(57)【要約】  本発明は、真核細胞において遺伝子発現を制御することができ、且つアンフォールディング型タンパク質応答(UPR)に応答性である、制御性核酸配列の使用に関する。遺伝子発現を制御することができる制御可能なイントロン及びUPR誘導性プロモーターが開示されている。そのような制御性核酸配列を含む組換え発現構築物であって、それにより、コードされた発現産物の発現が、その構築物を含有する真核細胞において、アンフォールディング型タンパク質応答(UPR)を誘起することにより誘導され得る、発現構築物、そのような構築物を用いる方法、並びに関連したベクター、細胞等も開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞において発現産物を産生するための合成核酸発現構築物であって、前記核酸発現構築物が、前記発現産物をコードする核酸配列と作動可能に連結したプロモーター配列を含み、前記発現産物をコードする核酸配列が、制御可能なイントロンをコードする配列を含み、前記制御可能なイントロンが、細胞におけるアンフォールディング型タンパク質応答(UPR)系により前記合成発現構築物から産生された転写産物からスプライシングで切り出される能力があり、それにより、結果として、機能性発現産物をコードする転写産物を生じる、切除可能な配列を含むイントロンである、合成核酸発現構築物。
【請求項２】
制御可能なイントロンが、IRE1タンパク質又はそのホモログ若しくはオルソログによりスプライシングで切り出される能力がある、請求項1に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項３】
発現産物がタンパク質である、請求項1又は2に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項４】
制御可能なイントロンの切除可能な配列のスプライシングでの切り出しが、発現産物をコードする核酸配列からの転写産物の正しい翻訳を可能にし、それにより、所望の発現産物が産生されるのを可能にする、請求項1〜3のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項５】
発現産物をコードする核酸配列からの転写産物におけるイントロンの存在が、結果として、非機能性である前記転写産物からタンパク質が翻訳されることになる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項６】
制御可能なイントロンの切除可能な配列のスプライシングでの切り出しが、転写産物において中途での停止コドンを排除する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項７】
制御可能なイントロンの切除可能な配列のスプライシングでの切り出しが、制御可能なイントロンの下流に位置する転写産物における配列についてリーディングフレームのシフトを生じる、請求項1〜6のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項８】
切除可能な配列のヌクレオチド長が3で割り切れない、請求項1〜7のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項９】
制御可能なイントロンが、配列CNG/CNG-Xn-CNG/CNGを含み、ただし、Xnが長さn塩基の配列を表し、/が切断部位を表し、配列CNG-Xn-CNGが転写産物から切除される、請求項1〜8のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項１０】
Xnが、10ヌクレオチドから500ヌクレオチドまで、より好ましくは15〜350ヌクレオチド、更により好ましくは15〜100ヌクレオチド、更により好ましくは15〜35ヌクレオチド、更により好ましくは20〜25ヌクレオチドの長さを有する、請求項9に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項１１】
制御可能なイントロンが、配列CNG/CNG-Xn-CNG/CNG[CG]を含み、ただし、Xnが長さnヌクレオチドの配列を表し、/が、切除可能な配列CNG-Xn-CNGがスプライシングにより転写産物から切除されるような切断部位を表し、配列Xnの5'末端におけるヌクレオチドがC又はGである、請求項1〜10のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項１２】
Xnが配列CACUCAGACUACGUGCACCU(配列番号1)又はそれと少なくとも60%同一である配列を含む、請求項9〜11のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項１３】
Xnが以下の配列の1つを含み、又はそれからなる、請求項12に記載の合成核酸発現構築物:
-  CACUCAGACUACGUGCACCU(配列番号1);
-  CACUCAGACUACGUGCUCCU(配列番号2);
-  CACUCAGACUACGUGCCCCU(配列番号3);
-  CACUCAGACUACGUGCGCCU(配列番号4);及び
-  CACUCAGACUAUGUGCACCU(配列番号5)。
【請求項１４】
制御可能なイントロンが、配列CNG/CNGCACUCAGACUACGUGCACCUCNG/CNGC(配列番号6)又はそれと少なくとも60%同一である配列を含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項１５】
制御可能なイントロンが、配列CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CUGC(配列番号7)又はそれと少なくとも60%同一である配列を含み、又はそれからなる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項１６】
制御可能なイントロンが以下の配列の1つを含み、又はそれからなる、請求項1〜15のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物:
-  CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CNG(配列番号8);
-  CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCUCCUCUG/CNG(配列番号9);
-  CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCCCCUCUG/CNG(配列番号10);
-  CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCGCCUCUG/CNG(配列番号11);及び
-  CNG/CAGCACUCAGACUAUGUGCACCUCUG/CNG(配列番号12)。
【請求項１７】
制御可能なイントロンが以下の配列の1つを含み、又はそれからなる、請求項1〜16のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物:
-  CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CUGC(配列番号7);
-  CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCUCCUCUG/CUGC(配列番号13);
-  CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCCCCUCUG/CUGC(配列番号14);
-  CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCGCCUCUG/CUGC(配列番号15);及び
-  CAG/CAGCACUCAGACUAUGUGCACCUCUG/CUGC(配列番号16)。
【請求項１８】
制御可能なイントロンが、配列CAG/CUGCAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CUG(配列番号17)又はCAG/CUGCAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CUGG(配列番号27)を含み、ただし、/が切断部位を表す、請求項1〜17のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項１９】
発現産物をコードする核酸配列と作動可能に連結した誘導性プロモーターを含む、請求項1〜18のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項２０】
誘導性プロモーターがアンフォールディング型タンパク質応答(UPR)誘導性プロモーターである、請求項19に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項２１】
発現産物をコードする核酸配列が導入遺伝子である、請求項1〜20のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項２２】
発現産物をコードする核酸配列がタンパク質をコードし、適切には、前記タンパク質が酵素、抗体若しくは抗体断片、ウイルスタンパク質、治療用タンパク質、又は毒性タンパク質である、請求項1〜21のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物。
【請求項２３】
発現産物をコードする配列を含む核酸であって、前記発現産物をコードする配列が制御可能なイントロンをコードする配列を含み、前記制御可能なイントロンが、細胞におけるアンフォールディング型タンパク質応答(UPR)系により合成発現構築物から産生された転写産物からスプライシングで切り出さる能力があり、それにより、結果として、機能性発現産物をコードする転写産物を生じる、切除可能な配列を含むイントロンであり、前記発現産物が、XBP1タンパク質でも、Hac1タンパク質でも、bZIP60タンパク質でも、そのホモログでもない、核酸。
【請求項２４】
請求項1〜22のいずれか一項に記載の合成核酸発現構築物又は請求項23に記載の核酸を含むベクター。
【請求項２５】
請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物、請求項23に記載の核酸、又は請求項24に記載のベクターを含む薬学的組成物。
【請求項２６】
薬学的組成物の製造のための、請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物、請求項23に記載の核酸、又は請求項24に記載のベクターの使用。
【請求項２７】
請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物、請求項23に記載の核酸、又は請求項24に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２８】
真核細胞、適切には、真菌細胞(例えば、酵母細胞)、動物(後生動物)細胞(例えば、哺乳類細胞)、又は植物細胞である、請求項27に記載の細胞。
【請求項２９】
請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物、請求項23に記載の核酸、又は請求項24に記載のベクターが、細胞への毒性がある発現産物をコードする、請求項27又は28に記載の細胞。
【請求項３０】
a)  請求項1〜22のいずれか一項に記載の合成核酸発現産物を含む真核細胞集団を供給する工程;
b) アンフォールディング型タンパク質応答を誘導するように前記細胞集団を処理して、それにより制御可能なイントロンからの切除可能な配列のスプライシングを誘導する工程;
c) 前記発現産物の産生についての最適な条件下で前記細胞集団をインキュベートする工程;及び
d) 前記細胞集団から前記発現産物を単離する工程
を含む、発現産物を産生するための方法。
【請求項３１】
アンフォールディング型タンパク質応答(UPR)を誘導するように前記細胞集団を処理する工程b)の前に、前記細胞集団を前記細胞の増殖に適した条件下でインキュベートする工程を含む、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
工程b)が、前記細胞にストレスを加えることを含み、前記ストレスがUPRを誘導するのに適している、請求項30又は31に記載の方法。
【請求項３３】
工程b)が、前記細胞においてUPRを誘導することができる化学物質を投与することを含む、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞においてUPRを誘導することができる化学物質が、フォルスコリン、ジチオスレイトール(DTT)、ツニカマイシン、タプシガルジン、飽和脂肪酸、ステアロイル-CoAデサチュラーゼ酵素活性を下方制御することができる作用物質の1つ又は複数を含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
工程b)が、細胞集団においてUPR応答を誘導するために、前記真核細胞集団において誘導タンパク質を発現することを含む、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
工程b)が、前記細胞において誘導タンパク質、好ましくは異種性タンパク質を発現する能力がある発現ベクターを前記細胞集団にトランスフェクションすることを含み、又は工程b)が、すでに細胞へ導入された発現ベクターから誘導タンパク質の発現を誘導することを含む、請求項34に記載の方法。
【請求項３７】
工程b)が、細胞を低酸素又は糖質欠乏に曝すことを含む、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
細胞集団が、真菌細胞、動物細胞、又は植物細胞を含み、好ましくは、細胞集団が哺乳類細胞を含む、請求項30〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
工程a)の前に、核酸発現構築物を細胞へ導入する工程を含む、請求項30〜37のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
処置又は治療の方法における使用のための、請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物、請求項23に記載の核酸、請求項24に記載のベクター、請求項25に記載の薬学的組成物、又は請求項27〜29のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４１】
遺伝子治療のための医薬の製造のための、請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物、請求項23に記載の核酸、請求項24に記載のベクター、請求項25に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項４２】
以下の工程を含む、遺伝子治療を必要としている対象における遺伝子治療のための方法:
-  請求項1〜22のいずれか一項に記載の核酸発現構築物を含む遺伝子治療ベクターを対象に導入して、前記遺伝子治療ベクターが前記核酸発現構築物を前記対象の標的細胞へ送達する工程であって、前記核酸発現構築物が、治療用発現産物をコードする配列を含む、工程;及び
-  治療的有効量の機能性治療用発現産物を対象の標的細胞において発現する工程。
【請求項４３】
合成のUPR応答性シス制御性エレメントを含む合成UPR誘導性プロモーターであって、前記UPR応答性シス制御性エレメントが、ATF6、XBP1、若しくはbZIP60、又はUPRの一部として遺伝子発現を駆動させるホモログ若しくは別途等価の転写因子に対する少なくとも1つの結合部位を含む、合成UPR誘導性プロモーター。
【請求項４４】
最小プロモーター又は近位プロモーターと作動可能に連結した少なくとも1つの合成UPR応答性シス制御性エレメントを含む、請求項43に記載の合成UPR誘導性プロモーター。
【請求項４５】
以下の転写因子標的配列の少なくとも1つの1つ又は複数のコピーを含むUPR応答性シス制御性エレメントを含む、請求項43又は44に記載の合成UPR誘導性プロモーター:
-  TGACGTG;
-  TGACGTGCT;
-  TGACGTG[TG];
-  CCAAT-N9-CCACG(ERSE1部位として知られている)(配列番号18);及び
-  ATTGG-N-CCACG(ERSE2部位として知られている)(配列番号19)。
【請求項４６】
転写因子標的配列TGACGTGの1つ又は複数のコピー、好ましくは転写因子標的配列TGACGTGの3つ又はそれ以上のコピー、及び好ましくは転写因子標的配列TGACGTGの5つ又はそれ以上のコピー、例えば、転写因子標的配列TGACGTGの6つ又はそれ以上のコピーを含む、UPR応答性シス制御性エレメントを含む、請求項43〜45のいずれか一項に記載の合成UPR誘導性プロモーター。
【請求項４７】
UPR応答性シス制御性エレメントが、配列
TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG(配列番号54)を含み、ただし、Sが任意選択のスペーサー配列を表す、請求項43に記載の合成UPR誘導性プロモーター。
【請求項４８】
UPR応答性シス制御性エレメントが、配列TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT(配列番号55)を含み、ただし、Sが任意選択のスペーサー配列を表す、請求項43に記載の合成UPR誘導性プロモーター。
【請求項４９】
UPR応答性シス制御性エレメントが、配列TGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCT(配列番号20)を含む、請求項43に記載の合成UPR誘導性プロモーター。
【請求項５０】
UPR応答性シス制御性エレメントが、配列
TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCT(配列番号56)又はそれと少なくとも50%同一である配列を含む、請求項43に記載の合成UPR誘導性プロモーター。
【請求項５１】
以下の配列の1つを含む、請求項43に記載の合成UPR誘導性プロモーター:
-  TGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTGGTACCGTCGACGATATCGGATCCAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTAGATACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATCGCCACC(配列番号22)又はそれと少なくとも70%同一である配列;
-  TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTGCAGTTAGCGTAGCTGAGGTACCGTCGACGATATCGGATCCAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGAT(配列番号57)又はそれと少なくとも50%同一である配列;及び
-  TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTGCAGTTAGCGTAGCTGAGGTACCGTCGACGATATCGGATCCTTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAG(配列番号58)又はそれと少なくとも50%同一である配列。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞において遺伝子発現を制御することができ、且つアンフォールディング型タンパク質応答(UPR)に応答性である制御性核酸配列の使用に関する。いくつかの態様において、本発明は、遺伝子発現を調節するための制御可能なイントロンの使用に関する。他の態様において、本発明はUPR誘導性プロモーターに関する。本発明はまた、そのような制御性核酸配列を含む組換え発現構築物であって、それによるコードされた発現産物の発現が、前記構築物を含有する真核細胞においてアンフォールディング型タンパク質応答(UPR)を誘起することにより誘導され得る、組換え発現構築物、並びにそのような構築物、及び関連したベクター、細胞等を用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
制御可能な遺伝子発現は、発現産物の発現レベルを調節することが有益又は必要である、非常に多くの状況において望ましい。例えば、バイオテクノロジー産業の場合、発酵プロセスにおいて所望の時点で発現産物(例えば、タンパク質)の産生を誘導し得ることは非常に有利であり得る。別の例では、遺伝子治療において、処置の所望の時点及び/又は位置において治療用産物(例えば、治療用タンパク質)の発現を誘導し得ることは望ましくあり得る。
【０００３】
誘導性プロモーターは、当技術分野において知られており、例えば、テトラサイクリン(Tet)-on及び-off誘導性発現系である(Gossen M及びBujard H. PNAS. 1992年6月15日; 89(12):5547〜51頁; Gossen M、Freundlieb S、Bender G、Muller G、Hillen W、及びBujard H. Science. 1995年6月23日; 268(5218))。
【０００４】
誘導性プロモーターは、転写レベルで発現を制御することにより働き、関連する発現系から産生されるmRNAの量を調節する。これにより、有用なレベルの遺伝子発現が提供されるが、発現を調節するために追加の、理想的には改善された系が必要である。
【０００５】
特に、毒性タンパク質、すなわち、それらが産生される細胞への毒性があるタンパク質の発現のための改善された発現調節系が必要である。毒性タンパク質の場合、そのタンパク質の少量の発現でさえも細胞死を引き起こす又は産生が非常に乏しいことが往々にしてあり得る。
【０００６】
更に、細胞治療の遺伝子の場合、治療用タンパク質若しくはRNA、又は他の発現産物の発現が所望の時点及び/又は位置で誘導されることを可能にする系が必要である。
【０００７】
本発明は、翻訳の時点で作用する発現の制御に関する。特に、それは、発現を調節するための真核細胞におけるアンフォールディング型タンパク質応答(UPR)の結果としてスプライシングで切り出されるイントロンの使用に関する。
【０００８】
アンフォールディング型タンパク質応答(UPR)は、小胞体ストレスに対する細胞の対処機構である。UPRは、小胞体(ER)の内腔におけるアンフォールディング型又はミスフォールディング型タンパク質の蓄積に応答して活性化される。UPRは、様々な機構を通して、細胞の正常な機能を回復することを目指す。これらの目的が、ある特定の時間スパン内に達成されず、又は破損が長引く場合には、UPRはアポトーシスを目指す。UPRは、異種性タンパク質産生等のタンパク質合成及びフォールディングの増加により、又は他の細胞ストレス、例えば、グリコシル化経路若しくはジスルフィド結合形成のブロック等の化学的に誘発されたストレスにより、引き起こされ得る。UPRは、全ての真核動物に渡って高度に保存されている。
【０００９】
哺乳類細胞において、ERストレスが感知され、且つUPRが活性化される以下の3つの機構が存在する:
1) XBP-1 mRNAのIRE-1スプライシング
タンパク質フォールディング需要の増加からの、又はERプロセスの化学的阻害によるERストレスは、シャペロンBiPの解離を経て、ER膜貫通タンパク質IRE1により検出される。このBiPの解離は、タンパク質のオリゴマー化及びリン酸化を可能にすることによりIRE1を活性化し、それにより、ER内腔に面しているRNアーゼドメインが露出される。その後、RNアーゼドメインは、スプライソソーム非依存性様式でXBP-1 mRNAからの非標準イントロンの除去を触媒する。非ストレス条件下で、XBP-1 mRNAは、スプライシングされない(XBP1u(翻訳された場合、非機能性タンパク質である261アミノ酸のORFを形成する))。しかしながら、ERストレスが検出された場合、XBP1uは、IRE1 RNアーゼによりスプライシングされて、機能性376アミノ酸タンパク質をコードするXBP1sを形成する。この機能性タンパク質、XBP1は、シャペロン、ジスルフィドイソメラーゼ、及びリン脂質生合成に関与する酵素等のタンパク質ホメオスタシスに関与するいくつかの遺伝子の発現を調節する転写因子であり、特定の配列、ERストレス応答エレメント(ERSE)又はアンフォールディング型タンパク質応答エレメント(UPRE)と結合し、遺伝子発現を増強することにより、これらのプロセスを制御する。したがって、遺伝子発現の調節は、IRE1によるXBP1uからのmRNAイントロンの除去である。非常に類似した系が、非哺乳類の真核細胞において機能している。
2) ATF6
