(57)【要約】  本発明は、乳癌または乳癌細胞を検出する方法を提供し、本方法は、  （ａ）細胞、微小胞および／またはエキソソームを含む液体試料を対象から得ることと、  （ｂ）前記試料中の可溶性または細胞表面結合性Ｃｙｒ６１の存在を測定することと、を含み、前記液体試料は血液および／または骨髄穿刺液から選択され、Ｃｙｒ６１の存在の測定はＥＬＩＳＡを介した検出を含む。
2020510844.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌または乳癌細胞を検出する方法であって、
（ａ）細胞、微小胞および／またはエキソソームを含む液体試料を対象から得ることと、
（ｂ）前記試料中の可溶性または細胞表面結合性Ｃｙｒ６１の存在を測定することと、
を含み、
前記液体試料が血液および／または骨髄穿刺液から選択され、Ｃｙｒ６１の存在の測定がＥＬＩＳＡを介した検出を含む、方法。
【請求項２】
前記ＥＬＩＳＡが、別個のＣｙｒ６１エピトープに結合する２つの異なる抗ヒトＣｙｒ６１抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡである、請求項１に記載の乳癌または乳癌細胞を検出する方法。
【請求項３】
異なる抗ヒトＣｙｒ６１抗体が結合する前記別個のＣｙｒ６１エピトープが、少なくとも５０アミノ酸離れているか、または少なくとも７５、８５もしくは１００アミノ酸離れている、請求項１または２に記載の乳癌または乳癌細胞を検出する方法。
【請求項４】
Ｃｙｒ６１の存在の検出が、前記試験試料中のＣｙｒ６１の濃度の測定を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の、対象において乳癌または乳癌細胞を検出する方法。
【請求項５】
（ｃ）前記試験試料中のＣｙｒ６１の濃度を参照試料中のＣｙｒ６１の濃度と比較することをさらに含む、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の、対象において乳癌または乳癌細胞を検出する方法。
【請求項６】
前記参照試料が、
（ｉ）５０歳を超える健常女性の血漿試料、または
（ｉｉ）年齢および性別が一致する参照試料
である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の、対象において乳癌または乳癌細胞を検出する方法。
【請求項７】
乳癌を検出するための方法であって、
（ａ）ヒト対象から血液試料を得て、血漿から細胞を分離することと、
（ｂ）サンドイッチＥＬＩＳＡを介して前記血漿中の可溶性Ｃｙｒ６１の濃度を測定し、前記ＥＬＩＳＡが少なくとも５０アミノ酸離れている別個のＣｙｒ６１エピトープに結合する２つの異なる抗ヒトＣｙｒ６１抗体を使用することと、
（ｃ）前記試験試料中の可溶性Ｃｙｒ６１の濃度を、参照試料中のＣｙｒ６１の濃度と比較し、前記参照試料が５０歳を超える健常女性の血漿試料であることと、
を含む、方法。
【請求項８】
前記試験試料中のＣｙｒ６１濃度が前記参照試料中よりも高い場合に乳癌が検出される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の乳癌を検出する方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の癌または癌細胞を検出する方法を含む、癌の診断または鑑別診断のための方法。
【請求項１０】
前記診断が、
（ａ）循環可溶性Ｃｙｒ６１、および／または
（ｂ）細胞表面結合性Ｃｙｒ６１腫瘍細胞および／または播種性腫瘍細胞
を識別する鑑別診断を含む、請求項９に記載の癌の診断のための方法。
【請求項１１】
ＨＩＦ−１αおよび／またはＰＤ−Ｌ１の検出をさらに含む、請求項９または１０に記載の癌の診断または鑑別診断のための方法。
【請求項１２】
前記診断が、乳癌細胞の転移能の鑑別診断である、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の癌の診断または鑑別診断のための方法。
【請求項１３】
前記診断が、早期癌炎症状態の鑑別診断である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の癌の診断または鑑別診断のための方法。
【請求項１４】
抗癌薬のスクリーニング方法であって、
（ａ）対象に薬物を投与することと、
（ｂ）前記対象から、細胞を含む液体試料を得ることと、
（ｃ）前記液体試料中の可溶性または細胞表面結合性Ｃｙｒ６１の存在および／または濃度を測定することと、
（ｄ）前記試料中のＣｙｒ６１の濃度が参照試料中のＣｙｒ６１の濃度よりも低い場合に、前記薬物を抗癌薬として同定することと、
を含む、方法。
【請求項１５】
前記液体試料中で可溶性または細胞表面結合性Ｃｙｒ６１の存在および／または濃度の測定が、ＥＬＩＳＡ、好ましくは、少なくとも５０アミノ酸離れている別個のＣｙｒ６１エピトープに結合する２つの異なる抗ヒトＣｙｒ６１抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより行われる、請求項１４に記載の抗癌薬のスクリーニング方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌細胞を検出する方法、特に癌を有する疑いがある対象から得られた液体試料中の循環および／または播種癌細胞を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌などの癌における転移性カスケードは、原発乳房腫瘍細胞の血中への放出（循環腫瘍細胞またはＣＴＣ）、それに続く二次臓器でのこのような腫瘍細胞の定着（播種性腫瘍細胞またはＤＴＣ）およびそれらの以後の転移性増殖を含む（１）。乳癌において、ＤＴＣは、骨髄（ＢＭ）に浸潤し、化学療法を生き延び、患者の臨床転帰不良が予測されることが多い（２、３）。
【０００３】
しかし、乳癌、肺癌および前立腺癌での初回診断時にＢＭの所見が陰性にもかかわらず、多数の患者が再発している。最近、乳癌のＣＴＣについても同様の所見が認められた。このような所見から、サイトケラチンのような上皮分化マーカーに対する抗体を使用する、ＣＴＣおよびＤＴＣの検出のための現在のアッセイにおける技術的限界が指摘され得る。
【０００４】
腫瘍細胞の可塑性は、上皮特性の喪失および中間表現型（ＥＭＴ）を介した間葉性の特性の獲得につながり得る。ゆえに、上皮特性の発現が減少しているために、間葉性の特質を有するＣＴＣおよびＤＴＣ（ｍＣＴＣ、ｍＤＴＣ）は、現在使用されている上皮分化マーカーのセットにより検出されない。最近の実験で、乳癌患者においてこのようなｍＣＴＣの存在が確認された（４）。
【０００５】
ｍＣＴＣおよびｍＤＴＣの生物学およびそれらの転移への寄与は完全には理解されていない。間葉性の特質の獲得および腫瘍細胞の播種を促進する１つの要因は低酸素である。低酸素は原発腫瘍に限定されず、ヒト骨髄でも起こり得、造血幹細胞ニッチの領域で僅か１％Ｏ2の値（低酸素）が検出された。前立腺癌マウスモデルにおいて、これらのニッチをＤＴＣが占めることが示されており、これにより骨髄ＤＴＣが低酸素にさらされ得るという考えが裏付けられる。発明者らは以前、骨髄中の微小環境ストレス耐性ｍＤＴＣを検出した。このようなＤＴＣは上皮分化マーカーを低レベルで発現するが、低酸素応答プログラムの小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）のタンパク質に対して強く陽性である。
【０００６】
このようにＣＴＣおよびＤＴＣはそれらが由来する癌と共通のいくつかの特徴を有する一方で、元の癌の上皮特性が失われ、同時にＣＴＣおよびＤＴＣ形質転換の過程で間葉性の特性が獲得される（５）。上皮分化を伴う腫瘍細胞（癌腫）の前駆細胞である癌幹細胞も上皮特性を欠き、間葉性の特質を示し得る。ゆえに、ＣＴＣ／ＤＴＣは癌幹細胞の特性に類似し得る。これは特に癌マーカー、すなわち癌細胞によって差次的に発現される配列の発現に当てはまる。
【０００７】
ＣＹＲ６１はＣＣＮファミリーの一員であるシグナル伝達タンパク質である。このタンパク質は分泌され得るか、または細胞外マトリクス（ＥＣＭ）と会合し得る。ＣＹＲ６１は、細胞表面インテグリン受容体との相互作用によって様々な細胞活性の制御に寄与することが知られる。様々なＣｙｒ６１活性が癌と関連付けられている。例えば、（６）は、性ステロイドまたは成長因子がＣｙｒ６１遺伝子に結合し、これを誘導するのを妨害または阻止する組成物を用いて、乳癌細胞増殖を防ぐかまたは阻害する方法を開示する。この刊行物はさらに、Ｃｙｒ６１タンパク質発現を制御するリガンドについてスクリーニングする方法に言及している。同様に、（７）は、患者における癌の診断および予後のための迅速かつ容易なスクリーニングとしての、尿試料中のＣｙｒ６１タンパク質の検出を開示する。
【０００８】
癌細胞上でのＣｙｒ６１の発現が観察され、癌細胞の細胞増殖、遊走および転移におけるそのタンパク質の役割が、（８）、（９）および（１０）を含む多数の科学刊行物で概説されている一方で、先行技術文献には、液体試料中の非癌性細胞の発現に対してＣＴＣおよびＤＴＣ上のＣｙｒ６１の発現を分析し、比較したことを明らかにするものはない。したがって、このタンパク質が液体試料中でマーカーとして使用し得るか否かは全く不明であった。
【０００９】
ｍＣＴＣおよびｍＤＴＣは、利用可能なマーカータンパク質を用いて検出することが困難であるので、人体におけるＣＴＣおよびＤＴＣの検出および特徴付けを改善するさらなる新しいマーカーに対する大きなニーズがある。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、癌または癌細胞を検出する方法を提供し、本方法は、
（ａ）細胞、微小胞（microvesicles）および／またはエキソソームを含む液体試料を対象から得ることと、
（ｂ）試料中の可溶性および／または細胞表面結合性Ｃｙｒ６１の存在を測定することと、
を含み、液体試料は血液および／または骨髄穿刺液から選択される。
【００１１】
好ましい実施形態において、本発明は、癌または癌細胞を検出する方法を提供し、本方法は、
（ａ）細胞、微小胞および／またはエキソソームを含む液体試料を対象から得ることと、
（ｂ）試料中の可溶性および／または細胞表面結合性Ｃｙｒ６１の存在を測定することと、
を含み、
液体試料は血液および／または骨髄穿刺液から選択され、Ｃｙｒ６１の存在の判定は、ＥＬＩＳＡを介した検出を含む。
【００１２】
驚くべきことに、発明者らは、Ｃｙｒ６１マーカーは癌細胞上で発現されるが、これらの液体試料中に存在する他の細胞上では発現されないので、Ｃｙｒ６１は、血液、血漿、血清および／または骨髄穿刺液中の癌および癌細胞および細胞断片に対する非常に有益なマーカーに相当することを発見した。
【００１３】
本発明による病的状態を検出する方法は、循環腫瘍細胞および／または播種性腫瘍細胞の検出に特に適している。
【００１４】
特に好ましい実施形態において、本発明は、
（ａ）ヒト対象から血液試料を得て、血漿から細胞を分離することと；
（ｂ）サンドイッチＥＬＩＳＡを介して血漿中の可溶性Ｃｙｒ６１の濃度を測定し、このＥＬＩＳＡが、少なくとも５０アミノ酸離れている別個のＣｙｒ６１エピトープに結合する２つの異なる抗ヒトＣｙｒ６１抗体を使用することと；
（ｃ）試験試料中の可溶性Ｃｙｒ６１の濃度を、参照試料中のＣｙｒ６１の濃度と比較し、この参照試料が、５０歳を超える健常女性の血漿試料であることと、
を含む、乳癌の検出方法を提供する。
【００１５】
これらの方法において、試験試料中のＣｙｒ６１の濃度が参照試料中よりも高い場合、乳癌または乳癌細胞が検出される。
【００１６】
さらなる実施形態において、本発明は、上記で特徴付けられるような液体試料中で癌細胞を検出する方法を含む、癌の診断または鑑別診断のための方法を提供する。
【００１７】
さらなる他の実施形態において、本発明は、抗癌薬をスクリーニングするための方法を提供し、本方法は、
（ａ）対象に薬物を投与することと；
（ｂ）対象から液体試料を得て、この液体試料が細胞を含むことと；
（ｃ）液体試料中の可溶性もしくは細胞表面結合性Ｃｙｒ６１の存在および／または濃度を測定することと；
（ｄ）試料中のＣｙｒ６１の濃度が参照試料中のＣｙｒ６１の濃度よりも低い場合には、その薬物を抗癌性として同定することと、
を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、癌または癌細胞を検出する方法を提供し、本方法は、
（ａ）細胞、微小胞および／またはエキソソームを含む液体試料を対象から得ることと、
（ｂ）試料中の可溶性および／または細胞表面結合性Ｃｙｒ６１の存在を測定することと、
を含み、液体試料は血液および／または骨髄穿刺液から選択され、Ｃｙｒ６１の存在の測定は、ＥＬＩＳＡを介した検出を含む。
【００１９】
液体試料は、好ましくはヒトであるが動物でもあり得る対象から得られる。
【００２０】
本願において、癌および腫瘍という用語は交換可能に使用される。癌細胞は、単一の腫瘍細胞または腫瘍細胞のより大きな凝集体の一部、すなわちＣＴＣにおける細胞塊またはＤＴＣおける微小転移巣である。癌細胞は本質的に不均一であり、全ての癌細胞を包含する定義を提供することは困難である。本発明の観点において、癌細胞は、上皮サイトケラチンを発現し、白血球マーカーＣＤ４５を発現しない細胞である。
【００２１】
本方法は最も頻繁には、癌を有する疑いがある対象または以前に癌と診断された対象から得られた液体試料を用いて行われる。したがって、本発明の方法は、好ましくは、本発明の方法とは異なる方法を用いて、以前に癌と診断された対象からの液体試料を用いて行われる。以下でより詳細に説明するように、この実施形態において、本発明の方法は癌または炎症状態の鑑別診断を提供する。
【００２２】
血液、血漿、血清および／または骨髄穿刺液から選択される液体試料を対象から得る方法は当技術分野で周知であり、本発明の方法の実施においてこれらの方法の何れか１つを使用し得る。最も単純な形態において、得られる液体試料は単純な血液試料である。全血または血漿試料から血清試料を得る方法は当技術分野において周知である。骨髄穿刺液を得る方法は、当技術分野において等しく周知である。本発明の方法は、癌細胞を検出するための、または癌の鑑別診断を提供するためのインビトロ法である。
【００２３】
本発明の方法は、可溶性および／または細胞表面結合性Ｃｙｒ６１の検出に使用され得る。本願において使用される「可溶性Ｃｙｒ６１」という用語は、血液試料の血清中などの試料の液体画分中に存在するときの、タンパク質およびその同定可能な断片を指す。本願において使用される「細胞表面結合性Ｃｙｒ６１」という用語は、細胞、微小胞および／またはエキソソームの表面上に存在するとき、またはそれらの不可欠な部分として存在するときの、タンパク質またはその同定可能な断片を指す。
【００２４】
一実施形態において、本発明は、癌または癌細胞を検出する方法を提供し、本方法は、
（ａ）細胞、微小胞および／またはエキソソームを含む液体試料を対象から得ることと、
（ｂ）試料中の可溶性Ｃｙｒ６１の存在を測定することと、
を含み、液体試料は血液および／または骨髄穿刺液から選択される。
【００２５】
同様に、本発明は、癌または癌細胞を検出する方法を提供し、本方法は、
（ａ）細胞、微小胞および／またはエキソソームを含む液体試料を対象から得ることと、
（ｂ）試料中の細胞表面結合性Ｃｙｒ６１の存在を測定することと、
を含み、液体試料は血液および／または骨髄穿刺液から選択される。
【００２６】
あるいは、本発明は、このようにして、癌または癌細胞を検出する方法を提供し、本方法は、
（ａ）細胞、微小胞および／またはエキソソームを含む液体試料を対象から得ることと、
（ｂ）試料中の可溶性および細胞表面結合性Ｃｙｒ６１の存在を測定することと、
を含み、液体試料は血液および／または骨髄穿刺液から選択される。
【００２７】
一態様において、本発明は、試料が血液試料であり、血清が単離され、血清中でＣｙｒ６１が検出される、癌を検出する方法を提供する。検出は免疫細胞化学的分析を含み得る。好ましい実施形態において、検出はＥＬＩＳＡで血清中のＣｙｒ６１を検出することを含む。
【００２８】
本発明の方法はまた、ＣＴＣおよび／またはＤＴＣの検出にも特に有利である。ＣＴＣは、上皮性サイトケラチンを発現し、癌性起源から放出され、したがって体液中に存在する白血球マーカーＣＤ４５を発現しない腫瘍細胞である。発明者らは、驚くべきことに、ＣＴＣがＣｙｒ６１の発現によって検出および特徴付けられ得ることを発見した。検出方法は、細胞、微小胞および／またはエキソソームあるいはそれらのホモジネートを、抗サイトケラチン抗体および抗ＣＤ４５抗体から選択される少なくとも１つのさらなる抗体と接触させることを含む。
【００２９】
ＤＴＣは、上皮性サイトケラチンを発現し、白血球マーカーＣＤ４５を発現せず、体内で癌性起源の外部に存在し、骨髄、肝臓、肺または脳などの二次的部位中に存在する腫瘍細胞または細胞である。二次的部位は、癌性起源の場所またはＣＴＣに対する起源として定義された部位ではない人体内の何らかの部位であり得る。したがって、ＤＴＣは、癌性起源の場所ではない人体の部位から得られるＣｙｒ６１を発現する癌細胞である。
【００３０】
特に好ましい態様において、本発明の乳癌または乳癌細胞を検出する方法は、別個のＣｙｒ６１エピトープに結合する２つの異なる抗ヒトＣｙｒ６１抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡを使用する。この態様において、試料は好ましくは血液であり、血清は単離され、Ｃｙｒ６１は別個のＣｙｒ６１エピトープに結合する２つの異なる抗ヒトＣｙｒ６１抗体を用いるサンドイッチＥＬＩＳＡを使用して血清中で検出される。一態様において、異なる抗ヒトＣｙｒ６１抗体が結合する別個のＣｙｒ６１エピトープは、少なくとも５０アミノ酸離れているか、または少なくとも７５、８５もしくは１００アミノ酸離れている。これは、抗ヒトＣｙｒ６１抗体が結合するＣｙｒ６１エピトープのそれぞれが、他のＣｙｒ６１エピトープから少なくとも７５アミノ酸離れていることを意味する。
【００３１】
さらなる好ましい実施形態において、本発明による対象における乳癌または乳癌細胞を検出する方法は、試験試料中のＣｙｒ６１の濃度の測定を含む。一態様において、この方法は、試験試料中のＣｙｒ６１の濃度を参照試料中のＣｙｒ６１の濃度と比較する工程をさらに含む。
【００３２】
発明者らは、対象における乳癌または乳癌細胞を検出する方法が以下：
（ｉ）５０歳を超える健常女性の血漿試料；および
（ｉｉ）年齢および性別が適合する参照試料
から選択される参照試料を使用する場合、個々の方法が特に有利であることを示した。
【００３３】
参照試料中のＣｙｒ６１の濃度は、１つの参照試料中、例えば５０歳を超える健常女性の１つの試料中のＣｙｒ６１の濃度を測定することによって得ることができる。あるいは、参照試料中のＣｙｒ６１の濃度は、いくつかの参照試料中のＣｙｒ６１の濃度の平均または平均値、例えば、５０歳を超える健常女性のいくつかの参照試料中のＣｙｒ６１の濃度の平均値として決定され得る。
【００３４】
一般に、上記のような乳癌を検出する方法は、試験試料中のＣｙｒ６１の濃度が参照試料中よりも高い場合、乳癌または乳癌細胞を検出する。
【００３５】
病理学的状態を検出する工程は、液体試料中に存在する細胞、微小胞および／またはエキソソームをホモジナイズし、Ｃｒｙ６１をホモジネート中で検出する工程を含み得る。試料中の細胞は、細胞膜を破壊し、細胞小器官および細胞質を放出させることによってホモジナイズされる。細胞をホモジナイズするための多数の方法が当技術分野で公知であり、細胞中にあるＣｙｒ６１を検出するために本発明で使用され得る。別のアプローチでは、細胞表面結合性Ｃｙｒ６１を検出し、このアプローチは細胞ホモジナイズを明らかに必要としない。両方法において、Ｃｙｒ６１の存在を測定する前に細胞、微小胞および／またはエキソソームを液体試料から分離し得る。これは例えば遠心分離により行い得る。分離工程はまた、液体試料それ自体に関して、またはＣｙｒ６１を発現していない他の細胞に関しての何れかで、細胞または細胞断片を濃縮する方法も包含し得る。
【００３６】
Ｃｙｒ６１の存在の検出は、Ｃｙｒ６１の存在の検出または濃度の測定を含み得る。Ｃｙｒ６１の存在を検出するかまたは濃度を測定するための多数の様々な方法が当技術分野で公知であり、核酸（ｃｙｒ６１）またはタンパク質レベルで液体試料中のＣｙｒ６１を検出するのに適している何らかの分析アプローチが本発明で使用され得る。
【００３７】
本発明の好ましい方法において、Ｃｙｒ６１の濃度は、Ｃｙｒ６１レベルを検出するための抗体または抗体誘導体を用いて測定される。したがって、本発明の癌細胞検出方法は、検出が細胞、微小胞および／またはエキソソームまたはそれらのホモジネートを抗Ｃｙｒ６１抗体と接触させることを含む工程を特徴とし得る。抗Ｃｙｒ６１抗体は当技術分野で公知であり、本発明の目的のために使用され得る。例えば、本方法は、当技術分野で周知の抗体に基づく免疫細胞化学的分析方法を含み得る。
【００３８】
特に好ましい実施形態において、本発明の癌または癌細胞を検出する方法は、細胞、微小胞および／またはエキソソームまたはそれらのホモジネートを抗Ｃｙｒ６１抗体と、および、抗サイトケラチン抗体および抗ＣＤ４５抗体から選択される少なくとも１つのさらなる抗体と接触させる工程をさらに含む。多数の抗サイトケラチンおよび抗ＣＤ４５抗体が当技術分野で公知であり、本発明の目的のために使用され得る。上記のように、ＣＴＣは、上皮サイトケラチンを発現するが白血球マーカーＣＤ４５を発現しない腫瘍細胞である。したがって、いくつかの抗体を用いる方法は、検出プロセスの一部として分析された細胞タイプのより完全な特徴付けを提供する。
【００３９】
一態様において、癌または癌細胞を検出する方法は、
（ａ）少なくとも、抗Ｃｙｒ６１抗体と抗サイトケラチン抗体および／または抗ＣＤ４５抗体とを含む第１の抗体セットを、細胞、微小胞および／またはエキソソームあるいはそれらのホモジネートに接触させることと；
（ｂ）第１の抗体セットの各抗体に対して特異性を有する第２の抗体セットを試料に接触させることと；
（ｃ）第２の抗体の結合によって放射されるシグナルを検出することと、
を含む。
【００４０】
関連する態様において、癌または癌細胞を検出する方法は、
（ａ）少なくとも、抗Ｃｙｒ６１抗体と抗サイトケラチン抗体および／または抗ＣＤ４５抗体とを含む少なくとも第１の抗体セットを、細胞、微小胞および／またはエキソソームまあるいはそれらのホモジネートに接触させることと；
（ｂ）洗浄によって未結合抗体を除去することと；
（ｃ）第１の抗体セットの各抗体に対して特異性を有する第２の抗体セットを試料にを接触させることと；
（ｄ）洗浄によって未結合抗体を除去することと；
（ｅ）第２の抗体の結合によって放射されるシグナルを検出することと、
を含む。
【００４１】
第二の抗体の結合によって放射されるシグナルは蛍光シグナルであり得、自動検出装置によって検出され得る。
【００４２】
抗体は、タンパク質全体またはＣｙｒ６１の一部もしくは断片に結合し得る。さらなる検出方法もまた使用され得、これにはＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、酵素アッセイ、ＰＣＲ、ハイブリッド形成およびアレイ技術が含まれる。さらに、顕微鏡分析を含む、生化学的または生物物理学的検出または分析に基づく方法、例えば全波長範囲分析、クロマトグラフィーまたは電気泳動法、例えば同位体もしくは化合物を使用する標識／誘導体化技術、ガスクロマトグラフィー、原子間力顕微鏡、例えばクロマトグラフィーおよび他の分光分析法と組み合わせるかもしくは組み合わせない質量分析、核磁気共鳴分光法および他の分光分析法など、が含まれる。さらに、免疫沈降によるＣｙｒ６１の捕捉とそれに続く質量分析または質量分析と組み合わせたクロマトグラフィーを含め、これらの方法の様々な部分が先行技術において組み合わせられてきた。Ｃｙｒ６１の存在または濃度の検出が核酸の検出に基づく限りにおいては、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡの検出が好ましい。
【００４３】
本発明による癌細胞検出方法は、得られた値と内部標準または外部標準との比較を含み得る。アッセイ方式に依存して、Ｃｙｒ６１の配列を有する、オリゴヌクレオチド（ＤＮＡまたはＲＮＡ）、タンパク質またはペプチドを標準物質として既知の濃度で使用し得る。
【００４４】
本発明による病的状態を検出する方法は、試料中のＣｙｒ６１の濃度を参照試料中のＣｙｒ６１の濃度と比較する工程も含み得る。参照試料中のＣｙｒ６１の濃度は、試験しようとする試料中のＣｙｒ６１の濃度と同じアッセイで検出され得るが、必ずしもそうである必要はない。実際、参照試料中のＣｙｒ６１の濃度は、試験しようとする試料中の濃度を測定するかなり前に標準として得られているものであり得、試験しようとする試料中の濃度と参照試料中の濃度との比較は、試験しようとする試料中のＣｙｒ６１の濃度を分析する装置により自動的に行われ得る。
【００４５】
本発明による癌細胞検出方法は、癌の診断に特に適している。したがって、本発明は、上記のような癌細胞検出方法を含む癌の診断方法を提供する。
【００４６】
本発明の方法において癌のあらゆる診断形態が使用され得る。しかし、好ましくは、本発明の方法は、循環腫瘍細胞および／または播種性腫瘍細胞の同定のためなど、癌の鑑別診断のために使用される。
【００４７】
本発明による癌の診断または鑑別診断のための方法は、例えばＨＩＦ−１および／またはＰＤ−Ｌ１の検出を含む、さらなる癌マーカーの検出を含み得る。本願は、特定の癌のタイプにおいて、液体試料中に存在する癌細胞におけるＣｙｒ６１の発現がＨＩＦ−１および／またはＰＤ−Ｌ１の発現と密接に関連することを初めて示す。ＨＩＦ−１および／またはＰＤ−Ｌ１の発現を検出するための多数の様々な代替法が当技術分野で公知であり、ＨＩＦ−１および／またはＰＤ−Ｌ１を検出するための本発明の方法において使用され得る。Ｃｙｒ６１の、ＨＩＦ−１および／またはＰＤ−Ｌ１の検出は、単一のアッセイまたは完全に無関係のアッセイで実施され得る。
【００４８】
特定の実施形態において、本発明によって提供されるような癌の診断は、上皮癌細胞または間葉性癌細胞タイプである癌細胞の診断に相当する。
【００４９】
癌の診断のための方法は、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞などの転移能の鑑別診断に特に適している。
【００５０】
このようにして、本発明は、癌と診断され、外科手術によって原発腫瘍が除去された患者を含む、癌と診断された患者に対する治療計画を特定するために使用され得る。
【００５１】
他の実施形態において、本発明による癌細胞検出方法は、早期癌の炎症状態の診断を対象とする。ある種の炎症状態が低酸素のような有害な微小環境状態を誘発することは周知であり、これにより、例えば膵炎または潰瘍性大腸炎などの状態における、初期悪性細胞の検出が可能になる。
【００５２】
さらなる関連する実施形態において、本発明は、抗癌薬をスクリーニングするための方法を提供し、本方法は、
（ａ）対象に薬物を投与することと；
（ｂ）対象から液体試料を得て、この液体試料が細胞を含むことと；
（ｃ）対象の液体試料中のＣｙｒ６１の存在および／または濃度を測定することと；
（ｄ）試料中のＣｙｒ６１の濃度が参照試料中のＣｙｒ６１の濃度よりも低い場合、その薬物を抗癌性として同定することと、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】Ａ：ウエスタンブロット分析による、乳癌細胞株との、播種性腫瘍細胞株ＢＣ−Ｍ１（乳癌）およびＬＣ−Ｍ１（肺癌）の上皮分化グレードの比較。細胞を標準的条件下で培養した。  Ｂ：ＳＩＬＡＣ  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によるシステインリッチ血管新生インデューサー６１（Ｃｙｒ６１）の定量および同定。上の画像：ＭＳ1−スペクトルの関連質量範囲。下の画像：ｍ／ｚ  １１８０．５５の陽イオンモードＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＣＩＤスペクトル。  Ｃ：ウエスタンブロットによる癌細胞におけるＣｙｒ６１発現の分析。ラミン−Ａ／Ｃは、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＤＡ−４６８）とＢＣ−Ｍ１との間で差次的に発現されないタンパク質の例として示される。  Ｄ：Ｃｙｒ６１発現の定量分析。シグナルをローディング対照アルファチューブリンに対して正規化した。３回の独立した実験の平均値を数値として与え、標準偏差を縦線のエラーバーにより示す。Ｅ：Ｃｙｒ６１に対する前立腺癌細胞株におけるウエスタンブロット分析。ＰＣ−Ｅ１およびＰＣ−Ｍ１は前立腺癌ＤＴＣ細胞株である。
【図２】表１：ＳＩＬＡＣおよびＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるシステインリッチ血管新生インデューサー６１（Ｃｙｒ６１）の差次的発現の同定。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＢＣ−Ｍ１のタンパク質発現プロファイルを４つの生物学的複製物において比較した。ラミン−Ａ／Ｃの発現値は、差次的に発現されないタンパク質に対する参照として示す。  a平均シグナル比の正の値は、ＢＣ−Ｍ１におけるタンパク質発現上昇を意味し、負の値はＭＤＡ−４６８におけるタンパク質発現上昇を意味する。b手作業で定量化を行った。cスチューデントｔ検定、ｐ＜０．０５を有意とみなした。
【図３】Ａ：原発乳房腫瘍組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）の試料における免疫組織化学的分析によるシステインリッチ血管新生インデューサー６１（Ｃｙｒ６１）シグナル。画像の中央は、ＴＭＡの切片を示し、左右の拡大切片は代表的な染色パターンを示す。分析症例数は１４７例であった。  Ｂ：乳癌患者の骨髄転移における免疫組織化学的Ｃｙｒ６１検出。核はヘマルム（ｈｅｍａｌｕｍ）により染色した。スケールバー：Ａ：１００μｍ；Ｂ：６７μｍ。
【図４】表２：乳癌組織マイクロアレイおよびヒト原発肺癌試料におけるＣｙｒ６１発現と臨床病理学的特性の関連。  aピアソンのカイ二乗またはフィッシャーの直接確率検定。  b全部で１４７例の原発乳房腫瘍についてＣｙｒ６１染色の結果を得た。  これら症例全てについて臨床病理学的データが全て利用可能というわけではなかったので、症例数は個々のパラメーターについて１４７例より少ないことがあり得る。
【図５】骨髄への腫瘍細胞播種に対するモデル系におけるシステインリッチ血管新生インデューサー６１（Ｃｙｒ６１）レベルの分析；ウエスタンブロットによる分析。  Ａ：標準的細胞培養条件下で細胞株を培養した後の開始条件。  Ｂ：骨髄中に見られるような低酸素（１％Ｏ2）微小環境へのＤＴＣの定着のシミュレーション。ＭＣＦ−７に対して、陽性対照（＋）はＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−２３１）であった。  Ｃ：図２Ｂで特定した条件に対する、Ｃｙｒ６１についての定量的ウエスタンブロット分析。  Ｄ：Ｃｙｒ６１に対する低酸素誘導因子１−アルファ（ＨＩＦ−１α）の安定化の効果。  Ｅ：ＭＤＡ−２３１の骨転移亜系統（ＭＤＡ−２３１  ＳＡおよびＭＤＡ−２３１  Ｂ０２）および脳転移亜系統（ＭＤＡ−２３１  ＢＲ）におけるＣｙｒ６１レベル。  Ｆ：Ｃｙｒ６１レベルに対するグルコース欠乏の影響。Ｇｒｐ７８（７８ｋＤａグルコース制御タンパク質）を陽性対照とした。大量のＭＤＡ−２３１細胞が５０時間のグルコース除去後に細胞培養フラスコから剥離したので、これらの細胞を別々に分析した。  Ｇ：非常に有害な条件下（低酸素およびグルコース欠乏）でのＣｙｒ６１およびビメンチンの誘導。  縦線のエラーバーは標準偏差を示す。Ｓ：標準的培養条件。
【図６】主に血管またはリンパ管を介して主に播種される（Ａ）または腹膜播種の割合が高い（Ｂ）癌実体におけるシステインリッチ血管新生インデューサー６１（Ｃｙｒ６１）およびＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死１リガンド１）に対するウエスタンブロット分析。細胞株を標準的条件下で培養し、アルファ−チューブリンをローディング対照とした。他の実験との比較のために、ＢＣ−Ｍ１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＤＡ−４６８）を分析した。  Ａ：分析した癌の実体：前立腺癌（ＬＮＣＡＰ、Ｄｕ１４５ＰＣ−３）、乳癌（ＢＴ２０、ＢＴ４７４、ＺＲ−７５−１）、頭頸部癌（Ｃａｌ２７、ＳＣＣ２５）。  Ｂ：分析した癌の実体：膵臓癌（Ｐａｎｃ１、Ｐａｎｃ２、ＢｘＰＣ３、５０６１）。
【図７】標準的細胞培養条件下（Ｓ）および低酸素条件下（１％Ｏ2）でのＥｒｂＢ−２に対するシステインリッチ血管新生インデューサー６１（Ｃｙｒ６１）の応答。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＤＡ−４６８）にＥｒｂＢ−２発現ベクターで遺伝子移入した（ＭＤＡ−４６８  ＥｒｂＢ−２）。ＭＤＡ−４６８ＰＭは、１２４８位のチロシンがフェニルアラニンに置換されたＥｒｂＢ−２タンパク質を発現する。挿入物なしの発現ベクターでＭＤＡ−４６８対照に遺伝子移入を行った。  Ａ：示されたタンパク質および条件に対するウエスタンブロット分析。  Ｂ：低酸素下でのＣｙｒ６１およびビメンチンレベルの定量分析。  Ｃ：標準的細胞培養条件下（Ｓ）および１％Ｏ2で９０時間での培養後にビメンチンおよび核（ＤＡＰＩ）に対して染色したＭＤＡ−４６８細胞の顕微鏡画像。ビメンチンおよびＤＡＰＩシグナルの合成画像を示す。ビメンチン陽性細胞を矢印で標識する。  Ｄ：ＭＤＡ−４６８細胞株中のビメンチン陽性細胞の割合（％）。  Ｅ：乳癌細胞株ＢＴ２０および３種類の扁平上皮癌細胞株に対するウエスタンブロット分析。  Ｆ：上皮増殖因子ＥＧＦでの細胞刺激後のＣｙｒ６１誘導。刺激は標準的条件下で行った。
【図８】ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（Ａ）およびＢＣ−Ｍ１（Ｂ）におけるシステインリッチ血管新生インデューサー６１（Ｃｙｒ６１）分泌の検出。細胞をブレフェルジンＡで処理してタンパク質分泌を遮断した。細胞培養培地の上清は分泌タンパク質分画を含有し、一方ペレットは剥離細胞を含有する。ウエスタンブロット画像は、Ｃｙｒ６１および７８ｋＤａグルコース制御タンパク質（Ｇｒｐ７８；陽性対照）についての分析を示す。α−チューブリンを分析して、上清中の潜在的な細胞質タンパク質汚染を検出した。右側のグラフは、細胞培養フラスコからのタンパク質量に対するバランスシートを示す。３つの独立した実験の平均値を示し、数値として与える。標準偏差は縦線のエラーバーにより示す。ＭＤＡ−２３１剥離細胞（未処理）の３つの複製物のうち２つについての総タンパク質量は５０μｇを下回ったので、この試料なしのウエスタンブロットを示す。（Ｃ）ウエスタンブロットによるインテグリンファミリーメンバーに対する、示される細胞株の分析。インテグリンファミリーからの最も顕著なＣｙｒ６１受容体は、インテグリンαｖおよびインテグリンβ３のヘテロ二量体であり、これらは両方とも高レベルでＤＴＣ細胞株に存在する。細胞を標準的条件下で培養した。
【図９】ウエスタンブロットにおけるＣｙｒ６１単離のためのウサギ抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）およびＣｙｒ６１検出のためのマウスモノクローナル抗体を用いた免疫沈降によるＣｙｒ６１の単離。ＢＣ−Ｍ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１からの全細胞溶解物を個々の免疫沈降に対する陽性対照とした。ＢＣ−Ｍ１からのＣｙｒ６１免疫沈降物をＢＣ−Ｍ１  Ｃｙｒ６１と命名し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１についてはそれをＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｃｙｒ６１と命名する。抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）の代わりにＩｇＧを使用するアッセイを免疫沈降の特異性に対する対照とした。陰性対照として、ＳＤＳ試料緩衝液を分析した。実験は生物学的な３つ組（biological triplicates）で実施した。
【図１０】Ａ：Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚの抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）およびＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇの抗体（ＣＳＴ）のウエスタンブロット分析。両抗体について、同じ細胞溶解物を適用した。ＣＳＴ抗体の分析のために、４０μｇのタンパク質を各レーンに適用し、一次抗体を１：５００希釈した。Ｈ７８抗体の分析のために、２０μｇのタンパク質を各レーンに適用し、一次抗体を１：１，０００希釈した。定量分析はＸ線フィルムの濃度測定分析により行った。平均値は数値として与え、エラーバーは標準偏差を示す。Ｂ：１：１０，０００（左）および１：１，０００（右）の希釈度での抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）の評価のためのウエスタンブロット分析。ヒト組み換えＣｙｒ６１の連続希釈物および特定の細胞株の全細胞溶解物を適用した。抗Ｃｙｒ６１抗体の非特異的検出の可視化のために、４０μｇのＭＣＦ−７細胞溶解物を適用した。これらのタンパク質試料を、様々な抗Ｃｙｒ６１抗体希釈物、ならびに様々なＸ線フィルムの露光時間で分析した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＤＡ−４６８）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−２３１）およびＢＣ−Ｍ１に対して、１０μｇの細胞溶解物を適用した。
【図１１】線形方程式の計算のための検量線。Ａ．値は、図１０Ｂで示されるようにウエスタンブロットの定量分析で測定した。ｘ軸は組み換えＣｙｒ６１に対するシグナル強度の値を示し、ｙ軸は組み換えＣｙｒ６１タンパク質のタンパク質量を示す。各測定点は３回の実験の平均値であり、ｘ値の標準偏差は水平なエラーバーとして示す。嵌め込みは、式のパラメーターを示し、これはｙ＝２．５６７８ｘとして計算され、ｙはＣｙｒ６１のタンパク質量［μｇ］、ｘはＸ線フィルム上のシグナル強度［任意単位］である。Ｂ、Ｃ、Ｄ：組み換えＣｙｒ６１に対するシグナル強度の値を伴うｘ軸および適用した組み換えＣｙｒ６１タンパク質のタンパク質量を伴うｙ軸を含む検量線。各測定点は３回のＥＬＩＳＡの平均値であり、ｘ値の標準偏差は水平エラーバーとして示す。嵌め込みは、式のパラメーターを示し、これは、Ｃｙｒ６１のタンパク質量としてのｙ［μｇ］、ＥＬＩＳＡリーダーにおけるシグナル強度（ＯＤ４０５ｎｍ）としてのｘ、および切片としての固定値からなる。Ｂ：ＭＣＦ−７の分析用の検量線。Ｃ：細胞培養上清を分析するための検量線。Ｄ：ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＢＣ−Ｍ１の細胞溶解物および細胞培養上清の分析のための検量線。
【図１２】Ａ：ＥＬＩＳＡによる乳癌細胞株の細胞培養上清中のＣｙｒ６１値の測定。細胞を標準的培養条件下で培養した。ｔ＝０時間の時点に対して、新鮮な培地を細胞に添加し、続いて各測定点に対してＣｙｒ６１濃度を測定した。測定されたＣｙｒ６１濃度（および既知の培地体積）および細胞数から、細胞あたりのＣｙｒ６１数を計算した。Ｂ：ＢＣ−Ｍ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＣｙｒ６１分泌速度の測定。図１２Ａの実験以外に、細胞培養培地を１２時間ごとに交換した。値は３回の独立した実験の平均値を示す。標準偏差は縦線のエラーバーで示す。Ｃ：Ｃｙｒ６１に対する健常ドナーからの血漿試料のウエスタンブロット分析。各ドナーから１００μＬの血漿を適用した。タンパク質精製工程を試料に適用したので、ドナー＃１からの１００μＬの血漿に１００ｎｇの組み換えＣｙｒ６１を添加することによってＣｙｒ６１の回収率を分析した。ＢＣ−Ｍ１の細胞溶解物（精製工程なし）をさらなる対照とした。弱いシグナル強度を有する潜在的な非特異的バンドを特定するために、Ｘ線フィルムを１５分間露光した。
【図１３】Ｓａｎｔ  Ｃｒｕｚ  Ｈ７８（左）およびＨ２（右）の抗Ｃｙｒ６１抗体のウエスタンブロット分析。両抗体について、同じ細胞溶解物を適用した。Ｈ７８およびＨ２抗体の分析のために、２０μｇのタンパク質を各レーンに適用し、一次抗体を１：１，０００希釈した。α−チューブリンをローディング対照とした。
【図１４】マウス抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ２）を用いた免疫沈降法によるＣｙｒ６１の単離ウエスタンブロットによるＣｙｒ６１の検出のために、ウサギ抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）を使用した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１からの細胞培養上清を免疫沈降に適用した（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｃｙｒ６１）。抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ２）の代わりにＩｇＧを適用して、免疫沈降の特異性に対する対照とした（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＩｇＧ）。組み換えＣｙｒ６１は、単離Ｃｙｒ６１量の推定のための参照とした。陰性対照として、ＳＤＳ試料緩衝液を分析した。細胞溶解物ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は、免疫沈降の特異性に対するさらなる対照とした。
【図１５】抗Ｃｙｒ６１抗体Ｈ７８（左）およびＨ２（右）の評価のためのウエスタンブロット分析。一次抗体を１：１０，０００の希釈度で適用した。ヒト組み換えおよび精製Ｃｙｒ６１および特定の細胞株の全細胞溶解物の希釈系列を適用した。抗Ｃｙｒ６１抗体の潜在的な非特異的検出の可視化のために、４０μｇのＭＣＦ−７細胞溶解物をさらに分析した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−２３１）。
【図１６】線形方程式の計算のための検量線。検量線を図１７で示す分析に使用した。ｘ軸は組み換えＣｙｒ６１に対するシグナル強度の値を示し、ｙ軸は適用した組み換えＣｙｒ６１タンパク質のタンパク質量を示す。嵌め込みは方程式のパラメーターを示し、Ｃｙｒ６１のタンパク質量としてのｙ［ｎｇ］、４５０ｎｍでのＥＬＩＳＡリーダーにおけるシグナル強度としてのｘ、および切片としての０．０００９２８の固定値で、ｙ＝０．４１１８ｘ＋０．０００９として計算した。
【図１７】ＥＬＩＳＡによる、Ｃｙｒ６１量、５μｇ全細胞溶解物（Ａ）および０．５μＬ細胞培養上清（Ｂ）の定量細胞溶解物および上清の純粋試料（薄灰色）、ならびに５００ｐｇの組み換えＣｙｒ６１を添加した細胞溶解物および培養上清の試料（暗灰色）を試験した。数値は３回の実験の平均値を示す。標準偏差は縦線のエラーバーで示す。細胞を標準的培養条件下で培養し、細胞培養上清を７２時間後に回収した。
【図１８】線形方程式の計算のための検量線。検量線を図１９で示す分析に使用した。ｘ軸は組み換えＣｙｒ６１に対するシグナル強度の値を示し、ｙ軸は適用した組み換えＣｙｒ６１タンパク質のタンパク質量を示す。嵌め込みは方程式のパラメーターを示し、Ｃｙｒ６１のタンパク質量としてのｙ［ｎｇ］、４５０ｎｍでのＥＬＩＳＡリーダーにおけるシグナル強度としてのｘ、および切片としての０．００４９８の固定値で、ｙ＝０．４０６３６ｘ＋０．００４９８として計算した。
【図１９】ＥＬＩＳＡによるＭＣＦ−７の試料中のＣｙｒ６１量の測定。Ａ：細胞溶解物の分析。純粋な細胞溶解物（薄灰色）および組み換えヒトＣｙｒ６１を添加した１０μｇの細胞溶解物（暗灰色）の試料を試験した。Ｂ：細胞培養上清の分析。純粋な細胞培養上清（薄灰色）および組み換えヒトＣｙｒ６１を添加した２０μＬの細胞培養上清（暗灰色）の試料を試験した。数値は３回の実験の平均値を示す。標準偏差は縦線のエラーバーで示す。細胞を標準的培養条件下で培養し、細胞培養上清を７２時間後に回収した。
【図２０】線形方程式の計算のための検量線。検量線を図２１で示す分析に使用した。ｘ軸は組み換えＣｙｒ６１に対するシグナル強度の値を示し、ｙ軸は適用した組み換えＣｙｒ６１タンパク質のタンパク質量を示す。嵌め込みは方程式のパラメーターを示し、Ｃｙｒ６１のタンパク質量としてのｙ［ｎｇ］、４５０ｎｍでのＥＬＩＳＡリーダーにおけるシグナル強度としてのｘ、および切片としての０．００２７９の固定値で、ｙ＝０．４０６６９ｘ＋０．００２７９として計算した。
【図２１】ＥＬＩＳＡによるＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−２３１）の試料中のＣｙｒ６１量の測定。Ａ：細胞溶解物の分析。純粋な細胞溶解物（薄灰色）および組み換えヒトＣｙｒ６１を添加した１μｇの細胞溶解物（暗灰色）の試料を試験した。Ｂ：細胞培養上清の分析。純粋な細胞培養上清（薄灰色）および組み換えヒトＣｙｒ６１を添加した７５ｎＬの細胞培養上清（暗灰色）の試料を試験した。数値は３回の実験の平均値を示す。標準偏差は縦線のエラーバーで示す。細胞を標準的培養条件下で培養し、細胞培養上清を７２時間後に回収した。
【図２２】抗Ｃｙｒ６１抗体Ｈ７８を用いたＣｙｒ６１に対する健常ドナーからの血漿試料のウエスタンブロット分析。各ドナーから１００μＬの血漿を適用した。タンパク質精製工程を試料に適用したので、ドナー＃１からの１００μＬの血漿に１００ｎｇの組み換えＣｙｒ６１を添加することによってＣｙｒ６１の回収率を分析した。ＢＣ−Ｍ１の細胞溶解物（精製工程なし）をさらなる対照とした。弱いシグナル強度を有する潜在的な非特異的バンドを特定するために、Ｘ線フィルムを１５分間露光した。
【図２３】線形方程式の計算のための検量線。検量線を図２４で示す分析に使用した。ｘ軸は組み換えＣｙｒ６１に対するシグナル強度の値を示し、ｙ軸は適用した組み換えＣｙｒ６１タンパク質のタンパク質量を示す。嵌め込みは方程式のパラメーターを示し、Ｃｙｒ６１のタンパク質量としてのｙ［ｎｇ］、４５０ｎｍでのＥＬＩＳＡリーダーにおけるシグナル強度としてのｘ、および切片としての０．００２８３の固定値で、ｙ＝０．４０９８２ｘ＋０．００２８３として計算した。
【図２４】５０歳を超える健常者の血漿試料へのＣｙｒ６１  ＥＬＩＳＡの適用。各データ点は、三つ組で分析した４名の個人からの血漿試料の平均値を示す。平均値は数値で、標準偏差は縦線のエラーバーとして示す。曲線は、値の非線形フィット（非比例的）を示す。対応する式は、形式ｙ＝２．３４１×ｘ-1.050を有した。
【図２５】５０歳を超える健常女性対照個体の血漿試料中のＣｙｒ６１  ＥＬＩＳＡの検出限界の測定。組み換えヒトＣｙｒ６１を２．５μＬの血漿体積に添加し、続いてＥＬＩＳＡを適用した。検出限界を評価するために、各データ点についてスチューデントの両側ｔ検定を使用して、添加したＣｙｒ６１を含有する血漿と３種類の純粋血漿試料を比較した。各ｔ検定のｐ値は数値として示す。０．０５のｐ値は水平線として示す。
【図２６】乳癌患者の血漿中のＣｙｒ６１の安定性試験全ての血漿試料は取得後−８０℃で保存した。Ａ：明白な転移の可視的徴候のない乳癌患者の血漿試料。試料は１９９８年および１９９９年に採取した。Ｂ：転移性乳癌患者の血漿試料。試料は２０１６年１０月に採取し、購入後すぐに分析した。２０１６年１０月、２０１７年４月および２０１７年８月に、全試料をＥＬＩＳＡによりＣｙｒ６１について反復して分析した。各試料を各時点で三つ組（in triplicates）で分析した。提示する値は平均値であり、標準偏差は縦線のエラーバーとして与える。経時的なＣｙｒ６１値の僅かな増加は、試料処理の進行ゆえであり得る。
【図２７】ＥＬＩＳＡによる健常対照者および乳癌患者からの１００μＬ血漿中のＣｙｒ６１レベルの測定。Ａ：無差別に選択した健常ドナーのセットにおけるＣｙｒ６１値。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１からの５マイクログラムの細胞溶解物（ＭＤＡ−２３１）を陽性対照として使用した。Ｂ：試料取得時の５０歳を超える女性健常者のセットにおけるＣｙｒ６１値。Ｃ：転移性乳癌患者（薄灰色）および原発腫瘍の診断時に明白な転移の徴候がない患者（黒色）からの試料中のＣｙｒ６１濃度。比較として、Ａ（健常、暗灰色）およびＢ（女性５０＋、白いバー）で示されるＣｙｒ６１濃度の平均値を示す。非特異的バックグラウンドの推定のために、１００μＬ（１００μＬ）の細胞培養培地を分析した。数値は３回の測定の平均値を示し、標準偏差は縦線のエラーバーにより示す。
【図２８】Ｃｙｒ６１サンドイッチＥＬＩＳＡによる細胞培養上清の分析。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７からの細胞培養上清を希釈系列で適用した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の場合、上清のＣｙｒ６１濃度は１０５０μｇ／ｍＬであり、１００μＬの試料を各測定点に適用した。単純化するために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１上清１００μＬあたりのＣｙｒ６１量の計算値をＸ軸上に指定する。各測定点について、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７からの３つの値をスチューデントのｔ検定により分析した。０．１２５ｎｇのＣｙｒ６１量に対して０．０３１のｐ値が得られた。
【図２９】乳癌細胞におけるシステインリッチ血管新生インデューサー６１（Ｃｙｒ６１）シグナルと健常対照者からの細胞との比較。  Ａ：ＢＣ−Ｍ１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＤＡ−４６８）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−２３１）および３名の健常志願者の血液単核球（ＰＢＭＣ）のウエスタンブロット分析。  Ｂ：サイトケラチンおよびＣｙｒ６１に対する免疫細胞化学的二重染色による、健常ボランティアの血液（ＭＤＡ−２３１およびＢＣ−Ｍ１）および骨髄（ＭＤＡ−２３１）試料への細胞株の添加後のＣｙｒ６１検出。  Ｃ：乳癌患者のＣｙｒ６１検出ＤＴＣ。合成画像は、サイトケラチン、Ｃｙｒ６１およびＤａｐｉシグナルを重ね合わせたものである。単核細胞の濃縮は、フィコール密度遠心分離によって行った。顕微鏡倍率：４００倍。
【図３０】乳癌細胞および健常対照者からの細胞におけるシステインリッチ血管新生インデューサー６１（Ｃｙｒ６１）の分析。Ａ、Ｂ：免疫細胞化学的二重染色による、健常ボランティアの血液試料に乳癌細胞株ＢＣ−Ｍ１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＤＡ−４６８）およびＭＣＦ−７を添加したものにおけるＣｙｒ６１検出。全実験ｎ＝３。Ｃ：乳癌患者の末梢血の循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）におけるＣｙｒ６１検出。ＣＴＣの位置を矢印で標識する。合成画像は、サイトケラチン、Ｃｙｒ６１、ＤａｐｉおよびＣＤ４５（適用されている場合）シグナルを重ね合わせたものである。ＣＴＣ分析の詳細については、図１７を参照のこと。サイズに基づくＣＴＣ濃縮装置を用いて腫瘍細胞を単離した。顕微鏡倍率：４００倍。Ｄ：低酸素微小環境から十分に酸素を含有する血液の区画への腫瘍細胞播種のシミュレーション。細胞株を１％Ｏ2下で１４日間培養するか（１４日）、または１％Ｏ2下で１４日間培養して、続いて１０％Ｏ2下で４時間培養した（１４ｄ  ４時間）。Ｃｙｒ６１の応答をウエスタンブロットによって分析し（上）、定量的に分析した（下）。数値は、３回の独立した実験の平均値を示し、標準偏差は縦線のエラーバーにより示す。Ｃｙｒ６１はこの細胞株では検出されなかったので、ＭＣＦ−７中のＣｙｒ６１レベルは定量的に分析しなかった。Ｓ：標準的培養条件。
【図３１】患者６の血液試料からのＣＴＣにおけるＣｙｒ６１の検出（図２７Ｃ参照）。核をＤＡＰＩで染色し、ＣＤ４５を正常血液細胞に対する排除マーカーとし、汎サイトケラチンをＣＴＣ検出マーカーとして使用した。合成画像は、ＤＡＰＩ、ＣＤ４５、サイトケラチンおよびＣｙｒ６１チャネルを重ね合わせたものである。顕微鏡倍率は４００倍であった。
【図３２】表３：ＣＴＣにおけるＣｙｒ６１分析の詳細；実施例１１。
【図３３】乳癌患者（ｎ＝７８６）対健常女性（年齢＞５０歳、ｎ＝１２４）の血漿中のＣｙｒ６１レベルの感度および特異度の分析。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を、分析した全患者（Ａ）、ステージＴ１サブグループ（Ｂ）およびＤＣＩＳサブグループ（Ｃ）について示す。ＡＵＣ：曲線下面積。ＣＩ：信頼区間。
【実施例】
【００５４】
実施例１
実施例１は、続く実施例２〜１１で使用される材料および方法に対する概要を提供する。
【００５５】
材料および方法
患者。
Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｈａｍｂｕｒｇの倫理委員会によって承認が得られた後、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ  ｒｕｌｅｓに従ってヒトの試験を行った。あらゆる研究関連手順の前に、全患者から書面によるインフォームドコンセントを得た。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｈａｍｂｕｒｇ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙで治療を受けた乳癌の女性または健常対照者からの試料を使用した。ＣＴＣ分析のために、遠隔転移について陽性の乳癌患者から血液を採取した。血漿中のＣｙｒ６１検出のために、診断時に明白な転移の検出可能な徴候を示さなかった乳癌患者または転移性再発を有する患者からの血液を分析した。
【００５６】
骨髄検体。
健常ボランティアの前腸骨稜および後腸骨稜の両方から骨髄を両側で吸引した（１０ｍＬ／部位）。以下の手順は無菌条件下で行った。骨髄穿刺液をＨＢＳＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で洗浄し、ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＵＳＡ）中で希釈し、Ｆｉｃｏｌｌ  Ｐａｑｕｅ  Ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた密度遠心分離によって分離した。単核細胞を相間の層（ｉｎｔｅｒｐｈａｓｅ  ｌａｙｅｒ）から回収し、１０％ウシ胎児血清入りのＰＢＳ（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ  Ｈａｅｍｅｋ，Ｉｓｒａｅｌ）で２回洗浄した。骨髄単核細胞をガラススライド（Ｓｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  ｐｌｕｓ，Ｇｌａｓｗａｒｅｎｆａｂｒｉｋ  Ｋａｒｌ  Ｈｅｃｈｔ  ＫＧ，Ｓｏｎｄｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ；スライドあたり単核細胞７×１０5個）上に遠心分離することによって、サイトスピンを調製した。スライドを一晩風乾し、−８０℃で保存した。血液試料を、骨髄試料について記載のように処理し、スパイク実験（spiking experiments）については細胞株を健常個体の血液または骨髄に添加し、記載のように処理した。
