(57)【要約】  本発明は、癌の予後と診断における放射性標識抗ナノボディの応用を開示する。具体的に、本発明は、ＰＤ−Ｌ１分子を検出するために使用される免疫複合体を開示し、前記免疫複合体は、特定の抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖及び放射性核種を含み、検出対象ＰＤ−Ｌ１発現状況の非侵襲的検出に使用することができる。本発明の免疫複合体は、小さいサイズおよび高い特異性を有し、原発腫瘍および転移腫瘍を同時に標的化する全身検出に適し、精度が高く、放射線量が少ない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫複合体であって、
（ａ）ＶＨＨ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−３のいずれかの一つに示される抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖または前記ＶＨＨ鎖を有する抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディ、および
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素抗体、抗体Ｆｃフラグメント、抗体ｓｃＦｖフラグメント、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、および細胞からなる群から選択されるカップリング部分
を含む、前記免疫複合体。
【請求項２】
前記放射性核種が、
（ｉ）Ｔｃ−９９ｍ、Ｇａ−６８、Ｆ−１８、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｃｕ−６４、Ｚｒ−８９、Ｃ−１１、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される診断用同位体、および／または
（ｉｉ）Ｌｕ−１７７、Ｙ−９０、Ａｃ−２２５、Ａｓ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｃｓ−１３７、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−６０、Ｄｙ−１６５、Ｅｒ−１６９、Ｆｍ−２５５、Ａｕ−１９８、Ｈｏ−１６６、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｉｒ−１９２、Ｆｅ−５９、Ｐｂ−２１２、Ｍｏ−９９、Ｐｄ−１０３、Ｐ−３２、Ｋ−４２、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｓｍ−１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ−１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ−１４９、Ｔｈ−２２７、Ｘｅ−１３３、Ｙｂ−１６９、Ｙｂ−１７７およびそれらの組み合わせからなる群から選択される治療用同位体
を含むことを特徴とする、請求項１に記載の免疫複合体。
【請求項３】
前記薬物が、細胞毒性薬物であり、好ましくは、前記細胞毒性薬物が、抗チューブリン薬物、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、葉酸拮抗薬、代謝拮抗薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の免疫複合体。
【請求項４】
前記毒素が、オーリスタチン系（例えば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、ＭＭＡＥとＭＭＡＦ）、オーレオマイシン、メタンソール（methanesol）、リシン、リシンＡ−鎖、コンブレタスタチン、ズオカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−八連球菌、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クルシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン、カリケアマイシン、サパオナリアオフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤および糖質コルチコイド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の免疫複合体。
【請求項５】
請求項１に記載の免疫複合体および検出学的許容される担体を含む、ＰＤ−Ｌ１タンパク質検出試薬。
【請求項６】
同位体トレーサー、造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、ナノ磁性粒子およびイメージング剤からなる群から選択される１つまたは複数の試薬であることを特徴とする、請求項５に記載の検出試薬。
【請求項７】
請求項１に記載の免疫複合体および薬学的に許容される担体を含む、薬物組成物。
【請求項８】
請求項１に記載の免疫複合体および取扱説明書を含む、ＰＤ-Ｌ１タンパク質を検出するためのキット。
【請求項９】
請求項１に記載の免疫複合体の用途であって、
（ａ）生体内でＰＤ−Ｌ１分子を検出するための検出試薬、検出キットまたは検出プレートと、（ｂ）ＰＤ−Ｌ１タンパク質（即ち、ＰＤ−Ｌ１陽性）を発現する腫瘍を治療または予防するための薬物組成物とを調製する、前記免疫複合体の用途。
【請求項１０】
抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖であって、
前記ＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−３のいずれかの一つに示されるとおりである、前記抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医学またはバイオイメージングの技術分野に関し、より具体的には、癌の予後と診断における放射性標識抗ナノボディの応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＤ−１及びそのリガンドＰＤ−Ｌ１は、腫瘍免疫の重要な標的であり、モノクローナル抗体を使用してＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１経路を遮断することが近年注目を集めている。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１は、一対の免疫抑制分子であり、自己免疫疾患を防ぐための免疫系の重要な組成部分であり、その経路の活性化は、腫瘍免疫応答を阻害し、腫瘍特異的Ｔ細胞アポトーシスを誘発する作用を有し、腫瘍の発達と密接に関係する。ＰＤ−１（ＣＤ２７９）は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するＩ型膜貫通タンパク質であり、主に活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、及びＢ細胞などに発現する。そのリガンドＰＤ−Ｌ１（Ｂ７-Ｈ１、ＣＤ２７４とも呼ばれる）は、Ｂ７ファミリーに属し、腫瘍浸潤免疫細胞（ＴＩＣ）、及び悪性黒色腫、非小細胞肺がん、頭頸部扁平上皮癌などのさまざまな悪性細胞で高く発現する。臨床試験では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は良好な有効性と安全性を示した。米国ＦＤＡは、黒色腫、非小細胞肺がん、進行腎細胞癌の治療のための抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体を承認しており、さまざまな抗ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体の臨床試験が進行中である。
【０００３】
ＰＤ−Ｌ１の発現をアップレギュレートすることにより、腫瘍は体の免疫系の認識と殺害を回避し、臨床検体は、さまざまな悪性腫瘍組織及びＴＩＣでのＰＤ−Ｌ１の高発現が、がん患者の予後不良と高度に相関していることを実証している。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、さまざまな悪性腫瘍の臨床試験で良好な治療効果を示しましたが、全体的な反応率は約２０％に過ぎず、臨床反応のある患者のほとんどは治療前のＴＩＣまたは腫瘍細胞ＰＤ−Ｌ１高発現患者である。したがって、さまざまなＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体は、患者をスクリーニングし、治療の臨床的効果を改善するために、腫瘍患者のブロッキング治療を受ける前に、生検腫瘍組織のＰＤ−Ｌ１発現レベルを検出する必要があり、現在、患者の組織におけるＰＤ−Ｌ１発現の検出は、依然として組織穿刺ＩＨＣ法に依拠している。ＰＤ−Ｌ１は動的バイオマーカーであり、その発現レベルは治療中に時間とともに変化するため、従来の組織穿刺法には実際に多くの欠点がある。したがって、より効果的な診断方法を開発し、原発腫瘍と転移腫瘍を同時に検出し、動的バイオマーカーであるＰＤ−Ｌ１をリアルタイムで非侵襲的に検出及び定量化し、治療に適した患者を選択し、治療効果を監視し、治療計画を最適化することが急務である。
