(57)【要約】  質量分析により、サンプル中の、Ｎ−アセチルスレオニン、ＴＭＡＰ、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、クレアチニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素、Ｃ−グリコシルトリプトファン、３−インドキシルスルファート、プソイドウリジン、及びそれらの組合せからなる群から選択される１種又は複数の分析物の量を決定するための方法を記載している。本方法は、これらの分析物の１種又は複数のそれぞれから、質量分析により検出可能な１種又は複数のイオンを生成するのに適した条件下で、サンプルをイオン源にかけるステップと；１種又は複数の分析物のそれぞれから、質量分析により、１種又は複数のイオンの量を測定するステップと；１種又は複数のイオンの測定された量を用いて、サンプル中の１種又は複数の分析物のそれぞれの量を決定するステップとを含む。１種又は複数の分析物のそれぞれについての内部標準としての１種又は複数の同位体標識された類似体を含むキットをも記載している。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析により、サンプル中の、Ｎ−アセチルスレオニン、ＴＭＡＰ、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、クレアチニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素、Ｃ−グリコシルトリプトファン、３−インドキシルスルファート、プソイドウリジン、及びそれらの組合せからなる群から選択される１種又は複数の分析物の量を決定するための方法であって、
ａ）該１種又は複数の分析物のそれぞれから、質量分析により検出可能な１種又は複数のイオンを生成するのに適した条件下で、該サンプルをイオン源にかけるステップであって、該分析物は、イオン化の前に誘導体化されない、ステップと；
ｂ）質量分析により、該１種又は複数の分析物のそれぞれからの該１種又は複数のイオンの量を測定するステップと；
ｃ）該１種又は複数のイオンの測定された量を用いて、該サンプル中の該１種又は複数の分析物のそれぞれの量を決定するステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記１種又は複数の分析物が、１種の分析物のみである場合、該１種の分析物は、クレアチニンでない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
２種以上の分析物の量が、決定される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記２種以上の分析物が、Ｎ−アセチルスレオニン及びフェニルアセチルグルタミンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記２種以上の分析物が、Ｎ−アセチルスレオニン及びトリプトファンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記２種以上の分析物が、Ｎ−アセチルスレオニン及びクレアチニンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記２種以上の分析物が、ＴＭＡＰ及びＮ−アセチルスレオニンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記２種以上の分析物が、ＴＭＡＰ及びプソイドウリジンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記２種以上の分析物が、ＴＭＡＰ及びフェニルアセチルグルタミンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記２種以上の分析物が、ＴＭＡＰ及びトリプトファンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記２種以上の分析物が、ＴＭＡＰ及びクレアチニンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記２種以上の分析物が、Ｎ−アセチルスレオニン及びプソイドウリジンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記２種以上の分析物が、プソイドウリジン及びフェニルアセチルグルタミンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記２種以上の分析物が、プソイドウリジン及びトリプトファンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記２種以上の分析物が、プソイドウリジン及びクレアチニンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記２種以上の分析物が、フェニルアセチルグルタミン及びトリプトファンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１７】
前記２種以上の分析物が、フェニルアセチルグルタミン及びクレアチニンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記２種以上の分析物が、トリプトファン及びクレアチニンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１９】
３種以上の分析物の量が、決定される、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
４種以上の分析物の量が、決定される、請求項１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
５種以上の分析物の量が、決定される、請求項１から２０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
６種以上の分析物の量が、決定される、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
Ｎ−アセチルスレオニン、プソイドウリジン、フェニルアセチルグルタミン、及びトリプトファンの量が決定される、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、プソイドウリジン、及びクレアチニンの量が決定される、請求項１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記１種又は複数の分析物のそれぞれの量を決定するために用いられる前記１種又は複数のイオンが、表３、４、５、６、及び７中のイオンから選択される１種又は複数のイオンである、請求項１から２４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
質量分析器が、正モードで操作される、請求項１から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記１種又は複数の分析物が、Ｎ−アセチルスレオニン、ＴＭＡＰ、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、クレアチニン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素、プソイドウリジン、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記１種又は複数の分析物が、１種の分析物のみである場合、該１種の分析物は、クレアチニンでない、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記質量分析器が、負モードで操作される、請求項１から２８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記１種又は複数の分析物が、Ｎ−アセチルスレオニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン、トリプトファン、Ｃ−グリコシルトリプトファン、３−インドキシルスルファート、プソイドウリジン、及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記サンプルが、イオン源にかけられる前に、液体クロマトグラフィーにより精製されている、請求項１から３０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記液体クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィー、及び乱流液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記サンプルが、イオン源にかけられる前に、高速液体クロマトグラフィー又は超高速液体クロマトグラフィーにより精製されている、請求項１から３２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
内部標準を用いて、前記サンプル中の前記１種又は複数の分析物の量を決定する、請求項１から３３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記内部標準が、測定される前記１種又は複数の分析物のうちの少なくとも１種の、同位体標識された類似体を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記サンプルが、生物学的サンプルを含む、請求項１から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記サンプルが、血液、血漿及び血清からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記１種又は複数の分析物が、単回の注入で決定される、請求項１から３７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
実行時間が、７分以下である、請求項１から３８までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
実行時間が、４分以下である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記２種以上の分析物が、Ｃ−グリコシルトリプトファン及びＮ−アセチルスレオニンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４２】
前記２種以上の分析物が、Ｃ−グリコシルトリプトファン及びプソイドウリジンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４３】
前記２種以上の分析物が、Ｃ−グリコシルトリプトファン及びフェニルアセチルグルタミンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４４】
前記２種以上の分析物が、Ｃ−グリコシルトリプトファン及びトリプトファンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４５】
前記２種以上の分析物が、Ｃ−グリコシルトリプトファン及びクレアチニンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４６】
前記２種以上の分析物が、Ｃ−グリコシルトリプトファン及びＴＭＡＰを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項４７】
Ｎ−アセチルスレオニン、プソイドウリジン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、及びＣ−グリコシルトリプトファンの量が決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４８】
Ｎ−アセチルスレオニン、プソイドウリジン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、ＴＭＡＰ、及びＣ−グリコシルトリプトファンの量が、決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
Ｎ−アセチルスレオニン、Ｃ−グリコシルトリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、プソイドウリジン、及びクレアチニンの量が、決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５０】
Ｎ−アセチルスレオニン、ＴＭＡＰ、Ｃ−グリコシルトリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、プソイドウリジン、及びクレアチニンの量が、決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５１】
前記質量分析が、タンデム質量分析である、請求項１から５０までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
Ｎ−アセチルスレオニン、プソイドウリジン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、及びＴＭＡＰの量が、決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５３】
Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、プソイドウリジン、クレアチニン、及びＴＭＡＰの量が、決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
Ｎ−アセチルスレオニン、プソイドウリジン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、及びＮ−アセチルセリンの量が、決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、クレアチニン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、及び尿素の量が、決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５６】
トリプトファン、３−インドキシルスルファート、及びＣ−グリコシルトリプトファンの量が、決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
Ｎ−アセチルスレオニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、３−インドキシルスルファート、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、及びＮ−アセチルセリンの量が、決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
Ｎ−アセチルスレオニン、アラビトール、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、及びプソイドウリジンの量が、決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
Ｎ−アセチルスレオニン、ミオ−イノシトール、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、及びプソイドウリジンの量が、決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項６０】
Ｎ−アセチルスレオニン、ＴＭＡＰ、プソイドウリジン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、クレアチニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素、Ｃ−グリコシルトリプトファン、３−インドキシルスルファート及びそれらの組合せからなる群から選択される１種又は複数の分析物のそれぞれについての内部標準としての１種又は複数の同位体標識された類似体、並びに包装材料及びキットを用いるための指示を含むキット。
【請求項６１】
前記１種又は複数のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、該１種の分析物は、クレアチニンでない、請求項６０に記載のキット。
【請求項６２】
前記分析物が、Ｎ−アセチルスレオニンであり、前記内部標準が、Ｎ−アセチル−ｄ３−ＤＬ−スレオニン−ｄ２である、請求項６０に記載のキット。
【請求項６３】
前記分析物が、ＴＭＡＰであり、前記内部標準が、１３Ｃ３−Ｌ，Ｌ−ＴＭＡＰである、請求項６０に記載のキット。
【請求項６４】
前記分析物が、プソイドウリジンであり、前記内部標準が、プソイドウリジン−１３Ｃ１５Ｎ２である、請求項６０に記載のキット。
【請求項６５】
前記分析物が、フェニルアセチルグルタミンであり、前記内部標準が、フェニルアセチルグルタミン−ｄ５である、請求項６０に記載のキット。
【請求項６６】
前記分析物が、トリプトファンであり、前記内部標準が、Ｌ−トリプトファン−ｄ５である、請求項６０に記載のキット。
【請求項６７】
前記分析物が、クレアチニンであり、前記内部標準が、クレアチニン−ｄ３である、請求項６０に記載のキット。
【請求項６８】
