(57)【要約】  本発明は、アルブミン融合タンパク質溶液から不純物を除去することにより、アルブミン融合タンパク質溶液の質を改善するためのクロマトグラフィー分離法を提供する。本発明は、（黄色）着色不純物およびＨＣＰの量が顕著に低減されたアルブミン融合タンパク質溶液を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルブミン融合タンパク質水溶液を精製する方法であって、前記方法が、（ｉ）カチオン交換クロマトグラフィー樹脂を含むカラムに前記融合タンパク質溶液をロードするステップと、（ｉｉ）カチオン含有グラジエントで溶出バッファを使用して前記カラムから前記融合タンパク質を溶出するステップと、を含む、方法。
【請求項２】
前記アルブミン融合タンパク質がＭＩＣ−１ヒト血清アルブミン融合タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カチオン含有グラジエントがＮａ＋、Ｍｇ２＋  ＮＨ４＋、Ｋ＋またはＣａ２＋含有グラジエントである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記カチオン含有グラジエントがＣａ２＋含有グラジエントである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記溶出バッファが４．０〜５．０のｐＨを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記溶出バッファが４．２のｐＨを有する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記アルブミン融合タンパク質が、２０Ｍｍ  酢酸、１１ｍＭ  ＮａＯＨおよび５００ｍＭ  ＣａＣｌ２を含むｐＨ４．２の溶出バッファグラジエントを用いて前記カチオン交換カラムから溶出され、ｐＨ４．２で前記溶出バッファ中の前記ＣａＣｌ２の含有量を徐々に５００ｍＭに増加させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項８】
前記アルブミン融合タンパク質溶液のアニオン交換精製ステップが、請求項１〜７のいずれか一項に記載の精製方法を実施する前に実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記アルブミン融合タンパク質が、エタノールおよびＣａ２＋を含む洗浄後、ｐＨ７．７のトリス緩衝塩化ナトリウム溶液中にアニオン交換カラムから溶出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の精製方法の後、ｐＨ４．６の２０ｍＭ  酢酸、１０ｍＭ  ＮａＯＨ、および１００ｍＭ  ＮａＣｌを含むバッファを用いて、前記カラムを洗浄するステップが行われる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、４７０ｎｍ〜２８０ｎｍの吸光度比で測定して、黄色不純物の含有量を少なくとも３分の１に減少させる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法が、ＥＬＩＳＡで測定して、ＨＣＰ不純物の含有量を少なくとも３分の１に減少させる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のアルブミン融合タンパク質溶液を精製する方法を含む、アルブミン融合タンパク質の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質精製の分野に関し、特にアルブミン融合タンパク質溶液から不純物を除去する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルブミン融合タンパク質はよく研究され、生物薬剤学において広く応用されている。アルブミン融合タンパク質の一般的な応用の一つは、治療用タンパク質およびペプチドの血漿中半減期を延長することである。その一例は、例えばＷＯ／２０１５／１９７４４６号及びＷＯ２０１５／１９８１９９に記載されている、マクロファージ阻害性サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）アルブミン融合タンパク質である。
【０００３】
アルブミン融合タンパク質溶液は、アルブミン融合タンパク質製品の品質および外観に影響を与える可能性がある不純物を含むことが多い。着色不純物、往々にして黄色不純物は、アルブミン融合タンパク質溶液と特に関連している。