【００５７】
細胞株および培養条件（標準的細胞培養条件）。
ＤＴＣ細胞株の培養は、基本的に記載のとおり行った（１１）。ＤＴＣ細胞株ＢＣ−Ｍ１（乳癌患者の骨髄から得られたもの）、ＬＣ−Ｍ１（肺癌患者の骨髄から得られたもの）、並びにＰＣ−Ｅ１およびＰＣ−Ｍ１（前立腺癌患者の骨髄から得たもの）の作製、認証および特性の詳細な概要が以前報告されている（１２）。細胞株の詳細な特徴付けについては、参考文献（１２、１１）を参照のこと。簡潔に述べると、５％二酸化炭素および１０％酸素の加湿環境にて３７℃でＤＴＣ細胞株を培養した。培養培地は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍｇ／Ｌインスリン、５．５ｍｇ／Ｌトランスフェリン（全て、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙより）、５０μｇ／Ｌ上皮増殖因子（ＥＧＦ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）および１０μｇ／Ｌヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂ−ＦＧＦ，Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を補給したＲＰＭＩ  １６４０であった。乳癌細胞株ＭＣＦ−７は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（ＭＤＡ−４６８）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−２３１）およびＢＴ−２０は、Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｅｐｐｅｌｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。乳癌細胞株Ｈｓ５７８ｔは、Ｔｈｏｍａｓ  Ｄｉｔｔｍａｒ氏（ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｔｔｅｎ／Ｈｅｒｄｅｃｋｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の厚意により提供された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＳＡ（１３）およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｂ０２（１４）の骨転移亜系統を１０％ＦＣＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミン入りのＤＭＥＭ中で培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  Ｂ０２は、Ｐｈｉｌｉｐｐｅ  Ｃｌｅｚａｒｄｉｎ氏、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＳＡは、Ｔｈｅｒｅｓａ  Ａ．Ｇｕｉｓｅ氏の厚意により提供された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ＢＲの（マウスにおける）脳転移性亜系統は、Ｆｒａｎｋ  Ｗｉｎｋｌｅｒ氏（Ｇｅｒｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｒｅ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の厚意により贈られ、ＭＤＡ−２３１に対して記載されるように培養した（以下参照）。
【００５８】
１０％ウシ胎児血清および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（全てＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより）を補給したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、ＭＤＡ−４６８、ＭＣＦ−７、ＰＣ−３、ＬＮＣＡＰ、Ｄｕ１４５、Ｈｓ５７８ｔ、ＭＤＡ−２３１、ＳＣＣ２５、Ｃａｌ２７およびＢＴ−２０を培養した。ＥｒｂＢ−２を過剰発現するＭＤＡ−４６８細胞（ＭＤＡ−４６８  ＥｒｂＢ−２）、挿入物なしの発現ベクターを有する対応するＧ４１８耐性対照細胞（ＭＤＡ−４６８対照）、および、Ｙ１２４８リン酸化部位を欠くＥｒｂＢ−２発現ベクターのＹＦ突然変異体（ＭＤＡ−４６８ＰＭ）［２３］を、培地に対して４００μｇ／ｍＬのＧ４１８を補充してＭＤＡ−４６８について記載のように培養した。細胞株は全て、加湿環境にて３７℃で培養した。ＲＰＭＩ中で培養した細胞株を５％ＣＯ2存在下で維持し、ＤＭＥＭ中で培養した細胞株は１０％ＣＯ2の存在下で維持した。ＤＴＣ細胞株を除き、残留ガス混合物は大気であった。この研究において、これらの細胞培養条件を「標準的細胞培養条件」と呼ぶ。細胞株の蘇生後６か月以内にタンパク質試料を作製した。
【００５９】
グルコース飢餓条件下または塩化コバルトの存在下、１％Ｏ2の存在下での細胞株の培養。
１％Ｏ2（低酸素）の存在下での細胞株の培養は、インキュベーターＨｅｒａｃｅｌｌ  １５（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）を用いて行った。酸素分圧はＮ2によって調整した。グルコース不含培地（Ｇｌｕ0）中で細胞株を培養した場合、ＤＭＥＭ、グルコース不含およびＲＰＭＩ、グルコース不含培地（両方ともＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した。１％Ｏ2の存在下でのグルコース飢餓実験のために、両条件を組み合わせた。他の培養条件は標準的培養条件と同じであった。ＨＩＦ−１αの安定化のために、細胞を１５０μＭの塩化コバルトとともに温置した。これらの実験に対して、他の全てのパラメーターは標準的細胞培養条件に対するものと同じであった。
【００６０】
ブレフェルジンＡ処理。
培養細胞中のＣｙｒ６１分泌を分析するためにブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）を適用した。ＢＦＡは、Ｍｅｒｃｋ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入し、１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＤＭＳＯに溶解させた（保存溶液）。次いで、各７５ｃｍ2細胞培養フラスコに対して５μｇ／ｍＬの最終濃度まで、ＦＣＳ不含の１２ｍＬの細胞培養培地中で保存溶液を希釈した。細胞を標準的細胞培養条件下でＢＦＡとともに１８時間温置した。対照細胞に対して、ＢＦＡ不含のＤＭＳＯを適用した。培地のタンパク質が溶解緩衝液（９．８Ｍ尿素、１５ｍＭ  ＥＤＴＡ、３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）中で溶解しなくなるまで、遠心分離工程を０℃で行った。培地を回収し、２０００×ｇで５分間遠心分離した。細胞ペレット（剥離細胞）を８ｍＬのＰＢＳで洗浄し、細胞を溶解緩衝液で溶解させ、以下のセクションに記載のように処理した。上清（細胞培養フラスコあたり１２ｍＬ）をウルトラスピン遠心装置（Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ４、１０，０００Ｄａ  ＭＷＣＯ、ＰＥＳメンブレン；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ−Ｓｔｅｄｉｍ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって２００μＬの体積に濃縮した。３ｍＬの溶解混合物を添加した後、上清を再び２００μＬの体積に濃縮した。ウエスタンブロット用の細胞回収について記載のように、細胞ペレットを回収した。３つの分画（剥離細胞、細胞溶解物および上清）を下記のようにウエスタンブロットに供した。ＢＦＡ実験のために、５０μｇのタンパク質をウエスタンブロットに適用した。
【００６１】
サイズに基づくＣＴＣ濃縮。
腫瘍細胞濃縮のために、マーカー非依存性分離装置（Ｐａｒｓｏｒｔｉｘ，ＡＮＧＬＥ  ＰＬＣ，Ｓｕｒｒｅｙ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を適用した。Ｐａｒｓｏｒｔｉｘシステムは、癌患者の血液からＣＴＣを捕捉するために、使い捨てカセット（細胞分離カセットｃｃ３Ｒ、Ｐａｒｓｏｒｔｉｘ）の形態でマイクロ流体技術を使用する。４ｍＬの血液をＢＤバキュテナー（ＢＤ  Ｂｅｌｌｉｖｅｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｅｓｔａｔｅ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）に回収した。血液はカセットを通して自動的に送られた。カセットは、他の血液成分と比較してサイズがより大きい（≧１０μｍ）ことに基づいてＣＴＣを濃縮する。バックグラウンドを減少させるために、カセットがＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で自動的に洗浄された。単離した腫瘍細胞を回収し、スライド（ＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓ）上でサイトスピンし、下記のように染色した。健常者の血液を用いた細胞株スパイク実験のために、新鮮な血液をＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｈａｍｂｕｒｇ−Ｅｐｐｅｎｄｏｒから受領した。乳癌患者からの臨床試料は、遠隔転移陽性の乳癌患者から採取した。
【００６２】
細胞株、血液および骨髄試料中の免疫細胞化学的Ｃｙｒ６１検出。
細胞株を健常対照者の血液または骨髄試料に添加した。骨髄検体の分析またはサイズに基づくＣＴＣ濃縮のために、記載のように試料を処理した。サイトケラチン特異的抗体カクテルと組み合わせて抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）を適用して免疫細胞化学的二重染色を行った。サイトケラチン抗体カクテルは、抗体ＡＥ１／ＡＥ３（マウスモノクローナル；ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）およびＣ１１（マウスモノクローナル；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ）からなる。個々の実験について述べた場合、ＡＥ１／ＡＥ３−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８およびＣ１１−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８の直接コンジュゲートを使用した。述べられる場合、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ）とカップリングされた抗ＣＤ４５抗体を使用して、正常血液細胞の検出を行った。
【００６３】
Ｅｐｉｍｅｔ−Ｋｉｔ（ＡＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ，Ｈｕｃｋｅｓｗａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からの新たに希釈した溶液Ｂ（１０ｍＬのＰＢＳ中１３５μＬの溶液Ｂ）とともに１０分間温置する前に、スライドを３０分間解凍した。ＰＢＳで３分間３回洗浄した後、細胞をＰＢＳ中の１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間透過処理した。さらなる洗浄工程の後に、ＡＢ−Ｓｅｒｕｍ（Ｂｉｏｔｅｓｔ，Ｄｒｅｉｅｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（ＰＢＳ中１０％）を用いて非特異的結合を２０分間ブロッキング処理した。Ｃｙｒ６１に対する一次抗体を１：５０希釈で添加し、室温で１時間温置した。希釈剤はＰＢＳ中１０％ＡＢ−Ｓｅｒｕｍであった。スライドをＰＢＳで３回再度洗浄し、Ａｌｅｘａ  ５４６またはＡｌｅｘａ  ５３２ウサギ抗マウス二次抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＵＳＡ）をＰＢＳ中の１０％ＡＢ血清中で１：２００希釈して４５分間適用した。ＰＢＳで３回洗浄した後、サイトケラチン特異的抗体を適用し、６０分間温置した。全ての場合において、希釈剤はＰＢＳ中１０％ＡＢ−Ｓｅｒｕｍであった。ＡＥ１／ＡＥ３  Ｃ１１抗体カクテルについては、希釈はＡＥ１／ＡＥ３の場合は１：７００であり、Ｃ１１は１：２００希釈した。ＰＢＳでの３回の洗浄工程によって、残留しているサイトケラチン特異的抗体を除去した。非コンジュゲートサイトケラチン特異的抗体を適用した場合、二次Ａｌｅｘａ  ４８８ウサギ抗マウス蛍光色素抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を１０％ＡＢ−Ｓｅｒｕｍ中１：２００希釈で添加し、４５分間温置した。さらなる洗浄工程（ＰＢＳで３回）の後、スライドをＤａｐｉ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ）を含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍで被覆した。一次抗体および二次抗体の代わりに希釈培地を用いて染色対照を並行して実行し、顕微鏡Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてスライドを手作業で評価した。
【００６４】
Ｃｙｒ６１組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）。
以下に記載のように免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色によって、臨床乳房腫瘍試料中のＣｙｒ６１のタンパク質発現を評価した。原発腫瘍におけるＣｙｒ６１発現分析に対して、乳癌組織マイクロアレイ（ＴＭＡ、参考文献［２４］参照）を使用した。ＴＭＡ生成のために、病理医によって選択され、３つの個別のアレイ上に配置された腫瘍の浸潤部分から０．６ｍｍのコアを採取した。ＴＭＡブロックから６μｍの切片を切り出した。組織学的タイプの評価およびグレード付けを含む術後診断は、全ホルマリン固定パラフィン包埋組織切片に対して病理学者が評価した。陰性対照として、並行切片で一次抗体を省略した。２４５個の腫瘍試料が評価の対象となり、そのうち１８２個の原発腫瘍について臨床病理学的データが利用可能であった。染色強度および陽性細胞のパーセンテージに基づく免疫反応性スコアを用いて、病理学者Ｓａｂｉｎｅ  ＲｉｅｔｈｄｏｒｆがＣｙｒ６１免疫染色を盲検的に評価した。各組織試料について、免疫染色された腫瘍細胞の割合を記録し、染色強度を３段階スケール（０、１、２）で推定した。次に、腫瘍を最初に、任意に事前に定められた基準に従って、非常に低い、強陽性および１つの中間群を含む３つの群に分類した。これらの群に対する正確な基準は次のとおりであった：０：非常に弱い（検出限界に近い、または全く染色なし）；１：中程度（（５０％の細胞において）１＋染色または（１０％の細胞）で２＋の染色）；２：強い：（＞５０％の細胞で１＋染色または＞１０％で２＋の染色）。臨床的および病理学的可変要素の分布における比較のための統計学的分析は、ピアソンのカイ二乗検定またはフィッシャーの直接確率検定を使用して調べた。０．０５未満のＰ値は統計学的に有意とみなした。臨床データは、最初の診断日から死亡まで、または最後のフォローアップまで評価した。統計学的分析は全て、ＳＰＳＳソフトウェアバージョン２１（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＵＳＡ）を用いて実施した。
【００６５】
Ｃｙｒ６１免疫組織化学染色。
ＴＭＡのＩＨＣ染色のために、抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）ウサギポリクローナル（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）を適用した。この抗体は前立腺癌でのＴＭＡ染色のために別のワーキンググループによって以前に適用された［３９］。乳癌患者の顕微鏡スライド上のパラフィン包埋標本を適用した。標本を６０℃で２時間温置し、続いて試料をそれぞれ１０分間、キシレン中で２回温置することによって、パラフィンワックスを除去した。キシレンを除去するために、スライドを９９％エタノール中で温置し、続いて９６％エタノール中および８０％エタノール中で温置した。各工程を２回行い、温置時間は各工程について２分間であった。水中での短時間の洗浄工程の後、試料をクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中で１２０℃にて５分間オートクレーブ処理した。その後、切片をＴＢＳＴで５分間すすいだ。ペルオキシダーゼ処理は、Ｄａｋｏ  ＲＥＡＬ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を用いて５分間行った。ＴＢＳＴでの短時間の洗浄工程の後、抗Ｃｙｒ６１抗体を適用した。Ｄａｋｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｄａｋｏ）を用いて１：７５０希釈で抗体を使用し、４℃で一晩温置した。続いて、ＴＢＳＴによる３分間の洗浄工程を３回行った。一次抗体の検出のために、製造元の説明に従って、ＤＡＫＯ  ＲＥＡＬ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎシステム  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ／ＤＡＢ（ＤＡＫＯ＃Ｋ５００１）からの標識されたポリマー−ＨＲＰおよび二次抗体を使用した。発色検出のために、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を適用した。短時間の洗浄工程後、核をヘマルム（ｈｅｍａｌｕｍ）染色（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって可視化した。標本を８０％エタノール中で温置し、続いて９６％エタノール、９９％エタノールおよびキシレン中で温置することによって乾燥させた。各工程はそれぞれ２分間２回行った。標本の保存には、Ｅｕｋｉｔｔ封入剤（Ｋｉｎｄｌｅｒ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。骨髄転移の染色はＴＭＡに対して記載のように行った。
【００６６】
細胞株中のビメンチンの免疫細胞化学的検出。
Ｅｐｉｍｅｔ−Ｋｉｔ（ＡＳ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｋ，Ｈｕｃｋｅｓｗａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）からの新たに希釈した溶液Ｂ（１０ｍＬのＰＢＳ中１３５μＬの溶液Ｂ）とともに１０分間温置する前に、スライドを３０分間解凍した。ＰＢＳで３分間３回洗浄した後、ＰＢＳ中１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１０分間、細胞透過処理を行った。別の洗浄工程の後に、ＡＢ−Ｓｅｒｕｍ（Ｂｉｏｔｅｓｔ，Ｄｒｅｉｅｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）（リン酸緩衝食塩水中１０％）を用いて非特異的結合を２０分間ブロッキング処理した。ビメンチンの検出のために、ウエスタンブロットに対しても使用した抗ビメンチン抗体（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ；マウスモノクローナルクローンＲＶ２０２）を適用した。抗ビメンチン抗体をＰＢＳ中１０％ＡＢ−Ｓｅｒｕｍで１：１００希釈し、６０分間温置した。希釈剤は、Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（ＤＡＫＯ）入りのＤａｋｏ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｉｌｕｅｎｔであった。二次抗体として、Ａｌｅｘａ  ５４６ヤギ抗マウス蛍光色素抗体をＰＢＳ中１０％ＡＢ−Ｓｅｒｕｍで１：２００希釈し、４５分間温置した。さらなる洗浄工程（ＰＢＳで３回）の後、Ｄａｐｉ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含有するＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ  Ｍｏｕｎｔｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍでスライドを被覆した。一次抗体および二次抗体の代わりに希釈培地を用いて染色対照を並行して実行し、顕微鏡Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてスライドを手作業で評価した。
【００６７】
ウエスタンブロットのための細胞回収および試料獲得。
細胞を３７℃予熱リン酸緩衝食塩水で３回洗浄し、７５ｃｍ2細胞培養フラスコあたり３００μＬの溶解緩衝液中で回収した。３つの同一工程（振幅１００％；１０秒）による超音波装置ＵＰ５０Ｈ（Ｈｉｅｌｓｃｈｅｒ，Ｔｅｌｔｏｗ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いた超音波処理によって細胞溶解物を氷上でホモジナイズし、室温で１時間温置した後、遠心分離し（１５，０００ｇ、室温で５分間）、上清を回収した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。次いで、細胞を溶解混合物中で温置し、超音波処理によってホモジナイズした。続いて、同量中、２５０μＬの試料および共沈剤（２−Ｄ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔの構成成分）あたり６００μＬの沈殿剤（２−Ｄ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔの構成成分、ＧＥ，Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いた沈殿によって、タンパク質を精製した（１７）。精製タンパク質を１００μＬの９．８Ｍ尿素中で溶解させ、室温で１時間可溶化した。
【００６８】
血漿試料からのタンパク質沈殿は、細胞株について以前に記載されたように実施した（３３）。沈殿したタンパク質を９．８Ｍの尿素中で溶解させた。
【００６９】
タンパク質濃度は、製造元の説明に従って、標準としてＢＳＡを使用して、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＵＳＡ）を使用して測定した。試料を−８０℃で保存した。試料の品質およびＢＣＡ試験結果の質は、コロイド状クーマシー染色ＳＤＳゲルによって確認した。染色手順は、Ｎｅｕｈｏｆｆに従って実施した（１８）。
【００７０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット。
１０％ポリアクリルアミド分離ゲルおよびＬａｅｍｍｌｉ緩衝液系を用いて、Ｎｏｖｅｘ  ＸＣｅｌｌ  Ｓｕｒｅ−Ｌｏｃｋミニシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）またはＰｒｏｔｅａｎ  ＩＩ  ｘｉ細胞（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＵＳＡ）によってタンパク質分離を行った。試料をＳＤＳ試料緩衝液中で希釈し、９５℃で５分間熱変性させ、ゲル上に載せた。分子サイズ標準は、ｐｅｑＧＯＬＤタンパク質マーカーＶ（Ｐｅｑｌａｂ，Ｅｒｌａｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）であった。ウエスタンブロット分析のために、他に特定される場合を除いて、試料あたり４０μｇのタンパク質を適用した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、タンパク質をＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−ＰSQ膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＧｍｂＨ，Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に移した。タンクブロット転写ユニット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を備えたｍｉｎｉＶＥ垂直電気泳動システムを用いてタンクブロットによりタンパク質を転写した。「ウエスタンブロットのために使用する抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）」のセクションに記載される希釈液を使用して、製造元の説明に従って一次抗体を適用した。供給元からの実行可能な情報が利用可能でなかった場合、膜をＴＢＳＴ（ブロッキング緩衝液）中５％低脂肪粉乳（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）とともに１時間穏やかに撹拌しながらブロッキング処理した。これらの場合、一次抗体をブロッキング緩衝液中で希釈し、一晩穏やかに撹拌しながら４℃で膜に適用した。西洋ワサビペルオキシダーゼと複合化した適切な二次抗体（全てＤＡＫＯ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を個々の実験に対するシグナル強度に応じて１：５００〜１：１０，０００希釈で使用した。全ての二次抗体をブロッキング緩衝液で希釈した。製造元の指示に従って、ＥＣＬ  Ｐｒｉｍｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔｔｉｎｇ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＲｅａｇｅｎｔおよびＸ線フィルム（両方ともＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してバンドを可視化した。ＧＳ−７００画像デンシトメーター（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いてＸ線フィルムをデジタル化した。デンシトメトリー分析は、Ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｏｎｅソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行った。各反応は生物学的三つ組（in biological triplicates）で行った。以下のストリッピング緩衝液を用いて膜をストリッピングした：７．５６ｇのトリス、２０ｇのＳＤＳ、７．８ｇの２−メルカプトエタノール、ＨＣｌ用いてｐＨ９．５に調整、１リットルになるまでＨ2Ｏ。使用前に、０．１ｇのＤＴＴを２５ｍＬのストリッピング緩衝液に添加した。穏やかに撹拌しながら、膜を室温で１時間温置した。ＴＢＳＴで洗浄した後、膜をブロッキング緩衝液とともに１時間温置し、異なる一次抗体を適用した。
