(57)【要約】  本発明は、iPS細胞の集団を調製する方法として、（i）標的細胞の集団中でOct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、およびLin28から選択される1つ以上の山中因子を発現させることと、メニン（Men1）の量および／または活性を低下させることと、（ii）場合によっては、その標的細胞の集団からiPS細胞を単離することを含む方法と；第1の細胞から目的の組織の体細胞への分化を増強する方法として、（i）目的のその組織の分化因子で細胞を処理することと、（ii）標的細胞の集団の中のメニン（Men1）の量および／または活性を低下させることを含む方法を開示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞の集団中で、（i）Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、およびLin28から選択される1つ以上の山中因子を発現させることと、（ii）メニン（Men1）の量および／または活性を低下させることを含む、iPS細胞の集団を調製する方法。
【請求項２】
第1の細胞から目的の組織の体細胞への分化を増強する方法であって、標的細胞の集団中で、（i）目的のその組織の分化因子で細胞を処理することと、（ii）メニン（Men1）の量および／または活性を低下させることを含み、（A）前記第1の細胞が、成体皮膚細胞もしくは成熟皮膚細胞、血液細胞、毛包細胞、または膀胱細胞から選択される分化転換能力が低い細胞であるか、（B）前記分化が、前記第1の細胞とは異なる胚葉の体細胞への分化であるか、または（C）前記体細胞が非心臓細胞である方法。
【請求項３】
メニンの量を低下させる前記工程が、メニンの発現を抑制する1つ以上の薬剤を前記細胞に投与することを含み、好ましくはその1つ以上の薬剤が抑制性核酸である、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
前記抑制性核酸が、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA、またはアンチセンス核酸分子である、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤が、前記標的細胞中の一過性発現系によってコードされる抑制性のsiRNA、shRNA、sgRNA、miRNA、またはアンチセンス核酸分子である、請求項3または4に記載の方法。
【請求項６】
前記標的細胞を36時間〜120時間にわたって一過性発現系に曝露する、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
メニンの活性を低下させる前記工程が、メニンの活性を抑制する1つ以上の薬剤を前記細胞に投与することを含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項８】
活性を抑制する前記1つ以上の薬剤が、抗体、メニンの抑制性リガンド、メニンの抑制性模倣体、またはメニンの活性を一過性に抑制する小分子阻害剤であり、好ましくはその小分子阻害剤が、KO-382、MI-3、MI-2、MI-463、MI-503、ビンポセチン、MI-136、および／またはシノメニンから選択される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
1つ以上の山中因子を発現させる前記工程、または細胞を分化因子で処理する前記工程が、それぞれ、組み込みアプローチ、好ましくはレトロウイルス発現ベクター、レンチウイルス発現ベクター、またはアデノウイルス発現ベクター、特に切除可能および誘導性ベクターを含むか、または非組み込みアプローチ、好ましくは組み込み欠陥ウイルス送達技術、エピソーマル送達技術、RNA送達技術、またはタンパク質送達技術、好ましくは非ウイルスベクターに基づくIVT-mRNAナノ送達系を含み、特に好ましいのは、1つ以上の山中因子を発現させるための前記組み込みアプローチまたは前記非組み込みアプローチが、一過性または誘導性である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
前記標的細胞中のPias1の活性を低下させることをさらに含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的細胞の集団から前記iPS細胞または前記体細胞をそれぞれ単離することを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的細胞が哺乳動物の体細胞であり；好ましくはヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、またはマウス細胞である；および／または好ましくは前記哺乳動物体細胞が、線維芽細胞、成体幹細胞、セルトリ細胞、顆粒膜細胞、ニューロン、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Bリンパ球とTリンパ球）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、または骨格筋細胞である、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
メニン（Men1）の量および／または活性を低下させることが、Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、およびLin28から選択される1つ以上の山中因子の発現による前記標的細胞からiPS細胞への再プログラミングを増強する、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
（i）Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、およびLin28から選択される1つ以上の山中因子を発現させることと、（ii）メニン（Men1）の量および／または活性を低下させることをともに含む、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
（i）請求項1、3〜14のいずれか1項に記載の方法に従ってiPS細胞の集団を調製し、（ii）1つのプロトコルまたは因子を用いて前記iPS細胞を分化させて分化した細胞の集団を形成することを含む、分化した細胞の集団を調製する方法。
【請求項１６】
メニンの量および／または活性が、メニン低下剤で処理されていないiPS細胞と比べて低下している、請求項1、3〜14のいずれか1項に記載の方法に従って調製されたiPS細胞の集団。
【請求項１７】
前記細胞がメニンの抑制性核酸分子を含む、請求項16に記載のiPS細胞の集団。
【請求項１８】
1つ以上の山中因子または1つ以上の山中誘導剤と、メニンの発現、翻訳、または活性を抑制する1つ以上の薬剤を含み、好ましくは前記山中因子または前記山中誘導剤と、メニンの発現、翻訳、または活性を抑制する前記1つ以上の薬剤が、1つ以上の細胞培養培地中にある、体細胞からiPS細胞への再プログラミングを増強するためのキット。
【請求項１９】
メニンの抑制性核酸分子を、好ましくは一過性トランスフェクション剤、好ましくは非組み込みウイルスまたはエピソーマルベクターとともにさらに含む、請求項18に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工多能性幹細胞（iPS）の形成効率を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞を再プログラミングして多能性にすることは、発見されて以来、広く利用される実験ツールになっている。人工多能性幹細胞（iPSC）の再プログラミングは、基礎的研究と生物医学的研究において非常に有用であることを超えて、細胞療法のための患者特異的な組織の生成など、広い範囲の医学用途に適用できると考えられている。しかしiPSC再プログラミングの方法は、まだ効率が非常に悪くて本質的に確率的であるため、特に体細胞の供給源が限られている場合には、多くの用途で有用性が低下している。効率的なiPS再プログラミングを妨げている大きな障害は、本来的にエピジェネティックな風景にあると考えられているが、この障害に寄与する重要な機構と因子はまだ完全には理解されていない。
【０００３】
Guoら（Stem Cell Research 第18巻、2017年、67〜69ページ）は、Oct4とNanogを発現するiPS細胞で、Men1のエキソン9に点変異を持つものを開示している。
【０００４】
Parekhら（International Journal of Endocrinology、第2015巻、1〜10ページ）は、3T3-L1細胞から脂肪細胞への分化を開示している。
【０００５】
Azizら（Developmental Biology第332巻、 2009年、116〜130ページ）は、C2C12筋芽細胞とC3H10T1線維芽細胞から筋管への分化を開示している。
【０００６】
iPS再プログラミングの改良が特にWO 2016/012544 A2に記載されており、SUMO経路の構成要素の量を減らすことによってiPS細胞の集団が調製される。それでもより多目的な再プログラミング増強剤、またはより効率的な再プログラミング増強剤が相変わらず必要とされている。
【０００７】
哺乳動物の細胞を再プログラミングする改良された方法が本分野で必要とされている。そのためiPS細胞を生成させる改良された方法を提供することが、1つの目的である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の要旨
本発明では、山中因子を発現させることに加えてメニン（Men1）の量および／または活性を低下させることによって体細胞からiPSへの再プログラミングを改善する。
【０００９】
したがってiPS細胞の集団を調製する方法として、（i）標的細胞の集団中でOct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、およびLin28から選択される1つ以上の山中因子を発現させることと、メニン（Men1）の量および／または活性を低下させることと、（ii）場合によっては、その標的細胞の集団からiPS細胞を単離することを含む方法が提供される。メニンの量および／または活性の低下は、メニンの発現または活性を抑制する1つ以上の薬剤を用いることによって実現できる。いくつかの実施態様では、1つ以上の山中因子の発現と、メニンの発現または活性の抑制は、一過性であること、すなわち可逆的であることが好ましい。
【００１０】
メニンに加え、代わりの再プログラミング因子、または組み合わせることができる再プログラミング因子がさらに見いだされた。すなわち、Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、Trp53である。これら再プログラミング因子は、Men1を含め、「再プログラミングの障害」とも呼ばれる。これらを抑制することで、iPS細胞の生成における細胞の再プログラミングを容易にすること、または増強することができる。したがって本発明により、iPS細胞の集団を調製する方法として、標的細胞の集団中でSocs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、Trp53のいずれか、またはこれらの組み合わせの量および／または活性を低下させることを含む方法も提供される。山中因子は、メニンに関して記載されているようにして発現させることができる。iPS細胞は、メニンに関して記載されているようにして標的細胞の集団から単離することができる。一般に、好ましい再プログラミング標的であるメニンに関して本明細書に記載されていることはすべて、他の再プログラミング標的（Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、Trp53）にも当てはまる。
【００１１】
本発明は、分化した細胞の集団を調製する方法にも関係しており、この方法は、（i）標的細胞の集団中でOct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、およびLin28から選択される1つ以上の山中因子を発現させることによってiPS細胞の集団を調製することと、メニン（Men1）および／または1つ以上の他の再プログラミング標的の量および／または活性を低下させることと、（ii）1つのプロトコルまたは因子を用いてiPS細胞を分化させて分化した細胞の集団を形成することを含んでいる。
【００１２】
別の1つの側面では、本発明により、iPS細胞の再プログラミングを増強する本発明の方法に従って調製されたiPS細胞の集団が提供される。現在入手できるiPS細胞とは異なり、本発明のiPS細胞は、メニンの機能が低下しているか存在しない、および／または1つ以上の他の再プログラミング標的の機能が低下しているか存在しない。
【００１３】
さらに別の1つの側面では、本発明に、iPS細胞の再プログラミングを増強するプロトコルのための細胞培養培地も含まれ、この細胞培養培地は、山中因子または山中誘導剤（Yamanaka-inducing agents）と、メニンの発現または活性を抑制する1つ以上の薬剤、および／または1つ以上の他の再プログラミング標的を抑制する1つ以上の薬剤を含んでいる。
【００１４】
本発明の方法を実施するのに適したキットとして、標的細胞と、本発明に従う細胞培地を含むキットも提供される。場合によっては、キットはさらに、本発明のiPS細胞を分化させるための1つ以上の薬剤を含んでいる。キットは、1つ以上の山中因子または山中誘導剤と、メニンの発現、翻訳、活性のいずれかを抑制する1つ以上の薬剤、および／または1つ以上の他の再プログラミング標的を抑制する1つ以上の薬剤を含むことができ、その山中因子または山中誘導剤と、メニンの発現、翻訳、活性のいずれかを抑制する1つ以上の薬剤、および／または1つ以上の他の再プログラミング標的を抑制する1つ以上の薬剤は、1つ以上の細胞培養培地の中にあることが好ましい。
【００１５】
本発明のすべての実施態様はまとめて以下の詳細な説明に記述されており、あらゆる好ましい実施態様は、あらゆる実施態様、側面、方法、キットに同様に関係する。例えば本発明の方法の好ましい記述と詳細な記述は、本発明のキットの適切さと条件にも同様に当てはまる。キットまたはその部品の記述は、本発明の方法で使用できる構成要素にも同様に当てはまる。特に断わらない限り、あらゆる実施態様を互いに組み合わせることができる。
発明の詳細な説明
【００１６】
発明者は、iPS再プログラミングの阻止に関与する因子を系統的に同定するための機能的遺伝子スクリーンにより、体細胞から多能性幹細胞への再プログラミングの新たな障害を発見した。再プログラミングは時間のかかるプロセスであり、低効率に悩まされているため、iPSCの臨床応用は制限される。体細胞からiPSCへの再プログラミングのための標準的なプロトコルは、中心的な一群の多能性関連転写因子（いわゆる山中因子（Oct4、Sox2、Klf、c-Mycが含まれる）、修飾因子（Lin28、Nanogなど））の異所性発現と、p53ノックダウンと、L-Mycをc-Mycと置換することである。多能性状態への再プログラミング効率はさまざまであり、再プログラムする細胞の種類、再プログラムに用いる因子、それら因子の用量に依存する。一般に、山中因子を用いた再プログラミング効率は、処理した細胞の1％未満である。驚くべきことに、新たに同定された遺伝子障害因子を抑制することによって細胞を再プログラムする効率が劇的に上昇することが見いだされた。したがって本発明では、これら障害因子を、iPSCの再プログラミングを増強するための標的として同定した。本出願の発明者が同定したそのような1つの障害因子はメニン（Men1）である。メニンと同様に、メニンに加えて、またはメニンの代わりに標的にすることのできるさらに別の再プログラミング標的は、Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、Trp53である（本明細書では「他の再プログラミング標的」とも呼ぶ）。メニンは本発明の最も好ましい再プログラミング標的であるため、本明細書ではメニンに関して多く記述する。しかしメニンに関して本明細書に記載されていることはすべて、これらの他の再プログラミング標的にも当てはまる。これまで、標的細胞の集団中で山中因子のサブセットを発現させることに組み合わせてメニンや他の再プログラミング標的を負に調節すると、細胞の再プログラミング効率の劇的な増大につながることは知られていなかった。
【００１７】
したがって本発明により、iPS細胞の集団を調製する方法として、標的細胞の集団中で、（i）Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、およびLin28から選択される1つ以上の山中因子を発現させることと、（ii）メニン（Men1）および／または1つ以上の他の再プログラミング標的の量および／または活性を低下させることを含む方法が提供される。同様に、本発明はiPS細胞を調製する方法に関するものであり、この方法は、標的細胞の集団中で、（i）Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、およびLin28から選択される1つ以上の山中因子を発現させることと、（ii）メニン（Men1）および／または1つ以上の他の再プログラミング標的の量および／または活性を低下させることを含んでいる。本発明のいくつかの実施態様では、この方法はさらに、iPS細胞またはiPS細胞の集団を標的細胞の集団から単離することを含んでいる。
【００１８】
ヒトのメニン（Men1遺伝子）はNCBIデータベースにGenID：4221として掲載されている。Men1の入力事項に含まれるのは、本出願の出願日の時点のアミノ酸配列と核酸配列を含む情報である（www.ncbi.nlm.nih.gov/gene?Db=gene&Cmd=DetailsSearch&Term=4221）。メニンは615個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコードしていて、多彩なタンパク質（転写因子JUND、NFKB、SMADが含まれる）と相互作用することによって転写調節因子として機能する。メニンは、多発性内分泌腫瘍症1型として知られる症候群と関係する推定腫瘍抑制因子である。メニンはMLL/SET1ヒストンメチルトランスフェラーゼ（HMT）複合体（ヒストンH3のLys-4（H3K4）を特異的にメチル化する複合体）の重要な構成要素でもある。
【００１９】
他の再プログラミング標的の配列と十分な記述は、公開されているデータベース（例えばGenCards（(www.genecards.org））に見いだすことができる。GenCardsデータベースは、他のデータベース（NCBIデータベースやEBIデータベースなど）で入手できる情報が編集されたものを含んでいる。もちろんこれらの他のデータベースを参照してもよい。例えばSocs3は「サイトカインシグナル伝達3のサプレッサ」としても知られ、Eif4e2は「真核生物翻訳開始因子4Eファミリーメンバー2」として、 Apcは「APC、WNTシグナル伝達経路調節因子」として、Setd2は「SETドメイン含有2」として、Axin1は「アクシン1」として、Cdk13は「サイクリン依存性キナーゼ13」として、Psip1は「PC4とSFRS1の相互作用タンパク質1」として、Cabinは「カルシニューリン結合タンパク質1」として、Fbxw7は「F-ボックスとWD反復ドメイン含有7」として、Tcf7l1は「転写因子7様1」として、Tlk2は「Tousled様キナーゼ2」として、Hiraは「ヒストン細胞周期調節因子」として、Uba2は「ユビキチン様修飾因子活性化酵素2」として、Ubr4は「ユビキチンタンパク質リガーゼE3構成要素N-レコグニン4」として、Sae1は「SUMO1活性化酵素サブユニット1」として、Chaf1aは「クロマチンアセンブリ因子1サブユニットA」として、Asf1aは「抗サイレンシング機能1Aヒストンシャペロン」として、Dot1lは「DOT1様ヒストンリシンメチルトランスフェラーゼ」として、Pias1は「活性化された STAT 1のタンパク質阻害剤」として、Ptenは「ホスファターゼとテンシンホモログ」として、Senp1は「SUMO1/セントリン特異的ペプチダーゼ1」として、 Trp53は「腫瘍タンパク質P53」として知られている。
【００２０】
本発明の方法の目的は、体細胞の中にある内在性メニンの機能、または1つ以上の他の再プログラミング標的の機能を抑制することである。機能抑制は、メニンの量および／または活性、および／または1つ以上の他の再プログラミング標的の量および／または活性を低下させることによって実現できる。細胞内のタンパク質の量を低下させる1つの方法は、内在性遺伝子の発現または翻訳を抑制するというものである。したがって本発明の一実施態様では、メニンおよび／または1つ以上の他の再プログラミング標的の量の低下は、標的細胞に、メニンおよび／または1つ以上の他の再プログラミング標的を抑制する1つ以上の薬剤を投与することを含んでいる。メニンおよび／または1つ以上の他の再プログラミング標的を抑制する1つ以上の薬剤は、抑制性核酸であることが好ましい。
【００２１】
抑制性核酸は、例えば遺伝子サイレンシングまたはRNA干渉（RNAi）と呼ばれる方法によって遺伝子の発現または核酸の翻訳を抑制することを通じて作用する。抑制性核酸は、通常は、Men1またはMen1転写産物と相補的な核酸配列を含んでいて、そのMen1またはMen1転写産物の抑制には、そのMen1またはMen1転写産物にハイブリダイズする工程が含まれる。このような抑制性核酸の例は、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA、アンチセンス核酸（すなわちアンチセンスRNA、アンチセンスDNA、または化学的類似体（LNA（ロックされた核酸）、PNA（ペプチド核酸）など））である。したがって本発明の好ましい一実施態様による抑制性核酸は、抑制性のsiRNA、shRNA、sgRNA、miRNA、アンチセンス核酸である。標的細胞中のメニンを抑制する目的が一過性ではなくて安定な抑制である場合には、sgRNAにCRISPR-Cas9を組み合わせて用いることができる。しかし例えば改変されたCas酵素（dCasなど）を用いることによるCRISPR-Cas9を通じた一過性の抑制も可能である。このようなCas酵素は標的遺伝子を切断できない可能性があるが、標的遺伝子に結合することによってその発現を抑制する。メニン抑制性のsiRNA、shRNA、sgRNA、miRNA、アンチセンス核酸、または本発明によるsgRNA、または他の再プログラミング因子に対するこのような抑制性核酸は、市販されているか、当業者に知られている標準的なRNAi設計ツール（例えばsiRNA Wizard（InvivoGen社）やBLOCK-iT RNAi Designer（ThermoFisher Scientific社））に従って設計することができる。
