(57)【要約】  本発明は、単分子および単一核単分子レベルでの単分子タンパク質検出およびＤＮＡシークエンシングプラットホームに基づく、次世代クロマチン相互作用アッセイのための方法を提供する。本発明は、単一核における単分子解像、ならびに近接ライゲーションおよびＰＣＲ増幅ステップの除去の利点を有する。本発明は、３Ｄゲノム構成およびその調節において画期的な生物学的見識を提供する。【選択図】図１
2020523993.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
クロマチン相互作用を単分子レベルで決定する方法であって：
ａ）細胞内のゲノムＤＮＡおよびタンパク質を架橋するステップと、
ｂ）架橋したゲノムＤＮＡを断片化してクロマチン複合体を提供するステップであって、前記クロマチン複合体がＤＮＡおよび１つまたはそれよりも多くの特異的タンパク質を含有する、ステップと、
ｃ）２つまたはそれよりも多くの異なるバーコード付きリンカーを前記クロマチン複合体中の前記ＤＮＡにライゲートして、バーコード付きクロマチン複合体を形成させるステップと、
ｄ）前記バーコード付きクロマチン複合体を表面上に固定するステップと、
ｅ）ＴＩＲＦ顕微鏡を使用して前記バーコード付きクロマチン複合体を単分子レベルで画像化するステップと、
ｆ）前記バーコード付きクロマチン複合体中の前記ＤＮＡを単分子レベルで逐次シークエンシングして、複数のシークエンスリードを生成させるステップと、
ｇ）前記複数のシークエンスリードを参照ゲノムに対してマッピングして、前記シークエンスリードのゲノム位置を提示して３Ｄゲノムコネクティビティマップを生成させるステップであって、
前記コネクティビティマップが、前記クロマチン複合体中に存在する前記ゲノムＤＮＡとタンパク質との間の単分子レベルでの物理的相互作用を示す、ステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記バーコード付きクロマチン複合体を前記表面上に固定する前に、前記バーコード付きクロマチン複合体が、前記バーコード付きクロマチン複合体中の前記特異的タンパク質に結合することができる第１の抗体によって免疫沈降される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バーコード付きクロマチン複合体を画像化するステップが、前記バーコード付きクロマチン複合体を、前記バーコード付きクロマチン複合体中の前記特異的タンパク質に結合することができる第２の抗体により免疫染色することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の抗体および前記第２の抗体が、同じである、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記架橋したゲノムＤＮＡを断片化するステップが、複数のクロマチン複合体を提供し、免疫沈降が、前記第１の抗体が結合する前記タンパク質を含有するクロマチン複合体について、前記複数のクロマチン複合体を濃縮する、請求項２から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫沈降が、前記第１の抗体が結合する前記タンパク質を含有する前記クロマチン複合体について、前記複数のクロマチン複合体を、前記免疫沈降前の前記複数のクロマチン複合体と比較して少なくとも２倍濃縮する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記バーコード付きリンカーが、蛍光標識を含有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記バーコード付きリンカーが、ビオチン分子をさらに含有し、前記表面が、ストレプトアビジンコーティングした表面である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記架橋するステップが、前記クロマチン複合体を細胞内でインタクトに保つために前記細胞内で行われ、それに続いて、前記細胞を透過処理するステップが行われる、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記架橋するステップが、ホルムアルデヒド、ＥＧＳまたはこれらの両方を使用して行われる、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記架橋するステップが、０．５〜３．０％ｖ／ｖのホルムアルデヒドおよび０．５ｍＭ〜５ｍＭのＥＧＳまたはこれらの両方を使用して行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記架橋するステップが、１．０％ｖ／ｖのホルムアルデヒドおよび１．５ｍＭのＥＧＳを使用して行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記透過処理するステップが、界面活性剤を使用して行われる、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記透過処理するステップが、０．１％〜３．０％ｗ／ｖのＳＤＳを使用して行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記透過処理するステップが、０．５％ｗ／ｖのＳＤＳを使用して行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記断片化するステップが、超音波処理によって行われる、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記断片化するステップが、制限酵素消化によって行われる、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記バーコード付きクロマチン複合体が、転写因子またはクロマチン構造因子に結合することができる抗体によって免疫沈降される、請求項２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体が、ＲＮＡＰＩＩ、ＲＡＲＡ、ＥＲ、ＣＴＣＦまたはコヒーシンに結合することができる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の抗体が、Ｈ３Ｒ２ｍｅ２、ＡＦ９、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＢＲＤ４、Ｃ／ＥＢＰ、ＣＢＦｂ、ＣＢＸ２、ＣＢＸ８、ＣＨＤ１、ＣＨＤ７、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＴＣＦ、ＣＸＸＣ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｅ２Ｆ６、ＥＲＲ、ＥＴＯ、ＥＺＨ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＭ１、ＦＵＢＰ１、ＧＲ、ＧＴＦ２Ｅ２、ヒストンＨ２Ａ．Ｘ、Ｈ２Ａ．Ｚ、Ｈ２Ａ．Ｚａｃ、Ｈ２Ａ．ＺＫ４ａｃ、Ｈ２Ａ．ＺＫ７ａｃ、Ｈ２ＡＫ１１９ｕｂ、Ｈ２ＡＫ５ａｃ、Ｈ２ＢＫ１２ａｃ、Ｈ２ＢＫ１５ａｃ、Ｈ２ＢＫ２０ａｃ、Ｈ２ＢＫ１２３ｕｂ、Ｈ２Ｂｐａｎ、Ｈ３．３、Ｈ３Ｋ１４ａｃ、Ｈ３Ｋ１８ａｃ、Ｈ３Ｋ１８ｍｅ１、Ｈ３Ｋ１８ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２３ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３Ｓ２８ｐ、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ１、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ２、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３Ｔ６ｐ、Ｈ３ｋ４ｕｎ、Ｈ３Ｋ５６ａｃ、Ｈ３Ｋ５６ｍｅ１、Ｈ３Ｋ６４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ７９ａｃ、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ１、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９／１４ａｃ、Ｈ３Ｋ９ａｃ、Ｈ３Ｋ９ａｃＳ１０ｐ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ１、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋｍｅ３Ｓ１０ｐ、Ｈ３Ｋ９ｕｎ、Ｈ３ｐａｎ、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２（ａｓｙｍ）、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２（ａｓｙｍ）Ｋ１８ａｃ、Ｈ３Ｒ２ｍｅ２Ｋ４ｍｅ２、Ｈ３Ｔ６ｐＫ９ｍｅ３、Ｈ４Ｋ１２ａｃ、Ｈ４Ｋ  １６ａｃ、Ｈ４Ｋ２０ａｃ、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ２、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３、Ｈ４Ｋ５，８，１２ａｃ、Ｈ４Ｋ５ａｃ、Ｈ４Ｋ８ａｃ、Ｈ４ｐａｎ、Ｈ４Ｓ１ｐ、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＩＦ１α、ＨＰ１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ、ＪＭＪ２ａ、ＪＭＪＤ６、ＫＡＰ１、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＤＭ６Ａ、ＬＳＤ１、ＭＢＤ１、ＭＢＤ１、ＭｅＣＰ２、ＭＹＨ１１、ＮＣＯＲ１、ＮＦ−Ｅ２、ＮＦＫＢ、ＮＦＹＢ、ＮＲＦ  １、ＮＲＦ２、ＯＣＴ４、ｐ３００、ｐ５３、ＰＡＲＰ１、ＰＡＸ８、Ｐｏｌ  ＩＩ、Ｐｏｌ  ＩＩ  Ｓ２ｐ、ＰＰＡＲＧ、ＲｂＡｐ４８、ＲＢＢＰ５、ＲＦＸ−ＡＰ、ＲＮＦ２、ＳＡＰ３０、ＳＩＮ３Ａ、Ｓｋｉ３、Ｓｋｉ８、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＹＤ３、Ｓｕｚ１２、ＴＡＬ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＲＰ、ＴＦＩＩＦ、ＴＨＯＣ１、ＴＩＰ５、ＴＲＲＡＰ、Ｔｙ１、ＵＨＲＦ１、ＹＹ１、ＺＨＸ２、およびＺＭＹＭ３からなる群から選択されるＣｈＩＰ抗体である、請求項２から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記バーコード付きクロマチン複合体が、転写因子またはクロマチン構造因子に結合することができる抗体により免疫染色される、請求項３から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗体が、ＲＮＡＰＩＩ、ＲＡＲＡ、ＥＲ、ＣＴＣＦまたはコヒーシンに結合することができる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の抗体が、Ｈ３Ｒ２ｍｅ２、ＡＦ９、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＢＲＤ４、Ｃ／ＥＢＰ、ＣＢＦｂ、ＣＢＸ２、ＣＢＸ８、ＣＨＤ１、ＣＨＤ７、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＴＣＦ、ＣＸＸＣ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｅ２Ｆ６、ＥＲＲ、ＥＴＯ、ＥＺＨ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＭ１、ＦＵＢＰ１、ＧＲ、ＧＴＦ２Ｅ２、ヒストンＨ２Ａ．Ｘ、Ｈ２Ａ．Ｚ、Ｈ２Ａ．Ｚａｃ、Ｈ２Ａ．ＺＫ４ａｃ、Ｈ２Ａ．ＺＫ７ａｃ、Ｈ２ＡＫ１１９ｕｂ、Ｈ２ＡＫ５ａｃ、Ｈ２ＢＫ１２ａｃ、Ｈ２ＢＫ１５ａｃ、Ｈ２ＢＫ２０ａｃ、Ｈ２ＢＫ１２３ｕｂ、Ｈ２Ｂｐａｎ、Ｈ３．３、Ｈ３Ｋ１４ａｃ、Ｈ３Ｋ１８ａｃ、Ｈ３Ｋ１８ｍｅ１、Ｈ３Ｋ１８ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２３ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３Ｓ２８ｐ、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ１、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ２、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３Ｔ６ｐ、Ｈ３ｋ４ｕｎ、Ｈ３Ｋ５６ａｃ、Ｈ３Ｋ５６ｍｅ１、Ｈ３Ｋ６４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ７９ａｃ、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ１、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９／１４ａｃ、Ｈ３Ｋ９ａｃ、Ｈ３Ｋ９ａｃＳ１０ｐ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ１、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋｍｅ３Ｓ１０ｐ、Ｈ３Ｋ９ｕｎ、Ｈ３ｐａｎ、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２（ａｓｙｍ）、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２（ａｓｙｍ）Ｋ１８ａｃ、Ｈ３Ｒ２ｍｅ２Ｋ４ｍｅ２、Ｈ３Ｔ６ｐＫ９ｍｅ３、Ｈ４Ｋ１２ａｃ、Ｈ４Ｋ  １６ａｃ、Ｈ４Ｋ２０ａｃ、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ２、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３、Ｈ４Ｋ５，８，１２ａｃ、Ｈ４Ｋ５ａｃ、Ｈ４Ｋ８ａｃ、Ｈ４ｐａｎ、Ｈ４Ｓ１ｐ、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＩＦ１α、ＨＰ１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ、ＪＭＪ２ａ、ＪＭＪＤ６、ＫＡＰ１、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＤＭ６Ａ、ＬＳＤ１、ＭＢＤ１、ＭＢＤ１、ＭｅＣＰ２、ＭＹＨ１１、ＮＣＯＲ１、ＮＦ−Ｅ２、ＮＦＫＢ、ＮＦＹＢ、ＮＲＦ  １、ＮＲＦ２、ＯＣＴ４、ｐ３００、ｐ５３、ＰＡＲＰ１、ＰＡＸ８、Ｐｏｌ  ＩＩ、Ｐｏｌ  ＩＩ  Ｓ２ｐ、ＰＰＡＲＧ、ＲｂＡｐ４８、ＲＢＢＰ５、ＲＦＸ−ＡＰ、ＲＮＦ２、ＳＡＰ３０、ＳＩＮ３Ａ、Ｓｋｉ３、Ｓｋｉ８、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＹＤ３、Ｓｕｚ１２、ＴＡＬ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＲＰ、ＴＦＩＩＦ、ＴＨＯＣ１、ＴＩＰ５、ＴＲＲＡＰ、Ｔｙ１、ＵＨＲＦ１、ＹＹ１、ＺＨＸ２、およびＺＭＹＭ３からなる群から選択されるＣｈＩＰ抗体である、請求項３から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
クロマチンＤＮＡが、前記バーコード付きリンカーをライゲートする前に末端修復およびＡテール付加に供される、請求項１から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
２〜８つの異なるバーコード付きリンカーが、前記クロマチン複合体中の前記ゲノムＤＮＡにライゲートされる、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記バーコード付きリンカーが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記バーコード付きリンカーが、３’末端でビオチン分子に共有結合された１０〜５０個のヌクレオチドを含む鋳型鎖と、複数の座位においてウラシルを含み、５’末端で蛍光標識された非鋳型鎖とを含む、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記バーコード付きクロマチン複合体が前記表面上に固定された後に前記バーコード付きクロマチン複合体を脱架橋して、前記クロマチン複合体中の前記タンパク質を放出するステップをさらに含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
