(57)【要約】  本開示は、細胞培養容器（１００）であって、その容器の底面に一体に設けられたか、もしくはその容器の底面に配置されたまたは取り付けられたマイクロキャビティのアレイを有する挿入物（２１６）により設けられたかのいずれかの、３Ｄで細胞を培養するのに適したマイクロキャビティのアレイ（１１５）を有する、細胞を培養するための表面（３１６）を有する細胞培養容器（１００）を提供する。本開示は、マイクロキャビティを最小の乱流で充填し空にし、それゆえ、マイクロキャビティ内にあるスフェロイドの撹乱を少なくできるようにマイクロキャビティに出入りする液体の流動を制御する、細胞培養チャンバ内のバッフル（１１３）およびその容器の首部にあるダム（１３０）を提供する。
2020526217.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器において、
細胞培養チャンバであって、上部、底部、側壁、および該細胞培養チャンバの壁を通り、該細胞培養チャンバと流体連通している首付き開口を含む細胞培養チャンバ、
マイクロキャビティのアレイを有する細胞培養表面、および
前記首付き開口と反対の壁と前記マイクロキャビティのアレイとの間にあるバッフル、
を備え、
前記マイクロキャビティのアレイが、前記細胞培養チャンバの長さ（Ｌｃ）より小さい長さ（Ｌｉ）に亘り延在し、
前記マイクロキャビティのアレイの長さ（Ｌｉ）に前記バッフルの長さ（Ｌｂ）を加えた長さが前記細胞培養チャンバの長さ（Ｌｃ）と等しく、
よって、前記首付き開口が上向きになるように前記容器が方向付けられているときに、前記バッフルと前記細胞培養チャンバの上部との間に貯留槽がある、細胞培養容器。
【請求項２】
前記底部が前記マイクロキャビティのアレイを備える、請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記マイクロキャビティのアレイが前記底部の内部表面と一体である、請求項２記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記マイクロキャビティのアレイの底面が平面である、請求項３記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記マイクロキャビティのアレイの底面が、微小突起のアレイを備える、請求項３記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記底部上に挿入物をさらに備え、該挿入物が前記マイクロキャビティのアレイを備える、請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記挿入物が前記底部に取り付けられている、請求項６記載の細胞培養容器。
【請求項８】
前記マイクロキャビティのアレイの底面が平面である、請求項６記載の細胞培養容器。
【請求項９】
前記マイクロキャビティのアレイの底面が、微小突起のアレイを備える、請求項６記載の細胞培養容器。
【請求項１０】
前記バッフルが傾斜している、請求項１から９いずれか１項記載の細胞培養容器。
【請求項１１】
前記バッフルが正方形である、請求項１から９いずれか１項記載の細胞培養容器。
【請求項１２】
前記容器の首付き開口内にダムをさらに備える、請求項１から１１いずれか１項記載の細胞培養容器。
【請求項１３】
前記ダムが湾曲している、請求項１２記載の細胞培養容器。
【請求項１４】
前記ダムが長方形である、請求項１２記載の細胞培養容器。
【請求項１５】
請求項１から１４いずれか１項記載の細胞培養容器内で細胞を培養する方法において、
前記容器の首付き開口と反対の端部壁で接するように該容器を置く工程、
前記容器に液体培地中に懸濁された細胞を導入し、そこで、該細胞および該液体培地が、前記バッフルと前記容器の上部との間の空間にある前記貯留槽内に入れられる工程、および
前記細胞および前記液体培地が、前記マイクロキャビティのアレイを備えた前記細胞培養表面上に流れるように、前記容器を回転させる工程、
を有してなる方法。
【請求項１６】
前記容器内で前記細胞を培養する工程をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞および前記液体培地が前記貯留槽に流れ込むように、前記容器を回転させる工程をさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
細胞を培養する方法において、
細胞培養容器の首付き開口に分注ポートを挿入する工程、
前記分注ポートから材料を分注することによって、壁の内面およびマイクロキャビティのアレイを備えた表面により画成された前記容器の細胞培養チャンバ内で第１の流路に沿って材料を流し、それによって、材料を該容器の外部から該細胞培養チャンバに加える工程、および
前記第１の流路に沿った材料の流れを遮る工程、
を有してなる方法。
【請求項１９】
前記第１の流路に沿った材料の流れを遮る工程が、該第１の流路に沿った材料の流れをダムで逸らせる工程を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の流路に沿った材料の流れをダムで逸らせる工程が、前記第１の流路に沿った材料の流れを少なくとも２つの分岐流に分割する工程を含む、請求項１９記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、その内容が依拠され、ここに全て引用される、「Cell Culture Container and Methods of Culturing Cells」と題する、２０１７年７月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／５３２６４８号の優先権の恩恵を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、広く、細胞培養容器および細胞を培養する方法に関し、より詳しくは、三次元細胞を収容し、操作するための細胞培養容器およびその細胞培養容器内で三次元細胞を培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞培養容器内に三次元細胞を収容し、培養することが公知である。
【発明の概要】
【０００４】
以下は、詳細な説明に記載されたいくつかの例示の実施の形態の基本的な理解を与えるために、本開示の簡単な概要を提示するものである。
【０００５】
実施の形態において、本開示は、細胞培養容器であって、首付き開口、細胞培養チャンバ、上部、底部、側壁、端部壁およびその容器の底面に一体に設けられたか、もしくはその容器の底面に配置されたまたは取り付けられた、マイクロキャビティのアレイを有する挿入物により設けられたかのいずれかの、マイクロキャビティのアレイを有する細胞を培養するための表面を有する細胞培養容器を提供する。実施の形態において、そのマイクロキャビティのアレイは、その容器の細胞培養チャンバの全長に沿って延在しない。実施の形態において、マイクロキャビティのアレイは、細胞培養チャンバの全長（Ｌｃ）未満で延在する。実施の形態において、マイクロキャビティのアレイは、長さ（Ｌｉ）だけ延在する。ＬｉはＬｃより小さい。実施の形態において、マイクロキャビティのアレイと容器の端部壁との間に、バッフルがある。そのバッフルは、長さ（Ｌｂ）を有する。バッフルは、容器の端部壁とマイクロキャビティのアレイとの間の空間を占める。Ｌｉ＋Ｌｂ＝Ｌｃ。実施の形態において、そのバッフルは、首付き開口が上になるように容器が置かれたときに、貯留槽を画成する。バッフルは、マイクロキャビティに最小の乱流で培地を充填し、それゆえ、マイクロキャビティ内にあるスフェロイドの撹乱を少なくできるようにマイクロキャビティに入る液体の流れを制御する。実施の形態において、バッフルは、傾斜、湾曲、正方形または任意の形状であってよい。追加の実施の形態において、また容器に出入りする液体の動きにより生じる乱流を減少させるために、容器の首付き開口は、容器に出入りする、液体培地などの液体の流れを妨げるダムを有することがある。実施の形態において、そのダムは、正方形または湾曲または任意の形状であってよい。これらの特徴構造は、単独で、または組合せで存在することがある。例えば、その容器は、マイクロキャビティのアレイおよび湾曲したまたは真っ直ぐのダムを有することがある。その容器は、マイクロキャビティのアレイおよびバッフルを有することがあり、そのバッフルは傾斜しているまたは正方形であることがある。その容器は、マイクロキャビティのアレイおよびダムとバッフルを有することがある。そして、そのダムは湾曲していても正方形であってもよく、そのバッフルは傾斜していても正方形であってもよい。細胞を培養し、培地を導入し、容器から培地を取り出す方法も提供される。
【０００６】
先の実施の形態は、例示であり、本開示の範囲から逸脱せずに、ここに与えられたどの１つ以上の実施の形態と、どの組合せで提供しても、または単独で提供しても差し支えない。さらに、先の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方とも、本開示の実施の形態を提示しており、記載され、請求項に定義されたような実施の形態の性質および特徴を理解するための概要または骨子を提供する意図があることを理解すべきである。添付図面は、その実施の形態のさらなる理解を与えるために含まれ、本明細書に包含され、その一部を構成する。図面は、本開示の様々な実施の形態を示しており、説明と共に、その原理および作動を説明する働きをする。
【０００７】
本開示のこれらと他の特徴、実施の形態、および利点は、添付図面を参照して読んだときに、さらに理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本開示の実施の形態による第１の例示の細胞培養容器の側面図
【図２】本開示の実施の形態による図１の線２−２に沿った第１の例示の細胞培養容器の平面図
【図３】本開示の実施の形態による図２の線３−３に沿った第１の例示の細胞培養容器の断面図
【図４】本開示の実施の形態による図１の線４−４に沿った第１の例示の細胞培養容器の断面図
【図５】本開示の実施の形態による、複数のマイクロキャビティを含むマイクロキャビティのアレイを有する表面を含む、図４の区域５でとられた第１の例示の細胞培養容器の一部の例示の実施の形態の拡大概略図
【図６】本開示の実施の形態による図５の線６−６に沿った、複数のマイクロキャビティを含むマイクロキャビティのアレイを有する表面を含む第１の例示の細胞培養容器のその一部の断面図
【図７】本開示の実施の形態による図６の複数のマイクロキャビティを含むマイクロキャビティのアレイを有する表面を含む第１の例示の細胞培養容器のその一部の代わりの例示の実施の形態の断面図
【図８】本開示の実施の形態による階段状プロファイルを含む、図２の線８−８に沿った第１の例示の細胞培養容器の一部の例示の実施の形態の部分断面図
【図９】本開示の実施の形態による傾斜プロファイルを含む、図８の第１の例示の細胞培養容器の一部の代わりの例示の実施の形態の部分断面図
【図１０】本開示の実施の形態による凸状プロファイルを含むバッフルを備えた、図１の線１０−１０に沿った第１の例示の細胞培養容器の一部の例示の実施の形態の部分断面図
【図１１】本開示の実施の形態による凹状プロファイルを含むバッフルを備えた、図１０の第１の例示の細胞培養容器の一部の代わりの例示の実施の形態の部分断面図
【図１２】本開示の実施の形態による第１の例示の細胞培養容器内で細胞を培養する方法を含む、図３の第１の例示の細胞培養容器の代わりの例示の実施の形態の断面図
【図１３】本開示の実施の形態による図１２の第１の例示の細胞培養容器内で細胞を培養する方法の例示の工程を示す断面図
【図１４】本開示の実施の形態による、複数のマイクロキャビティを含むマイクロキャビティのアレイを有する表面を含む図１３の区域１４でとられた第１の例示の細胞培養容器の一部の例示の実施の形態の拡大概略図
【図１５】本開示の実施の形態による図１３の第１の例示の細胞培養容器内で細胞を培養する方法の例示の工程を示す断面図
【図１６】本開示の実施の形態による、複数のマイクロキャビティを含むマイクロキャビティのアレイを有する表面を備えた図１５の区域１６でとられた第１の例示の細胞培養容器の一部、およびその複数のマイクロキャビティの内の少なくとも１つのマイクロキャビティ内で細胞を培養する方法の例示の実施の形態の拡大概略図
【図１７】本開示の実施の形態による、バッフルを含む図１０の第１の例示の細胞培養容器の一部および分注ポートで容器に材料を加える方法の代わりの例示の実施の形態の部分断面図
【図１８】本開示の実施の形態による、バッフルを含む図１０の第１の例示の細胞培養容器の一部および収集ポートで容器から材料を取り出す方法の代わりの例示の実施の形態の部分断面図
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ここで、本開示の例示の実施の形態が示されている添付図面を参照して、特徴構造を下記により十分に記載する。できるときはいつでも、同じまたは同様の部分を称するために、図面に亘り同じ参照番号が使用される。しかしながら、本開示は、多くの異なる形態で具体化することができ、ここに述べられた実施の形態に限定されると解釈すべきではない。
【００１０】
細胞培養容器（例えば、フラスコ）は、細胞を培養するための無菌チャンバを提供することができる。いくつかの実施の形態において、細胞培養は、疾患と毒物学の研究、薬物と治療の効果、腫瘍の特徴、有機体、遺伝学、並びに細胞のおよび細胞に関連する他の科学、生物学、および化学原理に関連する情報を提供することができる。いくつかの実施の形態において、三次元細胞培養は、二次元細胞培養と比べて、より生理学的に正確であり、二次元細胞培養と比べて、実生活用途で細胞が存在し、成長できる環境をより実現的に表す多細胞性構造を生じることができる。例えば、三次元細胞培養は、「インビボ」（すなわち、生存している実生活内の）細胞増殖をシミュレーションする現実的環境をより厳密に提供することが分かっており、一方で、二次元細胞培養は、現実的環境をそれほど表していない「インビトロ」（すなわち、研究室環境におけるガラス内）細胞増殖をシミュレーションする環境を提供することが分かっている。三次元細胞培養物と相互作用し、その性質と挙動を観察することによって、例えば、疾患と毒物学の研究、薬物と治療の効果、腫瘍、有機体の特徴、遺伝学、並びに細胞のおよび細胞に関連する他の科学、生物学、および化学原理に関連する細胞の理解の向上を成し遂げることができる。
【００１１】
実施の形態において、細胞培養容器１００は、各々が、液体培地および培養下の細胞と接触する内部表面を有する、底部１０８、上部１０１、および端部壁１０７と側壁１０６を備えることができる。これらの内部表面は、細胞培養チャンバ１０３を画成する。これらの表面の内の少なくとも１つは、細胞増殖に一層特別に適することができる。例えば、細胞培養表面は、細胞が表面にくっつくのを助長するまたは妨げるコーティングで処理されることがある。あるいは、スフェロイド細胞の培養を支援するために、細胞培養表面は、例えば、アレイ状に配列された複数のマイクロキャビティまたは区画（例えば、微小サイズのウェル、ミリリットル未満のサイズのウェル）を備えることができる。その細胞培養表面は、フラスコと一体であり得る、または細胞培養チャンバ内に置かれたまたは取り付けられたマイクロキャビティのアレイを有する別個の表面であり得る。上面、底面、１つ以上の側面、もしくはこれらの組合せは、アレイ状にマイクロキャビティを備えることができる。
【００１２】
例えば、いくつかの実施の形態において、１つのスフェロイドが、複数のマイクロキャビティの各々のマイクロキャビティ中に形成し得る。容器内の液体培地中に導入された細胞は、重力によってマイクロキャビティ中に沈降する。液体培地中に懸濁された１つ以上の細胞は、その液体を通って落下し、各マイクロキャビティ内に収まる。マイクロキャビティの形状（例えば、ウェルを画成する凹状表面）、および細胞が表面に付着するのを防ぐマイクロキャビティの表面コーティングも、細胞が三次元形態に増殖し、各マイクロキャビティ内にスフェロイドを形成するのを促進することができる。
【００１３】
マイクロキャビティは、例えば、波状のまたは正弦波の形状で形成され、丸まった上部と丸まった底部を有するマイクロキャビティまたはマイクロウェルを形成することができる。これらの丸まったエッジは、液体培地が容器を満たしたときに、気泡が形成されるのを防ぐであろう。いくつかの実施の形態において、フラスコに、三次元細胞培養物（例えば、細胞集合体、オルガノイドまたはスフェロイド）の増殖を促進する材料（例えば、培地、固体、液体、気体）を充填することができる。例えば、液体中に懸濁された細胞を含む培地を、細胞培養チャンバまたは容器に加えることができる。懸濁された細胞は、重力によって複数のマイクロキャビティ内に集まることができ、細胞の集団または塊を形成する（例えば、増殖する）ことができる。集団または塊の細胞は、三次元で増殖して、他にスフェロイドまたはオルガノイドとして知られている、３Ｄの細胞を形成する。細胞の１つの塊またはスフェロイドが、１つのマイクロキャビティ内に形成する。それゆえ、マイクロキャビティのアレイを有する細胞培養表面を有する容器または細胞培養チャンバを使用して、各々が自らのマイクロキャビティ内にある、スフェロイドのアレイを培養することができる。
【００１４】
培養中、スフェロイドは、培地（例えば、食物、栄養素）を消費し、副生成物として代謝産物（例えば、老廃物）を産生し得る。それゆえ、いくつかの実施の形態において、培地の形態にある食物を培養中に細胞培養チャンバに加えることができ、培養中に、細胞培養チャンバから廃棄培地を除去することができる。細胞に食物を与えるために培地を交換し、老廃物を除去するこの能力は、細胞の長期間の培養にとって重要である。しかしながら、培地を加え、除去すると、マイクロキャビティ内にあるスフェロイドを乱したり、移動されたりすることのある乱流が生じるであろう。このことは、細胞がマイクロキャビティの表面にくっつくのを防ぐために、マイクロキャビティが低結合性コーティングで被覆されている場合、特に当てはまる。スフェロイドは、固定されておらず（表面に接着されておらず）、マイクロキャビティの居場所から押しのけられ、そこから離れて浮かぶことがある。多くの理由のために、培養中に増殖しているスフェロイドが押しのけられることは好ましくない。スフェロイドは、使用済みの培地を除去することにより培養液から除去されることがある。押しのけられたスフェロイドは、他のスフェロイドがいるマイクロキャビティ中に沈降することがあり、他のスフェロイドと合併して不均一な３Ｄ細胞構造を形成することがある。すなわち、培地の交換後、いくつかのスフェロイドが、培養液中の他のものより大きいことがある。これにより、細胞培養の均一性が低下し、３Ｄ細胞に行われる検定または他の試験の結果が影響を受けるであろう。本開示において、乱流を減少させ、マイクロキャビティからスフェロイドを移動させる虞を低下させ、それゆえ、スフェロイドの長期の培養を促進する構造が開示されている。
【００１５】
細胞培養容器１００および例示の細胞培養容器１００内で細胞を培養する方法の実施の形態を、図１〜１８を参照して記載する。図１は、例示の細胞培養容器１００の側面図を概略示している。図２は、図１の線２−２に沿った容器１００の平面図である。図１および図２に示されるように、細胞培養容器１００の実施の形態が示されている。細胞培養容器１００は、ポートまたは開口１０５（キャップ１０４付きで図１に示されているが、図３を参照のこと）およびそのポートまたは開口１０５を細胞培養チャンバ１０３に接続する首部１１２を有する。実施の形態において、その開口は、解放可能に密封することができる。例えば、実施の形態において、首部１１２の開口１０５の断面は、相補的なネジ付き構造を有するキャップ１０４によって、開口１０５を解放可能に密封できるネジ山（内部か外部のいずれか）を有することができる。あるいは、首の開口１０５は、容器を閉じるために当該技術分野に公知のどの他の機構によって、解放可能に密封されても差し支えない。首部１１２と組み合わされた開口１０５は、首付き開口１０９である（図３参照）。首付き開口１０９は、細胞培養チャンバ１０３の壁を通り、細胞培養チャンバ１０３と流体連通している。首付き開口１０９により、液体を容器の細胞培養チャンバ（内部）に導入し、そこから除去することができる。
【００１６】
