(57)【要約】本出願は、多重化イメージングを実施するある特定の有利な方法を提供する。【選択図】図１Ｄ
2020504600.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法であって、
（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、前記接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）前記試料を、核酸鎖に対して相補性を有する非線形アンプリファイアー鎖と接触させることであって、前記核酸鎖がドッキング鎖またはプライマー鎖のいずれかである、前記接触させることと、
（４）任意に、非結合非線形アンプリファイアー鎖を除去することと、
（５）１つまたは２つのステップのいずれかで、前記ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させ、前記試料を、前記ドッキング鎖または増幅鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることと、
（６）前記試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
（７）前記結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、
（８）任意に、ステップ（１）〜（８）またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、前記方法。
【請求項２】
ポリメラーゼがローリングサークル増幅のために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非線形アンプリファイアー鎖が、前記試料と接触させる前に、核酸鎖に結び付けられた前記標的特異的結合パートナーと組み合わされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させることが、前記試料を、前記ドッキング鎖または増幅鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることとは別に起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させることが、前記試料を、前記ドッキング鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることと同じステップで起こり、前記イメージャー鎖が、前記イメージャー鎖の増幅を防止するために３’修飾を任意に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記イメージャー鎖が、ローリングサークル増幅のための環状イメージャー鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記イメージャー鎖またはアンプリファイアー鎖が、前記ドッキング鎖に相補的である少なくとも２つの領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標識化イメージャー鎖が、直鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記非線形アンプリファイアー鎖が、環状鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記非線形アンプリファイアー鎖が、ライゲーション後に環状になる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法であって、
（１）前記試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが、直接または間接的に核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、前記接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）前記核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、前記核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、任意に、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、任意に、２つ以上のドッキング鎖を前記プライマー鎖と会合させることと、
（４）前記試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（６）前記試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
（７）任意に、前記結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
（８）任意に、ステップ（１）〜（７）またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、前記方法。
【請求項１２】
ステップ（６）の後、及び任意にステップ（７）を実施した後に、前記方法が、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることと、ステップ（４）、任意に（５）、（６）、及び任意に（７）を反復することと、をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、ステップ（３）において、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることか、または２つ以上のドッキング鎖を前記プライマー鎖と会合させることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数の前記増加が、酵素を使用して達成され、前記酵素が任意に、ポリメラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
非結合標識化イメージャー鎖を酵素的に開裂、修飾、または分解することが、酵素を使用することによって達成され、前記酵素が任意に、グリコシラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ、及び非天然ヌクレオチドにおいて開裂する酵素である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
２つ以上の標的特異的結合パートナーに結合した試料を含む、組成物であって、各結合パートナーが、核酸鎖、及び直接または間接的に標識化イメージャー鎖に安定的に結合した少なくとも１つのドッキング鎖に結合し、前記核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、前記核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖を前記プライマー鎖と会合させる、前記組成物。
【請求項１７】
直接または間接的に標識化イメージャー鎖に結合した前記ドッキング鎖が、３０分間少なくとも９０％の結合を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記
（ａ）ドッキング鎖、または
（ｂ）ドッキング鎖及び任意の中間鎖
が、８０個以下のヌクレオチド、７０、６０、５０、４０、または３０個以下のヌクレオチドである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記イメージャー鎖が、６０個以下のヌクレオチドである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
（１）標識と、
（２）第１の核酸ドメイン、第２の核酸ドメイン、及び第３の核酸ドメインであって、各核酸ドメインが、１〜９ヌクレオチド長である、前記核酸ドメインと、
（３）前記第１の核酸ドメイン及び前記第２の核酸ドメインを結び付ける第１の結合部分と、
（４）前記第２の核酸ドメイン及び前記第３の核酸ドメインを結び付ける第２の結合部分と、を含む、組成物であって、
両方の結合部分が、（ａ）無傷ホスホジエステル骨格を有する非塩基部位、（ｂ）核酸グリコシラーゼによって開裂可能なリンカー、（ｃ）非天然ヌクレオチド、または（ｄ）制限部位またはニッキング部位から独立して選択される、前記組成物。
【請求項２１】
追加の核酸ドメインが、追加の結合部分によって結び付けられる、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
少なくとも１つの結合部分が、無傷ホスホジエステル骨格を有する非塩基部位（アピリミジン）である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
少なくとも１つの結合部分が、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩからの開裂を起こしやすい、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記核酸ドメインが、ＤＮＡを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記核酸ドメインが、ＲＮＡを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
少なくとも１つの結合部分が、少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
前記イメージャー鎖及び／または前記中間鎖が、ＵＳＥＲによる開裂が可能な少なくとも１つのＵを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記イメージャー鎖及び／または中間鎖が、少なくとも１つの非塩基部位を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも２つの標的が、同じイメージングステップで少なくとも２つの標識を使用してイメージングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも２つの標的が、少なくとも２つの標識を使用してイメージングされ、前記シグナルが消失され、次いで少なくともさらに１つの標識が、同じ標識のうちの少なくとも１つを使用してイメージングされ、前記イメージングステップが、いずれかの順序で実施され得る、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、概して、分析物（例えば、標的）の検出及び定量化の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
蛍光顕微鏡は、例えば生物学系において分子を調査するための強力なツールである。しかしながら、識別可能かつ同時に視覚化され得る異なる種の数（すなわち、多重倍率）は、フルオロフォア間のスペクトルの重複によって制限される。いくつかの多重化イメージング法が既知であるが、十分に強力なシグナルを適切に発しない場合があるか、またはイメージングされている標的間の特定の切り替え手段を必要とする場合がある。したがって、改善された増幅法及びイメージングされている標的間の追加の切り替え手段を用いた、新しく、かつ改善された多重化イメージング法の必要性がある。
【発明の概要】
【０００３】
本記載によると、いくつかの実施形態では、１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法は、
（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）試料を、核酸鎖に対して相補性を有する非線形アンプリファイアー鎖と接触させることであって、核酸鎖がドッキング鎖またはプライマー鎖のいずれかである、接触させることと、
（４）任意に、非結合非線形アンプリファイアー鎖を除去することと、
（５）１つまたは２つのステップのいずれかで、ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させ、試料を、ドッキング鎖または増幅鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることと、
（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
（７）結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、
（８）任意に、ステップ（１）〜（８）またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む。
【０００４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法は、
（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが、直接または間接的に核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、任意に、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、任意に、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
（４）試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
（７）任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
（８）任意に、ステップ（１）〜（７）またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む。
【０００５】
いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上の標的特異的結合パートナーに結合した試料を含み、各結合パートナーは、核酸鎖、及び直接または間接的に標識化イメージャー鎖に安定的に結合した少なくとも１つのドッキング鎖に結合し、核酸鎖は、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させる。
【０００６】
いくつかの実施形態では、組成物は、
（１）標識と、
（２）第１の核酸ドメイン、第２の核酸ドメイン、及び第３の核酸ドメインであって、各核酸ドメインが、１〜９ヌクレオチド長である、核酸ドメインと、
（３）第１の核酸ドメイン及び第２の核酸ドメインを結び付ける第１の結合部分と、
（４）第２の核酸ドメイン及び第３の核酸ドメインを結び付ける第２の結合部分と、を含み、
両方の結合部分は、（ａ）無傷ホスホジエステル骨格を有する非塩基部位、（ｂ）核酸グリコシラーゼによって開裂可能なリンカー、（ｃ）非天然ヌクレオチド、または（ｄ）制限部位またはニッキング部位から独立して選択される。
【０００７】
追加の目的及び利点は、一部が以下の説明に記載され、一部が説明から明白になるか、または実施によって習得され得る。目的及び利点は、添付の特許請求の範囲で特に指摘される要素及び組み合わせによって実現及び達成される。
【０００８】
上記の概要及び以下の詳細な説明が両方とも単に例示的かつ説明的であり、特許請求の範囲を限定するものではないことを理解されたい。
【０００９】
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、かつ本明細書の一部を構成するが、１つの（いくつかの）実施形態（複数可）を例示し、本説明と併せて、本明細書に記載の原理を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ−Ｃ】Ａ〜Ｅは、標的認識部分を介してドッキング鎖を標的に付着させるスキームを示す。具体的には、図１Ａは、シグナル増幅なしの、ドッキング鎖の標的認識部分への付着を示す。図１Ｂは、ＨＣＲなどのプロセスを使用して作られ得る分岐構造を使用したシグナル増幅を用いた、ドッキング鎖の標的認識部分への付着を示す。図１Ｃは、ＲＣＡなどのプロセスを使用して作られ得る線形構造を使用したシグナル増幅を用いた、ドッキング鎖の標的認識部分への付着を示す。図１Ｄは、ドッキング部位（ドメインｂ）がＨＣＲの２つのヘアピンのうちの１つに付着し、複数のドッキング部位の、１つの標的認識部分への導入を可能にする、修正されたハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）を示す。図１Ｅは、複数のドッキング部位（ドメインｃ〜ｄ）を１つの標的認識部分に導入するためのローリングサークル増幅を示す。以下の参照番号がこの図面で使用される。１０１：標的。１０２：標的認識部分。１０３：ドッキング鎖。１２０：標的認識部分に付着したＨＣＲ反応のプライマー鎖。１２１：ドッキング部位と付着したＨＣＲの１つのヘアピン。１２２：ＨＣＲの別のヘアピン。１２３〜１２６：連続的なヘアピン集合反応。１２７：標的認識部分に付着したプライマー。１２８：ライゲーションによって環状化され得る線形鋳型。１２９：ライゲーション反応。１３０：鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマー伸長。１３１：複数のドッキング部位。
【図１Ｄ】Ａ〜Ｅは、標的認識部分を介してドッキング鎖を標的に付着させるスキームを示す。具体的には、図１Ａは、シグナル増幅なしの、ドッキング鎖の標的認識部分への付着を示す。図１Ｂは、ＨＣＲなどのプロセスを使用して作られ得る分岐構造を使用したシグナル増幅を用いた、ドッキング鎖の標的認識部分への付着を示す。図１Ｃは、ＲＣＡなどのプロセスを使用して作られ得る線形構造を使用したシグナル増幅を用いた、ドッキング鎖の標的認識部分への付着を示す。図１Ｄは、ドッキング部位（ドメインｂ）がＨＣＲの２つのヘアピンのうちの１つに付着し、複数のドッキング部位の、１つの標的認識部分への導入を可能にする、修正されたハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）を示す。図１Ｅは、複数のドッキング部位（ドメインｃ〜ｄ）を１つの標的認識部分に導入するためのローリングサークル増幅を示す。以下の参照番号がこの図面で使用される。１０１：標的。１０２：標的認識部分。１０３：ドッキング鎖。１２０：標的認識部分に付着したＨＣＲ反応のプライマー鎖。１２１：ドッキング部位と付着したＨＣＲの１つのヘアピン。１２２：ＨＣＲの別のヘアピン。１２３〜１２６：連続的なヘアピン集合反応。１２７：標的認識部分に付着したプライマー。１２８：ライゲーションによって環状化され得る線形鋳型。１２９：ライゲーション反応。１３０：鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマー伸長。１３１：複数のドッキング部位。
【図１Ｅ】Ａ〜Ｅは、標的認識部分を介してドッキング鎖を標的に付着させるスキームを示す。具体的には、図１Ａは、シグナル増幅なしの、ドッキング鎖の標的認識部分への付着を示す。図１Ｂは、ＨＣＲなどのプロセスを使用して作られ得る分岐構造を使用したシグナル増幅を用いた、ドッキング鎖の標的認識部分への付着を示す。図１Ｃは、ＲＣＡなどのプロセスを使用して作られ得る線形構造を使用したシグナル増幅を用いた、ドッキング鎖の標的認識部分への付着を示す。図１Ｄは、ドッキング部位（ドメインｂ）がＨＣＲの２つのヘアピンのうちの１つに付着し、複数のドッキング部位の、１つの標的認識部分への導入を可能にする、修正されたハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）を示す。図１Ｅは、複数のドッキング部位（ドメインｃ〜ｄ）を１つの標的認識部分に導入するためのローリングサークル増幅を示す。以下の参照番号がこの図面で使用される。１０１：標的。１０２：標的認識部分。１０３：ドッキング鎖。１２０：標的認識部分に付着したＨＣＲ反応のプライマー鎖。１２１：ドッキング部位と付着したＨＣＲの１つのヘアピン。１２２：ＨＣＲの別のヘアピン。１２３〜１２６：連続的なヘアピン集合反応。１２７：標的認識部分に付着したプライマー。１２８：ライゲーションによって環状化され得る線形鋳型。１２９：ライゲーション反応。１３０：鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いたプライマー伸長。１３１：複数のドッキング部位。
【図２】増幅し除去可能なシグナルのための連続的な増幅、重合、及びデンドリマー化を示す。
【図３】増幅し除去可能なシグナルのための同時の増幅、重合、及びデンドリマー化を示す。
【図４Ａ】ＨＲＰ様酵素からの連続増幅を伴う連続イメージングを示す。
【図４Ｂ】ＨＲＰ様酵素からの連続増幅を伴う同時イメージングを示す。
【図５】Ａ〜Ｄは、核酸分解酵素を使用したイメージャー鎖の除去を示す。（Ａ）一般スキーム。（Ｂ）イメージャー鎖のドッキング鎖認識部分において単一のデオキシウリジン（ｄＵ）ヌクレオチドが存在する実施形態。（Ｃ）イメージャー鎖のドッキング鎖認識部分において複数のｄＵヌクレオチドが存在する実施形態。（Ｄ）ｄＵヌクレオチドが、イメージャー鎖のドッキング鎖認識部分とシグナル発生部分との間のリンケージ内に配置される実施形態。１０４：イメージャー鎖。１０５：イメージャー鎖のシグナル発生部分。１０６：標的認識部分とドッキング鎖との間のリンケージ。１０７：追加のドッキング鎖への追加のリンケージ。１２０：付着したハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）のプライマー鎖。２０１：酵素的に分解され得る部分の一例としてのｄＵ。２０２：ｄＵを分解するための酵素反応。２０３：分解反応の残部がドッキング鎖から自発的に解離するプロセス。
【図６Ａ−Ｃ】Ａ〜Ｆは、ポリメラーゼ酵素を使用したイメージャー鎖の除去を示す。（Ａ）自己プライミングヘアピンがイメージャー鎖の３’末端に配置され、イメージャー鎖が鎖置換活性を有するポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９）を使用して除去される。（Ｂ）自己プライミングヘアピンが、核酸ハイブリダイゼーションを介してシグナル発生部分に結び付けられたイメージャー鎖の３’末端に配置され、イメージャー鎖が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して除去される。（Ｃ）自己プライミングヘアピンがドッキング鎖の３’末端に配置され、イメージャー鎖が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して除去される。（Ｄ）自己プライミングヘアピンがイメージャー鎖の３’末端に配置され、イメージャー鎖が５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ）を使用して除去される。（Ｅ）自己プライミングヘアピンがドッキング鎖の３’末端に配置され、イメージャー鎖が、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用して除去される。（Ｆ）自己プライミングヘアピンが伸長可能な３’末端を有するハイブリダイズされた二本鎖によって置き換えられる。３０１：自己プライミングヘアピン。３０２：自己プライミングヘアピン、または伸長可能な３’末端を有するハイブリダイズされた二本鎖が、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって伸長される、反応。３０３：ハイブリダイゼーションを介してシグナル発生部分をイメージャー鎖に導く短いオリゴヌクレオチド。３０４：自己プライミングヘアピン、または伸長可能な３’末端を有するハイブリダイズされた二本鎖が、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって伸長される、反応。３０５：伸長可能な３’末端を有するハイブリダイズされた二本鎖。３０６：標的認識部分とドッキング鎖との間のリンケージであり、リンケージは、共有結合または非共有結合相互作用を含む。
【図６Ｄ−Ｆ】Ａ〜Ｆは、ポリメラーゼ酵素を使用したイメージャー鎖の除去を示す。（Ａ）自己プライミングヘアピンがイメージャー鎖の３’末端に配置され、イメージャー鎖が鎖置換活性を有するポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９）を使用して除去される。（Ｂ）自己プライミングヘアピンが、核酸ハイブリダイゼーションを介してシグナル発生部分に結び付けられたイメージャー鎖の３’末端に配置され、イメージャー鎖が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して除去される。（Ｃ）自己プライミングヘアピンがドッキング鎖の３’末端に配置され、イメージャー鎖が、鎖置換活性を有するポリメラーゼを使用して除去される。（Ｄ）自己プライミングヘアピンがイメージャー鎖の３’末端に配置され、イメージャー鎖が５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ）を使用して除去される。（Ｅ）自己プライミングヘアピンがドッキング鎖の３’末端に配置され、イメージャー鎖が、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用して除去される。（Ｆ）自己プライミングヘアピンが伸長可能な３’末端を有するハイブリダイズされた二本鎖によって置き換えられる。３０１：自己プライミングヘアピン。３０２：自己プライミングヘアピン、または伸長可能な３’末端を有するハイブリダイズされた二本鎖が、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって伸長される、反応。３０３：ハイブリダイゼーションを介してシグナル発生部分をイメージャー鎖に導く短いオリゴヌクレオチド。３０４：自己プライミングヘアピン、または伸長可能な３’末端を有するハイブリダイズされた二本鎖が、５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによって伸長される、反応。３０５：伸長可能な３’末端を有するハイブリダイズされた二本鎖。３０６：標的認識部分とドッキング鎖との間のリンケージであり、リンケージは、共有結合または非共有結合相互作用を含む。
【図７Ａ】Ａ〜Ｇは、増幅後の画像を提供する。図７Ａは、ＤＮＡ交換及びＨＲＰベースの増幅を用いた、蛍光イメージングと明視野イメージングとの間の切り替えプロセスを示す概略図を提供する。図７Ｂは、抗体−ＤＮＡコンジュゲートで標識化された扁桃腺組織サイトケラチン、及び対応する蛍光標識化イメージャー鎖の得られる蛍光画像を提供する。図７Ｃは、ＤＮＡ交換及びＨＲＰベースの発色増幅後の同じ扁桃腺組織中のサイトケラチンの得られる明視野免疫組織化学画像を提供する。図７Ｄ及びＥは、増幅なし（Ｄ、左）及びローリングサークル増幅あり（Ｅ、右）の、ビメンチン及びＤＡＰＩに対して染色された細胞試料から得られた蛍光シグナルを示す。図７Ｆは、抗体−ＤＮＡコンジュゲートで標識化された扁桃腺組織サイトケラチン、及び対応する蛍光標識化イメージャー鎖の得られる蛍光画像を提供する（Ｆ、左）。図７Ｇ、右は、ドッキング鎖のＨＣＲ増幅及び対応する蛍光標識化イメージャー鎖のハイブリダイゼーション後の同じ組織切片からの蛍光画像を示す。図７Ｄ及び７Ｅ中、画像は、青色のＤＡＰＩ核染色を示し、典型的には細胞の中心領域に位置する略円形または豆形の物体として現れる。ＤＡＰＩは、細胞の核の内側のＤＮＡを染色し、細胞が視野内に存在するという証拠として画像中に含まれた。図７Ｄ中のビメンチン染色（赤色）は、増幅なしでより低く、図７Ｅ中では、増幅を伴いより明るく、かつより強かった。赤色ビメンチン染色は、主に細胞核の外側のフィラメント状または細い染色を示す。
