(57)【要約】ユニバーサルドナー幹細胞及びそれに由来する細胞、並びにそれらの関連する使用及び生産方法が開示される。開示されるユニバーサルドナー幹細胞は、細胞ベースの移植療法における同種免疫拒絶を克服するのに有用である。特定の実施形態では、開示されるユニバーサルドナー細胞は、１つ以上のＭＨＣクラスＩ細胞表面タンパク質を発現せず、少なくとも１つのＮＫ活性化リガンドの発現が破壊又は阻害されている膵臓内胚葉細胞である。
2020526224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵臓系統細胞を含むインビトロ細胞集団であって、少なくとも１つの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ遺伝子及び少なくとも１つのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化リガンドの機能が、前記膵臓系統細胞において破壊又は阻害されている、インビトロ細胞集団。
【請求項２】
前記ＭＨＣクラスＩ遺伝子が、β−２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）又はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−ＡＢＣ細胞表面タンパク質をコードする、請求項１に記載のインビトロ細胞集団。
【請求項３】
前記ＮＫ細胞活性化リガンドが、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）１、分化抗原群（ＣＤ）５８、ＣＤ１５５、ポリオウイルス受容体（ＰＶＲ）、癌胎児性抗原関連細胞接着分子（ＣＥＡＣＡＭ）１、細胞接着分子（ＣＡＤＭ）１、主要組織適合性クラスＩ関連鎖タンパク質（ＭＩＣ）Ａ、ＭＩＣＢ、又はそれらの組み合わせである、請求項１又は２に記載のインビトロ細胞集団。
【請求項４】
ＮＫ細胞活性化リガンドの組み合わせが、前記膵臓系統細胞において破壊又は阻害され、前記ＮＫ細胞活性化リガンドの組み合わせが、ａ）ＣＤ５８及びＩＣＡＭ１、ｂ）ＣＤ５８、ＩＣＡＭ１、及びＣＤ１５５、ｃ）ＣＤ５８及びＣＡＤＭ１、ｄ）ＣＤ５８及びＣＤ１５５、ｅ）ＣＤ５８、ＩＣＡＭ１、ＣＤ１５５、及びＣＡＤＭ１、又はｆ）ＩＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、及びＣＤ１５５である、請求項１又は２に記載のインビトロ細胞集団。
【請求項５】
前記膵臓系統細胞が、胚体内胚葉、前腸内胚葉、膵臓内胚葉、内分泌前駆体、又はインスリン産生細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のインビトロ細胞集団。
【請求項６】
前記膵臓系統細胞が、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに前記剤が膵臓系統細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載のインビトロ細胞集団。
【請求項７】
前記タンパク質が、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼであり、前記細胞死誘導剤が、ガンシクロビルである、請求項６に記載のインビトロ細胞集団。
【請求項８】
前記ＭＨＣクラスＩ遺伝子が、ゲノム編集を使用して破壊又は阻害されるか、又は前記ＮＫ細胞活性化リガンドが、ゲノム編集を使用して破壊及び／又は阻害される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のインビトロ細胞集団。
【請求項９】
前記ゲノム編集が、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、エンドデオキシリボヌクレアーゼ、クラスター化され規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ｃａｓ）システム、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システム、又は相同組換えの使用を含む、請求項８に記載のインビトロ細胞集団。
【請求項１０】
前記ＮＫ細胞活性化リガンドが、抗ＮＫ細胞活性化リガンド剤を使用して破壊又は阻害される、請求項１〜７のいずれか一項に記載のインビトロ細胞集団。
【請求項１１】
前記抗ＮＫ細胞活性化リガンド剤が、抗体又は抗体断片である、請求項１０に記載のインビトロ細胞集団。
【請求項１２】
哺乳動物対象におけるヒト膵臓系統細胞の細胞移植片拒絶を低減する方法であって、治
療有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載のインビトロ細胞集団を前記哺乳動物対象に移植することを含み、前記ＭＨＣクラスＩ遺伝子及びＮＫ細胞活性化リガンドの機能の破壊又は阻害によって、前記ＭＨＣクラスＩ遺伝子及びＮＫ細胞活性化リガンドの機能が破壊又は阻害されていないヒト膵臓系統細胞と比較して、細胞移植片拒絶が低減される、方法。
【請求項１３】
哺乳動物対象においてインスリンを産生する方法であって、治療有効量の請求項１〜１１のいずれか一項に記載のインビトロ細胞集団を前記哺乳動物対象に移植することを含み、前記細胞集団が、前記哺乳動物対象において、グルコース刺激に応答してインスリンを産生する細胞へと成熟する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる２１０７年７月１２日に出願された「ユニバーサルドナー（UNIVERSAL DONOR）細胞及び関連方法」と題する米国実用出願第１５／６４８，３３７号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本出願は、遺伝子発現、ゲノム工学、及び遺伝子／細胞療法の分野に関連する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）は、患者への移植のための任意の成人細胞種を生成するための有用なツールである。原則として、ｈＰＳＣベースの細胞療法は、全てではないにしても大部分の変性疾患を処置する可能性を有するが、そのような療法の成功は対象の免疫応答によって制限され得る。免疫系は、高い特異性の層状防御により感染から生物を保護する。簡単に言えば、物理的な障壁は、細菌及びウイルスなどの病原体が生物に侵入するのを防ぐ。病原体がこれらの障壁を突破した場合、自然免疫系は即座であるが非特異的な反応を提供する。病原体が自然応答をうまく回避できた場合、脊椎動物は、自然応答によって活性化される適応免疫系という第２の保護層を有する。適応免疫系は、さらにより特異的な応答を生じさせる。ここで、免疫系は、病原体の認識を改善するように感染中の応答を適応させる。次いで、この改善された応答は、病原体が排除された後に免疫記憶の形で保持され、この病原体に遭遇するたびに適応免疫系はより速く開始し、より強力に攻撃することができる。適応免疫応答は、抗原特異的であり、抗原提示と呼ばれるプロセス中の特定の「非自己」抗原の認識を必要とする。抗原特異性は、特定の病原体又は病原体感染細胞に合わせた応答を生じさせることを可能にする。インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）は、感染性及び非感染性疾患に対抗するのに重要な役割を果たす。ヒト免疫応答におけるＩＦＮ−γの主な供給源はＴ細胞である。ＮＫ細胞、マクロファージ、ＩＦＮ−γは、自然免疫及び獲得免疫の両方で重要な役割を果たす。
【０００４】
主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）は、免疫系の調節に不可欠な一連の細胞表面タンパク質である。ＭＨＣ分子の主な機能は、病原体に由来する抗原に結合し、適切なＴ細胞による認識のために細胞表面にそれらを提示することである。ＭＨＣ遺伝子ファミリーは、クラスＩ、クラスＩＩ、クラスＩＩＩの３つのサブグループに分けられる。ヒトＭＨＣは、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体（しばしば単にＨＬＡ）とも呼ばれる。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、自然免疫及び適応免疫の間の境界面で機能するリンパ球である。ＮＫ細胞は、細胞傷害性及びサイトカイン分泌などのエフェクター機能を介して、また自然免疫及び適応免疫応答を調節することにより、免疫防御に直接寄与する。標的細胞又は宿主細胞がＮＫ細胞に遭遇したとき、いくつかの結果があり得る。ＮＫ応答の程度は、ＮＫ細胞上の活性化及び阻害性受容体の量及び種類、並びに標的細胞上の活性化及び阻害性リガンドの量及び種類によって決まる。図１を参照のこと。シナリオＡでは、標的細胞がヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ及びＮＫ活性化リガンドを有さない場合、ＭＨＣクラスＩ阻害性受容体及び活性化リガンド受容体を発現するＮＫ細胞は標的細胞を攻撃しない（応答なし又は許可なし）。シナリオＢでは、標的細胞がＨＬＡクラスＩを発現するが、活性化リガンドを有さない場合、阻害性受容体及び活性化受容体を発現するＮＫ細胞は標的を攻撃することができない。シナリオＣでは、標的細胞がＨＬＡクラスＩをダウンレギュレートするか又はＨＬＡクラスＩを有さず、ＮＫ活性化リガンドを発現する場合、阻害性受容体及び活性化受容体を発現するＮＫ細胞は標的細胞を攻撃する。シナリオＤでは、標的細胞が自己ＨＬＡクラスＩ及びＮＫ活性化リガンドの両方を発現する場合、阻害性受容体及び活性化受容体を発現するＮＫ細胞による応答のレベルは、ＮＫ細胞に対する阻害性及
び活性化シグナルのバランスによって決まる。Haynes et al., THE IMMUNE SYSTEM IN HEALTH AND DISEASE, PART 15: Immune-Mediated, Inflammatory, and Rheumatologic Disorders, 372e Introduction to the Immune System。
【０００５】
歴史的に、同種細胞に対する宿主の免疫応答を克服するための努力は、適応免疫応答、すなわち、Ｔ細胞と異物細胞上に提示されるＭＨＣクラスＩ抗原との間の付着を妨げることに焦点を当てていた。そのため、ＣＲＩＳＰＲ及びＴＡＬＥＮシステムは、機能喪失遺伝的修飾を生じさせるために使用され、したがって１つ以上の古典的なＭＨＣ／ＨＬＡ遺伝子を発現しない幹細胞を作り出す。しかしながら、これらの細胞及びそれらに由来する細胞は、宿主の自然免疫応答（ＮＫ細胞）に対して依然として脆弱である。例えば、Parham et al. (2005) Nat Rev Immunol. 5(3):201-214を参照のこと。宿主の自然免疫応答を克服するために、他の人々は免疫寛容原性因子を標的細胞に再導入することを試みた。焦点は「自己性の喪失（missing self）」にあった。国際公開第２０１６１８３０４１Ａ２号（その開示は参照によりその全体が組み込まれる）を参照されたい。本出願人は、驚くべきことに、宿主のＮＫ媒介免疫応答を回避する鍵は、「自己性の喪失」ではなく、標的細胞上のＮＫ細胞活性化リガンドの発現及び大きさであることを発見した。
【０００６】
したがって、一部又は全ての古典的なＨＬＡ発現を欠くが、溶解のためのＮＫ細胞によって攻撃されない細胞を開発するための組成物及び方法に対する必要性が存在している。
【発明の概要】
【０００７】
本明細書では、ユニバーサルドナー細胞株を提供することにより、移植片拒絶、特に、細胞ベースの移植療法における同種免疫移植片拒絶を克服する戦略が開示される。一実施形態では、古典的なＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質発現及びＮＫ活性化リガンド発現の一部又は全てを欠く、ヒト多能性幹細胞が提供される。一実施形態では、古典的なＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質発現及びＮＫ活性化リガンド発現の一部又は全てを欠く、膵臓細胞などのヒト多能性幹細胞に由来する細胞が提供される。一実施形態では、β−２−マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）などの少なくとも１つのＭＨＣ遺伝子及び細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ−１）などの少なくとも１つのＮＫ活性化リガンド遺伝子が破壊、欠失、改変、又は阻害された移植膵臓細胞を提供することにより、細胞移植片拒絶を防止する方法が提供される。別の実施形態では、Ｂ２Ｍなどの少なくとも１つのＭＨＣタンパク質及びＩＣＡＭ−１などの少なくとも１つのＮＫ活性化リガンドタンパク質の発現が破壊、欠失、改変、又は阻害された移植膵臓細胞を提供することにより、細胞移植片拒絶を予防する方法が提供される。Ｂ２Ｍの破壊、欠失、改変、又は阻害により、ＨＬＡクラスＩの表面発現及び機能の全てが欠損する。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、（標的細胞に対するＮＫ媒介性応答の）異なるシナリオを示す、上記のＨａｙｎｅｓらの図３７２ｅ−４（これはその全体が本明細書に組み込まれる）の複写物である。標的細胞上にＭＨＣクラスＩが存在せず、ＮＫ活性化リガンドが存在しない場合、ＮＫ細胞上の阻害性受容体及び活性化受容体は関与せず、ＮＫ細胞は応答しないままである（シナリオＡ）。標的細胞上にＭＨＣクラスＩが存在するが、ＮＫ活性化リガンドが存在しない場合、ＮＫ細胞上の阻害性受容体は関与するが、ＮＫ細胞上の活性化受容体は関与せず、ＮＫ細胞は応答しないままである（シナリオＢ）。標的細胞上に自己ＭＨＣクラスＩが存在しないが、ＮＫ活性化リガンドが存在する場合、ＮＫ細胞上の阻害性受容体は関与しないが、ＮＫ細胞上の活性化受容体は関与し、ＮＫ細胞は攻撃する（シナリオＣ）。標的細胞上にＭＨＣクラスＩ及びＮＫ活性化リガンドが存在する場合、ＮＫ細胞上の阻害性受容体及び活性化受容体が関与し、シグナルのバランスによって結果が決まる（シナリオＤ）。
【図２Ａ】図２Ａは、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）の野生型（ＷＴ）ｈＥＳ細胞上のＢ２Ｍ細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。網掛け部分は、抗体染色のないバックグラウンド発現である。ＩＦＮ−γへの曝露は、ＷＴ  ｈＥＳ細胞におけるＢ２Ｍ細胞表面タンパク質発現を増加させる。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＢ２Ｍノックアウト（Ｂ２Ｍ−／−）ｈＥＳ細胞上のＢ２Ｍ細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。Ｂ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞は、Ｂ２Ｍ細胞表面タンパク質の発現がほとんどなく、該発現はＩＦＮ−γへの曝露後に有意に変化しない。
【図３Ａ】図３Ａは、汎ＨＬＡクラスＩ抗体を使用した、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＷＴ  ｈＥＳ細胞でのＨＬＡ−ＡＢＣ細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。網掛け部分は、抗体染色のないバックグラウンド発現である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＢ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞上のＨＬＡ−ＡＢＣ細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。Ｂ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞では、検出可能なＨＬＡ−ＡＢＣ細胞表面タンパク質発現がない。
【図４Ａ】図４Ａは、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＷＴ膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）上のＢ２Ｍ細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。網掛け部分は、抗体染色のないバックグラウンド発現である。ＩＦＮ−γへの曝露は、ＷＴ  ＰＥＣにおけるＢ２Ｍ細胞表面タンパク質発現を増加させる。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＢ２ＭノックアウトＰＥＣ上のＢ２Ｍ細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。Ｂ２Ｍ−／−ＰＥＣでは、検出可能なＢ２Ｍ細胞表面タンパク質発現がない。
【図５Ａ】図５Ａは、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣ上のＨＬＡ−ＡＢＣ細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。網掛け部分は、抗体染色のないバックグラウンド発現である。ＩＦＮ−γへの曝露は、ＷＴ  ＰＥＣにおけるＨＬＡ−ＡＢＣ細胞表面タンパク質発現を増加させる。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＢ２ＭノックアウトＰＥＣ上のＨＬＡ−ＡＢＣ細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。Ｂ２Ｍ−／−ＰＥＣでは、検出可能なＨＬＡ−ＡＢＣ細胞表面タンパク質発現がない。
【図６Ａ】図６Ａは、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＷＴ  ｈＥＳ細胞上のＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。網掛け部分は、抗体染色のないバックグラウンド発現である。ＩＦＮ−γへの曝露は、ＷＴ  ｈＥＳ細胞におけるＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現を増加させる。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＢ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞上のＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。Ｂ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞は、ＩＦＮ−γ曝露の前後においてＷＴ  ｈＥＳ細胞と同様のＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現を有する。
【図７Ａ】図７Ａは、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣ上のＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。網掛け部分は、抗体染色のないバックグラウンド発現である。ＩＦＮ−γへの曝露は、ＷＴ  ＰＥＣにおけるＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現を増加させる。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＢ２ＭノックアウトＰＥＣ上のＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。ＩＦＮ−γへの曝露後に、Ｂ２Ｍ−／−ＰＥＣは、バックグラウンド（網掛け領域）の発現より大きいＷＴ  ＰＥＣと同様のＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現を有する。
【図８】図８は、各々がＩＦＮ−γに曝露されていない（対照）又はＩＦＮ−γに曝露されたＷＴ  ｈＥＳ細胞、Ｂ２Ｍ（−／−）ｈＥＳ細胞、ＷＴ  ＰＥＣ、及びＢ２Ｍ（−／−）ＰＥＣにおけるＩＣＡＭ−１のｍＲＮＡ発現データ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ発現アレイ）を示す棒グラフである。ＩＣＡＭ−１発現が、低いＩＣＡＭ細胞表面タンパク質発現を有することが既知である細胞：癌細胞（Ｋ５６２及びＳＫＢＲ３）、インビボでインスリン産生細胞に成熟することが可能であった移植されたＰＥＣ、ヒト膵島細胞、及び末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の２つの異なる試料（ＩＦＮ−γへの曝露なし）においても評価されている。ＩＣＡＭ−１  ｍＲＮＡ発現は、ｈＥＳ細胞（ＷＴ又はＢ２Ｍ−／−）又はＰＥＣ（ＷＴ又はＢ２Ｍ−／−）のＩＦＮ−γへの曝露後に増加する。
【図９】図９は、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣ上のＣＤ５８（別名：ＬＦＡ−３）細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。Ｃ線は、抗体染色のないバックグラウンド発現である。ＩＦＮ−γへの曝露は、未処理の対照と比較して、ＷＴ  ＰＥＣにおけるＣＤ５８細胞表面タンパク質の発現を僅かだけ増加させる。ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから得た抗体、カタログ番号＃３３０９０９。
【図１０】図１０は、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣ上のＣＤ１５５細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。Ｃ線は、抗体染色のないバックグラウンド発現である。ＩＦＮ−γへの曝露後に、ＷＴ  ＰＥＣは、ＷＴ未処理ＰＥＣ対照と同様のＣＤ１５５細胞表面タンパク質発現を有する。遺伝子記号ＰＶＲ（別名：ＣＤ１５５、ＮＥＣＬ−５、ＨＶＥＤ）。Ｍｉｌｔｅｎｅｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から得た抗体、カタログ番号＃１３０−１０５−９０５。
【図１１】図１１は、ＩＦＮ−γへの曝露なし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣ上のＣＥＡＣＡＭ１（別名：ＣＤ６６ａ、ＢＧＰ、ＢＧＰ１）細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。Ｃ線は、抗体染色のないバックグラウンド発現である。ＩＦＮ−γへの曝露は、未処理の対照と比較して、ＷＴ  ＰＥＣにおけるＣＥＡＣＡＭ１細胞表面タンパク質の発現を僅かに増加させる。Ｍｉｌｔｅｎｅｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から得た抗体、カタログ番号＃１３０−０９８−８５８。
【図１２】図１２は、ＩＦＮ−γへの曝露なし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣ上のＢＡＴ３細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。Ｃ線は、抗体染色のないバックグラウンド発現である。未処理対照のＷＴ  ＰＥＣは、ＩＦＮ−γに曝露されたＷＴ  ＰＥＣと同様のＢＡＴ３細胞表面タンパク質発現を有する。遺伝子記号ＢＡＧ６（別名：ＢＡＴ３、ＨＬＡ−Ｂ関連転写物３）。Ａｂcａｍ，Ｉｎｃ．から得た抗体、カタログ番号＃ａｂ２１０８３８。
【図１３】図１３は、ＩＦＮ−γへの曝露なし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣ上のＣＡＤＭ１（別名：ＮＥＣＬ２、ＴＳＬＣ１、ＩＧＳＦ４、ＲＡ１７５）細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。Ｃ線は、抗体染色のないバックグラウンド発現である。ＩＦＮ−γへの曝露後、ＷＴ  ＰＥＣは、未処理対照と同様のＣＡＤＭ１細胞表面タンパク質発現を有する。ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐ．から得た抗体、カタログ番号＃ＣＭ００４−４。
【図１４】図１４は、ＩＦＮ−γへの曝露なし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γへの曝露後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣ上のＣＤ１１２細胞表面タンパク質発現の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。Ｃ線は、抗体染色のないバックグラウンド発現である。ＩＦＮ−γへの曝露後、ＷＴ  ＰＥＣは、未処理の対照と同様のＣＤ１１２細胞表面タンパク質発現を有する。遺伝子記号ＰＶＲＬ２（別名；ＣＤ１１２、ネクチン−２、ＰＶＲＲ２、ＨＶＥＢ）。Ｍｉｌｔｅｎｅｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から得た抗体、カタログ番号＃１３０−１０９−０５６。
【図１５】図１５は、標的細胞におけるＩＣＡＭ−１発現を抗ＩＣＡＭ１抗体で遮断した後の標的細胞のＮＫ細胞溶解の減少を示す棒グラフである（左から右へ、ＮＫ細胞傷害性アッセイのためのＷＴ  ｈＥＳＣ、ＩＦＮ−γに曝露したＷＴ  ｈＥＳＣ、Ｂ２Ｍ−／−ｈＥＳＣ、ＩＦＮ−γに曝露したＢ２Ｍ−／−ｈＥＳ、ＷＴ  ＰＥＣ、ＩＦＮ−γに曝露したＷＴ  ＰＥＣ、Ｂ２Ｍ−／−ＰＥＣ、ＩＦＮ−γに曝露したＢ２Ｍ−／−ＰＥＣ、Ｋ５６２対照細胞株）。左から右へ、各組の３つのバーは、ＮＫ−０６２２１６；ＮＫ−０６２２１６＋ＩＣＡＭ１ＡＢ（５μｇ／ｍｌ）；ＮＫ−０６２２１６＋ＩＣＡＭ１ＡＢ（１０μｇ／ｍｌ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸及びアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２で定義されている核酸塩基についての標準的な文字略語及びアミノ酸についての３文字コードを使用して示される。各核酸配列の１つの鎖のみが示されているが、示された鎖についての任意の参照により、相補鎖が含まれているものと理解される。配列表は、ＡＳＣＩＩテキストファイルＳｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ、２０１８年７月３日、１１ＫＢとして提出され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００１０】
ＭＨＣクラスＩ分子は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子の２つの主なクラスのうちの１つである（他方はＭＨＣクラスＩＩである）。その機能は、細胞内からの非自己タンパク質のペプチド断片を細胞傷害性Ｔ細胞に提示することである。これにより、ＭＨＣクラスＩタンパク質の助けを伴って提示される特定の非自己抗原に対する免疫系からの即時応答が引き起こされる。ヒトでは、ＭＨＣクラスＩに対応するＨＬＡは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、及びＨＬＡ−Ｇである。ヒトＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、及びＨＬＡ−Ｇは、限られた多型及び古典的なパラログ（ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ）よりも低い細胞表面発現を特徴とする、非古典的なＭＨＣクラスＩ分子である。全てのＭＨＣクラスＩタンパク質は、細胞表面上の機能的発現の前に、機能的ヘテロダイマーＭＨＣクラスＩタンパク質複合体を生成するためにβ２−マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と結合する必要がある。ＭＨＣクラスＩ分子は、ＮＫ細胞の阻害リガンドとしても機能する。細胞表面ＭＨＣクラスＩの正常レベルの低下により、ＮＫ細胞による死滅が活性化される。
【００１１】
歴史的に、ＭＨＣクラスＩ阻害リガンドを有する標的細胞は、ＭＨＣクラスＩの阻害シグナルの推測された支配的性質に起因して、ＮＫ細胞に曝露された場合に攻撃を回避すると考えられていた（Harrison’s Principles of Internal Medicine 19 E (Vol. 1 and Vol. 2) A Major Histocompatibility Complexのパート１５の図３７２ｅ−４から複写した図１のシナリオＢを参照のこと）。しかし、本出願人は、驚くべきことに事実と反対であることを発見した。
【００１２】
