(57)【要約】  本発明は、新生児における脳損傷の診断のための方法であって、新生児から得られた組織または体液試料中のアルファ−Ｂクリスタリンのレベルを分析する工程を含む、方法を提供する。その方法は、早産児または低い出生時体重を有する新生児を診断するのに特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生児における脳損傷の診断のための方法であって、
ａ）前記新生児からの試料中のアルファ−Ｂクリスタリンのレベルを分析することと、任意に
ｂ）アルファ−Ｂクリスタリンの前記レベルを参照値と比較することと、
を含む方法。
【請求項２】
前記試料が、血液、血漿、血清、痰、髄液または尿の試料である、請求項１に記載の診断方法。
【請求項３】
前記新生児が、３７週以下の妊娠期間で生まれた早産児である、請求項１または２に記載の診断方法。
【請求項４】
前記新生児が、２８００ｇ未満の出生時体重を有する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項５】
前記試料が、生後１時間以内に前記新生児から採取されたものである、請求項１〜４のいずれか１項に記載の診断方法。
【請求項６】
前記診断された脳損傷が、炎症、虚血性または出血性脳損傷である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記診断された脳損傷が、脳室周囲白質軟化症または脳室内出血である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
新生児における脳損傷を予測するための診断または予後診断方法における使用のためのアルファ−Ｂクリスタリンに対する抗体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
新生児医療は多くの課題に直面している。特に出産時の合併症が早産のために起こる場合、新生児は特別な医療および保護を必要とする。早産児はいくつかの高リスク因子の影響を受けやすく、そのうちの一部は脳の発達に影響を及ぼすことに関連している。
【０００２】
早産または早期出産は、３７週未満の妊娠期間での子供の出産である。未熟児は、重度の疾患、ならびに発達の遅れまたは聴覚および視力の障害のリスクがより高い。
【０００３】
ＷＨＯによれば、早産の数は毎年増加しており、現時点で１０人の乳児のうち約１人が早産である。例えば、ドイツでは、毎年推定６３，０００人の乳児が早期に生まれ、８，０００人の乳児が妊娠３０週前に生まれている。早期陣痛の原因は依然としてとらえどころがない。研究ではいくつかのリスク因子が特定されているが、明確な原因はない。
【０００４】
早産の合併症は、世界的に５歳未満の子供の間で最も一般的な死因である。医療、特に新生児集中治療の改善により、早産児の生存率は近年急激に増加しており、それ故、現時点では早産児の約９０％が生存している。残念ながら、長期的な困難および障害を伴わずに生存する可能性はより低い。
【０００５】
多くの早産児は、早産の結果として脳損傷を被る。発達している脳に対するそのような損傷は、壊滅的な神経学的結果を招く場合がある。これらの損傷の重症度は妊娠期間および出生時体重に反比例し、早産児は、通常の妊娠期間で生まれた乳児よりも長期間の神経脱落のリスクがはるかに高い。
【０００６】
非常に低い出生時体重の新生児（１５００ｇ未満）のおよそ５０％が低酸素性虚血性傷害を患っている。脳室周囲白質軟化症（ＰＶＬ）および脳室内出血（ＩＶＨ）は、未熟児の脳損傷の最も頻度の高い種類である。
【０００７】