【０００４】
ナノボディは現在、分子量が通常の抗体の約１／１０の既知の最小の抗体分子であり、最初はベルギーの科学者Ｈａｍｅｒｓ、Ｒがラクダの血液で発見され、非常に興味深い工程化抗体製品である。ナノ抗体は、モノクローナル抗体の抗原反応性に加えて、低分子量、強力な安定性、良好な溶解性、簡単な発現、弱い免疫原性（ヒトタンパク質配列と７０％以上類似）、強力な浸透性、強力なターゲティング、単純な人間化、および低い準備コストなどのいくつかのユニークな機能特性を持つ。ナノボディはその特別な構造により、放射性同位元素を標的とする担体として、腫瘍組織に迅速かつ特異的に浸透して標的に結合することができるが、非結合抗体は血液から迅速に除去され、身体の放射線量を減らし、トレーサーとしての従来の抗体よりも多くの明らかな利点がある。
【０００５】
しかし、現在、当該技術分野におけるＰＤ−Ｌ１の臨床的検出のための満足できるナノボディの欠如がある。したがって、当技術分野では、ＰＤ−Ｌ１に対して有効な新しい特定のナノボディを開発することが急務である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＰＤ−Ｌ１に対して有効な特異的ナノボディを提供することである。
より具体的に、本発明の目的は、ＰＤ−Ｌ１のナノボディ結合同位体標識に対するＰＤ−Ｌ１発現を非侵襲的に検出するための応用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様では、
（ａ）ＶＨＨ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−３のいずれかの一つに示される抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖または前記ＶＨＨ鎖を有する抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディと、及び
（ｂ）検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素抗体、抗体Ｆｃフラグメント、抗体ｓｃＦｖフラグメント、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、または細胞からなる群から選択されるカップリング部分とを含む免疫複合体を提供する。
【０００８】
別の好ましい例において、前記ＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：２に示された通りである。
別の好ましい例において、前記抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディとＰＤ−Ｌ１の結合は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を遮断しない。
別の好ましい例において、前記抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディは、ＰＤ−Ｌ１上のＰＤ−１結合領域以外の領域に結合する。
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、放射性核種である。
【０００９】
別の好ましい例において、前記放射性核種は、
（ｉ）Ｔｃ−９９ｍ、Ｇａ−６８、Ｆ−１８、Ｉ−１２３、Ｉ−１２５、Ｉｎ−１１１、Ｇａ−６７、Ｃｕ−６４、Ｚｒ−８９、Ｃ−１１、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される診断用同位体、および／または
（ｉｉ）Ｌｕ−１７７、Ｙ−９０、Ａｃ−２２５、Ａｓ−２１１、Ｂｉ−２１２、Ｂｉ−２１３、Ｃｓ−１３７、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−６０、Ｄｙ−１６５、Ｅｒ−１６９、Ｆｍ−２５５、Ａｕ−１９８、Ｈｏ−１６６、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｉｒ−１９２、Ｆｅ−５９、Ｐｂ−２１２、Ｍｏ−９９、Ｐｄ−１０３、Ｐ−３２、Ｋ−４２、Ｒｅ−１８６、Ｒｅ−１８８、Ｓｍ−１５３、Ｒａ２２３、Ｒｕ−１０６、Ｎａ２４、Ｓｒ８９、Ｔｂ−１４９、Ｔｈ−２２７、Ｘｅ−１３３、Ｙｂ−１６９、Ｙｂ−１７７またはそれらの組み合わせからなる群から選択される治療用同位体を含む。
【００１０】
別の好ましい例において、前記薬物は、細胞毒性薬物である。
別の好ましい例において、前記細胞毒性薬物は、
抗チューブリン薬物、ＤＮＡ副溝結合試薬、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤、抗生物質、葉酸拮抗薬、代謝拮抗薬、化学療法増感剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどからなる群から選択される。
【００１１】
特に有用な細胞毒性薬物系の例は、例えば、ＤＮＡ小溝結合試薬、ＤＮＡアルキル化試薬、およびチューブリン阻害剤を含み、典型的な細胞毒性薬物は、例えば、オーリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、カンプトテシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ）、デュオカルマイシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｓ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅｓ）、メイタンシン（ｍａｙｔａｎｓｉｎｅｓ）及びメイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄｓ）（例えば、ＤＭ１及びＤＭ４）、タキサン（ｔａｘａｎｅｓ）、ベンゾジアゼピン（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）またはベンゾジアゼピンを含有する薬物（ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｄｒｕｇｓ）（例えば、ピロロ［１，４］ベンゾジアゼピン（ＰＢＤｓ）、インドリノベンゾジアゼピン（ｉｎｄｏｌｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ）及びオキサゾリジノベンゾジアゼピン（ｏｘａｚｏｌｉｄｉｎｏｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ））、ビンカアルカロイド（ｖｉｎｃａ  ａｌｋａｌｏｉｄｓ）、またはそれらの組み合わせを含む。
【００１２】
別の好ましい例において、前記毒素は、
オーリスタチン系（例えば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、ＭＭＡＥ和ＭＭＡＦ）、オーレオマイシン、メタンソール（methanesol）、リシン毒素、リシン毒素Ａ−鎖、コンブレタスタチン、ズオカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−八連球菌、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クルシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン、カリケアマイシン、サパオナリアオフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤、糖質コルチコイド、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１３】
別の好ましい例において、前記免疫複合体は、多価（例えば、二価）の前記ＶＨＨ鎖または前記ＶＨＨ鎖を有する抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディを含む。前記多価とは、前記免疫複合体のアミノ酸配列が複数の重複の前記ＶＨＨまたは前記抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディを含むことを意味する。