【図７Ｂ−Ｃ】Ａ〜Ｇは、増幅後の画像を提供する。図７Ａは、ＤＮＡ交換及びＨＲＰベースの増幅を用いた、蛍光イメージングと明視野イメージングとの間の切り替えプロセスを示す概略図を提供する。図７Ｂは、抗体−ＤＮＡコンジュゲートで標識化された扁桃腺組織サイトケラチン、及び対応する蛍光標識化イメージャー鎖の得られる蛍光画像を提供する。図７Ｃは、ＤＮＡ交換及びＨＲＰベースの発色増幅後の同じ扁桃腺組織中のサイトケラチンの得られる明視野免疫組織化学画像を提供する。図７Ｄ及びＥは、増幅なし（Ｄ、左）及びローリングサークル増幅あり（Ｅ、右）の、ビメンチン及びＤＡＰＩに対して染色された細胞試料から得られた蛍光シグナルを示す。図７Ｆは、抗体−ＤＮＡコンジュゲートで標識化された扁桃腺組織サイトケラチン、及び対応する蛍光標識化イメージャー鎖の得られる蛍光画像を提供する（Ｆ、左）。図７Ｇ、右は、ドッキング鎖のＨＣＲ増幅及び対応する蛍光標識化イメージャー鎖のハイブリダイゼーション後の同じ組織切片からの蛍光画像を示す。図７Ｄ及び７Ｅ中、画像は、青色のＤＡＰＩ核染色を示し、典型的には細胞の中心領域に位置する略円形または豆形の物体として現れる。ＤＡＰＩは、細胞の核の内側のＤＮＡを染色し、細胞が視野内に存在するという証拠として画像中に含まれた。図７Ｄ中のビメンチン染色（赤色）は、増幅なしでより低く、図７Ｅ中では、増幅を伴いより明るく、かつより強かった。赤色ビメンチン染色は、主に細胞核の外側のフィラメント状または細い染色を示す。
【図７Ｄ−Ｇ】Ａ〜Ｇは、増幅後の画像を提供する。図７Ａは、ＤＮＡ交換及びＨＲＰベースの増幅を用いた、蛍光イメージングと明視野イメージングとの間の切り替えプロセスを示す概略図を提供する。図７Ｂは、抗体−ＤＮＡコンジュゲートで標識化された扁桃腺組織サイトケラチン、及び対応する蛍光標識化イメージャー鎖の得られる蛍光画像を提供する。図７Ｃは、ＤＮＡ交換及びＨＲＰベースの発色増幅後の同じ扁桃腺組織中のサイトケラチンの得られる明視野免疫組織化学画像を提供する。図７Ｄ及びＥは、増幅なし（Ｄ、左）及びローリングサークル増幅あり（Ｅ、右）の、ビメンチン及びＤＡＰＩに対して染色された細胞試料から得られた蛍光シグナルを示す。図７Ｆは、抗体−ＤＮＡコンジュゲートで標識化された扁桃腺組織サイトケラチン、及び対応する蛍光標識化イメージャー鎖の得られる蛍光画像を提供する（Ｆ、左）。図７Ｇ、右は、ドッキング鎖のＨＣＲ増幅及び対応する蛍光標識化イメージャー鎖のハイブリダイゼーション後の同じ組織切片からの蛍光画像を示す。図７Ｄ及び７Ｅ中、画像は、青色のＤＡＰＩ核染色を示し、典型的には細胞の中心領域に位置する略円形または豆形の物体として現れる。ＤＡＰＩは、細胞の核の内側のＤＮＡを染色し、細胞が視野内に存在するという証拠として画像中に含まれた。図７Ｄ中のビメンチン染色（赤色）は、増幅なしでより低く、図７Ｅ中では、増幅を伴いより明るく、かつより強かった。赤色ビメンチン染色は、主に細胞核の外側のフィラメント状または細い染色を示す。
【図８】ローリングサークル重合のための開始点としてドッキング鎖にハイブリダイズされ得る、予め形成された非線形ＤＮＡ鎖の使用を示す。
【図９Ａ−Ｇ】Ａ〜Ｆ及びＨ〜Ｋは、試料中の標的を再検索するために交換イメージング実験中にＣｙ５チャネルで得られる一連の画像を示す。図９Ｇは、図９Ａ〜Ｆの画像の平均シグナル強度を示す。
【図９Ｈ−Ｋ】Ａ〜Ｆ及びＨ〜Ｋは、試料中の標的を再検索するために交換イメージング実験中にＣｙ５チャネルで得られる一連の画像を示す。図９Ｇは、図９Ａ〜Ｆの画像の平均シグナル強度を示す。
【図１０】Ａ〜Ｂは、安定した結合を伴う近接検出の概略図及び結果を示す。図７Ｄ〜７Ｅのように、図１０Ａ〜Ｂは、細胞の内側の核のＤＡＰＩ（青色）染色を示す。図１０Ａはまた、主に細胞の核の外側のアルファ−チューブリン染色（緑色）を示す。
【図１１】Ａ〜Ｃは、標的外の交差反応性を評価するように設計された実験における細胞染色を示す。これらの図面はまた、細胞の外側の核のＤＡＰＩ染色（青色）も使用する。アルファ−チューブリン染色（赤色）は、図１１Ａ中に強く存在し、図１１Ｂ中に存在せず、図１１Ｃ中に弱く存在する。
【図１２】Ａ〜Ｄは、標的からのシグナルがＵＳＥＲまたはＵＤＧのいずれかを使用してほぼ完全に消失し得ることを示す。
【図１３Ａ−Ｂ】Ａ〜Ｄは、イメージャー鎖及びドッキング鎖に加えて、プライマー鎖及び中間鎖を使用するものもある、交換イメージングの様々な実施形態を示す。図１３Ａは、イメージャー鎖と、標的認識部分を通して標的に結合したドッキング鎖とを結び付けるために中間鎖（４０１）を使用する、ＤＮＡ交換イメージングを示す。図１３Ｂは、標的結合複合体と会合したドッキング鎖の数を増幅させるために使用されるプライマー鎖（４０４）を示し、得られる増幅産物（４０３）は、複数のドッキング部位（１０３）に付着し、示されるように中間鎖を通して直接または間接的にイメージャー鎖とイメージングされ得る。図１３Ｃは、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始するためのプライマー鎖を使用した、標的と会合したドッキング鎖の数の増幅、及び中間鎖を通してドッキング鎖に結合したイメージャー鎖の付加を伴うイメージングを示す。図１３Ｄは、ライゲーション及びローリングサークル増幅のための鋳型としてのプライマー鎖を使用した、標的と会合したドッキング鎖の数の増幅、続くイメージングのための中間鎖を通してドッキング鎖に結合したイメージャー鎖の付加を示す。
【図１３Ｃ−Ｄ】Ａ〜Ｄは、イメージャー鎖及びドッキング鎖に加えて、プライマー鎖及び中間鎖を使用するものもある、交換イメージングの様々な実施形態を示す。図１３Ａは、イメージャー鎖と、標的認識部分を通して標的に結合したドッキング鎖とを結び付けるために中間鎖（４０１）を使用する、ＤＮＡ交換イメージングを示す。図１３Ｂは、標的結合複合体と会合したドッキング鎖の数を増幅させるために使用されるプライマー鎖（４０４）を示し、得られる増幅産物（４０３）は、複数のドッキング部位（１０３）に付着し、示されるように中間鎖を通して直接または間接的にイメージャー鎖とイメージングされ得る。図１３Ｃは、ハイブリダイゼーション連鎖反応を開始するためのプライマー鎖を使用した、標的と会合したドッキング鎖の数の増幅、及び中間鎖を通してドッキング鎖に結合したイメージャー鎖の付加を伴うイメージングを示す。図１３Ｄは、ライゲーション及びローリングサークル増幅のための鋳型としてのプライマー鎖を使用した、標的と会合したドッキング鎖の数の増幅、続くイメージングのための中間鎖を通してドッキング鎖に結合したイメージャー鎖の付加を示す。
【図１４】Ａ〜Ｄは、核酸分解酵素を使用したイメージャー鎖の除去効率が配列設計によって異なることを示す。イメージャー鎖を非塩基部位あり（図１４Ｂ及びＤ）ならびになし（図１４Ａ及びＣ）で合成した。対応する蛍光標識化イメージャー鎖の除去前（図１４Ａ〜Ｂ、３０，０００強度スケールで示される）及び後（図１４Ｃ〜Ｄ、２，０００強度スケールで示される）の、抗体−ＤＮＡコンジュゲートで標識化された扁桃腺組織中のＣＤ３の蛍光画像が示される。
【図１５】Ａ〜Ｆは、４つの標識が、一度に２つの標的で連続的に、２つの異なるフルオロフォアで標識化された４つのイメージャー鎖を使用してイメージングされる、交換イメージングの実施形態を示す。したがって、図１５は、スペクトル及び連続多重化の組み合わせを示す。
【００１１】
以下の参照番号が図面及び本出願全体を通して使用される。
2020504600.tif 000003
2020504600.tif 000004
【発明を実施するための形態】
【００１２】
Ｉ．１つ以上の標的の存在に関して試料を試験する方法
本出願は、１つ以上の標的特異的結合パートナーを用いて、１つ以上の標的の存在に関して試験するための改善された方法及び組成物に関する。
【００１３】
交換イメージングは、多くの標的が同じ試料上でイメージングされ得るような高い多重化能力を達成するための方法である。交換イメージングの主要な概念は、以下のステップを伴う。（１）異なるデコード可能な情報伝達分子（ドッキング鎖と呼ばれる）を異なる標的特異的結合パートナー（標的を認識する抗体などであるがこれに限定されない）に付着させ（異なる特異性の標的特異的結合パートナー（すなわち、異なる標的に結合する）は、異なるドッキング鎖に結び付けられる）、任意に非結合標的特異的結合パートナーを除去すること、（２）各々がドッキング鎖を特異的に認識し、観察可能な部分を担持する分子のセット（イメージャー鎖と呼ばれる）を使用して、ドッキング鎖のサブセットを標識化し、対応する標識のサブセットをイメージングすること、（３）ステップ２で使用されたイメージャー鎖のセットを除去することによって、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させること、イメージャー鎖から観察可能な部分を除去すること、またはそのようなイメージャー鎖上の観察可能な部分を不活性化すること、（４）各々がドッキング鎖を特異的に認識し、観察可能な部分を担持するイメージャー鎖の別のセットを使用して、ドッキング鎖の別のサブセットを標識化し、対応する標識のサブセットをイメージングすること、（５）任意に、ステップ３及び４が反復されて、標識の複数のサブセットを視覚化することができる。エンドユーザは、全てのステップが全ての実験で反復されるべきとは限らないことを容易に理解するであろう。例えば、イメージングの最終回において、さらなるイメージング鎖が適用されないため、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させる必要はない。
【００１４】
交換イメージングの１つの非限定的な例は、ＤＮＡ交換免疫蛍光であり、抗体を標的認識分子として使用して、標的タンパク質または他の生体分子をイメージングし、ＤＮＡオリゴヌクレオチドをドッキング鎖として使用し、ドッキング鎖に相補的であり、少なくとも１つの観察可能な部分（フルオロフォアなど）で標識化されるＤＮＡオリゴヌクレオチドをイメージャー鎖として使用する。ステップ３において、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることは、いくつかの実施形態を含む。いくつかの実施形態では、イメージャー鎖を除去し、イメージャー鎖から標識を除去し、及び／またはイメージャー鎖に付着した標識を不活性化し得る。これらの様々な方法は、高温、低イオン強度緩衝液、変性剤（例えば、ホルムアミドを含む）、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮａｓｅ、鎖置換、化学開裂、酵素的開裂、化学漂白、光漂白、及び／または光化学漂白を使用することによって用いられ得る。結合した標識化イメージャー鎖によって、我々は、ある時点でドッキング鎖に結合している標識化イメージャー鎖を、ドッキング鎖に結合しなかった過剰な標識化イメージャー鎖と区別することを目標とする。シグナルを消失させるプロセス中、いわゆる結合した標識化イメージャー鎖は、ドッキング鎖に結合したままであってもよいか、またはドッキング鎖に結合したままではなくてもよい。
【００１５】
いくつかの実施形態では、試料をイメージングして結合した標識化イメージャー鎖を検出することは、結合した標識化イメージャー鎖の存在を検出する。いくつかの実施形態では、試料をイメージングして結合した標識化イメージャー鎖を検出することは、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び／または数を検出する。
【００１６】
様々なタイプのイメージングが方法と併用され得る。例えば、イメージングは、対物レンズ、照明、及びセンサを有する任意のタイプの顕微鏡法を含んでもよい。いくつかの実施形態では、イメージングは、光学顕微鏡、広視野、共焦点（線及び点走査、スピニングディスク）、全反射照明（ＴＩＲ）、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）、光シート照明（格子光シート照明を含む）、構造化照明（ＳＩＭ）を含む蛍光顕微鏡、膨張顕微鏡法、ならびに電子顕微鏡法を使用して実施される。
【００１７】
Ａ．増幅法
顕微鏡法において、シグナル増幅は、標的の存在量が低い場合、許容可能な曝露時間が短い場合、及び／またはイメージング機器の感度が低い場合などの多くの状況において望ましい。シグナル増幅は、ＤＮＡ交換免疫蛍光において利点を提供する。従来のシングルプレックス免疫蛍光（１つの標的のみが分析される）において、多くの場合、非共役一次抗体及び蛍光標識化二次抗体を使用する。二次抗体は多くの場合、ポリクローナルであるため、二次抗体の複数の分子が一次抗体の１つの分子に結合することができ、シグナルの増幅をもたらす。しかしながら、ＤＮＡ交換免疫蛍光において、いくつかの実施形態では、ユーザは、ＤＮＡドッキング鎖を一次抗体に直接標識化し、したがってポリクローナル二次抗体を使用することによって得られたそのようなシグナル増幅ステップを排除する。結果として、場合によっては、ＤＮＡ交換免疫蛍光は、従来の免疫蛍光と比較してより低いシグナル強度を有する可能性がある。
【００１８】
したがって、一実施形態では、多重化ＤＮＡ交換免疫蛍光におけるシグナル強度を改善するために、増幅が使用される。顕微鏡法におけるシグナル増幅のための多くの方法が存在するが、全てがＤＮＡ交換免疫蛍光に適用され得るとは限らない。最も周知の方法のうちの１つは、標的認識分子（例えば、抗体）を、観察不可能な基質を観察可能な産物に変換することができる酵素に（共有結合的または非共有結合的に）結び付けることを伴う。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）、β−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）などの多くの酵素が、これらの目的で使用されてきた。また、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、塩化ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（ＢＣＩＰ）、及び５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）など、これらの酵素のための数々の発色、蛍光発生、及び化学発光基質が開発されてきた。シグナル増幅においてそのような酵素を利用する別の戦略は、標的（または標的の近傍の他の分子）と観察可能なレポーター分子との間の共有結合を作り出すことである。この戦略は、とりわけ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒによって商品化されているチラミドシグナル増幅（ＴＳＡ）技術によって例示される。しかしながら、観察可能なレポーター、酵素／プライマー、または基質が永久的に、またはデコード可能なドッキング鎖なしで標的の近傍に運ばれるため、これらのシグナル増幅法のどれも交換イメージングと適合しない。観察可能なシグナルが少なくとも原則として除去され得るＤＮＡベースの（すなわち、デコード可能な）シグナル増幅法が報告されている（例えば、Ｚｉｍａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ  １３（１８）：２７２２−８（２０１２）（ＰＭＩＤ：２３１６５９１６））。しかしながら、そのような方法は複数回の操作を伴い、シグナル利得はわずかである。
【００１９】
別のタイプのシグナル増幅は、標的認識分子を重合またはデンドリマー化反応のプライマー分子に（共有結合的または非共有結合的に）結び付けることを伴う。そのような重合反応の一例は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）であり、ＲＣＡのプライマーは、標的認識分子に結び付けられ、長い反復一本鎖ＤＮＡに変換される。蛍光分子は、蛍光標識化ヌクレオチドを介してＲＣＡ産物に直接組み込まれるか、またはＲＣＡ産物にハイブリダイズするように設計された蛍光標識化オリゴヌクレオチドの一部としてＲＣＡ産物に結合するかのいずれかが可能である。そのような重合またはデンドリマー化反応の他の例としては、分岐ＤＮＡトーホールドベース鎖置換（Ｓｃｈｗｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３５１７００５）、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）（Ｄｉｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，ＰＭＩＤ：１５４９２２１０，２４７１２２９９）、及び同様のＤＮＡヘアピンベースのデンドリマー化反応（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＭＩＤ  １８２０２６５４）（ここでは、ＨＤＲと呼ぶ）が挙げられる。ＲＣＡ、ＨＣＲ、及びＨＤＲなどの増幅法の一般的な適用は、交換イメージングの選択肢を含まないが、本明細書に記載の改善によって実証されるように適合され得る。
【００２０】
本明細書において、我々は、交換イメージングと適合するシグナル増幅を含む実施形態を考察する。我々は、シグナル増幅を交換イメージングと適合するものにする一連の実施形態を記載する。これらの実施形態は、増幅産物がデコード可能であるかどうかに基づき、２つのクラスに分割され得る。例えば、増幅産物がドッキング鎖成分（例えば、一本鎖ＤＮＡ）を含有する場合、異なる標的に対する多くの（例えば、５を越える）抗体が、後に相補配列のｓｓＤＮＡ分子によってデコードされ得る異なるドッキング鎖配列のそのような産物を生成するようにプログラムされ得る。したがって、そのような増幅産物は、デコード可能と見なされる。そのような場合、異なる標的に対するシグナル増幅は、同時に実施され得、異なる増幅産物の同時及び／または連続的イメージングが後に続く。異なる標的に対して実施される同時増幅は、多重化増幅と見なされ得る。
【００２１】
対照的に、標的に共有結合的に付着しているか、またはその付近に非共有結合的に沈着しているが、イメージャー鎖と相互作用し得るドッキング鎖を含有しないフルオロフォアまたは標識である増幅産物の場合、これらの増幅産物は、デコード不可能と見なされる。例えば、シグナル増幅に関与する酵素がＨＲＰである場合、産物は、イメージャー鎖として機能する多くの分子によって特異的に結合され得る多くの変化形を可能にしない、化学発色団である。そのような場合、異なる標的に対するシグナル増幅は、連続的に実施され得、すでに増幅している標的に結び付けられた酵素は、試料から除去され得る。デコード不可能な増幅産物の同時シグナル増幅は、直交酵素−基質対が使用され得る場合に可能である。
【００２２】
したがって、いくつかの実施形態では、方法は、（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸鎖が、（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと（（ａ）または（ｂ）のいずれかにおいて、例えば、利用可能なドッキング鎖の数を増幅させるなど）、（４）試料を、直接または間接的に、ドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、（７）任意に、ドッキング鎖から結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、（８）任意に、ステップ（１）〜（６）またはこれらの任意のサブセットを反復することとを含む。
【００２３】
ここで、かつ本出願全体を通して、各標的特異的結合パートナーと会合するドッキング鎖によって、出願者は、増幅が１つ１つのドッキング鎖上で起こることを要求することではなく、増幅が概して、ユーザの要求通りに様々な標的特異的結合パートナーと会合するドッキング鎖上で起こることを意図する（標的Ａ及びＢの検出に関与しているほんの一部のドッキング鎖を増幅させる一方で、標的Ｂの検出に関与しているドッキング鎖を増幅させないことを含む）。増幅はまた、所与の標的の検出に関与しているドッキング鎖のコピーの全てではないがほんの一部上で起こる増幅など、不完全であり得る。加えて、増幅は、ドッキング鎖全体を複製し得るか、またはイメージャー鎖に結合するのに十分なドッキング鎖の一部分のみを複製し得る。
【００２４】
加えて、いくつかの実施形態では、方法は、（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）試料を、直接または間接的に、ドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであって、（１）の核酸鎖が、プライマー鎖またはドッキング鎖のいずれかであり、核酸鎖がプライマー鎖である場合、ドッキング鎖に結び付けられる、接触させることと、（４）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（５）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出し、増幅（ステップ（７））が必要とされるかを判定することと、（６）任意に、ドッキング鎖から結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、（７）任意に、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることと（例えば、ドッキング鎖複合体の自己集合、他の集合法、分岐及び環状ドッキング鎖などが挙げられるが、これらに限定されない複数の手段によって、利用可能なドッキング鎖の数を増幅させることをなど）、（８）任意に、ステップ（１）〜（７）またはこれらの任意のサブセットを反復することとを含む。
【００２５】
１．増幅
デコード可能な増幅産物。デコード可能な増幅産物は、増幅産物がドッキング鎖である場合を含む。一実施形態では、ドッキング鎖は、観察可能な標識を含有しない。一実施形態では、ドッキング鎖は、観察可能な標識のためのバーコード（またはイメージャー鎖）として機能する。最初に、ドッキング鎖またはドッキング部位が、シグナル増幅反応中に標的に導入され得（図１ｂ〜ｃ）、これにより複数のドッキング鎖が１つの標的分子に付着することに留意されたい。限定しないが、これを達成する少なくとも２つの戦略が存在する。（戦略１）骨格に付着し、次いで標的認識部分に付着する複数のドッキング部位を作り出すこと（図１ｂ）、及び（戦略２）標的認識部分に付着した１つの長い一本鎖ＤＮＡ上に複数の結合部位を作り出すこと（図１ｃ）。
【００２６】
ＲＣＡ、ＨＣＲ、またはＨＤＲを使用して、抗体に結び付けられたプライマー分子からポリマーまたはデンドリマー生成物を生成してもよい。いくつかの実施形態では、生成物は、ドッキング鎖として機能することができ、したがってイメージャー鎖として機能するオリゴヌクレオチドによって認識され得る一本鎖ＤＮＡドメインの多くの（例えば、２、５、１０、１５、２０、２５、５０、１００超などの）コピーを含有し得る。そのようなＤＮＡドメインは、十分に長くてもよい（例えば、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０ヌクレオチド超、もしくはそれ以上、またはイメージング条件において１ｎＭを超えるＫｄでその相補鎖に結合することが可能であり得る）。ＲＣＡに関して、これは、通常達成される。ＨＣＲ及びＨＤＲに関して、必要な場合、基質ヘアピンのループまたはテールにおいて、鎖置換カスケードに関与しないが、イメージャー鎖結合部位の一部または全部を構成するＤＮＡドメインを含むことができる。
【００２７】
一実施形態では、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）の修正されたバージョンがシグナル増幅に用いられ、２つのヘアピン（図１ｄの１０５及び１０６）が、交互にプライマー鎖（図１ｄの１０４）上に集合する。２つのヘアピンの片方または両方が、ドッキング部位（図１ｄのヘアピン１０５上のドメインｂ）を担持することができる。何十個〜何百個のヘアピン単位が１つのプライマー鎖上に集合し、何十個〜何百個のドッキング部位を標的認識部分に導くことができる。ヘアピン配列（ドッキング部位なし）のいくつかの対は、良好なＨＣＲ反応を可能にすることがＰｉｅｒｃｅ  ｇｒｏｕｐによって実証されている。ドッキング部位を有するヘアピン配列は、同じ原理で設計され得るが、ドッキング部位がヘアピンの残部との望ましくない二次構造を形成しないことを確実にするために注意が払われ得る。
【００２８】
別の実施形態では、シグナル増幅は、標的認識分子を重合またはデンドリマー化反応のプライマー分子に（共有結合的または非共有結合的に）結び付けることを伴う。そのような重合反応の一例は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ、図１ｅ）であり、ＲＣＡのプライマーは、標的認識分子に結び付けられ、長い反復一本鎖ＤＮＡに変換される。蛍光分子は、蛍光標識化ヌクレオチドを介してＲＣＡ産物に直接組み込まれるか、またはＲＣＡ産物にハイブリダイズするように設計された蛍光標識化オリゴヌクレオチドの一部としてＲＣＡ産物に結合するかのいずれかが可能である。
【００２９】
ＲＣＡを実施する方法は多くあり、それらのうちの１つは、標的認識部分に共役したリゴヌクレオチド（ここでは、「プライマー」と呼ぶ、図１ｅの１１１）が伸長可能な３’末端を有することを最初に確実にすることである。次いで、環状にプライマーにハイブリダイズすることができる線形鋳型鎖（図１ｅの１１２）を導入することができ、プライマーは、鋳型の２つの末端を集め、これにより２つの末端がライゲーションされ得る。次に、リガーゼ（例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ｓｓＬｉｇａｓｅなど）が、２つの末端をライゲーションして環を形成するために使用される。ライゲーション後、プライマーは、環状鋳型にハイブリダイズされる。次に、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９、Ｂｓｔ、Ｖｅｎｔ（エキソ−））は、環状鋳型に沿ってプライマーを複数回伸長させて、鎖状反復を作り出すことができる。反復単位の全体の一部（図１ｅのドメインｃ〜ｄまたは１１５）は、イメージャー鎖のためのドッキング部位（またはドッキング鎖）として機能することができる。
【００３０】
ＲＣＡの代替の方法は、非線形アンプリファイアーまたは鋳型鎖の使用を伴い、標的認識部分に共役したオリゴヌクレオチド（ドッキング鎖など）は、環状ＤＮＡ鋳型（アンプリファイアー鎖）にハイブリダイズされ、ＤＮＡポリメラーゼによるドッキング鎖の伸長が後に続いて、アンプリファイアー鎖の逆相補体の鎖状反復（すなわち、増幅鎖またはＲＣＡ産物）を作り出す。アンプリファイアー鎖のオリゴヌクレオチド共役標的認識部分へのハイブリダイゼーションは、オリゴヌクレオチド共役標的認識部分が試料と接触する前（組み立て前もしくはハイブリダイゼーション前）または後に起こり得る。
【００３１】
