(57)【要約】アルツハイマー病などの神経変性障害の予防または治療のための候補物質のスクリーニングのための方法および組成物が開示される。本開示はまた、公知のアルツハイマー病薬またはアルツハイマー病薬と推定されるものについて作用の機序を同定すること、ならびに概して、CD33を発現する細胞の機能をモジュレートするための組成物および方法にも関する。2020526201.tif 000004
2020526201.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性障害の予防剤または治療剤の候補物質の治療有効性を試験するための方法であって、
a．任意で、完全長ヒトCD33を発現する免疫細胞または免疫様細胞を培養する段階；
b．前記CD33発現免疫細胞または免疫様細胞を、妥当な濃度の前記候補物質で処理する段階；
c．前記CD33発現免疫細胞または免疫様細胞を、妥当な濃度のアミロイド-β（Aβ）で処理する段階；
d．前記CD33発現細胞におけるAβの細胞内レベルを測定する段階
を含み、
その結果、候補物質で処理されたCD33細胞におけるAβのレベルが陰性対照に比して高いことにより、治療有効性が示されると考えられる、方法。
【請求項２】
免疫細胞または免疫様細胞がミクログリア細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
神経変性障害の予防剤または治療剤の候補物質の治療有効性を試験するための方法であって、
a．任意で、完全長ヒトCD33を発現する免疫細胞または免疫様細胞を培養する段階；
b．前記CD33発現免疫細胞または免疫様細胞を、妥当な濃度の前記候補物質で処理する段階；
c．前記CD33発現免疫細胞または免疫様細胞を、リポ多糖で処理する段階；
d．前記CD33発現細胞の培地における炎症誘発性サイトカインのレベルを測定する段階
を含み、
その結果、候補物質で処理されたCD33細胞の培地における炎症誘発性サイトカインのレベルが陰性対照に比して低いことにより、治療有効性が示されると考えられる、方法。
【請求項４】
免疫細胞または免疫様細胞がミクログリア細胞である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
神経変性障害が、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、パーキンソン病、認知症、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病および多発性硬化症から選択されるが、それらには限定されない、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
物質とヒトCD33との結合性相互作用を試験するための方法であって、
a．任意で、完全長ヒトCD33を発現する免疫細胞または免疫様細胞を培養する段階；
b．前記CD33発現免疫細胞または免疫様細胞を、妥当な濃度の前記物質で処理する段階；
c．結合性相互作用の読み取り値を標準的アッセイを用いて測定する段階；
を含み、
その結果、前記物質で処理したCD33細胞における読み取り値が陰性対照に比して高いことにより、結合性相互作用が示されると考えられる、方法。
【請求項７】
免疫細胞または免疫様細胞がミクログリア細胞である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
1-(3-(2-(1-ベンゾチオフェン-5-イル)エトキシ)プロピル)アゼチジン-3-オールまたはその塩を含む、ミクログリア細胞の機能をモジュレートするための医薬組成物。
【請求項９】
ミクログリア細胞の機能をモジュレートするための方法であって、それを必要とする患者に対して、1-(3-(2-(1-ベンゾチオフェン-5-イル)エトキシ)プロピル)アゼチジン-3-オールまたはその塩を投与する段階を含む、方法。
【請求項１０】
患者が、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、パーキンソン病、認知症、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病または多発性硬化症を有する、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
ミクログリア細胞の機能をモジュレートすることが、ミクログリア細胞の食作用を強化するかまたはサイトカイン産生を阻害することである、請求項8または9記載の方法。
【請求項１２】
ミクログリア細胞の機能をモジュレートするための方法であって、それを必要とする患者に対して、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法によって同定された物質を投与する段階を含む、方法。
【請求項１３】
物質が、1-(3-(2-(1-ベンゾチオフェン-5-イル)エトキシ)プロピル)アゼチジン-3-オールまたはその塩である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
患者が、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、パーキンソン病、認知症、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病または多発性硬化症を有する、請求項12または13記載の方法。
【請求項１５】
神経変性疾患を治療または予防するための方法であって、患者に対して、開示されたアッセイにおいて見込みのある薬物であると同定された組成物の治療的な用量または投与量を投与する段階を含む、方法。
【請求項１６】
神経変性疾患がアルツハイマー病である、請求項15記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国特許法第119（e）条（35 U.S.C. §119（e））の下で、2017年7月8日に提出された米国仮出願第62／530,125号および2017年7月21日に提出された米国仮出願第62／535,589号の恩典を主張し、これらのそれぞれの内容は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
技術分野
本開示は概して、神経変性障害の予防または治療のための候補物質のスクリーニングのための方法および組成物に関する。本開示はまた、概して、CD33を発現する細胞の機能をモジュレートするための組成物および方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
神経変性疾患は重篤で頻度が高く、世界的な問題になってきている。これらには、アルツハイマー病（AD）、認知機能障害、パーキンソン病、認知症、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、ハンチントン病または多発性硬化症が含まれる。特に高齢者では、神経変性疾患は苦痛と生活の質の低下を引き起こし、死亡の主な予測因子となっている。アルツハイマー病（AD）は高齢者において最も頻度の高い型の神経変性疾患であり、米国および全世界で高齢者の人口が増すのに伴って、ADはエピデミックの規模に近づいている。ADは進行性の認知症およびパーソナリティ機能障害によって特徴づけられる。変性ニューロンおよび反応性アストロサイトの近傍でのアミロイドプラークの異常蓄積が、ADの病理学的特徴である。
【０００４】
ミクログリアは脳に存在する免疫細胞であり、アミロイド-β（Abeta、Aβ）などの有毒な病原体の排除を担っている。ADが進行するうちに、ミクログリアは、神経保護性／食作用誘発性の状態から、炎症誘発性サイトカインの分泌増大を特徴とする神経毒性状態に移行する（Heneka et al. Nature Immunology, 2015（非特許文献1））。家族に基づく大規模なGWAS解析（Bertram et al., Am. J. Hum. Genet., 2008（非特許文献2））において、ミクログリア受容体CD33は遅発型ADの危険因子であることが見いだされた。また、CD33がミクログリア細胞におけるAβの取り込みおよび排除を阻害することによって、アミロイド病態を促進することも発見されている（Griciuc et al., Neuron, 2013（非特許文献3））。
【０００５】
ドネペジルおよびメマンチンなどの薬物はADの症状を治療するが、それらは疾患そのものを治療するわけではない。新薬であるT-817MA（1-{3-[2-(1-ベンゾチオフェン-5-イル)エトキシ]プロピル}-3-アゼチジノールマレイン酸塩）は、第1相および第2相臨床試験の段階にあり、Aβによる毒性に対するその神経保護効果および神経突起伸長を促進するその作用は、文書で十分に裏づけられている（Takamura et al., Neurobiol Aging, 2014（非特許文献4））。これらの薬物がどのようにCD33と相互作用してCD33の活性をモジュレートするかは不明である。加えて、ADなどの神経変性疾患に対する新たな治療を発見することも依然として必要とされている。例えば、生物学的に意義のある化合物および化合物の組み合わせ、ならびにそれらの用量反応に対して適用しうる迅速スクリーニング法は、この分野における大幅な進歩をもたらして、これらの疾患の根絶および抑止の一助となりうる画期的な治療法および薬物につながると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Heneka et al. Nature Immunology, 2015
【非特許文献２】Bertram et al., Am. J. Hum. Genet., 2008
【非特許文献３】Griciuc et al., Neuron, 2013
【非特許文献４】Takamura et al., Neurobiol Aging, 2014
【発明の概要】
【０００７】
概要
本開示は、神経変性障害の予防または治療のための候補物質のスクリーニングのための方法の発見に関する。本開示はまた、ミクログリア受容体CD33が神経変性疾患における危険因子であることの発見、ならびにスクリーニングアッセイおよび機構プローブとしての、CD33を発現する細胞の機能をモジュレートするための組成物および方法にも関する。
【０００８】
1つの局面においては、神経変性障害の予防剤または治療剤の候補物質の治療有効性を試験するための方法が提供される。概して、本方法は、本明細書においてCD33発現免疫細胞または免疫様細胞とも称される、完全長ヒトCD33を発現する免疫細胞または免疫様細胞を、妥当な濃度の候補物質で処理する段階、前記処理されたCD33発現免疫細胞または免疫様細胞を、妥当な濃度のアミロイド-β（Abeta、Aβ）またはリポ多糖でさらに処理する段階、およびAβの細胞内レベル（Aβで処理された細胞の場合）または炎症誘発性サイトカインの培地中レベル（リポ多糖で処理された細胞の場合）を測定する段階を含む。CD33発現免疫細胞または免疫様細胞は、任意で、候補物質による処理の前に培養することができる。
【０００９】
Aβによる処理を含む方法の諸態様においては、候補物質で処理されたCD33細胞におけるAβのレベルが陰性対照に比して高いことにより、被験候補物質が治療有効性を有することが示される。リポ多糖による処理を含む方法の諸態様においては、候補物質で処理されたCD33細胞の培地における1つまたは複数の炎症誘発性サイトカインのレベルが陰性対照に比して低いことにより、被験候補物質が治療有効性を有することが示される。
【００１０】
いくつかの態様において、本方法は、CD33発現免疫細胞または免疫様細胞を、妥当な濃度の候補物質で処理する段階；前記処理されたCD33発現免疫細胞または免疫様細胞を、妥当な濃度のアミロイド-β（Abeta、Aβ）でさらに処理する段階；および前記CD33発現細胞におけるAβの細胞内レベルを測定する段階を含み、ここで、候補物質で処理されたCD33細胞におけるAβのレベルが陰性対照に比して高いことにより、被験候補物質が治療有効性を有することが示される。
【００１１】
いくつかの態様において、本方法は、CD33発現免疫細胞または免疫様細胞を、妥当な濃度の候補物質で処理する段階；前記処理されたCD33発現免疫細胞または免疫様細胞をリポ多糖でさらに処理する段階；および前記CD33発現細胞の培地における炎症誘発性サイトカインのレベルを測定する段階を含み、ここで、候補物質で処理されたCD33細胞の培地における炎症誘発性サイトカインのレベルが陰性対照に比して低いことにより、被験候補物質が治療有効性を有することが示される。
【００１２】
もう1つの局面においては、物質のヒトCD33との結合性相互作用を試験するための方法が提供される。概して、本方法は、前記CD33発現免疫細胞または免疫様細胞を、妥当な濃度の候補物質で処理する段階；および結合性相互作用の読み取り値を標準的アッセイを用いて測定する段階を含み、ここで、物質で処理したCD33細胞における読み取り値が陰性対照に比して高いことにより、結合性相互作用が示される。CD33発現免疫細胞または免疫様細胞は、任意で、候補物質による処理の前に培養することができる。
