(57)【要約】ＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉ剤を含む組成物、およびアルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）遺伝子の阻害のための方法が記載される。本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤およびＲＮＡｉ剤コンジュゲートは、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害する。必要に応じて、１つまたは複数のさらなる治療剤と共に、１つまたは複数のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物も記載される。記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の、肺上皮細胞などの上皮細胞へのｉｎ  ｖｉｖｏでの送達は、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子発現の阻害およびＥＮａＣ活性の低下を提供し、ヒト被験体を含む被験体に治療利益を提供することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤であって、
表２または表３に提供される配列のいずれか１つと０または１個のヌクレオチドが異なる少なくとも１７個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖；および
前記アンチセンス鎖と少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を含むセンス鎖
を含む、ＲＮＡｉ剤。
【請求項２】
前記アンチセンス鎖が、表２または表３に提供される配列のいずれか１つのヌクレオチド２〜１８を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３】
前記センス鎖が、表２または表４に提供される配列のいずれか１つと０または１個のヌクレオチドが異なる少なくとも１７個の連続するヌクレオチドのヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が、前記アンチセンス鎖の１７個の連続するヌクレオチドにわたって少なくとも８５％の相補性の領域を有する、請求項１または請求項２に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項４】
前記アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の少なくとも１個のヌクレオチドが、改変ヌクレオチドであるか、または改変ヌクレオシド間連結を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項５】
前記ヌクレオチドの全部または実質的に全部が、改変ヌクレオチドである、請求項１から３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項６】
前記改変ヌクレオチドが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、２’−フルオロヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチド、２’，３’−ｓｅｃｏヌクレオチド模倣体、ロックドヌクレオチド、２’−Ｆ−アラビノヌクレオチド、２’−メトキシエチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、リビトール、反転ヌクレオチド、反転２’−Ｏ−メチルヌクレオチド、反転２’−デオキシヌクレオチド、２’−アミノ改変ヌクレオチド、２’−アルキル改変ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド、および３’−Ｏ−メチルヌクレオチドからなる群より選択される、請求項４または５に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項７】
前記ヌクレオチドの全部または実質的に全部が、２’−Ｏ−メチルヌクレオチドまたは２’−フルオロヌクレオチドで改変される、請求項５に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項８】
前記アンチセンス鎖が、表３に提供される改変配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項９】
前記センス鎖が、表４に提供される改変配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１０】
前記アンチセンス鎖が、表３に提供される改変配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖が、表４に提供される改変配列のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１１】
標的化リガンドに連結されている、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１２】
前記標的化リガンドが、インテグリン標的化リガンドを含む、請求項１１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１３】
前記インテグリン標的化リガンドが、αｖβ６インテグリン標的化リガンドである、請求項１２に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１４】
前記αｖβ６インテグリン標的化リガンドが、図４〜１１の構造のいずれか１つによって表される構造を有する、請求項１３に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１５】
前記標的化リガンドが前記センス鎖にコンジュゲートされている、請求項１１から１４のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１６】
前記標的化リガンドが、前記センス鎖の５’末端にコンジュゲートされている、請求項１５に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１７】
前記センス鎖が、１８〜３０ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖が、１８〜３０ヌクレオチド長である、請求項１から１６のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１８】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、それぞれ１８〜２７ヌクレオチド長である、請求項１７に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項１９】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、それぞれ１８〜２４ヌクレオチド長である、請求項１８に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２０】
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖が、それぞれ２１ヌクレオチド長である、請求項１９に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２１】
２個の平滑末端を有する、請求項２０に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２２】
前記センス鎖が、１つまたは２つの末端キャップを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２３】
前記センス鎖が、１つまたは２つの反転脱塩基残基を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２４】
表５の二本鎖のいずれか１つの構造を有する二本鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成される、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２５】
前記ＲＮＡｉ剤がセンス鎖およびアンチセンス鎖から構成され、前記アンチセンス鎖が、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号２）；
ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｃ（配列番号６）；
ｃＰｒｐｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号１０）；
ｕｓＧｆｓａｓＵｆｕＵｆｇＵｆｕＣｆｕＧｆｇＵｆｕＧｆｃＡｆｃＡｆｓｇ（配列番号１０７）；または
ａｓＧｆｓａｓＡｆｇＵｆｃＡｆｕＵｆｃＵｆｇＣｆｕＣｆｕＧｆｃｕｓｕ（配列番号１５２）；
の１つと０または１個のヌクレオチドが異なる改変ヌクレオチド配列を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表し、ｃＰｒｐｕは、５’−シクロプロピルホスホネート−２’−Ｏ−メチルウリジンを表し、前記センス鎖上のヌクレオチドの全部または実質的に全部が、改変ヌクレオチドである、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２６】
前記センス鎖が、３’末端に脱塩基残基をさらに含む、請求項２５に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２７】
前記ＲＮＡｉ剤がアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖および前記センス鎖が、配列番号２および４；配列番号３および５；配列番号６および８；配列番号７および９；ならびに配列番号１０および４からなる群より選択されるヌクレオチド配列対を含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２８】
ＡＤ０５４５３、ＡＤ０５６２５、ＡＤ０５３４７、ＡＤ０５８３１、ＡＤ０５８３３、ＡＤ０４８３５、およびＡＤ０５９２４からなる群より選択される二本鎖構造を有する、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項２９】
前記ＲＮＡｉ剤がアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖および前記センス鎖が、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）対：
ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＧ（配列番号３）およびＣＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号５）；
ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＣ（配列番号７）およびＧＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号９）；
ＵＧＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧ（配列番号２３０）およびＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＣＡ（配列番号２５９）；または
ＡＧＡＡＧＵＣＡＵＵＣＵＧＣＵＣＵＧＣＵＵ（配列番号２５４）およびＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＵＧＡＣＵＵＣＵＵＵ（配列番号２８９）
の１つと０または１個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含む、請求項１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３０】
前記ヌクレオチドの全部または実質的に全部が、改変ヌクレオチドである、請求項２９に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３１】
前記ＲＮＡｉ剤の前記センス鎖が、標的化リガンドに連結されている、請求項２４から３０のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３２】
前記標的化リガンドが、上皮細胞上に発現される細胞受容体に対する親和性を有する、請求項３１に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３３】
前記標的化リガンドが、αｖβ６インテグリン標的化リガンドである、請求項３１または３２に記載のＲＮＡｉ剤。
【請求項３４】
薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤を含む組成物。
【請求項３５】
アルファ−ＥＮａＣの発現を阻害するための第２のＲＮＡｉ剤をさらに含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
１つまたは複数のさらなる治療剤をさらに含む、請求項３４または３５に記載の組成物。
【請求項３７】
吸入による投与のために製剤化される、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
定量吸入器、ジェットネブライザー、振動メッシュネブライザー、またはソフトミスト吸入器によって送達される、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
細胞中でのアルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害するための方法であって、細胞中に、有効量の、請求項１から３３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤または請求項３４から３８のいずれか一項に記載の組成物を導入するステップを含む、方法。
【請求項４０】
前記細胞が被験体内にある、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記被験体がヒト被験体である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現が少なくとも約３０％阻害される、請求項３９から４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ＥＮａＣ活性レベルの増強または上昇と関連する１つまたは複数の症状または疾患を処置する方法であって、それを必要とするヒト被験体に、治療有効量の請求項３４から３８のいずれか一項に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項４４】
前記疾患が、呼吸器疾患である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記呼吸器疾患が、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、非嚢胞性線維症性気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、気道感染症、原発性線毛運動障害、または肺癌嚢胞性線維症である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患が、ドライアイ症候群などの眼疾患である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記ＲＮＡｉ剤が、約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約０．５００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される、請求項４３から４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＲＮＡｉ剤が、２つまたはそれより多い用量で投与される、請求項３９から４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
ＥＮａＣ活性および／またはアルファ−ＥＮａＣ遺伝子発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害、または症状の処置のための、請求項１から３３のいずれか一項に記載のＲＮＡｉ剤の使用。
【請求項５０】
ＥＮａＣ活性および／またはアルファ−ＥＮａＣ遺伝子発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害、または症状の処置のための、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項５１】
ＥＮａＣ活性および／またはアルファ−ＥＮａＣ遺伝子発現によって少なくとも部分的に媒介される疾患、障害、または症状の処置のための医薬の製造のための、請求項３４から３８のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項５２】
前記疾患が嚢胞性線維症である、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年６月１日に出願された米国仮特許出願第６２／６７９，５４９号、２０１８年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／６３１，６８３号、および２０１７年７月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５２９，１３２号の優先権を主張し、それぞれの内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で提出された配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＡＳＣＩＩのコピーは、３０６５６＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇという名称であり、７４ｋｂのサイズである。
【０００３】
発明の分野
本開示は、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子発現の阻害のためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む組成物、およびその使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
脊椎動物のアミロリド感受性上皮性ナトリウムチャネル（「ＥＮａＣ」または「アミロリド感受性ナトリウムチャネル」）は、２つの膜貫通ドメイン、細胞内Ｎ−およびＣ末端、ならびにフリンプロテアーゼの基質である大きい細胞外ループを特徴とする、デジェネリン／ＥＮａＣチャネルスーパーファミリーのメンバーである。チャネルは、３個の別々の遺伝子：ＳＣＮＮ１Ａ（アルファ）、ＳＣＮＮ１Ｂ（ベータ）、およびＳＣＮＮ１Ｇ（ガンマ）によりコードされる３個の相同サブユニット（アルファ（α）、ベータ（β）、およびガンマ（γ））から構成されるヘテロ三量体複合体である。３個全部のサブユニットが、完全なチャネル活性にとって必要である。ＳＣＮＮ１Ｄによってコードされる第４のサブユニット（デルタ（δ））は、精巣および卵巣において発現され、これらの組織においてアルファ（α）サブユニットの機能的に代わりとなることができることがある。
【０００５】
ＥＮａＣは、特に、肺、遠位曲尿細管、胃腸（ＧＩ）管、生殖器官、および眼の眼表面上皮における上皮細胞の頂端膜上で発現される。これらの上皮では、ＥＮａＣチャネルは、後に基底外側ナトリウム／カリウムＡＴＰａｓｅによって細胞から能動輸送される細胞外ナトリウムイオンの流入を媒介し、浸透勾配を確立し、上皮内腔の水が間質中へと吸収されるようにする。腎臓では、ＥＮａＣは、電解質平衡および血圧を媒介し、アミロリドなどの全身性低分子利尿剤の標的である。肺では、気道上皮ＥＮａＣは、肺湿潤化（ｌｕｎｇ  ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）および粘膜せん毛クリアランスの調節において重要な役割を果たしている。
【０００６】
ＳＣＮＮ１Ａ、ＳＣＮＮ１Ｂ、またはＳＣＮＮ１Ｇの機能喪失変異を有する１型偽性低アルドステロン症（ＰＨＡ）患者は、過剰な気道表面液を産生し、有意により高い粘膜せん毛クリアランス率を有する。逆に、気道上皮ＥＮａＣ活性は、あらゆる遺伝子型の嚢胞性線維症（ＣＦ）患者において有意に上昇している。嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）クロライドチャネル活性の低下と共に、ＥＮａＣ活性の増強が、ＣＦ肺疾患患者における気道乾燥（ａｉｒｗａｙ  ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ）および粘液線毛静止の基礎となる主な病原性機序である。
【０００７】
吸入された低分子ＥＮａＣ阻害剤は、ＣＦの処置において最初は有望であったが、その臨床開発は、肺における短い作用持続期間および腎臓ＥＮａＣの阻害と関連するオンターゲット毒性（高カリウム血症）によって制限されてきた（例えば、Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、２７巻  Ｊ．  Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｍｅｄ．  ＆  Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．、２００〜２０８頁（２０１４年）を参照されたい）。
【０００８】
例えば、米国特許第７，７１８，６３２号に開示されたものなどの、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子（すなわち、ＳＣＮＮ１Ａ）の発現を阻害することができるある特定のＲＮＡｉ剤が以前に同定されている。しかしながら、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の配列および改変は、以前に開示されたもの、または当該分野で公知のものとは異なる。本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現の高度に強力かつ効率的な阻害を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第７，７１８，６３２号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎら、Ｊ．Ａｅｒｏｓｏｌ  Ｍｅｄ．＆Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．（２０１４年）２７巻２００〜２０８頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
アルファ−ＥＮａＣ遺伝子（すなわち、ＳＣＮＮ１Ａ）の発現を選択的かつ効率的に阻害することができる新規ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）剤（ＲＮＡｉ剤、ＲＮＡｉトリガー、またはトリガー（ｔｒｉｇｇｅｒ）と呼ばれる）、例えば、二本鎖ＲＮＡｉ剤が必要である。さらに、ＥＮａＣ活性の増強と関連する疾患の処置のための新規なアルファ−ＥＮａＣ特異的ＲＮＡｉ剤の組成物が必要である。
【００１２】
一般に、本開示は、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子特異的ＲＮＡｉ剤、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む組成物、ならびにアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤および本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む組成物を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでアルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害するための方法を特徴とする。本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を選択的かつ効率的に減少させ、それによって、被験体におけるＥＮａＣレベルを低下させる、被験体におけるＥＮａＣ活性を低下させる、または被験体、例えば、ヒトもしくは動物被験体におけるＥＮａＣレベルとＥＮａＣ活性の両方を低下させることができる。
【００１３】
記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、限定されるものではないが、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、気道感染症、原発性線毛運動障害、および肺癌嚢胞性線維症などの様々な呼吸器疾患を含む、ＥＮａＣ活性レベルの増強または上昇と関連する症状および疾患の治療的処置（防止的または予防的処置を含む）のための方法において使用することができる。例えば、嚢胞性線維症（ＣＦ）に罹患している被験体では、ＥＮａＣ活性の増加は、気道における粘液の乾燥ならびに肺が毒素および感染性因子を排除させる能力の低下に寄与することが知られている。さらに、良好に機能していないＥＮａＣ遺伝子が遺伝したＣＦ被験体は、より軽度の肺疾患を示すことも知られており、これは、ＥＮａＣレベルの阻害がある特定の患者集団にとって有益であり得るというさらなる証拠を提供する。記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、例えば、ドライアイ症候群などの眼の疾患および障害の処置のためを含め、結膜上皮などの眼表面上皮におけるＥＮａＣ活性レベルの増強または上昇と関連する症状および疾患の治療的処置（予防的または防止的処置を含む）のために使用することもできる。本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アルファ−ＥＮａＣ発現を選択的に低下させることができ、ＥＮａＣ活性の低下をもたらすことができる。本明細書に開示される方法は、エアロゾル吸入もしくは乾燥粉末吸入、鼻内投与、気管内投与、または口腔咽頭吸引投与などの、当該分野で公知の任意の好適な手段による、被験体、例えば、ヒトまたは動物被験体への１つまたは複数のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の投与を含む。
【００１４】
一態様では、本開示は、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤であって、センス鎖およびアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤を特徴とする。また、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害することができるＲＮＡｉ剤を含むか、またはそれからなる組成物であって、ＲＮＡｉ剤がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むか、またはそれからなり、組成物が少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、組成物も本明細書で記載される。
【００１５】
別の態様では、本開示は、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を選択的かつ効率的に減少させることができる開示されたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の１つまたは複数を含む組成物を特徴とする。本明細書に記載の１つまたは複数のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む組成物を、ＥＮａＣ活性の増強または上昇（本明細書では、ＥＮａＣチャネル活性レベルの増強またはＥＮａＣチャネル活性レベルの上昇とも呼ばれる）と関連する症状および疾患の処置（予防的処置または阻害を含む）のために、ヒトまたは動物被験体などの被験体に投与することができる。
【００１６】
本明細書に開示されるそれぞれのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。センス鎖およびアンチセンス鎖は、互いに部分的に、実質的に、または完全に相補的であってもよい。本明細書に記載のＲＮＡｉ剤のセンスおよびアンチセンス鎖の長さは、それぞれ、１６〜３０ヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立に１７〜２６ヌクレオチド長である。センスおよびアンチセンス鎖は、同じ長さであるか、または異なる長さであってもよい。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立に２１〜２６ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、独立に２１〜２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖は両方とも、２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センスおよび／またはアンチセンス鎖は、独立に１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチド長である。本明細書に記載のＲＮＡｉ剤は、アルファ−ＥＮａＣを発現する細胞への送達の際に、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで１つまたは複数のアルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害する。
【００１７】
本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ中の同じ数のヌクレオチドのコアストレッチ配列（本明細書では「コアストレッチ」または「コア配列」とも呼ばれる）に対して少なくとも８５％の同一性を有する少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、このセンス鎖コアストレッチは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、このセンス鎖コアストレッチは１７ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、このセンス鎖コアストレッチは１９ヌクレオチド長である。