ＰＶＬは、脳性麻痺および認知障害の主要な既知の原因であり、視覚機能障害およびてんかんとも関連している（Ｓｅｒｄａｒｏｇｌｕ  Ｇ，Ｔｅｋｇｕｌ  Ｈ，Ｋｉｔｉｓ  Ｏ，Ｓｅｒｄａｒｏｇｌｕ  Ｅ，Ｇｏｅｋｂｅｎ  Ｓ．：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ．Ｄｅｖ  Ｍｅｄ  Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００４  Ｎｏｖ；４６（１１）：７３３−９；Ｒｅｓｉｃ  Ｂ，Ｔｏｍａｓｏｖｉｃ  Ｍ，Ｋｕｚｍａｎｉｃ−Ｓａｍｉｊａ  Ｒ，Ｌｏｚｉｃ  Ｍ，Ｒｅｓｉｃ  Ｊ，Ｓｏｌａｋ  Ｍ．：Ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ．Ｃｏｌｌ  Ａｎｔｒｏｐｏｌ．２００８  Ｊａｎ；３２  Ｓｕｐｐｌ  １：１４３−７；Ｄｅｎｇ  Ｗ，Ｐｌｅａｓｕｒｅ  Ｊ，Ｐｌｅａｓｕｒｅ  Ｄ．：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ．Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００８  Ｏｃｔ；６５（１０）：１２９１−５．ｄｏｉ：１０．１００１／ａｒｃｈｎｅｕｒ．６５．１０．１２９１．）。ＩＶＨは、胚マトリックスおよび脳室下帯に対する損傷を引き起こし得る。ＰＶＬは単独でまたはＩＶＨに加えて発生する。現在、ＰＶＬまたはＩＶＨに対する治療法はない。
【０００８】
現在最も一般的な診断方法である頭部超音波検査では重度の損傷しか特定することができないため、ＰＶＬおよびＩＶＨの早期検出は依然として未解決の問題である。拡散強調磁気共鳴画像法（ＤＷＩ）はＰＶＬの特定においてより効率的であるが、早産児が特に困難な発達過程を有していない限り、早産児がＭＲＩを受けることはめったに使用されない。
【０００９】
それ故、早産児の生存に重点を置いた全ての取り組みでは、ＰＶＬおよびＩＶＨは気付かれずに進行する場合があり、一連の損傷を妨げるための潜在的な時間枠は過ぎ去る。そのため、損傷のリスクがある乳児を迅速に識別することができるようにするためのバイオマーカーが必要とされている。
【００１０】
これまでのところ、脳損傷について乳児をスクリーニングし、疾患の進行をモニターするためのバイオマーカーの緊急の必要性にもかかわらず、ＰＶＬおよびＩＨＶを有する早産児および満期産児において研究されているバイオマーカーはわずかにすぎない。これまでに特定されたＩＶＨについての最も有望なバイオマーカーの一部は、Ｓ１００βおよびアクチビンである。それらは脳損傷の早期検出に潜在的に有用である可能性があるが、残念なことにこれらのバイオマーカーのレベルはまた、妊娠期間および子宮内成長制限などの他の因子によって影響され、残念ながら信頼できない診断結果をもたらす。
【００１１】
また、ＰＶＬについてのバイオマーカーに関する報告はまれである。早期段階のＰＶＬの免疫マーカーは、早産児に対する剖検研究を通して発見された。ヒトベータ−アミロイド前駆体タンパク質（β−ＡＰＰ）はびまん性軸索損傷のマーカーである場合があり（Ａｒａｉ  Ｙ，Ｄｅｇｕｃｈｉ  Ｋ，Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｔａｋａｓｈｉｍａ  Ｓ．：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ａｘｏｎｓ  ｏｆ  ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ  ｂｒａｉｎｓ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｎｅｕｒｏｌ．１９９５  Ｓｅｐ；１３（２）：１６１−３）、フラクチンはアポトーシスマーカーである場合がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｓｅｒｄａｒｏｇｌｕ  Ｇ，Ｔｅｋｇｕｌ  Ｈ，Ｋｉｔｉｓ  Ｏ，Ｓｅｒｄａｒｏｇｌｕ  Ｅ，Ｇｏｅｋｂｅｎ  Ｓ．：Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅ  ｖａｌｕｅ  ｏｆ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ．Ｄｅｖ  Ｍｅｄ  Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００４  Ｎｏｖ；４６（１１）７３３−９