したがって、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド共役標的認識部分は、試料に導入される前に非線形アンプリファイアー鎖にハイブリダイズされる。ユーザが抗体−ＤＮＡコンジュゲートをアンプリファイアーと予め組み立てることを選択する場合、１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法は、（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられ、少なくとも１つの核酸鎖が非線形アンプリファイアー鎖にハイブリダイズされる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させて（すなわち、ドッキング鎖の数を増加させるか、または複数のドッキング鎖を導入させて）、ローリングサークル増幅産物を生成することと、（４）試料を、ドッキング鎖またはローリングサークル増幅産物に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることと、（５）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、（６）任意に、結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、（７）任意に、ステップ（１）〜（７）またはこれらの任意のサブセットを反復することとを含む。このプロセスにおいて、ローリングサークル増幅産物は、アンプリファイアー鎖の逆相補体の鎖状反復を含む。
【００３２】
別の実施形態では、イメージャー鎖は、ＲＣＡ反応中にＲＣＡ産物にハイブリダイズされ得る（例えば、標的認識部分に結び付けられたアンプリファイアー鎖の逆相補体の鎖状反復）。したがって、いくつかの実施形態では、増幅は、増幅鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖の存在下にある間に、ローリングサークル増幅を使用して起こる。例えば、試料は、アンプリファイアー鎖に予めハイブリダイズされたか、またはアンプリファイアー鎖が後のステップでハイブリダイズされ得るかのいずれかの標的認識部分に共役したオリゴヌクレオチドと接触し得る。次いで、タンパク質（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、任意にＢＳＡ）、ヌクレオチド、緩衝溶液、塩、及びイメージャー鎖を含むＲＣＡ反応のための追加の全ての成分は、１つのステップで付加され得る。いくつかの実施形態では、ユーザは、イメージャー鎖が増幅することを防止することを望む場合がある。これは、３’末端上で修飾を有する３’修飾イメージャー鎖を用いることが挙げられるが、これらに限定されないいくつかの手段によって達成され得る。例えば、イメージャー鎖上の３’修飾としては、標識（フルオロフォアなど）、修飾塩基、停止コードまたはターミネーター、３’−Ｏ−修飾、ジデオキシ−Ｃ、ジデオキシ−Ｇ、ジデオキシ−Ａ、ジデオキシ−Ｔ、反転ヌクレオチド、３’ヒドロキシル基の存在を排除する任意の修飾、またはアンプリファイアー鎖に相補的ではない３’末端の一本鎖伸長が挙げられ得る。
【００３３】
ＨＣＲ及びＲＣＡに加えて、そのような重合またはデンドリマー化反応の他の例としては、ＤＮＡヘアピンベースのデンドリマー化反応（ＨＤＲ）（Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＰＭＩＤ  １８２０２６５４）、及びトーホールド媒介鎖置換が挙げられる。
【００３４】
ＤＮＡ鎖置換は、ＤＮＡ複合体の等温及び動的交換のための方法である。鎖置換は、ＤＮＡハイブリダイゼーション相互作用及び熱力学の理解に基づき設計され、意図的に制御され得、「トーホールドドメイン」として既知である操作されたハンドルを導入することによって促進され得る。結合相互作用及び交換ハイブリダイゼーションパートナーを調節する能力は、一連の潜在的なシグナル増幅の適用をもたらす。
【００３５】
別の実施形態では、コード可能なチラミドベースのシグナル増幅産物が記載される。この方法は、（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）試料を、ドッキング鎖に結合することが可能な酵素標識化鎖と接触させることであって、（１）の核酸鎖が、プライマー鎖またはドッキング鎖のいずれかであり、核酸鎖がプライマー鎖である場合、ドッキング鎖に結び付けられる、接触させることと、（５）任意に、非結合酵素標識化鎖を除去することと、（４）試料をチラミド結合ドッキング鎖と接触させること、（５）チラミド部分を活性化状態に酵素的に変換することであって、活性化状態がチラミド結合ドッキング鎖の酵素標識化標識部位への共有結合リンケージをもたらす、変換することと、（６）任意に、酵素反応をクエンチすることと、（７）酵素標識化鎖を除去することと、（８）任意に、ステップ３〜８のサブセットを反復することとを含む。一実施形態では、酵素結合鎖は、ＨＲＰ結合鎖である。
【００３６】
別の実施形態では、方法は、（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つの標的特異的結合パートナーと接触させることであって、標的特異的結合パートナーが酵素に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）試料をチラミド結合ドッキング鎖と接触させることと、（４）チラミド部分を活性化状態に酵素的に変換することであって、活性化状態がチラミド結合ドッキング鎖の酵素標識化標識部位への共有結合リンケージをもたらす、変換することと、（５）酵素反応をクエンチすることと、（６）任意に、ステップ１〜８のサブセットを反復することであって、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが導入される、反復することとを含む。一実施形態では、酵素結合標的特異的結合パートナーは、ＨＲＰを含有する。
【００３７】
図２に示されるように、複数の標的の増幅は、連続的に実施され得る。あるいは、複数の標的の増幅は、同時に実施され得る（図３）。イメージングステップは、増幅の回の間、または増幅の全ての回の後に実施され得る。
【００３８】
デコード不可能な増幅産物。デコード不可能な増幅産物は、増幅産物がイメージャー鎖に対して特異親和性を有しない観察可能な標識である場合を含む。一実施形態では、デコード不可能な増幅産物は、フルオロフォア、発色染色、またはナノ粒子であり得る。
【００３９】
一実施形態では、デコード不可能な増幅産物を生成するための方法は、（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）試料を、ドッキング鎖に結合することが可能な酵素標識化鎖と接触させることであって、（１）の核酸鎖が、プライマー鎖またはドッキング鎖のいずれかであり、核酸鎖がプライマー鎖である場合、ドッキング鎖に結び付けられる、接触させることと、（５）任意に、非結合酵素標識化鎖を除去することと、（４）試料を酵素のための基と接触させること、（５）酵素反応が増幅産物を生成することを可能にすることと、（６）酵素反応をクエンチすることと、（７）試料をイメージングして、１つ以上の標的の有無を検出することと、（８）増幅産物を除去することと、（９）ステップ１〜９のサブセットを反復することとを含む。使用され得る酵素の例としては、ＨＲＰ、ＡＰ、ＧＯ、β−ｇａｌが挙げられる。酵素がイメージャー鎖（すなわち、ドッキング鎖に結合することが可能な鎖）に結び付けられたとき、連続増幅及びイメージングが実施され得る（図４）。図４ａは、連続増幅及び連続イメージングのための方法を示す。ここでは、各イメージング回の間に増幅産物を除去または不活性化するための方法が用いられる。増幅産物を除去または不活性化することは、基質を注意深く選択することによって行われ得る。例えば、試料に適した有機溶液に可溶性であるＨＲＰの発色基質を使用し得る（例えば、アルコール可溶性である３−アミノ−９−エチルカルバゾール、ＰＭＩＤ  １９３６５０９０）。この場合、ドッキング鎖共役抗体を染色し（図４ａ、ステップ１）、１つの標的のためのイメージャー鎖共役ＨＲＰ及び基質を導入し（図４、ステップ２）、試料をイメージングした後に、アルコール（例えば、メタノール）を使用して、本明細書に記載の方法のいずれかまたはそれらの組み合わせを用いて、ＨＲＰ生成物を除去し、イメージャー鎖を除去することができる。次に、別の標的のためのイメージャー鎖共役ＨＲＰを導入し、プロセスを反復することができる。
【００４０】
また、フルオロフォアが容易に漂白され得るＴＳＡ増幅法も使用し得る。例えば、多くのシアニンフルオロフォア及びＡｌｅｘａフルオロフォアは、酸性または塩基性条件において過酸化水素によって容易に漂白され得る（ＰＭＩＤ：２６３９９６３０）。あるいは、チラミドとフルオロフォアとの間の開裂可能な結合を含有するＴＳＡ色素を合成することができる。この場合、フルオロフォアは、この結合を開裂し、洗浄することによって不活性化され得る。
【００４１】
図４ｂは、連続増幅及び同時イメージングのための方法を示す。この場合、ドッキング鎖共役抗体を染色し（図４ｂ、ステップ１）、１つの標的のためのイメージャー鎖共役酵素及び基質を導入して（図４、ステップ２、例えばＨＲＰ及びＴＳＡを使用する）増幅産物を生成した後に、増幅産物を除去することなくイメージャー鎖共役酵素を除去し、単一イメージングステップにおいて試料をイメージングする前に複数の標的のために増幅の複数の回を反復することができる。
【００４２】
また、ＲＣＡ、ＨＣＲ、及びＨＤＲを使用して、増幅産物をデコードすることなくシグナル増幅を達成し得る。例えば、多重化抗体の染色後、標的の１つのサブセットの重合／デンドリマー化、ならびに（例えば、ＲＣＡの場合、蛍光標識化ヌクレオチドを介し、かつＨＣＲ及びＨＤＲの場合、フルオロフォア標識化ヘアピン基質を介した）増幅産物中への蛍光色素の直接的な組み込みのみを支持する試薬（ＲＣＡの場合、環状鋳型、ならびにＨＣＲ及びＨＤＲの場合、基質ヘアピン）を付加することができる。標的のこのサブセットのイメージング及び上記の漂白または開裂による色素の不活性化の後、標的の別のサブセットの重合／デンドリマー化、及び増幅産物中への蛍光色素の直接的な組み込みを支持する試薬を導入することができる。次いで、このプロセスは、反復され得る。
【００４３】
複数のタイプのシグナル増幅が組み合わせても使用され得る。例えば、Ｇｕｓｅｖらは、ローリングサークル増幅及びＨＲＰベースのシグナル増幅を組み合わせることを報告している（ＰＭＩＤ：１１４３８４５５）。
【００４４】
（ＤＮＡ複合体または他の増幅法を介して標的に導かれる）フルオロフォアを、直接または間接的に観察され得る他の分子または部分によって置き換えることができる。これらの分子または部分としては、金属粒子、プラズモンエンハンサー、及びタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
２．非線形増幅
非線形ＤＮＡ鋳型は、環状増幅鎖としてシグナル増幅のために用いられ得る。ドッキング鎖に対して相補性を有する環状オリゴは、増幅法とは別に生成され得る。例えば、実験施設内ライゲーションは、ＤＮＡの環状鎖を形成するために鋳型ＤＮＡ鎖上で実施され得る。環状鎖は、試料と接触する前に、標的特異的結合パートナーに付着したドッキング鎖にハイブリダイズされ得る。あるいは、標的特異的結合パートナーが試料を染色するために最初に使用され得、次いで後に続いて、環状鎖が試料に導入されて、標的特異的結合パートナー上のドッキング鎖とハイブリダイズし得る。環状鎖が標的特異的結合パートナーに結び付けられたドッキング鎖に付着した複合体の形成後に、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）が実施され得る。この方法は、非効率的な原位置ライゲーションステップでの問題を回避するために使用され得るため、ある特定の利点をもたらす。
【００４６】
いくつかの状況においては、アンプリファイアー鎖が用いられ得る。例えば、いくつかの実施形態では、方法は、（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）試料を、核酸鎖に対して相補性を有する非線形アンプリファイアー鎖と接触させることであって、（１）の核酸鎖がプライマー鎖またはドッキング鎖のいずれかである、接触させること、（４）任意に、非結合非線形アンプリファイアー鎖を除去することと、（５）ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させること（すなわち、ドッキング鎖の数を増加させるか、または複数のドッキング鎖を導入させること）と、（６）試料を、直接または間接的のいずれかでドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、（７）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、（８）結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、（９）任意に、ステップ（１）〜（８）またはこれらの任意のサブセットを反復することとを含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ポリメラーゼがＲＣＡのために使用され得る。場合によっては、標識化イメージャー鎖は、直鎖である。場合によっては、非線形アンプリファイアー鎖は、環状鎖である。場合によっては、非線形アンプリファイアー鎖は、分岐鎖である。場合によっては、非線形アンプリファイアー鎖は、ライゲーション後に環状になる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、増幅産物は、三角形、四辺形、五角形、六角形などの幾何学的形状を含み得る。
【００４９】
Ｂ．方法ステップの変化形
異なる時点で増幅ステップを使用してシグナルを増幅させ、複数の標的のイメージングまたは単一の標的の再検索を可能にするためにステップを反復するための選択肢を含む、多重化イメージングに取り組む様々な方法が存在する。方法はまた任意に、様々な時点でシグナル伝達画像を消失させることを含んでもよい。
【００５０】
１．イメージャー鎖を適用する前にシグナルを増幅させること、及び任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させること
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法は、（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸鎖が、（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、（４）試料を、直接または間接的のいずれかでドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、（７）任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることとを含む。場合によっては、ステップ（４）の後、及び任意にステップ（５）を実施した後に、方法は、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ドッキング鎖の数を増加させた後に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することをさらに含む。したがって、いくつかの様式では、ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させることは、試料を、増幅鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることとは別に起こる。増幅鎖とは、増幅の産物を意味する（ローリングサークル増幅が用いられる場合、増幅産物またはＲＣＡ産物とも呼ばれる場合がある）。
【００５１】
場合によっては、試料は、光学的に透明な支持体に載置される。いくつかの実施形態では、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることは、酵素を使用して達成される。例えば、上記のセクションＩ．Ａに記載された酵素アプローチが用いられ得る。
【００５２】
１．イメージャー鎖の存在下でシグナルを増幅させること、及び任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させること
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法は、（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）試料を、直接または間接的のいずれかでドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、（４）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸鎖が、（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと（増幅がイメージャー鎖の存在下で起こる）、（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、（７）任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることとを含む。場合によっては、ステップ（４）の後、及び任意にステップ（５）を実施した後に、方法は、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、ドッキング鎖の数を増加させた後に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することをさらに含む。
【００５３】
場合によっては、試料は、光学的に透明な支持体に載置される。いくつかの実施形態では、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることは、酵素を使用して達成される。例えば、上記のセクションＩ．Ａに記載された酵素アプローチが用いられ得る。
【００５４】
イメージャー鎖は、ドッキング鎖に対して相補性を有し得る。イメージャー鎖は、ローリングサークル増幅のための環状イメージャー鎖であってもよい。イメージャー鎖は、ドッキング鎖及びリガーゼの存在下で環状化するイメージャー鎖であってもよい。いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は、ドッキング鎖に相補的である少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の領域を含んでよい。
【００５５】
２．光学的に透明な支持体に載置された試料を試験するための方法
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的の存在に関して光学的に透明な支持体に載置された試料を試験するための方法は、（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸鎖が、（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、（４）試料を、直接または間接的のいずれかでドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであり、標識化イメージャー鎖が液体培地または緩衝溶液中に提供される、接触させることと、（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（６）任意に、液体を除去して液体を含まない試料を作り出すことと、（７）第１の支持体と平行に第２の光学的に透明な材料を取り付けることと、（８）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することとを含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、第２の光学的に透明な材料は、ガラスまたはプラスチックである。場合によっては、第２の光学的に透明な材料は、第１の支持体から約５ミクロン〜５ｍｍ、５０ミクロン〜５００ミクロン、または５００ミクロン〜５ｍｍである。場合によっては、イメージングは、正立顕微鏡を用いて実施される。
【００５７】
いくつかの実施形態では、任意に液体を除去して液体を含まない試料を作り出すことは、少なくとも４時間、１日、３日、１週間、２週間、または１ヶ月の長期貯蔵などの貯蔵のために試料を調製することを含む。いくつかの実施形態では、任意に液体を除去して液体を含まない試料を作り出すことは、ユーザが試料を水和状態で保持する必要がないため、試料の取扱の利便性を高める。
【００５８】
任意に液体を除去して液体を含まない試料を作り出すとは、試料中の液体（すなわち、試料中にすでに存在し、試料自体、ドッキング鎖、イメージャー鎖などの他の試料成分と会合した液体）の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％を除去することを意味する。いくつかの実施形態では、マウンティング培地は、空気を含む。他の実施形態では、マウンティング培地は、ゲル製剤中のマウンティング培地を含む。いくつかの実施形態では、マウンティング培地は、液体として始まるが、時間が経過するにつれてゲルまたは固体に変化する配合物（硬化材料、糊、セメント、または他の光学的に透明かつ同様に機能する材料など）を含む。
【００５９】
他の実施形態では、試料中の液体は、生理食塩水ベースの緩衝溶液（ＰＢＳなど）の液体マウンティング培地によって置き換えられてもよい。
【００６０】
マウンティング培地は、検体を定位置に保持するために、試料が乾燥することを防止するために、使用する目的の屈折率により厳密に一致するために、光漂白を防止するために（望ましくない場合）、かつ長期貯蔵のために試料を保存するために使用され得る。ウンティング培地の選択は、試料タイプ、観察可能な部分が使用されるイメージング戦略、及びユーザの目的（ユーザが試料を水和させたいかどうか、またはユーザが試料を貯蔵したいかどうか）によって決まる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的の存在に関して光学的に透明な支持体に載置された固定試料を試験するための方法は、（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、（４）試料を、直接または間接的のいずれかでドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（６）任意に、液体を除去して液体を含まない試料を作り出すことと、（７）第１の支持体と平行に第２の光学的に透明な材料を取り付けることと、（８）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することとを含む。
【００６２】
様々な複数の実施形態では、光学的に透明な支持体及び第１の支持体に平行な第２の光学的に透明な材料は、フローセルを含んでもよい。様々な複数の実施形態では、平行とは、完全に平行である幾何学的配列、ならびに最大１°、２°、３°、４°、５°、６°、７°、８°、９°、または１０°平行から外れる配列を含む。
【００６３】
３．試料再検索
いくつかの実施形態では、ユーザは、同じ標的に対する試料を複数回再検索することを望む場合がある。再検索が望ましい場合、多重イメージングは、同じイメージャー鎖を用いたイメージングの別の回を実施することによって実施される。したがって、ユーザが異なる標的をイメージングすることを望む場合、イメージャー鎖は、全ての他のイメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する。ユーザが同じ標的を複数回イメージングすることを望む場合、反復されるステップは、全ての他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有しないが、代わりにすでに用いられたイメージャー鎖と同じ配列を有するイメージャー鎖を使用する。
【００６４】
したがって、いくつかの実施形態では、方法は、（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸鎖が、（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、（４）試料を、直接または間接的のいずれかでドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び数を検出することと、（７）結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、（８）ステップ（３）〜（６）または（３）〜（７）を反復することであって、標識化イメージャー鎖が任意に、全ての他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する、反復することとを含む。
【００６５】
４．スペクトル及び連続多重化
交換イメージングにおいて多重化を生じさせる２つの主な方法、スペクトル多重化及び連続多重化が存在する。スペクトル多重化は、単回のイメージングにおいて異なる標識（異なるフルオロフォアなど）を使用する能力を指す。スペクトル多重化は、第２の標識を見る前に第１の標識からシグナルを消失させる必要はない。例えば、フルオロフォアの場合、異なるフルオロフォアを個々に励起するために光の異なる波長励起が使用され得る。これは、イメージングの別々の回を必要としない。連続多重化は、イメージングの第２の回の前にイメージングの第１の回からシグナルを消失させることによって、複数回のイメージングにおいて同じ標識（同じフルオロフォアなど）を使用する能力を指す。スペクトル多重化及び連続多重化は、単独でまたは互いと連結してのいずれかで使用され得る。しかしながら、多重化の２つ以上の技術を使用することはユーザが特定の実験中に視覚化することができる標識の数を有意に増加させることができる。
【００６６】
いくつかの実施形態では、複数回のイメージングは、同じフルオロフォアのうちの少なくとも一部を用いて実施される。例えば、イメージングの第１の回において、標的Ａは、標識Ｘでイメージングされ得、標的Ｂは、標識Ｙでイメージングされ得、標的Ｃは、標識Ｚでイメージングされ得る。次のステップとして、これらの標識からのシグナルが消失し得る。次いで、イメージングの第２の回において、標的Ｄは、標識Ｘでイメージングされ得、標的Ｅは、標識Ｙでイメージングされ得、標的Ｆは、標識Ｚでイメージングされ得る。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの標的が少なくとも２つの標識を使用してイメージングされ、シグナルが消失され、次いで、少なくともさらに１つの標的が、同じ標識のうちの少なくとも１つを使用してイメージングされ、イメージングステップは、いずれの順序でも実施され得る。これは、ステップの順序が逆にされ得、これにより第１のイメージングステップが、少なくとも１つの標的をイメージングし、シグナルを消失させることを含み、第２のイメージングステップが、少なくとも２つの標的をイメージングすることを含むことを意味する。
【００６７】
スペクトル多重化及び連続多重化の両方を組み合わせることは、ユーザにとってイメージングを実施する全体的な利便性を高め、イメージングされている試料の破壊を低減することができる。
【００６８】
Ｃ．安定した結合
いくつかの実施形態では、イメージングで使用される相補的な薬剤のうちの少なくとも一部が、互いに安定的に結合しており、他の実施形態では、イメージングで使用される全ての相補的な薬剤が、互いに安定的に結合している。いくつかの実施形態では、ドッキング鎖は、イメージャー鎖に安定的に結合している。いくつかの実施形態では、アンプリファイアー鎖は、ドッキング鎖に安定的に結合している。いくつかの実施形態では、アンプリファイアー鎖は、イメージャー鎖に安定的に結合している。