【００１３】
本明細書に記載のさまざまな局面のいくつかの態様において、CD33発現免疫細胞または免疫様細胞はミクログリア細胞である。
【００１４】
本明細書に記載のさまざまな局面のいくつかの態様において、CD33発現免疫細胞または免疫様細胞は、任意で、候補物質による処理の前に培養することができる。
【００１５】
治療有効性またはCD33との結合性相互作用を有すると同定された物質は、ミクログリア細胞の機能をモジュレートするために用いることができる。ミクログリア細胞はインビトロ、インビボまたはエクスビボにあってよい。したがって、もう1つの局面において、本明細書において提供されるのは、対象におけるミクログリア細胞の機能をモジュレートするためのための方法である。概して、本方法は、それを必要とする患者または対象に対して、本明細書に記載の方法によって同定された物質を投与する段階を含む。
【００１６】
いくつかの態様において、対象に投与される物質は、本明細書に記載の方法によって、治療有効性を有すると同定されている。
【００１７】
いくつかの態様において、対象に投与される物質は、1-(3-(2-(1-ベンゾチオフェン-5-イル)エトキシ)プロピル)アゼチジン-3-オールまたはその塩である。
【００１８】
いくつかの態様において、本方法は、対象における神経変性疾患を治療するため、または予防するために用いることができる。例えば、それを必要とする患者または対象に対して、本明細書に記載の方法によって同定された物質の治療的な用量または投与量を投与することによって用いることができる。例示的な神経変性障害には、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、パーキンソン病、認知症、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病および多発性硬化症が非限定的に含まれる。例えば、本方法をアルツハイマー病に対して適用することができる。
【００１９】
もう1つの局面においては、ミクログリア細胞の機能をモジュレートするための医薬組成物が提供される。一般に、医薬組成物は、1-(3-(2-(1-ベンゾチオフェン-5-イル)エトキシ)プロピル)アゼチジン-3-オールまたはその塩を含む。
【００２０】
いくつかの態様において、医薬組成物は、薬学的に許容される添加剤または担体をさらに含む。
【００２１】
本明細書に記載のさまざまな局面のいくつかの態様において、本方法は、ミクログリア細胞の食作用を強化するかまたはサイトカイン産生を阻害することを含む。
【００２２】
本明細書に記載のさまざまな局面のいくつかの態様において、化合物は1-(3-(2-(1-ベンゾチオフェン-5-イル)エトキシ)プロピル)アゼチジン-3-オールマレイン酸塩であり、これは本明細書においてT-817MAとも称される。
【００２３】
本発明のその他の特徴および利点は、詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。したがって、本発明の他の局面は下記の開示において記載されており、本発明の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】DMSO、817MA、817A11、および614Pによる5時間の処理後のナイーブBV2ミクログリア細胞に対する乳酸デヒドロゲナーゼ（LDH）毒性アッセイの結果を、棒グラフとして示している。これらの濃度では統計的に有意な毒性は認められなかった。
【図２】DMSO、817MA、817A11および614Pによる5時間の処理後のwtCD33発現ミクログリア細胞に対するLDH毒性アッセイの結果を、棒グラフとして示している。これらの濃度では統計的に有意な毒性は認められない。
【図３】ナイーブBV2ミクログリア細胞へのAbeta42取り込みアッセイに関する結果を、折れ線グラフとして示している。ナイーブBV2ミクログリア細胞へのDMSO、817MA、817A11および614Pに関する結果を示している。化合物817MAおよび817A11は、同程度のAbeta42取り込みEC50を有する。化合物614Pは、より高いEC50を有する。
【図４】wt-CD33発現BV2細胞へのAbeta42取り込みアッセイに関する結果を、折れ線グラフとして示している。wt-CD33発現BV2細胞へのDMSO、817MA、817A11および614Pに関する結果を示している。化合物817MAおよび817A11は、同程度のAbeta42取り込みEC50を有する。化合物614Pは、より高いEC50を有する。
【図５】ナイーブBV2ミクログリア細胞へのAbeta40取り込みアッセイに関する結果を、折れ線グラフとして示している。ナイーブBV2ミクログリア細胞へのDMSO、817MA、817A11および614Pに関する結果を示している。化合物817A11は、817MAよりも低い取り込みEC50を有する。化合物614Pは、817MAおよび817A11のどちらよりも高いEC50を有する。
【図６】wt-CD33発現BV2細胞へのAbeta40取り込みアッセイに関する結果を、折れ線グラフとして示している。wt-CD33発現BV2細胞へのDMSO、817MA、817A11および614Pに関する結果を示している。化合物817A11は、817MAよりも低い取り込みEC50を有する。化合物614Pは、817MAおよび817A11のどちらよりも高いEC50を有する。
【図７】LPS活性化を示している表である。ミクログリア馴化培地中の10種のサイトカインを同時に分析した。サイトカインKC／GRO、IL-6、IL-10およびTNF-αは、LPS活性化を受けて検出可能なレベルを示した。KC／GROは非希釈培地中でのみ検出可能であった。サイトカインIFN-γ、IL-2、IL-5、IL-12p70、IL-1βおよびIL-4は検出されなかった。
【図８】BV2でのTNFαのLPS活性化についての第1の実験に関する結果を、折れ線グラフとして示している。このグラフは、TNFα濃度産生反応を、DMSO、817MA、817A11および614Pの添加濃度との関係で示している。化合物817MAが、TNFα産生を有効に低下させた唯一の化合物である。
【図９】BV2でのTNFαのLPS活性化についての第2の実験に関する結果を、折れ線グラフとして示している。このグラフは、TNFα濃度産生反応を、DMSO、817MA、817A11および614Pの添加濃度との関係で示している。化合物817MAが、TNFα産生を有効に低下させた唯一の化合物である。
【図１０】BV2でのIL-6のLPS活性化についての第1の実験に関する結果を、折れ線グラフとして示している。このグラフは、IL-6濃度産生反応を、DMSO、817MA、817A11および614Pの添加濃度との関係で示している。化合物817MAが、IL-6産生を低下させるのに最も有効な化合物である。
【図１１】BV2でのIL-6のLPS活性化についての第2の実験に関する結果を、折れ線グラフとして示している。このグラフは、IL-6濃度産生反応を、DMSO、817MA、817A11および614Pの添加濃度との関係で示している。化合物817MAが、IL-6産生を低下させるのに最も有効な化合物である。
【図１２】BV2でのIL-10のLPS活性化についての第1の実験に関する結果を、折れ線グラフとして示している。このグラフは、IL-10濃度産生反応を、DMSO、817MA、817A11および614Pの添加濃度との関係で示している。化合物817MAが、IL-10産生を低下させるのに最も有効な化合物である。
【図１３】BV2でのIL-10のLPS活性化についての第2の実験に関する結果を、折れ線グラフとして示している。このグラフは、IL-10濃度産生反応を、DMSO、817MA、817A11および614Pの添加濃度との関係で示している。化合物817MAが、IL-10産生を低下させるのに最も有効な化合物である。
【図１４】BV2でのKC／GROのLPS活性化についての第1の実験に関する結果を、折れ線グラフとして示している。このグラフは、KC／GRO濃度産生反応を、DMSO、817MA、817A11および614Pの添加濃度との関係で示している。
【図１５】BV2でのKC／GROのLPS活性化についての第2の実験に関する結果を、折れ線グラフとして示している。このグラフは、KC／GRO濃度産生反応を、DMSOおよび817MAの添加濃度との関係で示している。
【図１６】AD 3D ReN細胞培養系における第1の試験によるデータに関する結果を、棒グラフの形で示している。この試験は、被験化合物DMSO、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）による1週間の処理後のHReN30-mGAP30培地におけるLDHアッセイである。各細胞系について、nは3または4である。
【図１７】AD 3D ReN細胞培養系における第2の試験によるデータに関する結果を、棒グラフの形で示している。この試験は、被験化合物DMSO、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）による1週間の処理後のHReN30-mGAP10#D4培地におけるLDHアッセイである。各細胞系について、nは3または4である。
【図１８Ａ】図18A〜18Hは、薬物処理後の可溶性培地（横軸）および不溶性Abetaレベル（縦軸）に関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。図18Aは、HReN30（HReN-mGAP30）培地におけるAbeta40を示している。
【図１８Ｂ】図18A〜18Hは、薬物処理後の可溶性培地（横軸）および不溶性Abetaレベル（縦軸）に関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。図18Bは、HReN30（HReN-mGAP30）培地におけるAbeta42を示している。
【図１８Ｃ】図18A〜18Hは、薬物処理後の可溶性培地（横軸）および不溶性Abetaレベル（縦軸）に関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。図18Cは、HReN30（HReN-mGAP30）不溶性画分におけるAbeta40を示している。
【図１８Ｄ】図18A〜18Hは、薬物処理後の可溶性培地（横軸）および不溶性Abetaレベル（縦軸）に関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。図18Dは、HReN30（HReN-mGAP30）不溶性画分におけるAbeta42を示している。図18E〜18Hは、ReN-mGAP#D4実験である。
【図１８Ｅ】図18A〜18Hは、薬物処理後の可溶性培地（横軸）および不溶性Abetaレベル（縦軸）に関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。図18E〜18Hは、ReN-mGAP#D4実験である。図18Eは、ReN-mGAP10#D4（ReN-mGAP#D4）培地におけるAbeta40を示している。
【図１８Ｆ】図18A〜18Hは、薬物処理後の可溶性培地（横軸）および不溶性Abetaレベル（縦軸）に関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。図18E〜18Hは、ReN-mGAP#D4実験である。図18Fは、ReN-mGAP10#D4（ReN-mGAP#D4）培地におけるAbeta42を示している。
【図１８Ｇ】図18A〜18Hは、薬物処理後の可溶性培地（横軸）および不溶性Abetaレベル（縦軸）に関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。図18E〜18Hは、ReN-mGAP#D4実験である。図18Gは、ReN-mGAP10#D4（ReN-mGAP#D4）不溶性画分におけるAbeta40を示している。
【図１８Ｈ】図18A〜18Hは、薬物処理後の可溶性培地（横軸）および不溶性Abetaレベル（縦軸）に関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。図18E〜18Hは、ReN-mGAP#D4実験である。図18Hは、ReN-mGAP10#D4（ReN-mGAP#D4）不溶性画分におけるAbeta42を示している。
【図１９Ａ】図19A〜19Dは、薬物処理後の不溶性p-タウレベルおよび総p-タウレベルに関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、DMSO、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。図19Aおよび19Bは、HReN-mGAP30試験である。図19Aは、HReN30不溶性画分におけるpタウ181濃度（単位／mL）を示している。