単一核内のクロマチン相互作用を決定する方法であって：
ａ）単一核を提供するステップであって、前記核はゲノムＤＮＡとタンパク質とを含むステップと、
ｂ）前記核内のゲノムＤＮＡおよびタンパク質を架橋するステップと、
ｃ）架橋したゲノムＤＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕで断片化して、複数のクロマチン複合体を提供するステップであって、各クロマチン複合体が、ゲノムＤＮＡおよび１つまたはそれよりも多くの特異的タンパク質を含有する、ステップと、
ｄ）２つまたはそれよりも多くの異なるバーコード付きリンカーを前記クロマチン複合体中の前記ＤＮＡにライゲートして、バーコード付きクロマチン複合体を形成させるステップと、
ｅ）前記単一核を表面上に固定するステップと、
ｆ）前記核内に含有される前記バーコード付きクロマチン複合体が前記表面上に分散されるように、前記単一核を溶解するステップと、
ｇ）前記バーコード付きクロマチン複合体を、前記バーコード付きクロマチン複合体中に存在する前記特異的タンパク質に結合することができる抗体により免疫染色するステップと、
ｈ）ＴＩＲＦ顕微鏡を使用して免疫染色したバーコード付きクロマチン複合体を画像化するステップと、
ｉ）前記バーコード付きクロマチン複合体を単分子レベルで逐次シークエンシングして、複数のシークエンスリードを生成させるステップと、
ｊ）前記複数のシークエンスリードを参照ゲノムに対してマッピングして、前記シークエンスリードのゲノム位置を提示して３Ｄゲノムコネクティビティマップを生成させるステップであって、前記コネクティビティマップが、前記クロマチン複合体中のゲノムＤＮＡとタンパク質との間の単分子レベルでの物理的相互作用を示す、ステップと
を含む方法。
【請求項３０】
前記架橋するステップが、ホルムアルデヒド、ＥＧＳまたはこれらの両方を使用して行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記架橋するステップが、０．５〜５．０％ｖ／ｖのホルムアルデヒド、０．５ｍＭ〜５．０ｍＭのＥＧＳまたはこれらの両方を使用して行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記架橋するステップが、１％のホルムアルデヒドおよび１．５ｍＭのＥＧＳを使用して行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記バーコード付きリンカーが、蛍光標識を含有する、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記バーコード付きリンカーが、ビオチン分子を含有し、前記表面が、ストレプトアビジンコーティングした表面である、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
核溶解ステップが、ＥｘＭを使用して行われる、請求項２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
核溶解ステップが、界面活性剤を使用して行われる、請求項２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記界面活性剤が、０．１％〜３．０％ｗ／ｖのＳＤＳである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記界面活性剤が、０．５％ｗ／ｖのＳＤＳである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記架橋したゲノムＤＮＡを断片化するステップが、制限酵素消化による、請求項２９から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記制限酵素が、ＭｂｏＩである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
クロマチンＤＮＡが、前記バーコード付きリンカーをライゲートする前に末端修復およびＡテール付加に供される、請求項２４から４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
２つまたはそれよりも多くの異なるバーコード付きリンカーが、前記クロマチン複合体中の前記ゲノムＤＮＡにライゲートされる、請求項２４から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
２〜８つの異なるバーコード付きリンカーが、前記クロマチン複合体中の前記ゲノムＤＮＡにライゲートされる、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記バーコード付きリンカーが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項２４から４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記バーコード付きリンカーが、３’末端でビオチン分子に共有結合された１０〜５０個のヌクレオチドを含む鋳型鎖と、複数の座位においてウラシルを含み、５’末端で蛍光標識された非鋳型鎖とを含む、請求項２４から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記免疫染色するステップが、前記核内の前記タンパク質のいずれか１つに対する抗体を使用して行われる、請求項２４から４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記タンパク質が、転写因子またはクロマチン構造因子である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記タンパク質が、ＲＮＡＰＩＩ、ＲＡＲＡ、ＥＲ、ＣＴＣＦまたはコヒーシンである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
バーコード付きクロマチン複合体がストレプトアビジンコーティングした基材上に固定された後に前記バーコード付きクロマチン複合体を脱架橋して、前記クロマチン複合体中の前記タンパク質を放出するステップをさらに含む、請求項２９から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記バーコード付きクロマチン複合体が、転写因子またはクロマチン構造因子に結合することができる抗体により免疫染色される、請求項２９から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記抗体が、ＲＮＡＰＩＩ、ＲＡＲＡ、ＥＲ、ＣＴＣＦまたはコヒーシンに結合することができる、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記抗体が、Ｈ３Ｒ２ｍｅ２、ＡＦ９、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＢＲＤ４、Ｃ／ＥＢＰ、ＣＢＦｂ、ＣＢＸ２、ＣＢＸ８、ＣＨＤ１、ＣＨＤ７、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＴＣＦ、ＣＸＸＣ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｅ２Ｆ６、ＥＲＲ、ＥＴＯ、ＥＺＨ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＭ１、ＦＵＢＰ１、ＧＲ、ＧＴＦ２Ｅ２、ヒストンＨ２Ａ．Ｘ、Ｈ２Ａ．Ｚ、Ｈ２Ａ．Ｚａｃ、Ｈ２Ａ．ＺＫ４ａｃ、Ｈ２Ａ．ＺＫ７ａｃ、Ｈ２ＡＫ１１９ｕｂ、Ｈ２ＡＫ５ａｃ、Ｈ２ＢＫ１２ａｃ、Ｈ２ＢＫ１５ａｃ、Ｈ２ＢＫ２０ａｃ、Ｈ２ＢＫ１２３ｕｂ、Ｈ２Ｂｐａｎ、Ｈ３．３、Ｈ３Ｋ１４ａｃ、Ｈ３Ｋ１８ａｃ、Ｈ３Ｋ１８ｍｅ１、Ｈ３Ｋ１８ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２３ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３Ｓ２８ｐ、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ１、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ２、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３Ｔ６ｐ、Ｈ３ｋ４ｕｎ、Ｈ３Ｋ５６ａｃ、Ｈ３Ｋ５６ｍｅ１、Ｈ３Ｋ６４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ７９ａｃ、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ１、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９／１４ａｃ、Ｈ３Ｋ９ａｃ、Ｈ３Ｋ９ａｃＳ１０ｐ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ１、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋｍｅ３Ｓ１０ｐ、Ｈ３Ｋ９ｕｎ、Ｈ３ｐａｎ、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２（ａｓｙｍ）、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２（ａｓｙｍ）Ｋ１８ａｃ、Ｈ３Ｒ２ｍｅ２Ｋ４ｍｅ２、Ｈ３Ｔ６ｐＫ９ｍｅ３、Ｈ４Ｋ１２ａｃ、Ｈ４Ｋ  １６ａｃ、Ｈ４Ｋ２０ａｃ、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ２、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３、Ｈ４Ｋ５，８，１２ａｃ、Ｈ４Ｋ５ａｃ、Ｈ４Ｋ８ａｃ、Ｈ４ｐａｎ、Ｈ４Ｓ１ｐ、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＩＦ１α、ＨＰ１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ、ＪＭＪ２ａ、ＪＭＪＤ６、ＫＡＰ１、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＤＭ６Ａ、ＬＳＤ１、ＭＢＤ１、ＭＢＤ１、ＭｅＣＰ２、ＭＹＨ１１、ＮＣＯＲ１、ＮＦ−Ｅ２、ＮＦＫＢ、ＮＦＹＢ、ＮＲＦ  １、ＮＲＦ２、ＯＣＴ４、ｐ３００、ｐ５３、ＰＡＲＰ１、ＰＡＸ８、Ｐｏｌ  ＩＩ、Ｐｏｌ  ＩＩ  Ｓ２ｐ、ＰＰＡＲＧ、ＲｂＡｐ４８、ＲＢＢＰ５、ＲＦＸ−ＡＰ、ＲＮＦ２、ＳＡＰ３０、ＳＩＮ３Ａ、Ｓｋｉ３、Ｓｋｉ８、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＹＤ３、Ｓｕｚ１２、ＴＡＬ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＲＰ、ＴＦＩＩＦ、ＴＨＯＣ１、ＴＩＰ５、ＴＲＲＡＰ、Ｔｙ１、ＵＨＲＦ１、ＹＹ１、ＺＨＸ２、およびＺＭＹＭ３からなる群から選択されるＣｈＩＰ抗体である、請求項２９から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記クロマチンＤＮＡが、前記バーコード付きリンカーをライゲートする前に末端修復およびＡテール付加に供される、請求項２９から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
２〜８つの異なるバーコード付きリンカーが、前記クロマチン複合体中の前記ゲノムＤＮＡにライゲートされる、請求項２９から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記バーコード付きリンカーが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択されるオリゴヌクレオチドを含む、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記バーコード付きリンカーが、３’末端でビオチン分子に共有結合された１０〜５０個のヌクレオチドを含む鋳型鎖と、複数の座位においてウラシルを含み、５’末端で蛍光標識された非鋳型鎖とを含む、請求項２９から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記バーコード付きクロマチン複合体が前記表面上に固定された後に前記バーコード付きクロマチン複合体を脱架橋して、前記クロマチン複合体中の前記タンパク質を放出するステップをさらに含む、請求項２９から５６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、全体を参照により本明細書に組み込む、２０１７年６月１６日出願の米国仮出願第６２／５２０，６６５号の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
[0001]本開示は概して、三次元（３Ｄ）ゲノム構成マッピングおよびクロマチン相互作用の分野に関する。本開示は、固相上の単分子解像および単一核解像、ならびに技術的ノイズを避ける、近接ライゲーションおよびＰＣＲ増幅ステップの除去の利点を有する。特に、本開示は、単一クロマチン複合体における、および単一核における、２つより多い座位（loci）間の相互作用を検出し得る、１組のクロマチン相互作用アッセイを提供する。本方法は、単分子タンパク質検出および市販のプラットホームＤＮＡシークエンシングに基づく。本開示のクロマチン相互作用アッセイは、３Ｄゲノム構成およびその調節において画期的な生物学的見識を提供する。
【背景技術】
【０００３】
[0002]ヒトゲノムは、転写調節を含むゲノム機能のための位相幾何学的な基礎を提供する３Ｄタンパク質媒介クロマチンループへと大規模にフォールディングされている。３Ｄゲノム構成の現在の知識は主として、数百万個の細胞からのクロマチン分子の集団レベルの研究に基づいていることから、現在の概観は、多くの個々の細胞の平均である。そのような観察により、３Ｄゲノム構成の原理が明らかになったが、それらは、ヒトゲノムが、個々のクロマチン複合体および個々の核において分子レベルでどのようにフォールディングされているかの正確な概観は提供できず、そのため重要な分子動力学および細胞間不均一性（heterogeneity）を覆い隠している。例えば、以前に報告されたペアエンドタグによるクロマチン相互作用アッセイ（ＣｈＩＡ−ＰＥＴ：ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ  ｂｙ  ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ｔａｇｇｅｄ）データは、複数の遺伝子プロモーターおよびエンハンサーが一緒になって、複雑なクロマチンループを形成し得ることを明らかにし、遺伝子共調節の位相幾何学的機構を示唆した（Ｌｉ，Ｇ．ら、Ｃｅｌｌ（２０１２）１４８（１〜２）：８４〜９８ページ、ＰＭＩＤ：２２２６５４０４；Ｔａｎｇ，Ｚ．ら、Ｃｅｌｌ（２０１５）１６３（７）：１６１１〜１６２７ページ、ＰＭＩＤ：２６６８６６５１）。しかしながら、個々の核がそのような多重のクロマチンループを含有するかどうか、それとも個々のループが核間で異なって生じ、バルク細胞分析においては集合的に結合したループ複合体として見えるのかどうかは明らかでない。これは、ＣｈＩＡ−ＰＥＴおよびクロマチン相互作用を検出するために通常使用される他の技術が基づく近接ライゲーションおよびペアエンドタグシークエンシングが、２つより多い座位に関与する接触関係ではなく、２つの座位間のペアクロマチン相互作用のみを明らかにし得るからである。
【０００４】
[0003]広範なゲノム構造の偶然性の存在および表現型的に同一の細胞間の転写不均一性についての増大する証拠は、より高次のゲノム構成および機能についての我々の解釈をさらに混乱させる。
【０００５】
