(57)【要約】標的細胞への核酸分子の送達または移入のための非ウイルス核酸送達剤及び方法を開示する。該薬剤は、送達用の核酸カーゴ、１つまたは複数のリポペプチド化合物、及び１つまたは複数の高分子電荷中和剤の複合体を含み、該複合体は、実質的に中性または負の表面電荷を有する粒子の形態である。該薬剤及び方法は、様々な用途、例えば疾患及び医学的障害に対する治療（遺伝子治療及び核酸ワクチン接種を含む）において有用であり得る。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ウイルス核酸送達剤であって、
（ｉ）細胞に送達するための核酸カーゴ、
（ｉｉ）１つまたは複数のリポペプチド化合物、及び
（ｉｉｉ）１つまたは複数の高分子電荷中和剤、
の複合体を含み、前記複合体が、実質的に中性または負の表面電荷を有する粒子の形態である、前記非ウイルス核酸送達剤。
【請求項２】
前記核酸カーゴが、タンパク質（複数可）、オリゴペプチド（複数可）またはペプチド（複数可）をコードするＤＮＡ分子である、請求項１に記載の送達剤。
【請求項３】
前記核酸カーゴが、タンパク質（複数可）、オリゴペプチド（複数可）またはペプチド（複数可）をコードするｍＲＮＡ分子である、請求項１に記載の送達剤。
【請求項４】
前記核酸カーゴが、ｍｏｄＲＮＡである、請求項１に記載の送達剤。
【請求項５】
前記リポペプチド化合物が、カチオン性リポペプチドである、先行請求項のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項６】
前記リポペプチド化合物が、一般式Ｉ：
（Ｉ）Ｒ−Ｌ−ペプチド
のものであり、
式中、Ｒは、直鎖または分岐鎖アルキルであり、
Ｌは、リンカー基であり、
前記ペプチドが、２〜１５個のアミノ酸を含む任意のアミノ酸配列のものであるが、ただし、前記アミノ酸の少なくとも２個が、強塩基性／正荷電性を有するものから独立して選択される、請求項５に記載の送達剤。
【請求項７】
前記リポペプチド化合物が、一般式ＩＩ：
（ＩＩ）Ｒ−ＣＯ−ペプチド
のものであり、
式中、Ｒが、ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎが、１１〜２１の範囲の整数であり、前記ペプチドが、２〜１５個のアミノ酸を含む任意のアミノ酸配列のものであるが、ただし、前記アミノ酸の少なくとも２個が、強塩基性／正荷電性を有するものから独立して選択される、請求項５に記載の送達剤。
【請求項８】
ｎが、１３〜１８の範囲の整数である、請求項７に記載の送達剤。
【請求項９】
前記ペプチドが、５〜１０個のアミノ酸を含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項１０】
前記アミノ酸配列の前記アミノ酸の少なくとも２個が、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）から独立して選択される、請求項６〜９のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項１１】
前記リポペプチド化合物が、一般式：ステアロイル−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｘ２−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号２）のものであり、式中、Ｘ１及びＸ２が、任意のアミノ酸であり、同じであっても異なってもよい、請求項７に記載の送達剤。
【請求項１２】
前記リポペプチド化合物が、一般式：ステアロイル−Ｘ０−Ｘ１−Ｘ２−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１）のものであり、式中、Ｘ０が、存在しないまたはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ１及びＸ２が、Ｃｙｓ以外の任意のアミノ酸であり、同じであっても異なってもよい、請求項７に記載の送達剤。
【請求項１３】
Ｘ０が、ＳｅｒまたはＴｈｒである、請求項１２に記載の送達剤。
【請求項１４】
Ｘ１及びＸ２が、Ａｌａ、Ａｒｇ及びＨｉｓから独立して選択される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項１５】
Ｘ１及びＸ２が、Ｈｉｓである、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項１６】
前記高分子電荷中和剤（複数可）が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のコポリマーから選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項１７】
前記高分子電荷中和剤（複数可）が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びポリアミノ酸ポリマーのコポリマーから選択される、請求項１６に記載の送達剤。
【請求項１８】
前記高分子電荷中和剤（複数可）が、ポリ（Ｌ−グルタミン酸塩）−ＰＥＧコポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）から選択される、請求項１６に記載の送達剤。
【請求項１９】
前記高分子電荷中和剤（複数可）が、ポリ（アクリル酸）のコポリマーから選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項２０】
前記高分子電荷中和剤（複数可）が、ポリ（アクリル酸）及びポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）（ポリＨＰＭＡ）のブロックコポリマー、ならびにポリ（アクリル酸）及びポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリルアミド）（ポリＨＥＭＡ）のブロックコポリマーから選択される、請求項１９に記載の送達剤。
【請求項２１】
前記粒子が、−２〜２ｍＶの範囲の零電位（ＺＰ）表面電荷を示す、先行請求項のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項２２】
前記粒子が、−４０〜−５ｍＶの範囲の零電位（ＺＰ）表面電荷を示す、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項２３】
核酸分子を対象の細胞に送達する方法であって、
先行請求項のいずれか一項に記載の非ウイルス核酸送達剤を提供するステップ、
及び
前記非ウイルス核酸送達剤を、前記対象の前記細胞に送達するステップを含む、前記方法。
【請求項２４】
前記非ウイルス核酸送達剤が、前記対象に非経口的に（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）送達される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の非ウイルス送達核酸剤を薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２２のいずれか一項に記載の非ウイルス送達核酸剤を生成する方法であって、
核酸カーゴ、１つまたは複数のリポペプチド化合物、及び１つまたは複数の高分子電荷中和剤を、複合化した粒子の形成に好適な条件下で、組み合わせることを含む、前記方法。
【請求項２７】
前記核酸カーゴ、１つまたは複数のリポペプチド化合物、及び１つまたは複数の高分子電荷中和剤を組み合わせるステップ（及び後続の複合化した粒子の形成）が、水相中で実行される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、疾患及び医学的障害に対する治療（遺伝子治療及び核酸ワクチン接種を含む）などの用途のための、標的細胞への核酸分子の送達または移入のための薬剤及び方法に関する。
【０００２】
優先権書類
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年６月１３日に出願された、「新規遺伝子送達システム２」という名称の、オーストラリア仮特許出願第２０１７９０２２３８号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
非ウイルスベクター及び薬剤を使用する標的細胞への有用な核酸（例えば、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド）の送達または移入は、いくつかの理由のために非常に望ましく、それには、安全性の改善の可能性（すなわち、自然ゲノム活性に干渉することなく治療遺伝子を安全に発現するために必要な制御機構を欠く可能性があるウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターと対比して［１］）、「バルク」医薬品としての生産に関する安定性及び適合性が含まれる。非ウイルス核酸の移入に関して試みられた戦略の中には、大量のプラスミドＤＮＡ溶液の全身投与（これは、血管内の高圧及びプラスミドの血管外漏出を引き起こすと見いだされている）、プラスミドと宿主ゲノムＤＮＡの安定した融合をもたらすことができるプラスミド（例えば、大きな人工染色体）の細胞内への直接的なマイクロインジェクション、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究用に細胞をトランスフェクトするための一般的及び有用な方法であり、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデル用にも操作されているエレクトロポレーションの非常に単純な技術がある。しかしながら、これらは全て、ヒトの治験において使用するには実用性が制限されている。
【０００４】
リポフェクション、つまり脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として知られるカチオン性粒子を形成するための核酸とカチオン性脂質の複合体化は、別の非ウイルス遺伝子移入ツールの基盤として機能する。しかしながら、上記の戦略と同様に、その有用性は、主に細胞培養及びいくつかの単純な動物モデルに制限されており、これは主に効率が低く、有効高用量の結果生じる毒性のためである［２］。それにもかかわらず、脂質−核酸ナノ粒子複合体を使用するいくつかの臨床試験が承認されており、様々な研究が複合体の特性を変えて毒性を低減し、組織特異性をより高めることを試みている、例えば、複合体の外側を静電吸着されたポリ（グルタミン酸）ベースのペプチドコーティングを用いてコーティングすることで、ｉｎ  ｖｉｖｏで裸のＤＮＡ複合体と比較して、毒性を低減させた［３］。他の変更例では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して、負に荷電した血清タンパク質との電子結合、それに伴う続くオプソニン化及び粒子のクリアランスを促進するカチオン性粒子の正電荷を「遮蔽」または中和している［４］。例えば、いくつかの場合では、ＬＮＰは、生体内分布及び効率を改善するために、核酸とカチオン性脂質ならびに「ＰＥＧ化」脂質、例えばホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ（ＰＥ−ＰＥＧ）［５］の複合体化によって生成されている。しかしながら、潜在的な治療用途のためのＬＮＰの開発における著しい進展にもかかわらず、使用されるカチオン性脂質（通常は、リン脂質誘導体である）が、自然免疫活性化［６］、低分解性及び／またはクリアランスに起因して、特に長期間にわたって（例えば、ＬＮＰベースの治療剤の長期または慢性使用）、体内で十分に耐用性を示さない可能性があるという懸念を含む多くの疑念が残っている。
【０００５】
従って、標的細胞に有用な核酸分子（例えば、治療用核酸）を送達または移入するための改善された及び／または代替の薬剤及び方法を、同定及び開発する必要性が存在している。この目的のために、本出願人は、カチオン性脂質の代わりにカチオン性リポペプチド（ＬＰ）を使用する代替戦略に注目した。
【０００６】
名前が示すように、リポペプチドは、疎水性部分（例えば、脂質）にコンジュゲートしたペプチドを含む。凝縮剤として使用するために、ＬＰはカチオン性であり、そのため、典型的には、ペプチド構成要素には、アミノ酸、例えばリジン及びアルギニンが含まれることになり、これはそれらの強塩基性／正荷電性のために、生理学的ｐＨにて核酸分子、例えばプラスミドＤＮＡの凝縮を可能にする［７］。加えて、ペプチドは、ヒスチジン残基を含んでよく、これもまた、核酸のエンドソーム脱出を促進することによりトランスフェクション効率を増加させると考えられている［８］、及び／またはシステイン残基を含んでよく、これは、ペプチド分子間のジスルフィド結合の形成を可能とし、それによって溶液中での核酸及びリポペプチドの解離を防ぐことにより、リポペプチド−核酸複合体の安定性を向上させることができる［９］。リポペプチドの疎水性部分も、核酸−リポペプチド複合体の安定化を助けると考えられている。典型的な部分には、親油性鎖（例えば、ステアロイル及びコレステリル）または非極性残基の繰り返し（例えば、バリン）が含まれる［１０、１１］。
【０００７】
以降、本出願人は、自己架橋カチオン性ＬＰ、ステアロイル−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（本明細書では以降、ステアロイル−ＣＨ２Ｋ３  ＬＰ、配列番号１とも称する）などの、核酸送達剤において使用するためのＬＰのさらなる開発を開示する。このようなＬＰは、水溶液中で、核酸分子、例えばプラスミドＤＮＡと容易に自己組織化でき、有機系溶媒の調製に対する必要性を回避する（すなわち、ＬＮＰの調製には必要とされる）ため、製造が容易であるという点で利点を提供し得、それによって、望ましくない溶媒の持ち越し汚染の可能性を限定する。さらには、ＬＰ、例えばステアロイル−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓは、生体適合性部分から構成されるため、ＬＰを組み込む核酸送達剤は、代替の核酸送達剤、例えばＬＮＰより低いまたは少なくとも許容可能な毒性を示し得ることが予期される。
