(57)【要約】本発明は、感染した脊髄後角ニューロンからシナプス間隙中への小胞GABAの放出を強化することによって侵害受容効果の誘導に有効である、GAD65（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）遺伝子およびVGAT（小胞GABA輸送体）遺伝子の脊髄分節特異的なアップレギュレーションのための組成物の少量の軟膜下投与による、神経障害性疼痛を処置するための治療法を提供する。2020533313.tif 000011
2020533313.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）組織特異的プロモーターの調節下の、ウイルスベクター配列、GAD65遺伝子配列、およびVGAT遺伝子配列と、
（ii）薬学的に許容されるウイルス担体と
を含む組成物の軟膜下投与を含み、それによって対象における神経障害性疼痛を処置する、
対象における神経障害性疼痛を処置する方法。
【請求項２】
前記対象が哺乳動物である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
核酸構築物が、AAVセロタイプ9またはAnc80キャプシドでキャプシド形成されている、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記組成物における核酸構築物の濃度が、約0.1〜2.0×1013 gc/mlの間である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記薬学的に許容されるウイルス担体が、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター（AV）、またはアデノ随伴ベクター（AAV）からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記薬学的に許容されるウイルス担体がAAVである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
前記AAVが、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh8、AAVrh10、AAVrh33、AAV rh34、およびAAV Anc80からなる群より選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記組織特異的プロモーターが、ヒトユビキチンプロモーターおよびヒトシナプシンプロモーターからなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
前記GAD65遺伝子配列が、SEQ ID NO:2または5である、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記VGAT遺伝子配列が、SEQ ID NO:4または6である、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
組織特異的プロモーターの調節下の、（i）ウイルスベクター配列、（ii）GAD65遺伝子配列、および（iii）VGAT遺伝子配列を含む遺伝子治療構築物の治療的有効量と、
薬学的に許容される担体と
を含む組成物を、軟膜下に投与する工程を含み、それによって対象における神経障害性疼痛を処置する、
遺伝子治療によって対象における神経障害性疼痛を処置するための方法。
【請求項１２】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター（AV）、およびアデノ随伴ベクター（AAV）からなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記ウイルスベクターがAAVである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
前記AAVが、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh8、AAVrh10、AAVrh33、AAV rh34、およびAAV Anc80からなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記遺伝子治療構築物が、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
前記組織特異的プロモーターが、ヒトユビキチンプロモーターおよびヒトシナプシンプロモーターからなる群より選択される、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、約0.1〜2.0×1013 gc/mlの濃度で遺伝子治療構築物を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が哺乳動物である、請求項11記載の方法。
【請求項１９】
GAD65をコードする第1のベクターおよびVGATをコードする第2のベクターの軟膜下投与を含み、それによって対象における神経障害性疼痛を処置する、対象における神経障害性疼痛を処置するための方法。
【請求項２０】
前記対象が哺乳動物である、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
第1のベクターおよび第2のベクターの各々が、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター（AV）、またはアデノ随伴ベクター（AAV）からなる群より独立して選択される、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
第1のベクターおよび第2のベクターの各々がAAVである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
前記AAVが、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh8、AAVrh10、AAVrh33、AAV rh34、およびAAV Anc80からなる群より選択される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
第1のベクターがSEQ ID NO:2を含み、かつ第2のベクターがSEQ ID NO:4を含む、請求項19記載の方法。
【請求項２５】
組織特異的プロモーターの調節下のウイルスベクター配列、GAD65遺伝子配列、およびVGAT遺伝子配列を含む、核酸構築物。
【請求項２６】
前記組織特異的プロモーターが、ヒトユビキチンプロモーターおよびヒトシナプシンプロモーターからなる群より選択される、請求項25記載の核酸構築物。
【請求項２７】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項25記載の核酸構築物。
【請求項２８】
前記AAVが、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh8、AAVrh10、AAVrh33、AAV rh34、およびAAV Anc80からなる群より選択される、請求項27記載の核酸構築物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体の内容が参照により本明細書に組み入れられる、2017年9月8日に出願された米国特許出願第62/556,088号の、米国特許法（35 U.S.C.）第119条（e）の下における優先権の恩典を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出されており、かつその全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含有する。2018年9月6日に作成されたASCIIコピーは、20378-201844_SL.txtという名称であり、サイズが22KBである。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、神経障害性疼痛を処置することに関連し、より具体的には、慢性神経障害性疼痛を処置するための1つまたは複数の遺伝子の脊髄軟膜下送達を含む併用治療計画に関連する。
【背景技術】
【０００４】
背景情報
神経障害性疼痛は、様々なタイプの神経損傷によって引き起こされる疼痛である。神経障害性疼痛状態のいくつかの例には、非限定的に、糖尿病性末梢性ニューロパチー、帯状疱疹、ヘルペス後神経痛、三叉神経痛、複合性局所疼痛症候群、反射性交感神経性ジストロフィー、片頭痛、幻肢症候群、慢性疾患（多発性硬化症、HIVなど）による神経障害性疼痛、外傷による神経障害性疼痛（灼熱痛）、インピンジメントによる神経障害性疼痛（すなわち、坐骨神経痛、手根管など）、薬物曝露または毒性化学物質曝露による神経障害性疼痛、感染によるかまたは感染後の神経障害性疼痛、臓器機能障害による神経障害性疼痛、血管疾患による神経障害性疼痛、代謝疾患による神経障害性疼痛、がんまたはがんの処置による神経障害性疼痛、自己免疫疾患による神経障害性疼痛、神経障害性背下部疼痛、線維筋痛による神経障害性疼痛、および既知の原因がない（突発性の）神経障害性疼痛が含まれる。実際に、神経障害性疼痛は、ほとんどの場合、症状に基づいて診断され、そのため、いずれかの疼痛は、灼熱感および/もしくは電撃痛および/もしくはしびれおよび/もしくは刺痛によって特徴付けられるものであり、かつ/また異痛症は、典型的には神経障害性と考えられる。神経障害性疼痛の他の特徴には、痛覚過敏（刺激に対する大きく誇張された痛覚）、感覚過敏（通常の刺激に対する増加した感受性）、異感覚（そうではない場合にまるで損傷が起きているような不快な異常な感覚）、および錯感覚（自発性であろうとまたは誘発性であろうと、例えば「しびれてじんじんする」、異常な感覚）が含まれる。
【０００５】
侵害受容性疼痛と神経障害性疼痛とは、異なる機序によって引き起こされ、したがって、異なる処置様式に応答することが周知である。侵害受容性疼痛は、皮膚、骨、結合組織、筋肉、および内臓に位置する受容体によって媒介される。これらの受容体は、典型的には、有害化学物質、熱刺激、および機械的刺激に応答し、鋭い、疼く、拍動性、またはさしこみと典型的に描写される疼痛を生じる。対照的に、神経障害性疼痛は、末梢神経系または中枢神経系に対する損傷、またはそこにおける病理学的変化によって生じ、典型的には、本質的に「灼熱」、「電気的」、「刺痛」、および「電撃」と描写される疼痛を生じる。最後に、侵害受容性疼痛は、通常、オピオイドおよび非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDS）に応答するのに対して、これらのアプローチでの神経障害性疼痛の処置の成功は限定されている。
【０００６】
現在のところ、髄腔内に注入される抗侵害受容性化合物（ガバペンチンおよびオピオイドなど）が、脊髄に限定された抗侵害受容効果を達成するために用いられている。しかし、いかなる遺伝子治療ベースの技術も、慢性神経障害性疼痛を処置するために利用可能ではない。同様に、特定の脊髄分節において侵害受容性伝達を抑制するために有効に用いることができる、かつ末梢神経損傷の部位に同側性である遺伝子治療ベースの技術は、現在利用可能ではない。加えて、現在利用可能な脊髄薬物送達システム（硬膜外送達または髄腔内送達など）は、脊髄分節に限定された治療効果を可能にしない。したがって、神経障害性疼痛のための、そのような改善された処置について必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、GAD65（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）およびVGAT（小胞GABA輸送体）の脊髄分節特異的なアップレギュレーションからなる併用処置が、感染した脊髄後角ニューロンからシナプス間隙中への小胞GABAの放出を強化することによって侵害受容効果の誘導に有効であるという観察に基づく。
【０００８】
したがって、本発明は、対象における神経障害性疼痛を処置する方法を提供する。方法は、（i）組織特異的プロモーターの調節下の、ウイルスベクター配列、GAD65遺伝子配列（例えば、SEQ ID NO:2または5）、およびVGAT遺伝子配列（例えば、SEQ ID NO:4または6）と；（ii）薬学的に許容されるウイルス担体とを含む組成物の軟膜下投与を含み、それによって対象における神経障害性疼痛を処置する。様々な態様において、対象は、哺乳動物であってもよい。様々な態様において、核酸構築物は、AAV7セロタイプ9キャプシドでキャプシド形成されている。様々な態様において、組成物における核酸構築物の濃度は、約0.1〜2.0×1013 gc/mlの間である。様々な態様において、薬学的に許容されるウイルス担体は、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター（AV）、またはアデノ随伴ベクター（AAV）からなる群より選択される。様々な態様において、AAVは、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh8、AAVrh10、AAVrh33、AAV rh34、およびAAV Anc80からなる群より選択される。様々な態様において、組織特異的プロモーターは、ヒトユビキチンプロモーターおよびヒトシナプシンプロモーターからなる群より選択される。
【０００９】
別の局面において、本発明は、対象における神経障害性疼痛を処置する方法を提供する。方法は、組織特異的プロモーターの調節下の、（i）ウイルスベクター配列、（ii）GAD65遺伝子配列、および（iii）VGAT遺伝子配列を含む遺伝子治療構築物の治療的有効量と、薬学的に許容される担体とを含む組成物を、軟膜下に投与する工程を含み、それによって対象における神経障害性疼痛を処置する。様々な態様において、核酸構築物は、AAVセロタイプ9キャプシドでキャプシド形成されている。様々な態様において、組成物における核酸構築物の濃度は、約0.1〜2.0×1013 gc/mlの間である。様々な態様において、薬学的に許容されるウイルス担体は、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター（AV）、またはアデノ随伴ベクター（AAV）からなる群より選択される。様々な態様において、AAVは、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh8、AAVrh10、AAVrh33、AAV rh34、およびAAV Anc80からなる群より選択される。様々な態様において、組織特異的プロモーターは、ヒトユビキチンプロモーターおよびヒトシナプシンプロモーターからなる群より選択される。
