(57)【要約】  本発明は、遺伝子工学の分野に関し、さらに詳細には核酸編集およびゲノム改変に関する。本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する単離されたＣａｓタンパク質またはそのポリペプチド断片を提供する。Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、２０℃から１００℃までの範囲の温度で、二本鎖標的ポリヌクレオチドの結合、切断、標識または改変が可能である。本発明は、前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼをコードする単離核酸分子、発現ベクターおよび宿主細胞をさらに提供する。本発明はまた、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドにより認識されるＰＡＭ配列を提供する。本明細書に開示されるＣａｓ９ヌクレアーゼは、一般に、特に高温における、遺伝子工学の新規ツールを提供する。
2020510410.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的核酸配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、切断する、標識するまたは改変するための、少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質の使用であって、
前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、前記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および前記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含み、
前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有し、
前記少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子が、前記標的配列を認識し、
前記非標的核酸鎖が、前記プロトスペーサー核酸配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’を含み、前記使用が、ヒト細胞におけるものあり、任意選択で前記ヒト細胞が胚性幹細胞ではない、使用。
【請求項２】
前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記標的核酸配列を含む前記ポリヌクレオチドが前記Ｃａｓタンパク質により切断され、好ましくは、前記切断がＤＮＡ切断である、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記標的配列を含む前記標的核酸鎖が二本鎖ＤＮＡであり、前記使用が、前記標的核酸配列を含む前記ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、請求項１から３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
前記標的核酸配列を含む前記ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質が前記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、前記使用が前記ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、請求項１または請求項２に記載の使用。
【請求項６】
前記Ｃａｓタンパク質を含む前記ポリヌクレオチドが、変異Ｄ８ＡおよびＨ５８２Ａを含む、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］を含む、請求項１から６のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＳＡＡ−３’［配列番号４８］を含む、請求項１から７のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＣＡＡ−３’［配列番号５０］を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、請求項８または請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項７から１０のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
前記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、請求項１から１１のいずれかに記載の使用。
【請求項１３】
前記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、請求項１から１２のいずれかに記載の使用。
【請求項１４】
前記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項１から１３のいずれかに記載の使用。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５〜２００ヌクレオチド残基の範囲である、請求項１から１４のいずれかに記載の使用。
【請求項１６】
前記標的核酸配列が、１５〜３２ヌクレオチド残基長である、請求項１から１５のいずれかに記載の使用。
【請求項１７】
前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項１から１６のいずれかに記載の使用。
【請求項１８】
前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、前記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項１から１７
のいずれかに記載の使用。
【請求項１９】
前記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、請求項１７または請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、請求項１７から１９のいずれかに記載の使用。
【請求項２１】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、前記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、請求項２０または請求項２１に記載の使用。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、請求項２０から２２のいずれかに記載の使用。
【請求項２４】
ヒト細胞中における二本鎖標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変する方法であって、前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および前記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸を含み、前記方法が、
ａ．少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を設計するステップであって、前記ターゲティングＲＮＡ分子が、前記標的鎖の前記標的配列を認識し、前記非標的鎖が、前記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’を含む、ステップ、
ｂ．前記ターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質を含むリボ核タンパク質複合体を形成するステップであって、前記単離Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、ステップ、および
ｃ．前記標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変する前記リボ核タンパク質複合体であって、任意選択で前記ヒト細胞が胚性幹細胞ではなく、任意選択で前記方法が前記ヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない、リボ核タンパク質複合体
を含む、方法。
【請求項２５】
前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的核酸配列を含む前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが前記Ｃａｓタンパク質により切断され、好ましくは前記切断がＤＮＡ切断である、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記使用が、前記ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、請求項２４から２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記標的核酸配列を含む前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質が、前記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、前記方法が、前記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、請求項２４または請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］を含む、請求項２４から２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＳＡＡ−３’［配列番号４８］を含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＣＡＡ−３’［配列番号５０］を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、請求項３０または請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項２９から請求項３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、請求項２４から３３のいずれかに記載の使用。
【請求項３５】
前記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、請求項２４から３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項２４から３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５〜２００ヌクレオチド残基の範囲である、請求項２４から３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記標的核酸配列が、１５〜３２ヌクレオチド残基長である、請求項２４から３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項２４から３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、前記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項２４から４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、請求項３９または請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、請求項３９から４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、前記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、請求項４２または請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、請求項４２から４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ−ヌクレアーゼであり、前記改変が、所望の遺伝子座における一本鎖または二本鎖切断である、請求項２０に記載の使用または請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、前記機能的部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサーから選択され、前記結合、切断、標識または改変が、遺伝子発現の改変をもたらす、請求項２０に記載の使用、または請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
前記結合、切断、標識または改変が、ｉｎ  ｖｉｖｏで行われる、請求項２０に記載の使用、または請求項４２に記載の方法。
【請求項４９】
前記結合、切断、標識または改変が、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入をもたらし、かつ／または前記結合、切断、標識または改変が、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現をもたらす、請求項１から４、７から２３、もしくは４６のいずれかに記載の使用、または請求項２４から２７、２９から４６のいずれかに記載の方法。
【請求項５０】
標的核酸配列を含む二本鎖標的ポリヌクレオチドを有する形質転換ヒト細胞であって、前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、前記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、および前記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含み、前記細胞が、
配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ：クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質、
前記標的核酸鎖中の前記標的核酸配列を認識する少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子であって、前記非標的鎖が、前記プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含み、前記ＰＡＭ配列が５’−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’を含む、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、および
少なくとも１つの前記Ｃａｓタンパク質および前記ターゲティングＲＮＡ分子をコードする核酸を含む発現ベクター
を含み、任意選択で、前記ヒト細胞が胚性幹細胞ではない、形質転換ヒト細胞。
【請求項５１】
前記Ｃａｓタンパク質および前記ターゲティングＲＮＡ分子により、前記細胞中の前記標的ポリヌクレオチドの結合、切断、標識または改変が可能になり、前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項５０に記載の形質転換細胞。
【請求項５２】
前記標的核酸配列を含む前記標的核酸鎖がＣａｓタンパク質により切断され、好ましくは前記切断がＤＮＡ切断である、請求項５０または請求項５１に記載の形質転換細胞。
【請求項５３】
前記標的配列を含む前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記結合、切断、標識または改変が、前記標的ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、請求項５０から５２のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項５４】
前記標的核酸配列を含む前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質が、前記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、前記結合、切断、標識または改変が、前記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらす、請求項５０または請求項５１に記載の形質転換細胞。
【請求項５５】
前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］を含む、請求項５０から５４のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項５６】
前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＳＡＡ−３’［配列番号４８］を含む、請求項５５に記載の形質転換細胞。
【請求項５７】
前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＣＡＡ−３’［配列番号５０］を含む、請求項５６に記載の形質転換細胞。
【請求項５８】
前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、請求項５６または請求項５７に記載の形質転換細胞。
【請求項５９】
結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項５５から請求項５８のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項６０】
前記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、請求項５０から５９のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項６１】
前記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、請求項５０から６０のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項６２】
前記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項５０から６１のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項６３】
前記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５〜２００ヌクレオチド残基の範囲である、請求項５０から６２のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項６４】
前記標的核酸配列が、１５〜３２ヌクレオチド残基長である、請求項５０から６３のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項６５】
前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項５０から６４のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項６６】
前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、前記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項５０から６５のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項６７】
前記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／またはＣ終端に、好ましくはＮ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、請求項６５または請求項６６に記載の形質転換細胞。
【請求項６８】
前記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、請求項６５から６７のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項６９】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、前記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、請求項６８に記載の形質転換細胞。
【請求項７０】
前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、請求項６５から６９のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項７１】
前記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、請求項６５から６９のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項７２】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ−ヌクレアーゼであり、前記改変が、所望の遺伝子座における一本鎖または二本鎖切断である、請求項６５から７０のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項７３】
前記二本鎖標的ポリヌクレオチドがｄｓＤＮＡであり、前記機能的部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサーから選択され、前記結合、切断、標識または改変が、遺伝子発現の改変をもたらす、請求項６５から６９のいずれかに記載の形質転換細胞、または請求項４２に記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｃａｓタンパク質が、発現ベクターから発現される、請求項６５から７０のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項７５】
前記結合、切断、標識または改変が、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入をもたらし、かつ／または前記結合、切断、標識または改変が、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現をもたらす、請求項５０から７４のいずれかに記載の形質転換細胞。
【請求項７６】
Ｃａｓタンパク質、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて標的核酸配列を認識する少なくとも１つのターゲッティングＲＮＡ分子、および前記標的ポリヌクレオチドを含む、核タンパク質複合体であって、
前記Ｃａｓタンパク質が、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有し、
前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが、前記標的核酸配列を含む標的核酸鎖、ならびに前記標的核酸配列に相補的であるプロトスペーサー核酸配列および前記プロトスペーサー配列の３‘末端に直接隣接したプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む非標的核酸鎖を含み、前記ＰＡＭ配列が、５‘−ＮＮＮＮＣＮＮ−３’を含み、前記核タンパク質複合体がヒト細胞におけるものではなく、任意選択で、前記細胞が胚性幹細胞ではない、核タンパク質複合体。
【請求項７７】
２０℃と１００℃の間の温度で、３０℃と８０℃の間の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で発生する、請求項７６に記載の核タンパク質複合体。
【請求項７８】
前記標的核酸配列を含む前記二本鎖標的ポリヌクレオチドが前記Ｃａｓタンパク質により切断され、好ましくは前記切断がＤＮＡ切断である、請求項７６または請求項７７に記載の核タンパク質複合体。
【請求項７９】
前記標的配列を含む前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記結合、切断、標識または改変が、前記標的ポリヌクレオチド中の二本鎖切断をもたらす、請求項７６から７８のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項８０】
前記標的核酸配列を含む前記標的ポリヌクレオチドが二本鎖ＤＮＡであり、前記Ｃａｓタンパク質が、前記二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠き、前記核タンパク質複合体が存在することにより、前記標的ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングがもたらされる、請求項７６または請求項７７に記載の核タンパク質複合体。
【請求項８１】
前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］を含む、請求項７６から８０のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項８２】
前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＳＡＡ−３’［配列番号４８］を含む、請求項８１に記載の核タンパク質複合体。
【請求項８３】
前記ＰＡＭ配列が、５’−ＮＮＮＮＣＣＡＡ−３’［配列番号５０］を含む、請求項８２に記載の核タンパク質複合体。
【請求項８４】
前記結合、切断、標識または改変が、２０℃と７０℃の間の温度で起こる、請求項８２または請求項８３に記載の核タンパク質複合体。
【請求項８５】
結合、切断、標識または改変が、２５℃と６５℃の間の温度で起こる、請求項８１から請求項８４のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項８６】
前記Ｃａｓタンパク質が、細菌、古細菌またはウイルスから、好ましくは好熱性細菌から得られる、請求項７６から８５のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項８７】
前記Ｃａｓタンパク質が、ゲオバチルス（Geobacillus）属種、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から得ることができる、請求項７６から８６のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項８８】
前記ターゲティングＲＮＡ分子が、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、請求項７６から８７のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項８９】
前記少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さが、３５〜２００ヌクレオチド残基の範囲である、請求項７６から８８のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項９０】
前記標的核酸配列が、１５〜３２ヌクレオチド残基長である、請求項７６から８９のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項９１】
前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項７６から９０のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項９２】
前記Ｃａｓタンパク質が、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供され、任意選択で、前記少なくとも１つのさらなるタンパク質が、少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、請求項７６から９１のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項９３】
前記Ｃａｓタンパク質またはさらなるタンパク質が、前記Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体のＮ終端および／もしくはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している、少なくとも１つの機能的部分を含む、請求項９１または請求項９２に記載の核タンパク質複合体。
【請求項９４】
前記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグ、例えば緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）から選択される、請求項９１から９３のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項９５】
前記Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、前記Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、請求項９４に記載の核タンパク質複合体。
【請求項９６】
前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、請求項９１から９５のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項９７】
前記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質である、請求項９１から９５のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項９８】
前記核酸がｄｓＤＮＡであり、前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ−ヌクレアーゼであり、前記標的ポリヌクレオチドが、所望の遺伝子座における一本鎖または二本鎖切断を有する、請求項９１から９６のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項９９】
前記核酸がｄｓＤＮＡであり、前記機能的部分が、ＤＮＡ改変酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性因子または転写リプレッサーから選択され、前記核タンパク質複合体形成により、遺伝子発現の改変がもたらされる、請求項９１から９５のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【請求項１００】
前記核タンパク質形成により、所望の位置に、所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入がもたらされ、かつ／または前記核タンパク質複合体形成により、所望の遺伝子座にサイレンシング遺伝子発現がもたらされる、請求項７６から９９のいずれかに記載の核タンパク質複合体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学の分野に関し、さらに詳細には核酸編集およびゲノム改変に関する。本発明は、遺伝物質の配列依存部位特異的結合、ニッキング、切断および改変のために構成することができるヌクレアーゼ；その上、遺伝物質の配列特異的部位に活性、特にヌクレアーゼ活性を働かせるリボ核タンパク質、ならびにマーカーとして使用するための修飾ヌクレアーゼおよびリボ核タンパク質の形態での遺伝子工学ツールに関する。したがって、本発明は、細胞内でのヌクレアーゼおよびガイドＲＮＡの送達および発現のための関連発現構築物にも関する。さらに、本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの核酸の配列特異的編集およびそれを達成するのに使用される方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓが多くの細菌および大半の古細菌での適応免疫系であることは２００７年に初めて実証された（Barrangou et al., 2007, Science 315: 1709-1712）、Brouns et al., 2008, Science 321: 960-964）。機能的および構造的判断基準に基づいて、３つのタイプをそれぞれ含む２種類のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系がこれまで特徴付けられており、その大半が相補的であるＤＮＡ配列を標的にするためのガイドとして小型ＲＮＡ分子を使用している（Makarova et al., 2015, Nat Rev Microbiol 13: 722-736；Mahanraju et al., 2016, Science 353: aad5147）。
【０００３】
Ｄｏｕｄｎａ／Ｃｈａｒｐｅｎｔｉｅｒ研究室による最近の研究では、クラス２／ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（Ｃａｓ９）のエフェクター酵素の徹底的な特徴付けが実施され、設計されたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイド（特異的スペーサー配列を有する）の導入によりプラスミド上の相補的配列（プロトスペーサー）が標的にされ、このプラスミドの二本鎖切断が引き起こされることが実証された（Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821）。Jinek et al., 2012に続いて、Ｃａｓ９はゲノム編集のためのツールとして使用される。
【０００４】
Ｃａｓ９は様々な真核細胞（例えば、魚、植物、ヒト）のゲノムを操作するのに使用されてきた（Charpentier and Doudna, 2013, Nature 495: 50-51）。
【０００５】
さらに、Ｃａｓ９は、特定の組換え事象を選び出すことにより細菌での相同組換えの収率を改善するのに使用されてきた（Jiang et al., 2013, Nature Biotechnol 31: 233-239）。これを達成するためには、毒性断片（ターゲティング構築物）に所望の変化をもつレスキュー断片（編集構築物、点突然変異または欠失を有する）を共トランスフェクトする。ターゲティング構築物は、デザインＣＲＩＳＰＲと組み合わせたＣａｓ９および宿主染色体上で所望の組換え部位を規定する抗生物質耐性マーカーからなり、対応する抗生物質の存在下では宿主染色体でのターゲティング構築物の組込みが選択される。ＣＲＩＳＰＲ標的部位を有する編集構築物の追加の組換えが宿主染色体で起こる場合のみ、宿主は自己免疫問題から逃れることが可能である。したがって、抗生物質の存在下では、所望の（マーカーなし）突然変異体のみが生き延びて成長することができる。染色体から組み込まれたターゲティング構築物のその後の除去を選ぶ関連戦略も提起されており、本物のマーカーなし突然変異体を生み出している。
【０００６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ媒介ゲノム編集は遺伝子工学のための有用なツールを成すことが近年確立された。原核生物ＣＲＩＳＰＲ系が適応免疫系としてその宿主に役立ち（Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821）、迅速で効果的な遺伝子工学のために使用することが可能であり（例えば、Mali et al., 2013, Nat Methods 10:957-963）、目的の配列を標的にするためにはガイド配列の改変のみが必要であることが確立されている。
【０００７】
しかし、遺伝子研究およびゲノム編集の分野での応用のために種々の実験条件下で改良された配列特異的核酸検出、切断および操作ができる作用因子の開発の必要性が続けて存在している。特に、Ｃａｓ９を含む現在利用可能な配列特異的ゲノム編集ツールは、あらゆる条件または生物での使用に適用可能なわけではなく、例えば、配列特異的ヌクレアーゼは相対的に熱感受性であり、したがって、厳密に好熱性の微生物（４１℃と１２２℃の間で成長することができ、最適には４５℃超から８０℃の温度範囲で成長し、超好熱菌は８０℃より上で最適成長できる）、例えば、工業用発酵においてまたは高温で行われるｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験工程のために使用される微生物での使用には適用可能ではない。
【０００８】
好熱菌において活性Ｃａｓ９タンパク質についての実験的証拠は現在まで存在しない。細菌におけるＣａｓ９の存在下でのChylinski et al. (2014; Nucleic Acids Research 42: 6091-6105)による比較ゲノムスクリーニングに基づいて、ＩＩ−Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系はすべての細菌ゲノムのおおよそ３．３％に存在するだけであることが見いだされた。好熱性細菌のなかで、ＩＩ型系は統計分析（Ｐ＝０．００１９）に基づいて過小に見積もられている。さらに、古細菌ではＩＩ型系は見いだされていないが、これはおそらく古細菌にはリボヌクレアーゼＩＩＩタンパク質（ＩＩ型系に関与する）が存在しないせいであろう。Chylinski, et al., (2014; Nucleic Acids Research 42: 6091-6105)は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の分類および進化を過去に報告しており、特に、これらの系を示す２つの種が同定されているが、これらの種は最大５５℃で成長し、最適成長温度が６０〜８０℃であり、超好熱菌では８０℃より上で最適に成長できる厳密に好熱性の成長を示してはいない。
【０００９】
細菌ゲノムにおけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の希少性、特に、Ｃａｓ９が最適成長温度が４５℃よりも低い細菌（古細菌ではない）でしか見つかっていないという事実にもかかわらず、本発明者らは、驚くべきことに、ゲノム編集を高温で実行するのを可能にするいくつかの熱安定性Ｃａｓ９変異体を発見した。発明者はまた、高温を含めた、幅広い範囲の温度にわたるゲノム編集の実施を可能にする、熱安定性Ｃａｓ９変異体と共に働く、最適化プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を発見した。関連ＰＡＭ配列の認識により設計された、これらのＣａｓ９ヌクレアーゼおよびＲＮＡ分子は、高温での遺伝子工学のための新規のツールとなり、好熱性生物、特に微生物の遺伝子操作に特に価値がある。
【００１０】
好熱性ゲオバチルス（Geobacillus）属の系統発生学的再評価が、最近行われ、これにより、新しい属、すなわちパラゲオバチルス（Parageobacillus）の創生をもたらした。これにより、ゲオバチルス（Geobacillus）の以前の一部の属種は、パラゲオバチルス（Parageobacillus）に系統的に、再度、帰属され、したがって、再命名された（Aliyu et al.,(2016) Systematic and Applied Microbiology 39:527-533）。
【００１１】
クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は、侵入遺伝的エレメントに対して、原核生物における、適応免疫および遺伝免疫をもたらす（Brouns et al. Science 321,(2008)；Barrangou et al. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes. Science 315,(2007)；Wright et al. Cell 164, 29-44(2016)；Mohanraju et al. Science 353, aad5147(2016)）。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、その複雑さおよびシグネチャタンパク質に応じて、２つのクラス（１および２）および６つのタイプ（Ｉ〜ＶＩ）に分類される（Makarova et al. Nat. Rev. Microbiol. 13, 722-736(2015)）。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９およびＶ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２ａ（以前には、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１と呼ばれていた）を含むクラス２系が、最近、真核生物（Komor et al. Cell 168, 20-36(2017)；Puchta, Curr. Opin. Plant Biol. 36, 1-8(2017)；Xu et al. J. Genet. Genomics 42, 141-149(2015)；Tang et al. Nat. Plants 3, 17018(2017)；Zetsche et al. Nat. Biotechnol. 35, 31-34(2016)）と原核生物（Mougiakos, et al. Trends Biotechnol. 34,、575-587(2016)）の両方に対するゲノム工学ツールとして活用された。これらの系は、単一ＣａｓエンドヌクレアーゼおよびＲＮＡガイドＲＮＡにより形成されるリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体に基づいた、標的二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を導入するので、それらの系は、最も簡単なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のなかで知られているものである。
【００１２】
現在まで、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）は、最もよく特徴付けられており、ゲノム工学のための最も広範に使用されているＣａｓ９である。数種の他のＩＩ型系が特徴付けられているが、それらのどれも、好熱性生物から誘導されたものではない（Nakade, et al. Bioengineered 1-9(2017). doi:10.1080/21655979.2017.1282018）。このようなＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の特徴付けは、基礎的な考察、および新規な用途にとって興味深いものとなろう。
【００１３】