活性化転写因子(ATF6)ATF6は、そのタンパク質の細胞質領域に転写因子ドメインを有する2型膜貫通タンパク質であり、不活性前駆体として合成され、BiP/GRP78との会合によりER内に保持される。ストレス条件に応答して、ATF6は解離し、ゴルジ体へ輸送され、ゴルジ体において、プロセシングが起きて、転写因子ドメインを放出する。その後、このドメインは、核へ輸送され、その核において、それは、ERSE及びUPREと結合して、タンパク質ホメオスタシスに関与する遺伝子の発現を増強することができる。
3) 二本鎖RNA活性化プロテインキナーゼ(PERK)
PERKは、ER内腔ストレスセンサー及び細胞質プロテインキナーゼドメインを含有する1型ER膜貫通タンパク質である。PERKは、ERストレスに応答して活性化され、真核生物開始因子(elF2a)をリン酸化によって不活性化することにより、哺乳類細胞のERにおける正常タンパク質翻訳を阻害する。
【００１０】
機構1)及び2)が、本発明に最も関連性が高い。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】米国特許第4,683,195号
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Gossen M及びBujard H. PNAS. 1992年6月15日; 89(12):5547〜51頁
【非特許文献２】Gossen M、Freundlieb S、Bender G、Muller G、Hillen W、及びBujard H. Science 1995年6月23日; 268(5218)
【非特許文献３】Yoshidaら、Cell、107巻、881〜891頁、2001年12月28日
【非特許文献４】Luら、Mol Cell. 2014年9月4日; 55(5): 758〜770頁
【非特許文献５】Samaliら、International Journal of Cell Biology、2010巻、Article ID 830307、11頁  doi:10.1155/2010/830307
【非特許文献６】Chakrabortyら、Appl Biol Chem DOI、10.1007/s13765-016-0167-6、オンラインISSN 2468-0842、プリントISSN 2468-0834
【非特許文献７】Nagashimaら、Scientific Reports 1、Article number: 29 (2011)、DOI: 10.1038/srep00029
【非特許文献８】「Therapeutic potentials of short interfering RNAs」、Appl Microbiol Biotechnol、DOI 10.1007/s00253-017-8433-z
【非特許文献９】「MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases」、Nature Reviews Drug Discovery; 16、203〜222頁(2017)
【非特許文献１０】Iwao及びShidoj、PLOS ONE DOI:10.1371/journal.pone.0132761 2015年7月17日
【非特許文献１１】Robbleeら、「Saturated Fatty Acids Engage an IRE1a-Dependent Pathway to Activate the NLRP3 Inflammasome in Myeloid Cells」  Cell Reports 14、2611〜2623頁、2016年3月22日
【非特許文献１２】Ariyamaら、「Decrease in Membrane Phospholipid Unsaturation Induces Unfolded Protein Response」  THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 285巻、29号、22027〜22035頁、2010年7月16日
【非特許文献１３】Basseri及びAustin  「Endoplasmic Reticulum Stress and Lipid Metabolism: Mechanisms and Therapeutic Potential」  Biochemistry Research International 2012巻、Article ID 841362、13頁、doi:10.1155/2012/841362
【非特許文献１４】Kitaiら、「Membrane lipid saturation activates IRE1a without inducing clustering」  Genes to Cells (2013) 18、798〜809頁
【非特許文献１５】Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel、2000年、Wiley and son Inc、Library of Congress、USA)
【非特許文献１６】Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、(Sambrookら、2001年、Cold Spring Harbor、New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press)
【非特許文献１７】Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編、1984年)
【非特許文献１８】Nucleic Acid Hybridization (Harries及びHiggins編、1984年)
【非特許文献１９】Transcription and Translation (Hames及びHiggins編、1984年)
【非特許文献２０】Culture of Animal Cells (Freshney、Alan R. Liss, Inc.、1987年)
【非特許文献２１】Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press、1986年)
【非特許文献２２】Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)
【非特許文献２３】シリーズ、Methods in Enzymology (Abelson及びSimon監修、Academic Press, Inc.、New York)、具体的には、154巻と155巻(Wuら編)、及び185巻、「Gene Expression Technology」(Goeddel編)
【非特許文献２４】Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller及びCalos編、1987年、Cold Spring Harbor Laboratory)
【非特許文献２５】Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer及びWalker編、Academic Press、London、1987年)
【非特許文献２６】Handbook of Experimental Immunology、I〜IV巻(Weir及びBlackwell編、1986)
【非特許文献２７】Manipulating the Mouse Embryo、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986年)
【非特許文献２８】Altschulら、1990年(J Mol Biol 215: 403〜10頁)
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【非特許文献４４】Kleinら  (1987) Nature 327:70頁
【非特許文献４５】Yoshidaら、Cell、107巻、881〜891頁、2001年12月28日
【非特許文献４６】Srivastavaら、「Nucleotide sequence and organization of the adeno-associated virus 2 genome」、J Virol. 1983年2月; 45(2): 555〜564頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明により、細胞において発現産物を産生するための合成核酸発現構築物であって、前記核酸発現構築物が、発現産物をコードする核酸配列と作動可能に連結したプロモーター配列を含み、前記発現産物をコードする核酸配列が制御可能なイントロンをコードする配列を含み、前記制御可能なイントロンが、細胞におけるアンフォールディング型タンパク質応答(UPR)系により、前記合成発現構築物から産生された転写産物からスプライシングで切り出される能力があり、それにより、結果として、機能性発現産物をコードする転写産物を生じる、切除可能な配列を含むイントロンである、合成核酸発現構築物が提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
このように、本発明は、発現を制御するUPR機構によって、発現産物をコードする核酸配列のRNA転写産物からスプライシングで切り出される能力がある制御可能なイントロンの使用に基づいている。UPR機構は、真核生物に渡って遍在し、その機構及び関連配列は、顕著に保存されている。したがって、本発明は、全ての真核細胞に渡って実施することができる。制御可能なイントロンは、好ましくは、IRE1タンパク質又はそのホモログ若しくはオルソログ(IRE1のホモログ又はオルソログは、真菌、植物、及び哺乳類を含む全ての真核生物において存在する)によりスプライシングで切り出される能力がある。
【００１５】
プロモーターは、典型的には、発現産物をコードする核酸配列に対して異種性である。つまり、プロモーターは、天然では、発現産物をコードする配列と作動可能に連結して見出されることはない。例えば、プロモーターと発現産物をコードする核酸配列は、典型的には、天然に存在する遺伝子において一緒には見出されない。本発明のいくつかの実施形態において、プロモーターは合成プロモーター、すなわち、天然では存在しないプロモーターである。真核細胞に用いるのに適した、当技術分野において公知の、様々な構成的及び非構成的プロモーターがあり、非限定的例として、CAGプロモーター、CMVプロモーター、SV40を挙げることができる。
【００１６】
好ましい実施形態において、発現産物はタンパク質である。そのような実施形態において、発現産物をコードする核酸配列から産生されたスプライシングされていない転写産物は、制御可能なイントロンの存在の結果として、そのタンパク質の切り詰められた、又は別途欠損したバージョンをコードするが、その転写産物が、細胞におけるUPR機構によりプロセシングされるとき、そのイントロンの切除可能な配列が、スプライシングで切り出され、機能性タンパク質が、その転写産物から産生され得る。したがって、制御可能なイントロンのスプライシングでの切り出しは、結果として、機能性タンパク質発現産物をコードする機能性mRNAを生じる。
【００１７】
しかしながら、いくつかの場合、発現産物は、タンパク質以外の産物であり得る。適切には、発現産物は、RNA分子、例えば、リボザイム、RNAアプタマー、siRNA、アンチセンスRNA、又はmiRNAであり得る。そのような実施形態において、RNA分子の非機能性型が、スプライシングされていない転写産物として産生され、そのイントロンの切除可能な部分のスプライシングでの切り出しは、そのRNA分子を活性型へ変換する。
【００１８】
本発明の好ましい実施形態において、制御可能なイントロンの切除可能な配列のスプライシングでの切り出しは、発現産物をコードする核酸配列からの転写産物の正しい翻訳を可能にし、それにより、所望の発現産物(例えば、タンパク質)が産生されることを可能にする。そのような実施形態において、発現産物をコードする核酸配列からの転写産物におけるイントロンの存在は、結果として、非機能性である転写産物からタンパク質が翻訳されることになる。典型的には、これは、イントロンによりコードされるアミノ酸の、翻訳されたタンパク質における挿入に起因するか、又はより好ましくは、イントロンの3'側の、転写産物における停止コドンの導入若しくは(機能性タンパク質をコードする正常な転写産物に対する)フレームシフトの結果としてのいずれかで生じる。スプライシングされていない転写産物によりコードされるタンパク質は、多くの理由、例えば、以下のために非機能性であり得る:
-  イントロンは、イントロンの下流で(すなわち、3'方向で)フレームシフトを生じる可能性がある。これは、典型的には、イントロンの切除可能な配列が3ヌクレオチド長の倍数ではない場合に生じる。そのようなフレームシフトは、停止コドンの導入を生じる場合が多く、その結果として、切り詰められたタンパク質を生じる。他の場合では、それは単に、イントロンの下流のコードされたアミノ酸配列における全面的な変更を単純に生じ得る。
-  タンパク質の機能に対して破壊的であるアミノ酸が、翻訳されたタンパク質に存在することになる、コード配列の導入。この場合、イントロンの下流のアミノ酸配列は変更されないが、スプライシングされていない型において、翻訳されたタンパク質に存在するだろう、イントロンによりコードされたアミノ酸配列が、タンパク質の機能を破壊する。
-  イントロン配列における停止コドンの導入。この場合、イントロン自体が、停止コドンを含む可能性があり、その結果として、翻訳の中途での終了、及び切り詰められたタンパク質の産生を生じるだろう。
【００１９】
本発明のある特定の好ましい実施形態において、合成核酸配列構築物は、イントロンの切除可能な配列のスプライシングでの切り出しが転写産物において中途での停止コドンを除去するように、形成される。本状況における「中途での」とは、正常な転写産物、すなわち、機能性タンパク質をコードする転写産物(例えば、野生型mRNA)における停止コドンの上流に(すなわち、5'方向に)存在する停止コドンを意味する。
【００２０】
好ましくは、制御可能なイントロンは、イントロンの切除可能な配列のスプライシングでの切り出しが、制御可能なイントロンの下流(すなわち、3'側)に位置する転写産物における配列についてのリーディングフレームのシフトを生じるように、形成される。
【００２１】
本発明のある特定の好ましい実施形態において、制御可能なイントロンは、スプライシングが生じたとき、3の倍数ではないヌクレオチドでの長さを有する配列が転写産物から切除されるように、形成される。換言すれば、切除可能な配列は、nが3で割り切れない、nヌクレオチドの長さを有する。
【００２２】
本発明の好ましい実施形態において、制御可能なイントロンは、配列CNG/CNG-Xn-CNG/CNGを含み、ただし、Xnは長さn塩基の配列を表し、/は切断部位を表し、配列CNG-Xn-CNGは転写産物から切除される。
【００２３】
したがって、換言すれば、制御可能なイントロンは、適切には、それぞれが配列CNG/CNGを有する2つのスプライス部位標的配列に隣接された中央配列(Xn)を含み、/が切断部位を表す。
【００２４】
CNG/CNGは、真核細胞においてUPR系により、高度に保存された様式でターゲットされるコンセンサススプライス部位配列である。当技術分野において知られているように、このスプライス部位コンセンサス配列は、UPR応答が誘導されたとき、IRE1タンパク質(それのホモログ又はオルソログは、真菌、植物、及び哺乳類を含む全ての真核生物に存在する)によってターゲットされる。天然では、このコンセンサススプライス部位標的配列を有するイントロンは、UPRにおいて活性化される転写因子、例えば、XBP1タンパク質(後生動物において)、Hac1タンパク質(酵母において)、及びbZIP60タンパク質(植物において)をコードするmRNA内に見出される。IRE1又はそのホモログ若しくはオルソログのエンドリボヌクレアーゼ活性は、/によって示された位置でRNA転写産物を切断するように作用して、切除可能なイントロン配列を除去し、その後、その切断されたRNAは、RNAリガーゼタンパク質(S.  セレビシエ(S. cerevisiae)におけるRNAリガーゼRlg1p、哺乳類細胞におけるRNAリガーゼRtcB)により一緒にライゲーションされる。哺乳類細胞、酵母細胞、及び植物細胞におけるUPR系は、広く調べられており、その機構は、比較的十分に特徴付けられている(例えば、Yoshidaら、Cell、107巻、881〜891頁、2001年12月28日; Luら、Mol Cell. 2014年9月4日; 55(5): 758〜770頁; Samaliら、International Journal of Cell Biology、2010巻、Article ID 830307、11頁  doi:10.1155/2010/830307; Chakrabortyら、Appl Biol Chem DOI、10.1007/s13765-016-0167-6、オンラインISSN 2468-0842、プリントISSN 2468-0834;及びNagashimaら、Scientific Reports 1、Article number: 29 (2011)、DOI: 10.1038/srep00029参照)。したがって、UPRの機構は、本明細書において徹底的には論じない。しかしながら、IRE1媒介性スプライシングの高レベルの保存を考慮すれば、ある1つの種から生じたイントロンが、進化的に高度に多様化している別の種によってうまくスプライシングされ得ることに注目することは重要である;例えば、Yoshidaら(同上)は、哺乳類細胞が、酵母Hac1 mRNA(Hac1は哺乳類細胞におけるXBP1に対応する)からイントロンをうまくスプライシングで切り出し得ることを説明している。
【００２５】
制御可能なイントロンの長さがかなり様々であり得ることは留意されるべきである。例えば、哺乳類及び植物におけるXBP1イントロンは、典型的には26ヌクレオチド長であるが、20ヌクレオチド及び23ヌクレオチドのバリアントが観察されている。酵母のHac1イントロンは、よりかなり長く、典型的には、ほぼ252ヌクレオチド長程度である(とはいえ、上記で言及されているように、このずっと長いHac1イントロンは、それでもなお、哺乳類細胞においてスプライシングで切り出され得る)。
【００２６】
したがって、本発明の様々な実施形態において、制御可能なイントロン又はXnは、10ヌクレオチド長から500ヌクレオチド長まで、より好ましくは15〜350ヌクレオチド長、更により好ましくは15〜100ヌクレオチド長、更により好ましくは15〜35ヌクレオチド長、更により好ましくは20〜25ヌクレオチド長であり得る。したがって、制御可能なイントロンの切除可能な配列は、適切には、16〜506ヌクレオチドの長さ、より好ましくは21〜356ヌクレオチド長、更により好ましくは21〜106ヌクレオチド長、更により好ましくは21〜41ヌクレオチド長、更により好ましくは26〜31ヌクレオチド長を有する。上記で言及されているように、本発明のいくつかの実施形態において、長さXnは、切除可能な配列の長さが3で割り切れないように選択されることが好ましい。
【００２７】
Xnの特定の配列に関してかなりの自由度がある。好ましい配列は下記に示されているが、もちろん、制御可能なイントロンが機能的なままである、すなわち、それがUPR系により適切なレベルで転写産物からスプライシングで切り出されるという条件で、多くの他のバリアントを用いることができる。もちろん、いくつかの可能な配列は、例えば、望ましくない二次構造の形成の結果として、最適以下であり得、又はスプライシングプロセスに干渉し得るが、当業者は容易に、任意の所定の配列の効果を評価して、それがスプライシングへいくらかの有害効果を生じるかどうかを決定することができる。
【００２８】
制御可能なイントロンの機能性、すなわち、制御可能なイントロンが、UPRの誘導により転写産物からうまくスプライシングで切り出される能力の評価は、様々なアプローチを用いて当業者により容易に評価することができ、これらは、その構築物が用いられることを意図される特定の発現系に合わせて構成することができる。一つの好ましい例として、下記の実施例、例えば、実施例1に記載された方法論を用いることができる。例えば、評価される任意の候補の制御可能なイントロンの機能性は、実施例1に記載された構築物（SYNP-XBP-01と呼ばれる）へ、実施例1に用いられた例示的なイントロンの代わりに置き換えることができ、UPRが誘導されたとき、うまくスプライシングで切り出される前記イントロンの能力は、まさに実施例1で行われている通り、2mM DTTによるUPR誘導の前及び後のEGFP発現のレベルを評価することにより測定することができる。機能的な制御可能なイントロンは、UPRの誘導後、うまくスプライシングで切り出されて、機能性EGFPの発現を生じ得るものである。好ましくは、機能性イントロンは、2mM DTTでのUPRの誘導から24時間後、EGFPの発現の少なくとも5倍の増加、より好ましくは発現の少なくとも10倍の増加、より好ましくは発現の少なくとも100倍の増加、更により好ましくは発現の少なくとも1000倍の増加を与える。UPRの誘導前、EGFPの発現レベルは最小、好ましくは無視できるものであることが好ましい。最小の発現は、例えば、実施例1に用いられているような対照構築物(すなわち、EGFPをコードする配列の発現がCMV-mpにより駆動される、制御可能なイントロンを含まない構築物)の発現レベルの50%未満、好ましくは20%未満、より好ましくは10%未満、更により好ましくは5%未満、更により好ましくは1%未満として定義することができる。無視できる発現レベルは、実施例1の方法論を用いて本質的に検出不可能であるレベルである。
【００２９】
しかしながら、当業者が、実施例1で採用されたアプローチを容易に改変し得ることは理解される。例えば、これは、異なる細胞型を用いること、異なる発現産物を用いること、スプライシングの成功の異なる指標を用いること(例えば、機能性発現産物をコードするスプライシングされたmRNAのレベルを測定すること、又は異なるレポータータンパク質を用いること)、及びUPRの異なる誘導剤を用いることを含み得る。そのような改変されたアプローチにおいて、それは、機能的な制御可能なイントロンがUPRの誘導後うまくスプライシングで切り出されて、UPRの誘導後に機能性発現産物の発現を生じ得るものであるという状況を保持する。好ましくは、これは、UPRの誘導から24時間後、機能性発現産物をコードする転写産物の発現の少なくとも5倍の増加、好ましくは少なくとも10倍の増加、より好ましくは少なくとも100倍の増加、更により好ましくは少なくとも1000倍の増加を生じる。UPRの誘導前に、機能性発現産物をコードする転写産物の発現レベルが最小又は無視できるものであることが好ましい。
【００３０】
CNG/CNG[CG]は、哺乳類細胞について好ましいスプライス部位コンセンサス標的配列であり、その配列において、示された位置におけるC又はGの存在が好ましい(必要とされるわけではないが)。この位置におけるCの存在は、典型的にはGより好ましい。したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態において、特に、合成核酸発現構築物が哺乳類細胞用に意図される場合、イントロンは、そのイントロンの一方の、他方の、又は両方の(好ましくは両方の)末端に配列CNG/CNG[CG]を含む。
【００３１】
したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態において、制御可能なイントロンは、配列CNG/CNG-Xn-CNG/CNG[CG]を含み、ただし、Xnは長さnヌクレオチドの配列を表し、/は、切除可能な配列CNG-Xn-CNGがスプライシングにより転写産物から切除されるような切断部位を表し、配列Xnの5'末端におけるヌクレオチドがC又はGである。Xnについての適切な長さは上記に示されている。
【００３２】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、Xnは配列CACUCAGACUACGUGCACCU(配列番号1)、又はそれと少なくとも60%同一、より好ましくはそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも90%同一、更により好ましくはそれと少なくとも95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一である配列を含む。
【００３３】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、Xnは配列CACUCAGACUACGUGCACCU(配列番号1)、又はそれと少なくとも60%同一、より好ましくはそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも90%同一、更により好ましくはそれと少なくとも95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一である配列からなる。
【００３４】
配列CACUCAGACUACGUGCACCU(配列番号1)は、上記で示されているようなIRE1切断部位の内側に位置する哺乳類XBP1イントロンの領域に対応する。したがって、これは、特に合成核酸発現構築物が哺乳類細胞用に意図される場合、本発明の好ましい実施形態を表す。しかしながら、これと非常に類似している配列も、様々な非哺乳類のXBP1イントロンに渡って見出される。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態において、Xnは以下の配列の1つを含み、又はそれからなる:
