(57)【要約】エクト酵素に結合するＵｎｉＡｂｓ（商標）などのヒト重鎖抗体は、相乗的な組み合わせを含む、エクト酵素上の非重複エピトープを標的とする、そのような重鎖抗体及び多重特異性重鎖抗体の組み合わせと共に提供される。そのような抗体を作製する方法、そのような抗体を含む医薬組成物を含む組成物、及びエクト酵素の発現に関連する疾患または状態の処置に関する方法もまた含まれる。【選択図】図３０
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
同じエクト酵素の非重複エピトープに結合する２つ以上の重鎖抗体の組み合わせを含む、組成物。
【請求項２】
前記エクト酵素が、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ２０３、ＶＡＰ１、ＡＲＴ２、及びＭＴ１−ＭＭＰからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記エクト酵素が、ＣＤ３８、ＣＤ３９、またはＣＤ７３である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記エクト酵素が、ＣＤ３８である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記重鎖抗体が、ＵｎｉＡｂ（商標）である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記２つ以上の重鎖抗体が、配列番号１〜６０、９９〜１４９、１７５〜２１８、２４７〜３０８、及び３２３〜３９１からなる群より選択される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記重鎖可変領域アミノ酸配列が、配列番号１、９９、１００、１７５、２４７、３２３、及び３２５からなる群より選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記重鎖可変領域アミノ酸配列が、配列番号９９、１００、１７５、３２３、及び３２５からなる群より選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
第１及び第２の重鎖抗体の組み合わせを含み、
（ａ）前記第１の抗体が、配列番号１５０及び３９４からなる群より選択されるＣＤＲ１配列、配列番号９２及び４１３からなる群より選択されるＣＤＲ２配列、ならびに配列番号１６８及び４３１からなる群より選択されるＣＤＲ３配列、を含み、
（ｂ）前記第２の抗体が、配列番号２１９及び３９３からなる群より選択されるＣＤＲ１配列、配列番号８３及び４１２からなる群より選択されるＣＤＲ２配列、ならびに配列番号２４０及び４２４からなる群より選択されるＣＤＲ３配列、を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記第１の抗体が、配列番号１００及び３２３からなる群より選択される重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、前記第２の抗体が、配列番号１７５及び３２５からなる群より選択される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記第１及び前記第２の抗体が、ＩｇＧ１である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組み合わせが、相乗的である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
ＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９０２１及び３０９２６５の組み合わせまたはＵｎｉＡｂｓ（商標）３２１９８６及び３２１６６３の組み合わせを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
第１及び第２の重鎖抗体の組み合わせを含み、
（ａ）前記第１の抗体が、配列番号３９４のＣＤＲ１配列、配列番号４１３のＣＤＲ２配列、及び配列番号４３１のＣＤＲ３配列を含み、
（ｂ）前記第２の抗体が、配列番号１５１のＣＤＲ１配列、配列番号１６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号１７２のＣＤＲ３配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記第１の抗体が、配列番号３２３の重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、前記第２の抗体が、９９の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１及び前記第２の抗体が、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組み合わせが、相乗的である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
ＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９０２１及び３０９４０７の組み合わせを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
３０９０２１、３０９４０７、及び３０９２６５からなる群より選択されるＵｎｉＡｂ（商標）を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
エクト酵素上の少なくとも２つの非重複エピトープに対し結合特異性を有する、多重特異性重鎖抗体。
【請求項２１】
前記エクト酵素が、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ２０３、ＶＡＰ１、ＡＲＴ２、及びＭＴ１−ＭＭＰからなる群より選択される、請求項２０に記載の多重特異性抗体。
【請求項２２】
前記エクト酵素が、ＣＤ３８、ＣＤ３９、またはＣＤ７３である、請求項２１に記載の多重特異性抗体。
【請求項２３】
前記エクト酵素が、ＣＤ３８である、請求項２２に記載の多重特異性抗体。
【請求項２４】
配列番号１〜６０、９９〜１４９、１７５〜２１８、２４７〜３０８、及び３２３〜３９１からなる群より選択される、ＣＤ３８上の非重複エピトープに結合する２つ以上の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の多重特異性抗体。
【請求項２５】
二重特異性である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項２６】
二価である、請求項２５に記載の多重特異性抗体。
【請求項２７】
四価である、請求項２５に記載の多重特異性抗体。
【請求項２８】
（ａ）配列番号１５０及び３９４からなる群より選択されるＣＤＲ１配列、配列番号９２及び４１３からなる群より選択されるＣＤＲ２配列、ならびに配列番号１６８及び４３１からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域、ならびに、（ｂ）配列番号２１９及び３９３からなる群より選択されるＣＤＲ１配列、配列番号８３及び４１２からなる群より選択されるＣＤＲ２配列、ならびに配列番号２４０及び４２４からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域を含む二重特異性である、請求項２２に記載の多重特異性抗体。
【請求項２９】
配列番号１００及び３２３からなる群より選択される第１の重鎖可変領域配列、ならびに、配列番号１７５及び３２５からなる群より選択される第２の重鎖可変領域配列を含む、請求項２８の多重特異性抗体。
【請求項３０】
二価である、請求項２８または２９に記載の多重特異性抗体。
【請求項３１】
四価である、請求項２８または２９に記載の多重特異性抗体。
【請求項３２】
ＩｇＧ１である、請求項２８または２９に記載の多重特異性抗体。
【請求項３３】
（ａ）配列番号３９４のＣＤＲ１配列、配列番号４１３のＣＤＲ２配列、及び配列番号４３１のＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域、ならびに、（ｂ）配列番号１５１のＣＤＲ１配列、配列番号１６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号１７２のＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域を含む二重特異性である、請求項２２に記載の多重特異性抗体。
【請求項３４】
配列番号３２３の第１の重鎖可変領域配列及び配列番号９９の第２の重鎖可変領域配列を含む、請求項３３の多重特異性抗体。
【請求項３５】
二価である、請求項３３または３４に記載の多重特異性抗体。
【請求項３６】
四価である、請求項３３または３４に記載の多重特異性抗体。
【請求項３７】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である、請求項３３または３４に記載の多重特異性抗体。
【請求項３８】
ＵｎｉＡｂ（商標）である、請求項２０〜３７のいずれか１項に記載の多重特異性抗体。
【請求項３９】
ＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９０２１、３０９２６５、３０９４０７、３２１９８６、及び３２１６６３のうちの１つ以上の結合特異性を含む、多重特異性抗体。
【請求項４０】
ＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９０２１、３０９２６５、及び３０９４０７の結合特異性を含む、請求項３９に記載の多重特異性抗体。
【請求項４１】
ＵｎｉＡｂｓ（商標）３２１９８６及び３２１６６３の結合特異性を含む、請求項３９に記載の多重特異性抗体。
【請求項４２】
請求項２０〜４１のいずれか１項に記載の多重特異性抗体のうちの１つ以上の重鎖可変領域配列を含む、ＣＡＲ−Ｔ。
【請求項４３】
請求項１〜１９いずれか１項に記載の組成物、請求項２０〜４１のいずれか１項の多重特異性抗体、または請求項４２に記載のＣＡＲ−Ｔを含む、医薬組成物。
【請求項４４】
エクト酵素の発現を特徴とする疾患または状態の処置のための方法であって、請求項４３に記載の有効量の医薬組成物を、必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４５】
ＣＤ３８、ＣＤ３９、またはＣＤ７３の発現を特徴とする疾患または状態の前記処置のための方法であって、ＣＤ３８、ＣＤ３９、またはＣＤ７３上の２つ以上の非重複エピトープに結合する有効量の多重特異性重鎖抗体を、必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項４６】
前記疾患または状態が、ＣＤ３８の発現を特徴とする、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾患または状態が、血液学的悪性腫瘍、気道過敏性を特徴とする状態、ならびにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の低下を特徴とする加齢関連及び代謝機能障害からなる群より選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記血液悪性腫瘍が、多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及びｄＴ細胞ＡＬＬを含む群から選択される、請求項４７に記載の方法。本発明のＣＤ３８重鎖抗体及び医薬組成物は、喘息及び気道過敏性を特徴とする他の状態、ならびにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の低下を特徴とする加齢関連及び代謝機能障害を処置するために使用することもできる。
【請求項４９】
前記血液悪性腫瘍が、ＭＭである、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記多重特異性抗体が、３０９０２１、３０９２６５、３０９４０７、３２１９８６、及び３２１６６３からなる群より選択される抗体のうちの２つ以上の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む、請求項４６〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記多重特異性抗体が、３０９０２１、３０９２６５、３０９４０７、３２１９８６、及び３２１６６３からなる群より選択されるＵｎｉＡｂｓ（商標）のうちの２つ以上の重鎖可変領域配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記多重特異性抗体が、ＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９２０１及び３０９２６５；ならびに３０９０２１及び３０９４０７；ならびに３２１９８６及び３２１６６３からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記多重特異性抗体が、ＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９２０１及び３０９２６５；ならびに３０９０２１及び３０９４０７；ならびに３２１９８６及び３２１６６３からなる群より選択される重鎖可変領域配列を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
さらに、ＭＭの処置のための１つ以上のさらなる薬剤の投与を含む、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記薬剤が、ダラツムマブ、イサツキシマブ、エロツズマブ、及びＭＭの前記処置に有効な化学療法薬からなる群より選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記化学療法薬が、レナリドマイド、デキサメタゾン、及びボルテゾミブからなる群より選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記化学療法薬が、レナリドマイド及びデキサメタゾンまたはボルテゾミブ及びデキサメタゾンである、請求項５６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月１３日出願の米国仮特許出願第６２／５５８，１４７号の出願日の優先権を主張し、この出願の開示は、参照することによりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、エクト酵素に結合するヒト重鎖抗体（例えば、ＵｎｉＡｂ（商標））に関する。本発明はさらに、そのような抗体の相乗的組み合わせを含むエクト酵素上の非重複エピトープを標的とする重鎖抗体及び多重特異性重鎖抗体の組み合わせに関する。本発明は特に、抗ＣＤ３８重鎖抗体；ＣＤ３８上の非重複エピトープを標的とする抗ＣＤ３８重鎖抗体、ＣＤ３８上の複数の非重複エピトープに対する結合特異性を有する多重特異性重鎖抗ＣＤ３８抗体の相乗的組み合わせを含む組み合わせ；ならびにそのような抗体を作製する方法、そのような抗体を含む医薬組成物を含む組成物、及びそれらの種々の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
エクト酵素
エクト酵素は、細胞外区画の膜の外側に触媒部位を有する膜タンパク質である。これらの細胞表面タンパク質は、多くの機能を促進し、免疫細胞、内皮細胞、及び神経組織細胞などの多種多様な細胞に見出される。エクト酵素は、ヌクレオチダーゼ、シクラーゼ、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、及びオキシダーゼとし得、以下の分子ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ２０３、ＶＡＰ１、ＡＲＴ２、及びＭＴ１−ＭＭＰを含むがこれらに限定されない。
【０００４】
ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ／サイクリックＡＤＰ−リボースヒドロラーゼ１としても知られるＣＤ３８は、エクト酵素活性を有するシングルパスＩＩ型膜貫通タンパク質である。ＮＡＤ（Ｐ）を基質として使用すると、いくつかの産物：環状ＡＤＰリボース（ｃＡＤＰＲ）；ＡＤＰ−リボース（ＡＤＰＲ）；ニコチン酸アデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＡＤＰ）；ニコチン酸（ＮＡ）；ＡＤＰ−リボース−２’−リン酸（ＡＤＰＲＰ）の形成を触媒する（例えば、Ｈ．Ｃ．Ｌｅｅ，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００６，１２：３１７−３２３を参照のこと）。
【０００５】
ＣＤ３８は、主に、形質細胞、活性化エフェクターＴ細胞、抗原提示細胞、肺の平滑筋細胞、多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞、Ｂ細胞リンパ腫、Ｂ細胞白血病細胞、Ｔ細胞リンパ腫細胞、乳がん細胞、骨髄由来抑制細胞、Ｂ制御細胞、及びＴ制御細胞を含む免疫細胞上で発現される。免疫細胞上のＣＤ３８は、内皮細胞及び他の細胞系統により発現されるＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１と相互作用する。この相互作用は、白血球の増殖、移動、Ｔ細胞の活性化、及び単球由来のＤＣ成熟を促進する。
【０００６】
ＣＤ３８に結合する抗体は、例えば、Ｄｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１４，２０（１７）：４５７４−８３、ならびに米国特許第８，１５３，７６５号；同第８，２６３，７４６号；同第８，３６２，２１１号；同第８，９２６，９６９号；同第９，１８７，５６５号；同第９，１９３，７９９号；同第９，２４９，２２６号；及び同第９，６７６，８６９号に記載される。
【０００７】
ヒトＣＤ３８に特異的な抗体であるダラツムマブは、２０１５年に多発性骨髄腫の処置用にヒトでの使用が承認された（Ｓｈａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０１７，６６（６）：６９７−７０３に概説される）。ＣＤ３８に対する別の抗体であるイサツキシマブ（ＳＡＲ６５０９８４）は、多発性骨髄腫の処置について臨床試験中である（例えば、Ｄｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｅｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１４，２０（１７）：４５７４−８３；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１５，１２６：５０９；Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１７，１２９：３２９４−３３０３を参照のこと）。これらの抗体は、強力な補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）、及び腫瘍細胞の間接アポトーシスを誘導する。イサツキシマブはまた、ＣＤ３８のシクラーゼ及び加水分解酵素の酵素活性をブロックし、腫瘍細胞の直接アポトーシスを誘導する。
【０００８】
抗体によるタンパク質のアロステリック調節の例は、ヒト成長ホルモン、インテグリン、及びベータ−ガラクトシダーゼである（Ｌ．Ｐ．Ｒｏｇｕｉｎ  ＆  Ｌ．Ａ．Ｒｅｔｅｇｕｉ，２００３，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５８（４）：３８７−３９４）。これらの例は、異なるエピトープを標的とする単一抗体によるリガンド−受容体相互作用の調節を示す。単一分子上の２つのエピトープを標的とする二重特異性抗体の例は、ｃ−ＭＥＴまたは肝細成長因子受容体（ＨＧＦＲ）に対するものである（ＤａＳｉｌｖａ，Ｊ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ３４：Ａ  ＭＥＴ  ｘ  ＭＥＴ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｐｏｔｅｎｔｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ＭＥＴ−ａｄｄｉｃｔｅｄ  ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ．ＡＡＣＲ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ２０１７；Ａｐｒｉｌ  １−５，２０１７；Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）。
【０００９】
重鎖抗体
従来のＩｇＧ抗体では、重鎖及び軽鎖の会合は、軽鎖定常領域及び重鎖のＣＨ１定常ドメイン間の疎水性相互作用に一部起因している。重鎖及び軽鎖間の疎水性相互作用にも寄与する、重鎖フレームワーク２（ＦＲ２）及びフレームワーク４（ＦＲ４）領域に追加の残基がある。
【００１０】