【００２２】
細胞に抑制性核酸またはその核酸をコードするコンストラクトをトランスフェクトすることによって遺伝子を沈黙させる方法は本分野で知られている。体細胞の中でRNAi剤を発現させるため、そのRNAi剤をコードしていて適切な発現制御エレメント（例えばプロモータ）に機能可能に連結された配列を含む核酸コンストラクトを、本分野で知られているようにして細胞の中に導入することができる。本発明の目的では、目的の核酸またはポリペプチドをコードしていて、目的の細胞の中で転写を指示するプロモータなどの発現制御エレメントに機能可能に連結されている配列を含む核酸コンストラクトを「発現カセット」と呼ぶ。プロモータとして、哺乳動物の体細胞の中で機能するRNAポリメラーゼIプロモータ、またはRNAポリメラーゼIIプロモータ、またはRNAポリメラーゼIIIプロモータが可能である。いくつかの実施態様では、RNAi剤の発現は条件的であり、例えば発現を開始させるのに外部信号または外部因子が必要とされる。いくつかの実施態様では、発現は、RNAi剤をコードする配列を条件的プロモータの制御下、したがって調節可能なプロモータ（例えば誘導性プロモータまたは抑制性プロモータ）の制御下に置くことによって調節される。当業者は、ヒトオルソログの対応する領域を標的とする抑制性核酸配列を同定することができよう。
【００２３】
本発明に従ってメニンの発現または翻訳を抑制すること、または他の任意の再プログラミング標的の発現または翻訳を抑制することが、一過性でしかない、すなわち一時的にしか過ぎないようにすることができる。さまざまな一過性遺伝子サイレンシング系が、市販されるとともに当業者に知られている。一過性の抑制は、例えば一過性送達法によって、または条件的発現カセットの安定な送達によって実現することができる。
【００２４】
当業者には理解できるように、一過性送達法の例に含まれるのは、抑制性核酸分子の一過性トランスフェクション、抑制性核酸発現カセットをコードするDNAベクターまたはRNAベクターの一過性トランスフェクション、標的を抑制するため抑制性核酸または他の抑制性遺伝エレメントをコードする非組み込みウイルス（例えばAAV、アデノウイルス、センダイウイルス、他の多くのウイルス）の感染である。さらに別の1つの選択肢は、エピソーマルベクター（プラスミドなど）である。
【００２５】
誘導性／条件的発現カセットを哺乳動物の細胞の中に安定に送達する方法には多くの例も存在しており、例えばレトロウイルス／レンチウイルス、CRISPR技術とTALEN技術、他の送達法がある。CRISPR-Casの設定ではsgRNAを用いることが好ましい。sgRNAをCas酵素によって複雑化して編集に用い、好ましくはメニン遺伝子を不活性化する。
【００２６】
したがって本発明の好ましい一実施態様では、メニン（または他の再プログラミング因子）の発現または翻訳を抑制する薬剤は、標的細胞中の一過性発現系（a transient expression system）によってコードされる抑制性のsiRNA、shRNA、sgRNA、miRNA、またはアンチセンス核酸である。
【００２７】
本発明の一実施態様では、Tet反応性エレメントプロモータ（TRE3G）の制御下にあるshRNAをコードする自己不活性化レトロウイルスベクターを使用できる。このベクターは、メニン、Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、および／またはTrp53から選択される1つ以上の再プログラミング障害因子（好ましくはメニン）の発現を標的細胞の集団中で抑制するために本発明の方法で使用されるshRNA をコードしていた。このベクターは、shRNAの誘導性かつ可逆的な発現を提供することが好ましい。可能な1つのベクターは、pSIN-TRE3G-mCherry-miRE-PGK-Neoである。しかし当業者であれば、本発明の方法で使用されるshRNA分子をコードするように改変できる他の適切な一過性の誘導性／調節可能な発現カセットとともに、そのベクターを標的細胞の集団に導入するために利用するプロトコルも容易に同定できると考えられる。
【００２８】
本発明のいくつかの実施態様では、細胞を、メニンまたは他の再プログラミング因子の発現または翻訳を抑制する1つ以上の薬剤と、少なくとも1日間の期間にわたって接触させるが、別の実施態様では、その期間は少なくとも3日間、または5日間、または10日間、または15日間、または20日間、またはそれよりも長期間か、これら日数の間の任意の範囲である。いくつかの実施態様では、細胞を少なくとも1日間、かつ3日間以下、または5日間以下、または10日間以下、または15日間以下、または20日間以下にわたって接触させる。
【００２９】
本発明のさらに別の一実施態様は、標的細胞を、RNAi剤を発現する一過性発現系に、120時間、または96時間、または72時間、または48時間、または36時間にわたって、またはこれらの時間の間の任意の時間にわたって曝露するというものである。上記の時間範囲は網羅的ではなくて単に便宜上の数値であり、示されている時間範囲の間のあらゆる時間が本発明の範囲に含まれることが理解される。例えばいくつかの実施態様では、標的細胞を、抑制性核酸を発現する一過性発現系に36〜120時間にわたって曝露する。
【００３０】
メニン（または他の再プログラミング因子）の発現または翻訳の量を減らすこと以外に、内在性メニン（または他の再プログラミング因子）の抑制は、このタンパク質の活性を低下させることによっても実現できる。したがってiPSの再プログラミングを増強するための本発明の方法のいくつかの実施態様では、メニン（または他の再プログラミング因子）の活性を低下させる工程は、細胞に、メニン（または他の再プログラミング因子）の活性を抑制する1つ以上の薬剤を投与することを含んでいる。メニン（または他の再プログラミング因子）の活性を抑制する本発明の薬剤は、抗体、メニンのリガンド（または他の再プログラミング因子のリガンド）、メニンまたは他の再プログラミング因子の抑制性模倣体、アプタマー、小分子阻害剤から選択されること、特に小分子阻害剤であることが好ましい。いくつかの実施態様では、薬剤（例えば抗体、リガンド、模倣体、アプタマー、小分子）は、対応する標的（例えばメニン（または他の再プログラミング因子））に結合してその標的を抑制するか、その標的に対する活性が必要とされるタンパク質に結合してそのタンパク質を抑制する。標的複合体または経路構成要素の小分子阻害剤を本発明のさまざまな実施態様で用いることができる。メニンのリガンドと模倣体は、例えばBorkin他、Cancer Cell、2015年、第27巻：1〜14ページと、Grembecka他、Nat Chem Biol第8巻(3)、2012年：277〜284ページに開示されており、Borkinが3Dタンパク質モデルで視覚化しているように、メニン結合部位に結合するペプチドを含む。メニンのリガンドは、メニンに結合してメニンの機能を抑制する化合物である。同様に、メニンの模倣体はメニン結合パートナーのメニン結合部位に結合するが、メニン活性を持っていない。すなわちメニンの模倣体はメニン結合部位を例えば競合的にブロックし、メニンがその結合パートナー（Mll1など）に接近するのを阻止する（Liu他、Cell Division（2016年）第2巻、16036ページ）。このリガンドと模倣体として、タンパク質、ペプチド、ペプチド模倣体（Borkin らが開示しているMI-136、MI-463、MI-503など）が可能である。タンパク質阻害剤またはペプチド阻害剤として、メニンの結合部位を含むがさらなるメニン活性（すなわち脱分化の抑制）は欠如したメニン類似体が可能である。このようなリガンドと模倣体は、メニンの結合ポケットとメニン結合パートナーへの結合に基づいて選択することができる。阻害剤は、Grembeckaら（上記文献）が開示しているように、メニン-MLL-AF9相互作用を阻止することができる。メニン模倣体として、不活性化されたメニンが可能である（例えばGrembecka他（上記文献）と、Murai他（2011年）J Biol Chem. 第286巻(36)：31742〜31748ページに開示されているように、ヒトのメニンに対応する変異M278Kおよび／またはY232Kを含むメニン）。Murai ら（特に図1の配列アラインメント）の論文は参照によって本明細書に組み込まれており、ヒトのメニンにおける対応するアミノ酸の位置を示している。本発明のメニン模倣体はMLLまたは他のメニン結合パートナーに結合するが、野生型メニンのM278および／またはT232は欠いていることが好ましい。メニン阻害剤は、MLLのメニン結合断片（MBM1、またはMBM2、またはMLLの残基4〜15を含む一方で野生型MLLの残基の例えば少なくとも50％を��いた断片）から選択することもできる（Murai他、上記文献）。MLLまたはメニンと、その断片または模倣体は、処理する細胞と同じ生物でなければならない。活性、特にメニンの抑制が原因で抑制される活性は、実施例（特に実施例15〜17）に示されているように、iPS細胞への分化転換または脱分化の抑制低下を試験する系で容易に調べることができる。このような試験は、細胞を山中因子または分化因子で処理することを含んでいる。この脱分化または分化転換は、同じ設定だが候補メニン阻害剤を用いてメニンを抑制する点が異なる設定と比較される。脱分化または分化転換の速度増大は、メニン阻害剤であることを示す。小分子阻害剤とペプチドは、細胞に接触させることによって標的細胞に導入することができる。ペプチドとタンパク質（メニン模倣体など）は、発現ベクターによって導入されることが好ましい。これについてはあとで詳述する。好ましい実施態様では、ペプチド阻害剤は、長さが3〜200個のアミノ酸、好ましくは長さが4〜150個のアミノ酸、または5〜100個のアミノ酸、または6〜50個のアミノ酸、または7〜30個のアミノ酸である。
【００３１】
メニン（または他の再プログラミング因子）の活性の抑制は、直接的でも間接的でもよい。本発明の別の一実施態様では、メニン（または他の再プログラミング因子）の活性の抑制は、メニンタンパク質-タンパク質-相互作用（PPI）（または他の再プログラミング因子の相互作用）の抑制を含むことができ、例えばその相互作用の抑制は、メニンが、FANCD2、GFAP、RPA2、VIM、TCF7L2、RBBP5、ASH2L、HIST3H3、CTNNB1、MLL2、IQGAP1、LEF1、SMAD3、GAST、JUND、NFKB1のいずれかに結合するのを抑制することによる（すべての名称に関してはgenecards.orgや、それ以外のデータベースを参照されたい）。このようなPPIを阻止することで、機能の抑制および／またはタンパク質の分解が可能になる。メニン阻害剤は、メニンによるMLL/SET1ヒストンメチルトランスフェラーゼ（HMT）複合体への干渉を減らすこともできる。したがって本発明の方法で使用できる適切なメニン阻害剤（または他の再プログラミング因子の阻害剤）に含まれるのは、細胞内タンパク質パートナーの結合と競合する小分子阻害剤、またはコンホメーションの変化を誘導して結合パートナーと相互作用できなくするアロステリック阻害剤である。本発明のいくつかの実施態様では、メニン阻害剤（または他の再プログラミング因子の阻害剤）は、本発明の方法で使用する前に試験して検証することができる。本分野で知られている実験技術を利用してPPIとタンパク質-阻害剤相互作用を分析することができる。一般にアッセイには、例えば対照としての山中因子と、テストランとしての山中因子とメニン阻害剤（または他の再プログラミング因子の阻害剤）を用意することにより、本発明に従って体細胞からiPS細胞への再プログラミングを実施することが含まれる。再プログラミングの速度増大は、効果的な阻害剤であることを示す。
【００３２】
本発明に従ったメニンの活性抑制に使用できる抑制剤の非限定的な例に含まれるのは、小分子阻害剤、特に阻害剤MI-1（Grembecka 他、Nat Chem Biol第8巻(3)、2012年：277〜284ページ）、KO-382、MI-3、MI-2（Mol Cell Biol、2015年、第36巻(4)：615〜627ページ）、MI-2-2、MI-136、MI-372、MI-389、MI-405、MI-463、MI-503（Borkin他、Cancer Cell、2015年、第27巻：1〜14ページ）、ビンポセチン、MI-136、シノメニン（Int Immunopharmacol、2016年、第40巻：492ページ）である。
【００３３】
メニンの阻害剤、または他の再プログラミング因子（Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、Trp53）の阻害剤が、本分野で入手可能である。阻害剤の情報を集めたデータベースは、www.selleckchem.comに見いだされる。Eif4e2の阻害剤は例えば4E1RCat、4EGI-1、SBI-0640756のいずれかであり；Apcの阻害剤はトシル-L-アルギニンメチルエステル（TAME）であり；Dot1lの阻害剤はピノメトスタット（EPZ5676）、SGC 0946、EPZ004777であり；Ptenの阻害剤はVO-Ohpic、SF1670であり；TRP53には多くの阻害剤が知られている（例えばピフィトリン、特にピフィトリン-αまたはピフィトリンμ）。
【００３４】
いくつかの実施態様では、メニン（または他の再プログラミング因子）の活性を抑制する薬剤は、10〜10,000 ng/ml（例えば100〜5,000 ng/ml、例えば1,000〜2,500 ng/ml、または2,500〜5,000 ng/ml、または5,000〜10,000 ng/ml）の濃度で培地に添加される。
【００３５】
本発明の方法は、細胞を複数の薬剤で同時に（すなわち少なくとも一部が重なる期間の間に）処理すること、または細胞を逐次的に、および／または繰り返して1つの薬剤で処理することを含むことができる。反復処理で用いる薬剤は、最初の処理の間に用いる薬剤と同じでも、異なっていてもよい。
【００３６】
細胞は、さまざまな長さの期間にわたって再プログラミング剤と接触させることができる。いくつかの実施態様では、細胞を1時間〜60日間（例えば10〜30日間、例えば約15〜20日間）の期間にわたって薬剤と接触させる。再プログラミング剤は、細胞培養培地を交換するたびに添加することができる。再プログラミング剤は、多能性細胞を富化するための選択を実施する前、または細胞の多能特性を評価する前に除去することができる。
【００３７】
抑制するとiPSの再プログラミングが増強されることを本出願の発明者が同定した他の障害因子は、Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、Trp53である。したがって本発明により、iPS細胞の集団を調製する方法として、（i）標的細胞の集団中でOct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、およびLin28から選択される1つ以上の山中因子を発現させることと、Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、Trp53のいずれか、またはこれらの組み合わせの量および／または活性を低下させることと、（ii）場合によってはその標的細胞の集団からiPS細胞を単離することを含む方法も提供される。
【００３８】
本発明の方法はさらに、本発明の発明者によって同定された2つ以上の再プログラミング障害因子の量および／または活性を低下させることによって改善することができる。したがって本発明により、iPS細胞の集団を調製する方法として、（i）Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、およびLin28から選択される1つ以上の山中因子を発現させることと、Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、Trp53から選択される2つ以上の量および／または活性を低下させることを含む方法も提供される。
【００３９】
メニンの量および／または活性を低下させる工程に関する本発明の方法の上記の実施態様と下記の実施態様は、Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、Trp53から選択される他の再プログラミング障害因子にも同様に当てはまる。
【００４０】
メニン（Men1）の量または活性の低下、または他の再プログラミング因子または障害因子の量または活性の低下は、その因子の量または活性の消失であることが好ましい。さらに別の実施態様では、その低下は、メニンの量または活性の絶対的な消失、または他のそれぞれの因子の量の絶対的な消失を必要としない。抑制されていない対照細胞と比べてメニン（または他のそれぞれの因子）の量または活性の正味の低下（少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、そしてもちろん100％も）があれば十分である。対照細胞は、メニンまたは他のそれぞれの因子が抑制されていないことを除き、抑制された細胞と同じである。対照との比較は同じ環境条件（例えば栄養、温度）でなされる。適切なメニン阻害剤（または他の因子の阻害剤）とその適切な濃度は、当業者が比較用の細胞のインビトロ結合アッセイで容易に調べることができる。濃度は、望む強度の効果を実現できるように変えることができる。
【００４１】
本発明で用いる標的細胞として、動物から新たに単離された細胞などの初代細胞（非不死化細胞）が可能である。あるいは標的細胞として、培地の中で増殖させることのできる細胞系、または培地の中で長期にわたって（例えば3ヶ月超）増殖する細胞系、または無限に増殖する細胞系（不死化細胞）に由来するものが可能である。成体体細胞は、個体（例えばヒト対象）から取得することができ、当業者が利用できる標準的な細胞培養プロトコルに従って培養することができる。細胞は、対象から単離した後に細胞培地に中に維持することができる。いくつかの実施態様では、細胞は、個体から単離した後、本発明の方法で使用する前に1回以上（例えば2〜5回、5〜10回、10〜20回、20〜50回、50〜100回、またはそれよりも多数回）継代する。細胞は凍結させ、あとで使用前に解凍することができる。いくつかの実施態様では、細胞は、個体から単離した後、本発明の方法で使用する前に継代を1回以下、または2回以下、または5回以下、または10回以下、または20回以下、または50回以下実施することになろう。継代として、3〜5日ごとに再培養することによる継代培養が可能である。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、1つの細胞系の細胞（例えば単一の祖先細胞に由来すること、または祖先細胞の特定の集団および／または実質的に同じ集団に由来すること、または特定の個体から取得した組織サンプルに由来することが典型的で、大半が同じ細胞または実質的に同じ細胞の集団）を利用する。細胞系は長期間（例えば数ヶ月、数年、無制限の期間）にわたって培地の中に維持されていた可能性、または維持できる可能性がある。細胞系は、細胞に無限の培養寿命を与える自発的な、または誘導された変換プロセスを経ていてもよい。細胞系には、本分野で細胞系であると認められているあらゆる細胞系が含まれる。時間が経過する間に細胞が変異とおそらくはエピジェネティックな変化を獲得することで、細胞系の個々の細胞の少なくともいくつかの特性が互いに異なるようになる可能性があることが理解されよう。
【００４２】
本発明の好ましい一実施態様は、標的細胞が哺乳動物の体細胞であり、好ましくはヒト、非ヒト霊長類、マウスいずれかの体細胞である実施態様である。哺乳動物の体細胞は、線維芽細胞、成体幹細胞、セルトリ細胞、顆粒膜細胞、ニューロン、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Bリンパ球とTリンパ球）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、骨格筋細胞のいずれかであることが好ましい。
【００４３】
本発明に従って再プログラミングする細胞は、通常は体細胞である。本発明で使用する体細胞は、典型的には哺乳動物の細胞、例えばヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、マウス細胞のいずれかである。これらの細胞は、周知の方法により、さまざまな臓器（例えば皮膚、肺、膵臓、肝臓、胃、小腸、心臓、生殖器、膀胱、腎臓、尿道とそれ以外の泌尿器など）から取得すること、一般には生きた体細胞を含有する任意の臓器または組織から取得することができる。本発明のさまざまな実施態様で有用な哺乳動物の体細胞として、線維芽細胞、成体幹細胞、セルトリ細胞、顆粒膜細胞、ニューロン、膵島細胞、表皮細胞、上皮細胞、内皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞、リンパ球（Bリンパ球とTリンパ球）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、骨格筋細胞などが可能であり、一般には任意の生きた有核体細胞が可能である。いくつかの実施態様では、体細胞は最終的な分化をした細胞である。すなわちその細胞は完全に分化しているため、（身体内の通常の条件下で）より特殊化された細胞を生じさせることはない。いくつかの実施態様では、体細胞は、身体内の通常の条件下で分化することがない最終的な分化をした細胞である。すなわちその細胞は自己複製することができない。いくつかの実施態様では、体細胞は前駆細胞である。すなわちその細胞は完全に分化していないため、より完全に分化した細胞を生じさせることができる。いくつかの実施態様では、ヒト対象から比較的簡単な手続きで取得できる細胞を使用する（例えば線維芽細胞、ケラチノサイト、循環している白血球細胞）。
【００４４】
本発明の方法では、標的細胞の集団は、一般に、標準的な条件の温度、pHと、それ以外の環境条件のもとで培養することができる（例えば5〜10％のCO2を含有する大気中で37℃にした組織培養プレートの中の接着細胞）。細胞および／または細胞培養培地を適切に改変し、本明細書に記載されているようにして再プログラミングを実現する。細胞培養培地は、生存を維持するとともに典型的には少なくとも数種類の細胞の増殖をサポートするのに十分な栄養素を含有している。培地は、塩、バッファー、アミノ酸、グルコースその他の糖、抗生剤、血清または代替血清、他の構成要素（ペプチド増殖因子など）などのいずれかを適切な組み合わせで含有することができる。特定のタイプの細胞で通常用いられる細胞培養培地は当業者に知られている。いくつかの非限定的な例が本明細書に提示されている。
