(57)【要約】本開示は、MAdCAM、好ましくはヒトMAdCAMに、特異的に結合し、かつ、MAdCAMを阻害するように機能する、ヒト抗体を含めた抗体およびその抗原結合部分に関する。本開示はまた、ヒト抗MAdCAM抗体およびその抗原結合部分に関する。本開示はまた、キメラ抗体、二重特異性抗体、誘導体化抗体、一本鎖抗体または融合タンパク質の部分に関する。本開示はまた、ヒト抗MAdCAM抗体に由来する単離された重鎖および軽鎖免疫グロブリン、ならびにそのような免疫グロブリンをコードする核酸分子に関する。本開示はまた、ヒト抗MAdCAM抗体を製造する方法、これらの抗体を含む組成物、ならびに診断および処置のための抗体および組成物を使用する方法に関する。本開示はまた、ヒト抗MAdCAM抗体を含む重鎖および／または軽鎖免疫グロブリン分子をコードする核酸分子を使用した遺伝子治療法を提供する。本開示はまた、本開示の核酸分子を含むトランスジェニック動物または植物に関する。2020533953.tif 000096
2020533953.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
粘膜アドレシン細胞接着分子（MAdCAM）に特異的に結合する、ヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
以下の性質のうちの少なくとも1つを保有する、請求項1記載のヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分：
（a）ヒト細胞に結合する；
（b）VCAMまたはフィブロネクチンと比べて少なくとも100倍の、MAdCAMに対する選択性を有する；
（c）ヒトMAdCAMに3×10-10 M以下のKdで結合する；または
（d）ヒトMAdCAMへのα4β7発現細胞の結合を阻害する；
（e）胃腸リンパ組織へのリンパ球の動員を阻害する。
【請求項３】
ヒトMAdCAMに3×10-10 M以下のKdで結合し、かつ、ヒトMAdCAMへのα4β7結合を阻害する、請求項2記載のヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
【請求項４】
重鎖が、SEQ ID NO：148と少なくとも80％、85％または90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項５】
重鎖が、SEQ ID NO：148と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項4記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項６】
重鎖が、SEQ ID NO：148と比較して1〜25のアミノ酸置換を含む、請求項4記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項７】
重鎖が、SEQ ID NO：148と比較して1〜10のアミノ酸置換を含む、請求項6記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項８】
軽鎖が、SEQ ID NO：150と少なくとも80％、85％または90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項９】
軽鎖が、SEQ ID NO：150と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項8記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１０】
軽鎖が、SEQ ID NO：150と比較して1〜25のアミノ酸置換を含む、請求項8記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１１】
軽鎖が、SEQ ID NO：150と比較して1〜10のアミノ酸置換を含む、請求項10記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１２】
重鎖が、SEQ ID NO：148と少なくとも80％、85％または90％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖が、SEQ ID NO：150と少なくとも80％、85％または90％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１３】
重鎖が、SEQ ID NO：148と同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖が、SEQ ID NO：150と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項12記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項１４】
請求項4〜13のいずれか一項記載のアミノ酸配列をコードする、核酸配列。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか一項記載のヒトモノクローナル抗体を産生する、細胞。
【請求項１６】
請求項14記載の核酸配列を含む、細胞。
【請求項１７】
請求項1記載のヒトモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株であって、1.7.2（ECACCアクセッション番号03090901）、1.8.2（ECACCアクセッション番号03090902）、6.14.2（ECACCアクセッション番号03090903）、6.22.2（ECACCアクセッション番号03090904）、6.34.2（ECACCアクセッション番号03090905）、6.67.1（ECACCアクセッション番号03090906）、6.73.2（ECACCアクセッション番号03090907）、6.77.1（ECACCアクセッション番号03090908）、7.16.6（ECACCアクセッション番号03090909）、7.20.5（ECACCアクセッション番号03090910）、7.26.4（ECACCアクセッション番号03090911）、および9.8.2（ECACCアクセッション番号03090912）からなる群より選択される、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項１８】
請求項17記載のハイブリドーマ細胞株によって産生されるヒトモノクローナル抗体、または該モノクローナル抗体の抗原結合部分。
【請求項１９】
重鎖C末端リシンが切断されている、請求項18記載のヒトモノクローナル抗体。
【請求項２０】
α4β7へのヒトMAdCAMの結合を阻害し、かつ、以下の性質：
（a）MAdCAMへの結合に対して参照抗体と交差競合する；
（b）MAdCAMへの結合に対して参照抗体と競合する；
（c）参照抗体と同じMAdCAMのエピトープに結合する；
（d）参照抗体と実質的に同じKdでMAdCAMに結合する；
（e）参照抗体と実質的に同じ解離速度でMAdCAMに結合する
のうちの少なくとも1つを有し、
ここで、参照抗体が、モノクローナル抗体1.7.2、モノクローナル抗体1.8.2、モノクローナル抗体6.14.2、モノクローナル抗体6.22.2、モノクローナル抗体6.34.2、モノクローナル抗体6.67.1、モノクローナル抗体6.73.2、モノクローナル抗体6.77.1、モノクローナル抗体7.16.6、モノクローナル抗体7.20.5、モノクローナル抗体7.26.4、モノクローナル抗体9.8.2、X481.2モノクローナル抗体、モノクローナル抗体6.22.2-mod、モノクローナル抗体6.34.2-mod、モノクローナル抗体6.67.1-mod、モノクローナル抗体6.77.1-modおよびモノクローナル抗体7.26.4-modからなる群より選択される、
請求項1または18のいずれか記載のヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２１】
MAdCAMに特異的に結合するモノクローナル抗体であって、以下からなる群より選択される、抗体：
（a）シグナル配列のない、SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：4に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（b）シグナル配列のない、SEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：8に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（c）シグナル配列のない、SEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：12に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（d）シグナル配列のない、SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：16に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（e）シグナル配列のない、SEQ ID NO：18およびSEQ ID NO：20に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（f）シグナル配列のない、SEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：24に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（g）シグナル配列のない、SEQ ID NO：26およびSEQ ID NO：28に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（h）シグナル配列のない、SEQ ID NO：30およびSEQ ID NO：32に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（i）シグナル配列のない、SEQ ID NO：34およびSEQ ID NO：36に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（j）シグナル配列のない、SEQ ID NO：38およびSEQ ID NO：40に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（k）シグナル配列のない、SEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：44に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（l）シグナル配列のない、SEQ ID NO：46およびSEQ ID NO：48に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（m）シグナル配列のない、SEQ ID NO：52およびSEQ ID NO：54に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（n）シグナル配列のない、SEQ ID NO：56およびSEQ ID NO：58に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（o）シグナル配列のない、SEQ ID NO：60およびSEQ ID NO：62に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（p）シグナル配列のない、SEQ ID NO：64およびSEQ ID NO：66に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；
（q）シグナル配列のない、SEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：68に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；および
（r）シグナル配列のない、SEQ ID NO：148およびSEQ ID NO：150に示されるアミノ酸配列を含む、抗体。
【請求項２２】
重鎖が、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modからなる群より選択されるモノクローナル抗体の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3を含むか、または、軽鎖が、該モノクローナル抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3を含む、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２３】
ヒトVH 1-18遺伝子、ヒトVH 3-15遺伝子、ヒトVH 3-21遺伝子、ヒトVH 3-23遺伝子、ヒトVH 3-30遺伝子、ヒトVH 3-33遺伝子またはヒトVH 4-4遺伝子を利用する重鎖を含む、請求項22記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分。
【請求項２４】
ヒトVK A2遺伝子、ヒトVK A3遺伝子、ヒトVK A26遺伝子、ヒトVK B3遺伝子、ヒトVK O12遺伝子またはヒトVK O18遺伝子を利用する軽鎖を含む、請求項23記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２５】
重鎖可変領域、軽鎖可変領域または両方が、モノクローナル抗体1.7.2、モノクローナル抗体1.8.2、モノクローナル抗体6.14.2、モノクローナル抗体6.22.2、モノクローナル抗体6.34.2、モノクローナル抗体6.67.1、モノクローナル抗体6.73.2、モノクローナル抗体6.77.1、モノクローナル抗体7.16.6、モノクローナル抗体7.20.5、モノクローナル抗体7.26.4、モノクローナル抗体9.8.2、モノクローナル抗体X481.2、モノクローナル抗体6.22.2-mod、モノクローナル抗体6.34.2-mod、モノクローナル抗体6.67.1-mod、モノクローナル抗体6.77.1-modおよびモノクローナル抗体7.26.4-modからなる群より選択されるモノクローナル抗体の対応する領域（1つまたは複数）とアミノ酸配列が少なくとも90％同一である、請求項1記載のヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
【請求項２６】
MAdCAMに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、
（a）重鎖が、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modからなる群より選択される参照抗体の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を含み；
（b）軽鎖が、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modからなる群より選択される参照抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を含み；
（c）該抗体が、（a）の重鎖および（b）の軽鎖を含み；かつ
（d）該抗体が、重鎖および軽鎖CDRアミノ酸配列が同じ参照抗体から選択される（c）の抗体である、
モノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２７】
重鎖、軽鎖または両方が、それぞれ、参照抗体の重鎖、軽鎖または両方のCDR1の始まりからCDR3の終わりまでのアミノ酸配列を含む、請求項26記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分。
【請求項２８】
（a）1.7.2（SEQ ID NO：2）；1.8.2（SEQ ID NO：6）；6.14.2（SEQ ID NO：10）；6.22.2（SEQ ID NO：14）；6.34.2（SEQ ID NO：18）；6.67.1（SEQ ID NO：22）；6.73.2（SEQ ID NO：26）；6.77.1（SEQ ID NO：30）；7.16.6（SEQ ID NO：34）；7.20.5（SEQ ID NO：38）；7.26.4（SEQ ID NO：42）；および9.8.2（SEQ ID NO：46）；X481.2（SEQ ID NO：148）、6.22.2-mod（SEQ ID NO：52）；6.34.2-mod（SEQ ID NO：56）；6.67.1-mod（SEQ ID NO：60）；6.77.1-mod（SEQ ID NO：64）；および7.26.4-mod（SEQ ID NO：42）からなる群より選択される抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む、重鎖；
（b）1.7.2（SEQ ID NO：4）；1.8.2（SEQ ID NO：8）；6.14.2（SEQ ID NO：12）；6.22.2（SEQ ID NO：16）；6.34.2（SEQ ID NO：20）；6.67.1（SEQ ID NO：24）；6.73.2（SEQ ID NO：28）；6.77.1（SEQ ID NO：32）；7.16.6（SEQ ID NO：36）；7.20.5（SEQ ID NO：40）；7.26.4（SEQ ID NO：44）；および9.8.2（SEQ ID NO：48）；X481.2（SEQ ID NO：150）、6.22.2-mod（SEQ ID NO：54）；6.34.2-mod（SEQ ID NO：58）；6.67.1-mod（SEQ ID NO：62）；6.77.1-mod（SEQ ID NO：66）；および7.26.4-mod（SEQ ID NO：68）からなる群より選択される抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む、軽鎖；または
（c）（a）の重鎖および（b）の軽鎖
を含む、請求項26記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分。
【請求項２９】
免疫グロブリンG（IgG）、IgM、IgE、およびIgAもしくはIgD分子、ヒト化抗体、キメラ抗体または二重特異性抗体である、請求項1〜13および18〜28のいずれか一項記載のモノクローナル抗体。
【請求項３０】
Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片または一本鎖抗体である、請求項1〜13、18〜20および22〜29のいずれか一項記載の抗原結合部分。
【請求項３１】
請求項1〜13および18〜30のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分の有効量と薬学的に許容される担体とを含む、薬学的組成物。
【請求項３２】
その必要のある対象における炎症性疾患を処置する方法であって、α4β7へのMAdCAMの結合を阻害する請求項1〜13および18〜30のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を前記対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３３】
炎症性疾患が、胃腸管の炎症性疾患である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
胃腸管の炎症性疾患が、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、憩室疾患、胃炎、肝疾患、原発性胆汁性硬化症および硬化性胆管炎からなる群より選択される、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
炎症性腸疾患が、クローン病、潰瘍性大腸炎または両方である、請求項33記載の方法。
【請求項３６】
炎症性疾患が、インスリン依存性糖尿病および移植片対宿主病である、請求項33記載の方法。
【請求項３７】
請求項1〜13および18〜30のいずれか一項記載のモノクローナル抗体もしくは抗原結合部分、または前記抗体もしくは前記部分の重鎖もしくは軽鎖を産生する、単離された細胞株。
【請求項３８】
1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2およびX481.2からなる群より選択される抗体、または前記抗体のうちの1つのアミノ酸配列を含む抗体を産生する、請求項17または37のいずれか記載の細胞株。
【請求項３９】
6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、7.26.4-modおよびX481.2からなる群より選択されるモノクローナル抗体、または前記抗体のうちの1つのアミノ酸配列を含む抗体を産生する、請求項38記載の細胞株。
【請求項４０】
請求項1〜13および18〜30のいずれか一項記載の抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分または軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項４１】
請求項40記載の核酸分子を含むベクターであって、該核酸分子に機能的に連結された発現制御配列を任意で含む、ベクター。
【請求項４２】
請求項41記載のベクターまたは請求項40記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項４３】
請求項1〜3および5〜17のいずれか一項記載の抗体または抗原結合部分の、重鎖またはその抗原結合部分をコードする核酸分子、および軽鎖またはその抗原結合部分をコードする核酸分子
を含む、請求項42記載の宿主細胞。
【請求項４４】
MAdCAMに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を産生するための方法であって、請求項42もしくは43記載の宿主細胞または請求項15〜17もしくは38のいずれか一項記載の細胞株を好適な条件下で培養すること、および前記抗体または抗原結合部分を回収することを含む、方法。
【請求項４５】
請求項1〜13または18〜30のいずれか一項記載の抗体の（a）重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸分子；（b）軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸分子；または（c）（a）および（b）の両方を含む、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物であって、前記重鎖または軽鎖または両方を発現する、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物。
【請求項４６】
MAdCAMに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を単離する方法であって、請求項45記載の非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物から該抗体を単離する工程を含む、方法。
【請求項４７】
その必要のある対象を、MAdCAMに特異的に結合してα4β7への結合を阻害するヒト抗体またはその抗原結合部分で処置する方法であって、
（a）重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子、または軽鎖および重鎖もしくはそれらの抗原結合部分をコードする核酸分子の有効量を投与する工程；ならびに
（b）該核酸分子を発現させる工程
を含む、方法。
【請求項４８】
MAdCAMに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を産生するための方法であって、
（a）ヒト抗体を産生することができる非ヒトトランスジェニック動物を、MAdCAMで、MAdCAMの免疫原性部分で、またはMAdCAMを発現する細胞もしくは組織で、免疫化する工程；および
（b）該トランスジェニック動物に、MAdCAMに対する免疫応答を起こさせる工程
を含む、方法。
【請求項４９】
請求項48記載の方法によって産生される、ヒトモノクローナル抗体。
【請求項５０】
ヒトMAdCAMを発現する細胞へのα4β7結合を阻害する方法であって、該細胞を請求項1〜13および18〜30のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させることを含む、方法。
【請求項５１】
MAdCAM媒介性白血球-内皮細胞接着を阻害するための方法であって、内皮細胞を請求項1〜13および18〜30のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させることを含む、方法。
【請求項５２】
組織へのMAdCAM媒介性白血球接着、遊走および浸潤を阻害するための方法であって、内皮細胞を請求項1〜13および18〜30のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させる工程を含む、方法。
【請求項５３】
α4β7/MAdCAM依存性細胞接着を阻害するための方法であって、ヒトMAdCAMを発現する細胞を請求項1〜13および18〜30のいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させる工程を含む、方法。
【請求項５４】
胃腸リンパ組織へのリンパ球のMAdCAM媒介性動員を阻害するための方法であって、ヒトMAdCAMを発現する細胞を請求項1〜13およびppのいずれか一項記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させる工程を含む、方法。
【請求項５５】
MAdCAMに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modからなる群より選択されるヒトモノクローナル抗体のFR1、FR2、FR3またはFR4アミノ酸配列の1つ以上を含む、抗体またはその部分。
【請求項５６】
（a）1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modからなる群より選択されるモノクローナル抗体の重鎖アミノ酸配列と少なくとも90％同一である重鎖アミノ酸配列；
（b）1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modからなる群より選択されるモノクローナル抗体の軽鎖アミノ酸配列と少なくとも90％同一である軽鎖アミノ酸配列；
（c）（a）および（b）の両方；または
（d）シグナル配列を有するまたは有さない、（a）、（b）または（c）のいずれか
を含む、請求項1記載のヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分。
【請求項５７】
循環可溶性ヒトMAdCAMによって特徴付けられる障害を診断するための方法であって、
（1）生物学的試料を請求項1〜13および18〜30のいずれか一項記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分と接触させる工程、および
（2）結合を検出する工程
を含む、方法。
【請求項５８】
対象における炎症を検出するための方法であって、
（1）検出可能に標識されている請求項1〜13および18〜30のいずれか一項記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分を前記対象に投与する工程、および
（2）結合を検出する工程
を含む、方法。
【請求項５９】
請求項1〜13および18〜30のいずれか一項記載のモノクローナル抗体または抗原結合部分を含む、診断キット。
【請求項６０】
1種または複数の追加の抗炎症性剤または免疫調節剤をさらに含む、請求項18記載の薬学的組成物。
【請求項６１】
1種または複数の追加の抗炎症性剤または免疫調節剤が、コルチコステロイド、アミノサリチラート、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、FK506、IL-10、GM-CSF、ラパマイシン、抗TNFα剤および接着分子アンタゴニストからなる群より選択される、請求項60記載の薬学的組成物。
【請求項６２】
請求項1〜13および18〜30のいずれか一項記載のヒト抗体またはその抗原結合部分の有効量と薬学的に許容される担体とを含む、ワクチン。
【請求項６３】
粘膜型である、請求項62記載のワクチン。
【請求項６４】
阻害性抗MAdCAM抗体またはその抗原結合部分の対象への投与の効果を検出する方法であって、
（a）MAdCAMに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を対象に投与する工程；および
（b）循環α4β7発現白血球のレベルの増加があるかどうかを判定する工程
を含む、方法。
【請求項６５】
前記白血球がリンパ球である、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
循環α4β7発現白血球のレベルの前記増加が、FACS解析によって判定される、請求項64記載の方法。
【請求項６７】
SEQ ID NO：150の軽鎖の可変領域およびSEQ ID NO：148の重鎖の可変領域を含む、MAdCAMに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分。
【請求項６８】
ヌクレオチドSEQ ID NO:149によってコードされる重鎖可変領域およびヌクレオチドSEQ ID NO:35によってコードされる軽鎖可変領域を含む、MAdCAMに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2017年7月14日に出願されたU.S.S.N. 62/532,809の恩典および優先権を主張するものであり、その内容は、その全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表の参照による組み入れ
2017年7月14日に作成された、サイズが197 KBである名称「SHR-1258A_ST25.txt」のテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
粘膜アドレシン細胞接着分子（MAdCAM）は、細胞接着受容体の免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。特定化されたリンパ組織および胃腸管の粘膜部位へのリンパ球ホーミングの選択性は、MAdCAMの内皮発現によって決定される（Berlin, C. et al., Cell, 80:413-422(1994); Berlin, C., et al., Cell, 74:185-195 (1993); および Erle, D.J., et al., J. Immunol., 153: 517-528 (1994)）。MAdCAMは、パイエル板および腸間膜リンパ節などの組織化された腸リンパ組織の高内皮細静脈の細胞表面上に固有に発現されるが（Streeter et al., Nature, 331:41-6 (1988); Nakache et al., Nature, 337:179-81 (1989); Briskin et al., Am. J. Pathol. 151-97-110 (1997)）、膵臓、胆嚢ならびに白脾髄の脾細静脈および周縁洞などの他のリンパ器官においても発現される（Briskin et al(1997)（前記）; Kraal et al., Am. J. Path., 147: 763-771 (1995)）。
【０００４】
MAdCAMは、腸管免疫監視において生理学的役割を果たしているが、慢性胃腸管炎症の条態下の炎症性腸疾患において過剰なリンパ球血管外遊走を促進するように思われる。TNFαおよび他の炎症誘発性サイトカインは、内皮MAdCAM発現を増加させ、そして、クローン病および潰瘍性大腸炎の患者から採取された生検標本では、炎症の部位に約2〜3倍の限局的なMAdCAM発現の増加がある（Briskin et al. (1997), Souza et al., Gut, 45:856-63 (1999); Arihiro et al., Pathol Int., 52:367-74 (2002)）。大腸炎の実験モデルにおいて、類似の上昇した発現パターンが観察された（Hesterberg et al., Gastroenterology, 111:1373-1380 (1997); Picarella et al., J. Immunol., 158: 2099-2106 (1997); Connor et al., J Leukoc Biol., 65:349-55 (1999); Kato et al., J Pharmacol Exp Ther., 295:183-9 (2000); Hokari et al., Clin Exp Immunol., 26:259-65 (2001); Shigematsu et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol., 281:G1309-15 (2001)）。インスリン依存性糖尿病（Yang et al. Diabetes, 46:1542-7 (1997); Hanninen et al., J Immunol., 160:6018-25 (1998)）、移植片対宿主病（Fujisaki et al., Scand J Gastroenterol., 38:437-42 (2003), Murai et al., Nat Immunol., 4:154-60 (2003)）、慢性肝疾患（Hillan et al., Liver, 19:509-18 （1999）; Grant et al., Hepatology, 33:1065-72 (2001)）、炎症性脳症（Stalder et al., Am J Pathol., 153:767-83 (1998); Kanawar et al., Immunol Cell Biol., 78:641-5 (2000)）、および胃炎（Barrett et al., J Leukoc Biol., 67:169-73 (2000); Hatanaka et al., Clin Exp Immunol., 130:183-9 (2002)）などの炎症性状態についての他の前臨床モデルでは、疾患病因に、胎児MAdCAM発現の再覚醒および活性化α4β7+リンパ球の関与もある。これらの炎症性モデルだけでなく、ハプテン媒介性（例えば、TNBS、DSSなど）または養子移入（CD4+CD45Rbhigh）マウス大腸炎モデルにおいても、MAdCAMへのα4β7+リンパ球の結合を遮断するラット抗マウスMAdCAMモノクローナル抗体（mAb）MECA-367は、リンパ球動員、組織血管外遊走、炎症および疾患重症度を低減させる。ヒトMAdCAMに対するマウスモノクローナル抗体（mAb）も報告されている（例えば、WO 96/24673およびWO 99/58573を参照のこと）。
【０００５】
炎症性腸疾患（IBD）および胃腸管または他の組織に関連した他の炎症性疾患におけるMAdCAMの役割を考慮すると、α4β7結合およびMAdCAM媒介性白血球動員を阻害するための手段が望ましい。さらには、限定されないが、患者において他の薬物との望ましくない相互作用が欠如していること、および好ましい物理化学的性質（ヒトにおけるpK/pD値、溶解性、安定性、有効期間およびインビボ半減期など）を含めた、有利な性質を備えたそのような治療的手段を有することが望ましいであろう。抗体などの治療用タンパク質は、有利なことに、望ましくない翻訳後修飾または凝集体形成がないとよい。したがって、治療用の抗MAdCAM抗体が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書において、MAdCAMに特異的に結合する単離された抗体であって、前記抗体の少なくともCDR配列がヒトCDR配列である抗体、または前記抗体の抗原結合部分が提供される。態様において、抗体は、ヒト抗体、好ましくは、MAdCAMアンタゴニストとして作用する抗体である。また、前記抗体または部分を含む組成物も提供される。
【０００７】
本開示はまた、前記抗MAdCAMアンタゴニスト抗体の重鎖および／もしくは軽鎖、またはその可変領域もしくは他の抗原結合部分、または前記のいずれかをコードする核酸分子と薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。本発明の組成物は、治療用物質または診断用物質などの別の構成成分をさらに含んでよい。診断方法および治療方法もまた、本発明によって提供される。
【０００８】
本開示は、前記抗MAdCAM抗体またはその抗原結合部分を産生する単離された細胞株をさらに提供する。
【０００９】
本開示はまた、前記抗MAdCAM抗体の重鎖および／もしくは軽鎖またはその可変領域またはその抗原結合部分をコードする核酸分子を提供する。
【００１０】
本開示は、前記核酸分子を含むベクターおよび宿主細胞、さらには、該核酸分子によってコードされるポリペプチドを組換え技術で産生する方法も提供する。
【００１１】
前記抗MAdCAM抗体の重鎖および／もしくは軽鎖またはその抗原結合部分を発現する、非ヒトトランスジェニック動物または植物も提供される。
【００１２】
態様において、粘膜アドレシン細胞接着分子（MAdCAM）に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分が提供される。
【００１３】
態様において、ヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分は、以下の性質のうちの少なくとも1つを保有する：（a）ヒト細胞に結合する；（b）VCAMまたはフィブロネクチンと比べて少なくとも100倍の、MAdCAMに対する選択性を有する；（c）ヒトMAdCAMに3×10-10 M以下のKdで結合する；または（d）ヒトMAdCAMへのα4β7発現細胞の結合を阻害する；（e）胃腸リンパ組織へのリンパ球の動員を阻害する。
【００１４】
態様において、ヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分は、ヒトMAdCAMに3×10-10 M以下のKdで結合し、かつ、ヒトMAdCAMへのα4β7結合を阻害する。
【００１５】
態様において、重鎖は、SEQ ID NO：148と少なくとも80％、85％または90％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
態様において、重鎖は、SEQ ID NO：148と同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
態様において、重鎖は、SEQ ID NO：148と比較して1〜25個のアミノ酸置換を含む。
【００１８】
態様において、重鎖は、SEQ ID NO：148と比較して1〜10個のアミノ酸置換を含む。
【００１９】
態様において、軽鎖は、SEQ ID NO：150と少なくとも80％、85％または90％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２０】
態様において、軽鎖は、SEQ ID NO：150と同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
態様において、軽鎖は、SEQ ID NO：150と比較して1〜25個のアミノ酸置換を含む。
【００２２】
態様において、軽鎖は、SEQ ID NO：150と比較して1〜10個のアミノ酸置換を含む。
【００２３】
態様において、重鎖は、SEQ ID NO：148と少なくとも80％、85％または90％同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、SEQ ID NO：150と少なくとも80％、85％または90％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２４】
態様において、重鎖は、SEQ ID NO：148と同一であるアミノ酸配列を含み、軽鎖は、SEQ ID NO：150と同一であるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
態様において、MAdCAM抗体のアミノ酸配列をコードする核酸配列が提供される。
【００２６】
態様において、MAdCAMに結合するヒトモノクローナル抗体を産生する細胞が提供される。
【００２７】
態様において、MAdCAM抗体をコードする核酸配列を含む細胞が提供される。
【００２８】
態様において、ヒトモノクローナルMAdCAM抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が提供される。態様において、ハイブリドーマは、1.7.2（ECACCアクセッション番号03090901）、1.8.2（ECACCアクセッション番号03090902）、6.14.2（ECACCアクセッション番号03090903）、6.22.2（ECACCアクセッション番号03090904）、6.34.2（ECACCアクセッション番号03090905）、6.67.1（ECACCアクセッション番号03090906）、6.73.2（ECACCアクセッション番号03090907）、6.77.1（ECACCアクセッション番号03090908）、7.16.6（ECACCアクセッション番号03090909）、7.20.5（ECACCアクセッション番号03090910）、7.26.4（ECACCアクセッション番号03090911）、および9.8.2（ECACCアクセッション番号03090912）からなる群より選択される。
【００２９】
態様において、ハイブリドーマ細胞株によって産生されるヒトモノクローナル抗体、または前記モノクローナル抗体の抗原結合部分が提供される。
【００３０】