-  CACUCAGACUACGUGCACCU(配列番号1);
-  CACUCAGACUACGUGCUCCU(配列番号2);
-  CACUCAGACUACGUGCCCCU(配列番号3);
-  CACUCAGACUACGUGCGCCU(配列番号4);及び
-  CACUCAGACUAUGUGCACCU(配列番号5)。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態において、Xnは、配列ACGGGCAACUUUACACGACG(配列番号49)、又はそれと少なくとも60%同一、より好ましくはそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも90%同一、更により好ましくはそれと少なくとも95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一である配列を含み、又はそれからなる。
【００３７】
本発明の特に好ましい実施形態において、制御可能なイントロンは、配列CNG/CNGCACUCAGACUACGUGCACCUCNG/CNGC(配列番号6)、又はそれと少なくとも60%同一、より好ましくはそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも90%同一、更により好ましくはそれと少なくとも95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一である配列を含み、又はそれからなり、ただし、/は切断部位を表す。上記の配列同一性レベルによるバリアント配列において、スプライス部位標的配列は、好ましくは、CNG/CNGCとして残存し、その他の領域において配列バリエーションが存在する。
【００３８】
適切には、制御可能なイントロンは、配列CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CUGC(配列番号7)、又はそれと少なくとも60%同一、より好ましくはそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも90%同一、更により好ましくはそれと少なくとも95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一である配列を含み、又はそれからなり、ただし、/は切断部位を表す。上記の配列同一性レベルによるバリアント配列において、スプライス部位標的配列は、好ましくは、CAG/CUGCとして残存し、その他の領域において配列バリエーションが存在する。
【００３９】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、制御可能なイントロンは以下の配列の1つを含み、又はそれからなる:
-  CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CNG(配列番号8);
-  CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCUCCUCUG/CNG(配列番号9);
-  CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCCCCUCUG/CNG(配列番号10);
-  CNG/CAGCACUCAGACUACGUGCGCCUCUG/CNG(配列番号11);及び
-  CNG/CAGCACUCAGACUAUGUGCACCUCUG/CNG(配列番号12)。
【００４０】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、制御可能なイントロンは以下の配列の1つを含み、又はそれからなる:
-  CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CUGC(配列番号7);
-  CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCUCCUCUG/CUGC(配列番号13);
-  CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCCCCUCUG/CUGC(配列番号14);
-  CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCGCCUCUG/CUGC(配列番号15);及び
-  CAG/CAGCACUCAGACUAUGUGCACCUCUG/CUGC(配列番号16)。
【００４１】
本発明の別の実施形態において、制御可能なイントロンは、配列
【化１】
2020533019.tif 000002
(配列番号17)又は
【化２】
2020533019.tif 000003
(配列番号27)を含み、ただし、/は切断部位を表す。この配列は、下線の引かれた位置における、哺乳類XBP1イントロン配列へのトリヌクレオチドCUGの付加から生じる。このトリヌクレオチドの付加は、そのイントロンのスプライシングをわずかに脱最適化（de-optimise）して、細胞におけるいかなる望ましくないスプライシングも(及びそれゆえに、発現産物のバックグラウンド発現を)低下させると考えられている。
【００４２】
したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態において、XnはCAGCACUCAGACUACGUGCACCU(配列番号23)を含み、又はそれからなる。
【００４３】
本発明の別の実施形態において、制御可能なイントロンは、配列:CNG/CAGACGGGCAACUUUACACGACGCUG/CNG(配列番号50)、又はそれと少なくとも60%同一、より好ましくはそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも90%同一、更により好ましくはそれと少なくとも95%、96%、97%、98%、若しくは99%同一である配列を含み、ただし、/は切断部位を表す。上記の配列同一性レベルによるバリアント配列において、スプライス部位標的配列は、好ましくは、CNG/CNGとして残存し、その他の領域において配列バリエーションが存在する。
【００４４】
誤解を避けるために、本発明のイントロン配列において、イントロンの各末端におけるスプライス部位標的配列は、CNG/CNGとして、より好ましくはCNG/CNG[CG]として制約されることが好ましいことは留意されたい。したがって、スプライス部位標的配列におけるいくつかのバリエーションがこれらの配列により提供されるが、必要があれば、さらなるバリエーションは、その2つのスプライス部位標的配列の間に位置する中央配列に収容されるべきである。
【００４５】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、制御可能なイントロンは、XBP1イントロン、Hac1イントロン、bZIP60イントロン、又はそのホモログである。これは、イントロンが、XBP1、Hac1、若しくはbZIP60イントロンの野生型、又はその天然に存在するホモログであり得ることを意味する。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態において、転写産物におけるスプライス部位標的配列(すなわち、配列CNG/CNGを含む)は、相互作用して、ステムループ構造を形成することができる配列によって隣接されていることが望ましくあり得る。したがって、スプライス部位標的配列は、好ましくは、互いとハイブリダイズして、ステムループ構造を形成するように、互いに相補的である配列によって隣接されており、そのステムループ構造において、スプライス部位標的配列は、転写産物に形成されるステムループ構造のループ領域内に、少なくとも部分的に、好ましくは全体的に位置する。
【００４７】
野生型XBP1、HAC1、及びbZIP60イントロンに関して、ステムループ構造がmRNA転写産物においてスプライス部位に形成されると仮定されている。これは、反対方向に読み取られるとき、ヌクレオチド配列において相補的である、スプライス部位標的配列に隣接した、イントロンにおける配列とエクソンにおける配列との間でのハイブリダイゼーションを含む。本明細書に報告された実験は、そのようなステムループ構造が形成されるとは予想されない状況でイントロンがコード配列に挿入された場合、スプライシングがうまく実行されることを示している。したがって、ステムループ構造の形成は、本発明の制御可能なイントロンのスプライシングの成功に必要ではないように思われる。
【００４８】
とは言うものの、場合によっては、ステムループ構造が形成されることが望ましくあり得、これが、例えば、最適なスプライシング活性を生じ得るためである。代わりに、場合によっては、ステムループ構造を形成することに修正可能である配列を提供することを回避することが望ましくあり得、ステムループ構造を形成することが、イントロンの望ましくない活性のスプライシングをもたらし得、それに従って、発現漏出をもたらす可能性があるためである。
【００４９】
ステムループ構造が形成されることになっている、本発明のある特定の実施形態において、転写産物により形成されるステムループ構造は、好ましくは、6ヌクレオチドから9ヌクレオチドまでを含むループ、及び3ヌクレオチド長から10ヌクレオチド長までであるステムを含む。より好ましくは、ステムループ構造は、7ヌクレオチドから8ヌクレオチドまでを含むループ、及び4ヌクレオチド長から8ヌクレオチド長までであるステムを含む。
【００５０】
ステムループ構造が形成されることになっている、本発明のある特定の実施形態において、イントロンは、以下のようにスプライス標的部位に配列を適切に含み得る:
-Yn-CNG/CNG-A-Zn-
ただし、Aは0ヌクレオチドから3ヌクレオチドまで(好ましくは1ヌクレオチド又は2ヌクレオチド)の長さを有し、/は切断部位を表し、Yn及びZnは、反対方向に読み取られるとき、ヌクレオチド配列において相補的であり、それゆえに、ハイブリダイズして、ステムループ構造のステムを形成することができる配列を表す。Yn及びZnは、好ましくは3ヌクレオチド長から10ヌクレオチド長まで、より好ましくは4ヌクレオチド長から8ヌクレオチド長までである。
【００５１】
いくつかの実施形態において、イントロンは、適切には、以下のようにスプライス標的部位に配列を含み得る:
-Zn-CNG/CNG[CG]-A-Yn-、ただし、その構成要素は上記と同じ意味をもつ。この場合、Aは、好ましくは、0ヌクレオチド、1ヌクレオチド、又は2ヌクレオチドの長さを有する。
【００５２】
ステム構造を与えるように適切な相補的配列(例えば、上記の構造におけるYn及びZn)を提供することは、隣接コード(すなわち、エクソン)配列における対応する配列に相補的である適切な領域を提供するようにイントロンの配列を適応させることにより達成され得ることは明らかだろう。コード領域の配列をある程度、例えば、コードされたアミノ酸配列に影響を与えることなく核酸配列を変化させるように遺伝暗号における重複性を利用することにより、変化させることもまた可能又は望ましくあり得る;典型的には、発現産物のアミノ酸配列における変化は、回避されるべきである。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態において、核酸発現構築物は、制御可能なイントロンをコードする配列を含む発現産物をコードする核酸配列と作動可能に連結した誘導性プロモーターを含む。上記で言及されているように、誘導性プロモーターは当技術分野において知られている。誘導性プロモーターと本発明の制御可能なイントロンを組み合わせることにより、発現の二重レベルを達成することができ、すなわち、転写レベルと翻訳レベルの両方において調節することができる。これは、例えば、いかなる発現「漏出」も回避するために、発現の非常に厳密な調節を可能にすることができる。これは、例えば、毒性タンパク質の発現中、又はバックグラウンド発現の量が、所望の時点での発現の誘導前に絶対的最小値に維持されなければならない任意の場合において、重要であり得る。
【００５４】
好ましい実施形態において、誘導性プロモーターは、アンフォールディング型タンパク質応答(UPR)誘導性プロモーター、すなわち、それ自体、UPRによって誘導されるプロモーターである。そのような実施形態において、UPRの誘導は、転写を駆動させることに関してと、制御可能なイントロンのスプライシングの結果として機能性発現産物の発現を可能にすることにおいての両方において、発現を誘導するように働く。
【００５５】
本発明の実施形態において、UPR誘導性プロモーターは、適切には、UPRにおいてタンパク質発現を駆動させる、ATF6、XBP1、bZIP60、又はホモログ若しくは別途等価の転写因子に対する少なくとも1つの結合部位を含む。
【００５６】
適切には、UPR誘導性プロモーターは、以下の配列の少なくとも1つの1つ又は複数のコピーを含む:
-  TGACGTG(ATF6コンセンサス配列)、
-  TGACGTGCT(上記のバリアント)
-  TGACGTG[TG](UPRE部位として知られている)、
-  CCAAT-N9-CCACG(ERSE1部位として知られている)(配列番号18)、及び
-  ATTGG-N-CCACG(ERSE2部位として知られている)(配列番号19)。
【００５７】
これらの部位は、ATF6、XBP1、及びbZIP60によって結合される。
【００５８】
適切には、プロモーターは、配列TGACGTG(任意選択で、TGACGTGCT又はTGACGTG[TG]の一部として)の1つ又は複数のコピー、好ましくは配列TGACGTG[TG](任意選択で、TGACGTGCT又はTGACGTG[TG]の一部として)の3つ又はそれ以上のコピー、及び好ましくは配列TGACGTG[TG](任意選択で、TGACGTGCT又はTGACGTG[TG]の一部として)の5つ又はそれ以上のコピーを含む。
【００５９】
例示的なUPR誘導性プロモーター配列は、以下の配列(配列番号20):TGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCT
を含む。この配列はUPRE部位の6つのタンデムコピーを含む。
【００６０】
別の例示的なUPR誘導性プロモーター配列は以下の配列(配列番号47):
TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTを含む。この配列は、UPRE部位の6つのコピーを含み、それぞれが、20ヌクレオチドの間隔を置いて配置されている。
【００６１】
適切には、UPR誘導性プロモーターは、最小プロモーター配列(例えば、CMV最小プロモーター)と作動可能に連結した、UPRを駆動させるATF6、XBP1、又はホモログ若しくは別途等価の転写因子に対する前記少なくとも1つの結合部位を含む。他の適切な最小プロモーターは当技術分野において知られている。
【００６２】
CMV最小プロモーターは、以下の配列(配列番号21):
AGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTAGATACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGAT
を有する。
【００６３】
したがって、例示的な誘導性プロモーターは、配列番号21による配列を有する核酸の上流に位置し、且つそれと作動可能に連結した、配列番号20による配列を含む核酸を含む。
【００６４】
例えば、誘導性プロモーターは、適切には、以下の配列(配列番号22):
TGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTGGTACCGTCGACGATATCGGATCCAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTAGATACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATCGCCACC
を含み得る。
【００６５】
制御可能なイントロンと共に用いることができるUPR誘導性プロモーターのさらなる詳細は、下記に提供されている。
【００６６】
発現産物をコードする核酸配列は、適切には、導入遺伝子である。導入遺伝子は、典型的には、RNA又はポリペプチド(タンパク質)等の遺伝子発現産物をコードする。導入遺伝子は、完全長cDNA若しくはゲノムDNA配列、又は少なくともいくらかの生物活性を有する任意の断片、サブユニット、若しくは変異体であり得る。導入遺伝子は、適切には、ミニ遺伝子、すなわち、それの天然のイントロンの配列の一部、大部分、又は全部を欠く遺伝子配列であり得る。導入遺伝子は、任意選択で、通常のイントロン配列を含んでもよい(すなわち、制御可能なイントロンに加えて)。任意選択で、導入遺伝子は、ハイブリッド核酸配列、すなわち、同種性及び/若しくは異種性cDNA並びに/又はゲノムDNA断片から構築されるものであり得る。「変異体」とは、野生型又は天然に存在する配列とは異なる1つ又は複数のヌクレオチドを含有する核酸配列を意味し、すなわち、変異体核酸配列は1つ又は複数のヌクレオチド置換、欠失、及び/又は挿入を含有する。ヌクレオチド置換、欠失、及び/又は挿入は、アミノ酸/核酸配列の点で野生型アミノ酸/核酸配列とは異なる遺伝子産物(すなわち、タンパク質又は核酸)を生じ得る。場合によっては、導入遺伝子はまた、その導入遺伝子産物が細胞から分泌されるだろうようにリーダーペプチド又はシグナル配列をコードする配列を含んでもよい。
【００６７】
通常の(すなわち、制御不可能な)イントロンは、上記で論じられた制御可能なイントロンに加えて、発現産物をコードする核酸配列において利用することができる。用語「通常のイントロン」は、核のスプライシング装置により認識及びスプライシングされるのに十分大きい、イントロン全体の任意の部分を包含する。典型的には、発現カセットのサイズをできる限り小さく保つ(そのことが、発現カセットの構築及び操作を容易にする)ために短く機能的なイントロン配列が好ましい。いくつかの実施形態において、イントロンは、発現産物をコードする核酸配列によりコードされるタンパク質をコードする遺伝子から得られる。通常のイントロンは、発現をコードする配列の5'側、発現をコードする配列の3'側、又は発現をコードする配列内に位置し得る。したがって、いくつかの実施形態において、発現産物をコードする核酸配列は、通常のイントロンを更に含む。適切なイントロンの非限定的例は、マウス微小ウイルス(MVM)イントロン、ベータ-グロビンイントロン(betalVS-ll)、第IX因子(FIX)イントロンA、サルウイルス(SV40)スモールtイントロン、及びベータ-アクチンイントロンである。イントロンは、当技術分野において周知されているように、発現レベルの向上に関して効果がある。
【００６８】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、発現産物をコードする核酸配列はタンパク質をコードする。本質的にいかなるタンパク質も用いることができ、非限定的例として、そのタンパク質は、酵素、抗体若しくは抗体断片(例えば、モノクローナル抗体)、ウイルスタンパク質(例えば、REP-CAP、REV、VSV-G、又はRD114)、治療用タンパク質、又は毒性タンパク質(例えば、カスパーゼ3、8、又は9)であり得る。
【００６９】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、発現産物をコードする核酸配列は毒性タンパク質をコードする。この場合における「毒性タンパク質」は、使用中、発現産物が産生される細胞への毒性があるタンパク質を意味する。例えば、毒性タンパク質は、以下のうちの1つであり得る:カスパーゼ3、カスパーゼ8、カスパーゼ9、及び毒性ウイルスタンパク質(VSV-G又はAAV REPタンパク質等)。
【００７０】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、発現産物をコードする核酸配列は治療用発現産物をコードする。治療用発現産物は、タンパク質、例えば、分泌性タンパク質、例えば、凝固因子、例えば、第IX因子若しくは第VIII因子、サイトカイン、増殖因子、抗体若しくはナノボディ、ケモカイン、血漿因子、インスリン、エリスロポイエチン、リポタンパク質リパーゼ、又は毒性タンパク質等であり得る。
【００７１】
或いは、治療用発現産物は、siRNA又はmiRNA等のRNAであり得る。様々な治療用siRNAが当技術分野において記載されており、非限定的例として、siRNAは、FTDP-17(前頭側頭型認知症)、DYT1ジストニア、成長ホルモン欠損症、アルツハイマー病におけるBACE1、白血病(例えば、c-raf、bcl-2をターゲットする)、メラノーマ(例えば、ATF2、BRAFをターゲットする)、前立腺癌(例えば、P110Bをターゲットする)、及び膵癌(例えば、K-Rasをターゲットする)を処置することを意図されるものであり得る。siRNA治療は、「Therapeutic potentials of short interfering RNAs」、Appl Microbiol Biotechnol、DOI 10.1007/s00253-017-8433-zに要約されている。同様に、miRNAについて、本発明により実行することができる様々なmiRNA治療アプローチは、「MicroRNA therapeutics: towards a new era for the management of cancer and other diseases」、Nature Reviews Drug Discovery; 16、203〜222頁(2017)に要約されている。
【００７２】
適切には、核酸発現構築物は、リボソーム結合部位、開始コドン、停止コドン、及び転写終結配列の1つ又は複数、好ましくは全部を提供し、又はコードする配列を含む。
【００７３】
さらなる態様において、本発明は、発現産物(例えば、遺伝子)をコードする配列を含む核酸であって、前記発現産物をコードする配列が、制御可能なイントロンをコードする配列を含み、前記制御可能なイントロンが、細胞におけるアンフォールディング型タンパク質応答(UPR)系によって、合成発現構築物から産生された転写産物からスプライシングで切り出される能力があり、それにより、結果として、機能性発現産物をコードする転写産物を生じる、切除可能な配列を含むイントロンであり、前記発現産物がXBP1タンパク質でも、Hac1タンパク質でも、bZIP60タンパク質でも、そのホモログでもない、核酸を提供する。
【００７４】
したがって、発現産物をコードする配列は、本発明による制御可能なイントロンを天然で含有する遺伝子ではない。換言すれば、制御可能なイントロンは、それが見出される、発現産物をコードする配列とは異種性である。
【００７５】
制御可能なイントロン、及び発現産物をコードする配列の好ましい特徴は、上記で示されている通りである。
【００７６】
そのような核酸は、前記核酸の転写を駆動させるのに必要とされるプロモーター及び任意の他のエレメントと作動可能に連結しているように、任意の適切な発現構築物、例えば、発現ベクターに挿入することができる。機能性発現産物の発現は、制御可能なイントロンによって調節されるだろう。
【００７７】
さらなる態様において、本発明は、上記で示されているように、合成核酸発現構築物を含むベクターを提供する。
【００７８】
用語「ベクター」は、当技術分野において周知されており、本出願で用いられる場合、本発明による核酸発現構築物に挿入され得る核酸分子、例えば、二本鎖DNAを指す。ベクターは、適切には、挿入された核酸分子を適切な宿主細胞へ輸送するために用いられる。ベクターは、典型的には、挿入核酸分子を転写し、及び、好ましくは、その転写産物をポリペプチドへ翻訳することを可能にする必要なエレメントの全部を含有する。ベクターは、典型的には、いったんベクターが宿主細胞内にあるならば、ベクターは、宿主染色体DNAとは無関係に、又は同時発生的に複製し得る(ベクター及びそれの挿入された核酸分子の数個のコピーが生成され得る)ように、必要なエレメントの全部を含有する。本発明のベクターは、エピソームベクター(すなわち、宿主細胞のゲノムへ統合されない)であり得、又は宿主細胞ゲノムへ統合されるベクターであり得る。この定義は、非ウイルスベクターとウイルスベクターの両方を含む。非ウイルスベクターには、プラスミドベクター(例えば、pMA-RQ、pUCベクター、bluescriptベクター(pBS)、及びpBR322、又は細菌配列を欠くそれらの誘導体(ミニサークル))、トランスポゾンに基づいたベクター(例えば、PiggyBac (PB)ベクター又はSleeping Beauty (SB)ベクター)等が挙げられるが、それらに限定されない。人工染色体(細菌(BAC)、酵母(YAC)、又はヒト(HAC))等のより大きいベクターが、より大きい挿入断片を収容するために用いられ得る。ウイルスベクターは、ウイルスに由来し、それには、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、肝炎ウイルスのベクター等が挙げられるが、それらに限定されない。必ずというわけではないが、典型的には、ウイルスベクターは、複製に必須のウイルス遺伝子がウイルスベクターから除去されているため、所定の細胞において増殖する能力を喪失しているので、複製欠損性である。しかしながら、いくつかのウイルスベクターはまた、例えば、癌細胞等の所定の細胞において特定的に複製するように適応させることができ、典型的には、(癌)細胞特異的(腫瘍)溶解を引き起こすために用いられる。ビロソームは、ウイルスエレメントと非ウイルスエレメントの両方を含むベクタ