【００４５】
当業者であればわかるように、上記の1つ以上の再プログラミング障害因子の量および／または活性を低下させるのに必要な薬剤の量は、本発明の方法で使用する標的細胞のタイプに依存する可能性がある。同様に、標的細胞を上記の薬剤に曝露する時間の長さは、本発明の方法で用いる標的細胞のタイプによって異なる可能性がある。特定のタイプの細胞で再プログラミングを最も効果的に促進するのに必要な量と時間は、本明細書に開示されている方法を利用するとともに通常の実験手続きも利用して容易に同定することができる。最も効果的なタイプの薬剤も同定することができる。
【００４６】
例えば当業者は、同じ標的細胞を用いて一連の実験を実施した後、（上記のように）メニンの発現または活性を抑制する薬剤の量をいろいろと変えて決められた期間にわたって使用して本発明の方法を実施すると、そのタイプの標的細胞にとって最も有効な条件を特定することができる。同じことが、メニンの代わりに他の再プログラミング標的に当てはまる。同様に、当業者は、同じ標的細胞を用いて一連の実験を実施した後、細胞を決められた量の薬剤に曝露する時間の長さをいろいろと変えて本発明の方法を実施すると、その標的細胞のタイプにとって最も効果的な条件を特定することができる。また、一過性発現系で用いるプロモータ配列を変えて同様の実験を実施すると、最適な系を特定することができる。さらに、標的細胞に一過性発現ベクターをトランスフェクトするさまざまな方法を利用して標的細胞にとって最適なプロトコルを特定することができる。上記のアプローチを定型的なやり方でさまざまに変化させて利用することで、本発明の方法を用いる特定の標的細胞のタイプに適用される最適な条件を特定できることがわかる。
【００４７】
本発明の第1の側面による方法では、標的細胞の集団は、再プログラミングを実施しつつiPS細胞を培養するのに適した培地の中で培養される。代表的な血清含有iPSC培地は、80％のDMEM（典型的にはKO DMEM）と、熱で不活化されていない20％の既知組成ウシ胎仔血清（FBS）と、1％の非必須アミノ酸と、1 mMのL-グルタミンと、0.1 mMの[β]-メルカプトエタノールを用いて作られる。この培地を濾過し、4℃で例えば2週間以下保管する。無血清ES培地は、80％のKO DMEMと、20％の代替血清と、1％の非必須アミノ酸と、1 mMのL-グルタミンと、0.1 mMの[β]-メルカプトエタノールを用いて調製することができ、代替血清は例えばInvitrogen社のカタログ番号10828-028である。この培地は濾過して4℃で保管する。コンディショニングのために用いる細胞と組み合わせる前にヒトbFGFを添加して最終濃度を4 ng/mlにすることができる。StemPro (R) hESC SFM（Invitrogen社のカタログ番号A1000701）を用いる。これは、ヒト胚性幹細胞を増殖させるために特別に調製された、組成が完全にわかっている無血清・無フィーダー培地（SFM）である。いくつかの実施態様では、iPS細胞を再プログラミングして1つ以上のタイプに分化した細胞にする。iPS細胞は、最初はES細胞を維持するのに適した培地の中で培養し、その後、望むタイプの細胞に適した培地に移すことができる。
【００４８】
本発明により、分化した細胞の集団を調製する方法として、本発明の方法に従うiPS細胞の集団を調製し、1つのプロトコルまたは因子を用いてiPS細胞を分化させて分化した細胞の集団を形成することを含む方法も提供される。
【００４９】
本発明の方法は、iPS細胞を調製するための再プログラミングプロトコルの一部として利用される。
【００５０】
「再プログラミングプロトコル」は、少なくとも数個の細胞を再プログラムされた状態にする任意の処置、または処置の組み合わせを意味する。いくつかの実施態様では、「再プログラミングプロトコル」は、既知の再プログラミングプロトコルのバリエーションであって、既知の再プログラミングプロトコルで用いられる因子または他の薬剤が除去されるか改変されているものを意味することができる。いくつかの実施態様では、「再プログラミングプロトコル」は、既知の再プログラミングプロトコルのバリエーションであって、再プログラミングに用いられることが知られている因子または薬剤を、再プログラミングでの有用性が確立されていない異なる薬剤とともに用いるものを意味することができる。再プログラミングプロトコルの詳細を以下に提示する。
【００５１】
本発明の好ましい実施態様では、本発明の方法は、標的細胞の集団中で、（i）Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、およびLin28から選択される1つ以上の山中因子を発現させることと、（ii）メニン（Men1）の量および／または活性を低下させることを合わせて含んでいる。「合わせて」には、1つ以上の山中因子の発現と、メニンの量または活性の低下が1個の細胞の中で重複して作用するという意味が含まれる。例えばその発現と低下を引き起こす薬剤（導入遺伝子、またはメニンの阻害剤）は、その細胞の中で同時に作用するが、もちろんその細胞内での保持時間に応じて異なる時点にその細胞に投与することができる。例えば1つ以上の山中因子を発現させた後にメニンの量および／または活性を低下させること、またはメニンの量および／または活性を低下させた後に1つ以上の山中因子を発現させることができる。
【００５２】
体細胞を再プログラムして多能性にするため、細胞を処理して1つ以上の再プログラミング因子または多能性因子をそのような処理がない場合よりも高いレベルで発現または含有させることができる。例えば体細胞を遺伝子改変し、そのような1つ以上の因子をコードする1つ以上の遺伝子を発現させること、および／または体細胞を、そのような因子をコードする1つ以上の内在性遺伝子の発現を増大させる薬剤および／またはそのような因子を安定化させる薬剤で処理することができる。薬剤として、例えば小分子、核酸、ポリペプチドなどが可能であると考えられる。いくつかの実施態様では、多能性因子は、例えば微量注入によって、またはそれら因子が細胞に取り込まれる条件下で細胞をそれら因子と接触させることによって導入される。いくつかの実施態様では、それら因子が改変されてタンパク質形質導入ドメインが組み込まれる。いくつかの実施態様では、細胞が透過性にされるかそれ以外のやり方で処理されてそれら因子の取り込みが増大する。多能性因子は、組み込み核酸アプローチまたは非組み込み核酸アプローチによって導入することもできる。組み込み送達法によって遺伝材料が標的細胞のゲノムの中に組み込まれる。因子の例については下に論ずる。
【００５３】
転写因子Oct4（Pou5fl、Oct-3、Oct3/4とも呼ばれる）は多能性因子の一例である。Oct4はES細胞の未分化な表現型を確立して維持するのに必要であることが示されており、胚発生と細胞分化における初期イベントを決定するのに主要な役割を果たしている（Nichols他、1998年、Cell 第95巻：379〜391ページ；Niwa他、2000年、Nature Genet. 第24巻：372〜376ページ）。Oct4の発現は、幹細胞が分化してより特殊化された細胞になるにつれて下方調節される。Nanogは多能性因子の別の一例である。Oct4は本発明の最も好ましい山中因子の1つであり、本発明のどの実施態様または側面（方法とキットを含む）でも、単独で使用すること、または他の任意の山中因子と組み合わせて使用することができる。Nanogはホメオボックス転写因子であり、主要な機能は、内部細胞塊の多能性細胞を維持することと、そこからES細胞を導出することである。さらに、Nanogを過剰発現させると、通常は分化誘導培養条件と考えられる条件下でESCの多能性と自己複製特性を維持することができる。（Chambers他、2003年、Cell第113巻：643〜655ページ；Mitsui他、Cell. 2003年、第113巻(5)：631〜642ページを参照されたい）。別の多能性因子であるSox2は、正常な多能性細胞の発生と維持に不可欠であることが知られているHMGドメイン転写因子である。（Avilion, A. 他、Genes Dev. 第17巻、126〜140ページ、2003年）。Klf4はKruppel型ジンクフィンガー転写因子であり、最初は腸内で発現するKlfファミリーのメンバーとして同定された（Shields, J.M.他、J. Biol. Chem. 第271巻：20009〜20017ページ、1996年）。マウスES細胞の中でKlf4を過剰発現させると、懸濁培地の中に形成される胚様体の分化が阻止されることが見いだされため、これはKlf4がES自己複製に寄与していることを示唆している（Li, Y.他、Blood第105巻：635〜637ページ、2005年）。Sox2はSOX（性決定領域Yボックス）転写因子のファミリーのメンバーであり、ES細胞自己複製の維持にとって重要である。c-Mycまたは「Myc」は、正常な発生と生理学において多彩な役割を果たしている転写因子であるほか、がん遺伝子でもあり、その異常な発現または変異はさまざまなタイプのがんに関係している（Pelengaris S、Khan M.、Arch Biochem Biophys. 第416巻(2)：129〜136ページ、2003年；Cole MD、Nikiforov MA、Curr Top Microbiol Immunol、第302巻：33〜50ページ、2006年に概説）。Mycを発現させる代わりに、またはMycを発現させることに加えて、Myc活性の代替または増強が可能なLin41（Trim71）を発現させることもできる（Rand他、Cell Reports第23巻、361〜375ページ、2018年、参照によって本明細書に組み込まれている）。また、Mycを発現させる代わりに、またはMycを発現させることに加えて、p21の発現または活性を低下させることが可能である。Mycのこれら代替物は、本発明の任意の側面または実施態様（方法とキットを含む）で利用することができる。いくつかの実施態様では、このような因子は、Oct4、Sox2、Klf4と、これらの組み合わせからなるグループから選択される。いくつかの実施態様では、Klfファミリーの中にあって機能が重複している別のメンバー（Klf2など）でKlf4を置き換える。いくつかの実施態様では、因子には少なくともOct4が含まれる。いくつかの実施態様では、因子に少なくともOct4とKlfファミリーのメンバー（例えばKlf2）が含まれる。Lin28は、発生で調節されるRNA結合タンパク質である。いくつかの実施態様では、体細胞を処理し、Oct4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、Lin28、およびこれらの組み合わせからなるグループから選択される1つ以上の再プログラミング因子を発現または含有するようにする。CCAAT/エンハンサ結合タンパク質α（C/EBPα）は、少なくともいくつかのタイプの細胞で再プログラミングを促進する別のタンパク質であり、例えばリンパ球様細胞（B系譜細胞）は、そのようなタイプの細胞の再プログラミング因子であると見なされている。山中因子の代替物として、他の任意のiPS細胞再プログラミング因子、またはiPS細胞再プログラミング因子の組み合わせを用いることができる。「iPS細胞再プログラミング因子」は、一般に、山中因子と同様、体細胞からiPS細胞への脱分化を再プログラミングすることができる因子である。メニンの量および／または活性の低下も、そのような「iPS細胞再プログラミング因子」の脱分化を促進することができる。山中因子に対するこれら代替物は、本発明の任意の側面または実施態様（方法とキットを含む）で利用することができる。
【００５４】
したがって本発明の好ましい一実施態様は、iPS細胞の集団を調製する方法に関するものであり、この方法では、1つ以上の山中因子を発現させる工程、または細胞を分化因子で処理する工程（下記の特に分化転換を参照されたい）は、それぞれ、組み込みアプローチ（integrative approaches）（好ましくはレトロウイルス発現ベクター、レンチウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクターのいずれか、特に切除可能および誘導性ベクター（excisable and inducible vectors））または非組み込みアプローチ（non-integrative approaches）（好ましくは組み込み欠陥ウイルス送達技術、エピソーマル送達技術、RNA送達技術、タンパク質送達技術のいずれか、好ましくは非ウイルスベクターに基づくIVT-mRNAナノ送達系）を含んでいる。特に好ましいのは、1つ以上の山中因子を発現させるための組み込みアプローチまたは非組み込みアプローチが一過性または誘導性である本発明の方法の実施態様である。
【００５５】
一実施態様では、外部から導入された遺伝子は、機能が多能性と関係している内在性遺伝子の染色体遺伝子座とは別の染色体遺伝子座から発現させることができる。このような染色体遺伝子座として、開いたクロマチン構造を持つ遺伝子座が可能であり、その遺伝子剤は、体細胞の中で発現する必要がない遺伝子を含んでいる（例えばその染色体遺伝子座は、破壊されても細胞の死を引き起こすことのない遺伝子を含有している）。代表的な染色体遺伝子座に含まれるのは、例えばマウスROSA 26遺伝子座とII型コラーゲン（Col2a1）である（Zambrowicz他、1997年を参照されたい）。
【００５６】
細胞の中で遺伝子を発現させる方法は本分野で知られている。一般に、ポリペプチドまたは機能的RNA（RNAi剤など）をコードする配列が、適切な調節配列（例えばプロモータ、および／またはエンハンサ、および／または他の発現制御エレメント）に機能可能に連結している。代表的な調節配列は、Goeddel；『Gene Expression Technology: Methods in Enzymology』、Academic Press社、サン・ディエゴ、カリフォルニア州（1990年）の［0086］に記載されている。遺伝子は、その発現を調節できるようにするため、誘導性または抑制性の調節配列、したがって条件性の調節配列から発現させることができる。代表的な誘導性プロモータに含まれるのは、例えば、重金属に反応するプロモータ（CRC社『Boca Raton, FIA』（1991年）、167〜220ページ；Brinster他、Nature（1982年）、第296巻、39〜42ページ）、熱ショックに反応するプロモータ、ホルモンに反応するプロモータ（Lee他、P.N.A.S. USA（1988年）、第85巻、1204〜1208ページ；（1981年）、第294巻、228〜232ページ；Klock他、Nature（1987年）、第329巻、734〜736ページ； IsraelとKaufman、Nucleic Acids Res.（1989年）、第17巻、2589〜2604ページ）、化学剤（グルコース、ラクトース、ガラクトース、抗生剤など）に反応するプロモータである。テトラサイクリン誘導性プロモータは、抗生剤（テトラサイクリンまたはその類似体）に反応する誘導性プロモータの一例である。Gossen, M.とBujard, H.、Annu Rev Genet.第36巻：153〜173ページ 2002年と、その中の参考文献を参照されたい。テトラサイクリン類似体に含まれるのは、テトラサイクリンと構造が似た任意の化合物であり、テトラサイクリン類似体は、テトラサイクリン誘導性プロモータを活性化することができる。代表的なテトラサイクリン類似体に含まれるのは、例えばドキシサイクリン、クロルテトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリンである。
【００５７】
本発明のいくつかの実施態様では、導入された遺伝子（例えば再プログラミング因子またはRNAi剤をコードする遺伝子）の発現は一過性である。一過性の発現は、一過性トランスフェクションによって、または調節可能なプロモータからの発現によって実現することができる。いくつかの実施態様では、発現は、部位特異的組み換え酵素によって調節することができる。すなわち発現は、部位特異的組み換え酵素に依存している。組み換え酵素系に含まれるのは、特にCre-Lox系とFlp-Frt系である（Gossen, M.とBujard, H.、2002年）。いくつかの実施態様では、組み換え酵素を使用して、その組み換え酵素がないときコード配列を発現制御配列から分離しているストッパ配列を除去することにより、発現を起こさせる。いくつかの実施態様では、再プログラミングを誘導した後に組み換え酵素を使用して遺伝子の少なくとも一部を切除する。いくつかの実施態様では、組み換え酵素を一過性に発現させる。例えば組み換え酵素は、約1〜2日後、約2〜7日後、約1〜2週間後などに検出できなくなる。いくつかの実施態様では、組み換え酵素を外部供給源から導入する。
【００５８】
タンパク質再プログラミング因子（例えば山中因子（Oct4、Sox2、Klf4など））を細胞の中に導入することで外来性遺伝材料の導入を回避できると考えられる。そのようなタンパク質を改変してタンパク質形質導入ドメインが含まれるようにすることができる。このような取り込み増強アミノ酸配列は、例えばHIV-I TATタンパク質、単純ヘルペスウイルス1（HSV-1）DNA結合タンパク質VP22、ショウジョウバエのアンテナペディア（Antp）転写因子などに見いだされている。人工配列も有用である（例えばFischer他、Bioconjugate Chem.、第12巻、第6号、2001年と、アメリカ合衆国特許第6,835,810号を参照されたい）。
【００５９】
多彩な追加の薬剤を用いて再プログラミングを増強することができると考えられる。そのような薬剤は、メニン、Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、およびTrp53から選択される1つ以上の再プログラミング障害因子（特にメニン）の量および／または活性を低下させる薬剤と組み合わせて用いることができる。
【００６０】
本開示は体細胞を再プログラミングして多能性にすることに焦点を当てているが、本発明の方法は、分化した体細胞または幹細胞を再プログラミングして第1のタイプの細胞から第2のタイプの細胞にすることにも適用できる。例えば本明細書で同定された遺伝子と方法を改変することにより、細胞内で転写因子の特定の組み合わせを発現させてその細胞を異なるタイプの細胞にすることが関与する再プログラミングプロトコルを増強することが考えられる。このような再プログラミングプロトコルには、本明細書で同定された標的の改変が関与する。体細胞の分化によって第1のタイプの細胞から（第1のタイプの細胞とは異なる）第2のタイプの細胞にすることも、本明細書では「分化転換」と呼ぶ。本明細書に示されているように、メニン（または他の再プログラミング因子）の抑制によっても分化転換効率が増大する。説明全体の中で人工幹細胞の生成に関して本明細書で述べられていることは、山中因子を必要としないが第2のタイプの細胞に分化させる分化因子が必要とされる点を除き、分化転換にも当てはまる。したがって本発明により、第1のタイプの細胞から、第1のタイプの細胞とは異なる第2のタイプの細胞に分化させる方法として、（i）第1のタイプの細胞を第2のタイプの細胞の分化因子で処理することと、（ii）メニン（Men1）、または他の再プログラミング因子（Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、Trp53など）のうちの1つの量および／または活性を低下させることを含む方法が提供される。メニン（Men1）、または他の再プログラミング因子のうちの1つの量および／または活性の低下に関して上に述べたのと同じことが当てはまる。言い換えると、本発明により、第1の細胞から目的の組織の体細胞への分化を増強する方法として、標的細胞の集団中で、（i）細胞を目的のその組織の分化因子で処理することと、（ii）メニン（Men1）の量および／または活性を低下させることを含む方法も提供される。（A）第1の細胞は、成体皮膚細胞もしくは成熟皮膚細胞、血液細胞、毛包細胞、または膀胱細胞から選択される分化転換能力が低い細胞であること；または（B）分化は、第1の細胞とは異なる胚葉の体細胞への分化であること；または（C）体細胞は、非心臓細胞、好ましくはやはり非中胚葉系の細胞（例えば内胚葉系譜または外胚葉系譜の細胞）であることが好ましい。
【００６１】
「第1」と「第2」は、本明細書では、細胞のタイプを識別するためにだけ用いられる。第1のタイプの細胞は、造血幹細胞、筋肉細胞、心筋細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、軟骨細胞(cartilage cells)、上皮細胞、尿管細胞、神経系細胞（例えばニューロン）、線維芽細胞、成体幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞、顆粒膜細胞、ニューロン、膵島細胞（非膵島細胞も）、表皮細胞、内皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞（chondrocytes）、リンパ球（Bリンパ球とTリンパ球）、マクロファージ、単球、単核細胞、心筋細胞、骨格筋細胞などから選択され得る。第2のタイプの細胞（目的の組織の体細胞とも呼ぶ）は、造血幹細胞、筋肉細胞、心筋細胞（非心筋細胞も）、肝臓細胞、膵臓細胞、軟骨細胞(cartilage cells)、上皮細胞、尿管細胞、神経系細胞（例えばニューロン）、線維芽細胞、成体幹細胞、胚性幹細胞、セルトリ細胞、顆粒膜細胞、ニューロン、膵島細胞（非膵島細胞も）、表皮細胞、内皮細胞、肝細胞、毛包細胞、ケラチノサイト、造血細胞、メラノサイト、軟骨細胞（chondrocytes）、リンパ球（Bリンパ球とTリンパ球）、マクロファージ、単球、単核細胞、骨格筋細胞などから選択され得る。
【００６２】
分化転換は本分野で知られており、例えばIeda他、Cell Stem Cell 第7巻(2)、2010年：139〜141ページ；Liu他、Cell Division（2016年）第2巻、16036ページ；Terai他、J. Biochem. 第134巻、551〜558ページ（2003年）；Lazaro他、Stem Cell Rev and Rep（2016年）第12巻：129〜139ページに開示されている（これらはすべて、参照によって本明細書に組み込まれている）。適切な分化因子はこのような文献に開示されており、本発明で使用することができる。転写因子として、上記の第2のタイプの細胞いずれかのための転写因子が可能である。すなわちその転写因子は、そのタイプの細胞へと分化するのを媒介する。
【００６３】