【００１０】
別の局面において、本発明は、対象における神経障害性疼痛を処置する方法を提供する。方法は、GAD65（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）遺伝子をコードする第1のベクターおよびVGAT（小胞GABA輸送体）遺伝子をコードする第2のベクターの軟膜下投与を含み、それによって対象における神経障害性疼痛を処置する。第1のベクターおよび第2のベクターの投与は、対象におけるGAD65遺伝子およびVGAT遺伝子の脊髄特異的なアップレギュレーションを結果としてもたらす。様々な態様において、第1のウイルスベクターは、GAD65をコードするポリヌクレオチドを含み、かつ第2のウイルスベクターは、VGATをコードするポリヌクレオチドを含み、GAD65およびVGATは対象において発現され、それによって対象における神経障害性疼痛を処置する。第1のベクターおよび第2のベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ベクター（AAV）であってもよい。AAVは、AAVタイプ9（AAV9）またはAAV Anc80であってもよい。様々な態様において、第1のベクターはAAV9-UBI-GAD65であり、かつ第2のベクターはAAV9-UBI-VGATである。
【００１１】
別の局面において、本発明は、対象における神経障害性疼痛を処置する方法を提供する。方法は、その必要がある対象に、GAD65をコードするポリヌクレオチドを含むウイルスベクターの治療的有効量を軟膜下投与する工程、および該対象にGABAアゴニストを全身投与する工程を含み、それによって対象における痙縮を処置する。ベクターは、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ベクター（AAV）であってもよく、かつ対象の脊椎中に直接投与されてもよい。AAVは、AAVタイプ9（AAV9）またはAAV Anc80であってもよい。様々な態様において、ベクターはAAV9-UBI-GAD65である。
【００１２】
別の局面において、本発明は、組織特異的プロモーターの調節下のウイルスベクター配列、GAD65遺伝子配列、およびVGAT遺伝子配列を含む核酸構築物を提供する。様々な態様において、組織特異的プロモーターは、ヒトユビキチンプロモーターおよびヒトシナプシンプロモーターからなる群より選択される。様々な態様において、ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、例えば、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV rh8、AAVrh10、AAVrh33、AAV rh34、またはAAV Anc80である。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図1A〜1Cは、片側性脊髄軟膜下ベクター送達を示す絵図である。図1Aは、動物モデルにおけるカテーテルを軟膜下に配置した骨髄の絵図を示す。図1Bは、ベクター組成物の送達のための軟膜下空間中への注射針の片側性軟膜下前進（3 mm）を示す。図1Cは、成体マウスにおけるAAV9-UBI-GFP（0.5μl；1.2×1013 gc/ml）の片側性軟膜下送達の2週間後の、片側性後角mRNA-GFPシグナル（蛍光インサイチュハイブリダイゼーション；FISH）を示す。
【図２】図2A〜2Fは、神経障害性疼痛を発症したマウスにおける、AAV9-UBI-GAD65/VGATまたはAnc80-UBI-GAD65/VGATの軟膜下送達後の抗侵害受容性の結果を示す、絵図およびグラフ図である。図2Aおよび2Bは、AAV9-UBI-GAD65/VGATベクターの片側性軟膜下注射を受けた動物の後足における、触覚およびブラシ誘発性の侵害受容性応答の有意な抑制を示す。図2Cおよび2Dは、AAV9-UBI-GAD65/VGATベクターの片側性軟膜下注射を受けた神経障害性動物におけるオープンフィールド運動能力（走行距離）および同側性後足配置パターン（Cat Walkアッセイ）の有意な改善を示す。図2Eおよび2Fは、匹敵する抗侵害受容効果が、Anc80-UBI-GAD65/VGATベクターで処置された神経障害性動物において見られたことを示す。
【図３】図3A〜3Eは、成体マウスにおける片側性（同側性）（L2-L4）軟膜下AAV9-UBI-GAD65/VGAT送達後の同側性脊髄後角興奮性介在ニューロンにおける阻害性-興奮性混合型の神経伝達物質表現型の誘導を示す、絵図およびグラフ図である。図3A〜3Dは、同側性脊髄後角ニューロンのVGLUT2（図3A）、GAD65（図3B）、VGAT（図3C）での染色、ならびにVGLUT2、GAD65、およびVGATで染色された点の共局在（図3D）の画像を示す。VGLUT2とVGATとの、およびVGLUT2とGAD65との明らかな同時発現（白矢印）が検出された。図3Eは、処置された（損傷＋GAD65＋VGAT）動物および対照（損傷＋PBS）動物の後角（ラミナI-III）における、VGLUT、GAD65、およびVGATの発現の定量的デンシトメトリーの結果を示す。マウスに、AAV9-UBI-GAD65/VGATベクターまたはPBSのみを、同側性（L2-L4）に注射した。対側性後角における発現の増加は、見られなかった/測定されなかった。
【図４】図4A〜4Dは、電子顕微鏡とカップリングした、VGLUT2抗体およびGAD65抗体およびVGAT抗体での包埋前免疫金染色の結果を示す絵図であり、PBS注射動物（PNI-PBS）と比較した場合に、AAV9-UBI-GAD65/VGAT注射動物（PNI＋GAD65＋VGAT）のVGLUT2+終末におけるGAD65およびVGATの免疫金タグ付加粒子の明らかな増加を示す。図4E〜4Jは、蛍光インサイチュハイブリダイゼーションからの結果を示す絵図であり、AAV9-UBI-GAD65/VGAT注射動物の同側性脊髄後角ニューロンにおける、VGLUT2、GAD65、およびVGATのmRNAを有するダブルタグ付加ニューロンおよびトリプルタグ付加ニューロン（白矢印）の明らかな出現を示す。
【図５】図5A〜5Dは、成体ブタモデルにおける片側性Anc80-UBI-Rpl22（3xHA）を示す絵図である。示されるように、同側性脊髄後角ニューロン特異的なRpl22タンパク質発現が、成体ブタモデルにおいて片側性軟膜下（L2-L3）Anc80-UBI-Rpl22-3xHAベクター送達（100μl；1.2×1013 gc/ml）後に観察された（DH-後角；VH-前角）。
【図６】図6A〜6Dは、成体ブタにおける片側性Anc80-UBI-GAD65/VGAT送達が、脊髄後角ニューロンにおいて興奮性-抑制性混合型のニューロン表現型を誘導することを示す、絵図である。同側性にAnc80-UBI-GAD65/VGATベクター（100μl；1.2×1013 gc/ml）が注射された動物モデル（成体ブタ；35 kg）におけるVGLUT2（図6A）、VGAT（図6B）、およびGAD65（図6C）の抗体での同側性脊髄後角ニューロンの染色。示されるように、VGLUT2とVGATおよびGAD65との明らかな同時発現（白い点）が検出され得る（図6D）。
【図７】図7は、慢性脊髄損傷誘導性筋肉痙縮を有するラットモデルにおけるGAD65遺伝子およびVGAT遺伝子の脊髄軟膜下送達の治療的抗痙縮効果を研究するための、実験設計の例示的な工程を示す絵図である。工程AおよびBは、後肢における筋肉痙縮を、Th9脊髄分節切断によって誘導し、痙縮を、足の触覚刺激に対する腓腹筋EMG応答における定量的変化によって特定/測定することを示す。工程CおよびDは、筋肉痙縮の誘導の2〜3か月後に、動物がAAV9（またはAnc80）-UBI-GAD65/VGATベクターの腰部軟膜下注射を受け、痙縮応答の存在をさらに2か月間測定したことを示す。工程Eは、屠殺後に、GAD65およびVGATのアップレギュレーションの存在を免疫蛍光染色によって測定したことを示す。
【図８】図8A〜8Dは、脊髄切断誘導性筋肉痙縮の慢性ラットモデルにおけるAAV9-UBI-GAD65/VGATの軟膜下送達後の抗痙縮効果を示す、絵図およびグラフ図である。図8Aおよび8Bは、対照ベクター（AAV9-GFP）を受けた動物における筋肉痙縮の測定の結果を示し、（脊髄切断の2〜3か月後に測定したベースラインと比較して）ウイルス送達後8週間にわたる筋肉痙縮の進行性の増加を示した。対照的に、AAV9-UBI-GAD65/VGATベクターを受けた動物においては、痙縮応答のほぼ完全な遮断が測定された。図8Cおよび8Dは、H-反射の速度依存的抑圧（RDD）の測定の結果を示し、AAV9-UBI-GAD65/VGATベクターで処置された動物におけるRDDの有意な回復を示した。
【図９】図9A〜9Dは、AAV9-UBI-GFP（対照ベクター）またはAAV9-UBI-GAD65/VGATベクターを注射した動物（ラット）の脊髄後角ニューロンにおける、VGLUT2、GAD65、およびVGATの発現を示す絵図である。図9Aおよび9Bは、対照AAV9-UBI-GFPベクターを受けた動物のVGLUT2終末における、GAD65とVGATとの同時発現を示さない。図9Cおよび9Dは、慢性筋肉痙縮の成体ラットモデルにおける両側性（L2-L4）軟膜下AAV9-UBI-GAD65/VGAT送達後の腰部興奮性介在ニューロンにおいて、阻害性-興奮性混合型の神経伝達物質表現型の誘導を示す。VGLUT2終末におけるGAD65とVGATとの同時発現が証拠となるように、脊髄介在ニューロンにおける混合型の神経伝達物質表現型の出現が見られ得る。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、GAD65（グルタミン酸デカルボキシラーゼ）遺伝子およびVGAT（小胞GABA輸送体）遺伝子の脊髄分節特異的なアップレギュレーションからなる併用処置の少量の軟膜下投与が、感染した脊髄後角ニューロンからシナプス間隙中への小胞GABAの放出を強化することによって侵害受容効果の誘導に有効であるという観察に基づく。
【００１５】
本組成物および方法が説明される前に、本発明は説明される特定の組成物、方法、および実験条件には限定されず、そのような組成物、方法、および条件は変化し得ることを理解されるべきである。本明細書において使用される用語は特定の態様を説明する目的のためのものにすぎず、限定を意図しないこと、したがって本発明の範囲は添付の特許請求の範囲においてのみ限定されることも理解されるべきである。
【００１６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるように、文脈によって特に明らかに指示されない限り、単数形の「a」、「an」、および「the」は複数の言及を含む。したがって、例えば「方法」という言及は１つもしくは複数の方法、および／または本開示等を読めば当業者には明らかとなる、本明細書において説明されるタイプの段階を含む。
【００１７】
「〜を含む（comprising）」という用語は、「〜を含んでいる（including）」、「〜を含有する（containing）」、または「〜によって特徴付けられる」と言い換え可能で使用され、付加的な列挙されない要素または方法段階を包含し、またはそれらと変更可能であり、それらを除外しない言葉である。「〜からなる」という句は、請求項において特定されない、いかなる要素、段階、または成分も除外する。「本質的に〜からなる」という句は、請求項の範囲を特定の材料または段階に、および主張される発明の基本的な新規の特徴には実質的に影響しないものに限定する。本開示によって、これらの句の各々の範囲に相当する本発明の様々な態様の組成物および方法が企図される。したがって、列挙される要素または段階を含む組成物または方法は、該組成物または方法が本質的にそれらの要素もしくは段階からなる、またはそれらの要素もしくは段階からなるような、特定の態様を企図する。
【００１８】
本明細書において提供される範囲は、範囲内の値の全てについての速記であると理解される。例えば、1〜50の範囲は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、および50からなる群由来の任意の数、数の組み合わせ、または部分範囲を含むと理解される。
【００１９】
「約」および「およそ」という用語は、概して、測定値の性質または精度を考慮して、測定された量についての誤差の許容される程度を意味するものとする。典型的には、誤差の例示的な程度は、所与の値または値の範囲の20パーセント（％）以内、好ましくは10％以内、およびより好ましくは5％以内である。あるいは、および生物学的システムにおいては特に、「約」および「およそ」という用語は、所与の値の1桁以内、好ましくは10倍または5倍以内、およびより好ましくは2倍以内である値を意味し得る。本明細書において与えられる数量は、特に述べられない限り概算であり、「約」または「およそ」という用語は、はっきりと述べられない場合は推測され得ることを意味する。
【００２０】
特に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者に一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施または試験においては本明細書において説明されるものと同様または同等の、任意の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料がここで説明される。
【００２１】
本明細書において使用される「対象」という用語は、本方法が行われる任意の個体または患者を指す。一般的に対象はヒトであるが、当業者には理解されるように、対象は動物であってよい。したがって、齧歯類（マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットを含む）、ネコ、イヌ、ウサギ、牛、馬、ヤギ、ヒツジ、ブタ等を含む家畜、ならびに霊長類（サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラを含む）のような哺乳動物を含む他の動物が対象の定義内に含まれる。
【００２２】
本明細書において使用されるような「治療的効果」は、本明細書において説明されるような治療的利益および／または予防的利益を包含する。
