(57)【要約】  生体試料中の核酸の精製、または検出、または増幅、または定量化のための組成物、方法、システム、およびキットが提供される。幾つかの態様では、単一のポイントオブケア用デバイス／反応器が提供される。
2020510420.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅産物の精製および検出のための方法であって、
ａ．未精製の核酸を有する試料をマイクロ流体領域に送達すること；
ｂ．前記核酸を前記マイクロ流体領域における固定表面と接触させ、前記核酸が前記表面に付着すること；
ｃ．前記マイクロ流体領域および表面を第１のバッファーで洗浄すること；
ｄ．前記マイクロ流体領域および表面を第２のバッファーで洗浄し、前記第２のバッファーが前記第１のバッファーと同じまたはこれよりも高いｐＨを有すること；
ｅ．前記核酸の少なくとも一部を増幅して増幅産物を生成すること；ならびに
ｆ．前記増幅産物を検出すること
を含み、
前記核酸を前記マイクロ流体領域に送達する前記工程が、コスモトロピック塩および任意にヌクレアーゼ阻害剤を含む付着溶液を使用し、前記付着溶液がカオトロピック塩およびエタノールを含まない、方法。
【請求項２】
前記第１のバッファーが、ＮａＣｌをさらに含み、１〜４．５のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第２のバッファーが、１〜４．５のｐＨを有し、コスモトロピック塩を含有しない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が生体試料であり、前記方法が、前記核酸をマイクロ流体領域に送達する工程の一部として、前記生体試料中のウイルスおよび／または細胞を溶解して未精製の核酸を溶液中に放出させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸を前記マイクロ流体領域における固定表面と接触させる前記工程が、核酸を前記マイクロ流体領域において２０〜８０℃の温度でインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記固定表面が、金属酸化物または金属窒化物またはシリコン酸化物またはシリコン窒化物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記金属酸化物が酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）または酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生体試料中の前記ウイルスおよび／または細胞を溶解する前記工程が、前記溶解が起こるように、前記付着バッファー中の前記生体試料を加熱することにより、または前記付着バッファー中の前記生体試料を化学組成物に暴露することにより、核酸を放出させることを含み、前記化学組成物が０．１〜１．０％のＳＤＳおよび／または０．１〜０．５％のＮＰ−４０洗剤を任意に含む、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記生体試料が前記マイクロ流体領域において前記付着バッファー中で加熱される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
マイクロ流体増幅アッセイのためのコスモトロピック溶液であって、コスモトロピック塩がＫＨ２ＰＯ４、または（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４であり、前記溶液が１〜３５％のＤＭＳＯを任意に含む、コスモトロピック溶液。
【請求項１１】
請求項１に記載の方法を使用する核酸配列の精製および増幅のためのシステムであって、前記システムが、金属酸化物もしくはコーティングまたはシリコン酸化物（ＳｉＯ２）コーティングまたはシリコン窒化物コーティングを有する少なくとも１つの固定表面を有するマイクロ流体反応器を含み、前記コーティングが、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、シリコン窒化物（Ｓｉ３Ｎ４）、またはシリコン酸化物（ＳｉＯ２）から本質的になる、システム。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの表面が、前記マイクロ流体反応器において複数のマイクロピラー上に存在する、請求項１１に記載のシステム。
【請求項１３】
前記複数のマイクロピラーが、以下の特徴：
ｉ）おおよそ１９０〜２００μｍのマイクロピラー高さ；
ｉｉ）おおよそ２０μｍのマイクロピラー幅；おおよそ５０μｍの中心間マイクロピラー距離；
ｉｉｉ）約３０μｍのピラー間距離
のうちの少なくとも１つを有する、請求項１２に記載のシステム。
【請求項１４】
前記複数のマイクロピラーの少なくとも一部が、ポリヌクレオチドと非共有結合している、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
核酸を決定するための方法であって、
ａ．核酸を含むまたは含むと疑われる生体試料を表面と接触させ、前記核酸が、存在する場合は前記表面に付着すること；
ｂ．付着した前記核酸および前記表面を第１のバッファーで洗浄すること；
ｃ．付着した前記核酸および前記表面を第２のバッファーで洗浄し、前記第２のバッファーが前記第１のバッファーと同じまたはこれよりも高いｐＨを有すること；
ｄ．前記核酸の少なくとも一部を増幅して増幅産物を生成すること；ならびに
ｅ．前記増幅産物を検出すること
を含み、
前記核酸を前記表面と接触させる前記工程が、コスモトロピック塩および任意にヌクレアーゼ阻害剤を含む付着溶液を使用して実施される、方法。
【請求項１６】
前記表面が、金属酸化物コーティングまたはシリコン酸化物もしくはシリコン窒化物のコーティングを含み、前記コーティングが酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、シリコン窒化物（Ｓｉ３Ｎ４）、またはシリコン酸化物（ＳｉＯ２）から本質的になる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記表面が複数のマイクロピラー上に存在する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数のマイクロピラーが、以下の特徴：
ｉ）おおよそ１９０〜２００μｍのマイクロピラー高さ；
ｉｉ）おおよそ２０μｍのマイクロピラー幅；おおよそ５０μｍの中心間マイクロピラー距離；
ｉｉｉ）約３０μｍのピラー間距離
のうちの少なくとも１つを有する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が前記核酸を含み、請求項１８に記載の工程ａ．において、前記試料中の核酸含有量の少なくとも１５％、最大で４０％が、前記表面に付着する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料中の前記核酸含有量の少なくとも１５％が増幅されて、工程ｄ．の前記増幅産物を得る、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸含有量が前記試料中の前記核酸含有量の３５〜１００％である、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸含有量が前記試料中の前記核酸含有量の４０％からである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
金属酸化物コーティングまたはシリコン酸化物もしくは窒化物のコーティングを含む表面を含む容器であって、前記コーティングが酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、シリコン窒化物（Ｓｉ３Ｎ４）、またはシリコン酸化物（ＳｉＯ２）から本質的になり、前記表面が複数のマイクロピラー上に存在する、容器。
【請求項２４】
前記複数のマイクロピラーが、以下の特徴：
ｉ）おおよそ１９０〜２００μｍのマイクロピラー高さ；
ｉｉ）おおよそ２０μｍのマイクロピラー幅；おおよそ５０μｍの中心間マイクロピラー距離；
ｉｉｉ）約３０μｍのピラー間距離
のうちの少なくとも１つを有する、請求項２３に記載の容器。
【請求項２５】
前記容器がマイクロ流体デバイスに存在する、請求項２３または２４に記載の容器。
【請求項２６】
請求項２５に記載のデバイスを含むキットであって、ポリヌクレオチドを前記マイクロピラーに付着させるのに使用するための少なくとも１つのバッファーをさらに含むキット。
【請求項２７】
少なくとも１つのポリメラーゼをさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
１種以上の病原微生物のゲノム配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
試料をマイクロ流体容器内に導入するように適合されたカートリッジをさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
病原体に由来する核酸を検出するための方法であって、
ａ．核酸を含むまたは含むと疑われる病原体に由来する生体試料を表面と接触させ、前記核酸が、存在する場合は前記表面に付着すること；
ｂ．付着した前記核酸および前記表面を第１のバッファーで洗浄すること；
ｃ．前記核酸および前記表面を第２のバッファーで洗浄し、前記第２のバッファーが前記第１のバッファーと同じまたはこれよりも高いｐＨを有すること；
ｄ．前記核酸の少なくとも一部を増幅して増幅産物を生成すること；ならびに
ｅ．前記増幅産物を検出すること
を含み、
前記核酸を前記表面と接触させる前記工程が、コスモトロピック塩および任意にヌクレアーゼ阻害剤を含む付着溶液を使用して実施され、前記方法に１時間未満かかる、方法。
【請求項３１】
前記病原体がＨＣＶ、ＨＩＶ、Ｚｉｋａ、またはＨＰＶである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法に２５分未満かかる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記増幅がＰＣＲチャンバーにおいて行われる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＰＣＲチャンバーがシリコンマイクロチャネルである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記シリコンマイクロチャネルが１つ以上の蛇行を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記シリコンマイクロチャネルが９つの蛇行を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記シリコンマイクロチャネルが１．３μＬの体積を有する、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願への相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１７年２月２７日に提出され「核酸を精製し増幅するためのシステムおよび方法」という表題の米国特許仮出願第６２／４６４，０９７号、および２０１７年９月６日に提出され「核酸を精製し増幅するためのシステムおよび方法」という表題の米国特許仮出願第６２／５５４，８７０号の優先権を主張し、これらの開示は参照によりその全体があらゆる目的のためにここに組み込まれる。
【開示の分野】
【０００２】
本開示は、概して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による核酸の精製および増幅に関する。さらに詳細には、本開示は、ポイントオブケア用システムおよびデバイスにおいて核酸の精製および増幅を実施するための組成物、システムおよび方法に関する。
【背景】
【０００３】
ポイントオブケア診断のシステムおよび方法は、費用がかかり時間もかかる研究室ベースの検査を使用せずに、医療従事者に適時な診断情報を提供する。典型的なポイントオブケア検査は、臨床医のオフィスもしくは診療所、野外診療所もしくは野外試験、医療提供者の家庭訪問、または類似する状況のいずれかにおいて、患者と医療提供者の接触時に実施される。
【０００４】
したがって、多くの貴重な診断検査は、ポイントオブケア診断には実行が難しいと見なされてきた。例えば、多くの核酸増幅検査は、特異的な疾患媒介物である核酸を同定して感染症およびその原因を正確に診断するが、ポイントオブケア診断には実用的ではない。生物検体から核酸を増幅するためには、核酸増幅反応、例えば、ＲＴ−ｑＰＣＲおよびＰＣＲ反応を阻害するであろう、検体内に存在する消化酵素、阻害剤分子および他のコンタミナントを除去するために核酸を精製する必要がある。さらに、これらの検査は、医療施設内外両方での多くのポイントオブケアの状況における問題である、環境汚染に極めて影響を受けやすい。要するに、既存の核酸の精製および増幅の方法は時間がかかり、比較的大量の試薬を使用し、分離もしくは遠心分離の工程が必要であり、または時間がかかる回収および再利用を必要とする高価なマイクロビーズもしくは類似の基材を利用する場合がある。したがって、ポイントオブケア用デバイスで使用することができる核酸を分離し、増幅し、定性的および／または定量的に分析するデバイス、組成物および方法を提供することが有利であると考えられる。本開示はこの必要性に関連する。
【発明の概要】
【０００５】
当該技術分野では、少量の試薬を用いてビーズも遠心分離も使用せずに実施することができる、核酸の抽出、精製および分析の方法およびシステムが必要とされている。本開示は、マイクロ流体環境における核酸の精製を提供することにより前述の関心に取り組む。シリカベースのクロマトグラフィーを使用する核酸精製のための既存の研究室方法は、チップベースの独立型診断デバイス上での使用に適していない試薬および方法論を必要とするが、本開示は、その後の定量アッセイと同じデバイス上での核酸の抽出、分離、増幅および分析を容易にするように設計されている。
【０００６】
一側面では、本開示は、生体試料からの核酸の精製のための方法であって、未精製の核酸をマイクロ流体領域に送達する工程、核酸をマイクロ流体領域における固定表面と接触させ、核酸が表面に付着する工程；マイクロ流体領域および表面を第１のバッファーで洗浄する工程；マイクロ流体領域および表面を第２のバッファーで洗浄し、第２のバッファーが第１のバッファーと同じまたはこれよりも高いｐＨを有する工程を含む方法を提供する。
【０００７】
一側面では、固定表面は、シリコン酸化物または金属酸化物または窒化物を含む。一側面では、金属酸化物は酸化アルミニウムまたは酸化ハフニウムを含む。
【０００８】
一側面では、本開示は、核酸の少なくとも一部を増幅して増幅産物を生成すること；および増幅産物を検出することも提供する。一側面では、核酸をマイクロ流体領域に送達することは、生体試料を付着バッファーに添加し、核酸が付着バッファーと混合するように付着バッファー中の細胞、ウイルスまたは細菌を破壊することを含む。破壊は細胞／ウイルスの溶解を含むことができる。溶解は、任意の適切なアプローチを使用して実施することができ、このアプローチには、熱、化学および機械ベースの溶解が含まれるが必ずしもこれらに限定されない。