容器１００の細胞培養表面２００は、実施の形態において、容器１００が細胞増殖のために正しい向きに置かれている場合、容器１００の底部１０８である。実施の形態において、容器１００の底部１０８が表面上に平らになるように容器１００が置かれている場合、容器１００は細胞増殖のために正しい向きに置かれている。容器１００は、側面１０６と首付き開口１０９と反対の端部壁１０７、上部１０１および底部１０８も有するであろう。実施の形態において、上部１０１は、容器１００の細胞培養表面２００と反対である。実施の形態において、首付き開口１０９は、容器１００の端部壁１０７と反対である。実施の形態において、細胞培養表面２００は、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する。容器１００のこれらの構造（首付き開口１０９、上部１０１、底部１０８、側壁１０６および端部壁１０７）の各々は、容器１００の内側に向いた内部表面を有する。すなわち、上部１０１は内部表面２０１を有する。端部壁１０７は内部表面２０７を有する。側壁１０６は内部表面２０６を有する。首部１１２は内部表面２１２を有し、実施の形態において、底部１０８は内部表面を有する。その容器の内側は細胞培養チャンバ１０３であり、容器１００の内側の空間は、上部１０１、底部１０８、側壁１０６および端部壁１０７により画成され、そこが、細胞が容器１００の内側にあるところである。
【００１７】
図２は、図１の線２−２に沿った容器１００の平面図を示す。いくつかの実施の形態において、細胞培養容器１００は、以下に限られないが、高分子、ポリカーボネート、ガラス、およびプラスチックを含む材料から製造することができる。実施の形態において、容器１００は、透き通った（例えば、透明）材料から製造されていると示されている；しかしながら、いくつかの実施の形態において、容器１００は、もう一つの方法として、本開示の範囲から逸脱せずに、半透明の、ほとんど不透明の、または不透明の材料から製造されることがある。
【００１８】
図２の線３−３に沿った容器１００の断面図を示す図３に示されるように、底部１０８は、底部１０８上に置かれた挿入物２１６を有することがある。挿入物２１６は内面３１６を有する。挿入物２１６の内面３１６は、マイクロキャビティのアレイ１１５を有することがある。実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５内のマイクロキャビティは、細胞接着を阻害するコーティングで被覆されている。マイクロキャビティのアレイ１１５を有する挿入物２１６の内面３１６は、実施の形態において、細胞培養表面２００を形成する。その挿入物は、高分子、ポリカーボネート、ガラス、およびプラスチックを含む、マイクロキャビティのアレイ１１５を形成するのに適したどの材料のものであってもよい。実施の形態において、挿入物２１６は、容器１００の製造中に底部１０８上に置かれる。実施の形態において、挿入物２１６は、接着、溶接、音波溶接、超音波溶接、レーザ溶接などを含む当該技術分野に公知の任意の方法を使用して、容器１００の製造中に底部１０８に取り付けられる。
【００１９】
図１および図２に戻ると、いくつかの実施の形態において、容器１００は、ポート１０５を覆ってポート１０５を密封するか塞ぐかの少なくとも一方を行い、それによって、ポート１０５を通る容器１００の外側からの細胞培養チャンバ１０３への通路を遮るように正しく置かれたキャップ１０４を備えることができる。明確にするために、キャップ１０４は取り除かれ、したがって、他の図面には示されていないが、いくつかの実施の形態において、本開示の範囲から逸脱せずに、キャップ１０４を設け、容器１００のポート１０５に選択的に加えたり、取り外したりできることを理解すべきである。いくつかの実施の形態において、キャップ１０４は、容器１００の細胞培養チャンバ１０３中へのおよび／またはそこからの気体の移動を可能にするフィルタを備えることができる。例えば、いくつかの実施の形態において、キャップ１０４は、細胞培養チャンバ１０３内の気体の圧力を調整し、それによって、容器１００の外部の環境の圧力（例えば、大気圧）に対して細胞培養チャンバ１０３の加圧（例えば、過圧）を防ぐように正しく置かれたガス透過性フィルタを備えることができる。
【００２０】
図４は、図１の線４−４に沿った断面図を示している。いくつかの実施の形態において、端部壁１０７は、容器１００の軸１１０に沿ってポート１０５と反対に位置しており、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する挿入物２１６は、細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｉ」に亘る。実施の形態において、挿入物がある場合の挿入物２１６の長さ「Ｌｉ」、または細胞培養チャンバ１０３の底部１０８の内部表面２０８にマイクロキャビティが設けられているときのマイクロキャビティのアレイ１１５の長さは、容器１００の細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｃ」より小さい。すなわち、実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５は、この容器の細胞培養チャンバの全長Ｌｃに沿って延在していない。実施の形態において、そのマイクロキャビティのアレイは、細胞培養チャンバの全長（Ｌｃ）未満しか延在していない。実施の形態において、マイクロキャビティのアレイは長さ（Ｌｉ）だけ延在している。ＬｉはＬｃより小さい。実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５と容器１００の端部壁１０７との間に、バッフル１１３がある。バッフル１１３は長さ（Ｌｂ）を有する。バッフル１１３は、容器１００の端部壁１０７とマイクロキャビティのアレイ１１５との間の空間を占める。
式１：  Ｌｉ＋Ｌｂ＝Ｌｃ
【００２１】
実施の形態において、前記バッフルは、首付き開口を上にして容器が配置されるときに、貯留槽を画成する。容器１００の端部壁１０７に沿って、バッフル面１１４を有するバッフル１１３（下記により詳しく記載されている）がある。図４は、容器１００の首付き開口１０９内のダム１３０も示している。図４に示された実施の形態において、ダムは正方形であるが、ダムは、湾曲、凹形、凸形、ねじれた、または任意の他の形状を含むどのような形状であっても差し支えない。それに加え、ダムのプロファイルは、図４に示されたように、正方形であることがある、またはダムのプロファイルは、湾曲、凹形、凸形、または任意の他の形状であることがある。
【００２２】
図５は、図４の区域５でとられたマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面の一部の拡大概略図を示している。さらに、図６は、図５の線６−６に沿ったマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面の一部の断面図を示しており、図７は、図６の断面図の代わりの実施の形態を示している。図５〜７に示されるように、いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５の各マイクロキャビティ１２０（１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃとして示されている）は、各マイクロキャビティ１２０の上部に開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃ（例えば、マイクロキャビティのアレイ１１５の内部表面１１６内に）を有する。そして、マイクロキャビティのアレイ１１５の各マイクロキャビティ１２０は、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃを画成する凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃ（図６および７参照）を備えることができる。さらに、各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃを備えることができる。これらの構造は、マイクロキャビティのアレイ１１５が容器１００の底部１０８と一体であるか、またはそのマイクロキャビティのアレイが、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する挿入物２１６により与えられるかにかかわらず、存在する。
【００２３】
図６に示されるように、いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５の内部表面１１６は、マイクロキャビティ１２０を画成する非線形（例えば、波状、正弦波）プロファイルを備えることができる。マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面の底部側は、図６に１２６ａとして示されるように、平面（例えば、平らな）プロファイルを備えることができる。これらの構造は、そのマイクロキャビティのアレイが容器１００の底部１０８と一体であるか、またはそのマイクロキャビティのアレイが、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する挿入物２１６により与えられるかにかかわらず、存在する。同様に、図７に示されるように、いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５の内部表面１１６および外部表面１２６の両方とも、非線形（例えば、波状、正弦波）プロファイルを備えることができる。これらの構造は、そのマイクロキャビティのアレイが容器１００の底部１０８と一体であるか、またはそのマイクロキャビティのアレイが、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する挿入物２１６により与えられるかにかかわらず、存在する。図７に示されるように、マイクロキャビティのアレイ１１５が容器１００の底部１０８と一体である場合、マイクロキャビティ１２０のプロファイルが均一な厚さを有する実施の形態において、その内部表面はマイクロキャビティ１２０のアレイを示し、その表面の底部側は、微小突起のアレイ１２６ｂを有する。これらが、１２６ｂとして図７に示されている。容器１００の底部１０８の外部表面１２６は、これらの波状部を示し、「凸凹」であることがある。すなわち、実施の形態において、容器１００の底部１０８の外部表面１２６は、個々のマイクロキャビティ１２０の底部輪郭を示すことがある。図７に示されるように、そのマイクロキャビティの底部輪郭は、そのマイクロキャビティの波状構造の底部側であるが、マイクロキャビティは、どの形状であってもよく、したがって、容器１００の底部１０８の外部表面は、マイクロキャビティ１２０の底部側であるどの形状であってもよい。すなわち、容器１００の底部１０８の外部表面１２６は、微小突起のアレイを有しても、または「凸凹」であってもよい。このことは、マイクロキャビティのアレイが挿入物２１６により与えられている場合にも当てはまる。その場合、挿入物の外部表面は「凹凸」であってよく、一方で、容器１００の底部１０８の外部表面は平面である。すなわち、挿入物２１６は、凸凹の外部表面１２６ｂ、または微小突起のアレイ１２６ｂを有する外部表面を有することがあり、それは、底部１０８の内部表面に支えられることがあり、その内部表面は平坦であることがある。
【００２４】
図６に示されたマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面は、マイクロキャビティのアレイ１１５を作り出す図６における波状または正弦波プロファイルを有するマイクロキャビティのアレイ１１５を有する内部表面１１６を示している。マイクロキャビティのアレイ１１５の外部表面１２６ａは、平面（例えば、平らな）プロファイルを有する。マイクロキャビティのアレイ１１５の内部表面１１６および外部表面１２６に関する図７において、底面は、丸まった微小突起のアレイを有する。図７に示されたマイクロキャビティのアレイ１１５のプロファイルは、削減されている。すなわち、実施の形態において、マイクロキャビティのアレイを作り出す材料のより薄いプロファイルにより、微小突起のアレイ１２６ｂを有する底面がもたらされる。これは、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面を作るために使用される材料の量を減少させることができ、例えば、マイクロキャビティのアレイ１１５の外部表面１２６ａが平面（例えば、平らな）プロファイルを含む（図６）マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面よりも薄い壁のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃを備えたマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面を提供することができる。いくつかの実施の形態において、壁がより薄いマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、マイクロキャビティ１２０の壁をガス透過性にできる材料のより薄いプロファイルを提供することができる。実施の形態において、これにより、マイクロキャビティのアレイを有する表面の気体移動（例えば、透過性）速度が速くなって、細胞培養中のウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃから出入りする気体が多くなるであろう。それゆえ、いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５の内部表面１１６および外部表面１２６の両方に、非平面（例えば、波状、正弦波）プロファイル（例えば、図７参照）を提供することにより、より健全な細胞培養環境を提供し、それによって、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内での細胞の培養を改善することができる。それに加え、実施の形態において、図６および図７に示された２つのプロファイルは、異なる製造方法を使用して製造されるであろう。図６に示されたようなプロファイルは、スタンピングまたは刻印もしくは比較的厚い材料の平らなシートの片面に形状を成形することによって、製造されることがある。図７に示されたプロファイルは、図７に示されたより薄いプロファイルを製造するために材料の薄いシートを成形または圧延することによって、製造されることがある。
【００２５】
いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面は、以下に限られないが、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレン共重合体、フルオロポリマー、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレンブタジエン共重合体、完全に水素化されたスチレン重合体、ポリカーボネートＰＤＭＳ共重合体、およびポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン共重合体および環状オレフィン共重合体などのポリオレフィンを含む高分子材料であり得る。それに加え、いくつかの実施の形態において、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃにより画成されたウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの少なくとも一部を低結合性コーティングで被覆し、それによって、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃのその少なくとも一部を、細胞に対して非接着性にすることができる。例えば、いくつかの実施の形態において、ペルフルオロ高分子、オレフィン、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシドなどのポリエーテル、ポリビニルアルコールなどのポリオールまたはその混合物の１種類以上を、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃにより画成されたウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの少なくとも一部に施すことができる。
【００２６】
さらに、いくつかの実施の形態において、複数のマイクロキャビティ１２０の各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、本開示の範囲から逸脱せずに、様々な特徴構造およびそれらの特徴構造の変種を含むことができる。例えば、いくつかの実施の形態において、複数のマイクロキャビティ１２０は、直線配列（図示の）、対角配列、長方形配列、円形配列、放射状配列、六方最密配置などを含むアレイ（マイクロキャビティのアレイ１１５）で配列することができる。それに加え、いくつかの実施の形態において、開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、様々な形状を含むことができる。いくつかの実施の形態において、開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、円形、卵形、長方形、四辺形、六角形、および他の多角形の１つ以上を含むことができる。それに加え、いくつかの実施の形態において、開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、約１００マイクロメートル（μｍ）から約５０００μｍの寸法（例えば、直径、幅、正方形または長方形の対角線など）を含むことができる。例えば、いくつかの実施の形態において、開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、９５０μｍ、１０００μｍ、１５００μｍ、２０００μｍ、２５００μｍ、３０００μｍ、３５００μｍ、４０００μｍ、４５００μｍ、５０００μｍの寸法、および約１００μｍから約５０００μｍの範囲内に含まれる任意の寸法または寸法の範囲を含むことができる。
【００２７】
いくつかの実施の形態において、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃにより画成されたウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃは、様々な形状を含むことができる。いくつかの実施の形態において、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃにより画成されたウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃは、円形、楕円形、放物形、双曲形、山形、傾斜、または他の断面プロファイル形状の１つ以上を含むことができる。それに加え、いくつかの実施の形態において、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの深さ（例えば、開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃにより画成される平面から、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃまでの深さ）は、約１００マイクロメートル（μｍ）から約５０００μｍまでの寸法を含むことができる。例えば、いくつかの実施の形態において、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの深さは、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、９５０μｍ、１０００μｍ、１５００μｍ、２０００μｍ、２５００μｍ、３０００μｍ、３５００μｍ、４０００μｍ、４５００μｍ、５０００μｍの寸法、および約１００μｍから約５０００μｍの範囲内に含まれる任意の寸法または寸法の範囲を含むことができる。
【００２８】
