(57)【要約】  真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法が提供される。方法は、意図する改変部位を有する内因性標的DNAを、(i)意図する改変部位において又はその近くにおいて内因性標的DNA中に二本鎖切断を導入するように構成された遺伝子編集システム、及び(ii)複数の縦列反復配列を含むドナーDNA修復鋳型と接触させる工程を含む。方法において、複数の縦列反復配列のそれぞれは、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列を含む。ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列は、内因性標的DNA中の意図する改変部位の各側の連続的なDNA配列に相同的である。
2020517299.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法であって、
意図する改変部位を有する前記内因性標的DNAを、
(i)前記意図する改変部位において又はその近くにおいて前記内因性標的DNA中に二本鎖切断を導入するように構成された遺伝子編集システム、及び
(ii)複数の縦列反復配列を含むドナーDNA修復鋳型
と接触させる工程を含み、
a.前記複数の縦列反復配列のそれぞれが、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列を含み、
b.前記ドナー5'隣接配列及び前記ドナー3'隣接配列が、前記内因性標的DNA中の前記意図する改変部位の各側の連続的なDNA配列に相同的である、方法。
【請求項２】
前記真核細胞を前記遺伝子編集システム及び前記ドナーDNA修復鋳型とインキュベートする工程により、前記遺伝子編集システム及び前記ドナーDNA修復鋳型を前記真核細胞中に導入する工程を更に含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子編集システム及び前記ドナーDNA修復鋳型が、同時に前記真核細胞中に導入される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子編集システムが、メガヌクレアーゼ、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)及びクラスター化等間隔短鎖回文リピート(CRISPR)-CRISPR関連システム(Cas)からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子編集システムがCRISPR-Cas9システムである、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
前記CRISPR-Cas9システムを導入する工程が、
前記真核細胞を1つ又は複数のDNAコンストラクトとインキュベートする工程
を含み、前記1つ又は複数のDNAコンストラクトが、
a)crRNA配列及びtracrRNA配列を含むガイドRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記真核細胞中で作動可能な第1の調節エレメント、及び
b)Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された前記真核細胞中で作動可能な第2の調節エレメント
を含み、成分(a)及び成分(b)が同じ又は異なるDNAコンストラクト上に位置する、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
前記CRISPR-Cas9システムを導入する工程が、Cas9タンパク質及びシングルガイドRNA(sgRNA)、又はcrRNAとtracrRNAとの組合せのいずれかを前記真核細胞に導入する工程を含む、請求項5に記載の方法。
【請求項８】
前記複数の縦列反復配列のそれぞれがチオエート化ヌクレオチドを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項９】
前記外因性ドナーDNA配列のサイズが、約10塩基対から約1kbまでの範囲内である、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
前記ドナーDNA修復鋳型が、ローリングサークル増幅(RCA)産物DNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項１１】
前記RCA産物DNAが、プロセシングされたRCA産物DNA又はプロセシングされていないRCA産物DNAである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記ドナーDNA修復鋳型が、二本鎖DNA、一本鎖DNA、又は一本鎖DNAと二本鎖DNAとの組合せである、請求項1に記載の方法。
【請求項１３】
前記ドナーDNA修復鋳型が一本鎖DNAである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
前記ドナーDNA修復鋳型が、チオエート化ヌクレオチドを含む一本鎖RCA産物DNAである、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記ドナーDNA修復鋳型が、チオエート化ヌクレオチドを含む二本鎖RCA産物DNAである、請求項12に記載の方法。
【請求項１６】
前記ドナーDNA修復鋳型が、前記ドナー5'隣接配列及び前記ドナー3'隣接配列により隣接された前記外因性ドナーDNA配列から本質的になる最小限のDNA配列の複数の反復から本質的になる一本鎖又は二本鎖RCA産物DNAである、請求項1に記載の方法。
【請求項１７】
前記内因性標的DNAの前記部位特異的改変が、前記二本鎖切断において前記内因性標的DNA中に前記外因性ドナーDNA配列を組み込む工程を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１８】
真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法であって、
前記内因性標的DNAを含む前記真核細胞中にDNA改変システム及びドナーDNA修復鋳型を導入する工程であって、
前記内因性標的DNAが、5'隣接配列及び3'隣接配列により隣接された二本鎖切断を導入するための前記遺伝子編集システムのための標的部位を含み、
前記ドナーDNA修復鋳型が、複数の縦列反復配列を含み、前記複数の縦列反復配列のそれぞれが、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列を含み、
前記ドナー5'隣接配列が前記内因性標的配列の前記5'隣接配列に相同的であり、前記ドナー3'隣接配列が前記内因性標的配列の前記3'隣接配列に相同的である、工程、及び
それにより、相同組換え修復を介して、前記二本鎖切断において前記内因性標的DNA中に前記外因性ドナーDNA配列を組み込んで、前記内因性標的DNAを改変する工程
を含む、方法。
【請求項１９】
前記ドナーDNA修復鋳型が、最小限のDNA配列の複数の縦列反復から本質的になる一本鎖又は二本鎖RCA産物DNAであり、前記最小限のDNA配列のそれぞれが、前記ドナー5'隣接配列及び前記ドナー3'隣接配列により隣接された前記外因性ドナーDNA配列から本質的になる、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記外因性ドナーDNA配列のサイズが、約10塩基対から約1kbまでの範囲内である、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法であって、
意図する改変部位を有する前記内因性標的DNAを、
(i)前記意図する改変部位において又はその近くにおいて前記内因性標的DNA中に二本鎖切断を導入するように構成された遺伝子編集システム、及び
(ii)ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列を含むドナーDNA修復鋳型
と接触させる工程を含み、
a.前記ドナー5'隣接配列及び前記ドナー3'隣接配列が、前記内因性標的DNA中の前記意図する改変部位の各側の連続的なDNA配列に相同的であり、
b.前記ドナーDNA修復鋳型が、チオエート化ヌクレオチドを更に含む、方法。
【請求項２２】
前記真核細胞を前記遺伝子編集システム及び前記ドナーDNA修復鋳型とインキュベートする工程により、前記遺伝子編集システム及び前記ドナーDNA修復鋳型を前記真核細胞中に導入する工程を更に含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
前記ドナーDNA修復鋳型がポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅産物DNAである、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
前記遺伝子編集システムが、メガヌクレアーゼ、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)及びクラスター化等間隔短鎖回文リピート(CRISPR)-CRISPR関連システム(Cas)からなる群から選択される、請求項21に記載の方法。
【請求項２５】
前記遺伝子編集システムがCRISPR-Cas9システムである、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
前記内因性標的DNAの前記部位特異的改変が、前記二本鎖切断において前記内因性標的DNA中に前記外因性ドナーDNA配列を組み込む工程を含む、請求項21に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。2017年4月4日に作成された前記ASCIIコピーは、315642-1_SL.txtという名称であり、2,937バイトのサイズである。
【０００２】
本開示は、一般に、複数の縦列反復配列を含むドナーDNA修復鋳型を使用する真核細胞中の標的DNAの部位特異的改変に関する。本開示は、特に、ローリングサークル増幅(RCA)産物DNAを使用する二本鎖切断(DSB)修復を介する真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変に関する。
【背景技術】
【０００３】
人工ヌクレアーゼ酵素は、細胞の特定のDNA配列を標的化することにより細胞の遺伝子マニピュレーションのための強力なツールとして大きな注目を集めてきた。特定のDNA配列を標的化することにより、人工ヌクレアーゼ酵素は、標的化された遺伝子の欠失、置換及び修復又はゲノムへの外因性配列(例えば、導入遺伝子)の挿入を可能とする。例えば、融合して一緒になった配列非特異的DNAエンドヌクレアーゼドメイン及び人工DNA結合ドメインを有するキメラエンドヌクレアーゼ酵素は、ゲノム中に標的化された二本鎖切断(DSB)を誘導することにより効率的で正確な遺伝子改変を可能とする。そのようなDSBは、非相同末端結合(NHEJ)及び相同組換え修復(HDR)等の細胞のDNA修復機構を刺激する。しかしながら、異なるゲノム遺伝子座を標的化するための異なる種類のキメラエンドヌクレアーゼ酵素の生成は、時間を消費し、高価である。アンチセンス技術及びRNA干渉(RNAi)もまた、調節のために任意の遺伝子を標的化するために用いられている。しかしながら、RNAiは、有意なオフターゲット効果及び毒性の点で制限を有する。
【０００４】
クラスター化等間隔短鎖回文リピート(CRISPR:Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-CRISPR関連システム(CRISPR-Cas)が、ゲノム改変のために最近研究されている。遺伝子編集ツールとしてのCRISPR-Cas9は、主にその簡便性に起因して大きな注目を集めた。例えば、II型CRISPRは、単一のCas9タンパク質及び2つのRNA、すなわち、成熟CRISPR RNA(crRNA)及び部分的に相補的なトランス作用性RNA(tracrRNA)のみを伴う。細胞中の標的DNAのin vivo又はin vitro部位特異的改変は、細胞に、crRNA、tracrRNA、及び、Cas9の発現ベクター(例えば、Cas9タンパク質をコードする発現コンストラクト)、Cas9タンパク質又はCas9 mRNAのうちの少なくとも1つを共トランスフェクトすることにより達成されうる。Cas9発現細胞中の標的DNAの部位特異的改変は、crRNA及びtracrRNAの共トランスフェクションにより達成されうる。crRNA及びtracrRNAはまた、融合されて一緒になって、CRISPR-Cas9システムにおけるその機能性に影響することなくキメラRNA分子であるシングルガイドRNA(sgRNA)を生成することができる。CRISPR-Cas9システムにおいて、Cas9により標的DNA中に形成されるDSBは、NHEJ及び/又はHDR経路により修復される。NHEJ経路は高い頻度で起こるが、よりエラーを起こしやすい。対照的に、HDRは、DNA損傷を修復するために損傷した標的DNAとのドナーDNAの配列相同性を使用し、したがってDSB修復のためにより正確である。HDRプロセスは、DSBにおける標的DNA配列に対してより高い相同性を有するドナーDNA修復鋳型の適切な選択により更にエラーを少なくすることができる。しかしながら、HDRは、非常に特異的な突然変異(例えば、点突然変異、欠失又は挿入)を標的DNAに導入するために用いることができるが、その効率は、競合的なNHEJと比較してはるかに低い。