細胞がＩＦＮ−γに曝露されることにより、ＭＨＣクラスＩ分子のｍＲＮＡ発現が増加し、細胞表面上のＭＨＣクラスＩタンパク質複合体の発現も増加することが示されている。このＭＨＣクラスＩ発現の増加によってＮＫ細胞が阻害されると予想される。本出願人は、野生型（ＷＴ）ｈＥＳ細胞が、ＩＦＮ−γ（ｈＥＳ細胞の細胞表面上のＭＨＣクラスＩ分子を増加させることが示されている、図２Ａ及び３Ａ）に曝露されたときにＮＫ細胞媒介細胞傷害性を増加させることを発見した。図１５を参照のこと、ＮＫ細胞媒介傷害（溶解）が５８％から７９％に増加することを示している（図１５の条件１及び２の最初のバーを比較）。ＷＴ  ＰＥＣ細胞がＩＦＮ−γに曝露されたときにも同じことが言え、細胞はＢ２Ｍ及びＨＬＡ−ＡＢＣ発現も増加した。図４Ａ及び５Ａを参照のこと。ＮＫ媒介傷害（溶解）は３３％から５３％に増加している（図１５の条件５及び６の最初のバーを比較）。このデータにより、宿主のＮＫ細胞免疫応答を克服する鍵は、阻害ＭＨＣクラス
Ｉシグナルの過剰発現ではなく、ＮＫ活性化リガンドシグナルの遮断であることが示唆された。
【００１３】
増強された（accentuated）ＮＫ細胞媒介細胞傷害性に関連してこの仮説をさらに試験するために、本出願人は、Ｂ２Ｍ−／−（ノックアウト）ｈＥＳ細胞を作成した（図１のシナリオＣと同様）。予想通り、Ｂ２Ｍ−／−は、ｈＥＳ細胞上（図２Ｂ及び３Ｂ）及びＰＥＣ上（図４Ｂ及び５Ｂ）のＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を排除した。また、予想通り、Ｂ２Ｍ−／−細胞は、ＷＴ細胞と比較してＮＫ細胞媒介性溶解の増加を示し、ｈＥＳ細胞では５８％から７１％への増加、ＰＥＣでは３３％から５４％への増加を示した（図１５の条件１対３又は条件５対７の最初のバーを比較）。本出願人は、Ｂ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞又はＰＥＣをＩＦＮ−γに曝露することにより、ＮＫ細胞媒介傷害（溶解）の割合がさらに増加することを発見した（図１５の条件２対４及び条件６対８の最初のバーを比較）。それに対応して、本出願人は、ＮＫ細胞活性化リガンドの細胞表面発現（図６Ｂ及び７Ｂ）及びｍＲＮＡ発現（図８）がＩＦＮ−γへの曝露下で増加することを発見した。このデータにより、標的細胞上のＮＫ細胞活性化リガンドがＮＫ細胞の細胞傷害において重要な役割を果たすことが示唆され、ＮＫ細胞活性化リガンド発現を阻害することにより、ＭＣＨクラスＩ発現の低減との関連で、例えばＢ２Ｍ−／−との関連で、ＮＫ細胞媒介細胞傷害から保護し得るという仮説が導かれた。
【００１４】
標的細胞上のＮＫ活性化リガンドの効果を阻害することによってＮＫ細胞傷害性が低減され得るかどうかを決定するために、本出願人は、標的細胞表面上のＩＣＡＭ１タンパク質を遮断するためのＩＣＡＭ１遮断抗体などを使用して、ＷＴ及びＢ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞及びＰＥＣにおけるＮＫ活性化リガンドの発現を遮断した。本出願人は、驚くべきことに標的細胞の細胞溶解が低減することを発見した（図１５の条件２、４、６、及び８の最初のバーを２番目及び３番目のバーと比較）。したがって、本出願人は、ＮＫ活性化リガンドを遮断することにより、ＮＫ細胞による細胞溶解を低減させることができることを発見した。ＮＫ活性化リガンドに対する抗体を使用してＢ２Ｍ−／−細胞においてＩＣＡＭ１発現を遮断することは、二重ノックアウト（ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックアウト及びＮＫ活性化リガンド遺伝子ノックアウト）を有する細胞を生成するための概念実証である。そうすることで、本出願人は、標的細胞（例えば、ｈＥＳ及び／又は膵臓系統細胞）を図１のシナリオＣからシナリオＡに移行させることができる。具体的には、本発明の細胞、組織、及び臓器は、ＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さず（Ｂ２Ｍ−／−）、ＮＫ活性化リガンド細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さない（例えば、ＩＣＡＭ１−／−）。細胞表面タンパク質発現の阻害は、遺伝子をノックアウトするか、又は抗体を使用してタンパク質の発現を遮断することにより達成することができる。細胞表面タンパク質発現を妨げるための他の戦略には、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡデコイ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ、トランスドミナントネガティブタンパク質（Transdominant negative protein）（ＴＮＰ）、キメラ／融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ケモカインリガンド、抗感染性細胞タンパク質、細胞内抗体（ｓＦｖ）、ヌクレオシド類似体（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体（ＮＮＲＴＩ）、インテグラーゼ阻害剤（オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド、及び化学剤）、及びプロテアーゼ阻害剤の使用が含まれる。二重又は多重遺伝子ノックアウトは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）媒介傷害及びＮＫ細胞媒介傷害の両方を効果的に防止するが、それは、ＣＴＬ又はＮＫ細胞が結合するための、細胞表面上で発現されるＨＬＡクラスＩがほとんど又は全くなく、ＮＫ活性化リガンドタンパク質がほとんど又は全くないためである。さらに、ＮＫ活性化を完全に排除するために、本出願人は、標的細胞における遺伝子ノックアウト（例えば、ｈＥＳ細胞由来細胞療法）によるか、あるいは遮断抗体又は現在既知であるか若しくは将来開発される他の戦略を使用するかにより、複数のＮＫ活性化リガンドの発現を排除／減少する必要があると想定する。
【００１５】
ＮＫ細胞活性化リガンド遮断剤
本発明の一態様によれば、ＮＫ細胞機能を抑制するための処置方法が提供される。本発明の別の態様によれば、少なくとも１つの免疫応答を抑制するための処置法が提供される。各方法は、処置を必要とする対象にＮＫ細胞機能を阻害する剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、剤は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、標的細胞上のＮＫ細胞活性化リガンドに選択的に結合する。
【００１６】
ＮＫ細胞と標的細胞のＮＫ活性化リガンドとの間の付着を妨げるために、抗体及び遮断タンパク質を含む様々な種類の試薬を使用することができることが企図される。
【００１７】
特定の実施形態では、そのようなＮＫ活性化リガンドは表１から選択される。
【００１８】
【表１−１】
2020526224.tif 000003
【００１９】
【表１−２】
2020526224.tif 000004
【００２０】
【表１−３】
2020526224.tif 000005
【００２１】
ＮＫ活性化リガンドは、Pegram et al., Activating and inhibitory receptors of NK
cells Immunology and Cell Biology (2011) 89, 216-224にさらに記載されており、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２２】
低免疫原性（Hypoimmunogenic）ｈＥＳ細胞及びそれに由来する細胞
【００２３】
ＨＬＡは、大きな遺伝子ファミリーによってコードされる細胞表面分子であり、クラスＩ及びクラスＩＩ分子に分類することができる。ＨＬＡクラスＩ分子は、全ての有核細胞の表面上に見出され、本明細書に記載される本発明の焦点である。移植中のドナー（標的）細胞とレシピエントの免疫細胞（例えばＴ細胞）との間のＨＬＡ不適合は、しばしば免疫拒絶又は移植片拒絶を引き起こす。ＨＬＡクラスＩ複合体は、構造的には、ＨＬＡクラスＩペプチドからなる多型（polymorphic）重鎖（例えば、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ）及び軽鎖β２−マイクログロブリン（β２ｍ又はＢ２Ｍ）からなる。Ｂ２Ｍがないと、クラスＩＨＬＡは適切に組み立てられず、細胞表面又は細胞膜にも発現しない。本明細書に記載の発明において、本出願人は、Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊する（いくつかの塩基対を付加又は欠失し、ｍＲＮＡ／タンパク質のフレームシフト及び機能喪失変異を生じさせる）ことにより、ｈＥＳ細胞株及びそれに由来する細胞を産生し、それにより、ｈＥＳＣの細胞表面からＨＬＡクラス１発現を枯渇させた。
【００２４】
上記の方法論は、ＩＣＡＭ１などのＮＫ活性化リガンドをコードする遺伝子をさらに破壊することにより、ｈＥＳ細胞株及びそれに由来する細胞を産生又は生成するために使用することもできる。したがって、本発明の一実施形態では、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ抗原及び少なくとも１つのＮＫ活性化リガンドを欠失した標的細胞を作成し、それにより、低免疫原性細胞を作成するための組成物及び方法が提供される。そのような低免疫原性細胞は、そのような細胞が移植される対象による免疫拒絶がより少ないと予想される。移植されたときに、この低免疫原性細胞は生着する（拒絶されない）はずである。一実施形態では、そのような標的細胞は、レシピエントの免疫抑制をほとんど又は全く必要とせずに生着及び生存することができる。
【００２５】
一実施形態では、ｈＥＳＣ細胞及びそれに由来する細胞におけるＨＬＡクラスＩ発現及びＮＫ活性化リガンド発現の両方の阻害、低減、及び／又は欠失（あるいはＨＬＡクラスＩ欠損及びＮＫ活性化リガンド欠損）は、移植療法のためのユニバーサルドナー細胞供給源として役立つことができる。これらの二重ノックアウト（ＨＬＡクラスＩ欠損及びＮＫ活性化リガンド欠損）は、マイナー組織適合性複合体（minor histocompatibility complex）（ＭｉＨＣ）の適合、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）の適合、又は免疫抑制なしで汎用的に移植できる。
【００２６】
新規なインビトロ由来の低免疫原性組成物及び細胞が本明細書に開示される。具体的には、特定の実施形態では、本明細書に開示される発明は、ＭＨＣクラスＩ遺伝子及びＮＫ活性化リガンド遺伝子の両方の重要な成分を低減又は欠失するために、ゲノムが改変（修飾）された幹細胞に関する。特定の実施形態では、本明細書に開示される発明は、膵臓内胚葉細胞、膵臓上皮細胞、膵臓前駆細胞、膵臓前駆体内分泌細胞、膵臓内分泌細胞、膵臓プレβ細胞、又は膵臓β細胞などの膵臓系統細胞に関し、そのゲノムがＭＨＣクラスＩ遺伝子及びＮＫ活性化リガンド遺伝子の両方の重要な成分を低減又は欠失するように改変（修飾）され、それにより、低免疫原性膵臓系統種の細胞が生成される。ナチュラルキラー活性化リガンドには、表１において分類１、２、３に列挙されたリガンド又はそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ナチュラルキラー活性化リガンドには、例えば、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢが含まれる。ＭＨＣクラスＩ遺伝子には、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、及びＢ２Ｍが含まれる。特定の態様では、ＭＨＣクラスＩ遺伝子及び／又はＭＨＣクラスＩＩ遺伝子のそのような発現の低減又はノックアウトは、ＮＬＲＣ５、Ｂ２Ｍ、及びＣＩＩＴＡ遺伝子、並びにＭＨＣエンハンセオソームの他の成分（エンハンソソームは、エンハンサーにおいて組み立てられた高次タンパク質複合体であり、標的遺伝子、例えばＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩの転写調節因子の発現を調節する）を直接的及び／又は間接的に標的化することにより達成される。
【００２７】
低免疫原性細胞を調製する方法であって、細胞によって発現される１つ以上のＮＫ活性化リガンドの発現を調節し、細胞による１つ以上のＭＨＣクラスＩ及び／又はＭＨＣクラスＩＩの発現を調節し、それにより、低免疫原性細胞を調製することを含む方法も、本明細書に開示される。特定の態様では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ及び／又はＭＨＣクラスＩＩ複合体の細胞表面タンパク質発現の調節には、１つ以上のＭＨＣクラスＩ及び／又はＭＨＣクラスＩＩ遺伝子又はタンパク質の発現を低減、阻害、及び／又は妨害することが含まれる。特定の実施形態では、１つ以上のＭＨＣクラスＩ及び／又はＭＨＣクラスＩＩ複合体の発現の調節には、細胞の少なくとも１つの対立遺伝子からＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩの１つ以上の転写調節因子をコードする１つ以上の遺伝子を欠失させることが含まれる。例えば、特定の実施形態では、そのような方法には、ＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍ及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ遺伝子の転写調節因子のうちの１つ以上をコードする１つ以上の遺伝子を欠失させることが含まれる。特定の態様では、１つ以上のＮＫ活性化リガンドの発現の調節に
は、ＮＫ活性化リガンドをコードする１つ以上の遺伝子の発現を欠失、阻害、又は低減させることが含まれる。特定の実施形態では、そのようなＮＫ活性化リガンドは、表１から選択される。特定の実施形態では、そのようなＮＫ活性化リガンドは、表１の分類１、２、３又はそれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、そのようなＮＫ活性化リガンドは、表１の分類１、２、及び３から選択される。特定の実施形態では、そのようなＮＫ活性化リガンドは、表１の分類１及び３から選択される。特定の実施形態では、そのようなＮＫ活性化リガンドは、表１の分類１及び２から選択される。特定の実施形態では、そのようなＮＫ活性化リガンドは、表１の分類２及び３から選択される。特定の実施形態では、そのようなＮＫ活性化リガンドは、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１  ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２８】
特定の実施形態では、移植される低免疫原性細胞は、動物源生成物、例えば、xenofree生成物を含まない培地中にある。
【００２９】
本発明は、当業者が利用可能な任意の方法で、例えば、メガヌクレアーゼ若しくはエンドデオキシリボヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ若しくはＺＮＦ）、転写活性化因子様エフェクターベースのヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、若しくはクラスター化され規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）システム、又は従来の相同組換え技術のいずれかを利用して、標的ポリヌクレオチド配列を改変することを企図する。そのようなＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、様々なＣａｓタンパク質を使用することができる（Haft et al. PLoS Comput Biol. 2005; l(6)e60）。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩシステムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲタイプＩＩシステムである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＣＲＩＳＰＲタイプＶシステムである。デュアルガイドＲＮＡ及びＦｏｋＩヌクレアーゼに融合された触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質を導入するＮＥＸＴＧＥＮ（商標）ＣＲＩＳＰＲ（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、ケンタッキー州レキシントン）を、標的ポリヌクレオチド配列を改変するために使用することもできる。当業者に現在既知であるか又は後に発見される標的細胞における発現を低減又は除去するためにポリヌクレオチド配列を標的化する他の方法を、本明細書に記載の低免疫原性細胞を生成するために使用することができる。
【００３０】
いくつかの実施形態では、改変により、標的ポリヌクレオチド配列の発現が低減する。いくつかの実施形態では、改変は、ホモ接合性改変である。いくつかの実施形態では、改変は、ヘテロ接合性改変である
【００３１】
いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、ヒトゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、哺乳動物ゲノム配列である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチド配列は、脊椎動物ゲノム配列である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、胚性幹細胞である。特定の実施形態では、低免疫原性細胞は、多能性幹細胞である。特定の実施形態では、低免疫原性細胞は、人工多能性幹細胞、再プログラム化（reprogrammed）細胞、脱分化（dedifferentiated）又は分化転換（transdifferentiated）細胞である。特定の実施形態では、低免疫原性細胞は、多能性膵臓前駆細胞である。特定の実施形態では、低免疫原性細胞は、単一ホルモン性（singly hormonal）又は多ホルモン性（polyhormonal）細胞である。特定の実施形態では、低免疫原性細胞は、中内胚葉細胞、胚体内胚葉細胞、ＰＤＸ−１陰性前腸内胚葉細胞、ＰＤＸ−１陽性前腸内胚葉細胞、膵臓内胚葉細胞、内分泌前駆細胞／前駆体細胞、内
分泌細胞、適切に特定された内分泌細胞、未成熟内分泌細胞、又は機能性β細胞である。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、同種又は異種細胞集団であり得る。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、１つ以上の目的の生物活性物質を産生する細胞である。低免疫原性細胞、例えば、膵臓前駆細胞又はＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉は、最初に移植される場合に初期には治療的に活性でなくてもよいが、ひと度移植されると、さらに発達し、成熟して、治療効果を有する。
【００３３】
いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、任意の細胞、組織、又は臓器を含むがこれらに限定されない、ヒト多能性幹細胞に由来することができる任意の細胞であり得、皮膚細胞、β細胞（すなわち、ランゲルハンス膵島にある膵臓の細胞）、副甲状腺細胞、腸細胞、内分泌細胞、心臓細胞、脳細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、消化管細胞及び副消化器官細胞、唾液腺細胞、副腎細胞、前立腺細胞、肺細胞、膵臓細胞、骨細胞、免疫細胞、造血細胞、血管細胞、目の細胞、結合組織細胞、筋骨格細胞、骨組織、筋骨格組織、角膜組織、皮膚組織、心臓弁、血管、免疫細胞、結合組織、肺組織、皮膚、角膜、腎臓、肝臓、肺、膵臓、心臓、並びに腸を含むことができる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、懸濁液又は細胞凝集体中の個々の（単一）細胞であり得る。いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞には、全能性細胞が含まれる。一実施形態では、低免疫原性細胞には、多能性細胞が含まれる。一実施形態では、低免疫原性細胞には、単能性細胞が含まれる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、低免疫原性細胞は、機能的ＨＬＡクラスＩ発現及びリガンド活性化ＮＫ発現を欠く多能性細胞集団に由来する。この由来細胞は、任意の細胞、組織、又は臓器からなる群から選択することができ、該由来細胞には、皮膚細胞、β細胞（すなわち、ランゲルハンス膵島にある膵臓の細胞）、副甲状腺細胞、腸細胞、内分泌細胞、心臓細胞、脳細胞、腎臓細胞、肝臓細胞、消化管細胞及び副消化器官細胞、唾液腺細胞、副腎細胞、前立腺細胞、肺細胞、膵臓細胞、骨細胞、免疫細胞、造血細胞、血管細胞、目の細胞、結合組織細胞、筋骨格細胞、骨組織、筋骨格組織、角膜組織、皮膚組織、心臓弁、血管、免疫細胞、結合組織、肺組織、皮膚、角膜、腎臓、肝臓、肺、膵臓、心臓、並びに腸が含まれ得る。
【００３６】
移植される低免疫原性細胞、組織及び／又は臓器は、移植を受ける対象と同系又は同種であり得る。
【００３７】
一実施形態では、低免疫原性細胞は、ヒト多能性細胞である。一実施形態では、低免疫原性細胞は、ヒト膵臓系統細胞である。一実施形態では、低免疫原性細胞は、ヒト膵臓内胚葉細胞である。一実施形態では、低免疫原性細胞は、ヒト膵臓前駆細胞である。一実施形態では、低免疫原性細胞は、ヒト膵臓前駆細胞である。一実施形態では、低免疫原性細胞は、ヒト膵臓内分泌細胞である。一実施形態では、低免疫原性細胞は、ヒト膵臓内分泌前駆体細胞である。一実施形態では、低免疫原性細胞は、ヒト膵臓内分泌プレβ細胞である。一実施形態では、低免疫原性細胞は、ヒト膵臓β細胞である。一実施形態では、低免疫原性細胞は、ヒト膵臓単一ホルモン性細胞又は多ホルモン性細胞である。一実施形態では、低免疫原性細胞は、ヒトインスリン発現細胞である。
【００３８】
一実施形態では、低免疫原性細胞は、周知であり公的に利用可能な多能性細胞株である。本明細書に記載の発明は、全てのｈＥＳ細胞及びｉＰＳＣ系統並びに少なくともｈＥＳＣ、例えば、ＣｙＴ４９、ＣｙＴ２５、ＣｙＴ２０３、及びＣｙＴ２１２において有用である。多能性細胞株には、ｗｉｃｅｌｌ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ／ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅｓ／ｏｒｄｅｒ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅｓ／ｏｂｔａｉｎ−ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ−ｌｉｎｅｓ．ｃｍｓｘのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  ＷｅｂでＷｉＣｅｌｌから商業的
に購入することができるものが含まれ、具体的には、ＢＧ０１、ＢＧ０２、及びＢＧ０３が含まれる。
【００３９】
一実施形態では、低免疫原性細胞は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるD'Amour et al. “Production of Pancreatic Hormone-Expressing Endocrine Cells From Human Embryonic Stem Cells” (Nov. 1, 2006) Nature Biotechnology 24, 1392-1401に記載されている細胞と実質的に同様である。Ｄ’Ａｍｏｕｒらは、５つのステップの分化プロトコルを記載している：ステージ１（大部分は、胚体内胚葉が生成される）、ステージ２（大部分は、ＰＤＸ１陰性前腸内胚葉が生成される）、ステージ３（大部分は、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉が生成される）、ステージ４（大部分は、多能性膵臓前駆細胞又は膵臓内分泌前駆細胞とも呼ばれる膵臓内胚葉が生成される）、及びステージ５（大部分は、ホルモン発現内分泌細胞が生成される）。一実施形態では、低免疫原性細胞は、米国特許第７，５１０，８７６号、第７，６９５，９６５号、同第７，９８５，５８５号、同第８，５８６，３５７号、同第８，６３３，０２４号、及び同第８，１２９，１８２号（これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものと実質的に同様である。
【００４０】
一実施形態では、低免疫原性細胞は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるSchulz et al. A Scalable System for Production of Functional Pancreatic Progenitors from Human Embryonic Stem Cells, PLoS One 7:5 1-17 (2012)に記載されている細胞と実質的に同様である。Ｓｃｈｕｌｚらは、ｈＥＳＣの増殖及びバンキング（banking）方法、並びに懸濁液ベースの分化システムを記載している。具体的には、未分化多能性細胞を動的回転懸濁培養で凝集させてクラスターにし、続いてステージ４のプロトコルで２週間一緒に分化させた。簡単に述べると、ｈＥＳ細胞凝集懸濁液から、ｈＥＳＣ単層をＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて分離し、収集し、ＳｔｅｍＰｒｏ  ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｇｌｕｔａｍａｘ、ＳｔｅｍＰｒｏｈＥＳＣサプリメント、ＢＳＡ、及び１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシンを含む、組み合わせＤＭＥＭ／Ｆ１２；ＦＧＦ−２及び２−メルカプトエタノールを省略）に１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁する。単一細胞懸濁液をＴＣ処理していない６ウェルプレートに分注し（５．５ｍＬ／ウェル）、Ｉｎｎｏｖａ２０００回転機（Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で９５ｒｐｍで回転させるか、又は５００ｍＬのＮａｌｇｅｎｅフィルターレシーバー（filter receiver）保存ボトルに分注し（１５０ｍＬ／ボトル）、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｃｅｒｔｏｍａｔ  ＲＭ−５０回転機（５ｃｍの回転軸で構成される）上で６５ｒｐｍで回転させる。細胞を３７℃／８％ＣＯ２インキュベーター中で一晩回転させ、約１００〜２００μｍの凝集体を形成した。直径１００〜２００μｍの凝集体の場合、６ウェル皿では６０〜１４０ｒｐｍの回転速度を使用することができ、５００ｍＬボトルでは５〜２０ｒｐｍの回転速度を使用することができる。懸濁液凝集体の分化には、Ｄ’Ａｍｏｕｒからのほんの少数の修飾が含まれていた。ステージ２中は、ＴＧＦ−βＲＩキナーゼ阻害剤ＩＶが含まれ、ステージ３中は、レチノイン酸をより安定したレチノイド類似体ＴＴＮＰＢ（３ｎＭ）に置き換えた。増殖因子ＫＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）及びＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）をステージ４で添加し、細胞質量を保持した。ノギン（５０ｎｇ／ｍＬ）もステージ４に含まれていた。一実施形態では、低免疫原性細胞は、米国特許第８，００８，０７５号及び同第８，８９５，３００号（これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているものと実質的に同様である。
【００４１】
一実施形態では、低免疫原性細胞は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるAgulnick et al. Insulin-Producing Endocrine Cells Differentiated In Vitro From Human Embryonic Stem Cells Function in Macroencapsulation Devices In Vivo Stem Cells Translationalmedicine 4:1-9 (2015)に記載されている細胞と実質的に同様である。Ａ
ｇｕｌｎｉｃｋらは、細胞集団のうちの７３％〜８０％がＰＤＸ１陽性（ＰＤＸ１＋）及びＮＫＸ６．１＋膵臓前駆細胞からなるような、膵臓前駆細胞を作成するための変更プロトコルを記載した。膵臓前駆細胞は、膵島様細胞（ＩＣ）にさらに分化し、これは７３％〜８９％の内分泌細胞を再現可能に含み、そのうち約４０％〜５０％がインスリンを発現した。これらのインスリン陽性細胞の大部分は、単一ホルモン陽性であり、転写因子ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現した。Ａｇｕｌｎｉｃｋは、Ｓｃｈｕｌｚらの２０１２プロトコルを、ステージ３（５〜７日目）においてアクチビンＡ、Ｗｎｔ３Ａ、及びヘレグリンβでさらに処理し、ステージ４（７〜１３日目）においてアクチビンＡ及びヘレグリンβでさらに処理することにより変更したプロトコルを記載している。一実施形態では、低免疫原性細胞は、米国特許第８，８５９，２８６号（これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている細胞と実質的に同様である。