【００２３】
本明細書において使用されるように、ある場合における低減は特定のアッセイの検出レベル以下まで減り得ることが認識されるため、「低減する」および「抑制する」という用語は共に使用される。そのように、発現のレベルまたは活性が、あるアッセイの検出レベル以下に「低減した」のか、または完全に「抑制された」のかは常に明らかではない可能性がある。とはいえ、本方法に従った治療の後にそれを明らかに決定することはできる。
【００２４】
本明細書において使用されるように、「処置」または「処置する」は、望ましくない状態を有する対象または系に組成物を投与することを意味する。該状態は疾患または障害を含み得る。「予防」または「予防する」は、該状態のリスクのある対象または系に組成物を投与することを意味する。該状態は、疾患または障害への素因を含み得る。組成物の対象への投与の効果は（処置および／または予防のいずれでも）、限定しないが、該状態の１つもしくは複数の症状の停止、該状態の１つもしくは複数の症状の低減もしくは予防、該状態の重症度の低下、該状態の完全な消失、特定の事象もしくは特徴の発現もしくは進行の安定化もしくは遅延、または特定の事象もしくは特徴が起こる頻度の最少化であり得る。
【００２５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書においてはアミノ酸残基のポリマーを指し、言い換え可能なように使用される。本用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、相当する天然のアミノ酸の人工の化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび天然には存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。
【００２６】
「アミノ酸」という用語は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるもの、ならびに、例えばヒドロキシプロリン、α-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリンのような、後に修飾されるアミノ酸である。アミノ酸アナログは、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、即ち、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびR基、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムと結合したα炭素を有する化合物を指す。そのようなアナログは、修飾されたR基（例えばノルロイシン）または修飾されたペプチドバックボーンを有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持している。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有しているが、天然に存在するアミノ酸と同様の様式で機能する化合物を指す。
【００２７】
本明細書においてアミノ酸は、その周知の3文字の記号か、または国際生化学分子生物学連合命名法委員会（IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission）により推奨される1文字の記号のいずれかで呼ばれ得る。ヌクレオチドは同様に、一般的に認められているその1文字表記で呼ばれ得る。
【００２８】
本明細書において使用されるように、「制御遺伝子」または「制御配列」は、他の遺伝子の発現を調節する産物（例えば転写因子）をコードする核酸配列である。
【００２９】
本明細書において使用されるように、「タンパク質コード配列」または特定のタンパク質もしくはポリペプチドをコードする配列は、適切な制御配列の調節下に置かれた場合に、インビトロまたはインビボにおいてmRNA（DNAの場合）に転写され、（mRNAの場合）ポリペプチドに翻訳される核酸配列である。コード配列の境界は5’末端（N末端）の開始コドンおよび3’末端（C末端）の翻訳停止ナンセンスコドンによって決定される。コード配列は非限定的に、真核生物mRNA由来のcDNA、真核生物DNA由来のゲノムDNA配列、および合成核酸を含み得る。転写終結配列は通常コード配列の3’側に位置する。
【００３０】
本明細書において使用されるように、「プロモーター」は、RNAポリメラーゼをDNAに結合させてRNA合成を開始させることにより転写開始を仲介する、遺伝子の上流に一般的に位置する制御DNA配列と定義付けられる。プロモーターは構成的に活性なプロモーター（即ち、構成的に活性／「ON」の状態にあるプロモーター）であってよく、誘導性プロモーター（即ち、活性／「ON」または不活性／「OFF」のその状態が外部刺激、例えば特定の化合物またはタンパク質の存在によって調節されるプロモーター）であってよく、空間的に制限されるプロモーター（即ち、転写調節エレメント、エンハンサー等）（例えば組織特異的プロモーター、細胞タイプ特異的プロモーター等）であってよく、時間的に制限されるプロモーター（即ち、胚発生の特定の段階において、または生物学的プロセスの特定の段階においてプロモーターが「ON」状態または「OFF」状態にある）であってよい。
【００３１】
本明細書において使用されるように、「遺伝子」という用語は構造遺伝子のコード領域を含むデオキシリボヌクレオチド配列を意味する。「遺伝子」は、該遺伝子が全長mRNAの長さに相当するように5’末端および3’末端の双方においてコード領域に隣接して位置する非翻訳配列をも含み得る。コード領域の5’側に位置し、mRNA上に存在する配列は5’非翻訳配列と呼ばれる。コード領域の3’側、すなわち下流に位置し、mRNA上に存在する配列は、3’非翻訳配列と呼ばれる。「遺伝子」という用語はcDNAと遺伝子のゲノム形態の双方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と呼ばれる非コード配列によって分断されたコード領域を含有する。イントロンはヘテロ核RNA（hnRNA）に転写される遺伝子の断片である；イントロンはエンハンサーのような制御エレメントを含有し得る。イントロンは核転写産物または一次転写産物から除去または「切り出」される；したがってイントロンはメッセンジャーRNA（mRNA）転写産物中にはない。翻訳の間mRNAは、新生ポリペプチドにおける配列またはアミノ酸の順序を特定するよう機能する。
【００３２】
本明細書において使用するように、「機能するように連結された」および「機能的に連結された」という用語は言い換え可能で使用され、2つまたはそれ以上のDNA断片、特に発現される遺伝子配列とその発現を調節する配列の間の機能的な関係を指す。例えば、シス作用性転写調節エレメントの任意の組み合わせを含むプロモーター／エンハンサー配列が、適切な宿主細胞または他の発現系におけるコード配列の転写を刺激または調節するのであれば、それはコード配列に機能的に連結されている。転写される遺伝子配列に機能的に連結されたプロモーター制御配列は、転写される配列に物理的に隣接している。
【００３３】
「保存的に修飾された変異体」は、アミノ酸配列および核酸配列の双方に適用される。特定の核酸配列に関して保存的に修飾された変異体は、同一もしくは本質的に同一のアミノ酸配列、または核酸がアミノ酸配列をコードしない場合は本質的に同一の配列をコードする核酸を指す。遺伝子コードの縮重によって、多数の機能的に同一の核酸が所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCG、およびGCUは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、あるコドンによってアラニンが特定される全ての位置において、コードされるポリペプチドを変えることなく、記載した相当コドンの任意のものに該コドンを変えることができる。そのような核酸変異は保存的に修飾された変異の一種である「サイレント変異」である。本明細書における、ポリペプチドをコードする全ての核酸配列は、核酸において可能な全てのサイレント変異をも含めて記載するものである。当業者には、核酸における各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるAUG、および、通常トリプトファンのための唯一のコドンであるTGGを除く）を修飾して機能的に同一の分子を得られることが認識される。したがって、あるポリペプチドをコードするある核酸の各々のサイレント変異は、記載される各配列において黙示的である。
【００３４】
アミノ酸配列については、コードされる配列において1つのアミノ酸または低い割合のアミノ酸を変化させる、加える、または欠失させるような、ある核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列への個々の置換、欠失、または付加は、「保存的に修飾された変異」であり、該変化の結果、あるアミノ酸が、化学的に類似したアミノ酸と置換されることが当業者には認識される。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換の一覧は、当技術分野においては周知である。そのような保存的に修飾された変異体は本発明の多型変異体、種間相同体、およびアレルに加えられるものであり、それらを除外するものではない。
【００３５】
以下の8群は各々、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む：
1）アラニン(A)、グリシン(G)；
2）アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；
3）アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；
4）アルギニン(R)、リシン(K)；
5）イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；
6）フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)；
7）セリン(S)、スレオニン(T)；および
8）システイン(C)、メチオニン(M)（例えばCreighton, Proteins(1984)を参照のこと）。
【００３６】
保存的置換は、塩基性から塩基性、酸性から酸性、極性から極性等のような置換を含み得る。そのように誘導されるアミノ酸のセットは構造上の理由で保存される可能性がある。これらのセットはベン図の形態において説明できる（Livingstone C.D.およびBarton G.J.(1993)「タンパク質配列アラインメント：残基の保存の階層分析のための戦略」Comput. Appl Biosci.9:745-756；Taylor W.R.(1986)「アミノ酸の保存の分類」J.Theor Biol. 119:205-218）。保存的置換は例えば、一般的に許容されるアミノ酸のベン図分類を説明する以下の表に従って行うことができる。
【００３７】
（表１）アミノ酸の分類
2020533313.tif 000003
【００３８】
「配列同一性のパーセンテージ」は、2つの最適にアラインメントされた配列の比較ウィンドウを通した比較によって決定され、2つの配列の最適なアラインメントについて、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分が、付加または欠失を含まない参照配列（例えば本発明のポリペプチド）と比べて付加または欠失（即ちギャップ）を含み得るような比較によって決定される。配列同一性パーセンテージは、双方の配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウにおける位置の総数で割り、配列同一性パーセンテージを得るために、結果に100をかけることによって計算される。
【００３９】
2つまたはそれ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈における「同一の」またはパーセント「同一性」という用語は、同じ配列である2つまたはそれ以上の配列またはサブ配列を指す。2つの配列は、比較ウィンドウで比較し最大の一致についてアラインメントした場合に、または、以下の配列比較アルゴリズムのうち１つを用いて、もしくはマニュアルアラインメントや目視検査によって指定された領域で測定した場合に、もし2つの配列が特定のパーセンテージの同じアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する（即ち特定の領域に渡って、または特定しない場合は配列全体に渡って60％の同一性、任意で65％、70％、75％、80％、85％、90％、または95％の同一性を有する）ならば「実質的に同一」である。本発明は、本明細書において例示される各々のポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドと同様に、非限定的に神経性疾患もしくは障害、例えば神経変性疾患もしくは障害の治療もしくは予防、および／またはSCIの治療のための使用を含むその使用をも提供する。任意で、少なくとも約50ヌクレオチド長の領域に渡って、またはより好ましくは100〜500もしくは1000もしくはそれ以上のヌクレオチド長の領域に渡って、または参照配列の全長に渡って同一性がある。
【００４０】
配列比較について、典型的に1つの配列が、試験配列を比較する参照配列となる。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。デフォルトプログラムパラメーターを用いることができ、別のパラメーターを指定することもできる。その後、配列比較アルゴリズムによって、プログラムパラメーターに基づいて参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントが計算される。
【００４１】
