(57)【要約】  本発明は、新規骨形成を誘導し、骨成長を促進し、骨欠損を処置するための自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）、自家骨移植代替組成物の調製方法およびインプラントの自家骨移植代替組成物を調製するためのキットに関する。特定の態様では、本発明は、骨欠損の処置、新規骨形成の誘導および骨折治癒および脊椎固定術のための骨成長の促進用であり、整形外科および口腔顎顔面歯科手術の骨再建術における骨欠損を修復するための、注射可能／押出可能／移植可能な自家骨移植代替組成物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
新規骨形成を誘導し、骨成長を促進し、かつ骨欠損を処置するための自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）であって、前記組成物が、
（ｉ）自己血、
（ｉｉ）ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質、
（ｉｉｉ）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）、
（ｉｖ）血液凝固剤を含み、
前記自己血が、骨形成を行う骨形成タンパク質と、前記耐圧縮性基材ＣＲＭと、を含む、凝塊ゲルを形成する、自家骨移植代替組成物。
【請求項２】
前記自己血が、多血小板血漿（ＰＲＰ）を更に含み、前記自己血と前記多血小板血漿（ＰＲＰ）との比率が、１：１、２：１および３：１であり、好ましくは１：１である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記自己血が、前記多血小板血漿（ＰＲＰ）を代用する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記血液凝固剤が、イオン溶液中またはナノ粒子における薬理学的に許容可能なカルシウム塩およびＣａ＋＋マイクロスフェア複合体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）が、移植骨、リン酸カルシウム−炭酸カルシウム複合材料、生体吸収性ポリマーまたはコポリマー、硫酸カルシウム、生体吸収性ヒドロゲルおよびこれらの組合せから成る群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記リン酸カルシウム−炭酸カルシウム複合材料が、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）およびこれらの組合せから成る群から選択される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）の顆粒サイズが７４μｍから８ｍｍであり、前記顆粒サイズは骨欠損に応じる、請求項５および６に記載の組成物。
【請求項８】
前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）が、円柱、スラブ、シート、網から選択されるいずれか１種の形状、または骨欠損に応じる他の形状を有する、請求項１〜７に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物が、外因的に提供された、骨細胞前駆細胞を含有する自家骨髄吸引物集団を更に含む、請求項１〜５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記組成物が、外因的に提供された、生体外で拡大された間葉系幹細胞の集団を更に含む、請求項１〜５に記載の組成物。
【請求項１１】
外因的に提供された、生体外で拡大された間葉系幹細胞の集団が、骨髄、脂肪組織、骨膜層または臍帯に由来し、自家性または免疫適合同種性である、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記組成物が、患者の隣接する局所骨、骨格筋および／または筋膜由来である、外因的に提供された細かい組織断片を更に含む、請求項１〜５に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、同種脱灰骨基質を更に含む、請求項１〜５に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、外因的に提供された多血小板血漿（ＰＲＰ）、フィブリンの微細構造ならびに／またはＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦおよびＴＧＦ−ベータから選択される成長因子用供給源を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が、逆相感熱性生分解性ポリマーを更に含む、請求項１〜５に記載の組成物。
【請求項１６】
前記逆相感熱性生分解性ポリマーが、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドブロック体から選択されるプルロナートである、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記骨形成タンパク質がＢＭＰ−６である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
自己血１ｍｌあたり、０．００２〜１ｍｇの骨形成タンパク質ＢＭＰ−６が存在する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
自己血１ｍｌあたり、０．００２〜１ｍｇの骨形成タンパク質ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せが存在する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が、注射可能、押出可能または移植可能である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物の調製方法であって、方法が、
（１）
ａ）自己血または前記自己血および多血漿（ＰＲＰ）もしくは多血小板血漿（ＰＲＰ）、
ｂ）ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質、
ｃ）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）ならびに
ｄ）血液凝固剤を組み合わせる工程と、
（２）凝塊ゲルを形成するのに十分な時間、工程（１）の成分をインキュベートする工程と、を含む、調製方法。
【請求項２２】
工程（２）の前に、更なる自家骨移植代替組成物成分が添加される、請求項２１に記載の調製方法。
【請求項２３】
前記方法が、
（１）
ａ）自己血、
ｂ）ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質、
ｃ）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）、
ｄ）血液凝固剤、
ｅ）任意選択的に、骨髄、脂肪組織、骨膜層もしくは臍帯に由来する、外因的に提供された、生体外で拡大された自家もしくは同種間葉系細胞の集団ならびに／または
ｆ）任意選択的に、脱灰骨基質を組み合わせる工程と、
２）凝塊ゲルを形成するのに十分な時間、工程（１）の成分をインキュベートする工程と、を含む、請求項２２に記載の調製方法。
【請求項２４】
前記方法が、
（１）
ａ）自己血、
ｂ）ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質、
ｃ）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）、
ｄ）血液凝固剤、
ｅ）逆相感熱性生体吸収性ポリマー、
ｆ）任意選択的に、骨髄、脂肪組織、骨膜層もしくは臍帯に由来する、外因的に提供された、生体外で拡大された自家もしくは同種間葉系細胞の集団ならびに／または
ｇ）任意選択的に、脱灰骨基質を組み合わせる工程と、
２）レオロジーを有する凝塊ゲルを形成するのに十分な時間、工程（１）の成分をインキュベートして、液相状態で室温にて注射され得、温度が体温に上昇するにつれて、送達／移植部位で生体適合性ゲルを形成する工程と、を含む、請求項２２に記載の調製方法。
【請求項２５】
新規骨形成が必要とされる骨欠損の処置、骨成長の促進および／またはこれらの処置を必要とする個体の特定部位で、骨を生成または再生するための手術時の誘導に使用するための、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
後側方固定術、前方椎体間固定術、成体の脊柱管狭窄症、成体の脊柱管狭窄症、外傷（脊椎再建術）、上顎頭蓋再建術または高位脛骨骨切り術を処置する際に使用するための、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
新規骨形成を誘導し、骨成長を促進し、骨欠損を処置するための自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）であって、前記組成物が、
（ｉ）自己血と、
（ｉｉ）ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質と、
（ｉｉｉ）血液凝固剤と、を含み、
前記自己血が、骨形成を行う骨形成タンパク質と、自己血液凝固剤とを含む、凝塊ゲルを形成する、自家骨移植代替組成物。
【請求項２８】
前記自己血が、多血小板血漿（ＰＲＰ）を更に含み、前記自己血と前記多血小板血漿（ＰＲＰ）との比率が、１：１、２：１および３：１であり、好ましくは１：１である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記自己血が、前記多血小板血漿（ＰＲＰ）の代用となる、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３０】
前記血液凝固剤が、イオン溶液中またはナノ粒子における薬理学的に許容可能なカルシウム塩およびＣａ＋＋マイクロスフェア複合体である、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３１】
前記組成物が、外因的に提供された、骨細胞前駆細胞を含有する自家骨髄吸引物集団を更に含む、請求項２７〜３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記組成物が、外因的に提供された、生体外で拡大された間葉系幹細胞の集団を更に含む、請求項２７〜３０に記載の組成物。
【請求項３３】
外因的に提供された、生体外で拡大された間葉系幹細胞の集団が、骨髄、脂肪組織、骨膜層または臍帯に由来し、自家性または免疫適合同種性である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記組成物が、患者の隣接する局所骨、骨格筋および／または筋膜由来である、外因的に提供された細かい組織断片を更に含む、請求項２７〜３０に記載の組成物。
【請求項３５】
前記組成物が、同種脱灰骨基質を更に含む、請求項２７〜３０に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組成物が、外因的に提供された多血小板血漿（ＰＲＰ）、フィブリンの微細構造ならびに／またはＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦおよびＴＧＦ−ベータから選択される成長因子用供給源を更に含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３７】
前記組成物が、逆相感熱性生分解性ポリマーを更に含む、請求項２７に記載の組成物。
【請求項３８】
前記逆相感熱性生分解性ポリマーが、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドブロック体から選択されるプルロナートである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記骨形成タンパク質がＢＭＰ−６である、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４０】
自己血１ｍｌあたり、０．００２〜１ｍｇの骨形成タンパク質ＢＭＰ−６が存在する、請求項３９に記載の組成物。
【請求項４１】
自己血１ｍｌあたり、０．００２〜１ｍｇの骨形成タンパク質ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せが存在する、請求項２７〜３８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記組成物が、注射可能、押出可能または移植可能である、請求項２７〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４３】
請求項２７〜４２のいずれか１項に記載の組成物の調製方法であって、方法が、
（１）
ａ）自己血または前記自己血および多血漿（ＰＲＰ）もしくは多血小板血漿（ＰＲＰ）、
ｂ）ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質、
ｄ）血液凝固剤、を組み合わせる工程と、
（２）凝塊ゲルを形成するのに十分な時間、工程（１）の成分をインキュベートする工程と、を含む、調製方法。
【請求項４４】
工程（２）の前に、更なる自家骨移植代替組成物成分が添加される、請求項４３に記載の調製方法。
【請求項４５】
前記方法が、
（１）
ａ）自己血、
ｂ）ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質、
ｄ）血液凝固剤、
ｅ）任意選択的に、骨髄、脂肪組織、骨膜層もしくは臍帯に由来する、外因的に提供された、生体外で拡大された自家もしくは同種間葉系細胞の集団ならびに／または
ｆ）任意選択的に、脱灰骨基質を組み合わせる工程と、
（２）凝塊ゲルを形成するのに十分な時間、工程（１）の成分をインキュベートする工程と、を含む、請求項４４に記載の調製方法。
【請求項４６】
前記方法が、
（１）
ａ）自己血、
ｂ）ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質、
ｄ）血液凝固剤、
ｅ）逆相感熱性生分解性ポリマー、
ｅ）任意選択的に、骨髄、脂肪組織、骨膜層もしくは臍帯に由来する、外因的に提供された、生体外で拡大された自家もしくは同種間葉系細胞の集団ならびに／または、
ｆ）任意選択的に、脱灰骨基質を組み合わせる工程と、
（２）レオロジーを有する凝塊ゲルを形成するのに十分な時間、工程（１）の成分をインキュベートして、液相状態で室温にて注射され得、温度が体温に上昇するにつれて、送達／移植部位で生体適合性ゲルを形成する工程と、を含む、請求項４４に記載の調製方法。
【請求項４７】
新規骨形成が必要とされる骨欠損の処置、骨成長の促進および／またはこれらの処置を必要とする個体の特定部位で、骨を生成または再生するための手術時の誘導に使用するための、請求項２７〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
長骨および脊椎に関連する偽関節症、脛骨癒合不全骨折、低ホスファターゼ症、骨形成不全症、Ｉ型神経線維腫症、非定型骨粗鬆症性骨折、歯科適応症、歯周組織修復、歯／骨インプラント、歯槽堤増大術、骨粗鬆症性骨折、非定型大腿骨骨折、椎骨骨折または橈骨遠位骨折の処置に使用するための、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
新規骨形成を誘導するためのインプラントの自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）であって、前記組成物が、
（ｉ）自己血と、
（ｉｉ）ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質と、
（ｉｉｉ）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）と、を含み、
前記自己血が、骨形成を行う骨形成タンパク質と、前記ＣＲＭとを含む、凝塊ゲルを形成する、自家骨移植代替組成物。
【請求項５０】
前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）が、移植骨および／またはリン酸カルシウム−炭酸カルシウム複合材料から成る群から選択される、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記リン酸カルシウム−炭酸カルシウム複合材料が、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）およびこれらの組合せから成る群から選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）の顆粒サイズが７４μｍから８ｍｍであり、前記顆粒サイズは骨欠損に応じる、請求項５０および５１に記載の組成物。
【請求項５３】
前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）が、円柱、スラブ、シート、網から選択されるいずれか１種の形状、または骨欠損に応じる他の形状を有する、請求項４９〜５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質が好ましくはＢＭＰ−６である、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５５】
自己血１ｍｌあたり、０．００２〜１ｍｇの前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６が存在する、請求項４９〜５３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５６】
自己血１ｍｌあたり、０．００２〜１ｍｇの前記ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せが存在する、請求項４９〜５３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５７】
前記組成物が移植可能である、請求項４９〜５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
新規骨形成を誘導するための自家骨移植代替組成物インプラントを調製するためのキットであって、
自己採血用の翼状針セット（６、７、８）と、
ゴムスリーブ（４）で保護された針（１）を含む凍結乾燥容器ホルダ（２）と、
前記翼状針セット（６、７、８）と前記凍結乾燥容器ホルダ（２）を接続する滅菌チューブ（５）と、
真空を解除するため、または前記自己血の流れを止めるためのチューブクランプ（３）と、
耐圧縮性基材（１２）（ＣＲＭ）と混合された凍結乾燥ＢＭＰ−６を収容するための、ゴム栓（９）を含む凍結乾燥容器（１０）と、を含む、キット。
【請求項５９】
前記耐圧縮性基材（１２）（ＣＲＭ）が、移植骨、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウムおよびこれらの組合せから成る群から選択される、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）の前記顆粒サイズが７４μｍから８ｍｍであり、前記顆粒サイズが骨欠損に応じる、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）が、円柱、スラブ、シートまたは網から選択されるいずれか１種の形状を有し、前記形状が骨欠損に応じる、請求項５８〜６０に記載のキット。
【請求項６２】
請求項４９〜５７のいずれか１項に記載の、新規骨形成を誘導するための自家骨移植代替組成物インプラントを調製するための方法であって、前記方法が、
（１）
ａ．自己血と、
ｂ．ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質と、
ｃ．移植骨、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウムおよびこれらの組合せから成る群から選択される、耐圧縮性基材（１２）（ＣＲＭ）と、を組み合わせる工程と、
（２）水溶液中の前記骨形成を行う骨形成タンパク質と前記耐圧縮性基材（１２）（ＣＲＭ）とを凍結乾燥容器（１０）中で混合する工程であって、前記耐圧縮性基材（１２）ＣＲＭに添加される骨形成を行う骨形成タンパク質水溶液の量が、前記耐圧縮性基材（１２）ＣＲＭを完全に濡らすように最適化される、混合する工程と、
（３）前記骨形成を行う骨形成タンパク質および前記耐圧縮性基材（１２）（ＣＲＭ）を凍結乾燥する工程と、
（４）自己血を添加する工程と、
（５）凍結乾燥した骨形成を行う骨形成タンパク質および前記耐圧縮性基材（１２）（ＣＲＭ）および自己血を、生体力学的に安定可能な血餅（１３）を前記凍結乾燥した骨形成を行う骨形成タンパク質と前記耐圧縮性基材（１２）（ＣＲＭ）の周辺に形成させるのに十分な時間、インキュベートする工程と、を含む、方法。
【請求項６３】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質が、好ましくはＢＭＰ−６である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
骨欠損であり、その処置を必要とする個体の特定部位で、新規骨形成が必要とされる骨欠損の処置時に使用するための、請求項４９〜５７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６５】
後側方固定術、前方椎体間固定術、成体の脊柱管狭窄症、成体の脊柱管狭窄症、外傷（脊椎再建術）、上顎頭蓋再建術または高位脛骨骨切り術を処置する際に使用するための、請求項６４に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組成物、組成物の調製方法およびインプラントの組成物を調製するためのキットに関する。当該組成物は、骨欠損の処置、新規骨形成の誘導および骨成長の促進に使用する「生体自家移植片」を模倣することができる。特定の態様では、本発明は、骨欠損の処置、新規骨形成の誘導および骨折治癒および脊椎固定術のための骨成長の促進用であり、整形外科および口腔顎顔面歯科手術の骨再建術における骨欠損を修復するための、注射可能／押出可能／移植可能な自家骨移植代替組成物（以下、略称ＡＢＧＳと呼ぶ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
骨移植は、新規骨の成長を促進して骨欠損を修復し、特定部位で骨成長を高め、隣接する骨の癒合を促進して再建させ、骨格構造の安定性を高め、病気に見舞われた個体が受けている背中および脚の疼痛を取り除くように設計された種々の外科手術で採用されている。多くの場合、外科手術では、椎弓根スクリュやロッドなどの任意の種々の器具使用と組み合わせて骨移植片を使用し、移植された骨移植片を固定し、新規骨が成長して欠損を補正する際の安定性を高める。
【０００３】
脊椎固定術は、主に、脊椎分節（椎骨−椎間板−椎骨）が損傷または炎症を起こした、個体の背中および脚の疼痛の原因を緩和するために使用される外科手術である。脊椎固定術中に、２つ以上の隣接する脊椎分節が癒合されて、分節間の動きと圧迫が制限される。これにより、疼痛や損傷した隣接分節の動きまたは圧迫に起因する更なる変性が終息または実質的に軽減される。したがって、脊椎固定術の所望の結果は、関節の線維軟骨性円板によって分けられている２つの椎骨の元の配置を、安定性があり、連続した耐荷重性の骨の分節に置き換えることであり、これにより、疼痛が軽減され、更なる分節の変性が緩和される（例えば、前方椎体間固定術、ＡＬＩＦ）。
【０００４】