しかし、ラクダ科の血清（ラクダ、ヒトコブラクダ、及びラマを含むラクダ亜目）は、対をなすＨ鎖のみからなる主要な種類の抗体（重鎖のみ抗体またはＵｎｉＡｂｓ（商標））を含むことが知られている。ラクダ科（Ｃａｍｅｌｕｓ  ｄｒｏｍｅｄａｒｉｕｓ、Ｃａｍｅｌｕｓ  ｂａｃｔｒｉａｎｕｓ、Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ、Ｌａｍａ  ｇｕａｎａｃｏ、Ｌａｍａ  ａｌｐａｃａ、及びＬａｍａ  ｖｉｃｕｇｎａ）のＵｎｉＡｂｓ（商標）は、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）、ヒンジ領域、ならびに２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）からなるユニークな構造を有し、典型的な抗体のＣＨ２及びＣＨ３ドメインと高度に相同である。これらのＵｎｉＡｂｓ（商標）は、ゲノムに存在する定常領域の最初のドメイン（ＣＨ１）を欠くが、ｍＲＮＡプロセシング中にスプライスアウトされる。ＣＨ１ドメインが存在しないことは、このドメインが軽鎖の定常ドメインの固定場所であるので、ＵｎｉＡｂｓ（商標）中に軽鎖が存在しないことを説明する。そのようなＵｎｉＡｂｓ（商標）は、従来の抗体またはそのフラグメント由来の３つのＣＤＲにより抗原結合特異性及び高親和性がもたらされるように自然に進化した（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２００１；Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７４：２７７−３０２、Ｒｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：１１１−１２４）。サメなどの軟骨魚は、軽鎖ポリペプチド鎖を欠き且つ完全に重鎖で構成されている、ＩｇＮＡＲと呼ばれる独自のタイプの免疫グロブリンも進化させてきた。ＩｇＮＡＲ分子は、分子工学により操作され単一重鎖ポリペプチドの可変ドメイン（ｖＮＡＲ）を生成することができる（Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３−３５５４（２００３）、Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５５，１８７−１９７（２００４）、Ｄｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０，２５−３３（２００３））。
【００１１】
軽鎖を欠く重鎖のみ抗体が抗原に結合する能力は、１９６０年代に確立された（Ｊａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５）。軽鎖から物理的に分離された重鎖免疫グロブリンは、四量体抗体に対して８０％の抗原結合活性を保持していた。Ｓｉｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６０，７８１−７９０は、再配列されたマウスμ遺伝子からＣＨ１ドメインを除去すると、哺乳動物細胞培養において、軽鎖を欠く重鎖のみ抗体が産生されることを実証した。産生された抗体は、ＶＨ結合特異性及びエフェクター機能を保持していた。
高い特異性及び親和性を有する重鎖抗体は、免疫感作を通して様々な抗原に対して生成させることができ（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７−４６（１９９９））、ＶＨＨ部分は容易にクローン化され、酵母中で発現させることができる（Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１−２１（２０００））。それらの発現レベル、溶解性、及び安定性は、古典的なＦ（ａｂ）またはＦｖフラグメントのレベルよりも有意に高い（Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，５２１−５２６（１９９７））。
λ（ラムダ）軽（Ｌ）鎖遺伝子座、及び／または、λ及びκ（カッパ（ｋａｐｐａ））Ｌ鎖遺伝子座が機能的にサイレンシングされているマウス、ならびにそのようなマウスによって産生される抗体は、米国特許第７，５４１，５１３号及び同第８，３６７，８８８号に記載される。マウス及びラットにおける重鎖のみ抗体の組み換え産生は、例えば、ＷＯ２００６００８５４８、米国特許出願公開第２０１００１２２３５８号、Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１０９（１），９３−１０１、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；２００６，２６（５）：３７７−９０、及びＺｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；２０４（１３）：３２７１−３２８３に報告されている。ジンクフィンガーヌクレアーゼの胚マイクロインジェクションによるノックアウトラットの生成は、Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５（５９３９）：４３３に記載される。可溶性重鎖のみ抗体及びそのような抗体を産生する異種重鎖遺伝子座を含むトランスジェニックげっ歯類は、米国特許第８，８８３，１５０号及び同第９，３６５，６５５号に記載される。結合（標的化）ドメインとして単一ドメイン抗体を含むＣＡＲ−Ｔ構造は、例えば、Ｉｒｉ−Ｓｏｆｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１７：２６３０−２６４１及びＪａｍｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１８４０：３７８−３８６に記載される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】米国特許第８，１５３，７６５号明細書
【特許文献２】米国特許第８，２６３，７４６号明細書
【特許文献３】米国特許第８，３６２，２１１号明細書
【特許文献４】米国特許第８，９２６，９６９号明細書
【特許文献５】米国特許第９，１８７，５６５号明細書
【特許文献６】米国特許第９，１９３，７９９号明細書
【特許文献７】米国特許第９，２４９，２２６号明細書
【特許文献８】米国特許第９，６７６，８６９号明細書
【特許文献９】米国特許第７，５４１，５１３号明細書
【特許文献１０】米国特許第８，３６７，８８８号明細書
【特許文献１１】国際公開第２００６／００８５４８号
【特許文献１２】米国特許出願公開第２０１００１２２３５８号明細書
【特許文献１３】米国特許第８，８８３，１５０号明細書
【特許文献１４】米国特許第９，３６５，６５５号明細書
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Ｈ．Ｃ．Ｌｅｅ，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，２００６，１２：３１７−３２３
【非特許文献２】Ｄｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２０１４，２０（１７）：４５７４−８３
【非特許文献３】Ｓｈａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０１７，６６（６）：６９７−７０３
【非特許文献４】Ｄｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃｅｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１４，２０（１７）：４５７４−８３
【非特許文献５】Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１５，１２６：５０９
【非特許文献６】Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２０１７，１２９：３２９４−３３０３
【非特許文献７】Ｌ．Ｐ．Ｒｏｇｕｉｎ  ＆  Ｌ．Ａ．Ｒｅｔｅｇｕｉ，２００３，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５８（４）：３８７−３９４
【非特許文献８】Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，２００１；Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７４：２７７−３０２
【非特許文献９】Ｒｅｖｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：１１１−１２４
【非特許文献１０】Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，３５４３−３５５４（２００３）
【非特許文献１１】Ｎｕｔｔａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ５５，１８７−１９７（２００４）
【非特許文献１２】Ｄｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０，２５−３３（２００３）
【非特許文献１３】Ｊａｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９６８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７，４１８５−４１９５
【非特許文献１４】Ｓｉｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｃｅｌｌ，６０，７８１−７９０
【非特許文献１５】ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｌｉｎｄｅｎ，Ｒ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１４３１，３７−４６（１９９９）
【非特許文献１６】Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７８，１１−２１（２０００）
【非特許文献１７】Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４，５２１−５２６（１９９７）
【非特許文献１８】Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；１０９（１），９３−１０１
【非特許文献１９】Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．；２００６，２６（５）：３７７−９０
【非特許文献２０】Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ；２０４（１３）：３２７１−３２８３
【非特許文献２１】Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２５（５９３９）：４３３
【非特許文献２２】Ｉｒｉ−Ｓｏｆｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３１７：２６３０−２６４１
【非特許文献２３】Ｊａｍｎａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，１８４０：３７８−３８６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、少なくとも部分的に、限定されないが、ＵｎｉＡｂｓ（商標）を含む、エクト酵素上の非重複エピトープへの結合親和性を有する重鎖抗体が、同じエピトープに個々に結合する抗体と比較して特性が改善されているという知見に基づく。
【００１５】
一態様では、本発明は、同じエクト酵素上の非重複エピトープに結合する２つ以上の重鎖抗体の組み合わせを含む組成物に関する。
【００１６】
一実施形態では、エクト酵素は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ２０３、ＶＡＰ１、ＡＲＴ２、及びＭＴ１−ＭＭＰからなる群より選択される。
【００１７】
別の実施形態では、エクト酵素は、ＣＤ３８、ＣＤ３９、またはＣＤ７３、好ましくは、ＣＤ３８である。
【００１８】
さらなる実施形態では、重鎖抗体は、ＵｎｉＡｂ（商標）である。
【００１９】
さらに別の実施形態では、２つ以上の重鎖抗体は、配列番号１〜６０、９９〜１４９、１７５〜２１８、２４７〜３０８、及び３２３〜３９１からなる群より選択される重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【００２０】
さらなる実施形態では、重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号１、９９、１７５、２４７、及び３２３からなる群より選択される。
【００２１】
別の実施形態では、重鎖可変領域アミノ酸配列は、配列番号９９、１７５、及び３２３からなる群より選択される。
【００２２】
さらに別の実施形態では、本明細書の組成物は、第１及び第２の重鎖抗体の組み合わせを含み、
（ａ）第１の抗体は、配列番号３９４のＣＤＲ１配列、配列番号４１３のＣＤＲ２配列、及び配列番号４３１のＣＤＲ３配列を含み、
（ｂ）第２の抗体は、配列番号２１９のＣＤＲ１配列、配列番号８３のＣＤＲ２配列、及び配列番号２４０のＣＤＲ３配列を含む。
【００２３】
さらなる実施形態では、第１の抗体は、配列番号３２３の重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、第２の抗体は、配列番号１７５の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【００２４】
さらに別の実施形態では、第１及び第２の抗体は、ＩｇＧ１である。
【００２５】
一実施形態では、第１及び第２の抗体の組み合わせは、相乗的である。
【００２６】
特定の実施形態では、本明細書の組成物は、ＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９０２１及び３０９２６５の組み合わせを含む。
【００２７】
別の実施形態では、本明細書の組成物は、第１及び第２の重鎖抗体の組み合わせを含み、第１の抗体は、配列番号３９４のＣＤＲ１配列、配列番号４１３のＣＤＲ２配列、及び配列番号４３１のＣＤＲ３配列を含み、第２の抗体は、配列番号１５１のＣＤＲ１配列、配列番号１６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号１７２のＣＤＲ３配列を含む。
【００２８】
さらに別の実施形態では、第１の抗体は、配列番号３２３の重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、第２の抗体は、９９の重鎖可変領域アミノ酸配列を含み、第１及び第２の抗体は、例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４であってよく、相乗的であってよい。
【００２９】
特定の実施形態では、組成物は、ＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９０２１及び３０９４０７の組み合わせを含む。
【００３０】
別の特定の実施形態では、組成物は、３０９０２１、３０９４０７、及び３０９２６５からなる群より選択されるＵｎｉＡｂ（商標）を含む。
【００３１】
さらなる態様では、本発明は、エクト酵素上の少なくとも２つの非重複エピトープに対する結合特異性を有する多重特異性重鎖抗体に関する。
【００３２】
一実施形態では、エクト酵素は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ２０３、ＶＡＰ１、ＡＲＴ２、及びＭＴ１−ＭＭＰからなる群より選択される。
【００３３】
種々の実施形態では、エクト酵素は、ＣＤ３８、ＣＤ３９、またはＣＤ７３、好ましくは、ＣＤ３８である。
【００３４】
一実施形態では、多重特異性抗体が、配列番号１〜６０、９９〜１４９、１７５〜２１８、２４７〜３０８、及び３２３〜３９１からなる群より選択される、ＣＤ３８上の非重複エピトープに結合する２つ以上の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む。
【００３５】
第２の実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性である。
【００３６】
第３の実施形態では、多重特異性抗体は、二価である。
【００３７】
第４の実施形態では、多重特異性抗体は、四価である。
【００３８】
さらなる実施形態では、多重特異性抗体は、（ａ）配列番号３９４のＣＤＲ１配列、配列番号４１３のＣＤＲ２配列、及び配列番号４３１のＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域、ならびに、（ｂ）配列番号２１９のＣＤＲ１配列、配列番号８３のＣＤＲ２配列、及び配列番号２４０のＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域、を含む二重特異性であり、抗体は、二価または四価であってよい。
【００３９】
さらに別の実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号３２３の第１の重鎖可変領域配列及び配列番号１７５の第２の重鎖可変領域配列を含み、抗体は、二価または四価であってよい。
【００４０】
一実施形態では、列挙されたＣＤＲ／可変領域配列を有する、本明細書の多重特異性抗体は、ＩｇＧ１である。
【００４１】
別の実施形態では、多重特異性抗体は、（ａ）配列番号３９４のＣＤＲ１配列、配列番号４１３のＣＤＲ２配列、及び配列番号４３１のＣＤＲ３配列を含む第１の重鎖可変領域、ならびに、（ｂ）配列番号１５１のＣＤＲ１配列、配列番号１６３のＣＤＲ２配列、及び配列番号１７２のＣＤＲ３配列を含む第２の重鎖可変領域を含む二重特異性であり、抗体は、二価または四価であってよい。
【００４２】
さらに別の実施形態では、多重特異性抗体は、配列番号３２３の第１の重鎖可変領域配列及び配列番号９９の第２の重鎖可変領域配列を含み、二価または四価であってよい。
【００４３】
一実施形態では、列挙されたＣＤＲ／可変領域配列を有する本明細書の多重特異性抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。
【００４４】
別の実施形態では、多重特異性抗体は、ＵｎｉＡｂ（商標）である。
【００４５】
さらに別の実施形態では、多重特異性抗体は、ＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９０２１、３０９２６５、及び３０９４０７のうちの１つ以上の結合特異性を含む。
【００４６】
さらなる実施形態では、多重特異性抗体は、ＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９０２１及び３０９２６５の結合特異性を含む。
【００４７】
さらに別の実施形態では、多重特異性抗体は、ＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９０２１及び３０９４０７の結合特異性を含む。
【００４８】
さらなる態様では、本発明は、本明細書の多重特異性抗体の１つ以上の重鎖可変領域配列を含むＣＡＲ−Ｔに関する。
【００４９】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書の組成物または多重特異性抗体またはＣＡＲ−Ｔを含む医薬組成物に関する。
【００５０】
さらに別の態様では、本発明は、有効量の本明細書の医薬組成物を必要とする対象に投与することを含む、エクト酵素の発現を特徴とする疾患または状態の処置のための方法に関する。
【００５１】
異なる態様では、本発明は、ＣＤ３８、ＣＤ３９、またはＣＤ７３の発現を特徴とする疾患または状態の処置のための方法に関し、方法は、ＣＤ３８、ＣＤ３９、またはＣＤ７３上の２つ以上の非重複エピトープに結合する有効量の多重特異性重鎖抗体を必要とする対象に投与することを含む。
【００５２】
一実施形態では、疾患または状態は、ＣＤ３８の発現を特徴とし、例えば、血液悪性腫瘍、気道過敏性を特徴とする状態、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の低下を特徴とする加齢関連及び代謝機能障害からなる群より選択されてもよい。
【００５３】
一実施形態では、血液悪性腫瘍は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、及びｄＴ細胞ＡＬＬを含む群から選択される。本発明のＣＤ３８重鎖抗体及び医薬組成物は、喘息及び気道過敏性を特徴とする他の状態、ならびにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の低下を特徴とする加齢関連及び代謝機能障害を処置するために使用することもでき、好ましくは、ＭＭである。
【００５４】
さらなる実施形態では、本明細書の処置方法で使用される多重特異性抗体は、抗体３０９０２１、３０９２６５、及び３０９４０７のうちの２つ以上の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む。
【００５５】
さらに別の実施形態では、本明細書の処置方法で使用される多重特異性抗体は、ＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９０２１、３０９２６５、及び３０９４０７のうちの２つ以上の重鎖可変領域配列：またはＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９２０１及び３０９２６５、または３０９０２１及び３０９４０７の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列；またはＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９２０１及び３０９２６５、または３０９０２１及び３０９４０７の重鎖可変領域配列を含む。
【００５６】
別の実施形態では、本明細書の処置方法はさらに、ＭＭの処置のための１つ以上のさらなる薬剤の投与を含む。
【００５７】
一実施形態では、さらなる薬剤は、ＭＭの処置に有効なダラツムマブ、イサツキシマブ、エロツズマブ、及び化学療法薬からなる群より選択され、化学療法薬は、例えば、レナリドマイド、デキサメタゾン、またはボルテゾミブ、例えば、レナリドマイド及びデキサメタゾンまたはボルテゾミブ及びデキサメタゾン、であってよい。
【００５８】