【図１９Ｂ】図19A〜19Dは、薬物処理後の不溶性p-タウレベルおよび総p-タウレベルに関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、DMSO、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。図19Aおよび19Bは、HReN-mGAP30試験である。図19Bは、HReN30不溶性画分におけるpタウ181濃度（pg／mL）を示している。
【図１９Ｃ】図19A〜19Dは、薬物処理後の不溶性p-タウレベルおよび総p-タウレベルに関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、DMSO、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。図19Cおよび図19Dは、ReN-mGAP#D4試験である。図19Cは、ReN-mGAP10#D4不溶性画分におけるpタウ181濃度（単位／mL）を示している。
【図１９Ｄ】図19A〜19Dは、薬物処理後の不溶性p-タウレベルおよび総p-タウレベルに関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、DMSO、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。図19Cおよび図19Dは、ReN-mGAP#D4試験である。図19Dは、ReN-mGAP10#D4不溶性画分におけるpタウ181濃度（pg／mL）を示している。
【図２０】ReN-mGAP#D4（4週間の分化）における一連の画像を示している。
【図２１】HReN-mGAP30（7週間の分化）における一連の画像を示している。
【図２２】AD 3D ReN細胞培養系におけるニトロプルシドナトリウム（SNP）毒性試験に関するデータの棒グラフを示している。このデータは、SNPによる1日間の処理後の、B27を伴わないReN細胞におけるWST-8アッセイのものである。
【図２３−１】4日間の817MA処理および1日間のSNP処理の後の、B27を伴わないReN細胞におけるWST-8アッセイに関するデータの棒グラフを示している。
【図２３−２】4日間の817MA処理および1日間のSNP処理の後の、B27を伴わないReN細胞におけるWST-8アッセイに関するデータの棒グラフを示している。
【図２４】4日間の817MA処理および1日間のSNP処理後の、B27を伴わないReN細胞におけるWST-8アッセイ（％生存度）に関するデータの棒グラフを示している。
【図２５】ミクログリア細胞における毒性（LDH）アッセイに関するデータの棒グラフを示している。被験化合物はさまざまな濃度の817MAであり、DMSO対照も含む。50μMの濃度は取り込み分析から除外した。
【図２６】Abeta42取り込みアッセイに関するデータの棒グラフを示している。このデータから、ミクログリア細胞における817MAによるAbeta42の取り込みが確かめられる。24時間の化合物前処理の後、EC50は約20μMである。
【図２７Ａ】図27Aおよび27Bは、817MA処理に関する例示的な時系列図を示している。
【図２７Ｂ】図27Aおよび27Bは、817MA処理に関する例示的な時系列図を示している。
【図２８】第26日のSNP濃度に応じた細胞生存度に関するデータの棒グラフを示している。
【図２９】選択した濃度での細胞生存度に関するデータの棒グラフを示している。各細胞系について、n＝3または4である。
【図３０Ａ】3日後のSNP誘導毒性に対する817MAの効果に関するデータを示す棒グラフを示している。
【図３０Ｂ】3週間後のSNP誘導毒性に対する817MAの効果に関するデータを示す棒グラフを示している。
【図３１Ａ】3日間にわたる細胞生存度（SNPなし）に対する817MAの効果に関するデータの棒グラフを示している。
【図３１Ｂ】3週間にわたる細胞生存度（SNPなし）に対する817MAの効果に関するデータの棒グラフを示している。
【図３２】細胞に対するSNPの効果を例証している一連の顕微鏡画像を示している。
【図３３】細胞に対するSNPの効果を例証している第2の一連の顕微鏡画像を示している。
【図３４−１】非AD細胞におけるSNP誘導毒性に対する、817MAによる4日間の処理の効果に関するデータの棒グラフを示している。
【図３４−２】非AD細胞におけるSNP誘導毒性に対する、817MAによる4日間の処理の効果に関するデータの棒グラフを示している。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
本開示は一部には、神経変性疾患または神経変性障害の治療において見込みのある薬物を検討するために有益なツールの発見に基づく。本開示はまた、一部には、遅発型ADにおける危険因子であってアミロイド病態につながるミクログリア受容体を発現する細胞を作製することにも基づく。本明細書に記載するように、そのような細胞を、神経変性障害に対する治療物として見込みのある薬物候補をスクリーニングするために用いうることが見いだされた。これらの細胞はまた、薬物活性の機序への、および有効な薬物治療の重要な特徴（例えば、構造と活性の関係）の発見への洞察も与える。加えて、本開示は、神経変性障害の治療において、およびCD33発現細胞に対するそれらの効果において有効である組成物も提供する。
【００２６】
したがって、1つの態様においては、神経変性障害の予防剤または治療剤の候補物質の治療有効性を試験するための方法が提供される。概して、本方法は、完全長ヒトCD33を発現する免疫細胞または免疫様細胞を、妥当な濃度の候補物質で処理する段階を含む。本方法はまた、処理されたCD33発現免疫細胞または免疫様細胞を、妥当な濃度のアミロイド-βで処理する段階、およびAβの細胞内レベルを測定する段階を含む。Aβ処理に代わる代替的な態様において、本方法は、CD33発現免疫細胞または免疫様細胞をリポ多糖で処理する段階、およびこれらの細胞の培地における炎症誘発性サイトカインのレベルを測定する段階を含む。CD33発現免疫細胞または免疫様細胞は、任意で、候補物質による処理（Aβまたはリポ多糖）の前に、培養することができる。
【００２７】
治療物（therapeutic）とは、疾患、病状または障害の症状を軽減する目的、またはそれらを治癒する目的で用いられる、任意の薬物、物質、化合物、化合物の組み合わせ、治療剤または治療法のことを指す。いくつかの態様において、治療物は、スクリーニングアッセイまたはスクリーニング試験が完了するまではその有効性が不明であるような被験化合物であってよい。
【００２８】
治療有効性は、被験化合物（例えば、物質、化合物、化合物の組み合わせ、治療剤または治療法）がどの程度有効であるかに関する。治療有効性を有する被験化合物とは、それが、疾患もしくは病状の症状を軽減するかまたは疾患もしくは病状を治癒することに関して、対照と比較してより有効であることを意味する。加えて、被験化合物の高い治療有効性とは、それが、疾患もしくは病状の症状を軽減するかまたは疾患もしくは病状を治癒することに関して、治療有効性のより低い別の被験化合物と比較してより有効であることを意味する。例えば、対照は、治療有効性のある被験化合物よりも、治療有効性の低い化合物であってよく、疾患もしくは病状の症状を軽減するかまたは疾患もしくは病状を治癒することに関して、同程度に有効ではない。「より有効な」という用語は、より有効でない治療物と比較して、より低投与量の治療物が同じ量の便益を与えること、より望ましくない、有害なもしくは有毒な副作用がより少ないこと、または、より有効な治療物が付加的な便益（例えば、健康上の便益、費用便益）を有することを含みうる。
【００２９】
毒性および治療有効性は、例えば、LD50（集団の50％にとって致死的な用量）およびED50（集団の50％に治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性作用と治療効果との用量比が治療指数であり、これはLD50／ED50の比として表現することができる。治療指数の大きい組成物が好ましい。本明細書で用いる場合、EDという用語は有効用量を表し、動物モデルに関連して用いられる。ECという用語は有効濃度を表し、インビトロモデルに関連して用いられる。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「対照」は、治療効果もしくは治療有効性がないか、または何らかの特定の量の有効性の治療効果などのように治療効果が判明している、薬物、物質、化合物、複数の化合物および／または試験条件である。本明細書で用いる場合、「陰性対照」は、被験治療用組成物と類似の物理的特性を有するが治療効果を有しないことが判明している対照である。例えば、陰性対照は、試験中に被験化合物が溶解される／組み合わされる溶媒、希釈剤または送達剤であってよいが、陰性対照として被験化合物は溶媒、希釈剤または送達剤中で／から除外される。例えば、被験化合物は、溶媒、DMSO、水、アルコール、ミセル、ベシクル、タンパク質、ポリマーまたは錯化剤のうち任意の1つまたは複数であってよい。「陽性対照」は、判明している治療効果があり、それ故にその治療効果に関して試験において肯定的な結果をもたらすと考えられる対照であってよい。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「候補化合物」、「候補物質」、「被験化合物」または「被験作用物質」という用語は、試験しようとする任意の化合物、分子または作用物質のことを指す。本明細書で用いる場合、互換的に用いられるこれらの用語は、単純または複雑な有機分子もしくは無機分子、低分子、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、糖質、またはリポタンパク質などの、生物学的または化学的な化合物のことを指す。極めて多岐にわたる化合物、例えばオリゴペプチドおよびオリゴヌクレオチドなどのオリゴマー、ならびに合成有機化合物を、さまざまなコア構造に基づいて合成することができ、これらには上述した用語も含まれる。加えて、さまざまな天然の供給源からも、植物性または動物性の抽出物および同様のものなどの、スクリーニングのための化合物を得ることができる。化合物は個別に試験することもでき、または互いに組み合わせて試験することもできる。作用物質または候補化合物は、無作為に選択すること、または合理的に選択もしくは設計することができる。本明細書で用いる場合、作用物質が、作用物質と標的化合物または標的部位との間の特異的相互作用を考慮せずに無作為に選択される場合には、作用物質または候補化合物は「無作為に選択される」と言われる。本明細書で用いる場合、作用物質が、作用物質と標的部位との間の特異的相互作用および／または作用物質の作用に関連した立体構造を考慮して非無作為的に選択される場合には、作用物質は「合理的に選択または設計される」と言われる。いくつかの態様において、本明細書に記載のアッセイは、例えば、被験化合物の選択を精緻にしていきながら一連のアッセイまたはスクリーニングに反復的な様式で投入される被験化合物の有効性について機構上の見通しを与えることによって、合理的な設計を導くために用いることができる。被験化合物は対照化合物であってよい。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「低分子」という用語は、「天然物様」である化合物を指すことができる。しかし、「低分子」という用語は「天然物様」の化合物には限定されない。そうではなくて、低分子は典型的には、それがいくつかの炭素-炭素結合を含むこと、および約50ダルトンを上回るが約5000ダルトン（5kD）未満である分子量を有することを特徴とする。好ましくは、低分子は、3kD未満、さらにより好ましくは2kD未満、最も好ましくは1kD未満である分子量を有する。場合によっては、低分子は、700ダルトンと等しいかそれ未満である分子質量を有することが好ましい。
【００３３】
実施される特定の態様によっては、被験化合物を、溶液中に遊離した状態で提供することができ、または担体もしくは固体支持体、例えばビーズに結びつけてもよい。いくつかの適した固体支持体を、被験化合物の固定化のために用いることができる。適した固体支持体の例には、アガロース、セルロース、デキストラン（すなわち、セファデックス（Sephadex）、セファロース（Sepharose）として市販されている）カルボキシメチルセルロース、ポリスチレン、ポリエチレングリコール（PEG）、濾紙、ニトロセルロース、イオン交換樹脂、プラスチックフィルム、ポリアミンメチルビニルエーテルマレイン酸コポリマー、ガラスビーズ、アミノ酸コポリマー、エチレン-マレイン酸コポリマー、ナイロン、絹などが含まれる。加えて、本明細書に記載の方法の場合に、被験化合物は個別に、またはグループでスクリーニングすることができる。グループでのスクリーニングは、有効な被験化合物のヒット率が低いことが予想され、そのため所与の群について複数の陽性結果が予想されないと考えられる場合に、特に有用である。グループでのスクリーニングはまた、相乗的に作用しうるヒットを判定するためにも有用である。
