(57)【要約】  本願発明は、生物学的に活性なタンパク質およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含むデュアル機能タンパク質を生産するための方法を提供する。方法は、標的タンパク質の分解を効果的に防止することによって標的タンパク質の安定な生産を可能にし、したがって、商業的使用のための高い可能性を有する。
2020517265.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
デュアル機能タンパク質またはその誘導体をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換された哺乳動物宿主細胞から組換えデュアル機能タンパク質を生産するための方法であって、該方法は、硫酸デキストランを補った培養培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、デュアル機能タンパク質は、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体タンパク質；生物学的に活性なタンパク質、またはその変異体またはフラグメント；および免疫グロブリンのＦｃ領域を含み、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、以下の変異（１）−（７）からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む：
（１）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置９８−１０１にてＥＩＲＰのアミノ酸配列（配列番号：５３）でのアミノ酸の置換；
（２）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０−１７４にてＴＧＬＥＡＶのアミノ酸配列（配列番号：５４）でのアミノ酸の置換；
（３）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０−１７４にてＴＧＬＥＡＮのアミノ酸配列（配列番号：５５）でのアミノ酸の置換；
（４）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０にてアミノ酸Ｎでのアミノ酸の置換；
（５）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７４にてアミノ酸Ｎでのアミノ酸の置換；
（６）１つ以上の上記変異（１）から（５）と共に、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１８０にてアミノ酸Ｅでのアミノ酸の置換；および
（７）野生型ＦＧＦ２１タンパク質の免疫原性を低下させるための１から１０のアミノ酸の変異、
方法。
【請求項２】
生物学的に活性なタンパク質が、インスリン、Ｃ−ペプチド、レプチン、グルカゴン、ガストリン、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、アミリン、カルシトニン、コレシストキニン、ペプチドＹＹ、神経ペプチドＹ、骨形成タンパク質−６（ＢＭＰ−６）、骨形成タンパク質−９（ＢＭＰ−９）、オキシントモジュリン、オキシトシン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、イリシン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有タンパク質５（ＦＮＤＣ５）、アペリン、アディポネクチン、Ｃ１ｑおよび腫瘍壊死因子関連タンパク質（ＣＴＲＰファミリー）、レジスチン、ビスファチン、オメンチン、レチノール結合タンパク質−４（ＲＢＰ−４）、グリセンチン、アンジオポイエチン、インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）、エキセンディン−４および成長ホルモンからなる群から選択される１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
デュアル機能タンパク質が、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、生物学的に活性なタンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
硫酸デキストランが、２０−５，０００ｋＤａの平均分子量を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
培養培地が、０．０１−１０ｇ／Ｌの濃度で硫酸デキストランを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
培養することが、
硫酸デキストランを補った培養培地において３４−３７℃で哺乳動物宿主細胞を初代培養する工程；および
２８−３３℃で初代培養培地を二次培養する工程
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
初代培養が、２４−１４４時間行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