いくつかの実施の形態において、複数のマイクロキャビティ１１５の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で培養できる三次元細胞１５０（例えば、スフェロイド、オルガノイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ）（図１６参照）は、約５０μｍから約５０００μｍの寸法（例えば、直径）、および約５０μｍから約５０００μｍの範囲内に含まれる任意の寸法または寸法の範囲を含むことができる。いくつかの実施の形態において、開示された明確な寸法より大きいまたは小さい寸法を提供することができ、したがって、特に明記のない限り、開示された明確な寸法より大きいまたは小さい寸法は、本開示の範囲内にあると考えられる。例えば、いくつかの実施の形態において、開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃの１つ以上の寸法、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの深さ、および三次元細胞１５０（例えば、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ）の寸法は、本開示の範囲から逸脱せずに、開示された明確な寸法より大きくても、小さくても差し支えない。
【００２９】
それに加え、またはそれに代えて、図２の線８−８に沿った容器１００の一部の部分断面図を示す図８に示されるように、いくつかの実施の形態において、バッフル１１３が、容器１００の端部壁１０７に沿って存在することがある。図８に示されるものなどの実施の形態において、そのバッフルは、階段状または正方形プロファイル１１４ａを有することがある。同様に、図８の容器１００の一部の部分断面図の代わりの例示の実施の形態を示す図９に示されるように、いくつかの実施の形態において、バッフル１１３は、傾斜したまたは角度の付いたプロファイル１１４ｂを含み得る。下記により詳しく記載されるように、いくつかの実施の形態において、階段状または傾斜したバッフル１１３は、細胞培養容器１００内で細胞を培養する方法に関する利点を提供することができる。
【００３０】
それに加え、またはそれに代えて、図３および図４に戻ると、いくつかの実施の形態において、細胞培養容器１００は、容器１００の首部１１２の内部表面２１２から延在するダム１３０を備えることができる。図３および図４に示されるように、そのダムは、形状が長方形であり得る。いくつかの実施の形態において、ダム１３０は、ポート１０５とマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面との間で画成される流体通路を遮るポートに面する表面１３１を備え得る。いくつかの実施の形態において、ダム１３０のポートに面する表面１３１は、容器１００の軸１１０に対して実質的に垂直であり得る。あるいは、図１の線１０−１０に沿った第１の例示の細胞培養容器１００の一部の部分断面図の例示の実施の形態を示す図１０に示されるように、いくつかの実施の形態において、ダム１３０のポートに面する表面１３１は、凸形プロファイル１３１ａを含むことができる。それに加え、図１１に示されるように、いくつかの実施の形態において、ダム１３０のポートに面する表面１３１は、凹形プロファイル１３１ｂを含むことができる。いくつかの実施の形態において、ダム１３０は、容器１００から出入りする材料の流れを妨げるように設けることができる。追加の実施の形態において、ダム１３０は、正方形または湾曲している、またはどの形状であってもよい。
【００３１】
さらに、図３に戻ると、いくつかの実施の形態において、ダム１３０のエッジ１３５の少なくとも一部は、例えば、上部１０１の内面２０１から距離「ｄ１」だけ距離をあけて配置することができる。いくつかの実施の形態において、ダム１３０の自由端１３５の少なくとも一部を内面２０１から距離をあけて配置することによって、いくつかの実施の形態において、容器１００の後方部分（例えば、ポート１０５と反対側）へのアクセスを設けることができる。例えば、いくつかの実施の形態において、１つ以上の器具（図示せず）を、ダム１３０を越えて（例えば、距離「ｄ１」を通って）容器１００のポート１０５中に挿入して、ダム１３０の背後に配置された細胞培養チャンバ１０３のある領域に到達することができる。したがって、いくつかの実施の形態において、ダム１３０は、第１の流路（図１７の１６１ａ、１６１ｂ、および１６１ｃ参照）および第２の流路（図１８の１６３ａ、１６３ｂ参照）の少なくとも一方に沿って流れる材料の速度を遅くしつつ、容器１００の細胞培養チャンバ１０３中へのバルクアクセスも可能にすることができる。
【００３２】
図１２に示されるように、いくつかの実施の形態において、容器１００が端部壁１０７で立っている場合、容器１００の軸１１０は、重力「ｇ」の方向に実質的に延在しつつ、所定量の液体１４０の液体が複数のマイクロキャビティ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１中に所定量の液体１４０を収容することができる。貯留槽１４１は、底部で端部壁１０７により、側部で容器１００の側壁１０６により境界された、上部１０１とバッフル１１３との間の領域である。貯留槽１４１は、その液体がマイクロキャビティ１２０に入らずに、液体を収容するように構造が作られ、配置されている。バッフル１１３のために、マイクロキャビティのアレイ１１５はその容器の底部１０８に亘り、端部壁１０７までずっと延在しないが、代わりに、マイクロキャビティのアレイ１１５はバッフル１１３で終わるので、容器１００内に貯留槽１４１がある。すなわち、マイクロキャビティのアレイの長さ（Ｌｉ）は、容器の長さ（Ｌｃ）より小さいので、その容器内に存在する貯留槽１４１がある。それに加え、貯留槽１４１は、所定量の液体１４０を収容するようなサイズかつ形状である。
【００３３】
例えば、いくつかの実施の形態において、容器１００は、容器１００の軸１１０が重力「ｇ」の方向に実質的に直立して延在した状態で、例えば、端部壁１０７で水平面（図示せず）上に置くことができる。それに加え、またはそれに代えて、いくつかの実施の形態において、容器１００は、軸１１０が重力「ｇ」の方向に実質的に延在した状態で、１つ以上の構造（例えば、フレーム、架台、人の手など）によって支持（例えば、保持、懸架）され得る。いくつかの実施の形態において、容器１００の外側からポート１０５を通って細胞培養チャンバ１０３中に液体を通過させること（例えば、矢印１０６により示される）、および所定量の液体１４０の液体がマイクロキャビティのアレイ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１中に所定量の液体１４０を収容することの少なくとも一方を行いつつ、容器１００を配置することおよび支持することの１つ以上に基づいて、軸１１０が重力「ｇ」の方向に実質的に延在する状態で、容器１００を設けることができる。
【００３４】
いくつかの実施の形態において、容器１００が静止している間に、所定量の液体１４０の液体が複数のマイクロキャビティ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容することができる。あるいは、いくつかの実施の形態において、容器１００が動いている（例えば、静止していない）間に、所定量の液体１４０の液体が複数のマイクロキャビティ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容することができる。例えば、いくつかの実施の形態において、所定量の液体１４０の液体が複数のマイクロキャビティ１２０の１つ以上のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃと接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容しながら、容器１００に、並進運動および回転運動の少なくとも一方を与えることができる。このように、重力「ｇ」の方向に実質的に延在することに加え、またはその代わりに、いくつかの実施の形態において、所定量の液体１４０の液体がマイクロキャビティのアレイ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容しつつ、容器１００の軸１１０が、重力「ｇ」の方向に対して非ゼロの角度を画成する１つ以上に方向に延在することができる。
【００３５】
さらに、いくつかの実施の形態において、所定量の液体１４０の液体がマイクロキャビティのアレイ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容する間の、容器１００の軸１１０の方向付け（例えば、重力「ｇ」の方向に対して）は、容器１００の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容する間の期間中に不変であり得る。あるいは、いくつかの実施の形態において、所定量の液体１４０の液体がマイクロキャビティのアレイ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容する間の、容器１００の軸１１０の方向付け（例えば、重力「ｇ」の方向に対して）は、容器１００の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容する間の期間中に一回以上変化し得る。さらに、いくつかの実施の形態において、本開示の実施の形態にしたがって、ある瞬間に（例えば、期間と比べて）、所定量の液体１４０の液体がマイクロキャビティのアレイ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、容器１００の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容することができる。図１２に示された実施の形態において、バッフル面１１４は、傾斜したまたは角度の付いたバッフル面１１４ｂである。マイクロキャビティのアレイ１１５を有する内部表面３１６を有する挿入物２１６が図１２に示されているが、マイクロキャビティの一体アレイ１１５を有する細胞培養容器の底部１０８を設けてもよいことが当業者には理解されるであろう。
【００３６】
図１３に概略示されるように、いくつかの実施の形態において、前記方法は、所定量の液体１４０の液体が複数のマイクロキャビティ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容した後（図１２参照）、容器１００を動かして、所定量の液体１４０の少なくとも一部が、細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｉ」に沿ってマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面上で貯留槽１４１から流れ、複数のマイクロキャビティ１１５（またはマイクロキャビティのアレイ１１５を有する内部表面３１６を有する挿入物２１６）の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０内に堆積する工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、容器１００を動かす工程は、第１の向き（例えば、図１２に与えられた向き）から第２の向き（例えば、図１３に与えられた向き）に、容器１００の並進および回転の少なくとも一方を行って、所定量の液体１４０の少なくとも一部が、細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｉ」に沿ってマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面上で貯留槽１４１から流れ、複数のマイクロキャビティ１１５の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０内に堆積させる工程を含むことができ、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０内への液体の堆積は、制御することができ、いくつかの実施の形態において、確保することができる。
【００３７】
例えば、図１４は、図１３の区域１４でとられた第１の例示の細胞培養容器１００の一部の例示の実施の形態の拡大概略図を示しており、所定量の液体１４０の少なくとも一部が、細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｉ」に沿ってマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面上を貯留槽１４１から流れだし、複数のマイクロキャビティ１１５の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０内に堆積しているのを示している。図１４は、マイクロキャビティの開口（１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃ）、マイクロキャビティのウェル（１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ）、マイクロキャビティの壁１２５、およびマイクロキャビティの底面（１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃ）を示している。これらの特徴構造がマイクロキャビティ（１２０ａ、１２０ｂおよび１２０ｃ）を構成している。いくつかの実施の形態において、液体を流す容器１００の動作は、制御することができ、遅いことがあり得る（例えば、およそ数分の期間で行われる）。例えば、複数のマイクロキャビティ１２０のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃに液体を直接充填する（例えば、本開示の方法に基づかない）と、細胞増殖を阻害するか阻むの少なくとも一方である望ましくない充填特徴が生じ得ることが観察された。理論で束縛する意図はないが、複数のマイクロキャビティ１２０のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃに液体を直接かつ急速に（例えば、およそ数秒の期間で行われる）充填しようとした場合、少なくとも、液体の表面張力およびウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内の気体の存在に基づいて、その液体がマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃの開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃに亘り延在するバリアを形成し、それによって、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内に気体（例えば、空気または気泡）を捕捉し得ると考えられる。いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面を通る気体透過速度は、細胞培養時間に対して遅すぎ（例えば、およそ数時間およびおよそ数日の期間で生じる）、よって、実際の適用には、細胞がウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内で培養できない程度まで、気泡がウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内に留まり、液体がウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの外部に留まる。すなわち、気泡は、細胞培養にとってよくない。
【００３８】
しかしながら、本開示の方法の１つ以上の特徴構造を利用することによって、例えば、容器１００を動かして、所定量の液体１４０の少なくとも一部を細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｉ」に沿ってマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面上を貯留槽１４１から流れ出させ、複数のマイクロキャビティ１１５の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内に堆積させることによって、その液体がその少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃのそれぞれの開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃの一部を通ってウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに入ることができることが観察された。例えば、液体がウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに流入するにつれて、その液体は、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内の気体を移動させ、それによって、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに液体を充填することができる。さらに、いくつかの実施の形態において、例えば、およそ数分の期間中にこの工程を行うことによって、液体が細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｉ」に沿ってマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面上を貯留槽１４１から流れ出て、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃのそれぞれの開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃの一部を通ってウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに入るにつれて、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内の気体の実質的に全てをウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃから移動させることができる。すなわち、マイクロキャビティ１２０に貯留槽１４１からの液体培地をゆっくりと充填することによって、マイクロキャビティ１２０内の気泡の形成が減少し、細胞培養が改善される。
【００３９】
いくつかの実施の形態において、容器１００のバッフル１１３のプロファイル１１４は、少なくとも容器１００の動きに基づいて、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面上の貯留槽１４１からの液体の流れを促進させる表面を提供することができる。例えば、いくつかの実施の形態において、バッフル１１３の傾斜したまたは角度の付いたプロファイル１１４ｂは、液体が貯留槽１４１からマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面へと（このマイクロキャビティのアレイは挿入物２１６により与えることができる）それに沿って流動できる傾斜面を提供することができる。いくつかの実施の形態において、バッフル１１３は、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面に当接することができ、流体は、バッフル１１３の傾斜したプロファイル１１４ｂに沿って貯留槽１４１から流れ出し、流動が制御されて（例えば、液体の飛沫が減少しているかまたはなく、乱流が減少しているかまたはない）、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ中に堆積し、それによって、気体をウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃから移動させつつ、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃのそれぞれの開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃを通ってウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ中に堆積する液体の定常流を与えることができる。
【００４０】