【０００５】
より大きな容易性及び最小のオフターゲット生成物で内因性標的DNA内の特定の位置への正確で効率的な組込みを可能とする好適なドナーDNA修復鋳型が非常に望まれている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
1つ又は複数の実施形態では、真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法が提供される。方法は、意図する改変部位を有する内因性標的DNAを、(i)意図する改変部位において又はその近くにおいて内因性標的DNA中に二本鎖切断を導入するように構成された遺伝子編集システム、及び(ii)複数の縦列反復配列を含むドナーDNA修復鋳型と接触させる工程を含む。方法において、複数の縦列反復配列のそれぞれは、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列を含む。ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列は、内因性標的DNA中の意図する改変部位の各側の連続的なDNA配列に相同的である。
【０００７】
一部の実施形態では、真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法が提供される。方法は、内因性標的DNAを含む真核細胞中にDNA改変システム及びドナーDNA修復鋳型を導入することを含み、内因性標的DNAは、二本鎖切断を導入するための遺伝子編集システムのための標的部位を含む。標的部位は、5'隣接配列及び3'隣接配列により隣接されている。ドナーDNA修復鋳型は、複数の縦列反復配列を含み、複数の縦列反復配列のそれぞれは、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列を含み、ドナー5'隣接配列は内因性標的配列の5'隣接配列に相同的であり、ドナー3'隣接配列は内因性標的配列の3'隣接配列に相同的である。DNA改変システム及びドナーDNA修復鋳型の導入は、それにより、相同組換え修復を介して、二本鎖切断において内因性標的DNA中に外因性ドナーDNA配列を組み込んで、内因性標的DNAを改変する。
【０００８】
一部の他の実施形態では、真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法が提供される。方法は、意図する改変部位を有する内因性標的DNAを遺伝子編集システム及びドナーDNA修復鋳型と接触させることを含む。遺伝子編集システムは、意図する改変部位において又はその近くにおいて内因性標的DNA中に二本鎖切断を導入するように構成されている。ドナーDNA修復鋳型は、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列を含み、チオエート化ヌクレオチドを更に含む。ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列は、内因性標的DNA中の意図する改変部位の各側の連続的なDNA配列に相同的である。
【０００９】
本発明のこれら及び他の特徴、態様及び利点は、添付の図面を参照して以下の詳細な説明を読んだ時により良好に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ドナーDNA修復鋳型としてプラスミドDNAと比較したチオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされた二本鎖RCA産物DNAの組込み効率を示すグラフである。
【図２】ドナーDNA修復鋳型としてプラスミドDNAと比較したチオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされた一本鎖RCA産物DNA の組込み効率を示すグラフである。
【図３】ドナーDNA修復鋳型としてプラスミドDNAと比較したチオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされた二本鎖及び一本鎖RCA産物DNAの組込み効率を示すグラフである。
【図４】ドナーDNA修復鋳型としてプラスミドDNAと比較したチオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされていない二本鎖及び一本鎖RCA産物の組込み効率を示すグラフである。
【図５】ドナーDNA修復鋳型としてプラスミドDNAと比較したチオエート化ヌクレオチドを有する二本鎖PCR産物DNAの組込み効率を示すグラフである。
【図６】DNAミニサークル鋳型から生成されたチオエート化ヌクレオチドを有する二本鎖RCA産物DNA、プラスミドDNA鋳型から生成されたチオエート化ヌクレオチドを有する二本鎖RCA産物DNA及びプラスミドDNAを含む様々なドナーDNA修復鋳型の組込み効率を示すグラフである。
【図７】TurboGFP遺伝子のインサートを含有するプラスミドSEC61Bのコンストラクト(pHR-EGFP-SEC61B)の構成図である。
【図８】EGFP遺伝子のインサートを含有するプラスミドLMNAのコンストラクト(pHR-EGFP-LMNA)の構成図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
以下の詳細な説明は例示的なものであり、本発明又は本発明の使用を限定することを意図しない。本明細書の全体を通じて、特定の用語の実例は、非限定的な例として考えられるべきである。単数形「1つの(a)」、「1つの(an)」及び「その(the)」は、文脈が明らかにそうでないことを規定しない限り、複数の指示対象を含む。本明細書及び特許請求の範囲の全体を通じて本出願において使用される近似的な表現は、それが関係する基本的機能の変化を結果としてもたらすことなく変化することが許容されうる任意の定量的な表現を修飾するために適用されうる。したがって、「約」のような用語により修飾された値は、特定された正確な値に限定されない。別に指し示さない限り、本明細書及び特許請求の範囲において使用される成分の量、分子量、反応条件等のような特性を表現する全ての数は、全ての場合において「約」という用語により修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、そうでないことを指し示さない限り、以下の明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値的パラメーターは、本発明により得ようとする所望の特性に応じて変化しうるおおよそのものである。必要な場合、範囲が提供され、それらの範囲は、それらの間の全ての部分的範囲を包含する。請求項の発明の主題をより明確で簡潔に記載及び指し示すために、以下の説明及び添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語について以下の定義を提供する。
【００１２】
「CRISPR」という略語は、クラスター化等間隔短鎖回文リピートを指す。CRISPRは、SPIDR、すなわちスペーサー散在型ダイレクトリピート(Spacer Interspersed Direct Repeat)としても公知である。CRISPR/SPIDRは、典型的に、少なくとも部分的にパリンドロームの短い高度に保存されたDNAリピート(例えば、最大40回繰り返される24〜50塩基対)からなるDNA遺伝子座のファミリーを構成する。反復配列は通常、種特異的であり、一定の長さ(例えば、20〜58塩基対)の可変配列により介在される。CRISPR遺伝子座はまた、1つ又は複数のタンパク質及びタンパク質に翻訳されない1つ又は複数のRNAをコードしうる。
【００１３】
「Cas」という略語は、CRISPR関連システム(CRISPR-Associated System)を指す。II型CRISPR-Cas9システムは、一般に、Cas9タンパク質、トランス活性化RNA(tracrRNA)及び標的化CRISPR RNA(crRNA)を含む。Cas9タンパク質は、二本鎖標的DNAを切断するためにtracrRNAとcrRNAとの間で塩基対を形成した構造に依拠するRNAガイドDNAエンドヌクレアーゼのファミリーを構成する。天然に存在するtracrRNA:crRNA二次構造(例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes))では、crRNA(42ヌクレオチド)の3'末端22ヌクレオチドと成熟tracrRNA(74ヌクレオチド)の5'末端の近くのセグメントとの間に塩基対が形成される。この塩基対形成は、crRNAの5'末端20ヌクレオチドがcrRNA毎に異なりうる、crRNAがCasタンパク質と会合した時に標的DNAに結合するために利用可能な構造を生成する。「CRISPR-Cas」システムは、細菌又は古細菌と同じであるか又はそれに由来し、CRISPR遺伝子座によりコードされる又はそれに由来する少なくとも1つのCasタンパク質を含有するシステムである。例えば、S.ピオゲネス(S. pyogenes)SF370 II型CRISPR遺伝子座は、Cas9ヌクレアーゼの遺伝子を含む4つの遺伝子の他に、2つのノンコーディングRNA;同一のリピートにより介在されたヌクレアーゼガイド配列(スペーサー)を含有するtracrRNA及びpre-crRNAアレイからなる。
【００１４】
「crRNA」という略語はCRISPR RNAを指す。crRNAは、多くの場合、単一の長いRNAとしてCRISPRアレイから構成的に転写された後、特定の部位においてプロセシングされる。crRNAはまた、化学合成することができる。crRNA分子は、DNA標的化セグメントを含む。crRNAのDNA標的化セグメントは、結合及びCRISPR-Casシステムによるその後の改変のために標的DNA部位へのヌクレオチド配列の相補的なストレッチ(例えば、少なくとも10ヌクレオチド)を含有するように操作することができる。crRNAの長さは、約25ヌクレオチドから約60ヌクレオチドまでの範囲内であってよい。crRNAはまた、リボヌクレオチドアナログ若しくはその修飾形態、若しくは修飾形態のアナログ、又は非天然ヌクレオシドを含むように操作することができる。
【００１５】
「tracrRNA」という略語は、トランス活性化crRNA(tracrRNA)を指す。tracrRNAは、小さいトランスにコードされたRNAである。tracrRNAもまた化学合成することができる。tracrRNAは、リボヌクレオチドアナログ若しくはその修飾形態、若しくは修飾形態のアナログ、又は非天然ヌクレオシドを含むように操作されてよい。
【００１６】
本明細書で使用される「シングルガイドRNA」又は「sgRNA」という用語は、crRNA及びtracrRNAを含むポリヌクレオチド配列を指す。sgRNAにおいて、crRNA及びtracrRNAは、それらの天然形態、又は修飾形態のいずれかで存在する。sgRNAは、約60ヌクレオチドから約120ヌクレオチドの長さであってよい。sgRNAは、発現ベクターを使用して発現させるか、又は化学合成することができる。合成sgRNAは、リボヌクレオチド又はそのアナログを含みうる。合成シングルガイドRNAはまた、非天然ヌクレオシド間連結を有する修飾された骨格を含有しうる。
【００１７】