【発明の概要】
【０００８】
第一の態様に従って、本開示は、非ウイルス核酸送達剤であって、
（ｉ）細胞に送達するための核酸カーゴ、
（ｉｉ）１つまたは複数のリポペプチド化合物、及び
（ｉｉｉ）１つまたは複数の高分子電荷中和剤、
の複合体を含み、前記複合体が、実質的に中性または負の表面電荷を有する粒子の形態である、前記非ウイルス核酸送達剤を提供する。
【０００９】
一特定の実施形態では、本開示の非ウイルス核酸送達剤は、ＤＮＡまたはＲＮＡワクチンとしてみなされ得る。
【００１０】
第二の態様では、本開示は、核酸分子を対象の細胞に送達する方法であって、
第一の態様に従う非ウイルス核酸送達剤を提供するステップ、及び
前記非ウイルス核酸送達剤を、対象の前記細胞に送達するステップを含む、前記方法を提供する。
【００１１】
非ウイルス核酸送達剤は、細胞に、（例えば、筋肉内（ｉｍ）投与などの非経口投与のために）単純な針注射を使用して送達され得る。
【００１２】
第三の態様では、本開示は、第一の態様に従う非ウイルス送達核酸剤を薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物を提供する。
【００１３】
第四の態様では、本開示は、第一の態様に従う非ウイルス送達核酸剤を生成する方法であって、
核酸カーゴ、１つまたは複数のリポペプチド化合物、及び１つまたは複数の高分子電荷中和剤を、複合化した粒子の形成に好適な条件下で、組み合わせることを含む、前記方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】（ＬＰ／ＤＮＡ複合体の例を使用して）ＬＮＰの特性評価試験の結果を提供する。Ａ）ステアロイル−ＣＨ２Ｋ３を用いて調製したＬＰ／ＤＮＡ複合体の色素排除プロフィール。全てのデータポイントは、溶液中のプラスミドＤＮＡの蛍光強度の割合（％）として計算した。ＤＮＡ単独と比較したときの蛍光強度における有意差に関して＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（一元配置分散分析、ダネットの事後検定）。電荷比の範囲にわたるステアロイル−ＣＨ２Ｋ３／ＤＮＡ複合体のＢ）ゼータ電位ならびにＣ）平均粒子サイズ及び多分散指数。ＤＮＡに対するＬＰの（＋／−）電荷比が増加するにつれて、ゼータ電位は増加し、一方でＺ平均は低いままであったが（概して１０〜１００ｎｍ間）、１に近い電荷比で形成された複合体は除く。全てのデータは、ｎ＝３の個別の実験の平均±ＳＥＭとして表示する。Ｄ）１．５：１及びＥ）２．５：１の電荷比で調製されたＬＰ／ＤＮＡ複合体のＣｒｙｏ−ＴＥＭ画像は、それぞれ、凝集複合体及びより小さな約３０ｎｍ粒子を図示する。スケールバーは、左下隅にある（Ｄ＝１００ｎｍ、Ｅ＝５０ｎｍ）。
【図２】本開示に従うＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡ複合体の特性評価試験の結果を提供する。ＰＥＧ化ＬＰ／ＤＮＡ複合体を、様々な電荷比にて調製し、結果得られたＡ）ゼータ電位ならびにＢ）粒子サイズ及び多分散指数を示す。ゼータ電位の低下は、負に荷電したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のＬＰ／ＤＮＡ複合体への添加に伴って観察された。データは、平均±ＳＥＭ、ｎ＝３として表示する。
【図３】ＮａＣｌの添加時の粒子安定性及び筋肉内注射後の筋肉における相対的遺伝子発現を示すグラフ結果を提供する。Ａ）０．１５Ｍ  ＮａＣｌの添加を伴う及び伴わない、２．５：１の電荷比にて調製されたＬＰ／ＤＮＡ及び０．７５：２：１の電荷比にて調製されたＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡの平均粒子サイズ及び多分散指数。＊は、未処置対照と比較したＺ平均における増加に関して、ｐ＜０．０５（対応のあるスチューデントのｔ検定）。データは、平均±ＳＥＭとして表示した。ｎ＝３。Ｂ）ＤＮＡ複合体または裸ＤＮＡの注射後１、３０、９０日での腓腹筋肉における相対的発光量（ＲＬＵ）として決定した相対的遺伝子発現。データは、ｎ＝３〜６マウスの平均±ＳＥＭとして表示する。指定した処置間での有意な発現レベルに関して、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（二元配置分散分析、テューキーの事後検定）。生理食塩水処置対照において決定したバックグラウンドＲＬＵは、１未満であった。
【図４】ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＮＡ複合体の局所分布を示すグラフ結果を提供する。Ａ）裸ＤＮＡ、ＬＰ／ＤＮＡまたはＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡの注射３０分後に注射された腓腹筋肉においてｑＰＣＲにより検出された合計標的プラスミド。データは、ｎ＝４〜５マウスの平均±ＳＥＭとして表示する。Ｂ）それぞれの領域：筋内膜（Ｅｎ）、筋周膜（Ｐｅ）及び筋上膜（Ｅｐ）への各製剤の注射後の筋肉におけるＤＮＡ−ＡＦ５９４の局在化の程度の半定量分析。データは、ｎ＝３マウスの平均±ＳＥＭとして表示し、各マウスから合計１２の筋肉切片を収集した。ピクセル数における有意差に関して＊ｐ＜０．０５及び＊＊＊ｐ＜０．００１（一元または二元配置分散分析とテューキーの事後検定）。
【図５】ＤＮＡ複合体の免疫原性を調査する実験の結果を示す。Ａ）ＤＮＡ複合体または対照製剤の投与後の（陽性指数と対比した）マウスの血清中のオボアルブミン特異的抗体活性レベル。記号は、個別のデータ点を表し、一方で線は、平均を表す。点線は、１の陽性指数を示す。１を超える値は、抗ＯＶＡ活性に関して陽性である、１未満の値は、抗ＯＶＡ活性に関して陰性である。Ｂ）ＯＶＡコーティング脾臓細胞（陽性対照）、生理食塩水（陰性対照）、ＬＰ／ＤＮＡ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡまたは裸ＤＮＡのいずれかを用いて免疫化したマウスにおいて除去された標的エピトープ特異的細胞の割合（％）。データは、平均±ＳＥＭとして表示した。生理食塩水処置マウスと比較して有意な活性レベルに関して＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（一元配置分散分析とダネットの事後検定）。生理食塩水（Ｃ）、ＬＰ／ＤＮＡ（Ｄ）またはＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡ（Ｅ）製剤を用いて免疫化したマウスにおいて検出された脾臓細胞の別個のＯＶＡ２５７−２６４パルス（高ＣＦＳＥ濃度）及びパルスされていない（低ＣＦＳＥ濃度）集団を示す代表的なヒストグラム。
【図６】ＰＬＧＡ−ＰＥＧ／ＬＰ／ＤＮＡ複合体ならびにポリリジン（ＰＬＬ）及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して調製した比較可能な粒子で得られたグラフ結果を提供する。（Ａ）様々な複合化した粒子の粒子サイズを示す、（Ｂ）形成された粒子のゼータ電位（ＺＰ）を示す。
【図７】３０または４００μｇ／ｍｌのいずれかのＤＮＡを用いて調製したＰＬＧＡ−ＰＥＧ／ＬＰ／ＤＮＡ複合体及び他の比較可能な粒子で得られたグラフ結果を提供する。（Ａ）様々な複合化した粒子の粒子サイズを示す、（Ｂ）形成された粒子のゼータ電位（ＺＰ）を示す。
【図８】Ｃ５７マウスへの筋肉内注射後に、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ／ＬＰ／ＤＮＡ複合体（ナノルシフェラーゼ遺伝子をコードするｐＮＬＬ１．１．ＣＭＶ）で得られたグラフ結果を提供する。グラフは、組織の単位質量当たりの相対的ナノルシフェラーゼ活性を示す：Ａ）４８時間後及びＢ）７日後（Ｎ．ＤＮＡ＝等張緩衝液中の裸ＤＮＡ）。
【図９】ｃ５７マウスへのＰＬＧＡ−ＰＥＧ／ＬＰ／ｍＲＮＡ粒子の筋肉内注射後の筋肉、流入領域リンパ節、肝臓及び脾臓におけるナノルシフェラーゼの発現の相対レベルを示すグラフ結果を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
第一の態様では、本開示は、非ウイルス核酸送達剤であって、
（ｉ）細胞に送達するための核酸カーゴ、
（ｉｉ）１つまたは複数のリポペプチド化合物、及び
（ｉｉｉ）１つまたは複数の高分子電荷中和剤、
の複合体を含み、前記複合体が、実質的に中性または負の表面電荷を有する粒子の形態である、前記非ウイルス核酸送達剤を提供する。
【００１６】
本明細書で用いる場合、「非ウイルス核酸送達剤」という用語は、非ウイルス遺伝子送達方法、例えば周知の物理学的手法（例えば針注射、遺伝子銃、エレクトロポレーション、超音波またはハイドロダイナミック送達）及び／または化学的手法（例えば合成または天然に生じる化合物の、細胞に核酸を送達するためのキャリアとしての使用）において使用され得る薬剤を指すとして理解されたい。そのため、該用語は、ウイルスをベースとする遺伝子送達剤、例えばウイルスベクターを指さない。本開示に従う非ウイルス核酸送達剤は、粒子の形態にて、好ましくは、５０ｎｍ〜３００ｎｍの範囲、より好ましくは５０ｎｍ〜１５０ｎｍ、及び最も好ましくは、５０ｎｍ〜１２５ｎｍの範囲内の平均粒径サイズを有する微小粒子またはナノ粒子として提供される。
【００１７】
非ウイルス核酸送達剤は、例えば、疾患及び医学的障害に対する核酸ワクチン接種及び遺伝子治療を含む、実験室（例えば、研究）または医学／獣医学用途のための、遺伝子送達または移入に関して有用であり得る。
【００１８】
核酸カーゴは、核酸分子を含み得る。「核酸分子」という用語は、本明細書で用いる場合、任意の一本鎖または二本鎖ポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド（ｐｏｌｙｄｅｏｘｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）を含む。そのため、該用語には、一本鎖及び二本鎖ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ、ならびに直鎖形態または非線状（すなわち、環状化）形態のＤＮＡ（例えば、ＤＮＡプラスミド））、一本鎖及び二本鎖領域の混合であるＤＮＡ、一本鎖及び二本鎖ＲＮＡ（例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ））、ならびに一本鎖及び二本鎖領域の混合であるＲＮＡ、ならびに、一本鎖もしくはより典型的には二本鎖、または一本鎖及び二本鎖領域の混合であり得るＤＮＡ及びＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれる。加えて、「核酸分子」という用語は、１つまたは複数の修飾塩基を含有するＤＮＡ及びＲＮＡ、ならびに安定性または他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡ及びＲＮＡも含む。「修飾された」塩基には、例えば、トリチル化塩基、珍しい塩基、例えばイノシン、及びメチル化塩基、例えば５−メチルシトシン及びＮ１−メチルシュードウラシルが含まれ、このように化学的に修飾されているｍＲＮＡは、「修飾されたｍＲＮＡ」または「ｍｏｄＲＮＡ」と称される場合がある。「核酸分子」という用語は、比較的短いポリヌクレオチドも包含し、しばしばオリゴヌクレオチドと称される。
【００１９】
核酸カーゴは、機能性遺伝子をコードする核酸遺伝子を含み得る、あるいはそうでなければ、例えば、非機能性遺伝子またはその一部をコードする核酸分子、あるいは、細胞の機能における変化（例えば、タンパク質の産生における増加または低減）に作用することができる別の実体、例えば、例として干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）をコードするもしくは阻害性ＲＮＡ分子それ自体を構成する、またはシス作用遺伝子制御エレメントを提供する核酸分子を含み得る。核酸カーゴが、機能性遺伝子（すなわち、導入遺伝子または関心対象の遺伝子）を提供する核酸分子を含む場合、遺伝子は、遺伝子治療剤の基盤を提供するために、関心対象のタンパク質（複数可）、オリゴペプチド（複数可）もしくはペプチド（複数可）、例えば、例として、ワクチンに重要である抗原もしくはエピトープ（複数可）、または疾患もしくは医学的障害において欠けているもしくは欠損している可能性がある酵素、受容体もしくはホルモンをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された好適なプロモーター配列（例えば、構成性または誘導性プロモーター）を含む発現カセットにて構成され得る。例えば、核酸ワクチン接種の状況では、核酸カーゴは、ＨＢＶに対するワクチンを提供するために、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）表面、エンベロープ及びコア抗原（一般的にそれぞれＨＢｓＡｇ、ＨｂｅＡｇ及びＨｂｃＡｇと示される）のうちの１つまたは複数をコードするＤＮＡ分子を含み得る。別の例では、疾患または医学的状態の処置の状況では、核酸カーゴは、レッシュ−ナイハン症状群の処置のために、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）タンパク質をコードするＤＮＡ分子を含み得る。同様に、核酸カーゴは、特定の疾患または医学的状態に対する治療の基盤を提供するために、関心対象のタンパク質（複数可）、オリゴペプチド（複数可）もしくはペプチド（複数可）、例えば、例として、ワクチンに重要であり得る抗原もしくはエピトープ（複数可）、または疾患もしくは医学的障害において欠いているもしくは欠損している可能性がある酵素、受容体もしくはホルモンをコードするメッセンジャーＲＮＡであり得る。当業者によって容易に理解され得るように、このようなｍＲＮＡは、ｍＲＮＡが細胞の細胞質内で効率的に翻訳されることを可能にするために必要な配列エレメントを伴って提供される。好ましくは、このようなｍＲＮＡは、修飾塩基、例えば５−メチルシトシン及びＮ１−メチルシュードウラシルも含み得、それはこれらが安定性、免疫刺激活性の低下、翻訳効率の向上などの多くの利点をもたらし得るためである［１２］。他の実施形態では、核酸カーゴは、関心対象のタンパク質（複数可）、オリゴペプチド（複数可）もしくはペプチド（複数可）、例えば、例として抗原もしくはエピトープ（複数可）、または酵素、受容体もしくはホルモンへの翻訳のために導入遺伝子からｍＲＮＡを、細胞の細胞質内で生成する導入遺伝子を含む自己増殖性レプリコンＲＮＡ（例えばアルファウイルス、（＋）ｓｓＲＮＡウイルスのグループに由来するもの［１７］）であり得る。