図１５に示されるように、いくつかの実施の形態において、少なくとも容器１００の動きに基づいて、所定量の液体１４０を、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する全面に亘り貯留槽１４１から流し出すことができる。それに加え、図１６は、細胞培養容器１００内で細胞１５０を培養する方法を含む、図１５の区域１６でとられた細胞培養容器１００の一部の実施の形態の拡大概略図を示している。例えば、いくつかの実施の形態において、その方法は、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内に所定量の液体１４０の少なくとも一部を堆積させた後、複数のマイクロキャビティ１１５の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０（例えば、スフェロイド１５０ａ、スフェロイド１５０ｂ、スフェロイド１５０ｃ）を培養する工程を含むことができる。図１５および図１６に示されるように、いくつかの実施の形態において、容器１００の軸１１０は、複数のマイクロキャビティ１２０のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０を培養している間、重力「ｇ」の方向に対して実質的に垂直であり得る。
【００４１】
例えば、図１７に示されるように、いくつかの実施の形態において、細胞培養容器１００内で細胞１５０を培養する方法は、ポート１０５に分注ポート１６０を挿入することによって、細胞培養チャンバ１０３中に材料（例えば、食物、栄養素、液体培地）を加える工程、および次いで、材料を分注ポート１６０から細胞培養チャンバ１０３中に分注する工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、その方法は、容器１００のポート１０５に分注ポート１６０を挿入する工程を含み得る。その方法は、容器１００の細胞培養チャンバ１０３内の第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿って材料を流す工程をさらに含み得る。その材料は、分注ポート１６０から材料を分注することによって、第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿って流れ、それによって、容器１００の外部から細胞培養チャンバ１０３中に材料を加えることができる。それに加え、いくつかの実施の形態において、その方法は、第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿った材料の流れを遮る工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿った流れを遮る工程は、第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿った流れをダム１３０で逸らす工程を含み得る。いくつかの実施の形態において、第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿った流れをダム１３０で逸らす工程は、第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿った流れを少なくとも２つの分岐流１６１ｃ、１６１ｄに分割する工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、２つの分岐流１６１ｃ、１６１ｄの少なくとも一方は、ダム１３０の外周を横に廻って（例えば、ダム１３０の外周と、側壁２０１の内面１０２との間）細胞培養チャンバ１０３内を流れることができる。いくつかの実施の形態において、その方法は、材料を分注ポート１６０から細胞培養チャンバ１０３中に分注しながら、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０を培養する工程（図１６参照）を含み得る。
【００４２】
それに加え、図１８に示されるように、いくつかの実施の形態において、前記方法は、ポート１０５を通じて収集ポート１６２を挿入することによって、細胞培養チャンバ１０３から材料（例えば、老廃物、副生成物、液体培地）を除去する工程、および次いで、収集ポート１６２により細胞培養チャンバ１０３から材料を収集する工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、その方法は、ポート１０５に収集ポート１６２を挿入する工程、収集ポート１６２で材料を収集することによって、細胞培養チャンバ１０３内で第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿って材料を流し、それによって、細胞培養チャンバ１０３から材料を除去する工程を含み得る。いくつかの実施の形態において、その方法は、第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿った材料の流れを遮る工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿った材料の流れを遮る工程は、第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿った流れをダム１３０で逸らす工程を含み得る。いくつかの実施の形態において、第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿った流れをダム１３０で逸らす工程は、第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿った流れを少なくとも２つの分岐流１６３ｃ、１６３ｄに分割する工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、２つの分岐流１６３ｃ、１６３ｄの少なくとも一方は、ダム１３０の外周を横に廻って（例えば、ダム１３０の外周と、側壁１０６の内面１０２との間）細胞培養チャンバ１０３内を流れることができる。いくつかの実施の形態において、その方法は、収集ポート１６２で細胞培養チャンバ１０３から材料を収集しながら、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０を培養する工程を含み得る。
【００４３】
いくつかの実施の形態において、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０を培養しながら、第１の流路１６１ａ、１６１ｂおよび第２の流路１６３ａ、１６３ｂの少なくとも一方に沿った材料の流れをダム１３０で遮る工程は、例えば、細胞１５０の培養に干渉せずに、容器１００の細胞培養チャンバ１０３に材料を加え、そこから材料を除去することができる。例えば、いくつかの実施の形態において、分注ポート１６０は、材料を分注ポート１６０から細胞培養チャンバ１３０中に第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿ってある速度で流し（例えば、分注する、吹き込む）、それによって、ポート１０５および細胞培養チャンバ１０３内とその周りに正圧の力を作り出すことによって、細胞培養チャンバ１０３中に材料を加えることができる。同様に、いくつかの実施の形態において、収集ポート１６２は、材料を細胞培養チャンバ１０３から第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿ってある速度で流し（例えば、収集する、吸引する）し、それによって、ポート１０５および細胞培養チャンバ１０３内とその周りに負圧の力を作り出すことによって、細胞培養チャンバ１０３から材料を除去することができる。したがって、いくつかの実施の形態において、ダム１３０は、第１の流路１６１ａ、１６１ｂおよび第２の流路１６３ａ、１６３ｂの少なくとも一方に沿った材料の速度を遅くし、それによって、ポート１０５および細胞培養チャンバ１０３内とその周りの正圧の力および負圧の力をそれぞれ減少させることができる。いくつかの実施の形態において、ダム１３０は、したがって、第１の流路１６１ａ、１６１ｂおよび第２の流路１６３ａ、１６３ｂの少なくとも一方に沿った材料の流れが、複数のマイクロキャビティ１２０のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で培養されている細胞１５０を押しのけるのを低下させるか防ぐかの少なくとも一方を行うことができる。例えば、いくつかの実施の形態において、材料の流れが１つ以上の細胞を押しのける場合、１つ以上のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃが複数のスフェロイドを含むか、スフェロイドを全く含まないことがあり得る。それに加え、いくつかの実施の形態において、材料の流れが、容器１００内で培養されている細胞１５０を押しのけるのを低下させるか防ぐかの少なくとも一方を行うことによって、より良い品質の細胞培養物および細胞培養に関連するより正確な科学的結果を得ることができる。
【００４４】
ここで、図１２〜１６を参照して、第１の例示の細胞培養容器１００内で細胞を培養する方法を説明する。図１２に示されるように、いくつかの実施の形態において、細胞培養容器１００内で細胞１５０を培養する方法（図１６参照）は、容器１００の外部からポート１０５を通じて液体を細胞培養チャンバ１０３に通し（例えば、矢印１０６に示される）、それによって、細胞培養チャンバ１０３内に所定量の液体１４０を提供する工程を含み得る。この方法は、バッフル１１３の傾斜したプロファイル１１４ｂを備えた容器１００に関して記載されているが、いくつかの実施の形態において、その方法は、本開示の範囲から逸脱せずに、非平面境界部分１１４（図３に示されている）、および階段状プロファイル１１４ａ（図８に示されている）、並びに本開示の実施の形態にしたがう容器１００の壁１０１の内面１０２の他のプロファイルに関して同じまたは同様の様式で利用することができることが理解されよう。
【００４５】
いくつかの実施の形態において、前記方法は、所定量の液体１４０の液体が、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面の複数のマイクロキャビティ１２０の１つ以上のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃと接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容する工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、所定量の液体１４０の液体が、複数のマイクロキャビティ１２０の１つ以上のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃと接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容しながら、所定量の液体１４０の液体は、バッフル１１３と接触することができる。下記により詳しく記載されるように、方法のこの段階で、所定量の液体１４０の液体が、複数のマイクロキャビティ１２０の１つ以上のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃと接触するのを防ぐことにより、例えば、細胞１５０の改善された培養（図１６参照）を促進するいくつかの利点を提供することができる。
【００４６】
図２の線３−３に沿った容器１００の断面図を示す図３に示されるように、底部１０８は、底部１０８上に置かれた挿入物２１６を有することがある。挿入物２１６は内面３１６を有する。挿入物２１６の内面３１６は、追加の実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５を有し、細胞培養容器１００は、複数のマイクロキャビティ１２０を備えたマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面を備えることができる（図５〜７参照）。いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面および壁１０１の内面１０２は、容器１００の細胞培養チャンバ１０３を画成することができ、ポート１０５が、壁１０１を通り、細胞培養チャンバ１０３と流体連通している。例えば、いくつかの実施の形態において、細胞培養チャンバ１０３は、容器１００の内部空間体積を含み得る。
【００４７】
実施の形態において、首付き開口の内部表面は、液体の流れを容器中に逸らせ、液体が容器に導入されるときに細胞培養表面上で培養された細胞が経験する乱流を減少させるための１つ以上のダムを有することがある。追加の実施の形態において、細胞を培養する方法は、首付き開口が上を向くように置かれるように容器を最初に配置し、容器の上部に沿って流体を流すことによって流体を容器に入れ、容器の後端から流体を除去することによって、培地を交換する工程を含み得る。さらに別の実施の形態において、細胞を培養する方法は、首付き開口が上を向くように置かれるように容器が配置されている間に培地を導入し、培地を容器の後端に充填し、次いで、マイクロキャビティのアレイを有する表面が下になるまで容器を注意深く傾斜させることによって、マイクロキャビティのアレイを有する表面上に培地を流す工程を含み得る。
【００４８】
いくつかの実施の形態において、容器は、細胞培養チャンバ中への液体の流れを妨げるためのダムを容器の首部に有する。追加の実施の形態において、細胞を培養する方法は、容器のポートに分注ポートを挿入する工程を含み得る。その方法は、壁の内面およびマイクロキャビティのアレイを有する表面により画成された容器の細胞培養チャンバ内で第１の流路に沿って材料を流し、それによって、材料を容器の外部から細胞培養チャンバ中に加える工程を含み得る。その方法は、その第１の流路に沿った材料の流れを妨げる工程を含み得る。
【００４９】
いくつかの実施の形態において、細胞を培養する方法は、容器内のポートを通じて容器の外部から、壁の内面およびマイクロキャビティのアレイを有する表面により画成された容器の細胞培養チャンバ中に液体を通し、それによって、細胞培養チャンバの貯留槽内に所定量の液体を提供する工程を含み得る。その方法は、細胞培養チャンバの貯留槽内に所定量の液体を、その液体が複数のマイクロキャビティの１つ以上と接触せずに収容する工程を含み得る。
【００５０】
いくつかの実施の形態において、細胞培養容器は、壁およびマイクロキャビティのアレイを有する表面を備えることができる。マイクロキャビティのアレイを有する表面および壁の内面および容器の上部は、容器の細胞培養チャンバ、すなわち前記細胞培養チャンバを画成する。ポートが、容器の外部を通り、その細胞培養チャンバと流体連通している。
【００５１】
細胞培養容器および細胞を培養する方法の数多くの態様をここに開示してきた。いくつかの選択された態様の概要が提示されている。
【００５２】
本開示の精神および範囲から逸脱せずに、本開示に様々な改変および変更を行えることが、当業者に明白であろう。それゆえ、本開示は、本開示の改変および変更を、それらが付随の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内に入るという前提で包含することが意図されている。
【００５３】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【００５４】
実施形態１
細胞培養容器において、
細胞培養チャンバであって、上部、底部、側壁、および該細胞培養チャンバの壁を通り、該細胞培養チャンバと流体連通している首付き開口を含む細胞培養チャンバ、
マイクロキャビティのアレイを有する細胞培養表面、および
前記首付き開口と反対の壁と前記マイクロキャビティのアレイとの間にあるバッフル、
を備え、
前記マイクロキャビティのアレイが、前記細胞培養チャンバの長さ（Ｌｃ）より小さい長さ（Ｌｉ）に亘り延在し、
前記マイクロキャビティのアレイの長さ（Ｌｉ）に前記バッフルの長さ（Ｌｂ）を加えた長さが前記細胞培養チャンバの長さ（Ｌｃ）と等しく、
よって、前記首付き開口が上向きになるように前記容器が方向付けられているときに、前記バッフルと前記細胞培養チャンバの上部との間に貯留槽がある、細胞培養容器。
【００５５】
実施形態２
前記底部が前記マイクロキャビティのアレイを備える、実施形態１に記載の細胞培養容器。
【００５６】
実施形態３
前記マイクロキャビティのアレイが前記底部の内部表面と一体である、実施形態２に記載の細胞培養容器。
【００５７】
実施形態４
前記マイクロキャビティのアレイの底面が平面である、実施形態３に記載の細胞培養容器。
【００５８】
実施形態５
前記マイクロキャビティのアレイの底面が、微小突起のアレイを備える、実施形態３に記載の細胞培養容器。
【００５９】
実施形態６
前記底部上に挿入物をさらに備え、該挿入物が前記マイクロキャビティのアレイを備える、実施形態１に記載の細胞培養容器。
【００６０】
実施形態７
前記挿入物が前記底部に取り付けられている、実施形態６に記載の細胞培養容器。
【００６１】
実施形態８
前記マイクロキャビティのアレイの底面が平面である、実施形態６に記載の細胞培養容器。
【００６２】
実施形態９
前記マイクロキャビティのアレイの底面が、微小突起のアレイを備える、実施形態６に記載の細胞培養容器。
【００６３】
実施形態１０
前記バッフルが傾斜している、実施形態１から９のいずれか１つに記載の細胞培養容器。
【００６４】
実施形態１１
前記バッフルが正方形である、実施形態１から９のいずれか１つに記載の細胞培養容器。
【００６５】
実施形態１２
前記容器の首付き開口内にダムをさらに備える、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の細胞培養容器。
【００６６】
実施形態１３
前記ダムが湾曲している、実施形態１２に記載の細胞培養容器。
【００６７】
実施形態１４
前記ダムが長方形である、実施形態１２に記載の細胞培養容器。
【００６８】
実施形態１５
実施形態１から１４のいずれか１つに記載の細胞培養容器内で細胞を培養する方法において、
前記容器の首付き開口と反対の端部壁で接するように該容器を置く工程、
前記容器に液体培地中に懸濁された細胞を導入し、そこで、該細胞および該液体培地が、前記バッフルと前記容器の上部との間の空間にある前記貯留槽内に入れられる工程、および
前記細胞および前記液体培地が、前記マイクロキャビティのアレイを備えた前記細胞培養表面上に流れるように、前記容器を回転させる工程、
を有してなる方法。
【００６９】
実施形態１６
前記容器内で前記細胞を培養する工程をさらに含む、実施形態１５に記載の方法。
【００７０】
実施形態１７
前記細胞および前記液体培地が前記貯留槽に流れ込むように、前記容器を回転させる工程をさらに含む、実施形態１６に記載の方法。
【００７１】
実施形態１８
細胞を培養する方法において、
細胞培養容器の首付き開口に分注ポートを挿入する工程、
前記分注ポートから材料を分注することによって、壁の内面およびマイクロキャビティのアレイを備えた表面により画成された前記容器の細胞培養チャンバ内で第１の流路に沿って材料を流し、それによって、材料を該容器の外部から該細胞培養チャンバに加える工程、および
前記第１の流路に沿った材料の流れを遮る工程、
を有してなる方法。
【００７２】
実施形態１９
前記第１の流路に沿った材料の流れを遮る工程が、該第１の流路に沿った材料の流れをダムで逸らせる工程を含む、実施形態１８に記載の方法。
【００７３】
実施形態２０
前記第１の流路に沿った材料の流れをダムで逸らせる工程が、前記第１の流路に沿った材料の流れを少なくとも２つの分岐流に分割する工程を含む、実施形態１９に記載の方法。
【符号の説明】
【００７４】
１００    細胞培養容器
１０１    上部
１０３    細胞培養チャンバ
１０４    キャップ
１０５    ポート、開口
１０６    側壁
１０７    端部壁
１０８    底部
１０９    首付き開口
１１２    首部
１１３    バッフル
１１５    マイクロキャビティのアレイ
１２０、１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ    マイクロキャビティ
１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃ    凹面
１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ    ウェル
１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃ    開口
１３０    ダム
１５０、１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ    細胞、スフェロイド
２００    細胞培養表面
２１６    挿入物
