(57)【要約】  本発明は、主要組織適合クラスＩ分子細胞表面発現を下方制御する組成物および方法、ならびに単離したＴ細胞（例えば、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞のような遺伝子改変抗原特異的Ｔ細胞）の機能活性を改善するためのこのような組成物および方法の使用を提供する。特には、本発明は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の治療有効性を支持するための方法および組成物を提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）ウイルスタンパク質を含まない単離したＴ細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩの細胞表面発現レベルと比較して、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルを減少させるウイルスタンパク質と、
（ｉｉ）細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と
を含む、単離したＴ細胞。
【請求項２】
ウイルスタンパク質が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質、アデノウイルスタンパク質、ヘルペスウイルスタンパク質、またはヒト免疫不全ウイルスタンパク質である、請求項１に記載の単離したＴ細胞。
【請求項３】
ウイルスタンパク質が、ＩＣＰ４７、Ｋ３、Ｋ５、Ｅ１９、ＵＳ３、ＵＳ６．ＵＳ２、Ｕ２１、Ｎｅｆ、ＵＳ１０またはＵ２１である、請求項１または２に記載の単離したＴ細胞。
【請求項４】
ウイルスタンパク質が、ＣＡＲを含むがウイルスタンパク質を含まない単離したＴ細胞のＣＡＲの細胞表面発現レベルと比較して、ＣＡＲの細胞表面発現レベルを著しくは減少させない、請求項１から３のいずれか１項に記載の単離したＴ細胞。
【請求項５】
ＮＫ細胞アンタゴニストをさらに含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の単離したＴ細胞。
【請求項６】
ＮＫ細胞アンタゴニストが、抗ＮＫ細胞阻害受容体アゴニスト抗体または抗ＮＫ細胞活性化受容体アンタゴニスト抗体である、請求項５に記載の単離したＴ細胞。
【請求項７】
抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む、請求項６に記載の単離したＴ細胞。
【請求項８】
抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体が、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ／Ｃ／Ｅヘテロ二量体、２Ｂ４（ＣＤ２４４）受容体、またはキラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）受容体に特異的に結合する、請求項６または７に記載の単離したＴ細胞。
【請求項９】
ＫＩＲが、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５ＢまたはＫＩＲ２ＤＬ４である、請求項８に記載の単離したＴ細胞。
【請求項１０】
ウイルスタンパク質を含まないことを除いて単離したＴ細胞のすべての構成成分を含む第２の単離Ｔ細胞のインビボでの残留性と比較して、インビボでの残留性の改善を示す、請求項１から９のいずれか１項に記載の単離したＴ細胞。
【請求項１１】
ウイルスタンパク質を含まないことを除いて単離したＴ細胞のすべての構成成分を含む第２の単離Ｔ細胞により誘発される移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）応答と比較して、組織不適合レシピエントにおいてＧＶＨＤ応答をまったく誘発しないか、または誘発が減少する、請求項１から１０のいずれか１項に記載の単離したＴ細胞。
【請求項１２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の単離したＴ細胞のうちの複数を含むＣＡＲ−Ｔ細胞集団。
【請求項１３】
ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルが、ウイルスタンパク質を含まないＴ細胞上のＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルと比較して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％減少する、請求項１２に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞集団。
【請求項１４】
ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルが、フローサイトメトリーにより測定される、請求項１３に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞集団。
【請求項１５】
単離したＴ細胞を生成する方法であって、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞を、ウイルスタンパク質が発現されるように改変するステップを含む、方法。
【請求項１６】
抗ＮＫ細胞アンタゴニストが発現されるようにＴ細胞を改変するステップをさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
ウイルスタンパク質が、細胞内に安定に導入される、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、トランスポゾン／トランスポザーゼ系、ウイルスベースの遺伝子導入系またはエレクトロポレーションによって細胞に導入される、請求項１４から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドが、トランスポゾン／トランスポザーゼ系、エレクトロポレーションまたはウイルスベースの遺伝子導入系により細胞に導入される、請求項１４から１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ウイルスベースの遺伝子導入系が、組換えレトロウイルスまたはレンチウイルスを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＮＫ細胞アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドが、トランスポゾン／トランスポザーゼ系によって、ウイルスベースの遺伝子導入系によって、またはエレクトロポレーションによって細胞に導入される、請求項１６から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１から１１のいずれか１項に記載の単離したＴ細胞を含む、障害の治療における使用のための医薬組成物。
【請求項２３】
障害が、がん、自己免疫疾患、または感染症である、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
細胞が、複数回提供される、請求項２２または２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
細胞が、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７日またはそれ以上の間隔で対象に提供される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
障害が、ウイルス性疾患、細菌性疾患、がん、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢に伴う疾患である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の単離したＴ細胞を対象に投与するステップを含む、対象において障害を治療するための方法。
【請求項２８】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の単離したＴ細胞を対象に投与するステップを含む、対象においてＧＶＨＤを減少させる方法。
【請求項２９】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の単離したＴ細胞を対象に投与するステップを含む、対象において残留性を改善する方法。
【請求項３０】
請求項１から１４のいずれか１項に記載の単離したＴ細胞を対象に投与するステップを含む、対象において持続的応答時間を延長する方法。
【請求項３１】
細胞が、対象に複数回提供される、請求項２７から３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
単離したＴ細胞の投与前に、対象が、治療薬であらかじめ治療されている、請求項２７から３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
治療薬が、抗体または化学療法剤である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＮＫ細胞アンタゴニストを投与するステップをさらに含む、請求項２７から３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
ＮＫ細胞アンタゴニストが、抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体が、抗ＫＩＲ抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
障害が、ウイルス性疾患、細菌性疾患、がん、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢に伴う疾患である、請求項２７から３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
がんが、血液悪性腫瘍または固形がんである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
血液悪性腫瘍が、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または多発性骨髄腫（ＭＭ）から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
固形がんが、胆道がん、膀胱がん、骨軟部癌、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸腺癌、結腸直腸がん、類腱腫、胚性がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、胃腺癌、多形神経膠芽腫、婦人科腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肝がん、肺がん、悪性黒色腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、膵管腺癌、原発星細胞腫、原発甲状腺がん、前立腺がん、腎がん、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚がん、軟部肉腫、精巣胚細胞腫瘍、尿路上皮がん、子宮肉腫、または子宮がんから選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
１つまたは複数の追加の治療薬を対象に投与するステップをさらに含む、請求項２７から４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
追加の治療薬が、抗体または化学療法剤である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
（ｉ）ウイルスタンパク質を含まない単離したＴ細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の細胞表面発現レベルと比較して、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現レベルを減少させるウイルスタンパク質と、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とをコードするポリヌクレオチド。
【請求項４４】
請求項４３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項４５】
ウイルスベクターである、請求項４４に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年４月１９日出願の米国仮特許出願第６２／４８７，２１５号の優先権を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。
本発明は、概して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が発現されるように操作した免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）の使用により疾患を治療することに関する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞は、臨床に入り、非常に有望な結果を実証した（Maus, M. et al., 2014, Blood 123, 2625-35）。対象の大多数は、対象自身のＴ細胞に由来する自家ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療しているが、健常なドナーに由来する同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞は、より商業的に実現性のある容易に入手可能な（ｏｆｆ−ｔｈｅ−ｓｈｅｌｆ）選択肢を提供し、広範な対象を治療する可能性を有する。
同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞は、健常なドナー由来のＴ細胞に、腫瘍関連抗原により特異的に活性化されるＣＡＲを賦与することにより生成する。ドナー不適合性は、同種異系移植で観察されているように、移植片対宿主（ＧｖＨ）疾患、または宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応によるＣＡＲ−Ｔ細胞の排除を生じ得る。対象の免疫系によって同種異系Ｔ細胞が拒絶されると、同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞の残留性が制限され、自家ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して有効性が低下する恐れがある（Berger, C. et al., 2015, Cancer Immunol Res 3, 206-16；Kochenderfer, J. et al., 2013, Blood 122, 4129-39）。これは、固形腫瘍のような状況において特に重要となる可能性があり、この場合、ＣＡＲ−Ｔの長期残留性が持続的応答に重要となり得る。
したがって、残留性を改善した同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞の必要性がある。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、主要組織適合クラスＩ（ＭＨＣクラスＩ）細胞表面発現を下方制御する組成物および方法、ならびに遺伝子改変Ｔ細胞（例えば、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞のような遺伝子改変抗原特異的Ｔ細胞）の機能活性を改善するためのこのような組成物および方法の使用を提供する。特には、本発明は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の治療有効性を支持するための方法および組成物を提供する。理論に拘束されないが、ウイルスタンパク質が発現すると、ＭＨＣクラスＩ細胞表面発現が減少してＴ細胞認識が低下し、これによりインビボでの残留性が増加して、結果的にＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性が改善される。
一態様では、本発明は、ウイルスタンパク質を含まない単離したＴ細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩの細胞表面発現レベルと比較して、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルを減少させるウイルスタンパク質、ならびに細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む単離したＴ細胞を提供する。
【０００４】
いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）タンパク質、アデノウイルスタンパク質、ヘルペスウイルスタンパク質、またはヒト免疫不全ウイルスタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ＢＦＰ、ＩＣＰ４７、Ｋ３、Ｋ５、Ｅ１９、ＵＳ３、ＵＳ６、ＵＳ２、Ｕ２１、Ｎｅｆ、ＵＳ１０またはＵ２１であり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、Ｋ５であり得る。いくつかの実施形態では、単離したＴ細胞は、いかなる検出可能なＭＨＣクラスＩ分子もその表面に発現しない。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、ＣＡＲおよびＭＨＣクラスＩ細胞表面発現を下方制御するウイルスタンパク質を発現する。
いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、ＣＡＲを含むがウイルスタンパク質を含まない単離したＴ細胞のＣＡＲの細胞表面発現レベルと比較して、ＣＡＲの細胞表面発現を著しくは減少させない。
【０００５】