前記１種又は複数の内部標準が、Ｎ−アセチル−ｄ３−ＤＬ−スレオニン−ｄ２、１３Ｃ３−Ｌ，Ｌ−ＴＭＡＰ、フェニルアセチルグルタミン−ｄ５、Ｌ−トリプトファン−ｄ５、クレアチニン−ｄ３、エリトリトール−１３Ｃ４、Ｄ−アラビニトール−１３Ｃ５、ミオ−イノシトール−ｄ６、アセチルセリン−ｄ３、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン−ｄ４、３−メチル−Ｌ−ヒスチジン−ｄ３、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン−ｄ３、キヌレニン−ｄ６、尿素−１３Ｃ，１５Ｎ２、プソイドウリジン−１３Ｃ１５Ｎ２、２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−Ｌ−トリプトファン−ｄ４、又は３−インドキシルスルファート−ｄ４を含む、請求項６０に記載のキット。
【請求項６９】
前記分析物が、Ｃ−グリコシルトリプトファンであり、前記内部標準が、２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−Ｌ−トリプトファン−ｄ４である、請求項６０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月１９日出願の米国特許仮出願第６２／４３５，９６７号、２０１７年６月２８日出願の米国特許仮出願第６２／５２６，０４３号、及び２０１７年９月１３日出願の米国特許仮出願第６２／５５８，０１４号の優先権を主張し、そのそれぞれの内容全体を参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景を説明する次の情報は、本発明の理解を補助するために提供されるのであって、本発明に対する先行技術を構成又は説明すると認めるものではない。
【０００３】
腎臓の排出機能（糸球体ろ過率、ＧＦＲ）を評価する高感度で高精度且つ簡便な試験についてのまだ対応されていない重要な臨床的必要性がある。腎機能の最も高精度な測定は、測定された糸球体ろ過率（ｍＧＦＲ）であり、これは、ろ過マーカー（例えば、イヌリン、イオタラマート、イオヘキソール）の使用を要する。それが複雑なことから、この測定は、高価であり、ルーチン的な診療において実施するのが難しく、研究試験において又は潜在的な腎提供者のために、通常、用いられるにすぎない。腎機能の他の現在の評価（例えば、ＢＵＮ、尿中アルブミン測定；血清クレアチニンのレベルに基づいた糸球体ろ過率推定値（ｅＧＦＲ）、シスタチンＣ）は、腎損傷の早期に損なわれた腎機能若しくは早期腎臓疾患を検出する又は、特に、個体が無症候である場合、慢性腎臓疾患（ＣＫＤ）の最も早期に、疾患の進行をモニターするのに、十分に高感度及び／又は高精度でない。したがって、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリン（ＴＭＡＰ）、クレアチニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素、Ｃ−グリコシルトリプトファン（２−マンノピラノシル−トリプトファン、２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−Ｌ−トリプトファン、マンノ−Ｌ−トリプトファン、又は２−ＭＴとも称される）、及び３−インドキシルスルファートからなる群から選択される１種以上で１７種までの代謝産物バイオマーカーの組合せの測定レベルに基づいた腎機能の代替的な尺度が開発された。これらの分析物の組合せは、複雑な方程式において用いられて、血清クレアチニン及び／又はシスタチンＣのレベルに基づいたｅＧＦＲ推定値よりも正確である推定ＧＦＲ（ｅＧＦＲ）を導く。この手法の利点は、腎機能のより正確な評価のためのルーチン的な診療における使用のその容易性である。腎機能を評価する改善された精度によって、適切な治療介入及び腎機能のモニタリングが可能になり、これによって、より良い治療成績が可能になる。
【０００４】
本明細書に記載されるのは、生物学的サンプル中の１７種までの分析物の検出及び定量のための方法である。１７種の分析物は、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、ＴＭＡＰ、クレアチニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素、Ｃ−グリコシルトリプトファン、及び３−インドキシルスルファートから選択される１種又は複数の分析物からなるパネルを含むことができる。有利なことには、代謝産物アッセイは、少量のサンプルで足り、誘導体化を要さず、質量分析方法を用いて行うことができる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の態様では、方法は、質量分析によりサンプル中の、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、ＴＭＡＰ、クレアチニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素、Ｃ−グリコシルトリプトファン、３−インドキシルスルファート及びそれらの組合せからなる群から選択される１種又は複数の分析物からなる分析物パネルの量を検出する及び決定するステップを含む。一実施形態では、本方法は、１種又は複数の分析物のそれぞれから質量分析により検出可能な１種又は複数のイオンを生成するのに適した条件下で、サンプルをイオン源にかけるステップを含む。他の実施形態では、これらの分析物は、イオン化の前に誘導体化されない。生物学的サンプルから分析物を抽出し、質量分析により検出する前に当該分析物をクロマトグラフ上で分離する方法も提供する。
【０００６】
他の態様では、方法は、質量分析によりサンプル中の、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、ＴＭＡＰ、クレアチニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素、Ｃ−グリコシルトリプトファン、３−インドキシルスルファート及びそれらの組合せからなる群から選択される１種又は複数の分析物からなる分析物パネルの量を検出する及び決定するステップを含み、１種又は複数のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、その１種の分析物は、クレアチニンでない。
【０００７】
一実施形態では、質量分析は、タンデム質量分析である。
【０００８】
１種又は複数の分析物が、Ｎ−アセチルスレオニンを含む一実施形態では、Ｎ−アセチルスレオニンから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約１６２．０±０．５、７４．１±０．５、１４４．０±０．５、１２６．１±０．５、１１９．９±０．５、１１６．１±０．５、１０２．０±０．５、９７．９±０．５、８４．０±０．５、７０．０±０．５、５７．０±０．５、５６．０±０．５、４３．０±０．５、２８．１±０．５、１５９．９±０．５、７３．９±０．５、１１８．１±０．５、１１５．８±０．５、９７．９±０．５、７１．９±０．５、７０．９±０．５、７０．１±０．５、５６．１±０．５、５４．０±０．５、４２．０±０．５、４０．９±０．５、２６．０±０．５、及び１５９．９±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【０００９】
１種又は複数の分析物が、フェニルアセチルグルタミンを含む一実施形態では、フェニルアセチルグルタミンから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約２６５．０±０．５、９１．０±０．５、２４８．１±０．５、２１９．１±０．５、１４７．１±０．５、１３６．０±０．５、１３０．０±０．５、１２９．１±０．５、１０１．１±０．５、８４．０±０．５、８３．０±０．５、６５．０±０．５、５６．０±０．５、５０．９±０．５、４４．０±０．５、４０．９±０．５、３９．１±０．５、２８．０±０．５、２６２．９±０．５、及び４２．０±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００１０】
１種又は複数の分析物が、クレアチニンを含む一実施形態では、クレアチニンから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約１１３．９±０．５、４３．０±０．５、８６．０±０．５、７２．０±０．５、４４．１±０．５、４２．０±０．５、２８．１±０．５、１１１．９±０．５、及び６７．９±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００１１】
１種又は複数の分析物が、トリプトファンを含む一実施形態では、トリプトファンから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約２０５．０±０．５、１４６．０±０．５、１９１〜１９３±０．５、１７３〜１７４±０．５、１６３〜１６４±０．５、１４４．８〜１５１．２±０．５、１１７．１〜１２２．１±０．５、１０２．９〜１１０．１±０．５、８９．９〜９６．０±０．５、７４．１〜８１．１±０．５、６０．９〜６８．９±０．５、５０．１〜５４．１±０．５、３８．０〜４３．１±０．５、２８．０〜２９．０±０．５、２０２．９±０．５、１１５．９±０．５、１８５．９±０．５、１５８．９±０．５、１４１．９±０．５、１３０．０±０．５、７４．１±０．５、７２．２±０．５、５９．０±０．５、４４．９±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００１２】
１種又は複数の分析物が、プソイドウリジンを含む一実施形態では、プソイドウリジンから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約２４４．９±０．５、１９１．０±０．５、２０９．０±０．５、１７９．０±０．５、１６７．０±０．５、１６３．０±０．５、１５４．８±０．５、１５１．０±０．５、１４８．０±０．５、１３９．０±０．５、１２５．０±０．５、１２０．０±０．５、１１１．８±０．５、１０９．８±０．５、１０７．８±０．５、９６．０±０．５、９２．０±０．５、８４．０±０．５、８２．０±０．５、８０．０±０．５、６８．０±０．５、６５．２±０．５、５５．０±０．５、５４．０±０．５、４３．０±０．５、４１．０±０．５、３９．０±０．５、２４２．９±０．５、１５３．０±０．５、１８２．８±０．５、１５１．９±０．５、１３９．９±０．５、１３８．９±０．５、１２４．０±０．５、１１０．８±０．５、１０９．９±０．５、９６．０±０．５、８２．０±０．５、５５．０±０．５、４２．０±０．５、及び４１．０±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００１３】
１種又は複数の分析物が、メソ−エリトリトールを含む一実施形態では、メソ−エリトリトールから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約１２０．９±０．５、８８．９±０．５、１２０．０±０．５、１１９．０±０．５、１０５．９±０．５、１０３．０±０．５、１００．９±０．５、９３．９±０．５、９２．８±０．５、７９．９±０．５、７７．０±０．５、７０．９±０．５、６７．９±０．５、６５．８±０．５、６５．０±０．５、５８．９±０．５、５２．０±０．５、４３．２±０．５、及び４０．０±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００１４】
１種又は複数の分析物が、アラビトールを含む一実施形態では、アラビトールから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）が約１５０．９±０．５、８８．９±０．５、１４９．１±０．５、１３６．０±０．５、１３３．０±０．５、１３１．１±０．５、１１９．０±０．５、１１２．８±０．５、１０８．２±０．５、１０３．１±０．５、１００．９±０．５、９６．８±０．５、９１．８±０．５、８４．９±０．５、８３．０±０．５、８１．９±０．５、７８．８±０．５、７７．０±０．５、７３．０±０．５、７０．９±０．５、６８．９±０．５、６６．９±０．５、５９．０±０．５、５７．０±０．５、５５．０±０．５、４５．０±０．５、４２．９±０．５、及び４１．２±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００１５】
１種又は複数の分析物が、ミオ−イノシトールを含む一実施形態では、ミオ−イノシトールから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約１７８．９±０．５、８７．０±０．５、１７７．２±０．５、１６１．０±０．５、１５９．０±０．５、１４６．８±０．５、１４１．０±０．５、１３４．９±０．５、１２８．８±０．５、１２５．０±０．５、１２２．７±０．５、１１７．０±０．５、１１２．８±０．５、１１０．９±０．５、１００．９±０．５、９８．９±０．５、９７．０±０．５、９５．０±０．５、９０．８±０．５、８９．０±０．５、８５．０±０．５、８２．９±０．５、８１．０±０．５、７８．８±０．５、７４．８±０．５、７３．１±０．５、７０．９±０．５、６８．９±０．５、５９．０±０．５、５６．９±０．５、５５．０±０．５、４５．１±０．５、４３．０±０．５、及び４１．０±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００１６】
１種又は複数の分析物が、Ｎ−アセチルセリンを含む一実施形態では、Ｎ−アセチルセリンから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約１４５．９±０．５、７４．０±０．５、１１９．０±０．５、１１６．０±０．５、１０４．９±０．５、１０３．９±０．５、１０３．０±０．５、９７．９±０．５、８４．０±０．５、８１．０±０．５、７２．０±０．５、７０．０±０．５、６４．９±０．５、６０．８±０．５、５７．０±０．５、４２．０±０．５、及び４０．９±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００１７】
１種又は複数の分析物が、Ｎ−アセチルアラニンを含む一実施形態では、Ｎ−アセチルアラニンから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約１３１．９±０．５、８９．９±０．５、１１４．１±０．５、８６．１±０．５、及び４４．０±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００１８】
１種又は複数の分析物が、３−メチルヒスチジンを含む一実施形態では、３−メチルヒスチジンから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約１７０．０±０．５、９４．９±０．５、１０９．１±０．５、９７．０±０．５、９６．０±０．５、９２．９±０．５、８３．０±０．５、８１．０±０．５、８０．１±０．５、７０．２±０．５、６７．９±０．５、６７．０±０．５、５５．０±０．５、５４．０±０．５、４２．０±０．５、及び４１．０±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００１９】
１種又は複数の分析物が、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリンを含む一実施形態では、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリンから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）が約１３１．９±０．５、６８．０±０．５、１１４．２±０．５、８６．０±０．５、５８．０±０．５、及び４１．０±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００２０】
１種又は複数の分析物が、キヌレニンを含む一実施形態では、キヌレニンから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約２０９．０±０．５、９４．０±０．５、１９２．１±０．５、１９１．２±０．５、１７４．０±０．５、１６４．１±０．５、１６３．１±０．５、１５０．０±０．５、１４６．１±０．５、１３６．０±０．５、１１９．９±０．５、１１８．１±０．５、９８．９±０．５、８８．０±０．５、及び７３．９±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００２１】
１種又は複数の分析物が、尿素を含む一実施形態では、尿素から得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約６０．９±０．５、２９．２±０．５、４４．０±０．５、４３．０±０．５、４２．１±０．５、２８．０±０．５、及び２７．１±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００２２】
１種又は複数の分析物が、３−インドキシルスルファートを含む一実施形態では、３−インドキシルスルファートから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約２１１．８±０．５、７９．９±０．５、１３２．０±０．５、１０４．０±０．５、８０．９±０．５、及び７７．０±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００２３】