別の好ましい例において、前記免疫複合体は、癌の予後、診断におけるＰＤ−Ｌ１の発現レベルを検出するために使用される。
別の好ましい例において、前記検出は生体内検出である。
別の好ましい例において、前記免疫複合体は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質を発現する（即ち、ＰＤ−Ｌ１陽性）腫瘍を治療または予防するために使用される。
【００１４】
本発明の第２の態様では、ＰＤ−Ｌ１タンパク質検出試薬を提供し、前記検出試薬は、本発明の第１の態様に記載の免疫複合体及び検出学的許容される担体を含む。
別の好ましい例において、前記免疫複合体のカップリング部分は、診断用同位体である。
別の好ましい例において、前記検出学的許容される担体は、非毒性の不活性水性担体媒体である。
別の好ましい例において、前記検出試薬は、同位体トレーサー、造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、ナノ磁性粒子およびイメージング剤からなる群から選択される１つまたは複数の試薬である。
【００１５】
別の好ましい例において、前記検出試薬は、造影剤であり、前記造影剤は、イメージング用の他の製剤をさらに含む。
別の好ましい例において、前記造影剤は、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）またはＣＴ（電子コンピュータ断層撮影技術）に使用される造影剤である。
別の好ましい例において、前記イメージング剤は、Ｇａ−６８およびＧｄなどの２つまたは複数の信号を同時にキレートし、ＰＥＴ／ＣＴおよびＭＲＩに使用され、またはＴｃ−９９ｍおよび蛍光剤は、同時にＳＰＥＣＴ／ＣＴおよび蛍光検出に同時に使用される。
別の好ましい例において、前記検出試薬は、生体内検出に使用される。
別の好ましい例において、前記検出試薬の剤形は、液体または粉末状（例えば、水剤、注射剤、凍結乾燥粉末、錠剤、バッカル剤、エアロゾル剤）である。
【００１６】
本発明の第３の態様では、本発明の第１の態様に記載の免疫複合体及び薬学的に許容される担体を含む薬物組成物を提供する。
別の好ましい例において、前記免疫複合体のカップリング部分は、薬物、毒素、および／または治療用同位体である。
別の好ましい例において、前記薬物組成物は、細胞毒性薬物などの腫瘍を治療する他の薬物をさらに含む。
別の好ましい例において、前記薬物組成物は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質（即ち、ＰＤ−Ｌ１陽性）を発現する腫瘍を治療または予防するために使用される。
別の好ましい例において、前記腫瘍は、胃がん、リンパ腫、肝臓癌、白血病、腎臓腫瘍、肺癌、小腸癌、骨癌、前立腺癌、結直腸癌、乳癌、大腸癌、前立腺癌、または副腎腫瘍を含む。
別の好ましい例において、前記薬物組成物は、注射剤である。
【００１７】
本発明の第４の態様では、本発明第１の態様に記載の免疫複合体と取扱説明書を含むＰＤ-Ｌ１分子を検出するためのキットを提供する。
別の好ましい例において、前記取扱説明書には、前記キットは、検出対象のＰＤ−Ｌ１の発現を非侵襲的に検出するために使用されることが記載されている。
別の好ましい例において、前記キットは、ＰＤ−Ｌ１タンパク質（即ち、ＰＤ−Ｌ１陽性）を発現する腫瘍を検出するために使用される。
【００１８】
本発明の第５の態様では、（ａ）生体内でＰＤ−Ｌ１分子を検出するための検出試薬、検出キットまたは検出プレートと、（ｂ）ＰＤ−Ｌ１タンパク質（即ち、ＰＤ−Ｌ１陽性）を発現する腫瘍を治療または予防するための薬物組成物とを調製する本発明の第１の態様に記載の免疫複合体を提供する。
本発明の別の態様において、生体内でＰＤ−Ｌ１分子を検出するための造影剤を調製する本発明の第１の態様に記載の免疫複合体の用途を提供する。
【００１９】
本発明の第６の態様では、抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖を提供し、前記ＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−３のいずれかの一つに示されるとおりである。
別の好ましい例において、前記ＰＤ−Ｌ１は、ヒトＰＤ−Ｌ１である。
なお、フレーム領域ＦＲと相補性決定領域ＣＤＲを含み、ここで、前記ＣＤＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−３のいずれか１つの配列のうち対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３と、および前記ＣＤＲ１−３により分離されたＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４とを含む抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖をさらに提供する。
【００２０】
なお、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、３つのＣＤＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−３のいずれか１つの配列のうち対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖可変領域をさらに提供する。
別の好ましい例において、前記３つのＣＤＲは、表２に示されたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【００２１】
本発明の第７の態様では、ＰＤ−Ｌ１エピトープに対するナノボディであり、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−３のいずれか１つに示されるアミノ酸配列のＶＨＨ鎖を有する抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディを提供する。
【００２２】
本発明の第８の態様では、第６の態様に記載の抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖、または第７の態様に記載の抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディからなる群から選択されるタンパク質をコードするポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を提供する。
別の好ましい例において、前記ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。
【００２３】
本発明の第９の態様では、第８の態様に記載のポリヌクレオチドを含む発現担体を提供する。
【００２４】
本発明の第１０の態様では、第９の態様に記載の発現担体を含むか、第８の態様に記載のポリヌクレオチドがそのゲノムに組み込まれる宿主細胞を提供する。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞を含む。
別の好ましい例において、前記宿主細胞は、大腸菌、酵母細胞からなる群から選択される。
【００２５】
本発明の第１１の態様では、
ナノボディの生成に適した条件の下で、第１０の態様に記載の宿主細胞を培養して、前記抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディを含む培養物を獲得するステップ（ａ）と、及び
前記培養物から前記抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディを分離または回収するステップ（ｂ）とを含む抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディの生成方法を提供する。
別の好ましい例において、前記抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−３に示されるアミノ酸配列を有する。
【００２６】
本発明の第１２の態様では、本発明のナノボディまたは免疫複合体を必要とする対象に投与する疾患を治療する方法を提供する。
別の好ましい例において、前記対象は、ヒトのような哺乳動物を含む。
【発明の効果】
【００２７】
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴および以下（例えば、実施例）に具体的に説明する各技術的特徴を互いに組み合わせて、新規または好ましい技術的解決手段を形成することができることを理解されたい。スペースの制限のため、ここでは繰り返しない。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディの精製図を示した。レーンＭは分子量標準であり、レーン１−２はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−２に示されるアミノ酸配列のナノボディに対応する。