好ましい分化転換は、骨髄細胞から肝芽細胞または肝細胞への分化転換（Terai他）；線維芽細胞から多能性幹細胞または心筋細胞への分化転換（Ieda他とLiu他）；アストロサイトまたは線維芽細胞からニューロンへの分化転換；アストロサイトから神経芽細胞への分化転換；グリア細胞からニューロンへの分化転換；脳梁ニューロンから皮質遠心性ニューロンへの分化転換；L4ニューロンからL5ニューロンへの分化転換；外分泌細胞からβ細胞への分化転換；線維芽細胞から骨格筋繊維または心筋細胞への分化転換；心筋細胞からペースメーカー細胞への分化転換（Lazaro他）；ニューロンへの分化（Zhang他、Neuron 第78巻、2013年：785〜798ページ）；肝臓細胞からインスリン分泌細胞への分化転換（Lazaro他、US2006/122104 とWO2016/108237）；非膵臓細胞から膵臓細胞への分化転換（WO 2004/087885）；表皮細胞から神経前駆細胞および／またはニューロン細胞および／またはグリア細胞への分化転換（アメリカ合衆国特許第6,949,380号）である。さまざまな分化転換に関するさらに別の文献は、WO2005/100550、WO01/95861、EP1642965A、WO01/08691、WO03/066856、WO2006/096640、WO2013/188748、WO2015/010417、WO2015/133879、WO2015/133792、WO2015/131797、WO2016/002937、WO2017/131353である。もちろん他の任意の出発（第1の）細胞を用いることができる。なぜなら分化因子が標的細胞（第2の細胞、体細胞）を決めているからである。
【００６４】
分化因子は第1のタイプの細胞ではないこと、すなわち分化転換用であることが好ましい。好ましい分化因子は、（ニューロンへの分化には）Ascl1、Brn2a、Myt1lまたはNgn2、neuroD1、Fezf2から選択され；（神経芽細胞への分化には）Sox2が選択され；（心筋細胞への分化には）Gata4、Mef2c、Tbx5、Hand2、miRNA 1、mirNA 133、miRNA 208、miRNA 499から選択され；（β細胞への分化には）Pdx1、Ngn3、MafAから選択され;（インスリン分泌細胞への分化には）Pdx1、NeuroD、6-セルリン、VP16、Ngn3、MafAから選択され；（骨格筋繊維への分化には）MyoDが選択され；（ペースメーカー細胞への分化には）Tbx18が選択され；（ニューロンへの分化には）Brn2、Ascl1、MytL1、Ngn2、NeuroDから選択される。単独で、または組み合わせて用いられるこのような分化因子は本分野で知られていて、Lazaroらによって概説されており、本発明に従って使用することができる。
【００６５】
目的の第2の細胞すなわち体細胞が何であるかに応じ、作製された細胞を（確立されている）疾患または病気の治療で用いること、または予防的療法でその疾患または病気のリスク低減のために用いることができる。作製された細胞は、例えば、糖尿病（インスリン産生細胞）、心疾患、心血管疾患、虚血症（心筋細胞、ペースメーカー細胞）、肝不全（肝臓細胞、肝細胞）、貧血（血液細胞）、（例えば白血病（白血球）における）不十分な白血球細胞、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症（ニューロン）、萎縮（骨格筋細胞を含む筋細胞）の治療で用いられる。
【００６６】
Liuら（Cell Division（2016年）第2巻、16036ページ）は、マウス胚性線維芽細胞から人工心筋細胞への分化転換を開示している。この文献は、主として細胞を再プログラムするためのMll1 H3K4メチルトランスフェラーゼの活性に関するが、Men1にも言及している。この文献の教示は、十分に成熟していなくて容易に分化転換できる胚性細胞から出発する近縁の細胞（線維芽細胞と心筋細胞の両方とも中胚葉系譜である）の再プログラミングに限定されているため、幹細胞への完全な脱分化と、幹細胞様段階を通過するあらゆる分化転換（胚葉境界を超える分化転換を含む）を可能にする本発明によって提供される画期的な洞察は欠けている。Liuの洞察は本発明の一部を形成していないため、上述の選択肢A〜Cのどれも否定される。Luら（Gastroenterology 2010年、第138巻：1954〜1965ページ）は、中胚葉系譜の膵臓α細胞にインスリン産生活性を導入することを開示している。非α細胞への分化転換は開示されておらず、分化因子を用いた処理も開示されていない。いずれにせよ、本発明のいくつかの実施態様では、膵臓細胞は（出発する）第1の細胞ではない、および／または目的の第2の細胞すなわち体細胞ではない。
【００６７】
本発明は、通常は分化転換させることが難しい細胞、または分化転換に抵抗する細胞を用いて分化転換を容易に実現できることを示した。分化転換能が低いこのような細胞は、例えば成体皮膚細胞または成熟皮膚細胞、血液細胞、毛包細胞、膀胱細胞である。成体皮膚細胞または成熟皮膚細胞は、例えば（非胚性だが成熟した）皮膚線維芽細胞である。このような細胞を患者から例えば皮膚サンプル中で取得して本発明に従って処理することにより、iPS細胞を形成することと、他の体細胞を形成することの両方が可能である。核を含んでいて脱分化転換または分化転換が可能な血液細胞は、例えば赤芽球、骨髄芽球、NK細胞、リンパ球、好塩基球、好中球、好酸球、単球、NK細胞である。さらに、毛包細胞または膀胱細胞、すなわち尿の中に見いだされる細胞を使用することができる。これら細胞のすべてが、通常は脱分化転換または分化転換が困難であり、いくつかの細胞ドナーでは、先行技術の方法ではまったく脱分化転換または分化転換させることができない。本発明のメニン抑制によってそのような障害が取り除かれ、その脱分化転換または分化転換が可能になる。
【００６８】
上述のように、本発明により、実質的に脱分化させて幹細胞状態にすることさえ可能になる。メニン抑制により、この脱分化能に加え、さまざまなタイプの細胞の間の分化転換も可能になり、その中には胚葉系譜が異なる細胞の間の分化転換が含まれる。胚葉は、中胚葉、内胚葉、外胚葉であり、あらゆる細胞が、これらの胚葉に由来する細胞系譜を有する。心筋細胞と線維芽細胞は両方とも中胚葉細胞である。神経細胞は外胚葉系譜（特に神経外胚葉）に由来する。驚くべきことに、本発明により、第1の胚葉の細胞から異なる胚葉の細胞への（例えば中胚葉系譜の細胞から外胚葉系譜の細胞（神経細胞など）への）分化転換が可能になる（山中因子なしでさえ、だがもちろん山中因子を使用することは可能である）。また、本発明によって初めて、外胚葉細胞および／または内胚葉細胞のグループ内での細胞の分化転換が提供される（第1と第2の細胞（目的の体細胞）の両方が外胚葉；または両方が内胚葉；または内胚葉系譜と外胚葉系譜の間の任意の方向が含まれる）。任意の細胞系譜間のこの広い適合性は、本発明よりも前には知られておらず、予想もされていなかった。
【００６９】
本発明のあらゆる側面の好ましい実施態様では、細胞を、細胞外マトリックスの1つ以上の特徴を模倣した材料か、1つ以上の細胞外マトリックスまたは基底膜構成要素を含む材料の上で、またはそのような材料の存在下で培養する。いくつかの実施態様では、マトリゲル（商標）を使用する。他の材料には、タンパク質（ゼラチン、コラーゲン、フィブロネクチンなど）またはその混合物が含まれる。本発明のいくつかの実施態様では、これらの細胞を、フィーダー層の細胞の存在下で培養する。そのような細胞として、例えばマウス起源またはヒト起源のものが可能である。それらの細胞は、放射線を照射すること、または化学的不活性化剤（マイトマイシンcなど）で化学的に不活化すること、または望むのであればそれ以外のやり方で処理して増殖を抑制することができる。別の実施態様では、標的細胞をフィーダー細胞なしで培養する。
【００７０】
本発明の第1の側面による方法に従って調製したiPS細胞において、望む状態の細胞または望むタイプの細胞の1つ以上の特徴を評価することができる。例えば細胞の多能性特性を評価することができる。多能性の存在は、標的細胞が再プログラミングされて多能性状態になっていることを示す。
【００７１】
「多能性特性」という用語は、本明細書では、多能性に関連する特徴と、多能性を示す特徴を意味し、その中には、例えば3つの胚性胚葉すべてからあらゆるタイプの細胞へと分化する能力と、多能性細胞に関する明確な遺伝子発現パターン（多能性因子の発現と、他のES細胞マーカーの発現が含まれる）が含まれる。
【００７２】
再プログラミングされる可能性のある標的細胞の多能性特性を評価するため、そのような細胞の特定の増殖特性とES細胞様形態を分析することができる。細胞を免疫不全SCIDマウスに皮下注射し、奇形腫を誘導するかどうかを調べることができる（ES細胞を探す標準的なアッセイ）。ES様細胞を分化させて胚葉体にすることができる（ESに特異的な別の特徴）。さらに、特定のタイプの細胞へと分化させることが知られているいくつかの増殖因子を添加することによってES様細胞をインビトロで分化させることができる。テロメラーゼ活性の誘導によってわかる自己複製能力は、モニタすることのできる別の多能性特性である。再プログラムされた標的細胞を胚盤胞の中に導入してその再プログラムされた標的細胞の機能的アッセイを実施することにより、細胞があらゆるタイプの細胞を生じさせることができるかどうかを調べることができる（Higan他、2003年参照）。再プログラムされた細胞が身体の少数のタイプの細胞を形成できる場合には、その細胞は複能性であり；再プログラムされた細胞が身体のあらゆるタイプの細胞（生殖細胞を含む）を形成できる場合には、その細胞は多能性である。
【００７３】
個々の多能性因子の発現を調べることもできる。それに加えて、またはその代わりに、他のES細胞マーカー（例えば時期特異的胎児性抗原-1、-3、-4（SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4）、これらは、初期胚発生に特異的に発現する糖タンパク質であるとともに、ES細胞のマーカーでもある）を評価することができる（SolterとKnowles、1978年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 第75巻：5565〜5569ページ；Kannagi他、1983年、EMBO J第2巻：2355〜2361ページ）。酵素アルカリホスファターゼ（AP）の発現増大は、未分化の胚性幹細胞に関する別のマーカーである（Wobus他、1984年、Exp. Cell第152巻：212〜219ページ；Pease他、1990年、Dev. Biol. 第141巻：322〜352ページ）。追加のES細胞マーカーは、Ginis, L.他、Dev. Biol、第269巻：369〜380ページ、2004年と、The International Stem Cell Initiative、Adewumi O他、Nat Biotechnol. 第25巻(7)：803〜816ページ、2007年と、これらの文献の中の参照文献に記載されている。例えばTRA- 1-60, TRA- 1-81, GCTM2、GCT343と、タンパク質抗原CD9、Thyl（CD90）クラスI HLA、NANOG、TDGF1、DNMT3B、GABRB3とGDF3、REX-I、TERT、UTF-I、TRF-I、TRF-2、コネキシン43、コネキシン45、Foxd3、FGFR-4、ABCG-2、Glut-1が有用である。
【００７４】
再プログラムされた標的細胞の発現プロファイリングを実施してその多能性特性を評価することができる。多能性細胞（胚性幹細胞など）と複能性細胞（成体幹細胞など）は、明確に異なる全体的遺伝子発現パターンを持つことが知られている。例えばRamalho-Santos他、Science第298巻：597〜600ページ、2002年；Ivanova他、Science第298巻：601〜604ページ、2002年；Boyer, LA他、Nature第441巻、349ページ、2006年；Bernstein, BE他、Cell 第125巻(2)、315ページ、2006年を参照されたい。DNAのメチル化、および／または遺伝子の発現、および／または細胞DNAのエピジェネティックな状態、および／または細胞の発生潜在力を、例えばWernig, M. 他、Nature、第448巻：318〜324ページ、2007年に記載されているようにして評価することができる。SCIDマウスに注射したときに内胚葉、中胚葉、外胚葉の特徴を持つ細胞を含有する奇形腫を形成することのできる細胞、および／または（マウス胚盤胞の中に注入した後に）長期にわたって生存するキメラの形成に関与する能力を持つ細胞は、多能性であると見なされる。多能性の評価に用いられる別の方法は、細胞がサイレントX染色体を再活性化したかどうかを調べるというものである。
【００７５】
同様の方法を利用して、細胞を望むタイプの細胞または細胞系譜に再プログラミングする効率を評価することができる。そのような細胞の中で選択的または特異的に発現するマーカーを評価することができる。例えば神経細胞系譜、造血細胞系譜、筋原細胞系譜や、それ以外の細胞系譜が選択的または特異的に発現するマーカーが知られており、その発現を評価することができる。本発明のいくつかの実施態様では、本発明の方法に従って細胞を再プログラミングすることにより、RNA（例えばmRNA）またはタンパク質の発現レベルが、2〜5倍、または5〜10倍、または10〜25倍、または25〜50倍、または50〜100倍、または100〜250倍、または250〜500倍、または500〜1000倍、またはそれ以上に増大する。細胞の機能的特徴または形態的特徴を評価して再プログラミングの効率を評価することができる。
【００７６】
本発明のいくつかの方法は、複能性細胞または多能性細胞が発現するマーカー、または望むタイプの細胞または細胞系譜の細胞が発現するマーカーを発現する細胞を同定または選択する工程を含んでいる。標準的な細胞分離法（例えばフローサイトメトリー、アフィニティ分離など）を利用することができる。その代わりに、またはそれに加えて、再プログラムされた可能性がある細胞の出所となった細胞に特徴的なマーカーを発現しない細胞を選択することができよう。細胞を分離する別の方法は、多能性細胞と元の標的細胞の間に存在する可能性のある細胞の平均サイズまたは密度の違いを利用することができる。例えば細胞を、特定の細胞だけを通過させることができる孔を有する材料を通過させることによって濾過することができる。したがっていくつかの実施態様では、本発明により、iPS細胞を調製する方法として、標的細胞の集団中で、Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、およびLin28から選択される1つ以上の山中因子を発現させることと、メニン（Men1）の量および／または活性を低下させることと、そのiPS細胞を標的細胞の集団から単離することを含む方法が提供される。別の一実施態様では、本発明により、iPS細胞の集団を調製する方法として、標的細胞の集団中で、Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、およびLin28から選択される1つ以上の山中因子を発現させることと、メニン（Men1）の量および／または活性を低下させることと、そのiPS細胞の集団を標的細胞の集団から単離することを含む方法が提供される。
【００７７】
いくつかの実施態様では、標的細胞は、選択マーカーまたは脱選択マーカー（例えばGFPまたはneo）に機能可能に連結された多能性因子をコードする遺伝子の調節配列を含む核酸を含有している。マーカーをコードする核酸配列は、多能性因子（例えばOct4、Nanog）をコードする遺伝子の内在性遺伝子座の位置に組み込むこと、またはコンストラクトが、マーカーに機能可能に連結された調節配列を含むことができる。マーカーの発現を利用して再プログラムされた細胞を選択すること、および／または同定すること、および／または定量することができる。
【００７８】
再プログラムされた標的細胞の生成に関する本発明の方法のどれも、細胞療法を必要とする個体から標的細胞または標的細胞の集団を取得する工程を含むことができる。iPS細胞は、得られた細胞の中から、または得られた細胞の子孫の細胞から生成させる、または選択する、または同定する。場合によっては、細胞を培地の中で増殖させた後に、ドナーと遺伝的に一致するiPS細胞を生成させる、または選択する、または同定する。
【００７９】
いくつかの実施態様では、コロニーを1回以上サブクローニングおよび／または継代し、望む細胞（すなわちiPS細胞）が富化された細胞の集団を取得する。この富化された集団は、望むタイプの細胞を少なくとも95％、または96％、または97％、または98％、または99％、またはそれよりも多く、例えば100％含有している。本発明により、安定的かつ遺伝的に再プログラムされてES様状態にされた標的細胞の細胞系が提供される。
【００８０】
いくつかの実施態様では、本発明の方法は、形態基準を利用して、再プログラムされた細胞を、望むタイプに再プログラムされていない細胞の集団中で同定する。いくつかの実施態様では、本発明の方法では、形態基準を利用して、再プログラミングされてES様状態になった標的細胞を、再プログラムされていない細胞、または一部だけが再プログラムされてES様状態になった細胞の集団中で同定する。「形態基準」は広い意味で用いられ、細胞またはコロニーの視覚的に検出できる任意の特質または特徴を意味する。形態基準に含まれるのは、例えばコロニーの形、コロニーの境界の鋭さ、密度、小さなサイズ、再プログラムされていない細胞と比べて細胞が丸い形であることなどである。例えば小さくて丸い細胞からなり、鋭い境界を持つ密なコロニーは、ES細胞とiPS細胞に特徴的である。本発明は、望むタイプの細胞の1つ以上の特徴を示すコロニーを同定し、場合によっては単離すること（または細胞をコロニーから単離すること）を包含する。iPS細胞は、第1の細胞培養皿（この用語は、任意の器、プレート、皿、入れ物、収容具などを意味し、その中に生きている細胞をインビトロで維持することができる）の中で増殖しているコロニーとして同定することができ、そのコロニーまたはその一部を第2の細胞培養皿に移すことによって再プログラムされた細胞を単離する。その後、細胞をさらに増殖させることができる。
【００８１】
本発明により、本発明の方法で作製されたiPS細胞が提供される。これらの細胞は、医学、農業や、興味深い他の分野において多数の応用がある。本発明により、哺乳動物の病気を治療または予防する方法が提供される。一実施態様では、本発明の方法は、個体から体細胞を取得し、それら体細胞を利用して標的細胞の集団を調製し、請求項の発明に従ってiPS細胞の集団を調製することを含んでいる。
【００８２】
本発明のいくつかの実施態様では、得られたiPS細胞を次に、望むタイプの細胞へと展開するのに適した条件下で培養する。すなわちこれらの細胞はその後、再分化したiPS細胞になる。望むタイプの細胞はその個体に導入されて、その病気が治療される。iPS細胞は、望む臓器になるように誘導することもでき、その臓器が回収されて個体に導入され、病気が治療される。病気として、細胞または臓器の機能が異常である、および／または正常レベルよりも低下している任意の病気が可能である。したがって本発明は、細胞療法を必要とする個体から体細胞を取得し、その細胞を標的細胞の集団として本発明の方法で利用し、場合によってはiPS細胞を分化させて1つ以上の望むタイプの細胞を生成させ、その細胞を個体に導入することを含んでいる。細胞療法を必要とする個体は、どの病気を患っていてもよく、その細胞をドナーに投与することによってその病気、またはその病気の1つ以上の症状を緩和すること、および／または細胞を個体に投与することによって病気の進行を遅延させることができる。この方法は、再プログラムされた体細胞を同定または選択し、その体細胞を再プログラムされていない細胞から分離する工程を含むことができる。
【００８３】
したがってiPS細胞の分化を、このような細胞を分化させる既知の方法に従って誘導して望むタイプの細胞を得ることができる。例えばiPS細胞の分化を誘導して造血幹細胞、筋肉細胞、心筋細胞、肝臓細胞、膵臓細胞、軟骨細胞、上皮細胞、膀胱細胞、神経系細胞（例えばニューロン）などにすることが、そのような細胞を分化培地の中で、細胞を分化させるための条件下で培養することによって可能になる。本分野で知られている伝統的な方法を利用して得られた胚性幹細胞を分化させる培地と方法のほか、適切な培養条件は、本分野で知られている。そのような方法と培養条件を、本発明に従って得られたiPS細胞に適用することができる（例えばTrounson, A.「ヒト胚性幹細胞の作製と定方向分化」、Endocr Rev. 第27巻(2)：208〜219ページ、2006年と、Yao, S.他、「決められた化学的条件でのヒト胚性幹細胞の長期自己複製と定方向分化」、Proc Natl Acad Sci USA、第103巻(18)：6907〜6912ページ、2006年を参照されたい）。
【００８４】
したがって当業者は、既知の方法と培地を利用してiPS細胞を培養し、望む分化されたタイプの細胞（例えば神経細胞、筋肉細胞、造血細胞など）を得ることができる。対象とする細胞を用いて望む任意のタイプの分化された細胞を得ることができる。このような分化したヒト細胞は治療に用いる機会が多くある。例えば本発明に従って再プログラムされた細胞に由来するヒト造血幹細胞は、骨髄移植が必要な医療で用いることができる。このような手続きを利用して多くの疾患（例えば末期がんや、白血病などの悪性腫瘍）が治療される。このような細胞は、貧血や、免疫系が損われる疾患（例えばエイズ）などの治療にも役立つ。本発明の方法を利用して神経疾患（アルツハイマー病、パーキンソン病ハンチントン病、ALS、ライソゾーム症、多発性硬化症、脊髄損傷など）を治療、または予防、または安定化することもできる。例えば治療が必要な個体から体細胞を取得し、再プログラミングして多能性を獲得させ、培養し、神経外胚葉細胞を導出することで、その神経外胚葉細胞を使用して病気の組織または損傷した組織と置き換えるか、その組織の正常な機能を補助することができる。例えば本発明に至る途中で、iPS細胞を本発明の方法に従って作製すると、したがってメニンの活性または発現が低下すると、体細胞をニューロンに分化転換することがより効率的であることが見いだされた。
【００８５】
増殖因子またはホルモン（インスリンなど）を産生する再分化されたiPS細胞を哺乳動物に投与して内分泌障害を治療または予防することができる。上皮細胞を形成する再分化されたiPS細胞を投与して体腔または臓器（肺、腸、外分泌腺、尿生殖管など）のライニングの損傷を修復することができる。iPSを哺乳動物に投与して臓器（膀胱、脳、食道、輸卵管、心臓、小腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、卵巣、膵臓、前立腺、神経、脊椎、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿管、尿道、子宮など）内の細胞の損傷または欠損を利用することも考えられる。