【０００９】
一側面では、本開示は、試料中の核酸の精製、増幅、および存在または非存在の検出のための方法を提供する。態様では、本開示は、未精製の核酸をマイクロ流体領域に送達する工程、核酸をマイクロ流体領域における固定表面と接触させ、核酸が表面に付着する工程；マイクロ流体領域および表面を第１のバッファーで洗浄する工程；マイクロ流体領域および表面を第２のバッファーで洗浄し、ある特定のアプローチでは第２のバッファーが第１のバッファーと同じまたはこれよりも高いｐＨを有する工程；核酸の少なくとも一部を増幅して増幅産物を生成する工程；および増幅産物を検出する工程を含む、核酸増幅産物の生成および分析を提供する。一側面では、核酸をマイクロ流体領域に送達することは、核酸を含むまたは潜在的に含むと分かっているまたは疑われる生体試料を入手すること、試料を付着バッファーに添加すること、およびウイルスまたは細胞内容物が付着バッファーと混合するように付着バッファー中の細胞および／またはウイルスを溶解させるか、あるいは破壊することを含む。一側面では、核酸をマイクロ流体領域に送達する工程は、コスモトロピック塩およびヌクレアーゼ阻害剤を含む付着溶液を使用する。態様では、本開示の態様において使用される、バッファーを含むがこれに限定されない１種以上の溶液は、有機溶媒を含まない。態様では、溶液は、エタノールを含まず、カオトロピック塩を含まず、または有機溶媒もカオトロピック塩も含まない。当業者であれば、ある特定の場合において、用語「含まない」は、それにもかかわらず微量のカオトロピック塩、または有機溶媒を含んでいてもよく、有機溶媒は、エタノールもしくは本開示の利点を考慮すれば当業者に明らかになる他のアルコールを含むが必ずしもこれらに限定されないことを認識するであろう。
【００１０】
本開示の一側面では、精製および増幅の工程は、同じデバイス内または同じデバイス上で行われる。一側面では、精製、増幅、および検出はすべて同じデバイスで起こる。一側面では、増幅産物の検出に続いて、方法は、核酸の供給源のアイデンティティを判定すること、およびこの結果を診断提供者に報告し、この結果の記録をコンピュータ可読媒体で作成すること、または両方を含む。
【００１１】
添付の図は、ここで開示される代表的態様をさらに完全に説明するために使用される視覚的表現を提供し、ここで開示される代表的態様およびその固有の利点をさらによく理解するのに当業者であれば使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ−Ｔｆｉ  ＲＴ−ｑＰＣＲ性能試験についてのＡ）増幅曲線およびＢ）標準曲線。
【図２】Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ−ＡｍｐＴａｑ３６０  ＲＴ−ｑＰＣＲ性能試験についてのＡ）増幅曲線およびＢ）標準曲線。
【図３】非限定的例としてブランケットウェーハを使用するＨｆＯ２被覆表面を使用して、異なる結合ｐＨ、溶出ｐＨおよび溶出温度でのバッファーからのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡの抽出。
【図４】ＨｆＯ２被覆表面を使用する血漿からのＲＮＡの抽出中の洗浄バッファーにおけるＫＨ２ＰＯ４濃度の滴定。
【図５】ＨｆＯ２被覆表面を使用する１５の異なる血漿検体からのＲＮＡの抽出。
【図６】Ａｌ２Ｏ３被覆表面を使用する異なる結合ｐＨ、溶出ｐＨおよび溶出温度でのバッファーからのＲＮＡの抽出。
【図７】Ａｌ２Ｏ３被覆表面を使用する血漿からのＲＮＡの抽出中の洗浄バッファーにおけるＮａＯＡｃ濃度の滴定。
【図８】Ａｌ２Ｏ３被覆反応器を使用する１５の異なる血漿検体からのＲＮＡの抽出の結果。
【図９】ピラー構造体を有する反応表面を使用するＲＮＡの抽出の結果。
【図１０】（Ａ）削り取られたピラー表面上でのバッファーからのＲＮＡの抽出および精製により得られるサイクル閾値（Ｃｔ）のデータ。（Ｂ）ＲＮＡ回収結果。
【図１１】異なるｐＨ値を有する結合バッファーを使用して得られるＲＮＡ回収結果。
【図１２】加熱された血漿および異なる塩を使用して得られるＲＮＡ回収結果。
【図１３】プロテイナーゼを有する非加熱血漿を使用して得られるＲＮＡ回収結果。
【図１４】毛細管フローによるＲＮＡの抽出を表すデータを描いている。
【図１５】細胞培養から得られ、異なるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）濃度（Ａ）および温度（５５℃（Ｂ）および７５℃（Ｃ））で削り取られたピラーと一緒にインキュベートされたウイルス粒子の溶解を示すデータ。
【図１６】内部標準ＲＮＡおよびＨＣＶ  ＲＮＡを使用する蛍光正規化を表すデータ。
【図１７】代表的マイクロピラー形状の走査電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）
【図１８】容器設計の概略図
【図１９】代表的な容器設計のＳＥＭ；右パネルは検出セグメントを図示している。
【図２０】ＨＣＶ  ＲＮＡのオンチップ増幅により得られる結果を描いているグラフである。
【図２１】ウイルスＲＮＡのベンチスケール増幅。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０上で実施したＡ）ＨＣＶ、Ｃ）ＨＩＶ、およびＥ）ＺＩＫ  Ｖ  ＲＮＡ標準（１×１０６〜１×１００コピー／μＬ）についての平均Ｃｔ値。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０上での３つのＢ）ＨＣＶ、Ｄ）ＨＩＶ、およびＦ）ＺＩＫ  Ｖ標準レプリケート（４×１０６〜４×１００コピー／反応）にわたる平均正規化蛍光曲線。
【図２２】ウイルスＤＮＡのベンチスケール増幅。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０上で実施したＡ）ＨＰＶ  １６およびＣ）ＨＰＶ  １８  ＤＮＡ標準（１×１０６〜１×１００コピー／μＬ）についての平均Ｃｔ値。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０上での３つのＢ）ＨＰＶ  １６およびＤ）ＨＰＶ  １８標準レプリケート（４×１０６〜４×１００コピー／反応）にわたる平均正規化蛍光曲線。
【図２３】シリコンマイクロチップ設計および性能。Ａ）マイクロ反応器設計；Ｂ）増幅ボックス前（左）および後（右）の１．３μＬマイクロ反応器の代表的写真は、反応蛍光の定量化中に使用されるセグメントを示しており；Ｃ）ＰＣＢ上にマウントされる代表的マイクロチップ；Ｄ）反応蛍光の外部検出のための研究室装置；Ｅ）９３のセグメントにわたるＴｍの分布、バーは指示温度と共にセグメントの総数を表す。
【図２４】ウイルスＲＮＡのオンチップ増幅。シリコンマイクロチップマイクロ反応器において５０サイクルで実施したＡ）ＨＣＶ、Ｃ）ＨＩＶ、およびＥ）ＺＩＫ  Ｖ  ＲＮＡ標準（１×１０６〜１×１０１コピー／μＬ）についての平均Ｃｔ値。シリコンマイクロチップマイクロ反応器における３つのＢ）ＨＣＶ、Ｄ）ＨＩＶ、およびＦ）ＺＩＫ  Ｖ標準レプリケート（４×１０５〜４×１００コピー／反応）にわたる平均正規化蛍光増幅曲線。
【図２５】ウイルスＤＮＡのオンチップ増幅。チップ上５０サイクルで実施したＡ）ＨＰＶ  １６およびＢ）ＨＰＶ  １８  ＤＮＡ標準（１×１０６〜１×１０１コピー／μＬ）についての平均Ｃｔ値。チップ上での３つのＨＰＶ  １６標準レプリケート（４×１０５〜４×１００コピー／反応）にわたる平均正規化蛍光曲線。Ｃ）チップ上５０サイクルで実施したＨＰＶ  １８  ＤＮＡ標準（１×１０６〜１×１０１コピー／μＬ）についての平均Ｃｔ値。チップ上での３つのＢ）ＨＰＶ  １６およびＤ）ＨＰＶ  １８標準（４×１０５〜４×１００コピー／反応）レプリケートにわたる平均正規化蛍光曲線。
【発明の詳細な説明】
【００１３】
ここで他に定義されていなければ、本開示において使用されるすべての専門および科学用語は、本開示が関係する技術分野の当業者が一般に理解しているのと同じ意味を有する。
【００１４】
本明細書全体を通じて与えられるすべての数値範囲は、その上限および下限値、ならびにその範囲内に包含されるすべてのもっと狭い数値範囲を、そのようなもっと狭い数値範囲がまるですべてここに明白に記載されているかのように含む。
【００１５】
本開示は概して、核酸分析のための組成物、方法およびデバイスに関する。態様は、細胞および／またはウイルスの非核酸成分から核酸を分離すること、並びに核酸を検出するおよび／または定量することを含む。
【００１６】
さらに詳細には、臨床研究室ベースの核酸増幅検査（ＮＡＴ）は、ウイルス感染を診断するのに重要な役割を果たしているが、その研究室インフラストラクチャー要件および必要な時点で診断できないことが、潤沢な資金の臨床現場でも資金が限られた臨床現場でも、その臨床的有用性を制限している。迅速で感度のよいポイントオブケア（ＰＯＣ）ウイルスＮＡＴが開発されると、これらの限界を克服する可能性がある。シリコンマイクロ流体技術の進歩と組み合わせたシリコンマイクロチップ製造のスケーラビリティは、シリコンマイクロチップ上での迅速で感度のよいＰＯＣ  ＮＡＴを開発するのによい機会を提供する。
【００１７】
本開示の方法は、チップを含むデバイスを使用して実施され、このチップは、チャネルを含んでいてもよく、このチップでは、オンチップの核酸の分離、増幅および検出／定量が実施される。本開示は、ここに記載されるそれぞれのプロセス工程およびプロセス工程のすべての組合せ、ここに記載されるそれぞれの構成要素およびデバイスのすべての組合せおよびデバイスそのもの、ここに記載されるそれぞれの試薬および試薬の組合せ、ならびに前述の構成要素のすべての組合せを含む。ここに開示される方法は、核酸抽出に一般的に使用される有機溶媒および他のカオトロピック剤の使用を最小限に抑えるかまたは完全に回避する。したがって、本開示のある特定の実施は、臨床または研究室の現場の外で使用するには不適切であり、製造コストを増加させ、あるいは、完成したポイントオブケア用デバイスの特別な輸送／取り扱いを必要とする構成要素の使用を回避するという点で利点がある。
【００１８】
本開示の態様を実施するのに適切である構成要素は、シリコン酸化物または金属酸化物を含むがこれらに限定されないある特定の組成物で被覆されていてもよい１つ以上の固定表面（例えば、シリコンウェーハ、シリコンピラー）、結合／溶解バッファー、１種以上の洗浄バッファー、１種以上の溶出バッファー（これらのバッファーのうちの後者は増幅バッファーとして機能してもよい）を含む。
【００１９】
表面は、ある特定の態様では、１０マイクロリットルから１５００ナノリットルまでの体積を有するマイクロ流体環境内に存在するかまたは含有される。態様では、体積は、５マイクロリットル未満、２マイクロリットル未満、または約５００〜１５００ナノリットルである。いかなる特定の理論にも縛られずに、そのような反応体積および表面積は、例えば、精製され増幅されるそれぞれ個々の核酸を取り囲むマイクロ流体またはナノ流体シェルにおける迅速で正確な温度制御および迅速で正確な変化による、精製および増幅の正確な制御を可能にすると考えられる。
【００２０】
表面は、態様では、シリコン酸化物または金属酸化物または窒化物、例えば、酸化アルミニウム（Ａｌ２Ｏ３）、酸化ハフニウム（ＨｆＯ２）、シリコン窒化物（Ｓｉ３Ｎ４）、またはシリコン酸化物（ＳｉＯ２）である。表面は、核酸の付着（例えば、非共有結合による）、およびある特定の温度またはある特定のマイクロ流体溶液での核酸の保持、および他の温度または他のマイクロ流体溶液での核酸の効率的な放出を提供する。表面は、例えばシリコン酸化物ウェーハを使用して部分的に作製されるマイクロ流体容器上で／内で、化学蒸着（ＣＶＤ）技法などの技法により作製される。核酸の結合、および／または増幅、および／または検出が実施される表面は、開放（すなわち、平らなまたは滑らかな）空間でもよく、または空間は表面内もしくは表面上にある三次元的特徴、例えば、ピラーを含んでいてもよく、これは体積に対する面積の比を改良することができる。
【００２１】
態様では、本開示のマイクロ流体容器の三次元的特徴、またはその一部、またはマイクロ流体容器の表面は、基材、例えば、シリコンウェーハまたはシリコン窒化物の基材を改変することにより、任意の適切なアプローチを使用して形成される。態様では、基材は、エッチングを含むプロセスにより、少なくとも一部において変更される。「エッチング」とは、製造中に基材、例えば、ウェーハの表面から層が取り除かれることを意味する。本開示の利点を考慮すると、当業者であれば、以下でさらに説明されるように、任意の適切なエッチングまたは他のアプローチを適合させて、本開示の種々の態様において使用することができる表面を作製することができる。ある特定のアプローチでは、エッチングは、レーザーエッチング、液相エッチングまたはプラズマ相エッチングを含む。液相エッチングは、湿式エッチングまたは異方性湿式エッチングを含むことができる。同様に、プラズマエッチングは等方性または異方性であってもよい。態様では、シリコンウェーハは、深掘り反応性イオンエッチングにより本開示の種々の実施で使用するために改変される。深掘り反応性イオンエッチングのためのデバイス、試薬および方法は、当該技術分野で公知であり、当業者であれば、本開示の利点を考慮して、これらデバイス、試薬および方法を適合させて、マイクロピラーを含むが必ずしもこれに限定されない三次元的特徴を含む表面領域を有するマイクロ流体デバイスおよび／またはその構成要素を作製することができる。
【００２２】
マイクロピラーは、本開示の方法およびマイクロ流体構成要素／デバイスにおいて使用するのに適している寸法を含む。非限定的な例では、マイクロピラーは柱状であり、したがって、四角形でもよくまたは丸い形でもよい。態様では、マイクロピラーは１９０〜２００μｍ長である。長さは、マイクロピラーが突出している基材に対して直角をなしてもよく、マイクロピラーは基材と同じ材料で形成されてもよいと理解されている。ある特定の態様では、マイクロピラーはおおよそ２０μｍの幅または径を有する。ここでさらに説明されるように、マイクロピラーは一般には、適切なフロースルー動力学および表面領域を提供するように表面に形成され、それにより核酸を含む生体試料を、核酸の少なくとも一部がマイクロピラー表面に付着するように、マイクロピラー表面領域と接触させることが可能になる。ある特定の実施において、マイクロピラーは、例えばチップなどのマイクロ流体デバイスの容器構成要素に存在し、約５０μｍの中心間距離を有するように間隔が空いている。態様では、ピラー間距離は約３０μｍである。マイクロピラーを含むチップの断面図の走査電子顕微鏡写真の代表的および非限定的な画像は、図１７に提示されている。図１８では、２０μｍ幅（左から２番目のピラーの幅）、３０μｍ幅（左から２番目と３番目のピラーの間の幅）、および５０μｍ幅（前記マイクロピラーの中心間の距離）のスケールバーが示されている。右下のスケールバーは１００μｍ長を表している。ピラーは互い違いになっているので、薄い灰色のピラーが前面に最も近く、濃い灰色のピラーは後退している。マイクロピラーの高さは１８９および１９９μｍとして描かれている。これらの寸法のいずれの変動も本開示は包含している。例えば、チップ上の全試料体積の容量は、チップ面積、例えば、そのフットプリントを増やすことにより、および／または任意の特定の試料体積を収容するようにマイクロピラー間の空洞の深さを改変することにより、改変できる。態様では、深さの非限定的な例は１００μｍ〜５００μｍである。態様では、深さは３００〜３５０μｍであり得る。態様では、空洞の深さは３５０μｍまでであり得る。
