(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、電位指示剤及び電位を測定する方法である。電位指示剤は、捕捉タンパク質に共役した膜局在型電位感受性タンパク質を含む。電位を測定する方法は、捕捉タンパク質に共役した膜局在型電位感受性タンパク質を含む電位指示剤を投与すること、及び捕捉タンパク質によって捕捉された小分子蛍光色素の蛍光発光の変化を決定することを含む。
2020514683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
捕捉タンパク質に共役した膜局在型電位感受性タンパク質を含む電位指示剤。
【請求項２】
前記捕捉タンパク質が、小分子蛍光色素を捕捉するように配置されている、請求項１に記載の電位指示剤。
【請求項３】
前記蛍光色素がアゼチジン含有ジャネリア蛍光（登録商標）色素を含む、請求項２に記載の電位指示剤。
【請求項４】
前記ジャネリア蛍光（登録商標）色素が、ジャネリア蛍光色素（登録商標）505、ジャネリア蛍光色素（登録商標）525、ジャネリア蛍光色素（登録商標）549、ジャネリア蛍光色素（登録商標）585、ジャネリア蛍光色素（登録商標）646、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の電位指示剤。
【請求項５】
前記電位感受性タンパク質がオプシンである、請求項１に記載の電位指示剤。
【請求項６】
前記オプシンが微生物オプシンである、請求項５に記載の電位指示剤。
【請求項７】
前記微生物オプシンが、QuasAr2、Ace2N、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項６に記載の電位指示剤。
【請求項８】
前記電位感受性タンパク質が、カタユウレイボヤ（Ciona intestinalis）電位感知ドメイン（CiVSD）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）電位感知ドメイン（DrVSD）、セキショクヤケイ（Gallus gallus）電位感知ドメイン（GgVSD）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つの電位感知ドメインを含む、請求項1に記載の電位指示剤。
【請求項９】
前記捕捉タンパク質が共有結合性捕捉タンパク質である、請求項１に記載の電位指示剤。
【請求項１０】
前記共有結合性捕捉タンパク質が、HaloTag、SNAP-tag、TMP-tag、βLac-tag、CLIP-tag、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の電位指示剤。
【請求項１１】
前記捕捉タンパク質が、非共有結合性捕捉タンパク質である、請求項１に記載の電位指示剤。
【請求項１２】
前記非共有結合性捕捉タンパク質が、TMP-tag、ビオチン−アビジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の電位指示剤。
【請求項１３】
請求項１に記載の電位指示剤を投与すること、及び共有結合性捕捉タンパク質によって共有結合的に捕捉された小分子蛍光色素の蛍光の変化を決定することを含む、電位を測定する方法。
【請求項１４】
蛍光の変化が顕微鏡で観察される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記電位指示剤が、前記電位感受性タンパク質と前記捕捉タンパク質との間にリンカーをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記リンカーの長さを改変することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記リンカーの長さを改変することが、少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することが、１〜２２の間のアミノ酸残基を除去することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記リンカーの長さを改変することが蛍光応答の大きさを変更する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
蛍光の変化に基づいて電位の変化を決定することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2016年11月30日出願の米国仮特許出願第62／428,066号の利益を主張するものであり、その全開示は本明細書中に参考として援用される。
配列表
【０００２】
本出願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出された配列表を含み、その全体が参考として本明細書中に援用される。2017年11月30日に作成された配列表のASCIIコピーは、18074N‐16049.txtという名前で、112キロバイトのサイズである。
【０００３】
本明細書に開示されている主題は、一般的に電位指示剤及びその使用方法に関する。より具体的には、本明細書に開示されている主題は、化学遺伝子学的電位指示剤、及び化学遺伝子学的電位指示剤を使用して電位を測定する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
