(57)【要約】  本発明は、高病原性ウイルス検出用マーカーおよびその用途に関し、より具体的には、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を含む高病原性ウイルス検出用マーカー、前記タンパク質変異体を測定する製剤を含む高病原性ウイルス検出用組成物およびこれを含む検出キット、前記タンパク質変異体を測定する段階を含む高病原性ウイルスの検出方法、６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたＰＢ１−Ｆ２タンパク質とＤＤＸ３の結合阻害剤を有効成分として含むインフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物、およびインフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス物質のスクリーニング方法に関する。本発明では、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質と前記ウイルスの高病原性間の相関関係およびその分子機序を最初に解明した結果、インフルエンザウイルスのＰＢ１−Ｆ２タンパク質配列で６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体は、高病原性ウイルスを検出するためのマーカーとして利用可能であり、前記変異体を測定することによって、高病原性のウイルスを有用に検出することができる。また、本発明で新しく解明したＰＢ１−Ｆ２タンパク質変異体によるウイルスの先天免疫反応回避機序は、抗ウイルス製剤の開発のための新しい理解を提供するものであり、本発明による抗ウイルス用組成物は、抗ウイルス治療製剤の開発に有用に利用され得る。【選択図】図１０
2020510682.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を含む、高病原性ウイルス検出用マーカー組成物。
【請求項２】
前記タンパク質変異体は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されている、請求項１に記載のマーカー組成物。
【請求項３】
前記タンパク質変異体は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のマーカー組成物。
【請求項４】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項１に記載のマーカー組成物。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列からなるＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を測定する製剤を含む、高病原性ウイルス検出用組成物。
【請求項６】
前記タンパク質変異体は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されている、請求項５に記載の検出用組成物。
【請求項７】
前記タンパク質変異体は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項６に記載の検出用組成物。
【請求項８】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項５に記載の検出用組成物。
【請求項９】
前記タンパク質変異体を測定するための製剤は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項５に記載の検出用組成物。
【請求項１０】
請求項５に記載の検出用組成物を含む、高病原性ウイルス検出キット。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を測定する段階を含む、高病原性ウイルス検出方法。
【請求項１２】
前記タンパク質変異体は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されている、請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記タンパク質変異体は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１５】
ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合阻害剤を有効成分として含む、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物であって、
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されている、組成物。
【請求項１６】
前記ＤＤＸ３は、配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記結合阻害剤は、核酸、化合物、微生物培養液または抽出物、天然物抽出物、ペプチド、基質類似体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、および抗体からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されている、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、細胞内インターフェロンβ（ＩＦＮβ）の生成を増加させる、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２１】
（ａ）インビトロ上で細胞に候補物質を処理する段階；
（ｂ）前記細胞でＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合を測定する段階；および
（ｃ）候補物質非処理群に比べて前記ＤＤＸ３とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合を減少させる物質をインフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス物質として選定する段階を含む、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス物質のスクリーニング方法であって、
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されている、スクリーニング方法。
【請求項２２】
前記候補物質は、核酸、化合物、微生物培養液または抽出物、天然物抽出物、ペプチド、基質類似体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、および抗体からなる群より選択される、請求項２１に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
前記核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、およびモルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）よりなる群から選択される、請求項２２に記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
前記（ｂ）段階は、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、免疫化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、および免疫蛍光染色法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）からなる群より選択される方法を利用して測定する、請求項２１に記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されている、請求項２１に記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項２５に記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合阻害剤を有効成分として含む抗ウイルス用組成物を個体に投与する段階を含む、インフルエンザＡウイルスの治療方法。
【請求項２８】
ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合阻害剤を有効成分として含む抗ウイルス用組成物の、インフルエンザＡウイルス治療用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、高病原性インフルエンザウイルス検出用マーカーおよびその用途に関し、より具体的には、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を含む高病原性ウイルス検出用マーカー、前記タンパク質変異体を測定する製剤を含む高病原性ウイルス検出用組成物およびこれを含む検出キット、前記タンパク質変異体を測定する段階を含む高病原性ウイルスの検出方法、６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたＰＢ１−Ｆ２タンパク質とＤＤＸ３の結合阻害剤を有効成分として含むインフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物、およびインフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス物質のスクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザＡウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ；ＩＡＶ）は、ヒトおよび動物の両方共を感染させることができる病原菌であって、１９１８年に５０００万人の犠牲者を出したスペインかぜを誘発したウイルスである。ＰＢ１−Ｆ２は、＋１  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅからＰＢ１遺伝子部位により暗号化されたインフルエンザウイルスの非構造タンパク質である。現在まで多様な研究を通じてＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、アポトーシス誘導および先天免疫反応阻害を含む多様な機能を有することが報告され、非常に高病原性のインフルエンザウイルスにおいて病原性に関連したウイルス性を示す重要な因子として知られている。前記タンパク質は、サイトカイン生成を阻害し、二次的バクテリア感染の免疫病理学を増加させ、マウスモデルでインフルエンザＡウイルスの感染中にウイルス消滅（ｖｉｒａｌ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ）を遅延させることによって発病に寄与すると報告されてきた。
【０００３】
インフルエンザウイルス感染に対する最初の防御機作のうち、第１型インターフェロン（ｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ）は、宿主の抗ウイルス免疫反応の重要な因子であり、適応免疫反応の調節子である。宿主がインフルエンザのようなウイルスまたは他の病原菌に感染した場合、先天免疫反応を誘導するＰＲＲｓ（ｐａｔｔｅｒｎ−ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）と知られた三つの主なタンパク質が病原菌のＰＡＭＰｓ（ｐａｔｈｏｇｅｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ）を認識する。このようなＰＲＲは、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、ＲＬＲｓ（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ−Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）、およびＮＬＲｓ（ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ−ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）であり、インフルエンザウイルスに感染した場合、ＲＩＧ−ＩがウイルスＲＮＡの主なセンサーとして作用してｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮの生成を誘導する。このような経路でＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）と他のリン酸化酵素との複合体の形成は、ｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮの生成誘導に必須なものであると知られている。