本明細書において使用されるように、「比較ウィンドウ」は、20〜600、通常約50〜約200、より普通には約100〜約150からなる群より選択される連続する位置の数のいずれか1つのセグメントに対する参照を含み、ここで配列は、2つの配列が最適にアラインメントされた後に、同じ数の連続する位置を有する参照配列と比較され得る。比較のための配列のアラインメントの方法は当技術分野においては周知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えばSmith and Waterman(1970) Adv.Appl.Math. 2:482cの局所的相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch(1970) J.Mol.Biol. 48:443の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman(1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似度検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピューター実行によって（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）、またはマニュアルアラインメントおよび目視検査によって（例えばAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995増補版) を参照のこと）行うことができる。
【００４２】
配列同一性および配列類似性の割合を決定するのに好適なアルゴリズムの2つの例は、Altschul et al.(1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402およびAltschul et al.(1990) J.Mol. Biol. 215:403-410の各々にて説明される、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムである。BLAST解析を実行するためのソフトウェアは米国国立バイオテクノロジー情報センターを介して公的に利用可能である。このアルゴリズムはまず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントした場合にある正値の閾値スコアTにマッチするかまたは満たす、クエリー配列中の長さWのショートワードを特定することによって、ハイスコアリング配列対（HSP）を同定する段階に関与する。Tは隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Altschul et al.,前記）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含むより長いHSPを見つける検索を開始するためのシードとして機能する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加できる限り各配列に沿って両方向に拡張する。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターM（マッチした残基対についてのリワードスコア；常に >0）およびN（ミスマッチの残基についてのペナルティスコア；常に <0）を用いて計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコアリングマトリクスが使用される。両方向へのワードヒットの拡張は：累積アラインメントスコアが量Xによってその最大達成値から下落した時点で；1つもしくは複数の負のスコアリング残基アラインメントの累積によって累積スコアがゼロもしくはそれ未満に達した場合に；または、いずれかの配列の末端に達した場合に停止する。BLASTアルゴリズムパラメーターW、T、およびXによってアラインメントの感度および速度が決定される。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列について）ではデフォルトとしてワード長（W）11、期待値（E）10、M=5、N=-4を用い、双方の鎖の比較を行う。アミノ酸配列については、BLASTPプログラムでデフォルトとしてワード長3、および期待値（E）10、およびBLOSUM62スコアリングマトリクス（Henikoff and Henikoff(1989) Proc Natl. Acad. Sci. USA 89:10915を参照のこと）アラインメント（B）50、期待値（E）10、M=5、N=-4を用い、双方の鎖の比較を行う。
【００４３】
BLASTアルゴリズムでは2つの配列の類似性の統計解析も行われる（例えば、Karlin and Altschul(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照のこと）。BLASTアルゴリズムによって提供される類似性の尺度の1つは、2つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のマッチが偶然生じる確率の指標を与える最小合計確率（P(N)）である。例えば、試験核酸の参照核酸に対する比較における最小合計確率が約0.2未満であれば、より好ましくは約0.01未満であれば、そして最も好ましくは約0.001未満であれば、核酸は参照配列に対して類似であると考えられる。
【００４４】
「核酸」は、単鎖または二重鎖の形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマー、ならびにその相補鎖を指す。本用語は、合成の、天然に存在する、および天然には存在しない核酸であり、参照核酸と同様の結合特性を有し、かつ参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される、公知のヌクレオチドアナログまたは修飾されたバックボーンの残基もしくは結合を含有する核酸を包含する。そのようなアナログの例は、非限定的に、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホン酸、キラル-メチルホスホン酸、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）を含む。様々な態様において、他の細胞成分または他の混入物質（例えば細胞中に存在する他の核酸もしくはタンパク質）から、アルカリ/SDS処理、CsClを用いたバンド形成、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動、および当技術分野において周知の他の技術を含む標準技術によって精製された場合に、核酸は単離される。例えば、F.Ausubel, et al., ed.(1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New Yorkを参照のこと。様々な態様において核酸は、例えばDNAまたはRNAであり、イントロン配列を含有してもしなくてもよい。好ましい態様において核酸はcDNA分子である。
【００４５】
本明細書において使用されるように、「ベクター」は、宿主細胞中に導入された場合に形質転換された宿主細胞を生じる核酸分子である。ベクターは、それが宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列、例えば、複製開始点を含み得る。ベクターはまた、1つまたは複数の選択可能マーカー遺伝子、および当技術分野において公知の他の遺伝子エレメントも含み得る。ベクターには、「遺伝子移入ベクター」、「遺伝子治療ベクター」、もしくは「遺伝子治療構築物」、または、所望の遺伝子を投与するために遺伝子移入を行うのに適している特定のベクター構築物を指す、類似の用語が含まれ得る。
【００４６】
したがって、「ベクター」、「クローニングベクター」、および「発現ベクター」という用語は、宿主を形質転換し、かつ導入された配列の発現（例えば、転写および翻訳）を促進するために、それによってDNAまたはRNA配列（例えば、外来遺伝子）を宿主細胞中に導入することができるビヒクルを指す。ベクターは、妥当な調節エレメントと会合した場合に複製が可能である、かつ細胞間で遺伝子配列を移すことができる任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオンなどを含む。したがって、用語は、クローニングおよび発現ビヒクル、ならびにウイルスベクターを含む。
【００４７】
本明細書において使用されるように、「薬学的に許容される担体」は、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、および油/水エマルジョンまたは水/油エマルジョンなどのエマルジョン、ならびに様々なタイプの湿潤剤のような、標準的な薬学的担体のうちのいずれかを包含する。薬学的に許容される担体として働くことができる物質のいくつかの例には、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；コーンスターチおよびバレイショデンプンなどのデンプン；セルロース、ならびに、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターおよび坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油などの油；プロピレングリコールなどのグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；パイロジェンフリーの水；等張生理食塩水；リンガー液；エチルアルコール；リン酸緩衝水溶液；ならびに薬学的製剤において使用される他の非毒性適合性物質が含まれる。適している薬学的担体は、本分野における標準的な参照テキストである、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Companyに記載されている。
【００４８】
本明細書において使用されるように、「遺伝子治療」という用語は、遺伝子、すなわち、GAD65および/またはVGAT遺伝子の外因性の投与によって内在性遺伝子の発現を変化させる方法を指す。本明細書において使用されるように、遺伝子治療はまた、必要がある個体の脊髄軟膜下空間中に、欠陥があるかまたは欠損しているGAD65および/またはVGAT遺伝子に対応する機能的遺伝子または遺伝子の一部分を導入することによる、欠陥があるGAD65および/もしくはVGAT遺伝子の交換、または欠損しているGAD65および/もしくはVGAT遺伝子の交換も指す。本開示の目的で、遺伝子治療は、治療成績を達成するための広範なウイルスベクター（例えば、AAV）、リポソーム、ナノ粒子、タンパク質:DNA複合体、修飾された核酸、または裸のDNAを用いた「インビボの」方法によって成し遂げることができる。
【００４９】
「導入遺伝子」という用語は、対象の細胞中に導入されて、適切な条件下で発現されることができ、それが導入された細胞に所望の特性を付与するか、またはそうではなく所望の治療成績をもたらす、ポリヌクレオチドを指す。
【００５０】
ウイルスタイターに関して使用されるような「ゲノム粒子（gp）」、「ゲノム当量」、または「ゲノムコピー（gc）」という用語は、感染性または機能性にかかわらず、組み換えAAV DNAゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター調製物におけるゲノム粒子の数は、本明細書における他の場所に、または例えば、Clark et al. (1999) Hum. Gene Ther., 10:1031-1039；Veldwijk et al. (2002) Mol. Ther., 6:272-278に記載されているような手順によって測定することができる。
【００５１】
本明細書において使用されるように、「ニューロン」という用語はニューロンおよびその部分（例えばニューロン細胞体、軸索、または樹状突起）を含む。したがって本明細書において使用される「ニューロン」という用語は、中心細胞体または神経細胞体、および2つのタイプの伸長または突出（通常神経細胞信号の大部分がそれによって細胞体まで伝達される樹状突起、および通常神経細胞信号の大部分がそれによって細胞体から標的ニューロンまたは筋肉のようなエフェクター細胞まで伝達される軸索）を含む神経系細胞を意味する。ニューロンは、組織および器官から中枢神経系（求心性神経または感覚ニューロン）まで情報を伝達でき、中枢神経系からエフェクター細胞（遠心性神経または運動ニューロン）までシグナルを伝送できる。介在ニューロンと呼ばれる他のニューロンは、中枢神経系（脳および脊柱）内のニューロンを連結する。本発明に従った治療または方法を受けることができるニューロンタイプのある特定の例は、小脳顆粒ニューロン、後根神経節ニューロン、および皮質ニューロンを含む。
【００５２】
「神経変性」という用語は広く使われ、非限定的に神経細胞の死滅または消失を含む、神経細胞におけるいかなる病理学的変化、細胞死に先行するいかなる変化、および神経細胞の活性または機能のいかなる低減または減弱をも指す。病理学的変化は自発性のものであってよく、またはある事象によって誘導されてもよく、例えばアポトーシスと関連する病理学的変化を含む。ニューロンは非限定的に感覚ニューロン、交感神経細胞、副交感神経細胞、または腸ニューロンを含む任意のニューロンであってよく、例えば後根神経節ニューロン、運動ニューロン、および中枢ニューロン、例えば脊髄からのニューロンであってよい。神経変性または細胞消失は様々な神経性疾患または障害、例えば神経変性疾患または障害の特徴である。ある態様においては、ニューロンは感覚ニューロンである。ある態様においてニューロンは運動ニューロンである。ある態様においてニューロンは損傷脊髄ニューロンである。
【００５３】
本明細書において使用されるように、「神経変性疾患」または「神経障害」は、神経細胞または神経細胞集団の形態学的および／または機能的な異常を引き起こす障害を指す。神経変性疾患は対象における正常な神経機能の減損もしくは欠如を、または異常な神経機能の存在をもたらし得る。例えば、神経変性疾患は、疾患、損傷、および／または老化の結果として生じ得る。形態学的および機能的な異常の非限定的な例は、神経細胞の物理的劣化および／もしくは死滅、神経細胞の異常な成長パターン、神経細胞間の物理的連絡の異常、神経細胞による例えば神経伝達物質のような物質の産生不足もしくは過剰産生、例えば神経伝達物質のように神経細胞によって正常であれば産生される物質の産生がなされないこと、および／または異常なパターンでのもしくは異常時の電気的刺激の伝達を含む。神経変性は、対象の脳のいかなる領域でも起こり得、例えば頭部外傷、脳卒中、ALS、多発性硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、およびアルツハイマー病を含む多くの疾患について認められる。
【００５４】