【００２０】
核酸カーゴを含む核酸分子のサイズは、５塩基〜５０キロ塩基長であり得る。例えば、核酸分子が、オリゴヌクレオチド分子（ペプチド核酸及びホスホチオエート修飾核酸を含む）である場合、核酸分子は、５〜５０塩基長であり得、ポリヌクレオチド分子である核酸分子に関しては、核酸分子は、５０塩基〜５０キロ塩基長、より好ましくは、１〜１０キロ塩基長であり得る。
【００２１】
非ウイルス核酸送達剤は、１つまたは複数のリポペプチド化合物を含む。好適なリポペプチドは、核酸カーゴ及び高分子電荷中和剤と複合体化して、実質的に中性または負の表面電荷を有する粒子を形成し得ることが見いだされている。このようなリポペプチドは、核酸凝縮剤として作用し得、ＬＮＰにおいて見られるカチオン性脂質の代わりに使用することができる。従って、いくつかの好ましい実施形態では、非ウイルス核酸送達剤には、カチオン性脂質が存在しない。また、非ウイルス核酸送達剤は、ポリカチオン性リガンド、例えばポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含まないことが好ましい。
【００２２】
好適なリポペプチドは、一般式Ｉ：
（Ｉ）Ｒ−Ｌ−ペプチド
のものを含み、
式中、Ｒは、直鎖または分岐鎖アルキル（例えば、Ｃ１２−３５、しかしより好ましくはＣ１２−２５）、例えばＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−であり、
ｎは、１１〜２１（好ましくは１３〜１８）の範囲の整数であり、
Ｌは、リンカー基（例えば、任意の好適な連結基、例えば、例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ベースのリンカー及びジスルフィド（−Ｓ−Ｓ−）リンカーを含む化学リンカー）であり、
ペプチドは、２〜１５個のアミノ酸、好ましくは５〜１０個のアミノ酸を含む任意のアミノ酸配列のものであるが、ただしアミノ酸の少なくとも２個が、強塩基性／正荷電性を有するもの（例えば、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）、ならびに他の非標準（「非正準」）アミノ酸、例えばアザ−ロイシン及びＮ−メチルアルギニン）から独立して選択される。
【００２３】
好ましいリポペプチドは、典型的には、一般式ＩＩ：
（ＩＩ）Ｒ−ＣＯ−ペプチド
のものであり得、
式中、Ｒは、ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎは、１１〜２１、好ましくは１３〜１８の範囲の整数であり、ペプチドは、２〜１５個のアミノ酸、好ましくは５〜１０個のアミノ酸を含む任意のアミノ酸配列のものであるが、ただし、アミノ酸の少なくとも２個は、強塩基性／正荷電性を有するもの（例えば、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）、ならびに他の非標準（「非正準」）アミノ酸、例えばアザ−ロイシン及びＮ−メチルアルギニン）から独立して選択される。
【００２４】
一般式（Ｉ）のリポペプチドは、例えば、Ｒのカルボン酸誘導体をペプチドのＮ末端と反応させることによって生成され得る、従って、表記Ｒ−ＣＯ−ペプチドであり得る。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ペプチドは、少なくとも１個のシステイン（Ｃｙｓ）及び強塩基性／正荷電性を有するアミノ酸から選択される少なくとも３個の残基を含む。好ましくは、ペプチドは、少なくとも３個のＬｙｓまたはＡｒｇアミノ酸を含む。例えば、ペプチドは、アミノ酸配列：Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｘ２−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号２）を含む６−ｍｅｒ（すなわち、ヘキサペプチド）であり得、式中、Ｘ１及びＸ２は、任意のアミノ酸であり、同じであっても異なってもよいが、Ｘ１及びＸ２は、好ましくは、Ａｒｇ及びＨｉｓから選択される。従って、いくつかの実施形態では、リポペプチドは、ステアロイル−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｘ２−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（すなわち、ここでｎは、１７である）（配列番号２）であり得る。ペプチド構成要素のＣ末端は、好ましくは、遊離ＣＯＯＨまたはアミドのいずれかである。Ｃｙｓ残基（複数可）は、リポペプチド分子間のジスルフィド架橋を可能にして、形成される複合体の安定性を向上させ得る、及び非ウイルス核酸送達剤のｉｎ  ｖｉｔｒｏ適用において有益であり得る、高密度の粒子の形成を助け得る。好ましくは、かかる実施形態のペプチドは、好ましくは１位に位置する、しかしながらペプチド内の他の位置も好適であり得る、単一のＣｙｓ残基を含むだろう。
【００２６】
いくつかの他の実施形態では、ペプチドは、システイン（Ｃｙｓ）残基を含まない場合がある。Ｃｙｓを欠くリポペプチドは、調製を単純化する（すなわち、ジスルフィド架橋を形成するために使用する前にリポペプチドが還元されているか確認する必要がない）ことにより、非ウイルス核酸送達剤の特にｉｎ  ｖｉｖｏ適用において有利であり得、リポペプチドのジスルフィド架橋を伴わなければ、一度細胞に送達された粒子複合体のｉｎ  ｖｉｖｏ「アンカップリング」はより効率的であり得る。前の段落において記載したリポペプチドと同様に、リポペプチドがＣｙｓを欠く実施形態のペプチドは、強塩基性／正荷電性を有するアミノ酸から選択される少なくとも３個の残基を含むことになる。好ましくは、ペプチドは、少なくとも３個のＬｙｓまたはＡｒｇアミノ酸を含む。例えば、ペプチドは、アミノ酸配列：Ｘ０−Ｘ１−Ｘ２−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号３）を含む６−ｍｅｒであり得、式中、Ｘ０は存在しないまたはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸（及び好ましくは、ＳｅｒまたはＴｈｒ）であり、Ｘ１及びＸ２は、任意のアミノ酸（Ｃｙｓ以外）であり、同じであっても異なってもよいが、Ｘ１及びＸ２は、好ましくはＡｌａ、Ａｒｇ及びＨｉｓから選択される。従って、いくつかの実施形態では、リポペプチドは、ステアロイル−Ｓｅｒ−Ｘ１−Ｘ２−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（すなわち、式中、ｎは１７である）（配列番号４）であり得る。ペプチド構成要素のＣ末端は、好ましくは遊離ＣＯＯＨまたはアミドのいずれかである。
【００２７】
特に好ましい実施形態では、非ウイルス核酸送達剤は、ステアリル−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（下記に示すステアロイル−ＣＨ２Ｋ３、配列番号１）、ステアロイル−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ステアロイル−ＣＡ２Ｋ３、配列番号５）及びＮ−ラウリル−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（ラウロイル−ＣＨ２Ｒ３、配列番号６）から選択されるリポペプチド化合物を含む。リポペプチドは、下記に示すように遊離ＣＯＯＨをＣ末端にて有し得る、またはアミド（ＣＯＮＨ２）をＣ末端にて備え得る。
2020528403.tif 000002
ステアロイル−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
【００２８】
他の特に好ましい実施形態では、非ウイルス核酸送達剤は、ステアロイル−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（下記に示すステアロイル−ＳＨ２Ｋ３、配列番号７）、ステアロイル−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ステアロイル−ＳＡ２Ｋ３、配列番号８）及びＮ−ラウリル−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（ラウロイル−ＳＨ２Ｒ３、配列番号９）から選択されるリポペプチド化合物を含む。リポペプチドは、下記に示すように、遊離ＣＯＯＨをＣ末端にて有し得る、またはアミド（ＣＯＮＨ２）をＣ末端にて備え得る。
【００２９】
有利なことに、リポペプチドは水溶性であり、それにより、溶媒（ＬＮＰの調製に必要とされる場合を比較されたい）または（例えば、溶媒を取り除くための）余計な精製ステップを必要とせずに完全に水性培地にて非ウイルス核酸送達剤の潜在的な生産を可能にする。
【００３０】
非ウイルス核酸送達剤は、１つまたは複数の高分子電荷中和剤を含む。高分子電荷中和剤は、（すなわち、カチオン性リポペプチドによって提供され得る）正電荷を遮蔽または中和するように機能すると考えられ、そのため非ウイルス核酸送達剤の粒子は、実質的に中性または負の粒子表面電荷を特徴とする。
【００３１】
好適な高分子電荷中和剤（複数可）には、脂質成分を組み込んだポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の誘導体、例えばリン脂質（例えば、ホスファチジルエタノールアミン−ＰＥＧ（ＰＥ−ＰＥＧ）及びジステアロイル−ホスホエタノールアミン−（ポリエチレングリコール）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ））、ポリアミノ酸ポリマー、例えばポリアスパラギン酸（ＰＡＡ）またはポリグルタミン酸（ＰＧＡ）及び他のアニオン性ポリマー、例えばポリ（アクリル酸）ポリマー、ならびに、負に荷電したブロック及び中性、親水性ブロックを含むある特定のブロックコポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）とポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミドのブロックコポリマー）（ポリＨＰＭＡ）、及びポリ（アクリル酸）とポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリルアミドのブロックコポリマー）（ポリＨＥＭＡ））が含まれる。
【００３２】
高分子電荷中和剤（複数可）は、好ましくは、対象の体内で少なくとも許容可能なレベルの生体適合性及び／または生分解性を示す。ポリアミノ酸ポリマー及び、特にＰＧＡは、少なくとも許容可能なレベルの生体適合性及び生分解性を両方とも示す。ゆえに、いくつかの好ましい実施形態では、高分子電荷中和剤（複数可）は、ポリ（グルタミン酸塩）−ＰＥＧコポリマー（ポリＧｌｕ−ＰＥＧ）から選択される。特定の例としては、ポリ（グルタミン酸塩）及びポリ（エチレングリコール）のブロックポリマーが挙げられ、ポリ（エチレングリコール）は、ポリ（エチレンオキシド）またはＰＥＧとしても知られる。このようなポリＧｌｕ−ＰＥＧコポリマーは、（例えば、Ａｌａｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａから）市販されている。いくつかの特定の実施形態では、高分子電荷中和剤（複数可）は、例えば、２２、１１３または４５４ＰＥＧユニット（それぞれ、分子量１０００Ｄａ、５０００Ｄａ及び２００００Ｄａ）を、１０、５０、１００または２００グルタミン酸塩ユニット（それぞれ、分子量１５００Ｄａ、７５００Ｄａ、１５０００Ｄａ及び３００００Ｄａ）と組み合わせて含むブロックコポリマー含む。一特定の実施形態では、高分子電荷中和剤（複数可）は、１１３ＰＥＧユニット（分子量約５０００Ｄａ）及び１００グルタミン酸塩ユニット（分子量約１５０００Ｄａ）を含むメトキシ−ＰＥＧ−ポリグルタミン酸ブロックポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）を含む。別の特定の実施形態では、高分子電荷中和剤（複数可）は、２０グルタミン酸塩ユニット（分子量約３０００Ｄａ）、１１３ＰＥＧユニット（分子量約５０００Ｄａ）そしてさらに２０グルタミン酸塩ユニット（分子量約３０００Ｄａ）を含む、ポリグルタミン酸−ＰＥＧ−ポリグルタミン酸トリブロックポリマーを含む。このようなブロックコポリマーは、高分子生成物の分子量の制御を可能とする、例えば、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合により、生成することができる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、高分子電荷中和剤（複数可）は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧコポリマーを除外し得る、または、より具体的には、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を除外し得る。つまり、ポリマー電荷中和剤は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧコポリマーまたはＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００以外のＰＥＧ誘導体であり得る。
