(57)【要約】  本発明は、組合せ物及び治療におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）式（Ｉ）：
【化１】
2020517621.tif 000011
［式中、
Ｙ１は、ハロゲン、Ｒａ、又はＧａ−Ｒａ基を表し；
Ａは、ＣＨ＝ＣＨ又はＣＨ２−ＣＨ２基を表し；
Ｙ２は、Ｇｂ−Ｒｂ基を表し；
Ｇａ及びＧｂは、同一であるか又は異なって、酸素又は硫黄原子を表し；
Ｒａは、水素原子、非置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール基又は１つ以上のハロゲン原子で置換されている（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ若しくは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルチオ基；（Ｃ３〜Ｃ１４）シクロアルキル基、（Ｃ３〜Ｃ１４）シクロアルキルチオ基又は複素環基を表し；
Ｒｂは、少なくとも−ＣＯＯＲｃ基で置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表し、該Ｒｃは、水素原子、又は１つ以上のハロゲン原子で置換されている若しくはされていない（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３〜Ｃ１４）シクロアルキル基、又は複素環基を表し；及び
Ｙ４及びＹ５は、同一であるか又は異なって、１つ以上のハロゲン原子で置換されている若しくはされていない（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３〜Ｃ１４）シクロアルキル基又は複素環基を表す。］
の化合物、その薬学的に許容される塩又は溶媒和化合物、並びに
（ｉｉ）抗ＮＡＳＨ剤、抗線維化剤又は抗胆汁うっ滞性剤
を含む組合せ物。
【請求項２】
成分（ｉ）が、エラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩である、請求項１に記載の組合せ物。
【請求項３】
成分（ｉｉ）が、ＡＳＫ１阻害剤、デュアルＮＯＸ１及びＮＯＸ４、ＶＡＰ−１阻害剤、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素−１阻害剤／脂肪酸胆汁酸コンジュゲート、ＧＰＲ８４アンタゴニスト／ＦＦＡＲ１アゴニスト又は免疫モジュレータ、ｍＴＯＲモジュレータ又はインスリン感受性改善薬、ＴＨＲβアゴニスト、ヘッジホッグ細胞シグナル伝達経路阻害剤、アデノシンＡ３受容体アゴニスト、アルドステロン受容体アンタゴニスト、ＴＬＲ−４アンタゴニスト、カスパーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ２阻害剤又は核内受容体リガンドである、請求項１又は２に記載の組合せ物。
【請求項４】
成分（ｉｉ）が、セロンセルチブ、ＧＫＴ−８３１、ＰＸＳ−４７２８Ａ、アラムコール、ＰＢＩ−４０５０、ＭＳＤＣ−０６０２ｋ、ＶＫ−２８０９、ＭＧＬ−３１９６、ビスモデギブ、ＣＦ−１０２（ナモデノソン）、ＭＴ−３９９５（アパラレノン）、ＪＫＢ−１２１（ナルメフェン）、エムリカサン、ＫＤ−０２５及びＤＵＲ−９２８又はその薬学的な塩である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組合せ物。
【請求項５】
成分（ｉｉ）が、ＧＫＴ−８３１、アラムコール、ＳＨＰ−６２５、エムリカサン、サログリタザール、ＩＭＭ−１２４−Ｅ、ＧＳ−９６７４、ＮＧＭ−２８２、Ａ−４２５０、ＧＲ−ＭＤ−０２、ＧＳ−４９９７、Ｆ−３５１、ソリスロマイシン、レモグリフロジン、ＢＴＴ−１０２３、ＩＶＡ−３３７（ラニフィブラノール）、ＪＫＢ−１２１、ＫＤ−０２５、ＭＳＤＣ−０６０２、ＰＢＩ−４０５０、ＰＥＧ−ＦＧＦ２１、チペルカスト、ＶＫ−２８０９、ＭＧＬ−３１９６、ＧＳ−０９７６、ペンタサ、ＲＧ−１２５、ボリキシバット、ピオグリタゾン、セマグルチド、ＧＳＫ２３３０６７２又はＭＢＸ−８０２５である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組合せ物。
【請求項６】
前記組合せ物が、成分（ｉ）及び（ｉｉ）並びに薬学的に許容される担体を含む組成物である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組合せ物。
【請求項７】
前記組合せ物が、連続、分離又は同時使用のための、成分（ｉ）及び（ｉｉ）を含むキットオブパーツ（ｋｉｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｓ）である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組合せ物。
【請求項８】
成分（ｉ）及び（ｉｉ）が、持効性及び／又は徐放性放出のために、注射可能な懸濁液、ジェル、オイル、ピル、錠剤、坐薬、粉末、カプセル、エアロゾル、軟膏、クリーム、パッチ、又はガレヌス形態の手段で製剤化される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組合せ物。
【請求項９】
医薬として使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組合せ物。
【請求項１０】
炎症性、代謝性、線維性又は胆汁うっ滞性疾患を治療するための方法において使用するための、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組合せ物。
【請求項１１】
線維性障害が、肝臓、腎臓、皮膚、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、陰茎、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、腸（例えば、小腸）、胆道、軟部組織（例えば、縦隔又は後腹膜）、骨髄、関節及び胃線維症、特に肝臓、腸、肺、心臓、腎臓、筋肉、皮膚、軟部組織、骨髄、腸、目及び関節線維症からなる群において選択される、請求項１０に記載の使用のための組合せ物。
【請求項１２】
疾患が、代謝性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、薬剤誘発性肝疾患、アルコール誘発性肝疾患、感染病原体誘発性肝疾患、炎症性肝疾患、免疫系機能障害媒介肝疾患、脂質異常症、循環器疾患、再狭窄、シンドロームＸ、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、高血圧、原発性硬化性胆管症（ＰＳＣ）、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）のような慢性胆管症、胆道閉鎖、進行性家族性胆内胆汁うっ滞症３型（ＰＦＩＣ３）、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ケロイド、陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性硬化症、炎症性疾患、神経変性疾患、がん、肝臓がん、肝細胞癌、胃腸がん、胃がん、神経線維腫症に伴う髄膜腫、膵内分泌腫瘍、膵外分泌腫瘍、白血病、骨髄増殖性／骨髄異形成疾患、肥満細胞症、皮膚線維肉腫、乳がん、肺がん、甲状腺がん又は結腸直腸がんを含む固形腫瘍、前立腺がん、任意の起源の肝線維症又は硬変症、代謝性疾患誘発性肝線維症又は硬変症、ＮＡＦＬＤ誘発性線維症又は硬変症、ＮＡＳＨ誘発性線維症又は硬変症、アルコール誘発性肝線維症又は硬変症、薬剤誘発性肝線維症又は硬変症、感染病原体誘発性肝線維症又は硬変症、寄生虫感染による肝線維症又は硬変症、細菌感染による肝線維症又は硬変症、ウイルス感染による線維症又は硬変症、ＨＢＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＣＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＩＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＣＶ及びＨＩＶの重複感染による肝線維症又は硬変症、放射線又は化学療法誘発性線維症又は硬変症、胆道線維症、任意の慢性胆汁うっ滞性疾患による肝線維症又は硬変症、任意の病因の腸線維症、クローン病誘発性線維症、潰瘍性大腸炎誘発性線維症、腸（例えば、小腸）線維症、結腸線維症、胃線維症、皮膚線維症、表皮線維症、内皮線維症、強皮症／全身性硬化症による皮膚線維症、肺線維症、ＣＯＰＤ、喘息、肺気腫、喫煙者の肺、結核のような慢性炎症性気道疾患につながる肺線維症、肺性線維症、特発性肺性線維症（ＩＰＦ）、心臓線維症、腎線維症、腎性全身性線維症、筋線維症、軟部組織（例えば、縦隔又は後腹膜）線維症、骨髄線維症、関節線維症（ｊｏｉｎｔ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腱線維症、軟骨線維症、膵臓線維症、子宮線維症、神経系線維症、精巣線維症、卵巣線維症、副腎線維症、動脈線維症、静脈線維症、眼線維症、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症（炭鉱夫塵肺の合併症）、増殖性線維症、腫瘍性線維形成、着床前後線維症及び石綿症、関節線維症（ａｒｔｈｒｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、癒着性関節包炎からなる群において選択される、請求項１０に記載の使用のための組合せ物。
【請求項１３】
疾患が、代謝性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、薬剤誘発性肝疾患、アルコール誘発性肝疾患、感染病原体誘発性肝疾患、炎症性肝疾患、免疫系機能障害媒介肝疾患、脂質異常症、循環器疾患、再狭窄、シンドロームＸ、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、高血圧、原発性硬化性胆管症（ＰＳＣ）、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）のような慢性胆管症、胆道閉鎖、進行性家族性胆内胆汁うっ滞症３型（ＰＦＩＣ３）、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、肝臓がん、肝細胞癌、胃腸がん、胃がん、結腸直腸がん、代謝性疾患誘発性肝線維症又は硬変症、ＮＡＦＬＤ誘発性線維症又は硬変症、ＮＡＳＨ誘発性線維症又は硬変症、アルコール誘発性肝線維症又は硬変症、薬剤誘発性肝線維症又は硬変症、感染病原体誘発性肝線維症又は硬変症、寄生虫感染による肝線維症又は硬変症、細菌感染による肝線維症又は硬変症、ウイルス感染による線維症又は硬変症、ＨＢＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＣＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＩＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＣＶ及びＨＩＶの重複感染による肝線維症又は硬変症、放射線又は化学療法誘発性線維症又は硬変症、胆道線維症、任意の慢性胆汁うっ滞性疾患による肝線維症又は硬変症、任意の病因の腸線維症、クローン病誘発性線維症、潰瘍性大腸炎誘発性線維症、腸（例えば、小腸）線維症、結腸線維症、胃線維症、肺線維症、ＣＯＰＤ、喘息、肺気腫、喫煙者の肺、結核のような慢性炎症性気道疾患につながる肺線維症、肺性線維症、特発性肺性線維症（ＩＰＦ）からなる群において選択される、請求項１０に記載の使用のための組合せ物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性、代謝性、線維性及び胆汁うっ滞性疾患を治療するための組合せ療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロパ−２−エン−１−オン（エラフィブラノール、又はＥＬＡ、以前はＧＦＴ５０５と名付けられていた）は、国際公開第２００４００５２３３号に開示されているが、多くの胃腸及び肝臓疾患、特にＰＢＣ（原発性胆汁性胆管炎）及びＰＳＣ（原発性硬化性胆管炎）のような胆汁うっ滞性疾患、又は肝臓疾患、特に非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）のような非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）の治療にとって有益であり得る特性を有する。
【０００３】
エラフィブラノールは、ＮＡＳＨにおいてこれまで行われた最大の介入研究の１つである、１年肝生検ベースのフェーズ２ｂ試験（ＧＦＴ５０５−２１２−７）においてＮＡＳＨでの臨床効果について試験された。エラフィブラノールは、現在まで８００人を超える患者と健康なボランティアに投与され、特に：ＡＬＡＴ、ＡＳＡＴ、γＧＴ、ＡＬＰを含む肝機能障害のマーカーの改善；インスリン感受性及びグルコース恒常性の改善；血漿トリグリセリド及びＬＤＬ−Ｃの減少並びにＨＤＬ−Ｃレベルの増加を含む、血漿脂質に対する有利な効果；抗炎症性特性；動物疾患モデルにおける組織学的ＮＡＳＨパラメータ（脂肪肝、炎症、線維症）に対する効果並びに抗線維化活性を含むＮＡＳＨに対する有益な特性を示した。安全性への懸念がないことが完全毒性学パッケージの２年に及ぶ発癌性研究において確かめられている。エラフィブラノールは、ＮＡＳＨの治療についての臨床フェーズ３試験において現在評価中である。臨床フェーズ２試験でのＰＢＣの治療についてのこの分子の評価も計画されている。
【０００４】
その優れた治療及び薬理学的プロファイルに鑑みて、エラフィブラノールは、多数の炎症性、代謝性、線維性及び胆汁うっ滞性疾患に関与する並行な又は相補的キー経路を標的にする組合せ薬理学的アプローチにおいて潜在的に使用することができると考えられる非常に有望な分子である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第２００４／００５２３３号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は：
（ｉ）ＰＰＡＲアゴニスト、特に化学式（Ｉ）：
【０００７】
【化１】
2020517621.tif 000002
［式中、
Ｙ１は、ハロゲン、Ｒａ、又はＧａ−Ｒａ基を表し；
Ａは、ＣＨ＝ＣＨ又はＣＨ２−ＣＨ２基を表し；
Ｙ２は、Ｇｂ−Ｒｂ基を表し；
Ｇａ及びＧｂは、同一であるか又は異なって、酸素又は硫黄原子を表し；
Ｒａは、水素原子、非置換（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、（Ｃ６〜Ｃ１４）アリール基又は１つ以上のハロゲン原子で置換されている（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、（Ｃ１〜Ｃ６）アルコキシ若しくは（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルチオ基；（Ｃ３〜Ｃ１４）シクロアルキル基、（Ｃ３〜Ｃ１４）シクロアルキルチオ基又は複素環基を表し；
Ｒｂは、少なくとも−ＣＯＯＲｃ基で置換された（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表し、Ｒｃは、水素原子、又は１つ以上のハロゲン原子で置換されている若しくはされていない（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３〜Ｃ１４）シクロアルキル基、又は複素環基を表し；及び
Ｙ４及びＹ５は、同一であるか又は異なって、１つ以上のハロゲン原子で置換されている若しくはされていない（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基、（Ｃ３〜Ｃ１４）シクロアルキル基又は複素環基を表す。］、の化合物、又はその薬学的に許容される塩並びに
（ｉｉ）抗ＮＡＳＨ剤、抗線維化剤又は抗胆汁うっ滞性剤
を含む組合せ物に関する。
【０００８】
式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態では、
Ｙ１はハロゲン、Ｒａ又はＧａ−Ｒａ基を表し；
Ａは、ＣＨ＝ＣＨ基を表し；
Ｙ２は、Ｇｂ−Ｒｂ基を表し；
Ｇａ及びＧｂは、同一であるか又は異なって、酸素又は硫黄の原子を表し；
Ｒａは、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル又は（Ｃ３〜Ｃ１４）シクロアルキル基、特に１つ以上のハロゲン原子により置換されているか若しくは置換されていない（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル又は（Ｃ３〜Ｃ１４）シクロアルキル基を表し；
Ｒｂは、−ＣＯＯＲ３基により置換されている（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表し、Ｒｃは水素原子又は１〜４炭素原子を有するアルキル基を表し；並びに
Ｙ４及びＹ５は、独立して（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表す。
【０００９】
式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態では、
Ｙ１はＲａ又はＧａ−Ｒａ基を表し；
ＡはＣＨ２−ＣＨ２基を表し；
Ｙ２はＧｂ−Ｒｂ基を表し；
Ｇａは酸素又は硫黄の原子を表し、Ｇｂは酸素原子を表し；
Ｒａは、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル又は（Ｃ３〜Ｃ１４）シクロアルキル基を表し；
Ｒｂは、少なくとも−ＣＯＯＲｃ基により置換されている（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表し、Ｒｃは水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表し；並びに
Ｙ４及びＹ５は、独立して（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表す。
【００１０】
式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態では、
Ｙ１はハロゲン原子又はＲａ若しくはＧａ−Ｒａ基を表し；
ＡはＣＨ２−ＣＨ２基を表し；
Ｙ２はＧｂ−Ｒｂ基を表し；
Ｇａは酸素又は硫黄の原子を表し、Ｇｂは酸素原子を表し；
Ｒａは、１つ以上のハロゲン原子で置換されている（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル又は（Ｃ３〜Ｃ１４）シクロアルキル基を表し；
Ｒｂは、１つ以上のハロゲン原子により置換されているか又は置換されていない及び少なくとも−ＣＯＯＲｃ基により置換されている（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を表し、Ｒｃは水素原子又は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表し；並びに
Ｙ４及びＹ５は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表す。
【００１１】
式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態では、Ｇｂは酸素原子でありＲｂは−ＣＯＯＲｃ基により置換されている（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基であり、Ｒｃは水素原子又は非置換直鎖若しくは分岐（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル基を表す。
【００１２】
式（Ｉ）の化合物の特定の実施形態では、Ｙ１は、直鎖又は分岐である（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基であって、１つ以上のハロゲン原子により置換されているか又は置換されていない（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基を含む（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルチオ基である。
【００１３】
特定の実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロプ−２−エン−１−オン（エラフィブラノール又はＧＦＴ５０５）、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−イソプロピルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロプ−２−エン−１−オン、１−［４−メチルチオフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔ−ブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロプ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔ−ブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロプ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロプ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−ｔ−ブチルオキシカルボニルジメチルメチルオキシフェニル］プロプ−２−エン−１−オン、１−［４−トリフルオロメチルオキシフェニル］−３−［３，５−ジメチル−４−カルボキシジメチルメチルオキシフェニル］プロプ−２−エン−１−オン、２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチルプロパン酸及び２−［２，６−ジメチル−４−［３−［４−（メチルチオ）フェニル］−３−オキソ−プロピル］フェノキシ］−２−メチル−プロパン酸イソプロピルエステルからなる群において選択される。
【００１４】
本発明の特定の実施形態において、成分（ｉｉ）は抗ＮＡＳＨ剤である。本発明の実行に有用である例示的、非限定的抗ＮＡＳＨ剤は：
・アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤；
・アデノシンＡ３受容体アゴニスト；
・アルドステロンアンタゴニスト及びミネラルコルチコイドアンタゴニスト
・ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ刺激物質
・アミリン受容体アゴニスト及びカルシトニン受容体アゴニスト；
・アンジオポエチン関連タンパク質−３阻害剤
・抗ＬＰＳ抗体；
・頂端側ナトリウム共依存性胆汁酸輸送体阻害剤；
・無水ベタイン又はＲＭ−００３；
・生理活性脂質；
・カンナビノイドＣＢ１受容体アンタゴニスト；
・デュアルカンナビノイドＣＢ１受容体／ｉＮＯＳ阻害剤；
・カスパーゼ阻害剤；
・カテプシン阻害剤；
・ＣＣＲアンタゴニスト；
・ＣＣＲ３ケモカインモジュレータ及びエオタキシン２リガンド阻害剤
・ジアシルグリセロール−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤；
・ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）阻害剤；
・インスリンリガンド及びインスリン受容体アゴニスト；
・インスリン感受性改善薬及びＭＣＨ受容体−１アンタゴニスト
・デュアルＮＯＸ１及び４阻害剤のような、ＮＯＸ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ）阻害剤；
・細胞外マトリックスタンパク質モジュレータ；
・ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素−１阻害剤／脂肪酸胆汁酸コンジュゲート（ＦＡＢＡＣ）；
・脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）阻害剤；
・組換え線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ−１９）タンパク質、又はＦＧＦ−１９タンパク質の機能的な操作変異体のような線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ−１９）受容体リガンド；
・線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）タンパク質、又はＦＧＦ−２１タンパク質の機能的な操作変異体のような線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）受容体リガンド；
・ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニスト；
・ガレクチン３阻害剤；
・グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）類似物及びＧＬＰ−１受容体アゴニスト；
・Ｇ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）モジュレータ；
・Ｇ−タンパク質共役型受容体８４アンタゴニスト、結合組織成長因子リガンド阻害剤及び遊離脂肪酸受容体１アゴニスト、
・ヘッジホッグ細胞シグナル伝達経路阻害剤
・インテグリン阻害剤；
・ケトヘキソキナーゼ阻害剤；
・ロイコトリエン（ＬＴ）／ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）／リポキシゲナーゼ（ＬＯ）阻害剤；
・リジルオキシダーゼ相同体２阻害剤（ＬＯＸＬ２阻害剤）；
・マクロライド；
・メチルＣｐＧ結合タンパク質２モジュレータ及びトランスグルタミナーゼ阻害剤；
・ｍｉＲＮＡアンタゴニスト；
・ミトコンドリア輸送担体ファミリー阻害剤及びミトコンドリアリン酸輸送担体タンパク質阻害剤
・モノクローナル抗体
・ミエロペルオキシダーゼ阻害剤；
・ｍＴＯＲモジュレータ；
・ＮＡＤ依存性デアセチラーゼサーチュイン刺激物質；ＰＤＥ５阻害剤
・ニコチン酸受容体（ＧＰＲ１０９）アゴニスト
・核内受容体リガンド；
・Ｐ２Ｙ１３タンパク質アゴニスト；
・フェニルアラニンヒドロキシラーゼ刺激物質；
・プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）−２アンタゴニスト；
・タンパク質キナーゼモジュレータ；
・ＰＰＡＲアルファアゴニスト；
・ＰＰＡＲガンマアゴニスト；
・ＰＰＡＲデルタアゴニスト；
・ＰＰＡＲアルファ／ガンマアゴニスト；
・ＰＰＡＲアルファ／デルタアゴニスト；
・ＰＰＡＲガンマ／デルタ；
・ＰＰＡＲアルファ／ガンマ／デルタアゴニスト又はＰＰＡＲ汎アゴニスト；
・Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ２（ＲＯＣＫ２）阻害剤；
・ナトリウム−グルコース輸送（ＳＧＬＴ）１阻害剤；
・ナトリウム−グルコース輸送（ＳＧＬＴ）２阻害剤；
・ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素−１阻害剤
・シグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）阻害剤；
・甲状腺ホルモン受容体β（ＴＨＲ  β）アゴニスト；
・Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ−２）アンタゴニスト；
・Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）アンタゴニスト；
・Ｉ型ナチュラルキラーＴ細胞阻害剤；
・チロシンキナーゼ受容体（ＲＴＫ）モジュレータ；
・尿酸陰イオン交換体１阻害剤及びキサンチンオキシダーゼ阻害剤
・血管接着タンパク質−１（ＶＡＰ−１）阻害剤；並びに
・ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）アゴニスト
を含む。
【００１５】
本発明のさらなる特定の実施形態において、成分（ｉｉ）は抗ＮＡＳＨ剤である。
【００１６】
特定の実施形態において、抗ＮＡＳＨ剤は：
・アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤；
・抗ＬＰＳ抗体；
・頂端側ナトリウム共依存性胆汁酸輸送体阻害剤；
・生理活性脂質；
・カンナビノイドＣＢ１受容体アンタゴニスト；
・デュアルカンナビノイドＣＢ１受容体／ｉＮＯＳ阻害剤；
・カスパーゼ阻害剤；
・カテプシン阻害剤；
・ＣＣＲアンタゴニスト；
・ジアシルグリセロール−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ）阻害剤；
・ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）阻害剤；
・デュアルＮＯＸ１及び４阻害剤のような、ＮＯＸ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ）阻害剤；
・細胞外マトリックスタンパク質モジュレータ；
・ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素−１阻害剤／脂肪酸胆汁酸コンジュゲート（ＦＡＢＡＣ）；
・組換え線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ−１９）タンパク質、又はＦＧＦ−１９タンパク質の機能的な操作変異体のような線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ−１９）受容体リガンド；
・線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）タンパク質、又はＦＧＦ−２１タンパク質の機能的な操作変異体のような線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）受容体リガンド；
・ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニスト；
・ガレクチン３阻害剤；
・グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）類似物；
・Ｇ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）モジュレータ；
・インテグリン阻害剤；
・ロイコトリエン（ＬＴ）／ホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）／リポキシゲナーゼ（ＬＯ）阻害剤；
・マクロライド；
・ｍｉＲＮＡアンタゴニスト；
・モノクローナル抗体
・ｍＴＯＲモジュレータ；
・核内受容体リガンド；
・Ｐ２Ｙ１３タンパク質アゴニスト；
・プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）−２アンタゴニスト；
・タンパク質キナーゼモジュレータ；
・ＰＰＡＲアルファアゴニスト；
・ＰＰＡＲガンマアゴニスト；
・ＰＰＡＲデルタアゴニスト；
・ＰＰＡＲアルファ／ガンマアゴニスト；
・ＰＰＡＲアルファ／デルタアゴニスト；
・ＰＰＡＲガンマ／デルタ；
・ＰＰＡＲアルファ／ガンマ／デルタアゴニスト又はＰＰＡＲ汎アゴニスト；
・Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ２（ＲＯＣＫ２）阻害剤；
・ナトリウム−グルコース輸送（ＳＧＬＴ）２阻害剤；
・シグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）阻害剤；
・甲状腺ホルモン受容体β（ＴＨＲ  β）アゴニスト；
・Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）アンタゴニスト；
・チロシンキナーゼ受容体（ＲＴＫ）モジュレータ；
・血管接着タンパク質−１（ＶＡＰ−１）阻害剤；並びに
・ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）アゴニスト
から選択される。
【００１７】
他の抗ＮＡＳＨ剤は、ＫＢ−ＧＥ−００１及びＮＧＭ−３８６及びＮＧＭ−３９５、ＮＣ−１０及びＴＣＭ−６０６Ｆを含む。さらに抗ＮＡＳＨ剤は、イコサブテート、ＮＣ−１０１、ＮＡＩＡ−１０１コレセベラム及びＰＲＣ−４０１６を含む。
【００１８】
本発明の特定の実施形態において、成分（ｉｉ）は抗線維化剤である。本発明の実行に有用である例示的、非限定的抗線維化剤は：
・アデノシンＡ３受容体アゴニスト；
・アンジオテンシンＩＩ受容体遮断剤；
・形質転換成長因子ベータ２（ＴＧＦ−β２）を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド；
・生理活性脂質；
・カスパーゼ阻害剤；
・カンナビノイドＣＢ２受容体模倣薬；
・デュアルファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）／ＴＧＲ５アゴニスト；
・デュアルＮＯＸ１及び４阻害剤のような、ＮＯＸ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ）阻害剤；
・ガレクチン３阻害剤；
・ヘッジホッグ細胞シグナル伝達経路阻害剤
・免疫調節剤；
・インテグリン阻害剤；
・マクロファージマンノース受容体モジュレータ；
・メタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）刺激物質；
・モノクローナル抗体；
・ＮＦ−カッパＢ阻害剤；
・非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；
・ＰＤＧＦＲモジュレータ；
・ＰＰＡＲアルファアゴニスト；
・ＰＰＡＲガンマアゴニスト；
・ＰＰＡＲデルタアゴニスト；
・ＰＰＡＲアルファ／ガンマアゴニスト；
・ＰＰＡＲアルファ／デルタアゴニスト；
・ＰＰＡＲガンマ／デルタ；並びに
・ＰＰＡＲアルファ／ガンマ／デルタアゴニスト又はＰＰＡＲ汎アゴニスト
を含む。
【００１９】
さらなる特定の実施形態において、抗線維化剤は：
・形質転換成長因子ベータ２（ＴＧＦ−β２）を標的にするアンチセンスオリゴヌクレオチド；
・生理活性脂質；
・カスパーゼ阻害剤；
・カンナビノイドＣＢ２受容体模倣薬；
・デュアルファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）／ＴＧＲ５アゴニスト；
・デュアルＮＯＸ１及び４阻害剤のような、ＮＯＸ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ）阻害剤；
・ガレクチン３阻害剤；
・免疫調節剤；
・インテグリン阻害剤；
・マクロファージマンノース受容体モジュレータ；
・メタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）刺激物質；
・モノクローナル抗体；
・ＮＦ−カッパＢ阻害剤；
・非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）；
・ＰＤＧＦＲモジュレータ；
・ＰＰＡＲアルファアゴニスト；
・ＰＰＡＲガンマアゴニスト；
・ＰＰＡＲデルタアゴニスト；
・ＰＰＡＲアルファ／ガンマアゴニスト；
・ＰＰＡＲアルファ／デルタアゴニスト；
・ＰＰＡＲガンマ／デルタ；並びに
・ＰＰＡＲアルファ／ガンマ／デルタアゴニスト又はＰＰＡＲ汎アゴニスト
からなる群から選択される。
【００２０】
他の抗線維化剤は、ＨＥＣ−５８５、ＩＮＶ−２４０、ＲＮＡｉ療法（サイレンス療法）及びＳＡＭｉＲＮＡプログラム（Ｂｉｏｎｅｅｒ  Ｃｏｒｐ）を含む。
【００２１】
他の例示的抗線維化剤は、ピルフェニドン若しくはニンテダニブ、ソラフェニブ及び他のＲＴＫＩのような受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＲＴＫＩ）、又はアンジオテンシンＩＩ（ＡＴ１）受容体遮断剤、又はＣＴＧＦ阻害剤、又はＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＴＨＢＳ１若しくは細胞表面インテグリンのような潜伏性ＴＧＦβ複合体の活性化剤、ＴＧＦβ受容体Ｉ型（ＴＧＦＢＲＩ）若しくはＩＩ型（ＴＧＦＢＲＩＩ）及びＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、Ｎｏｄａｌ、抗ミューラー管ホルモン、ＧＤＦ若しくはＢＭＰのようなそのリガンド、補助共受容体（ＩＩＩ型受容体としても知られる。）を含むＴＧＦβ及びＢＭＰ活性化経路を妨害しやすい任意の抗線維化化合物、又は調節性若しくは阻害性ＳＭＡＤタンパク質を含むＳＭＡＤ依存性キャノニカル経路の成分、又はＭＡＰＫシグナル伝達の種々の分岐、ＴＡＫ１、Ｒｈｏ様ＧＴＰアーゼシグナル伝達経路、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ／ＡＫＴ経路、ＴＧＦβ誘導ＥＭＴプロセスを含むＳＭＡＤ非依存性若しくは非キャノニカル経路のメンバー、又はＨｈリガンド若しくは標的遺伝子を含むキャノニカル及び非キャノニカルヘッジホッグシグナル伝達経路、又はＴＧＦβに影響を及ぼしやすいＷＮＴ若しくはＮｏｔｃｈ経路の任意のメンバーを含む。
【００２２】
本発明の特定の実施形態において、成分（ｉｉ）は抗胆汁うっ滞性剤である。本発明の実行において有用である例示的非限定的抗胆汁うっ滞性剤は：
・頂端側ナトリウム共依存性胆汁酸輸送体阻害剤（ＡＳＢＴｉ）；
・胆汁酸；
・カテプシン阻害剤；
・ＣＣＲアンタゴニスト；
・ＣＤ４０阻害剤；
・ＣＤ８０阻害剤；
・デュアルＮＯＸ１及び４阻害剤のような、ＮＯＸ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ）阻害剤；
・ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニスト；
・線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）１９リコンビナント；
・フラクタルカインリガンド阻害剤；
・回腸ナトリウム胆汁酸共輸送体阻害剤；
・モノクローナル抗体；
・ＰＰＡＲアルファアゴニスト；
・ＰＰＡＲガンマアゴニスト；
・ＰＰＡＲデルタアゴニスト；
・ＰＰＡＲアルファ／ガンマアゴニスト；
・ＰＰＡＲアルファ／デルタアゴニスト；
・ＰＰＡＲガンマ／デルタ；並びに
・ＰＰＡＲアルファ／ガンマ／デルタアゴニスト又はＰＰＡＲ汎アゴニスト
を含む。
【００２３】
特定の実施形態において、抗胆汁うっ滞性剤は：
・頂端側ナトリウム共依存性胆汁酸輸送体阻害剤（ＡＳＢＴｉ）；
・胆汁酸；
・カテプシン阻害剤；
・ＣＣＲアンタゴニスト；
・ＣＤ４０阻害剤；
・ＣＤ８０阻害剤；
・ＮＯＸ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ）阻害剤；
・ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニスト；
・線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）１９リコンビナント；
・フラクタルカインリガンド阻害剤；
・回腸ナトリウム胆汁酸共輸送体阻害剤；
・モノクローナル抗体；
・ＰＰＡＲアルファアゴニスト；
・ＰＰＡＲガンマアゴニスト；
・ＰＰＡＲデルタアゴニスト；
・ＰＰＡＲアルファ／ガンマアゴニスト；
・ＰＰＡＲアルファ／デルタアゴニスト；
・ＰＰＡＲガンマ／デルタ；
・ＰＰＡＲアルファ／ガンマ／デルタアゴニスト又はＰＰＡＲ汎アゴニスト
からなる群において選択される。
【００２４】
例示的アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ阻害剤は、ＧＳ−０９７６、ＮＤ−６５４、ＡＣ−８６３２、ＰＦ０５２２１３０４、ＣＰ６４０１８６、ゲムカベン、ＭＫ−４０７４及びＰＦ０５１７５１５７を含むがこれらに限定されない。
【００２５】
例示的アデノシンＡ３受容体アゴニストは、２−（１−ヘキシニル）−Ｎ−メチルアデノシン、ピクリデノソンＣＦ−１０１（ＩＢ−ＭＥＣＡ）、ナモデノソンＣＦ−１０２、２−ＣＩ−ＩＢ−ＭＥＣＡ、ＣＰ−５３２，９０３、イノシン、ＬＵＦ−６０００及びＭＲＳ−３５５８を含むがこれらに限定されない。
【００２６】
例示的アルドステロンアンタゴニスト及びミネラルコルチコイド受容体アンタゴニストは、アパラレノン（Ａｐａｒａｒｅｎｏｎｅ）（ＭＴ３９９５）、アミロライド、スピノロラクトン、エプレレノン、カンレノン及びカンレノ酸カリウム、プロゲステロン、ドロシピレノン、ゲストデン並びにベニジピンを含むがこれらに限定されない。
【００２７】
例示的ＡＭＰ活性化タンパク質キナーゼ刺激物質は、ＰＸＬ−７７０、ＭＢ−１１０５５  Ｄｅｂｉｏ−０９３０Ｂメトホルミン、ＣＮＸ−０１２、Ｏ−３０４、マンギフェリンカルシウム塩、エルトロンボバク、カロツキシマブ及びイメグリミンを含むがこれらに限定されない。
【００２８】
例示的アミリン受容体アゴニスト及びカルシトニン受容体アゴニストは、ＫＢＰ−０４２及びＫＢＰ−０８９を含むがこれらに限定されない。
【００２９】
例示的アンジオポエチン関連タンパク質−３阻害剤は、ＡＲＯ−ＡＮＧ３、ＩＯＮＩＳ−ＡＮＧＧＰＴＬ３−ＬＲｘ又はＡＫＣＥＡ−ＡＮＧＰＴＬ３ＬＲｘ、エビナクマブ及びＡＬＮ−ＡＮＧを含むがこれらに限定されない。
【００３０】
本発明に従えば、本明細書で使用される用語「アンジオテンシン１型受容体アンタゴニスト」はイルベサルタンを含むがこれに限定されない。
【００３１】
本発明に従えば、本明細書で使用される用語「抗ＬＰＳ抗体」はＩＭＭ−１２４−Ｅを含むがこれに限定されない。
【００３２】
形質転換成長因子ベータ２を標的にする例示的アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＡＳＰＨ−００４７、ＩＭＣ−ＴＲ１及びＩＳＴＨ−００４７を含むがこれらに限定されない。
【００３３】
例示的頂端側ナトリウム共依存性胆汁酸輸送体阻害剤は、Ａ−４２５０、ボリキシバット、マラリキシバット（以前はＳＨＰ−６２５）、ＧＳＫ−２３３０６７２、エロビキシバット及びＣＪ−１４１９９を含むがこれらに限定されない。
【００３４】
例示的胆汁酸は、オベチコール酸（ＯＣＡ）及びＵＤＣＡ、ノルウルソデオキシコール酸及びウルソジオールを含むがこれらに限定されない。
【００３５】
例示的生理活性脂質は、５−ヒドロキシエイコサペンタエン酸（１５−ＨＥＰＥ、ＤＳ−１０２）を含むがこれに限定されない。
【００３６】
さらなる特定の実施形態において、生理活性脂質は、２５アラキドン酸、イコサペントエチルエステル、エイコサペンタエン酸及びドコサヘキサエン酸のような不飽和脂肪酸から選択してもよい。
【００３７】
例示的カンナビノイドＣＢ１受容体アンタゴニストは、ナマシズマブ、ＧＲＣ−１０８０１、ＭＲＩ−１５６９、ＭＲＩ−１８６７、ＤＢＰＲ−２１１、ＡＭ−６５２７：ＡＭ−６５４５、ＮＥＳＳ−１１−ＳＭ、ＣＸＢ−０２９、ＧＣＣ−２６８０、ＴＭ−３８８３７、Ｏｒｇ−５０１８９、ＰＦ−５１４２７３、ＢＭＳ−８１２２０４、ＺＹＯ−１、ＡＺＤ−２２０７、ＡＺＤ−１１７５、オテナバント、イビピナバント、スリナバント、リモナバント、ドリナバント、ＳＬＶ−３２６、Ｖ−２４３４３及びＯ−２０９３を含むがこれらに限定されない。
【００３８】
例示的カンナビノイドＣＢ２受容体模倣薬は、アナバサム（ａｎａｂａｓｕｍ）（レスナブ（Ｒｅｓｕｎａｂ）、ＪＫＴ−１０１）を含むがこれに限定されない。
【００３９】
例示的カスパーゼ阻害剤は、エムリカサン、ベルナカサン、ニボカサン、ＩＤＮ−７３１４、Ｆ−５７３、ＶＸ−１６６、ＹＪＰ−６０１０７、ＭＸ−１１２２、ＩＤＮ−６７３４、ＴＬＣ−１４４、ＳＢ−２３４４７０、ＩＤＮ−１９６５、ＶＸ−７９９、ＳＤＺ−２２０−９７６及びＬ−７０９０４９を含むがこれらに限定されない。
【００４０】
例示的カテプシン阻害剤は、ＶＢＹ−３７６、ＶＢＹ−８２５、ＶＢＹ−０３６、ＶＢＹ−１２９、ＶＢＹ−２８５、Ｏｒｇ−２１９５１７、ＬＹ３０００３２８、ＲＧ−７２３６及びＢＦ／ＰＣ−１８を含むがこれらに限定されない。
【００４１】
例示的ＣＣＲアンタゴニストは、セニクリビロクのようなＣＣＲ２／５アンタゴニスト；ＰＧ−０９２、ＲＡＰ−３１０、ＩＮＣＢ−１０８２０、ＲＡＰ−１０３、ＰＦ−０４６３４８１７及びＣＣＸ−８７２を含むがこれらに限定されない。
【００４２】
例示的ＣＤ４０阻害剤は、ＦＦｐ−１０４、ｘｌ−０５０、ＤＯＭ−０８００、ＸｍＡｂ−５４８５、ＫＧＹＹ−１５、ＦＦＰ−１０６、ＴＤＩ−００２８及びＡＢＩ−７９３を含むがこれらに限定されない。
【００４３】
例示的ＣＤ８０阻害剤は、ＲｈｕＤｅｘ、ＦＰＴ−１５５、トレリマブ、ガリキシマブ、ＳＣＨ−２１２３９４、ＩＧＭ−００１、ＡＳＰ−２４０８及びＳＣＨ−２０４６９８を含むがこれらに限定されない。
【００４４】
例示的ＣＣＲ３ケモカインモジュレータ及びエオタキシン２リガンド阻害剤は、ベルチリムマブ、ＣＭ−１０１（ヒト化）、ＣＭ−１０２及びＲＮＳ−６０を含むがこれらに限定されない。
【００４５】
例示的ジアシルグリセロール−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ阻害剤は、ＩＯＮＩＳ−ＤＧＡＴ２Ｒｘ（以前はＩＳＩＳ−ＤＧＡＴ２Ｒｘ）、ＬＹ−３２０２３２８、ＢＨ−０３００４、ＫＲ−６９５３０、ＯＴ−１３５４０、ＡＺＤ−７６８７、ＰＦ−０６８６５５７１、ＰＦ−０６４２４４３９及びＡＢＴ−０４６を含むがこれらに限定されない。
【００４６】
例示的ジペンチジルペプチダーゼＩＶ阻害剤は、エボグリプチン、ビルダグリプチン、フォタグリプチン、アログリプチン、サクサグリプチン、チログリプチン、アナグリプチン、シタグリプチン、レタグリプチン、メログリプチン、ゴソグリプチン、トレラグリプチン、テネリグリプチン、デュトグリプチン、リナグリプチン、ゲミグリプチン、ヨグリプチン、ベタグリプチン、イミグリプチン、オマリグリプチン、ビダグリプチン及びデナグリプチンを含むがこれらに限定されない。
【００４７】
例示的脂肪酸シンターゼ（ＦＡＳ）阻害剤は、ＴＶＢ−２６４０；ＴＶＢ−３６６４；ＴＶＢ−３１６６、ＴＶＢ−３１５０、ＴＶＢ−３１９９、ＴＶＢ−３６９３ＢＺＬ−１０１、２−オクタデシン酸、ＭＤＸ−２、Ｆａｓｎａｌｌ、ＭＴ−０６１、Ｇ２８ＵＣＭ、ＭＧ−２８、ＨＳ−１６０、ＧＳＫ−２１９４０６９、ＫＤ−０２３、シロスタゾールを含むがこれらに限定されない。
【００４８】
特定の実施形態において、ＦＡＳ阻害剤は、化合物の以下の一覧において選択される化合物である：