膜電位の光学的画像化は、ニューロンが連絡するために使用する迅速な電気信号の直接の視覚化を可能にする。ニューロン内の電気信号は高速であるため、現在の光学的方法は、映画の１コマの画像用にイメージングカメラで集めることができる光子の数によって制限される。1 従って、１コマの画像の間により多くの光子を放出し、不可逆的な光退色が起こる前に、より多数コマの画像にわたってより多くの光子を放出する電位指示剤は、電位測定の精度と期間に質的な改善をもたらす。
【０００５】
既存の小分子電位指示色素は明るく、細胞膜電位の変化に伴って蛍光の大きな変化を生じる。しかしながら、それらは特定のニューロンを容易に標的にすることができず、全ての細胞膜が色素で染色され、個々のニューロンが明確に観察できないため、インビボでの有用性が制限される。逆に、タンパク質ベースの指示剤（遺伝子によりコードされた電位指示剤、GEVIs）は、個々のニューロンまたは特定のニューロン集団を標的にすることができるが、明るさと光安定性は限定される。
【０００６】
従って、増大した明るさ及び光安定性を生じる、標的となる電位指示薬に対する必要性が依然としてある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書で提供される情報を検討した後に当業者に明らかになるように、本明細書に開示されている主題は、上記で特定された必要性の幾つかまたは全てを満たす。
【０００８】
この要約は、本明細書に開示されている主題の幾つかの実施形態を説明しており、多くの場合、これらの実施形態の変形及び置換を列挙している。この概要は、多数の様々な実施形態の単なる例示である。所与の実施形態の１つ以上の代表的な特徴の言及は、同様に例示的である。そのような実施形態は、通常、言及された特徴を伴って、または伴わずに存在することができる。同様に、それらの特徴は、この要約に列挙されているか否かにかかわらず、本明細書に開示されている主題の他の実施形態に適用することができる。過度の繰り返しを避けるために、この要約は、そのような機能のすべての可能な組み合わせを列挙または示唆していない。
【０００９】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されている主題は電位指示剤に関する。幾つかの実施形態では、電位指示剤は、捕捉タンパク質に共役した膜局在型電位感受性タンパク質を含む。幾つかの実施形態では、捕捉タンパク質は、小分子蛍光色素を捕捉するように配置されている。一実施形態では、蛍光色素はアゼチジン含有ジャネリア蛍光（登録商標）色素を含む。別の実施形態では、ジャネリア蛍光（登録商標）色素は、ジャネリア蛍光（登録商標）色素505、ジャネリア蛍光（登録商標）色素525、ジャネリア蛍光（登録商標）色素549、ジャネリア蛍光（登録商標）色素585、ジャネリア蛍光（登録商標）色素646、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１０】
幾つかの実施形態において、電位感受性タンパク質は、オプシン、例えば、これに限定されないが、微生物オプシンである。適切な微生物オプシンとしては、これらに限定されないが、QuasAr2、Ace2N、またはそれらの組み合わせを含む。幾つかの実施形態では、電位感受性タンパク質は、カタユウレイボヤ（Ciona intestinalis）電位感知ドメイン（CiVSD）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）電位感知ドメイン（DrVSD）、セキショクヤケイ（Gallus gallus）電位感知ドメイン（GgVSD）、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つの電位感知ドメインを含む。
【００１１】
幾つかの実施形態では、捕捉タンパク質は共有結合性捕捉タンパク質である。一実施形態では、共有結合性捕捉タンパク質は、HaloTag、SNAP-tag、TMP-tag、βLac-tag、CLIP-tag、またはそれらの組み合わせからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、捕捉タンパク質は非共有結合性捕捉タンパク質である。一実施形態では、非共有結合性捕捉タンパク質は、TMP-tag、ビオチン−アビジン、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１２】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示されている主題は、電位を測定する方法、捕捉タンパク質に共役した膜局在型電位感受性タンパク質を含む電位指示剤を投与すること、及び捕捉タンパク質によって捕捉された小分子蛍光色素の蛍光の変化を決定することを含む方法に関する。幾つかの実施形態では、蛍光の変化は顕微鏡で観察される。幾つかの実施形態において、その方法は蛍光の変化に基づいて電位の変化を決定することをさらに含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、電位指示剤は電位感受性タンパク質と捕捉タンパク質との間にリンカーをさらに含む。幾つかの実施形態では、その方法はリンカーの長さを改変することをさらに含む。一実施形態では、リンカーの長さを改変することは、少なくとも1つのアミノ酸残基を除去することを含む。別の実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することは、１〜２２の間のアミノ酸残基を除去することを含む。さらなる実施形態において、リンカーの長さを改変することが蛍光応答の大きさを変更する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