疼痛を緩和させ、圧迫を避けるために脊椎を更に安定させることに加え、所与の分節（レベル）において、自家移植片を用いて、または失活同種移植片部分を用いて、または患者骨髄で濃縮されており、失活同種移植片粒子もしくは患者の骨髄を含有する同種脱灰骨基質（例えば、後側方固定術、ＰＬＦ）を用いて異所性部位に新しい機能的骨を形成することにより、両側における２つの横突起が癒合される。外科医は、動きの固定（関節固定）により２つの腰椎間を通る脊髄神経の圧迫が最小限に抑えられるといった理由から、前方（椎体）と後方（脊椎突起）の両方の腰椎分節の融合を支援するために、ケージ、スクリュ、ロッドなどの金属器具を使用する。癒合率を高めるために、骨移植によって器具使用は補充され、椎間部（前方椎体間固定術、ＡＬＩＦ）か、または横突起間の異所性部位（後側方固定術、ＰＬＦ）、またはその両方（後方椎体間固定術、ＰＬＩＦ）のいずれかにて骨形成を刺激する。例えば、Ｍｏｂｂｓ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｕｍｂａｒ  ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｐｔｉｏｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ＰＬＩＦ，ＴＬＩＦ，ＭＩ−ＴＬＩＦ，ＯＬＩＦ／ＡＴＰ，ＬＬＩＦ  ａｎｄ  ＡＬＩＦ．Ｊ  Ｓｐｉｎｅ  Ｓｕｒｇ  １：２−１８（２０１５）を参照されたい。変性椎間板疾患（ＤＤＤ）、脊椎すべり症、脊柱管狭窄症、脊柱側弯症、感染症、骨折、脊髄性筋萎縮症、および種々の腫瘍を含むがこれらに限定されない、種々の障害を脊椎固定術で処置してよい。
【０００５】
脊椎固定術では、隣接する椎骨を癒合するための新規骨成長を促進させるのに役立つ材料が必要である。何十年もの間、標準的な脊椎固定術では、患者臀部の腸骨稜から自家骨片（自家移植片）を採取するために、患者に追加の切開が必要であった。採取した骨片を患部の椎骨間領域に挿入し、椎弓根スクリュやロッドなどの適切な器具使用により安定させる。患者からの自家移植片を使用するこの脊椎固定術は、腸骨移植（以下、略称ＩＣＢＧと呼ぶ）とも呼ばれる。ＩＣＢＧを使用する利点は、採取した骨片が生体骨髄細胞および患者の体と免疫学的に適合する細胞外基質を有し、赤血球や白血球、巨核球などの機能的な骨髄要素が含まれていることである。ただし、ＩＣＢＧを利用するには、患者が追加の切開を受ける必要がある。自家移植片として使用する目的で骨を採取するための追加の切開は、外科手術を延長させ、結果、患者が麻酔下にある時間が延長し、別の部位に術後疼痛を抱える（例えばＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．９：８８６−９２；２００９を参照されたい）。また、患者に別の切開をもたらすことにより、感染症リスクが増大するため、現場では憂慮されてきた。更に、採取可能なＩＧＢＧの量は限られている。
【０００６】
患者に対し、そのような更なるリスクを低減するために、外科手術中の自家移植片の必要性を置き換えるために、多くの代替移植可能な組成物が開発および試験されてきた。そのような代替組成物には、同種移植片（例えば、骨バンクからの死体骨）、脱灰骨基質（ＤＢＭ）、種々のセラミックス（カルシウムベースの化合物）、合成ポリマー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）および動物由来コラーゲン足場と組み合わせたそれらの類似体およびそれらの種々の組合せを含んでよい。詳細については、Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ  Ｓ，Ｓａｍｐａｔｈ．ＫＴ．（ｅｄ）Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ中の、Ｇｕｐｔａ  Ｓ，Ｍ．Ｖ．，Ｇｕｐｔａ  ＭＣ（２０１７）Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｐｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｉｎ  ｓｐｉｎｅ  ｓｕｒｇｅｒｙを参照されたい。しかし、脊椎固定術のための自家移植片の代替品を開発する試みは、規制当局の承認を得るための独自の特定の課題に直面している。
【０００７】
ＩＮＦＵＳＥ（登録商標）骨移植／ＬＴ−ケージ腰椎用先細状癒合デバイス（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｏｆａｍｏｒ  Ｄａｎｅｋ，Ｍｅｍｐｈｉｓ，Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ，ＵＳＡ）は、骨格が成熟した患者に前方アプローチを使用し、Ｌ２〜Ｓ１のあるレベルでのＤＤＤ処置（椎骨−椎間板−椎骨、ＡＬＩＦ）用に、２００２年にＩＣＢＧ用代替物として承認された。ＩＮＦＵＳＥ（登録商標）骨移植コンポーネントは、前弯スレッド状（ＬＴ）ケージコンポーネントを充填するために使用される、吸収可能なウシアキレス腱由来コラーゲンスポンジ担体に適用される、ヒト骨形成タンパク質−２（ｒｈＢＭＰ−２）から構成される。各デバイスには、１２ミリグラムのｒｈＢＭＰ−２（総量）、６ｍｇで浸漬され、椎間板スペースへと挿入される２−ＬＴケージでそれぞれ充填される、コラーゲンシートのシートが含まれる。詳細については、ＩＮＦＵＳＥ骨移植製品情報の、Ｌｕｍｂａｒ．（２００２）Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｏｆａｍｏｒ  Ｄａｎｅｋ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｒｈ＿ｄｏｃｓ／ｐｄｆ／Ｐ００００５８ｃ．ｐｄｆ．２０１０年２月にアクセス、を参照されたい。承認された外科手術では、患部の椎骨レベルの各側にデバイスを移植し、分節の各側における癒合の安定化を促進する。種々の適応外後方アプローチにて、脊椎固定術を促進するデバイスの能力も、多くの研究の対象となっている。例えば、Ｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  ３０２：５８−６６（２００９）Ｃａｒｒａｇｅｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ  Ｊ  １１：４７１−４９１（２０１１）を参照されたい。ただし、適応外使用は、議会聴聞会とＦＤＡによる監視につながる、望ましくない安全性の懸念を生み出した。
【０００８】
ＡＭＰＬＩＦＹ（登録商標）骨移植代替製品（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ）は、当初、後側方アプローチ（ＰＬＦ）を使用した脊椎固定術のＩＣＢＧ代替物として設計および試験された。このＩＣＢＧ代替物は、多孔質合成スラブ中に４０ｍｇのｒｈＢＭＰ−２を送達した。これは、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）およびリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）複合材料のセラミックス顆粒を充填させたウシアキレス腱由来コラーゲンスポンジで構成されている。ＡＭＰＬＩＦＹ（登録商標）骨移植代替製品は、ＤＤＤ処置において中程度の脊椎固定術を提供したが、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、非常に多くの患者が腰痛および下肢痛に襲われ続けていることと、ｒｈＢＭＰ−２を比較的大容量投与することに関連する、考えられる癌リスクといった懸念と、デバイスで使用される高用量のＢＭＰ−２に基づく、インプラントから離れた部位における望ましくない異所性骨形成に見舞われ続けることと、を理由にこの製品の承認を拒否した。例えば、Ｐ０５００３６  Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ’ｓ  ＡＭＰＬＩＦＹ（商標）ｒｈＢＭＰ−２  Ｍａｔｒｉｘ  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｐａｎｅｌ（２０１０）Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎに関するエグゼクティブサマリを参照されたい。
【０００９】
ＯＰ−１（登録商標）インプラント（Ｏｌｙｍｐｕｓ／Ｓｔｒｙｋｅｒ）は、骨を再生するための移植可能なデバイスである。デバイスには、ウシ骨由来のＩ型コラーゲン内に分散された組換え型ヒトＢＭＰ−７（ｒｈＢＭＰ−７）が含有される。ＯＰ−１（登録商標）インプラントは、自家移植片よりも新規骨形成の統計的差異を得ることができないために自家移植片の使用を実施することが不可能であり、代替処置が失敗した場合、扱いにくい長骨癒合不全欠損における自家移植片に対する代替物として人道機器適用免除（ＨＤＥ）を使用することについてのみ、ＦＤＡの承認を受けた。例えば、Ｓｔｒｙｋｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＯＰ−１  Ｉｍｐｌａｎｔ（登録商標）ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（２００９）ｗｗｗ．ｓｔｒｙｋｅｒ．ｃｏｍ／ｓｔｅｌｌｅｎｔ／ｇｒｏｕｐｓ／ｐｕｂｌｉｃ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｗｅｂ＿ｐｒｏｄ／  １２６７３７．ｐｄｆ．２０１０年２月にアクセス、を参照されたい。
【００１０】
ＯＰ−１  Ｐｕｔｔｙ（登録商標）は、ｒｈＢＭＰ−７、ウシ骨コラーゲン、およびパテ添加剤（カルボキシメチルセルロース）を組み合わせた組成物である。ＯＰ−１  Ｐｕｔｔｙ（登録商標）デバイスは、後側方固定術（ＰＬＦ）臨床研究で評価されたが、自家移植片と比較して統計的差異も得られなかった。したがって、ＯＰ−１  Ｐｕｔｔｙ（登録商標）は脊椎固定術でのＨＤＥの使用が承認されている。例えば、Ｓｔｒｙｋｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＯＰ−１  Ｐｕｔｔｙ（登録商標）ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（２００９）ｗｗｗ．ｓｔｒｙｋｅｒ．ｃｏｍ／ｓｔｅｌｌｅｎｔ／ｇｒｏｕｐｓ／ｐｕｂｌｉｃ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｗｅｂ＿ｐｒｏｄ／１２７０２４．ｐｄｆ．２０１０年２月にアクセス、を参照されたい。
【００１１】
脊椎固定術における自家移植片の使用に加えて、自家移植片を使用して処置される種々の他の整形外科適応症および歯科適応症がある。そのような適応症には、骨幹部、橈骨遠位骨折、脛骨癒合不全骨折、高位脛骨骨切り術、骨粗鬆症性骨折（椎骨圧迫骨折、非定型大腿骨骨折）、骨嚢胞による欠損および骨腫瘍による欠損などの種々の欠損と骨折、また、種々の口腔、歯周組織および顎顔面の欠損および異常が含まれる。更に、自家移植片は、低ホスファターゼ症（組織非特異的アルカリホスファターゼ遺伝子の突然変異）、Ｉ型神経線維腫症（ニューロフィブロミン遺伝子の突然変異）、骨形成不全症（Ｉ型コラーゲン遺伝子の突然変異）など、稀少な筋骨格疾患に関連する偽関節症および偽性骨折を処置するためにも使用される。そのような状態での骨損失の重症度によっては、所望の処置を提供するには、患者から安全に得られ得る自家移植片の量は十分ではないか、または（危険な状態の喫煙者、糖尿病、ステロイド使用者および骨粗鬆症患者においては）骨の質を損なう可能性がある。こうした場合、欠損部位に限定される、安全で強固な骨形成を誘導可能である生物学的骨移植片代替物が大いに求められる。包括的な読解のため、Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ  Ｓ，Ｓａｍｐａｔｈ  ＴＫ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｆｒｏｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｂａｓｅｌ：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，２００２；Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ  Ｓ，Ｓａｍｐａｔｈ，ＫＴ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；２０１７が挙げられる。
これまで、患者は脊椎固定術および他の整形外科手術に対する自家移植手術を受けるための可能性のある選択肢は、ごく少数の製品に限られている。明らかに、患者を自家移植片手術に関連する追加のリスク、疼痛および制限にさらす必要なく、骨欠損の正常な修復および脊椎固定術に必要となる新規骨成長のレベルと品質を促進し得る、改善された組成物への必要性が存在している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｍｏｂｂｓ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｌｕｍｂａｒ  ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ：ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｂｏｄｙ  ｆｕｓｉｏｎ  ｏｐｔｉｏｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ＰＬＩＦ，ＴＬＩＦ，ＭＩ−ＴＬＩＦ，ＯＬＩＦ／ＡＴＰ，ＬＬＩＦ  ａｎｄ  ＡＬＩＦ．Ｊ  Ｓｐｉｎｅ  Ｓｕｒｇ．２０１５  １：２−１８
【非特許文献２】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ  Ｊ．９：８８６−９２；２００９
【非特許文献３】Ｇｕｐｔａ  Ｓ，Ｍ．Ｖ．，Ｇｕｐｔａ  ＭＣ（２０１７）  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｐｉｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  ｉｎ  ｓｐｉｎｅ  ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｉｎ：Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ  Ｓ，  Ｓａｍｐａｔｈ．  ＫＴ．（ｅｄ）  Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
【非特許文献４】Ｌｕｍｂａｒ．［ｏｎｌｉｎｅ］．Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｏｆａｍｏｒ  Ｄａｎｅｋ  ＵＳＡ，  Ｉｎｃ，２００２．［Ａｃｃｅｓｓｅｄ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１０］．＜ＵＲＬ：ｗｗｗ．ａｃｃｅｓｓｄａｔａ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｒｈ＿ｄｏｃｓ／ｐｄｆ／Ｐ００００５８ｃ．ｐｄｆ＞  ２０１０年２月にアクセス
【非特許文献５】Ｃａｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  ３０２：５８−６６  ２００９
【非特許文献６】Ｃａｒｒａｇｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｎｅ  Ｊ  １１：４７１−４９１  ２０１１
【非特許文献７】Ｐ０５００３６  Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ’ｓ  ＡＭＰＬＩＦＹ（商標）  ｒｈＢＭＰ−２  Ｍａｔｒｉｘ  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  ａｎｄ  Ｒｅｈａｂｉｌｉｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ａｄｖｉｓｏｒｙ  Ｐａｎｅｌ（２０１０）Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ
【非特許文献８】ＯＰ−１  Ｉｍｐｌａｎｔ（登録商標）  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ［ｏｎｌｉｎｅ］．Ｓｔｒｙｋｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００９．［Ａｃｃｅｓｓｅｄ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ２０１０］．＜ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｓｔｒｙｋｅｒ．ｃｏｍ／ｓｔｅｌｌｅｎｔ／ｇｒｏｕｐｓ／ｐｕｂｌｉｃ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｗｅｂ＿ｐｒｏｄ／  １２６７３７．ｐｄｆ＞  ２０１０年２月にアクセス
【非特許文献９】ＯＰ−１  Ｐｕｔｔｙ（登録商標）  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ［ｏｎｌｉｎｅ］．Ｓｔｒｙｋｅｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００９．＜ＵＲＬ：ｗｗｗ．ｓｔｒｙｋｅｒ．ｃｏｍ／ｓｔｅｌｌｅｎｔ／ｇｒｏｕｐｓ／ｐｕｂｌｉｃ／ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ｗｅｂ＿ｐｒｏｄ／１２７０２４．ｐｄｆ＞  ２０１０年２月にアクセス
【非特許文献１０】Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ  Ｓ，Ｓａｍｐａｔｈ  ＴＫ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｆｒｏｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｂａｓｅｌ：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，２００２
【非特許文献１１】Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ  Ｓ，Ｓａｍｐａｔｈ，ＫＴ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；２０１７
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明は、処置を必要とする個体の部位での新規骨成長の促進に使用するためのＩＣＢＧの模倣物として機能する自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）を提供することにより、背景技術で示される問題を解決する。特定の態様では、本発明は、骨欠損の処置、新規骨形成の誘導および骨折治癒、脊椎固定術のための骨成長の促進に使用し、ならびに整形外科および口腔顎顔面歯科手術の骨再建術にて骨欠損を修復するための、注射可能／押出可能／移植可能な自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
一実施形態では、本発明は、新規骨成長を促進するための自家移植片代替物である自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）を提供し、
１）自己血（ＡＢ）、
２）骨形成を行う骨形成タンパク質（ＢＭＰ）および
３）イオン溶液中またはナノ粒子における薬理学的に許容可能なカルシウム塩およびＣａ＋＋マイクロスフェア複合体から選択される血液凝固剤および
４）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）を含み、
自己血は、骨形成を行う骨形成タンパク質、カルシウム塩および耐圧縮性基材（以下、略称ＣＲＭと呼ぶ）を含む、凝塊ゲルを形成する。
【００１５】
骨形成を行う骨形成タンパク質は、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体ならびにこれらの組合せから選択される。非常に好適には、骨形成を行う骨形成タンパク質はＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７であり、好ましくはＢＭＰ−６である。
【００１６】
更に、自己血（以下略称ＡＢと呼ぶ）は、自己または同種多血小板血漿（以下略称ＰＲＰと呼ぶ）を含むことができ、または自己血（ＡＢ）は、多血小板血漿（ＰＲＰ）で代用されてよい。
【００１７】
耐圧縮性基材（ＣＲＭ）は、移植骨、リン酸カルシウム−炭酸カルシウム複合材料、生体吸収性ポリマーまたはコポリマー、硫酸カルシウム、生体吸収性ヒドロゲル、およびそれらの組合せから成る群から選択される。
【００１８】
本発明の別の実施形態では、骨欠損を処置し、新規骨形成を誘導し、骨成長を促進するための自家骨移植代替組成物は、
１）自己血、
２）ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体ならびにこれらの組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質および
３）イオン溶液中またはナノ粒子における薬理学的に許容可能なカルシウム塩およびＣａ＋＋マイクロスフェア複合体から選択される血液凝固剤を含み、
ここで、自己血は、骨形成を行う骨形成タンパク質およびカルシウム塩を含む凝塊ゲルを形成する。
【００１９】
好適には、骨形成を行う骨形成タンパク質はＢＭＰ−６またはＢＭＰ−７であり、好ましくはこれはＢＭＰ−６である。
【００２０】
更に、自己血（ＡＢ）は、自己または同種多血小板血漿（ＰＲＰ）を含んでもよく、または自己血（ＡＢ）は自己多血小板血漿（ＰＲＰ）で代用されてよい。
【００２１】
本発明の別の実施形態では、新規骨形成を誘導し、骨成長を促進するためのインプラントの自家骨移植代替組成物は、
１）自己血、
２）ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体ならびにその組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質および
３）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）を含み、
ここで、自己血は、骨形成を行う骨形成タンパク質およびＣＲＭを含む凝塊ゲルを形成する。
【００２２】
好適には、骨形成を行う骨形成タンパク質はＢＭＰ−６である。骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６の代わりに、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質を使用し得る。
【００２３】
好ましくは、耐圧縮性基材（ＣＲＭ）は、移植骨および／またはリン酸カルシウム−炭酸カルシウム複合材料から成る群から選択される。
【００２４】
別の実施形態では、本発明は、新規骨形成を誘導するための自家骨移植代替組成物インプラント調製用キットを提供する。
【００２５】
別の実施形態では、本明細書に記載の自家骨移植代替組成物は、骨細胞前駆細胞を含有する患者の骨髄吸引物の、外因的に提供された集団を更に含んでよい。
【００２６】