二次培養が、３１−３３℃で行われる、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本願発明は、生物学的に活性なタンパク質および線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体タンパク質を含むデュアル機能タンパク質を生産するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
動物細胞が組換えタンパク質を生産するために使用されるとき、標的タンパク質の特定の領域が動物細胞（宿主細胞）によって分泌されるプロテアーゼによって切断され、組換えタンパク質の不均一性、低下または不活性化を引き起こすという問題が起こりうる。加えて、発現されたタンパク質のかかる切断はまた、生産および精製プロセス中に「ロット間」均質性を維持することを困難にさせるという問題に至る。この理由のため、組換えタンパク質の生産中、低いレベルでプロテアーゼを維持するか、またはプロテアーゼ活性を抑制する必要がある。
【０００３】
この問題を解決する代替手段として、セリン、システイン、アスパラギン酸またはアミノペプチダーゼに対するインヒビター（例えばアプロチニン、ベスタチン、ロイペプチン、Ｅ−６４およびペプスタチンＡなど）が培養培地に加えられる生産方法が、提案された（ＷＯ  １９９０−００２１７５、ＥＰ  ０，３０６，９６８、およびＵＳ  ５，８５１，８００参照）。しかしながら、商業生産におけるこれらのインヒビターの使用は、細胞毒性および最終産物から完全に除去されていることを証明するために特別な努力の必要性のため、効果的ではない。加えて、慣用の代替手段の中で、宿主細胞において生産される全ての標的タンパク質に適用できる普遍的な方法は、未だ見つかっていない。
【発明の概要】
【０００４】
発明の記載
技術的問題
本願発明の目的は、改善された薬物動態パラメータ、高い安定性、複合体を形成する凝集の低い可能性、および低下した免疫原性の可能性を有する、生物学的に活性なタンパク質およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含むデュアル機能タンパク質を生産するための培養方法を提供することである。
【０００５】
解決手段
本願発明の１つの目的によると、デュアル機能タンパク質またはその誘導体をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換された哺乳動物宿主細胞から組換えデュアル機能タンパク質を生産するための方法であって、該方法は、硫酸デキストランを補った培養培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、デュアル機能タンパク質は、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体タンパク質；生物学的に活性なタンパク質、またはその変異体またはフラグメント；および免疫グロブリンのＦｃ領域を含み、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、以下の変異（１）−（７）からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む：
（１）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置９８−１０１にてＥＩＲＰのアミノ酸配列（配列番号：５３）でのアミノ酸の置換；
（２）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０−１７４にてＴＧＬＥＡＶのアミノ酸配列（配列番号：５４）でのアミノ酸の置換；
（３）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０−１７４にてＴＧＬＥＡＮのアミノ酸配列（配列番号：５５）でのアミノ酸の置換；
（４）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０にてアミノ酸Ｎでのアミノ酸の置換；
（５）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７４にてアミノ酸Ｎでのアミノ酸の置換；
（６）１つ以上の上記変異（１）から（５）と共に、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１８０にてアミノ酸Ｅでのアミノ酸の置換；および
（７）野生型ＦＧＦ２１タンパク質の免疫原性を低下させるための１から１０のアミノ酸の変異、
方法を提供することにある。
【０００６】
発明の有利な効果
本願発明の生産方法は、標的タンパク質の分解を効果的に防止することによって、標的タンパク質の安定な生産を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、デュアル機能タンパク質を発現する細胞系の懸濁培養後の、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる培養上清の分析の結果を示す模式図である。培養時間が経過すると、非切断デュアル機能タンパク質よりも小さい他のタンパク質が一緒に発現されたことを見出した。
