(57)【要約】ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団からのＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、及び／又はＣＸＣＲ５のバイオマーカーを比較することにより、例えば、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）の服用を停止する場合の自己免疫疾患の臨床転帰（具体的には疾患再燃）を評価するための方法及びキットが開示されている。具体的な実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋（未処理）Ｔ細胞を含む第２のサブセットに対するＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋（記憶）Ｔ細胞の第１のサブセットの比を決定し、この比の増加は、若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）の疾患再燃状態を示す。別の実施形態では、Ｔ細胞集団間でのＣＤ４５ＲＡ−ＣＲ５＋サブセットの富化は、Ｂ細胞相互作用を介した記憶持続の増強によるＪＩＡでの再燃状態の可能性を示す。別の実施形態では、ＩＬ−６、ＣＣＲ６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１を含む追加のマーカーも決定する。【選択図】図３
2020523583.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の自己免疫疾患の臨床転帰を評価する方法であって、
前記対象から得られたサンプル中の、ＣＤ３＋ＣＤ４＋を含むＴ細胞集団を単離するステップと、
ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、又はＣＸＣＲ５＋を含む１種又は複数種のバイオマーカーに関して前記Ｔ細胞集団を試験するステップと
を含み、
前記Ｔ細胞集団における前記バイオマーカーの有無、又は所定のレベルに対する前記Ｔ細胞集団における前記バイオマーカーのレベルが、前記対象の前記自己免疫疾患の前記臨床転帰を示す、
方法。
【請求項２】
ＩＬ−６、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ１５２、ＰＤ１、ＦＹＮ、ＴＮＦＲＳＦ９  ＣＡＳＰ１、ＴＲＡＦ１、及びＩＫＢＫＥからなる群から選択される１種又は複数種の追加のバイオマーカーに関して前記Ｔ細胞集団を試験するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記臨床転帰が前記自己免疫疾患の再燃状態、活動性状態、又は非活動性状態を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
所定のレベルを超える前記Ｔ細胞集団における前記バイオマーカーＴＮＦ−アルファのレベル、及びＣＤ４５ＲＡの不在が、前記自己免疫疾患の再燃状態又は活動性状態の可能性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
所定のレベルを下回る前記Ｔ細胞集団における前記バイオマーカーＴＮＦ−アルファのレベルが、前記自己免疫疾患の非活動性状態の可能性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
所定のレベルを超える前記Ｔ細胞集団におけるＦＹＮ、ＴＮＦＲＳＦ９  ＣＡＳＰ１、ＴＲＡＦ１、ＩＫＢＫＥ、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１つから選択される前記１種又は複数種の追加のバイオマーカーの発現が、前記自己免疫疾患の非活動性状態の可能性を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
所定のレベルを超える前記Ｔ細胞集団における前記バイオマーカーＴＮＦ−アルファのレベル、ＣＤ４５ＲＡの不在、及び前記１種又は複数種のバイオマーカーＩＬ−６の存在が、前記自己免疫疾患の拡大の可能性を示す、請求項２〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
所定のレベルを超える前記Ｔ細胞集団における前記バイオマーカーＣＸＣＲ５＋のレベル、及びＣＤ４５ＲＡの不在が、Ｂ細胞相互作用を介した記憶持続の増強による前記自己免疫疾患の再燃状態の可能性を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
所定のレベルを超える前記Ｔ細胞集団における前記バイオマーカーＣＸＣＲ５＋のレベル、ＣＤ４５ＲＡの不在、及び前記１種又は複数種の追加のバイオマーカーＣＣＲ６＋の存在が、前記自己免疫疾患の活動性状態の可能性を示す、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞集団における前記１種又は複数種の追加のバイオマーカーＣＤ１５２及びＰＤ１の不在が、不適切な免疫チェックポイント制御に起因する前記自己免疫疾患の再燃状態の可能性をさらに示す、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記自己免疫疾患がリウマチ性疾患である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記リウマチ性疾患が若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）又は関節リウマチである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記若年性特発性関節炎が多関節型ＪＩＡである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｔ細胞集団を、２種のサブセットである、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋を含む第１のサブセットとＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋を含む第２のサブセットとに分け、前記第１のサブセットの量及び前記第２のサブセットの量を決定し、前記第２のサブセットの量に対する前記第１のサブセットの量の比を算出し、所定の比に対する前記比が、前記対象の前記自己免疫疾患の前記臨床転帰を示す、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬を服用している対象のリウマチ性疾患の臨床転帰を評価する方法であって、
前記対象から得られたサンプル中の、ＣＤ３＋ＣＤ４＋を含むＴ細胞集団を単離するステップと、
ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ４５ＲＡ、又はＣＸＣＲ５＋を含むバイオマーカーに関して記憶Ｔ細胞集団を試験するステップと
を含み、
前記Ｔ細胞集団における前記バイオマーカーの有無、又は所定のレベルに対する前記Ｔ細胞集団における前記バイオマーカーのレベルが、前記対象が前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の前記臨床転帰を示す、
方法。
【請求項１６】
ＩＬ−６、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ１５２、ＰＤ１、ＦＹＮ、ＴＮＦＲＳＦ９  ＣＡＳＰ１、ＴＲＡＦ１、及びＩＫＢＫＥからなる群から選択される１種又は複数種の追加のバイオマーカーに関して前記Ｔ細胞集団を試験するステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記臨床転帰が、前記対象が前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の前記リウマチ性疾患の再燃状態又は非活動性状態を含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
所定のレベルを超える前記Ｔ細胞集団における前記バイオマーカーＴＮＦ−アルファのレベル、及びＣＤ４５ＲＡの不在が、前記対象が前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の前記リウマチ性疾患の再燃状態の可能性を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
所定のレベルを下回る前記Ｔ細胞集団における前記バイオマーカーＴＮＦ−アルファのレベルが、前記対象が前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の前記リウマチ性疾患の非活動性状態の可能性を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
所定のレベルを超える、ＦＹＮ、ＴＮＦＲＳＦ９  ＣＡＳＰ１、ＴＲＡＦ１、ＩＫＢＫＥ、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１つから選択される前記１種又は複数種の追加のバイオマーカーの発現が、前記対象が前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の前記リウマチ性疾患の非活動性状態の可能性を示す、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
所定のレベルを超える前記Ｔ細胞集団における前記バイオマーカーＣＸＣＲ５＋のレベル、及び前記Ｔ細胞集団上でのＣＤ４５ＲＡの不在が、前記対象が前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の、Ｂ細胞相互作用を介した記憶持続の増強による前記リウマチ性疾患の再燃状態の可能性を示す、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
所定のレベルを超える前記Ｔ細胞集団上での前記バイオマーカーＴＮＦ−アルファのレベル、前記Ｔ細胞集団上でのＣＤ４５ＲＡの不在、及び前記Ｔ細胞集団上での前記１種又は複数種の追加のバイオマーカーＣＤ１５２又はＰＤ１の不在が、前記対象が前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の、不適切な免疫チェックポイント制御に起因する前記疾患の再燃状態の可能性を示す、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬が抗ＴＮＦアルファ療法である、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗ＴＮＦアルファ療法が、任意選択でメトトレキサートとの組み合わせで、ＴＮＦレセプター２及びＩｇＧ１  Ｆｃ用のタンパク質の融合タンパク質、ＴＮＦアルファ抗体、アダリムマブ、並びにインフレキシマブからなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記リウマチ性疾患が関節リウマチである、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記リウマチ性疾患が若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）である、請求項１５〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記若年性特発性関節炎が多関節型ＪＩＡである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記サンプルが血液サンプルであり、好ましくは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプルである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記サンプルを、非活動性疾患を有すると思われる、前記生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬を服用している前記対象から採取する、請求項１５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｔ細胞集団を、２種のサブセットである、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋を含む第１のサブセットとＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋を含む第２のサブセットとに分け、サブセット群の量及び前記第２のサブセットの量を決定し、前記第２のサブセットの量に対する第１のサブセットの量の比を算出し、所定の比に対する前記比が、前記対象の前記リウマチ性疾患の前記臨床転帰を示す、
請求項１５〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記方法が、前記サンプルを、前記Ｔ細胞集団バイオマーカー、又は前記１種若しくは複数種のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも１種の抗体に曝露するステップを含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１種の抗体が重金属結合抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法が、タイムオブフライトによるサイトメトリ（ＣｙＴｏＦ）を利用して前記サンプルを分析するステップを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法がインビトロでの方法である、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
対象の免疫疾患の臨床転帰を評価するためのキットであって、
前記対象から得られたサンプル中のＴ細胞集団上の少なくとも１種のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも１種の抗体であり、前記少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、ＣＸＣＲ５、ＩＬ−６、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる群から選択される、抗体と、
前記対象の前記自己免疫疾患の前記臨床転帰の予測での使用のための、前記Ｔ細胞集団における前記バイオマーカーの所定のレベルと
を含むキット。
【請求項３６】
前記少なくとも１種の抗体が重金属結合抗体である、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
ＦＹＮ、ＴＲＡＦ１、ＴＮＦＲＳＦ９、ＩＫＢＫＥ、又はＣＡＳＰ１の発現を検出するためのプライマーをさらに含む、請求項３５又は３６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0002]本出願は、好ましくは関節炎疾患の治療を受けている対象において、自己免疫疾患の臨床転帰を評価するための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
[0003]自己免疫疾患とは、適応免疫反応を有する脊椎動物中に通常存在する物質及び組織に対する、この適応免疫反応の異常な反応のことである。自己免疫疾患には８０種を超える様々なタイプが存在すると推定される。自己免疫疾患は多くの場合、慢性であるか、消耗性であるか、又は生命を脅かす可能性があり、病気のあらゆるカテゴリーのうちで最も理解されておらず且つ最も認識されていないものの一つである。自己免疫疾患は、米国だけでも年間１，０００億米ドル超の直接医療費の原因であると推定されている。この疾患のさらなる理解だけでなく、臨床転帰を評価するための及び／又は管理するためのより良くてより効果的な方法も必要とされている。
【０００３】
[0004]２００３年の米国における関節炎及び他のリウマチ性状態に起因する総費用は、約１，２８０億ドルであった。若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）は最も一般的な小児リウマチ性疾患であり、世界的な有病率は１０，０００例の個体当たり１６〜１５０例である。多関節型ＪＩＡは、成人関節リウマチに臨床的に類似するＪＩＡのサブタイプである。
【０００４】
[0005]一部の自己免疫疾患（例えば、関節炎、及び他のリウマチ性状態、特に、例えばＪＩＡ、クローン病、炎症性腸疾患、ループス、乾癬）の一般的な処置は、抗ＴＮＦＡ療法等の生物疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）である。ＴＮＦ阻害剤は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に対する生理学的反応を抑制する薬物の一群である。特に成人関節リウマチでは、生物製剤による早期の積極的な処置が現在提唱されている。ＴＮＦ阻害剤は、入院又は死亡につながる場合がある日和見感染のリスクの増加を患者にもたらす。ＪＩＡ患者の約３０％は抗ＴＮＦ生物製剤療法に反応せず、反応する患者に関しては、どの患者が薬物中止に適しているかを予測するための明白な尺度が存在しない。中期／長期の毒性及び費用に関する懸念からも、成功裏の薬物中止のための予測因子を見つけるという臨床上のニーズが生じている。臨床管理に情報を提供するためには、より良い予測因子が明らかに必要である。
【０００５】
[0006]ＪＩＡでの抗ＴＮＦＡ生物製剤療法の出現により、薬物療法により臨床的寛解を達成する患者の数が増えている（Ａ．Ｔａｄｄｉｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２，６４１−６４９（２０１６））。明確な治療中止ガイドラインの欠如により、一部の患者は、不必要な長期の薬物効果と経済的負担とに曝される。臨床医は、中止の決断の決定における最も強力な要因として、薬物中止前の寛解の持続期間を引用している（Ｄ．Ｂ．Ｈｏｒｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  ４４，３５２−３６０（２０１７））。代理の疾患活動性マーカー（例えば、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）又は臨床症状（活動性関節））の組み合わせの一般的な使用は、日常の臨床診療では有用であるが、無症状の炎症へのアクセスでは不適切である（Ｃ．Ｈｉｎｚｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  １１，２９０−３００（２０１５））。実際に、臨床的寛解のための米国リウマチ学会（ＡＣＲ）基準を満たす患者の２０％は、無症状の炎症に起因するＸ線撮像での損傷を依然として示す（Ａ．Ｋ．Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ５８，２９５８−２９６７（２００８））。患者が薬物療法中止時の臨床的寛解（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆｆ  ｍｅｄｉｃａｔｉｏｎ）を達成するかどうかを判断するための臨床医向けの新規のツールを開発する必要がある。
【０００６】
[0007]ある特定の自己免疫性関節炎患者が薬物中止時に再燃する理由に関する機構的理解の不足は、薬物中止戦略による臨床管理への障害である。現在の抗ＴＮＦＡ療法は、若年性特発性関節炎患者の７０〜８０％において有効な反応を反映しているが、長期にわたる処置の維持により患者は潜在的な薬物副作用に曝される。薬物中止の明白で明確なガイドラインの欠如は、患者の５０〜８０％における高い再発率によりさらに複雑になる。
【０００７】
[0008]抗ＴＮＦＡ生物製剤療法により成功裏に処置されており、同時に目に見える臨床症状を示さない関節炎患者が治療中止時に再発する理由の科学的理解が不足している。このことは、薬物中止戦略を確立することを明らかに困難にしている。抗ＴＮＦＡ療法等の生物製剤ＤＭＡＲＤの開発における顕著な成功は、若年性突発性関節炎（ＪＩＡ）患者の７０〜８０％において臨床スコアの改善が見られることであり（Ｒ．Ｃｉｍａｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  Ｒｅｖ  １６，１００８−１０１５（２０１７））、処置された患者の最大５０％が、長期にわたる処置で臨床的寛解を達成する（Ｓ．Ｖｅｒａｚｚａ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｊ  １４，６８（２０１６））。薬物療法により臨床的寛解を達成するＪＩＡ患者の数の世界的な増加により、現在では薬物中止ガイドラインへの疑問が注目されている。短期／中期の処置は患者に十分に許容されるが、抗ＴＮＦＡ療法による長期にわたる処置の維持により患者は潜在的な薬物副作用に曝され、深刻な有害事象（ＳＡＥ）の報告は２〜２０例の事象／１００例の患者／年の範囲であり、有害事象（ＡＥ）の報告は５０〜２５００例の症例／１００例の患者／年の範囲である（Ａ．Ｔａｄｄｉｏ，ｅｔ  ａｌ．．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １２，６４１−６４９（２０１６））。臨床的寛解を達成する患者における薬物中止の明白で明確なガイドラインの必要性は、治療中止時に５０〜８０％の患者が再発するという事実により複雑になる（Ｋ．Ｂａｓｚｉｓ，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６３，３１６３−３１６８（２０１１））。このことは、薬物療法により臨床的寛解を達成する患者の相当な割合が無症状の炎症及び疾患の持続を経験し続けることを示す。逆に、疾患の消散を真に達成している患者は、長期にわたる薬物効果を免れ得る。従って、抗ＴＮＦＡ療法の中止を安全に実施し得る方法に対処しようとする臨床的に満たされていないニーズと、疾患の持続又は消散がどのように起こるかを理解しようとする科学的ニーズとが存在する。
【０００８】
[0009]本発明の目的は、上述した困難の内のいくつかを改善することである。
【０００９】
〔発明の概要〕
[0010]ＣＤ４Ｔ細胞は疾患再発の主要な機構的ドライバ（ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｄｒｉｖｅｒ）であり、（ａ）臨床的運命を決定するための識別ツールとして、（ｂ）新規療法の潜在的標的として、役立つ可能性があると仮定される。
【００１０】
[0011]従って、本発明の第１の態様は、対象の自己免疫疾患の臨床転帰を評価する方法であって、この対象から得られたサンプル中の、ＣＤ３＋ＣＤ４＋を含むＴ細胞集団を単離するステップと、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、又はＣＸＣＲ５＋を含む１種又は複数種のバイオマーカーに関して、このＴ細胞集団を試験するステップとを含み、このＴ細胞集団におけるバイオマーカーの有無、又は所定のレベルに対するこのＴ細胞集団におけるバイオマーカーのレベルが、この対象の自己免疫疾患の臨床転帰を示す、方法を含む。
【００１１】
[0012]本発明の別の態様は、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬を服用している対象のリウマチ性疾患の臨床転帰を評価する方法であって、この対象から得られたサンプル中の、ＣＤ３＋ＣＤ４＋を含むＴ細胞集団を単離するステップと、ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ４５ＲＡ、又はＣＸＣＲ５＋を含むバイオマーカーに関して記憶Ｔ細胞集団を試験するステップとを含み、このＴ細胞集団におけるバイオマーカーの有無、又は所定のレベルに対するこのＴ細胞集団におけるバイオマーカーのレベルが、この対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の臨床転帰を示す、方法に関する。
【００１２】
[0013]本発明の別の態様は、対象の免疫疾患の臨床転帰を評価するためのキットであって、この対象から得られたサンプル中の、Ｔ細胞集団上の少なくとも１種のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも１種の抗体であり、この少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、ＣＸＣＲ５、ＩＬ−６、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる群から選択される、抗体と、この対象の自己免疫疾患の臨床転帰の予測での使用のための、このＴ細胞集団におけるバイオマーカーの所定のレベルとを含むキットを含む。
【００１３】
[0014]本発明の他の態様及び特徴は、添付図面と併せて本発明の具体的な実施形態の下記の説明を検討して、当業者に明らかになるだろう。
【００１４】
[0015]本発明の実施形態をほんの一例として示す図面において、
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１Ａ】ＣｙＴｏＦマーカーのクラスタリング。再燃（ｆｌａｒｅ）個体及び非活動性（Ｔｏ）個体に由来する正規化されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の監視なしクラスタリングを、ＭａｒＶｉｓで実施した。細胞を、３１種の機能マーカーの発現に基づいてｔ−ＳＮＥ  Ｘ−Ｙスケール全体にわたり分布し、別個のノードに分離する。（Ａ）ＣＤ４コンパートメント内に存在するノード表現型のスペクトルを反映する、マーカーの発現値の中央値を有するノードの階層的クラスタリングを示すヒートマップ。ＣＤ４５ＲＡ−（記憶）表現型を有する特定のサブセットが強調されている。（Ｂ）再燃個体又は非活動性（Ｔｏ）個体に由来する各ノードにおける細胞の相対的に正規化された平均寄与率の散布図。ノードにおける再燃細胞の富化を、１５０〜２３０ＩＤ範囲内で観察した（赤い点線のボックス）。（Ｃ）ノード（１５０〜２３０）はＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋の発現に対応する。（Ｄ）試験採用前の患者の臨床的非活動性の持続期間（月数）。（Ｅ）試験での採用前の患者の疾患活動性の持続期間。（Ｆ）治療中止前の炎症患者と非活動性（Ｔｏ）患者とを比較するための、疾患の持続期間（月数）で構築された受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｂ】ＣｙＴｏＦマーカーのクラスタリング。再燃（ｆｌａｒｅ）個体及び非活動性（Ｔｏ）個体に由来する正規化されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の監視なしクラスタリングを、ＭａｒＶｉｓで実施した。細胞を、３１種の機能マーカーの発現に基づいてｔ−ＳＮＥ  Ｘ−Ｙスケール全体にわたり分布し、別個のノードに分離する。（Ａ）ＣＤ４コンパートメント内に存在するノード表現型のスペクトルを反映する、マーカーの発現値の中央値を有するノードの階層的クラスタリングを示すヒートマップ。ＣＤ４５ＲＡ−（記憶）表現型を有する特定のサブセットが強調されている。（Ｂ）再燃個体又は非活動性（Ｔｏ）個体に由来する各ノードにおける細胞の相対的に正規化された平均寄与率の散布図。ノードにおける再燃細胞の富化を、１５０〜２３０ＩＤ範囲内で観察した（赤い点線のボックス）。（Ｃ）ノード（１５０〜２３０）はＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋の発現に対応する。（Ｄ）試験採用前の患者の臨床的非活動性の持続期間（月数）。（Ｅ）試験での採用前の患者の疾患活動性の持続期間。（Ｆ）治療中止前の炎症患者と非活動性（Ｔｏ）患者とを比較するための、疾患の持続期間（月数）で構築された受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｃ】ＣｙＴｏＦマーカーのクラスタリング。再燃（ｆｌａｒｅ）個体及び非活動性（Ｔｏ）個体に由来する正規化されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の監視なしクラスタリングを、ＭａｒＶｉｓで実施した。細胞を、３１種の機能マーカーの発現に基づいてｔ−ＳＮＥ  Ｘ−Ｙスケール全体にわたり分布し、別個のノードに分離する。（Ａ）ＣＤ４コンパートメント内に存在するノード表現型のスペクトルを反映する、マーカーの発現値の中央値を有するノードの階層的クラスタリングを示すヒートマップ。ＣＤ４５ＲＡ−（記憶）表現型を有する特定のサブセットが強調されている。（Ｂ）再燃個体又は非活動性（Ｔｏ）個体に由来する各ノードにおける細胞の相対的に正規化された平均寄与率の散布図。ノードにおける再燃細胞の富化を、１５０〜２３０ＩＤ範囲内で観察した（赤い点線のボックス）。（Ｃ）ノード（１５０〜２３０）はＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋の発現に対応する。（Ｄ）試験採用前の患者の臨床的非活動性の持続期間（月数）。（Ｅ）試験での採用前の患者の疾患活動性の持続期間。（Ｆ）治療中止前の炎症患者と非活動性（Ｔｏ）患者とを比較するための、疾患の持続期間（月数）で構築された受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｄ】ＣｙＴｏＦマーカーのクラスタリング。再燃（ｆｌａｒｅ）個体及び非活動性（Ｔｏ）個体に由来する正規化されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の監視なしクラスタリングを、ＭａｒＶｉｓで実施した。細胞を、３１種の機能マーカーの発現に基づいてｔ−ＳＮＥ  Ｘ−Ｙスケール全体にわたり分布し、別個のノードに分離する。（Ａ）ＣＤ４コンパートメント内に存在するノード表現型のスペクトルを反映する、マーカーの発現値の中央値を有するノードの階層的クラスタリングを示すヒートマップ。ＣＤ４５ＲＡ−（記憶）表現型を有する特定のサブセットが強調されている。（Ｂ）再燃個体又は非活動性（Ｔｏ）個体に由来する各ノードにおける細胞の相対的に正規化された平均寄与率の散布図。ノードにおける再燃細胞の富化を、１５０〜２３０ＩＤ範囲内で観察した（赤い点線のボックス）。（Ｃ）ノード（１５０〜２３０）はＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋の発現に対応する。（Ｄ）試験採用前の患者の臨床的非活動性の持続期間（月数）。（Ｅ）試験での採用前の患者の疾患活動性の持続期間。（Ｆ）治療中止前の炎症患者と非活動性（Ｔｏ）患者とを比較するための、疾患の持続期間（月数）で構築された受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５。