【図２】異なる抗原に対する抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディのＥＬＩＳＡ結果の棒グラフを示した。ロッド１−２はそれぞれＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−２に示されるアミノ酸配列のナノボディに対応する。
【図３】ＰＤ−Ｌ１過剰発現腫瘍を有するマウスにおけるＩ−１２５マーカーＰＤ−Ｌ１ナノボディのＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージングの結果を示した。ＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−２ナノボディは、ＰＤ−Ｌ１過剰発現腫瘍の効果的な蓄積に効果的であり、同時に非結合抗体は腎臓及び膀胱を介して血液から迅速に除去できる。
【００２９】
【図４】抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディのＨＰＬＣスペクトルを示した。マウス血清とヒト血清をそれぞれ異なる時間インキュベートした後の抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディの含有量と組成に対応して測定し、抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディの安定性を示した。
【図５】ＰＤ−Ｌ１を過剰発現している担癌マウスにおける９９ｍ−ＴｃマーカーＰＤ−Ｌ１ナノボディのＳＰＥＣＴ−ＣＴイメージングの結果を示した。ナノボディは腫瘍のＰＤ−Ｌ１発現を明確に識別でき、非結合抗体は腎臓及び膀胱を介して血液から迅速に除去できる。
【図６】ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−３のアミノ酸配列の比較図を示し、ここで赤でマークされた領域はＣＤＲ領域である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
注：図面中のＳＥＱ  ＮＯ.とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.は同じ意味を有し、両方とも配列リストの配列番号を表す。
本発明者は、広範囲にわたる綿密な研究により、ＰＤ−Ｌ１分子を検出するための免疫複合体を初めて発見し、前記免疫複合体は、特定の抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖と放射性核種を含み、また本発明の抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディとＰＤ−Ｌ１の結合は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を遮断せず、試験対象のＰＤ−Ｌ１発現の非侵襲的検出に使用できる。本発明の免疫複合体は、小さいサイズおよび高い特異性を有し、原発性腫瘍および転移性腫瘍を同時に標的化する全身検出に適し、精度が高く、放射線量が少ない。本発明はこれに基づいて完成された。
【００３１】
用語
本明細書で使用される用語「本発明のナノボディ」、「本発明の抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディ」、「本発明ＰＤ−Ｌ１ナノボディ」は互換的に使用されることができ、すべてＰＤ−Ｌ１（ヒトＰＤ−Ｌ１を含む）を特異的に認識して結合するナノボディを指し、また本発明の抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディとＰＤ−Ｌ１の結合は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を遮断しない。特に好ましいのは、ＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−３のいずれかの一つに示されるナノボディである。
本発明の各ＶＨＨ鎖のアミノ酸配列は以下に示したとおりであり、ここで、下線が引かれた領域はＣＤＲ領域を表す。
【００３２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.１：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＴＳＩＹＳＮＮＹＭＡＷＦＳＱＡＰＧＫＧＲＥＧＶＡＡＶＹＩＤＤＧＲＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＳＡＫＮＴＶＹＬＱＭＮＲＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＡＡＰＧＰＬＳＨＮＹＷＹＴＳＡＮＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.２：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＹＳＳＤＧＭＧＷＦＲＱＴＰＧＫＥＲＥＧＶＡＡＩＳＰＴＧＲＲＴＥＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＮＫＮＭＬＳＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＧＭＹＹＣＡＲＥＧＳＷＳＦＳＬＡＮＳＡＶＲＳＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.３：
ＱＶＱＬＱＥＳＧＧＧＳＶＱＴＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＴＳＩＹＳＮＮＹＭＡＷＦＳＱＳＰＧＫＧＲＥＧＶＡＡＶＹＭＤＤＧＲＰＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＬＤＳＡＫＮＴＭＹＬＱＭＮＳＬＫＰＥＤＴＡＭＹＹＣＡＡＡＰＧＰＬＳＲＮＹＷＹＴＳＡＮＹＤＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳ
【００３３】
本発明のナノボディのアミノ酸に対して配列アラインメントを実行し、結果は図６に示したように、本発明のナノボディ間の違いは主にＣＤＲ領域にある。ここで、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１に示されるナノボディおよびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：３に示されるナノボディは、＞９５％の相同性を有する。
【００３４】
本明細書で使用される用語「抗体」または「免疫グロブリン」は、２つの同じ軽鎖（Ｌ）および２つの同じ重鎖（Ｈ）からなる、同じ構造特性を有する約１５００００ダルトンのヘテロテトラグリカンタンパク質である。各軽鎖は共有ジスルフィド結合を介して重鎖に接続され、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間のジスルフィド結合の数は異なる。各重鎖と軽鎖にも、一定の間隔で鎖内ジスルフィド結合がある。各重鎖の一端に可変領域（ＶＨ）があり、その後に複数の定常領域が続く。各軽鎖の一端に可変領域（ＶＬ）があり、他端に定常領域があり、軽鎖の定常領域は重鎖の第１の定常領域の反対側にあり、軽鎖の可変領域は重鎖の可変領域の反対側にある。特別なアミノ酸残基は、軽鎖と重鎖の可変領域間に界面を形成する。
【００３５】
本明細書で使用される用語「単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）」、「ナノボディ」（ｎａｎｏｂｏｄｙ）は、同じ意味を有し、抗体重鎖の可変領域をクローンすることを指し、１つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を構築し、これは完全な機能を持つ最小の抗原結合フラグメントを有する。通常、軽鎖および重鎖の定常領域１（ＣＨ１）を自然欠缺の抗体を最初に取得した後、抗体の重鎖の可変領域をクローニングして、１つの重鎖可変領域のみからなる単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）を構築する。
【００３６】