【００７１】
ウエスタンブロットのために使用する抗体。
抗体は以下の供給業者から購入した：抗ＡＥ１／ＡＥ３抗体、マウスモノクローナル、希釈率１：１０，０００。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＵＳＡ：抗インテグリンαｖ（ＣＤ５１）、マウスモノクローナル、クローンＣｌｏｎｅ  ２１／ＣＤ５１、希釈率１：５００。ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｅｒｅｍｂｏｄｅｇｅｍ，Ｂｅｌｇｉｕｍ：抗ビメンチン抗体、マウスモノクローナルクローンＲＶ２０２、希釈率１：５，０００。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＵＳＡ：抗アルファチューブリン（１１Ｈ１０）抗体、ウサギモノクローナル、希釈率１：１０，０００。抗ＢｉＰ（Ｃ５０Ｂ１２）抗体、ウサギモノクローナル（ＢｉＰはＧｒｐ７８に対する同義語である）、希釈率１：１，０００。抗Ｃｙｒ６１抗体、ウサギポリクローナル、希釈率１：１，０００（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｈｓ５７８ｔ、ＢＣ−Ｍ１、ＬＣ−Ｍ１）他の細胞株１：５００。抗ＨＩＦ−１α（Ｄ２Ｕ３Ｔ）、ウサギモノクローナル、希釈率１：１，１０００。抗ラミンＡ／Ｃ抗体、ウサギポリクローナル、希釈率１：１０００。抗ＰＤ−Ｌ１（Ｅ１Ｌ３Ｎ）抗体、ウサギモノクローナル、希釈率１：１０００。抗インテグリン抗体は、抗インテグリンαｖを除いて、インテグリン抗体サンプラーキット（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）から得た。適用した希釈液は、抗インテグリンα５：１：１，０００、インテグリンβ４（Ｄ８Ｐ６Ｃ）ＸＰ１：１，０００、インテグリンα４（Ｄ２Ｅ１）ＸＰ１：５００、インテグリンβ１（Ｄ２Ｅ５）１：２，０００、インテグリンβ３（Ｄ７Ｘ３Ｐ）ＸＰ１：２，０００、インテグリンβ５（Ｄ２４Ａ５）１：１，０００。
【００７２】
Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ：抗ＥｒｂＢ−２抗体、マウスモノクローナル（クローンＣＢ１１）、希釈率１：５００。抗ＣＸＣＲ４抗体、ウサギポリクローナル、希釈率１：４，０００。ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ：抗インテグリンαｖ抗体、マウスモノクローナル（クローン２１／ＣＤ５１）、希釈率１：５００。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：抗ＡＫＴ抗体、ウサギポリクローナル、希釈率１：５，０００。抗ホスホＡＫＴ抗体（Ｓｅｒ４７３）、ウサギモノクローナル（クローン１９３Ｈ１２）、希釈率１：５００。抗αチューブリン抗体、ウサギモノクローナル（クローン１１Ｈ１０）、希釈率１：１０，０００。抗ＢｉＰ抗体、ウサギモノクローナル（クローンＣ５０Ｂ１２）（ＢｉＰはＧｒｐ７８に対する同義語である）、希釈率１：１，０００。抗Ｃｙｒ６１抗体、ウサギポリクローナル、希釈率１：１，０００（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｈｓ５７８ｔ、ＢＣ−Ｍ１、ＬＣ−Ｍ１）他の細胞株１：５００。抗ＥＧＦ受容体抗体、ウサギモノクローナル（クローンＤ３８Ｂ１）、希釈率１：１，０００。抗ＨＩＦ−１α、ウサギモノクローナル（クローンＤ２Ｕ３Ｔ）、希釈率１：１，０００。抗インテグリンα５抗体、ウサギポリクローナル、希釈率１：１，０００。抗インテグリンβ４抗体、ウサギモノクローナル（クローンＤ８Ｐ６Ｃ）、希釈率１：１，０００。抗インテグリンα４抗体、ウサギモノクローナル（クローンＤ２Ｅ１）、希釈率１：５００。抗インテグリンβ１抗体、ウサギモノクローナル（クローンＤ２Ｅ５）、希釈率１：２，０００。抗インテグリンβ３抗体、ウサギモノクローナル（クローンＤ７Ｘ３Ｐ）、希釈率１：２，０００。抗インテグリンβ５抗体、ウサギモノクローナル（クローンＤ２４Ａ５）、希釈率１：１，０００。抗ラミンＡ／Ｃ抗体、ウサギポリクローナル、希釈率１：１，０００。抗ＰＤ−Ｌ１抗体、ウサギモノクローナル（クローンＥ１Ｌ３Ｎ）、希釈率１：２，０００。Ｅｐｉｔｏｍｉｃｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ：抗Ｅカドヘリン抗体、ウサギモノクローナル（クローンＥＰ７００Ｙ）、希釈率１：２０，０００。Ｍｅｒｃｋ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ），Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ：抗ｃ−ＥｒｂＢ−２／ｃ−Ｎｅｕ（Ａｂ−３）抗体、マウスモノクローナル（クローン３Ｂ５）、希釈率１：４，０００。Ｍｉｃｒｏｍｅｔ，Ｍｕｎｉｃｈ．Ｇｅｒｍａｎｙ：抗汎サイトケラチン抗体、マウスモノクローナル（クローンＡ４５／ＢＢ３）、希釈率１：１０，０００。Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＵＳＡ：抗Ｎ−カドヘリン抗体、ウサギモノクローナル（クローンＥＰＲ１７９２Ｙ）、希釈率１：１０，０００。Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ：抗ＥＧＦＲ（１００５）抗体、ウサギポリクローナル、希釈率１：５，０００。抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）、ウサギポリクローナル、希釈率１：１，０００（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７、ＰＢＭＣ）または１：１０，０００（他の全ての細胞株）。抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ２）、マウスモノクローナル��希釈率１：１，０００（ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＣＦ−７）または１：１０，０００（他の全ての細胞株）。
【００７３】
細胞培養中のアミノ酸による安定同位体標識（ＳＩＬＡＣ）。
タンパク質発現プロファイルの分析のために、乳癌細胞株ＭＤＡ−４６８およびＢＣ−Ｍ１を選択し、他に特定したものを除いて、標準的細胞培養条件について記載のように培養した。他に記載がなければ、Ｐｉｅｒｃｅ  ＳＩＬＡＣ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）からの指示に従った。ＤＭＥＭ以外、ＲＰＭＩは、プロリンおよびヒドロキシプロリンを含有し、培地にプロリンを人工的に添加することなく、プロリンが誤って標識される可能性が避けられるので、タンパク質標識のためにＢＣ−Ｍ１を選択した。ＳＩＬＡＣの場合はＢＣ−Ｍ１  ＲＰＭＩ培地を、およびＳＩＬＡＣの場合はＭＤＡ−４６８  ＤＭＥＭ培地を使用し、１０％透析ウシ胎児血清（全てＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙより）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補給した。ＲＰＭＩに、１０ｍｇ／Ｌのインスリン、５．５ｍｇ／Ｌのトランスフェリン（両方ともＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより）、５０μｇ／ＬのＥＧＦおよび１０μｇ／Ｌのｂ−ＦＧＦ（両方ともＭｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）をさらに補給した。13Ｃ6−アルギニン−ＨＣｌおよび13Ｃ6−リジン−２ＨＣｌ（両方ともＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を１００ｍｇ／Ｌ  ＲＰＭＩの濃度で用いてＢＣ−Ｍ１のタンパク質を標識した。ＭＤＡ−４６８用のＤＭＥＭには、アルギニン−ＨＣｌおよびリジン−２ＨＣｌ（両方ともＰｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を補給した。滅菌濾過後にアミノ酸を培地に添加した。以下、これらの培地をＳＩＬＡＣ培地（重および軽）と呼ぶ。顕微鏡による細胞の形態学的分析によって、７代の継代まで（それが±１８日であることを含む）標準的細胞培養条件下で培養した細胞と比較して、ＳＩＬＡＣ培地中で培養した細胞の検出可能な形態変化は明らかにならなかった。
【００７４】
質量分析のための分取用試料調製。
タンパク質の分取用標識化のために、標準条件下で７５ｃｍ2細胞培養フラスコ中のＳＩＬＡＣ培地中で３代にわたり細胞を継代培養した。細胞増殖に応じて、２〜３日ごとに１：３または１：４の比率で細胞を分割した。異なる日付に培養した、それぞれが３代の継代の４本のフラスコを分析した。以下のプロトコールは１つのフラスコについて記載する。ウエスタンブロットに対して記載のように細胞回収を行い、細胞を４００μＬの溶解混合物（８Ｍ尿素／１５ｍＭ  ＥＤＴＡ／３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ）中で溶解させた。超音波装置ＵＰ５０Ｈ（３回の同一工程（振幅１００％；１０秒））を用いた超音波処理によって溶解物をホモジナイズ処理した。その後、室温で１時間試料を温置することによってタンパク質を溶解させ、続いて遠心分離（室温で１２，０００ｇ、５分間）し、上清を回収した。その後、試料に０．０５容量の１Ｍ  ＤＴＴ／１Ｍ  Ｔｒｉｓを補給し、激しく振盪しながら５６℃で２０分間温置した。ＤＴＴはまた、尿素からのイソシアネートイオンの潜在的形成に対する捕捉剤としても機能した。ＳＨ基の不可逆的遮断は、最終濃度２００ｍＭまでのＩＡＡの添加により実施した。２Ｍ  Ｔｒｉｓを用いてｐＨ値をｐＨ９．５に調整した。次に、試料を室温で温置し、激しく振盪しながら３０分間遮光した。その後、沈殿剤と同量で、５００μＬの試料および共沈剤（２−Ｄ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔの構成成分）あたり１．２ｍＬの沈殿剤（２−Ｄ  Ｑｕａｎｔ  Ｋｉｔ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅの構成成分）を用いた沈殿によって、タンパク質を精製した（１７）。タンパク質を遠心分離（１６，０００ｇで５分間）によりペレット化し、８０％アセトン中の１ｍＬの８０ｍＭトリスで洗浄した。１ｍＬの８０ｍＭアセトンでのさらなる洗浄工程によって残留汚染物質を除去した。精製タンパク質を１００μＬの９．８Ｍ尿素中で溶解させ、室温で１時間可溶化した。これに続いて、ＢＣＡ試験を用いてタンパク質濃度を測定した。試料を９容量の１００ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3  ｐＨ８．３で希釈した。試料のタンパク質２０μｇあたり１μｇのトリプシンを添加することにより、タンパク質をトリプシン（トリプシンシークエンシンググレード、Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって消化した。その後の分析のために、各細胞株（ＭＤＡ−４６８およびＢＣ−Ｍ１）のタンパク質３８０μｇを１：１の比率で合わせた。その後、試料を激しく振盪しながら３７℃で一晩温置した。
【００７５】
ペプチド脱塩。
トリプシン消化後、逆相カートリッジ（Ｏａｓｉｓ  ＨＬＢ  Ｐｌｕｓ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ，２２５ｍｇ、６０μｍ、Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を用いてペプチドを脱塩した。カートリッジを３ｍＬの１００％メタノール（ＭｅＯＨ）で調整し、５ｍＬシリンジを用いて３ｍＬの０．２％ギ酸（ＦＡ）、５％ＭｅＯＨ（洗浄緩衝液、ＨＰＬＣ−Ｈ2Ｏ中で溶解）で平衡化した。トリプシンペプチドを１ｍＬの洗浄緩衝液中で溶解させ、１ｍＬシリンジを使用してカートリッジ上に載せた。載せた後、カートリッジを３ｍＬの洗浄緩衝液で洗浄し、３ｍＬシリンジを用いて１．５ｍＬの６０％ＭｅＯＨでペプチドを溶出した。スピードバックを用いて溶出液を蒸発させた。
【００７６】
ＯＦＦＧＥＬ分画化。
ＯＦＦＧＥＬ分画装置（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，３１００  ＯＦＦＧＥＬ分画装置、Ｗａｌｄｂｒｏｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してそれらの等電点に従って脱塩ペプチドを分画化した。等電点電気泳動（ＩＥＦ）に対して、２４ウェル設定および直線的勾配ｐＨ４〜７、２４ｃｍを有するＩＰＧストリップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｕｎｉｃｈ）を使用した。試料を３ｍＬのローディング緩衝液（２０％ＭｅＯＨ、１％ＩＰＧ緩衝液［ｐＨ４〜７］、ＨＰＬＣ−Ｈ2Ｏ中で溶解）中で溶解させ、１５０μＬの試料体積を各ウェルに添加した。フォーカシングプロセス中の分画を乾燥から保護するために、試料なしの１００μＬローディング緩衝液を分画１および２４に添加した。分画２および２３に対して、５０μＬのローディング緩衝液を添加した。ＩＥＦは、５０μＡの最大電流および合計５０ｋＶｈが達成されるまで３００Ｖ〜２５００Ｖの範囲の典型的な電圧で行った。ＩＥＦの後、分画を回収し、スピードバックシステムを用いて乾燥させた。
【００７７】
ナノＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ分析。
質量分析は、ナノＵＰＬＣ（ｎａｎｏＡｃＱＵＩＴＹ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を備えたＱＴＯＦ質量分析計（ＱＴＯＦ  Ｐｒｅｍｉｅｒ，Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ／Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）で行った。ＱＴＯＦ測定のために、濃縮試料を３０μＬの０．１％ＦＡ中で溶解させ、４μＬを捕捉カラム（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ｃｏｌｕｍｎ，Ｃ１８，１８０μｍ×２０ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）に載せた。捕捉後、捕捉カラムを２％ＡＣＮ、０．１％ＦＡ（５μＬ／分）で５分間洗浄した。ペプチドを分離カラム（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣカラム、ＢＥＨ  １３０  Ｃ１８，Ｗａｔｅｒｓ；１００μｍ×１００ｍｍ、５００ｎＬ／ｍｉｎ、勾配：Ａ、ＨＰＬＣ−Ｈ2Ｏ中０．１％ギ酸；Ｂ、アセトニトリル中０．１％ギ酸、８７分で２〜５０％Ｂ）に溶出させた。スプレーは、陽イオンモードにおいて、１５２０Ｖのキャピラリー電圧、１００℃のイオン源温度および４０Ｖのコーン電圧で、溶融石英エミッタ（Ｉ．Ｄ．１０μｍ，Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＵＳＡ）から生成させた。データはデータ依存性取得モード（ＤＤＡ）で記録した。ＭＳサーベイスキャンは、スキャン時間０．６秒およびスキャン間遅延０．０５秒で、４００〜１５００のｍ／ｚ範囲にわたり行った。断片化のために、３つの最も多いシグナルを使用した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、３．２秒のスキャン時間および１５〜３５ｅＶの衝突傾斜（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｒａｍｐ）で１００〜１５００ｍ／ｚから得た。多重断片化（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）事象を防ぐためにオンライン排除（ｏｎｌｉｎｅ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ）を使用した（排除時間：６０秒、排除ウィンドウ：＋／−０．１ｍ／ｚ）。較正のために、２２ｅＶの衝突エネルギーを用いて１００〜１５００のｍ／ｚ範囲にわたってロックスプレースペクトルを１０秒ごとに記録した（１ｐＭｏｌ／μＬ［Ｇｌｕ１］フィブリノペプチドＢ（Ｓｉｇｍａ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ））。
【００７８】
以下の変更を加えて、定方向Ｃｙｒ６１ペプチドナノＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ／ＭＳ分析を上記のように行った。ペプチドを分離カラム（ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣカラム、ＢＥＨ  １３０  Ｃ１８，Ｗａｔｅｒｓ；７５μｍ×２００ｍｍ、２００ｎＬ／ｍｉｎ、勾配：Ａ、ＨＰＬＣ−Ｈ2Ｏ中０．１％ギ酸；Ｂ、アセトニトリル中０．１％ギ酸、８７分で２〜５０％Ｂ）上で溶出させた。ＭＳサーベイスキャンは、スキャン時間０．６秒およびスキャン間遅延０．０５秒で、４００〜１５００のｍ／ｚ範囲にわたり行った。断片化のために、２つの最も多いシグナルを使用した。ＭＳ／ＭＳスペクトルは、０．９５秒のスキャン時間および２０〜３２ｅＶの衝突傾斜（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｒａｍｐ）で１００〜１５００ｍ／ｚから得た。Ｃｙｒ６１検出のために包含リストを使用した：ｍ／ｚ１１８０．６３８９（＋／−０．１Ｄａ）、保持時間：４１７４．８秒（＋／−９０秒）、スキャン時間：４．９５秒、スキャン間遅延：０．０５秒、衝突傾斜（ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ  ｒａｍｐ）：２０〜３２ｅＶ。
【００７９】
ペプチドの同定。
ペプチド同定のために、生スペクトルを平滑化し（サビツキー・ゴーレイ法、平滑窓チャネル：３、平滑数：２）、中央に置いて（ピーク値の半分の最小ピーク幅：４、セントロイド：８０％まで）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．５．２（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＵＫ）を用いてロックマス補正した。結果のピークリストをｍｚＭＬファイルとしてエクスポートした。ＯｐｅｎＭＳ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ  Ｐｉｐｅｌｉｎｅ（ＴＯＰＰ）（１９）で、オープンソースのソフトウェアパッケージＯｐｅｎＭＳ（２０）の一部であるグラフィカル・ユーザ・インタフェースＴＯＰＰＡＳを使用して同定を行った。以下のパラメーター：前駆体の質量許容差を３５ｐｐｍに設定し、フラグメントの質量許容差を０．１Ｄａに設定し、２つの異なる検索エンジン（オープン質量分析検索アルゴリズム（ＯＭＳＳＡ）（２１）、ＸＴＡＮＤＥＭ（２２）を用いて、ヒトデコイデータベース（ユニプロット、タンパク質知識ベース（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ）、ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）に対してｍｚＭＬファイルを検索した。さらに、切断の失敗を１回許容し、メチオニンの酸化、システイン上のカルバミドメチル化、ならびにリジンおよびアルギニンの両方上の13Ｃ6標識を可変修飾とみなした。その後、ＩＤＰｏｓｔＥｒｒｏｒＰｒｏｂａｂｉｌｉｔｙツールを用いて事後エラー確率を推定し、コンセンサスＩＤツールを用いて２つの検索エンジンからのペプチド同定に基づいてコンセンサス・アイデンティフィケーション（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を計算した（２３）。ＦａｌｓｅＤｉｓｃｏｖｅｒｙＲａｔｅツールを用いて、ｑ値を計算し、正しいペプチド同定のための閾値をｑ値０．０５に設定した。最後に、ペプチド同定ファイルをｉｄＸＭＬ−ファイルとしてエクスポートした。
【００８０】
ＳＩＬＡＣの定量化。
ＳＩＬＡＣ定量化のために、ｍａｓｓＷｏｌｆファイルコンバーターを用いて生データファイルをプロファイルモードでｍｚＸＭＬファイルに変換した。ＴＯＰＰＡＳを用いてシグナル処理を行った（１９）。ＦｉｌｅＣｏｎｖｅｒｔｅｒツールを使用して、最初のｍｚＸＭＬファイルをｍｚＭＬファイルに変換した。その後のデータ処理のために、ｍｚＭＬファイルをＦｉｌｅＦｉｌｔｅｒツールでフィルタリングした（ＭＳ１レベルのみ、ｒｔ−範囲［ｓ］：１８００−５０００）。ＮｏｉｓｅＦｉｌｔｅｒＳＧｏｌａｙ（フレーム長：１３、多項式次数：４）を用いて、フィルタ処理した生データを平滑化した。以下のパラメーターを使用し、ＳＩＬＡＣＡｎａｌｙｚｅｒツールを用いて、ＳＩＬＡＣペアを同定および定量した。保持時間閾値を５０秒に設定し、５カウントの強度カットオフを使用した。強度相関を０．６に設定し、２．５のモデル偏差を考慮した。ＳＩＬＡＣＡｎａｌｙｚｅｒにより考慮されるために、ペプチドは少なくとも３つの同位体ピークおよび最大７つの同位体ピークを必要とした。標識は、リジンおよびアルギニンについては13Ｃ6に設定し、検出に対して、１つの誤切断を許容した。結果はコンセンサスＸＭＬファイルとしてエクスポートした。同定したペプチドのデータセットは、ｉｄＸＭＬファイルとして扱い、ＩＤＭａｐｐｅｒツールを使用して対応するＳＩＬＡＣペアと照合し、ｃｓｖファイルとしてエクスポートした。ＣＳＶファイルをＭａｔｈｅｍａｔｉｃａにロードした。各ＳＩＬＡＣペアについて、軽ペプチドの強度を重ペプチドの強度で割ることによって比率を計算した。ペプチド比は、それらが割り当てられたタンパク質によって分類し、ペプチドの平均比はタンパク質比として使用した。
【００８１】
データ分析のために、単一のタンパク質（ユニークペプチド）に適合するペプチド同定のみを考慮した。タンパク質は、４つの生物学的複製物のうち少なくとも３つにおいて特有のペプチドが検出された場合にのみさらに分析した。ＫまたはＲで終わらなかったタンパク質のＣ末端由来のペプチドは手作業で除外した。１つのタンパク質について検出された全ペプチドの平均値および標準偏差を計算した。示差的に発現したと考えられるタンパク質は、ｐ＜０．０５の統計学的有意性を有する倍数変化に関して２．０の値を超えなければならない（スチューデントのｔ検定）。
【００８２】
細胞計数による増殖速度の測定。
増殖速度を測定するために、腫瘍細胞を最初に標準条件下にて６ウェルプレート中で培養した。１ウェルあたり１５，０００〜２５，０００個の細胞を用い、１日間増殖させた。開始細胞数の測定のために、１つのウェルの細胞数を以下のように測定した。細胞をトリプシン処理によって剥離させ、死滅細胞を同定するために生体染色トリパンブルーを使用してＮｅｕｂａｕｅｒ計数チャンバーに移した。細胞数を９つの正方形について測定し、ウェルあたりの細胞数をこれらの値について計算した。得られた細胞数を個々の実験に対する開始細胞数（ｔ＝０時間）の値とした。細胞をさらなるウェル中で並行して培養し、細胞培養のセクションに記載のように処理した。適切な時点の後、細胞を回収し、記載のように計数した。生物学的複製物は、独立した実験において同じ方法で実施した。
【００８３】
グルコース飢餓下の細胞の形態学的分析は、顕微鏡Ａｘｉｏｖｅｒｔ２５（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ）を用いて行った。
【００８４】
酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）。
試料調達：健常対照者または乳癌患者の血漿は、新鮮血液試料を２５００×ｇで１５分間遠心分離することによって得た。細胞培養上清を２５００×ｇで１５分間遠心分離することにより清澄化した。細胞株の全細胞溶解物については、細胞をＬＰＩＰ緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ＮＰ４０、１０％グリセロール）で溶解させ、細胞溶解物を適切な希釈液中で適用した。希釈剤はＰＢＳであった。血漿および細胞培養上清の場合、１００μＬの未希釈試料体積を適用した。組み換えヒトＣｙｒ６１タンパク質は、Ａｂｎｏｖａ（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）から購入した。タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて測定した。
【００８５】
腫瘍細胞試料中のＣｙｒ６１の検出のために、ＥＬＩＳＡを確立した。ピペッティング工程は１００μＬのマルチチャネルピペットを用いて行った。まず、９６ウェルプレート（９６ウェルプレート平底、ｃｏｓｔａｒ，Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を抗Ｃｙｒ６１抗体（抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）ウサギポリクローナル、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）でコーティングした。抗Ｃｙｒ６１抗体をＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で３μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、２５μＬの希釈抗体を各ウェルに添加した。プレートを４℃で一晩温置した。未結合抗体を除去するために、ウェルを１００μＬの体積で３回洗浄した。最初にウェルをＰＢＳで洗浄し、続いて０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０入りのＰＢＳ（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２工程行った。次に、ウェルあたり３０μＬのブロッキング緩衝液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ入りのＰＢＳ中５％脱脂粉乳［Ｒｏｔｈ］）を用いて、ブロッキング緩衝液で２時間、室温にてブロッキング処理を行った。これに続いて、１００μＬの体積を用いて３回の洗浄工程を行った。最初にウェルをＰＢＳで洗浄し、続いて０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０入りのＰＢＳを用いて２工程行った。試料中のＣｙｒ６１検出のために、１００μＬの試料体積を各ウェルに添加し、室温で２時間温置した。次に、上記のように３回の洗浄工程でウェルを洗浄した。二次抗体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ−ＡＰ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をブロッキング緩衝液で１：３，０００希釈し、その希釈液３０μＬを各ウェルに添加した後、室温で１時間温置した。記載のように、３回の洗浄工程でウェルを洗浄した。１００μＬの予め温めた基質溶液（パラ−ニトロフェニルホスフェート一成分マイクロウェル基質溶液、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＵＳＡ）を各ウェルに添加した後、反応物を暗所で室温にて３０分間温置した。１５μＬの３Ｎ  ＮａＯＨを添加することにより反応を停止させた。ＥＬＩＳＡリーダー（ＮａｎｏＱｕａｎｔ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ｐｒｏ，Ｔｅｃａｎ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて４０５〜６２０ｎｍで試料を分析した。患者群間のＣｙｒ６１レベルの統計学的分析は、プログラムＯｒｉｇｉｎＰｒｏ  ８．０（Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ，ＵＳＡ）を用いて一元配置ＡＮＯＶＡ検定で行い、ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【００８６】