【００４２】
ヒト胚性幹細胞の成長、継代、及び増殖は、米国特許第７，９６４，４０２号、同第８，２１１，６９９号、同第８，３３４，１３８号、同第８，００８，０７号、及び同第８，１５３，４２９号に記載されるのと実質的に同様にして行うことができる。
【００４３】
標準的な製造プロトコル
ｈＥＳＣに由来する膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）を生成するための標準的な作製方法を以下の表２に開示する。
【００４４】
【表２】
2020526224.tif 000006
【００４５】
ｈＥＳＣ  Ａｇｇ．：ｈＥＳＣ凝集体；ＸＦ  ＨＡ：１０％ｖ／ｖ  Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  ＫｎｏｃｋＯｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１％ｖ／ｖ  非必須アミノ酸、１％ｖ／ｖ  ペニシリン／ストレプトマイシン（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）、１０ｎｇ／ｍＬ  ヘレグリン−１β（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及び１０ｎｇ／ｍＬ  アクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２；ＳＰ：ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭ  （Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ｒ０．２ＦＢＳ：ＲＰＭＩ１６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ）、０．２％  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ｖ／ｖ  ペニシリン／ストレプトマイシン；ＩＴＳ：１：５０００又は１：１０００に希釈したインスリン−トランスフェリン−セレニウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ａ１００：１００ｎｇ／ｍＬ  組換えヒトアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｗ５０：５０ｎｇ／ｍＬ  組換えマウスＷｎｔ３Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｋ２５：２５ｎｇ／ｍＬ  換えヒトＫＧＦ（Ｒ＆Ｄ
Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＩＶ：２．５μＭ  ＴＧＦ−βＲＩキナーゼ阻害剤ＩＶ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；ｄｂ：０．５×Ｂ−２７  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、及び１％ｖ／ｖ  ペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、ＤＭＥＭ  ＨＩ  Ｇｌｕｃｏｓｅ（ＨｙＣｌｏｎｅ）；ＣＴＴ３：０．２５μＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ））及び３ｎＭ  ＴＴＮＰＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；Ｎ５０：５０ｎｇ／ｍＬ  組換えヒトノギン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｋ５０：５０ｎｇ／ｍＬ  組換えヒトＫＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｅ５０：５０ｎｇ／ｍＬ  組換えヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【００４６】
カルセイン放出アッセイ
カルセイン放出アッセイは、ＮＫ細胞の細胞傷害性を研究するための非放射性代替法である。標的細胞は蛍光色素（カルセインＡＭ）を取り込み、該蛍光色素は細胞質によって活性な蛍光色素に変換され、これは溶解時にのみ細胞から放出される。溶解した細胞は蛍光色素を上清に放出し、次いで該上清を採取し、蛍光計で蛍光量を定量する。細胞溶解率は、ＮＫ細胞（エフェクター）、遮断抗体、又はその両方の存在下又は非存在下でインキュベートした後に上清に存在する蛍光量から計算される。
【００４７】
特定の溶解は、溶解％＝１００×［（抗体ありの場合の平均蛍光−平均自発蛍光）／（平均最大蛍光−平均自発蛍光）］の式を使用することによって計算することができる。最大蛍光は、界面活性剤（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）とともにインキュベートした細胞の溶解によって決定され、自発的溶解は、抗体又はエフェクター細胞のない標的細胞で得られた蛍光とした。
【００４８】
多能性幹細胞に由来する様々な細胞組成物及びその方法は、本明細書に記載されており、２００２年８月６日に出願された、METHODS FOR CULTURE OF HESC ON FEEDER CELLSと題する本出願人の米国特許出願第１０／４８６，４０８号；２００４年１２月２３日に出願された、DEFINITIVE ENDODERMと題する同第１１／０２１，６１８号；２００５年４月２６日に出願された、PDX1 EXPRESSING ENDODERMと題する同第１１／１１５，８６８号；２００５年６月２３日に出願された、METHODS FOR IDENTIFYING FACTORS FOR DIFFERENTIATING DEFINITIVE ENDODERMと題する同第１１／１６５，３０５号；２００５年８月１５日に出願された、METHODS FOR INCREASING DEFINITIVE ENDODERM DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT HUMAN EMBRYONIC STEM CELLS WITH PI-3 KINASE INHIBITORSと題する同第１１／５７３，６６２号；２００５年１０月２７日に出願された、PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERMと題する同第１２／７２９，０８４号；２００５年１１月
１４日に出願された、MARKERS OF DEFINITIVE ENDODERMと題する同第１２／０９３，５９０号；２００６年６月２０日に出願された、EMBRYONIC STEM CELL CULTURE COMPOSITIONS
AND METHODS OF USE THEREOFと題する同第１１／９９３，３９９号；２００６年１０月２７日に出願された、PDX1-EXPRESSING DORSAL AND VENTRAL FOREGUT ENDODERMと題する同第１１／５８８，６９３号；２００７年３月２日に出願された、ENDOCRINE PROGENITOR/PRECURSOR CELLS, PANCREATIC HORMONE-EXPRESSING CELLS AND METHODS OF PRODUCTIONと題する同第１１／６８１，６８７号；２００７年５月２４日に出願された、METHODS FOR CULTURE AND PRODUCTION OF SINGLE CELL POPULATIONS OF HESCと題する同第１１／８０７，２２３号；２００７年７月５日に出願された、METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONESと題する同第１１／７７３，９４４号；２００７年９月２４日に出願された、METHODS FOR INCREASING DEFINITIVE ENDODERM PRODUCTIONと題する同第１１／８６０，４９４号；２００８年４月８日出願された、METHODS OF PRODUCING PANCREATIC HORMONESと題する同第１２／０９９，７５９号；２００８年４月２１日に出願された、PURIFYING ENDODERM AND PANCREATIC ENDODERM CELLS DERIVED FORM HUMAN EMBRYONIC STEM CELLSと題する同第１２／１０７，０２０号；２００９年１１月１３日に出願された、ENCAPSULATION OF PANCREATIC LINEAGE CELLS DERIVED FROM HUMAN PLURIPOTENT STEM CELLS）と題する同第１２／６１８，６５９号；２０１０年４月２２日及び２０１３年２月６日に出願された、両方とも、CELL COMPOSITIONS FROM DEDIFFERENTIATED REPROGRAMMED CELLSと題する同第１２／７６５，７１４号及び同第１３／７６１，０７８号；２００７年８月１３日に出願された、COMPOSITIONS AND METHODS USEFUL FOR CULTURING DIFFERENTIABLE CELLSと題する同第１１／８３８，０５４号；２００８年１１月４日に出願された、STEM CELL AGGREGATE SUSPENSION COMPOSITIONS AND METHODS OF DIFFERENTIATION THEREOFと題する同第１２／２６４，７６０号；２０１０年４月２７日に出願された、SMALL MOLECULES SUPPORTING PLURIPOTENT CELL GROWTHと題する同第１３／２５９，１５号；２０１１年２月２１日に出願された、LOADING SYSTEM FOR AN ENCAPSULATION DEVICEと題する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１１／２５６２８；２０１０年１２月２８日に出願された、AGENTS AND METHODS FOR INHIBITING PLURIPOTENT STEM CELLS）と題する同第１３／９９２，９３１号；並びに２０１１年１２月１２日に出願された米国意匠出願第２９／４０８，３６６号；同第２０１１年１２月１２日に出願された同第２９／４０８，３６８号；２０１２年５月３１日に出願された同第２９／４２３，３６５号；及び２０１３年３月１３日に出願された同第２９／４４７，９４４号；２０１４年３月７日に出願された、DIMENSIONAL LARGE CAPACITY CELL ENCAPSULATION DEVICE ASSEMBLYと題する米国出願第１４／２０１，６３０号；２０１３年１２月１３日に出願された、IN VITRO DIFFERENTIATION OF PLURIPOTENT STEM CELLS TO PANCREATIC ENDODERM CELLS (PEC) AND ENDOCRINE CELLSと題する米国出願第１４／１０６，３３０号；２０１６年１１月１０日に出願された、PDX1 PANCREATIC ENDODERM CELLS IN CELL DELIVERY DEVICES AND METHODS THEREOFと題する国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６１４４２に見出すことができ、これらは全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００４９】
多能性幹細胞に由来する様々な細胞組成物及びその方法は、本明細書に記載されており、本出願人によって独占的にライセンスされた出願：２００８年４月２４日に出願された、Pluripotent cellsと題する米国特許公開第２００９／０２６９８４５号；２０１０年７月２０日に出願された、Differentiation of Human Embryonic Stem Cellsと題する米国特許公開第２０１１／００１４７０３号；２０１０年７月１９日に出願された、Differentiation of Human Embryonic Stem Cellsと題する米国特許公開第２０１１／００１４７０２号；２０１０年１２月１６日に出願された、Differentiation of Human Embryonic
Stem Cellsと題する米国特許公開第２０１１／０１５１５６１号；２００９年１０月２２日に出願された、Differentiation of Human Embryonic Stem Cellsと題する米国特許公開第２０１０／０１１２６９２号；２０１１年８月１７日に出願された、Differentiation of Pluripotent Stem Cellsと題する米国特許公開第２０１２／００５２５７６号；
２００９年１０月２３日に出願された、Differentiation of human pluripotent stem cellsと題する米国特許公開第２０１０／０１１２６９３号；２０１０／１２／１６日に出願された、Differentiation of human embryonic stem cellsと題する米国特許公開第２０１１／０１５１５６０号；２００８年７月３１日に出願された、Differentiation of human embryonic stem cellsと題する米国特許公開第２０１０／００１５１００号；２００８年１１月２５日に出願された、Differentiation of human embryonic stem cellsと題する米国特許公開第２００９／０１７０１９８号；２０１５年５月７日に出願された、Use of Small Molecules to Enhance MAFA Expression in Pancreatic Endocrine Cellsと題する米国特許公開第２０１５／０３２９８２８号；２０１３年６月６日に出願された、Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Pancreatic Endocrine Cellsと題する米国特許公開第２０１３／０３３０８２３号；２０１３年６月１３日に出願された、Differentiation of human embryonic stem cells into pancreatic endocrine cellsと題する国際公開第２０１３／１９２００５号；２０１３年１２月３０日に出願された、Suspension and clustering of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cellsと題する米国特許公開第２０１４／０２４２６９３号；２０１４年６月１７日に出願された、Suspension and clustering of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cellsと題する米国特許公開第２０１４／０２９５５５２号；２０１４年５月２１日に出願された、Suspension
and clustering of human pluripotent stem cells for differentiation into pancreatic endocrine cellsと題する国際公開第２０１５／０６５５２４号；２０１３年６月６日に出願された、Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Pancreatic Endocrine Cellsと題する米国特許公開第２０１３／０３３０８２３号；２０１３年１２月１８日に出願された、Differentiation of Human Embryonic Stem Cells Into Pancreatic Endocrine Cells Using HB9 Regulatorsと題する米国特許公開第２０１４／０１８６９５３号；２０１５年１２月９日に出願された米国出願第１４／９６３７３０号；２０１５年１２月１１日に出願された米国出願第１４／８９８，０１５号に見出すことができ、これらは全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００５０】
一実施形態では、低免疫原性細胞は、細胞送達デバイス内にカプセル化される。細胞送達デバイスは、不織布を含んでもよい。細胞送達デバイスは、それぞれが１つの機能又は複数の機能を果たす様々な層を含む。いくつかの実施形態では、細胞送達デバイスは、細胞除外（cell-excluding）膜及び不織布の両方を含む。別の実施形態では、送達デバイスは、ＴｈｅｒａＣｙｔｅ（以前はＢａｘｔｅｒ）デバイス（Ｉｒｖｉｎｅ、カリフォルニア州）である。ＴｈｅｒａＣｙｔｅ細胞送達デバイスは、米国特許第６，７７３，４５８号、同第６，１５６，３０５号、同第６，０６０，６４０号、同第５，９６４，８０４号、同第５，９６４，２６１号、同第５，８８２，３５４号、同第５，８０７，４０６号、同第５，８００，５２９号、同第５，７８２，９１２号、同第５，７４１，３３０号、同第５，７３３，３３６号、同第５，７１３，８８８号、同第５，６５３，７５６号、同第５，５９３，４４０号、同第５，５６９，４６２号、同第５，５４９，６７５号、同第５，５４５，２２３号、同第５，４５３，２７８号、同第５，４２１，９２３号、同第５，３４４，４５４号、同第５，３１４，４７１号、同第５，３２４，５１８号、同第５，２１９，３６１号、同第５，１００，３９２号、及び同第５，０１１，４９４号に記載され、これらは全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【００５１】
別の実施形態では、送達デバイスは、米国特許第８，２７８，１０６号に実質的に記載されているデバイス、並びに２０１４年３月７日に出願された米国出願第１４／２０１，６３０号、及び２０１６年１１月１０日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０６１４４２号、及び米国意匠第２９／４４７，９４４、同第２９／５０９，１０２号、同第２９／４８４，３６３号、同第２９／４８４，３６０号、同第２９／４８４，３５９号、同第２９／４８４，３５７号、同第２９／４８４，３５６号、同第２９／４８４，３５
５号、同第２９／４８４，３６２号、同第２９／４８４，３５８号、同第２９／４０８，３６６号、同第２９／５１７，３１９号、同第２９／４０８，３６８号、同第２９／５１８，５１３号、同第２９／５１８，５１６号、同第２９／４０８，３７０号、同第２９／５１７，１４４号、同第２９／４２３，３６５号、同第２９／５３０，３２５号、同第２９／５８４，０４６に記載されているデバイスであり、これらは全て参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。他の実施形態では、細胞送達デバイス又は大容量アセンブリは、細胞送達デバイスの管腔をさらに仕切る１つ又は２つ以上のシール（seal）、すなわち仕切りシールからなる。例えば、本出願人の米国意匠出願第２９／４０８３６６号、同第２９／４０８３６８号、同第２９／４０８３７０号、同第２９／４２３，３６５号、及び同第２９／５８４，０４６号を参照のこと。
【００５２】
一実施形態では、低免疫原性細胞は、宿主の血管細胞とカプセル化細胞との間の直接的な細胞間接触を提供する有孔（perforated）細胞送達デバイスに移植される。有孔とは、デバイスの穴又は孔を意味する。いくつかの実施形態では、デバイスの全ての層が有孔となっているのではない。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／００６１４４２号を参照のこと、これは、ただ１つの層、例えば細胞除外膜において又は細胞除外膜及び不織布層において有孔がある有孔細胞送達デバイスについて論じている。一実施形態では、低免疫原性細胞は、不織布に囲まれた有孔デバイス中にカプセル化される。これらの実施形態では、不織布は細胞送達デバイスの外側にある。不織布は、移植された細胞に影響を与えるのではなく、細胞ハウジング（cell housing）を取り囲む宿主の血管新生を促進する。例えば、有孔デバイス及びデバイスポリマーを記載している国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／００６１４４２及び米国特許第８，２７８，１０６号（これらは両方とも、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００５３】
一実施形態では、穴／有孔は、デバイスに含まれる細胞凝集体、例えば、デバイスに含まれる胚体内胚葉系統細胞凝集体などのｈＰＳＣ由来の凝集体よりも小さい。一実施形態では、ラット又はヒトに移植された有孔細胞送達デバイスは、細胞除外膜のみに有孔を含み（デバイスの他の層は有孔ではない）、穴は約２ｍｍ以上離れており、穴の直径は約１００ミクロン未満である。
【００５４】
低免疫原性細胞の枯渇（「自殺遺伝子」）
体内の組織を置換及び回復するための胚性幹細胞及び人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞の多様性は、癌リスクの増加と並行して生じる。癌リスクの増加は遺伝子療法にも関連する。したがって、再プログラム化組織は、ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞に由来するかどうか（Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676, (2006)及びHanna, J. H., Saha, K. & Jaenisch, R. Pluripotency and Cellular Reprogramming:
Facts, Hypotheses, Unresolved Issues. Cell 143, 508-525, (2010)（これらは両方とも、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる））、又は他の多能性細胞若しくは前駆体細胞に由来するかどうか、及び遺伝子治療ベクターで処置された細胞に由来するかどうかに関係なく、安全上の懸念を与える（Knoepfler, P. S. Deconstructing Stem Cell Tumorigenicity: A Roadmap to Safe Regenerative Medicine. Stem Cells 27, 1050-1056, (2009)（これは、参照によりその全体が組み込まれる））。例えば、皮下移植されたｉＰＳ細胞は奇形腫を引き起こし、ｉＰＳキメラ動物は高い発生率で原発性悪性癌を発症する（Takahashi, K. & Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676, (2006); Knoepfler, P. S. Deconstructing Stem Cell Tumorigenicity: A Roadmap
to Safe Regenerative Medicine. Stem Cells 27, 1050-1056, (2009)）。良性の奇形腫は手術で容易に除去し得るが、浸潤性癌は細胞療法のリスクが残ったままである。
【００５５】
自殺遺伝子戦略を含む、幹細胞の腫瘍形成性（tumorigenicity）を克服するための戦略が検討されている（Knoepfler, P. S. Deconstructing Stem Cell Tumorigenicity: A Roadmap to Safe Regenerative Medicine. Stem Cells 27, 1050-1056, (2009)）。具体的には、全身的に利用可能なプロドラッグを局所的に活性な抗腫瘍剤へと代謝する酵素をコードする遺伝子を移植細胞に選択的に導入することができる。例えば、チミジンキナーゼによって細胞キナーゼによる三リン酸化後に毒性となる化合物へと変換されるガンシクロビルでの処置は、インビトロでの腫瘍細胞の破壊をもたらした。したがって、宿主組織と移植細胞との間における利用可能な生化学的差異を人工的に生じさせるように、移植細胞を修飾することができる。移植細胞の標的化は、自殺遺伝子を送達するために使用されるベクターの選択によって、及び使用される自殺遺伝子／プロドラッグシステムの生物学によって達成される。その結果、細胞が移植される環境でのみ生成される高用量の薬物は、他の組織での副作用を制限する。
【００５６】
低免疫原性細胞の枯渇は、低免疫原性細胞に遺伝子を選択的に導入し、その遺伝子の発現が低免疫原性細胞死を直接的にもたらすか、又は低免疫原性細胞を他の剤に対して特異的に感受性にするかのいずれかにより達成され得る。この方法による低免疫原性細胞のインビボ又はエクスビボ枯渇は、レトロウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス遺伝子送達などであるがこれらに限定されないウイルス遺伝子送達システムを使用して、所望の遺伝子を低免疫原性細胞に送達することによって達成され得る。所望のウイルス送達システムは、例えば低免疫原性細胞のアポトーシスを誘導することにより、例えば細胞死を直接引き起こすタンパク質をゲノムがコードするウイルスを含み得る。あるいは、ウイルス送達システムは、例えば単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子をゲノムがコードするウイルスを含み得る。低免疫原性細胞における単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子の発現により、低免疫原性細胞は薬理的用量のガンシクロビルに感受性を示すようになる。したがって、ウイルス形質導入された低免疫原性細胞とガンシクロビルとのその後の接触により、低免疫原性細胞の死がもたらされる。低免疫原性細胞の枯渇は、例えばＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ、及びＴＡＬＥＮシステムなどのゲノム編集アプリケーショを介していわゆる「自殺遺伝子」を導入することによって達成され得る。
【００５７】
チミジンキナーゼなどの遺伝子の発現時に細胞の死滅を媒介するガンシクロビルなどの剤を本明細書では「細胞死誘導剤」と称する。
【００５８】
低免疫原性細胞を死滅させるために使用することができる遺伝子には、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ及びシトシンデアミナーゼ、又は誘導性プロモーター／調節配列（本明細書では、「プロモーター／調節配列」又は「プロモーター」と同義的に称する）の制御下に置くことができる細胞死を誘導する任意の遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子は低免疫原性細胞に移入され、細胞は適切な選択圧下で選択され、細胞は患者に移入され、そこで生着が可能となる。次いで、患者はプロモーター活性を誘発する剤で処置され、それにより、生成物が低免疫原性細胞を死滅させるように機能する遺伝子の発現を誘発する。チミジンキナーゼの場合、この酵素による細胞の死滅を促進する他の剤、例えばガンシクロビルなども使用することができる（Bonini et al., 1997, Science 276:1719-1724; Bordignon et al., 1995, Human Gene Therapy 6:813-819; Minasi et al., 1993, J. Exp. Med. 177:1451-1459; Braun et al., 1990, Biology of Reproduction 43:684-693）。この目的に有用な他の遺伝子には、カスパーゼ３、８、及び９の構成的に活性な形態、ｂａｘ、グランザイム、ジフテリア毒素、シュードモナスＡ毒素、リシン（ricin）、及び本明細書の別の箇所で開示されている他の毒素遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。そのような遺伝子をヒトに送達するための適切な構築物の生成は、当業者には容易に明らかであり、例えば、Sambrook et al.(1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 及びAusubel et 
al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に記載されている。
【００５９】
細胞を死滅させる目的で低免疫原性細胞に移入される遺伝子は、適切な誘導剤が細胞に添加（哺乳動物へ投与）されたときに遺伝子発現の誘導が達成され得るように、適切なプロモーター配列の制御下に置かれることが重要である。そのような誘導性プロモーター配列には、細胞への金属の添加時に誘導されるプロモーター、ステロイド誘導性プロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、エクジソンプロモーターシステムを使用し得る。この実施形態では、エクジソンプロモーターは、エクジソン受容体タンパク質配列の上流にクローニングされ、該配列は、所望の遺伝子、例えば、所望の毒素に作動可能に連結されたエクジソン結合部位の発現を駆動する第２のプロモーター配列の上流に位置する。プロモーターの誘導によって毒素の発現が誘導され、それにより、毒素遺伝子が存在している細胞が死滅する。