【００１８】
本明細書に記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、アルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ中の同じ数のヌクレオチドのコアストレッチおよび対応するセンス鎖と少なくとも８５％の相補性を有する少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、このアンチセンス鎖コアストレッチは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチド長である。
【００１９】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、表１に開示される配列のいずれかの配列を有するアルファ−ＥＮａＣ遺伝子の一部を標的とする。
【００２０】
アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤において使用することができるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤センス鎖およびアンチセンス鎖の例を、表３および４に提供する。アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤二本鎖の例を、表５に提供する。本明細書に開示されるある特定のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖からなってもよいか、またはその中に含まれていてもよい１９ヌクレオチドのコアストレッチ配列の例を、表２に提供する。
【００２１】
別の態様では、本開示は、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、哺乳動物などの被験体中の上皮細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達するための方法を特徴とする。また、そのような方法における使用のための組成物も本明細書に記載される。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、被験体の肺上皮細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達するための方法が本明細書に開示される。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、ヒト被験体の肺上皮細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達するための方法が本明細書に開示される。１つまたは複数のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、当該分野で公知の任意のオリゴヌクレオチド送達技術を使用して標的細胞または組織に送達することができる。核酸送達法としては、限定されるものではないが、リポソームへの封入、イオン導入、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、および生体接着性ミクロスフェア、タンパク質性ベクター、またはＤｙｎａｍｉｃ  Ｐｏｌｙｃｏｎｊｕｇａｔｅ（商標）（ＤＰＣ）などの他のビヒクルへの組込みが挙げられる（例えば、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０００／０５３７２２、ＷＯ２００８／０２２３０９、ＷＯ２０１１／１０４１６９、およびＷＯ２０１２／０８３１８５を参照されたい）。
【００２２】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤を標的化基に共有結合により連結することによって、細胞または組織に送達される。一部の実施形態では、標的化基は、インテグリン標的化リガンドなどの、細胞受容体リガンドを含んでもよい。インテグリンは、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）の接着を容易にする膜貫通受容体のファミリーである。特に、インテグリンアルファ−ｖ−ベータ−６（αｖβ６）は、ＥＣＭタンパク質およびＴＧＦ−ベータ潜伏関連ペプチド（ＬＡＰ）の受容体であることが公知である上皮特異的インテグリンであり、様々な細胞および組織中で発現される。インテグリンαｖβ６は、傷害を受けた肺上皮において高度に上方調節されることが公知である。一部の実施形態では、本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、インテグリンαｖβ６に対する親和性を有するインテグリン標的化リガンドに連結されている。本明細書で言及されるように、「αｖβ６インテグリン標的化リガンド」は、インテグリンαｖβ６に対する親和性を有し、所望の細胞および／または組織（すなわち、インテグリンαｖβ６を発現する細胞）に結合するＲＮＡｉ剤の標的化および送達を容易にするためのリガンドとして使用することができる化合物である。一部の実施形態では、複数のαｖβ６インテグリン標的化リガンドまたはαｖβ６インテグリン標的化リガンドのクラスターは、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤に連結されている。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤−αｖβ６インテグリン標的化リガンドコンジュゲートは、受容体媒介性エンドサイトーシスまたは他の手段によって、肺上皮細胞により選択的に内在化される。
【００２３】
αｖβ６インテグリン標的化リガンドを含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を送達するのに有用な標的化基の例は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／０８５４１５号ならびに米国仮特許出願第６２／５８０，３９８号および第６２／６４６，７３９号に開示されており、それぞれの内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２４】
標的化基を、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖の３’または５’末端に連結することができる。一部の実施形態では、標的化基を、センス鎖の３’または５’末端に連結する。一部の実施形態では、標的化基を、センス鎖の５’末端に連結する。一部の実施形態では、標的化基を、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖および／またはアンチセンス鎖上のヌクレオチドに内部的に連結する。一部の実施形態では、標的化基を、リンカーを介してＲＮＡｉ剤に連結する。
【００２５】
リンカーを含む、または含まない、標的化基を、表２、３、および４に開示されるセンスおよび／またはアンチセンス鎖のいずれかの５’または３’末端に結合することができる。標的化基を含む、または含まない、リンカーを、表２、３、および４に開示されるセンスおよび／またはアンチセンス鎖のいずれかの５’または３’末端に結合することができる。
【００２６】
別の態様では、本開示は、表５に開示される二本鎖構造を有する１つまたは複数のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む組成物を特徴とする。
【００２７】
一部の実施形態では、異なる配列を有する少なくとも２つのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の組合せまたはカクテルを含む組成物が本明細書に記載される。一部の実施形態では、２つまたはそれより多いアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、それぞれ別々に、かつ独立に、標的化基に連結されている。一部の実施形態では、２つまたはそれより多いアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、インテグリン標的化リガンドを含むか、またはそれからなる標的化基にそれぞれ連結されている。一部の実施形態では、２つまたはそれより多いアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、αｖβ６インテグリン標的化リガンドを含むか、またはそれからなる標的化基にそれぞれ連結されている。
【００２８】
別の態様では、本開示は、被験体におけるアルファ−ＥＮａＣ遺伝子発現を阻害するための方法であって、被験体に、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害することができるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の量を投与するステップを含み、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤がセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む、方法を特徴とする。また、そのような方法における使用のための組成物も本明細書に記載される。
【００２９】
さらなる態様では、本開示は、ＥＮａＣ活性の増強または上昇によって引き起こされる疾患または症状の処置（予防的または防止的処置を含む）の方法であって、それを必要とする被験体に、表２または表３中の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を投与するステップを含む方法を特徴とする。また、そのような方法における使用のための組成物も本明細書に記載される。
【００３０】
一部の実施形態では、記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、必要に応じて、１つまたは複数のさらなる（すなわち、第２の、第３の、など）治療剤と組み合わされる。第２の治療剤は、別のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤（例えば、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子内の異なる配列を標的とするアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤）であってもよい。さらなる治療剤は、低分子薬物、抗体、抗体断片、および／またはアプタマーであってもよい。１つまたは複数のさらなる治療剤を含む、または含まない、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、１つまたは複数の賦形剤と組み合わせて、医薬組成物を形成させることができる。
【００３１】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、上皮細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達するための組成物が記載される。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、標的化リガンドまたは薬物動態（ＰＫ）モジュレーター（「裸の」または「裸のＲＮＡｉ剤」と呼ばれる）にコンジュゲートせずに送達される。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、標的化基、連結基、ＰＫモジュレーター、および／または別の非ヌクレオチド基にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、インテグリン標的化リガンドを含む標的化基にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、インテグリン標的化リガンドは、αｖβ６インテグリン標的化リガンドである。一部の実施形態では、標的化基は、１つまたは複数のαｖβ６インテグリン標的化リガンドを含む。
【００３２】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、１つまたは複数の連結基または他の非ヌクレオチド基または薬物動態モジュレーターなどの化合物に連結されている。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、またはコレステロールもしくはパルミトイル基などの、１２個もしくはそれより多い炭素原子を有する疎水性基にコンジュゲートされている。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、それぞれ、線状、分枝状、環状、および／または置換もしくは非置換であってもよい、コレステロールもしくはコレステリル誘導体、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、またはアラルキニル基から選択される１つまたは複数の薬物動態モジュレーターに連結されている。一部の実施形態では、これらの部分のための結合の位置は、センス鎖の５’もしくは３’末端、センス鎖の任意の所与のヌクレオチドのリボース環の２’位にあるか、および／またはセンス鎖の任意の位置のホスフェートもしくはホスホロチオエート骨格に結合されている。
【００３３】
一部の実施形態では、記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の１つまたは複数は、薬学的に許容される担体または希釈剤中で哺乳動物に投与される。一部の実施形態では、哺乳動物は、ヒトである。
【００３４】
アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の使用は、ＥＮａＣ活性の増強または上昇と関連する疾患または障害の治療的（予防的を含む）処置のための方法を提供する。記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アルファ−ＥＮａＣの発現を阻害することができる（例えば、阻害する）。アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を使用して、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、非嚢胞性線維症性気管支拡張症（ｎｏｎ−ｃｙｓｔｉｃ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ  ｂｒｏｎｃｈｉｅｃｔａｓｉｓ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、気道感染症、原発性線毛運動障害、および肺癌嚢胞性線維症などの様々な呼吸器疾患を処置することもできる。アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤をさらに使用して、例えば、ドライアイなどの様々な眼の疾患および障害を処置することができる。そのような処置方法は、ＥＮａＣ活性レベルが上昇または増強したヒトまたは動物へのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の投与を含む。肺上皮細胞へのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の送達のための組成物が本明細書で記載される。さらに、腎上皮細胞および／またはＧＩもしくは生殖器官中の上皮細胞および／または眼の眼表面上皮細胞などの細胞への、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの送達のための組成物が、本明細書で一般的に記載される。
【００３５】
１つまたは複数のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物を、局部または全身処置が望まれるかどうかに応じて、いくつかの方法で投与することができる。投与は、限定されるものではないが、例えば、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、真皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）（例えば、埋込みデバイスによる）、および実質内投与であってもよい。一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、吸入（乾燥粉末もしくはエアロゾル吸入など）、鼻内投与、気管内投与、または口腔咽頭吸引投与によって投与される。
【００３６】
記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤および／またはアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む組成物を、ＥＮａＣ活性レベルの増強または上昇によって引き起こされる疾患または状態の治療的処置のための方法において使用することができる。そのような方法は、被験体、例えば、ヒトまたは動物被験体への、本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の投与を含む。
【００３７】
別の態様では、本開示は、アルファ−ＥＮａＣ発現によって少なくとも部分的に媒介される病的状態（状態または疾患など）の処置（予防的処置を含む）のための方法であって、被験体に、表２または表３中の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を含む治療有効量のＲＮＡｉ剤を投与するステップを含む方法を提供する。
【００３８】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害するための方法であって、細胞に、表２または表３中の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤を投与するステップを含む方法が、本明細書に開示される。
【００３９】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ発現によって少なくとも部分的に媒介される病的状態の処置（予防的処置を含む）のための方法であって、被験体に、表２または表４中の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖を含む治療有効量のＲＮＡｉ剤を投与するステップを含む方法が、本明細書に開示される。
【００４０】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害するための方法であって、細胞に、表２または表４中の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤を投与するステップを含む方法が、本明細書に開示される。
【００４１】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ発現によって少なくとも部分的に媒介される病的状態の処置（予防的処置を含む）のための方法であって、被験体に、表４中の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖および表３中の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を含む治療有効量のＲＮＡｉ剤を投与するステップを含む方法が、本明細書に開示される。
【００４２】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害するための方法であって、細胞に、表４中の配列のいずれかの配列を含むセンス鎖および表３中の配列のいずれかの配列を含むアンチセンス鎖を含むＲＮＡｉ剤を投与するステップを含む方法が、本明細書に開示される。
【００４３】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害するための方法であって、被験体に、表４中の配列のいずれかの核酸塩基配列からなるセンス鎖および表３中の配列のいずれかの核酸塩基配列からなるアンチセンス鎖を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を投与するステップを含む方法が、本明細書に開示される。他の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害する方法であって、被験体に、表４中の改変配列のいずれかの改変配列からなるセンス鎖および表３中の改変配列のいずれかの改変配列からなるアンチセンス鎖を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を投与するステップを含む方法が、本明細書に開示される。
【００４４】
一部の実施形態では、細胞中のアルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害するための方法であって、表５に記載される二本鎖の１つの二本鎖構造を有する１つまたは複数のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を投与するステップを含む方法が、本明細書に開示される。
【００４５】
本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子（配列番号１）上の特定の位置を標的とするように設計される。本明細書で定義される場合、アンチセンス鎖配列は、アンチセンス鎖の５’末端核酸塩基を、遺伝子と塩基対形成する場合に遺伝子上の位置から１９ヌクレオチド下流にある（３’末端に向かって）位置と整列させた場合、遺伝子上の所与の位置のアルファ−ＥＮａＣ遺伝子を標的とするように設計される。例えば、本明細書の表１および２に例示されるように、９７２位のアルファ−ＥＮａＣ遺伝子を標的とするように設計されるアンチセンス鎖配列は、遺伝子と塩基対形成する場合、アンチセンス鎖の５’末端核酸塩基が、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の９９０位と整列することが必要である。
【００４６】
本明細書で提供される場合、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の１位（５’→３’）の核酸塩基が遺伝子と相補的であることを必要としないが、但し、少なくとも１６個の連続するヌクレオチドのコアストレッチ配列にわたってアンチセンス鎖と遺伝子との少なくとも８５％の相補性（例えば、少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の相補性）が存在することを条件とする。例えば、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の９７２位を標的とするように設計される本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤については、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖の５’末端核酸塩基は、遺伝子の９９０位と整列しなければならない；しかしながら、アンチセンス鎖の５’末端核酸塩基は、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の９９０位と相補的であってもよいが、相補的である必要はなく、但し、少なくとも１６個の連続するヌクレオチドのコアストレッチ配列にわたってアンチセンス鎖と遺伝子との少なくとも８５％の相補性（例えば、少なくとも８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の相補性）が存在することを条件とする。特に、本明細書に開示される様々な例によって示されるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖による遺伝子の特定の結合部位（例えば、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤が９７２位、１２９１位、１０００位、または他の位置のアルファ−ＥＮａＣ遺伝子を標的とするように設計されるかどうか）は、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤によって達成される阻害レベルにとって重要な因子である。
【００４７】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＧ（配列番号３）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＧ（配列番号３）と１個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、ヌクレオチドの全部または実質的に全部が改変ヌクレオチドである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＧ（配列番号３）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、配列番号３は、アンチセンス鎖の１〜２１位（５’→３’）に位置する。
【００４８】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号２）（ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表す）と１個以下のヌクレオチドが異なる改変ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖と少なくとも実質的に相補的である。当業者であれば明確に理解するように、本明細書に開示される改変ヌクレオチド配列中に示されるホスホロチオエート連結の含有は、オリゴヌクレオチド中に典型的に存在するホスホジエステル連結を置き換える（例えば、全てのヌクレオシド間連結を示す図１２Ａ〜１２Ｇを参照されたい）。
【００４９】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号２）（ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表す）からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖と少なくとも実質的に相補的である。
【００５０】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＣＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号５）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＣＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号５）と１個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含み、ヌクレオチドの全部または実質的に全部が改変ヌクレオチドである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＣＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号５）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、配列番号５は、アンチセンス鎖の１〜２１位（５’→３’）に位置する。
【００５１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｃｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号４）（ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表す）と１個以下のヌクレオチドが異なる改変ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、センス鎖と少なくとも実質的に相補的である。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、改変ヌクレオチド配列（５’→３’）ｃｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号４）（ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表す）からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、センス鎖と少なくとも実質的に相補的である。一部の実施形態では、１つまたは複数の反転脱塩基残基を、配列番号４のセンス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端、またはセンス鎖の５’と３’末端の両方に付加する。一部の実施形態では、αｖβ６インテグリン標的化リガンドなどの標的化リガンドを、配列番号４のセンス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端、またはセンス鎖の５’と３’末端の両方に共有結合により連結することができる。
【００５２】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＧ（配列番号３）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖およびヌクレオチド配列（５’→３’）ＣＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号５）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＧ（配列番号３）と１個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖（ここでヌクレオチドの全部または実質的に全部が改変ヌクレオチドである）およびヌクレオチド配列（５’→３’）ＣＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号５）と１個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含み、ヌクレオチドの全部または実質的に全部が改変ヌクレオチドである。