本明細書で使用される用語「可変」は、抗体の可変領域のある部分が配列で異なり、その特定の抗原に対する様々な特定の抗体の結合および特異性を形成することを意味する。しかし、可変性は抗体の可変領域全体に均等に分布されていない。相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる軽鎖および重鎖の可変領域の３つのフラグメントに集中している。可変領域のより保存された部分は、フレーム領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ４つのＦＲ領域を含み、それらは一般に−折り畳まれた構成で、３つのＣＤＲで連結されて連結ループを形成し、場合によっては部分的な折り畳まれた構造を形成する。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって密接に結合され、他の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位を形成する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ.  Ｎｏ.  ９１−３２４２、巻Ｉ、６４７−６６９ページ（１９９１）を参照）。定常領域は、抗体と抗原の結合には直接関与しないが、抗体に関与する抗体依存性細胞毒性などの異なるエフェクター機能を示す。
【００３７】
当業者に知られているように、免疫複合体および融合発現産物は、薬物、毒素、サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）、放射性核種、酵素、および他の診断または治療分子と本発明の抗体またはそのフラグメントが結合することにより形成すされる複合体を含む。本発明はまた、前記抗ＰＤ−Ｌ１タンパク質抗体またはそのフラグメントに結合した細胞表面マーカーまたは抗原を含む。
本明細書で使用される用語「重鎖可変領域」と「ＶＨ」は、互換的に使用されることができる。
【００３８】
本明細書で使用される用語「可変領域」と「相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ，ＣＤＲ）」は、互換的に使用されることができる。
本発明の一好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖可変領域は、３つの相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。
本発明の一好ましい実施形態において、前記抗体の重鎖は、前記重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
【００３９】
本発明において、用語「本発明の抗体」、「本発明のタンパク質」、または「本発明のポリペプチド」は、互換的に使用されることができ、重鎖可変領域を有するタンパク質またはポリペプチドなどのＰＤ−Ｌ１タンパク質に特異的に結合するポリペプチドを指す。それらは出発メチオニンを含んでも含まなくてもよい。
本発明は、本発明の抗体を有する他のタンパク質または融合発現産物をさらに提供する。具体的に、本発明は、可変領域を含む重鎖を有する任意のタンパク質複合体及び融合発現産物（即ち、免疫複合体および融合発現産物）を含み、前記可変領域と本発明の抗体の重鎖可変領域が同一であるか、少なくとも９０％相同であり、好ましくは、少なくとも９５％相同である。
【００４０】
一般に、抗体の抗原結合特性は、可変領域（ＣＤＲ）と呼ばれる重鎖の可変領域にある３つの特定の領域によって説明することができる。前記セグメントを、４つのフレーム領域（ＦＲ）に分け、４つのＦＲのアミノ酸配列は、比較的保存的で、結合反応に直接関与しない。これらのＣＤＲはループ構造を形成し、それらの間のＦＲによって形成されるβ折り畳みは、空間構造において互いに近接し、重鎖のＣＤＲと対応する軽鎖の対応するＣＤＲは抗体の抗原結合部位を構成する。同じタイプの抗体のアミノ酸配列を比較して、どのアミノ酸がＦＲまたはＣＤＲ領域を構成するかを決定することができる。
【００４１】
本発明の抗体の重鎖の可変領域は、それらの少なくとも一部が抗原の結合に関与しているため、特に興味深い。従って、本発明は、そのＣＤＲが本明細書で同定されたＣＤＲと９０％以上（好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上）相同である限り、ＣＤＲを持つ抗体重鎖可変領域を有する分子を含む。
本発明は、完全な抗体だけでなく、免疫活性を有する抗体のフラグメントまたは抗体と他の配列によって形成された融合タンパク質をさらに含む。したがって、本発明は、前記抗体のフラグメント、誘導体、および類似体をさらに含む。
【００４２】
本明細書で使用される用語「フラグメント」、「誘導体」および「類似体」は、本発明の抗体と同じ生物学的機能または活性を実質的に保持するポリペプチドを指す。本発明のポリペプチドフラグメント、誘導体または類似体は、（ｉ）１つまたは複数の保存的または非保存的アミノ酸残基（好ましくは保存的アミノ酸残基）が置換されたポリペプチド、ここで、そのような置換アミノ酸残基は、遺伝暗号によってコードされていてもいなくてもよい、または（ｉｉ）１つまたは複数のアミノ酸残基に置換基を有するポリペプチド、または（ｉｉｉ）成熟ポリペプチドと、別の化合物（例えば、ポリエチレングリコールなどのポリペプチドの半減期を延長する化合物）との融合によって形成されるポリペプチド、または（ｉｖ）追加のアミノ酸配列をこのポリペプチド配列に融合することにより形成されたポリペプチド（例えば、リーダー配列または分泌配列、またはこのポリペプチドまたはタンパク質を精製するために使用される配列、または６Ｈｉｓタグと形成された融合タンパク質）であることができる。本明細書の教示によれば、これらのフラグメント、誘導体、および類似体は、当業者に知られている範囲内にある。
【００４３】
本発明の抗体は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質結合活性を有し、前記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドを指す。この用語は、本発明の抗体と同じ機能を有する前記ＣＤＲ領域を含むポリペプチドのバリアントをさらに含む。これらのバリアントは、以下を含む（ただし、これらに限定されない）。１つまたは複数（通常は１個−５０個、好ましくは１個−３０個、より好ましくは１個−２０個、最も好ましくは１個−１０個）のアミノ酸欠失、挿入および／または置換、ならびにＣ末端および／またはＮ末端に１つまたは複数（通常２０個以内、好ましくは１０個以内、より好ましくは５個以内）のアミノ酸を付加。例えば、当該技術分野において、近接または類似の特性を有するアミノ酸で置換する場合、一般にタンパク質の機能を変化させない。別の例として、Ｃ末端および／またはＮ末端に１つまたは複数のアミノ酸を追加しても、通常、タンパク質の機能は変わらない。当該用語は、本発明の抗体の活性フラグメントおよび活性誘導体をさらに含む。
【００４４】
前記ポリペプチドのバリアントは、相同配列、保存的変異体、対立遺伝子変異体、天然変異体、誘導変異体、および高または低ストリンジェンシー条件下で本発明の抗体のコードＤＮＡとハイブリダイズできるＤＮＡにコードされたタンパク質、および本発明の抗体に対する抗血清を使用して得られたポリペプチドまたはタンパク質を含む。
本発明は、ナノボディまたはそのフラグメントを含む融合タンパク質などの他のポリペプチドをさらに提供する。ほぼ全長のポリペプチドに加えて、本発明は、本発明のナノボディのフラグメントをさらに含む。一般に、前記フラグメントは、本発明の抗体の少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、好ましくは少なくとも約５０個の連続したアミノ酸、より好ましくは少なくとも約８０個の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約１００個の連続したアミノ酸を有する。
【００４５】
本発明において、「本発明の抗体の保存的変異体」とは、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較して、最大１０個、好ましくは最大８個、より好ましくは最大５個、最も好ましくは最大３個のアミノ酸を、近接または類似の特性を有するアミノ酸で置換することにより形成されるポリペプチドを指す。これらの保存的変異体ポリペプチドは、好ましくは表１によるアミノ酸置換により生成される。
【００４６】
【表１】
2020533370.tif 000002
【００４７】
本発明は、上記抗体またはそのフラグメントまたはその融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド分子をさらに提供する。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ形態またはＲＮＡ形態であることができる。ＤＮＡ形態は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡを含む。ＤＮＡは、一本鎖または二本鎖であることができる。ＤＮＡは、コーディング鎖または非コーディング鎖であることができる。