態様において、重鎖C末端リシンは、切断されている。
【００３１】
態様において、前記抗体または抗原結合部分は、α4β7へのヒトMAdCAMの結合を阻害し、ここで、該抗体またはその部分は、以下の性質のうちの少なくとも1つを有する：（a）MAdCAMへの結合に対して参照抗体と交差競合する；（b）MAdCAMへの結合に対して参照抗体と競合する；（c）参照抗体と同じMAdCAMのエピトープに結合する；（d）参照抗体と実質的に同じKdでMAdCAMに結合する；（e）参照抗体と実質的に同じ解離速度でMAdCAMに結合する；ここで、参照抗体は、モノクローナル抗体1.7.2、モノクローナル抗体1.8.2、モノクローナル抗体6.14.2、モノクローナル抗体6.22.2、モノクローナル抗体6.34.2、モノクローナル抗体6.67.1、モノクローナル抗体6.73.2、モノクローナル抗体6.77.1、モノクローナル抗体7.16.6、モノクローナル抗体7.20.5、モノクローナル抗体7.26.4、モノクローナル抗体9.8.2、X481.2モノクローナル抗体、モノクローナル抗体6.22.2-mod、モノクローナル抗体6.34.2-mod、モノクローナル抗体6.67.1-mod、モノクローナル抗体6.77.1-modおよびモノクローナル抗体7.26.4-modからなる群より選択される。
【００３２】
態様において、抗体は、（a）シグナル配列のない、SEQ ID NO：2およびSEQ ID NO：4に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（b）シグナル配列のない、SEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：8に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（c）シグナル配列のない、SEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：12に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（d）シグナル配列のない、SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：16に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（e）シグナル配列のない、SEQ ID NO：18およびSEQ ID NO：20に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（f）シグナル配列のない、SEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：24に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（g）シグナル配列のない、SEQ ID NO：26およびSEQ ID NO：28に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（h）シグナル配列のない、SEQ ID NO：30およびSEQ ID NO：32に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（i）シグナル配列のない、SEQ ID NO：34およびSEQ ID NO：36に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（j）シグナル配列のない、SEQ ID NO：38およびSEQ ID NO：40に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（k）シグナル配列のない、SEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：44に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（l）シグナル配列のない、SEQ ID NO：46およびSEQ ID NO：48に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（m）シグナル配列のない、SEQ ID NO：52およびSEQ ID NO：54に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（n）シグナル配列のない、SEQ ID NO：56およびSEQ ID NO：58に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（o）シグナル配列のない、SEQ ID NO：60およびSEQ ID NO：62に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；（p）シグナル配列のない、SEQ ID NO：64およびSEQ ID NO：66に示されるアミノ酸配列を含む、抗体；ならびに（q）シグナル配列のない、SEQ ID NO：42およびSEQ ID NO：68に示されるアミノ酸配列を含む、抗体、（r）シグナル配列のない、SEQ ID NO：148およびSEQ ID NO：150に示されるアミノ酸配列を含む、抗体、からなる群より選択される。
【００３３】
態様において、前記抗体またはその部分の重鎖は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modからなる群より選択されるモノクローナル抗体の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3を含むか、または、軽鎖は、前記モノクローナル抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3を含む。
【００３４】
態様において、前記抗体または部分は、ヒトVH 1-18遺伝子、ヒトVH 3-15遺伝子、ヒトVH 3-21遺伝子、ヒトVH 3-23遺伝子、ヒトVH 3-30遺伝子、ヒトVH 3-33遺伝子またはヒトVH 4-4遺伝子を利用する重鎖を含む。
【００３５】
態様において、前記抗体または部分は、ヒトVK A2遺伝子、ヒトVK A3遺伝子、ヒトVK A26遺伝子、ヒトVK B3遺伝子、ヒトVK O12遺伝子またはヒトVK O18遺伝子を利用する軽鎖を含む。
【００３６】
態様において、重鎖可変領域、軽鎖可変領域または両方は、モノクローナル抗体1.7.2、モノクローナル抗体1.8.2、モノクローナル抗体6.14.2、モノクローナル抗体6.22.2、モノクローナル抗体6.34.2、モノクローナル抗体6.67.1、モノクローナル抗体6.73.2、モノクローナル抗体6.77.1、モノクローナル抗体7.16.6、モノクローナル抗体7.20.5、モノクローナル抗体7.26.4、モノクローナル抗体9.8.2、モノクローナル抗体X481.2、モノクローナル抗体6.22.2-mod、モノクローナル抗体6.34.2-mod、モノクローナル抗体6.67.1-mod、モノクローナル抗体6.77.1-modおよびモノクローナル抗体7.26.4-modからなる群より選択されるモノクローナル抗体の対応する領域（1つまたは複数）とアミノ酸配列が少なくとも90％同一である。
【００３７】
態様において、MAdCAMに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、（a）重鎖が、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modからなる群より選択される参照抗体の重鎖CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を含み；（b）軽鎖が、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modからなる群より選択される参照抗体の軽鎖CDR1、CDR2およびCDR3アミノ酸配列を含み；（c）抗体が、（a）の重鎖および（b）の軽鎖を含み；かつ（d）抗体が、重鎖および軽鎖CDRアミノ酸配列が同じ参照抗体から選択される（c）の抗体である、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分が提供される。
【００３８】
態様において、重鎖、軽鎖または両方は、それぞれ、参照抗体の重鎖、軽鎖または両方のCDR1の始まりからCDR3の終わりまでのアミノ酸配列を含む。
【００３９】
態様において、前記抗体は、（a）1.7.2（SEQ ID NO：2）；1.8.2（SEQ ID NO：6）；6.14.2（SEQ ID NO：10）；6.22.2（SEQ ID NO：14）；6.34.2（SEQ ID NO：18）；6.67.1（SEQ ID NO：22）；6.73.2（SEQ ID NO：26）；6.77.1（SEQ ID NO：30）；7.16.6（SEQ ID NO：34）；7.20.5（SEQ ID NO：38）；7.26.4（SEQ ID NO：42）；および9.8.2（SEQ ID NO：46）；X481.2（SEQ ID NO：148）、6.22.2-mod（SEQ ID NO：52）；6.34.2-mod（SEQ ID NO：56）；6.67.1-mod（SEQ ID NO：60）；6.77.1-mod（SEQ ID NO：64）；および7.26.4-mod（SEQ ID NO：42）からなる群より選択される抗体の重鎖可変領域アミノ酸配列を含む重鎖；（b）1.7.2（SEQ ID NO：4）；1.8.2（SEQ ID NO：8）；6.14.2（SEQ ID NO：12）；6.22.2（SEQ ID NO：16）；6.34.2（SEQ ID NO：20）；6.67.1（SEQ ID NO：24）；6.73.2（SEQ ID NO：28）；6.77.1（SEQ ID NO：32）；7.16.6（SEQ ID NO：36）；7.20.5（SEQ ID NO：40）；7.26.4（SEQ ID NO：44）；および9.8.2（SEQ ID NO：48）；X481.2（SEQ ID NO：150）、6.22.2-mod（SEQ ID NO：54）；6.34.2-mod（SEQ ID NO：58）；6.67.1-mod（SEQ ID NO：62）；6.77.1-mod（SEQ ID NO：66）；および7.26.4-mod（SEQ ID NO：68）からなる群より選択される抗体の軽鎖可変領域アミノ酸配列を含む軽鎖；または（c）（a）の重鎖および（b）の軽鎖を含む。
【００４０】
態様において、モノクローナル抗体は、免疫グロブリンG(IgG)、IgM、IgE、およびIgAもしくはIgD分子、ヒト化抗体、キメラ抗体または二重特異性抗体である。
【００４１】
態様において、抗原結合部分は、Fab断片、F(ab')2断片、Fv断片または一本鎖抗体である。
【００４２】
態様において、モノクローナル抗体またはその抗原結合部分の有効量と薬学的に許容される担体とを含む薬学的組成物が提供される。
【００４３】
態様において、その必要のある対象における炎症性疾患を処置する方法であって、α4β7へのMAdCAMの結合を阻害するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を前記対象に投与する工程を含む方法が提供される。
【００４４】
態様において、炎症性疾患は、胃腸管の炎症性疾患である。
【００４５】
態様において、胃腸管の炎症性疾患は、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、憩室疾患、胃炎、肝疾患、原発性胆汁性硬化症および硬化性胆管炎からなる群より選択される。
【００４６】
態様において、炎症性腸疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎または両方である。
【００４７】
態様において、炎症性疾患は、インスリン依存性糖尿病および移植片対宿主病である。
【００４８】
態様において、モノクローナル抗体もしくは抗原結合部分または前記抗体もしくは前記その部分の重鎖もしくは軽鎖を産生する単離された細胞株が提供される。態様において、細胞株は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2およびX481.2からなる群より選択される抗体、または前記抗体のうちの1つのアミノ酸配列を含む抗体を産生する。態様において、細胞株は、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、7.26.4-modおよびX481.2からなる群より選択されるモノクローナル抗体、または前記抗体のうちの1つのアミノ酸配列を含む抗体を産生する。
【００４９】
態様において、抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分または軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸分子が提供される。
【００５０】
態様において、核酸分子を含むベクターであって、核酸分子に機能的に連結された発現制御配列を任意で含むベクターが提供される。態様において、該ベクターまたは核酸分子を含む宿主細胞が提供される。
【００５１】
態様において、抗体または抗原結合部分の、重鎖またはその抗原結合部分をコードする核酸分子および軽鎖またはその抗原結合部分をコードする核酸分子を含む、宿主細胞が提供される。
【００５２】
態様において、MAdCAMに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体またはその抗原結合部分を産生するための方法であって、宿主細胞または細胞株を好適な条件下で培養すること、および前記抗体または抗原結合部分を回収することを含む方法が提供される。
【００５３】
態様において、（a）重鎖またはその抗原結合部分をコードする核酸分子；（b）軽鎖またはその抗原結合部分をコードする核酸分子；または（c）抗体の（a）および（b）の両方を含む、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物であって、前記重鎖または軽鎖または両方を発現する、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物が提供される。
【００５４】
態様において、MAdCAMに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分を単離する方法であって、非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物から抗体を単離する工程を含む方法が提供される。
【００５５】
態様において、MAdCAMに特異的に結合してα4β7への結合を阻害するヒト抗体またはその抗原結合部分でその必要のある対象を処置する方法であって、（a）重鎖もしくはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子、軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子、または軽鎖および重鎖もしくはそれらの抗原結合部分をコードする核酸分子の有効量を投与する工程；ならびに（b）該核酸分子を発現させる工程を含む方法が提供される。
【００５６】
態様において、MAdCAMに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を産生するための方法であって、（a）ヒト抗体を産生することができる非ヒトトランスジェニック動物をMAdCAM、MAdCAMの免疫原性部分またはMAdCAMを発現する細胞もしくは組織で免疫化する工程；および（b）トランスジェニック動物に、MAdCAMに対する免疫応答を起こさせる工程を含む方法が提供される。
【００５７】
態様において、ヒトモノクローナル抗体は、上記のとおり産生される。
【００５８】
態様において、ヒトMAdCAMを発現する細胞へのα4β7結合を阻害する方法であって、該細胞をモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させることを含む方法が提供される。
【００５９】
態様において、MAdCAM媒介性白血球-内皮細胞接着を阻害するための方法であって、内皮細胞をモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させることを含む方法が提供される。
【００６０】
態様において、組織へのMAdCAM媒介性白血球接着、遊走および浸潤を阻害するための方法であって、内皮細胞をモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させる工程を含む方法が提供される。
【００６１】
態様において、α4β7/MAdCAM依存性細胞接着を阻害するための方法であって、ヒトMAdCAMを発現する細胞をモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させる工程を含む方法が提供される。
【００６２】
態様において、胃腸リンパ組織へのリンパ球のMAdCAM媒介性動員を阻害するための方法であって、ヒトMAdCAMを発現する細胞をモノクローナル抗体またはその抗原結合部分と接触させる工程を含む方法が提供される。
【００６３】
態様において、MAdCAMに特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分であって、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modからなる群より選択されるヒトモノクローナル抗体のFR1、FR2、FR3またはFR4アミノ酸配列の1つ以上を含む、前記抗体またはその部分が提供される。
【００６４】
態様において、ヒトモノクローナル抗体または抗原結合部分は、（a）1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modからなる群より選択されるモノクローナル抗体の重鎖アミノ酸配列と少なくとも90％同一である重鎖アミノ酸配列；（b）1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modからなる群より選択されるモノクローナル抗体の軽鎖アミノ酸配列と少なくとも90％同一である軽鎖アミノ酸配列；（c）（a）および（b）の両方；または（d）シグナル配列を有するまたは有さない（a）、（b）または（c）のいずれか、を含む。
【００６５】
態様において、循環可溶性ヒトMAdCAMによって特徴付けられる障害を診断するための方法であって、（1）生物学的試料をモノクローナル抗体または抗原結合部分と接触させる工程、および（2）結合を検出する工程を含む方法が提供される。
【００６６】
態様において、対象における炎症を検出するための方法であって、（1）検出可能に標識されているモノクローナル抗体または抗原結合部分を前記対象に投与する工程、および（2）結合を検出する工程を含む方法が提供される。
【００６７】
態様において、モノクローナル抗体または抗原結合部分を含む診断キットが提供される。
【００６８】
態様において、1種または複数の追加の抗炎症性剤または免疫調節剤をさらに含む薬学的組成物が提供される。態様において、1種または複数の追加の抗炎症性剤または免疫調節剤は、コルチコステロイド、アミノサリチラート、アザチオプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、FK506、IL-10、GM-CSF、ラパマイシン、抗TNFα剤および接着分子アンタゴニストからなる群より選択される。
【００６９】
態様において、そのヒト抗体または抗原結合部分の有効量と薬学的に許容される担体とを含むワクチンが提供される。態様において、ワクチンは、粘膜型である。
【００７０】
態様において、阻害性抗MAdCAM抗体またはその抗原結合部分の対象への投与の効果を検出する方法であって、（a）MAdCAMに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を対象に投与する工程；および（b）循環α4β7発現白血球のレベルの増加があるかどうかを判定する工程を含む方法が提供される。態様において、前記白血球は、リンパ球である。態様において、前記の循環α4β7発現白血球のレベルの増加は、FACS解析によって判定される。
【００７１】
態様において、SEQ ID NO：150の軽鎖の可変領域およびSEQ ID NO：148の重鎖の可変領域を含む、MAdCAMに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合部分が提供される。
【００７２】
態様において、ヌクレオチドSEQ ID NO：149によってコードされる重鎖可変領域およびヌクレオチドSEQ ID NO：35によってコードされる軽鎖可変領域を含む、MAdCAMに結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合断片が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００７３】
【図１Ａ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Aは、抗体1.7.2および1.8.2についての重鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトVH 3-15遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｂ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Bは、抗体6.14.2についての重鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトVH 3-23遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｃ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Cは、抗体6.22.2についての重鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトVH 3-33遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｄ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Dは、抗体6.34.2についての重鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトVH 3-30遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｅ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Eは、抗体6.67.1についての重鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトVH 4-4遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｆ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Fは、抗体6.73.2についての重鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトVH 3-23遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｇ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Gは、抗体6.77.1についての重鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトVH 3-21遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｈ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Hは、抗体7.16.6および7.26.4についての重鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトVH 1-18遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｉ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Iは、抗体7.20.5についての重鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトVH 4-4遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｊ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Jは、抗体9.8.2についての重鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトVH 3-33遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｋ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Kは、抗体1.7.2および1.8.2についての軽カッパ鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトA3遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｌ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Lは、抗体6.14.2についてのカッパ軽鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトO12遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｍ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Mは、抗体6.22.2についてのカッパ軽鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトA26遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｎ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Nは、抗体6.34.2についてのカッパ軽鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトO12遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｏ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Oは、抗体6.67.1についてのカッパ軽鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトB3遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｐ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Pは、抗体6.73.2についてのカッパ軽鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトO12遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｑ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Qは、抗体6.77.1についてのカッパ軽鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトA2遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｒ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Rは、抗体7.16.6および7.26.4についてのカッパ軽鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトA2遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｓ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Sは、抗体7.20.5についてのカッパ軽鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトA3遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図１Ｔ】図1（すなわち、図1A〜図1T）は、12個のヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の重鎖およびカッパ軽鎖可変領域の予測アミノ酸配列の、対応するヒト遺伝子の生殖系列アミノ酸配列とのアラインメントである。図1Tは、抗体9.8.2についてのカッパ軽鎖の予測アミノ酸配列の、生殖系列ヒトO18遺伝子産物とのアラインメントを示す。
【図２Ａ−１】図2（すなわち、図2Aおよび図2B）は、ヒト抗MAdCAM抗体の予測重鎖およびカッパ軽鎖アミノ酸配列のCLUSTALアラインメントである。図2Aは、抗MAdCAM抗体カッパ軽鎖間の類似性の程度を示す、予測カッパ軽鎖アミノ酸配列のCLUSTALアラインメントおよび放射状樹である。
【図２Ａ−２】図2（すなわち、図2Aおよび図2B）は、ヒト抗MAdCAM抗体の予測重鎖およびカッパ軽鎖アミノ酸配列のCLUSTALアラインメントである。図2Aは、抗MAdCAM抗体カッパ軽鎖間の類似性の程度を示す、予測カッパ軽鎖アミノ酸配列のCLUSTALアラインメントおよび放射状樹である。
【図２Ａ−３】図2（すなわち、図2Aおよび図2B）は、ヒト抗MAdCAM抗体の予測重鎖およびカッパ軽鎖アミノ酸配列のCLUSTALアラインメントである。図2Aは、抗MAdCAM抗体カッパ軽鎖間の類似性の程度を示す、予測カッパ軽鎖アミノ酸配列のCLUSTALアラインメントおよび放射状樹である。
【図２Ｂ−１】図2（すなわち、図2Aおよび図2B）は、ヒト抗MAdCAM抗体の予測重鎖およびカッパ軽鎖アミノ酸配列のCLUSTALアラインメントである。図2Bは、抗MAdCAM抗体重鎖間の類似性の程度を示す、予測重アミノ酸配列のCLUSTALアラインメントおよび放射状樹である。
【図２Ｂ−２】図2（すなわち、図2Aおよび図2B）は、ヒト抗MAdCAM抗体の予測重鎖およびカッパ軽鎖アミノ酸配列のCLUSTALアラインメントである。図2Bは、抗MAdCAM抗体重鎖間の類似性の程度を示す、予測重アミノ酸配列のCLUSTALアラインメントおよび放射状樹である。
【図２Ｂ−３】図2（すなわち、図2Aおよび図2B）は、ヒト抗MAdCAM抗体の予測重鎖およびカッパ軽鎖アミノ酸配列のCLUSTALアラインメントである。図2Bは、抗MAdCAM抗体重鎖間の類似性の程度を示す、予測重アミノ酸配列のCLUSTALアラインメントおよび放射状樹である。
【図３】図3は、α4β7結合ドメインを形成するカニクイザルおよびヒトMAdCAMの2N末端ドメインのアミノ酸配列CLUSTALアラインメントである。β鎖は、Tan et al., Structure (1998) 6:793-801に従って整列されている。
【図４】図4は、精製されたビオチン化1.7.2および7.16.6の用量の、MAdCAMを発現する凍結ヒト肝臓内皮の切片へのヒト末梢血リンパ球の接着に対する効果を表すグラフである。
【図５】図5は、抗MAdCAM抗体1.7.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2が結合するMAdCAMエピトープの多様性の表7に記録されたデータに基づく2次元グラフ表示を示す。同じ円内の抗MAdCAM抗体は、同じ反応性パターンを示し、同じエピトープビンに属し、かつ、MAdCAM上の同じエピトープを認識する可能性が高い。重複している円内の抗MAdCAM抗体クローンは、同時に結合できず、それ故に、MAdCAM上の重複するエピトープを認識する可能性が高い。統合されていない円は、別個の空間的なエピトープ分離を伴う抗MAdCAM抗体クローンを表す。
【図６】図6は、抗MAdCAM抗体1.7.2およびAlexa 488標識7.16.6を用いたサンドイッチELISAデータを示しており、MAdCAM上の異なるエピトープを検出することができる2つの抗体を、診断目的として可溶性MAdCAMを検出するために使用することもできることを示す。
【図７】図7は、カニクイザルモデルにおいて抗MAdCAM mAb 7.16.6を使用して、対照IgG2a mAbまたはビヒクルに対する倍率増加として表される、循環末梢α4β7+リンパ球の数に対する阻害性抗MAdCAM抗体（1mg/kg）の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７４】
発明の詳細な説明
定義および一般的技術
本明細書において他に定義されない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈によって他に必要とされない限り、単数形の用語は、複数形を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載される、細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、タンパク質および核酸化学ならびにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、ならびに、それらの技術は、当技術分野において周知でありかつ一般に使用されているものである。本開示の方法および技術は、一般に、他に指定のない限り、当技術分野において周知の従来の方法に従って、かつ、本明細書を通して引用および考察されている様々な一般参考文献およびより具体的な参考文献に記載されているように、実施される。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989) and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992) および Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990)を参照されたい。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って、当技術分野において一般に達成されているようにまたは本明細書に記載されるように実施される。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤化、および送達、ならびに患者の処置には、標準技術が使用される。
【００７５】
以下の用語は、他に指定のない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。
【００７６】
用語「ポリペプチド」は、天然または人工のタンパク質、タンパク質断片およびタンパク質配列のポリペプチド類似体を包含する。ポリペプチドは、単量体であっても重合体であってもよい。
【００７７】
用語「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」は、その起源または派生源に基づいて、（1）その天然状態でそれに付随する天然に会合された構成成分と会合していない、（2）同じ種由来の他のタンパク質を含まない、（3）異なる種由来の細胞によって発現される、または（4）天然に存在していない、タンパク質またはポリペプチドである。したがって、化学合成されているポリペプチド、またはそれが天然で生じる細胞とは異なる細胞系で合成されているポリペプチドは、その天然に会合された構成成分から「単離されている」。タンパク質はまた、当技術分野において周知のタンパク質精製技術を使用して、単離によって、天然に会合された構成成分を実質的に含まないようにしてもよい。
【００７８】
タンパク質またはポリペプチドは、試料の少なくとも約60〜75％が単一種のポリペプチドを示すときに、「実質的に純粋である」、「実質的に均質である」または「実質的に精製されている」。ポリペプチドまたはタンパク質は、単量体であっても多量体であってもよい。実質的に純粋なポリペプチドまたはタンパク質は、典型的には、タンパク質試料の約50％、60％、70％、80％または90％ W/W、より通常には、約95％を含み、好ましくは、99％超純粋である。タンパク質純度または均質性は、タンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続く当技術分野において周知の染色剤でゲルを染色することによる単一ポリペプチドバンドの可視化などの、当技術分野において周知の多数の手段によって示してよい。特定の目的のために、HPLCまたは精製のための当技術分野において周知の他の手段を使用することによって、より高い分解能が提供されてよい。
【００７９】
用語「ポリペプチド断片」は、本明細書において使用される場合、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が天然に存在する配列中の対応する位置と同一である、ポリペプチドを指す。いくつかの態様において、断片は、少なくとも5、6、8または10アミノ酸長である。他の態様において、断片は、少なくとも14アミノ酸長、より好ましくは、少なくとも20アミノ酸長、通常は、少なくとも50アミノ酸長、さらにより好ましくは、少なくとも70、80、90、100、150または200アミノ酸長である。
【００８０】
用語「ポリペプチド類似体」は、本明細書において使用される場合、アミノ酸配列の一部との実質的同一性を有し、かつ、以下の性質のうちの少なくとも1つを有する、少なくとも25アミノ酸のセグメントを含むポリペプチドを指す：（1）好適な結合条件下でのMAdCAMへの特異的結合、（2）MAdCAMへのα4β7インテグリンおよび／もしくはL-セレクチン結合を阻害する能力、または（3）インビトロもしくはインビボでのMAdCAM細胞表面発現を低減する能力。典型的には、ポリペプチド類似体は、天然に存在する配列に対する保存的アミノ酸置換（または挿入または欠失）を含む。類似体は、典型的には、少なくとも20アミノ酸長、好ましくは、少なくとも50、60、70、80、90、100、150もしくは200アミノ酸長またはより長く、しばしば、完全長の天然に存在するポリペプチドと同じくらいの長さであってよい。
【００８１】
好ましいアミノ酸置換は、（1）タンパク分解に対する感受性を低減する、（2）酸化に対する感受性を低減する、（3）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変更する、（4）結合親和性を変更する、または（5）そのような類似体の他の物理化学的もしくは機能的性質を付与もしくは修飾する、アミノ酸置換である。類似体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々な変異タンパク質を含むことができる。例えば、単一または複数のアミノ酸置換（好ましくは、保存的アミノ酸置換）が、天然に存在する配列において（好ましくは、分子間接触を形成するドメインの外側のポリペプチドの部分において）、なされてよい。保存的アミノ酸置換は、親配列の構造的特性を実質的に変化させるべきではない（例えば、置換アミノ酸は、親配列中の存在するヘリックスを破壊するまたは親配列を特徴付ける他のタイプの二次構造を崩壊させる傾向があるべきではない）。当技術分野において認められているポリペプチドの二次および三次構造の例は、各々参照により本明細書に組み入れられる、Proteins, Structures and Molecular Principles（Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)）；Introduction to Protein Structure（C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)）; および Thornton et al., Nature, 354:105 (1991)に記載されている。
【００８２】
非ペプチド類似体は、鋳型ペプチドのものと類似した性質を有する薬物として製薬業において一般に使用される。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣体（peptide mimetics）」または「ペプチド模倣体（peptidomimetics）」と称される。参照により本明細書に組み入れられる、Fauchere, J. Adv. Drug Res., 15:29(1986); Veber and Freidinger, TINS, p.392(1985); および Evans et al., J. Med. Chem., 30:1229(1987)。そのような化合物は、しばしば、コンピュータ化された分子モデリングの助けを借りて開発される。治療上有用なペプチドと構造的に類似するペプチド模倣体を使用して、等価な治療または予防効果をもたらしてよい。一般に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体などのパラダイムポリペプチド（すなわち、所望の生化学的性質または薬理学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似するが、当技術分野において周知の方法によって、-CH2NH-、-CH2S-、-CH2-CH2-、-CH=CH-（シスおよびトランス）、-COCH2-、-CH(OH)CH2-および-CH2SO-などの連結によって置換されていてもよい1つ以上のペプチド連結を有する。また、共通配列の1つ以上のアミノ酸の、同じタイプのD-アミノ酸による系統的置換（例えば、L-リシンの代わりにD-リシン）を使用して、より安定したペプチドを作製してもよい。加えて、共通配列または実質的に同一の共通配列変異を含む拘束されたペプチドを、当技術分野において公知の方法によって（Rizo and Gierasch Ann. Rev. Biochem. 61:387 (1992)、参照により本明細書に組み入れられる）；例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成することができる内部システイン残基を付加することによって、作製してもよい。
