(57)【要約】  本発明は、カンジダ・アルビカンスの検出のための多孔質材料、上記多孔質材料を使用する診断方法、及びその作製方法に関する。特に、本発明は、病原性微生物カンジダ・アルビカンスのＤＮＡを認識するように設計された新規の多孔質材料の生産、及び迅速で高感度なｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法におけるその使用に関する。【選択図】図１
2020537535.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンジダ・アルビカンスの検出のための多孔質材料であって、内部細孔内に指標化学種を含むと共に、前記材料の外表面に固定されたカンジダ・アルビカンスのゲノムの断片に相補的な少なくとも１種のＤＮＡを含み、前記相補的ＤＮＡ配列が、担体の内部細孔からの前記指標化学種の放出を遮断する、多孔質材料。
【請求項２】
前記相補的ＤＮＡ配列は、中性有機基及び結合用オリゴヌクレオチドによって前記担体の外表面に結合されている、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項３】
前記中性有機基は、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）、アルコール（−ＯＨ）、アルデヒド（−ＣＨＯ）、アルケン、アルキン、アミン（−ＮＨ2又は−ＮＲ’Ｒ’’）、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’）、アジド（−Ｎ3）、ケトン（−Ｃ＝Ｏ）、エステル（−ＣＯＯＲ’）、エーテル（Ｒ’−Ｏ−Ｒ’’）、ハロゲン、イミン（ＲＲ’Ｃ＝ＮＲ’’）、イソシアネート（−ＮＣＯ）、イソチオシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）、ニトリル（−Ｃ≡Ｎ）、ニトロ（−ＮＯ2）又はチオール（−ＳＨ）から選択される、請求項２に記載の多孔質材料。
【請求項４】
前記結合用オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドＯ１（配列番号１）である、請求項３に記載の多孔質材料。
【請求項５】
オリゴヌクレオチドＯ１（配列番号１）は、オリゴヌクレオチドＯ２（配列番号２）とハイブリダイズしている、請求項４に記載の多孔質材料。
【請求項６】
前記相補的ＤＮＡ配列は、カチオン性有機基によって前記担体の外表面に結合されている、請求項１に記載の多孔質材料。
【請求項７】
前記カチオン性有機基は、アミン類、グアニジン基（Ｈ−Ｎ＝（ＮＨＲ）ＮＨ2）、ホスホニウム（ＰＨ4+）又は第四級アンモニウム（ＮＲ4+）から選択される、請求項６に記載の多孔質材料。
【請求項８】
前記相補的ＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチドＯ３（配列番号３）である、請求項７に記載の多孔質材料。
【請求項９】
２００ｍ2ｇ-1から１４００ｍ2ｇ-1の間の比表面積を有するメソ多孔質二酸化ケイ素のみからなることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の多孔質材料。
【請求項１０】
ナノ多孔質陽極酸化アルミナからできたフィルム又はプレートのみからなることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の多孔質材料。
【請求項１１】
カンジダ・アルビカンスを検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法であって、
ａ）請求項１に記載の多孔質材料を、分析対象のＤＮＡ試料と水溶液中で接触させることと、
ｂ）工程ａ）の混合物をインキュベートすることで、ハイブリダイゼーション反応を引き起こすことと、
ｃ）前記混合物の水相中に放出された指標化学種の量を測定することと、
を含む、方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の多孔質材料の作製方法であって、以下の工程：
ａ）多孔質二酸化ケイ素又はナノ多孔質陽極酸化アルミナからできた担体を調製する工程と、
ｂ）工程ａ）で調製された基材の内部細孔内に前記指標化学種を導入する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた負荷された基材を、前記基材の表面への中性有機基又はカチオン性有機基の結合により機能化させる工程と、
ｄ）必要に応じて、前記基材を、前記中性有機基に結合された結合用オリゴヌクレオチドにより誘導体化する工程と、
ｅ）前記カンジダ・アルビカンスのゲノムの断片に相補的なＤＮＡ配列を、工程ｃ）又は工程ｄ）で得られた多孔質無機担体に添加する工程と、
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項１３】
カンジダ・アルビカンスのゲノムの断片に相補的なＤＮＡ配列とハイブリダイズするＤＮＡ配列を、工程ｅ）で得られた担体に添加することを特徴とする、請求項１２に記載の多孔質材料の作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ｉｎ  ｓｉｔｕ診断方法に適用できる、生物学的、薬理学的及び医学的に関心が持たれる種の検出に用途を有する新規材料の分野に属する。特に、本発明は、病原性微生物カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）のＤＮＡを認識するように調製された新規の多孔質材料の取得、及び迅速かつ高感度のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法におけるその使用を開示する。
【背景技術】
【０００２】
近年、様々な学術及び産業の分野において多数の用途を有する有機−無機ハイブリッド材料の開発が大いに成長している。これらのハイブリッド材料の中でも、「分子ゲート」の概念を考慮することにより開発されたものは、制御放出及び分子同定のための方法でのその潜在的な用途のため注目されている。「分子ゲート」を有する機能化されたハイブリッド材料は、或る特定の種類の分子／種を内部細孔内に貯蔵することが可能であり、そしてまた外表面に固定された分子又は超分子であり得る有機基又は無機基を有する多孔質担体から構成されており、ここで、上記基は、担体の負荷として知られるその内部細孔内に貯蔵された分子の放出を、外部刺激を加えることにより調節することが可能である。これらの材料は非常に有望な技術であり、近年では、生物工学、生物学的検出及びバイオナノテクノロジー等の分野で集中的に研究されており、これにより新境地が開拓されている（非特許文献１、非特許文献２）。「分子ゲート」の開閉を制御するために最も一般的に使用される外部刺激は、光化学的刺激、電気化学的刺激、イオン的刺激（ｐＨ変化、或る特定のカチオン及びアニオンの存在）、温度変化、極性変化又は或る特定の分子若しくは生体分子（酵素、抗原／抗体系、一本鎖ＤＮＡ等）の存在と分類できる（非特許文献３〜非特許文献５）。これらの外部刺激を加えることにより、指標化学種（色素、蛍光体、レドックス活性を有する物質、プラズモン共鳴を有する物質又は生物学的活性物質、例えば細胞傷害剤、タンパク質、小さな生体分子、酵素若しくは核酸断片）の放出を、適切な場所及び時間で、制御された様式で誘導できる（非特許文献６〜非特許文献１２）。この用途は非常に重要ではあるが、「分子ゲート」により機能化された有機−無機ハイブリッド材料の用途の例は、認識プロトコル及び検出プロトコルにおいてほとんど記載されていない（非特許文献１３〜非特許文献１５ａ及び非特許文献１５ｂ）。
【０００３】
「分子ゲート」を有するハイブリッド材料を検出方法に適用するためには、無機担体の細孔に通常、指標化学種が負荷され、その固体の外表面は（生体）分子、超分子又は無機粒子で機能化される。担体の機能化とは、或る特定の標的分析物との相互作用により、担体の細孔の入口で空間的変化を誘導する或る特定の（生体）分子、超分子又は無機粒子の担体の外表面への結合又は固定を指し、したがって、標的分析物が存在しない場合には、「分子ゲート」は閉じられることとなる。それというのも、担体の外表面に固定された生体分子、超分子又は無機粒子が、内部細孔内に収容される分子の放出を妨害又は阻害するからである。一方、標的分析物が存在する場合には、「分子ゲート」として作用する（生体）分子、超分子又は無機粒子の構造／コンフォメーションの変化が誘発されて、内部細孔の負荷が放出されることとなる。この溶液中への放出は、簡単に定量化できる物理的変化、化学的変化又は生物学的変化（例えば、色又は蛍光）に反映されることとなる（非特許文献１６、非特許文献１７）。この新しい検出の構想は、認識過程とシグナル過程とが分離されているので、古典的な「配位サブユニット−指標サブユニット」超分子システムとは異なっている（非特許文献１８〜非特許文献２４）。さらに、この新しいプロトコルのもう１つの利点は、シグナルの増幅である。例えば、これらの材料では、分析物分子が少しでも存在すると、担体の細孔内部からの大量の指標化学種の放出が誘導され得ることが記載されている（非特許文献２５）。