【００６９】
いくつかの実施形態では、中間鎖は、ドッキング鎖に安定的に結合している。いくつかの実施形態では、中間鎖は、アンプリファイアー鎖に安定的に結合している。いくつかの実施形態では、中間鎖は、イメージャー鎖に安定的に結合している。いくつかの実施形態では、アンプリファイアー鎖は、イメージャー鎖に安定的に結合している。いくつかの実施形態では、プライマー鎖は、ドッキング鎖に安定的に結合している。
【００７０】
いくつかの実施形態では、組成物は、２つ以上の標的特異的結合パートナーに結合した試料を含み、各結合パートナーは、ドッキング鎖に結合し、少なくとも１つのドッキング鎖は、標識化イメージャー鎖に安定的に結合している。
【００７１】
いくつかの実施形態では、安定した結合は、少なくとも表２に列挙された時間にわたる結合割合を含む。例えば、表２は、少なくとも３０分間９０％の結合を含む。これは、ｔ＝０で結合したもののうち、９０％のものが少なくとも３０分間結合したままであることを意味する。これはまた、例えば、どの時点においてもイメージャー鎖に結合した少なくとも９０％のドッキング鎖、及び１０％以下の非結合を有するという平衡が達成されることを意味する。安定した結合は、集団結合割合を達成するためにいくつかの分子の非結合及び他の分子の再結合を含むことができ、少なくとも９０％が永久的に結合していることを必要とせず、どの時点においても少なくとも９０％が結合していることのみを必要とする。安定した結合はまた、Ｖが、ユーザの実験に必要とされる長さに対応する時間の可変量であり、ｘが、その時間の長さにわたって結合した割合が安定した結合として認められることを意味する場合を含むことができる。
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【００７２】
例えば、安定的に結合したとは、約５分〜７日、１０分〜６０分、２０分〜３時間、３０分〜２４時間、３時間〜２４時間、または２４時間〜７日における７０％、８０％、または９０％の結合を含み得る。
【００７３】
表２中の値は、上述の安定した結合の全てのタイプに適用する。そのような測定は、非反応性緩衝液洗浄（複数可）後または非酵素的緩衝液洗浄（複数可）後に、イメージング条件（いくつかの状況においては、室温、中性ｐＨ、及び生理緩衝液条件）において行われ得る。
【００７４】
いくつかの実施形態では、安定した結合に関与するドッキング鎖、プライマー鎖、または中間鎖は、約８〜３０個のヌクレオチド、１０〜２５個のヌクレオチド、または１０〜２０個のヌクレオチドなど、３０個以下のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、安定した結合に関与するイメージャー鎖は、約８〜３０個のヌクレオチド、１０〜２５個のヌクレオチド、または１０〜２０個のヌクレオチドなど、３０個以下のヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、アンプリファイアー鎖は、約３０〜６０個のヌクレオチド、２０〜８０個のヌクレオチド、３０〜７０個のヌクレオチド、３０〜６０個のヌクレオチド、または６０個超のヌクレオチドである。増幅反応のタイプはまた、望ましいアンプリファイアー鎖の長さに影響を及ぼし得、例えば、より長い長さは、ハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）に望ましい。当業者は、ドッキング鎖、イメージャー鎖、及び／またはアンプリファイアー鎖中の異なる塩基の組成が、親和性の差により各鎖中で望ましいヌクレオチドの数に影響を及ぼすことを認識するであろう。温度もまた、望ましいヌクレオチドの数に影響を及ぼすであろう。
【００７５】
１．安定した結合を伴う近接イメージング
いくつかの実施形態では、ユーザは、安定した結合を伴う近接イメージングを用いてもよい。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）半ドッキングドメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも１つの第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｂ）半ドッキングドメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも１つの第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲート（（ａ）及び（ｂ）の安定ドメインは、互いに相補的であり、（ａ）及び（ｂ）の半ドッキングドメインは、線形に組み合わされて完全ドッキングドメインを形成することができる）と、（ｃ）５’ドメイン、３’ドメイン、及び５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインを含む、少なくとも１つの標識化イメージャー鎖または中間鎖（５’ドメインは、（ａ）の半ドッキングドメインに相補的であり、３’ドメインは、（ｂ）の半ドッキングドメインに相補的であり、標識化イメージャー鎖または中間鎖は、完全ドッキングドメインに安定的に結合することが可能であり、中間鎖が使用される場合、標識化イメージャー鎖も提供する）とを含む。あるいは、中間鎖が使用され得、ドッキング鎖及びイメージャー鎖の両方に相補的であり得る。増幅もまた用いられ得る。表２に記載される安定性基準もこれに関して適用される。
【００７６】
いくつかの実施形態では、ユーザは、プライマーを用いたときに安定した結合を伴う近接イメージングを用い得る。いくつかの実施形態では、組成物は、（ａ）半プライマードメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも１つの第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｂ）半プライマードメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも１つの第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲート（（ａ）及び（ｂ）の安定ドメインは、互いに相補的であり、（ａ）及び（ｂ）の半プライマードメインは、線形に組み合わされて完全プライマードメインを形成することができる）と、（ｃ）完全プライマードメインに安定的に結合することが可能な少なくとも１つのドッキング鎖と、（ｄ）ドッキング鎖に安定的に結合することが可能な少なくとも１つの標識化イメージャー鎖またはドッキング鎖に安定的に結合することが可能な中間鎖、及び中間鎖に安定的に結合することが可能な標識化イメージャー鎖とを含む。完全プライマードメインに安定的に結合することが可能なドッキング鎖は、同じ核酸鎖の相補的結合（非共有結合）及び同じ核酸鎖からの伸長（共有結合）を含む。ドッキング鎖が完全プライマードメインに非共有結合し、相補核酸配列を有する実施形態では、ドッキング鎖は、５’ドメイン、３’ドメイン、及び５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインを含んでもよく、５’ドメインは、（ａ）の半プライマードメインに相補的であり、３’ドメインは、（ｂ）の半プライマードメインに相補である。ドッキング鎖が共有結合している実施形態では、それは、核酸合成によって完全プライマードメインから伸長していてもよい。加えて、またはあるいは、中間鎖が使用され得、ドッキング鎖及びイメージャー鎖の両方に相補的であり得る。増幅もまた用いられ得る。表２に記載される安定性基準もこれに関して適用される。
【００７７】
Ｄ．対照実験及びバックグラウンド除去
対照実験及びバックグラウンド除去が、１つ以上の標的の存在に関して試料を試験する方法の結果をさらに改善するために用いられ得る。これらの態様のいずれも有用な実験のために必要ではないが、両方とも多重化の品質を改善し、単独で、または互いと併せて使用され得る。
【００７８】
１．対照実験
対照測定が、多重化プロセスの複数の時点で追加され得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的の存在に関して光学的に透明な支持体に載置された固定試料を試験するための方法は、（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、（４）試料を、直接または中間鎖を通すなど間接的のいずれかでドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、（７）結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、（８）試料を、ドッキング鎖または中間鎖（すなわち、仮想の中間鎖ではなく、使用される場合、方法において実際に存在するもの）に相補的ではないヌクレオチド配列を有する標識化イメージャー鎖と接触させることによって、対照ステップを実施することと、（９）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（１０）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、（１１）任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることとを含む。
【００７９】
いくつかの実施形態では、１つ以上の標的の存在に関して光学的に透明な支持体に載置された固定試料を試験するための方法は、（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、（４）試料を、ドッキング鎖または中間鎖（すなわち、仮想の中間鎖ではなく、使用される場合、方法において実際に存在するもの）に相補的ではないヌクレオチド配列を有する標識化イメージャー鎖と接触させることによって、対照ステップを実施することと、（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び／または数を検出することと、（７）結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、（８）試料を、直接または中間鎖を通すなど間接的のいずれかでドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、（９）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（１０）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び／または数を検出することと、（１１）任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることとを含む。
【００８０】
上記の２つの実施形態のいずれにおいても、場合によっては、方法は、ステップ（４）〜（１１）を反復することをさらに含む。いくつかの実施形態では、ユーザは、対照ステップを反復しない。他の実施形態では、ユーザは、対照ステップを反復して、非相補的結合を評価する。
【００８１】
これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、反復されるステップで使用されるドッキング鎖に相補的な標識化イメージャー鎖は、任意に、少なくとも１つの他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、対照実験は、非相補鎖の交差結合を評価して、標的Ａ、Ｂ、及びＣ（例えば）を評価する実施例において、標的Ａに対する標的特異的結合パートナー（抗Ａ）に取り付けられたドッキング鎖（ドッキングＡ）に結合することを目的とするイメージャー鎖（イメージャーＡ）が、Ｂに対する標的特異的結合パートナーに取り付けられたドッキング鎖（イメージャーＢ）と相互作用しないことを確実にするために、またはその相互作用の程度を測定するために使用される。そのような実施形態では、反復されるプロセスは、ドッキング鎖ＡとイメージャーＣとの相互作用などを評価し得る。これらの実施形態では、相補鎖（ドッキングＡに結合するイメージャーＡ）は、必ずしも反復されない。
【００８３】
２．バックグラウンド除去
本出願全体を通して考察される実施形態のいずれにおいても、方法は、バックグラウンド除去を用い得る。いくつかの実施形態では、方法は、試料をイメージングして、バックグラウンドシグナルを検出及び／または測定することと、試料の画像からバックグラウンドシグナルを除去して、結合した標識化イメージャー鎖を検出することとを含む。そのようなバックグラウンドシグナルは、自家蛍光、及び／または結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを不完全に消失させることと関連した残留蛍光を含んでもよい。いくつかの態様では、バックグラウンドシグナルは、結合した標識化イメージャー鎖を検出するための試料の画像の前に測定される。他の態様では、バックグラウンドシグナルは、結合した標識化イメージャー鎖を検出するための試料の画像の後に測定される。
【００８４】
Ｅ．結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させる方法
結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させるために様々な方法が使用され得、これは、同じタイプの検出可能な部分（フルオロフォアなど）が複数のイメージャー鎖上で使用され得、これにより実験がスペクトル的に制限されないようにするために、望ましくあり得る。
【００８５】
換言すれば、イメージャー鎖のセットを除去すること、またはイメージャー鎖上の観察可能な部分を不活性化することは、スペクトル的に無制限の多重イメージングを可能にする。多重イメージングのためのいくつかの従来の方法は、利用可能なフルオロフォアまたは他のイメージング剤の色の数によって制限されていた。イメージャー鎖を除去すること、イメージャー鎖から標識を除去すること、または観察可能な部分を不活性化することは、単一の実験においてフルオロフォアの同じ色の再利用を可能にする。いくつかの実施形態では、理想的に、連続イメージングのために可能な限り低いバックグラウンドを確実にするために、可能な限りのシグナルが除去されるべきである。いくつかの実施形態では、前のシグナル発生部分の１００％が除去または破壊され、一方でいくつかの実施形態では、前のシグナル発生部分の少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が除去または破壊される。
【００８６】
したがって、標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることは、直接または間接的にドッキング鎖に結合することからイメージャー鎖を除去するか、イメージャー鎖から標識を除去するか、またはイメージャー鎖上の標識を不活性化するための任意の方法を含む。
【００８７】
イメージャー鎖からシグナルを消失させるための全ての方法が、ドッキング鎖にも適用され得る。いくつかの実施形態では、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることは、ドッキング鎖（またはプライマー鎖）と標的認識部分との間の結合を破壊することを伴う。いくつかの実施形態では、ドッキング鎖は、光化学的に（例えば、ＵＶ曝露、可視光、赤外線、近赤外線、Ｘ線、マイクロ波、電波、またはガンマ線によって）開裂され得る光開裂可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、ドッキング鎖（またはプライマー鎖）自体は、酵素によって開裂され得る部分を含有する。そのような酵素開裂可能な部分の例としては、様々なＲＮａｓｅによって開裂され得るリボヌクレオチド、ＵＳＥＲ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）などの酵素の組み合わせによって開裂され得るデオキシウリジン、及び配列特異的ニッキング酵素または制限酵素によって開裂され得る制限部位が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ドッキング核酸は、デオキシウリジンを含み、ウラシル基は、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼによって開裂され得る。いくつかの実施形態では、ドッキング核酸は、エンドヌクレアーゼによって開裂され得る非塩基部位を含む。
【００８８】
交換イメージングの１つの非限定的な例は、ＤＮＡ交換免疫蛍光であり、抗体を標的認識分子として使用して、標的タンパク質または他の生体分子をイメージングし、ＤＮＡオリゴヌクレオチドをドッキング鎖として使用し、ドッキング鎖に相補的であり、フルオロフォアで標識化されるＤＮＡオリゴヌクレオチドをイメージャー鎖として使用する。ユーザは、高温、変性剤、ＤＮＡヘリカーゼ、ＤＮａｓｅ及び／または鎖置換を使用することによって、標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させ得るか、または化学開裂、酵素的開裂、化学漂白、光漂白、及び／または光化学漂白によってイメージャー鎖上のフルオロフォアを除去し得る。
【００８９】
１．核酸分解酵素
多くの酵素が、核酸分子内の共有結合を破壊することができる。例えば、一部のグリコシラーゼは、ヌクレオチドの糖部分から塩基を除去することができ、エンドヌクレアーゼは、核酸分子の内側のホスホジエステル架橋内の結合を切断することができ、一方で、エキソヌクレアーゼは、連続的に核酸分子の５’または３’末端においてホスホジエステル架橋を同様に破壊することができる。別の例は、ＤＮＡｚｙｍｅまたはデオキシリボザイム、核酸分子中のホスホジエステル結合を開裂することが可能な触媒活性を有するオリゴヌクレオチドを含む。これらの全てのタイプの酵素が、イメージャー鎖除去のために操作され得（図５）、標識化イメージャー鎖核酸を酵素的に開裂、修飾、または分解することをもたらす。
【００９０】
グリコシラーゼ。グリコシラーゼがドッキング鎖とイメージャー鎖との間の塩基対合に関与する塩基を特異的に除去することができる場合、それは、２つの鎖間の相互作用の強度を低減することができる。例えば、デオキシウリジン（ｄＵ）を使用して、イメージャー鎖中のデオキシチミジン（ｄＴ）を置き換えることができる。ｄＵは、ｄＴと同様にドッキング鎖中のｄＡと対合することができるが、ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから市販、カタログ番号Ｍ０２８０Ｓ）によって特異的に除去され得る。この反応は、イメージャー鎖上の非塩基部位（複数可）をもたらす。そのような非塩基部位は、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩによってさらに開裂され得る。これは、イメージャー鎖の残部とドッキング鎖との間の解離をさらに促進する。ＵＤＧ及びエンドヌクレアーゼＶＩＩＩの両方を含む酵素ブレンドもまた市販されている（例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから商標名ＵＳＥＲで、カタログ番号Ｍ５５０５Ｓ）。イメージャー鎖中に約１〜２０、１〜１５、１〜１０、または１〜５個のｄＵヌクレオチドを配置してもよい。ＵＳＥＲでは、ｄＵは、Ｕの除去後に残部が十分に短く（例えば、約９、８、７、６、５、４、３、２、または１個以下のヌクレオチド）、それらが自発的かつ迅速に解離する方法で配置され得る。ＵＤＧのみ（すなわち、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩなし）が使用される場合、ｄＵ単位の除去は、除去を促進するのに十分な鎖を不安定化し得る。ｄＵ除去後のイメージャー鎖とドッキング鎖との間の塩基対の総数は、９、８、７、６、５、４、３、２、または１個以下のヌクレオチドであり得る。したがって、いくつかの実施形態では、イメージャー鎖または中間鎖は、ＵＳＥＲによる開裂が可能な少なくとも１つのＵを含んでもよい。
【００９１】
残部の配列ならびに温度は、残部が自発的に解離するのにどれほど短くあるべきかに影響を及ぼす。例えば、ＧＣ含量が高い配列は、より長い長さの別の配列よりも短い長さにおいてより多くの結合親和性を有し得る。したがって、ある場合では、９マーは、安定した結合に十分であり得、他の場合では、９マーは、解離するのに十分であり得る。当業者は、ここで、かつ以下で考察される非天然ヌクレオチドの開裂において、配列、温度、及び親和性を評価することができる。
【００９２】
制限エンドヌクレアーゼ及びニッキングエンドヌクレアーゼ。ドッキング鎖：イメージャー鎖二本鎖中の制限部位を操作し得る。これは、そのような制限部位を切断するための対応する制限エンドヌクレアーゼの使用を可能にし、それは、標的とイメージャー鎖のシグナル発生部分との間のリンケージを破壊する。一例として、Ｃａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ会合タンパク質９）は、対応する配列中の特異的認識部位を操作することによって、ドッキング：イメージャー鎖二本鎖を特異的に開裂するために使用され得るＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼである。この結果として、両方の鎖が開裂され、対応する標的を再検索することができないようにする。この問題を解決するために、１つの鎖のみを切断するニッキングエンドヌクレアーゼを使用することができる。一例として、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｃａｓ９の高い特異性を保持しながら単一の鎖切断をもたらす、１つの活性開裂部位のみを含むように操作されたＣａｓ９酵素である。イメージャー鎖のみが切断され、シグナル発生部分を担持するイメージャー鎖の残部が、ドッキング鎖から自発的かつ迅速に解離するのに十分短い（例えば、７個未満のヌクレオチド）方法で、制限部位を設計することができる。部位特異的活性を有するエンドヌクレアーゼの他の例としては、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、及びデオキシリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９３】
Ｒｎａｓｅ。ＤＮＡヌクレオチド（デオキシヌクレオチドとも呼ばれる）の代わりに、イメージャー鎖ＲＮＡヌクレオチド（リボヌクレオチドとも呼ばれる）中のヌクレオチドの一部または全部を作製し得る。そのようなＲＮＡヌクレオチドは、Ｒｎａｓｅによって除去され得る。ドッキング鎖がＤＮＡヌクレオチドからなり、イメージャー鎖がＲＮＡヌクレオチドを含有する場合、ＤＮＡ：ＲＮＡヘテロ二本鎖中のそのようなＲＮＡヌクレオチドは、Ｒｎａｓｅ  Ｈによって除去され得る。
【００９４】
ポリメラーゼ。イメージャー鎖はまた、鎖置換活性または５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを使用することによって除去され得る。例えば、ＤＮＡから作られたドッキング鎖の３’末端におけるヘアピン構造を操作することができる。鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、Ｐｈｉ２９、Ｂｓｔ、Ｖｅｎｔ）が導入され、好適な緩衝液及びｄＮＴＰが供給される場合、ドッキング鎖の３’は伸長することができ、その間、イメージャー鎖は置き換えられる（図６ｃ）。自己プライミングヘアピンはまた、イメージャー鎖上で操作され得（図６ａ〜ｂ）、そのために、シグナル発生部分が直接イメージャー鎖に付着し得るか（図６ａ）、あるいはＤＮＡハイブリダイゼーションを介してイメージャー鎖に付着し得る（図６ｂ）。５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔａｑ）が導入され、好適な緩衝液及びｄＮＴＰが供給され、自己プライミングヘアピンがドッキング鎖の３’末端で操作される場合、３’は伸長することができ、その間、イメージャー鎖は分解される（図６ｅ）。自己プライミングヘアピンがイメージャー鎖の３’末端で操作される場合、同様の効果が達成され得る（図６ｄ）。自己プライミングヘアピンがまた安定した二本鎖によって置き換えられ得ることに留意されたい（例えば、図６ｆ）。
【００９５】
非天然ヌクレオチドの開裂。特定の酵素のための基質として機能する非天然ヌクレオチドが使用され得る。例えば、８−オキソグアニンがＤＮＡグリコシラーゼＯＧＧ１によって開裂され得る。非塩基部位がまた、エンドヌクレアーゼによって開裂され得る、イメージャー鎖などのＤＮＡ鎖に組み込まれ得る。例えば、１’，２’−ジデオキシリボース、ｄＳｐａｃｅｒ、アプリン／アピリミジン、テトラヒドロフラン、または脱塩基フランが、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩによって開裂され得る。したがって、いくつかの実施形態では、イメージャー鎖または中間鎖は、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩによる開裂が可能な少なくとも１つの非塩基部位を含み得る。いくつかの実施形態では、イメージャー鎖または中間鎖は、ＵＳＥＲ、ＵＤＧ、またはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩによる開裂が可能な少なくとも１つのデオキシウリジン及び少なくとも１つの非塩基部位を含み得る。リボスペーサー（ｒＳｐａｃｅｒ）または脱塩基ＩＩ修飾などの、光開裂可能なスペーサーまたはＲＮＡ非塩基部位もまた使用され得る。非天然ヌクレオチドの他の対及びそれらの対になった酵素が用いられ得る。
【００９６】
したがって、いくつかの実施形態では、組成物は、（１）標識と、（２）第１の核酸ドメイン、第２の核酸ドメイン、及び第３の核酸ドメイン（各核酸ドメインが、約１〜９ヌクレオチド長（例えば、約９、８、７、６、５、４、３、２、または１個のヌクレオチド）である）と、（３）第１の核酸ドメイン及び第２の核酸ドメインを結び付ける第１の結合部分と、（４）第２の核酸ドメイン及び第３の核酸ドメインを結び付ける第２の結合部分（両方の結合部分が独立して、（ａ）無傷ホスホジエステル骨格を有する非塩基部位、（ｂ）核酸グリコシラーゼによって開裂可能なリンカー、または（ｃ）制限部位もしくはニッキング部位から選択される）とを含む。いくつかの実施形態では、追加の核酸ドメインは、追加の結合部分によって結び付けられる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの結合部分は、無傷ホスホジエステル骨格を有する非塩基部位（アピリミジン）である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの結合部分は、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩからの開裂を起こしやすい。いくつかの実施形態では、核酸ドメインは、ＤＮＡを含み、いくつかの実施形態では、核酸ドメインは、ＲＮＡを含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの結合部分は、少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、少なくとも１つの結合部分は、８−オキソグアニンを含む。
【００９７】