【０００４】
熱処理、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）、活性炭濾過（ＵＳ２０１１０２７２２１）などの方法は、アルブミン溶液の品質および外観を改善する試みにおいて従来使用されてきた。しかしながら、これらの方法は十分に効率的ではなく、代替的な精製方法に対するニーズがある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、不純物の含有量を減少させることにより、アルブミン融合タンパク質溶液の質を改善する方法を提供する。一態様において、本発明は、アルブミン融合タンパク質溶液から黄色不純物および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）不純物などの不純物を除去するためのクロマトグラフィー分離法に関する。
【０００６】
一態様において、本発明のアルブミン融合タンパク質水溶液を精製する方法は、以下のステップ：（ｉ）カチオン交換クロマトグラフィー樹脂を含むカラムに前述の融合タンパク質溶液をロードするステップ、（ｉｉ）カチオン含有グラジエントで融合タンパク質をカラムから溶出するステップを含む。
【０００７】
一実施形態において、アルブミン融合タンパク質はＭＩＣ−１ヒト血清アルブミン融合タンパク質（ＨＳＡ−ＭＩＣ−１）である。
【０００８】
一実施形態において、カチオン含有グラジエントはＣａ２＋含有グラジエントを含む。
【０００９】
一実施形態において、溶出バッファは４．０〜５．０のｐＨを有する。さらなる実施形態では、溶出バッファは４．６、４．５、４．４、４．３、４．２、または４．０のｐＨを有する。
【００１０】
一実施形態において、除去された不純物は黄色不純物を含む。
【００１１】
一態様において、本発明は、アルブミン融合タンパク質の産生方法に関し、この方法は、
（ｉ）溶液中のアルブミン融合タンパク質を発現するステップ、および
（ｉｉ）カチオン交換クロマトグラフィー樹脂を含むカラムに前述の融合タンパク質溶液をロードする工程と、（ｉｉ）増加するＣａ２＋濃度のグラジエントによりカラムから融合タンパク質を溶出するステップを含む。
【００１２】
一実施形態において、本産生方法のアルブミン融合タンパク質はＭＩＣ−１ヒト血清アルブミン融合タンパク質である。
【００１３】
本発明の産業的示唆として、タンパク質精製の最適化に関連する。最適化された精製の目的は、不純物、特に黄色不純物およびＨＣＰ不純物の含有量が低減され、より良好に制御されたアルブミン融合タンパク質溶液を含む商業的に使用されうる最終製品を達成することである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、異なるｐＨ値での溶出を示す。保持時間は低ｐＨで増加し、ＨＣＰの減少を改善する（実施例６に記載されるように）。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明の発明者らは、アルブミン融合タンパク質溶液からのＨＣＰおよび黄色不純物などの不純物を効率的に除去する方法を開発した。
【００１６】
一態様において、本発明は、アルブミン融合タンパク質溶液がカチオン交換クロマトグラフィー樹脂にロードされる精製ステップに関し、かつカチオン含有グラジエントによる溶出中に、多量のＨＣＰおよび黄色不純物が分離されかつ除去される。
【００１７】
アルブミン融合タンパク質
本明細書におけるアルブミン融合タンパク質は、アルブミンタンパク質、および場合によりリンカーによって分離された少なくとも一つの異なるタイプのタンパク質またはペプチドを元々コードした二つ以上のＤＮＡ配列のインフレーム結合を通して作製されるタンパク質である。融合タンパク質ＤＮＡ配列の翻訳は、元のタンパク質またはペプチドの各々から誘導された機能的特性を有しうる単一のタンパク質配列をもたらす。得られた融合タンパク質ＤＮＡ配列は、標準宿主生物における異種融合タンパク質発現を支持する適切な発現ベクターに挿入されてもよい。