「PAM」という頭字語は、プロトスペーサー隣接モチーフ(Protospacer Adjacent Motif)を指す。PAMは、典型的に、3〜5ヌクレオチドの長さであり、非標的鎖上の下流又は3'に、CRISPR遺伝子配列中のプロトスペーサーに隣接して位置する。プロトスペーサーは、標的配列に相補的なsgRNA又はcrRNA配列の一部分である。PAMの配列及び位置は、CRISPR-Casシステムの種類にしたがって変化しうる。例えば、S.ピオゲネスII型システムにおいて、PAMは、2つのG:C塩基対を含有するNGGコンセンサス配列を有し、標的DNA内のプロトスペーサー由来配列の1塩基対下流に存在する。PAM配列は、標的DNAの非相補鎖(プロトスペーサー)上に存在し、PAMの反転相補体は、標的DNA配列の5'に位置する。
【００１８】
本開示は、真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法を提供する。一部の実施形態では、真核ゲノムの改変は、ドナー核酸及びDNA改変システムを用いることにより行われる。開示されるDNA改変システムは、in vitro又はin vivoにおいて、所望のレベルの特異性で、ドナーDNAを挿入することにより真核ゲノムを効果的で効率的に改変しうる。開示されるDNA改変方法は、部位特異的な様式での真核ゲノムへのドナーDNAのより高い組込み効率を確実にするために複数の縦列反復配列を含むドナーDNA鋳型を用いる。1つ又は複数の実施形態では、DNA改変システムは、遺伝子編集システムを含む。
【００１９】
真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法が提供される。方法は、意図する改変部位を有する内因性標的DNAを、(i)意図する改変部位において又はその近くにおいて内因性標的DNA中に二本鎖切断を導入するように構成された遺伝子編集システム、及び(ii)複数の縦列反復配列を含むドナーDNA修復鋳型と接触させる工程を含む。方法において、複数の縦列反復配列のそれぞれは、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列を含む。ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列は、内因性標的DNA中の意図する改変部位の各側の連続的なDNA配列に相同的である。
【００２０】
真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変は、真核細胞の少なくとも1つの標的配列の改変を含んでよい。一部の実施形態では、部位特異的改変は、真核細胞の複数の遺伝子を編集することを含む。一部の実施形態では、部位特異的改変は、真核細胞のゲノム中の特定のDNA遺伝子座において少なくとも1つのヌクレオチドの置換、挿入を含む。そのような部位特異的なゲノム改変は、遺伝子サイレンシング、遺伝子活性化又は標的視覚化のために使用されてよい。一部の実施形態では、内因性標的DNAの部位特異的改変は、所望の効率での単一ヌクレオチド多型(SNP)である。SNPを使用する遺伝子編集は、がん、心臓血管疾患及び糖尿病のような様々な疾患の新規の疾患モデルの開発に役立ちうる。
【００２１】
一部の実施形態では、内因性標的DNAを含む真核細胞抽出物をドナーDNA修復鋳型及び遺伝子編集システムと接触させて、内因性標的DNAの部位特異的改変を促進することができる。一部の実施形態では、真核細胞内の内因性標的DNAを遺伝子編集システム及びドナーDNA修復鋳型と接触させて、真核細胞内の内因性標的DNAの部位特異的改変を促進する。そのような実施形態では、遺伝子編集システム及びドナーDNA修復鋳型は、(例えば、トランスフェクション、形質導入、又はマイクロインジェクションを介して)外側から真核細胞に導入され、それにより、遺伝子編集システム、ドナーDNA修復鋳型及び内因性標的DNAは細胞内で共局在する。一部の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型及び遺伝子編集システムの少なくとも1つの成分は、真核細胞ゲノムの部分として前記遺伝子編集システムの成分の残りを含む真核細胞中に導入されてよい。一部の他の実施形態では、遺伝子編集システムの全ての成分及びドナーDNA修復鋳型は外側から真核細胞中に導入され、それにより、内因性標的DNAは遺伝子編集システム及びドナーDNA修復鋳型と接触して、真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変を促進する。
【００２２】
遺伝子編集システム及びドナーDNA修復鋳型は、同時又は逐次的のいずれかで真核細胞中に導入されてよい。一部の実施形態では、遺伝子編集システム又は遺伝子編集システムの1つ若しくは複数の成分及びドナーDNA修復鋳型は、同時に真核細胞中に導入される。そのような実施形態では、遺伝子編集システムによりDSBが生成された時に修復部位にドナーDNA修復鋳型が存在することが望ましい。これは、ドナーDNA修復鋳型の非存在下でDSBが生成された時に細胞がNHEJを介してDNA修復を受ける可能性がより高くなるので、DSB修復のHDR経路の利用を促進する。ある特定の実施形態では、遺伝子編集システムの1つ又は複数の成分及びドナーDNA修復鋳型は同時に真核細胞中に導入され、同じ遺伝子編集システムの残りの成分は真核細胞中に既に存在する(例えば、遺伝子編集システムのタンパク質成分をコードする遺伝子は、以前から存在するか、又は真核ゲノム内に予め組み込まれていてよい)。1つ又は複数の成分が導入されると、意図する改変部位において又はその近くにおいてDSBを導入するために完全に機能的な遺伝子編集システムが真核細胞内に形成される。例えば、CRISPR-Casシステムにおいて、crRNA及びtracrRNAは、Cas 9遺伝子が真核ゲノムに既に組み込まれている真核細胞にドナー修復鋳型と共に導入されてよい。代替的な態様では、シングルガイドRNA(sgRNA)は、内因性標的DNAの部位特異的改変を促進するために、Cas9が組み込まれた真核細胞にドナーDNA修復鋳型と共に導入されてよい。
【００２３】
一部の他の実施形態では、完全な遺伝子編集システム又は遺伝子編集システムの1つ若しくは複数の成分及びドナーDNA修復鋳型は、逐次的に真核細胞中に導入される。そのような実施形態の一部では、遺伝子編集システムは、ドナーDNA修復鋳型を真核細胞に導入する前に導入されてよい。そのような実施形態の一部では、遺伝子編集システムは、ドナーDNA修復鋳型を導入した後に真核細胞に導入されてよい。
【００２４】
一部の実施形態では、遺伝子編集システム及びドナーDNA修復鋳型は、真核細胞を遺伝子編集システム及びドナーDNA修復鋳型とインキュベートすることにより真核細胞中に導入される。ドナーDNA修復鋳型及び遺伝子編集システムは、トランスフェクション及び形質導入が挙げられるがこれらに限定されない、外的な分子を真核細胞中に導入するために使用される任意の技術により真核細胞に導入されてよい。一部の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型はトランスフェクションにより導入される。例えば、ドナーDNA修復鋳型と共にCas9及びsgRNAをコードするプラスミドを用いる真核細胞のトランスフェクションは、内因性標的DNAの部位特異的改変を促進するために用いられうる。一部の他の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型及び/又はsgRNAは、ウイルスコンストラクト媒介性の形質導入を使用することにより細胞に導入される。例えば、トランスフェクトが難しい多くのヒト細胞種へのCRISPR/Cas9成分の送達は、ウイルス形質導入により達成されうる。ウイルス形質導入の例は、アデノ随伴ウイルス(AAV)媒介性の形質導入である。一部の他の実施形態では、遺伝子編集のためにドナーDNA修復鋳型を導入するためにレンチウイルス送達を用いてよい。例えば、レンチウイルスDNAコンストラクトは、細胞株及び初代細胞において効率的な標的化された遺伝子破壊を提供する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)タンパク質のためのキャリアとして使用されてよい。ZFNタンパク質は、ドナーDNAと共にレンチウイルス粒子中に一緒にパッケージ化され、ZFNタンパク質及びドナーDNA修復鋳型は、相同組換え修復のために一緒に送達されて、標的化されたドナーDNA修復鋳型の挿入及び遺伝子改変に繋がりうる。
【００２５】
本明細書に開示される遺伝子編集システムは、内因性標的DNA中にDSBを導入することができる。内因性標的DNA中に二本鎖切断を効率的に生成するために様々な様式で完全な遺伝子編集システムが真核細胞内に構成されうる。一部の態様では、遺伝子編集システムの異なる成分は、真核細胞に共トランスフェクトされて、内因性標的配列にDSBを導入するために真核細胞内で単一の遺伝子編集システムとして機能してよい。例えば、CRISPR/Cas遺伝子編集システムは、意図する改変部位において又はその近くにおいて内因性標的DNA中に二本鎖切断を導入するように構成される。CRISPR-Casシステムにおいて、シングルガイドRNA又は2つのRNA(crRNA及びtracrRNA)のいずれか及びCas9遺伝子は、細胞に共トランスフェクトされて、完全なCRISPR-Casシステムとして機能してよい。一部の他の実施形態では、内因性標的DNA中に二本鎖切断を生成するために、対形成したgRNAをCas9タンパク質と共に使用してよい。一部の他の例では、CRISPR-CasシステムのcrRNA及びtracrRNAは、Cas9発現真核細胞中に共トランスフェクトされてよい。これらの異なるアプローチは、内因性標的DNA中にDSBを導入するために用いられる。更にCRISPR-Casシステムにおいて、Cas 9発現コンストラクト、Cas9タンパク質又はCas9 mRNAのいずれかと共に2つのRNAを細胞に共トランスフェクトすることは、in vivo及びin vitroの両方において標的DNAの二本鎖切断及びその後の部位特異的改変を誘導することが実証されている。
【００２６】
一部の実施形態では、DSBは、内因性標的DNAの意図する改変部位において生成される。ドナーDNA修復鋳型は、意図する改変部位のDSBにおいて挿入される。CRISPR-Cas遺伝子編集システムの場合、一部の実施形態では、内因性標的DNAは、標的化配列(すなわち、crRNA)又はPAM配列の配列相補性に起因して高い特異性で意図する改変部位においてCas9により切断される。
【００２７】
一部の他の実施形態では、DSB部位及び意図する改変部位は異なってよい。これらの実施形態では、DSBは、内因性標的DNA中で意図する改変部位の近くにおいて生成されてよい。例えば、CRISPR-Casシステムにおいて、内因性標的DNA配列の配置はPAM依存性なので、DSB部位のすぐ隣に意図する改変部位を有することは必ずしも可能でないことがある。そのような実施形態では、意図する改変部位は、DSB部位から距離を置いて位置してよい。ドナーDNA修復鋳型を使用するHDR組換えDNA修復の許容される効率は、多くの場合、DSB部位と意図する改変部位との距離が100bpヌクレオチド未満の場合に達成される。「bpヌクレオチド」は、以下では「bp」(塩基対)と称する。DSBは、意図する改変部位の上流の配列又は意図する改変部位の下流の配列のいずれかにおいて生成されてよい。一部の実施形態では、内因性標的DNAの意図する改変部位は、DSB部位からの距離が10bpヌクレオチド未満である。一部の他の実施形態では、DSB部位と意図する改変部位との距離は20bp以内である。一部の他の実施形態では、DSB部位と意図する改変部位との距離は20bp〜100bpである。ある特定の実施形態では、内因性標的DNAの意図する改変部位は、DSB部位からの距離が100bpより大きくてよい(例えば、1000bp又はそれより大きい)。一般に、DSBと意図する改変部位との距離がより長い場合、ドナーDNA修復鋳型の挿入は、より低い組込み効率で起こりうる。DSBと意図する改変部位との最適な距離はまた、種に依存しうる。
【００２８】
一部の実施形態では、遺伝子編集システムは、メガヌクレアーゼ、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)及びクラスター化等間隔短鎖回文リピート(CRISPR)-CRISPR関連システム(Cas)からなる群から選択される。メガヌクレアーゼ、ZFN及びTALENは、様々な異なる細胞種及び生物においてゲノム編集のために広範に使用されてきた。メガヌクレアーゼは、典型的に、伸長したDNA認識配列(例えば、14〜40bp)を有する、天然に存在する制限酵素の人工型である。ZFN及びTALENは、FokI制限酵素からの非特異的なヌクレアーゼドメインに融合した人工DNA結合ドメインから構成される人工的な融合タンパク質である。カスタマイズされた特異性を有するジンクフィンガー及びTALEN反復ドメインを連結させて、伸長したDNA配列に結合するアレイとすることができる。メガヌクレアーゼの操作は、これらの酵素のDNA認識及び切断機能は単一のドメイン中で絡み合っているので、困難であった。