別の実施形態では、本明細書に記載の自家骨移植代替組成物は、患者の骨髄からの生体外で拡大された間葉系幹細胞（骨細胞前駆細胞）の、外因的に提供された集団を更に含んでよい。
【００２７】
別の実施形態では、本明細書に記載の自家骨移植代替組成物は、患者の脂肪組織からの生体外で拡大された間葉系幹細胞（骨細胞前駆細胞）の、外因的に提供された集団を更に含んでよい。
【００２８】
別の実施形態では、本明細書に記載の自家骨移植代替組成物は、患者の骨膜層（骨膜）からの生体外で拡大された間葉系幹細胞（骨細胞前駆細胞）の、外因的に提供された集団を更に含んでよい。
【００２９】
別の実施形態では、本明細書に記載の自家骨移植代替組成物は、患者の隣接する局所骨、好適な骨格筋および／または筋膜から調製された、外因的に提供された、細かい組織断片を更に含んでよい。
【００３０】
別の実施形態では、本明細書に記載の自家骨移植代替組成物は、患者の免疫適合個体からの同種骨髄または脂肪組織または骨膜に由来する生体外で拡大された間葉系幹細胞（骨細胞前駆細胞）の、外因的に提供された集団を更に含んでよい。
【００３１】
別の実施形態では、本明細書に記載の自家骨移植代替組成物は、同種の臍帯から誘導され、生体外で拡大された間葉系幹細胞（骨細胞前駆細胞）の、外因的に提供された集団を更に含んでよい。
【００３２】
別の実施形態では、本明細書に記載の自家骨移植代替組成物は、同種または外因的に提供された、患者の多血小板血漿（ＰＲＰ）、フィブリンの微細構造および成長因子（例えば、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＶＥＧＦおよびＴＧＦ−ベータ）用の供給源を更に含んでよい。
【００３３】
別の実施形態では、耐圧縮性基材（ＣＲＭ）として本明細書に記載の自家骨移植代替組成物は、移植骨（例えば、皮質骨または海綿骨または両方から調製）、リン酸カルシウム−炭酸カルシウム複合材料（以下、略称でセラミックスと呼ぶ）、感熱性生体吸収性ポリマーまたはコポリマー（例えば、ラクチドまたはグリコリドのポリマーおよびコポリマーならびにそれらの組合せ）、硫酸カルシウム、生体吸収性ヒドロゲルおよびこれらの組合せから成る群から選択される。当該リン酸カルシウム−炭酸カルシウム複合材料は、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、およびＴＣＰ／ＨＡ複合体から成る群から選択される。
【００３４】
更に別の実施形態では、本明細書に記載の自家骨移植代替組成物は、同種の脱灰骨基質を更に含んでよい。
【００３５】
本発明の別の実施形態では、本明細書に記載の自家骨移植代替組成物は、逆相感熱性生体吸収性ポリマーを更に含み得る骨移植片代替物を更に含んでよい。当該逆相感熱性生体吸収性ポリマーは、自己血（ＡＢ）に混合されてよい。これは、ＡＢ、ＢＭＰおよびＣＲＭを含む組成物のレオロジーを仮定している。その結果、液相状態で室温にて注射され得、温度が体温（３７℃）に上昇するにつれて送達／移植部位で生体適合性ゲルを形成する。したがって、組成物は、ＢＭＰ、ＣＲＭおよび自己血内の逆相感熱性生体吸収性ポリマーを含有する、非侵襲性の注射可能な組成物を提供する。この製剤は、例えば注射により非侵襲的に投与し得、したがって現在市販されている個体の骨移植片代替物に関連する制限を克服することができる。注射可能なＡＢＧＳは、異所性骨形成の標準的なラットモデルで、新規骨形成を効果的に誘導する。この注射可能な組成物により、持続可能な間、体温にて逆相感熱性生体吸収性ポリマーによって保持される血漿タンパク質と強固に結合するため、比較的低いＢＭＰ濃度にて新規骨形成が可能となる。
【００３６】
別の実施形態では、本発明は、骨欠損を処置し、新規骨形成を誘導し、骨成長を促進するための自家骨移植代替組成物の調製方法を提供し、この方法は、
（１）
ａ）自己血（ＡＢ）、または自己血と多血小板血漿（ＰＲＰ）または多血小板血漿（ＰＲＰ）、
ｂ）ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体ならびにこれらの組合せから選択される骨形成を行う骨形成タンパク質、
ｃ）イオン溶液中またはナノ粒子における薬理学的に許容可能なカルシウム塩およびＣａ＋＋マイクロスフェア複合体から選択される血液凝固剤および
ｄ）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）を組み合わせる工程と、
（２）凝塊ゲルを形成するのに十分な時間、工程（１）の成分をインキュベートする工程と、を含む。
【００３７】
別の実施形態では、工程（２）の前に、更なる成分が追加される。
【００３８】
別の実施形態では、本発明は、骨欠損を処置し、新規骨形成を誘導し、骨成長を促進するための自家骨移植代替組成物の調製方法を提供し、ＡＢＧＳは、
（１）
ａ）自己血、
ｂ）ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２およびＢＭＰ−１３、これらのヘテロ二量体ならびにその組合せから選択される、骨形成を行う骨形成タンパク質、
ｃ）イオン溶液中またはナノ粒子における薬理学的に許容可能なカルシウム塩およびＣａ＋＋マイクロスフェア複合体から選択される血液凝固剤、
ｄ）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）、
（ｄ）任意選択的に、骨髄、脂肪組織、骨膜層および／もしくは臍帯に由来する、生体外で拡大された自家または同種間葉系細胞（骨細胞前駆細胞）の外因的に提供された集団、ならびに／または
（ｅ）任意選択的に、脱灰骨基質を結合することと、
（２）凝塊ゲルを形成するのに十分な時間、工程（１）の成分をインキュベートすることと、を含む、工程によって調製される。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、骨欠損を処置し、新規骨形成を誘導し、骨成長を促進するための自家骨移植代替組成物の調製方法を提供し、ＡＢＧＳは、
（１）
ａ）自己血、
ｂ）骨形成を行う骨形成、
ｃ）イオン溶液中またはナノ粒子における薬理学的に許容可能なカルシウム塩およびＣａ＋＋マイクロスフェア複合体から選択される血液凝固剤、
ｄ）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）、
（ｄ）逆相感熱性生体吸収性ポリマー、
（ｅ）任意選択的に、骨髄、脂肪組織、骨膜層もしくは臍帯に由来する、生体外で拡大された自家または同種間葉系細胞（骨細胞前駆細胞）の外因的に提供された集団、および／または
（ｆ）任意選択的に、脱灰骨基質を結合することと、
（２）レオロジーを有する凝塊ゲルを形成するのに十分な時間、工程（１）の成分をインキュベートして、液相状態で室温にて注射され得、温度が体温（３７℃）に上昇するにつれて、送達／移植部位で生体適合性ゲルを形成することと、を含む工程によって調製される。
【００４０】
本明細書に記載のＡＢＧＳは、骨欠損の部位または新規骨成長を必要とする部位（例えば、脊椎固定術、骨格補強）に移植または注射（例えば、注射器を使用）されてよい。
【００４１】
好ましくは、本明細書に記載のＡＢＧＳ組成物に有用な骨形成を行うＢＭＰは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体、およびその組合せから成る群から選択される。より好ましくは、骨形成性ＢＭＰはＢＭＰ−６である。
【００４２】
別の実施形態では、骨形成性ＢＭＰは、本明細書に記載のＡＢＧＳ中に、自己血１ミリリットル（ｍｌ）あたり、０．００２ｍｇ〜１ｍｇの範囲の量の、骨形成を行うタンパク質ＢＭＰ（好ましくはＢＭＰ−６）が存在する。
【００４３】
別の実施形態では、本明細書に記載のＡＢＧＳは、移植骨、リン酸カルシウム−炭酸カルシウム複合材料、生体吸収性ポリマーまたはコポリマー、およびそれらの組合せから成る群から選択される耐圧縮性基材（ＣＲＭ）を含む。好ましくは、リン酸カルシウム−炭酸カルシウム組成物は、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、およびそれらの組合せから成る群から選択される。
【００４４】
別の実施形態では、本発明は、
自己血採血用の翼状針セットと、
ゴムスリーブで保護された針を含む、凍結乾燥容器ホルダと、
翼状針と凍結乾燥容器ホルダを接続する滅菌チューブと、
真空を解除するか、または血流を止めるためのチューブクランプと、
ＣＲＭと混合された凍結乾燥された骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰを有する、ゴム栓付きの凍結乾燥容器と、を含み、
ＣＲＭは、移植骨、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、およびこれらの組合せから成る群から選択され、骨形成を行う骨形成タンパク質はＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せから選択される、新規骨形成を誘導するためのＡＢＧＳインプラントを調製するためのキットを提供する。好ましくは、骨形成を行う骨形成タンパク質はＢＭＰ−６である。
【００４５】
別の実施形態では、本発明は、新規骨形成を誘導するためのＡＢＧＳインプラントを調製する方法を提供し、この調製方法は、
（１）
ａ．自己血、
ｂ．ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−８、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらの類似体、これらのヘテロ二量体ならびにこれらの組合せから選択される骨形成を行う骨形成タンパク質、
ｃ．移植骨、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、およびそれらの組合せから成る群から選択される、耐圧縮性基材（ＣＲＭ）を組み合わせる工程と、
（２）水溶液中の骨形成を行う骨形成タンパク質を凍結乾燥バイアル中のＣＲＭと混合し、ＣＲＭに添加される骨形成を行う骨形成タンパク質水溶液の量は、ＣＲＭを完全に濡らすように最適化される、混合する工程と、
（３）骨形成を行う骨形成タンパク質およびＣＲＭを凍結乾燥させる工程と、
（４）自己血を追加する工程と、
（５）ＣＲＭの周囲に生体力学的に安定した血餅を形成するのに十分な時間、工程（１）の成分をインキュベートする工程と、を含む。
【００４６】
好ましくは、骨形成を行う骨形成タンパク質はＢＭＰ−６である。
【００４７】
本明細書に記載の自家骨移植代替組成物はまた、新規骨形成または成長が必要とされる種々の骨欠損のいずれかの処置にも使用されてもよい。本明細書に記載のＡＢＧＳを使用することで処置され得る、こうした骨欠損には、骨幹部骨折、橈骨遠位骨折、脛骨癒合、骨粗鬆症性骨折、骨嚢胞欠損（例えば、新規骨を生成し、以前に嚢胞により占有されていた空隙を充填する必要がある場合）、骨腫瘍欠損（例えば、癌によって失われた骨または外科手術によって除去された骨を置き換えるために、新規骨を生成する必要がある場合）、偽関節症および先天性骨格疾患（例、低ホスファターゼ症、Ｉ型神経線維腫症、骨形成不全症）に関連する偽性骨折、骨粗鬆症性骨折（例えば、椎骨圧迫骨折、非定型骨幹骨折）、口腔骨欠損（例えば、種々の歯欠損）、歯周組織欠損、および顎顔面欠損または異常（顎、顔および頭の骨の補強を含む）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書に記載の「自家骨移植代替物」（ＡＢＧＳ）はまた、脊椎固定術、高位脛骨骨切り術および顎顔面補強を含むがこれらに限定されない種々の整形外科および歯科適応症のいずれにおいても、新規骨成長を促進するために使用されてもよい。ＡＢＧＳでは、ＢＭＰは自己血液凝固物と組み合わせられる。その後、新規骨組織の形成を誘導するため、耐圧縮性基材で強化される。ＢＭＰ−６は好ましいＢＭＰである。これはＢＭＰアンタゴニストであるノギン（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．；２８５（１６）：１２１６９−８０（２０１０））にしっかりと結合しないためであり、骨内に豊富に存在する。これはまた、大半の信号用ＢＭＰ−６のタイプＩおよびタイプＩＩ受容体（ＢＭＰ２およびＢＭＰ７とは異なる）に結合する。自己血液凝固物（ＡＢＣ）は、多くの血漿タンパク質がＢＭＰ６に強固に結合し、７〜１０日間にわたってＢＭＰ６の持続的かつ直線的な放出をもたらすため、ＢＭＰの送達に好ましい基質である。ＡＢＣは、土台として動物由来のコラーゲンにＢＭＰを移植した場合に見られる炎症とは際立って対照的に、ＣＲＭの存在下で炎症や免疫応答を引き起こすことなく、骨形成の許容環境もまた提供する。更に、自己血には骨細胞前駆細胞（間葉系幹細胞）が含有されており、これは凝塊形成中にＢＭＰ−６に容易に応答し、移植部位で新規骨形成を開始する。
【００４９】
上記のような自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）は、閉経後または老人性またはステロイド誘発性骨減少症に罹患している重度骨減少症患者の大腿骨頭および椎体の骨密度を高めるためにも使用されてよい。これらの重度骨減少症患者は、転倒時に股関節および椎骨の骨折に見舞われることがある。こうした患者においては、骨成長を促進し、大腿骨頭と椎体の骨密度を高めるために、少量のＡＢＧＳを、少量の体積でもって複数の部位で海綿骨へと注射されてよい。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】方法＃２または＃３によって調製されたＡＢＧＳの顕微鏡写真およびボランティアからのヒト血液由来のＣＲＭを示す。組織骨バンクからのヒト同種移植片はＣＲＭとして使用される。左は全体図、中央はＸ線、右はマイクロＣＴスキャンである。
【図２Ａ】（同種移植片／ドナー由来の同種骨を含有する自己血液凝固物）ＡＬＬＯプラスＡＢＣインプラントおよびＡＢＣ＋ＡＬＬＯ＋ｒｈＢＭＰ６インプラントの７日目および３５日目の組織学的観察を示す。
【図２Ｂ】（同種移植片／ドナー由来の同種骨を含有する自己血液凝固物）ＡＬＬＯプラスＡＢＣインプラントおよびＡＢＣ＋ＡＬＬＯ＋ｒｈＢＭＰ６インプラントの７日目および３５日目の組織学的観察を示す。
【図２Ｃ】７日目および３５日目のインプラントによるＡＢＣ／ＡＬＬＯおよびＡＢＧＳ（ＡＢＣ／ＡＬＬＯ／ｒｈＢＭＰ６）のマイクロＣＴ分析を示す。
【図２Ｄ】７日目および３５日目のインプラントによるＡＢＣ／ＡＬＬＯおよびＡＢＧＳ（ＡＢＣ／ＡＬＬＯ／ｒｈＢＭＰ６）のマイクロＣＴ分析を示す。
【図２Ｅ】ラット皮下インプラントの７日目および３５日目における、ＡＢＣプラスＡＬＬＯおよびＡＢＣ＋ＡＬＬＯ＋ｒｈＢＭＰ６に対しマイクロＣＴ分析を用いて定量化した、同種移植片体積および骨体積を示したグラフである。
【図２Ｆ】ラット皮下インプラントの７日目および３５日目における、ＡＢＣプラスＡＬＬＯおよびＡＢＣ＋ＡＬＬＯ＋ｒｈＢＭＰ６に対しマイクロＣＴ分析を用いて定量化した、同種移植片体積および骨体積を示したグラフである。
【図３Ａ】ラット皮下部位に移植された同種移植片（ＡＬＬＯ）を含有する自己血液凝固物による、組織構造の顕微鏡写真を示す。
【図３Ｂ】ＡＬＬＯ粒子がラット皮下部位に移植されたＡＢＣ内に処方された際の、組織構造の顕微鏡写真を示す。
【図３Ｃ】ＡＢＣ＋ＡＬＬＯ＋ｒｈＢＭＰ６、ＡＬＬＯ粒子を含有するインプラントが、ラット皮下部位で処方および移植された際の組織構造の顕微鏡写真を示す。
【図３Ｄ】ＡＬＬＯ、ＡＬＬＯ＋ＡＢＣおよびＡＬＬＯ＋ＡＢＣ＋ｒｈＢＭＰ６インプラントによる３つの代表的な組織構造区分から形態計測学的に集計された、平均数の多核ＦＢＧＣを示したグラフを示す。
【図３Ｅ】酸性ホスファターゼ染色の免疫組織染色によって特徴付けられる組織構造の顕微鏡写真を示す。
【図３Ｆ】酸性ホスファターゼ染色の免疫組織染色によって特徴付けられる組織構造の顕微鏡写真を示す。
【図４Ａ】同種移植片なしおよび２つの異なる粒子サイズの同種移植片ありのＡＢＧＳから放出されたｒｈＢＭＰ６の量を示すグラフである。
【図４Ｂ】同種移植片なしおよび２つの異なる粒子サイズの同種移植片ありのＡＢＧＳからのｒｈＢＭＰ６の累積放出を示すグラフである。
【図４Ｃ】同種移植片なしおよび２つの異なる粒子サイズの同種移植片ありのＡＢＧＳからのｒｈＢＭＰ６の累積放出を示すグラフである。
【図５】６週目、９週目、１３週目、１６週目、１９週目および２３週目に表される、再現性があるよう誘導されたウサギ尺骨内の新規骨形成、および用量依存的様式で放射線撮影法により測定された再建済臨界サイズ欠損を示す。
【図６Ａ】用量依存的な応答を示す、Ｘ線写真および各マイクロＣＴウサギ尺骨分析を示す。
【図６Ｂ】図６ＡのＸ線によるＸ線スコアリングを示す。
【図６Ｃ】用量依存的な応答を示す、Ｘ線写真および各マイクロＣＴウサギ尺骨分析を示す。
【図６Ｄ】髄管および欠損の骨体積の形態計測的分析を示す。
【図７】異なるｒｈＢＭＰ６用量でのウサギ尺骨欠損の組織構造区分を示す。
【図８Ａ】６週目と２週目に表される、コラーゲン中のｒｈＢＭＰ７で処置されたウサギ尺骨および自己血液凝固物（ＡＢＣ）中のｒｈＢＭＰ６で処置されたウサギ尺骨の、Ｘ線写真を示す。
【図８Ｂ】６週目と２週目に表される、コラーゲン中のｒｈＢＭＰ７で処置されたウサギ尺骨および自己血液凝固物（ＡＢＣ）中のｒｈＢＭＰ６で処置されたウサギ尺骨ならびにコラーゲンのみで処置されたウサギ尺骨の、Ｘ線スコアを示すグラフを示す。
【図８Ｃ】６週目と２週目に表される、コラーゲン中のｒｈＢＭＰ７で処置されたウサギ尺骨および自己血液凝固物（ＡＢＣ）中のｒｈＢＭＰ６コラーゲンのみで処置されたウサギ尺骨の、骨体積（ＢＶ）を示すグラフを示す。
【図８Ｄ】ノギンによる、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７の活性を示すグラフを示す。
【図９】ウサギの後側方固定術（ＰＬＦ）の脊椎固定術用ＡＢＣ単独およびＡＢＣプラスＡＬＬＯグループと比較した、ＡＢＣ１ｍｌあたりの種々の用量のｒｈＢＭＰ６にて、ＡＬＬＯありおよびＡＬＬＯなしのＡＢＣＳのＸ線写真、マイクロＣＴ写真および肉眼形態写真を示す。
【図１０Ａ】マイクロＣＴ分析により測定される骨体積、骨梁数および骨梁相互連結性の定量的測定を示すグラフを示す。
【図１０Ｂ】マイクロＣＴ分析により測定される骨体積、骨梁数および骨梁相互連結性の定量的測定を示すグラフを示す。
【図１０Ｃ】マイクロＣＴ分析により測定される骨体積、骨梁数および骨梁相互連結性の定量的測定を示すグラフを示す。
【図１０Ｄ】マイクロＣＴ分析により測定される骨体積、骨梁数および骨梁相互連結性の定量的測定を示すグラフを示す。
【図１１Ａ】ＡＢＧＳインプラントの組織構造を示す。これは、新規に形成された骨と固有の横突起との間にある界面での、典型的なリモデリングと骨統合を伴う新規骨形成を示す。
【図１１Ｂ】０日目と比較して、ＡＢＧＳＳ移植後２１日目にＡＢＣ／ｒｈＢＭＰ６インプラントで処置されたウサギ血清の組織構造を示す。
【図１２Ａ】同種骨移植ならびに同種骨移植および器具使用により、６２．５μｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ６および１８７．５μｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ６で処置されたヒツジの脊椎固定術のＸ線写真を示す。
【図１２Ｂ】μＣＴスキャン後の同じヒツジの標本を示す。
【図１２Ｃ】脊椎固定術の骨体積（Ｃ）、骨梁数（Ｄ）、骨梁間隙（Ｅ）および連結密度（Ｆ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１２Ｄ】脊椎固定術の骨体積（Ｃ）、骨梁数（Ｄ）、骨梁間隙（Ｅ）および連結密度（Ｆ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１２Ｅ】脊椎固定術の骨体積（Ｃ）、骨梁数（Ｄ）、骨梁間隙（Ｅ）および連結密度（Ｆ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１２Ｆ】脊椎固定術の骨体積（Ｃ）、骨梁数（Ｄ）、骨梁間隙（Ｅ）および連結密度（Ｆ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１３Ａ】新規に形成された骨が腰椎横突起（白矢印）と完全に統合された肉眼形態のヒツジ脊椎固定術の標本を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｃ〜図１３Ｅの形態計測パラメータを中で測定した、腰椎（白色ボックス）、横突起（黒色ボックス）および横突起間に新規に形成された骨（灰色ボックス）の両側の四角形領域を示す。新規に形成された骨を有する横突起を完全に統合した、より正確な横断面区分が、図１３Ｂの右パネルに示される（白矢印）。
【図１３Ｃ】骨体積（Ｃ）、骨梁の形態（Ｄ）および骨厚さ（Ｅ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１３Ｄ】骨体積（Ｃ）、骨梁の形態（Ｄ）および骨厚さ（Ｅ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１３Ｅ】骨体積（Ｃ）、骨梁の形態（Ｄ）および骨厚さ（Ｅ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１４】外科手術の１１週間後のヒツジにおける、前方椎体間固定術（ＡＬＩＦ）モデルのＸ線およびμＣＴスキャンを示す。
【図１５】ＢＭＰ６結合のための血液凝固容積を示す。
【図１６】Ｅｌｉｓａアッセイで測定された、ＢＭＰ導入セラミックスからのＢＭＰの放出、および３日間隔での、ＡＢＣ添加の放出時の影響を示す。
【図１７】新規骨形成を誘導するためのＡＢＧＳ調製用キットの概略斜視図を示す。
【図１８】新規骨形成を誘導するためのＡＢＧＳ調製用キットの概略側面図を示す。
【図１９】凍結乾燥内容物（ＢＭＰ＋ＣＲＭ）を含む凍結乾燥容器を示す。
【図２０】凍結乾燥ｒｈＢＭＰ−６および耐圧縮性基材の周囲に形成された、機械的に安定した血餅を含む凍結乾燥容器を示す。
【図２１】ラットの皮下部位にｒｈＢＭＰ６とともにＡＢＣに移植され、１日目、３日目、７日目および３５日目に分析されたリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）を示す。３５日目には、ＴＣＰ粒子間に新規骨が形成された（最後の段）。
【図２２】新規に形成された骨が、骨に関してＴＣＰ置換の兆候を示すＴＣＰ粒子を取り囲むことを示す（クリーピング置換）（白矢印）、３５日目の図２１による高倍率インプラントを示す。
【図２３】２ｍｌのラット血液から調製され、ＢＭＰ６を有さない、５または２０μｇのＢＭＰ６を有する、ラット皮膚下に移植された多血小板血漿（ＰＲＰ）ゲルを示す。ＢＭＰ６濃縮ＰＲＰサンプル中の新規に形成された骨は、白色円で印がつけられている。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
本発明は、骨欠損の処置、新規骨形成の誘導、および所望の部位での新規骨成長の促進に使用するための自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）を提供する。本発明によるＡＢＧＳは、その処置を必要とする個体の特定部位にて、骨を生成または修復する手術で自家移植片の代わりに有利に使用されてよい。本発明の一実施形態によるＡＢＧＳは、自己血のサンプル、骨形成を行う骨形成タンパク質（好ましくはＢＭＰ−６）および耐圧縮性基材（ＣＲＭ）を含む一連の成分を組み合わせる（混合する）ことによって形成される。当該成分は、凝塊ゲルを形成するのに十分な時間インキュベートされる。本発明の別の実施形態によるＡＢＧＳは、最初に特定の幾何学的形状（例えば、粒子、円柱またはスラブ）の耐圧縮性基材上に骨形成を行う骨形成タンパク質（好ましくはＢＭＰ−６）を沈殿または凍結乾燥させることにより製剤化されてよい。自己血を添加し、骨形成を行う骨形成タンパク質とＣＲＭの、凍結乾燥された組合せの周りに生体力学的に安定した血餅を形成するのに十分な時間、インキュベートする。