【００８３】
「免疫グロブリン」は、四量体分子である。天然に存在する免疫グロブリンでは、各四量体は、2つの同一のポリペプチド鎖の対から構成され、各々の対は、1つの「軽」鎖（約25kDa）および1つの「重」鎖（約50〜70kDa）を有する。各鎖のアミノ末端部分は、主として抗原認識に関与する約100〜110またはより多くのアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、主としてエフェクター機能に関与する定常領域を規定する。ヒト軽鎖は、κおよびλ軽鎖として分類される。重鎖は、μ、δ、γ、αまたはεとして分類され、それぞれ、IgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEとして抗体のアイソタイプを規定する。軽鎖および重鎖内において、可変および定常領域は、約12以上のアミノ酸の「J」領域によって接続され、重鎖はまた、約10以上のアミノ酸の「D」領域を含む。一般に、Fundamental Immunology, Ch. 7 （Paul, W., ed., 2nd ed. Raven Press, N.Y. (1989)）（全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。各々の軽鎖/重鎖の対の可変領域は、無傷の免疫グロブリンが2つの結合部位を有するように抗体結合部位を形成する。
【００８４】
免疫グロブリン鎖は、相補性決定領域またはCDRとも呼ばれる3つの超可変領域によって接続された相対的に保存されたフレームワーク領域（FR）の同じ一般構造を示す。各々の対の2つの鎖由来のCDRは、エピトープ特異的結合部位を形成するようにフレームワーク領域によって整列される。N末端からC末端へ、軽鎖および重鎖の両方は、ドメインFR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3およびFR4を含む。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、カバット（Kabat）の定義、Sequences of Proteins of Immunological Interest（National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 and 1991)）、またはChothia & Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917(1987); Chothia et al., Nature, 342:878-883(1989)（各々、その全体が参照により本明細書に組み入れられる）に従う。
【００８５】
「抗体」は、特異的結合に対して無傷の抗体と競合する、無傷の免疫グロブリンまたはその抗原結合部分を指す。いくつかの態様において、抗体は、その抗原結合部分である。抗原結合部分は、組換えDNA技術によってまたは無傷の抗体の酵素的もしくは化学的切断によって産生されてよい。抗原結合部分は、とりわけ、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、dAb、および相補性決定領域（CDR）断片、一本鎖抗体（scFv）、キメラ抗体、ダイアボディ、ならびにポリペプチドに特異的抗原結合を付与するのに十分な免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドを含む。Fab断片は、VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価の断片である；F(ab)2断片は、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価の断片である；Fd断片は、VHおよびCH1ドメインからなる；Fv断片は、抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなる；ならびに、dAb断片（Ward et al., Nature, 341:544-546(1989)）は、VHドメインからなる。
【００８６】
本明細書において使用される場合、例えば、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.34.2、6.67.1、6.77.2、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2またはX481.2と称される抗体は、同じ名称のハイブリドーマによって産生されるモノクローナル抗体である。例えば、抗体1.7.2は、ハイブリドーマ1.7.2によって産生される。6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-mod、7.26.4-modまたはX481.2と称される抗体は、その対応する親から部位特異的変異誘発によって配列が改変されたモノクローナル抗体である。
【００８７】
一本鎖抗体（scFv）は、VLおよびVH領域が単一のタンパク質鎖として作られるのを可能にする合成リンカーを介して、VLおよびVH領域が一価の分子を形成するように対合している、抗体である（Bird et al., Science, 242:423-426 (1988) および Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988)）。ダイアボディは、そのVHおよびVLドメインが単一ポリペプチド鎖上に発現されるが、同じ鎖上の2つのドメイン間を対合するには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインが別の鎖の相補性ドメインと対合するようになり、2つの抗原結合部位が生み出された、二価の二重特異性抗体である（例えば、Holliger, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) および Poljak, R. J., et al., Structure, 2:1121-1123 (1994)を参照のこと）。本開示の抗体由来の1つ以上のCDRを共有結合または非共有結合のいずれかで分子に組み込んで、MAdCAMに特異的に結合するイムノアドヘシンにしてよい。イムノアドヘシンは、CDRをより大きなポリペプチド鎖の一部として組み込み得るか、CDRを別のポリペプチド鎖に共有結合で連結し得るか、またはCDRを非共有結合で組み込み得る。CDRは、イムノアドヘシンが関心対象の特定の抗原に特異的に結合するのを可能にする。
【００８８】
抗体は、1つ以上の結合部位を有し得る。1を超える結合部位がある場合、結合部位は、互いに同一であっても、異なっていてもよい。例として、天然に存在する免疫グロブリンは、2つの同一の結合部位を有し、一本鎖抗体またはFab断片は、1つの結合部位を有するが、一方で、「二重特異性」または「二機能性」抗体（ダイアボディ）は、2つの異なる結合部位を有する。
【００８９】
「単離された抗体」は、（1）その天然状態でそれに付随する天然に会合された構成成分（他の天然に会合された抗体を含む）と会合していない、（2）同じ種由来の他のタンパク質を含まない、（3）異なる種由来の細胞によって発現される、または（4）天然に存在していない、抗体である。単離された抗体の例は、MAdCAMを使用してアフィニティー精製された抗MAdCAM抗体、ハイブリドーマまたは他の細胞株によってインビトロ産生された抗MAdCAM抗体、およびトランスジェニック哺乳動物または植物に由来するヒト抗MAdCAM抗体を含む。
【００９０】
本明細書において使用される場合、用語「ヒト抗体」は、可変および定常領域配列がヒト配列である抗体を意味する。その用語は、ヒト遺伝子に由来する配列を有するが、例えば、可能性のある免疫原性を減少させる、親和性を増加させる、望ましくない折り畳みを引き起こし得るシステインまたはグリコシル化部位を除去するなどのために変更されている、抗体を包含する。その用語は、ヒト細胞に特有ではないグリコシル化を与え得る、非ヒト細胞において組換え技術で産生されるそのような抗体を包含する。その用語はまた、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の遺伝子座の一部または全部を含むトランスジェニックマウスにおいて作製された抗体も包含する。
【００９１】
一局面において、本開示は、ヒト化抗体を提供する。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、重鎖および軽鎖のフレームワークおよび定常ドメインにおける特定のアミノ酸が、ヒトにおける免疫応答を回避または無効にするように変異されている、非ヒト種に由来する抗体である。いくつかの態様において、ヒト化抗体は、ヒト抗体由来の定常ドメインを非ヒト種の可変ドメインに融合することによって産生されてよい。ヒト化抗体を製造する方法の例は、米国特許第6,054,297号、第5,886,152号および第5,877,293号に見いだしてよい。いくつかの態様において、本開示のヒト化抗MAdCAM抗体は、本開示の1つ以上のヒト抗MAdCAM抗体の1つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列を含む。
【００９２】
別の局面において、本開示は、「キメラ抗体」を提供する。いくつかの態様において、キメラ抗体は、ある1つの抗体由来の1つ以上の領域と1つ以上の他の抗体由来の1つ以上の領域を含有する抗体を指す。好ましい態様において、CDRの1つ以上が、本開示のヒト抗MAdCAM抗体に由来する。より好ましい態様において、CDRの全てが、本開示のヒト抗MAdCAM抗体に由来する。別の好ましい態様において、本開示の1を超えるヒト抗MAdCAM抗体由来のCDRを、キメラ抗体において混合および一致させる。例として、キメラ抗体は、第二のヒト抗MAdCAM抗体の軽鎖由来のCDR2およびCDR3と組み合わされ得る第一のヒト抗MAdCAM抗体の軽鎖由来のCDR1を含んでよく、重鎖由来のCDRは、第三の抗MAdCAM抗体に由来してよい。さらに、フレームワーク領域は、同じ抗MAdCAM抗体の1つに由来しても、ヒト抗体などの1つ以上の異なる抗体に由来しても、ヒト化抗体に由来してもよい。
【００９３】
「中和抗体」、「阻害性抗体」またはアンタゴニスト抗体は、α4β7もしくはα4β7発現細胞、または任意の他の同族リガンドもしくは同族リガンド発現細胞のMAdCAMへの結合を少なくとも約20％阻害する抗体である。好ましい態様において、抗体は、α4β7インテグリンまたはα4β7発現細胞のMAdCAMへの結合を、少なくとも40％、より好ましくは60％、さらにより好ましくは80％、85％、90％、95％または100％低減および／または阻害する。結合低減は、当業者に公知の任意の手段によって、例えば、インビトロの競合結合アッセイにおいて測定されるように、測定されてよい。α4β7発現細胞のMAdCAMへの結合の低減を測定する一例は、実施例Iに提示される。
【００９４】
抗体の断片または類似体は、本明細書の教示に従って、当業者が容易に調製することができる。断片または類似体の好ましいアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界近くに存在する。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを公共または所有権のある配列データベースと比較することによって特定することができる。好ましくは、コンピュータ化された比較方法を使用して、既知の構造および／または機能の他のタンパク質に存在する配列モチーフまたは予測されるタンパク質立体構造ドメインを特定する。既知の3次元構造へ折り畳むタンパク質配列を特定するための方法は公知である（Bowie et al., Science, 253:164 (1991)）。
【００９５】
用語「表面プラズモン共鳴」は、本明細書において使用される場合、例えばBIAcoreシステム（Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, N.J.）を使用して、バイオセンサーマトリクス内のタンパク質濃度の変化を検出することによってリアルタイムの生体特異的相互作用の解析を可能にする光学的現象を指す。さらなる説明については、Jonsson, U., et al., Ann. Biol. Clin., 51:19-26 (1993); Jonsson, U., et al., Biotechniques, 11:620-627 (1991); Johnsson, B., et al., J. Mol. Recognit., 8:125-131 (1995); および Johnnson, B., et al., Anal. Biochem., 198:268-277 (1991)を参照されたい。
【００９６】
用語「koff」は、抗体/抗原複合体からの抗体の解離についての解離速度定数を指す。
【００９７】
用語「Kd」は、特定の抗体-抗原相互作用の解離定数を指す。抗体は、解離定数が≦1μM、好ましくは≦100nM、最も好ましくは≦10nMであるときに、抗原に結合すると言われる。
【００９８】
用語「エピトープ」は、免疫グロブリンもしくはT細胞受容体に特異的結合するかまたはそれ以外の方法で分子と相互作用することができる、任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基群からなり、通常、特異的な3次元構造特性だけでなく、特異的な電荷特性も有する。エピトープは、「線状」であっても「立体構造」であってもよい。線状エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（抗体など）との間の相互作用の点の全てが、そのタンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に生じる。立体構造エピトープでは、相互作用の点は、互いに分離されているタンパク質上のアミノ酸残基にわたって生じる。
【００９９】
本明細書において使用される場合、20個の従来のアミノ酸およびそれらの略称は、慣例の用法に従う。参照により本明細書に組み入れられる、Immunology-A Synthesis （2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. （1991））を参照されたい。また、20個の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、D-アミノ酸）、α-,α-二置換型アミノ酸などの非天然アミノ酸、N-アルキルアミノ酸、乳酸、および従来のもの以外の他のアミノ酸も、本開示のポリペプチドのための好適な構成成分であり得る。従来のもの以外のアミノ酸の例は、4-ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタマート、ε-N,N,N-トリメチルリシン、ε-N-アセチルリシン、O-ホスホセリン、N-アセチルセリン、N-ホルミルメチオニン、3-メチルヒスチジン、5-ヒドロキシリシン、s-N-メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸およびイミノ酸（例えば、4-ヒドロキシプロリン）を含む。本明細書において使用されるポリペプチド表記では、標準的用法および慣例に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【０１００】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において言及される場合、リボヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドまたはいずれかのヌクレオチドタイプの改変形態のいずれかの、少なくとも10塩基長の重合形態のヌクレオチドを意味する。その用語は、一本鎖および二本鎖の形態のDNAを含む。
【０１０１】
用語「単離されたポリヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、ゲノム、cDNAもしくは合成起源またはそれらの一部の組み合わせのポリヌクレオチドであって、その起源に基づいて、「単離されたポリヌクレオチド」が、（1）「単離されたポリヌクレオチド」が天然において見いだされるポリヌクレオチドの全部もしくは一部と会合していない、（2）それが天然において連結されていないポリヌクレオチドに機能的に連結されている、または（3）より大きな配列の一部として天然に存在していない、ポリヌクレオチドを意味するものとする。
【０１０２】
本明細書において言及される用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に存在するおよび天然に存在しないオリゴヌクレオチド連結によって一緒に連結された、天然に存在するおよび改変されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般に200塩基またはより短い長さを含むポリヌクレオチドサブセットである。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、10〜60塩基長であり、最も好ましくは、12、13、14、15、16、17、18、19、または20〜40塩基長である。オリゴヌクレオチドは、通常、例えばプローブの場合に一本鎖であるが；オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子変異体の構築において使用する場合に二本鎖であり得る。本開示のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスのいずれかのオリゴヌクレオチドであることができる。
【０１０３】
本明細書において言及される用語「天然に存在するヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。本明細書において言及される用語「改変されたヌクレオチド」は、改変または置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。本明細書において言及される用語「オリゴヌクレオチド連結」は、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホラニラダート、ホスホラミダートなどのオリゴヌクレオチド連結を含む。例えば、LaPlanche et al., Nucl. Acids Res. 14:9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106:6077(1984); Stein et al., Nucl. Acids Res., 16:3209(1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6:539(1991); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England(1991)); Stec et al., U.S. Patent No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews, 90:543(1990)を参照されたい。それらの開示は、参照により本明細書に組み入れられる。オリゴヌクレオチドは、所望であれば、検出用の標識を含むことができる。
【０１０４】
「機能的に連結された」配列は、関心対象の遺伝子と隣接する発現制御配列と、関心対象の遺伝子を制御するようにトランスにまたは少し離れて作用する発現制御配列の両方を含む。用語「発現制御配列」は、本明細書において使用される場合、それらが連結されているコード配列の発現およびプロセシングをもたらすのに必要である、ポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモーターおよびエンハンサー配列；スプライシングおよびポリアデニル化シグナルなどの効率的なRNAプロセシングシグナル；細胞質mRNAを安定化する配列；翻訳効率を増強する配列（すなわち、コザック共通配列）；タンパク質安定性を増強する配列；ならびに、所望であれば、タンパク質分泌を増強する配列を含む。そのような制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる；原核生物では、そのような制御配列は、一般に、プロモーター、リボソーム結合部位および転写終結配列を含む；真核生物では、一般に、そのような制御配列は、プロモーターおよび転写終結配列を含む。用語「制御配列」は、最小限でも、存在が発現およびプロセシングに必須である全ての構成成分を含むことを意図しており、また、存在が有利である追加の構成成分、例えば、リーダー配列および融合パートナー配列を含むこともできる。
【０１０５】
用語「ベクター」は、本明細書において使用される場合、それに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことを意図している。ベクターの1つのタイプは、追加のDNAセグメントが連結され得る環状の二本鎖DNAループを指す「プラスミド」である。別のタイプのベクターは、追加のDNAセグメントがウイルスゲノム内に連結され得るウイルスベクターである。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソームの哺乳動物ベクター）を、宿主細胞への導入によって宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、ある特定のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を指令することができる。そのようなベクターは、本明細書において、「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と称される。一般に、組換えDNA技術において実用的な発現ベクターは、しばしば、プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されている形態のベクターであることから、互換的に使用してよい。しかしながら、本開示は、等価の機能を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などのそのような他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。
【０１０６】
用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）は、本明細書において使用される場合、組換え発現ベクターが導入された細胞を指すことを意図している。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなくそのような細胞の子孫も指すことを意図していると理解されるべきである。変異または環境的影響のいずれかに起因して後世に特定の改変が生じる可能性があるため、そのような子孫は、実際に、親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書において使用される場合の「宿主細胞」という用語の範囲内になお含まれる。
【０１０７】
本明細書において言及される用語「選択的にハイブリダイズする」は、検出可能かつ特異的に結合することを意味する。本開示に従うポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよびそれらの断片は、非特異的核酸への検出可能な相当量の結合を最小限に抑えるハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。「高ストリンジェンシー」または「高度にストリンジェントな」条件を使用して、当技術分野において公知で本明細書において考察されているような選択的なハイブリダイゼーション条件を達成することができる。「高ストリンジェンシー」または「高度にストリンジェントな」条件の例は、あるポリヌクレオチドと別のポリヌクレオチド（一方のポリヌクレオチドを膜などの固体表面に付着してよい）とを、6×SSPEまたはSSC、50％ホルムアミド、5×デンハート試薬、0.5％ SDS、100μg/mlの変性した断片化サケ精子DNAのハイブリダイゼーション緩衝液中、42℃のハイブリダイゼーション温度で12〜16時間インキュベートし、続いて、1×SSC、0.5％ SDSの洗浄緩衝液を使用して55℃で2回洗浄する方法である。また、Sambrook et al.（前記） pp. 9.50-9.55も参照されたい。
【０１０８】
用語「配列同一性パーセント」は、ヌクレオチド配列に関して、最大の一致が得られるように整列されたときに同じである2つの配列中の残基を指す。配列同一性比較の長さは、少なくとも約9ヌクレオチド、通常は少なくとも約18ヌクレオチド、より通常には少なくとも約24ヌクレオチド、典型的には少なくとも約28ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約32ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約36、48またはより多くのヌクレオチドに及ぶ一続きのものであってよい。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用できる当技術分野において公知の多数の異なるアルゴリズムがある。例として、ポリヌクレオチド配列は、Wisconsin Package Version 10.3（Accelrys, San Diego, CA）内のプログラムであるFASTA、GapまたはBestfitを使用して比較することができる。例えばプログラムFASTA2およびFASTA3を含むFASTAは、質問配列と検索配列との間の最高の重複の領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Pearson, Methods Enzymol., 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol., 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol., 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol., 276: 71-84 (1998)；参照により本明細書に組み入れられる）。他に規定されない限り、特定のプログラムまたはアルゴリズム用のデフォルトパラメーターが使用される。例として、ヌクレオチド配列間の配列同一性パーセントは、参照により本明細書に組み入れられるWisconsin Package Version 10.3に提供されているとおり、FASTAをそのデフォルトパラメーター（ワードサイズ6およびスコア行列についてのNOPAMファクター）と共に使用してまたはGapをそのデフォルトパラメーターと共に使用して、決定することができる。
【０１０９】
ヌクレオチド配列への言及は、他に規定されない限り、その相補体を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸分子への言及は、その相補性配列を持つその相補鎖を包含すると理解されるべきである。
【０１１０】
分子生物学分野において、研究者は、「配列同一性パーセント」、「配列類似性パーセント」および「配列相同性パーセント」という用語を互換的に使用する。本願において、これらの用語は、ヌクレオチド配列のみに関して同じ意味を有するものとする。
【０１１１】
核酸またはその断片に言及するとき、用語「実質的類似性」または「実質的配列類似性」は、適切なヌクレオチド挿入または欠失が別の核酸（またはその相補鎖）と最適に整列されたとき、上で考察したとおりのFASTA、BLASTまたはGapなどの任意の周知の配列同一性のアルゴリズムによって決定した場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約85％、好ましくは少なくとも約90％、より好ましくは少なくとも約95％、96％、97％、98％または99％においてヌクレオチド配列同一性があることを示す。
【０１１２】
ポリペプチドに適用される場合、用語「実質的同一性」は、2つのペプチド配列が、例えばデフォルトギャップ重みを使用したプログラムGAPまたはBESTFITによって最適に整列されたとき、少なくとも75％または80％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％または95％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも98％または99％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）を持つ側鎖（R基）を有する別のアミノ酸残基によって置換されていることである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的性質を実質的には変化させない。2以上のアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合に、配列同一性パーセントまたは類似性の程度を、置換の保存的性質を補正するように上向きに調整してよい。この調整を行うための手段は当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Pearson, Methods Mol. Biol., 24: 307-31 (1994)を参照されたい。類似の化学的性質を持つ側鎖を有するアミノ酸の群の例は、1）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；2）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；3）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；4）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；5）塩基性側鎖：リシン、アルギニンおよびヒスチジンを含み；かつ、6）硫黄含有側鎖は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、グルタマート-アスパルタート、およびアスパラギン-グルタミンである。
【０１１３】
あるいは、保存的置換は、参照により本明細書に組み入れられるGonnet et al., Science, 256: 1443-45 (1992)に開示されているPAM250対数尤度行列において正値を有する任意の変化である。「中程度に保存的な」置換は、PAM250対数尤度行列において非負値を有する任意の変化である。
【０１１４】
ポリペプチドについての配列類似性は、典型的には、配列解析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含めた様々な置換、欠失および他の修飾に割り当てられる類似性の尺度を使用して、類似の配列をマッチさせる。例として、GCGは、異なる種の生物由来の相同性ポリペプチドなどの密接に関連したポリペプチド間または野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定するためにデフォルトパラメーターと共に使用できる「Gap」および「Bestfit」などのプログラムを含有する。例えば、Wisconsin package Version 10.3を参照されたい。ポリペプチド配列はまた、Wisconsin package Version 10.3内のプログラムである、デフォルトまたは推奨パラメーターを使用したFASTAを使用して比較することができる。FASTA（例えば、FASTA2およびFASTA3）は、質問配列と検索配列との間の最高の重複の領域のアラインメントおよび配列同一性パーセントを提供する（Pearson (1990); Pearson (2000)）。本開示の配列を異なる生物由来の多数の配列を含有するデータベースと比較するときの別の好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメーターを使用したコンピュータプログラムBLAST、特にblastpまたはtblastnである。例えば、参照により本明細書に組み入れられる、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-402 (1997)を参照されたい。
【０１１５】
相同性について比較されるポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約16アミノ酸残基、通常は少なくとも約20残基、より通常には少なくとも約24残基、典型的には少なくとも約28残基、好ましくは約35残基超である。多数の異なる生物由来の配列を含有するデータベースを検索するとき、アミノ酸配列を比較することが好ましい。
【０１１６】
本明細書において使用される場合、用語「標識」または「標識された」は、抗体中への別の分子の組み込みを指す。一態様において、標識は、検出可能なマーカー、例えば、放射性標識されたアミノ酸の組み込み、または、マークされたアビジン（例えば、光学的または比色定量的方法によって検出できる蛍光マーカーまたは酵素活性を含有するストレプトアビジン）によって検出できるビオチニル部分のポリペプチドへの付着である。別の態様において、標識またはマーカーは、治療用物質、例えば、薬物コンジュゲートまたは毒素であることができる。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法は、当技術分野において公知であり、これらの方法を使用してよい。ポリペプチド用の標識の例は、以下を含むが、これらに限定されない：放射性同位体または放射性核種（例えば、3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I）、蛍光標識（例えば、FITC、ローダミン、ランタニドリン光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学ルミネセンスマーカー、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体用の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）、ガドリニウムキレートなどの磁気物質、百日咳毒素などの毒素、タキソール、サイトカラシンB、グラミシジンD、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンD、1-デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、およびピューロマイシン、ならびにそれらの類似体または相同体。いくつかの態様において、標識は、潜在的な立体障害を低減するように様々な長さのスペーサーアームによって付着される。
【０１１７】
用語「作用物質」は、本明細書において、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的高分子、または生物学的材料から作られた抽出物を表すために使用される。用語「薬学的物質または薬物」は、本明細書において使用される場合、患者に適正に投与されたときに所望の治療効果を誘導することができる化学化合物または組成物を指す。本明細書における他の化学用語は、参照により本明細書に組み入れられるThe McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms （Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)）によって例示されているような当技術分野における慣例の用法に従って使用される。
【０１１８】
用語「抗炎症性」または「免疫調節性」物質は、本明細書において、ヒトを含めた対象における炎症性疾患を含めた炎症を阻害する機能的性質を有する作用物質を指すために使用される。本開示の様々な態様において、炎症性疾患は、クローン病、潰瘍性大腸炎、憩室疾患、胃炎、肝疾患、原発性胆汁性硬化症、硬化性胆管炎を含めた胃腸管の炎症性疾患であり得るが、これらに限定されない。炎症性疾患はまた、腹部疾患（腹膜炎、虫垂炎、胆道疾患を含む）、急性横断性脊髄炎、アレルギー性皮膚炎（アレルギー性皮膚、アレルギー性湿疹、皮膚アトピー、アトピー性湿疹、アトピー性皮膚炎、皮膚炎症、炎症性湿疹、炎症性皮膚炎、ノミ皮膚（flea skin）、粟粒性皮膚炎、粟粒性湿疹、イエダニ皮膚を含む）、強直性脊椎炎（ライター症候群）、喘息、気道炎症、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、胆道閉鎖症、膀胱炎症、乳癌、心血管炎症（血管炎、リウマチ性爪郭梗塞、下腿潰瘍、多発性筋炎、慢性血管炎症、心膜炎、慢性閉塞性肺疾患を含む）、慢性膵炎、神経周囲炎症、大腸炎（アメーバ性大腸炎、感染性大腸炎、細菌性大腸炎、クローン大腸炎、虚血性大腸炎、潰瘍性大腸炎、特発性直腸結腸炎、炎症性腸疾患、偽膜性大腸炎を含む）、膠原血管病（関節リウマチ、SLE、全身性進行性硬化症、混合結合組織病、真性糖尿病）、クローン病（限局性腸炎、肉芽腫性回腸炎、回結腸炎、消化器系炎症）、脱髄疾患（脊髄炎、多発性硬化症、散在性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、静脈周囲性脱髄、ビタミンB12欠乏症、ギラン-バレー症候群、MS関連レトロウイルスを含む）、皮膚筋炎、憩室炎、滲出性下痢、胃炎、肉芽腫性肝炎、肉芽腫性炎症、胆嚢炎、インスリン依存性真性糖尿病、肝臓炎症性疾患（肝臓線維症、原発性胆汁性肝硬変、肝炎、硬化性胆管炎）、肺炎症（特発性肺線維症、肺好酸球性肉芽腫、肺組織球増殖症X、細気管支周囲炎症、急性気管支炎）、性病性リンパ肉芽腫、悪性黒色腫、口腔/歯疾患（歯肉炎、歯周病を含む）、粘膜炎、筋骨格系炎症（筋炎）、非アルコール性脂肪性肝炎（非アルコール性脂肪肝疾患）、眼&眼窩炎症（ブドウ膜炎、視神経炎、周辺リウマチ性潰瘍、周辺角膜炎症を含む）、変形性関節症、骨髄炎、咽頭炎症、多発性関節炎、直腸炎、乾癬、放射線傷害、サルコイドーシス、鎌状赤血球壊死症、表在性血栓性静脈炎、全身性炎症反応症候群、甲状腺炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病、急性火傷、ベーチェット症候群、シェーグレン症候群を含むが、これらに限定されない。
【０１１９】
患者および対象という用語は、ヒトおよび獣医学的対象を含む。
【０１２０】
ヒト抗MAdCAM抗体およびその特徴付け
一態様において、本開示は、ヒトCDR配列を含む抗MAdCAM抗体を提供する。好ましい態様において、本開示は、ヒト抗MAdCAM抗体を提供する。いくつかの態様において、そのゲノムにヒト免疫グロブリン遺伝子が含まれる非ヒトトランスジェニック動物、例えば齧歯類を、当該トランスジェニック動物がヒト抗体を産生するように免疫化することによって、ヒト抗MAdCAM抗体が産生される。いくつかの態様において、本開示は、補体と結合しない抗MAdCAM抗体を提供する。
【０１２１】
好ましい態様において、抗MAdCAM抗体は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modである。別の好ましい態様において、抗MAdCAM抗体は、SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68もしくは150から選択されるアミノ酸配列（シグナル配列を有するまたは有さない）、または前記アミノ酸配列のいずれか1つの可変領域、またはこれらのアミノ酸配列由来の1つ以上のCDRを含む軽鎖を含む。別の好ましい態様において、抗MAdCAM抗体は、SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64もしくは148から選択されるアミノ酸配列（シグナル配列を有するまたは有さない）、または可変領域のアミノ酸配列、または前記アミノ酸配列由来の1つ以上のCDRを含む重鎖を含む。また、上記の配列のいずれか1つのCDR1の始まりからCDR3の終わりまでのアミノ酸配列を含むヒト抗MAdCAM抗体も本開示に含まれる。本開示は、上記の配列のいずれかの1つ以上のFR領域を含む抗MAdCAM抗体をさらに提供する。
【０１２２】
本開示は、1つ以上の改変がなされている前述のアミノ酸配列のうちの1つを含む抗MAdCAM抗体をさらに提供する。いくつかの態様において、化学反応性であり得る抗体中のシステインは、非限定的にアラニンまたはセリンなどの別の残基と置換される。一態様において、置換は、非標準システインにおいてである。置換は、可変ドメインのCDRもしくはフレームワーク領域においてまたは抗体の定常ドメインにおいてなされてよい。いくつかの態様において、システインは、標準である。
【０１２３】
いくつかの態様において、アミノ酸置換は、抗体中の潜在的なタンパク分解性部位を排除するようになされる。そのような部位は、可変ドメインのCDRもしくはフレームワーク領域または抗体の定常ドメインに存在し得る。システイン残基の置換およびタンパク分解性部位の除去は、抗体産物において不均一性を減少させ得る。いくつかの態様において、潜在的な脱アミド化部位を形成するアスパラギン-グリシン対は、残基の一方または両方を変更することによって排除される。いくつかの態様において、アミノ酸置換は、本開示の抗体の可変領域に、潜在的なグリコシル化部位を付加または除去するようになされる。
【０１２４】
いくつかの態様において、本開示の抗MAdCAM抗体の重鎖のC末端リシンは、切断されている。本開示の様々な態様において、抗MAdCAM抗体の重鎖および軽鎖は任意でシグナル配列を含んでよい。