【００２９】
一部の実施形態では、遺伝子編集システムはCRISPR-Cas9システムであり、真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法は、CRISPR-Cas9システムを導入することを含む。一部の実施形態では、CRISPR-Cas9システムの導入は、真核細胞を1つ又は複数のDNAコンストラクトとインキュベートする工程を含み、1つ又は複数のDNAコンストラクトは、a)crRNA配列及びtracrRNA配列を含むガイドRNAをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された真核細胞中で作動可能な第1の調節エレメント、及びb)Cas9タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された真核細胞中で作動可能な第2の調節エレメントを含み、成分(a)及び成分(b)は同じ又は異なるDNAコンストラクト上に位置する。一部の実施形態では、真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法は、crRNA配列及びtracrRNAを含むガイドRNA(sgRNA)並びにCas9タンパク質を真核細胞に導入することによりCRISPR-Cas9システムを導入することを更に含んでよい。そのような実施形態では、ガイドRNAは、シングルガイドRNA(sgRNA、これは単一のRNA分子中にcrRNA配列及びtracrRNA配列を含む)、又は別々のcrRNAとtracrRNAとの組合せのいずれかでありうる。
【００３０】
ドナーDNA修復鋳型は、相同組換えのプロセスにおいて鋳型として働く。ドナーDNA修復鋳型は直鎖状DNA配列である。ドナーDNA修復鋳型は、一本鎖、二本鎖又は一本鎖DNAと二本鎖DNAとの組合せであってよい。一部の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型は一本鎖DNAである。一部の実施形態では、一本鎖ドナーDNA修復鋳型は、ローリングサークル増幅(RCA)産物である。一部の他の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型は二本鎖DNAである。一部の実施形態では、二本鎖ドナーDNA修復鋳型は、ローリングサークル増幅(RCA)産物である。
【００３１】
ドナーDNA修復鋳型は、意図する改変部位において又はその近くにおいてドナーDNA修復鋳型を挿入することにより内因性標的DNA配列を修復しうる、複数の縦列反復配列を含むコンカテマーDNAである。ドナーDNA修復鋳型は、2つの相同アーム、及び外因性ドナーDNA配列を含む。ドナーDNA修復鋳型の相同アームは、外因性ドナーDNA配列の各側に構築される。ドナーDNA修復鋳型の相同アームは、本明細書においてドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列と称される。5'隣接配列は左の相同アームであり、3'隣接配列は右の相同アームである。ドナーDNA修復鋳型中の複数の縦列反復配列のそれぞれは、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列を含む。
【００３２】
ドナー5'隣接配列は、一般に、crRNA標的配列の上流の配列に相同的であり、又は、crRNA標的配列と部分的若しくは全体的に重なり合ってよい。或いは、ドナー3'隣接配列は、一般に、crRNA標的配列の下流の配列に相同的であり、又は、crRNA標的配列と部分的若しくは全体的に重なり合ってよい。一部の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型は、DSB部位の配列が、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列を有するドナーDNA修復鋳型内の中心にあるように、Cas9誘導性のDSB部位に導入されてよい。ドナーDNA修復鋳型は、修復、挿入、欠失又は置換のために使用されてよい。例えば、ドナーDNA修復鋳型は、配列中の改変のため並びに/又は単一の点突然変異及び/若しくは最大約20,000bpの突然変異配列を導入するために使用されてよい。
【００３３】
修復鋳型としてドナーDNA配列を使用することにより、ドナーDNA中にコードされる遺伝情報は、相同組換えにより真核ゲノムの内因性標的DNA配列中に移行しうる。一部の場合には、ドナーDNA修復鋳型の配列は、異なることにより相同組換え時に点突然変異の導入を結果としてもたらす1ヌクレオチドを除いて、置換される内因性標的DNA配列の部分と本質的に同一でありうる。一部の態様では、ドナーDNA修復鋳型の配列は、内因性標的DNA配列中に以前には存在しなかった追加の配列又は遺伝子からなるものでありうることを除いて、置換される内因性標的DNA配列の部分と本質的に同一でありうる。ドナーDNA修復鋳型の長さ、塩基組成、及び内因性標的DNA配列との類似性は、内因性標的DNA配列をどのように改変する必要があるかに依存する。
【００３４】
真核細胞のゲノムDNA中に相同組換えにより組み込まれるドナーDNA修復鋳型は、異なる特徴により特徴付けられてよい。特徴としては以下を挙げることができる:(i)ドナー5'隣接配列により上流(5'端)及びドナー3'隣接配列により下流(3'端)に隣接したドナーDNA配列、(ii)ドナー5'隣接配列はドナー3'隣接配列と異なってよい、(iii)ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列のそれぞれは、意図する改変部位の各側の連続的なDNA配列に相同的である。しかしながら、隣接配列とDSBの各側の連続的なDNA配列との相同性は、相同組換えのために100%である必要はない。一部の実施形態では、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列は、様々な調節配列を含有する遺伝子のコーディング領域の各側に存在する非コーディング配列である。
【００３５】
一部の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型は、複数の縦列反復配列を含み、複数の縦列反復配列のそれぞれは、1つ又は複数の修飾ヌクレオチドを含む。修飾ヌクレオチドは、それらの核酸塩基中又は糖-リン酸部分中に修飾を含んでよい。修飾塩基は、例えば、ローリングサークル増幅(RCA)反応又はポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用する増幅反応を用いることによりDNA骨格中にランダムに導入されてよい。例えば、RCA又はPCR反応においてアルファ-ホスホロチオエート化ヌクレオチドを使用することにより、アルファ-ホスホロチオエート化ヌクレオチドがDNA中に含まれてよい。一部の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型の複数の縦列反復配列のそれぞれは、1つ又は複数のホスホロチオエート化修飾ヌクレオチドを含む。「ホスホロチオエート化修飾ヌクレオチド」という用語は、一般的に、本明細書において「チオエート化ヌクレオチド」と称される。一部の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型は、1つ又は複数のチオエート化ヌクレオチドを含む一本鎖DNAである。一部の他の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型は、1つ又は複数のチオエート化ヌクレオチドを含む二本鎖DNAである。
【００３６】
ドナーDNA修復鋳型の全体的長さは、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列(相同アーム)の長さ並びに外因性ドナーDNA配列の長さを含む。1つ又は複数の実施形態では、外因性ドナーDNA配列のサイズは、約10塩基対から約10kbまでの範囲内である。一部の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型のサイズは、約100bpから約200bpまでの範囲内である。一部の実施形態では、各縦列反復配列の外因性ドナーDNA配列は、少なくとも1kbのサイズである。
【００３７】
外因性ドナーDNA配列の各側のドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列は、同じ長さ又は異なる長さであってよい。1つ又は複数の実施形態では、意図する改変部位の各側のドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列の長さは、約40bpから約80bpまでの範囲内である。一部の他の実施形態では、意図する改変部位各側のドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列は、約50bpから約60bpまでの範囲内である。例示的な実施形態では、ドナーDNA修復鋳型の長さは、約100bpから約200bpまでの範囲内であり、意図する改変部位の各側のドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列のそれぞれは少なくとも40bpである。より大きいインサートについて、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列を含むドナーDNA修復鋳型は、それぞれ800bp、又はより大きいものが使用されてよい。本発明の方法の一例では、SEC61B遺伝子標的が用いられ(図7)、ドナーDNA修復鋳型は、714bpのTurbo GFPインサート、それぞれ1,004ヌクレオチドのドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列を有する。説明した例では、SEC61B遺伝子へのTurbo GFPの組込みは、小胞体(ER)中に局在するGFP融合タンパク質の産生を結果としてもたらす。本発明の方法の他の例では、LMNA遺伝子標的が用いられ(図8)、ドナーDNA修復鋳型は、750bpのEGFPインサート、577bpのドナー5'隣接配列及び450bpのドナー3'隣接配列を有する。説明した例では、LMNA遺伝子中のEGFPインサートの組込みは、核中に局在するGFP融合タンパク質を結果としてもたらす。
【００３８】
1つ又は複数の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型は、ローリングサークル増幅(RCA)産物DNAである。RCAは、コンカテマー縦列反復DNA配列を結果としてもたらす。ドナーDNA修復鋳型は、一本鎖RCA産物又は二本鎖RCA産物であってよい。複数のコンカテマー縦列反復配列の各縦列反復単位は、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列並びに外因性DNA配列を含む。RCAは、一本鎖及び二本鎖の両方の形態の大きいDNAドナー(約1,000bp)を生成するために用いられてよい。RCA産物DNAは、(実施例2〜5、図1〜図3、図5〜図6に示すように)HDRにおけるドナーDNA修復鋳型として使用された時に、従来のプラスミドと比較して使用のより大きな容易性と共に組込み効率の増加を示した。
【００３９】
遺伝子編集用のドナーDNA鋳型として使用されるRCA産物DNAは、プロセシングされてよく、又はプロセシングされていない形態で使用されてよい。RCA産物DNAの「プロセシング」は、目的のRCA産物DNAの制限消化、化学変性、熱変性、自己切断、酵素切断又は精製の作用を含みうる。一部の実施形態では、RCA産物は、いかなる精製もせずにドナーDNA修復鋳型として用いることができる。一部の実施形態では、RCA産物は、ドナーDNA修復鋳型としてそれを用いる前により小さい断片を形成させるためのいかなる種類の制限消化又は自己切断にも供されない。一部の他の実施形態では、RCA産物は、ドナーDNA修復鋳型として用いる前にRCA産物DNAを変性させるためのいかなる化学変性又は熱変性にも供されない。一部の実施形態では、RCA産物は、いかなる更なるプロセシングもせずに真核細胞中にトランスフェクト又は導入される。
【００４０】