【００５２】
本発明の更なる実施形態によるＡＢＧＳは、自己血のサンプル、骨形成を行う骨形成タンパク質（好ましくはＢＭＰ−６）および血液凝固剤を含む一連の成分を組み合わせる（混合する）ことにより形成される。
【００５３】
本発明によれば、本明細書に記載のＡＢＧＳは、新規骨成長の必要性または所望の部位に容易に移植または注射されるか、さもなければ適用され得る。
【００５４】
自家骨移植代替物（ＡＢＧＳ）は、本質的に「生体自家移植片」を次のように模倣する。
１）これは、炎症性サイトカインストームおよび異物反応を引き起こさない、自己血を使用する。この理由は、（粒子、円柱またはスラブのいずれかとして）耐圧縮性基材表面をマスキングし、Ｔ細胞による異物認識を遮断する（例えば、異所性部位における高ミネラル内容物のセラミックス）。
２）これは、直ちにＢＭＰに応答する血液凝固物中に捕捉される循環骨前駆細胞を提供する。
３）これは、組換え型ＢＭＰに対し免疫応答するためのアジュバントとして作用する可能性がある従来の動物由来コラーゲンとは異なり、抗体の生成を伴う免疫応答を引き起こさない。
４）これにより、ＢＭＰは、フィブリンの微細構造内で血漿タンパク質と強固に結合することができるが、一方でＢＭＰは局所にて使用可能なままであるか、または数日にわたり移植部位にてゆっくりと放出され、骨形成応答のために動員された間葉系幹細胞上のＢＭＰ受容体を活性化させる。
５）移植片中の耐圧縮性基材粒子は生体適合性であり、良好な取扱特性をも提供する。更に、ミネラル内容物（ハイドロキシアパタイト）は、新規に形成された骨に置換されるにつれ、クリーピング置換を受ける。
６）ＢＭＰ−６は好ましいＢＭＰである。これは、骨内に豊富に存在する、天然のＢＭＰアンタゴニストであるノギン（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．；２８５（１６）：１２１６９−８０（２０１０））にしっかりと結合しないためである。したがって、これにより、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７と比較して、安全性への懸念を低減し、かつクリニックにて度を超える用量で使用することを避け、低用量での使用が可能となる。
【００５５】
本発明の別の実施形態によるＡＢＧＳは、自己血のサンプル、骨形成を行う骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、耐圧縮性基材（ＣＲＭ）および逆相感熱性生体吸収性ポリマーのサンプルを含む一連の成分を組合せ（混合させ）、レオロジーを有する凝塊ゲルを形成するのに十分な時間、該成分をインキュベートして、組成物を液相状態で室温にて注射し得、温度が体温（３７℃）に上昇するにつれて、送達／移植部位で生体適合性ゲルを形成することにより、製剤化されてよい。
【００５６】
本発明をより明確に理解するために、以下の用語を定義する。用語「骨形成タンパク質」、「ＢＭＰ」、「骨形成を行うＢＭＰ」、および「モルフォゲン」は同義語であり、タンパク質の形質転換成長因子−□（ＴＧＦ−□）スーパーファミリー（例えば、Ｍａｓｓａｇｕｅ  Ｊ（１９９８）ＴＧＦ−β  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６７：７５３−７９１；Ｓａｍｐａｔｈ  ＴＫ，Ｒｕｅｇｅｒ  ＤＣ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１（ＯＰ−１）．Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ  ９：１０１−１０７（１９９４）、米国特許第４，９６８，５９０号、米国特許第５，０１１，６９１号、米国特許第５，６７４，８４４号、米国特許第６，３３３，３１２号を参照されたい）の特定のサブクラス（すなわち、ＢＭＰファミリー）のいずれかのメンバーを指す。このようなＢＭＰは全て、シグナルペプチド、プロドメインおよびカルボキシ末端（成熟）ドメインを有する。カルボキシル末端ドメインはＢＭＰモノマーの成熟型であり、システインノットを形成するＢＭＰファミリータンパク質の特徴である、「７−システインドメイン」と呼ばれる７つのシステインによって特徴付けられる、高度に保存された領域を含有する（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ．，９３：８７８−８８３（１９９６）を参照されたい）。
【００５７】
ＢＭＰは当初、タンパク質精製法を使用し、哺乳類の骨から単離された（例えば、Ｓａｍｐａｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７１０９−７１１３（１９８７）；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：９４８４−９４８８（１９８８）；Ｓａｍｐａｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１３１９８−１３２０５（１９９０）、米国特許第５，４９６，５５２号を参照されたい）。
ただし、ＢＭＰは、腎臓、肝臓、肺、脳、筋肉、歯および腸管を含む、他の哺乳類の組織および器官でも検出または単離されている。原核細胞または真核細胞培養で発現するため、標準的な生体外組換え型ＤＮＡ技術を使用してＢＭＰを産生してもよい（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２２０−２２２４（１９９０）；Ｗｏｚｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：１５２８−１５３４（１９８８）を参照されたい）。同様に、いくつかのＢＭＰは、局所使用用に市販されている（例えば、ＢＭＰ−７は、Ｓｔｒｙｋｅｒ（Ｋａｌａｍａｚｏｏ，Ｍｉｃｈｉｇａｎ，Ｕ．Ｓ．）による長骨癒合不全骨折の処置用に製造および販売されている）。ＢＭＰ−２は、Ｗｙｅｔｈ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，Ｕ．Ｓ．）による長骨急性期骨折のため、および移植可能な前弯スレッド状ケージ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｓｏｆａｍｏｒ  Ｄａｎｅｋ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ（Ｍｅｍｐｈｉｓ，Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ，Ｕ．Ｓ．）によるＬＴ／ＣＡＧＥ（登録商標）腰椎先細癒合デバイス）と組み合わせた、処理済ウシＩ型コラーゲンスポンジ担体を使用する、ＩｎＦＵＳＥ（登録商標）骨移植片による脊椎固定術用にも、製造および販売されている。
【００５８】
ＢＭＰは通常、疎水性相互作用および少なくとも１つの鎖間（モノマー間）ジスルフィド結合により保持されている、同じモノマーポリペプチド（ホモ二量体）の二量体として存在する。本明細書に記載の組成物および方法において有用なＢＭＰは、骨形成活性、すなわち骨形成を刺激する能力を有するものである。骨形成（または「骨誘導」）活性は、種々の標準アッセイのいずれかを使用して検出されてよい。そのような骨形成アッセイには、コラーゲンおよびＢＭＰを含む担体基材がげっ歯類の異所性部位に移植され、その後骨形成についてモニタリングする、異所性骨形成アッセイが含まれる（Ｓａｍｐａｔｈ  ＴＫ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｉ  ＡＨ  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：７５９９−７６０３（１９８１））。そのようなアッセイの変形例では、基材は異所性部位に移植されてよく、ＢＭＰは、例えばげっ歯類への静脈内注射によりその部位へと投与されてよい。ＢＭＰ骨形成活性をアッセイするための別の方法は、培養された間葉系前駆細胞をＢＭＰとインキュベートし、その後軟骨細胞および／または骨芽細胞への分化について細胞をモニタリングすることである（例えば、Ａｓａｈｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ．Ｒｅｓ．，２２２：３８−４７（１９９６）を参照されたい）。骨形成活性を有し、そのことにより本明細書に記載の組成物および方法に有用であるＢＭＰには、仮に存在すれば天然源から精製されるか、真核（例えば、哺乳類、酵母、昆虫、魚類）細胞もしくは原核（細菌類）細胞により組換え体が産生されるか、または生体外タンパク質合成法により全体的もしくは部分的に産生される、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３およびそのヘテロ二量体が含まれるが、これに限定されない。骨形成活性を有するＢＭＰは、例えば虚血性腎臓といった、損傷した軟部組織または器官を再建または再生させる能力など、１つ以上の他の有益な薬理活性も保有する場合がある（Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０２：２０２−２１４（１９９８））。
【００５９】
用語「薬学的に許容可能」とは、生物学的、化学的または他の手段で、生体の化学反応および代謝と必ず適合し、かつ骨形成性ＢＭＰの、所望の効果的な活性または本発明による骨成長を促進するための、個体に投与され得る組成物中の他の成分に悪影響を与えることもない物質を指す。こう示された１つ以上の要素または工程はまた、同様に示された要素または工程「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）（または「から本質的に成る（ｗｈｉｃｈ  ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」）、該当の、より限定される組成物または方法を記載する。これは、該組成物または方法が、示された本質的な要素または工程を含み、該組成物または方法の、基本的で新規性のある１つまたは複数の特徴に著しく悪影響を与えることがない、追加の要素または工程をも含むことを意味するものである。１つ以上の要素または工程「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」といったような、本明細書に記載される任意の組成物または方法はまた、その他示されていない要素または工程を除外したものに対して、示された要素または工程「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）（または「から成る（ｗｈｉｃｈ  ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」、該当の、より限定され、かつクローズエンド型である組成物または方法を記載することもまた、理解される。本明細書に開示される任意の組成物または方法において、任意の示された必須の要素または工程の、既知または開示される同等物が、その要素または工程を代用してもよい。特に明記しない限り、他の用語の意味は、整形外科、医学、免疫学、生化学、分子生物学および組織再生学分野を含む、当業者によって理解および使用されるものと同じである。
【００６０】
本明細書に記載の骨移植片代替物に存在するＢＭＰは、骨移植片代替物が移植される場合、欠損部位に存在するか、または欠損部位へと移動する前駆細胞から新規骨成長を促進する。その類似体、２つのＢＭＰのヘテロ二量体、および２つ以上のＢＭＰの組合せ（混合物）を含む、任意の骨形成を行う骨形成タンパク質（ＢＭＰ）が、本明細書に記載の組成物および方法に使用されてよい。本明細書に記載の骨移植片代替物に有用である、好ましい骨形成性ＢＭＰには、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−５、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、ＢＭＰ−９、ＢＭＰ−１２、ＢＭＰ−１３、これらのヘテロ二量体およびこれらの組合せが含まれるが、これに限定されない。本明細書に記載の骨移植片代替物での使用において、更により好ましいのは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−６、ＢＭＰ−７、これらの類似体、これらのヘテロ二量体、およびこれらの組合せから選択される骨形成性ＢＭＰである。最も好ましくは、本明細書に記載の骨移植片代替物に使用されるＢＭＰは、ＢＭＰ−６である。
【００６１】
本明細書に記載の骨移植片代替物に存在する耐圧縮性基材（ＣＲＭ）は、生体適合性の足場を提供する。これは、構造的に支持するだけでなく、移植される自家骨移植代替物の骨形成性ＢＭＰ成分により刺激された新規骨成長によって徐々に置き換わるものである。本明細書に記載の自家骨移植代替物に有用なＣＲＭには、脊椎固定術での使用が承認されているデバイスで現在使用されている耐圧縮性基材類のうちいずれかが含まれる。現在承認されている脊椎固定術デバイスのＣＲＭの特徴は、局所的な脊椎筋組織および椎骨によって移植された骨移植片代替物へと添加される局所的な力に耐えることが可能なことである。本明細書に記載の自家骨移植代替物に有用なＣＲＭには、同種移植片（処置を必要とする個体以外の個体の骨から調製された骨移植片）、生体吸収性ポリマーまたはコポリマー（例えば、ポリラクチド、ポリグリコリドなど）、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）およびそれらの組合せなどのリン酸カルシウム−炭酸カルシウム複合材料が含まれる。本明細書に記載の骨移植片代替物に有用なＣＲＭは、同種移植片および１つ以上のリン酸カルシウム−炭酸カルシウム複合材料および／または生体吸収性ポリマーもしくはコポリマーまたはそれらの組合せも含んでよい。本発明による骨移植片代替物に使用するためのＣＲＭ顆粒は、そのような顆粒サイズ用のふるいを使用して得られる、７４μｍから８ｍｍの顆粒サイズを有してよい。
【００６２】
本明細書に記載の自家骨移植代替物で使用するためのＣＲＭ顆粒サイズは、７４μｍから８ｍｍの範囲である。好ましいＣＲＭの外形または形状には、骨欠損に応じ、特定の寸法の円柱、スラブ、シートまたは網が含まれる。ＣＲＭの外形または形状は、円柱、スラブ、シート、網または骨欠損に応じ、他の形状から選択されるいずれか１種の形状を有してもよい。
【００６３】
耐圧縮性基材の幾何学的形状は、医療適用によって規定される。ＢＭＰ６を含むＡＢＣを含む組成物中のＣＲＭ粒子および細孔サイズは、好ましくは骨欠損サイズと適合しなければならない。例えば、抜歯後の骨欠損を充填するための歯科用途では、ＣＲＭ粒子サイズは、ＡＢＧＳ体積全体の約３０％をまかなう量については、７２〜４２０μｍの範囲でなければならない。更に多くの歯科インプラントセラミックスの挿入を可能とする歯科医学における歯槽堤増大術用には、ＣＲＭ粒子サイズは０．５〜４ｍｍの範囲であることが好ましい場合がある。脛骨の癒合不全のような長骨の骨欠損には、３〜８ｍｍの粒子サイズを有するＣＲＭで長さにして１〜３ｃｍの欠損を充填し得る。長さにして３ｃｍより大きく、最大で１０ｃｍの長骨の骨欠損には、円柱またはスラブ形状であるＣＲＭを、ＡＢＣおよびＢＭＰ６と組み合わせて使用可能である。ＣＲＭ粒子の細孔サイズは、正所性部位（骨端間）または異所性部位（骨格から離れる）での新規骨の形成を更に促進するであろう、血管の内部成長を可能にするために十分な大きさでなければならない。
【００６４】
同様に、脛骨の癒合不全のような長骨の骨欠損には、３〜８ｍｍの粒子サイズを有する、合成リン酸カルシウム−炭酸カルシウム（セラミックス）または同種移植片から成るＣＲＭで、長さにして１〜３ｃｍの欠損を充填し得る。長さにして３ｃｍより大きく、最大で１０ｃｍの長骨の骨欠損には、円柱またはスラブ形状であるセラミックスを、ＡＢＣおよびＢＭＰ６と組み合わせて使用可能である。好ましくは、円柱またはスラブは２０％ハイドロハイラパタイト（ＨＡ）および８０％のリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）から作製される。これらは、適量の血液が円柱またはスラブを覆うことが可能である採血ユニットに接続されている滅菌凍結乾燥容器内で、ＢＭＰ（好ましくはＢＭＰ６）とともに凍結乾燥され、その後、大きい骨欠損間または脊椎の横突起間（好ましくは腰椎椎骨の横突起間）に挿入され、異所性骨形成を誘導し、２つの隣接する腰椎の癒合を支持する。同様の原理を使用して、胸椎を癒合することが可能である。セラミックス粒子の細孔サイズは、正所性部位（骨端間）または異所性部位（骨格から離れる）での新規骨の形成を更に促進するであろう、血管の内部成長を可能にするために十分な大きさでなければならない。セラミックス製円柱は、芯要素に沿って個々のセラミックス粒子を重複せずに結合することを目的とした、中央に芯を有する基幹部を有するものとする。これにより、部分的な骨欠損および変性椎間板疾患による腰背部疼痛を有する患者の２つ以上の椎骨の脊椎固定術用に、より生体力学的に安定した構造を提供する。
【００６５】
逆感熱性ポリマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖が側面にあるポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央疎水性鎖で構成される非イオン性トリブロックコポリマーであるポロキサマーである。一般には、米国特許第３，７４０，４２１号を参照されたい。ポロキサマーには、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃｓ（Ｃｒｏｄａ  Ｉｎｃ．，Ｅｄｉｓｏｎ  ＮＪ）、特にポロキサマー４０７、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｆｌｏｒｈａｍ  Ｐａｒｋ，ＮＪ）およびＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ，ＮＹ）、ポリエトキシ化したヒマシ油および２０％（生理食塩水中重量パーセント）精製ポロキサマー４０７で構成される、ＬｅＧｏｏ（登録商標）血管閉塞ゲルといった製品が含まれる。ポロキサマー４０７／ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ−１２７コポリマー（エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドブロック体）は、本研究で使用したＢＡＳＦ（Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）から購入した。ポリマーは、最終ポリマー濃度が２０〜４０重量／体積％となるように、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に可溶化した。この濃度にて、ポリマーは熱可逆性、室温での液体状態、体温でのゲル状態を示す。例えば、２０ｇのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ−１２７を、１００ｍｌの冷却したＰＢＳに添加して２０％のゲルを調製し、適切に可溶化させるために４℃で一晩撹拌した。次に、溶液を滅菌するために０．２２μｍフィルタでろ過した。ポロキサマーは、逆感熱性（つまり、温度上昇に伴って粘度が上昇する）を持つ、生体適合性のある水溶性ポリマーの系統である。特に、使用されるポロキサマーは非毒性、生体適合性、水溶性のものであり、その粘度は使用範囲内にて、温度上昇とともに低下する。室温では、組成物は注射可能だが、粘性がある。体温まで加熱すると、化学組成物に効果的な変性（硬化なし）を伴わない、温度誘起相変化ポリマーのプラグまたはスラブを形成する。室温以下では、組成物の粘度は注射器による注射に好適である。例えば、ＡＢＧＳは、２０Ｇ−１．５の針サイズを有する、５〜１５ｃｃ注射器により送達される注射器を示す。ＡＢＧＳは柔軟性のあるパテであり得る。組成物は、５０〜８０重量％の液体を含む。ＣＲＭの平均粒子サイズは、７０〜４２５μｍの範囲、または粒子ふるいで測定される１〜５ｍｍの範囲である。組成物成分は、自己血に溶解／懸濁される。ＡＢＧＳには造影剤が含まれてよい。
【００６６】
自家骨髄吸引物を含むもしくは含まない、または本明細書に記載の、自家骨髄もしくは自家脂肪もしくは自家骨膜もしくは同種臍帯から拡大されたＭＳＣを含むもしくは含まない、自家骨移植代替組成物（自己血液凝固物／ＢＭＰ−６／ＣＲＭまたはＢＭＰ６／ＣＲＭ／自己血液凝固物またはＢＭＰ６／ＣＲＭ／自己多血小板血漿または同種血液／ＢＭＰ−６／ＣＲＭ／逆相感熱性ポリマー）は、許容微細環境を提供し、ヒトにおいてＢＭＰを用いての使用を承認されている、移植骨または高ミネラルの合成セラミックス（リン酸カルシウムまたは炭酸カルシウムまたは硫酸カルシウム）動物由来コラーゲンまたはコラーゲン−ＣＲＭ複合材料足場を使用することで発生する可能性のある、望ましくない応答を克服することによって、強固な新規骨形成を誘導する。特に、本明細書に記載のＡＢＧＳの移植は、現在承認されている骨移植片代替物を移植する部位（特に異所性部位）で発生する可能性のある、迅速かつ強力な炎症応答および免疫応答（「炎症性ストーム」）および異物反応（多核巨細胞の形成）を引き起こさない。「炎症性ストーム」は、豊富な浸潤性、炎症性、サイトカイン産生細胞（例えば、単球、多形核白血球、マクロファージ、筋線維芽細胞、線維細胞）、免疫応答または異物反応（多核巨細胞の形成）を含む。ＣＲＭ／ＣＲＭ−コラーゲン複合材料によって誘発される炎症性ストームならびに動物由来コラーゲンによって引き起こされる免疫および線維形成反応を克服するため、移植部位から離れて異所性骨形成を引き起こすといった、望ましくない安全性の問題を引き起こす高濃度のＢＭＰが現在のデバイスにて使用されている。「炎症性ストーム」の間、そのような炎症性／免疫学的（非前駆）細胞の集団は、骨形成性ＢＭＰと接触すると新規骨を形成するように応答する間葉系幹細胞（骨細胞前駆細胞）の集団よりも著しく多い。非前駆細胞の「炎症性ストーム」の主な引き金は、ＢＭＰ骨移植片代替物の足場として現在使用されているＣＲＭ成分の存在によるものと考えられる。
【００６７】
この見解によれば、異所性部位にて多核異物巨細胞は、骨細胞前駆細胞を妨害、またそうでない場合には骨細胞前駆細胞の能力を阻害するのに十分大きく、現在承認されている多くの骨移植片代替物のＣＲＭにより動員される。骨形成性ＢＭＰに応答し、かつ骨欠損を処置するのに必要とされる十分な新規骨成長を産生するためには、これが存在しないか、また著しく小さい数で存在するかのいずれかである。対照的に、現在承認されている骨移植片代替物に見られる類似または同等のＣＲＭ成分を含有する、本明細書に記載の自家骨移植代替物（ＡＢＧＳ）は、新規骨成長を必要とする部位に移植、そうでない場合には適用した際、細胞の炎症性ストームを誘発しない。代わりに、本明細書に記載されるＡＢＧＳのＣＲＭは、最初は（凝塊ゲル内に）鉱物のような構造を提供する。ＣＲＭは、吸収され、かつ順序正しく、骨欠損の修復または隣接する骨区分の癒合などといった、所望される処置を達成するのに必要とされる量および種類の新規骨成長と置換される。この予期されていなかった生物学的発見は、本明細書に記載のＡＢＧＳの自己血成分が、ＣＲＭ成分、および仮に凝塊が存在しない場合に発生する可能性がある多核巨細胞の形成を阻害することによる異物反応の抑止により、「炎症性ストーム」の惹起を抑止または阻害するように応答可能であることを示す。
【００６８】