【０００８】
【図２】図２は、一定期間後の保存温度条件に応じたＳＤＳ−ＰＡＧＥによる培養上清の分析の結果を示す模式図である。４℃または−２０℃で貯蔵された培養上清は、３７℃で貯蔵されたものと比較してデュアル機能タンパク質の切断の低下を示した。この結果は、デュアル機能タンパク質の切断現象が宿主細胞に由来するプロテアーゼによって誘導されたことを示した。
【０００９】
【図３】図３は、プロテアーゼインヒビターを培養上清に加え、３７℃で一定期間、混合物を保存した後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果を示す模式図である。主に、セリンプロテアーゼインヒビターの添加が、デュアル機能タンパク質の切断現象を減少させたことが見出された。この結果は、デュアル機能タンパク質の切断現象が宿主細胞に由来するプロテアーゼによって誘導されたことを示した。
【００１０】
【図４】図４は、硫酸デキストランを培養培地に加えた細胞培養後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる培養上清の分析の結果、およびそのグラフである。デュアル機能タンパク質の切断現象を低下させる効果は、１．６ｋＤａの重量平均分子量を有する硫酸デキストランが加えられたとき観察されなかったが、デュアル機能タンパク質の切断現象は、５００ｋＤａの硫酸デキストランが加えられたとき低下した。
【００１１】
【図５】図５は、培養培地に加えられた様々な重量平均分子量を有する硫酸デキストランで培養した後のＳＤＳ−ＰＡＧＥによる培養上清の分析の結果を示す模式図である。２００ｋＤａ以上の重量平均分子量を有する硫酸デキストランが培養培地に加えられたとき、デュアル機能タンパク質の切断現象は低下した。
【００１２】
【図６】図６は、種々の濃度での硫酸デキストランが培養培地に加えられた培養後の培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、およびそのグラフである。硫酸デキストランが２００−１，０００ｍｇ／Ｌで加えられたとき、デュアル機能タンパク質の切断現象は低下した。加えて、培養温度が培養中に３２℃に変化されたとき、デュアル機能タンパク質の切断現象はより効果的に防止することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本願発明を実施するための最良の形態
本願発明の１つの目的によると、デュアル機能タンパク質またはその誘導体をコードするｃＤＮＡを含む発現ベクターで形質転換された哺乳動物宿主細胞から組換えデュアル機能タンパク質を生産するための方法であって、該方法は、硫酸デキストランを補った培養培地中で哺乳動物宿主細胞を培養することを含み、デュアル機能タンパク質は、線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）変異体タンパク質；生物学的に活性なタンパク質、またはその変異体またはフラグメント；および免疫グロブリンのＦｃ領域を含み、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、以下の変異（１）−（７）からなる群から選択される少なくとも１つの変異を含む：
（１）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置９８−１０１にてＥＩＲＰのアミノ酸配列（配列番号：５３）でのアミノ酸の置換（以下、「ＥＩＲＰ」）；
（２）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０−１７４にてＴＧＬＥＡＶのアミノ酸配列（配列番号：５４）でのアミノ酸の置換（以下、「ＴＧＬＥＡＶ」）；
（３）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０−１７４にてＴＧＬＥＡＮのアミノ酸配列（配列番号：５５）でのアミノ酸の置換（以下、「ＴＧＬＥＡＮ」）；
（４）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７０にてアミノ酸Ｎでのアミノ酸の置換（以下、「Ｇ１７０Ｎ」）；
（５）野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１７４にてアミノ酸Ｎでのアミノ酸の置換（以下、「Ｇ１７４Ｎ」）；
（６）１つ以上の上記変異（１）から（５）と共に、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ−末端から位置１８０にてアミノ酸Ｅでのアミノ酸の置換（以下、「Ａ１８０Ｅ」）；および
（７）野生型ＦＧＦ２１タンパク質の免疫原性を低下させるための１から１０のアミノ酸の変異、
方法を提供することにある。
【００１４】
ＦＧＦ２１変異体タンパク質
グルコースおよび脂質ホメオスタシスにおいて重要な役割を果たすことが知られているホルモンである野生型ＦＧＦ２１タンパク質は、哺乳動物、例えばヒト、マウス、ブタ、サルなど、好ましくはヒト由来のものであり得る。さらに好ましくは、野生型ＦＧＦ２１タンパク質は、配列番号：１によって示されるアミノ酸配列を有する野生型ヒトＦＧＦ２１タンパク質であり得る。
