(57)【要約】  少なくとも１つのアルキルアミノ連結を介して足場に結合した少なくとも１つのループ状ペプチド構造を含む化合物。好ましくは、ループ状ペプチド構造は、２つのアルキルアミノ連結と１つのチオエーテル連結を介して足場に結合した２つのペプチドループを含み、連結のうちの１つが両方のループに共通している二環性構造である。少なくとも１つのアルキルアミノ連結を介して足場に結合した少なくとも１つのループ状ペプチド構造を含む化合物を作製する方法であって、システイン、ジアミノプロピオン酸、β−Ｎ−アルキルジアミノプロピオン酸およびβ−Ｎ−アルキルジアミノプロピオン酸から選択される少なくとも２つの残基を有するペプチドを準備するステップと、但し、残基のうちの少なくとも１つが、ジアミノプロピオン酸、β−Ｎ−アルキルジアミノプロピオン酸およびβ−Ｎ−アルキルジアミノプロピオン酸であることを条件とし；前記少なくとも２つの残基とアルキルアミノ連結またはチオエーテル連結を形成するための少なくとも２つの反応性部位を有する足場分子を準備するステップと；ペプチドと足場分子の間に前記連結を形成するステップとを含む方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つのアルキルアミノ連結を介して足場に結合した少なくとも１つのループ状ペプチド構造を含む化合物。
【請求項２】
前記ループ状ペプチド構造が、少なくとも１つのチオエーテル連結を介して前記足場にさらに結合している、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ループ状ペプチド構造が、２つ以上のアルキルアミノ連結によって前記足場に結合している、請求項１または２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ループ状ペプチド構造が、前記足場に対する３つの連結間を結ぶ２つのペプチドループを含む二環性構造であり、中央の連結が、前記２つのペプチドループに共通する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項５】
前記足場が、（ヘテロ）芳香族部分または（ヘテロ）脂環式部分を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項６】
前記足場が、トリス置換６員環構造を含み、好ましくは、前記足場が、３回対称軸を有する、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
前記足場が、（ヘテロ）アリール足場のベンジル位にアルキルアミノ連結を含む、請求項５または６に記載の化合物。
【請求項８】
前記足場が、（ヘテロ）アリール足場または（ヘテロ）脂環式足場に位置するカルボニルに関して、アルファまたはベータ炭素位にアルキルアミノ連結を含む、請求項５または６に記載の化合物。
【請求項９】
前記アルキルアミノ連結が、その側鎖に少なくとも１つのアミン基を有するペプチドのアミノ酸残基によって作られ、好ましくは、前記アルキルアミノ連結が、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）またはβ−Ｎ−アルキル−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＡｌｋＤａｐ）またはβ−Ｎ−ハロアルキル−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＡｌｋＤａｐ）から選択される残基の側鎖アミン基によって作られ、「アルキル」は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルを指し、適切には、メチルである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１０】
少なくとも１つがアルキルアミノ連結である少なくとも２つの連結を介して足場に結合した少なくとも１つのループ状ペプチド構造を含む化合物を作製する方法であって、
システイン、ジアミノプロピオン酸、β−Ｎ−アルキルジアミノプロピオン酸およびβ−Ｎ−ハロアルキルジアミノプロピオン酸から選択される少なくとも２つのアミノ酸残基を有するペプチドを準備するステップと、ここで、前記残基のうちの少なくとも１つが、ジアミノプロピオン酸、β−Ｎ−アルキルジアミノプロピオン酸およびβ−Ｎ−ハロアルキルジアミノプロピオン酸から選択されることを条件とし、
前記少なくとも２つのアミノ酸残基の側鎖基とアルキルアミノ連結またはチオエーテル連結を形成するための少なくとも２つの反応性部位を有する足場分子を準備するステップと、
前記ペプチドと前記足場分子の間に前記連結を形成するステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記ペプチドが、前記アルキルアミノ連結を形成することを意図したアミノ基以外の求核基に保護基を有する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
求核置換反応において、前記ペプチドのアミノ基を、２つ以上の脱離基を有する足場分子と反応させることを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ペプチドが、システイン、ジアミノプロピオン酸、β−Ｎ−アルキルジアミノプロピオン酸およびβ−Ｎ−ハロアルキルジアミノプロピオン酸から選択される少なくとも３つのアミノ酸残基を有し、前記残基のうちの少なくとも２つが、ジアミノプロピオン酸、β−Ｎ−アルキルジアミノプロピオン酸およびβ−Ｎ−ハロアルキルジアミノプロピオン酸から選択される、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記反応が、式ＮＲ１Ｒ２Ｒ３（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基である）の第三級アルキルアミン非求核塩基中で実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記求核置換反応が、極性の、プロトン性溶媒、好ましくはＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ中で実施される、請求項１２または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物が、１つまたは複数のエフェクター基および／または官能基にコンジュゲートした前記ループ状ペプチド構造を含む薬物コンジュゲートである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記エフェクター基および／または官能基が、細胞毒性剤または金属キレーターを含む、請求項１６に記載の化合物。
【請求項１８】
前記細胞毒性剤が、切断可能な結合、例えば、ジスルフィド結合によって前記ループ状ペプチド構造に連結されている、請求項１７に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項１９】
前記細胞毒性剤が、ＤＭ１またはＭＭＡＥから選択される、請求項１７または請求項１８に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２０】
以下の構造：
【化１】
2020502238.tif 000046
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
毒素は、任意の適切な細胞毒性剤を指し、
二環は、前記ループ状ペプチド構造を表し、
ｎは、１から１０から選択される整数を表し、
ｍは、０から１０から選択される整数を表す）
を有する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がすべてＨであるか；または、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３がすべてＨであり、Ｒ４＝メチル；または、Ｒ１、Ｒ２＝メチル、かつＲ３、Ｒ４＝Ｈ；または、Ｒ１、Ｒ３＝メチル、かつＲ２、Ｒ４＝Ｈ；または、Ｒ１、Ｒ２＝Ｈ、かつＲ３、Ｒ４＝Ｃ１〜Ｃ６アルキルのいずれかである、請求項２０に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２２】
以下の構造：
【化２】
2020502238.tif 000047
を有する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【請求項２３】
以下の構造：
【化３】
2020502238.tif 000048
（式中、（ａｌｋ）は、式ＣｎＨ２ｎ（ｎは、１から１０である）の直鎖状アルキレン基または分枝状アルキレン基である）
を有する、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の薬物コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ペプチドにコンホメーションを付与し、より構造化された主鎖をもたらす足場部分に共有結合により連結することによって、その構造が制約されるペプチドに関する。詳細には、本発明は、ペプチドと足場分子の間に２つまたはそれより多い結合を形成するための新規化学に関する。
【背景技術】
【０００２】
様々な研究チームは、以前に、ペプチドのシステイン残基と足場分子の適切な官能基の間に２つまたはそれより多いチオエーテル結合を形成することによって、ペプチドを足場部分に係留してきた。例えば、トリス（ブロモメチル）ベンゼンのように、システイン含有ペプチドを分子足場に連結させることによる、候補薬物化合物の生成のための方法がＷＯ２００４／０７７０６２およびＷＯ２００６／０７８１６１に開示されている。
【０００３】
環化を達成することを目的として、共有結合によるチオエーテル連結を生じさせるためにシステインチオールを利用する利点は、システインチオールの選択的かつ生体直交型の反応性にある。チオール含有直鎖状ペプチドは、１，３，５トリス−ブロモメチルベンゼン（ＴＢＭＢ）などのチオール反応性足場化合物を用いて環化され、二環性ペプチドを形成する場合があり、得られた生成物はベンジル位に３つのチオエーテルを含有する。チオエーテル連結を有するループ状二環性ペプチドを形成するための、直鎖状ペプチドのＴＢＭＢを用いる反応全体は、図１に示される。
【０００４】
ペプチドを足場部分にカップリングさせて、チオエーテル部位の適切な置き換えを用いるループ状ペプチド構造を形成し、それによって、異なるペプチドとの適合性、溶解度の改善などの物理化学特性の変化、代替生体分布および他の利点を達成するための代替化学に対する需要が存在する。
【０００５】
ＷＯ２０１１／０１８２２７には、第１のペプチド誘導体またはペプチド誘導体の群のコンホメーションを変更するための方法であって、各ペプチド誘導体が、第２のペプチド誘導体またはペプチド誘導体の群を生成するために、少なくとも２つの反応性基と共有結合を形成する分子足場に共有結合により連結したループ配列によって分離された前記反応性基を含み、上記方法が、ペプチド由来の前記第２の誘導体または誘導体の群と前記第１の誘導体または誘導体の群の足場とをアセンブルすることを含み、（ａ）少なくとも１つの反応性基を変更すること；または（ｂ）分子足場の性質を変更すること；または（ｃ）少なくとも１つの反応性基と分子足場の間の結合を変更すること；または（ａ）、（ｂ）もしくは（ｃ）の任意の組合せのうちの１つが組み込まれている、方法が記載されている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、ループ状ペプチドにおける１つまたは複数のシステイン残基の、側鎖アミノ基を有するペプチドによる置き換えにより、先行技術のチオエーテル連結を置き換えて、アルキルアミノ連結を有するループ状ペプチド誘導体を生成する機会がもたらされることを見出した。アルキルアミノ連結によるチオエーテル連結の置き換えは、本発明によるループ状ペプチド誘導体の溶解度の改善および／または酸化安定性の改善をもたらすことが期待される。本発明者らは、驚くべきことに、目的の標的分子に対する誘導体の親和性が、アルキルアミノ連結によるチオエーテル連結の置き換え後に保存され得ることを見出した。
【０００７】
したがって、第１の態様では、本発明は、少なくとも１つのＮ−アルキルアミノ連結を介して足場に結合した少なくとも１つのループ状ペプチド構造を含む化合物を提供する。
【０００８】
用語「アルキルアミノ連結」は、適切には、一般式
Ｓ−Ｒ１−Ｎ（Ｒ３）−Ｒ２−Ｐ
（式中、
Ｓは、足場コア、例えば、以下でさらに説明される（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式環を表し、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、例えば、０〜２個のＣ１〜Ｃ３アルキル基で任意選択的に置換される、Ｃ１からＣ３アルキレン基であり、適切には、Ｒ１およびＲ２は、独立して、メチレン基またはエチレン基であり、最も適切には、Ｒ１およびＲ２は、両方メチレン（ＣＨ２）であり、
Ｒ３は、１つまたは複数のハロゲン原子で任意選択的に置換される、分枝状アルキルおよびシクロアルキル、例えば、メチルを含むＣ１〜４アルキル、またはＨであり、
Ｐは、ペプチド主鎖を表し、すなわち、上記連結のＲ２部分は、ペプチド主鎖のカルボン酸炭素に隣接する炭素原子に連結している）
の連結を指す。
【０００９】
実施形態では、ループ状ペプチド構造は、少なくとも１つのチオエーテル連結を介して足場にさらに結合している。チオエーテル連結は、以下でさらに説明されるように、環状ペプチドの形成の間にアンカーをもたらす。これらの実施形態では、好ましくは、唯一のこのようなチオエーテル連結が存在する。これらの実施形態では、適切には、１つのこのようなチオエーテル連結と２つのアルキルアミノ連結が存在する。適切には、チオエーテル連結は、二環性または多環性ペプチド誘導体の中央の連結であり、すなわち、ペプチド配列において、ペプチドのアルキルアミノ連結を形成する２つの残基（例えば、ジアミノプロピオン酸残基）が、チオエーテル連結を形成するアミノ酸残基（例えば、システイン）の両側と一定の距離を保ち、その両側に位置する。したがって、適切には、ループ状ペプチド構造は、中央のチオエーテル連結と２つの周辺のアルキルアミノ連結とを有する二環性ペプチド化合物である。チオエーテル連結を含む他の実施形態では、チオエーテル結合の配置は、２つの隣接するＮ−アルキルアミノ連結を有するＮ末端またはＣ末端であってもよい。
【００１０】
他の適切な実施形態では、ループ状ペプチド構造は、ペプチドと足場の間にいずれのチオエーテル連結も含まない。適切には、これらの実施形態では、ペプチドは、アルキルアミノ連結によってのみ足場に結合している。適切には、ペプチド鎖に沿って一定の距離を保って３つのアルキルアミノ連結が存在し、それによって、ループ状ペプチド構造は、中央のアルキルアミノ連結と２つの周辺のアルキルアミノ連結とを有する二環性ペプチド化合物である。これらの実施形態では、アルキルアミノ連結が、Ｒ３＝Ｈである連結よりも良好な反応速度論で形成されるため、これらの連結は、適切には、上記式において、Ｒ３＝アルキルまたはハロアルキルで形成される。
【００１１】
適切には、足場は、（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分を含む。適切には、足場は、トリス置換（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分、例えば、トリスメチレン置換（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分を含む。（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分は、適切には、足場が三回対称軸を有するように、好ましくはトリス置換された、６員環構造である。したがって、ある特定の好ましい実施形態では、足場は、１，３，５−トリスメチルベンゼンである。他の好ましい実施形態では、足場分子は、例えば、ペプチドの（ブロモアセトアミド）ベンゼン（ＴＢＡＢ）との反応によって導出された、１，３，５−トリス−（アセトアミド）ベンゼンである。
【００１２】
適切には、アルキルアミノ連結は、その側鎖に少なくとも１つの−ＮＨ２基または−ＮＨＲ３基を有するペプチドのアミノ酸残基によって作られる。これらのアミノ酸残基は、天然に存在するアミノ酸であってもよく、または非天然アミノ酸であってもよい。特に、非天然アミノ酸は、２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄａｐ）またはβ−Ｎ−アルキル−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＡｌｋＤａｐ）またはβ−Ｎ−ハロアルキル−２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＡｌｋＤａｐ）から選択されてもよい。この文脈では、「アルキル」は、Ｃ１〜Ｃ４アルキルを指し、適切には、メチルである。
【００１３】
第２の態様では、本発明は、少なくとも１つのアルキルアミノ連結を介して足場に結合した少なくとも１つのループ状ペプチド構造を含む化合物を作製する方法であって、ジアミノプロピオン酸またはβ−Ｎ−（ハロ）アルキルジアミノプロピオン酸から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するペプチドを準備することと、前記ジアミノプロピオン酸残基またはβ−Ｎ−（ハロ）アルキルジアミノプロピオン酸残基の側鎖アミノ基とアルキルアミノ連結を形成するための少なくとも２つの反応性部位を有する足場分子を準備することと、ペプチドと足場分子の間に前記アルキルアミノ連結を形成することとを含む方法を提供する。
【００１４】
実施形態では、ペプチドは、足場にチオエーテル連結を形成するための少なくとも１つのシステイン残基をさらに含む。これらの実施形態では、ペプチドは、適切には、唯一のこのようなシステイン残基を有する。適切には、システイン残基は、ペプチドの２つのジアミノプロピオン酸残基またはβ−Ｎ−アルキルジアミノプロピオン酸残基の中間に位置し、それによって、誘導体の２つのペプチドループの間に中央の連結を形成する。システインの−ＳＨ基は求核性が高く、最初に、足場分子の求電子中心と反応してペプチドを足場分子に固定し、その後、アミノ基は、足場分子の残りの求電子中心と反応してループ状ペプチド誘導体を形成することが期待される。他の実施形態では、中央の連結は、ジアミノプロピオン酸残基またはβ−Ｎ−（ハロ）アルキルジアミノプロピオン酸残基によって形成され、周辺の連結は、それぞれ、システインとジアミノプロピオン酸残基またはβ−Ｎ−（ハロ）アルキルジアミノプロピオン酸残基とによって形成される。
【００１５】
他の実施形態では、出発ペプチドはシステイン残基を含まない。これらの実施形態では、ペプチドは、適切には、足場分子との反応によって二環性構造を形成するために、鎖に沿って一定の距離を保って、ジアミノプロピオン酸またはβ−Ｎ−（ハロ）アルキルジアミノプロピオン酸から選択される３つのアミノ酸残基を有する。これらの実施形態では、３つのアミノ酸残基は、適切には、上記で与えた理由で、−（ハロ）アルキルジアミノプロピオン酸残基から選択される。