本発明の新規な特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載されている。本発明の特徴及び利点のより良い理解は、本発明の原理が使用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、及び添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【００１５】
【図１】図１は、本開示の一実施形態による化学遺伝子学的電位指示剤の概略図である。
【００１６】
【図２】図２A〜Fは、本開示の実施形態による様々な蛍光色素リガンドの化学構造を示す。その構造は、JF505−HaloTagリガンド（図２A）、JF525−HaloTagリガンド（図２B）、JF549−HaloTagリガンド（図２C）、JF585−HaloTagリガンド（図２D）、JF635−HaloTagリガンド（図２E）、及びJF549−SNAP−Tagリガンド（図２F）を含む。
【００１７】
【図３】図３A〜Bは、培養ラット海馬ニューロンのASAP1、Ace2N−mNeonGreen、及びAce2N−HaloTag−JF549の蛍光輝度（図３A）、及び蛍光光退色速度（図３B）を比較するグラフを示す。
【００１８】
【図４】図４は、QuasAr2とHaloTagを接続する異なるサイズのリンカーを有するQuasAr2−HaloTag電位指示剤の蛍光応答の大きさを図示するグラフを示す。蛍光応答はASAP1に対して測定した。
【００１９】
【図５】図５A〜Bは、JF549で標識されたQuasAr−HaloTagを発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図５Ａ】JF549で標識されたQuasAr−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図５Ｂ】ニューロンのフィールド電極誘導脱分極から生じる電位依存性蛍光の変化を示す、図５Aからの画像内の３つの領域からの蛍光トレース。
【００２０】
【図６】図６A〜Bは、JF549で標識されたQuasAr2−HaloTag−16を発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図６Ａ】JF549で標識されたQuasAr2−HaloTag−16を発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図６Ｂ】ニューロンの自発活動電位から生じる電位依存性蛍光の変化を示す、図６Aからの画像内の４つの領域からの蛍光トレース。
【００２１】
【図７】図７A〜Bは、JF549で標識されたQuasAr−cpHaloTagを発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図７Ａ】JF549で標識されたQuasAr−cpHaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図７Ｂ】ニューロンのフィールド電極誘導脱分極から生じる電位依存性蛍光の変化を示す、図７Aからの画像内の３つの領域からの蛍光トレース。
【００２２】
【図８】図８A〜Bは、JF549で標識されたQuasAr2−SNAP-Tagを発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図８Ａ】JF549で標識されたQuasAr2−SNAP-Tagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図８Ｂ】ニューロンのフィールド電極誘発活動電位から生じる電位依存性蛍光の変化を示す、図８Aからの画像内の３つの領域からの蛍光トレース。
【００２３】
【図９】図９A〜Bは、JF549で標識されたHaloTag−QuasAr2を発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図９Ａ】JF549で標識されたHaloTag−QuasAr2を発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図９Ｂ】ニューロンのフィールド電極誘導脱分極から生じる電位依存性蛍光の変化を示す、図９Aからの画像内の１つの領域からの蛍光トレース。
【００２４】
【図１０】図１０A〜Dは、ゼブラフィッシュ幼体（受精後６日）におけるインビボ電位イメージングを図示するグラフ及び画像を示す。
【図１０Ａ】Ace2N−HaloTagを発現し、JF525で標識された幼体ゼブラフィッシュ腹側中脳におけるニューロンからの蛍光の蛍光顕微鏡写真。４８８ｎｍ励起の光シート顕微鏡を使用した。
【図１０Ｂ】図１０C及び図１０Dの蛍光トレースに対応する関心領域が重なっていること以外は図１０Aと同じである。
【図１０Ｃ】魚に提示された視覚刺激の状態と魚の意図的遊泳を示す電気生理学的記録（上）、図１０Bに示す12の個々のニューロンからの蛍光トレース。
【図１０Ｄ】示された領域での図１０Cの拡大。
【００２５】
【図１１】図１１は、培養海馬ニューロンにおけるJF525で標識されたAce2N−HaloTagの電位ステップ（挿入図）に対する蛍光応答を図示するグラフを示す。
【００２６】