[0004]実際に、単一細胞Ｈｉ−Ｃ（Ｎａｇａｎｏ，Ｔ．ら、Ｎａｔｕｒｅ（２０１３）５０２（７４６９）：５９〜６４ページ、ＰＭＩＤ：２４０６７６１０）などの単一細胞３Ｄゲノムマッピング技術の開発において活発な努力がなされている。しかしながら、単一細胞単離または個々の細胞のバーコード化に基づく現在の方法は、近接ライゲーション、ＤＮＡ増幅およびシークエンシングのためのライブラリー調製を含む、ＤＮＡ操作の従来型分子手法に頼り続けている。そのような方法は、単一細胞におけるクロマチン相互作用の真の単分子分析についての現在の技術的障壁を壊しそうにない。新しい技術が緊急に必要とされている。具体的に必要とされているのは、２つより多いクロマチン座位間の相互作用を特定することができ、単一クロマチン複合体（単分子）からのデータを提供することができ、単一核からのクロマチン複合体の単分子データであるデータを提供することができ、およびこのデータをマッピングしてゲノム間のクロマチン相互作用の概観を提供することができる、クロマチン相互作用アッセイである。
【発明の概要】
【０００６】
[0005]本開示は、２つより多いクロマチン座位間の相互作用を含む、単一クロマチン複合体におけるクロマチン相互作用を調査し、その後、単一クロマチン複合体からのデータを使用してクロマチン相互作用のゲノムワイドマップを生成させるための新規技術を提供する。本開示は、単分子クロマチン相互作用分析（ｓｍＣｈＩＡ：ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）と呼ばれるアッセイを提供し、これは、単分子タンパク質検出およびＤＮＡシークエンシングのための市販のプラットホームを簡便に利用し得る。ＳＥＱ  ＬＬは、そのようなプラットホームの一例である。
【０００７】
[0006]一態様において、本発明は、単分子クロマチン相互作用分析のための新規逐次シークエンシング法を提供する。具体的には、ｓｍＣｈＩＡは、各クロマチン複合体における単分子タンパク質検出およびタンパク質により繋がれたＤＮＡ断片の直接的逐次単分子シークエンシングのために、フローセル表面上にクロマチン材料を固定することを含む。注目すべきことに、逐次シークエンシングは、クロマチン近接ライゲーションまたはＤＮＡ増幅なしで達成される。
【０００８】
[0007]本開示は、各座位における複数のタンパク質およびＲＮＡ因子の共局在の決定のための方法を提供する。したがって、ｓｍＣｈＩＡは、クロマチン相互作用分析および３Ｄゲノム生物学の分野を一変させる可能性を有する。
【０００９】
[0008]本開示は、クロマチン相互作用を単分子レベルで決定する方法であるｓｍＣｈＩＡを提供する。ｓｍＣｈＩＡは：
ａ）細胞内のゲノムＤＮＡおよびタンパク質を架橋するステップと、
ｂ）架橋したゲノムＤＮＡを断片化してクロマチン複合体を提供するステップであって、クロマチン複合体がＤＮＡおよび１つまたはそれよりも多くの特異的タンパク質を含有する、ステップと、
ｃ）２つまたはそれよりも多くの異なるバーコード付きリンカーをクロマチン複合体中のＤＮＡにライゲートして、バーコード付きクロマチン複合体を形成させるステップと、
ｄ）バーコード付きクロマチン複合体を表面上に固定するステップと、
ｅ）ＴＩＲＦ顕微鏡を使用してバーコード付きクロマチン複合体を単分子レベルで画像化するステップと、
ｆ）バーコード付きクロマチン複合体中のＤＮＡを単分子レベルで逐次シークエンシングして、複数のシークエンスリードを生成させるステップと、
ｇ）前記複数のシークエンスリードを参照ゲノムに対してマッピングして、前記シークエンスリードのゲノム位置を提示して３Ｄゲノムコネクティビティマップ（ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｉｔｙ  ｍａｐ）を生成させるステップであって、前記コネクティビティマップが、クロマチン複合体中に存在するゲノムＤＮＡとタンパク質との間の単分子レベルでの物理的相互作用を示す、ステップと
を含む。
【００１０】
[0009]バーコード付きクロマチン複合体を表面上に固定する前に、ｓｍＣｈＩＡ分析のためにクロマチン複合体を濃縮するために、バーコード付きクロマチン複合体は、バーコード付きクロマチン複合体中の特異的タンパク質に結合することができる第１の抗体によって免疫沈降され得る。
【００１１】
[0010]画像化ステップｅ）は、バーコード付きクロマチン複合体を、バーコード付きクロマチン複合体中の特異的タンパク質に結合することができる第２の抗体により免疫染色することを含み得る。画像化ステップに続いて、ｓｍＣｈＩＡ法は、クロマチン複合体中に存在する特異的タンパク質に対する蛍光標識抗体により免疫染色することによって特異的タンパク質を逐次的に検出するステップを含み得る。また、ｓｍＣｈＩＡ法は、クロマチン複合体からタンパク質成分を除去するステップと、表面上に固定されたクロマチン複合体のＤＮＡ鋳型を保持するステップとを含み得る。
【００１２】
[0011]また、本開示は、単一核内のクロマチン相互作用を決定する方法であって：
ａ）単一核を提供するステップであって、前記核はゲノムＤＮＡとタンパク質とを含むステップと、
ｂ）核内のゲノムＤＮＡおよびタンパク質を架橋するステップと、
ｃ）架橋したゲノムＤＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕで断片化して、複数のクロマチン複合体を提供するステップであって、各クロマチン複合体が、ゲノムＤＮＡおよび１つまたはそれよりも多くの特異的タンパク質を含有する、ステップと、
ｄ）２つまたはそれよりも多くの異なるバーコード付きリンカーをクロマチン複合体中のＤＮＡにライゲートして、バーコード付きクロマチン複合体を形成させるステップと、
ｅ）前記単一核を表面上に固定するステップと、
ｆ）核内に含有されるバーコード付きクロマチン複合体が表面上に分散されるように、前記単一核を溶解するステップと、
ｇ）バーコード付きクロマチン複合体を、バーコード付きクロマチン複合体中に存在するタンパク質に結合することができる抗体により免疫染色するステップと、
ｈ）ＴＩＲＦ顕微鏡を使用して免疫染色したバーコード付きクロマチン複合体を画像化するステップと、
ｉ）２つまたはそれよりも多い抗体の逐次検出のためにｇ）およびｈ）を繰り返すステップと、
ｊ）バーコード付きクロマチン複合体を単分子レベルで逐次シークエンシングして、複数のシークエンスリードを生成させるステップと、
ｌ）複数のシークエンスリードを参照ゲノムに対してマッピングして、シークエンスリードのゲノム位置を提示して３Ｄゲノムコネクティビティマップを生成させるステップであって、前記コネクティビティマップが、クロマチン複合体中に存在するゲノムＤＮＡとタンパク質との間の単分子レベルでの物理的相互作用を示す、ステップと
を含む方法を提供する。ある特定の実施形態において、この方法のステップｇ）およびｈ）は、２つまたはそれよりも多い抗体による逐次検出のために繰り返され得る。
【００１３】
[0012]本開示の様々な目的および利点は、付属の図面および特許請求の範囲に照らして読めば、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】[0013]図１は、ｓｍＣｈＩＡ法の模式図である。[0014]図１Ａは、クロマチン複合体調製のプロセスを示す。[0015]図１Ｂは、フローセル表面上へのクロマチン複合体ローディングを示す。[0016]図１Ｃは、単分子タンパク質検出およびＤＮＡシークエンシングのための全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ：Ｔｏｔａｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）顕微鏡を使用するＳＥＱ  ＬＬプラットホームを説明する。[0017]図１Ｄは、逐次プライマーシークエンシングのために、各クロマチン複合体において繋げられていた、様々なバーコード付きリンカーとライゲートされたＤＮＡ断片が、直径約４００ｎｍ（ＴＩＲＦの光学解像限界）の分散したスポット中にクラスター化されることを説明する。
【図２】[0018]図２は、ｓｍＣｈＩＡの目的のためのクロマチン複合体を得るために必要なステップを例示する。
【図３】[0019]図３は、フローセルへのクロマチン複合体ローディング、および個々のクロマチン複合体の逐次シークエンシングに必要な重要なステップを示す。
【図４】[0020]図４Ａは、単分子シークエンシングによる２つの試験のｓｍＣｈＩＰ実験からのｓｍＣｈＩＰシークエンシングのリード長分布を示す。両方のデータセットについて、ピークリード長は、２８〜２９ｂｐである。[0021]図４Ｂは、ｓｍＣｈＩＰリードのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ参照ゲノム（ｄｍ３）に対するマッピングを示す。ゲノム領域の例を示す。上部の２つのパネルは、２つのｓｍＣｈＩＰ実験からのｓｍＣｈＩＰリードのマッピング整列であり、ＣｈＩＡ−ＰＥＴ（下部の２つのパネル）により特定されるクロマチン相互作用に関与するＲＮＡＰＩＩ結合ピークを示す。
【図５】[0022]図５Ａは、ＳＥＱ  ＬＬ器具からのｓｍＣｈＩＡシークエンシングのスナップショット画像を示す。各スポットは、シークエンシング進行中に蛍光シグナルが各ヌクレオチド付加についてキャプチャーされた、フローセル上の光学点を示す。各スポットは、異なるプライマーにより逐次シークエンシングされる複数のＤＮＡ断片を含有する場合があり、各プライマーは、異なるバーコード付きリンカーに相補的である。[0023]図５Ｂは、２つのプライマーによる逐次シークエンシングランの蛍光シグナルプロットを示す。特定のリンカーのヌクレオチドインデックスを示す。[0024]図５Ｃは、特定のｓｍＣｈＩＡシークエンシングリードの例、それらのヌクレオチド組成、参照ゲノムにおけるそれらのマッピング整列および対応するＣｈＩＡ−ＰＥＴデータを示す。
【図６】[0025]図６は、ｓｍＣｈＩＡ法において使用されるバーコード付きビオチニル化リンカーおよびシークエンシングプライマーを説明する。各リンカーの６ｂｐランダムバーコード付き領域は、ビオチニル化ＤＮＡオリゴヌクレオチドの５’末端に存在する。リンカーライゲーションを促進する、クロマチン複合体のゲノムＤＮＡに含有される「Ａテール」に相補的な「Ｔ」ヌクレオチドオーバーハングは、太字で強調される。各バーコード付きリンカーについての各々のシークエンシングプライマーは、ビオチニル化リンカーの上に示される。末端３’連結ビオチンは、「／３Ｂｉｏ」として示され、任意選択の末端連結ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６４７フルオロフォアは、「／ｉＴｈｉｏＭＣ６Ｄ／／ＮＡｌｅｘａ６４７−５」として示される。オリゴヌクレオチドは、ウラシルヌクレオチド（Ｕ）を含有するように設計され、これにより特異的ＵＳＥＲ消化が可能になる。オリゴヌクレオチドは、オリゴの非鋳型鎖の５ヌクレオチド毎にＵ塩基を含有するように設計される。この設計は、非鋳型鎖の部分の明確な除去を可能にし、プライマーアニーリングを促進し、逐次シークエンシングを可能にする。バーコード付きリンカーは、特許請求の範囲において配列番号によって参照される。ｓｍＣｈＩＡリンカー１は、配列番号１である；ｓｍＣｈＩＡリンカー２は、配列番号２である；ｓｍＣｈＩＡリンカー３は、配列番号３である；ｓｍＣｈＩＡリンカー４は、配列番号４である；ｓｍＣｈＩＡリンカー５は、配列番号５である；ｓｍＣｈＩＡリンカー６は、配列番号６である；ｓｍＣｈＩＡリンカー７は、配列番号７である；ｓｍＣｈＩＡリンカー８は、配列番号８である。
【図７】[0026]ｓｍＣｈＩＡ法のブロック図を示す。
【図８】[0027]ｓｍＣｈＩＡを単一核に適用するために必要なステップを示す。簡潔に説明すると、細胞を架橋し、それらの細胞膜を除去した。核はインタクトなままであり、制限酵素消化、末端修復、Ａテール付加およびリンカーライゲーションをｉｎ  ｓｉｔｕで行うことを可能にするために核膜を透過処理した。その後、インタクトな核をストレプトアビジンコーティングしたフローセル上に分散させ、ハイブリダイズさせ、フローセル表面上のそれらの別個の２次元位置を記録した。その後、核をスライド上で溶解し、クロマチン複合体を、別々の複合体として観察するのに十分に離れている（＞４００ｎｍ）一方でフローセル上の核の元の位置に比較的近いままで分散させた。重要なことに、特定の核由来のクロマチン複合体は、互いに緊密に集まったままであり、１つの核からの内容物を別の核の内容物から区別することを可能にした。
【図９】[0028]図９は、単一核に適用したｓｍＣｈＩＡ（単一核ｓｍＣｈＩＡ）の画像の例を提供する。[0029]図９Ａは、インタクトな核内で行われた、ｉｎ  ｓｉｔｕでの成功したリンカーライゲーションを示し、ＡＬＥＸＡ  ６４７フルオロフォア標識ビオチニル化リンカーは、制限酵素消化、末端修復およびＡテール付加ステップが行われた後にゲノムワイドに適用された。[0030]図９Ｂは、ＡＬＥＸＡ  ６４７フルオロフォアおよびビオチニル化リンカーで標識したクロマチン複合体を、ストレプトアビジンコーティングしたフローセル上で解像し、互いに区別したことを示す。[0031]図９Ｃは、ＡＬＥＸＡ  ６４７フルオロフォア標識ビオチニル化リンカーおよびＲＮＡＰＩＩ（または抗体染色によって特定される任意の他の目的の転写因子）を含有するクロマチン複合体を、ＴＩＲＦ顕微鏡によって特定し、ユニークな単一核から区別したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
[0032]本開示は、付属の図面と合わせて、以下の実施形態の説明からより良く理解され得る。説明される実施形態は、単に例示であり、限定ではないことが当業者に明らかであるべきである。
【００１６】
定義
[0033]以下の用語は、明細書および特許請求の範囲において使用される。
[0034]用語「約」は、およその数値を示すために使用される。値の近似のレベルは、関連分野における当業者に容易に明らかである。
【００１７】
[0035]「Ａテール付加」は、二本鎖核酸分子の３’平滑末端に鋳型によらないヌクレオチドを付加するために使用される酵素ベースの方法である。
[0036]「バーコード付きリンカー」は、クロマチン複合体中に含有されるクロマチンＤＮＡの遊離末端にライゲートされた短い（例えば、１０〜５０ｂｐ）ＤＮＡ配列である。バーコード付きリンカーは、６〜１６個のヌクレオチドの「バーコード」を含有する。バーコードは、単一のクロマチン複合体中の複数のゲノムＤＮＡ配列の効率的な特定のための分類用タグとして機能する。バーコード付きリンカーの残りの部分は、バーコードと蛍光標識またはビオチンなどの基質リガンドとをつなぎ得るリンカーＤＮＡである。
【００１８】
[0037]「ＣｈＩＡ−ＰＥＴ」は、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ：ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）−ベースの濃縮、クロマチンの近接ライゲーション、ＰＣＲ増幅、ハイスループットシークエンシングおよび参照ゲノムマッピングを組み込んで長距離クロマチン相互作用をゲノムワイドに決定するクロマチンキャプチャー技術である。
【００１９】
[0038]「クロマチン」は、細胞内に見られるゲノムＤＮＡおよびタンパク質のネイティブ複合体である。クロマチンは、ＲＮＡも含有し得る。
[0039]「クロマチン複合体」とは、ＤＮＡ、タンパク質および任意選択でＲＮＡを含有する、クロマチンの機能単位を指す。ある特定のクロマチン複合体は、遺伝子調節上の意義を有する。
【００２０】
[0040]「クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）」は、特定のタンパク質がｉｎ  ｖｉｖｏで特定のＤＮＡ配列に結合するかどうか、または特定のＤＮＡ配列に局在するかどうかを決定するために使用される、クロマチンの架橋を含む手技である。
【００２１】
[0041]「架橋」は、１つのポリマーの別のポリマーへの化学結合である；この場合において、架橋は、追加のステップ中にクロマチン複合体の構造を維持するために、クロマチン複合体内のＤＮＡを化学結合するために使用される。
【００２２】
[0042]本開示の文脈における「クロマチンローディング」とは、クロマチン複合体をフローセルに付加する行為である。フローセルは、クロマチン中に含有されるビオチン分子を介したクロマチンとストレプトアビジンとのハイブリダイゼーションのために、ストレプトアビジンでコーティングしてもよい。
【００２３】
[0043]「Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞」は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ胚後期の初代培養物に由来するＳｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２細胞である。