【００１６】
実施形態では、出発ペプチドは、アルキルアミノ連結を形成することを意図したアミノ基以外に、求核基に保護基を有する。
【００１７】
適切には、本発明の方法は、求核置換反応において、ジアミノプロピオン酸残基またはβ−Ｎ−（ハロ）アルキルジアミノプロピオン酸残基を有するペプチドを、２つ以上の脱離基を有する足場分子と反応させることを含む。
【００１８】
例えば、脱離基が従来のアニオン性脱離基である求核置換反応は、塩基の存在下で実施されてもよい。本発明者らは、本発明による環化ペプチド誘導体の収率は、求核置換反応に対する溶媒および塩基の適切な選択によって大いに増加する可能性があり、さらに、好ましい溶媒および塩基は、チオエーテル連結の形成にのみ関与する従来技術の溶媒と塩基の組合せとは異なることを見出した。特に、本発明者らは、収率の改善は、トリアルキルアミン塩基、すなわち、式ＮＲ１Ｒ２Ｒ３（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基、適切には、Ｃ２〜Ｃ４アルキル基、特に、Ｃ２〜Ｃ３アルキル基である）の塩基を使用する場合に達成されることを見出した。特に適切な塩基は、トリエチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）である。これらの塩基は、わずかに弱い求核性の特性を有し、この特性によって、これらの塩基に関して観察される副反応の少なさと高収率について説明されると考えられる。本発明者らは、求核置換反応に好ましい溶媒が、極性かつプロトン性の溶媒、特にＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（５０：５０）であることをさらに見出した。
【００１９】
実施形態では、本発明の化合物は、１つまたは複数のエフェクター基および／または官能基、例えば、細胞毒性剤または金属キレーターにコンジュゲートしたループ状ペプチド構造を含む薬物コンジュゲートである。
【００２０】
適切には、コンジュゲートは、切断可能な結合、例えば、ジスルフィド結合によってループ状ペプチド構造に連結した細胞毒性剤を有する。適切には、細胞毒性剤は、ＤＭ１またはＭＭＡＥから選択される。
【００２１】
実施形態では、薬物コンジュゲートは、以下の構造：
【化１】
2020502238.tif 000002
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素またはＣ１〜Ｃ６アルキル基を表し、
毒素は、任意の適切な細胞毒性剤を指し、
二環は、ループ状ペプチド構造を表し、
ｎは、１から１０から選択される整数を表し、
ｍは、０から１０から選択される整数を表す）
を有する。
【００２２】
適切には、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４はすべてＨであるか；またはＲ１、Ｒ２、Ｒ３はすべてＨでありＲ４＝メチル；またはＲ１、Ｒ２＝メチルかつＲ３、Ｒ４＝Ｈ；またはＲ１、Ｒ３＝メチルかつＲ２、Ｒ４＝Ｈ；またはＲ１、Ｒ２＝ＨかつＲ３、Ｒ４＝Ｃ１〜Ｃ６アルキルのいずれかである。
【００２３】
毒素と二環性ペプチドの間のリンカーは、アジド官能基化毒素とアルキン官能基化二環性ペプチド構造（またはその逆）の間のクリック反応によって形成されるトリアゾール基を含んでもよい。他の実施形態では、二環性ペプチドは、カルボキシレート官能基化毒素と二環性ペプチドのＮ末端アミノ基の間の反応によって形成されるアミド連結を含有してもよい。
【００２４】
毒素と二環性ペプチドの間のリンカーは、標的細胞内で毒素の選択的放出をもたらす、カテプシンにより切断可能な基を含んでもよい。適切なカテプシンにより切断可能な基は、バリン−シトルリンである。
【００２５】
毒素と二環性ペプチドの間のリンカーは、コンジュゲートに対する所望の官能性、例えば、結合親和性またはカテプシンによる切断可能性をもたらす、１つまたは複数のスペーサー基を含んでもよい。適切なスペーサー基は、バリン−シトルリン基と毒素部分の中間に位置し得るパラ−アミノベンジルカルバメート（ＰＡＢＣ）である。
【００２６】
したがって、実施形態では、二環性ペプチド−薬物コンジュゲートは、毒素−ＰＡＢＣ−ｃｉｔ−ｖａｌ−トリアゾール−二環から構成される以下の構造：
【化２】
2020502238.tif 000003
を有してもよい。
【００２７】
さらなる実施形態では、二環性ペプチド−薬物コンジュゲートは、毒素−ＰＡＢＣ−ｃｉｔ−ｖａｌ−ジカルボキシレート−二環から構成される以下の構造：
【化３】
2020502238.tif 000004
を有してもよい。
ここで、（ａｌｋ）は、式ＣｎＨ２ｎ（式中、ｎは、１から１０であり、直鎖状または分枝状であってもよく、適切には、（ａｌｋ）は、ｎ−プロピレンまたはｎ−ブチレンである）のアルキレン基である。
【００２８】
さらなる態様では、本発明は、本発明による複数の異なる化合物を含むライブラリーを提供する。異なる化合物は、異なるペプチド配列および／または異なる足場を含んでもよい。ライブラリーは、所望の生物学的活性を有する化合物を特定するためにスクリーニングされ得る。
【００２９】
さらなる態様では、本発明は、候補薬物化合物を選択するための方法であって、本発明の第１の態様による化合物のライブラリーを提供することと、標的分子の前記化合物への結合を決定することと、前記標的分子に最大限に結合する化合物を特定することとを含む方法を提供する。
【００３０】
スクリーニングは、個々の分子の分析によって行われてもよい。このような方法は、ＷＯ２００４／０７７０６２、ＷＯ２００６／０７８１６１およびＷＯ２０１１／０１８２２７に提供される。
【００３１】
別の態様では、本発明は、本発明による少なくともペプチド誘導体を含むキットをさらに提供する。
【００３２】
またさらなる態様では、本発明は、本発明のペプチド誘導体、および薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤を含む組成物を提供する。
【００３３】
さらに、本発明は、本発明によるペプチド誘導体、または組成物を使用する、疾患の処置のための方法を提供する。
【００３４】
さらなる態様では、本発明は、本発明によるペプチド誘導体、または組成物を使用する、疾患の診断を含む、診断のための方法を提供する。したがって、一般的に、分析物のペプチド誘導体への結合が、薬剤を押しのけるために活用され、押しのけが生じるとシグナルの発生につながる場合がある。例えば、特に、酵素が、活性部位を介してペプチド誘導体に保持される場合、分析物（第２の標的）の結合により、ペプチド誘導体に結合した酵素（第１の標的）を押しのけることができ、これは結合アッセイの基礎となる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】先行技術によるチオエーテルにより連結した二環性ペプチドリガンドの調製に対する反応スキームを示す図である。
【図２】１７−６９−０７−Ｎ２４１として示される、先行技術によるチオエーテルにより連結した二環性ペプチドリガンドを示す図である。
【図３】本発明による、第１の第二級アミノにより連結した二環性ペプチドリガンドを示す図である。
【図４】本発明による、第三級Ｎ−メチルアミノにより連結した二環性ペプチドリガンドを示す図である。
【図５】１７−６９−０７−Ｎ２４１のＤａｐアナログである、本発明による、第３の第二級アミノにより連結した二環性ペプチドリガンドを示す図である。
【図６】ＴＢＡＢ足場により環化された、本発明による、第４の第二級アミノにより連結した二環性ペプチドリガンドを示す図である。
【図７】図３の誘導体に関する、ＭＴ１−ＭＭＰに対する競合的結合親和性アッセイのデータを示すグラフである。
【図８】図４の誘導体に関する、ＭＴ１−ＭＭＰに対する競合的結合親和性アッセイのデータを示すグラフである。
【図９】本発明によるさらなる誘導体に関する、ＭＴ１−ＭＭＰに対する競合的結合親和性アッセイのデータを示すグラフである。
【図１０】本発明による、ある特定の二環性ペプチド−ＴＢＭＢ誘導体の模式構造を示す図である。
【図１１】本発明に従う、さらなる二環性ペプチド−ＴＢＭＢ誘導体の模式構造を示す図である。
【図１２】本発明に従う、さらなる二環性ペプチド−ＴＢＭＢ誘導体の模式構造を示す図である。
【図１３】本発明に従う、さらなる二環性ペプチド−ＴＢＭＢ誘導体の模式構造を示す図である。
【図１４】トリアゾール連結を形成するためのクリック反応による、本発明による二環性ペプチド−薬物コンジュゲートの調製のための反応スキームを示す図である。
【図１５】アミド連結を有することによる、本発明による二環性ペプチド−薬物コンジュゲートの調製のための反応スキームを示す図である。
【図１６】本発明による二環性ペプチド−薬物コンジュゲートによる処置後のＨＴ１０２０腫瘍細胞腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスに関して、腫瘍体積と体重を経時的に示すグラフである。
【図１７】本発明によるさらなる二環性ペプチド−薬物コンジュゲートによる処置後のＨＴ１０２０腫瘍細胞腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスに関して、腫瘍体積と体重を経時的に示すグラフである。
【図１８】本発明によるさらなる二環性ペプチド−薬物コンジュゲートによる処置後のＨＴ１０２０腫瘍細胞腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスに関して、腫瘍体積と体重を経時的に示すグラフである。
【図１９】本発明によるさらなる二環性ペプチド−薬物コンジュゲートによる処置後のＨＴ１０２０腫瘍細胞腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスに関して、腫瘍体積と体重を経時的に示すグラフである。
【図２０】本発明によるさらなる二環性ペプチド−薬物コンジュゲートによる処置後のＨＴ１０２０腫瘍細胞腫瘍を有するＢａｌｂ／ｃヌードマウスに関して、腫瘍体積と体重を経時的に示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
別段定義されていなければ、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、ペプチド化学、細胞培養およびファージディスプレイ、核酸化学および生化学の技術分野などの当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学、遺伝学的方法および生化学的方法に対する標準的技術が使用され（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，２００１，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  （１９９９）  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．を参照のこと）、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
【００３７】
本発明は、少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つのアルキルアミノ連結を介して足場に結合した少なくとも１つのループ状ペプチド構造を含む化合物を提供する。
【００３８】
ループ状ペプチド構造は、分子足場における２つの連結間を結ぶ、少なくとも１つのペプチドループを含む。適切には、ループ状ペプチド構造は、二環性構造であり、すなわち、分子足場の３つの連結間を結ぶ２つのペプチドループを含むか、またはそれらからなり、中央の連結は、２つのループに共通する。
【００３９】
実施形態では、ループ状ペプチド構造は、チオエーテル連結を介して足場にさらに結合している。適切には、１つだけのチオエーテル連結が存在する。適切には、ループ状ペプチド構造は、中央の、共通の連結が、適切には、チオエーテル連結であり、外側の連結がアルキルアミノ連結である３つの連結間を結ぶ、２つのループを形成する前記二環性構造である。しかし、他の実施形態では、チオエーテル連結は外側の連結のうちの１つであってもよいと想像される。
【００４０】
他の実施形態では、ループ状ペプチド構造は、ペプチドと足場構造の間にチオエーテル連結を含まなくてもよい。これらの実施形態では、ペプチドは、アルキルアミノ連結によってのみ、足場に連結され得る。これらの実施形態では、ループ状ペプチド構造は、適切には、そのそれぞれがアルキルアミノ連結である、３つの連結間を結んで、２つのループを形成する前記二環性構造である。これらの実施形態では、アルキルアミノ連結は、適切には、（ハロ）アルキルＤａｐから形成される。
【００４１】
したがって、本発明の化合物は、分子足場に共有結合により結合したペプチドを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。本明細書における用語「足場」または「分子足場」は、本発明の化合物の、２つ以上のアルキルアミノ連結でペプチドに結合する化学的部分を指す。本明細書における用語「足場分子」または「分子足場分子」は、アルキルアミノ結合を有するコンジュゲートを形成するペプチドまたはペプチド誘導体と反応することができる分子を指す。したがって、足場分子は、分子のそれぞれの反応性基（例えば、脱離基）が、足場部分のペプチドに結合したアルキルアミノ結合によって、および任意選択的にチオエーテル結合によっても置き換えられていることを除いて、足場部分と同じ構造を有する。
【００４２】
分子足場分子とは、複数の点でペプチドと接続して、ペプチドに対する２つ以上のアルキルアミノ結合を形成することができる任意の分子である。分子足場は、通常、２つのペプチドに連結しないという点において、架橋剤ではなく、代わりに、単一のペプチドに対して２つ以上の結合点をもたらす。好ましくは、分子足場分子は、足場反応性基と称される、ペプチドに対する少なくとも３つの結合点を含む。これらの基は、ペプチド上のアミノ基と反応してアルキルアミノ連結を形成することができる。したがって、分子足場は、本発明のコンジュゲートにおけるアルキルアミノ連結までの足場部分を表すが、本発明のコンジュゲートにおけるアルキルアミノ連結は含まない。足場分子は足場の構造を有するが、本発明のコンジュゲートにおけるアルキルアミノ結合の位置に反応性基を有さない。足場および／または足場分子は、適切には、約１０００ダルトン未満、一部の場合には約５００ダルトン未満、例えば約３００ダルトン未満の分子量を有する。
【００４３】
適切には、足場は、（ヘテロ）芳香族部分または（ヘテロ）脂環式部分を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「（ヘテロ）アリール」は、芳香族環、例えば、４〜１２員を有する芳香環、例えば、フェニル環を含むことを意図する。これらの芳香環、例えば、チエニル環、ピリジル環、およびフラニル環は、任意選択的に、１つまたは複数のヘテロ原子（例えば、１つまたは複数のＮ、Ｏ、Ｓ、およびＰ）を含有することができる。芳香環は、任意選択的に、置換され得る。「（ヘテロ）アリール」はまた、１つまたは複数の他のアリール環または非アリール環が縮合した芳香環を含むことを意味する。例えば、ナフチル基、インドール基、チエノチエニル基、ジチエノチエニル、および５，６，７，８−テトラヒドロ−２−ナフチル基（そのそれぞれは、任意選択的に、置換されてもよい）は、本出願の目的のためのアリール基である。上記で示したように、アリール環は、任意選択的に置換されてもよい。適切な置換基として、アルキル基（任意選択的に、置換されてもよい）、他のアリール基（それ自身が置換されていてもよい）、複素環（飽和または不飽和）、アルコキシ基（アリールオキシ基（例えば、フェノキシ基）を含むことを意味する）、水酸基、アルデヒド基、ニトロ基、アミン基（例えば、無置換、またはアリール基もしくはアルキル基で一置換もしくは二置換された）、カルボン酸基、カルボン酸誘導体（例えば、カルボン酸エステル、アミドなど）、ハロゲン原子（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ、およびＩ）などが挙げられる。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「（ヘテロ）脂環式」は、同素環または複素環の飽和環を指す。環は、置換されていなくてもよく、または１つまたは複数の置換基で置換されていてもよい。置換基は、飽和または不飽和、芳香族または非芳香族であってもよく、適切な置換基の例として、アルキル基およびアリール基に関する置換基に関連する議論において上記したものが挙げられる。さらに、２つ以上の環置換基を組み合わさって別の環を形成することがあり、その結果、本明細書で使用する場合、「環」は、縮合環系を含むことを意味する。
【００４６】
適切には、足場は、トリス置換（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分、例えば、トリスメチレン置換（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分を含む。（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式部分は、適切には、６員環構造、好ましくは、足場が３回対称軸を有するトリス置換である。
【００４７】
実施形態では、足場は、トリス−メチレン（ヘテロ）アリール部分、例えば、１，３，５−トリスメチレンベンゼン部分である。これらの実施形態では、対応する足場分子は、適切には、メチレン炭素上に脱離基を有する。次いで、メチレン基は、本明細書で定義されるアルキルアミノ連結のＲ１部分を形成する。これらのメチレン置換（ヘテロ）芳香族化合物では、芳香環の電子が、求核置換の間の遷移状態を安定化させることができる。したがって、例えば、ハロゲン化ベンジルは、（ヘテロ）芳香族基に接続していないハロゲン化アルキルよりも求核置換に対して１００〜１０００倍反応性である。
【００４８】
これらの実施形態では、足場および足場分子は、一般式：
【化４】
2020502238.tif 000005
（式中、ＬＧは、足場分子について、以下にさらに説明される脱離基を表すか、またはＬＧ（アルキルアミノ基のＲ１部分を形成する隣接するメチレン基を含む）は、本発明のコンジュゲートにおけるペプチドに対するアルキルアミノ連結を表す）
を有する。
【００４９】
実施形態では、上記の基ＬＧは、これらに限定されないが、足場分子が１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ）である場合の臭素原子などのハロゲンであってもよい。別の適切な分子足場分子は、２，４，６−トリス（ブロモメチル）メシチレンである。これは、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンと同様であるが、ベンゼン環に結合したさらに３つのメチル基を含有する。この足場の場合には、さらなるメチル基はペプチドとのさらなる接触を形成することができ、それゆえ、さらなる構造上の制約を付加する。したがって、１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼンに関するよりも異なる多様性範囲が実現される。