【０００４】
たとえＩＦＮシステムが強い抗ウイルス活性を有するとしても、インフルエンザウイルスもやはり宿主内でそれらの複製および増殖のためにＩＦＮ反応を弱化させることができるように進化してきた。例えば、Ｈ５Ｎ１鳥インフルエンザウイルスのような高病原性ウイルスのＮＳ１タンパク質は、ｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮに対する強い阻害効果を有し、またＩｆｎａｒ１−／−マウスで急激な好中球募集、深刻な肺損傷および急激な炎症性サイトカイン分泌を誘導することが報告されている（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００２；９９：１０７３６−１０７４１）。
【０００５】
本発明では、インフルエンザＡウイルス感染の発病機序で高病原性１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質の影響を調べてみるために、ウイルスの病毒性とＰＢ１−Ｆ２タンパク質間の相関関係を調査し、ｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ反応阻害と関連した分子的機序を解明しようとした。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、高病原性を示すインフルエンザＡウイルス１９１８株でＰＢ１−Ｆ２タンパク質が病毒性に及ぼす影響および相関関係を調査した結果、１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質配列上の６８番目および６９番目のアミノ酸がウイルスの低い安定性を媒介し、細胞内ＤＤＸ３との結合を通じて抗ウイルス反応を誘導するＩＦＮβの発現を阻害して、ウイルスの病毒性を増加させることを確認し、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質と前記ウイルスの高病原性間の相関関係およびその分子機序を最初に解明した結果、これに基づいて本発明を完成した。
【０００７】
そこで、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を含む、高病原性ウイルス検出用マーカー組成物を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は、前記タンパク質変異体を測定する製剤を含む、高病原性ウイルス検出用組成物および前記組成物を含む高病原性ウイルス検出キットを提供することを他の目的とする。
【０００９】
また、本発明は、前記タンパク質変異体を測定する段階を含む、高病原性ウイルス検出方法を提供することをさらに他の目的とする。
【００１０】
また、本発明は、ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合阻害剤を有効成分として含む、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物を提供することをさらに他の目的とする。
【００１１】
また、本発明は、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス物質のスクリーニング方法を提供することをさらに他の目的とする。
【００１２】
しかしながら、本発明が解決しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
前記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を含む、高病原性ウイルス検出用マーカー組成物を提供する。
【００１４】
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を測定する製剤を含む、高病原性ウイルス検出用組成物およびこれを含む検出キットを提供する。
【００１５】
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を測定する段階を含む、高病原性ウイルス検出方法を提供する。
【００１６】
本発明の一具現例として、前記タンパク質変異体は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されたものであってもよい。
【００１７】
本発明の他の具現例として、前記タンパク質変異体は、配列番号２のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００１８】
本発明のさらに他の具現例として、前記ウイルスは、インフルエンザウイルスであってもよい。
【００１９】
本発明のさらに他の具現例として、前記タンパク質変異体を測定する製剤は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体であってもよい。
【００２０】
また、本発明は、ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合阻害剤を有効成分として含む、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物を提供し、
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたものであってもよい。
【００２１】
本発明の一具現例として、前記ＤＤＸ３は、配列番号３のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００２２】
本発明の他の具現例として、前記結合阻害剤は、核酸、化合物、微生物培養液または抽出物、天然物抽出物、ペプチド、基質類似体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、および抗体より構成された群から選択されるいずれか一つのものであってもよい。
【００２３】
本発明のさらに他の具現例として、前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されたものであってもよい。
【００２４】
本発明のさらに他の具現例として、前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００２５】
本発明のさらに他の具現例として、前記組成物は、細胞内インターフェロンβ（ＩＦＮβ）の生成を増加させることができる。
【００２６】
また、本発明は、（ａ）インビトロ上で細胞に候補物質を処理する段階；
（ｂ）前記細胞でＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合を測定する段階；および
（ｃ）候補物質非処理群に比べて前記ＤＤＸ３とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合を減少させる物質をインフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス物質として選定する段階を含む、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス物質のスクリーニング方法を提供し、
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたものであってもよい。
【００２７】
本発明の一具現例として、前記候補物質は、核酸、化合物、微生物培養液または抽出物、天然物抽出物、ペプチド、基質類似体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、および抗体よりなる群から選択されるものであってもよい。
【００２８】
本発明の他の具現例として、前記核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、およびモルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）よりなる群から選択されるものであってもよい。
【００２９】
本発明のさらに他の具現例として、前記（ｂ）段階は、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、免疫化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、および免疫蛍光染色法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）よりなる群から選択される方法を利用して測定するものであってもよい。
【００３０】
また、ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合阻害剤を有効成分として含む抗ウイルス用組成物を個体に投与する段階を含むインフルエンザＡウイルスの治療方法を提供する。
【００３１】
また、本発明は、ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合阻害剤を有効成分として含む抗ウイルス用組成物のインフルエンザＡウイルス治療用途を提供する。
【発明の効果】
【００３２】
本発明者らは、インフルエンザＡウイルス感染の発病機序で高病原性の１９１８株と低い病原性を示すＰＲ８株を利用して１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質配列上の６８番目および６９番目のアミノ酸が前記ウイルスの低い安定性を媒介し、細胞内ＤＤＸ３との結合を通じて抗ウイルス反応を誘導するＩＦＮβの発現を抑制することによって、ウイルスの病毒性を増加させることを解明したところ、インフルエンザウイルスのＰＢ１−Ｆ２タンパク質配列で６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体は、高病原性ウイルスを検出するためのマーカーとして利用可能であり、前記変異体を測定することによって、高病原性のウイルスを有用に検出することができる。
【００３３】
また、本発明で新しく解明したＰＢ１−Ｆ２タンパク質変異体によるウイルスの先天免疫反応回避機序は、抗ウイルス製剤の開発のための新しい理解を提供するものであり、本発明による抗ウイルス用組成物は、抗ウイルス治療製剤の開発に有用に利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】図１は、Ａ５４９およびＵ９３７細胞にＰＲ８株（ＰＲ８）、ＰＲ８株において１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質でアミノ酸配列を変化させたウイルス（ＰＲ８−ＰＢ１−Ｆ２（１９１８））およびＰＢ１−Ｆ２タンパク質を欠損させたＰＲ８株（以下、ＰＲ８−ＰＢ１−Ｆ２（−）という）をそれぞれＭＯＩ  １または５で２４時間の間感染させた後、ウェスタンブロットを用いてＰＢ１−Ｆ２タンパク質の発現レベルを測定して、インフルエンザＡウイルス１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質（以下、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２）の低い安定性を確認した結果である。