[0044]「ＤＰＢＳ」は、２５℃でｐＨ７．２〜７．６を有し、塩化カリウム、第１リン酸カリウム、塩化ナトリウム、第２リン酸ナトリウムおよび任意選択で、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムを含有する緩衝液である、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水である。
【００２４】
[0045]「ＥＧＳ」は、１２原子スペーサーアームの周りにアミン反応性ＮＨＳ−エステル末端を含有する架橋試薬である、（エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート））である。
【００２５】
[0046]「フルオロフォア」は、光励起に際して特異的に光を再放射する単一蛍光分子である。
[0047]「フローセル」は、ＤＮＡシークエンシングの目的のために使用される、複数のチャネルを有する特別な顕微鏡スライドである。
【００２６】
[0048]「ホルムアルデヒド」（「ＦＡ」）は、式ＣＨ２Ｏを有する化学物質である。それは、クロマチン構造を維持するために、クロマチン複合体内のＤＮＡをタンパク質に、またはＤＮＡをＤＮＡに架橋するための化学架橋試薬として使用され得る。
【００２７】
[0049]「ゲノム」は、遺伝子および非コード調節領域を含む、生物内のＤＮＡの全集合物である。
[0050]「ゲノムＤＮＡ」は、生物のクロマチン内の内因性ＤＮＡである。
【００２８】
[0051]「ＧＭ１２８７８」は、ヒトリンパ芽球様細胞株である。
[0052]「Ｈｉ−Ｃ」は、全対全クロマチンコンフォメーションキャプチャー法である。Ｈｉ−Ｃ法は、ゲノム内で相互作用するすべてのゲノム座位を検出するためにＰＣＲ増幅に頼る。
【００２９】
[0053]「クレノウ断片（３’→５’エキソ−）」は、クロマチン複合体中のＤＮＡの遊離平滑末端のＡテール付加に使用される、ＤＮＡポリメラーゼＩのＮ末端切断型である。
[0054]「ＬｉＣｌ」は、塩化リチウムである。
【００３０】
[0055]本開示の文脈における「リンカー」は、１つの末端をクロマチンＤＮＡに結合することができる短い二本鎖核酸分子である。リンカーは、ゲノムＤＮＡにおいて生成された「Ａ」オーバーハングの基質として働く「Ｔ」オーバーハングヌクレオチドを有し得る。適用の目的のために、リンカーは、その３’末端上に共有結合されたリガンド、例として、ビオチン、およびその５’末端上に共有結合されたフルオロフォア、例として、ＡＬＥＸＡ  ６４７フルオロフォアを含有する。ビオチンは、ストレプトアビジンコーティングしたフローセルへの結合を促進する。最後に、ＡＬＥＸＡ  ６４７フルオロフォアは、クロマチン複合体の存在を明らかにする。
【００３１】
[0056]「ＭＥＳ」は、２５℃で６．１０のｐＫａを有する６〜８のｐＨ範囲内の緩衝液である、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸である。
[0057]「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ポリヌクレオチド（約３０核酸塩基）である。
【００３２】
[0058]「ＰＡＧＥ」は、生体高分子、通常、タンパク質または核酸をそれらの電気泳動移動度により分離するために使用される方法である、ポリアクリルアミドゲル電気泳動である。
【００３３】
[0059]「ＰＢＳ」は、生理的条件をシミュレートするために生物学的研究において使用される緩衝溶液である、リン酸緩衝生理食塩水である。
[0060]「ＰＩ」とは、プロテアーゼ（タンパク質を消化する酵素）の機能を阻害する分子である、プロテアーゼ阻害剤を指す。
【００３４】
[0061]「ＲＮＡＰＩＩ」は、ｍＲＮＡ前駆体を合成するＤＮＡの転写を触媒するために生存真核細胞においてタンパク質をコードする遺伝子のプロモーターにリクルートされるＲＮＡポリメラーゼＩＩホロ酵素である。
【００３５】
[0062]「ＳＥＱ  ＬＬ」は、真の単分子シークエンシング（ｔＳＭＳ：ｔｒｕｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）と呼ばれる単分子シークエンシングを行うシークエンシングプラットホームである。ＳＥＱ  ＬＬ（Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）プラットホームの特色として、ストレプトアビジンコーティングしたフローセルおよびＴＩＲＦベースの画像化が挙げられる。
【００３６】
[0063]「逐次シークエンシング」とは、同じフローセル上で逐次的に起こる多ラウンドのシークエンシングを指す。特に、ユニークなＤＮＡ配列、例として、バーコード付きリンカーを最初に、クロマチンＤＮＡ上にライゲートする。バーコード付きリンカーに相補的なシークエンシングプライマーを、一度に１つフローセルに添加し、それによって、同じフローセル上でクロマチン複合体からの多ラウンドのＤＮＡシークエンシングが行われることを可能にする。
【００３７】
[0064]「シークエンシングプライマー」は、逐次シークエンシング反応において使用される一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーである。シークエンシングプライマーは、バーコード付きリンカー中に存在する鋳型鎖配列に相補的であり、シークエンシング反応を刺激する。
【００３８】
[0065]「Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ」は、二本鎖核酸の並置した５’リン酸と３’ヒドロキシル末端との間のホスホジエステル結合の形成を触媒する酵素である。
[0066]「Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ」は、５’から３’の方向のＤＮＡ合成を触媒し、鋳型およびプライマーの存在を必要とする酵素である。「ＴＢＳＴ」は、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ  ２０、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するトリス緩衝生理食塩水である。例えば、ＴＢＳＴは、０．０５Ｍトリス、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％ＴＷＥＥＮ  ２０を含有し、２５℃でｐＨ７．６であり得る。
【００３９】
[0067]「ＴＣＥＰ」は、還元剤である、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンである。
[0068]「ＴＥ」は、トリスおよびＥＤＴＡを含有する緩衝液である。
【００４０】
[0069]「ＴＩＲＦ」とは、全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡を指す。ＴＩＲＦは、蛍光標識した分子、例として、タンパク質または核酸の単分子検出を可能にする。
[0070]「ＴＮＥ」は、トリス−ＨＣｌ、ＮａＣｌおよびＥＤＴＡを含有する緩衝液である。
【００４１】
[0071]「ＵＳＥＲ」は、ウラシルの位置に単一ヌクレオチドギャップを生成させる、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ：Ｕｒａｃｉｌ  ＤＮＡ  ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）とＤＮＡグリコシラーゼ−リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩとの混合物である、ウラシル特異的切除試薬である。ＵＳＥＲは特に、ビオチニル化リンカーの非鋳型鎖に見られるウラシルヌクレオチドを除去し、そのようにしてＤＮＡリンカーの一本鎖領域を生成させ、シークエンシングプライマーが結合することを可能にする。
【００４２】
[0072]本開示は、機能的に重要な３Ｄ  ＤＮＡ空間的近接を明らかにするための単分子ＤＮＡシークエンシングの新規適用を提供する。
アッセイの説明
（Ｉ）単分子クロマチン相互作用アッセイ（ｓｍＣｈＩＡ）法
[0073]一態様において、本開示は、単一クロマチン分子における座位間の接触相互作用を決定するための方法である、ｓｍＣｈＩＡを提供する。
【００４３】
[0074]ｓｍＣｈＩＡ法は、クロマチン複合体中のＤＮＡ座位間の相互作用をアッセイするための以前の方法に優るいくつかの利点を有する。ｓｍＣｈＩＡは、２つより多いクロマチン座位間のクロマチン相互作用を決定し、単一クロマチン複合体（単分子）からのデータを提供し、このデータをマッピングしてゲノムにわたるクロマチン相互作用の概観を提供することができる。ｓｍＣｈＩＡ法は、近接ライゲーションまたはＤＮＡ増幅を伴わずに、これを達成することができる。ｓｍＣｈＩＡ法の延長である、単一核ｓｍＣｈＩＡは、単一核からの単一クロマチン複合体内の相互作用についてのデータを提供することができる。現在のｓｍＣｈＩＡ法において、何千ものクロマチン複合体（各々はＤＮＡおよびタンパク質の複数の分子から構成される）は、ホルムアルデヒド（ＦＡ）およびエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（ＥＧＳ）などの架橋剤を使用して二重架橋することによって生成する。その後、クロマチン複合体は、超音波処理または制限酵素ベースの断片化によって生成する。断片化されたクロマチン複合体は、例えば、約３ｋｂ〜８ｋｂのＤＮＡを含有する。その後、クロマチン複合体は、ＣｈＩＰによって目的のタンパク質を含有する複合体について濃縮される。その後、複合体内のＤＮＡの遊離末端が、バーコード付きリンカーへのライゲートのために調製される。例えば、ＤＮＡの遊離末端は、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して平滑末端化され、クレノウ断片（３’−５’エキソ−）を使用してＡテール付加され、露出された末端上でバーコード付きリンカーとライゲートされ得る。バーコード付きリンカーは、それらの末端の各鎖上にビオチン分子を含有するユニークなＤＮＡ断片である。また、二本鎖バーコード付きリンカーの１つのＤＮＡ鎖は、共有結合した蛍光標識を含有し得る。その後、クロマチン複合体は、ＤＮＡバーコード付きリンカーを含有するビオチンを特異的に結合するストレプトアビジンコーティングした表面（例えば、フローセル）にハイブリダイズする。最後に、複合体は、ＴＩＲＦ顕微鏡ベースのシークエンシングによって解像され、（例えば、ＳＥＱ  ＬＬプラットホーム上で）蛍光抗体免疫染色を使用してタンパク質画像化が行われる。その後、各複合体から得られたゲノムＤＮＡシークエンスリードおよび固定された物理的位置を、参照ゲノムに対してマッピングし戻して、ゲノム内のＤＮＡ座位間の相互作用を決定し、どのクロマチンタンパク質がこれらの相互作用に関与するかを決定し得る。
【００４４】
[0075]ｓｍＣｈＩＡ法は、両方とも集団ベースの技術であるＣｈＩＡ−ＰＥＴおよびＨｉ−Ｃなどの、現存の３Ｄゲノムマッピング技術に優る、いくつかの重要な利点を有する。ＣｈＩＡ−ＰＥＴ（ＣｈｉＡ−ＰＥＴ）およびＨｉ−Ｃは、シグナルを生じるのに十分な頻度で起こる相互作用を検出する。ｓｍＣｈＩＡは、単分子タンパク質検出およびＤＮＡシークエンシングプラットホームに基づき、単分子解像を提供する。検出は、統計的に偏らない；より一般的でない相互作用が、頻繁な相互作用と同程度に容易に検出される。別の実施形態において、また、ｓｍＣｈＩＡプラットホームは、個々のヌクレオソームのヒストン修飾とゲノム位置との同時検出を可能にする。ヒストン修飾は、特異的ヒストン修飾エピトープに対する蛍光標識抗体の使用により検出することができる。
【００４５】
[0076]ＣｈＩＡ−ＰＥＴおよびＨｉ−Ｃとは異なり、ｓｍＣｈＩＡは、クロマチンＤＮＡ断片間の対での相互作用が検出されるようにクロマチン複合体中のＤＮＡの２つの遊離末端が、ＤＮＡシークエンシングプライマーの各末端にライゲートされる技術である、近接ライゲーションを使用しない。ｓｍＣｈＩＡにおいて、クロマチン複合体は、フローセル表面上に固定される。複合体は、例えば、転写因子特異的抗体またはヒストンタンパク質特異的抗体による、免疫染色によって可視化される。クロマチン複合体中のＤＮＡの遊離末端にライゲートされたバーコード付きリンカーは、プライマー結合部位として使用される。シークエンシングの各ラウンドについて異なるプライマーを使用する単分子シークエンシングは、フローセル表面上の同じ光学スポットに由来する逐次リードを生成するように行われる。これらのシークエンシングリードから検出された配列は、クロマチン相互作用に関与するゲノム座位を表す。
【００４６】
[0077]また、ｓｍＣｈＩＡ法は、ＰＣＲ増幅を避けるという利点を有する。代わりに、個々のクロマチン複合体が分析される。ｓｍＣｈＩＡ法は、各クロマチン複合体中の複数のタンパク質を連続的に検出し得る。本方法は、クロマチン複合体においてタンパク質によって繋げられたＤＮＡ断片の逐次ラウンドの単分子シークエンシングを含む。
【００４７】
[0078]ｓｍＣｈＩＡ技術は、ゲノムワイドな単分子クロマチン相互作用マップを創出するために使用され、また、各座位における複数のタンパク質およびＲＮＡ因子の共局在を決定することができる。
【００４８】
[0079]本開示は、ｓｍＣｈＩＡ分析における使用のためにバルク細胞からクロマチン試料を調製するための方法を提供する。
[0080]ｓｍＣｈＩＡは、インタクトなクロマチン相互作用複合体が検出されることを可能にし、接触するＤＮＡ断片の単分子解像を可能にする。本方法は、３Ｄ核空間において互いに物理的に関連付けられる２つまたはそれよりも多いＤＮＡ配列の同時検出、および複合体のタンパク質成分の検出を可能にする。
【００４９】
[0081]ｓｍＣｈＩＡは、４つの主要なステップにおいて単一クロマチン複合体内の複数の相互作用の検出を達成する。
[0082]第１に、クロマチンをインタクトに保つために細胞を架橋し、ｉｎ  ｓｉｔｕ消化を可能にするために核を透過処理する。あるいは、クロマチンは、超音波処理を使用して調製することができる。
【００５０】
[0083]第２に、クロマチン複合体を生成させるために、制限酵素消化を使用する。バーコード付きリンカーのライゲーションを可能にするために、平滑末端化およびＡテール付加を行う。
【００５１】
[0084]第３に、ビオチニル化した蛍光標識バーコード付きリンカーを、ゲノムワイドにライゲートする。
[0085]第４に、クロマチン複合体を表面、例として、ストレプトアビジンコーティングした表面に結合し、ＴＩＲＦ顕微鏡（例えば、ＳＥＱ  ＬＬプラットホーム）を使用して画像化およびシークエンシングする。クロマチン複合体は、ＴＩＲＦ顕微鏡による解像を可能にするのに十分に表面上に分散される。ある特定の実施形態において、クロマチン複合体は、解像を可能にするために少なくとも４００ｎｍであるべきである。
【００５２】
[0086]発明の概要の節において示されるｓｍＣｈＩＡのためのステップに加えて、本開示は、以下の特徴を有するｓｍＣｈＩＡを提供する。
[0087]本開示は、免疫沈降に使用される第１の抗体、および免疫染色に使用される第２の抗体が、同じか、または異なるｓｍＣｈＩＡを提供する。ある特定の実施形態において、第１および第２の抗体は同じである。
【００５３】
[0088]ｓｍＣｈＩＡにおける架橋したゲノムＤＮＡを断片化するステップは、複数のクロマチン複合体を提供し得る。免疫沈降は、第１の抗体が結合するタンパク質を含有するクロマチン複合体について、複数のクロマチン複合体を濃縮する。第１の抗体が結合するタンパク質を含有するクロマチン複合体についての濃縮は、免疫沈降前の複数のクロマチン複合体と比較して、少なくとも２倍、４倍、１０倍、２０倍であり得る。
【００５４】
[0089]ある特定の実施形態において、バーコード付きリンカーは、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ標識またはＴＩＲＦ顕微鏡による使用に好適な励起発光波長を有する任意の蛍光標識などの、蛍光標識を含有し得る。ある特定の実施形態において、バーコード付きリンカーは、ビオチン分子に結合され、クロマチン複合体が固定される表面は、ストレプトアビジンコーティングした表面である。クロマチンＤＮＡは、バーコード付きリンカーとライゲートする前に末端修復およびＡテール付加に供してもよい。一部の実施形態において、少なくとも２つ、少なくとも４つまたは２〜８つの異なるバーコード付きリンカーが、クロマチン複合体中のゲノムＤＮＡにライゲートされる。バーコード付きリンカーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８から選択されるバーコード付きオリゴヌクレオチドを含み得る。ある特定の実施形態において、バーコード付きリンカーは、ビオチン分子に３’末端で共有結合した１０〜１００、１０〜７０または１０〜５０個のヌクレオチドを含む鋳型ＤＮＡ鎖、および複数の座位においてウラシルを含み、５’末端で蛍光標識された非鋳型鎖を含む。バーコードそれ自体は、６〜１６ｎｔ、６〜１２ｎｔまたは約８〜１２ｎｔの短いユニークな配列である。