【００５３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、改変ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号２）からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖、および改変ヌクレオチド配列（５’→３’）ｃｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号４）からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表す。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、改変ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号２）からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖、および改変ヌクレオチド配列（５’→３’）ｃｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号４）からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、３’末端に反転脱塩基残基および５’末端に共有結合により連結されたαｖβ６インテグリン標的化リガンドをさらに含む。
【００５４】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＣ（配列番号７）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＣ（配列番号７）と１個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、ヌクレオチドの全部または実質的に全部が改変ヌクレオチドである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＣ（配列番号７）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、配列番号７は、アンチセンス鎖の１〜２１位（５’→３’）に位置する。
【００５５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、改変ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｃ（配列番号６）（ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表す）と１個以下のヌクレオチドが異なる改変ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖と少なくとも実質的に相補的である。
【００５６】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＧＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号９）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＧＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号９）と１個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含み、ヌクレオチドの全部または実質的に全部が改変ヌクレオチドである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＧＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号９）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、配列番号９は、アンチセンス鎖の１〜２１位（５’→３’）に位置する。
【００５７】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｇｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号８）（ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表す）と１個以下のヌクレオチドが異なる改変ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、センス鎖と少なくとも実質的に相補的である。一部の実施形態では、１つまたは複数の反転脱塩基残基を、配列番号８のセンス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端、またはセンス鎖の５’と３’末端の両方に付加することができる。一部の実施形態では、αｖβ６インテグリン標的化リガンドなどの標的化リガンドを、配列番号８のセンス鎖の５’末端、センス鎖の３’末端、またはセンス鎖の５’と３’末端の両方に共有結合により連結することができる。
【００５８】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＣ（配列番号７）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖およびヌクレオチド配列（５’→３’）ＧＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号９）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＣ（配列番号７）と１個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖（ここでヌクレオチドの全部または実質的に全部が改変ヌクレオチドである）およびヌクレオチド配列（５’→３’）ＧＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号９）と１個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含み、ヌクレオチドの全部または実質的に全部が改変ヌクレオチドである。
【００５９】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｃ（配列番号６）と１個以下のヌクレオチドが異なる改変ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖、およびヌクレオチド配列（５’→３’）ｇｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号８）と１個以下のヌクレオチドが異なる改変ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表す。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、改変ヌクレオチド配列（５’→３’）ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｃ（配列番号６）からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖、および改変ヌクレオチド配列（５’→３’）ｇｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号８）からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、３’末端に反転脱塩基残基および５’末端に共有結合により連結されたαｖβ６インテグリン標的化リガンドをさらに含む。
【００６０】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｃＰｒｐｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号１０）（ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表し、ｃＰｒｐｕは、５’−シクロプロピルホスホネート−２’−Ｏ−メチルウリジンを表す）（表６を参照されたい）と１個以下のヌクレオチドが異なる改変ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、センス鎖は、アンチセンス鎖と少なくとも実質的に相補的である。
【００６１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ｃＰｒｐｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号１０）と１個以下のヌクレオチドが異なる改変ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖、およびヌクレオチド配列（５’→３’）ｃｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号４）と１個以下のヌクレオチドが異なる改変ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含み、ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表し、ｃＰｒｐｕは、５’−シクロプロピルホスホネート−２’−Ｏ−メチルウリジンを表す（表６を参照されたい）。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、改変ヌクレオチド配列（５’→３’）ｃＰｒｐｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号１０）からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖、および改変ヌクレオチド配列（５’→３’）ｃｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号４）からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、３’末端に反転脱塩基残基および５’末端に共有結合により連結されたαｖβ６インテグリン標的化リガンドをさらに含む。
【００６２】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＧ（配列番号３）；
ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＣ（配列番号７）；
ＵＧＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧ（配列番号２３０）；または
ＡＧＡＡＧＵＣＡＵＵＣＵＧＣＵＣＵＧＣＵＵ（配列番号２５４）；
の１つと０または１個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み；アンチセンス鎖とセンス鎖の両方の上のヌクレオチドの全部または実質的に全部は改変ヌクレオチドである。
【００６３】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＧ（配列番号３）；
ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＣ（配列番号７）；
ＵＧＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧ（配列番号２３０）；または
ＡＧＡＡＧＵＣＡＵＵＣＵＧＣＵＣＵＧＣＵＵ（配列番号２５４）；
の１つと０または１個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、ここで、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み；アンチセンス鎖とセンス鎖の両方の上のヌクレオチドの全部または実質的に全部は改変ヌクレオチドであり；センス鎖は３’末端に反転脱塩基残基を含み；αｖβ６インテグリン標的化リガンドは、センス鎖の５’末端に連結されている。
【００６４】
一部の実施形態では、本明細書で開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＧ（配列番号３）；
ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＣ（配列番号７）；
ＵＧＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧ（配列番号２３０）；または
ＡＧＡＡＧＵＣＡＵＵＣＵＧＣＵＣＵＧＣＵＵ（配列番号２５４）；
の１つと０または１個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、ここで、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み；アンチセンス鎖とセンス鎖の両方の上のヌクレオチドの全部または実質的に全部は改変ヌクレオチドであり；センス鎖は３’末端に反転脱塩基残基を含み；αｖβ６インテグリン標的化リガンドは、センス鎖の５’末端に連結されており；それぞれのアンチセンス鎖配列は、アンチセンス鎖の１〜２１位に位置する。
【００６５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）対：
ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＧ（配列番号３）およびＣＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号５）；
ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＣ（配列番号７）およびＧＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号９）；
ＵＧＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧ（配列番号２３０）およびＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＣＡ（配列番号２５９）；または
ＡＧＡＡＧＵＣＡＵＵＣＵＧＣＵＣＵＧＣＵＵ（配列番号２５４）およびＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＵＧＡＣＵＵＣＵＵＵ（配列番号２８９）；
の１つと０または１ヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含み、ここで、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方の上のヌクレオチドの全部または実質的に全部は、改変ヌクレオチドである。
【００６６】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、ここで、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）対：
ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＧ（配列番号３）およびＣＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号５）；
ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧＣ（配列番号７）およびＧＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＡ（配列番号９）；
ＵＧＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡＧ（配列番号２３０）およびＣＵＧＵＧＣＡＡＣＣＡＧＡＡＣＡＡＡＵＣＡ（配列番号２５９）；または
ＡＧＡＡＧＵＣＡＵＵＣＵＧＣＵＣＵＧＣＵＵ（配列番号２５４）およびＧＣＡＧＡＧＣＡＧＡＡＵＧＡＣＵＵＣＵＵＵ（配列番号２８９）；
の１つと０または１個のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含み、ここで、アンチセンス鎖とセンス鎖の両方の上のヌクレオチドの全部または実質的に全部は改変ヌクレオチドであり；センス鎖は３’末端に反転脱塩基残基を含み；αｖβ６インテグリン標的化リガンドは、センス鎖の５’末端に連結されている。
【００６７】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号２）；
ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｃ（配列番号６）；
ｃＰｒｐｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号１０）；
ｕｓＧｆｓａｓＵｆｕＵｆｇＵｆｕＣｆｕＧｆｇＵｆｕＧｆｃＡｆｃＡｆｓｇ（配列番号１０７）；または
ａｓＧｆｓａｓＡｆｇＵｆｃＡｆｕＵｆｃＵｆｇＣｆｕＣｆｕＧｆｃｕｓｕ（配列番号１５２）；
（ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表し、ｃＰｒｐｕは、５’−シクロプロピルホスホネート−２’−Ｏ−メチルウリジンを表す）（表６を参照されたい）の１つと０または１個のヌクレオチドが異なる改変ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含み、ここで、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み、センス鎖上のヌクレオチドの全部または実質的に全部は改変ヌクレオチドである。
【００６８】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列（５’→３’）：
ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号２）；
ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｃ（配列番号６）；
ｃＰｒｐｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号１０）；
ｕｓＧｆｓａｓＵｆｕＵｆｇＵｆｕＣｆｕＧｆｇＵｆｕＧｆｃＡｆｃＡｆｓｇ（配列番号１０７）；または
ａｓＧｆｓａｓＡｆｇＵｆｃＡｆｕＵｆｃＵｆｇＣｆｕＣｆｕＧｆｃｕｓｕ（配列番号１５２）；
の１つと０または１個のヌクレオチドが異なる改変ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖を含み、ここで、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖と少なくとも部分的に相補的であるセンス鎖をさらに含み；センス鎖上のヌクレオチドの全部または実質的に全部は改変ヌクレオチドであり；センス鎖は３’末端に反転脱塩基残基を含み；αｖβ６インテグリン標的化リガンドは、センス鎖の５’末端に連結されている。
【００６９】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列対（５’→３’）：
ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号２）および
ｃｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号４）；
ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｃ（配列番号６）および
ｇｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号８）；
ｃＰｒｐｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号１０）および
ｃｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号４）；
ｕｓＧｆｓａｓＵｆｕＵｆｇＵｆｕＣｆｕＧｆｇＵｆｕＧｆｃＡｆｃＡｆｓｇ（配列番号１０７）および
ｃｓｕｇｕｇｃａａＣｆＣｆＡｆｇａａｃａａａｕｃａｓ（配列番号２９３）；または
ａｓＧｆｓａｓＡｆｇＵｆｃＡｆｕＵｆｃＵｆｇＣｆｕＣｆｕＧｆｃｕｓｕ（配列番号１５２）および
ｇｓｃａｇａｇＣｆＡｆＧｆａａｕｇａｃｕｕｃｕｕｕ（配列番号２９４）；
（ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表し、ｃＰｒｐｕは、５’−シクロプロピルホスホネート−２’−Ｏ−メチルウリジンを表す）（表６を参照されたい）の１つと０または１個のヌクレオチドが異なる改変ヌクレオチド配列からなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
【００７０】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、以下のヌクレオチド配列対（５’→３’）：
ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号２）および
ｃｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号４）；
ｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｃ（配列番号６）および
ｇｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号８）；
ｃＰｒｐｕｓＡｆｓｕｓＵｆｕＧｆｕＵｆｃＵｆｇＧｆｕＵｆｇＣｆａＣｆａＧｆｓｇ（配列番号１０）および
ｃｓｃｕｇｕｇｃａＡｆＣｆＣｆａｇａａｃａａａｕａ（配列番号４）；
ｕｓＧｆｓａｓＵｆｕＵｆｇＵｆｕＣｆｕＧｆｇＵｆｕＧｆｃＡｆｃＡｆｓｇ（配列番号１０７）および
ｃｓｕｇｕｇｃａａＣｆＣｆＡｆｇａａｃａａａｕｃａｓ（配列番号２９３）；または
ａｓＧｆｓａｓＡｆｇＵｆｃＡｆｕＵｆｃＵｆｇＣｆｕＣｆｕＧｆｃｕｓｕ（配列番号１５２）および
ｇｓｃａｇａｇＣｆＡｆＧｆａａｕｇａｃｕｕｃｕｕｕ（配列番号２９４）；
（ここで、ａ、ｃ、ｇおよびｕは、それぞれ、２’−Ｏ−メチルアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、それぞれ、２’−フルオロアデノシン、シチジン、グアノシン、またはウリジンを表し；ｓは、ホスホロチオエート連結を表し、ｃＰｒｐｕは、５’−シクロプロピルホスホネート−２’−Ｏ−メチルウリジンを表す）（表６を参照されたい）の１つからなるか、それから本質的になるか、またはそれを含むアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、ここで、センス鎖は、３’末端に反転脱塩基残基を含み；αｖβ６インテグリン標的化リガンドは、センス鎖の５’末端に連結されている。
【００７１】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡ（配列番号２１）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列を含むアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡ（配列番号２１）と１個以下のヌクレオチドが異なるヌクレオチド配列を含むアンチセンス鎖を含み、ヌクレオチドの全部または実質的に全部が改変ヌクレオチドである。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ヌクレオチド配列（５’→３’）ＵＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧＣＡＣＡ（配列番号２１）と０または１個の核酸塩基が異なる核酸塩基配列を含むアンチセンス鎖を含み、配列番号２１は、アンチセンス鎖の１〜１９位（５’→３’）に位置する。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、それぞれ独立に改変されていてもよいか、または改変されていなくてもよい、連結されたヌクレオシドのポリマーを意味する。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「ＲＮＡｉ剤」（「ＲＮＡｉトリガー」とも呼ばれる）は、配列特異的様式で標的ｍＲＮＡのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物の翻訳物を分解する、または阻害することができる（例えば、適切な条件下で分解する、または阻害する）ＲＮＡまたはＲＮＡ様（例えば、化学的に改変されたＲＮＡ）オリゴヌクレオチド分子を含有する組成物を意味する。本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡ干渉機構（すなわち、哺乳動物細胞のＲＮＡ干渉経路機構（ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体もしくはＲＩＳＣ）との相互作用によってＲＮＡ干渉を誘導すること）によって、または任意の代替的な機構もしくは経路によって動作することができる。ＲＮＡｉ剤は、本明細書でその用語が使用される場合、主にＲＮＡ干渉機構によって動作すると考えられるが、開示されるＲＮＡｉ剤は、いかなる特定の経路または作用機構によっても束縛されず、それに限定もされない。本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、限定されるものではないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）（ｓｈＲＮＡ）、およびダイサー基質を含む。本明細書に記載のＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、標的化されるｍＲＮＡ（すなわち、アルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ）と少なくとも部分的に相補的である。ＲＮＡｉ剤は、１つもしくは複数の改変ヌクレオチドおよび／または１つもしくは複数の非ホスホジエステル連結を含んでもよい。
【００７４】
本明細書で使用される場合、所与の遺伝子の発現に言及する場合の用語「サイレンシングする」、「減少させる」、「阻害する」、「下方調節する」、または「ノックダウンする」とは、遺伝子が転写される細胞、細胞群、組織、臓器、または被験体中で、遺伝子から転写されるＲＮＡのレベルまたはｍＲＮＡから翻訳されるポリペプチド、タンパク質、もしくはタンパク質サブユニットのレベルにより測定された場合、遺伝子の発現が、細胞、細胞群、組織、臓器、または被験体が本明細書に記載のＲＮＡｉ剤で処置される場合に、そのように処置されていない第２の細胞、細胞群、組織、臓器、または被験体と比較して減少することを意味する。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「配列」および「ヌクレオチド配列」とは、標準的な命名法を使用して文字の連続と共に記載される、核酸塩基またはヌクレオチドの連続または順序を意味する。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「塩基」、「ヌクレオチド塩基」または「核酸塩基」は、ヌクレオチドの成分である複素環ピリミジンまたはプリン化合物であり、主要なプリン塩基アデニンおよびグアニン、ならびに主要なピリミジン塩基シトシン、チミン、およびウラシルを含む。核酸塩基は、限定されるものではないが、ユニバーサル塩基、疎水性塩基、無差別塩基、サイズ拡大塩基、およびフッ素化塩基を含むようにさらに改変することができる（例えば、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，  Ｐ．（編）、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、２００８年を参照されたい）。そのような改変核酸塩基（改変核酸塩基を含むホスホルアミダイト化合物を含む）の合成は、当該分野で公知である。
【００７７】
本明細書で使用される場合、また、別途指摘しない限り、第２の核酸塩基またはヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉ剤アンチセンス鎖または一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド）との関連で第１の核酸塩基またはヌクレオチド配列（例えば、ＲＮＡｉ剤センス鎖または標的化されたｍＲＮＡ）を記述するために使用される場合の用語「相補的」とは、第１のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドが、第２のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと、ある特定の標準的な条件下でハイブリダイズし（哺乳動物の生理学的条件（またはｉｎ  ｖｉｔｒｏの類似する条件）下で塩基対水素結合を形成し）、二本鎖または二重らせん構造を形成する能力を意味する。相補配列は、ワトソン−クリック塩基対または非ワトソン−クリック塩基対を含み、少なくとも上記のハイブリダイゼーション要件が満たされる程度で、天然または改変ヌクレオチドまたはヌクレオチド模倣体を含む。配列同一性または相補性は、改変とは無関係である。例えば、本明細書で定義される、ａおよびＡｆは、同一性または相補性を決定する目的では、Ｕ（またはＴ）と相補的であり、Ａと同一である。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「完璧に相補的」または「完全に相補的」とは、核酸塩基またはヌクレオチド配列分子のハイブリダイズした対において、第１のオリゴヌクレオチドの連続する配列中の塩基の全部（１００％）が、第２のオリゴヌクレオチドの連続する配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。連続する配列は、第１または第２のヌクレオチド配列の全部または一部を含んでもよい。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「部分的に相補的」とは、核酸塩基またはヌクレオチド配列分子のハイブリダイズした対において、第１のオリゴヌクレオチドの連続する配列中の塩基の全部ではないが、少なくとも７０％が、第２のオリゴヌクレオチドの連続する配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。連続する配列は、第１または第２のヌクレオチド配列の全部または一部を含んでもよい。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「実質的に相補的」とは、核酸塩基またはヌクレオチド配列分子のハイブリダイズした対において、第１のオリゴヌクレオチドの連続する配列中の塩基の全部ではないが、少なくとも８５％が、第２のオリゴヌクレオチドの連続する配列中の同じ数の塩基とハイブリダイズすることを意味する。連続する配列は、第１または第２のヌクレオチド配列の全部または一部を含んでもよい。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「相補的」、「完全に相補的」、「部分的に相補的」および「実質的に相補的」は、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖とアルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡの配列との間の核酸塩基またはヌクレオチドの一致に関して使用される。