【図１２】図１２A〜Cは、JF505で標識されたAce2N−HaloTagを発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図１２Ａ】JF505で標識されたAce2N−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図１２Ｂ】図１２Aにあるような細胞に対する蛍光対電位。
【図１２Ｃ】活動電位スパイク波形及び閾値以下の脱分極を示す図１２Aにあるようなニューロンからの電位（下、ホールセルパッチクランプピペットで測定した時）と比較した蛍光（上）。
【００２７】
【図１３】図１３A〜Cは、JF525で標識されたAce2N−HaloTagを発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図１３Ａ】JF525で標識されたAce2N−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図１３Ｂ】図１３Aにあるような細胞に対する蛍光対電位。
【図１３Ｃ】活動電位スパイク波形及び閾値以下の脱分極を示す図１３Aにあるようなニューロンからの電位（下、ホールセルパッチクランプピペットで測定した時）と比較した蛍光（上）。
【００２８】
【図１４】図１４A〜Cは、JF549で標識されたAce2N−HaloTagを発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図１４Ａ】JF549で標識されたAce2N−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図１４Ｂ】図１４Aにあるような細胞に対する蛍光対電位。
【図１４Ｃ】活動電位スパイク波形及び閾値以下の脱分極を示す図１４Aにあるようなニューロンからの電位（下、ホールセルパッチクランプピペットで測定した時）と比較した蛍光（上）。
【００２９】
【図１５】図１５A〜Cは、JF585で標識されたAce2N−HaloTagを発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図１５Ａ】JF585で標識されたAce2N−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図１５Ｂ】図１５Aにあるような細胞に対する蛍光対電位。
【図１５Ｃ】活動電位スパイク波形及び閾値以下の脱分極を示す図１５Aにあるようなニューロンからの電位（下、ホールセルパッチクランプピペットで測定した時）と比較した蛍光（上）。
【００３０】
【図１６】図１６A〜Cは、JF635で標識されたAce2N−HaloTagを発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図１６Ａ】JF635で標識されたAce2N−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図１６Ｂ】図１６Aにあるような細胞に対する蛍光対電位。
【図１６Ｃ】活動電位スパイク波形及び閾値以下の脱分極を示す図１６Aにあるようなニューロンからの電位（下、ホールセルパッチクランプピペットで測定した時）と比較した蛍光（上）。
【００３１】
【図１７】図１７A〜Bは、JF635で標識されたCiVSD−HaloTagを発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図１７Ａ】JF635で標識されたCiVSD−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図１７Ｂ】ニューロンの自発活動電位から生じる電位依存性蛍光の変化を示す、図１７Aからの画像内の６つの領域からの蛍光トレース。
【００３２】
【図１８】図１８A〜Bは、JF635で標識されたCiVSD−cpHaloTagを発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図１８Ａ】JF635で標識されたCiVSD−cpHaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図１８Ｂ】ニューロンの自発活動電位から生じる電位依存性蛍光の変化を示す、図１８Aからの画像内の３つの領域からの蛍光トレース。
【００３３】
【図１９】図１９A〜Bは、JF635で標識されたDrVSD−HaloTagを発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図１９Ａ】JF635で標識されたDrVSD−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図１９Ｂ】ニューロンの自発活動電位から生じる電位依存性蛍光の変化を示す、図１９Aからの画像内の４つの領域からの蛍光トレース。
【００３４】
【図２０】図２０A〜Bは、JF635で標識されたGgVSD−HaloTagを発現しているラット海馬ニューロンの蛍光を図示するグラフ及び画像を示す。
【図２０Ａ】JF635で標識されたGgVSD−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光顕微鏡写真。
【図２０Ｂ】ニューロンの自発活動電位から生じる電位依存性蛍光の変化を示す、図２０Aからの画像内の５つの領域からの蛍光トレース。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
（具体的な実施形態の説明）