【００３４】
本明細書で用いる場合、「神経変性疾患」という用語は、神経組織および／または神経組織機能の段階的および進行性の喪失を特徴とする、多様な種別の中枢神経系障害のことを指す。神経変性疾患は一群の神経学的障害または疾患であり、その神経学的疾患は神経組織の段階的および進行性の喪失、および／または神経組織の段階的および進行性の喪失の結果としての神経学的機能の改変、典型的には神経学的機能の低下を特徴とする。神経変性疾患の例には、例えば、アルツハイマー病（AD）、パーキンソン病（PD）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ALS、ルー・ゲーリッグ病とも命名される）および多発性硬化症（MS）、ポリグルタミン伸長障害（例えば、HD、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、ケネディ病（球脊髄性筋萎縮症とも称される）、脊髄小脳失調症（例えば、1型、2型、3型（マシャド・ジョセフ病とも称される）、6型、7型および17型））、他の三塩基反復伸長障害（例えば、脆弱X症候群、脆弱XE精神遅滞症、フリートライヒ運動失調症、筋緊張性ジストロフィー、脊髄小脳失調症8型および脊髄小脳失調症12型）、アレキサンダー病、アルパース病、毛細血管拡張性運動失調症、バッテン病（スピールマイヤー・フォークト・シェーグレン・バッテン病）、カナバン病、コケイン症候群、大脳皮質基底核変性症、クロイツフェルト・ヤコブ病、虚血性脳卒中、クラッベ病、レビー小体型認知症、多系統萎縮症、ペリツェウス・メルツバッハ病、ピック病、原発性側索硬化症、レフサム病、サンドホフ病、シルダー病、脊髄損傷、脊髄性筋萎縮症（SMA）、スティール・リチャードソン・オルゼウスキー症候群、脊髄癆などが非限定的に含まれる。いくつかの態様において、疾患は、アルツハイマー病、軽度認知機能障害、パーキンソン病、認知症、統合失調症、筋萎縮性側索硬化症ハンチントン病または多発性硬化症といった、これらの疾患のサブセットである。いくつかの他の態様において、神経変性疾患はアルツハイマー病である。
【００３５】
本明細書において記載する場合、「細胞を培養すること」または「1つの細胞を培養すること」とは、細胞を、その集団を増やすために増殖させることを指す。これは「細胞培地」（本明細書では「培地」または「培養基」とも称する）中で行うことができ、これは本明細書において言及される場合、細胞の生存を維持して増殖を支える栄養分を含有する、細胞を培養するための培養基のことである。細胞培地は、以下の任意のものを適した組み合わせで含有することができる：塩、緩衝剤、アミノ酸、グルコースまたは他の糖、抗生物質、血清または血清代替物、およびペプチド増殖因子などの他の構成要素、その他。特定の細胞種のために通例用いられる細胞培地は、当業者に公知である。加えて、本明細書に記載するようなアッセイおよび試験の目的のためには、細胞培養物は薄膜もしくは単層などの2D細胞培養物であってもよく、または3D細胞培養物であってもよい。細胞を培養して3D構造にするための多種多様な手法が今日では存在する。限定はされないが、これらの3D細胞培養モデルには、ポリマー性硬質スカフォールド、生体スカフォールド、マイクロパターン化表面マイクロプレート、懸滴マイクロプレート、超低接着コーティングを含有するスフェロイドマイクロプレート、またはマイクロ流体3D細胞培養物が含まれうる。いくつかの態様においては、例えば、A 3D human neural cell culture system for modeling Alzheimer's disease, Y. H Kim et al., Nat Protoc. 2015 Jul; 10(7): 985-1006に記載されたような、AD 3D ReN細胞培養系を利用することができる。
【００３６】
本明細書で用いる場合、「免疫」細胞および「免疫様」細胞とは、病原体を貪食する、破壊する、または無能力にする、さまざまな細胞のいずれかのことである。例えば、病原体に対する防御を行うこと、および組織修復を補助することによって、免疫系において機能しうる細胞である。これらには、骨髄中で産生される白血球（white blood cell）（例えば、白血球（leukocyt）、白血球（white cell）、白血球（white corpuscle））が含まれる。免疫細胞には、好中球、マクロファージ、樹状細胞、好酸球、好塩基球、リンパ球および単球が含まれ、これらは血液、リンパ液および他の組織中に認めることができる。また、これらには、中枢神経系の常在細胞である「ミクログリア細胞」も含まれる。いくつかの態様においては、不死化されたマウスミクログリア細胞系BV-2が用いられる。
【００３７】
CD33は、シアル酸結合受容体ファミリーの膜貫通性の骨髄系特異的メンバーであり、骨髄系前駆細胞上に高度に発現されるが、分化した細胞でははるかに低いレベルでしか発現されない。シアル酸の結合はCD33を活性化し、免疫受容体のチロシン主体の阻害モチーフドメインを介して単球阻害をもたらす。ヒトCD33は、その細胞質ドメイン内に2つのチロシン残基を有する（Y340およびY358）。いくつかの態様において、CD33には「完全長」ペプチドが含まれうる。CD33のアミノ酸配列は当技術分野において公知であり、参照のために以下に提示する：
2020526201.tif 000003
。任意で、シアル酸結合ドメインを欠く切断型ペプチドを、いくつかの態様において用いることもできる。
【００３８】
いくつかの態様においては、不死化されたマウスミクログリア細胞系BV-2が用いられる。いくつかの態様においては、完全長ヒトCD33を発現するBV-2細胞が用いられ、また他の態様においては、シアル酸結合ドメインを欠くCD33を発現するBV-2細胞が用いられる。本明細書に記載のアッセイのいくつかの態様において、細胞は、実質的に純粋な細胞の単離された集団であってよい。
【００３９】
本明細書で用いる場合、ある物質で細胞を「処理すること」とは、細胞を当該物質と、任意の時間にわたって接触させることを意味する。例えば、細胞および化合物を直接的に組み合わせること、またはそれらを溶媒、緩衝液もしくは他の媒質などの媒質中で組み合わせることを意味する。例えば、媒質には、細胞増殖培養基、生体液、例えば脳脊髄液、血液もしくは血漿など、または模倣生体液が含まれうる。処理は任意の時間、例えば1秒間から数日間、例えば60日間またはそれを上回る日数までの間などにわたってよい。例えば、処理は1分間から60日間までの間、1時間から45日間までの間、1日間から30日間までの間、1日間から7日間までの間、1日間から3日間までの間にわたってよい。処理はまた、処理と同時に、処理の前に、または後に、インキュベーション（例えば、5℃〜50℃、25℃〜40℃、約37℃などの温度で）、混合、標識、単離、超音波処理、遠心法、濾過、凍結乾燥および照射を含んでもよい。
【００４０】
被験化合物または治療物は、任意の所望の濃度で試験することができる。本明細書で用いる場合、「妥当な濃度」とは、効果があると予想され、かつ対象への投与用の薬物中に配合しうる濃度に近い濃度のことを指す。例えば、被験化合物を、0.01nM〜約10mMの最終濃度で試験することができる。さらに、試験は、2通りまたはそれ以上（例えば、2通り、3通り、4通り、5通り、6通り、7通り、8通り、9通り、10通りまたはそれ以上）の異なる濃度で行うことができる。これは、被験化合物がある範囲の濃度のみにおいて活性がある場合には役に立ちうる。被験化合物を2通りまたはそれを上回る異なる濃度で試験する場合に、濃度の違いは10〜10,000倍（例えば、10〜5000倍、10〜1000倍、10〜500倍または10〜250倍）の範囲にわたりうる。加えて、2種またはそれを上回る異なる化合物を同時に試験すること、または任意の組み合わせの順序および濃度で逐次的に追加することもできる。
【００４１】
本明細書で用いる場合、「アミロイド-β」または「β-アミロイドペプチド」（AβまたはAbeta）とは、AD患者の脳内に認められるアミロイド斑と呼ばれる粘着性集積物の主成分である、長さ36〜43アミノ酸の一群のペプチドのことである。これらのペプチドはアミロイド前駆体タンパク質（APP）に由来しており、これはβセクレターゼおよびγセクレターゼによって切断されてAβを生じる。Aβには、42残基のAβ42（Abeta42）および40残基のAβ40（Abeta40）という2つの主なアイソフォームがある。Aβ40と比較して、Aβ42はC末端に余分に2つの残基がある。血管のAβ40濃度はAβ42を数倍上回るにもかかわらず、アルツハイマー病の脳内のアミロイド斑は大半がAβ42からなることがあり、一部のプラークはAβ42のみを含有する。諸態様においてかかわるAβは、天然型または合成型のいずれでもありうる。
【００４２】
本明細書で用いる場合、「リポ多糖」とは、脂質分子が共有結合によって多糖と結合している化合物のことである。例えば、任意の細胞結合型細菌毒素を指しうるか、または大腸菌（Escherichia coli）、サルモネラ菌（Salmonella）、赤痢菌（Shigella）、シュードモナス（Pseudomonas）、ナイセリア（Neisseria）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）およびコレラ菌（Vibrio cholera）などのグラム陰性病原体の外膜と結合した複合体を指しうる、エンドトキシンである。この用語は、疎水性脂質区域、親水性コア多糖、および反復性の親水性O-抗原オリゴ糖側鎖を含む分子を指すことができる。脂質区域は、両方の糖質に脂肪酸エステルが結びついたβ-グルコサミン-(1→6)-グルコサミン-1-リン酸塩基で構成されうる。親水性コア多糖は、内部コアおよび外部コアを含みうる。内部多糖コアは、典型的には、二糖コアと結びついた1〜4個のKDO（3-デオキシ-α-D-マンノ-オクツロソン酸）の分子を含む。また、KDOを含む内部コアが、ヘプツロース（ケトヘプトース）単糖で修飾されていることもあり、その中で最も頻度が高いものはL-グリセロ-α-D-マンノ-ヘプトピラノースである。内部コアグリカン残基がリン酸化されていること、またはリン酸含有基、例えば、ピロリン酸または2-アミノエチルリン酸で修飾されていることもある。リポ多糖の外部コアは、グルコース、ガラクトースおよびN-アセチルグルコサミンを含む、より頻度の高いヘキソースを含むことができ、内部コアよりも構造的により多様でありうる。O-抗原は、典型的には2つ〜6つの糖で構成される反復性オリゴ糖単位である。
【００４３】
本明細書で用いる場合、「サイトカイン」とは、細胞によって放出されて、細胞間の相互作用および情報交換を生じさせうるような小型タンパク質のことを指す。サイトカインには、リンホカイン（リンパ球によって作られるサイトカイン）、モノカイン（単球によって作られるサイトカイン）、ケモカイン（走化性活性を有するサイトカイン）、およびインターロイキン（白血球の1つによって作られて、他の白血球に対して作用するサイトカイン）が含まれる。サイトカインは、それらを分泌する細胞に対して（オートクリン作用）、近傍の細胞に対して（パラクリン作用）、または隔たった細胞に対して（内分泌作用）、作用しうる。炎症誘発性サイトカイン（TNFα、IL1、IL6、IL8など）ならびに（TGF-βおよびIL-10）などの抗炎症性サイトカインの両方がある。いくつかの態様において、サイトカインには、IFN-γ、IL-2、IL-5、IL-12p70、IL-1β、IL-4、KC／GRO、IL-6、IL-10およびTNF-αが非限定的に含まれうる。
【００４４】
「測定すること」とは、細胞内レベルを測定すること、またはレベルを測定すること、などにおいて本明細書で用いる場合、半定量的または定量的な測定方法を意味しうる。例えば、定性的測定には、試料における呈色の有無によって検出しうるような、ある指標の有無の検出が含まれうる。いくつかの態様において、定性的測定では、例えば、指標分子またはタグを通じて、Aβまたは炎症誘発性サイトカインの有無を検出する。半定量的方法には、2つまたはそれを上回る試料を、例えば、呈色指標に関して、最高位から最低位に、またはより強いものからより強くないものにランク付けすることが含まれうる。定量的な測定には、試料中の分析物の濃度の数値が含まれうる。いくつかの態様において、測定により、被験試料中のAβおよび炎症誘発性サイトカインの濃度が得られる。いくつかの態様において、測定は、吸光度、蛍光またはパーセント細胞生存度のものである。例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）を、市販のアミロイドβ40ヒトELISAキットまたはアミロイドβ42ヒトELISAキット（Thremo Scientific）を用いることなどによって、Aβを定量するために用いることができる。いくつかの態様において、本方法は、被験化合物の毒性を測定することを含む。例えば、毒性は、細胞傷害性（LDH）試験、例えばPierce（商標）LDH細胞傷害性アッセイキット（Thermo Scientific）またはCytoTox-ONE（商標）LDHアッセイ（Promega, WI）などを利用して試験することができる。いくつかの態様において、本方法は、サイトカインに関する測定を含む。表面を用いるELISAの変法、例えば、アドレス指定可能ビーズ（例えば、Luminex（登録商標）Mulitiplexアッセイ、Invitrogen-thermofisher）などが行えるように、ELISAはサイトカインを測定するために用いることができる。