【００６０】
細胞がエクスビボ様式で形質導入される場合、細胞を死滅させるための遺伝子を形質導入した細胞は、形質導入遺伝子に加えて選択マーカーを細胞に提供することによって選択され得る（すなわち、遺伝子を含まない細胞から分離され得る）。選択可能なマーカーは、当該技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y.)に記載されている。
【００６１】
低免疫原性細胞の枯渇は、低免疫原性細胞集団にオリゴヌクレオチド（例えば、限定するものではないが、アンチセンス分子）又はリボザイムを導入することによりさらに達成され、このオリゴヌクレオチド又はリボザイムは、低免疫原性細胞の死又は低免疫原性細胞機能の障害を誘導することができる。そのようなオリゴヌクレオチドには、低免疫原性細胞を死滅させるか、又はＴ細胞の刺激に関して低免疫原性細胞の機能を損なうものとして本明細書で定義される低免疫原性細胞の必須の機能を標的とするものが含まれる。低免疫原性細胞のそのような機能には、特に、Ｂ７１及びＢ７２の共刺激機能、ＣＤ４０が含まれるが、これらに限定されない。したがって、本発明の方法に有用なオリゴヌクレオチド及びリボザイムには、これらの標的に対するものが含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
本明細書に記載されるように、低免疫原性細胞の枯渇には、低免疫原性細胞機能の障害が含まれる。低免疫原性細胞機能の障害には、低免疫原性細胞の物理的除去又は枯渇を伴う又は伴わない全ての形態の低免疫原性細胞障害が含まれる。したがって、低免疫原性細胞機能の障害には、低免疫原性細胞機能に重要な低免疫原性細胞表面分子の機能を遮断する抗体の使用が含まれる。
【００６３】
あるいは、遮断が低免疫原性細胞機能の障害をもたらす、低免疫原性細胞表面分子の機能を遮断するペプチドが、宿主生物における低免疫原性細胞を効果的に枯渇させるために使用され得る。そのようなペプチドには、低免疫原性細胞の表面上の受容体分子に特異的に結合するように設計されたもの、及び例えばこれらの細胞の必須の酵素機能を阻害するように設計されたものが含まれるが、これらに限定されない。
【００６４】
同様に、本明細書に記載されるのと同じ目的のために設計された遺伝子及びオリゴヌクレオチドも、本発明の方法におけるツールとして含まれる。したがって、低免疫原性細胞の生物学的機能を損なうペプチド、オリゴヌクレオチド、及び遺伝子は、その用語が本明細書で定義されているように、本明細書で開示される本発明の方法における使用も企図される。
【００６５】
本発明は、本発明の方法を実施するための適切な低免疫原性細胞枯渇組成物の医薬組成
物の使用をさらに包含し、組成物は適切な低免疫原性細胞枯渇組成物及び薬学的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、細胞枯渇組成物は、抗体及び毒素を含むキメラ組成物である。
【００６６】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、適切な低免疫原性細胞枯渇組成物と組み合わせることができ、組み合わせ後において適切な低免疫原性細胞枯渇組成物を哺乳動物に投与するために使用することができる化学組成物を意味する。
【００６７】
本発明の方法に有用な医薬組成物は、経口固形製剤、眼科用製剤、坐剤、エアロゾル製剤、局所製剤、又は他の類似の製剤で全身投与され得る。そのような医薬組成物は、低免疫原性細胞枯渇組成物に加えて、薬学的に許容される担体及び薬剤投与を促進及び容易化することが知られている他の成分を含んでもよい。ナノ粒子、リポソーム、再封赤血球（resealed erythrocyte）、及び免疫学に基づくシステムなどの他の可能な製剤も、本発明の方法による適切な低免疫原性細胞枯渇組成物を投与するために使用され得る。
【００６８】
「自殺遺伝子」を細胞に導入する方法は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０２２２６３３号に開示されている。
【００６９】
本発明は、哺乳動物宿主における低免疫原性細胞を枯渇させる方法を含む。低免疫原性細胞が宿主に移植された後、この方法は、低免疫原性細胞を細胞枯渇組成物と接触させて低免疫原性細胞機能の障害又は低免疫原性細胞の死滅を引き起こし、それにより、哺乳動物宿主における低免疫原性細胞を枯渇させることを含む。
【００７０】
別の態様では、低免疫原性細胞枯渇組成物は、毒素、抗体、放射性分子、核酸、ペプチド、ペプチド模倣物、及びリボザイムからなる群から選択される。
【００７１】
一態様では、毒素は、免疫毒素である。毒素は、リシン、ジフテリア毒素、及びシュードモナス外毒素Ａからなる群から選択される。
【００７２】
別の実施形態では、抗体は、ＣＤ１ａに特異的な抗体、ＣＤ１１ｃに特異的な抗体、ＭＨＣＩＩに特異的な抗体、ＣＤ１１ｂに特異的な抗体、ＤＥＣ２０５に特異的な抗体、Ｂ７１に特異的な抗体、Ｂ７２に特異的な抗体、ＣＤ４０に特異的な抗体、Ｉ型レクチンに特異的な抗体、及びＩＩ型レクチンに特異的な抗体からなる群から選択される。
【００７３】
さらに別の実施形態では、核酸分子は、遺伝子及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される。
【００７４】
さらなる実施形態では、放射性分子は、放射性標識抗体である。
【００７５】
別の実施形態では、抗原枯渇組成物は、抗体及び毒素を含むキメラ組成物である。毒素は、リシン、ジフテリア毒素、及びシュードモナス外毒素Ａからなる群から選択され得る。
【００７６】
別の実施形態では、抗体は、ＣＤ１ａに特異的なｆ抗体、ＣＤ１１ｃに特異的な抗体、ＭＨＣＩＩに特異的な抗体、ＣＤ１１ｂに特異的な抗体、ＤＥＣ２０５に特異的な抗体、Ｂ７１に特異的な抗体、Ｂ７２に特異的な抗体、ＣＤ４０に特異的な抗体、Ｉ型レクチンに特異的な抗体、及びＩＩ型レクチンに特異的な抗体からなる群から選択される。
【００７７】
組み合わせ製品
本明細書に記載の実施形態は、低免疫原性細胞又は治療剤が充填されたデバイスを指す
組み合わせ製品も開示し、すなわち、それぞれが単独で医療デバイス又は細胞製品の候補であり得るが、それらは組み合わせて使用することで組み合わせ製品となる。一実施形態では、組み合わせ製品は、低免疫原性細胞が充填された有孔デバイスを指す。これは、「組み合わせ製品」又は「有孔組み合わせ製品」と称される。デバイス（有孔又は非有孔）は、米国特許第８，２７８，１０６号及び同第９，５２６，８８０号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／００６１４４２号、並びに米国意匠特許第Ｄ７１４９５６号、同第Ｄ７１８４７２号、同第Ｄ７１８４６７号、同第Ｄ７１８４６６号、同第Ｄ７１８４６８号、同第Ｄ７１８４６９号、同第Ｄ７１８４７０号、同第Ｄ７１８４７１号、同第Ｄ７２０４６９号、同第Ｄ７２６３０６号、同第Ｄ７２６３０７号、同第Ｄ７２８０９５号、同第Ｄ７３４１６６号、同第Ｄ７３４８４７号、同第Ｄ７４７４６７号、同第Ｄ７４７４６８号、同第Ｄ７４７７９８号、同第Ｄ７５０７６９号、同第Ｄ７５０７７０号、同第Ｄ７５５９８６号、同第Ｄ７６０３９９号、同第Ｄ７６１４２３号、同第Ｄ７６１４２４号（参照によりそれらの全体が組み込まれる）に記載されるような細胞カプセル化デバイスを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載されている任意のマクロ細胞送達デバイスであり得る。デバイス（有孔又は非有孔）に充填される細胞は、胚体内胚葉、ＰＤＸ１陽性内胚葉、ＰＤＸ１陽性前腸内胚葉、膵臓内胚葉、ＰＤＸ１及びＮＫＸ６．１を発現する膵臓内胚葉細胞、内分泌前駆細胞、ＮＫＸ６．１及びＩＮＳを発現する内分泌前駆細胞、未成熟β細胞、ＮＫＸ６．１、ＩＮＳ、及びＭＡＦＢを発現する未成熟β細胞、成熟内分泌細胞、ＩＮＳ、ＧＣＧ、ＳＳＴ、及びＰＰを発現する成熟内分泌細胞、及び成熟β細胞、並びにＩＮＳ及びＭＡＦＡを発現する成熟β細胞を含むがこれらに限定されない、上記で論じた任意の低免疫原性細胞であり得る。
【００７８】
膵臓内胚葉又はインビボで移植されたときに成熟する膵臓前駆低免疫原性細胞が充填された有孔送達デバイスは、糖尿病患者のインスリン依存を軽減させる及び／又は低血糖を軽減させることが意図される。これには、低血糖に気付いていない、不安定な（脆弱な）、又は臓器移植を受けていて、かつ、免疫抑制療法に耐えられるか又はすでに免疫抑制療法を受けている、ハイリスクＩ型糖尿病患者が含まれるが、これらに限定されない。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／００６１４４２号（参照によりその全体が組み込まれる）に実質的に記載されているように、主な作用方法は、直接的な宿主の血管新生を促進する透過性かつ耐久性の移植可能な医療デバイスに含まれるヒト膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）又は膵臓前駆低免疫原性細胞を介する。ＰＥＣの低免疫原性細胞は、移植後に、治療用のグルコース応答性インスリン放出低免疫原性細胞に分化及び成熟する。したがって、有孔組み合わせ製品は、ヒトインスリンの分泌を助長する。有孔組み合わせ製品は、インビボでＰＥＣ低免疫原性細胞の分布（脱出（egress））を制限する。有孔組み合わせ製品は、デバイス内に治療用低免疫原性細胞集団を維持し、インスリン及び他の膵臓生成物の血流への分布を促進するための十分な血管生着を可能にする場所に移植される。有孔組み合わせ製品は、従来の外科手術具で移植及び外植され、治療用量を２年以上提供することが意図される。デバイスは、処方中、保存期間中、取り扱い中、及び外科的移植中に十分な用量のＰＥＣ低免疫原性細胞製品を保持して臨床効果を達成し、かつ安全性要件を満たすために細胞製品が組織カプセル内に置かれることを保証することが意図されている。
【００７９】
ノックイン
特定の実施形態では、免疫寛容原性因子をゲノム編集された幹細胞株に挿入又は再挿入して、免疫特権を有するユニバーサルドナー幹細胞株を作成することができる。特定の実施形態では、本明細書に開示されるユニバーサル幹細胞は、１つ以上の免疫寛容原性因子を発現するようにさらに修飾されている。例示的な免疫寛容原性因子には、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、ＣＩ−阻害剤、及びＩＬ−３５のうちの１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子編集の任意の方法が、上記の免疫寛容原性因子などの免疫寛容原性因子をＡＡＶＳ１遺伝子座に挿入することを促進して免疫拒絶を積極的に阻害するために使用され得る。
【００８０】
具体的には、特定の実施形態では、本明細書に開示される発明は、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ遺伝子及び少なくとも１つのＮＫ活性化リガンド遺伝子の重要な成分を低減又は欠失させるようにゲノムが改変され、１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を増加させるようにさらに改変された幹細胞に関する。特定の実施形態では、本明細書に開示される発明は、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ遺伝子及び少なくとも１つのＮＫ活性化リガンド遺伝子の重要な成分を低減又は欠失させるようにゲノムが改変され、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、ＣＩ−阻害剤、及びＩＬ−３５のうちの１つ以上の発現を増加させるようにさらに改変された幹細胞に関する。
【００８１】
実施形態
本発明の他の実施形態を以下の番号付き項目を参照して記載する。
【００８２】
遮断抗体に関する：組成物
【００８３】
項目１：少なくとも１つのヒト白血球抗原（ＨＬＡ）クラスＩ遺伝子を欠く多能性由来細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化リガンドに結合する少なくとも１つの剤を含む組成物。
【００８４】
項目２：剤が抗体である、項目１の組成物。
【００８５】
項目３：ＨＬＡクラスＩ遺伝子が、Ｂ２Ｍである、項目１の組成物。
【００８６】
項目４：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はそれらの組み合わせである、項目１〜３の組成物。
【００８７】
項目５：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１及びＣＥＡＣＡＭ１である、項目１〜２の組成物。
【００８８】
項目６：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢである、項目１〜２の組成物。
【００８９】
項目７：多能性由来細胞が、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤が多能性細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに発現する、項目１〜２の組成物。
【００９０】
項目８：細胞死誘導剤が、ガンシクロビルである、項目７の組成物。
【００９１】
項目９：多能性由来細胞が、１つ以上の免疫寛容原性因子をさらに過剰発現する、項目１〜８のいずれか１つの組成物。
【００９２】
項目１０：免疫寛容原性因子が、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、ＣＩ−阻害剤、又はＩＬ−３５である、項目９の組成物。
【００９３】
項目１１：免疫寛容原性因子が、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、及びＨＬＡ−Ｇである、項目９の組成物。
【００９４】
遮断抗体に関する：方法
【００９５】
項目１：ヒト多能性由来細胞の細胞移植片拒絶を防止する方法であって、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ遺伝子を欠く標的細胞集団及び標的細胞上のＮＫ細胞活性化リガンドに結合する少なくとも１つの剤を含む組成物を対象のＮＫ細胞攻撃を抑制するのに有効な量で処置を必要とする対象に投与し、それにより、ヒト多能性由来細胞の細胞移植片拒絶を防止することを含む、方法。
【００９６】
項目２：剤が抗体である、項目１の方法。
【００９７】
項目３：ＮＫ細胞活性化リガンドに対する対象の免疫応答が抑制される、項目１の方法。
【００９８】
項目４：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、又はＭＩＣＢである、項目１の方法。
【００９９】
項目５：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢである、項目１の方法。
【０１００】
項目６：対象がヒトである、項目１の方法。
【０１０１】
項目７：抗体がヒト抗体である、項目２の方法。
【０１０２】
ｈＥＳ細胞ダブルノックアウトに関する：組成物
【０１０３】
項目１：多能性由来細胞を含むインビトロ細胞集団であって、該多能性由来細胞が、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ遺伝子及び少なくとも１つのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化リガンド遺伝子を欠く、インビトロ細胞集団。
【０１０４】
項目２：ＨＬＡクラスＩ遺伝子が、Ｂ２Ｍである、項目１のインビトロ細胞集団。
【０１０５】
項目３：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はそれらの組み合わせである、項目１〜２のインビトロ細胞集団。
【０１０６】
項目４：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１及びＣＥＡＣＡＭ１である、項目１〜２のインビトロ細胞集団。
【０１０７】
項目５：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢである、項目１〜２のインビトロ細胞集団。
【０１０８】
項目６：多能性由来細胞が、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤が多能性由来細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに発現する、項目１〜５のインビトロ細胞集団。
【０１０９】
項目７：細胞死誘導剤が、ガンシクロビルである、項目６のインビトロ細胞集団。
【０１１０】
項目８：多能性由来細胞が、１つ以上の免疫寛容原性因子をさらに過剰発現する、項目１〜７のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１１１】
項目９：免疫寛容原性因子が、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、ＣＩ−阻害剤、ＩＬ−３５、又はその組み合わせである、項目８のインビトロ細胞集団。
【０１１２】
項目１０：免疫寛容原性因子が、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、及びＨＬＡ−Ｇである、項目９のインビトロ細胞集団。
【０１１３】
多能性幹細胞トリプルノックアウトに関する：組成物
【０１１４】
細胞中のＢ２Ｍ表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＢ２Ｍ遺伝子が編集された、第１のゲノム修飾と、（ｂ）細胞中のＩＣＡＭ−１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＩＣＡＭ−１遺伝子が編集された、第２のゲノム修飾と、（ｃ）細胞中のＣＥＡＣＡＭ１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＣＥＡＣＡＭ１遺伝子が編集された、第３のゲノム修飾と、を含む修飾されたゲノムを含むヒト多能性幹細胞。
【０１１５】
転写調節因子のノックアウトに関する：組成物
【０１１６】
項目１２：野生型多能性幹細胞に対して、１つ以上のＭＨＣクラスＩ若しくはＭＨＣクラスＩＩ遺伝子又はタンパク質複合体及び１つ以上のＮＫ細胞活性化リガンドの調節された発現を含む多能性由来細胞であって、多能性幹細胞が、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩの１つ以上の転写因子をコードする１つ以上の遺伝子及び細胞の少なくとも１つの対立遺伝子から欠失されたＮＫ細胞活性化リガンド遺伝子を有する、多能性由来細胞。
【０１１７】
項目１３：野生型ヒト多能性幹細胞に対して、１つ以上のＮＫ細胞活性化リガンドの調節された発現を含む、多能性幹細胞。
【０１１８】
項目１４：Ｂ２Ｍ又はＩＣＡＭ−１を発現しないヒト多能性幹細胞。
【０１１９】
項目１５：ＣＩＩＴＡ又はＩＣＡＭ−１を発現しないヒト多能性幹細胞。
【０１２０】
項目１６：ＬＲＣ５又はＩＣＡＭ−１を発現しないヒト多能性幹細胞。
【０１２１】
項目１７：ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、Ｂ２Ｍのうちの１つ以上を発現せず、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢのうちの１つ以上をさらに発現しない、ヒト多能性幹細胞。
【０１２２】
項目１８：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃのうちの１つ以上を発現せず、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢのうちの１つ以上をさらに発現しない、ヒト多能性幹細胞。
【０１２３】
項目１９：１つ以上のＭＨＣクラスＩ抗原及び１つ以上のＮＫ細胞活性化リガンドのうちの１つ以上を発現せず、細胞の少なくとも１つの対立遺伝子のセーフハーバー遺伝子座（safe harbor locus）に挿入された１つ以上の免疫寛容原性因子をさらに有する、ヒト多能性幹細胞。
【０１２４】
項目２０：細胞中のＢ２Ｍ表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＢ２Ｍ遺伝子が編集され、細胞中のＩＣＡＭ−１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＩＣＡＭ−１遺伝子が編集された、第１のゲノム修飾を含む、修飾されたゲノムを含むヒト多能性幹細胞。
【０１２５】
項目２１：細胞中のＢ２Ｍ表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＢ２Ｍ遺伝子が編集された、第１のゲノム修飾と、（ｂ）細胞中のＩＣＡＭ−１表面発現及び／又
は活性を低減又は排除するようにＩＣＡＭ−１遺伝子が編集された、第２のゲノム修飾と、を含む修飾されたゲノムを含むヒト多能性幹細胞。
【０１２６】
ｈＥＳダブルノックアウト細胞に関する：組成物
【０１２７】
項目１：多能性細胞を含むインビトロ細胞集団であって、該多能性細胞は、少なくとも１つの機能的ＭＨＣクラスＩ細胞表面タンパク質及び少なくとも１つの機能的ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質を欠く、インビトロ細胞集団。
【０１２８】
項目２：ＭＨＣクラスＩ細胞表面タンパク質が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、又はそれらの組み合わせである、項目１のインビトロ細胞集団。
【０１２９】
項目３：ＭＨＣクラスＩ細胞表面タンパク質が、Ｂ２Ｍである、項目１〜２のインビトロ細胞集団。
【０１３０】
項目４：多能性細胞が、少なくとも２つの機能的ＮＫ細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質を欠いている、項目１〜３のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１３１】
項目５：多能性細胞が、少なくとも３つの機能的ＮＫ細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質を欠いている、項目１〜４のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１３２】
項目６：ＮＫ細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質が、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はそれらの組み合わせである、項目１〜５のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１３３】
項目７：ＮＫ細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質が、ＩＣＡＭ−１及びＣＥＡＣＡＭ１である、項目１〜５のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１３４】
項目８：多能性細胞が、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤が多能性細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに発現する、項目１〜７のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１３５】
項目９：細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤が多能性細胞を死滅させることができるタンパク質が、単純ヘルペスウイルス、チミジンキナーゼ、又はシトシンデアミナーゼである、項目１〜８のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１３６】
項目１０：細胞死誘導剤が、ガンシクロビルである、項目８〜９のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１３７】
ｈＥＳダブルノックアウト細胞に関する：組成物
【０１３８】
項目１：多能性細胞を含むインビトロ細胞集団であって、該多能性細胞が、元の遺伝子型又は野生型ヒト細胞に対して、少なくとも１つのＭＨＣクラスＩ細胞表面タンパク質の発現が低減され、少なくとも１つのＮＫ活性化リガンド細胞表面タンパク質の機能及び／又は発現が低減されている、インビトロ細胞集団。
【０１３９】
項目２：多能性細胞を含むインビトロ細胞集団であって、該多能性細胞が、元の遺伝子型又は野生型ヒト細胞に対して、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃ細胞表面タンパク質のうちの１つ以上の発現が低減され、少なくとも１つのＮＫ活性化リガンド細胞表面タンパク質の機能及び／又は発現が低減されている、インビトロ細胞集団。
【０１４０】
項目３：多能性細胞を含むインビトロ細胞集団であって、該多能性細胞が、機能的ＨＬＡ細胞表面タンパク質の発現、ＮＫ細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質の発現を欠き、多能性細胞中において細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤が多能性細胞を死滅させることができるタンパク質を有する、インビトロ細胞集団。
【０１４１】
項目４：１つ以上のＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質及び１つ以上のＮＫ活性化リガンド細胞表面タンパク質の発現が野生型幹細胞に対して調節される、幹細胞。
【０１４２】
項目５：１つ以上のＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質、１つ以上のＮＫ活性化リガンド細胞表面タンパク質、及び１つ以上の寛容原性細胞表面タンパク質因子の発現が野生型幹細胞に対して調節され、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤が多能性細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに発現する、多能性細胞。
【０１４３】
項目６：多能性細胞を含むインビトロ細胞集団であって、多能性細胞が、機能的ＭＨＣクラスＩ遺伝子及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化リガンド遺伝子を欠き、多能性細胞が、野生型多能性細胞に対して寛容原性細胞表面タンパク質因子を過剰発現し、多能性細胞が、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤が多能性細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに発現する、インビトロ細胞集団。
【０１４４】
ＰＥＣダブルノックアウト細胞に関する：組成物
【０１４５】
項目１：膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞を含むインビトロ細胞集団であって、ＰＥＣ細胞が、少なくとも１つの機能的ＨＬＡクラスＩ遺伝子及び少なくとも１つのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化リガンド遺伝子を欠く、インビトロ細胞集団。
【０１４６】
項目２：少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ遺伝子が、Ｂ２Ｍである、項目１のインビトロ細胞集団。
【０１４７】
項目３：少なくとも１つのＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はそれらの組み合わせである、項目１〜２のインビトロ細胞集団。
【０１４８】
項目４：少なくとも１つのＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１及びＣＥＡＣＡＭ１である、項目１〜２のインビトロ細胞集団。
【０１４９】
項目５：少なくとも１つのＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢである、項目１〜２のインビトロ細胞集団。
【０１５０】
項目６：ＰＥＣ細胞が、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤がＰＥＣ細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに発現する、項目１〜５のインビトロ細胞集団。
【０１５１】
項目７：細胞死誘導剤がガンシクロビルである、項目６のインビトロ細胞集団。
【０１５２】
項目８：細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤がＰＥＣ細胞を死滅させることができる遺伝子が、単純ヘルペスウイルス、チミジンキナーゼ、又はシトシンデアミナーゼである、項目６のインビトロ細胞集団。
【０１５３】
項目９：ＰＥＣ細胞が、１つ以上の寛容原性細胞表面タンパク質をさらに過剰発現する
、項目１〜８のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１５４】