【００５０】
求核置換によってペプチドと反応するための足場を形成するための別の好ましい分子は、１，３，５−トリス（ブロモアセトアミド）ベンゼン（ＴＢＡＢ）：
【化５】
2020502238.tif 000006
である。
【００５１】
さらに他の実施形態では、分子足場は、コードペプチドの４つの官能基の分子足場との反応により２つ以下の生成物異性体しか生じないように四面体幾何構造を有してもよい。他の幾何構造も可能であり、実際に、ほぼ無限の数の足場の幾何構造が可能であり、ペプチド誘導体多様化に対するより大きな可能性をもたらす。
【００５２】
典型的には、アルキルアミノ結合を形成する基は、ペプチドのアミノ酸側鎖に存在する。これらの基は、適切には、第一級アミン基または第二級アミン基である。ジアミノプロピオン酸（ＤＡＰ）などの適切な人工アミノ酸の第一級−ＣＨ２ＮＨ２基またはβ−Ｎ−アルキルジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＡｌｋＤａｐ）またはβ−Ｎ−ハロアルキルジアミノプロピオン酸（Ｎ−ＨＡｌｋＤａｐ）などの第二級−ＣＨ２ＮＨＲ３アミノ基が好ましい。ジアミノプロピオン酸の構造は、ＮＨ２によってシステインの末端−ＳＨ基が置き換えられた、先行技術において足場へのチオエーテル結合を形成するために使用されたシステインのアナログである。
【化６】
2020502238.tif 000007
【００５３】
用語「アルキルアミノ」は、２つの炭素原子に結合したＮＨまたはＮ（Ｒ３）（炭素原子は、独立して、アルキル、アルキレン、またはアリール炭素原子から選択され、Ｒ３は、適切には、１から４個の炭素原子を含有するアルキル基またはハロアルキル基である）からなる連結を示す通常の化学的意味で、本明細書において使用される。適切には、本発明のアルキルアミノ連結は、２つの飽和炭素原子、最も適切には、メチレン（−ＣＨ２−）炭素原子に結合したＮＨ部分を含む。実施形態では、本発明のアルキルアミノ連結は、一般式
Ｓ−Ｒ１−Ｎ（Ｒ３）−Ｒ２−Ｐ
（式中、
Ｓは、足場コア、例えば、以下でさらに説明される（ヘテロ）芳香族または（ヘテロ）脂環式環を表し、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、例えば、０〜２個のＣ１〜Ｃ３アルキル基で任意選択的に置換される、Ｃ１からＣ３アルキレン基であり、適切には、Ｒ１およびＲ２は、独立して、メチレン基またはエチレン基であり、最も適切には、Ｒ１およびＲ２は、両方メチレン（ＣＨ２）であり、
Ｒ３は、１つまたは複数のハロゲン原子で任意選択的に置換される、Ｈ、または分枝状アルキルおよびシクロアルキル、例えばメチルを含むＣ１〜４アルキルであり、
Ｐは、ペプチド主鎖を表し、すなわち、上記連結のＲ２部分は、ペプチド主鎖のカルボン酸炭素に隣接するペプチド主鎖の炭素原子に連結している）
を有する。
【００５４】
本発明のペプチドコンジュゲートのペプチド要素は、足場への結合の要因である２つ以上の反応性基、好ましくは３つ以上の反応性基と、反応性基間のループ状アミノ酸配列を含む。先行技術におけるように、ループの配列を変えることによって多様性を得ることができる。
【００５５】
本発明のペプチド誘導体の特定の利点は、これらが、例えば、先行技術の免疫学的結合剤より小さいということである。典型的には、本発明の化合物は、約５０００ダルトン未満、好ましくは約４０００ダルトン未満、好ましくは約３０００ダルトン未満の分子量を有する。ループのいずれかの末端または両方の末端から伸長するさらなるペプチド配列により構築された誘導体は、これらの範囲を超えたより大きい分子量を有する可能性があることが理解されるであろう。さらに、細胞毒性剤または治療剤、ＨＳＡポリマーまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーなどの分子に結合したペプチド誘導体は、さらに大きい分子量を有することになる。
【００５６】
本発明の化合物のサイズの小ささは、典型的には、質量が最大約５００ダルトンの、小さい分子足場の使用に起因する。ペプチド自体は、分子足場と結合するＮ末端の結合点とＣ末端の結合点の間を測定した場合、好ましくは、約２７アミノ酸長未満である。当然のことながら、さらなるペプチドが結合点の外側に存在するかまたは結合されて、ペプチド構造が伸ばされていてもよい。ペプチドの各ループは、隣接する結合点の間を測定して、好ましくは、０から９アミノ酸長である。有利には、いずれのペプチド誘導体のループも、独立して、３、４、５、６、７、８または９アミノ酸長である。
【００５７】
いくつかのループ状ペプチドは、本発明に従って、同一の分子に一緒に組み込まれてもよい。例えば、同一の特異性の２つのこのようなループ状ペプチドは、分子足場を介して一緒に連結され、その標的に対する誘導体のアビディティーを増加させることができる。
【００５８】
あるいは、別の実施形態では、複数のループ状ペプチドを組み合わせて多量体を形成する。例えば、２つの異なるループ状ペプチドを組み合わせて多重特異的分子を作出する。あるいは、同一であっても異なっていてもよい３つ以上のループ状ペプチドを組み合わせて多重特異的誘導体を形成することができる。一実施形態では、多価複合体は、同一であっても異なっていてもよい分子足場を一緒に連結させることによって構築されてもよい。
【００５９】
ペプチドは、分子足場結合セグメントを含む。これは、分子足場が結合する領域である。適切には、ペプチド上の反応性基に関する解説は、この結合セグメントに適用される。適切には、標的ペプチドの分子足場結合セグメントは、１から２７個のアミノ酸残基、適切には５から２０個のアミノ酸残基を含む。適切には、標的ペプチドの分子足場結合セグメントは、１５個より少ないアミノ酸を含む。これは、それが分子足場に結合すると、さらなるコンホメーションの制約をペプチドセグメントに課すという利点を有する。
【００６０】
標的ペプチドは、適切には、配列（Ｘ）ｌＡ１（Ｘ）ｍＡ２（Ｘ）ｎＡ３（Ｘ）ｏ（式中、Ａ１、Ａ２およびＡ３は、システイン、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐから選択され、但し、Ａ１、Ａ２およびＡ３のうちの少なくとも１つは、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐであることを条件とし、Ｘは、ランダムアミノ酸を表し、ｍおよびｎは、１から２０の間、好ましくは４から１０の間の数であり、介在するペプチドセグメントの長さを定義し、ｌおよびｏは、０から２０の間の数であり、近接するペプチドセグメントの長さを定義する）を含む。ある特定の実施形態では、ペプチドは、適切には、配列（Ｘ）１Ａ１（Ｘ）ｍ）Ａ２（Ｘ）ｎＡ３（Ｘ）ｏまたは（Ｘ）１Ａ１（Ｘ）ｍ）Ａ２（Ｘ）ｎＡ３（Ｘ）ｏを含むことができる。以前に議論したように、適切には、Ａ１、Ａ２およびＡ３のうちの少なくとも２つは、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐである。実施形態では、Ａ１、Ａ２およびＡ３のうちの１つは、システインであり、その他は、Ｄａｐ、Ｎ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐである。
【００６１】
ループ状二環性リガンドが細胞表面メタロプロテアーゼＭＴ１−ＭＭＰに高い親和性で結合するある特定の実施形態では、ペプチドは、式（ＩＩ）：
−Ａ１−Ｘ１−Ｕ／Ｏ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｇ５−Ａ２−Ｅ６−Ｄ７−Ｆ８−Ｙ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ａ２−  （配列番号１）      （ＩＩ）
またはその薬学的に許容される塩
（式中、
Ａ１、Ａ２およびＡ３は、上記で定義される通りであり、Ｘは、任意のアミノ酸残基を表し、
Ｕは、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｍ、ＳおよびＴから選択される、極性の、無電荷アミノ酸残基を表し、
Ｏは、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＰおよびＶから選択される、非極性の、脂肪族アミノ酸残基を表す）
のアミノ酸配列を含む。
【００６２】
本発明のこれらの誘導体は、ＤａｐまたはＮ−ＡｌｋＤａｐまたはＮ−ＨＡｌｋＤａｐ残基に対する２つのアルキルアミノ連結と、システインに対するチオエーテル連結またはＤａｐもしくはＮ−ＡｌｋＤａｐに対するアルキルアミノ連結から選択される第３の連結とによって、足場にカップリングしたペプチドループを含むことを見て取ることができる。存在する場合、チオエーテル連結は、以下でさらに説明される環状ペプチドの形成の間にアンカーをもたらすことができる。存在する場合、チオエーテル連結は、二環性ペプチドコンジュゲートの中央の連結であり得、すなわち、ペプチド配列において、ペプチドのアルキルアミノ連結を形成する２つの残基は、チオエーテル連結を形成するシステイン残基の両側と一定の距離を保ち、その両側に位置する。したがって、本出願の実施例で例証されるように、ループ状ペプチド構造は、中央のチオエーテル連結またはアルキルアミノ連結と周辺のアルキルアミノ連結またはチオエーテル連結とを有する二環性ペプチドコンジュゲートである。
【００６３】
適切には、Ｘ１は、以下のアミノ酸、すなわち、Ｙ、Ｍ、ＦまたはＶ、例えばＹ、ＭまたはＦ、特にＹまたはＭ、さらに特にＹのうちのいずれか１つから選択される。
【００６４】
適切には、Ｕ／Ｏ２は、Ｕ、例えばＮ、またはＯ、例えばＧから選択される。
【００６５】
適切には、Ｘ３は、ＵまたはＺから選択され、Ｕは、Ｎ、Ｃ、Ｑ、Ｍ、ＳおよびＴから選択される、極性の、無電荷アミノ酸残基を表し、Ｚは、ＤまたはＥから選択される、極性の、負電荷アミノ酸残基を表し、特に３位のＵは、Ｑから選択されるかまたは３位のＺは、Ｅから選択される。
【００６６】
適切には、Ｘ４は、Ｊから選択され、Ｊは、Ｆ、ＷおよびＹから選択される、非極性の、芳香族アミノ酸残基を表す。
【００６７】
適切には、Ｘ１０は、Ｚから選択され、Ｚは、ＤまたはＥ、例えば、Ｄから選択される、極性の、負電荷アミノ酸残基を表す。
【００６８】
適切には、Ｘ１１は、Ｏから選択され、Ｏは、Ｇ、Ａ、Ｉ、Ｌ、ＰおよびＶ、例えば、Ｉから選択される、非極性の、脂肪族アミノ酸残基を表す。
【００６９】
適切には、式（ＩＩ）の二環は、式（ＩＩａ）の化合物：
−Ａ１−Ｙ／Ｍ／Ｆ／Ｖ−Ｕ／Ｏ−Ｕ／Ｚ−Ｊ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｚ−Ｏ−Ａ３−  （配列番号６）（ＩＩａ）
（式中、Ｕ、Ｏ、ＪおよびＺは上記に定義した通りである）；または
式（ＩＩｂ）の化合物：
−Ａ１−Ｙ／Ｍ／Ｆ／Ｖ−Ｎ／Ｇ−Ｅ／Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （配列番号７）（ＩＩｂ）；または
式（ＩＩｃ）の化合物：
−Ａ１−Ｙ／Ｍ／Ｆ−Ｎ／Ｇ−Ｅ／Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （配列番号８）（ＩＩｃ）；または
式（ＩＩｄ）の化合物：
−Ａ１−Ｙ／Ｍ−Ｎ−Ｅ／Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （配列番号９）（ＩＩｄ）；または
式（ＩＩｅ）の化合物：
−Ａ１−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （１７−６９−０７）（配列番号２）（ＩＩｅ）
である。
【００７０】
適切には、式（ＩＩ）の二環は、
−Ａ１−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （１７−６９−０７）  （配列番号２）；
−Ａ１−Ｍ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （１７−６９−１２）  （配列番号１０）；
−Ａ１−Ｆ−Ｇ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （１７−６９−０２）  （配列番号１１）；
−Ａ１−Ｖ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （１７−６９−０３）  （配列番号１２）；
−Ａ１−Ｆ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （１７−６９−０４）  （配列番号１３）；
−Ａ１−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｙ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （１７−６９−０７−Ｎ０５７）  （配列番号１４）；および
−Ａ１−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｗ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （１７−６９−４４−Ｎ００２）  （配列番号１５）、
例えば、
−Ａ１−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （１７−６９−０７）  （配列番号２）；および
−Ａ１−Ｍ−Ｎ−Ｑ−Ｆ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （１７−６９−１２）  （配列番号１０）、
特に、
−Ａ１−Ｙ−Ｎ−Ｅ−Ｆ−Ｇ−Ａ２−Ｅ−Ｄ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｉ−Ａ３−  （１７−６９−０７）  （配列番号２）、
最も特に、
配列番号１６：（（ｂＡｌａ）−Ｓａｒ１０−ＡＡ１（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）Ａ２ＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）Ａ３として示される１７−６９−０７−Ｎ２４１のＤａｐホモログ；
および配列番号１７：ＡＡ１（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）Ａ２ＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）Ａ３として示される１７−６９−０７−Ｎ２６８のＤａｐホモログ
から選択される配列を含む。
【００７１】
上記配列のすべてにおいて、Ａ１、Ａ２、およびＡ３は、上記に定義した通りである。Ａ１、Ａ２、およびＡ３の適切かつ好ましいタイプおよび位置は、上記に定義した通りである。
【００７２】
本発明のこれらの実施形態および他の実施形態では、ペプチドリガンドは、さらに、Ｎ末端および／またはＣ末端の修飾、１つまたは複数のアミノ酸残基の１つまたは複数の非天然アミノ酸残基による置き換え（例えば、１つまたは複数の極性アミノ酸残基の１つまたは複数の等配電子アミノ酸または等電子アミノ酸による置き換え、１つまたは複数の疎水性アミノ酸残基の他の非天然の、等配電子アミノ酸または等電子アミノ酸による置き換え）、スペーサー基の付加、１つまたは複数の酸化感受性アミノ酸残基の１つまたは複数の酸化抵抗性アミノ酸残基による置き換え、１つまたは複数のアミノ酸残基のアラニンによる置き換え、１つまたは複数のＬ−アミノ酸残基の１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基による置き換え、二環性ペプチドリガンド内の１つまたは複数のアミド結合のＮアルキル化、１つまたは複数のペプチド結合のサロゲート結合（ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｂｏｎｄ）による置き換え、ペプチド主鎖長の改変、１つまたは複数のアミノ酸残基のα炭素上の水素の別の化学基による置換、ならびにシステイン、リシン、グルタミン酸およびチロシンなどのアミノ酸の適切なアミン、チオール、カルボン酸およびフェノール反応性試薬による、合成後の生体直交型修飾から選択される１つまたは複数の修飾を含む。
【００７３】
適切には、これらの実施形態は、適切なアミノ反応性化学を使用するＮ末端修飾、および／または適切なカルボキシ反応性化学を使用するＣ末端修飾を含んでもよい。例えば、Ｎ末端修飾は、エフェクター基のコンジュゲーションおよびその標的に対する二環性ペプチドの効力の保持を容易にする分子スペーサー基の付加を含んでもよい。スペーサー基は、適切には、Ａｌａなどの約５から約３０個のアミノ酸を含有するオリゴペプチド基、Ｇ−Ｓａｒ１０−Ａ基またはｂＡｌａ−Ｓａｒ１０−Ａ基である。あるいはまたはさらに、Ｎ末端および／またはＣ末端の修飾は、細胞毒性剤の付加を含む。
【００７４】
これらのＭＴ１−ＭＭＰ結合ペプチドについてのさらなる詳細は、本発明者らの同時係属中の公開された出願ＷＯ２０１６／０６７０３５および２０１６年５月４日に提出した係属中の出願ＧＢ１６０７８２７．１に見出すことができる。これらの出願の開示全体は、参照により明示的に本明細書の一部をなすものとする。
【００７５】
第２の態様では、本発明は、少なくとも１つの、例えば、少なくとも２つのアルキルアミノ連結を介して足場に結合した少なくとも１つのループ状ペプチド構造を含む化合物を作製する方法であって、少なくとも１つのジアミノプロピオン酸残基またはβ−Ｎ−（ハロ）アルキルジアミノプロピオン酸残基を有するペプチドを準備するステップと、ジアミノプロピオン酸残基またはβ−Ｎ−アルキルジアミノプロピオン酸残基のアミノ基とアルキルアミノ連結を形成するための少なくとも２つの反応性部位を有する足場分子を準備するステップと、ペプチドと足場分子の間に前記アルキルアミノ連結を形成するステップとを含む方法を提供する。
【００７６】
適切には、本発明のこの態様による方法は、本発明の第１の態様による化合物を作製することを対象とする。したがって、分子足場およびペプチドの詳細は、適切には、本発明の第１の態様に関連して上述されている。
【００７７】
本発明の方法において使用するためのペプチドは、アミノ酸出発材料から、従来の固相合成を使用して作製することができ、本明細書に記載した適当な保護基を含んでもよい。ペプチドを作製するこれらの方法は、当技術分野で周知である。
【００７８】
実施形態では、ペプチドは、アルキルアミノ連結またはチオエーテル連結（存在する場合）を形成することを意図したアミン基または−ＳＨ基以外の求核基に保護基を有する。アミノ酸側鎖の求核性はいくつかの研究の対象とされ、降順で、システインにおけるチオレート、リシンにおけるアミン、ヒスチジンおよびトリプトファンにおける第二級アミン、アルギニンにおけるグアニジノアミン、セリン／トレオニンにおけるヒドロキシル、ならびに最後にアスパラギン酸およびグルタミン酸におけるカルボキシレートが列挙されている。したがって、これらの基に関する望ましくない副反応を防ぐために、ペプチド上のより求核性の基に保護基を適用する必要がある。