いくつかの好熱菌の場合、基礎的な遺伝的ツールが利用可能であるが（Taylor et al. Microb. Biotechnol. 4, 438-448(2011)；Olson, et al. Curr. Opin. Biotechnol. 33, 130-141(2015)；Zeldes, et al. Front. Microbiol. 6, 1209(2015)）、これらのツールの効率は、依然として低すぎるため、この興味深い生物群の完全な探索および実施は可能ではない。ＳｐＣａｓ９は、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、≧４２℃で活性ではないという本発明者らの知見に基づくと、本発明者らは、高温での相同組換えと中温でのＳｐＣａｓ９に基づく対向選択とを組み合わせた、条件的好熱菌に対するＳｐＣａｓ９に基づく工学ツールを以前に開発した（Mougiakos et al. ACS Synth. Biol. 6, 849-861(2017)）。しかし、ＳｐＣａｓ９は、４２℃以上では活性ではないので、偏性好熱菌に対するＣａｓ９に基づく編集およびサイレンシングツールは、依然として利用可能ではなく（Mougiakos et al. ACS Synth. Biol. 6, 849-861(2017)）、これまで、好熱性Ｃａｓ９は特徴付けられていない。
【発明の概要】
【００１４】
発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９：好熱性細菌であるゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＩＩＣ型系からＲＮＡ−ガイドＤＮＡ−エンドヌクレアーゼを発見して、特徴付けた。発明者らは、驚くべきことに、幅広い温度範囲にわたる、そのｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性を示し、熱安定性に対するｓｇＲＮＡ−構造の重要性を実証し、幅広い温度範囲にわたる、ｉｎ  ｖｉｖｏでのゲノム編集に、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を適用した。
【００１５】
したがって、本発明は、
ａ．アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；および／または
ｂ．アミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；および／または
ｃ．アミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；および／または
ｄ．アミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；および／または
ｅ．アミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）
を含む、単離されたＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ：クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質またはポリペプチドを提供する。
【００１６】
疑義タンパク質を回避するため、本発明のＣａｓタンパク質をコードするポリペプチドまたは核酸はまた、「ＧｔＣａｓ９」または「ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９」と称することができる。「ＧｔＣａｓ９」および「ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９」は、本明細書全体にわたって互換的に使用され、同じ意味を有する。
【００１７】
本発明の状況でのポリペプチドは、完全長Ｃａｓタンパク質の断片と見なしてもよい。そのような断片は不活性であり、遺伝物質の結合、編集および／または切断と直接関連のない方法でおよび目的のために、例えば、アッセイでの標準または抗体を産生するなどのために使用してもよい。
【００１８】
しかし、好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、およびターゲティングＲＮＡ分子により認識される標的核酸配列を含むポリヌクレオチドと会合すると、２０℃から１００℃までの範囲の温度で機能的であり、切断、結合、標識または改変することができる。好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、機能的であり、５０℃から７０℃までの範囲の温度、例えば５５℃または６０℃で、前記切断、結合、標識または改変が可能である。
【００１９】
特定の実施形態では、本発明は、アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］を含むＣａｓタンパク質またはポリペプチドを提供することができる。他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドはアミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）をさらに含んでいてもよい。
【００２０】
他の実施形態では、本明細書で定義されるＣａｓタンパク質またはポリペプチドはアミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）を追加でさらに含んでいてもよい。
【００２１】
他の実施形態では、本明細書で定義されるＣａｓタンパク質またはポリペプチドはアミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）を追加でさらに含んでいてもよい。
【００２２】
他の実施形態では、本明細書で定義されるＣａｓタンパク質またはポリペプチドはアミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）を追加でさらに含んでいてもよい。
【００２３】
本発明に従えば、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは配列番号２から６のモチーフのうちのいずれでも、単独でまたは組み合わせて含むことができることが認識されうる。以下は、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドを特徴付けることができるモチーフの組合せのそれぞれを要約している。
【００２４】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］
【００２５】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）。
【００２６】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）。
【００２７】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
【００２８】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
【００２９】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
【００３０】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
【００３１】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
【００３２】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）。
【００３３】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
【００３４】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
【００３５】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
【００３６】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
【００３７】
ＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
【００３８】
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）。
【００３９】
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
【００４０】
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
【００４１】
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
【００４２】
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
【００４３】
Ｘ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
【００４４】
Ｘ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
【００４５】
Ｘ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）。
【００４６】
Ｘ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
【００４７】
Ｘ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；およびＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）。
【００４８】
別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、単離Ｃａｓタンパク質またはそのポリペプチド断片を提供し、Ｃａｓタンパク質またはそのポリペプチド断片は、以下のモチーフまたはアミノ酸：
ＩＧＬＤＩＧＩＴＳＩＧ［配列番号２３］、好ましくはＩＧＬＤＩＧＩＴＳＩＧＷＡＶＩＮＬＤ［配列番号２４］を含む、ＲｕｖＣ−Ｉドメイン
ＲＳＡＲＲ［配列番号２５］、好ましくはＰＲＲＬＡＲＳＡＲＲＲＬＲＲＲＫＨＲＬＥＲＩＲＲＬ［配列番号２６］を含む架橋ドメイン；および／または
ＷＱＬＲ［配列番号２７］を含む、α−ヘリカル／認識ローブドメイン；および／または
ＨＬＡＫＲＲＧ［配列番号２８］、好ましくはＬＡＲＩＬＬＨＬＡＫＲＲＧ［配列番号２９］を含む、α−ヘリカル／認識ローブドメイン；および／または
ＩＦＡＫＱ［配列番号３０］、好ましくはＥＩＫＬＩＦＡＫＱ［配列番号３１］を含む、α−ヘリカル／認識ローブドメイン；および／または
ＩＷＡＳＱＲ［配列番号３２］；および／または
ＫＶＧＦＣＴＦＥＰＫＥＫＲＡＰＫ［配列番号３３］；および／または
ＦＴＶＷＥＨＩＮＫＬＲＬ［配列番号３４］を含む、α−ヘリカル／認識ローブドメイン；および／または
モチーフＩＡＮＰＶＶＭＲＡＬＴＱ［配列番号３５］、好ましくはＩＡＮＰＶＶＭＲＡＬＴＱＡＲＫＶＶＮＡＩＩＫＫＹＧ［配列番号３６］を含む、ＲｕｖＣ−ＩＩドメイン；および／または
モチーフＥＬＡＲ［配列番号３７］、好ましくはＩＨＩＥＬＡＲＥ［配列番号３８］を含む、ＲｕｖＣ−ＩＩドメイン；および／または
モチーフＱＮＧＫＣＡＹ［配列番号３９］、好ましくはＩＶＫＦＫＬＷＳＥＱＮＧＫＣＡＹ［配列番号４０］を含む、ＨＮＨドメイン；および／または
モチーフＶＤＨＶＩＰ［配列番号４１］、好ましくはＶＤＨＶＩＰＹＳＲＳＬＤＤＳＹＴＮＫＶＬ［配列番号４２］を含む、ＨＮＨドメイン；および／または
モチーフＤＴＲＹＩＳＲＦＬＡＮ［配列番号４３］を含む、ＲｕｖＣ−ＩＩＩドメイン；および／または
モチーフＶＹＴＶＮＧＲＩＴＡＨＬＲＳＲＷ［配列番号４４］を含む、ＲｕｖＣ−ＩＩＩドメイン；および／または
モチーフＨＨＡＶＤＡ［配列番号４５］、好ましくはＨＨＡＶＤＡＡＩＶＡ［配列番号４６］を含む、ＲｕｖＣ−ＩＩＩドメイン
のいずれかを、単独または組合せのどちらかで含む。
【００４９】
好ましくは、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する、単離Ｃａｓタンパク質またはそのポリペプチド断片を提供し、Ｃａｓタンパク質またはそのポリペプチド断片は、アミノ酸モチーフ［配列番号２３］〜［配列番号４６］の各々を組み合わせて含む。
【００５０】
別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する単離されたＣａｓタンパク質またはそのポリペプチド断片を提供する。好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、２０℃から１００℃までの範囲の温度で、結合、切断、標識または改変が可能である。好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、２０℃と７０℃の間の範囲、例えば２５℃、５５℃、６０℃または６５℃で、前記切断、結合、標識または改変が可能である。好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、５０℃と７０℃の間の範囲の温度、例えば５５℃または６０℃で、前記切断、結合、標識または改変が可能である。好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、３０℃と８０℃の間の範囲の温度で、３７℃と７８℃の間の温度で、好ましくは５５℃超の温度で、より好ましくは５５℃と８０℃の間の温度で、さらにより好ましくは、５５℃と６５℃の間または６０℃と６５℃の間の温度で、前記切断、結合、標識または改変が可能である。
【００５１】
本発明はまた、標的核酸配列を含む標的ポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、標識するまたは改変するための、本明細書で提供されるターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質またはポリペプチドの使用を提供する。ターゲティングＲＮＡ分子は、ポリヌクレオチドの標的核酸鎖上の標的核酸配列を認識する。
【００５２】
標的核酸配列を含む標的ポリヌクレオチドは、二本鎖であってもよく、したがって、前記標的核酸配列を含む標的核酸配列鎖、およびプロトスペーサー核酸配列を含む非標的核酸鎖を含む。プロトスペーサー核酸配列は、この標的核酸配列に実質的に相補的であり、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて、それと対合する。非標的核酸鎖は、プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列をさらに含むことができる。このＰＡＭ配列は、長さが少なくとも６つ、７つまたは８つの核酸とすることができる。好ましくは、ＰＡＭ配列は、５位にシトシンを有する。好ましくは、ＰＡＭ配列は、配列５’−ＮＮＮＮＣ−３’を含み、したがって、ＰＡＭ配列は、５’末端から、５’−ＮＮＮＮＣ−３’が始まる。さらにまたは代替的に、ＰＡＭ配列は、８位にアデニンを有することができ、したがってＰＡＭ配列は、配列５’−ＮＮＮＮＮＮＮＡ−３’を含み、ＰＡＭ配列は、５’末端から、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＡ−３’が始まる。さらにまたは代替的に、ＰＡＭ配列は、１位、２位、３位、４位および６位のうちの１つまたは複数にシトシンを有してもよく、こうして、ＰＡＭ配列は、５’末端から、５’−ＣＮＮＮＮ−３’、５’−ＮＣＮＮＮ−３’、５’−ＮＮＣＮＮ−３’、５’−ＮＮＮＣＮ−３’および／または５’−ＮＮＮＮＮＣ−３’が始まる。任意選択で、ＰＡＭ配列は、ＰＡＭ配列が、５’末端から、５’−ＣＣＣＣＣＣＮＡ−３’［配列番号１０］から始まるように含み、さらに好ましくは、ＰＡＭ配列は、５’末端から、ＰＡＭ配列が５’−ＣＣＣＣＣＣＡＡ−３’［配列番号１１］で始まるように含む。他の好ましいＰＡＭ配列は、５’−ＡＴＣＣＣＣＡＡ−３’［配列番号２１］および５’−ＡＣＧＧＣＣＡＡ−３’［配列番号２２］を含む。
【００５３】
好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、４０℃から８０℃までの範囲、好ましくは４５℃から８０℃までの範囲、さらに好ましくは５０℃から８０℃までの範囲の温度で、結合、切断、標識または改変することができる。例えば、結合、切断、標識または改変は、４５℃、４６℃、４７℃、４８℃、４９℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃、７２℃、７３℃、７４℃、７５℃、７６℃、７７℃、７８℃、７９℃または８０℃の温度で行われる。より好ましくは、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、５５から６５℃までの範囲の温度で、結合、切断、標識または改変が可能である。好ましい態様では、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片は、配列番号１に対して少なくとも７５％の同一性；好ましくは少なくとも８５％；より好ましくは少なくとも９０％；さらにより好ましくは少なくとも９５％の同一性のアミノ酸配列を含むことができる。
【００５４】
Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、標的核酸鎖上の標的核酸配列を認識するターゲティングＲＮＡ分子と組み合わせて使用することができ、非標的核酸配列は、本明細書に開示される通り、非標的鎖上のプロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するＰＡＭ配列を有する。したがって、ＰＡＭ配列は、配列５’−ＮＮＮＮＣ−３’を含むことができ、Ｃａｓタンパク質は、２０℃から１００℃までの範囲、好ましくは３０℃から９０℃までの範囲、３７℃から７８℃までの範囲、４０℃から８０℃までの範囲、５０℃から７０℃までの範囲、または５５℃から６５℃までの範囲の温度で、標的鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変することができる。好ましくは、５’末端から、ＰＡＭ配列は、５’−ＮＮＮＮＣ−３’で始まり、Ｃａｓタンパク質は、２０℃から１００℃までの範囲、好ましくは３０℃から９０℃までの範囲、３７℃から７８℃までの範囲、４０℃から８０℃までの範囲、５０℃から７０℃までの範囲、または５５℃から６５℃までの範囲の温度で、標的鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変することができる。好ましくは、５’末端から、ＰＡＭ配列は、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＡ−３’で始まり、Ｃａｓタンパク質は、２０℃から１００℃までの範囲、好ましくは３０℃から９０℃までの範囲、３７℃から７８℃までの範囲、４０℃から８０℃までの範囲、５０℃から７０℃までの範囲、または５５℃から６５℃までの範囲の温度で、標的鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変することができる。さらに好ましくは、ＰＡＭ配列の５’末端は、５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］で始まり、Ｃａｓタンパク質は、２０℃から１００℃までの範囲、好ましくは３０℃から９０℃までの範囲、３７℃から７８℃までの範囲、４０℃から８０℃までの範囲、５０℃から７０℃までの範囲、または５５℃から６５℃までの範囲の温度で、標的鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変することができる。
【００５５】
さらに詳細には、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、配列番号１と以下の通り：少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または少なくとも９９．８％のパーセント同一性を有するアミノ酸配列を含むことができる。パーセント同一性は、少なくとも８９％とすることができる。パーセント同一性は、少なくとも９０％とすることができる。好ましくは、パーセント同一性は、少なくとも９５％、例えば９８％となろう。
【００５６】
配列番号１とのパーセントアミノ酸配列同一性は、２つの配列の最適整列のために導入する必要があるギャップの数およびそれぞれのギャップの長さを考慮に入れて、選択された比較窓において配列により共有されている同一の位置の数の関数として決定可能である。
【００５７】
本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片は、基準配列の配列番号１とパーセント配列同一性により定義されるその任意の前述のパーセント変異体の両方の点から、単独でまたは本質的特徴としての前述のアミノ酸モチーフ（すなわち、配列番号２および／または３および／または４および／または５および／または６）のいずれかと組み合わせて、特徴付けることができる。
【００５８】
本発明は、標的核酸配列を含む標的核酸鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変するための、本明細書で提供されるターゲティングＲＮＡ分子、および本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドの使用を提供する。好ましくは、前記結合、切断、標識または改変は、本明細書に開示される温度で、例えば２０と１００℃の間の温度で行われる。本発明はまた、本明細書で提供されるターゲティングＲＮＡ分子の設計、ならびに本発明のターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質またはポリペプチドを含むリボ核タンパク質複合体の形成を含む標的核酸鎖中の標的核酸配列に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する方法を提供する。好ましくは、標的核酸配列のリボ核タンパク質複合体結合、切断、標識または改変は、本明細書に開示される温度で、例えば３７と１００℃の間の温度で行われる。
【００５９】
本発明の使用および方法を行うことができ、本発明の核タンパク質は、例えばヒト細胞において、ｉｎ  ｖｉｖｏで、形成して使用される。任意選択で、本発明の使用および方法を行うことができ、本発明の核タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば胚性幹細胞ではないヒト細胞において形成し、使用することができる。任意選択で、本発明の使用および方法を行うことができ、本発明の核タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えばヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変することを含まない方法で、ヒト細胞において形成し、使用することができる。代替として、本発明の使用および方法を行うことができ、本発明の核タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、形成して使用される。本発明のＣａｓタンパク質は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用する場合、またはトランスフェクションにより細胞に添加する場合、単離形態で提供されてもよく、Ｃａｓタンパク質は、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸によって細胞の一過性または安定的な転換後に、非相同的に発現されてもよく、ターゲティングＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードする核酸によって細胞の一過性または安定的な転換後に、発現ベクターから転写されてもよく、かつ／またはＲＮＡ分子は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用した場合、またはトランスフェクションにより細胞に添加する場合、単離形態で提供されてもよい。好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドが、宿主細胞のゲノムにおいて、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸の安定な統合後に、宿主細胞のゲノムから発現される。したがって、Ｃａｓタンパク質および／またはＲＮＡ分子は、そうでなければ存在しない、細胞にタンパク質または核酸分子を加えるための人為的または意図的方法のいずれかを使用して、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの環境に加えることができる。
【００６０】
標的核酸配列を含むポリヌクレオチドは、Ｃａｓタンパク質によって切断することができ、任意選択で、切断は、ＤＮＡ切断とすることができる。標的配列を含む標的核酸鎖は、二本鎖ＤＮＡとすることができ、本方法または使用は、標的核酸配列を含むポリヌクレオチドにおける二本鎖切断をもたらすことができる。標的核酸配列を含むポリヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡとすることができ、Ｃａｓタンパク質は、二本鎖ＤＮＡを切断する能力を欠いてもよく、その使用または方法は、ポリヌクレオチドの遺伝子サイレンシングをもたらすことができる。
【００６１】
Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドを本方法、使用、および本発明の核タンパク質を、２５０ｎＭ以下の濃度で、例えば２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．５ｎＭ以下の濃度で提供することができる。代替的に、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも０．５ｎＭ、少なくとも１ｎＭ、少なくとも５ｎＭ、少なくとも１０ｎＭ、少なくとも２５ｎＭ、少なくとも５０ｎＭ、少なくとも１００ｎＭ、少なくとも１５０ｎＭ、少なくとも２００ｎＭまたは少なくとも２５０ｎＭの濃度で提供することができる。本発明のＰＡＭ配列は、８位にアデニンを有することができ、したがって、ＰＡＭ配列は、配列５’−ＮＮＮＮＮＮＮＡ−３’［配列番号４７］を含み、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドの濃度は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．５ｎＭ以下とすることができる。ＰＡＭ配列は、配列５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’を含むことができ、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドの濃度は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．５ｎＭ以下とすることができる。ＰＡＭ配列は、配列５’−ＣＣＣＣＣＣＮＡ−３’［配列番号１０］を含むことができ、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドの濃度は、１００ｎＭ以下、５０ｎＭ以下、２５ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、５ｎＭ以下、１ｎＭ以下または０．５ｎＭ以下とすることができる。
【００６２】
その上、本発明は本発明の前述のタンパク質またはポリペプチドのいずれかをコードする核酸を提供する。核酸は単離されていても発現構築物の形態であってもよい。
【００６３】
本発明のすべての前述の態様では、アミノ酸残基は保存的にも非保存的にも置換されていてよい。保存的アミノ酸置換とは、アミノ酸残基が類似する化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、したがって、得られるポリペプチドの機能的特性を変化させないアミノ酸置換のことである。
【００６４】
同様に、核酸配列がポリペプチドの機能に影響を与えずに保存的にも非保存的にも置換されうることは当業者であれば認識している。保存的に改変された核酸とは、アミノ酸配列の同一のまたは機能的に同一の変異体をコードする核酸で置換された核酸のことである。核酸のそれぞれのコドン（ＡＵＧおよびＵＧＧを除く；典型的にはそれぞれメチオニンまたはトリプトファンの唯一のコドン）は改変して機能的に同一の分子を生じることが可能であることは当業者であれば認識している。したがって、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドのそれぞれのサイレント変異（すなわち、同義コドン）は、本発明のポリペプチドをコードし、それぞれの記載されているポリペプチド配列に潜在的に含まれている。
【００６５】
本発明は、二本鎖標的ポリヌクレオチドに標的核酸配列を有する形質転換ヒト細胞を提供し、前記細胞は、本明細書で提供されるＣａｓタンパク質またはポリペプチド、および本明細書で提供される少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を含み、発現ベクターは、前記Ｃａｓタンパク質および前記ターゲティングＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つをコードする核酸を含む。任意選択で、形質転換されたヒト細胞は、単離ヒト細胞である。任意選択で、ヒト細胞は、胚性幹細胞ではない。Ｃａｓタンパク質およびターゲティングＲＮＡ分子により、高温で、または、例えば本明細書に開示される３７と１００℃の間の温度の範囲の形質転換細胞において、標的配列の結合、切断、標識または改変を行うことが可能となり得る、またはこれらを許容することができる。本発明は、１）本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、および本発明のターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターを細胞に形質転換、トランスフェクトまたは形質導入する、ステップ；または２）本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、およびさらには本発明のターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる発現ベクターを細胞に形質転換、トランスフェクトまたは形質導入する、ステップ；または３）本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、および本発明において提供されているターゲティングＲＮＡ分子を細胞にまたは細部内に送達する発現ベクターを細胞に形質転換、トランスフェクトまたは形質導入する、ステップのいずれかを含む、ヒト細胞中における標的核酸に結合する、それを切断する、標識するまたは改変する方法をさらに提供する。Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、例えば、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のゲノムへの安定な統合後に、形質転換細胞のゲノムから発現することができる。任意選択で、ヒト細胞は、胚性幹細胞ではない。任意選択で、本方法は、ヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変することを含まない。
【００６６】
本発明はまた、本発明の使用および方法を行うため、または本発明の形質転換ヒト細胞もしくは核タンパク質複合体を生成するための、１種または複数の試薬を含むキットであって、本発明のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチド、または本発明のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクター；および／または本発明のターゲティングＲＮＡ分子、もしくは本発明のターゲティングＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む、キットを提供する。本キットは、本発明を行うための指示書、例えば、本発明により、ターゲティングＲＮＡ分子を設計する方法に関する指示書をさらに含むことができる。
【００６７】
ＲＮＡガイドおよび標的配列
本発明のＣａｓタンパク質は、高温での標的核酸の配列特異的結合、切断、タグ付け、標識付けまたは改変を可能にする。標的核酸は、ＤＮＡ（一本鎖または二本鎖）でもＲＮＡでも合成核酸でもよい。本発明の特に有用な応用は、ゲノムＤＮＡの標的配列に相補的に結合する１つまたは複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と複合した本発明の１つまたは複数のＣａｓタンパク質によるゲノムＤＮＡの配列特異的ターゲティングおよび改変である。したがって、標的核酸は好ましくは二本鎖ＤＮＡである。そのようなターゲティングはｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでも実施することができる。好ましくは、そのようなターゲティングはｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。この方法で、本発明のＣａｓタンパク質を使用してヒト細胞のゲノムＤＮＡに位置する特定のＤＮＡ配列を標的にして改変することができる。Ｃａｓ系を使用して、異なる生物の種々の細胞型でおよび／または異なる生物でゲノムを改変することができることが想定されている。任意選択で、本発明のＣａｓタンパク質および系は、様々なヒト細胞タイプの、特に、胚性幹細胞を除く、単離ヒト細胞のゲノムを改変するために使用することができる。
【００６８】
ターゲティングＲＮＡ分子とも呼ばれるｇＲＮＡは、ポリヌクレオチド標的鎖上の標的核酸配列を認識する。ＲＮＡ分子はまた、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおける標的配列を認識するよう設計され得、非標的鎖は、プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接するプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を含む。本発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチドを用いて、最適な方法で働くＰＡＭ配列が本明細書に開示される。これらのＰＡＭ配列の認識により、ｇＲＮＡは、本発明の温度範囲および高い温度にわたり、本発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチドとの使用のために設計することができる。
【００６９】
したがって、本発明は、上文に記載される本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドを含み、標的ポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列を認識するという点でターゲティング機能を有する少なくとも１つのＲＮＡ分子をさらに含むリボ核タンパク質複合体を提供する。本発明はまた、標的核酸鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変するための、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質またはポリペプチドの使用、および本発明のリボ核タンパク質または核タンパク質、およびＣａｓタンパク質またはポリペプチドおよびターゲティングＲＮＡ分子を有する形質転換ヒト細胞を使用する、標的核酸鎖の標的核酸配列に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する方法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、本明細書で提供されるＰＡＭ配列により、プロトスペーサー配列の３’末端に直接隣接する、規定されたＰＡＭ配列をさらに含むことができる。このＰＡＭ配列は、長さが６、７または８またはそれより長い、好ましくは長さが８の核酸とすることができる。好ましくは、ＲＮＡ分子は、一本鎖ＲＮＡ分子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）であり、例えば、ハイブリダイゼーションによりｔｒａｃｒＲＮＡと会合する。ターゲティングＲＮＡはｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡのキメラでもよい。前述のＲＮＡ分子は、標的ヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％の同一性、または相補性のリボヌクレオチド配列を有することができる。任意選択で、ＲＮＡ分子は、標的ヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％もしくは１００％の同一性または相補性のリボヌクレオチド配列を有する。好ましい標的ヌクレオチド配列はＤＮＡである。任意選択で、本発明のリボ核タンパク質または核タンパク質を使用する、標的核酸鎖に結合する、これを切断する、標識するまたは改変するための、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子およびＣａｓタンパク質またはポリペプチドの使用、ならびに標的核酸鎖中の標的核酸配列に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する方法を、ヒト細胞において使用することができる。任意選択で、ヒト細胞は単離されるであろう。任意選択で、ヒト細胞は胚性幹細胞ではない。任意選択で、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドまたはリボ核タンパク質または核タンパク質は、ヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変するために使用されないであろう。
【００７０】
好ましい態様では、本発明は、少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子が標的ＤＮＡ配列にその長さに沿って実質的に相補的である、上文に記載されるリボ核タンパク質複合体を提供する。
【００７１】
ターゲティングＲＮＡ分子は、核タンパク質複合体内の標的配列に結合し得るまたはこれと会合することができ、その結果、非標的鎖上の標的配列およびＰＡＭ配列を含む標的ポリヌクレオチドは、本発明の核タンパク質複合体と会合し、その結果、本発明の核タンパク質複合体の一部を形成することができる。
【００７２】
したがって、本発明のＣａｓタンパク質と会合するＲＮＡガイドの配列を変化させると、Ｃａｓタンパク質をガイドＲＮＡに相補的である部位で二本鎖ＤＮＡを標識または切断するようプログラムすることが可能になる。
【００７３】
好ましくは、本発明のリボ核タンパク質複合体中の少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子の長さは、３５から１３５残基の範囲、任意選択で、３５から１３４残基、３５から１３３残基、３５から１３２残基、３５から１３１残基、３５から１３０残基、３５から１２９残基、３５から１２８残基、３５から１２７残基、３５から１２６残基、３５から１２５残基、３５から１２４残基、３５から１２３残基、３５から１２２残基、３５から１２１残基、３５から１２０残基、３５から１１９残基、３５から１１８残基、３５から１１７残基、３５から１１６残基、３５から１１５残基、３５から１１４残基、３５から１１３残基、３５から１１２残基、３５から１１１残基、３５から１００残基、３５から１０９残基、３５から１０８残基、３５から１０７残基、３５から１０６残基、３５から１０５残基、３５から１０４残基、３５から１０３残基、３５から１０２残基、３５から１０１残基、３５から１００残基、３５から９９残基、３５から９８残基、３５から９７残基、３５から９６残基、３５から９５残基、３５から９４残基、３５から９３残基、３５から９２残基、３５から９１残基、３５から９０残基、３５から８９残基、３５から８８残基、３５から８７残基、３５から８６残基、３５から８５残基、３５から８４残基、３５から８３残基、３５から８２残基、３５から８１残基、３５から８０残基、３５から７９残基、３５から７８残基、３５から７７残基、３５から７６残基、３５から７５残基、３５から７４残基、３５から７３残基、３５から７２残基、３５から７１残基、３５から７０残基、３５から６９残基、３５から６８残基、３５から６７残基、３５から６６残基、３５から６５残基、３５から６４残基、３５から６３残基、３５から６２残基、３５から６１残基、３５から６０残基、３５から５９残基、３５から５８残基、３５から５７残基、３５から５６残基、３５から５５残基、３５から５４残基、３５から５３残基、３５から５２残基、３５から５１残基、３５から５０残基、３５から４９残基、３５から４８残基、３５から４７残基、３５から４６残基、３５から４５残基、３５から４４残基、３５から４３残基、３５から４２残基、３５から４１残基、３５から４０残基、３５から３９残基、３５から３８残基、３５から３７残基、３５から３６残基、または３５残基の範囲である。好ましくは、少なくとも１つのＲＮＡ分子の長さは、３６から１７４残基、３７から１７３残基、３８から１７２残基、３９から１７１残基、４０から１７０残基、４１から１６９残基、４２から１６８残基、４３から１６７残基、４４から１６６残基、４５から１６５残基、４６から１６４残基、４７から１６３残基、４８から１６２残基、４９から１６１残基、５０から１６０残基、５１から１５９残基、５２から１５８残基、５３から１５７残基、５４から１５６残基、３６から７４残基、３７から７３残基、３８から７２残基、３９から７１残基、４０から７０残基、４１から６９残基、４２から６８残基、４３から６７残基、４４から６６残基、４５から６５残基、４６から６４残基、４７から６３残基、４８から６２残基、４９から６１残基、５０から６０残基、５１から５９残基、５２から５８残基、５３から５７残基、５４から５６残基の範囲である。
【００７４】
好ましい態様では、本発明は、少なくとも１つのＲＮＡ分子の相補的部分が少なくとも３０残基長である、リボ核タンパク質複合体を提供する。代わりに、少なくとも１つのＲＮＡ分子の相補的部分は、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４または７５残基長でもよい。
【００７５】