【００２３】
マイクロピラーを形成後、その形成に使用した特定の技法とは無関係に、マイクロピラーは、適切な材料、例えば、ここに記載されるシリコン酸化物または金属酸化物で被覆される。ある特定の態様では、マイクロピラーは、任意の適切なアプローチを使用して、例えば、Ａｌ２Ｏ３、ＨｆＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、またはＳｉＯ２で被覆される。一つのアプローチでは、化学蒸着（ＣＶＤ）が使用される。ＣＶＤ技法は、当該技術分野で公知であり、本開示の利点を考慮すれば、本開示の態様において使用するためにこの技法を適合させて、例えば、マイクロピラーをＡｌ２Ｏ３、ＨｆＯ２、Ｓｉ３Ｎ４で被覆することができる。ある特定のアプローチでは、マイクロピラーは、ＣＶＤとは異なるアプローチを使用して、例えば、シリコンの熱酸化によりＳｉＯ２で被覆することができる。当業者であれば、シリコンの熱酸化中に酸化物成長動力学の周知のパラメータを適合させて、適切なＳｉＯ２マイクロピラーコーティングを達成することが容易にできる。態様では、本開示のマイクロピラーは、１０〜５００ｎｍ、ならびにその間のすべての数字および数字の範囲を含めた厚さを有する、Ａｌ２Ｏ３、ＨｆＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、またはＳｉＯ２の外層を含む。
【００２４】
上で述べたように、マイクロピラーは容器中に存在してもよい。ここに記載される核酸を含む試料を単離する、および／または精製する、および／または分析することができるように、任意の適切な容器を利用することができる。一般的に容器は、まっすぐな容器、角を含む屈曲または湾曲した屈曲のある容器を含むが必ずしもこれらに限定されない、流体試料のフローを可能にする任意の形状を有する。態様では、容器は、曲がりくねった形状を有し、したがって、１つ以上の屈曲または蛇行を有する。非限定的な態様では、曲がりくねった容器は４〜１２の屈曲を有する。容器は、特定の実施に応じておよびそのフットプリントの面積および／またはその深さを変化させることにより変わり得る全流体体積の容量を有する。一般に、適切な容器は、１μＬ以上の流体容量の容積を有する。非限定的な例では、容器は、４．０ｍｍ×６．０ｍｍ、ならびにその間のすべての数字および数字の範囲を含めた領域に収まる。態様では、本開示は、おおよそ４．５ｍｍ×５．０ｍｍであるピラーチャンバーを含む容器を含む。１つの非限定的な例として、容器設計の概略図が図１８に示されており、容器表面の分解立体図が右下角にあり、この図は図１７に描かれている電子顕微鏡写真に関連して提供されている。
【００２５】
ここで使用されるある特定の例では、上記の通りに形成されるマイクロピラーは、それが形成されるウェーハから削り取られる。次に、削り取られたマイクロピラーは、溶液中で使用されて、容積、バッファー成分、増幅および検出の試薬、時間、温度、マイクロピラー密度、表面積、ｐＨ等の点で内部容器環境を模倣するように設計されている核酸アッセイを実施する。
【００２６】
種々の態様では、本開示は、ここに記載される任意の表面を含み、表面は核酸と非共有結合によって結合している。態様では、本開示は、ここに記載されるＡｌ２Ｏ３、ＨｆＯ２、Ｓｉ３Ｎ４、またはＳｉＯ２を含むかまたはこれらから本質的になる組成物で被覆された複数のマイクロピラーを含み、ここで、ポリヌクレオチドはマイクロピラーの表面と非共有結合によって物理的結合をしており、すなわち、ポリヌクレオチドはマイクロピラーと複合体になっている。当業者であれば、ここに記載される物理的結合／複合体は一時的でもよく、本開示の任意の核酸の単離、検出、定量化または定量プロセスの実施中に存在してもよい熱力学、流体力学、生化学的要因、緩衝条件、平衡等に晒されることは認識している。
【００２７】
本開示で使用される溶液は、ここではバッファーとも呼ばれるが、溶解バッファー、結合バッファー、洗浄バッファー、および溶出バッファーのそれぞれの１種以上を含む。ある特定の態様では、結合／溶解溶液は、酸性緩衝ｐＨ（例えば、０、１、２、３、４、５、６、または７）を有し、コスモトロピック塩およびＮａＣｌを含めて１種以上の塩、ならびに任意にヌクレアーゼ阻害剤および／またはプロテイナーゼを含む。ある特定の態様では、この溶液は約１〜５のｐＨを有する。例えば、溶液は、約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、および５．０のｐＨを有してもよい。ある特定の態様では、この溶液は約２．０〜４．０のｐＨを有する。一態様では、溶液は約２．５〜３．９のｐＨを有する。ある特定の態様では、塩成分は、約０．５Ｍ〜２．０Ｍ（例えば、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、および２．０Ｍ）のＮａＣｌおよび約０．０１Ｍ〜５Ｍのコスモトロピック塩を含む。例えば、コスモトロピック塩は、約０．０１Ｍ、０．０２Ｍ、０．０３Ｍ、０．０４Ｍ、０．０５Ｍ、０．０６Ｍ、０．０７Ｍ、０．０８Ｍ、０．０９Ｍ、０．１Ｍ、０．１１Ｍ、０．１２Ｍ、０．１３Ｍ、０．１４Ｍ、０．１５Ｍ、０．１６Ｍ、０．１７Ｍ、０．１８Ｍ、０．１９Ｍ、０．２Ｍ、０．２１Ｍ、０．２２Ｍ、０．２３Ｍ、０．２４Ｍ、０．２５Ｍ、０．２６Ｍ、０．２７Ｍ、０．２８Ｍ、０．２９Ｍ、０．３Ｍ、０．３１Ｍ、０．３２Ｍ、０．３３Ｍ、０．３４Ｍ、０．３５Ｍ、０．３６Ｍ、０．３７Ｍ、０．３８Ｍ、０．３９Ｍ、０．４Ｍ、０．４１Ｍ、０．４２Ｍ、０．４３Ｍ、０．４４Ｍ、０．４５Ｍ、０．４６Ｍ、０．４７Ｍ、０．４８Ｍ、０．４９Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、２．０Ｍ、２．１Ｍ、２．２Ｍ、２．３Ｍ、２．４Ｍ、２．５Ｍ、２．６Ｍ、２．７Ｍ、２．８Ｍ、２．９Ｍ、３．０Ｍ、３．１Ｍ、３．２Ｍ、３．３Ｍ、３．４Ｍ、３．５Ｍ、３．６Ｍ、３．７Ｍ、３．８Ｍ、３．９Ｍ、４．０Ｍ、４．１Ｍ、４．２Ｍ、４．３Ｍ、４．４Ｍ、４．５Ｍ、４．６Ｍ、４．７Ｍ、４．８Ｍ、４．９Ｍ、および５．０Ｍの濃度を有してもよい。ある特定の態様では、コスモトロピック塩は約０．１Ｍ〜３Ｍの濃度を有する。一態様では、コスモトロピック塩は約０．１〜１．０Ｍの濃度を有する。一態様では、コスモトロピック塩は約０．１Ｍ〜０．３５Ｍの濃度を有する。ヌクレアーゼ阻害剤成分は、精製核酸を分解することができるリボヌクレアーゼによる精製核酸のコンタミネーションを予防または低減し、例えば、ＰＲＯＴＥＣＴＯＲリボヌクレアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ）、ＳＵＰＥＲａｓｅＩｎ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＲＮａｓｅＯＵＴ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、リボヌクレアーゼ阻害剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＲＮａｓｉｎ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む。ある特定の態様では、阻害剤の濃度は約１〜２Ｕ／μＬである。例えば、阻害剤の濃度は、約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２．０Ｕ／μＬでもよい。プロテイナーゼ成分は、タンパク質コンタミナント、および核酸増幅を妨害する溶解を通じて放出されるタンパク質を変性して分解し、例えば、ペプチダーゼＫまたはエンドペプチダーゼとしても知られるプロテイナーゼＫ（Ｇｅｒｉａｉｄ）を含む。ある特定の態様では、プロテイナーゼの濃度は約０．００１〜１００Ｕ／μｌである。一態様では、プロテイナーゼの濃度は約０．０１〜１０Ｕ／μｌである。コスモトロピック塩は、極性溶媒（例えば、水）の整然とした安定性に貢献する陽イオンまたは陰イオンを提供する。ある特定の態様では、コスモトロピック塩は、幾つかの溶液または緩衝液に含まれる。コスモトロピック塩は、例えば、硫酸塩、酢酸塩、炭酸塩、およびリン酸塩、例えば、（ＮＨ４）２ＳＯ４（硫酸アンモニウム）、ＣＨ３ＣＯＯＮａ（酢酸ナトリウム）、Ｈ２ＣＯ３（炭酸およびその塩基性種）、およびＫ２ＨＰＯ４（リン酸カリウムおよびその酸性／塩基性種）でもよい。態様では、ここに開示される方法は、核酸精製に一般的に使用されている有機溶媒および他のカオトロピック剤の使用を最小限に抑えるかまたは完全に回避する。いかなる特定の理論に縛られることを意図せずに、これらの構成成分は、臨床または研究室の現場の外での使用に適しておらず、製造コストを増加させ、あるいは、完成したポイントオブケア用デバイスの特別な輸送／取り扱いを必要とすると考えられる。
【００２８】
幾つかの態様では、１種以上の洗浄液は、少なくとも第１の洗浄バッファーおよび第２の洗浄バッファーを含む。洗浄バッファーは、核酸が表面に付着した後、核酸由来の溶解デブリスおよび他のコンタミナントを除去するように機能する。ある特定の態様では、第１の洗浄バッファーは、弱酸性であり、コスモトロピック塩、還元剤を含有し、例えば、リボヌクレアーゼ阻害剤を含んでもよい。一態様では、第１の洗浄バッファーは７未満のｐＨを有する。例えば、第１の洗浄バッファーは、約０．０、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、または６．９のｐＨを有してもよい。ある特定の態様では、第１の洗浄バッファーは約５未満のｐＨを有する。一態様では、第１の洗浄バッファーは約４未満のｐＨを有する。コスモトロピック塩は上記の通りに選択されてもよく、０．１Ｍ〜５Ｍの濃度で存在してもよい。例えば、コスモトロピック塩は、約０．１Ｍ、０．１１Ｍ、０．１２Ｍ、０．１３Ｍ、０．１４Ｍ、０．１５Ｍ、０．１６Ｍ、０．１７Ｍ、０．１８Ｍ、０．１９Ｍ、０．２Ｍ、０．２１Ｍ、０．２２Ｍ、０．２３Ｍ、０．２４Ｍ、０．２５Ｍ、０．２６Ｍ、０．２７Ｍ、０．２８Ｍ、０．２９Ｍ、０．３Ｍ、０．３１Ｍ、０．３２Ｍ、０．３３Ｍ、０．３４Ｍ、０．３５Ｍ、０．３６Ｍ、０．３７Ｍ、０．３８Ｍ、０．３９Ｍ、０．４Ｍ、０．４１Ｍ、０．４２Ｍ、０．４３Ｍ、０．４４Ｍ、０．４５Ｍ、０．４６Ｍ、０．４７Ｍ、０．４８Ｍ、０．４９Ｍ、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１．０Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、１．６Ｍ、１．７Ｍ、１．８Ｍ、１．９Ｍ、２．０Ｍ、２．１Ｍ、２．２Ｍ、２．３Ｍ、２．４Ｍ、２．５Ｍ、２．６Ｍ、２．７Ｍ、２．８Ｍ、２．９Ｍ、３．０Ｍ、３．１Ｍ、３．２Ｍ、３．３Ｍ、３．４Ｍ、３．５Ｍ、３．６Ｍ、３．７Ｍ、３．８Ｍ、３．９Ｍ、４．０Ｍ、４．１Ｍ、４．２Ｍ、４．３Ｍ、４．４Ｍ、４．５Ｍ、４．６Ｍ、４．７Ｍ、４．８Ｍ、４．９Ｍ〜約５．０Ｍの濃度を有してもよい。ある特定の態様では、コスモトロピック塩は約０．２〜４．０Ｍの濃度を有する。幾つかの態様では、コスモトロピック塩は約０．５〜２．５Ｍの濃度を有する。本開示の還元剤は、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）およびＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）を含むがこれらに限定されない。還元剤は約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で存在してもよい。例えば、還元剤は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９〜約２０ｍＭの濃度で存在してもよい。幾つかの態様では、還元剤は約１〜１０ｍＭの濃度で存在する。幾つかの態様では、還元剤は、上で選択され記載されているリボヌクレアーゼ阻害剤と一緒に、約１〜１０ｍＭの濃度で存在する。
【００２９】
追加の洗浄バッファーは、ｐＨおよび他の特性が異なっていてもよく、例えば、表面への核酸の付着を低減させることなく、付着した核酸の精製を改善するために溶質の組成および濃度を調整して、より低いもしくはより高いイオン強度、より低いもしくはより高いｐＨ、またはより低いもしくはより高い濃度のコスモトロピック塩もしくはリボヌクレアーゼ阻害剤を有していてもよい。より低いイオン強度の第２の洗浄バッファーを使用して、第１の洗浄バッファーから残っている追加のコンタミナントまたは残留塩を除去してもよい。ある特定の態様では、第２の洗浄バッファーは、弱酸性であり、コスモトロピック塩、ならびに任意に、たとえあるにしても、より少量の還元剤およびより少量のリボヌクレアーゼ阻害剤を含有する。幾つかの態様では、第２の洗浄バッファーは７未満のｐＨを有する。一態様では、第２の洗浄バッファーはｐＨ５未満のｐＨを有する。幾つかの態様では、第２の洗浄バッファーは約３．５〜４．５のｐＨを有する。コスモトロピック塩は上記の通りに選択してもよく、０．１〜５０ｍＭの濃度で存在してもよい。例えば、コスモトロピック塩は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ｍＭの濃度を有してもよい。幾つかの態様では、コスモトロピック塩は約１〜４０ｍＭの濃度を有する。幾つかの態様では、コスモトロピック塩は約１０〜２５ｍＭの濃度を有する。例えば、１０〜２５ｍＭのコスモトロピック塩（例えば、ＮａＯＡｃ）で緩衝された約４．０のｐＨを有する第２の洗浄バッファーを利用してもよい。
【００３０】
溶出バッファー（増幅バッファーとして機能してもよい）は、核酸を表面から取り外す。核酸が付着している間に増幅が実施される方法では、溶出バッファーは増幅の後に投与される。増幅が溶液中で実施される場合、溶出バッファーを使用して核酸を取り外し、増幅試薬は同時にまたはその後に添加される。ある特定の態様では、増幅および精製は、同じマイクロ流体スペースまたは反応器において実施される。ある特定の態様では、溶出バッファーは、低いイオン強度および中性から弱塩基性のｐＨを有する。例えば、溶出バッファーは６〜１０のｐＨを有してもよい。例えば、溶出バッファーは６、７、８、９、または１０のｐＨを有する。幾つかの態様では、溶出バッファーは約８．５のｐＨを有する。一態様では、溶出バッファーは、約８．５のｐＨを有し、約１０〜２５ｍＭのトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）および約０％〜３５％のＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を含有する。いかなる特定の理論にも縛られず、０％〜３５％はｖ／ｖを指す。幾つかの態様では、溶出バッファーは、安定化剤として約５〜２５％のＤＭＳＯを含有する。したがって、ある特定の態様における溶出バッファー／増幅バッファーは、ＤＭＳＯを含まなくてもよいし、またはごく微量のＤＭＳＯを含有してもよい。幾つかの態様では、本開示は、単一工程で、ウイルスおよび／または細胞の構成成分を溶解すること、および核酸を表面に結合させることを含み、したがって、同じ溶液が結合工程および溶解工程において使用される。なぜならば、これにより核酸の全体的な精製、増幅および検出の速度が増すからである。