【００７９】
適切には、本発明の方法は、求核置換反応において、２つ以上の反応性側鎖アミン基を有するペプチドを、２つ以上の脱離基を有する足場分子と反応させることを含む。
【００８０】
本明細書において、用語「脱離基」は、アミン基による求核置換を可能とする部分を意味する通常の化学的意味において使用される。ここで、任意のこのような脱離基は、アミンによる求核置換によって容易に除去されることを条件として、使用することができる。適切な脱離基は、約５未満のｐＫａを有する酸のコンジュゲート塩基である。本発明において有用な脱離基の非限定例として、ハロ、例えば、ブロモ、クロロ、ヨード、Ｏ−トシレート（ＯＴｏｓ）、Ｏ−メシレート（ＯＭｅｓ）、Ｏ−トリフレート（ＯＴｆ）またはＯ−トリメチルシリル（ＯＴＭＳ）が挙げられる。
【００８１】
求核置換反応は、例えば、脱離基が従来の陰イオン性脱離基である場合、塩基の存在下で実施され得る。本発明者らは、環化ペプチド誘導体の収率が、求核置換反応のための溶媒および塩基の適切な選択によって非常に増加する可能性があり、さらに、好ましい溶媒および塩基は、チオエーテル連結の形成にのみ関与する先行技術の溶媒および塩基の組合せと異なることを見出した。特に、本発明者らは、トリアルキルアミン塩基、すなわち、式ＮＲ１Ｒ２Ｒ３の塩基（式中、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３は、独立して、Ｃ１〜Ｃ５アルキル基、適切にはＣ２〜Ｃ４アルキル基、特にＣ２〜Ｃ３アルキル基である）を使用する場合に収率の改善が達成されることを見出した。特に、適切な塩基は、トリエチルアミンおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）である。これらの塩基は、ほんのわずかに求核性であるという特性を有し、この特性が、これらの塩基について観察される副反応の少なさと高い収率を説明すると考えられる。本発明者らは、求核置換反応について好ましい溶媒が、極性のプロトン性溶媒、特に体積比１：１０から１０：１、適切には２：１０から１０：２、より適切には３：１０から１０：３、特に４：１０から１０：４のＭｅＣＮとＨ２Ｏを含有するＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏであることをさらに見出した。
【００８２】
さらなる態様では、本発明は、本発明による複数の異なる化合物を含むライブラリーを提供する。異なる化合物は、異なるペプチド配列および／または異なる足場を含んでもよい。ライブラリーは、所望の生物学的活性を有する化合物を特定するためにスクリーニングされ得る。
【００８３】
ライブラリーは、例えば、本発明による少なくとも約１０、１００または１０００個の異なるペプチドコンジュゲートを含むかまたはそれらからなる。適切には、ライブラリーは、それぞれ同一の足場構造を有するが、足場に結合したペプチドが異なるペプチドコンジュゲートからなってもよい。
【００８４】
さらなる態様では、本発明は、候補薬物化合物を選択するための方法であって、本発明の上記態様による化合物の化学的ライブラリーを提供することと、標的分子の前記化合物への結合を決定することと、前記標的分子に最大限に結合する化合物を特定することとを含む方法を提供する。
【００８５】
標的は、ペプチド誘導体が結合する分子またはその部分である。適切には、本発明の化合物は、生物学的標的に選択的に結合する。例えば、本発明の化合物は、本明細書に記載の方法によって決定した場合、約Ｋｄ＝１０００より高い、適切には約Ｋｄ＝１００より高い、例えば、約Ｋｄ＝１０より高い親和性で結合することができる。典型的には、標的は、エピトープに対するアナログとなる。当業者は、標的分子の選択が多種多様であることを認識するであろう。これらは、例えば、ヒトまたは動物のタンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素に対する酵素補因子またはＤＮＡ結合タンパク質であってもよい。適切なサイトカインおよび増殖因子として、これらに限定されないが、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カルジオトロフィン−１、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＥＮＡ７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エキソダス−２（Ｅｘｏｄｕｓ−２）、ＦＧＦ−酸性、ＦＧＦ−塩基性、線維芽細胞増殖因子−１０（３０），ＦＬＴ３誘導体、フラクタルカイン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−ｌ、インスリン、ＩＦＮｙ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−ｌａ、ＩＬ−１（３、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２  ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７  ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７ａ、ＩＬ−１７ｃ、ＩＬ−１７ｄ、ＩＬ−１７ｅ、ＩＬ−１７ｆ、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ＩＬ−３４、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト増殖因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンフォタクチン、ミュラー阻害物質、単球コロニー阻害因子、単球誘引タンパク質（３０  ｉｂｉｄ）、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７  ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９  ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７  ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９  ａ．ａ．）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−ｌａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＭＩＰ−３ａ、ＭＩＰ３（３、ＭＩＰ−４、骨髄前駆体阻害因子-１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニュールツリン、神経成長因子、Ｐ−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦｌａ、ＳＤＦｌｐ、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−２、ＴＧＦ−３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体Ｉ、ＴＮＦ受容体ＩＩ、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＶＥＧＦ受容体３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−□、ＧＲＯ−□、ＨＣＣ１，１−３０９、ＨＥＲ  １、ＨＥＲ  ２、ＨＥＲ  ３およびＨＥＲ  ４が挙げられる。サイトカイン受容体としては、前記サイトカインに対する受容体が挙げられる。ケモカイン標的としては、ＣＣケモカイン誘導体である、ＣＣＬ２１／６Ｃｋｉｎｅ、ＣＣＬ１２／ＭＣＰ−５、ＣＣＬ６／Ｃ１０、ＣＣＬ２２／ＭＤＣ、ＣＣＬ１４／ＨＣＣ−１／ＨＣＣ−���、ＣＣＬ３Ｌ１／ＭＩＰ−１アルファアイソフォームＬＤ７８ベータ、ＣＣＬ２３／Ｃｋベータ８−１、ＣＣＬ３／ＭＩＰ−１アルファ、ＣＣＬ２８、ＣＣＬ４Ｌ１／ＬＡＧ−１、ＣＣＬ２７／ＣＴＡＣＫ、ＣＣＬ４／ＭＩＰ−１ベータ、ＣＣＬ２４／エオタキシン−２／ＭＰＩＦ−２、ＣＣＬ１５／ＭＩＰ−１デルタ、ＣＣＬ２６−様／エオタキシン−３−様、ＣＣＬ９／１０／ＭＩＰ−１ガンマ、ＣＣＬ２６／エオタキシン−３、ＣＣＬ１９／ＭＩＰ−３ベータ、ＣＣＬ１１／エオタキシン、ＣＣＬ２０／ＭＩＰ−３アルファ、ＣＣＬ１４ａ／ＨＣＣ−１、ＣＣＬ２３／ＭＰＩＦ−１、ＣＣＬ１４ｂ／ＨＣＣ−３、ＣＣＬ１８／ＰＡＲＣ、ＣＣＬ１６／ＨＣＣ−４、ＣＣＬ５／ＲＡＮＴＥＳ、ＣＣＬ１／Ｉ−３０９／ＴＣＡ−３、ＴＡＦＡ１／ＦＡＭ１９Ａ１、ＭＣＫ−２、ＴＡＦＡ５／ＦＡＭ１９Ａ５、ＣＣＬ２／ＪＥ／ＭＣＰ−１、ＴＡＦＡ３／ＦＡＭ１９Ａ３、ＣＣＬ８／ＭＣＰ−２、ＴＡＦＡ４／ＦＡＭ１９Ａ４、ＣＣＬ７／ＭＣＰ−３／ＭＡＲＣ、ＣＣＬ１７／ＴＡＲＣ、ＣＣＬ１３／ＭＣＰ−４およびＣＣＬ２５／ＴＥＣＫが挙げられ；ケモカイン受容体としては、ＣＣＲ１、ＣＣＲ７、ＣＣＲ２、ＣＣＲ８、ＣＣＲ３、ＣＣＲ９、ＣＣＲ４、ＣＣＲ１０、ＣＣＲ５、ＣＣＲＬ２／ＬＣＣＲ／ＣＲＡＭ−Ａ／ＢおよびＣＣＲ６が挙げられ；ＣＸＣケモカイン誘導体としては、ＣＸＣＬ１３／ＢＬＣ／ＢＣＡ−１、ＣＸＣＬ１０／ＩＰ−１０／ＣＲＧ−２、ＣＸＣＬ１４／ＢＲＡＫ、ＬＩＸ、ＣＸＣＬ１６、ＣＸＣＬ１５／Ｌｕｎｇｋｉｎｅ、ＣＸＣＬ５／ＥＮＡ−７８、ＣＸＣＬ９／ＭＩＧ、ＣＸＣＬ６／ＧＣＰ−２、ＣＸＣＬ７／ＮＡＰ−２、ＣＸＣＬ１／２／３／ＧＲＯ、ＣＸＣＬ４／ＰＦ４、ＣＸＣＬ１／ＧＲＯアルファ／ＫＣ／ＣＩＮＣ−１、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１アルファ、ＣＸＣＬ２／ＧＲＯベータ／ＭＩＰ−２／ＣＩＮＣ−３、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１ベータ、ＣＸＣＬ３／ＧＲＯガンマ／ＣＩＮＣ−２／ＤＣＩＰ−１、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ−１、ＣＸＣＬ１１／Ｉ−ＴＡＣ、ＣＸＣＬ７／胸腺ケモカイン−１およびＣＸＣＬ８／ＩＬ−８が挙げられ；ＣＸＣケモカイン受容体としては、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ７／ＲＤＣ−１、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ１／ＩＬ−８  ＲＡ、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ２／ＩＬ−８  ＲＢおよびＣＸＣＲ６が挙げられ；ＴＮＦスーパーファミリー誘導体としては、４−１ＢＢ誘導体／ＴＮＦＳＦ９、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＳＦ１３、リンホトキシン、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、リンホトキシンベータ／ＴＮＦＳＦ３、ＣＤ２７誘導体／ＴＮＦＳＦ７、ＯＸ４０誘導体／ＴＮＦＳＦ４、ＣＤ３０誘導体／ＴＮＦＳＦ８、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＣＤ４０誘導体／ＴＮＦＳＦ５、ＴＮＦ−アルファ／ＴＮＦＳＦ１Ａ、ＥＤＡ（ｐａｎ）、ＴＮＦ−ベータ／ＴＮＦＳＦ１Ｂ、ＥＤＡ−Ａ１／エクトジスプラシンＡ１、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＳＦ１０、ＥＤＡ−Ａ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１、Ｆａｓ誘導体／ＴＮＦＳＦ６、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＳＦ１２およびＧＩＴＲ誘導体／ＴＮＦＳＦ１８が挙げられ；ＴＮＦスーパーファミリー受容体としては、４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／ＣＤ１３７、ＮＧＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳ���１６、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、オステオプロテジェリン／ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ、ＢＣＭＡ／ＴＮＦＲＳＦ１７、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＲＡＮＫ／ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＤｃＲ３／ＴＮＦＲＳＦ６Ｂ、ＴＮＦＲＨ３／ＴＮＦＲＳＦ２６、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ２３、ＴＮＦ  ＲＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＤｃＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ２２、ＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＴＲＡＩＬ  Ｒ１／ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＤＲ６／ＴＮＦＲＳＦ２１、ＴＲＡＩＬ  Ｒ２／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＥＤＡＲ、ＴＲＡＩＬ  Ｒ３／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ、Ｆａｓ／ＴＮＦＲＳＦ６／ＣＤ９５、ＴＲＡＩＬ  Ｒ４／ＴＮＦＲＳＦ１０Ｄ、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＴＲＯＹ／ＴＮＦＲＳＦ１９、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＴＷＥＡＫ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１２、リンホトキシンベータＲ／ＴＮＦＲＳＦ３およびＸＥＤＡＲが挙げられ；ＴＬＲ−１、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−６、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８およびＴＬＲ−９を含むＴｏｌｌ様受容体；カテプシンＡ、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＤ、カテプシンＥ、カテプシンＦ、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１０、ＭＭＰ１１、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５、ＭＭＰ１６、ＭＭＰ１７、ＭＭＰ１９、ＭＭＰ２０、ＭＭＰ２１、ＭＭＰ２３Ａ、ＭＭＰ２３Ｂ、ＭＭＰ２６、ＭＭＰ２７、ＭＭＰ２８、ウロキナーゼ、カリクレイン（ＫＬＫ１、ＫＬＫ２、ＫＬＫ３、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ９、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１２、ＫＬＫ１３、ＫＬＫ１４およびＫＬＫ１５を含む）を含む、酵素；補体系の成分；細胞内シグナル伝達分子および転写因子；ｐ５３；およびＭＤＭ２。標的は、以下に示すように、血清アルブミンなどの大型の血漿タンパク質であってもよい。
【００８６】
このリストは、決して網羅的でないことが認識されるであろう。
【００８７】
さらなる結合または機能活性は、分子足場に共有結合による連結したペプチドのＮ末端またはＣ末端に結合されてもよい。官能基は、例えば、インビボでペプチド誘導体の半減期を延長する分子に結合することができる基、およびインビボでペプチド誘導体の半減期を延長する分子からなる群から選択されてもよい。このような分子は、例えば、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質であってもよく、インビボでペプチド誘導体の半減期を延長する分子に結合することができる基は、ＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質に特異的な抗体または抗体断片である。このような分子はまた、高分子量ＰＥＧとのコンジュゲートであってもよい。
【００８８】
一実施形態では、官能基は、分子足場に共有結合により連結したペプチドを含む第２のペプチド誘導体からなる群から選択される結合分子、および抗体または抗体断片である。２、３、４、５またはそれより多いペプチド誘導体は一緒に接合することができる。任意の２つ以上のこれらの誘導体の特異性は同一であっても異なっていてもよく、これらが同一である場合、多価結合構造が形成されることになり、一価の結合分子と比較して、標的に対するアビディティーが増加した。さらに、分子足場は、同一であっても異なっていてもよく、同一または異なる数のループを結んでもよい。
【００８９】
官能基は、さらに、エフェクター基、例えば、抗体のＦｃ領域であってもよい。
【００９０】
Ｎ末端またはＣ末端への結合は、ペプチドの分子足場への結合の前になされてもよく、または後になされてもよい。したがって、Ｎ末端またはＣ末端ペプチド基が既に存在するペプチドが生成されてもよい（合成により、または生物学的に派生させた発現系により）。しかし、好ましくは、Ｎ末端またはＣ末端への付加は、ペプチドが分子骨格と組み合わされてコンジュゲートを形成した後に起こる。例えば、フルオレニルメチルオキシカルボニルクロリドを使用して、ペプチドのＮ末端にＦｍｏｃ保護基を導入することができる。Ｆｍｏｃは、親和性の高いＨＳＡを含む血清アルブミンに結合し、Ｆｍｏｃ−ＴｒｐまたはＦｍｏｃ−Ｌｙｓは、親和性が増加したものに結合する。ペプチドは、残されたＦｍｏｃ保護基と合成され、次いで、アルキルアミノを介して足場にカップリングされ得る。選択肢は、ＨＳＡにも結合し、例えば、リラグルチドにおいて使用され、このＧＬＰ−１アナログの半減期を延長するパルミトイル部分である。
【００９１】
あるいは、ペプチドの足場とのコンジュゲートが作製され、次いで、Ｎ末端において、例えば、アミンおよびスルフヒドリル反応性リンカーＮ−ｅ−マレイミドカプロイルオキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）で修飾され得る。このリンカーを介して、ペプチドコンジュゲートは、他のペプチド、例えば、抗体Ｆｃ断片に連結され得る。
【００９２】