【図１Ｅ】ＣｙＴｏＦマーカーのクラスタリング。再燃（ｆｌａｒｅ）個体及び非活動性（Ｔｏ）個体に由来する正規化されたＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の監視なしクラスタリングを、ＭａｒＶｉｓで実施した。細胞を、３１種の機能マーカーの発現に基づいてｔ−ＳＮＥ  Ｘ−Ｙスケール全体にわたり分布し、別個のノードに分離する。（Ａ）ＣＤ４コンパートメント内に存在するノード表現型のスペクトルを反映する、マーカーの発現値の中央値を有するノードの階層的クラスタリングを示すヒートマップ。ＣＤ４５ＲＡ−（記憶）表現型を有する特定のサブセットが強調されている。（Ｂ）再燃個体又は非活動性（Ｔｏ）個体に由来する各ノードにおける細胞の相対的に正規化された平均寄与率の散布図。ノードにおける再燃細胞の富化を、１５０〜２３０ＩＤ範囲内で観察した（赤い点線のボックス）。（Ｃ）ノード（１５０〜２３０）はＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋の発現に対応する。（Ｄ）試験採用前の患者の臨床的非活動性の持続期間（月数）。（Ｅ）試験での採用前の患者の疾患活動性の持続期間。（Ｆ）治療中止前の炎症患者と非活動性（Ｔｏ）患者とを比較するための、疾患の持続期間（月数）で構築された受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５。
【図２Ａ】ｔ−ＳＮＥマップ内の再燃細胞及び非活動性（Ｔｏ）細胞の分布。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートした（ｂａｃｋ−ｇａｔｅｄ）。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域全体に分布する（Ａ）サイトカイン（ＴＮＦＡ、ＩＬ−６、ＩＦＮｇ、及びＩＬ−１７Ａ）並びに（Ｂ）免疫チェックポイント（ＰＤ１及びＣＤ１５２）の発現プロファイルを示す。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の（Ｃ）再燃個体又は（Ｄ）非活動性（Ｔｏ）個体の患者分布を示す。（Ｅ）ＰＢＭＣを、未処理のＣｙＴｏＦ  ＦＣＳファイルからＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞に関してゲートした（ｇａｔｅｄ）。コホート全体にわたる総ＣＤ４＋集団において、有意な変化を検出しなかった。（Ｆ）再燃個体及び非活動性（Ｔｏ）個体に由来する総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のクラスタリング。３１種の機能マーカーが示された細胞の分布及び発現を示す密度発現マップ。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５。
【図２Ｂ】ｔ−ＳＮＥマップ内の再燃細胞及び非活動性（Ｔｏ）細胞の分布。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートした（ｂａｃｋ−ｇａｔｅｄ）。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域全体に分布する（Ａ）サイトカイン（ＴＮＦＡ、ＩＬ−６、ＩＦＮｇ、及びＩＬ−１７Ａ）並びに（Ｂ）免疫チェックポイント（ＰＤ１及びＣＤ１５２）の発現プロファイルを示す。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の（Ｃ）再燃個体又は（Ｄ）非活動性（Ｔｏ）個体の患者分布を示す。（Ｅ）ＰＢＭＣを、未処理のＣｙＴｏＦ  ＦＣＳファイルからＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞に関してゲートした（ｇａｔｅｄ）。コホート全体にわたる総ＣＤ４＋集団において、有意な変化を検出しなかった。（Ｆ）再燃個体及び非活動性（Ｔｏ）個体に由来する総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のクラスタリング。３１種の機能マーカーが示された細胞の分布及び発現を示す密度発現マップ。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５。
【図２Ｃ】ｔ−ＳＮＥマップ内の再燃細胞及び非活動性（Ｔｏ）細胞の分布。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートした（ｂａｃｋ−ｇａｔｅｄ）。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域全体に分布する（Ａ）サイトカイン（ＴＮＦＡ、ＩＬ−６、ＩＦＮｇ、及びＩＬ−１７Ａ）並びに（Ｂ）免疫チェックポイント（ＰＤ１及びＣＤ１５２）の発現プロファイルを示す。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の（Ｃ）再燃個体又は（Ｄ）非活動性（Ｔｏ）個体の患者分布を示す。（Ｅ）ＰＢＭＣを、未処理のＣｙＴｏＦ  ＦＣＳファイルからＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞に関してゲートした（ｇａｔｅｄ）。コホート全体にわたる総ＣＤ４＋集団において、有意な変化を検出しなかった。（Ｆ）再燃個体及び非活動性（Ｔｏ）個体に由来する総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のクラスタリング。３１種の機能マーカーが示された細胞の分布及び発現を示す密度発現マップ。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５。
【図２Ｄ】ｔ−ＳＮＥマップ内の再燃細胞及び非活動性（Ｔｏ）細胞の分布。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートした（ｂａｃｋ−ｇａｔｅｄ）。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域全体に分布する（Ａ）サイトカイン（ＴＮＦＡ、ＩＬ−６、ＩＦＮｇ、及びＩＬ−１７Ａ）並びに（Ｂ）免疫チェックポイント（ＰＤ１及びＣＤ１５２）の発現プロファイルを示す。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の（Ｃ）再燃個体又は（Ｄ）非活動性（Ｔｏ）個体の患者分布を示す。（Ｅ）ＰＢＭＣを、未処理のＣｙＴｏＦ  ＦＣＳファイルからＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞に関してゲートした（ｇａｔｅｄ）。コホート全体にわたる総ＣＤ４＋集団において、有意な変化を検出しなかった。（Ｆ）再燃個体及び非活動性（Ｔｏ）個体に由来する総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のクラスタリング。３１種の機能マーカーが示された細胞の分布及び発現を示す密度発現マップ。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５。
【図２Ｅ】ｔ−ＳＮＥマップ内の再燃細胞及び非活動性（Ｔｏ）細胞の分布。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートした（ｂａｃｋ−ｇａｔｅｄ）。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域全体に分布する（Ａ）サイトカイン（ＴＮＦＡ、ＩＬ−６、ＩＦＮｇ、及びＩＬ−１７Ａ）並びに（Ｂ）免疫チェックポイント（ＰＤ１及びＣＤ１５２）の発現プロファイルを示す。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の（Ｃ）再燃個体又は（Ｄ）非活動性（Ｔｏ）個体の患者分布を示す。（Ｅ）ＰＢＭＣを、未処理のＣｙＴｏＦ  ＦＣＳファイルからＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞に関してゲートした（ｇａｔｅｄ）。コホート全体にわたる総ＣＤ４＋集団において、有意な変化を検出しなかった。（Ｆ）再燃個体及び非活動性（Ｔｏ）個体に由来する総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のクラスタリング。３１種の機能マーカーが示された細胞の分布及び発現を示す密度発現マップ。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５。
【図２Ｆ】ｔ−ＳＮＥマップ内の再燃細胞及び非活動性（Ｔｏ）細胞の分布。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートした（ｂａｃｋ−ｇａｔｅｄ）。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域全体に分布する（Ａ）サイトカイン（ＴＮＦＡ、ＩＬ−６、ＩＦＮｇ、及びＩＬ−１７Ａ）並びに（Ｂ）免疫チェックポイント（ＰＤ１及びＣＤ１５２）の発現プロファイルを示す。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の（Ｃ）再燃個体又は（Ｄ）非活動性（Ｔｏ）個体の患者分布を示す。（Ｅ）ＰＢＭＣを、未処理のＣｙＴｏＦ  ＦＣＳファイルからＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ８−Ｔ細胞に関してゲートした（ｇａｔｅｄ）。コホート全体にわたる総ＣＤ４＋集団において、有意な変化を検出しなかった。（Ｆ）再燃個体及び非活動性（Ｔｏ）個体に由来する総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のクラスタリング。３１種の機能マーカーが示された細胞の分布及び発現を示す密度発現マップ。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５。
【図３Ａ】臨床的運命を予測するための受信者動作特性曲線の構築。（Ａ）本発明者らは、ＦＣＳファイルから手動でゲートし、未処理ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋の細胞頻度を、再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体における総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の割合として算出した。（Ｂ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体における総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の記憶ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／未処理ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞の比を示す。ＡＵＣと表にまとめた感度／特異度とを示す、非活動性（Ｔｏ）個体に対する再燃個体からの総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の（Ｃ）ＣＤ４ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞、（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞の比による受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の構築。
【図３Ｂ】臨床的運命を予測するための受信者動作特性曲線の構築。（Ａ）本発明者らは、ＦＣＳファイルから手動でゲートし、未処理ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋の細胞頻度を、再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体における総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の割合として算出した。（Ｂ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体における総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の記憶ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／未処理ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞の比を示す。ＡＵＣと表にまとめた感度／特異度とを示す、非活動性（Ｔｏ）個体に対する再燃個体からの総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の（Ｃ）ＣＤ４ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞、（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞の比による受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の構築。
【図３Ｃ】臨床的運命を予測するための受信者動作特性曲線の構築。（Ａ）本発明者らは、ＦＣＳファイルから手動でゲートし、未処理ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋の細胞頻度を、再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体における総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の割合として算出した。（Ｂ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体における総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の記憶ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／未処理ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞の比を示す。ＡＵＣと表にまとめた感度／特異度とを示す、非活動性（Ｔｏ）個体に対する再燃個体からの総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の（Ｃ）ＣＤ４ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞、（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞の比による受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の構築。
【図３Ｄ】臨床的運命を予測するための受信者動作特性曲線の構築。（Ａ）本発明者らは、ＦＣＳファイルから手動でゲートし、未処理ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋の細胞頻度を、再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体における総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の割合として算出した。（Ｂ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体における総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の記憶ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／未処理ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞の比を示す。ＡＵＣと表にまとめた感度／特異度とを示す、非活動性（Ｔｏ）個体に対する再燃個体からの総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の（Ｃ）ＣＤ４ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞、（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞の比による受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の構築。
【図３Ｅ】臨床的運命を予測するための受信者動作特性曲線の構築。（Ａ）本発明者らは、ＦＣＳファイルから手動でゲートし、未処理ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋の細胞頻度を、再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体における総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の割合として算出した。（Ｂ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体における総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の記憶ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／未処理ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞の比を示す。ＡＵＣと表にまとめた感度／特異度とを示す、非活動性（Ｔｏ）個体に対する再燃個体からの総ＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞の（Ｃ）ＣＤ４ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞、（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞の比による受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線の構築。
【図４Ａ】ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の再燃（Ｔｏ）患者において有意に富化されたノードの統計的フィルタリング及び検証。（Ａ）非活動性（Ｔｏ）個体に対して再燃個体において有意に高いＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の５つのノード（１９６、２０９、２１１、２２２、１７８）の位置。（Ｂ）有意なノードのノード表現型を示す表。（Ｃ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図。炎症／非活動性（Ｔｏ）個体からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、下記の集団を検証した：（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−、（Ｆ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−、及び（Ｇ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｈ）非活動性（Ｔｏ）個体に対して再燃個体において富化されたノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード１９６、２０９、２１１、２２２、１７８（非活動性（Ｔｏ）個体と比較して再燃個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＥマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図４Ｂ】ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の再燃（Ｔｏ）患者において有意に富化されたノードの統計的フィルタリング及び検証。（Ａ）非活動性（Ｔｏ）個体に対して再燃個体において有意に高いＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の５つのノード（１９６、２０９、２１１、２２２、１７８）の位置。（Ｂ）有意なノードのノード表現型を示す表。（Ｃ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図。炎症／非活動性（Ｔｏ）個体からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、下記の集団を検証した：（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−、（Ｆ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−、及び（Ｇ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｈ）非活動性（Ｔｏ）個体に対して再燃個体において富化されたノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード１９６、２０９、２１１、２２２、１７８（非活動性（Ｔｏ）個体と比較して再燃個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＥマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図４Ｃ】ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の再燃（Ｔｏ）患者において有意に富化されたノードの統計的フィルタリング及び検証。（Ａ）非活動性（Ｔｏ）個体に対して再燃個体において有意に高いＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の５つのノード（１９６、２０９、２１１、２２２、１７８）の位置。（Ｂ）有意なノードのノード表現型を示す表。（Ｃ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図。炎症／非活動性（Ｔｏ）個体からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、下記の集団を検証した：（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−、（Ｆ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−、及び（Ｇ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｈ）非活動性（Ｔｏ）個体に対して再燃個体において富化されたノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード１９６、２０９、２１１、２２２、１７８（非活動性（Ｔｏ）個体と比較して再燃個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＥマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図４ＤＧ】ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の再燃（Ｔｏ）患者において有意に富化されたノードの統計的フィルタリング及び検証。（Ａ）非活動性（Ｔｏ）個体に対して再燃個体において有意に高いＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の５つのノード（１９６、２０９、２１１、２２２、１７８）の位置。（Ｂ）有意なノードのノード表現型を示す表。（Ｃ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図。炎症／非活動性（Ｔｏ）個体からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、下記の集団を検証した：（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−、（Ｆ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−、及び（Ｇ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｈ）非活動性（Ｔｏ）個体に対して再燃個体において富化されたノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード１９６、２０９、２１１、２２２、１７８（非活動性（Ｔｏ）個体と比較して再燃個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＥマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図４Ｈ】ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の再燃（Ｔｏ）患者において有意に富化されたノードの統計的フィルタリング及び検証。（Ａ）非活動性（Ｔｏ）個体に対して再燃個体において有意に高いＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の５つのノード（１９６、２０９、２１１、２２２、１７８）の位置。（Ｂ）有意なノードのノード表現型を示す表。（Ｃ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図。炎症／非活動性（Ｔｏ）個体からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、下記の集団を検証した：（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−、（Ｆ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−、及び（Ｇ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ｈ）非活動性（Ｔｏ）個体に対して再燃個体において富化されたノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード１９６、２０９、２１１、２２２、１７８（非活動性（Ｔｏ）個体と比較して再燃個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＥマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図５Ａ】ＭａｒＶｉｓによる再燃（Ｔｏ）細胞及び健康細胞のクラスタリング。（Ａ）再燃（Ｔｏ）個体及び（Ｂ）健康個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を正規化してＭａｒＶｉｓによりクラスター化した。本発明者らは、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。ＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋領域内の、（Ｃ）サイトカイン（ＩＦＮｇ、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−６）並びに（Ｄ）免疫チェックポイント（ＰＤ１、ＣＤ１５２）を発現する、ゲートした適切な細胞を、ｔ−ＳＮＥマップに示す。ノード４８、４９、７６、及び７７は統計的に有意であり、（Ｅ）ｔ−ＳＮＥマップ上の位置、（Ｆ）表現型、及び（Ｇ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。（Ｈ）再燃／非活動性（Ｔｏ）及び健康からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋集団を検証した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。