強固な「炎症性ストーム」の生成は、脊椎固定術用に認可されているものなどの現在承認されている非自己血液凝固物骨移植片代替物が、新規骨成長を促進するため、比較的大量に骨形成性ＢＭＰを使用する（例えば、脊椎適応症のためのレベルあたり１２〜４０ｍｇ超である）ことが理由となることがある。このような比較的大量のＢＭＰを使用することにより、局所移植部位から遠位の部位に骨形成が生じ得るという事実は、潜在的に有害である副作用に対して、規制当局の懸念を引き出す。対照的に、本明細書に記載のＡＢＧＳは、自己血液凝塊ゲルを含み、現在承認されている骨移植片代替デバイスに見られるレベルよりも著しく少ない量のＢＭＰを有利に使用し、新規骨成長を促進する。典型的には、本明細書に記載の自家骨移植代替組成物中に存在するＢＭＰの量は、現在承認されている骨移植片代替デバイスで使用されるＢＭＰの量よりも５〜２０倍少ない。非限定的な例として、本発明のＡＢＧＳは、自己血１ｍｌあたり０．００２ｍｇ〜１ｍｇのＢＭＰを含んでもよい。好ましくは、ＢＭＰはＢＭＰ−６であり、これは骨中および大半のＩ型およびＩＩ型ＢＭＰ受容体全体にわたって豊富である、天然ＢＭＰアゴニストであるノギンに結合しない。
【００６９】
任意選択的に、本明細書に記載のＡＢＧＳは、同種骨に由来するゲル組成物であり、新規骨成長を高める残留因子を含有する、同種脱灰骨基質（または「脱灰骨基質」）を更に含んでよい。このゲル状態に起因して、本明細書に記載のＡＢＧＳは、移植（部位内または部位での骨移植片代替物の配置）または注射（例えば、注射器を使用）により、新規骨成長を必要とする部位に投与されてよい。特に明記しない限り、用語「移植（ｉｍｐｌａｎｔｅｄ）」および「移植（ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」は、本明細書に記載される骨移植片代替物を、注射により欠損部位へ適用することを包含するとも理解される。
【００７０】
任意選択的に、ＡＢＧＳは、自家もしくは同種骨髄または脂肪組織から取得または拡大された間葉系幹細胞（骨細胞前駆細胞）で高められ得る。場合によっては、ＡＢＧＳが局所骨、筋肉、筋膜からの組織片によって濃縮されてよい。このレベルの細胞／組織増強ＡＢＧＳは、ＢＭＰ用の応答細胞が、所与の部位（例えば、遠位脛骨）で最小化され、稀少な遺伝性疾患（低ホスファターゼ症、Ｉ型神経線維腫症および骨形成不全症）で有利である。更に、逆相感熱性生体吸収性ポリマーを含むＡＢＧＳは、室温で注射可能な生体適合性および取扱特性を提供することにより、体温にて固体ゲル様構造を得る。自己血の存在により、ＡＢＧＳに追加されたＣＲＭおよび生体適合性によって誘発される炎症性ストームに対する保護が提供され、これは、「自家移植片」組織等価物を提供する。
【００７１】
いくつかの設定では、自己血（ＡＢ）に代わる同種または自己多血小板血漿（ＰＲＰ）を用いてＡＢＧＳを調製してもよい。その種々の特性により、本明細書に記載の自家骨移植代替組成物は、処置を必要とする個体から採取した自家移植片を使用する１つ以上の種々の処置において、「自家移植片」の代わりに有利に使用されてよい。こうした処置には、脊椎固定術、骨格骨折の修復、高位脛骨骨切り術、歯科修復、歯周組織修復、偽関節症、稀少な骨格疾患に関連する偽性骨折、および顎顔面の補強が含まれるが、これらに限定されない。特に、種々の骨欠損のいずれかを処置する際使用するための本明細書に記載のＡＢＧＳ。このような骨欠損には、骨幹部骨折、橈骨遠位骨折、脛骨癒合不全骨折、骨粗鬆症性骨折（椎骨圧迫骨折や非定型骨幹部骨折など）、骨嚢胞（空隙を充填するために骨が発生しなければならない場合）、骨腫瘍（癌によって失われた、または外科手術によって除去された骨を新規骨に置き換える必要がある場合）、口腔骨欠損、歯周組織欠損、および種々の顎顔面異常が含まれるが、これに限定されない。本明細書に記載の自家骨移植代替物の使用により、その処置を必要とする個体から安全に採取し得る自家移植片の量の制限を超えて、こうした手技の使用が有利に拡張される。本発明の移植可能な組成物の調製には、薬学的に許容可能な成分のみが使用される。
【００７２】
用語「同種移植片」は、当該技術分野の用語であり、患者の移植用に無菌的に調製された死体からの骨を指す。同種移植片は、組織骨バンクから商業的に入手されてよい。
【００７３】
用語「疾患」および「疾病」は同義語であり、原因または病原因子に関係なく、あらゆる病態を指す。骨または他の組織の「欠損」とは、異常な組織成長または組織成長が欠損した部位を指す。「疾病」または「疾患」は、１つ以上の組織において、１つ以上「欠損」することによって特徴付けられ得る。本明細書で使用されるように、用語「処置」および「処置する」は、疾病または疾患の１つ以上の症状または発現を緩和し、疾病もしくは疾患を阻害し、抑えるかもしくは逆転させ（退行を引き起こす）、または疾病もしくは疾患の発症を妨害する、任意の治療計画を指す。用語「処置」は、疾病の１つまたは複数の症状または発現を予防する（阻止する）ことを含み、処置のない状態にて、他の点では疾病を特徴付ける可能性もある疼痛を含む、症状または発現の程度を改善するか、または阻害することを含む。
【００７４】
「治療有効量」とは、所望の位置で骨成長を促進する化合物（例えば、骨形成性ＢＭＰタンパク質）の量であり、隣接する椎骨の安定した脊椎固定術、新規骨で骨欠損を充填すること、骨欠損の遠位端部の空隙を充填すること、または口腔もしくは顎顔面の外傷もしくは異常を補正もしくは再生することなどに限定されないが、所望のエンドポイントを達成することが所望される量である。こうしたエンドポイントは、診療する外科医または他の高度な技能を持つ開業医による、Ｘ線または目視検査などの標準的な方法を用いて、以下の新規骨成長により測定され得る。
【００７５】
１つ以上の示された要素または工程「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」として本明細書に記載される組成物または方法は、オープンエンドである。示された要素または工程は本質的であるが、他の要素または工程は組成物または方法の範囲内に付加され得る。多重性を避けるために、「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（または「を含む（ｗｈｉｃｈ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」として本明細書に記載される任意の組成物または方法もまた理解される。
セラミックス放出試験の説明
【００７６】
リン酸カルシウム−炭酸カルシウム複合材料を含まないｒｈＢＭＰ６の存在下で形成された凝塊物（以下、セラミックス）を比較のために使用した。ｒｈＢＭＰ６／ＡＢＣを含有するＡＢＧＳが最初に大量に放出され、１０日後には非常に低いレベルまで着実に減少することが明らかになった。
【００７７】
対照的に、ｒｈＢＭＰ６／ＡＢＣ／セラミックスを含有するＡＢＧＳでは、１０日後にも依然としてかなりの放出が見られた。したがって、セラミックスの作用は長期にわたる。
【００７８】
リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）−ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）ＴＣＰ−ＨＡの粒子サイズは、ある程度の影響を有するものの、全てのサイズがＢＭＰに結合する。
【００７９】
ＡＢＣを含まず、予めＢＭＰを導入したセラミックスを用いると、少なくとも６日が経過するまでは早期放出は見られないことが観察された。放出は、１０日および場合によってはそれ以上の日数で増加している。
【００８０】
ただし、予め導入したセラミックスがＡＢＣと混合された場合、ある程度の放出の後、放出の間隔が短くなった。予め導入したセラミックスのみの放出曲線と、セラミックスを含まないＡＢＣの放出曲線の組合せがこれにより生じた。初期放出は、凝固反応によるプラスミンプロテアーゼを含有するＡＢＣを添加することによると推定された。これにより、セラミックスへの結合能力を除去する方法で、ＢＭＰの一部が変更されることになった。
【００８１】
放出を可能にするＢＭＰ６の確実な修飾は、ヘパリン結合部位も含有する、アルギニンに富むＮ末端ループの除去である。初期放出は、ＡＢＣの添加がないと見られなかった。したがって、ＡＢＣの添加による放出は、放出を引き起こすＢＭＰと相互作用する凝塊物に存在するタンパク質およびプロテアーゼによるものであった。ただし、全てのＢＭＰがこの方法で直ちに変換されるわけではなく、これはセラミックスに残ったＢＭＰに相当する。最終的に、これは、残留プロテアーゼの作用時間が長くなったときにも放出されるであろう。
【００８２】
放出がより遅延し、より長く続くといった改善点としてこのことは主張される。
【００８３】
また、ＣＲＭへの結合は非常に強固である（１００ｍＭのリン酸塩によって放出されるが、生理食塩水／培地のみでは放出は発生しない）。セラミックスは、最初の数日間はほとんど放出されないように、イオン相互作用を介してＢＭＰと非常に強固に結合すると結論付けられている。このことは、新規骨形成が密に局所化する上で有利である。
【００８４】
そして、この強固な結合により、過剰放出および骨形成の拡散が防止される。
【００８５】
図１６は、種々のサイズの粒子を使用したセラミックスから得られるＢＭＰ６放出結果を示す。セラミックスは、ＣａＰ，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＬＬＣにより製造されている。種々のサイズのセラミックスを、エッペンドルフチューブへと、各チューブにつき１４０ｍｇずつ静置した。次に、２０ｍＭのグリシンバッファ（ｐＨ６）中に５０μｇのＢＭＰ６原薬を含有する、２００μｌ溶液を、乾燥セラミックスに添加したところ、すぐに吸収された。室温にて１５分間相互作用させた。
【００８６】
この２００μｌの液体は、より細かい程度のセラミックス粒子に急速に吸収されたが、その一方で大きな粒子は液体の吸着容積が著しく低下した。
【００８７】
湿潤状態であるセラミックスを有するチューブを−８０℃の冷凍庫に３０分間入れ、その後棚温度が−１８℃のＧＥＡ  ＳＬ−２凍結乾燥機に移し、２４時間凍結乾燥した。この時点までに、材料は完全に乾燥されており、真空状態は２０マイクロバールの残圧で安定状態を保持していた。
【００８８】
次に、ＢＭＰ６を予め導入したこのセラミックスを、ＲｎＤシステムによるＢＭＰ６  Ｅｌｉｓａアッセイを使用して、１０日間のＢＭＰ放出試験にて評価した。予め導入した凍結乾燥基材を有するチューブに血液を収容した。これにより、セラミックス粒子と穏やかに混合した後に凝固できた。凝塊物から血清を取り除き、これらのサンプルもまた、１０日間にわたるＢＭＰの放出について評価された。
【００８９】
また、放出動態を比較するために、「ＡＢＣ＋ＢＭＰ６」のサンプル、すなわちＢＭＰ５０μｇと血液２００μｌを凝結させて凝塊を形成し、その凝塊から血清もまた取り除いた。
【００９０】
ＢＭＰ６の放出を測定するために、記載されている凝塊サンプルおよびそれぞれＡＢＣを含まないＢＭＰ６マトリックスサンプルを、１ｍｌの組織培養培地で最初に一度すすぎ、１ｍｌの新鮮な培地を１日間添加した。この１ｍｌをＥｌｉｓａアッセイ用に採取し、３日後に新鮮な培地に交換した。Ｅｌｉｓａアッセイ用に６日目に再び採取して交換し、１０日目に再び採取した。
【００９１】
試験の結果を図１６のパネルＡ〜Ｇに示す。これはＥｌｉｓａアッセイで測定された、最初の１０日間生体外でＡＢＧＳからｒｈＢＭＰ６が放出されることを示している。パネルＡはＡＢＣ＋ＢＭＰ６凝塊からの放出を示し、パネルＢ、ＤおよびＥは種々の粒径範囲、すなわち１〜４ｍｍ（Ｂ）、０．５〜２．５ｍｍ（Ｄ）、０．５〜１．５ｍｍ（Ｅ）であるセラミックスからの放出を示す。パネルＣ、ＦおよびＧは、凝塊を含むセラミックスからの該当する放出を示し、一方では粗粒、中粒、細粒を比較している。
【００９２】
５０ｎｇのｒｈＢＭＰ６を含有する、７つの種々のＢＭＰ担体（それぞれ１４０ｍｇ）を１０日間超のＢＭＰ６の放出について比較する。Ｙ軸は、担体を浸漬するために使用され、数日ごとに交換され（Ｘ軸）、Ｅｌｉｓａによってアッセイされる培地を伴う、１ｍｌの無血清細胞培養培地に放出されたＢＭＰ６のマイクログラムを示す。
【００９３】
パネルＡ：０．１４ｍｌＡＢＣ＋ＢＭＰ６、セラミックスなし。パネルＢ、Ｄ、Ｆは、ＢＭＰ６を含むがＡＢＣを含まないセラミックスを示す。パネルＣ、Ｅ、およびＧは、ＢＭＰ６を含み、ＡＢＣを添加したセラミックスを示す。パネルＢ：大きな粒子サイズのセラミックス（１０００〜４０００μｍ）、パネルＣ：Ｂと同じだが、ＡＢＣが追加されている、パネルＤ：中サイズの粒子（５００−２５００μｍ）のセラミックス、Ｅ：Ｄと同じだが、ＡＢＣが追加されている、Ｆ：小サイズの粒子（５００−１５００μｍ）のセラミックス、およびＧ：Ｆと同じだが、ＡＢＣが追加されている。各パネルの最初のデータポイント（Ｗ）は、担体の最初の洗浄（１ｍｌ）により得られるＢＭＰ６を表す。
【００９４】
結論は、ＡＢＣを含まないＢＭＰ６を予め導入したセラミックスは、ＢＭＰの遅延放出を示したが、セラミックスプラスＡＢＣは二相性放出を示す。これは、最初はＡＢＣ＋ＢＭＰ６と同様であったが、その後ＡＢＣ＋ＢＭＰ６よりはるかに長く持続した。こうして、この組合せにより、より均一で長期にわたる放出が実現した。
【００９５】
（実施例１）  自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）の調製
自家骨移植代替物（ＡＢＧＳ）は、以下：
１）組換え型ヒトＢＭＰ６（ｒｈＢＭＰ６）、
２）自己血および
３）水溶液、もしくはナノ粒子もしくはマイクロスフェアの形態である、カルシウムもしくはストロンチウムもしくはマグネシウム塩（低ｍＭ）
または
１）組換え型ヒトＢＭＰ６（ｒｈＢＭＰ６）、
２）自己血、
３）水溶液もしくはナノ粒子もしくはマイクロスフェアの形態であるカルシウムもしくはストロンチウムもしくはマグネシウム塩（低ｍＭ）および
４）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）から構成される。
【００９６】
調製方法
方法＃１：耐圧縮性基材（ＣＲＭ）成分を含まない比較骨移植
比較骨移植片は以下：
１）組換え型ヒトＢＭＰ６（ｒｈＢＭＰ６）
２）自己血
３）水溶液、ナノ粒子、またはマイクロスフェアの形態であるカルシウムまたはストロンチウムまたはマグネシウム塩（低ｍＭ）で構成される。
【００９７】
自己血は、患者から末梢採取されるか、局所で採取される（局所血液）。前臨床試験のため、自己血をウサギの場合には耳翼辺縁静脈から、またはヒツジの場合には頸静脈から、任意の抗凝固性物質を含まないチューブへと採取することができた。このチューブは任意の抗凝固性物質を含まず、特異な体積の自己血中に、溶液またはナノ粒子またはマイクロスフェア溶液のいずれかの中の、１ｍｌの血液あたり５〜５０ｍＭのカルシウムまたはストロンチウムもしくはマグネシウム塩（例えば、塩化物、炭酸塩、重炭酸塩、グルコナート）を用いて補充されていた。凍結乾燥されたｒｈＢＭＰ６は、注射用の少量の水（１０〜５００μＬ）に溶解され、その後、自己血（０．２〜１０ｍｌ）と混合された。ｒｈＢＭＰ６を自己血と混合した直後（１分以内）に室温で放置すると、剛性、弾性および歪みによって測定されるよう定義された構造およびレオロジー特性で凝固した。
【００９８】
方法＃２：耐圧縮性基材（ＣＲＭ）成分を含む比較骨移植
自家骨移植代替物（ＡＢＧＳ）は、以下：
１）組換え型ヒトＢＭＰ６（ｒｈＢＭＰ６）
２）自己血
３）水溶液、ナノ粒子、またはマイクロスフェアの形態であるカルシウムまたはストロンチウムまたはマグネシウム塩（低ｍＭ）で構成される。
４）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）から構成される。
【００９９】
自己血は、患者から末梢採取されるか、局所で採取される（局所血液）。前臨床試験のため、自己血をウサギの場合には耳翼辺縁静脈から、またはヒツジの場合には頸静脈からそれぞれ、適応症によって特異な体積の０．１ｍｌ〜５０ｍＭＣａＣｌ２溶液を用いて補充された、任意の抗凝固性物質を含まないチューブへと採取することができた。凍結乾燥されたｒｈＢＭＰ６は、注射用の少量の水（１０〜２００μｌ）に溶解され、自己血と混合された。ｒｈＢＭＰ６を自己血と混合した直後に、粒子状のＣＲＭを添加し、室温で静置して、剛性、弾性、および歪み（ｒｅｆ）によって測定されるよう定義された構造およびレオロジー特性で凝固させた。
【０１００】
方法＃３：耐圧縮性基材（ＣＲＭ）成分を含む自家骨移植代替物
ＣＲＭ（微粒子または円柱またはスラブまたは網の形状）は、注射用に少量（１０〜１０００μＬ）の水に溶解したｒｈＢＭＰ６に浸漬させるか、またはこれで十分に濡らし、真空下で凍結乾燥させた。凍結乾燥したＣＲＭ−ｒｈＢＭＰ６複合材料に、０．１ｍｌの５０ｍＭＣａＣｌ２で補充し、抗凝固性物質を含むことなく、自己血を十分に添加し、室温で静置して、剛性、弾性および歪みによって測定されるよう定義された構造およびレオロジー特性で凝固させた。
【０１０１】
方法＃４  耐圧縮性基材（ＣＲＭ）成分を含む自家骨移植代替物
新規骨形成を誘導するためのＡＢＧＳを調製する方法であって、調製方法は、
（１）
ａ．自己血、
ｂ．組換え型ヒト骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６（ｒｈＢＭＰ−６）、
ｃ．移植骨、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウムおよびそれらの組合せから成る群から選択される耐圧縮性基材１２（ＣＲＭ）を組み合わせる工程と、
（２）水溶液中のｒｈＢＭＰ６を、凍結乾燥容器１０中の耐圧縮性基材１２（ＣＲＭ）と混合させ、ＣＲＭに添加されるｒｈＢＭＰ−６水溶液の量は、ＣＲＭを完全に濡らすように最適化される工程と、
（３）ｒｈＢＭＰ−６および耐圧縮性基材１２（ＣＲＭ）を凍結乾燥する工程と、
（４）自己血を添加する工程と、
（５）凍結乾燥したｒｈＢＭＰ−６および耐圧縮性基材１２（ＣＲＭ）の周りに生体力学的に安定した血餅１３を形成するのに十分な時間、凍結乾燥した骨形成を行う骨形成タンパク質および耐圧縮性基材１２（ＣＲＭ）および自己血をインキュベートする工程と、を含む。
【０１０２】
最初に、水溶液中のｒｈＢＭＰ６は、真空下でゴム栓９によって密閉され、アルミニウムキャップまたは追加のネジキャップで圧着することで固定され得る凍結乾燥容器１０内で、耐圧縮性基材１２（ＣＲＭ）と混合される。選択された耐圧縮性基材１２（ＣＲＭ）に追加されるｒｈＢＭＰ６水溶液の量は、ＣＲＭが完全に濡れるように最適化される。湿潤用のｒｈＢＭＰ６水溶液の量は、ＣＲＭの形状（多孔質と非多孔質、微粒子と円柱）に応じて、耐圧縮性基材１２（ＣＲＭ）の体積に対して十分であるか、または同等であるのみでよい。水分量が湿潤量を超える場合、凍結乾燥容器１０の表面に沿っていくらかの乾燥ｒｈＢＭＰ６が生じることがあり得る。完全に乾くまで凍結乾燥を実施する。凍結乾燥時、ＲｈＢＭＰ６／ＣＲＭの凍結乾燥容器１０は真空下で閉じられ（ゴム栓が完全に押し下げられる）、好ましくは−２０℃または４℃で冷蔵保存される。
【０１０３】
次に、典型的な静脈切開などで自己血を患者静脈からバキュテナーへと採取する。バキュテナーには、凍結乾燥されたｒｈＢＰＭ６−ＣＲＭ（図１９内で示す）が含有される。クランプ３を備えた滅菌チューブ５の長いラインは、凍結乾燥容器１０への血液処理を促進する可能性が高い。凍結乾燥内容物（ｒｈＢＭＰ６＋ＣＲＭ）１２を含む凍結乾燥容器１０は、凍結乾燥容器ホルダ２中に静置され、凍結乾燥容器１０のゴム栓９の安全な穿刺を確保する。この結果、隔壁を通って針１の滅菌挿入を保証する。針１は、無菌性を更に確実にもするために、別のゴムスリーブ４によって保護されてよい。凍結乾燥容器ホルダ２は、滅菌チューブ５によって静脈切開用の針７に接続されており、最初は小さなプラスチック製ホースクランプによって留められている。
【０１０４】
図１７〜図２０は、新規骨形成を誘導するためのインプラントのＡＢＧＳ調製用キットを示す。例えば、新規骨形成を誘導するためのインプラントのＡＢＧＳ調製用キットには、自己採血用の翼状針セット６、７、８と、
ゴムスリーブ９で保護された針１を含む、凍結乾燥容器ホルダ２と、
翼状針セット６、７、８と凍結乾燥容器ホルダ２を接続する滅菌チューブ５と、
真空を解除するか、または血流を止めるためのチューブクランプ３と、
耐圧縮性基材１２（ＣＲＭ）と混合され凍結乾燥されたｒｈＢＭＰ６を含有するゴム栓９を備える凍結乾燥容器１０と、を含む。
【０１０５】
耐圧縮性基材１２（ＣＲＭ）は、移植骨、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム、およびそれらの組合せから成る群から選択される。
【０１０６】
凍結乾燥容器１０は、耐圧縮性基材１２（ＣＲＭ）を受け入れるのに好適な任意の形状を有してよく、耐圧縮性基材１２（ＣＲＭ）は、円柱、スラブ、シート、網または骨欠損に応じた任意の他の形状から選択される、任意の形状を有してよい。
【０１０７】
（実施例２）  ＣＲＭ評価の方法（ラット皮下インプラント）
以下のＣＲＭはＡＢＧＳの調製に使用される。
同種移植片
ＴＣＰ
ＨＡ
ＴＣＰ／ＨＡ複合体
硫酸カルシウム
リン酸カルシウム−炭酸カルシウム複合材料（セラミックス）
生体吸収性ポリマー
生体吸収性ヒドロゲル
【０１０８】
ＡＢＧＳの製造に使用される所与のＣＲＭの以下の外形
粒子サイズは７４μｍ〜８ｍｍの範囲
ＣＲＭは粒子の一形態であってよく、または円柱、スラブ、シート、網から選択されるいずれか１種の形状または骨欠損部に応じた他の形状を有してよい
【０１０９】
実施例１に記載されるように、方法＃２または＃３のいずれかを使用して、物理的特性が異なるＣＲＭをｒｈＢＭＰ６で製剤化する。自家骨移植代替組成物ＡＢＧＳの細胞応答性および骨誘導活性は、皮下部位に移植するか、またはげっ歯類の腹筋膜または骨格筋の嚢に経皮的に注射することにより測定した。移植／注射の１、３、７、および１２〜３５日後、インプラントを採取し、記載のように組織構造により細胞応答性および骨形成活性をアッセイした（Ｓａｍｐａｔｈ，ＴＫ．ａｎｄ  Ｒｅｄｄｉ，ＡＨ．ＰＮＡＳ  １９８１）。
【０１１０】
ＡＢＧＳは、適切な量のＢＭＰ（例えば、血液１ｍｌあたり２〜２００μｇの組換え型ＢＭＰ−６）と混合した、０．２５〜０．５ｍｌのラット全血から調製された。次に、ＣＲＭ（同種移植片、ドナー由来の同種骨（ＡＬＬＯ）またはリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）もしくはＴＣＰとハイドロキシアパタイト（ＨＡ）複合材料）を６０分間静置し、１ｍｌ注射器内で凝固させた。血清を取り除いた後、約１２５〜３００μｌの容量のＡＢＣを移植した。ｒｈＢＭＰ−６（９５％超）のほとんどはＡＢＣに結合した。各ｒｈＢＭＰ−６用量の骨形成応答を、２〜４匹のラットそれぞれにおいて、４〜８箇所のインプラントで試験した。自己血／ｒｈＢＭＰ−６／ＣＲＭで調製されたＡＢＧＳを移植するために、腋窩領域下の腹部皮膚の下に小さなポケットを作成した。ＡＢＧＳ（血清を含まない約１２５〜３００μｌ）を移植し、筋膜に１本の縫合糸を用いて、皮膚に対して３針で封着した。異所性骨形成を分析するために、移植後２８日目に１０７６マイクロＣＴデバイス（ＳｋｙＳｃａｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を使用して動物をスキャンした。異所性骨形成は動物の全てのグループで観察され、マイクロＣＴ分析によって定量化された。異所性骨の定量化は、用量依存性を示した。細胞応答性および骨形成は、より高倍率でより明確に、クリーピング置換後の種々の時間間隔における組織構造によって測定される。
【０１１１】