好ましい一実施形態では、第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の非重複ＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する二重特異性二価重鎖抗体は、配列番号１５０のＣＤＲ１配列、配列番号９２のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６８のＣＤＲ３配列、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインを含む重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む、第１のＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する第１のポリペプチド、ならびに配列番号３９３のＣＤＲ１配列、配列番号４１２のＣＤＲ２配列、及び配列番号４２４のＣＤＲ３配列、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインを含む重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む、第２のＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する第２のポリペプチド、ならびに第１のポリペプチドのＣＨ２ドメイン及び第２のポリペプチドのＣＨ２ドメイン間の非対称界面、ならびにヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、またはサイレンシングされたＩｇＧ４  Ｆｃ領域であるＦｃ領域を含む。
【００５９】
好ましい一実施形態では、第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の非重複ＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する二重特異性四価重鎖抗体は、２つの同一のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、配列番号１５０のＣＤＲ１配列、配列番号９２のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６８のＣＤＲ３配列を含む、第１のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第１の抗原結合ドメイン、配列番号３９３のＣＤＲ１配列、配列番号４１２のＣＤＲ２配列、及び配列番号４２４のＣＤＲ３配列を含む、第２のＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する重鎖抗体の第２の抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメイン、ならびにヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、またはサイレンシングされたＩｇＧ４  Ｆｃ領域であるＦｃ領域を含む。
【００６０】
好ましい一実施形態では、第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の非重複ＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する二重特異性四価重鎖抗体は、第１及び第２の重鎖ポリペプチドを含み、第１の重鎖ポリペプチドは、第１のＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する重鎖抗体の２つの抗原結合ドメインを含み、各抗原結合ドメインは、配列番号１５０のＣＤＲ１配列、配列番号９２のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６８のＣＤＲ３配列、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメイン、ならびに第１のポリペプチドのＣＨ２ドメイン及び第２のポリペプチドのＣＨ２ドメイン間の非対称界面を含み、第２の重鎖ポリペプチドは、第２のＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する重鎖抗体の２つの抗原結合ドメインを含み、各抗原結合ドメインは、配列番号３９３のＣＤＲ１配列、配列番号４１２のＣＤＲ２配列、及び配列番号４２４のＣＤＲ３配列、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメイン、第１のポリペプチドのＣＨ２ドメイン及び第２のポリペプチドのＣＨ２ドメイン間の非対称界面、ならびにヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、またはサイレンシングされたＩｇＧ４  Ｆｃ領域であるＦｃ領域を含む。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１−１】ファミリー１抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）可変ドメインアミノ酸配列を示す。
【図１−２】同上。
【図１−３】同上。
【図１−４】同上。
【図２】ファミリー１抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体のユニークなＣＤＲ配列を示す。
【図３−１】ファミリー１抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を示す。
【図３−２】同上。
【図４−１】ファミリー１抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体の生物学的活性を示す。
【図４−２】同上。
【図４−３】同上。
【図５−１】ファミリー３抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）可変ドメインアミノ酸配列を示す。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図５−４】同上。
【図６】ファミリー３抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体のユニークなＣＤＲ配列を示す。
【図７−１】ファミリー３抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を示す。
【図７−２】同上。
【図８−１】ファミリー３抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体の生物学的活性を示す。
【図８−２】同上。
【図９−１】ファミリー４抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）可変ドメインアミノ酸配列を示す。
【図９−２】同上。
【図９−３】同上。
【図１０】ファミリー４抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体のユニークなＣＤＲ配列を示す。
【図１１−１】ファミリー４抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を示す。
【図１１−２】同上。
【図１２−１】ファミリー４抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体の生物学的活性を示す。
【図１２−２】同上。
【図１３−１】ファミリー７抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）可変ドメインアミノ酸配列を示す。
【図１３−２】同上。
【図１３−３】同上。
【図１３−４】同上。
【図１４】ファミリー７抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体のユニークなＣＤＲ配列を示す。
【図１５−１】ファミリー７抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を示す。
【図１５−２】同上。
【図１５−３】同上。
【図１６−１】ファミリー７抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体の生物学的活性を示す。
【図１６−２】同上。
【図１６−３】同上。
【図１７−１】ファミリー９抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）可変ドメインアミノ酸配列を示す。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１７−４】同上。
【図１７−５】同上。
【図１８】ファミリー９抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体のユニークなＣＤＲ配列を示す。
【図１９−１】ファミリー９抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を示す。
【図１９−２】同上。
【図１９−３】同上。
【図２０−１】ファミリー９抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体の生物学的活性を示す。
【図２０−２】同上。
【図２０−３】同上。
【図２１】２つの四価の二重特異性重鎖抗体及び１つの二価の二重特異性重鎖抗体の概略図である。ノブイントゥーホール技術を使用して表された、対称抗体構造がパネルａに示され、非対称抗体がパネルｂ及びｃに示される。ＣＤ３８上の非重複エピトープに結合するＶＨドメインは、塗りつぶしの異なる色合いで示される。
【図２２】ＣＤ３８抗原で免疫したＵｎｉＲａｔｓ（商標）の血清力価。全ての免疫された動物は、標準的な固相抗原ＥＬＩＳＡアッセイで、ヒト及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ３８タンパク質と共に顕著な血清活性を有する。
【図２３】５つのユニークな重鎖ＣＤＲ３配列ファミリーを表すＵｎｉＡｂｓ（商標）が、各ファミリーがユニークな特性セットを発揮して、様々な機能的挙動を呈することを示す。ＩｇＧ１  ＵｎｉＡｂ（商標）形式での追加機能スクリーニングのために、５つのＣＤＲ３配列ファミリー（クローンＩＤ番号３０８９３６；３０９０２１；３０９２４６；３０９４０７；及び３０９２６５）のそれぞれから、単一リードＶＨ配列を選択した。一部のアッセイでは、ダラツムマブ及びイサツキシマブが参照対照として含まれていた。ヒト及びｃｙｎｏ  ＣＤ３８タンパク質への結合、ならびにヒトまたはｃｙｎｏ  ＣＤ３８のいずれかを発現する細胞への結合について、各ＵｎｉＡｂ（商標）を特性決定した。加えて、ＣＤ３８の天然シクラーゼ（酵素）活性を阻害する能力、ならびに適切なアッセイ条件下でＣＤ３８発現哺乳動物細胞上の間接アポトーシス、直接アポトーシス、ＡＤＣＣ、及びＣＤＣを刺激する能力について、ＵｎｉＡｂｓ（商標）を評価した。
【図２４】異なる濃度のダラツムマブが混合された異なる組み合わせのＵｎｉＡｂ（商標）３０９４０７（１２．５ｎＭの濃度）のＣＤＣを示す。ＵｎｉＤａｂ（商標）３０９４０７は、ＣＤＣだけではＲａｍｏｓ細胞を溶解させなかった。ＵｎｉＡｂ（商標）３０９４０７と混合されたダラツムマブは、ダラツムマブ単独よりも強力であった。ヒトＩｇＧ４バックグラウンド上のＵｎｉＡｂ（商標）３０９４０７はさらに、ダラツムマブのＣＤＣ活性を増加させた。ＩｇＧ４は、補体に結合しない。これは、ＣＤ３８へのＵｎｉＡｂ（商標）３０９４０７の結合が、非重複エピトープに結合する抗体のＣＤＣ活性を調節することを示す。
【図２５】ＵｎｉＡｂ（商標）ＩＤ３０９０２１及びＩＤ３０９４０７のＶＨドメインを含むＵｎｉＡｂ（商標）ならびに四価二重特異性ＵｎｉＡｂｓ（商標）の組み合わせの補体結合を示す。これらの２つのＵｎｉＡｂｓ（商標）及びそのＶＨドメインは、ＣＤ３８の２つの非重複エピトープに結合する。これらの２つのＣＤ３８バインダーを単一の四価抗体（３０９０２１＿３０９４０７＿２ＸＧＳｌｉｎｋ）に組み合わせると、強力な補体結合及び腫瘍細胞の死滅が生じた。ＵｎｉＡｂｓ（商標）及び四価二重特異性ＵｎｉＡｂ（商標）の混合物は、ダラツムマブと比較して、より効果的なＲａｍｏｓ細胞のＣＤＣを誘導した。個々のＵｎｉＡｂｓ（商標）は、ＣＤＣを誘発しなかった。
【図２６】二価及び四価のＵｎｉＡｂｓ（商標）によるＣＤ３８のシクラーゼ活性の酵素阻害を示す。ＣＤ３８上の２つの非重複エピトープに結合する四価二重特異性ＵｎｉＡｂ（商標）は、シクラーゼ活性を強力に阻害した。二価単一特異性ＵｎｉＡｂｓ（商標）は、シクラーゼ活性を阻害しなかった。抗ＢＣＭＡ  ＵｎｉＡｂ（商標）を、陰性対照として使用した。
【図２７】ＣＤ３８への結合について抗体間の競合を示す。５つの配列ファミリーのＵｎｉＡｂｓ（商標）は、ダラツムマブ及びイサツキシマブがＣＤ３８＋細胞へのＵｎｉＡｂ（商標）の結合をブロックする能力に基づいて、２つの広範な競合グループに分類される。ダラツムマブ及びイサツキシマブのエピトープと部分的または完全に重複するエピトープを有するＵｎｉＡｂｓ（商標）を同定するために、フローサイトメトリーを使用して、ダラツムマブまたはイサツキシマブを用いるＲａｍｏｓ細胞の前処理によりブロックされるＵｎｉＡｂ（商標）結合のパーセントを測定した。ブロッキングの割合が増加すると、２つの抗体が重複エピトープを有する可能性が高くなる。このセットでは、ファミリーＦ０１、Ｆ０４、Ｆ０７、及びＦ０９は全て、ダラツムマブ及びイサツキシマブの両方による、少なくともある程度のブロッキングを示し、重複エピトープへの結合の可能性が示される（競合グループ１に入れる）。対照的に、Ｆ０３  ＵｎｉＡｂ（商標）（３０９４０７）の結合は、ダラツムマブまたはイサツキシマブのいずれかでの前処理によりブロックされず、異なるエピトープに結合する可能性が高いことを示す（競合グループ２に入れる）。
【図２８】Ｒａｍｏｓ細胞に対するＣＤＣ活性を示す。ＵｎｉＡｂ（商標）３０９０２１を滴定し、固定濃度の異なるＵｎｉＡｂｓ（商標）と混合した（凡例を参照のこと）。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の形式のＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９４０７は、ＵｎｉＡｂ（商標）３０９０２１との相乗作用を示した。ＩｇＧ１形式のＵｎｉＡｂ（商標）３０９２６５は、ＵｎｉＡｂ（商標）３０９０２１との相乗作用を示した。他の全てのＵｎｉＡｂ（商標）は、ＵｎｉＡｂ（商標）３０９０２１と相乗作用しなかった。
【図２９】これらの同じ２つのＵｎｉＡｂｓの二価単一特異性混合物の混合物と比較した、クローンＩＤ３２１９８６及びクローンＩＤ３２１６６３のＶＨドメインを含む四価二重特異性ＵｎｉＡｂｓによる、Ｒａｍｏｓ細胞上のＣＤＣ媒介性活性を示す
【図３０】クローンＩＤ３２１９８６及びクローンＩＤ３２１６６３のＶＨドメインを含む四価二重特異性ＵｎｉＡｂｓによる、Ｒａｍｏｓ細胞の直接腫瘍細胞アポトーシスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
本発明の実施は、他に示さない限り、当技術分野の範囲内である分子生物学（組み換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を用いるであろう。そのような技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１９９４）；“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（Ｐｅｒｂａｌ  Ｂｅｒｎａｒｄ  Ｖ．，１９８８）；“Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）；Ｈａｒｌｏｗ，Ｌａｎｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｎｏ．Ｉ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９９８）；及びＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；（１９８８）などの文献で十分に説明される。
【００６３】
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値及び下限値間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。それらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、また、記載範囲内の任意の具体的な除外限度を条件に、本発明に包含される。記載範囲が一端または両端を含む場合、それらの含まれる一端または両端を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００６４】
特記しない限り、本明細書中の抗体残基は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））。
【００６５】
以下の説明では、本発明の完全な理解を提供するために、多くの具体的な詳細が述べられている。しかし、本発明がこれらの具体的な詳細のうちの１つ以上を用いずに実施され得ることは、当業者には明らかであろう。他の例では、本発明を曖昧にすることを避けるために、当業者らに周知の、周知の特徴及び手順は説明されていない。
【００６６】
特許出願及び刊行物を含む、本開示の全体にわたって引用される全ての参考文献は、全体が参照により組み込まれる。
【００６７】
Ｉ．定義
「含む」は、列挙された要素が組成物／方法／キットに必要とされることを意味するが、請求項の範囲内で組成物／方法／キットなどを形成するために他の要素が含まれてもよい。
【００６８】
「から本質的になる」は、記載された組成物または方法の範囲を、本発明の基本的及び新規な特徴（複数可）に実質的に影響を与えない特定の材料またはステップに限定することを意味する。
【００６９】
「からなる」は、任意の要素の組成、方法、またはキット、請求項で指定されていないステップ、または成分の除外を意味する。
【００７０】
「抗体」という用語は、最も広い意味で本明細書で使用され、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、モノマー、ダイマー、マルチマー、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、重鎖のみ抗体、三鎖抗体、単鎖Ｆｖ、ナノボディなどを網羅し、所望の生物学的活性を呈する限り、抗体フラグメントも含む（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ（２００３）Ｊｏｕｒ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７０：４８５４−４８６１）。抗体は、マウス、ヒト、ヒト化、キメラ、または他の種に由来するものであってよい。
【００７１】
抗体という用語は、完全長重鎖、完全長軽鎖、インタクト免疫グロブリン分子、またはこれらのポリペプチドのいずれかの免疫学的に活性な部分、すなわち、目的の標的の抗原またはその一部に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含むポリペプチドを指してもよく、そのような標的は、がん細胞または自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞を含むが、これらに限定されない。本明細書に開示の免疫グロブリンは、エフェクター細胞活性の低減または増強をもたらす改変Ｆｃ部分を用いて操作されたサブクラスを含む、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、またはサブクラスのものとし得る。免疫グロブリンは、任意の種に由来し得る。一態様では、免疫グロブリンは、大部分がヒト起源である。
【００７２】
本明細書の抗体残基は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム及びＥＵナンバリングシステムに従って番号付けされる。可変ドメイン中の残基（重鎖の約１〜１１３残基）を指す場合、Ｋａｂａｔ番号付けシステムが一般的に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵナンバリングシステム」または「ＥＵインデックス」は、免疫グロブリン重鎖定常領域の残基を指す時に一般的に使用される（例えば、上掲のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．報告されたＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔのようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号を指す。本明細書で別途記載のない限り、抗体の可変ドメインにおける残基番号への言及は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによる残基番号付けを意味する。本明細書で別途記載のない限り、抗体の定常ドメインにおける残基番号への言及は、ＥＵナンバリングシステムによる残基番号付けを意味する。
【００７３】
「モノクローナル抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、実質的に同種の抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、その集団に含まれる個別の抗体は、微量で存在し得る可能な自然に発生する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、通常異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。
【００７４】