【０１２５】
一局面において、本開示は、12個の阻害性ヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体およびそれらを産生するハイブリドーマ細胞株を提供する。表1は、完全長の重鎖および軽鎖（シグナル配列を含む）をコードする核酸の配列識別子（SEQ ID NO：）、ならびに対応する完全長の推定アミノ酸配列を列記する。
【０１２６】
（表１）
2020533953.tif 000003
【０１２７】
別の局面において、本開示は、上で特定されたヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の特定の改変バージョンを提供する。表2は、改変抗体のDNAおよびタンパク質配列についての配列識別子を列記する。
【０１２８】
（表２）
2020533953.tif 000004
【０１２９】
抗MAdCAM抗体のクラスおよびサブクラス
抗体は、IgG、IgM、IgE、IgAまたはIgD分子であり得る。好ましい態様において、抗体は、IgGクラスであり、かつ、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4サブクラスである。より好ましい態様において、抗MAdCAM抗体は、サブクラスIgG2またはIgG4である。別の好ましい態様において、抗MAdCAM抗体は、IgG2である抗体1.7.2、1.8.2、7.16.6、7.20.5、7.26.4、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modもしくは7.26.4-mod、またはIgG4である6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1もしくは9.8.2と同じクラスおよびサブクラスである。
【０１３０】
抗MAdCAM抗体のクラスおよびサブクラスは、当技術分野において公知の任意の方法によって決定してよい。一般に、抗体のクラスおよびサブクラスは、抗体の特定のクラスおよびサブクラスに特異的である抗体を使用して決定してよい。そのような抗体は、市販されている。ELISA、ウェスタンブロットだけでなく他の技術も、クラスおよびサブクラスを決定することができる。あるいは、抗体の重鎖および／または軽鎖の定常ドメインの全部または一部をシーケンシングし、それらのアミノ酸配列を免疫グロブリンの様々なクラスおよびサブクラスの既知のアミノ酸配列と比較し、そして、抗体のクラスおよびサブクラスを最高の配列同一性を示すクラスとして決定することによって、クラスおよびサブクラスを決定してもよい。
【０１３１】
種選択性および分子選択性
本開示の別の局面において、抗MAdCAM抗体は、種選択性および分子選択性の両方を実証する。一態様において、抗MAdCAM抗体は、ヒト、カニクイザルまたはイヌのMAdCAMに結合する。いくつかの態様において、抗MAdCAM抗体は、マーモセットなどの新世界サル種には結合しない。本明細書の教示に従って、当技術分野において周知の方法を使用して抗MAdCAM抗体についての種選択性を決定してよい。例として、ウェスタンブロット、FACS、ELISAまたは免疫組織化学を使用して種選択性を決定してよい。好ましい態様において、免疫組織化学を使用して種選択性を決定してよい。
【０１３２】
いくつかの態様において、MAdCAMに特異的に結合する抗MAdCAM抗体は、VCAM、フィブロネクチンまたは任意の他の抗原と比べて少なくとも10倍、好ましくは少なくとも20、30、40、50、60、70、80または90倍、最も好ましくは少なくとも100倍の、MAdCAMに対する選択性を有する。好ましい態様において、抗MAdCAM抗体は、MAdCAM以外のVCAM、フィブロネクチンまたは任意の他の抗原への結合をほとんど示さない。本明細書の教示に従って、当技術分野において周知の方法を使用してMAdCAMに対する抗MAdCAM抗体の選択性を決定してよい。例として、ウェスタンブロット、FACS、ELISAまたは免疫組織化学を使用して選択性を決定してよい。
【０１３３】
MAdCAMへの抗MAdCAM抗体の結合親和性
本開示の別の局面において、抗MAdCAM抗体は、高い親和性でMAdCAMに特異的に結合する。一態様において、抗MAdCAM抗体は、BIAcoreなどの表面プラズモン共鳴によって測定した場合に3×10-8 M以下のKdで、MAdCAMに特異的に結合する。より好ましい態様において、抗体は、1×10-8以下または1×10-9 M以下のKdで、MAdCAMに特異的に結合する。さらにより好ましい態様において、抗体は、1×10-10 M以下のKdで、MAdCAMに特異的に結合する。他の好ましい態様において、本開示の抗体は、2.66×10-10 M以下、2.35×10-11 M以下または9×10-12 M以下のKdで、MAdCAMに特異的に結合する。別の好ましい態様において、抗体は、1×10-11 M以下のKdで、MAdCAMに特異的に結合する。別の好ましい態様において、抗体は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modから選択される抗体と実質的に同じKdで、MAdCAMに特異的に結合する。参照抗体と「実質的に同じKd」を有する抗体は、同じ実験での参照抗体のKdと比較して、±100pM、好ましくは±50pM、より好ましくは±20pM、なおより好ましくは±10pM、±5pMまたは±2pMであるKdを有する。別の好ましい態様において、抗体は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modから選択される抗体由来の1つ以上の可変ドメインまたは1つ以上のCDRを含む抗体と実質的に同じKdで、MAdCAMに結合する。なお別の好ましい態様において、抗体は、SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68、148もしくは450から選択されるアミノ酸配列（シグナル配列を有するまたは有さない）の1つまたはその可変ドメインを含む抗体と実質的に同じKdで、MAdCAMに結合する。別の好ましい態様において、抗体は、SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68、148または450から選択されるアミノ酸配列を含む抗体由来の1つ以上のCDRを含む抗体と実質的に同じKdで、MAdCAMに結合する。
【０１３４】
MAdCAMへの抗MAdCAM抗体の結合親和性は、当技術分野において公知の任意の方法によって決定してよい。一態様において、結合親和性は、競合的ELISA、RIA、またはBIAcoreなどの表面プラズモン共鳴によって測定することができる。より好ましい態様において、結合親和性は、表面プラズモン共鳴によって測定される。さらにより好ましい態様において、結合親和性および解離速度は、BIAcoreを使用して測定される。結合親和性を決定する一例は、下の実施例IIに記載される。
【０１３５】
抗MAdCAM抗体の半減期
本開示の別の目的によれば、抗MAdCAM抗体は、インビトロまたはインビボで少なくとも1日の半減期を有する。好ましい態様において、該抗体またはその部分は、少なくとも3日の半減期を有する。より好ましい態様において、該抗体またはその部分は、4日またはより長い半減期を有する 。別の態様において、該抗体またはその部分は、8日またはより長い半減期を有する。別の態様において、抗体またはその抗原結合部分は、下で考察するとおり、より長い半減期を有するように誘導体化または改変される。別の好ましい態様において、抗体は、例えば2000年2月24日に公開されたWO 00/09560に記載されている、血清半減期を増加させる点変異を含有してよい。
【０１３６】
抗体半減期は、当業者に公知の任意の手段によって測定してよい。例として、抗体半減期は、ウェスタンブロット、ELISAまたはRIAによって、適切な期間にわたって測定してよい。抗体半減期は、霊長類、例えばカニクイザルまたはヒトなどの、任意の適切な動物において測定してよい。
【０１３７】
抗MAdCAM抗体によって認識されるMAdCAMエピトープの特定
本開示はまた、本明細書に提供されるヒト抗MAdCAM抗体と同じ抗原またはエピトープに結合するヒト抗MAdCAM抗体を提供する。さらに、本開示は、ヒト抗MAdCAM抗体と競合または交差競合するヒト抗MAdCAM抗体を提供する。好ましい態様において、ヒト抗MAdCAM抗体は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modである。別の好ましい態様において、ヒト抗MAdCAM抗体は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modから選択される抗体由来の1つ以上の可変ドメインまたは1つ以上のCDRを含む。なお別の好ましい態様において、ヒト抗MAdCAM抗体は、SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68、148もしくは150から選択されるアミノ酸配列（シグナル配列を有するまたは有さない）の1つまたはその可変ドメインを含む。別の好ましい態様において、ヒト抗MAdCAM抗体は、SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68、148または150から選択されるアミノ酸配列のうちの1つを含む抗体に由来する1つ以上のCDRを含む。大いに好ましい態様において、抗MAdCAM抗体は、別のヒト抗体である。
【０１３８】
抗MAdCAM抗体が別の抗MAdCAM抗体と同じ抗原に結合するかどうかを当技術分野において公知の多種多様な方法を使用して判定してよい。例として、既知の抗MAdCAM抗体を使用して抗原を捕捉し、抗MAdCAM抗体から抗原を溶離させ、次いで、溶離した抗原に試験抗体が結合するかどうかを判定することができる。飽和条件下で抗MAdCAM抗体をMAdCAMに結合させ、次いで、MAdCAMに結合する試験抗体の能力を測定することによって、抗体が抗MAdCAM抗体と競合するかどうかを判定してよい。試験抗体が抗MAdCAM抗体と同時にMAdCAMに結合できる場合、試験抗体は、抗MAdCAM抗体とは異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験抗体が同時にMAdCAMに結合できない場合、試験抗体は、ヒト抗MAdCAM抗体と競合する。この実験は、ELISAまたは表面プラズモン共鳴、または好ましくは、BIAcoreを使用して実施してよい。抗MAdCAM抗体が別の抗MAdCAM抗体と交差競合するかどうかを試験するために、上記の競合方法を、両方向で使用して、すなわち、既知の抗体が試験抗体をブロックするかどうかとその逆を判定してよい。
【０１３９】
軽鎖および重鎖遺伝子の利用
本開示はまた、ヒトκ遺伝子によってコードされる軽鎖可変領域を含む抗MAdCAM抗体を提供する。好ましい態様において、軽鎖可変領域は、ヒトVκ A2、A3、A26、B3、O12またはO18遺伝子ファミリーによってコードされる。様々な態様において、軽鎖は、生殖系列ヒトVκ A2、A3、A26、B3、O12またはO18配列からの11以下、6以下または3以下のアミノ酸置換を含む。好ましい態様において、アミノ酸置換は、保存的置換である。
【０１４０】
SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48および150は、13個の抗MAdCAM抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4および9.8.2およびX481.2の完全長のカッパ軽鎖のアミノ酸配列を提供する。図1K〜1Tは、12個の抗MAdCAM抗体の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列の、それらが由来する生殖系列配列とのアラインメントである。図2Aは、12個の抗MAdCAM抗体のカッパ軽鎖の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列の互いのアラインメントを示す。本明細書の教示に従って、当業者は、生殖系列配列と追加の抗MAdCAM抗体の抗体配列との間の相違を判定することもできる。SEQ ID NO：54、58、62、66または68は、それぞれ、親抗MAdCAM抗体6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1または7.26.4からアミノ酸置換によって改変された、5つの追加の抗MAdCAM抗体6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modの完全長のカッパ軽鎖のアミノ酸配列を提供する。
【０１４１】
好ましい態様において、抗MAdCAM抗体のVLは、生殖系列アミノ酸配列に対して、抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modのVLのいずれか1つ以上と同じ変異を含有する。本開示は、例示された抗体と同じヒトVκおよびヒトJk遺伝子を利用する抗MAdCAM抗体を含む。いくつかの態様において、抗体は、1つ以上の例示された抗体と同じ、生殖系列からの変異の1つ以上を含む。いくつかの態様において、抗体は、例示された抗体の1つ以上と同じ位置の1つ以上において、異なる置換を含む。例えば、抗MAdCAM抗体のVLは、抗体7.16.6に存在するものと同じである1つ以上のアミノ酸置換、および抗体7.26.4と同じであるもう1つのアミノ酸置換を含有し得る。このように、抗体結合の異なる特徴を、例えば、MAdCAMに対する抗体の親和性または抗原からのその解離速度を変更させるために、組み合わせるおよび一致させることができる。別の態様において、変異は、抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modのVLのいずれか1つ以上に見いだされる位置と同じ位置でなされるが、同じアミノ酸を使用する代わりに保存的アミノ酸置換がなされる。例えば、抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの1つにおける生殖系列と比較したアミノ酸置換がグルタマートである場合、アスパルタートに保存的に置換してよい。同様に、アミノ酸置換がセリンである場合、トレオニンに保存的に置換してよい。
【０１４２】
別の好ましい態様において、軽鎖は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modのVLのアミノ酸配列と同じであるアミノ酸配列を含む。別の大いに好ましい態様において、軽鎖は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの軽鎖のCDR領域と同じであるアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様において、軽鎖は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの軽鎖の少なくとも1つのCDR領域を有するアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様において、軽鎖は、同じVκおよびJκ遺伝子を使用する異なる軽鎖由来のCDRを有するアミノ酸配列を含む。より好ましい態様において、異なる軽鎖由来のCDRは、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modから得られる。別の好ましい態様において、軽鎖は、シグナル配列を有するまたは有さないSEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、64、66、68または150から選択されるアミノ酸配列を含む。別の態様において、軽鎖は、SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65もしくは67から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列（シグナル配列を有するまたは有さない）、またはそれからの1〜11個のアミノ酸挿入、欠失もしくは置換を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、アミノ酸置換は、保存的アミノ酸置換である。別の態様において、該抗体またはその部分は、ラムダ軽鎖を含む。
【０１４３】
本開示はまた、ヒトVH遺伝子配列またはヒトVH遺伝子に由来する配列を含む、抗MAdCAM抗体またはその部分を提供する。一態様において、重鎖アミノ酸配列は、ヒトVH 1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33または4-4遺伝子ファミリーに由来する。様々な態様において、重鎖は、生殖系列ヒトVH 1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33または4-4遺伝子配列からの15以下、6以下または3以下のアミノ酸変化を含む。
【０１４４】
SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46および148は、13個の抗MAdCAM抗体の完全長の重鎖のアミノ酸配列を提供する。図1A〜1Jは、12個の抗MAdCAM抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列の、それらが由来する生殖系列配列とのアラインメントである。図2Bは、12個の抗MAdCAM抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列の互いのアラインメントを示す。本明細書の教示および本開示のヌクレオチド配列に従って、当業者は、12個の抗MAdCAM重鎖および生殖系列重鎖のコードされたアミノ酸配列を判定し、生殖系列配列と抗体配列との間の相違を判定することもできる。SEQ ID NO：52、56、60および64は、それぞれ、親抗MAdCAM抗体6.22.2、6.34.2および6.67.1からアミノ酸置換によって改変された、抗MAdCAM抗体6.22.2-mod、6.34.2-modおよび6.67.1-modの完全長の重鎖のアミノ酸配列を提供する。1つのさらなる改変された抗MAdCAM抗体7.26.4-modは、SEQ ID NO：42である完全長の重鎖アミノ酸配列を有する。
【０１４５】
好ましい態様において、抗MAdCAM抗体のVHは、生殖系列アミノ酸配列に対して、抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modのVHのいずれか1つ以上と同じ変異を含有する。上で考察されたものと同様に、抗体は、1つ以上の例示された抗体と同じ、生殖系列からの変異の1つ以上を含む。いくつかの態様において、抗体は、例示された抗体の1つ以上と同じ位置の1つ以上において、異なる置換を含む。例えば、抗MAdCAM抗体のVHは、抗体7.16.6に存在するものと同じである1つ以上のアミノ酸置換、および抗体7.26.4と同じであるもう1つのアミノ酸置換を含有し得る。このように、抗体結合の異なる特徴を、例えば、MAdCAMに対する抗体の親和性または抗原からのその解離速度を変更させるために、組み合わせるおよび一致させることができる。別の態様において、生殖系列と比較したアミノ酸置換は、参照抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modのVHのいずれか1つ以上に見いだされる生殖系列からの置換と同じ位置でなされるが、その位置は、参照抗体と比較して保存的置換である、異なる残基で置換される。
【０１４６】
別の好ましい態様において、重鎖は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modのVHのアミノ酸配列と同じであるアミノ酸配列を含む。別の大いに好ましい態様において、重鎖は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの重鎖のCDR領域と同じであるアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様において、重鎖は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.4、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの重鎖の少なくとも1つのCDR領域由来のアミノ酸配列を含む。別の好ましい態様において、重鎖は、異なる重鎖由来のCDRを有するアミノ酸配列を含む。より好ましい態様において、異なる重鎖由来のCDRは、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modから得られる。別の好ましい態様において、重鎖は、シグナル配列を有するまたは有さないSEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64または148から選択されるアミノ酸配列を含む。別の態様において、重鎖は、SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59、63もしくは149から選択されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列、またはそれからの1〜15個のアミノ酸挿入、欠失もしくは置換を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。別の態様において、置換は、保存的アミノ酸置換である。
【０１４７】
抗体および抗体産生細胞株を産生する方法
免疫化
本開示の一態様において、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖遺伝子座の一部または全部を含む非ヒト動物をMAdCAM抗原で免疫化することによって産生される。好ましい態様において、非ヒト動物は、XENOMOUSE（商標）動物であり、これは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の大きな断片を含みかつマウス抗体産生を欠損している、操作されたマウス系統である。例えば、Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) ならびに米国特許5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598および6,130,364を参照されたい。また、WO 91/10741、WO 94/02602、WO 96/34096およびWO 96/33735、WO 98/16654、WO 98/24893、WO 98/50433、WO 99/45031、WO 99/53049、WO 00 09560およびWO 00/037504も参照されたい。XENOMOUSE（商標）動物は、完全ヒト抗体の成人様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトmAbを生成する。第二世代XENOMOUSE（商標）動物は、ヒト重鎖遺伝子座およびκ軽鎖遺伝子座のメガベースサイズの生殖系列立体構造YAC断片の導入を通して、ヒト抗体V遺伝子レパートリーの約80％を含有する。他の態様において、XENOMOUSE（商標）マウスは、ヒト重鎖およびλ軽鎖遺伝子座のほぼ全てを含有する。参照によりその開示が本明細書に組み入れられるMendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)を参照されたい。
【０１４８】
本開示はまた、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物を免疫化することによる、非ヒト非マウス動物から抗MAdCAM抗体を製造するための方法を提供する。すぐ上に記載された方法を使用してそのような動物を産生してよい。これらの文書に開示された方法は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許5,994,619（「‘619特許」）に開示されているように改変することができる。‘619特許は、ブタおよびウシに由来する新規な培養内細胞塊（CICM）細胞および細胞株、ならびに異種性DNAが挿入されているトランスジェニックCICM細胞を産生するための方法を記載している。CICMトランスジェニック細胞を使用して、クローニングされたトランスジェニック胚、胎児および子孫を産生することができる。‘619特許はまた、異種性DNAをその子孫に伝播することができるトランスジェニック動物を産生する方法も記載している。好ましい態様において、非ヒト動物は、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマであってよい。
【０１４９】
別の態様において、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリンの「ミニ遺伝子座」を有する動物である。ミニ遺伝子座アプローチでは、外因性Ig遺伝子座は、Ig遺伝子座由来の個々の遺伝子の包含を通して模倣される。したがって、1つ以上のVH遺伝子、1つ以上のDH遺伝子、1つ以上のJH遺伝子、μ定常ドメイン、および第二の定常ドメイン（好ましくは、ガンマ定常ドメイン）が、動物への挿入のための構築物へと形成される。このアプローチは、とりわけ、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,545,807号、第5,545,806号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,661,016号、第5,770,429号、第5,789,650号、第5,814,318号、第5,591,669号、第5,612,205号、第5,721,367号、第5,789,215号および第5,643,763号に記載されている。
【０１５０】
ミニ遺伝子座アプローチの利点は、Ig遺伝子座の部分を含む構築物を作製して動物に導入することができる迅速性である。しかしながら、ミニ遺伝子座アプローチの潜在的な欠点は、完全なB細胞発生を支持するのに十分な免疫グロブリン多様性が存在せず、それにより抗体産生が低くなり得ることである。
【０１５１】
ヒト抗MAdCAM抗体を産生するために、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部または全部を含む非ヒト動物をMAdCAM抗原で免疫化し、その動物から抗体または抗体産生細胞を単離する。MAdCAM抗原は、単離および／または精製されたMAdCAMであってよく、好ましくはヒトMAdCAMである。別の態様において、MAdCAM抗原は、MAdCAMの断片、好ましくは、MAdCAMの細胞外ドメインである。別の態様において、MAdCAM抗原は、MAdCAMの少なくとも1つのエピトープを含む断片である。別の態様において、MAdCAM抗原は、MAdCAMをその細胞表面に発現する細胞、好ましくは、MAdCAMをその細胞表面に過剰発現する細胞である。
【０１５２】
動物の免疫化は、当技術分野において公知の任意の方法によって行ってよい。例えば、Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press （1990）を参照されたい。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシおよびウマなどの非ヒト動物を免疫化するための方法は、当技術分野において周知である。例えば、Harlow and Laneおよび米国特許5,994,619を参照されたい。好ましい態様において、MAdCAM抗原は、免疫応答を刺激するためにアジュバントと共に投与される。そのようなアジュバントは、完全もしくは不完全フロイントアジュバント、RIBI（ムラミルジペプチド）またはISCOM（免疫賦活性複合体）を含む。そのようなアジュバントは、ポリペプチドを局所沈着物に隔離することによってポリペプチドを急速な分散から保護し得るか、または、免疫系のマクロファージおよび他の構成成分に対して走化性である因子を分泌するように宿主を刺激する物質を含有し得る。好ましくは、ポリペプチドが投与される場合には、免疫化計画は、該ポリペプチドの数週間にまたがる2回以上の投与を含む。
【０１５３】
実施例Iは、XENOMOUSE（商標）動物をリン酸緩衝食塩水中の完全長ヒトMAdCAMで免疫化するためのプロトコルを提供する。
【０１５４】
抗体および抗体産生細胞株の産生
動物をMAdCAM抗原で免疫化した後、その動物から抗体および／または抗体産生細胞を得てよい。抗MAdCAM抗体を含有する血清は、その動物を採血または屠殺することによって動物から得られる。動物から得られたままの血清を使用しても、免疫グロブリン画分を血清から得ても、抗MAdCAM抗体を血清から精製してもよい。
【０１５５】
別の態様において、免疫化された動物から、抗体を産生する不死化細胞株を調製してよい。免疫化後、動物を屠殺し、当技術分野において周知の方法を使用してB細胞を不死化する。細胞を不死化する方法は、細胞に発癌遺伝子をトランスフェクションすること、細胞を発癌性ウイルスに感染させ、不死化細胞について選択する条件下で培養すること、発癌性化合物または変異させる化合物に細胞を供すること、細胞を不死化細胞、例えば骨髄腫細胞と融合すること、および腫瘍抑制遺伝子を不活性化することを含むが、これらに限定されない。例えば、Harlow and Lane（前記）を参照されたい。骨髄腫細胞を含む態様において、骨髄腫細胞は、免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌性細胞株）。不死化および抗生物質選択の後、不死化細胞またはその培養上清を、MAdCAM、その一部、またはMAdCAMを発現する細胞を使用してスクリーニングする。好ましい態様において、最初のスクリーニングは、酵素結合免疫測定法（ELISA）または放射性免疫測定法（RIA）、好ましくはELISAを使用して実施される。ELISAスクリーニングの一例は、参照により本明細書に組み入れられるPCT公開第WO 00/37504号に提供されている。
【０１５６】
別の態様において、抗体産生細胞を、自己免疫障害を有しかつ抗MAdCAM抗体を発現するヒトから調製してよい。白血球を単離し、それらを蛍光活性化細胞ソーティング（FACS）に供することによって、または、MAdCAMもしくはその一部でコーティングされたプレート上でパンニングすることによって、抗MAdCAM抗体を発現する細胞を単離してよい。これらの細胞をヒト非分泌性骨髄腫と融合させて、ヒト抗MAdCAM抗体を発現するヒトハイブリドーマを産生させてよい。一般に、抗MAdCAM抗体はMAdCAMに対して低い親和性を有する可能性が高いので、これは、あまり好ましい態様ではない。
【０１５７】
抗MAdCAM抗体を産生する細胞、例えば、ハイブリドーマが選択され、クローニングされ、さらに、頑強な細胞成長、高い抗体産生および望ましい抗体特性を含めた望ましい特性について、下でさらに考察されるとおりスクリーニングされる。ハイブリドーマを、インビボで同系動物において、免疫系を欠く動物、例えばヌードマウスにおいて、またはインビトロで細胞培養において、培養および増大させてよい。ハイブリドーマを選択、クローニングおよび増大させる方法は、当業者に周知である。
【０１５８】
好ましくは、免疫化された動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現する非ヒト動物であり、そして、脾臓B細胞が、非ヒト動物と同じ種に由来する骨髄腫に融合される。より好ましくは、免疫化された動物は、XENOMOUSE（商標）動物であり、そして、骨髄腫細胞株は、非分泌性マウス骨髄腫であり、例えば、骨髄腫細胞株は、P3-X63-AG8-653（ATCC）である。例えば、実施例Iを参照されたい。
【０１５９】
したがって、一態様において、本開示は、MAdCAMを指向するヒトモノクローナル抗体またはその断片を産生する細胞株を産生するための方法であって、（a）本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物をMAdCAM、MAdCAMの一部またはMAdCAMを発現する細胞もしくは組織で免疫化すること；（b）トランスジェニック動物に、MAdCAMに対する免疫応答を起こさせること；（c）トランスジェニック動物から抗体産生細胞を単離すること；（d）抗体産生細胞を不死化すること；（e）不死化された抗体産生細胞の個々のモノクローナル集団を生み出すこと；および（f）不死化された抗体産生細胞またはその培養上清をスクリーニングして、MAdCAMを指向する抗体を特定することを含む方法を提供する。
【０１６０】
一局面において、本開示は、ヒト抗MAdCAM抗体を産生するハイブリドーマを提供する。好ましい態様において、ハイブリドーマは、上記のとおりのマウスハイブリドーマである。別の態様において、ハイブリドーマは、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマなどの非ヒト非マウス種において産生される。別の態様において、ハイブリドーマは、ヒト非分泌性骨髄腫が抗MAdCAM抗体を発現するヒト細胞と融合されたヒトハイブリドーマである。
【０１６１】
核酸、ベクター、宿主細胞および抗体を製造する組換え法
核酸
本開示の抗MAdCAM抗体をコードする核酸分子が提供される。一態様において、核酸分子は、抗MAdCAM免疫グロブリンの重鎖および／または軽鎖をコードする。好ましい態様において、単一の核酸分子は、抗MAdCAM免疫グロブリンの重鎖をコードし、別の核酸分子は、抗MAdCAM免疫グロブリンの軽鎖をコードする。より好ましい態様において、コードされた免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリン、好ましくはヒトIgGである。コードされた軽鎖は、λ鎖またはκ鎖、好ましくはκ鎖であってよい。
【０１６２】
好ましい態様において、軽鎖の可変領域をコードする核酸分子は、ヒトVκの生殖系列配列A2、A3、A26、B3、O12もしくはO18遺伝子または前記配列のバリアントを含む。好ましい態様において、軽鎖をコードする核酸分子は、ヒトJκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4またはJκ5遺伝子に由来する配列を含む。好ましい態様において、軽鎖をコードする核酸分子は、生殖系列A2、A3、A26、B3、O12またはO18 Vκ遺伝子からの11以下のアミノ酸変化、好ましくは6以下のアミノ酸変化、さらにより好ましくは3以下のアミノ酸変化をコードする。より好ましい態様において、軽鎖をコードする核酸は、生殖系列配列である。
【０１６３】
本開示は、生殖系列配列と比較して最大11のアミノ酸変化を含有する軽鎖の可変領域（VL）をコードする核酸分子であって、アミノ酸変化が、抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの1つのVL由来の生殖系列配列からのアミノ酸変化と同一である、核酸分子を提供する。本開示はまた、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの軽鎖の可変領域のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。本開示はまた、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの軽鎖のいずれか1つのCDRの1つ以上のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を提供する。好ましい態様において、核酸分子は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの軽鎖のいずれか1つのCDRの全てのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。別の態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68、150の1つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、または、SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65もしくは67の1つのヌクレオチド配列を含む。別の好ましい態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68、150のいずれか1つのCDRの1つ以上のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、または、SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65もしくは67のいずれか1つのCDRの1つ以上のヌクレオチド配列を含む。より好ましい態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68、150のいずれか1つのCDRの全てのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、または、SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65もしくは67のいずれか1つの全てのCDRのヌクレオチド配列を含む。
【０１６４】
本開示はまた、上記のVLと、特に、SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68または150の1つのアミノ酸配列を含むVLと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるアミノ酸配列を有するVLのアミノ酸配列をコードする核酸分子を提供する。本開示はまた、SEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65または67の1つのヌクレオチド配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるヌクレオチド配列を提供する。
【０１６５】
別の態様において、本開示は、高度にストリンジェントな条件下で上記のとおりのVLをコードする核酸分子に、特に、SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68、150のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする、核酸分子を提供する。本開示はまた、高度にストリンジェントな条件下でSEQ ID NO：3、7、11、15、19、23、27、31、35、39、43、47、53、57、61、65または67の1つのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズする、核酸分子を提供する。
【０１６６】
本開示はまた、ヒトVH 1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33または4-4 VH遺伝子を利用する重鎖可変領域（VH）をコードする核酸分子を提供する。いくつかの態様において、VH遺伝子をコードする核酸分子は、さらに、ヒトJH4またはJH6ファミリー遺伝子を利用する。いくつかの態様において、VH遺伝子をコードする核酸分子は、ヒトJH4bまたはJH6b遺伝子を利用する。別の態様において、核酸分子は、ヒトD 3-10、4-23、5-5、6-6または6-19遺伝子に由来する配列を含む。さらにより好ましい態様において、VHをコードする核酸分子は、生殖系列VH 1-18、3-15、3-21、3-23、3-30、3-33または4-4遺伝子からの15以下のアミノ酸変化、好ましくは6以下のアミノ酸変化、さらにより好ましくは3以下のアミノ酸変化を含有する。大いに好ましい態様において、VHをコードする核酸分子は、生殖系列配列と比較して少なくとも1つのアミノ酸変化であって、抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの1つの重鎖由来の生殖系列配列からのアミノ酸変化と同一であるアミノ酸変化を含有する。さらにより好ましい態様において、VHは、生殖系列配列と比較して15以下のアミノ酸変化であって、抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの1つのVH由来の生殖系列配列からの変化と同一である変化を含有する。
【０１６７】
一態様において、核酸分子は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modのVHのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。別の態様において、核酸分子は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの重鎖のCDRの1つ以上のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、核酸分子は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの重鎖のCDRの全てのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む。別の好ましい態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64もしくは148の1つのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、または、SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59、63もしくは149の1つのヌクレオチド配列を含む。別の好ましい態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64もしくは148のいずれか1つのCDRの1つ以上のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、または、SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59、63もしくは149のいずれか1つのCDRの1つ以上のヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、核酸分子は、SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64、148のいずれか1つのCDRの全てのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、または、SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59、63もしくは149のいずれか1つのCDRの全てのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、核酸分子は、前述の抗MAdCAM抗体のいずれかの重鎖または軽鎖のCDR1の始めからCDR3の終わりまでの連続した領域をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１６８】