【００５５】
[0090]ｓｍＣｈＩＡは、バーコード付きクロマチン複合体が表面上に固定された後にバーコード付きクロマチン複合体を脱架橋して、クロマチン複合体中のタンパク質を放出するさらなるステップを含み得る。
【００５６】
[0091]架橋するステップは、クロマチン複合体を細胞内でインタクトに保つために細胞内で行ってもよく、それに続いて、細胞を透過処理するステップを行ってもよい。架橋するステップは、化学架橋またはＵＶ架橋であり得る。化学架橋は、ホルムアルデヒド、メタノールまたはＥＧＳ、あるいは同様のものなどの、好適な化学架橋剤を使用して行われ得る。ある特定の実施形態において、ホルムアルデヒド（０．５〜３．０％ｖ／ｖまたは１．０％ｖ／ｖ）およびＥＧＳ（０．５ｍＭ〜５．０ｍＭまたは１．５ｍＭ）の組合せが、架橋のために使用される。
【００５７】
[0092]細胞を透過処理するステップは、機械的に、例えば、超音波処理によって、もしくは化学膜破壊剤、例として、界面活性剤、例えば、ＴＲＩＴＯＮ、ＴＷＥＥＮ、ＮＰ４０、ＳＤＳなどを使用することによって行ってもよく、または特定の場合において、ＳＤＳ、例えば、０．１％〜３．０％ｗ／ｖのＳＤＳもしくは１．０％のＳＤＳを使用してもよい。
【００５８】
[0093]断片化するステップは、ＭｂｏＩ制限酵素消化などの制限酵素消化によって行われ得る。
別の実施形態において、本開示は、以下の：
ａ）細胞内のゲノムＤＮＡおよびタンパク質を架橋するステップと、
ｂ）架橋したゲノムＤＮＡを断片化してクロマチン複合体を提供するステップであって、クロマチン複合体がＤＮＡおよび１つまたはそれよりも多くの特異的タンパク質を含有する、ステップと、
ｃ）２つまたはそれよりも多くの異なるバーコード付きリンカーをクロマチン複合体中のＤＮＡにライゲートして、バーコード付きクロマチン複合体を形成させるステップと、
ｄ）バーコード付きクロマチン複合体を表面上に固定するステップと、
ｅ）ＴＩＲＦ顕微鏡を使用してバーコード付きクロマチン複合体を単分子レベルで画像化するステップと、
ｆ）バーコード付きクロマチン複合体中に存在する特異的タンパク質に対する蛍光標識抗体により免疫染色することによってタンパク質を逐次的に検出するステップと、
ｇ）クロマチン複合体からタンパク質を除去し、表面上に固定されたバーコード付きクロマチン複合体のＤＮＡ鋳型を保持するステップと、
ｈ）バーコード付きクロマチン複合体中のＤＮＡを単分子レベルで逐次シークエンシングして、複数のシークエンスリードを生成させるステップと、
ｉ）前記複数のシークエンスリードを参照ゲノムに対してマッピングして、前記シークエンスリードのゲノム位置を提示して３Ｄゲノムコネクティビティマップを生成させるステップであって、前記コネクティビティマップが、クロマチン複合体中に存在するゲノムＤＮＡとタンパク質との間の単分子レベルでの物理的相互作用を示す、ステップと
を含むｓｍＣｈＩＡを提供する。
【００５９】
（ＩＩ）単一核単分子クロマチン相互作用アッセイ（単一核ｓｍＣｈＩＡ）
[0094]別の態様において、本開示は、単一核ｓｍＣｈＩＡを提供する。ｓｍＣｈＩＡ分析のための固体表面上の単一核からクロマチン試料を調製するための方法が、開示される。単一核ｓｍＣｈＩＡは、バルク細胞試料のために開発されたｓｍＣｈＩＡプロトコールの延長であるが、解像および分析は、単一核レベルで行われる。
【００６０】
[0095]単一核ｓｍＣｈＩＡにおいて、精製した核を、制限酵素によるｉｎ  ｓｉｔｕクロマチン消化に供し、続いて、バーコード付きリンカーとライゲートする。各バーコード付きリンカーを、ビオチン標識し、また、蛍光マーカーにより標識する。核が緩衝溶液、例えば、ＰＢＳ溶液の層中で表面上に低密度で位置付けられるように、核を希釈して、表面、例として、ストレプトアビジンコーティングした表面（例えば、フローセル）上にロードする。その後、核を、穏やかな溶解条件、例として、１５分間の０．５％ＳＤＳ下で、ストレプトアビジンコーティングした表面上にて透過処理する。核は、任意の好適な界面活性剤、例として、ＳＤＳ、ＴＲＩＴＯＮ、例として、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、ジギトニン、サポニンもしくはＴＷＥＥＮ、例として、ＴＷＥＥＮ−２０もしくはＮＰ４０によって、または酵素、例として、プロテイナーゼＫおよびストレプトリジンＯなどの使用により透過処理され得る。ビオチン標識したクロマチン複合体は、透過処理した核から放出され、放射状に分散され、ガラス表面上の規定の微小領域内に固定される。その効果は、ｓｍＣｈＩＡのために十分にクロマチン複合体を分離するが、それらが同じ核に由来したことが容易に特定され得るように、小領域内に各核からの複合体を付着させることである。次に、フローセル表面上に固定したクロマチン複合体を、上記に説明する（図４Ａ）ｓｍＣｈＩＡに供する。ｓｍＣｈＩＡ法の単一核への適用について２つの重要な問題がある。第１に、ビオチン標識したバーコード付きリンカーは、ｉｎ  ｓｉｔｕで断片化クロマチンＤＮＡとライゲートする必要がある。第２に、単一核は、個々の核を区別するためにそれらの起源に十分に近く保たれている一方で、ｓｍＣｈＩＡシークエンシングのために十分に分散されなければならない。
【００６１】
[0096]発明の概要の節において示される単一核ｓｍＣｈＩＡのためのステップに加えて、また、本開示は、以下の特徴を有する単一核ｓｍＣｈＩＡを提供する。ある特定の実施形態において、架橋するステップは、ｓｍＣｈＩＡについて上記に説明する手段のいずれかによって行われ得る。ある特定の実施形態において、バーコード付きリンカーは、ｓｍＣｈＩＡに使用されるバーコード付きリンカーについて上記に説明する限定のいずれかを有し得る。また、クロマチン複合体を生成するためにクロマチンＤＮＡを断片化するステップは、ｓｍＣｈＩＡについて説明される方法のいずれかによって行われ得る。ｓｍＣｈＩＡと同様に、単一核ｓｍＣｈＩＡは、免疫染色するステップを含み得る。免疫染色するステップにおいて使用される抗体は、ｓｍＣｈＩＡのための免疫染色について説明される抗体のいずれかであり得る。ｓｍＣｈＩＡと同様に、単一核ｓｍＣｈＩＡにおけるクロマチン複合体は、ストレプトアビジンコーティングした表面上に固定され得る。
【００６２】
[0097]核を溶解するステップは、界面活性剤、例として、ＴＷＥＥＮ、ＴＲＩＴＯＮ、ＮＰ４０、ＳＤＳなどを使用して行ってもよく、またはある特定の場合において、ＳＤＳ、例えば、０．１％〜３．０％ｗ／ｖのＳＤＳもしくは０．５％ｗ／ｖのＳＤＳを、もしくは以下に説明するＥｘＭによって、使用してもよい。
【００６３】
[0098]別の実施形態において、本開示は、以下の：
ａ）単一核を提供するステップであって、前記核はゲノムＤＮＡとタンパク質とを含むステップと、
ｂ）核内のゲノムＤＮＡおよびタンパク質を架橋するステップと、
ｃ）架橋したゲノムＤＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕで断片化して、複数のクロマチン複合体を提供するステップであって、各クロマチン複合体が、ゲノムＤＮＡおよび１つまたはそれよりも多くの特異的タンパク質を含有する、ステップと、
ｄ）２つまたはそれよりも多くの異なるバーコード付きリンカーをクロマチン複合体中のＤＮＡにライゲートして、バーコード付きクロマチン複合体を形成させるステップと、
ｅ）前記単一核を表面上に固定するステップと、
ｆ）核内に含有されるバーコード付きクロマチン複合体が表面上に分散されるように、前記単一核を溶解するステップと、
ｇ）バーコード付きクロマチン複合体を、バーコード付きクロマチン複合体中に存在する特異的タンパク質に結合することができる抗体により免疫染色するステップと、
ｈ）ＴＩＲＦ顕微鏡を使用して免疫染色したバーコード付きクロマチン複合体を画像化するステップと、
ｉ）２つまたはそれよりも多い抗体の逐次検出のためにステップｇ）およびｈ）を繰り返すステップと、
ｊ）バーコード付きクロマチン複合体を単分子レベルで逐次シークエンシングして、複数のシークエンスリードを生成させるステップと、
ｌ）複数のシークエンスリードを参照ゲノムに対してマッピングして、シークエンスリードのゲノム位置を提示して３Ｄゲノムコネクティビティマップを生成させるステップであって、前記コネクティビティマップが、クロマチン複合体中のゲノムＤＮＡとタンパク質との間の単分子レベルでの物理的相互作用を示す、ステップと
を含む単一核ｓｍＣｈＩＡを提供する。
【００６４】
単一核（ＳＮ）／単一細胞（ＳＣ）に適用されるｓｍＣｈＩＡの代替法
[0099]また別の態様において、本開示は、各クロマチン複合体単位を分離するが、それでも核の境界を保持するために互いに十分に緊密に核からクロマチン複合体を局在化させるのに十分に、クロマチン複合体をフローセル表面上に確実に分散させる手段を提供することによる、単一核クロマチン調製の代替法を提供する。この方法は、膨張顕微鏡法（ＥｘＭ：ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｃｏｐｙ）を使用して、核を溶解する（Ｃｈｅｎ，Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１５）３４７（６２２１）：５４３〜５４８ページ；ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２６００８８）。ＥｘＭは、細胞内のタンパク質およびヌクレオチドを含む細胞物質を固定するために膨張可能な（膨潤可能な）高分子電解質ゲルマトリックスを使用し、続いて、細胞−ゲル混成物が浸透膨潤する。ＥｘＭは、元の細胞構造を保存する。それは、従来型顕微鏡を使用して超解像度でタンパク質およびＲＮＡを検出するために組織スライスおよび単一細胞に適用されてきた（Ｃｈｅｎ，Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１６）１３：６７９〜６８４ページ；ＤＯＩ：１０．１０３８／ＮＭＥＴＨ．３８９９）。反復型膨張顕微鏡法（ｉＥｘＭ：ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）と呼ばれるこの方法の最近の発展型は、試料を最大で２２倍拡張するために使用されている（Ｃｈａｎｇ，Ｊ−Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（２０１７）１４：５９３〜５９９ページ；ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｍｅｔｈ．４２６１）。
【００６５】
[0100]ｉＥｘＭは、高分子電解質ゲルを核（ｉｎ  ｓｉｔｕで消化し、ＤＮＡオリゴをライゲートした）に注入し、したがって、すべての消化されたクロマチン複合体をｉｎ  ｓｉｔｕでの相対的位置に化学固定するために使用される。浸透圧条件は、核−ゲル混成物を膨張させて、各個々のクロマチン複合体を約２０倍の距離分、分離するように変えられる。カバーガラスを、膨張した核（３次元）をフローセル表面（２次元）上で圧縮するために適用する。その後、クロマチン複合体をフローセル表面上に、リガンド／基質系、例として、ビオチン／ストレプトアビジンを使用して固定する。ある特定の実施形態において、ビオチンは、クロマチンＤＮＡに結合したバーコード付きリンカーに共有結合してもよく、ストレプトアビジンは、フローセル表面上に組み込んでもよい。ｉＥｘＭの単一細胞ｓｍＣｈＩＡプロトコールへの統合は、ネイティブ核構造の保存を促進し、単分子タンパク質検出およびＤＮＡシークエンシングのために別個のクロマチン複合体を十分に膨張する。平均的なヒトの核が５〜１０ｍｍ３であることを考慮すれば、ｉＥｘＭ膨張は、核を３次元で２００ｍｍ３、おそらくフローセル表面上への２次元への圧縮後は４００ｍｍ２まで拡大する。標準の顕微鏡スライドガラス（７５ｍｍ×２５ｍｍ）は、ｓｍＣｈＩＡ分析のために少なくとも５，０００個の核を含有する。
【００６６】
細胞回収および架橋
[0101]約１×１０８個の細胞は、１％ホルムアルデヒドおよび１．５ｍＭ  ＥＧＳを使用して一重または二重架橋され得る。架橋した細胞は、−８０℃で保存され得る。
【００６７】
細胞溶解
[0102]細胞溶解を行うために、細胞を、緩衝液、例として、ＰＢＳ（ＰＩを含む）で２回、室温にて洗浄する。細胞溶解および核溶解は、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００を含まない１０ｍｌの０．１％細胞溶解緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で室温（ＲＴ）にて６分間行われ得る。その後、３７℃の９００μｌの１０％ＳＤＳを添加し、細胞をＩＮＴＥＬＬＩ−ＭＩＸＥＲ（Ｅｌｍｉ  Ｌｔｄ．、Ｒｉｇａ、Ｌａｔｖｉａ）上で１０ｒｐｍにて１０分間回転させる。顕微鏡下での溶解の特徴的な視覚的指標についての目視観察によって、溶解を決定する。細胞が十分に溶解していない場合、プロセスを繰り返してもよい。その後、細胞を、プロテイナーゼ阻害剤（ＰＩ）を含む０．１％細胞溶解緩衝液で２回洗浄し、超音波処理のためにＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（ＰＩ）を含む１０ｍｌの氷冷０．１％細胞溶解緩衝液中に懸濁する。試料が４℃である場合、クロマチン沈殿を避けるために、ＴＲＩＴＯＮを添加する。
【００６８】
クロマチン複合体生成
[0103]クロマチンＤＮＡは、約３ｋｂに剪断されるか、または断片は、少なくとも３ｋｂのＤＮＡ、少なくとも５ｋｂのＤＮＡ、３ｋｂ〜１０ｋｂのＤＮＡ、５ｋｂ〜１０ｋｂのＤＮＡ、約８ｋｂのＤＮＡもしくは８〜１０ｋｂのＤＮＡを含有し得る。クロマチンは、超音波処理、制限酵素消化または他の好適な方法により剪断され得る。制限酵素消化に好適な酵素は、ＭｂｏＩおよびＰｖｕＩＩを含む。超音波処理が使用される場合、クロマチンＤＮＡをチューブに一定分量に分け、例えば、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒを３８％振幅、２０秒間オン／３０秒間オフで６分間使用して超音波処理する。過熱を避けるために、試料を冷却し続ける。その後、クロマチンＤＮＡを、１７００×ｇで少なくとも５分間遠心分離する。
【００６９】
複合体のＣｈＩＰ濃縮
[0104]クロマチン複合体は、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）を通して得られ得る。
[0105]ＣｈＩＰは、目的の特異的タンパク質を含有する複合体について、クロマチン複合体の試料を濃縮するために使用され得る。特定のタンパク質について濃縮したクロマチン複合体の試料を有することにより、そのタンパク質、例として、ヒストンおよび核酸タンパク質複合体中の核酸に結合する他のタンパク質と関連付けられるゲノム領域の特定が可能になる（Ｔａｖｅｒｎｅｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ、２００４．５（３）：２１０ページにおいて概略される）。ＣｈＩＰにおいて、タンパク質は、ＤＮＡとそれらの相互作用部位において架橋される。架橋は、培養物中の生細胞に直接的に好適な固定剤、例として、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ＥＧＳまたはメタノールを添加することによって迅速かつ効率的に達成され得る。
【００７０】
[0106]その後、これらの固定した細胞の粗抽出物を調製し、クロマチンを、超音波処理、ハイドロシアリング（ｈｙｄｒｏｓｈｅａｒｉｎｇ）、皮下シリンジ針を通した反復吸引によって、または制限酵素消化によって、通常約１ｋｂの平均サイズまで剪断し、その後、目的のＤＮＡ関連タンパク質（例えば、転写因子またはヒストン）に対して産生させた抗体による免疫沈降反応において使用する。その後、各免疫沈降において濃縮したＤＮＡ断片を、脱結合および精製して様々な方法によるそれらの特定を可能にする。ＣｈＩＰを使用する利点は、この手法が、クロマチンと他の非ヒストンタンパク質との迅速な架橋によってｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子調節ネットワークを「凍結し」、それによって、例えば、異種（heterologous）発現によって課される潜在的な人為的結果を伴わずに、任意の時点における調節系の状況を提供することができることである。
【００７１】
[0107]目的のタンパク質（例えば、ＲＮＡＰＩＩ）を含有するクロマチン複合体を調製するために、タンパク質Ｇ磁気ビーズは、４℃でのインキュベーションおよび回転によってＲＮＡＰＩＩ抗体中でコーティングされ得る。