【図２】図２ａおよび図２ｂは、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質がプロテアソーム依存的経路により分解されることを確認した結果であって、図２ａは、Ａ５４９細胞にそれぞれＦｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ  ＰＲ８または１９１８  ＰＢ１−Ｆ２発現プラスミドをトランスフェクションし、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２を処理した後、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを用いてＰＢ１−Ｆ２  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルを測定した結果であり、図２ｂは、ユビキチン化分析を通じてＰＢ１−Ｆ２タンパク質がユビキチン−プロテアソームシステムを通じて分解されることを確認した結果である。
【図３】図３ａ〜図３ｄは、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質安定性の分子的決定因子を解明した結果であって、図３ａは、ＰＲ８および１９１８  ＰＢ１−Ｆ２の多様な変異プラスミドを示すものであり、図３ｂは、Ａ５４９細胞にＰＢ１−Ｆ２キメラ変異体であるＰＲ８−Ｎ＋１９１８−Ｃおよび１９１８−Ｎ＋ＰＲ８−Ｃをそれぞれトランスフェクションした後、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを用いてＰＢ１−Ｆ２  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルを測定した結果であり、図３ｃは、ＰＲ８  ＰＢ１−Ｆ２配列の一部アミノ酸を１９１８  ＰＢ１−Ｆ２で置換して作製したｃ−末端の点突然変異体の発現プラスミドを細胞にトランスフェクションした後、図３ｂと同じ方法でＰＢ１−Ｆ２  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルを測定した結果であり、図３ｄは、ＰＲ８および１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質骨格に６８および６９番目のアミノ酸を互いに代替してクローニングした後、それぞれのプラスミドを細胞にトランスフェクションし、図３ｂと同じ方法でＰＢ１−Ｆ２  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルを測定した結果である。
【図４】図４ａ〜図４ｄは、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質によりＩＦＮβ誘導が阻害されることを確認した結果であって、図４ａは、ＰＲ８および１９１８  ＰＢ１−Ｆ２発現プラスミドをトランスフェクションした細胞でＮＦ−κＢルシフェラーゼ活性および炎症誘発サイトカイン（ＩＬ６、ＩＬ１β、およびＩＬ３２）のｍＲＮＡ発現レベルを測定した結果であり、図４ｂは、ＰＲ８および１９１８  ＰＢ１−Ｆ２発現プラスミドをトランスフェクションしたＡ５４９およびＵ９３７細胞でｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲおよびｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲを通じてＩＦＮβｍＲＮＡの発現レベルを測定した結果であり、図４ｃは、Ｕ９３７細胞でルシフェラーゼレポータ分析を通じてＩＦＮβのプロモーター活性を測定した結果であり、図４ｄは、Ａ５４９およびＵ９３７細胞にＰＲ８および１９１８株のインフルエンザＡウイルスをＭＯＩ  １で感染させた後、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを用いて細胞内ＩＦＮβｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルを測定した結果である。
【図５】図５ａおよび図５ｂは、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質のプロテアソーム依存的分解とｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ誘導抑制の相関関係を解明した結果であって、図５ａは、ＰＲ８および１９１８  ＰＢ１−Ｆ２発現プラスミドをトランスフェクションしたＡ５４９およびＵ９３７細胞でｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを用いてプロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２の処理有無によるＩＦＮβｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルを測定した結果であり、図５ｂは、ＰＲ８  ＰＢ１−Ｆ２配列の６８および６９番目のアミノ酸を１９１８  ＰＢ１−Ｆ２のもので置換して作製した突然変異体発現プラスミドを細胞にトランスフェクションした後、ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを用いてＩＦＮβｍＲＮＡおよびタンパク質発現レベルを測定した結果である。
【図６】図６ａ〜図６ｆは、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２の６８および６９番目のアミノ酸がインフルエンザＡウイルス１９１８株の病原性に及ぼす影響を解明した結果であって、図６ａおよび図６ｂは、マウスにＰＲ８および１９１８株のインフルエンザウイルスをそれぞれ５×１０２  ＰＦＵおよび１×１０３  ＰＦＵで鼻腔投与した後、１４日間マウスの体重変化および生存率を測定した結果であり、図６ｃは、ＰＲ８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８および６９番目のアミノ酸を１９１８  ＰＢ１−Ｆ２のもので置換した変異インフルエンザウイルスをマウスに感染させた後、体重および生存率を測定した結果であり、図６ｄ〜図６ｆは、図６ｃと同じ変異インフルエンザウイルスを多様な用量（６×１０２、８×１０２、および１×１０３  ＰＦＵ）で感染させた後、体重および生存率を測定した結果である。
【図７】図７ａ〜図７ｄは、インフルエンザＡウイルス感染モデルで１９１８  ＰＢ１−Ｆ２によるＩＦＮβ誘導阻害を確認した結果であって、図７ａは、ＰＲ８、１９１８、およびＰＢ１−Ｆ２欠損１９１８（ＰＢ１−Ｆ２（−））ウイルスを５×１０２  ＰＦＵでマウスに感染させ、２日後にウェスタンブロットを用いてマウス肺組織でウイルスタンパク質であるＰＢ１−Ｆ２、ＮＰ（ｎｅｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）、およびＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）の発現レベルを測定した結果であり、図７ｂは、図７ａの各グループマウスの肺組織粉砕液を利用したｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙを通じて前記各インフルエンザＡウイルスの力価を測定した結果であり、図７ｃは、図７ａの各グループマウスの肺組織を利用してＲＴ−ＰＣＲを実施してＩＦＮβｍＲＮＡの発現レベルを測定した結果であり、図７ｄは、ＥＬＩＳＡを通じて図７ａの各グループマウスの肺で分泌されたＩＦＮβタンパク質水準を測定した結果である。
【図８】図８ａ〜図８ｆは、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２とＤＤＸ３の結合を介したＩＦＮβ誘導阻害機序を解明した結果であって、図８ａは、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２と相互作用するものとして導き出されたタンパク質のうちウイルス感染に関連した機能を有するタンパク質を示すものであり、図８ｂは、Ａ５４９細胞にＤＤＸ３発現プラスミド（ＨＡ−ｔａｇｇｅｄ  ＤＤＸ３）および、ＰＲ８または１９１８のＰＢ１−Ｆ２発現プラスミド（Ｆｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ  ＰＢ１−Ｆ２）をトランスフェクションした後、ＩＰを実施したり、ＰＲ８  ＰＢ１−Ｆ２の６８および６９番目のアミノ酸を１９１８  ＰＢ１−Ｆ２のもので置換させて作製した変異体（Ｉ６８Ｔ、Ｌ６９Ｐ、およびＩ６８Ｔ／Ｌ６９Ｐ）発現プラスミドをトランスフェクションした後、ＭＧ１３２処理条件で１９１８のＰＢ１−Ｆ２とＤＤＸ３タンパク質の結合を確認した結果であり、図８ｃは、Ａ５４９細胞をそれぞれＰＲ８、１９１８、およびＰＲ８−ＰＢ１−Ｆ２（−）ウイルスで感染させた後、ウェスタンブロットを用いてＤＤＸ３タンパク質の発現レベルを測定した結果であり、図８ｄは、マウスに前記各インフルエンザＡウイルスを感染させた後、肺組織でＤＤＸ３タンパク質の発現レベルを測定した結果であり、図８ｅは、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２によるＩＲＦ３の核内への移動有無を測定した結果であり、図８ｆは、Ａ５４９細胞にＰＲ８および１９１８のＰＢ１−Ｆ２発現プラスミドおよびＤＤＸ３発現プラスミドをトランスフェクションした後、ＩＦＮβｍＲＮＡ発現変化を分析した結果である。
【図９】図９ａ〜図９ｄは、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルで組換えＤＤＸ３処理による１９１８  ＰＢ１−Ｆ２インフルエンザウイルスの病原性減少を確認した結果であって、図９ａは、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験過程を絵で示すものであり、図９ｂは、１９１８インフルエンザＡウイルスを感染させたマウスモデルで組換えＤＤＸ３タンパク質投与後２週間の生存率を測定した結果であり、図９ｃは、前記マウスモデルの肺組織で１９１８インフルエンザＡウイルスの力価を測定した結果であり、図９ｄは、前記マウスモデルの肺組織でＩＦＮβｍＲＮＡの発現レベルを測定した結果である。
【図１０】図１０は、本発明によるインフルエンザＡウイルス１９１８株の先天免疫反応回避を介した高病原性誘発機序を総合して示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明者らは、高病原性を示すインフルエンザＡウイルス１９１８株においてＰＢ１−Ｆ２タンパク質が病毒性に及ぼす影響および相関関係を調査した結果、１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質配列上の６８番目および６９番目のアミノ酸が前記ウイルスの低い安定性をもたらし、細胞内ＤＤＸ３との結合を通じて抗ウイルス反応を誘導するＩＦＮβの発現を阻害することによってウイルスの病毒性を増加させることを確認し、組換えＤＤＸ３タンパク質を１９１８  ＰＢ１−Ｆ２インフルエンザウイルスが感染したマウスに注入して、ＩＦＮβの発現が回復され、生存率の増加を通じてウイルスの病原性が減少することを確認した。これを通じて、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質と前記ウイルスの高病原性間の相関関係およびその分子機序を最初に解明したところ、これに基づいて本発明を完成した。
【００３６】
そこで、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を含む、高病原性ウイルス検出用マーカー組成物を提供する。
【００３７】