（Ｉ）健康個体に対して再燃（Ｔｏ）個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード４８、４９、７６、７７（健康個体と比較して再燃（Ｔｏ）個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＲマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図５Ｂ】ＭａｒＶｉｓによる再燃（Ｔｏ）細胞及び健康細胞のクラスタリング。（Ａ）再燃（Ｔｏ）個体及び（Ｂ）健康個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を正規化してＭａｒＶｉｓによりクラスター化した。本発明者らは、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。ＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋領域内の、（Ｃ）サイトカイン（ＩＦＮｇ、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−６）並びに（Ｄ）免疫チェックポイント（ＰＤ１、ＣＤ１５２）を発現する、ゲートした適切な細胞を、ｔ−ＳＮＥマップに示す。ノード４８、４９、７６、及び７７は統計的に有意であり、（Ｅ）ｔ−ＳＮＥマップ上の位置、（Ｆ）表現型、及び（Ｇ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。（Ｈ）再燃／非活動性（Ｔｏ）及び健康からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋集団を検証した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。（Ｉ）健康個体に対して再燃（Ｔｏ）個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード４８、４９、７６、７７（健康個体と比較して再燃（Ｔｏ）個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＲマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図５Ｃ】ＭａｒＶｉｓによる再燃（Ｔｏ）細胞及び健康細胞のクラスタリング。（Ａ）再燃（Ｔｏ）個体及び（Ｂ）健康個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を正規化してＭａｒＶｉｓによりクラスター化した。本発明者らは、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。ＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋領域内の、（Ｃ）サイトカイン（ＩＦＮｇ、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−６）並びに（Ｄ）免疫チェックポイント（ＰＤ１、ＣＤ１５２）を発現する、ゲートした適切な細胞を、ｔ−ＳＮＥマップに示す。ノード４８、４９、７６、及び７７は統計的に有意であり、（Ｅ）ｔ−ＳＮＥマップ上の位置、（Ｆ）表現型、及び（Ｇ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。（Ｈ）再燃／非活動性（Ｔｏ）及び健康からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋集団を検証した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。（Ｉ）健康個体に対して再燃（Ｔｏ）個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード４８、４９、７６、７７（健康個体と比較して再燃（Ｔｏ）個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＲマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図５Ｄ】ＭａｒＶｉｓによる再燃（Ｔｏ）細胞及び健康細胞のクラスタリング。（Ａ）再燃（Ｔｏ）個体及び（Ｂ）健康個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を正規化してＭａｒＶｉｓによりクラスター化した。本発明者らは、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。ＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋領域内の、（Ｃ）サイトカイン（ＩＦＮｇ、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−６）並びに（Ｄ）免疫チェックポイント（ＰＤ１、ＣＤ１５２）を発現する、ゲートした適切な細胞を、ｔ−ＳＮＥマップに示す。ノード４８、４９、７６、及び７７は統計的に有意であり、（Ｅ）ｔ−ＳＮＥマップ上の位置、（Ｆ）表現型、及び（Ｇ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。（Ｈ）再燃／非活動性（Ｔｏ）及び健康からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋集団を検証した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。（Ｉ）健康個体に対して再燃（Ｔｏ）個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード４８、４９、７６、７７（健康個体と比較して再燃（Ｔｏ）個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＲマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図５Ｅ】ＭａｒＶｉｓによる再燃（Ｔｏ）細胞及び健康細胞のクラスタリング。（Ａ）再燃（Ｔｏ）個体及び（Ｂ）健康個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を正規化してＭａｒＶｉｓによりクラスター化した。本発明者らは、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。ＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋領域内の、（Ｃ）サイトカイン（ＩＦＮｇ、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−６）並びに（Ｄ）免疫チェックポイント（ＰＤ１、ＣＤ１５２）を発現する、ゲートした適切な細胞を、ｔ−ＳＮＥマップに示す。ノード４８、４９、７６、及び７７は統計的に有意であり、（Ｅ）ｔ−ＳＮＥマップ上の位置、（Ｆ）表現型、及び（Ｇ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。（Ｈ）再燃／非活動性（Ｔｏ）及び健康からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋集団を検証した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。（Ｉ）健康個体に対して再燃（Ｔｏ）個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード４８、４９、７６、７７（健康個体と比較して再燃（Ｔｏ）個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＲマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図５Ｆ】ＭａｒＶｉｓによる再燃（Ｔｏ）細胞及び健康細胞のクラスタリング。（Ａ）再燃（Ｔｏ）個体及び（Ｂ）健康個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を正規化してＭａｒＶｉｓによりクラスター化した。本発明者らは、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。ＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋領域内の、（Ｃ）サイトカイン（ＩＦＮｇ、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−６）並びに（Ｄ）免疫チェックポイント（ＰＤ１、ＣＤ１５２）を発現する、ゲートした適切な細胞を、ｔ−ＳＮＥマップに示す。ノード４８、４９、７６、及び７７は統計的に有意であり、（Ｅ）ｔ−ＳＮＥマップ上の位置、（Ｆ）表現型、及び（Ｇ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。（Ｈ）再燃／非活動性（Ｔｏ）及び健康からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋集団を検証した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。（Ｉ）健康個体に対して再燃（Ｔｏ）個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード４８、４９、７６、７７（健康個体と比較して再燃（Ｔｏ）個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＲマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図５Ｇ】ＭａｒＶｉｓによる再燃（Ｔｏ）細胞及び健康細胞のクラスタリング。（Ａ）再燃（Ｔｏ）個体及び（Ｂ）健康個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を正規化してＭａｒＶｉｓによりクラスター化した。本発明者らは、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。ＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋領域内の、（Ｃ）サイトカイン（ＩＦＮｇ、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−６）並びに（Ｄ）免疫チェックポイント（ＰＤ１、ＣＤ１５２）を発現する、ゲートした適切な細胞を、ｔ−ＳＮＥマップに示す。ノード４８、４９、７６、及び７７は統計的に有意であり、（Ｅ）ｔ−ＳＮＥマップ上の位置、（Ｆ）表現型、及び（Ｇ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。（Ｈ）再燃／非活動性（Ｔｏ）及び健康からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋集団を検証した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。（Ｉ）健康個体に対して再燃（Ｔｏ）個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード４８、４９、７６、７７（健康個体と比較して再燃（Ｔｏ）個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＲマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図５Ｈ】ＭａｒＶｉｓによる再燃（Ｔｏ）細胞及び健康細胞のクラスタリング。（Ａ）再燃（Ｔｏ）個体及び（Ｂ）健康個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を正規化してＭａｒＶｉｓによりクラスター化した。本発明者らは、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。ＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋領域内の、（Ｃ）サイトカイン（ＩＦＮｇ、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−６）並びに（Ｄ）免疫チェックポイント（ＰＤ１、ＣＤ１５２）を発現する、ゲートした適切な細胞を、ｔ−ＳＮＥマップに示す。ノード４８、４９、７６、及び７７は統計的に有意であり、（Ｅ）ｔ−ＳＮＥマップ上の位置、（Ｆ）表現型、及び（Ｇ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。（Ｈ）再燃／非活動性（Ｔｏ）及び健康からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋集団を検証した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。（Ｉ）健康個体に対して再燃（Ｔｏ）個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード４８、４９、７６、７７（健康個体と比較して再燃（Ｔｏ）個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＲマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図５Ｉ】ＭａｒＶｉｓによる再燃（Ｔｏ）細胞及び健康細胞のクラスタリング。（Ａ）再燃（Ｔｏ）個体及び（Ｂ）健康個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を正規化してＭａｒＶｉｓによりクラスター化した。本発明者らは、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ上にバックゲートし、ノード全体にわたる個体の細胞頻度分布を可視化した。ＣＤ４５ＲＡ−  ＴＮＦＡ＋領域内の、（Ｃ）サイトカイン（ＩＦＮｇ、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−６）並びに（Ｄ）免疫チェックポイント（ＰＤ１、ＣＤ１５２）を発現する、ゲートした適切な細胞を、ｔ−ＳＮＥマップに示す。ノード４８、４９、７６、及び７７は統計的に有意であり、（Ｅ）ｔ−ＳＮＥマップ上の位置、（Ｆ）表現型、及び（Ｇ）個体からの細胞頻度の箱ひげ図を示す。（Ｈ）再燃／非活動性（Ｔｏ）及び健康からのＦＣＳファイルの手動ゲーティングを実施して、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋集団を検証した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、及び＊＊ｐ＜０．０１。（Ｉ）健康個体に対して再燃（Ｔｏ）個体で富むノード内のマーカーの発現を示すヒストグラム。ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋領域内の統計的に有意なノード４８、４９、７６、７７（健康個体と比較して再燃（Ｔｏ）個体において富化されている）のノード表現型。赤色の直線はノード内のマーカーの発現を示し、黒色の直線はｔ−ＳＮＲマップ中の全てのノードにわたるマーカーの発現を示す。
【図６Ａ】総Ｔ制御集団の監視付きゲーティングを、再燃／非活動性（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）個体及び健康個体で実施した。（Ａ）ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉＴｒｅｇに関するゲート戦略を示す。（Ｂ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体、（Ｃ）再燃個体、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体、又は健康個体からの総Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉ）の手動ゲーティング。（Ｄ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体、（Ｅ）再燃個体、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体、又は健康個体からのＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉ）の手動ゲーティング。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図６Ｂ】総Ｔ制御集団の監視付きゲーティングを、再燃／非活動性（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）個体及び健康個体で実施した。（Ａ）ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉＴｒｅｇに関するゲート戦略を示す。（Ｂ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体、（Ｃ）再燃個体、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体、又は健康個体からの総Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉ）の手動ゲーティング。（Ｄ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体、（Ｅ）再燃個体、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体、又は健康個体からのＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉ）の手動ゲーティング。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図６Ｃ】総Ｔ制御集団の監視付きゲーティングを、再燃／非活動性（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）個体及び健康個体で実施した。（Ａ）ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉＴｒｅｇに関するゲート戦略を示す。（Ｂ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体、（Ｃ）再燃個体、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体、又は健康個体からの総Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉ）の手動ゲーティング。（Ｄ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体、（Ｅ）再燃個体、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体、又は健康個体からのＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉ）の手動ゲーティング。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図６Ｄ】総Ｔ制御集団の監視付きゲーティングを、再燃／非活動性（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）個体及び健康個体で実施した。（Ａ）ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉＴｒｅｇに関するゲート戦略を示す。（Ｂ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体、（Ｃ）再燃個体、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体、又は健康個体からの総Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉ）の手動ゲーティング。（Ｄ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体、（Ｅ）再燃個体、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体、又は健康個体からのＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉ）の手動ゲーティング。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図６Ｅ】総Ｔ制御集団の監視付きゲーティングを、再燃／非活動性（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）個体及び健康個体で実施した。（Ａ）ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉＴｒｅｇに関するゲート戦略を示す。（Ｂ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体、（Ｃ）再燃個体、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体、又は健康個体からの総Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉ）の手動ゲーティング。（Ｄ）再燃個体、非活動性（Ｔｏ）個体、又は健康個体、（Ｅ）再燃個体、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体、又は健康個体からのＣＤ４５ＲＡ−Ｔｒｅｇ（ＣＤ２５ｈｉＦｏｘＰ３ｈｉ）の手動ゲーティング。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図７Ａ】ＭａｒＶｉｓによる再燃個体及び非活動性（Ｔｅｎｄ）個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のクラスタリング。２つの統計的に有意なノードが、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体と比べて再燃（Ｔｅｎｄ）個体で高かった。（Ａ）ｔ−ＳＮＥマップにおけるノード４０及び４５の位置、（Ｂ）ノード４０及び４５の表現型、並びに（Ｃ）ノード４０及び４５における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃／非活動性（Ｔｅｎｄ）個体又は健康個体のＦＣＳファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した：（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋、（Ｆ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２＋、（Ｇ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１＋。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図７Ｂ】ＭａｒＶｉｓによる再燃個体及び非活動性（Ｔｅｎｄ）個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のクラスタリング。２つの統計的に有意なノードが、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体と比べて再燃（Ｔｅｎｄ）個体で高かった。（Ａ）ｔ−ＳＮＥマップにおけるノード４０及び４５の位置、（Ｂ）ノード４０及び４５の表現型、並びに（Ｃ）ノード４０及び４５における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃／非活動性（Ｔｅｎｄ）個体又は健康個体のＦＣＳファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した：（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋、（Ｆ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２＋、（Ｇ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１＋。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図７Ｃ】ＭａｒＶｉｓによる再燃個体及び非活動性（Ｔｅｎｄ）個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のクラスタリング。２つの統計的に有意なノードが、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体と比べて再燃（Ｔｅｎｄ）個体で高かった。（Ａ）ｔ−ＳＮＥマップにおけるノード４０及び４５の位置、（Ｂ）ノード４０及び４５の表現型、並びに（Ｃ）ノード４０及び４５における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃／非活動性（Ｔｅｎｄ）個体又は健康個体のＦＣＳファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した：（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋、（Ｆ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２＋、（Ｇ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１＋。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図７Ｄ】ＭａｒＶｉｓによる再燃個体及び非活動性（Ｔｅｎｄ）個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のクラスタリング。２つの統計的に有意なノードが、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体と比べて再燃（Ｔｅｎｄ）個体で高かった。（Ａ）ｔ−ＳＮＥマップにおけるノード４０及び４５の位置、（Ｂ）ノード４０及び４５の表現型、並びに（Ｃ）ノード４０及び４５における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃／非活動性（Ｔｅｎｄ）個体又は健康個体のＦＣＳファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した：（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋、（Ｆ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２＋、（Ｇ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１＋。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図７Ｅ】ＭａｒＶｉｓによる再燃個体及び非活動性（Ｔｅｎｄ）個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のクラスタリング。２つの統計的に有意なノードが、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体と比べて再燃（Ｔｅｎｄ）個体で高かった。（Ａ）ｔ−ＳＮＥマップにおけるノード４０及び４５の位置、（Ｂ）ノード４０及び４５の表現型、並びに（Ｃ）ノード４０及び４５における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃／非活動性（Ｔｅｎｄ）個体又は健康個体のＦＣＳファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した：（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋、（Ｆ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２＋、（Ｇ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１＋。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図７Ｆ】ＭａｒＶｉｓによる再燃個体及び非活動性（Ｔｅｎｄ）個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のクラスタリング。２つの統計的に有意なノードが、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体と比べて再燃（Ｔｅｎｄ）個体で高かった。（Ａ）ｔ−ＳＮＥマップにおけるノード４０及び４５の位置、（Ｂ）ノード４０及び４５の表現型、並びに（Ｃ）ノード４０及び４５における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃／非活動性（Ｔｅｎｄ）個体又は健康個体のＦＣＳファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した：（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋、（Ｆ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２＋、（Ｇ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１＋。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図７Ｇ】ＭａｒＶｉｓによる再燃個体及び非活動性（Ｔｅｎｄ）個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞のクラスタリング。２つの統計的に有意なノードが、非活動性（Ｔｅｎｄ）個体と比べて再燃（Ｔｅｎｄ）個体で高かった。（Ａ）ｔ−ＳＮＥマップにおけるノード４０及び４５の位置、（Ｂ）ノード４０及び４５の表現型、並びに（Ｃ）ノード４０及び４５における細胞の頻度を示す箱ひげ図。本発明者らは、再燃／非活動性（Ｔｅｎｄ）個体又は健康個体のＦＣＳファイルからの手動ゲーティングを実施して、下記の集団に関するクラスタリング結果を検証した：（Ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋、（Ｅ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋、（Ｆ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２＋、（Ｇ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１＋。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定、平均±Ｓ．Ｄ．、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図８Ａ】ＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞に関する選別戦略。（Ａ）ＰＢＭＣを解凍し、それぞれの抗体で染色し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の選別をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩで実施した。示したように、非一重項及び死滅細胞を除外した。６例の再燃（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）ＪＩＡ患者、６例の非活動性（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）ＪＩＡ患者、及び３例の健康な小児コントロールから選別された同数のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で２４時間にわたり刺激し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ２パネルによるｍＲＮＡ分析にかけた。健康コントロールと比較して、（Ｂ）再燃ＪＩＡ患者、又は（Ｃ）非活動性（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）ＪＩＡ患者において有意に（ｐ＜０．０５、倍差±１．５）増加した遺伝子を示すヒートマップ。青色で強調されており、非活動性個体で富化されている遺伝子、赤色で強調されており、ＧＷＡＳ研究で既に説明されている遺伝子、緑色で強調されており、議論で言及されている遺伝子に留意されたい。