1つ又は複数の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型は、チオエート化ヌクレオチドを含む一本鎖RCA産物である。一部の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型は、チオエート化ヌクレオチドを含む二本鎖RCA産物DNAである。そのような実施形態の一部では、チオエート化ヌクレオチドを有するRCA産物を形成するためにRCA反応混合物にチオエート化dNTPが添加される。チオエート化dNTPとしては、cc-S-dGTP、a-S-dCTP、cc-S-dATP及びcc-S-dTTPを挙げることができるがこれらに限定されない。cc-S-dATP又はα-S-dTTPのようなチオエート化dNTPは、RCA産物DNAの修飾DNA骨格を製造するためにRCA反応の間のチオエート化塩基のランダムな組込みのためにdNTP混合物に加えられてよい。
【００４１】
チオエート化ヌクレオチドを含むRCA産物DNAは、非チオエート化RCA産物と比較した時に、in vitro又はin vivoで真核ゲノムへのドナーDNA修復鋳型の組込み効率を増加させる。例えば、チオエート化塩基を有するdsRCAドナーDNAの組込み効率は、図1に示されるように、チオエート化塩基を有しないRCA産物の効率と比較して高かった。更に、別の例では、チオエート化塩基を有するssRCAドナーDNAは、チオエート化塩基を有しないRCA産物の効率と比較して高い組込み効率を示した(図2)。別の例では、図5に示すように、PCR増幅産物中にそれぞれ約10%及び12%チオエート化dATP及びチオエート化dCTPを組み込むことにより組込み効率は増進された。
【００４２】
ある特定の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型は、最小限のDNA配列の複数の縦列反復から本質的になる一本鎖又は二本鎖RCA産物DNAである。最小限のDNA配列は、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列から本質的になる。最小限のDNA配列は、最小で、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列を含む。それは、HDRによる真核細胞の内因性標的DNAの改変に実質的に影響しない配列を追加的に含有してよい。RCA産物の最小限のDNA配列は、真核細胞の内因性標的DNAの改変に負の影響を及ぼしうるいかなる追加の配列も含まない。例えば、最小限のDNA配列の複数の縦列反復から本質的になるドナーDNA修復鋳型は、細菌繁殖のために必要とされる配列を欠いている。例えば、RCA産物DNAは、複製起点、抗生物質選択遺伝子、マルチクローニングサイト、又は一般にクローニング、選択、スクリーニング及び/若しくは宿主細胞における複製のために使用される任意の他のアクセサリー配列のような任意の外来の配列を排除する。RCA産物DNA(ドナーDNA修復鋳型)中のそのような外来の配列の存在は、ドナーDNA修復鋳型の組込み効率に実質的に影響しうる。更に、RCA産物DNA(ドナーDNA修復鋳型)中のそのような外来の配列の存在は、宿主細胞中に組み込まれる低い確率を有する。最小限のDNA配列の使用は、抗生物質抵抗性のような遺伝子をコードするDNA及び複製起点の使用に伴う懸念の一部を取り除く。加えて、最小限の発現配列の使用は、ドナーDNA修復鋳型の比活性を増加させる。最小限の発現配列の使用はまた、in vivoでの標的DNA改変事象に伴う安全性の懸念を減少させる。
【００４３】
1つ又は複数の実施形態では、RCA産物は、鋳型としてDNAミニサークルから生成され、DNAミニサークルは、最小限のDNA配列から本質的になる。一部の実施形態では、DNAミニサークルの最小限のDNA配列は、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列からなる。RCA産物は、DNAミニサークルに由来する最小限のDNA配列の縦列反復を含む、直鎖状又は分岐したコンカテマーであってよい。DNAミニサークルは最小限のDNA配列のみを含み、細菌繁殖のために必要とされる任意の外来の配列のような最小限のDNA配列以外の任意の配列を排除する。一実施形態では、最小限のDNA配列を含むRCA直鎖状コンカテマーは二本鎖である。別の実施形態では、最小限のDNA配列を含むRCA直鎖状コンカテマーは一本鎖である。
【００４４】
真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法が提供される。方法は、内因性標的DNAを含む真核細胞中にDNA改変システム及びドナーDNA修復鋳型を導入することを含み、内因性標的DNAは、二本鎖切断を導入するための遺伝子編集システムのための標的部位を含む。標的部位は、5'隣接配列及び3'隣接配列により隣接されている。ドナーDNA修復鋳型は、複数の縦列反復配列を含み、複数の縦列反復配列のそれぞれは、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列を含む。ドナー5'隣接配列は内因性標的配列の5'隣接配列に相同的であり、ドナー3'隣接配列は内因性標的配列の3'隣接配列に相同的である。DNA改変システム及びドナーDNA修復鋳型の導入は、それにより、内因性標的DNAを改変するために、相同組換え修復を介して、二本鎖切断において内因性標的DNA中に外因性ドナーDNA配列を組み込むことを可能とする。本明細書において用いられるドナーDNA修復鋳型は、最小限のDNA配列の複数の縦列反復から本質的になる一本鎖又は二本鎖RCA産物DNAである。最小限のDNA配列のそれぞれは、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列から本質的になる。そのような実施形態では、外因性ドナーDNA配列のサイズは、10塩基対から10kbまでの範囲内である。
【００４５】
真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の方法が提供される。方法は、意図する改変部位を有する内因性標的DNAを遺伝子編集システム及びドナーDNA修復鋳型と接触させることを含む。遺伝子編集システムは、意図する改変部位において又はその近くにおいて内因性標的DNA中に二本鎖切断を導入するように構成されている。ドナーDNA修復鋳型は、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列により隣接された外因性ドナーDNA配列を含み、ドナー5'隣接配列及びドナー3'隣接配列は、内因性標的DNA中の意図する改変部位の各側の連続的なDNA配列に相同的であり、ドナーDNA修復鋳型は、チオエート化ヌクレオチドを更に含む。
【００４６】
方法のために用いられるドナーDNA修復鋳型は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)増幅産物DNA又はRCA産物DNAであってよい。一部の実施形態では、ドナーDNA修復鋳型は、少なくとも1つのチオエート化ヌクレオチドを含むPCR増幅産物である。一部の実施形態では、方法は、真核細胞抽出物中に存在する内因性標的DNAを遺伝子編集システム及びドナーDNA修復鋳型と接触させることを含む。一部の他の実施形態では、方法は、真核細胞を遺伝子編集システム及びドナーDNA修復鋳型とインキュベートすることにより遺伝子編集システム及びドナーDNA修復鋳型を真核細胞中に導入して、真核細胞内の内因性標的DNA中にDSBを導入することを含む。ドナー修復鋳型としてPCR産物DNAを使用する異なる遺伝子編集システムを内因性標的DNAの部位特異的改変のために用いてよい。好適な遺伝子編集システムとしては、メガヌクレアーゼ、転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)及びクラスター化等間隔短鎖回文リピート(CRISPR)-CRISPR関連システム(Cas)が挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、遺伝子編集システムはCRISPR-Cas9システムであり、内因性標的DNAの部位特異的改変は、二本鎖切断において又は二本鎖切断の近くの位置において内因性標的DNA中に外因性ドナーDNA配列を組み込むことを含む。
【００４７】
真核細胞の内因性標的DNAの部位特異的改変の効果は、相同組換え修復(HDR)を通じてもたらされる。HDRは、内因性標的配列上のDNA損傷又は切断を修復するために配列相同性を使用する。損傷した鎖とドナーDNA修復鋳型のインタクトなドナー鎖とのより高い配列相同性の必要性に起因して、HDRは、DSBベースの修復経路のためにより正確である。修復のために使用されるドナーDNA修復鋳型が、DSBの各側における内因性標的DNA配列に対して相同アームについて同一の配列を有する場合、遺伝子改変プロセスはエラーを起こしにくくなり、又は、遺伝子改変プロセスは、非常に特異的な突然変異(例えば、点突然変異、欠失又は挿入)を損傷したDNA中に導入することができる。
【実施例】
【００４８】
別段の記載がなければ、実施例に記載される成分は、一般的な化学物質供給業者からの市販品である。実施例セクションにおいて使用される一部の略語の詳細は以下の通りである:「mg」:ミリグラム;「ng」:ナノグラム;「pg」:ピコグラム;「fg」:フェムトグラム;「mL」:ミリリットル;「mg/mL」:ミリグラム/ミリリットル;「mM」:ミリモル濃度;「mmol」:ミリモル;「pM」:ピコモル濃度;「pmol」:ピコモル;「μL」:マイクロリットル;「min.」:分及び「h.」:時間。
【００４９】
材料及び方法:
材料:Cas-9組込み型細胞株(U2OS-Cas9細胞、HEK293T-Cas9細胞)、CRISPR RNA(crRNA)、トランス活性化crRNA(tracrRNA)、プラスミドSEC61B(EGFP)及びLMNA(EGFP)(RCA反応用の鋳型として使用した)及びDharmaFECT(商標) DUOトランスフェクション試薬(図中、DUOと略記される)は、Dharmacon, GE Healthcare社から入手した。微量遠心チューブ及び96ウェル細胞培養プレートはFisher Scientific社から入手した。dNTP及びランダム六量体プライマーはGE Healthcare Life Sciences社(Piscataway、NJ、USA)から入手し、アルファ-チオ-dNTPのSp異性体(Sp-dTTPaS、Sp-dGTPaS、Sp-dATPaS及びSp-dCTPaS等)はBiolog-Life Science Institute社(Bremen、Germany)から入手した。Phi29 DNAポリメラーゼ(1mg/ml)はEnzymatics社(Beverly、MA、USA)のものであった。オリゴヌクレオチド(PCR用のフォワード及びリバースプライマー、RCA用のプライマー等)はIntegrated DNA Technologies社(IDT Inc、Iowa、USA)から購入した。LongAmp(登録商標)Taq PCRキット、T4 DNAリガーゼ、制限酵素PvuI、HindIII、BamHI及びBglII、並びにエキソヌクレアーゼ(ラムダエキソヌクレアーゼ及びエキソヌクレアーゼI)はNew England BioLabs社(登録商標)(NEB Inc.、MA、USA)からのものであった。MEM-RS(還元ナトリウム培地)、ハンクス平衡塩溶液(HBSS)、HEPESはHyClone, GE Healthcare社(Utah、US)から購入し、pH8のトリス緩衝液はAmbion(登録商標)社(MA、US)から入手した。D-グルコースはSigma Aldrich社(MO、USA)から購入し、10%のFBSはThermo Fisher Scientific社(MA、USA)から購入した。
【００５０】
crRNA及びtracrRNAを製造者の指示にしたがって10mMのトリス(pH8)中に再懸濁した(100μM)。10mMのトリス(pH8.0)は、1Mのトリス(pH8)(Ambion(登録商標)社、MA、US)のストックから調製した。10%のウシ胎児血清(FBS)及び2mMのL-グルタミンを含有する高グルコースDMEMを細胞を培養するために使用した。フローサイトメトリーのために、20mMのHEPES(pH8)、16.8mMのD-グルコース、及び10%のFBSを含むハンクス平衡塩溶液(HBSS)を含む培地を使用した。遺伝子編集のためのPCR DNA及びRCA DNA修復鋳型を調製するために使用したdNTP及びdNTP混合物のより低レベル及びより高レベルのSp異性体は1:400(低レベル)及び1:40(高レベル)の比であった。