【図１】
2020526217.tif 000003
【図２】
2020526217.tif 000004
【図３】
2020526217.tif 000005
【図４】
2020526217.tif 000006
【図５】
2020526217.tif 000007
【図６】
2020526217.tif 000008
【図７】
2020526217.tif 000009
【図８】
2020526217.tif 000010
【図９】
2020526217.tif 000011
【図１０】
2020526217.tif 000012
【図１１】
2020526217.tif 000013
【図１２】
2020526217.tif 000014
【図１３】
2020526217.tif 000015
【図１４】
2020526217.tif 000016
【図１５】
2020526217.tif 000017
【図１６】
2020526217.tif 000018
【図１７】
2020526217.tif 000019
【図１８】
2020526217.tif 000020
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月1日(2020.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【関連出願の説明】
【０００１】
本出願は、その内容が依拠され、ここに全て引用される、「Cell Culture Container and Methods of Culturing Cells」と題する、２０１７年７月１４日に出願された米国仮特許出願第６２／５３２６４８号の優先権の恩恵を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、広く、細胞培養容器および細胞を培養する方法に関し、より詳しくは、三次元細胞を収容し、操作するための細胞培養容器およびその細胞培養容器内で三次元細胞を培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞培養容器内に三次元細胞を収容し、培養することが公知である。
【発明の概要】
【０００４】
以下は、詳細な説明に記載されたいくつかの例示の実施の形態の基本的な理解を与えるために、本開示の簡単な概要を提示するものである。
【０００５】
実施の形態において、本開示は、細胞培養容器であって、首付き開口、細胞培養チャンバ、上部、底部、側壁、端部壁およびその容器の底面に一体に設けられたか、もしくはその容器の底面に配置されたまたは取り付けられた、マイクロキャビティのアレイを有する挿入物により設けられたかのいずれかの、マイクロキャビティのアレイを有する細胞を培養するための表面を有する細胞培養容器を提供する。実施の形態において、そのマイクロキャビティのアレイは、その容器の細胞培養チャンバの全長に沿って延在しない。実施の形態において、マイクロキャビティのアレイは、細胞培養チャンバの全長（Ｌｖ）未満で延在する。実施の形態において、マイクロキャビティのアレイは、長さ（Ｌｉ）だけ延在する。ＬｉはＬｖより小さい。実施の形態において、マイクロキャビティのアレイと容器の端部壁との間に、バッフルがある。そのバッフルは、長さ（Ｌｂ）を有する。バッフルは、容器の端部壁とマイクロキャビティのアレイとの間の空間を占める。Ｌｉ＋Ｌｂ＝Ｌｖ。実施の形態において、そのバッフルは、首付き開口が上になるように容器が置かれたときに、貯留槽を画成する。バッフルは、マイクロキャビティに最小の乱流で培地を充填し、それゆえ、マイクロキャビティ内にあるスフェロイドの撹乱を少なくできるようにマイクロキャビティに入る液体の流れを制御する。実施の形態において、バッフルは、傾斜、湾曲、正方形または任意の形状であってよい。追加の実施の形態において、また容器に出入りする液体の動きにより生じる乱流を減少させるために、容器の首付き開口は、容器に出入りする、液体培地などの液体の流れを妨げるダムを有することがある。実施の形態において、そのダムは、正方形または湾曲または任意の形状であってよい。これらの特徴構造は、単独で、または組合せで存在することがある。例えば、その容器は、マイクロキャビティのアレイおよび湾曲したまたは真っ直ぐのダムを有することがある。その容器は、マイクロキャビティのアレイおよびバッフルを有することがあり、そのバッフルは傾斜しているまたは正方形であることがある。その容器は、マイクロキャビティのアレイおよびダムとバッフルを有することがある。そして、そのダムは湾曲していても正方形であってもよく、そのバッフルは傾斜していても正方形であってもよい。細胞を培養し、培地を導入し、容器から培地を取り出す方法も提供される。
【０００６】
先の実施の形態は、例示であり、本開示の範囲から逸脱せずに、ここに与えられたどの１つ以上の実施の形態と、どの組合せで提供しても、または単独で提供しても差し支えない。さらに、先の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方とも、本開示の実施の形態を提示しており、記載され、請求項に定義されたような実施の形態の性質および特徴を理解するための概要または骨子を提供する意図があることを理解すべきである。添付図面は、その実施の形態のさらなる理解を与えるために含まれ、本明細書に包含され、その一部を構成する。図面は、本開示の様々な実施の形態を示しており、説明と共に、その原理および作動を説明する働きをする。
【０００７】
本開示のこれらと他の特徴、実施の形態、および利点は、添付図面を参照して読んだときに、さらに理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】本開示の実施の形態による第１の例示の細胞培養容器の側面図
【図２】本開示の実施の形態による図１の線２−２に沿った第１の例示の細胞培養容器の平面図
【図３】本開示の実施の形態による図２の線３−３に沿った第１の例示の細胞培養容器の断面図
【図４】本開示の実施の形態による図１の線４−４に沿った第１の例示の細胞培養容器の断面図
【図５】本開示の実施の形態による、複数のマイクロキャビティを含むマイクロキャビティのアレイを有する表面を含む、図４の区域５でとられた第１の例示の細胞培養容器の一部の例示の実施の形態の拡大概略図
【図６】本開示の実施の形態による図５の線６−６に沿った、複数のマイクロキャビティを含むマイクロキャビティのアレイを有する表面を含む第１の例示の細胞培養容器のその一部の断面図
【図７】本開示の実施の形態による図６の複数のマイクロキャビティを含むマイクロキャビティのアレイを有する表面を含む第１の例示の細胞培養容器のその一部の代わりの例示の実施の形態の断面図
【図８】本開示の実施の形態による階段状プロファイルを含む、図２の線８−８に沿った第１の例示の細胞培養容器の一部の例示の実施の形態の部分断面図
【図９】本開示の実施の形態による傾斜プロファイルを含む、図８の第１の例示の細胞培養容器の一部の代わりの例示の実施の形態の部分断面図
【図１０】本開示の実施の形態による凸状プロファイルを含むバッフルを備えた、図１の線１０−１０に沿った第１の例示の細胞培養容器の一部の例示の実施の形態の部分断面図
【図１１】本開示の実施の形態による凹状プロファイルを含むバッフルを備えた、図１０の第１の例示の細胞培養容器の一部の代わりの例示の実施の形態の部分断面図
【図１２】本開示の実施の形態による第１の例示の細胞培養容器内で細胞を培養する方法を含む、図３の第１の例示の細胞培養容器の代わりの例示の実施の形態の断面図
【図１３】本開示の実施の形態による図１２の第１の例示の細胞培養容器内で細胞を培養する方法の例示の工程を示す断面図
【図１４】本開示の実施の形態による、複数のマイクロキャビティを含むマイクロキャビティのアレイを有する表面を含む図１３の区域１４でとられた第１の例示の細胞培養容器の一部の例示の実施の形態の拡大概略図
【図１５】本開示の実施の形態による図１３の第１の例示の細胞培養容器内で細胞を培養する方法の例示の工程を示す断面図
【図１６】本開示の実施の形態による、複数のマイクロキャビティを含むマイクロキャビティのアレイを有する表面を備えた図１５の区域１６でとられた第１の例示の細胞培養容器の一部、およびその複数のマイクロキャビティの内の少なくとも１つのマイクロキャビティ内で細胞を培養する方法の例示の実施の形態の拡大概略図
【図１７】本開示の実施の形態による、バッフルを含む図１０の第１の例示の細胞培養容器の一部および分注ポートで容器に材料を加える方法の代わりの例示の実施の形態の部分断面図
【図１８】本開示の実施の形態による、バッフルを含む図１０の第１の例示の細胞培養容器の一部および収集ポートで容器から材料を取り出す方法の代わりの例示の実施の形態の部分断面図
【発明を実施するための形態】
【０００９】
ここで、本開示の例示の実施の形態が示されている添付図面を参照して、特徴構造を下記により十分に記載する。できるときはいつでも、同じまたは同様の部分を称するために、図面に亘り同じ参照番号が使用される。しかしながら、本開示は、多くの異なる形態で具体化することができ、ここに述べられた実施の形態に限定されると解釈すべきではない。
【００１０】
細胞培養容器（例えば、フラスコ）は、細胞を培養するための無菌チャンバを提供することができる。いくつかの実施の形態において、細胞培養は、疾患と毒物学の研究、薬物と治療の効果、腫瘍の特徴、有機体、遺伝学、並びに細胞のおよび細胞に関連する他の科学、生物学、および化学原理に関連する情報を提供することができる。いくつかの実施の形態において、三次元細胞培養は、二次元細胞培養と比べて、より生理学的に正確であり、二次元細胞培養と比べて、実生活用途で細胞が存在し、成長できる環境をより実現的に表す多細胞性構造を生じることができる。例えば、三次元細胞培養は、「インビボ」（すなわち、生存している実生活内の）細胞増殖をシミュレーションする現実的環境をより厳密に提供することが分かっており、一方で、二次元細胞培養は、現実的環境をそれほど表していない「インビトロ」（すなわち、研究室環境におけるガラス内）細胞増殖をシミュレーションする環境を提供することが分かっている。三次元細胞培養物と相互作用し、その性質と挙動を観察することによって、例えば、疾患と毒物学の研究、薬物と治療の効果、腫瘍、有機体の特徴、遺伝学、並びに細胞のおよび細胞に関連する他の科学、生物学、および化学原理に関連する細胞の理解の向上を成し遂げることができる。
【００１１】
実施の形態において、細胞培養容器１００は、各々が、液体培地および培養下の細胞と接触する内部表面を有する、底部１０８、上部１０１、および端部壁１０７と側壁１０６を備えることができる。これらの内部表面は、細胞培養チャンバ１０３を画成する。これらの表面の内の少なくとも１つは、細胞増殖に一層特別に適することができる。例えば、細胞培養表面は、細胞が表面にくっつくのを助長するまたは妨げるコーティングで処理されることがある。あるいは、スフェロイド細胞の培養を支援するために、細胞培養表面は、例えば、アレイ状に配列された複数のマイクロキャビティまたは区画（例えば、微小サイズのウェル、ミリリットル未満のサイズのウェル）を備えることができる。その細胞培養表面は、フラスコと一体であり得る、または細胞培養チャンバ内に置かれたまたは取り付けられたマイクロキャビティのアレイを有する別個の表面であり得る。上面、底面、１つ以上の側面、もしくはこれらの組合せは、アレイ状にマイクロキャビティを備えることができる。
【００１２】
例えば、いくつかの実施の形態において、１つのスフェロイドが、複数のマイクロキャビティの各々のマイクロキャビティ中に形成し得る。容器内の液体培地中に導入された細胞は、重力によってマイクロキャビティ中に沈降する。液体培地中に懸濁された１つ以上の細胞は、その液体を通って落下し、各マイクロキャビティ内に収まる。マイクロキャビティの形状（例えば、ウェルを画成する凹状表面）、および細胞が表面に付着するのを防ぐマイクロキャビティの表面コーティングも、細胞が三次元形態に増殖し、各マイクロキャビティ内にスフェロイドを形成するのを促進することができる。
【００１３】
マイクロキャビティは、例えば、波状のまたは正弦波の形状で形成され、丸まった上部と丸まった底部を有するマイクロキャビティまたはマイクロウェルを形成することができる。これらの丸まったエッジは、液体培地が容器を満たしたときに、気泡が形成されるのを防ぐであろう。いくつかの実施の形態において、フラスコに、三次元細胞培養物（例えば、細胞集合体、オルガノイドまたはスフェロイド）の増殖を促進する材料（例えば、培地、固体、液体、気体）を充填することができる。例えば、液体中に懸濁された細胞を含む培地を、細胞培養チャンバまたは容器に加えることができる。懸濁された細胞は、重力によって複数のマイクロキャビティ内に集まることができ、細胞の集団または塊を形成する（例えば、増殖する）ことができる。集団または塊の細胞は、三次元で増殖して、他にスフェロイドまたはオルガノイドとして知られている、３Ｄの細胞を形成する。細胞の１つの塊またはスフェロイドが、１つのマイクロキャビティ内に形成する。それゆえ、マイクロキャビティのアレイを有する細胞培養表面を有する容器または細胞培養チャンバを使用して、各々が自らのマイクロキャビティ内にある、スフェロイドのアレイを培養することができる。
【００１４】
培養中、スフェロイドは、培地（例えば、食物、栄養素）を消費し、副生成物として代謝産物（例えば、老廃物）を産生し得る。それゆえ、いくつかの実施の形態において、培地の形態にある食物を培養中に細胞培養チャンバに加えることができ、培養中に、細胞培養チャンバから廃棄培地を除去することができる。細胞に食物を与えるために培地を交換し、老廃物を除去するこの能力は、細胞の長期間の培養にとって重要である。しかしながら、培地を加え、除去すると、マイクロキャビティ内にあるスフェロイドを乱したり、移動されたりすることのある乱流が生じるであろう。このことは、細胞がマイクロキャビティの表面にくっつくのを防ぐために、マイクロキャビティが低結合性コーティングで被覆されている場合、特に当てはまる。スフェロイドは、固定されておらず（表面に接着されておらず）、マイクロキャビティの居場所から押しのけられ、そこから離れて浮かぶことがある。多くの理由のために、培養中に増殖しているスフェロイドが押しのけられることは好ましくない。スフェロイドは、使用済みの培地を除去することにより培養液から除去されることがある。押しのけられたスフェロイドは、他のスフェロイドがいるマイクロキャビティ中に沈降することがあり、他のスフェロイドと合併して不均一な３Ｄ細胞構造を形成することがある。すなわち、培地の交換後、いくつかのスフェロイドが、培養液中の他のものより大きいことがある。これにより、細胞培養の均一性が低下し、３Ｄ細胞に行われる検定または他の試験の結果が影響を受けるであろう。本開示において、乱流を減少させ、マイクロキャビティからスフェロイドを移動させる虞を低下させ、それゆえ、スフェロイドの長期の培養を促進する構造が開示されている。
【００１５】
細胞培養容器１００および例示の細胞培養容器１００内で細胞を培養する方法の実施の形態を、図１〜１８を参照して記載する。図１は、例示の細胞培養容器１００の側面図を概略示している。図２は、図１の線２−２に沿った容器１００の平面図である。図１および図２に示されるように、細胞培養容器１００の実施の形態が示されている。細胞培養容器１００は、ポートまたは開口１０５（キャップ１０４付きで図１に示されているが、図３を参照のこと）およびそのポートまたは開口１０５を細胞培養チャンバ１０３に接続する首部１１２を有する。実施の形態において、その開口は、解放可能に密封することができる。例えば、実施の形態において、首部１１２の開口１０５の断面は、相補的なネジ付き構造を有するキャップ１０４によって、開口１０５を解放可能に密封できるネジ山（内部か外部のいずれか）を有することができる。あるいは、首の開口１０５は、容器を閉じるために当該技術分野に公知のどの他の機構によって、解放可能に密封されても差し支えない。首部１１２と組み合わされた開口１０５は、首付き開口１０９である（図３参照）。首付き開口１０９は、細胞培養チャンバ１０３の壁を通り、細胞培養チャンバ１０３と流体連通している。首付き開口１０９により、液体を容器の細胞培養チャンバ（内部）に導入し、そこから除去することができる。
【００１６】
容器１００の細胞培養表面２００は、実施の形態において、容器１００が細胞増殖のために正しい向きに置かれている場合、容器１００の底部１０８である。実施の形態において、容器１００の底部１０８が表面上に平らになるように容器１００が置かれている場合、容器１００は細胞増殖のために正しい向きに置かれている。容器１００は、側面１０６と首付き開口１０９と反対の端部壁１０７、上部１０１および底部１０８も有するであろう。実施の形態において、上部１０１は、容器１００の細胞培養表面２００と反対である。実施の形態において、首付き開口１０９は、容器１００の端部壁１０７と反対である。実施の形態において、細胞培養表面２００は、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する。容器１００のこれらの構造（首付き開口１０９、上部１０１、底部１０８、側壁１０６および端部壁１０７）の各々は、容器１００の内側に向いた内部表面を有する。すなわち、上部１０１は内部表面２０１を有する。端部壁１０７は内部表面２０７を有する。側壁１０６は内部表面２０６を有する。首部１１２は内部表面２１２を有し、実施の形態において、底部１０８は内部表面を有する。その容器の内側は細胞培養チャンバ１０３であり、容器１００の内側の空間は、上部１０１、底部１０８、側壁１０６および端部壁１０７により画成され、そこが、細胞が容器１００の内側にあるところである。
【００１７】
図２は、図１の線２−２に沿った容器１００の平面図を示す。いくつかの実施の形態において、細胞培養容器１００は、以下に限られないが、高分子、ポリカーボネート、ガラス、およびプラスチックを含む材料から製造することができる。実施の形態において、容器１００は、透き通った（例えば、透明）材料から製造されていると示されている；しかしながら、いくつかの実施の形態において、容器１００は、もう一つの方法として、本開示の範囲から逸脱せずに、半透明の、ほとんど不透明の、または不透明の材料から製造されることがある。
【００１８】
図２の線３−３に沿った容器１００の断面図を示す図３に示されるように、底部１０８は、底部１０８上に置かれた挿入物２１６を有することがある。挿入物２１６は内面３１６を有する。挿入物２１６の内面３１６は、マイクロキャビティのアレイ１１５を有することがある。実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５内のマイクロキャビティは、細胞接着を阻害するコーティングで被覆されている。マイクロキャビティのアレイ１１５を有する挿入物２１６の内面３１６は、実施の形態において、細胞培養表面２００を形成する。その挿入物は、高分子、ポリカーボネート、ガラス、およびプラスチックを含む、マイクロキャビティのアレイ１１５を形成するのに適したどの材料のものであってもよい。実施の形態において、挿入物２１６は、容器１００の製造中に底部１０８上に置かれる。実施の形態において、挿入物２１６は、接着、溶接、音波溶接、超音波溶接、レーザ溶接などを含む当該技術分野に公知の任意の方法を使用して、容器１００の製造中に底部１０８に取り付けられる。
【００１９】
図１および図２に戻ると、いくつかの実施の形態において、容器１００は、ポート１０５を覆ってポート１０５を密封するか塞ぐかの少なくとも一方を行い、それによって、ポート１０５を通る容器１００の外側からの細胞培養チャンバ１０３への通路を遮るように正しく置かれたキャップ１０４を備えることができる。明確にするために、キャップ１０４は取り除かれ、したがって、他の図面には示されていないが、いくつかの実施の形態において、本開示の範囲から逸脱せずに、キャップ１０４を設け、容器１００のポート１０５に選択的に加えたり、取り外したりできることを理解すべきである。いくつかの実施の形態において、キャップ１０４は、容器１００の細胞培養チャンバ１０３中へのおよび／またはそこからの気体の移動を可能にするフィルタを備えることができる。例えば、いくつかの実施の形態において、キャップ１０４は、細胞培養チャンバ１０３内の気体の圧力を調整し、それによって、容器１００の外部の環境の圧力（例えば、大気圧）に対して細胞培養チャンバ１０３の加圧（例えば、過圧）を防ぐように正しく置かれたガス透過性フィルタを備えることができる。
【００２０】