【００１８】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、約６６  ５００Ｄａの血漿タンパク質であり、少なくとも１７個のジスルフィド架橋を含む５８５個のアミノ酸から成る。（Ｐｅｔｅｒｓ，Ｔ．，ｊｒ．（１９９６），Ａｌｌ  ａｂｏｕｔ  Ａｌｂｕｍｉｎ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐ１０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ（ＩＳＢＮ  ０−１２−５５２１１０−３）。ＨＳＡは、発現収量を改善し、さまざまな治療タンパク質に安定性を付与するための融合パートナーとしての使用が有益である高溶解性および高安定性などの固有の特性を有する。本明細書の融合パートナーとしてのヒト血清アルブミンはまた、腎クリアランスを阻害するおよび／またはエンドソームからのリサイクルおよびリソーム分解の防止を可能にする新生児Ｆｃ受容体の結合により、治療用タンパク質の血漿半減期を顕著な規模で延長し、治療用タンパク質が循環中により長く存在することを可能とする。
【００１９】
したがって、アルブミン、好ましくはヒト血清アルブミンは、例えば、凝固因子（例えば、因子ＶＩＩ、因子ＶＩＩＩ、または因子ＩＸ）、ヒト成長ホルモン、インスリン、ＧＬＰ−１、例えばマクロファージ阻害サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）などのペプチドなどの様々な治療用タンパク質と融合されてもよい。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ０１／７９２７１およびＷＯ０３／５９９３４は、様々な治療用タンパク質を含むアルブミン融合タンパク質を開示する。
【００２０】
本発明の一態様において、アルブミン融合タンパク質はＭＩＣ−１（ＨＳＡ−ＭＩＣ−１）に融合したアルブミンである。例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ２０１５／１９７４４６およびＷＯ２０１５／１９８１９９は、ＭＩＣ−１アルブミン融合タンパク質およびその産生方法を開示する。本発明の実施形態において、アルブミン融合タンパク質は、ヒト血清アルブミンまたはその機能的バリアント、ならびにヒトＭＩＣ−１またはその機能的バリアント（ＨＳＡ−ＭＩＣ−１）を含む。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ＭＩＣ−１」という用語は、マクロファージ阻害サイトカイン−１（ＭＩＣ−１）を意味し、成長分化因子１５（ＧＤＦ−１５）、胎盤骨形成タンパク質（ＰＬＡＢ）および非ステロイド性抗炎症性薬活性化遺伝子（ＮＡＧ−１）としても知られる。活性化マクロファージにおける発現の増加を示す実験に基づき、１９９７年にＭＩＣ−１について初めて記述された（Ｂｏｏｔｃｏｖら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｏｃｔ  １９９７）。次いで、フーリン様プロテアーゼによって２４．５ｋＤａホモ二量体に切断される６２ｋＤａ細胞内ホモ二量体前駆体タンパク質としてＭＩＣ−１が合成される。完全長野生型ヒトＭＩＣ−１の配列は、登録番号Ｑ９９９８８にてＵＮＩＰＲＯＴデータベースから入手可能である。
【００２２】
本発明のアルブミン融合タンパク質は、当業者に公知の組み換えタンパク質技術によって作製されてもよい。一般的に、対象となる融合タンパク質をコードする核酸配列は、所望の融合タンパク質をコードするよう修飾される。次いで、この修飾された配列が発現ベクターに挿入され、これが次に発現宿主細胞に形質転換またはトランスフェクトされる。その後、所望の融合タンパク質は宿主細胞で発現され、その後回収されて精製される。
【００２３】
本明細書のタンパク質溶液は、少なくとも９０％の水を含み、好ましくは有機溶媒を含まないか、または含むとしてもわずか少量（１％未満）の有機溶媒である、アルブミン融合タンパク質水溶液であることが好ましい。
【００２４】
イオン交換クロマトグラフィー
イオン交換クロマトグラフィーは、イオンおよび極性分子をイオン交換器への親和性に基づいて溶液中で分離するクロマトグラフィープロセスである。水溶性の荷電分子は、不溶性の固定相への非共有結合を形成することによって、反対の荷電部分に結合する。カラム内の平衡化された固定相は、カラムを通して溶液を通過する間に分離される標的分子が結合できるイオン化可能な官能基を含む。
【００２５】
本発明の精製ステップのための出発物質は、アルブミン融合タンパク質を含む任意の水溶液であってもよい。出発物質は、本発明による精製前に一つ以上の精製ステップまたは化学修飾ステップに供されてもよい。一実施形態において、出発物質は、本発明によるカチオン交換クロマトグラフィー法の前にアニオン交換クロマトグラフィーによる精製に供された。
【００２６】