【００８２】
本明細書で使用される場合、核酸配列に適用される用語「実質的に同一」または「実質的な同一性」は、ヌクレオチド配列（またはヌクレオチド配列の一部）が、参照配列と比較して、少なくとも約８５％の配列同一性またはそれより高い、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％の同一性を有することを意味する。配列同一性のパーセンテージは、２つの最適に整列された配列を、比較ウィンドウにわたって比較することによって決定される。パーセンテージは、同じ型の核酸塩基が両配列内に存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を、比較ウィンドウ中の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。本明細書に開示される発明は、本明細書に開示されるものと実質的に同一のヌクレオチド配列を包含する。
【００８３】
本明細書で使用される場合、用語「処置する」、「処置」などは、被験体における疾患の１つまたは複数の症状の数、重症度、および／または頻度からの緩和またはその軽減を提供するために取られる方法またはステップを意味する。本明細書で使用される場合、「処置する」および「処置」は、防止的処置、管理、予防的処置、ならびに／または被験体における疾患の１つもしくは複数の症状の数、重症度、および／もしくは頻度の阻害もしくは減少を含んでもよい。
【００８４】
本明細書で使用される場合、ＲＮＡｉ剤に言及する場合の語句「細胞中に導入すること」は、ＲＮＡｉ剤を細胞中に機能的に送達することを意味する。語句「機能的送達」は、ＲＮＡｉ剤が、予想される生物活性、例えば、遺伝子発現の配列特異的阻害を有することを可能とする様式で、ＲＮＡｉ剤を細胞中に送達することを意味する。
【００８５】
別途記述しない限り、本明細書で使用される記号
【化１】
2020526192.tif 000002
の使用は、任意の基または複数の基を、本明細書に記載の発明の範囲に従ってそれに連結することができることを意味する。
【００８６】
本明細書で使用される場合、用語「異性体」とは、同一の分子式を有するが、性質またはその原子の結合の配列または空間中のその原子の配置が異なる化合物を指す。空間中のその原子の配置が異なる異性体は、「立体異性体」と呼ばれる。互いに鏡像ではない立体異性体は、「ジアステレオ異性体」と呼ばれ、重ね合わせることができない鏡像である立体異性体は、「エナンチオマー」または時には光学異性体と呼ばれる。４個の非同一の置換基に結合した炭素原子は、「キラル中心」と呼ばれる。
【００８７】
本明細書で使用される場合、特定のコンフォメーションを有するものとして構造中で具体的に同定されない限り、非対称中心が存在し、かくして、エナンチオマー、ジアステレオマー、または他の立体異性配置を生じるそれぞれの構造について、本明細書に開示されるそれぞれの構造は、その光学的に純粋な形態およびラセミ形態を含む、全てのそのような可能な異性体を表すことが意図される。例えば、本明細書に開示される構造は、ジアステレオマーの混合物および単一の立体異性体を包含することが意図される。
【００８８】
本明細書の特許請求の範囲で使用される場合、語句「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲で特定されない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。本明細書の特許請求の範囲で使用される場合、語句「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」は、特許請求の範囲を、特定された材料またはステップおよび特許請求された発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しないものに限定する。
【００８９】
当業者であれば、本明細書に開示される化合物および組成物が、その化合物または組成物が置かれる環境に応じて、プロトン化または脱プロトン化された状態のある特定の原子（例えば、Ｎ、Ｏ、またはＳ原子）を有してもよいことを容易に理解および認識するであろう。したがって、本明細書で使用される場合、本明細書に開示される構造は、例えば、ＯＨ、ＳＨ、またはＮＨなどのある特定の官能基がプロトン化または脱プロトン化されていてもよいことを想定する。本明細書の開示は、当業者であれば容易に理解するように、開示される化合物および組成物を、環境（ｐＨなど）に基づくそれらのプロトン化の状態に関係なく包含することが意図される。
【００９０】
本明細書で使用される場合、２つの化合物または分子の間の接続に言及する場合の用語「連結された」または「コンジュゲートされた」は、２つの化合物または分子が共有結合によって繋がれていることを意味する。記述しない限り、本明細書で使用される用語「連結された」および「コンジュゲートされた」は、任意の介在する原子または原子群を用いる、または用いない、第１の化合物と第２の化合物との間の接続を指してもよい。
【００９１】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、語句「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味するように本明細書で使用され、それと互換的に使用される。用語「または」は、文脈が他のものを明確に示さない限り、用語「および／または」を意味するように本明細書で使用され、それと互換的に使用される。
【００９２】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者が一般に理解するものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと類似するか、または等価である方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料を以下で説明する。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が支配する。さらに、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定を意図するものではない。
【００９３】
本発明の他の目的、特徴、態様、および利点は、以下の詳細な説明、添付の図面、および特許請求の範囲から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】図１は、ビヒクル対照と比較した、様々なアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の投与後のマウス全肺アルファ−ＥＮａＣ発現の相対的発現を示すヒストグラムである。
【図２】図２は、ビヒクル対照と比較した、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０４０２５およびＡＤ０４８５８の投与後のマウス全肺アルファ−ＥＮａＣ発現の相対的発現を示すヒストグラムである。
【図３】図３は、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０４０２５およびＡＤ０４０２５コンジュゲート（すなわち、ペプチドに基づくαｖβ６上皮細胞標的化リガンドにコンジュゲートされたＡＤ０４０２５）のラット全肺アルファ−ＥＮａＣ発現の相対的発現を示すグラフである。
【図４】図４は、本明細書でＴｒｉ−ＳＭ２と呼ばれる、三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドの化学構造表示である。
【図５】図５は、本明細書でＴｒｉ−ＳＭ１と呼ばれる、三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドの化学構造表示である。
【図６】図６は、本明細書でＴｒｉ−ＳＭ６．１と呼ばれる、三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドの化学構造表示である。
【図７】図７は、本明細書でＴｒｉ−ＳＭ９と呼ばれる、三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドの化学構造表示である。
【図８】図８は、本明細書でＴｒｉ−ＳＭ６と呼ばれる、三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドの化学構造表示である。
【図９】図９は、本明細書でＴｒｉ−ＳＭ８と呼ばれる、三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドの化学構造表示である。
【図１０】図１０は、本明細書でＴｒｉ−ＳＭ１０と呼ばれる、三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドの化学構造表示である。
【図１１】図１１は、本明細書でＴｒｉ−ＳＭ１１と呼ばれる、三座αｖβ６上皮細胞標的化リガンドの化学構造表示である。
【図１２−１】図１２Ａは、標的化リガンドへの連結を容易にするためのセンス鎖の５’末端上のアミノ基と共に示される、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３（表３〜５を参照されたい）の改変されたセンスおよびアンチセンス鎖の模式図である。図１２Ａ〜１２Ｇにおいては、以下の省略形が使用される：ａ、ｃ、ｇおよびｕは、２’−Ｏ−メチル改変ヌクレオチドであり；Ａｆ、Ｃｆ、Ｇｆ、およびＵｆは、２’−フルオロ改変ヌクレオチドであり；ｐは、ホスホジエステル連結であり；ｓは、ホスホロチオエート連結であり；ｉｎｖＡｂは、反転脱塩基残基であり；ｃＰｒｐは、５’末端シクロプロピルホスホネート基（表６を参照されたい）であり；ＮＨ２−Ｃ６は、Ｃ６アミノ基（表６を参照されたい）であり；ＴｒｉＡｌｋ１４は、本明細書に示される構造を有するトリ−アルキンリンカー（表６を参照されたい）である。  図１２Ｂは、標的化リガンドへの連結を容易にするためのセンス鎖の５’末端上のトリ−アルキン基で官能化されて示される、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５９２４（表３〜５を参照されたい）の改変されたセンスおよびアンチセンス鎖の模式図である。本明細書に記載されるように、ＡＤ０５４５３およびＡＤ０５９２４は、同じ改変ヌクレオチド配列を有し、本明細書に開示されるアルファＥＮａＣ−ＲＮＡｉ剤コンジュゲートを合成するための代替的手法を表す。  図１２Ｃは、標的化リガンドへの連結を容易にするためのセンス鎖の５’末端上のアミノ基で官能化されて示される、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５６２５（表３〜５を参照されたい）の改変されたセンスおよびアンチセンス鎖の模式図である。
【図１２−２】図１２Ｄは、標的化リガンドへの連結を容易にするためのセンス鎖の５’末端上のアミノ基で官能化されて示される、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５３４７（表３〜５を参照されたい）の改変されたセンスおよびアンチセンス鎖の模式図である。  図１２Ｅは、標的化リガンドへの連結を容易にするためのセンス鎖の５’末端上のアミノ基で官能化されて示される、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５８３１（表３〜５を参照されたい）の改変されたセンスおよびアンチセンス鎖の模式図である。  図１２Ｆは、標的化リガンドへの連結を容易にするためのセンス鎖の５’末端上のアミノ基で官能化されて示される、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５８３３（表３〜５を参照されたい）の改変されたセンスおよびアンチセンス鎖の模式図である。
【図１２−３】図１２Ｇは、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３と、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５９２４（表３〜５を参照されたい）との両方の改変されたセンスおよびアンチセンス鎖の模式図（ここで、Ｘは、三座αｖβ６インテグリン標的化リガンド（任意のリンカーを含む）を表す）である。  図１２Ｈは、三座αｖβ６インテグリン標的化リガンドがセンス鎖の５’末端にコンジュゲートされている、本明細書に記載の三座αｖβ６インテグリン標的化リガンド−ＲＮＡｉ剤コンジュゲートの例の模式図である。そこに示されるように、それぞれのαｖβ６は、αｖβ６インテグリン標的化化合物を表す。
【図１３Ａ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ナトリウム塩として示される、ＮＨ２−Ｃ６末端アミノ基を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３の化学構造表示である。
【図１３Ｂ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ナトリウム塩として示される、ＮＨ２−Ｃ６末端アミノ基を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３の化学構造表示である。
【図１３Ｃ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ナトリウム塩として示される、ＮＨ２−Ｃ６末端アミノ基を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３の化学構造表示である。
【図１３Ｄ】図１３Ａ〜１３Ｄは、ナトリウム塩として示される、ＮＨ２−Ｃ６末端アミノ基を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３の化学構造表示である。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｄは、ナトリウム塩として示される、トリ−アルキン官能化リンカー基（ＴｒｉＡｌｋ１４）を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５９２４の化学構造表示である。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｄは、ナトリウム塩として示される、トリ−アルキン官能化リンカー基（ＴｒｉＡｌｋ１４）を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５９２４の化学構造表示である。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｄは、ナトリウム塩として示される、トリ−アルキン官能化リンカー基（ＴｒｉＡｌｋ１４）を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５９２４の化学構造表示である。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜１４Ｄは、ナトリウム塩として示される、トリ−アルキン官能化リンカー基（ＴｒｉＡｌｋ１４）を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５９２４の化学構造表示である。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｅは、ナトリウム塩として、Ｔｒｉ−ＳＭ６．１にコンジュゲートして示される、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３の化学構造表示である。本明細書で論じられるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５９２４の改変センス鎖ヌクレオチド配列（すなわち、表４中のＡＭ０７８０７−ＳＳ）に記載されるように、ホスホルアミダイト合成によって付加することができる、トリ−アルキン官能化リンカー基（ＴｒｉＡｌｋ１４）を使用して、同じ化学構造を合成することができる。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｅは、ナトリウム塩として、Ｔｒｉ−ＳＭ６．１にコンジュゲートして示される、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３の化学構造表示である。本明細書で論じられるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５９２４の改変センス鎖ヌクレオチド配列（すなわち、表４中のＡＭ０７８０７−ＳＳ）に記載されるように、ホスホルアミダイト合成によって付加することができる、トリ−アルキン官能化リンカー基（ＴｒｉＡｌｋ１４）を使用して、同じ化学構造を合成することができる。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｅは、ナトリウム塩として、Ｔｒｉ−ＳＭ６．１にコンジュゲートして示される、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３の化学構造表示である。本明細書で論じられるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５９２４の改変センス鎖ヌクレオチド配列（すなわち、表４中のＡＭ０７８０７−ＳＳ）に記載されるように、ホスホルアミダイト合成によって付加することができる、トリ−アルキン官能化リンカー基（ＴｒｉＡｌｋ１４）を使用して、同じ化学構造を合成することができる。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜１５Ｅは、ナトリウム塩として、Ｔｒｉ−ＳＭ６．１にコンジュゲートして示される、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３の化学構造表示である。本明細書で論じられるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５９２４の改変センス鎖ヌクレオチド配列（すなわち、表４中のＡＭ０７８０７−ＳＳ）に記載されるように、ホスホルアミダイト合成によって付加することができる、トリ−アルキン官能化リンカー基（ＴｒｉＡｌｋ１４）を使用して、同じ化学構造を合成することができる。
【図１５Ｅ】図１５Ａ〜１５Ｅは、ナトリウム塩として、Ｔｒｉ−ＳＭ６．１にコンジュゲートして示される、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３の化学構造表示である。本明細書で論じられるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５９２４の改変センス鎖ヌクレオチド配列（すなわち、表４中のＡＭ０７８０７−ＳＳ）に記載されるように、ホスホルアミダイト合成によって付加することができる、トリ−アルキン官能化リンカー基（ＴｒｉＡｌｋ１４）を使用して、同じ化学構造を合成することができる。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｄは、遊離酸として示される、ＮＨ２−Ｃ６末端官能化アミノ基を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３の化学構造表示である。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｄは、遊離酸として示される、ＮＨ２−Ｃ６末端官能化アミノ基を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３の化学構造表示である。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｄは、遊離酸として示される、ＮＨ２−Ｃ６末端官能化アミノ基を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３の化学構造表示である。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｄは、遊離酸として示される、ＮＨ２−Ｃ６末端官能化アミノ基を含むアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３の化学構造表示である。
【発明を実施するための形態】
【００９５】
ＲＮＡｉ剤
アルファ−ＥＮａＣ（すなわち、ＳＣＮＮ１Ａ）遺伝子の発現を阻害するためのＲＮＡｉ剤（本明細書ではアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤またはアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉトリガーと呼ばれる）が本明細書に記載される。それぞれのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含む。センス鎖およびアンチセンス鎖は、それぞれ、１６〜３０ヌクレオチド長であってもよい。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、それぞれ、１７〜２６ヌクレオチド長である。センスおよびアンチセンス鎖は、同じ長さであってもよく、または異なる長さであってもよい。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、それぞれ独立に１７〜２６ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、それぞれ独立に１７〜２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖は両方とも、それぞれ２１〜２６ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖は、それぞれ２１〜２４ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖は、約１９ヌクレオチド長であるが、アンチセンス鎖は、約２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖は、約２１ヌクレオチド長であるが、アンチセンス鎖は、約２３ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖は両方とも、それぞれ２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンスおよびアンチセンス鎖は、それぞれ独立に１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、約１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドの二本鎖の長さを有する。
【００９６】
一部の実施形態では、センス鎖とアンチセンス鎖との間の完璧な、実質的な、または部分的な相補性の領域は、１６〜２６（例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または２６）ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖の５’末端に、またはその近くに存在する（例えば、この領域は、完璧に、実質的に、または部分的に相補的ではない０、１、２、３、または４個のヌクレオチドによって、アンチセンス鎖の５’末端から分離していてもよい）。
【００９７】
センス鎖およびアンチセンス鎖はそれぞれ、１６〜２３ヌクレオチド長であるコアストレッチ（本明細書では「コア配列」または「コアストレッチ配列」とも呼ばれる）を含有する。アンチセンス鎖コアストレッチは、アルファ−ＥＮａＣ標的中に存在するヌクレオチド配列（例えば、標的配列と呼ばれることもある）と１００％（完璧に）相補的であるか、または少なくとも８５％（実質的に）相補的である。センス鎖コアストレッチは、アンチセンス鎖中のコアストレッチと１００％（完璧に）相補的であるか、または少なくとも８５％（実質的に）相補的であり、かくして、センス鎖コアストレッチは、典型的には、アルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ標的中に存在するヌクレオチド配列（標的配列）と完璧に同一であるか、または少なくとも８５％同一である。センス鎖コアストレッチは、対応するアンチセンスコアストレッチと同じ長さであってもよく、または異なる長さであってもよい。一部の実施形態では、アンチセンス鎖コアストレッチは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチド長である。一部の実施形態では、センス鎖コアストレッチは、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチド長である。
【００９８】
アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を形成する際に使用されるヌクレオチド配列の例を、表２、３および４に提供する。表２、３および４中のセンス鎖およびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列を含むＲＮＡｉ剤二本鎖の例を、表５に示す。
【００９９】
アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンスおよびアンチセンス鎖は、アニーリングして二本鎖を形成する。アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、互いに部分的に、実質的に、または完全に相補的であってもよい。相補的二本鎖領域内で、センス鎖コアストレッチ配列は、アンチセンスコアストレッチ配列と少なくとも８５％相補的であるか、または１００％相補的である。一部の実施形態では、センス鎖コアストレッチ配列は、アンチセンス鎖コアストレッチ配列の対応する１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３ヌクレオチドの配列と少なくとも８５％または１００％相補的である、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３ヌクレオチドの配列を含有する（すなわち、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンスおよびアンチセンスコアストレッチ配列は、少なくとも８５％塩基対形成する、または１００％塩基対形成する少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、または少なくとも２３ヌクレオチドの領域を有する）。
【０１００】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２または表３中のアンチセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、または３ヌクレオチドが異なる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表２または表４中のセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、または３ヌクレオチドが異なる。
【０１０１】
センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、必要に応じて、また、独立に、コアストレッチ配列の３’末端、５’末端、または３’と５’末端の両方に、追加の１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチド（伸長）を含有してもよい。存在する場合、アンチセンス鎖の追加のヌクレオチドは、アルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ中の対応する配列と相補的であっても、相補的でなくてもよい。存在する場合、センス鎖の追加のヌクレオチドは、アルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ中の対応する配列と同一であっても、同一でなくてもよい。存在する場合、アンチセンス鎖の追加のヌクレオチドは、存在する場合、対応するセンス鎖の追加のヌクレオチドと相補的であっても、相補的でなくてもよい。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、伸長は、センス鎖コアストレッチ配列および／またはアンチセンス鎖コアストレッチ配列の５’および／または３’末端に１、２、３、４、５、または６個のヌクレオチドを含む。センス鎖上の伸長ヌクレオチドは、対応するアンチセンス鎖中の、コアストレッチ配列ヌクレオチドまたは伸長ヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドと相補的であっても、相補的でなくてもよい。逆に、アンチセンス鎖上の伸長ヌクレオチドは、対応するセンス鎖中の、コアストレッチヌクレオチドまたは伸長ヌクレオチドのいずれかのヌクレオチドと相補的であっても、相補的でなくてもよい。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖とアンチセンス鎖は両方とも、３’および５’伸長を含有する。一部の実施形態では、一方の鎖の３’伸長ヌクレオチドの１つまたは複数は、他方の鎖の１つまたは複数の５’伸長ヌクレオチドと塩基対を形成する。他の実施形態では、一方の鎖の３’伸長ヌクレオチドの１つまたは複数は、他方の鎖の１つまたは複数の５’伸長ヌクレオチドと塩基対を形成しない。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、３’伸長を有するアンチセンス鎖および５’伸長を有するセンス鎖を有する。一部の実施形態では、伸長ヌクレオチドは、対形成せず、突出部を形成する。本明細書で使用される場合、「突出部」とは、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤のハイブリダイズした、または二本鎖を形成した部分の一部を形成しないセンス鎖またはアンチセンス鎖の末端に位置する１つまたは複数の対形成しないヌクレオチドのストレッチを指す。