サンドイッチＥＬＩＳＡに対するＣｙｒ６１  ＥＬＩＳＡの改変が最近確立され、以下のように実施した。アッセイは、Ｆ８マキシソープ・ルーズ・ストリップ（ｍａｘｉｓｏｒｐ  ｌｏｏｓｅ  ｓｔｒｉｐｅｓ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）で行った。抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）をＰＢＳ中で６μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、２５μＬの希釈抗体を各ウェルに添加した。アッセイを４℃で一晩温置した。次に、ウェルを１００μＬのＰＢＳで洗浄し、１００μＬの０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０入りのＰＢＳ（Ｒｏｔｈ）で２回洗浄した。続いて、１ウェルあたり３０μＬを用いてウェルをブロッキング緩衝液でブロッキング処理し、室温で２時間温置した。ウェルを１００μＬのＰＢＳで再度洗浄し、１００μＬの０．０２％Ｔｗｅｅｎ  ２０入りＰＢＳ（Ｒｏｔｈ）で２回洗浄した。その後、１００μＬの試料、例えば未希釈血漿を各ウェルに添加し、室温で２時間温置し、続いて記載のように３回の洗浄工程を行った。検出抗体として、Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）の抗Ｃｙｒ６１抗体、マウスモノクローナル（クローン３６５１０８）を使用した。この抗体をＰＢＳ中で３０μｇ／ｍＬの濃度に希釈し、２５μＬの希釈物を各ウェルに適用し、続いて４℃で一晩温置した。記載のように、未結合抗体を３回の洗浄工程により除去した。二次抗体として、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｐ０４４７，Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と結合したポリクローナルヤギ抗マウス抗体をブロッキング緩衝液で１：２５０に希釈し、３０μＬの希釈物を各ウェルに適用した。二次抗体を室温で１時間温置した。記載のようにアッセイを３回洗浄した。基質として、１００μＬのＴＭＢ一成分ＨＲＰマイクロウェル基質（Ｅ１０２，Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＵＳＡ）を各ウェルに添加した。１５分間遮光して温置し、続いて１００μＬの１Ｎ硫酸を添加して反応を停止させた。ＥＬＩＳＡリーダーＮａｎｏＱｕａｎｔ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ｐｒｏを用いて４５０ｎｍでの吸光度を検出した。
【００８７】
免疫沈降。
免疫沈降によるＣｙｒ６１の分析のために、１〜２×１０7個の細胞を適用した。細胞回収後、細胞を４℃で１５分間、１４５０ｒｐｍでペレット化した。上清を廃棄し、細胞をＰＢＳで洗浄し、遠心分離によりペレット化した。細胞溶解のために、１００μＬのＬＰＩＰ緩衝液、５μＬの５Ｍ塩化ナトリウムおよび１０５μＬの水を細胞ペレットに添加した。ホモジナイズ後、試料を４℃で５分間温置し、続いて４℃で１５分間１０，０００×ｇで遠心分離した。ペレットを廃棄した。
【００８８】
次に、４００μＬのＬＰＩＰ緩衝液を各チューブに添加した。Ｃｙｒ６１の沈殿のために、２０μＬの抗Ｃｙｒ６１抗体（抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）ウサギポリクローナル、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を適用した。ＩｇＧ対照アッセイのために、１０μＬの正常ウサギＩｇＧ−Ａ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用した。試料を４℃にてローテータ中で温置した。３時間の温置後、２５μＬのビーズ（プロテインＡセファロース、ＣＬ−４Ｂ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を各アッセイに添加し、さらに１時間４℃でローテータ上で温置した。その後、各アッセイにつき１ｍＬのＬＰＩＰ緩衝液を用いてビーズ−抗体コンジュゲートを洗浄し、続いて４℃で２，０００ｒｐｍで遠心分離した。洗浄を４回繰り返した。５０μＬの試料緩衝液および５μＬの還元剤（ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳ試料緩衝剤４Ｘ、ＮｕＰＡＧＥ試料還元剤１０Ｘ両者ともＧｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を試料に添加し、続いてサーモサイクラー中で７０℃にて温置することによって抗体を切断した。４℃、２０００ｒｐｍで１分間スピンダウンした後、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、ＸＣｅｌｌ  ＳｕｒｅＬｏｃｋ  Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ  １ユニット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＵＳＡ）、ＴｒｕＰａｇｅプレキャストゲル４〜１２％、１２ウェル、およびＴｒｕＰＡＧＥ  ＴＥＡ−トリシンＳＤＳランニング緩衝液（両方ともＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して実施した。製造元の説明に従い、ＸＣｅｌｌ  ＩＩブロットモジュール（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）によって、Ｐｒｏｔａｎニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にタンパク質を転写した。１：５００希釈でＲ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）の抗Ｃｙｒ６１抗体、マウスモノクローナル（クローン３６５１０８）を使用して、Ｃｙｒ６１を検出した。
【００８９】
改良酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）。
試料調達：健常対照者または乳癌患者の血漿は、新鮮血液試料を２５００×ｇで１５分間遠心分離する細胞培養上清を２５００×ｇで１５分間遠心分離することにより清澄化した。細胞株の全細胞溶解物については、細胞をＬＰＩＰ緩衝液（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ＮＰ４０、１０％グリセロール）で溶解させ、細胞溶解物を適切な希釈液中で適用した。希釈剤はＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。血漿試料の場合には、２．５μＬの試料体積を適用した。組み換えヒトＣｙｒ６１タンパク質は、Ａｂｎｏｖａ（Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）から購入した。タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを用いて測定した。
【００９０】
ピペッティング工程は、ＴＣ−Ｐｌａｔｔｅｓ  ９６  Ｗｅｌｌ，Ｓｔａｎｄａｒｄ，Ｆ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を用いて１００μＬのマルチチャンネルピペットを用いて行った。ウェルのコーティングのために、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の抗Ｃｙｒ６１抗体Ｈ２を適用した。抗体を１０％ＦＣＳ入りのダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）で１：２５０希釈し、３５μＬの希釈抗体を各ウェルに加えた。プレートを穏やかに撹拌しながら４℃で一晩温置した。未結合抗体を除去するために、ウェルを１００μＬの容量で３回洗浄した。最初にウェルをＰＢＳで洗浄し、続いて０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０入りのＰＢＳ（Ｒｏｔｈ，Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて２工程行った。次に、ウェルあたり１００μＬのブロッキング緩衝液（０．０２％Ｔｗｅｅｎ入りのＰＢＳ中５％脱脂粉乳［Ｒｏｔｈ］）を用いて、ブロッキング緩衝液で非特異的結合に対してブロッキング処理を行った。穏やかに撹拌しながら４℃で一晩、アッセイを温置した。次に、記載のようにそれぞれ１００μＬの容量を用いて３回の洗浄工程を行った。血漿試料との温置のために、１０％ＦＣＳ入りの９７．５μＬのＤＭＥＭ中で希釈した２．５μＬの血漿をウェルに添加し、穏やかに撹拌しながら室温で２時間温置した。これに続いて、記載のようにそれぞれ１００μＬの容量を用いて３回の洗浄工程を行った。次に、抗Ｃｙｒ６１抗体Ｈ７８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をウェルに添加した。抗Ｃｙｒ６１抗体を１０％ＦＣＳ入りのＤＭＥＭで１：５００希釈し、３５μＬの希釈抗体を各ウェルに添加し、続いて室温で２時間、穏やかに撹拌しながら温置した。これに続いて、記載のようにそれぞれ１００μＬの容量を用いて３回の洗浄工程を行った。Ｃｙｒ６１の検出のために、西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）と結合したポリクローナルヤギ抗ウサギ免疫グロブリン抗体をブロッキング緩衝液で１：２５０希釈し、３５μＬの希釈物を各ウェルに適用した。穏やかに撹拌しながら室温で１時間、反応物を温置した。これに続いて、記載のようにそれぞれ１００μＬの容量を用いて３回の洗浄工程を行った。次に、１００μＬのＴＭＢ一成分ＨＲＰマイクロウェル基質（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，ＵＳＡ）を各ウェルに添加した。温置は室温で１５分間遮光して行った。ＴＭＢ基質用の停止溶液（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｂｌｏｏｍｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）１００μＬを添加し、１５分間穏やかに撹拌しながら暗所で温置することによって反応を停止させた。ＥＬＩＳＡリーダーＮａｎｏＱｕａｎｔ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００  ｐｒｏ（Ｔｅｃａｎ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて４５０／６２０ｎｍでの吸光度を検出した。標準として組み換えおよび精製Ｃｙｒ６１タンパク質を用いてＯＤ値をＣｙｒ６１濃度に変換した。
【００９１】
改良Ｃｙｒ６１免疫沈降（ＩＰ）。
Ｃｙｒ６１の単離のために、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞上で７２時間であった、新たに回収した細胞培養上清１００μＬを使用した。ビーズ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ，ＣＬ−４Ｂ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｕｈｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を５００μＬの冷ＩＰ緩衝液（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，ＧｅｒｍａｎｙのｃＯｍｐｌｅｔｅ  ＵＬＴＲＡ  Ｔａｂｌｅｔｓプロテアーゼ阻害剤入りのＬＰＩＰ緩衝液）中で懸濁した。次に、４μｇのマウスモノクローナル抗Ｃｙｒ６１抗体Ｈ２（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を添加した。対照アッセイにおいて、抗Ｃｙｒ６１抗体を正常マウスＩｇＧ−ＡＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で置き換えた。アッセイをローテータ上で４℃にて一晩温置した。未結合抗体を除去するために、ビーズを１ｍＬのＩＰ緩衝液で５回洗浄した（２，０００×ｇ、１分間）。ビーズを１００μＬの細胞培養上清および９００μＬの冷ＩＰ緩衝液中で懸濁し、ローテータ上で４℃にて３日間温置した。その後、各アッセイにつき１ｍＬのＬＰＩＰ緩衝液を用いてビーズ−抗体コンジュケートを洗浄し、続いて遠心分離した（２０００×ｇ、１分間）。洗浄を４回繰り返した。ペレット化したビーズに１００μＬのＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液を加えることによって抗体を切断し、７０℃に１０分間加熱した。遠心分離（１０，０００×ｇ、１分間）後、Ｃｙｒ６１の検出のために、抗Ｃｙｒ６１抗体Ｈ７８（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いたＣｙｒ６１に対するウエスタンブロットによって上清のアリコートを分析した。
【００９２】
実施例２−  間葉性マーカーとしてのＣｙｒ６１の発見
癌患者の骨髄由来のｍＤＴＣ細胞株（ＢＣ−Ｍ１：乳癌、ＬＣ−Ｍ１：肺癌、ＰＣ−Ｅ１およびＰＣ−Ｍ１：前立腺癌）は、ＤＴＣ生物学を研究するための有用なモデルとなった（１２）。特に、ＢＣ−Ｍ１およびＬＣ−Ｍ１は、ビメンチンの高発現などの間葉性の特徴を示したが、ある種のサイトケラチンの低発現など、一部の上皮特質を保持していた（図１Ａ）。対照的に、基底様ＭＤＡ−４６８乳癌細胞は、上皮表現型が優勢であるが、ビメンチンのような間葉性マーカータンパク質に富む腫瘍細胞の亜集団を含有する（下記参照）。播種過程へのより深い洞察を得るために、発明者らはＳＩＬＡＣ（細胞培養中のアミノ酸を用いた安定同位体標識）およびＬＣ−ＭＳ／ＭＳ質量分析によってＢＣ−Ｍ１およびＭＤＡ−４６８のタンパク質プロファイルを分析した。ＢＣ−Ｍ１細胞は代謝性標識し、一方でＭＤＡ−４６８は対応する軽同位体の存在下で培養した。発明者らの要求を満たす唯一の検出タンパク質はＣｙｒ６１であった。これらの実験において、Ｃｙｒ６１はＭＤＡ−４６８と比較してＢＣ−Ｍ１で過剰発現した（図２の表１；図１Ｂ）。ラミン−Ａ／Ｃは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳアプローチにおいてＢＣ−Ｍ１とＭＤＡ−４６８との間で差次的に発現されなかったタンパク質に対する例として提示される。これらの結果はウエスタンブロットにより確認された（図１Ｃ、Ｄ）。したがって、発明者らは、その後の分析においてＣｙｒ６１に焦点を合わせた。
【００９３】
実施例３−  間葉性特質を有する腫瘍細胞における高Ｃｙｒ６１タンパク質発現
顕著な間葉性表現型（Ｈｓ５７８ｔ、ＢＣ−Ｍ１およびＬＣ−Ｍ１）を有する腫瘍細胞は、Ｃｙｒ６１に対して陽性である（図１Ｃ、Ｄ）。上皮性および間葉性の特質を共有する乳癌細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−２３１）も高レベルのＣｙｒ６１を示す。対照的に、上皮性の特質（ＭＤＡ−４６８、ＭＣＦ−７）を有する細胞株は、Ｃｙｒ６１の発現レベルが非常に低い。前立腺癌細胞株ＰＣ−Ｅ１およびＰＣ−Ｍ１（図１Ｅ）におけるＣｙｒ６１レベルは、ＢＣ−Ｍ１におけるレベルよりも低かった。したがって、発明者らの細胞株分析から、発明者らは、ｍＣＴＣ／ｍＤＴＣが、サイトケラチンを僅かに発現しながら、Ｃｙｒ６１に対して陽性であると想定する。
【００９４】
実施例４−  微小環境ストレスに対するＣｙｒ６１応答およびＰＤ−Ｌ１との同時発現
発明者らは、低酸素に重点を置いて、癌細胞を骨髄に播種する過程でＣｙｒ６１レベルを分析するためのモデル系を確立した（図５）。
【００９５】
発明者らは、発明者らのモデル系の開始条件（標準的細胞培養条件、図５Ａ）で、Ｃｙｒ６１とＨＩＦ−１α（低酸素誘導因子１−アルファ）との非常に近い同時発現を認めた。ＨＩＦ−１αは低酸素への代謝順応の主要な制御因子である。次に、発明者らは、時系列で１％Ｏ2に細胞を供することにより、骨髄の低酸素領域におけるＤＴＣの定着をモデル化した（図５Ｂ）。ＭＤＡ−２３１およびＭＤＡ−４６８において、Ｃｙｒ６１の下方制御には、低酸素の期間中、間葉性マーカータンパク質ビメンチンの誘導が付随した。Ｃｙｒ６１とＨＩＦ−１αとの逆相関は、Ｃｙｒ６１のＨＩＦ−１α依存性下方制御を示唆したが、この効果は１％Ｏ2下ではあまり明らかではなかった。これを明確にするために、発明者らは、標準的細胞培養条件の存在下で細胞を塩化コバルトで処理した（図５Ｄ）。コバルト（Ｃｏ2+）はＨＩＦ−１αとフォンヒッペル−リンダウタンパク質との相互作用を阻害するが、これはＨＩＦ−１αの蓄積につながる（２４）。これらの実験から、Ｃｙｒ６１のその後の下方制御を伴うＨＩＦ−１αの蓄積が明らかになった。次に、発明者らは、これらの腫瘍細胞が転移増殖中にインビボで低酸素状態に順応しなければならなかったと仮定して、ＭＤＡ−２３１  ＭＤＡ−２３１  ＳＡ（１３）およびＭＤＡ−２３１  Ｂ０２（１４）の骨転移亜系統中のＣｙｒ６１を分析した（図５Ｅ）。発明者らは、これらの細胞株においてＣｙｒ６１およびＨＩＦ−１αの逆相関を認めたが、これはＣｏ2+処理時のＣｙｒ６１およびＨＩＦ−１αの細胞応答に合っている。発明者らはさらに、脳転移の観点での骨髄転移に関する発明者らの知見を試験するためにＭＤＡ−２３１、ＭＤＡ−２３１  ＢＲの脳転移亜系統を分析した。ＭＤＡ−２３１  ＢＲは、標準的培養条件下で培養したこの実験系統において分析した全ての細胞の中で最大のＣｙｒ６１レベルを示す。
【００９６】
低酸素症は、栄養素の不足が付随する腫瘍における非効率的な血液供給の結果であることが多い。したがって、発明者らは、グルコース飢餓に対する細胞応答を分析した（図５Ｆ）。ＢＣ−Ｍ１およびＬＣ−Ｍ１では、グルコース飢餓時のＣｙｒ６１発現の減少が検出されたが、一方で、ＭＤＡ−２３１およびＨｓ５７８ｔ細胞ではＣｙｒ６１誘導が観察された。ＭＤＡ−４６８を低酸素およびグルコース飢餓に一緒に供した場合、Ｃｙｒ６１およびビメンチンの両方が誘導された（図５Ｄ、Ｅ）。
【００９７】
腫瘍細胞が播種過程中に免疫監視から逃れなければならない患者の状況を考慮するために、発明者らはＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死１リガンド１）レベルをモニターした。ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞による排除から腫瘍細胞を保護し、最近ＣＴＣで検出された（２５）。ＰＤ−Ｌ１がＨＩＦ−１αを介して０．５％Ｏ2によって誘導され得ることに気付いたので（２６）、発明者らは、骨髄に適切であるＯ2濃度（１％Ｏ2）に対する、またはＣｏ2+処理による、ＰＤ−Ｌ１誘導の可能性を分析した。発明者らは、１％Ｏ2下でＢＣ−Ｍ１およびＨｓ５７８ｔにおいてＰＤ−Ｌ１誘導を観察し（図５Ｂ）、両細胞株において、ＰＤ−Ｌ１はＣｏ2+処理に応答して一時的に誘導される（図５Ｄ）。さらに、ＭＤＡ−２３１  ＢＲにおいて異常に高レベルのＰＤ−Ｌ１が観察された（図５Ｅ）。これにより、ＢＣ−Ｍ１のような表現型を有するＤＴＣが、インビボで骨髄に存在するような低酸素条件下でＰＤ−Ｌ１レベルを維持することが可能であることが示され、発明者らのモデルがこの点で患者の状況と適合性であることが確認される。
【００９８】
実施例５−  ＰＤ−Ｌ１とのＣｙｒ６１の同時発現および膵臓癌細胞株における頻繁なＣｙｒ６１発現
発明者らは、Ｃｙｒ６１およびＰＤ−Ｌ１のある一定の同時発現に気付いた（図５Ａ）。この仮定を実証するために、発明者らは、異なる腫瘍実体のさらなる細胞株においてＣｙｒ６１およびＰＤ−Ｌ１を比較した（図６）。発明者らは、前立腺癌、乳癌ならびに頭頸部癌由来の細胞株について、Ｃｙｒ６１とＰＤ−Ｌ１との間の同時発現を発見した（図６Ａ）。これらの腫瘍実体において、腫瘍細胞播種は主に血行性またはリンパ系播種の何れかを介して起こる。
【００９９】
対照的に、膵臓癌では、転移性の拡散は腹膜播種を介して起こることが多い（２７）。分析した膵臓癌細胞株に対して、発明者らは、Ｃｙｒ６１レベルとＰＤ−Ｌ１レベルとの間の逆相関を認めた（図６Ｂ）。
【０１００】
さらに、膵臓癌は腫瘍細胞実体の一例であり、これは、炎症（膵炎）から発生し得、これは前悪性細胞の播種につながる（２８）。発明者らは、４つ全ての分析において膵臓癌細胞株Ｃｙｒ６１を検出し、このことから、Ｃｙｒ６１膵臓癌の頻繁な発現が示唆される。
【０１０１】
実施例６−  低酸素条件下でのＥｒｂＢ−２発現に対するＣｙｒ６１応答
トリプルネガティブ乳癌以外に、ＥｒｂＢ−２陽性腫瘍が示す間葉性特質を有する個々の腫瘍細胞は少数しかない（４）。したがって、発明者らは、ＥｒｂＢ−２が間葉性特質の獲得およびＣｙｒ６１レベルに影響を及ぼし得ると想定した（図７Ａ、Ｂ）。ＥｒｂＢ−２はＭＤＡ−４６８において過剰発現され、得られた細胞株はＭＤＡ−４６８  ＥｒｂＢ−２と名付けた。ＭＤＡ−４６８対照細胞は挿入物なしの発現ベクターを担持し、ＭＤＡ−４６８  ＰＭはチロシン１２４８がフェニルアラニンにより置換されたＥｒｂＢ−２タンパク質を発現した（１２）。標準的細胞培養条件下で、Ｃｙｒ６１発現は、ＭＤＡ−４６８対照と比較して、ＭＤＡ−４６８  ＥｒｂＢ−２において低下していた。低酸素状態に曝露した後、ＭＤＡ−ＥｒｂＢ−２におけるＣｙｒ６１発現値はさらにもっと減少した。ＭＤＡ−４６８対照と比較して、ＭＤＡ−ＥｒｂＢ−２およびＭＤＡ−４６８  ＰＭは低酸素条件下でビメンチン誘導の減弱を示した。これは、ビメンチンに対する免疫蛍光染色によって細胞レベルで確認された（図７Ｃ、Ｄ）。
【０１０２】
実際、発現ベクターなしのＭＤＡ−４６８では低酸素下でＣｙｒ６１が下方制御され（図５Ｂ）、一方でＭＤＡ−４６８対照についてはこれが観察されなかったので（図７Ａ）、発明者らの細胞モデルは系統的誤差を含有する。したがって、発明者らは、独立した細胞株のセットにおいてＣｙｒ６１の下方制御を確認した（図７Ｅ）。乳癌細胞株ＢＴ２０および頭頸部癌からの３種類の扁平上皮癌細胞株を選択した。４種類全ての細胞株について、同時Ｃｙｒ６１下方制御を伴う低酸素下でのＥｒｂＢ−２誘導が観察された。
【０１０３】
さらに、ＭＤＡ−４６８対照およびＭＤＡ−４６８  ＥｒｂＢ−２のＥＧＦ刺激は、Ｃｙｒ６１の大量の誘導につながる（図７Ｆ）。これらの実験は標準的細胞培養条件下で行った。
【０１０４】
実施例７−  ＤＴＣにおけるＣｙｒ６１分泌の発見
原発性腫瘍細胞はＣｙｒ６１を細胞外間隙に分泌し得る。しかし、Ｃｙｒ６１がＣＴＣまたはＤＴＣによっても分泌され得るか否かは不明である。したがって、分泌されたＣｙｒ６１の存在について、ＢＣ−Ｍ１  ＤＴＣの細胞培養培地を分析した（図８）。溶解した細胞がＣｙｒ６１を放出し得ることを排除することはできないので、細胞をブレフェルジンＡ（ＢＦＡ）で並行して処理した。ＢＦＡは小胞体からゴルジ装置へのタンパク質輸送を阻害する。細胞培養培地を剥離細胞から除去するために、培養培地を遠心分離した。可溶性分画を上清と名付け、不溶性破片を剥離細胞と名付けた。ＢＦＡ処理はＧｒｐ７８の活性化につながるので（３０）、Ｇｒｐ７８誘導を陽性対照とした。
【０１０５】
対応するＢＦＡ処理分画と比較した未処理上清対照におけるＣｙｒ６１レベルの上昇が、ＭＤＡ−２３１およびＢＣ−Ｍ１において検出された（図８Ａ、Ｂ）。さらに、非分泌細胞質タンパク質α−チューブリンの分析から、上清分画への細胞質タンパク質の検出可能な混入は明らかにならず、このことから、分析した細胞株における分泌Ｃｙｒ６１の検出が示唆される。
【０１０６】
分泌Ｃｙｒ６１の生物学的機能の誘導のために、細胞は適切なＣｙｒ６１受容体の存在を必要とする。様々な異なるＣｙｒ６１受容体の中で、インテグリンαｖおよびインテグリンβ３のヘテロ二量体（インテグリンαｖβ３）は最もよく研究されているＣｙｒ６１受容体の１つである（３４）。したがって、発明者らは、Ｃｙｒ６１受容体インテグリンαｖβ３に重点を置いて、細胞株中の異なるインテグリンの存在を調べた（図８Ｃ）。インテグリンβ３が検出可能でなかったＭＣＦ−７を除いて、調べた全ての細胞株が機能的Ｃｙｒ６１−インテグリンαｖβ３複合体の形成のための構造的前提条件を有する。ＤＴＣ細胞株は非常に高レベルのインテグリンαｖおよびインテグリンβ３を示す。さらに、ＭＤＡ−２３１、ＭＤＡ−２３１  ＳＡおよびＭＤＡ−２３１  Ｂ０２の骨転移亜系統は、親細胞株と比較して高レベルのインテグリンαＶおよびインテグリンβ３を示す。
【０１０７】
実施例８−  システインリッチ血管新生インデューサー６１の検出のための酵素結合免疫吸着測定法の確立（Ｃｙｒ６１  ＥＬＩＳＡ）
ウエスタンブロットによる細胞株の分析。
最初に、抗Ｃｙｒ６１抗体（抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）ウサギポリクローナル、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）が溶液中でＣｙｒ６１に結合可能か否かを調べた。発明者らは、ＢＣ−Ｍ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞溶解物についてＣｙｒ６１免疫沈降（ＩＰ）を確立した（図９）。細胞株を標準的培養条件下で培養した。Ｃｙｒ６１タンパク質は、ウサギ抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）を用いて捕捉し、マウス抗Ｃｙｒ６１抗体によってウエスタンブロットで検出した。これらのデータから、Ｃｙｒ６１が抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）によって液体試料から単離され得ることが示される。
【０１０８】
次に、ウエスタンブロットにより、抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）の品質をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（ＣＳＴ）からの抗Ｃｙｒ６１抗体と比較した（図１０Ａ）。それらのＣｙｒ６１レベルが異なる４種類の異なる細胞株からの細胞溶解物を分析した。両抗体が、およそ４０ｋＤａの分子量でシグナルを検出し、どちらの場合もウエスタンブロットにおいて優勢なシグナルであった。Ｈ７８抗体は、特にＭＤＡ−ＭＢ−４６８のようなＣｙｒ６１レベルが低い細胞溶解物において、ＣＳＴ抗体と比較して、バックグラウンドシグナルがより少なく、より明瞭なシグナルをもたらした。ウエスタンブロットの定量分析において、Ｈ７８抗体を用いてＢＣ−Ｍ１について最大のＣｙｒ６１シグナルが検出され、一方でＣＳＴ抗体の場合はＭＤＡ−ＭＢ−２３１について最大値が観察された。全実験について同じ細胞溶解物を使用したので、この効果が生体の効果の結果である可能性は低い。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＢＣ−Ｍ１の値に対するエラーバーが重なっているため、おそらくこれは測定精度の限界ゆえであり得る。あるいは、この効果は、２つの異なる抗体によるＣｙｒ６１上の異なる認識部位ゆえであり得る。Ｈ７８抗体によってバックグラウンドノイズのより少ないシグナルが得られたので、この抗体をＥＬＩＳＡの確立に使用した。