本発明において、前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、好ましくは＋１  ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅからＰＢ１遺伝子部位により暗号化されたインフルエンザウイルスの非構造タンパク質である。前記タンパク質は、ＣＤ８  Ｔ細胞および肺胞マクロファージでミトコンドリアに結合して、シトクロムｃの放出を媒介してアポトーシスを誘導すると知られており、１次的ウイルスおよび２次的バクテリア感染時に深刻性を増加させると報告されたことがあり、インフルエンザウイルスで高病原性と関連があることが報告された。これより、本発明の実施例では、インフルエンザＡウイルス１９１８株の高病原性に対してＰＢ１−Ｆ２タンパク質が及ぼす影響を調べてみるために、前記１９１８株および低病原性のＰＲ８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質を比較分析することによって、高病原性とＰＢ１−Ｆ２の相関関係およびその分子機序を最初に解明した。
【００３８】
本発明の一実施例では、低病原性のインフルエンザＡウイルスＰＲ８株と比較して高病原性を示す１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質が顕著に低い安定性を有し、これは、ユビキチン−プロテアソームシステムを介した速いタンパク質分解により起こることを確認した（実施例２および３参照）。
【００３９】
本発明の他の実施例では、高病原性の１９１８株由来ＰＢ１−Ｆ２タンパク質だけで分解が誘導される原因を調べてみるために、アミノ酸を置換させて作製した多様なＰＢ１−Ｆ２タンパク質変異体を利用してＰＢ１−Ｆ２タンパク質の発現様相を分析した結果、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質のアミノ酸配列上で６８および６９番目のアミノ酸が前記タンパク質の安定性に影響を及ぼすことを確認した（実施例４参照）。
【００４０】
本発明のさらに他の実施例では、インフルエンザＡウイルス１９１８の感染時にＰＢ１−Ｆ２タンパク質の不安定性が宿主の防御システムに及ぼす影響を調べてみるために、先天免疫反応でウイルスに対する防御に大変重要な役割をするｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ誘導に対するＰＢ１−Ｆ２タンパク質の影響を分析した。その結果、ＰＲ８株とは異なり、１９１８株ではＰＢ１−Ｆ２によりＩＦＮβの発現が抑制され、そのプロモーター活性も阻害されることを確認した（実施例５参照）。また、このような現象は、プロテアソーム依存的分解を阻害したときに現れず、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質で不安定性を決定するものと確認された６８および６９番目のアミノ酸がｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ誘導阻害反応に影響を及ぼすことを確認することによって、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質のプロテアソーム依存的分解を介した不安定性とｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ誘導阻害反応間に相関関係があることを確認した（実施例６参照）。
【００４１】
本発明のさらに他の実施例では、ＰＲ８株および１９１８株のインフルエンザウイルスをそれぞれ感染させたマウスモデルで１９１８株感染時に高い病毒性が誘発されることを確認し、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８および／または６９番目のアミノ酸を置換させて作製したタンパク質変異体を利用してＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８および６９番目位置のアミノ酸がインフルエンザＡウイルス１９１８株の高い病原性に寄与することを確認した（実施例７参照）。
【００４２】
本発明のさらに他の実施例では、インフルエンザＡウイルス感染モデルで１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質がＩＦＮβ誘導を阻害し、結局、ウイルス消滅反応が正確に起こらないため、ウイルス力価が高く維持されることが分かった（実施例８参照）。
【００４３】
前記のような本発明の実施例を通じてＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質、好ましくは１９１８株と同一にそれぞれスレオニンおよびプロリンで置換されたＰＢ１−Ｆ２タンパク質変異体を高病原性ウイルス検出用マーカーとして利用することができ、前記変異体を測定して高病原性ウイルス検出用途に活用することができる。
【００４４】
したがって、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を測定する製剤を含む、高病原性ウイルス検出用組成物、および前記組成物を含む高病原性ウイルス検出キットを提供する。
【００４５】
本発明において、前記タンパク質変異体は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されたものであってもよく、配列番号２のアミノ酸からなるものであってもよい。
【００４６】
本発明において、前記ウイルスは、好ましくはインフルエンザウイルスであってもよいが、これに制限されるものではない。
【００４７】
本発明において、前記タンパク質変異体を測定する製剤は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体であってもよいが、これに制限されるものではない。
【００４８】
本発明で使用される用語「抗体」は、免疫学的に特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含み、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を全部含む。また、前記抗体は、キメラ性抗体（例えば、ヒト化ミュリン抗体）および異種結合抗体（例えば、二重特異性抗体）のような遺伝工学により生産された形態を含む。
【００４９】
本発明の検出キットは、分析方法に適合した一種類またはそれ以上の他の構成成分の組成物、溶液または装置から構成される。
【００５０】
また、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を測定する段階を含む、高病原性ウイルス検出方法を提供する。
【００５１】
本発明のさらに他の実施例では、１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質によるＩＦＮβ誘導抑制反応が前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質と細胞内ＤＤＸ３タンパク質間の結合を通じてＤＤＸ３の機能を阻害することによって起こり（実施例９参照）、１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質が存在する場合にも、組換えＤＤＸ３タンパク質を処理する場合、ＩＦＮβ誘導抑制が回復され、これを通じて、ウイルス消滅反応が誘導されることを確認した（実施例１０参照）。
【００５２】
したがって、１９１８株のように６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニンおよびプロリンで置換されたＰＢ１−Ｆ２タンパク質および細胞内ＤＤＸ３の結合を抑制することによって、高病原性インフルエンザＡウイルスの増殖を阻害するのに利用することができる。
【００５３】
よって、本発明の他の様態として、本発明は、ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合阻害剤を有効成分として含む、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物を提供し、前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたものであってもよい。
【００５４】
本発明において、前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されたものであってもよく、配列番号２のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５５】
本発明で使用される用語「抗ウイルス」とは、体内でウイルスの増殖を阻害して、体内に侵入したウイルスの作用を弱くしたり消滅させることを意味し、より詳細には、ウイルスの核酸合成過程、遺伝子発現過程、またはウイルス複製過程などを阻害することによって、ウイルスの増殖を阻害することを意味し、本発明では、インフルエンザＡウイルス、より好ましくはインフルエンザＡウイルス１９１８株（Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１））を対象とする。
【００５６】
前記ＤＤＸ３は、細胞内で多様な機能をするＤＥＡＤ  ｂｏｘファミリーＲＮＡヘリカーゼであって、遺伝子発現の色々な段階、すなわち転写、核およびミトコンドリアｍＲＮＡの成熟、翻訳開始、リボソームおよびスプライソソームの再配列などに関与し、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）ＲＮＡ複製に関与し、ＨＢＶ感染による肝臓癌で発現が減少していると報告されたことがあり、腫瘍抑制タンパク質として機能することが知られている。また、ＴＢＫ１（ＴＡＮＫ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｎａｓｅ  １）およびＩκＢＫε（Ｉκ−Ｂ  ｋｉｎａｓｅ−ｅｐｓｉｌｏｎ）依存的ＩＲＦ３活性化によるＩＦＮβ誘導に関与すると知られている。前記ＤＤＸ３タンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５７】
本発明において、前記結合阻害剤は、核酸、化合物、微生物培養液または抽出物、天然物抽出物、ペプチド、基質類似体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、および抗体から構成された群から選択されるいずれか一つであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【００５８】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、（ａ）インビトロ上で細胞に候補物質を処理する段階；
（ｂ）前記細胞でＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合を測定する段階；および
（ｃ）候補物質非処理群に比べて前記ＤＤＸ３とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合を減少させる物質をインフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス物質として選定する段階を含む、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス物質のスクリーニング方法を提供し、前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたものであってもよい。
【００５９】
本発明において、前記候補物質は、核酸、化合物、微生物培養液または抽出物、天然物抽出物、ペプチド、基質類似体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、および抗体よりなる群から選択されるものであってもよく、前記核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、およびモルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）よりなる群から選択されるものであってもよいが、これらに制限されるものではない。
【００６０】
前記（ｂ）段階でＤＤＸ３とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合を測定する段階は、ウェスタンブロッティング、免疫沈降法、免疫化学染色法、および免疫蛍光染色法よりなる群から選択される方法を利用して行われ得るが、これに制限されるものではない。