【０００４】
さらに、過去数十年間で、入院患者においてカンジダ症等の酵母によって引き起こされる院内感染症の症例が増加している（非特許文献２６）。潜在的に危険なカンジダ菌株は様々存在するが、最も侵襲性が高い感染症はカンジダ・アルビカンスによって引き起こされる感染症である。したがって、この種によって引き起こされる感染症の症例を迅速かつ明確に診断することは非常に重要であり、大きな関心が持たれている。さらに、各症例で従わねばならない処理は異なるため、カンジダ・アルビカンスと他の種とを区別できることも重要である。実際に、カンジダ・アルビカンスは、最も一般的に使用される抗微生物剤であるフルコナゾールに対して固有の耐性を有している（非特許文献２７）。近年では、カンジダ・アルビカンスを検出するための確実な方法が存在するが、それらの方法は時間がかかり、高価であり、特別に訓練された職員のいる専門的な研究所に頼っている（非特許文献２８〜非特許文献３０）。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】E. Katz et al, Integrated nanoparticle-biomolecule hybrid systems: synthesis, properties, and applications, Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 6042-6108.
【非特許文献２】F. Wang, et al, DNA switches: from principles to applications, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 1098-1129.
【非特許文献３】A. Bernardos, et al, Enzyme-responsive intracellular controlled release using nanometric silica mesoporous supports capped with "saccharides", ACS Nano, 2010, 4(11), 6353-6368.
【非特許文献４】A. Bernardos, et al, Enzyme-responsive controlled release using mesoporous silica supports capped with lactose, Angew Chem Int Ed Engl. 2009; 48(32): 5884-5887.
【非特許文献５】N. Mas, et al, Enhanced antifungal efficacy of tebuconazole using gated pH-driven mesoporous nanoparticles, Int. J. Nanomedicine. 2014, 9, 2597-2606.
【非特許文献６】E. Aznar, Gated Materials for On-Command Release of Guest Molecules, Chem. Rev., 2016, 116, 561-718.
【非特許文献７】A. B. Descalzo, et al, The supramolecular chemistry of organic-inorganic hybrid materials, Angew. Chem. Int. Ed., 2006, 45, 5924.
【非特許文献８】R. Casasus, et al, Dual Aperture Control on pH- and Anion-Driven Supramolecular Nanoscopic Hybrid Gate-like Ensembles, J. Am. Chem. Soc., 2008, 140, 1903-1917.
【非特許文献９】S. Angelos, et al, pH-responsive supramolecular nanovalves based on cucurbit [6]uril pseudorotaxanes, Angew. Chem. Int. Ed., 2008, 47, 2222-2226.
【非特許文献１０】C. Park, et al, Controlled Release of Guest Molecules from Mesoporous Silica Particles Based on a pH-Responsive Polypseudorotaxane Motif, Angew. Chem. Int. Ed., 2007, 46, 1455-1457.
【非特許文献１１】M. Vallet-Regi, et al, A New Property of MCM-41: Drug Delivery System, J. Chem. Mater., 2001, 13, 308-311.
【非特許文献１２】M. Vallet-Regi, et al, Arcos, Mesoporous materials for drug delivery, Angew. Chem. Int. Ed. 2007, 46, 7548-7558.
【非特許文献１３】F. Sancenon, et al, Gated Silica Mesoporous Materials in Sensing Applications, ChemistryOpen, 2015, 4, 418-437.
【非特許文献１４】Y. Salinas, et al, Chromo-Fluorogenic Detection of Nitroaromatic Explosives by Using Silica Mesoporous Supports Gated with Tetrathiafulvalene Derivatives, Chem. Eur., J. 2014, 20, 855-866.
【非特許文献１５ａ】E. Climent, et al, Controlled Delivery Using Oligonucleotide-Capped Mesoporous Silica Nanoparticles, Angew. Chem. 2010, 122, 7439-7441.
【非特許文献１５ｂ】Ll. Pascual, et al, Oligonucleotide-capped mesoporous silica nanoparticles as DNA-responsive dye delivery systems for genomic DNA detection, Chem. Commun., 2015, 51, 1414-1416.
【非特許文献１６】C. Coll, et al, Gated Silica Mesoporous Supports for Controlled Release and Signaling Applications, Acc. Chem. Res., 2013, 46, 339-349.
【非特許文献１７】E. Climent, et al, Selective, Highly Sensitive, and Rapid Detection of Genomic DNA by Using Gated Materials: Mycoplasma Detection, Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 8938-8942.
【非特許文献１８】L. E. Santos-Figueroa, et al, Chromogenic and fluorogenic chemosensors and reagents for anions. A comprehensive review of the years 2010-2011, Chem. Soc. Rev., 2013, 42, 3489-3613.
【非特許文献１９】M. E. Moragues, et al, Chromogenic and fluorogenic chemosensors and reagents for anions. A comprehensive review of the year 2009, Chem. Soc. Rev., 2011, 40, 2593-2643.
【非特許文献２０】Y. Salinas, et al, Optical chemosensors and reagents to detect explosives, Chem. Soc. Rev. 2012, 41, 1261-1296.