自己血液凝固物（ＡＢＣ）のみの皮下移植は、１〜３日以内に移動する間葉系幹細胞（骨細胞前駆細胞）を動員し、７〜９日までに溶解が進行する組織カプセルを形成する。ｒｈＢＭＰ６インプラントを含有するＡＢＣが、７日目までに軟骨内骨へとＭＳＣの分化を誘導した一方で、新規に形成された骨は次いで、機能的な骨髄要素を含有する小骨で充填した状態で、２１〜３５日目までにリモデリングを進める。７日目と３５日目のＡＬＬＯプラスＡＢＣインプラントおよびＡＢＣ＋ＡＬＬＯ＋ｒｈＢＭＰ６インプラントの組織学的観察を図２Ａと図２Ｂに示す。７日目までに、ｒｈＢＭＰ６含有インプラント中で軟骨内骨形成の兆候がすでに存在する。３５日目のインプラントでは、ＡＢＣ／ＡＬＬＯ／ｒｈＢＭＰ６インプラント間におよびＡＬＬＯ粒子に付着した状態で強固な骨形成が発生している。この骨形成は、クリーピング置換（新規に形成された骨で置き換えられる同種移植片吸収）による典型的な骨リモデリングを受けたものであった。７日目および３５日目のインプラントによる、ＡＢＣ／ＡＬＬＯおよびＡＢＧＳ（ＡＢＣ／ＡＬＬＯ／ｒｈＢＭＰ６）のマイクロＣＴ分析は、包括的なマイクロＣＴとして視覚化される。具体的には、ＡＬＬＯ粒子およびＡＬＬＯ粒子を含まず、新規形成され、リモデリングされた骨を、図２Ｃおよび図２Ｄに示す。ＡＬＬＯおよびＡＢＣインプラント単独では、骨を誘導することはなく、インプラント周囲にカプセルのような線維組織を形成した。これはその後、１８〜２１日目までに再吸収された。ｒｈＢＭＰ６を含有するＡＢＣ／ＡＬＬＯインプラントでは、段階的な解像度で同種移植片の骨形成が観察された。図２Ｅおよび図２Ｆは、ラット皮下インプラントの７日目および３５日目でのＡＢＣプラスＡＬＬＯおよびＡＢＣ＋ＡＬＬＯ＋ｒｈＢＭＰ６のマイクロＣＴ分析を使用して定量化された、同種移植片体積および骨体積を表す。
【０１１２】
（実施例３）  自己血による予期されていなかった生物活性
ＣＲＭ（同種移植片および／または合成セラミックス（リン酸三カルシウムまたはハイドロキシアパタイトまたはこれらの組合せ）は、方法＃２または＃３を用いてＡＢＧＳを発生させる際に使用される）を含有する、ＡＢＧＳによる炎症性反応および異物反応を克服するといった点で自己血の役割を評価するため、ラット皮下移植アッセイを使用した。ｒｈＢＭＰ６骨形成活性を、種々の用量にて試験した。ＡＢＣ／ｒｈＢＭＰ６／ＡＬＬＯインプラントであり、７４〜４２０μｍのラット同種移植片粒子を、０．１〜０．５ｇ／ｍｌで自己血に添加した。
【０１１３】
インプラントを含有する同種移植片の炎症および異物拒絶を識別するために、インプラントを１、３、７日目のものから採取した。パラフィン包埋切片上で、組織化学によるＨ＆Ｅ／またはトルイジンブルー染色および酸性ホスファターゼ検出を行うことで切片を染色した。試験したグループには、同種移植片のみ、ＡＢＣと混合した同種移植片、または自己血１ｍｌあたり２５μｇのｒｈＢＭＰ６を含む同種移植片が含まれた。７日目または１４日目に動物からインプラントを取り除き、異物巨細胞の分析を行った。
【０１１４】
結果は、ラット皮下部位に移植した際の同種移植片（ＡＬＬＯ）粒子は、１〜３日目までに単核食細胞を動員することで、異所性部位にてミネラル内容物が高くなることが原因で、炎症および異物反応を誘発し、その後７日目〜１４日目までに融合して多核異物巨細胞（ＦＢＧＣ）を形成したことを実証した（図３Ａ）。ＡＢＣを含むＡＬＬＯ粒子が製剤化された場合、多核ＦＢＧＣによる炎症性傷害数および多核ＦＢＧＣの癒合数は、著しく減少した（図３Ｂおよび図３Ｄ）。ＡＢＣ＋ＡＬＬＯ＋ｒｈＢＭＰ６を含有するＡＢＧＳインプラントでは、ＡＬＬＯ粒子に付着し、軟骨内骨形成した（図３Ｃおよび図３Ｄ）ＦＢＧＣは、ほとんどまたは全くなかった。図３Ｄは、ＡＬＬＯ、ＡＬＬＯ＋ＡＢＣおよびＡＬＬＯ＋ＡＢＣ＋ｒｈＢＭＰ６インプラントの代表的な３つの組織構造区分から形態計測的に集計された多核ＦＢＧＣの平均数を表す。ＡＬＬＯインプラントによって動員された多核ＦＢＧＣ細胞は、酸性ホスファターゼ染色の免疫組織染色によって更に特徴付けられ、ＡＢＣの添加によって減少した（図３Ｅおよび図３Ｆ）。セラミックス（リン酸三カルシウムまたはハイドロキシアパタイトまたはこれらの組合せ）をＣＲＭとして使用した際にも、同様の結果が観察された（図２１を参照されたい）。
【０１１５】
（実施例４）  生体外でのＡＢＧＳからのｒｈＢＭＰ６の薬物動態と累積放出、およびインプラントでのｒｈＢＭＰ６の保持。
ヒト血液および同種移植片を含有するＡＢＧＳは、方法＃２または＃３のいずれかに記載されるように製剤化された。健康なヒトボランティアからの血液サンプルを、肘静脈から抗凝固剤を含まないチューブに採取した。回収時、血液は同種移植片（粒子サイズ２〜５ｍｍまたは５〜８ｍｍ）および２つの濃度（血液１ｍｌあたり６２．５または１２５μｇのいずれか）でｒｈＢＭＰ６を混合した。凝固完了後（６０分）、ＡＢＣ＋ｒｈＢＭＰ６と同種移植片を１ｍｌの基礎培地ですすいだ。各インプラントを、３ｍｌのダルベッコ変性イーグル培地を含有するファルコンチューブに静置した。チューブを３７℃で１０日間インキュベートし、１、３、６、８および１０日目に培地を交換した。培地中のＡＢＣプラス同種移植片から放出されたＢＭＰ６の量は、ｒｈＢＭＰ６特異的ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＤＹ５０７）によって測定された。
【０１１６】
同種移植片を含まない、および２つの異なる粒子サイズの同種移植片を含むＡＢＧＳから放出されたｒｈＢＭＰ６の量を、図４Ａに示す。ボランティアからのヒト血液を使用してＡＢＧＳを調製した。ＣＲＭは、患者用に利用される、クリニック内の骨組織バンクからのヒト同種移植片であり、安定した状態になった後、ｒｈＢＭＰ６は最初の３〜６日間で容易に放出された。同種移植片を含有するＡＢＧＳは、少しばかりのｒｈＢＭＰ６の放出を示したが、これは統計的に有意ではなかった。１、３、６、８および１０日目に測定された累積放出とＡＢＧＳから計算された総放出（％）は、ｒｈＢＭＰ６の総用量の約３〜９％であった（図４Ｂ〜４Ｃ）。同種移植片の追加は、累積放出がわずかに多くあるように見えた。ｒｈＢＭＰ６は、生体外で試験したように、同種移植片の有無に関わらず、主にＡＢＧＳの血漿タンパク質に結合している。ｒｈＢＭＰ６の薬物動態は、タンパク質が応答する細胞に取り込まれ、軟骨内骨の分化を引き起こすため、移植部位で変化する可能性がある。
【０１１７】
セラミックスまたはＡＬＬＯを含有するＡＢＧＳについてのｒｈＢＭＰ６結合および放出特性：
追加されたｒｈＢＭＰ６は、イオン相互作用および疎水性相互作用を介して、表面および細孔内部のセラミックスに強固かつ明確に結合した。結合タンパク質を溶出するために１００ｍＭのリン酸塩を必要とした。ｒｈＢＭＰ６と凝塊との結合は、疎水性相互作用を有する、赤血球表面にて血漿タンパク質と細胞膜に基づくタンパク質−タンパク質である。また、ＢＭＰ６はヘパリンスルファートと結合することで知られているため、ヘパリン様グリコソアミノグリカンとの高親和性結合を含み得る。したがって、ｒｈＢＭＰ６がＡＢＧＳを含有するＣＥＲＡＭＩＣ−ｒｈＢＭＰ６−ＡＢＣに保持されることによる、２つの（直交する）構造が存在する。
【０１１８】
凝塊の非常に高い結合能力は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび抗ＢＭＰ６を使用したイムノブロット法によって示されている（注意：抗体の交差反応により、全てのレーン上部に、高い分子量のバックグラウンドが見られる）。ＢＭＰ６結合の凝塊容積を図１５に示す。レーン２〜１３は、凝塊中で結合するＢＭＰのために添加され、その後ＳＤＳサンプルバッファによる可溶化により定量的に放出され得るＢＭＰ量が、増加していることを示す。血液１ｍｌあたり８００μｇであっても、血清上清中に有意な量のＢＭＰ６は見られず、凝塊物の飽和の兆候は見られない。ＢＭＰの広範な放出が存在しないことで過剰な骨形成が起こらないため、これは重要である。図１６は、Ｅｌｉｓａアッセイにより測定した、予め導入したセラミックスからの３日間隔でのＢＭＰ放出を示す。
【０１１９】
（実施例５）  ＡＢＧＳの対象製品プロファイル：自家移植片模倣物
我々は、同種移植片（ＡＬＬＯ）粒子を用いて自己血液凝固物（ＡＢＣ）内に分散した組換え型ヒトＢＭＰ６（ｒｈＢＭＰ６）を含有する自家骨移植代替物（ＡＢＧＳ）が、新規骨形成を誘導可能であることを提示する。ＢＭＰ６は、骨に豊富に存在する天然のＢＭＰアンタゴニストであるノギンに強く結合しないため、好ましい形態形成タンパク質として選択された。また、ＢＭＰ６は、Ｉ型およびＩＩ型ＢＭＰ受容体のほとんどにも結合し、骨芽細胞の細胞培養物にて高い特異的アルカリホスファターゼ活性を示す。これにより、ＢＭＰ２またはＢＭＰ７と比較して低用量の使用が可能である。自己血液凝固物（ＡＢＣ）は、１）炎症を軽減し、２）循環骨前駆細胞を提供し、３）フィブリンの微細構造内にて、血漿タンパク質とｒｈＢＭＰ６との強固な結合を促進して、無傷のタンパク質としてゆっくりと放出し、４）免疫応答を低下させ、ｒｈＢＭＰ６に対する抗体の生成を回避し、５）最終的に、軟骨内骨分化に対する許容環境を提供するため、担体として選択された。ＡＬＬＯ粒子は、ＡＢＣ全体に均一に添加され、生体適合性、良好な取扱特性および圧縮抵抗を提供した。
【０１２０】
ＡＢＣとＡＬＬＯを含有するＡＢＧＳは、定義されたレオロジー特性で製造される。同種移植片粒子の追加により、凝塊を達成するのに必要な時間が短縮され、取扱特性が向上する。ＡＢＣが、異所性部位での高いＣａ／Ｐ含有ミネラル（ＡＬＬＯ）によって誘発される異物応答を克服することから、予期されていなかった固有の生物学的特性を有することを最初に観察した。ＡＢＣは、同種移植片粒子周りの多核異物巨細胞の形成を著しく減少させ、間葉系幹細胞の動員を可能にし、次いでｒｈＢＭＰ６に応答して、軟骨内骨分化を起こす。ｒｈＢＭＰ６の結合と放出特性、および最適な骨形成を誘導するのに必要とされるｒｈＢＭＰ６の用量は、同種移植片の有無に関わらずＡＢＧＳにて比較可能である。同種移植片を含有するＡＢＧＳで新規に形成された骨は密集しており、ラット皮下インプラントのマイクロＣＴ分析および組織構造により試験されるように、典型的な骨リモデリングを起こす。これは、直交異方性部位で観察される自家移植片の同化を模倣する。ＡＢＧＳ（ＡＢＣ／同種移植片／ｒｈＢＭＰ６）は軟骨内骨を誘導し、ＡＬＬＯ粒子はクリーピング置換により新規に形成された骨と同化された（図２２）。合成セラミックスを含有するＡＢＧＳ（ＡＢＣ／ＴＣＰ／ｒｈＢＭＰ６）を図２２に表す。ＡＢＧＳは、１ｍｌあたり１００μｇのＡＢＣで効果的なｒｈＢＭＰ６用量を伴う、用量依存的な方法で骨を誘導する。
【０１２１】
ウシ由来コラーゲンは、ＢＭＰを送達するための担体として使用され、ＩｎＦｕｓｅ（登録商標）３１、またはＡｍｐｌｉｆｙ（登録商標）３８といった合成セラミックスを含むスラブ形状の複合材料といった、ウシアキレス腱由来の酸可溶性再構成Ｉ型コラーゲン網が、ｒｈＢＭＰ２を送達するために使用される。粒状および／または追加のＣＭ−セルロース（注射可能なパテ状）と組み合わせられるウシ骨幹部骨誘導不溶性Ｉ型コラーゲンは、ＯＰ１−Ｉｍｐｌａｎｔｓ（登録商標）３９およびＯＰ１−Ｐｕｔｔｙ（登録商標）４０として、ｒｈＢＭＰ７／ＯＰ１用に使用される。化学的方法または臨床使用を目的とするガンマ放射線によるこれらのウシ由来コラーゲンの滅菌によっても、コラーゲン担体に望ましくない変性が加わる４０。ここで我々は、自己血液凝固物を同種移植片（ＡＬＬＯ）を含むｒｈＢＭＰ６（ＡＢＧＳ）を耐圧縮性基材として送達する天然担体として提示し、後側方固定術を促進する。また、１）アジュバントとして機能する動物由来コラーゲンとともに送達する際、ＢＭＰに対する抗体の生成、２）使用され、かつ移植部位から容易に放出される、高用量のＢＭＰの結果としての神経炎症、３）生体力学的な骨支持の機能的障害による神経圧迫といった有害事象例を最小化することを提示する。
【０１２２】
（実施例６）  ＡＢＧＳ（ＡＢ対自己多血小板血漿）
ＡＢＧＳは、自己血（ＡＢ）由来のｒｈＢＭＰ６を有する多血小板血漿（ＰＲＰ）タンパク質を使用して製剤化され、これを自己血液凝固物（ＡＢＣ）で製剤化されたＡＢＧＳと比較した。更に、ＡＢＧＳはＡＢＣおよびＰＲＰで製剤化された。ＡＢＧＳ−ＡＢＣ（ＡＢＣで製剤化）、ＡＢＧＳ−ＰＲＰ（ＰＲＰで製剤化）およびＡＢＧＳ−ＡＢＣ／ＰＲＰ（ＡＢＣおよびＰＲＰの両方で製剤化）をラット皮下移植アッセイで調べた。図２３は、５〜２０μｇのＢＭＰ−６が、用量によって新規骨を誘導する自家ＰＲＰ（白丸にて示される）に添加される一方で、ラットから調製され、ラット皮膚下に移植される自己ＰＲＰが、１４日後に骨を形成しなかったことを示す。
【０１２３】
（実施例７）  臨床結果を予測するために実施される前臨床試験
ウサギの骨幹部切片の欠損モデル：
骨臨界サイズ欠損の縮小におけるＡＢＧＳの有効性は、ウサギ尺骨分節欠損モデルにて試験された。ＡＢＣは、ウサギの耳翼辺縁静脈から１．５ｍｌの容量で採取された。ｒｈＢＭＰ６を、５０ｍＭ濃度の塩化カルシウムとともに血液に２５μｇ、５０μｇ、１００μｇの量で添加し、チューブを回転させて混合した。ＡＢＣ＋ｒｈＢＭＰ６を注射器で調製し、室温で６０〜９０分間静置して凝固させた。液体部分（血清）を取り除き、均質で粘着性、注射可能な柔軟性のあるＡＢＧＳゲルを使用できる状態とした。
【０１２４】
研究プロトコルは、１０週齢（体重２．３〜２．５ｋｇ）のニュージーランド系のオス実験用ウサギ（アナウサギ）で実施された。動物を４つのグループ（各ｎ＝５）：Ａ）対照、ＡＢＣのみで充填された欠損、Ｂ）ＡＢＣ＋ｒｈＢＭＰ６（２５μｇ／ｍｌ）で充填された欠損、Ｃ）ＡＢＣ＋ｒｈＢＭＰ６（５０μｇ／ｍｌ）で充填された欠損、およびＤ）ＡＢＣ＋ｒｈＢＭＰ６（１００μｇ／ｍｌ）で充填された欠損にランダムに分けた。別の実験（１グループあたりｎ＝５）では、ＡＢＧＳ（１．５ｍｌＡＢＣ＋ｒｈＢＭＰ６（１００μｇ／ｍｌ）を、移植後２および８週目に、コラーゲン（１５０ｍｇ）＋ｒｈＢＭＰ７（１００μｇ／１００ｍｇ）と比較した。
【０１２５】
１７ｍｍ（大きな欠損）の尺骨切片を取り除き、ＡＢＧＳを欠損部位に移植した。内部または外部固定デバイスを使用せず、機械的安定性のために無傷の橈骨は残した。右前肢の放射線画像は、手術直後と２３週間の骨治癒期間中に撮影された。実験中、悪影響はなかった。治癒による結果は、放射線撮影、マイクロＣＴ定量化および組織構造によって分析された。
【０１２６】
単独で移植されたＡＢＣは新規骨形成を生じず、欠損を埋めることができなかった（図５）。ただし、ｒｈＢＭＰ６（ＡＢＧＳ）を含有するＡＢＣは、再現性のある新規骨形成を誘導し、放射線撮影法で測定されたように欠損を再建した。６、９、１３、１６、１９および２３週目（図５）に表すように、新規骨形成は用量依存的様式で誘導され、全てのウサギ尺骨は２３週目（図６Ａおよび６Ｃ）に示される。マイクロＣＴ分析は、反対側の無処置骨と比較される骨体積（ＢＶ）および骨髄体積（ＭＶ）で試験されたように、骨量の用量依存的な増加を示した（図６Ｄ）。各グループの代表的なサンプルに示すように、骨質は組織構造によって更に確認された（図７）。１ｍｌのＡＢＣあたり１００μｇの用量のｒｈＢＭＰ６を投与すると、皮質が完全に確立され、髄管がリモデリングされた状態の完全な再建が生じた。組織学的評価により、１ｍｌのＡＢＣあたり１００μｇのｒｈＢＭＰ６で処置されたウサギ尺骨の臨界サイズ欠損は完全に埋められることを確認した（図７）。
【０１２７】
同様のモデルで、ＡＢＧＳを含むｒｈＢＭＰ７／ウシ骨コラーゲンデバイス（ｒｈＢＭＰ６／ＡＢＣ）を並べて比較した。コラーゲン単独では骨形成を誘導しなかったが、コラーゲンを含有するｒｈＢＭＰ７は新規骨形成を誘導した（図８Ａ）。ｒｈＢＭＰ７／ウシ骨コラーゲンの市販デバイスには、１ｇのコラーゲンあたり３．５ｍｇのｒｈＢＭＰ７が含まれており、ウサギ尺骨の欠損を充填するためには、我々は総量１．０６ｍｇのｒｈＢＭＰ７に相当する、３００ｍｇをコラーゲン担体に使用した。図８Ａに示すように、尺骨欠損をｒｈＢＭＰ７／コラーゲンを誘導して埋めたものと、ＡＢＧＳ（１．５ｍｌの血液中、１００μｇのｒｈＢＭＰ６）と比較した。２週目と６週目に、ＡＢＧＳＳは新しい均一な骨の形成を誘導し、リモデリングを行って隣接する宿主骨に新しい皮質を再架橋したが、ｒｈＢＭＰ７／コラーゲンによる骨形成は遅れた。マイクロＣＴ分析により、ｒｈＢＭＰ６を含有するＡＢＧＳは、手術後８週目に約２倍以上の骨体積を誘導することが確認された（図８Ｂ〜８Ｃ）。
【０１２８】
この前臨床試験からの結果により、我々は、橈骨遠位骨折（ＤＲＦ）（１）に関し、患者へのファースト・イン・ヒューマン（ＦＩＨ）無作為化プラセボ対照研究およびＩ期の二重盲検安全研究および高位脛骨骨切り術（ＨＴＯ）（２）に関し、患者へのＩ／ＩＩ期有効性研究および安全研究を評価することができた。
【０１２９】
ウサギの後側方固定術（ＰＬＦ）の研究：
後側方固定術（ＰＬＦ）ウサギモデルにおける脊椎固定術の骨誘導活性について、ＡＢＧＳを評価した。研究プロトコルは、１４週齢、３〜５ｋｇの体重であるニュージーランド系のオス実験用白ウサギ（アナウサギ）で実施された。２８匹の骨格が成熟したウサギは、腰椎Ｌ５〜Ｌ６４７間の両側の後方横突起間の固定術を受けた。動物はそれぞれ４匹ずつ、対照として機能するＡＢＣ単独、５０μｇ（０．０５ｍｇ／ｍｌ、デバイスにつき１２５μｇ）のｒｈＢＭＰ６を含むＡＢＣ、１００μｇ（０．１ｍｇ／ｍｌ、デバイスにつき２５０μｇ）のｒｈＢＭＰ６を含むＡＢＣ、２００μｇ（０．２ｍｇ／ｍｌ、デバイスにつき５００μｇ）のｒｈＢＭＰ６を含むＡＢＣ、２００μｇ（０．２ｍｇ／ｍｌ、デバイスにつき５００μｇ）のｒｈＢＭＰ６を含むＡＢＣおよび失活ウサギ移植骨（０．３ｇ／ｍｌ）、４００μｇ（０．４ｍｇ／ｍｌ、デバイスにつき１０００μｇ）のｒｈＢＭＰ６を含むＡＢＣおよび失活ウサギ移植骨（０．３ｇ／ｍｌ）、対照として機能する、ｒｈＢＭＰ６を含まないＡＢＣおよび失活ウサギ移植骨（０．３ｇ／ｍｌ）といった７つの試験グループへと分けた。デバイス調製用のＡＢＣの体積は、移植側ごとに２．５ｍｌであった。
【０１３０】
図９は、ＡＢＣ単独およびＡＢＣプラスＡＬＬＯグループと比較して、ＡＢＣ１ｍｌあたりの種々の用量のｒｈＢＭＰ６にて、ＡＬＬＯありおよびＡＬＬＯなしのＡＢＧＳのＸ線写真、マイクロＣＴ写真および肉眼形態の写真を示す。ＡＢＧＳにより２つの移行突起間に新規に形成された骨は密集しており、インプラント中に均一に分散し、１４週目に試験されるようにインプラントの周りの軟部組織周囲により分離されている。１ｍｌのＡＢＣあたり５０μｇ（１２５μｇ／インプラント）にて、ｒｈＢＭＰ６を含有するグループは新規骨形成を実証したが、癒合は４匹のウサギのうち２匹のウサギで達成されたものであった。ここから、ｒｈＢＭＰ６の量が十分ではない可能性が考えられた。１ｍｌのＡＢＣあたり１００μｇ（２５０μｇ／インプラント）のｒｈＢＭＰ６では、全てのウサギで完全な癒合が観察された。１ｍｌのＡＢＣあたり２００μｇ（５００μｇ／インプラント）のｒｈＢＭＰ６では、全てのウサギが両側で癒合を示したが、１ｍｌのＡＢＣあたり１００μｇのグループで観察された量以下であった。ＡＬＬＯは炎症を誘発し、多核ＦＢＧＣを形成できるため、１ｍｌのＡＢＣあたり２００μｇで２倍のｒｈＢＭＰ６または１ｍｌのＡＢＣあたり４００μｇで４倍のｒｈＢＭＰ６（５００または１０００μｇ／インプラント）を含有するＡＢＧＳインプラントを製剤化した。１ｍｌのＡＢＣあたり２００μｇ（５００μｇ／インプラント）を含有するＡＢＧＳプラスＡＬＬＯは、１ｍｌのＡＢＣあたり１００μｇ（２５０μｇ／インプラント）を有するＡＢＧＳと比較して、骨体積を伴う完全な癒合を誘導した。１ｍｌのＡＢＣあたり４００μｇ（１０００μｇ／インプラント）へと量を増加したｒｈＢＭＰ６は、骨体積を更に増加することがなかった。ＡＢＣ単独またはＡＢＣプラスＡＬＬＯを有するグループは、ＡＢＣはＡＬＬＯ粒子内に内因性循環骨前駆細胞および成長因子を含有し、ＡＬＬＯは吸収時に内因性ＢＭＰを放出し得るにも関わらず、全く癒合することがなかった。横突起間と新規に形成された骨との間の接触領域は区別不可能であり、１つの連続した骨切片に癒合された。マイクロＣＴ分析によって測定される骨体積、骨梁数および骨梁相互連結性の定量的測定値を図１０Ａ〜１０Ｄに示す。１ｍｌのＡＢＣあたり１００μｇのｒｈＢＭＰ６でのＡＢＧＳは最適用量であり、用量を２倍にしても骨形成パラメータは必ずしも増加しないようである。１ｍｌのＡＢＣあたり１００μｇにてＡＬＬＯを含まないＡＢＧＳと比べると、１ｍｌのＡＢＣあたり２００μｇまたは４００μｇのいずれかを含有するＡＢＧＳプラスＡＬＬＯインプラントもまた、新規骨形成を生じる。
【０１３１】
ＡＢＧＳインプラントの組織構造は、新規に形成された骨と固有の横突起との間に生じる界面において典型的なリモデリングおよび骨統合を伴う、新規骨形成を示した（図１１Ａ）。ＡＬＬＯインプラントを含有するＡＢＧＳでは、低倍率および高倍率にて、１ｍｌのＡＢＣあたり２００μｇ（５００μｇ／インプラント）でのＡＢＣ／ｒｈＢＭＰ６／ＡＬＬＯで示されるように、新規に形成された骨は急速に骨リモデリングされ、ＡＬＬＯ粒子と完全に同化され、最終的にはクリーピング置換によって置き換わる（図１１Ａ）。ＡＢＣ／ＡＬＬＯの組織構造は、線維組織の形成を除いて、新規骨の欠如を示した。更に、０日目と比較して、ＡＢＧＳ移植後２１日目には、ＡＢＣ／ｒｈＢＭＰ６インプラントで処置されたウサギの血清中に抗ｒｈＢＭＰ６抗体が検出されなかったことに言及することは注目に値する（図１１Ｂ）。図１１Ｃおよび図１１Ｄは、１ｍｇおよび２ｍｇのｒｈＢＭＰ６で、０日目および２１日目の血清希釈度に依る吸収度を示す。
【０１３２】
ヒツジにおける後側方固定術（ＰＬＦ）の研究
研究プロトコルは、衛生証明書を有し、体重６０〜７０ｋｇである２〜３歳の混合種のメスヒツジ（Ｏｖｉｓ  ｓｐｐ．）で実施された。
【０１３３】
２種類のＰＬＦ実験がヒツジで行われた。最初の実験では、８匹のメスヒツジを、ＡＢＣ単独（ｎ＝２）、および１ｍｌにつき６２．５μｇ（合計０．５ｍｇ）のｒｈＢＭＰ６を含有するＡＢＣ（ｎ＝６）で、器具を使用することなく処置した。２番目の実験では、１４匹のヒツジに、１ｍｌにつき１８７．５μｇ（合計１．５ｍｇ）のｒｈＢＭＰ６を含有するＡＢＣを投与した。動物は、３つのグループ：グループＡ、ＡＢＣ単独（ｎ＝２）、グループＢ、器具を使用してのＡＢＣ／ｒｈＢＭＰ６（ｎ＝６）およびグループＣ、器具を使用してのＡＢＣ／ｒｈＢＭＰ６／および失活ヒツジ同種移植片（２ｇ／インプラント）（ｎ＝６）に割り当てた。手術は全身麻酔下で行われ、同じ手術チームによって全ての動物に対して行われた。インプラント調製用の自己血液サンプル（１６ｍＬ）を動物の頸静脈から採取し、動物ごとに両側に２つのインプラント（各８ｍＬ）を調製し、出血が明らかになるまで横突起の外側面の皮質をむく手術を行った後、移植した。ヒツジは無作為にグループへと割り当てられ、横突起と椎弓の両側に配置した適切なインプラントを受容した。臨床および放射線画像の管理は、研究が終了した８週目と２７週目に、手術直後に獣医師によって行われた。実験中、いずれの実験グループでも悪影響は観察されなかった。
【０１３４】
１ｍｌのＡＢＣあたりｒｈＢＭＰ６を６２．５μｇ（０．５ｍｇ／インプラント）または１ｍｌのＡＢＣあたりｒｈＢＭＰ６を１８７．５μｇ（１．５ｍｇ／インプラント）の用量で、ＡＬＬＯを含まないＡＢＧＳを評価した。両方のグループは、Ｘ線（図１２Ａ）およびマイクロＣＴ（図１２Ｂ）で試験したように、新規骨形成を誘導し、移植後６か月で採取される完全な癒合を得た。２つの用量の間で形成される骨量に明らかな違いはなく、１ｍｌのＡＢＣあたり約１００μｇの範囲であるｒｈＢＭＰ６が効果的な用量であると思われる。また、ウサギとヒツジの両方のＰＬＦ研究では、効果的な用量に大きな違いはなかった。器具使用の有無に関わらず、１ｍｌのＡＢＣあたりｒｈＢＭＰ６が１８７．５μｇであるＡＬＬＯ（１．５ｍｇ／インプラント）を含むＡＢＧＳの試験はまた、新規骨形成を誘導し、ＡＬＬＯを含まないＡＢＧＳよりも著しく多いＡＢＧＳを示した（図１２Ｃ〜１２Ｆ）。ＡＢＧＳおよび器具使用により処置されたヒツジは、両側の新規骨形成に約８３％成功した（１２個のうち２個のインプラントは完全に癒合しなかった）が、一方でＡＢＧＳに同種骨移植を追加すると、癒合成功率が約９３％に増加した（１２個のうち１個のインプラントは完全に癒合しなかった）（図１２を参照されたい）。
【０１３５】