【００４９】
【化２】
2020517621.tif 000003
2020517621.tif 000004
2020517621.tif 000005
【００５０】
別の特定の実施形態において、ＦＡＳ阻害剤は：
【００５１】
【化３】
2020517621.tif 000006
から選択される。
【００５２】
特定の実施形態において、ＦＡＳ阻害剤はＴＶＢ−２６４０である。
【００５３】
例示的デュアルファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）／ＴＧＲ５アゴニストはＩＮＴ−７６７を含むがこれに限定されない。
【００５４】
例示的ＮＯＸ（ＮＡＤＰＨオキシダーゼ）阻害剤は、デュアルＮＯＸ１及び４阻害剤；ＧＫＴ−８３１（２−（２−クロロフェニル）−４−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６（２Ｈ，５Ｈ）−ジオン）、（以前はＧＫＴ１３７８３１）、及びＧＫＴ−９０１を含むがこれらに限定されない。
【００５５】
例示的細胞外マトリックスタンパク質モジュレータは、ＣＮＸ−０２４、ＣＮＸ−０２５及びＳＢ−０３０を含むがこれらに限定されない。
【００５６】
例示的ファルネソイドＸ受容体（ＦＸＲ）アゴニストは、オベチコール酸（ＯＣＡ）、ＧＳ−９６７４、ＬＪＮ−４５２又はＬＪＮ４５２、ＬＭＢ７６３、ＥＤＰ−３０５、ＡＫＮ−０８３、ＩＮＴ−７６７、ＧＮＦ−５１２０、ＬＹ２５６２１７５、ＩＮＶ−３３、ＮＴＸ−０２３−１、ＥＰ−０２４２９７、Ｐｘ−１０３及びＳＲ−４５０２３を含むがこれらに限定されない。
【００５７】
例示的フラクタルカインリガンド阻害剤は、Ｅ−６０１１及びＫＡＮ−０４４０５６７を含むがこれらに限定されない。
【００５８】
例示的線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ−１９）受容体リガンド、リコンビナント線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ−１９）タンパク質又はＦＧＦ−１９の機能的な操作された変異体は、ＮＧＭ−２８２を含むがこれに限定されない。
【００５９】
例示的線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）受容体リガンド、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ−２１）タンパク質は、ＰＥＧ−ＦＧＦ２１（以前はＢＭＳ−９８６０３６）、ＹＨ−２５３４８、ＢＭＳ−９８６１７１、ＹＨ−２５７２３、ＬＹ−３０２５８７６及びＮＮＣ−０１９４−０４９９を含むがこれらに限定されない。
【００６０】
例示的ガレクチン３阻害剤は、ＧＲ−ＭＤ−０２、ＴＤ−１３９、ＡＮＧ−４０２１、ガレクチン−３Ｃ、ＬＪＰＣ−２０１、ＴＦＤ−１００、ＧＲ−ＭＤ−０３、ＧＲ−ＭＤ−０４、ＧＭ−ＭＤ−０１、ＧＭ−ＣＴ−０１、ＧＭ−ＣＴ−０２、Ｇａｌ−１００及びＧａｌ−２００を含むがこれらに限定されない。
【００６１】
例示的グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）類似物は、セマグルチド、リラグルチド、エキセナチド、アルビグルチド、デュラグルチド、リキシセナチド、ロキセナチド、エフペグレナチド、タスポグルチド、ＭＫＣ−２５３、ＤＬＰ−２０５及びＯＲＭＤ−０９０１を含むがこれらに限定されない。
【００６２】
例示的グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）受容体アゴニストは、ＬＹ−３３０５６７７及びオキシントモジュリン長時間作用型を含むがこれらに限定されない。
【００６３】
例示的Ｇ−タンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）モジュレータは、ＣＮＸ−０２３を含むがこれに限定されない。
【００６４】
例示的Ｇ−タンパク質共役型受容体８４アンタゴニスト（ＧＰＲ８４アンタゴニスト）、結合組織成長因子リガンド阻害剤及び遊離脂肪酸受容体１アゴニスト（ＦＦＡＲ１アゴニスト）は、ＰＢＩ−４０５０、ＰＢＩ−４２６５、ＰＢＩ−４２８３及びＰＢＩ−４２９９を含むがこれらに限定されない。
【００６５】
例示的ヘッジホッグ細胞シグナル伝達経路阻害剤は、ビスモデギブ、ＴＡＫ−４４１、ＩＰＩ−９２６、サリデギブ、ソニデジブ／エリスモデジブ、ＢＭＳ−８３３９２３／ＸＬ１３９、ＰＦ−０４４４９９１３、タラデギブ／ＬＹ２９４０６８０、ＥＴＳ−２４００、ＳＨＲ−１５３９及びＣＵＲ６１４１４を含むがこれらに限定されない。
【００６６】
例示的回腸ナトリウム胆汁酸共輸送体阻害剤は、Ａ−４２５０、ＧＳＫ−２３３０６７２、ボリキシバット、ＣＪ−１４１９９及びエロビキシバットを含むがこれらに限定されない。
【００６７】
例示的免疫調節剤は、ＰＢＩ−４０５０、ＰＢＩ−４２６５、ＰＢＩ−４２８３、ＰＢＩ−４２９９及びＡＩＣ−６４９を含むがこれらに限定されない。
【００６８】
例示的インスリン感受性改善薬及びＭＣＨ受容体−１アンタゴニストは、ＭＳＤＣ−０６０２ｋ、ＭＳＤＣ−０６０２、ＣＳＴＩ−１００及びＡＭＲＩを含むがこれらに限定されない。
【００６９】
例示的インテグリン阻害剤は、プリアント治療（Ｐｌｉａｎｔ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）のインテグリン阻害剤、インダロ治療（Ｉｎｄａｌｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）のインテグリン阻害剤、セントルイス大学のインテグリン阻害剤、ＰｒｏＡｇｉｏ及びＧＳＫ−３００８３４８を含むがこれらに限定されない。
【００７０】
例示的ケトヘキソキナーゼ阻害剤は、ＪＮＪ−２８１６５７２２；ＪＮＪ−４２０６５４２６；ＪＮＪ−４２１５２９８１；ＪＮＪ−４２７４０８１５；ＪＮＪ−４２７４０８２８及びＰＦ−０６８３５９１９を含むがこれらに限定されない。
【００７１】
例示的ロイコトリエン／ホスホジエステラーゼ／リポキシゲナーゼ阻害剤は、タイペルカスト（以前はＭＮ−００１）、トメルカスト、スルカスト、マシルカスト、ザフィルルカスト、プランルカスト、モンテルカスト、ゲミルカスト、ベルルカスト、アクルカスト、ポビリカスト、シナルカスト及びイラルカストを含むがこれらに限定されない。
【００７２】
例示的リジルオキシダーゼ相同体２阻害剤は、ラパポート、インターミューン、ファーマクシス、ＡＢ−００２３、シンツズマブ、ＰＸＳ−５３８２Ａ及びＰＸＳ−５３３８を含むがこれらに限定されない。
【００７３】
例示的マクロライドは、ソリスロマイシン、アジスロマイシン及びエリスロマイシンを含むがこれらに限定されない。
【００７４】
例示的マクロファージマンノース受容体モジュレータは、ＡＢ−００２３、ＭＴ−１００１、［１８Ｆ］ＦＢ１８ｍＨＳＡ、Ｘｅｍｙｓ、テクニチウムＴｃ９９ｍティルマノセプト及びＣＤＸ−１３０７を含むがこれらに限定されない。
【００７５】
例示的メチルＣｐＧ結合タンパク質２モジュレータ及びトランスグルタミナーゼ阻害剤は、システアミン、ＥＣシステアミン、腸溶性システアミン酒石酸水素塩、システアミン酒石酸水素塩（腸溶性）、Ｂｅｎｎｕ、システアミン酒石酸水素塩（腸溶性）、Ｒａｐｔｏｒ、システアミン酒石酸水素塩、ＤＲシステアミン、遅延放出腸溶性システアミン酒石酸水素塩、メルカプトアミン、メルカプトアミン（腸溶性）、Ｂｅｎｎｕ、メルカプトアミン（腸溶性）、Ｒａｐｔｏｒ、ＲＰ−１０３、ＲＰ−１０４、ＰＲＯＣＹＳＢＩ及びメルカプトアミン（腸溶性）を含むがこれらに限定されない。
【００７６】
例示的ｍｉＲＮＡアンタゴニストは、ＲＧ−１２５（以前はＡＺＤ４０７６）、ＲＧＬＳ−５０４０、ＲＧ−１０１、ＭＧＮ−５８０４及びＭＲＧ−２０１を含むがこれらに限定されない。
【００７７】
例示的メタロプロテアーゼ−９（ＭＭＰ−９）刺激物質は、エラストミックスＡｂのＭＭＰ−９刺激物質を含むがこれらに限定されない。
【００７８】
例示的ミトコンドリア輸送担体ファミリー阻害剤及びミトコンドリアリン酸輸送担体タンパク質阻害剤は、ＴＲＯ−１９６２２、Ｔｒｏｐｈｏｓ、オレソキシム、ＲＧ−６０８３、又はＲＯ−７０９０９１９を含むがこれらに限定されない。
【００７９】
例示的ミエロペルオキシダーゼ阻害剤は、ＰＦ−０６６６７２７２を含むがこれに限定されない。
【００８０】
例示的モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、ベルチリムマブ、ＮＧＭ−３１３、ＩＬ−２０ターゲティングｍＡｂ、フレソリムマブ（抗ＴＧＦβ、以前はＧＣ１００８）、チモルマブ（ｔｉｍｏｌｕｍａｂ）以前はＢＴＴ−１０２３、ナマシズマブ、オマリズマブ、ラニビズマブ、ベバシズマブ、レブリキズマブ、エプラツズマブ、フェルビズマブ、マツズマブ、モナリズマブ、レスリズマブ、フォラルマブ（ＮＩ−０４０１、抗−ＣＤ３）、ＬＯＸＬ２に対するシンツズマブ（ＧＳ−６６２４）ｍＡｂ、ウステキヌマブ、抗ＴＮＦ抗体及びイネビリズマブを含むがこれらに限定されない。
【００８１】
例示的モノクローナル抗体は、抗ＩＬ２０ｍＡｂ、抗ＴＧＦβ抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＬＯＸＬ２抗体及び抗ＴＮＦ抗体からなる群において選択される。
【００８２】
例示的ｍＴＯＲモジュレータは、ＭＳＤＣ−０６０２及びＳＶＰ−シロリムスと同時に施されるＡＡＶ遺伝子療法を含むがこれらに限定されない。
【００８３】
例示的ＮＡＤ依存性脱アセチル化酵素サーチュイン刺激物質；ＰＤＥ５阻害剤はＮＳ−０２００を含むがこれに限定されない。
【００８４】
例示的ＮＦ−カッパＢ阻害剤は、ＬＣ−２８０１２６を含むがこれに限定されない。
【００８５】
例示的ニコチン酸受容体（ＧＰＲ１０９）アゴニストは、ＡＲＩ−３０３７ＭＯ、ＭＭＦ、ＬＵＦ  ６２８３、アシフラン、ＩＢＣ  ２９３、ＭＫ−１９０３、ＧＳＫ２５６０７３、ＭＫ−６８９２、ＭＫ−０３５４、ＳＬｘ−４０９０、ロミタピド、レキシブリン、アパベタロン、アシフラン、ラロピプラント、ダポリナド、アナセトラピブ、ＩＮＣＢ−１９６０２、ＳＴ−０７−０２、ロメフロキサシン、ナイアシン及び徐放化／ラロピプラントを含むがこれらに限定されない。
【００８６】
例示的非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）は、Ｆ−３５１、サリチル酸塩（アスピリン）、アセトアミノフェン、プロピオン酸誘導体（イブプロフェン、ナプロキセン）、酢酸誘導体（インドメタシン、ジクロフェナク）、エノール酸誘導体（ピロキシカム、フェニルブタゾン）、アントラニル酸誘導体（メクロフェナム酸（ｍｅｃｌｏｆｅｎａｌｍｉｃ  ａｃｉｄ）、フルフェナム酸）、選択的ＣＯＸ−２阻害剤（セレコキシブ、パレコキシブ）及びスルホンアニリド（ニメスリド）を含むがこれらに限定されない。
【００８７】
例示的核内受容体リガンドは、ＤＵＲ−９２８（以前はＤＶ９２８）を含むがこれに限定されない。
【００８８】
例示的Ｐ２Ｙ１３タンパク質アゴニストは、ＣＥＲ−２０９を含むがこれに限定されない。
【００８９】
例示的ＰＤＧＦＲモジュレータは、ＢＯＴ−５０１及びＢＯＴ−１９１を含むがこれらに限定されない。
【００９０】
例示的フェニルアラニンヒドロキシラーゼ刺激物質は、ペグバリアーゼ、サプロプテリン、ＡＡＶ−ＰＡＨ、ＣＤＸ−６１１４、セピアプテリン、ＲＭＮ−１６８、ＡＬＴＵ−２３６、ＥＴＸ−１０１、ＨｅｐａＳｔｅｍ、ロリプラム及びアルプロスタジルを含むがこれらに限定されない。
【００９１】
例示的ＰＰＡＲアルファアゴニストは、フェノフィブラート、シプロフィブラート、ペマフィブラート、ゲムフィブロジル、クロフィブラート、ビニフィブラート、クリノフィブラート、クロフィブリン酸、ニコフィブラート、ピリフィブラート、プラフィブリド、ロニフィブラート、テオフィブラート、トコフィブラート及びＳＲ１０１７１を含むがこれらに限定されない。
【００９２】
例示的ＰＰＡＲガンマアゴニストは、ピオグリタゾン、重水素化ピオグリタゾン、ロシグリタゾン、エファツタゾン、ＡＴｘ０８−００１、ＯＭＳ−４０５、ＣＨＳ−１３１、ＴＨＲ−０９２１、ＳＥＲ−１５０−ＤＮ、ＫＤＴ−５０１、ＧＥＤ−０５０７−３４−Ｌｅｖｏ、ＣＬＣ−３００１及びＡＬＬ−４を含むがこれらに限定されない。
【００９３】
例示的ＰＰＡＲデルタアゴニストは、ＧＷ５０１５１６（エンドゥーラブル又は（｛４−［（｛４−メチル−２−［４−（トリフルオロメチル）フェニル］−１，３−チアゾール−５−イル｝メチル）スルファニル］−２−メチルフェノキシ｝酢酸））、ＭＢＸ８０２５（セラデルパル又は｛２−メチル−４−［５−メチル−２−（４−トリフルオロメチル−フェニル）−２Ｈ−［１，２，３］トリアゾール−４−イルメチルスルファニル］−フェノキシ｝−酢酸）、ＧＷ０７４２（［４−［［［２−［３−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル］−４−メチル−５−チアゾリル］メチル］チオ］−２−メチルフェノキシ］酢酸）、Ｌ１６５０４１、ＨＰＰ−５９３及びＮＣＰ−１０４６を含むがこれらに限定されない。
【００９４】
例示的ＰＰＡＲアルファ／ガンマアゴニスト（グリタザールとも名付けられる）は、サログリタザール、アレグリタザル、ムラグリタザル、テサグリタザル及びＤＳＰ−８６５８を含むがこれらに限定されない。
【００９５】
エラフィブラノールに加えて、例示的ＰＰＡＲアルファ／デルタアゴニストはＴ９１３６５９を含むがこれに限定されない。
【００９６】
例示的ＰＰＡＲガンマ／デルタアゴニストは、共役リノール酸（ＣＬＡ）及びＴ３Ｄ−９５９を含むがこれらに限定されない。
【００９７】
例示的ＰＰＡＲアルファ／ガンマ／デルタアゴニスト又は「ＰＰＡＲ汎アゴニスト」は、ＩＶＡ３３７（ラニフィブラノール（Ｌａｎｉｆｉｂｒａｎｏｒ））、ＴＴＡ（テトラデシルチオ酢酸）、ババキニン、ＧＷ４１４８、ＧＷ９１３５、ベザフィブラート、ロベグリタゾン及びＣＳ０３８を含むがこれらに限定されない。
【００９８】
例示的プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ）−２アンタゴニストは、ＰＺ−２３５及びＮＰ−００３を含むがこれらに限定されない。
【００９９】
例示的タンパク質キナーゼモジュレータは、ＣＮＸ−０１４、ＭＢ−１１０５５、ＡＬＦ−１、マンギフェリン、アンレキサノクス、ＧＳ−４４４２１７、ＲＥＧ−１０１及びバリンを含むがこれらに限定されない。
【０１００】
例示的Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ２（ＲＯＣＫ２）阻害剤は、ＫＤ−０２５、ＴＲＸ−１０１、ＢＡ−１０４９、ＬＹＣ−５３９７６、ＩＮＳ−１１７５４８及びＲＫＩ−１４４７を含むがこれらに限定されない。
【０１０１】
例示的シグナル調節キナーゼ１（ＡＳＫ１）阻害剤は、セロンセルティブ（以前はＧＳ−４９９７）を含むがこれに限定されない。
【０１０２】
例示的ナトリウム−グルコース輸送（ＳＧＬＴ）１阻害剤は、ＬＸ−４２１２／ＬＸ−４２１１／ソタグリフロジン、ＳＡＲ−４３９９５４、ＬＩＫ−０６６（リコグリフォジン）、ＬＸ−２７６１、ＧＳＫ−１６１２３５、ＬＰ−９２５２１９、ＫＧＡ−２７２７、ＳＡＲ−７２２６、ＳＡＲ−４７４８３２、ＳＹ−００８及びＡＶＸ−３０３０を含むがこれに限定されない。
【０１０３】
例示的ナトリウム−グルコース輸送（ＳＧＬＴ）２阻害剤は、レモグリフロジン、ダパグリフロジン、エンパグリフロジン、エルトグリフロジン、ソタグリフロジン、イプラグリフロジン、チアナグリフロジン、カナグリフロジン、トホグリフロジン、ジャナグリフロジン、ベキサグリフロジン、ルセオグリフロジン、セルグリフロジン、ＨＥＣ−４４６１６、ＡＳＴ−１９３５及びＰＬＤ−１０１を含むがこれらに限定されない。
【０１０４】
例示的ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素−１阻害剤／脂肪酸胆汁酸コンジュゲートは、アラムコール、ＧＲＣ−９３３２、ステアムコール、ＴＳＮ−２９９８、ＧＳＫ−１９４００２９及びＸＥＮ−８０１を含むがこれらに限定されない。
【０１０５】
例示的甲状腺ホルモン受容体β（ＴＨＲ  β）アゴニストは、ＶＫ−２８０９、ＭＧＬ−３１９６、ＭＧＬ−３７４５、ＳＫＬ−１４７６３、ソベチロム、ＢＣＴ−３０４、ＺＹＴ−１、ＭＢ−０７８１１及びエプロチロームを含むがこれらに限定されない。
【０１０６】
例示的Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ−２）アンタゴニストは、ＶＢ−２０１としても知られるＣＩ−２０１を含むがこれに限定されない。
【０１０７】
例示的Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）アンタゴニストは、ナルトレキソン、ナルメフェンとしても知られるＪＫＢ−１２１、Ｍ−６２８１２、レサトルビド、デンドロフィリン、ＣＳ−４７７１、ＡｙｕＶ−１、ＡｙｕＶ−２５、ＮＩ−０１０１、ＥＤＡ−ＨＰＶＥ７及びエリトランを含むがこれらに限定されない。
【０１０８】
例示的Ｉ型ナチュラルキラーＴ細胞阻害剤はＧＲＩ−０６２１を含むがこれに限定されない。
【０１０９】
例示的受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）モジュレータは、ＣＮＸ−０２５、ＫＢＰ−７０１８、ニンテダニブ及びソラフェニブを含むがこれらに限定されない。
【０１１０】
例示的尿酸陰イオン交換体１阻害剤及びキサンチンオキシダーゼ阻害剤は、レシヌラド、ＲＬＢＮ−１００１、ベニヌラド、ＫＵＸ−１１５１及びレシヌラド＋アロプリノールを含むがこれらに限定されない。
【０１１１】
例示的血管接着タンパク質−１（ＶＡＰ−１）阻害剤は銅含有アミンオキシダーゼ２（ＡＯＣ３）とも名付けられるが、ＢＩ−１４６７３３５以前はＰＸＳ−４７２８Ａ、ＣＰ−６６４５１１、ＰＲＸ−１６７７００、ＡＳＰ−８２３２、ＲＴＵ−１０９６、ＲＴＵ−００７及びＢＴＴ−１０２３を含むがこれらに限定されない。
【０１１２】
例示的ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）アゴニストは、カルシフェロール、アルファカルシドール、１，２５−ジヒドロキビタミンＤ３、ビタミンＤ２、ビタミンＤ３、カルシトリオール、ビタミンＤ４、ビタミンＤ５、ジヒドロタキステロール、カルシポトリオール、タカルシトール１，２４−ジヒドロキビタミンＤ３及びパリカルシトールを含むがこれらに限定されない。
【０１１３】
本発明に従えば、用語「ＰＰＡＲアゴニスト」とは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体アゴニストのことであり、これは脂質及びグルコース恒常性に中心的な役割をはたしているクラスの薬物である。ＰＰＡＲαは主に脂肪酸代謝に影響を与え、その活性化は脂質レベルを低下させるが、ＰＰＡＲγは大部分が脂肪生成、エネルギー収支及び脂質生合成の調節に関与している。ＰＰＡＲδは、大部分が骨格筋及び心筋において脂肪酸酸化に関与しているが、血糖値及び血中コレステロール値も調節している。
【０１１４】
さらに詳細な実施形態において、式（Ｉ）の化合物はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩である。
【０１１５】
本発明の組合せ物の特定の実施形態において、
・成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、
・成分（ｉｉ）は、ＧＫＴ−８３１、アラムコール、ＳＨＰ−６２５、エムリカサン、サログリタザール、ＩＭＭ−１２４−Ｅ、ＧＳ−９６７４、ＮＧＭ−２８２、Ａ−４２５０、ＧＲ−ＭＤ−０２、ＧＳ−４９９７、Ｆ−３５１、ソリスロマイシン、レモグリフロジン、ＢＴＴ−１０２３、ＩＶＡ−３３７（ラニフィブラノール）、ＪＫＢ−１２１（ナルメフェン）、ＫＤ−０２５、ＭＳＤＣ−０６０２又はＭＳＤＣ−０６０２ｋ、ＰＢＩ−４０５０、ＰＥＧ−ＦＧＦ２１、チペルカスト、ＶＫ−２８０９、ＭＧＬ−３１９６、ＧＳ−０９７６、ＲＧ−１２５、ボリキシバット、ピオグリタゾン、セマグルチド、ＧＳＫ２３３０６７２、ＭＢＸ−８０２５、ＣＰ−６４０１８６、セロンセルチブ、ＧＫＴ−８３１、ＰＸＳ−４７２８Ａ、ビスモデギブ、ＣＦ−１０２（ナモデノソン）、ＭＴ−３９９５（アパラレノン）、イコサペントエチルエステル、ＫＤ−０２５、ＤＵＲ−９２８及びゲムカベン、特に、セロンセルチブ、ＧＫＴ−８３１、ＰＸＳ−４７２８Ａ、アラムコール、ＰＢＩ−４０５０、ＭＳＤＣ−０６０２ｋ、ＶＫ−２８０９、ＭＧＬ−３１９６、ビスモデギブ、ＣＦ−１０２（ナモデノソン）、ＭＴ−３９９５（アパラレノン）、ＪＫＢ−１２１（ナルメフェン）、エムリカサン、ＫＤ−０２５及びＤＵＲ−９２８から選択される。
【０１１６】
本発明の組合せ物の特定の実施形態において、
・成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、
・成分（ｉｉ）は、ＧＫＴ−８３１、アラムコール、ＳＨＰ−６２５、エムリカサン、サログリタザール、ＩＭＭ−１２４−Ｅ、ＧＳ−９６７４、ＮＧＭ−２８２、Ａ−４２５０、ＧＲ−ＭＤ−０２、ＧＳ−４９９７、ＬＪＮ−４５２、Ｆ−３５１、ソリスロマイシン、レモグリフロジン、ＢＴＴ−１０２３、ＩＶＡ−３３７（ラニフィブラノール）、ＪＫＢ−１２１（ナルメフェン）、ＫＤ−０２５、ＭＳＤＣ−０６０２、ＰＢＩ−４０５０、ＰＥＧ−ＦＧＦ２１、チペルカスト、ＶＫ−２８０９、ＭＧＬ−３１９６、ＧＳ−０９７６、ペンタサ、ＲＧ−１２５、ボリキシバット、ピオグリタゾン、ウルソデオキシコール酸、セマグルチド、ＧＳＫ２３３０６７２及びＭＢＸ−８０２５から、特に、アラムコール、ＳＨＰ−６２５、エムリカサン、サログリタザール、ＩＭＭ−１２４−Ｅ、ＧＳ−９６７４、ＮＧＭ−２８２、Ａ−４２５０、ＧＲ−ＭＤ−０２、ＧＳ−４９９７、ＬＪＮ−４５２、Ｆ−３５１、ソリスロマイシン、レモグリフロジン、ＢＴＴ−１０２３、ＩＶＡ−３３７（ラニフィブラノール）、ＪＫＢ−１２１、ＫＤ−０２５、ＭＳＤＣ−０６０２、ＰＢＩ−４０５０、ＰＥＧ−ＦＧＦ２１、チペルカスト、ＶＫ−２８０９、ＭＧＬ−３１９６、ＧＳ−０９７６、ＲＧ−１２５、ボリキシバット、ピオグリタゾン、ウルソデオキシコール酸、セマグルチド、ＧＳＫ２３３０６７２及びＭＢＸ−８０２５から選択される。
【０１１７】
本発明の組合せ物の特定の実施形態において、
・成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、
・成分（ｉｉ）は、ＧＫＴ−８３１、アラムコール、ＳＨＰ−６２５、エムリカサン、サログリタザール、ＩＭＭ−１２４−Ｅ、ＧＳ−９６７４、ＮＧＭ−２８２、Ａ−４２５０、ＧＲ−ＭＤ−０２、ＧＳ−４９９７、Ｆ−３５１、ソリスロマイシン、レモグリフロジン、ＢＴＴ−１０２３、ＩＶＡ−３３７（ラニフィブラノール）、ＪＫＢ−１２１、ＫＤ−０２５、ＭＳＤＣ−０６０２、ＰＢＩ−４０５０、ＰＥＧ−ＦＧＦ２１、チペルカスト、ＶＫ−２８０９、ＭＧＬ−３１９６、ＧＳ−０９７６、ペンタサ、ＲＧ−１２５、ボリキシバット、ピオグリタゾン、セマグルチド、ＧＳＫ２３３０６７２及びＭＢＸ−８０２５から選択される。
【０１１８】
特定の実施形態において、組合せ物は、ＥＬＡとＧＫＴ−８３１、ＥＬＡとセロンセルチブ、ＥＬＡとＧＳ−０９７６又はＥＬＡとペンタサの組合せである。
【０１１９】