【図８Ｂ】ＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞に関する選別戦略。（Ａ）ＰＢＭＣを解凍し、それぞれの抗体で染色し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の選別をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩで実施した。示したように、非一重項及び死滅細胞を除外した。６例の再燃（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）ＪＩＡ患者、６例の非活動性（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）ＪＩＡ患者、及び３例の健康な小児コントロールから選別された同数のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で２４時間にわたり刺激し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ２パネルによるｍＲＮＡ分析にかけた。健康コントロールと比較して、（Ｂ）再燃ＪＩＡ患者、又は（Ｃ）非活動性（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）ＪＩＡ患者において有意に（ｐ＜０．０５、倍差±１．５）増加した遺伝子を示すヒートマップ。青色で強調されており、非活動性個体で富化されている遺伝子、赤色で強調されており、ＧＷＡＳ研究で既に説明されている遺伝子、緑色で強調されており、議論で言及されている遺伝子に留意されたい。
【図８Ｃ】ＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−細胞に関する選別戦略。（Ａ）ＰＢＭＣを解凍し、それぞれの抗体で染色し、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞の選別をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩで実施した。示したように、非一重項及び死滅細胞を除外した。６例の再燃（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）ＪＩＡ患者、６例の非活動性（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）ＪＩＡ患者、及び３例の健康な小児コントロールから選別された同数のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞を、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で２４時間にわたり刺激し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ２パネルによるｍＲＮＡ分析にかけた。健康コントロールと比較して、（Ｂ）再燃ＪＩＡ患者、又は（Ｃ）非活動性（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）ＪＩＡ患者において有意に（ｐ＜０．０５、倍差±１．５）増加した遺伝子を示すヒートマップ。青色で強調されており、非活動性個体で富化されている遺伝子、赤色で強調されており、ＧＷＡＳ研究で既に説明されている遺伝子、緑色で強調されており、議論で言及されている遺伝子に留意されたい。
【図９Ａ】持続性遺伝子の経路増強。（Ａ）ＪＩＡ患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するＤＡＶＩＤにエクスポートし、Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを使用して、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅにより遺伝子関連を構築した。５種の主要な経路：（Ｂ）ＴＣＲ活性化、（Ｃ）ＴＮＦＡシグナル伝達、（Ｄ）ＮＦ−ｋＢシグナル伝達、（Ｅ）アポトーシス、（Ｆ）ＭＡＰＫシグナル伝達が、健康コントロールと比較して再燃ＪＩＡ患者及び非活動性ＪＩＡ患者において調節不全である（赤色＝再燃のみ、黄色＝再燃又は非活動性、青色＝非活動性のみ）。非活動性個体で富化されている遺伝子；１Ｆｙｎ、２ＴＲＡＦ１、３ＴＮＦＲＳＦ９、４ＣＡＳＰ１、５ＩＫＢＫＥ。抗ＴＮＦＡ療法の前（処置未経験）又は後（最近発生の臨床的寛解）の４組のＪＩＡ患者及び３例の健康な小児コントロールから選別された同数のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８で２４時間にわたり刺激し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ２パネルによるｍＲＮＡ分析にかけた。（Ｇ）健康コントロールと比較してＪＩＡ患者で有意に（ｐ＜０．０５、倍差±１．５）増加した遺伝子を示すヒートマップ。（Ｈ）ＪＩＡ患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するＤＡＶＩＤにエクスポートし、Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを使用して、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅにより遺伝子関連を構築した。５種の主要な経路（ＴＣＲ活性化、アポトーシス、ＴＮＦＡシグナル伝達、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達、ＭＡＰＫシグナル伝達）が、健康コントロールと比較してＪＩＡ患者において調節不全である。
【図９ＢＦ】持続性遺伝子の経路増強。（Ａ）ＪＩＡ患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するＤＡＶＩＤにエクスポートし、Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを使用して、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅにより遺伝子関連を構築した。５種の主要な経路：（Ｂ）ＴＣＲ活性化、（Ｃ）ＴＮＦＡシグナル伝達、（Ｄ）ＮＦ−ｋＢシグナル伝達、（Ｅ）アポトーシス、（Ｆ）ＭＡＰＫシグナル伝達が、健康コントロールと比較して再燃ＪＩＡ患者及び非活動性ＪＩＡ患者において調節不全である（赤色＝再燃のみ、黄色＝再燃又は非活動性、青色＝非活動性のみ）。非活動性個体で富化されている遺伝子；１Ｆｙｎ、２ＴＲＡＦ１、３ＴＮＦＲＳＦ９、４ＣＡＳＰ１、５ＩＫＢＫＥ。抗ＴＮＦＡ療法の前（処置未経験）又は後（最近発生の臨床的寛解）の４組のＪＩＡ患者及び３例の健康な小児コントロールから選別された同数のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８で２４時間にわたり刺激し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ２パネルによるｍＲＮＡ分析にかけた。（Ｇ）健康コントロールと比較してＪＩＡ患者で有意に（ｐ＜０．０５、倍差±１．５）増加した遺伝子を示すヒートマップ。（Ｈ）ＪＩＡ患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するＤＡＶＩＤにエクスポートし、Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを使用して、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅにより遺伝子関連を構築した。５種の主要な経路（ＴＣＲ活性化、アポトーシス、ＴＮＦＡシグナル伝達、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達、ＭＡＰＫシグナル伝達）が、健康コントロールと比較してＪＩＡ患者において調節不全である。
【図９Ｇ】持続性遺伝子の経路増強。（Ａ）ＪＩＡ患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するＤＡＶＩＤにエクスポートし、Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを使用して、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅにより遺伝子関連を構築した。５種の主要な経路：（Ｂ）ＴＣＲ活性化、（Ｃ）ＴＮＦＡシグナル伝達、（Ｄ）ＮＦ−ｋＢシグナル伝達、（Ｅ）アポトーシス、（Ｆ）ＭＡＰＫシグナル伝達が、健康コントロールと比較して再燃ＪＩＡ患者及び非活動性ＪＩＡ患者において調節不全である（赤色＝再燃のみ、黄色＝再燃又は非活動性、青色＝非活動性のみ）。非活動性個体で富化されている遺伝子；１Ｆｙｎ、２ＴＲＡＦ１、３ＴＮＦＲＳＦ９、４ＣＡＳＰ１、５ＩＫＢＫＥ。抗ＴＮＦＡ療法の前（処置未経験）又は後（最近発生の臨床的寛解）の４組のＪＩＡ患者及び３例の健康な小児コントロールから選別された同数のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８で２４時間にわたり刺激し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ２パネルによるｍＲＮＡ分析にかけた。（Ｇ）健康コントロールと比較してＪＩＡ患者で有意に（ｐ＜０．０５、倍差±１．５）増加した遺伝子を示すヒートマップ。（Ｈ）ＪＩＡ患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するＤＡＶＩＤにエクスポートし、Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを使用して、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅにより遺伝子関連を構築した。５種の主要な経路（ＴＣＲ活性化、アポトーシス、ＴＮＦＡシグナル伝達、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達、ＭＡＰＫシグナル伝達）が、健康コントロールと比較してＪＩＡ患者において調節不全である。
【図９Ｈ】持続性遺伝子の経路増強。（Ａ）ＪＩＡ患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するＤＡＶＩＤにエクスポートし、Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを使用して、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅにより遺伝子関連を構築した。５種の主要な経路：（Ｂ）ＴＣＲ活性化、（Ｃ）ＴＮＦＡシグナル伝達、（Ｄ）ＮＦ−ｋＢシグナル伝達、（Ｅ）アポトーシス、（Ｆ）ＭＡＰＫシグナル伝達が、健康コントロールと比較して再燃ＪＩＡ患者及び非活動性ＪＩＡ患者において調節不全である（赤色＝再燃のみ、黄色＝再燃又は非活動性、青色＝非活動性のみ）。非活動性個体で富化されている遺伝子；１Ｆｙｎ、２ＴＲＡＦ１、３ＴＮＦＲＳＦ９、４ＣＡＳＰ１、５ＩＫＢＫＥ。抗ＴＮＦＡ療法の前（処置未経験）又は後（最近発生の臨床的寛解）の４組のＪＩＡ患者及び３例の健康な小児コントロールから選別された同数のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞を抗ＣＤ３／ＣＤ２８で２４時間にわたり刺激し、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｖ２パネルによるｍＲＮＡ分析にかけた。（Ｇ）健康コントロールと比較してＪＩＡ患者で有意に（ｐ＜０．０５、倍差±１．５）増加した遺伝子を示すヒートマップ。（Ｈ）ＪＩＡ患者で富化されている遺伝子を、機能遺伝子セット富化に関するＤＡＶＩＤにエクスポートし、Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを使用して、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅにより遺伝子関連を構築した。５種の主要な経路（ＴＣＲ活性化、アポトーシス、ＴＮＦＡシグナル伝達、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達、ＭＡＰＫシグナル伝達）が、健康コントロールと比較してＪＩＡ患者において調節不全である。
【図１０Ａ】比較集団における総Ｔ細胞記憶細胞での様々なマーカーの監視付きゲーティング（Ａ）治療の中止前に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、（Ｂ）治療の中止前に採取した再燃サンプルと健康対象由来のサンプルとの比較、（Ｃ）治療の中止後に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、及び（Ｄ）治療の中止前に採取したサンプルにおける活動性と非活動性との比較。
【図１０Ｂ】比較集団における総Ｔ細胞記憶細胞での様々なマーカーの監視付きゲーティング（Ａ）治療の中止前に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、（Ｂ）治療の中止前に採取した再燃サンプルと健康対象由来のサンプルとの比較、（Ｃ）治療の中止後に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、及び（Ｄ）治療の中止前に採取したサンプルにおける活動性と非活動性との比較。
【図１０Ｃ】比較集団における総Ｔ細胞記憶細胞での様々なマーカーの監視付きゲーティング（Ａ）治療の中止前に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、（Ｂ）治療の中止前に採取した再燃サンプルと健康対象由来のサンプルとの比較、（Ｃ）治療の中止後に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、及び（Ｄ）治療の中止前に採取したサンプルにおける活動性と非活動性との比較。
【図１０Ｄ】比較集団における総Ｔ細胞記憶細胞での様々なマーカーの監視付きゲーティング（Ａ）治療の中止前に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、（Ｂ）治療の中止前に採取した再燃サンプルと健康対象由来のサンプルとの比較、（Ｃ）治療の中止後に採取したサンプルにおける再燃と非活動性との比較、及び（Ｄ）治療の中止前に採取したサンプルにおける活動性と非活動性との比較。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
[0026]疾患の持続に関与するＣＤ４サブセットを明らかにするために、臨床的に制御された試験から採用された免疫表現型ＪＩＡ個体にサイトメトリタイムオブフライト（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）（ＣｙＴｏＦ）プラットフォームを活用している。このＣｙＴｏＦプラットフォームは、スペクトル補償の必要性を回避する重金属結合抗体を利用する。これにより、ＣＤ４コンパートメント内の複雑な細胞不均一性を介した高次元の分析の機会が提供される。この研究では、抗ＴＮＦＡ療法により臨床的寛解を達成しているＪＩＡ患者を募集し、この試験中の薬物中止の前後に、このＪＩＡ患者の臨床的進行を前向き追跡した。循環ＣＤ４サブセットをＣｙＴｏＦで調べた。
【００１７】
[0027]病因におけるＣＤ４Ｔ細胞の関与は既に報告されているが、これが疾患再発にどのように寄与するかは研究されていない。再発の臨床的予測因子を発見する試みでは、臨床的に制御された試験から採用された個体から、高次元のプラットフォームＣｙＴｏＦにより不均一ＣＤ４コンパートメントを分析した。臨床的に制御された試験からのＣＤ４Ｔ細胞コンパートメントのＣｙＴｏＦ調査により、臨床的運命を予測し且つ疾患の消散に機構的洞察を提供するのに役立つ炎症性記憶Ｔ細胞のサブセットの持続が明らかになる。
【００１８】
[0028]従って、本発明の第１の態様は、対象の自己免疫疾患の臨床転帰を評価する方法であって、この対象から得られたサンプル中の、ＣＤ３＋ＣＤ４＋を含むＴ細胞集団を単離するステップと、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、又はＣＸＣＲ５＋を含む１種又は複数種のバイオマーカーに関して、このＴ細胞集団を試験するステップとを含み、このＴ細胞集団におけるバイオマーカーの有無、又は所定のレベルに対するこのＴ細胞集団におけるバイオマーカーのレベルが、この対象の自己免疫疾患の臨床転帰を示す、方法を含む。
【００１９】
[0029]本明細書で使用される場合、用語「自己免疫疾患」は、自己反応性細胞の存在及び／又は作用に基づくことが分かっているあらゆる疾患を指し得る。自己免疫疾患として下記が挙げられ得る：橋本甲状腺炎、グレーブス病、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、抗リン脂質抗体症候群−二次、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、強皮症、関節リウマチ、抗リン脂質抗体症候群−一次、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、多発性硬化症、重症筋無力症、若年性特発性関節炎、急性播種性脳脊髄炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、筋萎縮性側索硬化症、強直性脊椎炎、自己免疫心筋症、自己免疫溶血性貧血、自己免疫内耳疾患、自己免疫リンパ増殖性症候群、自己免疫末梢神経障害、自己免疫膵炎、自己免疫プロゲステロン皮膚炎、自己免疫多内分泌症候群、自己免疫血小板減少性紫斑病、自己免疫蕁麻疹、自己免疫ぶどう膜炎、ベーチェット病、セリアック病、寒冷凝集素症、クローン病、皮膚筋炎、Ｉ型糖尿病、好酸球性筋膜炎、胃腸類天疱瘡、グッドパスチャー症候群、ギラン・バレー症候群、橋本脳症、混合性結合組織病、モルフェア、ナルコレプシー、尋常性天疱瘡、多発性筋炎、原発性胆汁性肝硬変、再発性多発軟骨炎、乾癬、乾癬性関節炎、リウマチ熱、側頭動脈炎、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化結合組織疾患、血管炎、ウェゲナー肉芽腫症、又は当分野で既知のあらゆる既知の若しくは疑わしい自己免疫疾患。
【００２０】
[0030]本明細書で使用される場合、用語「対象」は、適応免疫反応系を有するあらゆる個体又は生物を指す。この対象はあらゆる顎口類又は有顎脊椎動物を含み得、好ましくは哺乳類を含み得、より好ましくはヒトを含み得る。様々な実施形態では、ヒトは０〜１５歳の若年者である。様々な実施形態では、この対象は、潜在的に自己免疫疾患に罹患している場合がある。様々な実施形態では、この対象は、この対象の徴候及び症状に基づいて自己免疫疾患と診断されている場合がある。様々な実施形態では、この対象は自己免疫疾患の処置を受けている場合がある。
【００２１】
[0031]Ｔ細胞集団を、当分野で既知の任意の手段により単離し得る。様々な実施形態では、このＴ細胞集団を、当分野で既知の富化及び／又は単離手段（例えば、抗体ろ過、フローサイトメトリー、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又は磁気ビーズ選別）を使用して生体サンプルから単離し得る。或いは、ＣＤ３＋を発現するＣＤ４＋Ｔ細胞が特定可能であるならば、当分野で既知の任意の富化及び／又は単離方法が適切であるだろう。
【００２２】
[0032]本明細書で使用される場合、用語「サンプル」は、上記で定義された対象から採取されたあらゆるサンプルを指す。サンプルの例として、この対象由来の組織、全血、血漿、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）滑液、単離滑液単核細胞（ＳＦＭＣ）、又は細胞が挙げられ得る。このサンプルを、既知の倫理的手順を経て得て、Ｔ細胞集団のような目的の特定の生体サンプルを抽出して必要に応じて単離すべきである。このサンプルを、新鮮なサンプルとしてすぐに使用し得るか、又はこのサンプルを最初に保存してもよい。サンプルを保存する場合には、理想的には、このサンプルは、新たに採取したサンプルと同等のままである。そのような保存方法は当分野で既知である。様々な実施形態では、このサンプルは体液サンプルであり、好ましくは血液サンプルである。様々な実施形態では、この生体サンプルは、ＰＢＭＣ又はＳＦＭＣ等の単核細胞を含む。
【００２３】
[0033]本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞集団におけるバイオマーカーのレベル」は、本明細書で使用されるＴ細胞の数に関連し、所定の参照値と比較した検出可能な増加又は減少に関する。様々な実施形態では、この所定の参照値は、健康対象の集団から単離されたＴ細胞から特定されたレベルであり得る。様々な実施形態では、この所定の参照値は、免疫疾患から回復している対象の集団から単離されたＴ細胞から特定されたレベルであり得る。様々な実施形態では、この所定の参照値は、特定のバイオマーカーシグネチャを含む総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の割合という観点で表され得る。様々な実施形態では、バイオマーカーの所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも０．５％である。様々な実施形態では、バイオマーカーの所定レベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも５％である。様々な実施形態では、バイオマーカーの所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも１０％である。様々な実施形態では、バイオマーカーの所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも２０％である。様々な実施形態では、バイオマーカーの所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも２５％である。様々な実施形態では、Ｔ細胞集団におけるバイオマーカーのレベルは、ある細胞タイプの別の細胞タイプに対する比に関連する。
【００２４】
[0034]本明細書で使用される場合、用語「臨床転帰」は、自己免疫疾患の診断を提供する当業者に既知のあらゆる徴候及び症状により検出される自己免疫疾患の有無を指し得る。様々な実施形態では、自己免疫疾患の存在は、自己免疫疾患の診断を提供するのに適したあらゆる徴候及び症状を対象が有する活動性自己免疫疾患と称され得る。様々な実施形態では、自己免疫疾患の不在は、自己免疫疾患の診断を提供するための徴候及び症状を対象が有しないか又は有するものの提供するには不十分である非活動性自己免疫疾患と称され得る。様々な実施形態では、この臨床転帰は、自己免疫疾患の再燃状態、活動性状態、又は非活動性状態を含む。
【００２５】
[0035]様々な実施形態では、本方法は、ＩＬ−６、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ１５２、ＰＤ１、ＦＹＮ、ＴＮＦＲＳＦ９  ＣＡＳＰ１、ＴＲＡＦ１、及びＩＫＢＫＥからなる群から選択される１種又は複数種の追加のバイオマーカーに関してＴ細胞集団を試験するステップをさらに含む。
【００２６】
[0036]様々な実施形態では、本方法は、ＣＤ４＋ＣＤ３＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞、又はＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＮＦＡ＋Ｔ細胞により発現される少なくとも１種の追加のバイオマーカーを決定するステップをさらに含み、この少なくとも１種の追加のバイオマーカーは、ＩＬ−６、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ１５２、ＰＤ１、ＦＹＮ、ＴＮＦＲＳＦ９  ＣＡＳＰ１、ＴＲＡＦ１、及びＩＫＢＫＥからなる群から任意選択に選択される。
【００２７】
[0037]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるＴ細胞集団におけるバイオマーカーＴＮＦ−アルファのレベル、及びＣＤ４５ＲＡの不在は、自己免疫疾患の再燃状態又は活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを超えるＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋Ｔ細胞集団は、自己免疫疾患の再燃状態又は活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋Ｔ細胞の所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも１０％である。様々な実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋Ｔ細胞の所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも２０％である。様々な実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋Ｔ細胞の所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも２５％である。
【００２８】