【非特許文献２１】S. K. Kim, et al, Chemosensors for pyrophosphate, Acc. Chem. Res., 2009, 42, 23 - 31.
【非特許文献２２】X. Chen, et al, Fluorescent and colorimetric probes for detection of thiols, Chem. Soc. Rev., 2010, 39, 2120 - 2135.
【非特許文献２３】A. P. de Silva, et al, Signaling Recognition Events with Fluorescent Sensors and Switches, Chem. Rev., 1997, 97, 1515 - 1566.
【非特許文献２４】R. Martinez-Manez et al, Fluorogenic and Chromogenic Chemosensors and Reagents for Anions, Chem. Rev. 2003, 103, 4419 - 4476.
【非特許文献２５】M. Hecht, et al, Gated hybrid delivery systems: En route to sensory materials with inherent signal amplification, Coord. Chem. Rev., 2013, 257, 2589-2606.
【非特許文献２６】S.K. Fridkin, The changing face of fungal infections in health care settings, Healthcare Epidemiology, 2005, 41, 1455-1460.
【非特許文献２７】A. Vahidnia, et al, High throughput multiplex-PCR for direct detection and diagnosis of dermatophyte species, Candida albicans and Candida parapsilosis in clinical specimen, J. Microbiol. Methods, 2015, 113, 38 - 40.
【非特許文献２８】Y. Guo, et al, A Real-Time PCR Assay Based on 5.8S rRNA Gene (5.8S rDNA) for Rapid Detection of Candida from Whole Blood Samples, Mycopathologia, 2016, 181, 405-413.
【非特許文献２９】J. Kim, et al, Evaluation of the Punch-itTM NA-Sample kit for detecting microbial DNA in blood culture bottles using PCR-reverse blot hybridization assay, J. Microbiol. meth, 2016, 128, 24-30.
【非特許文献３０】X. Jiang, et al, Rapid Detection of Candida albicans by Polymerase Spiral Reaction Assay in Clinical Blood Samples, Front. Microbiol., 2016, 7, 916.
【非特許文献３１】Y. H. Lim and D. H. Lee, Rapid PCR Method for Detecting Candida albicans Using Primers Derived from the Integrin-like Protein Gene αINT1 of Candida albicans, J. Microbiol, 2000, 38, 105-108.
【非特許文献３２】E. P. Barrett, et al, The Determination of Pore Volume and Area Distributions in Porous Substances. I. Computations from Nitrogen Isotherms, J. Am. Chem. Soc. 1951, 73, 373-380.
【非特許文献３３】S. Brunauer, et al, Adsorption of Gases in Multimolecular Layers, J. Am. Chem. Soc. 1938, 60, 309-319.
【発明の概要】
【０００６】
本発明の著者らは、カンジダ・アルビカンスを検出するための新規の多孔質材料を見出し、その作製方法及びそれを使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法を開発した。
【０００７】
本発明の第１の態様は、内部細孔内に指標化学種を含むと共に、カンジダ・アルビカンスのゲノムの断片に相補的な少なくとも１種のＤＮＡを含む、カンジダ・アルビカンスの検出のための多孔質材料からできた担体であって、前記相補的ＤＮＡ配列が、担体の内部細孔からの前記指標化学種の放出を遮断する、多孔質材料からできた担体に関する。
【０００８】
本発明では、多孔質材料の外表面に固定されているカンジダ・アルビカンスのゲノムの断片に相補的なＤＮＡ配列であって、該相補的なＤＮＡ配列を多孔質材料に結合する有機構造物（中性有機基又はカチオン性有機基）と一緒に上記材料の内部細孔からの指標化学種の放出を遮断する、ＤＮＡ配列は、現在「分子ゲート」として知られるものを構成する。相補的ＤＮＡ配列の３次元構造及びコンフォメーションを考慮すると、この配列は多孔質材料の細孔を遮断し、それにより指標化学種の放出が妨害される。
【０００９】
上記ＤＮＡ配列は、カンジダ・アルビカンスのゲノムから選択される配列に相補的である。本発明の具体的な実施形態では、細孔を遮断する相補的ＤＮＡ配列は、カンジダ・アルビカンスの遺伝子αＩＮＴ１の配列に相補的である（非特許文献３１）。
【００１０】
本発明の具体的な実施形態では、前記相補的ＤＮＡ配列は、中性有機基及びカンジダ・アルビカンスの相補的ＤＮＡとハイブリダイズする結合用オリゴヌクレオチドによって前記担体の外表面に結合されている。より具体的な実施形態では、結合用オリゴヌクレオチドとハイブリダイズする相補的ＤＮＡ配列は、カンジダ・アルビカンスの遺伝子αＩＮＴ１の配列に相補的なオリゴヌクレオチドＯ２（配列番号２）である。より具体的な実施形態では、結合用オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドＯ１（配列番号１）である。より具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチドＯ１（配列番号１）は、中性有機基によって担体の外表面に結合されている。更に具体的な実施形態では、前記中性有機基は、カルボン酸（−ＣＯＯＨ）、アルコール（−ＯＨ）、アルデヒド（−ＣＨＯ）、アルケン、アルキン、アミン（−ＮＨ2又は−ＮＲ’Ｒ’’）、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’）、アジド（−Ｎ3）、ケトン（−Ｃ＝Ｏ）、エステル（−ＣＯＯＲ’）、エーテル（Ｒ’−Ｏ−Ｒ’’）、ハロゲン、イミン（ＲＲ’Ｃ＝ＮＲ’’）、イソシアネート（−ＮＣＯ）、イソチオシアネート（−Ｎ＝Ｃ＝Ｓ）、ニトリル（−Ｃ≡Ｎ）、ニトロ（−ＮＯ2）又はチオール（−ＳＨ）から選択される。好ましい実施形態では、中性有機基は、イソシアネート基（−ＮＣＯ）である。