１種又は複数の分析物が、ＴＭＡＰを含む一実施形態では、ＴＭＡＰから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約２２９．１±０．５、１７０．１±０．５、１４２．２±０．５、１２６．０±０．５、１２４．０±０．５、１１６．０±０．５、１１４．０±０．５、９８．０±０．５、９６．０±０．５、７０．０±０．５、６８．０±０．５、６０．０±０．５、５９．１±０．５、５８．１±０．５、５４．９±０．５、２２７．０±０．５、１８１．０±０．５、１５９．０±０．５、１３３．２±０．５、１１４．８±０．５、１１２．９±０．５、１０５．８±０．５、８９．１±０．５、７１．０±０．５、６９．０±０．５、及び４５．１±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００２４】
１種又は複数の分析物が、Ｃ−グリコシルトリプトファンを含む一実施形態では、Ｃ−グリコシルトリプトファンから得られた１種又は複数のイオンは、質量対電荷比（ｍ／ｚ）約３６５．２±０．５、２４５．０±０．５、１３０．０±０．５、１４２．０±０．５、１５６．０±０．５、及び１１６．０±０．５を有するイオンからなる群から選択される１種又は複数のイオンを含むことができる。
【００２５】
一実施形態では、本方法には、質量分析により単回の注入で、サンプル中の複数の分析物の量、例えば、トリプトファン及び３−インドキシルスルファートからなる群から選択される２種以上の分析物の量等を決定するステップが含まれる。
【００２６】
一実施形態では、本方法には、質量分析により単回の注入で、サンプル中の複数の分析物の量、例えば、トリプトファン、３−インドキシルスルファート、及びＣ−グリコシルトリプトファンからなる群から選択される２種以上の又は３種の分析物の量等を決定するステップが含まれる。
【００２７】
一実施形態では、本方法には、質量分析により単回の注入で、サンプル中の複数の分析物の量、例えば、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、及びクレアチニンからなる群から選択される２種以上、３種以上、４種以上、又は５種の分析物の量等を決定するステップが含まれる。他の実施形態では、本方法には、Ｎ−アセチルスレオニン、プソイドウリジン、フェニルアセチルグルタミン、及びトリプトファンの量を決定するステップが含まれる。
【００２８】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、プソイドウリジン及びＮ−アセチルスレオニンを含む。
【００２９】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、プソイドウリジン及びフェニルアセチルグルタミンを含む。
【００３０】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、プソイドウリジン及びトリプトファンを含む。
【００３１】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、プソイドウリジン及びクレアチニンを含む。
【００３２】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、Ｎ−アセチルスレオニン及びフェニルアセチルグルタミンを含む。
【００３３】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、Ｎ−アセチルスレオニン及びトリプトファンを含む。
【００３４】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、Ｎ−アセチルスレオニン及びクレアチニンを含む。
【００３５】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、フェニルアセチルグルタミン及びトリプトファンを含む。
【００３６】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、フェニルアセチルグルタミン及びクレアチニンを含む。
【００３７】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、トリプトファン及びクレアチニンを含む。
【００３８】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、ＴＭＡＰ及びプソイドウリジンを含む。
【００３９】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、ＴＭＡＰ及びＮ−アセチルスレオニンを含む。
【００４０】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、ＴＭＡＰ及びフェニルアセチルグルタミンを含む。
【００４１】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、ＴＭＡＰ及びトリプトファンを含む。
【００４２】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、ＴＭＡＰ及びクレアチニンを含む。
【００４３】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、Ｃ−グリコシルトリプトファン及びプソイドウリジンを含む。
【００４４】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、Ｃ−グリコシルトリプトファン及びＮ−アセチルスレオニンを含む。
【００４５】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、Ｃ−グリコシルトリプトファン及びフェニルアセチルグルタミンを含む。
【００４６】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、Ｃ−グリコシルトリプトファン及びトリプトファンを含む。
【００４７】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、Ｃ−グリコシルトリプトファン及びクレアチニンを含む。
【００４８】
例示的な実施形態では、２種以上の分析物のレベルが、決定され、その２種以上の分析物は、Ｃ−グリコシルトリプトファン及びＴＭＡＰを含む。
【００４９】
一実施形態では、本方法には、質量分析により単回の注入で、サンプル中の複数の分析物の量、例えば、Ｎ−アセチルスレオニン、アラビトール、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、及びプソイドウリジンからなる群から選択される２種以上、３種以上、４種以上、若しくは５種の分析物の量等を決定するステップが含まれる。
【００５０】
一実施形態では、本方法には、質量分析により単回の注入で、サンプル中の複数の分析物の量、例えば、Ｎ−アセチルスレオニン、プソイドウリジン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、及びＮ−アセチルセリンからなる群から選択される２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、又は６種の分析物の量等を決定するステップが含まれる。
【００５１】
一実施形態では、本方法には、質量分析により単回の注入で、サンプル中の複数の分析物の量、例えば、Ｎ−アセチルスレオニン、プソイドウリジン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、ＴＭＡＰ、及びクレアチニンからなる群から選択される２種以上、３種以上、４種以上、５種以上又は６種の分析物の量等を決定するステップが含まれる。
【００５２】
一実施形態では、本方法には、質量分析により単回の注入で、サンプル中の複数の分析物の量、例えば、Ｎ−アセチルスレオニン、ミオ−イノシトール、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、及びプソイドウリジンからなる群から選択される２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、又は６種の分析物の量等を決定するステップが含まれる。
【００５３】
一実施形態では、本方法には、質量分析により単回の注入で、サンプル中の複数の分析物の量、例えば、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、クレアチニン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素、及びそれらの組合せからなる群から選択される２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、又は９種の分析物の量等を決定するステップが含まれる。分析物の例示的な組合せは、付録Ａとして提供された表Ａにおいて示される。
【００５４】
一実施形態では、本方法には、質量分析により単回の注入で、サンプル中の複数の分析物の量、例えば、Ｎ−アセチルスレオニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、３−インドキシルスルファート、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、及びＮ−アセチルセリン、並びにそれらの組合せからなる群から選択される２種以上、３種以上、４種以上、５種以上、６種以上、７種以上、８種以上、９種以上、又は１０種の分析物の量等を決定するステップが含まれる。
【００５５】
一実施形態では、実行時間(run time)は、７分以下となり得る。他の実施形態では、実行時間は、４分未満となり得る。
【００５６】
実施形態では、サンプルは、血漿サンプルでも血清サンプルでもよい。サンプル容積は、１０μｌ〜２００μｌとなり得る。例えば、サンプル容積は、１０μｌ、１５、２０、２５、３０、４０、５０μｌ、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０若しくは２００μｌとなり得、又は１０から２００μｌの間の任意の他の容積となり得る。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１Ａ】、クロマトグラフィー方法１を用いて生成された、内部標準を用いた単一のクロマトグラムにおける、フェニルアセチルグルタミン、プソイドウリジン、トリプトファン、Ｎ−アセチルスレオニン、及びクレアチニンのクロマトグラムの例を示す図である。
【図１Ｂ−１Ｆ】それぞれ、クロマトグラフィー方法１を用いて生成された、各分析物についての個別のクロマトグラムを示す図である。
【００５８】
【図２Ａ】クロマトグラフィー方法２を用いて生成された、血清から得られた内部標準を含む単一のクロマトグラムにおける、メソ−エリトリトール、Ｎ−アセチルセリン、アラビトール、Ｎ−アセチルスレオニン、ミオ−イノシトール、及びプソイドウリジンのクロマトグラムの例を示す図である。
【図２Ｂ】クロマトグラフィー方法２を用いて生成された、ＢＳＡ中の較正標準を含む単一のクロマトグラムにおける、メソ−エリトリトール、Ｎ−アセチルセリン、アラビトール、Ｎ−アセチルスレオニン、ミオ−イノシトール、及びプソイドウリジンのクロマトグラムの例を示す図である。
【図２Ｃ−２Ｅ】クロマトグラフィー方法２を用いて生成された、各分析物についての個別のクロマトグラムを示す図である。
【図２Ｆ−２Ｈ】クロマトグラフィー方法２を用いて生成された、各分析物についての個別のクロマトグラムを示す図である。
【００５９】
【図３Ａ】クロマトグラフィー方法３を用いて生成された、血清から得られた単一のクロマトグラムにおける、尿素、クレアチニン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−アセチルアラニン、Ｎ−アセチルスレオニン、３−メチルヒスチジン、トリプトファン、キヌレニン、及びフェニルアセチルグルタミンのクロマトグラムを示す図である。
【図３Ｂ】クロマトグラフィー方法３を用いて生成された、血漿から得られた単一のクロマトグラムにおける、尿素、クレアチニン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−アセチルアラニン、Ｎ−アセチルスレオニン、３−メチルヒスチジン、トリプトファン、キヌレニン、及びフェニルアセチルグルタミンのクロマトグラムを示す図である。
【図３Ｃ−３Ｇ】クロマトグラフィー方法３を用いて生成された、各分析物についての個別のクロマトグラムを示す図である。
【図３Ｈ−３Ｋ】クロマトグラフィー方法３を用いて生成された、各分析物についての個別のクロマトグラムを示す図である。
【００６０】
【図４Ａ】クロマトグラフィー方法４を用いて生成された、血清から得られた単一のクロマトグラムにおける、Ｃ−グリコシルトリプトファン、トリプトファン及び３−インドキシルスルファートのクロマトグラムを示す図である。
【図４Ｂ−４Ｄ】クロマトグラフィー方法４を用いて生成された、血清から得られた各分析物についての個別のクロマトグラムを示す図である。
【図４Ｅ】クロマトグラフィー方法４を用いて生成された、血漿から得られた単一のクロマトグラムにおける、Ｃ−グリコシルトリプトファン、トリプトファン及び３−インドキシルスルファートのクロマトグラムを示す図である。
【図４Ｆ−４Ｈ】クロマトグラフィー方法４を用いて生成された、血漿から得られた各分析物についての個別のクロマトグラムを示す図である。
【００６１】
【図５】クロマトグラフィー方法５を用いて生成された、単一のクロマトグラムにおけるフェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、Ｎ−アセチルスレオニン、トリプトファン、プソイドウリジン、及びＴＭＡＰの例示的なクロマトグラムを示す図である。内部標準は、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、Ｎ−アセチルスレオニン、トリプトファン、及びプソイドウリジンについて含まれ；ＴＭＡＰは、内性(endogenous)である。
【００６２】
【図６】クロマトグラフィー方法６を用いて生成された、内部標準を含めた、単一のクロマトグラムにおける、Ｎ−アセチルスレオニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、３−インドキシルスルファート、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、及びＮ−アセチルセリンの例示的なクロマトグラムを示す図である。
【００６３】
【図７】クロマトグラフィー方法７を用いて生成された、内部標準を含めた、単一のクロマトグラムにおけるアラビトール、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、及びＮ−アセチルスレオニンの例示的なクロマトグラムを示す図である。
【００６４】
【図８】クロマトグラフィー方法８を用いて生成された、内部標準を含めた、単一のクロマトグラムにおけるミオ−イノシトール、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン及びＮ−アセチルスレオニンの例示的なクロマトグラムを示す図である。
【００６５】
【図９】Ｎ−アセチルスレオニンのタンデム質量分析による断片化から生成された、例示的な親(parent)及び娘(daughter)イオンのピークを示す図である。
【００６６】
【図１０】フェニルアセチルグルタミンのタンデム質量分析による断片化から生成された、例示的な親及び娘イオンのピークを示す図である。
【００６７】
【図１１】クレアチニンのタンデム質量分析による断片化から生成された、例示的な親及び娘イオンのピークを示す図である。
【００６８】
【図１２】トリプトファンのタンデム質量分析による断片化から生成された、例示的な親及び娘イオンのピークを示す図である。
【００６９】
【図１３】プソイドウリジンのタンデム質量分析による断片化から生成された、例示的な親及び娘イオンのピークを示す図である。
【００７０】
【図１４Ａ】正イオン化モードにおけるＴＭＡＰのタンデム質量分析による断片化から生成された、例示的な親及び娘イオンのピークを示す図である。
【図１４Ｂ】負イオン化モードにおけるＴＭＡＰのタンデム質量分析による断片化から生成された、例示的な親及び娘イオンのピークを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７１】
サンプル中のＮ−アセチルスレオニン、プソイドウリジン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、ＴＭＡＰ、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素、Ｃ−グリコシルトリプトファン、３−インドキシルスルファート及びクレアチニンからなる代謝産物の群から選択される１種又は複数の分析物の量の測定方法について記載され、１種又は複数のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、その１種の分析物は、クレアチニンでない。質量分析方法は、単回の注入での方法を用いたサンプル中の単一及び複数の分析物の定量化について記載される。これらの方法は、液体クロマトグラフィーのステップ、例えば、ＵＰＬＣ等を用いて、質量分析の方法と組み合わせて、選択された分析物の分離（精製、濃縮）を行うことができ、それによって、自動化を適用できるサンプル中の複数の分析物を定量化するための高処理アッセイ系が提供される。
【００７２】
本明細書中に示される方法は、これらの分析物を測定する現在の方法に優る利点を提供する。単回の注入で、様々な組合せで複数の分析物を測定する能力によって、分析結果を得るために要する時間が短縮され、試験室の使い捨て器具（例えば、チューブ、ピペット先端部、試薬）、試験室の機器に関する資源及びヒトの資源の使用がより少なくなる。これらを改善することによって、アッセイの費用を減少させる及びサンプル分析についての機器及び試験室の能力を増加させることにより節約がもたらされる。