[0038]様々な実施形態では、所定のレベルを下回るＴ細胞集団におけるバイオマーカーＴＮＦ−アルファのレベルは、自己免疫疾患の非活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを下回るＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＮＦＡ＋Ｔ細胞集団は、自己免疫疾患の非活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＮＦＡ＋Ｔ細胞の所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の少なくとも１０％である。様々な実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＴＮＦＡ＋Ｔ細胞の所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも２０％である。
【００２９】
[0039]様々な実施形態では、所定のレベルを上回るＴ細胞集団におけるＦＹＮ、ＴＮＦＲＳＦ９  ＣＡＳＰ１、ＴＲＡＦ１、ＩＫＢＫＥ、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１つから選択される１種又は複数種のバイオマーカーの発現は、自己免疫疾患の非活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、ＦＹＮ、ＴＮＦＲＳＦ９  ＣＡＳＰ１、ＴＲＡＦ１、ＩＫＢＫＥ及びこれらの組み合わせの内のいずれか１つのｍＲＮＡレベルを測定する。上記の様々な実施形態では、発現の所定のレベルは、参照レベルと比べて少なくとも１．５倍高い。
【００３０】
[0040]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるＴ細胞集団におけるバイオマーカーＴＮＦ−アルファのレベル、ＣＤ４５ＲＡの不在、及び１種又は複数種のバイオマーカーＩＬ−６の存在は、再燃状態等の自己免疫疾患の拡大の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを超えるＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋Ｔ細胞集団は、自己免疫疾患の拡大の可能性を示す。様々な実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋Ｔ細胞の所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも０．５％である。様々な実施形態では、無症状疾患サブセットＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋ＰＤ１−ＣＤ１５２−の存在の検出は、最終的には明白な再燃が顕在化するであろうことを示す。
【００３１】
[0041]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるＴ細胞集団におけるバイオマーカーＣＸＣＲ５のレベル、及びＣＤ４５ＲＡの不在は、Ｂ細胞相互作用を介した記憶持続の増強による自己免疫疾患の再燃状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを超えるＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞集団は、自己免疫疾患の再燃状態又は活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞の所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも４％である。様々な実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞の所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも５％である。様々な実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞の所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも６％である。
【００３２】
[0042]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるＴ細胞集団におけるバイオマーカーＣＸＣＲ５＋のレベル、ＣＤ４５ＲＡの不在、及び１種又は複数種の追加のバイオマーカーＣＣＲ６＋の存在は、自己免疫疾患の活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを超えるＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞は、自己免疫疾患の活動性状態の可能性を示す。
【００３３】
[0043]様々な実施形態では、Ｔ細胞集団における１種又は複数種のバイオマーカーＣＤ１５２及び／又はＰＤ１の不在は、不適切な免疫チェックポイント制御に起因する自己免疫疾患の再燃状態の可能性をさらに示す。様々な実施形態では、Ｔ細胞集団におけるＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−ＰＤ１−、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−、又はＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−は、不適切な免疫チェックポイント制御に起因する自己免疫疾患の再燃状態の可能性を示す。様々な実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−ＰＤ１−細胞、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−細胞、又はＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−Ｔ細胞の所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも５％である。様々な実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−ＰＤ１−細胞、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−細胞、又はＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−Ｔ細胞の所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも１０％である。様々な実施形態では、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−ＰＤ１−細胞、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−細胞、又はＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−Ｔ細胞の所定のレベルは、総ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞集団の少なくとも２０％である。様々な実施形態では、炎症性ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−ＣＤ１５２−のサブセットの存在の検出は、活動性疾患が発生し得ることを示す。
【００３４】
[0044]様々な実施形態では、自己免疫疾患はリウマチ性疾患である。本明細書で使用される場合、用語「リウマチ性疾患」は結合組織障害を指し得る。様々な実施形態では、リウマチ性疾患として下記が挙げられ得る：全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、強皮症、関節リウマチ、若年性特発性関節炎、強直性脊椎炎、ベーチェット病、再発性多発軟骨炎、乾癬性関節炎、リウマチ熱、側頭動脈炎、痛風、炎症性関節炎、偽痛風、多発性筋炎、又は当分野で既知のあらゆる既知の若しくは疑わしい結合組織障害。
【００３５】
[0045]様々な実施形態では、このリウマチ性疾患は若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）又は関節リウマチである。
【００３６】
[0046]様々な実施形態では、この若年性特発性関節炎は多関節型ＪＩＡである。
【００３７】
[0047]様々な実施形態では、Ｔ細胞集団を、２種のサブセットである、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋を含む第１のサブセットとＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋を含む第２のサブセットとに分け、第１のサブセットの量及び第２のサブセットの量を決定し、第２のサブセットの量に対する第１のサブセットの量の比を算出し、所定の比に対するこの比は、対象の自己免疫疾患の臨床転帰を示す。
【００３８】
[0048]様々な実施形態では、この所定の比は、健康対象の集団から単離されたＴ細胞から特定された参照値である。ここでは、健康対象から単離されたＴ細胞を、２種のサブセットである、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋を含む第１の健康サブセットとＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋を含む第２の健康サブセットとに分け、第１の健康サブセットの量及び第２の健康サブセットの量を決定し、第２の健康サブセットの量に対する第１の健康サブセットの量の所定の比を算出する。様々な実施形態では、この所定の比は、免疫疾患から回復している対象から単離されたＴ細胞集団から特定された参照値である。ここでは、回復している対象から単離されたＴ細胞を、２種のサブセットである、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋を含む第１の回復サブセットとＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋を含む第２の回復サブセットとに分け、第１の回復サブセットの量及び第２の回復サブセットの量を決定し、第２の回復サブセットの量に対する第１の回復サブセットの量の所定の比を算出する。
【００３９】
[0049]この実施形態では、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋サブセットの比の反比例関係は、患者の明確で有意な分離を可能にするという利点を有する。この比は、免疫疾患から回復している対象から算出された所定の比と比較して、臨床転帰を評価するために非常に高い感度及び特異度を提供する。全体として、比の優れた結果は、臨床医が臨床決定をどのようにして管理し得るかにおいて、この持続的な病原性ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋サブセットの臨床予測有用性を支持する。
【００４０】
[0050]この研究は、臨床的に十分に特徴付けられた患者のコホートの収束と高次元プラットフォームＣｙＴｏＦの適用とにより、患者が治療中に疾患を持続するか又は消散させるかの理由を説明するのに役立った。
【００４１】
[0051]本発明の別の態様は、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬を服用している対象のリウマチ性疾患の臨床転帰を評価する方法であって、この対象から得られたサンプル中の、ＣＤ３＋ＣＤ４＋を含むＴ細胞集団を単離するステップと、ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ４５ＲＡ、又はＣＸＣＲ５＋を含むバイオマーカーに関して記憶Ｔ細胞集団を試験するステップとを含み、このＴ細胞集団におけるバイオマーカーの有無、又は所定のレベルに対するこのＴ細胞集団におけるバイオマーカーのレベルが、この対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の臨床転帰を示す、方法に関する。
【００４２】
[0052]本明細書で使用される場合、用語「リウマチ性疾患」は、本明細書において上記で定義されたような結合組織障害を指し得る。
【００４３】
[0053]本明細書で使用される場合、用語「生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬」又は「生物学的ＤＭＡＲＤ」は、あらゆるリウマチ性疾患を処置するために、軽減するために、又は和らげるために使用される治療レジメンを指し得る。様々な実施形態では、生物学的ＤＭＡＲＤとして、抗体、例えば、腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−ａ）に対する抗体、インターロイキン６（ＩＬ−６）に対する抗体、又は他の生物製剤が挙げられ得る。生物製剤として、ワクチン、血液又は血液成分、体細胞治療、遺伝子治療、組織、組換えタンパク質、生細胞、リウマチ性疾患を処置するために使用される治療用抗体等の医薬品が挙げられ得る。抗体は、あらゆるモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二機能性融合タンパク質、又は特定のエピトープ若しくはそのレセプターに付着して、このエピトープ若しくはそのレセプターの活性を中和し得るか又は停止させ得るあらゆる類似の構築物を指し得る。リウマチ性疾患を処置するために使用される生物製剤及び抗体の例として、下記が挙げられ得る：ベータインターフェロン、甲状腺補充剤、輸血、自己幹細胞（ａｎｔｉｌｏｇｏｕｓ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）移植、アダリムマブ、ＴＮＦレセプター２及びＩｇＧ１  Ｆｃ用のタンパク質の融合タンパク質（エタネルセプト（商標））、インフレキシマブ（ｉｎｆｌｅｘｉｍａｂ）、セルトリズマブ、ゴリムマブ、リツキシマブ、アバタセプト、アナキンラ、トシリズマブ、ムロノマブ（ｍｕｒｏｎｏｍａｂ）、アブシキシマブ、ダクリズマブ、バシリマブ（ｂａｓｉｌｉｍａｂ）、オマリズマブ、エファリズマブ、ナタリズマブ、セルトリズマブペゴル、ウステキヌマブ（ｕｓｔｅｒｋｉｎｕｍａｂ）、ベリムマブ、クレノリキシマブ（ｃｌｅｎｏｉｘｉｍａｂ）、ケリキシマブ、プリリキシマブ（ｐｒｉｌｉｘｉｍａｂ）、テネリキシマブ（ｔｅｎｅｌｉｘｉｍａｂ）、バパリキシマブ（ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、イバリズマブ（ｉｂａｌｉｚｕｍａｂ）、アセリズマブ（ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、アポリズマブ、ベンラリズマブ、セデリズマブ（ｃｅｄｅｌｉｚｕｍａｂ）、エクリズマブ、エプラツズマブ、エルリズマブ（ｅｒｌｉｚｕｍａｂ）、フォントリズマブ、メポリズマブ、オクレリズマブ、パスコリズマブ（ｐａｓｃｏｌｉｚｕｍａｂ）、パキセリズマブ、レスリズマブ、ロンタリズマブ（ｒｏｎｔａｌｉｚｕｍａｂ）、ロベリズマブ（ｒｏｖｅｌｉｚｕｍａｂ）、ルピズマブ（ｒｕｐｉｚｕｍａｂ）、シプリズマブ、タリズマブ、テプリズマブ、トシリズマブ、トラリズマブ（ｔｏｒａｌｉｚｕｍａｂ）、ベドリズマブ、又はビジリズマブ。
【００４４】
[0054]様々な実施形態では、この生物製剤又は抗体はＴＮＦａを阻害する。ＴＮＦａを阻害する抗体又は生物製剤の例として、アダリムマブ、ＴＮＦレセプター２及びＩｇＧ１  Ｆｃ用のタンパク質の融合タンパク質（エタネルセプト（商標））、インフレキシマブ、セルトリズマブ、並びにゴリムマブが挙げられる。しかしながら、これらの実施形態では、ＴＮＦａに付着し、ＴＮＦａのそのレセプターへの結合を阻害し得るあらゆる抗体が企図される。様々な実施形態では、本治療レジメンは、メトトレキサート及び／又はプレドニゾロンの投与を含む。様々な実施形態では、この治療レジメンは、ＴＮＦａを阻害する抗体、及び／又はメトトレキサート、及び／又はプレドニゾロンの投与を含む。様々な実施形態では、生物学的ＤＭＡＲＤは、ＴＮＦａを阻害する抗体、及び／又はメトトレキサートを含む。
【００４５】
[0055]リウマチ性疾患から回復していると思われる対象が、服用しているＤＭＡＲＤ治療レジメンが中止されても寛解の状態であり続けるかどうかを評価し得るか又は決定し得るという利点は大きい。処置を依然として必要とする患者又は対象のみに、ＤＭＡＲＤの服用のあらゆる副作用のリスクがあるだろう。寛解の状態である患者及び寛解の状態であるだろう患者は、早期にＤＭＡＲＤ処置を中止し得る。これにより、ＤＭＡＲＤをもはや必要としない患者における長期にわたる薬物使用の副作用が最小限に抑えられる。
【００４６】
[0056]様々な実施形態では、対象は、３回超の連続した診察でリウマチ性疾患の徴候又は症状を有しないと評価される場合には、リウマチ性疾患から回復していると思われる。
【００４７】
[0057]様々な実施形態では、臨床転帰は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合に少なくとも１年以内であるか又は少なくとも８ヶ月以内である。
【００４８】
[0058]様々な実施形態では、本方法は、ＩＬ−６、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ１５２、ＰＤ１、ＦＹＮ、ＴＮＦＲＳＦ９  ＣＡＳＰ１、ＴＲＡＦ１、及びＩＫＢＫＥからなる群から選択される１種又は複数種のバイオマーカーに関してＴ細胞集団を試験するステップをさらに含む。
【００４９】
[0059]様々な実施形態では、臨床転帰は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合にリウマチ性疾患の再燃状態又は非活動性状態を含む。
【００５０】
[0060]様々な実施形態では、臨床転帰は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の再燃状態を含み、この対象は、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用の停止から少なくとも１年以内に又は少なくとも８ヶ月以内にリウマチ性疾患の再燃又は活発な徴候若しくは症状に遭遇する可能性がある。対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合に、この対象が再燃状態を有する可能性があるという結果に基づいて、臨床医は、そのときに、この対象の生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬による処置を中止しないという選択をし得る。
【００５１】
[0061]様々な実施形態では、臨床転帰は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の非活動性状態を含み、この対象は、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用の停止から少なくとも１年以内に又は少なくとも８ヶ月以内にリウマチ性疾患の徴候又は症状を有しないはずである。非活動性状態の臨床転帰を有すると評価された対象は寛解していると見なされ、臨床医は、この対象の生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬による処置を中止するという選択をし得る。
【００５２】
[0062]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるＴ細胞集団におけるバイオマーカーＴＮＦ−アルファのレベル、及びＣＤ４５ＲＡの不在は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のリウマチ性疾患の再燃状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを超えるＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋Ｔ細胞集団は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のリウマチ性疾患の再燃状態の可能性を示す。
【００５３】
[0063]様々な実施形態では、所定のレベルを下回るＴ細胞集団におけるバイオマーカーＴＮＦ−アルファのレベルは、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のリウマチ性疾患の非活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを下回るＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋Ｔ細胞集団は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のリウマチ性疾患の非活動性状態の可能性を示す。この場合には、この対象を、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止すると評価し得る。
【００５４】
[0064]様々な実施形態では、所定のレベルを超える、ＦＹＮ、ＴＮＦＲＳＦ９  ＣＡＳＰ１、ＴＲＡＦ１、ＩＫＢＫＥ、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１つから選択される１種又は複数種のバイオマーカーの発現は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のリウマチ性疾患の非活動性状態の可能性を示す。様々な実施形態では、ＦＹＮ、ＴＮＦＲＳＦ９  ＣＡＳＰ１、ＴＲＡＦ１、ＩＫＢＫＥ、及びこれらの組み合わせの内のいずれか１つのｍＲＮＡレベルを測定し、参照レベルと比べて少なくとも１．５倍高い発現の所定のレベルを超えるｍＲＮＡの量は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のリウマチ性疾患の非活動性状態の可能性を示す。この場合には、この対象を、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止すると評価し得る。
【００５５】
[0065]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるＴ細胞集団におけるバイオマーカーＣＸＣＲ５＋のレベル、及びＴ細胞集団上でのＣＤ４５ＲＡの不在は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のＢ細胞相互作用を介した記憶持続の増強によるリウマチ性疾患の再燃状態の可能性を示す。様々な実施形態では、所定のレベルを超えるＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞集団は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合のＢ細胞相互作用を介した記憶持続の増強によるリウマチ性疾患の再燃状態の可能性を示す。
【００５６】
[0066]様々な実施形態では、所定のレベルを超えるＴ細胞集団上でのバイオマーカーＴＮＦ−アルファのレベル、Ｔ細胞集団上でのＣＤ４５ＲＡの不在、及びＴ細胞集団上での１種又は複数種のバイオマーカーＣＤ１５２又はＰＤ１の不在は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の不適切な免疫チェックポイント制御に起因する疾患の再燃状態の可能性を示す。様々な実施形態では、Ｔ細胞集団におけるＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−ＰＤ１−、ＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２−、又はＣＤ４＋ＣＤ３＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−は、対象が生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬の服用を停止する場合の不適切な免疫チェックポイント制御に起因する疾患の再燃状態の可能性を示す。
【００５７】
[0067]様々な実施形態では、この生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬は抗ＴＮＦアルファ療法である。様々な実施形態では、この抗ＴＮＦアルファ療法として、アダリムマブ、ＴＮＦレセプター２及びＩｇＧ１  Ｆｃ用のタンパク質の融合タンパク質（エタネルセプト（商標））、アダリムマブ、インフレキシマブ、セルトリズマブ、並びにゴリムマブが挙げられ得る。
【００５８】
[0068]様々な実施形態では、この抗ＴＮＦアルファ療法は、任意選択でメトトレキサートとの組み合わせで、ＴＮＦレセプター２及びＩｇＧ１  Ｆｃ用のタンパク質の融合タンパク質（エタネルセプト（商標））、ＴＮＦアルファ抗体、アダリムマブ、並びにインフレキシマブからなる群から選択される。
【００５９】
[0069]様々な実施形態では、リウマチ性疾患は関節リウマチである。
【００６０】
[0070]様々な実施形態では、このリウマチ性疾患は若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）である。様々な実施形態では、この若年性特発性関節炎は多関節型ＪＩＡである。
【００６１】
[0071]様々な実施形態では、サンプルは血液サンプルであり、この血液サンプルは、対象からの組織、全血、血漿、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）滑液、単離滑液単核細胞（ＳＦＭＣ）、又は細胞を含み得、好ましくは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプルを含み得る。様々な実施形態では、このサンプルは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）サンプルである。このサンプルを、新鮮なサンプルとしてすぐに使用し得るか、又はこのサンプルを最初に保存してもよい。生体サンプルを保存する場合には、理想的には、この生体サンプルは、新たに採取したサンプルと同等のままである。そのような保存方法は当分野で既知である。様々な実施形態では、この生体サンプルは体液サンプルであり、好ましくは血液サンプルである。様々な実施形態では、この生体サンプルは、ＰＢＭＣ又はＳＦＭＣ等の単核細胞を含む。
【００６２】
[0072]様々な実施形態では、このサンプルを、非活動性疾患を有すると思われる、生物学的疾患修飾性抗リウマチ薬を服用している対象から採取する。様々な実施形態では、対象は、３回超の連続した診察でリウマチ性疾患の徴候又は症状を有しないと評価される場合には、非活動性疾患を有するか又はリウマチ性疾患から回復していると思われる。
【００６３】
[0073]様々な実施形態では、Ｔ細胞集団を、２種のサブセットである、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋を含む第１のサブセットとＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋を含む第２のサブセットとに分け、第１のサブセットの量及び第２のサブセットの量を決定し、第２のサブセットの量に対する第１のサブセットの量の比を算出し、所定の比に対するこの比は、対象のリウマチ性疾患の臨床転帰を示す。
【００６４】
[0074]様々な実施形態では、この所定の比は、健康対象の集団から単離されたＴ細胞から特定された参照値である。ここでは、健康対象から単離されたＴ細胞を、２種のサブセットである、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋を含む第１の健康サブセットとＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋を含む第２の健康サブセットとに分け、第１の健康サブセットの量及び第２の健康サブセットの量を決定し、第２の健康サブセットの量に対する第１の健康サブセットの量の所定の比を算出する。様々な実施形態では、この所定の比は、免疫疾患から回復している対象から単離されたＴ細胞集団から特定された参照値である。ここでは、回復している対象から単離されたＴ細胞を、２種のサブセットである、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋を含む第１の回復サブセットとＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋を含む第２の回復サブセットとに分け、第１の回復サブセットの量及び第２の回復サブセットの量を決定し、第２の回復サブセットの量に対する第１の回復サブセットの量の所定の比を算出する。
【００６５】
[0075]この実施形態では、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋サブセットの比の反比例関係は、患者の明確で有意な分離を可能にするという利点を有する。この比は、免疫疾患から回復している対象から算出された所定の比と比較して、臨床転帰を評価するために非常に高い感度及び特異度を提供する。全体として、比の優れた結果は、臨床医がＤＭＡＲＤ中止決定をどのように管理し得るかにおいて、この持続的な病原性ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋サブセットの臨床予測有用性を支持する。
【００６６】
