を著明に誘導し、ニューロフィラメントのIF全載染色によって可視化されたように（図3B）、28日目により複雑な神経ネットワークをもたらした。2回の処理（−2日目〜0日目および8〜15日目）は、1回の処理（8日目〜15日目）より有利ではないと思われた。
【０１９７】
神経分化の最適化
【０１９８】
文献の多数の従来のプロトコルは、分化および成熟段階でのニューロンの生存を改善するために神経栄養因子BDNFおよびGDNFを使用する。そのため、培養10〜28日目にBDNF（20ng／ml）およびGDNF（10ng／ml）をNPEMに添加すると、28日目までにより多くの成熟ニューロンが生じるかどうかを試験した（図4）。
【０１９９】
これらの結果は、BDNFおよびGDNFがニューロンマーカーPAX 6または成熟マーカーMAP2の量を増加させないことを実証する。したがって、本プロトコルではBDNFまたはGDNFによる処理を採用しなかった。他方で、NDMへのノッチ阻害剤DAPTの添加（2．5μM、15〜28日目）はPAX 6転写物の増加をもたらし、プラスの作用を示唆した（図5）。
【０２００】
最適化実験
【０２０１】
最適化の最終段階で、神経分化に最も有効なプロトコルを同定するために、5つの異なるプロトコルを試験し、比較した。すべてのプロトコルにおいて、B27およびN2を補充したNeurobasal培地で分化を実施した。胚の神経発生中に起こるシグナル伝達を模倣するために、hiPS細胞を、二重のSMAD阻害（ノギンとSB431542）および追加のレチノイン酸（RA）補充下で神経外胚葉誘導（0〜8日目）に供した。プロトコル2では、神経前駆細胞（NPC）におけるＦＧＦ−２の増殖作用（8〜15日目）を試験した。プロトコル3では、NPCの神経拘束におけるノッチ阻害剤DAPTの作用（15〜28日目）を試験した。プロトコル4では、グリア細胞のTGFβ1増殖作用（8〜28日目）を試験した。プロトコル5では、グリアとニューロンの発生を同時に促進できるかどうかを試験するために、TGF−β1処理とDAPT処理を組み合わせた。様々なプロトコルを図6Aに要約する。
【０２０２】
様々なプロトコルで得られる神経原性およびグリア新生の潜在的可能性を評価するために、−1、0、3、8、15、28、および40日目に組織を収集した（3〜6組織/時点）。8日目までの処理はすべてのプロトコルで同一であったため、その時点までの組織はプロトコル1からのみ収集した。ＦＧＦ−２での処理（プロトコル2）は、いずれの時点でも様々なマーカーのレベルに有意な影響を及ぼさず、予想外の結果であった。しかし、DAPTでの処理（プロトコル3および5）は、ニューロンマーカーPAX6、MAP2、GRIN1およびGABBR2の量を有意に増加させた。TGF−β1での処理（プロトコル4および5）は、その他の3つのプロトコルと比較して、40日目までにより多くの量のグリアマーカーGFAPを示した（図6B）。DAPTでの処理（プロトコル3および5）は明らかに神経発生を支持しており、TGF−β1はグリア新生を支持するように見えたため、プロトコル3（DAPT）およびプロトコル5（DAPTおよびTGF−β1）の時間経過分析を拡大した。50日目と60日目に、両方のプロトコルで経時的にニューロンマーカーの発現が減少し、他の細胞型が発生し得ることを示唆したが、28日目以降は組織が処理を受けていないため、予想された結果であった。興味深いことに、プロトコル5は、GFAP転写物の10倍の増加によって証明されたように、グリア新生を明確に支持した。まとめると、試験した様々なプロトコルの転写時間経過分析は、プロトコル5が神経発生とグリア新生を有効に生じさせるためにその他のプロトコルよりも優れていることを示唆する。
【０２０３】
転写物分析データを検証するために、プロトコル3およびプロトコル5を受けた60日目の組織を、ニューロフィラメント（ニューロン）、GFAP（グリア）、シナプトフィジン（神経シナプス）およびMAP2（成熟ニューロン）に対する抗体を使用して染色した（図6C）。プロトコル5由来の組織にはプロトコル3由来の組織よりも多くのグリアが含まれていたが、成熟ニューロンの量は同じであるように見えた。
【０２０４】
グリアの存在は神経活動にとって重要である。そのため、プロトコル5でBENO活性が増強されるという最初の仮説を、自発的カルシウム活性を測定することによってさらに調べた。これを体系的に分析するために、FURA−4で組織（n＝3／群）を染色した後、5つの異なる領域/組織の共焦点イメージングによってカルシウム活性を可視化した（図6Dに示されている）。これら5つの領域のそれぞれで観察された平均カルシウム活性をグラフに示す。TGF−β1およびDAPTで処理した組織（プロトコル5）は、カルシウム活性を示すより多くの組織領域を明らかにした。