【００３１】
幾つかの態様では、本開示は、検査される試料中の閾値量の核酸の検出を促進する。非限定的および仮説的な例として、試料が１００コピーのウイルスゲノムを含む場合、態様では本開示は、ゲノムのコピーのうちの少なくとも１つを検出するのに適切であり、コピーのうちの４〜１００、ならびにその間のすべての数字および数字の範囲を検出することを含むことができる。幾つかの態様では、本開示は、わずか４コピーの核酸、例えば、ＨＣＶゲノムを有する陽性結果を生じることを含む。幾つかの態様では、１×１０７〜４×１０７コピーが検出される。
【００３２】
本開示の非限定的な実証は、既知のＲＮＡ投入量を含む血漿を使用して提供されるが、核酸を含むか、または含むと疑われるもしくは疑われる可能性があるか、または含むことが知られている任意の生体試料または他の試料は、態様において使用可能であると予想される。幾つかの実施では、試料は、環境試料、例えば、水、食物物質の試料、あるいはデバイスまたは他の平坦なもしくは立体的な物、デバイス等を含むがこれらに限定されない無生物もしくは無生物表面から採取される試料を含む。態様では、試料は生体試料である。生体または他の試料は、直接使用してもよいし、または本開示のデバイスに適用される前に処理工程を受けてもよい。態様では、生体試料は、血液、血漿、尿、脳脊髄液、リンパ液、唾液、汗、精液、および涙腺分泌物を含むがこれらに限定されない、液体の生体試料を含む。生体試料は、処理された固形の生体試料、例えば、機械的解離を受けた生検および／または１種以上の溶液に晒され得る生検であってもよい。生体試料は、任意の適切な技法を使用してヒトもしくは非ヒト哺乳動物またはトリ動物から入手してもよい。したがって、ある特定の側面では、本開示は、ヒト医療応用に加えて、獣医学の分野での診断応用に適している。
【００３３】
本開示のアプローチを使用して単離／増幅／検出／定量化／定量されるポリヌクレオチドは、特に限定されない。一般にポリヌクレオチドは、ここでさらに説明されるように、リアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、すなわち、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含むがこれに限定されないポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を伴う方法による増幅を含むが必ずしもこれに限定されない増幅を受けるような適切な長さを有する。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖、または部分的に一本鎖もしくは二本鎖でもよく、ＲＮＡまたはＤＮＡでもよい。幾つかの態様では、ポリヌクレオチドはＲＮＡ分子であり、その増幅は、ｃＤＮＡ生成ならびにさらなる増幅および／または定量のための逆転写酵素を含むことができる。本開示の態様を使用して決定される核酸の種類および／または起源は、特に限定されず、例えば、任意の微生物に由来するものでもよく、この微生物は病原微生物を含むが必ずしもこれに限定されない。微生物は、原核生物でもまたは真核生物でもよい。本開示の目的のための「微生物」は、ウイルスも含む。態様では、微生物は、真菌、細菌、古細菌、ウイルス、および寄生原生動物を含む原生動物から選択される。態様では、本開示は、病原菌から核酸を同定することに関する。本開示は、細菌の任意の属、種、または株を用いて使用可能であると考えられる。ある特定の例では、本開示を使用して細胞内寄生体から核酸を検出する。
【００３４】
ウイルスに関しては、任意のウイルスを分析可能であると予想されるが、ある特定の態様では、ウイルスは一本鎖ＲＮＡゲノムを特徴とする。ゲノムは、（＋）鎖または（−）鎖でもよい。ウイルスは、エンベロープ型または非エンベロープ型でもよい。態様では、ウイルスＲＮＡは、以下のウイルス科、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）、またはパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）、またはラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）、またはブニヤウイルス科（Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ）、またはアレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）、またはオルトミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（あらゆるタイプのインフルエンザウイルスを含む）由来のウイルスゲノムである。態様では、ウイルスＲＮＡは、以下のウイルス科、ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）、アストロウイルス科（Ａｓｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）、カリシウイルス科（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ）、ヘペウイルス科（Ｈｅｐｅｖｉｒｉｄａｅ）、フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）、トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）、アルテリウイルス科（Ａｒｔｅｒｉｖｉｒｉｄａｅ）、およびコロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）由来のウイルスゲノムまたはその断片である。特定の態様では、ウイルスＲＮＡは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトリンパ球向性ウイルス、エプスタイン・バール・ウイルス、パルボウイルス、パラミクソウイルス、または単純ヘルペスウイルス由来である。他の態様では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡまたは非コードＲＮＡである。態様では、ＲＮＡは、ｓｎｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはミトコンドリアＲＮＡを含む。ある特定の態様では、ＲＮＡは、エキソソームを含むがこれに限定されない膜小胞の構成成分として生体試料に最初に存在してもよい。態様では、ＲＮＡは、がんを含むが必ずしもこれに限定されない障害を示す任意のタイプの循環ＲＮＡでもよい。本開示の非限定的な態様は、ＨＣＶ、ＨＩＶ、Ｚｉｋａ、ＨＰＶ−１６、およびＨＰＶ−１８を使用して例証される。
【００３５】
ある特定の非限定的な態様では、ポリヌクレオチドを含むまたは含むと疑われる生体試料は、分析されるポリヌクレオチドが存在する可能性がある細胞、ウイルスまたは他の物質を破壊することを意図した組成物またはプロセスに晒される。ある特定の態様では、破壊は、細胞またはウイルス粒子内の核酸が本開示の表面へ結合しやすくなるように、細胞の溶解もしくは細胞膜の破壊、および／またはウイルス粒子の破壊を含む。非限定的な態様では、存在する場合には試料中の核酸が、本開示の表面にアクセスできるか、またはアクセルできるように準備されるように、試料は、化学的処理、熱処理、もしくは機械的処理（超音波処理を含むがこれに限定されない）またはその組合せを受ける。ある特定の態様では、溶解は、例えば、洗剤を含むがこれに限定されない種々の成分のいずれかを含んでもよい化学的処理を使用して実施される。適切な洗剤は、当該技術分野で公知であり、ＳＤＳ（これは、任意の適切な濃度、例えば１％で使用可能である）、およびＮＰ−４０（これは、例えば０．５％で使用可能である）を含む。ある特定のアプローチでは、試料は、デバイス構成要素、例えば、カートリッジにおいて処理工程を受けることができ、ここで試料は、前述の組成物および／または条件のいずれか１つまたは組合せに晒される。試料は、例えば、試料の流体成分を分離材料、例えば、任意の適切な多孔度を有する膜を通過させる機械的圧力に晒されてもよい。機械的圧力は、試料体積の一部もしくはすべてをここに記載されるマイクロ流体容器に、および／または、部分的もしくは完全にこのマイクロ流体容器に通過させるのに十分であればよい。態様では、試料は、機械的圧力なしでデバイスの中を進み、代わりに、毛細管現象を介して移動する。態様では、ウィッキング材料が含まれていてもよい。態様では、試料は、任意の適切な供給源または装置により、例えば、オンボード発熱性化学反応成分により供給される熱に晒すことできる。同じアプローチは、例えば、増幅反応中に生じる加熱に適合させることができ、プロセスは、冷却目的のために吸熱性化学反応成分をさらに利用してもよく、したがって、ある特定の態様では、本開示のデバイスは、電池や他の電力源とは無関係に作動することができ、戦場環境を含むがこれに限定されない医療的緊急場面を含むが必ずしもこれに限定されない広範囲な状況におけるポイントオブケア適用にさらに利点を与える。
【００３６】
ある特定の態様では、本開示の方法および／またはデバイスおよび／またはシステムを使用することから得られる結果は、任意の適切な参照と比較可能であり、参照の例は、対照試料、標準曲線、および／または実験的に設計された対照、例えば、ポリヌクレオチドの量の定性的または定量的な決定のための実験データを正規化するのに使用される既知の投入ポリヌクレオチド値、またはカットオフ値を含むがこれらに限定されず、そのような対照は、必要に応じて、質量、モル濃度、濃度などを正規化するのに有用である。参照値は、グラフ上の面積として描いてもよい。態様では、本開示は、核酸の量を示すシグナルなどの結果を正規化するのに使用可能である内部標準を提供する。態様では、本開示は、キャリブレーター、すなわち、任意の特定のシグナルの精度を試験する、確立する、確認する等に使用可能である既知の投入量の使用を提供する。ある特定の態様では、１種以上のキャリブレーターおよび／または内部標準試料は、オンチップで保存することができるか、または、永久固定のおよび／もしくは着脱可能なカートリッジ構成要素を含むが必ずしもこれに限定されない別体のデバイス構成要素に保存することができる。ある特定の側面では、本開示は、それぞれのチップをキャリブレーションすること、またはチップの群（すなわち、ロット）から選択されたチップのみをキャリブレーションすることを含む。ある特定の非限定的な例では、本開示は、チップの別個のチャネルまたは他のセグメントにおいて正の対照および／またはキャリブレーターを含む。一つの実施では、溶解／結合バッファーは、セグメントの上を通過することができ、そこでは既知の濃度の対照ＲＮＡが、これはいわゆるアーマードＲＮＡ（例えば、バクテリオファージタンパク質とＲＮＡとの複合体を含む）を含んでもよいが、溶解／結合バッファー中で可溶化されており、抽出／増幅チャンバーまで送達される。アーマードＲＮＡは、検査試料と同じやり方で、溶解、ここに記載されるピラーへ結合、洗浄、増幅／検出することができる。態様では、対照のＣｔ値は、チップの特定のロットに関連する既定の標準曲線との比較のために使用され、したがって、標準曲線は、対照のＣｔ値に基づいて、例えば、それが予め定義された範囲内に収まる場合には、調整可能である。追加的または択一的に、本開示の態様は、内部標準を含むことができ、例えば、試料がＲＮＡについて検査されている場合には、アッセイパラメータ、性能等を評価するのに使用可能である任意の適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡを含むことができる。非限定的な態様では、内部標準ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写された苔の遺伝子ＲＮＡを含む。そのような内部標準ＲＮＡは、検査チャネルと正の対照チャネルの両方において分析を受け、したがって、検査ＲＮＡと同時に、抽出され、増幅され、検出されることになり、これはマルチプレックスフォーマットで実施することができる。内部標準プローブは、検査プローブのフルオロフォアとは分光的に異なったフルオロフォアまたは他の検出可能な標識とコンジュゲートしてもよい。したがって、両方のプローブ由来の増加した蛍光は、同時にモニターすることができ、内部標準が、妥当である��見なされる検査結果について予め定義された範囲内に必ず収まるように設定することができる。
【００３７】
ある特定の態様では、本開示のアプローチを使用してポリヌクレオチドの存在、非存在、または量の決定に基づく結果が得られ、その結果は、有形的表現媒体、例えば、デジタルファイルに固定され、および／または携帯式の記憶デバイスもしくはハードドライブに保存され、またはウェブベースもしくはクラウドベースの保存システムに伝達される。決定は、例えば、細菌もしくはウイルスの感染について診断するもしくは診断を補助するために、または試料中のポリヌクレオチドの存在および／もしくは量に関連する任意の疾患、障害もしくは状態についての治療的もしくは予防的アプローチをモニターするもしくは変更するために、医療提供者に伝達することができる。
【００３８】
ある特定の例では、本開示は製品を含み、これは態様ではキットと見なすことも可能である。製品は、ここに記載される核酸分析アプローチにおける使用のための少なくとも１つの構成要素および包装を含む。包装は、ここに記載されるマイクロ流体容器を含むデバイスおよび／またはチップを含有することができる。種々の態様では、製品は印刷物を含む。印刷物は、包装の一部であってもよく、あるいは印刷物は、ラベル上に、または包装と一緒に含まれる挿入紙もしくは他の文書として、提供することができる。印刷物は、包装の内容物に関する情報を提供し、使用者に核酸分析のための包装内容物の使用法を教える。態様では、製品は、例えば、ここに記載されるバッファーまたはストック溶液、任意の特定の生物についての既知のポリヌクレオチド配列に向けられたプライマー、ＲＴ−ＰＣＲ反応において使用するためのプライマー、そのような反応において使用するための標識プローブ、酵素、例えば、逆転写酵素および適切なＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼ阻害剤、ヌクレオチド等を含有する１種以上の適切な密封の無菌容器を含むことができる。一つのアプローチでは、包装は、核酸抽出においておよび／またはデバイス構成要素の表面に核酸をアニーリングするために使用される１種以上のバッファーを含むカートリッジを含む。
【００３９】