[0076]様々な実施形態では、本方法は、サンプルを、Ｔ細胞集団のバイオマーカー、又は１種若しくは複数種の追加のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも１種の抗体に曝露するステップを含む。様々な実施形態では、この方法は、サンプルを、Ｔ細胞集団のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも１種の抗体、又は１種若しくは複数種の追加のバイオマーカーを標的とするように適応されているプライマーに曝露するステップを含む。様々な実施形態では、この方法は、サンプルを、Ｔ細胞集団のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも１種の抗体と、１種又は複数種の追加のバイオマーカーを標的とするのに適合されているプライマー又は抗体とに曝露するステップとを含む。
【００６７】
[0077]様々な実施形態では、この少なくとも１種の抗体は重金属結合抗体である。
【００６８】
[0078]様々な実施形態では、この方法は、タイムオブフライトによるサイトメトリ（Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｂｙ  Ｔｉｍｅ−Ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ）（ＣｙＴｏＦ）を利用してサンプルを分析するステップを含む。
【００６９】
[0079]様々な実施形態では、この方法は、サンプルを、１種又は複数種の追加のバイオマーカーを標的とするように適応されているプライマーに曝露するステップを含む。
【００７０】
[0080]様々な実施形態では、この方法はインビトロでの方法である。
【００７１】
[0081]非活動性のままであるＪＩＡ患者におけるＣＤ４記憶細胞ｍＲＮＡのプロファイリングによっても、疾患の消散で役割を果たすいくつかの遺伝子の存在が明らかになる。持続性のＣＤ４記憶サブセットを使用して、治療中止前に患者の最終的な臨床的運命を予測した。
【００７２】
[0082]本発明の別の態様は、対象の免疫疾患の臨床転帰を評価するためのキットであって、この対象から得られたサンプル中の、Ｔ細胞集団上の少なくとも１種のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも１種の抗体であり、この少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、ＣＸＣＲ５、ＩＬ−６、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる群から選択される、抗体と、この対象の自己免疫疾患の臨床転帰の予測での使用のための、このＴ細胞集団におけるバイオマーカーの所定のレベルとを含むキットを含む。
【００７３】
[0083]様々な実施形態では、この少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ４５ＲＡを含むか、又はＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ４５ＲＡからなる。様々な実施形態では、この少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、及びＴＮＦ−アルファを含むか、又はＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、及びＴＮＦ−アルファからなる。様々な実施形態では、この少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＸＣＲ５を含むか、又はＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、及びＣＸＣＲ５からなる。様々な実施形態では、この少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、及びＣＸＣＲ５を含むか、又はＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、及びＣＸＣＲ５からなる。様々な実施形態では、この少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、及びＩＬ−６を含むか、又はＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、及びＩＬ−６からなる。様々な実施形態では、この少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ１５２、及びＰＤ１を含むか、又はＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる。様々な実施形態では、この少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＸＣＲ５、及びＣＣＲ６を含むか、又はＣＤ３、ＣＤ４、ＣＸＣＲ５、及びＣＣＲ６からなる。様々な実施形態では、この少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ  ＣＸＣＲ５、ＩＬ−６、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１を含むか、又は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ  ＣＸＣＲ５、ＩＬ−６、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる。
【００７４】
[0084]様々な実施形態では、ＣＤ３抗体は重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＧＹＧＭＨ（配列番号１）、ＶＩＷＹＤＧＳＫＫＹＹＶＤＳＶＫＧ（配列番号２）、ＱＭＧＹＷＨＦＤＬ（配列番号３）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖ＣＤＲは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＹＬＡ（配列番号４）、ＤＡＳＮＲＡＴ（配列番号５）、ＱＱＲＳＮＷＰＰＬＴ（配列番号６）のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このＣＤ３抗体は、市販の抗体等のＣＤ３に結合するあらゆる既知の抗体である。
【００７５】
[0085]様々な実施形態では、ＣＤ４（好ましくはヒトＣＤ４抗原）に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＬＡＳＥＤＩＹＳＤＬＡ（配列番号７）、ＮＴＤＴＬＱＮ（配列番号８）、及びＱＱＹＮＮＹＰＷＴ（配列番号９）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖ＣＤＲは、ＮＹＧＭＡ（配列番号１０）、ＴＩＳＨＤＧＳＤＴＹＦＲＤＳＶＫＧ（配列番号１１）、及びＱＧＴＩＡＧＩＲＨ（配列番号１２）のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このＣＤ４抗体は、市販の抗体等のＣＤ４に結合するあらゆる既知の抗体である。
【００７６】
[0086]様々な実施形態では、ＣＤ４５ＲＡ（好ましくはヒトＣＤ４５ＲＡ抗原）に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＮＹＩＩＨ（配列番号１３）、ＹＦＮＰＹＮＨＧＴＫＹＮＥＫＦＫＧ（配列番号１４）、及びＳＧＰＹＡＷＦＤＴ（配列番号１５）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖ＣＤＲは、ＲＡＳＱＮＩＧＴＳＩＱ（配列番号１６）、ＳＳＳＥＳＩＳ（配列番号１７）、及びＱＱＳＮＴＷＰＦＴ（配列番号１８）のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このＣＤ４５ＲＡ抗体は、市販の抗体等のＣＤ４５ＲＡに結合するあらゆる既知の抗体である。
【００７７】
[0087]様々な実施形態では、ＴＮＦ−アルファ（好ましくはヒトＴＮＦ−アルファ抗原）に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＮＹＷＭＮ（配列番号１９）、ＥＶＲＬＱＳＤＮＦＴＴＳＨＹＡＥＳＶＫＧ（配列番号２０）、及びＰＦＡＹ（配列番号２１）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖ＣＤＲは、ＳＡＳＳＳＶＳＦＭＹ（配列番号２２）、ＤＡＳＩＬＡＳ（配列番号２３）、及びＱＱＷＳＤＹＳＰＲＴ（配列番号２４）のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このＴＮＦ−アルファ抗体は、市販の抗体等のＴＮＦ−アルファに結合するあらゆる既知の抗体である。
【００７８】
[0088]様々な実施形態では、ＣＸＣＲ５（好ましくはヒトＣＸＣＲ５抗原）に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＧＦＳＬＩＤＹＧＶＮ（配列番号２５）、ＶＩＷＧＤＧＴＴＹ（配列番号２６）、及びＩＶＹ（配列番号２７）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖ＣＤＲは、ＲＳＳＫＳＬＬＨＳＳＧＫＴＹＬＹ（配列番号２８）、ＲｌＳＮＬＡＳ（配列番号２９）、及びＭＱＨＬＥＹＰＹＴ（配列番号３０）のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このＣＸＣＲ５抗体は、市販の抗体等のＣＸＣＲ５に結合するあらゆる既知の抗体である。
【００７９】
[0089]様々な実施形態では、ＩＬ−６（好ましくはヒトＩＬ−６抗原）に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＧＥＮＦＮＤＹＦＭＮ（配列番号３１）、ＱＭＲＮＫＮＹＱＹＧＴＹＹＡＥＳＬＥＧ（配列番号３２）、及びＥＳＹＹＧＦＴＳＹ（配列番号３３）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖ＣＤＲは、ＱＡＳＱＤＩＧＩＳＬＳ（配列番号３４）、ＮＡＮＮＬＡＤ（配列番号３５）、及びＱＨＮＳＡＰＹＴ（配列番号３６）のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このＩＬ−６抗体は、市販の抗体等のＩＬ−６に結合するあらゆる既知の抗体である。
【００８０】
[0090]様々な実施形態では、ＩＦＮ−ｇ（好ましくはヒトＩＦＮ−ｇ抗原）に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＳＹＡＭＳ（配列番号３７）、ＡＩＳＧＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３８）、及びＤＧＳＳＧＷＹＶＰＨＷＦＤＰ（配列番号３９）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖ＣＤＲは、ＴＲＳＳＧＳＩＡＳＮＹＶＱ（配列番号４０）、ＥＤＮＱＲＰＳ（配列番号４１）、及びＱＳＹＤＧＳＮＲＷＭ（配列番号４２）のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このＩＮＦ−ｇ抗体は、市販の抗体等のＩＦＮ−ｇに結合するあらゆる既知の抗体である。
【００８１】
[0091]様々な実施形態では、ＩＬ−２１（好ましくはヒトＩＬ−２１抗原）に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＷＭＨ（配列番号４３）、ＬＩＤＴＳＤＶＹＴＩＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号４４）、及びＡＲＹＧＰＬＡＭＤＹ（配列番号４５）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖ＣＤＲは、ＲＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮ（配列番号４６）、ＹＹＴＳＲＬＨＳ（配列番号４７）、及びＱＱＦＨＴＬＲＴ（配列番号４８）のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このＩＬ−２１抗体は、市販の抗体等のＩＬ−２１に結合するあらゆる既知の抗体である。
【００８２】
[0092]様々な実施形態では、ＣＸＣＲ３（好ましくはヒトＣＸＣＲ３抗原）に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＮＹＭＡＳ（配列番号４９）、ＴＩＳＳＧＧＧＹＴＹＹＰＤＳＬＫＧ（配列番号５０）、及びＨＧＡＰＭＴＴＶＩＴＹＡＰＹＹＦ（配列番号５１）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖ＣＤＲは、ＲＡＳＳＳＶＫＹＭＹ（配列番号５２）、ＹＴＳＮＬＡＰ（配列番号５３）、及びＱＱＦＴＴＳＰＹＴ（配列番号５４）のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このＣＸＣＲ３抗体は、市販の抗体等のＣＸＣＲ３に結合するあらゆる既知の抗体である。
【００８３】
[0093]様々な実施形態では、ＣＣＲ６（好ましくはヒトＣＣＲ６抗原）に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＦＩＦＴＴＹＹＭＳＷＶＲ（配列番号５５）、ＶＳＮＩＡＡＧＧＡＴＤＹＡＤＳ（配列番号５６）、及びＣＡＲＧＰＷＧＲＹＨＰＭＧＦＤＹＷＧＱ（配列番号５７）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖ＣＤＲは、ＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡ（配列番号５８）、ＧＡＳＳＲＡＴ（配列番号５９）、及びＣＱＱＡＹＹＳＰＶＴＦＧＱ（配列番号６０）のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このＣＣＲ６抗体は、市販の抗体等のＣＣＲ６に結合するあらゆる既知の抗体である。
【００８４】
[0094]様々な実施形態では、ＣＤ１５２（好ましくはヒトＣＤ１５２抗原）に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＦＳＬＳＤＹＧＶＨ（配列番号６１）、ＶＩＷＡＧＧＧＴＮＹＮＳＡＬＭＳ（配列番号６２）、及びＧＹＳＳＴＳＦ（配列番号６３）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖ＣＤＲは、ＲＡＳＥＳＶＥＹＹＶＴＳＬ（配列番号６４）、ＡＡＳＮＶＥＳ（配列番号６５）、及びＱＱＳＲＫＶＰＹ（配列番号６６）のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このＣＤ１５２抗体は、市販の抗体等のＣＤ１５２に結合するあらゆる既知の抗体である。
【００８５】
[0095]様々な実施形態では、ＰＤ１（好ましくはヒトＰＤ１抗原）に結合し得る抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＧＹＴＦＴＴＹＹＬＹ（配列番号６７）、ＧＩＮＰＳＮＧＧＴＮＦＮＥＫＦ（配列番号６８）、及びＲＤＹＲＹＤＲＧ（配列番号６９）からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。軽鎖ＣＤＲは、ＲＡＳＫＳＶＳＴＳＧＦＮＹＩＨ（配列番号７０）、ＬＡＳＮＬＥＳ（配列番号７１）、及びＱＨＳＲＥＬＰＬＴ（配列番号７２）のアミノ酸配列からなる群から選択される配列と少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％、又はより高く同一のアミノ酸配列を含むことが好ましい。様々な実施形態では、このＰＤ１抗体は、市販の抗体等のＰＤ１に結合するあらゆる既知の抗体である。
【００８６】
[0096]様々な実施形態では、少なくとも１種の抗体は重金属結合抗体である。
【００８７】
[0097]様々な実施形態では、本キットは、ＦＹＮ、ＴＲＡＦ１、ＴＮＦＲＳＦ９、ＩＫＢＫＥ、又はＣＡＳＰ１の発現を検出するためのプライマーをさらに含む。
【００８８】
[0098]様々な実施形態では、ＦＹＮ用のプライマーは、フォワードプライマーＧＣＣＧＣＣＴＡＧＴＡＧＴＴＣＣＣＴＧＴ（配列番号７３）とリバースプライマーＣＴＴＣＡＴＧＡＴＣＴＧＣＧＣＴＴＣＣＴ（配列番号７４）とを含む。様々な実施形態では、ＦＹＮ用の当分野で既知のあらゆるプライマーが適切であり得る。
【００８９】
[0099]様々な実施形態では、ＴＲＡＦ１用のプライマーは、フォワードプライマーＣＡＣＴＧＣＣＡＡＧＴＡＴＧＧＴＴＡＣＡＡＧＴ（配列番号７５）とリバースプライマーＧＧＴＴＧＴＴＣＴＧＧＴＣＡＡＧＴＡＧＣＡＴ（配列番号７６）とを含む。様々な実施形態では、ＴＲＡＦ１用の当分野で既知のあらゆるプライマーが適切であり得る。
【００９０】
[00100]様々な実施形態では、ＴＮＦＲＳＦ９用のプライマーは、フォワードプライマーＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ（配列番号７７）とリバースプライマーＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ（配列番号７８）とを含む。様々な実施形態では、ＴＮＦＲＳＦ９用の当分野で既知のあらゆるプライマーが適切であり得る。
【００９１】
[00101]様々な実施形態では、ＩＫＢＫＥ用のプライマーは、フォワードプライマーＣＡＧＧＧＣＴＴＧＧＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧ（配列番号７９）とリバースプライマーＧＡＴＧＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＴＧＣ（配列番号８０）とを含む。様々な実施形態では、ＩＫＢＫＥ用の当分野で既知のあらゆるプライマーが適切であり得る。
【００９２】
[00102]様々な実施形態では、ＣＡＳＰ１用のプライマーは、フォワードプライマーＡＣＡＡＧＧＣＡＣＧＧＧＡＣＣＴＡＴＧ（配列番号８１）とリバースプライマーＴＣＣＣＡＧＴＣＡＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＧ（配列番号８２）とを含む。様々な実施形態では、ＣＡＳＰ１用の当分野で既知のあらゆるプライマーが適切であり得る。
【００９３】
[00103]当業者により理解されるように、実施形態を、他の各実施形態又はいくつかの実施形態と組み合わせて使用してもよい。
【００９４】
[00104]別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本明細書の主題が属する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で使用される場合、本発明の理解を容易にするために下記の定義が提供される。
【００９５】
[00105]この文書全体を通して、別途反対のことが示されない限り、用語「含む」、「からなる」、「有する」、及び同類のものは、非包括的と解釈すべきであり、換言すると、「含むが限定されない」という意味と解釈すべきである。
【００９６】
[00106]さらに、本明細書全体を通して、別途文脈が必要としない限り、単語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」若しくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等のバリエーションは、示された整数又は整数の群を含むがあらゆる他の整数又は整数の群を排除しないことを暗示すると理解されるだろう。
【００９７】
[00107]本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」及び「ｔｈｅ」は、別途文脈が明確に指示しない限り、複数の参照を含む。
【実施例】
【００９８】
[00108]
実施例１  多関節型ＪＩＡ患者コホート、及び研究デザイン
[00109]多関節型ＪＩＡ患者の相当な割合が、抗ＴＮＦＡ生物製剤による治療的臨床制御を達成しているにもかかわらず、疾患の無症状の持続を経験し続けている。特定のＪＩＡ患者が持続的な無症状疾患に直面し、且つ治療中止時に最終的に再発する理由を理解することを目的として、臨床試験（ＪＩＡにおける抗ＴＮＦ処置の安全な中止の予測因子の決定）を設計した。抗ＴＮＦ生物製剤（エタネルセプト、アダリムマブ、又はインフリキシマブ）により処置されたＪＩＡ患者を、６ヶ月の期間にわたり非活動性疾患を有することが証明され、且つ臨床的非活動性（Ｗａｌｌａｃｅ基準）が来診で少なくとも３回連続して証明された場合に、この試験に採用し、その後、８ヶ月の持続期間にわたり治療を中止した（表１）。
【００９９】
【表１】
2020523583.tif 000003
【０１００】
[00110]表１．ＪＩＡ患者及び健康コントロールに関する人口構成及び薬物療法コースの履歴。ＪＩＡ患者を、少なくとも６ヶ月にわたり、同時のメトトレキサートの併用あり／なしの抗ＴＮＦＡ薬物療法（エタネルセプト、アダリムマブ、又はインフリキシマブ）を施し、非活動性疾患であることが証明され（Ｗａｌｌａｃｅ基準）、抗ＴＮＦＡを中止した。ＪＩＡ患者を、再燃又は非活動性のいずれかにスコア化した。炎症性疾患がない健康な非疾患コントロールを、日帰り手術から採用した。
【０１０１】
[00111]研究デザイン
[00112]この研究の目的は、特定のＪＩＡ患者が既に治療的制御を達成しているにもかかわらず、治療中止時に再発する理由を特定することである。ＰＢＭＣサンプルを、試験「ＪＩＡにおける抗ＴＮＦ処置の安全な中止の予測因子の決定（Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｓａｆｅ  Ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ＴＮＦ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ＪＩＡ）」（ＩＤ：ＮＣＴ００７９２２３３）で採用した４８例の無作為に選択された多関節型ＪＩＡ患者から使用した。この研究は、治験審査委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）を通じて承認され、全ての参加者からの告知に基づく同意書／承諾書のいずれかを満たす必要があった。患者を抗ＴＮＦＡ生物製剤で処置し、６ヶ月にわたり非活動性疾患を有すると決定した（３回連続の来診により検証した）。疾患の非活動性は、下記のＷａｌｌａｃｅ基準により定義されている通りである：（ａ）活動性関節の不在、（ｂ）ＪＩＡに起因する発熱、発疹、漿膜炎の欠如、（ｃ）活動性ぶどう膜炎なし、（ｄ）ＪＩＡに起因しない限りＥＳＲの正常な範囲内、（ｅ）≦０．５リッカート様スケールの医師による全体的な疾患活動性（ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  ｇｌｏｂａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、及び（ｆ）朝の硬直の持続期間≦１５分。疾患の非活動性が証明されると、患者はこの試験に参加し、その後、８ヶ月の持続期間（Ｔｏと定義される中止の開始）にわたり治療を中止した（Ｔｅｎｄと定義される中止の終了）。ＰＢＭＣを、治療中止前の患者（Ｔｏ）と治療終止後の患者（Ｔｅｎｄ）とから得る。この試験の終了時の患者を、下記の６つの中心的なＪＩＡパラメータに応じて、再燃個体（ｎ＝２４）又は非活動性個体（ｎ＝２４）のいずれかに指定した：（ａ）活動性関節の数、（ｂ）動きを喪失した関節の数、（ｃ）現在の疾患活動性に関する医師による全体的評価（リッカート様スケール）、（ｄ）前週での全体的な疾患重症度に関する患者／親による全体的評価（リッカート様スケール）、（ｅ）身体機能の検証された測定（ＣＨＡＱ）、及び（ｆ）ＥＳＲ。対象患者が６つのＪＩＡ中心的パラメータの内の３つ以上で少なくとも３０％悪化を示し、且つ１つ超が＞３０％改善されない場合には、この患者を再燃と見なした。年齢が一致する健康コントロールに関して、ＫＫ  Ｗｏｍｅｎ'ｓ  ａｎｄ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ（ＰＲＩＰ）研究からのＰＢＭＣを使用した。炎症の徴候がない１７例の健康な（非ＪＩＡ）小児コントロールのコホートを、日帰り手術を予定している患者から、手術前に（静脈内プラグのセッティング中に）告知に基づく同意／承諾と共に採用した。４組のＪＩＡ患者からのＰＢＭＣを使用し、全員を、ＫＫ  Ｗｏｍｅｎ'ｓ  ａｎｄ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌにおける研究「ヒト関節炎における治療に対する反応性を理解して予想するための精密医療アプローチ（Ａ  ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ  ａｎｄ  ｐｒｅｄｉｃｔ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｔｏ  ｔｈｅｒ��ｐｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ）」を通して告知に基づく同意／承諾と共に採用した。これらの活動性ＪＩＡ患者は、最初は抗ＴＮＦＡ生物製剤に対して処置未経験（処置前）であり、抗ＴＮＦＡ生物製剤による６ヶ月の持続期間の後、活動性関節の完全な不在より処置に対する最近の感受性を反映する（処置後）。
【０１０２】
[00113]ＰＢＭＣの単離及び凍結保存
[00114]血液をＥＤＴＡチューブ中に吸引して凝固を防ぎ、室温で輸送して２４時間以内に処理した。ＰＢＭＣを、製造業者の指示の下でＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）又はＦｉｃｏｌｌ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により、密度勾配遠心分離によって単離した。細胞を９０体積／体積％ＦＢＳ、１０体積／体積％ＤＭＳＯに再懸濁させ、長期保存のために液体窒素で凍結させる。
【０１０３】
[00115]循環免疫細胞（ＰＢＭＣ）を、中止の開始時（Ｔｏ）及び試験の終了時の治療の中止後（Ｔｅｎｄ）に患者から得た。４８例の多関節型ＪＩＡ患者をスコア化し、これらの患者の臨床的運命（表２）を、下記の６つの中心的な疾患パラメータに応じて再燃（ｎ＝２４）又は非活動性（ｎ＝２４）のいずれかに分類した：（ａ）活動性関節炎を有する関節の数、（ｂ）動きの喪失、（ｃ）現在の疾患活動性に関する医師による全体的評価、（ｄ）前週での全体的な疾患重症度に関する患者／親による全体的評価、（ｅ）身体機能の検証された測定、及び（ｆ）ＥＳＲ。
【０１０４】
[00116]表２．再燃及び非活動性への分類に使用されるＪＩＡ患者のスコアリングマトリックス。患者は疾患の非活動性に関して最初にスコア化され（Ｗａｌｌａｃｅ基準）、疾患の活動性を示す場合には、続いて再燃に関してスコア化されることに留意されたい。
【０１０５】
【表２】
2020523583.tif 000004
【０１０６】
[00117]炎症性疾患のない健康な（非ＪＩＡ）小児コントロールの別個のコホート（ｎ＝１７）も、日帰り手術を予定している患者から手術前に（静脈内プラグのセッティング中に）採用した。採用された再燃ＪＩＡ患者は、非活動性患者と比較して、試験前に非活動性疾患が維持される月数（再燃＝２１．４±３９．８、非活動性＝２８．６±２９．８、ｐ＝０．１１２３）に有意差はなく（図１Ｄ）、両方のカテゴリーは生物製剤治療と同様の事前の臨床的寛解制御を有したことを示す。特に成人関節リウマチでは、生物製剤による早期の積極的な処置が現在提唱されていることから、処置前の患者の疾患の持続期間（２０、２１）も調べた。実際には、再燃患者は治療前の非活動性患者と比較して疾患の持続期間が長かった（再燃＝９０．３±６３．７、非活動性＝５４．４±２９．３ヶ月、ｐ＜０．０５、図１Ｅ）が、但し、このパラメータ単独では、治療中止時の再燃に関する予測の程度はわずかである（ＡＵＣ＝０．６７１、図１Ｆ）。試験を実施して、ＪＩＡ患者のサブセットが、治療的制御を達成したにもかかわらず疾患を消散できず、最終的には治療中止時に再燃した理由を調べた。
【０１０７】
[00118]
実施例２：ＣＤ４コンパートメントの調査
[00119]循環ＰＢＭＣ集団を、ＣＤ４  Ｔ細胞コンパートメントを調べるための標的から主になる３１種の機能マーカー及び６種の系統マーカーパネル（表３）を有する高次元の単一細胞分解能プラットフォーム（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）ＣｙＴｏＦにより調べた。サンプルのバーコーディングの使用により染色を実施し、マスターミックスによる一貫した染色のための個体のプール化を容易にした。ＦＣＳデータ強度をＥＱビーズで正規化し、既に説明されているように（Ｖ．Ｃｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１４，Ｅ５９００−Ｅ５９０９  （２０１７））細胞を脱バーコード化した。結果を、患者カテゴリー全体にわたり総ＣＤ３＋ＣＤ４＋集団のあらゆる総差に関して調べた。有意な変化（図２Ｅ）を検出しなかった。ＣＤ４コンパートメント。ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を、治療中止前に再燃／非活動性（Ｔｏ）個体からのあらゆる内部差に関して分析した。細胞事象を正規化し、ＭａｒＶｉｓによりクラスター化して、ｔ−ＳＮＥを介して３１種の機能マーカーを二変量Ｘ−Ｙ軸上に次元縮小した（図２Ｆ）。細胞のクラスタリングにより、免疫表現型の分離と、細胞サブセットの異なるノードへの分類とが可能になる（図１Ａ）。正規化された平均細胞頻度分布をノード全体で調べ、１５０〜２３０ＩＤの範囲のノードの領域内の再燃（Ｔｏ）個体からの細胞の富化が認められた（図１Ｂ）。これらのノードは、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋発現を示すｔ−ＳＮＥマップ内の領域に対応する（図１Ｃ）。これらのＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ノードは、様々なサイトカイン（ＴＮＦＡ、ＩＬ−６、ＩＦＮｇ、及びＩＬ−１７Ａ）並びに免疫チェックポイント（ＰＤ１及びＣＤ１５２）表現型を含む（図２Ａ〜Ｂ）。