【００７２】
[0108]抗体コーティングインキュベーションは、最大で時間の２４時間前に行われ得るが、少なくとも６時間行われるべきである。ＲＮＡＰＩＩ抗体は、以下のようにタンパク質Ｇビーズとインキュベートされる。第１に、１ｍｌのタンパク質Ｇ磁気ビーズをＰＢＳ／０．１％ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００で２回洗浄し、ビーズを７ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００に懸濁し、目的の抗体と４℃でインキュベートし、１２ｒｐｍで約６〜８時間回転させる。タンパク質ビーズは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、カタログ番号１０００３Ｄからの免疫沈降用ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇであり得る。
【００７３】
[0109]クロマチンは、目的の細胞、例えば、ＧＭ１２８７８細胞またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌｉａ  Ｓ２細胞から調製され得る。ＧＭ１２８７８細胞を使用する例において、１×１０８個のＧＭ１２８７８細胞を、室温のＰＢＳ（ＰＩ）により２回洗浄する。
【００７４】
[0110]細胞および核溶解を成し遂げるために、ＧＭ１２８７８細胞を、プロテイナーゼ阻害剤を含まない／含む１０ｍｌの０．１％細胞溶解緩衝液中に室温で６分間懸濁する。その後、３７℃の９００μｌの１０％ＳＤＳを添加し、細胞を１０ｒｐｍで１０分間回転させる。細胞を、顕微鏡下で検分して溶解が起こったかどうかを決定する。細胞が十分に溶解していない場合、溶解手技を繰り返す。その後、細胞を０．１％細胞溶解緩衝液（ＴＲＩＴＯＮなし、ＰＩ）で２回洗浄し、超音波処理のためにＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（ＰＩ）を含む１０ｍｌの氷冷１０ｍｌ  ０．１％細胞溶解緩衝液中に懸濁する。超音波処理のために、細胞をチューブに一定分量に分ける。細胞を、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｓｏｎｉｆｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｅｒを３８％振幅、２０秒間オン／３０秒間オフで６分間使用して超音波処理し、その後、１，７００ｇで５分間スピンダウンする。
【００７５】
[0111]クロマチンは、事前浄化してクロマチンのビーズへのバックグラウンド結合を除去してもよい。これは、１ｍｌのタンパク質Ｇ磁気ビーズを、超音波処理したクロマチン複合体と４℃でローター上にて少なくとも２時間インキュベートすることによって行われ得る。インキュベーション後の上清は、事前浄化したクロマチンを含有し、新しいチューブに移され得る。ＲＮＡＰＩＩ抗体結合ビーズは、０．１％ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳで３回洗浄して非結合抗体を除去することができる。
【００７６】
[0112]ＣｈＩＰを設定するために、抗体結合ビーズの上清を捨て、事前浄化したクロマチン複合体上清を、抗体結合ビーズを含むチューブに移し、一晩４℃で回転しながらインキュベートする。その後、ＣｈＩＰ洗浄ステップを行って複合体の非特異的結合を除去する。２０μｌのクロマチンを、断片サイズの品質管理のために保存する。ＣｈＩＰ洗浄ステップは、高塩分緩衝液洗浄、例として、０．１％ＳＤＳ／．３５Ｍ  ＮａＣｌ（ＰＩ）細胞溶解緩衝液で１回、ＬｉＣｌ緩衝液で１回、続いてＴＥ（ＰＩ）緩衝液洗浄を含む。
【００７７】
バーコード付きリンカーの調製およびライゲーション
[0113]ｓｍＣｈＩＡバーコード付きリンカー（オリゴヌクレオチド）、例として、図６において示されるｓｍＣｈＩＡバーコード付きリンカーを合成する。ビオチン修飾は、鋳型鎖の３’末端に共有結合される。チミンは、非鋳型鎖の複数の位置においてウラシルによって置換され、非鋳型鎖は、例えば、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６４７またはＤＮＡシークエンシングに好適な他の蛍光標識により蛍光標識される。ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６４７に加えて、例えば、約３５０ｎｍ〜約７４０ｎｍの吸収波長、および吸収波長より約１５〜５０ｎｍ長いか、または約３５０ｎｍ〜約３７０ｎｍ〜約７７０ｎｍの発光波長を有する、ＴＩＲＦ顕微鏡によって検出可能な発光波長を有する任意の蛍光染料が使用され得る。ＴＩＲＦによって検出可能な蛍光標識は、約４８０ｎｍ〜約６８０ｎｍの吸収波長、および吸収波長より約１５〜５０ｎｍ長い発光波長を有し得る。ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６４７に加えて、使用され得る他の蛍光標識として、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ４８８、５３２、５４６、５６８および５９４、ＣＹ２、ＣＹ３、ＣＹ３Ｂ、ＣＹ５、ＣＹ５．５、ＣＹ７、ＤＹＬＩＧＨＴ４８８、５５０、５９４、６３３および６５０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＡＴＴＯ  ４８８、５３２、５６５、５９０、６４７Ｎおよび６８０、ＡＴＴＯ  ＲＨＯ３Ｂ、ＡＴＴＯ  ＲＨＯ１１、ＡＴＴＯ  ＲＨＯ３Ｂならびにローダミン６Ｇが挙げられる。ビオチニル化バーコード付きアダプターは、設計すると、商業的供給業者、例として、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ）から得られ得る。
【００７８】
[0114]一本鎖ｓｍＣｈＩＡバーコード付きリンカーオリゴを、１×ＴＮＥ緩衝液中に溶解し、４℃で一晩インキュベートして二本鎖アダプターを調製する。ｓｍＣｈＩＡバーコード付きリンカーの鎖を、二本鎖を形成するようにアニーリングして二本鎖バーコード付きリンカーを形成し、品質管理のためにＰＡＧＥを行う。ｓｍＣｈＩＡバーコード付きリンカーを、以下の実験における使用前に２００ｎｇ／μｌに希釈する。
【００７９】
[0115]抗体により濃縮したクロマチン複合体内に位置するゲノムＤＮＡ断片末端は、バーコード付きリンカーのライゲーション前に修復する必要がある。リンカーライゲーションは、平滑末端ライゲーションまたは付着末端ライゲーションとして設計され得る。この実施例において、付着末端ライゲーションが使用される。第１に、ゲノムＤＮＡのすべての末端を平滑化するために、末端修復を行う。末端修復ステップに続いて、ゲノムＤＮＡ断片のここで平滑化した３’末端のＡテール付加を行う。リンカーは、ゲノムＤＮＡ断片末端に相補的に結合する「Ｔ」オーバーハングを含有する。ビオチニル化バーコード付きリンカー（例えば、１０〜５０ｂｐ、２０〜４０ｂｐ、３０〜３５ｂｐまたは３３ｂｐを有する）は、一本鎖オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって生成し得る。リンカーは、相補的Ｔ／ＡオーバーハングベースのライゲーションによってゲノムＤＮＡにライゲートされ得る。２、３以上、３〜２０、４〜１０、４〜８、６〜８または８個のバーコード付きリンカーの混合物を、クロマチン複合体にライゲートして複数の別個のバーコード付きリンカーを含有するクロマチン複合体を生成させ、各クロマチン複合体から複数のシークエンスリードが得られることを可能にする。
【００８０】
フローセルへのクロマチンローディング
[0116]クロマチン複合体をロードし、それらのビオチニル化リンカーによってストレプトアビジンコーティングしたフローセルに特異的に結合させる。クロマチン複合体の濃度は、実験的に決定されなければならず、ライブラリーのＤＮＡ断片分布および試料のタンパク質含有量に依存する。
【００８１】
ＴＩＲＦベースのタンパク質画像化
[0117]クロマチン複合体のタンパク質成分の画像化は、ドットブロットスタイルのアッセイを使用して行われ得る。クロマチン複合体をロードした後、フローセルを４ｍｌのブロッキング緩衝液（５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳＴ）で４時間ブロックして蛍光抗体の非特異的結合を減少させる。次に、フローセルをＴＢＳＴで３回洗浄し、一次抗体を添加する。一次抗体は、４℃でローター上にて一晩インキュベートされ得る。アレイをＴＢＳＴ中で３回洗浄して過剰の一次抗体を除去する。二次抗体をフローセルに添加し、室温で１時間インキュベートしたままにする。その後、フローセルを再びＴＢＳＴ中で３回洗浄して非結合二次抗体を除去し、シグナルをＦＬＵＯＲＣＨＥＭ  Ｑ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｉｍｐｌｅ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によって検出する。事前に吸着させたロバ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６４７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）は、１つの好適な二次抗体検出系である。
【００８２】
[0118]抗体を、画像化緩衝液中に５０〜１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように希釈し、画像を３時間の全インキュベーション時間の間１５分毎に撮る。複数のタンパク質標的の画像化を必要とする実験については、フローセルを画像化緩衝液により広範に洗浄する（１０回の洗浄×各洗浄について５分間のインキュベーション）。すべての位置を再び画像化し、残りのスポットはさらなる分析から除外する。その後、追加の抗体を適用し、第１の抗体について説明するように画像化してもよい。
【００８３】
逐次ＤＮＡシークエンシング
[0119]単分子スクリプトを、流体素子を無効にするように適合し、一方で、経時的な抗体結合および解離事象についてフローセルを画像化する。
【００８４】
[0120]クロマチン複合体からタンパク質を放出するために、脱架橋するステップを行ってもよい。フローセルは、２Ｍ  ＮａＣｌにより１０分間洗浄し、温度を３７℃まで増大してもよい。脱架橋プロセスは、以下の２つの方法により行われ得る。
【００８５】
方法１：０．５％ＳＤＳ緩衝液を含有するＴＥ緩衝液中で３７℃〜６５℃にて一晩または少なくとも４時間、プロテイナーゼＫとインキュベートする。
方法２：０．５％ＳＤＳ緩衝液を含有するＴＥ緩衝液と６５℃で２時間インキュベートし、その後、０．５％ＳＤＳ緩衝液を含有するＴＥ緩衝液中で４時間または一晩、プロテイナーゼＫとインキュベートする。
【００８６】
[0121]ＵＳＥＲ制限酵素を適用し、フローセル上で３７℃にて１時間インキュベートしてリンカーの１つの鎖内のウラシルヌクレオチドを除去し、シークエンシングプライマーがアクセスし、鋳型鎖にハイブリダイズすることを可能にする。
【００８７】
[0122]その後、フローセルを、Ｈ２Ｏで数回洗浄し、５５℃まで事前加熱してシークエンシング反応を準備してもよい。逐次ＤＮＡシークエンシングを、１０ｎＭの最終濃度でフローセルに添加される、一度に１つのプライマーを使用して行う。シークエンシングプライマーを２０分間ハイブリダイズさせ、続いてブロッキングしてシークエンシング反応を抑制し、洗浄して非結合プライマーを除去する。単分子シークエンシングを、一度に１つのバーコード付きＤＮＡ鋳型を特異的にシークエンシングするためのその都度ユニークなバーコード付きプライマーを使用する多ラウンドのシークエンシングを通して行う。
【００８８】
参照ゲノムマッピング
[0123]基材表面上の固定されたＤＮＡ断片を、１つのプライマー（Ｐ１）を使用してシークエンシングする。各シークエンシングランにおいて、複数の断片シークエンス（リード）をＰ１プライマーについて生成させる。ほとんどのリードは、約３０ｂｐであることが分かったが、１０〜１５ｂｐ、２０〜１００ｂｐ、３０〜８０ｂｐまたは４０〜５０ｂｐであり得る（図４Ａ）。これらのリードを、参照ゲノムに対してマッピングする。図４Ｂにおいて示されるマップについて、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ参照ゲノム（ｄｍ３）を使用した。一態様において、本開示は、長距離にわたる、および様々な染色体間の、特異的ＤＮＡ結合タンパク質、例として、ヒストンによって媒介されるクロマチン相互作用事象を特定するための方法を提供する。別の態様において、本開示は、少なくとも１つの第１のタグおよび少なくとも１つの第２のタグを含む単離されたオリゴヌクレオチドであって、第１のタグが第１のポリヌクレオチドから得られ、第２のタグが第２のポリヌクレオチドから得られ、第１および第２のポリヌクレオチドは核酸−タンパク質複合体から得られる、単離されたオリゴヌクレオチドを提供する。タグは、核酸−タンパク質複合体中のクロマチン領域に対応する。その後、これらのタグを、シークエンシングして分析し、特定し、および／またはクロマチン相互作用事象を検出してもよい（図３および５）。
【００８９】
リンカー
[0124]リンカーは、任意のＤＮＡオリゴヌクレオチドであり得る。リンカーは、基材に選択的に結合することができるペプチドまたは他の分子を含有してもよく、例えば、リンカーは、ストレプトアビジンコーティングまたはアビジンコーティングした基材に結合するビオチンを含有してもよい。また、リンカーは、蛍光標識を含有する。図６は、ｓｍＣｈＩＡ法において使用され得る、８つのバーコード付きリンカー、リンカーへのビオチンの結合およびこれらのリンカーに特異的なプライマーを示す。３’末端でビオチニル化されたバーコード付きリンカーの５’〜３’配列は、配列番号１〜８として提供され、図６で３’〜５’で示される、５’末端でＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６４７フルオロフォアにより標識された相補鎖の配列は、配列番号９〜１６として提供される。これらの配列は、複数の座位においてチミンの代わりにウラシルを組み込む。バーコード付きリンカーのプライマー配列は、配列番号１７〜２４として提供される。
【００９０】
ｓｍＣｈＩＡ系の開発
[0125]本発明者らは、各クロマチン複合体が、クロマチンタンパク質、例としてＲＮＡＰＩＩとのクロマチン相互作用に関与する複数のゲノム座位を表す、最大で８つのＤＮＡ断片を繋ぎ得ると推測した。各ＤＮＡクラスターのサイズは直径約４００ｎｍであり、４００ｎｍはＴＩＲＦ顕微鏡の光学解像限界であり、各クラスター内の異なるＤＮＡ鋳型に由来するシークエンシングリードをどのように区別するかの技術的困難を示す。クラスター内の別々のＤＮＡ鋳型からのシークエンシングリードを区別する技術的問題は、逐次シークエンシング法（図１）で克服された。このシークエンシング法は、バーコード付きＤＮＡリンカーの使用を含む。各クロマチン複合体中の複数のＤＮＡ断片は、特有のバーコード付きリンカーの各々へのライゲーションにランダムに供された。
【００９１】
[0126]ＤＮＡ断片がそれらのバーコード付きリンカーで標識され、固定されると、ＤＮＡ断片は、リンカー特異的プライマーを一度に１つ使用して連続して別々にシークエンシングされ得る。各クラスター（ＴＩＲＦによって検出される光学スポット）中のＤＮＡ配列のそのような逐次リードアウトは、参照ゲノムに対してマッピングされ、シークエンシングの前または後に行われ得る免疫染色によって特定されるタンパク質によって媒介される複数の座位に関与するクロマチン相互作用を反映することが分かる。
【００９２】
[0127]図１は、ｓｍＣｈＩＡ系およびその複数のステップの開発を示す。
（ｉ）クロマチン調製：図１Ａは、クロマチン調製のプロセスを示す。クロマチン試料を、細胞／核溶解、断片化、ＣｈＩＰならびに末端修復およびＡテール付加、続いてＤＮＡリンカーライゲーションを通して調製する。各リンカーは、３’末端にＴオーバーハング、ビオチン基、ユニークなＤＮＡ配列バーコード、非鋳型鎖内に分布する複数のウラシル（Ｕ）塩基および蛍光標識を有するｄｓＤＮＡを含有し得る。典型的に、少なくとも２つおよび最大で８つの異なるバーコード付きリンカーが、クロマチン試料にライゲートされる。
【００９３】