図４は、図１の線４−４に沿った断面図を示している。いくつかの実施の形態において、端部壁１０７は、容器１００の軸１１０に沿ってポート１０５と反対に位置しており、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する挿入物２１６は、細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｉ」に亘る。実施の形態において、挿入物がある場合の挿入物２１６の長さ「Ｌｉ」、または細胞培養チャンバ１０３の底部１０８の内部表面２０８にマイクロキャビティが設けられているときのマイクロキャビティのアレイ１１５の長さは、容器１００の細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｖ」より小さい。すなわち、実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５は、この容器の細胞培養チャンバの全長Ｌｖに沿って延在していない。実施の形態において、そのマイクロキャビティのアレイは、細胞培養チャンバの全長（Ｌｖ）未満しか延在していない。実施の形態において、マイクロキャビティのアレイは長さ（Ｌｉ）だけ延在している。ＬｉはＬｖより小さい。実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５と容器１００の端部壁１０７との間に、バッフル１１３がある。バッフル１１３は長さ（Ｌｂ）を有する。バッフル１１３は、容器１００の端部壁１０７とマイクロキャビティのアレイ１１５との間の空間を占める
式１：  Ｌｉ＋Ｌｂ＝Ｌｖ。
【００２１】
実施の形態において、前記バッフルは、首付き開口を上にして容器が配置されるときに、貯留槽を画成する。容器１００の端部壁１０７に沿って、バッフル面１１４を有するバッフル１１３（下記により詳しく記載されている）がある。図４は、容器１００の首付き開口１０９内のダム１３０も示している。図４に示された実施の形態において、ダムは正方形であるが、ダムは、湾曲、凹形、凸形、ねじれた、または任意の他の形状を含むどのような形状であっても差し支えない。それに加え、ダムのプロファイルは、図４に示されたように、正方形であることがある、またはダムのプロファイルは、湾曲、凹形、凸形、または任意の他の形状であることがある。
【００２２】
図５は、図４の区域５でとられたマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面の一部の拡大概略図を示している。さらに、図６は、図５の線６−６に沿ったマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面の一部の断面図を示しており、図７は、図６の断面図の代わりの実施の形態を示している。図５〜７に示されるように、いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５の各マイクロキャビティ１２０（１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃとして示されている）は、各マイクロキャビティ１２０の上部に開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃ（例えば、マイクロキャビティのアレイ１１５の内部表面１１６内に）を有する。そして、マイクロキャビティのアレイ１１５の各マイクロキャビティ１２０は、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃを画成する凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃ（図６および７参照）を備えることができる。さらに、各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃを備えることができる。これらの構造は、マイクロキャビティのアレイ１１５が容器１００の底部１０８と一体であるか、またはそのマイクロキャビティのアレイが、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する挿入物２１６により与えられるかにかかわらず、存在する。
【００２３】
図６に示されるように、いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５の内部表面１１６は、マイクロキャビティ１２０を画成する非線形（例えば、波状、正弦波）プロファイルを備えることができる。マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面の底部側は、図６に１２６として示されるように、平面（例えば、平らな）プロファイルを備えることができる。これらの構造は、そのマイクロキャビティのアレイが容器１００の底部１０８と一体であるか、またはそのマイクロキャビティのアレイが、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する挿入物２１６により与えられるかにかかわらず、存在する。同様に、図７に示されるように、いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５の内部表面１１６および外部表面１２６の両方とも、非線形（例えば、波状、正弦波）プロファイルを備えることができる。これらの構造は、そのマイクロキャビティのアレイが容器１００の底部１０８と一体であるか、またはそのマイクロキャビティのアレイが、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する挿入物２１６により与えられるかにかかわらず、存在する。図７に示されるように、マイクロキャビティのアレイ１１５が容器１００の底部１０８と一体である場合、マイクロキャビティ１２０のプロファイルが均一な厚さを有する実施の形態において、その内部表面はマイクロキャビティ１２０のアレイを示し、その表面の底部側は、微小突起のアレイ１２６を有する。これらが、１２６として図７に示されている。容器１００の底部１０８の外部表面１２６は、これらの波状部を示し、「凸凹」であることがある。すなわち、実施の形態において、容器１００の底部１０８の外部表面１２６は、個々のマイクロキャビティ１２０の底部輪郭を示すことがある。図７に示されるように、そのマイクロキャビティの底部輪郭は、そのマイクロキャビティの波状構造の底部側であるが、マイクロキャビティは、どの形状であってもよく、したがって、容器１００の底部１０８の外部表面は、マイクロキャビティ１２０の底部側であるどの形状であってもよい。すなわち、容器１００の底部１０８の外部表面１２６は、微小突起のアレイを有しても、または「凸凹」であってもよい。このことは、マイクロキャビティのアレイが挿入物２１６により与えられている場合にも当てはまる。その場合、挿入物の外部表面は「凹凸」であってよく、一方で、容器１００の底部１０８の外部表面は平面である。すなわち、挿入物２１６は、凸凹の外部表面１２６、または微小突起のアレイ１２６を有する外部表面を有することがあり、それは、底部１０８の内部表面に支えられることがあり、その内部表面は平坦であることがある。
【００２４】
図６に示されたマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面は、マイクロキャビティのアレイ１１５を作り出す図６における波状または正弦波プロファイルを有するマイクロキャビティのアレイ１１５を有する内部表面１１６を示している。マイクロキャビティのアレイ１１５の外部表面１２６は、平面（例えば、平らな）プロファイルを有する。マイクロキャビティのアレイ１１５の内部表面１１６および外部表面１２６に関する図７において、底面は、丸まった微小突起のアレイを有する。図７に示されたマイクロキャビティのアレイ１１５のプロファイルは、削減されている。すなわち、実施の形態において、マイクロキャビティのアレイを作り出す材料のより薄いプロファイルにより、微小突起のアレイ１２６を有する底面がもたらされる。これは、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面を作るために使用される材料の量を減少させることができ、例えば、マイクロキャビティのアレイ１１５の外部表面１２６が平面（例えば、平らな）プロファイルを含む（図６）マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面よりも薄い壁のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃを備えたマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面を提供することができる。いくつかの実施の形態において、壁がより薄いマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、マイクロキャビティ１２０の壁をガス透過性にできる材料のより薄いプロファイルを提供することができる。実施の形態において、これにより、マイクロキャビティのアレイを有する表面の気体移動（例えば、透過性）速度が速くなって、細胞培養中のウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃから出入りする気体が多くなるであろう。それゆえ、いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５の内部表面１１６および外部表面１２６の両方に、非平面（例えば、波状、正弦波）プロファイル（例えば、図７参照）を提供することにより、より健全な細胞培養環境を提供し、それによって、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内での細胞の培養を改善することができる。それに加え、実施の形態において、図６および図７に示された２つのプロファイルは、異なる製造方法を使用して製造されるであろう。図６に示されたようなプロファイルは、スタンピングまたは刻印もしくは比較的厚い材料の平らなシートの片面に形状を成形することによって、製造されることがある。図７に示されたプロファイルは、図７に示されたより薄いプロファイルを製造するために材料の薄いシートを成形または圧延することによって、製造されることがある。
【００２５】
いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面は、以下に限られないが、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレン共重合体、フルオロポリマー、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレンブタジエン共重合体、完全に水素化されたスチレン重合体、ポリカーボネートＰＤＭＳ共重合体、およびポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン共重合体および環状オレフィン共重合体などのポリオレフィンを含む高分子材料であり得る。それに加え、いくつかの実施の形態において、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃにより画成されたウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの少なくとも一部を低結合性コーティングで被覆し、それによって、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃのその少なくとも一部を、細胞に対して非接着性にすることができる。例えば、いくつかの実施の形態において、ペルフルオロ高分子、オレフィン、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシドなどのポリエーテル、ポリビニルアルコールなどのポリオールまたはその混合物の１種類以上を、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃにより画成されたウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの少なくとも一部に施すことができる。
【００２６】
さらに、いくつかの実施の形態において、複数のマイクロキャビティ１２０の各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、本開示の範囲から逸脱せずに、様々な特徴構造およびそれらの特徴構造の変種を含むことができる。例えば、いくつかの実施の形態において、複数のマイクロキャビティ１２０は、直線配列（図示の）、対角配列、長方形配列、円形配列、放射状配列、六方最密配置などを含むアレイ（マイクロキャビティのアレイ１１５）で配列することができる。それに加え、いくつかの実施の形態において、開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、様々な形状を含むことができる。いくつかの実施の形態において、開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、円形、卵形、長方形、四辺形、六角形、および他の多角形の１つ以上を含むことができる。それに加え、いくつかの実施の形態において、開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、約１００マイクロメートル（μｍ）から約５０００μｍの寸法（例えば、直径、幅、正方形または長方形の対角線など）を含むことができる。例えば、いくつかの実施の形態において、開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、９５０μｍ、１０００μｍ、１５００μｍ、２０００μｍ、２５００μｍ、３０００μｍ、３５００μｍ、４０００μｍ、４５００μｍ、５０００μｍの寸法、および約１００μｍから約５０００μｍの範囲内に含まれる任意の寸法または寸法の範囲を含むことができる。
【００２７】
いくつかの実施の形態において、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃにより画成されたウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃは、様々な形状を含むことができる。いくつかの実施の形態において、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃにより画成されたウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃは、円形、楕円形、放物形、双曲形、山形、傾斜、または他の断面プロファイル形状の１つ以上を含むことができる。それに加え、いくつかの実施の形態において、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの深さ（例えば、開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃにより画成される平面から、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃまでの深さ）は、約１００マイクロメートル（μｍ）から約５０００μｍまでの寸法を含むことができる。例えば、いくつかの実施の形態において、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの深さは、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、９５０μｍ、１０００μｍ、１５００μｍ、２０００μｍ、２５００μｍ、３０００μｍ、３５００μｍ、４０００μｍ、４５００μｍ、５０００μｍの寸法、および約１００μｍから約５０００μｍの範囲内に含まれる任意の寸法または寸法の範囲を含むことができる。
【００２８】
いくつかの実施の形態において、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で培養できる三次元細胞１５０（例えば、スフェロイド、オルガノイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ）（図１６参照）は、約５０μｍから約５０００μｍの寸法（例えば、直径）、および約５０μｍから約５０００μｍの範囲内に含まれる任意の寸法または寸法の範囲を含むことができる。いくつかの実施の形態において、開示された明確な寸法より大きいまたは小さい寸法を提供することができ、したがって、特に明記のない限り、開示された明確な寸法より大きいまたは小さい寸法は、本開示の範囲内にあると考えられる。例えば、いくつかの実施の形態において、開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃの１つ以上の寸法、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの深さ、および三次元細胞１５０（例えば、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ）の寸法は、本開示の範囲から逸脱せずに、開示された明確な寸法より大きくても、小さくても差し支えない。
【００２９】
それに加え、またはそれに代えて、図２の線８−８に沿った容器１００の一部の部分断面図を示す図８に示されるように、いくつかの実施の形態において、バッフル１１３が、容器１００の端部壁１０７に沿って存在することがある。図８に示されるものなどの実施の形態において、そのバッフルは、階段状または正方形プロファイル１１４ａを有することがある。同様に、図８の容器１００の一部の部分断面図の代わりの例示の実施の形態を示す図９に示されるように、いくつかの実施の形態において、バッフル１１３は、傾斜したまたは角度の付いたプロファイル１１４ｂを含み得る。下記により詳しく記載されるように、いくつかの実施の形態において、階段状または傾斜したバッフル１１３は、細胞培養容器１００内で細胞を培養する方法に関する利点を提供することができる。
【００３０】
それに加え、またはそれに代えて、図３および図４に戻ると、いくつかの実施の形態において、細胞培養容器１００は、容器１００の首部１１２の内部表面２１２から延在するダム１３０を備えることができる。図３および図４に示されるように、そのダムは、形状が長方形であり得る。いくつかの実施の形態において、ダム１３０は、ポート１０５とマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面との間で画成される流体通路を遮るポートに面する表面１３１を備え得る。いくつかの実施の形態において、ダム１３０のポートに面する表面１３１は、容器１００の軸１１０に対して実質的に垂直であり得る。あるいは、図１の線１０−１０に沿った第１の例示の細胞培養容器１００の一部の部分断面図の例示の実施の形態を示す図１０に示されるように、いくつかの実施の形態において、ダム１３０のポートに面する表面１３１は、凸形プロファイル１３１ａを含むことができる。それに加え、図１１に示されるように、いくつかの実施の形態において、ダム１３０のポートに面する表面１３１は、凹形プロファイル１３１ｂを含むことができる。いくつかの実施の形態において、ダム１３０は、容器１００から出入りする材料の流れを妨げるように設けることができる。追加の実施の形態において、ダム１３０は、正方形または湾曲している、またはどの形状であってもよい。
【００３１】
さらに、図３に戻ると、いくつかの実施の形態において、ダム１３０のエッジ１３５の少なくとも一部は、例えば、上部１０１の内面２０１から距離「ｄ１」だけ距離をあけて配置することができる。いくつかの実施の形態において、ダム１３０の自由端１３５の少なくとも一部を内面２０１から距離をあけて配置することによって、いくつかの実施の形態において、容器１００の後方部分（例えば、ポート１０５と反対側）へのアクセスを設けることができる。例えば、いくつかの実施の形態において、１つ以上の器具（図示せず）を、ダム１３０を越えて（例えば、距離「ｄ１」を通って）容器１００のポート１０５中に挿入して、ダム１３０の背後に配置された細胞培養チャンバ１０３のある領域に到達することができる。したがって、いくつかの実施の形態において、ダム１３０は、第１の流路（図１７の１６１ａ、１６１ｂ、および１６１ｃ参照）および第２の流路（図１８の１６３ａ、１６３ｂ参照）の少なくとも一方に沿って流れる材料の速度を遅くしつつ、容器１００の細胞培養チャンバ１０３中へのバルクアクセスも可能にすることができる。