【０１０８】
[00120]ＰＢＭＣのＣｙＴｏＦ調査
[00121]ＰＢＭＣを解凍し、既に説明されているように（Ｖ．Ｃｈｅｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｕｔ，（２０１８））３７種の重金属結合抗体（表３）のＴ細胞焦点パネル（Ｔ  ｃｅｌｌ  ｆｏｃｕｓ  ｐａｎｅｌ）で染色し、フライトのサイトメトリータイム（ＣｙＴｏＦ）により分析した。簡潔に説明すると、ＰＢＭＣを、６時間にわたりホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（１５０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）及びイオノマイシン（７５０ｎｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）により又はこれらなしで刺激し、３７℃、５％ＣＯ２にて１０体積／体積％ヒト血清、１体積／体積％ＰＳＧ、ＲＰＭＩにおいて最後の４時間にわたり分泌阻害剤ブリフェディン（ｂｒｉｅｆｅｄｉｎ）Ａ（１：１０００、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）及びモネシン（ｍｏｎｅｓｉｎ）（１：１０００，  Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）でブロックした。次いで、細胞を洗浄し、室温にて５分にわたり細胞生存率色素シスプラチン（２００μＭ、Ｓｉｇｍａ−ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。次いで、細胞を洗浄し、別個の個体サンプルを、氷上で２５分にわたり、既に説明されているように（Ｌ．Ｌａｉ，ｅｔ  ａｌ．．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ａ  ８７，３６９−３７４（２０１５））重金属８９、１１５、１４１、又は１６７のいずれかと結合した抗ＣＤ４５の固有の組み合わせでバーコード化する。次いで、バーコード化細胞を洗浄し、氷上で３０分にわたり、４体積／体積％熱不活性化ＦＢＳ中の表面抗体カクテル、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４ＰＢＳ中の０．０５重量／体積％アジ化ナトリウムで染色する。次いで、細胞を洗浄し、氷上で４５分にわたり、固定／透過処理緩衝液（１：３、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に再懸濁させる。次いで、透過処理された細胞を、氷上で４５分にわたり内部抗体カクテル（１：１０、透過処理緩衝液、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により染色する。次いで、染色された細胞を洗浄し、４℃で一晩又は氷上で２０分にわたりＤＮＡインターカレーターＩｒ−１９１／１９３（１．６重量／体積％パラホルムアルデヒド中に１：２０００、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で染色する。細胞を洗浄し、１×１０６個の細胞／ｍｌにて超純粋蒸留水中のＥＱ（商標）Ｆｏｕｒ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎビーズ（１：１０、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で再懸濁させる。細胞混合物をロードし、ＣｙＴｏＦ  Ｔｕｎｎｉｎｇ溶液（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で較正されているＨｅｌｉｏｓ質量サイトメーター（Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）で取得する。次いで、出力ＦＣＳファイルを無作為化し、製造業者の推奨の通りに、全実行に対してＥＱ（商標）Ｆｏｕｒ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎビーズにより正規化する。
【０１０９】
[00122]ＭａｒＶｉｓによるＣｙＴｏＦデータの分析
[00123]ＣｙＴｏＦからの正規化された出力ＦＣＳファイルを、ＦｌｏｗＪｏ（ｖ．１０．２）において個々のサンプルへと手動で脱バーコード化し、各サンプル及びカテゴリー（再燃、非活動性、又は健康）に関して等しい細胞事象へとダウンサンプリングした。バッチ実行の効果を、内部の生物学的コントロール（実行毎に同一の健康なドナーからのＰＢＭＣアリコート）でチェックした。次いで、正規化された細胞（最小５０００事象）を、Ｂａｒｎｅｓ  Ｈｕｔ  ＳＮＥ非線形次元縮小アルゴリズム及びｋ−ｍｅａｎｓクラスタリングアルゴリズムを使用して、多次元自動縮小及び可視化（Ｍｕｌｔｉ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌｉｓａｔｉｏｎ）（ＭａｒＶｉｓ）でクラスター化した。デフォルトのクラスタリングパラメータは、３０の複雑性、及びｐ＜０．０００１の最小値に設定されている。次いで、細胞を、マーカーのそれぞれの組み合わせの類似性スコアに基づいて、２次元のｔ−分布型確率的近傍埋め込み（ｔ−ＳＮＥ）スケールにマッピングし、ノードに分類した。ノード表現型を、ヒストグラムレイアウト中のノードの母集団に対するノードマーカー強度を比較するＲ−スクリプトで読み取った。ノードの統計的検定をＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ両側検定で実施し、ｐ＜０．０５の場合に有意と定義した。クラスタリングから得られた有意なノードが適切であることを確実にするために、検証としてのＦｌｏｗＪｏによる元々のＦＣＳファイルの監視付きゲーティングに加えて、クラスター化されたＣＳＶファイルのバックゲーティングを実施した。
【０１１０】
【表３】
2020523583.tif 000005
【０１１１】
[00124]表３．ＪＩＡ患者／コントロールからのＰＢＭＣの染色で使用されるＣｙＴｏＦ抗体パネル。ＰＢＭＣのＣｙＴｏＦ染色で使用される抗体クローン及びベンターの詳細は、列挙された通りである。
【０１１２】
[00125]
実施例３：この発見コホートにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋サブセットの臨床予測値
[00126]残存する非活動性（Ｔｏ）と比較した再燃（Ｔｏ）の予測因子として、この発見コホートにおけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋サブセットの細胞頻度を使用することの可能性を調べるために、ＲＯＣ曲線の構築において、内部の個体ゲーティング制御を開発した。非活動性（Ｔｏ）／健康個体は、再燃（Ｔｏ）個体と比較して未処理ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋細胞の有意に高い頻度を反映することが分かった（図３Ａ）。再燃（Ｔｏ）する個体における未処理ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋サブセットのより低いレベルは、循環からの放出に起因する可能性があった。再燃／非活動性（Ｔｏ）個体に関するＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋とＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋との間の反比例関係により、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／ＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋サブセットの比を利用した場合に、患者の明確で有意な分離が可能になる（図３Ｂ）。この比を利用して、本発明者らは、１．３７での基準の場合に感度が８１．８２％であり且つ特異度が８８．８９％である、０．９３９  ＡＵＣのＲＯＣ曲線（再燃個体対非活動性（Ｔｏ）個体）を構築した（図３Ｃ）。再燃個体対非活動性（Ｔｏ）個体からのＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋（ＡＵＣ＝０．７９８、図３Ｄ）又はＣＤ４５ＲＡ＋ＴＮＦＡ＋（ＡＵＣ＝０．９０４、Ｆｉｇ．３Ｅ）のいずれかのみによるＲＯＣ曲線の構築は、劣っている。全体として、ＲＯＣ曲線は、臨床医が薬物中止の決定をどのように管理し得るかにおいて、この持続的な病原性ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋サブセットの臨床予測有用性を支持する。
【０１１３】
[00127]
実施例４  治療にかかわらずＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−ＣＤ１５２−記憶の持続
[00128]ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞のこの領域内で再燃／非活動性（Ｔｏ）細胞がどのようにして差次的に分離されるかを決定するために、再燃又は非活動性（Ｔｏ）のＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞をｔ−ＳＮＥマップ（図２Ｃ〜Ｄ）上にバックゲートし、このｔ−ＳＮＥマップは、再燃（Ｔｏ）個体からのほとんどの細胞は、非活動性（Ｔｏ）個体の広がった分布とは対照的に、集中したノード分布を示す富化領域上にマッピングされることを示す。再燃（Ｔｏ）個体は、純粋にＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋であるノード内に強く集中する傾向があるが、非活動性（Ｔｏ）個体は、ＣＤ１５２＋表現型、ＰＤ１＋表現型、又はＫｉ６７＋／ＩＬ−１０＋表現型の有無にかかわらずＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋を発現する細胞の混合分布を示す傾向がある。ノード１９６、２０９、２１１、２２２、１７８は、非活動性（Ｔｏ）個体と比較して再燃（Ｔｏ）個体において有意に富化され（ｐ＜０．０５又は０．０１、図４Ａ〜Ｃ、図４Ｈ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋バックグラウンドを主に純粋に発現し、特筆すべきことに他のサイトカイン（ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−１７、ＩＬ−６）及び免疫チェックポイント（ＰＤ１、ＣＤ１５２）を欠いていた。ノード１９６、２０９、２１１、２２２におけるＰＤ１及びＣＤ１５２の不在は、これらのＣＤ４記憶細胞の持続に寄与している可能性がある免疫チェックポイント制御の欠如の可能性を示す。特に、ノード１７８はＣＸＣＲ５＋の発現を示し、可能なＴ−Ｂ細胞相互作用を暗示する。これらのノードが、クラスタリング分析のプロセスから生成されたアーチファクトに起因しないことを確実にするために、下記の集団（ａ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋、（ｂ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＣＤ１５２、（ｃ）ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−、及び（ｄ）ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋に関してＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞において手動ゲーティング（図４Ｄ〜Ｇ）により標的の検証を実施し、非活動性（Ｔｏ）／健康個体に対して再燃（Ｔｏ）個体において有意に高い（ｐ＜０．０５、０．０１、又は０．００１）ことが分かった。ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−ＣＤ１５２−記憶サブセットにおける全体的な実質的持続を、疾患の持続に寄与する可能性がある再燃（Ｔｏ）個体で観察した。
【０１１４】
[00129]この研究では、ＪＩＡ個体の不均一プールを、薬物療法（抗ＴＮＦＡ）で非活動性疾患を成功裏に達成した患者から採用した。薬物中止後での患者のその臨床的運命へのさらなる細分化により、治療にもかかわらず疾患を消散し得ない患者のグループが特定された。高次元の単一細胞分解能ＣｙＴｏＦプラットフォームの適用により、治療にもかかわらず持続する炎症性ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−ＣＤ１５２−記憶Ｔ細胞のグループを、循環ＣＤ４Ｔ細胞の不均一プールから発見した。このサブセットの持続性により、本発明者らは、ＲＯＣ曲線で再燃患者と非活動性患者とを識別し得た。再燃患者では、抗ＴＮＦＡ生物製剤によるＴＮＦＡの細胞外中和は、この炎症性記憶細胞を「リセットする」には不十分であるように思われる。より高い薬物用量又は薬物療法による臨床的寛解のより長い持続期間が、最終的にはこの炎症性細胞を遮断するのに役立つと仮定されてはいるが、そうなのかどうかは現時点では不明である。しかしながら、細胞が寛解のシグネチャを有すると、細胞が採取された者からの忍耐は薬物処置の中止を有する場合があり、疾患が再度再燃することが最小限に抑えられる。炎症性サイトカインＴＮＦＡの中和も、免疫チェックポイントシグナル伝達による並行消散を必要とする場合がある。実際には、癌患者における免疫遮断療法（抗ＰＤ１、抗ＣＤ１５２）の進化により、リウマチ性疾患の新規のクラスが現在生じており（Ｌ．Ｃａｌａｂｒｅｓｅ，ａｎｄ  Ｘ．Ｍａｒｉｅｔｔｅ，Ｔ．Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ７７，１６２−１６４（２０１８））、リウマチ性免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）と称されている。
【０１１５】
[00130]
実施例５  再燃個体における無症状疾患ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋サブセットの存在
[00131]再燃個体と非活動性（Ｔｏ）個体との比較は、両方の根底にある疾患バックグラウンドに存在するわずかな無症状ＣＤ４Ｔ細胞サブセットをマスクするという脆弱性を有する。このマスキングを回避するために、無症状サブセットを明らかにしようとして、再燃（Ｔｏ）を、炎症状態を有しない健康な小児個体と比較した。再燃（Ｔｏ）個体及び健康な非疾患個体からのＣＤ３＋ＣＤ４＋細胞のｔ−ＳＮＥマップへのクラスタリングにより、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋細胞のレベルでの類似の調節不全が明らかになり（図５Ａ〜Ｂ）、特に再燃個体において顕著に富化している。この領域内のノードを、サイトカイン（ＩＦＮｇ、ＩＬ−１７Ａ、及びＩＬ−６、図５Ｃ）の発現、並びに免疫チェックポイント発現（ＰＤ１、ＣＤ１５２、図５Ｄ）に基づいて分離する。特に再燃個体は、純粋にＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋を示すか、又はＰＤ１若しくはＣＤ１５２を欠くＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋に対する二重陽性を示すノードにおける集中的な分布を反映する。ノード４８、４９、７６、及び７７は、健康個体と比較して、再燃（Ｔｏ）個体から有意に富化された（ｐ＜０．０５又は０．０１、図５Ｅ〜Ｇ、図５Ｉ）。ノード４８及び４９はＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＰＤ１−ＣＤ１５２−表現型を発現し、ノード７６及び７７はＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋ＰＤ１−ＣＤ１５２−発現を反映する。ＦＣＳファイルの手動ゲーティングによりクラスタリング結果を再確認し、再燃個体はＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋が実際に富化されている（ｐ＜０．００１）ことが示される（図５Ｈ）。この二重陽性サブセットの存在は、再燃と非活動性（Ｔｏ）との比較において以前では検出されなかったことから、このサブセットは、健康な非疾患個体との比較でのみ明らかになる無症状疾患サブセットを表す可能性がある。実際には、治療中止後に再燃個体及び非活動性（Ｔｅｎｄ）個体を調べた場合には、ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋／ＩＬ−６＋二重陽性細胞の存在は再燃時に患者で有意に増加する（図７Ａ〜Ｂ）。この二重陽性サブセットの結果して生じる検出及び出現は、以前は無症状であったものが明白な疾患顕性化を起こしたことに起因する可能性がある。治療の中止後に再燃個体と非活動性（Ｔｅｎｄ）個体とを比較した場合には、おそらく再燃個体における炎症に対する反応として、ＰＤ１／ＣＤ１５２の上方調節も観察した（図７Ｂ〜Ｅ、ノード４５）。この再燃個体でのＰＤ１／ＣＤ１５２の上方調節は、炎症を経験していない健康個体とレベルが類似していることから（図７Ｆ〜Ｇ）、不適切であると思われる。
【０１１６】
[00132]再燃ＪＩＡ患者を健康な小児コントロール（非ＪＩＡ）と比較した場合には、二重陽性ＴＮＦＡ＋／ＩＬ−６＋（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＰＤ１−ＣＤ１５２−）記憶Ｔ細胞の無症状集団が観察可能になる。この集団は明白な再燃顕性化時（薬物中止中）に出現し、以前に、薬物中止前に再燃を非活動性個体と比較した場合に検出可能ではなかった。特に、重度の多発性関節炎を後に発症する、免疫遮断療法による３例の癌個体の最近の症例シリーズの報告（Ｓ．Ｔ．Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ７６，２０６１−２０６４（２０１７））では、トシリズマブ（抗ＩＬ−６）により成功裏に処置された。このことは、自己免疫療法及び癌療法の両方で、炎症メカニズム及び消散メカニズムにおいて本発明者らが観察する全体的な共通性を反映する。
【０１１７】
[00133]
実施例６：疾患を補償する記憶Ｔ調節サブセット
[00134]ＪＩＡにおけるＴｒｅｇｓの調節役割を考慮して、治療の中止の前後の患者において総Ｔｒｅｇ集団も調べて（図６Ａ）、調節不全が観察し得たかどうかを決定した。興味深いことに、治療の中止の前後の患者において総Ｔｒｅｇ集団は有意に変化しなかった（図６Ｂ〜Ｃ）。本発明者らは、Ｔｒｅｇｓの記憶ＣＤ４５ＲＡ−サブセット（図６Ｄ〜Ｅ）は、治療の中止前の非活動性（Ｔｏ）／健康個体と比較して再燃（Ｔｏ）において有意に増加する（ｐ＜０．０５）ことに気付いたが、健康個体と比較して治療の中止後（Ｔｅｎｄ）に程度が低いことに気付いた。ＣＤ４５ＲＡ−記憶Ｔｒｅｇの富化は、治療の中止時に最終的に再燃する患者で進行中の無症状炎症に対して補償的であり得るが、おそらく不適切な反応である可能性が高い。
【０１１８】
[00135]ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ調節集団における補償性が高い反応を、再燃する個体でも検出した。他者により、滑膜ＴエフェクタがＴ調節抑制に対して耐性があること（Ｓ．Ｈａｕｆｅ，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６３，３１５３−３１６２（２０１１））、及びこのＴエフェクタ耐性が抗ＴＮＦＡ治療下の患者において緩和されること（Ｅ．Ｊ．Ｗｅｈｒｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６５，３２７９−３２８４（２０１３））が示されている。このことは、治療中止時に再燃する運命である個体が、処置中における炎症の制御に役立つ可能性があるが疾患を完全に消散するには十分ではない並行補償Ｔ調節反応を特徴とする無症状炎症を経験することを示す。再燃患者における抗ＴＮＦＡ療法のその後の除去により、Ｔ調節抑制に対するＴエフェクタ耐性が再び現れている可能性がある。興味深いことに、抗ＩＬ−６は、ＪＩＡ患者のサブセットにおいてＴ調節抑制に対するＴエフェクタ耐性を除去するように思われる（Ｗｅｈｒｅｎｓ他）。ＪＩＡ患者におけるＴ調節ＴＣＲレパートリーの歪みが広く実証されており（Ｍ．Ｒｏｓｓｅｔｔｉ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ７６，４３５−４４１（２０１７））、単一細胞ＲＮＡｓｅｑによる最近のマウス研究により、Ｔ調節表現型のタイプにおけるＴＣＲクローンタイプの制限が明らかになった（Ｄ．Ｚｅｍｍｏｕｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９，２９１−３０１（２０１８））。
【０１１９】
[00136]
実施例７  治療及び成功裏の臨床制御にもかかわらずＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞における遺伝子調節不全の持続
[00137]ＪＩＡ個体におけるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦＡ＋Ｔ細胞の持続性は、生物製剤療法により臨床的寛解を達成しているにもかかわらず、治療全体を通して調節不全のままである遺伝子の並行サブセットが存在するかどうかを決定することにつながる。同数のＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、再燃（ｎ＝６）／非活動性（ｎ＝６）（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）及び健康個体（ｎ＝３）から選別し（図８）、抗ＣＤ３／ＣＤ２８で２４時間刺激した。これらの細胞のｍＲＮＡプロファイルを、５００種超の免疫学的遺伝子からなる標的化パネルを使用して、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇでスクリーニングした。再燃個体（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）（図８Ｂ）又は非活動性個体（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）（図８Ｃ）での治療にもかかわらず、調節不全のままである遺伝子のコレクションを検出した（ｐ＜０．０５、倍差±１．５）。ＵＢＥ２Ｌ３、ＩＬ−６、ＳＴＡＴ４、ＴＹＫ２、ＴＮＦＡＩＰ３、及びＰＴＰＮ２の発現の調節不全を、再燃個体及び非活動性個体の両方において観察し、この調節不全はＪＩＡと関連していることが既に報告されている（Ａ．Ｈｉｎｋｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４５，６６４−６６９（２０１３））。機能遺伝子富化を、ＪＩＡ患者（再燃／非活動性）対健康で富化された遺伝子でＤＡＶＩＤにより実施し、再燃個体（表４）及び非活動性個体（表５）の両方において下記の５種の主要な経路が調節不全であることが分かった：（ａ）ＴＣＲ活性化、（ｂ）アポトーシス、（ｃ）ＴＮＦＡシグナル伝達、（ｄ）ＮＦ−ｋＢシグナル伝達、及び（ｅ）ＭＡＰＫシグナル伝達。
【０１２０】
[00138]
【表４】
2020523583.tif 000006
【０１２１】
[00139]表４：再燃（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）個体で富化された遺伝子のＤＡＶＩＤ機能遺伝子セット富化。ＤＡＶＩＤ機能遺伝子セット富化を、ヒトバックグラウンドに対するデフォルト設定により、健康個体と比較して再燃（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）個体で富化された遺伝子に対して実施した。関与する経路を４以上の遺伝子数に関して表にする。
【０１２２】
[00140]細胞の選別及び培養
[00141]ＰＢＭＣを解凍し、２×１０６個の細胞／ｍｌにて氷上で２０分にわたりＣＤ３−ＡＦ７００（ＵＣＨＴ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１４−ＡＰＣ／Ｈ７（ＭφＰ−９、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４−ＢＶ６０５（ＯＫＴ４、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ／Ｄａｚｚｌｅ（ＨＩ１００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４５ＲＯ−ＦＩＴＣ（ＵＣＨＬ１、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色する。細胞生存率を、Ｓｙｔｏｘ  Ｒｅｄ（１：１０００、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）による染色によって決定した。ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でＣＤ３＋ＣＤ１４−ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−Ｔ細胞を選別し、二重項及び死滅細胞を排除した。この細胞を、３７℃、５％ＣＯ２にて１０体積／体積％ヒト血清中の可溶性四量体抗ＣＤ３／ＣＤ２８（１：１００、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）、１体積／体積％ＰＳＧ、ＲＰＭＩにより、２４時間にわたり９６ウェルプレート中のウェル当たり４×１０４個の細胞で播種した。
【０１２３】
[00142]ｍＲＮＡの精製、及びＮａｎｏｓｔｒｉｎｇによるスクリーニング
[00143]製造業者の指示に従って、Ａｒｃｔｕｒｕｓ  Ｐｉｃｔｕｒｅ  ＲＮＡ単離キット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、細胞からのｍＲＮＡの抽出を実施した。簡潔に説明すると、細胞を４２℃にて３０分にわたり抽出緩衝液で溶解させた。溶解物を７０体積／体積％エタノールと等体積で混合した。混合物をロードし、精製カラムに結合させ、室温にて１５分にわたりＤＮａｓｅ  Ｉ（Ｑｉａｇｅｎ）で消化する。ＲＮＡを洗浄して溶出させた。ＲＮＡを、ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｌｏｗ  ＲＮＡ  Ｉｎｐｕｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）で増幅させた。簡潔に説明すると、６０分にわたり４２℃にて、ＲＴ酵素及びプライマーミックスにより、第１の鎖ｃＤＮＡ合成を実施した。次に、８サイクルにわたり、遺伝子特異的プライマー（ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｐａｎｅｌ  Ｖ２、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）により多重標的富化を実施した。１６時間にわたる６５℃での、捕捉／レポータープローブ（ｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｐａｎｅｌ  ｖ２、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）による、増幅されたＲＮＡサンプルのハイブリダイゼーション。サンプルを、プレップステーション（ｐｒｅｐ  ｓｔａｔｉｏｎ）を使用してｎＣｏｕｎｔｅｒチップ上に捕捉し、最大感度（５５５ＦＯＶ）でデジナルアナライザにより読み取る。
【０１２４】
[00144]Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇデータの分析
[00145]ＲＣＣファイルをエクスポートし、ｔｈｅｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｒのｎＳｌｏｖｅｒ（ｖ３、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）ソフトウェアで読み取った。遺伝子を、ハウスキーピング遺伝子の推奨されるセットにより正規化した。遺伝子の統計的フィルタリングを、Ｗｅｌｃｈのｔ検定ｐ＜０．０５、及び倍差≧１．５でｎＳｌｏｖｅｒ（ｖ３、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ）により実施した。有意な遺伝子を、スピアマン相関を使用してヒートマップ中に表し、Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ、ｖ６．８）ウェブサイトのデータベースにエクスポートする。機能遺伝子富化を、ヒトバックグラウンド遺伝子リスト下でＤＡＶＩＤにより実施した。ＤＡＶＩＤで有意に表される経路のクラスターからの遺伝子をマッピングし、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅ（ｖ３．５．１）を使用して、Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースによりグラフで表す。