ターゲティングＲＮＡ分子は、好ましくは、標的核酸配列に対する高い特異性および親和性を必要とすることになる。未変性ゲル電気泳動、または代わりに等温滴定熱量測定、表面プラズモン共鳴、もしくは蛍光ベースの滴定法により決定することができる場合、１μＭから１ｐＭ、好ましくは１ｎＭから１ｐＭ、より好ましくは１〜１００ｐＭの範囲の解離定数（Ｋｄ）が望ましい。親和性は、ゲル遅延度アッセイとも呼ばれる電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を使用して決定してもよい（Semenova et al. (2011) PNAS 108: 10098-10103参照）。
【００７６】
ターゲティングＲＮＡ分子は、好ましくは、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子として原核生物の性質から分かっていることに合わせて作られる。ｃｒＲＮＡ分子の構造はすでに確立されており、Jore et al., 2011, Nature Structural & Molecular Biology 18: 529-537でさらに詳細に説明されている。手短に言えば、Ｉ−Ｅ型の成熟ｃｒＲＮＡは、多くの場合、６１ヌクレオチド長であり、８ヌクレオチドの５’「ハンドル」領域、３２ヌクレオチドの「スペーサー」配列、およびテトラヌクレオチドループを有するヘアピンを形成する２１ヌクレオチドの３’配列からなる（図５）。Ｉ型系はＩＩ型（Ｃａｓ９）とは異なり、異なる系の詳細はVan der Oost 2014 Nat Rev Micr 12: 479-492に記載されている。ＩＩ型（Ｃａｓ９）系には異なるプロセシング機構が存在しており、第２のＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）および２つのリボヌクレアーゼを利用している。ヘアピンよりはむしろ、ＩＩ型中の成熟ｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡの断片に結合したままである（図５）。しかし、本発明で使用されるＲＮＡは、長さであれ、領域であれまたは特定のＲＮＡ配列であれ、天然に存在するｃｒＲＮＡの設計に厳密に合わせて設計する必要はない。しかし、明白なのは、本発明で使用するためのＲＮＡ分子は、公開データベース中のまたは新たに発見された遺伝子配列情報に基づいて設計され、次に、例えば、化学合成により全体をまたは部分を人工的に作ってもよいことである。本発明のＲＮＡ分子は、遺伝的に改変された細胞または無細胞発現系での発現のために設計および作製されてもよく、この選択肢にはＲＮＡ配列の一部または全部の合成が含まれてもよい。
【００７７】
ＩＩ型（Ｃａｓ９）中のｃｒＲＮＡの構造および必要条件もJinek et al., 2012 ibidに記載されている。Ｉ型には、スペーサー配列の５’末端を形成し、そこの５’で８ヌクレオチドの５’ハンドルと隣接しているいわゆる「シード（SEED）」部分が存在する。Semenova et al. (2011, PNAS 108: 10098-10103)は、シード配列のすべての残基が標的配列に相補的であるはずであるが、６位の残基ではミスマッチが許容されうることを見いだした（図５）。ＩＩ型には、スペーサーの３’末端に位置している１０〜１２ヌクレオチドのシードが存在する（図５）（Van der Oost 2014 ibid.により概説されている）。同様に、標的遺伝子座（すなわち、配列）に向けられている本発明のリボ核タンパク質複合体のＲＮＡ成分を設計し作る場合、ＩＩ型シード配列についての必要なマッチおよびミスマッチルールを適用することが可能である。
【００７８】
したがって、本発明は、標的核酸分子において単一塩基変化を検出するおよび／または位置付ける方法であって、核酸試料を上文に記載される本発明のリボ核タンパク質複合体と、または上文に記載される本発明のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチドおよび別のターゲティングＲＮＡ成分と接触させることを含み、ターゲティングＲＮＡの配列（リボ核タンパク質複合体中にある場合を含めて）は、例えば、８ヌクレオチド残基の連続する配列の６位での単一塩基変化に基づいて正常対立遺伝子と突然変異対立遺伝子を区別するようになっている、方法を含む。
【００７９】
特定の理論に縛られたくはないが、本発明のリボ核タンパク質複合体のターゲティングＲＮＡ成分の調製に使用してもよいデザインルールは、二本鎖標的ポリヌクレオチドにいわゆる「ＰＡＭ」（プロトスペーサー隣接モチーフ）配列を含む。大腸菌（E. coli）のＩ−Ｅ型系において、ＰＡＭ配列は、５’−ＣＴＴ−３’、５’−ＣＡＴ−３’、５’−ＣＣＴ−３’、５’−ＣＡＣ−３’、５’−ＴＴＴ−３’、５’−ＡＴＴ−３’、および５’−ＡＷＧ−３’などのヌクレオチド残基の保存されたトリプレットとすることができ、ＷはＡ、ＴまたはＵである。Ｉ型では、標的鎖に位置しているＰＡＭ配列は、通常、シードの５’に対応する位置にある。しかし、ＩＩ型では、ＰＡＭは、シードの３’に対応する位置で、ｃｒＲＮＡスペーサーの３’末端に近い置換または非標的鎖上のもう一方の末端に位置している（図５）（Jinek et al., 2012, op. cit.）。化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９では、ＰＡＭ配列は保存された対のヌクレオチド残基、５’−ＮＧＧ−３’を有する。最近、異なるＣａｓ９変異体（ＩＩＡ型およびＩＩＣ型）（Ran et al., 2015 Nature 520:186-191）−図１Ａ）が特徴付けられ、ＰＡＭが明らかにされた（Ran et al., 2015, ibid.参照−図１Ｃ）。現在確立されているＣａｓ９  ＰＡＭは、ＩＩＡ型５’−ＮＧＧＮＮＮＮ−３’（化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes））、５’−ＮＮＧＴＮＮＮ−３’（ストレプトコッカス・パスツリアヌス（Streptococcus pasteurianus））、５’−ＮＮＧＧＡＡＮ−３’（ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus））、５’−ＮＮＧＧＧＮＮ−３’（黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus））、およびＩＩＣ型５’−ＮＧＧＮＮＮＮ−３’（ジフテリア菌（Corynebacterium difteriae））、５’−ＮＮＧＧＧＴＮ−３’（カンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari））、５’−ＮＮＮＣＡＴＮ−３’（パルビバクラム・ラバメンティボランス（Parvobaculum lavamentivorans））、５’−ＮＮＮＮＧＴＡ−３’（ナイセリア・シネレア（Neiseria cinerea））を含む。ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２のＣａｓ９（本発明）はＩＩＣ型に属する（Ran et al., 2015, ibid.）。本発明者は、驚くべきことに、本発明により使用するためのＰＡＭ配列の選択により、本発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチドが標的配列と相互作用する温度に、影響を及ぼすことができるということを見いだした。特に、本発明者は、標的配列の３’末端の後の５位にシトシン、および／または８位にアデニンを有する、８ｍｅｒのＰＡＭ配列が、幅広い温度範囲にわたり、活性を付与するのに好ましいことを見いだした。プロトスペーサー配列の３’末端の後の、ＰＡＭ配列の１位、２位、３位、４位および／または６位にシトシンが存在することがやはり好ましい。
【００８０】
特定の態様では、幅広い温度範囲、例えば２０℃から１００℃、２０℃から８０℃、３０から８０℃、２０℃から７０℃または２５℃から６５℃の幅広い温度範囲内での、標的配列との相互作用は、５’−ＮＮＮＮＣＶＡＡ−３’［配列番号４８］のＰＡＭ配列を利用することにより実現することができる。最初の４つのＰＡＭ位が、特に好ましいわけではない。したがって、最初の４つのヌクレオチドは、任意のヌクレオチド（ＮＮＮＮ）であることが好都合とすることができる。好ましくは、このような幅広い温度範囲内での標的配列との相互作用は、５’−ＮＮＮＮＣＳＡＡ−３’［配列番号４９］であるＰＡＭ配列を利用することにより行うことができる。最適には、ＰＡＭは、配列５’−ＮＮＮＮＣＧＡＡ−３’［配列番号５０］または５’−ＮＮＮＮＣＣＡＡ−３’［配列番号５１］とすることができる。
【００８１】
標的配列との相互作用が、≧３０℃、例えば、３０℃から１００℃で、好ましくは、３０℃から７０℃、３０℃から６５℃、または４５℃から６５℃の範囲で必要となる場合、ＰＡＭ配列は、最適には、配列５’−ＮＮＮＮＣＮＡＡ−３’［配列番号５２］または５’−ＮＮＮＮＣＭＣＡ−３’［配列番号５３］とすることができる。最初の４つのＰＡＭ位が、特に好ましいわけではない。したがって、最初の４つのヌクレオチドは、任意のヌクレオチド（ＮＮＮＮ）であるのが好都合とすることができる。任意選択で、例えば、ＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＣＣＣＮＡＡ−３’または５’−ＣＣＣＣＣＭＣＡ−３’とすることができる。任意選択で、例えば、ＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＣＣＣＡＡＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＡＴＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＡＧＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＡＣＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＴＡＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＴＴＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＴＧＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＴＣＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＧＡＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＧＴＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＧＧＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＧＣＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＣＡＡ−３’［配列番号１１］、５’−ＣＣＣＣＣＣＴＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＣＧＡ−３’、または５’−ＣＣＣＣＣＣＣＡ−３’から選択することができる。
【００８２】
本発明の実施形態では、ターゲティングＲＮＡ分子は３５〜２００残基の範囲の長さを有していてもよい。好ましい実施形態では、ＲＮＡのうち所望の核酸配列に相補的であり、これを標的にするために使用される部分は１５から３２残基長である。天然に存在するｃｒＲＮＡの文脈では、これは、例えば、Semenova et al. (2011 ibid.)の図１に示されているスペーサー部分と一致する。
【００８３】
本発明のリボ核タンパク質複合体は、ＤＮＡ標的配列に実質的な相補性を有するＲＮＡ配列の５’にＣＲＩＳＰＲ繰り返しに由来する８残基を含むターゲティング成分を有していてもよい。ＤＮＡ標的配列に相補性を有するＲＮＡ配列は、スペーサー配列であるｃｒＲＮＡの文脈で一致すると理解される。ＲＮＡの５’隣接配列は、例えば、Semenova et al. (2011 ibid.)の図１に示されているように、ｃｒＲＮＡの５’ハンドルに一致すると見なされるであろう。
【００８４】
本発明のリボ核タンパク質複合体は、ＤＮＡ標的配列に相補性を有するターゲティングＲＮＡ配列の３’に、すなわち、例えば、Semenova et al. (2011 ibid.)の図１に示されているように、ｃｒＲＮＡ中のスペーサー配列に隣接する３’ハンドルに一致するものの３’にヘアピンおよびテトラヌクレオチドループ形成配列を有していてもよい。
【００８５】
特定の理論に縛られたくはないが、好ましいリボ核タンパク質複合体および二本鎖標的ポリヌクレオチドにおいて、リボ核タンパク質複合体のターゲティングＲＮＡと対合しない非標的核酸鎖は、５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］、５’−ＣＮＮＮＣＮＮ−３’、５’−ＮＮＮＣＣＮＮ−３’、５’−ＮＮＣＮＣＮＮ−３’、５’−ＮＮＮＮＣＣＮ−３’および５’−ＮＣＮＮＣＮＮ−３’のうちの１つまたは複数から選択される、直接３’隣接ＰＡＭ配列を含むことができる。任意選択で、例えば、ＰＡＭ配列は、５’−ＮＮＮＮＣ−３’、５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］、５’−ＣＮＮＮＣ−３’、５’−ＣＮＮＮＣＮＮＡ−３’、５’−ＮＣＮＮＣ−３’、５’−ＮＣＮＮＣＮＮＡ−３’、５’−ＮＮＣＮＣ−３’、５’−ＮＮＣＮＣＮＮＡ−３’、５’−ＮＮＮＣＣ−３’、５’−ＮＮＮＣＣＮＮＡ−３’、５’−ＮＮＮＮＣＣ−３’、５’−ＮＮＮＮＣＣＮＡ−３’、５’−ＣＣＮＮＣ−３’、５’−ＣＣＮＮＣＮＮＡ−３’、５’−ＣＮＣＮＣ−３’、５’−ＣＮＣＮＣＮＮＡ−３’、５’−ＣＮＮＣＣＮ−３’、５’−ＣＮＮＣＣＮＮＡ−３’、５’−ＣＮＮＮＣＣ−３’、５’−ＣＮＮＮＣＣＮＡ−３’、５’−ＣＣＣＮＣＮ−３’、５’−ＣＣＣＮＣＮＮＡ−３’、５’−ＣＣＮＣＣＮ−３’、５’−ＣＣＮＣＣＮＮＡ−３’、５’−ＣＣＮＮＣＣ−３’、５’−ＣＣＮＮＣＣＮＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣ−３’［配列番号１２］、５’−ＣＣＣＣＣＮＮＡ−３’［配列番号１３］、５’−ＣＣＣＣＣＣ−３’［配列番号１４］、５’−ＣＣＣＣＣＣＮＡ−３’［配列番号１０］、５’−ＮＣＣＮＣ−３’、５’−ＮＣＣＮＣＮＮＡ−３’、５’−ＮＣＣＣＣ−３’、５’−ＮＣＣＣＣＮＮＡ−３’、５’−ＮＣＣＣＣＣ−３’［配列番号１５］、５’−ＮＣＣＣＣＣＮＡ−３’［配列番号１６］、５’−ＮＮＣＣＣ−３’、５’−ＮＮＣＣＣＮＮＡ−３’、５’−ＮＮＣＣＣＣ−３’、５’−ＮＮＣＣＣＣＮＡ−３’、５’−ＮＮＮＣＣＣ−３’、および５’−ＮＮＮＣＣＣＮＡ−３’から選択することができる。ＰＡＭ配列は、５’−ＣＮＣＣＣＣＡＣ−３’［配列番号１７］、５’−ＣＣＣＣＣＣＡＧ−３’［配列番号１８］、５’−ＣＣＣＣＣＣＡＡ−３’［配列番号１１］、５’−ＣＣＣＣＣＣＡＴ−３’［配列番号１９］、５’−ＣＣＣＣＣＣＡＣ−３’［配列番号２０］、５’−ＡＴＣＣＣＣＡＡ−３’［配列番号２１］、または５’−ＡＣＧＧＣＣＡＡ−３’［配列番号２２］とすることができる。好ましくは、ＰＡＭ配列は、配列５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］となろう。しかし、ヌクレオチドの他の組合せを所望の用途、および／またはＣａｓタンパク質もしくはポリペプチドの濃度に応じて使用してもよいことは認識されている。特に、最初の４つのＰＡＭ位が、特に好ましいわけではない。したがって、最初の４つのヌクレオチドは、任意のヌクレオチド（ＮＮＮＮ）であることが好都合となり得る。これらの配列は、天然に存在するｃｒＲＮＡの文脈で「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「ＰＡＭ」と呼ばれているものと一致している。ＩＩＣ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系では、これらのＰＡＭ配列は、天然系標的でも、したがって好ましくは本発明に従ったＲＮＡでも、標的配列に対するｃｒＲＮＡの高度な特異性を保証するために、そのｄｓＤＮＡ標的とのＣａｓｃａｄｅ／ｃｒＲＮＡ複合体の安定な相互作用を促進する。好ましくは、プロトスペーサーに直接隣接する配列は、５’−ＮＮＮＣＡＴＮ−３’ではないであろう。
【００８６】
さらに、ＰＡＭ配列は、配列５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］、例えば５’−ＮＮＮＮＣＮＡＡ−３’［配列番号５２］、または５’−ＮＮＮＮＣＭＣＡ−３’［配列番号５３］とすることができる。
【００８７】
中温性ＳｐＣａｓ９が限定される１つは、それが、２５と４４℃の間でしか活性を示さないことである。これらの温度より高いと、ＳｐＣａｓ９活性は、非検出可能レベルまで、急速に低下する（Mougiakos et al., 2017, ACS Synth Biol. 6: 849-861）。中温オルソログＳｐＣａｓ９が２５〜４４℃の範囲であることと対照的に、本発明のＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、２０〜７０℃とかなり幅広い温度範囲で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性である。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性の延長および安定性により、２０〜７０℃の温度においてＤＮＡ操作を必要とする、分子生物学技法におけるその応用、および強固な酵素活性を必要とする過酷な環境でのその実施が可能となる。したがって、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９はまた、ヒト細胞のためのゲノム編集ツールとして使用することができる。任意選択で、前記ヒト細胞は、胚性幹細胞ではないであろう。
【００８８】
幅広い機能温度活性範囲を有する、すなわち低温および高温の両方において、例えば、２０℃と７０℃、または２０℃と６５℃、または２５℃と６５℃の両方で機能があることに加え、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、ターゲティング切断または結合を可能にする温度範囲、またはＴｈｅｒｍｏＣａｓ９もしくは関連エレメント（例えば、ｓｇＲＮＡまたはｔｒａｃＲＮＡなど）の構造的特徴を改変することにより、標的化切断または結合が効率的に行われる温度範囲を操作する能力により、核酸配列操作にわたり一層高いレベルの制御を行うことが可能となる。しかし、これまで、特定の温度において、Ｃａｓ９活性の分子決定因子に関してほとんど知られていなかった。
【００８９】
発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の熱安定性を付与するために重要ないくつかの因子を特定し、その１つは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のＰＡＭ優先性である。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のＰＡＭ優先性は、温度範囲（≦３０℃）の低い方の部分で活性に対して非常に厳密である一方、ＰＡＭの多数の変化が、中温から最適温度（３７℃から６０℃）において、活性となり得る。したがって、ＰＡＭ配列が改変されて、所与の温度において、標的物の最も効率的な結合、切断、標識または改変を得ることができる。これは、特定の用途に応じて、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の用途に、非常に大きな適応性をもたらす。例えば、一部の用途では、標的結合、切断、標識または改変の非常に幅広い温度範囲、例えば、２０℃から７０℃、好ましくは２０℃から６５℃または２５℃から６５℃が望ましいものとなり得る。このような幅広い温度範囲内での標的配列の結合、切断、標識または改変は、５’−ＮＮＮＮＣＶＡＡ−３’［配列番号４８］であるＰＡＭ配列を利用することにより行うことができる。好ましくは、このような幅広い温度範囲内での標的配列の結合、切断、標識または改変は、５’−ＮＮＮＮＣＳＡＡ−３’［配列番号４９］、例えば５’−ＮＮＮＮＣＧＡＡ−３’［配列番号５０］または５’−ＮＮＮＮＣＣＡＡ−３’［配列番号５１］であるＰＡＭ配列を利用することにより行うことができる。最初の４つのＰＡＭ位が、特に好ましいわけではない。したがって、最初の４つのヌクレオチドは、任意のヌクレオチド（ＮＮＮＮ）であることが好都合となり得る。任意選択で、例えば、５’−ＣＣＣＣＣＧＡＡ−３’または５’−ＣＣＣＣＣＣＡＡ−３’［配列番号１１］。
【００９０】
標的物の結合、切断、標識または改変は、≧３０℃、例えば、３０℃から１００℃で、好ましくは、３０℃から７０℃、３０℃から６５℃、または４５℃から６５℃の範囲で必要な場合、ＰＡＭ配列は、最適には、配列５’−ＮＮＮＮＣＮＡＡ−３’［配列番号５２］または５’−ＮＮＮＮＣＭＣＡ−３’［配列番号５３］とすることができる。最初の４つのＰＡＭ位が、特に好ましいわけではない。したがって、最初の４つのヌクレオチドは、任意のヌクレオチド（ＮＮＮＮ）であることが好都合となり得る。任意選択で、例えば、ＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＣＣＣＮＡＡ−３’または５’−ＣＣＣＣＣＭＣＡ−３’とすることができる。任意選択で、例えば、ＰＡＭ配列は、５’−ＣＣＣＣＣＡＡＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＡＴＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＡＧＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＡＣＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＴＡＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＴＴＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＴＧＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＴＣＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＧＡＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＧＴＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＧＧＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＧＣＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＣＡＡ−３’［配列番号１１］、５’−ＣＣＣＣＣＣＴＡ−３’、５’−ＣＣＣＣＣＣＧＡ−３’、または５’−ＣＣＣＣＣＣＣＡ−３’から選択することができる。
【００９１】
本明細書で提供される本発明のＰＡＭ配列は、例えば、６ｍｅｒ、７ｍｅｒまたは８ｍｅｒの配列として、本明細書に開示される配列を含む。６ｍｅｒ、７ｍｅｒまたは８ｍｅｒの配列は、非標的鎖上のプロトスペーサー配列の３’で直接、始まってもよく、標的ＲＮＡにより結合したプロトスペーサー配列に相補的なプロトスペーサー配列と、ＰＡＭ配列の５’末端との間に間隔を置いた追加の核酸は存在しない。しかし、６ｍｅｒ、７ｍｅｒまたは８ｍｅｒの配列の３’末端における、ＰＡＭ配列の部分を形成する追加の核酸が存在してもよいことが認識されよう。さらにまたは代替的に、非標的鎖は、ＰＡＭ配列の追加の核酸３’を含むことができる。
【００９２】
本発明の核タンパク質複合体は、本発明のリボ核タンパク質複合体、および該リボ核タンパク質が会合する核酸の標的核酸鎖を含むことができる。
【００９３】
結合、切断、標識および改変の温度
活性、例えば本発明のＣａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性の最適温度範囲を含めた、温度範囲は、既知のＣａｓ９タンパク質の温度範囲よりもかなり高い。同様に、活性を維持する範囲の高い側の程度は、既知のＣａｓ９タンパク質のそれよりもかなり高い。最適温度および機能範囲がより高いことにより、高温での遺伝子工学に大きな利点をもたらす。したがって、本発明の方法、使用、核タンパク質および形質転換ヒト細胞は、高温でゲノム編集に有用となり得る。非標的鎖のプロトスペーサー配列に直接隣接する本発明のＰＡＭ配列が存在することにより、標的配列に対するＣａｓタンパク質およびポリペプチドの特異性が改善され、より高い温度において、およびより大きな機能的温度範囲にわたり、Ｃａｓタンパク質およびポリペプチドの使用を支持する。
【００９４】
かなり大きな熱安定性により、本発明のＣａｓタンパクは、既知のＣａｓ９タンパク質の温度範囲よりもかなり大きな温度範囲にわたり、機能、例えばヌクレアーゼ活性を保持する。同様に、活性を維持する、範囲の高い側の程度は、既知のＣａｓ９タンパク質のそれよりもかなり高い。最適温度および機能範囲がより高いことにより、高温での遺伝子工学、したがって、高温でのヒト細胞のゲノムの編集に大きな利点をもたらす。任意選択で、胚性幹細胞の操作を含まない。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性および安定性の延長により、例えば、２０〜７０℃の幅広い温度範囲内でＤＮＡ操作を必要とする、分子生物学技法におけるその応用、および強固な酵素活性を必要とする過酷な環境でのその実施が可能となる。
【００９５】
有利には、本発明者らはまた、本発明のＣａｓタンパク質は、標的配列に配列特異的に結合することによって、標的配列の直接的な転写制御、例えば、サイレンシング転写に使用することもできることを示す。したがって、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９はまた、ヒト細胞において、例えば、標的遺伝子のサイレンシングまたは活性転写において、転写制御ツールとして使用することもできる。したがって、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９はまた、ヒト細胞における、遺伝子−サイレンシングツールとして使用することもできる。任意選択で、本発明のＣａｓタンパク質は、胚性幹細胞に使用されない。任意選択で、本発明のＣａｓタンパク質は、ヒトの生殖細胞系遺伝的同一性の改変に使用されない。
【００９６】
有利には、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、２０℃から１００℃までの温度で、核酸の結合、切断、標識または改変が可能であるが、高温で、例えば、４１℃と１２２℃の間の温度、好ましくは５０℃と１００℃の間の温度で、特に有用である。本発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび合成核酸に結合する、これを切断する、標識するまたは改変することが可能である。本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、例えば、２０℃から５０℃までの範囲の温度で、ヌクレアーゼ活性、遺伝子編集および核酸標識の用途に関する操作性をやはり実現することができる。
【００９７】
温度範囲が、本明細書に含まれている場合、開示されている温度範囲に端点が含まれる、すなわちこの範囲を「含む」ことが意図される。例えば、２０℃と１００℃の間の範囲の温度で活性があると明記する場合、２０℃と１００℃の温度が、前記範囲に含まれる。
【００９８】
好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、結合される、切断される、標識されるまたは改変されるポリヌクレオチド分子の標的配列を認識する、好適なｇＲＮＡ（ターゲティングＲＮＡ分子とも呼ばれる、ガイドＲＮＡ）と会合する場合、２０℃から１００℃の範囲、任意選択で２０℃から７０℃、２０℃から６５℃、２５℃から７０℃、２５℃から６５℃、５５℃から１００℃、５０℃から７０℃、５５℃から７０℃、または５５℃から６５℃の範囲の温度において、上記のことを行う。
【００９９】
好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、結合される、切断される、標識されるまたは改変されるポリヌクレオチド分子の標的配列を認識する、好適なｇＲＮＡ（ターゲティングＲＮＡ分子とも呼ばれる、ガイドＲＮＡ）と会合する場合、５０℃から１００℃、任意選択で５５℃から１００℃、６０℃から１００℃、６５℃から１００℃、７０℃から１００℃、７５℃から１００℃、８０℃から１００℃、８５℃から１００℃、９０℃から１００℃、９５℃から１００℃の範囲の温度において、上記のことが行われる。より好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質は、５１℃から９９℃、５２℃から９８℃、５３℃から９７℃、５４℃から９６℃、５５℃から９５℃、５６℃から９４℃、５７℃から９３℃、５８℃から９２℃、５９℃から９１℃、６０℃から９０℃、６１℃から８９℃、６２℃から８８℃、６３℃から８７℃、６４℃から８６℃、６５℃から８５℃、６６℃から８４℃、６７℃から８３℃、６８℃から８２℃、６９℃から８１℃、７０℃から８０℃、７１℃から７９℃、７２℃から７８℃、７３℃から７７℃、７４℃から７６℃の範囲の温度で、または７５℃の温度において、核酸を切断、標識または改変する。好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質は、６０℃から８０℃、６１℃から７９℃、６２℃から７８℃、６３℃から７７℃、６４℃から７６℃、６０℃から７５℃、６０℃から７０℃の範囲の温度で、核酸に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する。最適には、本発明のＣａｓタンパク質は、６０℃から６５℃の範囲の温度で、好ましくは６５℃で核酸に結合する、核酸を切断する、標識するまたは改変する。
【０１００】
標的ＲＮＡ分子は、本発明のＣａｓタンパク質およびポリペプチドと共に使用するよう設計することができ、標的ＲＮＡ分子は、標的鎖における標的配列に結合し、非標的鎖は、プロトスペーサー配列の直後の３’の本明細書に提供されるＰＡＭ配列をさらに含む。ＰＡＭ配列は、５’−ＮＮＮＮＮＮＮＡ−３’、好ましくは５’−ＮＮＮＮＣＮＮＡ−３’［配列番号４７］、任意選択で、例えば５’−ＣＣＣＣＣＣＮＡ−３’［配列番号１０］または５’−ＣＣＣＣＣＣＡＡ−３’［配列番号１１］を含み、本発明の使用、方法、形質転換細胞および核タンパク質は、５５℃から６５℃の温度範囲、好ましくは５０℃から７０℃、４０℃から６５℃、４５℃から７５℃、３７℃から７８℃、および／または２０℃から８０℃の温度範囲にわたる、標的鎖への結合、この切断、標識および／または改変を実現することができる。
【０１０１】
ＰＡＭ配列が改変されて、所与の温度において、標的物の最も効率的な切断を得ることができる。これは、特定の用途に応じて、本発明のＣａｓタンパク質の適用に、非常に大きな適応性をもたらす。結合、切断、標識または改変活性、例えば切断活性が、２０℃から１００℃、好ましくは２０℃から７０℃、または２０℃から６５℃、または２５℃から６５℃の温度範囲において必要な場合、活性は、５’−ＮＮＮＮＣＶＡＡ−３’［配列番号４８］となるＰＡＭ配列を利用することにより実現することができ、好ましくは、このような温度範囲内の活性は、５’−ＮＮＮＮＣＳＡＡ−３’［配列番号４９］、例えば５’−ＮＮＮＮＣＧＡＡ−３’［配列番号５０］または５’−ＮＮＮＮＣＣＡＡ−３’［配列番号５１］となるＰＡＭ配列を利用することにより実現することができる。任意選択で、例えば、５’−ＣＣＣＣＣＧＡＡ−３’［配列番号５２］または５’−ＣＣＣＣＣＣＡＡ−３’［配列番号１１］。
【０１０２】
発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の熱安定性は、ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の会合と共に増大して、リボ核タンパク質複合体を形成することを見いだした。ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡを好適に含むことができる。このような配置では、ガイドは、ヌクレオチドスペーサー断片および繰り返し断片を含むｃｒＲＮＡを好適に含むことができる。ｃｒＲＮＡは、長さが１７〜２０ｎｔであるのが好適となり得る。任意選択で、ｃｒＲＮＡは、長さが１７ｎｔとすることができる。代替的に、ｃｒＲＮＡは、長さが１８ｎｔ、長さが１９ｎｔまたは長さが２０ｎｔとすることができる。ガイドはまた、ｔｒａｃｒＲＮＡ（抗繰り返し断片（ｃｒＲＮＡの繰り返し断片との対合塩基））を含むことができる。ｔｒａｃｒＲＮＡおよびｃｒＲＮＡは、合成リンカーによって分離され得る。以下のガイドが、好ましい配置：５’−［ｃｒＲＮＡ（１７〜２０ヌクレオチドスペーサー−断片および繰り返し断片）−（任意選択：２つのＲＮＡを連結する合成ループ）−ｔｒａｃｒＲＮＡ（抗繰り返し断片（ｃｒＲＮＡの繰り返し断片との対合塩基）および一部の可変ステムループ構造（以下に示されているものに関する）、これは、一部の系では、ある程度、トランケートされていてもよい）］−３’ を表す。
【０１０３】
通常、ｔｒａｃｒＲＮＡは、例えば、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡを含む、キメラ単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の一部として提供されるであろう。ｔｒａｃｒＲＮＡは、抗繰り返し領域、その後の１つまたは複数のヘアピン構造、好ましくは２つ以上のヘアピン構造、またはより好ましくは３つ以上のヘアピン構造からなることができる。スペーサー遠位終端において、（４−ヌクレオチドリンカー、例えば５’−ＧＡＡＡ−３’によって融合された合成ｓｇＲＮＡキメラにおける、相補的であるｔｒａｃｒＲＮＡ部分（抗繰り返し）のｃｒＲＮＡ部分（繰り返し）の３’末端、およびその５’末端により形成された）完全長繰り返し／抗繰り返しヘアピンの存在は、ヌクレアーゼへのアンカーとして機能するが、標的選択および切断活性に必須ではない。例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分の最大で５０ｎｔ長の欠失のスペーサー遠位末端における欠失は、ＤＮＡ切断効率に及ぼす効果はほとんどまたは全くなしに許容され得る。したがって、完全長繰り返し−抗繰り返しヘアピンのスペーサー遠位終端の欠失は、標的ＤＮＡ切断効率に関して妥協点なしに、最大で５０ｎｔ、最大で４５ｎｔ、最大で４０ｎｔ、最大で３５ｎｔ、最大で３０ｎｔ、最大で２５ｎｔ、最大で２０ｎｔ、最大で１５ｎｔ、最大で１０ｎｔ、または最大で５ｎｔまで作製することができる。
【０１０４】
驚いたことに、発明者らは、ｔｒａｃｒＲＮＡの構造が、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の熱安定性、および活性、特に切断活性の効率に影響を及ぼすことも見いだした。具体的には、所与の温度における、標的物の最も効率的な結合、切断、標識または改変を得るため、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡにおけるヘアピン（または、ステムループ）構造の数を修正することができる。これは、特定の用途に応じて、本発明のＣａｓタンパク質の適用に、非常に大きな適応性をもたらす。任意選択で、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のステムループ構造、２つ以上のステムループ構造、または３つ以上のステムループ構造を形成することができる、核酸配列を含んで提供され得る。任意選択で、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡは、１つまたは複数のステムループ構造、２つ以上のステムループ構造、または３つ以上のステムループ構造を形成するよう配列された、核酸配列を含んで提供され得る。好ましくは、ｓｇＲＮＡは、少なくとも３つのステムループ構造を形成することができる、核酸配列を含んで提供されよう。
【０１０５】
任意選択で、活性物に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する、例えば、切断活性は、２０℃から６０℃、好ましくは３７℃から６０℃、または３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃または６０℃の温度範囲内で必要とされる場合、活性は、１つまたは複数のステムループ構造を形成することが可能な、ｓｇＲＮＡ配列を利用することにより実現することができる。
【０１０６】
任意選択で、活性物に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する、例えば、切断活性は、２０℃から６５℃、好ましくは３７℃から６５℃、より好ましくは４５℃から５５℃、または３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃または６０℃の温度範囲内で必要とされる場合、活性は、２つ以上のステムループ構造を形成することが可能な、ｓｇＲＮＡ配列を利用することにより実現することができる。
【０１０７】
任意選択で、活性物に結合する、これを切断する、標識するまたは改変する、例えば、切断活性は、２０℃から１００℃、好ましくは２０℃から７０℃、より好ましくは３７℃から６５℃または３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃の温度範囲内で必要とされる場合、活性は、３つ以上のステムループ構造を形成することが可能な、ｓｇＲＮＡ配列を利用するにより実現することができる。
【０１０８】
好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡに対応するｓｇＲＮＡの一部は、５’ヘアピンを例示する、配列；ＡＡＧＧＧＣＵＵＵＣＵＧＣＣＵＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＵＧＣＣＣ［配列番号５４］を含むであろう。好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡに対応するｓｇＲＮＡの部分は、「ミドル」ヘアピンを例示する、配列；ＧＵＧＧＣＧＵＵＧＧＧＧＡＵＣＧＣＣＵＡＵＣＧＣＣ［配列番号５５］をさらに含むであろう。好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡに対応するｓｇＲＮＡの部分は、３’ヘアピンを例示する、配列；ＣＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＧＣＡＵＵＣＣＣＣＡＣＵＣＵＵＡＧＧＣＧＵＵＵＵ［配列番号５６］をさらに含むであろう。
【０１０９】
好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡに対応するｓｇＲＮＡの部分は、配列；ＡＡＧＧＧＣＵＵＵＣＵＧＣＣＵＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＵＧＣＣＣＧＵＧＧＣＧＵＵＧＧＧＧＡＵＣＧＣＣＵＡＵＣＧＣＣ［配列番号５７］を含み、すなわち５’ヘアピンおよびミドルを含むであろう。好ましくは、ｔｒａｃｒＲＮＡに対応するｓｇＲＮＡの部分は、配列；
ＡＡＧＧＧＣＵＵＵＣＵＧＣＣＵＡＵＡＧＧＣＡＧＡＣＵＧＣＣＣＧＵＧＧＣＧＵＵＧＧＧＧＡＵＣＧＣＣＵＡＵＣＧＣＣＣＧＣＵＵＵＣＵＵＣＧＧＧＣＡＵＵＣＣＣＣＡＣＵＣＵＵＡＧＧＣＧＵＵＵＵ［配列番号５８］を含むことができ、すなわち、５’ヘアピン、ミドルヘアピンおよび３’ヘアピンを含む。
【０１１０】
発明者らは、ｔｒａｃｒＲＮＡ足場の予測されたステムループの数が、特に高温において、ＤＮＡ切断に重大な役割を果たすことを発見した。本発明者らは、３つのループすべてが存在する場合、ｔｒａｃｒＲＮＡ足場の３つのステムループの存在は、切断活性に必須ではないが、切断は、この範囲の温度すべてにおいて最も効率的であることを決定し、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡは、高温において、最適なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくＤＮＡ切断に必要であることを示している。対照的に、３‘ヘアピンの除去により、切断効率の低下がもたらされる。さらに、本発明者らは、ミドルヘアピンと３‘ヘアピンの両方を除去すると、特に、機能的温度範囲の高い方の端と低い方の端において、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の切断効率の劇的な低下がもたらされることを見いだした。好ましくは、標的配列の結合、切断、標識または改変は、高温、例えば４５℃から１００℃、５０℃から１００℃、５０℃から７０℃、５０℃から６５℃、５５℃から６５℃、または２０℃から１００℃、２０℃から７０℃、２０℃から６５℃などの幅広い温度範囲内が必要とされる。好ましくは、３つのステムループ構造を有するｓｇＲＮＡと会合するＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、２０℃から１００℃、２０℃から７０℃、２０℃から６５℃、４５℃から１００℃、５０℃から１００℃、５０℃から７０℃、５０℃から６５℃、または５５℃から６５℃の範囲の選択した温度で、少なくとも１分間、少なくとも２分間、少なくとも３分間、少なくとも４分間または少なくとも５分間、好ましくは５分間、安定のままであり、かつ標的配列の結合、切断、標識または改変を可能にするであろう。
【０１１１】
さらに、発明者らはまた、ｓｇＲＮＡのスペーサー配列の長さが、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９活性、例えば、結合、切断、標識または改変活性の効率を操作するために、様々となり得ることを発見した。通常、スペーサー配列は、長さが、１８ｎｔ〜２５ｎｔの範囲になろう。任意選択で、スペーサー配列は、長さが、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔまたは２５ｎｔになろう。好ましくは、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔまたは２３ｎｔのスペーサー長さが使用され、なぜなら、これらのスペーサー長さを有するｓｇＲＮＡと会合した場合に、本発明のＣａｓ９タンパク質が、最も高い効率で標的配列を切断するからである。１８ｎｔのスペーサーが使用される場合、切断効率は、著しく低下する。好ましくは、スペーサーの長さは、２３ｎｔとなろう。
【０１１２】