【０２０５】
要約すると、集合データは、RAの存在下での二重のSMAD阻害時に、ＦＧＦ−２処理がNPCを増強し、DAPTが神経発生を支持し、TGF−βがグリア新生を支持するという結論を裏付ける。したがって、最適化された分化プロトコル（実施例2）は、上記の因子のすべてを使用した処理を組み込んでいる（図6Aに示されている時点）。
【０２０６】
［実施例２］
ヒトの生体工学的に作製された神経オルガノイド（BENO）を生成するための最適化されたプロトコル
【０２０７】
以下の試験は、ヒトの生体工学的に作製された神経オルガノイド（BENO）を生産するための最適なプロトコルを確立する。
【０２０８】
材料
【０２０９】
これらの実験で使用した材料は、実施例1で使用したものと同じである。
【０２１０】
保存溶液（−20℃）
【０２１１】
これらの実験で使用した保存溶液は、実施例1で使用したものと同じである。
【０２１２】
作業溶液（4℃）
【０２１３】
これらの実験で使用したEDTA 0．5mM溶液、マトリゲル1：30溶液、TeSR（商標）−E8（商標）培地、および基礎培地は、実施例1で使用したものと同じである。
【０２１４】
神経拘束培地（NCM）
【０２１５】
10μΜ  SB 431542（50μl）、50ng／mlノギン（10μl）、および1μΜ  RA（5μl）を補充した基礎培地（50ml）。
【０２１６】
神経前駆細胞増殖培地（NPEM）
【０２１７】
10ng／ml ＦＧＦ−２（50μl）および5ng／ml TGFβ1を補充した基礎培地（50ml）。
【０２１８】
神経分化培地（NDM）
【０２１９】
2．5μΜ  DAPT（1．25μl）および5ng／ml TGFβ1（25μl）を補充した基礎培地（50ml）。
【０２２０】
実験方法
【０２２１】
−4日目（細胞の調製の例として使用される多能性幹細胞の標準的な維持培養）
【０２２２】
これらの実験で使用したマトリゲルコーティング、およびEDTA継代（T−25フラスコ用）は、実施例1で使用したものと同じである。
【０２２３】
−1日目（BENOSの成形）
【０２２４】
実施例1で使用したプロトコルと同じ。
【０２２５】
0、1および2日目（培地の交換）
【０２２６】
培地200μlを除去し、ウェルあたりNCM 200μlを添加する。
【０２２７】
3日目（培地の交換およびBENOの移動）
【０２２８】
10個のBENOを、ワイドボアチップピペットを使用してNCM 5mlを含む6ウェルプレートに移す。
【０２２９】
6日目（培地の交換）
【０２３０】
培地4mlを除去し、ウェルあたり新鮮NCM 5mlを添加する。
【０２３１】
8、10および13日目（培地の交換）
【０２３２】
培地4mlを除去し、ウェルあたり新鮮NPEM 5mlを添加する。
【０２３３】
15、17、20、22、24および27日目（培地の交換）
【０２３４】
培地4mlを除去し、ウェルあたり新鮮NDM 5mlを添加する。28日目に細胞を評価する。培養を延長する場合は、細胞を基礎培地で維持し、培地を上記のように2日ごとに交換する。
【０２３５】
［実施例３］
BENOのハイスループットトランスクリプトーム分析
【０２３６】
様々な時点（例えば−1、0、3、8、15、28、40、50および60日目）でのBENO組織の生産中に生じる細胞型を特徴付けるために、細胞をRNAseq分析；各時点ごとに3〜6組織）に供した。
【０２３７】
最初に、細胞培養の時間経過中の細胞の分化状態を試験した。予想されたように、幹細胞マーカーNANOGおよびPOUF5A1は、−1日目および0日目には高発現されたが、神経誘導の3日後に、これらのマーカーの発現は有意に減少した。対照的に、幹細胞マーカーおよびNPCマーカーの両方であるSOX2は、これらの時点で減少を示さなかったが、他の神経外胚葉マーカーおよびNPCマーカーと共に15日目に最大発現に達した。これらのデータは、ＦＧＦ−２の公知の増殖作用と一致する。ほとんどの神経構造マーカー（MAP2、MAPT、NFASC、TUBA1A）は、28〜40日目までに有意に増加した。神経発生が完了すると、グリア新生が開始された（50〜60日目）。放射状グリアマーカーPDGFR−αも、幹細胞のほとんどが前駆細胞に拘束される時点である8日目に強く発現されることが観察された（図7A）。
【０２３８】
細胞培養物に存在する異なる種類の神経細胞を特徴付けるために、セロトニン作動性、GABA作動性、グルタミン酸作動性、ドーパミン作動性およびコリン作動性ニューロンで発現される特定のマーカーを検討し、結果を図7Bに示した。これらのニューロン型すべてのマーカーが、28日目から神経組織に存在することが認められた。興味深いことに、神経構造の転写物は50日目から減少することが認められたが、個々のニューロンマーカーは増加または持続し、したがって細胞の成熟はまだ進行中であるが、神経分化は40日目までに完了し得ることを示唆した。