いくつかの実施形態では、イメージャー鎖を除去する方法が増幅ステップと組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法は、（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが直接または間接的に核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、（４）試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであって、標識化イメージャー鎖が、すぐ上に記載された組成物を含む、接触させることと、（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、（７）ドッキング鎖から結合した標識化イメージャー鎖を除去することであって、標識化イメージャー核酸を酵素的に開裂、修飾、または分解することによって、標識化イメージャー鎖がドッキング鎖から除去される、除去することと、（８）任意に、ステップ（１）〜（７）またはこれらの任意のサブセットを反復することとを含む。
【００９８】
いくつかの態様では、標識化イメージャー核酸は、標識化イメージャー鎖を酵素的に開裂することによって除去される。
【００９９】
Ｆ．試料の説明
１．試料のタイプ
様々なタイプの試料が、これらの方法を使用してイメージングされ得る。いくつかの実施形態では、試料は、固定試料である。いくつかの実施形態では、試料は、細胞、細胞溶解物、組織、組織溶解物、及び／または全生物である。いくつかの実施形態では、試料は、細胞もしくは組織試料、細胞もしくは組織解物、または体液である。いくつかの実施形態では、試料は、組織であり、イメージングは、免疫染色のための組織中の多重化を含む。
【０１００】
試料は、液体培地または緩衝溶液中に提供され得る。
【０１０１】
２．抗原賦活化
いくつかの実施形態では、試料を標的特異的結合パートナーで染色することは、特異的な条件を必要とし、全ての標的特異的結合パートナーが同じ条件下でそれらの抗原に結合するわけではない。これは、それらの標的抗原が同じ条件下で利用可能ではないためであり得る。
したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法は、（１）試料を処理して、１つ以上の前に利用不可能な標的を曝露することと、（２）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（３）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（４）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、（５）試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、（６）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（７）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、（８）結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、（９）任意に、ステップ（１）〜（８）を反復することであって、毎回、（ａ）前に利用不可能な標的の異なるセットを曝露し、（ｂ）１つ以上の異なる標的特異的結合パートナーを使用し、（ｃ）少なくとも１つの他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する標識化イメージャー鎖を使用する、反復することとを含む。
【０１０２】
３．標的の説明及びバイオマーカーの同定における使用
いくつかの実施形態では、方法は、バイオマーカーを同定するのに有用である。場合によっては、試料がイメージングされ、データ分析がそれらの試料に対して実施される。いくつかの実施形態では、複数の標的が、各標的に対して対応する標的特異的結合パートナーの使用について試験される。場合によっては、異なる標的間の関係が評価され得、例えば、ユーザは、病状に対する複数のマーカーの関係を決定し、疾病試料がそのバイオマーカー分布を有しない健康な組織と比較して、Ａのレベルの上昇、Ｂのレベルの低下、及びある特定の範囲内のＣのレベルを有すると結論付けようとし得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１０、９６、１００、３８４、または５００個の試料がイメージングされ、データ分析がそれらの試料に対して実施される。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、少なくとも５、１０、１５、２５、３０、５０、７５、または１００個以上の標的が、各標的に対して対応する標的特異的結合パートナーの使用について試験される。
【０１０５】
Ｇ．機器及びソフトウェア
１．フローセルなどのイメージングチャンバ
いくつかの実施形態では、イメージングチャンバが用いられ得る。場合によっては、イメージングチャンバは、入口も出口もない固定チャンバである。いくつかの実施形態では、イメージングチャンバは、単一の入口／出口の組み合わせを有する。他の場合では、イメージングチャンバは、流動を可能にし、フローセルに指定される。フローセルは、フローセルに頂部及び底部表面ならびにそれらの間の流体流動を提供するために、第２の光学的に透明な材料（ガラスまたはプラスチックのカバースリップなど）と組み合わせた第１の光学的に透明な支持体からなってもよい。第１及び第２の光学的に透明な材料が使用される場合、それらは、互いに平行に配置され得る。平行とは、完全に平行である幾何学的配列、ならびに最大１°、２°、３°、４°、５°、６°、７°、８°、９°、または１０°平行から外れる配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の光学的に透明な材料は、約５ミクロン〜５ｍｍ、５０ミクロン〜５００ミクロン、または５００ミクロン〜５ｍｍなど、第１の光学的に透明な材料のすぐ近くにある。
【０１０６】
イメージングチャンバはまた、第１の光学的に透明な支持体及びガスケット（アイソレーターまたはスペーサーとも呼ばれる）からなってもよい。ガスケットは、頂部表面上の空気に開放されていてもよいか、または閉鎖され、光学的に透明な頂部表面を有してもよい。ガスケットは、組み合わされた入口／出口を有してもよいか、または入口及び出口の両方を有してもよい。ガスケットはまた、出口を有しなくてもよい。ガスケットは、プラスチック、ゴム、接着剤であってもよい。ガスケットは、ＣｏｖｅｒＷｅｌｌ  Ｃｈａｍｂｅｒ  Ｇａｓｋｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、正立顕微鏡もしくは倒立顕微鏡用の超薄型密封チャンバ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｏｏｌｓ）、またはインキュベーションチャンバ（Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ、ＨｙｂｒｉＳｌｉｐ（商標）ハイブリダイゼーションカバー、ＨｙｂｒｉＷｅｌｌ（商標）密封システム、ＣｏｖｅｒＷｅｌｌ（商標）インキュベーションチャンバ、イメージングスペーサー、ＳｅｃｕｒｅＳｅａｌ（商標）ハイブリダイゼーションチャンバ、ＦｌｅｘＷｅｌｌ（商標）インキュベーションチャンバ、ＦａｓｔＷｅｌｌｓ（商標）試薬バリア、及びＳｉｌｉｃｏｎｅ  Ｉｓｏｌａｔｏｒｓ（商標）を含む）を含んでもよい。
【０１０７】
場合によっては、ガスケットは、イメージングチャンバまたはフローセルの頂部表面を形成するカバースリップと共に用いられ得る。
【０１０８】
フローセルなどであるが、これに限定されないイメージングチャンバは、再利用可能または使い捨てであってもよい。
【０１０９】
したがって、いくつかの実施形態では、１つ以上の標的の存在に関して第１の光学的に透明な支持体に載置された固定試料を試験するための方法は、（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、（４）イメージングチャンバ（フローセルなど）において、試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び数を検出し、任意に、イメージングチャンバを除去することと、（７）結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、（８）ステップ（４）〜（６）または（４）〜（７）を反復することであって、少なくとも一度、標識化イメージャー鎖が任意に、少なくとも１つの他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する、反復することとを含む。
【０１１０】
光学的に透明な支持体に載置された固定試料をイメージングするための方法は、（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、（４）試料を、直接または間接的のいずれかでドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、（６）任意に、液体を除去して液体を含まない試料を作り出すことと、（７）第１の支持体のすぐ近く（すなわち、約５ミクロン〜５ｍｍ、５０ミクロン〜５００ミクロン、または５００ミクロン〜５ｍｍ）、かつそれと平行に第２の光学的に透明な材料を取り付けることと、（８）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することとを含む。
【０１１１】
２．流体ステップの制御のためのソフトウェア
いくつかの実施形態では、全ての流体交換ステップは、電子、及び／または空気、及び／または油圧、及び／または電子流体アクチュエータ及びシステムを含む流体システムを使用して実施される。ある特定の状況において、流体システムは、ソフトウェアによって制御される。いくつかの実施形態では、流体システムは、ステップ（１（試料を標的特異的結合パートナーと接触させること）、及び／または２（任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去すること）、及び／または３（ドッキング鎖の数を増加させること、もしくは増幅）、及び／または４（試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させること）、及び／または５（任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去すること）、及び／または７（任意に、ドッキング鎖から結合した標識化イメージャー鎖を除去すること）をイメージングステップ（６）と同期化するソフトウェアによって自動的に制御される。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、流体システムは、前の段落に記載されたステップ番号を参照して、イメージングソフトウェアと通信することによって、ステップ（１、及び／または２、及び／または３、及び／または４、及び／または５、及び／または７）をイメージングステップ（６）と同期化するソフトウェアによって制御される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、試料がイメージングデバイス上にある間に全ての流体ステップが実施される。いくつかの実施形態では、前の２つの段落に記載されたステップ番号を参照して、試料がイメージングデバイス上にある間にステップ４、５、及び７が実施される。
【０１１４】
試料は、使い捨てイメージングチャンバ（フローセルなど）または再利用可能なイメージングチャンバ（フローセルなど）内で固定されていてもよい。
【０１１５】
Ｈ．キット
いくつかの実施形態では、組成物は、（１）ドッキング鎖に結び付けられた標的特異的結合パートナー（異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なるドッキング鎖に結び付けられる）、標識化イメージャー鎖、緩衝液、増幅試薬、及び／または結合したイメージャー鎖を除去するための試薬が挙げられるが、これらに限定されない１つ以上の試薬（複数可）と、（２）全ての流体交換ステップを実施するための流体システム、流体システム及び時間を制御し、及び／または流体ステップをイメージングステップと同期化するためのソフトウェアと、（３）少なくとも１つの光学的に透明な側面を対象となる試料に付けて、試料のイメージングを可能にするためのイメージングチャンバ（フローセルなど）とを含む。いくつかの実施形態では、イメージングチャンバ（フローセルなど）は、使い捨てである。
【０１１６】
ＩＩ．方法の構成要素
Ａ．標的特異的結合パートナー
標的認識部分は、標的分子を検出するために使用され得る抗体及び抗体様分子を指す。抗体は、標的分子を特異的に認識することができる任意の種からの任意の免疫グロブリンを指す。抗体様分子は、（クラスＡ）Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、単一重鎖、ダイアボディなどの抗体の任意の操作された変異またはフラグメント（抗体の抗原結合フラグメント）、（クラスＢ）標的分子の任意の既知の結合パートナー及びそのような結合パートナーの操作された変異体、（クラスＣ）指向性進化を介して操作された標的分子の任意の結合パートナー（例えば、ペプチド及びアプタマー）、ならびに（クラスＤ）標的との共有結合（複数可）を選択的に形成する任意の分子（例えば、対象となる酵素の自殺基質）を指す。
【０１１７】
標的特異的結合パートナーは、液体培地または緩衝溶液中に提供され得る。
【０１１８】
表３は、標的及び対応する標的認識部分の代表的な列挙を提供する。
2020504600.tif 000006
【０１１９】
表４は、追加の標的の列挙を提供する。これらの標的の抗体及び他の既知の結合パートナーが、標的認識部分として使用され得る。
2020504600.tif 000007
【０１２０】
Ｂ．ドッキング鎖
いくつかの実施形態では、ドッキング部分またはドッキング鎖は、核酸、タンパク質、ペプチド、または化学化合物である。多くのタンパク質及びタンパク質のドメインは、他のタンパク質、ドメイン、またはペプチドと相互作用することが既知である。最も知られているドメインのいくつかとしては、ＳＨ２、ＳＨ３、及びＷＤ４０ドメインが挙げられる。多くの場合、これらのタンパク質及びドメインの結合パートナーが既知であり、望ましい親和性を有するように操作され得る。例えば、ビオチン及びアビジン／ストレプトアビジンは、十分な特異的で相互作用する。ジゴキシゲニン、フルオレセイン、タクロリムス、及びラパマイシンなどの多くの他の化学化合物もまた、周知の結合パートナーを有する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ドッキング鎖は、核酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸類似体などの一本鎖核酸である。核酸類似体（非天然核酸としても既知）は、変性ホスフェート骨格、変性ペントース糖、及び／または変性ヌクレオ塩基を含み得る。核酸類似体としては、２’−Ｏ−メチルリボ核酸、２’−フルオロリボ核酸、ペプチド核酸、モルフォリノ及びロックド核酸、グリコール核酸、ならびにトレオース核酸が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ドッキング鎖は、共有結合的に、及び他の実施形態では非共有結合的に、イメージャー鎖に付着する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ドッキング鎖は、一本鎖核酸を含み、約５〜２０ヌクレオチド長、約８〜１５、または約１０〜１２ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、ドッキング鎖は、約５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、または２０ヌクレオチド長である。
【０１２４】
ドッキング鎖は、独立した要素であってもよいか、または標的認識部分の一部であってもよい。例えば、標的認識部分が抗体である場合、抗体のＦｃドメインの一部は、ドッキング鎖であってもよく、タンパク質Ａまたはタンパク質ＧなどのＦｃドメインに結合するペプチドまたはタンパク質が使用されてもよい。
【０１２５】
ドッキング鎖は、液体培地または緩衝溶液中に提供され得る。
【０１２６】
Ｃ．イメージャー鎖
いくつかの実施形態では、ドッキング鎖は、核酸鎖であってもよい。そのような場合、観察可能な部分または標識は、ドッキング鎖に相補的である核酸鎖であってもよいイメージャー部分に共役してもよい。換言すれば、イメージャー鎖は、ドッキング鎖に特異的に結合する。そのような場合、標識は、約５〜２０ヌクレオチド長、約８〜１５、または約１０〜１２ヌクレオチド長であってもよいイメージャー部分に共役し得る。いくつかの実施形態では、イメージャー部分は、約５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、または２０ヌクレオチド長である。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、イメージャー鎖は、２０〜８０ヌクレオチド長、例えば、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、または３０ヌクレオチド長以下など、さらに長い。イメージャー鎖に対してヘアピン構造を用いる実施形態では、イメージャー鎖の長さは、ヘアピン構造が使用されない場合よりも長くあり得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、イメージャー部分とドッキング鎖との間の相補部分は、約５〜２０ヌクレオチド長、約８〜１５、または約１０〜１２ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、イメージャー部分とドッキング鎖との間の相補部分は、約５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、または２０ヌクレオチド長であってもよい。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、核酸イメージャー鎖は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸類似体などの一本鎖核酸を含む。核酸類似体（非天然核酸としても既知）は、変性ホスフェート骨格、変性ペントース糖、及び／または変性ヌクレオ塩基を含み得る。核酸類似体としては、２’−Ｏ−メチルリボ核酸、２’−フルオロリボ核酸、ペプチド核酸、モルフォリノ及びロックド核酸、グリコール核酸、ならびにトレオース核酸が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、イメージャー部分は、上記のセクションＩＩ．Ｂで考察されるドッキング鎖の選択肢に対するパートナーとしてのタンパク質、ペプチド、または化学化合物である。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ドッキング鎖は、中間部分を通してなど間接的にイメージャー部分に結合し得る。例えば、ドッキング鎖及びイメージャー部分が核酸である場合、核酸を含む中間部分は、それがドッキング鎖に相補的な第１の領域と、イメージャー部分に相補的な第２の領域とを有する限り、使用され得る。この実施形態では、ドッキング鎖がイメージャー部分に相補的である必要はない。中間部分は、架橋機能のみを果たしてもよいか、またはそれは、増幅機能も果たし得る。
【０１３２】
イメージャー鎖は、液体培地または緩衝溶液中に提供され得る。
【０１３３】
Ｄ．プライマー鎖
場合によっては、標的特異的結合パートナーは、プライマーを通してなど間接的にドッキング鎖に結び付けられる。例えば、ドッキング部分及びイメージャー部分が核酸を含む場合、核酸を含むプライマー鎖は、（ドッキング鎖がプライマー鎖に相補的な領域を有する場合）ドッキング鎖のための結合位置として使用され得るか、またはそれは、例えば、ローリングサークル増幅を通して核酸合成のためのプライマーとして使用され得る。プライマー鎖はまた、ハイブリダイゼーション連鎖反応増幅における一連の結合事象を開始するために使用され得る。プライマーが増幅（ローリングサークル増幅、ハイブリダイゼーション連鎖反応増幅など）のための位置として機能する場合、プライマーは、必ずしもドッキング鎖に相補的ではない。代わりに、それは、増幅のための鋳型として機能し、ドッキング鎖が増幅プロセスを通して含まれる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、標的特異的結合パートナー及び結び付けられたプライマーが第１のステップとして試料に付加され、ドッキング鎖が第２のステップとして付加され、イメージャー鎖が第３のステップとして付加される。別の実施形態では、成分は、別々のステップで付加されない。洗浄ステップが第１、第２、及び／または第３のステップの間に追加されてもよい。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、プライマー鎖は、核酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸類似体などの一本鎖核酸である。核酸類似体（非天然核酸としても既知）は、変性ホスフェート骨格、変性ペントース糖、及び／または変性ヌクレオ塩基を含み得る。核酸類似体としては、２’−Ｏ−メチルリボ核酸、２’−フルオロリボ核酸、ペプチド核酸、モルフォリノ及びロックド核酸、グリコール核酸、ならびにトレオース核酸が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、プライマー鎖は、一本鎖核酸を含み、約５〜２０ヌクレオチド長、約８〜１５、または約１０〜１２ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、プライマー鎖は、約５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０ヌクレオチド長である。
【０１３７】
プライマー鎖は、液体培地または緩衝溶液中に提供され得る。
【０１３８】
Ｅ．中間鎖
場合によっては、ドッキング鎖は、中間部分（または中間鎖）を通してイメージャー鎖に結合する。例えば、ドッキング部分及びイメージャー部分が核酸を含む場合、核酸を含む中間鎖は、それがドッキング鎖に相補的な第１の領域と、イメージャー鎖に相補的な第２の領域とを有する限り、使用され得る。そのような実施形態では、ドッキング鎖がイメージャー部分に相補的である必要はない。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、中間鎖が、直接または間接的のいずれかでドッキング鎖に結び付けられた標的特異的結合パートナーを含む試料に第１のステップとして付加され、イメージャー鎖が第２のステップとして付加される。別の実施形態では、中間鎖及びイメージャー鎖は、別々のステップで付加されない。場合によっては、中間鎖及びイメージャー鎖は、単一ステップで付加される前に一緒にハイブリダイズされる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、中間鎖は、核酸を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、または核酸類似体などの一本鎖核酸である。核酸類似体（非天然核酸としても既知）は、変性ホスフェート骨格、変性ペントース糖、及び／または変性ヌクレオ塩基を含み得る。核酸類似体としては、２’−Ｏ−メチルリボ核酸、２’−フルオロリボ核酸、ペプチド核酸、モルフォリノ及びロックド核酸、グリコール核酸、ならびにトレオース核酸が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、中間鎖は、一本鎖核酸を含み、約５〜３０ヌクレオチド長、約８〜１５、または約１０〜１２ヌクレオチド長であってもよい。いくつかの実施形態では、中間鎖は、約５、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１８、２０、２５、または３０ヌクレオチド長である。
【０１４２】
中間鎖は、液体培地または緩衝溶液中に提供され得る。
【０１４３】
Ｆ．ヘアピン形式の核酸
本明細書に記載の線形核酸のいずれも、任意に、ヘアピン形式で提供され得る。これは、イメージャー鎖、ドッキング鎖、プライマー鎖、及び中間鎖を含む。ヘアピン形式では、ヘアピンステム領域の末端における少なくとも１〜５個のヌクレオチドの領域が、任意に、Ｇ’及びＣ’のみを含み得る。このＧ／Ｃ領域は、クランプとして既知である。Ｇ／Ｃ領域は、ヘアピンの末端におけるフレイングを防止または低減して、直鎖ＤＮＡへの開放を防止する。
【０１４４】
ヘアピンは、ユーザが、鎖置換活性を有するポリメラーゼ（例えば、ｐｈｉ２９）、または５’から３’へのエキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼＩ）を使用して、イメージャー鎖とドッキング鎖との間の（直接的または間接的）相互作用を破壊しようとする状況で使用され得る。ヘアピンはまた、一本鎖核酸の望ましくない結合を制限するためにも使用され得る。
【０１４５】
Ｇ．標識
観察可能な部分としても既知の様々な標識が、イメージャー鎖に結合され得る。これらの標識または観察可能な部分は、結合したイメージャー鎖の検出を可能にすることによってユーザを補助する。本出願が結合した標識化イメージャー鎖を検出することを指す場合、本出願は、イメージャー鎖に結合した標識または観察可能な部分によって発生したシグナルを検出することに言及する。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、任意の観察可能な部分が用いられ得、いくつかの実施形態では、その部分は、光学的に観察可能である。その部分は、シグナル吸収性またはシグナル放出性であってもよい。シグナル放出分子のうち、フルオレセイン、ローダミン、シアニン色素、Ａｌｅｘａ色素、ＤｙＬｉｇｈｔ色素、Ａｔｔｏ色素などであるが、これらに限定されないフルオロフォアが挙げられるが、これらに限定されない有機小分子などの蛍光を発する分子が使用され得る。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、ｐ−ｄｏｔなどの有機ポリマーが用いられ得る。いくつかの実施形態では、観察可能な部分は、蛍光タンパク質または蛍光核酸（ホウレンソウ及びその誘導体を含む蛍光ＲＮＡを含む）が挙げられるが、これらに限定されない生体分子であってもよい。いくつかの実施形態では、観察可能な部分は、Ｑ−ｄｏｔを含む無機部分であってもよい。いくつかの実施形態では、観察可能な部分は、ナノ粒子及び表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）レポーター（例えば、４−メルカプト安息香酸、２，７−メルカプト−４−メチルクマリン）など、弾性散乱または非弾性散乱のいずれかの散乱を通して動作する部分であってもよい。いくつかの実施形態では、観察可能な部分は、ルテニウム錯体及びルシフェラーゼなど化学発光／電気化学発光エミッターであってもよい。観察可能な部分は、光シグナル、電磁シグナル（電磁スペクトル全体にわたる）、原子／分子質量（例えば、質量分析法によって検出可能）、実体質量（例えば、原子間力顕微鏡によって検出可能）、電流、または電圧を発生させ得る。