【００７３】
さらに詳細に本発明を記載する前に、次の用語を定義する。
【００７４】
定義：
用語「固相抽出」とは、混合物(complex mixture)の構成成分（すなわち、移動相）が、固体粒子のクロマトグラフの充てん材料（すなわち、固相又は固定相）を用いて、これらの物理的及び化学的特性に従って分離される、サンプル調製方法を意味する。固体粒子の充てん材料は、カートリッジタイプのデバイス（例えば、カラム）中に含有することができる。
【００７５】
用語「分離」とは、混合物を、その構成成分分子又は代謝産物に分離する方法を意味する。一般的な、例示的な試験室の分離技法には、電気泳動及びクロマトグラフィーが含まれる。
【００７６】
用語「クロマトグラフィー」とは、分離されようとする構成成分（すなわち、化学成分）が、２相間で分布し、その１つが、固定され（固定相）、もう一方（移動相）が、一定の方向に動く、分離の物理的な方法を意味する。移動相は、気体（「ガスクロマトグラフィー」、「ＧＣ」）でも、液体（「液体クロマトグラフィー」、「ＬＣ」）でもよい。クロマトグラフの出力データは、本明細書に記載した方法の実施形態において用いることができる。
【００７７】
用語「液体クロマトグラフィー」又は「ＬＣ」とは、流体が、微粉砕した物質のカラム又はキャピラリー通路を通って均一に移動するとき、流体溶液の１種又は複数の構成成分を選択的に阻害する方法を意味する。この阻害は、移動相（単数又は複数）が、固定相（単数又は複数）に対して移動するとき、１種又は複数の固定相と移動相（単数又は複数）との間で混合物の構成成分が分布することによって生じる。「液体クロマトグラフィー」の例には、「逆相液体クロマトグラフィー」又は「ＲＰＬＣ」、「高速液体クロマトグラフィー」又は「ＨＰＬＣ」、「超−高速液体クロマトグラフィー」又は「ＵＰＬＣ」若しくは「ＵＨＰＬＣ」が含まれる。
【００７８】
用語「保持時間」とは、サンプルを分離デバイスに投入してからの、クロマトグラフィー方法における経過時間を意味する。サンプルの構成物の保持時間とは、サンプルの分離デバイスへの注入の時間とサンプルの構成物が、固定相を含有する分離デバイスの部分から溶出される（例えば、その部分から出る）時間との間のクロマトグラフィー方法における経過時間を意味する。
【００７９】
用語サンプル構成成分の「保持指標」とは、サンプル構成成分の保持時間又は保持因子を、サンプル構成成分のピーク前及び後に溶出された標準の保持時間と関連付ける内挿（通常、対数的）により得られた数を意味し、この内挿は、既知の標準の分離特性を用いて系統誤差を除去する機序である。
【００８０】
用語「分離指標」とは、分離技法により分離した化学成分に関する距離関数(metric)を意味する。クロマトグラフ分離技法の場合、分離指標は、保持時間でも保持指標でもよい。非クロマトグラフ分離技法の場合、分離指標は、化学成分が移動する物理的距離となり得る。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「分離情報」及び「分離データ」とは、分離指標に関する化学成分の有無を示すデータを意味する。例えば、分離データは、ある特定の時間で溶出されるある特定の質量を有する化学成分の存在を示すことができる。分離データは、経時的に溶出される化学成分の量が、上昇し、ピークに達し、次いで、下降することを示すことができる。分離指標（例えば、時間）に対してプロットされた化学成分の存在のグラフによって、グラフのピークを示すことができる。したがって、分離データに関連して、用語「ピーク情報」及び「ピークデータ」は、用語「分離情報」及び「分離データ」と同義である。
【００８２】
用語「質量分析」（ＭＳ）とは、標的分子をイオン化するか、又はイオン化し、断片化し、次いで、これらの質量／電荷比に基づき、イオンを分析して、「分子のフィンガープリント」として働く質量スペクトルを生成することを伴う、分子を測定及び分析する技法を意味する。物体の質量／電荷比の決定は、電磁エネルギーが、その物体により吸収される波長を決定することによって行うことができる。イオンの質量対電荷比を決定するいくつかの一般的に用いられる方法があり、イオン軌道の電磁波との相互作用を測定する方法、イオンが、所与の距離を移動するためにかかる時間を測定する他の方法、又は両方の組み合わせがある。これらの断片の質量測定から得られたデータは、データベースに対して探索して、標的分子の同定を得ることができる。
【００８３】
用語「負モードで操作する」又は「負ＭＲＭモードで操作する」又は「負イオン化モードで操作する」とは、負イオンが生成される及び検出される質量分析方法を意味する。用語「正モードで操作する」又は「正ＭＲＭモードで操作する」又は「正イオン化モードで操作する」とは、正イオンが生成される及び検出される質量分析方法を意味する。
【００８４】
用語「質量分析計」とは、これらの質量対電荷（「ｍ／ｚ」）比により、イオンの混合物を分離する質量分析器におけるデバイスを意味する。
【００８５】
用語「ｍ／ｚ」とは、イオンの質量数をその電荷数で割ることにより形成された無次元量を意味する。これは、「質量対電荷」比と長い間呼ばれてきた。
【００８６】
本明細書で使用される場合、用語「供給源」とは、分析しようとするサンプルをイオン化する質量分析器におけるデバイスを意味する。イオン源の例には、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化法（ＡＰＣＩ）、熱エレクトロスプレーイオン化法（ＨＥＳＩ：ｈｅａｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）、大気圧光イオン化法（ＡＰＰＩ）、水素炎イオン化型検出器（ＦＩＤ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）等が含まれる。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「検出器」とは、イオンを検出する質量分析器におけるデバイスを意味する。
【００８８】
用語「イオン」とは、電荷を含有する任意の物体を意味し、これは、例えば、電子を物体に付加する又は物体から電子を除去することにより形成することができる。
【００８９】
用語「質量スペクトル」とは、通常、ｘ−軸上のｍ／ｚ値及びｙ−軸上の強度値を含有する質量分析器により生成されたデータのプロットを意味する。
【００９０】
用語「走査」とは、ある特定の分離指標を伴う質量スペクトルを意味する。例えば、クロマトグラフ分離技法を用いる系は、複数の走査、異なる保持時間における各走査を生成することができる。
【００９１】
用語「実行時間」とは、サンプル注入から機器データの生成までの時間を意味する。全実行時間には、サンプル用のクロマトグラフィー及び質量分析が含まれる。
【００９２】
用語「タンデムＭＳ」とは、「１次ＭＳ」と呼ばれる第１のＭＳステップが行われ、その後、「２次ＭＳ」と一般に称されるその後のＭＳステップの１種又は複数が行われる操作を意味する。１次ＭＳでは、１種の（場合によっては１種以上の）化学成分を表すイオンは、１次質量スペクトルの創出中に検出され、記録される。イオンによって表される物質は、２次ＭＳにかけられ、目的とする物質は、断片化を受けて、サブ成分に分割され、これらは、２次質量スペクトルとして検出され、記録される。真のタンデムＭＳでは、１次ＭＳにおける目的とするイオンと２次ＭＳ中に創出された結果のピークとの間に明瞭な関係がある。１次ＭＳにおける目的とするイオンは、「親」又は前駆イオンに対応し、２次ＭＳ中に創出されたイオンは、親イオンのサブ成分に対応し、本明細書では、「娘」又は「プロダクト」イオンと称される。
【００９３】
したがって、タンデムＭＳによって、混合物中の化学成分の親−娘関係を表すデータ構造の創出が可能になる。この関係は、互いに親及び娘イオンの関係を例示する樹木様構造により表すことができ、娘イオンは、親イオンのサブ成分を表す。タンデムＭＳは、娘イオンにおいて繰り返されて、例えば、「孫娘」イオンを決定することができる。したがって、タンデムＭＳは、断片化の２つのレベルに限定されないが、「ＭＳｎ」とも称されるマルチ−レベルＭＳを意味するために総称的に用いられる。用語「ＭＳ／ＭＳ」は、「ＭＳ２」の同義語である。平易にする場合、用語「娘イオン」は、以後、２次又は高次の（すなわち、１次でない）ＭＳにより創出された任意のイオンを意味する。
【００９４】
１種又は複数のバイオマーカーの「レベル」は、サンプル中で測定されたバイオマーカーの絶対量若しくは相対量又は濃度を意味する。
【００９５】
「サンプル」又は「生物学的サンプル」は、対象から単離された生体物質を意味する。生物学的サンプルは、所望のバイオマーカーを検出するのに適した任意の生体物質を含有することができ、対象から得られた細胞及び／又は非細胞の材料を含有することができる。サンプルは、任意の適当な生体液又は生体組織、例えば、血液、血液血漿（血漿）、血液血清（血清）、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、又は組織等から単離することができる。
【００９６】
「対象」とは、任意の動物を意味するが、好ましくは、哺乳動物、例えば、ヒト、サル、マウス、ウサギ又はラット等である。
【００９７】
Ｃ−グリコシルトリプトファンはまた、２−マンノピラノシル−トリプトファン、２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−Ｌ−トリプトファン、マンノ−Ｌ−トリプトファン、２−ＭＴとも称される。したがって、これらの用語は、本明細書において同義的に用いられる。
【００９８】
Ｉ．サンプル調製及び品質管理（ＱＣ）
分析物を含有するサンプル抽出物を、サンプル中に存在し得る高分子（例えば、タンパク質、核酸、脂質）から離して分析物を単離することにより調製する。サンプル中のいくつかの又はすべての分析物は、タンパク質に結合することがある。様々な方法は、ＭＳ分析前に分析物（単数又は複数）とタンパク質との間の相互作用を中断するために用いることができる。例えば、これらの分析物は、存在し得るタンパク質を沈殿させ、除去しながら、サンプルから抽出して、液体抽出物を生成することができる。タンパク質は、例えば、酢酸エチル又はメタノールの溶液を用いて、沈殿させることができる。サンプル中のタンパク質を沈殿させるために、酢酸エチル又はメタノール溶液を、サンプルに加え、次いで、混合物を、遠心機中で高速に回転させて、液体の上澄みを分離させ、この上澄みは、沈殿させたタンパク質から、抽出させた分析物を含有する。
【００９９】
他の実施形態では、分析物は、タンパク質を沈殿させずに、タンパク質から放出させることができる。例えば、ギ酸溶液は、サンプルに加えて、タンパク質と分析物との間の相互作用を中断させることができる。或いは、硫酸アンモニウム、ギ酸のエタノール溶液、又はギ酸のメタノール溶液をサンプルに加えて、タンパク質を沈殿させずに、タンパク質と分析物との間のイオン相互作用を中断させることができる。一例では、アセトニトリル、メタノール、水、及びギ酸の溶液を用いて、サンプルから分析物を抽出することができる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、抽出物は、本明細書に記載した液体クロマトグラフィー、電気泳動、ろ過、遠心、及び親和性分離を含めた、様々な方法にかけて、サンプル中の１種又は複数の他の構成成分に対して、選択された分析物を精製し又はその量を強化することができる。
【０１０１】
例えば、分析物を検出する及び定量化する方法の精度、真度、キャリブレーション範囲、又は分析感度を評価するために、品質管理（ＱＣ）サンプルを用いることができる。ＱＣサンプルに用いようとする所与の分析物（単数又は複数）の濃度は、サンプル中で検出された、所与の分析物（単数又は複数）の定量の下限（ＬＬＯＱ）又は定量の上限（ＵＬＯＱ）に基づき、決定することができる。一例では、ＬＬＯＱは、標準の濃度（例えば、標準Ａ）によって表すことができ、ＵＬＯＱは、第２の標準の濃度（例えば、標準Ｈ）によって表すことができる。低ＱＣ値は、約３×ＬＬＯＱの濃度に設定することができ、中間ＱＣ値は、高ＱＣの約２５〜５０％の濃度となり、高ＱＣ値は、ＵＬＯＱの約８０％の濃度となり得る。ＱＣ標的濃度レベルは、分析の測定範囲（ＡＭＲ：Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  Ｒａｎｇｅ）の組み合わせ及び代表的なサンプルのセットにおいて測定されたサンプル結果の頻度に基づき選ぶことができる。
【０１０２】
ＩＩ．クロマトグラフィー
質量分析前に、分析物抽出物は、１種又は複数の分離方法、例えば、電気泳動、ろ過、遠心、親和性分離、又はクロマトグラフィー等にかけることができる。一実施形態では、分離方法は、例えば、超高速ＬＣ（ＵＨＰＬＣ）を含めた、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を含むことができる。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ＵＨＰＬＣは、逆相カラムクロマトグラフ系、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）、又は混合相カラムクロマトグラフ系を用いて行うことができる。
【０１０４】
ＬＣ用のカラムヒーター（又はカラムマネージャ）は、約２５℃〜約８０℃までの温度に設定することができる。例えば、カラムヒーターは、約３０℃、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃等に設定することができる。
【０１０５】
一例では、ＵＨＰＬＣは、ＨＩＬＩＣ系を用いて行うことができる。他の例では、ＵＨＰＬＣは、逆相カラムクロマトグラフ系を用いて行うことができる。この系は、２種以上の移動相を含むことができる。移動相は、例えば、移動相Ａ、移動相Ｂ、移動相Ａ’、及び移動相Ｂ’と称され得る。
【０１０６】
２つの移動相、Ａ及びＢを用いた例示的な実施形態では、移動相Ａは、ギ酸アンモニウム、ギ酸、及び水を含むことができ、移動相Ｂは、アセトニトリルを含むことができる。移動相Ａにおけるギ酸アンモニウムの濃度は、０．１ｍＭ〜１００ｍＭまでの範囲となり、ギ酸の濃度は、０．００１％〜５％までの範囲となり得る。更に、アセトニトリルの濃度は、０％〜１００％までの範囲となり得る。一例では、移動相Ａは、水中で２０ｍＭギ酸アンモニウム＋１％ギ酸を含むことができ、移動相Ｂは、１００％アセトニトリルを含むことができる。他の例では、移動相Ａは、水中で５０ｍＭギ酸アンモニウム＋１％ギ酸を含むことができ、移動相Ｂは、１００％アセトニトリルを含むことができる。
【０１０７】
一例では、直線状のグラジエント溶出は、クロマトグラフィーのために用いることができる。直線状のグラジエント溶出についての開始条件は、移動相（例えば、移動相Ａ）の濃度及び／又はそのカラムを通したある移動相（例えば、移動相Ａ）の流速を含むことができる。開始条件は、１種又は複数の分析物の分離及び／又は保持のために最適化することができる。グラジエント条件はまた、分析物の分離及び／又は保持のために最適化することもでき、選択された流速に応じて変わり得る。例えば、移動相Ａ１２％及び流速１分当たり５５０μＬの初期条件で、移動相Ａは、１．９分で２２％、２．５分で３０％、次いで、２．７分で４２％まで増加し得る。移動相Ｂは、次のサンプル注入の場合０．３分間平衡に維持することができる場合、３．４分で１２％まで戻ることもある。他の例では、初期条件は、移動相Ａ１２％及び流速１分当たり５００μＬとなり得る。移動相Ａは、０．５分間維持することができる場合、１．９分で２２％、２．５分で３０％、３．１分で３５％、３．７分で３８％、及び５．０分で４５％まで増加し得る。移動相Ａは、次のサンプル注入前に１．３分間平衡に維持することができる場合、５．７分で１２％まで戻ることもある。他の例では、初期条件は、移動相Ａ１２％及び流速１分当たり５５０μＬとなり得る。移動相Ａは、１．９分で２２％、２．５分で３０％、及び２．７分で４２％まで増加し得る。次いで、移動相Ａは、次のサンプル注入前に０．３分間平衡に維持することができる場合、３．４分で１２％まで戻ることもある。
【０１０８】
他の例では、移動相Ａは、酢酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、及び水を含むことができ、移動相Ｂは、アセトニトリルを含むことができる。酢酸アンモニウムの濃度は、約５ｍＭ〜約２００ｍＭまでの範囲となり得る。例えば、酢酸アンモニウムの濃度は、約５０ｍＭ又は約１００ｍＭとなり得る。水酸化アンモニウムの濃度は、約０．００１％〜約１％までの範囲となり得る。例えば、水酸化アンモニウムの濃度は、約０．１％又は約０．２％となり得る。更なる例では、移動相Ａは、水中の５０ｍＭ酢酸アンモニウム＋０．１％水酸化アンモニウムとなり得、移動相Ｂは、１００％アセトニトリルとなり得る。直線状のグラジエント溶出は、クロマトグラフィーのために用いることができ、移動相Ａ７％及び流速１分当たり４５０μＬの初期条件で行うことができる。次いで、移動相Ａの割合は、１．５分で２０％まで増加し得る。移動相Ａの割合は、次のサンプル注入前に１．９分間平衡に維持することができる場合、４．７分で３０％まで、５．０分で３５％まで増加し、次いで、５．１分で７％まで戻ることもある。全実行時間は、７分以下となり得る。他の例では、移動相Ａは、水中の１００ｍＭ酢酸アンモニウム＋０．２％水酸化アンモニウムとなり得、移動相Ｂは、１００％アセトニトリルとなり得る。直線状のグラジエント溶出は、クロマトグラフィーのために用いることができ、移動相Ａ７％及び流速１分当たり５００μＬの初期条件で行うことができる。移動相Ａは、１．５分で２０％まで、４．７分で３０％まで及び５．０分で３５％まで増加し得る。次いで、移動相Ａは、次のサンプル注入前に１．９分平衡に維持することができる場合、５．１分で７％まで戻ることもある。他の例では、直線状のグラジエント溶出は、移動相Ａ７％及び流速１分当たり８００μＬの初期条件で行うことができる。移動相Ａは、０．９分で２０％まで、１．９分で２５％まで、及び２．１分で３０％まで増加し得る。次いで、移動相Ａは、次のサンプル注入前に０．５分間平衡に維持することができる場合、２．２分で７％まで戻ることもある。直線状のグラジエント溶出のために移動相Ａ７％及び流速１分当たり８００μＬの初期条件を用いた、更なる他の例では、移動相Ａは、０．９分で２２％まで、２．５分で３０％まで、及び２．７分で３５％まで増加し得る。次いで、移動相Ａは、次のサンプル注入前に０．４分間平衡に維持することができる場合、２．８分で７％まで戻ることもある。