【０１０９】
希釈系列のヒト組み換えＣｙｒ６１の適用によってＨ７８抗体をさらに分析した（図１０Ｂ）。ウエスタンブロットによって、細胞溶解物中および組み換えＣｙｒ６１タンパク質の試料中の両方でおよそ４０ｋＤａの分子量のバンドが示された。観察された分子量は、およそ３９．５ｋＤａの処理した（切断されたシグナルペプチド）の予想分子量と一致する。
【０１１０】
組み換えＣｙｒ６１入りの試料の場合、およそ９０ｋＤａの分子量でさらなるシグナルが観察された。Ｃｙｒ６１は５個のジスルフィド架橋を有するので、これらのシグナルは、試料調製において完全には切断され得なかったＣｙｒ６１二量体であり得る。
【０１１１】
Ｘ線フィルムの露光時間が長くなると、細胞株において弱い非特異的シグナルが検出された。これらの条件下で、特異的Ｃｙｒ６１シグナルは、メイヤー（ｍａｙｏｒ）部の全体シグナルを構成するが、非特異的シグナルが検出可能になる。特に、ＭＣＦ−７の細胞溶解物からは検出可能な特異的Ｃｙｒ６１シグナルが得られず、分析した細胞株のうち非特異的バックグラウンドが最大であった。この知見はＣｙｒ６１−ＥＬＩＳＡの確立に極めて重要であるため、この細胞株における非特異的なバックグラウンドを可視化するために４０μｇのＭＣＦ−７細胞溶解物も適用した。
【０１１２】
組み換えＣｙｒ６１希釈系列のシグナル強度から（図１０Ｂ）、検量線を導き出した（図１１Ａ）。既知のＣｙｒ６１タンパク質量のシグナル強度［任意単位］をプロットし、検量線（線形フィット）を導き出した。
【０１１３】
一次方程式は、ｙ＝２．５６７８ｘ（式１）として決定され、ｙはＣｙｒ６１のタンパク質量［μｇ］、ｘはＸ線フィルム上のシグナル強度とした。
【０１１４】
細胞株の細胞溶解物中の決定されたＣｙｒ６１シグナル強度への式１の適用（図１０Ｂ）により、細胞溶解物中のＣｙｒ６１タンパク質の量（１０μｇの総タンパク質）の計算が可能になった。３回の実験のＣｙｒ６１タンパク質の量の計算平均値は、
ＭＣＦ−７：０．１ｎｇ±０．４ｎｇ
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８：６．５ｎｇ±５．４ｎｇ
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：２３．９ｎｇ±１４．３ｎｇ
および
ＢＣ−Ｍ１：３２．８ｎｇ±１２．５ｎｇであった。
【０１１５】
したがって、１０μｇのＢＣ−Ｍ１細胞溶解物はおよそ３３ｎｇのＣｙｒ６１を含有し、これは総タンパク質量の０．３３％である。
【０１１６】
Ｃｙｒ６１  ＥＬＩＳＡ（下記参照）の場合とは異なり、細胞溶解物のタンパク質はそれらの質量に従って分離されたので、ＭＣＦ−７におけるＣｙｒ６１シグナル強度の値は、他の細胞株のＣｙｒ６１シグナル強度から非特異的バックグラウンドとして差し引かなかった。これにより、これらの実験において特異的Ｃｙｒ６１シグナルからの非特異的シグナルの識別が可能になった。
【０１１７】
Ｃｙｒ６１  ＥＬＩＳＡによる細胞株での技術的分析。
ウエスタンブロットによる細胞溶解物の分析と同様に、Ｃｙｒ６１をＥＬＩＳＡにより分析した。最初に、既知のタンパク質量の組み換えＣｙｒ６１を用いた検量線を希釈系列で作成した（図１１Ｂ）。
【０１１８】
一次方程式は、ｙ＝６４．１０４ｘ＋０．４６７として決定し（式２）、ｙはＣｙｒ６１のタンパク質量［μｇ］、ｘはＸ線フィルム上のシグナル強度、切片は０．４６７の固定値であった。
【０１１９】
ウエスタンブロット分析において、ＭＣＦ−７は、検出可能なＣｙｒ６１シグナルはないが、ある程度の非特異的バックグラウンドを有する細胞株であることが認められた。これをさらに調べるために、タンパク質量を増加させた一連のＭＣＦ−７細胞溶解物を分析した。以下のＯＤ４０５ｎｍ値が観察された：
【０１２０】
【表１】
2020510844.tif 000003
【０１２１】
これらのデータは、非特異的バックグラウンドの量が細胞溶解物のタンパク質添加量に比例することを示す。例としてＭＣＦ−７の１０μｇ値に式２を適用すると、その結果、１７．２６ｎｇ±０．６７ｎｇのＣｙｒ６１の値が得られるが、これは、ＭＣＦ−７においてＣｙｒ６１に対する偽陽性（バックグラウンド値）と見なし得る。
【０１２２】
ＭＣＦ−７試料からの値を分析しようとする試料から差し引いてバックグラウンドノイズのないＣｙｒ６１定量を得ることができるという考えを検証するために、発明者らは、１０μｇのＭＣＦ−７細胞溶解物の試料に異なる量の組み換えＣｙｒ６１タンパク質を添加して、ＯＤ４０５値を決定した。これらの値から、１０μｇのＭＣＦ−７細胞溶解物（０．２６１９７３３２７）について以前に測定されたＯＤ４０５値を差し引いた後、式２をその値に適用した。得られる値はカラム４および５で示す：
【０１２３】
【表２】
2020510844.tif 000004
【０１２４】
得られた値（カラム４）と入力値（カラム１）を比較したところ、偽陽性Ｃｙｒ６１値が大部分除去されることが示される。
【０１２５】
Ｃｙｒ６１  ＥＬＩＳＡの確立の主な焦点は、分泌されたＣｙｒ６１を分析するための細胞培養上清からの分析であった。したがって、発明者らはＭＣＦ−７細胞培養上清を分析した。
【０１２６】
Ｃｙｒ６１はウエスタンブロットにより分析されたＭＣＦ−７細胞溶解物中で検出可能ではなかったので、発明者らはＣｙｒ６１がＭＣＦ−７中で合成されない（または非常に低いレベルでのみ合成される）と想定した。したがって、細胞溶解物において行われた実験と同様に、上清がバックグラウンドの減算に適用され得るように、Ｃｙｒ６１はＭＣＦ−７において分泌されないと想定する可能性がある。
【０１２７】
細胞溶解物における実験と同様に（図１１Ｂ）、細胞培養上清の分析のために、組み換えＣｙｒ６１を用いた検量線を作成した（図１１Ｃ）。
【０１２８】
検量線に対する得られた式は、ｙ＝６３．５２８ｘ＋１．１１６２（式３）であり、ｙはＣｙｒ６１のタンパク質量［μｇ］、ｘはＥＬＩＳＡリーダーにおけるシグナル強度（ＯＤ４０５ｎｍ）であり、切片は１．１１６２の固定値であった。
【０１２９】
ＭＣＦ−７の細胞培養上清に対するＯＤ４０５値が、培養上清の適用容量［μＬ］に比例するか否かを試験した。
【０１３０】
【表３】
2020510844.tif 000005
【０１３１】
細胞株で行われた実験の結果と同様に、ＯＤ４０５値は、ＭＣＦ−７細胞培養上清の量が増加するにつれて上昇する。ＭＣＦ−７培養上清５０μＬ値を式３に適用すると、その試料中のＣｙｒ６１タンパク質量の計算値（偽陽性）は２．１５ｎｇ±１．１８ｎｇ  Ｃｙｒ６１となる。
【０１３２】
次に、ＭＣＦ−７試料からの値を分析しようとする試料から差し引いてバックグラウンドノイズなしでＣｙｒ６１定量を得ることができるか否かを試験した。したがって、発明者らは、５０μＬのＭＣＦ−７細胞培養上清の試料に組み換えＣｙｒ６１タンパク質を添加した。得られた値から、５０μＬのＭＣＦ−７上清に対して以前に測定されたＯＤ４０５値（０．０１６３２５）を差し引いて、次いで式３をその値に適用した。得られる値は、カラム４および５で示す：
【０１３３】
【表４】
2020510844.tif 000006
【０１３４】
得られた値（カラム４）と入力値（カラム１）を比較したところ、偽陽性Ｃｙｒ６１値が大部分除去されることが示される。
【０１３５】
これらの結果は、Ｃｙｒ６１レベルが細胞培養試料中で正確に測定され得ることを示唆するので、この手順を新しいセットの細胞株試料に適用した。再び、組み換えＣｙｒ６１を用いた検量線を作成した（図１１Ｄ）。検量線に対する対応式は、
ｙ＝６３．９１４ｘ＋０．４２２６（式４）
であり、ｙはＣｙｒ６１のタンパク質量［μｇ］、ｘはＥＬＩＳＡリーダーにおけるシグナル強度（ＯＤ４０５ｎｍ）であり、切片は０．４２２６の固定値であった。
【０１３６】
次に、細胞株ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＢＣ−Ｍ１からの細胞培養上清５０μＬを分析した（以下のカラム１）。ＭＣＦ−７の上清に対する値を他の細胞株の値から差し引いて、得られた値に式４を適用した。Ｃｙｒ６１のタンパク質量［ｎｇ］はカラム４で示す。
【０１３７】
【表５】
2020510844.tif 000007
【０１３８】
したがって、ＢＣ−Ｍ１の細胞培養上清５０μＬは４４．３ｎｇ±１．０ｎｇのＣｙｒ６１を含有した。
【０１３９】
５０μＬの個々の細胞培養上清に５０ｎｇの組み換えＣｙｒ６１を添加することによってこれらの値の品質を評価し、再度分析した。この場合、５０ｎｇのＣｙｒ６１を試料に添加したので、ＭＣ−７の値を処理した。したがって、他の細胞株と同様に、ＭＣＦ−７の測定値から細胞培養上清の以前の値（０．０１８２４４）を差し引いた。これに続いて、４種類全ての細胞株からの値に式４を適用した。期待値は、Ｃｙｒ６１および添加した５０ｎｇの添加された組み換えＣｙｒ６１について以前に計算した値の合計である。例  ＢＣ−Ｍ１：４４．３ｎｇ＋５０ｎｇ＝９４．３ｎｇ：
【０１４０】
【表６】
2020510844.tif 000008
【０１４１】
試料の細胞溶解物を用いて対応する実験を実施した。細胞溶解物のタンパク質５μｇを添加した。ＭＣＦ−７の値を他の細胞株の値から差し引いて、式４を用いることによって、得られた値を処理した：
【０１４２】
【表７】
2020510844.tif 000009
【０１４３】
したがって、５μｇのＢＣ−Ｍ１全細胞溶解物は６２．２ｎｇ±０．６ｎｇのＣｙｒ６１を含有する。
【０１４４】
細胞培養上清と同様に、５０ｎｇの組み換えＣｙｒ６１を試料に添加することによって品質評価を実施した。試料から、ＭＣＦ−７の以前の値（０．０９４７９６６６７）を差し引き、タンパク質量［ｎｇ］を式４によって計算した：
【０１４５】
【表８】
2020510844.tif 000010
【０１４６】
ＭＣＦ−７におけるこれらの試料中のＣｙｒ６１の計算量が予想より少ない（検出４５ｎｇ対５０ｎｇ予想）にしても、他の３つの試料についての期待値は観察値（例えばＢＣ−Ｍ１に対して計算値１１０．５ｎｇ対期待値１１２ｎｇ）に対して十分に適している。これは、Ｃｙｒ６１  ＥＬＩＳＡが全細胞溶解物および細胞培養上清中のＣｙｒ６１レベルの定量分析に対する適したツールであるという考えを裏付ける。
【０１４７】
試料中でＣｙｒ６１のタンパク質量はｎｇで測定し得るので、試料中のＣｙｒ６１分子の量を計算することが可能である。計算は、４４ｎｇのＣｙｒ６１の値を提供したＢＣ−Ｍ１上清の試料について提示される。切断シグナルペプチドを用いて、処理されたＣｙｒ６１について計算を行う。
【０１４８】
仮定：ｍ（Ｃｙｒ６１）＝４４ｎｇおよびＭ（Ｃｙｒ６１）＝３９４３８．４ｇ／ｍｏｌとする。
【０１４９】
検索：ｎ（物質量［ｍｏｌ］）。
式は：ｍ＝ｎ×Ｍ
変換率：ｎ＝ｍ／Ｍ
値の挿入：ｎ＝４４ｎｇ×３９４３８．４ｇ／ｍｏｌ
収量：ｎ＝１，１２×１０-12ｍｏｌ
【０１５０】
アボガドロ定数と物質量とを乗じると、試料中のＣｙｒ６１分子数が得られる：
分子数＝１．１２×１０-12ｍｏｌ×６，０２２×１０23
分子数＝６．７７×１０11
【０１５１】
したがって、この試料中の５０μＬのＢＣ−Ｍ１上清は６．７７×１０11分子のＣｙｒ６１を含有した。
【０１５２】
同様の計算過程により、他の細胞培養上清についても以下の値が得られる（５０μＬの体積の細胞培養上清について）。
ＢＣ−Ｍ１細胞培養上清：６．７７×１０11±１．４８×１０10個の分子、
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養上清：５．２３×１０11±１．０６×１０10個の分子、
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞培養上清：１．３９×１０11±８．６８×１０9個の分子。
【０１５３】
細胞溶解物の計算により、５μｇの細胞溶解物中に以下の量のＣｙｒ６１分子が得られる：
ＢＣ−Ｍ１細胞溶解物：９．５０×１０11±９．６６×１０9個の分子。
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞溶解物：７．３９×１０11±８．８６×１０9個の分子。
ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞溶解物：１．７１×１０11±９．７１×１０9個の分子。
【０１５４】
これらの分析は、Ｃｙｒ６１の確立における技術的問題にのみ言及する。生物医学的結論を可能にする、細胞培養上清中の分泌されたＣｙｒ６１の分析は、以下のセクションに記載する。
【０１５５】
ウエスタンブロットの結果とＥＬＩＳＡによって得られる結果とを比較したところ、両方のアプローチが同等の値を提供したことが示された。両方のアプローチ間の違いは、ＥＬＩＳＡと比較してウエスタンブロットアプローチの感度がより低いことが主な原因であり、これは、組み換えＣｙｒ６１での検量線上で見られ得る。その結果、ＥＬＩＳＡアプローチのダイナミックレンジは、ウエスタンブロット分析よりもはるかに大きい。さらに、ＥＬＩＳＡ測定に対するエラーバーは、ウエスタンブロット分析の場合よりもはるかに小さかった。その点から、ＥＬＩＳＡは、感度、ダイナミックレンジおよび精度の点でウエスタンブロット法よりはるかに優れている。
【０１５６】
対照的に、ウエスタンブロット法の固有の利点は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにおけるタンパク質分離ゆえに、特異的Ｃｙｒ６１シグナルと非特異的バックグラウンドシグナルとを識別することができることである。ＥＬＩＳＡアプローチは、同様の分画工程を含有しないので、真のＣｙｒ６１シグナルと非特異的バックグラウンドとを区別することはより困難である。この問題は、非常に特異的な抗Ｃｙｒ６１（Ｈ７８）抗体を適用することによって、およびバックグラウンドノイズ低減工程を導入することによって対処し得る。したがって、ウエスタンブロット後のＸ線フィルムの大規模な過剰エクスポジション（ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ）後にＭＣＦ−７細胞溶解物中で非常に弱いシグナルが検出された場合でも、ＭＣＦ−７に対するＣｙｒ６１値が定義によりゼロであることに留意しなければならない。しかし、これらのシグナルは、非特異的結合でもあり得る。さらに、このようなバックグラウンド減算法には、ＭＣＦ−７のプロテオームに存在するタンパク質しか含まれない。他のタンパク質、例えばＭＤＡ−ＭＢ−４６８では非特異的シグナルを生じさせ得るがＭＣＦ−７において欠如し得るタンパク質はこのアプローチでは考慮されない。それにもかかわらず、このアプローチはＥＬＩＳＡにおいて信頼できる値を提供する。この分析は、非常に低いＣｙｒ６１値では、計算値が実際よりも僅かに低くなるという考えを裏付ける。その限りにおいて、発明者らのアッセイは、ある程度、偽陽性の結果よりも偽陰性の結果を生じる傾向がある。
【０１５７】
Ｃｙｒ６１  ＥＬＩＳＡによる細胞株での生物学的分析。
ウエスタンブロットによる細胞株中のＣｙｒ６１値の測定は、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ上の添加タンパク質の量を指す。このアプローチは分泌タンパク質には適用できないので、分泌Ｃｙｒ６１に対する代替の標準化参照系を確立した。この系は、細胞数および培養時間を含むので、Ｃｙｒ６１分泌速度は、細胞および１日あたりのＣｙｒ６１分子の数におけるＣｙｒ６１分泌速度として決定され得るようになる。
【０１５８】
したがって、定められた細胞数を播種した。定められた培養時間にわたり、細胞培養上清を回収し、各時点について細胞数を測定した。試料中のＣｙｒ６１分子数を計算するために、組み換えおよび精製Ｃｙｒ６１の標準を分析した。Ｃｙｒ６１分子の数の計算は上記のとおり行った。これらの分析結果を図１２Ａで示す。細胞あたりのＣｙｒ６１分子数は、各測定点に対する細胞数を考慮に入れており、一方でＣｙｒ６１濃度は細胞数に関係なく計算される。ｔ＝０の時点に対して、新鮮な培地を細胞に添加した。
【０１５９】
細胞は迅速にＣｙｒ６１を培地に分泌した（０時間対２４時間）。その後、Ｃｙｒ６１濃度は経時的に著しく一定であり、個々の細胞株に特異的であると思われる。
【０１６０】
Ｃｙｒ６１の予想外の迅速な分泌ゆえに、改変してＢＣ−Ｍ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１について実験を繰り返した（図１２Ｂ）。その場合、１２時間ごとに細胞培養培地を新鮮な培地と交換し、回収した培地をＣｙｒ６１について分析した。これらのデータは、ＢＣ−Ｍ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１がその条件下で図１２Ａにおいて観察されるよりも４８時間でより多くのＣｙｒ６１を分泌可能であることを示す（例えばＢＣ−Ｍ１  ０時間対４８時間：０対４８時間に対して、図１２Ａの７７２ｎｇ／ｍＬおよび図１２Ｂでは４６９＋４６３＋５２７＋５２７ｎｇ＝１９８３ｎｇ／ｍＬ。特に、Ｃｙｒ６１分泌速度は、経時的に培地除去の繰り返しの後にＭＤＡ−ＭＢ−２３１において上昇した（図１２Ｂ）。結果として、細胞は、１２時間以内に、２４時間にわたり図１２Ａで検出されたＣｙｒ６１量の殆どを分泌した（図１２Ａ：０時間対２４時間９９９ｎｇ／ｍＬおよび図１２Ｂ：４８時間９５４ｎｇ／ｍＬ）。
【０１６１】
これらのデータから、局所的なＣｙｒ６１濃度は細胞数よりもむしろ個々の細胞株に依存することが示唆される。Ｃｙｒ６１濃度のこの的確な維持は、細胞中のＣｙｒ６１測定および調節装置を示唆し得る。おそらく、小さな腫瘍細胞コロニーでさえも、細胞を取り囲む局所的なＣｙｒ６１濃縮微小環境を生じる。これらのＣｙｒ６１値はＣｙｒ６１分子の一定の新規合成および分解を伴う定常状態をおそらく反映することに留意しなければならない。
【０１６２】
実施例９−  システインリッチ血管新生インデューサー６１の検出のための酵素結合免疫吸着測定法（Ｃｙｒ６１  ＥＬＩＳＡ）の改良
細胞株
システインリッチ血管新生インデューサー６１（Ｃｙｒ６１）の検出のための上記ＥＬＩＳＡの改良のために、２つの抗Ｃｙｒ６１抗体を適用した。１つの抗体は、ヒトＣｙｒ６１のアミノ酸１６３〜２４０に対して産生されたウサギポリクローナル抗Ｃｙｒ６１抗体Ｈ７８であった。他方の抗体は、ヒトＣｙｒ６１のアミノ酸３４５〜３８１に対して産生されたマウスモノクローナル抗Ｃｙｒ６１抗体Ｈ２であった。両抗体とも、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＵＳＡのものであった。
【０１６３】
第一に、ウエスタンブロットにより一連の細胞株において、Ｈ７８およびＨ２抗体のＣｙｒ６１認識プロファイルを調べた（図１３）。両抗体とも、およそ４０ｋＤａに１本の単一バンドのみを示した。さらに、細胞株におけるＣｙｒ６１シグナル強度の分布は両抗体について類似していた。
【０１６４】
次に、抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）が溶液中でその標的Ｃｙｒ６１に結合可能であるか否かを調べた。したがって、発明者らは、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞培養上清におけるＣｙｒ６１免疫沈降（ＩＰ）を確立した（図１４）。細胞株を標準的培養条件下で培養した。Ｃｙｒ６１タンパク質は、マウス抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ２）を用いて捕捉し、ウサギ抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）によってウエスタンブロットで検出した。Ｃｙｒ６１のＩＰのために、１．０５ｎｇ／ｍＬのＣｙｒ６１濃度を有する２００μＬのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞培養上清、従って総量２１０ｎｇのＣｙｒ６１を適用した。免疫沈降物の２０％をウエスタンブロットに対して適用した。免疫沈降Ｃｙｒ６１のシグナル強度は、５０ｎｇの組み換えＣｙｒ６１のシグナル強度と同程度であり、このことから、培養上清からの単離Ｃｙｒ６１の収率が１００％に近いことが示唆される。
【０１６５】
Ｃｙｒ６１  ＥＬＩＳＡの確立のために、Ｈ７８およびＨ２抗体を分析した。希釈系列でのヒト組み換えＣｙｒ６１タンパク質および細胞溶解物の適用によって両抗体を調べた（図１５）。
【０１６６】
ウエスタンブロットから、両抗体に対して、細胞溶解物中でおよそ４０ｋＤａの分子量の１本の単一バンドが示された。観察された分子量は、およそ３９．５ｋＤａの処理した（切断されたシグナルペプチド）の予想分子量と一致する。組み換えＣｙｒ６１試料については、およそ８０ｋＤａの分子量でさらなるシグナルが観察された。Ｃｙｒ６１は５個のジスルフィド架橋を含有するので、これらのシグナルは、試料調製において完全には切断され得なかった、ジスルフィド架橋により連結されるＣｙｒ６１二量体であり得る。
【０１６７】
組み換えＣｙｒ６１に対して得られたシグナル強度をＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｓ５７８ｔ細胞溶解物中のシグナル強度と比較することにより、細胞溶解物中のＣｙｒ６１量の推定が可能になる。Ｈ７８抗体の場合、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＨｓ５７８ｔにおけるシグナル強度はおよそ１ｎｇのＣｙｒ６１に対応する。１０μｇの細胞溶解物を分析したので、１μｇのＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＨｓ５７８ｔ細胞溶解物は、Ｈ７８抗体によって検出する場合、１００ｐｇのＣｙｒ６１を含有する。同様に、Ｈ２抗体の適用により、細胞溶解物は１０μｇあたりおよそ２．５ｎｇのＣｙｒ６１または１μｇの細胞溶解物あたり２５０ｐｇのＣｙｒ６１を含有する。
【０１６８】
ウエスタンブロット分析から、抗Ｃｙｒ６１抗体Ｈ７８およびＨ２がＥＬＩＳＡにおける適用に適切であり得ることが示唆されたので、これらの抗体をさらに評価した。ウエスタンブロット分析は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＤＡ−２３１）およびＨｓ５７８ｔにおいて高レベルのＣｙｒ６１を示し、ＭＣＦ−７およびＳＫＢＲ３においては検出可能なシグナルは示されなかった。したがって、Ｃｙｒ６１−ＥＬＩＳＡの確立のための陽性対照または陰性対照としてこれらの細胞株を選択した。
【０１６９】
細胞株のＥＬＩＳＡ分析に対して、既知のタンパク質量の組み換えＣｙｒ６１を用いた検量線を希釈系列で作成した（図１６）。
【０１７０】
一次方程式は、ｙ＝０．４１１８ｘ＋０．０００９（式１）として決定され、ｙはＣｙｒ６１のタンパク質量［ｎｇ］、ｘは４５０ｎｍでのＯＤ（光学密度）であり、切片は０．０００９の固定値であった。一連の試験試料の細胞溶解物および細胞培養上清中のＣｙｒ６１量の決定のために式１を使用した（図１７）。５μｇのＭＤＡ−２３１細胞溶解物中４１３ｐｇおよびＨｓ５７８ｔの細胞溶解物中に４１４ｎｇのＣｙｒ６１が検出された一方で、ＭＣＦ−７およびＳＫＢＲ３ではシグナルは観察されなかった（図１７Ａ）。これらが特異的なＣｙｒ６１シグナルであることを確認するために、５００ｎｇの組み換えＣｙｒ６１を試料に添加した。その後、ＭＤＡ−２３１に対する値は９３５ｐｇに増加し、Ｈｓ５７８ｔについては９３０ｐｇの値が検出された。ＭＣＦ−７およびＳＫＢＲ３の場合、５００ｐｇの組み換えＣｙｒ６１を試料に添加した後、５０３ｐｇのＣｙｒ６１がそれぞれの細胞溶解物中で検出された。Ｃｙｒ６１は細胞外間隙に分泌され得るので、他の分泌タンパク質がＥＬＩＳＡの特異性に影響を及ぼし得る可能性があり得る。ＥＬＩＳＡがＣｙｒ６１を他の分泌タンパク質と特異的に識別するか否かを試験するために、細胞培養上清を分析した（図１７Ｂ）。細胞質Ｃｙｒ６１について陽性であった細胞株は、細胞培養上清中のＣｙｒ６１についても陽性であった（ＭＤＡ−２３１、Ｈｓ５７８ｔ）が、一方で、細胞質においてＣｙｒ６１に対して陰性であった細胞株（ＭＣＦ−７、ＳＫＢＲ３）は細胞培養上清中のＣｙｒ６１についても陰性であった。これらの細胞株の細胞培養上清中に５００ｐｇの組み換えＣｙｒ６１を添加すると、検出されたＣｙｒ６１値が、各細胞株に対しておよそ５００ｎｇ上昇した。
【０１７１】
さらに、ＥＬＩＳＡによる検出Ｃｙｒ６１量を、ウエスタンブロットによって検出されたものと比較し得た。ＭＤＡ−２３１およびＨｓ５７８ｔにおいて、Ｈ７８抗体を使用しておよそ１００ｐｇ／μｇのＣｙｒ６１が検出され、Ｈ２抗体を使用して、Ｃｙｒ６１の量はウエスタンブロットにより２５０ｐｇ／μｇ  Ｃｙｒ６１であった。ＥＬＩＳＡから、ＭＤＡ−２３１およびＨｓ５７８ｔに対して、およそ８３ｐｇ／μｇのＣｙｒ６１の値が得られた。
【０１７２】
ＥＬＩＳＡにおける潜在的な非特異的シグナルを同定するために、Ｃｙｒ６１陰性細胞株ＭＣＦ−７の細胞溶解物および培養上清をさらに分析した。検量線に対する式は、
ｙ＝０．４０６３６ｘ＋０．００４９８（式２）であり、ｙはＣｙｒ６１のタンパク質の量［ｎｇ］、ｘは４５０ｎｍでのＯＤであり、切片は０．００４９８の固定値であった（図１８）。ＭＣＦ−７の一連の試験試料の細胞溶解物および細胞培養上清中のＣｙｒ６１量の決定のために式２を使用した（図１９）。
【０１７３】
非特異的タンパク質結合によるＥＬＩＳＡでの偽陽性シグナルは、ＭＣＦ−７における適用タンパク質量に比例するシグナル強度として検出可能である（図１９Ａ）。実際に、同様の値が検出され、これは適用したタンパク質量とは独立していた。ＭＣＦ−７細胞溶解物１０μｇに異なる量の組み換えＣｙｒ６１を添加すると、予想よりも僅かに低いＣｙｒ６１値が得られた。このことから、このアッセイがＣｙｒ６１値を過小評価する傾向があること、およびＭＣＦ−７細胞溶解物におけるバックグラウンド値が非特異的結合に由来しないことが示唆される。細胞培養上清に対して対応する実験を実施した（図１９Ｂ）。ＭＣＦ−７細胞培養上清の容量の増加は、バックグラウンドノイズとして割り当てられ得る一定の低い値を示した。２０μＬの細胞培養上清への異なる量の組み換えＣｙｒ６１の添加は、精度範囲内でＣｙｒ６１の量を正確に反映する。
【０１７４】
ＭＤＡ−２３１の試料をＭＣＦ−７の試料と同様に分析した。ＭＤＡ−２３１に対する検量線は図２０で示され、検量線は、形態：ｙ＝０．４０６６９ｘ  ＋  ０．００２７９（式３）を有し、ｙはＣｙｒ６１のタンパク質の量［ｎｇ］、ｘは４５０ｎｍでのＥＬＩＳＡリーダーにおけるシグナル強度であり、切片は０．００２７９の固定値であった。
【０１７５】
ＭＤＡ−２３１細胞溶解物に対する分析は図２１Ａで示し、培養上清に対しては図２１Ｂで示す。１マイクログラムのＭＤＡ−２３１細胞溶解物は、これらの測定において８０ｐｇのＣｙｒ６１を含有し（図２１Ａ）、これは組み換えＣｙｒ６１を用いたスパイク実験のための参照値とし得る。例えば、１μｇのＭＤＡ−２３１細胞溶解物中に５０ｐｇの組み換えＣｙｒ６１を添加した後、１４０ｐｇのＣｙｒ６１が試料中で検出され、これは予想よりも１０ｐｇ多い。細胞培養上清の場合（図２１）、７５ｎＬのＭＤＡ−２３１細胞培養上清に対して、９３ｐｇのＣｙｒ６１が検出された。７５ｎＬの上清に５０ｐｇの組み換えＣｙｒ６１を添加すると、１５１ｐｇのＣｙｒ６１の値が得られ、これは予想よりも８ｐｇＣｙｒ６１が多かった。