本発明のすべての態様において、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドは、細菌、古細菌またはウイルスから得ることができるか、もしくはこれらに由来することができ、または代替として、ｄｅ  ｎｏｖｏで合成されてもよい。好ましい実施形態では、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、好熱性原核生物に由来し、これらの生物は、古細菌または細菌として分類することができるが、好ましくは細菌である。より好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、好熱性細菌に由来する。本明細書において、好熱性という用語は、比較的高い温度で、生存および成長することが可能である、例えば、本発明の文脈では、４１と１２２℃（１０６と２５２°Ｆ）の間の温度で、核酸の切断、結合または改変を行うことができるという意味として理解されるべきである。好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、１つまたは複数の好熱性細菌から単離されてもよく、６０℃超で機能するであろう。好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、１つまたは複数の好熱性細菌から単離されてもよく、６０℃から８０℃の範囲で、最適には６０℃と６５℃の間で機能するであろう。好ましい実施形態では、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、ゲオバチルス（Geobacillus）属種に由来する。より好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質は、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）に由来する。さらにより好ましくは、本発明のＣａｓタンパク質は、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２に由来する。本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、ウイルスに由来することができる。
【０１１３】
機能的部分
有利なことに、任意のポリヌクレオチド配列を配列特異的に標的にする本発明のＣａｓタンパク質、ポリペプチドおよびリボ核タンパク質複合体の能力は、何らかの方法で、例えば、標的核酸を切断および／または標識および／または修飾することにより、標的核酸を改変するために利用することができる。したがって、これを達成するためにはＣａｓタンパク質またはポリペプチドと共に追加のタンパク質を提供してもよいことが認識されよう。したがって、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドは、少なくとも１つの機能的部分をさらに含んでもよく、かつ／または本発明のＣａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体は、少なくとも１つのさらなるタンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供されてもよい。好ましい態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質または少なくとも１つのさらなるタンパク質が少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、Ｃａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体を提供する。少なくとも１つの機能的部分は、Ｃａｓタンパク質に融合または連結していてもよい。好ましくは、少なくとも１つの機能的部分は、天然のまたは人工的タンパク質発現系での発現を通じてＣａｓタンパク質に翻訳によって融合してもよい。代わりに、少なくとも１つの機能的部分は、化学合成ステップによりＣａｓタンパク質に共有結合によって連結してもよい。好ましくは、少なくとも１つの機能的部分は、Ｃａｓタンパク質のＮ終端および／またはＣ終端、好ましくはＣ終端に融合または連結している。
【０１１４】
少なくとも１つの機能的部分はタンパク質であることが望ましい。タンパク質は、異種タンパク質であってもよく、または代わりにＣａｓタンパク質が由来した細菌種に固有であってもよい。少なくとも１つの機能的部分はタンパク質であってもよく、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択されうる。
【０１１５】
特に好ましい態様では、本発明は、少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質、例えば、ＧＦＰである、Ｃａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体を提供する。
【０１１６】
ヌクレアーゼ活性
本発明のＣａｓリボ核タンパク質は、本明細書にて開示される温度で、好ましくは高温で、例えば、５０℃と１００℃の間の温度で、核酸結合、切断、標識または改変活性を有する。本発明のリボ核タンパク質は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成核酸に結合する、これを切断する、標識する、または改変することが可能となり得る。好ましい態様では、本発明のＣａｓリボ核タンパク質は、ＤＮＡを、特に二本鎖ＤＮＡを配列特異的に切断することができる。
【０１１７】
本発明のＣａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質は、１つよりも多いヌクレアーゼドメインを有してもよい。部位特異的ヌクレアーゼは、ＤＮＡの鎖に沿って選択された位置で二本鎖切断（ＤＳＢ）を生じさせることができる。標的宿主細胞では、これによりゲノム内の特定の前選択した位置でＤＳＢを作ることができる。部位特異的ヌクレアーゼによるそのような切断の作製に促されて、目的のゲノム内の所望の位置でＤＮＡを挿入、欠失または改変するために内在性細胞修復機構が別の目的で利用される。
【０１１８】
タンパク質またはポリペプチド分子の１つまたは複数のヌクレアーゼ活性部位は、例えば、タンパク質またはポリペプチドに連結または融合している別の機能的部分、例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼなどのヌクレアーゼドメインの活性を可能にするように不活化され得る。
【０１１９】
したがって、本発明のＣａｓタンパク質、ポリペプチドおよびリボ核タンパク質がある特定の応用のために内在性ヌクレアーゼ活性を有する場合があるにもかかわらず、Ｃａｓタンパク質の天然のヌクレアーゼ活性を不活化し、天然のＣａｓ９ヌクレアーゼ活性が不活化されＣａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結しているＣａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体を提供するのが望ましい場合がある。天然のＣａｓ９ヌクレアーゼ活性の相補性によるミスターゲティング事象の発生率を減らすことは１つのそのような応用である。これは、望ましくは、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体の天然のＣａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活化させ、好ましくはＣａｓタンパク質に融合している、異種ヌクレアーゼを提供することにより達成することもできる。したがって、本発明は、少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体を提供する。特に好ましい態様では、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合している本発明のＣａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体は、好ましくは、ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合している本発明の別のＣａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体を含み、２つの複合体が標的ゲノムＤＮＡの反対の鎖を標的にする、タンパク質複合体の一部として提供される。
【０１２０】
いくつかの応用では、例えば、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体が核酸中の特定の標的配列を認識し改変する、例えば、その標的配列を診断検査の一部として標識するのに利用する応用では、Ｃａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質のヌクレアーゼ活性を完全に減弱させるのが望ましい場合がある。そのような応用では、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性は不活化されてもよく、Ｃａｓタンパク質に融合している機能的部分はタンパク質でもよく、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択されうる。
【０１２１】
好ましい態様では、触媒として不活性な、またはヌクレアーゼ活性を欠く「死滅した」Ｃａｓタンパク質もしくはポリペプチド（ｄＣａｓ）は、標的核酸配列に結合することができ、それにより、その配列の活性を立体的に抑制する。例えば、遺伝子のプロモーターまたはエクソンの配列に相補的である標的ＲＮＡを設計することができ、その結果、遺伝子へのｄＣａｓおよび標的ＲＮＡの結合は、遺伝子配列の転写開始または伸長を立体的に抑制し、それにより、遺伝子の発現を抑制する。代替的に、本明細書に記載される方法および使用は、ニッカーゼであるｇｔＣａｓ９の改変ヌクレアーゼ変異体を使用することができる。ニッカーゼは、ＨＮＨまたはｇｔＣａｓ９ヌクレアーゼのＲｕｖＣ触媒ドメインの一方において変異により作製することができる。これは、それぞれ、不活性なＲｕｖＣまたはＨＮＨヌクレアーゼドメインを有する、ｓｐＣａｓ９−変異体Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａを含む化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）Ｃａｓ９（ｓｐＣａｓ）の場合に示される。これらの２つの変異を組み合わせることにより、触媒的に死滅したＣａｓ９変異体に至る（Standage-Beier, K. et al., 2015, ACS Synth. Biol. 4, 1217-1225；Jinek, M. et al., 2012, Science 337, 816-821；Xu, T. et al., 2015, Appl. Environ. Microbiol. 81, 4423-4431）。配列相同性に基づいて（図３）、これらの残基は、ｇｔＣａｓ９のＤ８（図３におけるＤ１７）およびＤ５８１またはＨ５８２（図３）とすることができる。
【０１２２】
好ましくは、ｇｔＣａｓ９（ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９）における変異Ｄ８ＡおよびＨ５８２Ａを使用して、ヌクレアーゼ活性を欠いている、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９（ｄＣａｓ）の触媒的に不活性な、または「死滅」Ｃａｓタンパク質もしくはポリペプチド変異体を作製することができる。このようなｄＣａｓは、ｄｓＤＮＡ切断を導入することなく、ＤＮＡエレメントに安定してかつ特異的に結合することができる、例えば、効率的な熱活性転写サイレンシングＣＲＩＳＰＲｉツールとしての用途を有用にも見いだすことができる。有利には、このようなシステムは、とりわけ、ヒト細胞の代謝検討をかなり容易にすることができる。
【０１２３】
特に好ましい態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質のヌクレアーゼ活性が不活化され少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質、例えば、ＧＦＰである、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質複合体を提供する。この方法で、目的の核酸配列を特異的に標的にし、光シグナルを発生させるマーカーを使用してその核酸配列を可視化することが可能になりうる。適切なマーカーは、例えば、蛍光レポータータンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）またはｍＣｈｅｒｒｙを含んでいてもよい。そのタンパク質の発現は蛍光測定により簡単に直接的にアッセイすることが可能なので、そのような蛍光レポーター遺伝子はタンパク質発現の可視化に適したマーカーを提供する。代わりに、レポーター核酸は、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ）など発光タンパク質をコードしてもよい。代わりに、レポーター遺伝子は、光シグナルを発生させるのに使用することが可能な発色酵素、例えば、発色酵素（ベータ−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）またはベータ−グルクロニダーゼ（Ｇｕｓ）など）でもよい。発現の測定に使用されるレポーターは、抗原ペプチドタグでもよい。他のレポーターまたはマーカーは当技術分野では公知であり、必要に応じて使用してもよい。
【０１２４】
マーカーは可視化することができるので、標的核酸がＲＮＡ、具体的にはｍＲＮＡであるある特定の実施形態では、特に、マーカーにより発生する光シグナルが発現産物の量に正比例している場合、マーカーにより発生する光シグナルの検出および定量化により遺伝子の転写活性を定量化することが可能でありうる。したがって、本発明の好ましい実施形態では、本発明のＣａｓタンパク質またはリボ核タンパク質を使用して、目的の遺伝子の発現産物をアッセイすることができる。
【０１２５】
一態様では、本明細書に記載されるｇｔＣａｓ９は、相同組換え（ＨＲ）媒介性ゲノム改変方法で使用されてもよい。このような方法は、ＨＲおよび部位特異的ｇｔＣａｓ９活性を含み、これにより、対向選択は、ｇｔＣａｓ９活性が、ＨＲにより導入された所望の改変を有していない細胞を除去することにより行われる。
【０１２６】
したがって、本明細書で提供される方法および使用により、第１の工程の間に好都合となる相同組換え方法が可能になり、こうして、ゲノムは、所望の変異、および非改変細胞が、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体によりターゲティングされて、非改変細胞のゲノムにＤＳＤＢを導入することができる第２の工程により改変することができる。これらの方法および使用は、いずれの非改変細胞を除去すると同時に、所望の変異を有する細胞の集団全体を増大する。好ましくは、このような方法および使用は、実質的に、内因性ＮＨＥＪ修復機構を有していない微生物において使用される。代替的に、本方法および使用は、内因性ＮＨＥＪ修復機構を有する細胞に適用してもよい。本明細書に記載される方法および使用は、内因性ＮＨＥＪ修復機構を有する細胞に適用することができるが、この場合、ＮＨＥＪ修復機構は、条件付きで低下されるか、またはＮＨＥＪ活性がノックアウトされるかのどちらかとなる。
【０１２７】
本明細書で提供される方法および使用は、ガイドＲＮＡと少なくとも１つのミスマッチを有する、相同組換えポリヌクレオチドの配列を利用することができ、こうして、ガイドＲＮＡは、改変ゲノムをもはや認識することができない。これは、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体が、改変ゲノムを認識しないことを意味する。したがって、ＤＳＤＢは、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体によって導入することはできず、その結果、改変細胞は、生存することになろう。しかし、非改変ゲノムを有する細胞は、ガイドＲＮＡに対して実質的な相補性を依然として有しており、その結果、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体により部位特異的に切断され得る。
【０１２８】
本発明の方法および使用の別の態様では、ｇｔＣａｓ９リボヌクレオアーゼ複合体が、微生物ゲノムを切断させる作用を防止する方法は、ガイドによって標的とされる配列を改変または除外することではなく、むしろ、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体によって必要とされるＰＡＭを改変または除外することである。ＰＡＭは、特定の切断部位に対してｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体を結合させるために、改変または除去のどちらか一方が行われる。したがって、本発明の方法および使用は、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体によって認識されるＰＡＭ配列を含まない、相同組換えポリヌクレオチドの配列を使用するものを含むことができる。したがって、ＤＳＤＢは、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体によって導入することはできず、その結果、ＨＲ改変細胞は、生存することになろう。しかし、非修飾細胞は、ｇｔＣａｓ９リボヌクレアーゼ複合体およびそのガイドにより依然として認識され、その結果、部位特異的に切断される。
【０１２９】
したがって、細胞のゲノムを改変するために、ＨＲに頼る方法および使用が、明細書において提供される。好ましくは、上流隣接部および下流隣接部は、長さが、それぞれ、０．５キロ塩基（ｋｂ）から１．０ｋｂである。しかし、それより長い断片またはそれより短い断片を使用する組換えが、同様に可能である。相同組換えポリヌクレオチドは、上流と下流の隣接領域との間にポリヌクレオチド配列をさらに含んでもよい。このポリヌクレオチド配列は、例えば、ゲノムに導入されることになる、改変を含むことができる。
【０１３０】
相同組換えは、標的領域に対して実質的な相補性を有する、上流隣接部および下流領隣接部に依存する一方、ミスマッチも同様に収容可能である。したがって、一部の実施形態では、相同組換えは、上流隣接部および下流隣接部に対して広範な相同性を有する、ＤＮＡセグメント間に行われることが知られている。代替実施形態では、上流および下流隣接部は、標的領域に対して完全な相補性を有する。上流および下流隣接部は、サイズが同一である必要がない。しかし、一部の例では、上流および下流隣接部は、サイズが同一である。相同組換えの効率は、隣接部の最小断片長さの相同組換えの可能性に応じて様々となろう。しかし、相同組換え法が、非効率である場合でさえも、有利には、本明細書に記載される方法は、非改変細胞よりも、所望の改変を有する任意の細胞を選択することになろう。相同組換えにより、やはり、完全遺伝子クラスターを包含する大きな欠失（例えば、５０ｋｂ以上）を作製することが可能となる。相同組換えは組換えに使用され、これは、より小さな断片（４５〜１００ｎｔ）に組換えを可能にする周知の方法である。本明細書に記載される方法および使用は、ゲノムにおいて、標的を含有する第２の標的領域に実質的に相補的である配列を有する相同組換えポリヌクレオチドをコードする配列を含む、少なくとも別の相同組換えポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをさらに任意選択で含むことができる。
【０１３１】
好ましい実施形態では、本明細書に記載される方法および使用は、ＤＮＡである相同組換えポリヌクレオチドを利用する。一部の実施形態では、ＤＮＡは一本鎖である。他の実施形態では、ＤＮＡは二本鎖である。さらなる実施形態では、ＤＮＡは、二本鎖であり、プラスミド媒介性である。
【０１３２】
本明細書で提供される方法および使用にＨＲを使用して、ゲノムからポリヌクレオチド配列を除去することができる。代替的に、本明細書で提供される方法および使用におけるＨＲを使用して、ゲノムに１つまたは複数の遺伝子またはその断片を挿入することができる。さらなる選択として、本明細書で提供される方法および使用においてＨＲを使用し、ゲノムにおける少なくとも１つのヌクレオチドを改変、またはこれに置き換えることができる。これにより、本明細書で提供される方法および使用は、任意の所望の種類のゲノム改変に使用することができる。
【０１３３】
代替的に、本明細書に記載されるｇｔＣａｓ９は、細胞において、ＨＲ媒介性ゲノム改変方法に使用してもよく、それにより、ｇｔＣａｓ９活性により、ＤＳＤＢが導入され、ｓｐＣａｓ９に関して示されている通り、細胞における細胞ＨＲを誘発することができる（Jiang et al. (2013) Nature Biotech, 31, 233-239；Xu et al. (2015) Appl Environ Microbiol, 81, 4423-4431；Huang et al. (2015) Acta Biochimica et Biophysica Sinica, 47, 231-243）。
【０１３４】
代替的に、相同組換えは、例えば、Ｍｏｕｇｉａｋｏｓらによって概説されている、ＲｅｃＴまたはベータプロテインをコードする遺伝子を発現する、細胞にオリゴヌクレオチドを導入することによる組換えによって促進することができる（(2016), Trends Biotechnol. 34: 575-587）。さらなる実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｒｏｎｄａらにより例示されている、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＭＡＧＥ）と組み合わせることができる（(2016), Sci. Rep. 6: 19452.）。
【０１３５】
初めから終わりまで、本発明のＣａｓタンパク質の基準配列は、アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列として定義することができる。例えば、配列番号２から６に定義されるモチーフのアミノ酸配列は、そのアミノ酸配列をコードするすべての核酸配列も含む。
【０１３６】
したがって、本発明は、
ａ．アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；および／または
ｂ．アミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；および／または
ｃ．アミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；および／または
ｄ．アミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；および／または
ｅ．アミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）
を含むＣａｓタンパク質であって、
少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子、およびターゲティングＲＮＡ分子により認識される標的核酸配列を含むポリヌクレオチドと会合すると５０℃と１００℃の間でＤＮＡを結合、切断、標識または改変することができるＣａｓタンパク質をコードする単離された核酸分子も提供する。任意選択で、Ｃａｓタンパク質は、ヒト細胞において前記切断、標識または改変が可能である。任意選択で、前記ヒト細胞は胚性幹細胞ではない。任意選択で、前記結合、切断、標識または改変はヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない。
【０１３７】
別の態様では、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有するＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）タンパク質をコードする単離された核酸分子も提供する。
【０１３８】
別の態様では、本発明は、翻訳されるとＣａｓタンパク質に融合するペプチドをコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含む、単離された核酸分子も提供する。
【０１３９】
別の態様では、本発明は、Ｃａｓタンパク質をコードする核酸分子に融合する少なくとも１つの核酸配列が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択されるタンパク質をコードする、単離された核酸分子も提供する。
【０１４０】
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ヌクレアーゼ活性：二価陽イオン
以前に特徴付けられた、中温性Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、標的ＤＮＡにおいて、二価陽イオンを使用して、ＤＳＢの生成を触媒する。発明者らは、以下の二価陽イオンＭｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋、およびＣｕ２＋のいずれかの存在下で、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、ｄｓＤＮＡ切断を媒介することができることを示した。
【０１４１】
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ヌクレアーゼ活性：基質
発明者らはまた、あるＩＩＣ型系は、効率的な一本鎖ＤＮＡカッターとなることが報告されているにもかかわらず（Ma, et al., Mol. Cell 60, 398-407(2015)；Zhang, et al., Mol. Cell 60, 242-255(2015)）、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、ｓｓＤＮＡを直接切断することができないことを驚くべきことに示した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のヌクレアーゼ活性は、ｄｓＤＮＡ基質に限定される。
【０１４２】
発現ベクター
本発明の核酸は単離されていてもよい。しかし、核酸感知構築物の発現が選ばれた細胞で実行されうるように、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、好ましくは、発現構築物中に提供されている。いくつかの実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはリボ核タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、適切な発現ベクターの一部として提供されることになる。ある特定の実施形態では、本発明の発現ベクター（発現するとＣａｓタンパク質に融合するアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列ありまたはなしで）は、上文に定義されているターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含んでいてもよい。したがって、そのような発現ベクターを適切な宿主で使用して、所望のヌクレオチド配列を標的にすることが可能な本発明のリボ核タンパク質複合体を産生することができる。代わりに、上文に定義されるターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列は別の発現ベクターで提供してもよく、または代わりに他の手段によって標的細胞に送達してもよい。
【０１４３】
適切な発現ベクターは受容細胞に応じて変化することになり、適宜、標的細胞での発現を可能にし、好ましくは高レベルの発現を促進する調節エレメントを組み込んでもよい。そのような調節配列は、例えば、開始、正確さ、速度、安定性、下流プロセシングおよび可動性の点で遺伝子または遺伝子産物の転写または翻訳に影響を与えることができてもよい。
【０１４４】
そのようなエレメントは、例えば、強力なおよび／または構成プロモーター、５’および３’ＵＴＲ、転写および／または翻訳エンハンサー、転写因子またはタンパク質結合配列、開始部位および終結配列、リボソーム結合部位、組換え部位、ポリアデニル化配列、センスまたはアンチセンス配列、転写の正確な開始を確実にする配列ならびに任意選択で、宿主細胞における転写の終結および転写物安定化を確実にするポリＡシグナルを含んでいてもよい。調節配列は、植物、動物、細菌、真菌またはウイルス由来でもよい。適切な調節エレメントが目的の宿主細胞に応じて変化することになるのは明らかである。ヒト宿主細胞で高レベルの発現を促進する調節エレメントは、酵母ではＡＯＸ１またはＧＡＬ１プロモーターあるいはヒト細胞ではＣＭＶもしくはＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサー、単純ヘルペスウイルス（Herpes simplex virus）ＶＩＰ１６転写活性化因子またはグロビンイントロンの包含を含んでいてもよい。
【０１４５】
適切な調節エレメントは構成的であってよく、この調節エレメントは大半の環境条件または発生段階、特異的もしくは誘導性の発生段階下で発現を指示する。好ましくは、プロモーターは誘導性であり、温度、光、化学物質、乾燥、および他の刺激などの環境的、化学的または発生的合図に応答して発現を指示する。適宜、特定の発生段階であるいは細胞外もしくは細胞内状態、シグナル、または外部から与えられる刺激に応答して目的のタンパク質の発現を可能にするプロモーターを選んでもよい。例えば、大腸菌（E.coli）で使用するための、特定の成長段階で（例えば、ｏｓｍＹ静止期プロモーター）または特定の刺激に応答して（例えば、ＨｔｐＧ熱ショックプロモーター）高レベルの発現を与える様々なプロモーターが存在する。
【０１４６】
適切な発現ベクターは、適切な宿主細胞においておよび／または特定の条件下で前記ベクターの選択を可能にする選択可能マーカーをコードする追加の配列を含んでいてもよい。
【０１４７】
本発明は、ヒト細胞中で標的核酸を改変する方法であって、細胞を上文に記載される発現ベクターのうちのいずれかでトランスフェクト、形質転換または形質導入することを含む方法も含む。トランスフェクション、形質転換または形質導入の方法は当業者には周知のタイプのものである。本発明のリボ核タンパク質複合体の発現を生み出すのに使用される１つの発現ベクターが存在する場合、およびターゲティングＲＮＡが細胞に直接添加される場合、トランスフェクション、形質転換または形質導入の同じまたは異なる方法を使用してもよい。同様に、本発明のリボ核タンパク質複合体の発現を生み出すのに使用される１つの発現ベクターが存在する場合、および別の発現ベクターが発現を介してターゲティングＲＮＡをｉｎ  ｓｉｔｕで生み出すのに使用されている場合、トランスフェクション、形質転換または形質導入の同じまたは異なる方法を使用してもよい。
【０１４８】
他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡは、細胞中でＣａｓｃａｄｅ複合体が発現されるように細胞内に導入される。Ｃａｓタンパク質複合体を所望の標的配列まで導くターゲティングＲＮＡも、ｍＲＮＡと同時でも、別々にでもまたは逐次でも、必要なリボ核タンパク質複合体が細胞中で形成されるように、細胞内に導入される。
【０１４９】
したがって、本発明は、標的核酸を改変する、すなわち、切断、タグ付け、改変、標識または結合する方法であって、核酸を上文で定義されるリボ核タンパク質複合体と接触させることを含む方法も提供する。任意選択で、前記核酸はヒト細胞に存在する。任意選択で、前記ヒト細胞は胚性幹細胞ではない。
【０１５０】
さらに、本発明は標的核酸を改変する方法であって、核酸を、上文で定義されるターゲティングＲＮＡ分子に加えて、上文で定義されるＣａｓタンパク質またはポリペプチドと接触させることを含む方法も含む。
【０１５１】
上記方法に従って、標的核酸の改変は、したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでおよび無細胞環境で実行することができる。無細胞環境では、標的核酸、Ｃａｓタンパク質およびターゲティングＲＮＡ分子のそれぞれの添加は、同時でも、逐次でも（希望通りのいかなる順番でも）、または別々でもよい。したがって、標的核酸とターゲティングＲＮＡが反応混合物に同時に添加され、次に、本発明のＣａｓタンパク質またはポリペプチドが後の段階で別々に添加されることが可能である。
【０１５２】
同様に、標的核酸の改変は、単離された細胞であれ多細胞組織、器官または生物の一部としてであれ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、すなわち、ヒト細胞中ｉｎ  ｓｉｔｕで行うことができる。全組織および器官の文脈では、ならびに生物の文脈では、方法はｉｎ  ｖｉｖｏで実行されるのが望ましい場合があり、または代わりに、全組織、器官もしくは生物からヒト細胞を単離し、方法に従って細胞をリボ核タンパク質複合体で処理し、それに続いてリボ核タンパク質複合体で処理された細胞を、同じ生物内であれ異なる生物内であれ、その前の位置に、もしくは異なる位置に戻すことにより実行してもよい。任意選択で、前記ヒト細胞は胚性幹細胞ではない。
【０１５３】
これらの実施形態では、リボ核タンパク質複合体またはＣａｓタンパク質もしくはポリペプチドは、細胞内への適切な形態の送達を必要とする。そのような適切な送達系および方法は当業者には周知であり、細胞質または核マイクロインジェクションを含むがこれらに限定されない。好ましい送達様式では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が使用され、この送達系はヒトでは病因性ではなく、欧州では臨床使用に承認されている。
【０１５４】
したがって、本発明は標的核酸を改変する方法であって、核酸を、
ａ．上文で定義されるリボ核タンパク質複合体、または
ｂ．上文で定義されるタンパク質もしくはタンパク質複合体および上文で定義されるＲＮＡ分子
と接触させることを含む方法を提供する。
【０１５５】
さらなる態様では、本発明はヒト細胞中で標的核酸を改変する方法であって、細胞を上文で定義されるリボ核タンパク質複合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入すること、または代わりに細胞を上文で定義されるタンパク質もしくはタンパク質複合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターおよび上文で定義されるターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる発現ベクターで形質転換、トランスフェクトもしくは形質導入することを含む方法を提供する。任意選択で、前記標的核酸はヒト細胞中に存在し、前記ヒト細胞は胚性幹細胞ではない。
【０１５６】
さらなる態様では、本発明はヒト細胞中で標的核酸を改変する方法であって、細胞を上文で定義されるタンパク質もしくはタンパク質複合体をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで形質転換、トランスフェクトまたは形質導入し、次いで上文で定義されるターゲティングＲＮＡ分子を細胞内に送達することを含む方法を提供する。任意選択で、前記標的核酸はヒト細胞中に存在し、前記ヒト細胞は胚性幹細胞ではない。
【０１５７】
ガイド（すなわち、ターゲティング）ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子およびＣａｓタンパク質またはポリペプチドが、リボ核タンパク質複合体の一部としてというよりむしろ別々に提供される実施形態では、ｇＲＮＡ分子は、Ｃａｓタンパク質またはタンパク質複合体と同時であれ、別々にであれ、逐次であれ、ヒト細胞内への適切な形態の送達を必要とする。ＲＮＡを細胞内に導入するそのような形態は当業者には周知であり、従来のトランスフェクション法を介したｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ送達を含んでもよい。マイクロインジェクションおよび電気穿孔法、ならびにカルシウム共沈、ならびに市販のカチオンポリマーおよび脂質、ならびに細胞透過性ペプチド、細胞透過性（微粒子銃）粒子などの物理的方法をそれぞれ使用してもよい。例えば、ウイルス、特に好ましくはＡＡＶを、例えば、本発明のＣａｓタンパク質複合体または本発明のリボ核タンパク質複合体のウイルス粒子への（可逆的）融合を介して、細胞質にであれおよび／または核にであれ送達媒体として使用してもよい。
【０１５８】
別の態様では、本発明は標的核酸を改変する方法であって、少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質またはレポータータンパク質であり、マーカータンパク質またはレポータータンパク質が標的核酸と会合し、好ましくは、マーカーが蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、方法を提供する。
【０１５９】
標的核酸を改変する上述の方法では、機能的部分はマーカーでもよく、マーカーは標的核酸と会合し、好ましくは、マーカーはタンパク質であり、任意選択で、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）またはｍＣｈｅｒｒｙである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏであれ、ｅｘ  ｖｉｖｏであれ、またはｉｎ  ｖｉｖｏであれ、本発明の方法を使用すれば、好ましくは、高次コイルのプラスミドもしくは染色体などの高次構造、またはｍＲＮＡなどの一本鎖標的核酸の形態で、核酸分子中の標的遺伝子座を直接可視化することが可能である。標的遺伝子座の直接可視化は電子顕微鏡写真、または蛍光顕微鏡法を使用してもよい。しかし、本発明の方法の文脈では、有機色素分子、放射性標識および小分子でもよいスピン標識を含む、他の種類の標識をマーカーとして使用してもよいことは認識される。
【０１６０】
標的核酸がｄｓＤＮＡである標的核酸を改変するための本発明の方法では、機能的部分はヌクレアーゼでもヘリカーゼ−ヌクレアーゼでもよく、改変は好ましくは所望の遺伝子座での一本鎖または二本鎖切断である。この方法で、ＤＮＡの独特な配列特異的切断は、リボ核タンパク質複合体に融合している適切な機能的部分を使用することにより操作することが可能である。最終的なリボ核タンパク質複合体のＲＮＡ成分の選ばれた配列は、機能的部分の作用に対する所望の配列特異性を提供する。
【０１６１】
したがって、本発明は、ｄｓＤＮＡ分子からヌクレオチド配列の少なくとも一部を取り除くための、任意選択で遺伝子（単数または複数）の機能をノックアウトするための、ヒト細胞中の所望の遺伝子座でのｄｓＤＮＡ分子の非相同末端結合の方法であって、上文に記載される標的核酸を改変する方法のうちのいずれかを使用して二本鎖切断を作ることを含む方法も提供する。任意選択で、前記方法はヒト細胞において行われ、前記ヒト細胞は胚性幹細胞ではない。
【０１６２】
本発明は、既存のヌクレオチド配列を改変する、または所望のヌクレオチド配列を挿入するために、ヒト細胞中の所望の遺伝子座でｄｓＤＮＡ分子内に核酸を相同組換えする方法であって、上文に記載される標的核酸を改変する方法のうちのいずれかを使用して所望の遺伝子座で二本鎖切断を作ることを含む方法をさらに提供する。任意選択で、前記方法はヒト細胞において行われ、前記ヒト細胞は胚性幹細胞ではない。
【０１６３】
したがって、本発明はまた、生物における遺伝子発現を改変する方法であって、以上に記載の方法のいずれかによる標的核酸配列を改変するステップを含み、核酸がｄｓＤＮＡであり、機能的部分がＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性化因子または転写リプレッサーから選択され、前記生物がヒトである、方法を提供する。
【０１６４】
本発明は、上文に記載される方法のうちのいずれかに従って標的核酸配列を改変することを含む、生物中で遺伝子発現を改変する方法であって、核酸がｍＲＮＡであり、機能的部分はリボヌクレアーゼであり、任意選択でエンドヌクレオアーゼ、３’エキソヌクレアーゼまたは５’エキソヌクレアーゼから選択され、前記生物がヒトである、方法をさらに提供する。
【０１６５】
標的核酸はＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成核酸でもよい。好ましくは、標的核酸はＤＮＡ、好ましくはｄｓＤＮＡである。
【０１６６】
しかし、標的核酸はＲＮＡ、好ましくはｍＲＮＡでも可能である。代わりに、したがって、本発明は、標的核酸を改変する方法であって、標的核酸がＲＮＡである、方法も提供する。
【０１６７】
別の態様では、本発明は、ヒト細胞における標的核酸を改変する方法であって、核酸がｄｓＤＮＡであり、少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ−ヌクレアーゼであり、改変が所望の遺伝子座での一本鎖または二本鎖切断である、方法を提供する。任意選択で、前記ヒト細胞は胚性幹細胞ではない。任意選択で、前記方法はヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない。
【０１６８】
別の態様では、本発明は、ヒト細胞における標的核酸を改変する方法であって、改変が、所望の遺伝子座における遺伝子発現のサイレンシングをもたらし、本方法は、
ａ．ｄｓＤＮＡ分子中で二本鎖切断を行うステップ、および
ｂ．非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）による細胞中のｄｓＤＮＡ分子を修復するステップ
を含み、任意選択で前記ヒト細胞は胚性幹細胞ではない、方法を提供する。任意選択で、前記方法は、ヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない。
【０１６９】
別の態様では、本発明は、ヒト細胞における標的核酸を改変する方法であって、存在するヌクレオチド配列が改変されるかもしくは欠失される、かつ／または所望のヌクレオチド配列が所望の位置に挿入されており、本方法が、
ａ．所望の遺伝子座において二本鎖切断を行うステップ、および
ｂ．相同組換えによる細胞中のｄｓＤＮＡ分子を修復するステップ
を含み、任意選択で前記ヒト細胞が胚性幹細胞ではない、方法を提供する。任意選択で、前記方法は、ヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない。
【０１７０】
別の態様では、本発明は、ヒト細胞における遺伝子発現を改変する方法であって、以上に記載の標的核酸配列を改変するステップを含み、核酸がｄｓＤＮＡであり、機能的部分が、ＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性化因子または転写リプレッサーから選択され、任意選択で前記ヒト細胞が胚性幹細胞ではない、方法を提供する。任意選択で、前記方法は、ヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない。
【０１７１】
別の態様では、本発明は、ヒト細胞における遺伝子発現を改変する方法であって、以上に記載の標的核酸配列を改変するステップを含み、核酸がｍＤＮＡであり、機能的部分がリボヌクレアーゼであり、任意選択で、エンドヌクレアーゼ、３’エクソヌクレアーゼまたは５’エクソヌクレアーゼから選択され、任意選択で前記ヒト細胞が胚性幹細胞ではない、方法を提供する。任意選択で、前記方法は、ヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない。