新規に形成された骨に関する両側および横突起の間隙におけるヒツジＰＬＦ研究による、脊椎固定術の肉眼形態の顕微鏡写真は図１３Ａに示される。代表的なヒツジによる同様のマイクロＣＴ分析は図１３Ｂに示される。異所性部位で新規に形成された骨と固有の横突起との間の骨統合は区別できず、癒合物は密集しており強固であった。マイクロＣＴ分析により試験されるように、新規癒合した骨ならびに隣接した固有の横突起および腰椎の骨体積、骨梁の形態および骨厚さの定量的測定を、図１３Ｃ〜１３Ｅに表す。新規に形成された骨は、固有の横方向骨および隣接する腰椎と比較すると、増加した骨体積、骨梁数および骨梁相互連結性を有する。研究は、ＡＬＬＯ粒子の用量と物理的特性とヒツジの個別レベルおよび複数レベルの２つの横突起間にて、正常に長期継続する腰椎癒合に必要とされる必要量（ＡＢＣの体積あたりの質量）を定義するため、進行中である。ウサギおよびヒツジのＰＬＦ研究の結果により、自家移植片（３）に対し、無作為化された二重盲検の対照ＩＩ期後方椎体間固定術（ＰＬＩＦ）を評価することができた（３）。
【０１３６】
ヒツジでの前方椎体間固定術研究
ｒｈＢＭＰ６を用いたＡＢＧＳＳの有効性は、ＤｅＰｕｙ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  ＣＦＲＰ  Ｉ／Ｆケージを移植後、ヒツジの前方腰椎固定術で試験された。体重５０〜６０ｋｇである３〜４歳のメスヒツジ（Ｍｅｒｉｎｏｌａｎｄｓｃｈａｆ種）１０匹を実験に使用し、２つの実験グループ、すなわち、対照：ｒｈＢＭＰ６なしのＡＢＣで充填されたケージ（ｎ＝４）および実験：１ｍｌのｒｈＢＭＰ６あたり２５０μｇを含む、自己血液凝固物で充填されたケージ（ｎ＝５）のグループへと分けた。
【０１３７】
手術は全身麻酔下で行われ、同じ手術チームによって全ての動物に対して行われた。インプラント調製用の血液サンプル（２ｍｌ）を頸静脈から採取した。ケージは、炭素繊維強化ポリマーで作成されており、寸法（幅／深さ／高さ）１５ｍｍＸ１２ｍｍＸ５ｍｍであった。椎間板（Ｌ５〜Ｌ６）を切除して終板の軟骨を削り、頸部ケージを移植して約１ｃｃの血液凝固物で充填し、別の１ｃｃはケージの周囲に左右に分布させた。ヒツジは、手術直後、７週間後および１１週間後に、臨床的および放射線学的に管理された。
【０１３８】
癒合成熟の時間経過は、外科検査、放射線撮影、μＣＴ分析によって測定された。前後方向および側面方向の単純Ｘ線写真は、一定の条件下で脊椎から作成された。癒合状態は、単純Ｘ線写真で評価された。Ｘ線写真は、盲検化された３人の整形外科医によって個々に測定された。断面および３次元における癒合を評価するために、コンピュータ断層撮影スキャンが行われた。
【０１３９】
実験は１１週目に終了し、手術後呼吸器感染症により死亡した対照グループの１匹のヒツジを除き、全ての動物が生存した。可動性、部分的または完全な麻痺、神経刺激および／または疼痛、食物摂取量の減少および体重減少に関する副作用は記録されていない。異所性骨形成、浮腫またはその他の目に見える形態学的変化は観察されなかった。ｒｈＢＭＰ６を受容したヒツジでは、新規に形成された骨がケージ（ｎ＝５）の内外に存在し、骨は両方の椎体に固定されていた。対照動物のケージに骨がある程度形成されたが、癒合は完全ではなかった。新規に形成された骨の骨体積と骨厚さは、対照動物と比較して、ｒｈＢＭＰ６を含むＡＢＧＳＳで処置されたヒツジで著しく高かった。１１週間後のヒツジの前方椎体間固定術（ＡＬＩＦ）モデルの結果を図１４に示す。
【０１４０】
図１４を参照すると、２つの椎骨間の空間（黒矢印）の対照ヒツジのＸ線写真は、新規に形成された骨に癒合されていない。これは、これは、ケージ内部の骨を指し示す白矢印およびケージ外部の空間を示す赤矢印（側面図および底面図）により、μＣＴスキャン上で示される。ＡＢＧＳおよびｒｈＢＭＰ６で処置されたヒツジのＸ線写真では、２つの隣接する椎骨間に新規に形成された骨が存在する。これはμＣＴスキャン上で連続骨（側面図および底面図の白矢印）ならびにケージの外側の空き空間（側面図と底面図上の黒矢印）によって確認される。ＡＬＩＦ用頸部ケージ（ヒト）を使用したこのヒツジ実験は、ｒｈＢＭＰ６（２５０μｇ／ｍｌ）を含むＡＢＧＳが、対照動物の不完全な癒合と比較して、２つの隣接する腰椎の完全な癒合を生じることを実証した。
【０１４１】
（参考文献）
Asahina, I., Sampath, T.K., Nishimura, I. and Hauschka, P.V.  (1993).  Human Osteogenic Protein-1 induces both chondroblastic and osteoblastic differentiation of osteoprogenitor cells derived from newborn rat calvaria.  J. Cell. Biol. 123:921-933.
Cahill, K. S., Chi, J. H., Day, A., Claus, E. B. (2009) Prevalence, complications, and hospital charges associated with use of bone-morphogenetic proteins in spinal fusion procedures. JAMA 302:58-66
Carragee, E. J., Hurwitz, E. L., Weiner, B. K. (2011) A critical review of recombinant human bone morphogenetic protein-2 trials in spinal surgery: emerging safety concerns and lessons learned. Spine J 11:471-491
Executive Summary for P050036 Medtronic’s AMPLIFYTM rhBMP-2 and analogs Matrix Orthopedic and Rehabilitation Devices Advisory Panel (2010) Food and Drug Administration.
Gupta S, M. V., Gupta MC (2017) Biology of spine fusion and application of osteobiologics in spine surgery. In: Vukicevic S, Sampath. KT. (ed) Bone Morphogenetic Proteins: Systems Biology Regulators. Springer International Publishing 
Griffith, D.L., Oppermann, H., Rueger, D.C., Sampath, T.K., Tucker, R.F. and Carlson, W.D. (1994).  Crystallization and preliminary crystallographic data of recombinant human Osteogenic Protein-1 (hOP-1).  J. Mol. Biol. 244: 657-8.
Kim DH, Rhim R, Li L, Martha J, Swaim BH, Banco RJ, et al. Prospective study of iliac crest bone graft harvest site pain and morbidity. Spine J. 9:886-92, (2009)
Massague J (1998) TGF-βsignal transduction. Annu Rev Biochem 67: 753-791
Medtronic Sofamor Danek USA, Inc. INFUSE Bone Graft product information: Oral/Facial. Memphis, TN; 2006. Available online at www.accessdata.fda.gov/cdrh_docs/pdf5/P050 053c.pdf. Last accessed February 2010
Mobbs, R. J. et al. (2015) Lumbar interbody fusion: techniques, indications and comparison of interbody fusion options including PLIF, TLIF, MI-TLIF, OLIF/ATP, LLIF and ALIF. J Spine Surg 1:2-18 
Sampath TK. The Systems Biology of Bone Morphogenetic Proteins. In: Vukicevic S, Sampath, KT, editor. Bone Morphogenetic Proteins: Systems Biology Regulators. Springer International Publishing; 2017. p. 15-38
Sampath TK, Reddi AH. Dissociative extraction and reconstitution of extracellular matrix components involved in local bone differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981;78(12):7599-603.
Sampath, T.K., Muthukumaran, N. and Reddi, A.H.  1987.  Isolation of osteogenin, an extracellular matrix-associated, bone-inductive protein, by heparin affinity chromatography. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7109-7113.
Sampath, T.K., Coughlin, J.E., Whetstone, R.M., Banach, D., Corbett, C., Ridge, R.J., Ozkaynak, E., Oppermann, H. and Rueger, D.C.  1990.  Bovine osteogenic protein is composed of dimers of OP-1 and BMP-2A, two members of the Transforming Growth Factor - βsuperfamily.  J. Biol. Chem. 265: 13198-13205.
Sampath TK, Maliakal JC, Hauschka PV, Jones WK, Sasak H, Tucker RF, et al. (1992) Recombinant human osteogenic protein-1 (hOP-1) induces new bone formation in vivo with a specific activity comparable with natural bovine osteogenic protein and stimulates osteoblast proliferation and differentiation in vitro. J Biol Chem. 267(28):20352-62.
Sampath TK, Rueger DC (1994) Structure, function and orthopedic application of osteogenic protein-1 (OP-1)  Complications in Orthopedics 9:101-107
Song K, Krause C, Shi S, Patterson M, Suto R, Grgurevic L, et al. (2010) Identification of a key residue mediating bone morphogenetic protein (BMP)-6 resistance to noggin inhibition allows for engineered BMPs with superior agonist activity. J Biol Chem. 285(16):12169-80
Stryker Biotech: OP-1 Implant product information (2009). www.stryker.com/stellent/groups/public/documents/web_prod/126737.pdf. Accessed February 2010
Stryker Biotech: OP-1 Putty product information (2009) www.stryker.com/stellent/groups/public/documents/web_prod/127024.pdf. Accessed February 2010
Vukicevic S, Sampath TK, editors. Bone Morphogenetic Proteins: from Laboratory to Clinical Practice. Basel: Birkhauser Verlag, 2002.
Vukicevic, S., Basic, V., Rogic, D., Basic, N., Shih, M-S., Shepard, A., Jin, D., 
Dattatreyamurty, B., Jones, W., Dorai, H., Ryan, S., Griffiths, D., Maliakal, J., Jelic, M., Pastorcic, M., Stavljenic, A. and  Sampath, T.K.  (1998).  Osteogenic Protein-1 reduces severity of injury in ischemic acute renal failure.  J. Clin. Invest. 102: 202-214.
Vukicevic S, Sampath, TK, editors, Bone Morphogenetic Proteins: Systems Biology Regulators. Springer International Publishing; 2017.
Wang EA, Rosen V, D'Alessandro JS, Bauduy M, Cordes P, Harada T, et al. (1990) Recombinant human bone morphogenetic protein induces bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 87(6):2220-4.
Wozney JM, Rosen V, Celeste AJ, Mitsock LM, Whitters MJ, Kriz RW, et al. (1988) Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities. Science. 242(4885):1528-34.
【図１】
2020537590.tif 000002
【図１Ａ】
2020537590.tif 000003
【図１Ｂ】
2020537590.tif 000004
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2020537590.tif 000006
【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
2020537590.tif 000008
【図２Ｅ】
2020537590.tif 000009
【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2020537590.tif 000013
【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１６Ｆ】
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【図１６Ｇ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
2020537590.tif 000064
【図２３】
2020537590.tif 000065
【手続補正書】
【提出日】令和2年1月19日(2020.1.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
脊椎固定術における自家移植片の使用に加えて、自家移植片を使用して処置される種々の他の整形外科適応症および歯科適応症がある。そのような適応症には、骨幹部、橈骨遠位骨折、脛骨癒合不全骨折、高位脛骨骨切り術、骨粗鬆症性骨折（椎骨圧迫骨折、非定型大腿骨骨折）、骨嚢胞による欠損および骨腫瘍による欠損などの種々の欠損と骨折、また、種々の口腔、歯周組織および顎顔面の欠損および異常が含まれる。更に、自家移植片は、低ホスファターゼ症（組織非特異的アルカリホスファターゼ遺伝子の突然変異）、Ｉ型神経線維腫症（ニューロフィブロミン遺伝子の突然変異）、骨形成不全症（Ｉ型コラーゲン遺伝子の突然変異）など、稀少な筋骨格疾患に関連する偽関節症および偽性骨折を処置するためにも使用される。そのような状態での骨損失の重症度によっては、所望の処置を提供するには、患者から安全に得られ得る自家移植片の量は十分ではないか、または（危険な状態の喫煙者、糖尿病、ステロイド使用者および骨粗鬆症患者においては）骨の質を損なう可能性がある。こうした場合、欠損部位に限定される、安全で強固な骨形成を誘導可能である生物学的骨移植片代替物が大いに求められる。包括的な読解のため、Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ  Ｓ，Ｓａｍｐａｔｈ  ＴＫ，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｆｒｏｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｔｏ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｂａｓｅｌ：Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，２００２；Ｖｕｋｉｃｅｖｉｃ  Ｓ，Ｓａｍｐａｔｈ，ＫＴ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ；２０１７が挙げられる。その他に、国際公開第２００９１２９６３１Ａ１号は、骨欠損周辺に適合されるような可撓性膜と、膜によって作成された空隙空間内に含有される多血小板血漿ゲル組成物と、膜によって作成された当該空隙空間内に含有される多血小板血漿ゲル組成物と、を含む、骨修復用生体適合性インプラントを開示する。し、国際公開第２００８０１１１９２Ａ２号は、（ａ）（１）全血、（２）骨形成タンパク質、（３）外因的に提供されたカルシウムイオン、および（４）任意選択的に、外因的に提供されたフィブリン−トロンビン混合物を組み合わせる工程と、（ｂ）機械的に安定した凝塊が形成されるまで工程（ａ）で組み合わせた成分をインキュベートし、外因的に提供されたカルシウムイオンが、均質、粘着性、注射可能（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｌｅ）、注射可能（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）、および柔軟性のある凝塊ゲルを提供するのに効果的である濃度で存在する工程と、を含む工程により調製される、骨欠損を処置するのに使用するため誘導された全血由来の凝塊を開示し、国際公開第９１１９５１０Ａ１号は、イプシロンアミノ酸カプロン酸（ＥＡＣＡ）または他のリジン類似体またはセリンプロテアーゼ阻害剤ならびに軟骨および／または骨誘導タンパク質などの抗線溶剤を含む、骨誘導性医薬製剤を開示する。製剤の効果は、軟骨および／または骨欠損の処置において、ＥＡＣＡが欠如したサンプルと比較したＥＡＣＡの���用に基づいている。
これまで、患者は脊椎固定術および他の整形外科手術に対する自家移植手術を受けるための可能性のある選択肢は、ごく少数の製品に限られている。明らかに、患者を自家移植片手術に関連する追加のリスク、疼痛および制限にさらす必要なく、骨欠損の正常な修復および脊椎固定術に必要となる新規骨成長のレベルと品質を促進し得る、改善された組成物への必要性が存在している。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５０】
【図１】方法＃２または＃３によって調製されたＡＢＧＳの顕微鏡写真およびボランティアからのヒト血液由来のＣＲＭを示す。組織骨バンクからのヒト同種移植片はＣＲＭとして使用される。左は全体図、中央はＸ線、右はマイクロＣＴスキャンである。
【図２Ａ】（同種移植片／ドナー由来の同種骨を含有する自己血液凝固物）ＡＬＬＯプラスＡＢＣインプラントおよびＡＢＣ＋ＡＬＬＯ＋ｒｈＢＭＰ６インプラントの７日目および３５日目の組織学的観察を示す。
【図２Ｂ】（同種移植片／ドナー由来の同種骨を含有する自己血液凝固物）ＡＬＬＯプラスＡＢＣインプラントおよびＡＢＣ＋ＡＬＬＯ＋ｒｈＢＭＰ６インプラントの７日目および３５日目の組織学的観察を示す。
【図２Ｃ】７日目および３５日目のインプラントによるＡＢＣ／ＡＬＬＯおよびＡＢＧＳ（ＡＢＣ／ＡＬＬＯ／ｒｈＢＭＰ６）のマイクロＣＴ分析を示す。
【図２Ｄ】７日目および３５日目のインプラントによるＡＢＣ／ＡＬＬＯおよびＡＢＧＳ（ＡＢＣ／ＡＬＬＯ／ｒｈＢＭＰ６）のマイクロＣＴ分析を示す。
【図２Ｅ】ラット皮下インプラントの７日目および３５日目における、ＡＢＣプラスＡＬＬＯおよびＡＢＣ＋ＡＬＬＯ＋ｒｈＢＭＰ６に対しマイクロＣＴ分析を用いて定量化した、同種移植片体積および骨体積を示したグラフである。
【図２Ｆ】ラット皮下インプラントの７日目および３５日目における、ＡＢＣプラスＡＬＬＯおよびＡＢＣ＋ＡＬＬＯ＋ｒｈＢＭＰ６に対しマイクロＣＴ分析を用いて定量化した、同種移植片体積および骨体積を示したグラフである。
【図３Ａ】ラット皮下部位に移植された同種移植片（ＡＬＬＯ）を含有する自己血液凝固物による、組織構造の顕微鏡写真を示す。
【図３Ｂ】ＡＬＬＯ粒子がラット皮下部位に移植されたＡＢＣ内に処方された際の、組織構造の顕微鏡写真を示す。
【図３Ｃ】ＡＢＣ＋ＡＬＬＯ＋ｒｈＢＭＰ６、ＡＬＬＯ粒子を含有するインプラントが、ラット皮下部位で処方および移植された際の組織構造の顕微鏡写真を示す。
【図３Ｄ】ＡＬＬＯ、ＡＬＬＯ＋ＡＢＣおよびＡＬＬＯ＋ＡＢＣ＋ｒｈＢＭＰ６インプラントによる３つの代表的な組織構造区分から形態計測学的に集計された、平均数の多核ＦＢＧＣを示したグラフを示す。
【図３Ｅ】酸性ホスファターゼ染色の免疫組織染色によって特徴付けられる組織構造の顕微鏡写真を示す。
【図３Ｆ】酸性ホスファターゼ染色の免疫組織染色によって特徴付けられる組織構造の顕微鏡写真を示す。
【図４Ａ】同種移植片なしおよび２つの異なる粒子サイズの同種移植片ありのＡＢＧＳから放出されたｒｈＢＭＰ６の量を示すグラフである。
【図４Ｂ】同種移植片なしおよび２つの異なる粒子サイズの同種移植片ありのＡＢＧＳからのｒｈＢＭＰ６の累積放出を示すグラフである。
【図４Ｃ】同種移植片なしおよび２つの異なる粒子サイズの同種移植片ありのＡＢＧＳからのｒｈＢＭＰ６の累積放出を示すグラフである。
【図５】６週目、９週目、１３週目、１６週目、１９週目および２３週目に表される、再現性があるよう誘導されたウサギ尺骨内の新規骨形成、および用量依存的様式で放射線撮影法により測定された再建済臨界サイズ欠損を示す。
【図６Ａ】用量依存的な応答を示す、Ｘ線写真および各マイクロＣＴウサギ尺骨分析を示す。