いくつかの実施形態では、単離したＴ細胞は、ＮＫ細胞アンタゴニストをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞アンタゴニストは、抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ／Ｃ／Ｅヘテロ二量体、２Ｂ４（ＣＤ２４４）受容体、またはキラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）受容体に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、ＫＩＲは、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５ＢまたはＫＩＲ２ＤＬ４であり得る。
いくつかの実施形態では、単離したＴ細胞は、ＣＡＲを含むがウイルスタンパク質を含まない単離したＴ細胞のインビボでの残留性と比較して、インビボでの残留性の改善を示す。
いくつかの実施形態では、単離したＴ細胞は、ＣＡＲを含むがウイルスタンパク質を含まない単離したＴ細胞により誘発される移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）応答と比較して、組織不適合レシピエントにおいてＧＶＨＤ応答をまったく誘発しないか、または誘発が減少する。いくつかの実施形態では、レシピエントは、ヒトまたはサルである。
【０００６】
別の態様では、本発明は、ウイルスタンパク質を含まない単離したＴ細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩの細胞表面発現レベルと比較して、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルを減少させるウイルスタンパク質、ならびに細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む複数の単離したＴ細胞を含む、ＣＡＲ−Ｔ細胞集団を提供する。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルは、ウイルスタンパク質を含まないＴ細胞上のＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルと比較して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％減少する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルは、フローサイトメトリーにより測定され得る。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲおよび選択されるウイルスタンパク質を含む本発明のＴ細胞を投与すると、拒絶反応は、ウイルスタンパク質を発現しないＴ細胞の投与と比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％減少する。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、表１から選択される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲおよびウイルスタンパク質を含む本発明のＴ細胞を投与すると、応答の持続時間は、ウイルスタンパク質を発現しないＴ細胞の投与と比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％増加する。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、表１から選択される。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲおよびウイルスタンパク質を含む本発明のＴ細胞を投与すると、残留性は、ウイルスタンパク質を発現しないＴ細胞の投与と比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％改善する。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、表１から選択される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲおよびウイルスタンパク質を含む本発明のＴ細胞を投与すると、ＧＶＨＤの発症率は、ウイルスタンパク質を発現しないＴ細胞の投与と比較して、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％減少する。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、表１から選択される。
別の態様では、本発明は、単離したＴ細胞を生成する方法であって、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むＣＡＲを発現するＴ細胞を、ウイルスタンパク質が発現されるように改変するステップを含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、抗ＮＫ細胞アンタゴニストが発現されるようにＴ細胞を改変するステップをさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、例えば、これに限定されないが、エレクトロポレーションによって細胞に導入され得る。
いくつかの実施形態では、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、トランスポゾン／トランスポザーゼ系、ウイルスベースの遺伝子導入系またはエレクトロポレーションによって細胞に導入され得る。
いくつかの実施形態では、ウイルスベースの遺伝子導入系は、組換えレトロウイルスまたはレンチウイルスを含む。
いくつかの実施形態では、抗ＮＫ細胞アンタゴニストが発現されるようにＴ細胞を改変するステップは、ＮＫ細胞アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを、例えば、これに限定されないが、エレクトロポレーションによって細胞に導入することを含む。
【０００９】
別の態様では、本発明は、ウイルスタンパク質を含まない単離したＴ細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩの細胞表面発現レベルと比較して、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルを減少させるウイルスタンパク質、ならびに細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む単離したＴ細胞を含む、障害の治療における使用のための医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、ＮＫ細胞アンタゴニストをさらに含む。
いくつかの実施形態では、障害は、がん、自己免疫疾患、または感染症であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、複数回提供され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７日またはそれ以上の間隔で対象に提供され得る。いくつかの実施形態では、障害は、ウイルス性疾患、細菌性疾患、がん、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢に伴う疾患であり得る。
【００１０】
別の態様では、本発明は、ウイルスタンパク質を含まない単離したＴ細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩの細胞表面発現レベルと比較して、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルを減少させるウイルスタンパク質、ならびに細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む単離したＴ細胞を投与するステップを含む、対象において障害を治療するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ＮＫ細胞アンタゴニストを投与するステップをさらに含む。別の態様では、本発明は、ＣＡＲおよびウイルスタンパク質を発現するＴ細胞集団をレシピエント対象に投与するステップを含む、レシピエント対象においてＧＶＨＤを減少させる方法を提供する。別の態様では、本発明は、ＣＡＲおよびウイルスタンパク質を発現するＴ細胞集団をレシピエント対象に投与するステップを含む、レシピエント対象において残留性を改善した方法を提供する。別の態様では、本発明は、ＣＡＲおよびウイルスタンパク質を発現するＴ細胞集団をレシピエント対象に投与するステップを含む、レシピエント対象において持続的応答時間を延長する方法を提供する。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、表１から選択される。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、単離したＴ細胞は、ＮＫ細胞アンタゴニストをさらに含むことができる。
本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＮＫ細胞アンタゴニストは、抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体は、抗ＫＩＲ抗体であり得る。
【００１１】
いくつかの実施形態では、細胞は、対象に複数回提供され得る。本発明の方法のいくつかの実施形態では、単離したＴ細胞の投与前に、対象は、治療薬であらかじめ治療されていてもよい。いくつかの実施形態では、治療薬は、抗体または化学療法剤であり得る。いくつかの実施形態では、障害は、ウイルス性疾患、細菌性疾患、がん、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢に伴う疾患であり得る。
【００１２】
いくつかの実施形態では、がんは、血液悪性腫瘍または固形がんであり得る。いくつかの実施形態では、血液悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性好酸球性白血病（ＣＥＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、または多発性骨髄腫（ＭＭ）から選択され得る。いくつかの実施形態では、固形がんは、胆道がん、膀胱がん、骨軟部癌、脳腫瘍、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、結腸直腸腺癌、結腸直腸がん、類腱腫、胚性がん、子宮内膜がん、食道がん、胃がん、胃腺癌、多形神経膠芽腫、婦人科腫瘍、頭頸部扁平上皮癌、肝がん、肺がん、悪性黒色腫、骨肉腫、卵巣がん、膵がん、膵管腺癌、原発星細胞腫、原発甲状腺がん、前立腺がん、腎がん、腎細胞癌、横紋筋肉腫、皮膚がん、軟部肉腫、精巣胚細胞腫瘍、尿路上皮がん、子宮肉腫、または子宮がんから選択され得る。
いくつかの実施形態では、方法は、１つまたは複数の追加の治療薬を対象に投与するステップを含むことができる。いくつかの実施形態では、追加の治療薬は、抗体または化学療法剤であり得る。
【００１３】
別の態様では、本発明は、（ｉ）ウイルスタンパク質を含まない単離したＴ細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の細胞表面発現レベルと比較して、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現レベルを減少させるウイルスタンパク質と、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とをコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）および（ｉｉ）が同時発現する、ポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、（ｉ）および（ｉｉ）のコード配列は、同一のプロモーターに動作可能に結合する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、（ｉｉｉ）ＮＫ細胞アンタゴニストをさらにコードする。
別の態様では、本発明は、（ｉ）ウイルスタンパク質を含まない単離したＴ細胞の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ分子の細胞表面発現レベルと比較して、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現レベルを減少させるウイルスタンパク質と、（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とをコードするポリヌクレオチドであって、（ｉ）および（ｉｉ）が同時発現する、ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、ウイルスベクターであり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】ウイルスタンパク質ＵＳ１１を同時発現するＣＡＲ＋ジャーカット細胞のサイトメトリー分析の結果をまとめるグラフである。Ｙ軸は、ＣＡＲ発現量を示し、Ｘ軸は、ＭＨＣクラスＩ発現量を示す。
【図１Ｂ】ウイルスタンパク質Ｋ５を同時発現するＣＡＲ＋ジャーカット細胞のサイトメトリー分析の結果をまとめるグラフである。Ｙ軸は、ＣＡＲ発現量を示し、Ｘ軸は、ＭＨＣクラスＩ発現量を示す。
【図２】ＣＡＲまたはウイルスタンパク質（左の棒グラフ、「−」）を発現しない細胞の、ＣＡＲおよび指示するウイルスタンパク質（右の棒グラフ、「＋」）を発現する細胞と比較したＭＨＣクラスＩ表面発現レベルをまとめるグラフである。ＧＭＦＩ＝幾何平均蛍光強度。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボでの残留性および治療有効性を改善するための方法および組成物を提供する。主要組織適合複合体（ＭＨＣ）クラスＩ細胞表面発現を下方制御する組成物および方法を本明細書において提供する。また、ＣＡＲ−Ｔ細胞のような単離したＴ細胞の機能活性を改善するための、このような組成物および方法の使用を提供する。また、残留性を改善したＣＡＲ−Ｔ細胞、およびこのようなＣＡＲ−Ｔ細胞を、障害を治療するために使用する方法を本明細書において提供する。
【００１６】
一般的技術
本発明の実践では、他に指示しない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の在来の技術を利用し、これらは当分野の技術の範囲内にある。このような技術は、分子クローニング：A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989) Cold Spring Harbor Press；Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984)；Methods in Molecular Biology, Humana Press；細胞生物学：A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press；Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press；細胞および組織培養：Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons；Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)；Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987)；Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)；ＰＣＲ：The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994)；Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991)；Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)；Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997)；Antibodies (P. Finch, 1997)；抗体：a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)；モノクローナル抗体：a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)；抗体の使用：a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)；The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995)のような文献において十分に説明される。
【００１７】
定義
本明細書において使用する場合、「自家」は、対象を治療するために使用する細胞、細胞株、または細胞集団が、この対象に由来することを意味する。
本明細書において使用する場合、「同種異系」は、対象を治療するために使用する細胞または細胞集団が、この対象に由来せず、ドナーに由来することを意味する。
本明細書において使用する場合、用語「内在性」は、生物、細胞、組織または系に由来するか、またはその内部で産生される任意の物質を指す。
本明細書において使用する場合、用語「外因性」は、生物、細胞、組織または系の外部から導入されるか、またはそれらの外部で産生される任意の物質を指す。
【００１８】
本明細書において使用する場合、「免疫細胞」は、自然および／または適応免疫応答の開始および／または実行に機能的に関与する造血系由来の細胞を指す。免疫細胞の例としては、Ｔ細胞、例えば、アルファ／ベータＴ細胞およびガンマ／デルタＴ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、マスト細胞、ならびに骨髄球系食細胞が挙げられる。
本明細書において使用する場合、用語「発現」は、プロモーターにより促進される特定のヌクレオチド配列の転写および／または翻訳を指す。
【００１９】