項目１０：免疫寛容原性因子が、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、ＣＩ−阻害剤、ＩＬ−３５、又はそれらの組み合わせである、項目１〜９のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１５５】
項目１１：免疫寛容原性因子が、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、及びＨＬＡ−Ｇである、項目１〜９のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１５６】
項目１２：膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞を含むインビトロ細胞集団であって、ＰＥＣ細胞が、少なくとも１つの機能的ＭＨＣクラスＩ遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化リガンド遺伝子を欠く、インビトロ細胞集団。
【０１５７】
項目１３：膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞を含むインビトロ細胞集団であって、ＰＥＣ細胞が、少なくとも１つの機能的ＭＨＣクラスＩ遺伝子及びＭＨＣクラスＩＩ遺伝子を欠き、少なくとも２つのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化リガンド遺伝子を欠く、インビトロ細胞集団。
【０１５８】
項目１４：１つ以上のＨＬＡクラスＩ遺伝子及び１つ以上のＮＫ活性化リガンド遺伝子が、野生型ＰＥＣ細胞に対して調節される、膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞。
【０１５９】
項目１５：１つ以上のＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質、１つ以上のＮＫ活性化リガンド、及び１つ以上の免疫寛容原性因子の発現が野生型ＰＥＣ細胞に対して調節され、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤がＰＥＣ細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに発現する、膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞。
【０１６０】
項目１６：Ｂ２Ｍ又はＩＣＡＭ−１を発現しない膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞。
【０１６１】
項目１７：ＣＩＩＴＡ又はＩＣＡＭ−１を発現しない膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞。
【０１６２】
項目１８：ＬＲＣ５又はＩＣＡＭ−１を発現しない膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞。
【０１６３】
項目１９：ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、及びＢ２Ｍのうちの１つ以上を発現せず、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣａ、及びＭＩＣＢの１つ以上をさらに発現しない、膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞。
【０１６４】
項目２０：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃのうちの１つ以上を発現せず、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣａ、及びＭＩＣＢのうちの１つ以上をさらに発現しない、膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞。
【０１６５】
項目２１：１つ以上のＭＨＣクラスＩ細胞表面タンパク質及び１つ以上のＮＫ細胞活性化リガンドを発現せず、細胞の少なくとも１つの対立遺伝子のセーフハーバー遺伝子座に挿入された１つ以上の免疫寛容原性因子をさらに有する、膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞。
【０１６６】
項目２２：細胞中のＢ２Ｍ表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＢ２Ｍ遺伝子が編集され、細胞中のＩＣＡＭ−１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＩＣＡＭ−１遺伝子が編集された、第１のゲノム修飾を含む、修飾されたゲノムを含む膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞。
【０１６７】
項目２３：細胞中のＢ２Ｍ表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＢ２Ｍ遺
伝子が編集された、第１のゲノム修飾と、（ｂ）細胞中のＩＣＡＭ−１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＩＣＡＭ−１遺伝子が編集された、第２のゲノム修飾と、を含む修飾されたゲノムを含む膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞。
【０１６８】
項目２４：細胞中のＢ２Ｍ表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＢ２Ｍ遺伝子が編集された、第１のゲノム修飾と、（ｂ）細胞中のＩＣＡＭ−１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＩＣＡＭ−１遺伝子が編集された、第２のゲノム修飾と、（ｃ）細胞中のＣＥＡＣＡＭ１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＣＥＡＣＡＭ１遺伝子が編集された、第３のゲノム修飾と、を含む修飾されたゲノムを含む膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞。
【０１６９】
低免疫原性細胞に関して
項目１：低免疫原性細胞を含むインビトロ細胞集団であって、低免疫原性細胞が、少なくとも１つの機能的ＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質及び少なくとも１つの機能的ＮＫ細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質を欠く、インビトロ細胞集団。
【０１７０】
項目２：ＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質が、Ｂ２Ｍである、項目１のインビトロ細胞集団。
【０１７１】
項目３：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はそれらの組み合わせである、項目１〜２のインビトロ細胞集団。
【０１７２】
項目４：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１及びＣＥＡＣＡＭ１である、項目１〜２のインビトロ細胞集団。
【０１７３】
項目５：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢである、項目１〜２のインビトロ細胞集団。
【０１７４】
項目６：低免疫原性細胞が、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤が低免疫原性細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに発現する、項目１〜５のインビトロ細胞集団。
【０１７５】
項目７：低免疫原性細胞が、１つ以上の免疫寛容原性因子をさらに過剰発現する、項目１〜６のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１７６】
項目８：免疫寛容原性因子が、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｇ、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４−Ｉｇ、ＣＤ４７、ＣＩ−阻害剤、ＩＬ−３５、及びそれらの組み合わせである、項目１〜７のインビトロ細胞集団。
【０１７７】
項目９：免疫寛容原性因子が、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ及びＨＬＡ−Ｇである、項目１〜７のインビトロ細胞集団。
【０１７８】
項目１０：低免疫原性細胞を含むインビトロ細胞集団であって、低免疫原性細胞が、少なくとも１つの機能的ＭＨＣクラスＩ遺伝子及び少なくとも１つのＮＫ細胞活性化リガンド遺伝子を欠く、インビトロ細胞集団。
【０１７９】
項目１１：低免疫原性細胞を含むインビトロ細胞集団であって、低免疫原性細胞が、少なくとも１つの機能的ＭＨＣクラスＩ遺伝子、ＭＨＣクラスＩＩ遺伝子、及びＮＫ細胞活性化リガンド遺伝子を欠く、インビトロ細胞集団。
【０１８０】
項目１２：ＭＨＣクラスＩ遺伝子が、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、又はそれらの組み合わせである、項目１０又は１１のインビトロ細胞集団。
【０１８１】
項目１３：ＭＨＣクラスＩ遺伝子が、Ｂ２Ｍである、項目１０、１１、又は１２のインビトロ細胞集団。
【０１８２】
項目１４：低免疫原性細胞が、少なくとも２つの機能的ＮＫ細胞活性化リガンド遺伝子を欠く、項目１０〜１３のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１８３】
項目１５：低免疫原性細胞が、少なくとも３つの機能的ＮＫ細胞活性化リガンド遺伝子を欠く、項目１０〜１３のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１８４】
項目１６：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はそれらの組み合わせである、項目１０〜１３のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１８５】
項目１７：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１及びＣＥＡＣＡＭ１である、項目１０〜１３のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１８６】
項目１８：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢである、項目１０〜１３のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１８７】
項目１９：低免疫原性細胞が、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤が低免疫原性細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに発現する、項目１０〜１８のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１８８】
項目２０：低免疫原性細胞が、ｈＥＳ細胞又は膵臓系統細胞である、項目７〜１５のいずれか１つのインビトロ細胞集団。
【０１８９】
項目２１：１つ以上のＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質及び１つ以上のＮＫ活性化リガンド細胞表面タンパク質の発現が、野生型低免疫原性細胞に対して調節される、低免疫原性細胞。
【０１９０】
項目２２：１つ以上のＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質、１つ以上のＮＫ活性化リガンド、及び１つ以上の寛容原性細胞表面タンパク質因子の発現が、野生型低免疫原性細胞に対して調節され、多能性細胞が、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤が低免疫原性細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに発現する、低免疫原性細胞。
【０１９１】
項目２３：野生型多能性幹細胞に対して、１つ以上のＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩ細胞表面タンパク質及び１つ以上のＮＫ細胞活性化リガンドの調節された発現を含む低免疫原性幹細胞であって、多能性幹細胞が、ＭＨＣクラスＩ又はＭＨＣクラスＩＩの１つ以上の転写因子をコードする１つ以上の遺伝子及び細胞の少なくとも１つの対立遺伝子から欠失されたＮＫ細胞活性化リガンド遺伝子を有する、低免疫原性幹細胞。
【０１９２】
項目２４：野生型ヒト低免疫原性細胞に対して、１つ以上のＮＫ細胞活性化リガンドの調節された発現を含む、低免疫原性細胞。
【０１９３】
項目２５：Ｂ２Ｍ又はＩＣＡＭ−１を発現しないヒト低免疫原性細胞。
【０１９４】
項目２６：ＣＩＩＴＡ又はＩＣＡＭ−１を発現しないヒト低免疫原性細胞。
【０１９５】
項目２７：ＬＲＣ５又はＩＣＡＭ−１を発現しないヒト低免疫原性細胞。
【０１９６】
項目２８：ＮＬＲＣ５、ＣＩＩＴＡ、及びＢ２Ｍのうちの１つ以上を発現せず、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣａ、及びＭＩＣＢのうちの１つ以上をさらに発現しない、ヒト低免疫原性細胞。
【０１９７】
項目２９：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃのうちの１つ以上を発現せず、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣａ、及びＭＩＣＢのうちの１つ以上をさらに発現しない、ヒト低免疫原性細胞。
【０１９８】
項目３０：１つ以上のＭＨＣクラスＩ細胞表面タンパク質及び１つ以上のＮＫ細胞活性化リガンドのうちの１つ以上を発現せず、細胞の少なくとも１つの対立遺伝子のセーフハーバー遺伝子座に挿入された１つ以上の免疫寛容原性因子をさらに有する、ヒト低免疫原性細胞。
【０１９９】
項目３１：細胞中のＢ２Ｍ表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＢ２Ｍ遺伝子が編集され、細胞中のＩＣＡＭ−１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＩＣＡＭ−１遺伝子が編集された、第１のゲノム修飾を含む、修飾されたゲノムを含む低免疫原性細胞。
【０２００】
項目３２：細胞中のＢ２Ｍ表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＢ２Ｍ遺伝子が編集された、第１のゲノム修飾と、（ｂ）細胞中のＩＣＡＭ−１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＩＣＡＭ−１遺伝子が編集された、第２のゲノム修飾と、を含む修飾されたゲノムを含む低免疫原性細胞。
【０２０１】
項目３３：細胞中のＢ２Ｍ表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＢ２Ｍ遺伝子が編集された、第１のゲノム修飾と、（ｂ）細胞中のＩＣＡＭ−１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＩＣＡＭ−１遺伝子が編集された、第２のゲノム修飾と、（ｃ）細胞中のＣＥＡＣＡＭ１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＣＥＡＣＡＭ１遺伝子が編集された、第３のゲノム修飾と、を含む修飾されたゲノムを含む低免疫原性細胞。
【０２０２】
ダブルノックアウトの方法
項目１：ａ）移植を必要とする対象に、有効量の、膵臓内胚葉細胞集団を含む移植片を投与することを含む、移植片拒絶を低減する方法であって、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質及び少なくとも１つのＮＫ細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質の機能が破壊されている、方法。
【０２０３】
項目２：ＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質が、Ｂ２Ｍである、項目１の方法
【０２０４】
項目３：ＮＫ細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質が、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はそれらの組み合わせである、項目１〜２の方法。
【０２０５】
項目４：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１及びＣＥＡＣＡＭ１である、項目１〜２の方法。
【０２０６】
項目５：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢである、項目１〜２の方法。
【０２０７】
項目６：細胞集団中の低免疫原性細胞を枯渇させる方法であって、前記低免疫原性細胞を低免疫原性細胞枯渇組成物と接触させて低免疫原性細胞機能の障害又は前記低免疫原性細胞の死滅をもたらし、それにより、前記細胞集団中の前記低免疫原性細胞を枯渇させることを含む、方法。
【０２０８】
項目７：低免疫原性細胞が、少なくとも１つの機能的ＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質及び少なくとも１つのＮＫ活性化リガンドの発現を欠く、請求項６記載の方法。
【０２０９】
項目８：宿主哺乳動物から低免疫原性細胞を除去する方法であって、（ａ）低免疫原性細胞を前記宿主哺乳動物に移入することと、（ｂ）宿主を低免疫原性細胞枯渇組成物と接触させて低免疫原性細胞機能の障害又は前記低免疫原性細胞の死滅をもたらし、それにより、宿主哺乳動物における前記低免疫原性細胞を除去することを含む、方法。
【０２１０】
項目９：少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質及び少なくとも１つのＮＫ活性化リガンドの機能を低下させる（diminished）、項目８の方法。
【０２１１】
項目１０：標的細胞集団中のＮＫ活性化リガンドを増加させる方法であって、標的細胞集団をＩＦＮ−γ刺激にさらし、それにより、野生型に対して標的細胞中のＮＫ活性化リガンドを増加させることを含む、方法。
【０２１２】
ＭＨＣクラスＩ遺伝子及びＮＫ細胞活性化リガンド遺伝子の両方の機能が破壊又は阻害された多能性細胞に関する：組成物
項目１：少なくとも１つの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ遺伝子及び少なくとも１つのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化リガンド遺伝子の機能が破壊又は阻害されている、多能性細胞を含むインビトロ細胞集団。
【０２１３】
項目２：ＭＨＣ遺伝子が、β−２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする、項目１のインビトロ細胞集団。
【０２１４】
項目３：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ１、ＣＤ５８、ＰＶＲ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はそれらの組み合わせである、項目１のインビトロ細胞集団。
【０２１５】
項目４：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ１及びＣＤ５８である、項目１のインビトロ細胞集団。
【０２１６】
項目５：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ１、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢである、項目１のインビトロ細胞集団。
【０２１７】
項目６：多能性細胞が、ヒト胚性幹細胞である、項目１のインビトロ細胞集団。
【０２１８】
項目７：多能性細胞が、膵臓内胚葉細胞に分化する、項目１のインビトロ細胞集団。
【０２１９】
項目８：多能性細胞が、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤が該細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに含む、項目１のインビトロ細胞集団。
【０２２０】
項目９：ＭＨＣクラスＩ遺伝子が、ゲノム編集アプリケーションを使用して破壊されている、項目１のインビトロ細胞集団。
【０２２１】
項目１０：ゲノム編集アプリケーションが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、クラスター化され規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）／ｃａｓ、又は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）システムである、項目９のインビトロ細胞集団。
【０２２２】
項目１１：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ゲノム編集アプリケーションを使用して破壊されている、項目１のインビトロ細胞集団。
【０２２３】
項目１２：ＮＫ細胞活性化リガンドが、抗ＮＫ細胞活性化リガンド剤を使用して破壊されている、項目１のインビトロ細胞集団。
【０２２４】
項目１３：剤が抗体である、項目８のインビトロ細胞集団。
【０２２５】
ＭＨＣクラスＩ遺伝子及びＮＫ細胞活性化リガンド遺伝子の両方の機能が破壊又は阻害された膵臓系統細胞に関する：組成物
項目１４：少なくとも１つの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ遺伝子及び少なくとも１つのナチュラルキラー（ＮＫ）細胞活性化リガンドの機能が破壊又は阻害されている、膵臓系統細胞を含むインビトロ細胞集団。
【０２２６】
項目１５：ＭＨＣクラスＩ遺伝子が、Ｂ２Ｍをコードする、項目１４のインビトロ細胞集団。
【０２２７】
項目１６：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ１、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はそれらの組み合わせである、項目１４のインビトロ細胞集団。
【０２２８】
項目１７：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ１及びＣＤ５８である、項目１４のインビトロ細胞集団。
【０２２９】
項目１８：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ１、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、及びＭＩＣＢである、項目１４のインビトロ細胞集団。
【０２３０】
項目１９：膵臓系統細胞が、胚体内胚葉、前腸内胚葉、膵臓内胚葉細胞、内分泌前駆体、又はインスリン産生細胞である、項目１４のインビトロ細胞集団。
【０２３１】
項目２０：膵臓系統細胞が、細胞死誘導剤の存在下で発現されたときに該剤が該細胞を死滅させることができるタンパク質をさらに発現する、項目１４のインビトロ細胞集団。
【０２３２】
膵臓細胞の細胞移植片拒絶を防止する方法
項目２１：以下を含む、ヒト膵臓細胞の細胞移植片拒絶を防止する方法：
【０２３３】
ａ．少なくとも１つの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ細胞表面タンパク質を発現せず、少なくとも１つのナチュラルキラー（ＮＫ）活性化リガンドを発現しない、ヒト膵臓細胞集団を提供すること、及び
ｂ．ヒト膵臓細胞集団を哺乳動物対象に移植し、ＭＨＣクラスＩ細胞表面タンパク質及びＮＫ活性化リガンド発現がないことによって細胞移植片拒絶が防止されること。
【０２３４】
項目２２：主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ細胞表面タンパク質が、β−２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）又はＨＬＡ−ＡＢＣ細胞表面タンパク質である、項目２１の方法。
【０２３５】
項目２３：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ１、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、ＰＶＲ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はそれらの組み合わせである、項目２１の方法。
【０２３６】
項目２４：ヒト膵臓細胞集団が、膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）である、項目２１の方法。
【０２３７】
項目２５．ヒト膵臓細胞集団が、細胞死誘導剤の存在下でヒト細胞集団において発現されたときに該剤がヒト膵臓細胞集団を死滅させることができるタンパク質をさらに含む、項目２１の方法。
【０２３８】
インスリンの産生方法
項目２６．以下を含む、インスリンの産生方法：
【０２３９】
ａ）少なくとも１つの主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ細胞表面タンパク質を発現せず、少なくとも１つのナチュラルキラー（ＮＫ）活性化リガンドを発現しない、ヒト膵臓内胚葉細胞集団を提供すること、及び
ｂ）ヒト膵臓内胚葉細胞集団を哺乳動物対象に移植し、膵臓内胚葉細胞は哺乳動物対象において成熟し、グルコース刺激に応答してインスリンを産生すること。
【０２４０】
項目２７：主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ細胞表面タンパク質が、β−２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）であるか、又はＨＬＡ−ＡＢＣ細胞表面タンパク質である、項目２６の方法。
【０２４１】
項目２８：ＮＫ細胞活性化リガンドが、ＩＣＡＭ１、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、ＰＶＲ、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＡＤＭ１、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、又はそれらの組み合わせである、項目２６の方法。
【０２４２】
項目２９：ヒト膵臓細胞集団が、細胞死誘導剤の存在下でヒト膵臓細胞集団において発現されたときに該剤がヒト膵臓細胞集団を死滅させることができるタンパク質をさらに含む、項目２６の方法。
【０２４３】
項目３０：タンパク質が単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼであり、剤がガンシクロビルである、項目２９の方法。
【０２４４】
低免疫原性幹細胞を調製する方法であって、低免疫原性幹細胞による１つ以上のＭＨＣクラスＩ細胞表面タンパク質及び１つ以上のＮＫ活性化リガンドの発現を調節し、それにより、低免疫原性幹細胞を調製することを含む、方法。
【０２４５】
低免疫原性幹細胞を調製する方法であって、１つ以上のＭＨＣクラスＩ細胞表面タンパク質、１つ以上のＮＫ活性化リガンドの発現を調節し、幹細胞上の１つ以上の免疫寛容原性因子の発現を調節し、それにより、低免疫原性幹細胞を調製することを含む、方法。
【０２４６】
幹細胞上の１つ以上のＭＨＣクラスＩ細胞表面タンパク質及びＮＫ細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質の発現を調節する方法であって、ＭＨＣ−クラスＩ遺伝子及びＮＫ細胞活性化リガンドの１つ以上の転写調節因子をコードする１つ以上の遺伝子を細胞の少なくとも１つの対立遺伝子から欠失させ、それにより、１つ以上のＭＨＣクラスＩ細胞表面タンパク質及びＮＫ細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質の発現を調節することを含む、方法
【０２４７】
（ａ）細胞を、配列番号１〜３のいずれか１つに相同なリボ核酸をコードするプラスミド又は配列番号１〜３のいずれか１つに相同なリボ核酸のいずれかと組み合わせて、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸のいずれかと接触させることにより、細胞中のＢ２Ｍ表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＢ２Ｍ遺伝子が編集された、第１のゲノム修飾と、（ｂ）細胞を、配列番号４〜６のいずれか１つに相同なリボ核酸をコードするプラスミド又は配列番号４〜６のいずれか１つに相同なリボ核酸のいずれかと組み合わせて、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸のいずれかと接触させることにより、細胞中のＩＣＡＭ−１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＩＣＡＭ−１遺伝子が編集された、第２のゲノム修飾と、を含む修飾されたゲノムを含む低免疫原性幹細胞。