本開示の一例では、核酸を含有するバッファー、血液血漿または他の生物検体は、結合バッファーに添加され、その混合物は約５０〜７０℃まで加熱され、上記の金属酸化物またはシリコン酸化物のコーティング表面と一緒にインキュベートされて核酸結合を可能にする。マイクロ／ナノ流体スケールの利点を活かして、インキュベーション時間は、ある特定の態様では、６０分以下である。幾つかの態様では、インキュベーション時間は４５分以下である。幾つかの態様では、インキュベーション時間は３０分以下である。幾つかの態様では、インキュベーション時間は２０分以下である。幾つかの態様では、インキュベーション時間は１５分以下である。幾つかの態様では、インキュベーション時間は約１〜１５分である。例えば、インキュベーション時間は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４〜１５分である。このインキュベーションに続いて、表面は、コンタミナントを除去するために第１の洗浄バッファーで洗浄される。次に、表面は、第２の洗浄バッファーで洗浄して残留洗浄塩を除去する。最後に、核酸は、溶出バッファー（および５５℃でのインキュベーション）を使用して表面から溶出させてもよく、またはさらなる工程（すなわち、増殖）が、核酸をまだ表面に付着させたまま実施されてもよい。
【００４０】
ある特定の態様では、図１９に図示されるように、蛍光発光は、反応チャンバーの１つ以上のセグメントで測定することができる。デバイスは、光透過性窓付きでまたはなしで提供してもよく、この窓は任意の適切な材料、例えば、シリコン（すなわち、シリコン積層）からなるものでもよい。態様では、本開示は、光学的にアクセス可能である（例えば、シリコン上の石英または他の透明な材料の）反応チャンバー、例えば、撮像装置が反応チャンバーの近位に位置している反応チャンバーを使用してシグナルの読み出し情報を提供する。態様では、蛍光は容器内で検出され、したがって、容器は、ファイバー光導管に類似する機能を果たすことができる。このように、本開示は別の態様では、シグナルが発生する場所の近位に置かれている任意の適切なシグナル検出デバイスを介してシグナルを検出するためのいわゆる自由空間光通信の使用、または反応チャンバーへの光学的アクセス可能性がシグナルを検出するのに必ずしも必要でないように、シグナルを任意の適切な測定デバイスに送るための光導波管の使用を包含する。ある特定の側面では、本開示は、発光波長を有する光が発生するように、励起光でフルオロフォアを刺激することを包含する。態様では、放出シグナルが検出されるように、励起光および放出光は、光導波管を通って検出デバイスまで進む。任意の適切な導波管材料を使用可能である。態様では、光導波管はシリコン窒化物で形成される。態様では、光導波管は本開示のチップ中に組み込むことができる。態様では、光導波管は、シリコン酸化物（ＳｉＯ２）、酸化チタン（ＴｉＯ2）、ガラス、またはポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）を含むが必ずしもこれに限定されない種々のポリマーのいずれかで形成されている導波管を含む。
【００４１】
態様では、容器の１つ以上のセグメントは、デジタルプロセッサーおよび／またはコンピュータ実行ソフトウェアに接続するかまたはこれらと連絡して、蛍光シグナルの位置、量、強度等を解釈することができる。プロセッサーは、チップを含むデバイスの構成要素として含まれてもよく、プロセッサーは、ソフトウェアを実行するかまたはアルゴリズムを実行して、蛍光または別の光学的検出可能シグナルを解釈し、機械および／または使用者が読取り可能な出力を生み出す。態様では、チップ構成要素は、例えばカメラなどの検出デバイスを含むアダプター中に組み込むかまたは他の方法で挿入することができ、検出デバイスは蛍光検出用のプロセッサーを含んでもよい。態様では、コンピュータ読取り可能記憶媒体は、本開示のデバイスの構成要素であってもよく、任意のアッセイまたはここに記載される任意のアッセイの１つ以上の工程を実施中にまたはそれに続いて使用可能である。態様では、コンピュータ記憶媒体は、非一時的な媒体であり、したがって、シグナル、搬送波、および他の一時的シグナルを排除することができる。
【００４２】
例１および２は、本開示の態様をオンチップ適用まで進めるための基盤として設計されたＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを説明している。例３および４は、酸化ハフニウムまたは酸化アルミニウムで被覆されたブランケットシリコンウェーハを使用して実施し、ブランケットは、付着したガスケットで形成されるウェルを含有するシリコンウェーハの角切り長方形ピースを含む。ブランケットは、本開示のマイクロ反応器の表面のモデルである。ＲＮＡは、ブランケットに結合し、洗浄され、溶出され、ベンチトップＲＴ−ｑＰＣＲにおいて定量される。例５、６および７は、マイクロ流体反応器から削り取られたシリコンナノピラーを使用して実施し、核酸は、上記の通りに形成されたピラー構造体に付着した。ピラーは、反応器の商業的態様においてピラー表面コーティングの代表であり、拡散への依存度が低く回収率が高かった。とりわけ、例６および７の結果は、シリコン酸化物コーティングピラーに結合しているＲＮＡを使用して得られ；ＲＮＡは、定量前にピラーから溶出されることはなく、したがってナノピラーの被覆表面を使用したオンチップ実施をサポートする。例８は、毛細管フローによるＲＮＡの抽出（図１４）、ＨＣＶ粒子の化学的溶解および異なるＳＤＳ濃度と温度での粒子溶解のパーセントの定量（図１５）、ならびにＲＴ−ｑＰＣＲ反応において得られる結果を正規化するための内部標準ＲＮＡの使用を実証する。本開示は、内部標準ＲＮＡおよびＨＣＶ  ＲＮＡを使用した蛍光正規化を示すデータ（図１６）をさらに含み、ＨＣＶ  ＲＮＡのオンチップ増幅（図２０）も実証する。
【００４３】
以下の実施例は、本開示の態様を例証するが限定しないことを意図している。例１および２では、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス）ＲＮＡ検出アッセイは、反応あたり４コピー（ｃｐ）の感度で実施した。複数の核酸増幅アッセイは、４×１００〜４×１０６ｃｐ／反応の標準濃度範囲にわたって試験した。これらの標準濃度は、ＨＣＶ感染患者の９８％において測定されたＨＣＶ  ＲＮＡ血漿濃度の範囲ならびに上流工程である血漿分離およびＲＮＡ抽出の性能仕様に基づいて選択された。［例えば、Ｔｉｃｅｈｕｒｓｔ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２００７  Ａｕｇ；  ４５（８）：  ２４２６−２４３３参照］。これらの仕様は、２０μＬの最大血液試料、血液試料からの血漿の５０％回収（血液は平均で〜５０％の血漿を含有する）、および抽出プロセス中のＲＮＡの４０％回収を含む。表１は、観察された患者ＨＣＶ  ＲＮＡ濃度のスペクトラムに沿った代表的なハイおよびロウエンドコピー数値を使用して、これらの仕様を考慮に入れたプロセスに沿ったそれぞれの工程におけるＨＣＶ  ＲＮＡコピー数を例示している。
【００４４】
【表１】
2020510420.tif 000003
【００４５】
したがって、これらのアッセイは、すべてのＨＣＶ  ＲＮＡ陽性検体の９８％を検出するのに十分なダイナミックレンジ（４×１００〜４×１０６ｃｐ／反応）を有していた。試験は、１×１００〜１×１０６ｃｐ／μＬまで希釈した、下記のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＨＣＶ  ５’ＵＴＲ  ＲＮＡ標準を使用して実施した。それぞれの試料の１０のレプリケートが性能試験中に分析された。
【００４６】
２つのＲＴ−ｑＰＣＲアッセイは、マイクロ流体の精製、増幅および検出での使用に先立って、予備試験のためにスクリーニングした。アッセイ（Ａ）Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ−Ｔｆｉ（例１）およびアッセイ（Ｂ）Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ−Ａｍｐｌｉｔａｑ３６０（例２）。両方のアッセイは、２つの酵素を利用する：１）より高い反応温度でのより長い半減期および減少したリボヌクレアーゼＨ活性のために遺伝的に操作されているＭＭＬＶベースの逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ）、および２）増強された処理能力および安定性のために遺伝的に操作されているテルムス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）（Ｔｆｉ）またはテルスム・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）（ＡｍｐＴａｑ３６０）からクローニングされたＤＮＡポリメラーゼ。逆転写（ＲＴ）とｑＰＣＲの反応の両方が、シリコンマイクロチップ上の単一反応チャンバーにおいて実施されるＲＴ−ｑＰＣＲアッセイをモデル化するために、１つのウェル中でＲＴ反応を実施した後に反応の一部をｑＰＣＲウェルに移す代わりに、９６ウェルプレート上の同じウェルにおいて実施される。この「１チューブ」反応では、温度は、ＲＴ酵素によるｃＤＮＡの生成（ＲＮＡから一本鎖ＤＮＡ）に最適な温度に維持される。次に、温度を上げて、ＲＴ酵素を不活化し、ＤＮＡポリメラーゼを活性化する。次に、ｃＤＮＡは、通常のＰＣＲ温度サイクリングを使用して増幅させ、高温ではＤＮＡ二重鎖を融解させ、低いほうの温度ではアニーリングされたオリゴヌクレオチドプライマーからＤＮＡを伸長させる。増幅されたＤＮＡは、蛍光標識されたオリゴヌクレオチドプローブの使用を通じて定量される。プローブは、標的配列に相補的な配列、５’末端にコンジュゲートされたフルオロフォア、および３’末端にコンジュゲートされたクエンチャー分子を含む。ｑＰＣＲ増幅中、ＤＮＡポリメラーゼの固有の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性により、プローブは５’−３’方向に消化され、フルオロフォアは放出され、５’フルオロフォア蛍光のクエンチャー媒介抑制が軽減される。蛍光は、それぞれのｑＰＣＲサイクル終了時に測定され、試料中のＲＮＡの濃度を定量するために標準から得られた値と比較される。両方のアッセイでは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ標準を使用して、４×１００〜４×１０６ｃｐ／反応の標準範囲にわたってそれぞれのアッセイの性能を試験した。ＲＮＡ標準は、Ａｍｓｂｉｏから供給され、標準研究室分離菌から得られたＨＣＶ  ５’ＵＴＲ領域の相補的な全長配列を含有するプラスミド鋳型から生成された。ＨＣＶ  ５’ＵＴＲは、ＨＣＶゲノムの高度に保存された領域であるので、この分離菌由来のこの配列の使用は、ＨＣＶ配列の天然の多様性を表すはずである。ＲＮＡは、標準ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写技法を使用して生成され、鋳型ＤＮＡは、デオキシリボヌクレアーゼを使用して消化される。得られた生成物は、＜０．０１％の鋳型ＤＮＡコンタミネーションを含有する。ＤＮＡコンタミネーションレベルは容認できる。なぜならば、この量のＤＮＡは、シグナル発生に著しく寄与することはなく、標準は、＜１×１０４ｃｐ／μＬ���濃度でＤＮＡフリーであるからである。
【００４７】
例１
本例は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ−Ｔｆｉ  ＲＴ−ｑＰＣＲを使用する分析の説明を提供する。逆転写酵素：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより供給されるＭＭＬＶベースのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（ＳＳＩＩＩ）；ＤＮＡポリメラーゼ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより供給されるテルムス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）ポリメラーゼ（Ｔｆｉ）。最終反応試薬濃度：４０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ（ｐＨ８．１）、１５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２％のグリセロール、２００ｎＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭのフォワードプライマー（５’−ＣＣＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴ−３’）、４００ｎＭのリバースプライマー（５’−ＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧ−３’）、２００ｎＭのＡｔｔｏ６３３コンジュゲートプローブ（５’−Ａｔｔｏ６３３−ＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧ−ＩＡｂＲＱＳｐ−３’）、３．０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、３ｍＭのＤＴＴ、５０ＵのＳＳＩＩＩ、および１．７ＵのＴｆｉポリメラーゼ。
【００４８】
１．６７×濃縮マスター混合物を調製し、このマスター混合物の６μＬを４μＬのＲＮＡに添加した。この実験では、標準は、１０ｎｇ／μＬのキャリアＲＮＡを含有する１０ｍＭのトリス  ｐＨ７．５中で１×１００〜１×１０６コピー／μＬの範囲の最終濃度まで希釈した。ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）機器での温度サイクリングパラメータは、５５℃で１５分間、９５℃で３分間、１）９５℃で５秒間、２）６０℃で３０秒間の５０サイクルであった。蛍光はサイクル１１〜５０の間だけモニターした。
【００４９】
データ解析−ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）機器からの生の蛍光値を使用し、Ｒ  ｑｐｃＲパッケージ（フリーウェア統計解析プログラム）を使用して増幅曲線に適合させた。レプリケートごとのＣｔ値は、５パラメータＳ字状フィット曲線についての２次導関数最大値を決定することにより割り当てた。標準ごとの平均Ｃｔ値は標準ごとのＬｏｇ１０濃度に対してプロットし、データは線形回帰線と適合していた。線の勾配を使用して反応効率（効率＝１０（−１／勾配）−１）を決定し、それぞれの標準レプリケートの逆算濃度を使用して、それぞれの標準希釈物の試料再現性（標準偏差）を評価した。
【００５０】
このアッセイの確認では、それぞれの標準（１×１００〜１×１０６ｃｐ／μＬ）の１０のレプリケートを、上記の方法を使用してＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）機器で分析し、増幅曲線はＲ  ｑｐｃＲパッケージを使用して解析し、標準曲線を作成し、アッセイ性能を上記の通りに評価した。図１は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ−Ｔｆｉ  ＲＴ−ｑＰＣＲ性能試験についての増幅曲線および標準曲線を図示している。線形回帰線の式は標準曲線グラフに含まれている。それぞれの標準希釈物の１０のレプリケートは、ＳＳＩＩＩ−Ｔｆｉ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを使用して分析し、試験の増幅曲線は図１に描かれている。標準ごとの平均Ｃｔ値は標準ＲＮＡ濃度に対してプロットされ、データは、以下の式：Ｙ＝−３．２８９Ｘ＋２７．９１を有する線形回帰線と適合していた（図１Ｂ）。この勾配は１０１．４％の反応効率に対応している。４×１０１〜４×１０６ｃｐ／反応標準の１０のレプリケートすべて（１００％検出）および４×１００ｃｐ／反応標準の８のレプリケート（８０％検出）が検出された（表２）。アッセイ再現性はＨＣＶ  ＲＮＡ標準の濃度が減少するにしたがって減少した（増加する変動性により表される）が、すべての標準にわたる平均再現性は０．０９  Ｌｏｇ１０であった（表２）。