【０１０９】
更なる他の実施形態では、移動相Ａは、ギ酸及び水を含むことができ、移動相Ｂは、ギ酸及びアセトニトリルを含むことができる。例示的な実施形態では、移動相Ａは、約０．００１〜約１．０％までのギ酸を含むことができ、移動相Ｂは、ギ酸及びアセトニトリルを０〜１００％まで含むことができる。一例では、移動相Ａの濃度は、水中の約０．１％ギ酸となり得、移動相Ｂの濃度は、アセトニトリル中の約０．１％ギ酸となり得る。直線状のグラジエント溶出は、クロマトグラフィーのために用いることができ、移動相Ｂ２％の初期条件で行うことができ、流速は、７００μＬ／分であった。移動相Ｂは、２．５分で９０％まで増加し、０．３分間９０％で維持することができ、次いで、次のサンプル注入前に０．４分間平衡に維持することができる場合、２．９分で２％まで減少し得る。全実行時間は、４分未満となり得る。
【０１１０】
ＩＩＩ．質量分析及び定量化
１種又は複数の分析物は、例えば、質量分析を含めた、当業者に公知の任意の方法によりイオン化することができる。質量分析は、分画されたサンプルをイオン化し、更なる分析用に荷電された分子を創出するためのイオン源を含む、質量分析器を用いて行われる。サンプルのイオン化は、例えば、エレクトロスプレーイオン化法（ＥＳＩ）により行うことができる。他のイオン源は、例えば、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、熱エレクトロスプレーイオン化法（ＨＥＳＩ）、大気圧光イオン化法（ＡＰＰＩ）、水素炎イオン化型検出器（ＦＩＤ）、又はマトリックス支援レーザー脱離イオン化法（ＭＡＬＤＩ）を含むことができる。イオン化法の選択は、いくつかの考慮に基づき、決定することができる。例示的な考慮には、測定しようとする分析物、サンプルのタイプ、検出器のタイプ、及び正又は負モードの選択が含まれる。
【０１１１】
１種又は複数の分析物は、正又は負モードでイオン化して、１種又は複数のイオンを創出することができる。例えば，分析物Ｎ−アセチルスレオニン、プソイドウリジン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、ＴＭＡＰ、クレアチニン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、及び尿素は、正モードでイオン化することができる。更なる他の例では、分析物Ｎ−アセチルスレオニン、ＴＭＡＰ、プソイドウリジン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン、トリプトファン、Ｃ−グリコシルトリプトファン、及び３−インドキシルスルファートは、負モードでイオン化することができる。更なる他の例では、分析物Ｎ−アセチルスレオニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、３−インドキシルスルファート、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、及びＮ−アセチルセリンは、負モードでイオン化することができる。いくつかの例では、分析物は、単回の注入において正モード及び負モードでイオン化することができる。
【０１１２】
質量分析器の機器設定は、所与の方法のために及び／又は特定の質量分析器を用いるために最適化することができる。本機器は、様々な気体、例えば、窒素、ヘリウム、アルゴン、又はゼロ空気を用いることができる。質量分析は、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＱＴｒａｐ  ５５００質量分析器を用いて行うことができる。一例では、質量分析器は、正の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作することができる。イオンスプレー電圧設定は、約０．５ｋＶ〜約５．０ｋＶまでの範囲となり得；一実施形態では、電圧は、４．０ｋＶに設定することができる。ソース温度は、約３５０℃〜約６００℃までの範囲となり得；一実施形態では、ソース温度は、５５０℃に設定することができる。カーテンガスは、約１０〜約５５ｐｓｉまでの範囲となり得；一実施形態では、カーテンガスは、２０ｐｓｉに設定される。ネビュライザー及び脱溶媒和ガス流速は、約０〜約９０ｐｓｉまでの範囲となり得る。一実施形態では、流速は、７５に設定することができる。ＣＡＤガス設定は、高から低までの範囲となり得；一実施形態では、衝突活性化解離（ＣＡＤ）ガスは中に設定される。デクラスタリング電位は、１５Ｖ未満から１７０Ｖを超える範囲となり得る。衝突エネルギー（ＣＥ）は、１２ｅＶ未満から１００ｅＶを超える範囲となり得る。エントランス電位（ＥＰ）設定は、約１０Ｖ未満から１０Ｖを超える範囲となり得る。コリジョンセルイグジット電位（ＣＸＰ）設定は、８Ｖ未満から１４Ｖを超える範囲となり得る。
【０１１３】
他の例では、本機器は、負ＭＲＭモードで操作することができる。イオンスプレー電圧設定は、−０．５ｋＶ〜−５．５ｋＶまでの範囲となり得；一実施形態では、電圧は、−４．０ｋＶに設定することができる。一実施形態では、電圧は、−４．５ｋＶに設定することができる。ソース温度は、約３５０℃〜６００℃までの範囲となり得；一実施形態では、ソース温度は、５５０℃に設定することができる。カーテンガスは、１０〜３０又は別の適切な値までの範囲となり得；一実施形態では、カーテンガスは、２０に設定することができる。ネビュライザー及び脱溶媒和ガスの流速は、４０〜８０又は別の適切な値までの範囲となり得る。一実施形態では、流速は、７０に設定することができ；他の実施形態では、流速は、５０に設定することができる。他の例では、ネビュライザーガス流速は、６０に設定することができ、脱溶媒和ガス流速は、６５に設定することができる。ＣＡＤガスは、低から高までの範囲となり得る。一例では、ＣＡＤは、例えば、中に設定することができる。他の例では、ＣＡＤは高に設定することができる。
【０１１４】
サンプルがイオン化された後、正又は負に荷電したイオンを分析して、質量対電荷比を決定することができる。質量対電荷比を決定するための例示的な適当な分析器には、四重極分析器、イオントラップ分析器、及び飛行時間分析器が含まれる。イオンは、例えば、選択モード又は走査モードを用いて検出することができる。例示的な走査モードには、ＭＲＭ及び選択反応モニタリング（ＳＲＭ）が含まれる。
【０１１５】
分析結果は、タンデムＭＳによって生成されたデータを含むことができる。例示的な実施形態では、タンデムＭＳは、精密質量タンデムＭＳとなり得る。例えば、精密質量タンデム質量分析は、四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）分析器を用いることができる。タンデムＭＳによって、混合物中の化学成分の親−娘関係を示すデータ構造の創出が可能になる。この関係は、樹木様構造が、親及び娘イオンの関係を互いに例証することにより示すことができ、娘イオンは、親イオンのサブ成分を示す。
【０１１６】
例えば、１次質量スペクトルは、５つの異なるイオンを含むことができ、これは、５つのグラフによるピークとして示すことができる。１次ＭＳにおける各イオンは、親イオンとなり得る。各親イオンは、その特定の親イオンについての娘イオンを示す質量スペクトルを生成する２次ＭＳにかけることができる。
【０１１７】
親／娘関係を、拡張して、分離した構成成分（例えば、クロマトグラフィー状態から溶出する構成成分）と１次ＭＳにおいて検出されたイオンとの間の関係、及び分析されようとするサンプルと分離した構成成分との関係を記載することができる。
【０１１８】
質量分析器は、通常、ユーザーに、イオン走査（すなわち、所与の範囲に対してある特定の質量／電荷を有する各イオンの相対的存在量）を提供する。質量分析データは、多くの方法により元のサンプル中の分析物の量に関係があり得る。一例では、所与のイオンの相対的存在量が、元の分析物の絶対量に変換することができるように、較正標準を用いて、標準曲線（検量線）が生成される。他の例では、較正標準は、外部標準となり得、標準曲線を、標準から生成されたイオンに基づき生成して、１種以上の分析物の物質量を算出することができる。更なる例では、外部標準は、非標識の分析物となり得る。
【０１１９】
内部標準は、較正標準及び／又は被検試料に加えることができる。サンプル中の測定された分析物のより高精度な値を得るために、内部標準を用いて、サンプルプロセシングの間分析物の喪失を説明することができる。較正標準のレベルにおける分析物ピーク面積対内部標準ピーク面積の比を用いて、検量線を生成し、サンプルを定量化することができる。分析物の、１種又は複数の同位体標識された類似体、例えば、Ｎ−アセチル−ｄ３−ＤＬ−スレオニン−ｄ２、フェニルアセチルグルタミン−ｄ５、クレアチニン−ｄ３、Ｌ−トリプトファン−ｄ５、プソイドウリジン−１３Ｃ，１５Ｎ２、エリトリトール−１３Ｃ４、Ｄ−アラビニトール−１３Ｃ５、ミオ−イノシトール−ｄ６、アセチルセリン−ｄ３、Ｎ−Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン−ｄ４、３−メチル−Ｌ−ヒスチジン−ｄ３、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン−ｄ３、キヌレニン−ｄ６、尿素−１３Ｃ，１５Ｎ２、２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−Ｌ−トリプトファン−ｄ４、３−インドキシルスルファート−ｄ４、及びＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリン−１３Ｃ３は、内部標準として用いることができる。
【０１２０】
分析データを、コンピュータに送り、コンピュータソフトウェアを用いて処理することができる。一例では、分析物対内部標準のピーク面積比を、定量化のための統計的回帰法を用いて、較正標準の濃度に対してフィッティングした。他の例では、統計的回帰は、重み付け線形最小二乗回帰である。検量線を用いて算出された傾き及び切片を用いて、実験サンプル中の分析物の未知の濃度を算出することができる。
【０１２１】
１種又は複数の腎臓パネル分析物の濃度を得た後、濃度の値を多変量アルゴリズムに入力して、推定ＧＦＲ（糸球体ろ過率）スコアを生成する。例えば、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、ＴＭＡＰ、プソイドウリジン、及びクレアチニンから選択される、２種の分析物、３種の分析物、４種の分析物、５種の分析物、又は６種の分析物の濃度を決定することができる。一例では、臨床パラメータ（例えば、ＢＵＮ、ＳＣｒ、尿中アルブミン測定）、腎機能のマーカー（例えば、β−２ミクログロブリン、β−ＴＲＡＣＥ、２−マンノピラノシルトリプトファン（２−ＭＰＴ））、及び／又は患者の情報（例えば、年齢、ＣＫＤの家族歴、他の危険因子）は、本明細書に記載した方法を用いて得られた分析物の濃度の値と組み合わせて用いることができる。
【０１２２】
ＩＶ．キット
Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、ＴＭＡＰ、プソイドウリジン、クレアチニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素、Ｃ−グリコシルトリプトファン、３−インドキシルスルファート、及びそれらの組合せからなる群から選択される腎臓パネル分析物の１種又は複数をアッセイするためのキット（１種又は複数のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、その１種の分析物は、クレアチニンでない）を、本明細書に記載する。例えば、キットは、包装材料及び１種又は複数のアッセイのために十分な量で、１種若しくは複数の分析物標準又は内部標準の測定された量を含むことができる。例示的な実施形態では、内部標準は、同位体標識することができ、本キットは、予め作製された移動相溶液を含むことができ、且つ／又は本キットは、移動相溶液を調製するための移動相の試薬及び指示を含むことができる。キットはまた、試薬を用いて、１種又は複数の分析物を測定するために、実体のある形態（例えば、書面で、例えば、取扱説明書又は電子媒体）で記録された指示を含むこともできる。
【実施例】
【０１２３】
Ｉ．サンプル調製
Ａ．試薬及び機器
質量分析用（９８％）ギ酸及びギ酸アンモニウム（＞９８％）を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手し；ＨＰＬＣ用メタノール及びアセトニトリルをＪＴ  Ｂａｋｅｒ社から入手し；塩酸、６Ｎ（保証済み）を、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から入手した。ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＭｕｌｔｉ−Ｔｕｂｅ  Ｖｏｒｔｅｘｅｒを、混合のために用いた。プレートの遠心を、３６１７バケットローターを有するＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製のＳｏｒｖａｌｌ  ＳＴ  ４０Ｒ遠心機で行った。ヒト血漿（リチウムヘパリン）及び血清を、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ社から入手した。ウシ血清アルブミン（脂肪酸無し）を、ＧｅｎＤｅｐｏｔ社から入手した。フェニルアセチルＬ−グルタミン、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン、β−プソイドウリジン−１３Ｃ、１５Ｎ２、Ｌ−トリプトファン−ｄ５、Ｄ−アラビニトール−１３Ｃ５、エリトリトール−１３Ｃ４、２−（α−Ｄ−マンノピラノシル）−Ｌ−トリプトファン−ｄ４、及び３−インドキシルスルファート−ｄ４カリウム塩を、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社から入手し；クレアチニン塩酸塩、Ｌ−トリプトファン、Ｎ−アセチル−ＤＬ−セリン、Ｌ−キヌレニン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン、３−メチル−Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−（＋）−アラビトール、メソ−エリトリトール、ミオ−イノシトール、硫酸３−インドキシルカリウム塩、及び尿素を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から入手し；β−プソイドウリジンを、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社から得；アセチル−Ｌ−スレオニンを、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手し；Ｎα−（フェニル−ｄ５−アセチル）−Ｌ−グルタミン、クレアチニン−ｄ３、Ｎ−アセチル−ｄ３−Ｌ−スレオニン−２，３−ｄ２、Ｎ−アセチル−Ｌ−アラニン−２，３，３，３−ｄ４、Ｎ−アセチル−Ｌ−セリン−２，３，３−ｄ３、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン−２，５，５−ｄ３、ＮＴ−メチル−ｄ３−Ｌ−ヒスチジン、ミオ−イノシトール−１，２，３，４，５，６−ｄ６を、ＣＤＮ  Ｉｓｏｔｏｐｅｓ社から入手し；Ｌ−キヌレニン硫酸塩（ｄ４、３，３−ｄ２環）及び尿素（１３Ｃ、１５Ｎ２）を、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社から入手した。Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−Ｌ−アラニル−Ｌ−プロリン−１３Ｃ３（１３Ｃ３−Ｌ，Ｌ−ＴＭＡＰ）を、Ａｌｂａｎｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社から入手した。
【０１２４】
Ｂ．サンプル調製
サンプル調製を、ポリプロピレン製９６穴プレート中で行った。試験サンプル、ＱＣサンプル、及び較正標準を、氷上で解凍し、ボルテックスした。試験サンプル及びＱＣサンプルから分析物を抽出するため、適切な内部標準（単数又は複数）を含有するアセトニトリル／メタノール／水／ギ酸混合物（８８／１０／２／０．２）の作業内部標準（ＷＩＳ）溶液１７５μＬを、各ウェルに加えた。ＷＩＳ溶液は、１種又は複数の内部標準を含むことができ、本明細書に記載した１７種の分析物のそれぞれについての１種又は複数の内部標準を含むことができる。ブランクサンプルを、内部標準を含まずにアセトニトリル／メタノール／水／ギ酸混合物（８８／１０／２／０．２）１７５μＬを加えることにより抽出した。１６種の分析物についてのＷＩＳ濃度を、表１に示す。すべてのＷＩＳ溶液を、アセトニトリル／メタノール／水／ギ酸（８８／１０／２／０．２）の溶液中で調製した。ＷＩＳ濃度の決定は、例えば、キャリブレーション範囲で分析物の濃度に基づき得る。例えば、ＴＭＡＰについてのＷＩＳの濃度は、ＴＭＡＰ較正標準Ｃ及びＤの濃度とほとんど同じとなり得る。
【表１】
2020502544.tif 000003
【０１２５】