【０１０３】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、１、２、３、４、５、または６ヌクレオチド長の３’伸長を有するアンチセンス鎖を含む。他の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、１、２、または３ヌクレオチド長の３’伸長を有するアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、アンチセンス鎖伸長ヌクレオチドの１つまたは複数は、ウラシルもしくはチミジンヌクレオチドまたは対応するアルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ配列と相補的であるヌクレオチドを含む。
【０１０４】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖の３’末端は、追加の脱塩基残基（Ａｂ）を含んでもよい。「脱塩基残基」または「脱塩基部位」は、糖部分の１’位の核酸塩基を欠くヌクレオチドまたはヌクレオシドである（例えば、米国特許第５，９９８，２０３号を参照されたい）。一部の実施形態では、ＡｂまたはＡｂＡｂを、アンチセンス鎖の３’末端に付加することができる。一部の実施形態では、脱塩基残基を、反転脱塩基残基（ｉｎｖＡｂ）として付加することができる（表６を参照されたい）（例えば、Ｆ．  Ｃｚａｕｄｅｒｎａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２００３年、３１巻（１１号）、２７０５〜１６頁を参照されたい）。
【０１０５】
一部の実施形態では、センス鎖またはアンチセンス鎖は、本明細書で使用される場合、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤の鎖の１つまたは複数の末端に組み込むことができる非ヌクレオチド化合物または他の部分であり、一部の例では、例えば、エキソヌクレアーゼ分解に対する保護などのある特定の有益な特性を有するＲＮＡｉ剤を提供することができる、「末端キャップ」を含んでもよい。末端キャップは、当該分野で一般に公知であり、反転脱塩基残基、および末端Ｃ３、Ｃ６、またはＣ１２基などの炭素鎖を含む。一部の実施形態では、末端キャップは、センス鎖の５’末端、３’末端、または５’と３’末端の両方に存在する。
【０１０６】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、１、２、３、４、または５ヌクレオチド長の３’伸長を有するセンス鎖を含む。一部の実施形態では、センス鎖伸長ヌクレオチドの１つまたは複数は、アデノシン、ウラシル、またはチミジンヌクレオチド、ＡＴジヌクレオチド、またはアルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ配列中のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、３’センス鎖伸長は、限定されるものではないが、以下の配列：Ｔ、ＵＴ、ＴＴ、ＵＵ、ＵＵＴ、ＴＴＴ、またはＴＴＴＴ（それぞれ５’から３’に向かって列挙される）の１つを含むか、またはそれからなる。
【０１０７】
一部の実施形態では、センス鎖の３’末端は、追加の脱塩基残基を含んでもよい。一部の実施形態では、ＵＵＡｂ、ＵＡｂ、またはＡｂを、センス鎖の３’末端に付加する。
【０１０８】
一部の実施形態では、１つまたは複数の反転脱塩基残基（ｉｎｖＡｂ）を、センス鎖の３’末端に付加する。一部の実施形態では、１つまたは複数の反転脱塩基残基または反転脱塩基部位を、標的化リガンドと、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の核酸塩基配列との間に挿入する。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の末端または複数の末端での、またはその近くでの１つまたは複数の反転脱塩基残基または反転脱塩基部位の含有は、ＲＮＡｉ剤の活性または他の望ましい特性の増強を可能にする。
【０１０９】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、１、２、３、４、５、または６ヌクレオチド長の５’伸長を有するセンス鎖を含む。一部の実施形態では、センス鎖伸長ヌクレオチドの１つまたは複数は、ウラシルまたはアデノシンヌクレオチドまたはアルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡ配列中のヌクレオチドに対応するヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、センス鎖５’伸長は、限定されるものではないが、以下の配列：ＣＡ、ＡＵＡＧＧＣ、ＡＵＡＧＧ、ＡＵＡＧ、ＡＵＡ、Ａ、ＡＡ、ＡＣ、ＧＣＡ、ＧＧＣＡ、ＧＧＣ、ＵＡＵＣＡ、ＵＡＵＣ、ＵＣＡ、ＵＡＵ、Ｕ、ＵＵ（それぞれ５’から３’に向かって列挙される）の１つである。センス鎖は、３’伸長および／または５’伸長を有してもよい。
【０１１０】
一部の実施形態では、センス鎖の５’末端は、１つまたは複数の追加の脱塩基残基（例えば、（Ａｂ）または（ＡｂＡｂ））を含んでもよい。一部の実施形態では、１つまたは複数の反転脱塩基残基（ｉｎｖＡｂ）を、センス鎖の５’末端に付加する。一部の実施形態では、１つまたは複数の反転脱塩基残基を、標的化リガンドと、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の核酸塩基配列との間に挿入することができる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の末端または複数の末端での、またはその近くでの１つまたは複数の反転脱塩基残基の含有は、ＲＮＡｉ剤の活性または他の望ましい特性の増強を可能にすることができる。一部の実施形態では、脱塩基（デオキシリボース）残基を、リビトール（脱塩基リボース）残基と置き換えることができる。
【０１１１】
一部の実施形態では、アンチセンス鎖コアストレッチ配列の３’末端またはアンチセンス鎖配列の３’末端は、反転脱塩基残基（ｉｎｖＡｂ（表６を参照されたい））を含んでもよい。
【０１１２】
アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を形成する際に使用される配列の例を、表２、３および４に提供する。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２または３中の配列のいずれかの配列を含む。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２または表３中の配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端に）１〜１７、２〜１５、２〜１７、１〜１８、２〜１８、１〜１９、２〜１９、１〜２０、２〜２０、１〜２１、２〜２１、１〜２２、２〜２２、１〜２３、２〜２３、１〜２４、または２〜２４の配列を含む。ある特定の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表３中の改変配列のいずれか１つの改変配列を含む、またはそれからなる。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表２または４中の配列のいずれかの配列を含む。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表２または４中の配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端に）１〜１８、１〜１９、１〜２０、１〜２１、１〜２２、１〜２３、１〜２４、２〜１９、２〜２０、２〜２１、２〜２２、２〜２３、２〜２４、３〜２０、３〜２１、３〜２２、３〜２３、３〜２４、４〜２１、４〜２２、４〜２３、４〜２４、５〜２２、５〜２３または５〜２４の配列を含む。ある特定の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表４中の改変配列のいずれか１つの改変配列を含む、またはそれからなる。
【０１１３】
一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉ剤のセンスおよびアンチセンス鎖は、同じ数のヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡｉ剤のセンスおよびアンチセンス鎖は、異なる数のヌクレオチドを含有する。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端は、平滑末端を形成する。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端は、平滑末端を形成する。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の両方の末端は、平滑末端を形成する。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のいずれの末端も、平滑末端ではない。本明細書で使用される場合、「平滑末端」とは、２つのアニーリングした鎖の末端ヌクレオチドが相補的である（相補的塩基対を形成する）、二本鎖ＲＮＡｉ剤の末端を指す。
【０１１４】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端およびアンチセンス鎖の３’末端は、フレイド末端（ｆｒａｙｅｄ  ｅｎｄ）を形成する。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の３’末端およびアンチセンス鎖の５’末端は、フレイド末端を形成する。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の両方の末端は、フレイド末端を形成する。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のいずれの末端も、フレイド末端ではない。本明細書で使用される場合、フレイド末端とは、２つのアニーリングした鎖の末端ヌクレオチドが対を形成する（すなわち、突出部を形成しない）が、相補的ではない（すなわち、非相補的対を形成する）、二本鎖ＲＮＡｉ剤の末端を指す。一部の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の一方の鎖の末端の１つまたは複数の対形成しないヌクレオチドは、突出部を形成する。対形成しないヌクレオチドは、センス鎖またはアンチセンス鎖の上にあり、３’または５’突出部を作出してもよい。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、平滑末端とフレイド末端、平滑末端と５’突出末端、平滑末端と３’突出末端、フレイド末端と５’突出末端、フレイド末端と３’突出末端、２つの５’突出末端、２つの３’突出末端、５’突出末端と３’突出末端、２つのフレイド末端、または２つの平滑末端を含有する。典型的には、存在する場合、突出部は、センス鎖、アンチセンス鎖、またはセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の３’末端に位置する。
【０１１５】
改変ヌクレオチドは、様々なポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド構築物において使用される場合、細胞中の化合物の血清安定性を同時に増加させながら、これらの化合物の活性を保持することができ、また、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド構築物の投与時にヒトにおけるインターフェロン活性を活性化する可能性を最小化することもできる。
【０１１６】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、塩、混合塩、または遊離酸として調製または提供される。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、ナトリウム塩として調製される。当該分野で周知であるそのような形態は、本明細書に開示される発明の範囲内にある。
【０１１７】
改変ヌクレオチド
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、１つまたは複数の改変ヌクレオチドを含有する。本明細書で使用される場合、「改変ヌクレオチド」は、リボヌクレオチド（２’−ヒドロキシルヌクレオチド）以外のヌクレオチドである。一部の実施形態では、ヌクレオチドの少なくとも５０％（例えば、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）が改変ヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、改変ヌクレオチドは、限定されるものではないが、デオキシリボヌクレオチド、ヌクレオチド模倣体、脱塩基ヌクレオチド（本明細書ではＡｂと表される）、２’−改変ヌクレオチド、３’−３’連結（反転）ヌクレオチド（本明細書ではｉｎｖｄＮ、ｉｎｖＮ、ｉｎｖｎと表される）、改変核酸塩基を含むヌクレオチド、架橋ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、２’，３’−ｓｅｃｏヌクレオチド模倣体（アンロックド核酸塩基アナログ、本明細書ではＮＵＮＡまたはＮＵＮＡと表される）、ロックドヌクレオチド（本明細書ではＮＬＮＡまたはＮＬＮＡと表される）、３’−Ｏ−メトキシ（２’ヌクレオシド間連結）ヌクレオチド（本明細書では３’−ＯＭｅｎと表される）、２’−Ｆ−アラビノヌクレオチド（本明細書ではＮｆＡＮＡまたはＮｆＡＮＡと表される）、５’−Ｍｅ、２’−フルオロヌクレオチド（本明細書では５Ｍｅ−Ｎｆと表される）、モルホリノヌクレオチド、ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド（本明細書ではｖｐｄＮと表される）、ビニルホスホネート含有ヌクレオチド、およびシクロプロピルホスホネート含有ヌクレオチド（ｃＰｒｐＮ）を含んでもよい。２’−改変ヌクレオチド（すなわち、５員糖環の２’位にヒドロキシル基以外の基を有するヌクレオチド）としては、限定されるものではないが、２’−Ｏ−メチルヌクレオチド（本明細書では、ヌクレオチド配列中で小文字の「ｎ」と表される）、２’−デオキシ−２’−フルオロヌクレオチド（本明細書では、２’−フルオロヌクレオチドとも呼ばれ、本明細書ではＮｆと表される）、２’−デオキシヌクレオチド（本明細書ではｄＮと表される）、２’−メトキシエチル（２’−Ｏ−２−メトキシルエチル）ヌクレオチド（本明細書では２’−ＭＯＥとも呼ばれ、本明細書ではＮＭと表される）、２’−アミノヌクレオチド、および２’−アルキルヌクレオチドが挙げられる。所与の化合物中の全ての位置が均一に改変される必要はない。逆に、１つより多い改変を、単一のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤に、またはさらにはその単一のヌクレオチドに組み込むことができる。アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖を、当該分野で公知の方法によって合成および／または改変することができる。あるヌクレオチドでの改変は、別のヌクレオチドでの改変とは無関係である。
【０１１８】
改変核酸塩基は、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンならびにＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリン（例えば、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、または５−プロピニルシトシン）、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−アルキル（例えば、６−メチル、６−エチル、６−イソプロピル、または６−ｎ−ブチル）誘導体、アデニンおよびグアニンの２−アルキル（例えば、２−メチル、２−エチル、２−イソプロピル、または２−ｎ−ブチル）および他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、２−チオシトシン、５−ハロウラシル、シトシン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、６−アゾウラシル、６−アゾシトシン、６−アゾチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−スルフヒドリル、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルならびに他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ（例えば、５−ブロモ）、５−トリフルオロメチル、ならびに他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、３−デアザグアニン、ならびに３−デアザアデニンなどの、合成および天然の核酸塩基を含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のヌクレオチドの全部または実質的に全部が、改変ヌクレオチドである。本明細書で使用される場合、存在するヌクレオチドの実質的に全部が改変ヌクレオチドであるＲＮＡｉ剤は、リボヌクレオチド（すなわち、非改変）であるセンス鎖とアンチセンス鎖の両方において４個の、またはそれより少ない（すなわち、０、１、２、３または４個）ヌクレオチドを有するＲＮＡｉ剤である。本明細書で使用される場合、存在するヌクレオチドの実質的に全部が改変ヌクレオチドであるセンス鎖は、非改変リボヌクレオチドであるセンス鎖において２個の、またはそれより少ない（すなわち、０、１または２個）ヌクレオチドを有するセンス鎖である。本明細書で使用される場合、存在するヌクレオチドの実質的に全部が改変ヌクレオチドであるアンチセンス鎖は、非改変リボヌクレオチドであるセンス鎖において２個の、またはそれより少ない（すなわち、０、１または２個）ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖である。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤の１つまたは複数のヌクレオチドは、非改変リボヌクレオチドである。
【０１２０】
改変ヌクレオシド間連結
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の１つまたは複数のヌクレオチドは、非標準的な連結または骨格（すなわち、改変ヌクレオシド間連結または改変骨格）によって連結されている。改変ヌクレオシド間連結または骨格としては、限定されるものではないが、ホスホロチオエート基（本明細書では、小文字の「ｓ」と表される）、キラルホスホロチオエート、チオホスホフェート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキル−ホスホトリエステル、アルキルホスホネート（例えば、メチルホスホネートまたは３’−アルキレンホスホネート）、キラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホルアミデート（例えば、３’−アミノホスホルアミデート、アミノアルキルホスホルアミデート、またはチオノホスホルアミデート）、チオノアルキル−ホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、モルホリノ連結、通常の３’−５’連結を有するボラノホスフェート、ボラノホスフェートの２’−５’結合アナログ、またはヌクレオシド単位の隣接する対が３’−５’から５’−３’に、または２’−５’から５’−２’に連結された反転極性を有するボラノホスフェートが挙げられる。一部の実施形態では、改変ヌクレオシド間連結または骨格は、リン原子を欠く。リン原子を欠く改変ヌクレオシド間連結としては、限定されるものではないが、短鎖アルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキル糖間連結、または１つもしくは複数の短鎖ヘテロ原子もしくはヘテロ環式糖間連結が挙げられる。一部の実施形態では、改変ヌクレオシド間骨格としては、限定されるものではないが、シロキサン骨格、スルフィド骨格、スルホキシド骨格、スルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＨ２成分を有する他の骨格が挙げられる。
【０１２１】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、１、２、３、４、５、もしくは６個のホスホロチオエート連結を含有してもよく、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、もしくは６個のホスホロチオエート連結を含有してもよく、またはセンス鎖とアンチセンス鎖は両方とも独立に、１、２、３、４、５、もしくは６個のホスホロチオエート連結を含有してもよい。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、１、２、３、もしくは４個のホスホロチオエート連結を含有してもよく、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、１、２、３、もしくは４個のホスホロチオエート連結を含有してもよく、またはセンス鎖とアンチセンス鎖は両方とも独立に、１、２、３、もしくは４個のホスホロチオエート連結を含有してもよい。
【０１２２】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、少なくとも２個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含有する。一部の実施形態では、少なくとも２個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、センス鎖の３’末端から１〜３位のヌクレオチド間にある。一部の実施形態では、１つのホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、センス鎖の５’末端にあり、別のホスホロチオエート連結は、センス鎖の３’末端にある。一部の実施形態では、少なくとも２個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、センス鎖の５’末端から１〜３、２〜４、３〜５、４〜６、４〜５、または６〜８位のヌクレオチド間にある。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、４個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含有する。一部の実施形態では、４個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結は、アンチセンス鎖の５’末端から１〜３位のヌクレオチド間および５’末端から１９〜２１、２０〜２２、２１〜２３、２２〜２４、２３〜２５、または２４〜２６位のヌクレオチド間にある。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、センス鎖中に少なくとも２個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結およびアンチセンス鎖中に３個または４個のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含有する。
【０１２３】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、１つまたは複数の改変ヌクレオチドおよび１つまたは複数の改変ヌクレオシド間連結を含有する。一部の実施形態では、２’−改変ヌクレオシドは、改変ヌクレオシド間連結と組み合わされる。
【０１２４】
アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、表１に示されるアルファ−ＥＮａＣ配列の位置の、またはその近くのアルファ−ＥＮａＣ遺伝子を標的とする。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表１に開示される標的アルファ−ＥＮａＣの１９マーの配列と完全に、実質的に、または少なくとも部分的に相補的であるコアストレッチ配列を含む。
【表１】
2020526192.tif 000003
【０１２５】
一部の実施形態では、アルファ−ＥｎａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖（５’→３’）の１９位が、表１に開示される１９マーの標的配列の１位と塩基対を形成することができるアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、アルファ−ＥｎａＣ剤は、アンチセンス鎖（５’→３’）の１位が、表１に開示される１９マーの標的配列の１９位と塩基対を形成することができるアンチセンス鎖を含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、アルファ−ＥｎａＣ剤は、アンチセンス鎖（５’→３’）の２位が、表１に開示される１９マーの標的配列の１８位と塩基対を形成することができるアンチセンス鎖を含む。一部の実施形態では、アルファ−ＥｎａＣ剤は、アンチセンス鎖（５’→３’）の２位から１８位までが、表１に開示される１９マーの標的配列の１８位から２位までに位置するそれぞれの相補的塩基のそれぞれと塩基対を形成することができるアンチセンス鎖を含む。
【０１２７】
本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤について、アンチセンス鎖（５’末端→３’末端に）の１位のヌクレオチドは、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子と完璧に相補的であってもよく、またはアルファ−ＥＮａＣ遺伝子と非相補的であってもよい。一部の実施形態では、アンチセンス鎖（５’末端→３’末端に）の１位のヌクレオチドは、Ｕ、Ａ、またはｄＴである。一部の実施形態では、アンチセンス鎖（５’末端→３’末端に）の１位のヌクレオチドは、センス鎖とＡ：ＵまたはＵ：Ａ塩基対を形成する。
【０１２８】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２または表３中のアンチセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端に）２〜１８または２〜１９の配列を含む。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉのセンス鎖は、表２または表４中のセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端に）１〜１７、１〜１８、または２〜１８の配列を含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、（ｉ）表２または表３中のアンチセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端に）２〜１８または２〜１９の配列を含むアンチセンス鎖、および（ｉｉ）表２または表４中のセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端に）１〜１７または１〜１８の配列を含むセンス鎖からなる。
【０１３０】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、以下の表２に示される１９マーのコアヌクレオチド配列を含む。
【表２−１】
2020526192.tif 000004
【表２−２】
2020526192.tif 000005
【０１３１】
表２中のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、改変ヌクレオチドまたは非改変ヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態では、表２中のヌクレオチド配列のいずれかを含むか、またはそれからなるセンスおよびアンチセンス鎖配列を有するアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、全部または実質的に全部が改変ヌクレオチドである。
【０１３２】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２中のアンチセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、または３ヌクレオチドが異なる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表２中のセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、または３ヌクレオチドが異なる。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、表２中に開示された配列中に列挙されたそれぞれのＮは、ありとあらゆる核酸塩基（改変と非改変ヌクレオチドの両方に見出されるものを含む）から独立に選択することができる。一部の実施形態では、表２に開示された配列中に列挙されたＮヌクレオチドは、他方の鎖上の対応する位置のＮヌクレオチドと相補的である核酸塩基を有する。一部の実施形態では、表２に開示された配列中に列挙されたＮヌクレオチドは、他方の鎖上の対応する位置のＮヌクレオチドと相補的ではない核酸塩基を有する。一部の実施形態では、表２に開示された配列中に列挙されたＮヌクレオチドは、他方の鎖上の対応する位置のＮヌクレオチドと同じである核酸塩基を有する。一部の実施形態では、表２に開示された配列中に列挙されたＮヌクレオチドは、他方の鎖上の対応する位置のＮヌクレオチドとは異なる核酸塩基を有する。
【０１３４】
ある特定の改変アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンスおよびアンチセンス鎖を、表３および表４に提供する。改変アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖、ならびにその基礎となる非改変核酸塩基配列を、表３に提供する。改変アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびその基礎となる非改変核酸塩基配列を、表４に提供する。アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の形成において、表３および４、ならびに上記の表２に列挙される基礎となる塩基配列のそれぞれにおけるヌクレオチドのそれぞれは、改変ヌクレオチドであってもよい。