【非特許文献２】Ｒｅｓｉｃ  Ｂ，Ｔｏｍａｓｏｖｉｃ  Ｍ，Ｋｕｚｍａｎｉｃ−Ｓａｍｉｊａ  Ｒ，Ｌｏｚｉｃ  Ｍ，Ｒｅｓｉｃ  Ｊ，Ｓｏｌａｋ  Ｍ．：Ｎｅｕｒｏｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ．Ｃｏｌｌ  Ａｎｔｒｏｐｏｌ．２００８  Ｊａｎ；３２  Ｓｕｐｐｌ  １：１４３−７
【非特許文献３】Ｄｅｎｇ  Ｗ，Ｐｌｅａｓｕｒｅ  Ｊ，Ｐｌｅａｓｕｒｅ  Ｄ．：Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ．Ａｒｃｈ  Ｎｅｕｒｏｌ．２００８  Ｏｃｔ；６５（１０）：１２９１−５．ｄｏｉ：１０．１００１／ａｒｃｈｎｅｕｒ．６５．１０．１２９１
【非特許文献４】Ａｒａｉ  Ｙ，Ｄｅｇｕｃｈｉ  Ｋ，Ｍｉｚｕｇｕｃｈｉ  Ｍ，Ｔａｋａｓｈｉｍａ  Ｓ．：Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ａｘｏｎｓ  ｏｆ  ｐｅｒｉｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｌｅｕｋｏｍａｌａｃｉａ  ｂｒａｉｎｓ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｎｅｕｒｏｌ．１９９５  Ｓｅｐ；１３（２）：１６１−３
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、新生児、特に早産児における脳損傷の診断のための方法に関する。その方法は、新生児における脳損傷のリスクおよび重症度のためのバイオマーカーとして機能することができる、αＢ−クリスタリン（アルファ−Ｂクリスタリン、ＣｒｙＡＢとも称される）のレベルについての新生児の試料の分析を含む。
【００１４】
なおさらなる態様では、本発明は、新生児における脳損傷の診断および／または予後診断のための方法で使用するためのαＢ−クリスタリンに特異的な抗体に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】満期産児（左）および早産児（右）のうち、上昇したαＢ−クリスタリンレベル（ＣｒｙＡＢ）を有しない乳児（白）と上昇したαＢ−クリスタリンレベルを有する乳児（黒）との数の比較。
【図２】αＢ−クリスタリンレベル（ＣｒｙＡＢ）が増加した全乳児のうち、超音波で診断された脳損傷を有する乳児の数（斜線部分）の図。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明者は、新生児における脳損傷の予測および診断、特に出血性または虚血性脳損傷の診断のための新たなバイオマーカーの必要性を特定した。驚くべきことに、αＢ−クリスタリンのレベルは、新生児、特に早産児における脳損傷、特に出血性および虚血性脳損傷の予後診断および／または診断のためのバイオマーカーとして機能することができることが見出された。
【００１７】
したがって、第１の態様では、本発明は、新生児における脳損傷の診断および／または予後診断のための方法に関し、その方法は、以下の工程：
ａ）新生児からの試料中のαＢ−クリスタリンのレベルを分析することと、任意に
ｂ）αＢ−クリスタリンのレベルを参照値と比較することと、
を含む。
【００１８】
一般に、αＢ−クリスタリンは眼の水晶体中の構造タンパク質である。それはまた、小さな熱ショックタンパク質のファミリーのメンバーである。
【００１９】