本明細書において使用されるように、「痛覚」という用語は、ある有害なまたは潜在的に有害な刺激に対する感覚神経系の反応を指す。痛覚においては、強烈な化学物質（例えば眼の中にチリパウダー）、機械的外傷（例えば切断、挫滅）、または温度（熱および冷たさ）からの、侵害受容器と呼ばれる感覚神経細胞の刺激によってシグナルが生じ、それが一連の神経繊維に沿って脊髄を通って脳まで伝播する。痛覚は様々な生理学的反応および行動学的反応を誘発し、感覚ある生物において痛みの主観的体験を通常もたらす。
【００５５】
γ-アミノ酪酸（GABA）とグルタミン酸は、哺乳動物における主要な抑制性神経伝達物質と興奮性神経伝達物質である。GABAとグルタミン酸の間のバランスによって神経発生、動作、生物時計、組織の発達および血糖調節のような多様な過程が調節される。GABAはピリドキサールリン酸（PLP）依存性酵素グルタミン酸デカルボキシラーゼの65 kDaおよび67 kDaアイソフォーム（それぞれGAD65およびGAD67）によってグルタミン酸から合成される。
【００５６】
ラットGAD2/GAD65の核酸配列が、当技術分野では公知である。例えば、以下の核酸配列（SEQ ID NO：5）を提供する、GenBankアクセッション番号NM_012563、ドブネズミ（Rattus norvegicus）グルタミン酸デカルボキシラーゼ2（Gad2）、mRNAを参照のこと：
2020533313.tif 000004
。
【００５７】
ヒトGAD65およびGAD67は、Bu et al.(1992) Proc Natl Acad Sci 89:2115-2119によって単離され、クローニングされた。ヒトGAD65 cDNAは、585アミノ酸残基を有するMr65,000ポリペプチド（Genbankアクセッション番号NM000818;M81882）をコードし、ヒトGAD67は594アミノ酸残基を有するMr67,000ポリペプチド（Genbankアクセッション番号NM013445;M81883）をコードする；その各々は参照により本明細書に組み入れられる。参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2016/0081956号も参照のこと。
【００５８】
ヒトGAD65についての付加的な核酸配列およびアミノ酸配列は当技術分野において公知である。例えば以下のアミノ酸配列（SEQ ID NO:1）を提供する、GenBankアクセッション番号:Q05329、ヒトグルタミン酸デカルボキシラーゼ2（GAD2/GAD65）を参照のこと：
2020533313.tif 000005
。
例えば以下の核酸配列（SEQ ID NO.2）を提供する、Genbankアクセッション番号:X69936、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD2/GAD65）についてのホモサピエンスmRNAも参照のこと：
2020533313.tif 000006
。
【００５９】
GABAは、シナプス前およびシナプス後の神経突起の双方の細胞膜における特異的な膜貫通受容体に結合することによって、脳の抑制性シナプスで作用する。この結合によってイオンチャンネルの開口が生じ、負の電荷を帯びた塩化物イオンを細胞に流入させるか、または正の電荷を帯びたカリウムイオンを細胞から流出させる。この作用によって膜電位において負の変化がもたらされ、通常過分極が生じる。GABA受容体には2つの大まかなクラスが知られている：リガンド作動性ゲート開閉イオンチャンネル複合体の一部であるGABAA受容体、および、中間物質（Gタンパク質）を介してイオンチャンネルを開閉するGタンパク質共役受容体であるGABAB代謝調節型受容体である。
【００６０】
当技術分野において周知のGABAアゴニストには、ムシモール、プロガビド、リルゾール、バクロフェン、ガパペンチン（NEURONTIN（登録商標））、ビガバトリン、バルプロ酸、チアガビン（GABITRIL（登録商標））、ラモトリギン（LAMICTAL（登録商標））、プレガバリン、フェニトイン（DILANTIN（登録商標））、カルバマゼピン（TEGRETOL（登録商標））、トピラマート（TOPAMAX（登録商標））、ならびにそれらのGABAアゴニストの類似体、誘導体、プロドラッグ、および薬学的に許容される塩が含まれる。他のGABAアゴニストもまた、本発明の組み合わせ、薬学的組成物、方法、およびキットにおいて有用であることが、当業者によって認識されるであろう。GABAアゴニストは、てんかん、ハンチントン舞踏病、脳虚血、パーキンソン病、遅発性ジスキネジア、および痙縮などの中枢神経系障害のための抗痙攣治療において有用であることが開示されている。GABAアゴニストはまた、抗うつ薬、抗不安薬、抗精神病薬として有用であること、および疼痛の処置において有用性を有することも開示されている。
【００６１】
VGAT（小胞GABA輸送体）（小胞抑制性アミノ酸輸送体(VIAAT)としても知られる）は、ヒトにおいてはSLC32A1遺伝子（VGAT遺伝子としても知られる）によってコードされるタンパク質である。VGATは、脳および脊髄のGABA性ニューロンの神経終末において非常に高濃度であるが、グリシン作動性神経終末にも存在する。参照により本明細書に組み入れられるCaudhry et al., J.Neurosci.,18(23):9733-9750(1998)。ヒトVGATについての核酸配列およびアミノ酸配列は、当技術分野においては公知である。例えば以下のアミノ酸配列（SEQ ID NO:3）を提供する、GenBankアクセッション番号:Q9H598、ヒト小胞抑制性アミノ酸輸送体（VIAAT/VGAT）を参照のこと：
2020533313.tif 000007
。
例えば、以下の核酸配列（SEQ ID NO:4）を提供する、GenBankアクセッション番号:NM_080552、ホモサピエンスsolute carrier family 32 member 1（SLC32A1）mRNAも参照のこと：
2020533313.tif 000008
。
【００６２】
加えて、ラットVGATについての核酸配列は、当技術分野において公知である。例えば、以下の核酸配列（SEQ ID NO:6）を提供する、GenBankアクセッション番号:AF030253.1、ラット（Rattus norvegicus）小胞GABA輸送体（VGAT）mRNA、完全cdsを参照のこと：
2020533313.tif 000009
。
【００６３】
慢性神経障害性疼痛のヒト患者においておよび動物モデルにおいて、神経障害性疼痛状態をもたらす機序および関連する神経病理学的変化は、比較的よく定義されている。これらは、末梢神経損傷誘導性神経腫または部分的脊髄分節外傷性もしくは虚血性損傷の存在によって表され得る。よって、疼痛を誘導する刺激の起源の分節レベルおよび部位を、特定することができる。したがって、本発明は、関連性のある脊髄分節での侵害受容性刺激の伝達を担う主要な脊髄ニューロンの集団を選択的に標的とするが、他のニューロン集団（例えば、標的とされない近隣の分節におけるα-運動ニューロンまたは介在ニューロン）には影響を及ぼさない処置戦略を提供する。本明細書において提供されるデータは、神経障害性疼痛のマウスモデルのL3-L5脊髄分節中へのGAD65遺伝子およびVGAT遺伝子の軟膜下送達が、強力なかつ長く続く抗侵害受容効果を提供することを実証する。
【００６４】
（ニューロンと対照的に）感染させたアストロサイトにおけるGAD65遺伝子の優先的な発現は、期待されるGABA仲介性抗痙縮効果に関して特定の利益を与えると考えられる（例えば各々参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第2014/116652号およびPCT/US2017/024285を参照のこと）。インビトロにおいて示されたように、初代のアストロサイトの感染によって細胞外GABA濃度のCa2+非依存的な増加が導かれた。したがって、脊髄実質におけるアストロサイト仲介性GABA放出が、局所的神経抑制回路の機能性や結合性によらず、Ia求心性神経および／またはα-運動ニューロン上で発現されるGABAB受容体に対するその過分極効果を特異的に及ぼすことが期待される。アストロサイトによって産生されるGABAの生物学的活性は、優先的にGABAA受容体を発現する培養hNTニューロンに対するその脱分極誘導効果によって確認された。
【００６５】
GAD65およびVGATのデュアル遺伝子治療の使用は、局所的なニューロン阻害を増加させる目的の、脊髄または脳への送達に関連して以前には試験されていない新規のアプローチに相当する。第1に、このアプローチは、少量で送達されるベクターの軟膜下投与を使用し、末梢神経損傷の部位に片側性であるベクター注射分節の後角において、ニューロンの局在化された感染のみをもたらす。これは、ベクターが、注射された領域全体にわたる（左および右ならびに複数の分節にわたる）脊髄前角ニューロンおよび後根神経節細胞の感染において有効である、髄腔内送達技術とは対照的である。（脳中への侵害受容性刺激の脊髄伝達を担う一次ニューロン集団である）脊髄後角ニューロンは、ベクターの髄腔内送達後に感染しない。第2に、GAD65遺伝子とVGAT遺伝子との組み合わせが、感染した脊髄後角ニューロンからシナプス間隙中への小胞GABAの放出を強化することによる侵害受容効果の有効な誘導に必要とされる。
【００６６】
したがって、1つの局面において、本発明は、GAD65遺伝子およびVGAT遺伝子の脊髄特異的なアップレギュレーションによって、対象における神経障害性疼痛を処置する方法を提供する。様々な態様において、方法は、GAD65およびVGATをコードし、かつGAD65およびVGATを発現するウイルスベクターの、対象の治療レベルでの投与部位への遠位、対側性、および/または同側性の軟膜下投与を含み、それによって対象における神経障害性疼痛を減少させる。様々な態様において、ベクターは、GAD65およびVGATをコードするヌクレオチド配列を含む。また、GAD65またはその機能的断片に対して少なくとも60％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド（すなわち、GAD65またはその断片に対して約70％の相同性、約75％の相同性、約80％の相同性、約85％の相同性、約90％の相同性、約95％の相同性、約99％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド）も、本発明の範囲内である。また、VGATまたはその断片に対して少なくとも60％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド（すなわち、VGATまたはその断片に対して約70％の相同性、約75％の相同性、約80％の相同性、約85％の相同性、約90％の相同性、約95％の相同性、約99％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチド）も、本発明の範囲内である。
【００６７】
本発明の方法を実施するために有用なポリヌクレオチドを標的細胞に導入するには、ウイルスベクターが特に有用となり得る。ウイルスベクターは、特定の宿主系において、特に哺乳動物系において使用するために開発され、例えばレトロウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）ベースのもののような他のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター（AV）、アデノ随伴ウイルスベクター（AAV）、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター等を含む（その各々が参照により本明細書に組み入れられる、Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-990, 1992; Anderson et al., Nature 392:25-30 増補版,1998; Verma and Somia, Nature 389:239-242, 1997; Wilson, New Engl. J.Med. 334:1185-1187 (1996) を参照のこと）。本発明のある局面においてはレンチウイルス、AV、またはAAVが利用される。
【００６８】
アデノウイルスは、エンドソームによって輸送できる最大のサイズであり、最も大きな無エンベロープウイルスである（即ち、エンベロープの融合は必要ない）。ウイルス粒子はまた、宿主細胞への付着を助ける、カプシドの各々のペントンベースと関連する特有の「突起」または繊維を有している。AAVは増殖性感染サイクルを開始および維持するために定義上は他のウイルス（典型的にはアデノウイルスまたはヘルペスウイルス）との共感染を必要とする依存性のパルボウイルスである。そのようなヘルパーウイルスがなくても、受容体が仲介する結合および内部移行、非分裂細胞および分裂細胞双方における核への侵入によって標的細胞に感染または形質導入するのに、AAVはなおもコンピテントである。
【００６９】
一旦核に入ると、ウイルスは脱殻し、多くの異なる形態において導入遺伝子が発現され、その最も持続性のものは環状モノマーである。AAVは安定して形質導入される細胞の1〜5％のゲノムに組み込まれる（Nakai et al., J.Virol. 76:11343-349, 2002）。導入遺伝子の発現は非常に安定である。ヘルパーウイルス不在でのAAV感染からは子孫ウイルスは産生されないため、形質導入の範囲はウイルスに感染した初代の細胞のみに限定される。この特徴により、AAVは本発明にとって好適な遺伝子療法ベクターである。
【００７０】