特定の実施形態において、組合せ物は、ＥＬＡとＧＳ−０９７６、ＥＬＡとＣＰ−６４０１８６、ＥＬＡとセロンセルチブ、ＥＬＡとＧＫＴ−８３１（以前はＧＫＴ１３７８３１）、ＥＬＡとＢＩ−１４６７３３５／ＰＸＳ−４７２８Ａ、ＥＬＡとアラムコール、ＥＬＡとＰＢＩ−４０５０、ＥＬＡとＭＳＤＣ−０６０２ｋ、ＥＬＡとＶＫ−２８０９、ＥＬＡとＭＧＬ−３１９６、ＥＬＡとビスモデギブ、ＥＬＡとＣＦ−１０２（ナモデノソン）、ＥＬＡとＭＴ−３９９５（アパラレノン）、ＥＬＡとＪＫＢ−１２１（ナルメフェン）、ＥＬＡとエムリカサン、ＥＬＡとＫＤ−０２５、ＥＬＡとＤＵＲ−９２８又はＥＬＡとゲムカベンの組合せである。
【０１２０】
特定の実施形態において、組合せ物は、ＥＬＡとセロンセルチブ、ＥＬＡとＧＫＴ−８３１（以前はＧＫＴ１３７８３１）、ＥＬＡとＢＩ−１４６７３３５／ＰＸＳ−４７２８Ａ、ＥＬＡとアラムコール、ＥＬＡとＰＢＩ−４０５０、ＥＬＡとＭＳＤＣ−０６０２ｋ、ＥＬＡとＶＫ−２８０９、ＥＬＡとＭＧＬ−３１９６、ＥＬＡとビスモデギブ、ＥＬＡとＣＦ−１０２（ナモデノソン）、ＥＬＡとＭＴ−３９９５（アパラレノン）、ＥＬＡとＪＫＢ−１２１（ナルメフェン）、ＥＬＡとエムリカサン、ＥＬＡとＫＤ−０２５及びＥＬＡとＤＵＲ−９２８の組合せである。
【０１２１】
本実施形態のさらなる特定の変種では、成分（ｉｉ）はＯＣＡでもＣＶＣでもない。
【０１２２】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は、ＡＣＣ阻害剤、ＡＳＫ１阻害剤、デュアルＮＯＸ１及びＮＯＸ４阻害剤、ＶＡＰ−１阻害剤、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素−１阻害剤／脂肪酸胆汁酸コンジュゲート、ＧＰＲ８４アンタゴニスト／ＦＦＡＲ１アゴニスト又は免疫モジュレータ、ｍＴＯＲモジュレータ又はインスリン感受性改善薬、ＴＨＲβアゴニスト、ヘッジホッグ細胞シグナル伝達経路阻害剤、アデノシンＡ３受容体アゴニスト、アルドステロン受容体アンタゴニスト、ＴＬＲ−４アンタゴニスト、カスパーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ２阻害剤及び核内受容体リガンドから選択される。
【０１２３】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は、ＡＣＣ阻害剤（特に、ＧＳ−０９７６又はＣＰ−６４０１８６又はゲムカベン）、ＡＳＫ１阻害剤（特に、セロンセルチブ）、デュアルＮＯＸ１及びＮＯＸ４阻害剤（特に、ＧＫＴ−８３１、以前はＧＫＴ１３７８３１）、ＶＡＰ−１阻害剤（特に、ＢＩ−１４６７３３５／ＰＸＳ−４７２８Ａ）、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素−１阻害剤／脂肪酸胆汁酸コンジュゲート（特に、アラムコール）、ＧＰＲ８４アンタゴニスト／ＦＦＡＲ１アゴニスト又は免疫モジュレータ（特に、ＰＢＩ−４０５０）、ｍＴＯＲモジュレータ又はインスリン感受性改善薬（特に、ＭＳＤＣ−０６０２ｋ）、ＴＨＲβアゴニスト（特に、ＶＫ−２８０９又はＭＧＬ−３１９６）、ヘッジホッグ細胞シグナル伝達経路阻害剤（特に、ビスモデギブ）、アデノシンＡ３受容体アゴニスト（特に、ＣＦ−１０２（ナモデノソン））、アルドステロン受容体アンタゴニスト（特に、ＭＴ−３９９５（アパラレノン））、ＴＬＲ−４アンタゴニスト（特に、ＪＫＢ−１２１（ナルメフェン））、カスパーゼ阻害剤（特に、エムリカサン）、ＲＯＣＫ２阻害剤（特に、ＫＤ−０２５）及び核内受容体リガンド（特に、ＤＵＲ−９２８）である。
【０１２４】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は、ＡＳＫ１阻害剤、デュアルＮＯＸ１及びＮＯＸ４阻害剤、ＶＡＰ−１阻害剤、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素−１阻害剤／脂肪酸胆汁酸コンジュゲート、ＧＰＲ８４アンタゴニスト／ＦＦＡＲ１アゴニスト又は免疫モジュレータ、ｍＴＯＲモジュレータ又はインスリン感受性改善薬、ＴＨＲβアゴニスト、ヘッジホッグ細胞シグナル伝達経路阻害剤、アデノシンＡ３受容体アゴニスト、アルドステロン受容体アンタゴニスト、ＴＬＲ−４アンタゴニスト、カスパーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ２阻害剤及び核内受容体リガンドである。
【０１２５】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は、ＡＳＫ１阻害剤（特に、セロンセルチブ）、デュアルＮＯＸ１及びＮＯＸ４阻害剤（特に、ＧＫＴ−８３１、以前はＧＫＴ１３７８３１）、ＶＡＰ−１阻害剤（特に、ＢＩ−１４６７３３５／ＰＸＳ−４７２８Ａ）、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素−１阻害剤／脂肪酸胆汁酸コンジュゲート（特に、アラムコール）、ＧＰＲ８４アンタゴニスト／ＦＦＡＲ１アゴニスト又は免疫モジュレータ（特に、ＰＢＩ−４０５０）、ｍＴＯＲモジュレータ又はインスリン感受性改善薬（特に、ＭＳＤＣ−０６０２ｋ）、ＴＨＲβアゴニスト（特に、ＶＫ−２８０９又はＭＧＬ−３１９６）、ヘッジホッグ細胞シグナル伝達経路阻害剤（特に、ビスモデギブ）、アデノシンＡ３受容体アゴニスト（特に、ＣＦ−１０２（ナモデノソン））、アルドステロン受容体アンタゴニスト（特に、ＭＴ−３９９５（アパラレノン））、ＴＬＲ−４アンタゴニスト（特に、ＪＫＢ−１２１（ナルメフェン））、カスパーゼ阻害剤（特に、エムリカサン）、ＲＯＣＫ２阻害剤（特に、ＫＤ−０２５）及び核内受容体リガンド（特に、ＤＵＲ−９２８）である。
【０１２６】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＡＣＣ阻害剤である。
【０１２７】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は、ＧＳ−０９７６、ＣＰ−６４０１８６又はゲムカベンである。
【０１２８】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＧＳ−０９７６である。
【０１２９】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＣＰ−６４０１８６である。
【０１３０】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はゲムカベンである。
【０１３１】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＡＳＫ１阻害剤である。
【０１３２】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はセロンセルチブである。
【０１３３】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は、デュアルＮＯＸ１及びＮＯＸ４阻害剤である。
【０１３４】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＧＫＴ−８３１である。
【０１３５】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＶＡＰ−１阻害剤である。
【０１３６】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は、ＢＩ−１４６７３３５／ＰＸＳ−４７２８Ａである。
【０１３７】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は、ステアロイルＣｏＡ不飽和化酵素−１阻害剤／脂肪酸胆汁酸コンジュゲートである。
【０１３８】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はアラムコールである。
【０１３９】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は、ＧＰＲ８４アンタゴニスト／ＦＦＡＲ１アゴニストである。
【０１４０】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＰＢＩ−４０５０である。
【０１４１】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は、ｍＴＯＲモジュレータ又はインスリン感受性改善薬である。
【０１４２】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は、特にＭＳＤＣ−０６０２ｋである。
【０１４３】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＴＨＲβアゴニストである。
【０１４４】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は、ＶＫ−２８０９又はＭＧＬ−３１９６である。
【０１４５】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＶＫ−２８０９である。
【０１４６】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＭＧＬ−３１９６である。
【０１４７】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は、ヘッジホッグ細胞シグナル伝達経路阻害剤である。
【０１４８】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はビスモデギブである。
【０１４９】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はアデノシンＡ３受容体アゴニストである。
【０１５０】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＣＦ−１０２（ナモデノソン）である。
【０１５１】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はアルドステロン受容体アンタゴニストである。
【０１５２】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＭＴ−３９９５（アパラレノン）である。
【０１５３】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＴＬＲ−４アンタゴニストである。
【０１５４】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＪＫＢ−１２１（ナルメフェン）である。
【０１５５】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は核内受容体リガンドである。
【０１５６】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はエムリカサンである。
【０１５７】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＲＯＣＫ２阻害剤である。
【０１５８】
さらに詳細な実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＫＤ−０２５である。
【０１５９】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）は核内受容体リガンドである。
【０１６０】
特定の実施形態において、成分（ｉ）はエラフィブラノール又はその薬学的に許容される塩であり、成分（ｉｉ）はＤＵＲ−９２８である。
【０１６１】
特定の実施形態において、本発明の組合せ物は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤並びに他の抗炎症剤及び／又は免疫抑制剤から選択される少なくとも１つの他の治療活性剤をさらに含む。
【０１６２】
例示的抗炎症及び／又は免疫抑制剤は、グルココルチコイド、ＮＳＡＩＤＳ、シクロホスファミド、ニトロソ尿素、葉酸類似物、プリン類似物、ピリミジン類似物、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、シクロスポリン、ミリオシン、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸誘導体、フィンゴリモド及び他のスフィンゴシン−１−リン酸受容体モジュレータ、炎症性サイトカイン及び炎症性サイトカイン受容体、Ｔ細胞受容体及びインテグリンのような標的に対するモノクローナル及び／又はポリクローナル抗体を含む。
【０１６３】
別の特定の実施形態において、本発明の組合せは、ピルフェニドン若しくはニンテダニブ、ソラフェニブ及び他のＲＴＫＩのような受容体チロシンキナーゼ阻害剤（ＲＴＫＩ）、又はアンジオテンシンＩＩ（ＡＴ１）受容体遮断剤、又はＣＴＧＦ阻害剤、又はＭＭＰ２、ＭＭＰ９、ＴＨＢＳ１若しくは細胞表面インテグリンのような潜伏性ＴＧＦβ複合体の活性化剤、ＴＧＦβ受容体Ｉ型（ＴＧＦＢＲＩ）若しくはＩＩ型（ＴＧＦＢＲＩＩ）及びＴＧＦβ、アクチビン、インヒビン、Ｎｏｄａｌ、抗ミューラー管ホルモン、ＧＤＦ若しくはＢＭＰのようなそのリガンド、補助共受容体（ＩＩＩ型受容体としても知られる。）を含むＴＧＦβ及びＢＭＰ活性化経路を妨害しやすい任意の抗線維化化合物、又は調節性若しくは阻害性ＳＭＡＤタンパク質を含むＳＭＡＤ依存性キャノニカル経路の成分、又はＭＡＰＫシグナル伝達の種々の分岐、ＴＡＫ１、Ｒｈｏ様ＧＴＰアーゼシグナル伝達経路、ホスファチジルイノシトール−３キナーゼ／ＡＫＴ経路、ＴＧＦβ誘導ＥＭＴプロセスを含むＳＭＡＤ非依存性若しくは非キャノニカル経路のメンバー、又はＨｈリガンド若しくは標的遺伝子を含むキャノニカル及び非キャノニカルヘッジホッグシグナル伝達経路、又はＴＧＦβシグナル伝達に影響を及ぼしやすいＷＮＴ若しくはＮｏｔｃｈ経路の任意のメンバーのような、既知の抗線維化活性を有する少なくとも１つの治療活性剤をさらに含んでいてもよい。
【０１６４】
本発明の特定の実施形態において、他の治療活性剤はＰＰＡＲアゴニストである。
【０１６５】
別の特定の実施形態において、ＰＰＡＲアゴニストは、ＰＰＡＲアルファアゴニスト、ＰＰＡＲガンマアゴニスト、ＰＰＡＲデルタアゴニスト、ＰＰＡＲアルファ／ガンマデュアルアゴニスト、ＰＰＡＲアルファ／デルタデュアルアゴニスト、ＰＰＡＲガンマ／デルタデュアルアゴニスト、又はＰＰＡＲアルファ／ガンマ／デルタ汎アゴニストである。
【０１６６】
特定の実施形態において、他の治療活性剤は：
・少なくとも１つのＰＰＡＲ−アルファアゴニスト；
・少なくとも１つのＰＰＡＲ−ガンマアゴニスト；
・少なくとも１つのＰＰＡＲ−デルタアゴニスト；
・少なくとも１つのＰＰＡＲ−アルファ／デルタデュアルアゴニスト；
・少なくとも１つのＰＰＡＲ−アルファアゴニスト及び少なくとも１つのＰＰＡＲ−デルタアゴニスト；
・少なくとも１つのＰＰＡＲ−アルファ／ガンマデュアルアゴニスト；
・少なくとも１つのＰＰＡＲ−アルファアゴニスト及び少なくとも１つのＰＰＡＲ−ガンマアゴニスト；
・少なくとも１つのＰＰＡＲ−ガンマ／デルタデュアルアゴニスト；
・少なくとも１つのＰＰＡＲ−ガンマアゴニスト及び少なくとも１つのＰＰＡＲ−デルタアゴニスト；
・少なくとも１つのＰＰＡＲ−アルファ／ガンマ／デルタ汎アゴニスト；並びに
・少なくとも１つのＰＰＡＲ−アルファアゴニスト、少なくとも１つのＰＰＡＲ−ガンマアゴニスト及び少なくとも１つのＰＰＡＲ−デルタアゴニスト
である。
【０１６７】
特定の実施形態では、本発明の組合せ物は、上記の成分（ｉ）及び（ｉｉ）並びに薬学的に許容される担体を含む組成物である。
【０１６８】
特定の実施形態では、組合せ物は、連続、分離又は同時使用のための上記の成分（ｉ）及び（ｉｉ）を含むキットオブパーツである。
【０１６９】
さらなる実施形態では、成分（ｉ）及び（ｉｉ）は、持効性及び／又は徐放性放出のために、注射可能な懸濁液、ジェル、オイル、ピル、錠剤、坐薬、粉末、カプセル、エアロゾル、軟膏、クリーム、パッチ、又はガレヌス形態の手段で製剤化される。
【０１７０】
本発明は、医薬として使用するための本発明による組合せ物にも関する。
【０１７１】
本発明は、疾患の治療のための方法において使用するための、本明細書に開示される組合せ物にも関する。別の実施形態において、本発明は、疾患の治療のための方法であって、これを必要とする対象に本明細書で開示される治療有効量の組合せ物を投与することを含む方法に関する。別の実施形態において、疾患の治療用の医薬の製造のための本発明に従った組合せ物の使用が提供される。
【０１７２】
特に、本発明の組合せ物は、免疫、炎症性、代謝性、線維性及び胆汁うっ滞性疾患のような疾患の治療に有用である。特定の実施形態において、疾患は、代謝性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、薬剤誘発性肝疾患、アルコール誘発性肝疾患、感染病原体誘発性肝疾患、炎症性肝疾患、免疫系機能障害媒介肝疾患、脂質異常症、循環器疾患、再狭窄、シンドロームＸ、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、高血圧、原発性硬化性胆管症（ＰＳＣ）、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）のような慢性胆管症、胆道閉鎖、進行性家族性胆内胆汁うっ滞症３型（ＰＦＩＣ３）、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ケロイド、陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性硬化症、炎症性疾患、神経変性疾患、がん、肝臓がん、肝細胞癌、胃腸がん、胃がん、神経線維腫症に伴う髄膜腫、膵内分泌腫瘍、膵外分泌腫瘍、白血病、骨髄増殖性／骨髄異形成（ｍｙｅｌｏｄｉｓｐｌａｓｔｉｃ）疾患、肥満細胞症、皮膚線維肉腫、乳がん、肺がん、甲状腺がん又は結腸直腸がんを含む固形腫瘍、前立腺がん、任意の起源の肝線維症又は硬変症、代謝性疾患誘発性肝線維症又は硬変症、ＮＡＦＬＤ誘発性線維症又は硬変症、ＮＡＳＨ誘発性線維症又は硬変症、アルコール誘発性肝線維症又は硬変症、薬剤誘発性肝線維症又は硬変症、感染病原体誘発性肝線維症又は硬変症、寄生虫感染による肝線維症又は硬変症、細菌感染による肝線維症又は硬変症、ウイルス感染による線維症又は硬変症、ＨＢＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＣＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＩＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＣＶ及びＨＩＶの重複感染による肝線維症又は硬変症、放射線又は化学療法誘発性線維症又は硬変症、胆道線維症、任意の慢性胆汁うっ滞性疾患による肝線維症又は硬変症、任意の病因の腸線維症、クローン病誘発性線維症、潰瘍性大腸炎誘発性線維症、腸（例えば、小腸）線維症、結腸線維症、胃線維症、皮膚線維症、表皮線維症、内皮線維症、強皮症／全身性硬化症による皮膚線維症、肺線維症、ＣＯＰＤ、喘息、肺気腫、喫煙者の肺、結核のような慢性炎症性気道疾患につながる肺線維症、肺性線維症、特発性肺性線維症（ＩＰＦ）、心臓線維症、腎線維症、腎性全身性線維症、筋線維症、軟部組織（例えば、縦隔又は後腹膜）線維症、骨髄線維症、関節線維症（ｊｏｉｎｔ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腱線維症、軟骨線維症、膵臓線維症、子宮線維症、神経系線維症、精巣線維症、卵巣線維症、副腎線維症、動脈線維症、静脈線維症、眼線維症、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症（炭鉱夫塵肺の合併症）、増殖性線維症、腫瘍性線維形成、着床前後線維症及び石綿症、関節線維化（ａｒｔｈｒｏｆｉｂｒｏｓｉｓ）、癒着性関節包炎からなる群において選択される。
【０１７３】
極めて好ましい実施形態において、疾患は、代謝性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、薬剤誘発性肝疾患、アルコール誘発性肝疾患、感染病原体誘発性肝疾患、炎症性肝疾患、免疫系機能障害媒介肝疾患、脂質異常症、循環器疾患、再狭窄、シンドロームＸ、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、高血圧、原発性硬化性胆管症（ＰＳＣ）、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）のような慢性胆管症、胆道閉鎖、進行性家族性胆内胆汁うっ滞症３型（ＰＦＩＣ３）、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、肝臓がん、肝細胞癌、胃腸がん、胃がん、結腸直腸がん、代謝性疾患誘発性肝線維症又は硬変症、ＮＡＦＬＤ誘発性線維症又は硬変症、ＮＡＳＨ誘発性線維症又は硬変症、アルコール誘発性肝線維症又は硬変症、薬剤誘発性肝線維症又は硬変症、感染病原体誘発性肝線維症又は硬変症、寄生虫感染による肝線維症又は硬変症、細菌感染による肝線維症又は硬変症、ウイルス感染による線維症又は硬変症、ＨＢＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＣＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＩＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＣＶ及びＨＩＶの重複感染による肝線維症又は硬変症、放射線又は化学療法誘発性線維症又は硬変症、胆道線維症、任意の慢性胆汁うっ滞性疾患による肝線維症又は硬変症、任意の病因の腸線維症、クローン病誘発性線維症、潰瘍性大腸炎誘発性線維症、腸（例えば、小腸）線維症、結腸線維症、胃線維症、肺線維症、ＣＯＰＤ、喘息、肺気腫、喫煙者の肺、結核のような慢性炎症性気道疾患につながる肺線維症、肺性線維症、特発性肺性線維症（ＩＰＦ）からなる群において選択される。
【０１７４】
さらなる態様では、本発明はコラーゲン線維の産生の原因であるか及び／又は細胞外マトリックスの産生の原因である線維芽細胞の増殖及び／又は活性化の阻害において使用するための本発明の組合せに関する。
【０１７５】
本発明に従えば、用語「自己免疫疾患」は、身体中に通常存在する物質及び組織に対する身体の異常な免疫応答から生じる状態を名付けるのに使用される。疾患はある特定の器官（例えば、Ｉ型糖尿病又は自己免疫性甲状腺炎において）に制限されるか又は異なる場所での特定の組織（例えば、グッドパスチャー病、肺及び腎臓での基底膜の疾患において）に関連してもよい。
【０１７６】
用語「炎症」は、細胞／組織損傷の原因はもちろん最初の損傷から生じる壊死性細胞／組織も取り除いて、修復過程を開始するのに役立つ可能性がある宿主細胞、血管及びタンパク質並びに他のメディエーターが関わる防御応答から生じる状態を名付けるのに使用される。炎症反応は、疼痛、熱、発赤、膨潤、血管膨張、血流増加及び機能喪失により現れることがある。
【０１７７】
本発明によれば、用語「線維症」、「線維性疾患」、「線維性障害」及びその語形変化は、器官又は組織における線維性結合組織の過剰な沈着という病態を意味する。より具体的には、線維症は病状過程であり、これには組織損傷に対する応答としての、遷延性線維性傷跡形成及び結合組織による細胞外マトリックスの過剰産生が含まれる。生理的には、結合組織の沈着は、根底にある器官又は組織の構造及び機能を全滅させることが可能である。