脳卒中を罹患している成人患者において、他のいくつかのポリペプチドと同様に、αＢ−クリスタリンも脳細胞保護において役割を果たし得ることが現在考えられており、これは臨床研究ではまだ確認されていない。
【００２０】
しかしながら、眼の水晶体の外側の新生児におけるαＢ−クリスタリンの発生、ならびに組織および体液におけるそのレベルは、まだ詳細には調査されていない。特に、新生児におけるαＢ−クリスタリンのレベルが、出生、または脳機能の発達、または脳に対する潜在的な損傷に関連する事象などの事象にどの程度反応するのかは全く知られていない。そのため、関連のαＢ−クリスタリンレベルが、新生児において、非眼科組織においてさえも見出され得ること、およびこれらのレベルが、例えば、早産に頻繁に関連するような脳の損傷に応答するか、またはそれと相関するように見えることは驚くべきことであった。
【００２１】
本発明による診断方法の主な利点の１つは、その方法が、新生児に対して行われるさらなる診断的および／または治療的介入を決定するための基礎を提供することである。さらなる診断には、例えば、子供の認知および運動発達の問題と有意に相関する白質の２つの重要な領域における微細構造の問題をスキャンすることを可能にする技術である拡散テンソル画像法（ＤＴＩ）が含まれ得る。上昇したαＢ−クリスタリンのレベルの場合に潜在的に有用である可能性がある治療的介入および新生児集中治療室（ＮＩＣＵ）の考慮事項には、限定するものではないが、正中線頭部位置決め、過度の取り扱い（腰椎穿刺など）を必要とする手順の遅延、重炭酸ナトリウム注入の回避および脳酸素化の近赤外分光モニタリングが含まれる。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「新生児（ｎｅｏｎａｔｅ）」および「新生児（ｎｅｗｂｏｒｎ  ｉｎｆａｎｔ）」（または「新生児（ｎｅｗｂｏｒｎ  ｂａｂｙ）」）という表現は互換的に使用される。
【００２３】
ヒトαＢ−クリスタリンは以下のタンパク質配列を有する（配列番号１）：
ＭＤＩＡＩＨＨＰＷＩ  ＲＲＰＦＦＰＦＨＳＰ  ＳＲＬＦＤＱＦＦＧＥ  ＨＬＬＥＳＤＬＦＰＴ  ＳＴＳＬＳＰＦＹＬＲ  ＰＰＳＦＬＲＡＰＳＷ  ＦＤＴＧＬＳＥＭＲＬ  ＥＫＤＲＦＳＶＮＬＤ  ＶＫＨＦＳＰＥＥＬＫ  ＶＫＶＬＧＤＶＩＥＶ  ＨＧＫＨＥＥＲＱＤＥ  ＨＧＦＩＳＲＥＦＨＲ  ＫＹＲＩＰＡＤＶＤＰ  ＬＴＩＴＳＳＬＳＳＤ  ＧＶＬＴＶＮＧＰＲＫ  ＱＶＳＧＰＥＲＴＩＰ  ＩＴＲＥＥＫＰＡＶＴ  ＡＡＰＫＫ
【００２４】
本発明者によって特定された方法は、新生児における脳損傷の予測に好適であることが見出された。特に、その方法は、脳損傷を発症するリスクが特に高い早産児における脳損傷の診断に好適である。
【００２５】
本発明の文脈内では、早産児は、３７週間の妊娠が完了する前に生まれた乳児である。このように、一実施形態では、本発明は、新生児における脳損傷の診断のための方法であって、その新生児が３７週以下、具体的には３７週未満の妊娠期間で生まれた、方法に関する。本発明の特定の実施形態では、新生児は３５週以下の妊娠期間で生まれた。別の実施形態では、新生児は３２週以下の妊娠期間で生まれた。
【００２６】
別のリスクグループは、低いまたは非常に低い出生時体重を有する新生児である。本発明の文脈において、低い出生時体重は、３０００ｋｇ未満、具体的には２８００ｇ未満、より具体的には２５００ｇ未満の出生時体重を指す。非常に低い出生時体重は、１５００ｇ未満の出生時体重を指す。
【００２７】
したがって、一態様では、本発明は、新生児における脳損傷の診断のための方法であって、その新生児が３０００ｇ未満の出生時体重を有する、方法に関する。特定の実施形態では、新生児は２８００ｇ未満の出生時体重を有する。より特定の実施形態では、新生児は２５００ｇ未満、より具体的には２０００ｇ未満の出生時体重を有する。さらなる実施形態では、新生児は１５００ｇ未満の出生時体重を有する。
【００２８】