本明細書において使用する場合、「発現ベクター」は、発現するヌクレオチド配列に動作可能に結合する発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指す。発現ベクターは、組換えポリヌクレオチドを組み込む、コスミド、プラスミド（例えば、裸の、またはリポソームに含まれる）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）を含む、当技術分野において公知のすべてのものを含む。
【００２０】
本明細書において使用する場合、「動作可能に結合」は、単一の核酸断片上の核酸配列が会合して、一方の機能が他方によって影響されることを指す。例えば、プロモーターは、そのコード配列の発現に影響することが可能である（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、コード配列と動作可能に結合する。
本明細書において使用する場合、「発現制御配列」は、核酸の転写を方向づける核酸配列を意味する。発現制御配列は、プロモーター、例えば、構成型もしくは誘導型プロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に動作可能に結合する。
【００２１】
「プロモーター」および「プロモーター配列」は、互換的に使用され、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を制御することが可能なＤＮＡ配列を指す。一般に、コード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。種々のプロモーターが、種々の組織もしくは細胞型において、または種々の発生段階において、または種々の環境的もしくは生理的条件に応じて遺伝子の発現を方向づけし得ることが当業者により理解される。
本発明の任意のベクターについては、ベクターは、本明細書に開示のプロモーターを含んでもよい。
「宿主細胞」は、ポリヌクレオチド挿入断片を組み込むためのベクターのレシピエントであり得るか、またはそのレシピエントであった個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一宿主細胞の後代を含み、この後代は、自然、偶発的、または計画的変異のために、元の親細胞と必ずしも完全に同一（形態学またはゲノムＤＮＡ相補性において）でなくてもよい。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチドによりインビボでトランスフェクトした細胞を含む。
【００２２】
用語「細胞外リガンド結合ドメイン」は、本明細書において使用する場合、リガンドに結合可能なオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。好ましくは、ドメインは、細胞表面分子と相互作用可能となる。例えば、細胞外リガンド結合ドメインは、特定の病状と関連する標的細胞の細胞表面マーカーとして作用するリガンドを認識するように選択され得る。
用語「ｓｔａｌｋドメイン」は、膜貫通ドメインを細胞外リガンド結合ドメインに結合させるように機能する、任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指すために本明細書において使用する。特には、ｓｔａｌｋドメインは、細胞外リガンド結合ドメインのさらなる可動性および接触性をもたらすために使用する。
用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、エフェクターシグナル機能シグナルを形質導入し、細胞が特殊化した機能を実行するように方向づけるタンパク質の部分を指す。
「共刺激分子」は、本明細書において使用する場合、共刺激リガンドと特異的に結合し、これにより細胞による共刺激応答、例えば、これに限定されないが、増殖を媒介する、Ｔ細胞上の同族結合パートナーを指す。共刺激分子は、ＭＨＣクラスＩ分子、ＢＴＬＡおよびＴｏｌｌリガンド受容体を含むが、これらに限定されない。共刺激分子の例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３およびＣＤ８３と特異的に結合するリガンド等を含む。
【００２３】
「共刺激リガンド」は、Ｔ細胞上の同族共刺激シグナル分子を特異的に結合させ、これにより、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体がペプチドを充填したＭＨＣ分子と結合することにより生じる一次シグナルに加えて、これらに限定されないが、増殖の活性化、分化等を含むＴ細胞応答を媒介するシグナルをもたらす、抗原提示細胞上の分子を指す。共刺激リガンドは、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子であるＩＣＡＭ、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、Ｍ１ＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、Ｔｏｌｌリガンド受容体を結合させるアゴニストまたは抗体、およびＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドを含み得るが、これらに限定されない。共刺激リガンドは、とりわけ、これらに限定されないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＴＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンドのような、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体をも包含する。
【００２４】
「抗体」は、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチド等のような標的に、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原認識部位を介して特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子である。本明細書において使用する場合、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、その抗原結合断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖ）、ならびに例えば、これらに限定されないが、一本鎖（ｓｃＦｖ）およびドメイン抗体（例えば、サメおよびラクダ抗体を含む）を含む抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の他の任意の改変した構造、ならびに抗体を含む融合タンパク質をも包含する。抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡもしくはＩｇＭ（またはそのサブクラス）のような任意のクラスの抗体を含み、抗体は、特定の任意のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、種々のクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２のようなサブクラス（アイソタイプ）にさらに分けることができる。免疫グロブリンの種々のクラスに対応する重鎖定常領域は、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューとそれぞれ呼ばれる。免疫グロブリンの種々のクラスのサブユニット構造および３次元構造は、周知である。
【００２５】
抗体の「抗原結合断片」または「抗原結合部分」の用語は、本明細書において使用する場合、所与の抗原に特異的に結合する能力を保持するインタクトな抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体の断片により実行することができる。抗体の「抗原結合断片」の用語に包含する結合断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward et al., Nature 341:544-546, 1989）ならびに単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【００２６】
標的に「特異的に結合する」抗体、抗体結合体、またはポリペプチドは、当技術分野において十分理解された用語であり、このような特異的結合を判定する方法はまた、当技術分野において周知である。分子は、代替細胞または物質と反応または会合するよりも、より頻繁に、より急速に、より長い持続時間で、および／またはより高い親和性で特定の細胞または物質と反応または会合する場合、「特異的結合」を示すと言われる。抗体は、他の物質に結合するよりも、より高い親和性、アビディティで、より容易に、および／またはより長い持続時間で結合する場合、標的に「特異的に結合する」。本定義を通読することにより、例えば、第１の標的に特異的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）が、第２の標的に特異的に結合するかどうかは分からないことがまた理解される。したがって、「特異的結合」は、（含み得るとしても）排他的結合を必ずしも条件としない。
【００２７】
抗体の「可変領域」は、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を単独で、または組み合わせて指す。当技術分野において公知のように、重および軽鎖の可変領域は、それぞれ、超可変領域としても知られる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により連結する４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖のＣＤＲは、他方の鎖のＣＤＲとＦＲに隣接して結び付いており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを判定するための少なくとも２つの技術が存在する：（１）異種間配列多様性に基づいた手法（すなわち、Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)）；および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づいた手法（Al-lazikani et al., 1997, J. Molec. Biol. 273:927-948）。本明細書において使用する場合、ＣＤＲは、いずれかの手法または両方の手法の併用により定義されるＣＤＲを指すことができる。
【００２８】
可変ドメインの「ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａの定義、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの両方の蓄積、ＡｂＭ、接触、および／または立体構造の定義、または当技術分野において周知のＣＤＲ判定の任意の方法に従って同定される可変領域内のアミノ酸残基である。抗体ＣＤＲは、Ｋａｂａｔらにより最初に定義された超可変領域として同定することができる。例えば、Kabat et al., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.を参照されたい。ＣＤＲの位置はまた、Ｃｈｏｔｈｉａらにより最初に定義された構造的ループ構造として同定することができる。例えば、Chothia et al., Nature 342:877-883, 1989を参照されたい。ＣＤＲ同定のための他の手法としては、ＫａｂａｔとＣｈｏｔｈｉａの譲歩案であり、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ社のＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（現在はＡｃｃｅｌｒｙｓ（登録商標）社）を使用して導出する「ＡｂＭの定義」、またはMacCallum et al., J. Mol. Biol., 262:732-745, 1996に記載の、観察される抗原接触に基づいたＣＤＲの「接触の定義」が挙げられる。本明細書においてＣＤＲの「立体構造の定義」と呼ぶ別の手法では、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的に寄与する残基として同定することができる。例えば、Makabe et al., Journal of Biological Chemistry, 283:1156-1166, 2008を参照されたい。さらに他のＣＤＲの境界の定義は、上記の手法のうちの１つに厳密には従わなくてもよいが、ＫａｂａｔのＣＤＲの少なくとも１部分とやはり重複する。ただし、これらは、特定の残基もしくは残基の基またはＣＤＲ全体でさえも抗原結合に著しくは影響しないという予測または実験的知見を考慮して、短縮または延長することができる。本明細書において使用する場合、ＣＤＲは、手法の併用を含む、当技術分野において公知の任意の手法により定義されるＣＤＲを指し得る。本明細書において使用する方法は、このような手法のいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用することができる。複数のＣＤＲを含む所与の任意の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、延長、ＡｂＭ、接触、および／または立体構造の定義のいずれかに従って定義することができる。
【００２９】
本発明の抗体は、当技術分野において周知の技術、例えば、組換え技術、ファージディスプレイ技術、合成技術、またはこのような技術もしくは当技術分野において容易に知ることができる他の技術の併用により生成することができる（例えば、Jayasena, S.D., Clin. Chem., 45: 1628-50, 1999およびFellouse, F.A., et al, J. MoI. Biol., 373(4):924-40, 2007を参照）。
【００３０】
当技術分野において公知のように、「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書において互換的に使用する場合、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、改変したヌクレオチドまたは基、および／もしくはその類似体、またはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼにより鎖に組み込むことが可能な任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびその類似体のような改変したヌクレオチドを含むことができる。存在する場合は、ヌクレオチド構造への改変は、鎖の構築の前後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分との結合による重合後にさらに改変することができる。他の種類の改変としては、例えば、「キャップ」、天然発生ヌクレオチドの１つまたは複数の類似体との置換、ヌクレオチド間の改変、例えば、非荷電の連鎖間（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）、および荷電した連鎖間（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）の改変；ペンダント部分を含む改変、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、トキシン、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシン等）；干渉物質（例えば、アクリジン、ソラレン等）による改変；キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含む改変；アルキル化剤を含む改変；改変した連鎖間（例えば、アルファアノマー核酸等）の改変、ならびにポリヌクレオチドの非改変形態が挙げられる。さらに、通常、糖に存在する任意のヒドロキシ基は、例えば、ホスホン酸基、リン酸基により置換するか、標準的保護基により保護するか、もしくは、活性化して追加のヌクレオチドへの追加の連鎖を作成することができるか、または、固体支持体に結合させることができる。５’および３’末端ＯＨは、リン酸化するか、またはアミンもしくは炭素原子１〜２０個の有機キャッピング基部分と置換することができる。他のヒドロキシはまた、標準的保護基に誘導体化することができる。ポリヌクレオチドはまた、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環状糖類似体、アルファ−またはベータ−アノマーの糖、エピマーの糖、例えば、アラビノース、キシロースまたはリキソース、ピラノースの糖、フラノースの糖、セドヘプツロース、非環状類似体および脱塩基ヌクレオシド類似体、例えば、メチルリボシドを含む、一般に当技術分野において公知のリボースまたはデオキシリボースの糖の類似形態を含むことができる。１つまたは複数のホスホジエステルの連鎖は、代替結合基により置換することができる。このような代替結合基は、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ2（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ2（「ホルムアセタール」）によりリン酸を置換する実施形態であって、各ＲまたはＲ’が独立してＨ、または置換もしくは非置換のアルキル（Ｃは１〜２０個）であり、このアルキルが、エーテル（−Ｏ−）連鎖、アリー���、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジルを含んでもよい、実施形態を含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドのすべての連鎖は、同一である必要はない。前述の記載は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含む、本明細書において言及する、すべてのポリヌクレオチドに適用する。
【００３１】