各分析物のキャリブレーション範囲を決定した。各分析物について、ＬＬＯＱは、キャリブレーション範囲の下限を表し、キャリブレーション範囲の上限は、ＵＬＯＱによって表される。当業者は、過度の実験をせずに、各分析物についてのキャリブレーション範囲の決定の仕方を理解しているはずである。８種の検量用試料（標準Ａ〜Ｈ）を用いて、キャリブレーション範囲を網羅した。各検量用試料における最終分析物濃度を、表２に記載する。キャリブレーション用スパイキング溶液（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｓｐｉｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を、対応するキャリブレーション濃度の２０倍で調製した。
【表２】
2020502544.tif 000004
【０１２６】
ＱＣレベルを、ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱに基づき決定した。低、中及び高レベルのＱＣサンプルを、必要に応じて分析物を強化しながら、適切な分析物濃度のヒト血漿又は血清プールの組み合わせから調製した。ＬＬＯＱサンプルを、すべての分析物についての表２中の標準Ａと同じ濃度で、脂肪酸がないＢＳＡ溶液（ＰＢＳ中の７．５％）中で調製した。ＱＣサンプルを、−８０℃で貯蔵した。
【０１２７】
試験サンプル、ＱＣサンプル、較正標準、及びブランクについて、抽出したサンプル２５μＬを、プレートの適切なウェルに移した。プレートを、密封し、プレートシェーカーにおいて高速でおよそ２分間混合した。プレートを、４℃で１０分間４，０００ｒｐｍで遠心し；上澄みのアリコート１５０μＬを、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析用の新たなプレートに移した。サンプルの回復を評価するために、媒体ＱＣサンプルを、表２に示した通り、較正標準Ｅに相当する濃度で添加した。標準Ｅについてのキャリブレーション値を、「Ｅ」が付いた列に示す。原液、キャリブレーション用スパイキング溶液、及び内部標準溶液を、４℃で貯蔵した。
【０１２８】
（例１）
サンプルからの分析物のクロマトグラフの精製及び分離
ＵＨＰＬＣを用いるクロマトグラフ方法を開発して、単回の注入から得られた１種以上で１０種までの分析物を分析した。各クロマトグラフ方法について、最終抽出溶液の単一の固定されたアリコート１．０μＬを、分析された各サンプル用のＵＰＬＣカラムに注入した。クロマトグラフィー方法１、３、５、６、７及び８について、バイナリ溶媒ポンプユニット、冷蔵オートサンプラー（４℃に設定）、及びカラムヒーター（６０℃に設定）を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＵＨＰＬＣ系を、ＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨアミド、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ）を有する液体クロマトグラフィーのために用いた。バイナリ溶媒ポンプユニット、冷蔵オートサンプラー（４℃に設定）、及びサーモスタット式カラムマネージャ（６０℃に設定）を装備したＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ系を、クロマトグラフィー方法２のためのＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  アミド、１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ）及びクロマトグラフィー方法４のための逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×１００ｍｍ）を有する液体クロマトグラフィーのために用いた。各クロマトグラフィー方法の詳細（すなわち、移動相緩衝液、溶出グラジエント、流速、実行時間）を、以下に例示する。
【０１２９】
Ａ．クロマトグラフィー方法１（５種の分析物：Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、プソイドウリジン、トリプトファン、クレアチニン）
一例では、液体クロマトグラフィー方法を、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、プソイドウリジン、トリプトファン、クレアチニン及びそれらの組合せからなる群から選択される１種以上若しくは２種以上で全５種までの分析物の単回の注入での精製及び分離のために開発し、１種又は複数のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、その１種の分析物は、クレアチニンでない。
【０１３０】
移動相Ａは、水中の２０ｍＭギ酸アンモニウム＋１％ギ酸であり、移動相Ｂは、１００％アセトニトリルであった。直線状のグラジエント溶出を、別段の指示がない限り、初期条件が、移動相Ａ１２％（移動相Ｂ８８％）及び流速１分当たり５５０μＬで行った。移動相Ａは、初回、１．９分で１２％〜２２％まで（移動相Ｂ７８％）、２．５分で２２％〜３０％まで（移動相Ｂ７０％）、及び２．７分で３０％〜４２％まで（移動相Ｂ５８％）増加した。次いで、移動相Ａは、３．４分で１２％（移動相Ｂ８８％）まで戻り、これは、次のサンプルが注入される前に、０．３分間平衡に維持された。全実行時間は、３．７０分であった。
【０１３１】
クロマトグラフィー方法１によって、良いピーク形を有する、複数の５種までの分析物が分離された。得られた分離された分析物の例示的なクロマトグラムを、図１Ａ〜Ｆに示す。各分析物についての目的とするピークのおおよその保持時間を示す。おおよその保持時間（分）は、フェニルアセチルグルタミン、プソイドウリジン、トリプトファン、Ｎ−アセチルスレオニン、及びクレアチニンが、それぞれ、１．１１、２．４５、２．６１、１．４３、及び１．８３であった。
【０１３２】
Ｂ．クロマトグラフィー方法２（６種の分析物：プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン）
他の例では、液体クロマトグラフィー方法を、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン及びそれらの組合せからなる群から選択される、１種以上若しくは２種以上で全６種までの分析物の単回の注入での精製及び分離のために開発した。
【０１３３】
移動相Ａは、水中の５０ｍＭ酢酸アンモニウム＋０．１％水酸化アンモニウムであり、移動相Ｂは、１００％アセトニトリルであった。直線状のグラジエント溶出を、別段の指示がない限り、移動相Ａ７％（移動相Ｂ９３％）及び流速１分当たり４５０μＬの初期条件で行った。移動相Ａは、初回、１．５分で７％〜２０％（移動相Ｂ８０％）、４．７分で２０％〜３０％（移動相Ｂ７０％）、及び５．０分で３０％〜３５％（移動相Ｂ６５％）まで増加した。次いで、移動相Ａは、５．１分で７％（移動相Ｂ９３％）まで戻り、これは、次のサンプルが注入される前に１．９分間平衡に維持された。全実行時間は、７．０分であった。
【０１３４】
クロマトグラフィー方法２によって、良いピーク形を有する複数の６種までの分析物が分離された。得られた分離された分析物の例示的なクロマトグラムを、図２Ａ〜Ｈに示す。おおよその保持時間（分）は、メソ−エリトリトール、Ｎ−アセチルセリン、アラビトール、Ｎ−アセチルスレオニン、ミオ−イノシトール、及びプソイドウリジンが、それぞれ、２．２１、３．３０、２．７２、２．９９、４．５９、及び２．８９であった。
【０１３５】
Ｃ．クロマトグラフィー方法３（９種の分析物：Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、クレアチニン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素）
他の例では、液体クロマトグラフィー方法を、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、クレアチニン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素及びそれらの組合せからなる群から選択される、１種以上若しくは２種以上で全９種までの分析物の単回の注入での精製及び分離のために開発し、１種又は複数のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、その１種の分析物は、クレアチニンでない。
【０１３６】
移動相Ａは、水中の２０ｍＭギ酸アンモニウム＋１％ギ酸であり、移動相Ｂは、１００％アセトニトリルであった。直線状のグラジエント溶出を、別段の指示がない限り、移動相Ａ１２％（移動相Ｂ８８％）及び流速１分当たり５００μＬの初期条件で行った。移動相Ａは、初回、１．９分で１２％〜２２％（移動相Ｂ７８％）、２．５分で２２％〜３０％（移動相Ｂ７０％）、３．１分で３０％〜３５％（移動相Ｂ６５％）、３．７分で３５％〜３８％（移動相Ｂ６２％）、及び５．０分で３８％〜４５％（移動相Ｂ５５％）まで増加し、これを、０．５分間維持した。次いで、移動相Ａは、５．７分で１２％（移動相Ｂ８８％）まで戻り、これは、次のサンプルが注入される前に、１．３分間平衡に維持した。全実行時間は、７．０分であった。
【０１３７】
クロマトグラフィー方法３によって、良いピーク形を有する複数の９種までの分析物が分離された。得られた分離された分析物の例示的なクロマトグラムを、図３Ａ〜Ｉに示す。おおよその保持時間（分）は、尿素、クレアチニン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、Ｎ−アセチルアラニン、Ｎ−アセチルスレオニン、３−メチルヒスチジン、トリプトファン、キヌレニン、及びフェニルアセチルグルタミンが、それぞれ、１．３６、１．９４、３．７４、１．１７、及び１．６９であった。
【０１３８】
Ｄ．クロマトグラフィー方法４（トリプトファン、３−インドキシルスルファート、Ｃ−グリコシルトリプトファン）
他の例では、液体クロマトグラフィー方法を、トリプトファン、３−インドキシルスルファート、及びＣ−グリコシルトリプトファン、及びそれらの組合せからなる群から選択される、１種以上若しくは２種以上で全３種までの分析物の単回の注入での精製及び分離のために開発した。
【０１３９】
移動相Ａは、水中の０．１％ギ酸であり、移動相Ｂは、アセトニトリル中の０．１％ギ酸であった。直線状のグラジエント溶出を、移動相Ｂ２％（移動相Ａ９８％）及び流速１分当たり７００μＬの初期条件で行った。移動相Ｂは、初回、２．５分で２％〜９０％（移動相Ａ１０％）まで増加し、９０％で０．３分間維持した。次いで、移動相Ｂは、２．９分で２％（移動相Ａ９８％）まで戻り、これを、次のサンプルが注入される前に０．４分間平衡に維持した。全実行時間は、３．３０分であった。
【０１４０】
クロマトグラフィー方法４によって、良いピーク形を有する複数の３種までの分析物が分離された。得られた分離された分析物の例示的なクロマトグラムを、図４Ａ〜Ｈに示す。おおよその保持時間（分）は、血清及び血漿中で、それぞれ、Ｃ−グリコシルトリプトファンの場合０．９１及び０．９５、トリプトファンの場合１．３２及び１．３３並びに３−インドキシルスルファートの場合１．４５であった。
【０１４１】
Ｅ．クロマトグラフィー方法５（６種の分析物：Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、プソイドウリジン、トリプトファン、ＴＭＡＰ、クレアチニン）
他の例では、液体クロマトグラフィー方法を、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、プソイドウリジン、トリプトファン、ＴＭＡＰ、クレアチニン、及びそれらの組合せからなる群から選択される１種以上若しくは２種以上で全６種までの分析物の単回の注入での精製及び分離のために開発した。１種又は複数のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、その１種の分析物は、クレアチニンでない。
【０１４２】
移動相Ａは、水中の２０ｍＭギ酸アンモニウム＋１％ギ酸であり、移動相Ｂは、１００％アセトニトリルであった。直線状のグラジエント溶出を、移動相Ａ１２％（移動相Ｂ８８％）及び流速１分当たり５５０μＬの初期条件で行った。移動相Ａは、初回、１．９分で１２％〜２２％（移動相Ｂ７８％）、２．５分で２２％〜３０％（移動相Ｂ７０％）、及び２．７分で３０％〜４２％（移動相Ｂ５８％）まで増加した。次いで、移動相Ａは、３．４分で１２％（移動相Ｂ８８％）まで戻り、これを、次のサンプルが注入される前に０．３分間平衡に維持した。全実行時間は、３．７０分であった。
【０１４３】
クロマトグラフィー方法５によって、良いピーク形を有する複数の６種までの分析物が分離された。得られた分離された分析物の例示的なクロマトグラムは、図５に示す。おおよその保持時間（分）は、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、Ｎ−アセチルスレオニン、トリプトファン、プソイドウリジン、及びＴＭＡＰが、それぞれ、１．４０、１．８６、２．１４、２．６１、２．７１、及び３．１６であった。
【０１４４】
Ｆ．クロマトグラフィー方法６（１０：Ｎ−アセチルスレオニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、３−インドキシルスルファート、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルセリン）
他の例では、液体クロマトグラフィー方法を、Ｎ−アセチルスレオニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、３−インドキシルスルファート、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、及びＮ−アセチルセリン、並びにそれらの組合せからなる群から選択される、１種以上若しくは２種以上で全１０種までの分析物の単回の注入で精製及び分離のために開発し、１種又は複数のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、その１種の分析物は、クレアチニンでない。
【０１４５】
移動相Ａは、水中の１００ｍＭ酢酸アンモニウム＋０．２％水酸化アンモニウムであり、移動相Ｂは、１００％アセトニトリルであった。直線状のグラジエント溶出を、移動相Ａ７％（移動相Ｂ９３％）及び流速１分当たり５００μＬの初期条件で行った。移動相Ａは、初回１．５分で７％〜２０％（移動相Ｂ８０％）、４．７分で２０％〜３０％（移動相Ｂ７０％）、及び５．０分で３０％〜３５％（移動相Ｂ６５％）まで増加した。次いで、移動相Ａは、５．１分で７％（移動相Ｂ９３％）まで戻り、これを、次のサンプルが注入される前に１．９分間平衡に維持した。全実行時間は、７．０分であった。
【０１４６】
クロマトグラフィー方法６によって、良いピーク形を有する複数の１０種までの分析物が分離された。得られた分離された分析物の例示的なクロマトグラムを、図６に示す。おおよその保持時間（分）は、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、３−インドキシルスルファート、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、及びＮ−アセチルセリンが、それぞれ、２．３５、２．８７、４．８５、０．７８、３．２０、２．８２、２．４０、３．００、３．３０、及び３．６９であった。
【０１４７】
Ｇ．クロマトグラフィー方法７（５：アラビトール、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン）
他の例では、液体クロマトグラフィー方法を、アラビトール、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、及びそれらの組合せからなる群から選択される１種以上若しくは２種以上で全５種までの分析物の単回の注入で精製及び分離のために開発し、１種又は複数のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、その１種の分析物は、クレアチニンでない。
【０１４８】
移動相Ａは、水中の１００ｍＭ酢酸アンモニウム＋０．２％水酸化アンモニウム及び移動相Ｂは、１００％アセトニトリルであった。直線状のグラジエント溶出を、移動相Ａ７％（移動相Ｂ９３％）及び流速１分当たり８００μＬの初期条件で行った。移動相Ａは、初回０．９分で７％〜２０％（移動相Ｂ８０％）、１．９分で２０％〜２５％（移動相Ｂ７５％）、及び２．１分で２５％〜３０％（移動相Ｂ７０％）まで増加した。次いで、移動相Ａは、２．２分で７％（移動相Ｂ９３％）まで戻り、これを、次のサンプルが注入される前に０．５分間平衡に維持した。全実行時間は、２．７分であった。
【０１４９】
クロマトグラフィー方法７によって、良いピーク形を有する複数の５種までの分析物が分離された。得られた分離された分析物の例示的なクロマトグラムを、図７に示す。おおよその保持時間（分）は、アラビトール、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、及びＮ−アセチルスレオニンが、それぞれ、１．７４、１．７４、１．４８、１．８４、及び１．９８であった。
【０１５０】
Ｈ．クロマトグラフィー方法８（６：ミオ−イノシトール、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン）