【００３２】
図１２に示されるように、いくつかの実施の形態において、容器１００が端部壁１０７で立っている場合、容器１００の軸１１０は、重力「ｇ」の方向に実質的に延在しつつ、所定量の液体１４０の液体が複数のマイクロキャビティ１２０の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１中に所定量の液体１４０を収容することができる。貯留槽１４１は、底部で端部壁１０７により、側部で容器１００の側壁１０６により境界された、上部１０１とバッフル１１３との間の領域である。貯留槽１４１は、その液体がマイクロキャビティ１２０に入らずに、液体を収容するように構造が作られ、配置されている。バッフル１１３のために、マイクロキャビティのアレイ１１５はその容器の底部１０８に亘り、端部壁１０７までずっと延在しないが、代わりに、マイクロキャビティのアレイ１１５はバッフル１１３で終わるので、容器１００内に貯留槽１４１がある。すなわち、マイクロキャビティのアレイの長さ（Ｌｉ）は、容器の長さ（Ｌｖ）より小さいので、その容器内に存在する貯留槽１４１がある。それに加え、貯留槽１４１は、所定量の液体１４０を収容するようなサイズかつ形状である。
【００３３】
例えば、いくつかの実施の形態において、容器１００は、容器１００の軸１１０が重力「ｇ」の方向に実質的に直立して延在した状態で、例えば、端部壁１０７で水平面（図示せず）上に置くことができる。それに加え、またはそれに代えて、いくつかの実施の形態において、容器１００は、軸１１０が重力「ｇ」の方向に実質的に延在した状態で、１つ以上の構造（例えば、フレーム、架台、人の手など）によって支持（例えば、保持、懸架）され得る。いくつかの実施の形態において、容器１００の外側からポート１０５を通って細胞培養チャンバ１０３中に液体を通過させること（例えば、矢印１０６により示される）、および所定量の液体１４０の液体がマイクロキャビティのアレイ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１中に所定量の液体１４０を収容することの少なくとも一方を行いつつ、容器１００を配置することおよび支持することの１つ以上に基づいて、軸１１０が重力「ｇ」の方向に実質的に延在する状態で、容器１００を設けることができる。
【００３４】
いくつかの実施の形態において、容器１００が静止している間に、所定量の液体１４０の液体が複数のマイクロキャビティ１２０の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容することができる。あるいは、いくつかの実施の形態において、容器１００が動いている（例えば、静止していない）間に、所定量の液体１４０の液体が複数のマイクロキャビティ１２０の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容することができる。例えば、いくつかの実施の形態において、所定量の液体１４０の液体が複数のマイクロキャビティ１２０の１つ以上のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃと接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容しながら、容器１００に、並進運動および回転運動の少なくとも一方を与えることができる。このように、重力「ｇ」の方向に実質的に延在することに加え、またはその代わりに、いくつかの実施の形態において、所定量の液体１４０の液体がマイクロキャビティのアレイ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容しつつ、容器１００の軸１１０が、重力「ｇ」の方向に対して非ゼロの角度を画成する１つ以上に方向に延在することができる。
【００３５】
さらに、いくつかの実施の形態において、所定量の液体１４０の液体がマイクロキャビティのアレイ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容する間の、容器１００の軸１１０の方向付け（例えば、重力「ｇ」の方向に対して）は、容器１００の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容する間の期間中に不変であり得る。あるいは、いくつかの実施の形態において、所定量の液体１４０の液体がマイクロキャビティのアレイ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容する間の、容器１００の軸１１０の方向付け（例えば、重力「ｇ」の方向に対して）は、容器１００の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容する間の期間中に一回以上変化し得る。さらに、いくつかの実施の形態において、本開示の実施の形態にしたがって、ある瞬間に（例えば、期間と比べて）、所定量の液体１４０の液体がマイクロキャビティのアレイ１１５の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、容器１００の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容することができる。図１２に示された実施の形態において、バッフル面１１４は、傾斜したまたは角度の付いたバッフル面１１４ｂである。マイクロキャビティのアレイ１１５を有する内部表面３１６を有する挿入物２１６が図１２に示されているが、マイクロキャビティの一体アレイ１１５を有する細胞培養容器の底部１０８を設けてもよいことが当業者には理解されるであろう。
【００３６】
図１３に概略示されるように、いくつかの実施の形態において、前記方法は、所定量の液体１４０の液体が複数のマイクロキャビティ１２０の１つ以上のマイクロキャビティ１２０と接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容した後（図１２参照）、容器１００を動かして、所定量の液体１４０の少なくとも一部が、細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｉ」に沿ってマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面上で貯留槽１４１から流れ、複数のマイクロキャビティ１２０（またはマイクロキャビティのアレイ１１５を有する内部表面３１６を有する挿入物２１６）の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０内に堆積する工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、容器１００を動かす工程は、第１の向き（例えば、図１２に与えられた向き）から第２の向き（例えば、図１３に与えられた向き）に、容器１００の並進および回転の少なくとも一方を行って、所定量の液体１４０の少なくとも一部が、細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｉ」に沿ってマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面上で貯留槽１４１から流れ、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０内に堆積させる工程を含むことができ、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０内への液体の堆積は、制御することができ、いくつかの実施の形態において、確保することができる。
【００３７】
例えば、図１４は、図１３の区域１４でとられた第１の例示の細胞培養容器１００の一部の例示の実施の形態の拡大概略図を示しており、所定量の液体１４０の少なくとも一部が、細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｉ」に沿ってマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面上を貯留槽１４１から流れだし、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０内に堆積しているのを示している。図１４は、マイクロキャビティの開口（１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃ）、マイクロキャビティのウェル（１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ）、マイクロキャビティの壁１２５、およびマイクロキャビティの底面（１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃ）を示している。これらの特徴構造がマイクロキャビティ（１２０ａ、１２０ｂおよび１２０ｃ）を構成している。いくつかの実施の形態において、液体を流す容器１００の動作は、制御することができ、遅いことがあり得る（例えば、およそ数分の期間で行われる）。例えば、複数のマイクロキャビティ１２０のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃに液体を直接充填する（例えば、本開示の方法に基づかない）と、細胞増殖を阻害するか阻むの少なくとも一方である望ましくない充填特徴が生じ得ることが観察された。理論で束縛する意図はないが、複数のマイクロキャビティ１２０のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃに液体を直接かつ急速に（例えば、およそ数秒の期間で行われる）充填しようとした場合、少なくとも、液体の表面張力およびウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内の気体の存在に基づいて、その液体がマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃの開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃに亘り延在するバリアを形成し、それによって、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内に気体（例えば、空気または気泡）を捕捉し得ると考えられる。いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面を通る気体透過速度は、細胞培養時間に対して遅すぎ（例えば、およそ数時間およびおよそ数日の期間で生じる）、よって、実際の適用には、細胞がウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内で培養できない程度まで、気泡がウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内に留まり、液体がウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの外部に留まる。すなわち、気泡は、細胞培養にとってよくない。
【００３８】
しかしながら、本開示の方法の１つ以上の特徴構造を利用することによって、例えば、容器１００を動かして、所定量の液体１４０の少なくとも一部を細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｉ」に沿ってマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面上を貯留槽１４１から流れ出させ、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内に堆積させることによって、その液体がその少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃのそれぞれの開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃの一部を通ってウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに入ることができることが観察された。例えば、液体がウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに流入するにつれて、その液体は、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内の気体を移動させ、それによって、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに液体を充填することができる。さらに、いくつかの実施の形態において、例えば、およそ数分の期間中にこの工程を行うことによって、液体が細胞培養チャンバ１０３の長さ「Ｌｉ」に沿ってマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面上を貯留槽１４１から流れ出て、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃのそれぞれの開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃの一部を通ってウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに入るにつれて、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内の気体の実質的に全てをウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃから移動させることができる。すなわち、マイクロキャビティ１２０に貯留槽１４１からの液体培地をゆっくりと充填することによって、マイクロキャビティ１２０内の気泡の形成が減少し、細胞培養が改善される。
【００３９】
いくつかの実施の形態において、容器１００のバッフル１１３のプロファイル１１４は、少なくとも容器１００の動きに基づいて、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面上の貯留槽１４１からの液体の流れを促進させる表面を提供することができる。例えば、いくつかの実施の形態において、バッフル１１３の傾斜したまたは角度の付いたプロファイル１１４ｂは、液体が貯留槽１４１からマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面へと（このマイクロキャビティのアレイは挿入物２１６により与えることができる）それに沿って流動できる傾斜面を提供することができる。いくつかの実施の形態において、バッフル１１３は、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面に当接することができ、流体は、バッフル１１３の傾斜したプロファイル１１４ｂに沿って貯留槽１４１から流れ出し、流動が制御されて（例えば、液体の飛沫が減少しているかまたはなく、乱流が減少しているかまたはない）、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ中に堆積し、それによって、気体をウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃから移動させつつ、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃのそれぞれの開口１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃを通ってウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ中に堆積する液体の定常流を与えることができる。
【００４０】
図１５に示されるように、いくつかの実施の形態において、少なくとも容器１００の動きに基づいて、所定量の液体１４０を、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する全面に亘り貯留槽１４１から流し出すことができる。それに加え、図１６は、細胞培養容器１００内で細胞１５０を培養する方法を含む、図１５の区域１６でとられた細胞培養容器１００の一部の実施の形態の拡大概略図を示している。例えば、いくつかの実施の形態において、その方法は、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内に所定量の液体１４０の少なくとも一部を堆積させた後、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０（例えば、スフェロイド１５０ａ、スフェロイド１５０ｂ、スフェロイド１５０ｃ）を培養する工程を含むことができる。図１５および図１６に示されるように、いくつかの実施の形態において、容器１００の軸１１０は、複数のマイクロキャビティ１２０のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０を培養している間、重力「ｇ」の方向に対して実質的に垂直であり得る。
【００４１】
例えば、図１７に示されるように、いくつかの実施の形態において、細胞培養容器１００内で細胞１５０を培養する方法は、ポート１０５に分注ポート１６０を挿入することによって、細胞培養チャンバ１０３中に材料（例えば、食物、栄養素、液体培地）を加える工程、および次いで、材料を分注ポート１６０から細胞培養チャンバ１０３中に分注する工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、その方法は、容器１００のポート１０５に分注ポート１６０を挿入する工程を含み得る。その方法は、容器１００の細胞培養チャンバ１０３内の第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿って材料を流す工程をさらに含み得る。その材料は、分注ポート１６０から材料を分注することによって、第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿って流れ、それによって、容器１００の外部から細胞培養チャンバ１０３中に材料を加えることができる。それに加え、いくつかの実施の形態において、その方法は、第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿った材料の流れを遮る工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿った流れを遮る工程は、第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿った流れをダム１３０で逸らす工程を含み得る。いくつかの実施の形態において、第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿った流れをダム１３０で逸らす工程は、第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿った流れを少なくとも２つの分岐流１６１ｃ、１６１ｄに分割する工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、２つの分岐流１６１ｃ、１６１ｄの少なくとも一方は、ダム１３０の外周を横に廻って（例えば、ダム１３０の外周と、側壁２０１の内面１０２との間）細胞培養チャンバ１０３内を流れることができる。いくつかの実施の形態において、その方法は、材料を分注ポート１６０から細胞培養チャンバ１０３中に分注しながら、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０を培養する工程（図１６参照）を含み得る。
【００４２】