【００３４】
ポリマー電荷中和剤（複数可）は、本開示の非ウイルス核酸送達剤へと、例えば、核酸カーゴ及びリポペプチド化合物（複数可）間での複合体形成中にポリマー電荷中和剤（複数可）を着実に加えることにより容易に組み込まれ得る。実際、驚くべきことに、核酸カーゴ、リポペプチド化合物（複数可）、例えばカチオン性リポペプチド、ならびに生体適合性及び／または生分解性高分子電荷中和剤（複数可）、例えばポリ（グルタミン酸塩）−ＰＥＧコポリマーの新しい組み合わせが、単一の生成ステップにおいて高濃度で複合化した粒子の形成を可能とし得ることが見いだされている。ポリ（グルタミン酸塩）−ＰＥＧを使用すると、ナノ粒子寸法のより微細な粒子（すなわち、平均粒径が５０〜１００ｎｍの粒子）を生成できることも見いだされた。
【００３５】
上述のように、非ウイルス核酸送達剤の粒子は、実質的に中性または負の粒子表面電荷を特徴とする。当業者は、実質的に中性の表面電荷を有する粒子が、当業者に周知の標準的なゼータ電位測定技術により（しかし、好ましくは、以降の実施例１に記載するように動的光散乱法（ＤＬＳ）と組み合わせた電気泳動技術を使用することにより）測定して、−５〜５ｍＶの範囲のゼータ電位（ＺＰ）を示すとみなされ得ることを理解するだろう。負の表面電荷を特徴とする粒子は、−４０〜−５ｍＶの範囲のゼータ電位（ＺＰ）を示し得る。
【００３６】
実質的に中性または負の表面電荷を有することにより、本開示に従う非ウイルス核酸送達剤の粒子は、細胞外タンパク質、例えば負に荷電した血清タンパク質と電子的に結合する可能性が低くなり、従来のＬＮＰをベースとする薬剤に比べて、生体内分布及び効率の改善を示し得る。好ましくは、中性粒子は、−２〜２ｍＶの範囲、より好ましくは０〜１ｍＶ範囲の零電位表面電荷を示すだろう。負の粒子が好まれる際は、これらは、−４０〜−１０ｍＶの範囲のゼータ電位表面電荷を示すだろう。
【００３７】
非ウイルス核酸送達剤は、好ましくは、リポペプチド化合物（複数可）及び核酸カーゴを、１：１（リポペプチド：核酸）〜４：１の範囲内、より好ましくは、約１．５：１〜約３．５：１の範囲内のモル電荷比で含み得る。いくつかの特定の実施形態では、リポペプチド化合物（複数可）及び核酸カーゴは、約２：１（リポペプチド：核酸）のモル電荷比で存在し得る。
【００３８】
非ウイルス核酸送達剤は、好ましくは、高分子電荷中和剤（複数可）及びリポペプチド化合物（複数可）を、１：４（ポリマー：リポペプチド）〜１：１の範囲内、より好ましくは、約１：３〜約１：２の範囲内のモル電荷比で含み得る。いくつかの特定の実施形態では、高分子電荷中和剤（複数可）及びリポペプチド化合物（複数可）は、約０．７５：２または約１：２（ポリマー：リポペプチド）のモル電荷比で存在し得る。
【００３９】
いくつかの実施形態では、高分子電荷中和剤（複数可）、リポペプチド化合物（複数可）及び核酸カーゴは、非ウイルス核酸送達剤内に、約０．７５：２：１または約１：２：１（ポリマー：リポペプチド：核酸）のモル電荷比で存在し得る。
【００４０】
非ウイルス核酸送達剤は、任意選択で、受容体媒介核酸移入リガンド、抗体または標的とする送達のために操作された抗体の断片を、組み込み得る。受容体媒介核酸移入リガンドの使用は、細胞表面受容体を標的とするリガンドを使用することにより、核酸カーゴの細胞または細胞特異的送達を達成することを目的とする。リガンドは、核酸分子、リポペプチド化合物（複数可）及び／または高分子電荷中和剤（複数可）にコンジュゲートし得る。受容体媒介遺伝子移入のためのリガンドの例としては、それぞれトランスフェリン受容体、ニューロテンシン受容体及びマンノース受容体を標的とする、トランスフェリン、ニューロテンシン及びマンナンが挙げられる。トランスフェリン受容体は、ほとんどの細胞上で見いだされ、ニューロテンシン受容体は、ニューロン、例えば脳内のグルタミン酸作動性ニューロン上で見いだされ、マンノース受容体は、細胞、例えばマクロファージ、樹状細胞及びいくつかの内皮細胞上で見いだされる。
【００４１】
一特定の実施形態では、本開示の非ウイルス核酸送達剤は、ワクチンに重要なＤＮＡまたはＲＮＡ分子（例えば、抗原またはエピトープをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはｍＲＮＡ分子）の細胞への送達のためのＤＮＡまたはＲＮＡワクチンとみなされ得る。
【００４２】
別の特定の実施形態では、本開示の非ウイルス核酸送達剤は、細胞への自己増殖性レプリコンＲＮＡの送達のための薬剤である。
【００４３】
なおも別の特定の実施形態では、本開示の非ウイルス核酸送達剤は、細胞へのｍｏｄＲＮＡの送達のための薬剤である。
【００４４】
第二の態様では、本開示は、核酸分子を対象の細胞に送達する方法であって、
第一の態様に従う非ウイルス核酸送達剤を提供するステップ、及び
非ウイルス核酸送達剤を、対象の前記細胞に送達するステップを含む、前記方法を提供する。
【００４５】
非ウイルス核酸送達剤は、細胞に、（例えば、筋肉内（ｉｍ）投与などの非経口投与のために）単純な針注射、遺伝子銃、エレクトロポレーション、超音波またはハイドロダイナミック送達方法を使用して送達され得る。
【００４６】
非ウイルス送達核酸剤は、１つまたは複数の好適なキャリアまたは賦形剤と組み合わせて送達され得る。
【００４７】
ゆえに、第三の態様では、本開示は、第一の態様に従う非ウイルス送達核酸剤を薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物を提供する。
【００４８】
非ウイルス核酸送達剤が送達される細胞は、急速に分化する細胞型、例えばがん細胞であり得る。しかしながら、そうでない場合、細胞は、急速に分化しているとみなされない型（例えば、筋肉の細胞型、腎臓及び肝臓の細胞型、免疫系の細胞型ならびに肺の細胞型を含む）のものであり得る。
【００４９】
第四の態様では、本開示は、第一の態様に従う非ウイルス送達核酸剤を生成する方法であって、
核酸カーゴ、１つまたは複数のリポペプチド化合物（複数可）、及び１つまたは複数の高分子電荷中和剤を、複合化した粒子の形成に好適な条件下で、組み合わせることを含む、前記方法を提供する。
【００５０】
リポペプチド化合物（複数可）及び核酸カーゴは、１：１（リポペプチド：核酸）〜４：１の範囲内、より好ましくは、約１．５：１〜約３．５：１の範囲内のモル電荷比で組み合わされ得る。いくつかの特定の実施形態では、リポペプチド化合物（複数可）及び核酸カーゴは、約２：１（リポペプチド：核酸）のモル電荷比で組み合わされ得る。
【００５１】
高分子電荷中和剤（複数可）及びリポペプチド化合物（複数可）は、１：４（ポリマー：リポペプチド）〜１：１の範囲内、より好ましくは、約１：３〜約１：２の範囲内のモル電荷比で組み合わされ得る。いくつかの特定の実施形態では、高分子電荷中和剤（複数可）及びリポペプチド化合物（複数可）は、約０．７５：２または約１：２（ポリマー：リポペプチド）のモル電荷比で組み合わされ得る。
【００５２】
いくつかの実施形態では、高分子電荷中和剤（複数可）、リポペプチド化合物（複数可）及び核酸カーゴは、約０．７５：２：１または約１：２：１（ポリマー：リポペプチド：核酸）のモル電荷比にて組み合わされ得る。
【００５３】
好ましくは、核酸カーゴ、１つまたは複数のリポペプチド化合物、及び１つまたは複数の高分子電荷中和剤を組み合わせるステップ（及び後続の複合化した粒子の形成）は、水相中で実行される。
【００５４】
本開示の非ウイルス核酸送達剤を、以下の非限定例及び添付の図面に関して、以降にさらに記載する。
【実施例】
【００５５】
実施例１
２つのＤＮＡ複合体、すなわちカチオン性ＬＰ／ＤＮＡ複合体及び中和したＰＥＧ化ＬＰ／ＤＮＡ複合体を開発し、ｉｎ  ｖｉｖｏにて評価した。ＰＥＧ化ＬＰ／ＤＮＡ複合体を、自己組織化中に、ジステアロイル−ホスホエタノールアミン−（ポリエチレングリコール）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）を、ＬＰ／ＤＮＡ複合体に加えることにより開発した。
2020528403.tif 000003
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００
【００５６】
ＤＮＡワクチン送達における複合体のカチオン性表面電荷を遮蔽する効果の理解を助けるために、２つのＤＮＡ複合体の分布、トランスフェクション及び免疫原性間の関係を調査し、溶液中の裸のＤＮＡの注射と比較した。
【００５７】
方法及び材料
材料
ステアロイル−ＣＨ２Ｋ３  ＬＰを、Ｇ．Ｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ，Ｃｈｉｎａ）によりカスタム製造し、一方でＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００は、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）から得た。全ての材料を、使用のために、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）−グルコース緩衝液（ＨＧＢ）（１５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び５％ｗ／ｖグルコース、ｐＨ＝７．４）に溶解した。蛍光分布試験において使用したプラスミドＤＮＡは、サイトメガロウイルスプロモーターにより制御されるベータ−ガラクトシダーゼ発現カセットを含有するｐｃＤＮＡ３．１ＨｙｇｒｏｌａｃＺ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）とした。組織キャリブレーション済みｑＰＣＲ試験に関して、ｐＣＭＶ−ｌｕｃ（ｐＧＬ２ベーシック（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）からのホタルルシフェラーゼｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のマルチプルクローニングサイトにライゲートすることにより構築、を使用した。Ｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝子発現試験は、ｐＮＬ１．１．ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、サイトメガロウイルスプロモーター（ｐＣＭＶ）の制御下でナノルシフェラーゼ遺伝子を含有する３８６１塩基対のＤＮＡプラスミドを使用した。免疫原性試験のために使用されたプラスミドは、分泌型のオボアルブミン［１３］を発現するｐＣＭＶ−ＯＶＡとした。これらの試験で使用されたオボアルブミンタンパク質及びＯＶＡ２５７−２６４合成ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ、配列番号１０）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）から購入した。オボアルブミン陽性対照と共注射された免疫刺激補助剤として使用されたリポ多糖類（ＬＰＳ）［１４］も、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）色素は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから得た。
【００５８】
マウス
動物は、８〜１２週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスを使用した。別段の指定がない限り、筋肉内注射を左腓腹筋肉に行い、５０μｇ用量の裸プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を５０μＬ容量にて使用した。全てのマウスは、筋肉内注射の前に、１〜４％滴定イソフルランガスを用いて麻酔した。
【００５９】
モル電荷比の計算
ＬＰ／ＤＮＡ複合体の文脈では、電荷比は、カチオン性トランスフェクション剤により提供される正に荷電したアミン基（ＮＨ３＋）／ＤＮＡの負に荷電したリン酸基（ＰＯ４−）（この場合、１リン酸基＝１ヌクレオチド）の数を指す。例えば、ステアロイル−ＣＨ２Ｋ３（１０４５．４５ｇ／ｍｏｌ、３ＮＨ３＋／分子）を使用して１：１（ＬＰ：ＤＮＡ）の理論的な電荷比を得るためには、１μｇのプラスミドＤＮＡ（３ｎｍｏｌ）を、１．０６μｇのステアロイル−ＣＨ２Ｋ３（１ｎｍｏｌ）と混合する。ＤＮＡのヌクレオチド当たりの３３０ｇ／ｍｏｌの平均質量を計算に使用した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡ複合体の文脈では、電荷比は、それぞれ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００により提供される負に荷電したリン酸基／ＬＰの正に荷電したアミン／ＤＮＡのリン酸基の数を指す。例えば、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（２８０５．５４ｇ／ｍｏｌ、ＰＯ４−／分子）及びステアロイル−ＣＨ２Ｋ３を用いて、１：１：１（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００：ＬＰ：ＤＮＡ）の理論的な電荷比を得るためには、１μｇのプラスミドＤＮＡ（３ｎｍｏｌ）を、１．０６μｇのステアロイル−ＣＨ２Ｋ３（１ｎｍｏｌ）及び８．５μｇのＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００（３ｎｍｏｌ）と混合する。