【００５１】
【表２】
2020510420.tif 000004
【００５２】
例２
本例は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ−Ａｍｐｌｉｔａｑ３６０  ＲＴ−ｑＰＣＲを使用する態様を示す。逆転写酵素：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより供給されるＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（ＳＳＩＩＩ）；ＤＮＡポリメラーゼ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより供給されるテルムス・アクウァーティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼ（ＡｍｐＴａｑ３６０）。最終反応試薬濃度：５０ｍＭのトリス（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、２００ｎＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭのフォワードプライマー（５’−ＣＣＣＣＴＧＴＧＡＧＧＡＡＣＴＡＣＴＧＴ−３’）、４００ｎＭのリバースプライマー（５’−ＧＡＣＣＡＣＴＡＴＧＧＣＴＣＴＣＣＣＧ−３’）、２００ｎＭのＡｔｔｏ６３３コンジュゲートプローブ（５’−Ａｔｔｏ６３３−ＡＧＣＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＧＴＡＴＧＡＧＴＧＴＣＧ−ＩＡｂＲＱＳｐ−３’）、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、３ｍＭのＤＴＴ、５０ＵのＳＳＩＩＩ、および１．２５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ３６０ポリメラーゼ。
【００５３】
１．６７×濃縮マスター混合物を調製し、このマスター混合物の６μＬを、１０ｎｇ／μＬのキャリアＲＮＡを含有する１０ｍＭのトリス  ｐＨ７．５中で１×１００〜１×１０６コピー／μＬの範囲の最終濃度まで希釈した４μＬのＲＮＡ標準に添加した。それぞれの標準の１０のレプリケートを試験した。ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）機器での温度サイクリングパラメータは、５５℃で１５分間、９５℃で３分間、ａ）９５℃で５秒間、続いてｂ）６０℃で３０秒間の５０サイクルであった。蛍光は最後の４０サイクルだけにわたりモニターした。
【００５４】
データ解析−ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）機器からの生の蛍光値を使用し、Ｒ  ｑＰＣＲパッケージ（フリーウェア統計解析プログラム）を使用して増幅曲線に適合させた。レプリケートごとのＣｔ値は、５パラメータＳ字状フィット線についての２次導関数最大値を決定することにより割り当てた。標準ごとの平均Ｃｔ値は標準ごとのＬｏｇ１０濃度に対してプロットし、データは線形回帰線と適合していた。線の勾配を使用して反応効率（効率＝１０（−１／勾配）−１）を決定し、それぞれの標準レプリケートの逆算濃度を使用して、それぞれの標準希釈物の試料再現性（標準偏差）を評価した。
【００５５】
ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）機器からの生の蛍光値を使用し、Ｒ  ｑｐｃＲパッケージ（フリーウェア統計解析プログラム）を使用して増幅曲線に適合させた。レプリケートごとのＣｔ値は、５パラメータＳ字状フィット線についての２次導関数最大値を決定することにより割り当てた。標準ごとの平均Ｃｔ値は標準ごとのＬｏｇ１０濃度に対してプロットし、データは線形回帰線と適合していた。線の勾配を使用して反応効率（効率＝１０（−１／勾配）−１）を決定し、それぞれの標準レプリケートの逆算濃度を使用して、それぞれの標準希釈物の試料再現性（標準偏差）を評価した。
【００５６】
このアッセイの確認では、それぞれの標準（１×１００〜１×１０６ｃｐ／μＬ）の１０のレプリケートを、上記の方法を使用してＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）機器で分析し、増幅曲線はＲ  ｑｐｃＲパッケージを使用して解析し、標準曲線を作成し、アッセイ性能を上記の通りに評価した。図２は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ−ＡｍｐＴａｑ３６０  ＲＴ−ｑＰＣＲ性能試験についての増幅曲線および標準曲線を図示している。線形回帰線の式は標準曲線グラフに含まれている。
【００５７】
それぞれの標準希釈物の１０のレプリケートは、ＳＳＩＩＩ−ＡｍｐＴａｑ３６０  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを使用して分析し、試験の増幅曲線は図２に描かれている。標準ごとの平均Ｃｔ値は標準ＲＮＡ濃度に対してプロットされ、データは、以下の式：Ｙ＝−３．１５４Ｘ＋２６．０６を有する線形回帰線と適合していた（図２）。この勾配は１０７．５％の反応効率に対応している。４×１０１〜４×１０６ｃｐ／反応標準の１０のレプリケートすべて（１００％検出）および４×１００ｃｐ／反応標準の９のレプリケート（９０％検出）が検出された（表３）。アッセイ再現性はＨＣＶ  ＲＮＡ標準の濃度が減少するにしたがって減少した（増加する変動性により表される）が、すべての標準にわたる平均再現性は０．０５  Ｌｏｇ１０であった（表３）。
【００５８】
【表３】
2020510420.tif 000005
【００５９】
例３
本例は、ＲＮＡの精製のためのＨｆＯ２被覆表面の使用を示している。特に、本例は、酸化ハフニウムの表面コーティングを有するシリコン酸化物ブランケットに添加された上記のＣ型肝炎ＲＮＡを含有する溶液の使用を示している。図３は、異なる結合ｐＨ、溶出ｐＨおよび溶出温度でのＲＮＡスパイクドバッファーからのＲＮＡの抽出を描いている。２から４未満のｐＨ値についての範囲および温度にわたるパーセント回収は４０％を超えており、血液または他の生物検体中の病原体核酸の感度の良い検出を可能にするのに十分な精製核酸の回収を実証している。図４は、血漿からのＲＮＡの抽出の間の洗浄バッファー中のＫＨ２ＰＯ４濃度の滴定を描いており、精製ＲＮＡの回収が１５００ｍＭのＫＨ２ＰＯ４で４０％を超えているので、コスモトロピックＫＨ２ＰＯ４の存在は効果的であることを示している。
【００６０】
図５は、１５人の異なるドナーから入手した１５の血漿検体からのＲＮＡの抽出を描き、平均回収３０．５％および平均からの分散１２．５％であり、病原体ＲＮＡの回収が広範囲の血漿検体にわたって達成されていることを示している。
【００６１】
例４
本例は、Ａｌ２Ｏ３被覆表面でのバッファーからのＲＮＡの抽出および精製を示している。Ｃ型肝炎ＲＮＡを含有する溶液を上記の通りに調製し、酸化アルミニウムの表面コーティングを有するシリコン酸化物ブランケットに添加した。図６は、異なる結合ｐＨ、溶出ｐＨおよび溶出温度でのＲＮＡスパイクドバッファーからのＲＮＡの抽出を描いている。ｐＨ３についての範囲および温度にわたるパーセント回収は４０％を超えており、血液または他の生物検体中の病原体核酸の感度の良い検出を可能にするのに十分な精製核酸の回収を実証している。図７は、血漿からのＲＮＡの抽出の間の洗浄バッファー中のＮａＯＡｃ濃度の滴定を描いており、精製ＲＮＡの回収が１０００ｍＭのＮａＯＡｃで３０％を超えているので、コスモトロピックＮａＯＡｃの存在は効果的であることを示している。図８は、１５人の異なるドナーから入手した１５の血漿検体からのＲＮＡの抽出を描き、平均回収２７．３％および平均からの分散１０．８％であり、病原体ＲＮＡの回収が広範囲の血漿検体にわたって達成されていることを示している。
【００６２】
例５
本例は、ｐＨ２〜４の結合バッファーを用いるマイクロピラー構造物からの血漿中のＲＮＡの抽出および精製を示している。さらに詳細には、血漿中に１×１０５のＣ型肝炎ＲＮＡを含有する溶液を調製し、シリコン酸化物、酸化ハフニウムおよび酸化アルミニウムのピラーを有する反応表面に添加した。コスモトロピック塩（Ｓｉ−なし、Ｈｆ−Ｋ２ＨＰＯ４、Ａｌ−ＮａＯＡｃ）の範囲を有するｐＨ４洗浄バッファー、続いて５５℃で塩基性溶出バッファー（Ｓｉ−ｐＨ９．５、Ｈｆ−９．５、Ａｌ−８．５）を使用し、他の条件は上記の通りであった。ピラーは反応表面から取り除き、次に、溶出バッファーで処理し、非結合画分はＱｉａｇｅｎウイルスＲＮＡ精製キットを用いて溶出バッファーから精製したことに留意されたい。溶出およびピラー結合のＲＮＡはＳＳＩＩＩ−ＡＴ３６０アッセイにより分析した。図９は、ピラー、溶出、およびピラー＋溶出バッファーからのＣ型肝炎ＲＮＡの回収のパーセントを示しており、反応器表面への付着および核酸回収の増加を改善するためにコスモトロピック塩およびピラー構造物を使用することの利点を明らかにしている。図９では、それぞれのｐＨ値（２、３および４）での４つのｐＨ値ごとに、グラフ中の柱は左から右に、溶出、非結合、ピラー、溶出＋ピラーである。
【００６３】
例６
本例は、ピラー表面でのバッファーからのＲＮＡの抽出および精製を示している。例５からの上記プロトコルは、１×１００〜１×１０６コピー／μＬの範囲に及ぶＣ型肝炎ＲＮＡの濃度を有する血漿標準を用いて、シリコン酸化物コーティングチップから削り取られたピラーを使用して、ならびに結合バッファーをｐＨ２．５でおよび洗浄バッファーをｐＨ２．３で使用して、実施した。血漿中のＲＮＡの精製およびポジティブな検出は、１μＬあたり１０コピー〜１×１０６の範囲に及ぶ濃度で達成された。下の表４に示すように、ＲＮＡの極端に低い濃度についてさえ平均回収は５０％またはこれに近いおよびこれよりも上であり、市販のキットにより得られる回収に近づいている。
【００６４】
【表４】
2020510420.tif 000006
【００６５】
図１０（ａ）は、すべての濃度について３０をずっと下回るサイクル閾値（Ｃｔ）を示しており、血漿からの核酸の安定した回収を示しており、図１０（ｂ）は、パーセント回収が平均して５０％近くまたはそれよりも高かったことを示している。
【００６６】
例７
本例は、異なった反応条件でのＲＮＡの回収を示している。
【００６７】
図１１にまとめられているデータは、異なるｐＨ値、塩および温度での血漿中のｐＨ２〜１０の結合バッファーにおいてスパイクされたＲＮＡ（１×１０５ｃｐ／μＬ）の回収を示している。特に、図１１に示されるように、２０ｍＭのバッファー（ｐＨ２〜１０）においてスパイクされたＲＮＡは、削り取られたシリコン酸化物コーティングピラーと一緒に１０分間インキュベートし、結合バッファーで２×洗浄し、次に、ピラーに結合したＲＮＡの量を決定した。しかし、いかなる特定のアプローチに制約されるつもりはないが、データは、バッファーにおいてスパイクされたＲＮＡの最大結合がｐＨ３〜４で起こることを実証している。
【００６８】
図１２および１３は、ｐＨ２〜５の範囲にわたる結合バッファーを使用するＲＮＡ（１×１０５ｃｐ／μＬ）の回収をまとめている。ＲＮＡは、結合バッファー（３００ｍＭの（ＮＨ３）２ＳＯ４を含有する）および５５℃で１０分間加熱された血漿（図１２）（熱ベースの溶解をモデル化するため）またはプロテイナーゼを有する非加熱血漿（化学ベースの溶解をモデル化するため；図１３）中にスパイクされ、その混合物は、削り取られたシリコン酸化物コーティングピラーと一緒に１０分間インキュベートされた。図１２では、ピラーは、（対照）コスモトロピック塩ありまたはなしで洗浄バッファー（２０ｍＭ  ｐＨ２、３、４または５）で１×洗浄し、次に、塩なしで洗浄バッファーを用いて１×洗浄した。次に、ピラーに結合しているＲＮＡの量はＲＴ−ｑＰＣＲにより分析した。示されるように、コスモトロピック塩の添加は回収を著しく増加させた。
【００６９】
図１３では、ＲＮＡは正常なヒト血漿中にスパイクされ、これは、３００ｍＭの（ＮＨ３）２ＳＯ４、ＤＴＴ（１ｍＭ、最終濃度）、ＲＮａｓｉｎ（１対２０希釈）およびプロテイナーゼＫ（０．２５ｍｇ／ｍｌ最終濃度）を含有する結合バッファー（ｐＨ２〜５）で希釈した。これを、シリカ酸化物被覆チップから削り取られたピラーに添加し、１０分間インキュベートした。血漿／結合バッファーは除去し、ピラーは、１）１ＭのＫＨ２ＰＯ４を含有する２０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４、次に２）２０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ４で洗浄した。次に、結合ＲＮＡはＨＣＶ  ＲＮＡ  ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを使用して定量した。結果は図１３に示されている。
【００７０】
例８
本例は、毛細管フローによるＲＮＡの抽出および増幅、ＲＮＡの分析のために商品名ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ（登録商標）４８０で販売されているデバイスにより定量されるＨＣＶ粒子の溶解、ならびに結果を正規化するための内部ＲＮＡ標準の使用を実証する。
【００７１】
図１７に示されるデータを得るために、ＨＣＶ細胞培養上澄みから精製されたＨＣＶ  ＲＮＡは正常なヒト血漿中にスパイクされ、この混合物は結合バッファー（３００ｍＭの（ＮＨ３）２ＳＯ４、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｎｇ／μＬのキャリアＲＮＡ、ＲＮａｓｉｎ（１対２０希釈）を有するＨＣｌ／ＫＣｌバッファーｐＨ２．５）に添加し、チップに添加した。チップは、リザーバー、ＲＮＡ結合のためにマイクロピラー付きのチャンバーに繋がっているチャネル、および第２のマイクロピラーアレイを含む第２のチャネル（キャピラリーポンプ）を含んでいた。ＲＮＡ／結合バッファーは、抽出チャンバーを横断して流れた。チップは、毛細管フローにより、洗浄バッファー１（１ＭのＫＨ２ＰＯ４を有する酢酸ナトリウムｐＨ４）、次に洗浄バッファー２（酢酸ナトリウムｐＨ４）で洗浄した。ピラーはチップから削り取り、ＨＣＶ  ＲＮＡは、ＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲを使用して定量した。Ｙ軸に示されるパーセント回収は、結合バッファー中にスパイクされたＲＮＡの量と比べて、ピラー上で検出されたＲＮＡの量を表す。
【００７２】