結合機能は、多量体を作出する分子足場に結合した別のペプチド、抗体もしくは抗体断片を含む別の結合タンパク質、または血清アルブミンもしくはエフェクター基、例えば、抗体Ｆｃ領域を含む任意の他の所望のものであってもよい。
【００９３】
さらなる結合または機能活性が、さらに、分子足場に直接結合され得る。
【００９４】
実施形態では、足場は、さらなる活性が結合され得る反応性基をさらに含んでもよい。好ましくは、この基は、ペプチドとの相互作用を避けるために、分子足場上の他の反応性基に対して直交型である。一実施形態では、反応性基は、さらなる活性にコンジュゲートするのに必要な場合、保護されても脱保護されてもよい。したがって、本発明のさらなる態様では、１つまたは複数のエフェクター基および／または官能基にコンジュゲートした、本明細書で定義されるペプチドリガンドを含む薬物コンジュゲートが提供される。
【００９５】
エフェクター基および／または官能基は、例えば、ポリペプチドのＮ末端もしくはＣ末端、または分子足場に結合することができる。
【００９６】
適当なエフェクター基として、抗体およびその一部または断片が挙げられる。例えば、エフェクター基は、１つまたは複数の定常領域ドメインに加えて、抗体軽鎖定常領域（ＣＬ）、抗体ＣＨ１重鎖ドメイン、抗体ＣＨ２重鎖ドメイン、抗体ＣＨ３重鎖ドメイン、またはこれらの任意の組合せを含むことができる。エフェクター基はまた、抗体のヒンジ領域（このような領域は、通常、ＩｇＧ分子のＣＨ１ドメインとＣＨ２ドメインの間にみられる）を含んでもよい。
【００９７】
本発明のこの態様のさらなる実施形態では、本発明によるエフェクター基は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域である。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、１日間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上または７日間以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合を含むかまたはそれからなる。最も有利には、本発明によるペプチドリガンドは、１日間以上のｔβ半減期を有するペプチドリガンドＦｃ融合を含むかまたはそれからなる。
【００９８】
官能基として、一般的に、結合基、薬物、他の実体の結合のための反応性基、大環状ペプチドの細胞内への取り込みを助ける官能基などが挙げられる。
【００９９】
細胞内へと浸透するペプチドの能力は、細胞内標的に対するペプチドを有効なものとする。細胞内へと浸透する能力を有するペプチドによりアクセスされ得る標的は、転写因子、チロシンキナーゼなどの細胞内シグナル伝達分子およびアポトーシス経路に関与する分子を含む。細胞の浸透を可能にする官能基は、ペプチドまたは分子足場のいずれかに付加されたペプチドまたは化学基を含む。ペプチド、例えば、ＶＰ２２、ＨＩＶ−Ｔａｔ、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のホメオボックスタンパク質（アンテナペディア）などに由来するペプチドは、例えば、Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  （２００７）  Ｖｏｌｕｍｅ  ３５，Ｐａｒｔ  ４，ｐ８２１；Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  （２００４）  Ｖｏｌｕｍｅ  ５７  ９６３７に記載されている。原形質膜を通した転位置において効率的であることが示された短いペプチドの例として、ショウジョウバエアンテナペディアタンパク質由来の１６アミノ酸ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）ペプチド（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ  （１９９４）  Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌｕｍｅ  ２６９  ｐ１０４４４）、１８アミノ酸「モデル両親媒性ペプチド」（Ｏｅｈｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  １４１４  ｐ１２７）およびＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質のアルギニンリッチ領域が挙げられる。非ペプチド性アプローチは、生体分子に容易に付着することができる小分子模倣物またはＳＭＯＣの使用を含む（Ｏｋｕｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｖｏｌｕｍｅ  ４  ｐ１５３）。分子にグアニジウム基を付加する他の化学的戦略も、細胞浸透を増強させる（Ｅｌｓｏｎ−Ｓｃｗａｂ  ｅｔ  ａｌ  （２００７）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  Ｖｏｌｕｍｅ  ２８２  ｐ１３５８５）。ステロイド等、低分子量の分子を分子足場に付加して、細胞内への取り込みを増強させてもよい。
【０１００】
ペプチドリガンドに結合することができる官能基の１つのクラスは、抗体およびＦａｂ、Ｆｖまたはシングルドメイン断片などの、その結合断片を含む。特に、インビボにおけるペプチドリガンドの半減期を増加させることができるタンパク質に結合する抗体を使用してもよい。
【０１０１】
多くの細胞上に存在するインテグリンに結合するＲＧＤペプチドを組み込んでもよい。
【０１０２】
一実施形態では、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基は、１２時間以上、２４時間以上、２日間以上、３日間以上、４日間以上、５日間以上、６日間以上、７日間以上、８日間以上、９日間以上、１０日間以上、１１日間以上、１２日間以上、１３日間以上、１４日間以上、１５日間以上または２０日間以上からなる群から選択されるｔβ半減期を有する。有利には、本発明によるペプチドリガンド−エフェクター基または組成物は、１２から６０時間の範囲内のｔβ半減期を有することとなる。さらなる実施形態では、これは、１日間以上のｔβ半減期を有することとなる。さらなる実施形態ではまた、これは、１２から２６時間の範囲内となる。
【０１０３】
本発明の特定の一実施形態では、ループ状ペプチドにコンジュゲートした官能基は、医薬関連の複合金属放射性同位体に適切な金属キレーターから選択される。このようなエフェクターは、前記放射性同位体と複合された場合、がん療法に有用な薬剤であり得る。適切な例としては、ＤＯＴＡ、ＮＯＴＡ、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ、ＨＥＨＡ、ＳａｒＡｒなどが挙げられる（Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｒａｄｉｏｎｕｃｌｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｏｄ  Ｓｐｅｅｒ，Ｗｏｌｔｅｒｓ／Ｋｌｕｖｅｒ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０１１）。
【０１０４】
可能なエフェクター基としてはまた、酵素、例えば、酵素／プロドラッグ療法での使用のためのカルボキシペプチダーゼＧ２などが挙げられ、ここで、このペプチドリガンドは、ＡＤＥＰＴにおいては抗体を置き換えられている。
【０１０５】
本発明のこの態様の特定の一実施形態では、官能基は、がん療法の細胞毒性剤のような薬物から選択される。適切な例としては、シスプラチンおよびカルボプラチンなどのアルキル化剤、ならびにオキサリプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、クロラムブシル、イホスファミド；プリンアナログ  アザチオプリンおよびメルカプトプリンを含む抗代謝剤またはピリミジンアナログ；ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビンおよびビンデシンなどのビンカアルカロイドを含む植物アルカロイドおよびテルペノイド；ポドフィロトキシンおよびその誘導体エトポシドおよびテニポシド；元々はタキソールとして知られた、パクリタキセルを含むタキサン；カンプトテシンを含むトポイソメラーゼ阻害剤；イリノテカンおよびトポテカン、ならびにアムサクリン、エトポシド、エトポシドホスフェート、およびテニポシドを含むＩＩ型阻害剤が挙げられる。さらなる薬剤は、免疫抑制薬ダクチノマイシン（腎臓移植において使用される）、ドキソルビシン、エピルビシン、ブレオマイシンなどを含む抗腫瘍抗生物質を含むことができる。
【０１０６】
この態様による本発明のさらに特定の一実施形態では、細胞毒性剤はＤＭ１またはＭＭＡＥから選択される。
【０１０７】
ＤＭ１は、メイタンシンのチオール含有誘導体であり、以下の構造：
【化７】
2020502238.tif 000008
を有する細胞毒性剤である。
【０１０８】
モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）は、合成の抗新生物薬であり、以下の構造：
【化８】
2020502238.tif 000009
を有する。
【０１０９】
一実施形態では、細胞毒性剤は、ジスルフィド結合などの切断可能な結合によって二環性ペプチドに連結している。さらなる実施形態では、ジスルフィド結合に隣接する基は、ジスルフィド結合の妨害を制御するために、そしてこれによって切断の速度および細胞毒性剤の同時の放出を制御するために修飾される。
【０１１０】
公開された研究によって、ジスルフィド結合のいずれかの側に対して立体障害を導入することによって、還元に対するジスルフィド結合の感受性を改変する能力が確立された（Ｋｅｌｌｏｇｇ  ｅｔ  ａｌ（２０１１）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，７１７）。立体障害の程度が大きいほど、細胞内グルタチオンおよびまた細胞外（全身性）還元剤による還元の速度は低下し、結果として、毒素が、細胞の内側および外側の両方で放出されにくくなる。したがって、循環中のジスルフィド安定性（毒素の望ましくない副作用を最小限にする）、対、細胞内環境における効率的な放出（治療効果を最大にする）における最適条件の選択は、ジスルフィド結合のいずれかの側における障害の程度を注意深く選択することによって達成され得る。
【０１１１】
ジスルフィド結合のいずれかの側にある障害は、分子構築物の標的化実体（ここでは、二環性ペプチド）または毒素側のいずれかに対して１つまたは複数のメチル基を導入することによりモジュレートされる。
【０１１２】
したがって、一実施形態では、細胞毒性剤は、式：
【化９】
2020502238.tif 000010
（式中、ｎは、１から１０から選択される整数を表し、
Ｒ１およびＲ２は、独立して、水素またはメチル基を表す）
の化合物から選択される。
【０１１３】
上記式の化合物の一実施形態では、ｎは、１を表し、Ｒ１およびＲ２は両方、水素を表す（すなわち、メイタンシン誘導体ＤＭ１）。
【０１１４】
上記式の化合物の代替の実施形態では、ｎは、２を表し、Ｒ１は、水素を表し、Ｒ２は、メチル基を表す（すなわち、メイタンシン誘導体ＤＭ３）。
【０１１５】
化合物の一実施形態では、ｎは、２を表し、Ｒ１およびＲ２は両方、メチル基を表す（すなわち、メイタンシン誘導体ＤＭ４）。
【０１１６】
細胞毒性剤は、ジスルフィド結合を形成することができ、二環性ペプチドとのコンジュゲート構造では、チオール毒素とチオール二環性ペプチドの間のジスルフィド接続性は、いくつかの可能な合成スキームを介して導入されることが認識される。
【０１１７】
一実施形態では、コンジュゲートの二環性ペプチド構成要素は、以下の構造：
【化１０】
2020502238.tif 000011
（式中、ｍは、０から１０から選択される整数を表し、
二環は、本明細書に記載される任意の適切なループ状ペプチド構造を表し、
Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素またはメチルを表す）
を有する。
【０１１８】
Ｒ３およびＲ４が両方とも水素である上記式の化合物を、障害を受けていないとみなし、Ｒ３およびＲ４の一方または両方がメチルを表す上記式の化合物を障害を受けているとみなす。
【０１１９】
上記式の二環性ペプチドがジスルフィド結合を形成することができ、上記の細胞毒性剤とのコンジュゲート構造において、チオール毒素とチオール二環性ペプチドの間のジスルフィド接続性は、いくつかの可能な合成スキームを通じて導入されることが認識されることとなる。
【０１２０】
一実施形態では、細胞毒性剤は、以下のリンカー：
【化１１】
2020502238.tif 000012
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素またはＣ１〜Ｃ６のアルキル基を表し、
毒素は、本明細書で定義される任意の適切な細胞毒性剤を指し、
二環は、本明細書に記載される任意の適切なループ状ペプチド構造を表し、
ｎは、１から１０から選択される整数を表し、
ｍは、０から１０から選択される整数を表す）
によって、二環性ペプチドに連結される。
【０１２１】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々水素である場合、ジスルフィド結合は、障害が最小であって、還元に対して最も感受性である。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が各々アルキルである場合、ジスルフィド結合は、障害が最大であって、還元に対する感受性が最小である。水素およびアルキルの部分的置換によって、還元、ならびにそれにともなう切断および毒素の放出に対する耐性の段階的な増大が生じる。好ましい実施形態は、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４がすべてＨ；Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３がすべてＨおよびＲ４＝メチル；Ｒ１、Ｒ２＝メチルおよびＲ３、Ｒ４＝Ｈ；Ｒ１、Ｒ３＝メチルおよびＲ２、Ｒ４＝Ｈ；およびＲ１、Ｒ２＝Ｈ、Ｒ３、Ｒ４＝Ｃ１〜Ｃ６アルキルを含む。
【０１２２】
一実施形態では、化合物の毒素はメイタンシンであり、コンジュゲートは以下の式の化合物：
【化１２】
2020502238.tif 000013
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、上記で定義された通りであり、
二環は、本明細書で定義された任意の適切なループ状ペプチド構造を表し、
ｎは、１から１０から選択される整数を表し、
ｍは、０から１０から選択される整数を表す）
を含む。
【０１２３】
毒素を有する二環性ペプチドリガンドの上述のコンジュゲートを調製するさらなる詳細および方法は、本発明者らの公開された特許出願ＷＯ２０１６／０６７０３５および２０１６年５月４日に提出した係属中の出願ＧＢ１６０７８２７．１に詳細に記載されている。これらの出願の開示全体は、参照により明示的に本明細書の一部をなすものとする。
【０１２４】
毒素と二環性ペプチドの間のリンカーは、アジド官能基化毒素とアルキン官能基化二環性ペプチド構造（またはその逆も同様）の間のクリック反応によって形成されるトリアゾール基を含んでもよい。他の実施形態では、二環性ペプチドは、カルボキシレート官能基化毒素と二環性ペプチドのＮ末端アミノ基の間の反応によって形成されたアミド連結を含有してもよい。
【０１２５】
毒素と二環性ペプチドの間のリンカーは、毒素の標的細胞内への選択的放出をもたらすカテプシンにより切断可能な基を含んでもよい。適切なカテプシンにより切断可能な基はバリン−シトルリンである。
【０１２６】
毒素と二環性ペプチドの間のリンカーは、所望の官能性、例えば、コンジュゲートに対する結合親和性またはカテプシン切断可能性をもたらす１つまたは複数のスペーサー基を含んでもよい。適切なスペーサー基は、バリン−シトルリン基と毒素部分の中間に位置し得るパラ−アミノベンジルカルバメート（ＰＡＢＣ）である。
【０１２７】
したがって、実施形態では、二環性ペプチド−薬物コンジュゲートは、毒素−ＰＡＢＣ−ｃｉｔ−ｖａｌ−トリアゾール−二環から構成される以下の構造：
【化１３】
2020502238.tif 000014
を有してもよい。
【０１２８】
さらなる実施形態では、二環性ペプチド−薬物コンジュゲートは、毒素−ＰＡＢＣ−ｃｉｔ−ｖａｌ−ジカルボキシレート−二環から構成される以下の構造：
【化１４】
2020502238.tif 000015
（式中、（ａｌｋ）は、式ＣｎＨ２ｎ（ｎは、１から１０である）のアルキレン基であり、直鎖状または分枝状であってもよく、適切な（ａｌｋ）は、ｎ−プロピレンまたはｎ−ブチレンである）
を有してもよい。
【０１２９】
本発明によるペプチド誘導体は、インビボ治療適用および予防適用、インビトロおよびインビボ診断適用、インビトロアッセイおよび試薬適用などで用いることができる。
【０１３０】
一般的に、ペプチド誘導体の使用によって、抗体の使用を置き換えることができる。本発明により選択される誘導体は、ウエスタン分析および標準的な免疫組織化学手順によるインサイチュタンパク質検出において、診断上有用であり、これらの適用における使用では、誘導体の選択されるレパートリーは、当技術分野で公知の技法に従って標識されてもよい。さらに、このようなペプチド誘導体は、クロマトグラフの支持体、例えば、樹脂と複合体を形成する場合、アフィニティークロマトグラフィー手順において予備的に使用することができる。すべてのこのような技法は、当業者に周知である。本発明によるペプチド誘導体は、抗体の結合能と同様の結合能を有し、このようなアッセイにおいて抗体を置き換えることができる。
【０１３１】
診断的使用には、試験片アッセイ、実験室アッセイおよび免疫診断アッセイを含む、抗体が通常置かれている任意の使用が含まれる。
【０１３２】
本発明に従って調製されるペプチド誘導体の治療的および予防的使用は、本発明に従って選択される誘導体のレシピエント哺乳動物、例えば、ヒトへの投与に関与する。少なくとも９０から９５％の均一性である実質的に純粋なペプチド誘導体が哺乳動物への投与に好ましく、９８から９９％またはそれより高い均一性が、特に哺乳動物がヒトである場合に、医薬としての使用に最も好ましい。所望に応じて部分的にまたは均一性まで精製した後、選択されたポリペプチドを、診断もしくは治療（体外が含まれる）において、またはアッセイ手順、免疫蛍光染色などの展開および実行において使用し得る（Ｌｅｆｋｏｖｉｔｅ  ａｎｄ  Ｐｅｒｎｉｓ，（１９７９  ａｎｄ  １９８１）  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）。
【０１３３】
本発明のペプチド誘導体には、典型的には、炎症状態、アレルギー性過敏症、がん、細菌感染またはウイルス感染、および自己免疫障害（これらに限定されないが、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病および重症筋無力症が挙げられる）を予防する、抑制するまたは処置することにおける用途が見出されるであろう。