その方法が好適であるさらなるリスクグループは、出生時または出生前に合併症が発生した新生児である。したがって、さらなる態様では、本発明は、分娩中または分娩後の合併症による脳損傷の診断または予測のための方法に関する。その合併症には、血管疾患を伴う母親の糖尿病、胎盤の血液循環の減少、胎児の先天性感染症、胎盤からの過剰な出血、非常に低い母親の血圧、臍帯傷害、長期の陣痛および異常な胎位が含まれる。
【００２９】
追加のリスクグループは、妊娠中、特に出生直前および／または出生中でさえも母親が疾患に罹患していた新生児である。このように、一態様では、本発明は、新生児の脳損傷の診断のための方法であって、母親が妊娠中に疾患を有していた、方法に関する。本発明の特定の実施形態では、母親は妊娠中に炎症性疾患を有していた。
【００３０】
新生児が罹患する場合がある様々な種類の脳損傷がある。これまでのところ、診断および予後診断は、いくつかの特定のおよび重度の種類の脳損傷を検出することしかできない、新生児の頭部の超音波検査、または複雑でコストのかかるＭＲＩ（ＤＷＩ）分析によってのみ実施することができた。
【００３１】
本発明者は、驚くべきことに、αＢ−クリスタリンが様々な種類の脳損傷に対する好適な指標であることを見出した。言い換えれば、このバイオマーカーは、例えば、超音波分析とは対照的に、特定の脳損傷に限定されない。そのため、特定の実施形態では、本発明は、新生児の脳損傷の診断のための方法であって、その脳損傷が、びまん性、炎症性、虚血性または出血性脳損傷である、方法に関する。
【００３２】
一実施形態では、脳損傷は虚血性または出血性脳損傷である。特定の実施形態では、その方法は、脳室周囲白質軟化症、脳室内出血または脳性麻痺の診断および予後診断のためのものである。
【００３３】
分析される試料は、新生児から得られた任意の好適な試料である。好ましくは、試料は体液の試料である。より好ましくは、試料は血液試料、髄液試料、尿試料または痰試料である。より好ましくは、試料は血液試料であるか、または血漿もしくは血清などの血液試料に由来する。例えば、血液試料は臍帯血、またはその血漿画分であり得る。代替的に、血液試料は任意の他の血管アクセスから得られたものであり得る。
【００３４】
必要な場合に医学的および薬学的介入を可能にする迅速かつ適度に速やかな分析を提供するために、出生後最初の数時間以内に試料が採取されたことが好ましい。好ましくは、試料は、出生後最初の２時間以内、より好ましくは最初の１時間以内、特に臍帯切断後の最初の１時間以内に採取された。記述したように、上昇したαＢ−クリスタリンのレベル、特に以下で論述する参照値を超えるレベルが見出された場合、このことはさらなる診断手順および／または治療的発明が示されることを示し得、さらなる遅延を伴うことなく開始することができる。
【００３５】
αＢ−クリスタリンの分析は、少なくともαＢ−クリスタリンの検出を可能にする任意の好適な分析方法を用いて実施され得る。好ましくは、その方法はαＢ−クリスタリンの定性的かつ定量的分析を可能にする。理想的には、その方法は、好ましくは定性的かつ定量的に、αＢ−クリスタリンの迅速な分析を可能にするであろう。
【００３６】
健康な新生児の試料中のαＢ−クリスタリンの濃度はかなり低いので、分析方法は、０．１ｎｇ／ｍｌほどの低い、もしくは０．０５ｎｇ／ｍｌほどの低い、またはさらに０．０５ｎｇ／ｍｌ未満のαＢ−クリスタリンのレベルの決定を可能にするのに十分に感受性であることが好ましい。好ましい実施形態では、分析方法は抗体に基づく方法または質量分光法である。
【００３７】
１つの特定の実施形態では、分析は抗体に基づくアッセイ、好ましくはＥＬＩＳＡアッセイを用いて実施される。代替的に、分析は、標準化されたウエスタンブロットまたはドットブロットアッセイを使用して実施される場合がある。
【００３８】