【００１５】
好ましくは、ＦＧＦ２１変異体タンパク質に含まれる変異は、ＥＩＲＰ、ＴＧＬＥＡＶ、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０ＮおよびＧ１７４Ｎの変異のいずれか１つ；ＴＧＬＥＡＶ、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０ＮおよびＧ１７４Ｎの変異のいずれか１つおよびＥＩＲＰの変異の組合せ；ＥＩＲＰ、ＴＧＬＥＡＶ、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０ＮおよびＧ１７４Ｎの変異のいずれか１つおよびＡ１８０Ｅの変異の組合せ；ＴＧＬＥＡＶ、ＴＧＬＥＡＮ、Ｇ１７０ＮおよびＧ１７４Ｎの変異のいずれか１つ、ＥＩＲＰの変異およびＡ１８０Ｅの変異の組合せであり得る。
【００１６】
ＥＩＲＰは、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端から位置９８−１０１でのアミノ酸であるＬＬＬＥが、ＥＩＲＰで置換されている変異を指す。さらに、ＴＧＬＥＡＶは、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端から位置１７０−１７４でのアミノ酸であるＧＰＳＱＧが、ＴＧＬＥＡＶで置換されている変異を指す。加えて、ＴＧＬＥＡＮは、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端から位置１７０−１７４でのアミノ酸であるＧＰＳＱＧが、ＴＧＬＥＡＮで置換されている変異を指す。さらに、Ｇ１７０Ｎは、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端から位置１７０でのアミノ酸であるＧが、Ｎで置換されている変異を指す。加えて、Ｇ１７４Ｎは、野生型ＦＧＦ２１タンパク質のＮ末端から位置１７４でのアミノ酸であるＧが、Ｎで置換されている変異を指す。
【００１７】
さらに、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、Ｎ−末端またはＣ−末端での１から１０のアミノ酸が野生型ＦＧＦ２１タンパク質と比較して欠失されている構造を有し得る。さらに好ましくは、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、配列番号：６から２３のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を含み得る。なおさらに好ましくは、ＦＧＦ２１変異体タンパク質は、配列番号：６から２３のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を含み、Ｎ−末端またはＣ−末端での１から１０のアミノ酸が野生型ＦＧＦ２１タンパク質と比較して欠失されている構造をさらに有してもよい。
【００１８】
デュアル機能タンパク質において、変異によって導入されるＦＧＦ２１変異体タンパク質のアミノ酸残基Ｎはグリコシル化され得る。
【００１９】
生物学的に活性なタンパク質
生物学的に活性なタンパク質は、インスリン、Ｃ−ペプチド、レプチン、グルカゴン、ガストリン、胃抑制ポリペプチド（ＧＩＰ）、アミリン、カルシトニン、コレシストキニン、ペプチドＹＹ、神経ペプチドＹ、骨形成タンパク質−６（ＢＭＰ−６）、骨形成タンパク質−９（ＢＭＰ−９）、オキシントモジュリン、オキシトシン、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、イリシン、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン含有タンパク質５（ＦＮＤＣ５）、アペリン、アディポネクチン、Ｃ１ｑおよび腫瘍壊死因子関連タンパク質（ＣＴＲＰファミリー）、レジスチン、ビスファチン、オメンチン、レチノール結合タンパク質−４（ＲＢＰ−４）、グリセンチン、アンジオポイエチン、インターロイキン−２２（ＩＬ−２２）、エキセンディン−４および成長ホルモンからなる群から選択される１つであり得る。好ましくは、生物学的に活性なタンパク質は、ＧＬＰ−１、その変異体およびエキセンディン−４から選択される１つであり得る。
【００２０】
ＧＬＰ−１タンパク質は、食物によって刺激されるなどによって、腸管におけるＬ細胞によって分泌される３１アミノ酸からなるインクレチンホルモンである。例えば、ＧＬＰ−１タンパク質は、配列番号：２９のアミノ酸配列によって示され得る。
【００２１】
ＧＬＰ−１の変異体は、例えば、配列番号：３０から３３のいずれかのアミノ酸配列によって示され得る。
【００２２】
免疫グロブリンのＦｃ領域
本願明細書において使用される「Ｆｃ領域」、「Ｆｃフラグメント」または「Ｆｃ」なる用語は、免疫グロブリンの重鎖定常領域１（ＣＨ１）、重鎖定常領域２（ＣＨ２）および重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含むが、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域および軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を含まないタンパク質を示す。さらに、本願明細書において使用される「Ｆｃ領域変異体」なる用語は、Ｆｃ領域のアミノ酸の一部を置換することによって、または様々な型のＦｃ領域を組み合わせることによって調製されるものを示す。