【実施例】
【０１４８】
実施例１：複数の増幅モード
増幅には複数のアプローチが存在する。この実施例は、ＨＲＰコンジュゲートを使用した酵素増幅（図７Ａ〜Ｃ）、ローリングサークル増幅（図７Ｄ〜Ｅ）、及びハイブリダイゼーション連鎖反応（ＨＣＲ）（図７Ｆ〜Ｇ）を含む３つのアプローチの使用を実証する。
【０１４９】
ＨＲＰベースの増幅に関して、ホルマリン固定／パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）扁桃腺組織切片を脱ろうし、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＰＴモジュールでＲ−Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抗原賦活化した。組織切片を３％  ＢＳＡ及び０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００中で１．５時間ブロックした。湿度チャンバにおいて４℃で一晩、組織切片をマウス抗サイトケラチン一次抗体で染色した。次いで、組織切片を１×ＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡドッキング鎖（Ｄ１）に共役したヤギ抗マウス二次抗体を用いて室温で２時間染色した。組織切片を１×ＰＢＳで再び洗浄し、ＤＡＰＩに対して染色した。
【０１５０】
蛍光顕微鏡を使用して、ブランクとして機能するためのＤＡＰＩ及びＣｙ５チャネル中の組織切片をイメージングした。ドッキング鎖Ｄ１に相補的なドメインを含むＤＮＡに付着した赤色フルオロフォアを含むイメージャー鎖（Ｉ１−６５０）を、調製した組織切片に付加し、室温で２５分間ハイブリダイズさせた。切片を洗浄して、非結合Ｉ１−６５０を除去した。次いで、１０倍対物レンズを使用して、ＤＡＰＩ及びＣｙ５チャネル中で蛍光画像を取り込んだ。図７Ｂを参照されたい。
【０１５１】
次いで、１０単位のＵＳＥＲ酵素を組織切片に室温で１５分間適用し、１×ＰＢＳで洗浄し、組織試料を３０％ホルムアミドで５分間インキュベートし、次いで１×ＰＢＳで洗浄することによって、イメージャー鎖Ｉ１−６５０を除去した。蛍光顕微鏡を使用して、Ｃｙ５チャネル中の蛍光シグナルの完全な除去を確認した。次いで、明視野画像をブランクとして１０倍倍率で撮った。
【０１５２】
明視野免疫組織化学的検出のためにサイトケラチンシグナルを増幅させるために、組織切片を、ドッキング鎖Ｄ１に相補的なドメインを含むＤＮＡに付着したホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）酵素を含むイメージャー鎖（Ｉ１−ＨＲＰ）でインキュベートした。１×ＰＢＳ中に組織切片を浸漬することによって、試料を洗浄した。次いで、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）色原体の溶液を試料に１０分間適用することによって、発色シグナル増幅を実施した。試料を１×ＰＢＳ中で洗浄した。最後に、明視野照明を使用して、試料をイメージングした。図７Ｃ。
【０１５３】
図７Ａ〜Ｃは、蛍光及び明視野（例えば、免疫組織化学）画像が同じ試料上で取り込まれることを可能にするためのＤＮＡ交換の使用を例示する。この実施例は、発色シグナル増幅のためのＨＲＰ共役イメージャー鎖の使用を実証しているが、ＨＲＰ共役イメージャー鎖は、代替の酵素基質（例えば、チラミド）を使用した蛍光シグナル増幅にも適用され得る。
【０１５４】
ローリングサークル増幅に基づく増幅のための別個のアプローチにおいて、培養されたＨｅＬａ細胞を、温かい３％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドで固定し、０．１％水素化ホウ素ナトリウムで還元し、３％ウシ血清アルブミン及び０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００でブロック及び透過処理し、次いで、ビメンチンに対するウサギ一次抗体で一晩染色した。
【０１５５】
対照試料のために、ドッキング鎖に共役したヤギ抗ウサギ抗体（Ｇｔ−ａ−Ｒｂ−Ｄ１）を、二次染色ステップとして、室温で２時間細胞とインキュベートした。対照試料の洗浄後、ＤＡＰＩ及び１００ｎＭ蛍光標識化イメージャー鎖を試料に付加した。対照ウェルのＤＡＰＩ及びＣｙ５チャネル中の蛍光画像を収集した。図７Ｄ。
【０１５６】
ローリングサークル増幅を受けている細胞試料に対して、以下の手順を実施した。ドッキング鎖に共役したヤギ抗ウサギ抗体（Ｇｔ−ａ−Ｒｂ−Ｄ１）をライゲーションのための鋳型として使用した。１×ライゲーション緩衝液（ＮＥＢ）中１２５ｎＭ環状オリゴ（ＩＤＴ  ＤＮＡ）、１２５ｎＭ  Ｇｔ−ａ−Ｒｂ−Ｄ１、２０Ｕ／μＬ  Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ）を用いて、ＰＣＲ管中でライゲーション溶液を作製した。ライゲーション溶液を室温で２時間インキュベートした。ライゲーション後、ライゲーション溶液をブロッキング緩衝液中で１：５に希釈し、細胞試料に添加し、室温で２時間インキュベートさせ、次いで１×ＰＢＳ中で洗浄した。
【０１５７】
別個の槽内で、１×ポリメラーゼ反応緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）中０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、及び１Ｕ／μＬ  ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを含有するポリメラーゼ溶液を作製した。ポリメラーゼ溶液を、ＲＣＡのために調製した細胞試料に直接適用した。試料を３０℃で１．５時間、ポリメラーゼ溶液でインキュベートした。細胞試料を１×ＰＢＳで３回洗浄した。ＤＡＰＩを添加して、細胞核を染色した。最後に、１００ｎＭ蛍光標識化イメージャー鎖をイメージング前に付加した。ＤＡＰＩ及びＣｙ５チャネル中の蛍光画像をＲＣＡ後に収集した。図７Ｅを参照されたい。
【０１５８】
ハイブリダイゼーション連鎖反応に基づく増幅のための別のアプローチとして、ホルマリン固定／パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）扁桃腺組織切片を脱ろうし、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  ＰＴモジュールでＲ−Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して抗原賦活化した。組織切片を３％  ＢＳＡ及び０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００中で１．５時間ブロックした。湿度チャンバにおいて４℃で一晩、組織切片をマウス抗サイトケラチン一次抗体で染色した。次いで、組織切片を１×ＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡドッキング鎖（Ｄ１）に共役したヤギ抗マウス二次抗体を用いて室温で２時間染色した。組織切片を１×ＰＢＳで再び洗浄し、ＤＡＰＩに対して染色した。
【０１５９】
蛍光顕微鏡を使用して、ブランクとして機能するためのＤＡＰＩ及びＣｙ５チャネル中の組織切片をイメージングした。ドッキング鎖Ｄ１に相補的なドメインを含むＤＮＡに付着した赤色フルオロフォアを含むイメージャー鎖（Ｉ１−６５０）を、調製した組織切片に付加し、室温で２５分間ハイブリダイズさせた。切片を洗浄して、非結合Ｉ１−６５０を除去した。次いで、１０倍対物レンズを使用して、ＤＡＰＩ及びＣｙ５チャネル中で蛍光画像を取り込んだ。図７Ｆを参照されたい。
【０１６０】
次いで、１０単位のＵＳＥＲ酵素を組織切片に室温で１５分間適用し、１×ＰＢＳで洗浄することによって、イメージャー鎖Ｉ１−６５０を除去した。蛍光顕微鏡を使用して、Ｃｙ５チャネル中の蛍光シグナルの完全な除去を確認した（データは図示せず）。
【０１６１】
イメージャー鎖の除去後、Ｉ１配列を含むプライマー鎖を室温で３０分間、Ｄ１ドッキング鎖（２０ｎＭ）にハイブリダイズした。切片を１×ＰＢＳで洗浄して、非結合プライマー鎖を洗浄した。並行して、ヘアピン鎖Ｈ１及びＨ２−Ｄ２を別々の微量遠心管において５×ＳＳＸ中１ｕＭに希釈した。管を加熱し、９０℃で５分間保持し、次いで室温までゆっくり冷却した。次いで、ヘアピンをプールし０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０及び１０％デキストランサルフェートで５×ＳＳＣ中２００ｎＭに希釈した。この溶液を組織切片に添加し、室温においてインキュベーションチャンバ内で一晩インキュベートした。次いで、切片を１×ＰＢＳで洗浄した。最後に、１００ｎＭ蛍光標識化イメージャー鎖Ｉ２をイメージング前に付加した。ＤＡＰＩ及びＣｙ５チャネル中の蛍光画像をＨＣＲ増幅後に収集した。図７Ｇ、右。
【０１６２】
実施例２：予めライゲーションされた環状オリゴを用いた増幅
アッセイを実施する前に非線形ＤＮＡ鎖を作製した。非線形ＤＮＡ鎖を使用することは、特に使用されるシグナル増幅法がローリングサークル増幅と同様である場合に、シグナル増幅の効率性を高めることができるという利点を提供する（図８）。この実施例では、ライゲーションステップを介して環状ＤＮＡ鎖を作製した。ライゲーションステップで使用されるＤＮＡ配列を環状オリゴと称し、これは、イメージャー鎖配列と同等（すなわち、ドッキング鎖に相補的）であるドメインを含む。
【０１６３】
培養されたＨｅＬａ細胞を、温かい３％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドで固定し、０．１％水素化ホウ素ナトリウムで還元し、３％ウシ血清アルブミン及び０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００でブロック及び透過処理し、次いで、ビメンチンに対するウサギ一次抗体で一晩染色した。次いで、ドッキング鎖に共役したヤギ抗ウサギ抗体（Ｇｔ−ａ−Ｒｂ−Ｄ１）を二次染色として使用し、室温で２時間インキュベートさせた。
【０１６４】
１×反応緩衝液（ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ）中０．５μＭ環状オリゴ（ＩＤＴ  ＤＮＡ）、５０μＭ  ＡＴＰ、２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５Ｕ／μＬ  ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（カタログ番号ＣＬ４１１１Ｋ、ＥｐｉＣｅｎｔｒｅ）を用いて、ＰＣＲ管中でライゲーション溶液を作製した。ライゲーション溶液をサーモサイクラー中に１時間配置して、６０℃でインキュベートした。ライゲーション後、ブロッキング緩衝液中で１：４の希釈のライゲーション溶液を作製し、染色した細胞試料に添加し、２５分間インキュベートさせて、ＰＢＳ中での洗浄前に抗体−標識化標的複合体上のドッキング鎖にハイブリダイズした。
【０１６５】
代替のアプローチとして、ライゲーションステップは、二次抗体コンジュゲートで試料を染色する前に実施され得る。ライゲーションステップ後、過剰なライゲーション溶液を抗体ＤＮＡコンジュゲートにハイブリダイズし、これにより、ライゲーションされた環状オリゴのモル比は、抗体に結合したドッキング鎖のモル比よりも少なくとも２倍大きかった。ライゲーションされた環状オリゴのＧｔ−ａ−Ｒｂ−Ｄ１へのハイブリダイゼーション後、複合体を試料に添加し、二次染色ステップとして室温で２時間インキュベートし、次いで、１×ＰＢＳ中で３回洗浄した。
【０１６６】
別個の槽内で、１×ポリメラーゼ反応緩衝液（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）中０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ、及び１Ｕ／μＬ  ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼを含有するポリメラーゼ溶液を作製した。ポリメラーゼ溶液を、一次抗体、二次抗体ドッキング鎖コンジュゲートですでに染色した固定細胞試料に直接適用し、ライゲーションされた環状オリゴにハイブリダイズした。試料を３０℃で１．５時間、ポリメラーゼ溶液でインキュベートした。細胞試料を１×ＰＢＳで３回洗浄した。ＤＡＰＩを添加して、細胞核を染色した。最後に、１００ｎＭ蛍光標識化イメージャー鎖をイメージング前に付加した。図８は、ローリングサークル重合のための開始点として、ドッキング鎖にハイブリダイズされ得る予め形成された非線形ＤＮＡ鎖の使用を示す。
【０１６７】
実施例３：試料再検索（０−Ａ−０−Ａ）
この実施例は、試料中の標的を再検索するために交換イメージングを使用する能力を実証する。シグナルを消失させる酵素的方法が、試料の染色に影響を及ぼさず、修飾せず、または分解しないことも示す。
【０１６８】
この実施例では、ドッキング鎖（Ｄ１及びＤ２）は、二次抗体ヤギ抗マウス及びヤギ抗ウサギのそれぞれに共役した。Ｄ１及びＤ２にそれぞれ相補的なイメージャー鎖Ｉ１Ｕ及びＩ２Ｕを、蛍光色素（ＡＴＴＯ６４７Ｎ）で標識化した。イメージャー鎖Ｉ１Ｕ及びＩ２Ｕの配列は、いくつかのウラシルヌクレオ塩基を含む。酵素または酵素のカクテルは、塩基を開裂してドッキング−イメージャー二本鎖の脱ハイブリダイゼーションをもたらし、観察されるシグナルの減少をもたらし得る。
【０１６９】
培養されたＨｅＬａ細胞を、温かい３％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドで固定し、０．１％水素化ホウ素ナトリウムで還元し、１×ＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン及び０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００で１．５時間ブロック及び透過処理した。最初に、マウス及びウサギのそれぞれにおいて育てられた一次抗体抗チューブリン及び抗ＴＯＭ２０のカクテルを使用して、細胞を４℃で一晩染色した。２つの異なるドッキング鎖に共役したマウス及びウサギに対するヤギ二次抗体（Ｇｔ−ａ−Ｍｓ−Ｄ１及びＧｔ−ａ−Ｒｂ−Ｄ２）を、室温で２時間の二次染色のために使用した。ＤＡＰＩを添加して、細胞核を染色した。
【０１７０】
蛍光モジュール及びＡｎｄｏｒ  Ｚｙｌａ  ｓＣＭＯＳカメラを備えた倒立Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上に、試料を搭載した。顕微鏡には、ＤＡＰＩ及び蛍光標識化イメージャー鎖（Ｃｙ５チャネル）をイメージングするための２つの蛍光フィルターセットが備わっていた。
【０１７１】
最初に、ＤＡＰＩ及びＣｙ５チャネルの両方において２０倍乾燥対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ、０．４５ＮＡ）を使用して、試料をイメージングして、ＤＡＰＩを使用して細胞を登録し、Ｃｙ５チャネル中で自家蛍光シグナルを測定した（図９Ａ）。１００ｎＭ  Ｉ１Ｕの溶液を試料に添加して、１５分間インキュベートした。次いで、試料を１×ＰＢＳで３回洗浄し、再びイメージングした（図９Ｂ）。シグナルを消失させるために、５単位のＵＳＥＲ（商標）、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス−酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する溶液を試料に添加し、室温で１５分間インキュベートした。次いで、試料を１×ＰＢＳで３回洗浄し、イメージングした（図９Ｃ）。１００ｎＭ  Ｉ２Ｕの溶液を試料に添加して、１５分間インキュベートした。次いで、試料を１×ＰＢＳで３回洗浄し、イメージングした（図９Ｄ）。シグナルを前のように消失させ、試料を再びイメージングした（図９Ｅ）。最後に、１００ｎＭ  Ｉ１Ｕの溶液を試料に添加して、１５分間インキュベートした。試料を１×ＰＢＳで３回洗浄し、イメージングした（図９Ｆ）。
【０１７２】
図９は、この実験中にＣｙ５チャネルにおいて得られた一連の画像を示す。図９Ａ、８Ｃ、及び８Ｅ中、シグナルは観察されない。これらの画像は、イメージャー鎖の導入前、Ｉ１Ｕの除去後、及びＩ２Ｕの除去後のそれぞれに対応する。イメージャー鎖Ｉ１Ｕの付加後、微小管ネットワークが観察される（図８Ｂ、８Ｆ）。図８Ｄは、Ｉ２Ｕを付加した後のミトコンドリアの存在を示す。図９Ｇは、図９Ａ〜Ｆの画像中の平均シグナル強度を示す。シグナルは、図９Ｃ及び８Ｅに示される両方の場合において９８％超減少する。２回の交換後の微小管標的上のシグナル回復は９５％を超え、複数の交換ステップ後に標的を確実に再検索する能力を実証する。
【０１７３】
イメージングチャンバの内外へインキュベーション溶液及び洗浄溶液を手動でピペットで移すことによって、図９Ａ〜Ｆの画像を得た。交換イメージングワークフローは、フローセル及び流体システムを使用することによって自動化され得る。
【０１７４】
顕微鏡の取得ソフトウェアと同期化された流体システムを使用して、イメージャー鎖のハイブリダイゼーションのために必要とされる流体ステップ（注入、インキュベーション、洗浄）、ならびにシグナル除去は、イメージング回の間に自動的に実施され得る。
【０１７５】
ＨｅＬａ細胞を、通常の顕微鏡台上に取り付けられ得るフローセル内で上記のように培養、固定、及び染色した。最初に、ＤＡＰＩ及びＣｙ５チャネルの両方において２０倍乾燥対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ、０．４５ＮＡ）を使用して、試料をイメージングして、ＤＡＰＩを使用して細胞を登録し、Ｃｙ５チャネル中で自家蛍光シグナルを測定した（図９、画像Ｈ）。１００ｎＭ  Ｉ１Ｕの溶液を試料チャンバに流入させ、１５分間インキュベートした。次いで、試料を３０秒間連続フローで１×ＰＢＳを用いて洗浄し、再びイメージングした（図９Ｉ）。次に、５単位のＵＳＥＲ（商標）、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス−酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する溶液をフローセルに注入し、１５分間インキュベートした。次いで、試料を１×ＰＢＳで３０秒間洗浄し、イメージングした（図９Ｊ）。最後に、イメージャーＩ１Ｕの溶液を再びフローセルに注入し、１５分間インキュベートし、３０秒間ＰＢＳで洗浄した。試料を最後にもう一度イメージングした（図９Ｋ）。
【０１７６】
実施例４：安定した結合を伴う近接検出
ＴｈｕｎｄｅｒＬｉｎｋキット（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、一対の近接プローブ（ＰＬ及びＰＲ）を抗マウス抗体に共役させた。培養されたＨｅＬａ細胞を、温かい３％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドで固定し、０．１％水素化ホウ素ナトリウムで還元し、３％ウシ血清アルブミン及び０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００でブロック及び透過処理し、次いで、アルファ−チューブリンに対するマウス一次抗体で染色した。次いで、固定細胞をＰＬ及びＰＲ共役二次抗体の混合物で染色し、洗浄していかなる非結合材料も除去した。試料中の抗アルファ−チューブリン抗体の大部分は、ＰＬ共役二次抗体の少なくとも１つの分子及びＰＲ共役抗体の少なくとも１つの分子を受容するはずである。近接シグナルを検出するために、ＤＡＰＩ及び１００ｎＭのイメージャー鎖を試料に付加し、試料を、ＬＥＤ光源を有する２０倍の広視野蛍光顕微鏡でイメージングした（図１０Ａ（上のパネル））。
【０１７７】
陰性対照実験（図１０、下のパネル）において、近接プローブのうちの１つは、標的外の抗ウサギ二次抗体に共役した。固定細胞をマウス抗チューブリン一次抗体、ＰＬ共役抗マウス二次抗体、及びＰＲ共役抗ウサギ二次抗体で染色した。抗ウサギ二次抗体は、マウス由来の一次抗体に結合するべきではなく、したがって近接プローブは、共局在化されるべきではなく、完全ドッキング部位は、イメージャー鎖に結合することができない。
【０１７８】
図１０に示されるように、微小管構造は、両方の近接プローブが標的に特異的に結合しているときに明らかである。蛍光シグナルは、標準的な蛍光イメージングに対して安定している。
【０１７９】
実施例５：標的外交差反応性に関する対照実験
非相補的イメージャー鎖配列への曝露の前及び後の試料のシグナル強度を測定することによって、標的外イメージャーとドッキング鎖との間の交差反応性を評価した。
【０１８０】
培養されたＨｅＬａ細胞を固定、還元、ブロック及び透過処理し、次いで、アルファ−チューブリンに対するマウス一次抗体で染色した。固定緩衝液は、３％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドからなった。０．１％水素化ホウ素ナトリウムを含有する溶液を使用して、固定細胞を還元した。一晩の一次抗体染色の前に、３％ウシ血清アルブミン及び０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を有する溶液を使用して、１．５時間細胞をブロック及び透過処理した。イメージャー鎖Ｂ及びＣへのドッキング鎖Ａの交差反応性を試験するために、ドッキング鎖Ａに共役した抗マウス抗体（ａ−Ｍｓ−Ａｄ）を、アルファ−チューブリンに対して染色した固定細胞試料に添加した。ａ−Ｍｓ−Ａｄを用いた二次染色をブロッキング緩衝液中で室温において２時間行い、次いで、１×ＰＢＳで３回洗浄した。ＤＡＰＩ染料を全てのウェルに添加し、２０倍対物レンズを有するＮｉｋｏｎ蛍光顕微鏡上でＤＡＰＩ及びＣｙ５チャネルの両方において、ブランク画像を撮った。
【０１８１】
ブランク画像を記録した後、イメージャー鎖溶液を調製した。この実施例では、イメージャー鎖は、部分的二本鎖であり、イメージャー鎖は、汎用ドメイン及び非汎用ドメインからなり、汎用ドメインは、フルオロフォアに付着した相補配列にハイブリダイズし、非汎用ドメインは、一本鎖であり、試料中のドッキング鎖と相互作用することが可能である。この実施例では、フルオロフォアは、ＤＮＡベースの架橋を通して間接的にイメージャー鎖に含まれる。この実施例では、イメージャー鎖中の非汎用ドメインは、特異的なドッキング鎖（例えば、ドッキング鎖Ａ、Ｂ、またはＣ）に相補的である。
【０１８２】
イメージャー鎖Ａ（Ａｉ）、Ｂ（Ｂｉ）、またはＣ（Ｃｉ）の１００ｎＭ溶液を別々の試料ウェルに添加し、１０分間ハイブリダイズさせた。イメージャー鎖のハイブリダイゼーション後、試料を１×ＰＢＳで３回洗浄した。２０倍対物レンズを有するＮｉｋｏｎ蛍光顕微鏡上でＤＡＰＩ及びＣｙ５チャネルの両方において、各ウェルの画像を撮った。前のブランク画像のために選択されたものと同じ視野をイメージングした。
【０１８３】
イメージャー鎖の付加の前及び後の各試料のシグナル強度を、特注のソフトウェアを使用して比較した。ＤＡＰＩチャネルを使用して画像を整合し、マスクを作製して、バックグラウンドから個々の細胞を分割した。細胞領域内の平均蛍光強度をＣｙ５チャネルに対して計算し、バックグラウンドの平均強度で割って、シグナル対ノイズ比を得た。ブランク画像で得られたシグナル対ノイズ比を、イメージャー鎖の付加後に得られたシグナル対ノイズ比と比較して、ドッキング鎖Ａとイメージャー鎖Ａｉ、Ｂｉ、及びＣｉとの間の交差反応性を評価した。
【０１８４】
図１１に示されるように、標的上イメージャー鎖Ａｉは、ａ−Ｍｓ−Ａｄで染色された特異的な微小管構造を明確に示す。図１１はまた、Ｂｉがドッキング鎖Ａと交差反応しないが、Ｃｉは交差反応することも示す。
【０１８５】
実施例６：ＵＳＥＲ及びｓｕｂＵＳＥＲ
この実施例は、酵素活性を使用して標的からシグナルを消失させる能力を実証する。この実施例では、ドッキング鎖（Ｄ１）は、二次抗体ヤギ抗マウスに共役した。Ｄ１に相補的なイメージャー鎖Ｉ１Ｕを、蛍光色素（ＡＴＴＯ６４７Ｎ）で標識化した。イメージャー鎖Ｉ１Ｕは、特異的酵素活性によって開裂され得るいくつかのウラシルヌクレオ塩基を含有し、二本鎖イメージャー／ドッキング鎖を不安定化し、蛍光シグナルの除去をもたらす。
【０１８６】
培養されたＨｅＬａ細胞を、温かい３％パラホルムアルデヒド及び０．１％グルタルアルデヒドで固定し、０．１％水素化ホウ素ナトリウムで還元し、１×ＰＢＳ中３％ウシ血清アルブミン及び０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００で１．５時間ブロック及び透過処理した。最初に、マウスで育てられた一次抗体抗チューブリンを用いて、細胞を４℃で一晩染色した。Ｄ１に共役したマウスに対するヤギ二次抗体を使用して、二次染色を室温で２時間実施した。ＤＡＰＩを添加して、細胞核を染色した。
【０１８７】
蛍光モジュール及びＡｎｄｏｒ  Ｚｙｌａ  ｓＣＭＯＳカメラを備えた倒立Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）上に、試料を搭載した。顕微鏡には、ＤＡＰＩ及び蛍光標識化イメージャー鎖（Ｃｙ５チャネル）をイメージングするための２つの蛍光フィルターセットが備わっていた。
【０１８８】
１００ｎＭ  Ｉ１Ｕの溶液を２つの別々の試料に添加して、１５分間インキュベートした。次いで、試料を１×ＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩ及びＣｙ５チャネルの両方において２０倍乾燥対物レンズ（Ｎｉｋｏｎ、０．４５ＮＡ）を使用してイメージングした（図１２、画像Ａ及びＣ）。シグナルを消失させるために、２単位のＵＳＥＲ（商標）、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス−酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、及び１００μｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有する溶液を試料に添加した。他方の試料には、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ中の１０単位のウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡを添加した。両方の試料を室温で１５分間インキュベートした。次いで、試料を１×ＰＢＳで３回洗浄し、イメージングした（図１２、ＵＳＥＲに対して画像Ｂ及びＵＤＧに対してＤ）。
【０１８９】
図１２に示されるように、シグナルは、ＵＳＥＲまたはＵＤＧのいずれかを使用してほぼ完全に消失し得る。
【０１９０】
実施例７：ＵＳＥＲによるイメージャー鎖の開裂
図１４に示されるように、シグナルが消失し得る程度は、イメージャー鎖の構造及び／または配列設計によって決まり得る。この実施例では、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織切片を脱ろうし、抗原賦活化し、ブロックし、ドッキング鎖Ｄ１に共役した抗ＣＤ３抗体で染色した。試料に結合したＤ１ドッキング鎖の数をＲＣＡによって増幅させ、Ｄ１に相補的で、フルオロフォアに結び付けられたドメインを含有するイメージャー鎖で標識化した。イメージャー鎖は、いくつかのウラシルヌクレオ塩基（図１４Ａ及びＣ）、またはいくつかのウラシルヌクレオ塩基及び非塩基部位（図１４Ｂ及びＤ）のいずれかを含有した。蛍光顕微鏡を使用して画像を収集して、標識化イメージャー鎖によって結合した標的の存在を検出した（図１４Ａ〜Ｂ）。