本発明の代替的な実施形態では、分析は質量分光法を使用して実施される。最も好ましくは、質量分光法は、αＢ−クリスタリンの検出および定量化を可能にする。一実施形態では、質量分光法は直接ＭＳ法である。好ましい実施形態では、その方法はクロマトグラフィ法と組み合わされる。別の好ましい実施形態では、分析はＬＣ／ＭＳ、好ましくはＨＰＬＣ／ＭＳ法を用いて実施される。αＢ−クリスタリンの検出および定量化のための好適な方法の例は、Ｒｏｔｈｂａｒｄ  ＪＢ，Ｚｈａｏ  Ｘ，Ｓｈａｒｐｅ  Ｏ，Ｓｔｒｏｈｍａｎ  ＭＪ，Ｋｕｒｎｅｌｌａｓ  Ｍ，Ｍｅｌｌｉｎｓ  ＥＤ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ＷＨ，Ｓｔｅｉｎｍａｎ  Ｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１１，Ａｐｒ  １；１８６（７）に提供されている。
【００３９】
質量分光分析、特にＬＣ／ＭＳまたはＨＰＬＣ／ＭＳ分析に関して、本発明はさらに、評価における標準として使用するための精製されたαＢ−クリスタリンタンパク質に関する。好ましくは、前記精製されたタンパク質は配列番号１を含む。より好ましくは、前記精製されたタンパク質は配列番号１からなる。
【００４０】
０．１ｎｇ／ｍＬを超える、好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬを超えるαＢ−クリスタリンのレベルは、新生児における脳損傷のリスクの増加を示すことが見出された。特に、αＢ−クリスタリンのレベルが新生児の潜在的な脳損傷のリスクおよび重症度を示すことが驚くべきことに見出された。
【００４１】
通常、αＢ−クリスタリンのレベルは、αＢ−クリスタリンについてのＥＬＩＳＡアッセイの検出限界以下である。本発明者は、新生児の試料中のαＢ−クリスタリンで、最大で０．１ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬを超えるαＢ−クリスタリンレベルが参照値として好適であり、ほとんどの場合において脳損傷を示さないことを見出した。０．１ｎｇ／ｍｌより高く、好ましくは０．５ｎｇ／ｍＬを超えるレベルは脳損傷のリスクを示し、レベルの増加に関連してリスクは増加する。
【００４２】
さらなる態様では、本発明は、上述のように新生児における脳損傷を予測するための診断または予後診断方法に使用するための抗体または抗体断片に関する。
【００４３】
好ましくは、抗体は、ＥＬＩＳＡまたはドットブロットなどの抗体に基づくアッセイにおけるαＢ−クリスタリンの検出に好適である。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。本発明の一実施形態では、抗体はポリクローナル抗体である。代替的な実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
【００４４】
抗体は検出可能な化合物に結合される場合がある。本発明の一実施形態では、抗体は蛍光色素に結合されている。代替的な実施形態では、抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの検出可能なシグナルを生成することが可能な酵素と結合されている。さらなる代替的な実施形態では、検出可能な化合物はビオチンなどの親和性タグである。
【実施例】
【００４５】
この先行研究では、５２人の未熟児（妊娠３５週未満で生まれた）の血漿からαＢ−クリスタリン濃度を分析し、４０人の満期産児から採取した試料と比較した。それ故、我々は健康な対照としてαＢ−クリスタリンのベースライン濃度を開発した。
【００４６】
早産児の血漿試料は、１日目に出生後最初の１時間の間に臍帯血から収集され、次いで３日目に通常の採血で繰り返された。健康な満期産児では、標準的な新生児スクリーニング時に臍帯血および３日目の試料が得られた。
【００４７】