ーの非限定的例であり、特に、それらは、リポソームを、不活性化HIV又はインフルエンザウイルスと組み合わせている(Yamadaら、2003)。別の例は、陽イオン性脂質と混合されたウイルスベクターを包含する。
【００７９】
いくつかの好ましい実施形態において、ベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、又はアデノ随伴ウイルス(AAV)のベクター等のウイルスベクターであり、より好ましくはAAVベクターである。AAVベクターは、好ましくは、AAV形質導入における律速段階の1つ(すなわち、一本鎖AAVから二本鎖AAVへの変換)を克服するために自己相補的な二本鎖AAVベクター(scAAV)として用いられるが(McCarty、2001、2003; Nathwaniら、2002、2006、2011; Wuら、2008)、一本鎖AAVベクター(ssAAV)の使用もまた本明細書に包含される。
【００８０】
いくつかの好ましい実施形態において、ベクターはプラスミドである。そのようなプラスミドは、1つ又は複数の選択マーカー、1つ又は複数の複製起点、ポリクローニング部位等の様々な他の機能性核酸配列を含み得る。
【００８１】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、ベクターは、真核生物細胞における発現のための発現ベクターである。真核生物発現ベクターの例には、Stratagene社から入手できるpW-LNEO、pSV2CAT、pOG44、pXTl、及びpSG; Amersham Pharmacia Biotech社から入手できるpSVK3、pBPV、pMSG、及びpSVL;並びにClontech社から入手できるpCMVDsRed2-express、pIRES2-DsRed2、pDsRed2-Mito、pCMV-EGFPが挙げられるが、それらに限定されない。多くの他のベクターが周知されており、市販されている。哺乳類細胞について、アデノウイルスベクター、pSVシリーズ及びpCMVシリーズのベクターが特に周知の非限定的例である。多くの周知の酵母発現ベクターがあり、それには、非限定的に、酵母組込み型プラスミド(YIp)及び酵母複製型プラスミド(YRp)が挙げられる。植物について、アグロバクテリウムのTiプラスミドは例示的な発現ベクターであり、植物ウイルスもまた、適切な発現ベクターを提供し、例えば、タバコモザイクウイルス(TMV)、ジャガイモウイルスX、及びササゲモザイクウイルスである。
【００８２】
いくつかの好ましい実施形態において、ベクターは遺伝子治療ベクターである。様々な遺伝子治療ベクターが当技術分野において知られており、AAVベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、及びレンチウイルスベクターを挙げることができる。ベクターが遺伝子治療ベクターである場合、発現産物をコードする核酸配列は、適切には、治療用タンパク質をコードする。治療用タンパク質は分泌性タンパク質であり得る。分泌性タンパク質、特に分泌性治療用タンパク質の非限定的例には、第VIII因子又は第IX因子等の凝固因子、インスリン、エリスロポイエチン、リポタンパク質リパーゼ、抗体又はナノボディ、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、血漿因子、毒性タンパク質等が挙げられる。
【００８３】
本発明の核酸発現構築物及びベクターは、薬学的に許容される賦形剤、すなわち、1つ又は複数の薬学的に許容される担体物質及び/又は添加物、例えば、バッファー、担体、賦形剤、安定剤等と共に薬学的組成物において製剤化され得る。薬学的組成物は、キットの形をとって提供され得る。本明細書で用いられる場合、用語「薬学的に許容される」は、その技術分野と一致し、薬学的組成物の他の成分と適合性であり、且つそれのレシピエントに有害ではないことを意味する。
【００８４】
したがって、本発明のさらなる態様は、本明細書に記載された核酸発現構築物又はベクターを含む薬学的組成物を提供する。
【００８５】
本発明のさらなる態様において、薬学的組成物の製造のための、本発明の様々な態様による核酸発現構築物及びベクターの使用が提供される。
【００８６】
本発明のさらなる態様によれば、本発明による合成核酸発現構築物又はベクターを含む細胞が提供される。
【００８７】
好ましくは、細胞は真核細胞である。真核細胞は、適切には、真菌細胞(例えば、酵母細胞)、動物(後生動物)細胞(例えば、哺乳類細胞)、又は植物細胞であり得る。
【００８８】
本発明のいくつかの実施形態において、細胞は原核細胞であり得る;原核細胞はUPRを有しないが、それにも関わらず、原核細胞は、合成核酸発現構築物の作製又は合成核酸発現構築物を取り扱うことにおける他の工程において有用であり得る。
【００８９】
本発明のいくつかの好ましい実施形態において、細胞はエクスビボ、例えば、細胞培養物中である。本発明の他の実施形態において、細胞は、組織又は多細胞生物体の一部であり得る。
【００９０】
いくつかの好ましい実施形態において、発現産物は、構築物又はベクターが存在する細胞への毒性がある。一つのそのような実施形態において、細胞は、本発明による合成核酸発現構築物又はベクターを含む細胞治療用の細胞(例えば、治療用T細胞等の治療用免疫細胞)であり、前記発現産物が前記細胞への毒性がある。そのような実施形態において、UPRの誘導は、細胞の死を誘導するのに、すなわち、殺害スイッチとして、適し得る。適切な毒性発現産物には、カスパーゼ、例えば、カスパーゼ3、カスパーゼ8、又はカスパーゼ9が挙げられる。
【００９１】
合成核酸発現構築物は、細胞のゲノムに挿入されてもよいし、エピソームベクター内に存在してもよい。
【００９２】
さらなる態様において、本発明は、
a) 本発明による合成核酸発現構築物を含む真核細胞集団を供給する工程;
b) アンフォールディング型タンパク質応答を誘導し、それにより、制御可能なイントロンからの切除可能な配列のスプライシングを誘導するように前記細胞集団を処理する工程;
c) 発現産物の産生のための適切な条件下で前記細胞集団をインキュベートする工程;及び
d) 前記細胞集団から前記発現産物を単離する工程
を含む、発現産物を産生するための方法を提供する。
【００９３】
方法は、適切には、細胞培養方法である。したがって、細胞は、用いられることになっている細胞型についての適切な細胞培養条件下で供給され得る。適切な細胞培養条件は当業者に周知されている。
【００９４】
合成核酸発現構築物は、ゲノム内に存在し得、又はエピソームであり得る。
【００９５】
本発明が、発現産物(又は発現産物の活性型)の産生が細胞培養プロセスにおいて所望の時点まで遅延することを可能にすることは明らかであろう。これは、例えば、細胞集団が、所望の細胞数若しくは濃度に達し、又は所望の成長期に達するような時点まで増殖することを可能にできる。
【００９６】
例えば、毒性タンパク質の場合、機能性(すなわち、毒性)発現産物の産生は、細胞培養系が所望の時期にあるまで回避させることができる。いったん毒性タンパク質が発現したならば、細胞は、もちろん、悪影響を受け、又は殺害されるだろう。
【００９７】
方法は、適切には、アンフォールディング型タンパク質応答(UPR)を誘導するように前記細胞集団を処理する工程b)の前に、前記細胞集団を前記細胞の増殖に適した条件下でインキュベートする工程を含む。
【００９８】
典型的には、工程b)は、前記細胞にストレスを加えることを含み、前記ストレスがUPRを誘導するのに適している。UPRを誘導するために用いることができる様々なストレスがあり、それらは文献に広く記載されている。
【００９９】
いくつかの好ましい実施形態において、UPRを誘導する工程は、適切には、前記細胞においてUPRを誘導することができる化学物質(すなわち、UPR誘導化学物質)を投与することを含む。
【０１００】
当業者は、UPRを誘導する任意の特定のストレス(例えば、化学物質)の能力を容易に評価することができる。例えば、当業者は、実施例1の方法において、DTTの代わりに(例えば、候補化学物質を投与することにより)ストレスを適切に加えることができる。UPRを誘導する作用物質の能力は、ストレス(例えば、化学物質)の適用が、機能性発現産物、すなわち、実施例1の場合ではEGFP、の発現へ生じる効果により同定される。もちろん、実施例1の方法は、必要に応じて、例えば、異なる細胞型又は異なる構築物を用いて、改変することができる。特に、実施例4は、どのようにして、様々な候補化学物質を、UPRを誘導するそれらの能力について試験することができるかを実証している。UPRを誘導するストレス(例えば、化学物質)の能力を評価するための様々な他の方法は、当業者にとって明らかだろう。
【０１０１】
ERストレスを誘導して、UPRを誘導することができる多くの化学物質が当技術分野において知られている。IRE1経路を誘導することができるUPR誘導化学物質は、本発明に用いるのに適しており、それらが、制御可能なイントロンのスプライシングをもたらすだろうからである。
【０１０２】
UPRを誘導するのに用いることができる例示的なUPR誘導化学物質には以下が挙げられる:
・ジチオスレイトール(DTT)  -  この作用物質はタンパク質のジスルフィド架橋を低下させる。変性したタンパク質はER内に蓄積された。
・ツニカマイシン  -  この作用物質はN結合型グリコシル化を阻害する。
・ブレフェルジンA  -  これは、アンフォールディング型タンパク質応答の誘導剤として一般的に用いられる。
・タプシガルジン  -  この作用物質は、筋小胞体/小胞体Ca2+-ATPアーゼ(SERCA)の阻害によりER Ca2+枯渇をもたらす。
・2-デオキシグルコース
・A23187(CAS番号  52665-69-7)
・ボルテゾミブ(Velcade)
・クエルセチン
・UPRが誘導されるように細胞における脂質バランスを乱す作用物質、例えば、飽和脂肪酸(例えば、パルミチン酸)  -  すなわち、脂質誘発型ERストレス応答/UPRを誘導する作用物質。
【０１０３】
そのようなUPR誘導化学物質は、適切な濃度で投与することができ、そのような濃度は、当業者により日常的な実験及び文献の参照を通して容易に決定することができる。様々な作用物質の投与についての適切な濃度は以下の通りである:DTT 2mM;ツニカマイシン  2.5〜5μg/ml;ブレフェルジンA 0.5μg/ml;タプシガルジン0.1〜1μM;2-デオキシグルコース  4mM;A23187(CAS番号  52665-69-7) 0.5μM;ボルテゾミブ(Velcade) 5〜30nM;及びパルミチン酸(又は他の脂肪酸) 100μM。これらの濃度は、細胞が曝露される培地中の作用物質の濃度を指す。
【０１０４】
本発明に用いられる別のUPR誘導化学物質は、フォルスコリンである。フォルスコリン(コレオノール)は、インドコレウス植物(プレクトランタス・バルバツス(Plectranthus barbatus))により産生されるラブダン型ジテルペンである。フォルスコリンの他の名前には、パシャナブヘジ(pashanabhedi)、インドコレウス(Indian coleus)、マカンジ(makandi)、HL-362、及びNKH477が挙げられる。
【０１０５】
ジチオスレイトール(DTT)、ツニカマイシン、及びタプシガルジンは、文献において、UPRを誘導するのに広く用いられており、したがって、本発明のいくつかの実施形態において、好ましいUPR誘導化学物質を代表する。フォルスコリンは、別の好ましいUPR誘導化学物質であるが、ただし、インビボでの使用についてのそれの安全性プロフィールを考慮すれば、これに限定されない。
【０１０６】
本発明の特定の好ましい実施形態において、前記細胞における脂質バランスを乱すことができるUPR誘導化学物質が、UPRを誘導するために投与される。UPRを誘導することにおける脂質及び脂質代謝の役割は文献において広く報告されており、その現象は「脂質誘発型ERストレス応答/UPR」と名付けられている。例えば、Iwao及びShidoj、PLOS ONE |DOI:10.1371/journal.pone.0132761 2015年7月17日; Robbleeら、「Saturated Fatty Acids Engage an IRE1a-Dependent Pathway to Activate the NLRP3 Inflammasome in Myeloid Cells」  Cell Reports 14、2611〜2623頁、2016年3月22日; Ariyamaら、「Decrease in Membrane Phospholipid Unsaturation Induces Unfolded Protein Response」  THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY 285巻、29号、22027〜22035頁、2010年7月16日; Basseri及びAustin  「Endoplasmic Reticulum Stress and Lipid Metabolism: Mechanisms and Therapeutic Potential」  Biochemistry Research International 2012巻、Article ID 841362、13頁、doi:10.1155/2012/841362; Kitaiら、「Membrane lipid saturation activates IRE1a without inducing clustering」  Genes to Cells (2013) 18、798〜809頁を参照。
【０１０７】
したがって、適切には、UPR誘導化学物質は、UPRが誘導されるように細胞の脂質バランスを変化させることができる。これを達成することができる様々な作用物質がある。例えば、脂質飽和レベルが増加する（したがって不飽和脂質レベルが減少する）ような、細胞における脂質バランスの乱れは、結果としてUPRの誘導を生じることが示されている。したがって、適切には、UPR誘導化学物質は、脂質飽和レベルが増加するように、細胞の脂質バランスを変化させることができる。
【０１０８】
好ましくは、UPR誘導化学物質は、飽和脂肪酸の割合が増加するように、細胞膜における飽和脂肪酸の不飽和脂肪酸に対する比を変化させることができる。これは、いくつかの方法、例えば、飽和脂肪酸を細胞に導入すること、又は飽和脂肪酸を不飽和脂肪酸へ変換する酵素の活性を阻害することで、達成することができる。
【０１０９】
したがって、一つの特に好ましい実施形態において、UPR誘導化学物質は、飽和脂肪酸、適切には、中鎖又は長鎖の飽和脂肪酸を含む。本発明のある特定の実施形態において、脂肪酸は、6個から26個までの炭素、より好ましくは9個から22個までの炭素、更により好ましくは12個から20個までの炭素、更により好ましくは14個から20個までの炭素の脂肪族鎖の長さを有する。
【０１１０】
適切には、UPR誘導化学物質は、以下からなるリストから選択される少なくとも1つの脂肪酸を含む:  カプロン酸、エナント酸、カプリル酸、ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシレン酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、アラキドン酸、ヘンイコシル酸、ベヘン酸、トリコシル酸、リグノセリン酸、ペンタコシル酸、及びセロチン酸。より好ましくは、UPR誘導化学物質は、以下からなるリストから選択される少なくとも1つの脂肪酸を含む:ペラルゴン酸、カプリン酸、ウンデシレン酸、ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、アラキドン酸、ヘンイコシル酸、及びベヘン酸。更により好ましくは、UPR誘導化学物質は、以下からなるリストから選択される少なくとも1つの脂肪酸を含む:ラウリン酸、トリデシル酸、ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、及びアラキドン酸。更により好ましくは、UPR誘導化学物質は、以下からなるリストから選択される少なくとも1つの脂肪酸を含む:ミリスチン酸、ペンタデシル酸、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、ノナデシル酸、及びアラキドン酸。
【０１１１】
特定の好ましい実施形態において、UPR誘導化学物質はパルミチン酸又はステアリン酸を含む。
【０１１２】
脂肪酸が言及される場合、これらは、任意の適切な形、例えば、塩(パルミチン酸塩、ステアリン酸塩等)として提供され得ることは留意されるべきである。
【０１１３】
別の好ましい実施形態において、UPR誘導化学物質は、細胞においてステアロイル-CoAデサチュラーゼ酵素活性を下方制御することができる作用物質を含む。ステアロイル-CoAデサチュラーゼは、飽和脂肪酸において二重結合を導入するER常在酵素である。例えば、UPR誘導化学物質は、適切には、ステアロイル-CoAデサチュラーゼの阻害剤を含む。MF-43は、ステアロイル-CoAデサチュラーゼの適切な阻害剤の例である。或いは、UPR誘導化学物質は、ステアロイル-CoAデサチュラーゼの発現を、例えば、ステアロイル-CoAデサチュラーゼ発現のノックダウン(例えば、RNA干渉により)又はステアロイル-CoAデサチュラーゼ遺伝子のノックアウトを通して、下方制御し得る。脂肪酸の不飽和化に関与する他の遺伝子もターゲットされ得る。
【０１１４】
他の例示的なUPR誘導化学物質には、ゲラニルゲラン酸(GGA)、2,3-ジヒドロGGA、9-シスレチノイン酸及びオールトランスレチノイン酸が挙げられる(Chieko Iwao及びYoshihiro Shidoj、PLOS ONE DOI:10.1371/journal.pone.0132761 2015年7月17日参照)。
【０１１５】
いくつかのUPR誘導化学物質の組合せが、本発明のいくつかの実施形態に用いることができる。例えば、飽和脂肪酸(例えば、パルミチン酸)は、ステアロイル-CoAデサチュラーゼ酵素活性を下方制御することができる作用物質(例えば、MF-43)と組み合わせて用いることができる。
【０１１６】
本発明の別の実施形態において、工程b)におけるUPRを誘導する工程は、適切には、細胞集団においてUPR応答を誘導するために前記真核細胞集団において誘導タンパク質を発現することを含む。そのようなタンパク質は、「誘導タンパク質」と呼ばれ、それが細胞集団において発現するとき、それは、UPR応答を、典型的にはERストレスを生じさせることにより、誘導するように作用するからである。誘導タンパク質は、典型的には、本発明の第1の態様による合成核酸発現構築物によりコードされるものと異なるタンパク質である。誘導タンパク質は、適切には、異種性タンパク質であるが、いくつかの実施形態では、それは、過剰発現する同種性タンパク質であり得る。重要なのは、細胞における誘導タンパク質の発現がUPRを誘導することであり、そのUPRが、結果として、制御可能なイントロンのスプライシングを生じる。誘導タンパク質の発現を細胞集団において達成させることができる多くの方法がある。適切な実施形態において、細胞集団は、細胞において誘導タンパク質を発現するように適応している発現ベクターをトランスフェクションされる。一実施形態において、細胞を、ERストレス及びUPRの誘導をもたらすウイルスタンパク質の発現を生じるウイルスに感染させることができる。ウイルス又は非ウイルスのタンパク質をコードする組換えウイルスベクターもまた用いることができ、AAVが細胞において発現してUPRを誘導する例が下記に記載されている;これは、本発明の一つの好ましい実施形態を形成する。或いは、本質的に任意の他の型の発現ベクター(例えば、プラスミド)を、異種性タンパク質を発現させるために細胞へ導入することができる。適切な発現ベクターを細胞にトランスフェクションする適切な方法は当技術分野において周知されている。誘導タンパク質の性質は、典型的には、特に懸念されることはないが、そのタンパク質が無毒であることは一般的に好ましい;むしろ、重要であることは、異種性タンパク質産生が細胞において生じるというERストレスである。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、工程b)は、前記細胞において誘導タンパク質、好ましくは異種性タンパク質を発現させる能力がある発現ベクターを前記細胞集団にトランスフェクションすることを含む。或いは、工程b)は、例えば工程a)の前に、すでに細胞へ導入された発現ベクターから誘導タンパク質の発現を誘導することを含み得る。
【０１１８】
誘導タンパク質の発現は、構成的又は非構成的プロモーターの調節下であり得る。例示的な非構成的プロモーターは誘導性プロモーター(この場合、誘導性プロモーターはUPR誘導性プロモーターではない)である。
【０１１９】
アンフォールディング型タンパク質応答を誘導する他の方法は、細胞を低酸素又は糖質(例えば、グルコース)欠乏に曝すことを含む。
【０１２０】
上記で言及されているように、真核生物に渡るIRE1媒介性イントロンスライシングの遍在性を考慮すれば、方法は任意の型の真核細胞に関して実施することができる。したがって、方法は、例えば、真菌細胞(例えば、酵母細胞)、動物(後生動物)細胞(例えば、哺乳類細胞)、及び植物細胞において行うことができる。
【０１２１】
ある特定の好ましい実施形態において、真核細胞集団は動物(後生動物)細胞集団である。適切には、動物細胞は無脊椎動物又は脊椎動物由来の細胞であり得る。
【０１２２】
いくつかの好ましい実施形態において、真核細胞集団は哺乳類細胞集団である。用いることができる様々な哺乳類細胞があり、それには、非限定的に、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞(例えば、HEK-293)、ヒト胎児由来網膜細胞、ヒト羊膜細胞、マウス骨髄腫リンパ芽球様細胞が挙げられる。そのような実施形態において、制御可能なイントロンが、そのイントロンの一方、他方、又は両方(好ましくは両方)の末端に配列CNG/CNG[CG]、すなわち、哺乳類スプライス標的コンセンサス配列を含むイントロンであることが好ましくあり得る。適切には、例えば、制御可能なイントロンは、配列:
CNG/CNGCACUCAGACUACGUGCACCUCNG/CNGC(配列番号6)、
CAG/CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG/CUGC(配列番号7)、又は
【化３】
2020533019.tif 000004
(配列番号17)を有する。
【０１２３】
他の実施形態において、真核細胞集団は、昆虫細胞集団である。本方法に用いられる適切な昆虫細胞には、以下の昆虫種由来の細胞等のバキュロウイルス感染細胞及び非感染細胞が挙げられる:  ヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(例えば、Sf9又はSf21)、イラクサギンウワバ(Trichoplusia ni)(例えば、Hi-5)、キイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)(例えば、Schneider 2細胞及びSchneider 3細胞)。
【０１２４】
本発明の他の実施形態において、真核細胞集団は、適切には、真核細胞、好ましくは、酵母細胞の集団である。本方法に用いられる適切な真菌細胞には、非限定的に、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、アスペルギルス種(Aspergillus spp.)、トリコデルマ種(Trichoderma spp.)、及びミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)が挙げられる。
【０１２５】
本発明の他の実施形態において、真核細胞集団は、適切には、植物細胞又は植物プロトプラストの集団である。
【０１２６】
本発明の他の実施形態において、真核細胞集団は、適切には、原生動物細胞、例えば、リーシュマニア・タレントラエ(Leishmania tarentolae)の集団である。
【０１２７】
工程d)、すなわち、前記細胞集団から発現産物を単離する工程は、当技術分野において周知の通常の技術を用いて行うことができる。そのような技術は、もちろん、発現産物の性質によって異なる。
【０１２８】
方法は、適切には、核酸発現構築物を細胞へ導入する工程を含み得る。真核細胞にトランスフェクションする多くの周知の方法があり、当業者は、任意の細胞型についての適切な方法を容易に選択することができる。核酸発現構築物は、もちろん、任意の適切なベクターにおいて提供され得る。
【０１２９】
さらなる態様において、本発明は、処置又は治療の方法に用いられる、本発明の様々な態様による核酸発現構築物、ベクター、細胞、又は薬学的組成物を提供する。