別の態様において、核酸分子は、すぐ上に記載したとおりのVH、特に、SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60または64の1つのアミノ酸配列を含むVHをコードするアミノ酸配列の1つと少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるVHのアミノ酸配列をコードする。本開示はまた、SEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59、63または149の1つのヌクレオチド配列と少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％同一であるヌクレオチド配列を提供する。
【０１６９】
別の態様において、VHをコードする核酸分子は、高度にストリンジェントな条件下で上記のとおりのVH、特に、SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64または148の1つのアミノ酸配列を含むVHをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする、核酸分子である。本開示はまた、高度にストリンジェントな条件下でSEQ ID NO：1、5、9、13、17、21、25、29、33、37、41、45、51、55、59、63、149の1つのヌクレオチド配列を含む核酸分子にハイブリダイズするVHをコードするヌクレオチド配列を提供する。
【０１７０】
抗MAdCAM抗体の全体の重鎖および軽鎖のいずれかもしくは両方またはそれらの可変領域をコードするヌクレオチド配列を、抗MAdCAM抗体を産生する任意の供給源から得てよい。抗体をコードするmRNAを単離する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)を参照されたい。mRNAを使用して、抗体遺伝子のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）またはcDNAクローニングにおいて使用するためのcDNAを作製してよい。本開示の一態様において、上記のとおりの抗MAdCAM抗体を発現するハイブリドーマ、好ましくは、XENOMOUSE（商標）動物、非ヒトマウストランスジェニック動物または非ヒト非マウストランスジェニック動物などのヒト免疫グロブリン遺伝子を発現するトランスジェニック動物細胞をその融合パートナーの1つとして有するハイブリドーマから、核酸分子を得てよい。別の態様において、ハイブリドーマは、例えばヒト化抗体に使用され得る、非ヒト非トランスジェニック動物に由来する。
【０１７１】
抗MAdCAM抗体の重鎖全体をコードする核酸分子を、重鎖の可変ドメイン全体またはその抗原結合ドメインをコードする核酸分子と重鎖の定常ドメインとを融合することによって構築してよい。同様に、抗MAdCAM抗体の軽鎖をコードする核酸分子を、軽鎖の可変ドメインまたはその抗原結合ドメインをコードする核酸分子と軽鎖の定常ドメインとを融合することによって構築してよい。VHセグメントがベクター内の重鎖定常領域（CH）セグメントに機能的に連結され、かつ、VLセグメントがベクター内の軽鎖定常領域（CL）セグメントに機能的に連結されるように、VH領域およびVL領域をコードする核酸分子を重鎖定常領域および軽鎖定常領域をそれぞれすでにコードする発現ベクターに挿入することによって、それらを完全長の抗体遺伝子へと変換してよい。あるいは、VH鎖をコードする核酸分子を標準的な分子生物学的技術を使用してCH鎖をコードする核酸分子に連結、例えばライゲーションすることによって、VH鎖またはVL鎖をコードする核酸分子が、完全長の抗体遺伝子へと変換される。同じことを、VL鎖およびCL鎖をコードする核酸分子を使用して達成してよい。ヒト重鎖および軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野において公知である。例えば、Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., NIH Publ. No. 91-3242 (1991)を参照されたい。次いで、完全長の重鎖および／または軽鎖をコードする核酸分子をそれらが導入されている細胞から発現させて、抗MAdCAM抗体を単離してよい。
【０１７２】
好ましい態様において、重鎖の可変領域をコードする核酸は、SEQ ID NO：2、6、10、14、18、22、26、30、34、38、42、46、52、56、60、64または148のアミノ酸配列の可変領域をコードし、軽鎖の可変領域をコードする核酸分子は、SEQ ID NO：4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、58、62、66、68または150のアミノ酸配列の可変領域をコードする。
【０１７３】
一態様において、抗MAdCAM抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分または抗MAdCAM抗体の軽鎖もしくはその抗原結合部分のいずれかをコードする核酸分子を、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現しかつMAdCAM抗原で免疫化されている非ヒト非マウス動物から単離してよい。他の態様において、抗MAdCAM抗体を産生する非トランスジェニック動物またはヒト患者に由来する抗MAdCAM抗体産生細胞から、核酸分子を単離してよい。抗MAdCAM抗体産生細胞からのmRNAを、標準技術によって単離し、PCRおよびライブラリー構築技術を使用してクローニングおよび／または増幅し、そして、標準プロトコルを使用してスクリーニングして、抗MAdCAM重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を得てよい。
【０１７４】
下記のとおり、核酸分子を使用して、大量の抗MAdCAM抗体を組換え技術によって発現させてよい。さらに下記のとおり、核酸分子を使用して、キメラ抗体、一本鎖抗体、イムノアドヘシン、ダイアボディ、変異抗体および抗体誘導体を産生させてもよい。核酸分子が非ヒト非トランスジェニック動物に由来する場合、核酸分子をまた下記のとおり抗体ヒト化に使用してもよい。
【０１７５】
別の態様において、本開示の核酸分子を、特異的な抗体配列に対するプローブまたはPCRプライマーとして使用してよい。例として、核酸分子プローブを診断方法で使用しても、核酸分子PCRプライマーを使用して、とりわけ抗MAdCAM抗体の可変ドメインを産生する際に使用するためのヌクレオチド配列を単離するために使用できる、DNAの領域を増幅させてもよい。好ましい態様において、核酸分子は、オリゴヌクレオチドである。より好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、関心対象の抗体の重鎖および軽鎖の高度可変領域に由来する。さらにより好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、CDRの1つ以上の全部または一部をコードする。
【０１７６】
ベクター
本開示は、重鎖またはその抗原結合部分をコードする本開示の核酸分子を含むベクターを提供する。本開示はまた、軽鎖またはその抗原結合部分をコードする本開示の核酸分子を含むベクターを提供する。本開示はまた、融合タンパク質、改変抗体、抗体断片およびそのプローブをコードする核酸分子を含む、ベクターを提供する。
【０１７７】
本開示の抗体または抗体部分を発現させるために、上記のとおり得られた部分的または完全長の軽鎖および重鎖をコードするDNAを、該遺伝子が転写および翻訳制御配列に機能的に連結されるように、発現ベクターに挿入する。発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、カリフラワーモザイクウイルス、タバコモザイクウイルスなどの植物ウイルス、コスミド、YAC、EBV由来エピソームなどを含む。抗体遺伝子は、ベクター内の転写および翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写および翻訳を調節するそれらの意図する機能を果たすように、ベクターにライゲーションされる。発現ベクターおよび発現制御配列は、使用される発現宿主細胞と適合性となるように選択される。抗体軽鎖遺伝子および抗体重鎖遺伝子を、別々のベクターに挿入することができる。好ましい態様において、両方の遺伝子が同じ発現ベクターに挿入される。抗体遺伝子は、標準的な方法（例えば、抗体遺伝子断片上の相補的制限部位とベクターのライゲーション、または、制限部位が存在しない場合には平滑末端ライゲーション）によって、発現ベクターに挿入される。
【０１７８】
簡便なベクターは、上記のとおり、任意のVHまたはVL配列を容易に挿入および発現できるように適切な制限部位が操作された、機能的に完全なヒトCHまたはCL免疫グロブリン配列をコードするものである。そのようなベクターにおいて、スプライシングは、通常、挿入されたJ領域中のスプライスドナー部位とヒトC領域に先行するスプライスアクセプター部位との間に、また、ヒトCHエクソン内に存在するスプライス領域に生じる。ポリアデニル化および転写終結は、コード領域の下流の天然の染色体部位において生じる。組換え発現ベクターはまた、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を容易にするシグナルペプチドをコードすることもできる。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングしてよい。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種性シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であることができる。
【０１７９】
抗体鎖遺伝子に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞における抗体鎖遺伝子の発現を制御する調節配列を担持する。調節配列の選択を含めた発現ベクターの設計が、形質転換されるべき宿主細胞の選択、望まれるタンパク質の発現のレベルなどの要因に依存し得ることが、当業者によって認識されよう。哺乳動物宿主細胞発現のための好ましい調節配列は、哺乳動物細胞において高レベルのタンパク質発現を指令するウイルスエレメント、例えば、レトロウイルスのLTR、サイトメガロウイルス（CMV）（CMVプロモーター/エンハンサーなど）、シミアンウイルス40（SV40）（SV40プロモーター/エンハンサーなど）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（AdMLP））、ポリオーマに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびに天然の免疫グロブリンおよびアクチンプロモーターなどの強い哺乳動物プロモーターを含む。ウイルス調節エレメントおよびそれらの配列のさらなる説明については、例えば、各々参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,168,062号、第4,510,245号および第4,968,615号を参照されたい。プロモーターおよびベクターの他に植物の形質転換の説明も含め、植物において抗体を発現させるための方法は、当技術分野において公知である。例えば、米国特許6,517,529を参照されたい。また、細菌細胞または真菌細胞、例えば酵母細胞においてポリペプチドを発現させる方法も当技術分野において周知である。
【０１８０】
抗体鎖遺伝子および調節配列に加えて、本開示の組換え発現ベクターは、宿主細胞においてベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）および選択マーカー遺伝子などの追加の配列を担持してよい。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第4,399,216号、第4,634,665号および第5,179,017号を参照のこと）。例えば、典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞にG418、ハイグロマイシンまたはメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子（dhfr-宿主細胞においてメトトレキサート選択/増幅と共に使用するため）およびネオ遺伝子（G418選択のため）、およびグルタミン酸シンテターゼ遺伝子を含む。
【０１８１】
非ハイブリドーマ宿主細胞およびタンパク質を組換え技術で産生する方法
抗MAdCAM抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分および／または軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸分子、ならびにこれらの核酸分子を含むベクターを、好適な哺乳動物、植物、細菌または酵母宿主細胞の形質転換に使用することができる。形質転換は、ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための任意の公知の方法によることができる。異種性ポリヌクレオチドの哺乳動物細胞への導入のための方法は、当技術分野において周知であり、デキストラン媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム沈降、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、リポソーム中のポリヌクレオチドのカプセル化、DNAの核への微粒子銃注入および直接マイクロインジェクションを含む。加えて、ウイルスベクターによって核酸分子を哺乳動物細胞に導入してもよい。細胞を形質転換する方法は、当技術分野において周知である。例えば、米国特許第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号および第4,959,455号（これらの特許は、参照により本明細書に組み入れられる）を参照されたい。例えば、アグロバクテリウム媒介性形質転換、微粒子銃形質転換、直接注入、エレクトロポレーションおよびウイルス形質転換を含め、植物細胞を形質転換する方法は、当技術分野において周知である。細菌および酵母細胞を形質転換する方法もまた当技術分野において周知である。
【０１８２】
発現のための宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当技術分野において周知であり、American Type Culture Collection（ATCC）から入手可能な多くの不死化された細胞株を含む。これらは、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、NS0、SP2細胞、HEK-293T細胞、NIH-3T3細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎臓（BHK）細胞、サル腎臓細胞（COS）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Hep G2）、A549細胞、3T3細胞、および多数の他の細胞株を含む。哺乳動物宿主細胞は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞を含む。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有するかを判定することを通じて選択される。使用され得る他の細胞株は、Sf9細胞などの昆虫細胞株、両生類細胞、細菌細胞、植物細胞および真菌細胞である。重鎖またはその抗原結合部分、軽鎖および／またはその抗原結合部分をコードする組換え発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、宿主細胞における抗体の発現を可能にする、またはより好ましくは、宿主細胞が成長する培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって、抗体が産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。植物宿主細胞は、例えば、タバコ（Nicotiana）、シロイヌナズナ（Arabidopsis）、ウキクサ、トウモロコシ、コムギ、ジャガイモなどを含む。細菌宿主細胞は、大腸菌（E. coli）およびストレプトマイセス（Streptomyces）種を含む。酵母宿主細胞は、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）およびピチア・パストリス（Pichia pastoris）を含む。
【０１８３】
さらに、産生細胞株からの本開示の抗体（またはそれら由来の他の部分）の発現を、多数の公知技術を使用して増強することができる。例えば、グルタミンシンテターゼ遺伝子発現系（GS系）が、ある特定の条件下の発現を増強するための一般的なアプローチである。GS系は、欧州特許第0 216 846号、第0 256 055号、第0 338 841号および第0 323 997号に関して、全部または一部考察されている。
【０１８４】
異なる細胞株によってまたはトランスジェニック動物において発現される抗体は、互いに異なるグリコシル化を有する可能性が高い。しかしながら、本明細書に提供される核酸分子によってコードされるまたは本明細書に提供されるアミノ酸配列を含む抗体は全て、抗体のグリコシル化にかかわらず、本開示の一部である。
【０１８５】
トランスジェニック動物および植物
本開示はまた、本開示の抗体を産生するために使用され得る本開示の1つ以上の核酸分子を含む非ヒトトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物を提供する。抗体を、ヤギ、ウシ、ウマ、ブタ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスターもしくは他の哺乳動物の組織または体液（乳、血液または尿など）中に産生して、そこから回収することができる。例えば、米国特許第5,827,690号、第5,756,687号、第5,750,172号および第5,741,957号を参照されたい。上記のとおり、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒトトランスジェニック動物を、MAdCAMまたはその一部で免疫化することができる。植物において抗体を製造するための方法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許6,046,037および5,959,177に記載されている。
【０１８６】
別の態様において、非ヒトトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物は、標準的なトランスジェニック技術によって本開示の1つ以上の核酸分子を動物または植物に導入するによって産生される。Hogan（前記）を参照されたい。トランスジェニック動物を製造するために使用されるトランスジェニック細胞は、胚性幹細胞、体細胞または受精卵細胞であることができる。非ヒトトランスジェニック生物は、キメラ、非キメラのヘテロ接合体および非キメラのホモ接合体であることができる。例えば、Hogan et al.,, Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); および Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999)を参照されたい。別の態様において、非ヒトトランスジェニック生物は、関心対象の重鎖および／または軽鎖をコードする、標的化された破壊および置換を有し得る。好ましい態様において、トランスジェニック動物または植物は、MAdCAM、好ましくはヒトMAdCAMに特異的に結合するように組み合わされた重鎖および軽鎖をコードする核酸分子を含み、発現する。別の態様において、トランスジェニック動物または植物は、一本鎖抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体などの改変抗体をコードする核酸分子を含む。抗MAdCAM抗体は、あらゆるトランスジェニック動物において製造してよい。好ましい態様において、非ヒト動物は、マウス、ラット、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシまたはウマである。非ヒトトランスジェニック動物は、前記のコードされたポリペプチドを血液、乳、尿、唾液、涙、粘液および他の体液中に発現する。
【０１８７】
ファージディスプレイライブラリー
本開示は、抗MAdCAM抗体またはその抗原結合部分を産生するための方法であって、ヒト抗体のライブラリーをファージ上で合成する工程、ライブラリーをMAdCAMまたはその一部でスクリーニングする工程、MAdCAMに結合するファージを単離する工程、およびファージから抗体を得る工程を含む方法を提供する。抗体のライブラリーを調製するための1つの方法は、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含む非ヒト宿主動物を、免疫応答を生み出すMAdCAMまたはその抗原性部分で免疫化する工程、宿主動物から抗体の産生に関与する細胞を抽出する工程；抽出された細胞からRNAを単離する工程、RNAを逆転写してcDNAを産生する工程、プライマーを使用してcDNAを増幅する工程、および抗体がファージ上に発現されるようにcDNAをファージディスプレイベクターに挿入する工程を含む。本開示の組換え抗MAdCAM抗体を、このようにして得てよい。
【０１８８】
本明細書に開示の抗MAdCAM抗体に加えて本開示の組換え抗MAdCAMヒト抗体を、ヒトリンパ球から単離されたmRNAから調製されたヒトVLおよびVH cDNAを使用して調製された組換えコンビナトリアル抗体ライブラリー、好ましくはscFvファージディスプレイライブラリーのスクリーニングによって、単離することができる。そのようなライブラリーを調製およびスクリーニングするための方法論は、当技術分野において公知である。ファージディスプレイライブラリーを作製するための市販されているキットがある（例えば、Pharmacia Recombinant Phage Antibody System、カタログ番号27-9400-01；および Stratagene SurfZAP（商標）ファージディスプレイキット、カタログ番号240612）。また、抗体ディスプレイライブラリーを作製およびスクリーニングする際に使用できる他の方法および試薬もある（例えば、米国特許第5,223,409号；PCT公開第WO 92/18619号；PCT公開第WO 91/17271号；PCT公開第WO 92/20791号；PCT公開第WO 92/15679号；PCT公開第WO 93/01288号；PCT公開第WO 92/01047号；PCT公開第WO 92/09690号；Fuchs et al. (1991), Biotechnology, 9:1369-1372; Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas, 3:81-85 (1992); Huse et al., Science, 246:1275-1281 （1989）; McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992); Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3576-3580 (1992); Garrad et al., Biotechnology, 9:1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nuc Acid Res, 19:4133-4137 (1991); および Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:7978-7982 (1991)を参照のこと）。
【０１８９】
好ましい態様において、所望の特定を備えたヒト抗MAdCAM抗体を単離するために、まず、Hoogenboom et al., PCT公開第WO 93/06213号に記載されているエピトープ刷り込み方法を使用し、本明細書に記載のとおりのヒト抗MAdCAM抗体を使用して、MAdCAMへの類似の結合活性を有するヒト重鎖および軽鎖配列を選択する。この方法において使用される抗体ライブラリーは、好ましくは、McCafferty et al., PCT公開第WO 92/01047号、McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990); および Griffiths et al., EMBO J, 12:725-734 (1993)に記載されているとおり調製およびスクリーニングされたscFvライブラリーである。scFv抗体ライブラリーは、好ましくは、抗原としてヒトMAdCAMを使用してスクリーニングされる。
【０１９０】
最初のヒトVLおよびVHセグメントが選択されたら、最初に選択されたVLおよびVHセグメントの異なる対がMAdCAM結合についてスクリーニングされる「混合および一致（mix and match）」実験を実施して、好ましいVL/VH対の組み合わせを選択する。加えて、抗体の質をさらに改善するために、好ましいVL/VH対のVLおよびVHセグメントを、天然の免疫応答中の抗体の親和性成熟に関与するインビボ体細胞変異プロセスに類似したプロセスで、好ましくはVHおよび／またはVLのCDR3領域内で、ランダムに変異させることができる。このインビトロ親和性成熟を、VH CDR3またはVL CDR3それぞれに相補的なPCRプライマーを使用してVHおよびVL領域を増幅させることによって達成することができるが、結果として生じたPCR産物が、ランダム変異がVHおよび／またはVL CDR3領域に導入されているVHおよびVLセグメントをコードするように、そのプライマーは、特定の位置において4つのヌクレオチド塩基のランダム混合物で「スパイク」されている。これらのランダムに変異されたVHおよびVLセグメントを、MAdCAMへの結合について再スクリーニングすることができる。
【０１９１】
組換え免疫グロブリンディスプレイライブラリーからの本開示の抗MAdCAM抗体のスクリーニングおよび単離に続いて、選択された抗体をコードする核酸を、ディスプレイパッケージから（例えば、ファージゲノムから）回収し、標準的な組換えDNA技術によって他の発現ベクターにサブクローニングすることができる。所望であれば、下記のとおり、核酸をさらに操作して、本開示の他の抗体形態を生み出すことができる。コンビナトリアルライブラリーのスクリーニングによって単離された組換えヒト抗体を発現させるために、抗体をコードするDNAを、上記のとおり、組換え発現ベクターにクローニングし、哺乳動物宿主細胞に導入する。
【０１９２】
クラススイッチング
本開示の別の局面は、抗MAdCAM抗体のクラスが別のものとスイッチされ得るメカニズムを提供することである。本開示の一局面において、VLまたはVHをコードする核酸分子は、それがCLまたはCHをコードするヌクレオチド配列を全く含まないように、当技術分野において周知の方法を使用して単離される。次いで、VLまたはVHをコードする核酸分子が、免疫グロブリン分子の異なるクラス由来のCLまたはCHをコードするヌクレオチド配列に機能的に連結される。これを、上記のとおり、CLまたはCHをコードする配列を含むベクターまたは核酸分子を使用して達成してよい。例えば、元々IgMであった抗MAdCAM抗体をIgGにクラススイッチングしてよい。さらに、クラススイッチングを使用して、一方のIgGサブクラスを別のものに、例えば、IgG4からIgG2に変換してよい。所望のアイソタイプまたは抗体サブクラスを含む本開示の抗体を産生するための好ましい方法は、抗MAdCAM抗体の重鎖をコードする核酸および抗MAdCAM抗体の軽鎖をコードする核酸を単離する工程、重鎖の可変領域を得る工程、重鎖の可変領域を所望のアイソタイプの重鎖の定常ドメインとライゲーションする工程、軽鎖およびライゲーションされた重鎖を細胞において発現する工程、および所望のアイソタイプを有する抗MAdCAM抗体を収集する工程を含む。
【０１９３】
抗体誘導体
上記の核酸分子を使用し、当業者に公知の技術および方法を使用して抗体誘導体を作製してよい。
【０１９４】
ヒト化抗体
非ヒト抗体の免疫原性を、ヒト化の技術を使用して、潜在的には、適切なライブラリーを使用したディスプレイ技術を用いて、ある程度まで低減することができる。マウス抗体または他の種由来の抗体は、当技術分野において周知の技術を使用してヒト化または霊長類化できることが認識されよう。例えば、Winter and Harris, Immunol Today, 14:43-46 (1993) および Wright et al., Crit. Reviews in Immunol., 12125-168 (1992)を参照されたい。関心対象の抗体を組換えDNA技術によって操作して、CH1、CH2、CH3、ヒンジドメインおよび／またはフレームワークドメインを対応するヒト配列に置換してよい（WO 92/02190ならびに米国特許第5,530,101号、第5,585,089号、第5,693,761号、第5,693,792号、第5,714,350号および第5,777,085号を参照のこと）。別の態様において、CH1、ヒンジドメイン、CH2、CH3および／またはフレームワークドメインを本開示の抗MAdCAM抗体の対応するヒト配列に置換することによって、非ヒト抗MAdCAM抗体をヒト化することができる。
【０１９５】
変異抗体
別の態様において、核酸分子、ベクターおよび宿主細胞を使用して、変異抗MAdCAM抗体を製造してよい。抗体を、重鎖および／または軽鎖の可変ドメインにおいて変異させて、抗体の結合性質を変更させてよい。例えば、MAdCAMについての抗体のKdを増加または減少させるようにCDR領域の1つ以上において、変異がなされてよい。部位特異的変異誘発における技術は、当技術分野において周知である。例えば、Sambrook et al., and Ausubel et al.（前記）を参照されたい。好ましい態様において、抗MAdCAM抗体の可変領域中の生殖系列と比較して変化していることが知られているアミノ酸残基において、変異がなされる。より好ましい態様において、抗MAdCAM抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modの1つの可変領域またはCDR領域中の生殖系列と比較して変化していることが知られているアミノ酸残基において、1つ以上の変異がなされる。別の態様において、アミノ酸配列がSEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68、148もしくは150で提示されているまたはヌクレオチド配列がSEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、61、63、65、67もしくは149で提示されている可変領域またはCDR領域中の生殖系列と比較して変化していることが知られているアミノ酸残基において、1つ以上の変異がなされる。別の態様において、核酸分子がフレームワーク領域の1つ以上において変異される。抗MAdCAM抗体の半減期を増加させるようにフレームワーク領域または定常ドメインにおいて、変異がなされてよい。例えば、参照により本明細書に組み入れられる2000年2月24日に公開されたWO 00/09560を参照されたい。一態様において、1、3または5または10の点変異および15以下の点変異があってよい。また、抗体の免疫原性を変更するために、別の分子への共有もしくは非共有結合のための部位を提供するために、または補体結合のような性質を変更するために、フレームワーク領域または定常ドメインにおいて変異がなされてもよい。単一変異抗体中のフレームワーク領域、定常ドメインおよび可変領域の各々において変異がなされてよい。あるいは、単一変異抗体中のフレームワーク領域、可変領域または定常ドメインのうちの1つだけにおいて変異がなされてよい。
【０１９６】
一態様において、変異の前の抗MAdCAM抗体と比較して、変異抗MAdCAM抗体のVH領域またはVL領域のいずれかに15以下のアミノ酸変化がある。より好ましい態様において、変異抗MAdCAM抗体のVH領域またはVL領域のいずれかに10以下のアミノ酸変化、より好ましくは5以下のアミノ酸変化、またはさらにより好ましくは3以下のアミノ酸変化がある。別の態様において、定常ドメインに15以下のアミノ酸変化、より好ましくは10以下のアミノ酸変化、さらにより好ましくは5以下のアミノ酸変化がある。
【０１９７】
改変抗体
別の態様において、別のポリペプチドに連結された抗MAdCAM抗体の全部または一部を含む、融合抗体またはイムノアドヘシンを製造してよい。好ましい態様において、抗MAdCAM抗体の可変領域だけが、ポリペプチドに連結される。別の好ましい態様において、抗MAdCAM抗体のVHドメインは、第一のポリペプチドに連結されるが、一方で、抗MAdCAM抗体のVLドメインは、第一のポリペプチドと会合する第二のポリペプチドに、VHおよびVLドメインが互いに相互作用して抗体結合部位を形成できるように連結される。別の好ましい態様において、VHドメインは、VHおよびVLドメインが互いに相互作用できるように、リンカーによってVLドメインから分離される（以下の一本鎖抗体の下を参照のこと）。次いで、VH-リンカー-VL抗体が関心対象のポリペプチドに連結される。融合抗体は、ポリペプチドを、MAdCAMを発現する細胞または組織に指向させるのに有用である。ポリペプチドは、毒素、成長因子もしくは他の調節タンパク質などの治療用物質であっても、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの容易に可視化され得る酵素などの診断用物質であってもよい。加えて、2つ（またはより多く）の一本鎖抗体が互いに連結されている融合抗体を生み出すことができる。これは、単一ポリペプチド鎖上に二価もしくは多価抗体を生み出したい場合に、または二重特異性抗体を生み出したい場合に、有用である。
【０１９８】
一本鎖抗体（scFv）を生み出すために、VHをコードするDNA断片およびVLをコードするDNA断片が、可動性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Gly4-Ser）3をコードする別の断片に、VLおよびVH領域が可動性リンカーによって接続された連続した一本鎖タンパク質としてVHおよびVL配列が発現され得るように、機能的に連結される（例えば、Bird et al., Science, 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988); McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990)を参照のこと）。一本鎖抗体は、単一のVHおよびVLが使用される場合には一価、2つのVHおよびVLが使用される場合には二価、または2超のVHおよびVLが使用される場合には多価であり得る。
【０１９９】
別の態様において、抗MAdCAMをコードする核酸分子を使用して、他の改変抗体を調製してよい。例として、「カッパボディ」（Ill et al., Protein Eng, 10: 949-57(1997)）、「ミニボディ」（Martin et al., EMBO J, 13: 5303-9(1994)）、「ダイアボディ」（Holliger et al., PNAS USA, 90: 6444-6448(1993)）、または「ジャヌシン（Janusins）」（Traunecker et al., EMBO J, 10:3655-3659 (1991) および Traunecker et al., "Janusin: new molecular design for bispecific reagents," Int J Cancer Suppl, 7:51-52 (1992)）を、本明細書の教示に従って、標準的な分子生物学的技術を使用して調製してよい。
【０２００】
別の局面において、キメラ抗体および二重特異性抗体を作製することができる。異なる抗体由来のCDRおよびフレームワーク領域を含むキメラ抗体を製造してよい。好ましい態様において、キメラ抗体のCDRは、ヒト抗MAdCAM抗体の軽鎖または重鎖の可変領域のCDRの全てを含むが、一方で、フレームワーク領域は、1つ以上の異なる抗体に由来する。より好ましい態様において、キメラ抗体のCDRは、ヒト抗MAdCAM抗体の軽鎖および重鎖の可変領域のCDRの全てを含む。フレームワーク領域は、別の種由来であってよく、好ましい態様において、ヒト化されてよい。あるいは、フレームワーク領域は、別のヒト抗体由来であってよい。
【０２０１】
1つの結合ドメインを通じてMAdCAMに、かつ、第二の結合ドメインを通じて第二分子に特異的に結合する、二重特異性抗体を作製することができる。二重特異性抗体は、組換え分子生物学的技術を通じて生産することができるし、物理的に一緒にコンジュゲートしてもよい。加えて、MAdCAMにかつ別の分子に特異的に結合する、1を超えるVHおよびVLを含有する一本鎖抗体を作製してもよい。そのような二重特異性抗体を、周知の技術を使用して作製することができ、例えば、（i）および（ii）に関しては、例えば、Fanger et al., Immunol Methods 4: 72-81 (1994) および Wright and Harris（前記）を参照されたく、また、（iii）に関しては、例えば、Traunecker et al., Int. J. Cancer (Suppl.) 7: 51-52 (1992)を参照されたい。好ましい態様において、二重特異性抗体は、MAdCAMに、かつ、内皮細胞上に高レベルで発現される別の分子に結合する。より好ましい態様において、他の分子は、VCAM、ICAMまたはL-セレクチンである。
【０２０２】
様々な態様において、上記の改変抗体は、1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、X481.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modまたは7.26.4-modから選択される抗体の1つ由来の可変領域の1つ以上または1つ以上のCDR領域を使用して調製される。別の態様において、改変抗体は、アミノ酸配列がSEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、52、54、56、58、62、64、66、68、148もしくは150で提示されているまたはヌクレオチド配列がSEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、51、53、55、57、61、63、65、67もしくは149で提示されている可変領域の1つ以上または1つ以上のCDR領域を使用して調製される。
【０２０３】
誘導体化抗体および標識化抗体
本開示の抗体または抗体部分を、誘導体化するかまたは別の分子（例えば、別のペプチドまたはタンパク質）に連結させることができる。一般に、抗体またはその部分は、誘導体化または標識化によってMAdCAM結合が悪影響を受けないように、誘導体化される。したがって、本開示の抗体および抗体部分は、本明細書に記載のヒト抗MAdCAM抗体の無傷形態および改変形態の両方を含むことを意図する。例えば、本開示の抗体または抗体部分と別の分子（ストレプトアビジンコア領域またはポリヒスチジンタグなど）との会合を媒介できる、別の抗体（例えば、二重特異性抗体またはダイアボディ）、検出用物質、細胞傷害性物質、薬学的物質および／またはタンパク質もしくはペプチドなどの1つ以上の他の分子実体に、抗体または抗体部分を機能的に連結させることができる（化学的カップリング、遺伝子融合、非共有会合またはそうでないものによって）。
【０２０４】
誘導体化抗体の1つのタイプは、2以上の抗体（例えば二重特異性抗体を生み出すために、同じタイプまたは異なるタイプの）を架橋することによって生産される。好適な架橋リンカーは、適切なスペーサーによって分離された2つの別個の反応性基を有するヘテロ二官能性であるもの（例えば、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル）、またはホモ二官能性であるもの（例えば、ジスクシンイミジルスベラート）を含む。そのようなリンカーは、Pierce Chemical Company, Rockford, Illから入手可能である。
【０２０５】