本明細書に開示されている主題の１つ以上の実施形態の詳細は、本明細書に記載されている。本明細書及び他の実施形態に記載された実施形態に対する変更は、本明細書に提供される情報の調査の後、当業者に明らかになるであろう。本明細書で提供される情報、特に記載された具体的な実施形態の特定なる詳細は、主として、明瞭な理解のために提供され、そこから不必要な制限が解釈されるべきでない。矛盾が生じた場合、定義を含むこの文書の明細書が統制する。
【００３６】
本明細書で使用される用語は、当業者によって十分に理解されると考えられるが、本明細書に開示されている主題の説明を容易にするために、特定の定義が示されている。
【００３７】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。
【００３８】
本明細書中の全開示を通して言及される全ての特許、特許出願、公開出願及び刊行物、GenBank配列、データベース、ウェブサイト及び他の公表された資料は、他に記載がない限り、その全体が参考として援用される。
【００３９】
URLまたは他のそのような識別子またはアドレスが参照される場合、その識別子は変更されることがあり、インターネット上の特定の情報も追加され削除されることがあると理解されるが、インターネットを検索することによって同等の情報を見つけることができる。それらへの言及は、そのような情報の入手可能性及び一般公開を証明している。
【００４０】
本明細書で使用される場合、任意の保護基、アミノ酸及び他の化合物の略語は、他に示されない限り、それらの一般的な使用法、認識された略語、またはIUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature（Biochem.(1972）11（9）：1726-1732参照）に従う。
【００４１】
本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法、装置、及び材料は、本明細書に開示されている主題の実施または試験において使用され得るが、代表的な方法、装置、及び材料が本明細書に記載されている。
【００４２】
本出願は、本発明の構成要素、ならびに本明細書に記載の他の成分または要素を「含む」（comprise）（制約なく）または、それらから「本質的になる」ことが可能である。本明細書で使用される場合、「含む」には制約がなく、列挙された要素、またはその構造や機能的同等物、それに加えて列挙されていない任意の他の要素を意味する。用語「有す」及び「含む（include）」もまた、文脈がそうでないと示唆していない限り、制約なしと解釈されるべきである。
【００４３】
長年にわたる特許法の慣例に従い、用語「a」、「an」及び「the」は、特許請求の範囲を含む本出願において使用される場合、「１つまたは複数」を指す。従って、例えば、「一細胞（a cell）」への言及は、その細胞の複数を含むという具合である。
【００４４】
他に示されない限り、明細書及び特許請求の範囲で使用される成分の量、反応条件などの特性を表す全ての数字は、全ての場合において用語「約」によって修飾されるものとして理解されるべきである。従って、逆に示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本明細書に開示されている主題によって得ることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、値または質量、重量、時間、容量、濃度またはパーセンテージに言及する時の用語「約」は、開示された方法を実施するのに適切であるように、幾つかの実施形態では±20％、幾つかの実施形態では±10％、幾つかの実施形態では±5％、幾つかの実施形態では±1％、幾つかの実施形態では±0.5％、幾つかの実施形態では±0.1％の指定された量からの変動を包含することを意味する。
【００４６】
本明細書で使用される場合、範囲は、「約」が付されたある特定値から、及び／または「約」が付された別の特定値までを表し得る。また、本明細書に開示されている幾つかの値があり、各値は、当該値自体に加えて「約」が付された当該特定値として本明細書に開示されていることも理解されよう。例えば、値「１０」が開示されている場合、「約１０」も開示される。２つの特定のユニット間の各ユニットもまた開示されることも理解されるであろう。例えば、１０及び１５が開示されている場合、１１、１２、１３、及び１４もまた開示される。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「任意選択」または「任意選択的」は、その後に記載される事象または状況が起こるかまたは起こらないことを意味し、該記載は、前記事象または状況が起こる場合及び起こらない場合を含む。例えば、任意選択的に変形した部分は、その部分が変形体または非変形体であることを意味する。
【００４８】
本明細書に開示されている主題は、電位指示剤、及び電位指示剤を用いて電位を測定する方法を含む。幾つかの実施形態では、電位指示剤は、小分子蛍光色素を捕捉するように設計された酵素に共役した膜局在型電位感受性タンパク質を含む（図１）。一実施形態では、これらの電位指示剤は、小分子色素の明るさ及び光安定性をタンパク質の遺伝子標的化能と組み合わせる。別の実施形態では、これらの電位指示剤は、色素、電位感受性タンパク質、及び捕捉タンパク質の任意の適切な組み合わせから形成される。さらなる実施形態では、電位指示剤は、異なるドメイン間リンカー長、構造変動（topological variation）、またはそれらの組み合わせを含む。様々な組み合わせは、色素の蛍光励起及び発光波長、共有結合性補足タンパク質の動態、及び電位感受性タンパク質の動態の調節を可能にする。