本明細書において使用する場合、「トランスフェクション」は、外因性または異種性ＲＮＡまたはＤＮＡが細胞により取り込まれることを指す。細胞は、外因性または異種性ＲＮＡまたはＤＮＡが細胞内に導入されている場合、このようなＲＮＡまたはＤＮＡにより「トランスフェクト」されている。細胞は、トランスフェクトしたＲＮＡまたはＤＮＡが表現型の変化をもたらす場合、外因性または異種性ＲＮＡまたはＤＮＡにより「形質転換」されている。形質転換するＲＮＡまたはＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡ内に組み込まれ（共有結合し）得る。
本明細書において使用する場合、「形質転換」は、核酸断片を宿主生物のゲノム内へ導入し、遺伝子的に安定な遺伝を生じさせることを指す。形質転換した核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック」または「組換え」または「形質転換」生物と呼ばれる。
【００３２】
本明細書において使用する場合、「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋（すなわち、混入物を含まない）、より好ましくは少なくとも９０％純粋、より好ましくは少なくとも９５％純粋、さらにより好ましくは少なくとも９８％純粋、および最も好ましくは少なくとも９９％純粋である物質を指す。
【００３３】
用語「競合する」は、抗体に関して本明細書において使用する場合、１次抗体、またはその抗原結合断片（もしくは部分）が、二次抗体、またはその抗原結合部分の結合と十分に類似する方法でエピトープに結合し、これにより１次抗体のその同族エピトープとの結合の結果が、二次抗体の非存在下での１次抗体の結合と比較して、二次抗体の存在下で検出可能に減少することを意味する。あるいは、二次抗体のそのエピトープとの結合も、１次抗体の存在下で検出可能に減少する可能性があるが、そうとは限らない。すなわち、二次抗体が、１次抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、１次抗体は、その二次抗体のそのエピトープへの結合を阻害し得る。しかし、各抗体が、他の抗体のその同族エピトープまたはリガンドとの結合を、同程度または多かれ少なかれ、検出可能に阻害する場合、抗体は、そのそれぞれのエピトープの結合について、互いに「交差競合する」と言われる。競合および交差競合する抗体はともに、本発明により包含する。このような競合または交差競合が生じる機構（例えば、立体障害、立体構造変化、または共通エピトープ、もしくはその部分への結合）にかかわらず、このような競合および／または交差競合する抗体を本明細書において包含し、これらが本明細書に開示の方法に有用であり得ることを、当業者は、本明細書に提供する教示に基づいて理解するであろう。
【００３４】
本明細書において使用する場合、「治療」は、有益または所望の臨床結果を得るための手法である。本発明の目的のために、有益または所望の臨床結果は、次：新生もしくは癌性細胞の増殖の減少（もしくは破壊）、新生細胞の転移の阻害、腫瘍サイズの収縮もしくは減少、疾患（例えば、がん）の寛解、疾患（例えば、がん）に起因する症状の減少、疾患（例えば、がん）を患う人のクオリティ・オブ・ライフの上昇、疾患（例えば、がん）を治療するのに必要とされる他の医薬の用量の減少、疾患（例えば、がん）の進行の遅延、疾患（例えば、がん）の治癒、および／または疾患（例えば、がん）を有する対象の生存の延長のうちの１つまたは複数を含むが、これらに限定されない。
「回復」は、治療を施さない場合と比較した、１つまたは複数の症状の減少、または改善を意味する。「回復」はまた、症状の持続時間の短縮または減少を含む。
【００３５】
本明細書において使用する場合、薬物、化合物、または医薬組成物の「有効用量」または「有効量」は、１つまたは複数の任意の有益または所望の結果をもたらすのに十分な量である。予防的使用では、有益または所望の結果は、疾患の生化学的、組織学的および／または行動学的症状、疾患発症の間に呈するその合併症および中間病理学的表現型を含む、疾患のリスクの除去もしくは減少、重症度の低下、または発症の遅延を含む。治療的使用では、有益または所望の結果は、種々の疾患もしくは状態のうちの１つもしくは複数の症状（例えば、がん等）の発症率の減少もしくは回復、疾患を治療するのに必要とされる他の医薬の用量の減少、別の医薬の作用の増強、および／または疾患の進行の遅延のような臨床結果を含む。有効用量は、１回または複数回の投与により施すことができる。本発明の目的のために、薬物、化合物、または医薬組成物の有効用量は、予防的または治療的処置を直接的または間接的に達成するのに十分な量である。臨床状況において理解されるように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効用量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併用した場合に達成されるかどうかは分からない。したがって、「有効用量」は、１つまたは複数の治療薬を投与する状況において考えることができ、単一の薬剤は、１つまたは複数の他の薬剤と併用して、所望の結果が達成され得るか、または達成される場合に、有効量与えられると考えることができる。
本明細書において使用する場合、「対象」は、任意の哺乳動物、例えば、ヒト、またはサルである。哺乳動物は、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットを含むが、これらに限定されない。例示的実施形態では、対象は、ヒトである。例示的実施形態では、対象は、サル、例えば、カニクイザルである。
【００３６】
本明細書において使用する場合、「ベクター」は、宿主細胞において１つまたは複数の目的の遺伝子または配列を送達、および好ましくは発現することが可能な構築物を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤と関連するＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソームに被包されるＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および特定の真核細胞、例えば、産生細胞を含むが、これらに限定されない。
【００３７】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」は、活性成分と混合する場合、成分が生物活性を保持することを可能とし、対象の免疫系に非反応性である任意の物質を含む。例としては、リン酸緩衝生理食塩溶液、水、油／水乳濁液のような乳濁液、および各種の湿潤剤のような任意の標準的医薬担体を含むが、これらに限定されない。エアロゾルまたは非経口投与用の好ましい希釈剤は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または通常（０．９％）の生理食塩水である。このような担体を含む組成物は、周知の在来の方法により処方する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990；およびRemington, The Science and Practice of Pharmacy 21st Ed. Mack Publishing, 2005を参照）。
本明細書において使用する場合、「同種異系反応性」は、胸腺での発生の間に遭遇しなかったＭＨＣ複合体をＴ細胞が認識する能力を指す。同種異系反応性は、宿主対移植片拒絶反応および移植片対宿主疾患として臨床的に現れる。
本明細書において「およそ／約（ａｂｏｕｔ）」の値またはパラメータに言及する場合、その値またはパラメータそれ自体を指示する実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記載は、「Ｘ」の記載を含む。数値範囲は、その範囲を定義する数値を含む。
本明細書において「含む」という言葉を用いて実施形態を記載する場合はいつでも、「からなる」および／または「から本質的になる」という意味において記載される、別の類似の実施形態もまた提供されることが理解される。
【００３８】
本発明の態様または実施形態をマーカッシュ群または代替の他の分類により記載する場合、本発明は、群の各メンバーのそれぞれ、および主群の可能なすべての亜群を除いて、まとめて列挙する群全体だけでなく、群のメンバーのうちの１つまたは複数を欠く主群をも包含する。本発明はまた、主張する発明における、群の任意のメンバーのうちの１つまたは複数を明示的に除外することを想定する。
【００３９】
他に定義しない限り、本明細書において使用する、すべての技術的および科学的用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。矛盾する場合は、定義を含む本明細書により規制する。本明細書および特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」のような変形は、定める整数または整数の群を包含することを意味するが、他の任意の整数または整数の群を除外することを意味しないことが理解される。状況により他に必要としない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数を含むものとする。
例示的方法および材料を本明細書において記載するが、本明細書に記載のものと類似または等価の方法および材料もまた本発明の実践または試験において使用することができる。材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定することは意図しない。
【００４０】
改善された単離Ｔ細胞
主要組織適合複合体クラス（ＭＨＣ）Ｉ細胞表面発現を下方制御する組成物および方法を本明細書において提供する。単離したＴ細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞の機能活性を改善するためのこのような組成物および方法の使用をまた提供する。本明細書において提供する方法および組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボでの残留性および治療有効性を改善するのに有用である。
本明細書において提供する単離したＴ細胞は、（ｉ）ＭＨＣクラスＩ細胞表面発現を下方制御するウイルスタンパク質および（ｉｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。好適には、本明細書において提供する単離したＴ細胞は、ウイルスタンパク質を発現しない細胞と比較して、インビボでの残留性の改善を示す。好ましくは、ウイルスタンパク質は、単離したＴ細胞のＣＡＲ細胞表面発現を減少させない。
【００４１】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供する単離したＴ細胞は、（ｉｉｉ）ＮＫ細胞活性を阻害するタンパク質をさらに含む。例えば、単離したＴ細胞は、例えば、抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体を含む、ＮＫ細胞アンタゴニストを発現し得る。いくつかの実施形態では、抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ９４−ＮＫＧ２Ａ／Ｃ／Ｅヘテロ二量体、２Ｂ４（ＣＤ２４４）受容体、キラー細胞レクチン様受容体Ｇ１（ＫＬＲＧ１）受容体、｛Tom: Please list any other possibilities｝に特異的に結合する。ＫＩＲは、例えば、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５ＢおよびＫＩＲ２ＤＬ４であり得るが、これらに限定されない。本発明において有用な抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体は、好ましくは、（ａ）強力な阻害シグナルを生成する受容体を標的とし、（ｂ）ＮＫ細胞において第１に発現し、および／または（ｃ）特異的かつ保存的エピトープを標的とし、このため、広範な対立遺伝子多様性により患者に適用可能である。
【００４２】
ウイルスタンパク質は、ＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現に干渉し得る任意のウイルスタンパク質であり得る。本発明において有用な例示的ウイルスタンパク質としては、ＢＦＰ、ＩＣＰ４７、Ｋ３、Ｋ５、Ｅ１９、Ｕ３、ＵＳ６、ＵＳ２、ＵＳ１１、Ｎｅｆ、Ｕ２１、ＥＢＮＡ１、ＵＬ４９．５、ＢＮＬＦ２ａ、ＣＰＸＶ２０３およびＵＳ１０を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質、アデノウイルスタンパク質、ヘルペスウイルスタンパク質、またはヒト免疫不全ウイルスタンパク質であり得る。ウイルスタンパク質がＭＨＣクラスＩ分子の細胞表面発現を下方制御するかどうかを判定するために、ウイルスタンパク質を発現する細胞において、ウイルスタンパク質を発現しない細胞のレベルと比較して、ＭＨＣクラスＩの表面発現レベルを定量することができる。ＭＨＣクラスＩの表面発現レベルを判定するためのアッセイは、当技術分野において公知である。例えば、細胞は、表面ＭＨＣクラスＩ発現をＨＬＡ−Ａ、Ｂ、Ｃの抗体により染色して、後続のフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）分析を行うことができる。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質を発現するＴ細胞上のＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルは、ウイルスタンパク質を含まないＴ細胞上のＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルと比較して、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％減少し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、表１に列挙するウイルスタンパク質配列、またはウイルス配列を有するウイルス配列を含む（例えば、発現する）。
【００４４】
【表１】
2020517244.tif 000003
2020517244.tif 000004
2020517244.tif 000005
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、ＩＣＰ４７を含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、例えばＫ３を含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、Ｋ５を含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、Ｅ１９を含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、ＵＳ３を含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、ＵＳ６を含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、ＵＳ２を含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、ＵＳ１１を含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、Ｎｅｆを含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、Ｕ２１を含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、ＵＳ１０を含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、ＥＢＮＡ−１を含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、ＢＮＬＦ２ａを含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、ＵＬ４９．５を含む（例えば、発現する）。いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、ＣＰＸＶ２０３を含む（例えば、発現する）。
【００４６】
本発明は、その特性に著しくは影響しない改変、ならびに活性および／または親和性を増強または減少させた変異体を有する機能的に等価なタンパク質を含む、表１に示す本発明の実施形態のタンパク質への改変を包含する。ポリペプチドの改変は、当技術分野において日常的に実践する業務であり、本明細書において詳細に記載する必要はない。改変ポリペプチドの例としては、機能活性を著しくは有害に変化させないか、もしくはそのリガンドに対するポリペプチドの親和性を成熟（増強）させる、アミノ酸残基の保存的置換、アミノ酸の１つもしくは複数の欠失もしくは付加を有するポリペプチド、または化学的類似体の使用が挙げられる。
【００４７】
アミノ酸配列の挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの範囲の長さのアミノおよび／またはカルボキシ末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体またはエピトープタグと融合した抗体が挙げられる。
【００４８】
置換変異体は、ウイルスタンパク質に少なくとも１つのアミノ酸残基の除去、およびその場所に異なる残基の挿入を有する。保存的置換は、表２の「保存的置換」の見出しの下に示す。このような置換により生物活性の変化が生じる場合、表２に「例示的置換」と命名する、すなわちアミノ酸クラスに関して以下にさらに記載するような、より実質的な変化を導入することができ、これはスクリーニングした結果である。
【００４９】
【表２】
2020517244.tif 000006
【００５０】