【００８６】
iPS細胞をマトリックスと組み合わせてインビトロまたは生体内で組織または臓器を形成し、それを用いてレシピエントの哺乳動物の組織または臓器を修復または置換することができる（このような方法は「細胞療法」という用語に包含される）。例えばiPS細胞をインビトロでマトリックスの存在下にて培養し、泌尿生殖器系、心血管系、筋骨格系の組織または臓器を作製することができる。あるいは細胞とマトリックスの混合物を哺乳動物に投与して生体内で望む組織を形成することができる。例えば望む1個または複数個の遺伝子を導入し、または本発明に従って作製されたiPS細胞の1個または複数個の内在性遺伝子の全体または一部を除去し、そのような細胞が望むタイプの細胞に分化できるようにすることで、本発明に従って作製されるiPS細胞を用いて遺伝子操作された細胞またはトランスジェニック分化細胞を作製することができる。このような改変を実現する1つの方法は相同組み換えである。この技術を利用して、ゲノム内の特定の1つまたは複数の部位に1個または複数個の遺伝子を挿入すること、欠失させること、改変することができる。
【００８７】
この方法論を利用して欠陥のある遺伝子を置換すること、または治療に有益なタンパク質（増殖因子、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、酵素など）を発現する遺伝子を導入することができる。例えば脳由来増殖因子をコードする遺伝子をヒトの胚性細胞または幹様細胞に導入し、その細胞を神経細胞へと分化させ、その細胞をパーキンソン病の患者に移植してこのような疾患を患っている間の神経細胞の喪失を遅延させることができる。望む遺伝子／変異をiPS細胞に導入する既知の方法を利用してiPS細胞を遺伝子操作し、得られる操作された細胞を望むタイプの細胞（例えば造血細胞、神経細胞、膵臓細胞、軟骨細胞など）へと分化させることができる。iPS細胞に導入することのできる遺伝子に含まれるのは、上皮増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、グリア由来神経栄養増殖因子、インスリン様増殖因子（IとII）、ニューロトロフィン3、ニューロトロフィン-4/5、毛様体神経栄養因子、AFT-1、サイトカイン遺伝子（インターロイキン、インターフェロン、コロニー刺激因子、腫瘍壊死因子（αとβなど））、治療用酵素をコードする遺伝子、コラーゲン、ヒト血清アルブミンなどである。
【００８８】
望むのであれば、本分野で知られている陰性選択系を利用して治療用細胞を患者から除去することができる。例えばチミジンキナーゼ（TK）遺伝子をトランスフェクトされた細胞は、TK遺伝子を含有していてやはりTK遺伝子を発現する再プログラムされた細胞を生成させるであろう。このような細胞は、ガンシクロビルを投与した患者から任意の時点に選択的に除去することができる。このような陰性選択系は、アメリカ合衆国特許第5,698,446号に記載されている。別の実施態様では、細胞を操作することにより、毒性産物をコードしていて発現が誘導性プロモータの制御下にある遺伝子を含有させる。誘導物質を投与するとその毒性産物の産生が引き起こされて細胞が死に至る。したがって本発明のどの体細胞も、自殺遺伝子を含むことができる。その自殺遺伝子は、場合によっては発現カセットの中に含有されていて、ゲノムに組み込むことができる。自殺遺伝子は、発現すると細胞にとって致死的になると考えられる遺伝子である。その例に含まれるのは、ジフテリア毒素、コレラ毒素、リシンなどをコードする遺伝子である。自殺遺伝子は、特別な誘導剤または刺激がない通常の環境では発現を指示しない発現制御エレメントの制御下に置くことができる。しかし適切な条件下では発現を誘導することができる。それは例えば、（i）適切な誘導剤を細胞または生物に投与する場合、または（ii）特定の遺伝子（例えばがん遺伝子、細胞分裂周期に関与する遺伝子、脱分化を示すか分化が失われたことを示す遺伝子など）が細胞内で発現する場合、または（iii）細胞周期を制御する遺伝子や、分化を示す遺伝子などの遺伝子の発現が消えた場合である（アメリカ合衆国特許第6,761,884号を参照されたい）。いくつかの実施態様では、遺伝子は、部位特異的組み換え酵素によって媒介される組み換えイベントの後にだけ発現する。このようなイベントは、コード配列を発現制御エレメント（プロモータなど）と機能可能に関連させることができる。自殺遺伝子の発現は、細胞（またはその先祖）を対象に投与した後にその対象の身体からその細胞（またはその子孫）を除去したい場合に誘導することができる。例えば再プログラムされた体細胞が腫瘍を生じさせる場合には、その腫瘍は、自殺遺伝子の発現を誘導して除去することができる。いくつかの実施態様では、腫瘍の形成が抑制される。なぜなら細胞は、脱分化のとき、または細胞周期が適切に制御されなくなったとき、自動的に除去されるからである。
【００８９】
治療または予防できる疾患、障害、病気の例に含まれるのは、神経、内分泌、構造、骨格、血管、尿、消化、外皮、血液、免疫、自己免疫、炎症、内分泌、腎臓、膀胱、心血管、がん、循環、消化、造血、筋肉の疾患、障害、病気である。それに加え、再プログラムされた細胞を再建の用途（例えば組織または臓器の修復または置換）に用いることができる。いくつかの実施態様では、増殖因子と、血管新生を促進するタンパク質またはそれ以外の薬剤を含めると有利である可能性がある。あるいは適切な培地と条件、増殖因子、生物分解性ポリマーマトリックスを用いて組織を全面的にインビトロで形成することができる。
【００９０】
本発明ではあらゆる投与方式を考慮する。その中に含まれるのは、筋肉内、静脈内、動脈内、病巣内、皮下の経路や、疾患の予防または治療に十分な用量を提供するのに十分な他の任意の経路である。iPS細胞は、哺乳動物に、単回用量または多回用量で投与することができる。多回用量を投与するとき、投与と投与の間を離して例えば1週間、または1ヶ月、または1年、または10年にすることができる。細胞をさらに特定のタイプの細胞に向かわせるため、その細胞を投与する前、または投与中、投与した後に、1つ以上の増殖因子、ホルモン、インターロイキン、サイトカインや、他の細胞を投与することもできる。
【００９１】
本発明の方法を利用して得られたiPS細胞は、メニンの量および／または活性が低下している点で独自である。したがって本発明のさらに別の1つの側面は、本発明の任意の方法に従って調製されたiPS細胞の集団であり、このiPS細胞の集団では、メニンの量および／または活性が、メニン抑制剤を用いて処理されていないiPS細胞と比べて低下している。
【００９２】
本発明のiPS細胞を分化のインビトロモデルとして用い、例えば初期発生の調節に関与する遺伝子を研究することができる。再プログラムされた細胞を用いて生成させた分化した細胞、組織、臓器を用いて薬の効果を研究すること、および／または有用である可能性のある医薬を同定することができる。一般に、本発明のiPS細胞は、上記の任意の治療法で用いることができる。
【００９３】
本明細書に開示されている再プログラミング法を利用してiPS細胞を多彩な動物種について作製することができる。作製されたiPS細胞は、望む動物の作製に役立つ可能性がある。動物に含まれるのは、例えば鳥類と哺乳動物のほか、絶滅危惧種の動物である。代表的なトリに含まれるのは、飼いならされたトリ（例えばニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ）である。代表的な哺乳動物に含まれるのは、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類である。これらのうちで好ましいメンバーに含まれるのは、飼いならされた動物、例えばウシ、ブタ、ウマ、雌牛、ウサギ、モルモット、ヒツジ、ヤギである。しかし好ましい細胞は、本発明の方法で使用されるヒト細胞である。
【００９４】
したがって本発明のさらに別の1つの側面により、分化した細胞の集団を調製する方法として、（i）本発明の第1の側面の方法に従ってiPS細胞の集団を調製し、（ii）1つのプロトコルまたは因子を用いてそのiPS細胞を分化させて分化した細胞の集団を形成することを含む方法が提供される。細胞を再プログラミングする方法とその有用性は上に示してある。
【００９５】
本発明のさらに別の1つの側面により、本発明の第1の側面の方法に従って調製されたiPS細胞の集団が提供される。本発明の一実施態様では、本発明によるiPS細胞の集団は、メニンの量および／または活性が低下している。本発明の別の一実施態様では、本発明によるiPS細胞の集団は、本発明の発明者が同定した以下の再プログラミング障害因子のうちのほんはの1つ以上の量および／または活性が低下している：Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、Trp53。
【００９６】
本発明のさらに別の1つの側面により、メニンの発現、翻訳、活性のいずれかを抑制する1つ以上の薬剤を含む細胞培養培地が提供される。本発明による細胞培養培地は、Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、Trp53の発現、翻訳、活性のいずれかを抑制する1つ以上の薬剤も含むことができる。本発明のいくつかの実施態様では、細胞培養培地は、Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、Trp53の発現、翻訳、活性のいずれかを抑制する1つ以上の薬剤だけを含み、メニン抑制剤は含まない。
【００９７】
いくつかの実施態様では、本発明により、山中因子または山中誘導剤と、メニンの発現または活性を抑制する1つ以上の薬剤を含む細胞培養培地も提供される。別の一実施態様では、本発明により、山中因子または山中誘導剤と、メニン、Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、および／またはTrp53から選択される1つ以上の再プログラミング障害因子の発現または活性を抑制する1つ以上の薬剤を含む細胞培養培地が提供される。
【００９８】
本発明の別の1つの側面により、体細胞からiPS細胞への再プログラミングを増強するためのキットが提供される。本発明のこのキットは、体細胞からiPS細胞を生成させるのに用いる1つ以上の細胞培養培地を含んでいる。本発明によるキットに含まれる細胞培養培地は、メニン、Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、および／またはTrp53から選択される1つ以上の再プログラミング障害因子をコードするセンダイウイルスベクターを含むことが好ましい。より好ましいのは、キットに含まれる細胞培養培地が、山中因子をコードする1つ以上のセンダイウイルスベクターと、メニン、Socs3、Eif4e2、Apc、Setd2、Axin1、Cdk13、Psip1、Cabin、Fbxw7、Tcf7l1、Tlk2、Hira、Uba2、Ubr4、Sae1、Chaf1a、Asf1a、Dot1l、Pias1、Pten、Senp1、および／またはTrp53から選択される1つ以上の再プログラミング障害因子をコードする1つ以上のセンダイウイルスベクターを含むことである。本発明によるキットは、生成したiPS細胞を分化した細胞へと再分化させるための細胞培養培地をさらに含むことができる。再分化に使用する細胞培養培地は、ニューロンへと直接分化させる薬剤を含むことが好ましい。
【００９９】
「山中因子」という用語には、上記のあらゆる標準的な再プログラミング因子、例えばOct3/4、Sox2、Klf4、Myc、Nanog、Lin28が含まれる。
【０１００】
以下の実施例と図面によって本発明をさらに説明する。実施例は説明だけを目的としており、本発明の範囲を制限する意図はない。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】CRISPR/Cas9スクリーンで用いられるUMIの模式図。CRISPRスクリーンにおけるデータ分析は、通常は同じ遺伝子を標的とするいくつかのsgRNAに基づいている。分析される細胞の総数をはるかに超える複雑さでランダムなバーコードを導入すると、個々の細胞に独自の分子識別子（UMI）のタグが付くことになる。こうすることで、単一細胞のレベルで、真の生物学的レプリカを表わす第3層の情報が生成する。
【図２】単一細胞を追跡することによるCRISPRスクリーン分析の理論上の利点。（a）sgRNAライブラリを感染させて選択すると、感染した各細胞は、さまざまな編集結果を伴った娘細胞の細胞コロニーを生成させる。ここには、複数の独立な細胞に感染する1つのガイドだけを示してある。機能喪失型アレル（LOF）に至るホモ接合フレームシフトをべた塗りで示してあり、代わりの編集結果については、核だけに標識が付けられている。陰性選択によってLOF細胞が減少（depletion）する。（b）NGSによる従来のCRISPRスクリーン分析では、技術的制約（例えばガイドの効率、LOFの頻度）によって効果の生物学的要素がマスクされてsgRNAのリード（赤い線）の部分的減少しか検出されないため、可能な減少レベルが制限される。（c）希釈とクローン増殖を制限すると、感染した各細胞には独自のタグ（UMI）が付けられてクローン編集結果を表わすことになり、そのことによってLOFクローンは完全な陰性選択を示す。（d）NGSを用いた単一細胞に基づくCRISPR分析は、生物学的表現型に基づいてLOFクローンの減少をスコアにし、減少レベルは、クローンの減少中央値によって近似される。（e）ガイドの陽性選択は、大きな浸透率または強力な増殖に基づくことができる。（f）従来の分析とは異なり、CRISPR-UMI分析は効果の偶然性と大きさを識別することができる。
【図３】sgRNA予測のバイオインフォマティクスパイプライン。われわれのクローニング戦略に合致するすべてのエキソンsgRNAについて、予測されるsgRNA活性の指標としてDoenchスコアを計算した。Doenchスコアには、生物学的効果に関する規則セットに基づいてペナルティを課した。これらの規則は、エキソンの長さ、タンパク質ドメインの予測、選択的スプライシング、ATG開始コドン、Pol-II末端配列、CDS内のsgRNAの位置の評価を組み合わせたものである。ペナルティは、異なるエキソンにわたって選択されたsgRNAにも広がっており、オフターゲット予測は、予測されるオフターゲットのペナルティをsgRNAに課す。
【図４】ライブラリのクローニングとシークエンシングの戦略。（a）ライブラリを生成させるためのベクターの設計。独自の分子識別子（UMI）をレトロウイルス骨格に106通りの複雑さで並列にクローニングしてプールした後、チップで合成されたsgRNAプール（26514通りの複雑さ）をUMI含有骨格に1000超個のクローン／ガイドのカバー度でクローニングした。カセット隣接PacI部位によって小さなsgRNAを含有する断片を哺乳動物のゲノムDNAから放出させることができる。（b）ライブラリのサブプールとクローニングの複雑さによって全体の複雑さが8300万通りになった。（c）臭化エチジウム染色したアガロースゲル、200 ngのDNA/レーン；スクリーン後のゲノムDNAと、対照としてのプラスミドDNAを、八量体認識部位酵素PacIで消化させると、大半が大きなゲノム断片になるが、sgRNA断片は長さが589 bpである（矢印の先端）。磁性ビーズを用いて長い断片と短い断片を分画することができる。（d）（c）に示した分画に関するゲノムQ-PCR；短い標的領域は、分画2が4.1×103と豊富になる。エラー棒は標準偏差であり、示されているのは、3つの実験を代表する技術的トリプリケートの中の1つの実験である。（e）Illumina SR50 NGSシークエンシング戦略；特注のU6プライマーによる最初のリード、標準的なIlluminaプライマーによる両方のインデックスリード。（f）sgRNAライブラリの中のガイドは、少ないクローンと多いクローンの間で4倍の差があることを示している（10番目と90番目の百分位数）。リードは個々のサブプールの間で規格化した。
【図５】CRISPR-UMIライブラリの複雑さの生成を図解するスキーム。連続する2つの複合クローニング工程によってCRISPR-UMIライブラリを生成させる。最初に、10個のヌクレオチドからなるランダムなバーコードをベクター骨格に組み込む。その後、30,000個のsgRNA からなるsgRNAプールを、1000件超の連結イベント／sgRNAでバーコードライブラリに連結した。そうすることにより、その1000件超の連結イベント／sgRNAのそれぞれが、そのsgRNAを別のランダムなバーコードと組み合わせる。sgRNAとランダムなバーコードの組み合わせが、sgRNAの数の1000倍を超える複雑さを生じさせる。sgRNAとバーコードのこの非常に複雑な組み合わせをわれわれはUMI（独自の分子識別子）と呼ぶ。われわれのライブラリは、8300万通りの複雑さに達した（図4も参照されたい）。
【図６】UMIに基づくCRISPRスクリーン分析の最適な条件を特定するためのパイロットスクリーン。（a）スクリーンの構成：編集時、さまざまなクローン増殖計画とそれに続くクローン増殖とドロップアウト（脱落）スクリーニングを並列して実施した。Cas9の発現をDoxによって誘導し、ガイドRNAを有する細胞を探す選択をG418選択によって実施した。限界希釈と増殖が、実験において変化する。細胞をLD30が3.3 nMのエトポシドで、またはエトポシドなしで8日間処理した。（b）クローンの数とサイズの変動を示す図。（c）NGSデータから求めたクローンの数とサイズの平均値。（d）各計画のクローンに由来する単一細胞の分布を、Nhej1に対するguide_1について示してある。各クローンに関するp値はリードの深度と相関するが、データ点はより少なくなる。（e）各条件に関するドロップアウト中間値を示すプロットと、MAGeCKを利用して多数のクローンを組み合わせることによって求めたp値。信号対雑音比（SNR）は、35個のリードの148個のクローンにおいて最大であり、5個未満のクローンを持つことが予測されるガイドの割合は、出現の変動性が原因で52個または21個のクローンデータセットよりも0.06％少ない。
【図７】陰性選択スクリーンの単一細胞分析。（a）エトポシドに関する感受性変異を同定するための大規模スクリーンの構成の図解。Cas9の発現をDoxによって誘導し、ガイドRNAを有する細胞を探す選択をG418選択によって実施した。（b）従来のCRISPR 分析のボルカノプロット；x軸は、対照に対するsgRNAの比、y軸は二項p値。（c）クローンに由来する単一細胞のボルカノプロット（CRISPR-UMI分析）。軸は（a）と同じである。各ガイドの減少中央値を点線で示してある。（d）減少するsgRNAの従来の分析。下に議論する4 sgRNA/遺伝子を同じ色で強調してある。（d）同じsgRNAのCRISPR-UMI分析。p値は、集団内の個々のクローンのMAGeCKスコアに基づく。（d）と（e）については、対照と比較した減少レベルと信号対雑音比が下に示されている。
【図８】従来の分析の性能とCRISPR-UMIの比較。（a）ガイドのレベルについて、従来の分析と単一細胞に基づく分析を比較。外れ値を除去する前（◆）と後（×）の違いを強調してある。（b）違いがあったクローンについて、処理なしの対照に対する相対量（x軸）と、クローンごとの全リード（y軸）の関係は、強力な外れ値クローンが全リード空間を支配していることを示している。減少したクローンはプロットの左側に位置する。（c）上位50/100ヒットの中に入るNHEJ複合体の陽性対照（Lig4、Xrcc4〜6、Nhej1）を標的とするsgRNAの数を示すベン図。（d）sgRNAのランクの関数としての、同じ遺伝子を標的とするガイドの平均数。CRISPR-UMIは、ヒットの範囲全体で遺伝子当たりのガイドの再現性／数がより大きい。（e）従来の分析とCRISPR-UMIに基づいて上位にランクされる遺伝子。ヒットのランキングは偽の陽性コールと陰性コールが回避されているため、CRISPR-UMIでより強い減少を示す。（f）3日間にわたる10 nMのエトポシド処理（5 nMで前処理）によって選択されたヒットのクローン検証。Lig4、Zfp451、Rad9a、Erbb4の中の機能喪失型ホモ接合変異は、エトポシドに対して感受性であることを示している。遺伝子1個当たり4個のクローン（Trim71とRac1については2個のクローン）。それぞれ3個の技術的レプリケート。エラー棒はSEM；分散不均一な両側t検定を適用した。p＜0.01＝***、p ＜0.01＝**、p＜0.05＝*、p＞0.05＝有意ではない。サンプル数は、Lig4、Zfp451、Slc25a4、Adcy3、Rad9a、Erbb4、なし、野生型については12個であり、 Rac1とTrim71については6個である。（g）CRISPR-UMIによって同定された全遺伝子の視覚的まとめ。Zfp451以外の全遺伝子が、DNA損傷に対する反応または修復に関与していることが以前にわかっており、例えば、（1）トポイソメラーゼIIが絡み合った染色体の解決に関与、または（2）NHEJに関与、または（3）おそらく短い相同性に基づく末端接合に関与、または（4）DNAの損傷に反応したSUMO化に関与していた（Srivastava, M.他、Cell第151巻、1474〜1487ページ（2012年）；Kurosawa, A. 他、PLoS ONE 第8巻、e72253ページ（2013年）；Fattah, F. J. 他、DNA Repair (Amst.) 第15巻、39〜53ページ（2014年）；Jackson, S. P. とBartek, J. Nature第461巻、1071〜1078ページ（2009年）；Black他、Genes (Basel) 第7巻、67ページ（2016年）；Takata他、Nat Commun第4巻、2338ページ（2013年）；Gilmore-Hebert, M.、Ramabhadran, R.、Stern, D. F. Mol. Cancer Res. 第8巻、1388〜1398ページ（2010年）；Icli, B.、Bharti, A.、Pentassuglia, L.、Peng, X.、Sawyer, D. B. Biochem. Biophys. Res. Commun. 第418巻、116〜121ページ（2012年）；Smilenov, L. B. 他、Cancer Res. 第65巻、933〜938ページ（2005年）；Koidl, S. 他、The International Journal of Biochemistry & Cell Biology第79巻、478〜487ページ（2016年）；Guzzo, C. M. 他、Sci Signal第5巻、ra88〜ra88ページ（2012年）；Kont, Y. S. 他、DNA Repair (Amst.) 第43巻、38〜47ページ（2016年）；Katsube, T. 他、J. Radiat. Res. 第52巻、415〜424ページ（2011年）； Pommier, Y. 他、DNA Repair (Amst.) 第19巻、114〜129ページ（2014年））。