【０１７２】
別の態様では、本発明は上文に記載の標的核酸を改変する方法であって、４５℃と１００℃の間の温度で実行される方法を提供する。好ましくは、方法は５０℃でまたはそれよりも高い温度で実行される。より好ましくは、方法は５５℃と８０℃の間の温度で実行される。最適には、方法は６０℃と６５℃の間の温度で実行される。代替的に、本方法は、２０℃と４５℃の間の温度で行うことができる。より好ましくは、３０℃と４５℃の間の温度である。さらにより好ましくは、３７℃および４５℃の間の温度であり、任意選択で、標的核酸はヒト細胞中に存在する。任意選択で、前記ヒト細胞は胚性幹細胞ではない。任意選択で、前記方法は、ヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない。
【０１７３】
以上に記載の標的核酸を改変する方法のいずれかにおいて、細胞は、ヒト細胞とすることができる。任意選択で、以上に記載の標的核酸を改変する方法のいずれかにおいて、前記ヒト細胞は、胚性幹細胞でなくてもよい。任意選択で、前記方法は、ヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない。
【０１７４】
宿主細胞
有利には、本明細書に記載されている方法は、幅広い応用性があり、本発明の宿主細胞は、培養することができる任意のヒト細胞から誘導することができる。したがって、本発明は、以上に記載の方法により、形質転換されたヒト細胞を提供する。本発明は、二本鎖標的ポリヌクレオチドにおける標的核酸配列を有する形質転換ヒト細胞を提供し、前記細胞は、本明細書で提供されるＣａｓタンパク質またはポリペプチド、および本明細書で提供される少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を含み、発現ベクターは、前記Ｃａｓタンパク質および前記ターゲティングＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つをコードする核酸を含む。任意選択で、前記ヒト細胞は、胚性幹細胞でなくてもよい。
【０１７５】
遺伝子学的に利用可能なヒト細胞を含む、一般に使用される宿主細胞であって、例えばヒト細胞（胚性幹細胞ではない）を含めた、培養することができる宿主細胞を、本発明による使用のために選択することができる。本発明に従って使用するための好ましい宿主細胞は、一般に、典型的には高成長速度を示し、容易に培養されおよび／もしくは形質転換され、短い世代時間を示し、付随する確立した遺伝資源を有するもの、または特定の条件下で異種タンパク質の最適発現のために選択され、改変されもしくは合成された細胞である。目的のタンパク質が最終的には特定の工業的または治療的状況で使用されることになる本発明の好ましい実施形態では、適切な宿主細胞は、目的のタンパク質が配置されることになる所望の特定の条件または細胞状況に基づいて選択してもよい。好ましくは、宿主細胞はヒト細胞になる。
【０１７６】
本明細書に記載される本発明の方法および使用は、ヒト細胞のゲノムを改変するために使用することができる。
【０１７７】
本発明は、今や特定の実施形態に関連しておよび添付図に関連して詳細に説明されることになる。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】Ｃａｓ９タンパク質配列の近隣結合樹を示す図である。ｐＢＬＡＳＴまたはＰＳＩ−ＢＬＡＳＴに基づいて菌株Ｔ１２と４０％を超える配列類似性を有するすべての配列、ならびに現在十分に特徴付けられている配列（化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophiles）およびアクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii））、ならびに、これらの配列が４０％より低い同一性であった場合、現在同定されている好熱性配列も含まれた。すべての好熱性配列では、Ｔ１２に対するパーセント同一性は菌株名の後に示される。遺伝子識別子（ｇｉ）番号は種名の前に示される。説明文：閉環：好熱性（最適６０℃より高い）Ｃａｓ９配列、閉四角：熱耐性（最適＜５０℃）Ｃａｓ９配列、開三角：中温性起源由来のゲノム編集目的で現在最も使用されているＣａｓ９配列；符号なし：中温性Ｃａｓ９。結節点の値は１０００レプリケートブートストラップ値を表し；スケールバーは部位当たりの推定アミノ酸置換を表す。
【図２】Ｃａｓ９遺伝子配列の近隣結合樹を示す図である。遺伝子レベルでの同一性は極端に乏しかった；タンパク質整列のために使用された生物と同じ生物由来の配列を遺伝子整列のために使用した。遺伝子識別子（ｇｉ）番号は種名の前に示されている。説明文：閉環：好熱性（最適６０℃より高い）Ｃａｓ９配列、閉四角：熱耐性（最適＜５０℃）Ｃａｓ９配列、開三角：中温性起源由来のゲノム編集目的で現在最も使用されているＣａｓ９配列；符号なし：中温性Ｃａｓ９。結節点の値は１０００レプリケートブートストラップ値を表す。
【図３−１】ｇｔＣａｓ９（配列番号１）（ＩＩ−Ｃ型）と十分に特徴付けられているＩＩ−Ｃ型（アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）｜「ａｎａ」；配列番号８）およびＩＩ−Ａ型（化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）｜「ｐｙｏ」；配列番号９およびストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus））Ｃａｓ９配列とのタンパク質配列整列を示す図である。重要な活性部位残基はよく保存されており、黒色矢印で示されている。Ａｎａ−Ｃａｓ９およびＰｙｏ−Ｃａｓ９について記載されているタンパク質ドメイン（Jinek, et al., 2014, Science 343: 1247997）は斜線囲みおよび類似の色付き文字で示されている。ＰＡＭ認識ドメインは、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）ＩＩ−Ａ型系では決定されているが、いかなるＩＩ−Ｃ型系についても決定されておらず、したがって、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）配列でのみ示されている。
【図３−２】ｇｔＣａｓ９（配列番号１）（ＩＩ−Ｃ型）と十分に特徴付けられているＩＩ−Ｃ型（アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）｜「ａｎａ」；配列番号８）およびＩＩ−Ａ型（化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）｜「ｐｙｏ」；配列番号９およびストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus））Ｃａｓ９配列とのタンパク質配列整列を示す図である。重要な活性部位残基はよく保存されており、黒色矢印で示されている。Ａｎａ−Ｃａｓ９およびＰｙｏ−Ｃａｓ９について記載されているタンパク質ドメイン（Jinek, et al., 2014, Science 343: 1247997）は斜線囲みおよび類似の色付き文字で示されている。ＰＡＭ認識ドメインは、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）ＩＩ−Ａ型系では決定されているが、いかなるＩＩ−Ｃ型系についても決定されておらず、したがって、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）配列でのみ示されている。
【図４】アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）Ｃａｓ９（Ｃａｓ９−Ａｎａ）のタンパク質構成を示す図である（Jinek et al., 2014）。ｇｔＣａｓ９は同じＩＩ−Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ系に属し、活性部位残基を同定することができた。
【図５】相補的ｄｓＤＮＡのｃｒＲＮＡガイドターゲティングの比較を示す図である。塩基対合は破線で示されている。ＲＮＡは黒色で、ＤＮＡは灰色で描かれている。ｃｒＲＮＡスペーサーと標的プロトスペーサー間の塩基対合は太い黒色破線で示され、ＤＮＡ鎖間およびＲＮＡ鎖間の塩基対合は太い灰色破線で示されている。ｃｒＲＮＡの５’末端が示されている。Ｉ型中のＰＡＭ（小さい白色囲み）は標的鎖（プロトスペーサー）の下流に存在し、ＩＩ型ではＰＡＭは置き換えられた鎖のもう一方の末端に存在することに注目されたい。同様に、シード（標的ＤＮＡ鎖との塩基対合が始まり、ミスマッチが許されないガイドの予想配列）はＰＡＭの近くに位置しており、したがって、Ｉ型とＩＩ型で異なる（Van der Oost, 2014 ibid.）。パネルＡは大腸菌（E. coli）のＩ型Ｃａｓｃａｄｅ系の模式図を示している。ｃｒＲＮＡは、内部スペーサー（灰色囲み、標的認識を可能にする３１〜３２ヌクレオチド）を有し、８ヌクレオチド５’ハンドルおよびステムループ構造（ヘアピン）からなる２９ヌクレオチド３’ハンドルで隣接している（Jore 2011 ibid.）。パネルＢは化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）のＩＩ型Ｃａｓ９系の模式図を示している。ｃｒＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡと塩基対合し、リボヌクレアーゼＩＩＩによるプロセシングを可能にする（向かい合った黒色三角）。さらに、ｃｒＲＮＡの５’末端はリボヌクレアーゼにより刈り込まれ（黒色三角）、典型的には２０ヌクレオチドスペーサーを生じる。合成ループを導入してｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを連結し、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を生じてもよいことに注目されたい（Jinek et al., 2012 ibid.）。
【図６】Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２型ＩＩｃ  ＣＲＩＳＰＲ系の配列のアライメントを示す図である。
【図７−１】ｇｔＣａｓ９のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの、ＰＡＭ予測をもたらすために得た６つの単一ヒットを示す図である。
【図７−２】ｇｔＣａｓ９のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでの、ＰＡＭ予測をもたらすために得た６つの単一ヒットを示す図である。
【図８】図７に例示したアライメントの結果を組み合わせたｗｅｂｌｏｇｏを示す図である。このｗｅｂｌｏｇｏは、ｗｅｂｌｏｇｏ．ｂｅｒｋｅｌｅｙ．ｅｄｕを使用して生成した。
【図９】精製済みｇｔＣａｓ９による、プラスミドを標的とした、６０℃でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイの結果を示すグラフである。このプラスミドは、ＰＡＭ配列の８ヌクレオチド長の特異的配列変異体を含んだ。
【図１０】ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］ＰＡＭ配列を含む標的プラスミドを使用する、ｇｔＣａｓ９濃度の効果を検討するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示すグラフである。
【図１１】ある範囲の温度にわたる、ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］ＰＡＭ配列を含む標的プラスミドを使用する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果を示すグラフである。
【図１２】実施例９に説明した通り、選択プレート上のバチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８細胞のコロニーの成長または不在により、ｇｔＣａｓ９および８ｎｔ  ＰＡＭ配列を使用するバチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８細胞のｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集の結果を示すグラフである。コロニーは、図１２中に矢印で示している。
【図１３】ｐｙｒＦ遺伝子を除外する、コロニーのＰＣＲスクリーニングの結果を示すグラフである。このコロニーは、構築物３（ネガティブ対照）による、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８細胞の変換後に生成した。１５のコロニーをスクリーニングしたが、実施例９に説明されている通り、欠失遺伝子型−２．１ｋｂのバンドサイズを示すものはなく、代わりにすべてが、野生型−２．９ｋｂのバンドサイズを示した。
【図１４】ｐｙｒＦ遺伝子が欠失された、コロニーのＰＣＲスクリーニングの結果を示すグラフである。このコロニーは、構築物１（ＰＡＭ配列ＡＴＣＣＣＣＡＡ［配列番号２１］）による、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８細胞の変換後に生成した。２０のコロニーをスクリーニングし、実施例９に説明されている通り、１つが、欠失遺伝子型−２．１ｋｂのバンドサイズを示した一方、残りは、野生型−２．９ｋｂのバンドサイズと欠失遺伝子型−２．１ｋｂのバンドサイズの両方を示した。野生型のみの遺伝子型は観察されなかった。
【図１５】ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２  ＩＩＣ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座は、熱安定性Ｃａｓ９ホモログであるＴｈｅｒｍｏＣａｓ９をコードする図である。  （Ａ）ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９をコードするゲノム遺伝子座の概略図。赤色で強調した予測活性部位残基を含む配列比較に基づく、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のドメインアーキテクチャ。Ｐｈｙｒｅ２を使用して生成した、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の相同性モデル（Kelley et al. Nat. Protoc. 10, 845-858(2015)）が、ドメインに対して様々な色を付けて示されている。  （Ｂ）  ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９と高度に同一のＣａｓ９オルソログの進化系統樹。進化的解析は、ＭＥＧＡ７において行った（Kumar et al. Mol. Biol. Evol. 33, 1870-1874(2016)）。  （Ｃ）  金属−アフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過による精製後のＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。得られた単一バンドの移動は、アポ−ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の１２６ｋＤという理論分子量に一致する。
【図１６−１】ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９  ＰＡＭ解析を示す図である。  （Ａ）  プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の位置および同一性（５’−ＮＮＮＮＮＮＮ−３’）を発見するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  切断アッセイの例示概略図である。黒色三角は、切断位を示す。  （Ｂ）標的ライブラリーのＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づく切断の比較解析によって得られた、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のコンセンサス７ｎｔ長のＰＡＭの配列ロゴである。各位置の文字の高さは、情報内容により測定される。  （Ｃ）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイにより８位とＰＡＭ同一性の伸長その各々が、個別の５’−ＣＣＣＣＣＣＡＮ−３’ＰＡＭを含有する、４つの線形プラスミド標的を、５５℃で１時間、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびｓｇＲＮＡと共にインキュベートし、次に、アガロースゲル電気泳動により解析した。  （Ｄ）３０℃および５５℃において、様々なＰＡＭを有するＤＮＡ標的に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイである。その各々が、１つの個別の５’−ＣＣＣＣＣＮＮＡ−３’［配列番号１３］ＰＡＭを含有する、１６の線形プラスミド標的を、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびｓｇＲＮＡと共にインキュベートし、次に、アガロースゲル電気泳動によって、切断効率を解析した。図２１も参照されたい。
【図１６−２】ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９  ＰＡＭ解析を示す図である。  （Ａ）  プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の位置および同一性（５’−ＮＮＮＮＮＮＮ−３’）を発見するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ  切断アッセイの例示概略図である。黒色三角は、切断位を示す。  （Ｂ）標的ライブラリーのＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づく切断の比較解析によって得られた、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のコンセンサス７ｎｔ長のＰＡＭの配列ロゴである。各位置の文字の高さは、情報内容により測定される。  （Ｃ）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイにより８位とＰＡＭ同一性の伸長その各々が、個別の５’−ＣＣＣＣＣＣＡＮ−３’ＰＡＭを含有する、４つの線形プラスミド標的を、５５℃で１時間、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびｓｇＲＮＡと共にインキュベートし、次に、アガロースゲル電気泳動により解析した。  （Ｄ）３０℃および５５℃において、様々なＰＡＭを有するＤＮＡ標的に対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイである。その各々が、１つの個別の５’−ＣＣＣＣＣＮＮＡ−３’［配列番号１３］ＰＡＭを含有する、１６の線形プラスミド標的を、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびｓｇＲＮＡと共にインキュベートし、次に、アガロースゲル電気泳動によって、切断効率を解析した。図２１も参照されたい。
【図１７−１】ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、幅広い温度範囲で活性であり、ｓｇＲＮＡに結合するとその熱安定性が増大することを示す図である。  （Ａ）ｓｇＲＮＡの概略図、および標的ＤＮＡのマッチング。標的ＤＮＡは、黒色輪郭により長方形として示されており、ＰＡＭは、黒色の輪郭により横方向の楕円で暗グレー色として示されている。ｃｒＲＮＡは、黒色輪郭で暗グレー色の長方形として示されており、ｃｒＲＮＡの３’末端がｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端と連結している部分は、黒色の縦方向の楕円として示されている。白色の文字による黒色の四角、および黒色文字による明グレーの四角は、それぞれ、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’側における３つおよび２つの予測ループを示している。ｃｒＲＮＡの相補的である３’末端およびｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端により形成された、繰り返し／抗繰り返し領域の４１ｎｔトランケートは、明グレー色の縦方向長点線で示されている。第１のｔｒａｃｒＲＮＡの予測３’位置は、黒色三角および黒色点線により印が付けられている。第２のｔｒａｃｒＲＮＡループの予測３’位置は、白色三角および黒色点線により印が付けられている。第３のｔｒａｃｒＲＮＡループの予測３’位置は、白色三角および白色点線により印が付けられている。  （Ｂ）  ｔｒａｃｒＲＮＡ足場の予測される３つのステムループの重要性は、ｓｇＲＮＡのトランケートした変異体を転写して、ガイドＲＮＡＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が様々な温度で標的ＤＮＡを切断する能力を評価することにより試験した。少なくとも２つの生物学的繰り返しの平均値が示されており、エラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。  （Ｃ）  最大温度を特定するため、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を６０℃、６５℃および７０℃で５分間または１０分間、インキュベートした後にアッセイした。予め加熱したＤＮＡ基質を加え、この反応物を、対応する温度で１時間、インキュベートした。  （Ｄ）指示温度で５分間、インキュベートした後に行った活性アッセイにより、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９の活性温度範囲の比較。予め加熱したＤＮＡ基質を加え、この反応物を、同一温度で１時間、インキュベートした。
【図１７−２】ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、幅広い温度範囲で活性であり、ｓｇＲＮＡに結合するとその熱安定性が増大することを示す図である。  （Ａ）ｓｇＲＮＡの概略図、および標的ＤＮＡのマッチング。標的ＤＮＡは、黒色輪郭により長方形として示されており、ＰＡＭは、黒色の輪郭により横方向の楕円で暗グレー色として示されている。ｃｒＲＮＡは、黒色輪郭で暗グレー色の長方形として示されており、ｃｒＲＮＡの３’末端がｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端と連結している部分は、黒色の縦方向の楕円として示されている。白色の文字による黒色の四角、および黒色文字による明グレーの四角は、それぞれ、ｔｒａｃｒＲＮＡの３’側における３つおよび２つの予測ループを示している。ｃｒＲＮＡの相補的である３’末端およびｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端により形成された、繰り返し／抗繰り返し領域の４１ｎｔトランケートは、明グレー色の縦方向長点線で示されている。第１のｔｒａｃｒＲＮＡの予測３’位置は、黒色三角および黒色点線により印が付けられている。第２のｔｒａｃｒＲＮＡループの予測３’位置は、白色三角および黒色点線により印が付けられている。第３のｔｒａｃｒＲＮＡループの予測３’位置は、白色三角および白色点線により印が付けられている。  （Ｂ）  ｔｒａｃｒＲＮＡ足場の予測される３つのステムループの重要性は、ｓｇＲＮＡのトランケートした変異体を転写して、ガイドＲＮＡＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が様々な温度で標的ＤＮＡを切断する能力を評価することにより試験した。少なくとも２つの生物学的繰り返しの平均値が示されており、エラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。  （Ｃ）  最大温度を特定するため、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体のエンドヌクレアーゼ活性を６０℃、６５℃および７０℃で５分間または１０分間、インキュベートした後にアッセイした。予め加熱したＤＮＡ基質を加え、この反応物を、対応する温度で１時間、インキュベートした。  （Ｄ）指示温度で５分間、インキュベートした後に行った活性アッセイにより、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびＳｐＣａｓ９の活性温度範囲の比較。予め加熱したＤＮＡ基質を加え、この反応物を、同一温度で１時間、インキュベートした。
【図１８−１】好熱菌における、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくゲノム工学を示す図である。  （Ａ）  基礎的な対象ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿Δｇｅｎｅ（ｇｏｉ）構築物の概略図である。ｐＮＷ３３ｎ（Ｂ．スミシイ（B. smithii））またはｐＥＭＧ（Ｐ．プチダ（P. putida））ベクターのどちらか一方に、ｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子を導入した。相同組換え隣接部を、標的ゲノムにおいて、上流でｔｈｅｒｍｏｃａｓ９に導入し、この隣接部は、上流領域に１ｋｂ（Ｂ．スミシイ（B. smithii））または０．５ｋｂ（Ｐ．プチダ（P. putida））を、および下流領域に１ｋｂまたは０．５ｋｂの目的の遺伝子（ｇｏｉ）を包含した。ｓｇＲＮＡ発現モジュールは、ｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子の下流に導入した。複製（ｏｒｉ）の起源、複製タンパク質（ｒｅｐ）、抗生物質耐性マーカー（ＡＢ）および可能な補助エレメント（ＡＥ）は、主鎖特異的であり、それらは、点線の輪郭で示されている。  （Ｂ）Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムに由来する、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくｐｙｒＦ欠失過程からの１０のコロニー上のゲノム特異的ＰＣＲから得られた生成物を示す、アガロースゲル電気泳動である。１０のコロニーはすべて、ΔｐｙｒＦ遺伝子型を含み、１つのコロニーは、野生型生成物を欠いた、クリーンなΔｐｙｒＦ変異体であった。  （Ｃ）基礎ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｇｏｉ構築物の概略図である。触媒的に不活性なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９（Ｔｈｅｒｍｏ−ｄＣａｓ９：Ｄ８Ａ、Ｈ５８２Ａ変異体）の発現を目的として、対応する変異を導入して、ｔｈｅｒｍｏ−ｄｃａｓ９遺伝子を作製した。ｔｈｅｒｍｏ−ｄｃａｓ９遺伝子は、ｐＮＷ３３ｎベクターに導入した。ｓｇＲＮＡ発現モジュールは、ｔｈｅｒｍｏ−ｄｃａｓ９の下流に導入した。  （Ｄ）  Ｔｈｅｒｍｏ−ｄＣａｓ９を使用したｌｄｈＬサイレンシング実験からの生成、成長およびＲＴ−ｑＰＣＲ結果のグラフ表示である。このグラフは、対照培養物と比較した、抑制培養物における、ラクテート生成、６００ｎｍにおける光学密度およびｌｄｈＬ転写率を示すグラフである。少なくとも２つの生物学的繰り返しからの平均値が示されており、エラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。
【図１８−２】好熱菌における、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくゲノム工学を示す図である。  （Ａ）  基礎的な対象ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿Δｇｅｎｅ（ｇｏｉ）構築物の概略図である。ｐＮＷ３３ｎ（Ｂ．スミシイ（B. smithii））またはｐＥＭＧ（Ｐ．プチダ（P. putida））ベクターのどちらか一方に、ｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子を導入した。相同組換え隣接部を、標的ゲノムにおいて、上流でｔｈｅｒｍｏｃａｓ９に導入し、この隣接部は、上流領域に１ｋｂ（Ｂ．スミシイ（B. smithii））または０．５ｋｂ（Ｐ．プチダ（P. putida））を、および下流領域に１ｋｂまたは０．５ｋｂの目的の遺伝子（ｇｏｉ）を包含した。ｓｇＲＮＡ発現モジュールは、ｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子の下流に導入した。複製（ｏｒｉ）の起源、複製タンパク質（ｒｅｐ）、抗生物質耐性マーカー（ＡＢ）および可能な補助エレメント（ＡＥ）は、主鎖特異的であり、それらは、点線の輪郭で示されている。  （Ｂ）Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムに由来する、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくｐｙｒＦ欠失過程からの１０のコロニー上のゲノム特異的ＰＣＲから得られた生成物を示す、アガロースゲル電気泳動である。１０のコロニーはすべて、ΔｐｙｒＦ遺伝子型を含み、１つのコロニーは、野生型生成物を欠いた、クリーンなΔｐｙｒＦ変異体であった。  （Ｃ）基礎ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｇｏｉ構築物の概略図である。触媒的に不活性なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９（Ｔｈｅｒｍｏ−ｄＣａｓ９：Ｄ８Ａ、Ｈ５８２Ａ変異体）の発現を目的として、対応する変異を導入して、ｔｈｅｒｍｏ−ｄｃａｓ９遺伝子を作製した。ｔｈｅｒｍｏ−ｄｃａｓ９遺伝子は、ｐＮＷ３３ｎベクターに導入した。ｓｇＲＮＡ発現モジュールは、ｔｈｅｒｍｏ−ｄｃａｓ９の下流に導入した。  （Ｄ）  Ｔｈｅｒｍｏ−ｄＣａｓ９を使用したｌｄｈＬサイレンシング実験からの生成、成長およびＲＴ−ｑＰＣＲ結果のグラフ表示である。このグラフは、対照培養物と比較した、抑制培養物における、ラクテート生成、６００ｎｍにおける光学密度およびｌｄｈＬ転写率を示すグラフである。少なくとも２つの生物学的繰り返しからの平均値が示されており、エラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。
【図１９−１】ＩＩ型Ａ、ＢおよびＣ  Ｃａｓ９オルソログの多重配列整列を示す図である。化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）（Ｓｐ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）（Ｓｔ）、ウオリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）（Ｗｓ）、ネイッセリア・メニンギティデス（Neisseria meningitides）（Ｎｍ）、アクチノマイセス・ナエスルンディイ（Actinomyces naeslundii）（Ａｎ）、およびゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）（Ｔｈｅｒｍｏ）のＣａｓ９タンパク質配列を、デフォルト設定のＭＥＧＡ７  ２におけるＣｌｕｓｔａｌＷ１を使用して整列させた。ＥＳＰｒｉｐｔ３を使用して、可視化した。厳密に保存された残基は、グレーの背景上の白色の文字で示す。類似残基は、黒色輪郭により白色の縦方向の長方形に、黒色の文字で示す。ピラミッドは、すべての配列において、２つの保存されたヌクレアーゼドメインを示している。横方向の黒色矢印および渦は、それぞれ、ＳｐＣａｓ９二次構造における、β鎖およびα−ヘリックスを示している（タンパク質データベース  ｎｒ  ４ＣＭＰ４）。構造ドメインは、図１５Ａと同様に、同じ色のスキームを使用して、ＳｐＣａｓ９およびＴｈｅｒｍｏＣａｓ９について示している。
【図１９−２】ＩＩ型Ａ、ＢおよびＣ  Ｃａｓ９オルソログの多重配列整列を示す図である。化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）（Ｓｐ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）（Ｓｔ）、ウオリネラ・サクシノゲネス（Wolinella succinogenes）（Ｗｓ）、ネイッセリア・メニンギティデス（Neisseria meningitides）（Ｎｍ）、アクチノマイセス・ナエスルンディイ（Actinomyces naeslundii）（Ａｎ）、およびゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）（Ｔｈｅｒｍｏ）のＣａｓ９タンパク質配列を、デフォルト設定のＭＥＧＡ７  ２におけるＣｌｕｓｔａｌＷ１を使用して整列させた。ＥＳＰｒｉｐｔ３を使用して、可視化した。厳密に保存された残基は、グレーの背景上の白色の文字で示す。類似残基は、黒色輪郭により白色の縦方向の長方形に、黒色の文字で示す。ピラミッドは、すべての配列において、２つの保存されたヌクレアーゼドメインを示している。横方向の黒色矢印および渦は、それぞれ、ＳｐＣａｓ９二次構造における、β鎖およびα−ヘリックスを示している（タンパク質データベース  ｎｒ  ４ＣＭＰ４）。構造ドメインは、図１５Ａと同様に、同じ色のスキームを使用して、ＳｐＣａｓ９およびＴｈｅｒｍｏＣａｓ９について示している。
【図２０】ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ＰＡＭ決定結果を示す図である。パネル（Ａ）は、ＣＲＩＳＰＲｔａｒｇｅｔ６を使用して、ファージゲノムを用いて得られた２つのヒットを示している。パネル（Ｂ）は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ＰＡＭ解析により得られた、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の７ｎｔ長のコンセンサスＰＡＭの配列ロゴを示している。各位置の文字の高さは、情報内容により測定される。
【図２１】ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９  ＰＡＭ発見を示す図である。２０℃、３７℃、４５℃および６０℃における、様々なＰＡＭを有するＤＮＡ標的のｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイ。その各々が、１つの個別の５’−ＣＣＣＣＣＮＮＡ−３’［配列番号１３］ＰＡＭを含有する、７（２０℃）または１６（３７℃、４５℃、６０℃）の線形プラスミド標的を、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびｓｇＲＮＡと共にインキュベートし、次に、アガロースゲル電気泳動によって、解析した。
【図２２】１つのループを含有する、ｓｇＲＮＡを使用する幅広い温度範囲のＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性を示している。ｔｒａｃｒＲＮＡ足場の予測される３つのステムループの重要性は、ｓｇＲＮＡのトランケートした変異体を転写して、ガイドＲＮＡＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が様々な温度で標的ＤＮＡを切断する能力を評価することにより試験した。上には、様々な温度における、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性に及ぼす１つのループの影響を示す。少なくとも２つの生物学的繰り返しからの平均値が示されており、エラーバーは、Ｓ．Ｄ．を表す。
【図２３−１】ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、触媒として二価陽イオンを使用して、ｄｓＤＮＡ標的化を媒介し、ｓｓＤＮＡを切断しないことを示す図である。パネル（Ａ）は、ＥＤＴＡおよび様々な金属イオンを含むＴｈｅｒｍｏＣａｓ９によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏプラスミドＤＮＡ切断を示す。Ｍ＝１ｋｂのＤＮＡラダー。パネル（Ｂ）は、ｓｓＤＮＡ基質に及ぼすＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性を示す。Ｍ＝１０ｂｐのＤＮＡラダー。
【図２３−２】ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、触媒として二価陽イオンを使用して、ｄｓＤＮＡ標的化を媒介し、ｓｓＤＮＡを切断しないことを示す図である。パネル（Ａ）は、ＥＤＴＡおよび様々な金属イオンを含むＴｈｅｒｍｏＣａｓ９によって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏプラスミドＤＮＡ切断を示す。Ｍ＝１ｋｂのＤＮＡラダー。パネル（Ｂ）は、ｓｓＤＮＡ基質に及ぼすＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性を示す。Ｍ＝１０ｂｐのＤＮＡラダー。
【図２４】ｌｄｈＬサイレンシング実験に関するスペーサー選択を示す図である。ｌｄｈＬサイレンシング過程の間の、スペーサー（ｓｇＲＮＡ）−プロトスペーサーアニールの概略図である。選択したプロトスペーサーは、ｌｄｈＬ遺伝子の開始コドンの下流の非鋳型鎖および３９ｎｔに存在する。
【図２５】ｐＥＭＧ主鎖、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ｐｙｒＦ隣接領域およびｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子、およびシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ｐｙｒＦターゲッティングｓｇＲＮＡからなる、プラスミドｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｐｐΔｐｙｒＦのマップを示す図である。
【図２６】シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）のゲノムに由来するＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくｐｙｒＦ欠失過程から得られたコロニーに関する、ゲノム特異的ＰＣＲから得られた生成物を示す、キャピラリーゲル電気泳動の結果を示す図である。１８５４ｂｐのバンドおよび１１１２ｂｐのバンドは、それぞれ、ｐｙｒＦおよびΔｐｙｒＦ遺伝子型に対応する。
【発明を実施するための形態】
【０１７９】
以下は、本発明に従って使用されるＣａｓタンパク質のポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列である。
【０１８０】
［配列番号１］ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２  Ｃａｓ９タンパク質アミノ酸配列
【０１８１】
【化１】
2020510410.tif 000003
【０１８２】
［配列番号７］ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）Ｔ１２  Ｃａｓ９  ＤＮＡ配列
【０１８３】
【化２−１】
2020510410.tif 000004
【０１８４】
【化２−２】
2020510410.tif 000005
【実施例】
【０１８５】
[実施例１]
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）の単離
驚くべきことに、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）は、嫌気性条件下でリグノセルロース基質を分解することができる好熱菌についての±５００単離菌のライブラリーの探索中に発見された。当初、±５００単離菌のライブラリーが確立され、これはセルロースおよびキシラン上での単離により数回の選択ラウンド後に、１１０単離菌にまで削減された。１１０単離菌のこのライブラリーはゲオバチルス（Geobacillus）単離菌のみからなり、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）がライブラリーの７９％を占めていた。
【０１８６】
単離されたゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）菌株は「Ｔ１２」と命名された。Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２に由来するＣａｓ９タンパク質は、「ｇｔＣａｓ９」と命名された。
【０１８７】
[実施例２]
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）でのＣａｓ９について必須のコンセンサス配列を定義する
以下のデータベース探索および整列が実施された。
ｐＢＬＡＳＴおよびｎＢＬＡＳＴは社内ＢＬＡＳＴサーバーで実施し、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２のタンパク質または遺伝子配列を問い合わせ配列として使用した。このデータベースは２０１４年５月に最後にアップデートされ、したがって、最も最近に追加されたゲオバチルス（Geobacillus）ゲノムを含有していないが、通常のオンラインＢＬＡＳＴはＴ１２配列の公開を防ぐために使用されなかった。ＢＬＡＳＴ中の４０％を超えることが分かった配列同一性を図１に含む。
【０１８８】
もっと最近の配列データを含めるために、ゲオバチルス（Geobacillus）ＭＡＳ１（ｇｔＣａｓ９に最も密接に関係している）の配列を使用してＮＣＢＩウェブサイト上でＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを実施した（Johnson et al., 2008 Nucleic Acids Res. 36(Web Server issue): W5-9）。２連続ラウンドのＰＳＩ−ＢＬＡＳＴが実施され、そこでは以下の基準：第１のラウンドでは最小配列包括度９６％、ならびに第２および第３のラウンドでは９７％、最小同一性４０％、種当たり１つの菌株のみを満たした配列のみが次のラウンドで使用された。
【０１８９】
ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴから生じる配列、ならびに内部サーバーｐＢＬＡＳＴ由来のＴ１２に対して４０％よりも大きな同一性を有し、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴには現われなかった配列を、現在十分に特徴付けられている中温性配列と、および、これらの配列がもっと離れた関係にある場合には、現在同定されているすべての好熱性配列とも整列させ、それから近隣結合樹を構築した（図１参照）。整列はＣｌｕｓｔａｌＷを使用してＭｅｇａ６で実施し、この後近隣結合法を使用して樹を構築し、ブートストラップ解析は１０００レプリケートを使用して実施した。
【０１９０】
問い合わせ配列としてゲオバチルス（Geobacillus）属種ＭＡＳ１を使用してＢＬＡＳＴｎを実施した場合、ゲオバチルス（Geobacillus）属種ＪＦ８  Ｃａｓ９のみが８８％の同一性で同定され、遺伝子レベルでは相同性が極めて少ないことを示していた。図２はＣｌｕｓｔａｌ整列Ｃａｓ９遺伝子配列の近隣結合樹である。
【０１９１】
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２、アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）および化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）のタンパク質配列は、デフォルト設定のＢＬＯＳＵＭ６２を使用してＣｌｏｎｅＭａｎａｇｅｒでその配列を整列させることによりタンパク質ドメイン相同性についてさらに解析した（図３参照）。
【０１９２】
[実施例３]
ＣＡＳ９の機能に不可欠であるコアアミノ酸モチーフおよび好熱性Ｃａｓ９ヌクレアーゼの熱安定性を与えるコアアミノ酸モチーフを同定する
上記整列されたタンパク質配列のパーセント同一性は図１に与えられている。ｇｔＣａｓ９はＩＩ−Ｃ型に属している。ＩＩ−Ｃ型系の最もよく研究され、最近結晶化された構造はアクチノマイセス・ネスランディ（Actinomyces naeslundii）由来である（Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997）。このタンパク質配列はｇｔＣａｓ９に対して２０％の同一性しか示していないが、高度に保存された残基を推定するのに使用することが可能である。２つの十分に特徴付けられているＩＩ−Ａ型系（化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）およびストレプトコッカス・サーモフィルス（S. thermophilus））も分析に含まれた（Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997；Nishimasu et al., 2014, Cell 156: 935-949）。これら４つのタンパク質配列の整列は図３に示されており、図４はアクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）について決定されたタンパク質構成（「Ａｎａ−Ｃａｓ９」）を示している（Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997）。Ｔ１２（ｇｔＣａｓ９）およびアクチノマイセス・ネスランディ（Actinomyces naeslundii）由来のＣａｓ９の長さは極めて類似しており（アクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）１１０１アミノ酸、ｇｔＣａｓ９  １０８２アミノ酸）、ｇｔＣａｓ９は類似するタンパク質構成を有すると予想されるが、Ｃａｓ９−Ａｎａに対する全体の配列同一性が２０％にすぎないために、これはまだ確定されていない。Jinek et al.（Jinek et al., 2014, Science 343: 1247997）により記載されているアクチノマイセス・ネスランディ（A. naeslundii）および化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）由来のＣａｓ９中の活性部位残基はすべてｇｔＣａｓ９において同定することができた（図３参照）。ＰＡＭ結合ドメインは化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）ＩＩ−Ａ型系については決定されているが、いかなるＩＩ−Ｃ型系についても決定されておらず、したがって、化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）配列においてのみ示されている。さらに、ＰＡＭ認識部位は、ＣＲＩＳＰＲ系間だけでなく、同じ系を含有する種間でも大きく変化する。ＰＡＭに関するさらなる情報については、問題点４および将来計画を参照されたい。
【０１９３】
[実施例４]
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）ｇｔＣａｓ９のＰＡＭ配列の決定
原核生物ＣＲＩＳＰＲ系が適応免疫系としてその宿主に役立ち（Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821）、迅速で効果的な遺伝子工学のために使用することが可能であること（Mali et al., 2013, Nat Methods 10: 957-963）は確立されている。
【０１９４】
Ｃａｓ９タンパク質はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のための配列特異的ヌクレアーゼとして機能する（Makarova et al., 2011, Nat Rev Micro 9: 467-477）。小型ｃｒＲＮＡ分子は、繰り返し領域に連結している「スペーサー」（標的）からなり、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の転写およびプロセシング産物である。「スペーサー」は天然にはバクテリオファージのゲノムおよび可動遺伝要素に起源をもつが、遺伝子工学工程中に特定のヌクレオチド配列を標的にするように設計することも可能である（Bikard et al., 2013, Nucleic Acids Research 41: 7429-7437）。ｃｒＲＮＡ分子はそのＤＮＡ標的の同定のためのガイドとしてＣａｓ９により用いられる。スペーサー領域は、切断ＤＮＡ領域の標的物、「プロトスペーサー」と同一である（Brouns et al., 2012, Science 337: 808-809）。ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）は、プロトスペーサーの隣にあり、Ｃａｓ９による標的の認識に必要である（Jinek et al., 2012, Science 337: 816-821）。
【０１９５】
ＩＩ型系に関する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのＰＡＭ決定検討を行うために、ｔｒａｃｒＲＮＡ発現モジュールであるこの系のＣＲＩＳＰＲアレイをｉｎ  ｓｉｌｉｃｏで予測することが必要である。ＣＲＩＳＰＲアレイを、ｃｒＲＮＡモジュールの特定に使用する。ｔｒａｃｒＲＮＡ発現配列は、５００ｂｐ窓隣接Ｃａｓ９内、またはＣａｓ遺伝子とＣＲＩＳＰＲ遺伝子座との間のどちらかに位置する（Chylinski, K., et al. (2014） Classification and evolution of type II CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 42, 6091-6105）。ｔｒａｃｒＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲアレイの直接繰り返しに対する相補性のレベルが高い、５’配列からなるはずであり、２つ以上のステムループ構造の予測構造、およびＲｈｏ独立性転写停止シグナルが後に続く（Ran, F.A., et al. (2015) In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186-191）。次に、キメラｓｇＲＮＡモジュールを設計するために、ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ分子を使用することができる。ｓｇＲＮＡの５’末端は、トランケートされた２０ｎｔ長のスペーサー、その後に、ＣＲＩＳＰＲアレイの１６〜２０ｎｔ長のトランケートされた繰り返しからなる。この繰り返しの後に、対応するトランケートされた抗繰り返しおよびｔｒａｃｒＲＮＡモジュールのステムループが続く。ｓｇＲＮＡの繰り返しおよび抗繰り返し部分は、ＧＡＡＡリンカーにより一般に接続されている（Karvelis, T., et al. (2015) Rapid characterization of CRISPR-Cas9 protospacer adjacent motif sequence elements. Genome Biol. 16, 253）。
【０１９６】
Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G.thermodenitrificans）Ｔ１２型ＩＩｃ  ＣＲＩＳＰＲ系のｃａｓ遺伝子（ｃａｓ９、次いでｃａｓ１およびｃａｓ２の遺伝子が続く）は、Ｔ１２染色体のアンチセンス鎖を使用して転写される。ｃａｓ２遺伝子の後に、転写時に、多重ループを有するＲＮＡ構造を形成する、１００ｂｐ長のＤＮＡ断片が続く。この構造は、明らかに、転写ターミネータとして働く。
【０１９７】
１１の繰り返しおよび１０のスペーサー配列を有するＣＲＩＳＰＲアレイは、転写終止配列の上流に位置し、このアレイのリーダーは、このアレイの５’末端に位置する。ｔｒａｃｒＲＮＡに転写されるＤＮＡ遺伝子座は、ｃａｓ９遺伝子の下流であることが予想される。ＣＲＩＳＰＲアレイから３６ｂｐ長の繰り返しを含むｃａｓ９遺伝子の右側下流の３２５ｂｐ長の配列のアライメントにより、ｔｒａｃｒＲＮＡ遺伝子座における３６ｂｐ長の配列が、この繰り返しにほとんど同一であることが明らかになった（図６に示されている）。この結果により、本発明者らは、ｔｒａｃｒＲＮＡ遺伝子座の転写の方向は、ＣＲＩＳＰＲアレイの転写の方向とは反対となるはずであるという結論に至った。したがって、ｔｒａｃｒＲＮＡの５’末端は、ｃｒＲＮＡの３’末端に相補的であり、Ｃａｓ９二重ＲＮＡ分子により必要とされるものの形成に至る。
【０１９８】
[実施例５]
無作為化されたＰＡＭを有する標的生成
ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２菌株のＣＲＩＳＰＲ  ＩＩ遺伝子座由来の２つの異なるスペーサーを、鋳型としてゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２ゲノムＤＮＡを使用してＰＣＲにより増幅させた。２対の縮重プライマーをそれぞれのスペーサーの増幅のために使用した。
【０１９９】
第１に、「プロトスペーサー」断片の上流に６つの無作為ヌクレオチドの導入を引き起こす対を使用し、無作為化されたＰＡＭ配列を有するプロトスペーサーのプールを作製した。
【０２００】
第２に、「プロトスペーサー」断片の下流に６つの無作為ヌクレオチドの導入を引き起こす対を使用し、無作為化されたＰＡＭ配列を有するプロトスペーサーのプールを作製した。
【０２０１】
作製された断片はｐＮＷ３３ｎベクターにライゲートされ、６ヌクレオチド長ＰＡＭそれぞれの考えられる４０９６の異なる組合せすべてを有する「プロトスペーサー」構築物の４プールを作製した。構築されたＤＮＡはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２細胞の形質転換のために使用された。細胞はクロラムフェニコール選択上に蒔かれ、それぞれのプロトスペーサープールから２×１０６を超える細胞がプールされることになる。プラスミドＤＮＡはプールから抽出され、標的領域はＰＣＲ増幅されることになり、その産物はディープシークエンシングのために送られた。最も少ないリードを有するＰＡＭは活性であると見なされ、その工程はこれらのＰＡＭを有するスペーサーを含有するｐＮＷ３３ｎ構築物のみを用いて繰り返されることになる。ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２の形質転換効率が減少していることはＰＡＭの活性を立証することになる。
【０２０２】
[実施例６]
ｇｔＣａｓ９のＰＡＭ配列のｉｎ  ｖｉｔｒｏ決定
ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔベクターの構築
ｃａｓ９ｇｔ遺伝子は、ＢＧ６９２７およびＢＧ６９２８プライマーを使用する、Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２ゲノムからＰＣＲ増幅し、１つの混合物中のｐＲｈａｍ  Ｃ−Ｈｉｓ  Ｋａｎベクター（Ｌｕｃｉｇｅｎ）と一緒にした。この混合物を、提示されているプロトコルに従い、Ｅ．ｃｌｏｎｉサーモコンピテント細胞を変換するために使用した。変換混合物からの１００μｌを、３７℃で一晩、成長させるため、ＬＢ＋５０カナマイシンプレート上でプレート培養した。形成したＥ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔ単一コロニー３の中から、無作為に選択し、５０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する１０ｍｌのＬＢ培地中に播種した。各培養物からの１ｍｌに滅菌グリセロールを最大で２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加することにより、グリセロール保存溶液を培養物から分離した。グリセロール保存溶液を−８０℃で保管した。各培養物からの残りの９ｍｌを、「ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ」（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）プロトコルに従い、プラスミド単離に使用した。このプラスミドをｃａｓ９ｇｔの配列確認のために送り、これらのプラスミドの１つを、右側配列を含む遺伝子を含有していることを確認した。対応する培養物は、ｇｔＣａｓ９の非相同性の発現および精製のためにさらに使用した。
【０２０３】
Ｅ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔベクターにおける、ｇｔＣａｓ９の非相同性の発現
対応するグリセロール保存溶液を含む１０ｍｌのＬＢ＋５０カナマイシンを接種した後に、Ｅ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔ事前培養物を調製した。３７℃および１８０ｒｐｍで一晩、成長させた後、ＬＢ＋５０カナマイシン培地の２００ｍｌを接種するため、事前培養物から２ｍｌを使用した。Ｅ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔ培養物を３７℃、１８０ｒｐｍで、ＯＤ６００が０．７になるまで、インキュベートした。次に、０．２％ｗ／ｖの最終濃度まで、Ｌ−ラムノースを加えることにより、ｇｔＣａｓ９発現を誘発させた。この発現を８時間、進行させ、この後に、培養物を４７００ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離し、細胞を収穫した。培地を廃棄し、ペレット化した細胞を、−２０℃で保管するか、または以下のプロトコルに従い、細胞不含抽出物（ＣＦＥ）の調製に使用した。
１．２０ｍｌ音波照射緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．５）、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５％（ｖ／ｖ）グリセロール、１ｍＭのＤＴＴ）中に上記のペレットを再懸濁させる。
２．超音波処理（３０秒のパルスを８回、その間、氷上で２０秒間、冷却）によって１ｍｌの細胞を破壊する。
３．不溶部分を沈殿させるために、３５０００ｇ、４℃で１５分間、遠心分離する。
４．上澄み液を除き、４℃で、または氷上でこの上澄み液を保管する。
【０２０４】
ｇｔＣａｓ９に対するｓｇＲＮＡモジュールを標的とするＰＡＭライブラリーの設計および構築
Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２株（上の実施例４を参照されたい）のゲノムにおいて、ｔｒａｃｒＲＮＡを発現するＤＮＡモジュールのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ決定の後に、単一分子におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡモジュールを組み合わせる、単一ガイド（ｓｇ）ＲＮＡ発現ＤＮＡモジュールを設計した。プラスミドライブラリーのプロトスペーサーに相補的であるように、ｓｇＲＮＡの５’末端におけるスペーサーを設計し、モジュールを、Ｔ７プロモーターの転写制御下で設定した。ｐＴ７＿ｓｇＲＮＡ  ＤＮＡモジュールは、Ｂａｓｅｃｌｅａｒにより合成して、ｐＵＣ５７ベクターに受け、ｐＵＣ５７：ｐＴ７＿ｓｇＲＮＡベクターを形成させた。ＤＨ５αの有能な大腸菌（E. coli）細胞（ＮＥＢ）をベクターで形質転換し、この変換混合物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ寒天プレート上でプレート培養した。このプレートを３７℃で一晩、インキュベートした。形成した単一コロニーのうちの３つを、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する１０ｍｌのＬＢ培地に播種した。各培養物からの１ｍｌに滅菌グリセロールを最大で２０％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加することにより、グリセロール保存溶液を培養物から分離した。グリセロール保存溶液を−８０℃で保管した。各培養物からの残りの９ｍｌを、「ＧｅｎｅＪＥＴ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ」（Ｔｈｅｒｍｏｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）プロトコルに従い、プラスミド単離に使用した。単離したプラスミドを使用して、ｐＴ７＿ｓｇＲＮＡモジュールの増幅用のＰＣＲ鋳型として使用した。２１８ｂｐ長のｐＴ７＿ｓｇＲＮＡ  ＤＮＡモジュール（その中で、第１の１８ｂｐがｐＴ７に相当する）は、プライマーＢＧ６５７４およびＢＧ６５７５を使用して得た。完全ＰＣＲ混合物を１．５％アガロースゲル上で泳動させた。所望のサイズを有するバンドを切り取り、「Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）ゲルＤＮＡ回収キット」プロトコルに従い精製した。
【０２０５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写（ＩＶＴ）は、「ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ」（ＮＥＢ）を使用して行った。精製済みｐＴ７＿ｓｇＲＮＡ  ＤＮＡモジュールを鋳型として使用した。ＩＶＴ混合物を等しい体積のＲＮＡローディング色素（ＮＥＢ）と混合し、二次構造を破壊するため、７０℃で１５分間、加熱した。熱処理したＩＶＴ混合物を、変性ウレア−ＰＡＧＥ上で泳動し、得られたポリアクリルアミドゲルを、染色目的のため、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０μｌ含有する１００ｍｌの０．５×ＴＢＥ緩衝液中で１０分間、エンバプティズ（embaptise）した。所望のサイズ（２００ｎｔ）のバンドを切り取り、以下のＲＮＡ精製プロトコルに従い、ｓｇＲＮＡを精製した：
１．外科用メスを用いてＲＮＡゲル剤断片を裁断し、１ｍｌのＲＮＡ溶出緩衝液を加え、室温で一晩、放置した。
２．３３０μＬの一定分量分を、新しい１．５ｍｌの管に分割する。
３．事前冷却（−２０℃）した１００％ＥｔＯＨを３体積分（９９０μｌ）加える。
４．−２０℃で、６０分間、インキュベートする。
５．マイクロ遠心器中、室温で、２０分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離する。
６．ＥｔＯＨを除去して、７０％ＥｔＯＨ１ｍｌによりペレットを洗浄する。
７．マイクロ遠心器中、室温で、５分間、１３０００ｒｐｍで遠心分離する。
８．９９０μｌの上澄み液を除去する。
９．５５℃で１５〜２０分間、サーモミキサー中の残りのＥｔＯＨを蒸発させる。
１０．２０μｌのＭＱ中にペレットを再懸濁し、−２０℃で保管する。
【０２０６】
７ｎｔ長のＰＡＭライブラリーの設計および構築、ならびにライブラリーの線形化
ＰＡＭライブラリーの設計および構築は、ｐＮＷ３３ｎベクターに基づいた。２０ｂｐ長のプロトスペーサーを、長さ７の縮重ヌクレオチド配列により、その３’側で隣接しているベクターに導入した。縮重配列は、ＰＡＭとして働き、プロトスペーサーが、右ＰＡＭにより隣接すると、ｓｇＲＮＡを搭載したＣａｓ９により標的として認識されて切断され得る。ＰＡＭライブラリーは、以下のプロトコルによって調製した：
１．一本鎖ＤＮＡオリゴ１（ＢＧ６４９４）および２（ＢＧ６４９５）をアニールすることによりＳｐＰＡＭ二本鎖ＤＮＡインサートを調製する。
Ｉ．１０μｌの１０×ＮＥ緩衝液２．１
ＩＩ．１μｌの５０μＭオリゴ１（約１．１２５μｇ）
ＩＩＩ．１μｌの５０μＭオリゴ２（約１．１２５μｇ）
ＩＶ．８５μｌのＭＱ
Ｖ．この混合物を９４℃で５分間、インキュベートし、０．０３℃／秒の速度で３７℃まで冷却する。
２．１μｌのＫｌｅｎｏｗ  ３’→５’エキソ−ポリメラーゼ（ＮＥＢ）を加え、それぞれアニールしたオリゴ混合物、次に、１０μＭのｄＮＴＰ２．５μｌを加える。３７℃で１時間、次に、７５℃で２０分間、インキュベートする。
３．アニール混合物４６μｌに２μｌのＨＦ−ＢａｍＨＩおよび２μｌのＢｓｐＨＩ制限酵素を加える。３７℃で１時間、インキュベートする。この過程により、粘着末端を有するＳｐＰＡＭｂｂインサートとなる。Ｚｙｍｏ  ＤＮＡクリーニングおよびコンセントレータキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、作製したインサートを清浄する。
４．ＨＦ−ＢａｍＨＩおよびＢｓｐＨＩ（ＮＥＢ）によりｐＮＷ３３ｎを消化し、Ｚｙｍｏ  ＤＮＡクリーニングおよびコンセントレータキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、粘着端部を有する３．４００ｂｐ長の線形ｐＮＷ３３ｎｂｂ断片を精製する。
５．提示されているプロトコルに準拠し、ＮＥＢ  Ｔ４リガーゼを使用して、１１ｎｇのＳＰＰＡＭｂｂインサートにより５０ｎｇのｐＮＷ３３ｎＢＢをライゲートする。Ｚｙｍｏ  ＤＮＡクリーニングおよび  コンセントレータキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、ライゲート混合物を精製する。
６．ＤＨ１０ｂエレクトロコンピテント細胞（５００ｎｇのＤＮＡを含む２００μｌの細胞）を形質転換する。ＳＯＣ培地（８００μｌのＳＯＣ中に２００μｌの細胞）中に１時間、細胞を回収し、次に、回収した細胞を５０ｍｌのＬＢ＋１２．５μｇ／ｍｌクロラムフェニコールに接種する。３７℃および１８０ｒｐｍで、培養物を一晩、インキュベートする。
７．ＪｅｔＳｔａｒ  ２．０ｍａｘｉｐｒｅｐキット（ＧＥＮＯＭＥＤ）を使用して、この培養物からプラスミドＤＮＡを単離する。
８．単離したプラスミドを線形化するために提示されているプロトコルに準拠し、ＳａｐＩ（ＮＥＢ）制限液を使用する。
【０２０７】
ＰＡＭ決定反応の設計および実施
標的したプロトスペーサーの３’末端の右側ＰＡＭ下流を含有する、ＰＡＭライブラリーメンバーへのｄｓＤＮＡ切断のｇｔＣａｓ９誘発性導入を行うために、以下の切断反応を設定した：
１．反応あたり、Ｅ．ｃｌｏｎｉ：：ｐＲｈａｍ：ｃａｓ９ｇｔ  ＣＦＥを２．５μｇ
２．ｓｇＲＮＡを３０ｎＭの最終濃度まで
３．反応あたり、線形化ＰＡＭライブラリーを２００ｎｇ
４．切断緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７．５）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５％（ｖ／ｖ）グリセロール、５ｍＭのＤＴＴ）を２μｌ
５．ＭＱ水を最大２０μｌの最終体積まで
【０２０８】
この反応物を６０℃で１時間、インキュベートし、６×ゲル搭載色素（ＮＥＢ）４μｌを加えた後に停止した。この反応混合物を、１％のアガロースゲルにロードした。ゲルに１００Ｖで１時間１５分の長さの電気泳動にかけ、次に、１０μｌのＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ  色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含有する０．５×ＴＡＥ緩衝液１００ｍｌ中で３０分間、インキュベートした。青色光を用いてＤＮＡバンドを可視化した後、首尾よく切断され、かつＰＡＭを含有するＤＮＡ断片に対応するバンドをゲルから切り出し、提示されているプロトコルに準拠して、「Ｚｙｍｏｃｌｅａｎ（商標）ゲルＤＮＡ回収キット」を使用してゲルを精製した。
【０２０９】
配列決定するための、ＰＡＭ含有ｇｔＣＡｓ９切断ＤＮＡ断片のタグ付け
Ｃａｓ９誘発性ＤＮＡ切断は、ＰＡＭ配列に対して近位の、プロトスペーサーの第３と第４のヌクレオチドとの間に、通常、導入される。その結果、さらなるオンシークエンス（on sequence）およびＰＡＭ配列を決定するため、切断したＤＮＡ断片のＰＡＭ含有部分をＰＣＲ増幅することができる、一対のプライマーを設計することができない。この目的の場合、５つの工程を使用した：
工程１：ＴａｑポリメラーゼによるＡテーリング
Ａテーリングは、Ｔａｑポリメラーゼを使用する、平滑二本鎖ＤｎＡ分子の３’末端に鋳型化されていないアデニンを付加する過程である。
反応構成成分：
・ｇｔＣａｓ９切断およびＰＡＭ含有ＤＮＡ断片  −  ２００ｎｇ
・１０×ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ（登録商標）緩衝液（ＮＥＢ）  −  ５μｌ
・１ｍＭ  ｄＡＴＰ  −  １０μｌ
・Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）  −  ０．２μｌ
・Ｈ２Ｏ−最大で５０μｌの最終反応体積
・インキュベート時間  −  ２０分間
・インキュベート温度  −  ７２℃
【０２１０】
工程２：配列決定アダプターの構築
２つの短い相補的ｓｓＤＮＡオリゴヌクレオチドをリン酸化し、アニールして、工程１からのＤＮＡ断片のＰＡＭ近位部に対する配列決定アダプターを形成させた。オリゴヌクレオチドのうちの１つは、Ａテールド断片に対するアダプターのライゲートを容易にするため、その３’末端におけるさらなるチミンを有した。
アダプターオリゴヌクレオチドリン酸化（各オリゴの個々のリン酸化反応）
・１００μＭオリゴヌクレオチド保存溶液  −  ２μＬ
・１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液（ＮＥＢ）  −  ２μＬ
・滅菌ＭＱ水  −  １５μＬ
・Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＮＥＢ）  −  １μＬ
・インキュベート時間  −  ６０分間
・インキュベート温度  −  ３７℃
・Ｔ４  ＰＮＫ不活性化  −  ６５℃で２０分間
リン酸化オリゴヌクレオチドのアニール
・オリゴヌクレオチド１  −  対応するリン酸化混合物から５μＬ
・オリゴヌクレオチド１  −  対応するリン酸化混合物から５μＬ
・滅菌ＭＱ水  −  ９０μＬ
・リン酸化オリゴを、９５℃で３分間、インキュベートする。室温で約３０分間から１時間、反応物をゆっくりと冷却する。
【０２１１】
工程３：配列決定アダプターによる、ｇｔＣａｓ９切断した、Ａテールド断片のライゲート
工程１および２の生成物は、以下のプロトコルに従い、ライゲートした。
・１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ緩衝液  −  ２μｌ
・生成物工程１  −  ５０ｎｇ
・生成物工程２  −  ４ｎｇ
・Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ  −  １μｌ
・滅菌ＭＱ水  −  ２０μｌまで
・インキュベート時間  −  １０分間
・インキュベート温度  −  ２０〜２５℃
・６５℃で１０分間、熱不活性化
【０２１２】
工程４：１５０ヌクレオチド長のＰＡＭ含有断片のＰＣＲ増幅
工程４のライゲート混合物からの５μｌを、Ｑ５  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）を使用して、ＰＣＲ増幅の鋳型として使用した。工程２からのチミン伸長によるオリゴヌクレオチドを、フォワードプライマーとして使用し、ＰＡＭ配列の下流の１５０ヌクレオチドをアニールするようリバースプライマーを設計した。
【０２１３】
非ｇｔＣａｓ９処理ＰＡＭライブラリーＤＮＡを鋳型として使用して、同一配列を増幅した。両方のＰＣＲ生成物をゲル精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００ペアド末端配列決定（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ）に送った。
【０２１４】
候補ＰＡＭ配列の配列決定結果および決定の解析
配列決定の結果を解析後、以下の頻度マトリックスを構築した。このマトリックスは、ｇｔＣａｓ９により消化した、および消化されなかったライブラリーの各ＰＡＭ位における、各ヌクレオチドの相対存在量を図示している。
【０２１５】
2020510410.tif 000006
【０２１６】
これらの結果は、ＰＡＭ５位におけるシトシンを標的とすることが明確に好ましいこと、および最初の４つのＰＡＭ位におけるシトシンを標的とすることが好ましいことを示している。
【０２１７】
[実施例７]
ｇｔＣａｓ９のＩｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ＰＡＭ予測
十分なプロトスペーサー配列が、ゲノムデータベースに利用可能である場合、ＰＡＭのＩｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測が可能である。ｇｔＣａｓ９  ＰＡＭのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測は、ＧｅｎＢａｎｋなどのゲノムデータベースにおける配列と比較することにより、Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２株のゲノムにおける、ＣＲＩＳＰＲアレイからのスペーサーのヒットを特定することから始まった。「ＣＲＩＳＰＲファインダー」（http://crispr.u-psud.fr/Server/）ツールを使用して、Ｔ１２における候補ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を特定した。次に、特定したＣＲＩＳＰＲ遺伝子座出力値を、選択データベースを検索し、プロトスペーサーとマッチする出力値をもたらす、「ＣＲＩＳＰＲ標的」（http://bioanalysis.otago.ac.nz/CRISPRTarget/crispr_analysis.html）ツールにロードした。次に、これらのプロトスペーサー配列を、特有のヒットに関して、およびスペーサーに対する相補性に関してスクリーニングした。例えば、シード配列のミスマッチは、ポジティブヒットの不良である可能性が高いと見なし、さらなる解析から除外した。プロファージ配列および（統合）プラスミドに対する同一性を伴うヒットにより、得られたヒットは真のポジティブとなることが実証された。全体として、この過程により、６つの単一ヒットが生じた（図７）。続いて、残りの特有のプロトスペーサーヒットの隣接領域（ＩＩ型ｇｔＣａｓヌクレアーゼの場合、３’）をアラインし、ＷｅｂＬｏｇｏ（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）を使用して、コンセンサス配列を比較した（Crooks GE, Hon G, Chandonia JM, Brenner SE WebLogo: A sequence logo generator, Genome Research, 14:1188-1190, (2004)）ツール（図８）。
【０２１８】
ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏの結果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＡＭの同定実験結果と比較し（実施例６を参照されたい）、この場合、ＰＡＭ配列の第５の残基をシトシンと同一であるとバイアスをかけた。
【０２１９】
[実施例８]
ｇｔＣａｓ９の８ヌクレオチド長のＰＡＭ配列の決定
実施例８からのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏデータは、ｇｔＣａｓ９が、８位にアデノシンが存在することがある程度好ましいことが示唆され、したがって、さらなるＰＡＭ決定実験を行い、この場合、ＰＡＭ配列の８位も同様に試験した。これは、プロトスペーサーの３’末端における、５位と８位との間に伸長していることが見いだされた、中温ブレビバチルス・ラテロスポラス（Brevibacillus laterosporus）ＳＳＰ３６０Ｄ４（Ｋａｒｖｅｌｉｓら、２０１５年）であるＣａｓ９ＰＡＭ配列の特徴と一致する。
【０２２０】
ＰＡＭの特異的な長さ８のヌクレオチド配列変異体を、ｇｔＣａｓ９で予備試験した：
１）ＣＮＣＣＣＣＡＣ［配列番号１７］、
２）ＣＣＣＣＣＣＡＧ［配列番号１８］、
３）ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］、
４）ＣＣＣＣＣＣＡＴ［配列番号１９］、
５）ＣＣＣＣＣＣＡＣ［配列番号２０］、
６）ＮＮＮＮＴＮＮＣ（ネガティブ対照ＰＡＭ）
【０２２１】
ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］配列をＰＡＭとして使用した場合、６０℃でｉｎ  ｖｉｔｒｏで切断アッセイを行った後、精製ｇｔＣａｓ９によるこれらのターゲティング（非線形化）プラスミド、およびｇｔＣａｓ９切断活性の向上前と同じｓｇＲＮＡ（実施例６を参照されたい）が観察された（図９）。しかし、切断活性は、ネガティブ対象のＰＡＭ配列の場合、かすかな切断バンドが観察された場合でさえも、すべての試験ＰＡＭ配列に対して、切断活性が明確に検出可能であった。特定の理論に縛られたくはないが、ネガティブ対照の場合に観察される切断に寄与する高いｇｔＣａｓ９濃度の使用が可能である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいてＣａｓ９濃度が高いと、厳密なＰＡＭ要件なしに、Ｃａｓ９誘発性ＤＮＡ切断に至ることが一般に観察されている。
【０２２２】
Ｃａｓ９濃度は、一般に、Ｃａｓ９誘発性ＤＮＡ切断の効率に影響を及ぼすことが知られている（Ｃａｓ９濃度が高いほど、Ｃａｓ９活性は高い）。このことは、ＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］ＰＡＭ配列を含む標的プラスミドおよび異なるｇｔＣａｓ９濃度を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを行った場合にも観察された（図１０）。
【０２２３】
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合のＣＣＣＣＣＣＡＡ［配列番号１１］ＰＡＭ配列を含む標的プラスミドを、３８と７８℃の間の幅広い温度範囲で行った（図１１）。驚くべきことに、ｇｔＣａｓ９は、すべての温度において活性であり、最高の活性は、４０．１と６４．９℃の間にあった。
【０２２４】
したがって、ゲオバチルス（Geobacillus）属種由来のＣａｓ９の最適温度範囲は今日まで特徴付けられているＣａｓ９タンパク質よりもはるかに高い。同様に、ゲオバチルス（Geobacillus）属種由来のＣａｓ９がヌクレアーゼ活性を保持する範囲の最上方は既知のＣａｓ９タンパク質よりもはるかに高い。より高い最適温度および機能的範囲は高温での遺伝子工学に、したがって、好熱性生物のゲノムの編集に著しい利点を与え、これは高温で実行される様々な工業、農業および製薬工程において有用性がある。
【０２２５】
[実施例９]
ｇｔＣａｓ９および８ヌクレオチド長のＰＡＭ配列による、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８のｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集
８ヌクレオチドＰＡＭもやはり、ｉｎ  ｖｉｖｏでｇｔＣａｓ９により認識されることを確認するため、５５℃でバチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８のゲノムにおけるｐｙｒＦ遺伝子を欠失するよう設計を行った。
【０２２６】
この方法は、相同組換え鋳型構築物の提供に依存し、ここでは、標的（ｐｙｒＦ）遺伝子の上流および下流に相補的である領域が、Ｂ・スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８細胞にもたらされる。鋳型の導入により、相同組換え法を使用して、相同組換え鋳型（ｐｙｒＦ遺伝子を含まない）をゲノムに導入し、こうして、細胞のゲノムにおけるＷＴ  ｐｙｒＦ遺伝子を置き換える。
【０２２７】
相同組換え構築物にｇｔＣａｓ９およびｓｇＲＮＡを含ませることを使用して、ＷＴ  ｐｙｒＦを含有する細菌ゲノムに二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＤＢ）を導入することができる。細菌のゲノムにおけるＤＳＤＢは、通常、細胞死をもたらす。したがって、ＷＴ  ｐｙｒＦの配列を認識するｓｇＲＮＡは、ＤＳＤＢ、およびＷＴ  ｐｙｒＦしか含有しない細胞の死滅をもたらす。ＤＳＤＢの導入は、好適なＰＡＭ配列が、ｇｔＣａｓ９により認識されるプロトスペーサーの３’末端において、下流に位置していることにやはり依存する。
【０２２８】
ｐＮＷ３３ｎプラスミドは、主鎖としてクローニングに使用した：
ｉ）自家開発グルコース抑制プロモーターの制御下でのｃａｓ９ｇｔ遺伝子、および
ｉｉ）Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムからのｐｙｒＦ遺伝子の欠失をもたらす相同組換えの鋳型として、Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムにおける、ｐｙｒＦ遺伝子の１ｋｂ上流領域および１ｋｂ下流領域、および
ｉｉｉ）構成プロモーターの転写制御下での単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）発現モジュール。
【０２２９】
単一ガイドＲＮＡの配列が、ゲノムにおけるその特異的ＤＮＡ標的にｇｔＣａｓ９をガイドする配列に相当する最初の２０ヌクレオチドにおいて相違点がある、３種の個別の構築物が生成された（スペーサーとしても知られている）。Ｂ・スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のｐｙｒＦ遺伝子におけるすべての３つの異なる候補プロトスペーサーを標的とするよう、３つの異なるスペーサー配列を設計した。これらの構築物は、本明細書において、それぞれ、構築物１、２および３と呼ばれる。
【０２３０】
３つの異なる標的プロトスペーサーは、それらの３’末端において、以下の候補ＰＡＭ配列を有した：
１．ＴＣＣＡＴＴＣＣ  （ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの結果によるネガティブ対照；構築物番号３にコードされるｓｇＲＮＡによりターゲティングされたプロトスペーサーの３’末端）
２．ＡＴＣＣＣＣＡＡ（構築物番号１［配列番号２１］にコードされるｓｇＲＮＡによりターゲティングされたプロトスペーサーの３’末端）
３．ＡＣＧＧＣＣＡＡ（構築物番号２；［配列番号２２］にコードされるｓｇＲＮＡによりターゲティングされたプロトスペーサーの３’末端）
【０２３１】
３つの構築物の１つおよび選択プレート上のプレート培養を、Ｂ・スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８細胞に形質転換した後、以下の結果が得られた：
１．細胞が、３’末端（構築物番号３）においてネガティブ対照であるＴＣＣＡＴＴＣＣ  ＰＡＭ配列を有するプロトスペーサーを標的とする構築物により形質転換しても、形質転換効率は影響を受けなかった（図１２Ａ）。コロニー数は、ｐＮＷ３３ｎポジティブ対照構築物による変換後のコロニー数と同じ範囲にあった（図１２Ｂ）。ｐｙｒＦ遺伝子が欠失されたコロニーをスクリーニングするために、コロニーＰＣＲに施した１５のコロニーの中で、欠失遺伝子型−２．１ｋｂ予期バンドサイズを示すものはなく、すべて、野生型−２．９ｋｂ予期バンドサイズであった（図１３）。このことは、試験したＰＡＭは、確かに、ｉｎ  ｖｉｖｏでｇｔＣａｓ９により認識されなかったことを示している。
２．ポジティブ対照（ｐＮＷ３３ｎで形質転換した細胞）と比較すると、細胞が構築物番号１により形質転換されると、わずか数個のコロニーしか得られなかった（図１２Ｃ）。２０のコロニーに、ｐｙｒＦ遺伝子を欠失したコロニーをスクリーニングするためのコロニーＰＣＲを施した。コロニーの大部分（１９）は、野生型およびｐｙｒＦ欠失遺伝子型の両方を含有した一方、１つのコロニーは、ｐｙｒＦ欠失遺伝子型を有した（図１４）。この結果により、ＷＴのみの遺伝子型が観察されなかったので、ＰＡＭ配列ＡＴＣＣＣＣＡＡ［配列番号２１］は、ｇｔＣａｓ９によってｉｎ  ｖｉｖｏで認識されることが示された。低下した形質転換効率はまた、細胞集団の割合が低下したことをやはり示し、このことは、ｇｔＣａｓ９によるターゲティングの成功によって、ＤＳＤＢによるＷＴのみの遺伝子型細胞に引き起こされる細胞死に寄与し得る。
３．細胞が構築物番号２により形質転換されると、コロニーが得られなかった（図１２Ｄ）。コロニーが欠如したことは、細胞集団のすべてがｇｔＣａｓ９により首尾よくターゲティングされ、これにより、ＤＳＤＢにより引き起こされる細胞死に至ったことを示す。これは、ＡＣＧＧＣＣＡＡ［配列番号２２］ＰＡＭ配列が、ｇｔＣａｓ９によって認識されることを示唆する。
【０２３２】
これらの結果は、ｇｔＣａｓ９が、５５℃で、ｉｎ  ｖｉｖｏで、上記のＰＡＭ配列により活性となること、すなわち、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＡＭ決定結果と一致する結果となることを示している。さらに、それは、プラスミド媒介性相同組換え鋳型と組み合わせて、同一温度においてゲノム編集ツールとして使用することができる。