【０１３０】
本明細書で用いられる場合、用語「処置する」又は「処置」は、治療的処置と予防的又は防止的手段の両方を指す。有益な又は望ましい臨床結果には、検出可能か検出不可能かに関わらず、望ましくない臨床状態若しくは障害の防止、障害の発生率を低下させること、障害に関連した症状の軽減、障害の程度の低下、障害の安定化した(すなわち、悪化していない)状態、障害の進行の遅延若しくは減速、障害の状態の改善若しくは緩和、寛解(部分的又は全体的に関わらず)、又はそれらの組合せが挙げられるが、それらに限定されない。「処置」はまた、処置を受けなかった場合の予想される生存期間と比較しての生存期間の延長を意味し得る。
【０１３１】
本明細書で用いられる場合、用語「治療的処置」又は「治療」等は、対象の身体若しくはその要素を望ましくない生理学的変化若しくは障害から望ましい状態、例えば、重症度若しくは不快度のより低い状態(例えば、改善又は緩和)にし、若しくはそれの正常な、健康な状態へ戻すこと(例えば、対象の健康、身体的完全性、及び身体的に満足な状態を回復させること)、それを前記の望ましくない生理学的変化若しくは障害に維持すること(例えば、安定化又は悪化しないこと)、又は前記望ましくない生理学的変化若しくは障害と比較してより重篤な若しくはより悪い状態への進行を防止し、若しくは減速させることが目的である処置を指す。
【０１３２】
本明細書で用いられる場合、用語「防止」、「防止的処置」、又は「予防的処置」等は、疾患又は障害に苦しめられる前に、疾患若しくは障害又はそれらに関連した症状の重症度を低下させることを含め、疾患又は障害の発症を防止することを包含する。そのような苦しみ前の防止又は低下は、投与時点においてその疾患又は障害の明らかな症状に苦しめられていない患者への、本明細書に記載された核酸発現構築物、ベクター、又は薬学的組成物の投与を指す。「防止すること」はまた、例として、改善の期間後に、疾患又は障害の再発又はぶり返しを防止することを包含する。実施形態において、本明細書に記載された核酸発現構築物、ベクター、又は薬学的組成物は、遺伝子治療用であり得る。
【０１３３】
本発明はまた、遺伝子治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載された核酸発現構築物、ベクター、又は薬学的組成物の使用を提供する。
【０１３４】
以下の工程を含む、前記遺伝子治療を必要としている対象における遺伝子治療のための方法も、本明細書に開示される:
-  本発明による核酸発現構築物を含む薬学的組成物を含む遺伝子治療ベクターを対象に導入して、その結果、前記遺伝子治療ベクターが前記核酸発現構築物を前記対象の標的細胞へ送達する工程であって、前記核酸発現構築物が、治療用発現産物をコードする配列を含む、工程;及び
-  治療的有効量の機能性治療用発現産物を対象の標的細胞において発現する工程。
【０１３５】
治療的有効量の機能性治療用発現産物の発現が、UPRが活性である細胞においてのみ起こることは明らかだろう。多くの場合、UPRは、ストレス下にある細胞、例えば、癌性である、又は病原体(例えば、ウイルス)に感染している細胞において活性である。したがって、機能性治療用産物(例えば、毒性タンパク質又は他の細胞毒性剤であり得る)の発現が、UPRが活性である細胞においてのみ起こることは、本発明の利点である。これは、機能性治療用発現産物の望ましくないオフターゲット発現を軽減し、又は回避するのに有用であり得る。
【０１３６】
したがって、治療に向けられた本発明の様々な態様において、処置され得る状態は癌又は感染症(例えば、ウイルスでの感染)であることが好ましい。
【０１３７】
或いは、UPRは、適切なUPR誘導剤を用いて細胞において誘導することができる。様々なUPR誘導剤が上記で論じられており、適切なUPR誘導剤には、UPRを誘導する薬学的に許容される作用物質(例えば、ボルテゾミブ、フォルスコリン)及びUPRを誘導するために細胞において脂質バランスを乱す作用物質が挙げられる（例えば、上記で論じられた飽和脂肪酸）。UPR誘導剤は、標的部位へ(例えば、注射により)直接的に送達され、又は全身性に与えられ得る。
【０１３８】
治療用発現産物は、ポリペプチド/タンパク質、例えば、分泌性タンパク質又はペプチド、例えば、第VIII因子又は第IX因子等の凝固因子、インスリン、エリスロポイエチン、リポタンパク質リパーゼ、抗体又はナノボディ、増殖因子、サイトカイン、ケモカイン、血漿因子、毒性タンパク質等であり得る。或いは、治療用発現産物は、siRNA又はmiRNA等のRNAであり得る。
【０１３９】
いくつかの好ましい実施形態において、治療用発現産物は、遺伝子治療ベクターが導入されている細胞への毒性があり得る。そのような実施形態において、UPRの誘導は、細胞において毒性、例えば、細胞死をもたらすことを誘導するために用いることができる。したがって、UPRの誘導、及び結果として生じる治療用発現産物の発現が、前記細胞において殺害スイッチを誘導するために用いることができる。タンパク質等の適切な毒性発現産物は当技術分野において周知されており、例えば、カスパーゼ3、カスパーゼ8、及びカスパーゼ9を挙げることができる。
【０１４０】
本発明のこの態様に用いられる適切な遺伝子治療ベクターは上記で論じられている。
【０１４１】
遺伝子治療プロトコールは、当技術分野において広く記載されている。これらには、適切なベクターの筋肉内注射、筋肉を含む様々な組織における水力学的遺伝子送達（hydrodynamic gene delivery）、間質注射、気道における点滴注入、内皮、肝実質内への適用、及び静脈内又は動脈内投与が挙げられるが、それらに限定されない。DNAの標的細胞への有効性を増強するために様々な装置が開発されている。単純なアプローチは、DNAを含有するカテーテル又は植え込み型材料と標的細胞を物理的に接触させることである。別のアプローチは、高圧下で標的細胞へ直接的に液体柱を発射する無針のジェット式注射器を利用することである。これらの送達パラダイムはまた、ベクターを送達するために用いることができる。標的化遺伝子送達への別のアプローチは、核酸の細胞への特異的ターゲティングのために核酸結合剤又はDNA結合剤が付着しているタンパク質又は合成リガンドからなる分子コンジュゲートの使用である(Cristianoら、1993)。
【０１４２】
用語「対象」及び「患者」は、本明細書で交換可能に用いられ、動物、好ましくは脊椎動物、より好ましくは哺乳類を指し、具体的には、ヒト患者及び非ヒト哺乳類を含む。「哺乳類」対象には、ヒトが挙げられるが、それに限定されない。好ましい患者又は対象はヒト対象である。
【０１４３】
本明細書で用いられる場合、「治療的量」又は「治療的有効量」は、対象において疾患又は障害を処置するのに有効な、すなわち、所望の局所的又は全身的効果を得るのに有効な、発現産物の量を指す。したがって、その用語は、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床医により求められている、組織、系、動物、又はヒトにおいて生物学的又は薬効的応答を誘発する発現産物の量を指す。そのような量は、典型的には、遺伝子産物及び疾患の重症度に依存するが、当業者により、おそらく日常的実験を通して、決定することができる。
【０１４４】
発現産物(例えば、タンパク質)の発現レベルは、例として、発現産物の治療的発現が達成されたかどうかを評価するために、抗体に基づいたアッセイ、例えば、ウェスタンブロット又はELISAアッセイによる等の様々な通常の手段により測定することができる。発現産物の発現はまた、遺伝子産物の酵素的又は生物学的活性を検出するバイオアッセイにおいて測定され得る。
【０１４５】
さらなる態様において、本発明は、合成のUPR応答性シス制御性エレメントを含む合成UPR誘導性プロモーターを提供する。適切には、UPR応答性シス制御性エレメントは、ATF6、XBP1、若しくはbZIP60、又はUPRの一部として遺伝子発現を駆動させるホモログ若しくは別途等価の転写因子に対する少なくとも1つの結合部位を含む。
【０１４６】
そのようなプロモーターは、UPRの誘導により、真核細胞において所望の発現産物の発現を選択的に駆動させるために用いることができる。そのようなプロモーターが、上記で論じられた制御可能なイントロンと組み合わせて用いられることは、遺伝子発現の厳密な調節に関して有利であり得るが、他の状況においては、UPR誘導性プロモーターは、制御可能なイントロン無しで用いることができる。
【０１４７】
UPR応答性シス制御性エレメントは、UPRの一部として遺伝子発現を駆動させる1つ又は複数の転写因子に対する機能性転写因子結合部位(TFBS)を含有する配列である。上記で論じられているように、これらには、ATF6、XBP1、及びbZIP60が挙げられるが、それらに限定されない。ATF6に対するTFBSを含むUPR応答性シス制御性エレメントは、本発明において特に関心対象となる。好ましくは、UPR応答性シス制御性エレメントはUPR特異的であり、すなわち、それは、UPR中だけ発現を増強する。例えば、それが、UPRに関与しない転写因子に対するいかなるTFBSも含有しないことは一般的に好ましい。
【０１４８】
合成UPR誘導性プロモーターは、典型的には、最小プロモーター又は近位プロモーターと作動可能に連結した少なくとも1つの合成UPR応答性シス制御性エレメントを含む。シス制御性エレメントは、近位プロモーターと作動可能に連結している場合、近位プロモーターは、それ自体、UPRが誘導されていないとき、真核細胞において作動可能に連結した遺伝子の転写を駆動させないUPR誘導性プロモーターであるべきである。最小プロモーターは、典型的には、追加の制御エレメントの存在なしで発現を駆動させることはできない。本発明に用いられる適切な最小プロモーターの例には、CMV-最小(配列番号21)プロモーター及びMinTk最小プロモーターが挙げられるが、それらに限定されない。他の適切な最小プロモーターは当技術分野において知られている。
【０１４９】
適切には、UPR誘導性プロモーターは、以下の転写因子標的配列の少なくとも1つの1つ又は複数のコピーを含むUPR応答性シス制御性エレメントを含む:
-  TGACGTG(ATF6転写因子結合部位コンセンサス配列)、
-  TGACGTGCT(上記のバリアント)、
-  TGACGTG[TG](UPRE部位として知られている)、
-  CCAAT-N9-CCACG(ERSE1部位として知られている)(配列番号18)、及び
-  ATTGG-N-CCACG(ERSE2部位として知られている)(配列番号19)。
【０１５０】
適切には、合成UPR応答性シス制御性エレメントは、上記で列挙された転写因子標的配列の少なくとも1つの2つ以上、好ましくは3つ以上、適切には5つ以上のコピーを含む。代替として、又は追加として、合成UPR応答性シス制御性エレメントは、適切には、上記で列挙された転写因子標的配列の少なくとも2つの1つ又は複数のコピーを含む。
【０１５１】
転写因子標的配列は、互いに直接隣接し得(タンデムリピート)、又は、例えば、スペーサー配列若しくは別の機能性配列(例えば、別の転写因子標的配列)によって間隔を置いて配置され得る。典型的には、存在するならば、スペーサー配列は、5〜50ヌクレオチド長であるが、場合によっては、より長く、又はより短くあり得る。例えば、スペーサー配列は、適切には2ヌクレオチド長から50ヌクレオチド長まで、適切には4ヌクレオチド長から30ヌクレオチド長まで、又は適切には5ヌクレオチド長から20ヌクレオチド長までである。スペーサー配列は、長さが5ヌクレオチドの倍数であることが好ましくあり得、これが、DNA二重らせんの整数回の半回転を提供するからである(一回の完全な回転はクロマチンにおいておよそ10ヌクレオチドに対応する)。長さが10ヌクレオチドの倍数であるスペーサー配列長はより好ましくあり得、それが、DNA二重らせんの整数回の完全な回転を提供するからである。スペーサー配列は、それが、UPR応答性シス制御性エレメントが要求通りに機能することを妨げる(例えば、それがサイレンサー配列を含む、所望の転写因子の結合を妨げる等)ことがないという条件で、本質的に任意の配列を有し得る。各転写因子標的配列間のスペーサー配列は、同一であり得、又はそれらは異なり得る。
【０１５２】
好ましい実施形態において、UPR応答性シス制御性エレメントは、転写因子標的配列TGACGTG(すなわち、ATF6コンセンサス配列)の1つ又は複数のコピー、好ましくは転写因子標的配列TGACGTGの3つ以上のコピー、好ましくは転写因子標的配列TGACGTGの5つ以上のコピー、例えば、転写因子標的配列TGACGTGの6つ以上のコピーを含む。上記で言及されているように、これらの転写因子標的配列は、タンデムリピートであり得、又は互いに間隔を置いて配置され得る。一般的に、UPR応答性シス制御性エレメントに存在する転写因子標的配列の少なくとも2つ、好ましくは全部が、例えば、上記で論じられているようなスペーサー配列によって、互いに間隔を置いて配置されることが好ましい。
【０１５３】
適切には、UPR応答性シス制御性エレメントは、転写因子標的配列TGACGTGCTの1つ又は複数のコピー、好ましくは転写因子標的配列TGACGTGCTの3つ以上のコピー、好ましくは転写因子標的配列TGACGTGCTの5つ以上のコピー、例えば、転写因子標的配列TGACGTGCTの6つ以上のコピーを含む。上記で言及されているように、これらは、タンデムリピートであり得、又は互いに間隔を置いて配置され得る。一般的に、UPR応答性シス制御性エレメントに存在する転写因子標的配列の少なくとも2つ、好ましくは全部が、例えば、上記で論じられているようなスペーサー配列によって、互いに間隔を置いて配置されることが好ましい。転写因子標的配列TGACGTGCTは、タンデムリピートとしてであろうがスペーサー配列を含んでいようが、UPR応答性シス制御性エレメントにおいて複数のコピー数で用いられる場合、特に効果的であることが見出されている。
【０１５４】
本発明のいくつかの実施形態において、UPR応答性シス制御性エレメントは配列
TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG-S-TGACGTG(配列番号54)を含み、ただし、Sは、上記で定義されているような任意選択のスペーサー配列を表す。好ましくは、上記で定義されているようなスペーサー配列は、転写因子標的配列(TGACGTG)の少なくとも2つ、好ましくは全部の間に存在する。
【０１５５】
本発明のいくつかの実施形態において、UPR応答性シス制御性エレメントは配列
TGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCT(配列番号20)を含む。
【０１５６】
本発明の他の実施形態において、UPR応答性シス制御性エレメントは配列
TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT-S-TGACGTGCT(配列番号55)を含み、ただし、Sは、上記で定義されているような任意選択のスペーサー配列を表す。好ましくは、上記で定義されているようなスペーサー配列は、転写因子標的配列の少なくとも2つ、好ましくは全部の間に存在する。
【０１５７】
本発明の他の実施形態において、UPR応答性シス制御性エレメントは配列
TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCT(配列番号56)、又はそれと少なくとも50%同一、更により好ましくはそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも85%、90%、95%、98%、若しくは99%同一である配列を含む。配列バリエーションは、転写因子標的配列、すなわち、配列TGACGTGCTを有するもの、ではない配列においてのみ存在することが非常に好ましい。配列バリエーションがスペーサー配列(すなわち、配列GATGATGCGTAGCTAGTAGT(配列番号61)を有するもの)にのみ存在することが一般的に好ましい。
【０１５８】
本発明のいくつかの実施形態において、UPR誘導性プロモーターは、以下の配列
TGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTTGACGTGCTGGTACCGTCGACGATATCGGATCCAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCGCCTAGATACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATCGCCACC(配列番号22)、又はそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも90%同一、更により好ましくはそれと少なくとも95%、96%、97%、98%、又は99%同一である配列を含む。このUPR誘導性プロモーターは、CMV-MP最小プロモーターと作動可能に連結した配列番号20のUPR応答性シス制御性エレメントを含む。配列バリエーションは、転写因子標的配列、すなわち、配列TGACGTGCTを有するもの、でもなく、CMV-MP配列でもない、配列においてのみ存在することが非常に好ましい。
【０１５９】
本発明の他の実施形態において、UPR誘導性プロモーターは、以下の配列:
TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTGCAGTTAGCGTAGCTGAGGTACCGTCGACGATATCGGATCCAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGAT(配列番号57)、又はそれと少なくとも50%同一、更により好ましくはそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも85%、90%、95%、98%、若しくは99%同一である配列を含む。このUPR誘導性プロモーターは、CMV-MP最小プロモーターと作動可能に連結した配列番号56のUPR応答性シス制御性エレメントを含む。配列バリエーションは、転写因子標的配列、すなわち、配列TGACGTGCTを有するもの、でもなく、CMV-MP配列でもない、配列においてのみ存在することが非常に好ましい。配列バリエーションがスペーサー配列(すなわち、配列GATGATGCGTAGCTAGTAGT(配列番号61)を有するもの)にのみ存在することが一般的に好ましい。
【０１６０】
本発明の他の実施形態において、UPR誘導性プロモーターは、以下の配列:
TGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTTGACGTGCTGATGATGCGTAGCTAGTAGTGCAGTTAGCGTAGCTGAGGTACCGTCGACGATATCGGATCCTTCGCATATTAAGGTGACGCGTGTGGCCTCGAACACCGAG(配列番号58)、又はそれと少なくとも50%同一、更により好ましくはそれと少なくとも70%同一、更により好ましくはそれと少なくとも80%同一、更により好ましくはそれと少なくとも85%、90%、95%、98%、若しくは99%同一である配列を含む。このUPR誘導性プロモーターは、MinTK最小プロモーターと作動可能に連結した配列番号56のUPR応答性シス制御性エレメントを含む。配列バリエーションは、転写因子標的配列、すなわち、配列TGACGTGCTを有するもの、でもなく、MinTK配列でもない、配列においてのみ存在することが非常に好ましい。配列バリエーションがスペーサー配列(すなわち、配列GATGATGCGTAGCTAGTAGT(配列番号61)を有するもの)にのみ存在することが一般的に好ましい。
【０１６１】
UPR誘導性プロモーターは、好ましくは、真核細胞に存在する場合、UPRの非存在下では、作動可能に連結した遺伝子の転写を駆動させない。UPR誘導性プロモーターは、真核細胞に存在する場合、UPRが前記細胞において生じているとき、作動可能に連結した遺伝子の転写を駆動させる。UPRの導入により転写を選択的に駆動させるUPR誘導性プロモーターの能力の評価は、様々なアプローチを用いて当業者により容易に評価することができ、これらは、その構築物が用いられることを意図される特定の発現系に合わせて作製することができる。一つの好ましい例として、下記の実施例、例えば実施例8に記載された方法論を用いることができる。例えば、評価され得る任意の候補UPR誘導性プロモーターは、実施例8に記載された構築物へと、実施例8において用いられた、例示的なATF6含有UPR誘導性プロモーターの代わりに置き換えることができ、UPRが導入された時に転写を選択的に駆動させる前記候補UPR誘導性プロモーターの能力は、まさに実施例8において行われている通り、2mM DTTによるUPR誘導前と後のルシフェラーゼ発現のレベルを評価することにより測定することができる。UPR誘導性プロモーターは、UPRの誘導により作動可能に連結した遺伝子(実施例8の場合、ルシフェラーゼ遺伝子)の転写を有意に増加させて、その遺伝子の発現を生じるようにうまく誘導され得るものである。好ましくは、UPR誘導性プロモーターは、2mM DTTでのUPRの誘導から24時間後、遺伝子(例えば、ルシフェラーゼ)の発現の少なくとも5倍の増加、より好ましくは発現の少なくとも10倍の増加、より好ましくは発現の少なくとも100倍の増加、更により好ましくは発現の少なくとも1000倍の増加を与える。UPRの誘導前、遺伝子(例えば、ルシフェラーゼ)の発現レベルは、最小、好ましくは無視できることが好ましい。最小発現は、例えば、実施例8に用いられているような陰性対照構築物(すなわち、ルシフェラーゼをコードする配列の発現がCMV-MP単独により駆動される構築物)の発現レベルと同等又はそれ未満、好ましくは、陰性対照構築物の発現レベルの50%未満、好ましくは20%未満、より好ましくは10%未満、更により好ましくは5%未満、更により好ましくは1%未満として定義することができる。無視で
きる発現レベルは、例えば、実施例8の方法論を用いて本質的に検出不可能であるものである。
【０１６２】
本発明はまた、発現産物をコードする核酸配列と作動可能に連結した、上記で示されているような合成UPR誘導性プロモーターを含む発現構築物又はベクターを提供する。発現構築物又はベクターは、上記で本発明の他の態様について論じられているような任意の発現構築物又はベクターであり得る。発現産物は、上記で本発明の他の態様について論じられているような任意の発現産物(例えば、タンパク質をコードする)であり得る。
【０１６３】
好ましい実施形態において、発現産物は、レポータータンパク質ではない、すなわち、それは、発現レベルの指標として通常用いられるタンパク質をコードしない。多くのレポーター遺伝子は当技術分野において知られており、それには、特に、蛍光、発光タンパク質、及び色素生産性タンパク質が挙げられる。したがって、いくつかの好ましい実施形態において、発現産物は、蛍光タンパク質でも発光タンパク質でもなく、例えば、それはルシフェラーゼではない。上記で示されているように、好ましい発現産物には、治療用タンパク質及び毒性タンパク質が挙げられる。
【０１６４】
さらなる態様において、本発明は、以下を含む、発現産物を産生するための方法を提供する:
a) 本発明による発現産物をコードする核酸配列と作動可能に連結したUPR誘導性プロモーターを含む合成核酸発現構築物を含む真核細胞集団を供給する工程;
b) アンフォールディング型タンパク質応答を誘導するように前記細胞集団を処理して、それにより前記UPR誘導性プロモーターから転写を誘導する工程;
c) 前記発現産物の産生についての最適な条件下で前記細胞集団をインキュベートする工程;及び
d) 前記細胞集団から前記発現産物を単離する工程。
【０１６５】
発現産物を産生するための方法のさらなる、任意選択で且つ好ましい特徴は、上記で本発明の他の態様について論じられており、これらは、変更すべきところは変更して、本態様に適用される。発現産物は治療用タンパク質又は毒性タンパク質であることが好ましい。発現産物がレポータータンパク質ではないことが好ましい。
【０１６６】
したがって、本発明のさらなる態様は、本発明による発現産物をコードする核酸配列と作動可能に連結したUPR誘導性プロモーターを含む核酸発現構築物又はベクターを含む薬学的組成物を提供する。薬学的組成物のさらなる、任意選択で且つ好ましい特徴は、上記で本発明の他の態様について論じられており、これらは、変更すべきところは変更して、本態様に適用される。
【０１６７】
本発明のさらなる態様において、薬学的組成物の製造のための、本発明による発現産物をコードする核酸配列と作動可能に連結したUPR誘導性プロモーターを含む核酸発現構築物及びベクターの使用が提供される。
【０１６８】
本発明のさらなる態様により、本発明によるUPR誘導性プロモーターを含む合成核酸発現構築物又はベクターを含む細胞が提供される。そのような細胞のさらなる、任意選択で且つ好ましい特徴は、上記で本発明の他の態様について論じられており、これらは、変更すべきところは変更して、本態様に適用される。
【０１６９】
さらなる態様において、本発明は、処置又は治療の方法に用いられる、本発明によるUPR誘導性プロモーターを含む核酸発現構築物、ベクター、細胞、又は薬学的組成物を提供する。そのような方法のさらなる、任意選択で且つ好ましい特徴は、上記で本発明の他の態様について論じられており、これらは、変更すべきところは変更して、本態様に適用される。