他の例では、液体クロマトグラフィー方法を、ミオ−イノシトール、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、及びそれらの組合せからなる群から選択される１種以上若しくは２種以上で全６種までの分析物の単回の注入での精製及び分離のために開発し、１種又は複数のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、その１種の分析物は、クレアチニンでない。
【０１５１】
移動相Ａは、水中の１００ｍＭ酢酸アンモニウム＋０．２％水酸化アンモニウム及び移動相Ｂは、１００％アセトニトリルであった。直線状のグラジエント溶出を、移動相Ａ７％（移動相Ｂ９３％）及び流速１分当たり８００μＬの初期条件で行った。移動相Ａは、初回０．９分で７％〜２２％（移動相Ｂ７８％）、２．５分で２２％〜３０％（移動相Ｂ７０％）、及び２．７分で３０％〜３５％（移動相Ｂ６５％）まで増加した。次いで、移動相Ａは、２．８分で７％（移動相Ｂ９３％）まで戻り、これは、次のサンプルが注入される前に０．４分間平衡に維持した。全実行時間は、３．２分であった。
【０１５２】
クロマトグラフィー方法８によって、良いピーク形を有する複数の６種までの分析物が分離された。得られた分離された分析物の例示的なクロマトグラムを、図８に示す。おおよその保持時間（分）は、ミオ−イノシトール、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、及びＮ−アセチルスレオニンが、それぞれ、２．６４、１．８３、１．６４、１．４０、１．７４、及び１．８５であった。
【０１５３】
（例２）
分析物のＭＳ／ＭＳ測定
質量分析を、Ｔｕｒｂｏ  Ｖ  ｓｏｕｒｃｅ（ＥＳＩ）を有するＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＱＴｒａｐ  ５５００質量分析器を用いた、以下の方法に記載されているサンプル抽出物で行った。生データを本機器から取得し、Ａｎａｌｙｓｔ  １．６．２ソフトウェア（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を用いて処理した。定量化のため、分析物対内部標準のピーク面積比を、重み付け（１／ｘ２）線形最小二乗回帰により、較正標準の濃度に対してフィッティングした。検量線の得られた傾き及び切片を用いて、実験サンプルにおける未知の濃度を算出した。
【０１５４】
Ａ．ＭＳ／ＭＳ方法１
単回の注入で、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、クレアチニン及びそれらの組合せからなる群から選択される、１種以上若しくは２種以上で全５種までの分析物のレベルを検出するために方法を開発したが、ここで、１種以上のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、その１種の分析物は、クレアチニンでない。同じＭＳ／ＭＳ方法を用いて、単回の注入で、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、ＴＭＡＰ、クレアチニン、及びそれらの組合せからなる群から選択される１種以上若しくは２種以上で全６種までの分析物のレベルを検出した。
【０１５５】
例１、クロマトグラフィー方法１に記載のクロマトグラフィーカラムから得られた溶離液を、直接的に及び自動的に質量分析器のエレクトロスプレー源に投入した。他の例では、例１、クロマトグラフィー方法５に記載のクロマトグラフィーカラムから得られた溶離液を、直接的に及び自動的に質量分析器のエレクトロスプレー源に投入した。アセトニトリル：水（５０：５０）を、針の洗浄のために用いた。本機器を、正の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作した。イオンスプレー電圧を、４．０ｋＶに設定し、ソース温度を５５０℃、カーテンガス（例えば、窒素）を２０ｐｓｉ、並びにネビュライザー及び脱溶媒和ガス（例えば、窒素）流速を７５ｐｓｉ、衝突活性化解離（ＣＡＤ）ガス（例えば、窒素）を中に設定した。
【０１５６】
生データを本機器から取得し、Ａｎａｌｙｓｔ  １．６．２ソフトウェア（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を用いて処理した。定量化のため、分析物対内部標準のピーク面積比を、重み付け（１／ｘ２）線形最小二乗回帰により、較正標準の濃度に対してフィッティングした。検量線の得られた傾き及び切片を用いて、実験サンプルにおける未知の濃度を算出した。プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、及びクレアチニン、並びにＴＭＡＰの定量化のために生成した例示的なイオンを、表３に挙げる。親イオンを、先頭に「親イオン（ｍ／ｚ）」が付く列下に挙げ、本例における定量化のために用いる娘イオンを、「定量化のための娘イオン（ｍ／ｚ）」と表示された列に挙げる。本例における定量化のための娘イオンの選択によって、本分析の測定範囲にわたって感度について最適化したが；追加の娘イオンを選択して、これらの例における定量化のために用いた娘イオンを置き換える又は増強することができる。
【表３−１】
2020502544.tif 000005
【表３−２】
2020502544.tif 000006
【０１５７】
図９〜１４では、表３に示した親イオンの断片化から得られた質量スペクトルを示す。
【０１５８】
正イオン化モードでＮ−アセチルスレオニンの定量化のために生成したＭＲＭ遷移には、ｍ／ｚ約１６２．０±０．５を有する親イオンを断片化して、ｍ／ｚが、約７４．１±０．５、１４４．０±０．５、１２６．１±０．５、１１９．９±０．５、１１６．１±０．５、１０２．０±０．５、９７．９±０．５、８４．０±０．５、７０．０±０．５、５７．０±０．５、５６．０±０．５、４３．０±０．５、及び２８．１±０．５を有する娘イオンを生成することにより生成されたものが含まれる。Ｎ−アセチルスレオニンのタンデム質量分析による断片化から生成されたこれらの親及び娘イオンのピークを、図９に例示する。娘イオンのいずれかは、定量化のために選択することができる。本例では、Ｎ−アセチルスレオニンの定量化のために用いられた娘イオンは、ｍ／ｚが、約７４．１±０．５である。Ｎ−アセチルスレオニンについてのキャリブレーション範囲を、０．０２００〜２．００μｇ／ｍＬと決定した。
【０１５９】
正イオン化モードでフェニルアセチルグルタミンの定量化のために生成したＭＲＭ遷移には、ｍ／ｚ約２６５．０±０．５を有する親イオンを断片化して、ｍ／ｚが、約９１．０±０．５、２４８．１±０．５、２１９．１±０．５、１４７．１±０．５、１３６．０±０．５、１３０．０±０．５、１２９．１±０．５、１０１．１±０．５、８４．０±０．５、８３．０±０．５、６５．０±０．５、５６．０±０．５、５０．９±０．５、４４．０±０．５、４０．９±０．５、３９．１±０．５、及び２８．０±０．５を有する娘イオンを生成することにより生成されたものが含まれる。フェニルアセチルグルタミンのタンデム質量分析による断片化から生成されたこれらの親及び娘イオンのピークを、図１０に例示する。娘イオンのいずれかは、定量化のために選択することができる。本例では、フェニルアセチルグルタミンの定量化のために用いられた娘イオンは、ｍ／ｚが、約９１．０±０．５である。フェニルアセチルグルタミンについてのキャリブレーション範囲を、０．１００〜２０．０μｇ／ｍＬと決定した。
【０１６０】
正イオン化モードでクレアチニンの定量化のために生成したＭＲＭ遷移には、ｍ／ｚ約１１３．９±０．５を有する親イオンを断片化して、ｍ／ｚ約４３．０±０．５、８６．０±０．５、７２．０±０．５、４４．１±０．５、４２．０±０．５、及び２８．１±０．５を有する娘イオンを生成することにより生成されたものが含まれる。クレアチニンのタンデム質量分析による断片化から生成されたこれらの親及び娘イオンのピークを、図１１に例示する。娘イオンのいずれかは、定量化のために選択することができる。本例では、クレアチニンの定量化のために用いられた娘イオンは、ｍ／ｚが、約４３．０±０．５である。クレアチニンについてのキャリブレーション範囲を、２．００〜２００μｇ／ｍＬと決定した。
【０１６１】
正イオン化モードでトリプトファンの定量化のために生成したＭＲＭ遷移には、ｍ／ｚ約２０５．０±０．５を有する親イオンを断片化して、ｍ／ｚが、約１４６．０±０．５、１９１〜１９３±０．５、１７３〜１７４±０．５、１６３〜１６４±０．５、１４４．８〜１５１．２±０．５、１１７．１〜１２２．１±０．５、１０２．９〜１１０．１±０．５、８９．９〜９６．０±０．５、７４．１〜８１．１±０．５、６０．９〜６８．９±０．５、５０．１〜５４．１±０．５、３８．０〜４３．１±０．５、及び２８．０〜２９．０±０．５を有する娘イオンを生成することにより生成されたものが含まれる。トリプトファンのタンデム質量分析による断片化から生成されたこれらの親及び娘イオンのピークを、図１２に例示する。娘イオンのいずれかは、定量化のために選択することができる。本例では、トリプトファンの定量化のために用いられた娘イオンは、ｍ／ｚが約１４６．０±０．５である。トリプトファンについてのキャリブレーション範囲を、１．００〜１００μｇ／ｍＬと決定した。
【０１６２】
正イオン化モードでプソイドウリジンの定量化のために生成したＭＲＭ遷移には、ｍ／ｚ約２４４．９±０．５を有する親イオンを断片化して、ｍ／ｚが、約１９１．０±０．５、２０９．０±０．５、１７９．０±０．５、１６７．０±０．５、１６３．０±０．５、１５４．８±０．５、１５１．０±０．５、１４８．０±０．５、１３９．０±０．５、１２５．０±０．５、１２０．０±０．５、１１１．８±０．５、１０９．８±０．５、１０７．８±０．５、９６．０±０．５、９２．０±０．５、８４．０±０．５、８２．０±０．５、８０．０±０．５、６８．０±０．５、６５．２±０．５、５５．０±０．５、５４．０±０．５、４３．０±０．５、４１．０±０．５、及び３９．０±０．５を有する娘イオンを生成することにより生成されたものが含まれる。プソイドウリジンのタンデム質量分析による断片化から生成されたこれらの親及び娘イオンのピークを、図１３に例示する。娘イオンのいずれかは、定量化のために選択することができる。本例では、プソイドウリジンの定量化のために用いられた娘イオンは、ｍ／ｚが約１９１．０±０．５である。プソイドウリジンについてのキャリブレーション範囲を、１０．０〜４００μｇ／ｍＬと決定した。
【０１６３】
正イオン化モードでＴＭＡＰの定量化のために生成したＭＲＭ遷移には、ｍ／ｚ約２２９．１±０．５を有する親イオンを断片化して、ｍ／ｚが、約１７０．１±０．５、１４２．２±０．５、１２６．０±０．５、１２４．０±０．５、１１６．０±０．５、１１４．０±０．５、９８．０±０．５、９６．０±０．５、７０．０±０．５、６８．０±０．５、６０．０±０．５、５９．１±０．５、５８．１±０．５、５４．９±０．５、２２７．０±０．５、１８１．０±０．５、１５９．０±０．５、１３３．２±０．５、１１４．８±０．５、１１２．９±０．５、１０５．８±０．５、８９．１±０．５、７１．０±０．５、６９．０±０．５、及び４５．１±０．５を有する娘イオンを生成することにより生成されたものが含まれる。娘イオンのいずれかは、定量化のために選択することができる。例えば、ｍ／ｚが、約５８．１±０．５、７０．０±０．５、１１４．０±０．５、又は１４２．２±０．５を有する娘イオンは、ＴＭＡＰの定量化のために用いることができる。ＴＭＡＰのタンデム質量分析による断片化から生成されたこれらの親及び娘イオンのピークを、図１４に例示する。
【０１６４】
Ｂ．ＭＳ／ＭＳ方法２
他の例では、単回の注入で、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、Ｎ−アセチルセリン及びそれらの組合せからなる群から選択される１種以上若しくは２種以上で全６種までの分析物のレベルを検出するために方法を開発した。例１、クロマトグラフィー方法２に記載のクロマトグラフィーカラムから得られた溶離液を、直接的に及び自動的に質量分析器のエレクトロスプレー源に投入した。水：アセトニトリル（９０：１０）を、強／シール洗浄のために用い；アセトニトリル：水（９０：１０）を、弱洗浄のために用いた。
【０１６５】
本機器を、負ＭＲＭモードで操作した。イオンスプレー電圧を、−４．０ｋＶに設定し、ソース温度を５５０℃、及びカーテンガスを２０ｐｓｉに設定し；ネビュライザー及び脱溶媒和ガス流速を、７０ｐｓｉ、ＣＡＤガスを中に設定した。
【０１６６】
プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、及びＮ−アセチルセリンの定量化のために生成した例示的なイオンを、表４に示す。親イオンを、先頭に「親イオン（ｍ／ｚ）」が付く列下に挙げ、本例における定量化のために用いる娘イオンを、「定量化のための娘イオン（ｍ／ｚ）」と表示された列に挙げる。本例における定量化のための娘イオンの選択によって、本分析の測定範囲にわたって感度について最適化したが；娘イオンのいずれかを選択して、これらの例における定量化のために用いた娘イオンを置き換える又は増強することができる。
【表４−１】
2020502544.tif 000007
【表４−２】
2020502544.tif 000008
【０１６７】
Ｃ．ＭＳ／ＭＳ方法３
他の例では、単回の注入で、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、クレアチニン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、尿素及びそれらの組合せからなる群から選択される１種以上若しくは２種以上で全９種までの分析物レベルを検出するために方法を開発したが、ここで、１種又は複数のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、その１種の分析物は、クレアチニンでない。例３、クロマトグラフィー方法３に記載のクロマトグラフィーカラムから得られた溶離液を、直接的に及び自動的に質量分析器のエレクトロスプレー源に投入した。水：アセトニトリル（９０：１０）を、強／シール洗浄のために用い；アセトニトリル：水（９０：１０）を、弱洗浄のために用いた。本機器を、正の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作した。イオンスプレー電圧を、４．０ｋＶに設定し、ソース温度を５５０℃、カーテンガス（例えば、窒素）を２０ｐｓｉ、並びにネビュライザー及び脱溶媒和ガス（例えば、窒素）流速を７５ｐｓｉ、衝突活性化解離（ＣＡＤ）ガス（例えば、窒素）を中に設定した。
【０１６８】
Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、クレアチニン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、及び尿素の定量化のために生成した例示的なイオンを、表５に示す。親イオンを、先頭に「親イオン（ｍ／ｚ）」が付く列下に挙げ、本例における定量化のために用いる娘イオンを、「定量化のための娘イオン（ｍ／ｚ）」と表示された列に挙げる。本例における定量化のための娘イオンの選択によって、本分析の測定範囲にわたって感度について最適化したが；娘イオンのいずれかを選択して、これらの例における定量化のために用いた娘イオンを置き換える又は増強することができる。
【表５−１】
2020502544.tif 000009
【表５−２】
2020502544.tif 000010
【０１６９】
Ｄ．ＭＳ／ＭＳ方法４
他の例では、単回の注入で、トリプトファン、Ｃ−グリコシルトリプトファン、及び３−インドキシルスルファートからなる群から選択される１種以上若しくは２種以上で、全３種までの分析物のレベルを検出するために方法を開発した。例１、クロマトグラフィー方法４に記載のクロマトグラフィーカラムから得られた溶離液を、直接的に及び自動的に質量分析器のエレクトロスプレー源に投入した。メタノールを、針の洗浄のために用いた。本機器を、負ＭＲＭモードで操作した。イオンスプレー電圧を、−４．５ｋＶに設定し、ソース温度を５５０℃、及びカーテンガスを２０ｐｓｉに設定し；ネビュライザー及び脱溶媒和ガス流速を、それぞれ、６０ｐｓｉ及び６５ｐｓｉ、及びＣＡＤガスを高に設定した。
【０１７０】
トリプトファン、Ｃ−グリコシルトリプトファン、及び３−インドキシルスルファートの定量化のために用いることができる例示的なイオン対を、表６に示す。親イオンを、先頭に「親イオン（ｍ／ｚ）」が付く列下に挙げ、本例における定量化のために用いる娘イオンを、「定量化のための娘イオン（ｍ／ｚ）」と表示された列に挙げる。本例における定量化のための娘イオンの選択によって、本分析の測定範囲にわたって感度について最適化したが；娘イオンのいずれかを選択して、これらの例における定量化のために用いた娘イオンを置き換える又は増強することができる。
【表６】
2020502544.tif 000011
【０１７１】
Ｄ．ＭＳ／ＭＳ方法５
他の例では、単回の注入で、メソ−エリトリトール、Ｄ−アラビトール、イノシトール、３−インドキシルスルファート、Ｌ−トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、及びＮ−アセチルセリン、並びにそれらの組合せからなる群から選択される１種以上若しくは２種以上で全１０種までの分析物レベルを検出するために方法を開発した。例１、クロマトグラフィー方法６に記載のクロマトグラフィーカラムから得られた溶離液を、直接的に及び自動的に質量分析器のエレクトロスプレー源に投入した。
【０１７２】
他の例では、例１、クロマトグラフィー方法７に記載のクロマトグラフィーカラムから得られた溶離液を、直接的に及び自動的に質量分析器のエレクトロスプレー源に投入した。本方法によって、単回の注入で、Ｄ−アラビトール、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、及びそれらの組合せからなる群から選択される１種以上若しくは２種以上で全５種までの分析物のレベルを検出し、１種又は複数のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、その１種の分析物は、クレアチニンでない。