【０１７６】
潜在的に、細胞培養上清に対して、ＥＬＩＳＡは、Ｃｙｒ６１量が少ないときに予想されるよりも僅かに高い値を与えた。これは、一連のＭＤＡ−２３１培養上清の希釈系列で見られ得、ここで、１０倍の試料体積の増加は、Ｃｙｒ６１の量の計算値の１０倍上昇未満であった。
【０１７７】
患者試料
血漿試料には細胞培養試料以外のタンパク質が含有され得るので、確立されたＣｙｒ６１−ＥＬＩＳＡを患者試料の分析に適用し得るか否かを調べた。第一に、Ｈ７８抗体を用いたウエスタンブロットによって、健常対照者の血漿中のＣｙｒ６１の状態を試験した（図２２）。これは、抗Ｃｙｒ６１抗体の他のタンパク質への非特異的結合の情報を提供し得る。１００μＬの血漿の適用の結果、ＳＤＳゲルバンドが大きく歪んだので（図示せず）、発明者らはタンパク質精製工程を適用した。Ｃｙｒ６１がこの精製工程で回収されることを確認するために、１００ｎｇの組み換えＣｙｒ６１を患者試料の１アリコートに添加した。
【０１７８】
ドナー＃３の試料においてのみ、およそ４０ｋＤａの質量の弱く非特異的なシグナルが検出された。Ｘ線フィルムの他の部分は非特異的シグナルを示さず、このことから、健常者の血漿は非常に低いレベルの可溶性Ｃｙｒ６１しか示さず、抗Ｃｙｒ６１抗体は血清中でＣｙｒ６１を特異的に検出することが示唆される。
【０１７９】
次に、健常ドナーからの血漿試料の分析に対してＣｙｒ６１  ＥＬＩＳＡを適用した。検量線は図２３で示され、形態：ｙ＝０．４０９８２ｘ＋０．００２８３（式４）を有し、ｙはＣｙｒ６１のタンパク質量［ｎｇ］、ｘは４５０ｎｍでのＥＬＩＳＡリーダーにおけるシグナル強度であり、切片は０．００２８３の固定値であった。
【０１８０】
５０歳を超える女性健常個体の血漿試料における分析を図２４で示す。これらの分析から、血漿中のＣｙｒ６１値がＭＤＡ−２３１の培養上清と比較して低いことが示された。さらに、試料中のＣｙｒ６１量の計算値は血漿量の増加とともに低下した。この効果に対する１つの理由はバックグラウンド減算後の残存ＯＤ値が小さいことであり、それは、バックグラウンド減算が全ての場合において完全ではないからである。この残存する小さい値もまた、１ミリリットルあたりのナノグラムへの変換中に増倍されるので、この残存値は試料体積の減少とともに上昇する。
【０１８１】
乳癌患者ならびに健常対照者の血漿試料の分析について、２．５μＬの血漿を分析した（図２４）。これらの分析から、試料中のＣｙｒ６１の真の存在ではなく不完全なバックグラウンド減算からの結果である１．１ｎｇ／ｍＬのＣｙｒ６１のバックグラウンド値の存在が示唆される。さらに、これらの分析から、健常個体の大きな体積の血漿を分析する場合、Ｃｙｒ６１測定結果がゼロに近いことが示唆された。
【０１８２】
５０歳を超える健常女性個体の血漿試料を用いて、Ｃｙｒ６１  ＥＬＩＳＡの検出限界を決定した。乳癌患者の分析には２．５μＬの血漿を適用したので、図２５で示される実験も２．５μＬの血漿を用いて実施した。この実験において、組み換えＣｙｒ６１を健常個体の血漿試料に添加し、検出されたＯＤ値をＣｙｒ６１添加なしの血漿のＯＤ値と比較した。これらの分析から、陰性試料からのＣｙｒ６１陽性試料の正しい識別の確率が、Ｃｙｒ６１の量の減少とともに低下したことが示された。陰性試料から有意に識別され得るＣｙｒ６１の最低量（ｐ＝０．０５；スチューデントのｔ検定）は、１．３ｐｇ  Ｃｙｒ６１（ｐ＝０．０２２）であったが、０．６ｐｇのＣｙｒ６１は有意に同定され得なかった（ｐ＝０．２９９）。
【０１８３】
２．５μＬの血漿中の１．３ｐｇのＣｙｒ６１の適用は、５２０ｐｇ／ｍＬのＣｙｒ６１濃度である。１．３ｐｇのＣｙｒ６１の場合、Ｃｙｒ６１濃度の計算値は１．７０７ｎｇ／ｍＬであった。２．５μＬの血漿体積に対して、１．１０９ｎｇ／ｍＬの偽陽性値が測定された（図２５）。検出値からこの偽陽性値を差し引くと、試料中に存在するＣｙｒ６１濃度は、１．７０７ｎｇ／ｍＬ〜１．１０９ｎｇ／ｍＬ＝０．５９８ｎｇ／ｍＬとなる。これは、１．３ｐｇの検出限界で７８ｐｇ／ｍＬまたは質量０．１９５ｐｇ  Ｃｙｒ６１の偏差である。
【０１８４】
血漿試料中のＣｙｒ６１安定性
乳癌患者の血漿試料中でＣｙｒ６１の安定性を分析した。加えて、これらの測定から、乳癌患者の血漿中のＣｙｒ６１濃度に対する最初の洞察がもたらされた（図２６）。最初の試料セットは、１９９８年および１９９９年に取得された、明白な転移の可視的徴候のない乳癌患者の血漿試料（ステージＭ０）を含んでいた（図２６Ａ）。発明者らは、試料取得時から発明者らの最初の測定までのＣｙｒ６１濃度の潜在的な変化を評価し得なかった。このような潜在的な変化を特定するために、第２の試料セットを分析した。第２セットは、診断時の転移性乳癌患者からの新鮮血漿試料（Ｍ１、図２６Ｂ）からなり、それらを２０１６年１０月の血液試料の調達直後に分析した。全ての試料を−８０℃で保存し、２．５μＬの血漿の適用によるＣｙｒ６１濃度の分析のために解凍した。
【０１８５】
Ｃｙｒ６１に対する最初の測定は２０１６年１０月に行い、１．５〜２２３．６ｎｇ／ｍＬのＭ０乳癌患者（ｎ＝１５）におけるＣｙｒ６１濃度の平均値が１１２．５±７１．５ｎｇ／ｍＬとなった。Ｍ１乳癌患者（ｎ＝１４）の場合、Ｃｙｒ６１濃度は５８．３ｎｇ／ｍＬ〜２８６．９ｎｇ／ｍＬの範囲であり、平均値は１４１．１±７８．１ｎｇ／ｍＬであった。
【０１８６】
新たに取得した血漿試料中のＣｙｒ６１濃度は、取得時（２０１６年１０月）、２０１７年４月および２０１７年８月に測定した（図２６Ｂ）。全体として、Ｃｙｒ６１濃度は経時的に著しく一定のままであり、その後の測定において初期Ｃｙｒ６１濃度（２０１６年１０月）と同様であった。１９９８年および１９９９年に取得した試料中の初期Ｃｙｒ６１濃度（図２６Ａ）は未知であった。実際に、２０１６年１０月、２０１７年４月および２０１７年８月に測定したＣｙｒ６１濃度は、各時点について各試料で同様であった。大部分の試料について、反復測定においてＣｙｒ６１濃度の僅かな上昇が観察されたが、これはＥＬＩＳＡの取り扱いが経時的に漸進的進歩したが故であり得る。
【０１８７】
これらの分析から、Ｃｙｒ６１は少なくとも調達後最初の１０か月間は血漿試料中で非常に安定しており、Ｃｙｒ６１レベルは凍結融解サイクルによって影響されないことが示唆された。１９９８年および１９９９年に取得した試料は、新たに分析した試料と同程度の安定性を示した。それゆえ、Ｃｙｒ６１の安定性のため、血漿試料は試料取得時のＣｙｒ６１濃度を正しく反映し得ると考えられる。
【０１８８】
結論
確立されたＣｙｒ６１  ＥＬＩＳＡは、細胞株試料（全細胞溶解物および培養上清）から、ならびに患者試料からのＣｙｒ６１の検出に適している。ＥＬＩＳＡの重要な構成要素である、２つの一次抗体Ｈ２およびＨ７８は、対照として組み換えヒトＣｙｒ６１タンパク質を使用して、これらの試料中のＣｙｒ６１への特異的結合を示した。特に、両抗体は、ＥＬＩＳＡと比較してウエスタンブロットにおいて同様の定量的結果を提供し、これは発明者らが異なる用途に使用し得る非常に均質でロバストな系を確立したことを示す。
【０１８９】
他の市販のＥＬＩＳＡについての詳細は通常業務上の秘密であり、一方で一次抗体は発明者らのアッセイで記載する。マウスモノクローナル抗Ｃｙｒ６１抗体とウサギ抗Ｃｙｒ６１抗体との組み合わせは、必要な特異性をアッセイに付与する。さらに、Ｃｙｒ６１に対する２つの抗体の認識部位は明確に分離され（Ｈ７８についてはａａ１６３〜２４０、Ｈ２についてはａａ３４５〜３８１）、これにより、高感度で立体障害が最小限であるＣｙｒ６１の特異的検出が可能になる。
【０１９０】
ＥＬＩＳＡに対して、発明者らは、試料中に存在するＣｙｒ６１に結合する捕捉抗体としてＨ２抗体を適用した。免疫沈降法を用いて、発明者らは、Ｈ２が試料中に存在するＣｙｒ６１のおよそ１００％を捕捉可能であることを示し得た。
【０１９１】
発明者らのＥＬＩＳＡから、例えば１〜１０００ｐｇ  Ｃｙｒ６１の、数桁の大きさにわたる線形ダイナミックレンジが示され、これにより、１回の実験で希釈度および濃縮度が高い試料から信頼性の高いＣｙｒ６１の定量が可能となる。ＥＬＩＳＡの検出限界は、血漿試料中の１．３ｐｇのＣｙｒ６１より低い。発明者らの経験からは、この感度は、乳癌、前立腺癌、肺癌または肝臓癌のような様々な異なる癌からの血漿試料を分析するのに間違いなく十分である。
【０１９２】
他のＥＬＩＳＡではあまり対処されない１つの興味深い特質は、患者試料における不完全なバックグラウンド減算から生じ得る偽陽性値の影響である（図２４参照）。発明者らは血漿試料に対してこの影響に対処し、この影響を考慮に入れる式を提供する。これらの研究により、偽陽性の結果の数が減少する。
【０１９３】
さらに、発明者らは、試料の具体的な要件に従いＥＬＩＳＡを設計し、評価できるようにするプロテアーゼ阻害剤カクテル、尿素、塩化ナトリウム、ＳＤＳなどのような試料中に存在する可能性がある様々な物質との適合性についてＥＬＩＳＡを分析した（結果は示さず）。
【０１９４】
発明者らのＥＬＩＳＡは記載の成分から設計されるので、１つの個々の実験に対して必要なウェルの正確な量を調製することが可能であり、これにより実験の費用効率が高まる。さらに、シグナル強度を失うことなく、試料の温置の前後にＥＬＩＳＡウェルを−２０℃で保存することが可能であり、これにより、実験設計の柔軟性が高まり、より大きな実験設定の設計がさらにサポートされる。
【０１９５】
実施例１０−  Ｃｙｒ６１  ＥＬＩＳＡによる乳癌患者の血漿中のＣｙｒ６１レベルの分析。
血液試料のプロテオームは癌細胞株の場合とは異なるため、発明者らは、確立されたＣｙｒ６１−ＥＬＩＳＡを血液試料の分析に適用し得るか否かを調べた。血中の可溶性Ｃｙｒ６１を検出するために、血漿を分析した。
【０１９６】
第一に、ウエスタンブロットによって、健常対照個体の血漿中のＣｙｒ６１の状態を試験した（図１２Ｃ）。細胞株における分析と同様に、これは抗Ｃｙｒ６１抗体の非特異的結合の情報を提供し得る。１００μＬの血漿の適用の結果、ＳＤＳ−ゲルバンドが大きく歪んだので、発明者らは、ここで分析した試料に対してタンパク質精製工程を適用した。Ｃｙｒ６１がこの精製工程で回収されることを確認するために、１００ｎｇの組み換えＣｙｒ６１を患者試料の１アリコートに添加した。
【０１９７】
ドナー＃３の試料においてのみ、およそ４０ｋＤａの質量の弱く非特異的なシグナルが検出された。Ｘ線フィルムの他の部分は非特異的シグナルを示さず、このことから、健常者の血漿は非常に低いレベルの可溶性Ｃｙｒ６１しか示さず、抗Ｃｙｒ６１抗体は血清中のＣｙｒ６１を特異的に検出することが示唆される。
【０１９８】
ウエスタンブロットにより抗Ｃｙｒ６１抗体の特異性を確認した後、以前に記載されたようにＣｙｒ６１−ＥＬＩＳＡを血漿試料に適用した（図２７）。ヒト材料に対して行われた全アッセイに対して、１００μＬの血漿を３つ組（in triplicates）で分析し、値をＣｙｒ６１濃度［ｎｇ／ｍＬ］に対して計算した。患者試料をタンパク質精製工程なしで分析した。最初に、健常個体から自由裁量で選択された１４名（性別、年齢に関係なく；図２７Ａ）の血漿を分析した。参考値として１００ｎｇの組み換えＣｙｒ６１を分析した。
【０１９９】
血漿中に存在するメイヤー（ｍａｙｏｒ）タンパク質はアルブミンであるので、発明者らはさらに、主要タンパク質成分としてウシアルブミンを含有する１０％の精製ウシ胎児血清を含む細胞培養培地を分析した。ゆえに、細胞培養培地について２．７８±０．２６ｎｇ／ｍＬの得られた値は、非特異的バックグラウンド値と見なされ得る。
【０２００】
健常対照者からの試料中のＣｙｒ６１濃度計算値は２．２７±０．３５ｎｇ／ｍＬ〜５．７１±０．６０ｎｇ／ｍＬの範囲であった。全１４試料の平均値は３．４７±１．４０ｎｇ／ｍＬであった。乳癌は５０歳を超える女性に頻繁に発生するので、発明者らは血液試料取得時に５０歳を超えていた２０名の健常女性からの血液試料を分析した（図２７Ｂ）。この群において、血漿中のＣｙｒ６１濃度は１．９３±０．３９ｎｇ／ｍＬ〜３．９８±０．６６ｎｇ／ｍＬの範囲であった。全２０試料の平均値は３．０７±０．２６ｎｇ／ｍＬであった。
【０２０１】
同様に、転移性乳癌患者および原発腫瘍の診断時に明白な転移がない乳癌患者（Ｍ０）からの血漿試料中のＣｙｒ６１値を分析した（図２７Ｃ）。転移性乳癌患者（ｎ＝７）からの試料の平均Ｃｙｒ６１値は１１５．４±８４．１ｎｇ／ｍＬであった。値は、個々の患者において５６．６±１．１ｎｇ／ｍＬ〜２９７．４±２．５ｎｇの範囲であった。非転移性（ステージＭ０）の癌患者（ｎ＝１７）については、１３．９±０．４９ｎｇ／ｍＬのＣｙｒ６１に対する平均値が検出され、その値は、個々の患者においては１１．０±０．８ｎｇ／ｍＬ〜１５．４±１．２ｎｇ／ｍＬの範囲であった。
【０２０２】
分析した全健常者（ｎ＝３５）と分析した全癌患者（Ｍ0およびＭ1；ｎ＝２２）との間のＣｙｒ６１レベルは統計学的に有意に異なっていた（ｐ＝１．３６×１０-5）。非転移性（Ｍ0；ｎ＝１７）および転移性患者（Ｍ1；ｎ＝７）の比較に対して、ｐ＝３．７０×１０-5の統計学的に有意な値が得られた。
【０２０３】
これらの分析から、乳癌患者の血漿が健常対照と比較して高いＣｙｒ６１値を示し、Ｃｙｒ６１値が転移進行の過程で上昇したことが示された。
【０２０４】
癌患者からの血漿試料の分析に対してＣｙｒ６１  ＥＬＩＳＡを適用し得る。健常対照者、特に５０歳を超える女性個体の血漿試料のＣｙｒ６１値は非常に低かった。これらの値は、腫瘍細胞のない細胞培養培地の値に匹敵し、これを非特異的対照として分析した。それにもかかわらず、発明者らは、ヒト試料に対する実際の値が計算値よりも僅かに低くなり得るように、血漿試料での分析に対してバックグラウンド減算を行っていない。
【０２０５】
発明者らは、最近、Ｃｙｒ６１  ＥＬＩＳＡをサンドイッチＥＬＩＳＡに変更した。最適化プロトコールは方法のセクションに記載する。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（陽性対照）およびＭＣＦ−７（陰性対照）からの細胞培養上清において得られたこのアッセイの例を図２８で示す。このアッセイにより、０．１２５ｎｇのＣｙｒ６１量に対して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の上清中のＣｙｒ６１を統計学的に有意に検出することが可能となった（ｐ＝０．０３１、スチューデントのｔ検定）。これらの実験のために、１０５０μｇ／ｍＬのＣｙｒ６１濃度を有するＭＤＡ−ＭＢ−２３１の細胞培養上清を適用した。標準として組み換えＣｙｒ６１を用いて濃度を測定した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＣＦ−７の細胞培養上清を希釈系列で適用した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１から得られた値の場合、検量線が導き出された。０．５ｎｇの組み換えＣｙｒ６１を添加した細胞培養培地の試料にこの検量線を適用した。この試料の吸光度に対する検量線の適用から、０．４８ｎｇのＣｙｒ６１の値が得られた。
【０２０６】
このＣｙｒ６１アッセイの最初の適用として、発明者らは、診断時からの、明白な転移の徴候のない５名の乳癌患者の試料を健常個体の５試料と比較した。乳癌患者に対して、発明者らは、平均値１０．３ｎｇ／ｍＬ±９．２ｎｇ／ｍＬが検出され、健常個体に対しては１．０ｎｇ／ｍＬ±０．４ｎｇ／ｍＬの値が認められた。
【０２０７】
ＥＬＩＳＡによるＣｙｒ６１の検出の場合、メイヤー（ｍａｙｏｒ）構成成分は、抗Ｃｙｒ６１抗体（Ｈ７８）ウサギポリクローナル（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）の抗Ｃｙｒ６１抗体、マウスモノクローナル（クローン３６５１０８）およびＥＬＩＳＡリーダー（例えば、適用される個々の基質に適した波長での、ＮａｎｏＱｕａｎｔ  ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００ｐｒｏ，Ｔｅｃａｎ，Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）である。陽性対照は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１またはＨｓ５７８ｔまたは市販の組み換えヒトＣｙｒ６１（Ａｂｎｏｖａ，Ｔａｉｐｅｉ，Ｔａｉｗａｎ）の細胞培養上清である。これらの細胞株の上清に対する値は、０．９〜１．４μＬ／ｍＬの範囲であるはずである。細胞培養上清は、細胞上で少なくとも４８時間維持するべきである。陰性対照は、ＭＣＦ−７もしくはＧＩ１０１由来の細胞培養上清または新鮮な細胞培養培地であり得る。ヒト血漿試料の分析のための適切なアプローチは、血漿単独と比較される健常対照者の血漿に添加される組み換えＣｙｒ６１を用いた希釈系列の作製である。血漿中のＣｙｒ６１濃度は通常１ｎｇ／ｍＬ（健常者）、１０ｎｇ／ｍＬ（転移のない乳癌）〜１００ｎｇ／ｍＬ（転移性乳癌）の範囲である。
【０２０８】
次に、発明者らは、Ｃｙｒ６１検出のために、抗Ｃｙｒ６１抗体Ｈ２およびＨ７８を含むＥＬＩＳＡを用いて、乳癌患者の血漿試料中のＣｙｒ６１濃度を調べた（図２４、図２５）。血中の可溶性Ｃｙｒ６１を検出するために、血漿を分析した。乳癌は５０歳を超える女性に頻繁に発生することが多いので、発明者らは血液試料取得時に５０歳を超えていた健常女性の血液試料を分析した。発明者らは、Ｃｙｒ６１タンパク質の検出用に特別に開発した発明者らの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いて、７８６名の乳癌患者および５０歳を超える１２４名の健常女性の血漿２．５μＬを分析した。健常女性は、０．５８８±０．１８７ｎｇ／ｍＬのＣｙｒ６１濃度を示したが、一方で乳癌患者（ｎ＝７８６）は２５．６±４１．３ｎｇ／ｍＬという高いＣｙｒ６１濃度であった。注目すべきことに、乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ、ｎ＝７４）またはステージＴ１乳癌（ｎ＝３８６）を有する患者が示したＣｙｒ６１レベルは既に上昇していた（それぞれ３１．８±４５．８ｎｇ／ｍＬおよび２９．０±４４．３ｎｇ／ｍＬ）。健常対照と乳癌患者との間のこの異なるＣｙｒ６１パターンゆえに、発明者らは、その後、ＲＯＣ分析を使用して乳癌の検出のためのＣｙｒ６１の感度および特異度を求めた（図３３）。全乳癌患者に対して、発明者らは感度６９．８％および特異度１００％であると判断した。早期（Ｔ１）浸潤性乳癌の患者では、感度は７１．５％、特異度はまた１００％であった。意外にも、発明者らのアッセイは、同様の精度で乳房の乳管内上皮内癌（ＤＣＩＳ）病変さえも検出可能であった（感度７４．３％；特異度１００％）。これらの高い特異性は、全ての健常対照がＣｙｒ６１に対して実質的に陰性であったという事実によるものであった。
【０２０９】
実施例１１−  乳癌患者の固形腫瘍組織におけるＣｙｒ６１発現
発明者らは、原発腫瘍におけるＣｙｒ６１発現が骨髄への腫瘍細胞播種の決定因子であるか否かを評価した。発明者らは、１４７個の原発乳房腫瘍の免疫染色を行い（図３Ａ、図４の表２）、発明者らの標準化アッセイで検出したＤＴＣの存在と知見を相関させた（３）。全部で３５個の腫瘍（２４％）が強いＣｙｒ６１シグナルを示し、２９個の腫瘍（２０％）が中程度のシグナルを示し、８３個の腫瘍（５６％）が弱いＣｙｒ６１シグナルを示すかまたは全く示さなかった。興味深いことに、原発腫瘍におけるＣｙｒ６１の状態とＤＴＣの状態との有意な相関は見られなかった。
【０２１０】
さらに、Ｃｙｒ６１染色は、乳癌患者の骨転移で観察された（図３Ｂ；ｎ＝４）。腫瘍細胞はＣｙｒ６１について一様に陽性であったが、一方で、周囲の正常組織は非常に弱い染色を示したか、またはシグナルを全く示さなかった。残念ながら、同じ患者からの一致した原発腫瘍は入手できなかった。
【０２１１】
実施例１２−  臨床試料からのＣＴＣ／ＤＴＣにおけるＣｙｒ６１発現
続いて、発明者らは、癌患者から新たに得られたＤＴＣおよびＣＴＣにおけるＣｙｒ６１発現を分析した。骨髄および血液中の腫瘍細胞に対するマーカーとしてのＣｙｒ６１の可能性を評価するために、乳癌細胞のＣｙｒ６１レベルを、健常ボランティアの単核血液細胞または骨髄細胞と比較した（図２９）。第１の実験において、発明者らはウエスタンブロットにより単核血液細胞を分析し（図２９Ａ）、これらの細胞がＣｙｒ６１に対して陰性であることを見出した。次に、健常ボランティアの単核血液（ＭＤＡ−２３１もしくはＢＣ−Ｍ１）または骨髄細胞（ＭＤＡ−２３１）に対する内部陽性対照として細胞株を添加した。ＭＤＡ−２３１およびＢＣ−Ｍ１におけるＣｙｒ６１シグナルは、血液細胞または骨髄細胞とは明らかに異なっていた（図２９Ｂ）。ＤＴＣ陽性乳癌患者の少数の３つの骨髄試料セットにおける方法の技術的評価から、殆どのＤＴＣがＣｙｒ６１シグナルを示さないことが明らかになったが、一方で大部分のＤＴＣが示すＣｙｒ６１シグナルは非常に弱いかまたは検出可能ではない（図２９Ｃ）。
【０２１２】
高感度のＣｙｒ６１検出は、それらのサイズによってＣＴＣを濃縮し、さらに低いＣｙｒ６１シグナル強度でも信頼性の高いその後の顕微鏡検出を可能にする、新規の標識不含技術によって得られた（図３０）。ＥＭＴが起こっているＣＴＣを検出するために重要であるサイトケラチン発現が弱い場合（図３０Ｂ）でさえも、腫瘍細胞がサイトケラチン染色によって検出され（図３０Ａ）、さらに白血球をＣＤ４５抗体で対比染色することによってアッセイ特異性が確認された。
【０２１３】
次いで、このアッセイを３３名の乳癌患者からの末梢血試料に適用した。合計で、８例でＣＴＣが検出され、３名の患者でＣｙｒ６１陽性ＣＴＣが発見された。３名の患者の６９個のＣＴＣから、１７個の細胞（２５％）がＣｙｒ６１陽性であった。ＣＴＣにおけるＣｙｒ６１分析の詳細は、図３２の表３で提供する。
【０２１４】
強いＣｙｒ６１シグナルを有するＣＴＣは、一般に、明確なサイトケラチン陽性細胞質病巣のみを有する断片化サイトケラチン染色パターンおよびシグナル強度低下を示した（図３０Ｃ上パネル）。対照的に、Ｃｙｒ６１弱陽性またはＣｙｒ６１陰性ＣＴＣは一般に、細胞質全体にわたって広がる高いシグナル強度を有するフィラメント状サイトケラチンパターンを示した（図３０Ｃ下パネル）。
【０２１５】
ＤＴＣおよびＣＴＣにおけるＣｙｒ６１発現の動態へのより深い洞察を得るために、発明者らは低酸素微小環境から血流への腫瘍細胞の播種のシミュレーションを行った。血中のＣＴＣの半減期はおよそ１〜２．４時間であり、４時間後にはＣＴＣのおよそ３分の１が依然として血中で検出可能である（３５）。より大きな血管中の酸素濃度は１０％Ｏ2前後である。したがって、発明者らは、腫瘍低酸素をシミュレーションするために細胞株を低酸素（１％Ｏ2）条件下で１４日間培養し、続いてこれらの細胞を４時間、１０％Ｏ2に供した（図３０Ｄ）。問題は、低酸素微小環境からのＣＴＣが、血中の酸素濃度上昇に対するＣＴＣ応答においてＣｙｒ６１よりも速く二次的部位に達するか否かということであった。
【０２１６】
Ｃｙｒ６１レベルは、標準的培養条件と比較して、持続性低酸素下で大きく変化し、ＭＤＡ−２３１およびＢＣ−Ｍ１はＣｙｒ６１を強く誘導し、ＭＤＡ−４６８はＣｙｒ６１を下方制御した。再酸素負荷条件下（１４日間１％Ｏ2＋４時間１０％Ｏ2対１４日間１％Ｏ2）で、ＭＤＡ−４６８およびＭＤＡ−２３１はＣｙｒ６１レベルをほぼ一定に保ち、このことから、対応するＣＴＣ表現型が、Ｃｙｒ６１レベルの小さな変化のみで二次的部位に達することが示唆される。対照的に、ＢＣ−Ｍ１は再酸素負荷に応答してＣｙｒ６１を１６％に下方制御し（１４日間１％Ｏ2＋４時間１０％Ｏ2対１４日間１％Ｏ2）、このことから、ＢＣ−Ｍ１表現型を有する細胞が、それらがそのパッセージを開始した際のもの以外のＣｙｒ６１表現型を有する遠隔部位に到達可能であり得ることを示唆する。
【０２１７】
転移性乳癌を有する患者（患者６）に対して、患者試料中のＣｙｒ６１検出の高い診断値が示される。血中の可溶性Ｃｙｒ６１の分析（図２７Ｃ）およびＣＴＣ中のＣｙｒ６１の同時分析（図１７）を実施し、これにより、この患者が血中で７９．８±４．５ｎｇ／ｍＬという高いＣｙｒ６１レベルおよびＣｙｒ６１陽性ＣＴＣを有したことが示された。
【０２１８】
実施例１３−  考察
今回、発明者らは、播種性癌細胞における低酸素およびグルコース飢餓などの微小環境ストレス条件に敏感に応答する関連タンパク質としてＣｙｒ６１を同定した。乳癌患者からの臨床試料を分析することによって、血漿中、原発腫瘍細胞、ＣＴＣ、ＤＴＣおよび明白な骨転移におけるＣｙｒ６１の存在を実証した。
【０２１９】
近年、癌患者の末梢血中の腫瘍細胞によって放出される循環腫瘍細胞または物質（ＤＮＡ、タンパク質またはエキソソーム）の「液体生検」分析は著しい進歩を遂げてきた（３７）。Ｃｏｈｅｎらの最近の研究において、循環ＤＮＡの突然変異分析と血清中の腫瘍関連タンパク質の測定とを組み合わせた新しい血液検査の開発により、さらに著しい進歩が報告された（３８）。しかし、癌スクリーニングの顕著な特徴となる、癌の初期段階の検出率は依然として課題がある。合計で、ステージＩの腫瘍のうち４３％のみが陽性となった。乳癌試料では割合がさらに低く、全ステージにわたる感度は僅か３３％にしか達しなかった（３８）。癌の早期検出によって癌関連死亡率を減少させ得ることが知られているので、これは意義のある挑戦である（３９）。
【０２２０】
対照的に、発明者らは、性別や年齢が合致する健常対照個体と比較して、乳癌の初期段階で血漿中のＣｙｒ６１濃度が既に上昇していることを発見した。発明者らのＥＬＩＳＡアッセイは、乳癌スクリーニングのための現在の標準的なツールとしてのマンモグラフィーと比較して優れた性能も示す。ＤＣＩＳサブグループの場合、マンモグラフィーを用いた感度が５８％〜８１％、特異度が７２％〜７９％であることが最近報告された（４０）。ゆえに、発明者らのＣｙｒ６１  ＥＬＩＳＡにとって、僅か２．５μＬの血漿の分析は、「健常な」状態と乳癌の初期段階とを識別するのに十分である。Ｃｙｒ６１  ＥＬＩＳＡアッセイは、確立された液体生検アッセイに対する単純で安価な代替法である。将来的には、このアッセイは、乳癌のスクリーニングプログラムにおける女性のマンモグラフィーの使用を補完し、先導し得る有用なツールとなり得る。
【０２２１】
Ｃｙｒ６１は、細胞外間隙に分泌され得る４２ｋＤａの細胞質タンパク質であり、遠隔の明白な転移の徴候の全くない早期乳癌においてＣｙｒ６１レベル上昇が既に観察され得る。発明者らは、血漿中の分泌Ｃｙｒ６１の検出が乳癌の早期検出およびリスク評価のための診断用途となる可能性があることを示すことができた（下記参照）。
【０２２２】
癌において、Ｃｙｒ６１は、分化、遊走に、および血管形成の誘導または細胞増殖の制御に関与する。乳癌において、Ｃｙｒ６１発現上昇は、細胞株における高い侵襲性およびマウスにおけるこれらの細胞株の注射後の転移形成と関連付けられることが報告された。
【０２２３】
実際、タンパク質は低酸素のような微小環境ストレス下で制御され得、これは間葉性の特質の誘導および腫瘍細胞の播種および転移にも影響を及ぼす。
【０２２４】
したがって、発明者らは骨髄中の酸素濃度の下限である１％Ｏ2に細胞株を供した。さらに、殆どのヒト細胞において１％Ｏ2はＨＩＦ−１αを安定化するのに十分である。ＢＣ−Ｍ１およびＨｓ５７８ｔを除いて、分析した全ての細胞株はこれらの条件下でＣｙｒ６１を下方制御した。ＢＣ−Ｍ１およびＨｓ５７８ｔにおいて、Ｃｙｒ６１の下方制御は、Ｃｏ2+処理によるＨＩＦ−１αの強力な安定化の際にのみ観察された。これは、１％Ｏ2が、これらの細胞においてＨＩＦ−１αのロバストな安定化およびその後のＣｙｒ６１の下方制御を誘導するのに十分ではないことを示唆する。ゆえに、Ｈｓ５７８ｔおよびＢＣ−Ｍ１の表現型を有するＤＴＣは、骨髄微小環境においてＣｙｒ６１レベルを維持することが可能であり、Ｃｙｒ６１発現によって検出可能である。Ｈｓ５７８ｔおよびＢＣ−Ｍ１は上皮マーカータンパク質に対して弱い陽性しか示さない間葉性表現型を示すので、この知見は特に興味深いものである（１２）。
【０２２５】