（ｉｉ）連続したクロマチンローディングおよび抗体（Ａｂ）特異的免疫染色：図１Ｂは、フローセル上へのクロマチンローディングを示す。クロマチン試料を、ストレプトアビジンコーティングしたフローセル表面にロードし、各クロマチン複合体を、ビオチン−ストレプトアビジン結合を通して固定する。クロマチン複合体を、隣接する複合体間で１μｍを超える距離が存在するように十分に希釈する。その後、クロマチン複合体中のタンパク質を、目的のタンパク質に特異的な抗体による、直接的にフローセル上での連続免疫染色によって可視化する。
【００９４】
[0128]ある特定の実施形態において、免疫染色手技を数回繰り返して、一般的な転写因子（ＴＦ）、例として、ＲＮＡＰＩＩ（ＲＮＡポリメラーゼＩＩ）、特異的ＴＦ、例として、ＲＡＲＡ（レチノイン酸受容体）、ＥＲ（エストロゲン受容体）など、およびクロマチン構造因子、例として、ＣＴＣＦ（ＣＴＣＣ結合因子）、コヒーシンなどを含むいくつかの異なるクロマチン結合タンパク質を検出する。ＣｈＩＰグレードの抗体が使用可能な任意のクロマチンタンパク質は、検出され得る。この手技によって免疫染色され得る追加のクロマチン結合タンパク質として、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｉａｇｅｎｏｄｅ．ｃｏｍ／ｅｎ／ｃａｔｅｇｏｒｉｅｓ／ｃｈｉｐ−ｇｒａｄｅ−ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓで見られ得る以下のＣｈＩＰグレードの抗体に結合するクロマチンタンパク質：Ｈ３Ｒ２ｍｅ２、ＡＦ９、ＡＭＬ１−ＥＴＯ、ＢＲＤ４、Ｃ／ＥＢＰ、ＣＢＦｂ、ＣＢＸ２、ＣＢＸ８、ＣＨＤ１、ＣＨＤ７、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＴＣＦ、ＣＸＸＣ１、ＤＮＭＴ３Ｂ、Ｅ２Ｆ６、ＥＲＲ、ＥＴＯ、ＥＺＨ２、ＦＯＸＡ１、ＦＯＸＡ２、ＦＯＸＭ１、ＦＵＢＰ１、ＧＲ、ＧＴＦ２Ｅ２、ヒストンＨ２Ａ．Ｘ、Ｈ２Ａ．Ｚ、Ｈ２Ａ．Ｚａｃ、Ｈ２Ａ．ＺＫ４ａｃ、Ｈ２Ａ．ＺＫ７ａｃ、Ｈ２ＡＫ１１９ｕｂ、Ｈ２ＡＫ５ａｃ、Ｈ２ＢＫ１２ａｃ、Ｈ２ＢＫ１５ａｃ、Ｈ２ＢＫ２０ａｃ、Ｈ２ＢＫ１２３ｕｂ、Ｈ２Ｂｐａｎ、Ｈ３．３、Ｈ３Ｋ１４ａｃ、Ｈ３Ｋ１８ａｃ、Ｈ３Ｋ１８ｍｅ１、Ｈ３Ｋ１８ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２３ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２７ａｃ、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ１、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ２、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３Ｓ２８ｐ、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ１、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ２、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ａｃ、Ｈ３Ｋ４ｍｅ１、Ｈ３Ｋ４ｍｅ２、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ４ｍｅ３Ｔ６ｐ、Ｈ３ｋ４ｕｎ、Ｈ３Ｋ５６ａｃ、Ｈ３Ｋ５６ｍｅ１、Ｈ３Ｋ６４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ７９ａｃ、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ１、Ｈ３Ｋ７９ｍｅ３、Ｈ３Ｋ９／１４ａｃ、Ｈ３Ｋ９ａｃ、Ｈ３Ｋ９ａｃＳ１０ｐ、Ｈ３Ｋ９ｍｅ１、Ｈ３Ｋ９ｍｅ２、Ｈ３Ｋ９ｍｅ３、Ｈ３Ｋｍｅ３Ｓ１０ｐ、Ｈ３Ｋ９ｕｎ、Ｈ３ｐａｎ、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２（ａｓｙｍ）、Ｈ３Ｒ１７ｍｅ２（ａｓｙｍ）Ｋ１８ａｃ、Ｈ３Ｒ２ｍｅ２Ｋ４ｍｅ２、Ｈ３Ｔ６ｐＫ９ｍｅ３、Ｈ４Ｋ１２ａｃ、Ｈ４Ｋ  １６ａｃ、Ｈ４Ｋ２０ａｃ、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ１、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ２、Ｈ４Ｋ２０ｍｅ３、Ｈ４Ｋ５，８，１２ａｃ、Ｈ４Ｋ５ａｃ、Ｈ４Ｋ８ａｃ、Ｈ４ｐａｎ、Ｈ４Ｓ１ｐ、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＩＦ１α、ＨＰ１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ、ＪＭＪ２ａ、ＪＭＪＤ６、ＫＡＰ１、ＫＡＴ２Ｂ、ＫＤＭ６Ａ、ＬＳＤ１、ＭＢＤ１、ＭＢＤ１、ＭｅＣＰ２、ＭＹＨ１１、ＮＣＯＲ１、ＮＦ−Ｅ２、ＮＦＫＢ、ＮＦＹＢ、ＮＲＦ  １、ＮＲＦ２、ＯＣＴ４、ｐ３００、ｐ５３、ＰＡＲＰ１、ＰＡＸ８、Ｐｏｌ  ＩＩ、Ｐｏｌ  ＩＩ  Ｓ２ｐ、ＰＰＡＲＧ、ＲｂＡｐ４８、ＲＢＢＰ５、ＲＦＸ−ＡＰ、ＲＮＦ２、ＳＡＰ３０、ＳＩＮ３Ａ、Ｓｋｉ３、Ｓｋｉ８、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＹＤ３、Ｓｕｚ１２、ＴＡＬ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＲＰ、ＴＦＩＩＦ、ＴＨＯＣ１、ＴＩＰ５、ＴＲＲＡＰ、Ｔｙ１、ＵＨＲＦ１、ＹＹ１、ＺＨＸ２、およびＺＭＹＭ３が挙げられる。連続免疫染色は、各クロマチン複合体における個々の、および複数の共局在タンパク質の特定を可能にする。目的のタンパク質の免疫染色は、逐次シークエンシングステップの前または後に行われ得る。
【００９５】
[0129]クロマチン複合体のタンパク質成分は、シークエンシング前に逆架橋を介して除去され得る。脱架橋は、前はクロマチンタンパク質によって繋げられていた、クロマチン複合体のＤＮＡ成分の精製をもたらす。バーコード付きリンカー中に含有される末端ビオチン基によって繋げられたゲノムＤＮＡは、ＤＮＡ断片の別個のクラスターとして、フローセル表面上に残った。個々のクラスター内でＤＮＡ断片の各々は個々のゲノム座位を表し、各クラスター内の様々なＤＮＡ断片は、クロマチンタンパク質によって媒介される長距離クロマチン相互作用を通して一緒になっていた複数のゲノム座位を表す。
【００９６】
[0130]（ｉｉｉ）ＳＥＱ  ＬＬプラットホーム：図１Ｃは、単分子タンパク質検出およびＤＮＡシークエンシングのために全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡を使用する、ＳＥＱ  ＬＬプラットホームを示す。ＳＥＱ  ＬＬプラットホームは、ＰＣＲ増幅を必要としない。図１Ｄは、別々のクロマチン複合体において繋がれたＤＮＡ断片を示す。別々のクロマチン複合体は、ＴＩＲＦ光学解像限界である、直径約４００ｎｍである。別々のクロマチン複合体を、重複しないようにフローセル表面上で十分に分散させる。単一のクロマチン複合体においてクラスター化されるＤＮＡの各々からの複数のＤＮＡ断片を読み取るために、ＤＮＡリンカーの各々に対応する特異的プライマー（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３など）を連続して適用して単一のクロマチン複合体からの複数のＤＮＡ断片がシークエンシングされることを可能にし、単分子シークエンシングを促進する、逐次シークエンシング法を実行する。各点線は、逐次リンカー特異的シークエンシングランを示す。
【００９７】
Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞の使用
[0131]Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞を、ｓｍＣｈＩＡの開発において使用した。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａは、比較的小さいゲノムを有し、既にＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞についての多くの３Ｄゲノム構成データ（Ｈｉ−ＣおよびＣｈＩＡ−ＰＥＴ）が存在し、そのため予備結果の比較が容易である。技術確証のために、ＲＮＡＰＩＩ媒介クロマチン相互作用を研究し、現存のＲＮＡＰＩＩ  ＣｈＩＡ−ＰＥＴデータを、収集したｓｍＣｈＩＡデータと比較した。
【００９８】
[0132]ストレプトアビジンコーティングしたガラス表面上に固定したクロマチン複合体についてのＲＮＡＰＩＩの免疫染色は、ＳＥＱ  ＬＬ系を使用する個々のヌクレオソームに対するヒストン修飾マーカーについての結果に匹敵する優れた結果を提供した（Ｓｈｅｍａ，Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１６）３５２（６２８６）：７１７〜７２１ページ、ＰＭＩＤ：２７１５１８６９）。
【実施例】
【００９９】
[0133]以下の実施例は、本発明の様々な好ましい実施形態および技術をさらに例示するために提供される。しかしながら、これらの実施例は、特許請求の範囲において説明される本発明の範囲を限定しないと理解されるべきである。多くの変形および改変が、本発明の趣旨および範囲内であると意図される。
【０１００】
実施例１
ｓｍＣｈＩＡバーコード付きリンカー調製
[0134]ｓｍＣｈＩＡバーコード付きリンカーオリゴヌクレオチド（例として、図６で示される配列）を合成する。鋳型鎖の３’末端をビオチニル化する。非鋳型鎖は、複数の座位においてチミンをウラシル（Ｕ）によって置換されている。非鋳型鎖を、例えば、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６４７により蛍光標識する。以下の実験において使用されるバーコード付きリンカーを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤＴ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｄｔｄｎａ．ｃｏｍ／）によって合成した。
【０１０１】
[0135]乾燥一本鎖ｓｍＣｈＩＡバーコード付きリンカーオリゴを、１×ＴＮＥ緩衝液中に溶解し、４℃で一晩インキュベートして二本鎖バーコード付きリンカーを調製する。バーコード付きリンカー鎖を、サーマルサイクラー中で９５℃〜２０℃まで徐々に１０分間にわたり下げることによってアニーリングさせ、品質管理のためにＰＡＧＥを行ってもよい。ｓｍＣｈＩＡバーコード付きアダプターは、以下の実験のために２００ｎｇ／μｌまで希釈する。
【０１０２】
実施例２
ＣｈＩＰによりＲＮＡＰＩＩについて濃縮したＧＭ１２８７８細胞からのクロマチン複合体の生成
[0136]ＧＭ１２８７８またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞を、ＥＧＳおよび１％ＦＡにより一重または二重架橋し、必要になるまで−８０℃で保存した。
【０１０３】
[0137]１ｍｌのタンパク質Ｇビーズを２回、ＰＢＳ／０．１％ＴＲＩＴＯＮ−１００で２回洗浄することによって、ＲＮＡＰＩＩ抗体をタンパク質Ｇビーズに結合させた。ビーズを、７ｍｌのＰＢＳ／０．１％ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００に懸濁し、回転しながら４℃で６〜８時間インキュベートする。
【０１０４】
[0138]１×１０８個のＧＭ１２８７８細胞を、室温のＰＢＳ（ＰＩ）で２回洗浄する。細胞を１０ｍｌの０．１％細胞溶解緩衝液（ＰＩ）に室温で６分間添加することによって、細胞および核溶解を成し遂げる。その後、９００μｌの１０％ＳＤＳを３７℃で添加し、細胞を１０ｒｐｍで１０分間回転させる。細胞を顕微鏡下で検分する。溶解が十分に完了していない場合、溶解手技を繰り返す。溶解が十分に完了すると、細胞を０．１％細胞溶解緩衝液（ＴＲＩＴＯＮまたはＰＩなし）で２回洗浄し、ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００（ＰＩ）を含む１０ｍｌの氷冷０．１％細胞溶解緩衝液中に懸濁して、超音波処理を行う。
【０１０５】
[0139]超音波処理のために、細胞をチューブに一定分量に分ける。細胞を、３８％振幅、２０秒間オン／３０秒間オフで６分間超音波処理し、その後、１７００ｇで５分間遠心分離する。
【０１０６】
[0140]１ｍｌのタンパク質Ｇ磁気ビーズを超音波処理したクロマチン複合体と４℃で回転しながら少なくとも２時間インキュベートすることによって、クロマチンを事前浄化する。超音波処理したクロマチンおよびタンパク質Ｇ磁気ビーズを、低速（約１００×ｇ）で４℃にて１分間遠心分離する。上清は、事前浄化したクロマチンを含有する。
【０１０７】
[0141]ＲＮＡＰＩＩ結合抗体ビーズを０．１％ｔｒｉｔｏｎ／ＰＢＳで３回洗浄することによって、過剰のＲＮＡＰＩＩをタンパク質Ｇ磁気ビーズから除去する。
[0142]ＣｈＩＰを行うために、抗体結合ビーズの上清を捨てる。事前浄化したクロマチンを、抗体結合ビーズに移し、４℃で一晩インキュベートする。クロマチンの２０μｌの一定分量を、断片サイズ品質管理のために保存する。
【０１０８】
[0143]クロマチンとＲＮＡＰＩＩ抗体結合ビーズとの一晩のインキュベーション後、ビーズを、０．１％細胞溶解緩衝液（ＰＩ）で３回；０．１％細胞溶解緩衝液／３５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ＰＩ）で１回、ＬｉＣｌ緩衝液で１回およびＴＥ（ＰＩ）で３回洗浄する。
【０１０９】
実施例３
超音波処理したＤＮＡ断片の平滑末端化
[0144]抗体結合ビーズに結合したクロマチンを、洗浄緩衝液で洗浄し、その後、氷冷ＴＥ緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ、ＡＭ９８４９、ヌクレアーゼ非含有）で洗浄する。
【０１１０】
[0145]Ｔ４ポリメラーゼマスターミックス（所望の体積の１．２倍）を、氷上の新しいチューブ中に調製する。マスターミックスは、６１５．８μｌのヌクレアーゼ非含有水、１７０μｌの０×Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ用緩衝液および１７０μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰを必要とする。
【０１１１】
[0146]ＴＥ緩衝液を抗体結合ビーズから捨て、６９２．８μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼマスターミックスを、ビーズを含有する４つのチューブの各々に一定分量に分ける。０．２μｌのＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍ４２１５）を磁気ビーズに添加する。ＤＮＡポリメラーゼおよび磁気ビーズを混合し、３７℃で４０分間ＩＮＴＥＬＬＩ−ＭＩＸＥＲ（プログラム：Ｆ８、３０ｒｐｍ；Ｕ＝５０、ｕ＝６０）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｌｍｉｎｏｒｔｈａｍｅｒｉｃａ．ｃｏｍ／ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ／ｉｎｔｅｌｌｉ−ｍｉｘｅｒｓ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｅｌｍｉ−ｒｍ−２１−ｉｎｔｅｌｌｉ−ｍｉｘｅｒｓ−ｌａｒｇｅ−ｉｎｃｌｕｄｅｓ−ｍｉｘ−ｒａｃｋ）上で回転しながらインキュベートする。４０分後、チューブを３７℃のインキュベーターから除去する。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼマスターミックスを捨てる。ビーズを、氷冷洗浄緩衝液［ＰＩ］で３回およびＴＥで１回洗浄する。
【０１１２】
実施例４
クロマチン断片のｄＡテール付加
[0147]クレノウ（３’−５’エキソ−）マスターミックスは、以下の成分：ヌクレアーゼ非含有水（６１６μｌ）、１０×ＮＥＢ緩衝液２（７０μｌ）および１０ｍＭ  ｄＡＴＰ（７μｌ）を含有する。７μｌのクレノウ断片（３’−５’エキソ−）およびクレノウマスターミックスを、クロマチン断片を含有するビーズに添加する。ビーズを、３７℃で５０分間インキュベートする。クロマチン断片を含有するチューブを、３７℃のインキュベーターから取り出す。クレノウマスターミックスを、ビーズからデカントする。ビーズを氷冷洗浄緩衝液［ＰＩ］で３回、その後ＴＥで１回洗浄する。
【０１１３】
実施例５
ビオチンおよび蛍光標識のバーコード付きアダプターへのライゲーション