ウイルスタンパク質は、ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入した後にインサイチュで細胞において合成することができる。あるいは、ウイルスタンパク質は、細胞外で生成し、次いで、細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチド構築物を細胞内に導入するための方法は、当技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、安定な形質転換方法を使用して、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込むことができる。他の実施形態では、一過性形質転換方法を使用してポリヌクレオチド構築物、および細胞のゲノムに組み込まれないポリヌクレオチド構築物を一過性に発現させることができる。他の実施形態では、ウイルスによる方法を使用することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等のような、適した任意の手段により細胞内に導入することができる。一過性形質転換方法は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは微粒子銃を含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクターのようなベクターに含まれ得る。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、少なくとも１つのウイルスタンパク質および少なくとも１つのＣＡＲを含むことができる。いくつかの実施形態では、単離したＴ細胞は、種々のウイルスタンパク質の少なくとも１つの集団および少なくとも１つのＣＡＲを含むことができる。いくつかの実施形態では、単離したＴ細胞は、少なくとも１つのウイルスタンパク質およびＣＡＲの集団を含むことができ、各ＣＡＲは、種々の細胞外リガンド結合ドメインを含む。
【００５２】
本明細書において提供する単離したＴ細胞のいくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞外リガンド結合ドメイン（例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ））、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインは、１つのポリペプチド、すなわち、一本鎖に存在する。多連鎖ＣＡＲおよびポリペプチドもまた、本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、多連鎖ＣＡＲは、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞外リガンド結合ドメインを含む第１のポリペプチド、ならびに膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドを含み、ここで、ポリペプチドは、ともに集合して多連鎖ＣＡＲを形成する。
【００５３】
細胞外リガンド結合ドメインは、目的の標的に特異的に結合する。目的の標的は、例えば、これらに限定されないが、ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｆｌｔ−３、ＷＴ−１、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ３８、ＣＤ７０、ＣＤ３３、ＣＤ１３３、ＭＨＣ−ＷＴ１、ＴＳＰＡＮ１０、ＭＨＣ−ＰＲＡＭＥ、Ｌｉｖ１、ＡＤＡＭ１０、ＣＨＲＮＡ２、ＬｅＹ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＳ１、ＣＤ４４ｖ６、ＲＯＲ１、ＣＤ１９、クローディン１８．２（クローディン１８Ａ２またはクローディン１８アイソフォーム２）、ＤＬＬ３（デルタ様タンパク質３、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）デルタ相同体３、デルタ３）、Ｍｕｃ１７（ムチン１７、Ｍｕｃ３、Ｍｕｃ３）、ＦＡＰアルファ（線維芽細胞活性化タンパク質アルファ）、Ｌｙ６Ｇ６Ｄ（リンパ球抗原６複合座タンパク質Ｇ６ｄ、ｃ６ｏｒｆ２３、Ｇ６Ｄ、ＭＥＧＴ１、ＮＧ２５）、ＲＮＦ４３（Ｅ３ユビキチン−タンパク質リガーゼＲＮＦ４３、ＲＩＮＧフィンガータンパク質４３）を含む、目的の任意の分子であり得る。
【００５４】
いくつかの実施形態では、細胞外リガンド結合ドメインは、可動性リンカーにより連結される標的抗原特異的モノクローナル抗体の軽鎖可変（ＶＬ）領域および重鎖可変（ＶＨ）領域を含むｓｃＦｖを含む。一本鎖可変領域断片は、短鎖結合ペプチドを使用することによって軽および／または重鎖可変領域に結合させることにより生成する（Bird et al., Science 242:423-426, 1988）。結合ペプチドの例は、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）3（配列番号１６）を有するＧＳリンカーであり、これは一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端の間の約３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーもデザインおよび使用されている（Bird et al., 1988、上記）。一般には、リンカーは、短鎖の可動性ポリペプチドであり、好ましくは、約２０個以下のアミノ酸残基からなり得る。次いで、リンカーは、追加の機能、例えば、薬物の付着または固体支持体への付着に応じて改変することができる。一本鎖変異体は、組換えまたは合成により生成することができる。ｓｃＦｖの合成による生成では、自動合成機を使用することができる。ｓｃＦｖの組換えによる生成では、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含む、適したプラスミドを、酵母、植物、昆虫もしくは哺乳動物細胞のような真核、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のような原核の適した宿主細胞に導入することができる。目的のｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションのような日常的操作により生成することができる。得られたｓｃＦｖは、当技術分野において公知の標準的タンパク質精製技術を使用して単離することができる。
【００５５】
本発明によるＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインが標的へ結合した後の細胞内シグナル伝達の原因となり、免疫細胞の活性化および免疫応答を生じる。細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫細胞の正常エフェクター機能のうちの少なくとも１つを活性化する能力を有する。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパー活性であり得る。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲにおける使用のための細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、これらに限定されないが、Ｔ細胞受容体、および協調して作用し抗原受容体の会合後にシグナル伝達を開始させる共受容体の細胞質配列、ならびにこのような配列の任意の誘導体または変異体、および同一の機能を有する任意の合成配列であり得る。細胞内シグナル伝達ドメインは、２つの別個のクラス：抗原依存性１次活性化を開始させるクラス、および抗原非依存性に作用して二次または共刺激シグナルをもたらすクラスの細胞質シグナル伝達配列を含む。１次細胞質シグナル伝達配列は、ＩＴＡＭの免疫受容体チロシンベース活性化モチーフとして知られるシグナル伝達モチーフを含むことができる。ＩＴＡＭは、ｓｙｋ／ｚａｐ７０クラスチロシンキナーゼの結合部位として働く多様な受容体の細胞質内テールにおいて見出された、詳細に明らかにされているシグナル伝達モチーフである。本発明において使用するＩＴＡＭの例としては、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＦｃＲε、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂおよびＣＤ６６ｄに由来するものを非限定的な例として挙げることができる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むことができる。いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子のドメインを含む。
いくつかの実施形態では、本発明のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、４１ＢＢ（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＡ５３１３３）およびＣＤ２８（ＮＰ＿００６１３０．１）の断片からなる群から選択される共刺激分子の一部を含む。
【００５７】
ＣＡＲは、細胞の表面膜上に発現する。したがって、ＣＡＲは、膜貫通ドメインを含み得る。本明細書に開示のＣＡＲに適した膜貫通ドメインは、（ａ）細胞、好ましくは免疫細胞、例えば、これらに限定されないが、リンパ球細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等の表面で発現させ、（ｂ）リガンド結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用して、あらかじめ定義された標的細胞に対する免疫細胞の細胞応答を方向づける能力を有する。膜貫通ドメインは、天然または合成のソースに由来し得る。膜貫通ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来し得る。非限定的な例として、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γまたはδのようなＴ細胞受容体のサブユニット、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ−２受容体ｐ５５（ａ鎖）、ｐ７５（β鎖）またはγ鎖、Ｆｃ受容体のサブユニット鎖、特にＦｃγ受容体ＩＩＩまたはＣＤタンパク質であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成することができ、ロイシンまたはバリンのような疎水性残基を主に含むことができる。いくつかの実施形態では、この膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）に由来する。膜貫通ドメインは、細胞外リガンド結合ドメインと、この膜貫通ドメインの間にｓｔａｌｋドメインをさらに含むことができる。ｓｔａｌｋドメインは、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５〜５０個のアミノ酸を含むことができる。ｓｔａｌｋ領域は、天然発生分子の全部もしくは一部、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４もしくはＣＤ２８の細胞外領域の全部もしくは一部、または抗体定常領域の全部もしくは一部に由来し得る。あるいは、ｓｔａｌｋドメインは、天然発生のｓｔａｌｋ配列に対応する合成配列であり得るか、または完全に合成のｓｔａｌｋ配列であり得る。いくつかの実施形態では、このｓｔａｌｋドメインは、ヒトＣＤ８α鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）の一部である。別の特定の実施形態では、この膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α鎖の一部を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示のＣＡＲは、ＢＣＭＡを特異的に結合させる細胞外リガンド結合ドメイン、ＣＤ８αヒトｓｔａｌｋおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、ならびに４−１ＢＢシグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、免疫細胞内に導入遺伝子としてプラスミドベクターを介して導入することができる。いくつかの実施形態では、プラスミドベクターはまた、例えば、ベクターを導入した細胞の同定および／または選択をもたらす選択マーカーを含むことができる。
【００５８】
ＣＡＲポリペプチドは、ＣＡＲポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞内に導入した後にインサイチュで細胞において合成することができる。あるいは、ＣＡＲポリペプチドは、細胞外で生成し、次いで、細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチド構築物を細胞内に導入するための方法は、当技術分野において公知である。いくつかの実施形態では、安定な形質転換方法を使用して、ポリヌクレオチド構築物を細胞のゲノムに組み込むことができる。他の実施形態では、一過性形質転換方法を使用してポリヌクレオチド構築物、および細胞のゲノムに組み込まれないポリヌクレオチド構築物を一過性に発現させることができる。他の実施形態では、ウイルスによる方法を使用することができる。ポリヌクレオチドは、例えば、組換えウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス）、リポソーム等のような、適した任意の手段により細胞内に導入することができる。一過性形質転換方法は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションまたは微粒子銃を含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドは、ベクター、例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクター等に含まれ得る。
【００５９】
本明細書に記載の方法のいずれか１つにより得られる単離したＴ細胞をまた本明細書において提供する。異種ＤＮＡを発現させることが可能な任意の免疫細胞は、目的のウイルスタンパク質およびＣＡＲを発現させる目的のために使用することができる。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、例えば、これに限定されないが、幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より詳細には非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、誘導多能性幹細胞、全能性幹細胞または造血幹細胞であり得る。代表的ヒト細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。単離した細胞はまた、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、または炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、制御性Ｔリンパ球もしくはヘルパーＴリンパ球からなる群から選択されるＴ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔリンパ球およびＣＤ８＋Ｔリンパ球からなる群に由来し得る。
【００６０】
増殖および遺伝子改変前に、細胞のソースは、多様な非限定的方法により対象から得ることができる。細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多くの非限定的ソースから得ることができる。いくつかの実施形態では、利用可能かつ当業者に公知の任意の数のＴ細胞株を使用することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、健常なドナー、がんと診断された対象、または感染症と診断された対象に由来し得る。いくつかの実施形態では、細胞は、種々の表現型特性を呈する細胞の混合集団の一部であり得る。
【００６１】
本明細書に記載のいずれかの方法による形質転換したＴ細胞から得られる、細胞株をまた本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、本発明による単離したＴ細胞は、ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明による単離したＴ細胞は、ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明による単離したＴ細胞は、ウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチド、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、およびＮＫ細胞アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドを含む。
【００６２】