【００６０】
ＤＮＡ複合体の調製
ＬＰ／ＤＮＡ複合体は、ＬＰ及びＤＮＡを、０．５：１〜５：１（ＬＰ：ＤＮＡ）の（＋／−）電荷比の範囲にわたって、一緒に混合することにより調製した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡ複合体は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００、ＬＰ及びＤＮＡを、０．５：２．５：１〜５：２．５：１（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００：ＬＰ：ＤＮＡ）の電荷比の範囲にわたって、一緒に混合することにより調製した。ＤＮＡ複合体混合物を、次いで、使用前に、室温で３０分間インキュベートした。ｉｎ  ｖｉｖｏ注射用にＤＮＡ複合体を濃縮するため、限外ろ過（５，０００ｇ、４℃にて約５．５時間）をＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心式ユニット（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を、３ｋＤａの公称分画分子量（ＮＭＷＬ）で用いて行った。
【００６１】
粒子特性評価
色素排除アッセイ
ＬＰがＤＮＡを効果的に凝縮する電荷比を決定するために、色素排除アッセイを行った。９６ウェルの黒底プレートにて、プラスミドＤＮＡ（２０μｇ／ｍＬ）を、１２ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）緩衝液中で調製した。ＤＮＡを含有する各ウェルに、０．０５μＬのインターカレーティングＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の１０，０００倍濃縮ストックを加え、プレートを室温で１５分間インキュベートした。ＬＰを、次いで、０．５：１から５：１の一連の電荷比にてウェルに加えた。２０μｇ／ｍＬの裸ＤＮＡ及びＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄを含有するウェルを、１００％蛍光強度標準（すなわち、ＬＰが添加されていない）として使用した。ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄのみを緩衝液中に含有するブランクウェルを使用して、各試料の蛍光読み取り値から差し引いた。プレートを、室温にて３０分間インキュベートして、粒子を形成させた。各試料の蛍光（励起４９２ｎｍ、発光５４０ｎｍ）を、Ｗａｌｌａｃ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２１０２マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を使用して測定した。
【００６２】
粒子サイズ分類及びゼータ電位
各複合体の平均粒子サイズ（Ｚ平均）及びゼータ電位を、ＤＬＳを介して、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して測定した。粒子サイズ分類に関しては、測定は２５℃にて実行し、各測定は１０回の実行から構成され、それぞれの持続時間は１０秒とした。試料のサイズの多分散指数（ＰＤＩ）を、各測定に関して記録した。機器がキャリブレーションされていることを確認するために、６０ｎｍ±２．７ｎｍサイズ標準（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を実験前に使用した。ゼータ電位測定に関しては、機器がキャリブレーションされていることを確認するために、−６８ｍＶ±６．８ｍＶゼータ電位標準（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を、実験前に分析した。全ての測定は、２５℃にて実行した。
【００６３】
Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ
低温透過型電子顕微鏡法（Ｃｒｙｏ−ＴＥＭ）を実行して、ＤＮＡ複合体を撮像した。複合体を、上述のように調製し、５μＬの各試料を穴の開いたカーボンコーティング銅３００メッシュグリッドに載せた。グリッドを、次いで、液体窒素で冷却した液体エタン浴中で急速凍結させた。各試料の温度を、撮像の時までクライオホルダーにて維持した。
【００６４】
塩安定性アッセイ
塩誘導凝集に対するＤＮＡ複合体の安定性を検査するために、ＮａＣｌの添加前後の粒子の粒子サイズ分類を実行した。簡潔には、ＤＮＡ複合体を、ＨＧＢにて調製し、ＤＬＳを使用して、粒子サイズを測定した。ＮａＣｌ溶液を、次いで、粒子に加えて、０．１５Ｍの最終濃度とした。粒子を３０分間インキュベートしてから、ＤＬＳ測定を再度実行した。
【００６５】
導入遺伝子発現
ルシフェラーゼアッセイを実行して、レポーターナノルシフェラーゼタンパク質をアッセイした。注射後１、３０及び９０日の時点で、各マウスの腓腹筋肉を解剖し、液体窒素中で急速凍結した。筋肉を、次いで、緩衝液（５０ｍＭリン酸カリウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭエチレンジアミン四酢酸、１０％グリセロール）中で、ローター／ステーター式組織ホモジナイザー（ＴｉｓｓｕｅＴｅａｒｏｒ，Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を使用してホモジナイズした。ナノルシフェラーゼレポータータンパク質の定量化を、市販のＮａｎｏ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステムをＧｌｏ  Ｌｙｓｉｓ緩衝液（両方ともＰｒｏｍｅｇａ製）と、製造業者の指示に従って使用して、実行した。発光は、ＬＵＭＩＳｔａｒ  Ｏｍｅｇａ機器（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ，Ｏｒｔｅｎｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した。試料間の比較を可能とするために、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイを採用して、発現レベルの標準化のために組織溶解物中の総タンパク質を決定した。このアッセイは、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を製造業者の指示に従って使用して実行し、ウシ血清アルブミンをタンパク質標準として使用した。結果得られた吸光度を、ＥｎＶｉｓｉｏｎ（登録商標）マルチラベルリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を５９５ｎｍの波長にて使用して測定した。
【００６６】
組織キャリブレーション済みｑＰＣＲ
組織キャリブレーション済みｑＰＣＲを、Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．［１５］により概説された手順に従って行った。簡潔には、マウスに、裸プラスミドＤＮＡまたはＤＮＡ複合体を、ｐＣＭＶ−ｌｕｃを使用して、筋肉内注注射した。注射３０分後、組織を採取し、ＤＮＡｚｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中で、ハンドヘルドＴｉｓｓｕｅＴｅａｒｏｒホモジナイザー（Ｂｉｏｓｐｅｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を使用して、またはＰｅｌｌｅｔ  Ｐｅｓｔｌｅｓモーターグラインダー（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて、ホモジナイズし、プロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖｅｎｌｏ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）（１００μｇ／ｍｌ）と室温で一晩インキュベートした。組織抽出物を、次いで、１０分間１０，０００ｇで４℃にて遠心分離し、総ＤＮＡを、Ｗｉｚａｒｄ  ＤＮＡプレップスピンカラム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、製造業者の指示に従って使用して、上清から抽出した。リアルタイム定量ＰＣＲを、ＣＦＸ９６（商標）リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて行った。フォワード（５’ＣＣＴＣＡＴＡＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＧ３’、配列番号１１）及びリバース（５’ＡＣＡＣＣＧＧＣＣＴＴＡＴＴＣＣＡＡＧ３’、配列番号１２）プライマーを使用して、ｐＣＭＶｌｕｃの１１４ｂｐ断片を増幅した。各ＰＣＲ反応は、５μＬのｉＱ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）、２００ｎｍｏｌ／ｌの各プライマー、１ｎｇの鋳型ＤＮＡ及び水からなり、総反応容量は、１０μＬであった。反応は、９５℃にて３分間初期インキュベーションを行い、その後４０サイクルの変性を９５℃にて１０秒間、アニーリングを４７℃にて３０秒間、そして伸長を７２℃にて３０秒間行った。全ての反応は、３重に行い、鋳型ＤＮＡの代わりに水を含有する「鋳型無し」対照を、全てのＰＣＲ実行に含めた。組織内に存在するプラスミドの絶対定量を、アッセイされた各組織に関して構築された標準曲線を使用して行った。標準曲線は、段階希釈したプラスミド標準を、事前に秤量して、切除した関心対象の各組織のホモジネートに加えることにより、作成した。
【００６７】
組織内のＤＮＡ複合体の局在化の追跡
投与後のＤＮＡ複合体を追跡するために、ｐｃＤＮＡ３．１ＨｙｇｒｏｌａｃＺを、蛍光ヌクレオチドＣｈｒｏｍａＴｉｄｅ（登録商標）Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（登録商標）５９４−５−ｄＵＴＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて共有結合標識した。簡潔には、プラスミドＤＮＡを、ＢｇｌＩＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）（２ユニット／１μｇのＤＮＡ）を用いて消化し、一晩３７℃にてインキュベートして、５’ＧＡＴＣオーバーハングを伴う直鎖プラスミドを得た。このプラスミドを、フェノール−クロロホルム抽出、その後のエタノール沈殿を介して精製した。クレノウ断片（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を、次いで、６０ｎｍの各ｄＮＴＰ（ｄＵＴＰを蛍光Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ（登録商標）５９４−５−ｄＵＴＰに置き換える）に加えて、線形化したプラスミドに加え、混合物を室温で４時間インキュベートした。反応を、エチレンジアミン四酢酸を加えることにより終了させて、１０ｍＭの最終濃度とした。フェノール−クロロホルム抽出及びエタノール沈殿を行って、結果得られた標識プラスミド（ＤＮＡ−ＡＦ５９４）を精製した。溶液中の組み込まれていない遊離ヌクレオチドの存在を最小限に抑えるため、ＤＮＡペレットを７０％エタノールで３回洗浄してから、ＤＮＡ再懸濁を行った。マウスに、裸ＤＮＡ−ＡＦ５９４またはＤＮＡ−ＡＦ５９４複合体を、５０μＬ中５０μｇの用量にて筋肉内注射した。これらのマウスを、次いで注射３０分後に安楽死させた。筋肉を解剖し、４％ＰＦＡにて固定し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（登録商標）ＯＣＴ（商標）コンパウンド（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）中ドライアイスを用いて凍結した。凍結切片化を、−２０℃にて行った。１０μｍ切片を、組織の８００μｍ毎に収集した。組織切片を、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）にマウントし、Ｎｉｋｏｎ  Ａ１Ｒ共焦点顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ，Ｍｉｎａｔｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して撮像した。ＤＮＡ−ＡＦ５４９の合計ピクセル計数を、Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（ＮＩＨ）を使用して、各画像に関して行い、設定しきい値レベルは、ビヒクル処置筋肉の撮像により決定して６０とした。加えて、画像のそれぞれにおける蛍光ＤＮＡの局在化の程度は、筋上膜、筋周膜または筋内膜のいずれかと関連して分類した。分類は、以下の通りとした：＋＋＋は、高度の関連性を示し、＋＋は、中程度の関連性を示し、＋は、低程度の関連性を示し、−は、この領域と関連する検出可能レベルの標識ＤＮＡがなかったことを示した）。値を、次いで、＋＋＋を３、＋＋を２、＋を１、−を０として、各カテゴリーに割り当てた。各細胞外領域に関するこれらの数の合計（すなわち、加重ピクセル数）を、各筋肉について決定し、平均をグラフにプロットした。
【００６８】
Ｉｎ  Ｖｉｖｏ細胞傷害性Ｔリンパ球除去アッセイ
ＤＮＡ複合体を注射したマウスにおいて誘発された全体的な細胞応答を評価するために、ｉｎ  ｖｉｖｏ細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）活性アッセイを、Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌに概説された手順に従って行った。［１６］。