【００４５】
本明細書で用いる場合、「T-817」または「817」とは、化合物1-(3-(2-(1-ベンゾチオフェン-5-イル)エトキシ)プロピル)アゼチジン-3-オールのことを指す。化合物「T-817MA」または「817MA」とは、エドネルピク（edonerpic）、または1-(3-(2-(1-ベンゾチオフェン-5-イル)エトキシ)プロピル)アゼチジン-3-オールマレイン酸塩であるエドネルピクマレイン酸塩のことを指す。
【００４６】
本明細書で用いる場合、「T-817A11」または「817A11」とは、1-{3-[2-(1-ベンゾチオフェン-5-イル)エトキシ]プロピオニル}アゼチジン-3-オールのことを指す。
【００４７】
本明細書で用いる場合、「T-614P」および「614P」とは、化学名N-(3-ホルムアミド-4-オキソ-6-フェノキシ-4H-クロメン-7-イル)である化合物イグラチモドのことを指す。
【００４８】
本明細書で用いる場合、「結合性相互作用」または「結合親和性」とは、2つの物質の間、例えば2つのタンパク質の間、タンパク質-低分子、またはタンパク質と核酸との間などの結合性相互作用の強度の定量的または定性的な尺度のことである。結合親和性は平衡解離定数（KD）として測定して報告することができ、これは二分子相互作用の強度を評価して順位付けをするために用いられる。KD値が小さいほど、リガンドのその標的に対する結合親和性は大きい。結合親和性は、2つの分子間の非共有結合性の分子間相互作用、例えば水素結合、静電的相互作用、疎水性力およびファンデルワールス力などによって影響される。「標準的アッセイ」とは、当技術分野において公知であるか、または慣行的に選択されうるであろうアッセイのことを指す。結合親和性を測定するいくつかの標準的アッセイには、ELISA、ゲルシフトアッセイ、プルダウンアッセイ、平衡透析、分析用超遠心法、細胞数測定、表面プラズモン共鳴（SPR）、等温滴定熱量測定および分光学的アッセイが含まれる。標準的アッセイは、例えば、結合性相互作用の度合いを直接的にまたは較正を経た上で関連づける、電子媒体または印刷物を通じて与えられる数字などの「読み取り値」を与える。読み取り値はまた、任意で顕微鏡を用いて観察または測定することができる色調変化であってもよい。また、読み取り値を、紫外-可視発光、蛍光または吸光度などの、プロットされたデータとして提示することもできる。
【００４９】
いくつかの態様は医薬組成物を含む。以下に詳細に記載するように、医薬組成物は、下記のために適合させたものを含む、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化することができる：（1）経口投与、例えば、水薬（水性または非水性の液剤または懸濁剤）、ロゼンジ剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、錠剤（例えば、頬側、舌下および全身吸収を目的とするもの）、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌に適用するためのペースト剤；（2）非経口的投与、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射により、例えば、滅菌液剤もしくは懸濁剤、または徐放性製剤として；（3）局所適用、例えば、クリーム剤、軟膏、または皮膚に適用される制御放出性パッチもしくは噴霧剤として；（4）腟内または直腸内、例えば、ペッサリー剤、クリーム剤または発泡剤として；（5）舌下；（6）眼；（7）経皮；（8）経粘膜；または（9）鼻内。加えて、作用物質を患者に植え込むか、または薬物送達システムを用いて注射することもできる。例えば、Urquhart, et al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24: 199-236 (1984)；Lewis, ed. "Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals" (Plenum Press, New York, 1981)；米国特許第3,773,919号；および米国特許第353,270,960号を参照されたい。
【００５０】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される」という用語は、正しい医学的判断の範囲内で、妥当な利益／リスク比に見合いながらも、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適する化合物、材料、組成物および／または剤形のことを指す。
【００５１】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、1つの臓器または身体の1つの部分から別の臓器または身体の別の部分への対象化合物の運搬または輸送にかかわる、薬学的に許容される材料、組成物または媒体、例えば、液体または固体の増量剤、希釈剤、添加剤、製造補助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）または溶媒封入材料などを意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性であって、患者に有害ではないという意味で、「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体として役立ちうる材料のいくつかの例には、下記が含まれる：（1）糖、例えばラクトース、グルコースおよびスクロースなど；（2）デンプン、例えばトウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなど；（3）セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロースなど；（4）粉末トラガカント；（5）麦芽；（6）ゼラチン；（7）潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなど；（8）添加剤、例えばカカオ脂および坐薬ワックスなど；（9）油、例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油など；（10）グリコール、例えばプロピレングリコールなど；（11）ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコールなど；（12）エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなど；（13）寒天；（14）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなど；（15）アルギン酸；（16）発熱物質を含まない水；（17）等張食塩水；（18）リンゲル液；（19）エチルアルコール；（20）pH緩衝化溶液；（21）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ酸無水物；（22）充填剤、例えばポリペプチドおよびアミノ酸など；（23）血清成分、例えば血清アルブミン、HDLおよびLDLなど；（22）C2-C12アルコール、例えばエタノールなど；ならびに（23）医薬製剤において用いられる他の非毒性の適合性物質。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、着香剤、保存剤および抗酸化剤も製剤中に存在しうる。「添加剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などの用語は、本明細書において互換的に用いられる。
【００５２】
いくつかの態様は、ミクログリア細胞の機能をモジュレートするための方法を含む。いくつかの態様において、ミクログリア細胞は細胞培養物などにおいてインビトロでモジュレートされる。他の態様において、細胞はインビボでモジュレートされ、ここで細胞は対象内にある。さらに他の局面において、細胞は、対象由来の生検組織または試料などから、エクスビボでモジュレートされる。
【００５３】
ミクログリア細胞は中枢神経系（CNS）の主要な免疫細胞として機能し、末梢マクロファージと類似している。例えば病原体または損傷に対する応答として、ひとたび活性化されると、それらは脳内の主要な炎症性細胞種として機能する。活性化された細胞は、急速に形態を変化させ、増殖して、感染／損傷の部位に移動するように機能することができ、そこで食作用を通じて、それらは病原体を破壊するとともに損傷細胞を除去する。それらの応答機能の一部として、ミクログリア細胞はサイトカインおよびケモカイン、さらにはプロスタグランジン、NOおよび活性酸素種も分泌することができる。CCl2などのサイトカインを放出することにより、ミクログリア細胞はまた、白血球をCNS内に動員するためにも重要である。ミクログリアはまた、浸潤性Tリンパ球とも相互作用するように機能し、それ故に脳内での免疫応答を媒介する。それらの機能の一部として、それらはTH1およびTH2のいずれのCD4陽性T細胞の増殖も刺激する能力を有する。加えて、それらはIl-10などの抗炎症性サイトカインの産生を通じて、炎症応答の消散における一助としても機能する。
【００５４】
本明細書で用いる場合、「食作用」とは、ある特定の細胞（例えば、貪食細胞）が、他の細胞、細胞断片、微生物または外来性粒子を摂取または貪食する過程のことを指す。例えば、膜の閉鎖および空胞の形成によって物質が取り囲まれて貪食されるまで、細胞の膜の局所的陥入および折りたたみ部の周囲のその細胞質の突出による。これはいくつかの種類の免疫細胞の特徴である。
【００５５】
いくつかの態様において、本方法は、患者に対して、開示されたアッセイにおいて見込みのある薬物であると同定された組成物の治療的用量または投与量を投与する段階を含む。本明細書で用いる場合、「治療的用量」または「治療的有効量」という用語は、少なくとも部分的に、所望の効果を達成するため、または治療される特定の疾患もしくは障害の症状発現を遅らせるため、その進行を阻害するため、もしくはその症状発現もしくは進行を完全に停止させるために必要な量を意味する。これには治療的処置および予防的処置の両方が含まれる。そのような量は、当然ながら、治療される特定の病状、病状の重症度、ならびに年齢、身体状態、体格、体重および併用治療を含む個々の患者パラメーターに依存すると考えられる。これらの要因は当業者には周知であり、日常的な程度を超えない実験によって対処することができる。
【００５６】
本明細書で用いる場合、「投与する」または「投与すること」という用語は、所望の効果が生じるような所望の部位での組成物の少なくとも部分的な局在をもたらす方法または経路による、対象内への組成物の配置のことを指す。本明細書に記載の化合物または組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、気道（エアロゾル）、肺、鼻、直腸および局所（頬側および舌下を含む）投与を含む、経口的または非経口的な経路を非限定的に含む、当技術分野において公知である任意の適した経路によって投与することができる。化合物は、疾患の極めて初期に、または初期症状発現の前に、またはかなりの進行の後に投与することができる。単独で投与される個々の有効成分に適用される場合、この用語はその成分単独のことを指す。組み合わせに適用される場合、この用語は、組み合わせて、逐次的にまたは同時に投与されるかにかかわらず、治療効果をもたらす有効成分のすべてを合わせた量のことを指す。
【００５７】
例示的な投与の様式には、注射、注入、滴下注入、吸入、または経口摂取が非限定的に含まれる。「注射」には、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、脳脊髄内、ならびに胸骨内の注射および注入が非限定的に含まれる。
【００５８】