本発明の単離したＴ細胞は、例えば、これらに限定されないが、米国特許第６，３５２，６９４号、第６，５３４，０５５号、第６，９０５，６８０号、第６，６９２，９６４号、第５，８５８，３５８号、第６，８８７，４６６号、第６，９０５，６８１号、第７，１４４，５７５号、第７，０６７，３１８号、第７，１７２，８６９号、第７，２３２，５６６号、第７，１７５，８４３号、第５，８８３，２２３号、第６，９０５，８７４号、第６，７９７，５１４号、第６，８６７，０４１号、および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に概して記載される方法を使用して、Ｔ細胞の遺伝子改変前または後に活性化および増殖させることができる。Ｔ細胞は、インビトロまたはインビボで増殖させることができる。一般には、本発明のＴ細胞は、例えば、Ｔ細胞表面上のＣＤ３ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激する薬剤と接触させて、Ｔ細胞の活性化シグナルを生成することにより増殖させることができる。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）、または分裂促進レクチン様フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）のような化学物質を使用して、Ｔ細胞の活性化シグナルを生成することができる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集団は、例えば、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、または表面上に固定化した抗ＣＤ２抗体と接触させることにより、あるいはカルシウムイオノフォアとの併用でプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによりインビトロで刺激することができる。Ｔ細胞表面上のアクセサリー分子の共刺激では、アクセサリー分子に結合させるリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。Ｔ細胞培養に適切な条件は、血清（例えば、ウシ胎仔またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＴＧＦｐおよびＴＮＦ、または当業者に公知の細胞の成長のための他の任意の添加物を含む、増殖および生存に必要な因子を含み得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０またはＸ−ｖｉｖｏ５（Ｌｏｎｚａ社））を含む。細胞の成長のための他の添加物は、界面活性物質、プラスマネートおよび還元剤、例えば、Ｎ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノール（ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｉ）を含むが、これらに限定されない。培地は、ＲＰＭＩ１６４０、Ａ１Ｍ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１およびＸ−Ｖｉｖｏ２０、オプティマイザを、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを加えて、血清を含まずに、あるいは適切な量の血清（もしくは血漿）もしくは規定のセットのホルモン、ならびに／またはＴ細胞の成長および増殖に十分な量のサイトカインを補足して含むことができる。抗菌薬、例えば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験培養物のみに含み、対象に注入する細胞の培養物には含まない。標的細胞は、成長の支持に必要な条件下、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および環境空気（例えば、プラス５％ＣＯ2の空気）に維持する。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、種々の特性を示し得る。
いくつかの実施形態では、本発明の細胞は、組織または細胞と共培養することにより増殖させることができる。細胞はまた、例えば、対象への細胞の投与後、対象の血液においてインビボで増殖させることができる。
【００６４】
別の態様では、本発明は、本発明の細胞のいずれかを含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載のウイルスタンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチド、およびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む、単離したＴ細胞を含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＮＫ細胞アンタゴニストをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。いくつかの実施形態では、ＮＫ細胞アンタゴニストは、抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体である。
発現ベクターおよびポリヌクレオチド組成物の投与を本明細書においてさらに記載する。
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを生成する方法を提供する。
このような任意の配列と相補的なポリヌクレオチドをまた、本発明により包含する。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードするか、もしくはアンチセンス）または二本鎖であり得、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡもしくは合成）またはＲＮＡ分子であり得る。ＲＮＡ分子は、イントロンを含みＤＮＡ分子に１対１で対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含まないｍＲＮＡ分子を含む。追加のコードまたは非コード配列は、本発明のポリヌクレオチド内に存在し得るが、そうである必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持物質に結合し得るが、そうである必要はない。
【００６５】
ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、抗体またはその部分をコードする内在性配列）を含むことができるか、またはこのような配列の変異体を含むことができる。ポリヌクレオチド変異体は、１つまたは複数の置換、付加、欠失および／または挿入を含み、これにより、コードされるポリペプチドの免疫反応性は、天然の免疫反応分子と比較して減少しない。コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する作用は、本明細書に記載のように一般に評価することができる。変異体は、天然抗体またはその部分をコードするポリヌクレオチド配列に対して、好ましくは少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは少なくとも約８０％の同一性、さらにより好ましくは少なくとも約９０％の同一性、および最も好ましくは少なくとも約９５％の同一性を示す。
【００６６】
２つの配列のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載のように最大対応関係で整列する場合に同一であるとき、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的に、比較ウインドウにわたって配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することにより行う。「比較ウインドウ」は、本明細書において使用する場合、少なくとも約２０個、通常３０〜約７５個、または４０〜約５０個の隣接位置のセグメントを指し、このセグメントにおいて、２つの配列を最適に整列後、配列を同数の隣接位置の対照配列と比較することができる。
【００６７】
比較のための配列の最適アライメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアであるＬａｓｅｒｇｅｎｅスイートのＭｅｇａｌｉｇｎプログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、マディソン、ＷＩ）により、デフォルトのパラメータを使用して行うことができる。このプログラムは、次の参照文献に記載のいくつかのアライメントスキームを具体化する：Dayhoff, M.O., 1978, A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships。Dayhoff, M.O. (ed.)によるAtlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358；Hein J., 1990, Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA；Higgins, D.G. and Sharp, P.M., 1989, CABIOS 5:151-153；Myers, E.W. and Muller W., 1988, CABIOS 4:11-17；Robinson, E.D., 1971, Comb. Theor. 11:105；Santou, N., Nes, M., 1987, Mol. Biol. Evol. 4:406-425；Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R., 1973, Numerical Taxonomy the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA；Wilbur, W.J. and Lipman, D.J., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:726-730。
【００６８】
好ましくは、「配列同一性の割合」は、２つの最適に整列させた配列を、少なくとも２０個の位置の比較ウインドウにわたって比較することにより決定し、ここで、比較ウインドウのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分が、２つの配列の最適アライメントについて、対照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセント以下、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。割合は、両方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が生じた位置の数を決定して適合した位置の数を得、適合した位置の数を対照配列の位置の総数（すなわち、ウィンドウサイズ）で割り、結果に１００を掛けて配列同一性の割合を得ることにより算出される。
【００６９】
変異体も、またはあるいは、天然の遺伝子、またはその部分もしくは補体と実質的に相同であり得る。このようなポリヌクレオチド変異体は、中程度にストリンジェントな条件下で、天然抗体（または相補配列）をコードする天然発生ＤＮＡ配列とハイブリダイズすることが可能である。
【００７０】
適した「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣ、一晩のハイブリダイゼーション、その後、６５℃で２０分間、０．１％のＳＤＳを含むそれぞれ２Ｘ、０．５Ｘおよび０．２ＸのＳＳＣによる２回の洗浄を含む。
【００７１】
本明細書において使用する場合、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェント条件」は、（１）洗浄に低イオン強度および高温度、例えば、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを５０℃で利用すること、（２）ハイブリダイゼーションにおいてホルムアミドのような変性剤を利用すること、例えば、５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミドを、０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のフィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液とｐＨ６．５で、７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムとともに４２℃で利用、または（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳおよび１０％のデキストラン硫酸を４２℃で利用し、４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５０％のホルムアミド５５℃中で洗浄し、その後、ＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェントな洗浄を５５℃で行うことである。当業者は、プローブ長等のような因子を適応させるために必要に応じて温度、イオン強度等を調整する方法を認識するであろう。
【００７２】
遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することは、当業者により理解されるであろう。このようなポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性を有する。それにもかかわらず、コドンの使用頻度の相違のために変化するポリヌクレオチドを本発明により詳細に検討する。さらに、本明細書において提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内にある。対立遺伝子は、ヌクレオチドの欠失、付加および／または置換のような１つまたは複数の変異の結果として変化する内在性遺伝子である。得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、構造または機能が変化し得るが、そうである必要はない。対立遺伝子は、標準的技術（例えば、ハイブリダイゼーション、増幅および／またはデータベース配列比較）を使用して同定することができる。
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを使用して得ることができる。ポリヌクレオチド化学合成の方法は、当技術分野において周知であり、本明細書において詳細に記載する必要はない。当業者は、本明細書において提供する配列および市販のＤＮＡ合成機を使用して所望のＤＮＡ配列を生成することができる。
【００７３】
組換え法を使用したポリヌクレオチドの調製では、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適したベクター内に挿入することができ、次いで、ベクターを適した宿主細胞内に導入して、本明細書においてさらに考察するように、複製および増幅することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の任意の手段により宿主細胞内に挿入することができる。細胞は、直接取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ接合またはエレクトロポレーションによって外因性ポリヌクレオチドを導入することにより形質転換する。導入すると、外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（例えば、プラスミド）として細胞内に維持するか、宿主細胞ゲノム内に組み込むことができる。このように増幅したポリヌクレオチドは、当技術分野において周知の方法により宿主細胞から単離することができる。例えば、Sambrook et al., 1989を参照されたい。
【００７４】
あるいは、ＰＣＲにより、ＤＮＡ配列の複製が可能である。ＰＣＲ技術は、当技術分野において周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，８００，１５９号、第４，７５４，０６５号および第４，６８３，２０２号ならびにＰＣＲ：The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al. eds., Birkauswer Press, Boston, 1994に記載されている。
ＲＮＡは、適切なベクター内の単離したＤＮＡを使用し、これを適した宿主細胞内に挿入することにより得ることができる。細胞が増殖し、ＤＮＡがＲＮＡに転写されると、例えば、Sambrook et al., 1989、上記に記載のような当業者に周知の方法を使用してＲＮＡを単離することができる。
【００７５】
適したクローニングベクターは、標準的技術により構築し得るか、または当技術分野において利用可能な多数のクローニングベクターから選択され得る。選択されるクローニングベクターは、使用することを意図する宿主細胞に応じて異なり得るが、有用なクローニングベクターは、一般に、自己複製能力を有し、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を有し得、かつ／またはベクターを含むクローンの選択に使用し得るマーカーの遺伝子を保有し得る。適した例としては、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ブルースクリプト（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡならびにシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８が挙げられる。これらおよび他の多くのクローニングベクターは、ＢｉｏＲａｄ社、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社のような商業的供給元より入手可能である。
【００７６】
発現ベクターは、一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含む複製可能なポリヌクレオチド構築物である。発現ベクターが、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの不可欠な部分として宿主細胞において複製可能でなければならないことを意味する。適した発現ベクターは、プラスミド；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含むウイルスベクター；コスミド；およびＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２号に開示の発現ベクターを含むが、これらに限定されない。ベクターの構成成分は、一般に、次：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、適した転写制御因子（例えば、プロモーター、エンハンサーおよびターミネーター）のうちの１つまたは複数を含み得るが、これらに限定されない。発現（すなわち、翻訳）のためには、例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドンのような、１つまたは複数の翻訳制御因子をも通常必要とする。
【００７７】
目的のポリヌクレオチドを含むベクターは、エレクトロポレーション；塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を利用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターがワクシニアウイルスのような感染病原体である場合）を含む、多数の適切な手段のいずれかにより宿主細胞内に導入することができる。導入ベクターまたはポリヌクレオチドの選択は、宿主細胞の特徴に依存することが多い。