【図６Ｂ】図６ＡのＸ線によるＸ線スコアリングを示す。
【図６Ｃ】用量依存的な応答を示す、Ｘ線写真および各マイクロＣＴウサギ尺骨分析を示す。
【図６Ｄ】髄管および欠損の骨体積の形態計測的分析を示す。
【図７】異なるｒｈＢＭＰ６用量でのウサギ尺骨欠損の組織構造区分を示す。
【図８Ａ】６週目と２週目に表される、コラーゲン中のｒｈＢＭＰ７で処置されたウサギ尺骨および自己血液凝固物（ＡＢＣ）中のｒｈＢＭＰ６で処置されたウサギ尺骨の、Ｘ線写真を示す。
【図８Ｂ】６週目と２週目に表される、コラーゲン中のｒｈＢＭＰ７で処置されたウサギ尺骨および自己血液凝固物（ＡＢＣ）中のｒｈＢＭＰ６で処置されたウサギ尺骨ならびにコラーゲンのみで処置されたウサギ尺骨の、Ｘ線スコアを示すグラフを示す。
【図８Ｃ】６週目と２週目に表される、コラーゲン中のｒｈＢＭＰ７で処置されたウサギ尺骨および自己血液凝固物（ＡＢＣ）中のｒｈＢＭＰ６コラーゲンのみで処置されたウサギ尺骨の、骨体積（ＢＶ）を示すグラフを示す。
【図８Ｄ】ノギンによる、ＢＭＰ６およびＢＭＰ７の活性を示すグラフを示す。
【図９】ウサギの後側方固定術（ＰＬＦ）の脊椎固定術用ＡＢＣ単独およびＡＢＣプラスＡＬＬＯグループと比較した、ＡＢＣ１ｍｌあたりの種々の用量のｒｈＢＭＰ６にて、ＡＬＬＯありおよびＡＬＬＯなしのＡＢＣＳのＸ線写真、マイクロＣＴ写真および肉眼形態写真を示す。
【図１０Ａ】マイクロＣＴ分析により測定される骨体積、骨梁数および骨梁相互連結性の定量的測定を示すグラフを示す。
【図１０Ｂ】マイクロＣＴ分析により測定される骨体積、骨梁数および骨梁相互連結性の定量的測定を示すグラフを示す。
【図１０Ｃ】マイクロＣＴ分析により測定される骨体積、骨梁数および骨梁相互連結性の定量的測定を示すグラフを示す。
【図１０Ｄ】マイクロＣＴ分析により測定される骨体積、骨梁数および骨梁相互連結性の定量的測定を示すグラフを示す。
【図１１Ａ】ＡＢＧＳインプラントの組織構造を示す。これは、新規に形成された骨と固有の横突起との間にある界面での、典型的なリモデリングと骨統合を伴う新規骨形成を示す。
【図１１Ｂ】０日目と比較して、ＡＢＧＳ移植後２１日目にＡＢＣ／ｒｈＢＭＰ６インプラントで処置されたウサギ血清の組織構造を示す。
【図１２Ａ】同種骨移植ならびに同種骨移植および器具使用により、６２．５μｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ６および１８７．５μｇ／ｍｌのｒｈＢＭＰ６で処置されたヒツジの脊椎固定術のＸ線写真を示す。
【図１２Ｂ】μＣＴスキャン後の同じヒツジの標本を示す。
【図１２Ｃ】脊椎固定術の骨体積（Ｃ）、骨梁数（Ｄ）、骨梁間隙（Ｅ）および連結密度（Ｆ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１２Ｄ】脊椎固定術の骨体積（Ｃ）、骨梁数（Ｄ）、骨梁間隙（Ｅ）および連結密度（Ｆ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１２Ｅ】脊椎固定術の骨体積（Ｃ）、骨梁数（Ｄ）、骨梁間隙（Ｅ）および連結密度（Ｆ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１２Ｆ】脊椎固定術の骨体積（Ｃ）、骨梁数（Ｄ）、骨梁間隙（Ｅ）および連結密度（Ｆ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１３Ａ】新規に形成された骨が腰椎横突起（白矢印）と完全に統合された肉眼形態のヒツジ脊椎固定術の標本を示す。
【図１３Ｂ】図１３Ｃ〜図１３Ｅの形態計測パラメータを中で測定した、腰椎（白色ボックス）、横突起（黒色ボックス）および横突起間に新規に形成された骨（灰色ボックス）の両側の四角形領域を示す。新規に形成された骨を有する横突起を完全に統合した、より正確な横断面区分が、図１３Ｂの右パネルに示される（白矢印）。
【図１３Ｃ】骨体積（Ｃ）、骨梁の形態（Ｄ）および骨厚さ（Ｅ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１３Ｄ】骨体積（Ｃ）、骨梁の形態（Ｄ）および骨厚さ（Ｅ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１３Ｅ】骨体積（Ｃ）、骨梁の形態（Ｄ）および骨厚さ（Ｅ）のμＣＴ定量分析を示す。
【図１４】外科手術の１１週間後のヒツジにおける、前方椎体間固定術（ＡＬＩＦ）モデルのＸ線およびμＣＴスキャンを示す。
【図１５】ＢＭＰ６結合のための血液凝固容積を示す。
【図１６】Ｅｌｉｓａアッセイで測定された、ＢＭＰ導入セラミックスからのＢＭＰの放出、および３日間隔での、ＡＢＣ添加の放出時の影響を示す。
【図１７】新規骨形成を誘導するためのＡＢＧＳ調製用キットの概略斜視図を示す。
【図１８】新規骨形成を誘導するためのＡＢＧＳ調製用キットの概略側面図を示す。
【図１９】凍結乾燥内容物（ＢＭＰ＋ＣＲＭ）を含む凍結乾燥容器を示す。
【図２０】凍結乾燥ｒｈＢＭＰ−６および耐圧縮性基材の周囲に形成された、機械的に安定した血餅を含む凍結乾燥容器を示す。
【図２１】ラットの皮下部位にｒｈＢＭＰ６とともにＡＢＣに移植され、１日目、３日目、７日目および３５日目に分析されたリン酸三カルシウム（ＴＣＰ）を示す。３５日目には、ＴＣＰ粒子間に新規骨が形成された（最後の段）。
【図２２】新規に形成された骨が、骨に関してＴＣＰ置換の兆候を示すＴＣＰ粒子を取り囲むことを示す（クリーピング置換）（白矢印）、３５日目の図２１による高倍率インプラントを示す。
【図２３】２ｍｌのラット血液から調製され、ＢＭＰ６を有さない、５または２０μｇのＢＭＰ６を有する、ラット皮膚下に移植された多血小板血漿（ＰＲＰ）ゲルを示す。ＢＭＰ６濃縮ＰＲＰサンプル中の新規に形成された骨は、白色円で印がつけられている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
強固な「炎症性ストーム」の生成は、脊椎固定術用に認可されているものなどの現在承認されている非自己血液凝固物骨移植片代替物が、新規骨成長を促進するため、比較的大量に骨形成性ＢＭＰを使用する（例えば、脊椎適応症のためのレベルあたり１２〜４０ｍｇ超である）ことが理由となることがある。このような比較的大量のＢＭＰを使用することにより、局所移植部位から遠位の部位に骨形成が生じ得るという事実は、潜在的に有害である副作用に対して、規制当局の懸念を引き出す。対照的に、本明細書に記載のＡＢＧＳは、自己血液凝塊ゲルを含み、現在承認されている骨移植片代替デバイスに見られるレベルよりも著しく少ない量のＢＭＰを有利に使用し、新規骨成長を促進する。典型的には、本明細書に記載の自家骨移植代替組成物中に存在するＢＭＰの量は、現在承認されている骨移植片代替デバイスで使用されるＢＭＰの量よりも５〜２０倍少ない。非限定的な例として、本発明のＡＢＧＳは、自己血１ｍｌあたり０．００２ｍｇ〜１ｍｇのＢＭＰを含んでもよい。好ましくは、ＢＭＰはＢＭＰ−６であり、これは骨中および大半のＩ型およびＩＩ型ＢＭＰ受容体全体にわたって豊富である、天然ＢＭＰアンタゴニストであるノギンに結合しない。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２７】
同様のモデルで、ＡＢＧＳを含むｒｈＢＭＰ７／ウシ骨コラーゲンデバイス（ｒｈＢＭＰ６／ＡＢＣ）を並べて比較した。コラーゲン単独では骨形成を誘導しなかったが、コラーゲンを含有するｒｈＢＭＰ７は新規骨形成を誘導した（図８Ａ）。ｒｈＢＭＰ７／ウシ骨コラーゲンの市販デバイスには、１ｇのコラーゲンあたり３．５ｍｇのｒｈＢＭＰ７が含まれており、ウサギ尺骨の欠損を充填するためには、我々は総量１．０６ｍｇのｒｈＢＭＰ７に相当する、３００ｍｇをコラーゲン担体に使用した。図８Ａに示すように、尺骨欠損をｒｈＢＭＰ７／コラーゲンを誘導して埋めたものと、ＡＢＧＳ（１．５ｍｌの血液中、１００μｇのｒｈＢＭＰ６）と比較した。２週目と６週目に、ＡＢＧＳは新しい均一な骨の形成を誘導し、リモデリングを行って隣接する宿主骨に新しい皮質を再架橋したが、ｒｈＢＭＰ７／コラーゲンによる骨形成は遅れた。マイクロＣＴ分析により、ｒｈＢＭＰ６を含有するＡＢＧＳは、手術後８週目に約２倍以上の骨体積を誘導することが確認された（図８Ｂ〜８Ｃ）。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
ウサギの後側方固定術（ＰＬＦ）の研究：
後側方固定術（ＰＬＦ）ウサギモデルにおける脊椎固定術の骨誘導活性について、ＡＢＧＳを評価した。研究プロトコルは、１４週齢、３〜５ｋｇの体重であるニュージーランド系のオス実験用白ウサギ（アナウサギ）で実施された。２８匹の骨格が成熟したウサギは、腰椎Ｌ５〜Ｌ６間の両側の後方横突起間の固定術を受けた。動物はそれぞれ４匹ずつ、対照として機能するＡＢＣ単独、５０μｇ（０．０５ｍｇ／ｍｌ、デバイスにつき１２５μｇ）のｒｈＢＭＰ６を含むＡＢＣ、１００μｇ（０．１ｍｇ／ｍｌ、デバイスにつき２５０μｇ）のｒｈＢＭＰ６を含むＡＢＣ、２００μｇ（０．２ｍｇ／ｍｌ、デバイスにつき５００μｇ）のｒｈＢＭＰ６を含むＡＢＣ、２００μｇ（０．２ｍｇ／ｍｌ、デバイスにつき５００μｇ）のｒｈＢＭＰ６を含むＡＢＣおよび失活ウサギ移植骨（０．３ｇ／ｍｌ）、４００μｇ（０．４ｍｇ／ｍｌ、デバイスにつき１０００μｇ）のｒｈＢＭＰ６を含むＡＢＣおよび失活ウサギ移植骨（０．３ｇ／ｍｌ）、対照として機能する、ｒｈＢＭＰ６を含まないＡＢＣおよび失活ウサギ移植骨（０．３ｇ／ｍｌ）といった７つの試験グループへと分けた。デバイス調製用のＡＢＣの体積は、移植側ごとに２．５ｍｌであった。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
ヒツジでの前方椎体間固定術研究
ｒｈＢＭＰ６を用いたＡＢＧＳの有効性は、ＤｅＰｕｙ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  ＣＦＲＰ  Ｉ／Ｆケージを移植後、ヒツジの前方腰椎固定術で試験された。体重５０〜６０ｋｇである３〜４歳のメスヒツジ（Ｍｅｒｉｎｏｌａｎｄｓｃｈａｆ種）１０匹を実験に使用し、２つの実験グループ、すなわち、対照：ｒｈＢＭＰ６なしのＡＢＣで充填されたケージ（ｎ＝４）および実験：１ｍｌのｒｈＢＭＰ６あたり２５０μｇを含む、自己血液凝固物で充填されたケージ（ｎ＝５）のグループへと分けた。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３９】
実験は１１週目に終了し、手術後呼吸器感染症により死亡した対照グループの１匹のヒツジを除き、全ての動物が生存した。可動性、部分的または完全な麻痺、神経刺激および／または疼痛、食物摂取量の減少および体重減少に関する副作用は記録されていない。異所性骨形成、浮腫またはその他の目に見える形態学的変化は観察されなかった。ｒｈＢＭＰ６を受容したヒツジでは、新規に形成された骨がケージ（ｎ＝５）の内外に存在し、骨は両方の椎体に固定されていた。対照動物のケージに骨がある程度形成されたが、癒合は完全ではなかった。新規に形成された骨の骨体積と骨厚さは、対照動物と比較して、ｒｈＢＭＰ６を含むＡＢＧＳで処置されたヒツジで著しく高かった。１１週間後のヒツジの前方椎体間固定術（ＡＬＩＦ）モデルの結果を図１４に示す。
【手続補正８】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
新規骨形成を誘導し、骨成長を促進し、骨欠損を処置するための自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）であって、前記組成物が、
（ｉ）自己血と、
（ｉｉ）１ｍｌあたり０．００２〜１ｍｇの範囲である自己血、またはその類似体、またはそのヘテロ二量体中の、骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６と、
（ｉｉｉ）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）であって、前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）は、骨自家移植片、移植骨、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）、およびそれらの組合せから成る群から選択される、耐圧縮性基材（ＣＲＭ）と、を含み、
前記自己血は、フィブリンの微細構造内に前記骨形成を行う骨形成タンパク質を含み、前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）で強化される凝塊ゲルを形成し、前記凝塊ゲルが、前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６の持続放出を提供する構造およびレオロジー特性を有する、自家骨移植代替組成物。
【請求項２】
前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）が、骨欠損に応じて、円柱、スラブ、シート、網、微粒子または任意の他の形状から選択されるいずれか１種の形状を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６が、耐圧縮性基材（ＣＲＭ）上で凍結乾燥されている、請求項１および２に記載の組成物。
【請求項４】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質の前記持続放出が、７〜１０日間にわたる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６の前記持続放出が、１０日後である、請求項１〜３に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が、血液凝固剤を更に含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記血液凝固剤が、イオン溶液中またはナノ粒子における薬理学的に許容可能なカルシウム、ストロンチウムまたはマグネシウム塩、およびＣａ＋＋マイクロスフェア複合体から選択され、前記血液凝固剤が、自己血１ｍｌあたり５〜５０ｍＭの範囲で存在する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６が、自己血１ｍｌあたり２〜２００μｇの範囲で存在し、好ましくは自己血１ｍｌあたり１００μｇの量で存在する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記凝塊ゲルを形成するのに十分な時間が６０分である、請求項７および８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６の前記持続放出が７〜１０日間にわたる、請求項７〜９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、注射可能、押出可能または移植可能である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）の調製方法であって、方法が、
（１）
ａ）自己血、
ｂ）自己血、その類似体またはそのヘテロ二量体１ｍｌあたり０．００２〜１ｍｇの範囲である、骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６、および
ｃ）耐圧縮性基材（ＣＲＭ）であって、前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）が、移植骨、移植骨、ハイドロキシアパタイト（ＨＡ）、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）およびこれらの組合せから成る群から選択される、耐圧縮性基材（ＣＲＭ）を混合する工程と、
（２）工程（１）の成分を、前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６の持続放出をもたらす構造およびレオロジー特性を有する凝塊ゲルを形成させるのに十分な期間、インキュベートする工程と、を含む、調製方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）の調製方法であって、前記方法が、
ａ．水溶液中の前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６と前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）とを、滅菌凍結乾燥容器（１０）中で混合する工程であって、
前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）に添加される骨形成を行う骨形成タンパク質水溶液の量が、前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）を完全に濡らすように最適化されている、混合する工程と、
ｂ．前記骨形成を行う骨形成タンパク質および前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）を凍結乾燥する工程と、
ｃ．自己血を添加する工程と、
ｄ．生体力学的に安定可能な血餅（１３）を凍結乾燥した骨形成を行う骨形成タンパク質および前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）の周辺に形成するのに十分な時間、凍結乾燥した骨形成を行う骨形成タンパク質、前記耐圧縮性基材（ＣＲＭ）および自己血をインキュベートする工程と、を含む、調製方法。
【請求項１４】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質の前記持続放出が７〜１０日以上である、請求項１２〜１３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１５】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６の前記持続放出が１０日後である、請求項１２〜１３のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項１６】
前記方法が、工程（１）で血液凝固剤を添加することを更に含み、前記血液凝固剤が、イオン溶液中またはナノ粒子における薬理学的に許容可能なカルシウム、ストロンチウムまたはマグネシウム塩、およびＣａ＋＋マイクロスフェア複合体から選択され、前記血液凝固剤が、自己血１ｍｌあたり５〜５０ｍＭの範囲で存在する、請求項１２に記載の調製方法。
【請求項１７】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質が、自己血１ｍｌ当たり２〜２００μｇの範囲、好ましくは自己血１ｍｌ当たり１００μｇの量で存在するＢＭＰ−６である、請求項１６に記載の調製方法。
【請求項１８】
前記凝塊ゲルを形成するのに十分な時間が６０分である、請求項１６および１７に記載の調製方法。
【請求項１９】
新規骨形成が必要とされる骨欠損の処置、骨成長の促進および／またはこれらの処置を必要とする個体の特定部位で、骨を生成または再生するための手術時の誘導に使用するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２０】
後側方固定術、前方椎体間固定術、成体の脊柱管狭窄症、外傷（脊椎再建術）、上顎頭蓋再建術または高位脛骨骨切り術を処置する際に使用するための、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
新規骨形成を誘導し、骨成長を促進し、骨欠損を処置するための自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）であって、前記組成物が、
（ｉ）自己血と、
（ｉｉ）自己血、またはその類似体、またはそのヘテロ二量体１ｍｌあたり０．００２〜１ｍｇの範囲である、骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６と、
（ｉｉｉ）血液凝固剤であって、前記血液凝固剤が、イオン溶液中またはナノ粒子における薬理学的に許容可能なカルシウム、ストロンチウムまたはマグネシウム塩、およびＣａ＋＋マイクロスフェア複合体から選択され、前記血液凝固剤が、自己血１ｍｌあたり５〜５０ｍＭの範囲で添加され、
自己血は、骨形成を行う骨形成タンパク質および自己血液凝固剤を含む凝塊ゲルを形成し、前記凝塊ゲルを形成するのに十分な時間が、６０〜９０分の範囲であり、前記凝塊ゲルは、前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６の持続放出を提供する構造およびレオロジー特性を有する、自家骨移植代替組成物。
【請求項２２】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６が、自己血液凝固物１．５ｍｌあたり２５μｇ、５０μｇおよび１００μｇの量、好ましくは自己血液凝固物１ｍｌあたり１００μｇの量である、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６の前記持続放出が、７〜１０日間にわたる、請求項２１〜２２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が、注射可能、押出可能または移植可能である、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の自家骨移植代替組成物（ＡＢＧＳ）の調製方法であって、前記方法が、
（１）
ａ）自己血、
ｂ）自己血、またはその類似体、またはそのヘテロ二量体１ｍｌあたり０．００２〜１ｍｇの範囲である骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６および
ｃ）血液凝固剤であって、前記血液凝固剤が、イオン溶液中またはナノ粒子における薬理学的に許容可能なカルシウム、ストロンチウムまたはマグネシウム塩、およびＣａ＋＋マイクロスフェア複合体から選択され、前記血液凝固剤が、自己血１ｍｌあたり５〜５０ｍＭの範囲で添加される、血液凝固剤を混合する工程と、
（２）凝塊ゲルを形成するのに十分な時間、工程（１）の成分をインキュベートする工程であって、前記凝塊ゲルを形成するのに十分な時間が、６０〜９０分の範囲であり、前記凝塊ゲルは、前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６の持続放出をもたらす構造およびレオロジー特性を有する、インキュベートする工程と、を含む、方法。
【請求項２６】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質ＢＭＰ−６が、自己血液凝固物１．５ｍｌあたり２５μｇ、５０μｇおよび１００μｇの量で、好ましくは自己血液凝固物１ｍｌあたり１００μｇの量で存在する、請求項２５に記載の調製方法。
【請求項２７】
前記骨形成を行う骨形成タンパク質の持続放出が７〜１０日間にわたる、請求項２５〜２６のいずれか１項に記載の調製方法。
【請求項２８】
新規骨形成が必要とされる骨欠損の処置、骨成長の促進および／またはこれらの処置を必要とする個体の特定部位で、骨を生成または再生するための手術時の誘導に使用するための、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
長骨および脊椎に関連する偽関節症、脛骨癒合不全骨折、低ホスファターゼ症、骨形成不全症、Ｉ型神経線維腫症、非定型骨粗鬆症性骨折、歯科適応症、歯周組織修復、歯／骨インプラント、歯槽堤増大術、骨粗鬆症性骨折、非定型大腿骨骨折、椎骨骨折または橈骨遠位骨折の処置に使用するための、請求項２８に記載の組成物。
【国際調査報告】
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