本発明の方法において使用できる、アデノウイルスベクターおよび他のウイルスベクターを説明する付加的な参照は以下を含む：Horwitz, M. S., Adenoviridae and Their Replication, in Fields, B., et al. (eds.) Virology, Vol. 2, Raven Press New York, pp. 1679-1721, 1990); Graham, F., et al., pp. 109-128 in Methods in Molecular Biology, Vol. 7: Gene Transfer and Expression Protocols, Murray, E. (ed.), Humana Press, Clifton, N.J. (1991); Miller, N., et al., FASEB Journal 9: 190-199, 1995; Schreier, H, Pharmaceutica Acta Helvetiae 68: 145-159, 1994; Schneider and French, Circulation 88:1937-1942, 1993; Curiel D. T., et al., Human Gene Therapy 3: 147-154, 1992; Graham, F. L., et al., WO 95/00655 (5 Jan. 1995); Falck-Pedersen, E. S., WO 95/16772 (22 Jun. 1995); Denefle, P. et al., WO 95/23867 (8 Sep. 1995); Haddada, H. et al., WO 94/26914 (24 Nov. 1994); Perricaudet, M. et al., WO 95/02697 (26 Jan. 1995); Zhang, W., et al., WO 95/25071 (12 Oct. 1995)。例えばMicrobix Biosystems of Toronto, Ontario（例えばMicrobix Product Information Sheet: Plasmids for Adenovirus Vector Construction, 1996を参照のこと）を含む、商業的供給源からの様々なアデノウイルスプラスミドも利用可能である。
【００７１】
本発明の方法において使用できるAAVベクターを説明する付加的な参照は以下を含む：Carter, B., Handbook of Parvoviruses, vol. I, pp. 169-228, 1990; Berns, Virology, pp. 1743-1764 (Raven Press 1990); Carter, B., Curr. Opin. Biotechnol., 3: 533-539, 1992; Muzyczka, N., Current Topics in Microbiology and Immunology, 158: 92-129, 1992; Flotte, T. R., et al., Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 7:349-356, 1992; Chatterjee et al., Ann. NY Acad. Sci., 770: 79-90, 1995; Flotte, T. R., et al., WO 95/13365 (18 May 1995); Trempe, J. P., et al., WO 95/13392 (18 May 1995); Kotin, R., Human Gene Therapy, 5: 793-801, 1994; Flotte, T. R., et al., Gene Therapy 2:357-362, 1995; Allen, J. M., WO 96/17947 (13 Jun. 1996); and Du et al., Gene Therapy 3: 254-261, 1996。
【００７２】
本明細書において使用されるように、「アデノ随伴ウイルス」（AAV）という用語は、非限定的に、AAVタイプ1、AAVタイプ2、AAVタイプ3（タイプ3Aおよび3Bを含む）、AAVタイプ4、AAVタイプ5、AAVタイプ6、AAVタイプ7、AAVタイプ8、AAVタイプ9、AAVタイプ10、AAVタイプ11、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、ヒツジAAV、および現在公知の任意の他のAAVを含む。AAVベクターは、哺乳動物に対して非病原性である一本鎖（ss）DNAパルボウイルスに由来する（参照により本明細書に組み入れられる、Muzyscka (1992) Curr. Top. Microb. Immunol., 158:97-129において概説されている）。簡潔に述べると、AAVベースのベクターは、ウイルスゲノムの96％を占めるrepおよびcapウイルス遺伝子が除去されており、ウイルスDNAの複製、パッケージング、および組み込みを開始するために用いられる2つの隣接する145塩基対（bp）の逆位末端配列（ITR）を残している。ヘルパーウイルスの非存在下では、野生型AAVは、染色体19q 13.3に優先的な部位特異性を有してヒト宿主細胞ゲノム中に組み込まれるか、またはエピソーマルに発現されるままであり得る。単一のAAV粒子は、5 kbのssDNAを収容することができ、したがって、典型的には十分である、導入遺伝子および制御エレメントのための約4.5 kbを残している。しかし、例えば、米国特許第6,544,785号に記載されているようなトランススプライシングシステムが、この限界をほぼ2倍にし得る。多くのセロタイプのアデノ随伴ウイルスが、遺伝子治療ベクターとして広く研究され、特徴付けられている。当業者は、機能的なAAVベースの遺伝子治療ベクターの調製について熟知しているであろう。ヒト対象への投与のためのAAVの産生、精製、および調製の様々な方法についての多数の参照文献が、刊行された文献の広い本文において見出され得る（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Viral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003を参照のこと）。さらに、CNSの細胞を標的とするAAVベースの遺伝子治療は、米国特許第6,180,613号および同第6,503,888号（その各々は参照により本明細書に組み入れられる）に記載されている。
【００７３】
任意で、AAVウイルスキャプシドは、AAV2/9、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAV Anc80、またはAAV PHP.Bである；しかし、本発明のある態様において使用されるウイルスキャプシドのセロタイプは、他の公知のセロタイプのAAVウイルスキャプシドを含む、公知のウイルスキャプシドの中から選択され得る。
【００７４】
任意で、遺伝子治療ベクター、例えば、AAVまたはAAVベースのベクターを、関心対象の標的組織中へのウイルスの取り込み、ウイルスの安定性、および指向性を改善するために改変することができる。例えば、AAVベクターのキャプシドは、関心対象の組織のまたはその中の受容体に結合するリガンド（例えば、合成または天然の小分子、ペプチド、もしくはポリペプチド、または他の生体分子）で改変されてもよい。関心対象の組織を標的とすること、および構築物が標的細胞に入って有効に形質導入することを可能にすることの両方に使用されるベクターの機能特性を改善するためおよび/または増強するために、他の改変が可能である。そのような改変は、当業者のスキルセット内であろう。
【００７５】
利用される宿主細胞／ベクター系によって、構成的プロモーターおよび誘導性プロモーター、転写エンハンサーエレメント、転写終結因子等を含む、多くの好適な転写エレメントおよび翻訳エレメントのうち任意のものを発現ベクターにおいて使用することができる（Bitter et al., Meth. Enzymol. 153:516-544, 1987）。上記に定義付けられるように、「プロモーター」または「プロモーター配列」という言及は、その最も広い文脈において解釈され、細胞におけるRNAポリメラーゼに結合でき、メッセンジャーRNA、リボソームRNA、核小体低分子RNA、または任意のRNAポリメラーゼの任意のクラスによって転写される任意の種類のRNAのような、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドコード配列の転写を開始できるDNA制御領域を含む。本明細書において企図される「プロモーター」は、CAT box配列および付加的な制御エレメント（即ち、上流の活性化配列、エンハンサーおよびサイレンサー）を含んで、または含まずに、真核細胞における正確な転写開始に必要とされるゴールドバーグ・ホグネス配列（Goldberg-Hogness box）のような、古典的ゲノム遺伝子の転写制御配列をも含み得る。
【００７６】
プロモーター配列の調節管理下に配列を置くことは、発現が該プロモーター配列によって調節されるように該分子を配置することを意味する。プロモーターは一般的にそれらが調節する遺伝子に対して5’側（上流）に位置する。異種プロモーター／構造遺伝子の組み合わせの構築において、一般的にプロモーターの位置は、遺伝子転写開始部位から、その天然の状況における該プロモーターとそれが調節する遺伝子、即ち該プロモーターが由来する遺伝子との間の距離とほぼ同じだけ離れていてよい。当技術分野においては公知のように、プロモーターの機能を損なわずに、この距離に幾らかの変更を適応させることができる。同様に、その調節下に置かれる異種遺伝子に関した制御エレメントの配置は、その天然の状況における、即ちそれが由来する遺伝子における該エレメントの配置によって決定される。再度、当技術分野においては公知のように、この距離においても幾らかの変更が可能である。
【００７７】
様々な特徴および発現プロファイルを有するプロモーター配列が、組織特異的、組織非特異的、構成的、および誘導性であるものを含めて、当技術分野において周知である。例えば、その内容が参照により本明細書に組み入れられる、Papadakis et al., "Promoters and Control Elements: Designing Expression Cassettes for Gene Therapy." Current Gene Therapy, 2004, 4, 89-113をさらに参照することができる。本発明によって企図されるプロモーターには、非限定的に、Apo A-I、ApoE、serpina（TBG）、α-1-アンチトリプシン（hAAT）（肝臓特異的）；MCK（筋肉特異的）；GFAP、NSE、シナプシンI、プレプロエンケファリン、ドーパミンb-ヒドロキシラーゼ（dbH）、プロラクチン、ミエリン塩基性タンパク質（ニューロン特異的）、GUSB、CBA、CAG、アンキリン（赤血球特異的）、ヒトユビキチンプロモーター（UBI）、およびヒトシナプシンプロモーターが含まれる。しかし、他の公知の組織特異的または細胞特異的プロモーターが、使用されてもよい。
【００７８】
組み換えAAV粒子を産生させるために好適な宿主細胞は、非限定的に、外因性の核酸分子のレシピエントとして使用できる、またはレシピエントとして使用されてきた、微生物、酵母細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞を含む。したがって、本明細書において使用される「宿主細胞」は概して、外因性の核酸分子をトランスフェクションされた細胞を指す。宿主細胞は該細胞または該細胞系が発現されるタンパク質、採用される選択系または使用される発酵系と不適合性でない限り、任意の真核細胞または細胞系を含む。
【００７９】
AAVベクターは、それらを適切な、薬学的に許容される担体または希釈剤に溶解、懸濁、または乳化することによって、注射または投与するための調製物に製剤化することができる。そのような薬学的に許容される担体または希釈剤の例は、水性または非水性の溶剤、例えば油、合成脂肪酸グリセリド、高級脂肪酸のエステルまたはプロピレングリコールを含み、必要に応じて、可溶化剤、等張剤、懸濁剤、乳化剤、安定剤、および保存剤のような従来的な添加剤を共に含む。
【００８０】
細胞タイプに特異的なウイルスベクターが入手可能でない場合、標的細胞上で発現されるリガンド（もしくは受容体）に対して特異的な受容体（もしくはリガンド）を発現するようにベクターを改変できるか、または、そのようなリガンド（もしくは受容体）を含むように同様に改変できるリポソームに封入することができる。例えばペプチドの細胞への移行を促進する、ヒト免疫不全ウイルスTATタンパク質形質導入ドメインのようなタンパク質形質導入ドメインをペプチドが含有するように操作することを含む様々な方法で、ペプチド薬を細胞に導入することができる。さらに、本技術を適応させるようにやはり改変できる、ナノケージおよび薬理学的送達ウエハー（脳腫瘍の化学療法薬において使用されるものなど）のような生体材料に基づく様々な技術が存在する。
【００８１】
したがって、別の局面において、本発明は、中枢神経系の組織において発現されることができる少なくとも1つのプロモーターエレメントに機能的に連結された、GAD65および/またはVGAT遺伝子、またはその誘導体および/もしくは変異体を含む遺伝子治療ベクターまたは構築物を提供する。許容されるマウス、ラット、およびブタのモデルを用いて本明細書において実証されるように、本発明の遺伝子治療ベクターは、神経障害性疼痛および/または筋肉痙縮の処置において有効であった。
【００８２】
したがって、様々な態様において、本発明において使用されるウイルスベクターのセロタイプは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh8、AAVrh10、AAVrh33、AAV rh34、AAV Anc80（Anc80）、AAV PHP.B、および他のものからなる群より選択されてもよい（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Cao et al. (2002) PNAS, 99:11854-11859；およびViral Vectors for Gene Therapy: Methods and Protocols, ed. Machida, Humana Press, 2003を参照のこと）。本明細書において列挙されるものに加えて、他のセロタイプもまた企図される。ある例示的な態様において、AAV9またはAnc80が使用される。開示される組成物および方法が、AAVの一部分がアデノウイルスなどの他の類似したベクターと融合されている、AAVキメラベクターを使用してもよいこともまた、企図される。
【００８３】
様々な態様において、本明細書において説明される遺伝子治療構築物はまた、ベクターのヌクレオチド配列が、関心対象の遺伝子（例えば、GAD65および/またはVGAT）の（構成的なまたはそうではないいくらかの様式で制御された）発現を可能にするような様式で、関心対象の遺伝子がクローニングされているか、またはそうではなく関心対象の遺伝子を含むベクター（または遺伝子治療発現ベクター）を含んでもよい。本明細書において説明されるベクター構築物は、関心対象の組織（例えば、CNS）に送達されることができる、および選択された関心対象の組織（例えば、CNS）において関心対象の遺伝子の発現を提供する、任意の適している遺伝子発現ベクターを含む。