【００６９】
マウス注射及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ計画
１日目に、マウスをＤＮＡ複合体または対照製剤でプライムした。ＬＰ／ＤＮＡ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡ複合体を、ｐＣＭＶ−ＯＶＡプラスミドを使用して前述のように調製した。この実験において使用した陽性対照製剤は、２×１０７個のオボアルブミンコーティング脾臓細胞と１μｇのＬＰＳの注射とした。オボアルブミンコーティング脾臓細胞は、（ナイーブＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスからの）単離された脾臓細胞の単細胞懸濁液を、オボアルブミンとインキュベートすることによって調製した。脾臓細胞を、赤血球溶解緩衝液に懸濁し、３７℃にて２分間インキュベートし、洗浄し、７０μｍセルストレーナーに通して、細胞デブリをいずれも濾去した。細胞を、次いで、オボアルブミン（１０ｍｇ／ｍＬ）と、３７℃にて１０分間インキュベートし、洗浄し、次いで、ＰＢＳに再懸濁した。免疫化６日後に、マウスに、標的脾臓細胞（調製は下記に概説する）を静脈内注射した。翌日、脾臓細胞をマウスから採取し、フローサイトメトリーを介して分析した（調製は下記に概説する）。除去された標的オボアルブミン−パルス脾臓細胞の割合（％）を次いで、各マウスに関して計算した。
【００７０】
標的脾臓細胞の調製
標的脾臓細胞を、赤血球の単離された脾臓細胞の単細胞懸濁液を枯渇させ、細胞の集団を均等に２本の管へと分割することにより調製した。一方の管に、ＯＶＡ２５７−２６４ペプチドを加えて、１μｇ／ｍＬの濃度とした。両方の管を、次いで、３７℃にて１時間インキュベートし、洗浄し、１０７個の細胞／ｍＬでＰＢＳ及び１％ＦＢＳ中に再懸濁した。脾臓細胞のＯＶＡ２５７−２６４ペプチドパルス管に、０．５μＬの１０ｍＭ  ＣＦＳＥを細胞の１ｍＬ当たりで加えた（すなわち、高ＣＦＳＥ濃度）。脾臓細胞のパルスされていない集団に、０．５μＬの１ｍＭ  ＣＦＳＥを細胞１ｍＬ当たりで加えた（すなわち、低ＣＦＳＥ濃度）。この２本の管を、次いで、３７℃にて１０分間インキュベートし、洗浄し、次いで、ＰＢＳ中に再懸濁した。細胞の２つの集団を、次いで、１：１の比率（高ＣＦＳＥ：低ＣＦＳＥ集団）にて１つに混合し、各マウスに、２００μＬのＰＢＳ中の２×１０７個の混合細胞を静脈内注射した。
【００７１】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーを、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を使用して行って、脾臓細胞のＯＶＡパルス（高ＣＦＳＥ標識）集団の、パルスされていない（低ＣＦＳＥ標識）脾臓細胞に対する比率を同定した。各試料に関して、２百万の事象が記録された。次いで、各マウスにおけるＯＶＡ特異的Ｔ細胞活性化から除去された細胞の割合（％）を、以下の式：
１−（陰性対照マウスにおけるパルス：パルスされていない脾臓細胞の比率）／（実験マウスにおけるパルス：パルスされていない脾臓細胞の比率）×１００
を使用して計算した。
【００７２】
抗体応答アッセイ
マウスに、裸プラスミド（対照）、ＬＰ／ＤＮＡもしくはＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡ複合体（試験製剤）、オボアルブミンタンパク質（陽性対照）または生理食塩水（陰性対照）いずれかの初回投与（プライム）を、１日目に施し、オボアルブミン発現ｐＣＭＶ−ＯＶＡをプラスミドＤＮＡとして使用した。ブースター注射を、次いで、４週間後に投与した。裸ＤＮＡ、ＤＮＡ複合体及び生理食塩水は全て、５０μＬ中５０μｇの用量を使用して、マウスの腓腹筋肉へと筋肉内投与した。オボアルブミン陽性対照（５０μｇオボアルブミンタンパク質＋１μｇ  ＬＰＳ）は、５０μＬ注射容量にて筋肉内投与した。血液（約１００μＬ）を、１日目（プライム注射の前）、４週間（ブースト注射の前）、次いで、初回プライムの９、１１、及び１３週後に、５ｍｍランセットを使用してマウスの顎下出血を介してマウスから収集した。血液試料を、次いで、３７℃にて９０分間インキュベートし、４℃にて約１８時間保管し、これはＷｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）［１６］に概説される手順に従った。血清を、次いで、遠心分離（１０，０００ｇで４℃にて１５分間）により収集し、−２０℃でさらなる使用まで保管した。血清中の抗オボアルブミン免疫グロブリン（ＩｇＧ、ＩｇＭ及びＩｇＡクラス抗体）の定量化のために、マウス抗オボアルブミンＩｇ  ＥＬＩＳＡキット（Ａｌｐｈａ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，ＴＸ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を使用した。アッセイは、製造業者の指示に従って行った。４５０ｎｍでの吸光度を、Ｅｎｖｉｓｏｎ  Ｗａｌｌａｃプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて測定した。データは、陽性指数の値に対する関連において表した（すなわち、対照の事前免疫化マウスの吸光度値の平均＋２ＳＤ）。抗ＯＶＡ活性レベルの定量は、以下の式
（試料吸光度）／（陽性指数）
により計算し、１．０という値は、マウスでの陽性抗体活性を示し、１．０を下回る値は、抗体活性に関して陰性であることを示す。
【００７３】
統計分析
複合体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性評価に関して、グラフのデータは、別段の指定がない限り、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表され、各データポイントはｎ＝３試料を表す。全てのｉｎ  ｖｉｖｏ実験に関して、グラフのデータは、別段の指定がない限り、平均±ＳＥＭとして表され、各データポイントは、ｎ＝６〜８試料を表す。対応のあるスチューデントのｔ検定を使用して、ＮａＣｌの添加後のＤＮＡ複合体のＺ平均またはＰＤＩにおける有意差を決定した。二元配置分散分析とダネットの事後検定を使用して、経時的なナノルシフェラーゼアッセイにおけるＤＮＡ複合体の導入遺伝子発現レベルの統計学的有意性を評価した。二元配置分散分析とテューキーの事後検定を使用して、製剤間の蛍光プラスミドの加重合計ピクセル数及び筋肉の細胞外領域でのそれらの局在化の程度における差異の統計学的有意性を評価した。クラスカル−ウォリス検定をダンの事後検定と共に使用して、各群間の抗ＯＶＡ陽性マウスの数における有意差を比較した。一元配置分散分析とダネットの事後検定を使用して、生理食塩水と比較して、マウスのエピトープ特異的Ｔリンパ球活性における統計学的有意性を評価した。一元配置分散分析とテューキーの事後検定を使用して、マウスにおける群間でのエピトープ特異的Ｔリンパ球活性、及び色素排除アッセイにおける蛍光強度の差異の統計学的有意性を評価した。全ての検定に関して、０．０５未満のｐ値は、統計学的に有意であるといみなした。
【００７４】
結果
自己組織化ＬＰ／ＤＮＡ複合体の形成及び特性評価
ＬＰ／ＤＮＡ複合体の色素排除アッセイにより、１：１〜２．５：１の（＋／−）電荷比間でＬＰのＤＮＡへの添加が増加するにつれて、蛍光が急激に低下することが明らかとなった。蛍光は、２．５：１を超える比率にて最小に達し、このことは、ＤＮＡのさらなる凝縮がこの段階を超えて生じなかったことを示す（図１Ａ）。ステアロイル−ＣＨ２Ｋ３のシステインを、同様の極性の残基であるセリンと置換すると、２：１以降の電荷比からより高い蛍光強度が観察された（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）（データは示さず）。同様に、より非極性のアラニンとの置換も、これらの後の電荷比にてより高い蛍光をもたらした（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）。低い電荷比にわたる蛍光の急激な低下は、ステアロイル−ＣＨ２Ｋ３で観察され、これらの２つの置換ＬＰでは観察されなかった。代わりに、蛍光のより緩やかな低減が観察された。このことは、システイン残基が、プラスミドＤＮＡの凝縮を助ける役割を果たすことを示した。ＤＮＡ複合体形成前に、還元剤ジチオトレイトール（ＤＴＴ）をステアロイル−ＣＨ２Ｋ３ＬＰに加えることにより、２．５：１の電荷比にてＬＰ／ＤＮＡ粒子に関して観察された蛍光の程度は有意に増加した（ｎ＝３、ｐ＜０．０５）（データは示さず）。このことは、ＬＰ／ＤＮＡ複合体におけるＤＮＡの凝縮を助けたのが、ＬＰの対間ジスルフィド結合の形成であることを示す。
【００７５】
ＤＬＳ及びゼータ電位測定により、電荷が中性に近いときに、見かけの直径が＞１μｍで形成された粒子の大きな、負に荷電した及び／または中性の集団の全体的に多分散の（ＰＤＩ＞０．２５）集団が明らかとなった。（図１Ｂ、Ｃ）。１．５：１の電荷比にて形成された複合体のＣｒｙｏ−ＴＥＭイメージングは、非球状の、不規則な形状の粒子の溶液中での形成を示し、これは主に小さな粒子の大きな凝集体を含んだ（図１Ｄ、Ｅ）。興味深いことに、凝集体は、直径おおよそ３０ｎｍの粒子を含むように見えた。より高い電荷比（＞２：１）では、小さい、正に荷電したＤＮＡ複合体のより狭い分散が形成され、ゼータ電位は≧＋３０ｍＶであり、粒径は、おおよそ１００ｎｍであった（ＰＤＩ≦０．２５）。２．５：１の電荷比にて形成されたＬＰ／ＤＮＡ複合体のＣｒｙｏ−ＴＥＭイメージングは、大部分が直径約３０ｎｍの小粒子であり、時折おおよそ６０〜９０ｎｍサイズのクラスターを含有するより均一な集団を明らかにした。これらの凝集体は、いくつかの約３０ｎｍの一次粒子から構成されるようにも見えた。比較的小さいサイズ及び高カチオン性表面電荷のため、２．５：１の電荷比（＋／−）にて形成されたＬＰ／ＤＮＡ複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のために選択された。これらの複合体は、１１２．５±１３．９ｎｍの直径及び＋３４．２±１．２ｍＶのゼータ電位を有した。
【００７６】
ＰＥＧ化ＬＰ／ＤＮＡ複合体の形成及び特性評価
負に荷電したＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００のＬＰ／ＤＮＡ粒子への添加が増加すると、それらの正のゼータ電位を低下させるため、結果得られる粒子は、０．７５：２：１及び１：２：１の比率にて約０ｍＶに近いゼータ電位に達した（図２Ａ）。０．７５：２：１の電荷比にて形成されたＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡ複合体を、塩誘導凝集に対するその安定性を検査するために選択し、続けてｉｎ  ｖｉｖｏ試験において使用した。これらの複合体は、１９８．６±４９．５ｎｍの直径及び＋０．７６±０．２ｍＶのゼータ電位を有した（図２Ｂ）。ＬＰ／ＤＮＡ複合体にＰＥＧ化コーティングを加えることで、わずかに大きい流体力学的直径を有する粒子がもたらされたが、それらの直径は、スチューデントのｔ検定に従い、カチオン性ＬＰ／ＤＮＡ粒子に対して統計学的に差はなかった。
【００７７】
ＰＥＧ化は、塩誘導凝集に対して安定性を付与する
等張緩衝液中でのＬＰ／ＤＮＡ複合体のインキュベーションは、複合体の凝集を誘発した。ＤＬＳ分析により、見かけの粒径が、１５倍有意に増加したことが示された（ｐ＜０．０１）（図３Ａ）。ＬＰ／ＤＮＡ複合体のＰＥＧ化は、ＤＮＡ複合体に塩安定性を付与した。ＤＬＳによる粒子サイズは、ＮａＣｌの添加後に有意差はなかった。
【００７８】
ＰＥＧ化は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＬＰ／ＤＮＡ複合体の導入遺伝子発現を増加させる
ナノルシフェラーゼ発現のアッセイにより、裸ＤＮＡ、ＬＰ／ＤＮＡ及びＰＥＧ化ＬＰ／ＤＮＡ複合体の投与が、３ヶ月の試験期間中の全てのアッセイ時点で、腓腹筋肉内で有意な遺伝子発現をもたらすことが明らかとなった（図３Ｂ）。ＰＥＧ化ＬＰ／ＤＮＡ複合体は、全ての時点にてＬＰ／ＤＮＡ複合体よりも筋肉内で高い遺伝子発現レベルを呈し、最大発現は注射１ヶ月後に観察された（ｎ＝３〜６、ｐ＜０．０００１）。この時点で、ＰＥＧ化複合体の注射によりもたらされる遺伝子発現は、その非ＰＥＧ化対応物の遺伝子発現よりも２００倍以上高かった。しかしながら、裸ＤＮＡ注射は、全体で腓腹筋肉において最も高い程度の遺伝子発現を呈した。３０日で、裸ＤＮＡは、それぞれ、ＬＰ／ＤＮＡ（ｎ＝３〜６、ｐ＜０．０００１）及びＰＥＧ化ＬＰ／ＤＮＡ複合体（ｎ＝３〜６、ｐ＜０．０００１）と比較して、ナノルシフェラーゼ発現において１，２００及び６０倍の増加を産生した。遺伝子発現は、９０日でも依然として明らかであった。裸ＤＮＡからの発現レベルは、依然として最も高かったが、３０から９０日の間に低下するように見え、一方で粒子製剤により誘導されたレベルは、３０から９０日の間、遺伝子発現を維持した。
【００７９】
組織におけるＤＮＡ複合体の分布