【００６１】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００６２】
［実施例１．実験準備および実験方法］
（１−１．細胞培養）
Ａ５４９および２９３Ｔ細胞は、熱処理して不活性化させた１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）が添加されたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）培地で３７℃および５％ＣＯ２条件下で培養した。Ｕ９３７細胞は、前記細胞と同じ条件で１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンが添加されたＲＰＭＩ培地（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）で培養した。トランスフェクションは、製造社のプロトコルによってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用して行った。
【００６３】
（１−２．プラスミド作製）
ＰＲ８  ＰＢ１−Ｆ２および１９１８  ＰＢ１−Ｆ２の発現プラスミドは、ＥｃｏＲ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限酵素部位を利用してｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＰＣＲを通じてクローニングした。キメラ変異体、すなわちＰＲ８株由来ＰＢ１−Ｆ２のＮ末端ドメインおよび１９１８株のＣ末端ドメイン；および１９１８株由来ＰＢ１−Ｆ２のＮ末端およびＰＲ８株のＣ末端ドメイン変異体は、ＰＣＲで増幅させて、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングした。これに加えて、アミノ酸置換を介したＰＲ８由来ＰＢ１−Ｆ２の変異体（Ｒ５９Ｋ、Ｒ６０Ｑ、Ｒ５９Ｋ／Ｒ６０Ｑ、Ｒ５９Ｋ／Ｒ６０Ｑ／Ｎ６６Ｓ、Ｒ５９Ｋ／Ｒ６０Ｑ／Ｎ６６Ｓ／Ｉ６８Ｔ、Ｒ５９Ｋ／Ｒ６０Ｑ／Ｎ６６Ｓ／Ｉ６８Ｔ／Ｌ６９Ｐ）は、ＰＣＲで増幅した後、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングした。本実験で使用したプライマー配列は、下記表１に示した。また、ＤＤＸ３発現プラスミドは、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩおよびＸｈｏ  Ｉ制限酵素部位を利用してｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターにクローニングし、ＩＲＦ３およびＴＬＲ３発現ベクターは、延世大学校の他の研究チームから提供されて使用した。
【００６４】
【表１】
2020510682.tif 000003
【００６５】
（１−３．抗体および試薬）
ａｎｔｉ−ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体、ａｎｔｉ−ＨＡ，およびａｎｔｉ−β−ａｃｔｉｎ抗体は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で購入し、Ｌａｍｉｎ  Ａ／Ｃ抗体は、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）で購入して使用した。ウイルスＰＢ１−Ｆ２タンパク質検出のためのマウスポリクローナル抗体は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現させた全長配列の組換えＰＢ１−Ｆ２タンパク質を利用して製造した。ＤＤＸ３抗体、Ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ、およびａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ  ＩｇＧ  ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で購入し、Ａｎｔｉ−ＮＰ抗体は、ＮＰタンパク質で免疫させたウサギ（ＬａｂＦｒｏｎｔｉｅｒ）から得た。本実施例で使用したＭＧ１３２およびＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）は、それぞれＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＩｎｖｉｖｏＧｅｎで購入した。
【００６６】
（１−４．インフルエンザウイルス）
Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）ウイルス（ＩＡＶ（ＰＲ８））、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質を欠損させたウイルス（ＩＡＶ  ＰＢ１−Ｆ２（−））、または、ＰＲ８ウイルス骨格でＡ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１）ウイルス（ＩＡＶ（１９１８））のＰＢ１−Ｆ２タンパク質でアミノ酸配列を置換させたウイルスをインビトロおよびインビボ実験で利用した。部位特異的変異を利用してＰＢ１−Ｆ２変異ウイルスを製造するために、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）のＰＢ１−Ｆ２タンパク質内６８Ｉｌｅ（ＡＴＣ）または６９Ｌｅｕ（ＣＴＧ）残基をそれぞれＴｈｒ（ＡＣＣ）およびＰｒｏ（ＣＣＧ）で置換した。変異されたＰＢ１−Ｆ２タンパク質を発現する組換えウイルスを得るために、逆遺伝学技術を利用した。簡単に、野生型の遺伝子部位を暗号化する７個のｃＤＮＡと一つの変異されたＰＢ１部位をｐＨＷ２０００ベクターにクローニングし、２９３Ｔ細胞に共にトランスフェクションした。３日後、上澄み液を回収して、プラークアッセイを実施した。精製したプラークは、ウイルスを増幅させるためにＭＤＣＫ細胞に接種した。
【００６７】
（１−５．インフルエンザウイルス感染）
６〜８週齢の雌性Ｂａｌｂ／ｃマウスを利用して、麻酔したマウスにインフルエンザウイルスを５０μｌの量で鼻腔を通じて感染させた。本動物実験は、建国大学校の実験動物運営委員会の承認を受けて進めた。細胞内インフルエンザウイルス感染のためには、Ａ５４９およびＵ９３７細胞をＰＢＳで洗浄し、インフルエンザウイルスをＭＯＩ  １で感染させた。２４時間後、細胞を回収し、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロット分析を実施した。
【００６８】
（１−６．リアルタイムＰＣＲ）
細胞およびマウス組織にＴｒｉｚｏｌを処理して溶解させて全ＲＮＡを抽出した。前記抽出されたＲＮＡ  ２μｇおよびＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（ｉＮｔＲＯＮ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）を利用して最終量が２０μｌになるように反応溶液を製造してｃＤＮＡを合成し、これを鋳型としてＰＣＲを実施した。反応条件は、下記条件、すなわち１次変性９４℃で５分間実行後、９４℃（３０秒）、５５〜６０℃（３０秒）、および７２℃（３０秒）で２５〜３０サイクル反復、および最終延長過程７２℃で５分間実施して増幅させた。本実験で使用したプライマー配列は、下記表２に示した。定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を利用して行い、ＰＣＲ増幅は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ７５００）ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ装置を利用した。相対的なｍＲＮＡ発現量の定量的分析は、ΔΔＣｔ方法を利用して行い、結果は、ｃａｌｉｂｒａｔｏｒ（ＲＱ＝２−ΔΔＣｔ）に対する相対的なｎ乗差異で示した。
【００６９】
【表２】
2020510682.tif 000004
【００７０】
（１−７．ウェスタンブロット）
細胞にｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．５，１％ＮＰ４０およびタンパク質分解酵素カクテル）を処理し、遠心分離して、細胞内タンパク質が溶出された上澄み液を得た。５０μｇのタンパク質を１２〜１５％のアクリルアミドゲル上にローディングした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを実施して、タンパク質がサイズ別に分離されるようにした後、ウェスタンブロットを実施した。化学的発光を介したタンパク質検出は、ＥＣＬ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を利用し、Ｂｉｏ−Ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎａｌｙｚｅｒ（ＬＡＳ−４０００，Ｆｕｊｉ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を利用して標的タンパク質の発現レベルを確認した。
【００７１】
（１−８．ルシフェラーゼレポータ分析法）
細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を利用してトランスフェクションを実施し、４８時間後、ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を利用してルシフェラーゼ活性を測定した。すべてのサンプルに対してβ−ガラクトシダーゼの活性を測定して結果を補正し、実験は、独立して、３回実施して平均±標準偏差値で示した。
【００７２】
（１−９．ＩＦＮβ含量の測定）
マウスの肺組織粉砕液を１０，０００×ｇで５分間遠心分離して上澄み液を回収し、前記上澄み液を利用して製造元のプロトコルに従ってＩＦＮβ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ）を利用してＩＦＮβタンパク質水準を測定した。
【００７３】
（１−１０．タンパク質発現プラスミドの作製）
ＬｙｓＲＳ−Ｒ９−ＤＤＸ３を暗号化するｐＧＥ−ＬｙｓＲＳ−Ｒ９−ＤＤＸ３の発現プラスミドは、Ｔ７プロモーター−ＬｙｓＲＳ−ＴＥＶタンパク質分解酵素認識配列−ｍｕｌｔｉｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ（ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ）およびヒスチジンｔａｇから構成されたｐＧＥ−ＬｙｓＲＳ−４ベクターを利用して作製した。ＬｙｓＲＳ−Ｒ９−ＤＤＸ３遺伝子は、下記表３のプライマー配列を利用してＰＣＲで増幅させ、増幅産物は、ＫｐｎＩ／ＳａｌＩで切断して、ｐＧＥ−ＬｙｓＲＳ−４のＫｐｎＩ／ＳａｌＩサイトに導入して作製した。
【００７４】
【表３】
2020510682.tif 000005
【００７５】
［実施例２．インフルエンザＡウイルス１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質安定性の分析］
多様な研究を通じてインフルエンザウイルスのＰＢ１−Ｆ２タンパク質が多様な機能を有していることが知られて来ており、最近には、１９１８流行性インフルエンザの高い死亡率が１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質と関連があることが報告されたことがある。これより、本実施例では、１９１８インフルエンザウイルスＰＢ１−Ｆ２タンパク質の分子および機能的特性を調べてみるために、まず、Ａ／Ｂｒｅｖｉｇ  Ｍｉｓｓｉｏｎ／１／１９１８（Ｈ１Ｎ１）（以下、１９１８株という）とＡ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）（以下、ＰＲ８株という）インフルエンザウイルスのＰＢ１−Ｆ２タンパク質を比較分析した。