【０２３３】
[実施例１０]
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の同定および精製
本発明者らは、６５℃で、最適成長温度を有する中程度のグラム陽性好熱性細菌である、ゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）株Ｔ１２を単離して配列決定した（Daas et al. Biotechnol. Biofuels 9, 210(2016)）。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が好熱性細菌に存在しない以前の特許請求とは対照的に（Li et al. Nucleic Acids Res. 44, e34-e34(2016)）、配列決定結果により、Ｇ．サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２のゲノムにおいて、ＩＩＣ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が存在することが明らかになった（図１５Ａ）。この系（ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９）のＣａｓ９エンドヌクレアーゼは、ＳｐＣａｓ９（１３６８アミノ酸）などの他のＣａｓ９オルソログと比べて、比較的小さな（１０８２アミノ酸）であると予測された。サイズ差異は大部分が、他の小さなＣａｓ９オルソログに関して実証された通り、トランケートされたＲＥＣローブによるものである（図１９）（Ran et al. Nature 520, 186-191 (2015)）。さらに、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、少なくともＧ．サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２の最適温度付近で、活性であることが予期された（Daas et al. Biotechnol. Biofuels 9, 210(2016)）。本発明者らは、クエリーとしてＴｈｅｒｍｏＣａｓ９配列を使用して、ＮＣＢＩ／非冗長タンパク質配列データセットにおいて、ＢＬＡＳＴ−Ｐ検索を行い、大部分がゲオバチルス属（Geobacillus）内に、いくつかの高度に同一性のＣａｓ９オルソログ（タンパク質レベルで８７〜９９％の同一性、表１）であることを見いだし、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、好熱性細菌の高度の保存された防御系の部分となるという考えが支持された（図１５Ｂ）。これらの特徴により、好熱性微生物の場合、およびタンパク質の頑健性の増強が必要な条件の場合の、ゲノム編集およびサイレンシングツールとして実施するための候補可能性となり得ることが示唆される。
【０２３４】
本発明者らは、既に記載した手法を使用して、Ｇ．サーモデニトリフィカンス（Ｇ.thermodenitrificans）Ｔ１２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡモジュールのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測を最初に行った（Mougiakos et al. Trends Biotechnol. 34, 575-587(2016)；Ran et al. Nature 520, 186-191(2015)）。この予測に基づいて、予測した全サイズのｃｒＲＮＡ（３０ｎｔ長のスペーサー、その後に３６ｎｔ長の繰り返し）とｔｒａｃｒＲＮＡ（３６ｎｔ長の抗繰り返し、その後に３つの予測ヘアピン構造を有する８８ｎｔ配列が続く）とを連結することにより、１９０ｎｔのｓｇＲＮＡキメラを設計した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、大腸菌（E. coli）に異種発現させ、均一に精製した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９にｓｇＲＮＡを搭載すると、タンパク質が安定化すると仮定して、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｓｇＲＮＡを搭載した精製済みアポＴｈｅｒｍｏＣａｓ９およびＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を、６０℃および６５℃で、１５分間および３０分間、インキュベートした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析により、精製したＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は６５℃において変性するが６０℃では変性しない一方、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体の変性温度は、６５℃を超えることが示された（図１５Ｃ）。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の実証された熱安定性により、熱耐性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集ツールとして、その潜在性があることが示され、本発明者らに、一層詳細に、一部の関連分子特徴の解析を促した。
【０２３５】
【表１】
2020510410.tif 000007
【０２３６】
[実施例１１]
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９  ＰＡＭ決定
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の特徴付けに対する第１の工程は、ＤＮＡ標的の切断の成功に対するそのＰＡＭ優先性のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ予測であった。本発明者らは、Ｇ．サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２  ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の１０のスペーサーを使用し、ＣＲＩＳＰＲｔａｒｇｅｔを使用する、ウイルス中の潜在的なプロトスペーサーおよびプラスミド配列を探索した（Biswas et al. RNA Biol. 10, 817-827(2013)）。ファージゲノムにより、わずか２つのヒットしか得られなかったので（図２０Ａ）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＡＭ決定手法を用いて進めることに決めた。本発明者らは、マッチングプロトスペーサーにより、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくターゲティング線形ｄｓＤＮＡ基質に対するスペーサーを含有する、予測ｓｇＲＮＡ配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写した。プロトスペーサーは、無作為化した７塩基対（ｂｐ）配列により、３’末端において隣接した。５５℃でＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づく切断アッセイを行った後、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９  ＰＡＭ優先性を特定するため、ライブラリーの切断されたメンバーにディープ配列決定を行い（対照として非標的ライブラリー試料も一緒）、比較した（図１６Ａ）。配列決定結果により、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、中温性Ｃａｓ９変異体と同様に、３位と４位のＰＡＭ近位ヌクレオチドとの間に大部分位置する、二本鎖ＤＮＡ切断を導入することが明らかとなった。さらに、切断された配列は、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、５’−ＮＮＮＮＣＮＲ−３’ＰＡＭを認識し、ＰＡＭ１、３、４および６位において、わずかにシトシン優先性がある（図１６Ｂ）。最近の検討により、ある種のＩＩＣ型Ｃａｓ９オルソログの標的認識に対するＰＡＭ８位の重要性が明らかとなった（Karvelis et al. Genome Biol. 16, 253(2015)；Kim et al. Genome Res. 24, 1012-9(2014)）。この目的のために、およびｉｎ  ｓｉｌｉｃｏでのＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ＰＡＭ予測からの結果を考慮すると、本発明者らは、追加的なＰＡＭ決定アッセイを行った。これにより、ＰＡＭ８位におけるアデニンの存在下で、最適標的効率となることが明らかになった（図１６Ｃ）。興味深いことに、ヒット数が限定されるにも関わらず、上述のｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ  ＰＡＭ予測（図２０Ｂ）はまた、ＰＡＭ５位におけるシトシンおよびＰＡＭ８位におけるアデニンの重要性がやはり示唆された。
【０２３７】
ＰＡＭ６位およびＰＡＭ７位におけるＰＡＭの不明確さをさらに明確にするため、本発明者らは、マッチングプロトスペーサーが、５’−ＣＣＣＣＣＮＮＡ−３’［配列番号１３］ＰＡＭにより隣接された、一式の１６の異なる標的ＤＮＡ断片を生成した。これらの断片の切断アッセイ（各々は、第６および第７のヌクレオチドの特有の組合せを有する）を行い、この場合、様々な構成成分（ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９、ｓｇＲＮＡガイドＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ標的）を、異なる温度（２０℃、３０℃、３７℃、４５℃、５５℃および６０℃）で１０分間、個別に予め加熱した後、それらを一緒にして、対応するアッセイ温度で１時間、インキュベートした。アッセイを３７℃と６０℃との間の温度で行った場合、異なるＤＮＡ基質はすべて切断された（図１６Ｄ、図２１）。しかし、最も消化された標的断片は、ＰＡＭ配列（ＰＡＭ５から８位）５’−ＣＮＡＡ−３’および５’−ＣＭＣＡ−３’からなる一方、最も消化されなかった標的は、５’−ＣＡＫＡ−３’ＰＡＭを含有した。３０℃では、最適なＰＡＭ配列（ＰＡＭ５から８位）５’−ＣＮＡＡ−３’および５’−ＣＭＣＡ−３’を有するＤＮＡ基質の切断しか、観察されなかった（図２Ｄ）。最後に、２０℃では、（ＰＡＭ５から８位）５’−ＣＶＡＡ−３’および５’−ＣＣＣＡ  ＰＡＭ配列を有するＤＮＡ基質しか標的とならず（図２１）、これらの配列が最も好ましいＰＡＭになった。これらの知見により、その温度下限値では、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、好ましいＰＡＭを有する断片しか切断しないことが実証される。この特徴は、例えば、標的外作用を回避するため、ｉｎ  ｖｉｖｏでの編集過程の間に利用することができる。
【０２３８】
[実施例１２]
熱安定性およびトランケート
予測したｔｒａｃｒＲＮＡは、抗繰り返し領域と、その後の３つのヘアピン構造からなる（図１７Ａ）。ｃｒＲＮＡと共にｔｒａｃｒＲＮＡを使用して、ｓｇＲＮＡキメラを形成させると、ＤＮＡ基質ＲＮＡの案内された切断が成功した。二重ガイド天然状態に良好に類似する可能性が最も高い、完全長繰り返し−抗繰り返しヘアピンのスペーサー遠位末端の４１−ｎｔ長の欠失（図１７Ａ）は、ＤＮＡ切断効率にほとんどまたは全く影響を及ぼさなかったことが観察された。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の切断効率に及ぼす予測ヘアピン（図１７Ａ）のさらなるトランケートの影響を、一連の時間で切断を行うことにより評価し、この場合、すべての構成成分（ｓｇＲＮＡ、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９、基質ＤＮＡ）を、様々な温度（３７〜６５℃）で１分間、２分間および５分間、個別に事前加熱した後、それらを一緒にして、様々なアッセイ温度（３７〜６５℃）において１時間、インキュベートした。ｔｒａｃｒＲＮＡ足場の予測したステム−ループの数は、ＤＮＡ切断において重要な役割を果たすように思われる。３つのループがすべて存在する場合、切断効率は、すべての試験温度で最高であった一方、その効率は、３’ヘアピンの除去時に、低下した（図１７Ｂ）。さらに、切断効率は、ミドルヘアピンと３’ヘアピンの両方を除去すると、劇的に低下した（図２２）。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を６５℃で１分間または２分間、事前加熱すると検出可能な切断がもたらされた一方、切断活性は、５分間のインキュベート後、消失した。熱安定性アッセイにより、３’ステムループのないｓｇＲＮＡ変異体は、６５℃において、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９タンパク質の安定性が低下し、完全長ｔｒａｃｒＲＮＡは、高温において、最適なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくＤＮＡ切断にとって必要であることを示している。さらに、本発明者らはまた、スペーサー配列の長さ（２５〜１８ｎｔ）を変えて、２３、２１、２０および１９のスペーサー長さは、最も高い効率で標的を切断することを見いだした。切断効率は、１８ｎｔのスペーサーを使用した場合、著しく低下する。
【０２３９】
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ  ＲＮＰ複合体は、おそらくは、数分以内に形成される。上記の知見と一緒にすると、このことにより、本発明者らは、ＲＮＰの活性および熱安定性を評価することが促された。事前に構築されたＲＮＰ複合体を６０℃、６５℃および７０℃で５分間および１０分間、加熱した後、予め加熱したＤＮＡを加え、次いで、６０℃、６５℃および７０℃で１時間、インキュベートした。顕著なことに、本発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９  ＲＮＰは、７０℃で５分間、事前加熱したにもかかわらず、７０℃まで活性であることを観察した（図１７Ｃ）。この知見により、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９安定性は、適切なｓｇＲＮＡガイドの会合と強く関連しているという本発明者らの仮説が確認された（Ma et al., Mol. Cell 60, 398-407(2015)）。
【０２４０】
一部の用途では、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、幅広い温度活性範囲を有することが有利である、すなわち、低温と高温の両方で機能的であると思われる。同様に、一部の状況では、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性が、より狭い温度範囲に制限され得る場合、例えば、低温または高温でしか活性でない場合に、有利になると思われる。したがって、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、標的化切断もしくは結合を可能にする温度の範囲、または標的化切断または結合が、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９または関連エレメント（ｓｇＲＮＡなど）の構造的特徴を改変することによって効率的に行われる温度の範囲を操作する能力により、核酸配列の操作全体にわたり、より高いレベルの制御を行い得ると思われる。したがって、本発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の温度範囲と、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）の温度範囲との比較に着手した。Ｃａｓ９ホモログのどちらにも、２０と６５℃の間のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性アッセイを施した。どちらもタンパク質も、ｓｇＲＮＡおよび標的ＤＮＡ分子を添加する前に、対応するアッセイ温度で５分間、インキュベートした。以前の解析２６に一致して、中温性ＳｐＣａｓ９は、２５と４４℃の間でしか活性でなかった（図１７Ｄ）。これらの温度より高い場合、ＳｐＣａｓ９は活性は、非検出レベルまで急速に低下した。対照的に、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９切断活性は、２５と６５℃の間で検知された（図１７Ｄ）。このことは、好熱性生物と中温生物の両方に対するゲノム編集ツールとして、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を使用する可能性を示している。
【０２４１】
以前に特徴付けられた中温性Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、二価陽イオンを使用して、標的ＤＮＡにおけるＤＳＢの生成を触媒する（Jinek et al. Science 337, 816-821(2012)；Chen et al. J. Biol. Chem. 289, 13284-13294(2014)）。陽イオンが、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９によってＤＮＡ切断に寄与することを評価するため、プラスミド切断アッセイは、以下の二価陽イオン：Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎｉ２＋およびＣｕ２＋のうちの１つの存在下で行った。陽イオンキレート剤であるＥＤＴＡを用いるアッセイをネガティブ対照として含めた。予期される通り、標的ｄｓＤＮＡは、二価陽イオンの存在下で切断され、ＥＤＴＡの存在下では不活性のままであった（図２３Ａ）。あるＩＩＣ型系は、効率的な一本鎖ＤＮＡカッターであるという報告（Ma et al. Mol. Cell 60, 398-407(2015)；Zhang et al. Mol. Cell 60, 242-255(2015)）に基づいて、本発明者らは、ｓｓＤＮＡ基質に及ぼすＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性を試験した。しかし、切断は観察されず、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、ｄｓＤＮＡヌクレアーゼであることが示される（図２３Ｂ）。
【０２４２】
[実施例１３]
好熱性Ｂ．スミシイ（B. smithii）における、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づく遺伝子欠失
本発明者らは、好熱性細菌に対するＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくゲノム編集ツールの開発に着手した。ここで、本発明者らは、５５℃で培養した、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）ＥＴ１３８を使用して、原理の証明を示す。最小限の遺伝部分を使用するため、本発明者らは、単一プラスミド手法に従った。本発明者らは、バチルス・コアグランス（Bacillus coagulans）に由来する構成的ｐｔａプロモーター（Ｐｐｔａ）の制御下で、目的の遺伝子内のＣａｓ９誘発性二本鎖ＤＮＡ切断、およびｓｇＲＮＡ発現モジュールを修復するための、相同組換え鋳型である、天然のｘｙｌＬプロモーター（ＰｘｙｌＬ）の制御下で、ｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子を含有するｐＮＷ３３ｎをベースとする、一連のｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９プラスミドを構築した。
【０２４３】
第１の目的は、Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムに由来する完全長ｐｙｒＦ遺伝子の欠失であった。ｐｙｒＦ遺伝子の様々な部位を標的とするスペーサーを有する、様々なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ガイドの発現について、ｐＮＷ３３ｎに由来するプラスミドｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｂｓΔｐｙｒＦ１およびｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｂｓΔｐｙｒＦ２を使用した一方、第３のプラスミド（ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌ）は、ｓｇＲＮＡ発現モジュールにおいて、ランダム非標的スペーサーを含有した。対照プラスミドｐＮＷ３３ｎ（ガイドなし）およびｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿  ｃｔｒｌによる、５５℃でのＢ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８コンピテント細胞の形質転換により、それぞれ、約２００のコロニーが形成した。スクリーニングした１０のｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿  ｃｔｒｌコロニーの中から、ΔｐｙｒＦ遺伝子型を含有するものはなく、Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８における相同組換えは、クリーンな変異体を得るには不十分であるという以前の検討からの知見が確認された（Mougiakos et al. ACS Synth. Biol. 6, 849-861(2017)；Bosma et al. Microb. Cell Fact. 14, 99(2015)）。対照的に、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｂｓΔｐｙｒＦ１およびｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｂｓΔｐｙｒＦ２プラスミドによる形質転換は、それぞれ、２０および０のコロニーとなり、５５℃におけるＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を確認し、タンパク質の上記の幅広いｉｎ  ｖｉｔｒｏでの温度範囲が立証付けられた。１０のスクリーニングされたｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ΔｐｙｒＦ１コロニーのなかで、１つが、クリーンなΔｐｙｒＦ変異体となった一方、残りは、混合型の野生型／ΔｐｙｒＦ遺伝子型（図４Ｂ）を有し、標的されたｐｙｒＦ遺伝子の設計された相同性特異的な修復が成功したので、この系の適応性が証明された。それにもかかわらず、厳密に制御されたＳｐＣａｓ９に基づく対向選択系では、本発明者らは、ｐｙｒＦ欠失効率が一層高くなることを以前に開発した（Olson et al., Curr. Opin. Biotechnol. 33, 130-141(2015)）。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくツールでは、得られた形質転換体およびクリーンな変異体の数が少ないことは、非常に活性なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の構成的発現を組み合わされた、Ｂ．スミシイ（B. smithii）では、低い相同組換え効率となることにより説明することができる（Olson et al., Curr. Opin. Biotechnol. 33, 130-141(2015)）。厳密に制御可能なプロモーターの使用は、効率が向上することが予測される。
【０２４４】
[実施例１４]
中温性生物シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）におけるＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づく遺伝子欠失
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づくゲノム編集ツールの適用性を広げるため、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏの結果が、ｉｎ  ｖｉｖｏで確認することができるかどうかを評価するため、中温性グラム陰性菌であるＰ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０におけるその活性を、相同組換えとＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づく対向選択とを組み合わせることにより評価した。この生物の場合、Ｃａｓ９をベースとするツールは、これまで、報告されてこなかった。本発明者らは、もう一度、単一プラスミド手法に従った。本発明者らは、ｐｙｒＦ遺伝子の欠失のための相同組換え鋳型である、３ーメチルベンゾエート誘発性Ｐｍ−プロモーターの制御下でのｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子、および構成的Ｐ３プロモーターの制御下でのｓｇＲＮＡ発現モジュールを含有するｐＥＭＧをベースとするｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｐｐΔｐｙｒＦプラスミドを構築した。Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０細胞の形質転換、およびプラスミド統合のＰＣＲ確認後、コロニーを３７℃で一晩の培養のために、選択的な液体培地中に接種した。一晩、培養物を選択的培地の接種に使用し、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９発現を３ーメチルベンゾエートにより誘発させた。続いて、希釈物を３−メチルベンゾエートを補給した、非選択的培地上にプレート培養した。比較のため、３−メチルベンゾエートによる誘発性ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９発現のない並行実験を行った。その過程は、誘発性培養物の場合、７６のコロニーとなり、非誘発性対照培養物の場合、５２のコロニーとなった。誘発性培養物の場合、３８のコロニー（５０％）は、クリーンな欠失遺伝子型を有し、６つのコロニーが混合型野生型／欠失遺伝子型を有した。それどころか、非誘発性培養物のわずか１つのコロニー（２％）しか、欠失遺伝子型を有しておらず、混合型野生型／欠失遺伝子型を有するコロニーは回収されなかった（図２４）。これらの結果は、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を使用して、３７℃で成長すると、中温性Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０における効率的な対向選択ツールとして使用することができることを示している。
【０２４５】
[実施例１５]
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に基づいた遺伝子サイレンシング
効率的な熱活性転写サイレンシングＣＲＩＳＰＲｉツールは、現在、利用可能ではない。このような系は、いくつかの用途に有用となり得る。例えば、このような系は、好熱菌の代謝検討をかなり容易にすると思われる。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の触媒的に死滅した変異体は、ｄｓＤＮＡ切断を導入することなく、ＤＮＡエレメントに容易に結合することにより、この目的を果たすことができる。この目的のため、本発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のＲｕｖＣおよびＨＮＨ触媒ドメインを特定し、死滅（ｄ）ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を作製するための対応するＤ８ＡおよびＨ５８２Ａ変異を導入した。設計した配列の確認後、Ｔｈｅｒｍｏ−ｄＣａｓ９は、異種生成して、精製し、上述のＴｈｅｒｍｏＣａｓ９アッセイにおいて使用されものと同一のＤＮＡ標的によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの切断アッセイに使用した。切断は観察されず、ヌクレアーゼの触媒的不活性が確認された。
【０２４６】
Ｔｈｅｒｍｏ−ｄＣａｓ９に基づくＣＲＩＳＰＲｉツールの開発に対して、本発明者らは、Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８のゲノムから、高度に発現したｌｄｈＬ遺伝子の転写サイレンシングを目的とした。本発明者らは、ｐＮＷ３３ｎベースとするベクターｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬおよびｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｃｔｒｌを構築した。どちらのベクターも、ＰｘｙｌＬプロモーターの制御下でのｔｈｅｒｍｏ−ｄＣａｓ９遺伝子、および構成的Ｐｐｔａプロモーターの制御下でのｓｇＲＮＡ発現モジュールを含有した（図４Ｃ）。ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬプラスミドは、Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８において、１３８ｌｄｈＬ遺伝子の５’末端における非鋳型ＤＮＡ鎖を標的とするスペーサーを含有した（図Ｓ７）。位置および標的鎖選択は、これまでの検討に基づき（Bikard et al. Nucleic Acids Res. 41. 7429-7437(2013)；Larson et al. Nat. Protoc. 8, 2180-2196(2013)）、ｌｄｈＬ遺伝子の有効な下方調節を目的とした。ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｃｔｒｌプラスミドは、ｓｇＲＮＡ発現モジュールにおける、無作為非標的スペーサーを含有した。構築物を使用して、５５℃でＢ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８コンピテント細胞を形質転換し、次いでＬＢ２寒天プレート上に播種して、当量のコロニーが得られた。構築物あたり約７００のコロニーのうちの２つを、既に示した通り、非好気性ラクテート生成条件下で、２４時間、培養するために選択した。（Bosma et al. Appl. Environ. Microbiol. 81, 1874-1883(2015)）。ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬ培養物の成長は、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｃｔｒｌ培養物の成長より５０％少なかった（図４Ｅ）。本発明者らは、ｌｄｈＬ遺伝子の欠失は、微好気性条件下で、ＬｄｈをベースとするＮＡＤ＋再生成能力の欠如により、Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８において、深刻な成長遅延に至ることを以前に示している（Bosma et al. Microb. Cell Fact. 14, 99 (2015)）。したがって、成長の観察された低下は、ｌｄｈＬ遺伝子の転写阻害、およびＮＡＤ＋再生成能力の欠失による、その後の酸化還元不均衡により引き起こされる可能性が高い。実際に、ＨＰＬＣ分析により、ｌｄｈＬサイレンシングした培養物のラクテート生成が４０％低下することが明らかになり、ＲＴ−ｑＰＣＲ解析により、ｌｄｈＬ遺伝子の転写レベルは、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｃｔｒｌ培養物と比べて、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬ培養物中で顕著に低下することが示された（図４Ｅ）。
【０２４７】
［実施例１６］
まとめ
大部分のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓの用途は、Ｃａｓ９およびＣａｓ１２ａなどのクラス２ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質によるＲＮＡにより案内されるＤＮＡ干渉に基づく（Komor et al., Cell 168, 20-36(2017)；Puchta, Curr. Opin. Plant Biol. 36, 1-8(2017)；Xu et al. J. Genet. Genomics 42, 141-149(2015)；Tang et al. Nat. Plants 3, 17018(2017)；Zetsche et al. Nat. Biotechnol. 35, 31-34(2016)；Mougiakos et al., Trends Biotechnol. 34, 575-587(2016)）。本検討の前に、その数種が好熱菌のゲノム編集に使用されてきた、好熱性細菌および古細菌に存在する非常に多量のクラス１  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系（Li et al. Nucleic Acids Res. 44, e34-e34(2016)）とは対照的に、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ免疫系は、特定されておらず、好熱性微生物に特徴付けられていない（Makarova et al., Nat. Rev. Microbiol. 13, 722-736(2015)；Weinberger et al., MBio 3, e00456-12(2012)）。その結果、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ技術の応用は、使用したＣａｓ−エンドヌクレアーゼの中温性性質のため、４２℃未満の温度に主に限定された。したがって、これは、偏性好熱菌における、および高温を必要とし、かつ／またはタンパク質安定性の改善された実験手法におけるこれらの技法の用途を除外する。
【０２４８】
発明者らは、本発明者らが、以前にコンポストから単離した株である、好熱性細菌Ｇ・サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２に由来する、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９、Ｃａｓ９オルソログを特徴付けている（Daas et al. , Biotechnol. Biofuels 9, 210(2016)）。データマイニングにより、他の好熱菌のゲノムにおいて、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９とほぼ同一のさらなるＣａｓ９オルソログが存在することが明らかになり、バチルス属（Bacillus）およびゲオバチルス属（Geobacillus）の少なくとも一部の群では、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＩＩ型系が好熱菌に存在することを最初に示した。本発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が、２０〜７０℃の幅広い温度範囲において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、活性であり、この温度範囲は、その中温性オルソログＳｐＣａｓ９の２５〜４４℃の範囲よりもかなり幅広いことを示した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の活性および安定性の延長により、２０〜７０℃の温度においてＤＮＡ操作を必要とする、分子生物学技法におけるその応用、および強固な酵素活性を必要とする過酷な環境でのその実施が可能となる。さらに、本発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の熱安定性を付与するのに重要な、いくつかの因子を特定した。第１に、本発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のＰＡＭ優先性は、温度範囲の低い方（≦３０℃）の部分で活性に対して非常に厳密である一方、ＰＡＭの多数の種類が、中温から最適温度（３７〜６０℃）において、活性となり得ることを実証した。第２に、発明者らは、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９活性および熱安定性は、適切なｓｇＲＮＡ案内との会合に強く依存することを実証した。特定の理論に縛られたくはないが、本発明者らは、多重ドメインＣａｓ９タンパク質のこのような安定化は、案内結合時に、ＳｐＣａｓ９に関して記載されている通り、開放／従順状態からむしろ小さくまとまった状態への主要な立体構造変化の結果である可能性が最も高い（Jinek et al. Science  343, 1247997-1247997(2014)）。
【０２４９】
新規なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９のここで記載されている特徴付けに基づいて、発明者らは、厳密な好熱性原核生物に対するゲノム工学ツールの開発に成功した。本発明者らは、５５℃および３７℃において、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９が活発であることを示し、本発明者らは、好熱性Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８および中温性Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０に関する現在のＣａｓ９に基づく工学技術を適用した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の幅広い温度範囲により、単純で有効かつ単一のプラスミドに基づくＴｈｅｒｍｏＣａｓ９手法は、３７℃から７０℃までの温度で成長することができる、好熱性および中温性微生物の幅広い範囲に好適となることが予期される。これは、既存の中温技法を補完し、これらの効率的なツールは、これまで利用不能であった、大きな生物群のための使用することが可能になる。
【０２５０】
所望の形質を有する新規酵素に関する天然源のスクリーニングは、疑問の余地なく、価値がある。これまでの検討により、指向性進化およびタンパク質工学を用いて、一層高い温度まで中温性Ｃａｓ９オルソログを適用することは、好熱性Ｃａｓ９タンパク質の構築２９に対して最良手法になると思われることが示唆される。代わりに、本発明者らは、ある好熱性細菌において、Ｃａｓ９の分岐群を特定し、好熱性生物と中温生物の両方に対する強力なゲノム工学ツールにこれらの熱安定性ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９変異体の１つを形質転換した。この検討により、本発明者らは、Ｃａｓ９に基づくゲノム編集技術の可能性をさらに拡大し、厳しい条件または幅広い温度範囲にわたり活性を必要とする条件下で新規な用途におけるＣａｓ９技術を使用する新しい可能性を広げる。
【０２５１】
[実施例１７]物質および方法：
ａ．  細菌株および成長条件
中等度の好熱菌Ｂ．スミシイ（B. Smithii）ＥＴ１３８ΔｓｉｇＦ  ΔｈｓｄＲ（Mougiakos, et al.,(2017) ACS Synth. Biol. 6, 849-861）を、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を使用して遺伝子編集およびサイレンシング実験に使用した。これを、ＬＢ２培地中にて、５５℃で成長させた（Bosma, et al. Microb. Cell Fact. 14, 99(2015)）。プレート培養の場合、培地１リットル当たり３０ｇの寒天（Ｄｉｆｃｏ）をすべての実験に使用した。必要な場合、クロラムフェニコールを７μｇ／ｍＬの濃度で加えた。タンパク質発現の場合、大腸菌（E.coli）Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）を、温度を１６℃に変更した後、０．５のＯＤ６００ｎｍに到達するまで、１２０ｒｐｍで震とう式インキュベータ中、３７℃のフラスコ中、ＬＢ培地中で成長させた。３０分後、０．５ｍＭの最終濃度になるまで、イソプロピル−１−チオ−β−ｄ−ガル−アクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより発現を誘発させて、この後、インキュベートを１６℃で継続した。ＰＡＭ６位および７位および８位の構築物のクローニングに関すると、製造業者により提供されているマニュアルに従い、ＤＨ５−アルファコンピテント大腸菌（E. coli）（ＮＥＢ）を形質転換し、ＬＢ寒天プレート上にて、３７℃で一晩、成長させた。縮重７−ｎｔ長のＰＡＭライブラリーをクローニングするため、標準的手順に従い（Sambrook, Fritsch & Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual.（Cold Spring Harbor Laboratory, 1989）、エレクトロコンピテントＤＨ１０Ｂ大腸菌（E. coli）細胞を形質転換し、３７℃で一晩、ＬＢ寒天プレート上で成長させた。大腸菌（E. coli）ＤＨ５α  λｐｉｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、Ａｕｓｕｂｅｌらにより記載されている形質転換手順を使用して、Ｐ．プチダ（P. putida）プラスミド構築に使用した（Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, Inc., 2001). doi:10.1002/0471142727）。すべての大腸菌（E. coli）株に関すると、必要な場合、クロラムフェニコールを２５ｍｇ／Ｌの濃度で、およびカナマイシンを５０ｍｇ／Ｌで使用した。特に明記しない場合、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）ＫＴ２４４０（ＤＳＭ６１２５）株を、ＬＢ培地中、３７℃で培養した。必要な場合、カナマイシンを５０ｍｇ／Ｌの濃度で、および３ーメチルベンゾエートを３ｍＭの濃度で加えた。
【０２５２】