【図９】単一細胞に由来するクローンのリードの分布。（a）従来の分析とCRISPR-UMI分析によって同定されたヒットで強い外れ値クローンは検出されない。（b）リードのカウント数が非常に多い強い外れ値クローンのほか、減少が、従来の分析によって呼び出される偽陽性ヒットに見られる。（c）CRISPR-UMIにおいてだけ同定された遺伝子は、多くの独立なクローンで中程度だが再現可能な減少を示すが、減少していないリードカウントの大きなクローンが優勢であることがしばしばある。
【図１０】クローン増殖なしのプールされたドロップアウトスクリーンも、偽陽性コールになる外れ値を示す。（a）クローンの希釈と増殖なしでのガイドのレベルに関するCRISPR-UMI分析と従来のスクリーン分析の比較から、強く相関する結果（黄色）のほか、両方の計画での違い（さまざまな色、ピアソン相関：0.729）がわかる。（b）相関しているsgRNAは、全リードカウントに基づく強い外れ値クローンを含まないが、従来の分析でだけ呼び出されるガイドは、全体的ドロップアウトに責任がある外れ値クローンを示す。（c）sgRNAのランキングは、データセットから外れ値クローン（リードカウントによる上位3つのクローン）を除去すると改善される。これはそれら外れ値クローンの交絡効果を示している。
【図１１】再プログラミングの障害を探すための、陽性選択スクリーンの単一細胞分析。（a）実験構成の模式図。ColA遺伝子座にT3G-OKMSを持ち、ROSA遺伝子座にrtTAを持ち、Oct4遺伝子座にGFPのノッキングを持つマウス胚性線維芽細胞に、Cas9をコードするレンチウイルスを感染させた後、sgRNAを送達するレンチウイルスライブラリを感染させた。Doxを投与することによって7日間にわたって再プログラミングを誘導し、11日目にGFP陽性iPS細胞をFACSによって精製した。UMIによって個々のiPSコロニーを評価する。（b）散布図は、存在量（abundance）（全リードのカウント数）に基づく個々のsgRNAの富化をy軸に、発生数（独立なコロニーの数）に基づく個々のsgRNAの富化をx軸に示している。両方の軸を、処理なしのMEF集団におけるsgRNAのリードの合計数（存在量）に規格化する。4つの実験のsgRNAの富化の中央値が示されている。（c）6ウエル形式で単一sgRNAをトリプリケートで検証。読み出しは、GFP陽性細胞の割合を測定するフローサイトメトリーによって実施した。検証は4つのバッチで実施したが、各バッチはわずかに異なる効率を示すため、対照に規格化する。Ube2iをノックダウンすると、低用量のOKSMで再プログラミングが100倍超改善される。エラー棒は標準偏差である。（d）6ウエルでの10日目のアルカリホスファターゼ染色は、トランスジェニック系でMen1またはPias1を標的にすると再プログラミングが増強されることを示している。（e）独自のバーコード-ガイドの組み合わせについて、規格化して中央値を基準にした存在量を用いて調べたコロニーのサイズの箱ひげ図から、1個の遺伝子を標的とするすべてのガイドで似た分布になることが明らかになった。これは、再プログラミングがより速いこと、またはiPSコロニーの増殖がより速いことが理由でコロニーのサイズが大きくなったことを示している。（f）検証実験においてDoxで誘導してから10日目に染色してアルカリホスファターゼ活性を調べた代表的なコロニーから、コロニーのサイズ予測が確認される。
【図１２】NGSデータのUMI分析によるコロニーの予想サイズ分布。（a）トランスジェニック系でDoxを用いて誘導してから10日後の6ウエルの皿におけるアルカリホスファターゼ染色であり、Men1またはPias1を標的とするガイドでiPSコロニー形成が増強されていることを示している。（b）各sgRNAに関するUMI当たりのリードカウントのサイズ中央値の分布。各UMIに関するリードをシークエンシングエラーに関してフィルタし、コロニーサイズ中央値を、同定された再プログラミングの障害のすべてではなくて多くにおいてiPSコロニー当たりのサイズ増加が顕著なサイズ中央値に対してプロットする。（c）図8fと比較するため、検証実験においてDoxの10日後にアルカリホスファターゼで染色した代表的なコロニー。
【図１３】再プログラムされたiPS細胞のアルカリホスファターゼ（AP）染色。APはiPS細胞コロニーを濃い青色に染色する（矢印の先端）のに対し、線維芽細胞は、染色されないか、染色された線維芽細胞として現われない（＊印）。shメニン（サンプル9と10）またはsgメニン（サンプル19と20）による再プログラミング。対照をサンプル21と22に示してある。
【図１４】ESCからiNへの分化。メニンのノックアウトありとなしのAscl1細胞系とNgn2細胞系に由来するiNの平均数が（a）に示されている。箱ひげ図（b）と（c）は、確認されたホモ接合メニンノックアウトを有する2つのクローンと、メニンノックアウトなしの対応する親細胞系からのデータを示している。3つの独立な実験でFACSを利用してカウントした細胞数がプロットされている。N＝3、エラー棒＝標準偏差。
【図１５】MEFからiNへの分化転換。（a）と（b）：メニンのノックアウトありとなしの細胞の画像。（c）のプロットは、メニンノックアウト後のAscl1細胞系から得られたiNの数と空のガイド対照の差を示している。N＝3、エラー棒＝標準偏差。
【実施例】
【０１０２】
実施例1：ガイドの選択
マウス核遺伝子を標的とするほか、投薬されたオルソログと、遺伝子1個当たり4個のsgRNA（投薬した遺伝子のサブセットに関しては遺伝子1個当たり5個のsgRNA）となるように手作業で選択した遺伝子セットを標的とするsgRNAを、バイオインフォマティクスパイプラインによって選択した。ガイド効率と、遺伝子構造に起因する生物学的効果の両方を考慮したガイド選択アルゴリズムを設計することを目指した。ガイドの選択基礎は、Doenchら（Nature Biotechnology 第32巻、1262〜1267ページ（2014年））によって記載されている活性スコアである。それに加え、考慮する各ガイドとエキソンの特性を同定し、それに応じたペナルティをDoenchスコアに課した。マウスゲノムmm10の中のすべてのエキソンPAM部位を同定した（Rosenbloom他。The UCSC Genome Browserデータベース：2015年更新。Nucleic Acids Res. 第43巻、D670〜681ページ（2015年））。われわれのクローニング戦略（GAAGAC、GTCTCC、CTCGAG、CGTCTC、GAGACGのいずれかを含有し、AAGACから始まるか、CTCGAで終わる）に合致しないsgRNAを除外した。次に、可能性のあるすべてのsgRNAについてDoenchスコアを計算した。LOF表現型につながる可能性が最も大きいsgRNAを選択することを目的としたヒューリスティックな規則に基づいてDoenchスコアにペナルティを課した（正確なペナルティスコアは図3に見いだすことができる）。これらの規則には、エキソンの特性（例えばPfamデータベース（Finn他、Nucleic Acids Res. 第44巻、D279〜285ページ（2016年））に注釈されているタンパク質ドメインの存在または不在）、エキソンのサイズ、エキソンの長さが3 bpの倍数であるかどうかが含まれる。次に、多くのエキソンにsgRNAを広げ、各エキソンでDoenchスコアが最良のsgRNAだけがペナルティを課されないようにするため、エキソンの分布に関するペナルティを設けた。スコアがより優れた別のsgRNAから4 nt未満しか離れていないsgRNAも回避した。さらに、可能性のある代わりのATG開始コドンの上流でDNAを切断するsgRNAと、遺伝子座からの注釈付きのすべての転写産物に共通しているのではないエキソンの中に切り込むsgRNAにペナルティを課した。一列に並んだ4個以上のTはPol-IIIターミネータとして作用すると考えられるため、それを含有するsgRNAは回避した。sgRNAから転写開始位置までの距離に基づいて距離-ペナルティを1〜0.5の範囲で計算した。次に、PAM部位を含有するすべてのエキソン配列に対する単純なオフターゲット予測を計算した（図3）。オフターゲット予測スコアは、sgRNA配列の中の位置によってミスマッチの重みを付ける。オフターゲット分析を含むペナルティ付きDoenchスコアを再度ランク付けし、遺伝子1個当たり上位4個のsgRNA（投薬可能な遺伝子（Druggable genes）については上位5個のsgRNA）を取り上げ、チップ上でオリゴを合成した（CustomArray Inc.社）。陰性対照ガイドについては、公開されているヒト対照ガイドのリスト（Wang他、Science第343巻、80〜84ページ（2014年））を用い、マウスゲノムと完全に一致するすべてのガイドを除去した。全部で112の対照ガイドを、6560個の遺伝子を標的とするわれわれのマウスライブラリに含めた。
【０１０３】
実施例2：ライブラリのクローニング
増幅のためのプライマー結合部位と、Illumina i7プライマー結合部位をクローニングするための制限部位EcoRIおよびMfeIと、その後に続く10 bpのランダムなヌクレオチド配列と、Illumina P7アダプタが隣接しているgBlock（IDT社）を注文した（NNNNNNNNgtc
ctcatctgagagctactcatcaacggtATCTCGTATGCCGTCTTaTGCTTGTTAATTAAGAATTCctggacga、配列ID番号1）（注：ライブラリをクローニングするため、P7アダプタ配列の中のCをAと交換してアダプタ内のBbS-I制限部位を除去したが、NGSの前にDNAサンプルを調製するときPCRの間にCを再導入した）。gBlockをEcoRI（NEB社 R3101L）とMfeI（NEB社 R3589L）で消化させ、カラム（Qiagen社 27106）で精製し、エタノールを用いて沈降させた。ベクター骨格（図4a参照）をXbaI（NEB社 R0145L）とMfeI（NEB社 R3589L）で消化させ、rSAP（NEB社 M0371L）を用いて脱リン酸化し、EcoRI制限部位を含有する1.5 kbのスタッファ（stuffer）を切除し、ベクター骨格の断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、ゲル抽出し（QIAGEN社 28704）、エタノールを用いて沈降させた。2μgのベクターを125 ngのプラスミドとモル比V：I＝1：3で連結させ、2μlのT4 DNAリガーゼ（NEB社 M0202M）を含む200μl の全体積を20μlずつの10個の反応物に分割した。連結産物をカラム（Qiagen社 27106）で精製し、0.2 cmのキュベット2.5 kV（BioRad社、Gene Pulser II）内の80μl のエレクトロコンピテントXL-1 Blueセル（Agilent社 200249）の中に電気穿孔した。コロニーのカウント数に基づいて電気穿孔の複雑さを評価すると100万通りであった。第2のライブラリクローニング工程では、複雑なバーコードを含有するベクターにsgRNAをクローニングした。このベクターをBbsI（NEB社 R0539LまたはFermentas社 ER1011）を用いて消化させ、XhoI結合部位を含有するスタッファを切除し、rSAP（NEB社 M0371L）を用いて脱リン酸化し、アガロースゲル電気泳動で直線状の断片を単離し、エタノールで沈降させた。sgRNAをチップ（Custom Array Inc.社）の表面に並べ、特異的隣接プライマーを用いてオリゴのサブセットを10サイクルのPCRで増幅した。PCR産物をカラム（Qiagen社 27106）で精製し、BbsI（NEB社 R0539LまたはFermentas社 ER1011）を用いて一晩消化させた。50μlの反応体積の中の0.25μlのT4 DNAリガーゼ（NEB社 M0202M）と1μlのBbsI（NEB社 R0539LまたはFermentas社 ER1011）を用いてベクターとインサートをゴールデンゲート反応で連結させた。この反応を20回（5分間37℃、5分間16℃、20回）繰り返した後、50℃で10分間にわたって不活化した。プラスミドをカラム（Qiagen社 27106）で精製し、エタノールで沈降させ、エレクトロコンピテントXL-1 Blueセル（Agilent社 200249）の中に電気穿孔した。電気穿孔されたXL-1 Blueセルを2 mlの回収希釈液の中に回収し、37℃、200 rpmで40分間にわたってインキュベートし、細胞を、100μg/mlのアンピシリン（Thermo社 166508）を含有する2枚の245×245 mmの正方形LB寒天プレートに播種し、37℃で10時間インキュベートした。細菌をプレートから回収し、2lの100μg/ml LB-Amp（Sigma社 A9518）の中でOD 2.0になるまで2〜4時間増殖させた。プラスミドDNAを製造者が勧めるようにして調製した（Macherey-Nagel NucleoBond Xtra Maxi Kit）。
【０１０４】
実施例3：ES細胞の培養
AN3-12と呼ばれるHMSc2の誘導体に由来するマウス胚性幹細胞クローンをドキシサイクリン誘導性Cas9（T3G-Cas9-IRES-mcherry PGK-GFP-rtTA）とともにこの研究で使用した。以下のES細胞培地（ESCM）を使用した：450 mlのDMEM（Sigma社 D1152）；75 mlのFCS（Invitrogen社）；5.5 mlのP/S（Sigma社 P0781）；5.5 mlのNEAA（Sigma社 M7145）；5.5 mlのLGlu（Sigma社 G7513）；5.5 mlのNaPyr（Sigma社 S8636）；0.55 mlのβ-メルカプトエタノール（Merck社 805740；1000×ストックのため、2.85 mlのPBSの中に希釈した10μlのbME）、7.5μlのLIF（IMBA-MolBioService；2 mg/ml）。細胞培養グレードの皿は、Greiner社（Greiner 15 cm 639160）とNUNC社（他のあらゆる形式、例えば10 cmの皿NunclonΔSurface、カタログ番号150350；6-ウエルのNunclonΔSurface、カタログ番号140675）からのものであった。細胞をトリプシンで処理し、2日ごとに再播種し、FCS：ESCM：DMSO＝4.5：4.5：1の中で凍結させた。細胞のマイコプラズマを2週間ごとに調べた。エトポシド処理：培地に3.3 nMのエトポシドを毎日補足し、8日目に処理するためのLD30用量（Sigma社 E2600000）には、PBS-10％EtOHに溶かした1000×エトポシドストックを使用した。ドキシサイクリンで処理するため、培地に1μg/ml（Sigma社）を補足した。細胞のマイコプラズマ汚染を2週間ごとに調べる。
【０１０５】
実施例4：ウイルスベクターとES細胞感染
レトロウイルスライブラリを生成させるため、ネオマイシン耐性カセットを有するバーコード付きCRISPRライブラリウイルスをPlatinumE細胞（Cell Biolabs社）の中に、製造者が勧めるようにして包み込んだ。ウイルスを含有する上清を-80℃で凍結させた。3億個のES細胞にウイルス含有上清の1：10希釈液を2μg/mlのポリブレン（Sigma社 TR1003）の存在下にて24時間にわたって感染させた。感染の24時間後、感染した細胞を探す選択を、0.5 mg/mlのG418（Gibco社）を用いて開始した。感染の多重性を評価するため、10,000個の細胞を15 cmの皿の上に播種し、G418を用いて選択した。比較のため、1000個の細胞を播種したが、G418に曝露する選択は実施しなかった。10日目、コロニーをカウントした。選択の24時間後に細胞を分割し、4.8億個の細胞を60枚の15 cmの皿（Greiner 639160）に播種した。その後、編集とスクリーニングの間はそれらの細胞を最少で3億個の細胞数に維持する。
【０１０６】
実施例5：iPS細胞のスクリーンと検証
Col1a1::tetOP-OKSMアレルとOct4-GFPアレルとRosa26 M2rtTAアレルを含有するか、Oct4-GFPだけを含有するマウス胚性線維芽細胞をE13.5胚（Stadtfeld他、Nature Methods 第7巻、53〜55ページ（2010年））から回収した。iPS細胞は、15％FBSと、100 U/mlのペニシリンと、100μg/mlのストレプトマイシンと、ピルビン酸ナトリウム（1 mM）と、L-グルタミン（4 mM）と、1,000 U/mlのLIFと、0.1 mMのβ-メルカプトエタノールと、50μg/mlのアスコルビン酸を補足したDMEMを37℃、5％CO2、4.5％O2にして誘導した。MEFに、Cas9を送達するレンチウイルスベクターを感染させ、ブラスチシジン耐性に関して3日間にわたって選択した後、sgRNAライブラリを感染させた。MEFを0.5 mg/mlのG418で3日間処理し、0.25 mg/mlのG418でさらに3日間処理した。iPSの誘導に関しては、MEFを15 cmの皿1枚につき500,000細胞の密度で播種し、ドキシサイクリン（1μg/ml）を用いて7日間にわたって誘導した。無ドキシサイクリン培地の中でさらに4日間継代させた後、FACSAriaIII（BD Bioscience社）を用いてOct4-GFPを発現している細胞を各レプリケートから選別した。すべての検証実験を、6ウエルの皿の中で20,000個のMEF（Doxで誘導）または40,000個の細胞（OKSM感染）から出発してトリプリケートにて実施した。一次再プログラミングは、OKSM因子とピューロマイシン耐性を有するレンチウイルスベクターを感染させ、ピューロマイシン耐性に関して3日間にわたって選択することによって実施した。FACS BD LSR Fortessa（BD Bioscience社）を用いてOct4の発現を定量し、FlowJoを用いてデータを分析した。細胞のマイコプラズマ汚染を2週間ごとに調べた。
【０１０７】
実施例6：エトポシド超感受性の検証
ヒットを検証するため、ドキシサイクリン（T3G-Cas9-IRES-mcherry PGK-GFP-rtTA）の制御下でCas9を発現するマウス胚性幹細胞を使用した。遺伝子Lig4、Zfp451、Slc25a4、Adcy3、Rad9a、Erbb4に関する4つのノックアウトクローンと、遺伝子Trim71、Rac1に関する2つのノックアウトクローンを作製し（sgRNAと、遺伝子型解析のためのPCRプライマー）、すべてのクローンをトリプリケートで調べた。細胞を5 nMのエトポシド（Sigma社 E2600000）で7日間にわたって前処理した後、10 nMのエトポシドを用いた選択から3日以内の細胞生存率（処理あり／対照）の低下を測定した。生存率は、Alamar Blue染色（DAL1100 Thermo Fisher社）を製造者が勧めるにようにして実施して測定した。
【０１０８】
実施例7：DNAの回収とNGSサンプルの調製
プールされたCRISPRスクリーンの読み出しは、組み込まれたsgRNAカセットの正確なPCR増幅に依存する。しかしゲノムDNA調製物の中でsgRNAカセットは全DNAのほんの約0.1 ppmしか占めていない。われわれのsgRNAカセットにPac-I部位を隣接させることによってこの比を3〜4桁改善し（図4）、消化されたゲノムDNAを用いてサイズ選択沈降を実施した。詳細には：選択の8日後、SDS溶解バッファー（10 mMのトリスpH 8、1％SDS、10 mMのEDTA、100 mMのNaCl）＋1 mg/mlのプロテイナーゼK（Sigma社 P4032）＋RNアーゼA（Qiagen社）を用いて条件ごとに1.7億個の細胞を溶解させた。ゲノムDNAをフェノール抽出によって精製し、イソプロパノールを用いて沈降させた。サンプルをPacI（NEB社 R0547L）で消化させた。Speed Beads（GE45152105050250 Sigma Aldrich社）を製造者が勧めるようにして用いてサイズ選択沈降を実施した。200回の個別の50μlのPCR反応において各サンプルをPCRで増幅した。そのとき用いたのは、プライマー（AATGAT
ACGGCGACCACCGAGATCTACAC-NNNNNN-CGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC、配列ID番号2）（6 bpが、NGSシークエンシングの後にサンプルを脱多重化するのに用いられる特別な実験インデックスである）と、プライマー（CAAGCAGAAGACGGCATACGAG
ATACCGTTGATGAGTAG、配列ID番号3）である。qPCR分析では、GoTaq（登録商標）qPCR Masterミックス（A6001 Promega社）プライマー（AATGATACGGCGACCACCGAGA
TCTACACGAGTGGCGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTC、配列ID番号4）と（CAAGCA
GAAGACGGCATACGAGATACCGTTGATGAGTAG、配列ID番号5）を、CRISPR-UMIカセットを有する589 bpのPac-I断片上の579 bpのアンプリコンを検出するために用い、プライマー（GCCTTTAAGCCAATGCTAGCTG、配列ID番号6）と（GTAAATGGACAGAGG
GTGTTTAACC、配列ID番号7）を、7710 bpのPac-I断片上に582 bpのアンプリコンを有する対照として用いた。PCRサンプルをカラム（Qiagen社 27106）で精製し、プールし、アガロースゲル電気泳動を利用してサイズを分離した。600 bpのバンドを切除し、ミニ溶離カラム（Qiagen社 28204）で精製した。Illumina HiSeq2500を用い、このサンプルを単一リード50二重インデクシングシークエンシングランでシークエンシングした。10倍に濃縮した特注リードプライマー（CGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAA
ACACCG、配列ID番号8）を用いてsgRNA配列をシークエンシングした。分析には、インデックス1（バーコード）のための少なくとも10 bpと、インデックス2（実験インデックス）のための6 bpを取得する必要がある。
【０１０９】
実施例8：データ分析
データを分析するため、bowtieと、samtoolsと、fastx- toolkitと、特注のスクリプトを用いて、sgRNAと、独自の分子識別子配列と、実験インデックスを、すべてのリードに割り当てた。ライブラリの中にあるガイドについて（図4f）、個々の実験インデックスを用いてライブラリのサブプールをシークエンシングし、各サブプールの中のリードをすべてのサブプールのガイドリード中央値に規格化した。