【００２３】
免疫グロブリンのＦｃ領域は、抗体を構成する完全Ｆｃ領域、そのフラグメントまたはＦｃ領域変異体であり得る。さらに、Ｆｃ領域は、単量体または多量体の形態の分子を含み、重鎖定常領域のヒンジ領域をさらに含み得る。Ｆｃ領域変異体は、ヒンジ領域での開裂を防止するように修飾され得る。さらに、Ｆｃのヒンジ配列は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を低下させるためにいくつかのアミノ酸配列において置換を有し得る。加えて、Ｆｃヒンジ配列のアミノ酸配列の一部は、Ｆａｂ領域の再配列を阻害するために置換され得る。ＦｃのＣ−末端でのリジン残基は除去され得る。
【００２４】
好ましくは、免疫グロブリンのＦｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＤのＦｃ領域のいずれか１つ；またはそれらの組合せであるハイブリッドＦｃであり得る。さらに、ハイブリッドＦｃはＩｇＧ４領域およびＩｇＤ領域を含み得る。さらに、ハイブリッドＦｃ領域は、ＩｇＤのＦｃのヒンジ配列の一部およびＣＨ２、およびＩｇＧ４のＦｃのＣＨ２およびＣＨ３配列を含み得る。
【００２５】
加えて、本願発明のＦｃフラグメントは、野生型グリコシル化鎖、野生型よりも多いグリコシル化鎖、野生型よりも少ないグリコシル化鎖または脱グリコシル化鎖の形態においてであり得る。グリコシル化鎖の増加、減少または除去は、当分野で知られている慣用の方法、例えば化学方法、酵素方法および微生物を使用する遺伝子操作方法によって行われ得る。
【００２６】
好ましくは、免疫グロブリンＦｃ領域は、配列番号：２４から２８から選択されるアミノ酸配列によって示され得る。
【００２７】
デュアル機能タンパク質
デュアル機能タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、生物学的に活性なタンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含み得る。さらに、デュアル機能タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、ＦＧＦ２１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域および生物学的に活性なタンパク質を含み得る。好ましくは、デュアル機能タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、ＧＬＰ−１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含み得る。さらに、デュアル機能タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、ＦＧＦ２１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域およびＧＬＰ−１変異体タンパク質を含み得る。
【００２８】
リンカー
さらに、デュアル機能タンパク質はリンカーをさらに含み得る。
【００２９】
デュアル機能タンパク質は、ＦＧＦ２１変異体タンパク質が免疫グロブリンＦｃ領域のＮ−末端またはＣ−末端に直接的に連結される、またはＦＧＦ２１変異体タンパク質がリンカーを介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結される形態であり得る。
【００３０】
そのような場合、リンカーは、ＦｃフラグメントのＮ−末端、Ｃ−末端または遊離基に連結され得、また、ＦＧＦ２１変異体タンパク質のＮ−末端、Ｃ−末端または遊離基に連結され得る。リンカーがペプチドリンカーであるとき、連結は任意の領域において起こり得る。例えば、リンカーは、免疫グロブリンＦｃ領域のＣ−末端およびＦＧＦ２１変異体タンパク質のＮ−末端に連結され、免疫グロブリンＦｃ領域およびＦＧＦ２１変異体タンパク質の融合タンパク質を形成し得る。さらに、本願発明のデュアル機能タンパク質は、生物学的に活性なタンパク質が融合タンパク質の免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ−末端に連結される形態であり得る。
【００３１】
リンカーおよびＦｃが別々に発現され、次に連結されるとき、リンカーは当分野で知られている架橋剤であり得る。架橋剤の例は、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば４−アジドサリチル酸およびジスクシンイミジルエステル、例えば３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含むイミドエステル、および二機能性マレイミド、例えばビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンを含み得るが、これらに限定されない。