【０１７０】
この発明の理解を促すために、いくつかの用語が下記で定義される。本明細書で定義された用語は、当業者により一般的に理解されているような意味をもつ。本明細書における専門用語は、本発明の特定の実施形態を記載するために用いられるが、それらの使用は、特許請求の範囲に示されている場合を除き、本発明の範囲を定めない。
【０１７１】
本明細書における本発明の背景の議論は、本発明の内容を説明するために含まれる。これは、言及された材料のいずれも、本特許請求の範囲のいずれについての優先日時点でも、公開され、知られ、又は任意の国における共通の一般的知識の一部であったという承認として解釈されるべきではない。
【０１７２】
この開示を通じて、様々な刊行物、特許、及び公開特許明細書が、識別引用により参照されている。本明細書で引用された全ての文書は、全体として参照により本明細書に組み入れられており、特に、本明細書で具体的に参照されたそのような文書の教示又は部分が、参照により組み入れられている。
【０１７３】
本発明の実施は、他に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、及び免疫学の通常の技術を用いる。そのような技術は、文献において十分、説明されている。例えば、Current Protocols in Molecular Biology(Ausubel、2000年、Wiley and son Inc、Library of Congress、USA); Molecular Cloning: A Laboratory Manual、第3版、(Sambrookら、2001年、Cold Spring Harbor、New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait編、1984年);米国特許第4,683,195号; Nucleic Acid Hybridization (Harries及びHiggins編、1984年); Transcription and Translation (Hames及びHiggins編、1984年); Culture of Animal Cells (Freshney、Alan R. Liss, Inc.、1987年); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press、1986年); Perbal、A Practical Guide to Molecular Cloning (1984);シリーズ、Methods in Enzymology (Abelson及びSimon監修、Academic Press, Inc.、New York)、具体的には、154巻と155巻(Wuら編)、及び185巻、「Gene Expression Technology」(Goeddel編); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller及びCalos編、1987年、Cold Spring Harbor Laboratory); Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer及びWalker編、Academic Press、London、1987年); Handbook of Experimental Immunology、I〜IV巻(Weir及びBlackwell編、1986);並びにManipulating the Mouse Embryo、(Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1986年)参照。
【０１７４】
「1つの(a)」、「1つの(an)」、及び「その(the)」のような用語は、単数形の実体だけを指すことを意図されるのではなく、特定の例が例証のために用いられ得る一般的クラスを含む。
【０１７５】
本明細書で用いられる場合、用語「含むこと(comprising)」、「含む(comprises)」、及び「で構成される(comprised of)」は、「含むこと(including)」、「含む(includes)」、又は「含有すること(containing)」、「含有する(contains)」と同義語であり、包含的又はオープンエンド型であり、追加の、列挙されていない特徴、要素、又は方法工程を排除しない。
【０１７６】
端点による数値範囲の列挙は、それぞれの範囲内に包含される全ての数及び分数、加えて、その列挙された端点を含む。
【０１７７】
本明細書で用いられる場合、用語「核酸」は、典型的には、本質的にヌクレオチドで構成された任意の長さのオリゴマー又はポリマー(好ましくは直鎖状ポリマー)を指す。ヌクレオチド単位は、一般的に、複素環塩基、糖基、及び修飾又は置換されたリン酸基を含む、少なくとも1つ、例えば、1つ、2つ、又は3つのリン酸基を含む。複素環塩基は、とりわけ、プリン及びピリミジン塩基、例えば、天然に存在する核酸において広く存在する、アデニン(A)、グアニン(G)、シトシン(C)、チミン(T)、及びウラシル(U)、他の天然に存在する塩基(例えば、キサンチン、イノシン、ヒポキサンチン)、加えて化学的若しくは生化学的に修飾された(例えば、メチル化された)、非天然の、又は誘導体化された塩基を含み得る。糖基は、とりわけ、ペントース(ペントフラノース)基、例えば、好ましくは、天然に存在する核酸において一般的なリボース及び/若しくは2-デオキシリボース、若しくはアラビノース、2-デオキシアラビノース、トレオース、又はヘキソースの糖基、加えて、修飾又は置換された糖基を含み得る。本明細書で意図されているような核酸は、天然に存在するヌクレオチド、修飾型ヌクレオチド、又はそれらの混合物を含み得る。修飾型ヌクレオチドは、修飾型複素環塩基、修飾型糖部分、修飾型リン酸基、又はそれらの組合せを含み得る。リン酸基又は糖の修飾は、安定性、酵素分解に対する抵抗性、又はいくつかの他の有用な性質を向上させるために導入され得る。用語「核酸」は更に好ましくは、DNA、RNA、及びDNA RNAハイブリッド分子を包含し、具体的には、hnRNA、プレmRNA、mRNA、cDNA、ゲノムDNA、増幅産物、オリゴヌクレオチド、及び合成された(例えば、化学合成された)DNA、RNA、又はDNA RNAハイブリッドが挙げられる。核酸は天然であり得、例えば、天然に存在し、又は天然から単離され得、或いは非天然であり得、例えば、組換え型、すなわち、組換えDNAテクノロジーにより作製され得、及び/又は部分的若しくは全体的に、化学的に若しくは生化学的に合成され得る。「核酸」は、二本鎖、部分的二本鎖、又は一本鎖であり得る。一本鎖である場合、核酸は、センス鎖又はアンチセンス鎖であり得る。加えて、核酸は環状又は直鎖状であり得る。
【０１７８】
本明細書で用いられる場合、「核酸発現構築物」は、1つ又は複数の所望の細胞型、組織、又は器官において発現を指揮する1つ又は複数の転写調節エレメント(例えば、非限定的に、プロモーター、エンハンサー、及び/又は制御性エレメント、ポリアデニル化配列、並びにイントロン)を含む核酸分子を指す。本発明の核酸発現構築物は、合成核酸分子である。
【０１７９】
本出願における「合成」は、天然に存在しない核酸分子を意味する。本発明の合成核酸発現構築物は、人工的に、典型的には組換えテクノロジーにより、作製される。そのような合成核酸は、天然に存在する配列(例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、及び他のそのような制御配列)を含有し得るが、これらは、天然では存在しない状況で存在する。例えば、合成遺伝子(又は遺伝子の一部)は、典型的には、天然では隣接していない1つ又は複数の核酸配列(キメラ配列)を含有し、並びに/又は置換、挿入、及び欠失、及びそれらの組合せを包含し得る。
【０１８０】
本明細書で用いられる場合、用語「作動可能に連結した」、「作動可能に接続した」、又は等価の表現は、エレメントが、機能的に接続され、且つ意図された様式で互いに相互作用することができるように、様々な核酸エレメントの互いに対する配置を指す。そのようなエレメントには、非限定的に、プロモーター、エンハンサー、及び/又は制御性エレメント、ポリアデニル化配列、1つ又は複数のイントロン及び/又はエクソン、並びに発現されるべき関心対象の遺伝子のコード配列が挙げられる。正しく配向され、又は作動可能に連結された場合、核酸配列エレメントは、互いの活性を調節するように一緒に作用し、最終的に、発現産物の発現のレベルに影響し得る。調節するとは、特定のエレメントの活性のレベルを増加させ、減少させ、又は維持することを意味する。各エレメントの他のエレメントに対する位置は、各エレメントの5'末端及び3'末端に関して表現され得、任意の特定のエレメント間の距離は、エレメント間の介在ヌクレオチド又は塩基対の数により言及され得る。当業者により理解されているように、作動可能に連結したとは、機能活性を意味し、必ずしも、天然の位置の連結に関係するとは限らない。実際、核酸発現カセットに用いられる場合、シス制御性エレメントは、典型的には、プロモーターのすぐ上流に位置するが(これは一般的に当てはまるとはいえ、厳密には、核酸発現カセット内の位置の限定又は除外として解釈されるべきではない)、これは、必ずしもインビボで当てはまるわけではない。例えば、天然では転写が影響を及ぼされる遺伝子の下流に存在する制御性エレメント配列が、そのプロモーターの上流に位置する場合、同じように機能することができる。このように、特定の実施形態によれば、制御性エレメントの制御性又は増強性効果は、位置に依存しない。
【０１８１】
「コンセンサス配列」  -  コンセンサス配列の意味は当技術分野において周知されている。本出願において、文脈が他に指示しない限り、以下の表示法がコンセンサス配列について用いられる。以下の例示的なDNA配列:
A[CT]N{A}YR
で考慮すると、Aは、Aがその位置に常に見出されることを意味する; [CT]は、その位置においてCか又はTのいずれかを表す;Nはその位置において任意の塩基を表す;及び{A}は、A以外の任意の塩基がその位置に見出されることを意味する。Yは任意のピリミジンを表し、Rは任意のプリンを示す。
【０１８２】
文脈が他に指示しない限り、本出願における「制御可能なイントロン」は、リボヌクレアーゼ、一般的にはIRE1又はそのホモログ若しくはオルソログについての標的部位に隣接した切除可能な配列を含むRNA分子(典型的には転写産物)に存在する核酸配列であって、前記切除可能な配列が、アンフォールディング型タンパク質応答の結果として、前記リボヌクレアーゼの作用により前記RNA分子から切除され得る、核酸配列を指す。場合によっては、当技術分野において、イントロンという用語は、もっぱらRNA分子から切除される(すなわち、スプライシングで切り出される)配列だけを指すために用いられるが、本発明の制御可能なイントロンの場合、それはあまり妥当ではない。
【０１８３】
用語「同一性」及び「同一の」等は、2つのポリマー分子間、例えば、2つの核酸分子、例えば、2つのDNA分子間の配列類似性を指す。配列アラインメント及び配列同一性の決定は、例えば、Altschulら、1990年(J Mol Biol 215: 403〜10頁)により最初に記載されたBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)、例えば、Tatusova及びMadden 1999年(FEMS Microbiol Lett 174: 247〜250頁)により記載された「Blast 2配列」アルゴリズムを用いて、行うことができる。
【０１８４】
比較のために配列をアラインメントするための方法は当技術分野において周知されている。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムが、例えば、Smith及びWaterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482頁; Needleman及びWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443頁; Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:2444頁; Higgins及びSharp (1988) Gene 73:237〜44頁; Higgins及びSharp (1989) CABIOS 5:151〜3頁; Corpetら  (1988) Nucleic Acids Res. 16:10881〜90頁; Huangら  (1992) Comp. Appl. Biosci. 8:155〜65頁; Pearsonら  (1994) Methods Mol. Biol. 24:307〜31頁; Tatianaら  (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174:247〜50頁に記載されている。配列アラインメント方法及び相同性計算の詳細に渡る検討は、例えば、Altschulら  (1990) J. Mol. Biol. 215:403〜10頁に見出すことができる。
【０１８５】
National Center for Biotechnology Information (NCBI) Basic Local Alignment Search Tool (BLAST(商標); Altschulら  (1990))は、National Center for Biotechnology Information (Bethesda、MD)を含むいくつかの供給源からインターネット上で入手でき、いくつかの配列分析プログラムと共に用いられる。このプログラムを用いて配列同一性を決定する方法の説明は、インターネット上、BLAST(商標)についての「ヘルプ」セクションにより入手できる。核酸配列の比較について、BLAST(商標)(Blastn)プログラムの「Blast 2配列」機能が、デフォルトパラメータを用いて使用され得る。参照配列と更に高い類似性をもつ核酸配列は、この方法により評価される場合、パーセンテージ同一性の増加を示す。典型的には、パーセンテージ配列同一性は、その配列の全長に対して計算される。
【０１８６】
例えば、グローバル最適アラインメントは、適切には、Needleman-Wunschアルゴリズムにより、以下のスコアリングパラメータを用いて見出される:  マッチスコア:+2、ミスマッチスコア:-3;  ギャップペナルティ:ギャップオープン  5、ギャップ伸長  2。生じた最適グローバルアラインメントのパーセンテージ同一性は、適切には、100を掛けた、マッチした塩基の数のそのアラインメントの全長に対する比率により計算され、そのアラインメントの長さは、マッチの数とミスマッチの数の両方を含む。
【０１８７】
本明細書で用いられる場合、「細胞培養」は、未分化状態でも分化状態でもいずれでもあり得る細胞の増殖性塊を指す。
【０１８８】
本明細書で用いられる場合、「シス制御性エレメント」又は「CRE」は、当業者に知られた用語である;それは、隣接遺伝子の(すなわち、シスでの)転写を制御する非コードDNAの領域に関係する。CREは、典型的には、転写因子との結合により遺伝子転写を制御する。CREは、例えば、エンハンサー、プロモーター、インスレーター、又はサイレンサーであり得る。この場合、UPR誘導性CREは、典型的には、UPRの一部として転写を誘導するように作用する、転写因子と結合するエンハンサーエレメントである。この状況において、CREが、プロモーター及び発現産物をコードする遺伝子の一部として提供される場合、UPR誘導性CREは、転写開始部位(TSS)から1500ヌクレオチド以内、より好ましくはTSSから1000ヌクレオチド以内、より好ましくはTSSから500ヌクレオチド以内、適切には、TSSから250ヌクレオチド以内、200ヌクレオチド以内、150ヌクレオチド以内、又は100ヌクレオチド以内に位置することが好ましい。
【０１８９】
本明細書で用いられる場合、「相補的な」又は「相補性」は、2つの核酸配列のWatson-Crick塩基対形成を指す。例えば、配列5'-AGT-3'は、その相補的配列3'-TCA-5'と結合する。2つの核酸配列間の相補性は、塩基の一部のみがそれらの相補体と結合する「部分的」であり得、又はそれは、その配列内のあらゆる塩基がそれの相補塩基と結合する場合のように完全であり得る。核酸鎖間の相補性の度合は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び強度に有意な効果を生じる。
【０１９０】
本明細書で用いられる場合、「通常のイントロン」は、プレmRNAに通常存在するイントロンを指し、典型的には、タンパク質合成についての情報をコードせず、mRNAの翻訳前にmRNA分子から除去される、スプライソソームのイントロンである。その用語は、そのようなイントロンを本発明の非標準の制御性イントロンから区別するために用いられる。
【０１９１】
本出願における「トランスフェクション」は、広くには、核酸を細胞へ計画的に導入する任意のプロセスを指し、ウイルス及び非ウイルスベクターの導入を網羅し、形質転換、形質導入等の用語を含む。例には、ウイルスベクターでのトランスフェクション;プラスミドベクターでの形質転換;エレクトロポレーション(Frommら  (1986) Nature 319:791〜3頁);リポフェクション(Feignerら  (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413〜7頁);マイクロインジェクション(Muellerら  (1978) Cell 15:579〜85頁);アグロバクテリウム媒介性移入(Fraleyら  (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:4803〜7頁);直接的DNA取り込み;whiskers媒介性形質転換;及び微粒子銃(Kleinら  (1987) Nature 327:70頁)が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１９２】
本明細書で用いられる場合、句「導入遺伝子」は、外因性核酸配列を指す。一例において、導入遺伝子は、遺伝子配列、産業的若しくは薬学的に有用な化合物をコードする遺伝子、又は所望の形質をコードする遺伝子である。更に別の例において、導入遺伝子は、アンチセンス核酸配列であり、前記アンチセンス核酸配列の発現が、標的核酸配列の発現を阻害する。
【０１９３】
本明細書で用いられる場合、句「プロモーター」は、一般的に、転写され得る核酸配列の上流に位置する、転写が起こるのに必要とされるDNAの領域を指す。プロモーターは、それらの調節下で配列の転写の適切な活性化又は抑圧を可能にする。プロモーターは、典型的には、転写因子、例えば、エンハンサー配列により認識され、且つ結合される特異的な配列を含有する。転写因子は、プロモーターDNA配列と結合し、RNAポリメラーゼ(遺伝子のコード領域からRNAを合成する酵素)のリクルートメントを生じる。非常に多くのプロモーターが当技術分野において知られている。
【０１９４】
本明細書で用いられる場合、「最小プロモーター」は、独力では不活性、又はほとんど不活性であるが、他の転写制御エレメントと組み合わされたとき、強い転写を媒介することができる、短いDNAセグメントを指す。最小プロモーター配列は、様々な異なる源に由来し得、その源には、原核生物及び真核生物の遺伝子が挙げられる。最小プロモーターの例は、ドーパミンベータ-ヒドロキシラーゼ遺伝子最小プロモーター及びサイトメガロウイルス(CMV)最初期遺伝子最小プロモーター(CMV-MP)及びヘルペスチミジンキナーゼ最小プロモーター(MinTK)である。
【０１９５】
「RNA転写産物」又は「転写産物」は、DNA配列のRNAポリメラーゼ触媒転写から生じる産物を指す。RNA転写産物が、DNA配列の、典型的には完全な、相補的コピーである場合、それは、一次転写産物と呼ばれ、又はそれは、一次転写産物の転写後プロセシングから導かれたRNA配列であり得、成熟RNAと呼ばれる。
【０１９６】
「メッセンジャーRNA」又は「(mRNA)」は、イントロンを含まず、且つ細胞によりタンパク質へ翻訳され得る、転写産物RNAのプロセシングされた型を指す。
【０１９７】
本発明の実施形態は、非限定的例として、添付の図面を参照して、ここで、記載される。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】2mM DTTによる誘導の前及び後の、SYNP-XBP-01をトランスフェクションされた細胞からのGFP蛍光の比率を示す図である。
【図２ａ】誘導の前及び後の、GFP蛍光の陽性対照に対する比率を示す図である。
【図２ｂ】2mM DTT有り及び無しでの、SYNP-XBP-01の蛍光顕微鏡観察を示す図である。
【図３】2mM DTTによる誘導後の両方のプラスミドからのGFPの発現を示す図である。数字はCMV-IEに対する比率である。
【図４】2mM DTTの添加の前及び後のSYNP-ATF6-01からの発現の生データを示す図である。
【図５】2mM DTTの添加の前及び後のSYNP-ATF6-02からの発現の生データを示す図である。
【図６】2mM DTTでの処理の前及び後のSYNP-ATF6-01又はSYNP-ATF6-02をトランスフェクションされたHEK293F細胞の蛍光顕微鏡観察を示す図である。
【図７】wtAAVでの誘導の前及び後のHEK293F細胞からのEGFP蛍光を示す図である。ZsGreenは、対照として用いられる、GFPのバリアントを生成する組換えAAVであり、pre-ZsGreenは、トランスフェクション無し(すなわち、ブランク)である。
【図８】wtAAV産生の前及び後のHEK293F細胞からのEGFP発現を示す図である。
【図９】CMV-IEに対する比率として測定されたEGFP発現を示す図である。用いられた構築物は、SYNP-ATF6-02(イントロン及びATF6誘導性プロモーターを含有する)であった。Maxcyte試薬を用いて、HEK293F細胞にトランスフェクションを実施した。トランスフェクションから24時間後、誘導剤が加えられ、GFP発現が、次の24時間、追跡された。誘導剤濃度; DTT 2mM、パルミチン酸塩  0.5mM、MF-43 1μM。
【図１０】pMA-RQのプラスミドマップを示す図である。
【図１１】CMV-IEプロモーターの調節下でのSEAPの発現(示された結果はHEK293細胞においてである)と比較した、CHO細胞及びHEK293細胞におけるDTTでの誘導後のSEAPの発現のグラフである(X軸は誘導後の時間を示す)。
【図１２】CHO細胞(A)及びHEK293細胞(B)におけるDTT又はパルミチン酸塩での誘導後のルシフェラーゼの発現のグラフである(X軸単位は時間である)。比較のために、CMV-IEプロモーター及びCMV最小プロモーター(CMV-MP)の調節下でのルシフェラーゼの発現が示されている。
【図１３】SYNP-CAS9_INTのプラスミドマップを示す図である。
【図１４】図14Aは、陰性対照及びCMV-IEプロモーターの調節下でのカスパーゼ9(CASP9)と比較した、DTT又はフォルスコリンでのカスパーゼ9(CASP9)の誘導後のHEK293細胞生存率のグラフを示す(X軸は誘導後の時間を示す)。図14Bは、発現構築物が制御可能なイントロンを含有しなかった細胞(左手パネル)、及び発現構築物が制御可能なイントロンを含有した細胞(右手パネル)における、CASP9と融合した蛍光マーカーSparkの顕微鏡写真を示す。
【図１５】陰性対照(HEK293細胞+DTT)及びCMV-IEプロモーターの調節下でのCASP9と比較した、DTTでのカスパーゼ9の誘導後のHEK293細胞生存率のグラフである。
【図１６】図16A〜図16Dは、イントロンが以下において用いられた時に形成される推定二次構造を示す図である:A. SEAP (CAG/CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG/CAG)B. EGFP (CAG/CTGGAGCACTCAGACTACGTGCACCTCTG/CTG)C. CASP9 (CAG/CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG/CTG)D. ルシフェラーゼ  (CCG/CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG/CAG)
【図１７】5×ATF6結合部位を含有するUPR応答性シス制御性エレメントが2つの異なる最小プロモーターと組み合わされた場合、DDTでの誘導後のルシフェラーゼの発現のグラフ(X軸単位は誘導後の時間である)である。対照は、CMV-IEプロモーター、及びいかなる追加の制御配列も含まないCMV-最小プロモーターであった。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１９９】
タンパク質発現の制御機構としてのXBP-1イントロンの使用
26bpの非通常イントロン(制御可能)は、スプライシング前、ナンセンスタンパク質をコードするXBP-1のmRNAに存在する。いったん小胞体(ER)ストレスがIRE1タンパク質によって感知されたならば、その非通常イントロンは、固有のスプライシング部位を介して除去され、その後、そのmRNAは再ライゲーションされて、XBP-1タンパク質を生成するように翻訳され得るmRNA転写産物を形成する。ERストレスは、多くの方法において、例えば、化学物質添加により、又は異種性タンパク質の発現により、誘導することができる。