【０１２５】
[00146]
【表５】
2020523583.tif 000007
【０１２６】
[00147]表５．非活動性（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）個体で富化された遺伝子のＤＡＶＩＤ機能遺伝子セット富化。ＤＡＶＩＤ機能遺伝子セット富化を、非活動性（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）で富化された遺伝子に関して実施した。
【０１２７】
[00148]これらの遺伝子間の関連を、Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースを使用してＣｙｔｏｓｃａｐｅにより構築し、再燃個体及び非活動性個体の両方において５種の調節不全経路に関与する遺伝子で相当な重複を発見した（図９Ａ〜Ｆ）。しかしながら、これらの経路内での分岐も認められ、非活動性個体は、他の疾患又は感染におけるこれらの経路の終了又は消散の支援に関与すると報告されている追加の差次的に発現される遺伝子（ＦＹＮ、ＴＮＦＲＳＦ９、ＣＡＳＰ１、ＴＲＡＦ１、ＩＫＢＫＥ）を有する。細胞頻度の数値の差異と関連するこれらの追加の消散メカニズムは、なぜ特定の個体が治療にもかかわらず再燃するか又は非活動性のままであるかの理由を説明し得る。再燃個体及び非活動性個体の両方における経路の重複の類似性は、連続的な抗ＴＮＦＡ治療による臨床制御に対するこれらの感受性を説明し得る。実際には、同様の経路の持続性を、処置未経験段階（処置前）から抗ＴＮＦＡ治療により最近発生の臨床非活動性（処置後）の活動性ＪＩＡ患者（表６）の別個のコホートで観察した（図９Ｇ〜Ｈ及び表７）。
【０１２８】
[00149]
【表６】
2020523583.tif 000008
【０１２９】
[00150]表６．活動性ＪＩＡ患者の疾患及び薬歴。抗ＴＮＦＡ治療の前（処置未経験）及び後（最近発生の臨床的寛解）に関して対の活動性ＪＩＡ患者を、そのＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ１４−ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞に関して選別し、ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇによるｍＲＮＡ分析にかけた。
【０１３０】
[00151]
【表７】
2020523583.tif 000009
【０１３１】
[00152]表７．活動性ＪＩＡ（前／後）個体で富化された遺伝子のＤＡＶＩＤ機能遺伝子セット富化。ＤＡＶＩＤ機能遺伝子セット富化を、ヒトバックグラウンドに対するデフォルト設定により、健康個体と比較して抗ＴＮＦＡ治療に供したＪＩＡ（前／後）個体で富化された遺伝子に対して実施した。関与する経路を４以上の遺伝子数に関して表にする。
【０１３２】
[00153]再燃個体及び非活動性個体でのＣＤ４記憶Ｔ細胞のＴＣＲにより媒介される反応を試験しており、ｍＲＮＡシグネチャを５００種超の免疫学的遺伝子の事前に選択されたパネルでプロファイリングした。健康コントロールと比較して、ＪＩＡ患者（再燃／非活動性）では、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ４５ＲＡ−記憶Ｔ細胞における遺伝子発現の強い調節不全が存在した。これらの遺伝子（ＵＢＥ２Ｌ３、ＩＬ−６、ＳＴＡＴ４、ＴＹＫ２、ＴＮＦＡＩＰ３、及びＰＴＰＮ２）の内のいくつかは、大規模コホート研究において他者により、ＪＩＡと高度に関連していることが既に示された（Ａ．Ｈｉｎｋｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ４５，６６４−６６９（２０１３））。採用された患者は抗ＴＮＦＡ治療を受けることができ、抗ＴＮＦＡ治療による薬物処置により臨床的寛解を達成した。再燃個体と非活動性個体との間で相当な重複が見られるものの、機能遺伝子富化及び経路のマッピングにより、５種の主要な経路（ＴＣＲ活性化、アポトーシス、ＴＮＦＡ、ＮＦ−ｋＢ、ＭＡＰＫシグナル伝達）での調節不全が明らかになり、これらの経路の特定の点での分岐を観察した。非活動性個体におけるいくつかの遺伝子の特に有意に高い発現を検出した（ＦＹＮ、ＴＲＡＦ１、ＴＮＦＲＳＦ９、ＩＫＢＫＥ、ＣＡＳＰ１）。ＦＹＮは、ＦＹＮ−／−マウスにおいてＰＡＧ／ＣＢＰによるＴＣＲシグナル伝達の負のフィードバック阻害に関与していることが報告されており（Ａ．Ｆｉｌｂｙ，ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９，４６３５−４６４４（２００７））、研究は、Ｔ細胞アネルギーがＦＹＮ−ＰＡＧ相互作用により媒介され得ることを示す（Ｄ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２７，１９６０−１９７３  （２００７））。グルココルチコイド及びＩＰ３媒介カルシウムシグナル伝達経路によるＦＹＮのノックダウンにより、Ｔリンパ球のオートファジーが増強された（Ｍ．Ｗ．Ｈａｒｒ，ｅｔ  ａｌ．Ａｕｔｏｐｈａｇｙ  ６，９１２−９２１（２０１０））。特に、低下したＬＣＫ発現下では、ＦＹＮ−／−マウスで自己免疫が生じ（Ｒ．Ｊ．Ｓａｌｍｏｎｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２２８，９−２２（２００９））、ＬＣＫ低下を再燃個体及び非活動性個体の両方で観察した（図９）。ゲノムワイド関連研究、及び遺伝子型判定研究により、ＴＲＡＦ１−Ｃ５遺伝子座とＪＩＡとのゲノム関連が明らかになっている（Ｈ．Ｍ．Ａｌｂｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎ  Ｒｈｅｕｍ  Ｄｉｓ  ６７，１５７８−１５８０（２００８））。転写因子との複雑な相互作用、及びヒストンマーカーの存在により、ＣＤ４Ｔ細胞のＴＲＡＦ１遺伝子座内で強力な後成的調節不全が検出された（Ｌ．Ｚｈｕ，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ  １９，５７（２０１７））。ＴＲＡＦ１−／−マウスは、ＴＲＡＦ１が、ＴＣＲ及びＴＮＦＡシグナル伝達に反応してＴ細胞において負の調節的役割を果たすことを明らかにする（Ｅ．Ｎ．Ｔｓｉｔｓｉｋｏｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １５，６４７−６５７（２００１））。ＴＲＡＦ１−／−Ｔ細胞は、ＴＣＲ及びＴＮＦＡ刺激（特に、ＮＦ−ｋＢ及びＡＰ−１活性化に向けた過反応性の下流ＴＮ��Ａシグナル伝達）に反応して増殖の増強を示した。ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９）の関与により、ウイルス感染の初期段階の間に、ＩＬ−１０によるＬＣＭＶに対するＣＤ４＋反応が低下する（Ｂ．Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１７，３０２９−３０４１（２００７））。ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＣＤ４Ｔ細胞上のＣＤ９５Ｌの誘導によるアポトーシスを誘導し得（Ｔ．Ｅｂａｔａ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１，１４１０−１４１６（２００１））、ＣＤ１３７のｓｉＲＮＡノックダウンは、デング熱に感染した細胞におけるＴＮＦＡ誘導アポトーシスを減少させた（Ａ．Ｎａｇｉｌａ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｒｏｌ  Ｊ  １０，１０５（２０１３））。関節リウマチ、ループス、及びＥＡＥに関する様々な自己免疫マウスモデルにおける抗体によるＣＤ１３７のアグノスティックな活性化は有益であることが分かるが、その作用機序は多変量によると思われる（Ｄ．Ｓ．Ｖｉｎａｙ，ａｎｄ  Ｂ．Ｓ．Ｋｗｏｎ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０，３６１−３７３（２０１６））。ＩＫＢＫＥは、マクロファージにおけるＮＬＲＰ３インフラマソームのプライミングの減少により、代謝性疾患及び動脈硬化性疾患の慢性炎症を制限する負の調節因子であることが示されている（Ｍ．Ｎ．Ｐａｔｅｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１２，５０６−５１１（２０１５））。Ｔ細胞では、ＩＫＢＫＥは、ＴＣＲ活性の下流であるＮＦＡＴ活性を阻害し、ＩＫＢＫＥの減少は、抗ウイルス及び抗腫瘍のＴ細胞反応を増強した（Ｊ．Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ  １６，４０５−４１８（２０１６））。ＮＦＡＴｃ１のより高い発現レベルを再燃個体及び非活動性個体の両方で観察し（図９）、ＮＦＡＴｃ１のＩＫＢＫＥリン酸化は核移行を阻害し、従って、頑強なＴ細胞活性化を制限する。ピロトーシスの主要ドライバであるＣＡＳＰ１は、ＨＩＶ感染中のＣＤ４Ｔ細胞の枯渇において極めて重要であることが示されている（Ｇ．Ｄｏｉｔｓｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ５０５，５０９−５１４（２０１４））。全体として、非活動性個体は、再燃個体と比較して同様の調節不全の経路を示すが、特定の重要な遺伝子発現ポイントで分岐もしている。
【０１３３】
[00154]抗ＴＮＦＡ治療が成功しているように見え且つ臨床症状が見られないにもかかわらず、特定のＪＩＡ個体がこの個体の疾患を消散していない理由を説明する病原性細胞標的の候補が提供される。薬物療法により臨床的寛解を達成しているＪＩＡ患者の集団の増加により、長期にわたる治療中のこれらのサブセットのモニタリングは、無症状炎症のより良い測定を提供し得、且つ中止戦略に役立ち得る。主要経路の分岐は、非活動性個体がこの個体の疾患をどのようにして消散したかの理解における重要性を示し、抗ＴＮＦＡ処置による同時治療標的を提供し得る。
【０１３４】
[00155]
実施例８：プロジェクトアプローチ：
[00156]臨床的運命：多関節型ＪＩＡ患者を、「ＪＩＡ試験による子供における生物学の理解の改善及びＴＮＦ阻害の使用（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＴＮＦ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ＪＩＡ  Ｔｒｉａｌ）」により採用した。抗ＴＮＦＡ治療を既に受けているこれらの患者を、（少なくとも６ヶ月）疾患活動性が静止していると最初に評価し、８ヶ月の期間にわたり治療を中止した。次いで、患者を、試験の完了後に臨床反応（再燃、活動性、及び非活動性）に分離する。
【０１３５】
[00157]イムノミクス（ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｓ）：ＪＩＡ患者をその臨床的運命（再燃、活動性、及び非活動性）に描写するＣＤ４Ｔ細胞メカニズムを解読するために、本発明者らは高次元の単一細胞分解能プラットフォームＣｙＴｏＦ（サイトメトリタイムオブフライト）を採用して、治療中止の前後に循環Ｔ細胞サブセットを調べた。
【０１３６】
[00158]方法論：
[00159]臨床試験：抗ＴＮＦ−アルファで処置された患者を、処置による臨床的に非活動性の疾患（Ｗａｌｌａｃｅ基準）による研究（ＪＩＡ試験による子供における生物学の理解の改善及びＴＮＦ阻害の使用（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  ＴＮＦ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ｗｉｔｈ  ＪＩＡ  Ｔｒｉａｌ））に採用し、治療中止と共に開始した。この患者を追跡して評価した。この患者を、下記の６種のＪＩＡコアセットパラメータ：活動性関節炎及び／又は動きの喪失を有する関節の数、現在の疾患活動性に関するＭＤによる全体的評価、前週での全体的な疾患重症度に関する患者／親による全体的評価、身体機能の検証された測定、並びにＥＳＲに基づいてＷａｌｌａｃｅ基準を使用して疾患の活動性／非活動性に関して最初にスコア化し、この患者が疾患を示す場合には、続いて、この患者を、同一基準に基づくが重症度スコアにより、再燃に関してスコア化する。従って、疾患を示す患者は、重症度に応じて活動性及び再燃に本質的に分類される。
【０１３７】
[00160]実験：この試験からのＪＩＡ患者由来のＰＢＭＣを治療中止の前後に採取し、包括的Ｔ細胞パネルで染色する。この細胞を重金属結合抗体で染色し、ＣｙＴｏＦ機械により取得した。生データを正規化して処理し、インハウスで改変されたソフトウェアアーキテクチャＭＡＲＶｉｓ（Ｍｕｌｔｉ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ）により分析する。ＴＳＮＥ（Ｂａｒｔｓ  Ｈｕｔ  ＳＮＥアルゴリズム）を介した次元縮小による二変量Ｘ−Ｙ軸上への３７種のマーカーのＭＡＲＶｉｓクラスタリングにより、異なるノード表現型への細胞の分離が可能になる。患者（再燃、活動性、及び非活動性）の統計的なカテゴリー比較により、それぞれのカテゴリーに関するノード富化を決定する。次いで、ＲＳｃｒｉｐｔソフトウェア環境を介してノード表現型を得る。
【０１３８】
[00161]結果：４７例のＪＩＡ患者（再燃＝１８例、活動性＝１１例、非活動性＝１８例）及び１４例の健康コントロ−ルに由来するＰＢＭＣを染色し、ＣｙＴｏＦで調べた。本発明者らは、（治療中止前に）再燃する運命である患者内で明確なＣＤ４記憶調節不全（ｐ＜０．０５）を観察している。このＣＤ４記憶コンパートメント内で、再燃患者（対非活動性／健康）は、（ａ）ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−（記憶）ＴＮＦＡ＋、（ｂ）ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−（記憶）ＣＸＣＲ５＋（ＴｆＨ：Ｔ濾胞性ヘルパー）のより高い頻度（ｐ＜０．０５）を経験しており、この集団は（ｃ）ＣＤ１５２−／ＰＤ１−に偏っている。ＣＤ３＋ＣＤ４＋記憶ＴＮＦＡ＋細胞は疾患の主要な炎症ドライバであり、且つ疾患の治療及び反応と直接相関すると考えられる。ＣＤ３＋ＣＤ４＋記憶ＣＸＣＲ５＋ＴｆＨは、Ｂ細胞相互作用／活性化に役立つことが知られている細胞であり、再燃顕性化後（治療中止後；対非活動性／健康）に有意に調節不全ではなかったことから病原性細胞の初期の波である可能性がある。ＣＤ１５２及びＰＤ１等の免疫チェックポイント調節因子は疾患制御に役立ち、再燃患者におけるＣＤ４記憶サブセットの歪みは、疾患での不適切な免疫調節を示す。再燃個体と健康個体との比較により、治療中止前の再燃対非活動性比較では明らかではなかった無症状疾患サブセットＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−（記憶）ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋二重陽性（ｐ＜０．０５）の存在がさらに明らかになった。この二重陽性（ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋）サブセットは、再燃する運命である患者における代替炎症経路を表す可能性がある。活動性患者と非活動性患者との比較により、本発明者らは、炎症性サブセットの非常に初期の波を表す可能性があるＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋Ｔ細胞の独特の遊走性集団に注目しており、その理由は、この集団は、循環からの可能な放出に起因して、再燃対非活動性／健康では調節不全であることが見出されなかったからである。治療中止後の完全な再燃顕性化（対非活動性）により、疾患拡大中に関与する可能性がある炎症マーカーの追加のより高いスペクトルが現れた（ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−（記憶）ＩＬ−２１＋ＩＦＮｇ＋ＴＮＦＡ＋；ｐ＜０．０５）。加えて、再燃顕性化中のＣＤ４記憶サブセットは、非活動性と比べて進行中の炎症に対する反応として、より高いレベルのＣＤ１５２＋／ＰＤ１＋細胞を示すが健康レベルと同等であり、但し、炎症を抑制するために必要とされるレベルとしては不相応である。
【０１３９】
[00162]治療の中止前の再燃患者と非活動性患者とから単離されたＴ細胞集団を比較した。治療の中止前の再燃患者から単離されたＴ細胞集団を、健康対象由来のＴ細胞集団と比較した。
【０１４０】
[00163]再燃する運命である患者におけるＣＤ４記憶サブセットの明確な調節不全を観察した。ＣＤ４記憶ＴＮＦＡ＋細胞はおそらく炎症性であり且つ疾患の活動性に直接影響を及ぼす。ＣＤ４記憶ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋細胞は、代替経路を介して疾患を拡大するのに役立ち得る無症状疾患サブセットを表す。ＣＤ４記憶ＣＸＣＲ５＋（ＴｆＨ）は、Ｂ細胞相互作用により記憶の持続を増強し得る（表８、図１０Ａ〜Ｂ）。
【０１４１】
【表８】
2020523583.tif 000010
【０１４２】
[00164]表８：治療の中止前の再燃患者における富化されたノードサブセット
[00165]治療の中止後の再燃患者と非活動性患者とから単離されたＴ細胞集団を比較した。再燃顕性化により、無症状疾患サブセット（ＣＤ４＋記憶ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋）が表面化し、より複雑な炎症サブセットが観察された（表９、図１０Ｃ）。
【０１４３】
【表９】
2020523583.tif 000011
【０１４４】
[00166]表９：治療の中止後の再燃患者における富化されたノードサブセット
[00167]治療の中止前の活動性患者と非活動性患者とから単離されたＴ細胞集団を比較した。活動性患者でのみ富化された遊走性サブセット（ＣＤ４＋記憶ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋）は、炎症性浸潤物（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｏｒ）の初期の波を表し得る（そのため、放出に起因して再燃患者では失われている）。表１０及び図１０Ｄを参照されたい。
【０１４５】
【表１０】
2020523583.tif 000012
【０１４６】
[00168]表１０：治療の中止前の活動性患者における富化されたノードサブセット
[00169]結論：一部の患者（再燃）に関して、抗ＴＮＦＡ治療は疾患の活動性を抑制するだけであり、治癒的ではない。ＣＤ４記憶細胞の持続性は、免疫チェックポイント（ＣＤ１５２／ＰＤ１）を介したより弱い調節により部分的に説明され得る疾患の再発において極めて重要な役割を果たす可能性がある。これらの結果は、臨床的運命が免疫学的に事前に決定されており、異なる臨床的運命を示す患者を、事前の生物学的サンプリングから特定し得ることを示唆する。
【０１４７】
[00170]生物製剤の中止時に再燃／活動性になる運命であるｐＪＩＡ患者は、持続するＣＤ４記憶細胞（ＴＮＦＡ＋、ＴＮＦＡ＋ＩＬ−６＋、ＴＮＦＡ＋ＩＬ−２１＋、ＣＸＣＲ５＋、ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋）の富化集団を維持する。これらのサブセットの表出も相（Ｔｏ／Ｔｅｎｄ）に依存し、循環系内の動態を反映する。
【０１４８】
[00171]これらの患者（再燃／活動性）に関して、生物製剤療法（抗ＴＮＦＡ）は、疾患の徴候の制御を助ける可能性があるが治癒ではない。
【０１４９】
[00172]これらのＣＤ４＋記憶Ｔ細胞はＣＴＬＡ４−／ＰＤ１−に偏っており、そのため、不適切な免疫チェックポイント制御を示す。
【０１５０】
[00173]多関節型ＪＩＡ患者は成人ＲＡ患者に類似しており、自己免疫のより広範なスケールで同様の疾患病因を説明するのに役立ち得る。
【０１５１】
[00174]様々な実施形態では、本発明は、対象の疾患の臨床転帰を評価する方法であって、少なくとも１種のバイオマーカーに関して、この対象から得られたサンプル中のＴ細胞集団を試験するステップを含む方法に関する。
【０１５２】
[00175]様々な実施形態では、この少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、ＣＸＣＲ５、ＩＬ−６、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる群から選択される。
【０１５３】
[00176]様々な実施形態では、この少なくとも１種のＴ細胞集団はＣＤ４＋Ｔ細胞集団を含む。
【０１５４】
[00177]様々な実施形態では、このＣＤ４＋Ｔ細胞集団はＣＤ４＋記憶Ｔ細胞集団を含む。
【０１５５】
[00178]様々な実施形態では、このＣＤ４＋記憶Ｔ細胞集団はＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−記憶Ｔ細胞を含む。
【０１５６】
[00179]様々な実施形態では、臨床転帰は、疾患の再燃状態、活動性状態、又は非活動性状態を含む。
【０１５７】
[00180]様々な実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦ−アルファ＋Ｔ細胞の存在は、疾患の再燃状態の可能性を示す。
【０１５８】
[00181]様々な実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＴＮＦ−アルファ＋ＩＬ−６＋Ｔ細胞の存在は、疾患の拡大の可能性を示す。
【０１５９】
[00182]様々な実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ５＋Ｔ細胞の存在は、Ｂ細胞相互作用を介した記憶持続の増強による疾患の再燃状態の可能性を示す。
【０１６０】
[00183]様々な実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＸＣＲ３＋ＣＣＲ６＋Ｔ細胞の存在は、疾患の活動性状態の可能性を示す。
【０１６１】
[00184]様々な実施形態では、ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＡ−ＣＤ１５２−／ＰＤ１−Ｔ細胞の存在は、不適切な免疫チェックポイント制御に起因する疾患の再燃状態の可能性を示す。
【０１６２】
[00185]様々な実施形態では、対象は、リウマチ性疾患を有する患者である。
【０１６３】
[00186]様々な実施形態では、このリウマチ性疾患は若年性特発性関節炎（ＪＩＡ）である。
【０１６４】
[00187]様々な実施形態では、この若年性特発性関節炎は多関節型ＪＩＡである。
【０１６５】
[00188]様々な実施形態では、サンプルは血液サンプルである。
【０１６６】
[00189]様々な実施形態では、この血液サンプルは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。
【０１６７】
[00190]様々な実施形態では、この方法は、このサンプルを、少なくとも１種のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも１種の抗体に曝露するステップを含む。
【０１６８】
[00191]様々な実施形態では、少なくとも１種の抗体は重金属結合抗体である。
【０１６９】
[00192]様々な実施形態では、この方法は、タイムオブフライトによるサイトメトリ（ＣｙＴｏＦ）を利用してサンプルを分析するステップを含む。
【０１７０】
[00193]様々な実施形態では、対象は抗ＴＮＦ−アルファ療法を受けている。
【０１７１】
[00194]様々な実施形態では、この方法を抗ＴＮＦ−アルファ療法の中止前に実施する。
【０１７２】
[00195]様々な実施形態では、抗ＴＮＦ−アルファ療法を中止した後のＴＮＦ−ＡＬＰＨＡ＋ＩＦＮ−ｇ＋ＩＬ−２１＋Ｔ細胞の存在は、疾患の再燃状態を示す。
【０１７３】
[00196]様々な実施形態では、この方法はインビトロでの方法である。
【０１７４】
[00197]様々な実施形態では、本発明は、対象の疾患の臨床転帰を評価するためのキットであって、対象から得られたサンプル中の、Ｔ細胞集団上の少なくとも１種のバイオマーカーを標的とするように適応されている少なくとも１種の抗体を含むキットに関する。
【０１７５】
[00198]様々な実施形態では、この少なくとも１種のバイオマーカーは、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４５ＲＡ、ＴＮＦ−アルファ、ＣＸＣＲ５、ＩＬ−６、ＩＦＮ−ｇ、ＩＬ−２１、ＣＸＣＲ３、ＣＣＲ６、ＣＤ１５２、及びＰＤ１からなる群から選択される。
【０１７６】
[00199]様々な実施形態では、この少なくとも１種の抗体は重金属結合抗体である。
【０１７７】
[00200]当業者は、上記で説明した特徴の変形及び組み合わせが、代替に又は代わりにではなく、本発明の意図された範囲内であるさらなる実施形態を形成するために組み合わされ得ることを理解すべきである。
【０１７８】
〔関連出願の相互参照〕
[0001]本出願は、２０１７年６月１４日に出願されたシンガポール出願第１０２０１７０４９０５Ｒ号に対する優先権を主張し、この出願の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
2020523583.tif 000013
【図１Ｂ】
2020523583.tif 000014
【図１Ｃ】
2020523583.tif 000015
【図１Ｄ】
2020523583.tif 000016
【図１Ｅ】
2020523583.tif 000017
【図１Ｆ】
2020523583.tif 000018
【図２Ａ】
2020523583.tif 000019
【図２Ｂ】
2020523583.tif 000020
【図２Ｃ】
2020523583.tif 000021
【図２Ｄ】
2020523583.tif 000022
【図２Ｅ】
2020523583.tif 000023
【図２Ｆ】
2020523583.tif 000024
【図３Ａ】
2020523583.tif 000025
【図３Ｂ】
2020523583.tif 000026
【図３Ｃ】
2020523583.tif 000027
【図３Ｄ】
2020523583.tif 000028
【図３Ｅ】
2020523583.tif 000029
【図４Ａ】
2020523583.tif 000030
【図４Ｂ】
2020523583.tif 000031
【図４Ｃ】
2020523583.tif 000032
【図４ＤＧ】
2020523583.tif 000033
【図４Ｈ】
2020523583.tif 000034
【図５Ａ】
2020523583.tif 000035
【図５Ｂ】
2020523583.tif 000036
【図５Ｃ】
2020523583.tif 000037
【図５Ｄ】
2020523583.tif 000038
【図５Ｅ】
2020523583.tif 000039
【図５Ｆ】
2020523583.tif 000040
【図５Ｇ】
2020523583.tif 000041
【図５Ｈ】
2020523583.tif 000042
【図５Ｉ】
2020523583.tif 000043
【図６Ａ】
2020523583.tif 000044
【図６Ｂ】
2020523583.tif 000045
【図６Ｃ】
2020523583.tif 000046
【図６Ｄ】
2020523583.tif 000047
【図６Ｅ】
2020523583.tif 000048
【図７Ａ】
2020523583.tif 000049
【図７Ｂ】
2020523583.tif 000050
【図７Ｃ】
2020523583.tif 000051
【図７Ｄ】
2020523583.tif 000052
【図７Ｅ】
2020523583.tif 000053
【図７Ｆ】
2020523583.tif 000054
【図７Ｇ】
2020523583.tif 000055
【図８Ａ】
2020523583.tif 000056
【図８Ｂ】
2020523583.tif 000057
【図８Ｃ】
2020523583.tif 000058
【図９Ａ】
2020523583.tif 000059
【図９ＢＦ】
2020523583.tif 000060
【図９Ｇ】
2020523583.tif 000061
【図９Ｈ】
2020523583.tif 000062
【図１０Ａ】
2020523583.tif 000063
【図１０Ｂ】
2020523583.tif 000064
【図１０Ｃ】
2020523583.tif 000065
【図１０Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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