アニオン交換カラムへのアルブミン融合タンパク質溶液のロード後、エタノールおよびＣａ２＋を含む洗浄後に、ｐＨ７．７のトリス緩衝塩化ナトリウム溶液中で、アルブミンタンパク質を溶出することができる。
【００２７】
カチオン交換プロセス：カラム内に充填されたカチオン交換樹脂は、平衡化バッファで平衡化される。アルブミン融合タンパク質溶液をカラムにロードし、平衡化バッファと同様の導電率およびｐＨに希釈する。次いで、アルブミン融合タンパク質は、平衡化バッファから溶出バッファへのグラジエントのカラムから溶出される。
【００２８】
バッファシステム：本明細書の適切なタイプのバッファシステムは、平衡化バッファ／溶液および／または溶出バッファ中で低ｐＨ（約４．０〜５．０のｐＨ値）を維持するために選択された酢酸およびＮａＯＨの組み合わせを含む。このバッファシステムを使用して、例えば、本明細書の溶出バッファおよび洗浄／平衡化バッファのｐＨを調節することができる。
【００２９】
平衡化／洗浄バッファ：本明細書の適切な平衡化バッファ／洗浄バッファの一例は：２０ｍＭ  酢酸、１０ｍＭ  ＮａＯＨ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．６である。
【００３０】
溶出バッファ：アルブミン融合タンパク質溶液は、カチオングラジエントを用いて溶出することができる。適切なカチオンのタイプはＮａ＋、Ｍｇ２＋およびＣａ２＋、ＮＨ４＋、Ｋ＋を含む。
【００３１】
好ましいカチオン対イオンは、塩化物および酢酸塩を含む。
【００３２】
好ましいイオンの組み合わせはＣａＣｌ２である。
【００３３】
本明細書の適切な溶出剤の一例は、２０ｍＭ  酢酸、１６ｍＭ  ＮａＯＨ、５００ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ４．７である。
【００３４】
この溶出剤は、例えば、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）でのさらなる精製に好適である。
【００３５】
不純物の除去
本発明の方法は、アルブミン融合タンパク質溶液からの黄色不純物および宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）などの不純物の含有量を低減することにおいて効率的である。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「黄色不純物」という用語は、その意味において、培養培地由来の着色汚染物質だけでなく、融合タンパク質溶液を黄色に着色できるすべてのあらゆる物質をも含む。黄色または濃黄褐色の不純物は、アルブミン融合タンパク質溶液と特に関連する。これらの不純物は、アルブミン融合タンパク質溶液の公知の精製方法によって十分な程度まで除去することができない。
【００３７】
本発明の精製方法を実施する時、黄色不純物の一部はカラムに結合せず、ロード中にフロースルーに現れる。黄色不純物の別の部分は、その後グラジエントで溶出され、そしてアルブミン融合タンパク質から分離される。さらに、別の部分はカラムに密接に結合し、カラムのアルカリ再生中に除去される。
【００３８】
本発明の方法の文脈で使用される場合、「除去」または「減少」という用語は、特定の含有量／量の不純物／汚染物質、特に融合タンパク質溶液からの黄色およびＨＣＰ不純物を除去すること、すなわち、本発明の方法に供される融合タンパク質溶液中の不純物の含有量／量を低減すること、を意味する。
【００３９】
黄色不純物のレベルは、特定の波長での吸収によって測定することができる。精製された試料は、２８０ｎｍ（タンパク質）および４７０ｎｍ（黄色）の波長での吸光度測定に供され、４７０ｎｍ〜２８０ｎｍの吸光度比に１０００を掛けた値をタンパク質に対する色の表示として計算した。減少因子は、精製前（ロード）の値を精製後（溶出）の値で割ることによって計算された。
【００４０】
本発明の方法の文脈において使用される場合、「宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）」という用語は、宿主生物（この場合にはＣＨＯ細胞）によって産生またはコードされるタンパク質として定義され、意図される組み換えタンパク質とは無関係である。
【００４１】
ＨＣＰ不純物はＥＬＩＳＡによって測定することができ、精製における減少率は精製の前（ロード）の値を精製後（溶出）の値で割ることにより計算できる。
【実施例】
【００４２】
以下の実施例において、哺乳類細胞（ＣＨＯ細胞）で発現されたヒト血清アルブミン（ＨＳＡ−ＭＩＣ−１）に融合されたＭＩＣ−１の精製を例示する。
【００４３】