本発明の成熟ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列と、成熟ポリペプチドのコード配列および様々な追加コード配列と、成熟ポリペプチドのコード配列（および任意の追加コード配列）および非コード配列を含む。
用語「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」は、前記ポリペプチドをコートするポリヌクレオチドであることができ、追加コードおよび／または非コード配列をさらに含むポリヌクレオチドであることもできる。
【００４８】
本発明はまた、上記配列にハイブリダイズし、２つの配列の間で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の同一性を有するポリヌクレオチドに関する。本発明は特に、厳密な条件下で本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズできるポリヌクレオチドに関する。本発明において、「厳密な条件」とは、（１）０.２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、６０ ℃などの低イオン強度および高温でのハイブリダイゼーションおよび溶出、または（２）ハイブリダイゼーション中に５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミド、０.１％ウシ血清／０.１％Ｆｉｃｏｌｌ、４２ ℃などの変性剤の添加、または（３）２つの配列の間の同一性が少なくとも９０％以上、より好ましくは９５％が以上である場合のみハイブリダイズが発生することを指す。また、ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドは、成熟ポリペプチドと同じ生物学的機能および活性を有する。
【００４９】
本発明の抗体のヌクレオチド全長配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え法、または人工合成法により獲得することができる。実行可能な方法は、特にフラグメントの長さが短い場合に、人工的な合成方法によって関連する配列を合成することである。通常、最初に複数の小さなフラグメントを合成し、次にそれらを連結することにより配列の長いフラグメントを獲得することができる。なお、重鎖のコード配列と発現タグ（例えば、６Ｈｉｓ）を融合して融合タンパク質を形成することもできる。
【００５０】
一旦関連配列を獲得すると、組換え法を使用して関連配列を大量に獲得することができる。これは通常、担体にクローニングし、細胞に移し、その後、従来の方法で増殖した宿主細胞から分離して関連配列を獲得する。本発明による生体分子（核酸、タンパク質など）は、分離された形態で存在する生体分子が含む。
現在、本発明のタンパク質（またはそのフラグメント、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、化学合成により完全に獲得することができる。次いで、前記ＤＮＡ配列を、当該分野で公知のさまざまな既存のＤＮＡ分子（または担体など）および細胞に導入することができる。なお、化学合成により、本発明のタンパク質配列に突然変異を導入することもできる。
【００５１】
本発明はまた、上記の適切なＤＮＡ配列および適切なプロモーターまたは制御配列を含む担体に関する。これらの担体を使用して適切な宿主細胞を形質転換して、タンパク質を発現させることができる。
宿主細胞は、細菌細胞などの原核細胞、または酵母細胞などの下等真核細胞、または哺乳動物細胞などの高等真核細胞であることができる。代表的な例は、大腸菌、ストレプトマイセスと、ネズミチフス菌の細菌細胞と、酵母などの真菌細胞と、ショウジョウバエＳ２またはＳｆ９の昆虫細胞と、ＣＨＯ、ＣＯＳ７、２９３細胞などの動物細胞がある。
【００５２】
組換えＤＮＡによる宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技術を使用して実施することができる。宿主が大腸菌などの原核生物である場合、指数関数的増殖期の後にＤＮＡを吸収できるコンピテント細胞を獲得し、ＣａＣｌ２法で処理し、使用されるステップは、当技術分野で周知である。別の方法は、ＭｇＣｌ２を使用することである。必要に応じて、エレクトロポレーションにより形質転換を行うこともできる。宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈法、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、リポソームパッケージングなどの従来の機械的方法などのＤＮＡトランスフェクション法を使用することができる。
【００５３】
得られた形質転換体は、常法により培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現させることができる。使用される宿主細胞に応じて、培養に使用される培地は、様々な従来の培地から選択されることができる。宿主細胞の増殖に適した条件下で培養する。宿主細胞が適切な細胞密度まで成長した後、適切な方法（例えば、温度変換または化学的誘導）によって選択されたプロモーターを誘導し、細胞を一定期間培養する。
【００５４】
上記の方法における組換えポリペプチドは、細胞内で、または細胞膜上で発現されるか、細胞外で分泌されることができる。必要に応じて、組換えタンパク質は、その物理的、化学的、およびその他の特性を使用したさまざまな分離方法によって分離および精製することができる。これらの方法は、当業者に周知である。これらの方法の例は、従来の再生処理、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧破壊、超処理、超遠心分離、モレキュラーシーブクロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびその他のさまざまな液体クロマトグラフィー技術、およびこれらの方法の組み合わせの結合を含むが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明の抗体は、単独で使用することができ、または検出可能なマーカー（診断目的のため）、治療薬、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分、またはこれらのいずれかの組み合わせまたは複合体することができる。
診断目的の検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）またはＣＴ（電子コンピューター断層撮影技術）造影剤、または検出可能な産物を生成できる酵素を含むが、これらに限定されない。好ましい検出可能なマーカーは放射性核種である。
【００５６】
本発明の抗体と組み合わせまたは複合体することができる治療薬は、１、放射性核種、２、生物毒性、３、ＩＬ−２などのサイトカイン、４、金ナノ粒子／ナノロッド、５、ウイルス粒子、６、リポソーム、７、ナノ磁性粒子、８、薬物活性化酵素（例えば、ＤＴ−ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニルヒドロラーゼ様タンパク質（ＢＰＨＬ））、１０、治療薬（例えば、シスプラチン）または任意の種類のナノ粒子などを含むが、これらに限定されない。
【００５７】
免疫複合体
本発明は、免疫複合体をさらに提供し、前記免疫複合体は、以下を含む。
（ａ）ＶＨＨ鎖のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−３のいずれかの一つに示される抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディのＶＨＨ鎖または前記ＶＨＨ鎖を有する抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディと、及び
（ｂ）放射性核種、酵素抗体、細胞、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるカップリング部分とを含む。
【００５８】
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、放射性核種である。
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、薬物または毒素である。
別の好ましい例において、前記カップリング部分は、検出可能なマーカーである。
【００５９】