【００７８】
本明細書において開示するウイルスタンパク質またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、発現カセットまたは発現ベクター（例えば、細菌宿主細胞内への導入のためのプラスミド、または昆虫宿主細胞のトランスフェクションのためのバキュロウイルスベクターのようなウイルスベクター、または哺乳動物宿主細胞のトランスフェクションのためのレンチウイルスのようなプラスミドもしくはウイルスベクター）に存在し得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドまたはベクターは、例えば、これに限定されないが、２Ａペプチドをコードする配列のような、リボソームスキップ配列をコードする核酸配列を含むことができる。ピコルナウイルスのアフトウイルスサブグループにおいて同定された２Ａペプチドは、コドンによりコードされる２つのアミノ酸間のペプチド結合を形成せずに、あるコドンから次のコドンへとリボソーム「スキップ」を引き起こす（（Donnelly and Elliott 2001；Atkins, Wills et al. 2007；Doronina, Wu et al. 2008）を参照）。「コドン」は、ｍＲＮＡ上（またはＤＮＡ分子のセンス鎖上）の３つのヌクレオチドを意味し、これらは、リボソームにより１つのアミノ酸残基に翻訳される。したがって、フレーム内の２Ａオリゴペプチド配列によりポリペプチドが分離されている場合、ｉｍＲＮＡ内の単一の隣接オープンリーディングフレームから２つのポリヌクレオチドを合成することができる。このようなリボソームスキップ機構は、当技術分野において周知であり、単一のメッセンジャーＲＮＡによりコードされるいくつかのタンパク質を発現させるために、いくつかのベクターにより使用されることで知られている。
【００７９】
膜貫通ポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に方向づけるために、いくつかの実施形態では、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはプレ配列としても知られる）をポリヌクレオチド配列またはベクター配列に設ける。分泌シグナル配列は、膜貫通核酸配列に動作可能に結合する、すなわち、正しいリーディングフレームにおいて２つの配列を連結し、新規合成したポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に方向づけるように配置する。分泌シグナル配列は、一般に、目的のポリペプチドをコードする核酸配列に対して５’に配置するが、特定の分泌シグナル配列は、目的の核酸配列の他の場所に配置し得る（例えば、Welch et al.、米国特許第５，０３７，７４３号；Holland et al.、米国特許第５，１４３，８３０号を参照）。当業者は、遺伝暗号の縮重を考慮しても、このようなポリヌクレオチド分子において、かなりの配列多様性があり得ることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、本発明の核酸配列は、哺乳動物細胞における発現のため、好ましくは、ヒト細胞における発現のためにコドン最適化される。コドン最適化は、目的の配列において、所与の種の高発現遺伝子中で一般に稀なコドンが、このような種の高発現遺伝子中で一般に頻出するコドンによって交換され、このようなコドンが、交換されるコドンとしてアミノ酸をコードすることを指す。
【００８０】
免疫療法における使用のための免疫細胞を調製する方法を本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、方法は、ウイルスタンパク質およびＣＡＲを免疫細胞に導入し、細胞を増殖させるステップを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、細胞を用意し、ＭＨＣ細胞表面発現を下方制御するウイルスタンパク質を発現させるステップ、および少なくとも１つのＣＡＲを細胞表面で発現させるステップを含む、免疫細胞を操作する方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、ウイルスタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、およびＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトするステップ、ならびに細胞においてポリヌクレオチドを発現させるステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、ウイルスタンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、ＣＡＲをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド、およびＮＫ細胞アンタゴニストをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトするステップ、ならびに細胞においてポリヌクレオチドを発現させるステップを含む。
【００８１】
いくつかの実施形態では、ウイルスタンパク質およびＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、細胞における安定な発現のための１つまたは複数の発現ベクターに存在する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、細胞における安定な発現のためのウイルスベクターに存在する。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、例えば、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターであり得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本発明によるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡであり、例えば、エレクトロポレーションにより細胞内に直接導入され得る。いくつかの実施形態では、ｃｙｔｏＰｕｌｓｅ技術を使用し、生細胞を一過性に透過処理して物質を細胞内に送達することができる。パラメータは、条件を決定してトランスフェクション効率を高め、死滅率を最小限とするために改変することができる。
【００８３】
Ｔ細胞をトランスフェクションする方法をまた本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、方法は、Ｔ細胞をＲＮＡと接触させるステップと、（ａ）１センチメートルあたり約２２５０〜３０００Ｖの電圧範囲の電気パルス、（ｂ）０．１ｍｓのパルス幅、（ｃ）ステップ（ａ）と（ｂ）との電気パルス間が約０．２〜１０ｍｓのパルス間隔、（ｄ）約１００ｍｓのパルス幅、およびステップ（ｂ）の電気パルスとステップ（ｃ）の最初の電気パルスとの間が約１００ｍｓのパルス間隔による約２２５０〜３０００Ｖの電圧範囲の電気パルス、ならびに（ｅ）約０．２ｍｓのパルス幅、および４回の電気パルス間がそれぞれ２ｍｓのパルス間隔による約３２５Ｖの電圧の４回の電気パルスからなる、迅速パルスシーケンスをＴ細胞に適用するステップとを含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞をトランスフェクトする方法は、このＴ細胞をＲＮＡと接触させるステップと、（ａ）１センチメートルあたり約２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２４００、２４５０、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００Ｖの電圧の電気パルス、（ｂ）０．１ｍｓのパルス幅、（ｃ）ステップ（ａ）と（ｂ）との電気パルス間が約０．２、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０ｍｓのパルス間隔、（ｄ）１００ｍｓのパルス幅、およびステップ（ｂ）の電気パルスとステップ（ｃ）の最初の電気パルスとの間が１００ｍｓのパルス間隔による約２２５０〜２２５０、２３００、２３５０、２４００、２４５０、２５００、２５５０、２４００、２４５０、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００または３０００Ｖの電圧範囲の１回の電気パルス、ならびに（ｅ）約０．２ｍｓのパルス幅、および４回の電気パルス間がそれぞれ約２ｍｓのパルス間隔による約３２５Ｖの電圧の４回の電気パルスを含む、迅速パルスシーケンスをＴ細胞に適用するステップとを含む。上記の値の範囲に含まれる任意の値は、本出願により開示される。エレクトロポレーション培地は、当技術分野において公知の適した任意の培地であり得る。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション培地は、約０．０１〜約１．０ミリジーメンスに及ぶ範囲の伝導率を有する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、方法は、例えば、これらに限定されないが、ＴＣＲの構成成分、免疫抑制剤の標的、ＨＬＡ遺伝子、および／または免疫チェックポイントタンパク質、例えば、ＰＤＣＤ１またはＣＴＬＡ−４等を発現する少なくとも１つの遺伝子を不活化させることにより細胞を遺伝子改変するステップをさらに含むことができる。遺伝子を不活化させることにより、目的の遺伝子が機能的なタンパク質の形態で発現しないよう意図する。いくつかの実施形態では、不活化される遺伝子は、例えば、これらに限定されないが、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＣＤ５２、ＧＲ、デオキシシチジンキナーゼ（ＤＣＫ）、ＰＤ−１およびＣＴＬＡ−４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、選択的にＤＮＡを切断することにより遺伝子を選択的に不活化することが可能な、低頻度切断エンドヌクレアーゼを細胞内に導入することによって１つまたは複数の遺伝子を不活化するステップを含む。いくつかの実施形態では、低頻度切断エンドヌクレアーゼは、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ）またはＣａｓ９エンドヌクレアーゼであり得る。
【００８５】
別の態様では、細胞を遺伝子改変するステップは、免疫抑制剤の標的を発現する少なくとも１つの遺伝子を不活化することによりＴ細胞を改変すること、および細胞を増殖させ、これが免疫抑制剤の存在下であってもよいことを含むことができる。免疫抑制剤は、作用のいくつかの機構のうちの１つにより免疫機能を抑制する薬剤である。免疫抑制剤は、免疫応答の程度および／または貪食を減少させることができる。免疫抑制剤の非限定的な例としては、カルシニューリン阻害剤、ラパマイシンの標的、インターロイキン２α鎖遮断剤、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼの阻害剤、ジヒドロ葉酸レダクターゼの阻害剤、コルチコステロイド、および免疫抑制代謝拮抗剤が挙げられる。いくつかの細胞傷害性免疫抑制剤は、ＤＮＡ合成を阻害することにより作用する。他は、Ｔ細胞の活性化により、またはヘルパー細胞の活性化を阻害することにより作用し得る。本発明による方法は、Ｔ細胞における免疫抑制剤の標的を不活化することにより、免疫療法のためのＴ細胞に対する免疫抑制抵抗性を付与することを可能とする。非限定的な例として、免疫抑制剤の標的は、免疫抑制剤の受容体、例えば、これらに限定されないが、ＣＤ５２、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＦＫＢＰファミリー遺伝子メンバー、およびシクロフィリンファミリー遺伝子メンバー等であり得る。
【００８６】
治療的方法
上記の方法により得られる単離したＴ細胞、またはこのような単離したＴ細胞に由来する細胞株を医薬として使用することができる。いくつかの実施形態では、このような医薬を、例えば、ウイルス性疾患、細菌性疾患、がん、炎症性疾患、免疫疾患、または加齢に伴う疾患のような障害を治療するために使用することができる。いくつかの実施形態では、がんは、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、肉腫、リンパ腫、白血病、頭頸部がん、胸腺がん、上皮がん、唾液腺がん、肝がん、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、肺がん、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、膵がん、神経膠腫、白血病、多発性骨髄腫、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、絨毛癌、結腸がん、口腔がん、皮膚がん、および黒色腫からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、対象は、局所進行性もしくは転移性の黒色腫、扁平細胞頭頸部がん（ＳＣＨＮＣ）、卵巣癌、肉腫、または再発もしくは難治性の古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）を有する、あらかじめ治療された成人対象である。
いくつかの実施形態では、本発明による単離したＴ細胞、または単離したＴ細胞に由来する細胞株は、それを必要とする対象における障害の治療のための医薬の製造において使用することができる。いくつかの実施形態では、障害は、例えば、がん、自己免疫疾患、または感染症であり得る。
【００８７】
対象を治療するための方法をまた本明細書において提供する。いくつかの実施形態では、方法は、本発明の単離したＴ細胞を、それを必要とする対象に提供するステップを含む。いくつかの実施形態では、方法は、本発明の単離したＴ細胞を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、インビボでの安定したＴ細胞発現を起こすことができ、長時間持続することができる。
本発明の治療の方法は、回復、治癒または予防することができる。本発明の方法は、自家免疫療法の一部、または同種異系免疫療法の治療の一部であり得る。本発明は、同種異系免疫療法に特に適する。ドナー由来のＴ細胞は、標準的プロトコルを使用して非同種異系反応性細胞に形質転換し、必要に応じて増殖させ、これにより１人または幾人かの対象に投与可能なＣＡＲ−Ｔ細胞を生成することができる。このようなＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、「容易に入手可能な（ｏｆｆ  ｔｈｅ  ｓｈｅｌｆ）」治療薬として利用可能となり得る。
【００８８】
別の態様では、本発明は、有効量の本明細書に記載の単離したＴ細胞を対象に投与するステップを含む、腫瘍を有する対象における腫瘍の増殖または進行を阻害する方法を提供する。別の態様では、本発明は、有効量の本明細書に記載の単離したＴ細胞をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、対象におけるがん細胞の転移を阻害または予防する方法を提供する。別の態様では、本発明は、有効量の本明細書に記載の単離したＴ細胞を対象に投与するステップを含む、腫瘍を有する対象における腫瘍の退縮を誘導する方法を提供する。
いくつかの実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、対象に非経口的に投与することができる。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
【００８９】
いくつかの実施形態では、方法は、有効量の第２の治療薬を投与するステップをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、第２の治療薬は、例えば、クリゾチニブ、パルボシクリブ、抗ＣＴＬ４抗体、抗４−１ＢＢ抗体、ＰＤ−１抗体、またはＰＤ−Ｌ１抗体である。
本明細書において提供する単離したＴ細胞のいずれかの、それを必要とする対象における、がん治療のための、または腫瘍の増殖または進行を阻害するための医薬の製造における使用をまた提供する。
いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルは、ウイルスタンパク質を含まないＴ細胞上のＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルと比較して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％減少する。いくつかの実施形態では、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現レベルは、フローサイトメトリーにより測定され得る。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲおよび表１から選択されるウイルスタンパク質を含む本発明のＴ細胞を投与すると、表１から選択されるウイルスタンパク質を発現しないＴ細胞の投与と比較して、拒絶反応が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％減少する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲおよび表１から選択されるウイルスタンパク質を含む本発明のＴ細胞を投与すると、表１から選択されるウイルスタンパク質を発現しないＴ細胞の投与と比較して、応答の持続時間が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％増加する。