【０１３５】
本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖とセンス鎖とをアニーリングさせることによって形成される。２つの配列が、連続する１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドの配列にわたって少なくとも８５％相補的な領域を有するという条件で、表２または表４に列挙される配列を含有するセンス鎖を、表２または表３に列挙される配列を含有する任意のアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることができる。
【０１３６】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２または表３中の配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、表２、表３、または表４中の配列のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖の核酸塩基配列を有する二本鎖を含むか、またはそれからなる。
【０１３８】
改変ヌクレオチドを含有するアンチセンス鎖の例を、表３に提供する。改変ヌクレオチドを含有するセンス鎖の例を、表４に提供する。
【０１３９】
表３および４で使用される場合、改変ヌクレオチド、標的化基、および連結基を示すために、以下の表記を使用する：
Ａ＝アデノシン−３’−リン酸
Ｃ＝シチジン−３’−リン酸
Ｇ＝グアノシン−３’−リン酸
Ｕ＝ウリジン−３’−リン酸
Ｉ＝イノシン−３’−リン酸
ａ＝２’−Ｏ−メチルアデノシン−３’−リン酸
ａｓ＝２’−Ｏ−メチルアデノシン−３’−ホスホロチオエート
ｃ＝２’−Ｏ−メチルシチジン−３’−リン酸
ｃｓ＝２’−Ｏ−メチルシチジン−３’−ホスホロチオエート
ｇ＝２’−Ｏ−メチルグアノシン−３’−リン酸
ｇｓ＝２’−Ｏ−メチルグアノシン−３’−ホスホロチオエート
ｉ＝２’−Ｏ−メチルイノシン−３’−リン酸
ｉｓ＝２’−Ｏ−メチルイノシン−３’−ホスホロチオエート
ｔ＝２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン−３’−リン酸
ｔｓ＝２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン−３’−ホスホロチオエート
ｕ＝２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−リン酸
ｕｓ＝２’−Ｏ−メチルウリジン−３’−ホスホロチオエート
Ｎｆ＝任意の２’−フルオロ改変ヌクレオチド
Ａｆ＝２’−フルオロアデノシン−３’−リン酸
Ａｆｓ＝２’−フルオロアデノシン−３’−ホスホロチオエート
Ｃｆ＝２’−フルオロシチジン−３’−リン酸
Ｃｆｓ＝２’−フルオロシチジン−３’−ホスホロチオエート
Ｇｆ＝２’−フルオログアノシン−３’−リン酸
Ｇｆｓ＝２’−フルオログアノシン−３’−ホスホロチオエート
Ｔｆ＝２’−フルオロ−５’−メチルウリジン−３’−リン酸
Ｔｆｓ＝２’−フルオロ−５’−メチルウリジン−３’−ホスホロチオエート
Ｕｆ＝２’−フルオロウリジン−３’−リン酸
Ｕｆｓ＝２’−フルオロシチジン−３’−ホスホロチオエート
ｄＮ＝任意の２’−デオキシリボヌクレオチド
ｄＴ＝２’−デオキシチミジン−３’−リン酸
ＮＵＮＡ＝２’，３’−ｓｅｃｏヌクレオチド模倣体（アンロックド核酸塩基アナログ）−３’−リン酸
ＮＵＮＡｓ＝２’，３’−ｓｅｃｏヌクレオチド模倣体（アンロックド核酸塩基アナログ）−３’−ホスホロチオエート
ＡＵＮＡ＝２’，３’−ｓｅｃｏ−アデノシン−３’−リン酸
ＡＵＮＡｓ＝２’，３’−ｓｅｃｏ−アデノシン−３’−ホスホロチオエート
ＣＵＮＡ＝２’，３’−ｓｅｃｏ−シチジン−３’−リン酸
ＣＵＮＡｓ＝２’，３’−ｓｅｃｏ−シチジン−３’−ホスホロチオエート
ＧＵＮＡ＝２’，３’−ｓｅｃｏ−グアノシン−３’−リン酸
ＧＵＮＡｓ＝２’，３’−ｓｅｃｏ−グアノシン−３’−ホスホロチオエート
ＵＵＮＡ＝２’，３’−ｓｅｃｏ−ウリジン−３’−リン酸
ＵＵＮＡｓ＝２’，３’−ｓｅｃｏ−ウリジン−３’−ホスホロチオエート
ａ＿２Ｎ＝表７を参照されたい
ａ＿２Ｎｓ＝表７を参照されたい
ｐｕ＿２Ｎ＝表７を参照されたい
ｐｕ＿２Ｎｓ＝表７を参照されたい
Ｄ２ｕｓ＝表７を参照されたい
Ｎｐｕ＝表７を参照されたい
Ｎｕｓ＝表７を参照されたい
ＮＬＮＡ＝ロックドヌクレオチド
ＮｆＡＮＡ＝２’−Ｆ−アラビノヌクレオチド
ＮＭ＝２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）ヌクレオチド
ＡＭ＝２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）アデノシン−３’−リン酸
ＡＭｓ＝２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）アデノシン−３’−ホスホロチオエート
ＴＭ＝２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）チミジン−３’−リン酸
ＴＭｓ＝２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）チミジン−３’−ホスホロチオエート
Ｒ＝リビトール
（ｉｎｖｄＮ）＝任意の反転デオキシリボヌクレオチド（３’−３’連結ヌクレオチド）
（ｉｎｖＡｂ）＝反転（３’−３’連結）脱塩基デオキシリボヌクレオチド−５’−リン酸、表７を参照されたい
（ｉｎｖＡｂ）ｓ＝反転（３’−３’連結）脱塩基デオキシリボヌクレオチド−５’−ホスホロチオエート、表７を参照されたい
（ｉｎｖｎ）＝任意の反転２’−ＯＭｅヌクレオチド（３’−３’連結ヌクレオチド）
ｓ＝ホスホロチオエート連結
ｖｐｄＮ＝ビニルホスホネートデオキシリボヌクレオチド
（５Ｍｅ−Ｎｆ）＝５’−Ｍｅ，２’−フルオロヌクレオチド
ｃＰｒｐ＝シクロプロピルホスホネート、表７を参照されたい
ｅｐＴｃＰｒ＝表７を参照されたい
ｅｐＴＭ＝表７を参照されたい
ｓｐｕｓ＝表７を参照されたい
（Ｃｈｏｌ−ＴＥＧ）＝表７を参照されたい
（ＴＥＧ−ビオチン）＝表７を参照されたい
（ＰＥＧ−Ｃ３−ＳＳ）＝表７を参照されたい
（Ａｌｋ−ＳＳ−Ｃ６）＝表７を参照されたい
（Ｃ６−ＳＳ−Ａｌｋ）＝表７を参照されたい
（Ｃ６−ＳＳ−Ｃ６）＝表７を参照されたい
（６−ＳＳ−６）＝表７を参照されたい
（Ｃ６−ＳＳ−Ａｌｋ−Ｍｅ）＝表７を参照されたい
（ＮＨ２−Ｃ６）＝表７を参照されたい
（ＴｒｉＡｌｋ＃）＝表７を参照されたい
（ＴｒｉＡｌｋ＃）ｓ＝表７を参照されたい。
【０１４０】
当業者であれば、配列によって別途指摘されない限り（例えば、ホスホロチオエート連結「ｓ」によるなど）、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、ヌクレオチド単量体は５’−３’−ホスホジエステル結合によって相互に連結されていることを容易に理解する。さらに、当業者であれば、所与のオリゴヌクレオチド配列の３’末端の末端ヌクレオチドは、典型的には、ｅｘ  ｖｉｖｏでホスフェート部分の代わりに所与の単量体のそれぞれの３’位にヒドロキシル（−ＯＨ）基を有することを容易に理解する。さらに、当業者であれば容易に理解および認識するように、本明細書に示されるホスホロチオエート化学構造は、典型的には硫黄原子上のアニオンを示すが、本明細書に開示される発明は、全てのホスホロチオエート互変異性体および／またはジアステレオマー（例えば、硫黄原子が二重結合を有し、アニオンが酸素原子である場合）を包含する。本明細書で別途明示的に指摘されない限り、当業者のそのような理解は、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤およびアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の組成物を説明する時に使用される。
【０１４１】
本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤と共に使用される標的化基および連結基のある特定の例は、以下の表６に提供される化学構造に含まれる。それぞれのセンス鎖および／またはアンチセンス鎖は、本明細書に列挙される任意の標的化基または連結基、ならびに配列の５’および／または３’末端にコンジュゲートされた他の標的化または連結基を有してもよい。
【表３−１】
2020526192.tif 000006
【表３−２】
2020526192.tif 000007
【表３−３】
2020526192.tif 000008
【表４−１】
2020526192.tif 000009
【表４−２】
2020526192.tif 000010
【表４−３】
2020526192.tif 000011
【表４−４】
2020526192.tif 000012
【０１４２】
本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖とセンス鎖とをアニーリングさせることによって形成される。２つの配列が、連続する１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドの配列にわたって少なくとも８５％相補的な領域を有するという条件で、表２または表４に列挙される配列を含有するセンス鎖を、表２または表３に列挙される配列を含有する任意のアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることができる。
【０１４３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表３中のアンチセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、または３ヌクレオチドが異なる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表４中のセンス鎖配列のいずれかと０、１、２、または３ヌクレオチドが異なる。
【０１４４】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２または表３中の配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２または表３中の配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端に）１〜１７、２〜１７、１〜１８、２〜１８、１〜１９、２〜１９、１〜２０、２〜２０、１〜２１、２〜２１、１〜２２、２〜２２、１〜２３、２〜２３、１〜２４、または２〜２４の配列を含む。ある特定の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表３中の改変配列のいずれか１つの改変配列を含む、またはそれからなる。
【０１４５】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表２または表４中の配列のいずれかのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表２または表４中の配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端に）１〜１７、２〜１７、３〜１７、４〜１７、１〜１８、２〜１８、３〜１８、４〜１８、１〜１９、２〜１９、３〜１９、４〜１９、１〜２０、２〜２０、３〜２０、４〜２０、１〜２１、２〜２１、３〜２１、４〜２１、１〜２２、２〜２２、３〜２２、４〜２２、１〜２３、２〜２３、３〜２３、４〜２３、１〜２４、２〜２４、３〜２４、または４〜２４の配列を含む。ある特定の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、表３中の改変配列のいずれか１つの改変配列を含む、またはそれからなる。
【０１４６】
本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤について、アンチセンス鎖（５’末端→３’末端に）の１位のヌクレオチドは、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子と完璧に相補的であってもよく、またはアルファ−ＥＮａＣ遺伝子と非相補的であってもよい。一部の実施形態では、アンチセンス鎖（５’末端→３’末端に）の１位のヌクレオチドは、Ｕ、Ａ、もしくはｄＴ（またはＵ、Ａ、もしくはｄＴの改変バージョン）である。一部の実施形態では、アンチセンス鎖（５’末端→３’末端に）の１位のヌクレオチドは、センス鎖とＡ：ＵまたはＵ：Ａ塩基対を形成する。
【０１４７】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖は、表２または表３中のアンチセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端に）２〜１８または２〜１９の配列を含む。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉのセンス鎖は、表２または表４中のセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端に）１〜１７または１〜１８の配列を含む。
【０１４８】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、（ｉ）表２または表３中のアンチセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端に）２〜１８または２〜１９の配列を含むアンチセンス鎖、および（ｉｉ）表２または表４中のセンス鎖配列のいずれかのヌクレオチド（５’末端→３’末端に）１〜１７または１〜１８の配列を含むセンス鎖を含む。
【０１４９】
２つの配列が、連続する１６、１７、１８、１９、２０、または２１ヌクレオチドの配列にわたって少なくとも８５％相補的な領域を有するという条件で、表２または表４に列挙される配列を含有するセンス鎖を、表２または表３に列挙される配列を含有する任意のアンチセンス鎖にハイブリダイズさせることができる。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、表４中の改変配列のいずれかの改変配列からなるセンス鎖、および表３中の改変配列のいずれかの改変配列からなるアンチセンス鎖を有する。ある特定の代表的な配列対を、表５に示される二本鎖ＩＤ番号によって例示する。
【０１５０】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二本鎖ＩＤ番号のいずれか１つによって表される二本鎖を含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二本鎖ＩＤ番号のいずれかからなる。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖ヌクレオチド配列ならびに標的化基、連結基、および／または他の非ヌクレオチド基を含み、ここで、標的化基、連結基、および／または他の非ヌクレオチド基は、センス鎖またはアンチセンス鎖に共有結合により連結（すなわち、コンジュゲート）される。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖改変ヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、本明細書に提示される二本鎖ＩＤ番号のいずれかのセンス鎖およびアンチセンス鎖改変ヌクレオチド配列ならびに標的化基、連結基、および／または他の非ヌクレオチド基を含み、ここで、標的化基、連結基、および／または他の非ヌクレオチド基は、センス鎖またはアンチセンス鎖に共有結合により連結されている。
【０１５１】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、表２または表５のアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかのヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、標的化基をさらに含む。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、表２または表５のアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかのヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、１つまたは複数のαｖβ６インテグリン標的化リガンドをさらに含む。
【０１５２】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、表２または表５のアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかのヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、インテグリン標的化リガンドである標的化基をさらに含む。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、表２または表５のアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかのヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、１つもしくは複数のαｖβ６インテグリン標的化リガンドまたはαｖβ６インテグリン標的化リガンドのクラスター（例えば、三座αｖβ６インテグリン標的化リガンド）をさらに含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は表５のアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかの改変ヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は表５のアンチセンス鎖／センス鎖二本鎖のいずれかの改変ヌクレオチド配列を有するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含み、インテグリン標的化リガンドをさらに含む。
【０１５５】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、表５の二本鎖のいずれかを含むか、それからなるか、または本質的にそれからなる。
【表５−１】
2020526192.tif 000013
【表５−２】
2020526192.tif 000014
【０１５６】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、塩、混合塩、または遊離酸として調製または提供される。本明細書に記載のＲＮＡｉ剤は、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子を発現する細胞への送達の際に、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで１つまたは複数のアルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害またはノックダウンする。
【０１５７】
標的化基、連結基、薬物動態（ＰＫ）モジュレーター、および送達ビヒクル
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、限定されるものではないが、標的化基、連結基、薬物動態（ＰＫ）モジュレーター、送達ポリマー、または送達ビヒクルを含む１つまたは複数の非ヌクレオチド基を含有するか、またはそれにコンジュゲートされている。非ヌクレオチド基は、ＲＮＡｉ剤の標的化、送達、または結合を増強することができる。標的化基および連結基の例を、表６に提供する。非ヌクレオチド基は、センス鎖および／またはアンチセンス鎖のいずれかの３’および／または５’末端に共有結合により連結されていてもよい。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、センス鎖の３’および／または５’末端に連結された非ヌクレオチド基を含有する。一部の実施形態では、非ヌクレオチド基は、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に連結されている。非ヌクレオチド基は、リンカー／連結基を介してＲＮＡｉ剤に直接的または間接的に連結されていてもよい。一部の実施形態では、非ヌクレオチド基は、不安定、切断性、または可逆性結合またはリンカーを介してＲＮＡｉ剤に連結されている。
【０１５８】
一部の実施形態では、非ヌクレオチド基は、それが結合されているＲＮＡｉ剤またはコンジュゲートの薬物動態または生体分布特性を増強して、コンジュゲートの細胞または組織特異的分布および細胞特異的取込みを改善する。一部の実施形態では、非ヌクレオチド基は、ＲＮＡｉ剤のエンドサイトーシスを増強する。
【０１５９】
標的化基または標的化部分は、それが結合されているコンジュゲートまたはＲＮＡｉ剤の薬物動態または生体分布特性を増強して、コンジュゲートまたはＲＮＡｉ剤の細胞特異的（一部の場合、臓器特異的を含む）分布および細胞特異的（または臓器特異的）取込みを改善する。標的化基は、それが指向する標的について一価、二価、三価、四価であり得るか、またはより高い価数を有してもよい。代表的な標的化基としては、限定されるものではないが、細胞表面分子に対する親和性を有する化合物、細胞受容体リガンド、ハプテン、抗体、モノクローナル抗体、抗体断片、および細胞表面分子に対する親和性を有する抗体模倣体が挙げられる。一部の実施形態では、標的化基は、ＰＥＧリンカー、または一部の例では、リンカーとして働くことができる、１つ、２つ、もしくは３つの脱塩基残基および／もしくはリビトール（脱塩基リボース）残基などのリンカーを使用してＲＮＡｉ剤に連結されている。一部の実施形態では、標的化基は、インテグリン標的化リガンドを含む。
【０１６０】
５’末端および／または３’末端に、アミノ基（本明細書ではアミンとも呼ばれる）などの反応基を有する、本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を合成することができる。その後、反応基を使用して、当該分野で典型的な方法を使用して標的化部分に結合することができる。
【０１６１】
例えば、一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端にＮＨ２−Ｃ６基を有する本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を合成する。次いで、末端アミノ基を反応させて、例えば、αｖβ６インテグリン標的化リガンドを含む基とのコンジュゲートを形成させることができる。一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に１つまたは複数のアルキン基を有する本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を合成する。次いで、末端アルキン基を反応させて、例えば、αｖβ６インテグリン標的化リガンドを含む基とのコンジュゲートを形成させることができる。
【０１６２】
一部の実施形態では、標的化基は、インテグリン標的化リガンドを含む。一部の実施形態では、インテグリン標的化リガンドは、αｖβ６インテグリン標的化リガンドである。αｖβ６インテグリン標的化リガンドの使用は、そのそれぞれの表面上にαｖβ６を有する細胞への細胞特異的標的化を容易にし、インテグリン標的化リガンドの結合は、それが連結されているＲＮＡｉ剤などの治療剤の、肺上皮細胞および腎上皮細胞を含む上皮細胞などの細胞への進入を容易にすることができる。インテグリン標的化リガンドは、単量体もしくは一価（例えば、単一のインテグリン標的化部分を有する）または多量体もしくは多価（例えば、複数のインテグリン標的化部分を有する）であってもよい。標的化基を、当該分野で公知の方法を使用して、ＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの３’および／または５’末端に結合することができる。αｖβ６インテグリン標的化リガンドなどの標的化基の調製は、例えば、国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／０８５４１５号ならびに米国仮特許出願第６２／５８０，３９８号および第６２／６４６，７３９号に記載されており、それぞれの内容はその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１６３】
本開示の実施形態は、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、肺上皮細胞にｉｎ  ｖｉｖｏで送達するための医薬組成物を含む。そのような医薬組成物は、例えば、インテグリン標的化リガンドを含む標的化基にコンジュゲートされたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含んでもよい。一部の実施形態では、インテグリン標的化リガンドは、αｖβ６インテグリンリガンドからなる。
【０１６４】
一部の実施形態では、連結基を、ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートする。連結基は、標的化基、薬物動態モジュレーター、送達ポリマー、または送達ビヒクルへの薬剤の共有結合による連結を容易にする。連結基を、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖の３’および／または５’末端に連結することができる。一部の実施形態では、連結基を、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖に連結する。一部の実施形態では、連結基を、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’または３’末端にコンジュゲートする。一部の実施形態では、連結基を、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端にコンジュゲートする。連結基の例としては、限定されるものではないが、Ａｌｋ−ＳＭＰＴ−Ｃ６、Ａｌｋ−ＳＳ−Ｃ６、ＤＢＣＯ−ＴＥＧ、Ｍｅ−Ａｌｋ−ＳＳ−Ｃ６、およびＣ６−ＳＳ−Ａｌｋ−Ｍｅ、第一級アミンおよびアルキン、アルキル基、脱塩基残基／ヌクレオチド、アミノ酸、トリ−アルキン官能化基、リビトール、ならびに／またはＰＥＧ基などの反応基が挙げられる。
【０１６５】
リンカーまたは連結基は、目的の一方の化学基（ＲＮＡｉ剤など）またはセグメントを、目的の別の化学基（標的化基、薬物動態モジュレーター、または送達ポリマーなど）またはセグメントに、１つまたは複数の共有結合を介して連結する２個の原子間の接続である。不安定な連結は、不安定な結合を含有する。連結は、必要に応じて、繋がれている２つの原子間の距離を増加させるスペーサーを含んでもよい。スペーサーは、連結に可撓性および／または長さをさらに加えることができる。スペーサーとしては、限定されるものではないが、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基、アラルキル基、アラルケニル基、およびアラルキニル基が挙げられ、それぞれ、１つまたは複数のヘテロ原子、複素環、アミノ酸、ヌクレオチド、およびサッカリドを含有してもよい。スペーサー基は、当該分野で周知であり、前記一覧は、記載の範囲を限定することを意図しない。
【０１６６】
一部の実施形態では、標的化基を、さらなるリンカーを使用することなく、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤に連結する。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤への連結を容易にするために容易に存在するリンカーを有する標的化基が設計される。一部の実施形態では、２つまたはそれより多いＲＮＡｉ剤が組成物中に含まれる場合、２つまたはそれより多いＲＮＡｉ剤を、同じリンカーを使用して、そのそれぞれの標的化基に連結することができる。一部の実施形態では、２つまたはそれより多いＲＮＡｉ剤が組成物中に含まれる場合、２つまたはそれより多いＲＮＡｉ剤を、異なるリンカーを使用して、そのそれぞれの標的化基に連結する。
【０１６７】
表２、３、および４に列挙されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ヌクレオチド配列のいずれかは、改変されていようと、改変されていなかろうと、３’および／もしくは５’標的化基、連結基、および／または薬物動態モジュレーターを含有してもよい。３’もしくは５’標的化基、連結基、または薬物動態モジュレーターを含有する、表３および４に列挙される、またはそうでなければ本明細書に記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤配列のいずれかは、あるいは、３’または５’標的化基も、連結基も、薬物動態モジュレーターも含有しないか、または限定されるものではないが、表６に示されるものを含む、異なる３’もしくは５’標的化基、連結基、または薬物動態モジュレーターを含有してもよい。表５に列挙されたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤二本鎖のいずれかは、改変されていようと、改変されていなかろうと、限定されるものではないが、表６に示されるものを含む標的化基または連結基をさらに含んでもよく、標的化基または連結基を、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤二本鎖のセンス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかの３’または５’末端に結合することができる。
【０１６８】
ある特定の標的化基および連結基の例を、表６に提供する。
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【表６−４】
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【表６−５】
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【表６−６】
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【表６−７】
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【表６−８】