抗体に関連して使用される「可変」という用語は、抗体可変ドメインの特定の部分の配列が抗体間で広範に異なるという事実を指し、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特異性において使用される。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン全体にわたって均等には分布していない。これは、軽鎖及び重鎖の両方の可変ドメイン中の超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。本来の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、３つの超可変領域により連結される、βシート構成を主に採用する４つのＦＲを含み、これらは、ループ連結を形成し、一部の場合では、βシート立体配置の一部を形成する。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによって近接近し一緒に保持されており、他方の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への関与などの種々のエフェクター機能を呈する。
【００７５】
「超可変領域」という用語は、本明細書に使用される時、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、重鎖可変ドメイン中の残基３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）、及び９５〜１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ．（１９９１））、及び／または、「超可変ループ」由来のそれらの残基、重鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）、及び９６〜１０１（Ｈ３）、Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  ＬｅｓｋＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義される超可変領域残基以外のそれらの可変ドメイン残基である。
【００７６】
例示的なＣＤＲ指定が本明細書に示されるが、当業者は、配列可変性に基づいており且つ最も一般的に使用されるＫａｂａｔ定義を含むＣＤＲの多くの定義が一般的に使用されることを理解するであろう（“Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｇｅｒｍｌｉｎｅ  ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  ｂａｓｅｄ  ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０；４７：６９４−７００を参照のこと）。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、構造ループ領域の位置に基づく（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．“Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ．”Ｎａｔｕｒｅ．１９８９；３４２：８７７−８８３）。重要な代替のＣＤＲ定義は、Ｈｏｎｅｇｇｅｒ，“Ｙｅｔ  ａｎｏｔｈｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎｓ：ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｏｏｌ．”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００１；３０９：６５７−６７０、Ｏｆｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎｓ（ＣＤＲｓ）ｒｅｖｅａｌｓ  ｐｅｃｕｌｉａｒ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ＣＤＲｓ  ａｎｄ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ．”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；１８１：６２３０−６２３５、Ａｌｍａｇｒｏ“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｓｉｚｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ．”Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．２００４；１７：１３２−１４３、及びＰａｄｌａｎｅｔ  ａｌ．“Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．”ＦａｓｅｂＪ．１９９５；９：１３３−１３９により開示されたものを含み、これらのそれぞれは、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
【００７７】
「重鎖のみ抗体」及び「重鎖抗体」という用語は、互換的に使用され、最も広い意味で、従来の抗体の軽鎖を欠く抗体を指す。この用語は具体的には、限定されないが、ＣＨ１ドメインが存在しない、ＶＨ抗原結合ドメイン及びＣＨ２及びＣＨ３定常ドメイン、そのような抗体の機能的（抗原結合）多様体、可溶性ＶＨ多様体、１つの可変ドメイン（Ｖ−ＮＡＲ）及び５つのＣ様定常ドメイン（Ｃ−ＮＡＲ）のホモ二量体を含むＩｇ−ＮＡＲ、ならびにそれらの機能フラグメント、ならびに可溶性単一ドメイン抗体（ｓＵｎｉＤａｂ（商標））を含むホモ二量体抗体である。一実施形態では、重鎖のみ抗体は、フレームワーク１、ＣＤＲ１、フレームワーク２、ＣＤＲ２、フレームワーク３、ＣＤＲ３、及びフレームワーク４からなる可変領域抗原結合ドメインから構成される。別の実施形態では、重鎖のみ抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成される。別の実施形態では、重鎖のみ抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ２ドメインから構成される。さらなる実施形態では、重鎖のみ抗体は、抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、及びＣＨ３ドメインから構成される。ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメインがトランケートされている重鎖のみ抗体もまた本明細書に含まれる。さらなる実施形態では、重鎖は、抗原結合ドメイン、及び少なくとも１つのＣＨ（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）ドメインから構成されるが、ヒンジ領域は含まない。重鎖のみ抗体は、２つの重鎖が他の方法では共有結合または非共有結合で互いにジスルフィド結合している二量体の形態とし得る。重鎖のみ抗体は、ＩｇＧサブクラスに属し得るが、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥサブクラスなどの他のサブクラスに属する抗体もまた本明細書に含まれる。特定の実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブタイプ、特に、ＩｇＧ１サブタイプである。一実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ４サブタイプのものであり、ＣＨドメインのうちの１つ以上は、抗体のエフェクター機能を変化させるために改変される。一実施形態では、重鎖抗体は、ＩｇＧ１サブタイプのものであり、ＣＨドメインのうちの１つ以上は、抗体のエフェクター機能を変化させるために改変される。エフェクター機能を変化させるＣＨドメインの改変はさらに、本明細書で説明される。
【００７８】
一実施形態では、本明細書の重鎖のみ抗体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の結合（標的化）ドメインとして使用される。定義は具体的には、ＵｎｉＡｂ（商標）と呼ばれるヒト免疫グロブリントランスジェニックラット（ＵｎｉＲａｔ（商標））により産生されるヒト重鎖のみ抗体を含む。ＵｎｉＡｂ（商標）の可変領域（ＶＨ）は、ＵｎｉＤａｂｓ（商標）と呼ばれ、効力を増加させ且つ半減期を延長させた、マルチ特異性を有する新規治療薬の開発のために、Ｆｃまたは血清アルブミンに連結させることができる多機能の構成単位である。ホモ二量体ＵｎｉＡｂｓ（商標）は軽鎖を欠き、従って、ＶＬドメインを欠くので、抗原は１つの単一ドメイン、すなわち重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン（ＶＨ）によって認識される。
【００７９】
本明細書で使用される「インタクト抗体鎖」は、全長可変領域及び全長定常領域（Ｆｃ）を含むものである。インタクトな「従来の」抗体は、インタクト軽鎖及びインタクト重鎖、ならびに分泌型ＩｇＧのための軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖定常ドメイン、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３を含む。ＩｇＭまたはＩｇＡなどの他のアイソタイプは、異なるＣＨドメインを有してもよい。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列多様体であってよい。インタクト抗体は、抗体のＦｃ定常領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列多様体Ｆｃ領域）に起因する生物学的活性を指す１つ以上の「エフェクター機能」を有してもよい。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、及び細胞表面受容体の下方制御が含まれる。定常領域多様体は、エフェクタープロファイル、Ｆｃ受容体への結合などを変化させるものを含む。
【００８０】
重鎖のＦｃ（定常ドメイン）のアミノ酸配列に応じて、抗体及び種々の抗原結合タンパク質を異なるクラスとして提供することができる。重鎖Ｆｃ領域の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらのいくつかはさらに、「サブクラス」（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２に分けられてもよい。抗体の異なるクラスに対応するＦｃ定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれてもよい。サブユニット構造及び異なるクラスの免疫グロブリンの三次元立体配置は周知である。Ｉｇ型は、ヒンジ改変型またはヒンジレス型を含む（Ｒｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：４０８３−４０９０；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：７２４６−７２５６；ＵＳ２００５／００４８５７２；ＵＳ２００４／０２２９３１０）。任意の脊椎動物種の抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる２つのタイプのうちの１つに割り当てることができる。
【００８１】
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。エフェクター機能の非限定例としては、Ｃ１ｑ結合；ＣＤＣ；Ｆｃ受容体結合；ＡＤＣＣ；ＡＤＣＰ；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御などが挙げられる。そのようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域が受容体、例えば、ＦｃγＲＩ；ＦｃγＲＩＩＡ；ＦｃγＲＩＩＢ１；ＦｃγＲＩＩＢ２；ＦｃγＲＩＩＩＡ；及びＦｃγＲＩＩＩＢ受容体、と相互作用する必要があり、低親和性ＦｃＲｎ受容体は、当技術分野で既知の種々のアッセイを使用して評価することができる。「死んだ」または「サイレンシングされた」Ｆｃは、例えば、血清半減期の延長に関して活性を保持するように変異しているが、これは、高親和性Ｆｃ受容体を活性化しないものである。
【００８２】
「天然配列Ｆｃ領域」は、自然界に見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。天然配列ヒトＦｃ領域は、例えば、天然配列ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域（非Ａ及びＡアロタイプ）；天然配列ヒトＩｇＧ２  Ｆｃ領域；天然配列ヒトＩｇＧ３  Ｆｃ領域；及び天然配列ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、ならびにその天然に存在する多様体を含む。
【００８３】
「多様性Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸改変、好ましくは、１つ以上のアミノ酸置換（複数可）により、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列は異なるものを含む。好ましくは、多様性Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域に、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、約１〜約１０のアミノ酸置、好ましくは、約１〜約５つのアミノ酸置換、を有する。本明細書の多様性Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域及び／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、最も好ましくは、それと少なくとも約９０％の相同性、より好ましくは、それと少なくとも約９５％相同性を有するであろう。
【００８４】
多様性Ｆｃ配列は、ＥＵインデックス位置２３４、２３５、及び２３７でのＦｃγＲＩ結合を低減させるために、ＣＨ２領域に３つのアミノ酸置換を含んでもよい（Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３を参照のこと）。ＥＵインデックス位置３３０及び３３１の補体Ｃ１ｑ結合部位の２つのアミノ酸置換は、補体結合を低減させる（Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８：６６１（１９９３）及びＣａｎｆｉｅｌｄ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７３：１４８３（１９９１）を参照のこと）。２３３〜２３６位のＩｇＧ２残基のヒトＩｇＧ１ならびに３２７、３３０、及び３３１位のＩｇＧ４残基への置換は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣを大幅に低減させる（例えば、Ａｒｍｏｕｒ  ＫＬ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（８）：２６１３−２４；及びＳｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ．ｅｔ  ａｌ．，２００１．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６（９）：６５９１−６０４を参照のこと）。ヒトＩｇＧ１アミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ０１８５７）は、本明細書では配列番号４３として提供される。ヒトＩｇＧ４アミノ酸配列（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号Ｐ０１８６１）は、本明細書では配列番号４４として提供される。サイレンシングされたＩｇＧ１は、例えば、Ｂｏｅｓｃｈ，Ａ．Ｗ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｉｇｈｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＩｇＧ  Ｆｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．”ＭＡｂｓ，２０１４．６（４）：ｐ．９１５−２７に記載され、この開示は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００８５】
限定されない、ジスルフィド結合を形成することができる領域が欠失しているもの、または天然のＦｃのＮ末端で特定のアミノ酸残基が除去されるもの、またはメチオニン残基が付加されているものを含む他のＦｃ多様体が可能である。従って、一部の実施形態では、抗体の１つ以上のＦｃ部分は、ヒンジ領域に１つ以上の変異を含み、ジスルフィド結合を除去することができる。さらに別の実施形態では、Ｆｃのヒンジ領域を完全に除去することができる。さらに別の実施形態では、抗体は、Ｆｃ多様体を含むことができる。
【００８６】
さらに、Ｆｃ多様体は、補体結合またはＦｃ受容体結合を生じるようにアミノ酸残基を置換（変異）するか、欠失させるか、または付加することによりエフェクター機能を除去または実質的に低減させるように構築することができる。例えば、限定ではなく、欠失は、Ｃ１ｑの結合部位などの補体結合部位で生じ得る。免疫グロブリンＦｃフラグメントのそのような配列誘導体を調製するための技術は、国際特許公開第ＷＯ９７／３４６３１号及び同第ＷＯ９６／３２４７８号に開示される。加えて、Ｆｃドメインは、リン酸化、硫酸化、アシル化、グリコシル化、メチル化、ファルネシル化、アセチル化、アミド化などにより改変されてもよい。
【００８７】
Ｆｃは、天然糖鎖、天然形態と比較して増加した糖鎖、もしくは天然形態と比較して減少した糖鎖を有する形態であってよく、または、非グリコシル化または脱グリコシル化形態であってよい。糖鎖の増加、減少、除去、または他の修飾は、化学的方法、酵素法などの当該技術分野において一般的な方法により、または遺伝子操作された産生細胞株でそれを発現させることにより達成されてもよい。そのような細胞株は、グリコシル化酵素を自然に発現する微生物、例えば、Ｐｉｃｈｉａ  Ｐａｓｔｏｒｉｓ、及び哺乳動物細胞株、例えば、ＣＨＯ細胞、を含み得る。さらに、微生物もしくは細胞は、グリコシル化酵素を発現するように操作することができ、またはグリコシル化酵素を発現できないようにすることができる（例えば、Ｈａｍｉｌｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，３１３：１４４１（２００６）；Ｋａｎｄａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３０：３００  （２００７）；Ｋｉｔａｇａｗａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９（２７）：１７８７２（１９９４）；Ｕｊｉｔａ−Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６４（２３）：１３８４８（１９８９）；Ｉｍａｉ−Ｎｉｓｈｉｙａ，ｅｔ  ａｌ，ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：８４（２００７）；及びＷＯ０７／０５５９１６を参照のこと）。シアリル化活性を変化させるように操作された細胞の一例として、α−２，６−シアリルトランスフェラーゼ１遺伝子が、チャイニーズハムスター卵巣細胞及びｓｆ９細胞に操作されている。従って、これらの操作された細胞により発現される抗体は、外因性遺伝子産物によりシアリル化される。複数の天然分子と比較して修正量の糖残基を有するＦｃ分子を得るためのさらなる方法は、例えば、レクチンアフィニティクロマトグラフィーを使用して、該複数の分子をグリコシル化及び非グリコシル化画分に分離することを含む（例えば、ＷＯ０７／１１７５０５を参照のこと）。特定のグリコシル化部分の存在は、免疫グロブリンの機能を変化させることが示されている。例えば、Ｆｃ分子からの糖鎖の除去は、第１の補体成分Ｃ１のＣ１ｑ部分への結合親和性における急激な減少、及び、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の減少もしくは低下をもたらし、それにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで不必要な免疫応答を誘導しなかった。追加の重要な改変は、シアリル化及びフコシル化を含み：ＩｇＧのシアル酸の存在は、抗炎症活性と相関している（例えば、Ｋａｎｅｋｏ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１３：７６０（２００６）を参照のこと）が、ＩｇＧからフコースの除去は、ＡＤＣＣ活性の増強をもたらす（例えば、Ｓｈｏｊ−Ｈｏｓａｋａ，ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１４０：７７７（２００６）を参照のこと）。
【００８８】