【００４９】
適切な小分子蛍光色素には、１つ以上のフルオロフォア（発蛍光団（fluorophores））色素が含まれるが、それだけには限定されない。一実施形態では、フルオロフォア色素は、1つ以上の環状アミン置換基を含むフルオロフォアを含む。別の実施形態では、フルオロフォア色素はアゼチジン含有ジャネリア蛍光（登録商標）色素を含む。さらなる実施形態では、ジャネリア蛍光（登録商標）色素は、既存のフルオロフォアの遍在性ジメチルアミノ基の代わりに1つ以上の4員アゼチジン環を含み、明るさ及び光安定性が増した小さな細胞透過性フルオロフォアを形成する。そのようなジャネリア蛍光（登録商標）色素は、ジャネリア蛍光（登録商標）色素505、ジャネリア蛍光（登録商標）色素525、ジャネリア蛍光（登録商標）色素549、ジャネリア蛍光（登録商標）色素585、ジャネリア蛍光（登録商標）色素635、及びそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない（図２A〜F）。
【００５０】
適切な電位感受性タンパク質には、１つ以上のオプシン、電位感受性ドメインを含む１つ以上の他の分子、またはそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。例えば、一実施形態では、電位感受性タンパク質は、QuasAr2、Ace2Nなどの微生物オプシンを含むが、それらに限定されない。別の実施形態では、電位感受性タンパク質は、カタユウレイボヤ（Ciona intestinalis）電位感知ドメイン（CiVSD）、ゼブラフィッシュ（Danio rerio）電位感知ドメイン（DrVSD）、セキショクヤケイ（Gallus gallus）電位感知ドメイン（GgVSD）、またはそれらの組み合わせを含む。
【００５１】
適切な捕捉タンパク質は、所望のリガンドに結合するように構成されている任意のタンパク質を含む。例えば、一実施形態では、捕捉タンパク質は共有結合性捕捉タンパク質を含む。別の実施形態では、共有結合性捕捉タンパク質は、HaloTag（図２A〜E）、SNAP-tag（図２F）、またはそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。他の適切な共有結合性捕捉タンパク質は、TMP-tag、βLac-tag、CLIP-tag、またはそれらの組み合わせを含むが、それらに限定されない。追加的または代替的に、捕捉タンパク質は、非共有結合性相互作用を用いて所望のリガンドを捕捉または結合する非共有結合性捕捉タンパク質を含み得る。適切な非共有結合性捕捉タンパク質には、特定のTMP-tag、ビオチン−アビジン、またはそれらの組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。
【００５２】
上述の色素、電位感受性タンパク質、及び捕捉タンパク質は、本発明の電位指示剤の設計のモジュール方式、及び一般性を実証する。幾つかの実施形態では、これは、色素の蛍光励起及び発光波長、色素を捕捉タンパク質に連結するリンカーの化学的性質、捕捉タンパク質の動態、及び／または電位感受性タンパク質の動態の調節を可能にする。例えば、一実施形態では、電位感受性タンパク質QuasAr2は、任意の適切な色素と共に、HaloTagまたはSNAP-tag捕捉タンパク質と組み合わせ得る。別の実施形態では、電位感受性タンパク質Ace2Nは、任意の適切な色素と共に、HaloTagまたはSNAP-tag捕捉タンパク質と組み合わせることができる。当業者によって理解されるように、上記の色素、電位感受性タンパク質、及び捕捉タンパク質は例示のためだけのものであり、そして本開示の範囲を限定することを意図しない。従って、任意の適切な色素、電位感受性タンパク質、及び／または捕捉タンパク質代替物を含む電位指示剤が本明細書において明確に企図される。
【００５３】
本明細書に開示されている主題はまた、電位指示剤を使用して電位を測定する方法を含む。幾つかの実施形態では、その方法は、電位指示剤を投与すること、及び任意の適切な方法によって色素の蛍光の変化を測定することを含む。蛍光の変化は、顕微鏡による観察、画像取得、記録映像、またはそれらの組み合わせなどの任意の適切な方法によって測定することができるが、それらに限定されない。一実施形態では、本明細書に開示されている電位指示剤は、既存のGEVIsよりも実質的に明るくそして光安定性が高い（図３A〜B）。別の実施形態では、指示剤応答の振幅は、電位感受性タンパク質と共有結合性捕捉タンパク質との間のリンカーペプチドを短縮または削除することによって増大させることができる。さらなる実施形態では、リンカーペプチドを短縮することは、そこから少なくとも１つのアミノ酸残基を除去することを含む。当業者によって認識されるように、除去されるアミノ酸残基の数は、所望の振幅及び／または特異的リンカーペプチドによって特定され得る。特定の実施形態において、除去されるアミノ酸残基の数は、少なくとも１、上限は１以外の全て、１〜２２の間、２〜２２の間、４、８、１２、１６、１８、２０、２２、または任意の適切な組み合わせ、部分的組み合わせ、範囲、または部分範囲である。
【００５４】
本明細書に開示されている主題は、以下の特定の、しかし非限定的な実施例によってさらに説明される。以下の実施例は、本明細書に開示されている主題に関する開発及び実験の過程の様々な時点で収集されたデータを代表するデータの編纂を含み得る。