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【表６−９】
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【表６−１０】
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【表６−１１】
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【表６−１２】
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【表６−１３】
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【表６−１４】
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【０１６９】
あるいは、当該分野で公知の他の連結基を使用することができる。
【０１７０】
一部の実施形態では、送達ビヒクルを使用して、ＲＮＡｉ剤を細胞または組織に送達することができる。送達ビヒクルは、ＲＮＡｉ剤の細胞または組織への送達を改善する化合物である。送達ビヒクルは、限定されるものではないが、両親媒性ポリマー、膜活性ポリマー、ペプチド、メリチンペプチド、メリチン様ペプチド（ＭＬＰ）、脂質、可逆的に改変されたポリマーもしくはペプチド、または可逆的に改変された膜活性ポリアミンなどのポリマーを含んでもよく、またはそれからなってもよい。
【０１７１】
一部の実施形態では、ＲＮＡｉ剤を、脂質、ナノ粒子、ポリマー、リポソーム、ミセル、ＤＰＣまたは当該分野で利用可能な他の送達系と組み合わせることができる。ＲＮＡｉ剤を、標的化基、脂質（限定されるものではないが、コレステロールおよびコレステリル誘導体を含む）、ナノ粒子、ポリマー、リポソーム、ミセル、ＤＰＣ（例えば、それぞれ、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０００／０５３７２２、ＷＯ２００８／０２２３０９、ＷＯ２０１１／１０４１６９、およびＷＯ２０１２／０８３１８５、ＷＯ２０１３／０３２８２９、ＷＯ２０１３／１５８１４１を参照されたい）、または当該分野で利用可能な他の送達系に化学的にコンジュゲートすることもできる。
【０１７２】
医薬組成物および製剤
本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、医薬組成物または製剤（本明細書では「医薬」とも呼ばれる）として調製することができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む。これらの医薬組成物は、標的細胞、細胞群、組織、または生物中でのアルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡの発現の阻害において特に有用である。医薬組成物を使用して、標的ｍＲＮＡのレベルの低下、または標的遺伝子の発現の阻害から利益を得る疾患、障害、または状態を有する被験体を処置することができる。医薬組成物を使用して、標的ｍＲＮＡのレベルの低下、または標的遺伝子の発現の阻害から利益を得る疾患または障害を発症するリスクがある被験体を処置することができる。一実施形態では、方法は、本明細書に記載の標的化リガンドに連結されたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、処置しようとする被験体に投与するステップを含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤（ビヒクル、担体、希釈剤、および／または送達ポリマーを含む）を、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物に添加することによって、ヒトを含む被験体へのｉｎ  ｖｉｖｏでの送達にとって好適な医薬製剤または医薬を形成する。
【０１７３】
アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物および本明細書に開示される方法は、被験体に、治療有効量の本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を投与することによって被験体中のアルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡの発現を阻害することによる場合を含め、細胞、細胞群、細胞群、組織、臓器、または被験体における標的ｍＲＮＡのレベルを低下させる。一部の実施形態では、被験体は、ＥＮａＣ発現によって少なくとも一部媒介される疾患または障害を有すると以前に同定または診断されたことがある。一部の実施形態では、被験体は、１つまたは複数の細胞または組織におけるＥＮａＣ活性が増強していると以前に同定または診断されたことがある。一部の実施形態では、被験体は、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、非嚢胞性線維症性気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、気道感染症、原発性線毛運動障害、および肺癌嚢胞性線維症などの１つまたは複数の呼吸器疾患を有すると以前に診断されたことがある。一部の実施形態では、被験体は、ドライアイなどの１つまたは複数の眼疾患を有すると以前に診断されたことがある。一部の実施形態では、被験体は、ＥＮａＣ活性の増強と関連するか、またはそれにより引き起こされる１つまたは複数の呼吸器疾患と関連する症状に罹患したことがある。
【０１７４】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む記載される医薬組成物は、ＥＮａＣの発現の阻害から利益を得る被験体における臨床所見を処置または管理するために使用される。一部の実施形態では、治療または予防有効量の医薬組成物の１つまたは複数を、そのような処置を必要とする被験体に投与する。一部の実施形態では、開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のいずれかの投与を使用して、被験体における疾患の症状の数、重症度、および／または頻度を減少させることができる。
【０１７５】
アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む記載される医薬組成物を使用して、アルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡの発現の低下または阻害から利益を得る疾患または障害を有する被験体における少なくとも１つの症状を処置することができる。一部の実施形態では、被験体に、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む治療有効量の１つまたは複数の医薬組成物を投与することによって症状を処置する。他の実施形態では、被験体に、予防有効量の１つまたは複数のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を投与することによって、少なくとも１つの症状を防止または阻害する。
【０１７６】
投与経路は、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤が身体と接触する経路である。一般に、哺乳動物の処置のために薬物、オリゴヌクレオチド、および核酸を投与する方法は、当該分野で周知であり、本明細書に記載の組成物の投与に適用することができる。本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、特定の経路に対して適切に調整された調製物中で、任意の好適な経路によって投与することができる。かくして、一部の実施形態では、本明細書に記載される医薬組成物は、吸入、鼻内投与、気管内投与、または口腔咽頭吸引投与によって投与される。一部の実施形態では、医薬組成物を、注射によって、例えば、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、関節内、もしくは腹腔内的に、または局所的に投与することができる。
【０１７７】
本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む医薬組成物を、当該分野で公知のオリゴヌクレオチド送達技術を使用して、細胞、細胞群、組織、または被験体に送達することができる。一般に、核酸分子を送達するための当該分野で認識される任意の好適な方法（ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで）を、本明細書に記載の組成物と共に使用するために適合させることができる。例えば、送達は、局部投与（例えば、直接的注射、埋込み、もしくは局所投与）、全身投与、または頭蓋内（例えば、脳室内、実質内および髄腔内）、筋肉内、経皮、気道（エアロゾル）、経鼻、経口、直腸、もしくは局所（頬および舌下を含む）投与を含む、皮下、静脈内、腹腔内、もしくは非経口経路によるものであってもよい。一部の実施形態では、組成物は、吸入、鼻内投与、口腔咽頭吸引投与、または気管内投与によって投与される。例えば、一部の実施形態では、本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、吸入による（例えば、定量吸入器などの吸入デバイス、またはジェットもしくは振動メッシュネブライザーなどのネブライザー、またはソフトミスト吸入器による）投与が特に好適であり、有利である、肺上皮におけるアルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現を阻害することが望ましい。
【０１７８】
一部の実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む。本明細書に記載の医薬組成物は、被験体への投与のために製剤化される。
【０１７９】
本明細書で使用される場合、医薬組成物または医薬は、薬理学的に有効な量の記載される治療化合物の少なくとも１つ、および１つまたは複数の薬学的に許容される賦形剤を含む。薬学的に許容される賦形剤（賦形剤）は、薬物送達系に意図的に含まれる薬学的有効成分（ＡＰＩ、治療生成物、例えば、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤）以外の物質である。賦形剤は、意図される投薬量で治療効果を発揮しないか、または発揮することを意図されない。賦形剤は、ａ）製造中の薬物送達系の加工処理を補助する、ｂ）ＡＰＩの安定性、バイオアベイラビリティ、もしくは患者許容性を保護する、支援する、もしくは増強する、ｃ）生成物の同定を援助する、および／またはｄ）保存もしくは使用中のＡＰＩの送達の全体的な安全性、有効性の任意の他の属性を増強するように作用することができる。薬学的に許容される賦形剤は、不活性物質であっても、または不活性物質でなくてもよい。
【０１８０】
賦形剤としては、限定されるものではないが、吸収促進剤、接着防止剤、消泡剤、酸化防止剤、結合剤、緩衝化剤、担体、コーティング剤、着色料、送達増強剤、送達ポリマー、洗剤、デキストラン、デキストロース、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、増量剤（ｅｘｔｅｎｄｅｒ）、充填剤、矯味矯臭剤、流動促進剤（ｇｌｉｄａｎｔ）、保湿剤、滑沢剤、油、ポリマー、保存剤、食塩水、塩、溶媒、糖、界面活性剤、懸濁化剤、持続放出マトリクス、甘味料、増粘剤、等張剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ａｇｅｎｔ）、ビヒクル、撥水剤、および湿潤剤が挙げられる。
【０１８１】
注入可能な使用にとって好適な医薬組成物としては、滅菌水性溶液（水溶性の場合）または分散物および滅菌注射溶液または分散物の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。静脈内投与については、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、ＮＪ）またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。それは、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保存するべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、ならびにその好適な混合物を含有する、溶媒または分散媒であってもよい。例えば、レシチンなどのコーティングの使用により、分散物の場合、必要とされる粒径の維持により、および界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、および塩化ナトリウムを組成物中に含有させることが好ましい。組成物中に、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含有させることによって、注射可能な組成物の長期的吸収をもたらすことができる。
【０１８２】
必要に応じて、上に列挙された成分の１つまたは組合せと共に、適切な溶媒中に、必要な量の活性化合物を組み込んだ後、滅菌濾過を行うことによって、滅菌注射溶液を調製することができる。一般に、分散物は、活性化合物を、基本分散媒および上に列挙されたものに由来する必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合、調製方法は、活性成分と、その予め滅菌濾過された溶液に由来する任意のさらなる所望の成分との粉末を生成する、真空乾燥および凍結乾燥を含む。
【０１８３】
関節内投与にとって好適な製剤は、微結晶形態、例えば、水性微結晶性懸濁液の形態にあってもよい薬物の滅菌水性調製物の形態にあってもよい。リポソーム製剤または生分解性ポリマー系を使用して、関節内投与と眼科的投与の両方のための薬物を提供することもできる。
【０１８４】
吸入投与にとって好適な製剤を、適切な溶媒中に所望の量の活性化合物を組み込んだ後、滅菌濾過を行うことによって調製することができる。一般に、吸入投与のための製剤は、生理的ｐＨでの滅菌溶液であり、低粘度（＜５ｃＰ）を有する。塩を製剤に添加して、張度を平衡化することができる。一部の場合、界面活性剤または共溶媒を添加して、活性化合物の溶解度を増大させ、エアロゾル特性を改善することができる。一部の場合、賦形剤を添加して粘度を制御して、噴霧される液滴のサイズおよび分布を確保することができる。
【０１８５】
埋込み物およびマイクロカプセル化送達系を含む、制御放出製剤などの、身体からの迅速な除去に対して化合物を保護する担体を用いて、活性化合物を調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸などの、生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。そのような製剤の調製のための方法は、当業者には明らかであろう。リポソーム懸濁液を、薬学的に許容される担体として使用することもできる。これらを、当業者には公知の、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載の方法に従って調製することができる。
【０１８６】
アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、投与の容易性および投薬量の均一性のために単位剤形で組成物に製剤化することができる。単位剤形とは、処置しようとする被験体のための単一の投薬量として適した物理的に個別の単位を指す；それぞれの単位は、必要とされる薬学的担体と関連する所望の治療効果をもたらすように計算された所定量の活性化合物を含有する。本開示の単位剤形のための仕様は、活性化合物の独特の特徴および達成しようとする治療効果、ならびに個体の処置のためのそのような活性化合物を配合する当該分野において固有の制限によって決定され、それらに直接依存する。
【０１８７】
医薬組成物は、医薬組成物中に一般的に見出される他の追加成分を含有してもよい。そのような追加成分としては、限定されるものではないが、かゆみ止め、収斂剤、局部麻酔剤、または抗炎症剤（例えば、抗ヒスタミン剤、ジフェンヒドラミンなど）が挙げられる。また、本明細書で定義されるＲＮＡｉ剤を発現する、または含む細胞、組織、または単離された臓器を、「医薬組成物」として使用することができることも想定される。本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療有効量」または単に「有効量」とは、薬理学的、治療的、または防止的結果をもたらすＲＮＡｉ剤の量を指す。
【０１８８】
一部の実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤を投与するステップに加えて、第２の治療剤または処置を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第２の治療剤は、別のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤（例えば、アルファ−ＥＮａＣ標的内の異なる配列を標的とするアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤）である。他の実施形態では、第２の治療剤は、低分子薬物、抗体、抗体断片、および／またはアプタマーであってもよい。
【０１８９】
一般に、本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の有効量は、約０．０００１〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重／日、例えば、約０．００１〜約３ｍｇ／ｋｇ体重／日の範囲にある。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の有効量は、約０．００１〜約０．５００ｍｇ／ｋｇ体重／用量の範囲にある。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の有効量は、約０．００１〜約０．１００ｍｇ／ｋｇ体重／用量の範囲にある。一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の有効量は、約０．００１〜約０．０５０ｍｇ／ｋｇ体重／用量の範囲にある。投与される量はまた、患者の全体的な健康状態、送達される化合物の相対的な生物学的効能、薬物の製剤、製剤中の賦形剤の存在および種類、ならびに投与経路などの変数に依存する可能性もある。また、投与される初期投薬量を、所望の血中レベルもしくは組織レベルを迅速に達成するために、上の上限レベルを超えて増加させてもよく、または初期投薬量は最適投薬量よりも小さくてもよい。
【０１９０】
疾患の処置のため、または疾患の処置のための医薬もしくは組成物の形成のために、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む本明細書に記載の医薬組成物を、賦形剤と、または限定されるものではないが、第２の、もしくは他のＲＮＡｉ剤、低分子薬物、抗体、抗体断片、ペプチド、および／またはアプタマーを含む、第２の治療剤もしくは処置と組み合わせることができる。
【０１９１】
薬学的に許容される賦形剤またはアジュバントに添加される場合、記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を、キット、容器、パック、またはディスペンサー中に包装することができる。本明細書に記載の医薬組成物を、乾燥粉末もしくはエアロゾル吸入器、他の定量吸入器、ネブライザー、予め充填されたシリンジ、またはバイアル中に包装することができる。
【０１９２】
処置の方法および発現の阻害の方法
本明細書に開示されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を使用して、ＲＮＡｉ剤の投与から利益を得る疾患または障害を有する被験体（例えば、ヒトまたは他の哺乳動物）を処置することができる。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤を使用して、アルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡの発現の減少および／または阻害から利益を得る被験体（例えば、ヒト）を処置することができる。
【０１９３】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤を使用して、被験体が、限定されるものではないが、例えば、嚢胞性線維症、慢性気管支炎、非嚢胞性線維症性気管支拡張症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、気道感染症、原発性線毛運動障害、および／もしくは肺癌嚢胞性線維症ならびに／またはドライアイを含む、ＥＮａＣチャネル活性の低下から利益を得る疾患または障害を有する被験体（例えば、ヒト）を処置することができる。被験体の処置は、治療的および／または予防的処置を含んでもよい。被験体は、治療有効量の本明細書に記載の任意の１つまたは複数のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を投与される。被験体は、ヒト、患者、またはヒト患者であってもよい。被験体は、成人、青年、小児、または幼児であってもよい。本明細書に記載の医薬組成物の投与は、ヒトまたは動物に対するものであってもよい。
【０１９４】
ＥＮａＣ活性の増加は、気道表面の液体乾燥を促進し、粘膜せん毛クリアランスを損ねることが知られている。一部の実施形態では、記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、被験体における、ＥＮａＣ活性レベルによって少なくとも一部媒介される少なくとも１つの症状を処置するために使用される。被験体は、治療有効量の記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の任意の１つまたは複数を投与される。一部の実施形態では、被験体に、予防有効量の記載されるＲＮＡｉ剤の任意の１つまたは複数を投与することによって、少なくとも１つの症状を防止または阻害することにより被験体を処置する。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、本開示は、それを必要とする患者において、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子発現によって少なくとも一部媒介される疾患、障害、状態、または病的状態の処置のための方法であって、患者に、本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のいずれかを投与するステップを含む、方法を提供する。
【０１９６】
一部の実施形態では、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、被験体における臨床所見または病的状態を処置または管理するために使用され、ここで、臨床所見または病的状態は、ＥＮａＣ発現によって少なくとも一部媒介される。被験体は、治療有効量の本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤またはアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含有する組成物の１つまたは複数を投与される。一実施形態では、方法は、本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を含む組成物を、処置しようとする被験体に投与するステップを含む。
【０１９７】
一部の実施形態では、記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤が投与される被験体のある特定の上皮細胞中でのアルファ−ＥＮａＣ遺伝子の遺伝子発現レベルおよび／またはｍＲＮＡレベルは、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を投与される前の被験体またはアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を受けていない被験体と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％より多く低下する。一部の実施形態では、記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤が投与される被験体のある特定の上皮細胞中でのＥＮａＣレベルまたはＥＮａＣチャネル活性レベルは、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を投与される前の被験体またはアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を受けていない被験体と比較して、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９％より多く低下する。被験体中の遺伝子発現レベル、タンパク質レベル、および／またはｍＲＮＡレベルを、被験体の細胞、細胞群、および／または組織において低下させることができる。一部の実施形態では、記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤が投与された被験体のある特定の上皮細胞中でのアルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡレベルは、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を投与される前の被験体またはアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を受けていない被験体と比較して、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％低下する。一部の実施形態では、記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤が投与された被験体のある特定の上皮細胞中でのＥＮａＣヘテロ三量体タンパク質複合体のレベルは、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を投与される前の被験体またはアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を受けていない被験体と比較して、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％低下する。被験体中のＥＮａＣレベルを、被験体の細胞、細胞群、組織、血液、および／または他の体液中で低下させることができる。例えば、一部の実施形態では、記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤が投与された被験体の肺上皮細胞中でのアルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡおよび／またはＥＮａＣヘテロ三量体タンパク質複合体のレベルは、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を投与される前の被験体またはアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を受けていない被験体と比較して、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％低下する。一部の実施形態では、記載されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤が投与された被験体の気道上皮細胞などの肺上皮細胞のサブセット中でのアルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡおよび／もしくはＥＮ���Ｃヘテロ三量体タンパク質複合体のレベルならびに／またはＥＮａＣチャネル活性レベルは、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を投与される前の被験体またはアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を受けていない被験体と比較して、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％低下する。
【０１９８】
遺伝子発現、ｍＲＮＡ、およびタンパク質レベルの低下を、当該分野で公知の任意の方法によって評価することができる。アルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡレベル、ＥＮａＣチャネル活性レベル、および／またはＥＮａＣヘテロ三量体タンパク質複合体レベルの低下または減少は、本明細書では、集合的に、アルファ−ＥＮａＣの低下もしくは減少またはアルファ−ＥＮａＣ遺伝子の発現の阻害もしくは低下と称する。本明細書に記載の実施例は、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子発現の阻害を評価するための公知の方法を例示する。
【０１９９】
細胞、組織、臓器、および非ヒト生物
本明細書に記載のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の少なくとも１つを含む細胞、組織、臓器、および非ヒト生物が企図される。細胞、組織、臓器、または非ヒト生物は、ＲＮＡｉ剤を細胞、組織、臓器、または非ヒト生物に送達することによって作製される。
【０２００】
上記に提供された実施形態および項目を、ここで、以下の非限定的な実施例を用いて例示する。
【実施例】
【０２０１】
（実施例１）
アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の合成
表５に示されたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤二本鎖を、以下に従って合成した。
【０２０２】