全ての乳児は、早産児の場合は頭部超音波検査および新生児眼底検査を含む詳細な臨床評価を受けた。血液試料をＥＤＴＡチューブ内に保存し、輸送のために氷上に配置し、１時間以内に処理した。チューブを４℃で５分間３５００ｇで遠心分離した。血漿画分を分離し、処理前に−８０℃で保存した別々のチューブに等分した。血液試料の体積が許す場合、白質損傷および脳性麻痺と関連している炎症性サイトカイン、すなわち、ＩＬ−６、ＩＬ−１５−αおよびＴＮＦ−αについてもスクリーニングした。
【００４８】
最初に、αＢ−クリスタリン特異的ＥＬＩＳＡキット（Ｓｔｒｅｓｓｍａｒｑ  Ｉｎｃ）を製造者のプロトコルに従って使用してαＢ−クリスタリンの血漿レベルを評価した。血液試料の採取および処理を簡素化するために、方法論をＥＬＩＳＡから、単一の乾燥血斑からのＣｒｙＡＢの迅速な決定および定量化を可能とする技術である、液体クロマトグラフィタンデム質量分光による分析のための新生児スクリーニングカード上の乾燥血斑を使用することに変更した。
【００４９】
分析の結果を以下の表１および２に示す。
【００５０】
成熟児では、２７人の成熟児のうち１人のみ（３．７％）がαＢ−クリスタリンレベルが増加していたが、未熟児のコホートでは、上昇したαＢ−クリスタリンレベルが５２人の新生児のうち１３人（２５％）で検出された（図１参照）。超音波検査または神経発達検査により、これらの１３人の未熟児のうち１０人に脳損傷が存在することが確認された（図２参照）。興味深いことに、最も高いαＢ−クリスタリンレベルを有する早産児番号１０については、超音波検査は脳損傷を示すことができなかったが、神経発達検査は潜在的な白質損傷を明らかにした。３ヶ月齢で、この患者は足の動きの運動発達の有意な遅延を示し、タイムラインおよび症状の両方が、（びまん性）脳室周囲白質軟化症（ＰＶＬ）に関連する発達遅延の典型的なマーカーである（Ｆｅｔｔｅｒｓ，Ｌ；Ｃｈｅｎ，Ｙｐ；Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ，Ｊ；Ｔｒｏｎｉｃｋ，Ｅｚ（Ａｐｒｉｌ  ２００４）．Ｋｉｃｋｉｎｇ  ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ  ｃａｐｔｕｒｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｆｕｌｌ−ｔｅｒｍ  ａｎｄ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｉｎｆａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｗｈｉｔｅ  ｍａｔｔｅｒ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ．Ｈｕｍａｎ  ｍｏｖｅｍｅｎｔ  ｓｃｉｅｎｃｅ．２２（６）：７２９ー４８参照）。そのため、超音波検査の所見を伴わない増加したαＢ−クリスタリンレベルの全ての症例が、後に、これまでに未特定の脳損傷であると確認されることが想定される。
【００５１】
一方、αＢ−クリスタリンレベルの上昇を伴わずに脳内出血スコアが１〜２（ＩＣＨ°Ｉ〜ＩＩと略される）であることが超音波検査によって特定された４人の患者がいた。これらの乳児については、損傷事象は出生から少なくとも２４時間前に発生したので、試料採取時には増加したαＢ−クリスタリンレベルはもはや存在しなかったと想定される。
【００５２】
以下の表は、新生児の決定されたαＢ−クリスタリンレベルに関する概説を提供する。欠けている値は、アルファ−Ｂクリスタリンレベルを決定することができなかったことを示している。
【００５３】
表１：満期産児で測定されたαＢ−クリスタリンレベル
【表１】
2020502533.tif 000002
【００５４】
表２：早産児で測定されたαＢ−クリスタリンレベル
【表２】
2020502533.tif 000003
【図１】
2020502533.tif 000004
【図２】
2020502533.tif 000005
【国際調査報告】
2020502533.tif 000006