【０１３４】
本出願では、用語「予防」は、疾患の誘発前の保護組成物の投与に関与する。「抑制」は、誘発事象後であるが、疾患の臨床的所見の前の組成物の投与を指す。「処置」は、疾患症状が現れた後の保護組成物の投与に関与する。
【０１３５】
疾患に対して保護することまたは疾患を処置することにおけるペプチド誘導体の有効性をスクリーニングするために使用され得る動物モデル系が利用可能である。
【０１３６】
感受性マウスにおける全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の試験のための方法は、当技術分野で公知である（Ｋｎｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ，（１９７８）  Ｊ  Ｅｘｐ，Ｍｅｄ．，１４７：１６５３；Ｒｅｉｎｅｒｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９７８）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ，Ｊ，Ｍｅｄ．，２９９：５１５）。重症筋無力症（ＭＧ）は、別の種に由来する可溶性ＡｃｈＲタンパク質で疾患を誘発することによって、雌のＳＪＬ／Ｊマウスにおいて試験される（Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８）  Ａｄｖ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２：２３３）。関節炎は、ＩＩ型コラーゲンの注射によって、感受性系統のマウスにおいて誘発される（Ｓｔｕａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，（１９８４）  Ａｎｎ，Ｒｅｖ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２：２３３）。マイコバクテリアのヒートショックタンパク質の注射によって、感受性ラットにおいて、アジュバント関節炎が誘発されるモデルについて記載されている（Ｖａｎ  Ｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ，３３１：１７１）。甲状腺炎は、記載されるサイログロブリンの投与によって、マウスにおいて誘導される（Ｍａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９８０）  Ｊ，Ｅｘｐ，Ｍｅｄ．，１５２：１１１５）。インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）は、自然に生じるかまたはＫａｎａｓａｗａ  ｅｔ  ａｌ，（１９８４）  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２７：１１３に記載されているもののように、ある特定系統のマウスにおいて誘発され得る。マウスおよびラットにおけるＥＡＥは、ヒトのＭＳに対するモデルとしての役割を果たす。このモデルでは、脱髄性疾患が、ミエリン塩基性タンパク質の投与によって誘発される（Ｐａｔｅｒｓｏｎ  （１９８６）  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｍｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ，Ｇｒｕｎｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｔｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ，１７９−２１３；ＭｃＦａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ，（１９７３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１７９：４７８：ａｎｄ  Ｓａｔｏｈ  ｅｔ  ａｌ，（１９８７）  Ｊ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：１７９を参照のこと）。
【０１３７】
一般的に、本発明のペプチド誘導体は、精製された形態で、薬理学的に適当な担体と一緒に利用される。典型的には、これらの担体には、生理食塩水および／または緩衝媒体を含む、水性またはアルコール／水性の溶液、乳濁液または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルとして、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウムならびに乳酸加リンゲルが挙げられる。ペプチド複合体を懸濁液中に保つために必要な場合は、適切な生理学的に許容されるアジュバントを、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチンおよびアルギネートなどの増粘剤から選択することができる。
【０１３８】
静脈内ビヒクルには、リンゲルデキストロースに基づくものなどの、体液および栄養素補充液ならびに電解質補充液が含まれる。また、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤および不活性ガスなどの保存料および他の添加剤も存在し得る（Ｍａｃｋ  （１９８２）  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）。
【０１３９】
本発明のペプチド誘導体は、別々に投与する組成物として使用されてもよく、または他の薬剤と併せて使用されてもよい。これらには、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシンまたはシスプラチン、および免疫毒素などの、抗体、抗体断片および様々な免疫治療薬が含まれる場合がある。医薬組成物には、それらを投与前にプールするかどうかに関わらず、様々な細胞毒性がある薬剤または他の薬剤と、本発明の選択された抗体、受容体もしくは結合タンパク質、またはさらには、様々な標的誘導体を使用して選択されたペプチドなどの様々な特異性を有する本発明によって選択されたペプチドの組合せとを併せた「カクテル」が含まれる場合がある。
【０１４０】
本発明による医薬組成物の投与経路は、当業者に一般的に知られているもののうちの任意のものであり得る。限定されるものではないが、免疫療法を含む治療のために、本発明の選択された抗体、受容体または結合タンパク質は、標準の技法に従って任意の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、肺の経路、また、適当には、カテーテルを用いた直接輸液によるものを含む任意の適当な様式によるものであり得る。投薬量および投与頻度は、患者の年齢、性別および状態、他の薬物の同時投与、対抗適応症ならびに臨床家が考慮すべき他のパラメータに依存する。
【０１４１】
この発明のペプチド誘導体は、貯蔵用に凍結乾燥し、使用前に適切な担体で復元することができる。この技法は有効であることが示されており、当分野で知られている凍結乾燥および復元の技法を用いることができる。当業者には、凍結乾燥および復元は様々な度合の活性の損失をもたらす場合があり、補償するために使用レベルを上方調節する必要があり得ることが認識されよう。
【０１４２】
本発明のペプチド誘導体またはそのカクテルを含有する組成物は、予防的および／または治療的な処置のために投与することができる。ある特定の治療適用では、選択された細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、変調、死滅、または何らかの他の測定可能なパラメータを達成するために十分な量が、「治療上有効な用量」として定義される。この投薬量を達成するために必要な量は、疾患の重度および患者自身の免疫系の一般的状態に依存するが、一般的に、体重１キログラム当たり０．００５から５．０ｍｇの選択されたペプチド誘導体の範囲であり、０．０５から２．０ｍｇ／ｋｇ／用量の用量がより一般的に使用される。予防適用では、本発明のペプチド誘導体またはそのカクテルを含有する組成物を、同様またはわずかに低い投薬量で投与してもよい。
【０１４３】
本発明によるペプチド誘導体を含有する組成物は、哺乳動物における選択された標的細胞集団の変更、不活性化、死滅または除去を支援するために、予防的および治療的な設定で利用し得る。さらに、本明細書に記載のペプチドの選択されたレパートリーは、不均一な細胞のコレクションから標的細胞集団を死滅、枯渇または他の様式で有効に除去するために、体外またはインビトロで選択的に使用することができる。哺乳動物由来の血液を体外で選択されたペプチド誘導体と合わせ、それによって、所望しない細胞を死滅させるかまたは他の様式で血液から除去して、標準的技法に従って哺乳動物に戻すことができる。
【０１４４】
本発明は、以下の実施例を参照してさらに説明される。
【実施例】
【０１４５】
［材料および方法］
＜タンパク質発現＞
ヒト遺伝子由来の残基Ｃｙｓ３１９−Ｇｌｙ５１１であるＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシン様リピート（ＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメインとしても公知）は、ｐＥＸＰＲ−ＩＢＡ４２（ＩＢＡ）発現ベクターを使用して、分泌されたＮ末端Ｈｉｓ６タグ化可溶性タンパク質として、ＨＥＫ２９３細胞において一過性に発現された。発現後、タンパク質を、ゲル濾過後にニッケル−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製し、純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってチェックした。バッチ間のばらつきはまた、ヘモペキシンドメイン結合性の二環の有無において蛍光熱シフト実験によってもモニターした。
【０１４６】
＜ペプチド合成＞
ペプチド合成は、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓが製造した、Ｓｙｍｐｈｏｎｙペプチドシンセサイザー、およびＭｕｌｔｉＳｙｎＴｅｃｈが製造したＳｙｒｏ  ＩＩシンセサイザーを使用する、Ｆｍｏｃ化学に基づいた。以下の側鎖保護基、すなわち、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）；Ａｓｎ（Ｔｒｔ）；Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）；Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）；ＧＩｕ（ＯｔＢｕ）；Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）；Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）；Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）；Ｓｅｒ（ｔＢｕ）；Ｔｈｒ（ｔＢｕ）；Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）；およびＴｙｒ（ｔＢｕ）（Ｓｉｇｍａ）を伴って、標準のＦｍｏｃ−アミノ酸（Ｓｉｇｍａ、Ｍｅｒｃｋ）を用いた。カップリング試薬は、ＨＣＴＵ（Ｐｅｐｃｅｕｔｉｃａｌｓ）であって、ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、Ｓｉｇｍａ）を塩基として用いて、脱保護は、ＤＭＦ（ＡＧＴＣ）中の２０％のピペリジンで達成した。合成は、０．３７ｍｍｏｌ／ｇｒのＦｍｏｃ−ＲｉｎｋアミドＡＭ樹脂（ＡＧＴＣ）を使用して実施し、Ｆｍｏｃ−アミノ酸を４倍過剰で利用し、塩基はアミノ酸に関して４倍過剰であった。アミノ酸を０．２ＭでＤＭＳＯ中に、ＨＣＴＵを０．４ＭでＤＭＦ中に、およびＤＩＰＥＡを１．６ＭでＮ−メチルピロリドン（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）中に溶解した。条件は、カップリング反応がＤＭＦ中に２０から５０％の間のＤＭＳＯを含有した条件であって、これによって、固相合成の間に凝集および欠失を低下させ、収率を向上させた。カップリング時間は、一般的に、３０分であって、脱保護時間は２×５分間であった。Ｆｍｏｃ−Ｎ−メチルグリシン（Ｆｍｏｃ−Ｓａｒ−ＯＨ、Ｍｅｒｃｋ）を、１時間カップリングして、以下の残基についての脱保護およびカップリング時間はそれぞれ２０分および１時間であった。合成後、樹脂をジクロロメタンで洗浄して、乾燥した。側鎖保護基のおよび支持体からの切断は、１０ｍＬの９５：２．５：２．５：２．５（ｖ／ｖ／ｖ／ｗ）のＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ｉＰｒ３ＳｉＨ／ジチオトレイトールを使用して３時間行った。切断後、使用済みの樹脂を濾過によって取り除き、濾液を、−８０℃で冷却された３５ｍＬのジエチルエーテルに添加した。ペプチドペレットを遠心分離して、エーテルの上清を廃棄して、冷エーテルを用いてペプチドペレットを２回以上洗浄した。次いで、ペプチドを５〜１０ｍＬのアセトニトリル−水中に再溶解させて凍結乾燥させた。わずかな試料を、質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、Ｖｏｙａｇｅｒ  ＤＥ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ））による粗生成物の純度の分析のために取り出した。凍結乾燥後、ペプチド粉末を１０ｍＬの６Ｍグアニジニウム塩酸塩（Ｈ２Ｏ中）中に採取し、０．５ｍＬの１Ｍジチオトレイトールを補充し、Ｃ８  Ｌｕｎａ分取ＨＰＬＣ  カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上にロードした。溶媒（Ｈ２Ｏ、アセトニトリル）を０．１％のヘプタフルオロ酪酸を用いて酸性化した。勾配は、Ｇｉｌｓｏｎ分取ＨＰＬＣシステムを使用して、１５〜２０ｍＬ／分の流速で、１５分で３０〜７０％のアセトニトリルにわたって行った。純粋な直鎖状ペプチド物質を含有する画分（ＭＡＬＤＩによって特定される通り）を、以下にさらに説明する足場分子へのカップリングによって、二環性誘導体の調��のために使用した。
【０１４７】
別段留意されていなければ、すべてのアミノ酸をＬ−立体配置で使用した。非天然アミノ酸は、上述の一般的方法を使用してペプチド配列に組み込んだ。本明細書で用いる非天然アミノ酸前駆体のリストを以下の表にまとめる。
【表１】
2020502238.tif 000016
【０１４８】
さらに、以下の非天然アミノ酸前駆体を、ＤＡＰおよびＮ−ＡｌｋＤａｐ修飾ペプチドの調製のために使用した。
【表２】
2020502238.tif 000017
【０１４９】
＜ＭＴ１−ＭＭＰに対する結合親和性＞
蛍光偏光（異方性）を使用する競合アッセイを使用して、結合親和性を測定した。
【０１５０】
本明細書中で言及した蛍光トレーサーは、５，６−カルボキシフルオレセインを使用して蛍光標識化された二環性ペプチドである。蛍光標識化は、サルコシンスペーサー（通常はＳａｒ５）によって、二環性コア配列から隔てられる、ペプチドのＮ末端アミノ基で実施されてもよい。これは、Ｎ末端アミノ基がペプチドに固有である場合、Ｆｍｏｃ固相合成の間に、または合成後（ＴＢＭＢおよび精製での環化後）に行われ得る。蛍光標識化はまた、Ｃ末端で、通常は、最初のＣ末端残基として導入されたリシンで実施してもよく、この残基は、次いで、サルコシンスペーサー（通常はＳａｒ６）によって二環性コア配列から隔てられている。したがって、Ｎ末端トレーサーは、Ｃ末端蛍光標識化構築物について、Ｆｌｕｏ−Ｇｌｙ−Ｓａｒ５−Ａ（二環性コア配列）および（二環性コア配列）−Ａ−Ｓａｒ６−Ｋ（Ｆｌｕｏ）として記載された分子フォーマットを有してもよい。実施例で使用される蛍光トレーサーは、Ａ−（１７−６９）−Ａ−Ｓａｒ６−Ｋ（Ｆｌｕｏ）、Ａ−（１７−６９−０７）−Ａ−Ｓａｒ６−Ｋ（Ｆｌｕｏ）、およびＡ−（１７−６９−１２）−Ａ−Ｓａｒ６−Ｋ（Ｆｌｕｏ）である。１７−６９蛍光ペプチドの酸性の性質に起因して、それらは、典型的には、濃縮ＤＭＳＯストックとして調製され、それから希釈液を、１００ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８緩衝液中で調製した。
【０１５１】
ＭＴ１−ＭＭＰヘモペキシンドメイン（ＰＥＸ）に対するそれらの高い親和性に起因して、本明細書の蛍光標識された誘導体を、競合実験（検出のためのＦＰを使用する）に使用してもよい。蛍光性ＰＥＸ−結合トレーサーとのＰＥＸの事前に形成された複合体を、遊離の非蛍光標識された二環性ペプチドで滴定する。すべての１７〜６９ベースのペプチドは、同一部位で結合すると期待されるので、滴定剤は、ＰＥＸから蛍光トレーサーを押しのけることになる。複合体の解離は、定量的に測定することができ、標的タンパク質に対する競合因子（滴定剤）のＫｄが決定され得る。競合方法の利点は、非蛍光標識の二環性ペプチドの親和性が、正確かつ迅速に決定され得るということである。
【０１５２】
トレーサーの濃度は、通常、Ｋｄ以下（ここでは、１ｎＭ）であり、結合タンパク質（ここでは、ＭＴ１−ＭＭＰのヘモペキシン）は、１５倍過剰であり、その結果トレーサーの９０％より多くが結合する。次に、非蛍光性競合因子二環性ペプチド（通常は、ほぼ二環性コア配列）が滴定され、その結果、標的タンパク質由来の蛍光トレーサーを押しのける。トレーサーが押しのけられるのを、測定して、蛍光偏光の低下と関連付ける。蛍光偏光における低下は、非蛍光性滴定剤と結合した標的タンパク質の画分と比例しており、したがって、標的タンパク質に対する滴定剤の親和性の尺度である。
【０１５３】
生のデータは、蛍光トレーサー、滴定剤、および結合タンパク質の間の平衡を記載する三次方程式の解析解にあてはめられる。このあてはめは、直接結合ＦＰ実験によって別々に決定され得る（前のセクションを参照のこと）、標的タンパク質に対する蛍光トレーサーの親和性の値を必要とする。曲線のあてはめは、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ  １２．０を使用して実施し、Ｚｈｉ−Ｘｉｎ  Ｗａｎｇ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３６０（１９９５）  １１１−１１４）に記載の式の適合したバージョンを使用した。
【０１５４】
［参照例１］
アルキルアミノに対するチオエーテルの足場連結の比較のために選択された二環性ペプチドを１７−６９−０７−Ｎ２４１と示した。これは、チオエーテル形成ペプチドのトリメチレンベンゼン足場との二環性コンジュゲートである。この二環性誘導体の構造を図２に模式的に示す。コンジュゲーション前の直鎖状ペプチドは配列：