【０１７８】
本発明に従えば、線維症又は線維性障害はいかなる器官又は組織線維症にも関連していてよい。特定の器官線維症の例示的、非限定的例は、肝臓、腸、腎臓、皮膚、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、陰茎、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、腸（例えば、小腸）、胆道、軟部組織（例えば、縦隔又は後腹膜）、骨髄、関節又は胃線維症、特に、肝臓、腎臓、皮膚、表皮、内皮、筋肉、腱、軟骨、心臓、膵臓、肺、子宮、神経系、精巣、卵巣、副腎、動脈、静脈、結腸、腸（例えば、小腸）、胆道、軟部組織（例えば、縦隔又は後腹膜）、骨髄、関節、目又は胃線維症を含む。
【０１７９】
本発明によれば、用語「胆汁うっ滞」、又は「胆汁うっ滞性疾患」、又は「胆汁うっ滞性障害」及びその語形変化は、肝細胞による分泌障害、又は肝内−若しくは肝外胆管を通る胆汁流の閉塞により胆汁流が減少することをもって定義される病態を意味する。したがって、胆汁うっ滞の臨床定義は、正常ならば胆汁に排泄される物質が保持される任意の状態である。
【０１８０】
特定の実施形態では、線維性障害は、肝臓、腸、肺、心臓、腎臓、筋肉、皮膚、軟部組織（例えば、縦隔又は後腹膜）、骨髄、腸、及び関節（例えば、膝、肩又は他の関節）線維症からなる群において選択される。
【０１８１】
好ましい実施形態では、線維性障害は、肝臓、肺、皮膚、腎臓及び腸線維症からなる群において選択される。
【０１８２】
本発明のさらに好ましい実施形態では、治療された線維性障害は、線維性障害の以下の包括的ではない一覧：非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、肺性線維症、特発性肺性線維症、皮膚線維症、眼線維症（水晶体嚢線維症のような）、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症（炭鉱夫塵肺の合併症）、増殖性線維症、腫瘍性線維形成、慢性炎症性気道疾患（ＣＯＰＤ、喘息、肺気腫、喫煙者の肺、結核）につながる肺線維症、アルコール又は薬剤誘発性肝線維症、肝硬変症、感染による肝線維症、放射線又は化学療法誘発性線維症、腎性全身性線維症、クローン病、潰瘍性大腸炎、ケロイド、陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性硬化症、関節線維化、癒着性関節包炎のいくつかの形態、原発性硬化性胆管症（ＰＳＣ）及び原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）のような慢性線維化胆管症、胆道閉鎖、進行性家族性胆内胆汁うっ滞症３型（ＰＦＩＣ３）、着床前後線維症並びに石綿症からなる群において選択される。
【０１８３】
胆汁うっ滞は、肝細胞による分泌障害（肝細胞性胆汁うっ滞）又は肝内若しくは肝外胆管を通じた胆汁流の閉塞（閉塞性胆汁うっ滞）に起因する胆汁流の減少と定義される。診療では、胆汁うっ滞は、肝臓からの胆汁の流れが遅くなるか又は遮断される任意の状態である。本発明の特定の実施形態に従えば、胆汁うっ滞性疾患は、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管症（ＰＳＣ）、妊娠性肝内胆汁うっ滞、進行性家族性胆内胆汁うっ滞、胆道閉鎖、胆石症、感染性胆管炎、ランゲルハンス細胞組織球症に伴う胆管症、アラジール症候群、非症候性管欠乏（Ｎｏｎｓｙｎｄｒｏｍｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ｐａｕｃｉｔｙ）、薬剤誘発性胆汁うっ滞及び完全非経口栄養関連胆汁うっ滞（Ｔｏｔａｌ  ｐａｒｅｎｔａｌ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ）からなる群において選択される。好ましい実施形態では、胆汁うっ滞性疾患は、ＰＢＣ又はＰＳＣ、特にＰＢＣである。
【０１８４】
炎症性疾患、線維性疾患、代謝性疾患及び胆汁うっ滞性疾患の例は、代謝性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、薬剤誘発性肝疾患、アルコール誘発性肝疾患、感染病原体誘発性肝疾患、炎症性肝疾患、免疫系機能障害媒介肝疾患、脂質異常症、循環器疾患、再狭窄、シンドロームＸ、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、高血圧、原発性硬化性胆管症（ＰＳＣ）、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）のような慢性胆管症、胆道閉鎖、進行性家族性胆内胆汁うっ滞症３型（ＰＦＩＣ３）、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ケロイド、陳旧性心筋梗塞、強皮症／全身性硬化症、炎症性疾患、神経変性疾患、がん、肝臓がん、肝細胞癌、胃腸がん、胃がん、神経線維腫症に伴う髄膜腫、膵内分泌腫瘍、膵外分泌腫瘍、白血病、骨髄増殖性／骨髄異形成疾患、肥満細胞症、皮膚線維肉腫、乳がん、肺がん、甲状腺がん又は結腸直腸がんを含む固形腫瘍、前立腺がん、任意の起源の肝線維症又は硬変症、代謝性疾患誘発性肝線維症又は硬変症、ＮＡＦＬＤ誘発性線維症又は硬変症、ＮＡＳＨ誘発性線維症又は硬変症、アルコール誘発性肝線維症又は硬変症、薬剤誘発性肝線維症又は硬変症、感染病原体誘発性肝線維症又は硬変症、寄生虫感染による肝線維症又は硬変症、細菌感染による肝線維症又は硬変症、ウイルス感染による線維症又は硬変症、ＨＢＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＣＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＩＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＣＶ及びＨＩＶの重複感染による肝線維症又は硬変症、放射線又は化学療法誘発性線維症又は硬変症、胆道線維症、任意の慢性胆汁うっ滞性疾患による肝線維症又は硬変症、任意の病因の腸線維症、クローン病誘発性線維症、潰瘍性大腸炎誘発性線維症、腸（例えば、小腸）線維症、結腸線維症、胃線維症、皮膚線維症、表皮線維症、内皮線維症、強皮症／全身性硬化症による皮膚線維症、肺線維症、ＣＯＰＤ、喘息、肺気腫、喫煙者の肺、結核のような慢性炎症性気道疾患につながる肺線維症、肺性線維症、特発性肺性線維症（ＩＰＦ）、心臓線維症、腎線維症、腎性全身性線維症、筋線維症、軟部組織（例えば、縦隔又は後腹膜）線維症、骨髄線維症、関節線維症（ｊｏｉｎｔ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ）、腱線維症、軟骨線維症、膵臓線維症、子宮線維症、神経系線維症、精巣線維症、卵巣線維症、副腎線維症、動脈線維症、静脈線維症、眼線維症、心内膜心筋線維症、縦隔線維症、骨髄線維症、後腹膜線維症、進行性塊状線維症（炭鉱夫塵肺の合併症）、増殖性線維症、腫瘍性線維形成、着床前後線維症及び石綿症、関節線維化、癒着性関節包炎を含む。
【０１８５】
好ましくは、疾患は、代謝性肝疾患、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、薬剤誘発性肝疾患、アルコール誘発性肝疾患、感染病原体誘発性肝疾患、炎症性肝疾患、免疫系機能障害媒介肝疾患、脂質異常症、循環器疾患、再狭窄、シンドロームＸ、メタボリックシンドローム、糖尿病、肥満、高血圧、原発性硬化性胆管症（ＰＳＣ）、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）のような慢性胆管症、胆道閉鎖、進行性家族性胆内胆汁うっ滞症３型（ＰＦＩＣ３）、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、肝臓がん、肝細胞癌、胃腸がん、胃がん、結腸直腸がん、代謝性疾患誘発性肝線維症又は硬変症、ＮＡＦＬＤ誘発性線維症又は硬変症、ＮＡＳＨ誘発性線維症又は硬変症、アルコール誘発性肝線維症又は硬変症、薬剤誘発性肝線維症又は硬変症、感染病原体誘発性肝線維症又は硬変症、寄生虫感染による肝線維症又は硬変症、細菌感染による肝線維症又は硬変症、ウイルス感染による線維症又は硬変症、ＨＢＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＣＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＩＶ感染による肝線維症又は硬変症、ＨＣＶ及びＨＩＶの重複感染による肝線維症又は硬変症、放射線又は化学療法誘発性線維症又は硬変症、胆道線維症、任意の慢性胆汁うっ滞性疾患による肝線維症又は硬変症、任意の病因の腸線維症、クローン病誘発性線維症、潰瘍性大腸炎誘発性線維症、腸（例えば、小腸）線維症、結腸線維症、胃線維症、肺線維症、ＣＯＰＤ、喘息、肺気腫、喫煙者の肺、結核のような慢性炎症性気道疾患につながる肺線維症、肺性線維症、特発性肺性線維症（ＩＰＦ）からなる群において選択される。
【０１８６】
用語「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」又は「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、それを必要とする対象における障害の治療又は予防のことである。治療は、明言された障害を有する対象に、すなわち、患者に、特に医薬組成物に含まれる化合物を投与して、障害を治療する、遅延させる、好転させるか又はその進行速度を落として、それによって対象の状態を改善することを含む。治療は、健康であるか又は胆汁うっ滞性若しくは線維性障害の発症のリスクがある対象に、障害を予防するため若しくは遅延するために施されてもよい。
【０１８７】
したがって、本発明に従えば、免疫、炎症性、代謝性、線維性及び胆汁うっ滞性疾患の治療は、障害を治療し、遅延させ、好転させ、若しくはこの進行の速度を遅くし、このようにして患者の状態を改善するために、表明された障害を有する対象に、又は健康な対象、特にそのような疾患を発症するリスクがある対象に、例えば、組合せの成分（ｉ）及び（ｉｉ）を含有する医薬組成物の形態で本発明の組合せを投与することを含む。
【０１８８】
治療は、患者の状態を治療し、遅延させ、若しくはこの進行の速度を遅くし、このようにして患者の状態を改善するために、表明された障害を有する患者に、又は健康な対象、特に炎症性、代謝性、線維性及び胆汁うっ滞性疾患を発症するリスクがある対象に、本発明の組合せを投与することを含む。
【０１８９】
治療する対象は哺乳動物、好ましくはヒトである。本発明に従って治療する対象は、以前の薬物治療、関連病状、遺伝子型、危険因子への曝露、ウイルス感染のような線維性疾患に関連するいくつかの基準に基づいて、並びにイメージング方法及び免疫学的、生化学的、酵素的、化学的又は核酸検出方法の手段により評価することが可能な任意の適切なバイオマーカーの検出に基づいて選択することが可能である。
【０１９０】
本発明に従って治療する対象は、以前の薬物治療、関連病状、遺伝子型、危険因子への曝露、ウイルス感染のような炎症性、代謝性、線維性及び胆汁うっ滞性疾患に関連するいくつかの基準、並びにイメージング方法及び免疫学的、生化学的、酵素的、化学的又は核酸検出方法の手段により評価することが可能な任意の他の適切なバイオマーカーに基づいて選択することが可能である。
【０１９１】
特定の実施形態において、炎症性、代謝性、線維性及び胆汁うっ滞性疾患の治療は、式（Ｉ）の少なくとも２つの化合物を含む組成物の投与を含んでいてもよい。この実施形態において、投与された成分（ｉｉ）は式（Ｉ）の少なくとも２つの化合物と同じ組成物中で、又は異なる組成物中でのような分離した形態で提供される。
【０１９２】
別の実施形態において、本発明の組合せは、治療において同時、連続又は分離した投与用であり、したがって、おそらく異なる組成物中に含まれる。連続投与の場合、式（Ｉ）の化合物、特にＥＬＡは成分（ｉｉ）に先立って投与してもよく、又は成分（ｉｉ）は式（Ｉ）の化合物に先立って投与される。
【０１９３】
式（Ｉ）の化合物は、薬学的に許容される塩、特に医薬使用に適合する酸性又は塩基性塩として製剤化してもよい。式（Ｉ）の化合物の塩は、薬学的に許容される酸付加塩、薬学的に許容される塩基付加塩、薬学的に許容される金属塩、アンモニウム及びアルキル化アンモニウム塩を含む。これらの塩は、化合物の最終精製ステップ中に、又は塩をすでに精製された化合物中に組み込むことにより得ることが可能である。
【０１９４】
本発明の医薬組成物は、薬学的な文脈内で許容される、１つ又はいくつかの賦形剤又は溶媒（例えば、医薬用途に適合する及び当業者であれば周知である生理食塩水、生理溶液、等張液、等）も含むことが可能である。
【０１９５】
これらの組成物は、分散剤、可溶化剤、安定化剤、保存剤、等の間から選択される１つ若しくはいくつかの作用物質又は溶媒も含むことが可能である。これらの製剤に有用な作用物質又は溶媒（液体及び／又は注射液及び／又は固体）は特に、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、マンニトール、ゼラチン、ラクトース、植物油、アカシア、リポソーム、等である。
【０１９６】
これらの組成物は、最終的には持効性及び／又は徐放性放出を保証するガレヌス形態又はデバイスを用いて、注射可能な懸濁液、ゲル、オイル、軟膏、ピル、錠剤、坐薬、粉末、ゲルカップ、カプセル、エアロゾル、等の形態で製剤化することが可能である。この種の製剤では、セルロース、炭酸塩又はデンプンのような作用物質を有利に使用することが可能である。
【０１９７】
式（Ｉ）の化合物及び１つ以上の成分（ｉｉ）を含む本発明の医薬組成物は、異なる経路により及び異なる形態で投与してもよい。例えば、化合物は、全身的方法、経口的、非経口的、吸入により、点鼻薬により、経鼻滴下により、又は、例えば、静脈内に、筋肉内経路により、皮下経路により、経皮経路により、局所経路により、動脈内経路により、等のような注射を介して投与してもよい。
【０１９８】
当然のことながら、投与経路は、当業者には周知である手順に従って、投与される化合物の形態に適応させる。
【０１９９】
本発明の組合せ物の成分（ｉ）及び（ｉｉ）は、治療有効量で投与される。本発明の文脈内では、用語「有効量」とは、所望の治療結果を生み出すのに十分な化合物の量のことである。
【０２００】
投与に関する回数及び／又は用量は、患者、病状、投与形態、等に応じて当業者が適応させることが可能である。典型的には、本発明の組合せ（医薬組成物又はパーツキットの形態でのような）は、成分（ｉ）又は成分（ｉｉ）について、５０ｍｇ／日〜２０００ｍｇ／日、特に、１００ｍｇ／日〜１０００ｍｇ／日のような０．０１ｍｇ／日〜４０００ｍｇ／日に含まれる用量で線維性疾患の治療のために投与することが可能である。
【０２０１】
本発明の好ましい実施形態において、ＥＬＡは、エラフィブラノールについて８０〜１２０ｍｇ／日に含まれる用量で成分（ｉｉ）と組み合わせて使用される。
【０２０２】
別の好ましい実施形態において、活性構成成分は、経口摂取を目的とするピル又は錠剤の形態で１つ以上の医薬組成物として投与される。
【０２０３】
投与は、毎日又は必要ならば１日あたり数回でさえ実施することが可能である。
【０２０４】
本発明は、以下の非限定的実施例を参照してさらに説明される。
【０２０５】
図において、表において及び本文において使用される略語
α−ＳＭＡ            α平滑筋アクチン
ＡＰ−１              活性化タンパク質
ＡＳＢＴｉ            頂端側ナトリウム共依存性胆汁酸輸送体阻害剤
ＡＳＫ１              アポトーシスシグナル調節キナーゼ１
ＡＴ１                アンジオテンシンＩＩ受容体１型
ＣＬＡ                共役リノール酸
ＣＯＰＤ              慢性閉塞性肺疾患
ＣＴＧＦ              結合組織成長因子
ＣＶＣ                セニクリビロク  
ＤＧＡＴ              ジアシルグリセロール−Ｏ−アシルトランスフェラーゼ
ＤＭＳＯ              ジメチルスルホキシド
ＤＰＰ４              ジペプチジルペプチダーゼ４
ＥＬＩＳＡ            酵素結合免疫アッセイ
ＥＯＢ                エクセスオーバーブリス
ＥＯＢＨＳＡ          エクセスオーバーブリス最高単剤
ＦＡＢＡＣ            脂肪酸胆汁酸コンジュゲート
ＦＢＳ                ウシ胎仔血清
ＦＧＦ                線維芽細胞成長因子
ＦＸＲ                ファルネソイドＸ受容体
ＧＤＦ                増殖分化因子
ＧＬＰ−１            グルカゴン様ペプチド−１
ＧＰＣＲ              Ｇタンパク質共役型受容体
ＨＢＶ                Ｂ型肝炎ウイルス
ＨＣＶ                Ｃ型肝炎ウイルス
１５−ＨＥＰＥ        ５−ヒドロキシエイコサペンタエン酸
ＨＩＶ                ヒト免疫不全ウイルス
ＨＳＣ                肝星細胞
ＩＣ５０                ５０％阻害濃度
ｉＮＯＳ              誘導型一酸化窒素合成酵素
ＩＰＦ                特発性肺性線維症
ＬＯ                  リポキシゲナーゼ
ＬＰＳ                リポ多糖
ＬＴ                  ロイコトリエン
ＭＡＰＫ              マイトジェン活性化プロテインキナーゼ
ＭＭＰ−９            マトリックスメタロプロテアーゼ９
ＭＭＰａｓｅ          マトリックスメタロプロテアーゼ
ＮＡＤＰＨ            ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸
ＮＡＦＬＤ            非アルコール性脂肪性肝疾患
ＮＡＳＨ              非アルコール性脂肪性肝炎
ＮＦ−κＢ            核内因子カッパＢ
ＮＯＸ                ＮＡＤＰＨオキシダーゼ
ＮＳＡＩＤｓ          非ステロイド性抗炎症剤
ＰＡＲ                プロテアーゼ活性化受容体
ＰＢＣ                原発性胆汁性胆管炎
ＰＢＳ                リン酸緩衝食塩水
ＰＤＥ                ホスホジエステラーゼ
ＰＤＧＦ              血小板由来成長因子
ＰＦＩＣ３            進行性家族性肝内胆汁うっ滞型３
ＰＦＯＲ              ピルベート：フェレドキシン酸化還元酵素
ＰＰＡＲ              ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体
ＰＰＲＥ              ＰＰＡＲ応答エレメント
ＰＳＣ                原発性硬化性胆管炎
ＲＯＣＫ              Ｒｈｏ関連タンパク質キナーゼ
ＲＴＫ                受容体チロシンキナーゼ
ＳＧＬＴ              ナトリウム−グルコース輸送
ＳＴＡＴ              転写のシグナルトランスデューサー及び活性化因子
ＴＧＦβ              形質転換成長因子β
ＴＧＦＢＲＩ          ＴＧＦβ受容体Ｉ型
ＴＧＦＢＲＩＩ        ＴＧＦβ受容体ＩＩ型
ＴＨＢＳ１            トロンボスポンジン１
ＴＨＲβ              甲状腺ホルモン受容体β
ＴＩＭＰ              メタロプロテアーゼ１の組織阻害剤
ＴＬＲ−４            Ｔｏｌｌ様受容体４
ＶＡＰ−１            血管接着タンパク質−１
ＶＤＲ                ビタミンＤ受容体
【図面の簡単な説明】
【０２０６】
【図１】線維症面の寸法に対する１ｍｇ／ｋｇ／日のＥＬＡと１０ｍｇ／ｋｇ／日のＯＣＡの組合せの効果を示す図である。
【図２】線維症面の寸法に対する３ｍｇ／ｋｇ／日のＥＬＡと１０ｍｇ／ｋｇ／日のＯＣＡの組合せの効果を示す図である。
【図３】肝臓コラーゲンに対する１ｍｇ／ｋｇ／日のＥＬＡと１０ｍｇ／ｋｇ／日のＯＣＡの組合せの効果を示す図である。
【図４】肝臓コラーゲンに対する３ｍｇ／ｋｇ／日のＥＬＡと１０ｍｇ／ｋｇ／日のＯＣＡの組合せの効果を示す図である。
【図５−１】線維症マーカーに対する３ｍｇ／ｋｇ／日のＥＬＡと１０ｍｇ／ｋｇ／日のＯＣＡの組合せの効果を示す図である。
【図５−２】線維症マーカーに対する３ｍｇ／ｋｇ／日のＥＬＡと１０ｍｇ／ｋｇ／日のＯＣＡの組合せの効果を示す図である。
【図６】ＴＧＦβ誘導ｈＨＳＣにおけるエラフィブラノール対セニクリビロク、及びベザフィブラートの差示的抗線維化効果を示す図である。  血清由来ＨＳＣは、線維形成促進性サイトカインＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）での活性化前にエラフィブラノール（Ａ）、セニクリビロク（Ｂ）、又はベザフィブラート（ＰＰＡＲ汎α／γ／δ）と一緒に１時間プレインキュベートした。  ４８時間のインキュベーション後、αＳＭＡの発現をＥＬＩＳＡによって測定した。  得られた値は、ＴＧＦβ１対照に対するパーセント阻害に変換された。データは平均（３通り）±標準偏差（ＳＤ）として提示される。統計解析は、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ１１．０ソフトウェアを使用して、一元配置分散分析、続いてボンフェローニ事後検定により実施した。［＊：ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（比較対ＴＧＦβ１  １ｎｇ／ｍＬ群）］。カーブフィッティング及び５０％阻害濃度（ＩＣ５０）の計算は、ＸＬＦｉｔソフトウェア５．３．１．３．を用いて実施した。
【図７】エラフィブラノールとセニクリビロクの組合せはＴＧＦβ１−誘導ｈＨＳＣにおいてαＳＭＡを相乗的に阻害することを示す図である。  組合せは用量応答マトリックスフォーマットで試験し、エクセスオーバーブリス（ＥＯＢ）アディティビズムモデルに従って分析した。  エラフィブラノール（横列）とセニクリビロク（縦列）の希釈系列を、そのそれぞれのＤＭＳＯ対照を含めて調製した。  得られた混合物は、線維形成促進性サイトカインＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）での活性化１時間前に、血清由来ＨＳＣに添加した。  （Ａ）すべての組合せ対についてのＴＧＦβ１対照に対するαＳＭＡ阻害のパーセント。データは４通りの平均として提示されている。  （Ｂ）ＥＯＢスコアは材料及び方法に記載される通りに計算した。ＥＯＢ値＞１０のいかなる化合物対も相乗的だと見なした（薄い灰色から黒色まで着色されている）。すべての組合せを含む全ＥＯＢスコアも計算した。  （Ｃ）相乗的組合せ対由来のデータ値は棒グラフ表示にプロットした。データは平均（４通り）±標準偏差（ＳＤ）として提示される。統計解析は、Ｓｉｇｍａ  Ｐｌｏｔ１１．０ソフトウェアを使用して、一元配置分散分析、続いてボンフェローニ事後検定により実施した。［＊：ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（比較対「製品組合せ」群）］。