【０２３９】
同様に、様々な皮質層マーカーの分析は、3つの層すべてがオルガノイドに存在することを明らかにした（図7C）。
【０２４０】
最後に、分化プロトコル中のBENOに含まれるニューロンの成熟状態を調べるために、ニューロン受容体発現（GABA、DOPA、カイニン酸、AMPA、NMDA）、イオンチャネル発現（K＋、Ca2＋、Na＋）およびシナプスタンパク質発現（SYN1、SYT4、SYP、SYNPO）を分析した。これらのタンパク質をコードする転写物の発現は、28日目に増加することが観察され、60日目まで安定したままであるかまたは増加し続けた。この所見は、分化は40日目までに停止するが、神経細胞の成熟とグリア新生は分化プロトコルの終了まで継続したという結論を裏付ける。
【０２４１】
［実施例４］
全載IF分析によるトランスクリプトーム分析所見の検証
【０２４２】
BENOモデルが正常な皮質発生を模倣したかどうかを検証するために、マーカーCTIP2（V−VI層ニューロン）、TBR2（脳室下帯前駆細胞）、およびSOX2（神経幹細胞）を免疫染色によって分析した。40日目に、SOX2陽性細胞は検出できなかった。他方で、皮質形成中に観察されたように、TBR2細胞とCTIP2細胞は互いに同心円状に分布していた（図8）。
【０２４３】
IF分析を使用して、BENOにおけるGABA作動性介在ニューロンの強い存在を検証した。GABA作動性マーカーGABAおよびそれぞれの受容体GABBR2の両方の染色（図9A、図9B）を実施した。GABAは、細胞体区画およびGABA作動性ニューロンの軸索のシナプスボタンで強く発現された。GABBR2は神経核周囲部で発現されることが観察された。さらに、精巧なドーパミン作動性ネットワークがTHで免疫染色され、それにより中脳の同一性を示した。GABAと同様に、THは、細胞体およびオルガノイドの周辺に伸びる神経軸索の両方で検出された（図9C）。最後に、シナプトフィジン染色は、ニューロン上のシナプスボタンが豊富であることを示し、したがって機能的神経ネットワークの存在を示唆した（図9D）。
【０２４４】
［実施例５］
神経活動：GABA作動性ネットワーク
【０２４５】
本明細書に開示されるデータ（例えば実施例1〜4において）は、BENOが正常な皮質層発生を有効に模倣でき、さらに様々なニューロンおよびグリアを含むことができることを実証する。これらの生成されたニューロンの機能性を、その後、神経ネットワークを同定することができるカルシウムイメージングを使用して検討した。
【０２４６】
神経ネットワークの活動を試験するために、BENO（30〜60日目）をGABA作動性阻害下で（ピクロトキシン、58μΜ；サクロフェン、330μΜ；n＝3を使用して実施）カルシウムイメージングに供した。GABAR阻害は、それまで自発的に同期していたニューロンの非同期性をもたらした（4対の細胞）。阻害剤をウォッシュアウトすると、同じニューロンが再同期し、それによって機能的GABA作動性ネットワークの存在を示唆した（図10）。機能的神経ネットワークは他の神経オルガノイドでは発達せず、細胞の複雑性を増強するための段階的指向性分化プロトコル（実施例2）が、構造的な意味だけでなく、階層的ネットワーク機能に関してもヒトの脳の発生を模倣することを示した。
【０２４７】
まとめると、本発明の実施例1〜5は、ヒト多能性幹細胞からの電気的に活性な神経ネットワークを構築するための、新規の、コラーゲンに基づく、無血清の、段階特異的指向性分化方法を納得がいくように実証する。
【０２４８】
［実施例６］
神経再生のモデルとしてのBENO
【０２４９】
損傷応答と組織修復機構を調べるために、BENOを損傷に曝露する。低温、機械的、低酸素、または神経毒によって誘発される全体的または局所的損傷は、例えばN2冷却した金属ピン、圧迫または切開、0％酸素までの亜臨界での培養、およびグルタミン酸、ドーパミン、エタノール、テトロドトキシン、ボツリヌスまたは破傷風毒素への曝露によって生じさせ得る。細胞特異的応答（例えばニューロンおよびグリア細胞による）を含む損傷からの回復が具体的に検討される。例えばニューロン増殖の誘導による修復と再生、および例えば抗酸化剤または薬理学的調節剤の適用による損傷からの保護が検討される。BENOは、神経細胞の保護、修復、および再生を含む疾患修飾の新規標的を同定し、検証するためのモデルとして役立つ。BENOは、例えば増殖中のニューロン（実施例2のプロトコルの15日目、28日目）および有糸分裂後のニューロン（実施例2のプロトコルの40日目、60日目）として、発生の様々な段階で使用される。
【０２５０】
［実施例７］
例えば統合失調症のための、個別化疾患モデルとしてのBENO