Ｈ−（β−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａｌａ−Ｃｙｓ−（Ｄ−Ａｌａ）−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−（１Ｎａｌ）−（Ｄ−Ａｌａ）−Ｃｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−（ｔＢｕＧｌｙ）−Ｃｙｓ−ＮＨ２
を有する。
【０１５５】
１，３，５−トリス（ブロモメチル）ベンゼン（ＴＢＭＢ、Ｓｉｇｍａ）へのコンジュゲーションは以下のように行った。直鎖状ペプチドを約３５ｍＬまでＨ２Ｏで希釈し、アセトニトリル中１００ｍＭのＴＢＭＢ  約５００μＬを添加し、反応をＨ２Ｏ中１ＭのＮＨ４ＨＣＯ３  ５ｍＬで開始した。反応を室温で約３０〜６０分間進行させ、反応が完了したら（ＭＡＬＤＩによって判断した）、凍結乾燥した。凍結乾燥後、修飾ペプチドを上記のように精製し、一方、Ｌｕｎａ  Ｃ８をＧｅｍｉｎｉ  Ｃ１８カラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）によって置き換え、酸を０．１％のトリフルオロ酢酸に変更した。正しいＴＭＢ修飾材料を含有する純粋な画分をプールし、凍結乾燥し、保存のために−２０℃に保った。
【０１５６】
１７−６９−０７−Ｎ２４１と示した得られた二環性誘導体は、ＭＴ１−ＭＭＰに対する高い親和性を示した。誘導体のＭＴ１−ＭＭＰに対する親和性（Ｋｄ）の測定値は０．２３ｎＭであった。したがって、誘導体を、細胞表面メタロプロテアーゼＭＴ１−ＭＭＰを発現する、腫瘍細胞を標的とするための有望な候補とみなす。
【０１５７】
［実施例１］
１７−６９−０７−Ｎ３８５と示した二環性ペプチドを、ｂ−Ａｌａ−Ｓａｒ１０テイルを除き、第１および第３のシステイン残基を、ＴＢＭＢ足場に対してアルキルアミノ連結を形成するＤＡＰ残基によって置き換えた、参照例１のペプチド誘導体の二環性領域に対応するものとして作製した。この誘導体の構造を図３に模式的に示す。
【０１５８】
この二環を形成するために使用される直鎖状ペプチドは：
Ａｃ−Ａ（Ｄａｐ）（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）ＣＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）（Ｄａｐ）
であった。
【０１５９】
直鎖状ペプチドと二環性ペプチドは、以下のＬＣＭＳ特徴を有した。
【表３】
2020502238.tif 000018
【０１６０】
環化ステップのための種々の試薬は次のように試された。試薬は、選択された溶媒中で以下の表に示した濃度に調合した。ペプチド溶液の体積に対して、半分の体積のＴＢＭＢ溶液を添加し、混合物を十分に撹拌し、次いで、塩基溶液の体積の半分を添加した。反応物を混合し、ＬＣＭＳ分析のために定期的にサンプリングした。
【表４】
2020502238.tif 000019
【０１６１】
実施例：５０μＬのペプチド溶液に、２５μＬのＴＢＭＢ溶液を添加した。溶液を全体的に混合し、次いで、２５μＬの塩基溶液を添加した。
【０１６２】
使用した溶媒がＤＭＦである場合には、すべての試薬をＤＭＦ中で調合した。使用した溶媒がＤＭＳＯである場合には、すべての試薬をＤＭＳＯ中で調合した。使用した溶媒がＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏである場合には、ペプチド溶液は５０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ中で調合し、ＴＢＭＢ溶液はＭｅＣＮ中で調合し、塩基溶液は、塩基がＤＩＰＥＡである場合（この場合には、塩基溶液はＭｅＣＮ中で調合する）を除き、Ｈ２Ｏ中で調合する。すべての環化は室温で実施した。結果は以下の通りである（スペクトルの範囲を３．５〜５．５分に設定した。２２０ｎｍのスペクトルを積分し、主要ピークの合計を得た）。
【表５】
2020502238.tif 000020
【０１６３】
環化後の純度は塩基の選択に高度に依存することが理解され得る。生成物の純度は２から６６％の範囲であり、後者は、ＤＩＰＥＡの存在下におけるアセトニトリル／水の混合物に関与する。参照例１の環化と異なり、塩基として従来のＮａＨＣＯ３を使用する場合、収率は比較的低い。最も高い収率は、トリアルキルアミン、すなわち、トリエチルアミンとジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）を使用して達成される。
【０１６４】
ＭＴ１−ＭＭＰに対する結合の比較データを図７に示す。Ｋｄの測定値は０．４５ｎＭであり、これは、参照例１のチオエーテル連結誘導体と比較して、この例のアルキルアミノ連結に対する変化は、結合親和性において、顕著なほど少ない変化しか生じなかったことを実証する。
【０１６５】
［実施例２］
１７−６９−０７−Ｎ４２６と示した二環性ペプチドを、ＤＡＰ残基をＮ−ＭｅＤＡＰ残基に置き換えた、実施例１の二環性ペプチドに対応するものとして作製した。この誘導体の構造を図４に模式的に示す。この二環を形成するために使用した直鎖状ペプチドは：
Ａｃ−Ａ（Ｄａｐ（Ｍｅ））（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）ＣＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）（Ｄａｐ（Ｍｅ））
であった。
【０１６６】
直鎖状ペプチドと二環性ペプチドは、以下のＬＣＭＳ特徴を有した。
【表６】
2020502238.tif 000021
【０１６７】
実施例１に記載された環化ステップに対して、種々の異なる反応条件、溶媒、および塩基を使用して、以下の結果を得た（すべての環化は室温で実施した）。
【表７】
2020502238.tif 000022
【０１６８】
環化後の純度は、再度、塩基の性質に依存する。塩基としてＮａ２ＣＯ３を用いた純度は、予期した通り、低い（実施例１を参照のこと）。ＤＩＰＥＡの存在下におけるアセトニトリル／水の最適条件を使用すると、環化後の純度は非常に高く（９３％）、ＤａｐのＮ−メチル化によって副反応のレベルが低減されることを実証する。
【０１６９】
ＭＴ１−ＭＭＰに対する結合の比較データを図８に示す。Ｋｄの測定値は０．３６ｎＭであり、参照例１のチオエーテル連結誘導体からほとんど変化していない。この効力は、連結における２つのＮ−メチル化にもかかわらず保持され、したがって、本発明の誘導体は大いに興味深い。
【０１７０】
［実施例３］
１７−６９−０７−Ｎ４２８と示した二環性ペプチドを、Ｔｙｒ９をＰｈｅ９に置き換えた（Ｔｙｒヒドロキシルの除去）、実施例１の二環性ペプチドに対応するものとして作製した。この二環を形成するために使用した直鎖状ペプチドは：
Ａｃ−Ａ（Ｄａｐ）（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）ＣＥＤＦＦ９Ｄ（ｔＢｕＧｌｙ）（Ｄａｐ）
であった。
【０１７１】
直鎖状ペプチドと二環性ペプチドは、以下のＬＣＭＳ特徴を有した。
【表８】
2020502238.tif 000023
【０１７２】
実施例１に記載された環化ステップに対して、種々の異なる反応条件、溶媒、および塩基を使用して、以下の結果を得た（スペクトルのＬＣＭＳ範囲を４〜６分に設定した。２２０ｎｍのスペクトルを積分し、主要ピークの合計を得た）。
【表９】
2020502238.tif 000024
【０１７３】
生成物の純度は２から７１％の範囲であり、後者は、ＤＩＰＥＡの存在下におけるアセトニトリル／水の混合物に関与することが理解され得る。Ｔｙｒ−ＯＨの除去（Ｔｙｒ→Ｐｈｅ９）により、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＭＧ／室温またはＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ／Ｋ２ＣＯ３／室温の条件下でチロシン含有ペプチドと同じ反応と比較して、生成物の収率が著しく増加する。溶媒としてのＤＭＳＯの使用は、容易に分析することができない非常に乱雑なクロマトグラムを与えた。
【０１７４】
ＭＴ１−ＭＭＰに対するこの１７−６９−０７−Ｎ４２８誘導体の結合の比較データを図９に示す。Ｋｄの測定値は３．５ｎＭである。参照例１のチオエーテル連結誘導体と比較した結合親和性のわずかな低減は、主に、Ｔｙｒ９のＰｈｅ９による置き換えのせいであると思われる。
【０１７５】
［実施例４］
１７−６９−０７−Ｎ４３４と示した二環性ペプチドを、参照例１のものと同様のＮ末端Ｓａｒ１０スペーサー、およびコンジュゲート基ＰＹＡ（毒素に関する「クリック」誘導体化のためのペンチン酸）を有する、実施例１の二環性ペプチドに対応するものとして作製した。この誘導体の構造を図５に模式的に示す。この二環を形成するために使用した直鎖状ペプチドは：
（ＰＹＡ）−（Ｂ−Ａｌａ）−Ｓａｒ１０−Ａ（Ｄａｐ）（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）ＣＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）（Ｄａｐ）
であった。
【０１７６】
直鎖状ペプチドと二環性ペプチドは、以下のＬＣＭＳ特徴を有した。
【表１０】
2020502238.tif 000025
【０１７７】
環化は以下のように実施した。
【表１１】
2020502238.tif 000026
【０１７８】
得られた誘導体１７−６９−０７−Ｎ４３４は、エフェクター、すなわち、毒素の誘導体化に必要とされるＮ末端アルキンを有するＮ２４１（参照例１）のＤａｐ１／３当量である。このペプチドは、６０％の純度のＴＢＭＢを用いて環化することができる。ＭＴ１−ＭＭＰに関するｋｄの測定値は１．５２ｎＭであり、この二環性ペプチドをＭＴ１−ＭＭＰを標的とするのに非常に適切にする。
【０１７９】
［実施例５］
実施例１から３で使用したＴＢＭＢ足場分子のＴＢＡＢによる置き換えを以下のように実施した。
【０１８０】
実施例１から３において、１７−６９−０７−Ｎ３８５、１７−６９−０７−Ｎ４２６および１７−６９−０７−Ｎ４２８を形成するために使用した直鎖状ペプチドを、ＴＢＭＢに対して使用したものと同一の濃度および当量のＴＢＡＢを用いて環化した。Ｎ３８５ペプチドを有するＴＢＡＢ誘導体の構造を図６に模式的に示す。
【０１８１】
室温で、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏの溶媒混合物に関して選択した塩基として、ＤＩＰＥＡを用いた。以下の結果が達成された。
【表１２】
2020502238.tif 000027
【０１８２】
これらの結果は、ＴＢＡＢ（ハロアセチル−）化学により、生成物カラムの％から理解できるように、ＴＢＭＢより高い環化率とより高い選択性がもたらされる。
【０１８３】
［実施例６］
１７−６９−０７−Ｎ４７４と示した二環性ペプチドを、Ｃｙｓ６をＤａｐ（Ｍｅ）で置き換えた実施例１の二環性ペプチドに対応するものとして作製した。この二環を形成するために使用した直鎖状ペプチドは：
Ａｃ−Ａ（Ｄａｐ（Ｍｅ））（Ｄ−Ａｌａ）ＮＥ（１Ｎａｌ）（Ｄ−Ａｌａ）（Ｄａｐ（Ｍｅ））ＥＤＦＹＤ（ｔＢｕＧｌｙ）（Ｄａｐ（Ｍｅ））
であった。
【０１８４】
Ｎ３８５ペプチドを有するＴＢＭＢ誘導体の構造を図１０に模式的に示す。
【０１８５】
直鎖状ペプチドと二環性ペプチドは、以下のＬＣＭＳ特徴を有した。
【表１３】
2020502238.tif 000028
【０１８６】
環化は以下の手順に従って実施した：ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（１：１）中１ｍＭのペプチド溶液５０μＬを、ＭｅＣＮ中２．６ｍＭのＴＢＭＢ  ２５μＬと混合し、次いで、ＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏ（酢酸を用いてｐＨを１０に調整した）中２００ｍＭのＤＩＰＥＡ  ２５μＬを添加し、溶液を混合した。（反応中に存在するペプチドに対し１．３当量のＴＢＭＢおよび１００当量の塩基）ＬＣＭＳ試料を４時間後に採取し、以下の表に示したように終夜反応を進行させた。
【表１４】
2020502238.tif 000029
【０１８７】
ＭＴ１−ＭＭＰに対する結合を、他の実施例と同様の手法で評価した。Ｋｄの測定値は８．０ｎＭであり、参照例１のチオエーテル連結誘導体より低い。この化合物は、連結における３つのＮ−メチルＤａｐにもかかわらず、依然として高い親和性で結合し、したがって、本実施例の誘導体は大いに興味深い。
【０１８８】
［実施例７］
本発明による以下のさらなる二環性ペプチドを、上述の方法を使用して調製し、ＭＴ１−ＭＭＰに関する結合親和性について試験した。これらの二環性ペプチド化合物の模式的構造を図１０〜１３に示す。
【表１５】
2020502238.tif 000030
【０１８９】
本発明によるこれらのアルキルアミノ連結二環性化合物に関して、ＭＴ１−ＭＭＰに対する高い親和性が達成されることが理解され得る。さらなる研究により、イヌ、マウス／ラットおよびヒトのＭＴ１−ＭＭＰに関して、本発明による二環性ペプチドの十分な交差反応性が示された。さらなる研究により、ＭＭＰ１外部ドメイン、ＭＭＰ２外部ドメイン、ＭＭＰ１５外部ドメイン（ヘモペキシンドメイン）またはＭＭＰ１６ヘモペキシンドメインとの有意な交差反応性を有さない、本発明による二環性ペプチドの高い特異性が示された。本発明による二環性ペプチドの薬物動態はまた、足場に対する３つのチオエーテル連結を有する対応する二環性ペプチドと同様であることが決定されたが、本発明の二環性ペプチドに対する血清測定値ではわずかにより長い半減期しか有さなかった。
【０１９０】
［実施例８］
本発明による二環性ペプチドが、トリアゾール環化反応によって、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）にカップリングされる二環性ペプチド−薬物コンジュゲート（ＢＣＤ）を、図１４に示す反応スキームに従って調製した。トリアゾール基に加えて、コンジュゲートのリンカー基は、バリン−シトルリン（カテプシンにより切断可能な基）およびパラアミノベンジルカルバメート（ＰＡＢＣ）、スペーサー基を含む。反応スキームのステップを以下のように実施した。
【０１９１】
＜化合物３の調製のための一般的手順＞
【化１５】
2020502238.tif 000031
【０１９２】
ＤＣＭ（３００ｍＬ）およびＭｅＯＨ（１５０ｍＬ）中の化合物２（３０ｇ、８０ｍｍｏｌ）の溶液に、暗所で、４−アミノフェニルメタノール（１１ｇ、８８ｍｍｏｌ）およびＥＥＤＱ（４０ｇ、１６０ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を３０℃で１６時間撹拌した。ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０／１、Ｒｆ＝０．４３）は、化合物２が完全に消費され、多くの新たなスポットが形成されたことを示した。反応物はＴＬＣにより清浄であった。得られた反応混合物を濃縮して残渣を得て、これを、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；３３０ｇｘ３  ＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  シリカフラッシュカラム、０〜２０％のＭｅＯＨ／ジクロロメタンを１００ｍＬ／分で溶出）によって精製した。化合物３（２０ｇ、５２％の収率）を白色固体として得た。
【０１９３】
＜化合物４の調製のための一般的手順＞
【化１６】
2020502238.tif 000032
【０１９４】
ＤＭＦ（４０ｍＬ）中の化合物３（５．０ｇ、１０．４ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（５．４ｇ、７．２６ｍＬ、４１．７ｍｍｏｌ）およびビス（４−ニトロフェニル）カーボネート（１２．７ｇ、４１．７ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を、０℃にて、窒素下で１時間撹拌した。ＴＬＣ（ＤＣＭ：ＭｅＯＨ＝１０／１、Ｒｆ＝０．６６）は、化合物３が完全に消費され、１つの新たなスポットが形成されたことを示した。反応物はＴＬＣにより清浄であり、ＬＣＭＳ（ＥＳ８２４１−１０−Ｐ１Ａ、生成物：ＲＴ＝１．１５分）は、所望の生成物が形成されたことを示した。得られた反応混合物を、中性条件下で、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣによって直接精製した。化合物４（１２ｇ、６０％の収率）を白色固体として得た。
【０１９５】
＜化合物５の調製のための一般的手順＞
【化１７】
2020502238.tif 000033
【０１９６】
反応の１つのバッチを以下のように実行した：ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の化合物４の溶液（１．２ｇ、１．６８ｍｍｏｌ）を、窒素雰囲気下で、ＤＩＥＡ（１．２２ｍＬ、６．９８ｍｍｏｌ）に添加し、溶液を０℃で１０分間撹拌し、次いで、ＨＯＢｔ（２２６ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ）およびＭＭＡＥ（１．００ｇ、１．４０ｍｍｏｌ）をそれに添加し、混合物を脱気して、Ｎ２を３時間パージし、これを３５℃で１６時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ８３９６−１−Ｐ１Ａ１、生成物：ＲＴ＝１．１９分）は、化合物４が完全に消費され、所望の質量を有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。５つのバッチの得られた反応混合物を１Ｌのビーカー内で合わせ、５００ｍＬの水を添加し、次いで、沈殿物を形成し、濾過して回収した。沈殿物をＥｔＯＡｃで終夜滴定した。化合物５（５ｇ、５９％の収率）を白色固体として得た。
【０１９７】
＜化合物６を調製のための一般的手順＞
【化１８】
2020502238.tif 000034
【０１９８】
化合物５（３．３ｇ、２．７ｍｍｏｌ）を、ＴＦＡ（４４ｍｍｏｌ、３．５ｍＬ）の存在下で、ＤＣＭ（１８ｍＬ）中に溶解させ、次いで、溶液を２５℃で３時間撹拌した。次に、反応混合物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭとＴＦＡを除去して残渣を得た。残渣はＴＨＦ（２０ｍＬ）中に溶解させ、Ｋ２ＣＯ３（１．８ｇ、１３ｍｍｏｌ）で処理し、さらに、混合物を２５℃でさらに１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ８３９６−２−Ｐ１Ｂ１、生成物：ＲＴ＝１．０４分）は、所望の質量を有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。反応混合物を濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得た。残渣を１０ｍＬのＤＭＦに溶解させ、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。化合物６（１．６ｇ、５３％の収率）を白色固体として得た。