【図８】ＴＧＦβ１−誘導ｈＨＳＣにおいてベザフィブラートはセニクリビロクと協同して線維症を低減することはないことを示す図である。  組合せは用量応答マトリックスフォーマットで試験し、エクセスオーバーブリスアディティビズムモデルに従って分析した。  ベザフィブラート（横列）とセニクリビロク（縦列）の希釈系列を、そのそれぞれのＤＭＳＯ対照を含めて調製した。得られた混合物は、線維形成促進性サイトカインＴＧＦβ１（１ｎｇ／ｍｌ）での活性化１時間前に、血清由来ＨＳＣに添加した。  （Ａ）ＴＧＦβ１対照に対するαＳＭＡのパーセント阻害。  （Ｂ）エクセスオーバーブリス（ＥＯＢ）スコアは材料及び方法に記載される通りに計算した。ＥＯＢ値＞１０のいかなる化合物対も相乗的だと見なした（薄い灰色から黒色まで着色されている）。すべての組合せを含む全ＥＯＢスコアも計算した。
【図９−１】エラフィブラノールとＭＳＤＣ−０６０２、ＰＸＳ−４７２８Ａ、アパラレノン、ＣＦ−１０２、ビスモデギブ、ＰＢＩ−４０５０、ＫＤ−０２５、ＤＵＲ−９２８、ＶＫ−２８０９、及びエムリカサンの組合せはＴＧＦβ１−誘導ｈＨＳＣにおいてαＳＭＡを相乗的に阻害することを示す図である。  組合せは用量応答マトリックスフォーマットで試験し、エクセスオーバーブリス（ＥＯＢ）アディティビズムモデルに従って分析した。ＴＧＦβ１対照に対するαＳＭＡ阻害のパーセントは、代表的な相乗的組合せについて棒グラフ表示にプロットした。データは平均（４通り）±標準偏差（ＳＤ）として提示される。一元配置分散分析及びフィシャーの最小有意差（ＬＳＤ）事後検定を使用して＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。ＭＳＤＣ＝ＭＳＤＣ−０６０２．
【図９−２】エラフィブラノールとＭＳＤＣ−０６０２、ＰＸＳ−４７２８Ａ、アパラレノン、ＣＦ−１０２、ビスモデギブ、ＰＢＩ−４０５０、ＫＤ−０２５、ＤＵＲ−９２８、ＶＫ−２８０９、及びエムリカサンの組合せはＴＧＦβ１−誘導ｈＨＳＣにおいてαＳＭＡを相乗的に阻害することを示す図である。  組合せは用量応答マトリックスフォーマットで試験し、エクセスオーバーブリス（ＥＯＢ）アディティビズムモデルに従って分析した。ＴＧＦβ１対照に対するαＳＭＡ阻害のパーセントは、代表的な相乗的組合せについて棒グラフ表示にプロットした。データは平均（４通り）±標準偏差（ＳＤ）として提示される。一元配置分散分析及びフィシャーの最小有意差（ＬＳＤ）事後検定を使用して＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。ＭＳＤＣ＝ＭＳＤＣ−０６０２．
【図９−３】エラフィブラノールとＭＳＤＣ−０６０２、ＰＸＳ−４７２８Ａ、アパラレノン、ＣＦ−１０２、ビスモデギブ、ＰＢＩ−４０５０、ＫＤ−０２５、ＤＵＲ−９２８、ＶＫ−２８０９、及びエムリカサンの組合せはＴＧＦβ１−誘導ｈＨＳＣにおいてαＳＭＡを相乗的に阻害することを示す図である。  組合せは用量応答マトリックスフォーマットで試験し、エクセスオーバーブリス（ＥＯＢ）アディティビズムモデルに従って分析した。ＴＧＦβ１対照に対するαＳＭＡ阻害のパーセントは、代表的な相乗的組合せについて棒グラフ表示にプロットした。データは平均（４通り）±標準偏差（ＳＤ）として提示される。一元配置分散分析及びフィシャーの最小有意差（ＬＳＤ）事後検定を使用して＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。ＭＳＤＣ＝ＭＳＤＣ−０６０２．
【図１０】エラフィブラノールとＣＰ−６４０１８６、ＧＳ−０９７６又はＪＫＢ−１２１（ナルメフェン）の組合せは肝臓微細組織においてコラーゲン産生を相乗的に阻害することを示す図である。  微細組織は、エラフィブラノール単独（白色バー）、化合物（ｉｉ）単独（黒色バー）又は両方の組合せ（灰色バー）を用いて又は用いずにＮＡＳＨ刺激の代謝誘発で処理した。組合せは用量応答マトリックスフォーマットで試験し、エクセスオーバーブリス（ＥＯＢ）アディティビズムモデルに従って分析した。ＮＡＳＨ刺激対照に対する阻害のパーセントは、代表的な相乗的組合せについて棒グラフ表示にプロットした。データは平均（３通り）±標準偏差（ＳＤ）として提示される。一元配置分散分析及びフィシャーの最小有意差（ＬＳＤ）事後検定を使用して＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図１１】エラフィブラノールとゲムカベンの組合せはＬＰＳ−活性化マクロファージにおいてＴＮＦα分泌を相乗的に阻害することを示す図である。  組合せは用量応答マトリックスフォーマットで試験し、エクセスオーバーブリス（ＥＯＢ）アディティビズムモデルに従って分析した。ＬＰＳ対照に対するＴＮＦα分泌の阻害のパーセントは、代表的な相乗的組合せについて棒グラフ表示にプロットした。データは平均（４通り）±標準偏差（ＳＤ）として提示される。一元配置分散分析及びフィシャーの最小有意差（ＬＳＤ）事後検定を使用して＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図１２】エラフィブラノールとＣＰ６４０１８６、ＶＫ−２８０９、アパラレノン（Ａｐａ）又はアラムコール（Ａｒａｍ）の組合せはＨｅｐＧ２における体脂肪蓄積を相乗的に阻害することを示す図である。  組合せは用量応答マトリックスフォーマットで試験し、エクセスオーバーブリス（ＥＯＢ）アディティビズムモデルに従って分析した。ＦＦＡ処理対照に対する体脂肪蓄積の阻害のパーセントは、代表的な相乗的組合せについて棒グラフ表示にプロットした。データは平均（４通り）±標準偏差（ＳＤ）として提示される。一元配置分散分析及びフィシャーの最小有意差（ＬＳＤ）事後検定を使用して＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊：ｐ＜０．００１。
【図１３】エラフィブラノールとＭＧＬ−３１９６の組合せは３Ｄ  Ｈｕｈ７  スフェロイド培養において体脂肪蓄積を相乗的に阻害することを示す図である。  スフェロイドは、エラフィブラノール単独（白色バー）、ＭＧＬ３１９６単独（灰色バー）又は両方の組合せ（黒色バー）を用いて又は用いずに代謝的ＮＡＳＨ刺激で処理した。体脂肪蓄積の測定は材料及び方法に記載される通りに実施した。標準偏差はエラーバーとして示される（ｎ＝３）。計算されたＥＯＢ値は上左に述べる。有意差（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１）は一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）及びフィッシャーの最小有意差（ＬＳＤ）検定に従う。
【図１４−１】エラフィブラノール（ＧＦＴ５０５、３ｍｇ／ｋｇ／日）及びセロンセルチブ（ＳＥＬ、３０ｍｇ／ｋｇ／日）はＮＡＳＨを有するマウス（ＣＤＦＦ食マウス）において協同して線維症、組織リモデリング及び炎症性マーカーを低減することを示す図である。  （Ａ）線維症面のパーセントは肝臓部領域と比べたピクロシリウス陽性領域の形態計測定量化により評価した。  （Ｂ）肝臓コラーゲン含有量  （Ｃ）血漿ＰＩＩＩＮＰ濃度、肝線維症の代替マーカー  （Ｄ）血漿ＴＩＭＰ１濃度、肝線維症の代替マーカー  線維症及び組織リモデリングのマーカーとしてのＣｏｌ１α１（Ｅ）、ＭＭＰ２（Ｆ）、ＴＧＦβ１（Ｇ）並びに炎症マーカーとしてのＴＮＦα（Ｈ）及びＣＣＲ２（Ｉ）の発現はリアルタイム定量的ＰＣＲにより評価した。  データは平均±ＳＤとして表される。ウェルチ補正付きの片側スチューデントｔ検定を使用して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＨＳＡ、最高単剤モデル。
【図１４−２】エラフィブラノール（ＧＦＴ５０５、３ｍｇ／ｋｇ／日）及びセロンセルチブ（ＳＥＬ、３０ｍｇ／ｋｇ／日）はＮＡＳＨを有するマウス（ＣＤＦＦ食マウス）において協同して線維症、組織リモデリング及び炎症性マーカーを低減することを示す図である。  （Ａ）線維症面のパーセントは肝臓部領域と比べたピクロシリウス陽性領域の形態計測定量化により評価した。  （Ｂ）肝臓コラーゲン含有量  （Ｃ）血漿ＰＩＩＩＮＰ濃度、肝線維症の代替マーカー  （Ｄ）血漿ＴＩＭＰ１濃度、肝線維症の代替マーカー  線維症及び組織リモデリングのマーカーとしてのＣｏｌ１α１（Ｅ）、ＭＭＰ２（Ｆ）、ＴＧＦβ１（Ｇ）並びに炎症マーカーとしてのＴＮＦα（Ｈ）及びＣＣＲ２（Ｉ）の発現はリアルタイム定量的ＰＣＲにより評価した。  データは平均±ＳＤとして表される。ウェルチ補正付きの片側スチューデントｔ検定を使用して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＨＳＡ、最高単剤モデル。
【図１４−３】エラフィブラノール（ＧＦＴ５０５、３ｍｇ／ｋｇ／日）及びセロンセルチブ（ＳＥＬ、３０ｍｇ／ｋｇ／日）はＮＡＳＨを有するマウス（ＣＤＦＦ食マウス）において協同して線維症、組織リモデリング及び炎症性マーカーを低減することを示す図である。  （Ａ）線維症面のパーセントは肝臓部領域と比べたピクロシリウス陽性領域の形態計測定量化により評価した。  （Ｂ）肝臓コラーゲン含有量  （Ｃ）血漿ＰＩＩＩＮＰ濃度、肝線維症の代替マーカー  （Ｄ）血漿ＴＩＭＰ１濃度、肝線維症の代替マーカー  線維症及び組織リモデリングのマーカーとしてのＣｏｌ１α１（Ｅ）、ＭＭＰ２（Ｆ）、ＴＧＦβ１（Ｇ）並びに炎症マーカーとしてのＴＮＦα（Ｈ）及びＣＣＲ２（Ｉ）の発現はリアルタイム定量的ＰＣＲにより評価した。  データは平均±ＳＤとして表される。ウェルチ補正付きの片側スチューデントｔ検定を使用して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＨＳＡ、最高単剤モデル。
【図１５】エラフィブラノール（ＧＦＴ５０５、１又は３ｍｇ／ｋｇ／日）及びＧＫＴ−８３１（ＧＫＴ、６０ｍｇ／ｋｇ／日）はＮＡＳＨを有するマウス（ＣＤＦＦ食マウス）において協同してＮＡＳＨ及び線維症を低減することを示す図である。  （Ａ）線維症面のパーセントは肝臓部領域と比べたピクロシリウス陽性領域の形態計測定量化により評価した。  （Ｂ）１０顕微鏡視野領域（２０Ｘ）での炎症巣の組織学的評価  （Ｃ）ＮＡＦＬＤ活性スコア、ＮＡＳＨ臨床研究ネットワーク（Ｋｌｅｉｎｅｒ  ２００５年、Ｂｒｕｎｔ  １９９９年）に従って脂肪肝、バルーニング及び小葉内炎症等級（最小０〜最大８）の合計の計算により評価される。  データは平均±ＳＤとして表される。ウェルチ補正付きの片側スチューデントｔ検定を使用して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。片側マン・ホイットニーのＵ（ノンパラメトリック）検定を使用して＄ｐ＜０．０５、＄＄ｐ＜０．０１、＄＄＄ｐ＜０．００１。ＨＳＡ、最高単剤モデル。
【図１６】エラフィブラノール（ＧＦＴ５０５、１ｍｇ／ｋｇ／日）及びＧＳ−０９７６（ＧＳ、３０ｍｇ／ｋｇ／日）はＮＡＳＨを有するマウス（ＣＤＦＦ食マウス）において協同して脂肪肝及び体重を低減することを示す図である。  （Ａ）脂肪肝等級、ＮＡＳＨ臨床研究ネットワーク指針に従った組織学的検査により評価される。  （Ｂ）肝臓トリグリセリド含有量  （Ｃ）対照と比べた８週間の処置後の体重減少  データは平均±ＳＤとして表される。ウェルチ補正付きの片側スチューデントｔ検定を使用して＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。ＨＳＡ、最高単剤モデル。
【実施例】
【０２０７】
［実施例１］  組合せ療法研究設計
材料及び方法
化合物はジメチルスリホキシド（ＤＭＳＯ、Ｆｌｕｋａ  カタログ番号４１６４０）に溶解した。
【０２０８】
１．ＴＧＦβ１−誘発ｈＨＳＣのモデルでの説明
ｈＨＳＣ培養
ヒト始原肝星細胞（ｈＨＳＣ）（ｉｎｎｏｐｒｏｔ）を、２％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  カタログ番号００１０）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  カタログ番号０５０３）及び星細胞成長補助剤（ＳｔｅＣＧＳ；ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  カタログ番号５３５２）を補充したＳＴｅＣＭ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  カタログ番号５３０１）で培養した。細胞培養フラスコは、接着をよくするためにポリ−Ｌ−リジン（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｐ４７０７）で被覆した。
【０２０９】
成分の調製
２つの成分組合せマトリックス
これらの実験では、チェッカーボードマトリックスを作成した。ＥＬＡ及び成分（ｉｉ）ストックは、９６ウェルプレートの横列（ＥＬＡ）での５ポイント系列及び縦列（成分（ｉｉ））での１１ポイント系列でＤＭＳＯに連続希釈した。続いて、５×１１組合せマトリックスは、すべての単剤濃度を１対１で混合することにより作成した。化合物ごとの試験濃度は、ＴＧＦ−β１で刺激を受けたＨＳＣモデルにおいてαＳＭＡ含有量を測定することにより得られる単剤としてのそれぞれの化合物のそれぞれのＩＣ５０に基づいて選択した。
【０２１０】
ＴＧＦ−β１を用いたｈＨＳＣの活性化及び化合物処理
ヒト原発性肝星細胞（ｈＨＳＣ）（Ｉｎｎｏｐｒｏｔ）は、上記の通り、標準条件下で培養した。続いて、細胞は、ＥＬＩＳＡによるαＳＭＡの測定のために９６ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルの密度で蒔いた。次の日、細胞培養培地を取り除き、細胞はＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号１４１９０）で洗浄した。ｈＨＳＣは、無血清及び無ＳｔｅＣＧＳ培地において２４時間枯渇させた。ＥＬＡ、成分（ｉｉ）及びそれぞれのＥＬＡ／成分（ｉｉ）組合せを用いた処置では、血清枯渇ｈＨＳＣは、化合物と一緒に１時間プレインキュベートし、続いて無血清及び無ＳｔｅＣＧＳ培地にさらに４８時間線維形成促進性刺激ＴＧＦ−β１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  カタログ番号１００−２１、１ｎｇ／ｍＬ）を添加した。
【０２１１】
αＳＭＡ  ＥＬＩＳＡ
αＳＭＡのレベルはサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。手短に述べれば、ＥＬＩＳＡプレートのウェルを先ず、４℃で一晩、捕捉抗体（マウスモノクローナル抗ＡＣＴＡ２、Ａｂｎｏｖａ）で被覆した。ＰＢＳ＋０．２％のＴｗｅｅｎ２０での３回洗浄後、ＰＢＳ＋０．２％のＢＳＡからなるブロッキング液を添加して１時間置き、続いて追加の洗浄サイクルにかけた。細胞可溶化物はウェルに移して、室温で２時間捕捉抗体に結合させた。洗浄手順の後、検出抗体（ビオチン化マウスモノクロール抗ＡＣＴＡ２、Ａｂｎｏｖａ）を室温で添加して２時間置き、続いて３回洗浄した。検出では、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  カタログ番号ＤＹ９９８）を先ず室温で３０分間適用させた。洗浄後、ＨＲＰ基質ＴＭＢ（ＢＤ、番号５５５２１４）を添加し、室温暗所で７分間インキュベートした。酸化させると、ＴＭＢは水溶性の青色反応生成物を形成し、これは硫酸の添加で黄色になり（溶解停止）、分光光度計を使用する４５０ｎｍでの強度の正確な測定が可能になる。発色は溶解物中に存在するα−ＳＭＡの量に正比例する。
【０２１２】
２．３Ｄヒト肝臓微細組織におけるＨＳＣ活性化のモデルでの説明
３Ｄヒト肝臓微細組織培養
凍結保存原発性ヒト肝細胞（ＩＰＨＨ＿１１）及び凍結保存原発性ヒト非実質細胞（ＮＰＣ、ＩＰＨＮ＿１１）はＢｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎＩＶＴから入手した。凍結保存原発性肝星細胞（ｈＨＳＣ）はＩｎｎｏｐｒｏｔから入手した。３Ｄ  ＩｎＳｉｇｈｔ（商標）ヒト肝臓微細組織（ＭＴ−０２−３０２−９５；ＩｎＳｐｈｅｒｏ  ＡＧ）は、９６ウェル懸滴培養プラットホーム（Ｇｒａｖｉｔｙ  ＰＬＵＳＴＭ）においてＩＰＨＨ＿１１、ＩＰＨＮ＿１１及びｈＨＳＣを用いて作製した。微細組織形成後、微細組織は微細組織特異的９６ウェル培養及びアッセイプラットホーム（Ｇｒａｖｉｔｙ  ＴＲＡＰＴＭ）に移した。さらなる維持及び化合物処理はＧｒａｖｉｔｙ  ＴＲＡＰＴＭプレートで実施した。組織形成後、３Ｄ微細組織は、加湿５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターにおいて３７℃で４日間、３Ｄ  ＩｎＳｉｇｈｔ（商標）ヒト肝臓維持培地−ＩＮＦ（ｈＬｉＭＭ  ＣＳ−０７−００１ｂ−０１；ＩｎＳｐｈｅｒｏ  ＡＧ）で維持した。培養培地の半分は２日ごとに補充した。
【０２１３】
組成物の調製：２つの成分組合せマトリックス
これらの実験では、チェッカーボードマトリックスを作成した。ＥＬＡ及び成分（ｉｉ）ストックは、９６ウェルプレートの横列（ＥＬＡ）での２ポイント系列及び縦列（成分（ｉｉ））での３ポイント系列でＤＭＳＯに連続希釈した。続いて、２×３組合せマトリックスは、すべての単剤濃度を１対１で混合することにより作成した。
【０２１４】
３Ｄ  ＩｎＳｉｇｈｔ（商標）ヒト肝臓微細組織の代謝刺激及び化合物処理
３Ｄ  ＩｎＳｉｇｈｔ（商標）ヒト肝臓微細組織（ＩｎＳｐｈｅｒｏ  ＡＧ）は、上記の通り、標準条件下で培養した。次に、微細組織は、無血清培地において２４時間枯渇させた。ＥＬＡ、成分（ｉｉ）及びそれぞれのＥＬＡ／成分（ｉｉ）組合せを用いた処置では、血清枯渇微細組織は、ＮＡＳＨ刺激の代謝誘発と化合物の両方で処置し（０日目）続いて３日目にＮＡＳＨ刺激の代謝誘発をさらに３日間更新した。Ｃｏｌ１α１の測定用の上澄みは６日目に収穫した。
【０２１５】
Ｃｏｌ１α１  ＥＬＩＳＡ
Ｃｏｌ１α１のレベルはサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。手短に述べれば、ＥＬＩＳＡプレートのウェルを先ず、室温で一晩、捕捉抗体（マウス抗ヒトプロコラーゲンｌα１捕捉抗体、「Ｅｌｉｓａプロコラーゲンｌα１／ＣＯＬＩＡ１」、ＤｕｏＳｅｔ  ＥＬＩＳＡ、Ｒ＆Ｄ、カタログ番号Ｎ°：ＤＹ６２２０−０５）で被覆した。ＰＢＳ＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０での３回洗浄後、ＰＢＳ＋１％のＢＳＡからなるブロッキング液を添加して１時間置き、続いて追加の洗浄サイクルにかけた。培養上澄みはウェルに移して、室温で２時間捕捉抗体に結合させた。洗浄手順の後、検出抗体（ビオチン化ヒツジ抗ヒトプロコラーゲンｌα１検出抗体）を室温で添加して２時間置き、続いて３回洗浄した。検出では、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンを先ず室温で２０分間適用させた。洗浄後、ＨＲＰ基質ＴＭＢ（ＢＤ、番号５５５２１４）を添加し、暗所で室温、２０分間インキュベートした。酸化されると、ＴＭＢは水溶性の青色反応産物を形成し、これは硫酸を添加すると黄色になり（溶解停止）、分光光度計を使用する４５０ｎｍでの強度の正確な測定が可能になる。発色は上澄みに存在するｃｏｌ１α１の量に正比例する。
【０２１６】
３．ＬＰＳ活性化マクロファージでの説明
ＴＨＰ−１単球のマクロファージへの分化
ＴＨＰ−１単球（ＥＣＡＣＣ  番号８８０８１２０１）を、１０％のＳＶＦを補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、２１８７５）中の３８４ウェルプレートにおいてウェルあたり２５５５０細胞の密度で播種し、ＰＭＡ（ホルボール  １２ミリステート  １３アセテート、Ｓｉｇｍａ、Ｐ８１３９）を使用して、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌで２４時間マクロファージに分化させた。
【０２１７】
組成物の調製：２つの成分組合せマトリックス
これらの実験では、チェッカーボードマトリックスを作成した。ＥＬＡ及び成分ストックは、他の化合物については９６ウェルプレートの横列（ＥＬＡ）での６ポイント系列及び縦列（成分）での１０ポイント系列でＤＭＳＯに連続希釈した。続いて、６×１０組合せマトリックスは、すべての単剤濃度を１対１で混合することにより作成した。
【０２１８】
化合物処理及びＬＰＳ刺激
ＰＭＡを用いた２４時間後、培地は取り除き、無血清ＲＰＭＩで置き換えた。ＥＬＡ、成分及びそれぞれのＥＬＡ／成分組合せを用いた処理では、血清枯渇ＴＨＰ−１マクロファージは化合物と一緒に２４時間プレインキュベートし、続いてリポ多糖ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ、大腸菌０５５Ｂ５、Ｓｉｇｍａ、Ｌ６５２９）をさらに添加して６時間置いた。
【０２１９】
ヒトＴＮＦα定量化
ヒトＴＮＦαは、ＦＲＥＴ技術に基づいて、ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）技術（Ｃｉｓｂｉｏ  ６２ＨＴＮＦＡＰＥＧ）を使用して上澄みにおいて定量化する。ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）は、近接している場合のドナーとアクセプターの２つのフルオロフォアの間でのエネルギー移動に基づいている。生体分子間の分子相互作用は、それぞれのパートナーを蛍光標識に結合させることにより及びエネルギー移動のレベルを検出する（６６５ｎｍ）ことにより評価することが可能である。細胞上澄み、試料又は標準は、ＨＴＲＦ（登録商標）試薬による検出のためにアッセイプレートに直接分注した。ＨＴＲＦドナー及びアクセプターで標識した抗体は予備混合し、単回分注ステップで添加した。シグナル強度は形成された抗原−抗体複合体の数に、したがって、ＴＮＦα濃度に比例している。７ポイント検量線（供給されたヒトＴＮＦαを用いて３９ｐｇ／ｍｌ〜２５００ｐｇ／ｍｌ）は、データを４パラメータロジスティックモデルを用いて適合させることにより得られた。
【０２２０】
４．脂肪負荷肝細胞（ＨｅｐＧ２）での説明
ＨｅｐＧ２培養
ヒト肝細胞癌を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号１０２７０）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号１５１４０）、１％のＭＥＮ  ＮＥＡＡ（Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号１１１４０）、１％のＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号２５０３０）及び１％のピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号１１３６０）を補充したＤＭＥＭ  ４．５ｇ／Ｌグルコース（Ｇｉｂｃｏ  カタログ番号３１０５３）で培養した。
【０２２１】
組成物の調製：２つの成分組合せマトリックス
これらの実験では、チェッカーボードマトリックスを作成した。ＥＬＡ及び成分ストックは、３８４ウェルプレートの横列（ＥＬＡ）での５ポイント系列及び縦列（成分）での１１ポイント系列でＤＭＳＯに連続希釈した。続いて、５×１１組合せマトリックスは、すべての単剤濃度を１対１で混合することにより作成した。