実施例１：
ロードの前処理：タンパク質溶液を、エタノールおよびＣａ２＋を含む洗浄後に、約ｐＨ７．７のトリス緩衝塩化ナトリウム溶液中で溶出されたアニオン交換樹脂で部分的に精製した。
【００４４】
カチオン交換カラムにロードする前に、約１０ｍＭの最終濃度にオクタン酸塩を加えること、およびｐＨを約４．９に調節することにより、ＨＳＡ−ＭＩＣ１溶液をウイルス不活性化に供した。タンパク質溶液を約３０分間不活性化のために放置し、次いで水で希釈して、導電率を約１１ｍＳ／ｃｍにし、ｐＨを４．６に調節した。
【００４５】
ＰＯＲＯＳ  ５０ＨＳを充填した９９ｍｌのカラムを、ｐＨ４．６の２９７ｍｌの２０ｍＭ  酢酸、１０ｍＭ  ＮａＯＨ、１００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した。カラムに約１．６ｇＨＳＡ−ＭＩＣ−１を含む３７５ｍｌの部分的に精製されたタンパク質溶液をロードし、次いで２９７ｍｌの平衡化バッファで洗浄した。カラムは、１２カラムの量を超えるグラジエントで溶出された。開始条件は９０％平衡化バッファ＋１０％溶出バッファ（２０ｍＭ  酢酸、１６ｍＭ  ＮａＯＨ、５００ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ４．７）であり、および最終条件は１０％平衡化バッファおよび９０％溶出バッファであった。
【００４６】
【表１】
2020517657.tif 000002
【００４７】
上述の通り実施された方法は、表１に示すように、黄色に対して４．２分の１、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）に関して３．１分の１への減少をもたらした。
【００４８】
実施例２
ロードの前処理：タンパク質溶液を、エタノールおよびＣａ２＋を含む洗浄後に、約ｐＨ７．７のトリス緩衝塩化ナトリウム溶液中で溶出されたアニオン交換樹脂で部分的に精製した。
【００４９】
カチオン交換カラムにロードする前に、約１０ｍＭの最終濃度にオクタン酸塩を加えること、およびｐＨを約４．９に調節することにより、ＨＳＡ−ＭＩＣ１溶液をウイルス不活性化に供した。タンパク質溶液を約３０分間不活性化のために放置し、次いで水で希釈して、導電率を約１５ｍＳ／ｃｍにし、ｐＨを４．２に調節した。
【００５０】
ＰＯＲＯＳ  ５０ＨＳを充填した３９．２５ｍｌのカラムをｐＨ４．２の１１７．７５ｍｌの２０ｍＭ  酢酸、５．８ｍＭ  ＮａＯＨ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した。カラムに約０．６ｇ  ＨＳＡ−ＭＩＣ−１を含む１０９．５ｍｌの部分的に精製されたタンパク質溶液をロードし、次いで１１７．７５ｍｌの平衡化バッファで洗浄した。カラムは、１０カラムの量を超えるグラジエントで溶出された。開始条件は９０％平衡化バッファ＋１０％溶出バッファ（２０ｍＭ  酢酸、１１ｍＭ  ＮａＯＨ、５００ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ４．２）であり、および最終条件は１０％平衡化バッファおよび９０％溶出バッファであった。
【００５１】
【表２】
2020517657.tif 000003
【００５２】
上述の通り実施された方法は、表２に示すように、黄色に対して７．４分の１、宿主細胞タンパク質（ＨＶＰ）に関して５．２分の１への減少をもたらした。
【００５３】
実施例３
ロードの前処理：タンパク質溶液を、エタノールおよびＣａ２＋を含む洗浄後に、約ｐＨ７．７のトリス緩衝塩化ナトリウム溶液中で溶出されたアニオン交換樹脂で部分的に精製した。
【００５４】
カチオン交換カラムにロードする前に、約１０ｍＭの最終濃度にオクタン酸塩を加えること、およびｐＨを約４．９に調節することにより、ＨＳＡ−ＭＩＣ１溶液をウイルス不活性化に供した。タンパク質溶液を約３０分間不活性化のために放置し、次いで水で希釈して、導電率を約１１ｍＳ／ｃｍにし、ｐＨを４．５に調節した。
【００５５】
ＰＯＲＯＳ  ５０ＨＳを充填した８．６ｍｌのカラムを、ｐＨ４．６の２５．８ｍｌの２０ｍＭ  酢酸、１０ｍＭ  ＮａＯＨ、１００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した。カラムに約１５６ｇ  ＨＳＡ−ＭＩＣ−１を含む２８．６ｍｌの部分的に精製されたタンパク質溶液をロードし、次いで２８．６ｍｌの平衡化バッファで洗浄した。カラムは、１２カラムの量を超えるグラジエントで溶出された。開始条件は９０％平衡化バッファ＋１０％溶出バッファ（２０ｍＭ  酢酸、１８ｍＭ  ＮａＯＨ、１０００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．８）であり、および最終条件は１０％平衡化バッファおよび９０％溶出バッファであった。