さらに、発明者らは、血行性またはリンパ系の何れかの拡散によって播種する腫瘍実体からの細胞株において、Ｃｙｒ６１およびＰＤ−Ｌ１が同時発現することが多いことに気付いた。発明者らはまだＰＤ−Ｌ１とＣｙｒ６１との機能的関係を調べていない。それにもかかわらず、Ｃｙｒ６１とＰＤ−Ｌ１との同時発現は、Ｃｙｒ６１陽性細胞が免疫細胞による排除から十分に保護されることを示唆する。ゆえに、乳癌、前立腺癌、肺癌および頭頸部癌患者由来のＣＴＣまたはＤＴＣにおける強力なＣｙｒ６１発現の検出は、免疫細胞標的化からの細胞保護の指標となり得る。ＭＤＡ−２３１の脳転移細胞株におけるＣｙｒ６１およびＰＤ−Ｌ１のレベル上昇は、Ｃｙｒ６１が骨への転移だけでなく他の遠隔部位、特に脳への転移にも関係し得ることを示唆する。ハーセプチンのような治療用抗体は血液脳関門を通過できないので、脳転移は乳癌転移の治療において特に興味深い。
【０２２６】
発明者らは、発明者ら自身の実験経験から、抗体によるＣｙｒ６１検出（ウエスタンブロットおよび免疫細胞化学）は、抗体によるＰＤ−Ｌ１検出よりもはるかに高感度でロバストであることを知っている。ゆえに、ＣＴＣおよびＤＴＣにおけるＣｙｒ６１検出はまた、ＣＴＣおよびＤＴＣが免疫細胞破壊から逃れる能力に対する適切な代用マーカーであり得る。
【０２２７】
分析した全ての膵臓癌細胞株はＣｙｒ６１に対して陽性であり、このことから、膵臓癌においてＣｙｒ６１が発現されることが多いことが示唆される。特に、発明者らは膵臓癌細胞株でＣｙｒ６１レベルが高く、ＢｘＰＣ３では間葉性の特質Ｐａｎｃ１があり、Ｃｙｒ６１レベルが低い（上皮表現型）ことを発見した。乳癌および前立腺癌のような腫瘍実体とは異なり、転移性拡散は膵臓癌での腹膜播種を介して起こることが多い。膵臓癌において、ＥＭＴおよび播種は、膵炎の炎症段階、したがって膵臓癌の前悪性段階で既に起こり得る。ゆえに、Ｃｙｒ６１が膵炎の段階でＥＭＴ中に上方制御されること、およびＣｙｒ６１が既に炎症段階にある膵臓疾患を検出するのに適している可能性がある。
【０２２８】
発明者らのインビトロ研究を検証するために、臨床検体中のＣｙｒ６１タンパク質レベルを免疫組織化学によって評価した。染色強度のスコア付けから、原発性乳房腫瘍の２４％が強いＣｙｒ６１発現を示したことが明らかになったが、これは他のグループによる以前の観察と同様である。Ｃｙｒ６１発現は骨髄中のＤＴＣの検出と相関しなかったが、これは実際の微小環境条件に応じたＣｙｒ６１の多用途制御によって説明し得る。
【０２２９】
続いて、発明者らは、乳癌患者の播種性癌細胞におけるＣｙｒ６１の発現に焦点を当てた。ＣＴＣ中のＣｙｒ６１を検出するために、高感度の多重免疫染色アッセイが開発され、それにより発明者らは低いＣｙｒ６１レベルを有する腫瘍細胞さえも検出することが可能になった。発明者らは、患者間および患者内の変動性の両方に関して、ＣＴＣにおけるＣｙｒ６１レベルの著しい不均一性を認めた。この知見は、ＣＴＣが様々な部位に由来し、Ｃｙｒ６１発現に影響を及ぼす様々な微小環境条件に遭遇したかもしれないという事実を反映し得る。ＣＴＣ／ＤＴＣにおけるサイトケラチン検出のために、発明者らはここで、高感度かつ広範囲の汎サイトケラチン抗体カクテルを適用した。このカクテルは、腺癌に典型的なサイトケラチンの発現下方制御を伴うＤＴＣ細胞株におけるサイトケラチンの検出に適している（１２、２９）。興味深いことに、Ｃｙｒ６１陽性／サイトケラチン陰性細胞は発見されず、これにより、全てのサイトケラチンタンパク質を完全に欠く乳癌細胞は非常に稀であるという以前の発見が裏付けられる（３２）。それはさらに、造血細胞におけるＣｙｒ６１の欠如を強調し、ＣＴＣ／ＤＴＣに対するマーカーとしてのＣｙｒ６１の潜在的な有用性を示す。
【０２３０】
発明者らの知見は、播種性腫瘍細胞において上皮性から間葉性特性への滑らかな移行が起こり得るが、腺癌細胞の全体的に間葉性の表現型への完全な変換が生体内原位置で起こり得ることは（たとえあっても）少ないという見解を裏付ける。
【０２３１】
まとめると、本発明の知見は、乳癌細胞におけるＣｙｒ６１発現が原発部位から転移部位への通過中の多様な制御の影響の根底にあり得、したがって原発腫瘍における細胞質Ｃｙｒ６１が、生存および転移性成長に必要な適応変化の良好な指標ではないという見解を裏付ける。
【０２３２】
発明者らは、正常な血液および骨髄細胞が極めて低いＣｙｒ６１レベルを示すことを観察し、これによって、発明者らは、間葉性特質を有するＣＴＣおよびＤＴＣに対する検出マーカーとしてＣｙｒ６１をさらに開発するようになり得る。これらの細胞は、偽陰性の所見を説明し得る、上皮抗原に基づく現在のアッセイでは見逃されることが多い。したがって、ｍＣＴＣおよびｍＤＴＣに対する新しいマーカーが緊急に必要とされる。間葉性特質を有する腫瘍細胞におけるＣｙｒ６１検出は、ｍＣＴＣ／ｍＤＴＣの同定を裏付け得る。
【０２３３】
将来の診断用途のために最も重要なこととして、乳癌患者における有意により高い値と比較した場合、年齢が適合した健常者の血漿は、Ｃｙｒ６１  ＥＬＩＳＡで検出される分泌Ｃｙｒ６１が非常に低いレベルであった。この重要な発見から、血漿中のＣｙｒ６１レベルの上昇が乳癌細胞の特質であることが示唆される。
【０２３４】
分析した全ての細胞株において、発明者らは分泌されたＣｙｒ６１の量が細胞質Ｃｙｒ６１の量に比例することを発見した。したがって、肺癌、前立腺癌、頭頸部癌または膵臓癌のような細胞質Ｃｙｒ６１に陽性である癌実体の細胞株もまたＣｙｒ６１を分泌すると考えられる。任意に集めた健常ドナー群が示すＣｙｒ６１レベルは非常に低いので、発明者らは、乳癌以外の実体の癌患者の血漿中の高Ｃｙｒ６１レベルの検出を予想する。
【０２３５】
診断時に癌患者から得られた分析血漿試料は全てＣｙｒ６１陽性であったが、一方で発明者らは原発腫瘍のうち５６％を組織マイクロアレイアレイ上でＣｙｒ６１の陽性が弱いかまたは陰性であるものとして分類した。これに対する１つの理由は、Ｃｙｒ６１に対して異なる感度を有する異なる検出方法（免疫組織化学対ＥＬＩＳＡ）であり得る。ＩＨＣの場合、Ｃｙｒ６１分子がスライド表面上に広がるが、ＥＬＩＳＡは、１００μＬの試料中の全Ｃｙｒ６１分子のシグナルを単一のＯＤ値に統合する。このＥＬＩＳＡアプローチは、感度を高め得、より多くのＣｙｒ６１陽性測定につながるが、Ｃｙｒ６１陽性単一細胞とＣｙｒ６１陰性単一細胞とを区別できない。
【０２３６】
さらに、腫瘍細胞はかなりの量のＣｙｒ６１を細胞外間隙に分泌し得；特に持続的な流体交換の条件下では、分泌されるＣｙｒ６１量が上昇する。患者において、これは腫瘍細胞が血管に近接している状況に類似している。これは、Ｃｙｒ６１分泌の定常的な離脱および腫瘍細胞によるＣｙｒ６１分泌誘導につながり得る。これらの条件下で、新生Ｃｙｒ６１は直ちに分泌され得るので、Ｃｙｒ６１が細胞内に蓄積され得なくなる。ゆえに、液体交換条件下でのＣｙｒ６１分泌を伴うＥＬＩＳＡの感度は、腫瘍細胞が低レベルのＣｙｒ６１を示すときまたは腫瘍細胞コロニーが比較的小さいときでさえ、血漿中のＣｙｒ６１の検出を可能にし得る。
【０２３７】
したがって、血漿中のＣｙｒ６１のＥＬＩＳＡに基づく検出は、乳癌の早期検出に適切であり得、これは５０歳を超える女性の現在のスクリーニングプログラムにおけるマンモグラフィーの数を減少させるのに役立ち得る。これによって、医療費および放射線により起こる副作用の可能性がかなり低下する。さらに、発明者らは、ＣＹＲ６１レベルが腫瘍進行とともに上昇する（すなわち、Ｍ０患者と比較してＭ１患者でより高値）ことを示し、このことから、癌関連死の第１位の原因である転移への進行のリスクを評価および監視し、抗転移療法の有効性を監視するための血液に基づくマーカーとしての使用の可能性が示される（３６）。
【０２３８】
References
1.  Pantel K, Brakenhoff RH. Dissecting the metastatic cascade. Nat Rev Cancer 2004;4(6):448-56.
2.  Pantel K, Alix-Panabieres C, Riethdorf S. Cancer micrometastases. Nat Rev Clin Oncol 2009;6(6):339-51.
3.  Janni W, Vogl FD, Wiedswang G, Synnestvedt M, Fehm T, Juckstock J, et al. Per-sistence of disseminated tumor cells in the bone marrow of breast cancer patients predicts increased risk for relapse--a European pooled analysis. Clin Cancer Res 2011;17(9):2967-76.
4.  Yu M, Bardia A, Wittner BS, Stott SL, Smas ME, Ting DT, et al. Circulating breast tumor cells exhibit dynamic changes in epithelial and mesenchymal composition. Science 2013; 339(6119):580-4.
5.  Alix-Panabieres & Pantel, Challenges in Circulating Tumor Cell Research, Nature Reviews, vol. 14, 2014, 623-631.
6.  US 2004/0086504. 
7.  US 2011/0189700.
8.  Sun et al., Involvement of Cyr61 in Growth, Migration and Metastasis of Prostate Cancer Cells, British Journal of Cancer, vol. 99, 2008, 1656-1667.
9.  Lin et al., Elevated Expression of Cyr61 Enhances Peritoneal Dissemination of Gas-tric Cancer Cells Through Integrin α2β1, The Journal of Biological Chemistry, vol. 282, 2007, 34594-34604.
10.  Bendas & Borsick, Cancer Cell Adhesion and Metastasis, Selectins, Integrins and the Inhibitory Potential of Heparins, International Journal of Cell Biology, vol. 2012, 1-10.
11.  Pantel K, Dickmanns A, Zippelius A, Klein C, Shi J, Hoechtlen-Vollmar W, et al. Es-tablishment of micrometastatic carcinoma cell lines: a novel source of tumor cell vaccines. J Natl Cancer Inst 1995;87(15):1162-8.
12.  Bartkowiak K, Effenberger KE, Harder S, Andreas A, Buck F, Peter-Katalinic J, et al. Discovery of a novel unfolded protein response phenotype of cancer stem/progenitor cells from the bone marrow of breast cancer patients. J Proteome Res 2010;9(6):3158-68.
13.  Pollari S, Kakonen SM, Edgren H, et al. Enhanced serine production by bone meta-static breast cancer cells stimulates osteoclastogenesis. Breast Cancer Res Treat 2012; 125: 421-430.
14.  Peyruchaud O, Winding B, Pecheur I, et al. Early detection of bone metastases in a murine model using fluorescent human breast cancer cells: application to the use of the bisphosphonate zoledronic acid in the treatment of osteolytic lesions. J Bone Miner Res 2001; 16: 2027-2034.
15.  Dittmar T, Husemann A, Schewe Y, Nofer JR, Niggemann B, Zanker KS, et al. In-duction of cancer cell migration by epidermal growth factor is initiated by specific phosphorylation of tyrosine 1248 of c-erbB-2 receptor via EGFR. FASEB J 2002;16(13):1823-5.
16.  Lehtinen L, Vainio P, Wikman H, Reemts J, Hilvo M, Issa R, et al. 15-Hydroxyprostaglandin dehydrogenase associates with poor prognosis in breast can-cer, induces epithelial-mesenchymal transition, and promotes cell migration in cul-tured breast cancer cells. J Pathol 2012;226(4):674-86.
17.  Bartkowiak K, Wieczorek M, Buck F, Harder S, Moldenhauer J, Effenberger KE, et al. Two-dimensional differential gel electrophoresis of a cell line derived from a breast cancer micrometastasis revealed a stem/ progenitor cell protein profile. J Proteome Res 2009;8(4):2004-14.
18.  Neuhoff V, Arold N, Taube D, et al. Improved staining of proteins in polyacryla-mide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis 1988; 9: 255-262.
19.  Kohlbacher O, Reinert K, Gropl C, et al. TOPP--the OpenMS proteomics pipeline. Bioinformatics 2007; 23: e191-197.
20.  Sturm M, Bertsch A, Gropl C, et al. OpenMS - an open-source software framework for mass spectrometry. BMC Bioinformatics 2008; 9: 163.
21.  Geer LY, Markey SP, Kowalak JA, et al. Open mass spectrometry search algorithm. J Proteome Res 2004; 3: 958-964.
22.  Fenyo D, Beavis RC. A method for assessing the statistical significance of mass spectrometry-based protein identifications using general scoring schemes. Anal Chem 2003; 75: 768-774.
23.  Nahnsen S, Bertsch A, Rahnenfuhrer J, et al. Probabilistic consensus scoring im-proves tandem mass spectrometry peptide identification. J Proteome Res 2011; 10: 3332-3343.
24.  Yuan Y, Hilliard G, Ferguson T, et al. Cobalt inhibits the interaction between hypox-ia-inducible factor-alpha and von Hippel-Lindau protein by direct binding to hypoxia-inducible factor-alpha. J Biol Chem 2003; 278: 15911-15916.
25.  Mazel M, Jacot W, Pantel K, Bartkowiak K, Topart D, Cayrefourcq L, Rossille D, Maudelonde T, Fest T, Alix-Panabiィィres C. Frequent expression of PD-L1 on circulat-ing breast cancer cells. Mol Oncol. 2015 Jun 9. doi: 10.1016/j.molonc.2015.05.009. [Epub ahead of print].
26.  Barsoum IB, Smallwood CA, Siemens DR, et al. A mechanism of hypoxia-mediated escape from adaptive immunity in cancer cells. Cancer Res 2014; 74: 665-674.
27.  Yachida S, Iacobuzio-Donahue CA. The pathology and genetics of metastatic pan-creatic cancer. Arch Pathol Lab Med. 2009 Mar;133(3):413-22.
28.  Rhim AD, Mirek ET, Aiello NM, Maitra A, Bailey JM, McAllister F, Reichert M, Beatty GL, Rustgi AK, Vonderheide RH, Leach SD, Stanger BZ. EMT and dissemination pre-cede pancreatic tumor formation. Cell. 2012 Jan 20;148(1-2):349-61.
29.  Effenberger KE, Borgen E, Eulenburg CZ, Bartkowiak K, Grosser A, Synnestvedt M, et al. Detection and clinical relevance of early disseminated breast cancer cells de-pend on their cytokeratin expression pattern. Breast Cancer Res Treat 2011;125(3):729-38.
30.  Dery MA, Jodoin J, Ursini-Siegel J, Aleynikova O, Ferrario C, Hassan S, et al. Endo-plasmic reticulum stress induces PRNP prion protein gene expression in breast can-cer. Breast Cancer Res 2013;15(2):R22.
31.  Braun S, Vogl FD, Naume B, Janni W, Osborne MP, Coombes RC, et al. A pooled analysis of bone marrow micrometastasis in breast cancer. N Engl J Med 2005;353(8):793-802.
32.  Willipinski-Stapelfeldt B, Riethdorf S, Assmann V, Woelfle U, Rau T, Sauter G, et al. Changes in Cytoskeletal Protein Composition Indicative of an Epithelial-Mesenchymal Transition in Human Micrometastatic and Primary Breast Carcinoma Cells. Clin Cancer Res 2005;11(22):8006-14.
33.  Bartkowiak, K., Kwiatkowski, M., Buck, F., Gorges, T. M., et al., Disseminated Tu-mor Cells Persist in the Bone Marrow of Breast Cancer Patients through Sustained Activation of the Unfolded Protein Response. Cancer Res 2015, 75, 5367-5377.
34.  Vellon, L., Menendez, J.A. and Lupu, R. (2005) AlphaVbeta3 integrin regulates her-egulin (HRG)-induced cell proliferation and survival in breast cancer. Oncogene, 24, 3759-3773.
35.  Meng, S., Tripathy, D., Frenkel, E.P., Shete, S., Naftalis, E.Z., Huth, J.F., Beitsch, P.D., Leitch, M., Hoover, S., Euhus, D., Haley, B., Morrison, L., Fleming, T.P., Her-lyn, D., Terstappen, L.W., Fehm, T., Tucker, T.F., Lane, N., Wang, J. and Uhr, J.W. (2004) Circulating tumor cells in patients with breast cancer dormancy. Clin Cancer Res, 10, 8152-8162.
36.  Bidard, F.C., Peeters, D.J., Fehm, T., Nole, F., Gisbert-Criado, R., Mavroudis, D., Grisanti, S., Generali, D., Garcia-Saenz, J.A., Stebbing, J., Caldas, C., Gazzaniga, P., Manso, L., Zamarchi, R., de Lascoiti, A.F., De Mattos-Arruda, L., Ignatiadis, M., Lebofsky, R., van Laere, S.J., Meier-Stiegen, F., Sandri, M.T., Vidal-Martinez, J., Politaki, E., Consoli, F., Bottini, A., Diaz-Rubio, E., Krell, J., Dawson, S.J., Raimondi, C., Rutten, A., Janni, W., Munzone, E., Caranana, V., Agelaki, S., Almici, C., Dirix, L., Solomayer, E.F., Zorzino, L., Johannes, H., Reis-Filho, J.S., Pantel, K., Pierga, J.Y. and Michiels, S. (2014) Clinical validity of circulating tumour cells in patients with metastatic breast cancer: a pooled analysis of individual patient data. Lancet Oncol, 15, 406-414
37.  Bardelli A and Pantel K. Liquid Biopsies, What We Do Not Know (Yet). Cancer Cell. 2017; 31(2):172-179]
38.  J. D. Cohen et al., Science 10.1126/science.aar3247 (2018)]
39.  Heidi Ledford. Simple blood test detects eight different kinds of cancer. Nature. 18 January 2018]
40.  Aminololama-Shakeri S et al. Can Radiologists Predict the Presence of Ductal Carci-noma In Situ and Invasive Breast Cancer? AJR Am J Roentgenol. 2017; Apr;208(4):933-939]
【図１】
2020510844.tif 000011
【図２】
2020510844.tif 000012
【図３】
2020510844.tif 000013
【図４】
2020510844.tif 000014
【図５】
2020510844.tif 000015
【図６】
2020510844.tif 000016
【図７】
2020510844.tif 000017
【図８】
2020510844.tif 000018
【図９】
2020510844.tif 000019
【図１０】
2020510844.tif 000020
【図１１】
2020510844.tif 000021
【図１２】
2020510844.tif 000022
【図１３】
2020510844.tif 000023
【図１４】
2020510844.tif 000024
【図１５】
2020510844.tif 000025
【図１６】
2020510844.tif 000026
【図１７】
2020510844.tif 000027
【図１８】
2020510844.tif 000028
【図１９】
2020510844.tif 000029
【図２０】
2020510844.tif 000030
【図２１】
2020510844.tif 000031
【図２２】
2020510844.tif 000032
【図２３】
2020510844.tif 000033
【図２４】
2020510844.tif 000034
【図２５】
2020510844.tif 000035
【図２６】
2020510844.tif 000036
【図２７】
2020510844.tif 000037
【図２８】
2020510844.tif 000038
【図２９】
2020510844.tif 000039
【図３０】
2020510844.tif 000040
【図３１】
2020510844.tif 000041
【図３２】
2020510844.tif 000042
【図３３】
2020510844.tif 000043
【国際調査報告】
2020510844.tif 000044
2020510844.tif 000045
2020510844.tif 000046
2020510844.tif 000047
2020510844.tif 000048