【０２５１】
BENOは、例えばCRISPR／CasまたはTALEN技術によるリプログラミングまたは遺伝子操作によって、例えば患者由来の多能性幹細胞から作製される。BENOは、カルシウム活性評価、免疫蛍光分析、または電気生理学的手段（例えばインパリング電極測定、多電極アレイ/電場電位測定）を使用して上記のように表現型分類される。並行して、表現型と遺伝子型の関連検討のためにRNAシーケンシングとプロテオーム解析が行われる。
【０２５２】
BENOの使用は、統合失調症の態様をモデル化する。BENOは、統合失調症患者から得られたiPSC細胞から作製される。その後、これらの患者からのBENOを表現型分類して、健常対照被験者との表現型の相違を分析する。他の試験は、自閉症、家族性片麻痺およびてんかんを患っている患者に由来するBENOを検討するために設計される。
【０２５３】
［実施例８］  工程CおよびDにおけるニューロンの誘導と増殖のさらなる最適化
【０２５４】
工程DおよびEの最適な期間を試験するために、工程DおよびEの期間のみを変更して実施例2のプロトコルを実施した（図11）。その後、各プロトコルの結果を、ニューロン拘束のパラメータとしてニューロンマーカーPAX6のmRNA発現を測定することによって評価した。
【０２５５】
これらの実験は、実施例2の標準プロトコルであるNCMとの8日間のインキュベーション（工程D）が、3または6日間のようなより短いインキュベーション時間よりも優れていることを示した（図11A）。10日間のNCMとのインキュベーションは、8日間のインキュベーションよりもわずかに高いPAX6 mRNA発現をもたらした（図11B）が、より長いインキュベーションはPAX6 mRNA発現をさらに増加させなかった（図11B）。この結果は、10日間がNCMとのインキュベーションの最適期間であることを示唆する（工程D）。
【０２５６】
これらの実験はまた、NPEM（工程E）とのインキュベーションを2または5日に短縮しても、実施例2の標準の7日間と比較して、PAX6 mRNA発現に悪影響を及ぼさないことを明らかにした（図11 A）。様々な時間量のNPEMインキュベーションを受けたBENOのさらなる特性を免疫蛍光分析によって検討した（図11C）。5日間の最小NPEMインキュベーションは、BENOが5日間のNPEMインキュベーション後にのみ堅固な組織凝縮と神経細胞増殖を示したため、好ましいことが認められた。この結果は、5〜7日間がNPEMとのインキュベーションの最適期間であることを示唆する（工程E）。
【０２５７】
参考文献
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Tiburcy et al., Circulation, 2017: “Defined Engineered Human Myocardium with Advanced Maturation for Applications in Heart Failure Modeling and Repair.”
【図１】
2020523013.tif 000003
【図２Ａ】
2020523013.tif 000004
【図２Ｂ】
2020523013.tif 000005
【図３Ａ】
2020523013.tif 000006
【図３Ｂ】
2020523013.tif 000007
【図４】
2020523013.tif 000008
【図５】
2020523013.tif 000009
【図６Ａ】
2020523013.tif 000010
【図６Ｂ】
2020523013.tif 000011
【図６Ｃ】
2020523013.tif 000012
【図６Ｄ】
2020523013.tif 000013
【図７Ａ】
2020523013.tif 000014
【図７Ｂ】
2020523013.tif 000015
【図７Ｃ】
2020523013.tif 000016
【図７Ｄ】
2020523013.tif 000017
【図８】
2020523013.tif 000018
【図９Ａ】
2020523013.tif 000019
【図９Ｂ】
2020523013.tif 000020
【図９Ｃ】
2020523013.tif 000021
【図９Ｄ】
2020523013.tif 000022
【図１０】
2020523013.tif 000023
【図１１Ａ】
2020523013.tif 000024
【図１１Ｂ】
2020523013.tif 000025
【図１１Ｃ】
2020523013.tif 000026
【国際調査報告】
2020523013.tif 000027
2020523013.tif 000028
2020523013.tif 000029
2020523013.tif 000030