代替実施形態では、本発明の抗体は、例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡへのそれらの結合能力を増加させ、ＡＤＣＣ活性を増加させることにより、増強されたエフェクター機能を有するＦｃ配列を有してもよい。例えば、ＦｃのＡＳＮ−２９７でＮ結合型グリカンに結合しているフコースは、ＦｃのＦｃγＲＩＩＩＡとの相互作用を立体的に障害し、糖鎖工学よるフコースの除去は、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合を増加させ得、これは、野生型ＩｇＧ１対照と比較して５０倍超高いＡＤＣＣ活性に変換する。ＩｇＧ１のＦｃ部分のアミノ酸変異によるタンパク質工学は、ＦｃγＲＩＩＩＡへのＦｃ結合の親和性を増加させる複数の多様体が生成している。特に、トリプルアラニン変異体Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａは、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合及びＡＤＣＣ機能の増加を２倍呈する。Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（２Ｘ）及びＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０Ｌ（３Ｘ）多様体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでのＦｃγＲＩＩＩＡへの結合親和性における有意な増加及びＡＤＣＣ能力の増強を有する。酵母ディスプレイにより同定された他のＦｃ多様体はまた、ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の改善を示し、マウス異種移植モデルで腫瘍細胞の死滅を増強した。例えば、本明細書に参照により具体的に組み込まれるＬｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＪＢＣ  ２８９（６）：３５７１−９０を参照のこと。
【００８９】
「Ｆｃ領域含有抗体」という用語は、Ｆｃ領域を含む抗体を指す。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵナンバリングシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の精製中に、または抗体をコードする核酸の組み換え工学により除去され得る。それに応じて、本発明によるＦｃ領域を有する抗体は、Ｋ４４７を含むか、または含まない抗体を含み得る。
【００９０】
本明細書で使用される「ＣＤ３８」という用語は、ＡＤＰ−リボシルシクラーゼ／環状ＡＤＰ−リボースヒドロラーゼ１としても知られる、エクト酵素活性を有するシングルパスＩＩ型膜貫通タンパク質に関する。「ＣＤ３８」という用語は、任意のヒト及び非ヒト動物種のＣＤ３８タンパク質を含み、具体的には、ヒトＣＤ３８及び非ヒト哺乳動物のＣＤ３８を含む。
【００９１】
本明細書で使用される「ヒトＣＤ３８」という用語は、その供給源または調製の様式に関係なく、ヒトＣＤ３８の任意の多様体、アイソフォーム、及び種相同体（ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ２８９０７）を含む。従って、「ヒトＣＤ３８」は、細胞により自然に発現されるヒトＣＤ３８及びヒトＣＤ３８遺伝子でトランスフェクトされた細胞で発現されるＣＤ３８が含まれる。
【００９２】
「抗ＣＤ３８重鎖のみ抗体」、「ＣＤ３８重鎖のみ抗体」、「抗ＣＤ３８重鎖抗体」、及び「ＣＤ３８重鎖抗体」という用語は、上で定義されたような重鎖のみ抗体を指すために本明細書では互換的に使用され、上で定義されたようなヒトＣＤ３８を含むＣＤ３８に免疫特異的に結合する。定義は、上で定義されたようなヒト抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体を産生するＵｎｉＲａｔｓ（商標）を含む、ヒト免疫グロブリンを発現するトランスジェニックラットまたはトランスジェニックマウスなどのトランスジェニック動物により産生されるヒト重鎖抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
標準ポリペプチド配列に関して「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、必要に応じて、最大のパーセント配列同一性を達成するように配列をアラインして、ギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義され、いかなる保存的置換も、配列同一性の一部と考えない。アミノ酸配列同一性パーセントを決定することを目的とするアラインメントは、当技術分野における技量の範囲内に含まれる種々の方法で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用して、達成することができる。当業者らであれば、比較される配列の完全長にわたって最大限のアラインメントを得るために必要とされる任意のアルゴリズムを含めて、配列のアラインメントを行うための適切なパラメータを決定することができる。しかし、本明細書における目的では、アミノ酸配列同一性％値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ−２を使用して生成される。
【００９４】
「単離」抗体は、その自然環境の構成要素から、同定及び分離及び／または回収されているものである。その自然環境の混入構成要素は、抗体の診断上または治療上の使用を妨げる材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含んでもよい。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法で測定された抗体の９５重量％を超えて、最も好ましくは９９重量％を越えて、（２）スピニングカップシーケネータ（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｃｕｐ  ｓｅｑｕｅｎａｔｏｒ）を使用によりＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度、または、（３）クーマシーブルー、もしくは、好ましくは、銀染色を使用する還元もしくは非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均質になるまで、精製されるであろう。単離抗体は、抗体の自然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しないので、組み換え細胞内のその場に抗体を含む。しかし、通常、単離抗体は、少なくとも１つの精製ステップにより調製されるであろう。
【００９５】
本発明の抗体は、多重特異性抗体を含む。多重特異性抗体は、複数の結合特異性を有する。「多重特異性」という用語は、具体的には、「二重特異性」及び「三重特異性」、ならびに高次ポリエピトープ特異性などの高次独立の特異的結合親和性、ならびに四価抗体及び抗体フラグメントを含む。「多重特異性」抗体は、具体的には、異なる結合実体の組み合わせを含む抗体、ならびに、複数の同じ結合実体を含む抗体を含む。「多重特異性抗体」、「多重特異性の重鎖のみ抗体」、「多重特異性重鎖抗体」、及び「多重特異性ＵｎｉＡｂ（商標）」は、最も広い意味で、本明細書中で使用され、複数の結合特異性を有する全ての抗体を網羅する。本発明の多重特異性重鎖抗ＣＤ３８抗体は具体的には、ヒトＣＤ３８などのＣＤ３８タンパク質上の複数の非重複エピトープに免疫特異的に結合する抗体を含む。
【００９６】
「エピトープ」は、単一の抗体分子が結合する抗原分子の表面上の部位である。一般的には、抗原は、いくつかのまたは多くの異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。この用語は、具体的には、線状エピトープ及び立体配座エピトープを含む。
【００９７】
「エピトープマッピング」は、それらの標的抗原上の抗体の結合部位またはエピトープを同定するプロセスである。抗体エピトープは、線状エピトープまたは立体配座エピトープであってよい。線状エピトープは、タンパク質中のアミノ酸の連続配列によって形成される。立体配座エピトープは、タンパク質配列において不連続であるが、タンパク質のその三次元構造への折り畳みの際に結合するアミノ酸から形成される。
【００９８】
「ポリエピトープ特異性」は、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。上記のように、本発明は具体的には、ポリエピトープ特異性を有する抗ＣＤ３８重鎖抗体、すなわち、ヒトＣＤ３８などのＣＤ３８タンパク質上の２つ以上の非重複エピトープに結合する抗ＣＤ３８重鎖抗体、を含む。抗原の「非重複エピトープ（複数可）」または「非競合的エピトープ（複数可）」は、本明細書では、一対の抗原特異的抗体の一方のメンバーにより認識されるが、他方のメンバーによっては認識されないエピトープ（複数可）を意味すると定義される。非重複エピトープを認識する抗体または多重特異性抗体上の同じ抗原を標的とする抗原結合領域のペアは、その抗原への結合についてについて競合せず、その抗原に同時に結合することができる。
【００９９】
２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合、抗体は、参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つのエピトープが同一または立体的に重複するエピトープに結合するかを決定するための、最も広く使用され且つ迅速な方法は競合アッセイであり、これは、標識抗原または標識抗体のいずれかを使用して様々な形式で構成することができる。通常、抗原は、９６ウェルプレートに固定化され、未標識抗体が標識抗体の結合を妨げる能力は、放射性または酵素標識を使用して測定される。
【０１００】
「価」という用語は、本明細書で使用される場合、抗体分子中の特定数の結合部位を指す。
【０１０１】
「多価」抗体は、２つ以上の結合部位を有する。従って、「二価」、「三価」、及び「四価」という用語は、それぞれ２つの結合部位、３つの結合部位、及び４つの結合部位の存在を指す。従って、本発明による二重特異性抗体は、少なくとも二価であり、及び三価、四価、またはそうでなければ多価であってよい。
【０１０２】
多種多様な方法及びタンパク質の立体配置が知られており、二重特異性モノクローナル抗体（ＢｓＭＡＢ）、三重特異性抗体などの調製に使用される。
【０１０３】
多価人工抗体の生成のため種々の方法が、２つ以上の抗体の可変ドメインを組み換え融合することにより開発されている。一部の実施形態では、ポリペプチド上の第１及び第２の抗原結合ドメインは、ポリペプチドリンカーで連結されている。そのようなポリペプチドリンカーの一非限定例は、４つのグリシン残基、続いて、１つのセリン残基のアミノ酸配列を有するＧＳリンカーであり、配列は、ｎ回繰り返され、ｎは、１〜約１０、例えば、２、３、４、５、６、７、８、または９の範囲の整数である。そのようなリンカーの非限定例としては、ＧＧＧＧＳ（配列番号４３３）（ｎ＝１）及びＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４３４）（ｎ＝２）が挙げられる。他の適切なリンカーを使用することもでき、例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１３  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５；６５（１０）：１３５７−６９に記載され、この開示は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０４】
「二重特異性三鎖抗体様分子」または「ＴＣＡ」という用語は、３つのポリペプチドサブユニットを含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる抗体様分子を指すために本明細書で使用され、このうちの２つは、モノクローナル抗体の１つの重鎖及び１つの軽鎖、または抗原結合領域及び少なくとも１つのＣＨドメインを含むそのような抗体鎖の機能的抗原結合フラグメントを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなる。この重鎖／軽鎖対は、第１の抗原に対する結合特異性を有する。第３のポリペプチドサブユニットは、ＣＨ１ドメインが存在しない、ＣＨ２及び／またはＣＨ３及び／またはＣＨ４ドメインを含むＦｃ部分を含む重鎖のみの抗体、ならびに、第２の抗原のエピトープまたは第１の抗原の異なるエピトープに結合する抗原結合ドメインを含むか、それらから本質的になるか、またはそれらからなり、そのような結合ドメインは、抗体重鎖または軽鎖の可変領域から誘導されるか、またはそれと配列同一性を有する。そのような可変領域の部分は、ＶＨ及び／またはＶＬ遺伝子セグメント、Ｄ及びＪＨ遺伝子セグメント、またはＪＬ遺伝子セグメントによりコードされてもよい。可変領域は、再配列されたＶＨＤＪＨ、ＶＬＤＪＨ、ＶＨＪＬ、またはＶＬＪＬ遺伝子セグメントによりコードされてもよい。ＴＣＡタンパク質は、上で定義されたような重鎖のみ抗体を利用する。
【０１０５】
「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、膜貫通ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに対する所望の結合特異性（例えば、モノクローナル抗体または他のリガンドの抗原結合領域）を融合する人工受容体を指すために本明細書では最も広い意味で使用される。通常、受容体は、Ｔ細胞にモノクローナル抗体の特異性を移植して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を作成するために使用される（Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，２０１５；１０８（７）：ｄｖｊ４３９；及びＪａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，２０１６；１３：３７０−３８３）。ヒトＶＨ細胞外結合ドメインを含む代表的なＣＡＲ−Ｔ構築物は、ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−Ｔ構築物（パネルＡ）と比較して図５（パネルＢ）に示される。
【０１０６】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書では、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有する抗体を含むために使用される。本明細書のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基、例えば、ランダムで導入された変異またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの部位特異的変異導入またはｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異、を含んでもよい。「ヒト抗体」という用語は、具体的には、上で定義されたような、トランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックラットまたはマウス、により産生されたヒト重鎖可変領域配列を有する重鎖のみ抗体、特に、ＵｎｉＲａｔｓ（商標）により産生されたＵｎｉＡｂｓ（商標）、を含む。
【０１０７】
「キメラ抗体」または「キメラ免疫グロブリン」は、少なくとも２つの異なるＩｇ遺伝子座からのアミノ酸配列を含む免疫グロブリン分子、例えば、ヒトＩｇ遺伝子座によってコードされる部分及びラットＩｇ遺伝子座によってコードされる部分を含むトランスジェニック抗体を意味する。キメラ抗体は、非ヒトＦｃ領域または人工Ｆｃ領域を有するトランスジェニック抗体、及びヒトイデオタイプを含む。そのような免疫グロブリンは、そのようなキメラ抗体を産生するように操作された本発明の動物から単離することができる。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「エフェクター細胞」という用語は、免疫応答の認知期及び活性化期ではなく、免疫応答のエフェクター期に関与する免疫細胞を指す。一部のエフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を行う。一部の実施形態では、ナチュラルキラー細胞などのエフェクター細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導することができる。例えば、ＦｃＲを発現する単球及びマクロファージは、標的細胞の特定の死滅及び免疫系の他の構成要素への抗原の提示、または抗原を提示する細胞への結合に関与する。一部の実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原または標的細胞を貪食し得る。
【０１０９】
「ヒトエフェクター細胞」は、Ｔ細胞受容体またはＦｃＲなどの受容体を発現し、エフェクター機能を実施する白血球である。好ましくは、この細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例としては、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、及び好中球が挙げられ、ＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は、本明細書に記載されるように、その天然源から、例えば、血液またはＰＢＭＣから単離されてもよい。
【０１１０】
限定されないが、骨髄またはリンパ起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＢ細胞及びＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好酸球、多形核細胞、例えば、好中球、顆粒球、肥満細胞、及び好塩基球を含む「免疫細胞」という用語は、最も広い意味で、本明細書で使用される。
【０１１１】
抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列のＦｃ領域またはアミノ酸配列多様性Ｆｃ領域）に帰属する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）などの下方制御が含まれる。
【０１１２】
「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的細胞傷害細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、及びマクロファージ）が、標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いて、標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞であるＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃＲ発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：４５７−９２（１９９１）の４６４頁の表３に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されるようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＣＣアッセイが実施されてもよい。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。代替的または追加的に、目的とする分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルで評価されてもよい。
【０１１３】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解させる分子の能力を指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の成分が、同種抗原と複合体化された分子（例えば、抗体）に結合することにより開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０２：１６３（１９９６）に記載されるＣＤＣアッセイが実施され得る。
【０１１４】
「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位及びその結合パートナー（例えば、抗原）間の非共有結合相互作用の合計の強度を指す。別途指示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）で表すことができる。親和性は、当技術分野で既知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性抗体は一般に、抗原に結合するのが遅く、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は一般に、抗原に結合するのがより速く、結合したままである傾向がある。
【０１１５】
本明細書中で使用される場合、「Ｋｄ」または「Ｋｄ値」は、動態モードで、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ３８４機器（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ  Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して、ＢｉｏＬａｙｅｒ干渉法によって決定される解離定数を指す。例えば、抗マウスＦｃセンサーは、マウス−Ｆｃ融合抗原を負荷し、次に、濃度依存的会合速度（ｋｏｎ）を測定するために、抗体含有ウェルに浸漬される。抗体解離速度（ｋｏｆｆ）は、最終ステップで測定され、センサーは、緩衝液のみを含有するウェルに浸漬される。Ｋｄは、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比率である。（さらなる詳細については、Ｃｏｎｃｅｐｃｉｏｎ，Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，１２（８），７９１−８００，２００９を参照のこと）。
【０１１６】