【００３２】
さらに、リンカーはペプチドであり得る。好ましくは、リンカーは１０から３０のアミノ酸残基からなるペプチドであり得る。
【００３３】
さらに、アラニンが、リンカーの末端にさらに結合され得る。好ましくは、リンカーは、配列番号：２から５のいずれか１つによって示されるアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。
【００３４】
デュアル機能タンパク質は、１つ以上のＦＧＦ２１変異体タンパク質が互いに連結したＦＧＦ２１変異体タンパク質の二量体または多量体が免疫グロブリンＦｃ領域に連結される形態であり得る。さらに、デュアル機能タンパク質は、２つ以上の免疫グロブリンＦｃ領域が連結される二量体または多量体の形態であって、免疫グロブリンＦｃ領域が連結されるＦＧＦ２１変異体タンパク質を有する、形態であり得る。
【００３５】
哺乳動物宿主細胞
哺乳動物宿主細胞は、組換えデュアル機能タンパク質を発現することができる任意の動物細胞、好ましくは標的化形質転換細胞の単離を容易にさせる動物細胞であり得る。具体的には、哺乳動物宿主細胞は、不死化ハイブリドーマ細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、ＨｅＬａ細胞、ＣＡＰ細胞（ヒト羊水由来細胞）、またはＣＯＳ細胞であり得る。
【００３６】
硫酸デキストラン
本願発明のデュアル機能タンパク質の細胞培養へプロテアーゼインヒビターを適用する結果として、宿主細胞由来のプロテアーゼによるデュアル機能タンパク質の切断現象を防止する効果は、不十分であった。
【００３７】
硫酸デキストランは、２０−５，０００ｋＤａの重量平均分子量を有し得る。具体的には、硫酸デキストランは、２００−５，０００ｋＤａの重量平均分子量を有し得る。
【００３８】
加えて、培養培地は、０．０１−１０ｇ／Ｌの濃度で硫酸デキストランを含み得る。具体的には、培養培地は、０．１−１０ｇ／Ｌ、または０．１−１ｇ／Ｌの濃度で硫酸デキストランを含み得る。
【００３９】
培養
培養は、硫酸デキストランを補った培養培地において３４−３７℃で哺乳動物宿主細胞を初代培養する工程；および２８−３３℃での初代培養培地を二次培養する工程を含み得る。具体的には、初代培養は、２４−１４４時間で実施され得る。また、二次培養は、３１−３３℃で実施され得る。
【００４０】
デュアル機能タンパク質は、ＧＬＰ−１およびＦＧＦ２１変異体、生物学的に活性なタンパク質が、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合されるポリペプチドであり、および動物細胞培養により生産されるとき無傷な形態において発現され、および肝炎、肝線維症、および肝硬変を予防または処置するための組成物として活性を示す。
【００４１】
本願発明の様式
以下、本願発明の典型的な態様は例を基準にして詳細に記載される。しかしながら、本願発明の例は多数の様々な形態において修飾することができ、本願発明の範囲はここに記載の例に限定されるべきでない。
【実施例】
【００４２】
［実施例］
調製例１．デュアル機能タンパク質の発現のための宿主細胞の調製
１−１：デュアル機能タンパク質の発現のための発現ベクターの調製
ＦＧＦ２１タンパク質に導入される各変異の位置、配列情報、標的および予期される効果は以下の表１に列挙される（表１において、Ｎはグリコシル化アスパラギン（Ｎ）を示す）。さらに、表１に記載されている変異を含むＦＧＦ２１変異体タンパク質は以下の表２に列挙される。
【００４３】
【表１】
2020517265.tif 000003
【００４４】
【表２】
2020517265.tif 000004
【００４５】
ＧＬＰ−１変異体タンパク質配列は以下の表３に示され、Ｆｃ融合ＧＬＰ−１変異体タンパク質配列は表４に示される。
【００４６】
【表３】
2020517265.tif 000005
【００４７】
【表４】
2020517265.tif 000006
【００４８】
表４において、ＨｙＦｃ５は配列番号：２７を示し、ＨｙＦｃ４０は配列番号：２８を示す。
【００４９】
さらに、ＧＬＰ−１変異体タンパク質およびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含むデュアル機能タンパク質の配列は、以下の表５に列挙される。各デュアル機能タンパク質は、Ｎ−末端からＣ−末端にこの順序において連結される、ＧＬＰ−１変異体タンパク質、免疫グロブリンのＦｃ領域、リンカーおよびＦＧＦ２１変異体タンパク質を含む。
【００５０】
【表５】
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【００５１】