ｂ．  ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９発現および精製
ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９をＧ．サーモデニトリフィカンス（G. thermodenitrificans）Ｔ１２のゲノムからＰＣＲ増幅し、次に、クローニングし、大腸菌（E. coli）Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）において異種発現させて、Ｎｉ２＋−親和性陰イオン交換とゲルろ過クロマトグラフィー工程とを組み合わせることによりＦＰＬＣを使用して精製した。遺伝子配列を、オリゴヌクレオチド（表２）を使用して、ライゲート非依存性クローニングにより、プラスミドｐＭＬ−１Ｂ（ＵＣ  Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  ＭａｃｒｏＬａｂ、Ａｄｄｇｅｎｅ  ＃２９６５３から入手）に挿入し、ヘキサヒスチジン配列およびタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）のプロテアーゼ切断部位を含むＮ末端タグと融合した、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ポリペプチド配列（残基１〜１０８２）をコードするタンパク質発現構築物を生成した。触媒的に不活性なＴｈｅｒｍｏＣａｓ９タンパク質（Ｔｈｅｒｍｏ−ｄＣａｓ９）を発現するため、ＰＣＲを使用してＤ８ＡおよびＨ５８２Ａポイント変異を挿入し、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２５３】
【表２−１】
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【０２５４】
【表２−２】
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【０２５５】
【表２−３】
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【０２５６】
【表２−４】
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【０２５７】
【表２−５】
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【０２５８】
【表２−６】
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【０２５９】
【表２−７】
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【０２６０】
【表２−８】
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【０２６１】
【表２−９】
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【０２６２】
【表２−１０】
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【０２６３】
タンパク質は、大腸菌（E. coli）Ｒｏｓｅｔｔａ２（ＤＥ３）株で発現した。培養物を、０．５〜０．６のＯＤ６００ｎｍまで成長させた。発現は、０．５ｍＭの最終濃度までＩＰＴＧを添加することにより誘発させて、インキュベートを１６℃で一晩、継続した。細胞を遠心分離により収穫し、プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  ｃＯｍｐｌｅｔｅ、ＥＤＴＡ不含）およびリゾチームを補給した溶解緩衝液（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８、５００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭのイミダゾール）２０ｍＬに、細胞ペレットを再懸濁した。一旦、超音波ＭＳ７２マイクロチッププローブ（Ｂａｎｄｅｌｉｎ）を使用して、３０％振幅で２秒のパルスおよび２．５秒の休止からなる、５〜８分間の音波照射（Ｓｏｎｏｐｌｕｓ、Ｂａｎｄｅｌｉｎ）によりホモジナイズした細胞を溶解し、次に、１６，０００×ｇで、４℃で１時間、遠心分離にかけ、不溶性物質を除去した。透明になった溶解物を０．２２ミクロンのフィルター（Ｍｄｉ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によりろ過して、ニッケルカラム（Ｈｉｓｔｒａｐ  ＨＰ、ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）に適用し、次に、２５０ｍＭのイミダゾールにより溶出した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を含むフラクションをプールし、透析用緩衝液に一晩、透析した（２５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨおよび１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．５）。透析後、試料は、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ（ｐＨ８）に１：１で希釈し、ＩＥＸ−Ａ緩衝液（１５０ｍＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ８）中で予め平衡したヘパリンＦＦカラムにロードした。カラムをＩＥＸ−Ａにより洗浄し、次に、ＩＥＸ−Ｃ（２ＭのＫＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ／ＫＯＨ、ｐＨ８）のグラジエントにより溶出した。ゲルろ過カラム（ＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）にロードする前に、ＦＰＬＣ（ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ）により、試料を７００μＬまで濃縮した。ゲルろ過からのフラクションを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９を含有するフラクションをプールし、２００μＬ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８、２ｍＭのＤＴＴ、５％グリセロール、５００ｍＭのＮａＣｌ）まで濃縮し、生化学的アッセイのために直接、使用するか、または保管のため、−８０℃で凍結するかのどちらかとした。
【０２６４】
ｃ．  ｓｇＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成
ｓｇＲＮＡモジュールを、５’−ＧＡＡＡ−３’リンカーを含む予測ｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡ配列を融合することにより設計した。ｓｇＲＮＡを発現するＤＮＡ配列は、Ｔ７プロモーターの転写制御下に置いた。これを合成し（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）、ｐＵＣ５７骨格に提供した。生化学反応に使用したｓｇＲＮＡをすべて、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７  Ｈｉｇｈ  Ｙｉｅｌｄ  ＲＮＡ合成キット（ＮＥＢ）を使用して合成した。５’末端にＴ７配列を有する、ｓｇＲＮＡをコードするＰＣＲ断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写反応のための鋳型として、利用した。Ｔ７転写を４時間、行った。ｓｇＲＮＡを電気泳動させて、ウレアＰＡＧＥゲルから切り離し、エタノールによる沈殿を使用して精製した。
【０２６５】
ｄ．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイを精製した組換えＴｈｅｒｍｏＣａｓ９で行った。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９タンパク質、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写したｓｇＲＮＡおよびＤＮＡ基質（表２に記載されているプライマーを使用したＰＣＲ増幅を使用して生成した）を、（他に示さない限り）明記した温度で１０分間、個別にインキュベートし、次いで、構成要素を一緒にして、切断用緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ＝７）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＭｇＣｌ２、２５（Ｖ／Ｖ％）グリセロール、５ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ））中、様々なアッセイ温度で１時間、インキュベートした。各切断反応物は、１６０ｎＭのＴｈｅｒｍｏＣａｓ９タンパク質、４ｎＭの基質ＤＮＡおよび１５０ｎＭの合成したｓｇＲＮＡを含んだ。反応物は、６ｘのロード用色素（ＮＥＢ）を加えることにより停止し、１．５％アガロースゲル上で電気泳動した。ゲルをＳＹＢＲ  ｓａｆｅ  ＤＮＡ染色剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により染色し、ゲルＤｏｃＴＭ  ＥＺゲル画像化システム（Ｂｉｏ−ｒａｄ）で画像化した。
【０２６６】
ｅ．  ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＡＭスクリーニング用ライブラリー構築
ＰＡＭライブラリーの構築の場合、その３’末端にプロトスペーサーおよび７−ｂｐ長の縮重配列を含有する１２２−ｂｐ長のＤＮＡ断片を、プライマーをアニールおよびＫｌｅｎｏｗ断片（エキソ−）（ＮＥＢ）をベースとする伸長により構築した。ＰＡＭ−ライブラリー断片およびｐＮＷ３３ｎベクターをＢｓｐＨＩおよびＢａｍＨＩ（ＮＥＢ）により消化し、次に、ライゲートした（Ｔ４リガーゼ、ＮＥＢ）。ライゲート混合物をエレクトロコンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ１０Ｂ細胞に形質転換し、プラスミドを液体培養物から単離した。７ｎｔ長のＰＡＭ決定法に関しては、プラスミドライブラリーをＳａｐＩ（ＮＥＢ）により線形化し、標的として使用した。アッセイの残りに関すると、ＤＮＡ基質をＰＣＲ増幅により線形化した。
【０２６７】
ｆ．  ＰＡＭスクリーニングアッセイ
ｔｈｅｒｍｏＣａｓ９のＰＡＭスクリーニングを、（反応当たり）１６０ｎＭのＴｈｅｒｍｏＣａｓ９、１５０ｎＭのｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写したｓｇＲＮＡ、４ｎＭのＤＮＡ標的、４μｌの切断用緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、２５％グリセロール）、およびＭＱ水を２０μｌまでの最終反応容積からなる、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイを使用して行った。５５℃の反応から切断断片を含有するＰＡＭをゲル精製し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプターを用いてライゲートし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００配列決定（Ｂａｓｅｃｌｅａｒ）に移送した。ＰＡＭライブラリーにより処理した等量の非ｔｈｅｒｍｏＣａｓ９に、同じ過程を施し、参照として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ２５００配列決定に移送した。基準配列と完全に配列が一致したＨｉＳｅｑの読み取り値を、さらに解析するために選択した。選択された読み取り値から、対照ライブラリーと比べて、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９処置ライブラリーで１０００倍超で存在しているもの、およびＴｈｅｒｍｏＣａｓ９処置ライブラリーで少なくとも１０倍超で存在しているものを、ＷｅｂＬｏｇｏ分析（Crooks et al., Genome Res. 14, 1188-1190(2004)）に使用した。
【０２６８】
ｇ．  Ｂ．スミシイ（B. smithii）およびＰ．プチダ（P. putida）に関する編集およびサイレンシング構築物
プラスミド構築に使用したプライマーおよびプラスミドはすべて、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡアセンブリ（ＮＥＢ）を行うことにより適切な突出部で設計し、それらをそれぞれ、表２および表３に列挙している。プラスミドを組み立てるための断片は、Ｑ５ポリメラーゼ（ＮＥＢ）またはＰｈｕｓｉｏｎ  Ｆｌａｓｈ  Ｈｉｇｈ−Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＣＲにより得て、ＰＣＲ生成物に１％アガロースゲル電気泳動を施し、チモーゲンゲルＤＮＡ回収キット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製した。化学的コンピテント大腸菌（E. coli）ＤＨ５α細胞（ＮＥＢ）に、またはＰ．プチダ（P. putida）構築物では、大腸菌（E. coli）ＤＨ５α  λｐｉｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に、組み立てたプラスミドを形質転換した（後者は、直接的なベクター結合を容易にする）。単一コロニーをＬＢ培地に接種し、ＧｅｎｅＪｅｔプラスミドｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してプラスミド物質を単離し、配列を確認して（ＧＡＴＣ−ｂｉｏｔｅｃｈ）、１μｇの各構築物を、既に記載したプロトコルに従って調製した、Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８エレクトロコンピテント細胞から形質転換した（Bosma, et al. Microb. Cell Fact. 14, 99(2015)）。Ｂ．スミシイ（B. smithii）およびＰ．プチダ（P. putida）液体培養物からゲノムＤＮＡ単離するため、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅ（商標）グラム陽性ＤｎＡ精製キット（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）を使用した。
【０２６９】
ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌの構築の場合、ΔｐｙｒＦ相同組換え隣接部と一緒にしたｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｂｓΔｐｙｒＦ１およびｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｂｓΔｐｙｒＦ２ベクター、ｐＮＷ３３ｎ主鎖を、ｐＷＵＲ＿Ｃａｓ９ｓｐ１＿ｈｒベクターからＰＣＲ増幅した（Mougiakos, et al. ACS Synth. Biol. 6,849-861(2017)）（ＢＧ８１９１およびＢＧ８１９２）。天然ＰｘｙｌＡプロモーターを、Ｂ．スミシイ（B. smithii）ＥＴ１３８（ＢＧ８１９４およびＢＧ８１９５）のゲノムからＰＣＲ増幅した。ｔｈｅｒｍｏｃａｓ９遺伝子は、Ｇ．サーモデニトリフィカン（G. thermodenitrificans）Ｔ１２（ＢＧ８１９６およびＢＧ８１９７）のゲノムからＰＣＲ増幅した。Ｐｐｔａプロモーターは、ｐＷＵＲ＿Ｃａｓ９ｓｐ１＿ｈｒベクターからＰＣＲ増幅した（Mougiakos, et al. ACS Synth. Biol. 6,849-861(2017)）（ＢＧ８１９８およびＢＧ８２６１＿２／ＢＧ８２６３＿ｎｃ２／ＢＧ８３１７＿３）。ｓｇＲＮＡ足場の後のスペーサーは、ｐＵＣ５７＿Ｔ７ｔ１２ｓｇＲＮＡベクターからＰＣＲ増幅した（ＢＧ８２６６＿２／ＢＧ８２６８＿ｎｃ２／８３２０＿３およびＢＧ８２１０）。
【０２７０】
４つの断片アセンブリを設計して、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬベクターの構築を実施した。鋳型としてｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌを使用する２工程ＰＣＲ手法により、最初に、標的ポイント変異をｔｈｅｒｍｏｃａｓ９触媒残基（変異Ｄ８ＡおよびＨ５８２Ａ）のコドンに導入した。第１のＰＣＲ工程（ＢＧ９０７５、ＢＧ９０７６）の間に、所望の変異が、生成したＰＣＲ断片の終了時に導入され、第２の工程の間（ＢＧ９０９１、ＢＧ９０９２）に、生成した断片を適切なアセンブリ−突出部の導入のためのＰＣＲ鋳型として使用した。ｌｄｈＬサイレンシングスペーサーと共に第２の変異の下流にｔｈｅｒｍｏｃａｓ９の一部を、鋳型として、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌを使用してＰＣＲ増幅した（ＢＧ９０７７およびＢＧ９２６７）。ｐＮＷ３３ｎ主鎖を一緒にしたｓｇＲＮＡ足場を、鋳型としてｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌを使用してＰＣＲ増幅した（ＢＧ９２６３およびＢＧ９０８８）。第１の変異の上流にｔｈｅｒｍｏｃａｓ９の部分と一緒にしたプロモーターを鋳型としてｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌを使用してＰＣＲ増幅した（ＢＧ９０８９、ＢＧ９０９０）。
【０２７１】
２つの断片アセンブリを設計して、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｃｔｒｌベクターの構築を実施した。ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬベクターにおけるスペーサー配列を、両末端にＢａｅＩ制限部位を含有するランダム配列で置き換えた。ｐＮＷ３３ｎ主鎖を一緒にしたｓｇＲＮＡ足場を、鋳型としてｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌを使用してＰＣＲ増幅した（ＢＧ９５４８、ＢＧ９６０１）。構築物の他の半分は、Ｔｈｅｒｍｏ−ｄＣａｓ９からなり、プロモーターを鋳型としてｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９ｉ＿ｌｄｈＬを使用して増幅した（ＢＧ９６００、ＢＧ９５４９）。
【０２７２】
５つの断片アセンブリを設計して、Ｐ．プチダ（P. putida）ＫＴ２４４０ベクターｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｐｐΔｐｙｒＦの構築を実施した。自殺ベクターｐＥＭＧ由来のレプリコンをＰＣＲ増幅した（ＢＧ２３６５、ＢＧ２３６６）。ｐｙｒＦの隣接領域を、ＫＴ２４４０ゲノムＤＮＡから増幅した（５７６ｂｐ上流隣接部の場合、ＢＧ２３６７、ＢＧ２３６８であり、５４０ｂｐ下流隣接部の場合、ＢＧ２３６９、ＢＧ２３７０）。隣接部は、プライマーＢＧ２３６７およびＢＧ２３７０を使用して重複伸長ＰＣＲで融合し、プライマーＢＧ２３６８およびＢＧ２３６９の重複を利用した。ｓｇＲＮＡは、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌプラスミドから増幅した（ＢＧ２３７１、ＢＧ２３７２）。構成的Ｐ３プロモーターは、ｐＳＷ＿Ｉ−ＳｃｅＩから増幅した（ＢＧ２３７３、ＢＧ２３７４）。プロモーター断片は、プライマーＢＧ２３７２およびＢＧ２３７３を使用して重複伸長ＰＣＲでｓｇＲＮＡ断片に融合し、プライマーＢＧ２３７１およびＢＧ２３７４の重複を利用した。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９は、ｐＴｈｅｒｍｏＣａｓ９＿ｃｔｒｌプラスミドから増幅した（ＢＧ２３７５、ＢＧ２３７６）。ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９の３ーメチルベンゾエート誘発に使用されることになる、誘発性Ｐｍ−ＸｙｌＳ系は、ｐＳＷ＿Ｉ−ＳｃｅＩから増幅した（ＢＧ２３７７、ＢＧ２３７８）。
【０２７３】
【表３−１】
2020510410.tif 000018
【０２７４】
【表３−２】
2020510410.tif 000019
【０２７５】
【表３−３】
2020510410.tif 000020
【０２７６】
ｈ．  Ｐ．プチダ（P. putida）の編集プロトコル
Ｃｈｏｉら（Choi et al., J. Microbiol. Methods 64, 391-397(2006)）に従い、Ｐ．プチダ（P. putida）へのプラスミドの形質転換を行った。統合体の形質転換および選択後に、培養物を一晩、接種した。３ｍｌの新しい選択培地を接種するために、一晩の培養物１０μｌを使用し、３７℃で２時間の成長後、ＴｈｅｒｍｏＣａｓ９に３−メチルベンゾエートで誘発させた。さらに６時間後、３−メチルベンゾエートを補給した、非選択的培地上に培養物の希釈物をプレート培養した。対照培養物の場合、３ーメチルベンゾエートの添加をすべての工程において省略した。Ｐ．プチダ（P. putida）染色体におけるプラスミド統合の確認は、プライマーＢＧ２３８１およびＢＧ２１３５を用いるコロニーＰＣＲにより行った。ｐｙｒＦ欠失の確認は、プライマーＢＧ２３８１およびＢＧ２３８２を用いるコロニーＰＣＲにより行った。
【０２７７】
ｉ．  ＲＮＡ単離
ＲＮＡ単離は、既に記載したプロトコルに基づいて、フェノール抽出により行った（van Hijum et al. BMC Genomics 6, 77 (2005)）。１０ｍＬ培養物を４℃、４８１６×ｇで１５分間、一晩、遠心分離にかけ、直ちにＲＮＡ単離に使用した。培地の除去後、細胞を０．５ｍＬの氷冷ＴＥ緩衝液（ｐＨ８．０）中で懸濁させ、氷上で維持した。試料をすべて、０．５ｇのジルコニウムビーズ、３０μＬの１０％ＳＤＳ、３０μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）および５００μＬのＲｏｔｉ−フェノール（ｐＨ４．５〜５．０、Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ）を含有する２つの２ｍＬのスクリューキャップ付き管に分割した。細胞を、５５００ｒｐｍで４５秒間、ＦａｓｔＰｒｅｐ−２４装置（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を使用して破壊し、４℃および１００００ｒｐｍで５分間、遠心分離にかけた。各管からの水相４００μＬを新しい管に移送し、ここに、４００μＬのクロロホルム−イソアミルアルコール（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ  ＧｍｂＨ）を加え、この後、試料を４℃および１８４００×ｇで３分間、遠心分離にかけた。水相３００μＬを新しい管に移送し、高純度のＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ）からの溶解緩衝液３００μＬと混合した。続いて、ＤＮアーゼインキュベート工程を除き（これは、４５分間、行った）、このキットからの手順の残りを、製造業者のプロトコルに従って行った。ｃＤＮＡの濃度および統合を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ−１０００  Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙを使用して決定し、単離したＲＮＡの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ１００で確認した。
【０２７８】
ｊ．ＲＴ−ｑＰＣＲによるｍＲＮＡの定量
製造業者のプロトコルに従いＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、単離ＲＮＡのための、第１の鎖ｃＤＮＡ合成を行った。Ｑｕａｎｔａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製のＰｅｒｆｅＣＴａ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ  ｆｏｒ  ｉＱを使用して、ｑＰＣＲを行った。４０ｎｇのｃＤＮＡライブラリーをそれぞれ、鋳型としてｑＰＣＲに使用した。２組のプライマー：ｌｄｈＬ遺伝子の１５０ｎｔ長の領域を増幅するＢＧ９６６５：ＢＧ９６６６、およびｒｐｏＤ（ＲＮＡポリメラーゼシグマ因子）遺伝子の１５０ｎｔ長の配列を増幅するＢＧ９８８９：ＢＧ９８９０を使用し、これは、ｑＰＣＲの対照として使用した。ｑＰＣＲは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｃ１０００サーマルサイクラーで行った。
【０２７９】
ｋ．ＨＰＬＣ
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムＩＣＳ−５０００をラクテート定量に使用した。２１０ｎｍで作動するＵＶ１０００検出器およびＲＩ−１５０  ４０℃屈折率検出器を装備した、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ製のＡｍｉｎｅｘ  ＨＰＸ  ８７Ｈカラムを用いて系を操作した。移動相は、０．１６Ｎ  Ｈ２ＳＯ４からなり、カラムを０．８ｍＬ／分で操作した。試料はすべて、０．０１Ｎ  Ｈ２ＳＯ４中の１０ｍＭ  ＤＭＳＯで４：１に希釈した。
【０２８０】
説明の以下の項目は、本明細書に既に記載されている、本発明の記述を単に提示する番号付けした段落からなる。この項目における番号付けした段落は、特許請求の範囲ではない。特許請求の範囲は、後の項目「特許請求の範囲」において以下に説明されている。
【０２８１】
１．ａ．アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；および／または
ｂ．アミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；および／または
ｃ．アミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；および／または
ｄ．アミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；および／または
ｅ．アミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）
を含む、単離されたＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ：クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質またはポリペプチドであって
少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子と会合すると、Ｃａｓタンパク質は、５０℃と１００℃の間の核酸切断が可能であり、ポリヌクレオチドは、ターゲティングＲＮＡ分子により認識される標的核酸配列を含む、上記タンパク質またはポリペプチド。
【０２８２】
２．配列番号１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有する単離Ｃａｓタンパク質またはポリペプチド断片であって、標的配列を認識する少なくとも１つのＲＮＡ分子と会合すると、Ｃａｓタンパク質は、５０℃と１００℃の間の温度で、標的核酸配列を含むポリヌクレオチドに結合する、これを切断する、改変するまたは標識することができる、単離Ｃａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
【０２８３】
３．Ｃａｓタンパク質またはポリペプチド断片が、５０℃と７５℃の間の温度、好ましくは６０℃超の温度、より好ましくは６０℃と８０℃の間の温度、より好ましくは６０℃と６５℃の間の温度で、核酸の結合、切断、標識または改変が可能である、段落番号１または段落番号２のＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
【０２８４】
４．核酸の結合、切断、標識または改変が、ＤＮＡ切断である、段落番号１から３のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
【０２８５】
５．アミノ酸配列が、配列番号１、またはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を含む、前記段落番号のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
【０２８６】
６．前記Ｃａｓタンパク質が細菌、古細菌またはウイルスから入手可能である、前記段落番号のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
【０２８７】
７．前記Ｃａｓタンパク質がゲオバチルス（Geobacillus）属種から、好ましくはゲオバチルス・サーモデニトリフィカンス（Geobacillus thermodenitrificans）から入手可能である、前記段落番号のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド断片。
【０２８８】
８．前記段落番号のいずれのＣａｓタンパク質を含み、標的ポリヌクレオチド中の配列を認識する少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子を含む、リボ核タンパク質複合体。
【０２８９】
９．前記ターゲティングＲＮＡ分子がｃｒＲＮＡおよび任意選択でｔｒａｃｒＲＮＡを含む、段落番号８のリボ核タンパク質複合体。
【０２９０】
１０．前記少なくとも１つのＲＮＡ分子の長さが３５〜１３５ヌクレオチド残基の範囲である、段落番号７から９のいずれかのリボ核タンパク質複合体。
【０２９１】
１１．前記標的配列が３１または３２ヌクレオチド残基長である、段落番号８または９のリボ核タンパク質複合体。
【０２９２】
１２．タンパク質またはポリペプチドが、少なくとも１つのさらなる機能的または非機能的タンパク質を含むタンパク質複合体の一部として提供される、段落番号１から７のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチド、または８から１１のいずれかのリボ核タンパク質複合体。
【０２９３】
１３．前記Ｃａｓタンパク質もしくはポリペプチドおよび／または前記少なくとも１つのさらなるタンパク質が少なくとも１つの機能的部分をさらに含む、段落番号１２のＣａｓタンパク質、ポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
【０２９４】
１４．前記少なくとも１つの機能的部分が、前記Ｃａｓタンパク質、ポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体のＮ終端および／またはＣ終端、好ましくはＮ終端に融合または連結している、段落番号１３のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
【０２９５】
１５．前記少なくとも１つの機能的部分がタンパク質であり、任意選択で、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択される、段落番号１３または１４のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
【０２９６】
１６．Ｃａｓ９ヌクレアーゼの天然の活性が不活化されており、Ｃａｓタンパク質が少なくとも１つの機能的部分に連結している、段落番号１５のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
【０２９７】
１７．前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼドメイン、好ましくはＦｏｋＩヌクレアーゼドメインである、段落番号１５または１６のＣａｓタンパク質もしくはポリペプチド、またはリボ核タンパク質複合体。
【０２９８】
１８．少なくとも１つの機能的部分が、マーカータンパク質、例えばＧＦＰである、段落番号１５から１７のいずれかのＣａｓタンパク質またはポリペプチドまたはリボ核タンパク質複合体。
【０２９９】
１９．Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドをコードする、単離核酸分子であって、
ａ．アミノ酸モチーフＥＫＤＧＫＹＹＣ［配列番号２］；および／または
ｂ．アミノ酸モチーフＸ１Ｘ２ＣＴＸ３Ｘ４［配列番号３］（式中、Ｘ１はイソロイシン、メチオニンまたはプロリンから独立して選択され、Ｘ２はバリン、セリン、アスパラギンまたはイソロイシンから独立して選択され、Ｘ３はグルタミン酸またはリシンから独立して選択され、Ｘ４はアラニン、グルタミン酸またはアルギニンのうちの１つである）；および／または
ｃ．アミノ酸モチーフＸ５ＬＫＸ６ＩＥ［配列番号４］（式中、Ｘ５はメチオニンまたはフェニルアラニンから独立して選択され、Ｘ６はヒスチジンまたはアスパラギンから独立して選択される）；および／または
ｄ．アミノ酸モチーフＸ７ＶＹＳＸ８Ｋ［配列番号５］（式中、Ｘ７はグルタミン酸またはイソロイシンであり、Ｘ８はトリプトファン、セリンまたはリシンのうちの１つである）；および／または
ｅ．アミノ酸モチーフＸ９ＦＹＸ１０Ｘ１１ＲＥＱＸ１２ＫＥＸ１３［配列番号６］（式中、Ｘ９はアラニンまたはグルタミン酸であり、Ｘ１０はグルタミンまたはリシンであり、Ｘ１１はアルギニンまたはアラニンであり、Ｘ１２はアスパラギンまたはアラニンであり、Ｘ１３はリシンまたはセリンである）
を含み、
少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子と会合すると、Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドが、５０℃と１００℃の間で、ＤＮＡ結合、切断、標識または改変が可能であり、ポリヌクレオチドが、ターゲティングＲＮＡ分子により認識される標的核酸配列を含む、上記単離核酸分子。
【０３００】
２０．配列番号１のアミノ酸配列もしくはそれと少なくとも７７％の同一性の配列を有するＣａｓ（ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ：クラスター化し規則的に間隔を置いた短い回文配列の繰り返し）ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ：ＣＲＩＳＰＲ関連）タンパク質、またはそのポリペプチド断片をコードする単離された核酸分子。
【０３０１】
２１．翻訳されると前記Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドと融合するアミノ酸配列をコードする少なくとも１つの核酸配列をさらに含む、段落番号１９または２０の単離された核酸分子。
【０３０２】
２２．前記Ｃａｓタンパク質またはポリペプチドをコードする核酸分子に融合する前記少なくとも１つの核酸配列が、ヘリカーゼ、ヌクレアーゼ、ヘリカーゼ−ヌクレアーゼ、ＤＮＡメチラーゼ、ヒストンメチラーゼ、アセチラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、転写（共）活性化因子、転写リプレッサー、ＤＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ構築タンパク質、マーカータンパク質、レポータータンパク質、蛍光タンパク質、リガンド結合タンパク質、シグナルペプチド、細胞内局在配列、抗体エピトープまたは親和性精製タグから選択されるタンパク質をコードする、段落番号２１の単離された核酸分子。
【０３０３】
２３．段落番号１９から２２のいずれかの核酸分子を含む発現ベクター。
【０３０４】
２４．少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、段落番号２３の発現ベクター。
【０３０５】
２５．ヒト細胞における標的核酸を改変する方法であって、核酸を
ａ．段落番号６〜１１のいずれかのリボ核タンパク質複合体；または
ｂ．段落番号１２から１８のいずれかのタンパク質またはタンパク質複合体、および段落番号６から１１のいずれかに定義されている少なくとも１つのターゲティングＲＮＡ分子
と接触させるステップを含み、任意選択で前記ヒト細胞が胚性幹細胞ではなく、任意選択で本方法がヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない、方法。
【０３０６】
２６．ヒト細胞における標的核酸を改変する方法であって、細胞を段落番号２４の発現ベクターで形質転換、トランスフェクトまたは形質導入するステップ、または代替として細胞を、段落番号２３の発現ベクター、および段落番号６から１１のいずれかに定義されているターゲティングＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド配列を含むさらなる発現ベクターで形質転換、トランスフェクトまたは形質導入するステップを含み、任意選択で前記ヒト細胞が胚性幹細胞ではなく、任意選択で本方法がヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない、方法。
【０３０７】
２７．ヒト細胞における標的核酸を改変する方法であって、細胞を段落番号２３の発現ベクターで形質転換、トランスフェクトまたは形質導入するステップ、次に細胞にまたは細胞内に段落番号６から１１のいずれかに定義されているターゲティングＲＮＡ分子を送達するステップを含み、任意選択で前記ヒト細胞が胚性幹細胞ではなく、任意選択で本方法がヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない、方法。
【０３０８】
２８．段落番号２５から２８のいずれかの標的核酸を改変する方法であって、前記少なくとも１つの機能的部分がマーカータンパク質またはレポータータンパク質であり、前記マーカータンパク質またはレポータータンパク質が前記標的核酸と会合し、好ましくは前記マーカーが蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、方法。
【０３０９】
２９．前記標的核酸がＤＮＡ、好ましくはｄｓＤＮＡである、段落番号２５から２８のいずれかの方法。
【０３１０】
３０．前記標的核酸がＲＮＡである、段落番号２５から２８のいずれかの方法。
【０３１１】
３１．段落番号２９の標的核酸を改変する方法であって、前記核酸がｄｓＤＮＡであり、前記少なくとも１つの機能的部分がヌクレアーゼまたはヘリカーゼ−ヌクレアーゼであり、前記改変が所望の遺伝子座での一本鎖または二本鎖切断である、方法。
【０３１２】
３２．段落番号２６、２７、２９または３１の方法のいずれかに従って所望の遺伝子座で遺伝子発現をサイレンシングする方法。
【０３１３】
３３．段落番号２６、２７、２９または３１の方法のいずれかに従って所望の位置で所望のヌクレオチド配列を改変または欠失および／もしくは挿入する方法。
【０３１４】
３４．段落番号２５から２９のいずれかの方法の標的核酸配列を改変することを含む、細胞中で遺伝子発現を改変する方法であって、前記核酸がｄｓＤＮＡであり、前記機能的部分がＤＮＡ修飾酵素（例えば、メチラーゼまたはアセチラーゼ）、転写活性化因子または転写リプレッサーから選択される、方法。
【０３１５】
３５．段落番号３０の方法の標的核酸配列を改変することを含む、細胞中で遺伝子発現を改変する方法であって、前記核酸がｍＲＮＡであり、前記機能的部分がリボヌクレアーゼであり、任意選択でエンドヌクレアーゼ、３’エキソヌクレアーゼまたは５’エキソヌクレアーゼから選択される、方法。
【０３１６】
３６．５０℃と１００℃の間の温度で実行される、段落番号２５から３５のいずれかの標的核酸を改変する方法。
【０３１７】
３７．６０℃または６０℃より上、好ましくは６０℃と８０℃の間、より好ましくは６０℃と６５℃の間の温度で実行される、段落番号３６の標的核酸を改変する方法。
【０３１８】
３８．段落番号２２から３６のいずれかにおける方法により形質転換された宿主細胞であって、細胞がヒト細胞であり、任意選択で前記ヒト細胞が胚性幹細胞ではなく、任意選択で本方法がヒトの生殖細胞系遺伝的同一性を改変しない、宿主細胞。
【図１】
2020510410.tif 000021
【図２】
2020510410.tif 000022
【図３−１】
2020510410.tif 000023
【図３−２】
2020510410.tif 000024
【図４】
2020510410.tif 000025
【図５】
2020510410.tif 000026
【図６】
2020510410.tif 000027
【図７−１】
2020510410.tif 000028
【図７−２】
2020510410.tif 000029
【図８】
2020510410.tif 000030
【図９】
2020510410.tif 000031
【図１０】
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【図１１】
2020510410.tif 000033
【図１２】
2020510410.tif 000034
【図１３】
2020510410.tif 000035
【図１４】
2020510410.tif 000036
【図１５】
2020510410.tif 000037
【図１６−１】
2020510410.tif 000038
【図１６−２】
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【図１７−１】
2020510410.tif 000040
【図１７−２】
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【図１８−１】
2020510410.tif 000042
【図１８−２】
2020510410.tif 000043
【図１９−１】
2020510410.tif 000044
【図１９−２】
2020510410.tif 000045
【図２０】
2020510410.tif 000046
【図２１】
2020510410.tif 000047
【図２２】
2020510410.tif 000048
【図２３−１】
2020510410.tif 000049
【図２３−２】
2020510410.tif 000050
【図２４】
2020510410.tif 000051
【図２５】
2020510410.tif 000052
【図２６】
2020510410.tif 000053
【配列表】
2020510410000001.app
【国際調査報告】
2020510410.tif 000054
2020510410.tif 000055
2020510410.tif 000056