「処置」、「処置すること」などの用語は、本明細書では、一般に、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを意味するために使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという観点で予防的であり得、及び／または疾患及び／または疾患に起因する有害反応の部分的もしくは完全な治癒という観点で治療的であり得る。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物における疾患の任意の処置を網羅し、（ａ）疾患に罹患しやすいが、まだそれを有すると診断されていないことがある対象において、疾患が発生することを予防すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわち、その発現を阻止すること、または、（ｃ）疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の退行を引き起こすこと、を含む。治療薬は、疾患、または傷害の発症前、発症中または発症後に投与されてもよい。進行中の病気の処置は、処置が患者の望ましくない臨床症状を安定化または軽減する場合、特に興味深い。そのような処置は、罹患組織の機能が完全な喪失する前に実施されることが望ましい。本療法は、疾患の兆候段階の間、一部の場合では、疾患の兆候段階の後に、投与されてもよい。
【０１１７】
「治療有効量」は、対象に治療上の利益を与えるのに必要な活性薬の量を意味する。例えば、「治療有効量」は、病理学的症状を改善する、またはそうでなければ改善を引き起こす、疾患の進行、または疾患に関連する生理学的状態、もしくは抵抗性を改善することを誘発する量である。
【０１１８】
本発明の文脈における「Ｂ細胞新生物」または「成熟Ｂ細胞新生物」は、小リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞前リンパ球性リンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、形質細胞腫瘍、形質細胞腫、例えば、形質細胞性骨髄腫、形質細胞腫、単クローン性免疫グロブリン沈着症、重鎖疾患、ＭＡＬＴリンパ腫、節性辺縁Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、毛様細胞性白血病、原発性滲出性リンパ腫、及びＡＩＤＳ関連非ホジキンリンパ腫を含む。
【０１１９】
「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用され、処置のために評価されている及び／または処置されている哺乳動物を指す。一実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。「対象」、「個体」、及び「患者」という用語は、がんを有する個体、自己免疫疾患を有する個体、病原体感染を有する個体などを含むがこれらに限定されない。対象は、ヒトであってよいが、他の哺乳動物、特に、ヒトの疾患の実験室モデルとして有用な哺乳動物、例えば、マウス、ラットなども含む。
【０１２０】
「医薬製剤」という用語は、活性成分の生物学的活性が有効となるのを可能にするような形態であり、且つ、製剤が投与されることになる対象に対して許容し難いほど毒性であるさらなる構成成分を含有していない、調製物を指す。そのような製剤は、無菌である。「薬学的に許容される」賦形剤（ビヒクル、添加剤）は、用いられた有効用量の活性成分を提供するために、対象哺乳動物に合理的に投与することができるものである。
【０１２１】
「無菌」製剤は、滅菌されているか、または、全ての生きている微生物及びそれらの胞子を含まないか、もしくは本質的に含まない。「凍結」製剤は、温度が０℃未満のものである。
【０１２２】
「安定な」製剤は、貯蔵した時にその中のタンパク質がその物理的安定性及び／または化学的安定性及び／または生物学的活性を本質的に保持しているものである。好ましくは、製剤は、貯蔵時にその物理的及び化学的安定性ならびにその生物学的活性を本質的に保持する。貯蔵期間は一般に、製剤の意図した貯蔵寿命に基づいて選択される。当技術分野ではタンパク質安定性を測定するための種々の分析技術が利用可能であり、例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，２４７−３０１．Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｌｅｅ  Ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｐｕｂｓ．（１９９１）、及びＪｏｎｅｓ．Ａ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．１０：２９−９０）（１９９３）に概説される。安定性は、選択された温度で、選択された期間にわたって測定することができる。安定性は、陽イオン交換クロマトグラフィー、イメージキャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）、またはキャピラリーゾーン電気泳動；アミノ末端またはカルボキシ末端配列分析；質量分析分析；還元抗体及びインタクト抗体を比較するためＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析；ペプチドマップ（例えば、トリプシンまたはＬＹＳ−Ｃ）分析；抗体の生物学的活性または抗原結合機能の評価などを使用して電荷の不均一性を評価することによる、凝集体形成の評価（例えば、サイズ排除クロマトグラフィーを使用する、濁度の測定による、及び／または目視検査による）を含む様々な異なる方法で定性的及び／または定量的に評価することができる。不安定性は、凝集、脱アミド化（例えば、Ａｓｎ脱アミド化）、酸化（例えば、Ｍｅｔ酸化）、異性化（例えば、Ａｓｐ異性化）、切取り／加水分解／フラグメント化（例えば、ヒンジ領域フラグメント化）、スクシンイミド形成、不対合システイン（複数可）、Ｎ末端伸張、Ｃ末端プロセシング、グリコシル化差異などのうちのいずれか１つ以上を含んでもよい。
ＩＩ．詳細な説明
【０１２３】
本発明は、少なくとも部分的に、エクト酵素上の非重複エピトープに結合する重鎖抗体の組み合わせが、腫瘍細胞を溶解させるように相乗的に作用し、及び／または標的エクト酵素の酵素活性を阻害するという知見に基づく。同様に、エクト酵素上の少なくとも２つの非重複エピトープに結合特異性を有する多重特異性、例えば、二重特異性重鎖抗体は、腫瘍細胞を死滅させるように相乗的に作用し、及び／または標的エクト酵素の酵素活性を阻害する。
【０１２４】
エクト酵素
エクト酵素は、原形質膜の外側に触媒部位を有する膜タンパク質の多様なグループである。エクト酵素の多くは、白血球及び内皮細胞に見られ、それらは、複数の生物学的役割を果たす。全てに共通する細胞外触媒活性は別として、エクト酵素は、非常に異なるタイプの酵素反応に関与する分子の多様なクラスである。異なるエクト酵素は、白血球−内皮接触の各ステップ、及びその後の組織内の細胞移動を調節し得る。エクト酵素は、ＣＤ３８、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ２０３、ＶＡＰ１、ＡＲＴ２、及びＭＴ１−ＭＭＰを含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
エクト酵素ＣＤ３８は、ヌクレオチド代謝酵素のファミリーに属し、ヌクレオチドのリサイクルに加えて、細胞の恒常性及び代謝を制御する化合物を生成する。ＣＤ３８の触媒活性は、インスリン分泌、膵腺房細胞におけるムスカリン性Ｃａ２＋シグナル伝達、好中球走化性、樹状細胞輸送、オキシトキシン分泌、食餌誘導性肥満の発症を含む種々の生理学的プロセスに必要である。Ｖａｉｓｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｅｕｋｅｍｉａ，２０１５，２９：３５６−３６８及びそこに引用されている参考文献を参照のこと。ＣＤ３８は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む様々な悪性腫瘍に発現される。ＣＤ３８は、特に、中悪性度形態のＣＬＬを識別することが示されており、ＣＬＬのこの中悪性度亜型のＣＬＬを有する患者のより短い全生存期間を予測する負の予後マーカーと考えられる。上掲のＭａｌａｖａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｂｌｏｏｄ，１１８：３４７０−３４７８，及びＶａｉｓｉｔｔｉ，２０１５を参照のこと。
【０１２６】
抗エクト酵素重鎖抗体の調製
本発明の重鎖抗体は、当技術分野で既知の方法により調製することができる。好ましい実施形態では、本明細書の重鎖抗体は、内因性免疫グロブリン遺伝子がノックアウトまたは無効化されたトランスジェニックマウス及びラット、好ましくは、ラットを含むトランスジェニック動物により産生される。好ましい実施形態では、本明細書の重鎖抗体は、ＵｎｉＲａｔ（商標）で産生される。ＵｎｉＲａｔ（商標）は、サイレンシングされた内在性免疫グロブリン遺伝子を有し、完全ヒトＨＣＡｂの多様で自然に最適化されたレパートリーを発現するためにヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座を使用する。ラットの内因性免疫グロブリン遺伝子座は、様々な技術を使用してノックアウトまたはサイレンシングすることができるが、ＵｎｉＲａｔ（商標）では、亜鉛フィンガー（エンド）ヌクレアーゼ（ＺＮＦ）技術を使用して、内因性ラット重鎖Ｊ遺伝子座、軽鎖Ｃκ遺伝子座、及び軽鎖Ｃλ遺伝子座を不活性化した。卵母細胞へのマイクロインジェクション用のＺＮＦ構築物は、ＩｇＨ及びＩｇＬノックアウト（ＫＯ）株を生成し得る。詳細については、例えば、Ｇｅｕｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：４３３を参照のこと。Ｉｇ重鎖ノックアウトの特性決定は、Ｍｅｎｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４０：２９３２−２９４１により報告されている。ＺＮＦ技術の利点は、数ｋｂまでの欠失を介して遺伝子または遺伝子座をサイレンシングする非相同末端結合が、相同的統合のための標的部位も提供し得ることである（Ｃｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２９：６４−６７）。ＵｎｉＲａｔ（商標）で産生されたヒト重鎖抗体は、ＵｎｉＡｂｓ（商標）と呼ばれ、従来の抗体を用いて攻撃することができないエピトープに結合することができる。それらの高い特異性、親和性、及び小さいサイズにより、それらは、モノ特異的及びポリ特異的用途に最適になる。
【０１２７】
ＵｎｉＡｂｓ（商標）に加えて、具体的には、ラクダ科動物ＶＨＨフレームワーク及び変異を欠く重鎖のみ抗体、ならびにそれらの機能的ＶＨ領域が含まれる。そのような重鎖のみの抗体は、例えば、トランスジェニックラットまたはマウスで産生させることができ、これは、例えば、ＷＯ２００６／００８５４８に記載されるような完全ヒト重鎖のみ遺伝子座を含むが、ウサギ、モルモット、ラットなどの他のトランスジェニック哺乳動物を使用することもでき、ラット及びマウスが好ましい。それらのＶＨＨもしくはＶＨ機能的フラグメントを含む重鎖のみ抗体は、組み換えＤＮＡ技術により、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母を含む適切な真核生物または原核生物宿主中のコード核酸の発現により、産生することもできる。
【０１２８】
重鎖のみ抗体のドメインは、抗体及び低分子薬の利点：一価または多価にすることができ；毒性が低く；製造の費用対効果がよい、を組み合わせる。それらのサイズが小さいため、これらのドメインは、経口または局所投与を含む投与が容易であり、胃腸の安定性を含む高い安定性を特徴とし；それらの半減期は、所望の使用または適応症に合わせて調整することができる。さらに、ＨＣＡｂのＶＨ及びＶＨＨドメインは、費用対効果の高い仕方で製造することができる。
【０１２９】
特定の実施形態では、ＵｎｉＡｂｓ（商標）を含む本発明の重鎖抗体は、別のアミノ酸残基で置換された、ＦＲ４領域の最初の位置（Ｋａｂａｔナンバリングシステムによるアミノ酸位置１０１）の天然アミノ酸残基を有し、これは、その位置で天然アミノ酸残基を含むかまたはそれと会合する表面露出疎水性パッチを破壊することができる。そのような疎水性パッチは通常、抗体軽鎖定常領域との界面に埋め込まれるが、ＨＣＡｂ中で表面が露出するようになり、少なくとも部分的に、ＨＣＡｂｓの望ましくない凝集及び軽鎖会合のためのものである。好ましくは、置換アミノ酸残基は、荷電し、より好ましくは、正に荷電し、例えば、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、またはヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、好ましくは、アルギニン（Ｒ）である。好ましい実施形態では、トランスジェニック動物に由来する重鎖のみ抗体は、位置１０１にＴｒｐからＡｒｇへの変異を含有する。得られたＨＣＡｂは、好ましくは、凝集が存在しない生理学的条件下で高い抗原結合親和性及び溶解性を有する。
【０１３０】
特定の実施形態では、抗エクト酵素重鎖抗体は、ＣＤ３８に結合する。好ましい実施形態では、抗ＣＤ３８重鎖のみ抗体は、ＵｎｉＡｂｓ（商標）である。
【０１３１】
本発明の一部として、ＥＬＩＳＡ（組み換えＣＤ３８細胞外ドメイン）タンパク質及び細胞結合アッセイでヒトＣＤ３８に結合する、ＵｎｉＲａｔ（商標）動物（ＵｎｉＡｂ（商標））由来のユニークなＣＤＲ３配列を有するヒトＩｇＧ重鎖抗ＣＤＲ３抗体ファミリーを同定した。５つの配列ファミリー（Ｆ０１、Ｆ０３、Ｆ０４、Ｆ０７、及びＦ０９）を含む重鎖可変領域（ＶＨ）配列（図１〜２０を参照のこと）は、ヒトＣＤ３８タンパク質結合及び／またはＣＤ３８＋細胞への結合について陽性であり、ＣＤ３８を発現しない細胞への結合について全て陰性である。これらの５つの配列ファミリーのＵｎｉＡｂｓ（商標）は、ダラツムマブ及びイサツキシマブがＣＤ３８＋細胞へのＵｎｉＡｂ（商標）の結合をブロックする能力に基づいて、２つの広範な競合グループに分類される。異なるエピトープに結合する２つ以上のＵｎｉＡｂｓ（商標）の組み合わせは、強力なＣＤＣを誘導して、直接アポトーシスを導き、同じＵｎｉＡｂｓ（商標）単独では、これらのエフェクター機能のいずれも誘導しない。ＵｎｉＡｂｓ（商標）の組み合わせはまた、個々のＵｎｉＡｂｓ（商標）よりも強力に酵素活性を阻害した。
【０１３２】
本明細書の抗体のファミリーのメンバーは、ＣＤ３８陽性バーキットリンパ腫細胞株Ｒａｍｏｓに結合し、一部は、カニクイザルのＣＤ３８タンパク質と交差反応性である。加えて、必要に応じて、任意の動物種のＣＤ３８タンパク質との交差反応性を提供するように操作することができる。
【０１３３】
本明細書のＵｎｉＡｂｓ（商標）などの抗ＣＤ３８重鎖抗体を含む抗エクト酵素重鎖抗体は、Ｋｄが、限定されないが約１０−６〜約１０−１０；約１０−６〜約１０−９；約１０−６〜約１０−８；約１０−８〜約１０−１１；約１０−８〜約１０−１０；約１０−８〜約１０−９；約１０−９〜約１０−１１；約１０−９〜約１０−１０；またはこれらの範囲内の任意の値を含む、約１０−６〜約１０−１１のＣＤ３８に対する親和性を有してもよい。親和性の選択は、インビトロアッセイ、前臨床モデル、及び臨床試験を含む、ＣＤ３８生物学的活性の調節、例えば、ブロックのための生物学的評価、ならびに潜在的な毒性の評価により確認されてもよい。
【０１３４】
限定されないが、抗ＣＤ３８重鎖抗体、例えば、ＵｎｉＡｂｓ（商標）、を含むエクト酵素標的上の非重複エピトープに結合する重鎖抗体は、酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡアッセイ）またはフローサイトメトリー競合結合アッセイなどの競合結合アッセイで同定することができる。例えば、標的抗原に結合する既知の抗体及び目的の抗体間の競合を使用することができる。このアプローチを使用することにより、参照抗体と競合するもの及びそうでないものに、一連の抗体を分け得る。非競合抗体は、参照抗体が結合しているエピトープと重複しない異なるエピトープへの結合としてとして同定される。多くの場合、１つの抗体は固定化され、抗原は結合され、第２の標識された（例えば、ビオチン化）抗体は、捕捉された抗原に結合する能力についてＥＬＩＳＡアッセイで試験される。これは、Ｐｒｏｔｅｏｎ  ＸＰＲ３６（ＢｉｏＲａｄ，Ｉｎｃ）、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００、及びＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ならびにＭＸ９６  ＳＰＲイメージャ（Ｉｂｉｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｂ．Ｖ．）を含む、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）のプラットフォームを使用することによっても、ならびに、Ｏｃｔｅｔ  Ｒｅｄ３８４及びＯｃｔｅｔ  ＨＴＸ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐａｌｌ  Ｉｎｃ）などのバイオレイヤー干渉法プラットフォーム上で、実施することができる。さらなる詳細については、実施例及び図２７を参照のこと。
【０１３５】
通常、抗体は、上記の競合結合アッセイなどの標準的な技術によって決定されるように、参照抗体の標的抗原への結合を約１５〜１００％低減させる場合、参照抗体と「競合する」。種々の実施形態では、相対的な阻害は、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、またはそれ以上である。
【０１３６】
一実施形態では、第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の非重複ＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する二重特異性二価重鎖抗体は、配列番号１５０のＣＤＲ１配列、配列番号９２のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６８のＣＤＲ３配列、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインを含む重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む、第１のＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する第１のポリペプチド、ならびに配列番号３９３のＣＤＲ１配列、配列番号４１２のＣＤＲ２配列、及び配列番号４２４のＣＤＲ３配列、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインを含む重鎖抗体の抗原結合ドメインを含む、第２のＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する第２のポリペプチド、ならびに第１のポリペプチドのＣＨ２ドメイン及び第２のポリペプチドのＣＨ２ドメイン間の非対称界面を含む。特定の好ましい実施形態では、この二重特異性二価重鎖抗体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、またはサイレンシングされたヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であるＦｃ領域を含む。
【０１３７】
一実施形態では、第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の非重複ＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する二重特異性四価重鎖抗体は、２つの同一のポリペプチドを含み、各ポリペプチドは、配列番号１５０のＣＤＲ１配列、配列番号９２のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６８のＣＤＲ３配列を含む、第１のＣＤ３８エピトープに結合親和性を有する重鎖抗体の第１の抗原結合ドメイン、配列番号３９３のＣＤＲ１配列、配列番号４１２のＣＤＲ２配列、及び配列番号４２４のＣＤＲ３配列を含む、第２のＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する重鎖抗体の第２の抗原結合ドメイン、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメインを含む。特定の実施形態では、この重鎖抗体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、またはサイレンシングされたヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であるＦｃ領域を含む。
【０１３８】
別の実施形態では、第１のＣＤ３８エピトープ及び第２の非重複ＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する二重特異性四価重鎖抗体は、第１及び第２の重鎖ポリペプチドを含み、第１の重鎖ポリペプチドは、第１のＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する重鎖抗体の２つの抗原結合ドメインを含み、各抗原結合ドメインは、配列番号１５０のＣＤＲ１配列、配列番号９２のＣＤＲ２配列、及び配列番号１６８のＣＤＲ３配列、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメイン、ならびに第１のポリペプチドのＣＨ２ドメイン及び第２のポリペプチドのＣＨ２ドメイン間の非対称界面を含み、第２の重鎖ポリペプチドは、第２のＣＤ３８エピトープに対する結合親和性を有する重鎖抗体の２つの抗原結合ドメインを含み、各抗原結合ドメインは、配列番号３９３のＣＤＲ１配列、配列番号４１２のＣＤＲ２配列、及び配列番号４２４のＣＤＲ３配列、ヒンジ領域の少なくとも一部、ならびにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含むＣＨドメイン、ならびに第１のポリペプチドのＣＨ２ドメイン及び第２のポリペプチドのＣＨ２ドメイン間の非対称界面を含む。特定の好ましい実施形態では、この重鎖抗体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域、サイレンシングされたヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域、またはサイレンシングされたヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域であるＦｃ領域を含む。