【０１９１】
シグナルを消失させるために、ＵＳＥＲを含有する溶液を添加し、１５分間組織試料とインキュベートし、続いて洗浄ステップを行って、開裂したイメージャー鎖を除去した。蛍光画像を収集して、蛍光シグナルの除去を確認した。図１４Ｄに示されるように、イメージャー鎖配列設計中のジデオキシウリジンに加えて非塩基部位の存在は、図１４Ｃと比較して改善された除去効率性をもたらす。
【０１９２】
実施例８：組み合わされた多色及び連続検出
この実施例は、異なるスペクトル的に分離されたフルオロフォアで官能化されたイメージャー鎖のセットを使用して、複数の標的を検出するために交換イメージングを使用する能力を実証する。
【０１９３】
ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）扁桃腺組織切片を脱ろうし、抗原賦活化し、ブロックし、ＤＡＰＩ、ならびにドッキング鎖Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４にそれぞれ共役した抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗Ｋｉ６７、及び抗サイトケラチン抗体で染色した。抗体を介して試料に結合したドッキング鎖（Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４）の数をＲＣＡによって増幅させた。Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、及びＤ４のそれぞれに相補的なドメインを含有するイメージャー鎖Ｉ１、Ｉ２、Ｉ３、及びＩ４もまた、酵素的除去のためのいくつかのウラシル塩基を含んだ。Ｉ１及びＩ３がＡｔｔｏ５６５色素で標識化される一方で、Ｉ２及びＩ４は、Ａｔｔｏ６４７Ｎで標識化される。蛍光モジュール及びＡｎｄｏｒ  Ｚｙｌａ  ｓＣＭＯＳカメラを備えた倒立Ｎｉｋｏｎ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｔｉ顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、試料をイメージングした。顕微鏡には、ＤＡＰＩ及び蛍光標識化イメージャー鎖（ＴＲＩＴＣ及びＣｙ５チャネル）をイメージングするための蛍光フィルターセットが備わっていた。
【０１９４】
第１のステップにおいて、試料上の２つの鎖のカクテルを２５分間インキュベートすることによって、Ｉ１及びＩ２イメージャー鎖を使用して、試料を標識化した。非結合鎖を洗い流し、画像をＴＲＩＴＣ及びＣｙ５チャネル中で収集して、イメージャー鎖Ｉ１及びＩ２で標識化された標的、ＣＤ４及びＣＤ８のそれぞれの存在を検出した（図１５Ｂ及びＣのそれぞれ）。ＤＡＰＩ画像もまた収集して、細胞核を検出した（図１５Ａ）。
【０１９５】
次いで、ＵＳＥＲを含有する溶液を使用してシグナルを消失させ、それを１５分間組織試料とインキュベートし、続いて洗浄ステップを行って、開裂したイメージャー鎖を除去した。蛍光画像を収集して、蛍光シグナルの除去を確認した。
【０１９６】
最後に、イメージャー鎖Ｉ３及びＩ４のカクテル溶液を使用して試料を再び標識化し、続いて洗浄ステップを行って、非結合イメージャー鎖を除去した。蛍光画像をＴＲＩＴＣ及びＣｙ５チャネル中で取得して、Ｋｉ６７及びサイトケラチンの存在を検出した（図１５Ｅ及びＦのそれぞれ）。ＤＡＰＩ画像もまた収集し（図１５Ｄ）、４つの標的の画像を整合し、重ね合わせるために使用した。
【０１９７】
実施例９：番号付き項目
以下の番号付き項目は、本明細書の実施形態及びそれらが互いにどのように関連し合うのかのさらなる説明を提供する。
【０１９８】
項目１。
（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
（４）試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
（７）任意に、ドッキング鎖から結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、
（８）任意に、ステップ（１）〜（６）またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、方法。
【０１９９】
項目２。
（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであって、（１）の核酸鎖が、プライマー鎖またはドッキング鎖のいずれかであり、核酸鎖がプライマー鎖である場合、ドッキング鎖に結び付けられる、接触させることと、
（４）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（５）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出し、増幅（ステップ（７））が必要とされるかを判定することと、
（６）任意に、ドッキング鎖から結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、
（７）任意に、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることと、
（８）任意に、ステップ（１）〜（７）またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、方法。
【０２００】
項目３。１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法であって、
（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）試料を、核酸鎖に対して相補性を有する非線形アンプリファイアー鎖と接触させることであって、核酸鎖がドッキング鎖またはプライマー鎖のいずれかである、接触させることと、
（４）任意に、非結合非線形アンプリファイアー鎖を除去することと、
（５）１つまたは２つのステップのいずれかで、ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させ、試料を、ドッキング鎖または増幅鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることと、
（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
（７）結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、
（８）任意に、ステップ（１）〜（８）またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、方法。
【０２０１】
項目４。ポリメラーゼがローリングサークル増幅のために使用される、項目３に記載の方法。
【０２０２】
項目５。非線形アンプリファイアー鎖が、試料と接触させる前に、核酸鎖に結び付けられた標的特異的結合パートナーと組み合わされる、項目３または４に記載の方法。
【０２０３】
項目６。ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させることが、試料を、ドッキング鎖または増幅鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることとは別に起こる、項目３〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０２０４】
項目７。ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させることが、試料を、ドッキング鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることと同じステップで起こり、イメージャー鎖が、イメージャー鎖の増幅を防止するために３’修飾を任意に含む、項目３〜６のいずれか１つに記載の方法。
【０２０５】
項目８。イメージャー鎖が、ローリングサークル増幅のための環状イメージャー鎖である、項目３〜５または７のいずれか１つに記載の方法。
【０２０６】
項目９。イメージャー鎖が、ドッキング鎖及びリガーゼの存在下で環状化する線形イメージャー鎖である、項目３〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０２０７】
項目１０。イメージャー鎖またはアンプリファイアー鎖が、ドッキング鎖に相補的である少なくとも２つの領域を含む、項目３〜９のいずれか１つに記載の方法。
【０２０８】
項目１１。標識化イメージャー鎖が、直鎖である、項目３〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０２０９】
項目１２。非線形アンプリファイアー鎖が、環状鎖である、項目３〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【０２１０】
項目１３。非線形アンプリファイアー鎖が、ライゲーション後に環状になる、項目３〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０２１１】
項目１４。１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法であって、
（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが、直接または間接的に核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、任意に、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、任意に、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
（４）試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
（７）任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
（８）任意に、ステップ（１）〜（７）またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、方法。
【０２１２】
項目１５。試料が光学的に透明な支持体に載置される、項目１４に記載の方法。
【０２１３】
項目１６。ステップ（６）の後、及び任意にステップ（７）を実施した後に、方法が、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることと、ステップ（４）、任意に（５）、（６）、及び任意に（７）を反復することと、をさらに含む、項目１４〜１５のいずれか１つに記載の方法。
【０２１４】
項目１７。方法が、ステップ（３）において、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることか、または２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることを含む、項目１４〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【０２１５】
項目１８。各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数の増加が、酵素を使用して達成され、酵素が任意に、ポリメラーゼである、項目１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【０２１６】
項目１９。非結合標識化イメージャー鎖を酵素的に開裂、修飾、または分解することが、酵素を使用することによって達成され、酵素が任意に、グリコシラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ、及び非天然ヌクレオチドにおいて開裂する酵素である、項目１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【０２１７】
項目２０。１つ以上の標的の存在に関して、光学的に透明な支持体に載置された試料を試験するための方法であって、
（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
（４）試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（６）任意に、液体を除去して液体を含まない試料を作り出すことと、
（７）第１の支持体に平行に第２の光学的に透明な材料を取り付けることと、
（８）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、を含む、方法。
【０２１８】
項目２１。第２の光学的に透明な材料が、ガラスである、項目２０に記載の方法。
【０２１９】
項目２２。第２の光学的に透明な材料が、プラスチックである、項目２１に記載の方法。
【０２２０】
項目２３。第２の光学的に透明な材料が、第１の支持体から約５ミクロン〜５ｍｍ、５０ミクロン〜５００ミクロン、または５００ミクロン〜５ｍｍである、項目２０〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【０２２１】
項目２４。イメージングが、正立顕微鏡を用いて実施される、項目２０に記載の方法。
【０２２２】
項目２５。１つ以上の標的の存在に関して、光学的に透明な支持体に載置された固定試料を試験するための方法であって、
（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
（４）試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（６）任意に、液体を除去して液体を含まない試料を作り出すことと、
（７）第１の支持体に平行に第２の光学的に透明な材料を取り付けることと、
（８）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、を含む、方法。
【０２２３】
項目２６。
（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
（４）試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び数を検出することと、
（７）結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
（８）ステップ（３）〜（６）または（３）〜（７）を反復することであって、標識化イメージャー鎖が任意に、全ての他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する、反復することと、を含む、方法。
【０２２４】
項目２７。２つ以上の標的特異的結合パートナーに結合した試料を含む、組成物であって、各結合パートナーが、核酸鎖、及び直接または間接的に標識化イメージャー鎖に安定的に結合した少なくとも１つのドッキング鎖に結合し、核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させる、組成物。
【０２２５】
項目２８。直接または間接的に標識化イメージャー鎖に結合したドッキング鎖が、３０分間少なくとも９０％の結合を含む、項目２７に記載の組成物。
【０２２６】
項目２９。
（ａ）ドッキング鎖、または
（ｂ）ドッキング鎖及び任意の中間鎖
が、８０個以下のヌクレオチド、７０、６０、５０、４０、または３０個以下のヌクレオチドである、項目２７〜２８のいずれか１つに記載の組成物。
【０２２７】
項目３０。イメージャー鎖が、６０個以下のヌクレオチドである、項目２７〜２９のいずれか１つに記載の組成物。
【０２２８】
項目３１。
（ａ）半ドッキングドメインを用いる組成物であって、（ｉ）半ドッキングドメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも１つの第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｉｉ）半ドッキングドメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも１つの第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲート（（ａ）（ｉ）及び（ａ）（ｉｉ）の安定ドメインが、互いに相補的であり、（ａ）（ｉ）及び（ａ）（ｉｉ）の半ドッキングドメインが、線形に組み合わされて完全ドッキングドメインを形成することができる）と、（ｉｉｉ）５’ドメイン、３’ドメイン、及び５’ドメインと３’ドメインとの間に位置するリンカードメインを含む、少なくとも１つの標識化イメージャー鎖または中間鎖（５’ドメインが、（ａ）（ｉ）の半ドッキングドメインに相補的であり、３’ドメインが、（ａ）（ｉｉ）の半ドッキングドメインに相補的であり、標識化イメージャー鎖または中間鎖が、完全ドッキングドメインに安定的に結合し、中間鎖が使用される場合、標識化イメージャー鎖も提供する）とを含む、組成物、または
（ｂ）半プライマードメインを用いる組成物であって、（ｉ）半プライマードメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも１つの第１の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲートと、（ｉｉ）半プライマードメイン、任意の安定ドメイン、及び任意にスペーサードメインを含むオリゴヌクレオチドに結び付けられた結合パートナーを含む、少なくとも１つの第２の結合パートナー−オリゴヌクレオチドコンジュゲート（（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）の安定ドメインが、互いに相補的であり、（ｂ）（ｉ）及び（ｂ）（ｉｉ）の半プライマードメインが、線形に組み合わされて完全プライマードメインを形成することができる）と、（ｉｉｉ）完全プライマードメインに安定的に結合することが可能な少なくとも１つのドッキング鎖と、（ｉｖ）ドッキング鎖に安定的に結合することが可能な少なくとも１つの標識化イメージャー鎖またはドッキング鎖に安定的に結合することが可能な中間鎖、及び中間鎖に安定的に結合することが可能な標識化イメージャー鎖とを含む、組成物、を含む、組成物。
【０２２９】
項目３２。少なくとも１つのイメージャー鎖が、少なくとも３０分間完全ドッキングドメインに結合している、項目３１に記載の組成物。
【０２３０】
項目３３。完全ドッキングドメインに結合したイメージャー鎖の少なくとも７０％が、少なくとも３０分間結合したままである、項目３１に記載の組成物。
【０２３１】
項目３４。完全ドッキングドメインに結合したイメージャー鎖の少なくとも９０％が、非酵素的緩衝液洗浄に耐性がある、項目３１に記載の組成物。
【０２３２】
項目３５。１つ以上の標的の存在に関して、光学的に透明な支持体に載置された固定試料を試験するための方法であって、
（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
（４）試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであって、使用される場合、間接結合が、中間鎖を通して起こることが可能である、接触させることと、
（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
（７）結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
（８）試料を、ドッキング鎖に相補的ではないヌクレオチド配列を有する標識化イメージャー鎖、または使用される場合、中間鎖と接触させることと、
（９）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（１０）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
（１１）任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、を含む、方法。
【０２３３】
項目３６。１つ以上の標的の存在に関して、光学的に透明な支持体に載置された固定試料を試験するための方法であって、
（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
（４）試料を、ドッキング鎖に相補的ではないヌクレオチド配列を有する標識化イメージャー鎖、または使用される場合、任意の中間鎖と接触させることと、
（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び／または数を検出することと、
（７）結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
（８）試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであって、使用される場合、間接結合が、中間鎖を通して起こることが可能である、接触させることと、
（９）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（１０）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び／または数を検出することと、
（１１）任意に、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、を含む、方法。
【０２３４】
項目３７。方法が、ステップ（４）〜（１１）を反復することをさらに含む、項目３５または３６のいずれか１つに記載の方法。
【０２３５】
項目３８。方法が、追加の非相補的イメージング鎖の結合を検出するためにステップを反復することをさらに含む、項目３５〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【０２３６】
項目３９。反復されるステップで使用される、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖が、任意に、直接または間接的に別のドッキング鎖に結合することが可能な少なくとも１つの他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する、項目３５〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【０２３７】
項目４０。
（１）標識と、
（２）第１の核酸ドメイン、第２の核酸ドメイン、及び第３の核酸ドメインであって、各核酸ドメインが、１〜９ヌクレオチド長である、核酸ドメインと、
（３）第１の核酸ドメイン及び第２の核酸ドメインを結び付ける第１の結合部分と、
（４）第２の核酸ドメイン及び第３の核酸ドメインを結び付ける第２の結合部分と、を含み、
両方の結合部分が、（ａ）無傷ホスホジエステル骨格を有する非塩基部位、（ｂ）核酸グリコシラーゼによって開裂可能なリンカー、（ｃ）非天然ヌクレオチド、または（ｄ）制限部位またはニッキング部位から独立して選択される、組成物。
【０２３８】
項目４１。追加の核酸ドメインが、追加の結合部分によって結び付けられる、項目４０に記載の組成物。
【０２３９】
項目４２。少なくとも１つの結合部分が、無傷ホスホジエステル骨格を有する非塩基部位（アピリミジン）である、項目４０〜４１のいずれか１つに記載の組成物。
【０２４０】
項目４３。少なくとも１つの結合部分が、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩからの開裂を起こしやすい、項目４０〜４２のいずれか１つに記載の組成物。
【０２４１】
項目４４。核酸ドメインが、ＤＮＡを含む、項目４０〜４３のいずれか１つに記載の組成物。
【０２４２】
項目４５。核酸ドメインが、ＲＮＡを含む、項目４０〜４４のいずれか１つに記載の組成物。
【０２４３】
項目４６。少なくとも１つの結合部分が、少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを含む、項目４０〜４５のいずれか１つに記載の組成物。
【０２４４】
項目４７。少なくとも１つの結合部分が、８−オキソグアニンを含む、項目４０〜４６のいずれか１つに記載の組成物。
【０２４５】
項目４８。１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法であって、
（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが、直接または間接的に核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
（４）試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであって、標識化イメージャー鎖が、項目３４〜４１のいずれか１つに記載の組成物を含む、接触させることと、
（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
（７）ドッキング鎖から結合した標識化イメージャー鎖を除去することであって、標識化イメージャー鎖が、標識化イメージャー核酸を酵素的に開裂、修飾、または分解することによってドッキング鎖から除去される、除去することと、
（８）任意に、ステップ（１）〜（７）またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、方法。
【０２４６】
項目４９。標識化イメージャー核酸が、標識化イメージャー鎖を酵素的に開裂することによって除去される、項目４８に記載の方法。
【０２４７】
項目５０。１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法であって、
（１）試料を処理して、１つ以上の前に利用不可能な標的を曝露することと、
（２）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（３）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（４）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
（５）試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
（６）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（７）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
（８）結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
（９）任意に、ステップ（１）〜（８）を反復することであって、毎回、（ａ）前に利用不可能な標的の異なるセットを曝露し、（ｂ）１つ以上の異なる標的特異的結合パートナーを使用し、（ｃ）少なくとも１つの他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する標識化イメージャー鎖を使用する、反復することと、を含む、方法。
【０２４８】
項目５１。１つ以上の標的の存在に関して、第１の光学的に透明な支持体に載置された固定試料を試験するための方法であって、
（１）試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、任意に核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させることと、