ＤＮＡ複合体または裸ＤＮＡの注射３０分後の、筋肉内のプラスミドＤＮＡ濃度に関するｑＰＣＲアッセイにより、同様の濃度のプラスミドが存在し、注射された製剤間で有意な差が観察されなかったことが明らかとなった（図４Ａ）。３つの製剤のそれぞれの注射後に筋肉全体において検出されたプラスミドの質量は、投与された用量の約１〜約５％の範囲であった。理論により束縛されることを望まないが、ＰＥＧ化複合体のトランスフェクション効率が、それらの非ＰＥＧ化対応物と比較してより高いのは、ＰＥＧ化複合体が筋肉組織全体にわたって広範に分布しているためである可能性があり、一方で、カチオン性複合体の分布は、粒子及び細胞外マトリックス間の電荷−電荷相互作用により制限されている可能性があると考えられる。これを検査するために、イメージング試験を、注射３０分後の蛍光標識プラスミドと複合体の分散を追跡する目的で行った。組織切片を、定性的に評価し、さらに定量的評価を、ピクセル計数技術を使用して行った。組織切片の検査により、両方の複合体の投与が、標識されたＤＮＡの大部分の局在化を筋内膜よりもむしろ筋上膜領域においてもたらしたことが示された。加重ピクセル計数法を使用して、これを、ＬＰ／ＤＮＡ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡ複合体について検証した（図４Ｂ、それぞれ、ｎ＝３、ｐ＜０．００１、ｐ＜０．０５）。対照的に、裸ＤＮＡの筋肉への注射は、筋肉内の３つの領域のいずれにもプラスミドの優先的な局在化をもたらさなかった。
【００８０】
ｐＣＭＶ−ＯＶＡの注射に対する体液性免疫応答
選択されたプライム−ブーストレジメンを使用したＬＰ／ＤＮＡ複合体の形での５０μｇ  ＤＮＡを用いた免疫化は、有意なオボアルブミン特異的免疫グロブリンレベルをマウスにおいて引き出さなかった。全てのマウスは、陽性指数を下回る活性を呈した（図５Ａ）。クラスカル−ウォリス検定に従うと統計学的に有意ではないが、裸ＤＮＡ及びＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡ複合体の注射は、両方とも陽性マウス（４匹中２匹のマウス）をもたらし、全体的に、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡ複合体に対する応答は、裸ＤＮＡよりも成功しているように見受けられ、第１１及び１３週にて、４匹のうち２匹が強く応答した。ＬＰＳと共投与したオボアルブミンコーティング脾臓細胞の陽性対照は、全てのマウス（３匹中３匹のマウス）において強い応答を誘導した。
【００８１】
ｐＣＭＶ−ＯＶＡの注射に対する細胞媒介免疫応答
フローサイトメトリーにより、その裸または複合体形態でのｐＣＭＶ−ＯＶＡプラスミドの注射が、生理食塩水対照との比較により、脾臓細胞の標的オボアルブミンパルス集団の高度に有意なエピトープ特異的Ｔ細胞除去を誘導したことが示された（図５Ｂ〜Ｅ）。結果は、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡ複合体及び裸ＤＮＡ複合体の両方を用いた免疫化が両方とも、マウスの細胞の、同様の割合（％）のオボアルブミン特異的除去を誘導したことを示し、それぞれ（２６．７±２．２％（ｎ＝８、ｐ＜０．０００１）及び２２．５±２．３％（ｎ＝８、ｐ＜０．０００１））の標的細胞が除去された。ＬＰ／ＤＮＡ複合体を用いた免疫化は、より低い応答を誘導し、１４．３±１．６％の細胞が除去された。この応答は、生理食塩水対照よりも有意に高かった（ｎ＝８、ｐ＜０．０１）が、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００／ＬＰ／ＤＮＡのそれよりも有意に低かった（ｎ＝８、ｐ＜０．０５）。予想通り、ＯＶＡコーティング脾臓細胞及びＬＰＳの陽性対照注射は、最も強い応答を誘導し、細胞の５７．２±５％が除去された（ｎ＝８、ｐ＜０．０００１）。
【００８２】
考察
この実施例の結果は、ＬＰ及び高分子電荷中和剤、例えばＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を新しい核酸送達剤の開発の基盤として使用することが、かなりの見込みがあることを示す。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を適切な比率にて含めることは、広範な凝集を伴わない小粒子（すなわち、約２００ｎｍの粒径）の生成を有利に可能とし、ＬＰ／ＤＮＡ複合体の強カチオン性表面電荷の有効な中和を示した。ＰＥＧ層が、塩誘導凝集に対する安定性を付与することも観察され、これは、ＰＥＧ化ＬＰ／ＤＮＡ複合体が、ｉｎ  ｖｉｖｏでの投与後に生体液との接触の際に凝集する可能性が低いだろうことを示す。さらには、ＰＥＧ化ＬＰ／ＤＮＡ複合体は、試験したＬＰ／ＤＮＡ複合体よりも筋肉内でより高い導入遺伝子発現レベルを誘導することができ、ｉｎ  ｖｉｖｏ  ＣＴＬアッセイでは、ＬＰ／ＤＮＡ複合体より高い細胞応答を引き出した。
【００８３】
実施例２
代替のＤＮＡ複合体を、ＬＰ及びポリ（グルタミン酸塩）−ＰＥＧ（具体的には、メトキシ−ＰＥＧ−ポリ（Ｌ−グルタミン酸塩）ブロックポリマー、これはＡｌｍａｎｄａ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓにより提供され、ＰＬＧＡ−ＰＥＧと称される）を、ジステアロイル−ホスホエタノールアミン−（ポリエチレングリコール）（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）の代わりに使用して開発した。
【００８４】
材料及び方法
核酸カーゴ（具体的には、ナノルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡ分子ｐＮＬ１．１．ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ））、ステアロイル−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（図６及び７においてＣＨ２Ｋ３と指名、配列番号１）、ステアロイル−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＣＡ２Ｋ３と指名、配列番号５）及びステアロイル−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（ＣＫ５と指名、配列番号１３）から選択されるカチオン性リポペプチド、ならびにＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む粒子複合体を、実施例１にて実質的に上に記載の通りに（すなわち、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００をＰＬＧＡ−ＰＥＧに置き換えて）生成した。簡潔には、ＤＮＡ分子及びポリ（Ｌ−グルタミン酸塩−ＰＥＧ）を、ＨＥＰＥＳ緩衝液中に一緒に溶解し、ＨＥＰＥＳ緩衝液中に溶解した等量のカチオン性リポペプチドに加えて、１５μｇ／ｍｌの最終ＤＮＡ濃度を生成した。比較のために、ポリリジン（ＰＬＬ）及びポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いたＤＮＡ分子の調製物も、ＤＮＡ分子と上記リポペプチド単独のそれぞれとの複合体に加えて生成した。
【００８５】
さらなる実験では、様々な粒子複合体を、変動量のＤＮＡ分子（具体的には、３０または４００μｇ／ｍｌのＤＮＡ分子）を使用して生成した。それぞれのＤＮＡ溶液を、カチオン性リポペプチド、ステアロイル−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１３）、またはポリカチオン性リガンドＰＬＬもしくはｐＥＩの一方のいずれかの（等量の）溶液、及びＰＬＧＡ−ＰＥＧに加えた。これにより、１５μｇ／ｍｌまたは２００μｇ／ｍｌの最終ＤＮＡ濃度を有する粒子がもたらされた。
【００８６】
様々な複合体を、粒子サイズ及びゼータ電位に関して、実施例１にて上に記載の方法を使用して評価した。
【００８７】
結果
複合化した粒子は全て、６０〜１００ｎｍの範囲のサイズ（平均粒径サイズ）のものであった（図６Ａ及び７Ｂ）。ＰＬＧＡ−ＰＥＧを含めると、試験したリポペプチドの全てに関する平均粒径サイズは、同様であった（粒子が１５μｇ／ｍｌの最終ＤＮＡ濃度を有した場合、約７０ｎｍ）が、調製中により高い濃度のＤＮＡ分子が使用された場合は、サイズは大きくなった。ＰＬＧＡ−ＰＥＧを含む粒子は全て、負に荷電していた（図６Ｂ及び７Ｂ）または中性に近かった。中性から負の電荷は、必要に応じて調整できる。
【００８８】
実施例３
材料及び方法
ｐＮＬ１．１．ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ステアロイル−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（図８においてＳ−ＣＨ２Ｋ３と指名、配列番号１）、ステアロイル−Ｃｙｓ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（図８においてＳ−ＣＡ２Ｋ３と指名、配列番号５）、ステアロイル−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（図８においてＳ−ＳＨ２Ｋ３と指名、配列番号７）及びステアロイル−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（図８においてＳ−ＣＨ２Ｒ３と指名、配列番号６）から選択されるカチオン性リポペプチド、ならびにＰＬＧＡ−ＰＥＧ（分子量ＰＬＧＡ＝１５ｋＤａ、分子量ＰＥＧ＝５ｋＤａを有するブロックポリマー）を含むさらなるＤＮＡ複合体粒子を、実施例２にて実質的に上に記載の通りに生成した。簡潔には、複合体は、０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）中の２つの水溶液、一方は、プラスミドＤＮＡ及びＰＬＧＡ−ＰＥＧを含有し、他方は、適切なリポペプチド（ＬＰ）を含有する、を混合することにより筋肉内（ｉｍ）投与に好適な形態に調製した。
【００８９】
各製剤を、Ｃ５７マウスの腓腹筋の筋肉へと、１０μｇ／注射の用量にて１回筋肉内注射した。４８時間または７日いずれかの後、動物を安楽死させ、腓腹筋の筋肉、流入領域リンパ節、脾臓及び肝臓を切除して、ホモジナイズした（ｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ  Ｃチューブを使用、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，Ｂｅｒｇｉｓｇ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。その後、上清を、ナノルシフェラーゼ発現に関して、Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｅｆｅｒａｓｅアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してアッセイした。
【００９０】
結果
結果を、図８Ａ及びＢに示し、組織１ｍｇ当たりの相対発光強度として表した。複合体粒子（概して、＜１００ｎｍで、ゼータ電位は−５ｍｖ〜−２０ｍｖである）は、４８時間及び７日間後で明らかであった筋肉内で高レベルの遺伝子発現をもたらし、複合体変異体は、全て活性を示した。ステアロイル−ＳＨ２Ｋ３製剤は、ジスルフィド結合能を欠き、ジスルフィド結合能を有した（すなわち、Ｃｙｓ残基を含んだ）ＬＰを用いて調製した製剤よりも低いレベルの活性を７日後にもたらすように見えた。流入領域リンパ節では、活性レベルは検出されたが、腓腹筋の筋肉組織において観察されたレベルよりも１００〜１０００倍低かった。
【００９１】
実施例４
なおもさらなるＤＮＡ複合体粒子を調製し、今回は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を核酸カーゴとして用いた。具体的には、ポリＡを３’末端に有するｍＲＮＡを、標準ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により、ｐＮＬ１．１．ＣＭＶ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのＣＭＶ−ナノルシフェラーゼ発現カセットをコードするｃＤＮＡを含むプラスミドから調製した。ｍＲＮＡを、５’末端でキャップして、次いで、ＰＬＧＡ−ＰＥＧ及びステアロイル−ＣＨ２Ｋ３リポペプチドを用いて製剤化して、実施例３に記載したものと同様の、負に荷電した粒子を生成した。
【００９２】
１０μｇ  ｍＲＮＡ当量の用量を、Ｃ５７マウスの腓腹筋の筋肉に注射した。マウスを、２４時間後に安楽死させて、組織を、ナノルシフェラーゼ発現に関して、実施例３にて上に記載のようにアッセイした。
【００９３】
結果
結果を図９に示し、組織１ｍｇ当たりの相対発光強度として表した。ルシフェラーゼ発現が、筋肉、流入領域リンパ節、肝臓及び脾臓にて検出されたが、筋肉における発現のレベルは、他の組織において観察されたものよりもおおよそ１００倍高かった。結果により、本開示に従う薬剤が、ｍＲＮＡを凝縮させて細胞に送達するために使用することができることが確認された。
【００９４】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈がそうでないことを必要としない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という単語ならびにその変形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、記載の整数または整数の群を含むが、任意の他の整数または整数の群を除外しないことを示すと理解されるだろう。
【００９５】
本明細書における先行技術への言及はいずれも、かかる先行技術が共通の一般知識の一部を形成するという示唆のいかなる形態の承認ではない、及びそのように解釈されるべきではない。
【００９６】
本開示の薬剤及び方法は、その使用が記載された特定の用途に限定されないことを当業者は理解するだろう。本薬剤及び方法はいずれも、本明細書に記載または図示されている特定の要素及び／または特徴に関するその好ましい実施形態に限定されない。本薬剤及び方法が、開示された１つまたは複数の実施形態に限定されず、本開示の範囲から逸脱することなく多くの再編成、修正、及び置換が可能であることが理解されるだろう。
【００９７】
参考文献