【０１３９】
一部の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合ドメインのうちの２つ以上は、本明細書に記載の及び／または当技術分野で既知の方法に従って、単一分子、例えば、二重特異性四価抗体に組み合わされる。一実施形態では、本発明の二重特異性四価抗体は、クローンＩＤ３２１９８６及びクローンＩＤ３２１６６３の重鎖可変領域配列を含む。本発明の実施形態による抗体は、結合化合物の各ポリペプチドサブユニットに沿って重鎖可変領域配列（Ｎ末端からＣ末端またはＣ末端からＮ末端）の任意の好適な配向を有し得る。特定の実施形態では、各ポリペプチドサブユニットに沿ったＮ末端からＣ末端への重鎖可変領域配列の配向は、ＶＨ３２１６６３、ＶＨ３２１９８６である。特定の実施形態では、各ポリペプチドサブユニットに沿ったＮ末端からＣ末端への重鎖可変領域配列の配向は、ＶＨ３２１９８６、ＶＨ３２１６６３である。本発明の一部の実施形態による四価抗体は、好適な位置に配置されるリンカー配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、各ポリペプチドサブユニット上の第１及び第２のＶＨドメイン間に配置される。一部の実施形態では、リンカーは、所与のＶＨドメインの近位または遠位に配置され、例えば、リンカーは、ＶＨドメインのＣ末端及び／またはＶＨドメインのＮ末端に位置する。
【０１４０】
医薬組成物、使用、及び処置方法
本発明の別の態様は、適切な薬学的に許容される担体と混合した本発明の１つ以上の抗体を含む医薬組成物を提供することである。本明細書で使用される薬学的に許容される担体は、限定されないが、アジュバント、固体担体、水、緩衝剤、または治療構成成分を保持するために当技術分野で使用される他の担体、またはそれらの組み合わせを例示する。
【０１４１】
一実施形態では、医薬組成物は、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＣＤ３９などの、エクト酵素上の非重複エピトープに結合する２つ以上の重鎖のみ抗体を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＣＤ３９などの、エクト酵素の非重複エピトープに結合する２つ以上の重鎖のみ抗体の相乗的な組み合わせを含む。
【０１４２】
別の実施形態では、医薬組成物は、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＣＤ３９などの、エクト酵素上の２つ以上の非重複エピトープに結合特異性を有する多重特異性（二重特異性を含む）重鎖のみ抗体を含む。好ましい実施形態では、医薬組成物は、同じエピトープに結合する単一特異性抗体のいずれかと比較して改善された特性を有するエクト酵素上の２つ以上の非重複エピトープ、例えば、ＣＤ３８、ＣＤ７３、またはＣＤ３９に対して結合特異性を有する多重特異性（二重特異性を含む）重鎖のみ抗体を含む。
【０１４３】
本発明に従って使用される抗体の医薬組成物は、所望の純度を有するタンパク質を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態などの、任意の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することにより貯蔵用に調製される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）を参照のこと）。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、レシピエントに対し、用いられる投薬量及び濃度で無毒であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液：アスコルビン酸、及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジン；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。
【０１４４】
非経口投与のための医薬組成物は好ましくは無菌であり、実質的に等張性であり、適正製造基準（ＧＭＰ）条件下で製造される。医薬組成物は、単位剤形（すなわち、単回投与のための投薬量）として提供することができる。製剤化は、選択される投与経路に依存する。本明細書の抗体は、静脈内注射もしくは輸注によって、または皮下に投与することができる。注射投与のためには、本明細書の抗体を、好ましくは、注射部位における不快感を軽減するために生理適合性緩衝液中に、水溶液として製剤化することができる。溶液は、上に述べたとおり担体、賦形剤、または安定化剤を含有し得る。あるいは、抗体は、使用前に好適なビヒクル、例えば、無菌の発熱原不含水で構成するための凍結乾燥形態とし得る。
【０１４５】
抗ＣＤ３８抗体製剤は、例えば、米国特許第９，０３４，３２４号に開示されている。類似した製剤は、本発明の、ＵｎｉＡｂｓ（商標）を含む重鎖抗体に使用することができる。皮下用抗体製剤は、例えば、ＵＳ２０１６０３５５５９１及びＵＳ２０１６０１６６６８９に記載される。
【０１４６】
使用方法
エクト酵素上の非重複エピトープに結合する重鎖のみの抗体、そのような抗体の相乗的組み合わせを含む組み合わせ、エクト酵素上の２つ以上の非重複エピトープに結合特異性を有する多重特異性抗体、ならびにそのような抗体及び抗体の組み合わせを含む医薬組成物は、標的エクト酵素の発現を特徴とする疾患及び状態を標的とするために使用することができる。
【０１４７】
種々の実施形態では、エクト酵素は、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＣＤ２６、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ７３、ＣＤ１５６ｂ、ＣＤ１５６ｃ、ＣＤ１５７、ＣＤ２０３、ＶＡＰ１、ＡＲＴ２、及びＭＴ１−ＭＭＰからなる群より選択される。
【０１４８】
特定の実施形態では、エクト酵素は、ＣＤ３８、ＣＤ７３、及び／またはＣＤ３９である。
【０１４９】
ＣＤ３８は、短い２０ａａＮ末端細胞質尾部及び長い２５６ａａ細胞外ドメインを有する４６ｋＤａのＩＩ型膜貫通糖タンパク質である（Ｍａｌａｖａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１９９４，１５：９５−９７）。多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫（Ｓｈａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，２０１７，６６（６）：６９７−７０３に概説される）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）（Ｖａｉｓｉｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ，２０１５，２９”３５６−３６８）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ｄＴ細胞ＡＬＬを含む多数の血液悪性腫瘍中に高レベルで発現するために、ＣＤ３８は、血液悪性腫瘍を処置する抗体ベースの治療薬の有望な標的である。ＣＤ３８はまた、加齢関連ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の低下に主役として関与しており、ＮＡＤの前駆体と組み合わされたＣＤ３８阻害は、代謝機能障害及び加齢関連疾患のための潜在的な治療法として役立ち得ることが示されている（例えば、Ｃａｍａｃｈｏ−Ｐｅｒｅｉｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２０１６，２３：１１２７−１１３９を参照のこと）。ＣＤ３８はまた、喘息の顕著な特徴である気道過敏性の発症に関与していると記載されており、そのような状態を処置するための標的として示唆されている。
【０１５０】
本明細書の重鎖のみ抗ＣＤ３８抗体、抗体の組み合わせ、多重特異性抗体、及び医薬組成物は、限定されないが、上記の状態及び疾患を含む、ＣＤ３８の発現または過剰発現を特徴とする疾患及び状態を標的とするために使用することができる。
【０１５１】
一態様では、本明細書のＣＤ３８重鎖抗体及び医薬組成物は、多発性骨髄腫（ＭＭ）、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、ｄＴ細胞ＡＬＬを含む、ＣＤ３８の発現を特徴とする血液悪性腫瘍を処置するために使用することができる。本発明のＣＤ３８重鎖抗体及び医薬組成物は、喘息及び気道過敏性を特徴とする他の状態、及びニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の低下を特徴とする加齢関連及び代謝機能障害を処置するために使用することもできる。
【０１５２】
ＭＭは、骨髄区画における異常な形質細胞のモノクローナル増殖及び蓄積を特徴とするＢ細胞悪性腫瘍である。ＭＭに対する現在の治療は、多くの場合、寛解をもたらすが、ほぼ全ての患者は最終的に、再発し死亡する。同種造血幹細胞移植の背景における骨髄腫細胞の免疫介在性除去の実質的な証拠があるが、このアプローチの毒性は高く、治癒する患者はほとんどいない。一部のモノクローナル抗体は、前臨床試験及び初期臨床試験においてＭＭを処置するための見込みを示しているが、ＭＭに対する任意のモノクローナル抗体療法の一貫した臨床効果は決定的には実証されていない。従って、ＭＭの免疫療法を含む新しい治療法に対して大きなニーズがある（例えば、上掲のＳｈａｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌを参照のこと）。
【０１５３】
ＣＤ７３は、細胞外アデノシンを産生するエクト酵素として機能することが報告されており、これは、アデノシン受容体シグナル伝達を介して抗腫瘍Ｔ細胞免疫を制限することにより腫瘍の成長を促進する。ＣＤ７３は、乳がん、大腸がん、及び前立腺がんなどの特定のがんで発現される。マウス腫瘍モデルにおけるＣＤ７３を標的とする低分子阻害薬またはモノクローナル抗体の結果は、単独療法として、または、抗ＰＤ１及び／もしくは抗ＣＴＬＡ−４抗体などの他の抗がん薬と組み合わせて、ＣＤ７３の発現を特徴とする腫瘍の成長を制御する、免疫療法を含む標的化ＣＤ７３治療法の可能性を示唆する。例えば、Ｂ  Ｚｈａｎｇ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ；２０１０，７０（１６），６４０７−１１；Ａｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，２０１３，１９（２０）：５６２６−５６３５を参照のこと。
【０１５４】
ＣＤ３９及びＣＤ７３は、アデノシン産生を介した免疫抑制性微小環境の生成において重要であると広く考えられている。ＣＤ３９の上方制御は、多数の上皮及び血液悪性腫瘍が報告されており、慢性リンパ性白血病におけるその発現は予後不良と相関することが示されている（Ｐｕｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｃｌｉｎ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｌｅｕｋ．２０１１；１１：３６７−３７２；Ｂａｓｔｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，３２：１７４３−１７５１；Ｂａｓｔｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．，３：２５４−２６５）。ＣＤ３９はまた、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）上に高度に発現され、ＣＤ３９ヌルマウスにおいてＴｒｅｇの抑制活性の低下で示されているように、それらの抑制機能に必要とされる（Ｄｅａｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，２０４：１２５７−１２６５）。ＣＤ３９は、Ｔｒｅｇ、腫瘍関連間質、または悪性上皮細胞上のいずれかで、酵素活性を高めることにより、腫瘍形成を引き起こすのに役立ち得、抗腫瘍Ｔ及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞のアデノシン媒介性免疫抑制、ならびに、化学療法によるＡＴＰ誘導性細胞死の中和がもたらされることが示唆されている（Ｂａｓｔｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３  ａｎｄ  ２０１５，ｓｕｐｒａ；Ｆｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，１３：２０６−２１６）。免疫抑制ＣＤ３９／ＣＤ７３−アデノシン経路の調節は、がん治療に有望な免疫療法方策として示唆されている（Ｓｉｔｋｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２：５９８−６０５）。さらに、Ｈａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓ  Ｒｅｓ，２０１５，７（６）：１１８１−１１８８を参照のこと。
【０１５５】
Ｔ細胞分化におけるＣＤ７３及びＣＤ３９エクトヌクレオチダーゼの役割の概説については、例えば、Ｂｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２０１５，５８９：３４５４−３４６０を参照のこと。
【０１５６】
疾患の処置のための本発明の組成物の有効用量は、投与の手段、標的部位、患者の生理的状態、患者がヒトであるか動物であるか、投与される他の薬剤、及び処置が予防的なものであるか治療的なものであるかを含む多くの異なる要因に応じて変動する。通常、患者はヒトであるが、非ヒト哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマなどのコンパニオン動物、ウサギ、マウス、ラットなどの実験動物なども処置されてもよい。処置投薬量は、安全性及び有効性を最適化するために滴定することができる。
【０１５７】
投薬量レベルは、当業者によって容易に決定することができ、例えば、治療に対する対象の応答を変更するために必要とされる場合、必要に応じて、変更することができる。単一剤形を生成するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、処置される宿主及び特定の投与様式に応じて異なる。一般的に単位剤形は、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの活性成分を含有する。
【０１５８】
一部の実施形態では、薬剤の治療投薬量は、宿主の体重の、約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より通常では、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇの範囲であってよい。例えば、投薬量は、１ｍｇ／ｋｇ体重もしくは１０ｍｇ／ｋｇ体重、または１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。例示的な処置レジメンは、２週間に１回または１ヶ月に１回または３〜６ヶ月に１回の投与を必要とする。本発明の治療実体は通常、複数の機会で投与される。単回投薬間の間隔は、毎週、毎月、または毎年であり得る。さらに、間隔は、患者の治療実体の血中レベルを測定することによって指定される場合、不定期であり得る。あるいは、本発明の治療実体は、徐放性製剤として投与することができ、この場合、あまり頻繁な投与を必要としない。投薬量及び頻度は、患者におけるポリペプチドの半減期に応じて変動する。
【０１５９】
通常、組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注射剤として調製され、さらに、注射前に液体ビヒクル中の溶解または懸濁に適する固体形態も調製することができる。本明細書の医薬組成物は、そのままで、または固体（例えば、凍結乾燥）組成物の再構成後に、静脈内または皮下投与に適する。調製物は、上記のように、増強されたアジュバント効果のために、リポソームまたはポリラクチド、ポリグリコリド、もしくはコポリマーなどのマイクロ粒子中に乳化またはカプセル化することもできる。Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７，１９９０及びＨａｎｅｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８：９７−１１９，１９９７。本発明の薬剤は、活性成分の持続放出またはパルス放出を可能にするような仕方で製剤化することができる蓄積注射またはインプラント調製物の形態で投与することができる。医薬組成物は一般に、無菌であり、実質的に等張性であり、及び米国食品医薬品局の全ての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全に準拠して製剤化される。
【０１６０】
本明細書に記載の抗体及び抗体構造の毒性は、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手順により、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）またはＬＤ１００（集団の１００％に対して致死的な用量）を決定することにより、決定することができる。毒性及び治療効果間の用量比が治療指数である。これらの細胞培養アッセイ及び動物実験から得られたデータは、ヒトに使用するのに毒性のない投薬量範囲を製剤化する際に使用することができる。本明細書に記載の抗体の投薬量は、好ましくは、毒性がほとんどないかまたは全くない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、採用される剤形及び利用される投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。正確な製剤化、投与経路、及び投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択することができる。
【０１６１】
投与用組成物は一般に、薬学的に許容される担体、好ましくは、水性担体に溶解した抗体または他の削摩剤を含むであろう。様々な水性担体、例えば、緩衝食塩水などを使用することができる。これらの溶液は、無菌であり、一般に、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術により滅菌されてもよい。組成物は、生理的条件に近づけるために必要とされるような薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤などの、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど、を含有してもよい。これらの製剤中の活性薬の濃度は広く変動し得、選択される特定の投与様式及び患者の必要性に従って、主に体液量、粘度、体重などに基づいて選択されるであろう（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（１５ｔｈ  ｅｄ．，１９８０）及びＧｏｏｄｍａｎ＆Ｇｉｌｌｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ（Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９６））。
【０１６２】
本発明のその活性薬及びその製剤を含むキット、ならびに使用説明書もまた、本発明の範囲内である。キットはさらに、少なくとも１つの追加の試薬、例えば、化学療法薬などを含有し得る。キットは通常、キットの内容物の意図される使用を示すラベルを含む。ラベルという用語は、キット上にもしくはキットと共に供給されるか、または他の方法でキットに付随する、あらゆる書面または記録物を含む。
【０１６３】
ここで、十分に説明されている本発明は、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、種々の変更及び修正を行うことができることが当業者に明らかとなるであろう。
【０１６４】
材料及び方法
ＣＤ３８タンパク質結合