【００１１】
本発明の別の具体的な実施形態では、相補的ＤＮＡ配列は、カチオン性有機基により担体の外表面に結合されている。より具体的な実施形態では、カチオン性有機基に結合されている相補的ＤＮＡ配列は、カンジダ・アルビカンスの遺伝子αＩＮＴ１の配列に相補的なオリゴヌクレオチドＯ３（配列番号３）である。より具体的な実施形態では、カチオン性有機基は、アミン類、グアニジン基（Ｈ−Ｎ＝（ＮＨＲ）ＮＨ2）、ホスホニウム（ＰＨ4+）又は第四級アンモニウム（ＮＲ4+）から選択される。Ｒは、線状又は分岐状のＣ1〜Ｃ6アルキル及びＣ3〜Ｃ6シクロアルキルから選択される。
【００１２】
本発明の１つの実施形態では、ＤＮＡ配列は、
オリゴヌクレオチドＯ１−５’−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＣＣ  ＣＣＣ−３’（配列番号１）
オリゴヌクレオチドＯ２−５’−ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＴＴ−３’（配列番号２）
オリゴヌクレオチドＯ３−５’−ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＴＴＧ  ＡＴＧ−３’（配列番号３）
から選択される。
【００１３】
本発明のより具体的な実施形態では、相補的ＤＮＡ配列は、
オリゴヌクレオチドＯ２−５’−ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＴＴ−３’（配列番号２）
オリゴヌクレオチドＯ３−５’−ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＴＴＧ  ＡＴＧ−３’（配列番号３）
から選択される。
【００１４】
本発明において、多孔質材料は、ナノ粒子形のメソ多孔質二酸化ケイ素（メソ多孔質ケイ素ナノ粒子（ＭＳＮ）としても知られる）又はフィルム形若しくはプレート形のナノ多孔質陽極酸化アルミナ（ＡＡＮ）から選択される。より具体的には、本発明の多孔質材料は、２００ｍ2ｇ-1から１４００ｍ2ｇ-1の間の比表面積を有する。
【００１５】
本発明の具体的な実施形態では、多孔質材料の作製方法は、以下の工程：
ａ）多孔質二酸化ケイ素又はナノ多孔質陽極酸化アルミナからできた担体を調製する工程と、
ｂ）工程ａ）で調製された基材の内部細孔内に前記指標化学種を導入する工程と、
ｃ）工程ｂ）で得られた負荷された基材を、前記基材の表面への中性有機基又はカチオン性有機基の結合により機能化させる工程と、
ｄ）必要に応じて、前記基材を、前記中性有機基に結合された結合用オリゴヌクレオチドにより誘導体化する工程と、
ｅ）前記カンジダ・アルビカンスのゲノムの断片に相補的なＤＮＡ配列を、工程ｃ）又は工程ｄ）で得られた多孔質無機担体に添加する工程と、
を含む。
【００１６】
本発明の別の具体的な実施形態では、カンジダ・アルビカンスを検出するｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法は、
ａ）多孔質材料でできた担体を、分析対象のＤＮＡ試料と水溶液中で接触させることと、
ｂ）工程ａ）の混合物をインキュベートすることで、ハイブリダイゼーション反応を引き起こすことと、
ｃ）前記混合物の水相中に放出された指標化学種の量を測定することと、
を含む。
【００１７】
多孔質材料がカンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡを含む試料と水溶液中で接触すると、そのゲノムＤＮＡは「分子ゲート」として使用されるＤＮＡ配列とハイブリダイズすることとなり、細孔の開放又は遮断解除と上記多孔質材料の内部に収容された指標化学種の放出とが結果として起こる。これらの材料はカンジダ・アルビカンスの存在を選択的に検出できるため、素早く、簡単で、かつ高感度の検知システムが構成される。
【００１８】
カンジダ・アルビカンスによって引き起こされる感染症のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断用のこの新規の多孔質材料は、感度及び特異性が高く、製造費用が安く、まさに患者から試料を採取する診察室において感染症の迅速な検出を可能にするため、専門的な研究所及び特別に訓練された研究所員への依存が最小限となる。
【００１９】
さらに、以下の利点を挙げることができる：
カンジダ・アルビカンス感染を検出するための高速で強力なツール（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法）を使用することにより、医療診断及び意思決定がし易くなること；
診断時間が３日〜４日から１０分〜１５分へと短縮されること；
診断試験の費用がその現在の額の５分の１まで低下すること；
患者からの試料中のカンジダ・アルビカンスの存在を検出するための専門的な研究所への依存が抑えられること；
患者から試料が採取される診察室でカンジダ・アルビカンスが診断されること；
患者の臨床的要求を満たすことを目的とするナノスケールデバイスの設計に超分子化学の概念及び知識が適用されること；
世界中の感染症の高い割合を占めるカンジダ・アルビカンスを検出するためのプローブ材料によって、ヘルスケア産業に革命をもたらすことができる革新的な技術が国内市場及び国際市場に提供されること。
【００２０】
本発明において、本明細書で使用される「機能化」という用語は、先述のように中性官能基又は有機官能基による多孔質担体の化学的修飾を指す。
【００２１】
本発明において、本明細書で使用される「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断方法」という用語は、カンジダ・アルビカンスの高感度かつ選択的な検出のためのプロトコルを指す。
【００２２】
本発明において、本明細書で使用される「負荷」という用語は、拡散法又は含浸法による多孔質担体の細孔内への指標化学種の取込みを指す。
【００２３】
本発明において、「指標化学種」という用語は、定量することが可能な任意の化学種、例えば、色素、蛍光体、レドックス活性を有する物質、プラズモン共鳴を有する物質又は生物学的活性物質、例えば細胞傷害剤、タンパク質、小さな生体分子、酵素若しくは核酸断片を指す。
【００２４】
本発明において、「誘導体化」という用語は、多孔質表面に固定された有機基を結合用オリゴヌクレオチドにより化学結合の形成を介して修飾することを指す。
【産業上の利用可能性】
【００２５】