【０２４８】
（ａ）細胞を、配列番号１〜３のいずれか１つに相同なリボ核酸をコードするプラスミド又は配列番号１〜３のいずれか１つに相同なリボ核酸のいずれかと組み合わせて、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸のいずれかと接触させることにより、細胞中のＢ２Ｍ表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＢ２Ｍ遺伝子が編集された、第１のゲノム修飾と、（ｂ）細胞を、配列番号４〜６のいずれか１つに相同なリボ核酸をコードするプラスミド又は配列番号４〜６のいずれか１つに相同なリボ核酸のいずれかと組み合わせて、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸のいずれかと接触させることにより、細胞中のＩＣＡＭ−１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＩＣＡＭ−１遺伝子が編集された、第２のゲノム修飾と、（ｃ）細胞を、配列番号７〜９のいずれか１つに相同なリボ核酸をコードするプラスミド又は配列番号７〜９のいずれか１つに相同なリボ核酸のいずれかと組み合わせて、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸のいずれかと接触させることにより、細胞中のＣＥＡＣＡＭ１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＣＥＡＣＡＭ１遺伝子が編集された、第３のゲノム修飾と、を含む修飾されたゲノムを含む低免疫原性幹細胞。
【０２４９】
（ａ）細胞を、配列番号１〜３のいずれか１つに相同なリボ核酸をコードするプラスミド又は配列番号１〜３のいずれか１つに相同なリボ核酸のいずれかと組み合わせて、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸のいずれかと接触させることにより、細胞中のＢ２Ｍ表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＢ２Ｍ遺伝子が編集された、第１のゲノム修飾と、（ｂ）細胞を、配列番号４〜６のいずれか１つに相同なリボ核酸をコードするプラスミド又は配列番号４〜６のいずれか１つに相同なリボ核酸のいずれかと組み合わせて、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸のいずれかと接触させることにより、細胞中のＩＣＡＭ−１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＩＣＡＭ−１遺伝子が編集された、第２のゲノム修飾と、を含む修飾されたゲノムを含む多能性幹細胞。
【０２５０】
配列番号１〜９の配列を以下の表４に提供し、これらの配列及び追加の配列を以下に説明する。
【０２５１】
配列番号１：エクソン１、マイナス鎖。
【０２５２】
配列番号２：エクソン２、マイナス鎖。
【０２５３】
配列番号３：エクソン１、マイナス鎖。
【０２５４】
配列番号４：エクソン２、プラス鎖。
【０２５５】
配列番号５：エクソン２、マイナス鎖。
【０２５６】
配列番号６：エクソン１、プラス鎖。
【０２５７】
配列番号７：エクソン１、マイナス鎖。
【０２５８】
配列番号８：エクソン１、プラス鎖。
【０２５９】
配列番号９：エクソン１、プラス鎖。
【０２６０】
配列番号１０：ヒトＩＣＡＭ１のコード配列。
【０２６１】
配列番号１１：ヒトＣＥＡＣＡＭ１のコード配列。
【０２６２】
配列番号１２：ヒトＢ２Ｍのコード配列。
【０２６３】
配列番号１３：ヒトＣＡＤＭ１のコード配列。
【０２６４】
配列番号１４：ヒトＣＤ５８のコード配列。
【０２６５】
配列番号１５：ヒトＣＤ１５５のコード配列。
【０２６６】
ＰＡＭ（ＮＧＧ）を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９切断のための標的配列を以下の表に示す。
【０２６７】
【表３】
2020526224.tif 000007
【０２６８】
（ａ）細胞をＣａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸又は配列番号１〜３のいずれか１つの配列を含むリボ核酸と接触させることにより、細胞中のＢ２Ｍ表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＢ２Ｍ遺伝子が編集された、第１のゲノム修飾と、（ｂ）細胞をＣａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸又は配列
番号４〜６のいずれか１つの配列を含むリボ核酸と接触させることにより、細胞中のＩＣＡＭ−１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＩＣＡＭ−１遺伝子が編集された、第２のゲノム修飾と、（ｃ）細胞をＣａｓタンパク質又はＣａｓタンパク質をコードする核酸又は配列番号７〜９のいずれか１つの配列を含むリボ核酸と接触させることにより、細胞中のＣＥＡＣＡＭ１表面発現及び／又は活性を低減又は排除するようにＣＥＡＣＡＭ１遺伝子が編集された、第３のゲノム修飾と、を含む修飾されたゲノムを含む膵臓内胚葉（ＰＥＣ）細胞。
【０２６９】
低血糖を軽減する方法であって、ａ）移植を必要とする対象に、有効量の、膵臓内胚葉細胞集団を含む移植片を投与することを含み、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質及び少なくとも１つのＮＫ細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質の機能が破壊され、膵臓内胚葉細胞集団がインビボで成熟し、インビボでのグルコース刺激に応答してインスリンを産生し、それにより、患者における低血糖を軽減する、方法。
【０２７０】
インスリン依存を軽減する方法であって、ａ）移植を必要とする対象に、有効量の、膵臓内胚葉細胞集団を含む移植片を投与することを含み、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質及び少なくとも１つのＮＫ細胞活性化リガンド細胞表面タンパク質の機能が破壊され、膵臓内胚葉細胞集団がインビボで成熟し、インビボでのグルコース刺激に応答してインスリンを産生し、それにより、患者におけるインスリン依存を軽減する、方法。
【０２７１】
定義
「低免疫原性」若しくは「ユニバーサルドナー細胞」若しくは「変異細胞」又はそれらの同等物は、少なくとも１つのＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質及び少なくとも１つのＮＫ活性化リガンドの発現が低減又は排除された細胞を意味する。そのような細胞は、そのような細胞又は移植片が移植される対象による免疫拒絶又は移植片拒絶の傾向が少ないと予想される。例えば、改変されていない野生型細胞に対して、そのような低免疫原性細胞は、そのような細胞が移植された対象による免疫拒絶の傾向が約２．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７．５％、９９％又はそれ以上少ないものであり得る。
【０２７２】
「処置する」若しくは「治癒する」という用語又はそれらの同等物は、兆候又は症状を軽減する（改善する）治療介入を指す。
【０２７３】
「患者」若しくは「宿主」若しくは「哺乳動物宿主」若しくは「対象」という用語又はそれらの同等物は、生きている多細胞脊椎動物、ヒト及び非ヒト哺乳動物の両方を含む分類を指す。いくつかの実施形態では、対象はヒト対象である。処置に好ましい患者はヒトである。標的患者集団は、組み合わせ製品自体とは関係ない形式で臨床使用／経験の時間とともに変化し得るが、むしろ免疫抑制レジメンの性質又はその欠如に関連している。例えば、組み合わせ製品は、操作上の耐性を達成するか又は傷害性及び副作用プロファイルが低い免疫抑制薬（ＩＳＤ）レジメンと組み合わせて低免疫原性細胞療法を使用する、Ｔ１Ｄ集団において使用され得る。
【０２７４】
本明細書における「遮断剤」という用語は、抗体を含むがこれに限定されない、標的細胞の表面上のＮＫ活性化リガンドに結合することができる任意の剤を指すか、あるいは現在既知であるか又は今後開発されるタンパク質、酵素、又は化学物質を含むがこれらに限定されない、ＮＫ活性化リガンドのタンパク質発現を防止又は阻害する剤を指す。
【０２７５】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成される多重特異性
抗体（例えば二重特異性抗体）、及び所望の生物学的遮断活性を示す限り、抗体断片を特に包含する。
【０２７６】
本明細書で使用される「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部を指し、好ましくはその抗原結合領域又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、ダイアボディ、線形抗体（linear antibody）、単鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【０２７７】
本明細書で使用される「遮断抗体」という用語は、インビボ又はインビトロで標的細胞上のＮＫ細胞活性化リガンドに結合したときに、標的細胞を溶解するＮＫ細胞の能力の防止又は低下をもたらす抗体を指す。
【０２７８】
本明細書で使用する場合、「同系（syngenic）」又は「同系（syngeneic）」という用語は、特に抗原又は免疫学的反応に関して、移植レシピエント（例えば、一卵性双生児）と遺伝的に同一であるか、又はそれと遺伝的に同一の供給源に由来する細胞、組織、又は器官を指す。そのような細胞、組織、又は器官は、同系移植と呼ばれる。本明細書で使用する場合、「同種（allogenic）」又は「同種（allogeneic）」という用語は、特に抗原又は免疫学的反応に関して、移植レシピエント（例えば、非血縁ドナー）と遺伝的に同一ではないか、又はそれと遺伝的に同一ではない供給源に由来する細胞、組織、又は器官を指す。そのような細胞、組織、又は器官は、同種移植（allograft）、同種間移植（allogeneic transplant）、同種移植（homograft）、又は同種移植（allotransplant）と呼ばれる。
【０２７９】
本明細書で使用する場合、「プロモーター／調節配列」という用語は、プロモーター／調節配列に作動可能に連結された遺伝子産物の発現に必要な核酸配列を意味する。いくつかの場合では、この配列は、コアプロモーター配列であり得、他の場合では、この配列は、遺伝子産物の発現に必要なエンハンサー配列及び他の調節要素も含み得る。プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的な様式で遺伝子産物を発現するものであり得る。
【０２８０】
「有効量」又は「治療有効量」という用語又はそれらの同等物は、処置される対象又は細胞において所望の効果を達成するのに十分な剤の量を指す。例えば、これは、血中グルコースレベルを阻害又は測定可能に低下させ、最終的に恒常性血糖制御を達成するために必要な細胞の量であり得る。これはまた、細胞又は対象の機能又は構造を変化させるための剤の有効量を意味することもあり得る。治療有効量の剤は、単回投与又は数回投与量で投与され得る。しかしながら、有効量は、適用される特定の剤、処置される対象、病気（affliction）の重症度及び種類並びに投与方法に依存する。
【０２８１】
本明細書では、「減少する（decrease）」、「破壊された」、「低減した（reduced）」、「低減」、及び「阻害する」とう用語は全て、一般には減少、具体的には統計的に有意な量の減少を意味するために使用される。しかしながら、疑義を避けるために、「減少」、「低減した」、「低減」、「阻害」には、参照レベルと比較して、少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、若しくは少なくとも約４０％、若しくは少なくとも約５０％、若しくは少なくとも約６０％、若しくは少なくとも約７０％、若しくは少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％、若しくは１００％を含む最大１００％（すなわち、参照試料と比較して、不在レベル）の減少、又は参照レベルと比較して、１０〜１００％の任意の減少、又は参照レベルと比較して、少なくとも約２倍、若しくは少なくとも約３倍、若しくは少なくとも約４倍、若しくは少なくとも約５倍、若しくは少なくとも約１０倍の減少、又は参照レベルと比較して、２倍〜１０倍以上の任意の減少が含まれる。
【０２８２】
本明細書では、「増加した（increased）」、「増加する（increase）」、若しくは「増強する」、又は「活性化する」という用語は全て、一般に、統計的に（statically）有意な量の増加を意味するために使用される。疑義を避けるために、「増加した」、「増加する」、「増強する」、又は「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して、少なくとも１０％の増加、例えば、少なくとも約２０％、若しくは少なくとも約３０％、若しくは少なくとも約４０％、若しくは少なくとも約５０％、若しくは少なくとも約６０％、若しくは少なくとも約７０％、若しくは少なくとも約８０％、若しくは少なくとも約９０％、若しくは１００％を含む最大１００％の増加、又は参照レベルと比較して、１０〜１００％の任意の増加、又は参照レベルと比較して、少なくとも約２倍、若しくは少なくとも約３倍、若しくは少なくとも約４倍、若しくは少なくとも約５倍、若しくは少なくとも約１０倍の増加、又は参照レベルと比較して、２倍〜１０倍以上の任意の増加を意味する。
【０２８３】
「統計的に有意な」又は「有意に」という用語は、統計的有意性を指し、一般に、標準以下の参照の濃度を下回る２つの標準偏差（２ＳＤ）を意味する。この用語は、標準以下の参照の濃度を上回る２つの標準偏差（２ＳＤ）以上も意味し得る。この用語は、差異がある統計的証拠を指す。帰無仮説が実際に真である場合に、帰無仮説を棄却する決定を行う確率として定義される。この決定はしばしば、ｐ値を使用して行われる。
【０２８４】
本明細書で使用する場合、「低血糖の軽減」又はその同等物は、血糖制御が悪化することなく、低血糖症状発現（episode）の数が減少することを意味し、０．２％以上のＨｂＡ１ｃの増加として定義される。
【０２８５】
本明細書で使用される「インスリン依存の軽減」又はその同等物は、血糖制御が悪化することなく、外因性インスリン注射の回数及び／又は用量の減少を意味し、０．２％以上のＨｂＡ１ｃの増加として定義される。
【０２８６】
本明細書で使用される「組織カプセル」又はその同等物は、インプラント又は移植片の周りに形成される異物カプセルを意味する。細胞を含む組み合わせ製品及び／若しくはデバイス又は有孔デバイスは、インプラント期間中にカプセル内に保持されることが意図される。
【０２８７】
「生着」又はその同等物は、前駆体細胞又は未成熟細胞集団の、成熟細胞種への分化を指す。例えば、膵臓内分泌細胞集団に成熟する、ＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞集団の生着である。
【０２８８】
「移植片」は、本明細書のデバイス中にカプセル化された又は該デバイス中で送達される分化細胞集団を指す。例えば、膵臓内胚葉、膵臓前駆細胞、ＰＤＸ−１陽性膵臓内胚葉、膵臓内分泌前駆体、膵臓内分泌、単一又は多ホルモン内分泌、プレβ、β、及び／又はインスリン分泌移植片を含むがこれらに限定されない細胞集団である。
【０２８９】
「本質的に」若しくは「実質的に」という用語又はそれらの同等物は、任意の細胞集団又は培養物中に存在する成分又は細胞の、大部分の量又は些細な（de minimus）量又は減少した量を意味し、例えば、未成熟β細胞培養物は、「ＩＮＳ、ＮＫＸ６．１、及びＰＤＸ１を発現し、ＮＧＮ３を本質的又は実質的に発現しない、本質的又は実質的に未成熟なβ細胞」を意味する。他の例には、「本質的又は実質的にｈＥＳ細胞」、「本質的又は実質的に胚体内胚葉細胞」、「本質的又は実質的に前腸内胚葉細胞」、「本質的又は実質的にＰＤＸ１陰性前腸内胚葉細胞」、「本質的又は実質的にＰＤＸ１陽性膵臓内胚葉細胞」、「本質的又は実質的に膵臓内分泌前駆体細胞」、「本質的又は実質的に膵臓内分泌細胞」などが含まれるが、これらに限定されない。
【０２９０】
細胞培養物又は細胞集団中の細胞に関して、「実質的にない」という用語又はその同等物は、細胞培養物又は細胞集団がない特定の細胞種が、細胞培養物又は細胞集団中に存在する細胞の総数の約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、又は約１％未満の量で存在することを意味する。
【０２９１】
「不織布」という用語又はその同等物には、製織（weaving）又は編成（knitting）以外のプロセスで製造される接着布（bonded fabrics）、形成布（formed fabrics）、又は加工布（engineered fabrics）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９２】
本明細書に開示された発明は、その用途が詳細な説明に記載された又は例示された詳細に限定されないことを理解されたい。本発明は他の実施形態を包含し、様々な方法で実施し又は行うことができる。本明細書で使用される用語及び専門用語は、説明を目的とするものであり、限定と見なされるべきではないことも理解されたい。
【０２９３】
本発明の特定の組成物、方法、及びアッセイは、特定の実施形態に従って特異的に説明されているが、以下の実施例は、本発明の方法及び組成物を説明するのに役立てるだけのものであり、それらを限定するものではない。
【０２９４】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、反対について明確に示されない限り、複数の指示対象を含むと理解されるべきである。グループメンバーのうちの１つ、２つ以上、又は全てが、所与の製品又はプロセスに存在するか、使用されるか、又はその他では関連する場合、反対について明確に示されない限り又はその他では文脈から明白でない限り、１つ以上のグループメンバー間に「又は」を含む請求項又は詳細な説明は満たされているとみなされる。本発明は、正確に１つのグループメンバーが、所与の製品又はプロセスに存在するか、使用されるか、又はその他では関連する実施形態を含む。本発明はまた、２つ以上又は全グループメンバーが、所与の製品又はプロセスに存在するか、使用されるか、又はその他では関連する実施形態も含む。
【０２９５】
さらに、本発明は、別の指示がない限り又は矛盾若しくは不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、列挙された請求項のうちの１つ以上からの１つ以上の制限、要素、条項、説明用語などが同じ基本の請求項（又は関連する他の請求項）に従属する別の請求項に導入される、全ての変形、組み合わせ、及び順列変更を包含することを理解されたい。要素が列挙として提示されている場合（例えば、マーカッシュグループ又は同様の形式）、要素の各サブグループもまた開示され、任意の要素をグループから除外することができることを理解されたい。一般に、本発明又は本発明の態様が特定の要素、特徴などを含むとして言及される場合、本発明の特定の実施形態又は本発明の態様はそのような要素、特徴などからなるか、又は本質的にそれらからなることを理解されたい。簡潔にするために、それらの実施形態は、全ての場合で本明細書において非常に多くの言葉で具体的に説明されているわけではない。本発明の任意の実施形態又は態様は、特定の除外が本明細書に記載されているかどうかにかかわらず、特許請求の範囲から明示的に除外し得ることも理解されたい。本発明の背景を説明し、その実施に関するさらなる詳細を提供するために本明細書で参照される刊行物及び他の参考資料は、参照により本明細書に組み込まれる。以下の非限定的な実施例により、本開示を例示する。
【実施例】
【０２９６】
実施例１：Ｂ２Ｍ欠損ｈＥＳ細胞の生成
Ｂ２Ｍ欠損ｈＥＳ細胞を、ＣｙＴ４９細胞株を使用して生成したが、任意のヒト多能性幹細胞株を使用することができる。Ｂ２Ｍ遺伝子の標的化破壊により、細胞表面上にＨＬ
ＡクラスＩタンパク質を発現しない細胞を生成した。ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ株におけるＢ２Ｍ遺伝子座の両方の対立遺伝子は、ＰＣＴ国際公開第２０１６１８３０４１Ａ号（これは、その全体が本明細書に組み込まれる）に概説される既知の技術を使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して破壊された。しかしながら、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）を含む他のヌクレアーゼを使用して、遺伝子の編集及び従来の相同組換えなどを行うことができる。Ｂ２Ｍの公開された配列の例は、配列番号１、２、及び３として提出している。デュアルガイドＲＮＡ及びＦｏｋIヌクレアーゼに融合された触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質を導入するＮＥＸＴＧＥＮ（商標）ＣＲＩＳＰＲ（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｉｎｃ．，ケンタッキー州レキシントン）が、遺伝子を編集するために使用される。ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９を含むプラスミドをＣｙＴ４９  ｈＥＳＣにエレクトロポレーションし、細胞を組織培養プレートに播種した。エレクトロポレーションの１２日後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により、Ｂ２Ｍ抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ＃３１６３０６）に対する陰性反応性について細胞を選別した。選別した細胞をクローン密度でプレーティングした。個々のクローンを選び、約２５日目にプレーティングした。クローンを増殖させて、凍結保存した。Ｇ分染法により正常な核型を示し、かつ、フローサイトメトリー及び／又は免疫蛍光法によりＢ２Ｍタンパク質の発現及びＨＬＡクラスＩタンパク質の表面発現が陰性である増殖クローンをさらなる実験のために選択した。
【０２９７】
野生型（ＷＴ）及びノックアウト細胞におけるＢ２Ｍ表面発現を、通常及び炎症性（インターフェロン（ＩＦＮ）−γに対する曝露後）条件下でフローサイトメトリーにより評価した。図２Ａを参照のこと：通常：未処置の増殖培地（Ｂ線）；炎症性：１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γに１８〜２４時間曝露（Ａ線）。炎症反応は、組織の外傷に関連して発生する。これにより炎症誘発性サイトカインが放出され、そのうちのいくつかはＩＬ−１−α、ＩＬ−１−β、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８、及びＩＦＮ−γである。ＷＴ及びＢ２Ｍ−／−  ＥＳＣ及びＰＥＣをＩＦＮ−γで処理したが、これらの観察は他のサイトカインにおいても同様に拡張できる。
【０２９８】
図２Ａは、ＩＦＮ−γのないＷＴ  ｈＥＳ細胞（Ｂ線）及びＩＦＮ−γによるＷＴ  ｈＥＳ細胞の曝露後のＢ２Ｍ発現（Ａ線）を示す。バックグラウンド（網掛け領域）と比較した、未処理のＷＴ  ｈＥＳ細胞（Ｂ線）の蛍光強度のシフト（増加）は、ＷＴ  ｈＥＳ細胞がＢ２Ｍを発現することを示している。ＩＦＮ−γへのＷＴ  ｈＥＳ細胞の曝露後のＷＴ  Ｂ２Ｍ発現（Ｂ線）を超える蛍光強度のさらなるシフト（増加）は、ＩＦＮ−γへの曝露後のＷＴ  ｈＥＳ細胞においてＢ２Ｍ発現が増加することを示唆している（Ａ線）。したがって、ＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質の発現は、少なくともＩＦＮ−γ処理によって引き起こされるものなど、細胞ストレス及び炎症によってアップレギュレートされる。
【０２９９】
図２Ｂは、Ｂ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞におけるＢ２Ｍ発現を示し、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用してノックアウト細胞を生成した。ＩＦＮ−γへの曝露を用いても又は用いなくても、バックグラウンド（網掛け領域）と比較して蛍光強度の実質的なシフト（増加）はなく、このことは、Ｂ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞がＢ２Ｍ表面発現を低減又は排除し、Ｂ２Ｍ発現をＩＦＮ−γ処理により誘導できなかったことを示唆している。このようなＢ２Ｍノックアウトにおいて、ＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質の発現はＩＦＮ−γ処理によって引き起こされる細胞ストレス及び炎症によってアップレギュレートされない。
【０３００】
この実施例は、Ｂ２Ｍ抗体を使用して示されるように、Ｂ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞がＢ２Ｍ表面発現を低減又は排除したことを実証している。
【０３０１】
実施例２：ＷＴ及びＢ２Ｍ欠損細胞におけるＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質発現の分析
次いで、野生型及びＢ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞をＰａｎ−ＨＬＡ−ＡＢＣモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ＃５６０１６９）を使用して分析し、これらのノックアウト細胞が細胞表面上でＨＬＡクラスＩタンパク質を発現しないことを確認した。Ｐａｎ−ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体は、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩタンパク質ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、及びＨＬＡ−Ｃと反応する。Ｐａｎ−ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体の発現を、野生型及びノックアウト細胞において、ＩＦＮ−γへの曝露後の通常及び炎症状態下でフローサイトメトリーにより評価した。通常：ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）；炎症：１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γへの１８〜２４時間の曝露（Ａ線）。
【０３０２】
図３Ａは、ＷＴ  ｈＥＳ細胞におけるＰａｎ−ＨＬＡ−ＡＢＣ細胞表面タンパク質発現（Ｂ線）及びＩＦＮ−γによるＷＴ  ｈＥＳ細胞の処理後のＰａｎ−ＨＬＡ−ＡＢＣ細胞表面タンパク質発現（Ａ線）を示す。バックグラウンド（網掛け領域）と比較した、未処理ＷＴ  ｈＥＳ細胞（Ｂ線）の蛍光強度の変化（増加）は、ＷＴ  ｈＥＳ細胞がＰａｎ−ＨＬＡ−ＡＢＣを発現することを示唆している。ＩＦＮ−γへの曝露後のＷＴ  ｈＥＳ発現を超える蛍光強度のシフト（増加）は、ＩＦＮ−γへの曝露後のＷＴ  ｈＥＳ細胞においてＰａｎ−ＨＬＡ−ＡＢＣ発現が増加することを示唆している。
【０３０３】
図３Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用したＢ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞におけるＰａｎ−ＨＬＡ−ＡＢＣ細胞表面タンパク質発現を示す。ＩＦＮ−γへの曝露を用いても又は用いなくても、バックグラウンド（網掛け領域）と比較して蛍光強度のシフト（増加）はなく、このことは、ノックアウトがＨＬＡクラスＩ細胞表面発現を低減又は排除し、ＨＬＡクラスＩタンパク質発現がＩＦＮ−γ処理によって誘発されなかったことを示唆している。
【０３０４】
この実施例は、Ｐａｎ−ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体を使用して示されるように、Ｂ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞がＨＬＡクラスＩ細胞表面発現を低減又は排除したことを実証している。
【０３０５】
実施例３：Ｂ２Ｍ欠損細胞の膵臓系統細胞への分化
Ｂ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞を、Schulz et al. A Scalable System for Production