【実施例】
【００５５】
以下の実施例は、本開示による様々な化学遺伝子学的電位指示剤の特性を記載する。
【００５６】
実施例１
【００５７】
この実施例は、QuasAr2とHaloTagとを接続する異なる長さのリンカーを有する様々なQuasAr2−HaloTag電位指示剤の蛍光応答を比較する。異なる長さを形成するために、アミノ酸残基をリンカーから除去した。QuasAr2−HaloTag（配列番号1及び配列番号2）、QuasAr2−HaloTag−4（配列番号3及び配列番号4）、QuasAr2−HaloTag−8（配列番号5及び配列番号6）、QuasAr2−HaloTag−12（配列番号7及び配列番号8）、QuasAr2−HaloTag−16（配列番号9及び配列番号10）、QuasAr2−HaloTag−18（配列番号11及び配列番号12）、QuasAr2−HaloTag−20（配列番号13及び配列番号14）、ならびにQuasAr2−HaloTag−22（配列番号15及び配列番号16）を含む、合計8つの異なるリンカー長を有する電位指示剤が形成された。各電位指示剤の末尾の数字は、そのリンカーから除去されたアミノ酸残基の数を示している。例えば、QuasAr2−HaloTag−4は4個のアミノ酸残基がリンカーから除去された電位指示剤であり、QuasAr2−HaloTag−12は12個のアミノ酸残基がリンカーから除去された電位指示剤である。
【００５８】
これらの電位指示剤の蛍光をASAP1に対して測定した。図４に示すように、それぞれの異なるリンカー長は、異なる大きさの蛍光応答を提供した。
【００５９】
実施例２
【００６０】
この実施例では、培養ラット海馬ニューロンにおいて、JF549で標識された電位指示剤を含む様々なQuasAr2の蛍光を測定した。具体的には、図５A〜Bは、JF549で標識されたQuasAr−HaloTag（配列番号1及び配列番号2）を発現しているラット海馬ニューロンの蛍光（図５A）、及びニューロンのフィールド電極誘導脱分極から生じる電位依存性蛍光の変化（図５B）を示す。図６A〜Bは、JF549で標識されたQuasAr2−HaloTag−16（配列番号9及び配列番号10）を発現しているラット海馬ニューロンの蛍光（図６A）、及びニューロンの自発活動電位から生じる電位依存性蛍光の変化（図６B）を示す。図７A〜Bは、JF549で標識されたQuasAr−cpHaloTag（配列番号17及び配列番号18）を発現しているラット海馬ニューロンの蛍光（図７A）、及びニューロンのフィールド電極誘導脱分極から生じる電位依存性蛍光の変化（図７B）を示す。図８A〜Bは、JF549で標識されたQuasAr2−SNAP−Tag（配列番号19及び配列番号20）を発現しているラット海馬ニューロンの蛍光（図８A）、及びニューロンのフィールド電極誘導脱分極から生じる電位依存性蛍光の変化（図８B）を示す。図９A〜Bは、JF549で標識されたHaloTag−QuasAr2（配列番号21及び配列番号22）を発現しているラット海馬ニューロンの蛍光（図９A）、及びニューロンのフィールド電極誘導脱分極から生じる電位依存性蛍光の変化（図９B）を示す。
【００６１】
実施例３
【００６２】
この実施例では、様々な蛍光色素で標識されたAce2N−HaloTag（配列番号23及び配列番号24）電位指示剤の蛍光を測定した。以下に論じるように、指示剤を培養ラット海馬ニューロン及び生きたゼブラフィッシュ幼体において試験したところ、細胞膜電位の変化は色素の蛍光に変化を生じた。
【００６３】
ある研究では、本明細書に開示されているセンサーを使用して、同時に目覚めて数分間連続して行動した幼体ゼブラフィッシュにおける１２個のニューロンからの蛍光電位信号を画像化した。より具体的には、図１０A〜Dは、JF525で標識されたAce2N−HaloTagを発現しているゼブラフィッシュ幼体におけるニューロンからの蛍光を示す。図１１は、培養ラット海馬ニューロンにおけるJF525で標識されたAce2N−HaloTagの電位ステップに対する蛍光応答を示す。図１２A〜Cは、JF505で標識されたAce2N−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光（図１２A）、蛍光対電位（図１２B）、ならびに活動電位スパイク波形及び閾値以下の脱分極を示す電位と比較した蛍光（図１２C）を示す。図１３A〜Cは、JF525で標識されたAce2N−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光発光（図１３A）、蛍光発光対電位（図１３B）、及び活動電位スパイク波形及び閾値以下の脱分極を示す電位と比較した蛍光発光（図１３C）を示す。図１４A〜Cは、JF549で標識されたAce2N−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光発光（図１４A）、及び蛍光発光対電位（図１４B）、ならびに活動電位スパイク波形及び閾値以下の脱分極を示す電位と比較した蛍光発光（図１４C）を示す。図１５A〜Cは、JF585で標識されたAce2N−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光発光（図１５A）、及び蛍光発光対電位（図１５B）、ならびに活動電位スパイク波形及び閾値以下の脱分極を示す電位と比較した蛍光発光（図１５C）を示す。図１６A〜Cは、JF635で標識されたAce2N−HaloTagを発現している培養ラット海馬ニューロンの蛍光発光（図１６A）、及び蛍光発光対電位（図１６B）、ならびに活動電位スパイク波形及び閾値以下の脱分極を示す電位と比較した蛍光発光（図１６C）を示す。