【００８４】
したがって、本発明はまた、本明細書において説明されるようなGAD65および/またはVGATを提供するベクターを含む遺伝子治療組成物も提供する。本発明の遺伝子治療組成物は、したがって、神経障害性疼痛または筋肉痙縮を処置するための、本明細書において説明されるようなベクター、および細胞または組織、例えば、CNS細胞または組織中へ入り込むための1つまたは複数の薬学的に許容される担体を含んでもよい。有利に、本発明の遺伝子治療組成物は、活性遺伝子、特に治療用遺伝子の、作用の部位への最適な速度および治療用量での調節された送達を提供する。遺伝子治療ベクターおよび/またはそのような遺伝子治療ベクターを含有するウイルスベクターと送達システムとを合わせることにより、特に、作用の部位へのその特異的な送達、または作用部位をターゲティングした後の遺伝子の調節された発現が可能になる。
【００８５】
レンチウイルスベクターを用いた後の細胞への組み込み型の遺伝子導入に加えて、視床下核へのAAV-GAD65注射後のGAD65遺伝子の過剰発現が成功したという報告がある。それらの試験においては、持続性のGAD65発現がAAV-GAD65の注射の4〜5か月後まで認められた。より重要なのは、最近の系統的なデータによって、わずかな回数のAAV注射（1〜2回の注射）でさえも、ラットまたはミニブタの線条体へのAAVベースの遺伝子送達の効率が高いと示されることである。したがって別の態様において本発明は、分節特異的なGAD65およびVGATの発現を達成するために、AAVベースのゲノム非組み込み型の、GAD65をコードするベクターおよびVGATをコードするベクターを採用する。
【００８６】
本明細書において実証されるように、GAD65とVGATとの脊髄送達（すなわち、軟膜下投与）を組み合わせることによって（両方の遺伝子をコードする単一のベクターを用いることによって、または各個々の遺伝子をコードする別個のベクターを用いることによってのいずれかで）、有意なかつ機能的に関連性のある神経障害性疼痛の減少が達成された。脊髄阻害の効力を、慢性神経障害性疼痛の十分に特徴付けられたマウスモデルにおいて試験した（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Pain 76(1-2): 215-222, 1998を参照のこと）。
【００８７】
本併用療法を投与する段階は、当業者には公知の様々な方法および送達系のうち任意のものを用いて達成または実施することができる。本明細書において使用されるように、「投与」または「投与する段階」という用語は、本発明の方法の実施において対象に本発明の化合物または薬学的組成物を提供する行為を含むよう定義付けられる。投与経路の例は非限定的に、静脈内、関節内、大槽内、眼内、脳室内、髄腔内、軟膜下、筋肉内、腹腔内、皮内、腔内等、およびその任意の2つまたはそれ以上の組み合わせを含む。ある態様においては、GAD65遺伝子およびVGAT遺伝子の脊髄でのアップレギュレーションを達成するために、ベクター組成物を脊髄実質、脊椎の髄腔内空間、対象の脊髄軟膜下空間、および／または末梢痙直筋肉に直接送達することができる。例えば参照により本明細書に組み入れられる国際公開公報第2016/122791号を参照のこと。
【００８８】
したがって、本明細書において提供される方法は、大型動物においてまたはヒトにおいて、例えばAAVの使用による、脊髄軟膜下遺伝子治療を可能にする。ベクターを軟膜下空間中へ送達するための例示的な送達システムは、90°で曲がったガイドチューブおよびカテーテル（例えば、PE-5またはPE-10）を含み、これは、標的とされる脊髄分節の後角軟膜下空間中への軟膜下カテーテルの正確なガイダンスおよび配置を可能にする。カテーテルの配置後、除去する前に、ベクターを、ある一定の時間にわたって注入する。
【００８９】
本明細書において使用されるように、「PE-10」という用語は、およそ0.010インチの内径を有するポリエチレンチューブを指す。ある態様において、PE-10チューブの内径は、約0.011インチである。同様に、「PE-5」という用語は、およそ0.005インチの内径を有するポリエチレンチューブを指す。ある態様において、PE-5チューブの内径は、約0.008インチである。
【００９０】
したがって、特許請求される方法は、処置されている対象の白質および灰白質の両方においてほぼ完全な脊髄実質ベクター媒介性遺伝子発現を提供する、軟膜下送達（すなわち、軟膜のバイパス）を提供する。現在利用可能な非侵襲性技術は、匹敵するレベルの脊髄実質導入遺伝子発現または十分に調節された分節特異的な遺伝子サイレンシングを可能にしない。
【００９１】
哺乳動物対象において軟膜下カテーテルを配置するための例示的な方法を、図7に示し、そこでは、露出した「硬膜を含まない」骨髄の近傍での機器/カテーテル操作に関連する潜在的な脊髄損傷を最小化するために、いくつかの連続的な手順工程に従い得る。図7の工程AおよびBに示されるように、後肢における筋肉痙縮を、Th9脊髄分節切断によって誘導し、痙縮を、足の触覚刺激に対する腓腹筋EMG応答における定量的変化によって特定/測定する。筋肉痙縮の誘導の2〜3か月後に、動物は、AAV9（またはAnc80）-UBI-GAD65/VGATベクターの腰部軟膜下注射を受け、痙縮応答の存在をさらに2か月間測定した（図7；工程CおよびD）。屠殺後に、GAD65およびVGATのアップレギュレーションの存在を、免疫蛍光染色によって測定する（図7；工程E）。
【００９２】
本明細書において説明される遺伝子治療ベクターを、中枢神経系の特定の領域へ、特に脊髄軟膜下空間へ特異的に送達するために、それは定位マイクロインジェクションによって投与されてもよい。したがって、様々な態様において、尾側および頭側の脊髄クランプの使用（椎弓切除の真上および真下に配置される）が、カテーテル配置中の脊髄拍動を最小化するために用いられ得る。また、様々な態様において、（例えば、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願公開第2015/0224331号に記載されているような）XYZマニピュレーター上に搭載された「L」形のカテーテルステンレススチールガイドチューブ（例えば、90°で曲がった16〜26 Gのステンレススチールチューブ）が、軟膜下カテーテル配置を容易にするために使用され得る。
【００９３】
ある態様において、軟膜に、湾曲した30G針を用いて最初に穴を開ける。穿通する針（例えば、30G針）の先端が約1〜1.5 mm、軟膜下空間の中に入るとすぐに、軟膜を1〜2 mm分、わずかに持ち上げてもよい。次いで、軟膜下カテーテルを、ガイドチューブからカテーテルを前進させることによって軟膜下空間中へ配置する。カテーテルを標的とする長さへ前進させた後、ガイドチューブの穿通する針の先端を、軟膜下空間から除去する。次いで、薬学的に許容される担体中のベクターを注射してもよい。（典型的には2〜5分にわたる、いくつかの態様においては約3分にわたる）ベクター注射が完了するとすぐに、カテーテルを軟膜下空間から引き抜いて、硬膜を閉じる。この技術アプローチを用いることによって、軟膜下カテーテルの配置は、硬膜開口の瞬間から約3〜5分以内に成し遂げられ得る。その後、導入遺伝子が、治療レベルで投与部位に遠位、対側性、および/または同側性で発現される。
【００９４】
「治療的有効量」または「有効量」という用語は、研究者、獣医師、医師、または他の臨床家によって探求されている組織、系、動物、またはヒトの生物学的応答または医学的応答、例えば、GAD65遺伝子およびVGAT遺伝子の脊髄でのアップレギュレーションを惹起する、化合物または組成物の量を意味する。したがって、「治療的有効量」という用語は、患部に対してある期間に渡って繰り返し適用された場合に、疾患状態において実質的な改善をもたらす製剤の任意の量を意味するように、本明細書において使用される。量は、処置されている状態、状態の進行のステージ、ならびに適用される製剤のタイプおよび濃度と共に変わる。任意の所与の例における適切な量は、当業者に容易に明らかであるか、または日常的な実験によって決定することができる。例えば、本処置の方法に関して、例えば、GAD65遺伝子を単独でもしくはVGAT遺伝子と組み合わせてコードするベクター、またはGAD65遺伝子およびVGAT遺伝子をコードするベクターを含む組成物の「治療的有効量」は、望ましい処置計画の一部として適用された場合にGAD65遺伝子およびVGAT遺伝子のアップレギュレーションをもたらす、調製物におけるベクターの量を指す。いくつかの場合には、複数の用量のベクターが投与される。例えば、いくつかの態様において、導入遺伝子を保有する本明細書において説明される遺伝子治療ベクターを含む組成物は、第1の投与部位に加えて、第1の投与部位に対側性または同側性であることができる別の部位に投与される。
【００９５】
有効量はまた、使用される特定のベクターに依存し得る。例えば、CNS組織をターゲティングするための投与量は、AAVのセロタイプ（例えば、キャプシドタンパク質）に依存し得る。例えば、AAVは、AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV6.2、AAV7、AAV8、AAV9、rh.10、rh.39、rh.43、およびCSp3からなる群より選択されるAAVセロタイプのキャプシドタンパク質を有し得る。ある態様において、AAVの有効量は、kg当たり1010、1011、1012、1013、または1014ゲノムコピーである。ある態様において、AAVの有効量は、対象当たり1010、1011、1012、1013、1014、または1015ゲノムコピーである。実験マウスにおいて、注射されたベクター、例えばAAVベクターの溶液の総体積は、例えば、0.25μl〜1.0μlの間であるのに対して、実験ブタにおいて注射されたベクター溶液の総体積は、50μl〜150μlの間である。
【００９６】
送達ベクターの治療的または予防的に有効な量の決定は、日常的な計算法を使用し、動物データに基づいて行うことができる。適切な用量は、数ある要因の中でも、選択された移入ベクターの特質、投与の経路、処置されている哺乳動物（例えば、ヒトまたは非ヒト霊長類または他の哺乳動物）、処置されるべき対象の年齢、体重、および全身状態、処置されている障害の重篤度、処置されている心内の領域の場所、ならびに投与の様式に依存する。したがって、適切な投与量は患者ごとに変わり得る。適切な有効量は、当業者が容易に決定することができる。
【００９７】
当業者は、動物モデルと比較してヒトのための投与量を改変することが当技術分野において日常的であると認識しているため、ヒトの投薬量は、最初に、マウス、ラット、および/またはブタにおいて使用された化合物の量から外挿することによって決定され得る。ある態様において、投与量は、約1 mg化合物/Kg体重〜約5000 mg化合物/Kg体重；または約5 mg/Kg体重〜約4000 mg/Kg体重、または約10 mg/Kg体重〜約3000 mg/Kg体重；または約50 mg/Kg体重〜約2000 mg/Kg体重；または約100 mg/Kg体重〜約1000 mg/Kg体重；または約150 mg/Kg体重〜約500 mg/Kg体重の間で変わり得ることが想像される。他の態様において、この用量は、約1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000 mg/Kg体重であり得る。他の態様において、より高い用量が使用されてもよく、そのような用量は、約5 mg化合物/Kg身体〜約20 mg化合物/Kg身体の範囲にあり得ることが想定される。他の態様において、用量は、約8、10、12、14、16、または18 mg/Kg体重であり得る。当然、この投薬量は、最初の臨床試験の結果および特定の患者の必要に応じて、そのような処置プロトコールにおいて日常的に行われるように、上方または下方へ調整されてもよい。ある態様において、投与量は、ベクター濃度に関するものであり得る。例えば、本明細書において説明される遺伝子治療ベクターの濃度は、少なくとも0.5、0.75、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、または2.0×1013 gc/mlであり得る。
【００９８】
投薬治療法は単回投与計画または複数回投与計画であってよい。さらに、対象は適切なだけの数の回数を投与されてよい。当業者は適切な投与回数を容易に決定できる。しかし、投与量は別の投与経路を考慮に入れるように、または副作用に対する治療的利益の均衡が保たれるように調整する必要があり得る。そのような投与量は該組み換えベクターが用いられる治療的適用によって変化し得る。
【００９９】
任意で、本発明に従うAAV仲介性送達は、他のウイルスベクターおよび非ウイルスベクターによる送達と組み合わせることができる。非限定的にアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（HSV）ベクター、バキュロウイルスベクター、および合成ベクターを含むそのような他のウイルスベクターは、当技術分野において公知の方法に従って容易に選択および作製することができる。同様に、非限定的にリポソーム、脂質ベースのベクター、ポリプレックスベクター、分子複合体、ポリアミンおよびポリカチオンベクターを含む非ウイルスベクターは、当技術分野において公知の方法に従って容易に選択および作製することができる。これらの代替経路によって投与された場合、投与量は上記に説明される範囲内にあることが望ましい。
【０１００】
本発明の遺伝子治療組成物は、投与のための説明書と共に、キットおよび/または薬学的パッケージ、容器、パック、またはディスペンサーに含まれることができる。したがって、本開示は、神経障害性疼痛および/または筋肉痙縮の処置のためのキットを提供する。1つの態様において、キットは、単位剤形における遺伝子治療ベクターの有効量を含有する治療用組成物を含む。いくつかの態様において、キットは、治療用組成物を含有する滅菌容器を含み、そのような容器は、箱、アンプル、瓶、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当技術分野において公知の他の適している容器形態であることができる。そのような容器は、プラスチック、ガラス、積層加工紙、金属箔、または薬剤を保持するのに適している他の材料から作られることができる。説明書は、概して、神経障害性疼痛および/または筋肉痙縮の処置のための組成物の使用についての情報を含む。他の態様において、説明書は、組成物の説明；神経障害性疼痛および/もしくは筋肉痙縮、またはそれに関連する症状の処置のための投薬スケジュールおよび投与；注意；警告；適応症；禁忌；過量情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；ならびに/または参照文献のうちの少なくとも1つを含む。説明書は、（存在する場合は）容器上に直接、または容器に貼られるラベルとして、または容器中にもしくは容器と共に供給される別個のシート、パンフレット、カード、もしくはホルダーとして印刷されてもよい。