いくつかの態様は、化合物の共投与を含む。これは2つまたはそれを上回る化合物の対象への投与のことを指すことができ、ここで2つまたはそれを上回る化合物は、それらが相加的または相乗的に作用する限り、同時に、または異なる時点に投与することができる。化合物は、同一の製剤で、または別々の製剤で投与することができる。別々の製剤で投与される場合、化合物は、相互に対して任意の時間内に投与することができる。例えば、化合物を、相互に対して24時間、12時間、6時間、5時間、4時間、3時間、2時間、1時間、45分間、30分間、25分間、20分間、15分間、10分間、5分間またはそれ未満の時間内に投与することができる。別々の製剤で投与される場合、いずれかの化合物をまず投与することができる。加えて、共投与は、異なる化合物が同じ経路によって投与されることを必要とはせず、すなわち、組み合わせの構成要素は同じまたは異なる投与経路によって対象に投与することができる。そのため、それぞれを独立に、または共通の剤形として投与することができる。同様に、「共試験する」という用語は、アッセイにおける2種またはそれを上回る化合物の試験を指すことができ、ここで2種またはそれを上回る化合物を、例えば、それらが相加的または相乗的に働くか否かを判定するために、同時にまたは異なる時に試験することができる。2種またはそれを上回る化合物が共試験される場合、化合物が相乗的に働くか否かが以前に知られていなくてもよく、試験は、相乗効果が存在するか否か、2つの化合物が適合性であるか否か、相加作用が存在するか否か、負の相乗効果が存在するか否か、または他の任意の併用効果が存在するかを判定するものであることができる。
【００５９】
本明細書において称する場合、スクリーニングアッセイまたはスクリーニング試験は、細胞培養のために当業者に利用可能である任意の適した容器または装置において行うことができる。例えば、アッセイは、24ウェルプレート、96ウェルプレート、または384ウェルプレートにおいて行うことができる。1つの態様において、アッセイは384ウェルプレートにおいて行われる。
【００６０】
いくつかの態様において、スクリーニング方法またはスクリーニング試験は、ハイスループットスクリーニングである。ハイスループットスクリーニング（HTS）は、ロボット操作、データ処理および制御ソフトウェア、液体操作デバイス、および高感度検出器を用いる科学的な実験法である。ハイスループットスクリーニングまたはHTSにより、研究者は、数百万を超える多数の生化学試験、遺伝子試験または薬理試験を迅速に実施することができる。ハイスループットスクリーニングは当業者に周知であり、例えば、米国特許第5,976,813号；第6,472,144号；第6,692,856号；第6,824,982号；および第7,091,048号に記載されているものがあり、これらのそれぞれの内容は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００６１】
HTSは、候補化合物のライブラリーに対するアッセイのスクリーニングを実行するために自動化を用いる。典型的なHTSスクリーニングライブラリーまたは「デッキ」は、100,000種から2,000,000種を上回る化合物までを含みうる。
【００６２】
HTSの重要な実験器具または試験容器はマイクロタイターである：これは通常使い捨て式でプラスチック製の小さな容器であり、ウェルと呼ばれる小さな開放型のくぼみのグリッドを特徴とする。最近のHTS用マイクロプレートは一般に、384個、1536個または3456個のいずれかのウェルを有する。これらはすべて96の倍数であり、これは9mm間隔で8×12個のウェルを有する当初の96ウェルマイクロプレートを反映している。いくつかの態様において、自動化は、比較的大きなウェルプレート、例えば24個または96個のウェルを有するプレートによって自動化される。
【００６３】
アッセイを準備するために、研究者は、例えば細胞などを用いて実験を実施しようとする適切な試薬をプレートの各ウェルに満たす。試薬がウェル内の化合物を吸収する、それと結合する、または他の様式でそれと反応する（または反応しない）ようにするための、あるインキュベーション時間が経過した後に、プレートのウェルすべてを対象とする測定が、手作業で、または機械によって行われる。手作業による測定は、（例えば）コンピュータがそれ自体では容易に判定することができないと考えられる変化を探るために、研究者が顕微鏡を用いる場合に往々にして必要である。また他の場合には、専用の自動分析機械が、ウェル上での多数の実験、例えば、比色測定、放射能計数などを実行することができる。この場合には、機械は各実験の結果を、各数値が個々のウェルから得られた値に対応付けられる、数値のグリッドとして出力する。処理能の高い分析機械は、このようにして数十ものプレートを数分の間に測定して、数千を上回る実験データポイントを極めて迅速に生成することができる。
【００６４】
いくつかの選択された定義
便宜のために、本明細書、実施例および添付の特許請求の範囲において使用されるある特定の用語をここにまとめる。特に記述のない限り、または文脈から暗に示されない限り、以下の用語および語句は、以下に提示する意味を含む。明示的に別の記述がされるか、または文脈から明らかな場合を除き、以下の用語および語句は、その用語または語句が、それに関連する技術分野において獲得している意味を除外するものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ限定されるため、これらの定義は、特定の態様を記述する上で助けとなるように与えられるものであり、特許請求される発明を限定することは意図していない。さらに、文脈によって別様のことが要求されない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。
【００６５】
特に定義しない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本発明の実施および試験には任意の公知の方法、装置および材料を用いうるが、本明細書にはこれに関連して方法、装置および材料が記載されている。
【００６６】
本明細書で用いる場合、「含む（comprising）」、「含む（comprises）」、「含む（includes）」または「含む（including）」という用語は、本発明にとって必須である組成物、方法、およびそれらのそれぞれの構成要素に言及して用いられるが、必須であるか否かにかかわらず、明記されていない要素を含めることを排除しない。
【００６７】
単数形の用語である「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈が明確に他のことを示していない限り、複数形の指示対象を含む。同様に、「または」という単語は、文脈が明確に他のことを示していない限り、「および」を含むものとする。
【００６８】
操作例における場合以外、または別様に指定される場合を除き、本明細書で用いられる成分の数量または反応条件を表す数字はすべて、いかなる場合にも「約」という用語によって修飾されると理解されるべきである。「約」という用語は、パーセンテージとともに用いられる場合は、言及される値の±5％（例えば、±4％、±3％、±2％または±1％）を意味しうる。
【００６９】
本明細書に記載の方法および材料と類似または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において用いることができるが、適した方法および材料について以下に述べる。「例えば（e.g.）」という略語は、ラテン語の例えば（exempli gratia）に由来するものであり、本明細書において非限定的な例を示すために用いられる。したがって、「例えば（e.g.）」という略語は、「例えば（for example）」という用語と同義である。
【００７０】
本明細書で用いる場合、「本明細書で」という用語は、本開示の全体を指して用いられ、本開示の特定の項または小項に限定されることは意味しない。
【００７１】
「減少する」、「低下した」、「低下」、「減少」または「阻害する」という用語はすべて、本明細書において概して、統計的に有意な量の減少を意味して用いられる。しかし、誤解を避けるために言うと、「低下した」、「低下」または「減少」または「阻害する」は、基準レベルと比較して少なくとも1％の減少、例えば、基準レベルと比較して、少なくとも約10％、または少なくとも約20％、または少なくとも約30％、または少なくとも約40％、または少なくとも約50％、または少なくとも約60％、または少なくとも約70％、または少なくとも約80％、または少なくとも約90％の減少、または最大で100％の減少（例えば、参照試料と比較して、存在しないレベル）、または1〜100％の任意の減少を意味する。
【００７２】
「増加した」、「増加する」または「強化する」または「活性化する」という用語はすべて、本明細書において概して、統計的に有意な量の増加を意味して用いられる；誤解を避けるために言うと、「増加した」、「増加する」または「強化する」または「活性化する」という用語は、基準レベルと比較して少なくとも1％の増加、例えば、基準レベルと比較して、約10％、もしくは少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％の増加、もしくは最大で100％までの増加、もしくは1〜100％の任意の増加、または基準レベルと比較して、少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、もしくは2倍〜10倍もしくはそれを上回る任意の増加を意味する。
【００７３】
「統計的に有意な」または「有意に」という用語は、統計的有意性のことを指し、これは一般に、基準レベルから少なくとも2標準偏差（2SD）隔たっていることを意味する。この用語は、差があるという統計的証拠のことを指す。これは、帰無仮説が実際に真である場合に帰無仮説を棄却する決定を下す確率と定義される。
【００７４】
「細胞系」とは、典型的には単一の起源細胞に、または明確なおよび／もしくは実質的に同一な起源細胞の集団に由来する、ほとんどまたは実質的に同一な細胞の集団のことを指す。細胞系は、長期間（例えば、数カ月間、数年間、無限の期間）にわたって培養下で維持されたもの、または維持されうるものであってよい。それは、細胞に無限の培養寿命を付与する自然発生的または誘導的な形質転換の過程を経たものであってよい。細胞系には、当技術分野でそのように認識されているすべての細胞系が含まれる。細胞が時の経過に伴って突然変異およびおそらくは後成的変化を獲得し、その結果、細胞系の個々の細胞の少なくともいくつかの特性が相互に異なるようになりうることは理解されるであろう。
【００７５】
本明細書で用いうるような「単離された細胞」とは、それが本来見いだされる生物から取り出されたか、またはそのような細胞の子孫である細胞のことを指す。任意で、細胞はインビトロで、例えば他の細胞の存在下で培養されたものである。任意で、細胞は後に第2の生物に導入されるか、またはそれ（もしくはそれから子孫が得られた細胞）が単離された生物に再び導入される。
【００７６】
本明細書で用いるような単離された細胞集団に関する「単離された集団」という用語は、細胞の混在集団または異種混交的な集団から取り出されて分離された細胞の集団のことを指す。いくつかの態様において、単離された集団は、細胞を単離または富化する元となった異種混交的な集団と比較して、実質的に純粋な細胞集団である。いくつかの態様において、単離された集団は、リプログラミングされた細胞およびリプログラミングされた細胞の由来となった細胞を含む細胞の異種混交的な集団と比較して実質的に純粋なリプログラミングされた細胞集団である、リプログラミングされた細胞の単離された集団である。
【００７７】
「実質的に純粋な」細胞集団は、細胞集団全体を構成する細胞に対して少なくとも約75％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、または少なくとも約95％純粋である、特定の細胞集団を指すことができる。
【００７８】
本開示を以下の実施例によってさらに例示するが、これらの実施例は限定的なものと解釈されるべきではない。これらの例は例示の目的のみで提供され、本明細書に記載の任意の局面を限定することは、いかなる様式でも意図されていない。以下の実施例は、本発明を全く限定するものではない。
【実施例】
【００７９】
概論
図に示されているように、ミクログリア細胞および3D AD細胞の培養モデルにおいて、ある範囲にわたる濃度で、数時間から数日間までの範囲の期間にわたって、化合物を選択して試験した。これらの培養モデルは、アルツハイマー病の種々の段階および生物学的局面を解明するために選択された。LDHの放出を測定する市販のアッセイ（CytoTox-ONE（商標）, Promega）によって培地を分析して、化合物の毒性を評価した。毒性を示す濃度は以降の試験から除外した。ミクログリア培養物については、3時間の化合物前処理の後、Aβ42およびAβ40の取り込みアッセイを2〜24時間にわたって行った。実験の成績は、内部移行したAβ42およびAβ40のレベルの上昇を、市販のELISAアッセイ（Wako Abeta42 ELISAキット）によって測定することによって決定した。または、3時間の化合物前処理の後、LPS活性化アッセイを3時間にわたって行った。培地中に放出された毒性サイトカインの低下をモニターした。