【０１１０】
従来のCRISPRデータを分析するため（図7b〜図7d、図6d、図9a〜図9c、図10b）、式（1）を用いてガイドまたはクローンの減少または富化を計算した後、ガイドに関するリードが存在しない場合には、擬似カウントとして0.5を付加した。p値は、式（2）を用い、累積二項分布関数（scipy.stats 0.19.0）を利用して計算した。減少（x軸）とpcdf（y軸）をボルカノプロットでプロットした。
【数１】
2020537522.tif 000002
d：ガイドまたはクローンの減少
RPM：そのガイドまたはクローン100万個当たりのリード
【数２】
2020537522.tif 000003
pcdf：p値累積二項分布関数
x：実験におけるガイドまたはクローンのリード
n：実験における全リード
p：確率（対照の中のガイドまたはクローンのリード／対照の全リード）
【０１１１】
クローンCRISPR-UMI分析のため（図7e、図6e）、「ボルカノ様」プロットを生成させた。（処理ありと対照を組み合わせた中に）合計で少なくとも3個のリードを含有するクローンと、少なくとも5個のクローンを有するガイドを考慮した。実験におけるランダムなバーコードのシークエンシングのエラーを説明するため、特注のスクリプトを用いた1倍リードカウントと3倍リードカウントの編集距離に差があると仮定して、近接性に基づくバーコード崩壊を使用した。クローンレベルに関するデータをガイドレベルに関するデータと組み合わせるため、クローンの減少中央値を、負のMAGeCKスコア（sgRNAの減少に関してMAGeCK0.5.5（Li他、Genome Biol. 第15巻、554ページ（2014年））を用いて計算されたスコア）に対してプロットした。MAGeCKを用いてn個のガイドに基づく遺伝子の減少スコアを計算する代わりに、それを用い、n個のクローンに基づくガイドの減少スコアを計算した。減少中央値（x軸）を負のMAGeCKスコア（y軸）に対してプロットすると、「ボルカノ様」プロットが得られる。
【０１１２】
ガイドレベルに関して従来の分析とCRISPR-UMI分析の性能を比較するため（図8aと図10a）、従来の分析では減少とp値の両方によってガイドをランク付けし、CRISPR-UMI分析では減少中央値と負のMAGeCKスコアによってガイドをランク付けした後、式（3）を用いて組み合わせガイドスコアを生成させた。
【数３】
2020537522.tif 000004
GS：ガイドスコア - 組み合わせスコア、ガイドの評価
ランク減少：減少によるガイドのランク（従来の分析）、
減少中央値によるガイドのランク（CRISPR-UMI分析）
ランクp値：p値によるガイドのランク（従来の分析）、
負のMAGeCKスコアによるガイドのランク（CRISPR-UMI分析）
N全ガイド：分析に含まれる全ガイド
【０１１３】
遺伝子をランク付けるため（図3e）、p値を組み合わせるフィッシャーの方法を利用して、従来の分析に関してはMAGeCKを用い、CRISPR-UMI分析に関しては組み合わせガイドスコア（GS）を用いた。p値が最も小さい上位5個の遺伝子については、数値制限が理由でフィッシャーの方法を適用できなかったため、式（4）を用いてp値を組み合わせることによってそれら5個の遺伝子を選別した。
【数４】
2020537522.tif 000005
P遺伝子：遺伝子のスコア
GSi：ガイドiのガイドスコア
n：その遺伝子に関するガイドの数
【０１１４】
スクリーンの信号対雑音比を計算するため（図3d、図3e、補足図3e）、ガイドの信号を、ボルカノプロットの原点からの距離と定義した。これは、減少（x軸）と有意差（y軸）の両方で雑音から分離することを考慮している。ボルカノプロットでは、x軸は、処理された対照全体に対するガイドリード（CRISPR-UMIについては多数のクローンの中央値）の比であり、y軸は、従来の分析では二項分布によって求まるp値の負の対数であり、CRISPR-UMI分析ではガイド1個当たりの複数のクローンに関するMAGeCKによって決まる負のスコアである。x軸上での距離は、実験において減少が最大であったガイドに規格化した。y軸上の距離は、有意性スコアが最良であるガイドに規格化した。信号は、式（5）を用いて計算した原点からのx規格化距離とy規格化距離の対角線の距離である。信号対雑音比は、式（6）を用いて計算される。
【数５】
2020537522.tif 000006
Si：ガイドiの信号
di：ガイドiの減少（従来の分析）、
ガイドiに関するクローンの減少中央値（CRISPR-UMI分析）
d最小：比較における減少が最大のガイドの減少（従来の分析）、
比較における全ガイドの最低の減少中央値（CRISPR-UMI分析）
pi：ガイドiの減少に関するp値（従来の分析）、
ガイドiの負のMAGeCKスコア（CRISPR-UMI分析）
p最小：比較における全ガイドの最低p値（従来の分析）、
比較における全ガイドの最低の負のMAGeCKスコア（CRISPR-UMI分析）
【数６】
2020537522.tif 000007
SNR：信号対雑音比
【数７】
2020537522.tif 000008
σ対照：全対照ガイドからの信号の標準偏差
【０１１５】
減少（NHEJ/対照）と名づけた値を用いてCRISPR-UMIと従来のスクリーンを評価した（図7dと図7e）。これは、NHEJ経路の遺伝子（Lig4、Nhej1、Xrcc4〜6）に対する全ガイドの倍数変化の幾何平均と、標的を持たない対照ガイドの倍数変化の幾何平均の比である。
【０１１６】
異なるスクリーニング法と分析法の効率を評価するため（図8d）、式（3）を利用して計算したガイドスコアGSによってガイドのランキングを評価した。上位のガイドのリストを1から100まで拡張し（x軸）、上位のガイドの中で遺伝子1個当たりに存在しているガイドの平均数（y軸）を求める。例えば上位30個のガイド（x軸）の中に15個の異なる遺伝子に対するガイドが存在している場合には、遺伝子1個当たり平均で2個（y軸）のガイドが存在する。
【０１１７】
MEFからiPSCへの再プログラミングの陽性選択スクリーンの発生数と存在量の関係を分析するため（図11b）、個々のUMIすべてについてリードカウントを求めた。同じガイドに属するすべてのUMIに関するリードカウントを足し合わせ、各ガイドの存在量の指標とした。iPSCコロニーであるための閾値基準（少なくとも10リード）を満たすガイド1個当たりの独立なUMIの数は、発生数の指標である。ガイドに関する存在量または発生数の富化は、開始時のMEF集団の中のガイドの存在量に規格化する。示されている各データ点は、4つの生物学的レプリカの中央値である。
【０１１８】
iPSCのコロニーのサイズを推定するため（図11eと図12）、全UMIに関するリードカウントを求め、処理した8つのレプリケートと処理なしの4つのレプリケートについて、ライブラリのサイズによって比率を決めた。ハミング距離が1のUMIバーコードを崩壊させると、UMIツールを用いたUMIシークエンシングのエラーが説明された（Smith他、Genome Res. 第27巻、491〜499ページ（2017年））。リードカウントが5個以上のUMIを保持することにより、カウント数が少ないUMIをフィルタした。最高位のガイド-UMIの組み合わせから出発し、ガイド1個につき90％の累積率になるまでの全UMIを含めた。規格化したUMIのカウント数を各サンプルのUMIカウント数の中央値で割り、処理した8つのレプリケートからの値をプールし、対数変換し、それを用いて各ガイドの実験的中央値に対する存在量の推定値の分布を視覚化した。
【０１１９】
実施例9：統計的情報
図の説明に示されているように、すべてのエラー棒は、平均値の標準偏差または標準誤差である。実験の回数nがすべての実験に与えられている。従来のスクリーン分析とCRISPR-UMIスクリーン分析についての統計情報は、データ分析の項に記載されている。
【０１２０】
実施例10：単一細胞に基づくCRISPRスクリーニングのための枠組み
理論的には、CRISPRスクリーンの減少限界は、集団のレベルでだけ存在する。単一細胞のレベルでは、ある細胞はホモ接合LOFアレルを有するのに対し、別の細胞は、代わりの結果の任意の組み合わせを有する（Shalem他、Nat. Rev. Genet. 第16巻、299〜311ページ（2015年））。言い換えると、単一細胞レベルでの遺伝学は二項で考えられるが、集団レベルの遺伝学は、ガイド効率に応じてランク付けされる。個別の細胞を追跡するため、ランダムなバーコードを付加した。このバーコードは、sgRNAと合わさって「独自の分子識別子」（UMI）を生成させる（Kivioja, T. 他、Nature Methods第9巻、72〜74ページ（2011年））。そのためCRISPRスクリーニングの深度が大きくなる（図1）。限界希釈の後、単一細胞由来で遺伝子に印を付けたクローンを追跡することにより、プールされたCRISPRスクリーンの中の独立な生物学的レプリケートを評価する（図2c）。このアプローチにより、ホモ接合LOFアレルが完全に脱落しているクローンが、選択を生き延びる非LOFアレルを持つクローンから識別され（図2d）、したがってLOFアレルを非LOFアレルから識別しない従来の集団に基づくスクリーンで予想される減少限界（図2b）が克服される。重要なことだが、選択に対するLOFクローンの反応は生物学的効果の真の反映であり、もはや編集効率に隠されることない。スコア化のこの二項モードは、i）sdRNAが感染した細胞を別の細胞からランダムなバーコード/UMIを用いて識別できる場合と、ii）細胞集団に狭いボトルネックを通過させて最大で1個の細胞になるようにすることで、独立な各感染イベント（クローンと呼ぶ）について集団内で1つの編集結果が残るようにする場合（UMI）に影響を受ける可能性がある。各細胞イベントの追跡を可能にする独自の分子識別子の存在を強調するため、われわれはこの方法をCRISPR-UMIを呼ぶ。
【０１２１】
CRISPR-UMIは、LOFスクリーンに改善された解決法を提供することを超えて、集団の挙動の分析をすることも可能にする。例えば陽性選択の後のsgRNAの富化は、少数の単一細胞の大量増幅か、特定のsgRNAを有する集団内のすべての細胞のより穏やかな増幅から生じる可能性がある。しかしこのような確率的イベントの頻度をCRISPRスクリーン分析に基づいて従来の集団から導出することはできない。逆に、CRISPR-UMIによって集団の挙動の評価が可能になり、したがって効果の大きさと確率の定量が可能になる。したがってCRISPR-UMIは、スクリーニングの読み出しからより多くの情報内容を生成させる（図2e、図2f）。
【０１２２】
実施例12：ランダムなバーコードを利用した複雑なCRISPRライブラリの生成
われわれのCRISPR-UMIライブラリに関して最適なsgRNA効率、最少のオフターゲットのほか、標的に対して生じる可能性が大きい生物学的効果を保証するため、ゲノム内の可能なすべてのsgRNAについてDoenchスコア（Doench, J. G.他、Nature Biotechnology 第32巻、1262〜1267ページ（2014年））を予測した後、複数の追加パラメータ（オフターゲット予測、標的上転写産物内の位置、エキソンの構造、タンパク質コードドメインなど）に分けた（図3）。
【０１２３】
個別の細胞のクローンを追跡するため、CRISPR-UMIは非常に複雑なライブラリを生成させる必要がある。レトロウイルスベクターを作製し、並列クローニングによってランダムな10個のヌクレオチドからなるストレッチを導入した（1×106個の細菌コロニー、10 ntのUMIの複雑さの理論的最大値は410＝1.048×106通りに達する）後、ランダムなバーコードの存在をNGSによって確認した。その後、4 sgRNA/遺伝子である合計6560個の異なるマウス遺伝子（その中にすべての核遺伝子が含まれている）を標的とするsgRNAのいくつかのサブプールを、1個のsgRNA当たり954〜8776件の独立なクローニングイベントというカバー度でベクター-バーコード-ライブラリにクローニングした。標的を持たない112個の対照sgRNAのセットもライブラリに含めた（Wang他、Science 第343巻、80〜84ページ（2014年））（図4a、図4b、図5と、実施例1〜10の方法）。したがって各連結イベントで各sgRNAは異なるバーコードと組み合わされる。sgRNAとバーコードの組み合わせは、独自の分子識別子（UMI）となる。ライブラリ全体の複雑さは8350万通りに達する。これは1つのスクリーンにおいて調べられるクローニングの数を超えているため、その後のゲノムスクリーンにおいて個々の細胞を追跡することが可能になった。ゲノムスクリーンの後に処理する必要がある大量のゲノム材料に対処するため、ベクターを設計して、PCR増幅の前に、PacIエンドヌクレアーゼを用いた消化とその後のサイズ選択によってsgRNAが組み込まれたゲノムDNAを富化できるようにした（図4c、方法と1工程ずつのプロトコルを参照されたい）。この工程でPCR鋳型が103〜104倍と豊富になり（図4d）、そのことによって必要なPCR反応とサイクルの数が最少になり、したがってPCR増幅バイアスが最少になる。特定の配列ストレッチを組み込んだベクターを設計することにより、標準的なilluminaプライマーの直接使用することがさらに可能になる（図4e）。
【０１２４】
われわれのシークエンシング戦略をわれわれのライブラリのプラスミドDNAに適用してsgRNAとUMIを分析した。シークエンシングされた異なるUMIの数は、sgRNA 1個当たりにすると、得られた細菌コロニーの数に基づくクローニング深度の推定と相関していた。ライブラリの中の10番目と90番目の百分位の位置におけるガイドの量の相対差は4倍であり（図4f）、公開されている他のsgRNAライブラリとよく一致している（Koike-Yusa他、Nature Biotechnology第32巻、267〜273ページ（2013年）；Wang他、Science第343巻、80〜84ページ（2014年）；Hart, T. 他、Cell第163巻、1515〜1526ページ（2015年））。これらを合わせて考えると、核タンパク質のタンパク質コードドメインを主に標的とするライブラリであって、単一細胞に基づくCRISPRスクリーンを可能にするほど分布が均一で非常に複雑なUMIを有するものが生成した。
【０１２５】
実施例13：単一の細胞系譜を追跡すると、ドロップアウトCRISPRスクリーニングにおける信号対雑音比が改善される
CRISPR-UMIを試験するため、トポイソメラーゼIIの抑制を通じてDNA二本鎖を破断させる化学療法薬エトポシドに細胞を曝露した（Burden, D. A. 他、Journal of Biological Chemistry第271巻、29238〜29244ページ（1996年））。二本鎖破断修復経路（非相同末端結合（NHEJ）など）に欠陥がある細胞は、この治療に対して感受性であることが予想される（Srivastava, M. 他、Cell 第151巻、1474〜1487ページ（2012年）；Kurosawa, A. 他、PLoS ONE 第8巻、e72253ページ（2013年）；Fattah, F. J. 他、DNA Repair (Amst.) 第15巻、39〜53ページ（2014年）；Jackson, S. P.とBartek, J. Nature 第461巻、1071〜1078ページ（2009年））。
【０１２６】
クローンCRISPRスクリーニングに由来する単一細胞のための条件を最適化するため、DNA損傷反応に関連する365個の遺伝子（1437個のガイド）からなるサブセットでパイロットスクリーンを実施した。ドキシサイクリン（Dox）誘導性Cas9カセットを有するマウス胚性幹細胞（mESC）に、われわれのsgRNAライブラリを送達するレトロウイルスベクターを感染させ、G419耐性クローンを選択した。クローンのサイズと数は、限界希釈のほか、感染した細胞のクローンの増殖時間を変えることによって変化させることができる（図6a、図6b）。重要なことだが、CRISPR-UMIスクリーンに必要なNGSリードの数は、従来の分析に必要な数を超えない。フルスケールの実験のためのシークエンシング空間がこのように限られていると仮定して、われわれは4つの条件で4000リード/ガイドのマトリックスを試験し、i）200個のリードの20個のクローン、ii）64個のリードの64個のクローン、iii）20個のリードの200個のクローン、iv）限界希釈または増殖なしについて4000個のほぼ独立に感染した細胞になることを目指した（図6c、実施例1〜10の中の方法を参照されたい）。それぞれの設定で、NHEJ複合体のコアメンバーを標的とする陽性対照ガイドの性能を評価した。減少に向かう傾向の有意さを評価するため、MAGeCK0.5.5（Li他、Genome Biol. 第15巻、554ページ（2014年））を用いてガイド1個当たりの個々のクローンの減少中央値と減少に関するp値を組み合わせ、1つのガイドに関する個々のクローンをデータセット全体に対してランク付けする（図6e）。このようにして、同じ遺伝子を標的とする独立なガイドを組み合わせるのと同様に、MAGeCKを用い、同じガイドを有する多数の個々のクローンを組み合わせた。こうすることで、一段階深いレベルのスクリーン、すなわちクローン分析に到達した。NHEJ複合体のすべてのコアメンバーを同定したところ、多数のガイドのスコアが非常に有意になり、ガイド予測とライブラリの品質が確認された。次に、クローンのサイズの異なる条件を比較した。クローンの数とクローンごとのp値の間の最適な妥協点を特定するため、性能を、対照sgRNAに対するNHEJ経路のメンバーの信号対雑音比（SNR）として、ボルカノプロットの原点から各sgRNAの距離を計算することによって定量した（図6e）。SNRはすべての条件で15〜18という似た値に達したが、35個のリードの148個のクローンで最高であった。重要なことだが、ガイドはガイド1個当たりの変動する数のクローンに翻訳されるのに対し、クローンのサイズはsgRNAの量の影響を受けない。われわれのライブラリの中のsgRNAの分布（図4f）に基づき、35個のリードの148個のクローンが、分析には少なすぎるクローンの中に現われる最少数のガイドになると考えられることも推定した（0.06％に対して1.4％または6.6％、図6e）。したがって、われわれの設定でCRISPRスクリーニングを追跡する単一細胞系譜のための理想的なパラメータは、平均して30〜40個のリードのほぼ150個のクローンであると結論したが、これは用途によって変わる可能性がある。
【０１２７】
次に、この最適化されたクローンの数とサイズを利用して、エトポシドを用いたスクリーンにおいて、6560個の遺伝子（マウスゲノムの中で予測されるすべての核遺伝子のほか、投薬されるヒト遺伝子のオルソログが含まれる）を標的とする26514個のガイドからなる完全ライブラリでCRISPR-UMIを調べた（図7a）。Dox誘導性Cas9を有する同じmESC系を用い、CRISPRに基づく陰性選択スクリーンにおける感度と特異度の指標として、ガイドレベルで性能を比較した。プールと単一細胞由来のクローンで減少レベルとp値を評価すると、単一細胞レベルで、クローンの変動のほか、減少レベルの上昇が観察された（図7b、図7c）。
【０１２８】
CRISPR-UMI が従来の分析を上回るかどうかを調べるため、ガイドごとのすべてのクローンを組み合わせ、各ガイドの減少中央値と、MAGeCK0.5.5（Li他、Genome Biol. 第15巻、554ページ（2014年））のロバストなランキングアルゴリズムを用いて計算したp値をプロットした（図7e、この図を図7dと比較されたい）。大半がLOFクローンである多数の個々のクローンの減少中央値は、生物学的効果に関するより優れた指標となることが予測される（図2eも参照されたい）。実際、CRISPR-UMIでは、従来の分析と比べて信号が雑音からよりよく分離され（NHEJ/対照は、SNRCRISPR-UMIでは9.2であるのに対してSNRCRISPRでは6.4）、減少がより強くなった（NHEJ/対照は、Depl.CRISPR-UMIでは2.4であるのに対してDepl.CRISPRでは1.4）（図7d、図7e）。
【０１２９】
従来の分析とCRISPR-UMI分析の性能を直接比較するため、各データセット内でガイドをランク付けした（方法の項を参照されたい）。従来の分析と単一細胞に基づくスクリーン分析の間に大きな相関（ピアソン相関：0.751）が観察されたが、従来の分析またはクローンCRISPR分析でだけカバーされなかったガイドも観察された（図8a）。
【０１３０】
興味深いことに、不一致は強い外れ値クローンに起因し、不一致があるすべてのケースで非常に過剰なリード数が全リード空間を支配していることが見いだされた（図8b、図9）。これらの強い外れ値は、実験におけるすべての細胞が等しく取り扱われると仮定している従来の分析に実質的に干渉する。従来の分析でだけ記録されたTrim71に対するガイド1とE11を標的とするガイド2について、外れ値クローンは、処理されたサンプルでは対照と比べてリードカウントが減少した。これら外れ値は、これらガイドに関する全リードを減らしたため、これらガイドの他のすべてのクローンは明らかな減少傾向を示さないという事実を見えなくした（図8b）。それとは逆に、CRISPR-UMIによってだけ同定されたガイド（Lig4に対するガイド3やRad9aに対するガイド4など）は、対照と比べて処理された細胞でリードカウントが増加した外れ値クローンと関係していたため、このガイドに関する全リードが増加し、これらガイドのクローンの大半が減少することを見えなくした。そこでわれわれは、これら外れ値クローンが、従来の分析で得られた結果とクローンに基づく分析で得られた結果の間の不一致を引き起こすという仮説に至った。
【０１３１】
この仮説を検証するため、リードが最も多い2個のクローンを各ガイドのデータから除去し、両方の方法を利用してすべてのデータを再分析した。すると両方の分析のパイプラインが再び一列に並んだ（図8aの星印を参照されたい、補正されたピアソン相関：0.764）。外れ値を除去すると、以前はCRISPR-UMIによってだけ同定されたガイドが、今や従来の分析によっても発見されるのに対し、外れ値を除去すると、以前は従来の分析によってだけ同定されたガイドが、遺伝子の従来のMAGeCKランキングではより下位に落ちた（Trim71：9位から214位へ；Ell：20位から4416位へ）。したがって集団に基づく方法によってだけ同定されるガイドは偽陽性であると推定され、従来の方法で見逃されたガイドは偽陰性であると推定された。われわれは、このスクリーニング計画において、通常は見逃される外れ値クローンが、CRISPR-UMIではなく従来のスクリーン分析を混乱させたと結論する。われわれは、われわれのプロトコルの限界希釈工程が原因で外れ値クローンが観察される可能性があると見なした。この可能性を調べるため、限界希釈なしの同じエトポシドドロップアウトスクリーンを実施した。両方のスコア化アルゴリズムの比較から、従来の分析とCRISPR-UMI分析で異なる呼ばれ方をするいくつかのガイドRNAが再び明らかになった。やはりこうした不一致は外れ値クローンに起因しており、従来の分析において強調される欠点であった（図10）。これらのことを合わせて考えると、外れ値クローンが限界希釈によって導入されることはない。したがってプールされたスクリーンのCRISPR-UMI分析は、クローンの変動と外れ値から生じると推定される偽陽性または陰性コールを回避しているため、従来の分析よりも優れている。