【００６４】
実施例３
【００６５】
この実施例では、JF635で標識されたHaloTag電位指示剤の蛍光発光を様々な異なる電位感受性タンパク質を用いて測定した。より具体的には、図１７A〜Bは、JF635で標識されたCiVSD−HaloTag（配列番号25及び配列番号26）を発現しているラット海馬ニューロンの蛍光発光（図１７A）、及びニューロンの自発活動電位から生じる電位依存性蛍光発光の変化（図１７B）を示す。図１８A〜Bは、JF635で標識されたCiVSD-cpHaloTag（配列番号27及び配列番号28）を発現しているラット海馬ニューロンの蛍光発光（図18A）、及びニューロンの自発活動電位に起因する電位依存性蛍光発光の変化（図18B）を示す。図１９A〜Bは、JF635で標識されたDrVSD−HaloTag（配列番号２９及び配列番号３０）を発現しているラット海馬ニューロンの蛍光発光（図１９A）、及びニューロンの自発活動電位から生じる電位依存性蛍光発光の変化（図１９B）を示す。図２０A〜Bは、JF635で標識されたGgVSD−HaloTag（配列番号31及び配列番号32）を発現しているラット海馬ニューロンの蛍光発光（図２０A）、及びニューロンの自発活動電位に起因する電位依存性蛍光発光の変化（図２０B）を示す。
【００６６】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、及び特許出願は、それぞれの刊行物、特許、または特許出願が具体的かつ個別に、以下のリストに記載されている参照により組み込まれることが示されるのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。：
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【００６７】
本明細書に開示されている主題の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示されている主題の様々な詳細を変更することができることが理解されよう。さらに、前述の説明は例示のみを目的としており、限定を目的としていない。
【図１】
2020514683.tif 000003
【図２Ａ】
2020514683.tif 000004
【図２Ｂ】
2020514683.tif 000005
【図２Ｃ】
2020514683.tif 000006
【図２Ｄ】
2020514683.tif 000007
【図２Ｅ】
2020514683.tif 000008
【図２Ｆ】
2020514683.tif 000009
【図３Ａ】
2020514683.tif 000010
【図３Ｂ】
2020514683.tif 000011
【図４】
2020514683.tif 000012
【図５Ａ】
2020514683.tif 000013
【図５Ｂ】
2020514683.tif 000014
【図６Ａ】
2020514683.tif 000015
【図６Ｂ】
2020514683.tif 000016
【図７Ａ】
2020514683.tif 000017
【図７Ｂ】
2020514683.tif 000018
【図８Ａ】
2020514683.tif 000019
【図８Ｂ】
2020514683.tif 000020
【図９Ａ】
2020514683.tif 000021
【図９Ｂ】
2020514683.tif 000022
【図１０Ａ】
2020514683.tif 000023
【図１０Ｂ】
2020514683.tif 000024
【図１０Ｃ】
2020514683.tif 000025
【図１０Ｄ】
2020514683.tif 000026
【図１１】
2020514683.tif 000027
【図１２Ａ】
2020514683.tif 000028
【図１２Ｂ】
2020514683.tif 000029
【図１２Ｃ】
2020514683.tif 000030
【図１３Ａ】
2020514683.tif 000031
【図１３Ｂ】
2020514683.tif 000032
【図１３Ｃ】
2020514683.tif 000033
【図１４Ａ】
2020514683.tif 000034
【図１４Ｂ】
2020514683.tif 000035
【図１４Ｃ】
2020514683.tif 000036
【図１５Ａ】
2020514683.tif 000037
【図１５Ｂ】
2020514683.tif 000038
【図１５Ｃ】
2020514683.tif 000039
【図１６Ａ】
2020514683.tif 000040
【図１６Ｂ】
2020514683.tif 000041
【図１６Ｃ】
2020514683.tif 000042
【図１７Ａ】
2020514683.tif 000043
【図１７Ｂ】
2020514683.tif 000044
【図１８Ａ】
2020514683.tif 000045
【図１８Ｂ】
2020514683.tif 000046
【図１９Ａ】
2020514683.tif 000047
【図１９Ｂ】
2020514683.tif 000048
【図２０Ａ】
2020514683.tif 000049
【図２０Ｂ】
2020514683.tif 000050
【配列表】
2020514683000001.xml
【国際調査報告】
2020514683.tif 000124