【０１０１】
別の局面において、神経障害性疼痛を処置する方法は、併用治療を含んでもよく、そこでは、本明細書において説明される1つまたは複数の遺伝子の局所的分節アップレギュレーションが、チアガビンなどのGABA取り込み阻害剤での全身処置と組み合わせて行われ、それによって、GAD65/VGATを過剰発現する脊髄分節および関連する皮膚分節中にのみ存在する抗侵害受容効果を強化する。したがって、処置計画は、GAD65遺伝子およびVGAT遺伝子をコードするウイルスベクターを、GABA取り込み阻害剤の全身投与と組み合わせて投与することを含んでもよい。
【０１０２】
さらに、本発明の方法は、重金属（例えば鉛、ヒ素および水銀）および工業用溶剤を含む毒性化合物、ならびに化学療法薬（例えばビンクリスチンおよびシスプラチン）、ダプソン、HIV薬（例えばジドブジン、ジダノシン、スタブジン、ザルシタビン、リトナビル、およびアンプレナビル）、コレステロール降下薬（例えばロバスタチン、インダパミド、およびゲムフィブロジル）、心臓または血圧の薬（例えばアミオダロン、ヒドララジン、ペルヘキシリン）、およびメトロニダゾールを含む薬剤への曝露によって引き起こされる末梢神経障害のような神経損傷の治療において使用できる。
【０１０３】
本発明の方法は、物理的、機械的、または化学的外傷によって引き起こされる神経系の損傷を治療するために使用することもできる。したがって、本方法は（例えば火傷、創傷、外科手術、および事故と関連する）物理的損傷、虚血、低温への長期にわたる曝露（例えば凍傷）によって引き起こされる末梢神経損傷、ならびに例えば脳卒中または頭蓋内出血（脳出血など）による中枢神経系の損傷の治療において使用できる。同様に、本発明の方法は、そのような外傷により引き起こされる慢性痛／痛覚の治療において使用できる。
【０１０４】
以下の実施例は本発明を例証することを意図するものであり、限定することを意図しない。
【実施例】
【０１０５】
実施例1
マウスモデルにおけるベクター送達
図1Aおよび1Bは、GAD65（グルタミン酸デカルボキシラーゼ65）およびVGAT（小胞GABA輸送体）をコードするAAV9（またはAnc80）ベクターの、標的とされた分節中への例示的な軟膜下送達を示す。ナイーブC57BL6マウスに、機械的異痛症を誘導するために、坐骨神経の直径の1/3〜1/2ぐらいに堅い結紮を配置した（片側性結紮）。神経損傷後に、動物を、von Freyフィラメントおよびブラシ誘発性の異痛症を用いて、触覚侵害受容閾値の変化について10日間試験した。
【０１０６】
坐骨神経損傷の誘導後10日目に、動物は、ユビキチンプロモーター（UBI）下のGAD65およびVGAT遺伝子をコードするAAV9の片側性軟膜下注射を受けた。2つの対照群を研究した。第1の対照群においては、PBSのみを、坐骨神経損傷動物におけるL2-L3の軟膜下に注射した。別の対照群（ナイーブ非損傷動物）においては、いかなる処置も行わなかった。GFPをコードするAAV9を用いたナイーブ動物の別個の群（n＝6）において、0.5μlのAAV9の軟膜下片側性注射（1.2×1013 gc/ml；L2-L3軟膜下空間中へ注射）は、成体マウスにおける片側性脊髄後角ニューロンに選択的に感染することが実証された（図1C）。したがって、本明細書において提供されるデータは、軟膜下ベクター送達技術の使用が、脊髄後角ニューロンに限定されており、かつベクター送達に同側性である標的化導入遺伝子発現を達成することを実証する。
【０１０７】
一貫して高い程度の、坐骨神経結紮の部位に同側性の触覚過敏症が、触覚退避閾値（tactile withdrawal threshold）が1 gぐらい（損傷前ベースライン）から約0.2 gへ減少した時である坐骨神経結紮の2日後から、坐骨神経損傷動物において測定された。触覚過敏症における変化は、対照PBSが注射された坐骨神経損傷動物において見られず、すべての動物は、軟膜下PBS送達後最大で10週間、神経障害性疼痛の継続的な徴候（すなわち、触覚およびブラシ誘発性の過敏症）を示した（図2Aおよび2B）。対照的に、AAV9-UBI-GAD65/VGATまたはAnc80-UBI-GAD65/VGATの軟膜下送達を受けた動物において、触覚およびブラシ誘発性の過敏症の進行性のかつ完全な（P＜0.05）逆転が見られ、10週間（すなわち、研究の期間）持続された（図2A、2B、2E、および2F）。これらのデータは、AAV9-UBI-GAD65/VGATの片側性脊髄送達が、長く続く抗侵害受容効果の提供において非常に強力であることを実証する。重要なことに、（全身性または髄腔内に送達された抗侵害受容薬物の使用後の主な問題である）運動衰弱などの、検出可能な副作用は見られなかった。
【０１０８】
オープンフィールド運動能力（走行距離）および同側性後足配置パターン（Cat Walkアッセイ）の解析により、AAV9-UBI-GAD65/VGATで軟膜下処置された動物における走行距離の有意な増加および同側性足配置の正常化が示された（図2Cおよび2D）。
【０１０９】
図3A〜3Eに示されるように、成体マウスにおける片側性（同側性）（L2-L4）軟膜下AAV9-UBI-GAD65/VGAT送達は、同側性脊髄後角興奮性介在ニューロンにおける、阻害性-興奮性混合型の神経伝達物質表現型の誘導を結果としてもたらす。しかし、VGULT2抗体、GAD65抗体、およびVGAT抗体での対側性脊髄後角ニューロンの染色は、VGLUT2とGAD65またはVGATとの共局在化の検出を結果としてもたらさなかった。それに対して、同じ抗体での同側性脊髄後角ニューロンの染色は、VGLUT2とVGATとのおよびVGLUTとGAD65両方の明らかな同時発現を実証した（図3A〜3D；白矢印）。同様に、定量的デンシトメトリー解析により、AAV9-UBI-GAD65/VGATベクターを注射した同側性後角におけるGAD65およびVGATの発現の有意な増加が示された（図3E）。対側性後角においては、発現の増加が測定されなかった。
【０１１０】
電子顕微鏡とカップリングした、VGLUT2抗体、GAD65抗体、およびVGAT抗体での包埋前免疫金染色により、AAV9-UBI-GAD65/VGAT注射動物のVGLUT2+終末におけるGAD65およびVGATの免疫金タグ付加粒子の明らかな増加が示された（図4Cおよび4D；PNI＋GAD65＋VGAT：同側イメージ）。対照PBS注射動物においては、VGLUT2とGAD65およびVGAT粒子との最小の同時発現が見られたか、または同時発現が見られなかった（図4Aおよび4B；PNI-PBS：同側イメージ）。蛍光インサイチュハイブリダイゼーションにより、AAV9-UBI-GAD65/VGAT注射動物におけるVGLUT2、GAD65、およびVGATのmRNAを有するダブルタグ付加ニューロンおよびトリプルタグ付加ニューロンの明らかな出現が示された（PNI：GAD65＋VGAT；同側イメージ）（図4E〜4J）。
【０１１１】
したがって、興奮性（VGLUT2）ニューロン/終末における阻害性神経伝達物質機構（すなわち、GAD65およびVGAT）の同時発現は、動物モデルにおいて運動能力の改善を伴う、測定された抗侵害受容効果をもたらす。さらに、興奮性-阻害性のデュアル神経伝達物質表現型の誘導は、末梢侵害受容性求心路の活性化後に優先的な阻害効果をもたらす。
【０１１２】
実施例2
ブタモデルにおけるベクター送達
この実施例においては、成体ブタモデルを用いて、ベクターの軟膜下送達が、成体ヒトのものに類似した脊髄の寸法を有する動物種において十分に標的化された導入遺伝子発現を達成することを実証した。成体ブタ（ユカタンブタ、15〜25 kg；n＝3）が、片側性軟膜下（L2-L3）Anc80-UBI-Rpl22-3xHAベクター送達（100μl；1.2×1013 gc/ml）を受けた。ベクター注射後に、動物を48時間生存させ、次いで、4％パラホルムアルデヒドで灌流固定した。次いで、横断脊髄切片を調製して、抗HA抗体で染色した。染色切片を、共焦点顕微鏡で解析した。図5A〜5Dに示されるように、ベクター注射の側に同側性の、脊髄後角ニューロン特異的なRpl22タンパク質発現が観察された。
【０１１３】
マウスモデルにおいて観察されたものに類似した、感染したニューロンにおける興奮性-抑制性混合型のニューロン表現型の誘導を実証するために、異なる群の成体ブタ（Gottingen-Minnesota；35〜45 kg；n＝3）が、片側性軟膜下（L2-L3）Anc80-UBI-GAD65/VGATベクター送達（100μl；1.2×1013 gc/ml）を受けた。ベクター注射後に、動物を8週間生存させ、オープンフィールド運動能力について定期的に評価した。検出可能な運動衰弱は、いずれの動物においても観察されなかった。8週目に、動物を4％パラホルムアルデヒドで灌流固定し、L1-L4分節から横断脊髄切片を調製した。切片を、抗VGLUT2抗体、抗GAD65抗体、および抗VGAT抗体で染色して、共焦点顕微鏡で解析した。
【０１１４】
図6A〜6Dに示されるように、VGLUT2抗体、GAD65抗体、およびVGAT抗体での同側性脊髄後角ニューロンの染色により、VGLUT2とVGATおよびGAD65との、明らかな同時発現が示された。したがって、軟膜下空間中へ送達されるベクターの体積を操作することによって、標的とされる導入遺伝子の匹敵する複数分節発現を、成体ヒト脊髄のものに類似した寸法を有する脊髄において達成することができる。
【０１１５】
実施例3
慢性筋肉痙縮のラットモデルにおけるベクター送達
慢性筋肉痙縮のラットモデル（すなわち、脊髄切断誘導性筋肉痙縮を有するラット）において、AAV9-UBI-GAD65/VGATの軟膜下送達後の抗痙縮効果を実証するために、ベクター治療を提供した。図8Aおよび8Bに示されるように、対照ベクター（AAV9-GFP）を受けた動物における筋肉痙縮の測定により、（脊髄切断後2〜3か月で測定されたベースラインと比較して）ウイルス送達後8週間にわたって、筋肉痙縮の進行性の増加が示された。対照的に、痙縮応答のほぼ完全な遮断が、AAV9-UBI-GAD65/VGATベクターを受けた動物において測定された。H-反射の速度依存的抑圧（RDD）の測定により、AAV9-UBI-GAD65/VGATベクターで処置された動物におけるRDDの有意な回復が示された（図8Cおよび8D）。
【０１１６】
慢性筋肉痙縮の成体ラットモデルにおける両側性（L2-L4）軟膜下AAV9-UBI-GAD65/VGAT送達は、腰部興奮性介在ニューロンにおいて阻害性-興奮性混合型の神経伝達物質表現型を誘導した。図9Cおよび9Dに示されるように、VGLUT2終末におけるGAD65とVGATとの同時発現が証拠となるような、脊髄介在ニューロンにおける混合型の神経伝達物質表現型の出現が観察された。しかし、VGLUT2終末におけるGAD65とVGATとの同時発現は、対照のAAV9-UBI-GFPベクターを受けた動物においては見られなかった（図9Aおよび9B）。
【０１１７】
対照ベクター注射動物との比較において、灰白質における、GAD65、VGAT発現の、ならびにGAD65とVGATとを同時発現するVGLUT1終末およびVGLUT2終末の数の、非常に有意な（p＜0.01）増加が、AAV9-UBI-GAD65/VGATベクターの腰部軟膜下注射を受けた痙性ラットにおいて測定された（表2）。したがって、AAV9-UBI-GAD65/VGATベクターの脊髄軟膜下送達は、脊髄切断誘導性後肢痙縮の十分に確立されたラットモデルにおいて慢性筋肉痙縮の抑制に非常に有効である。したがって、測定された抗痙縮効果の機序は、脊髄興奮性介在ニューロンにおける興奮性-阻害性混合型の神経伝達物質表現型の誘導、および結果として生じる、そうではなく悪化した痙性EMG応答の抑制に基づく。
【０１１８】
（表２）GAD65およびVGATの発現の定量解析
2020533313.tif 000010
【０１１９】
本発明を上記の実施例に関して説明してきたが、改変および変更が、本発明の精神および範囲内に包含されることが理解される。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
2020533313.tif 000012
【図１Ｂ】
2020533313.tif 000013
【図１Ｃ】
2020533313.tif 000014
【図２Ａ】
2020533313.tif 000015
【図２Ｂ】
2020533313.tif 000016
【図２Ｃ】
2020533313.tif 000017
【図２Ｄ】
2020533313.tif 000018
【図２Ｅ】
2020533313.tif 000019
【図２Ｆ】
2020533313.tif 000020
【図３Ａ】
2020533313.tif 000021
【図３Ｂ】
2020533313.tif 000022
【図３Ｃ】
2020533313.tif 000023
【図３Ｄ】
2020533313.tif 000024
【図３Ｅ】
2020533313.tif 000025
【図４−１】
2020533313.tif 000026
【図４−２】
2020533313.tif 000027
【図５Ａ】
2020533313.tif 000028
【図５Ｂ】
2020533313.tif 000029
【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
2020533313.tif 000031
【図６】
2020533313.tif 000032
【図７】
2020533313.tif 000033
【図８】
2020533313.tif 000034
【図９−１】
2020533313.tif 000035
【図９−２】
2020533313.tif 000036
【配列表】
2020533313000001.app
【国際調査報告】
2020533313.tif 000037