別の好ましい例において、前記複合体は、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）またはＣＴ（電子コンピュータ断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成できる酵素、放射性核種、生体毒素、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２など）、抗体、抗体Ｆｃフラグメント、抗体ｓｃＦｖフラグメント、金ナノ粒子／ナノロッド、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ磁性粒子、プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ−心筋細胞（ＤＴＤ）またはビフェニル加水分解酵素様タンパク質（ＢＰＨＬ））、化学療法剤（例えば、シスプラチン）、または任意の形態のナノ粒子などから選択される。
本発明の免疫複合体は、試験対象のＰＤ−Ｌ１発現を非侵襲的に検出するために使用することができ、サイズが小さく、特異性が高く、原発性および転移性腫瘍を同時に標的とする全身検出に適し、精度が高く、放射線量が少ない。
【００６０】
キット
本発明は、本発明の免疫複合体を含むキットをさらに提供し、本発明の一好ましい例において、前記キットは、容器、取扱説明書、同位体トレーサー及び造影剤、フロー検出試薬、細胞免疫蛍光検出試薬、ナノ磁性粒子とイメージング剤からなる群から選択される１つまたは複数の試薬をさらに含む。
好ましくは、本発明のキットは、被験者のＰＤ−Ｌ１発現を非侵襲的に検出するための生体内診断キットである。
【００６１】
細胞毒剤
本発明の抗体複合体構成する結合部分は、細菌、真菌、植物または動物由来の小分子毒素などの毒素を含み、そのフラグメントおよび／または変異体を含む。細胞毒性の例は、オーリスタチン系（例えば、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＦ、ＭＭＡＥとＭＭＡＦ）、オーレオマイシン、メタンソール（methanesol）、リシン毒素、リシン毒素Ａ−鎖、コンブレタスタチン、ズオカルマイシン、ドラスタチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、パクリタキセル、シスプラチン、ｃｃ１０６５、臭化エチジウム、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ジヒドロキシアントラシンジオン、アクチノマイシン、ジフテリア毒素、緑膿菌外毒素（ＰＥ）Ａ、ＰＥ４０、アブリン、アブリンＡ鎖、モデッシンＡ鎖、α−八連球菌、ゲロニン、ミトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトシン（ｒｅｔｓｔｒｉｃｔｏｃｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン、クルシン（ｃｕｒｉｃｉｎ）、クロチン、カリケアマイシン、サパオナリアオフィシナリス（Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）阻害剤及び糖質コルチコイドと他の化学療法薬、およびＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２または２１３、Ｐ３２とＬｕ１７７を含むＬｕの放射性同位体などの放射性同位体を含むが、これらに限定されない。抗体は、プロドラッグをその活性型に変換することができる抗癌プロドラッグ活性化酵素に複合体させることもできる。
【００６２】
好ましい小分子薬物は、高い細胞毒性を有する化合物であり、好ましくは、モノメチルオーリスタチン（ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）、カリケアマイシン、メイタンシノイド、またはそれらの組み合わせであり、より好ましくは、モノメチルオーリスタチン−Ｅ（ＭＭＡＥ）、モノメチルオーリスタチン−Ｄ（ＭＭＡＤ）、モノメチルオーリスタチン−Ｆ（ＭＭＡＦ）、またはそれらの組み合わせである。
【００６３】
薬物組成物
本発明は、組成物をさらに提供する。好ましくは、前記組成物は、薬物組成物であり、上記抗体またはその活性フラグメントまたはその融合タンパク質または免疫複合体、及び薬学的許容される担体を含む。通常、これらの物質を非毒性、不活性、および薬理学的に許容される水性担体媒体で製剤することができ、ここで、ｐＨは通常約５〜８、好ましくは約６〜８であり、ｐＨは、製剤化される物質の性質と治療する病気によって異なる場合がある。製剤化された薬物組成物は、腫瘍内、腹腔内、静脈内、または局所投与を含む（しかし、これらに限定されない）従来の経路により投与することができる。
【００６４】
本発明の薬物組成物は、ＰＤ−Ｌ１タンパク質分子の結合に直接に使用することができるため、腫瘍を治療に使用することができる。なお、他の治療薬を同時に使用することもできる。
本発明の薬物組成物は、安全かつ有効な量（例えば、０.００１−９９ ｗｔ％、好ましくは、０.０１−９０ ｗｔ％、より好ましくは、０.１−８０ ｗｔ％）の本発明の上記ナノボディ（またはその複合体）及び薬学的許容される担体または賦形剤を含む。このタイプの担体は、塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせを含む（しかし、これらに限定されない）。薬物製剤は、投与方法と合わせる必要がある。本発明の薬物組成物は、例えば、生理食塩水またはグルコースおよび他のアジュバントを含む水溶液を用いた従来の方法により、注射剤の形態で調製することができる。注射剤および液剤などの薬物組成物は、無菌条件下で製造されることが好ましい。活性成分の投与量は、治療有効量であり、例えば、１日当たり約１０ μｇ／ｋｇ体重−約５０ ｍｇ／ｋｇ体重である。なお、本発明のポリペプチドは、他の治療薬とともに使用することもできる。
【００６５】
薬物組成物を使用する場合、安全かつ有効な量の免疫複合体を哺乳動物に投与し、安全かつ有効な量は通常少なくとも約１０ μｇ／ｋｇ体重であり、ほとんどの場合、約５０ ｍｇ／ｋｇ体重を超えず、好ましくは、投与量は約１０ μｇ／ｋｇ体重−約１０ ｍｇ／ｋｇ体重である。もちろん、具体的な投与量は、投与経路、患者の健康などの他の要因などの要因も考慮する必要があり、これらはすべて熟練した医師のスキルの範囲内である。
【００６６】
本発明の主な利点は、以下を含む。
（ａ）本発明の免疫複合体は、原発性および転移性腫瘍、全身画像化、局在化、定性的、定量的、およびステージングを同時に標的とする。
（ｂ）本発明の免疫複合体は、サイズが小さく、特異性が高いという特徴を有し、腫瘍組織をより効果的に貫通し、身体により容易に除去され、それにより非標的組織への放射線量を減らす。
（ｃ）本発明の免疫複合体は、半減期が短く、診断時間がさらに短いため、結果を迅速に観察することができる。
（ｄ）本発明の免疫複合体は、高い特異性、正確な検出、および局所的な偽陰性を回避する。
（ｅ）本発明の抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディとＰＤ−Ｌ１の結合は、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を遮断しない。
【００６７】
以下、具体的な実施例に結び付けて、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例にある具体的な条件のない実験方法は、通常、従来の条件またはメーカーが推奨する条件に基づく。特に明記しない限り、パーセンテージと部は重量による。
【００６８】
実施例１  宿主細菌大腸菌におけるナノボディの発現および精製
（１）ナノボディ（図６に示された配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１−３）の対応するプラスミドを大腸菌ＷＫ６に電気形質転換し、ＬＡ  ＋グルコース（ｇｌｕｃｏｓｅ）、即ち、アンピシリンとグルコースを含む培養プレートにコーティングし、３７ ℃で一晩インキュベートした。
（２）単一のコロニーを選び、アンピシリンを含むＬＢ培地５ ｍＬに接種し、３７ ℃でシェーカーで一晩培養した。
（３）１ ｍＬのオーバーナイト菌種を３３０ ｍＬのＴＢ培養液に接種し、３７ ℃でシェーカーで培養し、ＯＤ値が０.６−１に達した時に、ＩＰＴＧを加え、２８ ℃でシェーカーで一晩培養した。
（４）遠心分離して菌を収集し、浸透法により粗抗体抽出液を得た。
（５）浸透法により粗抗体抽出液を得た。
（６）ニッケルカラムイオンアフィニティークロマトグラフィーによる純度９０％以上のナノボディを調製した。
【００６９】
配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ.：１−３のナノボディは、それぞれナノボディＮｏ.１、ナノボディＮｏ.２、ナノボディＮｏ.３と命名された。
ナノボディＮｏ.１、ナノボディＮｏ.２の精製結果は図１に示した通り、調整されたナノボディの純度は９５％以上に達する。