【０２２２】
遊離脂肪酸（ＦＦＡ）調製
オレイン酸（番号Ｏ１３８３）及びパルミチン酸（Ｐ０５００）はＳｉｇｍａから購入した。ＦＦＡストック液（１００ｍＭ）は８０℃、０．１ＭのＮａＯＨで調製した。４．５ｍＭのパルミチン酸／１０％のウシ胎仔血清（ＢＳＡ）及び９ｍＭのオレイン酸／１０％のＢＳＡの作業液は、５５℃水浴において適切な容積のストック液と１０％のＢＳＡ（無ＦＦＡ低内毒素；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｂｏｒｎｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を組み合わせる（１５分）ことにより調製した。
【０２２３】
脂肪負荷及び化合物処理
ＨｅｐＧ２は、脂肪滴含有量を評価するために、３８４ウェルプレートに４００００細胞／ウェルの密度で蒔いた。次の日、細胞培養培地は取り除き、細胞はＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号１４１９０）で洗浄した。ＨｅｐＧ２は無血清培地において２４時間枯渇させた。ＥＬＡ、成分及びそれぞれのＥＬＡ／成分組合せを用いた処理では、血清枯渇ＨｅｐＧ２は化合物と一緒に２４時間プレインキュベートし、続いてオレイン酸：パルミチン酸混合物（２対１）を最終濃度０．５ｍＭでさらに添加して２４時間置いた。
【０２２４】
細胞内脂肪滴の測定
細胞内脂肪滴含有量を測定するため、細胞を室温に至らせ４０μｌのＰＢＳで洗浄した。細胞は、４０μｌの希釈Ａｄｉｐｏｒｅｄ試薬（２００μＬのＰＢＳあたり２．５μＬのＡｄｉｐｏｒｅｄ試薬）（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）と一緒に室温で３０分間インキュベートした。蛍光分光器（Ｓｐａｒｋ  Ｔｅｃａｎ  カタログ番号３００８６３７６  ＳＮ番号１８０１００２７４５）を使用して相対蛍光を測定した（ｋ励起４８３ｎｍで、ｋ放出５８０ｎｍで）。分析は４通り実施した。
【０２２５】
５．３Ｄ  Ｈｕｈ７  スフェロイド培養での説明
３Ｄ  Ｈｕｈ７  スフェロイド培養
凍結保存Ｈｕｈ７はＥＣＡＣＣから購入した。細胞は、加湿５％ＣＯ２細胞培養インキュベーターにおいて３７℃、ＵＬＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）、１０％のＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するウィリアムズ培地（Ｓｉｇｍａ）で生育した。細胞は５日以内に凝集しスフェロイドを形成した。
【０２２６】
組成物の調製：２つの成分組合せマトリックス
これらの実験では、チェッカーボードマトリックスを作成した。ＥＬＡ及び成分（ｉｉ）ストックは、９６ウェルプレートの横列（ＥＬＡ）での２ポイント系列及び縦列（成分（ｉｉ））での３ポイント系列でＤＭＳＯに連続希釈した。続いて、２×３組合せマトリックスは、すべての単剤濃度を１対１で混合することにより作成した。
【０２２７】
３Ｄ  Ｈｕｈ７  スフェロイド培養の代謝刺激及び化合物処理
３Ｄ  Ｈｕｈ７  スフェロイドは、上記の通り、標準条件下で培養した。次に、３Ｄ  Ｈｕｈ７  スフェロイドは、無血清培地において２４時間枯渇させた。ＥＬＡ、成分（ｉｉ）及びそれぞれのＥＬＡ／成分（ｉｉ）組合せを用いた処置では、血清枯渇スフェロイドは、代謝ＮＡＳＨ刺激と化合物の両方で処理し（０日目）続いて４日目に代謝ＮＡＳＨ刺激及び化合物をさらに３日間更新した。スフェロイドは７日目に脂肪蓄積のために染色した。
【０２２８】
脂質染色＆定量化
細胞内脂質蓄積はＡｄｉｐｏＲｅｄ（商標）アッセイ試薬（Ｌｏｎｚａ）を使用して定量化した。スフェロイドは、蛍光プレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を使用して、λｅｘｃ：４８５ｎｍ及びλｅｍ：５７２ｎｍで蛍光アッセイ定量化に供した。
【０２２９】
結果及び考察
分化した筋線維芽細胞の異常な持続性は多くの線維性疾患の特徴である。肝損傷に続いて、静止状態ＨＳＣは（αＳＭＡ）陽性筋線維芽細胞への分化を特徴とする活性化の過程を経る。ＰＰＡＲアゴニストエラフィブラノールは、線維形成促進性サイトカインＴＧＦβ１で活性化されたｈＨＳＣにおいて抗線維形成活性を有する（図９）。驚くべきことに、ＭＳＤＣ−０６０２、ＰＸＳ−４７２８、アパラレノン、ＣＦ−１０２（ナモデノソン）、ビスモデギブ、ＰＢＩ−４０５０、エムリカサン、ＤＵＲ−９２８、ＶＫ−２８０９又はＫＤ−０２５とエラフィブラノールの組合せは、ＨＳＣによるαＳＭＡ産生を相乗的に阻害したことを本明細書では明らかにしている（図９）。
【０２３０】
肝臓は異なる細胞型（肝細胞、免疫細胞、ＨＳＣ…）で構成されているので、及びＨＳ活性化は他の肝細胞が関与する異なる刺激から生じることが可能なので、線維症に対する組合せ処理を試験するために肝臓微細組織モデルも用いた。代謝ＮＡＳＨ刺激を用いた処理により微細組織によるコラーゲン産生が増加した。このモデルでは、エラフィブラノールはＣＰ−６４０１８６、ＧＳ−０９７６及びナルメフェンと協同してコラーゲンモデルを生成した（図１０）。
【０２３１】
まとめると、これらの結果は、エラフィブラノールとＭＳＤＣ−０６０２、ＰＸＳ−４７２８、アパラレノン、ＣＦ−１０２（ナモデノソン）、ビスモデギブ、ＰＢＩ−４０５０、エムリカサン、ＤＵＲ−９２８、ＶＫ−２８０９、ＫＤ−０２５、ＣＰ−６４０１８６、ＧＳ−０９７６又はナルメフェン（ＪＫＢ−１２１）の組合せの相乗的抗線維化効果を示している。
【０２３２】
ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨのような代謝性疾患は軽度の炎症を伴う。免疫細胞が活性化されると、肝臓及び末梢器官（脂肪組織、膵臓…）の代謝機能を変えるサイトカインが産生される。腸浸透性は、代謝性疾患及び肝疾患に記載されているが、肝臓及び末梢器官（脂肪組織）においてマクロファージを活性化する循環細菌成分（リポ多糖又はＬＰＳ）を増加させる。ＰＰＡＲは抗炎症活性を有するので、エラフィブラノールと他の化合物がＬＰＳによるマクロファージ活性化を阻害できるかどうかを本発明者らは調べた。マクロファージに分化するＴＨＰ１単球のモデルでは、ＴＮＦα分泌により測定した場合、ＬＰＳ処理はマクロファージを活性化する。エラフィブラノール（１μＭ）単独だとＴＮＦαを２１％阻害した（図１１）。驚くべきことに、エラフィブラノールとゲムカベンの組合せはＴＮＦα分泌を５０％強力に阻害した（図１１）。したがって、この結果は、エラフィブラノールが他の化合物と協同してＮＡＳＨ及び代謝性疾患を含む、多くの疾患において観察される炎症性傾向を低減する能力を明らかにしている。
【０２３３】
ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨは肝細胞（脂肪肝）における原発性脂肪蓄積を特徴とし、この蓄積は脂肪毒性を誘発し、炎症、細胞死、組織リモデリング及び最終的に線維症をもたらす。ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲδは脂肪酸化を誘発し新規の脂肪合成を阻害することが分かっているので、他の化合物と組み合わせたエラフィブラノールが肝細胞での脂肪蓄積を妨げることができるかどうかを確かめることを本発明者らは望んだ。したがって、ＨｅｐＧ２細胞を遊離脂肪酸（ＦＦＡ）で処理して脂肪滴の蓄積を誘発した。このモデルでは、エラフィブラノール（１０μＭ）単独で脂肪蓄積を２０％低減した。思いがけないことに、エラフィブラノールをＣＰ−６４０１８６、ＶＫ−２８０９、アパラレノン又はアラムコールに組み合わせると、低減は４０％に到達した（図１２）。肝細胞の三次元（３Ｄ）ビトロモデルも用いてこの問題に取り組み、肝臓構造のもっと多くの生理的再生を可能にした。このモデルでは、脂肪蓄積は代謝的ＮＡＳＨ刺激を用いた処理によって得られた。エラフィブラノール（３μＭ）は脂肪含有量を１２％低減した（図１３）。エラフィブラノールをＭＧＬ−３１９６（１μＭ）と組み合わせると、肝細胞脂質含有量は２８％強力に低減し（図１３）、両方の薬物が一緒に使用された場合には相乗効果を示した。
【０２３４】
まとめると、これらの結果は、エラフィブラノールがＣＰ−６４０１８６、ＶＫ−２８０９、アパラレノン、アラムコール及びＭＧＬ−３１９６と協同して特に脂肪肝を低減することを明らかにしている。
【０２３５】
結論として、これらの結果は、エラフィブラノールがＭＳＤＣ−０６０２、ＰＸＳ−４７２８、アパラレノン、ＣＦ−１０２（ナモデノソン）、ビスモデギブ、ＰＢＩ−４０５０、エムリカサン、ＤＵＲ−９２８、ＫＤ−０２５、ＣＰ−６４０１８６、ＧＳ−０９７６、ナルメフェン（ＪＫＢ−１２１）、ＶＫ−２８０９、ＭＧＬ−３１９６及びアラムコールと協同して特にＮＡＦＬＤを低減する能力を明らかにしている。
【０２３６】
［実施例２］  ＥＬＡとＯＣＡの組合せ
材料及び方法
慢性ＣＤＡＡ＋１％のコレステロールモデルにおけるエラフィブラノール、ＯＣＡ及び組合せエラフィブラノール＋ＯＣＡの評価（１２週間）
エラフィブラノール単独、ＯＣＡ単独及び両方の組合せの予防効果を、ＣＤＡＡ＋１％コレステロール食を与えられたラットの線維化ＮＡＳＨモデルにおいて評価した。１５０〜１７５ｇのオスウィスターラットに、対照（ＣＳＡＡ）食、ＣＤＡＡ＋１％コレステロール食又はエラフィブラノール１、３及び１０ｍｇ／ｋｇ／日、ＯＣＡ１０及び３０ｍｇ／ｋｇ／日若しくは組合せ薬（エラフィブラノール１、３及び１０ｍｇ／ｋｇ／日をＯＣＡ１０ｍｇ／ｋｇ／日に組み合わせた）を補充したＣＤＡＡ＋１％コレステロール食を１２週間与えた。
【０２３７】
体重及び食物摂取量は週２回モニターした。処置の最終日、ラットは６時間の断食期間後屠殺した。生化学的及び組織学的研究のため肝臓を速やかに切除した。
【０２３８】
すべての動物手順は、標準プロトコルに従って及び実験動物の適切な管理と使用のための標準的な勧告の通りに実施した。
【０２３９】
組織学
組織包埋及び切片化：
肝臓切片は先ずホルマリン４％液中１２時間固定した。次に、肝臓片はＰＢＳで３０分間洗浄し、エタノール液（７０、８０、９５及び１００％エタノールの連続浴槽）中で脱水した。肝臓片はキシレンの３つの異なる浴槽（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号５３４０５６）、続いて液体パラフィン（５６℃）の２つの浴槽でインキュベートした。次に、肝臓片はＨｉｓｔｏｗａｘ（登録商標）で穏やかに満たされたラック中に入れ組織を完全に覆った。
【０２４０】
組織片を含有するパラフィンブロックはラックから取り除き、室温で保存した。肝臓塊は３μｍ薄片に切断した。
【０２４１】
ヘマトキシリン／エオシン染色
肝臓切片は、マイヤーヘマトキシリン液（Ｍｉｃｒｏｍ、カタログ番号Ｆ／Ｃ０３０３）中で脱パラフィンし、再水和し、３分間インキュベートした。次に、肝臓切片は水ですすぎ、エオシンＧ（ＶＷＲ、カタログ番号１．０９８４４．１０００）中１分間インキュベートした。切片は水ですすぎ、次に、脱水して、ＣＶ  Ｍｏｕｎｔ培地（Ｌｅｉｃａ、カタログ番号１４０４６４３００１１）を使用してマウントした。
【０２４２】
ピクロシリウスレッド染色
肝臓切片は、０．５％酢酸（Ｐａｎｒｅａｃ、カタログ番号１３１００８．１６１１）の浴ですすぐ前に、Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＣＦ０．１％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ７２５８）の溶液中で脱パラフィンし、再水和し、１５分間インキュベートした。次に、肝臓切片は水ですすぎ、飽和水性ピクリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ６７４４）中０．１％シリウスレッド（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｄ８０、Ｆｌｕｋａ  カタログ番号４３６６５）の溶液中３０分間インキュベートした。次に切片は脱水し、ＣＶ  Ｍｏｕｎｔ培地（Ｌｅｉｃａ、カタログ番号１４０４６４３００１１）を使用してマウントした。
【０２４３】
組織学的検査
それぞれの肝臓検体の供給源に盲検の専門家が組織学的検査を実施した。バーチャルスライドは、３Ｄ  ＨｉｓｔｅｃｈからＰａｎｎｏｒａｍｉｃ  ２５０スキャナーを使用して作成した。動物ごとに、ＮＡＳＨの主な組織病変を要約するスコアは、ＮＡＳＨ臨床研究ネットワーク（Ｋｌｅｉｎｅｒ  ２００５年、Ｂｒｕｎｔ  １９９９年）に従って帰属させた。手短に述べれば、脂肪肝、小葉性炎症及び肝細胞バルーニングをスコア化した。ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳスコア）は、脂肪肝（０〜３）、小葉性炎症（０〜３）及びバルーニング（０〜２）損傷等級付けの非加重合計として個体ごとに確立した。
【０２４４】
Ｑｕａｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒソフトウェア（３Ｄ  Ｈｉｓｔｅｃｈ、Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｑｕａｎｔ及びＨｉｓｔｏ  Ｑｕａｎｔモジュールを含む）を使用して、コラーゲン染色領域を定量化した。手短に述べれば、Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｑｕａｎｔを使用して組織を検出しその表面を測定した。次に、カラー閾値法に基づいて、Ｈｉｓｔｏ  Ｑｕａｎｔを使用して染色コラーゲン含有量を検出しその表面を測定した。次に、線維症領域は、動物ごとのコラーゲン表面の全組織に対するパーセントとして表した。
【０２４５】
肝臓コラーゲン含有量の測定
肝臓コラーゲン含有量は、適切なＱｕｉｃｋＺｙｍｅキット（Ｔｏｔａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｓｓａｙ、カタログ番号ＱＺＢ−ｔｏｔｃｏｌ２）を使用して測定した。アッセイはヒドロキシプロリンの検出に基づいており、これは主にコラーゲンの３重らせんに見出される非タンパク質原性アミノ酸である。したがって、組織加水分解物中のヒドロキシプロリンは組織中に存在するコラーゲンの量の直接的尺度として使用可能である（プロコラーゲン、成熟コラーゲン及びコラーゲン分解産物の区別なし）。
【０２４６】
ヒドロキシプロリンを投薬する前には、９５℃、６ＭのＨＣｌ中での組織試料の完全加水分解が必要である。アッセイにより、５７０ｎｍでの最大吸光度を有する色素原が生成する。結果は、肝臓１ｇあたりのｍｇコラーゲンとして表される。
【０２４７】
アルファ２マクログロブリン（α２Ｍ）
α２Ｍの血漿濃度は、Ａｂｃａｍキット（カタログ番号ａｂ１５７７３０）を製造業者の説明書に従って使用して測定した。手短に述べれば、マイクロプレートにラットα２Ｍに特異的である抗体をプレコートする。次に、標準、対照及び試料をピペットでウェルに移し、血漿中に存在するα２Ｍはいずれも固定された抗体が結合する。洗浄後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識二次抗体をウェルに添加する。洗浄に続いて、基質溶液をウェルに添加する。酵素反応は停止液を添加することにより停止させる。４５０ｎｍで測定した色の強度は最初のステップで結合したα２Ｍの量に比例している。次に、試料値は検量線から推定する。結果はｎｇ／ｍＬで表される。
【０２４８】
プロコラーゲンＩＩＩ  Ｎ終端プロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）
ＰＩＩＩＮＰの血漿濃度は、Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ  Ｃｏｒｐ社製のＥＬＩＳＡアッセイ（カタログ番号ＳＥＡ５７３Ｒａ）を製造業者の説明書に従って使用して測定した。マイクロタイタープレートにＰＩＩＩＮＰに特異的な抗体をプレコートする。標準又は試料を、ＰＩＩＩＮＰに特異的なビオチンコンジュゲート抗体と一緒に適切なマイクロタイタープレートウェルに添加する。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたアビジンをそれぞれのマイクロプレートウェルに添加しインキュベートする。ＴＭＢ基質溶液を添加した後、ＰＩＩＩＮＰ、ビオチンコンジュゲート抗体及び酵素コンジュゲートアビジンを含有するウェルのみが色の変化を示す。酵素基質反応は硫酸溶液の添加により終了させ、色の変化は４５０ｎｍ±１０ｎｍの波長で分光光度的に測定する。次に試料中のＰＩＩＩＮＰの濃度は、試料のＯＤを標準曲線と比較することにより測定する。結果はｐｇ／ｍＬで表される。
【０２４９】
肝臓遺伝子発現の分析
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用して、ラット肝臓から単離した。全ＲＮＡは、１×ＲＴバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５ｍＭのＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１８ｍＭのｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２００ｎｇのｐｄＮ６（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び３０ＵのＲＮアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でＭ−ＭＬＶ  ＲＴ（モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２８０２５）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。
【０２５０】
次に、ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、定量的ＰＣＲを実行した。手短に述べれば、ＰＣＲ反応は、以下のプライマー配列を使用して、１μＬの逆転写反応、０．５μＬのリバース及びフォワードプライマー（それぞれ１０ｐｍｏｌ）、並びに１２．５μｌの２×  ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）を含有する２５μｌの全容積中、９６−ＷＰフォーマットにおいて実施した。
【０２５１】
【表１】
2020517621.tif 000007
【０２５２】
発現レベルは、試料中の参照のハウスキーピング遺伝子としてＲＰＬＰ０遺伝子の発現を使用して正規化した。遺伝子ごとに、ＰＣＲ反応効率を１００％に近づけ相関係数を１に近づけるために最良点（少なくとも３点）を選択することにより検量線を描いた。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子と標的遺伝子の両方について検量線方程式を使用して測定した（それぞれの標的遺伝子の特定のＰＣＲ効率を考慮して）。
【０２５３】
結果及び考察
結果は以下の表に及び図１〜５に報告する。
【０２５４】
【表２】
2020517621.tif 000008
【０２５５】
西洋の生活様式は、多くの場合肝線維症及び肝硬変症にまで進行し、最終的には肝細胞癌をもたらす場合がある慢性肝疾患である非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の高い発生率と常に連動している。現在、ＮＡＳＨには承認された療法はない。複数の治療標的に同時に向けられる薬物組合せは、薬物応答を劇的に改善し最も広い患者集団のためになる潜在力がある。薬物組合せは以前、高血圧、脂質異常、又は２型糖尿病のような他の全身性疾患において試験され、基礎疾患のより優れた管理を示し、罹患率及び死亡率を減少した。最近のフェーズ２Ｂ研究では、エラフィブラノール（ＰＰＡＲα／δアゴニスト）とＯＣＡ（ＦＸＲアゴニスト）の両方がＮＡＳＨ及び線維症エンドポイントに有効性を示した。本発明者らは、関連するＮＡＳＨ病理結果に関してその作用を比較し、組合せの治療効果を探すことを望んだ。
【０２５６】
この目的を達成するため、コレステロールを補充したコリン欠乏アミノ酸置換食（ＣＤＡＡ／ｃｈｏｌ食）をウィスターラットに与えることにより、ＮＡＳＨ組織像及び線維症を誘発した。介在群の動物は、全研究期間、エラフィブラノール若しくはＯＣＡのいずれか又は両方の化合物を受けた。ＮＡＳＨ及び線維症発症は組織像により評価した。追加の生化学的分析及び分子分析も異なる適切なバイオマーカーで実施した。
【０２５７】
ＣＤＡＡ／ｃｈｏｌ食で飼われたウィスターラットはＮＡＳＨ関連組織像及び重症の高浸透線維症を発症した。進行した脂肪肝、小葉性炎症及びバルーニングがすべての動物に存在しＮＡＳスコアは６〜８で変動した。肝臓組織像（ピクロシリウス陽性領域）及び生化学（肝臓コラーゲン濃度）は、肝線維症含有量の平均で４倍の増加を示し、線維症スコアは薬物処置を受けなかったＣＤＡＡ／ｃ食の動物すべてで３又は４であった。炎症、酸化ストレス、組織リモデリング及び線維症に関連する遺伝子の発現は増加し、重症のＮＡＳＨ患者で以前報告された遺伝子シグネチャーと一致していた。
【０２５８】
エラフィブラノール及びＯＣＡ投与単独だと、線維症発症の極めて顕著な減衰を生じた。両方の化合物を受けた動物では線維症に対する類似する有効性が観察されたが、有意に低い用量であった。肝細胞の損傷は、バルーニングによって判断した場合、エラフィブラノールにより用量依存的様式で予防された又は減弱された。代わりに、ＯＣＡは、本研究で使用された用量では部分的なバルーニング減弱を示しただけであった。小葉性炎症は、エラフィブラノールにより用量依存的様式で減弱され、ＯＣＡでは減弱の程度はもっと少なかった。最後に、どちらかの薬物候補単独の投与は、組織リモデリング、炎症及び酸化ストレスマーカーの増加を部分的に減弱し、両方の化合物の組合せは、いずれの単剤と比べても効果は高かった。
【０２５９】
したがって、ＣＤＡＡ／ｃ食誘発ＮＡＳＨモデルにおける肝線維症に対するエラフィブラノールとＯＣＡの相乗作用により、いずれの単剤と比べても、両方の薬物候補の有意に低い用量で匹敵する治療効果が生じたことが本明細書で明らかにされている。本研究から、両方の薬物候補の用量は、個別に使用されるそれぞれの化合物の最初の用量に類似する結果を得るのに、少なくとも１．５、２、２．５の係数で又は少なくとも３の係数でさえ減らすことが可能であると確実に予測される。さらに、エラフィブラノールは、肝臓損傷に対して明白な保護効果を示した。バルーニング及び小葉性炎症に対するＯＣＡの効果はこのモデルでは幾分控え目であった。この研究から、エラフィブラノール／ＯＣＡ組合せはより広範な患者集団の役に立ち、関連する治療用量低下は薬物副作用の発生を減少すると結論付けることが可能である。
【０２６０】
［実施例３］  ＥＬＡとＣＶＣの組合せ
材料及び方法
化合物はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、Ｆｌｕｋａ、カタログ番号４１６４０）に溶解した。ＣＶＣはＣＬＩＮＩＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｒｅｆ：Ａ１３６４３−１０、バッチ番号：４９７２２３−２５−３）から購入した。ベザフィブラートはＧｅｎｆｉｔで合成した。