いくつかの実施形態では、ＣＡＲおよび表１から選択されるウイルスタンパク質を含む本発明のＴ細胞を投与すると、表１から選択されるウイルスタンパク質を発現しないＴ細胞の投与と比較して、残留性が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％改善される。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲおよび表１から選択されるウイルスタンパク質を含む本発明のＴ細胞を投与すると、表１から選択されるウイルスタンパク質を発現しないＴ細胞の投与と比較して、ＧＶＨＤの発症率が少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％または１００％減少する。
いくつかの実施形態では、治療は、抗体療法、化学療法、サイトカイン療法、樹状細胞療法、遺伝子療法、ホルモン療法、レーザー光療法および放射線療法の群から選択される、がんに対する１つまたは複数の療法と併用することができる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、治療は、免疫抑制治療を受けている対象に施すことができる。実際、本発明は、好ましくは、このような免疫抑制剤の受容体をコードする遺伝子を不活化したために少なくとも１つの免疫抑制剤に抵抗性とした、細胞または細胞集団に依存する。この態様では、免疫抑制治療は、対象における本発明によるＴ細胞の選択および増殖を支持するはずである。本発明による細胞または細胞集団の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸注、注入または移植を含む、好適な任意の方法で行うことができる。本明細書に記載の組成物は、対象の皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内、髄内、筋肉内に、静脈内もしくはリンパ内注射により、または腹腔内に投与することができる。一実施形態では、本発明の細胞組成物は、好ましくは、静脈内注射により投与する。
【００９３】
いくつかの実施形態では、細胞または細胞集団の投与は、例えば、１ｋｇ体重あたり約１０4〜約１０9個の細胞の投与を含むことができ、このような範囲内のすべての整数値の細胞数を含む。いくつかの実施形態では、細胞または細胞集団の投与は、１ｋｇ体重あたり約１０5〜１０6個の細胞の投与を含むことができ、このような範囲内のすべての整数値の細胞数を含む。細胞または細胞集団は、１回または複数の用量で投与することができる。いくつかの実施形態では、この有効量の細胞は、単回用量として投与することができる。いくつかの実施形態では、この有効量の細胞は、ある期間にわたって複数回の用量として投与することができる。投与のタイミングは、処置する医師の判断に委ねられ、対象の臨床状態次第である。細胞または細胞集団は、血液バンクまたはドナーのような任意のソースから得ることができる。個人の必要性が異なる一方、特定の疾患または状態のための所与の細胞型の有効量の最適範囲の決定は、当業者の技術範囲内にある。有効量は、治療的または予防的利点をもたらす量を意味する。投与する用量は、レシピエントの年齢、健康および体重、併用療法の種類、該当する場合、治療の頻度ならびに所望の作用の性質に依存する。いくつかの実施形態では、有効量の細胞またはこのような細胞を含む組成物は、非経口的に投与する。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内投与であり得る。いくつかの実施形態では、投与は、腫瘍内注射により直接行うことができる。
【００９４】
本発明のいくつかの実施形態では、細胞は、これらに限定されないが、薬剤による治療、例えば、モノクローナル抗体療法、ＣＣＲ２アンタゴニスト（例えば、ＩＮＣ−８７６１）、抗ウイルス療法、シドホビルおよびインターロイキン２、ＭＳ対象のためのシタラビン（ＡＲＡ−Ｃとしても知られる）もしくはナタリズマブ（ｎａｔａｌｉｚｉｉｍａｂ）治療、または乾癬対象のためのエファリズマブ（ｅｆａｌｉｚｔｉｍａｂ）治療、またはＰＭＬ対象のための他の治療を含む、任意の数の適切な治療法と併用して（例えば、前、同時または後に）対象に投与する。いくつかの実施形態では、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、次：抗ＰＤ−１抗体（例えば、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、またはＰＦ−０６８０１５９１）、抗ＰＤ−Ｌ１抗体（例えば、アベルマブ、アテゾリズマブ、またはデュルバルマブ）、抗ＯＸ４０抗体（例えば、ＰＦ−０４５１８６００）、抗４−１ＢＢ抗体（例えば、ＰＦ−０５０８２５６６）、抗ＭＣＳＦ抗体（例えば、ＰＤ−０３６０３２４）、抗ＧＩＴＲ抗体、および／または抗ＴＩＧＩＴ抗体のうちの１つまたは複数と併用して対象に投与する。さらなる実施形態では、本発明の単離したＴ細胞は、化学療法、放射線療法、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６、抗体もしくは他の免疫除去剤、例えば、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体、または他の抗体療法、サイトキシン（ｃｙｔｏｘｉｎ）、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および／または照射と併用して使用することができる。このような薬物は、カルシウム依存性ホスファターゼであるカルシニューリンを阻害する（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）か、または増殖因子誘導シグナル伝達に重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）（Henderson, Naya et al. 1991；Liu, Albers et al. 1992；Bierer, Hollander et al. 1993）。さらなる実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンのような化学療法剤を使用したＴ細胞除去療法、外照射放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、またはＯＫＴ３もしくはＣＡＭＰＡＴＨのような抗体と併用して（例えば、前、同時または後に）対象に投与する。いくつかの実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えば、リツキサンのようなＢ細胞除去療法の後に投与する。例えば、一実施形態では、対象は、高用量の化学療法による標準的治療の後、末梢血幹細胞移植を受ける可能性がある。特定の実施形態では、移植の後、対象は、本発明の増殖免疫細胞の注入を受ける。いくつかの実施形態では、増殖細胞は、手術の前または後に投与する。
【００９５】
キット
本発明はまた、本発明の方法における使用のためのキットを提供する。本発明のキットは、本明細書に記載のウイルスタンパク質およびＣＡＲをコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む単離したＴ細胞を含む１つまたは複数の容器、ならびに本明細書に記載の本発明の方法のいずれかによる使用のための説明書を含む。一般には、このような説明書は、上記の治療的処置のための単離したＴ細胞の投与の説明を含む。
【００９６】
本明細書に記載の単離したＴ細胞の使用に関する説明書は、一般に、目的とする治療の用量、投与スケジュール、および投与経路についての情報を含む。容器は、単位用量、バルク包装（例えば、複数用量包装）またはサブユニット用量であり得る。本発明のキットに封入して提供される説明書は、典型的に、ラベルまたは添付文書（例えば、キットに含まれる紙のシート）上に書かれた説明書であるが、機械可読説明書（例えば、磁気または光学記憶ディスク上に保存された説明書）も許容される。
【００９７】
本発明のキットは、適切に包装される。適した包装は、バイアル、ビン、ジャー、柔軟材包装（例えば、密封したマイラー（Ｍｙｌａｒ）またはプラスチックのバッグ）等を含むが、これらに限定されない。吸入器、鼻腔投与装置（例えば、噴霧器）またはミニポンプ等の注入装置のような、特定の装置と組み合わせた使用のための包装もまた検討される。キットは、無菌アクセスポート（例えば、容器が静注用溶液のバッグまたは皮下注射針により穴を開けることが可能な栓を有するバイアルであり得る）を有し得る。容器はまた、無菌アクセスポート（例えば、容器が静注用溶液のバッグまたは皮下注射針により穴を開けることが可能な栓を有するバイアルであり得る）を有し得る。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、ウイルスタンパク質およびＣＡＲを含む単離したＴ細胞である。容器には、第２の薬学的に活性な薬剤をさらに含み得る。
キットでは、緩衝液および解釈的情報のような追加の要素を提供してもよい。通常、キットは、容器、および容器上または容器に付随したラベルまたは添付文書を含む。
以下の例は、例示目的のみのために提供し、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。実際、本発明の種々の改変は、本明細書に指示し記載するものに加えて、前述の記載により当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれる。
【実施例】
【００９８】
（例１）
Ｔ細胞上でのＭＨＣクラスＩ分子細胞表面発現の下方制御
本例では、ＣＡＲを発現する単離したＴ細胞上でのＭＨＣクラスＩの細胞表面発現を下方制御するウイルスタンパク質の使用を説明する。
【００９９】
宿主対移植片（ＨｖＧ）拒絶反応では、ドナー細胞上のＭＨＣは、宿主Ｔ細胞により認識され、これは次いで、ＭＨＣを発現しているドナー細胞を除去する。したがって、同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞由来のＭＨＣクラスＩの細胞表面発現を減少させてＣＡＲ−Ｔ細胞残留性を改善し、かつ／またはＨｖＧ拒絶反応から回復させることが望ましい。
【０１００】
単離したＴ細胞上でのＭＨＣクラスＩの細胞表面発現を下方制御する種々のウイルスタンパク質の能力を判定するために、表３に示すように、種々のＣＭＶタンパク質を同時発現するか、またはしない、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードする構築物により、ジャーカット細胞および１次ヒトＴ細胞を形質導入した。ＢＦＰを陰性対照タンパク質として使用した。発現構築物デザインに基づいて、ＣＡＲ＋細胞のみが、ＣＭＶタンパク質を同時発現可能である。
【表３】
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機能性ＭＨＣクラスＩ複合体は、形質導入細胞上でＨＬＡ  Ａ／Ｂ／Ｃに特異的な抗体を使用して検出し、抗ＢＣＭＡ  ＣＡＲ表面発現は、ビオチン化ＢＣＭＡを使用して検出した。結果を表４および５、ならびに図１および２にまとめる。
【表４】
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【０１０１】
【表５】
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【０１０２】
ウイルスタンパク質によるＭＨＣクラスＩ下方制御が、ＣＡＲ陽性Ｔ細胞において、様々なレベルで観察された。ウイルスタンパク質によるＭＨＣクラスＩ下方制御は、ＣＡＲおよびＩＣＰ４７、Ｋ３、Ｋ５、Ｅ１９、ＵＳ３、ＵＳ６またはＵＳ２を発現するＴ細胞において観察された（表４および５）。例えば、Ｋ５の発現は、ＣＡＲ＋ジャーカット細胞において、結果としてＭＨＣクラスＩの細胞表面発現の減少を伴った（図１、右；表４）。ＣＡＲ発現の減少は、ＭＨＣクラスＩ細胞表面発現のこの減少とともに観察されなかった（図１）。対照的に、ＵＳ１１の発現は、ＣＡＲ＋ジャーカット細胞において、ＭＨＣクラスＩの細胞表面発現を減少させなかった（図１、左；表４）。いくつかの例では、ＭＨＣクラスＩ下方制御は、ＣＡＲ表面発現の低下を伴った（データ未提示）。
【０１０３】
ウイルスタンパク質ＩＣＰ４７、Ｋ３、Ｋ５、Ｅ１９、Ｕ３、ＵＳ６およびＵＳ２それぞれのＣＡＲとの同時発現は、結果としてＭＨＣクラスＩ細胞表面発現を様々な程度減少させた（図２；表４および５）。図２では、左の棒グラフ（−）は、ＣＡＲまたはウイルスタンパク質を発現しない細胞を表し、右の棒グラフ（＋）は、ＣＡＲおよび指示するウイルスタンパク質を発現する細胞を表す。発現構築物デザインに基づいて、ＣＡＲ＋細胞のみが、ＣＭＶタンパク質を同時発現可能である。
このような結果は、ウイルスタンパク質が、ＣＡＲ−Ｔ細胞表面上でのＭＨＣクラスＩ提示を減少させることが可能であることを実証する。
【０１０４】
（例２）
本例では、インビトロおよびインビボの両方におけるＣＡＲ−Ｔ細胞活性およびＴ細胞による同種異系反応性に対する同時発現ウイルスタンパク質の作用を説明する。本試験では、種々のＣＭＶタンパク質を同時発現するＣＡＲ−Ｔ細胞を、インビトロでのＴ細胞による同種異系反応性アッセイを使用して評価する。ＭＨＣクラスＩ細胞表面発現を測定して、ＭＨＣクラスＩ細胞表面発現と同種異系反応性との相関性を判定する。
同種異系反応性を判定するために、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを利用する。アッセイは、２人の対立遺伝子不適合ドナー由来のＴ細胞をインキュベートし、次いで、増殖およびサイトカイン放出をモニターすることを含む。アッセイでは、不適合のＭＨＣ／ＴＣＲ対を有するドナーは、適合するＭＨＣ／ＴＣＲ対を有するドナーと比較して、増殖およびサイトカイン産生が増加することにより応答する。
【０１０５】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的特異的活性についてインビトロでの細胞傷害性アッセイを使用して試験する。このようなアッセイは、ＣＡＲ−Ｔ細胞を種々の割合の標的細胞と混合し、標的細胞の殺傷の程度を、標準的細胞傷害性測定を使用して測定することで構成される。最も大幅な同種異系反応性の減少を示しながらインビトロで著しい溶解活性を維持するＣＡＲ−Ｔ細胞を、活性および残留性について、ＮＳＧマウスモデルを使用して、インビボで試験する。簡潔には、このようなＣＡＲ−Ｔ細胞を担癌マウスに投与し、改変されていないＴ細胞を有するマウスおよびウイルスタンパク質を同時発現しないＣＡＲ−Ｔ細胞を有するマウスにおける腫瘍の増殖と、その腫瘍の増殖とを比較する。Ｔ細胞の残留性を末梢血、腫瘍および脾臓において測定する。ＨｖＧ反応をシミュレートするために、試験は、対立遺伝子不適合ドナー由来のＴ細胞に付加して、ＣＡＲ−Ｔ細胞の同種異系拒絶反応を誘導することを含む。
【０１０６】
（例３）
本例では、ＭＨＣクラスＩ細胞表面発現を下方制御するウイルスタンパク質を同時発現するＣＡＲ−Ｔ細胞のＮＫ細胞によるＨｖＧについての評価を説明する。
対立遺伝子適合ＭＨＣクラスＩ分子を欠く細胞は、ＮＫ細胞により非自己として認識され、除去される（宿主対移植片拒絶反応、またはＨｖＧ）。ＭＨＣクラスＩ表面発現を下方制御するウイルスタンパク質を同時発現するＣＡＲ−Ｔ細胞のＮＫ細胞によるＨｖＧの程度を判定するために、インビトロおよびインビボでのアッセイを使用する。
インビトロアッセイ。対立遺伝子非適合ドナー由来のＮＫ細胞を別々に精製する。精製したＮＫ細胞を、ＨｖＧ反応を誘導する能力について、ＭＬＲアッセイを使用して評価する。アッセイは、２人の対立遺伝子不適合ドナー由来のＴ細胞をインキュベートし、次いで、増殖およびサイトカイン放出をモニターすることを含む。アッセイでは、不適合のＭＨＣ／ＴＣＲ対を有するドナーは、適合するＭＨＣ／ＴＣＲ対を有するドナーと比較して、増殖およびサイトカイン産生が増加することにより応答する。
【０１０７】
（例４）
本例では、ウイルスタンパク質を発現してＭＨＣクラスＩ細胞表面発現を減少させるＣＡＲ−Ｔ細胞の、ＮＫ細胞による除去を減弱させる、抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体の使用を説明する。
ＫＩＲおよびレクチン様分子のようなＮＫ細胞阻害受容体を特異的に結合させる抗体を生成し、ＭＨＣクラスＩ阻害シグナル伝達を模倣する能力について試験する。生化学的アッセイおよび上記と同様のインビトロアッセイを使用して、その結合および機構的特性について抗体を評価する。選択された抗ＮＫ細胞阻害受容体抗体を一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）として、ウイルスタンパク質を同時発現するＣＡＲ−Ｔ細胞表面上に同時発現させ、前述のインビトロアッセイを使用して試験する。ＮＫ細胞による殺傷を減少させたＣＡＲ−Ｔ細胞を、インビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞活性、ＣＡＲ−Ｔ細胞残留性およびＨｖＧ拒絶反応について、前述のＮＳＧマウスモデルを使用して評価する。
【０１０８】
本明細書に開示する教示は、種々の出願、方法、キット、および組成物に関連して記載しているが、本明細書の教示および以下の特許請求の範囲に主張する発明から逸脱することなく、種々の変更および改変がなされ得ることが理解される。前述の例は、開示の教示をより良く説明するために提供し、本明細書に提示する教示の範囲を限定することは意図しない。本教示は、このような例示的実施形態に関して記載しているが、当業者は、このような例示的実施形態の多数の変形および改変が、過度の実験を行うことなく可能であることを容易に理解するであろう。このようなすべての変形および改変は、本教示の範囲内にある。
特許、特許出願、論文、教科書等を含む、本明細書において引用するすべての参照、およびそれらに引用される参照は、既に組み込まれていない範囲において、その全体を参照により本明細書に組み込む。組み込まれる文献および類似の資料の１つまたは複数が、これらに限定されないが、定義する用語、用語の用法、記載する技術等を含む本出願と異なるか、または矛盾する場合には、本出願により規制することとなる。
【０１０９】
前述の記載および例は、本発明のある特定の実施形態を詳述し、本発明者らが検討した最良の形態を記載する。ただし、前述が、本文においていかに詳細であるように思われようと、本発明は、様々な方法で実践することが可能であり、本発明は、添付の特許請求の範囲および任意のその等価物に従って解釈されるべきであることが理解されよう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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