【００７６】
このために、Ａ５４９およびＵ９３７細胞を前記各インフルエンザウイルス、すなわちＰＲ８株（ＰＲ８）、ＰＲ８株において１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質でアミノ酸配列を変化させたウイルス（ＰＲ８−ＰＢ１−Ｆ２（１９１８））およびＰＢ１−Ｆ２タンパク質を欠損させたＰＲ８株（ＰＲ８−ＰＢ１−Ｆ２（−））をＭＯＩ  １または５で２４時間の間感染させた後、細胞でウェスタンブロットを用いてＰＢ１−Ｆ２タンパク質の発現様相を観察した。その結果、図１に示されたように、ＰＲ８のＰＢ１−Ｆ２タンパク質は発現する反面、１９１８のＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、検出されないことを確認した。このような結果を通じて、ＰＲ８株と比較して１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質安定性が低いことが分かった。
【００７７】
［実施例３．プロテアソーム依存的経路による１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質分解確認］
前記実施例２の結果に基づいて、ＰＲ８株と１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質発現様相に違いが現れる理由が、プロテアソーム媒介タンパク質分解によるのかを調べてみるために、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２を処理した条件でＰＢ１−Ｆ２タンパク質の発現様相を観察した。
【００７８】
より具体的に、Ａ５４９細胞にＰＲ８株および１９１８株のＦｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ  ＰＢ１−Ｆ２発現プラスミドをそれぞれトランスフェクションした後、ＭＧ１３２を６時間の間処理して細胞を回収して、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを用いてＰＢ１−Ｆ２  ｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルを分析した。その結果、図２ａに示されたように、ＭＧ１３２を処理するか処理しない場合、いずれも１９１８  ＰＢ１−Ｆ２のｍＲＮＡが検出された反面、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、ＭＧ１３２が処理された場合にのみ発現することを確認した。このような結果を通じて１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の低い安定性がプロテアソーム依存的経路と関連があることが分かった。
【００７９】
ユビキチン−プロテアソーム系は、タンパク質分解を誘導し、多くのタンパク質の機能を調節すると知られている。ＰＢ１−Ｆ２タンパク質が前記ユビキチン−プロテアソーム系により分解されるかを確認するために、ユビキチン化アッセイを実施した。その結果、図２ｂに示されたように、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、ユビキチン依存的プロテアソーム経路を通じて分解されることが分かった。
【００８０】
［実施例４．１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質安定性の分子的決定因子の解明］
前記実施例２および３の結果に基づいて、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の安定性を決定する分子的因子を解明するために、ＰＲ８および１９１８  ＰＢ１−Ｆ２の多様な変異プラスミドを作製し、図３ａに示した。
【００８１】
より具体的には、Ａ５４９細胞に図３ａに示したＰＢ１−Ｆ２キメラ変異体であるＰＲ８−Ｎ＋１９１８−Ｃおよび１９１８−Ｎ＋ＰＲ８−Ｃをそれぞれトランスフェクションした後、前記実施例３の方法と同一にＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを実施して、ＰＢ１−Ｆ２のｍＲＮＡおよびタンパク質の発現レベルを測定した。その結果、図３ｂに示すように、プロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２が処理されない場合、ＰＲ８−Ｎ＋１９１８−Ｃをトランスフェクションした細胞でＰＢ１−Ｆ２タンパク質が発現されず、これを通じてＰＢ１−Ｆ２のＣ−末端部分に前記タンパク質の安定性を決定する部位が存在することが分かった。
【００８２】
次に、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の安定性決定部位をより詳しく調べてみるために、ＰＲ８  ＰＢ１−Ｆ２配列の一部のアミノ酸を１９１８  ＰＢ１−Ｆ２で置換する方法を利用してＣ末端の点突然変異体を作製した後、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを実施した。その結果、図３ｃに示したように、ＭＧ１３２が処理されない条件でＲ５９Ｋ／Ｒ６０Ｑ／Ｎ６６Ｓ変異体を導入させた場合には、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質が発現する反面、Ｒ５９Ｋ／Ｒ６０Ｑ／Ｎ６６Ｓ／Ｉ６８Ｔ変異体およびＲ５９Ｋ／Ｒ６０Ｑ／Ｎ６６Ｓ／Ｉ６８Ｔ／Ｌ６９Ｐ変異体を導入させた場合には、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質が発現しないことを観察した。これを通じて、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８および６９番目の位置が前記タンパク質の安定性に大変重要であることが分かった。
【００８３】
さらに、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８および６９番目のアミノ酸の位置が前記タンパク質の不安定性を決定する因子であることを再び検証するために、ＰＲ８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質上で６８および６９番目のアミノ酸を１９１８株由来のＰＢ１−Ｆ２に置き換え、またその逆の置き換えも行って、それぞれクローニングした後、それぞれのプラスミドを細胞にトランスフェクションし、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを実施した。その結果、図３ｄに示したように、ＭＧ１３２が処理されていない条件で６８、６９番目のアミノ酸いずれかを置換した場合、および６８と６９番目のアミノ酸の両方を置換した場合、ＰＲ８株骨格の場合、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の発現が阻害され、１９１８株骨格の場合、前記タンパク質発現が増加することを確認した。これを通じて、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の安定性が６８および６９番目のアミノ酸に依存的であることを分かった。
【００８４】
さらに、各ＰＢ１−Ｆ２クローンの細胞内局在を分析した結果、ＰＲ８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、一次的にミトコンドリアに局在する反面、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、細胞質に広がっているか、核に存在した。したがって、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８および６９番目のアミノ酸は、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の細胞内局在を決定するのに重要であることが分かった。前記結果は、Ｉｌｅ６８およびＬｅｕ６９がＰＢ１−Ｆ２タンパク質の安定性を決定する分子的因子であることを意味するものである。
【００８５】
［実施例５．１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質によるＩＦＮβ分泌阻害の確認］
宿主で１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の不安定性が及ぼす影響を調べてみるために、炎症誘発サイトカインのｍＲＮＡ発現およびＮＦ−ｋＢルシフェラーゼ活性を分析した。その結果、図４ａに示したように、ＰＲ８と１９１８株間のＰＢ１−Ｆ２タンパク質による差異は大きくないことを確認した。
【００８６】
先天免疫反応体系の重要な構成要素であるｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ反応は、ウイルス病原体に対する防御に大変重要であると知られている。例えば、多くの研究を通じてインフルエンザ感染に対する宿主の防御体系でｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮが大変重要な役割をすることが報告されてきた。そこで、本発明者らは、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質によりＩＦＮβ誘導が影響を受けるかを検証するために、Ａ５４９およびＵ９３７細胞にそれぞれＰＲ８または１９１８株のＰＢ１−Ｆ２タンパク質を発現するプラスミドをトランスフェクションした後、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。
【００８７】
その結果、図４ｂに示したように、二種類の細胞の両方で１９１８  ＰＢ１−Ｆ２の場合、ＰＲ８株と対照的に、細胞でＩＦＮβ誘導を強く阻害することを観察した。また、図４ｃから明らかなように、Ｕ９３７細胞にＩＦＮβルシフェラーゼレポータプラスミドと各ＰＢ１−Ｆ２またはＮＳ１発現プラスミドを共にトランスフェクションし、細胞を回収する１２時間前にｐｏｌｙＩ：Ｃを処理した後、ルシフェラーゼ分析を実施した結果、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２によりＩＦＮβプロモーターの活性が阻害されることを確認した。
【００８８】
前記結果に基づいて実際にインフルエンザウイルスに感染した細胞で１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の発現がＩＦＮβ遺伝子の発現に影響を及ぼすかを調べてみるために、Ａ５４９およびＵ９３７細胞にそれぞれのインフルエンザＡウイルス、すなわちＰＲ８および１９１８株をＭＯＩ  １で細胞に感染させた後、ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを実施して、細胞内ＩＦＮβｍＲＮＡおよびタンパク質発現変化を観察した。
【００８９】
その結果、図４ｄに示したように、ウイルス感染により誘導される細胞内ＩＦＮβｍＲＮＡの発現が１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質により阻害されることを確認した。
【００９０】
このような結果は、ウイルスが感染した細胞で１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質がｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ反応を阻害することを意味するものである。
【００９１】
［実施例６．１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質のプロテアソーム依存的分解とｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ誘導阻害の相関関係の解明］