【００８０】
実験情報
ナイーブBV2細胞、またはwt-CD33を安定して発現するBV2を、増殖培地中で、BV2については2.5×10E5個、wt-CD33クローンについては4×10E5個の密度で24ウェルプレートに播種した。翌日に、細胞を、化合物または対照としてのDMSOにより、増殖培地中で3時間にわたって異なる濃度で処理した。Abeta42およびAbeta40の取り込みアッセイについては、細胞を500μL／ウェルのPBSで2回洗浄して、DMEM培地中300nM Abetaペプチドの存在下で、化合物／DMSOにより2時間にわたって処理した。2時間のインキュベーションの終了時に、150μLの培地を24ウェルプレートから収集した。それらを4℃、2500rpmで10分間遠心処理し、新たなプレートに移して、化合物の毒性をCytoTox-ONE（商標）（LDH）アッセイによって評価するために用いた。24ウェルプレート内の残りの細胞は500μL／ウェルの冷PBSで3回洗浄して、Complete（商標）EDTA非含有プロテアーゼ阻害剤カクテル、HALT（商標）ホスファターゼ阻害剤および1,10-フェナントロリンを加えた50μLのRIPA緩衝液により、揺動させながら4℃で20分間かけて溶解した。細胞を4℃、13,500rpmで15分間遠心処理して、上清を新たな微小遠心管に移した。溶解液上清中のタンパク質濃度を、Pierce（商標）BCAタンパク質アッセイキットによって決定した。溶解液からの2〜3μg／ウェルのタンパク質を、Wako Abeta42 ELISAキットを用いてAbeta42取り込みについて分析した。Abeta40取り込みについては、Cisbio Abeta40 HTRFアッセイを用いた。
【００８１】
毒性を示す化合物濃度は、Abeta42およびAbeta40の分析から除外した。
【００８２】
ミクログリア活性化実験については、細胞を、増殖培地中にて1μg／mL LPSの存在下で、3時間にわたって化合物／DMSOにより処理した。培地を収集し、微粒子を除いた上で、MSD炎症誘発性Panel 1サイトカインアッセイキットを用いて分析した。
【００８３】
化合物817 MAの試験
ミクログリア細胞における24時間の処理前試験のために用いたプロトコールは以下の通りであった。
【００８４】
第0日に、ナイーブBV2ミクログリア細胞を増殖培地中に播種した。
【００８５】
第1日に、続いて細胞を、817MAまたは対照としてのDMSOにより、増殖培地中で24時間にわたって、0〜50μMの範囲にわたる濃度で処理した。
【００８６】
第2日に、続いて細胞をPBSで2回洗浄して、DMEM培地中にて300nM Abeta42ペプチドの存在下で、化合物／DMSOにより2時間にわたって処理した。化合物の毒性は、処理の終了時に収集した培地中にて、CytoTox-ONE（商標）（LDH）アッセイにより評価した。残りの細胞は、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を加えたRIPA緩衝液によって溶解した。タンパク質濃度を、Pierce（商標）BCAタンパク質アッセイキットによって決定した。正規化した溶解液を、Wako Abeta42 ELISAキットを用いてAbeta42取り込みについて分析した。
【００８７】
LDH毒性試験
毒性試験の結果を、図1および2を参照して示している。どちらの図も、LDH毒性に関する棒グラフとして結果を示している。被験化合物は、DMSO、817MA、817A11および614Pである。図1はナイーブミクログリア細胞に対する毒性試験の結果を示しており、図2はwtCD33発現ミクログリア細胞に対する結果を示している。どちらの場合にも、化合物により細胞を5時間処理した後に、被験化合物に関して統計的に有意な毒性は認められない。
【００８８】
Abeta取り込みアッセイ
被験化合物DMSO、817MA、817A11および614Pを用いたAbeta取り込みアッセイを、図3〜6によって表示されている結果を参照して示している。濃度との関係での、ナイーブBV2細胞およびwt-CD33発現BV2細胞へのAbeta40およびAbeta42の取り込みに対する効果をアッセイしている。図3は、817MAおよび817MAが、被験化合物614Pと比較して、試験したすべての細胞種において、Abeta40およびAbeta42の取り込みに関するEC50がより低いことを示している。このアッセイはまた、817MAと817A11とを識別してもいる。例えば、図3および4は、817MAおよび817A11で処理された細胞がナイーブBV2細胞およびwt-CD33発現BV2細胞におけるAbeta42取り込みについては同程度であることを示しているが、一方、図5および6は、ナイーブBV2細胞およびwt-CD33発現BV2細胞において、817A11で処理された細胞の方が817MAで処理された細胞よりもAbeta40取り込みのEC50が低いことを示している。
【００８９】
サイトカインの検出および低下
図7はミクログリア細胞のLPS活性化試験による結果を表にまとめており、サイトカインKC／GRO、IL-6、IL-10およびTNF-αはLPS活性化を受けると検出可能であるが、KC／GROは非希釈培地中でのみ検出可能であったことを示している。10種のサイトカインをミクログリア馴化培地中で同時に分析した。図8〜15は、サイトカインKC／GRO、IL-6、IL-10およびTNF-αに対する被験化合物DMSO、817MA、817A11および614Pの効果を試験するためのアッセイに関する結果を示している。これらのアッセイは、817MAで処理されたBV2細胞がIL-6、IL-10およびTNF-αの濃度低下を示すことを示している。2つの連続したアッセイは、いずれかのサイトカインがLPS活性化を受けて検出されるかを判定し、その後、被験化合物に対する処理／曝露後に、検出可能なサイトカインにおける低下の判定を行っている。
【００９０】
AD 3D細胞培養物における試験
図16は、AD 3D ReN細胞培養系における第1の試験によるデータに関する結果を、棒グラフの形で示している。この試験は、被験化合物DMSO、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）による1週間の処理後のHReN30-mGAP30培地におけるLDHアッセイである。各細胞系について、nは3または4である。
【００９１】
図17は、AD 3D ReN細胞培養系における第2の試験によるデータに関する結果を、棒グラフの形で示している。この試験は、被験化合物DMSO、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）による1週間の処理後のHReN30-mGAP10#D4培地におけるLDHアッセイである。各細胞系について、nは3または4である。
【００９２】
図18A〜18Hは、薬物処理後の可溶性（培地）（横軸）および不溶性Abetaレベル（縦軸）に関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。これらのグラフのそれぞれにおいて、各バーは左から右の順に下記に関するものである：DMSO（0.1％）、T-817MA（0.3μM）、T-817MA（3μm）、T-817A11（0.3μM）、T-817A11（3μM）、DMSO（0.5％）、T-614P（10μM）、T-614P（100μM）およびGuHCl／分化培地。図18A〜図18Dは、HReN-mGAP30実験である。図18Aは、HReN30（HReN-mGAP30）培地におけるAbeta40を示している。図18Bは、HReN30（HReN-mGAP30）培地におけるAbeta42を示している。図18Cは、HReN30（HReN-mGAP30）不溶性画分におけるAbeta40を示している。図18Dは、HReN30（HReN-mGAP30）不溶性画分におけるAbeta42を示している。図18E〜18Hは、ReN-mGAP#D4実験である。図18Eは、ReN-mGAP10#D4（ReN-mGAP#D4）培地におけるAbeta40を示している。図18Fは、ReN-mGAP10#D4（ReN-mGAP#D4）培地におけるAbeta42を示している。図18Gは、ReN-mGAP10#D4（ReN-mGAP#D4）不溶性画分におけるAbeta40を示している。図18Hは、ReN-mGAP10#D4（ReN-mGAP#D4）不溶性画分におけるAbeta42を示している。
【００９３】
図19A〜19Dは、薬物処理後の不溶性p-タウレベルおよび総p-タウレベルに関するデータの一連の棒グラフを示している。被験化合物は、DMSO、T-817MA（817MA）、T-817A11（817A11）およびT-614（614P）である。これらのグラフのそれぞれにおいて、データは左から右の順に下記に関するものである：DMSO（0.1％）、T-817MA（0.3μM）、T-817MA（3μm）、T-817A11（0.3μM）、T-817A11（3μM）、DMSO（0.5％）、T-614P（10μM）、T-614P（100μM）およびGuHCl。図19Aおよび19Bは、HReN-mGAP30試験である。図19Aは、HReN30不溶性画分におけるpタウ181濃度（単位／mL）を示している。図19Bは、HReN30不溶性画分におけるpタウ181濃度（pg／mL）を示している。図19Cおよび図19Dは、ReN-mGAP#D4試験である。図19Cは、ReN-mGAP10#D4不溶性画分におけるpタウ181濃度（単位／mL）を示している。図19Dは、ReN-mGAP10#D4不溶性画分におけるpタウ181濃度（pg／mL）を示している。
【００９４】
図20は、ReN-mGAP#D4（4週間の分化）における一連の画像を示している。横の行は上から下に、DMSO 3μM、817MA 0.3μM、817MA 3μM、817A11 0.3μM、817A11 3μM、DMSO 100μM、614Pイグラチモド10μMおよび614Pイグラチモド100μMに関する画像を示している。
【００９５】
図21は、HReN-mGAP30（7週間の分化）における一連の画像を示している。横の行は上から下に、DMSO 3μM、817MA 0.3μM、817MA 3μM、817A11 0.3μM、817A11 3μM、DMSO 100μM、614Pイグラチモド10μMおよび614Pイグラチモド100μMに関する画像を示している。
【００９６】
図22は、AD 3D ReN細胞培養系におけるニトロプルシドナトリウム（SNP）毒性試験に関するデータの棒グラフを示している。このデータは、SNPによる1日間の処理後の、B27を伴わないReN細胞におけるWST-8アッセイのものである。左側の6本のバーは、混合クローン性非AD細胞系のデータである。右側の6本のバーは、単一クローン性非AD細胞系のデータである。各細胞系について、n＝3または4である。
【００９７】
図23は、4日間の817MA処理および1日間のSNP処理の後の、B27を伴わないReN細胞におけるWST-8アッセイに関するデータの棒グラフを示している。左側の20本のバーは、混合クローン性非AD細胞系のデータである。右側の20本のバーは、単一クローン性非AD細胞系のデータである。各細胞系について、n＝3または4である。左側の20本のバーについて、処理の濃度は左から右の順に下記の通りである：ReN-G2 DMSO SNP 0mM；ReN-G2 817MA 0.1μM SNP 0mM；ReN-G2 817MA 0.5μM SNP 0mM；ReN-G2 817MA 1μM SNP 0mM；ReN-G2 817MA 3μM SNP 0mM；ReN-G2 DMSO SNP 4mM；ReN-G2 817MA 0.1μM SNP 4mM；ReN-G2 817MA 0.5μM SNP 4mM；ReN-G2 817MA 1μM SNP 4mM；ReN-G2 817MA 3μM SNP 4mM；ReN-G2 DMSO SNP 5mM；ReN-G2 817MA 0.1μM SNP 5mM；ReN-G2 817MA 0.5μM SNP 5mM；ReN-G2 817MA 1μM SNP 5mM；ReN-G2 817MA 3μM SNP 5mM；ReN-G2 DMSO SNP 10mM；ReN-G2 817MA 0.1μM SNP 10mM；ReN-G2 817MA 0.5μM SNP 10mM；ReN-G2 817MA 1μM SNP 10mM；およびReN-G2 817MA 3μM SNP 10mM。右側の20本のバーについて、処理の濃度は左から右の順に下記の通りである：#G2B2 DMSO SNP 0mM；#G2B2 817MA 0.1μM SNP 0mM；#G2B2 817MA 0.5μM SNP 0mM；#G2B2 817MA 1μM SNP 0mM；#G2B2 817MA 3μM SNP 0mM；#G2B2 DMSO SNP 2mM；#G2B2 817MA 0.1μM SNP 2mM；#G2B2 817MA 0.5μM SNP 2mM；#G2B2 817MA 1μM SNP 2mM；#G2B2 817MA 3μM SNP 2mM；#G2B2 DMSO SNP 3mM；#G2B2 817MA 0.1μM SNP 3mM；#G2B2 817MA 0.5μM SNP 3mM；#G2B2 817MA 1μM SNP 3mM；#G2B2 817MA 3μM SNP 3mM；#G2B2 DMSO SNP 10mM；#G2B2 817MA 0.1μM SNP 10mM；#G2B2 817MA 0.5μM SNP 10mM；#G2B2 817MA 1μM SNP 10mM；および#G2B2 817MA 3μM SNP 10mM。