【０２００】
本発明者らは、このプロセスが、関心対象となる遺伝子の配列における適切なスプライス部位を含む制御可能なイントロンを含むことにより、mRNA/翻訳レベルでタンパク質発現を制御するのに適応し得ることを認識している。適切なプロモーターの調節下で、mRNAは生成されるが、プロセシングされて、関心対象となる遺伝子の機能性発現産物を形成することができない。しかしながら、いったんUPRが、例えば、DTTの投与又は別の異種性タンパク質の発現により、誘導されたならば、そのmRNAはプロセシングされ、制御可能なイントロンは、スプライシングで切り出され、mRNAは、機能性タンパク質へ翻訳され得る。
【０２０１】
この機構を用いることにより、タンパク質(例えば、毒性タンパク質)の産生は、タンパク質が生成される前に誘導が必要とされるような製造プロセスに合うように調整することができる。したがって、例えば、タンパク質の翻訳を、発酵の所望の時期に達するまで遅らせることができる。この方法はまた、機能性RNA(例えば、siRNA又はmiRNA)等の非タンパク質発現産物にも用いることができる。
【０２０２】
スプライス部位及びイントロン
IRE1に対するコンセンサススプライス認識部位配列:
CNG/CNG
【０２０３】
このコンセンサス配列は、真核生物に渡って保存されている。コンセンサス配列CNG/CNG[CG]、優先的にはCNG/CNGCが、典型的には、哺乳類細胞において見出され、CNG/CNGコンセンサス配列を用いることができると考えられる。
【０２０４】
WT哺乳類XBP1スプライス認識部位配列:
5'部位: CCG/CAGC
3'部位: CUG/CAGC
【０２０５】
哺乳類由来のWTイントロン配列:
切除されるイントロン配列(配列番号23):
cagcacucagacuacgugcaccucug
【０２０６】
スプライス認識部位配列に隣接した切除される配列を含むWT哺乳類イントロン:CCG/cagcacucagacuacgugcaccucug/CAGC(配列番号24)
【０２０７】
制御可能なイントロンを含むEGFP配列の構築
イントロンの挿入のために選択された領域は、スプライス認識部位との配列類似性によった。イントロンの挿入を可能にするために、CTCGからCTGGへの単一のサイレント変異のみが3'認識部位に必要とされた。
【０２０８】
イントロン挿入のための下線の引かれた領域を有するEGFP遺伝子配列(配列番号25)
【化４】
2020533019.tif 000005
【０２０９】
EGFPタンパク質配列(配列番号26)
MVSKGEELFT GVVPILVELD GDVNGHKFSV SGEGEGDATY GKLTLKFICT TGKLPVPWPT
LVTTLTYGVQ CFSRYPDHMK QHDFFKSAMP EGYVQERTIF FKDDGNYKTR AEVKFEGDTL
VNRIELKGID FKEDGNILGH KLEYNYNSHN VYIMADKQKN GIKVNFKIRH NIEDGSVQLA
DHYQQNTPIG DGPVLLPDNH YLSTQSALSK DPNEKRDHMV LLEFVTAAGI TLGMDELYK
【０２１０】
この研究に用いられる配列は下記に示されている。GFPは下線が引かれ、イントロン及びスプライス部位は太字で示されている。本例において、イントロンの5'末端に追加の3bp配列を付加して、わずかに最適以下のスプライシングを生じることが予想されるイントロンが生成された。その意図は、バックグラウンド発現レベルを、すなわち、UPRがまだ導入されていないとき、最小に維持することであった。浮遊適応細胞は、典型的には、接着細胞よりわずかに大きいストレスを受けた状態にあることが知られており、したがって、このわずかな改変が、バックグラウンド発現を避けるのに効果があると予想された。もちろん、野生型イントロンを、用いることができ、場合によっては好ましくあり得る。本例で用いられる場合のイントロン配列は以下の通りである(追加の3bp配列は下線が引かれている):
【化５】
2020533019.tif 000006
(配列番号27)
【０２１１】
制御可能なXBP-1イントロンを有するEGFP配列、CMV最小プロモーター(CMV-MP)、及びSV40ポリAテール(XBP-1イントロン配列は太字で示され、EGFP及びそのイントロンをコードする配列は下線が引かれている)(この構築物はSYNP-XBP-01と名付けられている)(配列番号28):
【化６】
2020533019.tif 000007
【０２１２】
上記で示されているように挿入された制御可能なXBP-1イントロンを有するEGFPは切り詰め型タンパク質(配列番号29、51、52、53  -  配列番号51、52、53は、最初の停止コドン後の後にある断片的配列を指し、これらは翻訳されないと考えられる)をコードすることを見ることができる:
【化７】
2020533019.tif 000008
【０２１３】
この例に用いられるDNA構築物:
-  CMV-MP-GFP: EGFPのCMV-MP調節性発現
-  SYNP-XBP-01: XBP1イントロンを有するEGFPのCMV-MP調節性発現
【０２１４】
これらの構築物は、上記で示されているように、EGFPコード配列におけるイントロンの存在を除けば、同一である。
【０２１５】
これらの構築物の全部は、Geneart社により合成され、プラスミドpMA-RQにおいて提供された(プラスミドマップについて図10参照)。これらの構築物を含有するプラスミドpMA-RQを、関連細胞へ直接的にトランスフェクションした。
【０２１６】
この例に用いられる細胞株:
-  Freestyle HEK293F、Invitrogen社カタログ番号: R790-07
-  Freestyle CHO-S、Invitrogen社カタログ番号: R80007
【０２１７】
HEK293F及びCHO-S細胞の増殖
-  細胞を製造会社の使用説明書に従って維持した。
-  細胞にMAX試薬(Invitrogen社カタログ番号: 16447100)を用いてトランスフェクションした。
【０２１８】
これらの細胞のトランスフェクションについての標準プロトコールを、以下のように、24ウェルプレート用に改変した:
-  40mlの細胞を、250mlのベント型Erlenmeyerフラスコ(Sigma-Aldrich社  CLS431144)中、37℃°、8%CO2において、100rpmで撹拌しながら、増殖させた。細胞を、製造会社の使用説明書に記載されているように播種した。
-  トランスフェクションの1日前に、細胞を、血球計算器を用いて計数し、500,000細胞/mlに分けた。
-  トランスフェクションの当日、細胞を24ウェルプレートにおいて500μlの適切な培地中100万細胞/mlで播種する。
-  その後、0.625μgのDNA/ウェルを、10μlのOptiMem培地(Thermofisher社; 11058021)に加え、室温で5分間、インキュベートした。
-  同時に、0.625μlのMax試薬を、OptiMemの添加により10μlにし、室温で5分間、インキュベートした。
-  このインキュベーション後、両方の混合物を、同じチューブに加え、室温で25〜30分間、インキュベートした。
-  その後、DNA/Max試薬混合物(20μl/ウェル)を細胞へ直接、加え、細胞を、前に記載されているようにインキュベートした。
-  その後、細胞を、24時間後、GFP蛍光について測定した。
-  GFP構築物からのイントロンスプライシングを、2mM DTTの添加及び1時間後のGFP蛍光のモニタリングにより測定した。DTTは、ER内のジスルフィド結合の形成を阻止することによりERストレスを誘導する強い還元剤である。
【０２１９】
GFP蛍光の測定:
-  細胞溶解バッファーを、ルシフェラーゼアッセイ系(Promega社; E1500)から、滅菌水で5分の1に希釈することにより調製した。
-  細胞を900xgで5分間、ペレット化し、ルシフェラーゼキットからの細胞溶解バッファーの100μl/1×106細胞中に再懸濁した。
-  その後、これを、溶解を起こすために室温で10〜15分間、インキュベートした。
-  細胞核及びデブリを900xgで5分間、採取した。
-  上清を、96ウェル黒色プレートへ最大100μl/試料で収集した。
-  上清をPBSで2分の1に希釈した(これは、GFPシグナルに影響を及ぼす、溶解バッファー由来のメルカプトエタノールを希釈することである;GFPシグナルは還元剤の存在下で減少する)。
-  試料を室温で5分間、インキュベートした。
-  GFP蛍光を、プレートリーダーを用いて測定し、励起及び発光をそれぞれ、485nm及び520nmに設定した。
-  GFP蛍光をまた、蛍光顕微鏡下で直接、可視化した。
【０２２０】
結果
SYNP-XBP-01実験
HEK293F実験:
-  24ウェルのトランスフェクションを上記のように設定した。各条件を2連/3連で実施した。
-  トランスフェクションから24時間後、細胞を2mM DTTによるか又は同量の水でのモック処理によるかのいずれかで処理した。
-  細胞の処理から1時間後、GFP蛍光を上記のように測定した。
-  GFP蛍光の対照プラスミドに対する比を、誘導の前と後で計算した。図1は3つの独立した実験の累積結果を示す。
【０２２１】
図1は、2mM DTTによる誘導の前と後の、SYNP-XBP-01をトランスフェクションされた細胞からのGFP蛍光の比を示す。その結果は明らかに、ERストレスの誘導により、陽性対照より、GFP産生が4〜10倍、誘導され、生じた活性は、2.5〜7倍であった。加えて、バックグラウンドは、対照(点線)よりかなり低く、EGFPの発現が、制御可能なイントロンにより調節されていることを明らかに示している。これは、異種性遺伝子（すなわち、XBP1以外の遺伝子）内に配置された場合、イントロンが機能性であり、誘導遺伝子発現とより高い発現レベルを促進することを示している。
【０２２２】
CHO-S実験:
CHO-S細胞を用いる実験を、HEK293F細胞について記載されているように同一方法で実施した。実験の結果は、図2a及び図2bに見ることができる。
【０２２３】
図2は、パネルa)において、誘導の前及び後のGFP蛍光の陽性対照に対する比を示す。パネルb)において、2mM DTT有り及び無しでのSYNP-XBP-01の蛍光顕微鏡観察が示されている。これらのデータは、CHO-S細胞において、誘導前、全くバックグラウンドがなく、したがって、GFP蛍光が、2mM DTTの添加により1000倍より大きく、誘導されることを示している。CHO-S細胞における調節は、HEK293F細胞において観察されたものより更に厳密である可能性があり得る。
【実施例２】
【０２２４】
制御可能なXBP1イントロンの存在下での、遺伝子発現を増強するため及び精巧な遺伝子調節を提供するためのATF6応答エレメントの使用
ATF6は、ERストレスにより活性化される転写因子である。いったん活性化されたならば、この転写因子はERSE又はUPREと結合し、タンパク質ホメオスタシスの重要な構成要素の遺伝子転写を活性化する(Yoshidaら、Cell、107巻、881〜891頁、2001年12月28日参照)。
【０２２５】
この研究において、本発明者らは、XBP1イントロンの存在下及び非存在下での、ATF6結合部位(哺乳類のUPRE)の結合及び遺伝子発現増強を調べた。このUPREは、TGACGTGのコンセンサス配列を有し、ATF6に加えて、XBP-1により結合され、それに従って、ERストレスに基づいた遺伝子発現の潜在的に強力なフィードバックループを生じる。イントロンの付加はまた、転写及び翻訳レベルでの調節が、独力でのそれぞれより良い誘導性を与えるかどうかの研究を可能にする。
【０２２６】
この研究について、以下の2つの構築物を調製した:
1) CMV最小プロモーター(CMV-MP)の上流の6×ATF6エレメント(配列TGACGTGCTを有する)及びEGFP;この構築物は、SYNP-ATF6-01と名付けられた(下記の配列番号30参照)。
2) CMV-MPの上流の6×ATF6エレメント及びXBP1イントロン挿入を有するEGFP;この構築物はSYNP-ATF6-02と名付けられた(下記の配列番31参照)。
【０２２７】
イントロンを、実施例1に記載されているようにEGFPに挿入した。
【０２２８】
HEK293F細胞をこの研究に用いた。全ての増殖条件、トランスフェクション、及び分析を、実施例1に記載されているように行った。
【０２２９】
この研究に用いられるプラスミド:
-  CMV-IE-GFP構築物を含有するpMA-RQ
-  CMV-MP-GFP構築物を含有するpMA-RQ
-  SYNP-ATF6-01構築物を含有するpMA-RQ
-  SYNP-ATF6-02構築物を含有するpMA-RQ
【０２３０】
SYNP-ATF6-01の配列、6×ATF6部位は下線が引かれている(配列番号30):
【化８】
2020533019.tif 000009
【０２３１】
SYNP-ATF6-02の配列、6×ATF6部位は下線が引かれ、切除されるイントロン配列は小文字且つ太字で示されている(配列番号31):
【化９】
2020533019.tif 000010
【０２３２】
結果
24ウェルのトランスフェクションを上記のように設定した。各条件を2連/3連で実施した。トランスフェクションから24時間後、細胞を、UPRを誘導するために2mM DTTでの処理か、又は同量の水でのモック処理によるかのいずれかで処理した。細胞の処理から1時間後、3時間後、5時間後、及び24時間後、GFP蛍光を、前に論じられているように測定した。
【０２３３】
GFP蛍光の対照プラスミドに対する比を、誘導の前及び後に計算した。図3は、3つの独立した実験の累積結果を示す。
【０２３４】
図3は、2mM DTTによる誘導後の両方のプラスミドからのGFPの発現を示す。数字は、CMV-IEに対する比である。これは、6×ATF6エレメントが、ERストレスによる誘導可能性が非常に高く、CMV-IEのレベルの3倍に遺伝子発現を増強し得ることを実証している。更に、XBP1イントロンのEGFPへの付加は、CMV-IEのレベルの4倍に発現を増加させる。バックグラウンドの生データを分析すると、SYNP-ATF6-01がCMV-MPと等価のバックグラウンド活性を有すること、及びそのイントロンのEGFPへの付加がGFP蛍光のバックグラウンドレベルを事実上ゼロに減少させることが明らかにされた(図4及び図5)。これは、蛍光顕微鏡観察により確認された(図6)。これは、本明細書に提供されたタンパク質発現への二重調節アプローチ、すなわち、制御可能なプロモーターを通しての転写と制御可能なイントロンを通しての翻訳が、厳密な制御された調節及び高い発現レベルを提供し得ることを示している。
【実施例３】
【０２３５】
wtAAV産生中におけるSYNP-ATF6-01及びSYNP-ATF6-02からのEGFPの誘導性発現
この例の目的は、ERストレス応答が、以前に用いられるような化学的ERストレスの代替として(又はそれに加えて)、異種性タンパク質の産生により活性化され得るかどうかを決定することであった。SYNP-ATF6-01及びSYNP-ATF6-02からのGFP発現がAAV産生中に測定される実験を実施した。
【０２３６】
HEK293F細胞をこの研究に用いた。全ての増殖条件、トランスフェクション、及び分析を、実施例1に記載されているように行った。
【０２３７】
この実験において、前に記載されているように、24ウェルプレートにおいてトランスフェクションを行った。ATF6プラスミド(pMA-RQベクターにおけるSYNP-ATF6-01及びSYNP-ATF6-02構築物)を、(上記のようにMAX試薬を用いて)HEK293F細胞へトランスフェクションし、24時間後、GFPを測定した。GFP測定後、同じ細胞に、wtAAV産生のためのプラスミド、1:1比でのpGRG25AAV2 (Adrien Savvy社による提供)及びTakara/Clonetech社製のpHelperプラスミドをトランスフェクションした。その後、EGFP蛍光を、1時間後、3時間後、5時間後、及び24時間後、測定した(図7及び図8  -  全てのデータが示されているわけではない)。wtAAV産生に両方のプラスミドが必要とされ、pGRG25AAV2がwtAAV2ゲノムを提供し、pHelperプラスミドが、ウイルス複製に必要とされるE2、VA、及びE4ヘルパー機能を提供する。
【０２３８】
wtAAV2ウイルスゲノムは当技術分野において周知されており(Srivastavaら、「Nucleotide sequence and organization of the adeno-associated virus 2 genome」、J Virol. 1983年2月; 45(2): 555〜564頁参照)、AAVについての発現系も当技術分野において周知されている。この場合、wtAAV2ウイルスゲノムを、プラスミドpGRG25(McKenzie及びCraig、「Fast, easy and efficient: site-specific insertion of transgenes into Enterobacterial chromosomes using Tn7 without need for selection of the insertion event」; BMC Microbiology 2006、6:39頁に記載されている)に挿入した。pHelperプラスミドは、Takara/Clonetech社(AAVpro系のカタログ# 6234)から入手できる。AAV発現を誘導するための適切なAAV2発現系は、広く市販されており、例えば、「AAVpro Helper Free System (AAV2)」としてTakara (Clonetech)から入手できる  - http://www.clontech.com/US/Products/Viral_Transduction/AAV_Vector_Systems/Helper_Free_Expression_System参照。
【０２３９】
プラスミドpAAV-CMV-ZsGreen(Takara/Clonetech社AAVベクター系からのカタログ# 6231)を、AAV発現が細胞において達成されたことを確認するための対照として用いた。1:1比でのpAAV-CMV-ZsGreenとpHelperプラスミドを、別個のHeK293F細胞集団へトランスフェクションした。これにより、AAV発現の成功が確認された。Zs greenは、eGFPのバリアントであり、それとして、GFP測定を、前に記載されているようにこれらの細胞に関して行った。
【０２４０】
これらのデータは、両方のプラスミドが、wtAAVの産生によりCMV-IEのレベルへ誘導され得ることを示している。更に、ATF6-01が前の実験と類似したバックグラウンドレベルを有するが、ATF6-02のバックグラウンドレベルがゼロであり、wtAAVの合成のみがEGFPの産生を誘導できることを観察できる。これは、両方のERストレスエレメントが発現の完全な調節に必要とされるという本発明者らの所見を裏付ける。
【実施例４】
【０２４１】
UPRの様々な誘導剤での誘導
いくつかの候補作用物質のUPRを誘導する能力を評価するために実験を実施した。これらの候補誘導剤のUPRを誘導する能力を、本質的に上記のような技術を用いて評価した。試験された追加の候補は、0.5mM  パルミチン酸、1uM MF-43(2-メチル-5-(6-(4-(2-(トリフルオロメチル)フェノキシ)ピペリジン-1-イル)ピリダジン-3-イル)-1,3,4-チアジアゾール)(ステアロイル-CoAデサチュラーゼの阻害剤である)、及びこれらの両方の組合せ(同じ濃度のそれぞれが用いられた)であった。
【０２４２】
これらの実験において、前に記載されているように、24ウェルプレートにおいてトランスフェクションを行った。SYNP-ATF6-02プラスミド(すなわち、pMA-RQベクターにおけるSYNP-ATF6-02)を、HEK293F細胞へトランスフェクションし、24時間後、GFPを測定した。その後、UPRの誘導を、前述の誘導剤を用いて、刺激し、誘導から0時間後、1時間後、3時間後、5時間後、及び24時間後、試料を採取し、測定した。GFP発現を、前に記載されているように測定した。結果は、3つの独立した実験の平均であり、誤差バーは、標準偏差を表す。
【０２４３】
要約した実験手順:
-  40mlの細胞を、250mlのベント型Erlenmeyerフラスコ(Sigma-Aldrich社  CLS431144)中、37℃°、8%CO2において、100rpmで撹拌しながら、増殖させた。細胞を、製造会社の使用説明書に記載されているように播種した。
-  トランスフェクションの1日前に、細胞を、血球計算器を用いて計数し、500,000細胞/mlに分けた。
-  トランスフェクションの当日、細胞を24ウェルプレートにおいて500μlの適切な培地中100万細胞/mlで播種する。
-  その後、0.625μgのDNA/ウェルを、10μlのOptiMem培地(Thermofisher社; 11058021)に加え、室温で5分間、インキュベートした。
-  同時に、0.625μlのMax試薬を、OptiMemの添加により10μlにし、室温で5分間、インキュベートした。
-  このインキュベーション後、両方の混合物を、同じチューブに加え、室温で25〜30分間、インキュベートした。
-  その後、DNA/Max試薬混合物(20μl/ウェル)を細胞へ直接、加え、細胞を、前に記載されているようにインキュベートした。
-  その後、細胞を、24時間後、GFP蛍光について測定した。
-  GFP構築物からのイントロンスプライシングを、2mM DTT、0.5mM  パルミチン酸塩、1μM MF-43、0.5mM  パルミチン酸塩と1μM MF-43の組合せのいずれかの添加、及びAAV合成後、1時間後、3時間後、5時間後、及び24時間後のGFP蛍光のモニタリングにより、測定した。
【０２４４】
UPRの誘導におけるAAV産生: ATF6プラスミド(すなわち、pMA-RQベクターにおけるSYNP-ATF6-02)を、前に記載されているように、HEK293F細胞へトランスフェクションした。24時間後、GFPを測定した。GFP測定後、上記のように、同じ細胞に、wtAAV産生のためのプラスミド、1:1比でのpGRG25AAV2及びpHelperプラスミドを細胞へトランスフェクションした。その後、1時間後、3時間後、5時間後、及び24時間後、EGFP蛍光を測定した。
【０２４５】
GFP蛍光の測定
-  細胞溶解バッファーを、ルシフェラーゼアッセイ系(Promega社; E1500)から、滅菌水で5分の1に希釈することにより調製した。
-  細胞を900xgで5分間、ペレット化し、ルシフェラーゼキットからの細胞溶解バッファーの100μl/1×106細胞中に再懸濁した。
-  その後、これを、溶解を起こすために室温で10〜15分間、インキュベートした。
-  細胞核及びデブリを900xgで5分間、採取した。
-  上清を、96ウェル黒色プレートへ最大100μl/試料で収集した。
-  上清をPBSで2分の1に希釈した(これは、GFPシグナルに影響を及ぼす、溶解バッファー由来のメルカプトエタノールを希釈することである;GFPシグナルは還元剤の存在下で減少する)。
-  試料を室温で5分間、インキュベートした。
-  GFP蛍光を、プレートリーダーを用いて測定し、励起及び発光をそれぞれ、485nm及び520nmに設定した。
-  GFP蛍光をまた、蛍光顕微鏡下で直接、可視化した。
【０２４６】
これらの実験の結果は図9に示され、作用物質の添加後の機能性EGFPの発現により示されているように、作用物質の全部がUPRを誘導するのに成功したことを、その図から見ることができる。作用物質のそれぞれからの誘導の様々な強度がある。DTTは、UPRの非常に強力な誘導剤である。細胞における脂質バランスに影響を及ぼすパルミチン酸塩とMF-43の両方は、個々にUPRを効果的に誘導し、組み合わされた場合、誘導のレベルはより強力であった。wtAAV産生は有効な誘導因子であったが、その効果は他の誘導剤より強くなかった。
【０２４７】
この実験からの興味深く、且つ潜在的に有用な観察は、異なる誘導剤が、異なるレベルでUPRを誘導するために用いることができ、したがって、機能性発現産物(この場合、EGFP)のスプライシング及びこの発現のレベルの調節を可能にすることである。代替として、又は追加として、様々な作用物質の異なる用量レベルを用いて、機能性発現産物の発現のレベルを調整することができる。
【０２４８】
この実施例で設定された手順は、任意の作用物質のUPRを誘導する能力を評価するために用いることができる。
【実施例５】
【０２４９】
分泌性アルカリフォスファターゼ(SEAP)の発現の制御のための制御可能なイントロンの使用
分泌性アルカリフォスファターゼは、バイオプロセシング産業においてマーカーとして用いられる標準タンパク質である。分泌性アルカリフォスファターゼは、分泌性タンパク質についての理想的なマーカーであり、そのタンパク質が、細胞のタンパク質品質管理(転写、翻訳、翻訳後修飾、及びその後、分泌)チェックポイントの全部を経験するからである。
【０２５０】
制御可能なイントロンを含むSEAP配列の構築