【０１３２】
両方のスコア化法の性能を直接比較するため、NHEJ複合体（Lig4、Xrcc4〜6、Nhej1）を標的とする陽性対照sgRNAのどれだけ多くが上位50〜100のガイドにランクされるかを調べた（図8c）。上位50または上位100の中に、従来の分析では21個のsgRNAのうちのそれぞれたった7個と8個が呼び出されるのに対し、CRISPR-UMIでは、それぞれ12個と13個のsgRNAが入る。次に、スクリーンで同定されたすべての遺伝子のsgRNAのレベルについて、再現性を調べた。（各群のガイドごとにすべての遺伝子ヒットについて）遺伝子1個当たりのsgRNAの平均数を、上位ほど数が多いsgRNAの関数としてプロットした（図8d、例えば上位30個のsgRNAによって15個の遺伝子がヒットする場合には値は2だが；ランダムなデータセットでは1という値が予想されると考えられる）。（クローン希釈-増殖ありとなし）両方の完全なライブラリスクリーンについて、CRISPR-UMIは、ヒットリスト全体で従来の分析よりも明らかに優れており、sgRNAの間でより高い再現性を示した。
【０１３３】
遺伝子レベルでの各分析法の結果を評価するため、従来の分析のためのMAGeCKを利用したガイドとCRISPR-UMI分析のためのフィッシャーの方法を利用したガイドを組み合わせ（方法の項を参照されたい）、それらを各方法におけるスコアに従ってランク付けした（図8e）。両方の方法で、DNA修復経路において予想通り多数のヒットが記録され、それらに機能に従って色彩コードを与えた（図8g）（Jackson, S. P.とBartek, J. Nature第461巻、1071〜1078ページ（2009年）；Black他、Genes (Basel) 第7巻、67ページ（2016年）；Takata他、Nat Commun第4巻、2338ページ（2013年））。さらに、両方の方法で、特別なプロトンポンプAbcc1のほか、新規なSUMO E3リガーゼZfp451が同定された。CRISPR-UMI分析は、ガイドのレベルだけでなく遺伝子のレベルでも従来の分析法より優れており、より強い減少レベルと、より上位のランキングのヒットを示す。陰性選択スクリーンで同定された遺伝子が実際に実験で有効であるかどうかを調べるため、共通するヒット（Lig4とZfp451）のほか、従来の分析に特異的なヒット（Slc25a4、Adcy3、Trim71）とCRISPR-UMIに特異的なヒット（Rad9a、Erbb4、Rac1）についていくつかの独立なKO細胞系を作製し、エトポシドに反応するドロップアウトを定量して対照と比較した（図8f）。両方に共通するヒットは強いドロップアウトを示し、Rad9aとErbb4も顕著に減少したが、従来の分析に特異的なヒットは有意でなかった。スクリーンの読み出しにおける効果の大きさと有意性もよく相関していたことに注目されたい。CRISPR-UMIによって同定された遺伝子、すなわちRad9aとErbb4（図8eと図9c）は、両方とも、以前はトポイソメラーゼII抑制に対する反応においてDSB修復またはDNAの脱カテナン化に関与していたことが再確認された（Gilmore-Hebert他、Mol. Cancer Res. 第8巻、1388〜1398ページ（2010年）；Icli他、Biochem. Biophys. Res. Commun. 第418巻、116〜121ページ（2012年）；Mukherjee他、Seminars in Radiation Oncology第20巻、250〜257ページ（2010年）；Greer他、J. Biol. Chem. 第285巻、15653〜15661ページ（2010年）；He他、Nucleic Acids Res. 第39巻、4719〜4727ページ（2011年）；Smilenov他、Cancer Res. 第65巻、933〜938ページ（2005年））。これらを合わせることで、エトポシドが媒介となってトポイソメラーゼIIを抑制するときにDNA修復に関与する多数の既知のタンパク質と新規なタンパク質が同定された。さらに、CRISPR-UMIによって得られるスクリーニング結果の品質は、表現型の確実な同定と定量の両方で、従来の方法によって得られた結果よりも優れていることが示された。
【０１３４】
実施例14：再プログラミングの障害を明らかにするための陽性選択スクリーン
次に、確実なiPS細胞誘導プロトコル（Stadtfeld他、Nature Methods 第7巻、53〜55ページ（2010年））を選択し、確率的単一細胞陽性選択パラダイムの間のCRISPR-UMIを調べた。クローン希釈工程をこのアプローチから削除し、バーコードの複雑さをできるだけ大きい状態に維持した。なぜならiPS誘導の偶然性が限界希釈に置き換わり、CRISPR-UMI分析のためのクローンを生成させるからである（図11a、この図を図2e、図2fと比較されたい）。Dox誘導性Oct4-Klf4-Sox2-Myc（OKSM）カセットを含有するほか、再プログラミング成功のプロキシとして機能することのできる内在性Oct4-GFPレポータを含有するマウス胚性線維芽細胞（MEF）を回収した。これらMEFに、Cas9を送達するレンチウイルスコンストラクトを感染させた後、われわれのsgRNAバーコードライブラリを感染させた（図11a）。感染から6日後（0日目）、7日間にわたってDox処理することによってOKSMを誘導した。次に細胞を継代させ、Doxアッセイなしで外来性OKSMとは独立なiPS運命を培養した後、11日目にOct4-GFP陽性細胞をFACSで精製してiPS細胞を単離した。その後、iPS細胞（「処理あり」）とMEF（「処理なし」）からゲノムDNAを単離し、sgRNAの量のほか、独立なガイド-バーコードの組み合わせ（すなわちiPSコロニー）の発生数を求めた（図11b）。独立なバーコードの数からわかる発生数は、iPSコロニーが形成される確率を反映しているのに対し、sgRNAのリードの量はiPS細胞の総量を教えてくれる。な既知の再プログラミングの障害が多数同定され、それは例えば、Trp53（Marion他、Nature第460巻、1149〜1153ページ（2009年））、Pten（Liao他、Mol. Ther. 第21巻、1242〜1250ページ（2013年））、Dot1l (Onder他、Nature 第483巻、598〜602ページ（2012年））、Socs3 (Buckley他、Cell Stem Cell第11巻、783〜798ページ（2012年））、Sae1、Uba2、Chaf1a（Cheloufi他、Nature第528巻、218〜224ページ（2015年））である（図11b）。本発明のいろいろな側面では、そのような既知の再プログラミング標的を単独では使用せず、本発明の別の再プログラミング標的（メニンなど）と組み合わせて用いることが好ましい。Senp1、Socs3、Dot1lに対するガイドが発生軸に主に記録され、Trp53では、おそらく再プログラミング前のMEF集団の増殖が原因で、UMIのほぼ100％がiPSコロニーを生じさせたことに注目されたい。これが、この追加読み出しパラメータから得られたこの追加の解決法の利点を示している。
【０１３５】
また、再プログラミングの障害に関するいくつかの新規な候補を同定し、そして20個の遺伝子について確認実験を実施した（図11c）。再プログラミングは、OKSMのタイミングと用量に強く依存するため（Cheloufi他、Nature第528巻、218-224ページ（2015年））、確認には2つのアプローチを利用した。すなわち（1）元のスクリーンを模倣した、Dox誘導性OKSM MEFで得られる低いOKSMレベルと、（2）レンチウイルスを用いたOKSM送達によって得られる高いOKSMレベルである。陽性対照としてUbe21のノックダウンを含めた。するとこの設定で再プログラミングが100倍超改善された。予想通り、このスクリーニング法ではほぼすべてのsgRNAが再プログラミング効率を増大させた（図11c、図11d、図12a）。しかし各遺伝子に関する効果の大きさは両方の再プログラミング系の間で異なっていた。これは以前の知見と一致しているため、iPS再プログラミングプロセスの系特異的な障害を示唆している（Santos他、Cell Stem Cell第15巻、102〜110ページ（2014年）と、Rais他、Nature第502巻、65〜70ページ（2013年））。重要なことだが、新規な遺伝子（Pias1、E3 SUMO-タンパク質リガーゼ、メニンの転写共因子をコードするMen1など）を標的とすることは、一次再プログラミング計画において試験されて以前に同定されたすべての障害を標的とすることと比べて顕著に優れていた。これらのことを合わせて考えると、ガイドRNAの量と独立なクローンの組み合わせに基づくわれわれのスクリーニング法により、再プログラミングに関する既知の障害と新規な障害が多数同定された。
【０１３６】
次に、われわれのバーコードをさらに利用して一次スクリーンからのデータをより深く分析することにし、再プログラミングの効率が最も有意に増大したsgRNAに焦点を絞った。バーコード付きの個々のコロニーそれぞれについてリードカウントを定量することにより、iPSコロニーのサイズの中央値をプロットした（図11e、図12b）。コロニーのサイズは、再プログラミングの速度、および／または得られるiPSコロニーの増殖動態を反映していて、コロニーが確立される偶発的な確率とは異なっているため、両方のパラメータが合わさって、sgRNAリードの量の増加に至ることに注目されたい。興味深いことに、遺伝子特異的であり、sgRNAの間で比較的再現可能なリードカウントの分布が観察された。この結果は生物学にただちに示唆を与え、異なるガイドRNAを用いて得られるコロニーのサイズは明確に異なるであろうことが予測される。リードカウントの分布が、iPSコロニー形成の発生とそのようなコロニーのサイズの間の関係についての真の生物学的結果を反映しているかどうかを調べるため、特に大きなコロニーと特に小さなコロニーを生成させることが予測されたガイドについて、Doxを用いた誘導から10日後にコロニーの出現を撮影した。実際、観察されたコロニーのサイズは、一次スクリーン分析から予想されるサイズ分布と完璧に相関していた（図11f、図12c）。まとめると、確率的陽性選択の計画における単一細胞に基づくCRISPR分析は、ヒットを強力に同定できるとともに、イベント数の変動の確率の変動を予測することができることがわかる。iPS細胞を生成させるための新しい再プログラミング標的が見いだされ、それをiPS細胞アッセイにおいてさらに確認したことを示した。
【０１３７】
実施例15：遺伝子操作によるヒト再プログラミング効率の改変
初代ヒト皮膚線維芽細胞に、ノックダウンshRNAまたはsgRNA＋CAs9を有するレンチウイルスコンストラクトを感染させ、遺伝子座を遺伝子ターゲティングの対象とした。これらコンストラクトは、ブラスチシジン選択カセットをさらに備えていた。その後、うまく感染した線維芽細胞を選択し、初期感染から46日後に、4個の「山中」因子Oct4、Klf4、Sox2、Myc（OKSM）に関する発現カセットを有するレンチウイルスベクターをピューロマイシン選択カセットにカップルさせて再度感染させた。ピューロマイシン選択は、翌日に開始した。OKSMを感染させてから6日後、細胞をトリプシンで処理し、CF-1細胞からなるフィーダー細胞層に移した。細胞をさらに2週間維持し、アルカリホスファターゼ（AP）染色によって再プログラミング効率を評価した。それを図13に示してある。APはiPS細胞コロニーを濃い青色に染色する（矢印の先端）のに対し、線維芽細胞は染色されないか、線維芽細胞染色細胞として出現しない（＊印）。
【０１３８】
shRNAまたはsgRNAのない対照ベクターでの再プログラミング効率は予想通り低かった。CHAF1A、SAE1、UBE2Iに対するsgRNAは再プログラミング効率を増大させなかったが、メニンmRNAをノックダウンすると再プログラミングは顕著に改善され、MEN1遺伝子座を編集するとそれがより顕著になった。結論として、メニンの活性は、ヒト皮膚線維芽細胞の効率的な再プログラミングを阻止するため、メニンの抑制が、ヒトサンプルにおいて再プログラミングを増強する効果的な1つの方法を提供する。
【０１３９】
実施例16：ESCからiN（誘導されたニューロン）への分化誘導
前神経因子Ascl1とNgn2が発現すると、胚性幹細胞（ESC）は中間状態なしにニューロンへと直接変換される。純粋な増殖因子によって誘導される以前の分化と比較すると、この計画により、ニューロンを、より単純に（多数の培地条件がある多工程分化プロトコルと比べて1工程のプロトコルで）、より速く（β-III-チューブリン（Tuj）陽性細胞の生成に関しては、例えばGaspard他、Nature Protocols 第4巻(10)、2009年：1454〜1463ページに記載されている7〜14日間ではなく、わずか4〜5日間で）、100％に近い純度で、エンドポイント分化としてより均一なニューロンサブタイプで生成させることが可能になる。さらに、この方法は、増殖因子の必要性が減っているためコスト効率がより優れている。
【０１４０】
ドキシサイクリン誘導性Ascl1（Achaete- ScuteファミリーBHLH転写因子1）またはNgn2（ニューロゲニン2）カセット（Ascl1-ESCとNgn2-ESC）と、構成的に活性なCas9を有するESCに、メニンに対するガイドを有するレトロウイルスを感染させ、メニンノックアウトを導入した。ES細胞をクローン密度で播種し、個々のコロニーを取り出して遺伝子型を分析し、ホモ接合メニンのノックアウトを確認した。対応するクローンを増殖させ、7日間にわたってドキシサイクリンに曝露して処理した。4日目から細胞を薬AraC（シトシンβ-D-アラビノフラノシド）で処理して分化中の細胞を除去し、ニューロン集団を精製した。Dox処理の7日目、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を利用して細胞を分析し、P2A-Venusレポータを内在性タグとして付けた全神経遺伝子MAPT（微小管関連タンパク質τ）の発現を探した。細胞数を、メニンノックアウトありのESCとメニンノックアウトなしのESCの間で比較した。データは、3つの生物学的レプリカから取得した。図14の第1のグラフは、メニンノックアウトありとなしのAscl1細胞系とNgn2細胞系に由来するiNの平均数を示している。図14（b）と図14（c）の箱ひげ図は、ホモ接合メニンノックアウトが確認された2つのクローンと、メニンのノックアウトなしの対応する親細胞系からのデータを示している。データは、神経転写因子Ascl1またはNgn2を用いた神経分化転換をメニンの抑制によって増強できることを示している。
【０１４１】
実施例17：MEFからiNへの分化転換
分化転換誘導遺伝子の強制的な発現が、現在のところ、例えば山中因子を用いた再プログラミングを通じた迂回を除くと、MEFを機能的ニューロンに変換するための唯一の方法である。さらに、分化転換では、ESCからの不完全な神経分化によって生じる可能性のある奇形腫の形成がない。誘導性Ascl1カセットを有するMEF（マウス胚性線維芽細胞）（Ascl1-MEF）に、メニンガイドとCas9を有するウイルスを感染させ、メニンノックアウトを導入した。細胞を、P3仔マウスから得られたp53ノックダウン不死化一次グリアの層で覆ったスライドガラスの上に播種した。ドキシサイクリンで13日間にわたって処理した後、4％PFAを用いて細胞を固定して染色し、全神経マーカーβ-III-チューブリン（Tuj）を探した。スライドガラス上の所定の面積（1.64μm2）当たりのTuj陽性ニューロンの数は、共焦点画像とFijiソフトウエアの手作業細胞カウントツールから取得した。
【０１４２】
図15は、メニンノックアウトありとなしの細胞の画像を示している。図15のグラフは、メニンノックアウト後のAscl1細胞系から得られたiNと空のガイド対照から得られたiNの数の差を示している。実験は生物学的トリプリケートとして実施した。
【０１４３】
さまざまな出発細胞でメニンを抑制することにより、神経転写因子Ascl1を用いた神経分化転換を増強できるという実施例16の結果が、データから確認される。
【０１４４】
実施例18：結果のまとめ
エトポシドに関する増感スクリーンにCRISPR-UMIを適用し、NHEJ経路で予想されるすべての遺伝子を同定したほか、従来の分析とCRISPR-UMI分析の両方において予想外の遺伝子（輸送体Abcc1、SUMO E3リガーゼZfp451など）を同定した。興味深いことに、最近、Zfp451内の変異が、DNA損傷を含む細胞ストレスと関係づけられたが、DNA損傷抵抗性における直接的な役割はそれ以前に報告されたことがなかった。そこでわれわれは、Zfp451の化学的抑制が、急速に細胞分裂している腫瘍細胞の中でエトポシドと強い相乗作用を示すであろうことを提案する。CRISPR-UMIは、以前はDNA損傷反応と関係づけられていた追加のヒット（Rad9aとErbb4）を明らかにした。これらのヒットは、シークエンシング空間で優勢な多数の単一外れクローンが原因で、従来の分析を用いて同定されることはなかった。従来の分析でのこのような外れ値を除去すると、推定される偽陽性ヒット（Trim71、Ellなど）も上位のスコアリングリストから除去された。さらに、特に効率的なガイドについて、クローン減少中間値に基づく減少レベルは、測定可能な理論的最高レベルの問題がある古典的な分析よりも真の生物学的効果を正確に予想する。
【０１４５】
さらに、CRISPR-UMIにより、単一のスクリーンにおいて形成される独立なiPS細胞コロニーの数を記録することが可能になり、したがって再プログラミングの既知の障害を同定することに加え、再プログラミングの新たな障害を同定することが可能になった。重要なことだが、予想される再プログラミングの障害Dotl1とSocs3は、たいてい発生の増加、すなわちコロニー数の増加が記録され、リードに基づく分析だけでは見逃されていた可能性がある。CRISPR-UMIでは、Pias1（SUMO化のE3リガーゼ）とメニンが同定されたが、そのどちらも以前はiPS再プログラミングには関与していなかった。興味深いことに、メニンの喪失は、他の系譜へのアイデンティティの切り換え（例えばグルカゴンを発現する細胞から、系譜のアイデンティティの維持においてより一般的な役割を果たす可能性のあるインスリノーマへの生体内分化転換）を容易にすることと関係していた。
【０１４６】
効果の大きさと数を研究することにより、すなわち各イベントから得られた独立なiPS細胞のコロニーの数とリードの数を調べることにより、スクリーンから得られたNGSデータから生物学的機能を直接予測することができる。検証実験によって確認されるように、CRISPR-UMIにより、主に、再プログラミングがより速くなる条件、したがって個々のiPSコロニーがより大きくなる条件が同定された。その例は、Axin、AP、Tcfl71を標的とするsgRNAであり、iPSCコロニーは少数だが非常に大きくなる。実際、AxinはAPCと合わさって、Wntシグナル伝達を負に調節するβ-カテニンの破壊複合体を形成し、内在性多能性遺伝子の発現の初期促進を通じて作用する。この複合体は、再プログラミングを増強するためのGsk3阻害剤CHIR99021を通じて標的とされることがしばしばある。またTcf7l1（ときにTcf3と呼ばれる）の抑制は、Wnt標的の転写リプレッサとして機能することによって初期再プログラミング段階を特異的に促進すると以前は記述されていた。Wntシグナル伝達軸とは異なり、Dot1l、Socs2、Senp1を標的にすると、小さなiPS細胞コロニーを表わす数個のリードを持つ独立なUMIの数が主に増加した。われわれが使用するトランスジェニック系で線維芽細胞がiPSコロニーへと分化する確率は、典型的には1％未満である。したがってこれら遺伝子は、動態に影響を与えるというよりは、iPSコロニー形成の可能性を変化させる。ユビキチンE3リガーゼSocs3は、以前はStat3シグナル伝達の負の調節因子として報告されていた。したがってSocs3をノックアウトするとLIFの下流のStat3シグナル伝達が推進されるため、われわれが観察したUMIの数の増加が説明される可能性がある。しかしSocs3をノックアウトすると、栄養膜巨大細胞への分化も増加することをわれわれは確認しており、その結果としてiPS細胞の絶対数は少なくなる。これは、Socs3によって栄養膜幹細胞から巨大細胞へと分化するという以前の観察と合致している。これらを合わせて考慮して、われわれは、Socs3のノックアウトによってLIFが誘導するStat3シグナル伝達が推進され、それがiPSCへの再プログラミングの増加につながるが、そのとき栄養膜巨大細胞への分化も誘導されるため、その結果として細胞数／独自の分子識別子の少なさが観察されたという仮説を立てる。同様に、Dot1lを標的にすることによっても、たいていは独立なコロニーの数が増加した。これらの観察結果は、陽性選択スクリーンによって追加して発見された見通しを実証している。さらに、数をカウントし、効果の発生を定量することができるため、この方法によって陽性選択スクリーンにおいてクローンの効果を検出することができ、そのことにより、例えば1個の細胞に2個のガイドビヒクルが二重に感染することで1個の陽性選択ガイドが別のパッセンジャーガイドも豊富にすることに起因したクローン増殖による偽陽性コールを回避することができる。
【０１４７】
われわれの研究は、メニンの抑制または編集を利用してヒトiPS細胞を生成させてメニンの活性を消すことによってさらに検証された。iPS細胞はESCと同じように振る舞うため、再プログラミングによって神経細胞にすることができた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ−ｃ】
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【図６ｄ−ｅ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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