【００５６】
結果：
上述の通り実施された方法は、目視評価において黄色と同様の減少をもたらした。
【００５７】
実施例４
ロードの前処理：タンパク質溶液を、エタノールおよびＣａ２＋を含む洗浄後に、約ｐＨ７．７のトリス緩衝塩化ナトリウム溶液中で溶出されたアニオン交換樹脂で部分的に精製した。
【００５８】
カチオン交換カラムにロードする前に、約１０ｍＭの最終濃度にオクタン酸塩を加えること、およびｐＨを約４．９に調節することにより、ＨＳＡ−ＭＩＣ１溶液をウイルス不活性化に供した。タンパク質溶液を約３０分間不活性化のために放置し、次いで水で希釈して、導電率を約１１ｍＳ／ｃｍにし、ｐＨを４．５に調節した。
【００５９】
ＰＯＲＯＳ  ５０ＨＳを充填した５．７ｍｌのカラムを、ｐＨ４．６の１７．１ｍｌの２０ｍＭ  酢酸、１０ｍＭ  ＮａＯＨ、１００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した。カラムに約９０ｇ  ＨＳＡ−ＭＩＣ−１を含む１９．４ｍｌの部分的に精製されたタンパク質溶液をロードし、次いで１７．１ｍｌの平衡化バッファで洗浄した。カラムは、１２カラムの量を超えるグラジエントで溶出された。開始条件は９０％平衡化バッファ＋１０％溶出バッファ（２０ｍＭ  酢酸、１６ｍＭ  ＮａＯＨ、５００ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ４．９）であり、および最終条件は１０％平衡化バッファおよび９０％溶出バッファであった。
【００６０】
【表３】
2020517657.tif 000004
【００６１】
上述の通り実施された方法は、表３に示すように、黄色に対して６．８分の１、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）に関して４．６分の１への減少をもたらした。
【００６２】
実施例５
アニオン交換カラム（ＧｉＧａｃａｐ  Ｑ  ６５０Ｍ）から部分的に精製された明確な黄色の試料４２ｍｌを、３０Ｋの分子量カットオフでＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａフィルター上で、約５倍、９ｍｌに濃縮した。試料を５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  トリス、１５ｍＭ  ＨＣｌ（ｐＨ７．７）を含むバッファ中に溶解した。透過物は無色であり、一方で保持物は濃度に応じてより色を増した。１１ｍＭ酢酸を用いてｐＨ４．５に調節後、実験を繰り返した。また、この条件では、黄色の色の除去は観察されなかった。
【００６３】
実施例６
ロードの前処理：タンパク質溶液を、エタノールおよびＣａ２＋を含む洗浄後に、約ｐＨ７．７のトリス緩衝塩化ナトリウム溶液中で溶出されたアニオン交換樹脂で部分的に精製した。
【００６４】
カチオン交換カラムにロードする前に、ロード試料中のｐＨを水で希釈して、酢酸で４．６、４．５、４．４、４．３、４．２、および４．０にそれぞれ調節した。
【００６５】
ＰＯＲＯＳ  ５０ＨＳで充填された５．７ｍｌのカラムを、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  酢酸からなる１７．１ｍｌのバッファを用いて平衡化し、ＮａＯＨを用いてｐＨ４．６〜ｐＨ４．０の様々なｐＨ値に調節した。カラムを試料でロードし、次いで１７．１ｍｌ平衡化バッファで洗浄した。カラムは、１２カラムの量を超えるグラジエントで溶出された。開始条件は９０％平衡化バッファ＋１０％溶出バッファ（５００ｍＭ  ＣａＣｌ２、２０ｍＭ  酢酸、ＮａＯＨを用いてｐＨ４．６〜ｐＨ４．０の様々なｐＨ値に調節）であり、および最終条件は１０％平衡化バッファおよび９０％溶出バッファであった。
【００６６】
低ｐＨは、表４および図１に示すように、より長い保持時間および概してＨＣＰ減少因子の増加をもたらした。
【００６７】
【表４】
2020517657.tif 000005
【図１】
2020517657.tif 000006
【国際調査報告】
2020517657.tif 000007
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