構築物SEAP-ATF6-001は、GeneART社において、化学合成により合成された。
【０２５１】
用いられるUPR誘導性シス制御性エレメント(エンハンサー領域)は6×ATF6(TGACGTGCT)であり、各ATF6が20bpの間隔を置いて配置され、CMV-MPに連結された。これは、上記で用いられたタンデムリピート6×ATF6プロモーターの改変であり、それの配列は、下記の配列において下線が引かれている。
【０２５２】
イントロンを、SEAPコード配列の位置1314における2つのCAGコドンの間に組み込んだ。挿入されたイントロンの切除される領域をコードするDNAは以下の通りであった:
CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG(配列番号32)
スプライス部位を含むと、これは、以下の配列を生じる:
CAG/CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG/CAG(配列番33)
【０２５３】
この配列は、文献におけるXBP1野生型イントロンについて記載されたイントロン二次構造をもたらさない(この点の議論について下記の実施例6を参照)。
【０２５４】
プロモーター及び制御可能なイントロンを含むSEAP発現構築物配列は以下の通りである(切除されるイントロン配列は太字で示され、6×ATF6エンハンサー領域は下線が引かれている):
【化１０】
2020533019.tif 000011
(配列番号34)
【０２５５】
イントロンを含有するコード配列の翻訳は、以下の切り詰め型タンパク質配列をもたらす:
MLLLLLLLGLRLQLSLGIIPVEEENPDFWNREAAEALGAAKKLQPAQTAAKNLIIFLGDGMGVSTVTAARILKGQKKDKLGPEIPLAMDRFPYVALSKTYNVDKHVPDSGATATAYLCGVKGNFQTIGLSAAARFNQCNTTRGNEVISVMNRAKKAGKSVGVVTTTRVQHASPAGTYAHTVNRNWYSDADVPASARQEGCQDIATQLISNMDIDVILGGGRKYMFRMGTPDPEYPDDYSQGGTRLDGKNLVQEWLAKRQGARYVWNRTELMQASLDPSVTHLMGLFEPGDMKYEIHRDSTLDPSLMEMTEAALRLLSRNPRGFFLFVEGGRIDHGHHESRAYRALTETIMFDDAIERAGQLTSEEDTLSLVTADHSHVFSFGGYPLRGSSIFGLAPGKARDRKAYTVLLYGNGPGYVLKDGARPDVTESESGSPEYRQQTGNFTRRCSQQCPWTKRHTQARTWRCSRAARRRTWFTACRSRPS(配列番号35)
【０２５６】
イントロンの除去は、SEAPタンパク質の完全な翻訳を可能にする:
MLLLLLLLGLRLQLSLGIIPVEEENPDFWNREAAEALGAAKKLQPAQTAAKNLIIFLGDGMGVSTVTAARILKGQKKDKLGPEIPLAMDRFPYVALSKTYNVDKHVPDSGATATAYLCGVKGNFQTIGLSAAARFNQCNTTRGNEVISVMNRAKKAGKSVGVVTTTRVQHASPAGTYAHTVNRNWYSDADVPASARQEGCQDIATQLISNMDIDVILGGGRKYMFRMGTPDPEYPDDYSQGGTRLDGKNLVQEWLAKRQGARYVWNRTELMQASLDPSVTHLMGLFEPGDMKYEIHRDSTLDPSLMEMTEAALRLLSRNPRGFFLFVEGGRIDHGHHESRAYRALTETIMFDDAIERAGQLTSEEDTLSLVTADHSHVFSFGGYPLRGSSIFGLAPGKARDRKAYTVLLYGNGPGYVLKDGARPDVTESESGSPEYRQQSAVPLDEETHAGEDVAVFARGPQAHLVHGVQEQTFIAHVMAFAACLEPYTACDLAPPAGTTDAAHPGYSRVGAAGRFEQT(配列番号36)
【０２５７】
実験を、本質的に上記の方法に記載されているように実施し、つまり、HEK又はCHO-s細胞に、前述の構築物(pMA-RQ)をトランスフェクションし、24時間、インキュベートした。この時点の後に、活性化化合物DTTを2mM  最終濃度で加え、その後、SEAP活性を、誘導後3時間目、5時間目、及び24時間目に測定した。
【０２５８】
より詳細には:
24ウェルプレートについてのトランスフェクションのプロトコールは、実施例1に記載されている通りであった。その後:
-  上清を、24時間後、SEAP活性について測定した。
-  SEAP構築物からのイントロンスプライシングを、2mM DTTの添加後、3時間後、5時間後、及び24時間後のSEAP活性のモニタリングにより測定した。
-  SEAP活性を、製造会社の使用説明書(Roche社、Sigma-Aldrich社、カタログNo. 11 779 842 001から得られるSEAPレポーター遺伝子アッセイキット)の通り、測定した。
【０２５９】
図11からわかるように、誘導前、SEAP発現はなかった。しかしながら、DTTの添加により、SEAP活性の急速な増加があり、実際、3時間後、SEAP活性のレベルは、CMV-IE(強い構成的プロモーター)と類似した。この発現速度は、転写だけで説明されるには速すぎ、mRNAが漏出性プロモーターから生成されて、イントロンの除去によりほとんどすぐに、翻訳されていることを示唆する。実際、24時間後、両方の細胞型における発現レベルは、CMV-IEの約2倍である。
【０２６０】
これらの結果は、イントロンが分泌性タンパク質との使用に適していることを示す。更に、イントロンにより形成される二次構造に関して、及びスプライス部位標的配列により隣接されている中央イントロン配列(すなわち、上記で示された場合、Xnと呼ばれる配列)に関して、かなりの柔軟性があり、イントロンのmRNAからのスプライシングの成功のための必須因子が、スプライス部位標的配列であることを示唆している。この実験に用いられる制御可能なイントロン(CAGACGGGCAACUUUACACGACGCUG(配列番号37))は、野生型XBP1イントロン配列(CAGCACUCAGACUACGUGCACCUCUG(配列番号23))とは全く異なるが、それでもなお有効なスプライシングが達成された。更に、下記でより詳細に論じられているように、この例に用いられるイントロンは、野生型XBP1イントロンにより形成されるものと似る二次構造を形成するとは予想されない。
【実施例６】
【０２６１】
ホタルルシフェラーゼ遺伝子を用いるタンパク質発現の制御のための制御可能なイントロンの使用
XBP1イントロンにより形成される二次構造がスプライシングに必須であることは、先行技術において主張されている。しかしながら、上記の全ての実験は、そのような二次構造又は野生型XBP1イントロンに似る構造を形成するとは予想されないイントロン構造を用いており、それにも関わらず、スプライシング系の性能は非常にロバストであった。
【０２６２】
したがって、この実験の一態様は、先行技術に記載された二次構造を有するように特定的にデザインされたイントロンの効果を決定することであった。細胞内タンパク質であるルシフェラーゼを、レポータータンパク質として選択し、ルシフェラーゼはまた、発現レベルについてのアッセイの容易さによって有利である。
【０２６３】
制御可能なイントロンを含むルシフェラーゼ配列の構築
発現構築物は、GeneART社において化学合成により合成された。エンハンサー領域は、上記のように、CMV-MPに連結した、20bpの間隔を置いて配置された6×ATF6 (TGACGTGCT)である。
【０２６４】
イントロンを、ルシフェラーゼコード配列の位置1447に、CCGコドンとCAGコドンの間に挿入した。挿入されたイントロン配列の切除される領域をコードするDNAは以下の通りであった:
CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG(配列番号32)
スプライス部位を含むと、これは、以下の配列を生じる:
CCG/CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG/CAG(配列番号38)
【０２６５】
この制御可能なイントロン配列は、下記のようにルシフェラーゼ遺伝子に挿入された場合、XBP1遺伝子における天然の位置でのXBP1野生型イントロンについて記載されているように、同じ二次構造を提供することが予想される(http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgiにおけるRNAフォールドウェブサーバーを用いて計算される)。ルシフェラーゼにおけるイントロンによって形成される推定二次構造は図16Dに示されている。比較のために、他の実験に用いられているような関連遺伝子に挿入された場合のそのイントロンにより形成される推定二次構造もまた、図16に示されている:
-  図16B - EGFPに用いられる場合のイントロン(すなわち、実施例1〜4に用いられる場合、CAG/CTGCAGCACTCAGACTACGTGCACCTCTG/CTG、配列番号48によりコードされる);
-  図16A - SEAPに用いられる場合のイントロン(すなわち、実施例5に用いられる場合、CAG/CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG/CAG、配列番号33によりコードされる);
-  図16C - CASP9に用いられる場合のイントロン(すなわち、実施例7に用いられる場合、CAG/CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG/CTG、配列番号43にコードされる)、図16C参照。
【０２６６】
プロモーター及び制御可能なイントロンを含むルシフェラーゼ発現構築物配列は、以下の通りである(イントロン配列は太字で示され、6×ATF6エンハンサー領域は下線が引かれている):
【０２６７】
前記イントロンを含有するコード配列の翻訳は以下の切り詰め型タンパク質をもたらす:
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAADGQLYTTLQTSCWNTVKP(配列番号39)
【０２６８】
イントロンの除去は、完全なルシフェラーゼタンパク質の翻訳を可能にする:
MEDAKNIKKGPAPFYPLEDGTAGEQLHKAMKRYALVPGTIAFTDAHIEVDITYAEYFEMSVRLAEAMKRYGLNTNHRIVVCSENSLQFFMPVLGALFIGVAVAPANDIYNERELLNSMGISQPTVVFVSKKGLQKILNVQKKLPIIQKIIIMDSKTDYQGFQSMYTFVTSHLPPGFNEYDFVPESFDRDKTIALIMNSSGSTGLPKGVALPHRTACVRFSHARDPIFGNQIIPDTAILSVVPFHHGFGMFTTLGYLICGFRVVLMYRFEEELFLRSLQDYKIQSALLVPTLFSFFAKSTLIDKYDLSNLHEIASGGAPLSKEVGEAVAKRFHLPGIRQGYGLTETTSAILITPEGDDKPGAVGKVVPFFEAKVVDLDTGKTLGVNQRGELCVRGPMIMSGYVNNPEATNALIDKDGWLHSGDIAYWDEDEHFFIVDRLKSLIKYKGYQVAPAELESILLQHPNIFDAGVAGLPDDDAGELPAADVVLEHGKTMTEKEIVDYVASQVTTAKKLRGGVVFVDEVPKGLTGKLDARKIREILIKAKKGGKIAV(配列番号40)
【０２６９】
実験を、本質的に実施例5に記載されているように実施し、つまり、HEK又はCHO-s細胞に、前述の構築物をトランスフェクションし、24時間、インキュベートした。この時点の後に、活性化化合物DTT又はパルミチン酸塩を加えた。その後、ルシフェラーゼ活性を、誘導後3時間目、5時間目、及び24時間目に測定した。ルシフェラーゼを以下の通り、測定した:
-  細胞溶解バッファーを、ルシフェラーゼアッセイ系(Promega社; E1500)から、滅菌水で5分の1に希釈することにより調製した。
-  細胞を900xgで5分間、ペレット化し、ルシフェラーゼキットからの細胞溶解バッファーの100μl/1×106細胞中に再懸濁した。
-  その後、これを、溶解を起こすために室温で10〜15分間、インキュベートした。
-  細胞核及びデブリを900xgで5分間、採取した。
-  上清を収集し、10μl/試料を96ウェル白色プレートへ加えた。
-  自動注入装置を用いるプレートリーダーを用いて、生物発光を測定し、50μlの基質を注入した。基質を、製造会社の使用説明書(Promega社; E1500)の通り、調製した。
【０２７０】
図12からわかるように、誘導前、ルシフェラーゼ発現はなかったが、いずれかの誘導剤の添加により、活性の急速な増加があり、実際、3時間後、ルシフェラーゼ活性のレベルは、CMV-IE(強い構成的プロモーター)のそれの2〜2.5倍であった。この発現速度は、この場合もはやり、転写だけで説明されるには速すぎ、一部のmRNAがプロモーターからすでに生成されつつあり、誘導後のイントロンの除去後ほとんどすぐに、翻訳されていることを示唆する。実際、24時間後、両方の細胞型における発現レベルは、CMV-IEの約3〜4倍である。
【０２７１】
これらの結果は、「完全な」イントロン二次構造が、場合によっては、より良い誘導レベル又はより高いスプライシング効率を与えるだろうことを幾分、示唆しているようである。しかしながら、その構造は、明らかに、その系の機能全体に重要ではない。更に、SEAPとルシフェラーゼは、全く異なるタンパク質であり、単純な比較は不可能である;SEAPは分泌され、したがって、さらなる修飾を受け、発現のための別のボトルネックである。
【実施例７】
【０２７２】
制御可能なイントロンを用いるカスパーゼ9遺伝子発現の調節
この実験は、制御可能なイントロンからの発現調節が、発現する細胞にとって致死性である毒性発現産物の発現を調節するのに適切に厳密であることを確認するために実施した。制御可能なイントロンを、アポトーシス誘発性タンパク質カスパーゼ9へ組み込んだ。HEK細胞におけるこのタンパク質の過剰発現は、迅速な死を引き起こす。したがって、このタンパク質の非修飾型配列からの少しの発現でも、培養物内で死細胞の有意な増加をもたらす。このことが、本発明者らが前記イントロンにより提供される調節の厳密性を決定するように促している。カスパーゼ9も、GFP-Sparkと融合させた(イントロンが転写産物に存在しているならば、目で見ることができない)。
【０２７３】
制御可能なイントロンを含むルシフェラーゼ配列の構築
発現のために、イントロンをCMV-IE構成的プロモーターと連結した。イントロン構築物を、BsaI制限部位及び2つの相補性オリゴを用いて、プラスミドベクターSYNP-CASPSp-001へクローニングした。そのプラスミドを、BsaI(NEB社  R0535S)で消化し、98℃へ5分間、加熱して二次構造を融解することにより、オリゴをアニールし、その後、55℃で20分間、インキュベートした。これは、オリゴが二本鎖DNAを形成することを可能にした。このDNAを、消化されたSYNP-CASPSp-001へのライゲーションを可能にするだろう、5'末端と3'末端の両方においてオーバーハングを有するようにデザインした。その後、二本鎖DNAをプラスミドへライゲーションし、続いて、one shot top ten chemically competent cells (Thermofisher社、C404003)へ形質転換した。単離されたDNAをシーケンシングして、イントロンの存在を確認した。完全なプラスミドは、SYNP-CASP9-INTと呼ばれ、プラスミドマップは図13に示されている。
【０２７４】
ベクターに付加されたイントロンオリゴは以下の配列を有する:
INTC9FP: ACGTCAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG(配列番号41)
INTC9RP: ACGTCAGCGTCGTGTAAAGTTGCCCGTCTG(配列番号42)
【０２７５】
このようにして、制御可能なイントロンを、カスパーゼ9コード配列の位置1087においてCCAGコドンとCTGコドンの間に組み込んだ。
【０２７６】
挿入されたイントロン配列の切除される領域をコードするDNAは以下の通りであった:
CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG(配列番号32)
スプライス部位を含むと、これは、以下の配列を生じる:
CAG/CAGACGGGCAACTTTACACGACGCTG/CTG(配列番号43)
【０２７７】
この配列は、XBP1野生型イントロンについて記載された「完全な」イントロン二次構造をもたらさない。
【０２７８】
CASP9-イントロン構築物配列を含むSYNP-CASP9-INTベクターは以下の通りである(イントロン配列は太字で示されている):
【化１１】
2020533019.tif 000012
【化１２】
2020533019.tif 000013
【化１３】
2020533019.tif 000014
【化１４】
2020533019.tif 000015
(配列番号44)
【０２７９】
イントロンを含有するコード配列は以下の切り詰め型タンパク質をもたらす:
MDEADRRLLRRCRLRLVEELQVDQLWDALLSRELFRPHMIEDIQRAGSGSRRDQARQLIIDLETRGSQALPLFISCLEDTGQDMLASFLRTNRQAAKLSKPTLENLTPVVLRPEIRKPEVLRPETPRPVDIGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWSAGDPGRHL(配列番号45)
【０２８０】
イントロンの除去は、カスパーゼ9タンパク質の完全な翻訳を可能にする:
MDEADRRLLRRCRLRLVEELQVDQLWDALLSRELFRPHMIEDIQRAGSGSRRDQARQLIIDLETRGSQALPLFISCLEDTGQDMLASFLRTNRQAAKLSKPTLENLTPVVLRPEIRKPEVLRPETPRPVDIGSGGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWSADGQLYTTLLETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTSGGGGS(配列番号46)
【０２８１】
転写を、前に記載されているように、実施した。DTTを2mMで加え、フォルスコリンを10μMで加えた。後者は、フォルスコリンが、イントロンの除去を誘導できるかどうかを決定するために行われた。とりわけ、フォルスコリンは、遺伝子治療に適用される可能性がある。イントロン除去の誘導を、細胞死の関数として測定し、より高い細胞死がイントロンの除去の指標となる。
【０２８２】
方法に記載されているように実験を実施し、つまり、HEK又はCHO-s細胞に前述の構築物をトランスフェクションし、24時間、インキュベートした。この時点の後に、活性化化合物DTT又はフォルスコリンを加え、その後、%細胞死を、誘導後3時間目、5時間目、及び24時間目に測定した。
【０２８３】
イントロンの誘導を、細胞死の関数として、Countess II細胞カウンター(Thermofisher社)を用いて、測定した。細胞をトリパンブルーで染色して、細胞生存率を確認した。10μlの細胞懸濁液を血球計算器に加え、カウント数に関して分析した。
【０２８４】
図14Aからわかるように、誘導前、細胞死はなかったが、いずれかの誘導剤の添加により、死細胞の%の急速な増加があり、実際、DTTに関して3時間後、死細胞の数は、イントロンを含有しない対照構築物に近かった。実際、DTT処理から5時間後、死細胞の%は、陽性対照と等しいが、フォルスコリン処理は、24時間後にようやくこのレベルに達し、それがスプライシングの弱い誘導剤であることを示唆した。誘導剤が加えられていない細胞は、ほとんど、又は全く細胞死を示さず、誘導物質の添加までカスパーゼ9の発現はないことを示した。このことは、この遺伝子発現の調節が非常に厳密(実際、一見したところ、絶対的)であり、且つmRNAレベルにおいてであることを示しており、その理由は、CMV-IEプロモーターが構成的であり、それゆえに、転写産物が連続して生成されているからである。図14Bはまた、前記イントロンからの遺伝子発現の調節が非常に厳密であることを示している。これは、カスパーゼ9が、SPARKと呼ばれるGFPバリアントと融合しており、したがって、カスパーゼ9の発現がGFPバリアントの発現をもたらすだろうからである。この図は、誘導剤の添加及び細胞死が始まるまで、GFP発現がないことを示している。
【０２８５】
さらなる実験において、上記と同じ構築物(SYNP-CASP9-INT)を用い、細胞死の速度を測定した。この図から、細胞の約50%が誘導後1時間以内に死滅し、応答が、信じられないくらい厳密に調節されることに加えて、迅速であることを示している。この実験の結果は図15に示されている。
【実施例８】
【０２８６】
異なる最小プロモーターを用いるUPR誘導性プロモーター
この実験の目的は、異なる最小プロモーターと共の、上記の実施例で用いられているようなATF6含有UPR応答性シス制御性エレメント(本明細書ではエンハンサーとも呼ばれる)を試験すること、及びそれらの調節の誘導性及び厳密性を更に評価することであった。この目的を達成するために、ATF6含有UPR応答性シス制御性エレメントを、CMV-MP及びMinTK(ヘルペスチミジンキナーゼ最小プロモーター)の最小プロモーターに作動可能に連結した。
【０２８７】
構築物は、上記のように、GeneARTにおいて化学合成により合成された。
【０２８８】
上記のように、エンハンサー配列は、20bpのスペーサー配列により間隔を置いて配置された、配列TGACGTGCT (ATF6コンセンサス配列、TGACGTGを含有する)の6つのリピートを含有する。エンハンサー配列を、MinTK(構築物ATF06-MP001内)か又はCMV-MP(構築物ATF06-MP002内)のいずれかと連結した。
【０２８９】
HEK293-F細胞のトランスフェクションを、前に記載されているように実施した。DTTを2mMの濃度で加えた。ルシフェラーゼ活性を、前に記載されているように測定した。結果は、図17に示されている  -  DTTは、X軸上に示されているように(単位は時間である)、時間=0時間目に加えられた。
【０２９０】
どちらの構築物も、良い誘導性、及びDTTの添加前の無視できる発現を示した。MinTKを含むプロモーターと比較して、CMV-MPを含むプロモーターについて、わずかにより高い発現が観察された。しかしながら、どちらのプロモーター構築物も、DTTによるUPRの誘導後、高い発現レベルを示し、構成的CMV-IEプロモーターにより提供されるよりも有意に高かった。
【０２９１】
ATF06-MP-001(ATF06及びMinTKプロモーター配列は下線が引かれている)
【化１５】
2020533019.tif 000016
(配列番号59)
【０２９２】
ATF06-MP-002(ATF06及びCMV-MPプロモーター配列は下線が引かれている)
【化１６】
2020533019.tif 000017
【化１７】
2020533019.tif 000018
(配列番号60)
【０２９３】
本発明の様々な実施形態の作製及び使用が上記で詳細に論じられているが、本発明が、様々な特定の状況において具体化することができる多くの適用可能な発明概念を提供することは認識されているはずである。本明細書で論じられた特定の実施形態が、本発明を作製及び使用するための特定の方法を単に例証するだけであり、本発明の範囲を定めるものではない。
【図１】
2020533019.tif 000019
【図２ａ】
2020533019.tif 000020
【図２ｂ】
2020533019.tif 000021
【図３】
2020533019.tif 000022
【図４】
2020533019.tif 000023
【図５】
2020533019.tif 000024
【図６】
2020533019.tif 000025
【図７】
2020533019.tif 000026
【図８】
2020533019.tif 000027
【図９】
2020533019.tif 000028
【図１０】
2020533019.tif 000029
【図１１】
2020533019.tif 000030
【図１２】
2020533019.tif 000031
【図１３】
2020533019.tif 000032
【図１４】
2020533019.tif 000033
【図１５】
2020533019.tif 000034
【図１６Ａ】
2020533019.tif 000035
【図１６Ｂ】
2020533019.tif 000036
【図１６Ｃ】
2020533019.tif 000037
【図１６Ｄ】
2020533019.tif 000038
【図１７】
2020533019.tif 000039
【配列表】
2020533019000001.app
【国際調査報告】
2020533019.tif 000040
2020533019.tif 000041
2020533019.tif 000042