【０２６１】
ｈＨＳＣ培養
ヒト原発性肝星細胞（ｈＨＳＣ）（Ｉｎｎｏｐｒｏｔ）を、２％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  カタログ番号００１０）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  カタログ番号０５０３）及び星状細胞成長栄養補助剤（ＳｔｅＣＧＳ；ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  カタログ番号５３５２）を補充したＳＴｅＣＭ培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ  カタログ番号５３０１）で培養した。細胞培養フラスコは付着をよくするためにポリ−Ｌリジン（Ｓｉｇｍａ  カタログ番号Ｐ４７０７）で被覆した。
【０２６２】
成分の調製
２つの成分組合せマトリックス（エラフィブラノール／ＣＶＣ）
これらの実験では、チェッカーボードマトリックスを作成した。ＣＶＣ及びエラフィブラノールストックは、９６ウェルプレートの横列（エラフィブラノール）での５ポイント系列及び縦列（セニクリビロク）での６ポイント系列でＤＭＳＯに連続希釈した。続いて、６×７組合せマトリックスは、すべての単剤濃度を１対１で混合することにより作成した。化合物ごとの試験濃度は、ＴＧＦ−β１で刺激したＨＳＣモデルにおいてαＳＭＡ含有量を測定することにより得られる単剤としてのそれぞれの化合物のそれぞれのＩＣ５０に基づいて選択した。
【０２６３】
ＴＧＦ−β１を用いたｈＨＳＣの活性化及び化合物処理
ヒト原発性肝星細胞（ｈＨＳＣ）（Ｉｎｎｏｐｒｏｔ）は、上記の通り、標準条件下で培養した。続いて、細胞は、ＥＬＩＳＡによるαＳＭＡの測定のために９６ウェルプレートに２×１０４細胞／ウェルの密度で蒔いた。
【０２６４】
次の日、細胞培養培地を取り除き、細胞はＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  カタログ番号１４１９０）で洗浄した。ｈＨＳＣは、無血清及び無ＳｔｅＣＧＳ培地において２４時間枯渇させた。ＣＶＣ、エラフィブラノール、ベザフィブラート並びにＣＶＣ／エラフィブラノール及びＣＶＣ／ベザフィブラートの対での組合せを用いた処置では、血清枯渇ｈＨＳＣは、化合物と一緒に１時間プレインキュベートし、続いて無血清及び無ＳｔｅＣＧＳ培地にさらに４８時間線維形成促進性刺激ＴＧＦ−β１（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  カタログ番号１００−２１、１ｎｇ／ｍＬ）を添加した。
【０２６５】
αＳＭＡ  ＥＬＩＳＡ
αＳＭＡのレベルはサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して測定した。手短に述べれば、ＥＬＩＳＡプレートのウェルを先ず、４℃で一晩、捕捉抗体（マウスモノクローナル抗ＡＣＴＡ２、Ａｂｎｏｖａ）で被覆した。ＰＢＳ＋０．２％のＴｗｅｅｎ２０での３回洗浄後、ＰＢＳ＋０．２％のＢＳＡからなるブロッキング液を添加して１時間置き、続いて追加の洗浄サイクルにかけた。細胞可溶化物はウェルに移して、室温で２時間捕捉抗体に結合させた。洗浄手順の後、検出抗体（ビオチン化マウスモノクロール抗ＡＣＴＡ２、Ａｂｎｏｖａ）を室温で添加して２時間置き、続いて３回洗浄した。検出では、ＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジン（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ  カタログ番号ＤＹ９９８）を先ず室温で３０分間適用させた。洗浄後、ＨＲＰ基質ＴＭＢ（ＢＤ、番号５５５２１４）を添加し、暗所で室温、７分間インキュベートした。酸化されると、ＴＭＢは水溶性の青色反応産物を形成し、これは硫酸を添加すると黄色になり（溶解停止）、分光光度計を使用する４５０ｎｍでの強度の正確な測定が可能になる。発色は可溶化液に存在するαＳＭＡの量に正比例する。
【０２６６】
エクセスオーバーブリス（ＥＯＢ）法による相乗作用の測定
αＳＭＡ  ＥＬＩＳＡアッセイで得られた値は、先ずＴＧＦ−β１対照に対するパーセント阻害に変換した。次に、これらのパーセント阻害を使用して、ＥＯＢ（エクセスオーバーブリス）を測定して薬剤組合せの相乗効果を明確にした。予測されるブリスアディティビズムスコア（Ｅ）は第一に式：
Ｅ＝（Ａ＋Ｂ）−（Ａ×Ｂ）により測定し、Ａ及びＢは所与の用量でのエラフィブラノール（Ａ）（又はベザフィブラート）及びセニクリビロク（Ｂ）のパーセント阻害である。同じ用量での組合せＣＶＣ／エラフィブラノール（又はベザフィブラート）のブリス予測と観測された阻害の差は「エクセスオーバーブリス」スコアである。
【０２６７】
・エクセスオーバーブリススコア＝０は、組合せ処置が相加的であることを示している（独立した経路効果について予測される通り）
・エクセスオーバーブリススコア＞０は、相加的よりも大きな活性を示している（相乗的）；及び
・エクセスオーバーブリススコア＜０は、組合せが相加的よりも低いことを示している（拮抗的）。
【０２６８】
組合せエラフィブラノール＋ＣＶＣ及びベザフィブラート＋ＣＶＣでは、付加的な全ブリススコアはすべてのＥＯＢの合計により計算した。
【０２６９】
相乗作用を確認するため、ＣＶＣ／エラフィブラノール組合せについてのトップＥＯＢスコアに応じた実験値は棒グラフにプロットした。
【０２７０】
最高単剤に対するＣＶＣ／エラフィブラノール又はＣＶＣ／ベザフィブラートの間の観察された差の有意性は、スチューデントｔ検定によって測定した。［＊：ｐ＜０．０５；＊＊：ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１］
【０２７１】
結果及び結論：
分化した筋線維芽細胞の異常な持続性は多くの線維性疾患の特徴である。
肝損傷に続いて、静止状態のＨＳＣは、（α−ＳＭＡ）陽性筋線維芽細胞への分化を特徴とする活性化の過程を経る。
【０２７２】
ＰＰＡＲアゴニストエラフィブラノールは、線維形成促進性サイトカインＴＧＦβ１で活性化したｈＨＳＣにおける抗線維化活性を明らかにしている。αＳＭＡマーカーは８０％低減され、ＩＣ５０は３．１７μＭであった（図６Ａ）。しかし、ベザフィブラートのような他のＰＰＡＲアゴニストは弱い抗線維化プロファイルを示し（図６Ｃ）、その抗線維化特性に関してＰＰＡＲアゴニストは同じではないことが示唆される。ＣＶＣ単独だと、ＴＧＦβ活性化ＨＳＣにおいてすべての用量で有意な効果を示さなかった（図６Ｂ）。エラフィブラノールとＣＶＣの組合せが線維症を相乗的様式で低減することができるかどうかを評価するため、組合せマトリックス実験をＴＧＦβ誘発ＨＳＣにおいて実施した。手短に述べれば、ＣＶＣとエラフィブラノール溶液を、エラフィブラノール／ＣＶＣ比の大きなパネルをカバーする４２の組合せマトリックスを作成するチェッカーボードフォーマットで連続希釈した。相乗作用は先ずエクセスオーバーブリススコアを計算することにより判定した。これらの実験により、エラフィブラノールがＣＶＣと協同して、活性化されたＨＳＣにおいてαＳＭＡ産生を低減することができることが明らかにされた（図７Ａ及び７Ｂ）。相乗作用の最良の例の１つは、それぞれの化合物を５μＭ用いた図７Ｃに示されている。５μＭのＣＶＣ単独だといかなる抗線維化活性も示さないが、５μＭのエラフィブラノールにそれを添加するとエラフィブラノールの活性を相乗的様式で有意に増加することができ、６０％の阻害まで到達した（５μＭのエラフィブラノールでの４０％と比べて）。これとは対照的に、ＣＶＣとベザフィブラートの組合せは、ずっと低いＥＯＢスコアを明らかにし（図８Ａ及び８Ｂ）、組合せのどれも統計的に有意な結果が得られなかった。
【０２７３】
結論として、出願者は、ＥＬＡとＣＶＣの組合せに思いがけない抗線維化活性を発見した。これらの結果により、式（Ｉ）の化合物とＣＶＣの組合せが相乗的であり、線維性疾患のような複数のタイプの疾患において治療効果を提供できることが示唆される。
【０２７４】
［実施例４］  エラフィブラノールとセロンセルチブ（ＳＥＬ）、ＧＫＴ−８３１又はＧＳ−０９７６（ＧＳ）の組合せ：マウス線維化ＮＡＳＨモデルでの評価（８週間）
エラフィブラノールとセロンセルチブ、ＧＫＴ−８３１又はＧＳ−０９７６の組合せの予防効果を、２％のコレステロール、３０％の乳脂肪食を補充したコリン欠乏アミノ酸置換食（ＣＤＡＡ）、及び飲料水中高フルクトースコーンシロップ５５（最終濃度４２ｇ／Ｌについて５５％のフルクトース／４５％のグルコース）（Ｍｅｌｌｓら、Ｊ  Ｎｕｔｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２０１５年）（ＣＤＦＦ食）を与えたマウスで評価した。生後５〜６週間のオスＣ５７ＢＩ／６Ｊマウスに、対照（ＣＳＡＡ）食（ｎ＝４）、ＣＤＦＦ（ｎ＝１２）又はエラフィブラノール（１又は３ｍｇ／ｋｇ／日）、セロンセルチブ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）、ＧＫＴ−８３１（６０ｍｇ／ｋｇ／日）若しくはＧＳ−０９７６（１０ｍｇ／ｋｇ／日）単独で又は組み合わせて補充したＣＤＦＦ（群あたりｎ＝８）を８週間与えた。
【０２７５】
体重、食物及び水摂取量は週あたり２回モニターした。処置の最終日、血漿試料を後眼窩採血から得て、マウスは６時間の断食期間後屠殺した。生化学的及び組織学的研究のため肝臓を速やかに切除した。すべての動物手順は、標準プロトコルに従って及び実験動物の適切な管理と使用のための標準的な勧告の通りに実施した。
【０２７６】
組織学
組織包埋及び薄片作製
肝臓薄片はホルマリン４％液で固定した。次に、肝臓片はＰＢＳ中で３０分間洗浄し、エタノール液で脱水した（７０、８０、９５及び１００％エタノールでの連続浴）。肝臓片はキシレン（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ  カタログ番号５３４０５６）の３つの異なる浴で、続いて液体パラフィン中２つの浴（５９℃）でインキュベートした。次に、肝臓片は、組織を完全に覆うためにＨｉｓｔｏｗａｘ（登録商標）で穏やかに満たしたラックに入れた。
【０２７７】
組織片を含有するパラフィンブロックをラックから取り出し、室温で保存した。肝臓ブロックは３μｍの薄片に切り分けた。
【０２７８】
ヘマトキシリン／エオシン／サフラニン染色
肝臓切片は、マイヤーヘマトキシリン液（Ｍｉｃｒｏｍ、カタログ番号Ｆ／Ｃ０３０３）中で脱パラフィンし、再水和し、３分間インキュベートした。次に、肝臓切片は水ですすぎ、エオシンＹ  ０．５％アルコール入り（ＶＷＲ、カタログ番号１．０２４３９．０５００）及びエリスロシン０．５％液（ＶＷＲ、カタログ番号１．１５９３６．００１０）中１分間インキュベートし、エタノールですすいだ。次に、切片はサフラニン中２分間インキュベートし、最終的に、脱水して、ＣＶ  Ｍｏｕｎｔ培地（Ｌｅｉｃａ、カタログ番号０４６４３００１１）を使用してマウントした。
【０２７９】
ピクロシリウスレッド染色
肝臓切片は、０．５％酢酸（Ｐａｎｒｅａｃ、カタログ番号１３１００８．１６１１）の浴ですすぐ前に、Ｆａｓｔ  Ｇｒｅｅｎ  ＦＣＦ０．１％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｆ７２５８）の溶液中で脱パラフィンし、再水和し１５分間インキュベートした。次に、肝臓切片は水ですすぎ、飽和水性ピクリン酸（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｐ６７４４）中０．１％のシリウスレッド（Ｄｉｒｅｃｔ  Ｒｅｄ  ８０、Ｆｌｕｋａ  カタログ番号４３６６５）の溶液中で３０分間インキュベートした。次に、切片は脱水して、ＣＶ  Ｍｏｕｎｔ培地（Ｌｅｉｃａ、カタログ番号１４０４６４３００１１）を使用してマウントした。
【０２８０】
組織学的検査
それぞれの肝臓標本の供給源に盲検の技術者が組織学的検査を実施した。バーチャルスライドは、３Ｄ  Ｈｉｓｔｅｃｈ社製のＰａｎｎｏｒａｍｉｃ２５０スキャナーを使用して作製した。動物ごとに、ＮＡＳＨの主な組織病変を要約するスコアは、ＮＡＳＨ臨床研究ネットワーク（Ｋｌｅｉｎｅｒ  ２００５年、Ｂｒｕｎｔ  １９９９年）に従って帰属させた。手短に述べれば、脂肪肝、小葉性炎症及び肝細胞バルーニングをスコア化した。ＮＡＦＬＤ活性スコア（ＮＡＳ）は、脂肪肝（０〜３）、小葉性炎症（０〜３）及びバルーニング（０〜２）損傷等級付けの非加重合計として個体ごとに確立した。
【０２８１】
Ｑｕａｎｔ  Ｃｅｎｔｅｒソフトウェア（３Ｄ  Ｈｉｓｔｅｃｈ、Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｑｕａｎｔ及びＨｉｓｔｏ  Ｑｕａｎｔモジュールを含む）を使用して、コラーゲン染色領域を定量化した。手短に述べれば、Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｑｕａｎｔを使用して組織を検出しその表面を測定した。次に、カラー閾値法に基づいて、Ｈｉｓｔｏ  Ｑｕａｎｔを使用して染色コラーゲン含有量を検出しその表面を測定した。次に、線維症領域は、動物あたりのコラーゲン表面の全組織に対するパーセントとして表した。
【０２８２】
肝臓の生化学分析
肝臓コラーゲン含有量の測定
肝臓コラーゲン含有量は、適切なＱｕｉｃｋＺｙｍｅキット（Ｔｏｔａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ａｓｓａｙ、カタログ番号ＱＺＢ−ｔｏｔｃｏｌ２）を使用して測定した。アッセイはヒドロキシプロリンの検出に基づいており、これは主にコラーゲンの３重らせんに見出される非タンパク質原性アミノ酸である。したがって、組織加水分解物中のヒドロキシプロリンは組織中に存在するコラーゲンの量の直接的尺度として使用可能である（プロコラーゲン、成熟コラーゲン及びコラーゲン分解産物の区別なし）。
【０２８３】
ヒドロキシプロリンを投薬する前には、９５℃、６ＭのＨＣｌ中での組織試料の完全加水分解が必要である。アッセイにより、５７０ｎｍでの最大吸光度を有する色素原が生成する。結果は、肝臓１ｇあたりのｍｇコラーゲンとして表される。
【０２８４】
肝臓トリグリセリド含有量の測定
おおよそ１００ｍｇの凍結肝臓組織を、１５．４ｍＭのＮａＮ３を含有する１５０ｍＭのＮａＣｌバッファー中で組織ホモジナイザー（Ｐｒｅｃｅｌｌｙｓ（登録商標）２４、Ｂｅｒｔｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を用いてホモジナイズした。ホモジネート中の脂質画分はクロロホルム−メタノール（２対１、ｖ／ｖ）で抽出し、続いてトリグリセリドを測定した（Ｂｉｏｌａｂｏ  カタログ番号８００１９）。
【０２８５】
血漿プロコラーゲンＩＩＩ  Ｎ−終端プロペプチド（ＰＩＩＩＮＰ）測定
ＰＩＩＩＮＰの血漿濃度は、Ｃｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ  Ｃｏｒｐ社製のＥＬＩＳＡアッセイ（カタログ番号ＳＥＡ５７３Ｍｕ）を製造業者の説明書に従って使用して測定した。マイクロタイタープレートは、ＰＩＩＩＮＰに特異的な抗体でプレコートする。標準又は試料は、ＰＩＩＩＮＰに特異的なビオチンコンジュゲート抗体付きの適切なマイクロタイタープレートウェルに添加する。次に、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートされたアビジンをそれぞれのマイクロプレートウェルに添加してインキュベートする。ＴＭＢ基質溶液を添加後、ＰＩＩＩＮＰ、ビオチンコンジュゲート抗体及び酵素コンジュゲートアビジンを含有するウェルのみが色の変化を示す。酵素−基質反応は硫酸溶液を添加することにより終了させ、色変化は４５０ｎｍ±１０ｎｍの波長で分光光度的に測定する。次に、試料中のＰＩＩＩＮＰの濃度は、試料のＯＤを検量線と比較することにより測定される。結果はｐｇ／ｍＬで表される。
【０２８６】
マトリックスメタロプロテイナーゼ１の血漿組織阻害因子（ＴＩＭＰ−１）測定
血漿ＴＩＭＰ−１レベルは、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社製の定量的サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ（カタログ番号ＭＴＭ１００）を、実験プロトコルＰＲＯ＿ＬＩＤＯ＿００００２０に従って使用して測定した。手短に述べれば、マウスＴＩＭＰ−１に特異的なモノクローナル抗体をマイクロプレート上にプレコートした。標準、対照及び試料はピペットでウェルに移し、存在するマウスＴＩＭＰ−１はいずれも固定化された抗体が結合する。非結合基質をいずれも洗い流した後、マウスＴＩＭＰ−１に特異的な酵素連結ポリクローナル抗体がウェルに添加される。いずれの非結合抗体−酵素試薬を取り除くための洗浄後、基質液をウェルに添加する。酵素反応により青色産物が得られ、これは停止溶液を添加すると黄色に変わる。測定される色の強度は最初のステップで結合しているマウスＴＩＭＰ−１の量に比例する。次に、試料値は検量線から計算する。結果はｐｇ／ｍｌで表される。
【０２８７】
肝臓遺伝子発現の分析
全ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造業者の説明書に従って使用して、マウス肝臓から単離した。全ＲＮＡは、１×ＲＴバッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．５ｍＭのＤＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、０．１８ｍＭのｄＮＴＰ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、２００ｎｇのｐｄＮ６（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及び３０ＵのＲＮアーゼ阻害剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）中でＭ−ＭＬＶ  ＲＴ（モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号２８０２５）を使用してｃＤＮＡに逆転写した。
【０２８８】
次に、ＣＦＸ９６  Ｔｏｕｃｈ（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、定量的ＰＣＲを実行した。手短に述べれば、ＰＣＲ反応は、以下のプライマー配列を使用して、１μＬの逆転写反応、０．５μＬのリバース及びフォワードプライマー（それぞれ１０ｐｍｏｌ）、並びに１２．５μｌの２×ｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（ＢｉｏＲａｄ）を含有する２５μｌの全容積中、９６−ＷＰフォーマットにおいて実施した。
【０２８９】
【表３】
2020517621.tif 000009
【０２９０】
発現レベルは、試料中の参照のハウスキーピング遺伝子としてＧＡＰＤＨ遺伝子の発現を使用して正規化した。遺伝子ごとに、ＰＣＲ反応効率を１００％に近づけ相関係数を１に近づけるために最良点（少なくとも３点）を選択することにより検量線を描いた。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子と標的遺伝子の両方について検量線方程式を使用して測定した（それぞれの標的遺伝子の特定のＰＣＲ効率を考慮して）。
【０２９１】
結果及び結論
最近の臨床研究では、エラフィブラノール、セロンセルチブ、ＧＫＴ−８３１及びＧＳ−０９７６は、ＮＡＳＨ及び線維症エンドポイントで有効性を示してきた。本発明者らは、関連するＮＡＳＨ病理結果に関してその作用を比較し、組合せの治療効果を探したいと望んだ。この目的を達成するため、コレステロール及び乳脂肪を補充したコリン欠乏Ｌアミノ酸限定食、並びに飲料水中高フルクトースコーンシロップ（ＣＤＦＦ食）をＣ５７ＢＩ／６Ｊマウスに与えることにより、ＮＡＳＨを誘発した。介在群の動物は、全研究期間、エラフィブラノール、セロンセルチブ、ＧＫＴ−８３１若しくはＧＳ−０９７６単独を又はエラフィブラノールと組み合わせて受けた。ＮＡＳＨ発症は組織学的及び生化学的測定値並びにＮＡＳＨ病理に関連する経路に関与している遺伝子の肝臓発現により評価した。
【０２９２】
ＣＤＦＦで飼われたマウスは重症の高浸透ＮＡＳＨを発症した。進行した脂肪肝及び小葉性炎症がすべての動物に存在し、６又は７の高ＮＡＳスコアを生じた（図１５Ｃ）。線維化、組織リモデリング及び炎症に関連する遺伝子の発現は増加し、重症のＮＡＳＨ患者で以前報告された遺伝子シグネチャーと一致していた（図１４Ｅ〜Ｉ）。
【０２９３】
このモデルでは、エラフィブラノール（３ｍｇ／ｋｇ／日）は、脂肪肝及び肝臓小葉性炎症を低減することによりＮＡＳＨ組織像を改善し、ＮＡＦＬＤ活性スコアを全体的に低減する（示されず）。エラフィブラノールは、炎症、組織リモデリング及び線維化に関連する遺伝子の発現も減少させ（図１４Ｅ〜Ｉ）、組織像により評価される肝線維症、肝臓コラーゲン含有量並びにＰＩＩＩＮＰ及びＴＩＭＰ−１の血液への放出を著しく低減する（図１４Ａ〜Ｄ）。
【０２９４】
セロンセルチブ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）単独は、このモデルで肝線維症を改善するが、エラフィブラノールよりも程度は低い（図１４）。エラフィブラノール（３ｍｇ／ｋｇ／日）とセロンセルチブ（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を組み合わせると、肝線維症に（組織像、肝臓コラーゲン含有量並びにＰＩＩＩＮＰ及びＴＩＭＰ−１の放出により評価した場合）、並びに線維化、組織リモデリング及び炎症に関与する遺伝子の肝臓発現に相乗的治療効果をもたらした（図１４）。
【０２９５】
ＧＫＴ−８３１（６０ｍｇ／ｋｇ／日）単独は、このモデルではＮＡＳＨ及び線維症に対して治療効果はなかった。しかし、エラフィブラノールの最適以下の用量（１ｍｇ／ｋｇ／日）と組み合わせると、ＧＫＴ−８３１は、肝臓炎症性浸透物、ＮＡＦＬＤ活性スコア及び線維症を低減した（図１５）。
【０２９６】
ＧＳ−０９７６（３０ｍｇ／ｋｇ／日）を用いた処置は、このモデルでは肝脂肪及び体重に対し軽い治療効果であった（図１６）。しかし、最適以下の用量（１ｍｇ／ｋｇ／日）でエラフィブラノールと組み合わせると、全体脂肪燃焼に対して相乗効果があり、２０％の体重減少並びに脂肪肝及びトリグリセリド含有量の目覚ましい減少をもたらした（図１６）。
【０２９７】
結論として、本発明者らは、エラフィブラノールとＭＳＤＣ−０６０２、ＰＸＳ−４７２８、ＭＴ−３９９５（アパラレノン）、ＣＦ−１０２（ナモデノソン）、ビスモデギブ、ＰＢＩ−４０５０、ゲムカベン、ＣＰ−６４０１８６、ＧＳ−０９７６、ＪＫＢ−１２１（ナルメフェン）、ＶＫ−２８０９、ＭＧＬ−３１９６、アラムコール、エムリカサン、ＤＵＲ−９２８（２５−ヒドロキシコレステロール−３−硫酸塩）、セロンセルチブ、ＫＤ−０２５、又はＧＫＴ−８３１の間に相乗効果を見出した。
【０２９８】
【表４】
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【図１】
2020517621.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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