of Functional Pancreatic Progenitors from Human Embryonic Stem Cells PLoS One 7:5 1-17 (2012)及び米国特許第８，８９５，３００号（これらは両方とも、参照によりその全体が本明細書中に組み込まれる）に記載されているようにＷＴ  ｈＥＳ細胞と同じ条件下で培養、継代、及び増殖させた。具体的には、Ｓｃｈｕｌｚらは、付着性ｈＥＳＣの増殖及び懸濁液ベースの分化について記載している。
【０３０６】
簡単に述べると、ＷＴ  ｈＥＳ細胞及びＢ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞を、４つのステージ手順を使用して、約２週間（又は１４日間）の期間にわたって懸濁凝集体中で分化させて、膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）と纏めて称する、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、及びホルモン発現細胞を含む、膵臓細胞種の集団を生成した。アキュターゼを使用してヒトＥＳ細胞を分離し、単一細胞をローラーボトル中に凝集させた。分化を開始させるために、凝集体をコニカルチューブ中にプールし、重力によって沈殿させ、続いて成長因子を含まないステージ１の培地（インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）の１：５０００希釈を含むＲＰＭＩ＋０．２％ｖｏｌ／ｖｏｌ  ＦＢＳ）で洗浄した。凝集体を再度沈殿させ、次いで、インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）の１：５０００希釈を含むＲＰＭＩ＋０．２％ｖｏｌ／ｖｏｌ  ＦＢＳ、アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）、及びｗｎｔ３ａ（５０ｎｇ／ｍＬ）からなる１日目の培地に再懸濁し、ローラーボトル中に２μＬ／ｍＬの密度で分配した。ローラーボトルを、ＦｌｅｘｉＲｏｌｌデジタルセルロー
ラー（FlexiRoll digital cell roller）（Ａｒｇｏｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上に３１ｒｐｍの速度で設置した。分化プロセスの残りの間、培養物を約３ｌｒｐｍで回転させ、上記のＳｃｈｕｌｚら（２０１２）から調整した以下の表２に記載するものに、毎日、培地交換を行った。ｈＥＳの成長、継代、及び増殖は、米国特許第７，９６４，４０２号、同８，２１１，６９９号、同８，３３４，１３８号、同８，００８，０７号、及び同８，１５３，４２９号に実質的に記載される通りである。ヒト胚性幹細胞由来の膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）を作るために使用される標準的な作製方法を以下の表２に提供する。
【０３０７】
【表４】
2020526224.tif 000008
【０３０８】
ｈＥＳＣ  Ａｇｇ．：ｈＥＳＣ凝集体；ＸＦ  ＨＡ：１０％ｖ／ｖ  Ｘｅｎｏ−ｆｒｅｅ  Ｋｎｏｃｋ  Ｏｕｔ  Ｓｅｒｕｍ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、１％ｖ／ｖ非必須アミノ酸、１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手）、１０ｎｇ／ｍＬヘレグリン−１β（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、及び１０ｎｇ／ｍＬアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した、ＧｌｕｔａＭＡＸを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２；ＳＰ：ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標）ｈＥＳＣ  ＳＦＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ｒ０．２ＦＢＳ：ＲＰＭＩ１６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ
）；０．２％ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ−１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシン；ＩＴＳ：１：５０００又は１：１０００に希釈したインスリン−トランスフェリン−セレン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ａ１００：１００ｎｇ／ｍＬ組換えヒトアクチビンＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｗ５０：５０ｎｇ／ｍＬ組換えマウスＷｎｔ３Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｋ２５：２５ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＫＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；ＩＶ：２．５μＭ  ＴＧＦ−β  ＲＩキナーゼ阻害剤ＩＶ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）；ｄｂ：０．５×Ｂ−２７サプリメント（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、１×ＧｌｕｔａＭＡＸ、及び１％ｖ／ｖペニシリン／ストレプトマイシンを補充した、ＤＭＥＭ  ＨＩグルコース（ＨｙＣｌｏｎｅ）；ＣＴＴ３：０．２５μＭ  ＫＡＡＤ−シクロパミン（Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、及び３ｎＭ  ＴＴＮＰＢ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；Ｎ５０：５０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトノギン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｋ５０：５０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＫＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）；Ｅ５０：５０ｎｇ／ｍＬ組換えヒトＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。
【０３０９】
分化したＢ２Ｍ−／−及びＷＴ  ＰＥＣをフローサイトメトリーを使用して分析し、表３に示すように、ステージ４の集団における内分泌細胞及び膵臓前駆細胞の相対量を決定した。
【０３１０】
【表５】
2020526224.tif 000009
【０３１１】
３つのクローン全てで、Ｂ２Ｍ−／−分化細胞における膵臓内分泌細胞、前駆細胞、ＰＤＸ−１のみの細胞、及びトリプルネガティブ細胞の相対的レベルは、ＷＴ細胞（上段）で観察されるレベルと実質的に同様である。
【０３１２】
この実施例は、Ｂ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞が、ＷＴ  ｈＥＳ細胞と同じように膵臓系統を分化することができることを示している。
【０３１３】
実施例４：ＷＴ及びＢ２Ｍ欠損膵臓内胚葉細胞におけるＢ２Ｍ発現の分析
次いで、実施例３の野生型及びＢ２Ｍノックアウト膵臓内胚葉細胞（ＰＥＣ）を、フローサイトメトリーを使用して、ＩＦＮ−γなしで又はＩＦＮ−γを用いて分析した：ＩＦ
Ｎ−γなし（Ｂ線）；１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γに１８〜２４時間曝露（Ａ線）。
【０３１４】
図４Ａは、ＩＦＮ−γなし（Ｂ線）及びＩＦＮ−γによる処理後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣ細胞におけるＢ２Ｍ発現を示す。バックグラウンド（網掛け領域）と比較した、未処理ＷＴ  ＰＥＣ細胞（Ｂ線）の蛍光強度のシフト（増加）は、ＷＴ  ＰＥＣ細胞がＢ２Ｍを発現することを示している。ＩＦＮ−γへのＷＴ  ＰＥＣの曝露後（Ａ線）のＷＴ発現を超える蛍光強度のシフト（増加）は、ＩＦＮ−γへの曝露後のＷＴ  ＰＥＣ細胞においてＢ２Ｍ発現が増加することを示している。すなわち、ＩＦＮ−γへの曝露は、ＷＴ  ＰＥＣにおけるＢ２Ｍ発現を増加させる。
【０３１５】
図４Ｂは、Ｂ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞由来のＰＥＣ細胞におけるＢ２Ｍ発現を示す。ＩＦＮ−γへの曝露を用いても又は用いなくても、バックグラウンド（網掛け領域）と比較して蛍光強度のシフト（増加）はなく、このことは、Ｂ２ＭノックアウトＰＥＣがＢ２Ｍ細胞表面発現を減少又は排除し、Ｂ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞由来のＰＥＣでは、Ｂ２Ｍ発現はＩＦＮ−γ処理によって誘導できなかったことを示している。
【０３１６】
この実施例は、Ｂ２Ｍ発現が調節／排除されたｈＥＳ細胞由来のＰＥＣがＢ２Ｍ表面発現を低減又は排除したことを示している。
【０３１７】
実施例５：ＷＴ及びＢ２Ｍノックアウト膵臓内胚葉細胞におけるＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質発現の分析
実施例２と同様に、野生型及びＢ２ＭノックアウトＰＥＣを、Ｐａｎ−ＨＬＡ−ＡＢＣモノクローナル抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ＃５６０１６９）を使用してＨＬＡクラスＩ細胞表面発現について分析した。野生型及びノックアウト細胞において（１）未処理（Ｂ線）及び（２）１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γで１８〜２４時間処理（Ａ線）の２つの条件下で、フローサイトメトリーにより、発現を評価した。
【０３１８】
図５Ａは、未処理条件下でのＷＴ  ＰＥＣにおけるＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質発現（Ｂ線）及びＩＦＮ−γによる処理後の発現（Ａ線）を示す。バックグラウンド（網掛け領域）と比較した、未処理ＷＴ  ＰＥＣ（Ｂ線）の蛍光強度のシフト（増加）は、ＷＴ  ＰＥＣが細胞表面上でＨＬＡクラスＩを発現することを示している。ＩＦＮ−γへの曝露後のＷＴ  ＰＥＣ発現を超える蛍光強度の変化（増加）は、ＩＦＮ−γへの曝露後のＷＴ  ＰＥＣ細胞においてＨＬＡクラスＩ細胞表面発現が増加することを示唆している。
【０３１９】
図５Ｂは、Ｂ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞由来のＰＥＣにおけるＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質発現を示す。ＩＦＮ−γへの曝露を用いても又は用いなくても、ＰＥＣ細胞のバックグラウンド（網掛け領域）と比較して蛍光強度にシフト（増加）はなく、このことは、ノックアウトがＨＬＡ表面発現を減少又は排除し、Ｂ２Ｍ−／−ＰＥＣにおけるＨＬＡクラスIの発現はＩＦＮ−γ処理によって誘導できなかったことを示している。
【０３２０】
したがって、Ｂ２Ｍの発現が調節／排除されたＰＥＣ細胞では、ＨＬＡクラスＩ細胞表面発現の低減又は排除が観察された。
【０３２１】
実施例６：ＷＴ及びＢ２ＭノックアウトＨＥＳ細胞におけるＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現の分析
標的細胞に対するＩＦＮ−γ処理の効果をさらに定義するために、ＷＴ及びＢ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞におけるＩＣＡＭ−１発現を、（１）未処理（Ｂ線）及び（２）１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γによる１８〜２４時間処理（Ａ線）の２つの条件下でフローサイトメトリーにより評価した。ＩＣＡＭ−１は、標的細胞における抗原提示を含むいくつかの免疫学的機能に必要であり、既知のＮＫ活性化リガンドである。インビボでは、特定
のモノクローナル抗体（「ｍＡｂｓ」）、すなわち、抗ＩＣＡＭ−１又は抗ＬＦＡ−１を適用することによって細胞間ＩＣＡＭ／ＬＦＡ結合相互作用を破壊することにより、免疫学的利点を得ることが可能である。Isobe et al., Specific Acceptance of Cardiac Allograft After Treatment With Antibodies to ICAM-1 and LFA-1, 255 SCIENCE 1125-1127 (Feb. 1992)を参照のこと。本出願人は、Ｍｉｌｔｅｎｅｙ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．から得たＩＣＡＭ−１抗体、カタログ番号１３０−１０３−９０９を使用した。
【０３２２】
図６Ａは、未処理（Ｂ線）及びＩＦＮ−γによる処理後（Ａ線）のＷＴ  ｈＥＳ細胞における細胞表面上のＩＣＡＭ−１タンパク質発現を示す。バックグラウンド（網掛け領域）と比較した、未処理ＷＴ  ｈＥＳ細胞（Ｂ線）の蛍光強度のシフト（増加）は、ＷＴ  ｈＥＳ細胞が細胞表面上にＩＣＡＭ−１タンパク質を発現することを示している。ＩＦＮ−γへのＷＴ  ｈＥＳ細胞の曝露後のＷＴ発現を超える蛍光強度のシフト（増加）は、ＩＣＡＭ−１発現がＩＦＮ−γへの曝露後に増加することを示唆している。
【０３２３】
図６Ｂは、未処理（Ｂ線）及びＩＦＮ−γによる処理後（Ａ線）のＢ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞におけるＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現を示す。図６Ｂは、Ｂ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞におけるＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現がＷＴ  ｈＥＳ細胞と同様であったことを示している。
【０３２４】
この実施例は、ＷＴ及びＢ２ＭノックアウトｈＥＳ細胞をＩＦＮ−γで処理することにより、ＩＣＡＭ−１の細胞表面タンパク質発現が増加することを実証している。
【０３２５】
実施例７：ＷＴ及びＢ２Ｍノックアウト膵臓内胚葉細胞におけるＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現の分析
実施例４及び５と同様に、野生型及びＢ２ＭノックアウトＰＥＣを、既知のＮＫ活性化リガンド、例えばＩＣＡＭ−１に対する抗体を使用して分析した。ＩＣＡＭ−１の細胞表面タンパク質発現を、ＷＴ及びノックアウトＰＥＣにおいて（１）未処理及び（２）１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γによる１８〜２４時間処理の２つの条件下でフローサイトメトリーにより評価した。
【０３２６】
図７Ａは、ＷＴ  ＰＥＣにおけるＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現（Ｂ線）及びＩＦＮ−γによるＷＴ  ＰＥＣの処理後のＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現（Ａ線）を示す。バックグラウンド（網掛け領域）と比較した、未処理ＷＴ  ＰＥＣ（Ｂ線）の蛍光強度のシフト（増加）は、ＷＴ  ＰＥＣが細胞表面上でＩＣＡＭ−１タンパク質を発現することを示している。ＩＦＮ−γへの曝露後のＷＴ  ＰＥＣ発現を超える蛍光強度のさらなるシフト（増加）は、ＩＣＡＭ−１発現がＩＦＮ−γへの曝露後のＷＴ  ＰＥＣにおいて増加することを示唆している。これは、ＮＫ活性化リガンド、特にＩＣＡＭ−１がＩＦＮ−γ刺激によって非常に誘導可能であることを示している。
【０３２７】
図７Ｂは、Ｂ２ＭノックアウトＰＥＣにおけるＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現を示す。Ｂ２ＭノックアウトＰＥＣにおけるＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現は、ＩＦＮ−γ曝露を用いても又は用いなくてもＷＴ  ＰＥＣと同様であり、蛍光がわずかに減少した。したがって、Ｂ２ＭノックアウトＰＥＣをＩＦＮ−γで処理することにより、ＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現が増加する。
【０３２８】
図８は、ＲＮＡ発現アレイデータ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を示し、これは、ｍＲＮＡレベルで、ＩＦＮ−γへの曝露がＷＴ  ｈＥＳＣ、Ｂ２Ｍ−／−ｈＥＳＣ、ＷＴ  ＰＥＣ、及びＢ２Ｍ−／−ＰＥＣにおけるＩＣＡＭ−１発現を増加させることを実証している。本出願人は、ＩＦＮ−γへの曝露後に、ＮＫ活性化リガンドＩＣＡＭ−１の細胞表面タンパク質発現が分化した細胞種（ＷＴ  ＰＥＣ及びＢ２Ｍ−／−ＰＥＣ）において増加する
ことを発見した。したがって、ＩＣＡＭ−１は、ＰＥＣにおいてＩＦＮ−γ刺激により非常に誘導可能である。
【０３２９】
実施例８：さらなるＮＫ活性化リガンドに対するＩＦＮ−γ処理の効果
標的細胞に対するＩＦＮ−γ処理の効果をさらに特徴付けるために、ＷＴ  ＰＥＣを、（１）未処理（Ｂ線）及び（２）１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γによる１８〜２４時間処理（Ａ線）の２つの条件下でフローサイトメトリーにより評価し、他の既知のＮＫ活性化リガンドの細胞表面タンパク質発現を分析した。
【０３３０】
図９は、未処理（Ｂ線）及びＩＦＮ−γによる処理後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣにおける、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄから得た抗体、カタログ＃３３０９０９を使用したＣＤ５８（ＬＦＡ−３としても知られている）細胞表面タンパク質発現を示す。バックグラウンド（Ｃ線）と比較した、未処理ＷＴ  ｈＥＳ細胞（Ｂ線）の蛍光強度の大きなシフト（増加）は、大部分の細胞が表面上にＣＤ５８タンパク質を発現することを示している。ＩＦＮ−γへの曝露後に、蛍光強度のさらなる小さなシフト（増加）があった。
【０３３１】
図１０は、未処理（Ｂ線）及びＩＦＮ−γによる処理後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣにおける、Ｍｉｌｔｅｎｅｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から得た抗体、カタログ番号１３０−１０５−９０５を使用したＣＤ１５５（ＰＶＲ、ＮＥＣＬ−５、ＨＶＥＤとしても知られる）細胞表面タンパク質発現を示す。バックグラウンド（Ｃ線）と比較した、未処理のＷＴ  ＰＥＣ（Ｂ線）の蛍光強度のシフト（増加）は、ＷＴ  ＰＥＣがＣＤ１５５を発現することを示している。ＩＦＮ−γへの曝露後には未処理条件を超える蛍光強度のさらなる増加（増加）はなく、このことは、ＣＤ１５５発現がＷＴ  ＰＥＣにおいてＩＦＮ−γへの曝露後には増加しないことを示唆している。
【０３３２】
図１１は、未処理（Ｂ線）及びＩＦＮ−γによる処理後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣにおける、Ｍｉｌｔｅｎｅｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から得た抗体、カタログ＃１３０−０９８−８５８を使用したＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６ａ、ＢＧＰ、及びＢＧＰ１としても知られている）細胞表面タンパク質発現を示す。バックグラウンド（Ｃ線）と比較した、未処理のＷＴ  ＰＥＣ（Ｂ線）の蛍光強度のシフト（増加）は、ＷＴ  ＰＥＣが細胞表面上でＣＥＡＣＡＭ１タンパク質を発現することを示している。ＩＦＮ−γへのＷＴ  ＰＥＣの曝露後における未処理条件を超える蛍光強度のシフト（増加）は、細胞表面上のＣＥＡＣＡＭ１タンパク質発現がＩＦＮ−γへの曝露後のＷＴ  ＰＥＣにおいて増加することを示唆している。
【０３３３】
図１２は、未処理（Ｂ線）及びＩＦＮγによる処理後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣにおける、Ａｂｃaｍ  Ｉｎｃ．から得た抗体、カタログ＃ａｂ２１０８３８を使用したＢＡＴ３（ＢＡＧ６としても知られる）細胞表面タンパク質発現を示す。バックグラウンド（Ｃ線）と比較した、未処理のＰＥＣ（Ｂ線）の蛍光強度の変化（増加）は、細胞がＣＥＡＣＡＭ１を発現することを示唆している。ＩＦＮ−γへのＷＴ  ＰＥＣ曝露後における未処理条件を超える蛍光強度のさらなるシフト（増加）はなく、このことは、ＢＡＴ３発現がＩＦＮ−γへの曝露後のＷＴ  ＰＥＣにおいて増加しないことを示唆している。
【０３３４】
図１３は、未処理（Ｂ線）及びＩＦＮ−γによる処理後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣにおける、ＭＢＬ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから得た抗体、カタログ＃ＣＭ００４−４を使用したＣＡＤＭ１（ＮＥＣＬ２、ＴＳＬＣ１、ＩＧＳＦ４、ＲＡ１７５としても知られる）細胞表面タンパク質発現を示す。バックグラウンド（Ｃ線）と比較した、未処理条件（Ｂ線）での蛍光強度のシフト（増加）は、ＷＴ  ＰＥＣが細胞表面上でＣＡＤＭ１タンパク質を発現することを示唆している。ＩＦＮ−γへのＰＥＣの曝露後における未処理状態を超える蛍光強度の追加のシフト（増加）はなく、このことは
、ＣＡＤＭ１発現がＩＦＮ−γへの曝露後に増加しないことを示唆している。
【０３３５】
図１４は、未処理（Ｂ線）及びＩＦＮ−γによる処理後（Ａ線）のＷＴ  ＰＥＣにおける、Ｍｉｌｔｅｎｅｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．から得た抗体、カタログ＃１３０−１０９−０５６を使用したＣＤ１１２（ネクチン−２、ＰＶＲＲ２、ＨＶＥＢとしても知られる）発現を示す。バックグラウンド（Ｃ線）と比較した、未処理条件（Ｂ線）の蛍光強度のシフト（増加）は、ＷＴ  ＰＥＣが細胞表面上でＣＤ１１２タンパク質を発現することを示唆している。ＩＦＮ−γへのＰＥＣの曝露後における未処理条件を超える蛍光強度のさらなるシフト（増加）はなく、このことは、ＣＤ１１２発現がＩＦＮ−γへの曝露後に増加しないことを示唆している。
【０３３６】
実施例９：ＭＨＣクラスＩ欠損、ＮＫ細胞活性化リガンド欠損細胞は、ＮＫ細胞媒介溶解を防止する
ＨＬＡクラスＩ発現の低減又は排除及びＮＫ細胞活性化リガンド発現の低減又は排除の組み合わせがＮＫ媒介細胞溶解を防止するのに十分かどうかを試験するために、５μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬの濃度のＩＣＡＭ−１遮断抗体を使用して、ＩＣＡＭ−１発現を標的細胞上で遮断した。ＩＣＡＭ−１抗体をＷＴ又はＢ２Ｍ−／−ＥＳ細胞若しくはＰＥＣに添加することにより、ＩＦＮ−γ処理後の標的細胞のＮＫ溶解が低減した（図１５）。
【０３３７】
カルセイン−ＡＭによる標的細胞の染色
カルセイン放出アッセイは、ＮＫ細胞の細胞傷害性を研究するための非放射性代替法である。標的細胞は、蛍光色素（カルセインＡＭ）を取り込み、それを細胞質で活性蛍光色素に変換し、該活性蛍光色素は溶解時にのみ細胞から放出される。溶解した細胞は蛍光色素を上清に放出し、次いで該上清を採取し、蛍光量を蛍光計で定量する。細胞溶解率は、ＮＫ細胞（エフェクター）、遮断抗体、又はその両方の存在下又は非存在下でインキュベーションを行った後に、上清に存在する蛍光の量から計算される。
【０３３８】
標的細胞は、標識する前に１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ−γで処理された又は処理しないＷＴ  ＥＳＣ、Ｂ２Ｍ−／−ＥＳＣ、ＷＴ  ＰＥＣ、又はＢ２Ｍ−／−ＰＥＣのいずれかを含んだ。標的細胞を調製するために、標的細胞集団を２μｇ／ｍｌカルセインＡＭ染色媒体（Ｅｎｚｏ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  １ｍｇ／ｍＬストック溶液（カタログ＃Ｃ３１００ＭＰ））で染色した。標的細胞を、断続的に混合しながら、８％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で１時間インキュベートした。標的細胞を２回洗浄して任意の遊離カルセインＡＭを除去し、ＲＰＭＩ完全培地（ＲＰＭＩ、１０％熱不活性化ＦＢＳ、及び１％抗生物質）に１×１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０３３９】
共培養標的ＮＫ細胞及び遮断抗体
次いで、カルセインＡＭ標識した標的細胞を、１０：１のエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ比）を有するＮＫ細胞（エフェクター細胞）とともにインキュベートした。具体的には、１ウェルあたり１００μLのＮＫ細胞（１×１０６個／ｍＬの密度）を９６ウェルＶ底プレートに添加し、次いで１００μLのカルセイン染色したＥＳＣ又はＰＥＣ細胞を添加した（１×１０５個／ウェル）。指示された場合、５μｇ／ｍＬ及び１０μｇ／ｍＬの濃度のヒトＩＣＡＭ−１表面抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、カタログ＃ＢＢＡ３）に対する遮断抗体をウェルに添加して、ＮＫ媒介細胞溶解を低減することができるかを決定した。
【０３４０】
プレートを８％ＣＯ２２インキュベーター中で３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーション期間の後、プレートを２００×ｇで２分間遠心分離した。１００μＬの上清を慎重に除去し、黒色着色９６ウェルプレートに移し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖ
ｉｃｅプレートリーダーを使用して蛍光を測定した（励起フィルター：４８５ｎｍ／発光フィルター：５３０ｎｍ）。特定の溶解は、溶解％＝１００×［（抗体ありの場合の平均蛍光−平均自発蛍光）／（平均最大蛍光−平均自発蛍光）］の式を使用して計算した。最大蛍光は、界面活性剤（１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）とともにインキュベートした細胞の溶解によって決定され、自発的溶解は、抗体又はエフェクター細胞を含まない標的細胞で得られた蛍光とした。
【０３４１】
結果
図１に示すように、目標は、シナリオＣ（ＮＫ細胞が標的細胞を攻撃する）からシナリオＡ（応答なし又は応答の低減）に移行させることである。図１５では、このシナリオは条件４及び８に示される。条件４及び８では、標的細胞（Ｂ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞又はＰＥＣ）は機能的ＨＬＡクラスＩ表面発現を欠き、ＩＦＮ−γに曝露される。上記で論じ、かつ条件４及び８に見られるように、ＩＦＮ−γへの曝露は、ＮＫ活性化リガンド（ＩＣＡＭ−１）の増加を引き起こし、これは、ＩＦＮ−γへの曝露なしのＨＬＡクラスＩノックアウトと比較して、より大きな細胞溶解をもたらす（条件３対４及び条件７対８の最初のバーを比較）。しかしながら、標的細胞上でＮＫ活性化シグナルの発現を遮断するように作用するＩＣＡＭ−１阻害抗体で処理すると、ＮＫ媒介細胞溶解は、Ｂ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞では８３％から７３％に低下し、ＩＦＮ−γで処理されたＢ２Ｍ−／−ＰＥＣでは７２％から６１％に低下する。ＮＫ媒介細胞溶解率はゼロにまで低下しないが、それは、ＩＣＡＭ−１細胞表面タンパク質発現が遮断抗体を使用しても完全に遮断され得ず、上記で論じたように、標的細胞が２つ以上のＮＫ活性化リガンドを発現するためである。ＮＫ媒介細胞溶解率は、ＩＣＡＭ−１発現がさらに阻害され、他のＮＫ活性化リガンドが標的細胞において遮断された場合に、より大幅に低下すると予想される。したがって、ＩＣＡＭ−１阻害抗体は、表１に列挙されたリガンド、好ましくは分類１（既知の活性化リガンド）及び分類２（遺伝子チップデータから同定されたリガンドを活性化する潜在的候補、それらはＩＦＮγ後にＰＥＣ及び／又はＥＳＣでアップレギュレートされる）のいずれかに対する阻害抗体を含む、さらなるＮＫ活性化リガンド阻害抗体と組み合わせることができる。一実施形態では、ＩＣＡＭ１遺伝子及び他のＮＫ活性化リガンド遺伝子は、それらの活性を完全に遮断するために破壊される。
【０３４２】