カンジダ・アルビカンスにより引き起こされる感染症のｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断の新規方法は、医療技術分野及びその中の企業の位置付けを潜在的に向上させ、その分野に新たな好機をもたらす堅実な提案となる。この新たな検出ツールを使用することによって、現在この感染症の検出に費やされている費用及び資本を大幅に削減できる。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】材料Ｓ１の略図を示す図である。この場合に、多孔質材料は、指標化学種（色素／蛍光体）で負荷されており、中性有機基で機能化されている。
【図２】材料Ｓ２の略図を示す図である。この場合に、多孔質材料は、指標化学種（色素／蛍光体）で負荷されており、中性有機基で機能化されており、ここで、オリゴヌクレオチドＯ１（配列番号１）が尿素官能基によって共有結合により固定されている。
【図３】材料Ｓ３の略図を示す図である。この場合に、多孔質材料は、色素／蛍光体で負荷されており、オリゴヌクレオチドＯ１（配列番号１）で機能化されており、そこにオリゴヌクレオチドＯ２（配列番号２）がハイブリダイズされている。
【図４】材料Ｓ４の略図を示す図である。この場合に、多孔質材料は、色素／蛍光体で負荷されており、外表面はカチオン性有機基で機能化されている。
【図５】材料Ｓ５の略図を示す図である。この場合に、多孔質材料は、色素／蛍光体で負荷されており、オリゴヌクレオチドＯ３（配列番号３）で機能化されている。
【図６】Ｉ）ａ）非焼成ＭＳＮ、ｂ）焼成ＭＳＮ、ｃ）Ｓ１（Ｓ４と同等）、ｄ）材料Ｓ２及びｅ）材料Ｓ３（Ｓ５と同等）についてのＸ線粉末回折図、ＩＩ）Ａ）焼成ＭＳＮ及びＢ）ナノ粒子に典型的な球状形態を示す材料Ｓ３、Ｓ５についての透過型電子顕微鏡画像を示す図である。
【図７】ａ）機能化されていない多孔質アルミナ、及びＢ）オリゴヌクレオチドで機能化された多孔質アルミナ（共有結合（Ｓ８）又は静電相互作用（Ｓ１０）により担体に固定され得る）の電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）画像を示す図である。両方の画像に、無機マトリックスの不規則な細孔系が観察され得る。
【図８】図８（Ａ及びＢ）は、カンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡが存在する場合の材料Ｓ３及び材料Ｓ５の機能図を示す図である。
【図９】カンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡが存在しない場合（Ｉ）及び存在する場合（ＩＩ）の、材料Ｓ３（ａ）及び材料Ｓ５（ｂ）の細孔内部からの色素／蛍光体の放出曲線（５５５ｎｍでの励起による５７５ｎｍでのローダミンＢの典型的な蛍光発光により測定される）を示す図である。
【図１０】カンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡが存在しない場合（Ｉ）及び存在する場合（ＩＩ）の、材料Ｓ８（ａ）及び材料Ｓ１０（ｂ）の細孔内部からの色素／蛍光体の放出曲線（５５５ｎｍでの励起による５７５ｎｍでのローダミンＢの典型的な蛍光発光により測定される）を示す図である。
【図１１】感染患者からの実際の試料（Ａ  脳脊髄液、Ｂ  腹膜液）中のカンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡが存在する場合の材料Ｓ８から放出されたローダミンＢの蛍光（５７５ｎｍで測定）を示す図である。
【図１２】材料Ｓ８の選択性を示す図である。種々の病原体及びカンジダの他の菌株が存在する場合のＳ８から放出されたローダミンＢの蛍光強度が示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明を以下の実施例により更に説明する。実施例は、例示の目的で提供されるものであって、決して本発明の範囲を限定するものではない。
【００２８】
材料及び器具類
マグネティックスターラーと通常のガラス材料及びプラスチック材料とを使用して、多孔質材料を調製した。材料が懸濁液である場合に、Ｈｅｔｔｉｃｈ  Ｒｏｔｉｎａ  ３５遠心分離機を使用して、材料を分離した。材料の調製に使用される全ての試薬は、一切追加の精製を行わずに商社から受け取ったままで使用した。
【００２９】
得られた材料は、Ｘ線粉末回折、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、電界放出型走査電子顕微鏡法（ＦＥＳＥＭ）、Ｎ2吸着−脱着等温線、動的光散乱（ＤＬＳ）による粒子サイズ、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、熱重量分析及び蛍光分光法によって特性決定した。Ｘ線粉末回折の測定において、ＣｕＫα放射を使用してＡｄｖａｎｃｅ  Ｄ８回折計を使用した（Philips社、オランダ、アムステルダム）。ＴＥＭ画像は、ＣＭ１０  １００ｋＶ顕微鏡（Philips社）を使用して取得した。ＦＥＳＥＭ画像は、ＵＬＴＲＡ  ５５顕微鏡（Zeiss社）を使用して取得した。窒素吸着−脱着等温線の測定において、自動式ＡＳＡＰ  ２０１０吸着分析装置（Micrometrics社、米国、ジョージア州、ノークロス）を使用した。
【００３０】
試料は、１２０℃、真空中で一晩脱ガスさせた。比表面積は、ブルナウアー−エメット−テラー（ＢＥＴ）モデルを使用して、低圧範囲で得られた吸着データに基づいて計算した（非特許文献３２）。細孔サイズは、バレット−ジョイナー−ハレンダ（ＢＪＨ）法に従って測定した（非特許文献３３）。種々の固体の粒子サイズの分布は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏユニット（Malvern Instruments社、英国、マルバーン）を使用して取得した。これらの測定のために、試料を脱イオン水中に分散させた。データ分析は、それぞれ分散剤とナノ粒子とについて１．３３及び１．４５の屈折率を使用してミー理論を基礎とした。試料全てについて０．００１の吸着値を使用した。全ての測定は３連で行った。
【００３１】
赤外線スペクトルは、Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＡＴＲを備えたＢｒｕｋｅｒ  ＴＥＮＳＯＲ  ＩＩ分光光度計を使用して取得した。熱重量分析は、ＴＧＡ／ＳＤＴＡ  ８５１ｅ天秤（Mettler Toledo社、米国、オハイオ州、コロンバス）を使用して、酸化雰囲気（空気、８０ｍｌ／分）を用いて１０℃／分での３９３Ｋ〜１２７３Ｋの勾配に続いて１２７３Ｋで３０分間の等温からなる温度プログラムで実施した。蛍光測定は、Ｆｅｌｉｘ  ３２  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  １．２の蛍光計（ビルド５６、Photon Technology International社、米国、ニュージャージー州、バーミンガム）で行った。
【実施例】
【００３２】
実施例１：メソ多孔質ケイ素ナノ粒子（ＭＳＮ）の合成