[0148]１，１１０μｌのヌクレアーゼ非含有水、４μｌの混合したリンカーおよび２８０μｌの５×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液を含有するライゲーション緩衝液を調製する。リガーゼ緩衝液を、クロマチン含有ビーズに添加し、軽くはじくことによって混合する。６μｌのＴ４  ＤＮＡリガーゼを混合物に添加し、軽くはじくことにより混合し、続いて短時間での回転と軽い旋回を行う。混合物を、１６℃で一晩インキュベートする。
【０１１４】
実施例６
タンパク質Ｇ磁気ビーズからのクロマチンの放出
[0149]ビーズを緩衝液で３回洗浄して過剰のリンカーを除去する。％ＳＤＳ（１００μｌの１０％ＳＤＳ＋９００μｌの緩衝液ＴＥ）を含有する溶離緩衝液を調製する。２００μｌの溶離緩衝液を、タンパク質Ｇビーズに添加する。チューブを、ＩＮＴＥＬＬＩ−ＭＩＸＥＲ上で回転（Ｆ８、３０ｒｐｍ、Ｕ＝５０、ｕ＝６０）させながら室温にて３０分間置く。タンパク質ＧビーズからのクロマチンＤＮＡ複合体を含有する２００μｌの溶離緩衝液を、新しいチューブに移す。放出反応を、１．６％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液を添加し、３７℃で１時間インキュベートすることによってクエンチする。
【０１１５】
実施例７
ＳＥＱ  ＬＬプラットホーム上での試料分析
[0150]クロマチン複合体の添加前に、ＳＥＱ  ＬＬフローセル表面を、スペルミンテトラヒドロクロリドで１時間ブロックし、画像化緩衝液で洗浄し、その後、ストレプトアビジン（０．２ｍｇ／ｍｌ）で１０分間コーティングする。フローセル表面を、画像化緩衝液で洗浄する。画像化緩衝液は、ｐＨ６．５の１０ｍＭ  ＭＥＳ、６０ｍＭ  ＫＣｌ、０．３２ｍＭ  ＥＤＴＡ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０％グリセロール、０．１ｍｇ／ｍｌアセチル化ＢＳＡおよび０．０２％Ｉｇｅｐａｌを含有する。クロマチン複合体を、ＳＥＱ  ＬＬフローセル表面上にハイブリダイズする。
【０１１６】
実施例８
単分子画像化（ＳＥＱ  ＬＬ）
[0151]蛍光励起のための２つのレーザー、５３２ｎｍ／７５ｍＷおよび６４０ｎｍ／４０ｍＷを有するＴＩＲＦ顕微鏡（Ｃｏｍｐａｓｓ  ２１５Ｍ  Ｃｕｂｅ−４０Ｃ、Ｃｏｈｅｒｅｎｔ）を、単分子シークエンシングに使用する。両方のレーザービームを、バンドパスフィルター（Ｃｈｒｏｍａ）を通してフィルターにかけ、ダイクロイックミラー（Ｔ：６４０ｎｍ、Ｒ：５３２ｎｍ）によって分光分離する。その後、レーザービームは、ＴＩＲＦレンズを通り、屈折率１．４９の６０×ＴＩＲＦ油浸対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ）を通して全内部反射が達成され、ＣＣＤカメラ上に画像化される。クロマチン複合体を画像化した後、リンカーにおいて標識したフルオロフォアを、画像化緩衝液で１：１０希釈したＴＣＥＰの添加を介して切断する。ＴＣＥＰとの１０分間のインキュベーション後、フローセルを、画像化緩衝液で洗浄する。すべての位置を再び画像化し、残りのスポットを、さらなる分析から除外する（スポットのうちの２％未満が残る）。
【０１１７】
実施例９
免疫染色
[0152]フローセルアレイに結合したクロマチンを４ｍｌのブロッキング緩衝液（５％脱脂粉乳を含有するＴＢＳＴ）で４時間ブロッキングすることによって、抗体特異性ドットブロットアッセイ（ＲＮＡＰＩＩ、ＣｈＩＰグレード）を行う。次に、フローセルアレイをＴＢＳＴで３回洗浄し、一次抗体を添加する。抗体をローター上で４℃にて一晩インキュベートする。その後、アレイをＴＢＳＴ中で３回洗浄する。二次抗体を室温で１時間添加する。アレイを再びＴＢＳＴ中で３回洗浄し、シグナルをＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  Ｑ（事前に吸着させたロバ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６４７）（ａｂ１５０１１１））によって検出する。
【０１１８】
[0153]抗体を、画像化緩衝液中に５０〜１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度になるように希釈し、画像を３時間の全インキュベーション時間の間１５分毎に撮る。２つより多いマークの画像化を必要とする実験については、フローセルを画像化緩衝液により広範に洗浄する（１０回の洗浄×各洗浄について５分間のインキュベーション）。すべての位置を再び画像化し、残りのスポットはさらなる分析から除外する。次に、第２ラウンドの抗体を適用し、第１ラウンドと同様に画像化する。
【０１１９】
実施例１０
単分子シークエンシング
[0154]単分子スクリプトを、流体素子を無効にするように適合させ、一方で、経時的な結合および解離事象についてフローセルを画像化する。フローセルを、２Ｍ  ＮａＣｌで１０分間洗浄し、温度を３７℃まで増大する。ｓｍＣｈＩＡの脱架橋するステップは、クロマチン複合体からタンパク質を放出する。脱架橋プロセスは、以下の２つの方法により行われ得る。
【０１２０】
[0155]方法１。フローセルを、０．５％ＳＤＳ緩衝液を含有するＴＥ緩衝液中で５０℃にて一晩または少なくとも４時間、プロテイナーゼＫとインキュベートする。
方法２。フローセルを、０．５％ＳＤＳ緩衝液を含有するＴＥ緩衝液と６５℃で２時間インキュベートし、その後、０．５％ＳＤＳ緩衝液を含有するＴＥ緩衝液中で４時間または一晩、プロテイナーゼＫとインキュベートする。
【０１２１】
[0156]脱架橋後、ＵＳＥＲ制限酵素を適用し、３７℃で１時間インキュベートする。フローセルを、Ｈ２Ｏで数回洗浄し、５５℃まで事前加熱する。プライマーを１０ｎＭの最終濃度で添加し、プライマーを２０分間ハイブリダイズさせ、続いて洗浄する。その後、単分子シークエンシングを行う。
【０１２２】
実施例１１
ＳＥＱ  ＬＬプラットホームを使用する単分子ＣｈＩＰシークエンシング（ｓｍＣｈＩＰ）
[0157]この研究において、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞から、ＲＮＡＰＩＩ  ＣｈＩＰ濃縮クロマチン材料を調製した。固定したクロマチンからの単分子ＤＮＡシークエンシングをＳＥＱ  ＬＬプラットホーム上で行い、得られたｓｍＣｈＩＰデータを以前に生成させたＲＮＡＰＩＩ  ＣｈＩＡ−ＰＥＴデータと比較した。
【０１２３】
[0158]ｓｍＣｈＩＡ実験のために、ＧＭ１２８７８またはＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞を、１％ホルムアルデヒドおよび１．５ｍＭ  ＥＧＳにより一重または二重架橋した。架橋した細胞は任意選択で、以下のステップに進む前に−８０℃で保存される。架橋したＳ２細胞を、細胞および核溶解に供した。クロマチン繊維を、超音波処理によって約３ｋｂの断片になるようにクロマチン複合体に剪断した。超音波処理したクロマチン複合体材料について、混合したバーコード付きリンカーを、剪断したクロマチン複合体中のＤＮＡにライゲートし（各々、特有のバーコードおよびビオチンを有し）、その後、クロマチン試料を、ストレプトアビジンコーティングしたフローセル表面上にロードし、複合体がハイブリダイズし、画像化されてフローセル上のクロマチン密度を決定することを可能にした。さらに、タンパク質を、脱架橋することによって除去し、表面上に固定されたゲノムＤＮＡ断片を残し、１つのプライマー（Ｐ１）を使用するシークエンシングを行った。１回の試験ランにおいて、１６，５７９個の品質リードを生成させた。
【０１２４】
[0159]本発明者らは、クロマチン複合体からＤＮＡが、タンパク質成分を除去することなく、ＳＥＱ  ＬＬプラットホームを使用して直接的にシークエンシングされ得るかどうかをさらに試験した。ｓｍＣｈＩＡは４８，７７７個のリードを生成し、クロマチン複合体から直接的に、最初にタンパク質を脱架橋することなく、高品質ｓｍＣｈＩＰリードが実際に強固に生成したことを示した。ｓｍＣｈＩＰリードの大部分は、約３０ｂｐであった（図４Ａ）。
【０１２５】
[0160]これらのｓｍＣｈＩＰリードの、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ参照ゲノム（ｄｍ３）に対するマッピングは、ＲＮＡＰＩＩ  ＣｈＩＡ−ＰＥＴによって特定されるように（図４Ｂ）クロマチン相互作用に関与することが以前に知られていたＲＮＡＰＩＩ結合ピークにおける著しい濃縮を示した。
【０１２６】
[0161]クロマチン複合体から直接的にｓｍＣｈＩＰシークエンシングすることができる性能は、全体的なｓｍＣｈＩＡ手技を著しく単純化し、タンパク質除去によって導入され得る技術的な人為的結果を避ける。
【０１２７】
実施例１２
単分子クロマチン相互作用分析（ｓｍＣｈＩＡ）
[0162]ｓｍＣｈＩＰ手技の成功後、核心である、ＳＥＱ  ＬＬプラットホームを使用するクロマチン複合体の逐次シークエンシングを試験した。クロマチン試料を上記に説明するように調製した。シークエンシングに１つのプライマーを使用するのではなく、本発明者らは、連続して２つのプライマー（Ｐ１およびＰ２）を使用した。これらのプライマーは、フローセル表面上に固定したクロマチンＤＮＡ断片にライゲートしたリンカーのうちの２つに対応する。クロマチン複合体に対応する各ＤＮＡクラスターは、ＴＩＲＦ顕微鏡の光学解像度に近い、直径約４００ｎｍであるので、同じ光学スポットからの予測される単分子シークエンシングリードは、複数のシークエンシングプライマーと一致するヌクレオチド組成を有する。図３は、第１のプライマー（Ｐ１）および続いて第２のプライマー（Ｐ２）を連続して使用する逐次シークエンシングにより個々にシークエンシングした４つのＤＮＡ鋳型を示し、Ｐ１シークエンシング相は１６ｎｔリードを生成させ、６ｎｔは第１のプライマー、Ｐ１からであり、１０ｎｔはクロマチンＤＮＡからであり、Ｐ２シークエンシングも１６ｎｔリードを生成させ、６ｎｔは第２のプライマー、Ｐ２からであり、１０ｎｔは第２のクロマチンＤＮＡ断片からである。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａの小さいゲノムサイズのために、ほとんどの１０ｎｔクロマチン配列は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ参照ゲノムに対してユニークにマッピングすることができ、シークエンスリードが実際にゲノムのものであるという確証を可能にし、対で相互作用する座位のゲノム位置を明らかにする。
【０１２８】
[0163]伝統的なＣｈＩＡ−ＰＥＴデータを参照として使用して、本発明者らは、多くのｓｍＣｈＩＡリードが、以前に特定したＲＮＡＰＩＩ  ＣｈＩＡ−ＰＥＴと同じ、事前に規定した相互作用座位に入ることを発見した（図５Ｃ）。
【０１２９】
実施例１３
ｓｍＣｈＩＡのためのプロトタイプ器具の開発
[0164]上記に説明するｓｍＣｈＩＡに基づいて、本発明者らは、現在のＳＥＱ  ＬＬプラットホームをｓｍＣｈＩＡ特異的な必要条件のために改変した。現在のＳＥＱ  ＬＬプラットホームは、フローセルの５０個のチャネルにわたる全ゲノム単分子ＤＮＡおよびＲＮＡシークエンシングのために設計されたものであり、蛍光励起のために単一レーザーを使用する。この系は、ヒストンマーカーと個々のヌクレオソームのゲノム位置との同時検出のために改変されている（Ｓｈｅｍａら、（２０１６）ＰＭＩＤ：２７１５１８６９）。
【０１３０】
[0165]ｓｍＣｈＩＡ特異的なプロトタイプにおいて、フローセルフットプリントサイズは、迅速な実験を可能にし、実験コストを低減するために低減されている。流体素子モジュールについては、デッドボリュームおよびフットプリントサイズは低減されている。約２５０ｍＷ出力レーザーを使用する多色画像化が、光学系に組み込まれている。これらの改変は、コストを著しく低減し、現在ＳＥＱ  ＬＬにおいて製造される、対で標識されるＣ／Ｔ、Ａ／Ｇ可逆的ターミネーターの使用を通してシークエンシング化学に要する時間の減少を可能にする。設計は適応性があり、追加の有色レーザーの将来的な組込みを可能にする。最後に、画像化およびデータ解析のための制御ソフトウェアを開発した。ソフトウェアは、視野範囲を画像化／シークエンシングすること、およびデータを産業標準のＦＡＳＴＱ形式において生成することを可能にする。
【０１３１】
実施例１４
単一核（ＳＮ）／単一細胞（ＳＣ）に適用されたｓｍＣｈＩＡ
[0166]ｓｍＣｈＩＡ法は、複数の別個のクロマチン複合体が、個々の単一核または異なる核内に同時に共存するかどうかを決定しない。それゆえ、本発明者らは、ｓｍＣｈＩＡ技術を単一核レベルに拡張した（すなわち、単一核ｓｍＣｈＩＡ）。単一細胞は単一核を含有するので、単一核ｓｍＣｈＩＡ技術は、単一細胞ｓｍＣｈＩＡ技術としても造られる。
【０１３２】
[0167]ｓｍＣｈＩＡ法の単一核適用は、ｉｎ  ｓｉｔｕ透過処理および制限酵素消化ならびに続いてリンカーライゲーションを行うために使用される現存の技術を利用する（図８）。このことは、ストレプトアビジンコーティングしたフローセル表面に直接的にハイブリダイズするようにゲノムワイドにリンカーによってタグ付けされた核の生成を可能にする。重要なことに、核の特定の希釈は、単一細胞が、別個の個々の核として区別され得るように互いに分離されることを確実にするために実験的に決定されなければならない（図８）。
【０１３３】
[0168]単一核がフローセルにハイブリダイズすると、核を溶解し、単一クロマチン複合体が解像され得るように内容物を分散してもよい。この方法は、分析が、各々の単一核内に含有される多くの単一クロマチン複合体の配列およびタンパク質組成を提供するように、個々の核の空間的区別を破壊することなく、個々のクロマチン複合体の適切な分離を可能にする（図９）。
【０１３４】
[0169]最適化したｉｎ  ｓｉｔｕクロマチン消化手技を、単一核ｓｍＣｈＩＡに使用した。細胞を最初に、ホルムアルデヒド（１％）処理によって架橋した。その後、細胞を低塩緩衝液と共にインキュベートして細胞を溶解した。単離した核を、ＳＤＳ（０．５％）中でのインキュベーションによって可溶化した。ＳＤＳが制限酵素効率に影響を及ぼすことを避けるために、核をＤＰＢＳ／０．１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄した。その後、核を、ＭｂｏＩ（４ｂｐカッター）と３７℃で一晩インキュベートした。
【０１３５】
[0170]洗浄後、核内の消化したクロマチン断片を、末端修復およびＡテール付加に供し、その後、ＤＮＡバーコード付きリンカー１（Ｐ１）にライゲートし、追加的に蛍光標識、例として、ＡＬＥＸＡ−６４７により標識した。共焦点顕微鏡検査は、強いＡＬＥＸＡ  ６４７蛍光シグナルを有するインタクトな核を示し、クロマチン消化およびリンカーライゲーションのｉｎ  ｓｉｔｕ操作が成功したことを示した（図９Ａ）。
【０１３６】
[0171]核は既に、ｉｎ  ｓｉｔｕ消化およびリンカーライゲーションのために透過処理されたので、クロマチン断片にライゲートされたビオチン基の一部は、核表面上に露出され、したがって個々の核がストレプトアビジンコーティングしたスライド上で半固定されることを可能にした。
【０１３７】
[0172]得られる単一核のクロマチン調製物を、ＤＰＢＳ／０．１％ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００溶液で洗浄し、ＴＩＲＦ蛍光顕微鏡によって検査した（図４Ｃ）。
[0173]本明細書中で引用されるすべての出版物および特許は、それらを全体として参照により本明細書に組み込む。説明する本発明の組成物、方法および系の様々な改変および変形は、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は特定の好ましい実施形態およびある特定の作業実施例に関して説明されているが、特許請求の範囲の本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことが理解されるべきである。
【図１】
2020523993.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
2020523993.tif 000010
【図９】
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【配列表】
2020523993000001.app
【国際調査報告】
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2020523993.tif 000013
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