前記実施例２および３の結果を通じて１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質が顕著に低い安定性を有することを確認したところ、これに基づいて１９１８  ＰＢ１−Ｆ２の安定性と前記タンパク質によるＩＦＮβ誘導阻害能間の相関関係があるかを調べてみようとした。このために、Ａ５４９およびＵ９３７細胞にＰＲ８および１９１８  ＰＢ１−Ｆ２発現プラスミドをトランスフェクションし、１８時間後にプロテアソーム阻害剤であるＭＧ１３２を６時間の間処理した後、ｓｅｍｉ−ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを実施して、ＩＦＮβの発現を観察した。
【００９２】
その結果、図５ａに示したように、ＭＧ１３２が処理されていない条件では、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２によりＩＦＮβのｍＲＮＡおよびタンパク質発現が阻害された反面、ＭＧ１３２が処理された場合、ＩＦＮβの発現阻害が現れないことを確認した。このような結果は、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２によるＩＦＮβ誘導阻害にＰＢ１−Ｆ２の安定性が重要な影響を及ぼすことを意味する。
【００９３】
ひいては、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の安定性を決定する分子的因子として解明された１９１８  ＰＢ１−Ｆ２の６８および６９番目の位置のアミノ酸がＩＦＮβの発現阻害に影響を及ぼすかを検証するために、Ａ５４９細胞にＰＢ１−Ｆ２の６８および６９番目のアミノ酸を置換させた変異体をトランスフェクションさせた後、半定量的ＲＴ−ＰＣＲおよびウェスタンブロットを実施して、ＩＦＮβの発現を観察した。
【００９４】
その結果、図５ｂに示したように、ＰＢ１−Ｆ２の６８および６９番目のアミノ酸にＴ（トリプトファン）および／または、Ｐ（プロリン）が位置する場合（Ｉ６８Ｔ、Ｌ６９Ｐ、Ｉ６８Ｔ／Ｌ６９Ｐ）、ＩＦＮβのｍＲＮＡおよびタンパク質発現が阻害されることを確認した。
【００９５】
前記結果は、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質のプロテアソーム依存的分解とｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮの強い発現阻害能間に相関関係があることを意味するものである。
【００９６】
［実施例７．１９１８  ＰＢ１−Ｆ２の６８および６９番目のアミノ酸がインフルエンザＡウイルス１９１８株の病原性に及ぼす影響の解明］
インフルエンザＡウイルス１９１８株が宿主に感染した場合、ＰＢ１−Ｆ２タンパク質がウイルス病原性に及ぼす影響を調べてみるために、マウスにＰＲ８および１９１８株のインフルエンザウイルスを５×１０２  ＰＦＵまたは１×１０３  ＰＦＵで鼻腔投与した後、１４日間マウスの体重変化および生存率を観察した。
【００９７】
その結果、図６ａおよび図６ｂに示したように、ＰＲ８株に比べて１９１８株のインフルエンザウイルスを感染させた場合、マウスで高い病毒性が誘発されることを確認した。
【００９８】
さらに、前記実施例４および６の結果を通じてＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８および６９番目のアミノ酸位置が前記タンパク質の不安定性およびＩＦＮβ誘導を決定する因子であることを確認された。これに基づいて前記アミノ酸位置がインフルエンザウイルスの病原性に重要な影響を及ぼすかを検証しようとした。このために、ＰＲ８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８および６９番目のアミノ酸を１９１８  ＰＢ１−Ｆ２のもので置換した変異インフルエンザウイルスをマウスに感染させた後、体重および生存率の変化を観察した。
【００９９】
その結果、図６ｃに示したように、ＰＲ８株およびＰＢ１−Ｆ２タンパク質欠損ウイルス（ＰＢ１−Ｆ２（−））を感染させた場合と比較するとき、変異ウイルス（Ｉ６８Ｔ、Ｌ６９Ｐ、Ｉ６８Ｔ／Ｌ６９Ｐ）を感染させたマウスでは、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２ウイルスを感染させた場合と類似した程度に体重が減少した。
【０１００】
これに加えて１９１８  ＰＢ１−Ｆ２の病毒性に前記位置のアミノ酸が及ぼす影響を調べてみるために、Ｉ６８Ｔ、Ｌ６９Ｐ、およびＩ６８Ｔ／Ｌ６９Ｐ変異ウイルスを多様な用量（６×１０２、８×１０２、および１×１０３  ＰＦＵ）でマウスに感染させた後、体重および生存率を測定した。その結果、図６ｄ〜図６ｆに示したように、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８および６９番目のアミノ酸がいずれもウイルスの病毒性に寄与することを確認した。
【０１０１】
上記結果を通じてＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８および６９番目の位置のアミノ酸がインフルエンザＡウイルス１９１８株の高い病原性に寄与することが分かった。
【０１０２】
［実施例８．インビボで１９１８  ＰＢ１−Ｆ２によるＩＦＮβ誘導阻害の確認］
１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質が実際にインフルエンザウイルス感染モデルでＩＦＮβの誘導を阻害するかを検証するために、各インフルエンザウイルス、すなわちＰＲ８、１９１８、およびＰＢ１−Ｆ２欠損１９１８（ＰＢ１−Ｆ２（−））を５×１０２  ＰＦＵでマウスに感染させ、２日後、ウェスタンブロットを用いてマウス肺組織でウイルスタンパク質であるＰＢ１−Ｆ２、ＮＰ（ｎｅｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ）、およびＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）の発現レベルを分析した。その結果、図７ａに示したように、１９１８株ウイルスを感染させた場合、ＨＡおよびＮＰウイルスタンパク質がＰＲ８株ウイルスを感染させたマウスに比べてさらに高く発現したことを確認した。
【０１０３】
このようなウイルスタンパク質の発現レベルがウイルス複製と関連があるかを調べてみるために、肺組織粉砕液でｐｌａｑｕｅ  ａｓｓａｙを通じてウイルス力価を測定した。その結果、図７ｂに示したように、１９１８株ウイルスの力価がＰＲ８株およびＰＢ１−Ｆ２欠損ウイルスに比べて約１０倍高いことを確認し、これは、１９１８株のウイルス消滅過程に欠損があることを意味するものである。
【０１０４】
したがって、前記結果に基づいて各ウイルスが感染したマウス肺組織で１９１８株ウイルスの感染がＩＦＮβ誘導を阻害するかを検証するために、ＲＴ−ＰＣＲを実施して、ＩＦＮβｍＲＮＡの発現レベルを測定した。その結果、図７ｃに示したように、１９１８株ウイルスが感染した場合にのみ、ＩＦＮβの発現が顕著に阻害されたことを確認した。
【０１０５】
これに加えて、ＥＬＩＳＡを通じて前記各ウイルスが感染したマウス肺でＩＦＮβタンパク質の分泌量を測定した結果、図７ｄに示したように、ＰＲ８株およびＰＢ１−Ｆ２欠損ウイルスを感染させた場合に比べて１９１８株ウイルスが感染したマウスでＩＦＮβタンパク質分泌量がさらに低いことを確認した。
【０１０６】
前記結果は、１９１８株ウイルスが感染したマウスでＰＢ１−Ｆ２がＩＦＮβ誘導を阻害することを意味する。
【０１０７】
［実施例９．１９１８  ＰＢ１−Ｆ２とＤＤＸ３の結合を介したＩＦＮβ誘導阻害の解明］
１９１８  ＰＢ１−Ｆ２によるＩＦＮβ誘導抑制の分子的機序を解明するために、ＩＰを実施して１９１８  ＰＢ１−Ｆ２と相互作用するタンパク質を分析した。その結果、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を通じて合計１３４種のタンパク質が１９１８  ＰＢ１−Ｆ２と相互作用することが明らかになった。ひいては、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）プログラムを利用してＰＢ１−Ｆ２と相互作用するタンパク質に対する生物学的機能による分析を実施し、ウイルス感染に関連したタンパク質に着目して分析した。その結果、図８ａに示したように、ＤＤＸ３Ｘ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、およびＨＳＰＤ１タンパク質が導き出された。これらのタンパク質は、ウイルス感染と関連したものであって、ＴＢＫ１、ＩＲＦ３およびＩＮＦＡ２タンパク質と相互作用すると知られている。
【０１０８】
そこで、前記結果を通じて導き出されたＤＤＸ３に焦点を合わせて１９１８  ＰＢ１−Ｆ２とＤＤＸ３間の相互作用を評価するために、Ａ５４９細胞にＤＤＸ３を発現するプラスミド（ＨＡ−ｔａｇｇｅｄ  ＤＤＸ３）および、ＰＲ８または１９１８のＰＢ１−Ｆ２発現プラスミド（Ｆｌａｇ−ｔａｇｇｅｄ  ＰＢ１−Ｆ２）をトランスフェクションした後、ＭＧ１３２処理条件でＩＰを実施した。その結果、図８ｂに示したように、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２とＤＤＸ３が結合することを確認した。ひいては、ＰＲ８  ＰＢ１−Ｆ２の６８および６９番目のアミノ酸を１９１８  ＰＢ１−Ｆ２のもので置換させて作製した変異タンパク質（Ｉ６８Ｔ、Ｌ６９Ｐ、およびＩ６８Ｔ／Ｌ６９Ｐ）の発現プラスミドをトランスフェクションして、同じ実験を行った結果を通じても、ＤＤＸ３と相互作用することを確認した。
【０１０９】
次に、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質によるＤＤＸ３阻害の有無を検証するために、Ａ５４９細胞を各インフルエンザウイルスで感染させた。その結果、図８ｃに示したように、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質によりＤＤＸ３の発現が減少した。また、各インフルエンザウイルスで感染させたマウスの肺組織でも、図８ｄのように、細胞内ＤＤＸ３の発現が減少したことを確認した。
【０１１０】
さらには、ＩＦＮβ誘導反応でＩＲＦ３のリン酸化および核内への移動が現れるので、本発明者らは、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２がＩＲＦ３の核内への移動を阻害するかを調べてみるために、ＩＲＦ３の核内への移動を評価した。その結果、図８ｅに示したように、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質によりＩＲＦ３の核内への移動が減少する反面、ＤＤＸ３の添加によってこのような現象が回復されることを確認した。このような結果は、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２がＤＤＸ３との相互作用を通じてＩＦＮβ誘導を抑制することを意味する。
【０１１１】
上記結果をもう一度検証するために、Ａ５４９細胞にＰＲ８および１９１８のＰＢ１−Ｆ２発現プラスミドおよびＤＤＸ３発現プラスミドをトランスフェクションした後、ＩＦＮβｍＲＮＡ発現量変化をｔｒａｎｓ−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎアッセイを通じて分析した結果、図８ｆに示したように、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２によりＩＦＮβｍＲＮＡの発現が減少したが、ＤＤＸ３発現によりＦＮβｍＲＮＡの発現が再び増加することを確認した。
【０１１２】
この結果は、１９１８  ＰＢ１−Ｆ２タンパク質がＤＤＸ３との結合を通じてＩＦＮβ誘導を抑制することを意味するものである。
【０１１３】
［実施例１０．インビボで組換えＤＤＸ３処理による１９１８  ＰＢ１−Ｆ２インフルエンザウイルスの病原性減少の確認］