【０１９９】
＜化合物７−１を調製のための一般的手順＞
【化１９】
2020502238.tif 000035
【０２００】
化合物６（１．２ｇ、１．１ｍｍｏｌ）および２−アジド酢酸（１６２ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解させた。ＴＥＡ（４５０ｕＬ、３．２ｍｍｏｌ）、ＨＯＢｔ（２１７ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）およびＥＤＣＩ（３０７ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を、窒素下で、この溶液に添加し、混合物を０℃で３０分間撹拌し、次いで、混合物を、さらに１５．５時間撹拌しながら、２５℃までゆっくりと温めた。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ８３９６−３−Ｐ１Ａ、生成物：ＲＴ＝１．０４分）は、化合物６が完全に消費され、所望の質量を有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。２ｍＬの水を反応混合物に添加して、清澄な溶液を形成した。次いで、この溶液を、中性条件下で、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣによって直接精製した。化合物７−１（０．９ｇ、７０％の収率）を白色固体として得た。
【０２０１】
＜ＢＴ１７ＢＤＣ−５３の調製のための一般的手順＞
【化２０】
2020502238.tif 000036
【０２０２】
ＤＭＦ（３ｍＬ）およびＨ２Ｏ（２ｍＬ）中（２−アジド酢酸）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ（１６ｍｇ、１３．２６ｕｍｏｌ、１当量）と二環性アルキン（１７−６９−０７−Ｎ４３４、３０ｍｇ、１１．０９ｕｍｏｌ、０．８当量）の混合物に、ＣｕＩ（１．２６ｍｇ、６．６３ｕｍｏｌ、０．５当量）を添加した。混合物を、２５℃にて、Ｎ２下で２０時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、（２−アジド酢酸）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥが完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。得られた反応混合物をｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。化合物ＢＴ１７ＢＤＣ−５３（２３．７ｍｇ、６．０６ｕｍｏｌ、５４．６４％の収率）を白色固体として得た。
【０２０３】
＜ＢＴ１７ＢＤＣ−５９の調製のための一般的手順＞
【化２１】
2020502238.tif 000037
【０２０４】
ＤＭＦ（３ｍＬ）中（２−アジド酢酸）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥ（３１ｍｇ、２５．６９ｕｍｏｌ、１．２当量）と（１７−６９−０７−Ｎ４３８、４０ｍｇ、２０．８ｕｍｏｌ、１当量）の混合物に、水（０．４ｍＬ）中のＣｕＳＯ４（１０．２５ｍｇ、６４．２４ｕｍｏｌ、３当量）溶液と水（０．４ｍＬ）中のアスコルビン酸（３７．７１ｍｇ、２１４．１２ｕｍｏｌ、１０当量）溶液を、窒素下で、添加した。次いで、混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、（２−アジド酢酸）−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢＣ−ＭＭＡＥが完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。得られた反応混合物を、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。ＢＴ１７ＢＤＣ−５９（２６．７ｍｇ、８．５３ｕｍｏｌ、４１．０２％の収率）を白色固体として得た。
【０２０５】
＜ＢＴ１７ＢＤＣ６１の調製のための一般的手順＞
【化２２】
2020502238.tif 000038
【０２０６】
化合物７−１（２５０ｍｇ、２０７ｕｍｏｌ）とＢＩＣＹ−アルキン１７−６９−０７−Ｎ４５０（５１５ｍｇ、１８８ｕｍｏｌ）を、５０ｍＬの丸底フラスコに入れ、ＤＭＦ（５ｍＬ）を添加し、続いて、窒素雰囲気下で、アスコルビン酸水溶液（１Ｍ、１．８８ｍＬ）とＣｕＳＯ４水溶液（１Ｍ、５７０ｕＬ）を添加し、次いで、混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ８３９６−８−Ｐ１Ａ、生成物：ＲＴ＝１．０３分）は、ＢＩＣＹ−アルキンが完全に消費され、所望の質量を有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。反応混合物を濾過して、溶解していない物質を除去し、濾液をｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＴ１７ＢＤＣ６１（２６２ｍｇ、３５％の収率）を白色固体として得た。
【０２０７】
＜ＢＴ１７ＢＤＣ６２の調製のための一般的手順＞
化合物７−１（２５０ｍｇ、２０７ｕｍｏｌ）とＢＩＣＹ−アルキン１７−６９−０７−Ｎ４４３（３６８ｍｇ、１８８ｕｍｏｌ）を、５０ｍＬの丸底フラスコに入れた。ＤＭＦ（５ｍＬ）を添加し、続いて、アスコルビン酸水溶液（１Ｍ、１．８８ｍＬ）とＣｕＳＯ４の水溶液（１Ｍ、５７０ｕＬ）を添加した。次いで、混合物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ８３９６−９−Ｐ１Ａ、生成物：ＲＴ＝１．０７分）は、ＢＩＣＹ−アルキンが完全に消費され、所望の質量を有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。反応混合物を濾過して、溶解していない物質を除去した。得られた濾液をｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって直接精製した。ＢＴ１７ＢＤＣ６２（２５３ｍｇ、４２％の収率）を白色固体として得た。
【０２０８】
［実施例９］
本発明による二環性ペプチドがリンカーの末端グルタリル基とペプチドの末端アミノの間のアミド形成によって、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）にカップリングする二環−薬物コンジュゲート（ＢＣＤ）を、図１５に示す反応スキームに従って調製した。反応スキームのステップは以下のように実施した。
【０２０９】
＜化合物３の調製のための一般的手順＞
【化２３】
2020502238.tif 000039
【０２１０】
ＤＣＭ（８０．００ｍＬ）およびＭｅＯＨ（４０．００ｍＬ）中の化合物２（７．００ｇ、１８．７０ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、暗所で、（４−アミノフェニル）メタノール（２．５３ｇ、２０．５６ｍｍｏｌ、１．１０当量）およびＥＥＤＱ（９．２５ｇ、３７．３９ｍｍｏｌ、２．００当量）を添加した。混合物を２５℃で８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物２が完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。得られた反応混合物を減圧下で濃縮して溶媒を除去し、残渣を得た。残渣を、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２０ｇ  ＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  シリカフラッシュカラム、０〜１０％のＭｅＯＨ／ＤＣＭを８５ｍＬ／分で溶出）によって精製した。化合物３（７．００ｇ、１４．６０ｍｍｏｌ、７８．０６％の収率）を白色固体として得た。
【０２１１】
＜化合物４の調製のための一般的手順＞
【化２４】
2020502238.tif 000040
【０２１２】
ＴＨＦ（２０．００ｍＬ）およびＤＣＭ（１０．００ｍＬ）中の化合物３（４．００ｇ、８．３４ｍｍｏｌ、１．００当量）および４−ニトロフェニルカルボノクロリデート（６．７２ｇ、３３．３６ｍｍｏｌ、４．００当量）の溶液に、ピリジン（２．６４ｇ、３３．３６ｍｍｏｌ、２．６９ｍＬ、４．００当量）を添加した。反応混合物を２５℃で５時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物３が完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。反応混合物を減圧下で濃縮して、残渣を得て、これを、フラッシュシリカゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２０ｇ  ＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  シリカフラッシュカラム、０〜２０％のＤＭ／ＭｅＯＨを８５ｍＬ／分で溶出）によって精製した。化合物４（２．２０ｇ、３．４１ｍｍｏｌ、４０．９２％の収率）を白色固体として得た。
【０２１３】
＜化合物５の調製のための一般的手順＞
【化２５】
2020502238.tif 000041
【０２１４】
ＤＭＦ（１０．００ｍＬ）中の化合物４（５００．００ｍｇ、７７５．５９ｕｍｏｌ、１．００当量）とＤＩＥＡ（１．００ｇ、７．７６ｍｍｏｌ、１．３５ｍＬ、１０．００当量）の混合物を、窒素下で、０℃で３０分間撹拌した。ＭＭＡＥ（４４５．４９ｍｇ、６２０．４７ｕｍｏｌ、０．８０当量）とＨＯＢｔ（１０４．８０ｍｇ、７７５．５９ｕｍｏｌ、１．００当量）を上記混合物に添加した。反応混合物を、窒素下で、０℃で１０分間撹拌し、３０℃でさらに１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物４が完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。得られた反応混合物を、フラッシュＣ１８ゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；３３０ｇ  ＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｃ１８フラッシュカラム、０〜５０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏを８５ｍＬ／分で溶出）によって直接精製した。化合物５（４００．００ｍｇ、３２６．９２ｕｍｏｌ、４２．１５％の収率）を白色固体として得た。
【０２１５】
＜化合物６の調製のための一般的手順＞
【化２６】
2020502238.tif 000042
【０２１６】
ＤＣＭ（３６．００ｍＬ）中の化合物５（４３０．００ｍｇ、３５１．４４ｕｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、ＴＦＡ（６．１６ｇ、５４．０３ｍｍｏｌ、４．００ｍＬ、１５３．７３当量）を添加し、混合物を２５℃で２時間撹拌した。次いで、混合物を減圧下で濃縮し、残渣を得て、これを、ＴＨＦ（１０．００ｍＬ）中に溶解させ、Ｋ２ＣＯ３（１．２１ｇ、８．７９ｍｍｏｌ、２５．００当量）をこの混合物に添加した。反応物を２５℃で１２時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳは、化合物５が完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。得られた反応混合物を濾過し、濾液を減圧下で濃縮して残渣を得て、これを、フラッシュＣ１８ゲルクロマトグラフィー（ＩＳＣＯ（登録商標）；１２０ｇ  ＳｅｐａＦｌａｓｈ（登録商標）  Ｃ１８フラッシュカラム、０〜５０％のＭｅＣＮ／Ｈ２Ｏを８５ｍＬ／分で溶出）によって精製した。化合物６（２９０．００ｍｇ、２５８．１４ｕｍｏｌ、７３．４５％の収率）を白色固体として得た。
【０２１７】
＜化合物７の調製のための一般的手順＞
【化２７】
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【０２１８】
（４００ｍｇ、３５６ｕｍｏｌ）を含有するバイアルに、窒素バルーンを使用してパージした。無水ＤＭＡ（５ｍＬ）を撹拌しながら添加し、溶液を氷水浴中で０℃まで冷却した。次いで、ＤＩＥＡ（１３０ｕＬ、７１２ｕｍｏｌ）を添加し、反応物を０℃で１０分間撹拌した。テトラヒドロピラン−２，６−ジオン（８１ｍｇ、７１２ｕｍｏｌ）を添加し、次いで、氷浴を除去した。反応物を２５℃で１時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ８３９６−４−Ｐ１Ａ、生成物：ＲＴ＝１．０８分）は、化合物６が完全に消費され、所望の質量を有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。混合物を５ｍＬの水で希釈し、次いで、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。化合物７−２（３３０ｍｇ、７５％の収率）を白色固体として得た。
【０２１９】
＜化合物８の調製のための一般的手順＞
【化２８】
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【０２２０】
無水ＤＭＡ（４．５ｍＬ）およびＤＣＭ（１．５ｍＬ）中の化合物７−２（３３０ｍｇ、２６７ｕｍｏｌ）を、窒素下で、氷浴を使用して、０℃で１０分間撹拌しながら、ＨＯＳｕ（９２ｍｇ、８００ｕｍｏｌ）に添加した。次いで、ＥＤＣＩ（１５４ｍｇ、８００ｕｍｏｌ）を、２５℃で１６時間さらに撹拌しながら、この混合物に添加した。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ８３９６−５−Ｐ１Ａ、生成物：ＲＴ＝１．１５分）は、化合物７−２が完全に消費され、所望の質量を有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。得られた反応混合物を５ｍＬの水で希釈し、次いで、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ（中性条件）によって精製した。化合物８（２５０ｍｇ、７０％の収率）を白色固体として得た。
【０２２１】
＜ＢＴ１７ＢＤＣ６８の調製のための一般的手順＞
ＤＭＡ（４ｍＬ）中にＢＩＣＹ−ＮＨ２  １７−６９−０７−Ｎ４５１（８０．０ｍｇ、３０ｕｍｏｌ）を含有した５０ｍＬの丸底フラスコを、窒素バルーンを使用してパージした。次いで、ＤＩＥＡ（２０ｕＬ、１１４ｕｍｏｌ）を、２５℃で１０分間撹拌しながら添加した。次いで、化合物８（４０ｍｇ、３０ｕｍｏｌ）を添加し、反応物を、正の窒素雰囲気下で、２５℃で１８時間撹拌した。ＬＣ−ＭＳ（ＥＳ６６３５−１２７−Ｐ１Ａ１、生成物：ＲＴ＝１．０６分）は、化合物８が完全に消費され、所望のＭＳを有する１つの主要なピークが検出されたことを示した。得られた反応混合物を、ｐｒｅｐ−ＨＰＬＣ（ＴＦＡ条件）によって精製した。ＢＴ１７ＢＤＣ６８（３３．９ｍｇ、２９％の収率）を白色固体として得た。
【０２２２】
［実施例１０］
上記で調製した二環性ペプチド−薬物コンジュゲートのインビトロでの結合親和性を、本明細書で以前に記載したように、ＭＴ１−ＭＭＰについて測定した。結果は以下の通りであった。
【表１６】
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【０２２３】
すべての場合に、二環性ペプチドの結合親和性は、ＭＭＡＥへのコンジュゲーション後に維持されることが理解され得る。
【０２２４】
［実施例１１］
マウスおよびヒトの血清中のＢＴ１７ＢＤＣ−５３の血漿安定性について研究した。マウスとヒトの血清の両方で、コンジュゲートが安定である（４μｍの濃度でＴ１／２が５０時間を超える）ことが分かった。この安定性は、ペプチドが３つのチオエーテル連結によって足場に連結する対応するコンジュゲートの安定性よりわずかに大きいようである。
【０２２５】
［実施例１２］
上記で調製した二環性ペプチド薬物コンジュゲートの腫瘍に対するインビボでの有効性を、以下のように評価した。
３７℃で、５％のＣＯ２と空気の雰囲気下で、１０％の熱不活性化ウシ胎仔血清を補充したＥＭＥＭ培地中の単層培養として、ＨＴ１０８０腫瘍細胞をインビトロで維持した。腫瘍細胞を、トリプシン−ＥＤＴＡ処理によって、週に２回、日常的に継代培養した。指数増殖期に増殖する細胞を採取し、腫瘍接種用に計数した。
【０２２６】
腫瘍形成のために、０．２ｍｌのＰＢＳ中のＨＴ１０８０腫瘍細胞（％×１０６）を、ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスの右脇腹に皮下接種した。平均腫瘍体積が１３４ｍｍ２に到達したら、３９頭の動物を無作為化した。
【０２２７】
２５ｍＭのヒスチジンと１０％のショ糖を含有するビヒクル緩衝液中に、ＢＤＣ化合物を、０．０３ｍｇ／ｍｌで配合した。配合物を、０．３、１、３および１０ｍｇ／ｋｇで、週に２回（ｂｉｗ）投与した。腫瘍体積と体重を、最初の投与から１４日まで測定した。結果を図１６〜２０に示す。
【０２２８】
結果は、試験したコンジュゲートの５つすべてが、強い用量依存腫瘍阻害を呈することを示す。３ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋｇの用量で、腫瘍が完全に根絶されたようであった。ＢＴ１７ＢＤＣ５３、６１および６８は、１０ｍｇ／ｋｇまで耐容性が良好であった。ＢＴ１７ＢＤＣ６２は、約５ｍｇ／ｋｇまで耐容性であった。ＢＴ１７ＢＤＣ５９は、３ｍｇ／ｋｇまで耐容性であった。このことは、ＢＴ１７ＢＤＣ５３、６１および６８におけるＮ末端Ｓａｒ１０スペーサーの存在が、コンジュゲートの全身毒性を低減することを示唆する。
【０２２９】
上記明細書で言及されたすべての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明について記載した態様および実施形態の種々の修正および変更は、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者にとって明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載したが、特許請求された本発明は、このような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことが理解されるべきである。実際に、当業者に明らかである本発明を実行するために記載された方式の種々の修正は、以下の請求項の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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