１．Ｔｈｏｍａｓ  ＣＥ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ  ２００３，４：３４６−３５８。
２．Ｆｉｌｉｏｎ  ＭＣ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓ  ＮＣ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９９７，１３２９：３４５−３５６。
３．Ｈａｒｒｉｓ  ＴＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１０，３１：９９８−１００６。
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５．Ｂｒｕｕｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  １０：５９９５−６００８（２０１５）。
６．Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ  ３：４０６−４１７（２０１３）。
７．Ａｄａｍｉ  ＲＣ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ８７：６７８−６８３（１９９８）。
８．Ｃｈｅｎ  Ｑ−Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２９：１３３４−１３４０（２００１）。
９．ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ＤＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５：９９７０−９９７７（２０００）。
１０．Ｒｙｕ  Ｄ−Ｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １１２：１４５８−１４６６（２０１１）。
１１．Ｔａｒｗａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ  １９：９４０−９５０（２００８）。
１２．Ｓｖｉｔｋｉｎ  ＹＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４５（１０）：６０２３−６０３６（２０１７）。
１３．Ｂｏｙｌｅ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ９：１８９７−１９０６（１９９７）。
１４．Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＢＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｌｅｕｋ  Ｂｉｏｌ  ７８：１２７３−１２８０（２００５）。
１５．Ｈｏ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５：ｅ３７１（２０１６）。
１６．Ｗｈｉｔｅ  ＰＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２６：６８２４−６８３１（２００８）。
１７．Ａｔｋｉｎｓ  ＧＪ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １０：ｅ３３（２００８）。
【図１−１】
2020528403.tif 000004
【図１−２】
2020528403.tif 000005
【図２】
2020528403.tif 000006
【図３】
2020528403.tif 000007
【図４】
2020528403.tif 000008
【図５−１】
2020528403.tif 000009
【図５−２】
2020528403.tif 000010
【図６】
2020528403.tif 000011
【図７】
2020528403.tif 000012
【図８】
2020528403.tif 000013
【図９】
2020528403.tif 000014
【配列表】
2020528403000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年2月12日(2020.2.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非ウイルス核酸送達剤であって、
（ｉ）細胞に送達するための核酸カーゴ、
（ｉｉ）１つまたは複数のカチオン性リポペプチド化合物、ならびに
（ｉｉｉ）ポリアミノ酸ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリアミノ酸ポリマーのコポリマー、及びポリ（アクリル酸）のコポリマーからなる群から選択される１つまたは複数の高分子電荷中和剤、
の複合体を含み、前記複合体が、実質的に中性または負の表面電荷を有する粒子の形態であり、前記複合体の前記形成が、水相中で行われる、前記非ウイルス核酸送達剤。
【請求項２】
前記核酸カーゴが、タンパク質（複数可）、オリゴペプチド（複数可）またはペプチド（複数可）をコードするＤＮＡ分子である、請求項１に記載の送達剤。
【請求項３】
前記核酸カーゴが、タンパク質（複数可）、オリゴペプチド（複数可）またはペプチド（複数可）をコードするｍＲＮＡ分子である、請求項１に記載の送達剤。
【請求項４】
前記核酸カーゴが、ｍｏｄＲＮＡである、請求項１に記載の送達剤。
【請求項５】
前記リポペプチド化合物が、一般式Ｉ：
（Ｉ）Ｒ−Ｌ−ペプチド
のものであり、
式中、Ｒは、直鎖または分岐鎖アルキルであり、
Ｌは、リンカー基であり、
前記ペプチドが、２〜１５個のアミノ酸を含む任意のアミノ酸配列のものであるが、ただし、前記アミノ酸の少なくとも２個が、強塩基性／正荷電性を有するものから独立して選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項６】
前記リポペプチド化合物が、一般式ＩＩ：
（ＩＩ）Ｒ−ＣＯ−ペプチド
のものであり、
式中、Ｒが、ＣＨ３−（ＣＨ２）ｎ−であり、ｎが、１１〜２１の範囲の整数であり、前記ペプチドが、２〜１５個のアミノ酸を含む任意のアミノ酸配列のものであるが、ただし、前記アミノ酸の少なくとも２個が、強塩基性／正荷電性を有するものから独立して選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項７】
ｎが、１３〜１８の範囲の整数である、請求項６に記載の送達剤。
【請求項８】
前記ペプチドが、５〜１０個のアミノ酸を含む、請求項５〜７のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項９】
前記アミノ酸配列の前記アミノ酸の少なくとも２個が、リジン（Ｌｙｓ）、アルギニン（Ａｒｇ）及びヒスチジン（Ｈｉｓ）から独立して選択される、請求項５〜８のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項１０】
前記リポペプチド化合物が、一般式：ステアロイル−Ｃｙｓ−Ｘ１−Ｘ２−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号２）のものであり、式中、Ｘ１及びＸ２が、任意のアミノ酸であり、同じであっても異なってもよい、請求項６に記載の送達剤。
【請求項１１】
前記リポペプチド化合物が、一般式：ステアロイル−Ｘ０−Ｘ１−Ｘ２−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ（配列番号１）のものであり、式中、Ｘ０が、存在しないまたはＣｙｓ以外の任意のアミノ酸であり、Ｘ１及びＸ２が、Ｃｙｓ以外の任意のアミノ酸であり、同じであっても異なってもよい、請求項６に記載の送達剤。
【請求項１２】
Ｘ０が、ＳｅｒまたはＴｈｒである、請求項１１に記載の送達剤。
【請求項１３】
Ｘ１及びＸ２が、Ａｌａ、Ａｒｇ及びＨｉｓから独立して選択される、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項１４】
Ｘ１及びＸ２が、Ｈｉｓである、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項１５】
前記高分子電荷中和剤（複数可）が、ポリ（Ｌ−グルタミン酸塩）−ＰＥＧコポリマー（ＰＬＧＡ−ＰＥＧ）から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項１６】
前記高分子電荷中和剤（複数可）が、ポリ（アクリル酸）のコポリマーから選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項１７】
前記高分子電荷中和剤（複数可）が、ポリ（アクリル酸）及びポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミド）（ポリＨＰＭＡ）のブロックコポリマー、ならびにポリ（アクリル酸）及びポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリルアミド）（ポリＨＥＭＡ）のブロックコポリマーから選択される、請求項１６に記載の送達剤。
【請求項１８】
前記粒子が、−２〜２ｍＶの範囲のゼータ電位（ＺＰ）表面電荷を示す、先行請求項のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項１９】
前記粒子が、−４０〜−５ｍＶの範囲のゼータ電位（ＺＰ）表面電荷を示す、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の送達剤。
【請求項２０】
核酸分子を対象の細胞に送達する方法であって、
先行請求項のいずれか一項に記載の非ウイルス核酸送達剤を提供するステップ、
及び
前記非ウイルス核酸送達剤を、前記対象の前記細胞に送達するステップを含む、前記方法。
【請求項２１】
前記非ウイルス核酸送達剤が、前記対象に非経口的に（ｐａｒｅｎｔａｌｌｙ）送達される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の非ウイルス送達核酸剤を薬学的に許容され得るキャリアまたは賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の非ウイルス送達核酸剤を生成する方法であって、
核酸カーゴ、１つまたは複数のリポペプチド化合物、及び１つまたは複数の高分子電荷中和剤を、水相中で、複合化した粒子の形成に好適な条件下で、組み合わせることを含む、前記方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
第一の態様に従って、本開示は、非ウイルス核酸送達剤であって、
（ｉ）細胞に送達するための核酸カーゴ、
（ｉｉ）１つまたは複数のカチオン性リポペプチド化合物、ならびに
（ｉｉｉ）ポリアミノ酸ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリアミノ酸ポリマーのコポリマー、及びポリ（アクリル酸）のコポリマーからなる群から選択される１つまたは複数の高分子電荷中和剤、
の複合体を含み、前記複合体が、実質的に中性または負の表面電荷を有する粒子の形態であり、前記複合体の前記形成が、水相中で行われる、前記非ウイルス核酸送達剤を提供する。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１５】
第一の態様では、本開示は、非ウイルス核酸送達剤であって、
（ｉ）細胞に送達するための核酸カーゴ、
（ｉｉ）１つまたは複数のカチオン性リポペプチド化合物、ならびに
（ｉｉｉ）ポリアミノ酸ポリマー、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリアミノ酸ポリマーのコポリマー、及びポリ（アクリル酸）のコポリマーからなる群から選択される１つまたは複数の高分子電荷中和剤、
の複合体を含み、前記複合体が、実質的に中性または負の表面電荷を有する粒子の形態であり、前記複合体の前記形成が、水相中で行われる、前記非ウイルス核酸送達剤を提供する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３１】
好適な高分子電荷中和剤（複数可）には、ポリアミノ酸ポリマー、例えばポリアスパラギン酸（ＰＡＡ）またはポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）とポリアミノ酸ポリマーのコポリマー、他のアニオン性ポリマー、例えばポリ（アクリル酸）ポリマーのコポリマー、及び負に荷電したブロック及び中性、親水性ブロックを含むある特定のブロックコポリマー（例えば、ポリ（アクリル酸）とポリ（ヒドロキシプロピルメタクリルアミドのブロックコポリマー）（ポリＨＰＭＡ）、及びポリ（アクリル酸）とポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリルアミドのブロックコポリマー）（ポリＨＥＭＡ））が含まれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３６】
実質的に中性または負の表面電荷を有することにより、本開示に従う非ウイルス核酸送達剤の粒子は、細胞外タンパク質、例えば負に荷電した血清タンパク質と電子的に結合する可能性が低くなり、従来のＬＮＰをベースとする薬剤に比べて、生体内分布及び効率の改善を示し得る。好ましくは、中性粒子は、−２〜２ｍＶの範囲、より好ましくは０〜１ｍＶ範囲のゼータ電位表面電荷を示すだろう。負の粒子が好まれる際は、これらは、−４０〜−１０ｍＶの範囲のゼータ電位表面電荷を示すだろう。
【国際調査報告】
2020528403.tif 000015
2020528403.tif 000016
2020528403.tif 000017
2020528403.tif 000018
2020528403.tif 000019