メソ多孔質ケイ素ナノ粒子（ＭＳＮ）を、界面活性剤（ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ＣＴＡＢｒ）及びケイ素源（テトラエトキシシラン、ＴＥＯＳ）を使用して合成した。このために、ＣＴＡＢｒ（１．００ｇ、２．７４ｍｍｏｌ）をまず４８０ｍｌの脱イオン水中に溶解させた。次いで、上記溶液にＮａＯＨ（２．００Ｍ、３．５０ｍｌ）を添加し、温度を８０℃に調整した。次いで、上記溶液にＴＥＯＳを一滴ずつ添加した（５．００ｍｌ、２５．７ｍｍｏｌ）。その混合物を撹拌下で２時間保持することで、白色の沈殿物が得られた。得られた粉末を遠心分離し、脱イオン水で洗浄した。最後に、固体を６０℃で乾燥させた。最終的な多孔質担体を調製するために、その材料を５５０℃で酸化雰囲気を利用して５時間焼成することで、界面活性剤を除去した。
【００３３】
実施例２：材料Ｓ１の合成
２００μｇの焼成ＭＳＮ（５０ｎｍ〜１５０ｎｍの直径、１２００ｍ2／ｇの総表面積）を、１０ｍｌのアセトニトリル中に７６６．４ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）のローダミンＢを含有する溶液中に懸濁させて、その混合物を撹拌下、室温で２４時間放置した。次いで、２４７μｌ（１ｍｍｏｌ）の（３−プロピルイソシアネート）トリエトキシシランを添加し、室温で５．５時間にわたり反応させた。次いで、その混合物を真空濾過し、アセトニトリルで洗浄し、ヒーター中、６５℃で乾燥させた。得られた固体を熱重量分析、ＴＥＭ及びＸ線粉末回折技術を使用して特性決定することで、材料Ｓ１として特定された。図１は、色素／蛍光体（ローダミンＢ）（２）で負荷され、中性有機基で機能化された得られたメソ多孔質無機マトリックス（１）を示している。
【００３４】
実施例３：材料Ｓ２の合成
１ｍｇの材料Ｓ１を、ローダミンＢ（１ｍＭ）を含む７００μｌのアセトニトリル溶液中に、１ｎｍｏｌ／ｍｇ（固体）の濃度でオリゴヌクレオチドＯ１（配列番号１）（ＮＨ2−（ＣＨ2）6−５’−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＣＣ−３’）を添加して懸濁させた。この混合物に２μｌのトリエチルアミンを添加し、室温、撹拌下で３時間放置した。次いで、その懸濁液を１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、液体を分離し、固体を１ｍｌのｐＨ７．５のバッファー水溶液（ＭｇＣｌ2  ３７．５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ）で洗浄した。この懸濁液を再び遠心分離により分離することで、材料Ｓ２が得られた。図２は、熱重量分析、ＴＥＭ及びＸ線粉末回折技術の使用により特性決定された得られた固体を示す。上記図２に示されるように、多孔質材料（１）は、色素／蛍光体（ローダミンＢ）（２）で負荷されており、オリゴヌクレオチドＯ１（配列番号１）（３）で機能化されており、そのオリゴヌクレオチドＯ１は尿素官能基によって共有結合により固定されている。材料Ｓ２におけるオリゴヌクレオチドＯ１の濃度は、１ｎｍｏｌ／ｍｇ（固体）である。
【００３５】
実施例４：材料Ｓ３の合成
１００μｇの材料Ｓ２を、オリゴヌクレオチドＯ２（配列番号２）（５’−ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＴＴ−３’）を２．５０×１０-6ｎｍｏｌ／ｍｇ（固体）の濃度で含む２９７．５μｌのｐＨ７．５のバッファー水溶液（ＭｇＣｌ2  ３７．５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ）中で懸濁し、室温、撹拌下で２時間放置した。次いで、その懸濁液を１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、液体を分離し、固体を５００μｇのｐＨ７．５のバッファー水溶液（ＭｇＣｌ2  ３７．５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ）で洗浄した。この懸濁液を再び遠心分離により分離することで、材料Ｓ３が得られた。図３は、熱重量分析、ＴＥＭ及びＸ線粉末回折技術の使用により特性決定された材料Ｓ３の略図を示す。先述のように、この材料Ｓ３は、色素／蛍光体（ローダミンＢ）（２）で負荷されており、オリゴヌクレオチドＯ１（配列番号１）（３）で機能化されている材料Ｓ２を使用して、そこにオリゴヌクレオチドＯ２（配列番号２：５’−ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＴＴ−３’）（４）がハイブリダイズすることで調製された。そのハイブリダイゼーションの結果として、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドＯ１−Ｏ２の３次元構造及びコンフォメーションを考慮すると、多孔質材料からできた担体の細孔は遮断されることとなる。固体Ｓ３におけるオリゴヌクレオチドＯ２の濃度は、２．５×１０-6ｎｍｏｌ／ｍｇ（固体）である。
【００３６】
実施例５：材料Ｓ４の合成
実施例１で得られた２００μｇの焼成ＭＳＮ（５０ｎｍ〜１５０ｎｍの直径、１２００ｍ2／ｇの総面積）を、１０ｍｌのアセトニトリル中に７６６．４ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）のローダミンＢを含有する溶液中に懸濁させて、その混合物を撹拌下、室温で２４時間放置した。次いで、２９３μｌ（１．２５ｍｍｏｌ）の（３−アミノプロピル）トリエトキシシランを添加し、室温で５．５時間にわたり反応させた。次いで、その混合物を真空濾過し、アセトニトリルで洗浄し、ヒーター中、６５℃で乾燥させた。得られた固体を熱重量分析技術及び元素分析技術の使用により特性決定することで、Ｓ４として特定された。図４は材料Ｓ４を示し、そこでは上記多孔質材料がＭＣＭ−４１のファミリーの多孔質無機ケイ素マトリックス（１）により形成されており、色素／蛍光体（ローダミンＢ）（２）で負荷されており、カチオン性有機基（７）、例えば（３−アミノプロピル）トリエトキシシランで機能化された外表面を有することを観察できる。
【００３７】
実施例６：材料Ｓ５の合成
５００μｇの材料Ｓ４を、オリゴヌクレオチドＯ３（配列番号３：５’−ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＴＴＧ  ＡＴＧ−３’）を２．００×１０-6ｎｍｏｌ／ｍｇ（固体）の濃度で含む５００μｌのｐＨ７．５のバッファー水溶液（ＭｇＣｌ2  ３７．５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ）中で懸濁し、３７℃、撹拌下で３０分間放置した。次いで、その懸濁液を１２０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、液体を分離し、固体を１ｍｌのバッファー水溶液で洗浄した。この懸濁液を再び遠心分離により分離することで、材料Ｓ５が得られ、その材料を、熱重量分析、ＴＥＭ及びＸ線粉末回折技術の使用により特性決定した。図５は、色素／蛍光体、例えばローダミンＢ（２）で負荷され、細孔がオリゴヌクレオチドＯ３（配列番号３：５’−ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＴＴＧ  ＡＴＧ−３’）（５）の添加により遮断された材料Ｓ４（１）を示し、こうして上記材料Ｓ５が生ずる。固体Ｓ５におけるオリゴヌクレオチドＯ３の濃度は、２．００×１０-6ｎｍｏｌ／ｍｇ（固体）である。