【００７０】
実施例２  酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によるナノボディの親和性の同定
（１）コーティングされた抗原タンパク質ＰＤ−Ｌ１、ＩｇＧ、およびＮａＨＣＯ３（１００ ｍＭ、Ｐｈ８.２）をブランクコントロールとして使用し、４ ℃で一晩培養した。
（２）翌日ＰＢＳＴで３回洗浄し、１％ＢＳＡを加えて室温で２時間ブロックした。
（３）精製したナノボディを希釈し、コーティングされたＰＤ−Ｌ１、ＩｇＧ、およびＮａＨＣＯ３と室温で１時間反応させた。
（４）結合していない抗体をＰＢＳＴで洗浄し、マウス抗ＨＡ抗体を加えて室温で１時間放置した。
（５）結合していない抗体をＰＢＳＴで洗浄し、ヤギ抗マウスアルカリホスファターゼ標識抗体を加え、室温で１時間放置した。
（６）結合していない抗体をＰＢＳＴで洗浄し、アルカリホスファターゼ発色溶液を加え、ＥＬＩＳＡ装置で４０５ ｎｍの波長で吸収値を読み取った。吸収値に基づいてナノボディの特異性を判断した。
【００７１】
検出結果は、図２に示したとおりであり、ナノボディＮｏ.１とナノボディＮｏ.２はＰＤ−Ｌ１にのみ結合する。ナノボディＮｏ.３の検出結果は、ナノボディＮｏ.１と類似し、図には具体的に示されていない。
ナノボディの勾配希釈により親和性をさらに測定した。
結果は、表１に示したように、本発明のナノボディの親和性が１×１０−９以上であることを示している。
【００７２】
【表２】
2020533370.tif 000003
【００７３】
実施例３  フローサイトメトリーによりナノボディがＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合を遮断する効果を有するかどうかを検出
（１）ヒトＰＤ−Ｌ１全長タンパク質を一時的に発現する１×１０６  ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を０.５ ％ＢＳＡ−ＰＢＳバッファーに再懸濁し、１０μｇの抗ＰＤ−Ｌ１ナノボディを加え、陽性対照、陰性対照、ブランクグループ（ＰＢＳ）を設定し、すべてのサンプルに５ μｇ  ｈＰＤ−１−Ｆｃ−Ｂｉｏｔｉｎを添加し、４ ℃で２０ 分間インキュベートした。
（２）ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＳＡ−ＰＥを加え、４ ℃で２０ 分間インキュベートし、細胞をＰＢＳで２ 回洗浄した後、フローサイトメトリーで検出した。
結果は表１に示したとおりであり、本発明のナノボディがＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合の効果を遮断できないことを示している。
【００７４】
実施例４  フローサイトメトリーによるナノボディの特異性の検出
（１）細胞タイプ：ＨＣＣ８２７およびＡ５４９。細胞をＰＢＳで２回洗浄した。
（２）ナノボディをＰＢＳで希釈し、陽性対照、陰性対照、およびブランクグループ（ＰＢＳ）を同時に設定した。
（３）洗浄した細胞を９６ウェルプレートに分注し、各サンプルの細胞数は３×１０５であり、希釈したナノボディを各ウェルに加え、４ ℃で２０ 分間均一に混合した。
（４）ＰＢＳで細胞を２回洗浄し、マウス抗ＨＡ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８を加え、４ ℃で２０ 分間放置した。
（５）ＰＢＳで細胞を２ 回洗浄し、機械（ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ）でテストした。
【００７５】
結果は表１に示したとおりであり、ＰＤ−Ｌ１過剰発現（ＨＣＣ８２７）細胞株では、ナノボディの陽性率は６７−９３ ％であり、ＰＤ−Ｌ１過少発現（Ａ５４９）細胞株では、ナノボディの陽性率は１２−３３ ％であり、２つの間の差は少なくとも約２倍であり、これはさらに、本発明のナノボディがＰＤ−Ｌ１に対して非常に良好な特異性を有することを示唆している。
【００７６】
実施例５  ナノボディＩ−１２５標識、分離および精製、およびＳＰＥＣＴイメージングスキャン
（１）１５０ μＬの抗体原液を取り、１００ μＬの０.０２ ｍｏｌ／Ｌ  ｐＨ７.４リン酸緩衝液と５０ μＬのＮａ１２５Ｉ溶液を加え、均一に混合し、２０ μＬの５ ｍｇ／ ｍＬクロラミンＴ溶液を加え、室温で７０ 秒間反応させ、２００ μＬのメタ重亜硫酸ナトリウム溶液（５ ｍｇ／ｍＬ）を加えて５ 分間作用させた。
（２）ＰＤ１０カラムで分離し、溶出液は０.０２ ｍｏｌ／ＬのｐＨ  ７.４リン酸緩衝液であり、チューブあたり１０滴を収集し、ペーパークロマトグラフィーによりＩ−１２５標識ナノボディの放射純度を同定した。
（３）ヌードマウスの右脇の下に５×１０５個のＰＤ−Ｌ１過剰発現（ＨＣＣ８２７）細胞を接種し、正式な実験研究のために腫瘍が１５０−２００ ｍｍ３に成長するまで待つ。
（４）担癌マウスをイソフルランで麻酔し、Ｉ−１２５標識ナノボディ（〜５０ ｕｇ、５ ＭＢｑ）を尾静脈に注射した。
（５）投与０.５ 時間後にスキャンを実施し、取得方法は静的１５ 分ＳＰＥＣＴおよび中解像度全身ＣＴである。
【００７７】
図３と表２は、担癌マウスの３０ 分のＳＰＥＣＴスキャン写真と体分布データを示し、結果は、ナノボディＮｏ.１とナノボディＮｏ.２がＰＤ−Ｌ１過剰発現腫瘍モデルに効果的に蓄積し、ＰＤ−Ｌ発現を非侵襲的に検出することができ、癌の予後と診断に使用されることを示している。同時に、非結合抗体は、腎臓と膀胱を介して血液から迅速に除去され、身体の放射線量を減らし、待ち時間を短縮する。ナノボディＮｏ.３の検出結果は、ナノボディＮｏ.１に類似しているため、ここでは具体的に示さない。
【００７８】
【表３】
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【００７９】
実施例５  ナノボディ９９ｍＴｃの標識、分離及び精製、血清安定性試験およびＳＰＥＣＴイメージングスキャン
（１）５.５ ｍＬのＮａ２ＣＯ３、１５.２ ｍｇの酒石酸カリウムナトリウム、及び２０.５ ｍｇのＮａＢＨ４を１０ ｍＬ滅菌ボトルに加え、２０分間のＣＯを通過させ、１ ｍＬ（３５ｍＣｉ）Ｎａ  ［９９ｍＴｃＯ４］を加え、反応ボトルを密閉し、８０ ℃で３０分間加熱する。
（２）５０ μｌの抗体原液を取り、５００ μｌの９９ｍＴｃ（ＣＯ）３（Ｈ２Ｏ）３反応溶液（６.５６ｍＣｉ）を加え、４５〜５０ ℃で９０分間反応させた。
（３）ＰＤ１０カラムで分離し、溶離液は０.０２ ｍｏｌ／ＬのｐＨ  ７.４リン酸緩衝液であり、薄層クロマトグラフィーにより９９ｍＴｃ標識ナノボディは放射純度を同定した。
（４）１００ μｌの９９ｍＴｃ標識ナノボディを取り、５００ μｌのマウスまたはヒトの血清を加え、３７ ℃で３０分、９０分および１８０分間インキュベートした。
（５）分子排除ＨＰＬＣにより９９ｍＴｃ標識ナノボディを分析した。
（６）ヌードマウスの右脇の下に５×１０５ 個のＰＤ−Ｌ１過剰発現（ＨＣＣ８２７）またはＰＤ−Ｌ１過少発現（Ａ５４９）細胞を接種し、正式な実験研究のために腫瘍が１５０−２００ ｍｍ３に成長するまで待つ。
（７）Ｔｃ−９９ｍ標識ナノボディ（〜１０ ｕｇ、５ ＭＢｑ）を尾静脈に注射するか、２０ｘ非標識ナノボディと同時に混合するか、アテゾリズマブを尾静脈に７２ 時間前に投与した。投与０.５ 時間後にスキャンを実施し、取得方法は静的１５分ＳＰＥＣＴおよび中解像度全身ＣＴである。
【００８０】
結果は図４に示したとおりであり、ＨＰＬＣスペクトルは、ナノボディＮｏ.２が生体外で１８０ 分間インキュベートされても分解することなく安定であることを示した。ナノボディＮｏ.１およびナノボディＮｏ.３の検出結果は、ナノボディＮｏ.１と類似し、図には具体的に示されていない。
図５と表３は、担癌マウスの３０ 分間のＳＰＥＣＴスキャン写真と体内分布データを示している。結果は、ナノボディＮｏ.２が腫瘍モデルでＰＤ−Ｌ１の発現を特異的かつ非侵襲的に検出でき、癌の予後と診断に使用されることを示している。ナノボディＮｏ.１およびナノボディＮｏ.３の検出結果は、ナノボディＮｏ.１と類似し、図には具体的に示されていない。
【００８１】
【表４】
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【００８２】
本発明で言及されるすべての文書は、あたかも各文書が個々に参照により組み込まれたかのように、本出願に参照により組み込まれる。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も本出願の添付の特許請求の範囲によって定義される範囲内に入ることを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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