具体的には、デュアル機能タンパク質のそれぞれをコードするヌクレオチド配列を、各タンパク質のアミノ酸配列に基づいてＢｉｏｎｅｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｋｏｒｅａ）と相談した後に合成した。ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩ制限酵素配列をデュアル機能タンパク質のそれぞれをコードするヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に加え、タンパク質翻訳のための開始コドンおよび細胞の外側に発現されたタンパク質の分泌を可能にするリーダー配列（配列番号：５６、ＭＤＡＭＬＲＧＬＣＣＶＬＬＬＣＧＡＶＦＶＳＰＳＨＡ）を５’末端で制限酵素配列の次に挿入した。終止コドンを、ＦＧＦ２１変異体タンパク質のそれぞれをコードするヌクレオチド配列の次に挿入した。デュアル機能タンパク質のそれぞれをコードするヌクレオチド配列を、ＮｈｅＩおよびＮｏｔＩの２つの制限酵素を使用することによってｐＴｒａｎｓ−ｅｍｐｔｙ発現ベクターにクローニングした。ＣＭＶプロモーター、ｐＵＣ−由来複製起点、ＳＶ４０−由来複製起点およびアンピシリン−耐性遺伝子を有するｐＴｒａｎｓ−ｅｍｐｔｙ発現ベクターを、ＣＥＶＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。
【００５２】
１−２：デュアル機能タンパク質の発現のためのプラスミドＤＮＡの構築
発現のために使用される大量のプラスミドＤＮＡを得るために、大腸菌を、調製例１−１において構築された発現ベクターのそれぞれで形質転換した。熱ショックを介して弱められた細胞壁を有する大腸菌細胞をそれぞれの発現ベクターで形質転換し、形質転換体をＬＢプレート上に置き、コロニーを得た。このように得られたコロニーをＬＢ培地に播種し、３７℃で１６時間培養し、それぞれの発現ベクターを含む各大腸菌培養物を１００ｍｌの容量において得た。その後に得られた大腸菌を遠心分離して培養培地を除去し、次にＰ１、Ｐ２、Ｐ３溶液（ＱＩＡＧＥＮ、Ｃａｔ  Ｎｏ．：１２９６３）を加え、細胞壁を破砕し、それによりタンパク質およびＤＮＡが分離されたＤＮＡ懸濁液を得た。Ｑｉａｇｅｎ  ＤＮＡ精製カラムを使用することによって、このように得られたＤＮＡ懸濁液からプラスミドＤＮＡを精製した。溶出したプラスミドＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によって同定し、濃度および純度をナノドロップ(nanodrop)装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  Ｌｉｔｅ）を使用して測定した。このように得られたＤＮＡを発現のために使用した。
【００５３】
１−３：デュアル機能タンパク質の発現のための形質転換された宿主細胞の生産
ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞（チャイニーズハムスター卵巣細胞）を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅＭＡＸ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １６４４７−１００）を使用して調製例１−２において単離される各プラスミドＤＮＡで形質転換した。形質転換されたチャイニーズハムスター卵巣細胞を培地（ＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ、Ｇｉｂｃｏ、Ｃａｔ．  Ｎｏ．  １２６８１−０１１）に播種し、８％  ＣＯ２および３７℃の条件下でインキュベーターにおいて培養し、継代を繰り返し生存細胞を選択および培養した。選択された細胞を、最後に、９６−ウェルプレートにおいて限界希釈により単一クローンとして選択した。
【００５４】
実験例１．デュアル機能タンパク質の発現のための懸濁培養、および分解現象
調製例１−３の物質コードＤＦＤ１１２（配列番号：５１）で形質転換されたＣＨＯ細胞系を、８ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸを補ったＣＤ  ＯｐｔｉＣＨＯ培地において懸濁培養した（作業容量  ３０ｍｌ／１２５ｍｌ  フラスコ、３７℃、８％  ＣＯ２、１２０ｒｐｍ）。その後、培養上清を３つの異なる保存温度（３７℃、４℃、または−２０℃）で３日間貯蔵し、次にタンパク質分解現象の程度を培養上清のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、非還元条件）分析により評価した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果は、図１および２に示される。
【００５５】
図１に示されるとおり、標的タンパク質よりも小さいタンパク質（８５から１１０ｋＤａ）が、デュアル機能タンパク質を生産するための細胞培養中に、切断されていない（無傷の）標的タンパク質と共に発現されたことを見出した。
【００５６】
図２に示されるとおり、４℃および−２０℃で貯蔵された培養上清は、３７℃で貯蔵された培養上清と比較して、デュアル機能タンパク質が切断された小さなサイズのタンパク質が少なかった。したがって、デュアル機能タンパク質の分解現象が、培養上清に存在する宿主細胞から分泌されるプロテアーゼによって引き起こされたことを見出した。
【００５７】
実験例２．デュアル機能タンパク質分解に関与するプロテアーゼインヒビターの検出