【００３８】
実施例７：ナノ多孔質陽極酸化アルミナからできた担体の合成
メソ多孔質アルミナプレートを、高純度アルミニウムプレート（９９．９９％）を使用して電気化学的陽極酸化によって合成した。陽極酸化の前に、アルミニウムプレートをエタノールと過塩素酸との混合物（４：１、容量／容量）中、２０Ｖで４分間にわたり電解研磨して、金属表面の粗さを取り除いた。次いで、それらを豊富な水及びエタノールで洗浄し、最後に風乾することで、ほんの僅かな酸も残らないように除去した。電解研磨されたプレートを、対応する電解液により２段階の陽極酸化過程を用いて陽極酸化した（非特許文献９、非特許文献１０）。１回目の陽極酸化は、シュウ酸により４０Ｖで、そして硫酸により１０Ｖで２０時間にわたり行った。電解液の温度は両方の場合に２℃であった。得られた材料は、不規則な細孔を有し、その幾つかが相互接続しているナノ構造化された多孔質アルミナプレートである。この最初のアルミナプレートを、リン酸（０．４Ｍ）とクロム酸（０．２Ｍ）との混合物により７０℃で３時間溶解させることで、表面に跡が付いたアルミニウムプレートが得られた。２回目の陽極酸化を１回目と同じ電圧及び温度条件下で実施することで、細孔が相互接続されていないナノ構造化された多孔質アルミナ層が得られた。細孔分布は、それぞれ図７ａ及び図７ｂに示されるように、使用された電解質がシュウ酸であるか又は硫酸であるかに応じて規則的又は不規則的である。
【００３９】
実施例８：材料Ｓ６の合成
約２ｃｍの直径及び８μｍの細孔深さを有する多孔質アルミナプレートを、１０ｍｌのアセトニトリル中に７６６．４ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）のローダミンＢを含有する溶液中に浸して、その混合物を撹拌下、室温で２４時間放置した。次いで、２４７μｌ（１ｍｍｏｌ）の（３−プロピルイソシアネート）トリエトキシシランを添加し、室温で５．５時間にわたり反応させた。次いで、そのプレートを取り出し、乾燥させた。乾燥したら、プレートを約２ｍｍの直径の８つの部片に分けた。こうして材料Ｓ６が得られ、その材料を、熱重量分析技術を使用して特性決定した。材料Ｓ６は、材料Ｓ１と同様であるが、先述のようにメソ多孔質ケイ素の代わりに多孔質アルミナを使用して得られた。
【００４０】
実施例９：材料Ｓ７の合成
材料Ｓ６を、ローダミンＢ（１ｍＭ）を含む７００μｌのアセトニトリル溶液中に、１ｎｍｏｌ／プレートの濃度でオリゴヌクレオチドＯ１（ＮＨ2−（ＣＨ2）6−５’−ＡＡＡ  ＡＡＡ  ＣＣＣ  ＣＣＣ−３’）を添加して浸した。この混合物に２μｌのトリエチルアミンを添加し、室温、撹拌下で３時間放置した。次いで、その材料を取り出して、室温で乾燥させ、こうして材料Ｓ７が得られ、その材料を、熱重量分析技術を使用して特性決定した。材料Ｓ７は、材料Ｓ２と同様であるが、先述のようにメソ多孔質ケイ素の代わりに多孔質アルミナを使用して得られた。
【００４１】
実施例１０：材料Ｓ８の合成
材料Ｓ７を、オリゴヌクレオチドＯ２（５’−ＴＴＴ  ＴＧＧ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＧＡＧ  ＡＡＧ  ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＴＣＣ  ＡＴＴ  ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＧＴＴ  ＴＴ−３’）を２．５０×１０-6ｎｍｏｌ／ｍｇ（固体）の濃度で含む２９７．５μｌのｐＨ７．５のバッファー水溶液（ＭｇＣｌ2  ３７．５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ）中に浸し、室温、撹拌下で２時間放置した。次いで、それを数滴のｐＨ７．５のバッファー水溶液（ＭｇＣｌ2  ３７．５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ）で洗浄し、室温で乾燥させ、こうして材料Ｓ８が得られ、その材料を、熱重量分析技術及びＦＥＳＥＭ技術を使用して特性決定した。材料Ｓ８は、材料Ｓ３と同様であるが、先述のようにメソ多孔質ケイ素の代わりに多孔質アルミナを使用して得られた。
【００４２】
実施例１１：材料Ｓ９の合成
約２ｃｍの直径及び８μｍの細孔深さを有する多孔質アルミナプレートを、１０ｍｌのアセトニトリル中に７６６．４ｍｇ（０．１６ｍｍｏｌ）のローダミンＢを含有する溶液中に浸して、その混合物を撹拌下、室温で２４時間放置した。次いで、２９３μｌ（１．２５ｍｍｏｌ）の（３−アミノプロピル）トリエトキシシランを添加し、室温で５．５時間にわたり反応させた。次いで、そのプレートを取り出し、乾燥させた。乾燥したら、プレートを約２ｍｍの直径の８つの部片に分けた。こうして材料Ｓ９が得られ、その材料を、熱重量分析技術を使用して特性決定した。
【００４３】
実施例１２：材料Ｓ１０の合成
材料Ｓ９を、オリゴヌクレオチドＯ３（５’−ＴＴＧ  ＡＧＡ  ＡＧＧ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＴＴＧ  ＡＴＧ−３’）を２．００×１０-6ｎｍｏｌ／プレートの濃度で含む２９７．５μｌのｐＨ７．５のバッファー水溶液（ＭｇＣｌ2  ３７．５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ）中に浸し、３７℃、撹拌下で３０分間放置した。次いで、それを数滴のｐＨ７．５のバッファー水溶液（ＭｇＣｌ2  ３７．５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ）で洗浄し、室温で乾燥させ、こうして固体Ｓ１０が得られ、その材料を、熱重量分析技術及びＦＥＳＥＭ技術を使用して特性決定した。
【００４４】
実施例１３：得られた材料の特性決定
合成された材料を、標準的な方法を使用して特性決定した。図６は、得られた種々の材料に対して行われた特性決定を示す。具体的には、ａ）非焼成ＭＳＮ、ｂ）焼成ＭＳＮ、ｃ）材料Ｓ１（Ｓ４と同等）、ｄ）材料Ｓ２及びｅ）材料Ｓ３（Ｓ５と同等）についてのＸ線粉末回折図が示され、ＩＩ）は、Ａ）焼成ＭＳＮ及びＢ）ナノ粒子に典型的な球状形態を示す材料Ｓ３、Ｓ５についての透過型電子顕微鏡画像を示している。非焼成ＭＳＮの担体は、面（１００）、（１１０）、（２００）及び（２１０）の方向に相当するＭＣＭ−４１型の材料の４つの典型的な反射を示している。ピーク（１００）の変位は、焼成ＭＳＮの回折図に観察することができ、それは約７Åの単位胞収縮に相当する。最後に、以下の回折図（材料Ｓ１、材料Ｓ２、材料Ｓ３、材料Ｓ４及び材料Ｓ５）において、ピーク強度値（１００）は、細孔を指標化学種（これらの場合には色素／蛍光体）で満たす過程及びメソ多孔質固体の表面の機能化が、ＭＳＮ材料の３次元構造を破壊しないことを証明している。調製された材料の球状形態は、透過型電子顕微鏡法によって視覚化できる（図６も参照のこと）。種々の材料中に存在する対応する有機物含量（３−プロピルイソシアネート、３−アミノプロピル、ローダミンＢ及びオリゴヌクレオチド）は、熱重量分析により測定した。ｍｍｏｌ／ｍｇ（ＳｉＯ2）で得られた値を表１及び表２に示す。
【００４５】
【表１】