【００９８】
図24は、4日間の817MA処理および1日間のSNP処理後の、B27を伴わないReN細胞におけるWST-8アッセイ（％生存度）に関するデータの棒グラフを示している。左側の4本のバーは、混合クローン性非AD細胞系ReN-G2データのデータである。右側の4本のバーは、単一クローン性非AD細胞系#G2B2データのデータである。各細胞系について、n＝3または4である。
【００９９】
薬物候補の最適化
図25は、817MAが約50μM未満では毒性が低いかまたは無毒性であること、例えば約30μMでは、DMSOと比較して、統計的に有意な毒性が認められないことを示している。図26は、約1μMを上回ると、ミクログリア細胞におけるAbeta42取り込みがDMSO対照よりも大きいことを示している（例えば、約5μMを上回る、約10μMを上回る、約20μMを上回る）。24時間の817MA処理後のEC50は約20μMである。この実施例は、毒性を最小限にし、かつAbeta取り込みを最大限にすることによって、薬物濃度の最適化をいかに達成しうるかを示している。
【０１００】
脳3D ADモデルにおけるSNPアッセイ
図27Aおよび27Bは、817MA処理に関する例示的な時系列図を示している。図27Aは、3日間の817MA処理を示しており、これは下記を含む：（第0日）細胞のプレーティング、分化の開始；（第25日）3日間の817MA処理の開始；（第26日）少数の非処理ウェルにおいてSNP毒性を試験する；（第27日）817MAの存在下でSNPアッセイを実行する；および（第28日）実験の終了。図27Bは、3週間の817MA処理を示しており、これは以下を含む：（第0日）細胞のプレーティング、分化の開始；（第7日）3週間にわたる2回／週の817MA処理の開始；（第26日）少数の非処理ウェルにおいてSNP毒性を試験する；（第27日）817MAの存在下でSNPアッセイを実行する；および（第28日）実験の終了。用いた非AD細胞系は混合クローン性ReN-G2であった。用いたAD細胞系は混合クローン性HReN30；単一クローン性mGAP#D4およびmAP#E6F4であった。読み取りアッセイはWST-8であった。
【０１０１】
図28は、第26日のSNP濃度に応じた細胞生存度に関するデータの棒グラフを示している。左から右の順に、非AD、AD混合クローン、AD単一クローンおよびAD単一クローンに関するデータである。
【０１０２】
図29は、選択した濃度での細胞生存度に関するデータの棒グラフを示している。左から右の順に、非AD、AD混合クローン、AD単一クローンおよびAD単一クローンに関するデータである。各細胞系について、n＝3または4である。
【０１０３】
図30Aおよび30Bは、SNP誘導毒性に対する817MAの効果に関するデータを示す2つの棒グラフを示している。図31Aは、3日間にわたる817MAに関するデータを示している。図31Bは、3週間にわたる817MAに関するデータを示している。4本のバーのグループでは、左から右の順に、非AD、AD混合クローン、AD単一クローンおよびAD単一クローンに関するデータである。各バーは、左から右の順に下記に関するものである：G2 DMSO＋SNP 2.5mM；G2 817MA 0.1μM SNP 2.5mM；G2 817MA 1μM SNP 2.5mM；G2 817MA 3μM＋SNP 2.5mM；HReN30 DMSO＋SNP 3mM；HReN30 817MA 0.1μM SNP 3mM；HReN30 817MA 1μM SNP 3mM；HReN30 817MA 3μM＋SNP 3mM；#D4 DMSO＋SNP 2mM；#D4 817MA 0.1μM SNP 2mM；#D4 817MA 1μM SNP 2mM；#D4 817MA 3μM＋SNP 2mM；#E6F4 DMSO＋SNP 2mM；#E6F4 817MA 0.1μM SNP 2mM；#E6F4 817MA 1μM SNP 2mM；および#E6F4 817MA 3μM＋SNP 2mM。
【０１０４】
図31Aおよび31Bは、細胞生存度に対する817MAの効果に関するデータの棒グラフを示している：SNPなし。図31Aは、3日間にわたる817MAに関するデータを示している。図31Bは、3週間にわたる817MAに関するデータを示している。4本のバーのグループでは、左から右の順に、非AD、AD混合クローン、AD単一クローンおよびAD単一クローンに関するデータである。各バーは、左から右の順に下記に関するものである：G2 DMSO＋SNP 0mM；G2 817MA 0.1μM SNP 0mM；G2 817MA 1μM SNP 0mM；G2 817MA 3μM＋SNP 0mM；HReN30 DMSO＋SNP 0mM；HReN30 817MA 0.1μM SNP 0mM；HReN30 817MA 1μM SNP 0mM；HReN30 817MA 3μM＋SNP 0mM；#D4 DMSO＋SNP 0mM；#D4 817MA 0.1μM SNP 0mM；#D4 817MA 1μM SNP 0mM；#D4 817MA 3μM＋SNP 0mM；#E6F4 DMSO＋SNP 0mM；#E6F4 817MA 0.1μM SNP 0mM；#E6F4 817MA 1μM SNP 0mM；および#E6F4 817MA 3μM＋SNP 0mM。
【０１０５】
図32は、細胞に対するSNPの効果を例証している一連の顕微鏡画像を示している。画像はアレイ状に配置されている。縦の列は左から右の順に、DMSO、DMSO＋SNP、817MA 1μMおよび817MA＋SNPのものである。横の行は上から下の順に、ReN-G2、HReN30およびmGAP#D4のものである。
【０１０６】
図33は、細胞に対するSNPの効果を例証している第2の一連の顕微鏡画像を示している。画像はアレイ状に配置されている。縦の列は左から右の順に、DMSO、DMSO＋SNP、817MA 3μMおよび817MA＋SNPのものである。横の行は上から下の順に、ReN-G2、HReN30およびmGAP#D4のものである。
【０１０７】
図34は、非AD細胞におけるSNP誘導毒性に対する、817MAによる4日間の処理の効果に関するデータの棒グラフを示している。左側の12本のバーは、混合クローン性非AD細胞系のデータである。右側の12本のバーは、単一クローン性非AD細胞系のデータである。各細胞系について、n＝3または4である。各バーは、左から右の順に下記に関するものである：ReN-G2 DMSO SNP 0mM；ReN-G2 817MA 1μM SNP 0mM；ReN-G2 817MA 5μM SNP 0mM；ReN-G2 817MA 10μM SNP 0mM；ReN-G2 DMSO SNP 4mM；ReN-G2 817MA 1μM SNP 4mM；ReN-G2 817MA 5μM SNP 4mM；ReN-G2 817MA 10μM SNP 4mM；ReN-G2 DMSO SNP 5mM；ReN-G2 817MA 1μM SNP 5mM；ReN-G2 817MA 5μM SNP 5mM；ReN-G2 817MA 10μM SNP 5mM；#G2B2 DMSO SNP 0mM；#G2B2 817MA 1μM SNP 0mM；#G2B2 817MA 5μM SNP 0mM；#G2B2 817MA 10μM SNP 0mM；#G2B2 DMSO SNP 2mM；#G2B2 817MA 1μM SNP 2mM；#G2B2 817MA 5μM SNP 2mM；#G2B2 817MA 10μM SNP 2mM；#G2B2 DMSO SNP 3mM；#G2B2 817MA 1μM SNP 3mM；#G2B2 817MA 5μM SNP 3mM；および#G2B2 817MA 10μM SNP 3mM。各細胞系について、n＝3または4である。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001。
【０１０８】
本明細書および実施例において特定されたすべての特許および他の刊行物は、あらゆる目的のために、参照により本明細書に明示的に組み入れられる。これらの刊行物は、本出願の提出日に先行するそれらの開示のためのみに提供される。この点に関して、本発明者らが、先行発明の権限に基づいて、または任意の他の理由によって、そのような開示に先行する権利を持たないことを認めたものとみなされるべきではない。これらの文書の日付に関するすべての記述、またはそれらの内容に関する描写は、出願人が入手可能な情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関していかなる承認も行うものではない。
【０１０９】
好ましい態様を、本明細書において詳細に描写し、説明してきたが、関連する技術分野における当業者には、本発明の趣旨を逸脱することなくさまざまな改変、追加、置換などを加えることができ、それ故にこれらは下記の特許請求の範囲において規定される本発明の範囲内にあるとみなされることは明らかであろう。さらに、既には指示されていない範囲において、本明細書において記載され、例示されたさまざまな態様の任意のものを、本明細書に開示された他の態様のいずれかにおいて示された特徴を組み入れるためにさらに改変しうることも、当業者には理解されるであろう。
【図１】
2020526201.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
2020526201.tif 000022
【図１８Ｂ】
2020526201.tif 000023
【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１８Ｇ】
2020526201.tif 000028
【図１８Ｈ】
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【図１９Ａ】
2020526201.tif 000030
【図１９Ｂ】
2020526201.tif 000031
【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
2020526201.tif 000033
【図２０】
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【図２１】
2020526201.tif 000035
【図２２】
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【図２３−１】
2020526201.tif 000037
【図２３−２】
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【図２４】
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【図２５】
2020526201.tif 000040
【図２６】
2020526201.tif 000041
【図２７Ａ】
2020526201.tif 000042
【図２７Ｂ】
2020526201.tif 000043
【図２８】
2020526201.tif 000044
【図２９】
2020526201.tif 000045
【図３０Ａ】
2020526201.tif 000046
【図３０Ｂ】
2020526201.tif 000047
【図３１Ａ】
2020526201.tif 000048
【図３１Ｂ】
2020526201.tif 000049
【図３２】
2020526201.tif 000050
【図３３】
2020526201.tif 000051
【図３４−１】
2020526201.tif 000052
【図３４−２】
2020526201.tif 000053
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月16日(2020.3.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020526201000001.app
【国際調査報告】
2020526201.tif 000054
2020526201.tif 000055