【００５１】
細胞培養:
付着細胞株U2OS-Cas9及びHEK293T-Cas9を以下の実験のために使用して、RCAドナーDNAのようなドナーポリヌクレオチドの効率を評価した。0日目に、細胞培養培地で処理した96ウェルプレートに細胞をプレーティングした。U2OS-Cas9細胞株のプレーティング密度は15×103細胞/ウェルであり、HEK293T細胞株のプレーティング密度は10×103細胞/ウェルであった。細胞を5%のCO2インキュベーター中37℃で終夜静置し、96ウェルプレートのウェルの内側表面への細胞の接着を誘導した。1日目に、培養細胞を細胞トランスフェクション実験のために使用した。トランスフェクション混合物を調製し、培地を吸引して細胞から除去した後、トランスフェクション混合物を細胞に加えた。
【００５２】
(実施例1)
ドナーDNA修復鋳型としてRCA産物DNA又はプラスミドDNAを使用する遺伝子編集
RCA産物DNA及びドナープラスミド(100ng/μl)の両方を10mMのトリス(pH8.0)中で調製した。crRNA及びtracrRNAの2.5μMのストックを10mMのトリス(pH8.0)中で別々に調製した。遺伝子編集実験のための対照及び実験試料をTable 1(表1)に示すように調製した。MEM(非トランスフェクション対照又はNTC、試料番号1)、トランスフェクション試薬(試料番号2)、トランスフェクション試薬及びcrRNA:tracr RNA(ガイドRNA又はgRNA)(ドナーDNA修復鋳型なし、試料番号3)、並びにトランスフェクション試薬及びドナーDNA修復鋳型(ガイドRNAなし、試料番号4)のみを含有する試料を陰性対照として使用した。陽性対照は、トランスフェクション試薬及びgRNAの存在下でのドナーDNA修復鋳型として、GFPインサートを含有するドナープラスミドDNA(SEC61B又はLMNA)(試料番号5)又は鋳型としてドナープラスミドを使用して生成されたドナーRCA産物DNA(試料番号6)のいずれかを含有した。ドナープラスミドDNA又はドナーRCA産物DNAの最終濃度は試料5及び試料6において200ng/ウェルであった。6つの別々の微量遠心チューブを使用して、下記のTable 1(表1)のように試薬を混合した。DharmaFECT(商標) DUOストック溶液をMEM-RS中に希釈し、希釈したDharmaFECT(商標) DUOを室温(30℃)で5分間インキュベートした後に各々のウェルに加えた。35μLの希釈したDharmaFECT(商標) DUOをトランスフェクション用のあらゆるウェルにおいて使用した。希釈したDharmaFECT(商標) DUOを加えた後、各ウェル中の混合物を30℃で20分間インキュベートした。ドナーDNA修復鋳型を除く試薬組成物の混合物を以下では「トランスフェクション混合物」と称する。
【００５３】
【表１Ａ】
2020517299.tif 000003
【００５４】
【表１Ｂ】
2020517299.tif 000004
【００５５】
細胞培養での使用の前に血清低減最小必須培地(MEM-RS)を室温に置いた。細胞培養の1日目に、細胞培養培地を吸引して細胞から除去した。Table 1(表1)に示す各試料1〜6から20μLの試薬組成物を280μLのDMEM培養培地を用いて希釈して、トランスフェクション混合液を生成した。次いで、100μLのトランスフェクション混合液を細胞に3連で加えた。試験条件当たり細胞を含む3連のウェルを含有する96ウェルプレートを5%のCO2の存在下37℃でインキュベートした。細胞の密集度を各日に観察し、細胞がコンフルエントに近くなったら細胞を継代した。7日目(U2OS細胞)又は8日目(HEK細胞)に、100μL未満のトリプシンを使用して細胞をトリプシン処理した後、培地を吸引した。懸濁液中の細胞をフローサイトメトリー培地(上記に示す通り)を用いて希釈して、200μLより多くの最終容量を得た。
【００５６】
200μLの各細胞試料を96ウェルプレートに加え、フローサイトメトリーを使用して解析した。計50,000の事象を測定し、及び/又は試料を60秒間流した。RCA産物ドナーDNA修復鋳型及びプラスミドドナーDNA修復鋳型はGFPインサートを含有したので、GFP陽性細胞のパーセンテージを定量化して遺伝子編集効率を推定した。図は、標準化したGFPのパーセント又はGFPのパーセントのいずれかを表し、GFPのパーセントは、実施例の説明において特定したように、総細胞集団内のGFP陽性の細胞のパーセンテージである。
【００５７】
CytoFLEX(商標) S(Beckman Coulter社)フローサイトメーターを使用して細胞試料を分析した。試料中の総細胞数に応じて細胞を200〜400μLの緩衝液中に希釈した。細胞濃度を最適化して、充分なシグナルを得るために細胞の濃度が充分高くなるようにし、それと同時にフローサイトメーターの正確な範囲内で読み取られるように濃度が充分低くなるようにした。フローサイトメーターにより、全ての非細胞破片を分析から除去することにより細胞とみなされた強調された全ての事象を得た。更に、総細胞試料からの全てのGFP陽性細胞を分析した。GFP細胞のパーセントを総細胞集団から算出した。GFP陽性細胞の強度は、総細胞集団の他にGFP陽性細胞亜集団から測定することができる。
【００５８】
(実施例2)
チオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされた二本鎖RCA産物DNAの組込み効率
プラスミドDNAのローリングサークル増幅(RCA)
試薬の調製:プラスミドDNA鋳型のRCAは、縦列反復配列を有する高分子量の、ハイパーブランチのコンカテマーをもたらす。水、反応緩衝液、プライマー及びphi29酵素を含むRCA試薬を、ライゲートされる鋳型及びdNTPの添加の前に予備洗浄して、オフターゲット増幅を最小化した。エキソヌクレアーゼ耐性プライマー及びヌクレオチド(dNTP)を含有するプライマー-ヌクレオチド溶液(プライマー-ヌクレオチド混合液)を、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII及び一本鎖DNA結合タンパク質(SSBタンパク質)の組合せとインキュベートすることにより、プライマー-ヌクレオチド混合液の汚染を除去した。任意選択でエキソヌクレアーゼの存在下(使用されるDNAポリメラーゼが非プルーフリーディングDNAポリメラーゼを含む場合)で二価の陽イオン(例えば、Mg2+)とインキュベートすることにより、DNAポリメラーゼを含有する酵素混合液の汚染を除去した。プラスミドDNA鋳型の増幅は、そのような汚染除去した酵素混合液及びプライマー-ヌクレオチド混合液を使用して行った。例えば、200ngのPhi29 DNAポリメラーゼを含有するポリメラーゼ溶液を、15mMのKCl、20mMのMgCl2、0.01%のTween-20及び1mMのTCEPを含有する5μLの50mMのHEPES緩衝液(pH=8.0)中で0.1単位のエキソヌクレアーゼIIIとインキュベートした。インキュベーションは、30℃で約60分又は4℃で12時間のいずれかで行った。汚染除去したPhi29 DNAポリメラーゼ溶液を氷浴に移した後、エキソヌクレアーゼIIIの事前の不活性化なしで標的RCAアッセイにおいて使用した。
【００５９】
dsRCA産物を生成するためのプライマー:二本鎖RCAドナー用のプラスミドDNA鋳型の増幅は、ランダムな六量体(配列番号7)を使用して行った。
【００６０】
dNTP及び修飾dNTP:プラスミドDNA鋳型からのRCA反応を使用して、一本鎖(ssRCA)又は二本鎖(dsRCA)産物のいずれかを調製した。完全なセットの伝統的なdNTPを使用して、又は伝統的なdNTPとアルファ-チオ-dNTPのSp異性体(Sp-dTTPaS、Sp-dGTPaS、Sp-dATPaS及びSp-dCTPaS等)との混合物を使用することにより二本鎖及び一本鎖RCAドナーの両方を合成した。アルファ-チオ-dNTPのSp異性体は、本明細書においてa-S-dNTPと交換可能に使用される。例えば、40:1の比の伝統的なdATP対Sp-ATPaSが、他の3つの伝統的なdNTPと共に増幅に含まれた。
【００６１】
プラスミドDNA鋳型:プラスミドSEC61B(pHR-EGFP-SEC61B)はEGFP遺伝子のインサートを含有した一方、プラスミドLMNA(pHR-EGFP-LMNA)はEGFP遺伝子のインサートを含有した。0.8mMのランダムな六量体の存在下でdsRCA産物を生成するためにpHR-EGFP-SEC61B用の10ナノグラム(10ng)のプラスミドDNAを反応混合物に加えた。
【００６２】
鋳型DNAの調製:プラスミドDNAのアルカリ変性によるEDTAの存在下でのアルカリにより、プラスミドDNAを最初に変性させた。変性のために、約22μgの再懸濁させたプラスミドDNA鋳型を含有する容量をチューブ中で等容量の0.4Nの水酸化ナトリウム及び0.4MのEDTAと混合した。室温で5分間のインキュベーション後、3Mの酢酸をチューブに加えて0.4Mの最終濃度とした後、総容量の75%の最終濃度までエタノールを加えた。次いで、チューブをドライアイスエタノール浴中で30分間インキュベートした。室温(30℃)及び重力の20,000倍より大きい遠心力で30分間遠心分離することにより、沈殿したプラスミドDNAを回収した。遠心分離後に得られたプラスミドDNAペレットを、約500μlの氷冷した70%(v/v)のエタノールを用いて洗浄し、室温(30℃)及び重力の20,000倍より大きい遠心力で15分間再遠心分離した。再遠心分離後、変性したプラスミドDNAを水中に再懸濁させ、分光光度法により濃度を決定した。変性したプラスミドDNAを同日にRCA反応に使用してssRCA産物を製造した。増幅によるssRCAの製造のために、特定のオリゴプライマーがプラスミドDNA鋳型にアニールできるように鋳型プラスミドDNAを変性形態で使用した。二本鎖RCA(dsRCA)産物の製造の場合、非変性プラスミドDNA鋳型及びより小さいランダムな六量体を使用した。
【００６３】
RCAの方法:ssRCA及びdsRCAの両方を生成するための増幅反応の前に、各々の鋳型DNAにプライマーをアニールさせるために10mMのトリス(pH8)及び50mMの塩化ナトリウムを含有する緩衝液中、50℃で10分間各々の鋳型DNAを増幅プライマー(ランダムな六量体等)とインキュベートした。ssRCA及びdsRCAの両方を生成するための増幅反応は、50mMのHEPES(pH8)、20mMの塩化マグネシウム、75mMの塩化カリウム、0.01%(v/v)のTween 20、1mMのTCEP及び2.5%(v/v)のポリエチレングリコールを含有する緩衝液中で達成した。増幅反応混合物は、2μgのPhi29 DNAポリメラーゼ及び800μMの各dNTPを更に含有した。4:1、40:1及び400:1をそれぞれ含む、伝統的なdNTP対アルファ-チオ-dNTPのSp異性体の比を試験した。Sp異性体では、α-リン酸のS位における非架橋酸素の1つが硫黄により置換されている。接尾辞「p」は、R/S命名法でリンを指すことを指し示す。増幅反応液を30℃で18時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、反応混合物を60℃で20分間加熱することにより反応混合物中のPhi29 DNAポリメラーゼを不活性化させた。
【００６４】
RCA産物の濃縮:0.1容量の3Mの酢酸ナトリウム及び2.5容量の無水エタノールを加えた後に室温(30℃)で30分間インキュベートすることにより各増幅反応からのRCA産物DNA(ssRCA及びdsRCA産物)を沈殿させた。沈殿したRCA産物DNAを室温(30℃)及び重力の20,000倍より大きい遠心力で30分間遠心分離することにより回収した。約500μlの氷冷した70%(v/v)のエタノールを用いて各DNAペレットを洗浄し、室温(30℃)及び重力の20,000倍より大きい遠心力で15分間再遠心分離した。上清を吸引してペレットから除去し、10mMのトリス(pH8)、0.1mMのEDTA及び0.01%(v/v)のTween 20を含有する緩衝液(TET緩衝液)中に各ペレットを直ちに再懸濁させた。増幅したDNAの濃度を分光光度法により決定し、トランスフェクションのためにTET緩衝液中に100ng/μlまで希釈した。
【００６５】
トランスフェクション用のdsRCAドナーDNAの調製:
dsRCA産物DNAを長いコンカテマーとして又はエンドヌクレアーゼを使用する制限消化後にトランスフェクトした。コンカテマー化したdsRCA産物をPvu Iを用いる制限消化に供して、直鎖状の単一コピーのDNA断片を生成した。本明細書において言及される単一コピーのDNA断片は、縦列反復配列の1つの単一の配列である。縦列反復配列からの単一の配列は、PvuIのような制限酵素を用いるRCAの制限消化により形成される。PvuIによる制限処理のために37℃で18時間dsRCAの試料をインキュベートした。完全な消化後、処理したDNA試料を上記のようにエタノール沈殿させ、TET緩衝液中に再懸濁させた。dsRCA増幅産物をエタノール沈殿後の150μlのTET緩衝液中に再懸濁させた。DNAゲル電気泳動による分析のためにこの工程の後に10マイクロリットルの懸濁したdsRCAを回収した。残りの140μlの懸濁したdsRCAを上記のように150単位のPvu Iを用いて適切な緩衝液中で消化させた。
【００６６】
ドナーとしてプラスミドDNA(対照)と比較したチオエート化ヌクレオチドを有するローリングサークル増幅(RCA)dsDNA(試験)の組込み効率を遺伝子編集システムを使用して決定した。全ての他のパラメーターを同じに保って、トランスフェクション混合物に100ナノグラムの各ドナーDNAを加えた。二本鎖縦列反復RCA DNA(dsRCA)を生成させ、実施例1に記載されるように制限エンドヌクレアーゼ(Pvu I、Hind III等)を用いて処理した。チオエート化dNTPと非チオエート化の通常のdNTPとの混合物を増幅反応の間に使用した。チオエート化dNTPは、(チオエート化dNTP:dNTPで)1:40(高レベル)及び1:400(低レベル)のような異なるレベルでdsRCA産物中に組み込まれた。U2OS Cas9組込み型細胞株及びSEC6ip遺伝子標的をトランスフェクションのために使用した。相同組換え修復経路(HDR)を通じたチオエート化dsRCAドナーの組込みに対するチオエート化骨格の効果を決定した。
【００６７】
チオエート化を有するdsRCAドナーDNAの組込み効率は、チオエート化を有しないRCA産物の効率と比較して高かった。チオエート化dGTPを使用して製造されたdsRCAドナーDNAを使用することにより、組込み効率の最大2倍の向上が見られた。更に、チオエート化を有しないRCA産物の組込み効率は、対照として使用したプラスミドドナーと同等であった。図1に示されるように、(異なるレベルで)チオエート化ヌクレオチドを有するdsRCAドナーDNAの組込み効率の正規化した値は、ドナーとしてプラスミドDNAより高かった。プラスミドDNAは、対照ドナーとして使用した。RCA用の鋳型として同じプラスミドを使用してdsRCAドナーDNAを生成した。フローサイトメトリーを使用してGFP陽性細胞のパーセントを追跡することにより組込み効率を評価した。各ドナーDNAの組込み効率を対照としてのプラスミドドナーDNAの組込み効率を1と考えて正規化した。U2OS Cas9組込み型細胞株及びSEC6ip遺伝子標的を使用する3連のトランスフェクション実験の平均を図1に示す。エラーバーは異なる実験間の標準偏差を指し示す。
【００６８】
(実施例3)
チオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされた一本鎖RCA産物DNAの組込み効率
プラスミドDNA鋳型:プラスミドpHR-EGFP-SEC61B(SEC61B)はTurboGFP遺伝子のインサートを含有した一方、プラスミドLMNA(pHR-EGFP-LMNA)はEGFP遺伝子のインサートを含有した。ssRCA産物を生成するためにプラスミドpHR-EGFP-SEC61B及びプラスミドpHR-EGFP-LMNAの500ngのプラスミドDNAを反応混合物(100μlの最終容量)中に加えた。
【００６９】
プラスミドDNAのアルカリ変性及びその後の再懸濁によりRCA反応用の鋳型DNAを調製して、実施例2に記載されるようにssRCA産物DNAを生成した。ssRCAを生成するための増幅反応の前に、各々の鋳型DNAにプライマーをアニールさせるために10mMのトリス(pH8)及び50mMの塩化ナトリウムを含有する緩衝液中、50℃で10分間鋳型DNAを増幅プライマーとインキュベートした。10ピコモルのプライマーを増幅を進めるためのアニーリング反応において使用してssRCAを生成した。増幅反応用の試薬は、実施例2に記載されるように予め処理した。ssRCAを生成するための増幅反応は、緩衝液、酵素、dNTP及び修飾dNTP、並びに実施例2に記載される他の試薬を使用して行った。増幅したssRCA DNAを実施例2に記載したように濃縮させた。増幅したDNAの濃度を分光光度法により決定し、トランスフェクションのためにTET緩衝液中に100ng/μlまで希釈した。
【００７０】
ssRCA産物を生成するためのプライマー:一本鎖RCAドナーを生成するためのプラスミドDNAの増幅は、Table 2(表2)に列記されるオリゴ配列(配列番号1〜4)を使用して行った。配列特異的プライマーを使用して、永久的に変性したプラスミドDNA鋳型からDNAを増幅させた。10ピコモルのプライマーを増幅を進めるためのアニーリング反応において使用してssRCAを生成した。
【００７１】
【表２Ａ】
2020517299.tif 000005
【００７２】
【表２Ｂ】
2020517299.tif 000006
【００７３】
トランスフェクション用のssRCAドナーDNAの調製:
ssRCA産物DNAを長いコンカテマーとして又はエンドヌクレアーゼを使用する制限消化後にトランスフェクトした。コンカテマー化したssRCA産物をPvu Iを用いる制限消化に供して、実施例2に記載されるように単一コピーのDNA断片を生成した。PvuIによる制限処理のために37℃で18時間ssRCA DNA試料をインキュベートした。完全な消化後、処理されたDNA試料を実施例1に記載のようにエタノール沈殿させ、TET緩衝液中に再懸濁させた。ssRCA増幅産物をエタノール沈殿後の50μlのTET緩衝液中に再懸濁させた。5マイクロリットルの懸濁したssRCAをDNAゲル電気泳動を使用して分析した。縦列反復RCA DNAを消化して二本鎖DNA制限部位を生成させてDNAにニックを入れるために、ssRCA DNAの以下の処理が必要とされた。残りの45μlの懸濁したssRCAを30ピコモルの20塩基デオキシリボオリゴヌクレオチド(オリゴ)配列に加え、該配列は、ssRCA産物DNAを20塩基オリゴ配列とアニールさせるためにssRCA産物上の適切な制限部位に相補的であり、該制限部位の中心にあった。アニーリング後、ssRCA DNA:20塩基オリゴハイブリッドをPvu Iの存在下37℃で18時間インキュベートした。Pvu I処理したssRCA DNA:20塩基オリゴハイブリッドを上記のようにエタノール沈殿させ、35μlのTET緩衝液中に再懸濁させた。再懸濁されたら、ssRCAのDNA濃度を分光光度的に決定した。ドナーとしてプラスミドDNA(対照)と比較したチオエート化ヌクレオチドを有するローリングサークル増幅(RCA)ssDNA(試験)の組込み効率を遺伝子編集システムを使用して決定した。全ての他のパラメーターを同じに保って、トランスフェクション混合物に100ナノグラムの各ssRCAドナーDNAを加えた。ドナープラスミドをRCA用の鋳型として使用してRCAドナーDNAを生成した。縦列反復ssRCA DNA(ssRCAドナーDNA)を生成し、実施例1に記載のように制限エンドヌクレアーゼによる制限消化に供した。dNTPとチオエート化dNTPとの混合物を増幅反応の間に使用した。チオエート化ヌクレオチドを異なるレベル(1:40-高レベル、1:400-低レベル)でssRCA産物中に組み込んで、相同組換え修復経路(HDR)を通じたチオエート化ssRCAドナーDNAの組込みに対するチオエート化骨格の効果を評価した。U2OS Cas9組込み型細胞株及びSEC6ip遺伝子標的をトランスフェクションのために使用した。
【００７４】
図2は、U2OS Cas9組込み型細胞株及びSEC6ip遺伝子標的を使用した単一のトランスフェクション実験を表し、エラーバーは3連のウェル間の標準偏差を指し示した。結果は、HDRを通じてドナーDNAを組み込むためにRCAドナーDNAの一本鎖のみが必要とされることを指し示した。チオエート化を有するssRCAドナーDNAの組込み効率は、チオエート化を有しないRCA産物の効率と比較して高かった。チオエート化dGTPを使用して製造されたssRCAドナーDNAを使用することにより、低(1:400)及び高(1:40)レベルの両方のチオエート化について組込み効率の最大2倍の向上がssRCAについて見られた。実施例3は、対照としての超らせんプラスミドDNAドナーと比較してssRCA DNAドナーを使用するチオエート化塩基の効果を決定する。
【００７５】
(実施例4)
チオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされた二本鎖及び一本鎖RCA産物DNAの組込み効率
ドナーとしてプラスミドDNA(対照)と比較した、一本鎖及び二本鎖の両方の、チオエート化ヌクレオチドを有するRCA DNA(試験)の組込み効率を遺伝子編集システムを使用して決定した。縦列反復dsRCA DNA及びssRCA DNAを実施例2及び実施例3にそれぞれ記載されるように調製した。全ての他のパラメーターを同じに保って、トランスフェクション混合物に100ナノグラムのdsRCA及びssRCAドナーDNAを加えた。ドナープラスミドをRCA用の鋳型として使用してRCAドナーを生成した。縦列反復dsRCA及びss RCA DNAを実施例2に記載されるようにPvu Iによる制限消化に供して単一コピーのRCAドナーDNAを生成した。チオエート化dNTPを異なるレベルでRCA産物中に組み込んで、相同組換え修復経路(HDR)を通じたドナーDNAの組込みに対するチオエート化骨格の効果を評価した。U2OS Cas9組込み型細胞株及びSEC6ip遺伝子標的をトランスフェクションのために使用した。
【００７６】
dNTPとチオエート化dNTPとの混合物を有する断片化されたRCA DNAの効率の増加を、ドナーとしてプラスミドDNAと比較して決定した。dsRCAドナーDNAは、少数の例外を除いて、ssRCAドナーDNA より高い組込み効率を示した。非チオエート化dNTPを有する断片化されたRCAドナーDNAと比較してチオエート化dNTPを有する断片化されたRCAドナーDNAを使用した時に、正規化された組込み効率の向上が実証された。低(1:400)及び高(1:40)レベルの両方のチオエート化を使用したチオエート化dNTPを使用してssRCA及びdsRCAドナーDNAを製造した。図3は、U2OS Cas9組込み型細胞株及びSEC6ip遺伝子標的を使用した2連のトランスフェクション実験の平均を示し、エラーバーは平均標準偏差を指し示す。ssRCA DNAのデータは、センス鎖及びアンチセンス鎖についての2連の実験の結果の平均を表す。
【００７７】
(実施例5)
チオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされていない一本鎖及び二本鎖RCA産物DNAの組込み効率
ドナーとしてプラスミドDNA(対照)と比較したチオエート化ヌクレオチドを有するプロセシングされていないコンカテマーssRCA及びdsRCA DNA(試験)の組込み効率を遺伝子編集システムを使用して決定した。全ての他のパラメーターを実施例2〜4と同じに保って、トランスフェクション混合物に100ナノグラムのコンカテマーssRCAドナーDNA及びdsRCAドナーDNAのそれぞれを加えた。ドナープラスミドをRCA用の鋳型として使用してドナーDNAとしてssRCA及びdsRCAを生成した。縦列反復配列を有するコンカテマーssRCAドナーDNA及びdsRCAドナーDNAを実施例1に記載されるようにPvu I制限エンドヌクレアーゼを使用して生成した。チオエート化dNTPを異なるレベル(1:40、1:400)でssRCA産物及びdsRCA産物中に組み込んだ。相同組換え修復経路(HDR)を通じたドナーDNAの組込みに対するチオエート化骨格の効果を決定した。U2OS Cas9組込み型細胞株及びSEC6ip遺伝子標的をトランスフェクションのために使用した。
【００７８】
チオエート化を有するコンカテマーssRCAドナーDNA及びdsRCAドナーDNAの両方の組込み効率を、チオエート化を有しないdsRCA及びssRCA産物の両方の効率並びにプラスミドDNAと比較した。dsRCAドナーDNAは、少数の例外を除いて、一本鎖RCAドナーDNAより高い組込み効率を示した。縦列反復dsRCAドナーDNA及びssRCAドナーDNAの組込み効率は、HDR用の鋳型として使用された場合、超らせんのプラスミドドナーDNAの効率と同等であった。プラスミドDNAより低いdsRCA及びssRCAドナーDNAについての組込み効率は、培養細胞のばらつき、非効率的な細胞送達又はHDRのためのRCAドナーDNAの能力の低減に起因しうる。図4は、U2OS Cas9組込み型細胞株及びSEC6ip遺伝子標的を使用した2連のトランスフェクション実験の平均を表す。エラーバーは平均標準偏差を指し示す。ssRCAデータは、センス鎖及びアンチセンス鎖についての各2連の実験の結果の平均の代表であった。