実験例１において同定されたデュアル機能タンパク質の分解に関与するプロテアーゼのカテゴリーを試験するために、実験例１の培養上清に種々のプロテアーゼインヒビターを加え、３日間３７℃で処理し、次にＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に付した。本願明細書において使用されるプロテアーゼインヒビターは表６に示され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果は図３に示される。
【００５８】
【表６】
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【００５９】
図３に示されるとおり、デュアル機能タンパク質の分解現象がセリンプロテアーゼに関するプロテアーゼインヒビター、例えばＡＥＢＳＦ、アンチパイン、ロイペプチン、ベンザミジン−ＨＣｌおよびアプロチニンで処理された培養上清において低下したことを見出した。したがって、デュアル機能タンパク質の分解現象が宿主細胞に由来するプロテアーゼによって引き起こされたことを見出した。
【００６０】
例１．硫酸デキストラン処理
デュアル機能タンパク質の細胞培養中に起こる切断現象を阻害するために、調製例１−３の形質転換されたＣＨＯ細胞系を、６ｍＭ  グルタミンを補ったＣＤ  Ｄｙｎａｍｉｓ培地（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ．  Ｎｏ．  Ａ２６６１５０１）において７日間懸濁培養した（作業容量  ３０ｍＬ／１２５ｍＬ  フラスコ、３７℃、８％  ＣＯ２、１２０ｒｐｍ）。懸濁培養について、硫酸デキストラン（重量平均分子量：１．６ｋＤａまたは５００ｋＤａ）を２００ｍｇ／Ｌの濃度で培養培地に加え、培養を低温変換およびフェドバッチ培養方法により３２℃で実施した。その後、培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、非還元条件）により分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果およびその模式図は図４に示される。図４において、ｗ／ｏおよびＬａｎｅ  １はコントロールであり、５００ｋＤａおよびＬａｎｅ  ２は５００ｋＤａ  硫酸デキストランで処理された培養上清であり、１．６ｋＤａおよびＬａｎｅ  ３は１．６ｋＤａ  硫酸デキストランで処理された培養上清である。
【００６１】
図４に示されるとおり、５００ｋＤａの重量平均分子量を有する硫酸デキストランを培養培地に加えたとき、デュアル機能タンパク質の切断現象が効果的に阻害されたことを見出した。
【００６２】
例２．分子量による硫酸デキストランの効果
細胞培養中のデュアル機能タンパク質の切断現象に対する保護効果が例１において特定された加えられる硫酸デキストランの効果的な濃度範囲を、試験した。
【００６３】
具体的には、加えられる硫酸デキストランの重量平均分子量（１．６ｋＤａ、８ｋＤａまたは２００ｋＤａ）および濃度（１００ｍｇ／Ｌ、２００ｍｇ／Ｌまたは５００ｍｇ／Ｌ）を調整することを除けば、培養を例１と同じ条件下で実施した。その後、培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、非還元条件）により分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果およびそのグラフは図５に示される。
【００６４】
図５に示されるとおり、デュアル機能タンパク質の切断現象は、２００ｋＤａまたはそれ以上の分子量を有する硫酸デキストランが１００から５００ｍｇ／Ｌの濃度で培養培地に加えられたとき、有意に低下した。
【００６５】
例３．デュアル機能タンパク質分解の防止のための培養条件の評価
例１および２において特定された硫酸デキストランによるデュアル機能タンパク質の切断を防止する効果を最大化するための培養条件を試験した。
【００６６】
具体的には、５００ｋＤａの硫酸デキストランを０ｍｇ／Ｌから１，０００ｍｇ／Ｌの濃度で加えたことを除けば、培養を例１と同じ条件下で実施した。ここで、培養温度が培養の４日目に３２℃に変化させた実験グループを、含んだ（以下の表７参照）。次に、培養上清をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、非還元条件）により分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果およびそのグラフは図６に示される。
【００６７】
【表７】
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【００６８】
図６に示されるとおり、５００ｋＤａの重量平均分子量を有する硫酸デキストランの処理での培養の培養上清が、硫酸デキストランの処理なしの培養の培養上清と比較して、デュアル機能タンパク質の有意に低下した切断現象を示したことを見出した。また、温度を培養中に変化させたとき、デュアル機能タンパク質の切断現象がさらに効果的に阻害されたことを見出した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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