別のタイプの誘導体化抗体は、標識化抗体である。本開示の抗体または抗体部分が誘導体化され得る有用な検出用物質は、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、5-ジメチルアミン-1-ナフタレンスルホニルクロリド、フィコエリトリン、ランタニドリン光体などを含めた蛍光化合物を含む。また、抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼなどの検出に有用な酵素で標識してもよい。検出可能な酵素で抗体が標識されると、酵素が使用することで識別可能な反応生成物が産生される追加の試薬を加えることによって、抗体が検出される。例えば、作用物質の西洋ワサビペルオキシダーゼが存在するとき、過酸化水素およびジアミノベンジジンの添加が、検出可能である着色反応生成物を導く。また、抗体をビオチンで標識し、アビジンまたはストレプトアビジン結合の間接的測定を通じて検出してもよい。抗体をガドリニウムなどの磁気物質で標識してよい。また、二次レポーター（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体用の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される所定のポリペプチドエピトープで抗体を標識してもよい。いくつかの態様において、標識は、潜在的な立体障害を低減させるために様々な長さのスペーサーアームによって付着される。
【０２０６】
抗MAdCAM抗体はまた、放射性標識されたアミノ酸で標識してもよい。放射性標識を診断目的および治療目的の両方に使用してよい。例として、放射性標識を使用して、X線または他の診断技術によってMAdCAMを発現する組織を検出してよい。さらに、放射性標識を、疾患組織またはMAdCAM発現腫瘍に対する毒素として治療的に使用してもよい。ポリペプチドに対する標識の例は、以下の放射性同位体または放射性核種を含むが、これらに限定されない--3H、14C、15N、35S、90Y、99Tc、111In、125I、131I。
【０２０７】
また、抗MAdCAM抗体を、ポリエチレングリコール（PEG）、メチルもしくはエチル基または糖基などの化学基で誘導体化してもよい。これらの基は、抗体の生物学的特性を改善するために、例えば、血清半減期を増加させるために、または組織結合を増加させるために、有用であり得る。この方法論は、抗MAdCAM抗体の任意の抗原結合断片またはバージョンにも適用されよう。
【０２０８】
薬学的組成物およびキット
さらなる局面において、本開示は、阻害性ヒト抗MAdCAM抗体を含む組成物、およびそのような組成物で対象を処置するための方法を提供する。いくつかの態様において、処置の対象は、ヒトである。他の態様において、対象は、獣医学的対象である。いくつかの態様において、獣医学的対象は、イヌまたはヒト以外の霊長類である。
【０２０９】
処置は、本開示の1つ以上の阻害性抗MAdCAMモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を単独でまたは薬学的に許容される担体と共に投与することを含み得る。本開示の阻害性抗MAdCAM抗体およびそれらを含む組成物を、1以上の他の治療用物質、診断用物質または予防用物質と組み合わせて投与することができる。追加の治療用物質は、抗炎症性剤または免疫調節剤を含む。これらの薬剤は、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、NCX-1015またはブデソニドなどの局所および経口コルチコステロイド；メサラジン、オルサラジン、バルサラジドまたはNCX-456などのアミノサリチラート；アザチオプリン、6-メルカプトプリン、メトトレキサート、シクロスポリン、FK506、IL-10（Ilodecakin）、IL-11（Oprelevkin）、IL-12、MIF/CD74アンタゴニスト、CD40アンタゴニスト、例えばTNX-100/5-D12、OX40Lアンタゴニスト、GM-CSF、ピメクロリムスまたはラパマイシンなどの免疫調節物質のクラス；イフリキシマブ、アダリムマブ、CDP-870、オネルセプト、エタネルセプトなどの抗TNFα剤のクラス；PDE-4阻害剤（ロフルミラストなど）、TACE阻害剤（DPC-333、RDP-58など）およびICE阻害剤（VX-740など）、ならびにダクリツマブなどのIL-2受容体アンタゴニストなどの抗炎症性剤のクラス、ナタリツマブ、MLN-02またはアリカホルセンなどの選択的な接着分子アンタゴニストのクラス、鎮痛剤のクラス、例えば限定されないが、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、セレコキシブなどのCOX-2阻害剤、ガバペンチンおよびプレガバリンなどのP/Q型電位感受性チャネル（α2δ）調節剤、NK-1受容体アンタゴニスト、カナビノイド受容体調節剤、およびデルタオピオイド受容体アゴニスト、ならびに抗新生物剤、抗腫瘍、抗血管形成剤または化学療法剤を含むが、これらに限定されない。そのような追加の薬剤を、同じ組成物中に含めても、別々に投与してもよい。いくつかの態様において、本開示の1つ以上の阻害性抗MAdCAM抗体を、ワクチンとしてまたはワクチンへのアジュバントとして使用することができる。特に、MAdCAMはリンパ組織中に発現されるので、有利なことに、ワクチン抗原を本開示の抗MAdCAM抗体にコンジュゲートすることによって、ワクチン抗原をリンパ組織に標的化することができる。
【０２１０】
本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性であるありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収促進剤または遅延剤などを意味する。薬学的に許容される担体のいくつかの例は、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、塩化ナトリウムを含む酢酸緩衝液、デキストロース、グリセロール、ポリエチレングリコール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。多くの場合、等張性剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物中に含めることが好ましい。薬学的に許容される物質の追加の例は、抗体の有効期間もしくは有効性を増強する、界面活性剤、湿潤剤、または少量の湿潤剤もしくは乳化剤などの補助物質、保存剤、または緩衝液である。
【０２１１】
本開示の組成物は、多種多様な形態、例えば、液体溶液（例えば、注射可能および注入可能な溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、凍結乾燥ケーキ、乾燥粉末、リポソームおよび坐剤などの、液体、半固体および固体の剤形であってよい。好ましい形態は、意図された投与様式および治療用途に依存する。典型的な好ましい組成物は、ヒトの受動免疫化に使用されるものと類似した組成物などの、注射可能または注入可能な溶液の形態である。好ましい投与様式は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内）である。好ましい態様において、抗体は、静脈内注入または注射によって投与される。別の好ましい態様において、抗体は、筋肉内、皮内または皮下注射によって投与される。
【０２１２】
治療用組成物は、典型的には、製造および保存の条件下で無菌および安定でなければならない。組成物は、溶液、凍結乾燥ケーキ、乾燥粉末、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高い薬物濃度に適した他の規則正しい構造として製剤化することができる。滅菌注射可能溶液は、抗MAdCAM抗体を、必要とされる量で、適切な溶媒に、必要に応じて、上で列記された成分の1つまたは組み合わせと共に組み入れ、続いて滅菌することによって、調製することができる。滅菌注射可能溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分プラス任意の追加の望ましい成分の粉末をそれらのあらかじめ滅菌した溶液から生じる、真空乾燥および凍結乾燥である。一般に、分散液は、基本的な分散媒および上で列記されたものからの必要とされる他の成分を含有する滅菌ビヒクルに活性化合物を組み入れることによって調製される。溶液の所望の特性を、例えば、界面活性剤の使用によって維持することができ、分散液の場合には必要とされる粒子サイズを、界面活性剤、リン脂質およびポリマーの使用によって維持することができる。注射可能組成物の長時間吸収は、吸収を遅らせる作用物質、例えば、モノステアリン酸塩、高分子材料、油およびゼラチンを組成物に含めることによってもたらすことができる。
【０２１３】
当技術分野において公知の多種多様な方法によって本開示の抗体を投与することができるが、多くの治療用途にとって、好ましい投与の経路/様式は、皮下、筋肉内、皮内または静脈内注入である。当業者に認識されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて変動する。
【０２１４】
特定の態様において、抗体組成物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化送達系を含めた制御放出製剤など、抗体を急速な放出から保護する担体と共に調製してよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性の生体適合性高分子を使用することができる。そのような製剤の調製のための多くの方法は、特許化されているか、または一般に当業者に公知である。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems （J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York (1978)）を参照されたい。
【０２１５】
特定の態様において、本開示の抗MAdCAM抗体を、例えば、不活性な希釈剤または同化可能な食用担体と共に経口投与することができる。また、化合物（および所望であれば他の成分）を、ハードシェルまたはソフトシェルゼラチンカプセルに入れることも、錠剤へと圧縮することも、対象の食事へ直接組み入れることもできる。経口の治療的投与のために、抗MAdCAM抗体を、賦形剤と共に組み入れ、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁液、シロップ剤、ウエハー剤などの形態で使用することができる。本開示の化合物を非経口以外の投与によって投与するために、その不活性化を防止する材料で化合物をコーティングすること、または、化合物を該材料と同時投与することが必要になる場合がある。
【０２１６】
本開示の組成物は、本開示の抗体または抗原結合部分の「治療有効量」または「予防有効量」を含み得る。「治療有効量」は、必要な投与量および期間における所望の治療結果を達成するのに有効な量を指す。抗体または抗体部分の治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する抗体または抗体部分の能力などの要因に応じて変動し得る。治療有効量はまた、治療上有益な効果が、抗体または抗体部分のあらゆる毒性または有害作用を上回るものである。「予防有効量」は、必要な投与量および期間における所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。典型的には、予防用量は、疾患の前または初期において対象に使用されるため、予防有効量は、治療有効量より少ない可能性がある。
【０２１７】
投薬レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的応答）を提供するように調整することができる。例えば、単一ボーラスを投与することができ、数回に分割された用量を長い期間をかけて投与することもできるし、その用量を、治療状況の緊急性が示される場合に比例して低減もしくは増加させることもできる。投与の簡便性および投与量の均一性のために、非経口組成物を単位剤形で製剤化することが特に有利である。単位剤形は、本明細書において使用される場合、処置されるべき哺乳動物対象に対する単位投与量として適した物理的に別個の単位を指す；各単位は、必要とされる薬学的担体と組み合わせて所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本開示の単位剤形についての仕様は、（a）抗MAdCAM抗体またはその部分の固有の特性および達成されるべき特定の治療または予防効果、ならびに、（b）個体における感受性の処置のためにそのような抗体を配合する当技術分野に固有の制限によって決定され、かつ直接に依存する。
【０２１８】
本開示の抗体または抗体部分の治療または予防有効量についての例示的な非限定的範囲は、0.025〜50mg/kg、より好ましくは0.1〜50mg/kg、より好ましくは0.1〜25、0.1〜10または0.1〜3mg/kgである。いくつかの態様において、製剤は、20mM酢酸ナトリウム、pH 5.5、140mM NaClおよび0.2mg/mLポリソルベート80の緩衝液中5mg/mLの抗体を含有する。緩和されるべき病状のタイプおよび重症度によって投与量値が変動し得ることに留意すべきである。さらに、任意の特定の対象に対して、特定の投薬レジメンが、個体の必要性および組成物の投与を施すまたは指揮する人の専門家としての判断に従って経時的に調整されるべきであること、本明細書に示される投与量範囲が、単に例示であって、特許請求される組成物の範囲または実施を限定する意図のないことを理解すべきである。
【０２１９】
本開示の別の局面は、本開示の抗MAdCAM抗体もしくは抗体部分またはそのような抗体を含む組成物を含むキットを提供する。キットは、抗体または組成物に加えて、診断用物質または治療用物質を含んでよい。キットはまた、診断法または治療法における使用説明書も含むことができる。好ましい態様において、キットは、抗体またはそれを含む組成物、および下記の方法に使用できる診断用物質を含む。別の好ましい態様において、キットは、抗体またはそれを含む組成物、および下記の方法に使用できる1以上の治療用物質を含む。
【０２２０】
遺伝子治療
本開示の核酸分子を、遺伝子治療を介してその必要のある患者に投与することができる。治療は、インビボまたはエクスビボのいずれであってもよい。好ましい態様において、重鎖および軽鎖の両方をコードする核酸分子が、患者に投与される。より好ましい態様において、B細胞は抗体を産生するために特殊化されているため、核酸分子は、B細胞の染色体に安定的に組み込まれるように投与される。好ましい態様において、前駆体B細胞が、エクスビボでトランスフェクションされるかまたは感染し、その必要のある患者に再移植される。別の態様において、前駆体B細胞または他の細胞が、関心対象の細胞タイプに感染することが知られた組換えウイルスを使用してインビボで感染する。遺伝子治療に使用される典型的なベクターは、リポソーム、プラスミドおよびウイルスベクターを含む。例示的なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスである。インビボまたはエクスビボのいずれかでの感染後、処置された患者から試料を採取し、当技術分野において公知のまたは本明細書に考察される任意のイムノアッセイを使用することによって、抗体発現のレベルをモニタリングすることができる。
【０２２１】
好ましい態様において、遺伝子治療法は、抗MAdCAM抗体の重鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する工程、および核酸分子を発現させる工程を含む。別の態様において、遺伝子治療法は、抗MAdCAM抗体の軽鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する工程、および核酸分子を発現させる工程を含む。より好ましい方法では、遺伝子治療法は、本開示の抗MAdCAM抗体の重鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子および軽鎖またはその抗原結合部分をコードする単離された核酸分子を投与する工程、ならびに核酸分子を発現させる工程を含む。遺伝子治療法はまた、別の抗炎症性剤または免疫調節剤を投与する工程を含んでもよい。
【０２２２】
診断的使用法
抗MAdCAM抗体を使用して、インビトロまたはインビボで生物学的試料中のMAdCAMを検出してよい。抗MAdCAM抗体を、非限定的に、ELISA、RIA、FACS、組織免疫組織化学、ウェスタンブロットまたは免疫沈降を含めた従来のイムノアッセイで使用してよい。本開示の抗MAdCAM抗体を使用して、ヒト由来のMAdCAMを検出してよい。別の態様において、抗MAdCAM抗体を使用して、カニクイザルおよびアカゲザル、チンパンジーならびに類人猿などの旧世界霊長類由来のMAdCAMを検出してよい。本開示は、生物学的試料中のMAdCAMを検出するための方法であって、生物学的試料を本開示の抗MAdCAM抗体と接触させること、およびMAdCAMに結合した抗体を検出することを含む方法を提供する。一態様において、抗MAdCAM抗体は、検出可能な標識で直接誘導体化される。別の態様において、抗MAdCAM抗体（第一の抗体）は標識されず、抗MAdCAM抗体に結合できる第二の抗体または他の分子が標識される。当業者に周知であるように、第一の抗体の特定の種およびクラスに特異的に結合することができる第二の抗体が選択される。例えば、抗MAdCAM抗体がヒトIgGである場合、二次抗体は、抗ヒトIgGであってよい。抗体に結合できる他の分子は、非限定的に、プロテインAおよびプロテインGを含み、その両方とも、例えばPierce Chemical Co.から市販されている。
【０２２３】
抗体または二次抗体（secondary）に対する好適な標識は、前記に開示されており、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、磁気物質および放射性物質を含む。好適な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む；好適な補欠分子族複合体の例は、ストレプトアビジン/ビオチンおよびアビジン/ビオチンを含む；好適な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンを含む；発光物質の例は、ルミノールを含む；磁気物質の例は、ガドリニウムを含む；好適な放射性物質の例は、125I、131I、35Sまたは3Hを含む。
【０２２４】
代替の態様において、検出可能な物質で標識されたMAdCAM標準および標識されていない抗MAdCAM抗体を利用した競合イムノアッセイによって、MAdCAMを生物学的試料においてアッセイすることができる。このアッセイでは、生物学的試料、標識されたMAdCAM標準および抗MAdCAM抗体を混合し、標識されていない抗体に結合した標識されたMAdCAM標準の量を決定する。生物学的試料中のMAdCAMの量は、抗MAdCAM抗体に結合した標識されたMAdCAM標準の量に反比例する。
【０２２５】
上で開示したイムノアッセイを多数の目的に使用してよい。一態様において、抗MAdCAM抗体を使用して、細胞培養中の細胞においてMAdCAMを検出してよい。好ましい態様において、様々な化合物で細胞を処理した後に、抗MAdCAM抗体を使用して、細胞表面MAdCAM発現のレベルを判定してよい。この方法を使用して、MAdCAMを活性化または阻害するために使用され得る化合物を試験することができる。この方法では、細胞の1つの試料を試験化合物で一定期間処理し、一方、別の試料を未処理のままとし、次いで、細胞表面発現をフローサイトメトリー、免疫組織化学、ウェスタンブロット、ELISAまたはRIAによって判定することもできる。加えて、MAdCAMの活性化または阻害のいずれかについて多数の化合物を試験するために、イムノアッセイをハイスループットスクリーニング用にスケールアップしてもよい。
【０２２６】
また、本開示の抗MAdCAM抗体を使用して、組織上または組織に由来する細胞においてMAdCAMのレベルを判定してもよい。好ましい態様において、組織は、疾患組織である。より好ましい態様において、組織は、炎症を起こした胃腸管またはその生検である。該方法の好ましい態様において、組織またはその生検が患者から切除される。次いで、組織または生検をイムノアッセイで使用して、例えば、MAdCAMレベル、MAdCAMの細胞表面レベル、またはMAdCAMの局在を上で考察した方法によって判定する。該方法を使用して、炎症を起こした組織がMAdCAMを高レベルで発現するかを判定することができる。
【０２２７】
上記の診断法を使用して、組織が高レベルのMAdCAMを発現するかどうかを判定することができ、これは、その組織が抗MAdCAM抗体による処置に良く応答するかの指標となり得る。さらに、該診断法を使用して、抗MAdCAM抗体（下記を参照のこと）による処置によって組織がより低いレベルのMAdCAMを発現させるかどうかを判定してもよく、ひいては、これを使用して、処置が成功したかどうかを判定することができる。
【０２２８】
また、本開示の抗体をインビボで使用して、MAdCAMを発現する組織および器官の位置を特定してもよい。好ましい態様において、抗MAdCAM抗体を使用して、炎症を起こした組織の位置を特定することができる。本開示の抗MAdCAM抗体の利点は、それらが投与によって免疫応答を生じないことである。該方法は、抗MAdCAM抗体またはその薬学的組成物をそのような診断検査の必要のある患者に投与する工程、および、患者を画像解析に供してMAdCAMを発現する組織の位置を判定する工程を含む。画像解析は、医学分野において周知であり、非限定的に、X線解析、ガンマシンチグラフィ、磁気共鳴画像検査（MRI）、陽電子放出断層撮影法またはコンピュータ断層撮影法（CT）を含む。該方法の別の態様において、患者を画像解析に供するよりむしろ、患者から生検を得て、関心対象の組織がMAdCAMを発現するかどうかを判定する。好ましい態様において、患者において画像検査できる検出可能な作用物質で抗MAdCAM抗体を標識してよい。例えば、X線解析に使用できるバリウムなどの造影剤、またはMRIもしくはCTに使用できるガドリニウムキレートなどの磁気造影剤で抗体を標識してよい。他の標識用物質は、非限定的に、99Tcなどの放射性同位体を含む。別の態様において、抗MAdCAM抗体は、標識されず、検出可能でありかつ抗MAdCAM抗体と結合することができる二次抗体または他の分子を投与することによって画像検査される。
【０２２９】
また、本開示の抗MAdCAM抗体を使用して、ドナーの血液、血清、血漿または他の生物流体（便、尿、痰または生検試料を非限定的に含む）中に存在する可溶性MAdCAMのレベルを判定してもよい。好ましい態様において、生物流体は、血漿である。次いで、生物流体をイムノアッセイで使用して、可溶性MAdCAMのレベルを判定する。可溶性MAdCAMは、進行中の胃腸炎症についての代理のマーカーであることもでき、その検出法を、疾患重症度を測定するための診断マーカーとして使用することもできる。
【０２３０】
上記の診断法を使用して、個体が高レベルの可溶性MAdCAMを発現するかどうかを判定することができ、これは、その個体が抗MAdCAM抗体による処置に良く応答するかの指標となり得る。さらに、該診断法を使用して、抗MAdCAM抗体（下記を参照のこと）または他の薬学的物質による疾患の処置によって個体がより低いレベルのMAdCAMを発現させるかどうかを判定してもよく、ひいては、これを使用して、処置が成功したかどうかを判定することができる。
【０２３１】
抗MAdCAM抗体によるα4β7/MAdCAM依存性接着の阻害
別の態様において、本開示は、MAdCAMに結合して、α4β7-インテグリン保有細胞のMAdCAMへのまたはL-セレクチンなどの他の同族リガンドのMAdCAMへの結合および接着を阻害する、抗MAdCAM抗体を提供する。好ましい態様において、MAdCAMは、ヒトであり、可溶性形態であるかまたは細胞の表面に発現されるかのいずれかである。別の好ましい態様において、抗MAdCAM抗体は、ヒト抗体である。別の態様において、該抗体またはその部分は、α4β7とMAdCAMとの間の結合を50nM以下のIC50値で阻害する。好ましい態様において、IC50値は、5nM以下である。より好ましい態様において、IC50値は、5nM未満である。より好ましい態様において、IC50値は、0.05μg/mL、0.04μg/mLまたは0.03μg/mL未満である。別の好ましい態様において、IC50値は、0.5μg/mL、0.4μg/mLまたは0.3μg/mL未満である。IC50値は、当技術分野において公知の任意の方法によって測定することができる。典型的には、IC50値は、ELISAまたは接着アッセイによって測定することができる。好ましい態様において、IC50値は、MAdCAMを天然に発現する細胞もしくは組織またはMAdCAMを発現するように操作された細胞もしくは組織のいずれかを使用した接着アッセイによって測定される。
【０２３２】
抗MAdCAM抗体による腸関連リンパ組織へのリンパ球動員の阻害
別の態様において、本開示は、天然に発現されるMAdCAMに結合し、特定化された胃腸リンパ組織へのリンパ球の結合を阻害する、抗MAdCAM抗体を提供する。好ましい態様において、天然に発現されるMAdCAMは、ヒトまたは霊長類MAdCAMであり、可溶性形態であるかまたは細胞の表面に発現されるかのいずれかである。別の好ましい態様において、抗MAdCAM抗体は、ヒト抗体である。別の態様において、該抗体またはその部分は、MAdCAMを発現する組織への腸栄養性α4β7+リンパ球の動員を5mg/kg以下のIC50値で阻害する。好ましい態様において、IC50値は、1mg/kg以下である。より好ましい態様において、IC50値は、0.1mg/kg未満である。一態様において、ガンマシンチグラフィまたは単一陽電子放出コンピュータ断層撮影法を使用して、胃腸管へのテクネチウム標識末梢血リンパ球の動員の用量効果関係を測定することによって、IC50値を判定することができる。別の態様において、限定されないがCD4+ α4β7+メモリーT細胞などの腸栄養性α4β7+リンパ球の末梢循環中の増加をフローサイトメトリーを使用して測定することによって、抗MAdCAM抗体の用量の関数として、IC50値を判定することができる。
【０２３３】
本開示がより良く理解され得るために、以下の実施例が示される。これらの実施例は、例証を目的としたものにすぎず、本開示の範囲を限定するものといかようにも解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２３４】
実施例1：
抗MAdCAM産生ハイブリドーマの作製
本実施例に従って、本開示の抗体を調製し、アッセイし、選択した。
【０２３５】
一次免疫原の調製：
XenoMouse（商標）マウスの免疫化のために2つの免疫原を調製した：（i）MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質および（ii）MAdCAMが安定的にトランスフェクトされた細胞から調製された細胞膜。
【０２３６】
（i）MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質
発現ベクターの構築：
MAdCAMの成熟細胞外免疫グロブリン様ドメインをコードするEcoRI/BglII cDNA断片を、pINCY Incyteクローン（3279276）から切除し、pIG1ベクターのEcoRI/BamHI部位にクローニングして（Simmons, D. L. (1993) in Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, ed. Hartley, D. A. (Oxford Univ. Press, Oxford), pp. 93-127.））、インフレームのIgG1 Fc融合物を作製した。生じたインサートをEcoRI/NotIで切除し、pCDNA3.1+(Invitrogen)にクローニングした。ベクター中のMAdCAM-IgG1 Fc cDNAを配列確認した。MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質のアミノ酸配列を下に示す：
MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質：
2020533953.tif 000005
下線：シグナルペプチド
太字：MAdCAM細胞外ドメイン
【０２３７】
組換えタンパク質の発現/精製：
CHO-DHFR細胞に、MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質cDNAを含有するpCDNA3.1+ベクターをトランスフェクトし、600μg/mL G418および100ng/mLメトトレキサートを含有するイスコフ（Iscove）培地においてMAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質を発現する安定なクローンを選択した。タンパク質発現のために、中空繊維バイオリアクターに、10％の低IgGウシ胎児血清（Gibco）、非必須アミノ酸（Gibco）、2mMグルタミン（Gibco）、ピルビン酸ナトリウム（Gibco）、100μg/mL G418および100ng/mLメトトレキサートを含有するイスコフ培地中、MAdCAM-IgG1 Fcを安定に発現するCHO細胞を播種し、これを使用して濃縮した培地上清を生成した。アフィニティークロマトグラフィーによって、採取された上清からMAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質を精製した。簡単に述べると、上清をHiTrap Protein G Sepharose（5mL、Pharmacia）カラムにアプライし（2mL/分）、25mM Tris pH 8、150mM NaCl（5カラム容量）で洗浄し、100mMグリシン pH 2.5で溶出させ（1mL/分）、すぐさま画分を1M Tris pH 8でpH 7.5に中和した。MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質を含有する画分をSDS-PAGEによって特定し、一緒にプールし、35mM BisTris pH 6.5、150mM NaClであらかじめ平衡化したSephacryl S100カラム（Pharmacia）にアプライした。ゲル濾過を0.35mL/分で実施し、約3×5mLの画分にてMAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質のピークを収集した。これらの試料をプールし、35mM BisTris pH 6.5中であらかじめ平衡化したResource Q（6mL、Pharmacia）カラムにアプライした。カラムを、5カラム容量の35mM Bis Tris pH 6.5、150mM NaClで洗浄し（6mL/分）、MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質を35mM Bis Tris pH 6.5、400mM NaClで4〜6mLの画分に溶出させた。この段階で、タンパク質は90％純粋であり、SDS-PAGEによって約68kDの単一バンドとして移動した。免疫原としての使用および全ての後続のアッセイのために、この材料を、25mM HEPES pH 7.5、1mM EDTA、1mM DTT、100mM NaCl、50％グリセロールに緩衝液交換し、アリコートとして-80℃で保存した。
【０２３８】
（ii）MAdCAMを安定に発現する細胞膜
公開されたMAdCAM配列（Shyjan AM, et al., J Immunol., 156, 2851-7 (1996)）のヌクレオチド645〜1222を含むSacI/NotI断片を、結腸cDNAライブラリーからPCR増幅させ、pIND-Hygroベクター（Invitrogen）のSacI/NotI部位にクローニングした。追加の5’コード配列を含むSacI断片を、pCDNA3.1 MAdCAM-IgG1 Fcからのこの構築物にサブクローニングし、完全長のMAdCAM cDNAを作製した。次いで、MAdCAM cDNAを含有するKpnI/NotI断片を、pEF5FRTV5GWCATベクター（Invitrogen）中の対応する部位にクローニングし、CATコード配列を置換した。cDNAインサートを配列確認し、これを、製造業者の使用説明書に従ったFlpリコンビナーゼテクノロジーによるFlpIn NIH 3T3細胞（Invitrogen）でのトランスフェクションに使用して、単一の安定に発現するクローンを作製した。下に概説するα4β7+JYヒトBリンパ芽球様細胞株（Chan BM, et al, J. Biol. Chem., 267:8366-70 (1992)）の結合を支持する能力によって、安定に発現するクローンを選択した。FlpIn CHO細胞（Invitrogen）を使用して、MAdCAMを発現するCHO細胞の安定なクローンを同じように調製した。
【０２３９】
MAdCAMを発現するFlpIn NIH-3T3細胞を、2mM L-グルタミン、10％ドナー子ウシ血清（Gibco）および200μg/mLハイグロマイシンB（Invitrogen）を含有するダルベッコ改変イーグル培地（Gibco）中で成長させ、ローラーボトル中で増大させた。MAdCAMを発現するFlpIn CHO細胞を、2mM L-グルタミン、10％ドナー子ウシ血清（Gibco）および350μg/mLハイグロマイシンB（Invitrogen）を含有するハムF12/ダルベッコ改変イーグル培地（Gibco）中で成長させ、ローラーボトル中で増大させた。非酵素的細胞解離溶液（Sigma）の使用および掻き取りによって細胞を採取し、リン酸緩衝食塩水中で遠心分離によって洗浄した。25mM Bis Tris pH 8、10mM MgCl2、0.015％（w/v）アプロチニン、100U/mLバシトラシン中での2ラウンドのポリトロンホモジナイゼーションおよび遠心分離によって、細胞ペレットから細胞膜を調製した。最終ペレットを同じ緩衝液に再懸濁し、50×106個の細胞等価物を厚肉エッペンドルフに分割し、>100,000gでスピンして、XenoMouseマウス免疫化用の細胞膜ペレットを作製した。上清をデカントし、必要となるまで膜をエッペンドルフ中に-80℃で保存した。細胞膜中のタンパク質発現の確認を、SDS-PAGEおよびMAdCAMのN末端残基（[C]-KPLQVEPPEP）に対して作製されたウサギ抗ペプチド抗体でのウェスタンブロッティングによって判定した。
【０２４０】
免疫化およびハイブリドーマ作製：
8〜10週齢のXENOMOUSE（商標）マウスを、精製された組換えMAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質（10μg/用量/マウス）、または、MAdCAMを安定に発現するCHO細胞もしくはNIH 3T3細胞のいずれかから調製された細胞膜（10×106個の細胞/用量/マウス）のいずれかで、腹腔内にまたは後部足蹠において免疫化した。この用量を3〜8週間かけて5〜7回繰り返した。融合の4日前に、マウスに、PBS中のヒトMAdCAMの細胞外ドメインの最終注射を受けさせた。免疫化マウス由来の脾臓およびリンパ節リンパ球を、非分泌性骨髄腫P3-X63-Ag8.653細胞株と融合させ、以前に記載されているようにHAT選択に供した（Galfre and Milstein, Methods Enzymol. 73:3-46 (1981)）。全てがMAdCAM特異的ヒトIgG2κおよびIgG4κ抗体を分泌するハイブリドーマの一団を回収し、サブクローニングした。MAdCAMに特異的なモノクローナル抗体を産生する12個のハイブリドーマサブクローン1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4および9.8.2を回収し、下記のアッセイで検出した。サブクローンハイブリドーマ株1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4および9.8.2が由来する親株1.7、1.8、6.14、6.22、6.34、6.67、6.73、6.77、7.16、7.20、7.26および9.8は全て、抗MAdCAM活性を有した。
【０２４１】
X481.2
選択したクローンを、最終タンパク質における想定外のスプライシング事象を除去するようにさらに操作した。想定外のスプライシング事象は、伸長したタンパク質の産生をもたらした。伸長が、想定外のスプライシング事象を導いたリードスルーの結果であったことが発見された。理論に束縛されるものではないが、想定外のスプライシング事象が、重鎖の終点と4244bp下流の領域（SV40由来配列領域中）とを結び付けたと考えられる。この観察された伸長を排除するように新しいベクターを設計した。重鎖領域を操作して重鎖の3’末端でヌクレオチドを置換して（TからAへ変化）、スプライスドナー部位の除去をもたらした。結果として得られたこの再操作されたクローン由来のMAdCAM抗体は、X481.2である。
【０２４２】
ELISAアッセイ：
マウス血清およびハイブリドーマ上清における抗原特異的抗体の検出を、記載されているようにELISAによって（Coligan et al., Unit 2.1 "Enzyme-linked immunosorbent assays," in Current ProtocolsIinImmunology （1994））、抗体を捕捉するMAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質を使用して判定した。MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質で免疫化した動物について、フローサイトメトリーによって、ヒトIgG1に対する非特異的反応性およびFlpIn CHO MAdCAM細胞に結合する能力について抗体をスクリーニングした。
【０２４３】
好ましいELISAアッセイにおいて、以下の技術を使用する。
【０２４４】
緩衝液（100mM炭酸/重炭酸ナトリウム緩衝液 pH 9.6）を含有するプレート中100μL/ウェルのMAdCAM-IgG1 Fc融合物（4.5μg/mL）で、4℃で一晩、ELISAプレートをコーティングした。インキュベーション後、コーティング緩衝液を除去し、プレートを200μL/ウェルのブロッキング緩衝液（リン酸緩衝食塩水中5％ BSA、0.1％ Tween 20）でブロッキングし、室温で1時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を除去し、50μL/ウェルのハイブリドーマ上清または他の血清または上清（例えば、陽性対照）を室温で2時間加えた。インキュベーション後、プレートをPBS（3×100μL/ウェル）で洗浄し、ハイブリドーマmAbの結合を、PBS中で希釈したHRPコンジュゲート二次抗体（すなわち、IgG2抗体について1：1000マウス抗ヒトIgG2-HRP（SB Cat. No. 9060-05）またはIgG4抗体について1：1000マウス抗ヒトIgG4-HRP（Zymed Cat. No. 3840））で検出した。プレートを室温で1時間インキュベートし、PBS（3×100μL/ウェル）中で洗浄し、最後に、100μLのOPD（o-フェニレンジアミン（DAKO S2405）＋5μL 30％ H2O2/12mL）で発色させた。プレートを10〜20分間発色させ、100μLの2M H2SO4で反応を停止した。プレートを490nmで読み取った。
【０２４５】
接着アッセイ：
MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質への結合がELISAによって実証された抗体を、α4β7+JY細胞および（i）MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質または（ii）MAdCAM-CHO細胞のいずれかとの接着アッセイで、アンタゴニスト活性について評価した。
【０２４６】
（i）MAdCAM-IgG1 Fc融合物アッセイ
ダルベッコPBS中の精製されたMAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質の4.5μg/mLの溶液100μLを、96ウェルのBlack Microfluor「B」u底（Dynex #7805）プレートに4℃で一晩吸着させた。次いで、MAdCAMコーティングプレートを反転させて、余分な液体を取り去った後、10％ BSA/PBS中にて37℃で少なくとも1時間ブロッキングした。この時間中、培養したJY細胞を、トリパンブルー排除を使用して計数し（約8×105細胞/mLであるはず）、20×106細胞/アッセイプレートを50mLの遠心チューブ中にピペッティングした。JY細胞を、2mM L-グルタミンおよび10％熱不活性化ウシ胎児血清（Life Technologies #10108-165）を含有するRPMI1640培養（Gibco）中で培養し、培養物が分化するのを防ぐために2〜3日毎に1〜2×105/mLで播種した。細胞を、2mM L-グルタミン（Gibco）を含有するRPMI 1640培養（Gibco）で遠心分離（240g）によって2回洗浄し、Calcein AMローディングのために最終細胞ペレットをRPMI 1640中に2×106細胞/mLで再懸濁した。Calcein AM（Molecular Probes #C-3099）を、DMSO中の1：200希釈物（終濃度約5μM）として細胞に加え、インキュベーション（37℃で30分間）中、細胞を光から保護した。この細胞インキュベーション工程の間、試験すべき抗体を以下のとおり希釈した：単一用量試験について、PBS中0.1mg/mL BSA（Sigma#A3059）中に最大3μg/mL（1μg/mL最終）で抗体を作製した；完全IC50曲線について、抗体を0.1mg/mL BSA/PBS中で希釈し、最高濃度を3μg/mL（1μg/mL最終）とし、次いで、プレート全体で希釈物を2倍（1：2比）にした。列の最終ウェルを、総結合を判定するために使用し、そのため、PBS中0.1mg/ml BSAを使用した。
【０２４７】