【００７９】
(実施例6)
チオエート化ヌクレオチドを有する又は有しない二本鎖PCRドナーの組込み効率
遺伝子編集のためのトランスフェクション用のドナーDNAとしてのPCR DNAの調製:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用してトランスフェクション実験用の鋳型を調製した。これらの鋳型は、完全なセットのdNTP又はdNTPとアルファ-チオ-dNTPのSp異性体(例えば、40:1の比のdATP対Sp-ATP-α-S)との混合物のいずれかを使用して合成した。PCRにおける各dNTP又はdNTPとアルファ-チオ-dNTPとの混合物の最終濃度は300μMであった。dNTP又は異なる比のdNTP及びアルファ-チオ-dNTPを使用する各PCRを3連で調整した。Table 2(表2)に示されるように、フォワードプライマーはSEC61Bフォワードラムダ耐性プライマー(配列番号6)であった一方、リバースプライマーはSEC61Bリバースリン酸(配列番号5)であった。各プライマーを0.5μMの濃度でPCRに含めた。
【００８０】
dNTP/α-S-dNTPを除く全ての成分を含有するバルク混合物を調製した。48.5μlのアリコートのバルク混合物を、氷上でインキュベートした個々のチューブに加え、1.5μlの適切なdNTP/α-S-dNTP混合物を適切なチューブに加えた。各dNTP/α-S-dNTP混合物を3連で調製した。チューブに蓋をし、混合し、予備加熱したサーマルサイクラーに入れた。
【００８１】
製造者の説明書にしたがってLongAmp(登録商標)Taq PCRキットを使用してPCRを行った。サーマルサイクリングプロファイルは、1)94℃で30秒、2)94℃で15秒、3)45℃で15秒、4)65℃で10分、5)工程#2を更に29回、6)65℃で10分、及び最後に7)反応液を4℃で保持を含んだ。アガロースゲル電気泳動によりPCR増幅産物を分析した(データ示さず)。各複製物の完了したPCRを合わせた。1X TBE緩衝液中で調製した1%アガロースゲルを使用する電気泳動により各合わせた複製物を分析し、1:200の希釈のSYBR Goldを用いて染色し、Typhoonスキャナーで可視化した。
【００８２】
dsDNA PCR産物からのssDNAの調製:アガロースゲル電気泳動によるDNA分析後、PCR反応混合物を総反応混合物の容量の約半分に分割した(それぞれ約75μl)。ラムダエキソヌクレアーゼ(5単位)を分割した反応混合物のそれぞれに加えた。エキソヌクレアーゼI(10単位)を、分割した反応混合物の残りのセットに加えた。全ての制限消化混合物を最初に37℃で1時間、次いで80℃で20分間インキュベートした。0.1容量の3Mの酢酸ナトリウム及び2.5容量の無水エタノールを加えた後に室温で30分間静置することにより各消化からのDNAを沈殿させた。室温及び重力の20,000倍より大きい遠心力で30分間遠心分離することにより、沈殿したDNAを回収した。約500μlの氷冷した70%(v/v)のエタノールを用いて各DNAペレットを洗浄し、指し示した温度及び遠心力で15分間再遠心分離した。上清を吸引してペレットから除去し、各ペレットを、10mMのトリス(pH8)、0.1mMのEDTA及び0.01%(v/v)のTween 20を含有する緩衝液(TET緩衝液)中に再懸濁させた。PCR増幅したDNAの濃度を分光光度法により決定し、PCR増幅したDNAを、トランスフェクションのためにTET緩衝液中に100ng/μlまで希釈した。
【００８３】
ドナーとしてプラスミドDNA(対照)と比較したdsPCR産物DNA(試験)の組込み効率を遺伝子編集システムを使用して決定した。全ての他のパラメーターを実施例2〜4と同じに保って、トランスフェクション混合物に100ナノグラムのPCRドナーDNAを加えた。ドナープラスミドDNAをPCR用の鋳型として使用してPCR産物ドナーDNAを生成した。二本鎖PCR産物DNAを標準的なプロトコールにしたがって生成した。dNTPとチオエート化dNTPとの混合物を異なるレベル(高レベル1:40、低レベル1:400等)でPCR産物中に組み込んで、HDRを通じたドナーDNAの組込みに対するチオエート化骨格の効果を決定した。超らせんプラスミドDNA(対照として)及び非チオエート化二本鎖PCR産物DNAと比較したチオエート化塩基を有する二本鎖PCR産物DNAの組込み効率を測定した。U2OS Cas9組込み型細胞株及びSEC61P遺伝子標的をトランスフェクションのために使用した。
【００８４】
図5は、U2OS Cas9組込み型細胞株及びSEC61P遺伝子標的を使用した単一のトランスフェクション実験の結果を表し、エラーバーは、トランスフェクションのために使用した3連の試料の間の標準偏差を指し示す。図5の結果は、少なくとも、PCR増幅産物中にチオエート化dATP及びチオエート化dCTPを組み込むことにより、ドナーDNAとしての組込み効率はそれぞれ約10%及び12%増進されたことを示した。この実験では、ガイドRNAの非存在下でドナーDNAを加えて、GFPタグ化ドナーDNAのバックグラウンド蛍光を更に決定した。超らせんプラスミドDNA(対照)について示されたバックグラウンド蛍光は、チオエート化の存在下又は非存在下で直鎖状PCR産物DNAについてほぼ検出不可能であった。
【００８５】
(実施例7)
チオエート化ヌクレオチドの存在下又は非存在下でDNAミニサークルから生成された二本鎖RCAドナーDNAの組込み効率
DNAミニサークル鋳型の生成:
ドナーDNAプラスミドを使用してPCRを介して直鎖状二本鎖DNAを合成した。Table 2(表2)に記載されるように(配列番号8〜11)、5'及び3'の両末端に特有の制限部位(それぞれNheI及びSpeI)を有するドナーDNAの隣接相同アーム上にプライマーを設計した。DNAミニサークルを作製するために、両方のエンドヌクレアーゼを用いてdsDNAを消化して、相補的な付着オーバーハングを製造した。T4 DNAリガーゼを使用してこの消化されたDNAをライゲートした。制限消化及びライゲーション工程は、20UのSpeI、10UのNheI、400UのT4リガーゼ、1mMのATP、100μg/mLのウシ血清アルブミン(BSA)、100mMのNaCl、10mMのMgCl2、50mMのトリス-HCl(pH7.5)及び10mMのジチオトレイトール(DTT)を含有する反応混合物を使用して逐次的(例えば、異なるチューブ中)又は同時(例えば、同じチューブ中)に実行した。全てのライゲーション産物(DNAミニサークル)をその後にエキソヌクレアーゼI及びエキソヌクレアーゼIIIを用いて処理してあらゆる残存した直鎖状DNA断片を消化した。ライゲーション産物を80℃で20分間インキュベートすることによりエキソヌクレアーゼを熱不活性化した。エキソヌクレアーゼの熱不活性化後、5μL(25ngのDNA)の完了したライゲーション反応液を、Phi29 DNAポリメラーゼを使用する等温RCA反応のために直接的に用いた。
【００８６】
DNAミニサークルの増幅
DNAミニサークル鋳型のRCAは、最小限の発現配列の縦列反復の高分子量の、ハイパーブランチのコンカテマーをもたらす。水、反応緩衝液、プライマー、及びphi29酵素を含むRCA試薬を、ライゲートされる鋳型及びdNTPの添加の前に予備洗浄して、実施例2に記載されるようにオフターゲット増幅を最小化した。DNAミニサークルの増幅は、そのような汚染除去した酵素混合液及びプライマー-ヌクレオチド混合液を使用して行った。例えば、200ngのPhi29 DNAポリメラーゼを含有するポリメラーゼ溶液を、15mMのKCl、20mMのMgCl2、0.01%のTween-20及び1mMのTCEPを含有する5μLの50mMのHEPES緩衝液(pH=8.0)中で0.1単位のエキソヌクレアーゼIIIとインキュベートした。インキュベーションは、30℃で約60分又は4℃で12時間のいずれかで行った。汚染除去したPhi29 DNAポリメラーゼ溶液を氷浴に移した後、エキソヌクレアーゼIIIの事前の不活性化なしで標的RCAアッセイにおいて使用した。
【００８７】
DNAミニサークルからdsRCA産物を生成するために使用したプライマー、dNTP及び修飾dNTP: DNAミニサークルの増幅は、ランダムな六量体(配列番号7)を使用して行った。完全なセットの伝統的なdNTPを使用して、又は伝統的なdNTPとアルファ-チオ-dNTPのSp異性体(Sp-dTTPaS、Sp-dGTPaS、Sp-dATPaS及びSp-dCTPaS等)との混合物を使用することにより、RCAドナーDNAをDNAミニサークル鋳型から合成した。例えば、40:1の比の伝統的なdATP対Sp-ATPaS(高レベル)又は400:1の伝統的なdATP対Sp-ATPaS(低レベル)が、他の3つの伝統的なdNTPと共に増幅に含まれた。
【００８８】
DNA増幅反応は、汚染除去したプライマー-ヌクレオチド混合液及び汚染除去した酵素混合液を30℃で約400分間DNAミニサークル鋳型とインキュベートすることにより行った。増幅反応混合物は、40μMのプライマー、400μMのdNTP(各400μMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP)又は400μMの修飾dNTPと伝統的なdNTPとの混合物;1pgのDNAミニサークル及び200ngのphi29 DNAポリメラーゼから構成された。15mMのKCl、20mMのMgCl2、0.01%(v/v)のTween-20、1mMのTCEPを含有する50mMのHEPES緩衝液(pH=8.0)中で反応混合物をインキュベートした。インキュベーションの終わりに、反応混合物を65℃で10分間加熱することにより反応混合物中のPhi29 DNAポリメラーゼを不活性化させた。
【００８９】
DNA最小環状鋳型から生成されるdsRCAドナーDNAの組込み効率に対するチオエート化ヌクレオチドの効果
プラスミドDNA鋳型から生成されたdsRCAドナーDNA又は合成により調製したDNA最小環状鋳型から生成されたdsRCAドナーDNAの組込み効率に対するチオエート化塩基の効果を決定した。この実施例では、超らせんプラスミドDNA、直鎖状化プラスミドDNA、DNAミニサークル及び直鎖化DNAミニサークルを対照として使用した。全ての他のパラメーターを同じに保ったまま、100ナノグラムの各ドナーDNAをトランスフェクション混合物に加えた。超らせんプラスミドDNA及び合成の最小環状DNAをRCA用の鋳型として使用してdsRCAドナーDNAを生成した。HEK293T Cas9組込み型細胞株をトランスフェクションのために使用した。dsRCA DNAを方法に記載したように生成した。チオエート化dNTPを異なるレベル(1:40、1:400)でRCA産物中に組み込んでHDRを通じたdsRCAドナーDNAの組込みに対するチオエート化骨格の効果を評価した。
【００９０】
図6は、HEK293T Cas9組込み型細胞株及びLMNA遺伝子標的を使用した単一のトランスフェクション実験を表し、エラーバーは、トランスフェクションのために使用した3連の試料の間の標準偏差を指し示す。ドナーDNAの組込みの効率は、GFP陽性細胞のパーセンテージと相関する。鋳型として合成の最小環状DNAを使用して生成されたdsRCAドナーDNAの組込み効率を、鋳型としてプラスミドDNAを使用して生成されたRCAドナーDNAと比較した。チオエート化ヌクレオチドを異なるレベル(1:40-高レベル、1:400-低レベル)でRCA産物中に組み込んで、相同組換え修復(HDR)経路を介するチオエート化RCAドナーDNAの組込み効率に対するチオエート化骨格の効果を評価した。図6は、ドナーDNA修復鋳型として合成の最小環状DNAからのRCA産物を使用する有用性を実証し、合成の最小環状DNAは、HDRが起こるために必須の配列を含有し、クローニング及び/又は細菌細胞中での繁殖のために必要とされるもののようないかなる追加のDNAコンストラクト配列も含有しない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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