抗原抗体親和性を決定する動態実験を、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ−３８４システム（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で実施した。抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃキャプチャー（ＡＨＣ）バイオセンサー（Ｆｏｒｔｅ  Ｂｉｏ、部品番号：１８−５０６４）をアッセイ緩衝液（１ｘ  ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、０．０２％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．２）で水和し、１００ｍＭのグリシンｐＨ１．５で事前調整した。ベースラインを、アッセイ緩衝液で１２０秒間確立した。次に、ＡＨＣバイオセンサーを、ＵｎｉＡｂｓ（商標）で５μｇ／ｍＬの濃度で１２０秒間固定した。別のベースライン（１２０秒）をアッセイ緩衝液で確立した。次に、それらを、２５０ｎＭから始まる、アッセイ緩衝液中の抗原ｃｙＣＤ３８（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ−９００５０−Ｃ０８Ｈ）の７点の１：２希釈系列に浸漬させた。検体列の最後のウェルは、緩衝液及びロードされたバイオセンサー間の非特異的結合を試験するために、アッセイ緩衝液のみを含有し、参照ウェルとして使用した。会合を６００秒間観察し、その後、９００秒間解離させた。Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖ９．０（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して、データ分析を実施した。標準的な１：１結合モデルを使用して、結合動態を分析した。
【０１６５】
ＣＤ３８細胞結合
Ｒａｍｏｓ細胞株（ＡＴＣＣ）を使用したフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で、ＣＤ３８陽性細胞への結合を評価した。要約すると、１００，０００の標的細胞を、精製されたＵｎｉＡｂｓ（商標）の希釈系列で、４℃で３０分間染色した。インキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液（１Ｘ  ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、０．１％のＮａＮ３）で２回洗浄し、Ｒ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号２０４２−０９）がコンジュゲートされたヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧで染色して、細胞結合抗体を検出した。４℃で２０分間のインキュベーション後、細胞をフローサイトメトリー緩衝液で２回洗浄し、次に、平均蛍光強度（ＭＦＩ）をフローサイトメトリーで測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７を使用して、ＥＣ５０値を計算した。以下の修正を含む同じプロトコルを使用して、カニクイザルＣＤ３８陽性細胞への結合を決定した。標的細胞は、カニクイザルＣＤ３８の細胞外ドメインを発現するように安定的にトランスフェクトされたラットＣ６細胞株（ＡＴＣＣ）由来のものであり、各抗体を単一濃度で試験した（約１．７μｇ／ｍＬ）ので、ＥＣ５０値を計算しなかった。
【０１６６】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）
ＣＤ３８陽性のＤａｕｄｉまたはＲａｍｏｓ細胞株（ＡＴＣＣ）を使用して、各抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）について、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を決定した。要約すると、２０，０００の標的細胞を、単一濃度の１μｇ／ｍＬの精製ＵｎｉＡｂ（商標）または用量範囲の精製ＵｎｉＡｂいずれかで、室温で１０分間オプソニン処理した。インキュベーション後、ヒト補体血清（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号ＩＰＬＡ−ＣＳＥＲ）を１７％の最終濃度まで添加するか、またはウサギ補体血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ７７６４）を５％の最終濃度まで添加し、それぞれ、３．５時間または３０分間インキュベートした（３７℃、８％のＣＯ２）。インキュベーション後、ＡＴＰ依存性発光試薬Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  ２．０（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ９２３２）の添加によるＡＴＰの間接定量により、細胞生存率を測定した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｉ３ｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、発光シグナルを記録し、パーセント生存率を、アイソタイプ対照抗体で処置された細胞と比較することにより決定した。
【０１６７】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
細胞ベースのＡＤＣレポーターバイオアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７０１０）を使用して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を評価した。簡単に言うと、１２，５００のＣＤ３８陽性Ｒａｍｏｓ標的細胞（ＡＴＣＣ）を、９６ウェルプレートのウェルに添加し、各抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）の希釈系列で処置した。次に、ＦｃγＲＩＩＩａを発現するレポーターの細胞、ならびに、ＮＦＡＴ応答エレメントの制御下のルシフェラーゼレポーターを、６：１のＥ：Ｔ比で添加し、組織培養インキュベーター中で６時間インキュベートした（３７℃、８％のＣＯ２）。Ｂｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ基質の添加後、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｉ３ｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、発光を測定した。発光レポーターシグナルの増加は、より多くのＡＤＣＣ活性を示す。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（シグモイド、４ＰＬ曲線近似）を使用して、ＥＣ５０値を計算した。
【０１６８】
抗体誘導性直接アポトーシス
ＣＤ３８陽性Ｒａｍｏｓ細胞（ＡＴＣＣ）を使用して、抗体誘導性直接アポトーシスを介する細胞傷害を分析した。要約すると、４５，０００の標的細胞を、２μｇ／ｍＬの精製ＵｎｉＡｂｓ（商標）または用量範囲の精製ＵｎｉＡｂｓ（商標）のいずれかで４８時間処理した（３７℃、８％のＣＯ２）。インキュベーション後、細胞をアネキシン−Ｖ結合緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２２０１）で２回洗浄し、アネキシンＶ及び７−ＡＡＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号６４０９４５及び４２０４０４）で染色した。次に、試料をフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により分析し、生細胞の割合を、アネキシンＶ及び７ＡＡＤに対して陰性の集団として決定した。
【０１６９】
抗体誘導性間接アポトーシス
Ｆｃ架橋に媒介されるアポトーシスを測定するために、ＣＤ３８陽性Ｒａｍｏｓ標的細胞（ＡＴＣＣ）を、０．４μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂｓ（商標）及び１．６μｇ／ｍＬの精製ヤギＦ（ａｂ’）２抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ９８５２６）で処置した。２４時間のインキュベーション（３７℃、８％のＣＯ２）後に、細胞をアネキシンＶ結合緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２２２０１）中で洗浄及び再懸濁し、アネキシンＶ及び７−ＡＡＤ（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号６４０９４５及び４２０４０４）で染色した。次に、試料をフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ  ｅａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により分析し、生細胞の割合を、アネキシンＶ及び７ＡＡＤに対して陰性の集団として決定した。
【０１７０】
ＣＤ３８酵素活性
ＣＤ３８シクラーゼ活性の阻害を測定するために、組み換えヒトＣＤ３８（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１０８１８−Ｈ０８Ｈ）を、シクラーゼ活性緩衝液（５０ｍＭのＭＥＳ  ｐＨ６．５）中の５０μｇ／ｍＬの各精製抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）と共に室温で１５分間インキュベーションした。インキュベーション後、ニコチンアミドグアニンジヌクレオチド（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｎ５１３１）を１５０μＭの最終濃度まで添加した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ｉ３ｘプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、蛍光分子サイクリックＧＤＰリボースの産生を１時間で測定した（ｅｘ  ３００ｎｍ／ｅｍ  ４１０ｎｍ）。ＵｎｉＡｂ（商標）で処理したウェルからのシグナルを、ＣＤ３８タンパク質をアイソタイプ対照抗体で処理した時に観察された総酵素活性のパーセント（最大）と比較することにより、シクラーゼ酵素阻害を評価した。
【０１７１】
実施例１：重鎖のみ抗体を発現する遺伝子操作されたラット
『ヒト−ラット』のＩｇＨ遺伝子座を、いくつかの部分で構築して、組み立てた。これは、ヒトＪＨｓの下流のラットＣ領域遺伝子の改変及び結合、ならびにその後のヒトＶＨ６−Ｄセグメント領域の上流付加を含む。次に、ヒトＶＨ６、全てのＤＳ、全てのＪＨｓ、及び改変ラットＣγ２ａ／１／２ｂ（ΔＣＨ１）を含む、組み立てられて改変された領域をコードする、ヒトＶＨ遺伝子の別のクラスタを有する２つのＢＡＣ［ＢＡＣ６及びＢＡＣ３］を、Ｇｅｏｒｇと称されるＢＡＣと同時注射した。
【０１７２】
再配置されていない立体配置の人工重鎖免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックラットを作製した。ＩｇＧ２ａ（ΔＣＨ１）、ＩｇＧ１（ΔＣＨ１）、ＩｇＧ２ｂ（ΔＣＨ１）遺伝子は、ＣＨ１セグメントを欠いていた。定常領域遺伝子ＩｇＥ、ＩｇＡ、及び３’エンハンサーが、Ｇｅｏｒｇ  ＢＡＣに含まれた。トランスジェニックラットのＲＴ−ＰＣＲ及び血清分析（ＥＬＩＳＡ）は、トランスジェニック免疫グロブリン遺伝子座の生産的な再配列及び血清中の種々のアイソタイプの重鎖のみ抗体の発現を明らかにした。トランスジェニックラットを、米国特許公開第２００９／００９８１３４  Ａ１号に以前に記載された変異内因性重鎖及び軽鎖遺伝子座を有するラットと交雑させた。そのような動物の分析は、ラット免疫グロブリン重鎖及び軽鎖発現の不活性化、ならびにヒトＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子によりコードされる可変領域を有する重鎖抗体の高レベル発現を示した。トランスジェニックラットの免疫化は、抗原特異的重鎖抗体の高力価血清応答の生成をもたらした。ヒトＶＤＪ領域を有する重鎖抗体を発現するこれらのトランスジェニックラットは、ＵｎｉＲａｔｓ（商標）と呼ばれていた。
【０１７３】
実施例２：ＵｎｉＲａｔｓ（商標）の免疫化及び血清力価の決定
ＢＣＭＡの組み換え細胞外ドメインによる免疫。
１２匹のＵｎｉＲａｔ（商標）動物（６匹のＨＣ２７、６匹のＨＣ２８）を組み換えヒトＣＤ３８タンパク質で免疫した。Ｔｉｔｅｒｍａｘ／Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントを使用して標準的なプロトコルに従って動物を免疫した。ＣＤ３８の組み換え細胞外ドメインを、Ｒ＆Ｄシステムズから購入し、滅菌生理食塩水で希釈し、アジュバントと混合した。免疫原をＴｉｔｅｒｍａｘ及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌアジュバントと組み合わせた。Ｔｉｔｅｒｍａｘ中の免疫原による初回免疫（プライミング）を左右の脚に投与した。その後の追加免疫をＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌの存在下で行い、採取３日前に追加免疫をＰＢＳ中の免疫原で実施した。最終採血時にラットから血清を収集し、血清力価を決定した。
【０１７４】
血清力価結果
血清力価希釈の結合活性を、６匹の動物について図２２に示されるような免疫原に対して試験した。全ての動物から採取された血清は、組み換えタンパク質に対する反応性を示し、対照抗原に結合しなかった。
【０１７５】
実施例３：遺伝子の組み立て、発現、及び配列決定
リンパ節細胞において高度に発現される重鎖のみ抗体をコードするｃＤＮＡを遺伝子構築のために選択し、発現ベクターにクローニングした。続いて、それらの重鎖配列を、ＵｎｉＡｂ重鎖（商標）のみ抗体（ＣＨ１欠失、軽鎖なし）としてＨＥＫ細胞に発現させた。
【０１７６】
図１、５、９、１３、及び１７は、それぞれ、抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）ファミリー１、３、４、７、及び９の重鎖可変ドメインアミノ酸配列を示す。
【０１７７】
図２、６、１０、１４、及び１８は、それぞれ、抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）ファミリー１、３、４、７、及び９のユニークなＣＤＲ１〜３配列を示す。
【０１７８】
図３、７、１１、１５、及び１９は、それぞれ、ファミリー１、３、４、７、及び９の列挙された抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体のＣＤＲ１〜ＣＤＲ３配列を示す。
【０１７９】
実施例４：細胞結合、酵素、及びＣＤＣ活性
図４、８、１２、１６、及び２０は、それぞれ、ファミリー１、３、４、７、及び９の列挙された抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂ（商標）抗体のＲａｍｏｓ細胞結合、ＣｙＣＤ３８  Ｃ６細胞結合、酵素活性、及びＣＤＣ活性を示す。最初の列は、試験されたＵｎｉＡｂ（商標）のクローンＩＤを示す。２番目の列は、Ｒａｍｏｓと共にインキュベートされた対照抗体のバックグラウンドＭＦＩで割った、Ｒａｍｏｓ細胞に結合する細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。３列目は、同じ細胞と共にインキュベートされた対照抗体のバックグラウンドＭＦＩで割った、カニクイザルＣＤ３８でトランスフェクトされたラットＣ６細胞に結合する細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。４列目は、それぞれのＣＤ３８結合ＵｎｉＡｂｓ（商標）対、対照ＵｎｉＡｂ（商標）の存在下での組み換えＣＤ３８の酵素活性の割合を示す。
【０１８０】
実施例５：抗ＣＤ３８  ＵｎｉＡｂｓ（商標）のさらなる特性決定
図２３に示されるように、５つの固有な重鎖ＣＤＲ３配列ファミリーを表すＵｎｉＡｂｓ（商標）は、各ファミリーがユニークな特性セットを発揮して、様々な機能的挙動を呈する。ＩｇＧ１  ＵｎｉＡｂ（商標）形式での追加の機能スクリーニングのために、５つのＣＤＲ３配列ファミリーのそれぞれから、単一リードＶＨ配列を選択した。一部のアッセイでは、ダラツムマブ及びイサツキシマブが参照対照として含まれていた。ヒト及びｃｙｎｏ  ＣＤ３８タンパク質への結合、ならびにヒトまたはｃｙｎｏ  ＣＤ３８のいずれかを発現する細胞への結合について、各ＵｎｉＡｂを特性決定した。加えて、ＣＤ３８の天然シクラーゼ（酵素）活性、ならびに、適切なアッセイ条件下で、ＣＤ３８発現哺乳動物細胞上の間接アポトーシス、直接アポトーシス、ＡＤＣＣ、及びＣＤＣを刺激する能力を阻害する能力について、ＵｎｉＡｂｓ（商標）を評価した。
【０１８１】
図２４は、異なる濃度のダラツムマブと混合されたＵｎｉＡｂ（商標）３０９４０７（１２．５ｎＭの）の異なる組み合わせのＣＤＣを示す。ＵｎｉＡｂ（商標）３０９４０７は、単独でＣＤＣによりＲａｍｏｓ細胞を溶解させなかった。ＵｎｉＡｂ  ３０９４０７と混合されたダラツムマブは、ダラツムマブ単独よりも強力であった。ヒトＩｇＧ４バックグラウンド上のＵｎｉＡｂ  ３０９４０７はまた、ダラツムマブのＣＤＣ活性を増強した。ＩｇＧ４は、補体に結合しない。これは、ＣＤ３８へのＵｎｉＡｂ  ３０９４０７の結合が、非重複エピトープに結合する抗体のＣＤＣ活性を調節することを示す。
【０１８２】
図２５は、ＵｎｉＡｂｓ（商標）ならびに、ＩＤ３０９０２１及びＩＤ３０９４０７のＶＨドメインを含む四価二重特異性ＵｎｉＡｂの組み合わせの補体結合を示す。これらの２つのＵｎｉＡｂｓ（商標）及びそのＶＨドメインは、ＣＤ３８の２つの非重複エピトープに結合する。これらの２つのＣＤ３８バインダーを単一の四価抗体（３０９０２１＿３０９４０７＿２ＸＧＳｌｉｎｋ）に組み合わせると、強力な補体結合及び腫瘍細胞の死滅が生じた。ＵｎｉＡｂｓ（商標）及び四価二重特異性ＵｎｉＡｂの混合物は、ダラツムマブと比較して、より効果的なＲａｍｏｓ細胞のＣＤＣを誘導した。個々のＵｎｉＡｂｓ（商標）は、ＣＤＣを誘発しなかった。
【０１８３】
図２６は、二価及び四価のＵｎｉＡｂｓ（商標）によるＣＤ３８のシクラーゼ活性の酵素阻害を示す。ＣＤ３８上の２つの非重複エピトープに結合する四価二重特異性ＵｎｉＡｂ（商標）は、シクラーゼ活性を強力に阻害した。二価単一特異性ＵｎｉＡｂｓ（商標）は、シクラーゼ活性を阻害しなかった。抗ＢＣＭＡ  ＵｎｉＡｂ（商標）を、陰性対照として使用した。２つの四価二重特異性重鎖抗体及び１つの二価二重特異性重鎖抗体の概略図である図２１も参照のこと。
【０１８４】
図２７は、ＣＤ３８への結合について抗体間の競合を示す。５つの配列ファミリーのＵｎｉＡｂｓ（商標）は、ダラツムマブ及びイサツキシマブがＣＤ３８＋細胞へのＵｎｉＡｂの結合をブロックする能力に基づいて、２つの広範な競合グループに分類される。ダラツムマブ及びイサツキシマブのエピトープと部分的または完全に重複するエピトープを有するＵｎｉＡｂｓ（商標）を同定するために、フローサイトメトリーを使用して、ダラツムマブまたはイサツキシマブによるＲａｍｏｓ細胞の前処理でブロックされるＵｎｉＡｂ結合のパーセントを測定した。ブロッキングの割合が増加すると、２つの抗体が重複エピトープを有する可能性が高くなる。このセットでは、ファミリーＦ０１、Ｆ０４、Ｆ０７、及びＦ０９は全て、ダラツムマブ及びイサツキシマブの両方による、少なくともある程度のブロッキングを示し、重複エピトープへの結合の可能性が示される（競合グループ１に入れる）。対照的に、Ｆ０３  ＵｎｉＡｂ（３０９４０７）結合は、ダラツムマブまたはイサツキシマブのいずれかによる前処理ではブロックされず、異なるエピトープに結合する可能性が高いことを示す（競合グループ２に入れる）。
【０１８５】
図２８は、Ｒａｍｏｓ細胞のＣＤＣを示す。ＵｎｉＡｂ（商標）３０９０２１を滴定し、固定濃度の異なるＵｎｉＡｂｓ（商標）と混合した（凡例を参照のこと）。ＩｇＧ１及びＩｇＧ４の形式のＵｎｉＡｂｓ（商標）３０９４０７は、ＵｎｉＡｂ（商標）３０９０２１との相乗作用を示した。ＩｇＧ１形式のＵｎｉＡｂ（商標）３０９２６５は、ＵｎｉＡｂ  ３０９０２１（商標）との相乗作用を示した。他の全てのＵｎｉＡｂ（商標）は、ＵｎｉＡｂ（商標）３０９０２１と相乗作用しなかった。
【０１８６】
実施例６：ＣＤＣ媒介性細胞死
図２９は、これらの同じ２つのＵｎｉＡｂｓ（商標）の二価単一特異性混合物の混合物と比較した、クローンＩＤ３２１９８６及びクローンＩＤ３２１６６３のＶＨドメインを含む四価二重特異性ＵｎｉＡｂｓ（商標）によるＲａｍｏｓ細胞のＣＤＣ媒介性腫瘍細胞死を示す。これらの２つのＶＨドメインは、ＣＤ３８上の非重複エピトープに結合し、単一の四価抗体（３２１９８６＿３２１６６３＿２ＸＧＳｌｉｎｋ及び３２１６６３＿３２１９８６＿２ＸＧＳｌｉｎｋ）に、これらのＶＨドメインを組み合わせることは、二価単一特異性ＵｎｉＡｂｓ（商標）（３２１９８６＋３２１６６３）の両方の混合物と比較して、腫瘍細胞の死滅を改善する。
【０１８７】
図３０は、クローンＩＤ３２１９８６及びクローンＩＤ３２１６６３のＶＨドメインを含む四価二重特異性ＵｎｉＡｂｓ（商標）によるＲａｍｏｓ細胞の直接腫瘍細胞アポトーシスを示す。死滅の有効性は、四価分子内のＶＨドメインの順序に影響される。クローンＩＤ３２１６６３のＶＨドメインが遠位（３２１６６３＿３２１９８６＿２ＸＧＳｌｉｎｋ）（すなわち、Ｎ末端に近い位置）にある時に、より強力な死滅が、クローンＩＤ３２１９８６のＶＨドメインが遠位（３２１９８６＿３２１６６３＿２ＸＧＳｌｉｎｋ）（すなわち、Ｃ末端に近い位置）にある時と比較して観察される。
【０１８８】
本発明の好ましい実施形態が、本明細書に示され、説明されているが、そのような実施形態が例としてのみ提供されることが、当業者らには明らかであろう。ここで、当業者らであれば、本発明から逸脱することなく多数の変形形態、変更、及び置換に想到するであろう。本明細書に記載される本発明の実施形態に対する種々の代替手段が、本発明の実施において用いられ得ることを理解すべきである。以下の特許請求の範囲が本発明の範囲を定義し、特許請求の範囲内の方法及び構造ならびにその等価物が特許請求に網羅されることが意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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