前記実施例の結果を通じて解明された１９１８  ＰＢ１−Ｆ２とＤＤＸ３の相互作用によるＩＦＮβの分泌阻害機序を証明するために、ＩＦＮβ誘導でＤＤＸ３の役割を検証しようとした。このために、インビボ実験を通じて１９１８インフルエンザウイルスを感染させたマウスモデルで組換えＤＤＸ３タンパク質の投与によりＩＦＮβ誘導抑制が回復され得るかを検証するために行い、実験過程を図９ａに示した。
【０１１４】
その結果、図９ｂに示したように、ＤＤＸ３を投与したマウス全部が２週間生存したことを確認した。これに加えて、マウス肺のウイルス力価を測定した結果、図９ｃから明らかなように、対照群グループに比べてＤＤＸ３タンパク質を投与したマウスで３７倍程度低いことを確認し、これは、ＤＤＸ３添加によってウイルス消滅が起こったことを意味するものである。また、図９ｄを通じてマウス肺組織でＤＤＸ３タンパク質発現により細胞内ＩＦＮβの発現が増加することを確認した。
【０１１５】
前記結果を通じてＤＤＸ３が１９１８  ＰＢ１−Ｆ２ウイルス感染からマウスを保護することが分かった。また、本実施例を通じて解明した高病原性のインフルエンザＡウイルス１９１８株の先天免疫反応回避モデルを図１０に図示した。
【０１１６】
前記記述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【０１１７】
本発明で新しく解明したＰＢ１−Ｆ２タンパク質変異体によるウイルスの先天免疫反応回避機序は、抗ウイルス製剤の開発のための新しい理解を提供するものであり、本発明による抗ウイルス用組成物は、抗ウイルス治療製剤の開発に有用に利用され得るものである。
【図１】
2020510682.tif 000006
【図２ａ】
2020510682.tif 000007
【図２ｂ】
2020510682.tif 000008
【図３ａ】
2020510682.tif 000009
【図３ｂ】
2020510682.tif 000010
【図３ｃ】
2020510682.tif 000011
【図３ｄ】
2020510682.tif 000012
【図４ａ】
2020510682.tif 000013
【図４ｂ】
2020510682.tif 000014
【図４ｃ】
2020510682.tif 000015
【図４ｄ】
2020510682.tif 000016
【図５ａ】
2020510682.tif 000017
【図５ｂ】
2020510682.tif 000018
【図６ａ】
2020510682.tif 000019
【図６ｂ】
2020510682.tif 000020
【図６ｃ】
2020510682.tif 000021
【図６ｄ】
2020510682.tif 000022
【図６ｅ】
2020510682.tif 000023
【図６ｆ】
2020510682.tif 000024
【図７ａ】
2020510682.tif 000025
【図７ｂ】
2020510682.tif 000026
【図７ｃ】
2020510682.tif 000027
【図７ｄ】
2020510682.tif 000028
【図８ａ】
2020510682.tif 000029
【図８ｂ】
2020510682.tif 000030
【図８ｃ】
2020510682.tif 000031
【図８ｄ】
2020510682.tif 000032
【図８ｅ】
2020510682.tif 000033
【図８ｆ】
2020510682.tif 000034
【図９ａ】
2020510682.tif 000035
【図９ｂ】
2020510682.tif 000036
【図９ｃ】
2020510682.tif 000037
【図９ｄ】
2020510682.tif 000038
【図１０】
2020510682.tif 000039
【配列表】
2020510682000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年5月28日(2019.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を含む、高病原性ウイルス検出用マーカー組成物。
【請求項２】
前記タンパク質変異体は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されている、請求項１に記載のマーカー組成物。
【請求項３】
前記タンパク質変異体は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項２に記載のマーカー組成物。
【請求項４】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項１〜３のいずれか一項に記載のマーカー組成物。
【請求項５】
配列番号１のアミノ酸配列からなるＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を測定する製剤を含む、高病原性ウイルス検出用組成物。
【請求項６】
前記タンパク質変異体は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されている、請求項５に記載の検出用組成物。
【請求項７】
前記タンパク質変異体は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項６に記載の検出用組成物。
【請求項８】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の検出用組成物。
【請求項９】
前記タンパク質変異体を測定するための製剤は、前記タンパク質に特異的に結合する抗体である、請求項５〜８のいずれか一項に記載の検出用組成物。
【請求項１０】
請求項５〜９のいずれか一項に記載の検出用組成物を含む、高病原性ウイルス検出キット。
【請求項１１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるＰＢ１−Ｆ２タンパク質の６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されたタンパク質変異体を測定する段階を含む、高病原性ウイルス検出方法。
【請求項１２】
前記タンパク質変異体は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されている、請求項１１に記載の検出方法。
【請求項１３】
前記タンパク質変異体は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項１２に記載の検出方法。
【請求項１４】
前記ウイルスは、インフルエンザウイルスである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の検出方法。
【請求項１５】
ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合阻害剤を有効成分として含む、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス用組成物であって、
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されている、組成物。
【請求項１６】
前記ＤＤＸ３は、配列番号３のアミノ酸配列からなる、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記結合阻害剤は、核酸、化合物、微生物培養液または抽出物、天然物抽出物、ペプチド、基質類似体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、および抗体からなる群より選択されるいずれか１つである、請求項１５又は１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されている、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物は、細胞内インターフェロンβ（ＩＦＮβ）の生成を増加させる、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
（ａ）インビトロ上で細胞に候補物質を処理する段階；
（ｂ）前記細胞でＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合を測定する段階；および
（ｃ）候補物質非処理群に比べて前記ＤＤＸ３とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合を減少させる物質をインフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス物質として選定する段階を含む、インフルエンザＡウイルスに対する抗ウイルス物質のスクリーニング方法であって、
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列で６８番目および６９番目のアミノ酸が置換されている、スクリーニング方法。
【請求項２２】
前記候補物質は、核酸、化合物、微生物培養液または抽出物、天然物抽出物、ペプチド、基質類似体、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、および抗体からなる群より選択される、請求項２１に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
前記核酸は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、アプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、ＬＮＡ（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、ＰＮＡ（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）、およびモルフォリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）よりなる群から選択される、請求項２２に記載のスクリーニング方法。
【請求項２４】
前記（ｂ）段階は、ウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、免疫沈降法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）、免疫化学染色法（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、および免疫蛍光染色法（ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）からなる群より選択される方法を利用して測定する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２５】
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、６８番目および６９番目のアミノ酸がそれぞれスレオニン（Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）およびプロリン（ｐｒｏｌｉｎｅ）で置換されている、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載のスクリーニング方法。
【請求項２６】
前記ＰＢ１−Ｆ２タンパク質は、配列番号２のアミノ酸配列からなる、請求項２５に記載のスクリーニング方法。
【請求項２７】
ＤＤＸ３（ＤＥＡＤ  ｂｏｘ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３）とＰＢ１−Ｆ２タンパク質の結合阻害剤を有効成分として含む抗ウイルス用組成物を個体（但し、ヒトを除く）に投与する段階を含む、インフルエンザＡウイルスの治療方法。
【請求項２８】
請求項１５〜２０のいずれか一項に記載の抗ウイルス用組成物の、インフルエンザＡウイルス感染治療用製剤の製造のための使用。
【国際調査報告】
2020510682.tif 000040
2020510682.tif 000041
2020510682.tif 000042
2020510682.tif 000043