図１５は、ウイルス粒子の溶解、および溶解した粒子のパーセントを測定するためのウイルスＲＮＡの分析から得た結果を描いている。図１５Ａ）細胞培養から得たＨＣＶウイルス粒子はＰＢＳに懸濁させ、０．１〜０．６％のＳＤＳを含有する結合バッファー（３００ｍＭの（ＮＨ３）２ＳＯ４、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｎｇ／μＬのキャリアＲＮＡ、ＲＮａｓｉｎ（１対２０希釈）を有するＨＣｌ／ＫＣｌバッファーｐＨ２．５）に添加し、削り取られたピラーと一緒にインキュベートした。ピラーは、洗浄バッファー１（１ＭのＫＨ２ＰＯ４を有する酢酸ナトリウムｐＨ４）、次に洗浄バッファー２（酢酸ナトリウムｐＨ４）で洗浄した。ＲＮＡに結合したＨＣＶの量はＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲ上で定量した。細胞培養から得たＨＣＶウイルス粒子はＰＢＳに懸濁させ、０．１〜０．６％のＳＤＳを含有する結合バッファー（３００ｍＭの（ＮＨ３）２ＳＯ４、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｎｇ／μＬのキャリアＲＮＡ、ＲＮａｓｉｎ（１対２０希釈）を有するＨＣｌ／ＫＣｌバッファーｐＨ２．５）に添加し、５５℃で５分間（図１５Ｂ）または７５℃で２もしくは５分間（図１５Ｃ）削り取られたピラーと一緒にインキュベートした。ピラーは、洗浄バッファー１（１ＭのＫＨ２ＰＯ４を有する酢酸ナトリウムｐＨ４）、次に洗浄バッファー２（酢酸ナトリウムｐＨ４）で洗浄した。ＲＮＡに結合したＨＣＶの量はＬＩＧＨＴＣＹＣＬＥＲで定量した。
【００７３】
図１６は、投入ＲＮＡとの比較のための内部ＲＮＡ標準の使用を描いている。グラフ上に描かれているデータを得るために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＨＣＶおよびニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）（広がる地苔、内部標準）ＲＮＡの４×１０４コピーを同じＲＴ−ｑＰＣＲ反応で増幅させ、蛍光を５０サイクルにわたってモニターした。最初の１０サイクルの平均蛍光を使用してサイクル１０〜５０での蛍光を正規化した（最初の１０サイクルは図には表されていない）。
【００７４】
図２０は、ＨＣＶ  ＲＮＡのオンチップ増幅を描いている。チップは、プリントされた回路基板にマウントされたピラーのない反応チャンバーを含んでいた。試薬はチップ上にピペットで移し、コンピュータ制御温度により集中制御された。蛍光は蛍光顕微鏡を使用してモニターした。図２０（左パネル）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡ標準中の１×１０６〜１×１０のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＨＣＶについての増幅曲線を示している。最終試薬濃度は以下の通りである：１０ｍＭのトリスｐＨ８．４、７５ｍＭのＫＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのｄＮＴＰ、２００ｎＭのフォワードプライマー、２００ｎＭの蛍光標識されたプローブ、４００ｎＭのリバースプライマー、１０ｎｇ／μＬのキャリアＲＮＡ、０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、３ｍＭのＤＴＴ、５０ＵのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩおよび５ＵのＡｍｐＴａｑ３６０。サイクリング条件は以下の通りである：５５℃で５分間、９５℃で３分間、９５℃で５秒間、続いて６０℃で１０秒間を５０サイクル。蛍光は、ＲＴ工程の終了時におよびそれぞれのサイクル後に測定した。ＲＴ後の蛍光はそれぞれのサイクル時の蛍光から減算し、次に最初の１０サイクルの平均蛍光を使用してサイクル１１〜５０の蛍光値を正規化した。最初の１０サイクルからの蛍光はグラフ上には表示されていない。曲線はＲでのｑＰＣＲプログラムにおいて５パラメータモデルを使用して適合させた。図２０（右パネル）は、フィット線の２次導関数最大値を決定することにより同定され、標準濃度に対してプロットされたＣｔ値を示している。線形回帰を使用して直線を適合させ、直線の勾配および適合度はグラフ上に表示されている。したがって、図２０は、シリカの存在下および組み込まれたヒーターを使用するオンチップでの効率的で感度の良いアッセイの性能を実証している。
【００７５】
例９
本例は、上の例を拡張し、ベンチトップリアルタイムＰＣＲ機器上でＨＣＶ、ＨＩＶ、Ｚｉｋａ、ＨＰＶ１６、およびＨＰＶ１８を検出する感度の良い（４コピー／反応）ＲＴ−ｑＰＣＲおよびｑＰＣＲアッセイを示している。
【００７６】
さらに詳細には、本例では、我々は、同じシリコンマイクロチッププラットホーム上でいくつかのＲＮＡおよびＤＮＡウイルスについての迅速で感度の良いＮＡＴを開発した。最初に、ベンチトップリアルタイムＰＣＲ機器上でＨＣＶ、ＨＩＶ、Ｚｉｋａ、ＨＰＶ１６、およびＨＰＶ１８を検出する感度の良い（検出限界（ＬＯＤ）、４コピー／反応）一工程ＲＴ−ｑＰＣＲおよびｑＰＣＲアッセイを開発した。融解温度分析を使用するマイクロ反応器の正確で局所的な加熱の実証に続いて、エッチングを施した蛇行しているマイクロ反応器、組み込まれたアルミニウムヒーター、断熱溝および試薬の送達のためのマイクロ流体チャネルを備えた同じ新規のシリコンマイクロチップ設計を本例でのすべてのオンチップ実験に使用した。反応条件の最小限の最適化に続いて、ベンチスケール一工程ＲＴ−ｑＰＣＲおよびｑＰＣＲアッセイを１．３μＬのシリコンマイクロ反応器に成功裏に移し、反応時間は２５分でＬＯＤへの影響はなかった。その上、ベンチスケールおよびオンチップアッセイの再現性および反応効率は類似していた。総合すると、これらの結果は、同じシリコンマイクロチッププラットホーム上で複数のウイルスの迅速で感度の良い検出が実現可能であることを実証している。シリコンマイクロチップベースの核酸抽出溶液と組み合わせた、この技術をさらに開発すれば、ウイルス核酸検出および診断を集中型臨床研究所からＰＯＣに潜在的に移すことができると考えられる。
【００７７】
以下の材料及び方法を使用して本例に記載される結果を得た。
【００７８】
オリゴヌクレオチドおよび標準
すべてのプライマーおよび加水分解プローブは、ＰｒｉｍｅｒＢｌａｓｔ  （ＮＣＢＩ）および一般公開されている配列（Ｇｅｎｍｅｄ、ＮＣＢＩ）を使用して設計し、ＩＤＴ技術により合成した（表１）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写された（ＩＶＴ）ウイルスＲＮＡは購入し（Ａｍｓｂｉｏ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、ＲＮＡ標的ごとの標準として使用した（表２）。ＤＮＡ標準では、直線化ｐＨＰＶ−１６プラスミドＤＮＡ（クローン４５１１３Ｄ、ＡＴＣＣ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）およびｐＨＰＶ−１８プラスミドＤＮＡ（クローン４５１５２Ｄ、ＡＴＣＣ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ）を標準として使用した。
【００７９】
ＲＮＡウイルスのベンチスケールアッセイ開発
ベンチスケールＲＴ−ｑＰＣＲアッセイはすべてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０機器（Ｒｏｃｈｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して開発し、標的ごとのＩＶＴ  ＲＮＡを標準として使用した。増幅は、５０ｍＭのトリスｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、２００μＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、２００ｎＭのフォワードプライマー（ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｏｗａ）、４００ｎＭのリバースプライマー（ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｏｗａ）、２００ｎＭの加水分解プローブ（ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｏｗａ）、０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、３ｍＭのＤＴＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、５０ユニットのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）および１．２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ３６０ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含有する１０μＬの反応を使用して実施した。ＨＣＶおよびＨＩＶアッセイは２．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含有し、Ｚｉｋａアッセイは３ｍＭのＭｇＣｌ２を含有した。ＨＣＶアッセイサイクリング条件は、５５℃で１５分間のＲＴ工程、９５℃で３分間の最初の変性工程、ならびに９５℃で１０秒間の変性および６０℃で３０秒間の増幅を５０サイクル、全アッセイ時間７０分間を含んだ。ＨＩＶとＺｉｋａアッセイの両方が、５５℃で５分間のＲＴ工程、９５℃で３分間の最初の変性工程、ならびに９５℃で５秒間の変性および６０℃で１０秒間の増幅を５０サイクル、全アッセイ時間５１分間を含むサイクリング条件を使用した。実験で使用した標準濃度は反応あたり４×１０６〜４×１００コピーの範囲に及んだ。
【００８０】
ＤＮＡウイルスのベンチスケールアッセイ開発
ベンチスケールアッセイはＤＮＡウイルスＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８について開発した。ＨＰＶ標的の増幅は、５０ｍＭのトリスｐＨ８．３、７５ｍＭのＫＣｌ、２００μＭのｄＮＴＰ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、２００ｎＭのフォワードプライマー（ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｏｗａ）、４００ｎＭのリバースプライマー（ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｏｗａ）、２００ｎＭの加水分解プローブ（ＩＤＴ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｏｗａ）、０．２ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、３ｍＭのＤＴＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）、１．２５ユニットのＡｍｐｌｉＴａｑ３６０ポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を含有する１０μＬの反応を使用して実施した。実験で使用した標準濃度は反応あたり４×１０６〜４×１００コピーの範囲に及んだ。ＨＰＶ１６アッセイは１．５ｍＭのＭｇＣｌ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を含有し、ＨＰＶ１８アッセイは４．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有した。ＨＰＶ１６アッセイについてのサイクリング条件は、９５℃で３分間の最初の変性工程、ならびに９５℃で１０秒間の変性および６０℃で３０秒間の増幅を５０サイクル、全アッセイ時間６７分間を含んだ。ＨＰＶ１８アッセイは同じプロトコルを利用したが、６０℃の代わりに６２℃で３０秒間の増幅を用いた。
【００８１】
ベンチスケールデータ解析
ベンチスケールアッセイでは、Ｃｔ値はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ４８０ソフトウェアを使用して決定した。アッセイごとに５０サイクルを実施したが、最初の１０サイクル中は反応蛍光をモニターしなかった。したがって、それぞれの実行の終了時には、１０サイクルがＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０ソフトウェアを使用して計算されたＣｔ値に加えられた。標準ごとの平均Ｃｔ値はＬｏｇ１０標準濃度に対してプロットし、線形回帰線を決定した。直線の勾配を使用して反応効率（効率＝１０（−１／勾配）−１）を決定し、それぞれの標準レプリケートの逆算濃度を使用して、それぞれの標準希釈物の試料再現性（標準偏差）を評価した。
【００８２】
チップ製作および特徴付け
ＰＣＲ反応器はシリコンガラス技術を使用して製作した。製作の詳細は以前報告されており６、ここに手短にまとめられている（図２３）。先ず、流体構造物および断熱溝は、標準リソグラフィーおよび深反応性イオンエッチングによりシリコンの前側で彫刻された。次に、Ｐｙｒｅｘウェーハはシリコンに陽極接合されてチャネルを封着した。後側エッチングを実施してアクセスホールを開け、完全にシリコンを通過して断熱溝をエッチングする。最後に、ヒーターは、蛇行するアルミニウム抵抗器からなるが、シリコンの後側に置かれ、薄いシリコン酸化物の層によりシリコンから電気的に絶縁された。ＰＣＲチャンバーは長く、蛇行するシリコンマイクロチャネルであり、幅２００μｍ、深さ約２２０〜２３０μｍ、および得られる体積は１．３μＬである。蛇行する形状は、熱の損失を埋め合わせするのに役立ち、充填中に気泡を閉じ込められるのを回避する。吸入／放出口は７５０μｍの径を有し、充填時小圧力を作り出し、空洞の規則的充填に貢献する標準ピペット先端の締りばめを可能にする。温度は、ヒーターと同じアルミニウム層に製作した抵抗温度検知器（ＲＴＤ）により測定した。さらに、サーミスタをプリント回路板（ＰＣＢ）上に置いて大部分のチップの温度をモニターした。製作されたマイクロ反応器は図２３に示される簡易注文品のＰＣＢ上に載せ、チップ上のコンタクトはＰＣＢコンタクトにワイヤ接合された。ＰＣＢは今度は、温度制御専用機器に接続されているホルダーに挿入され、この機器は社内製であった。ホルダーは、ＣＭＯＳカメラ（Ｏｒｃａ  Ｆｌａｓｈ  ４．０、Ｈａｍａｍａｔｓｕ、Ｊａｐａｎ）および蛍光光源（Ｘ−Ｃｉｔｅ  ｅｘａｃｔｅ、Ｅｘｃｅｌｉｔａｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を搭載した倒立型蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＩＸ−７３）の試料台の上に置かれた。温度を制御しＰＣＲ増幅のそれぞれのサイクル後に蛍光画像を獲得するためのスクリプトはＬａｂＶＩＥＷ  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で書かれた。マイクロ反応器の温度均一性は、既知の融点温度を有するＤＮＡ断片（配列は要求に応じて入手可能である）を使用して融解曲線分析により評価した。蛍光画像は、一定の傾斜率で温度を上げながら一定時間間隔で撮影した。融解温度は、蛍光強度の２次導関数が最大に到達する点として決定された。