【０１７３】
他の例では、例１、クロマトグラフィー方法８に記載のクロマトグラフィーカラムから得られた溶離液を、直接的に及び自動的に質量分析器のエレクトロスプレー源に投入した。本方法によって、単回の注入で、イノシトール、Ｌ−トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、及びそれらの組合せからなる群から選択される１種以上若しくは２種以上で全６種までの分析物のレベルを検出し、１種又は複数のアッセイされた分析物が、１種の分析物のみである場合、その１種の分析物は、クレアチニンでない。アセトニトリル：水（５０：５０）を、針の洗浄のために用いた。本機器を、負ＭＲＭモードで操作した。イオンスプレー電圧を、−４．５ｋＶに設定し、ソース温度を５５０℃、及びカーテンガスを２０ｐｓｉに設定し；ネビュライザー及び脱溶媒和ガス流速を、５０ｐｓｉ、ＣＡＤガスを中に設定した。
【０１７４】
メソ−エリトリトール、Ｄ−アラビトール、イノシトール、３−インドキシルスルファート、Ｌ−トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、及びＮ−アセチルセリンの定量化のために用いることができる例示的なイオン対を、表７に示す。親イオンを、先頭に「親イオン（ｍ／ｚ）」が付く列下に挙げ、本例における定量化のために用いる娘イオンを、「定量化のための娘イオン（ｍ／ｚ）」と表示された列に挙げる。本例における定量化のための娘イオンの選択によって、本分析の測定範囲にわたって感度について最適化したが；娘イオンのいずれかを選択して、これらの例における定量化のために用いた娘イオンを置き換える又は増強することができる。
【表７】
2020502544.tif 000012
【０１７５】
（例３）
方法のバリデーション
Ａ．クロマトグラフィー方法１及びＭＳ／ＭＳ方法１
クロマトグラフィー方法１及びＭＳ／ＭＳ方法１の組み合わせの分析性能によって、単回の注入で、実行時間が３．７分で複数の５種までの分析物を定量化した。
【０１７６】
複数の５種の分析物を測定するための方法の精度を、血漿及び血清中で３つのＱＣレベル（低、中、及び高）で評価した。マトリックス当たりのＱＣレベルにつき３回の反復を、合計４０回実行するために２０日間にわたって１日２回実行して分析した。ＱＣレベルにつき合計１２０回分は、マトリックス当たりの各分析物についての日間ＣＶ算出に含めた。日間の精度は、血漿中の各ＱＣレベルで６．３％未満、血清中の各ＱＣレベルで７．１％未満であった。これらの結果を、表８に示す。線形応答（Ｒ２＞０．９８）を、Ｎ−アセチルスレオニン、クレアチニン、プソイドウリジン、及びトリプトファンについて１００倍の範囲にわたって、及びフェニルアセチルグルタミンについて２００倍の範囲にわたって観察した。キャリブレーション範囲を、１，０００種を超える血漿及び血清サンプルの分析に基づき選択した。
【表８】
2020502544.tif 000013
【０１７７】
血清及び血漿中の希釈ＱＣの真度及び精度を評価して、ＵＬＯＱを超える（すなわち、キャリブレーション範囲外の）分析物値を含むサンプルを高精度に測定した。高ＱＣマトリックスを脂肪酸が無いＢＳＡ溶液で５倍に希釈することにより、希釈ＱＣを調製した。マトリックス当たりの希釈ＱＣの３回の反復を、合計１０回実行するために５日間にわたって１日２回実行して分析した。合計３０回分は、日間の真度及び精度の算出に含めた。血清中の（測定された高ＱＣ値と比較した）日間の真度は、９４．５％より高く、日間の精度は、７．６％より低く；血漿中の日間の真度は、９４．７％より高く、日間の精度は、４．４％より低かった。これらの結果を、表９に示す。
【表９】
2020502544.tif 000014
【０１７８】
ＬＬＯＱにおける精度を評価した。あらゆる分析物についての信号雑音比は、５：１より大きかった。ＬＬＯＱサンプルの３回の反復を、合計３０回実行するために１５日間にわたって、１日２回実行して分析した。ＬＬＯＱの合計９０回分は、各分析物についての日間の％ＣＶ算出に含めた。すべての日内及び日間の精度は、２．８％ＣＶより低くかった；本データを、表１０に示す。これらの結果によって、下限の分析物の多数の定量化が、極めて正確であったことが示される。
【表１０】
2020502544.tif 000015
【０１７９】
抽出中に分析物の回収を評価するために、血清及び血漿中のＱＣサンプルを、公知の濃度の分析物で強化した。添加されたＱＣサンプルの６回の反復を、抽出し、標準のＱＣサンプルと一緒に３回分析した。添加されたＱＣサンプル中の量を減算した後、添加された量の回収を算出した。５種の分析物の回収を、５種の分析物について、血清中で９７．４％〜１１３％及び血漿中で１０３％〜１１０％であると決定した。本データを、表１１に示す。
【表１１】
2020502544.tif 000016
【０１８０】
分析物の定量化に対する、サンプルタイプによる干渉を評価するために、内部標準溶液を用いたポストカラム注入実験を、内部標準を用いずに抽出した血漿及び血清サンプルの１０種の個別のロットの分析と同時に行った。内部標準の遷移をモニターし、分析物の保持時間における抑制／増強のレベルを観察した。トリプトファンは、保持領域におけるマトリックス効果を示し、影響を受けていないシグナルの２５％を上回るようにみえる抑制の直前に溶出された。しかしながら、本アッセイにおける共溶出する内部標準は同位体標識されているため、いかなる軽度のサンプルタイプの効果も、分析物及び内部標準について同様に起きるはずである。したがって、定量化のために分析物対内部標準のピーク面積比を用いることにより、サンプルタイプの効果は、最終の算出においては補償されている。
【０１８１】
干渉を、黄疸、脂血症（ｌｉｐｉｄｅｍｉａ）、分析物の公知の異性体、並びにスタチン、ＮＳＡＩＤｓ、鎮痛剤（ｐａｉｎ  ｒｅｌｉｅｖｅｒ）、抗ヒスタミン薬、及び抗糖尿病薬を含めた、医薬品についても評価した。クロマトグラフィー方法１及びＭＳ／ＭＳ方法１では、試験された干渉条件からの干渉が無いことを決定した。
【０１８２】
Ｂ．クロマトグラフィー方法２及びＭＳ／ＭＳ方法２
クロマトグラフィー方法２及びＭＳ／ＭＳ方法２の組み合わせの分析性能によって、単回の注入で、実行時間が７．０分で、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、メソ−エリトリトール、アラビトール、ミオ−イノシトール、及びＮ−アセチルセリンからなる群から選択される複数の６種までの分析物を定量化した。
【０１８３】
複数の６種の分析物を測定するための方法の精度を、血漿及び血清の代表的なロットにおいて評価した。血漿についての１２回の反復及び血清についての６回の反復を、３回実行することによって分析した。実行間の精度は、血漿において７．３％未満及び血清において２０％未満であった。これらの結果を、表１２に示す。
【表１２】
2020502544.tif 000017
【０１８４】
ＬＬＯＱにおける精度及び真度を評価した。あらゆる分析物についての信号雑音比は、５：１より大きかった。ＬＬＯＱサンプル６回の反復を、３回実行して分析した。ＬＬＯＱの合計１８回分は、各マトリックスについての各分析物についての日間の％ＲＳＤ及び真度の算出に含めた。実行間の精度は、血漿の場合１８．０％より低く、血清の場合１３％より低かった。実行間の真度は、血漿の場合９８．７〜１０４％の間及び血清の場合９５．７〜１０１．１％の間であった。本データを、表１３に示す。
【表１３】
2020502544.tif 000018
【０１８５】
抽出中に分析物の回収を評価するために、血清及び血漿中のＱＣサンプルを、公知の濃度の分析物で強化した。添加されたＱＣサンプルの６回の反復を、抽出し、標準のＱＣサンプルと一緒に３回分析した。添加されたＱＣサンプル中の量を減算した後、添加された量の回収を算出した。６種の分析物の回収を、６種の分析物について、血漿中で８０．４％〜９７．５％及び血清中で７５．６％〜９６．０％であると決定した。本データを、表１４に示す。
【表１４】
2020502544.tif 000019
【０１８６】
Ｃ．クロマトグラフィー方法３及びＭＳ／ＭＳ方法３
クロマトグラフィー方法３及びＭＳ／ＭＳ方法３の組み合わせの分析性能によって、単回の注入で、実行時間が７．０分で、Ｎ−アセチルスレオニン、フェニルアセチルグルタミン、トリプトファン、クレアチニン、Ｎ−アセチルアラニン、３−メチルヒスチジン、ｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、キヌレニン、及び尿素からなる群から選択される、複数の９種までの分析物を定量化した。
【０１８７】
複数の９種の分析物を測定するための方法の精度を、血漿及び血清の代表的なロットで評価した。血漿についての１２回の反復及び血清についての６回の反復を、３回実行することによって分析した。実行間の精度は、血漿において６．２％未満及び血清において６．０％未満であった。これらの結果を、表１５に示す。
【表１５】
2020502544.tif 000020
【０１８８】
ＬＬＯＱにおける精度及び真度を評価した。あらゆる分析物についての信号雑音比は、５：１より大きかった。ＬＬＯＱサンプル６回の反復を、３回実行して分析した。ＬＬＯＱの合計１８回分は、各マトリックスについての各分析物についての日間の％ＲＳＤ及び真度の算出に含めた。実行間の精度は、血漿の場合１４．４％未満及び血清の場合９．５％未満であった。実行間の真度は、血漿の場合９１．７〜１０２％の間及び血清の場合９２．６〜１０１．９％の間であった。本データを、表１６に示す。
【表１６】
2020502544.tif 000021
【０１８９】
抽出中に分析物の回収を評価するために、血清及び血漿中のＱＣサンプルを、公知の濃度の分析物で強化した。添加されたＱＣサンプルの６回の反復を、抽出し、標準のＱＣサンプルと一緒に３回分析した。添加されたＱＣサンプル中の量を減算した後、添加された量の回収を算出した。９種の分析物の回収を、９種の分析物について、血漿中で８６．１％〜９６．４％及び血清中で９１．５％〜９８．３％であると決定した。本データを、表１７に示す。
【表１７】
2020502544.tif 000022
【０１９０】
Ｄ．クロマトグラフィー方法４及びＭＳ／ＭＳ方法４
クロマトグラフィー方法４及びＭＳ／ＭＳ方法４の組み合わせの分析性能によって、単回の注入で、実行時間が３．３０分で、トリプトファン、Ｃ−グリコシルトリプトファン、及び３−インドキシルスルファートからなる群から選択される複数の３種までの分析物を定量化した。
【０１９１】
トリプトファン及び／又は３−インドキシルスルファートを測定するための方法の精度を、血漿及び血清の代表的なロットにおいて評価した。血漿についての１２回の反復及び血清についての６回の反復を、３回実行することによって分析した。実行間の精度は、血漿中で４．４％未満及び血清中で５．８％未満であった。これらの結果を、表１８に示す。
【表１８】
2020502544.tif 000023
【０１９２】
ＬＬＯＱにおける精度及び真度を評価した。あらゆる分析物についての信号雑音比は、５：１より大きかった。ＬＬＯＱサンプル６回の反復を、３回実行して分析した。ＬＬＯＱの合計１８回分は、各マトリックスについての各分析物についての日間の％ＲＳＤ及び真度の算出に含めた。実行間の精度は、血漿の場合７．８％未満及び血清の場合８．３％未満であった。実行間の真度は、血漿の場合１０６〜１０７％の間及び血清の場合９３．５〜９４．２％の間であった。本データを、表１９に示す。
【表１９】
2020502544.tif 000024
【０１９３】
抽出中に分析物の回収を評価するために、血清及び血漿中のＱＣサンプルを、公知の濃度の分析物で強化した。添加されたＱＣサンプルの６回の反復を、抽出し、標準のＱＣサンプルと一緒に３回分析した。添加されたＱＣサンプル中の量を減算した後、添加された量の回収を算出した。トリプトファンについての回収を、血漿中で９７．７％及び血清中で９０．９％と決定し；３−インドキシルスルファートについての回収を、血漿中で９４．３％及び血清中で９６．３％であると決定した。
【０１９４】
Ｅ．クロマトグラフィー方法６及びＭＳ／ＭＳ方法５
クロマトグラフィー方法６及びＭＳ／ＭＳ方法５の組み合わせの分析性能によって、単回の注入で、実行時間が７．０分で、メソ−エリトリトール、Ｄ−アラビトール、イノシトール、３−インドキシルスルファート、Ｌ−トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニン、及びＮ−アセチルセリンからなる群から選択される、複数の１０種までの分析物を定量化した。
【０１９５】
複数の１０種の分析物を測定するための方法の精度を、血漿及び血清の代表的なロットにおいて評価した。血漿及び血清についての１２回の反復を、３回実行することによって分析した。これらの結果を、表２０に示す。
【表２０】
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【０１９６】
抽出中に分析物の回収を評価するために、血清及び血漿中のＱＣサンプルを、公知の濃度の分析物で強化した。添加されたＱＣサンプルの６回の反復を、抽出し、血漿及び血清中の標準の６種のＱＣ複製サンプルと一緒に分析した。添加されたＱＣサンプル中の量を減算した後、添加された量の回収を算出した。１０種の分析物の回収を、血漿及び血清中で９０％より大きいと決定した。
【０１９７】
Ｆ．クロマトグラフィー方法７及びＭＳ／ＭＳ方法５
クロマトグラフィー方法７及びＭＳ／ＭＳ方法５の組み合わせの分析性能によって、単回の注入で、実行時間が２．７分で、アラビトール、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニンからなる群から選択される複数の５種までの分析物を定量化した。
【０１９８】
複数の５種の分析物を測定するための方法の精度を、血漿及び血清の代表的なロットにおいて評価した。血漿及び血清についての１２回の反復を、３回実行することによって分析した。これらの結果を、表２１に示す。
【表２１】
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【０１９９】
抽出中に分析物の回収を評価するために、血清及び血漿中のＱＣサンプルを、公知の濃度の分析物で強化した。添加されたＱＣサンプルの６回の反復を、抽出し、血漿及び血清中の標準の６種のＱＣ複製サンプルと一緒に分析した。添加されたＱＣサンプル中の量を減算した後、添加された量の回収を算出した。分析物フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、及びプソイドウリジンの回収を、血漿及び血清中で９０％より大きいと決定し；分析物アラビトール及びＮ−アセチルスレオニンの回収を、８５％より大きいと決定した。
【０２００】
Ｇ．クロマトグラフィー方法８及びＭＳ／ＭＳ方法５
クロマトグラフィー方法８及びＭＳ／ＭＳ方法５の組み合わせの分析性能によって、単回の注入で、実行時間が３．２分で、ミオ−イノシトール、トリプトファン、フェニルアセチルグルタミン、クレアチニン、プソイドウリジン、Ｎ−アセチルスレオニンからなる群から選択される複数の６種までの分析物を定量化した。
【０２０１】
複数の６種の分析物を測定するための方法の精度を、血漿及び血清の代表的なロットにおいて評価した。血漿及び血清についての１２回の反復を、３回実行することによって分析した。これらの結果を、表２２に示す。
【表２２】
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【０２０２】
抽出中に分析物の回収を評価するために、血清及び血漿中のＱＣサンプルを、公知の濃度の分析物で強化した。添加されたＱＣサンプルの６回の反復を、抽出し、血漿及び血清中の標準の６種のＱＣ複製サンプルと一緒に分析した。添加されたＱＣサンプル中の量を減算した後、添加された量の回収を算出した。６種の分析物の回収を、血漿及び血清中で９０％より大きいと決定した。
付録Ａ
【表２３−１】
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【表２３−２】
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【表２３−３】
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【表２３−４】
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【表２３−５】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2020502544.tif 000036
【図２Ｃ−２Ｅ】
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【図２Ｆ−２Ｈ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2020502544.tif 000040
【図３Ｃ−３Ｇ】
2020502544.tif 000041
【図３Ｈ−３Ｋ】
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【図４Ａ】
2020502544.tif 000043
【図４Ｂ−４Ｄ】
2020502544.tif 000044
【図４Ｅ】
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【図４Ｆ−４Ｈ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【国際調査報告】
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