（４）イメージングチャンバ（フローセルなど）において、試料を、直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることと、
（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（６）試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び／または数を検出することと、
（７）結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
（８）ステップ（４）〜（６）または（４）〜（７）を反復することであって、少なくとも一度、標識化イメージャー鎖が任意に、少なくとも１つの他の標識化イメージャー鎖に対して固有のヌクレオチド配列を有する、反復することと、を含む、方法。
【０２４９】
項目５２。イメージングチャンバが、イメージングステップの後及びステップ（４）〜（６）または（４）〜（７）を反復する前に除去される、項目５１に記載の方法。
【０２５０】
項目５３。イメージングチャンバが、流体流動を可能にせず、イメージングチャンバが、イメージングステップの後及びステップ（４）〜（６）または（４）〜（７）を反復する前に除去される、項目５１〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【０２５１】
項目５４。フローセルが、第２の光学的に透明な材料で形成される、項目５１〜５３のいずれか１つに記載の方法。
【０２５２】
項目５５。第２の光学的に透明な材料が、ガラスを含む、項目５４に記載の方法。
【０２５３】
項目５６。第２の光学的に透明な材料が、プラスチックを含む、項目５４に記載の方法。
【０２５４】
項目５７。イメージングチャンバ（フローセルなど）が、少なくとも１つの流体入口及び／または出口ポートを有するガスケットを備える、項目５１〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【０２５５】
項目５８。フローセルが、第１の光学的に透明な支持体に平行な第２の光学的に透明な材料を含む、項目５４〜５６のいずれか１つに記載の方法。
【０２５６】
項目５９。全ての流体交換ステップが、電子、及び／または空気、及び／または油圧、及び／または電子流体アクチュエータ及びシステムを含む流体システムを使用して実施される、項目１〜２６、３５〜３９、または４８〜５８のいずれか１つに記載の方法。
【０２５７】
項目６０。流体システムが、ソフトウェアによって制御される、項目５９に記載の方法。
【０２５８】
項目６１。流体システムが、項目１に提供された番号付けを参照して、ステップ（１、及び／または２、及び／または３、及び／または４、及び／または５、及び／または７）をイメージングステップ（６）と同期化するソフトウェアによって自動的に制御される、項目５９に記載の方法。
【０２５９】
項目６２。流体システムが、項目１に提供された番号付けを参照して、イメージングソフトウェアと通信することによって、ステップ（１、及び／または２、及び／または３、及び／または４、及び／または５、及び／または７）をイメージングステップ（６）と同期化するソフトウェアによって制御される、項目５９に記載の方法。
【０２６０】
項目６３。試料がイメージングデバイス上にある間に全ての流体ステップが実施される、項目５９〜６２のいずれか１つに記載の方法。
【０２６１】
項目６４。項目１に提供された番号付けを参照して、試料がイメージングデバイス上にある間にステップ４、５、及び７が実施される、項目５９〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０２６２】
項目６５。試料が、使い捨てイメージングチャンバ（フローセルなど）内に固定される、項目５９〜６４のいずれか１つに記載の方法。
【０２６３】
項目６６。試料が、再利用可能イメージングチャンバ（フローセルなど）内に固定される、項目５９〜６５のいずれか１つに記載の方法。
【０２６４】
項目６７。
（１）核酸鎖に結び付けられた標的特異的結合パートナー（異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる）、標識化イメージャー鎖、緩衝液、増幅試薬、及び／または結合したイメージャー鎖を除去するための試薬が挙げられるが、これらに限定されない１つ以上の試薬（複数可）（核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、核酸鎖が、ドッキング鎖である場合、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、またはプライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖をプライマー鎖と会合させる）と、
（２）全ての流体交換ステップを実施するための流体システム、
流体システム及び時間を制御し、及び／または流体ステップをイメージングステップと同期化するためのソフトウェアと、
（３）少なくとも１つの光学的に透明な側面を対象となる試料に付けて、試料のイメージングを可能にするためのフローセルと、を備える、キット。
【０２６５】
項目６８。フローセルが、使い捨てフローセルである、項目６７に記載のキット。
【０２６６】
項目６９。試料をイメージングして結合した標識化イメージャー鎖を検出することが、結合した標識化イメージャー鎖の存在を検出する、項目１〜２６、３５〜３９、または４８〜６６のいずれか１つに記載の方法。
【０２６７】
項目７０。試料をイメージングして結合した標識化イメージャー鎖を検出することが、結合した標識化イメージャー鎖の存在、位置、及び／または数を検出する、項目１〜２６、３５〜３９、または４８〜６６のいずれか１つに記載の方法。
【０２６８】
項目７１。方法が、試料をイメージングして、バックグラウンドシグナルを検出及び／または測定することと、試料の画像からバックグラウンドシグナルを除去して、結合した標識化イメージャー鎖を検出することとを含む、項目７０に記載の方法。
【０２６９】
項目７２。バックグラウンドシグナルが、自家蛍光を含む、項目７１に記載の方法。
【０２７０】
項目７３。バックグラウンドが、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを不完全に消失させることと関連した残留蛍光を含む、項目７１または７２に記載の方法。
【０２７１】
項目７４。バックグラウンドシグナルが、結合した標識化イメージャー鎖を検出するための試料の画像の前に測定される、項目７１〜７３のいずれか１つに記載の方法。
【０２７２】
項目７５。バックグラウンドシグナルが、結合した標識化イメージャー鎖を検出するための試料の画像の後に測定される、項目７１〜７４のいずれか１つに記載の方法。
【０２７３】
項目７６。試料が、固定試料である、項目１〜２６、３５〜３９、または４８〜７５のいずれか１つに記載の方法。
【０２７４】
項目７７。試料が、細胞、細胞溶解物、組織、組織溶解物、体液、及び／または全生物である、項目１〜２６、３５〜３９、または４８〜７６のいずれか１つに記載の方法。
【０２７５】
項目７８。方法が、バイオマーカーを同定するのに有用である、項目１〜２６、３５〜３９、または４８〜７７のいずれか１つに記載の方法。
【０２７６】
項目７９。少なくとも９６個の試料が、イメージングされ、データ分析がそれらの試料に対して実施される、項目７８に記載の方法。
【０２７７】
項目８０。少なくとも１５個の標的が、各標的に対して対応する標的特異的結合パートナーの使用について試験される、項目７８〜７９のいずれか１つに記載の方法。
【０２７８】
項目８１。イメージングが、光学顕微鏡、広視野、共焦点（線及び点走査、スピニングディスク）、全反射照明（ＴＩＲ）、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）、光シート照明、構造化照明（ＳＩＭ）を含む蛍光顕微鏡、及び膨張顕微鏡法を使用して実施される、項目１〜２６、３５〜３９、または４８〜８０のいずれか１つに記載の方法。
【０２７９】
項目８２。直接または間接的に標識化イメージャー鎖に結合したドッキング鎖が、３０分間少なくとも９０％の結合を含む、項目１〜２６、３５〜３９、または４８〜８１のいずれか１つに記載の方法。
【０２８０】
項目８３。標的特異的結合パートナーが、ドッキング鎖に直接結び付けられる、項目１〜２６、３５〜３９、または４８〜８２のいずれか１つに記載の方法。
【０２８１】
項目８４。標的特異的結合パートナーが、プライマー鎖を通して間接的にドッキング鎖に結び付けられる、項目１〜２６、３５〜３９、または４８〜８３のいずれか１つに記載の方法。
【０２８２】
項目８５。ドッキング鎖が、直接イメージャー鎖に結合する、項目１〜２６、３５〜３９、または４８〜８４のいずれか１つに記載の方法。
【０２８３】
項目８６。ドッキング鎖が、イメージャー鎖に対して相補性を有する、項目１〜２６、３５〜３９、または４８〜８５のいずれか１つに記載の方法。
【０２８４】
項目８７。ドッキング鎖が、中間鎖を通して間接的にイメージャー鎖に結合する、項目１〜２６、３５〜３９、または４８〜８６のいずれか１つに記載の方法。
【０２８５】
項目８８。イメージャー鎖及び／または中間鎖が、ＵＳＥＲによる開裂が可能な少なくとも１つのＵを含む、項目１〜２６、３５〜３９、もしくは４８〜８７のいずれか１つに記載の方法、または項目６７〜６８に記載のキット。
【０２８６】
項目８９。イメージャー鎖及び／または中間鎖が、少なくとも１つの非塩基部位を含む、項目１〜２６、３５〜３９、もしくは４８〜８８のいずれか１つに記載の方法、または項目６６〜６７、及び８８に記載のキット。
【０２８７】
項目９０。イメージャー鎖及び／または中間鎖が、ヘアピンを含む、項目１〜２５、３４〜３８、もしくは４７〜８９のいずれか１つに記載の方法、または項目６６〜６７、及び８９に記載のキット。
【０２８８】
項目９１。イメージャー鎖及び／または中間鎖が、クランプを有するヘアピンを含む、項目１〜２５、３４〜３８、もしくは４７〜９０のいずれか１つに記載の方法、または項目６６〜６７、もしくは８８〜９０に記載のキット。
【０２８９】
項目９２。少なくとも２つの標的が、同じイメージングステップで少なくとも２つの標識を使用してイメージングされる、項目１〜２５、３４〜３８、または４７〜９１のいずれか１つに記載の方法。
【０２９０】
項目９３。少なくとも２つの標的が、異なるイメージングステップで同じ標識を使用してイメージングされる、項目１〜２５、３４〜３８、または４７〜９２のいずれか１つに記載の方法。
【０２９１】
項目９４。少なくとも２つの標的が、少なくとも２つの標識を使用してイメージングされ、シグナルが消失され、次いで少なくともさらに１つの標識が、同じ標識のうちの少なくとも１つを使用してイメージングされ、イメージングステップが、いずれかの順序で実施され得る、項目１〜２５、３４〜３８、または４７〜９３のいずれか１つに記載の方法。
【０２９２】
項目９５。結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることが、標的特異的結合パートナーから核酸鎖を除去することを含む、項目１〜２５、３４〜３８、または４７〜９３のいずれか１つに記載の方法。
【０２９３】
項目９６。核酸鎖を除去することが、標的特異的結合パートナーに結び付けられた核酸鎖を酵素的に開裂、修飾、または分解することを含む、項目９５に記載の方法。
【０２９４】
項目９７。核酸鎖が、ドッキング鎖である、項目９７に記載の方法。
【０２９５】
項目９８。核酸鎖が、プライマー鎖である、項目９７に記載の方法。
【０２９６】
項目９９。標的特異的結合パートナーに結び付けられた核酸鎖がプライマー鎖である場合、結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることが、プライマー鎖からドッキング鎖を除去することを含む、項目１〜２５、３４〜３８、または４７〜９４のいずれか１つに記載の方法。
【０２９７】
項目１００。ドッキング鎖を除去することが、ドッキング鎖を酵素的に開裂、修飾、または分解することを含む、項目９９に記載の方法。
【０２９８】
項目１０１。結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることが、イメージャー鎖を除去することを含む、項目１〜２５、３４〜３８、または４７〜９４のいずれか１つに記載の方法。
【０２９９】
項目１０２。イメージャー鎖を除去することが、イメージャー鎖を酵素的に開裂、修飾、または分解することを含む、項目１〜２５、３４〜３８、または４７〜９４のいずれか１つに記載の方法。
【０３００】
項目１０３。結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることが、イメージャー鎖から標識を除去することを含む、項目１〜２５、３４〜３８、または４７〜９４のいずれか１つに記載の方法。
【０３０１】
均等物
上記の書面による明細は、当業者が本実施形態を実施することを可能にするのに十分である。上記の説明及び実施例がある特定の実施形態を詳述し、本発明者らによって企図される最良のモードを記載する。しかしながら、上記が文中でどれほど詳細に表示されようと、実施形態が多くの方法で実施され得、添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
【０３０２】
本明細書で使用される場合、約という用語は、明示的に指示されるかどうかにかかわらず、例えば、整数、分数、及び百分率を含む数値を指す。約という用語は、概して、当業者が列挙された値（例えば、同じ機能または結果を有する）と同等であると見なす数値の範囲（例えば、列挙された範囲の＋／−５〜１０％）を指す。少なくとも及び約などの用語が数値または範囲のリストの前に置かれる場合、その用語は、リストに提供される値または範囲の全てを修正する。場合によっては、約という用語は、最も近い有効数字に四捨五入される数値を含んでもよい。
【図１Ａ−Ｃ】
2020504600.tif 000008
【図１Ｄ】
2020504600.tif 000009
【図１Ｅ】
2020504600.tif 000010
【図２】
2020504600.tif 000011
【図３】
2020504600.tif 000012
【図４Ａ】
2020504600.tif 000013
【図４Ｂ】
2020504600.tif 000014
【図５】
2020504600.tif 000015
【図６Ａ−Ｃ】
2020504600.tif 000016
【図６Ｄ−Ｆ】
2020504600.tif 000017
【図７Ａ】
2020504600.tif 000018
【図７Ｂ−Ｃ】
2020504600.tif 000019
【図７Ｄ−Ｇ】
2020504600.tif 000020
【図８】
2020504600.tif 000021
【図９Ａ−Ｇ】
2020504600.tif 000022
【図９Ｈ−Ｋ】
2020504600.tif 000023
【図１０】
2020504600.tif 000024
【図１１】
2020504600.tif 000025
【図１２】
2020504600.tif 000026
【図１３Ａ−Ｂ】
2020504600.tif 000027
【図１３Ｃ−Ｄ】
2020504600.tif 000028
【図１４】
2020504600.tif 000029
【図１５】
2020504600.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】平成30年10月9日(2018.10.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法であって、
（１）１つ以上の標的の存在に関して試験される試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが核酸鎖に結び付けられ、前記核酸鎖がドッキング鎖であり、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが異なる核酸鎖に結び付けられる、前記接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）前記試料を、前記ドッキング鎖に対して相補性を有する非線形アンプリファイアー鎖と接触させることと、
（４）任意に、非結合非線形アンプリファイアー鎖を除去することと、
（５）１つまたは２つのステップのいずれかで、前記ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させ、前記試料を、中間鎖を介して直接または間接的に前記ドッキング鎖または増幅鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであって、前記標識化イメージャー鎖の各々が、標識が付着したイメージャー鎖を含み、前記イメージャー鎖または中間鎖が、少なくとも１つのウラシルまたは非塩基部位を含む、前記接触させることと、
（６）前記試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
（７）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ単独で、もしくはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを伴って、前記イメージャー鎖もしくは前記中間鎖の前記少なくとも１つのウラシルを開裂することによって、またはエンドヌクレアーゼによって前記イメージャー鎖もしくは前記中間鎖の前記非塩基部位を開裂することによって、前記結合した標識化イメージャー鎖を除去することと、
（８）任意に、ステップ（１）〜（７）またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、前記方法。
【請求項２】
ポリメラーゼがローリングサークル増幅のために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記非線形アンプリファイアー鎖が、前記試料と接触させる前に、核酸鎖に結び付けられた前記標的特異的結合パートナーと組み合わされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させることが、前記試料を、前記ドッキング鎖または増幅鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることとは別に起こる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ドッキング鎖をローリングサークル増幅で増幅させることが、前記試料を、前記ドッキング鎖に対して相補性を有する標識化イメージャー鎖と接触させることと同じステップで起こり、前記イメージャー鎖が、前記イメージャー鎖の増幅を防止するために３’修飾を任意に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ドッキング鎖に対して相補性を有する前記非線形アンプリファイアー鎖が、前記イメージャー鎖と同一の配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記イメージャー鎖またはアンプリファイアー鎖が、前記ドッキング鎖に相補的である少なくとも２つの領域を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標識化イメージャー鎖が、直鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記非線形アンプリファイアー鎖が、環状鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記非線形アンプリファイアー鎖が、ライゲーションされて環状鎖を形成することが可能な２つの末端を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
１つ以上の標的の存在に関して試料を試験するための方法であって、
（１）前記試料を１つ以上の標的特異的結合パートナーと接触させることであって、各標的特異的結合パートナーが、直接または間接的に核酸鎖に結び付けられ、異なる特異性の標的特異的結合パートナーが、異なる核酸鎖に結び付けられる、前記接触させることと、
（２）任意に、非結合標的特異的結合パートナーを除去することと、
（３）前記核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、前記核酸鎖が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、任意に、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させるか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、任意に、２つ以上のドッキング鎖を前記プライマー鎖と会合させることと、
（４）前記試料を、中間鎖を介して直接または間接的にドッキング鎖に結合することが可能な標識化イメージャー鎖と接触させることであって、前記標識化イメージャー鎖の各々が、イメージャー鎖とそれに付着した標識とを含み、前記イメージャー鎖または中間鎖が、少なくとも１つのウラシルまたは非塩基部位を含む、前記接触させることと、
（５）任意に、非結合標識化イメージャー鎖を除去することと、
（６）前記試料をイメージングして、結合した標識化イメージャー鎖を検出することと、
（７）ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ単独で、もしくはエンドヌクレアーゼＶＩＩＩを伴って、前記イメージャー鎖もしくは前記中間鎖の前記少なくとも１つのウラシルを開裂することによって、またはエンドヌクレアーゼによって前記イメージャー鎖もしくは前記中間鎖の前記非塩基部位を開裂することによって、前記結合した標識化イメージャー鎖からシグナルを消失させることと、
（８）任意に、ステップ（１）〜（７）またはこれらの任意のサブセットを反復することと、を含む、前記方法。
【請求項１２】
ステップ（７）の後、前記方法が、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることと、ステップ（４）、任意に（５）、（６）、及び（７）を反復することと、をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、ステップ（３）において、各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数を増加させることか、または２つ以上のドッキング鎖を前記プライマー鎖と会合させることを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
各標的特異的結合パートナーと会合したドッキング鎖の数の前記増加が、酵素を使用して達成され、前記酵素が任意に、ポリメラーゼである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
非結合標識化イメージャー鎖を酵素的に開裂、修飾、または分解することが、酵素を使用することによって達成され、前記酵素が任意に、グリコシラーゼ、制限エンドヌクレアーゼ、ニッキングエンドヌクレアーゼ、ＲＮａｓｅ、及び非天然ヌクレオチドにおいて開裂する酵素である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
２つ以上の標的特異的結合パートナーに結合した試料を含む、組成物であって、各結合パートナーが、核酸鎖、及び中間鎖を介して直接または間接的に標識化イメージャー鎖に安定的に結合した少なくとも１つのドッキング鎖に結合し、前記核酸鎖が、ドッキング鎖またはプライマー鎖であり、前記核酸が、
（ａ）ドッキング鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖が各標的特異的結合パートナーと会合するか、または
（ｂ）プライマー鎖である場合、２つ以上のドッキング鎖が前記プライマー鎖と会合し、
前記標識化イメージャー鎖が、標識が付着したイメージャー鎖を含み、前記イメージャー鎖または中間鎖が、少なくとも１つのウラシルまたは非塩基部位を含む、組成物。
【請求項１７】
直接または間接的に標識化イメージャー鎖に結合した前記ドッキング鎖が、３０分間少なくとも９０％の結合を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記
（ａ）ドッキング鎖、または
（ｂ）ドッキング鎖及び任意の中間鎖
が、８０個以下のヌクレオチド、７０、６０、５０、４０、または３０個以下のヌクレオチドである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
前記イメージャー鎖が、６０個以下のヌクレオチドである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項２０】
（１）標識と、
（２）第１の核酸ドメイン、第２の核酸ドメイン、及び第３の核酸ドメインであって、各核酸ドメインが、１〜９ヌクレオチド長である、前記核酸ドメインと、
（３）前記第１の核酸ドメイン及び前記第２の核酸ドメインを結び付ける第１の結合部分と、
（４）前記第２の核酸ドメイン及び前記第３の核酸ドメインを結び付ける第２の結合部分と、を含む、組成物であって、
両方の結合部分が、（ａ）無傷ホスホジエステル骨格を有する非塩基部位、（ｂ）核酸グリコシラーゼによって開裂可能なリンカー、（ｃ）非天然ヌクレオチド、または（ｄ）制限部位またはニッキング部位から独立して選択される、前記組成物。
【請求項２１】
追加の核酸ドメインが、追加の結合部分によって結び付けられる、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
少なくとも１つの結合部分が、無傷ホスホジエステル骨格を有する非塩基部位（アピリミジン）である、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
少なくとも１つの結合部分が、エンドヌクレアーゼＶＩＩＩからの開裂を起こしやすい、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記核酸ドメインが、ＤＮＡを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２５】
前記核酸ドメインが、ＲＮＡを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
少なくとも１つの結合部分が、少なくとも１つの非天然ヌクレオチドを含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
少なくとも２つの標的が、同じイメージングステップで少なくとも２つの標識を使用してイメージングされる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも２つの標的が、少なくとも２つの標識を使用してイメージングされ、前記シグナルが消失され、次いで少なくともさらに１つの標識が、同じ標識のうちの少なくとも１つを使用してイメージングされ、前記イメージングステップが、いずれかの順序で実施され得る、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
2020504600.tif 000031