【００８３】
ベンチスケールアッセイのシリコンマイクロチップ反応器への移動
ＲＮＡとＤＮＡ標的両方について最適化されたベンチスケールアッセイは、次に、いくつかの変更を加えてシリコンマイクロ反応器に移した。ＡｍｐｌｉＴａｑ３６０濃度をすべての標的オンチップについて反応あたり５ユニットまで増やしたことを除いて、試薬濃度はすべてベンチスケールアッセイと同じであった。それぞれのベンチスケールアッセイを開発するのに使用した同じ標準は、反応あたり４×１００〜４×１０５コピーの範囲でオンチップで試験した。反応は反応チャンバー中に入れ、以下のサイクリング条件に従って増幅した。ＨＣＶアッセイは、５５℃で５分間のＲＴ工程、９５℃で３分間の最初の変性工程、ならびに９５℃で５秒間の変性および６０℃で１０秒間の増幅を４０サイクル、全アッセイ時間２４．８分間を含んだ。ＨＩＶとＺｉｋａッセイの両方のサイクリング条件は、５５℃で２．５分間のＲＴ工程、９５℃で１．５分間の最初の変性工程、ならびに９５℃で５秒間の変性および６０℃で１０秒間の増幅を５０サイクル、全アッセイ時間２５分間を含んだ。ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８アッセイは、９５℃で１．５分間の最初の変性工程、ならびに９５℃で５秒間の変性および６０℃（ＨＰＶ１６）または６２℃（ＨＰＶ１８）で１０秒間の増幅を５０サイクル、全アッセイ時間２２．５分間を含んだ。実行と実行の間、チップは、９５℃で５分間１０％の漂白剤中でマイクロ反応器をインキュベートし、続いて９５℃で５分間水で１度洗浄し、次に、２度の追加の室温水洗浄によりきれいにした。
【００８４】
オンチップ画像分析
ＲＴ−ｑＰＣＲオンチッププログラム中、反応チャンバーの画像は、倒立型蛍光顕微鏡を使用して捉えた。第１の画像が実行の開始時に捉え、第２の画像はＲＴ工程の終了時に捉え、残りの画像はそれぞれの増幅サイクルの終了時に捉えた。次に、すべての画像はＩｍａｇｅＪ分析ソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して分析した。反応チャンバーは９つのセグメントに分割し、それぞれのセグメントは蛇行を包含した（図２３）。分析がチップ間で同一であることを確かめるため、９ボックス構成はとっておき、取り込んでそれぞれの一続きのチップ画像に整列させた。次に、平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、ソフトウェア中の多重尺度機能を使用して９つの蛇行ごとにすべての画像にわたり計算した。チップバックグランドＭＦＩ（ＲＴ後、ＲＮＡ；実行の開始、ＤＮＡ）はすべてのそれに続くＭＦＩ値から減算した。次に、得られたチップ正規化ＭＦＩ値を最初の１０サイクルにわたる平均ＭＦＩ（アッセイバックグランド）で割った。これらの正規化された蛍光値を使用して増幅曲線を適合させそれぞれの標準のＣｔを決定した。
【００８５】
オンチップＣｔ決定
Ｃｔ値は、５パラメータＳ字状フィット線について２次導関数最大値を計算することによりＲ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェア（ＲＳｔｕｄｉｏ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）中のｑＰＣＲパッケージを使用して標準レプリケートごとに決定した。標準ごとの平均Ｃｔ値はＬｏｇ１０標準濃度に対してプロットし、線形回帰線を決定した。線の勾配を使用して反応効率（効率＝１０（−１／勾配）−１）を決定し、それぞれの標準レプリケートの逆算濃度を使用して、それぞれの標準希釈物の試料再現性（標準偏差）を評価した。
【００８６】
以下の結果は上記の本例の材料および方法を使用して得られた。
【００８７】
ベンチスケールＲＮＡアッセイ
それぞれのベンチスケールＲＮＡアッセイの性能を試験するため、ＩＶＴ  ＲＮＡ標準希釈系列（４×１０６〜４×１００コピー／反応）を試験する３つの独立した実験を実施した。すべての標的では、それぞれの標準濃度はそれぞれの独立した実験において検出し、標的ごとに少なくとも４ｃｐ／反応のアッセイ感度が示唆された。３つの独立した実験にわたって計算された平均Ｃｔ値は、標的ごとに対応するＬｏｇ１０  ＲＮＡ濃度に対してプロットした。それぞれのアッセイの全体効率は、線形回帰線の勾配から導き出されるが、ＨＣＶで１０７．８％、ＨＩＶで１０９．８％およびＺｉｋａで９８．８％であった。アッセイ変動性を評価するため、それぞれの標準レプリケートのＣｔ値を使用して３つのレプリケートにわたる平均効率曲線から逆算ＲＮＡ濃度を決定した。すべてのＲＮＡ標的の平均変動性は０．５  Ｌｏｇ１０未満（ＨＣＶ、０．０５  Ｌｏｇ１０；ＨＩＶ、０．３５  Ｌｏｇ１０；およびＺｉｋａ、０．１０  Ｌｏｇ１０）であった。
【００８８】
ベンチスケールＤＮＡアッセイ
それぞれのベンチスケールアッセイの性能を、プラスミドＤＮＡ標準希釈系列（４×１０６〜４×１００コピー／反応）を試験する３つの独立した実験を使用して評価した。ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８の両方では、それぞれの標準濃度はそれぞれの独立した実験において検出し、標的ごとに少なくとも４ｃｐ／反応のアッセイ感度が示された。３つの独立した実験にわたって計算された平均Ｃｔ値は、ＲＮＡベンチスケールアッセイと同じやり方でプロットし、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８について得られた反応効率はそれぞれ１０８．９％および１００．９％であった。両方のＤＮＡ標的の平均変動性は、逆算濃度に基づいて、０．５  Ｌｏｇ１０未満（ＨＰＶ１６、０．１６  Ｌｏｇ１０；およびＨＰＶ１８、０．０８  Ｌｏｇ１０）であった。
【００８９】
ＰＣＲマイクロチップの特徴付け
オンチップアッセイ開発に先立って、一連の試験を実施した。ＰＣＢ上にチップをマウントした後、ＰＣＲ中の温度の正確な測定を保証するようＲＴＤをオーブンにおいてキャリブレーションした。温度の値および均一性は、ＰＣＲプライマーのアニーリング温度（Ｔｍ＝６０℃および７０℃）におよび変性温度（Ｔｍ＝８０℃）に近い既知の融解温度を有するＤＮＡ断片を使用する融解曲線分析によりさらに確認した。８０℃では、マイクロ反応器にわたる温度均一性は０．７℃、測定した温度は０．５℃内で正確であった。６０℃から９５℃までのランプ時間は０．１Ａのヒーター電流で２秒であった。９５℃から６０℃までの冷却時間は４秒であり、熱設計により固定されている。温度サイクリング中、ＰＣＲマイクロ反応器を取り囲むチップのバルク温度は、断熱溝のおかげで５０℃を超えなかった（図３）。
【００９０】
オンチップＲＮＡアッセイ
オンチップＲＮＡアッセイの性能を評価するため、３つの独立した実験を実施し、その間、標準範囲（４×１０５〜４×１００コピー／反応）にわたるそれぞれのＩＶＴ  ＲＮＡ標準をマイクロチップ上で試験した。それぞれの標的のすべての標準レプリケートを検出し、少なくとも４ｃｐ／反応のアッセイ感度を示唆した。３つのレプリケートにわたって計算された平均Ｃｔ値は、ベンチスケールアッセイと同じやり方でプロットし、ＨＣＶ、ＨＩＶ、およびＺｉｋａについてそれぞれ１００．６％、９５．７％、および１０３．９％の反応効率を得た。ＨＣＶ、ＨＩＶ、およびＺｉｋａ  ＲＮＡのすべての標準濃度にわたる平均変動性は、逆算濃度に基づいて、それぞれ０．３５  Ｌｏｇ１０、０．４１  Ｌｏｇ１０；および０．３２  Ｌｏｇ１０であった。
【００９１】
オンチップＤＮＡアッセイ
オンチップＤＮＡアッセイの性能を評価するため、３つの独立した実験を実施し、その間、標準範囲（４×１０５〜４×１００コピー／反応）にわたってそれぞれのプラスミドＤＮＡ標準をマイクロチップ上で試験した。それぞれの標的のすべての標準レプリケートを検出し、少なくとも４ｃｐ／反応のアッセイ感度が示された。ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８についての効率は、それぞれ９７．７％および９８．２％であった。すべての標準濃度にわたる平均再現性は、逆算濃度に基づいて、ＨＰＶ１６では０．１８  Ｌｏｇ１０およびＨＰＶ１８では０．１７  Ｌｏｇ１０であった。
【００９２】
前述の結果が、新規のＲＴ−ｑＰＣＲおよびｑＰＣＲアッセイおよびシリコンマイクロチップ上のマイクロ反応器を使用してウイルス核酸を検出することの実行可能性を支持していることは認識されるであろう。４ｃｐ／反応のアッセイ感度を有するＨＣＶ、ＨＩＶ、およびＺＩＫＶについてのベンチスケールＲＴ−ｑＰＣＲアッセイならびにＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８についてのｑＰＣＲアッセイを、標準ベンチスケールリアルタイムＰＣＲ機器を使用して開発した。１．３μＬのマイクロ反応器ならびに迅速で一貫した温度サイクリングを有するＰＣＲシリコンマイクロチップを設計し製造した。最後に、これらのアッセイは、ほとんど最適化せずに、感度（４ｃｐ／反応）および再現性（＜０．５  Ｌｏｇ１０）を失うことなく、開発したＰＣＲシリコンマイクロチップに成功裏に移した。これらの結果は、１．３μＬのマイクロ反応器におけるウイルス核酸の迅速で感度の良い増幅が実行可能であることを実証しており、スケーラブルなシリコンマイクロチップ技術を使用する核酸ベースの診断デバイスを支持している。
【００９３】
急性ウイルス感染の診断のための既に利用可能であるＰＯＣ血清検査は、遅延性の抗体産生によって疾病の第１週での免疫アッセイの感度が制限されるために、臨床的感度が下がってしまう。その上、検出可能になったのち、抗体の残留性のせいで、現在対過去の感染の同定が複雑化する。診断用ＮＡＴはウイルス感染の検出のためのゴールドスタンダードと見なされているが、大型で高価な設備および熟練した操作員が必要である。その結果、本開示より前は、集中化臨床研究室においてウイルスＮＡＴを実施しなければならず、結果を出すまでに長い時間がかかる。こうしたことすべてが、ＰＯＣでの診断の不確実性を増し、重大な意味を持つ公衆衛生上の懸念である不適切な抗菌剤使用をもたらす。感度が良いだけでなく、迅速なＰＯＣウイルスＮＡＴを提供すれば、これらの限界を克服し、臨床医は必要に応じてウイルス感染のもっと正確な診断が可能になる可能性がある。これに関して、現在実証されている５つのオンチップアッセイは、ＨＣＶ、ＨＩＶ、Ｚｉｋａ、ＨＰＶ−１６、およびＨＰＶ−１８の再現性のある感度の良い検出を提供する。さらに、本研究で利用されるシリコンマイクロチップ技術は、迅速で正確な熱サイクリングおよび結果を出すまでの時間の短縮を可能にする。実際、我々のウイルス核酸アッセイは２５分で実施され、５１分のベンチスケールアッセイよりも有意に短い。アッセイおよびシリコンマイクロチップ設計のさらなる最適化は、本開示の利点を考慮して達成することができ、もっと短いサイクルおよび全反応時間をもたらすと予想される。例えば、ＨＣＶアッセイは、ＲＴ工程時間の長さを増しながら４０サイクルで実施することができ、その他のアッセイはもっと短いＲＴ工程で感度および効率を維持するのに５０サイクル必要であった。これにより、標的ごとのサイクリング時間の最適化は、シリコンマイクロ反応器における感度の良い効率的なアッセイには欠かせないことが示唆される。シリコンマイクロチップベースの診断デバイス上でこれらのアッセイを利用すれば、分子ＰＯＣ診断デバイスの結果を出すまでの時間を著しく減少させる可能性がある。
【００９４】
シリコンマイクロチップの柔軟性およびスケーラビリティは、他の流体溶液との統合を可能にする。例えば、これらのマイクロ反応器はマイクロ流体血漿分離および核酸抽出溶液と連結させてもよく、血液収集以外の試料調製を必要とせずに、少量（＜５０μＬ）の全血検体を受け入れるＰＯＣ診断デバイスが得られる。本研究で使用される標準濃度範囲は、急性および慢性ウイルス感染中の体液中のウイルス核酸の濃度に基づいていた。本研究での標準濃度範囲ならびに連結されたマイクロ流体血漿分離および核酸抽出を含有する仮説のデバイスを使用すれば、５０μｌ血液検体（２５μｌ、血漿）を想定する６４０ｃｐ／ｍＬの血漿、、血漿の５０％オンチップ回収、および５０％オンチップ核酸抽出収率まで検出することができると考えられる。この検出限界は大半の急性および慢性ウイルス感染の感度の良い診断を可能にすると考えられる。例えば、非ヒト霊長類研究は、我々の理論的検出限界よりも有意に高いレベルでの急性感染の第１週の血漿中のピークＺＩＫＶ  ＲＮＡレベル（＞１０５ｃｐ／ｍＬ血漿）を示していた。さらに、この理論的にもっと低い検出限界は、慢性ＨＣＶ感染の＞９９．５％の検出を可能にすると考えられる。したがって、シリコンマイクロチップベースの分子診断にこれらの超低ボリュームの反応を組み入れれば、急性および慢性ウイルス感染を診断するのに十分な感度が得られる。
【００９５】
エッチングされ蛇行するマイクロ反応器、パターン形成されたアルミニウムヒーター、抵抗温度検出器、断熱溝および試薬の送達のためのマイクロ流体チャネルを有するシリコンマイクロチップが作製され、マイクロ反応器のみの正確な加熱が実証されたことは、本例の前述の説明から認識されるであろう。次に、ベンチスケールウイルスＲＮＡおよびＤＮＡアッセイは１．３μＬのシリコンマイクロ反応器に成功裏に移された。オンチップ反応感度および効率はベンチスケールアッセイに類似していたが、重要なことに、２５分またはそれよりも少ない反応時間はベンチスケールアッセイよりも有意に短かった。本例の本開示は、ウイルス核酸検出および診断を高度な臨床研究所からＰＯＣに移すことを目的にして、上で考察されたシリコンマイクロチップベースの核酸抽出法と組み合わせることができる。
【００９６】
結論として、本例およびそれよりも上の例は、ウイルス感染のための、および任意のポリヌクレオチドの検出のためのシリコンマイクロチップ分子診断デバイスを提供する。我々は、ＲＮＡおよびＤＮＡウイルスの検出のためのベンチスケールＰＣＲベースのアッセイを開発し、このアッセイは、最小限の最適化で、シリコンマイクロチップマイクロ反応器に成功裏に移された。本発見は、シリコンマイクロチップ技術が、かなりのマイクロチップ設計またはアッセイ最適化を必要とせずに広範囲の病原体を検出するように適応させることができることを示している。これらとオンチップ血漿分離および核酸抽出とを連結すれば、アッセイ結果を出すまでの時間を著しく減らし、それによってあらゆる臨床現場での診断確実性を高める、迅速で感度が良く、試料投入で結果が得られる（sample to result）ＰＯＣ分子診断ソリューションの開発のためのプラットホームを提供することができる。
【００９７】
本開示はその好ましい態様との関連で説明されてきたが、添付の特許請求の範囲において定義される本開示の精神および範囲から逸脱することなく、具体的に記載されていない追加、削除、変更、および置き換えを加えてもよいことは当業者であれば認識するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【国際調査報告】
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