ブロッキング後、プレート内容物をはじき飛ばし、抗体/対照50μLを各ウェルに加え、プレートを37℃で20分間インキュベートした。この時間中、CalceinをローディングしたJY細胞を、10％ウシ胎児血清を含有するRPMI 1640培地で1回、1mg/mL BSA/PBSで1回遠心分離によって洗浄し、最終細胞ペレットを1mg/mL BSA/PBS中に1×106/mLに再懸濁した。細胞100μLをU底プレートの各ウェルに加え、プレートを密閉して、短時間遠心し（1000rpmで2分間）、次いで、プレートを37℃で45分間インキュベートした。この時間の終わりに、Skatronプレート洗浄装置でプレートを洗浄し、Wallac Victor2 1420 Multilabel Readerを使用して蛍光を測定した（励起λ485nm、発光λ535nm、上面から、プレートの底から8mm、通常の発光開口で0.1秒のカウント）。抗体濃度毎に、接着率を、非特異的結合に関連した蛍光を差し引いた任意の抗体の非存在下における最大蛍光応答の百分率として表した。IC50値は、接着応答が抗MAdCAM抗体の非存在下における応答の50％まで減少した抗MAdCAM抗体濃度として定義される。MAdCAM-IgG1 Fc融合物へのJY細胞の結合をIC50値<0.1μg/mLで阻害することができた抗体を強力なアンタゴニスト活性を有するとみなし、これをMAdCAM-CHO接着アッセイへと進めた。試験したAbの12個全てが、強力なアンタゴニスト活性を示した（表3）。モノクローナル抗体1.7.2、1.8.2、7.16.6、7.20.5および7.26.4は、IgG2κ系列に由来するものであり、モノクローナル抗体6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1および9.8.2は、IgG4κ系列に由来するものであった。
【０２４８】
（ii）MAdCAM-CHO細胞接着アッセイ
JY細胞を上記のとおり培養した。pEF5FRT MAdCAM cDNA構築物を用いて、上記のとおりのFlpリコンビナーゼテクノロジー（Invitrogen）を使用して、MAdCAMを発現するCHO細胞を作製した。JY細胞の接着を支持する能力およびMAdCAMのN末端に対して作製された上記のウサギ抗ペプチド抗体のフローサイトメトリーによる結合に基づいて、MAdCAMを発現するCHO細胞の単一の安定なクローンを選択した。MAdCAMを発現するCHO細胞を、2mM L-グルタミン、10％ウシ胎児血清（Gibco）および350μg/mLハイグロマイシンB（Invitrogen）を含有するDMEM/F12培地（Gibco # 21331-020）中で培養し、2/3日毎に1：5に分割した。接着アッセイのために、MAdCAMを発現するCHO細胞を、96ウェルの黒色プレート-透明底（Costar # 3904）に培養培地200μL中4×104細胞/ウェルで播種し、37℃/5％ CO2で一晩培養した。
【０２４９】
翌日、ハイブリドーマ上清または精製されたモノクローナル抗体を、上記のとおり、1mg/mL BSA/PBS中に開始濃度30μg/mL（終濃度10μg/mLと等しい）から希釈した。MAdCAM CHOプレートについて、プレート内容物をはじき飛ばし、抗体／対照50μLを各ウェルに加え、プレートを37℃で20分間インキュベートした。列の最終ウェルを、総結合を判定するために使用し、そのため、PBS中0.1mg/ml BSAを使用した。Calcein AMをローディングしたJY細胞（1mg/mL BSA/PBS中1×106/mLまでの終濃度）を上記のとおり調製し、次いで、抗体との20分間のインキュベーション後に100μLをプレートに加えた。次いで、プレートを37℃で45分間インキュベートし、次いで、Tecanプレート洗浄装置（PW 384）上で洗浄し、上記のとおりWallacプレートリーダーを使用して蛍光を測定した。抗体濃度毎に、接着率を、非特異的結合に関連した蛍光を差し引いた任意の抗体の非存在下における最大蛍光応答の百分率として表した。MAdCAM CHO細胞へのJY細胞の結合をIC50値<1μg/mLで阻害することができた抗体を強力なアンタゴニスト活性を有するとみなした。前述のように、IC50値は、接着応答が抗MAdCAM抗体の非存在下における応答の50％まで減少した抗MAdCAM抗体濃度として定義される。このアッセイにおける1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4および9.8.2についてのIC50効力を下の表3に記載する。
【０２５０】
（表３）例示的な抗MAdCAM抗体のIC50値
2020533953.tif 000006
【０２５１】
腸関連リンパ組織の役目を果たす高内皮細静脈上の微小血管環境を模倣するように設計されたずり応力（sheer stress）条件下、フローに基づいたアッセイにおいて、抗MAdCAM mAbのアンタゴニスト効力を測定するために、MAdCAMを発現するCHO細胞をマイクロスライドガラス（50×4mm）に播き、集密的な単層（約2.5×105細胞）を形成するまで接着させた。次いで、細胞を、フローアッセイシステムに接続する前に、アフィニティー精製したmAbと広範な濃度（0.1〜10μg/mL）にわたって37℃で20分間インキュベートした。アイソタイプが一致したIgG2またはIgG4 mAb（10μg/mL）を陰性対照として使用した。正常なドナー末梢血リンパ球（PBL）を、0.05 Paの一定のずり応力で細胞単層に対して灌流した。実験をビデオに撮り、リンパ球の総接着（ローリング+強力接着）を計算した。試験したモノクローナル抗体の全てが、記載の条件下で強力なアンタゴニストであることが示された。
【０２５２】
（iii）スタンパー−ウッドラフ（Stamper-Woodruff）アッセイ
MAdCAM+血管を可視化するために、製造業者の使用説明書に従ってリン酸緩衝食塩水中20モル過剰のビオチン-NHS（Pierce）を使用して、1〜2mgのアフィニティー精製したタンパク質上でビオチン化抗MAdCAM mAbを作製した。反応物を室温で静置し（30分）、PD-10（Pharmacia）カラムで脱塩し、タンパク質濃度を決定した。
【０２５３】
正常な肝臓リンパ節をドナー器官から取り出し、液体窒素中で急速凍結し、使用まで-70℃で保存した。10μmのクリオスタット切片を切断し、ポリ-L-リシンでコーティングされたスライド上で空気乾燥させ、アッセイの前にアセトン中に固定した。切片を、アビジン-ビオチンブロッキングシステム（DAKO）を使用してブロッキングし、次いで、ビオチン化抗MAdCAM mAbと共に広範な濃度（1〜50μg/mL）にわたって室温でインキュベートした（2時間）。アイソタイプが一致したIgG2またはIgG4 mAb（50μg/mL）を陰性対照として使用し、ブロッキング抗β7抗体（50μg/mL）を陽性対照として使用した。
【０２５４】
正常なドナーから採取された末梢血リンパ球をマウス抗ヒトCD2 mAb（DAKO）で標識して、接着細胞のその後の可視化を可能にした。5×105個のPBLを各リンパ節切片に加え、30分間インキュベートした後に、接着細胞の脱離を回避するように穏やかに洗い流した。次いで、切片をアセトン中に再固定し、ビオチン化抗MAdCAM mAb（10μg/mL）、続いて、ビオチン化ヤギ抗マウスmAb（CD2標識PBLおよび未染色のMAdCAM+血管を認識するため）、次いで、streptABcomplex/HRP（DAKO）と再インキュベートした。最後に、切片にDAB基質（DAKO）を加えてMAdCAM+血管&CD2標識PBLを可視化し、ここで、茶色の反応生成物が陽性染色の領域を示している。門脈管、静脈または類洞の50個のMAdCAM-1+血管に接着しているリンパ球の数を計数することによって、リンパ球接着を定量した。次いで、平均値として表されるデータを、いずれの抗体も存在しない場合のPBLの接着を100％として使用して、接着率へと標準化した。n=3の異なるPBLドナーに基づき、かつ、異なる肝臓リンパ節ドナーについて、データを編集した。ビオチン化された精製モノクローナル抗体1.7.2および7.16.6についての代表的なデータを、ブロッキング抗β7抗体対照と比較して図4に描写する。
【０２５５】
選択性アッセイ：
VCAMおよびフィブロネクチンは、MAdCAMに近い構造および配列の相同体である。α4β1+/α5β1+ Jurkat T細胞（ATCC）のそれらの同族細胞接着分子への結合を遮断する能力を判定することによって、アフィニティー精製した抗MAdCAM mAbをMAdCAM特異性について評価した。ダルベッコPBS中のフィブロネクチン細胞結合断片（110Kd、Europa Bioproducts Ltd, Cat. No. UBF4215-18）またはVCAM（Panvera）の4.5μg/mLの溶液100μLを、96ウェルのBlack Microfluor「B」u底（Dynex #7805）プレートに4℃で一晩吸着させた。次いで、コーティングプレートを反転させて、余分な液体を取り去った後、10％ BSA/PBS中にて37℃で少なくとも1時間ブロッキングした。この時間中、培養したJurkat T細胞を、トリパンブルー排除を使用して計数し、上記JY細胞について以前に記載されているようにCalcein AM色素をローディングした。試験すべき抗体を、PBS中0.1mg/ml BSA中に10μg/mLの最高濃度から希釈した。列の最終ウェルを、総結合を判定するために使用し、そのため、PBS中0.1mg/ml BSAを使用した。PBS中に調製したエキスタチン（Bachem, Cat. No. H-9010）を最高濃度100nMで使用して、α5β1／フィブロネクチン相互作用を遮断した。最高濃度1μg/mLの抗CD106 mAb（Clone 51-10C9, BD Pharmingen Cat. No. 555645）を使用して、α4β1/VCAM相互作用を遮断した。
【０２５６】
ブロッキング後、プレート内容物をはじき飛ばし、抗体/対照50μLを各ウェルに加え、プレートを37℃で20分間インキュベートした。CalceinをローディングしたJurkat T細胞を前述のように1回洗浄し、最終細胞ペレットを1mg/mL BSA/PBS中に1×106/mLに再懸濁した。細胞100μLをU底プレートの各ウェルに加え、プレートを密閉して、短時間遠心し（1000rpmで2分間）、次いで、プレートを37℃で45分間インキュベートした。この時間の終わりに、Skatronプレート洗浄装置でプレートを洗浄し、Wallac Victor2 1420 Multilabel Readerを使用して蛍光を測定した（励起λ485nm、発光λ535nm、上面から、プレートの底から8mm、通常の発光開口で0.1秒のカウント）。抗体毎に、阻害の程度を下の表4に記号で表す（-無視できる接着の阻害、***完全な接着阻害）。例示されたmAbは全て、VCAMおよびフィブロネクチンと比べて実質的に100倍を超えるMAdCAMに対する選択性を実証した、強力かつ選択的な抗MAdCAMアンタゴニストである。
【０２５７】
（表４）他の細胞接着分子、フィブロネクチンおよびVCAMと比べた、MAdCAMに対する抗MAdCAM抗体の相対的選択性
2020533953.tif 000007
【０２５８】
ハイブリドーマは、CAMR, Porton Down, Salisbury, Wiltshire SP4 0JGにあるEuropean Collection of Cell Cultures(ECACC), H.P.Aに2003年9月9日に以下の寄託番号で寄託された。
2020533953.tif 000008
【０２５９】
実施例II：
BIAcoreによる完全ヒト抗MAdCAMモノクローナル抗体の親和性定数（Kd）の決定
本発明者らは、製造業者のプロトコルに従ってBIAcore 3000装置を使用した表面プラズモン共鳴によって、精製した抗体の親和性測定を実施した。
【０２６０】
プロトコル1
動態解析を実施するために、ルーチンのアミンカップリングを使用して、CM5 BIAcoreセンサーチップ上に高密度マウス抗ヒト（IgG2およびIgG4）抗体表面を調製した。ハイブリドーマ上清を、100μg/mL BSAおよび10mg/mLカルボキシメチルデキストランを含有するHBS-P（10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、0.005％ Surfactant P20）ランニング緩衝液中で10、5、2倍希釈するかまたは未希釈で使用した。mAbベースラインの安定化のために1分の接触時間および5分の洗浄を使用して各mAbを別々の表面上に捕捉した。次いで、MAdCAM-IgG1 Fc（141nM）融合タンパク質を、全ての表面にわたって1分間注入し、続いて、3分解離させた。データを、各表面上に捕捉された抗体の量について標準化し、BIAcoreによって提供されるBIAevaluationソフトウェアで利用可能なベースラインドリフトモデルを使用して、グローバルフィットラングミュア1：1で評価した。
【０２６１】
プロトコル2
アフィニティー精製したmAbを、アミンカップリングを使用して、CM5バイオセンサーチップのデキストラン層上に固定化した。pH 4.5の酢酸緩衝液を固定化緩衝液として使用してチップを調製し、タンパク質濃度2.5〜5.5kRUを達成した。ランニング緩衝液中のMAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質の試料を0.2〜55nMの範囲の濃度で調製した（ランニング緩衝液単独を含む0nM溶液をゼロ参照として含めた）。試料をランダム化し、ランニング緩衝液としてHBS-EP（10mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、3mM EDTA、0.005％ Surfactant P20）を使用して、4フロー細胞にわたって、それぞれ、二連で3分間注入した。流速100μL/分を使用して、大量輸送制限を最小限にした。MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質の解離を180分間モニタリングし、25mM H3PO4（50μL/分）、または10mM（6.22.2）、20mM（6.67.1、6.73.2、6.77.1）〜25mM（6.34.2）および45mM NaOH（6.14.2）の6秒注入によって表面を再生し、BIAevaluation（v3.1）ソフトウェアパッケージを使用してデータを解析した。
【０２６２】
表5は、本開示の代表的な抗MAdCAM抗体についての親和性測定値を列記する。
【０２６３】
（表５）表面プラズモン共鳴（BIAcore）による親和性定数Kdの決定
2020533953.tif 000009
【０２６４】
動態解析は、本開示に従って調製された抗体が、MAdCAMの細胞外ドメインに対して高い親和性および強い結合定数を有することを示している。
【０２６５】
実施例III：
抗MAdCAM mAbのエピトープ選択性および種交差反応性の特定
抗体は、抗原上の表面露出エピトープを線状（一次）配列または構造（二次）配列の領域として認識する。抗MAdCAM抗体の機能的エピトープランドスケープを定義するために、Luminexエピトープビニング、BIAcoreビニングおよび種免疫組織化学的分析を併せて使用した。
【０２６６】
Luminexに基づくエピトープビニング：
MxhlgG2,3.4コンジュゲートビーズ（Calbiochem Ml 1427）を未知の一次抗MAdCAM抗体にカップリングさせた。本発明者らは、未知の一次抗体希釈液（ハイブリドーマ培地に希釈された0.1μg/mL）150μLを96ウェル組織培養プレートのウェルに加えた。ビーズストックを穏やかにボルテックスし、上清中で0.5×105ビーズ/mLの濃度に希釈した。ビーズを、上清中、暗所にて振盪機上4℃で一晩インキュベートした。
【０２６７】
96ウェルマイクロタイターフィルタープレート（Millipore # MABVN1250）の各ウェルを、洗浄緩衝液（0.05％ Tween20を含有するPBS）200μLを加えることによってあらかじめ湿らせ、吸引によって除去した。次に、0.5×105ビーズ/mLストックの50μL/ウェルを、フィルタープレートに加え、洗浄緩衝液（2×100μL/ウェル）でウェルを洗浄した。ハイブリドーマ培地中に希釈したMAdCAM-IgG1 Fc 抗原（0.1μg/mL）の60μL/ウェルを加えた。プレートを覆い、室温で穏やかに振盪させながら1時間インキュベートした。ウェルを、100μL/ウェルの洗浄緩衝液の添加によって2回洗浄し、続いて吸引した。次に、本発明者らは、ハイブリドーマ培地中に希釈した未知の二次抗MAdCAM抗体（0.1μg/mL）の60μL/ウェルを加えた。プレートを暗所にて室温で2時間振盪させた。次に、ウェルを、100μL/ウェルの洗浄緩衝液の添加によって2回洗浄し、続いて吸引した。次に、60μL/ウェルのビオチン化MxhIgG 2,3,4（0.5μg/mL）を加えた。プレートを暗所にて室温で1時間振盪させた。ウェルを、100μL/ウェルの洗浄緩衝液の添加によって2回洗浄し、続いて吸引した。各ウェルに、ハイブリドーマ培地中に希釈した1μg/mLのMxhIgG 2,3,4ストレプトアビジン-PE（Pharmacia #554061）60μLを加えた。プレートを暗所にて室温で20分間振盪させた。ウェルを、100μL/ウェルの洗浄緩衝液の添加によって2回洗浄し、続いて吸引した。次に、各ウェルをブロッキング緩衝液（0.5％ウシ血清アルブミン、0.1％ TWEENおよび0.01％ Thimerosalを含むPBS）80μLに、慎重に上下にピペッティングして再懸濁し、ビーズを再懸濁させた。
【０２６８】
Luminex 100およびその添付のソフトウェア（Luminex（登録商標）Corporation）を使用して、プレートを読み取って、ルミネセンス読み取りを決定した。試験した様々な抗MAdCAM抗体について得られたルミネセンスデータに基づいて、抗MAdCAM抗体をそれらの結合特異性に従って分類した。試験した抗MAdCAM抗体は、表8に表示した一連のエピトープビンに属する。
【０２６９】
BIAcoreビニング：
上記のものと類似の方法で、BIAcoreを使用して、本開示によって例示される抗MAdCAM抗体のエピトープ排他性を判定することもできる。9つの抗MAdCAM抗体クローン6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1、7.20.5、9.8.2、1.7.2、7.26.4および7.16.6を、アミンカップリングを使用して、CM5バイオセンサーチップの別々のフローセルのデキストラン層上に固定化した。固定化緩衝液は、10mM酢酸緩衝液pH 4.5（クローン6.22.2、6.34.2、7.20.5、9.8.2、1.7.2、7.26.4および7.16.6）または10mM酢酸緩衝液pH 5.5（クローン6.67.1および6.77.1）のいずれかであった。タンパク質密度約3750 RUが全ての場合に達成された。1Mエタノールアミン塩酸塩pH 8.5を使用して、未反応のN-ヒドロキシスクシンイミドエステルの不活性化を実施した。
【０２７０】
MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質を、HBS-EPランニング緩衝液（0.01M HEPES pH 7.4、0.15M NaCl、3mM EDTA、0.005％ポリソルベート20）中1.5μg/mL（約25nM）の濃度に希釈した。次いで、それを、5μL/分の速度、50μLの量で、第一フローセルに注入した。注入が完了した後、第一の抗体プローブを同じフローセルに加えた。全ての試験抗体を、HBS-EP中約20μg/mLの濃度に希釈し、また、5μL/分の流速、50μLの量で注入した。試験抗体の結合が観察されなかった場合、次の試験クローンをすぐ後に注入した。結合が生じた場合、センサー表面を再生して、MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質および試験抗体の両方を除去した。固定化抗体および存在する試験抗体に応じて、多種多様な再生溶液を使用した。使用される再生条件の概要を表6に描写する。
【０２７１】
（表６）BIAcoreエピトープマッピングを実施するために使用される再生条件の概要
2020533953.tif 000010
（流速は、全ての再生手順中、50μL/分であった）
【０２７２】
再生後、MAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質を再び結合させ、さらなる試験抗体を注入した。これらの手順を、クローンの一団全体が、結合したMAdCAM-IgG1 Fc融合タンパク質を有する固定化抗体の表面一面に注入されるまで、行った。次いで、異なる固定化抗体および結合したMAdCAMを含む新しいフローセルを、9つの試験クローンで探索するために使用した。抗MAdCAM抗体1.7.2および1.8.2は、それらの重鎖およびカッパ軽鎖SEQ ID NO：2、4、6、8の近い一次アミノ酸配列相同性に基づいて、同じMAdCAMエピトープを認識すると予想された。したがって、1.7.2だけ、BIAcore応答マトリクスを通して評価した。抗体6.14.2および6.73.2をこの分析から除外したが、抗MAdCAM抗体ペアの他の全ての組み合わせをこのように試験した。100 RUの任意レベルを、結合／非結合の間の閾値として選択し、結合が観察されたかどうかに基づいて応答マトリクス（表7）を作成した。
【０２７３】
（表７）BIAcoreエピトープビニング応答マトリクス
2020533953.tif 000011
抗体ペアの全ての組み合わせについての応答マトリクス。-は、抗体プローブの結合がないことを示し、xは、結合が観察されたことを示す（100 RUの選択された閾値レベルより上）。
【０２７４】
表7中のマトリクス対角線（網掛けの灰色）は、同一のプローブペアについての結合データを保持する。全ての例において、2つのクローン7.16.6および9.8.2を除き、抗体は自己ブロッキングされた。抗体7.16.6および9.8.2は、交差競合しない。自己ブロッキングの欠如は、mAbのMAdCAM-IgFc上の第二部位への追加の結合を可能にする、mAbによって誘導される融合タンパク質の立体構造変化に起因し得る。同じ反応性パターンを示すクローンの分類は、グラフ表示に示されているように（図5）、少なくとも6つの異なるエピトープビンを生じる。
【０２７５】
抗MAdCAM抗体が相互作用するMAdCAMエピトープ配列のさらなる正確な特定は、限定されないが、スポットされたペプチドライブラリーアレイのウェスタン分析（Reineke et al., Curr. Topics in Microbiol. and Immunol 243: 23-36 (1999), M. Famulok, E-L Winnacker, C-H Wong eds., Springer-Verlag, Berlin）、ファージもしくは細菌フラジェリン／fliC発現ライブラリーディスプレイ、または限定的なタンパク分解後の結合したタンパク質断片の単純MALDI-TOF解析を含めた多数の方法のいずれかによって判定することができる。
【０２７６】
免疫組織化学的アッセイ：
回腸（パイエル板）、腸間膜リンパ節、脾臓、胃、十二指腸、空腸および結腸のOCTまたはスクロースで包埋した凍結組織検体を、抗MAdCAM mAbについての陽性染色対照として使用した。ヒト切片をヒトIgG2 mAbで染色するために、抗MAdCAM mAbのビオチン化誘導体を作製した。10μmの凍結組織切片を、ポリ-L-リシンでコーティングされたスライド上で切断し、4℃の100％アセトン（10分）中、次いでメタノール中3％過酸化水素（10分）中に直接置き、工程間にPBSで洗浄した。スライドを、Biotin Blocking System（DAKO Cat. No. X0590）でブロッキングした後、PBS中一次抗体（1：100〜1：1000）とインキュベーションし（1時間）、PBS-Tween 20（0.05％）で洗浄し、次いで、HRP-ストレプトアビジン（BD Bioscience Cat. No.550946、30分）およびDAB基質（Sigma Cat. No. D5905）で結合を発色させた。IgG4 mAbについては、HRPコンジュゲートマウス抗ヒトIgG4（Zymed Cat. No. 3840）二次抗体を使用した。スライドをマイアーのヘマラムで対比染色し（1分）、洗浄し、次いでDPXに載せた。
【０２７７】
多数の種（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、カニクイザルおよびヒト組織）に対して結合親和性を比較した。免疫組織化学により、ラット、ウサギおよびブタ組織において反応性はなく、ELISAによって分析したときに組換えマウスMAdCAMに対する抗MAdCAM抗体の交差反応性もなかった。ヒト、カニクイザルおよびイヌ組織についてのデータを、表形式で以下の表8に提示する。
【０２７８】
（表８）MAdCAM種オーソログへの抗MAdCAM抗体の交差反応性のパターン
2020533953.tif 000012
n.d：未判定
【０２７９】
特定化された内皮構造およびリンパ組織への抗MAdCAM結合は、その凡例に従った濃淡によって示す。Luminexエピトープ分析に基づいたエピトープビンおよびMAdCAM交差反応性のパターンを抗体毎に示す。フォント文字の違いによって示しているとおり、抗MAdCAM抗体6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.3および6.77.1についてのLuminexエピトープビニングデータ（イタリック文字）は、1.7.2、1.8.2、7.16.6、7.20.5、7.26.4および9.8.2（太字）の実験とは別々の実験に由来する。
【０２８０】
試験した抗MAdCAM抗体は全て、胃腸管の血管内皮コンパートメント上に発現されるヒトMAdCAMエピトープを認識する能力を有した。1.7.2および1.8.2とは別に、試験した他の抗MAdCAM抗体は全て、カニクイザル胃腸管の血管内皮コンパートメントに特異的に結合することができた。特定の他の抗MAdCAM抗体、すなわち6.14.2および6.67.1もまた、カニクイザルMAdCAMだけでなく、イヌMAdCAMオーソログも特異的に認識する能力を有した。
【０２８１】
機能的に活性なキメラカニクイザル/ヒトMAdCAMを発現するCHO細胞株の作製：
特定の抗MAdCAM抗体のヒトおよびカニクイザルMAdCAMに対する結合親和性の差から、本発明者らは、この知見に対して構造的な根拠が組み立てることができるかどうかを判定した。
【０２８２】
マカクMAdCAMについての公開されたアミノ酸配列（Shyjan AM, et al., J Immunol., 156, 2851-7 (1996)）に基づいて、カニクイザルMAdCAM α4β7結合ドメイン配列をPCR増幅させるようにプライマーを設計した。Trizol法（Invitrogen）を製造業者の使用説明書に従って使用して、凍結した切除されたカニクイザル腸間膜リンパ節（約200mg）から全RNAを調製した。1〜2μgをオリゴ-dTプライミングし、AMV逆転写酵素（Promega）で逆転写した。ある割合の逆転写産物を、
2020533953.tif 000013
プライマーを用いて、1M GC melt（Clontech）中、アニール温度62℃でのGC-2ポリメラーゼによるPCRに供した。電気泳動後に1％アガロースゲルから適切なサイズのRT-PCR産物を切除および精製し、次いで、pCR2.1のEcoRI部位間にTOPO-TAクローニングした（Invitrogen）。インサートを配列確認した。ヌクレオチドおよび予測される翻訳されたアミノ酸配列を、それぞれSEQ ID NO 49および50に示す。
【０２８３】
α4β7結合ドメインについての予測されるヒトおよびカニクイザルMAdCAMアミノ酸配列は、整列させたときに（図3は、この配列アラインメントを提供する）、高程度の配列同一性（90.8％）を示す。表8によって示される抗MAdCAM結合パターンを模倣する機能的に活性なカニクイザルMAdCAM発現細胞株を作製するために、pCR2.1におけるカニクイザルα4β7結合ドメイン配列に対応するSacI断片を、上記のカルボキシル末端ムチンストークおよび膜貫通ドメインを含有するC末端ヒトMAdCAM pIND-Hygro構築物に直接サブクローニングした。配列および配向を検証し、次いで、KpnI/NotI断片をpEF5FRTV5GWCATベクター（Invitrogen）にクローニングしてCATコード配列を置換し、これを、製造業者の使用説明書に従ったFlp In CHO細胞（Invitrogen）でのトランスフェクションに使用して、単一の安定に発現するクローンを作製した。
【０２８４】
フローサイトメトリーによってカニクイザル/ヒトMAdCAMキメラを発現するCHO細胞への抗MAdCAM抗体クローンの結合を評価し、上記のものと非常に類似したJY細胞接着アッセイを使用して抗MAdCAM抗体の機能活性を判定した。抗MAdCAM抗体の結合および機能活性を表9に表す。
【０２８５】
（表９）広範な抗MAdCAM抗体についての、カニクイザル/ヒトMAdCAM-CHO/JY接着アッセイにおける機能活性と、FACSによって測定した場合のヒトおよびカニクイザル/ヒトMAdCAM CHO細胞結合との間の相関
2020533953.tif 000014
【０２８６】
まとめると、免疫組織化学によって検出した場合のヒトまたはカニクイザルMAdCAMに結合する所与の抗MAdCAM抗体の能力（表8）と、組換え細胞に基づく結合および機能活性（表9）との間には良好な相関がある。例として、抗MAdCAM抗体1.7.2、1.8.2および6.73.2は、キメラカニクイザル/ヒトMAdCAMタンパク質を発現するカニクイザル組織および細胞への結合の一貫した欠如を実証した。抗MAdCAM抗体1.7.2、1.8.2および6.73.2はまた、カニクイザル/ヒトMAdCAM/JY接着アッセイにおいて機能的なブロッキング活性を検出する能力を有していなかった。
【０２８７】
類似したアプローチを使用して、イヌMAdCAMを認識する抗MAdCAM抗体6.14.2および6.67.1のエピトープを定義することもできる。
【０２８８】
実施例IV：
疾患診断の方法としての循環可溶性MAdCAMの検出における抗MAdCAM mAbの使用
抗MAdCAM抗体を、循環可溶性MAdCAM（sMAdCAM）の検出に使用することができる。臨床血漿、血清試料または他の生物流体（例えば、限定されないが便、尿、痰）中のsMAdCAMの検出は、限定されないが炎症性腸疾患を含む潜在する疾患についての有用な代理の疾患バイオマーカーである可能性が高い。
【０２８９】
エピトープビニングデータ（表7および8）に基づいて、抗MAdCAM抗体1.7.2および7.16.6は、ヒトMAdCAM上の異なるエピトープを認識するようである。ELISAプレートを、4℃で一晩、リン酸緩衝食塩水（PBS）中50μg/mLの1.7.2の溶液100μL／ウェルでコーティングした。インキュベーション後、10％ミルクを含有するPBSブロッキング緩衝液（200μL/ウェル）でプレートを1.5時間ブロッキングした。インキュベーション後、PBS（2×100μL/ウェル）でプレートを洗浄し、MAdCAM-IgG1-Fc融合タンパク質の段階希釈液（PBS中50μg/mLの最高濃度から約5ng/mLまで、最終量100μLまで）を、室温での2時間のインキュベーションのためにプレートに加えた。類似したアプローチでは、MAdCAM-IgG1-Fcタンパク質を血漿もしくは血清、またはいくつかの他のそのような関連する生物流体中で希釈し、これを使用して下記のとおり、臨床試料において可溶性MAdCAMの発現を判定することができる。陰性対照として、緩衝液だけを、一次抗MAdCAM抗体を含有するウェルに加えた。この後、プレートをPBS（3×100μL/ウェル）で洗浄し、次いで、プレートをAlexa488標識7.16.6（100μL、5μg/mL）と暗所でインキュベートした。Alexa488標識7.16.6は、市販されているキット（Molecular Probes, A-20181）を製造業者のプロトコルに従って使用して作製した。
【０２９０】
プレートを、0.05％ Tween-20を含有するPBSで洗浄し、そして、捕捉された可溶性MAdCAMへの標識7.16.6の結合を、蛍光を測定することによって判定した（Wallac Victor2 1420 Multilabel Reader、励起λ485nm、発光λ535nm、上面から、プレートの底から3mm、通常の発光開口で0.1秒のカウント）。蛍光をMAdCAM-IgG1-Fc融合タンパク質の濃度の関数としてプロットしたら（図6）、それは、1.7.2および標識7.16.6を診断目的に使用して、生物流体または臨床試料において発現される循環可溶性MAdCAMのレベルを決定できることを示す。このサンドイッチELISAアプローチは、表7および図5のデータおよび解釈によって概略されるように、1.7.2および7.16.6だけでなく、MAdCAM上の異なるエピトープを認識する抗MAdCAM抗体のあらゆる組み合わせの使用にも制限されない。類似した戦略を、記載される他の抗MAdCAM抗体と共に異なるパートナー、バリアント、標識などを使用した免疫組織化学およびウェスタンブロットなどの類似のアッセイの開発に適用することもできる。
【０２９１】
実施例V：
本開示に従って調製された抗MAdCAM mAbのアミノ酸構造
以下の考察では、本開示に従って調製された抗MAdCAM mAbに関する構造情報が提供される。
【０２９２】
本開示に従って生産されたmAbの構造を解析するために、本発明者らは、特定したハイブリドーマクローンからの重鎖および軽鎖断片をコードする遺伝子をクローニングした。遺伝子クローニングおよびシーケンシングを以下のとおり達成した。
【０２９３】
Fast-Trackキット（Invitrogen）を使用して、免疫化されたXenoMouseマウスに由来する約2×105のハイブリドーマ細胞からポリ(A)+mRNAを単離した。ランダムにプライミングされたcDNAの作製に続いて、PCRを行った。ヒトVHまたはVκファミリー特異的プライマー（Marks et al.,‘Oligonucleotide primers for polymerase chain reaction amplification of human immunoglobulin variable genese and design of family-specific oligonucleotide probes'; Eur. J. Immunol., 21, 985-991 (1991)）またはユニバーサルヒトVHプライマー
2020533953.tif 000015
を、ヒトCγ2
2020533953.tif 000016
またはCγ4定常領域
2020533953.tif 000017
またはCκ定常領域（hκP2；以前にGreen et al., 1994に記載されているような）に特異的なプライマーと共に使用した。ハイブリドーマからのヒトmAb由来の重鎖およびカッパ鎖転写物の配列を、上記のプライマーを使用してポリ(A+)RNAから生成されたPCR産物の直接シーケンシングによって得た。TOPO-TAクローニングキット（Invitrogen）を使用して、PCR産物をpCR2.1にクローニングし、PrismダイターミネーターシーケンシングキットおよびABI 377シーケンシング装置を使用して両方の鎖をシーケンシングした。「V BASE配列ディレクトリ」（Tomlinson, et al, J. Mol. Biol., 227, 776-798 (1992); Hum. Mol. Genet., 3, 853-860 (1994); EMBO J., 14, 4628-4638 (1995)）へのアラインメントによって全ての配列を解析した。
【０２９４】
さらに、抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4、9.8.2、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modの各々を完全長DNAシーケンシングに供した。そのために、RNeasy kit（Qiagen）を使用して、約3〜6×106のハイブリドーマ細胞から全RNAを単離した。オリゴ-dTおよびAMVに基づく逆転写酵素系（Promega）を使用してmRNAを逆転写した。V BASEを使用して、表10に示すとおり、特定の重鎖およびカッパ鎖のための、最適なコザック配列およびATG開始コドン（下線を引いた）を含有する5'特異的増幅プライマーならびに3'リバースプライマーを設計した。
【０２９５】
（表１０）抗MAdCAM mAbを発現するハイブリドーマからのcDNA増幅のためのPCRプライマー対および抗MAdCAM抗体の改変バージョンの構築に使用されるプライマー
2020533953.tif 000018
2020533953.tif 000019
【０２９６】
該プライマー対を使用し、Expand High Fidelity Taqポリメラーゼ（Roche）を使用してcDNAを増幅させ、後続のシーケンシングのためにPCR産物をpCR2.1 TOPO-TA（Invitrogen）にクローニングした。次いで、重鎖およびカッパ軽鎖配列を確認したクローンを、XbaI/EcoRIおよびHindIII/EcoRI部位をそれぞれ使用してpEE6.1およびpEE12.1ベクター（LONZA）にクローニングした。
【０２９７】
遺伝子利用解析
表11は、本開示に概説される各ハイブリドーマについての重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子利用を表示する。
【０２９８】
（表１１）重鎖およびカッパ軽鎖遺伝子利用
2020533953.tif 000020
【０２９９】
配列解析
抗体構造をさらに調べるために、クローンから得られたcDNAから抗体の予測アミノ酸配列を得た。
【０３００】
配列識別番号（SEQ ID NO：）1〜48および51〜68は、抗MAdCAM抗体1.7.2（SEQ ID NO 1〜4）、1.8.2（SEQ ID NO 5〜8）、6.14.2（SEQ ID NO 9〜12）、6.22.2（SEQ ID NO 13〜16）、6.34.2（SEQ ID NO 17〜20）、6.67.1（SEQ ID NO 21〜24）、6.73.2（SEQ ID NO 25〜28）、6.77.1（SEQ ID NO 29〜32）、7.16.6（SEQ ID NO 33〜36）、7.20.5（SEQ ID NO 37〜40）、7.26.4（SEQ ID NO 41〜44）、9.8.2（SEQ ID NO 45〜48）ならびに改変された抗MAdCAM抗体6.22.2-mod（SEQ ID NO 51〜54）、6.34.2-mod（SEQ ID NO 55〜58）、6.67.1-mod（SEQ ID NO 59〜62）および6.77.1-mod（SEQ ID NO 63〜66）および7.26.4-mod（SEQ ID NO 41〜42、67〜68）の重鎖およびカッパ軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。クローニングされた各々の抗MAdCAM抗体配列について、シグナルペプチド配列（またはそれをコードする塩基）の配列を小文字で示し、下線を引いている。
【０３０１】
図1A〜1Jは、抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4および9.8.2の予測重鎖アミノ酸配列とそれぞれの生殖系列遺伝子産物のアミノ酸配列との間の配列アラインメントを提供する。抗体のCDR1、CDR2およびCDR3配列の位置に下線を引き、発現された配列と対応する生殖系列配列との間の違いを太字で示し、生殖系列と比較して発現された配列に付加がある場合、これらを、生殖系列配列において（-）として示す。
【０３０２】
図1K〜1Tは、抗体1.7.2、1.8.2、6.14.2、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.16.6、7.20.5、7.26.4および9.8.2の予測カッパ軽鎖アミノ酸配列とそれぞれの生殖系列遺伝子産物のアミノ酸配列との間の配列アラインメントを提供する。抗体のCDR1、CDR2およびCDR3配列の位置に下線を引き、発現された配列と対応する生殖系列配列との間の違いを太字で示し、生殖系列と比較して発現された配列に付加がある場合、これらを、生殖系列配列において（-）として示す。
【０３０３】
翻訳後修飾：グリコシル化および脱アミド化の存在：
発現された抗MAdCAM抗体配列中の、由来する生殖系列配列と比較した変化の一部の効果は、N連結グリコシル化（Asn-X-Ser/Thr）および／または脱アミド化（Asn-Gly）を潜在的に受け得る残基を導入することである（表12を参照のこと）。抗MAdCAM抗体6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.26.4および9.8.2のカッパ軽鎖可変ドメインアミノ酸配列（SEQ ID NO：16、20、24、28、32、44および48）ならびに抗体6.14.2の重鎖可変ドメイン（SEQ ID NO：10）をコードする核酸配列は、N連結グリコシル化の存在を予測する。この翻訳後修飾の存在を、SDS-PAGEおよびPro-Q（登録商標）Emerald 488 Glycoprotein （Molecular Probes）染色をmAb 6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.26.4および9.8.2と組み合わせて使用して調査した。
【０３０４】
簡単に述べると、還元された抗MAdCAM抗体約2μgを、MOPS緩衝液を使用した4〜12％ SDS-ポリアクリルアミドゲル上にロードした。電気泳動に続いて、ゲルを、50％ MeOH、5％酢酸中で固定し、3％酢酸中で洗浄した。次いで、ゲル上のあらゆる糖を過ヨウ素酸で酸化し、Pro-Q（登録商標）Emerald 488 Glycoprotein Stain Kit（Molecular Probes）を使用して染色した。最後の洗浄工程の後、糖タンパク質染色を、473nmの波長に設定された蛍光スキャナを使用して可視化した。
【０３０５】