図１のシナリオＤは、図１５の条件２及び６の最初のバーに示されている。条件２及び６では、ＷＴ  ｈＥＳ細胞及びＰＥＣは、ＩＦＮ−γへの曝露の結果として、ＨＬＡクラスＩ抗原及びＮＫ活性化リガンドの両方の細胞表面タンパク質発現をアップレギュレートした。細胞をＩＣＡＭ−１阻害抗体とインキュベートしたとき、これは図１のシナリオＤからシナリオＢに移行する状況を表す。ＩＣＡＭ１阻害抗体とインキュベートしたとき、細胞死がＷＴ  ｈＥＳ細胞では７９から６０％に低下し、ＩＦＮ−γに曝露されたＷＴ  ＰＥＣでは５３％から２７％に低下する。実際に、ＷＴ  ＰＥＣをＩＦＮ−γに曝露し、ＩＣＡＭ−１阻害抗体とともにインキュベートしたとき、ＮＫ細胞溶解は未処理のＷＴ  ＰＥＣのものを下回り、ＩＦＮ−γなしでのＷＴ  ＰＥＣ及びＩＣＡＭ−１阻害抗体の場合での３７％と比較して、ＷＴ  ＰＥＣ、ＩＦＮ−γ、及びＩＣＡＭ−１阻害抗体の場合では２７％である。
【０３４３】
図１のシナリオＢは、図１５の条件１、２、５、及び６におけるＩＣＡＭ１抗体処理のバーによって例示される。ここでは、標的ｈＥＳ細胞及びＰＥＣはＨＬＡクラスＩ及びＮＫ活性化リガンドを有するが、標的細胞がＩＦＮ−γに曝露されないとき、ＩＣＡＭ−１の細胞表面タンパク質発現の増加はない。結果として、ＩＣＡＭ−１阻害抗体は効果がより少ない。したがって、細胞溶解はほぼ同じままであり、ｈＥＳ細胞では５８％から５７％であり、ＰＥＣ細胞では３３％から３７％である。
【０３４４】
図１のシナリオＣは、図１５の条件３、４、７、及び８における最初のバーと同様であ
る。これらの条件では、細胞は、Ｂ２Ｍ−／−の結果としてＨＬＡクラスＩ細胞表面発現を示さない。したがって、ＮＫ活性化リガンドが細胞のＩＦＮ−γ曝露によって活性化されない場合、ＩＣＡＭ−１阻害抗体はほとんど効果がなく、ｈＥＳ細胞では７１％から７０％であり、ＰＥＣでは５４％から５７％である。
【０３４５】
一般的な観察として、ＮＫ媒介細胞溶解は、分化した細胞集団（ＷＴ  ＰＥＣ及びＢ２Ｍ−／−ＰＥＣ）では未分化細胞集団（ＷＴ  ｈＥＳ及びＢ２Ｍ−／−ｈＥＳ）と比較して少ない。ＮＫ媒介細胞溶解は、細胞（ＷＴ又はＢ２Ｍ−／−ノックアウト  ｈＥＳ又はＰＥＣ）がＩＦＮ−γで活性化されたときにより大幅に増加する。
【０３４６】
実施例１０：ＮＫ活性化リガンド欠損Ｂ２Ｍ−／−ノックアウトｈＥＳ細胞の生成
実施例９は、ＩＣＡＭ−１発現の阻害又は抑制によって、ＩＦＮ−γ処理Ｂ２Ｍ−／−ＰＥＣがＮＫ媒介細胞殺傷活性から保護されることを記載している。したがって、移植後のＮＫ細胞媒介殺傷からＢ２Ｍ−／−ＰＥＣを保護するためには、ＮＫ細胞活性化リガンド遺伝子を破壊することが望ましい。例えば、上記の実施例に基づき、既知のＮＫ活性化リガンド遺伝子であるＩＣＡＭ−１を破壊又は「ノックアウト」することができる。好ましくは、Ｂ２Ｍ−／−ＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ株におけるＩＣＡＭ−１遺伝子座の両方の対立遺伝子を、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又は現在知られている若しくは将来既知となるべき他の遺伝子編集技術を使用して破壊することができる。ＰＣＴ国際公開第２０１６１８３０４１Ａ号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。ＩＣＡＭ−１の公開された配列の例は、配列番号４、５、及び６として提出されている。例えば、本発明の一実施形態では、デュアルガイドＲＮＡ及びＦｏｋｌヌクレアーゼに融合された触媒的に不活性なＣａｓ９タンパク質を導入するＮＥＸＴＧＥＮ（商標）ＣＲＩＳＰＲ（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、ケンタッキー州レキシントン）が細胞の遺伝子編集に使用される。
【０３４７】
ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９を含むプラスミドをＢ２Ｍ−／−ＣｙＴ４９ｈＥＳＣにエレクトロポレーションし、組織培養プレートに播種することができる。エレクトロポレーション後、フローサイトメトリーにより、ＩＣＡＭ−１抗体に対する陰性反応性について細胞を選別することができる。選別された細胞は、クローン密度でプレーティングすることができる。個々のクローンを選び、再度プレーティングすることができる。クローンを増殖し、凍結保存することができる。Ｇ分染法により正常な核型を示し、フローサイトメトリー及び／又は免疫蛍光法によりＩＣＡＭ−１タンパク質の発現及びＩＣＡＭ−１タンパク質の表面発現が陰性である増殖クローンをさらなる実験のために選択することができる。
【０３４８】
上記のように、ＩＣＡＭ１及びＢ２Ｍを欠損する細胞は、少なくとも１つのＮＫ活性化リガンド及び少なくとも１つ又は全てのＭＨＣクラスＩタンパク質を細胞表面上で発現することができず、したがって、ＮＫ細胞活性化受容体に結合し得ず、ＮＫ媒介細胞死から保護される。
【０３４９】
実施例１１：複数のＮＫ活性化リガンド欠損Ｂ２Ｍ−／−ノックアウトhＥＳ細胞の生成
実施例９及び１０は、機能的細胞表面発現の阻害（抗ＮＫ活性化リガンド）及びＭＨＣクラスＩ細胞表面発現の破壊（例えば、Ｂ２Ｍ−／−）と組み合わせたＮＫ細胞活性化リガンドの遺伝子破壊（例えば、ＩＣＡＭ１−／−）は、ＮＫ媒介細胞死から標的細胞を保護することができることを実証している。２つ以上のＮＫ細胞活性化リガンドを欠損した細胞の移植を行い、ＮＫ媒介細胞死からさらに保護することができる。
【０３５０】
ＣＤ５８遺伝子は、ノックアウトするためのＮＫ活性化リガンド遺伝子として選択され
る。ＣＤ５８遺伝子座の両方の対立遺伝子は、国際公開第２０１６１８３０４１Ａで概説されている既知の技術を使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、Ｂ２Ｍ−／−：ＩＣＡＭ−／−ダブルノックアウトＣｙＴ４９  ｈＥＳＣ株において破壊することができる。ＣＥＡＣＡＭ１の公開された配列の例は、配列番号７、８、及び９として提出されている。再度、編集バージョンは、ＮＥＸＴＧＥＮ（商標）ＣＲＩＳＰＲ（Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｉｎｃ．、ケンタッキー州レキシントン）であり得る。
【０３５１】
ガイドＲＮＡ及びＣａｓ９を含むプラスミドをＢ２Ｍ−／−、ＩＣＡＭ−／−ノックアウトＣｙＴ４９  ｈＥＳＣにエレクトロポレーションし、組織培養プレートに播種することができる。エレクトロポレーション後、フローサイトメトリーにより、ＣＤ５８抗体に対する陰性反応性について細胞を選別することができる。選別された細胞は、クローン密度でプレーティングすることができる。個々のクローンを選び、再度プレーティングすることができる。クローンを増殖し、凍結保存することができる。Ｇ分染法により正常な核型を示し、フローサイトメトリー及び／又は免疫蛍光法によりＣＤ５８タンパク質の発現及びＣＤ５８タンパク質の表面発現が陰性である増殖クローンをさらなる実験のために選択することができる。
【０３５２】
上記のように、破壊、欠失、又は改変されたＩＣＡＭ１、ＣＤ５８、及びＢ２Ｍを有する細胞は、細胞表面上でＩＣＡＭ１、ＣＤ５８もＭＨＣクラスＩタンパク質も発現することができず、したがって、ＮＫ細胞活性化受容体に結合し得ず、ＮＫ媒介細胞死から保護される。
【０３５３】
ＣＤ１５５（ＰＶＲとしても知られる）遺伝子はまた、ノックアウトするためのＮＫ活性化リガンド遺伝子として選択することができる。ＣＤ５８に加えて又はＣＤ５８の代わりに、ＣＤ１５５を選択することができる。上記のように、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、ＣＤ２８遺伝子を破壊することができる。ＣＤ１５５遺伝子はまた、ノックアウトするためのＮＫ活性化リガンド遺伝子として選択することができる。ＣＤ５８に加えて又はＣＤ５８の代わりに、ＣＤ１５５を選択することができる。ＣＡＥＣＡＭ１遺伝子はまた、ノックアウトするためのＮＫ活性化リガンド遺伝子として選択することができる。ＣＤ５８及び／若しくはＣＤ１５５に加えて又はＣＤ５８及び／若しくはＣＤ１５５の代わりに、ＣＡＥＣＡＭ１を選択することができる。
【０３５４】
実施例１２：ＮＫ活性化リガンドＩＣＡＭ１及びＣＤ５８の不活性化
【０３５５】
ＮＫ活性化を完全に排除するためには、標的細胞における遺伝子ノックアウト（例えば、ｈＥＳ細胞由来の細胞療法）によって、あるいは遮断抗体又は現在既知であるか若しくは将来開発される他の戦略を使用することによって、複数のＮＫ活性化リガンドを排除／低減する必要があり得る。標的細胞上のＮＫ活性化リガンドの効果を阻害することによってＮＫ細胞傷害性が低減し得るかどうかを決定するために、ＷＴ及びＢ２Ｍ−／−  ｈＥＳ細胞及びＰＥＣにおけるＮＫ活性化リガンドの発現を、標的細胞表面上のＩＣＡＭ１及びＣＤ５８タンパク質を遮断するためのＩＣＡＭ１及びＣＤ５８遮断抗体を使用して遮断することができる。標的細胞の細胞溶解が低減されることが期待できる（図１５と同様）。したがって、ＮＫ細胞による細胞溶解は、ＩＣＡＭ１及びＣＤ５８などのＮＫ活性化リガンドを遮断することによって低減することができる。Ｂ２Ｍ−／−細胞においてＮＫ活性化リガンドに対する抗体を使用してＩＣＡＭ１及びＣＤ５８の発現を遮断することは、３つのノックアウト（ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックアウト及びＮＫ活性化リガンド遺伝子ノックアウト）を有する細胞を生成するための概念実証である。そうすることで、標的細胞（例えば、ｈＥＳ及び／又は膵臓系統細胞）は、図１のシナリオＣからシナリオＡに移行する。具体的には、本発明の細胞、組織、及び器官は、ＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さず（Ｂ２Ｍ−／−）、ＮＫ活性化リガンド細胞
表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さない（例えば、ＩＣＡＭ１−／−及びＣＤ５８−／−）。細胞表面タンパク質発現の阻害は、遺伝子をノックアウトするか、又は抗体を使用してタンパク質の発現を遮断することによって達成することができる。細胞表面タンパク質発現を妨げる他の戦略には、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡデコイ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ、トランスドミナントネガティブタンパク質（ＴＮＰ）、キメラ／融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ケモカインリガンド、抗感染性細胞タンパク質、細胞内抗体（ｓＦｖ）、ヌクレオシド類似体（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体（ＮＮＲＴＩ）、インテグラーゼ阻害剤（オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド、及び化学剤）、及びプロテアーゼ阻害剤の使用が含まれる。多重遺伝子ノックアウトは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）媒介傷害及びＮＫ細胞媒介傷害の両方を効果的に防止するが、それは、ＣＴＬ又はＮＫ細胞が結合するための、細胞表面上で発現されるＨＬＡクラスＩがほとんど又は全くなく、ＮＫ活性化リガンドタンパク質がほとんどないか又は全くないためである。
【０３５６】
実施例１３：ＮＫ活性化リガンドＣＡＤＭ１及びＣＤ５８の不活性化
ＮＫ活性化を完全に排除するためには、標的細胞における遺伝子ノックアウト（例えば、ｈＥＳ細胞由来の細胞療法）によって、あるいは遮断抗体又は現在既知であるか若しくは将来開発される他の戦略を使用することによって、複数のＮＫ活性化リガンドを排除／低減する必要があり得る。標的細胞上のＮＫ活性化リガンドの効果を阻害することによってＮＫ細胞傷害性が低減し得るかどうかを決定するために、ＷＴ及びＢ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞及びＰＥＣにおけるＮＫ活性化リガンドの発現を、標的細胞表面上のＣＡＤＭ１及びＣＤ５８タンパク質を遮断するためのＣＡＤＭ１及びＣＤ５８遮断抗体を使用して遮断することができる。標的細胞の細胞溶解が低減されることが期待できる（図１５と同様）。したがって、ＮＫ細胞による細胞溶解は、ＣＡＤＭ１及びＣＤ５８などのＮＫ活性化リガンドを遮断することによって低減することができる。Ｂ２Ｍ−／−細胞においてＮＫ活性化リガンドに対する抗体を使用してＣＡＤＭ１及びＣＤ５８の発現を遮断することは、３つのノックアウト（ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックアウト及びＮＫ活性化リガンド遺伝子ノックアウト）を有する細胞を生成するための概念実証である。そうすることで、標的細胞（例えば、ｈＥＳ及び／又は膵臓系統細胞）は、図１のシナリオＣからシナリオＡに移行する。具体的には、本発明の細胞、組織、及び器官は、ＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さず（Ｂ２Ｍ−／−）、ＮＫ活性化リガンド細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さない（例えば、ＣＡＤＭ１−／−及びＣＤ５８−／−）。細胞表面タンパク質発現の阻害は、遺伝子をノックアウトするか、又は抗体を使用してタンパク質の発現を遮断することによって達成することができる。細胞表面タンパク質発現を妨げる他の戦略には、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡデコイ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ、トランスドミナントネガティブタンパク質（ＴＮＰ）、キメラ／融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ケモカインリガンド、抗感染性細胞タンパク質、細胞内抗体（ｓＦｖ）、ヌクレオシド類似体（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体（ＮＮＲＴＩ）、インテグラーゼ阻害剤（オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド、及び化学剤）、及びプロテアーゼ阻害剤の使用が含まれる。多重遺伝子ノックアウトは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）媒介傷害及びＮＫ細胞媒介傷害の両方を効果的に防止するが、それは、ＣＴＬ又はＮＫ細胞が結合するための、細胞表面上で発現されるＨＬＡクラスＩがほとんど又は全くなく、ＮＫ活性化リガンドタンパク質がほとんどないか又は全くないためである。
【０３５７】
実施例１４：ＮＫ活性化リガンドＣＤ１５５及びＣＤ５８の不活性化
ＮＫ活性化を完全に排除するためには、標的細胞における遺伝子ノックアウト（例えば、ｈＥＳ細胞由来の細胞療法）によって、あるいは遮断抗体又は現在既知であるか若しくは将来開発される他の戦略を使用することによって、複数のＮＫ活性化リガンドを排除／低減する必要があり得る。標的細胞上のＮＫ活性化リガンドの効果を阻害することによっ
てＮＫ細胞傷害性が低減し得るかどうかを決定するために、ＷＴ及びＢ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞及びＰＥＣにおけるＮＫ活性化リガンドの発現を、標的細胞表面上のＣＤ１５５及びＣＤ５８タンパク質を遮断するためのＣＤ１５５及びＣＤ５８遮断抗体を使用して遮断することができる。標的細胞の細胞溶解が低減されることが期待できる（図１５と同様）。したがって、ＮＫ細胞による細胞溶解は、ＣＤ１５５及びＣＤ５８などのＮＫ活性化リガンドを遮断することによって低減することができる。Ｂ２Ｍ−／−細胞においてＮＫ活性化リガンドに対する抗体を使用してＣＤ１５５及びＣＤ５８の発現を遮断することは、３つのノックアウト（ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックアウト及びＮＫ活性化リガンド遺伝子ノックアウト）を有する細胞を生成するための概念実証である。そうすることで、標的細胞（例えば、ｈＥＳ及び／又は膵臓系統細胞）は、図１のシナリオＣからシナリオＡに移行する。具体的には、本発明の細胞、組織、及び器官は、ＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さず（Ｂ２Ｍ−／−）、ＮＫ活性化リガンド細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さない（例えば、ＣＤ１５５−／−及びＣＤ５８−／−）。細胞表面タンパク質発現の阻害は、遺伝子をノックアウトするか、又は抗体を使用してタンパク質の発現を遮断することによって達成することができる。細胞表面タンパク質発現を妨げる他の戦略には、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡデコイ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ、トランスドミナントネガティブタンパク質（ＴＮＰ）、キメラ／融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ケモカインリガンド、抗感染性細胞タンパク質、細胞内抗体（ｓＦｖ）、ヌクレオシド類似体（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体（ＮＮＲＴＩ）、インテグラーゼ阻害剤（オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド、及び化学剤）、及びプロテアーゼ阻害剤の使用が含まれる。多重遺伝子ノックアウトは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）媒介傷害及びＮＫ細胞媒介傷害の両方を効果的に防止するが、それは、ＣＴＬ又はＮＫ細胞が結合するための、細胞表面上で発現されるＨＬＡクラスＩがほとんど又は全くなく、ＮＫ活性化リガンドタンパク質がほとんどないか又は全くないためである。
【０３５８】
実施例１５：ＮＫ活性化リガンドＩＣＡＭ１、ＣＤ１５５、及びＣＤ５８の不活性化
ＮＫ活性化を完全に排除するためには、標的細胞における遺伝子ノックアウト（例えば、ｈＥＳ細胞由来の細胞療法）によって、あるいは遮断抗体又は現在既知であるか若しくは将来開発される他の戦略を使用することによって、複数のＮＫ活性化リガンドを排除／低減する必要があり得る。標的細胞上のＮＫ活性化リガンドの効果を阻害することによってＮＫ細胞傷害性が低減し得るかどうかを決定するために、ＷＴ及びＢ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞及びＰＥＣにおけるＮＫ活性化リガンドの発現を、標的細胞表面上のＩＣＡＭ１、ＣＤ１５５、及びＣＤ５８タンパク質を遮断するためのＩＣＡＭ１、ＣＤ１５５、及びＣＤ５８遮断抗体を使用して遮断することができる。標的細胞の細胞溶解が低減されることが期待できる（図１５と同様）。したがって、ＮＫ細胞による細胞溶解は、ＩＣＡＭ１、ＣＤ５８、及びＣＤ１５５などのＮＫ活性化リガンドを遮断することによって低減することができる。Ｂ２Ｍ−／−細胞においてＮＫ活性化リガンドに対する抗体を使用してＩＣＡＭ１、ＣＤ５８、及びＣＤ１５５の発現を遮断することは、４つのノックアウト（ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックアウト及びＮＫ活性化リガンド遺伝子ノックアウト）を有する細胞を生成するための概念実証である。そうすることで、標的細胞（例えば、ｈＥＳ及び／又は膵臓系統細胞）は、図１のシナリオＣからシナリオＡに移行する。具体的には、本発明の細胞、組織、及び器官は、ＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さず（Ｂ２Ｍ−／−）、ＮＫ活性化リガンド細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さない（例えば、ＩＣＡＭ１−／−、ＣＤ５８−／−、及びＣＤ１５５−／−）。細胞表面タンパク質発現の阻害は、遺伝子をノックアウトするか、又は抗体を使用してタンパク質の発現を遮断することによって達成することができる。細胞表面タンパク質発現を妨げる他の戦略には、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡデコイ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ、トランスドミナントネガティブタンパク質（ＴＮＰ）、キメラ／融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ケモカインリガン
ド、抗感染性細胞タンパク質、細胞内抗体（ｓＦｖ）、ヌクレオシド類似体（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体（ＮＮＲＴＩ）、インテグラーゼ阻害剤（オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド、及び化学剤）、及びプロテアーゼ阻害剤の使用が含まれる。多重遺伝子ノックアウトは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）媒介傷害及びＮＫ細胞媒介傷害の両方を効果的に防止するが、それは、ＣＴＬ又はＮＫ細胞が結合するための、細胞表面上で発現されるＨＬＡクラスＩがほとんど又は全くなく、ＮＫ活性化リガンドタンパク質がほとんどないか又は全くないためである。
【０３５９】
実施例１６：ＮＫ活性化リガンドＩＣＡＭ１、ＣＤ１５５、ＣＤ５８、及びＣＡＤＭ１の不活性化
ＮＫ活性化を完全に排除するためには、標的細胞における遺伝子ノックアウト（例えば、ｈＥＳ細胞由来の細胞療法）によって、あるいは遮断抗体又は現在既知であるか若しくは将来開発される他の戦略を使用することによって、複数のＮＫ活性化リガンドを排除／低減する必要があり得る。標的細胞上のＮＫ活性化リガンドの効果を阻害することによってＮＫ細胞傷害性が低減し得るかどうかを決定するために、ＷＴ及びＢ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞及びＰＥＣにおけるＮＫ活性化リガンドの発現を、標的細胞表面上のＩＣＡＭ１、ＣＤ１５５、ＣＤ５８、及びＣＡＤＭ１タンパク質を遮断するためのＩＣＡＭ１、ＣＤ１５５、ＣＤ５８、及びＣＡＤＭ１遮断抗体を使用して遮断することができる。標的細胞の細胞溶解が低減されることが期待できる（図１５と同様）。したがって、ＮＫ細胞による細胞溶解は、ＩＣＡＭ１、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、及びＣＡＤＭ１などのＮＫ活性化リガンドを遮断することによって低減することができる。Ｂ２Ｍ−／−細胞においてＮＫ活性化リガンドに対する抗体を使用してＩＣＡＭ１、ＣＤ５８、ＣＤ１５５、及びＣＡＤＭ１の発現を遮断することは、５つのノックアウト（ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックアウト及びＮＫ活性化リガンド遺伝子ノックアウト）を有する細胞を生成するための概念実証である。そうすることで、標的細胞（例えば、ｈＥＳ及び／又は膵臓系統細胞）は、図１のシナリオＣからシナリオＡに移行する。具体的には、本発明の細胞、組織、及び器官は、ＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さず（Ｂ２Ｍ−／−）、ＮＫ活性化リガンド細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さない（例えば、ＩＣＡＭ１−／−、ＣＤ５８−／−、ＣＤ１５５−／−、及びＣＡＤＭ１−／−）。細胞表面タンパク質発現の阻害は、遺伝子をノックアウトするか、又は抗体を使用してタンパク質の発現を遮断することによって達成することができる。細胞表面タンパク質発現を妨げる他の戦略には、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡデコイ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ、トランスドミナントネガティブタンパク質（ＴＮＰ）、キメラ／融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ケモカインリガンド、抗感染性細胞タンパク質、細胞内抗体（ｓＦｖ）、ヌクレオシド類似体（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体（ＮＮＲＴＩ）、インテグラーゼ阻害剤（オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド、及び化学剤）、及びプロテアーゼ阻害剤の使用が含まれる。多重遺伝子ノックアウトは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）媒介傷害及びＮＫ細胞媒介傷害の両方を効果的に防止するが、それは、ＣＴＬ又はＮＫ細胞が結合するための、細胞表面上で発現されるＨＬＡクラスＩがほとんど又は全くなく、ＮＫ活性化リガンドタンパク質がほとんどないか又は全くないためである。
【０３６０】
実施例１７：ＮＫ活性化リガンドＩＣＡＭ１、ＣＤ１５５、及びＣＡＤＭ１の不活性化、
ＮＫ活性化を完全に排除するためには、標的細胞における遺伝子ノックアウト（例えば、ｈＥＳ細胞由来の細胞療法）によって、あるいは遮断抗体又は現在既知であるか若しくは将来開発される他の戦略を使用することによって、複数のＮＫ活性化リガンドを排除／低減する必要があり得る。標的細胞上のＮＫ活性化リガンドの効果を阻害することによってＮＫ細胞傷害性が低減し得るかどうかを決定するために、ＷＴ及びＢ２Ｍ−／−ｈＥＳ細胞及びＰＥＣにおけるＮＫ活性化リガンドの発現を、標的細胞表面上のＩＣＡＭ１、Ｃ
Ｄ１５５、及びＣＡＤＭ１タンパク質を遮断するためのＩＣＡＭ１、ＣＤ１５５、及びＣＡＤＭ１遮断抗体を使用して遮断することができる。標的細胞の細胞溶解が低減されることが期待できる（図１５と同様）。したがって、ＮＫ細胞による細胞溶解は、ＩＣＡＭ１、ＣＤ１５５、及びＣＡＤＭ１などのＮＫ活性化リガンドを遮断することによって低減することができる。Ｂ２Ｍ−／−細胞においてＮＫ活性化リガンドに対する抗体を使用してＩＣＡＭ１、ＣＤ１５５、及びＣＡＤＭ１の発現を遮断することは、４つのノックアウト（ＨＬＡクラスＩ遺伝子ノックアウト及びＮＫ活性化リガンド遺伝子ノックアウト）を有する細胞を生成するための概念実証である。そうすることで、標的細胞（例えば、ｈＥＳ及び／又は膵臓系統細胞）は、図１のシナリオＣからシナリオＡに移行する。具体的には、本発明の細胞、組織、及び器官は、ＨＬＡクラスＩ細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さず（Ｂ２Ｍ−／−）、ＮＫ活性化リガンド細胞表面タンパク質発現を阻害したか又はその発現を有さない（例えば、ＩＣＡＭ１−／−、ＣＤ１５５−／−、及びＣＡＤＭ１−／−）。細胞表面タンパク質発現の阻害は、遺伝子をノックアウトするか、又は抗体を使用してタンパク質の発現を遮断することによって達成することができる。細胞表面タンパク質発現を妨げる他の戦略には、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡデコイ、リボザイム、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ、トランスドミナントネガティブタンパク質（ＴＮＰ）、キメラ／融合タンパク質、ヌクレアーゼ、ケモカインリガンド、抗感染性細胞タンパク質、細胞内抗体（ｓＦｖ）、ヌクレオシド類似体（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体（ＮＮＲＴＩ）、インテグラーゼ阻害剤（オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド、及び化学剤）、及びプロテアーゼ阻害剤の使用が含まれる。多重遺伝子ノックアウトは、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）媒介傷害及びＮＫ細胞媒介傷害の両方を効果的に防止するが、それは、ＣＴＬ又はＮＫ細胞が結合するための、細胞表面上で発現されるＨＬＡクラスＩがほとんど又は全くなく、ＮＫ活性化リガンドタンパク質がほとんどないか又は全くないためである。
【０３６１】
本発明で有用な遮断抗体は、以下の通りである：ＣＡＤＭ１抗体、クローン９Ｄ２、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ＃ＢＲＤ−０００７ＭＺ；ＣＤ１５５抗体、クローンＳＫＩＩ．４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ＃３３７６０２；及びＣＤ５８抗体、クローンＴＳ２／９、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ＃３３０９１１。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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