それに加え、図１８に示されるように、いくつかの実施の形態において、前記方法は、ポート１０５を通じて収集ポート１６２を挿入することによって、細胞培養チャンバ１０３から材料（例えば、老廃物、副生成物、液体培地）を除去する工程、および次いで、収集ポート１６２により細胞培養チャンバ１０３から材料を収集する工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、その方法は、ポート１０５に収集ポート１６２を挿入する工程、収集ポート１６２で材料を収集することによって、細胞培養チャンバ１０３内で第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿って材料を流し、それによって、細胞培養チャンバ１０３から材料を除去する工程を含み得る。いくつかの実施の形態において、その方法は、第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿った材料の流れを遮る工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿った材料の流れを遮る工程は、第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿った流れをダム１３０で逸らす工程を含み得る。いくつかの実施の形態において、第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿った流れをダム１３０で逸らす工程は、第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿った流れを少なくとも２つの分岐流１６３ｃ、１６３ｄに分割する工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、２つの分岐流１６３ｃ、１６３ｄの少なくとも一方は、ダム１３０の外周を横に廻って（例えば、ダム１３０の外周と、側壁１０６の内面１０２との間）細胞培養チャンバ１０３内を流れることができる。いくつかの実施の形態において、その方法は、収集ポート１６２で細胞培養チャンバ１０３から材料を収集しながら、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０を培養する工程を含み得る。
【００４３】
いくつかの実施の形態において、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０を培養しながら、第１の流路１６１ａ、１６１ｂおよび第２の流路１６３ａ、１６３ｂの少なくとも一方に沿った材料の流れをダム１３０で遮る工程は、例えば、細胞１５０の培養に干渉せずに、容器１００の細胞培養チャンバ１０３に材料を加え、そこから材料を除去することができる。例えば、いくつかの実施の形態において、分注ポート１６０は、材料を分注ポート１６０から細胞培養チャンバ１３０中に第１の流路１６１ａ、１６１ｂに沿ってある速度で流し（例えば、分注する、吹き込む）、それによって、ポート１０５および細胞培養チャンバ１０３内とその周りに正圧の力を作り出すことによって、細胞培養チャンバ１０３中に材料を加えることができる。同様に、いくつかの実施の形態において、収集ポート１６２は、材料を細胞培養チャンバ１０３から第２の流路１６３ａ、１６３ｂに沿ってある速度で流し（例えば、収集する、吸引する）し、それによって、ポート１０５および細胞培養チャンバ１０３内とその周りに負圧の力を作り出すことによって、細胞培養チャンバ１０３から材料を除去することができる。したがって、いくつかの実施の形態において、ダム１３０は、第１の流路１６１ａ、１６１ｂおよび第２の流路１６３ａ、１６３ｂの少なくとも一方に沿った材料の速度を遅くし、それによって、ポート１０５および細胞培養チャンバ１０３内とその周りの正圧の力および負圧の力をそれぞれ減少させることができる。いくつかの実施の形態において、ダム１３０は、したがって、第１の流路１６１ａ、１６１ｂおよび第２の流路１６３ａ、１６３ｂの少なくとも一方に沿った材料の流れが、複数のマイクロキャビティ１２０のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で培養されている細胞１５０を押しのけるのを低下させるか防ぐかの少なくとも一方を行うことができる。例えば、いくつかの実施の形態において、材料の流れが１つ以上の細胞を押しのける場合、１つ以上のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃが複数のスフェロイドを含むか、スフェロイドを全く含まないことがあり得る。それに加え、いくつかの実施の形態において、材料の流れが、容器１００内で培養されている細胞１５０を押しのけるのを低下させるか防ぐかの少なくとも一方を行うことによって、より良い品質の細胞培養物および細胞培養に関連するより正確な科学的結果を得ることができる。
【００４４】
ここで、図１２〜１６を参照して、第１の例示の細胞培養容器１００内で細胞を培養する方法を説明する。図１２に示されるように、いくつかの実施の形態において、細胞培養容器１００内で細胞１５０を培養する方法（図１６参照）は、容器１００の外部からポート１０５を通じて液体を細胞培養チャンバ１０３に通し（例えば、矢印１０６に示される）、それによって、細胞培養チャンバ１０３内に所定量の液体１４０を提供する工程を含み得る。この方法は、バッフル１１３の傾斜したプロファイル１１４ｂを備えた容器１００に関して記載されているが、いくつかの実施の形態において、その方法は、本開示の範囲から逸脱せずに、非平面境界部分１１４（図３に示されている）、および階段状プロファイル１１４ａ（図８に示されている）、並びに本開示の実施の形態にしたがう容器１００の壁１０１の内面１０２の他のプロファイルに関して同じまたは同様の様式で利用することができることが理解されよう。
【００４５】
いくつかの実施の形態において、前記方法は、所定量の液体１４０の液体が、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面の複数のマイクロキャビティ１２０の１つ以上のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃと接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容する工程を含み得る。例えば、いくつかの実施の形態において、所定量の液体１４０の液体が、複数のマイクロキャビティ１２０の１つ以上のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃと接触せずに、細胞培養チャンバ１０３の貯留槽１４１内に所定量の液体１４０を収容しながら、所定量の液体１４０の液体は、バッフル１１３と接触することができる。下記により詳しく記載されるように、方法のこの段階で、所定量の液体１４０の液体が、複数のマイクロキャビティ１２０の１つ以上のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃと接触するのを防ぐことにより、例えば、細胞１５０の改善された培養（図１６参照）を促進するいくつかの利点を提供することができる。
【００４６】
図２の線３−３に沿った容器１００の断面図を示す図３に示されるように、底部１０８は、底部１０８上に置かれた挿入物２１６を有することがある。挿入物２１６は内面３１６を有する。挿入物２１６の内面３１６は、追加の実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５を有し、細胞培養容器１００は、複数のマイクロキャビティ１２０を備えたマイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面を備えることができる（図５〜７参照）。いくつかの実施の形態において、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する表面および壁１０１の内面１０２は、容器１００の細胞培養チャンバ１０３を画成することができ、ポート１０５が、壁１０１を通り、細胞培養チャンバ１０３と流体連通している。例えば、いくつかの実施の形態において、細胞培養チャンバ１０３は、容器１００の内部空間体積を含み得る。
【００４７】
実施の形態において、首付き開口の内部表面は、液体の流れを容器中に逸らせ、液体が容器に導入されるときに細胞培養表面上で培養された細胞が経験する乱流を減少させるための１つ以上のダムを有することがある。追加の実施の形態において、細胞を培養する方法は、首付き開口が上を向くように置かれるように容器を最初に配置し、容器の上部に沿って流体を流すことによって流体を容器に入れ、容器の後端から流体を除去することによって、培地を交換する工程を含み得る。さらに別の実施の形態において、細胞を培養する方法は、首付き開口が上を向くように置かれるように容器が配置されている間に培地を導入し、培地を容器の後端に充填し、次いで、マイクロキャビティのアレイを有する表面が下になるまで容器を注意深く傾斜させることによって、マイクロキャビティのアレイを有する表面上に培地を流す工程を含み得る。
【００４８】
いくつかの実施の形態において、容器は、細胞培養チャンバ中への液体の流れを妨げるためのダムを容器の首部に有する。追加の実施の形態において、細胞を培養する方法は、容器のポートに分注ポートを挿入する工程を含み得る。その方法は、壁の内面およびマイクロキャビティのアレイを有する表面により画成された容器の細胞培養チャンバ内で第１の流路に沿って材料を流し、それによって、材料を容器の外部から細胞培養チャンバ中に加える工程を含み得る。その方法は、その第１の流路に沿った材料の流れを妨げる工程を含み得る。
【００４９】
いくつかの実施の形態において、細胞を培養する方法は、容器内のポートを通じて容器の外部から、壁の内面およびマイクロキャビティのアレイを有する表面により画成された容器の細胞培養チャンバ中に液体を通し、それによって、細胞培養チャンバの貯留槽内に所定量の液体を提供する工程を含み得る。その方法は、細胞培養チャンバの貯留槽内に所定量の液体を、その液体が複数のマイクロキャビティの１つ以上と接触せずに収容する工程を含み得る。
【００５０】
いくつかの実施の形態において、細胞培養容器は、壁およびマイクロキャビティのアレイを有する表面を備えることができる。マイクロキャビティのアレイを有する表面および壁の内面および容器の上部は、容器の細胞培養チャンバ、すなわち前記細胞培養チャンバを画成する。ポートが、容器の外部を通り、その細胞培養チャンバと流体連通している。
【００５１】
細胞培養容器および細胞を培養する方法の数多くの態様をここに開示してきた。いくつかの選択された態様の概要が提示されている。
【００５２】
本開示の精神および範囲から逸脱せずに、本開示に様々な改変および変更を行えることが、当業者に明白であろう。それゆえ、本開示は、本開示の改変および変更を、それらが付随の特許請求の範囲およびその等価物の範囲内に入るという前提で包含することが意図されている。
【００５３】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【００５４】
実施形態１
細胞培養容器において、
細胞培養チャンバであって、上部、底部、側壁、および該細胞培養チャンバの壁を通り、該細胞培養チャンバと流体連通している首付き開口を含む細胞培養チャンバ、
マイクロキャビティのアレイを有する細胞培養表面、および
前記首付き開口と反対の壁と前記マイクロキャビティのアレイとの間にあるバッフル、
を備え、
前記マイクロキャビティのアレイが、前記細胞培養チャンバの長さ（Ｌｖ）より小さい長さ（Ｌｉ）に亘り延在し、
前記マイクロキャビティのアレイの長さ（Ｌｉ）に前記バッフルの長さ（Ｌｂ）を加えた長さが前記細胞培養チャンバの長さ（Ｌｖ）と等しく、
よって、前記首付き開口が上向きになるように前記容器が方向付けられているときに、前記バッフルと前記細胞培養チャンバの上部との間に貯留槽がある、細胞培養容器。
【００５５】
実施形態２
前記底部が前記マイクロキャビティのアレイを備える、実施形態１に記載の細胞培養容器。
【００５６】
実施形態３
前記マイクロキャビティのアレイが前記底部の内部表面と一体である、実施形態２に記載の細胞培養容器。
【００５７】
実施形態４
前記マイクロキャビティのアレイの底面が平面である、実施形態３に記載の細胞培養容器。
【００５８】
実施形態５
前記マイクロキャビティのアレイの底面が、微小突起のアレイを備える、実施形態３に記載の細胞培養容器。
【００５９】
実施形態６
前記底部上に挿入物をさらに備え、該挿入物が前記マイクロキャビティのアレイを備える、実施形態１に記載の細胞培養容器。
【００６０】
実施形態７
前記挿入物が前記底部に取り付けられている、実施形態６に記載の細胞培養容器。
【００６１】
実施形態８
前記マイクロキャビティのアレイの底面が平面である、実施形態６に記載の細胞培養容器。
【００６２】
実施形態９
前記マイクロキャビティのアレイの底面が、微小突起のアレイを備える、実施形態６に記載の細胞培養容器。
【００６３】
実施形態１０
前記バッフルが傾斜している、実施形態１から９のいずれか１つに記載の細胞培養容器。
【００６４】
実施形態１１
前記バッフルが正方形である、実施形態１から９のいずれか１つに記載の細胞培養容器。
【００６５】
実施形態１２
前記容器の首付き開口内にダムをさらに備える、実施形態１から１１のいずれか１つに記載の細胞培養容器。
【００６６】
実施形態１３
前記ダムが湾曲している、実施形態１２に記載の細胞培養容器。
【００６７】
実施形態１４
前記ダムが長方形である、実施形態１２に記載の細胞培養容器。
【００６８】
実施形態１５
実施形態１から１４のいずれか１つに記載の細胞培養容器内で細胞を培養する方法において、
前記容器の首付き開口と反対の端部壁で接するように該容器を置く工程、
前記容器に液体培地中に懸濁された細胞を導入し、そこで、該細胞および該液体培地が、前記バッフルと前記容器の上部との間の空間にある前記貯留槽内に入れられる工程、および
前記細胞および前記液体培地が、前記マイクロキャビティのアレイを備えた前記細胞培養表面上に流れるように、前記容器を回転させる工程、
を有してなる方法。
【００６９】
実施形態１６
前記容器内で前記細胞を培養する工程をさらに含む、実施形態１５に記載の方法。
【００７０】
実施形態１７
前記細胞および前記液体培地が前記貯留槽に流れ込むように、前記容器を回転させる工程をさらに含む、実施形態１６に記載の方法。
【００７１】
実施形態１８
細胞を培養する方法において、
細胞培養容器の首付き開口に分注ポートを挿入する工程、
前記分注ポートから材料を分注することによって、壁の内面およびマイクロキャビティのアレイを備えた表面により画成された前記容器の細胞培養チャンバ内で第１の流路に沿って材料を流し、それによって、材料を該容器の外部から該細胞培養チャンバに加える工程、および
前記第１の流路に沿った材料の流れを遮る工程、
を有してなる方法。
【００７２】
実施形態１９
前記第１の流路に沿った材料の流れを遮る工程が、該第１の流路に沿った材料の流れをダムで逸らせる工程を含む、実施形態１８に記載の方法。
【００７３】
実施形態２０
前記第１の流路に沿った材料の流れをダムで逸らせる工程が、前記第１の流路に沿った材料の流れを少なくとも２つの分岐流に分割する工程を含む、実施形態１９に記載の方法。
【符号の説明】
【００７４】
１００    細胞培養容器
１０１    上部
１０３    細胞培養チャンバ
１０４    キャップ
１０５    ポート、開口
１０６    側壁
１０７    端部壁
１０８    底部
１０９    首付き開口
１１２    首部
１１３    バッフル
１１５    マイクロキャビティのアレイ
１２０、１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ    マイクロキャビティ
１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃ    凹面
１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ    ウェル
１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃ    開口
１３０    ダム
１５０、１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ    細胞、スフェロイド
２００    細胞培養表面
２１６    挿入物
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器において、
細胞培養チャンバであって、上部、底部、側壁、および該細胞培養チャンバの壁を通り、該細胞培養チャンバと流体連通している首付き開口を含む細胞培養チャンバ、
マイクロキャビティのアレイを有する細胞培養表面、および
前記首付き開口と反対の壁と前記マイクロキャビティのアレイとの間にあるバッフル、
を備え、
前記マイクロキャビティのアレイが、前記細胞培養チャンバの長さ（Ｌｖ）より小さい長さ（Ｌｉ）に亘り延在し、
前記マイクロキャビティのアレイの長さ（Ｌｉ）に前記バッフルの長さ（Ｌｂ）を加えた長さが前記細胞培養チャンバの長さ（Ｌｖ）と等しく、
よって、前記首付き開口が上向きになるように前記容器が方向付けられているときに、前記バッフルと前記細胞培養チャンバの上部との間に貯留槽がある、細胞培養容器。
【請求項２】
前記底部が前記マイクロキャビティのアレイを備える、請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記マイクロキャビティのアレイが前記底部の内部表面と一体である、請求項２記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記マイクロキャビティのアレイの底面が平面である、請求項３記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記マイクロキャビティのアレイの底面が、微小突起のアレイを備える、請求項３記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記底部上に挿入物をさらに備え、該挿入物が前記マイクロキャビティのアレイを備える、請求項１記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記挿入物が前記底部に取り付けられている、請求項６記載の細胞培養容器。
【請求項８】
前記マイクロキャビティのアレイの底面が平面である、請求項６記載の細胞培養容器。
【請求項９】
前記マイクロキャビティのアレイの底面が、微小突起のアレイを備える、請求項６記載の細胞培養容器。
【請求項１０】
前記バッフルが傾斜している、請求項１から９いずれか１項記載の細胞培養容器。
【請求項１１】
前記バッフルが正方形である、請求項１から９いずれか１項記載の細胞培養容器。
【請求項１２】
前記容器の首付き開口内にダムをさらに備える、請求項１から１１いずれか１項記載の細胞培養容器。
【請求項１３】
前記ダムが湾曲している、請求項１２記載の細胞培養容器。
【請求項１４】
前記ダムが長方形である、請求項１２記載の細胞培養容器。
【請求項１５】
請求項１から１４いずれか１項記載の細胞培養容器内で細胞を培養する方法において、
前記容器の首付き開口と反対の端部壁で接するように該容器を置く工程、
前記容器に液体培地中に懸濁された細胞を導入し、そこで、該細胞および該液体培地が、前記バッフルと前記容器の上部との間の空間にある前記貯留槽内に入れられる工程、および
前記細胞および前記液体培地が、前記マイクロキャビティのアレイを備えた前記細胞培養表面上に流れるように、前記容器を回転させる工程、
を有してなる方法。
【請求項１６】
前記容器内で前記細胞を培養する工程をさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞および前記液体培地が前記貯留槽に流れ込むように、前記容器を回転させる工程をさらに含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
細胞を培養する方法において、
細胞培養容器の首付き開口に分注ポートを挿入する工程、
前記分注ポートから材料を分注することによって、壁の内面およびマイクロキャビティのアレイを備えた表面により画成された前記容器の細胞培養チャンバ内で第１の流路に沿って材料を流し、それによって、材料を該容器の外部から該細胞培養チャンバに加える工程、および
前記第１の流路に沿った材料の流れを遮る工程、
を有してなる方法。
【請求項１９】
前記第１の流路に沿った材料の流れを遮る工程が、該第１の流路に沿った材料の流れをダムで逸らせる工程を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記第１の流路に沿った材料の流れをダムで逸らせる工程が、前記第１の流路に沿った材料の流れを少なくとも２つの分岐流に分割する工程を含む、請求項１９記載の方法。
【国際調査報告】
2020526217.tif 000021
2020526217.tif 000022
2020526217.tif 000023