糖タンパク質染色後、SYPRO Rubyタンパク質ゲル染色を使用して、ゲルを総タンパク質について染色し、473nmの波長に設定された蛍光スキャナを使用して分析した。抗MAdCAM抗体6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.73.2、6.77.1、7.26.4および9.8.2のカッパ軽鎖は全て、グリコシル化の存在について陽性に染色された。追加の確認として、抗MAdCAM抗体7.26.4をトリプシン/キモトリプシンによる消化に供し、LC-MS/MS分析により、改変されたトリプシン性ペプチドの存在を確認し、カッパ軽鎖グリコシル化を追加で確認した。
【０３０６】
抗MAdCAM抗体1.7.2、1.8.2、6.22.2および7.20.5のCDR1領域中の特定のAsn-Gly配列は、これらの領域を脱アミド化に感受性にする。中性pHにおける脱アミド化は、負電荷を導入し、またβ-異性化を導くこともでき、これが抗体の性質に影響を与える可能性がある。抗MAdCAM抗体1.7.2、1.8.2および7.20.5について、脱アミド化されたAsn-イソアスパラギン酸残基の存在を、イソアスパラギン酸側鎖をMeOHでトラップした後に質量分光法によって評価した。
【０３０７】
手短に述べると、抗MAdCAM抗体1.7.2について、トリプシン/Asp-Nペプチド
2020533953.tif 000021
（1573.7Da）の状態を、LC-MS/MSによるモニタリングのために選択した。抗MAdCAM抗体1.7.2を10mM DTT中で還元し、5mMヨウ化酢酸Na中でアルキル化し、その後、トリプシン消化緩衝液（50mM Tris-HCl、1mM CaCl2、pH 7.6）へ緩衝液交換した。次いで、抗体を、シーケンシング等級の改変トリプシン（Promega）とプロテアーゼ：タンパク質比1：20で混合した。タンパク質をトリプシン中、30℃で15時間消化し、生じたペプチドを、Ettan LCシステム上C-18 RPCを使用したHPLCによって分離した。カラムから33Asnを含有するペプチド（4032Da）を回収し、Asp-N消化緩衝液（50mMリン酸ナトリウム緩衝液、pH 8.0）中で希釈した。次いで、エンドプロテイナーゼAsp-N（Roche）を近似ペプチド：酵素比10：1で加えた。
【０３０８】
塩化アセチル（100μL）をメタノール試料（1mL、-20℃）に加え、混合物を室温まで温めた。トリプシン＋Asp-N消化物をSpeed-Vac内で乾燥させ、次いで、メタノール/塩化アセチル5μLを加え（45分、室温）、次いで、Speed-Vac内で再び乾燥させた。生じた残基を0.1％ TFA中で再構築し、ペプチドを、最初に、Voyager-DE STR MALDI-TOF質量分析計上でニトロセルロース薄層試料調製法またはC18 Zip Tips（Millipore）を使用した逆相精製のいずれかを使用して分析し、続いて、α-シアノマトリクスとの液滴混合を行った。また、メチル化ペプチド混合物も、上記のように、Deca XP Plus Ion Trap質量分析計上でLC-MS/MSを使用して分析した。溶出液を、Ion Trap MS中へ真っすぐに配置し、その後、ペプチドをMSおよびMS/MSによって分析した。MSを、300Da〜2000Daの全てのイオンを分析するように設定した。次いで、任意の特定のスキャンにおいて最も強いイオンをMS/MS分析に供した。
【０３０９】
（表１２）抗MAdCAM抗体の翻訳後修飾
2020533953.tif 000022
【０３１０】
変異誘発研究：
本開示において例示された抗MAdCAM抗体の一次アミノ酸配列を、部位特異的変異誘発によって修飾して、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、脱アミド化）の潜在的な部位を除去することも、アイソタイプバックグラウンドを変更することも、治療有用性を改善し得る他の変化を操作することもできる。一例として、PCRを使用して、抗MAdCAM抗体6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1および7.26.4への変化を操作して、特定のフレームワーク配列を生殖系列に戻し、潜在的なグリコシル化部位を除去し、かつ/またはアイソタイプバックグラウンドをヒトIgG2に変化させた。重鎖ヌクレオチドSEQ ID NO：13、17、21および29、ならびにカッパ軽ヌクレオチドSEQ ID NO：15、19、23、31および43に対応するpCR2.1 TOPO-TAクローニングされたcDNA（100ng）を、重複−伸長および表10に記載のプライマーセットの一団を使用した一連のPCRにおいて鋳型として使用した。
【０３１１】
6.22.2重鎖：PCRプライマーセット6.22.2_VH_F1および6.22.2VH_CS*（1）ならびにVH3-33および6.22.2_VH_R1（2）を使用して、Expand Taqポリメラーゼおよびヌクレオチド配列SEQ ID NO：13によって表されるpCR2.1 TOPO-TA cDNA鋳型（100ng）を使用し、別々のPCR産物（1）および（2）を作製した。産物（1）および（2）を精製し、第三のPCR工程（各々約50ng）でVH3-33およびVK6.22.2_CS*プライマーと一緒に組み合わせて、改変された6.22.2重鎖V-ドメインを作製した。この改変バージョンは、FR1にHis/Phe変異を含有し、対応するヒトIgG2定常ドメインを含有するpEE6.1CHと呼ばれるpEE6.1由来ベクターへのインフレームクローニングを可能にするXbaI制限部位を導入する。最終PCR断片をpEE6.1CHのXbaI部位にクローニングし、配向をチェックし、インサートを全配列確認した。改変された6.22.2重鎖についてのヌクレオチド配列はSEQ ID NO：51に、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO：52に見いだされる。親と比較したヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変化を示す。
【０３１２】
6.22.2カッパ軽鎖：PCRプライマーセット6.22.2_VK_F1およびrevカッパ（1）、ならびにA26および6.22.2_VK_R1（2）を使用して、Expand Taqポリメラーゼおよびヌクレオチド配列SEQ ID NO：15によって表されるpCR2.1 TOPO-TA cDNA鋳型（100ng）を使用し、別々のPCR産物（1）および（2）を作製した。産物（1）および（2）を精製し、第三のPCR工程（各々約50ng）でA26およびrevカッパプライマーと一緒に組み合わせて、改変された6.22.2カッパ軽鎖V-ドメインを作製した。この改変バージョンは、FR3配列に対するAsn/AspおよびGly/Ser変化を含有する。生じたPCR産物を、HindIII/EcoR1部位を使用してpEE12.1にクローニングし、完全に配列確認した。改変された6.22.2カッパ軽鎖についてのヌクレオチド配列はSEQ ID NO：53に、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO：54に見いだされる。親と比較したヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変化を示す。
【０３１３】
6.34.2重鎖：PCRプライマーセット6.34.2_VH_F1および6.22.2VH_CS*（1）ならびにVH3-30および6.34.2_VH_R1（2）を使用して、Expand Taqポリメラーゼおよびヌクレオチド配列SEQ ID NO：17によって表されるpCR2.1 TOPO-TA cDNA鋳型（100ng）を使用し、別々のPCR産物（1）および（2）を作製した。産物（1）および（2）を精製し、第三のPCR工程（各々約50ng）でVH3-30およびVK6.22.2_CS*プライマーと一緒に組み合わせて、改変された6.34.2重鎖V-ドメインを作製した。この改変バージョンは、FR3にSer/Arg変異を含有し、対応するヒトIgG2定常ドメインを含有するpEE6.1CHと呼ばれるpEE6.1由来ベクターへのインフレームクローニングを可能にするXbaI制限部位を導入する。最終PCR断片をpEE6.1CHのXbaI部位にクローニングし、配向をチェックし、インサートを全配列確認した。改変された6.34.2重鎖についてのヌクレオチド配列はSEQ ID NO：55に、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO：56に見いだされる。親と比較したヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変化を示す。
【０３１４】
6.34.2カッパ軽鎖：PCRプライマーセットO12および6.34.2_VK_R1（1）、6.34.2_VK_F1および6.34.2_VK_R2（2）、ならびに6.34.2_VK_F2およびrevカッパ（3）を使用して、Expand Taqポリメラーゼおよびヌクレオチド配列SEQ ID NO：19によって表されるpCR2.1 TOPO-TA cDNA鋳型（100ng）を使用し、別々のPCR産物（1）、（2）および（3）を作製した。産物（1）、（2）および（3）を精製し、そして、（1）および（2）を第三のPCR工程（各々約50ng）でO12および6.34.2_VK_R2プライマーと組み合わせて、PCR産物（4）を作製した。PCR産物（2）および（3）を、第四のPCR工程（各々約50ng）で6.34.2_VK_F1およびrevカッパと組み合わせて、PCR産物（5）を作製した。PCR産物（4）および（5）を精製し、プライマーO12およびrevカッパと一緒に組み合わせて（各々約50ng）、改変された6.34.2カッパ軽鎖V-ドメインを作製した。この改変バージョンは、CDR1にAsn/Ser変化、FR2にPhe/Tyr変化ならびにFR3配列に対してArg-Thr/Ser-Ser、Asp/GluおよびSer/Tyr変化を含有する。生じたPCR産物を、HindIII/EcoR1部位を使用してpEE12.1にクローニングし、完全に配列確認した。改変された6.34.2カッパ軽鎖についてのヌクレオチド配列はSEQ ID NO：57に、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO：58に見いだされる。親と比較したヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変化を示す。
【０３１５】
6.67.1重鎖：PCRプライマーセット6.67.1_VH_F1および6.67.1VH_CS*（1）ならびにVH4-4および6.67.1_VH_R1（2）を使用して、Expand Taqポリメラーゼおよびヌクレオチド配列SEQ ID NO：21によって表されるpCR2.1 TOPO-TA cDNA鋳型（100ng）を使用し、別々のPCR産物（1）および（2）を作製した。産物（1）および（2）を精製し、第三のPCR工程（各々約50ng）でVH4-4およびVK6.67.1_CS*プライマーと一緒に組み合わせて、改変された6.67.1重鎖V-ドメインを作製した。この改変バージョンは、FR3にIle-Leu-Ala/Met-Ser-Val変換を含有し、対応するヒトIgG2定常ドメインを含有するpEE6.1CHと呼ばれるpEE6.1由来ベクターへのインフレームクローニングを可能にするXbaI制限部位を導入する。最終PCR断片をpEE6.1CHのXbaI部位にクローニングし、配向をチェックし、インサートを全配列確認した。改変された6.67.1重鎖についてのヌクレオチド配列はSEQ ID NO：59に、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO：60に見いだされる。親と比較したヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変化を示す。
【０３１６】
6.67.1カッパ軽鎖：PCRプライマーセット6.67.1_VK_F1およびrevカッパ（1）、ならびにB3および6.67.1_VK_R1（2）を使用して、Expand Taqポリメラーゼおよびヌクレオチド配列SEQ ID NO：23によって表されるpCR2.1 TOPO-TA cDNA鋳型（100ng）を使用し、別々のPCR産物（1）および（2）を作製した。産物（1）および（2）を精製し、第三のPCR工程（各々約50ng）でB3およびrevカッパプライマーと一緒に組み合わせて、改変された6.67.1カッパ軽鎖V-ドメインを作製した。この改変バージョンは、CDR1にThr/Asn変化およびFR2にArg/Gly変化を含有する。生じたPCR産物を、HindIII/EcoR1部位を使用してpEE12.1にクローニングし、完全に配列確認した。改変された6.67.1カッパ軽鎖についてのヌクレオチド配列はSEQ ID NO：61に、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO：62に見いだされる。親と比較したヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変化を示す。
【０３１７】
6.77.1重鎖：PCRプライマーセットVH 3-21および6.22.2VH_CS*を使用して、Expand Taqポリメラーゼおよびヌクレオチド配列SEQ ID NO：29によって表されるpCR2.1 TOPO-TA cDNA鋳型（100ng）を使用し、単一PCR産物を作製した。PCR産物をXbaIで消化し、ゲル精製して、pEE6.1CHのXbaI部位にクローニングし、配向をチェックした。インサートを完全に配列確認した。改変された6.77.1重鎖についてのヌクレオチド配列はSEQ ID NO：63に、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO：64に見いだされる。親と比較したヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変化を示す。
【０３１８】
6.77.1カッパ軽鎖：PCRプライマーセットA2および6.77.1_VK_R1（1）、6.77.1_VK_VK_F1および6.77.1_R2（2）、ならびに6.77.1_VK_F2およびrevカッパ（3）を使用して、Expand Taqポリメラーゼおよびヌクレオチド配列SEQ ID NO：31よって表されるpCR2.1 TOPO-TA cDNA鋳型（100ng）を使用し、別々のPCR産物（1）、（2）および（3）を作製した。産物（1）、（2）および（3）を精製し、そして、（1）および（2）を第三のPCR工程（各々約50ng）でA2および6.77.1_VK_R2プライマーを組み合わせて、PCR産物（4）を作製した。PCR産物（2）および（3）を、第四のPCR工程（各々約50ng）で6.77.1_VK_F1およびrevカッパプライマーと組み合わせて、PCR産物（5）を作製した。PCR産物（4）および（5）を精製し、プライマーA2およびJK2と一緒に組み合わせて（各々約50ng）、改変された6.77.1カッパ軽鎖V-ドメインを作製した。この改変バージョンは、CDR1にAsn/Lys変化、FR3にSer/Tyr変化およびCDR3配列にCys/Ser残基変化を含有する。生じたPCR産物を、HindIII/EcoR1部位を使用してpEE12.1にクローニングし、完全に配列確認した。改変された6.77.1カッパ軽鎖についてのヌクレオチド配列はSEQ ID NO：65に、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO：66に見いだされる。親と比較したヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変化を示す。
【０３１９】
7.26.4カッパ軽鎖：PCRプライマーセット7.26.4_VK_F1およびrevカッパ（1）、ならびにA2および7.26.4_VK_R1（2）を使用して、Expand Taqポリメラーゼおよびヌクレオチド配列SEQ ID NO：43によって表されるpCR2.1 TOPO-TA cDNA鋳型（100ng）を使用し、別々のPCR産物（1）および（2）を作製した。産物（1）および（2）を精製し、第三のPCR工程（各々約50ng）でA2およびrevカッパプライマーと一緒に組み合わせて、改変された7.26.4カッパ軽鎖V-ドメインを作製した。この改変バージョンは、CDR1にAsn/Ser変化を含有する。生じたPCR産物を、HindIII/EcoR1部位を使用してpEE12.1にクローニングし、完全に配列確認した。改変された7.26.4カッパ軽鎖についてのヌクレオチド配列はSEQ ID NO：67に、対応するアミノ酸配列はSEQ ID NO：68に見いだされる。親と比較したヌクレオチドおよびアミノ酸配列の変化を示す。
【０３２０】
6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modと称され、それぞれ重鎖ヌクレオチド配列SEQ ID NO：51、55、59、63および41、ならびに対応するアミノ酸配列SEQ ID NO：52、56、60、64および42、さらには、カッパ軽鎖ヌクレオチド配列SEQ ID NO：53、57、61、65および67、ならびに対応するアミノ酸配列SEQ ID NO：54、58、62、66および68を表している、6.22.2、6.34.2、6.67.1、6.77.1および7.26.4の改変バージョンの各々についての機能的な真核生物発現ベクターを以下のとおりアセンブルした：6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-modおよび6.77.1-modに対応する重鎖cDNAインサートを、NotI/SalIでpEE6.1CHベクターから切除し、7.26.4の重鎖の親バージョンを、NotI/SalIでpEE6.1ベクターから切除し、精製された断片を、カッパ軽鎖配列の改変バージョン6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modを含有する対応するpEE12.1ベクターに同一部位にクローニングした。ベクターの配列を確認し、HEK 293T細胞との一過性トランスフェクションに使用する量を精製した。簡単に述べると、トランスフェクションの前日にT165フラスコに播種し、Optimem中で洗浄した、9×106のHEK 293T細胞に、6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modに対応するベクターcDNA（40μg）を、Lipofectamine PLUS（Invitrogen）を製造業者の使用説明書に従って使用して一過性トランスフェクトした。細胞を3時間インキュベートし、次いで、トランスフェクション培地を、10％超低IgGウシ胎児血清（Invitrogen 16250-078）およびL-グルタミンを含有するDMEM（Invitrogen 21969-035）培地（50mL）に交換した。培地上清を5日後に採取し、濾過殺菌し、上記のものと類似した方法でプロテインGセファロースアフィニティークロマトグラフィーを使用して抗MAdCAM抗体を精製した。回収された抗体の量（20〜100μg）をBradfordアッセイによって定量した。
【０３２１】
6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modに対応するアフィニティー精製された抗体の抗MAdCAM活性を、以前に記載したとおりのMAdCAM-IgG1-Fc融合アッセイで評価した。これらの抗MADCAM抗体のIC50値を、これらが由来する親抗MAdCAM抗体と比較して表13に提示する。改変された抗MAdCAM抗体の活性に対する上記のアミノ酸置換の効果は、それらの親と比較して最小であった。抗体はまた、組換えヒトMAdCAMまたはカニクイザル／ヒトMAdCAMキメラを発現するCHO細胞への結合も維持した。
【０３２２】
（表１３）抗MAdCAM抗体の改変バージョン6.22.2-mod、6.34.2-mod、6.67.1-mod、6.77.1-modおよび7.26.4-modのそれらの親と比較した活性
2020533953.tif 000023
【０３２３】
実施例VI
抗MAdCAM抗体をブロッキングすることによる末梢循環におけるβ7+リンパ球の増加
抗MAdCAM抗体の機構的効果およびその血液中の循環レベルを特定および相関させるアッセイを開発した。阻害性抗MAdCAM抗体は、α4β7インテグリンを発現する白血球の胃腸管への動員を阻害する効果を有するはずである。α4β7インテグリンを保有する白血球のクラスは、それ故、末梢循環に制限されるはずである。
【０３２４】
これは、カニクイザルにおいて、完全ヒト抗ヒトMAdCAM mAb 7.16.6を用いて実証された。
【０３２５】
精製された抗ヒトMAdCAM mAb 7.16.6（1mg/kg）またはビヒクル（20mM酢酸Na、0.2mg/mLポリソルベート80、45mg/mLマンニトール、および0.02mg/mL EDTA、pH 5.5）を、2群のカニクイザル（n=4/群）への伏在静脈を介した静脈内投与によって類似した方法で評価した。投薬後3日目に、大腿静脈穿刺によって血液試料をEDTAチューブに収集した。カニクイザルα4β7インテグリンと交差反応するLPAM特異的抗体は市販されておらず、そのため、抗β7抗体（α4β7およびαEβ7インテグリンを認識する）を代わりに使用した。以下の表（表15）による抗体（30μL）を、カニクイザル血液100μLを含有するチューブに加え、穏やかなボルテックスによって混合し、4℃で20〜30分間インキュベートした。
【０３２６】
（表１５）カニクイザル血液のイムノフェノタイピングに使用される抗体（BD Pharmingen）
2020533953.tif 000024
【０３２７】
各チューブに、1：10 FACSlyse溶液（BD # 349202）1mLを加え、穏やかなボルテックスによって混合し、赤血球溶解が完了するまで暗所にて室温で約12分間インキュベートした。次いで、BD染色緩衝液（# 554656）2mLを各チューブに加え、混合し、250×gにて室温で6〜7分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを染色緩衝液3mLに再懸濁し、再び混合し、250×gにて室温で6〜7分間遠心分離した。w/vパラホルムアルデヒド（100μL）を含有するCytofix緩衝液（BD # 554655）を、サルの末梢血由来の細胞ペレットに加え、低/中速度のボルテックサーによって十分に混合した。試料を、それらがFACSCalibur上に取得されるまで、暗所にて4℃で維持した。取得直前に、全てのチューブにPBS（100μL）を加え、その直後に取得した。CD4+β7+CD95loCD28+（ナイーブ）、CD4+β7+CD95hiCD28+（セントラルメモリー）、CD4+β7-CD95hiCD28+（セントラルメモリー）、CD4+β7+CD95hiCD28-（エフェクターメモリー）の絶対細胞数を、適切なゲーティングおよび象限解析によって取得した。また、他のT細胞サブセット、例えば、CD8+ Tセントラルメモリー細胞（β7+CD8+CD28+CD95+）およびMAdCAMリガンドを保有する任意の他の白血球を、適切な抗体を用いてこの方法によって解析してもよい。ビヒクル対照と比較して、抗MAdCAM mAb 7.16.6は、図7に示すとおり、循環CD4+β7+CD95hiCD28+セントラルメモリーT細胞のレベルのおよそ3倍の増加を引き起こした。循環CD4+β7-CD95hiCD28+セントラルメモリーT細胞の集団に対して効果はなく、このことは、抗MAdCAM mAb 7.16.6の効果は、腸管ホーミングT細胞に特異的であることを示している。カニクイザルにおける抗MAdCAM mAb 7.16.6の循環（α4）β7+リンパ球の集団に対する効果は、これが、特に臨床状況における実際の適用に関して、代理バイオマーカーのメカニズムの頑強な証拠であることを示している。
【０３２８】
配列
SEQ ID NO：1〜48、51〜68および148〜150は、13個のヒト抗MAdCAM抗体についての重鎖およびカッパ軽鎖のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、カニクイザルMAdCAM α4β7結合ドメイン配列のヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびに5つの改変されたヒト抗MAdCAM抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。
【０３２９】
SEQ ID NO：1〜48および148〜150は、13個のヒトモノクローナル抗MAdCAM抗体：1.7.2（SEQ ID NO：1〜4）、1.8.2（SEQ ID NO：5〜8）、6.14.2（SEQ ID NO：9〜12）、6.22.2（SEQ ID NO：13〜16）、6.34.2（SEQ ID NO：17〜20）、6.67.1（SEQ ID NO：21〜24）、6.73.2（SEQ ID NO：25〜28）、6.77.1（SEQ ID NO：29〜32）、7.16.6（SEQ ID NO：33〜36）、7.20.5（SEQ ID NO：37〜40）、7.26.4（SEQ ID NO：41〜44）、9.8.2（SEQ ID NO：45〜48）、X481.2（SEQ ID NO：35、148〜150）の重鎖およびカッパ軽鎖ヌクレオチドならびにアミノ酸配列を提供する。
【０３３０】
SEQ ID NO：49〜50は、カニクイザルMAdCAM α4β7結合ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。
【０３３１】
SEQ ID NO：51〜68は、改変されたモノクローナル抗MAdCAM抗体：6.22.2（SEQ ID NO：51〜54）、改変された6.34.2（SEQ ID NO：55〜58）、改変された6.67.1（SEQ ID NO：59〜62）、改変された6.77.1（SEQ ID NO：63〜66）についての重鎖およびカッパ軽鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびに、改変されたモノクローナル抗MAdCAM抗体：改変された7.26.4（SEQ ID NO：67〜68）のカッパ軽鎖ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。
【０３３２】
SEQ ID NO：70〜106および108〜110は、様々なプライマー配列を提供する。
【０３３３】
凡例
シグナル配列：下線を引いた小文字
親と比較した、改変された抗MAdCAM抗体配列のアミノ酸変化：下線を引いた大文字
【０３３４】
SEQ ID NO：1
1.7.2重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000025
【０３３５】
SEQ ID NO：2
1.7.2予測重鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000026
【０３３６】
SEQ ID NO：3
1.7.2カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000027
【０３３７】
SEQ ID NO：4
1.7.2予測カッパ軽鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000028
【０３３８】
SEQ ID NO：5
1.8.2重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000029
【０３３９】
SEQ ID NO：6
1.8.2予測重鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000030
【０３４０】
SEQ ID NO：7
1.8.2カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000031
【０３４１】
SEQ ID NO：8
1.8.2予測カッパ軽鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000032
【０３４２】
SEQ ID NO：9
6.14.2重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000033
【０３４３】
SEQ ID NO：10
6.14.2予測重鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000034
【０３４４】
SEQ ID NO：11
6.14.2カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000035
【０３４５】
SEQ ID NO：12
6.14.2予測カッパ軽鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000036
【０３４６】
SEQ ID NO：13
6.22.2重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000037
【０３４７】
SEQ ID NO：14
6.22.2予測重鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000038
【０３４８】
SEQ ID NO：15
6.22.2カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000039
【０３４９】
SEQ ID NO：16
6.22.2予測カッパ軽鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000040
【０３５０】
SEQ ID NO：17
6.34.2重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000041
【０３５１】
SEQ ID NO：18
6.34.2予測重鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000042
【０３５２】
SEQ ID NO：19
6.34.2カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000043
【０３５３】
SEQ ID NO：20
6.34.2予測カッパ軽鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000044
【０３５４】
SEQ ID NO：21
6.67.1重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000045
【０３５５】
SEQ ID NO：22
6.67.1予測重鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000046
【０３５６】
SEQ ID NO：23
6.67.1カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000047
【０３５７】
SEQ ID NO：24
6.67.1予測カッパ軽鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000048
【０３５８】
SEQ ID NO：25
6.73.2重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000049
【０３５９】
SEQ ID NO：26
6.73.2予測重鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000050
【０３６０】
SEQ ID NO：27
6.73.2カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000051
【０３６１】
SEQ ID NO：28
6.73.2予測カッパ軽鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000052
【０３６２】
SEQ ID NO：29
6.77.1重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000053
【０３６３】
SEQ ID NO：30
6.77.1予測重鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000054
【０３６４】
SEQ ID NO：31
6.77.1カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000055
【０３６５】
SEQ ID NO：32
6.77.1予測カッパ軽鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000056
【０３６６】
SEQ ID NO：33
7.16.6重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000057
【０３６７】
SEQ ID NO：34
7.16.6予測重鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000058
【０３６８】
SEQ ID NO：35
7.16.6カッパ軽鎖ヌクレオチド配列およびX481.2カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000059
【０３６９】
SEQ ID NO：36
7.16.6カッパ軽鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000060
【０３７０】
SEQ ID NO：37
7.20.5重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000061
【０３７１】
SEQ ID NO：38
7.20.5予測重鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000062
【０３７２】
SEQ ID NO：39
7.20.5カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000063
【０３７３】
SEQ ID NO：40
7.20.5予測カッパ軽鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000064
【０３７４】
SEQ ID NO：41
7.26.4重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000065
【０３７５】
SEQ ID NO：42
7.26.4予測重鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000066
【０３７６】
SEQ ID NO：43
7.26.4カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000067
【０３７７】
SEQ ID NO：44
7.26.4予測カッパ軽鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000068
【０３７８】
SEQ ID NO：45
9.8.2重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000069
【０３７９】
SEQ ID NO：46
9.8.2予測重鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000070
【０３８０】
SEQ ID NO：47
9.8.2カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000071
【０３８１】
SEQ ID NO：48
9.8.2予測カッパ軽鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000072
【０３８２】
SEQ ID NO：49
カニクイザルMAdCAM α4β7結合ドメインのヌクレオチド配列
2020533953.tif 000073
【０３８３】
SEQ ID NO：50
カニクイザルMAdCAM α4β7結合ドメインのアミノ酸配列
2020533953.tif 000074
【０３８４】
SEQ ID NO：51
改変された6.22.2重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000075
【０３８５】
SEQ ID NO：52
改変された6.22.2重鎖アミノ酸配列
2020533953.tif 000076
【０３８６】
SEQ ID NO：53
改変された6.22.2カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000077
【０３８７】
SEQ ID NO：54
改変された6.22.2カッパ軽鎖アミノ酸配列
2020533953.tif 000078
【０３８８】
SEQ ID NO：55
改変された6.34.2重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000079
【０３８９】
SEQ ID NO：56
改変された6.34.2重鎖アミノ酸配列
2020533953.tif 000080
【０３９０】
SEQ ID NO：57
改変された6.34.2カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000081
【０３９１】
SEQ ID NO：58
改変された6.34.2カッパ軽鎖アミノ酸配列
2020533953.tif 000082
【０３９２】
SEQ ID NO：59
改変された6.67.1重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000083
【０３９３】
SEQ ID NO：60
改変された6.67.1重鎖アミノ酸配列
2020533953.tif 000084
【０３９４】
SEQ ID NO：61
改変された6.67.1カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000085
【０３９５】
SEQ ID NO：62
改変された6.67.1カッパ軽鎖アミノ酸配列
2020533953.tif 000086
【０３９６】
SEQ ID NO：63
改変された6.77.1重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000087
【０３９７】
SEQ ID NO：64
改変された6.77.1重鎖タンパク質配列
2020533953.tif 000088
【０３９８】
SEQ ID NO：65
改変された6.77.1カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000089
【０３９９】
SEQ ID NO：66
改変された6.77.1カッパ軽鎖アミノ酸配列
2020533953.tif 000090
【０４００】
SEQ ID NO：67
改変された7.26.4カッパ軽鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000091
【０４０１】
SEQ ID NO：68
改変された7.26.4カッパ軽鎖アミノ酸配列
2020533953.tif 000092
【０４０２】
SEQ ID NO：148
X481.2重鎖アミノ酸配列
2020533953.tif 000093
【０４０３】
SEQ ID NO：149
X481.2重鎖ヌクレオチド配列
2020533953.tif 000094
【０４０４】
SEQ ID NO：150
X481.2軽鎖アミノ酸配列
2020533953.tif 000095
【図１Ａ】
2020533953.tif 000097
【図１Ｂ】
2020533953.tif 000098
【図１Ｃ】
2020533953.tif 000099
【図１Ｄ】
2020533953.tif 000100
【図１Ｅ】
2020533953.tif 000101
【図１Ｆ】
2020533953.tif 000102
【図１Ｇ】
2020533953.tif 000103
【図１Ｈ】
2020533953.tif 000104
【図１Ｉ】
2020533953.tif 000105
【図１Ｊ】
2020533953.tif 000106
【図１Ｋ】
2020533953.tif 000107
【図１Ｌ】
2020533953.tif 000108
【図１Ｍ】
2020533953.tif 000109
【図１Ｎ】
2020533953.tif 000110
【図１Ｏ】
2020533953.tif 000111
【図１Ｐ】
2020533953.tif 000112
【図１Ｑ】
2020533953.tif 000113
【図１Ｒ】
2020533953.tif 000114
【図１Ｓ】
2020533953.tif 000115
【図１Ｔ】
2020533953.tif 000116
【図２Ａ−１】
2020533953.tif 000117
【図２Ａ−２】
2020533953.tif 000118
【図２Ａ−３】
2020533953.tif 000119
【図２Ｂ−１】
2020533953.tif 000120
【図２Ｂ−２】
2020533953.tif 000121
【図２Ｂ−３】
2020533953.tif 000122
【図３】
2020533953.tif 000123
【図４】
2020533953.tif 000124
【図５】
2020533953.tif 000125
【図６】
2020533953.tif 000126
【図７】
2020533953.tif 000127
【配列表】
2020533953000001.app
【国際調査報告】
2020533953.tif 000128
2020533953.tif 000129
2020533953.tif 000130
2020533953.tif 000131
2020533953.tif 000132
2020533953.tif 000133