2020537535.tif 000003
【００４６】
【表２】
2020537535.tif 000004
【００４７】
合成された固体Ｓ６〜Ｓ１０を、この種類の系に慣例の技術を使用して特性決定した。図７は、ナノ多孔質陽極酸化アルミナからできた最初の担体及び固体Ｓ８についてのＦＥＳＥＭ（電界放出型走査電子顕微鏡法）画像を示している。種々の材料中に存在する対応する有機物含量（３−プロピルイソシアネート、３−アミノプロピル、ローダミンＢ及びオリゴヌクレオチド）は、熱重量分析により測定した。ｍｍｏｌ／ｍｇ（ＡｌＯ2）で得られた値を表３及び表４に示す。
【００４８】
【表３】
2020537535.tif 000005
【００４９】
【表４】
2020537535.tif 000006
【００５０】
実施例１４：カンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡが存在する場合の材料Ｓ３及び材料Ｓ５の挙動
図８ａ）は、材料Ｓ３（１）の機能図を示す。１００μｇの材料Ｓ３を、４００μｌのｐＨ７．５のバッファー溶液（ＭｇＣｌ2  ３７．５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ）中に懸濁した。この懸濁液から２００μｌをピペットで取り、８００μｌの緩衝水溶液を添加した。時間の経過に伴って指標化学種（色素／蛍光体）（２）の放出は観察されなかった。しかしながら、カンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡ（６）（２．５×１０-5ｎｍｏｌ／ｍｇ（固体）の濃度）の存在下でその過程を繰り返すと、図９ａに示されるように指標化学種（色素／蛍光体）（２）の放出が観察された。
【００５１】
ｐＨ７．５のバッファー溶液（ＭｇＣｌ2  ３７．５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ）中にカンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡが存在する場合に（それぞれＳ３（８ａ）及びＳ５（８ｂ）について２×１０-5ｎｍｏｌ／ｍｇ（固体）及び４×１０-6ｎｍｏｌ／ｍｇ（固体））、「分子ゲート」の開放が起こり、その際に色素／蛍光体（２）の放出が、結果として起こる。材料Ｓ８及び材料Ｓ１０は同様の挙動を取る。
【００５２】
同様に、図８ｂ）は、材料Ｓ５の機能図を示す。この実験では、５００μｇの材料Ｓ５（１）を、４００μｌのｐＨ７．５のバッファー溶液（ＭｇＣｌ2  ３７．５ｍＭ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ２０ｍＭ）中に懸濁した。この懸濁液の２００μｌをピペットで取り、８００μｌのバッファー溶液を添加したが、３７℃で時間の経過に伴って指標化学種（色素／蛍光体）（２）の放出は観察されなかった（図８Ｂを参照）。しかしながら、カンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡ（６）（４×１０-6ｎｍｏｌ／ｍｇ（固体）の濃度）の存在下でその過程を繰り返すと、図９ｂに示されるように指標化学種（色素／蛍光体）（２）の放出が観察された。
【００５３】
先述のように、色素／蛍光体（ローダミンＢ）の大量の放出は、種々の材料上にあるオリゴヌクレオチド（Ｏ２及びＯ３）が、研究される試料中に存在するカンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡとハイブリダイズする際の「分子ゲート」の開放により引き起こされる。
【００５４】
実施例１５：カンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡが存在する場合の材料Ｓ８及び材料Ｓ１０の挙動
材料Ｓ８を１ｍｌのバッファー溶液中に浸したが、室温で時間の経過に伴って指標化学種の放出は観察されなかった。しかしながら、カンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡ（２．５×１０-5ｎｍｏｌ／ｍｇ（固体）の濃度）の存在下でその過程を繰り返すと、図１０ａに示されるように指標化学種の放出が観察された。
【００５５】
同様に、材料Ｓ１０を１ｍｌのバッファー溶液中に浸したが、カンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡ（４×１０-6ｎｍｏｌ／固体の濃度）の存在下で観察されたものとは対照的に、３７℃で時間の経過に伴う指標化学種の放出は一切観察されなかった。この場合に、図１０ｂに示されるように指標化学種（色素／蛍光体）の顕著な放出が観察された。
【００５６】
観察されたように、両方の材料は、カンジダ・アルビカンスのゲノムＤＮＡが存在しない場合に色素／蛍光体（ローダミンＢ）を放出できない。それに対して、ゲノムＤＮＡが存在する場合に、種々の材料上にあるオリゴヌクレオチド（Ｏ２及びＯ３）が、カンジダ・アルビカンスにより提供されるゲノムＤＮＡとハイブリダイズする際に「分子ゲート」が開放するため、ローダミンＢの大量の放出が観察される。
【００５７】
実施例１６：感染患者からのカンジダ・アルビカンスにより感染した試料が存在する場合の材料Ｓ８の挙動
図１１で観察されたように、感染患者の異なる競合媒体（competitive media）（脳脊髄液（Ａ）及び腹膜液（Ｂ））における実際の試料中にカンジダ・アルビカンスが存在する場合に、材料Ｓ８は色素／蛍光体（ローダミンＢ）を放出することができ、こうして顕著な蛍光強度が生ずる。それに対して、カンジダ・アルビカンスが存在しない場合にはローダミンＢの放出は観察されない。
【００５８】
実施例１７：カンジダの他の菌株及び他の感染性病原体のＤＮＡが存在する場合の材料Ｓ８の挙動
図１２は、種々の病原体及びカンジダの他の菌株が存在する場合の材料Ｓ８から放出されたローダミンＢを示す。観察されたように、ローダミンＢは、カンジダ・アルビカンスが存在する場合にのみ放出される。この実験は、材料Ｓ８で高い選択性が達成されたことを裏付けている。
【図１】
2020537535.tif 000007
【図２】
2020537535.tif 000008
【図３】
2020537535.tif 000009
【図４】
2020537535.tif 000010
【図５】
2020537535.tif 000011
【図６】
2020537535.tif 000012
【図７】
2020537535.tif 000013
【図８ａ】
2020537535.tif 000014
【図８ｂ】
2020537535.tif 000015
【図９】
2020537535.tif 000016
【図１０】
2020537535.tif 000017
【図１１】
2020537535.tif 000018
【図１２】
2020537535.tif 000019
【配列表】
2020537535000001.app
【国際調査報告】
2020537535.tif 000020
2020537535.tif 000021
2020537535.tif 000022
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