Ａ．合成。アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のセンスおよびアンチセンス鎖を、オリゴヌクレオチド合成において使用される固相上でホスホルアミダイト技術に従って合成した。規模に応じて、ＭｅｒＭａｄｅ９６Ｅ（登録商標）（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）、ＭｅｒＭａｄｅ１２（登録商標）（Ｂｉｏａｕｔｏｍａｔｉｏｎ）、またはＯＰ  Ｐｉｌｏｔ  １００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した。合成を、制御細孔ガラス（ＣＰＧ、５００Åまたは６００Å、Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｓｔｏｎ、ＰＡ、ＵＳＡから取得）製の固体支持体上で実施した。全てのＲＮＡおよび２’−改変ＲＮＡホスホルアミダイトを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ、ＵＳＡ）から購入した。具体的には、使用した２’−Ｏ−メチルホスホルアミダイトは、以下のもの：（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ６−（ベンゾイル）−２’−Ｏ−メチル−アデノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホルアミダイト、５’−Ｏ−ジメトキシ−トリチル−Ｎ４−（アセチル）−２’−Ｏ−メチル−シチジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−アミノ）ホスホルアミダイト、（５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ２−（イソブチリル）−２’−Ｏ−メチル−グアノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホルアミダイト、および５’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−ウリジン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホルアミダイトを含んでいた。２’−デオキシ−２’−フルオロ−ホスホルアミダイトは、２’−Ｏ−メチルＲＮＡアミダイトと同じ保護基を担持していた。５’−ジメトキシトリチル−２’−Ｏ−メチル−イノシン−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホルアミダイトを、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（Ｖｉｒｇｉｎｉａ）から購入した。反転脱塩基（３’−Ｏ−ジメトキシトリチル−２’−デオキシリボース−５’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）ホスホルアミダイトを、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）から購入した。以下のＵＮＡホスホルアミダイトを使用した：５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ６−（ベンゾイル）−２’，３’−ｓｅｃｏ−アデノシン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−アセチル−２’，３’−ｓｅｃｏ−シトシン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト、５’−（４，４’−ジメトキシトリチル）−Ｎ−イソブチリル−２’，３’−ｓｅｃｏ−グアノシン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト、および５’−（４，４’−ジメトキシ−トリチル）−２’，３’−ｓｅｃｏ−ウリジン、２’−ベンゾイル−３’−［（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト。ＴＦＡアミノ結合ホスホル��ミダイトも、商業的に購入した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。
【０２０３】
トリ−アルキン含有ホスホルアミダイトを、無水ジクロロメタンまたは無水アセトニトリル（５０ｍＭ）に溶解したが、他のアミダイトは全て、無水アセトニトリル（５０ｍＭ）に溶解し、分子ふるい（３Å）を添加した。５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ、アセトニトリル中の２５０ｍＭ）または５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中の２５０ｍＭ）を、アクチベーター溶液として使用した。カップリング時間は、１０分（ＲＮＡ）、９０秒（２’Ｏ−Ｍｅ）、および６０秒（２’Ｆ）であった。ホスホロチオエート連結を導入するために、無水アセトニトリル中の３−フェニル１，２，４−ジチアゾリン−５−オン（ＰＯＳ、ＰｏｌｙＯｒｇ，Ｉｎｃ．、Ｌｅｏｍｉｎｓｔｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡから取得）の１００ｍＭ溶液を用いた。
【０２０４】
あるいは、トリ−アルキン部分を、合成後に導入した（以下のセクションＥを参照されたい）。この経路については、センス鎖を、第一級アミンを含む５’および／または３’末端ヌクレオチドを用いて官能化した。ＴＦＡアミノ結合ホスホルアミダイトを、無水アセトニトリル（５０ｍＭ）中に溶解し、分子ふるい（３Å）を添加した。５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＢＴＴ、アセトニトリル中の２５０ｍＭ）または５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール（ＥＴＴ、アセトニトリル中の２５０ｍＭ）を、アクチベーター溶液として使用した。カップリング時間は、１０分（ＲＮＡ）、９０秒（２’Ｏ−Ｍｅ）、および６０秒（２’Ｆ）であった。ホスホロチオエート連結を導入するために、無水アセトニトリル中の３−フェニル１，２，４−ジチアゾリン−５−オン（ＰＯＳ、ＰｏｌｙＯｒｇ，Ｉｎｃ．、Ｌｅｏｍｉｎｓｔｅｒ、ＭＡ、ＵＳＡから取得）の１００ｍＭ溶液を用いた。
【０２０５】
Ｂ．支持体に結合したオリゴマーの切断および脱保護。固相合成の最終化の後、乾燥した固体支持体を、水中の４０重量％メチルアミンと２８％〜３１％の水酸化アンモニウム溶液（Ａｌｄｒｉｃｈ）の１：１容量の溶液で、３０℃で１．５時間処理した。溶液を蒸発させ、固体残渣を水中で再構成させた（以下を参照されたい）。
【０２０６】
Ｃ．精製。ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ、１３μｍカラムおよびＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−８システムを使用する陰イオン交換ＨＰＬＣにより、粗オリゴマーを精製した。緩衝液Ａは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ９．０であり、２０％アセトニトリルを含有し、緩衝液Ｂは、１．５Ｍ塩化ナトリウムを添加した緩衝液Ａと同じものであった。２６０ｎｍでのＵＶトレースを記録した。適切な画分をプールした後、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム、ｐＨ６．７および２０％アセトニトリルまたは濾過水の泳動緩衝液を用いて、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  ｆｉｎｅを充填したＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＸＫ  １６／４０カラムを使用するサイズ排除ＨＰＬＣ上で泳動した。あるいは、プールした画分を脱塩し、接線流濾過により適切な緩衝液または溶媒系に交換した。
【０２０７】
Ｄ．アニーリング。１×ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、１×、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｃｅｌｌｇｒｏ）中で等モル濃度のＲＮＡ溶液（センスおよびアンチセンス）を合わせることによって相補鎖を混合して、ＲＮＡｉ剤を形成させた。一部のＲＮＡｉ剤を凍結乾燥し、−１５〜−２５℃で保存した。１×ＰＢＳ中でＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計上で溶液の吸光度を測定することにより、二本鎖濃度を決定した。次いで、２６０ｎｍでの溶液の吸光度に、変換係数および希釈係数を乗じ、二本鎖濃度を決定した。別途記述しない限り、使用した変換係数は、０．０３７ｍｇ／（ｍＬ・ｃｍ）であった。
【０２０８】
Ｅ．トリ−アルキンリンカーのコンジュゲーション。アニーリングの前または後に、５’または３’アミン官能化センス鎖を、トリ−アルキンリンカーにコンジュゲートする。本明細書に開示される構築物を形成させる際に使用することができるトリ−アルキンリンカー構造の例は、以下の通りである：
【化２】
2020526192.tif 000029
以下は、トリ−アルキンリンカーの、アニーリングした二本鎖へのコンジュゲーションを記載する。アミン官能化二本鎖を、９０％ＤＭＳＯ／１０％Ｈ２Ｏ中に、約５０〜７０ｍｇ／ｍＬで溶解した。４０当量のトリエチルアミンを添加した後、３当量のトリ−アルキン−ＰＮＰを添加した。完了したら、コンジュゲートを１×リン酸緩衝食塩水／アセトニトリル（１：１４比）の溶媒系中で２回沈降させ、乾燥した。
【０２０９】
Ｆ．標的化リガンドのコンジュゲーション。アニーリングの前または後に、５’または３’三座アルキン官能化センス鎖を、標的化リガンドにコンジュゲートする。以下の例は、標的化リガンドの、アニーリングした二本鎖へのコンジュゲーションを記載する。０．５Ｍのトリス（３−ヒドロキシプロピルトリアゾリルメチル）アミン（ＴＨＰＴＡ）、０．５Ｍの硫酸Ｃｕ（ＩＩ）五水和物（Ｃｕ（ＩＩ）ＳＯ４・５Ｈ２Ｏ）およびアスコルビン酸ナトリウムの２Ｍ溶液のストック溶液を、脱イオン水中で調製した。標的化リガンドのＤＭＳＯ中の７５ｍｇ／ｍＬ溶液を作製した。トリ−アルキン官能化二本鎖（３ｍｇ、７５μＬ、脱イオン水中で４０ｍｇ／ｍＬ、約１５，０００ｇ／ｍｏｌ）を含有する１．５ｍＬの遠心管中に、２５μＬの１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ  ｐＨ８．５の緩衝液を添加する。ボルテックス後、３５μＬのＤＭＳＯを添加し、溶液をボルテックスする。標的化リガンドを反応物（６当量／二本鎖、２当量／アルキン、約１５μＬ）に添加し、溶液をボルテックスする。ｐＨ紙を使用して、ｐＨをチェックし、ｐＨが約８であることを確認した。別の１．５ｍＬの遠心管中で、５０μＬの０．５Ｍ  ＴＨＰＴＡを、１０μＬの０．５Ｍ  Ｃｕ（ＩＩ）ＳＯ４・５Ｈ２Ｏと混合し、ボルテックスし、室温で５分間インキュベートした。５分後、ＴＨＰＴＡ／Ｃｕ溶液（７．２μＬ、６当量、５：１のＴＨＰＴＡ：Ｃｕ）を反応バイアルに添加し、ボルテックスした。その直後、２Ｍアスコルビン酸塩（５μＬ、５０当量／二本鎖、１６．７／アルキン）を反応バイアルに添加し、ボルテックスした。反応が完了したら（典型的には、０．５〜１時間で完了する）、反応物を、非変性陰イオン交換クロマトグラフィーによってすぐに精製した。
【０２１０】
（実施例２）
マウスにおけるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの気管内投与
ｉｎ  ｖｉｖｏでのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の活性を評価するために、オスのＩＣＲマウスに、試験の１日目および２日目に、対照としての使用のための等張性食塩水ビヒクル、または等張性食塩水中で製剤化された、コンジュゲートリガンドを含まない５ｍｇ／ｋｇの以下のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤（すなわち、「裸のＲＮＡｉ剤」）：ＡＤ０４０１９、ＡＤ０４０２０、ＡＤ０４０２１、ＡＤ０４０２２、ＡＤ０４０２３、ＡＤ０４０２４、ＡＤ０４０２５、もしくはＡＤ０４０２６のうちの１つのいずれかを、気管内（ＩＴ）投与に適したマイクロスプレーデバイス（Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を介して、５０マイクロリットル投与した（例えば、本実施例において使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）。
【０２１１】
１群あたり４匹または５匹のマウスに投与した。マウスを試験９日目に屠殺し（ｓａｃ）、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【０２１２】
図１は、同定されたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤組成物（ＡＤ０４０１９、ＡＤ０４０２０、ＡＤ０４０２１、ＡＤ０４０２２、ＡＤ０４０２３、ＡＤ０４０２４、ＡＤ０４０２５、およびＡＤ０４０２６）の相対的発現を示し、それぞれのＲＮＡｉ剤は、ビヒクル対照と比較して肺アルファ−ＥＮａＣ発現の有意な低下を示した。
【０２１３】
（実施例３）
マウスにおけるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの気管内投与
試験１日目および２日目に、オスのＩＣＲマウスに、対照として使用するための等張性食塩水ビヒクル、または等張性食塩水中で製剤化された、３ｍｇ／ｋｇのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤（すなわち、ＡＤ０４０２５もしくはＡＤ０４８５８（例えば、本実施例において使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい））のいずれかを、気管内（ＩＴ）投与に適したマイクロスプレーデバイス（Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を介して、５０マイクロリットル投与した。１群あたり４匹または５匹のマウスに投与した。マウスを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【０２１４】
図２は、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０４０２５およびＡＤ０４８５８の相対的発現を示し、両方のＲＮＡｉ剤は、対照と比較して肺アルファ−ＥＮａＣ発現の有意な低下を示した。
【０２１５】
（実施例４）
ラットにおける上皮細胞標的化リガンドにコンジュゲートされた、およびコンジュゲートされていないアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの気管内投与
試験１日目および２日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、等張性食塩水中で製剤化された、０．５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、または５ｍｇ／ｋｇのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のいずれかを、気管内（ＩＴ）投与に適したマイクロスプレーデバイス（Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を介して２００マイクロリットル投与した。１群あたり５匹のラットに投与した。ラットを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【０２１６】
図３は、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０４０２５およびＡＤ０４０２５−コンジュゲートの相対的発現を示す。αｖβ６インテグリンに対する親和性を有するペプチドに基づくインテグリン標的化リガンドを、マスクされたポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）足場を介して、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖の５’末端に付加されたアミノ基に合成後に連結することによって、ＡＤ０４０２５−コンジュゲートを合成した（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）。裸のＲＮＡｉ剤と、ＲＮＡｉ剤−コンジュゲートとは両方とも、ベースライン測定値と比較して肺アルファ−ＥＮａＣ発現の実質的な低下を示したが、ＡＤ０４０２５−コンジュゲートは、測定された３つの投薬レベル（０．５ｍｇ／ｋｇ、１．５ｍｇ／ｋｇ、および５ｍｇ／ｋｇ）のそれぞれにわたって数値的に改善されたレベルのノックダウンを示し、特に顕著な改善は、１．５ｍｇ／ｋｇの用量であった（リガンドを含む場合、７８％のノックダウンに対して、リガンドを含まない場合、４７％のノックダウン）。
【０２１７】
（実施例５）
ラットにおける上皮細胞標的化リガンドにコンジュゲートされたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの口腔咽頭吸引投与
試験１日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、口腔咽頭（「ＯＰ」）吸引投与により、表７に記載される以下の投薬群に従って、ピペットを使用して２００マイクロリットルを投与した。
【表７】
2020526192.tif 000030
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２１８】
群２〜７においてＴｒｉ−ＳＭ２と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図４に示される構造を有し、センス鎖の５’末端上の末端アミンを介して（すなわち、末端ＮＨ２−Ｃ６基との共有結合を形成させることにより）ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされた。
【０２１９】
１群あたり５匹のラットに投与した（ｎ＝５）。ラットを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表８】
2020526192.tif 000031
【０２２０】
上の表８に示されるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤はそれぞれ、対照と比較してラットにおいてｍＲＮＡ発現の低下を示した。例えば、アンチセンス鎖の５’末端に位置するシクロプロピル−ホスホネート基を含むＡＤ０５３４７は、対照群と比較して約５９％（０．４１１）のｍＲＮＡの平均低下を有していた。さらに、他のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤はそれぞれ、対照と比較して、少なくとも約２７％のｒＥＮａＣ  ｍＲＮＡの低下を示した。
【０２２１】
（実施例６）
ラットにおける上皮細胞標的化リガンドにコンジュゲートされたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの気管内投与
試験１日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、対照としての使用のための等張性食塩水ビヒクル、または表９に記載される以下の投薬群に従う以下のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の１つのいずれかを、気管内（ＩＴ）投与に適したマイクロスプレーデバイス（Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を介して、２００マイクロリットル投与した。
【表９】
2020526192.tif 000032
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２２２】
群２、５、および６においてＴｒｉ−ＳＭ１と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図５に示される構造を有し、センス鎖の５’末端上の末端アミンを介して（すなわち、末端ＮＨ２−Ｃ６基との共有結合を形成させることにより）ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされた。群３および４については、群３および４中の三座低分子リガンドは、図５に示されるグルタルリンカー（ｇｌｕｔａｒｉｃ  ｌｉｎｋｅｒ）を、以下に示されるシステイン−ＰＥＧ２連結を含むリンカーで置き換えたものであった。
【化３】
2020526192.tif 000033
【０２２３】
群１、２、３、４、５および７のそれぞれにおいては、５匹のラットに投与し（ｎ＝５）、群６においては４匹のラットに投与した。ラットを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表１０】
2020526192.tif 000034
【０２２４】
上の表１０に示されるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤はそれぞれ、対照と比較してラットにおいてｍＲＮＡ発現の低下を示した。さらに、三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドの使用は、２０ｋＤａのＰＥＧ  ＰＫ改変剤をさらに含むペプチドに基づくαｖβ６上皮細胞標的化リガンドと比較した場合、ｍＲＮＡ発現の同等の低下を示す。
【０２２５】
（実施例７）
ラットにおける上皮細胞標的化リガンドにコンジュゲートされたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの口腔咽頭吸引投与
試験１日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、口腔咽頭（「ＯＰ」）吸引投与により、表１１に記載される以下の投薬群に従って、ピペットを使用して２００マイクロリットルを投与した。
【表１１】
2020526192.tif 000035
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２２６】
群２〜６および群８〜１０のそれぞれにおいてＴｒｉ−ＳＭ２と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図４に示される構造を有し、センス鎖の５’末端上の末端アミンを介して（すなわち、末端ＮＨ２−Ｃ６基との共有結合を形成させることにより）ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされた。群７のリガンドは、システイン連結基を含んでいた（例えば、実施例６を参照されたい）。
【０２２７】
群１、２、３、４、５、６、７および９においては、４匹のラットに投与し（ｎ＝４）、群８および１０においては３匹のラットに投与した（ｎ＝３）。ラットを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表１２】
2020526192.tif 000036
【０２２８】
上の表１２に示されるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤はそれぞれ、対照と比較してラットにおいてｍＲＮＡ発現の低下を示した。例えば、ＡＤ０５３４７は、対照と比較して、平均ｒＥＮａＣ  ｍＲＮＡ発現の約５４％の低下（０．４５７）を示した。
【０２２９】
（実施例８）
ラットにおける上皮細胞標的化リガンドにコンジュゲートされたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの口腔咽頭吸引投与
試験１日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、口腔咽頭（「ＯＰ」）吸引投与により、表１３に記載される以下の投薬群に従って、ピペットを使用して２００マイクロリットルを投与した。
【表１３】
2020526192.tif 000037
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２３０】
群２および群４においてＴｒｉ−ＳＭ２と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図４に示される構造を有する；群３および８においてＴｒｉ−ＳＭ６．１と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図６に示される構造を有する；群５においてＴｒｉ−ＳＭ９と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図７に示される構造を有する；群６においてＴｒｉ−ＳＭ６と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図８に示される構造を有する；群７においてＴｒｉ−ＳＭ８と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図９に示される構造を有する；群９においてＴｒｉ−ＳＭ１０と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図１０に示される構造を有する；ならびに群１０においてＴｒｉ−ＳＭ１１と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図１１に示される構造を有する。それぞれの三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドのそれぞれを、それぞれのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の５’末端上のアミノ基を介するコンジュゲーションによって付加した。
【０２３１】
各群において４匹のラットに投与した（ｎ＝４）。ラットを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表１４】
2020526192.tif 000038
【０２３２】
上の表１４に示されるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤はそれぞれ、対照と比較してラットにおいてｍＲＮＡ発現の低下を示した。例えば、ＡＤ０５３４７−Ｔｒｉ−ＳＭ６．１（群３）は、対照と比較して平均ｒＥＮａＣ  ｍＲＮＡ発現の約６４％の低下（０．３５８）を示し、ＡＤ０５４５３−Ｔｒｉ−ＳＭ６．１（群８）は、対照と比較して平均ｒＥＮａＣ  ｍＲＮＡ発現の約５５％の低下（０．４５４）を示した。さらに、群８および９は、アンチセンス鎖上の５’末端シクロプロピル−ホスホネート改変を使用せずに平均ｒＥＮａＣ  ｍＲＮＡ発現の約５５％の低下（０．４５４）を達成し、５’アンチセンスシクロプロピル−ホスホネート改変を用いた平均ｒＥＮａＣ  ｍＲＮＡ発現の約５３％の低下（０．４６９）を有する、群２と同等の阻害効果を示した。さらに、群４、６、８、９、および１０において観察されたように、三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、インテグリンαｖβ６に対する親和性を有することが知られる三座ペプチドに基づくαｖβ６上皮細胞標的化リガンドを使用する、群１１と同等であったか、または一部の例では、群１１より数値的に優れていた（例えば、Ｔｒｉ−ＳＭ６．１およびＴｒｉ−ＳＭ１０を含む群８および群９）（化学構造情報については、国際特許出願公開第ＷＯ２０１８／０８５４１５の図１１を参照されたい）。
【０２３３】
（実施例９）
ラットにおける上皮細胞標的化リガンドにコンジュゲートされたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの口腔咽頭吸引投与
試験１日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、口腔咽頭（「ＯＰ」）吸引投与により、表１５に記載される以下の投薬群を含む２００マイクロリットルを、ピペットを使用して投与した。
【表１５】
2020526192.tif 000039
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２３４】
群３および５〜８においてＴｒｉ−ＳＭ６．１と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図６に示される構造を有する。
【０２３５】
各群において４匹のラットに投与した（ｎ＝４）。ラットを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表１６】
2020526192.tif 000040
【０２３６】
上の表１６に示されるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤はそれぞれ、対照と比較してラットにおいてｍＲＮＡ発現の低下を示した。さらに、裸で投与した場合、ＡＤ０５４５３は、わずかに約２９％の阻害（０．７１３）を示したが、Ｔｒｉ−ＳＭ６．１インテグリン標的化リガンドとコンジュゲートした場合、それは平均ｒＥＮａＣ  ｍＲＮＡ発現の４４％の低下（０．５６２）を示した。
【０２３７】
（実施例１０）
ラットにおける上皮細胞標的化リガンドにコンジュゲートされたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの口腔咽頭吸引投与
試験１日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、口腔咽頭（「ＯＰ」）吸引投与により、表１７に記載される以下の投薬群を含む２００マイクロリットルを、ピペットを使用して投与した。
【表１７】
2020526192.tif 000041
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２３８】
群２〜１０においてＴｒｉ−ＳＭ６．１と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図６に示される構造を有する。
【０２３９】
各群において４匹のラットに投与した（ｎ＝４）。ラットを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表１８】
2020526192.tif 000042
【０２４０】
上の表１８に示されるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤はそれぞれ、対照と比較してラットにおいてｍＲＮＡ発現の低下を示した。
【０２４１】
（実施例１１）
ラットにおける上皮細胞標的化リガンドにコンジュゲートされたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの口腔咽頭吸引投与
試験１日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、口腔咽頭（「ＯＰ」）吸引投与により、表１９に記載される以下の投薬群を含む２００マイクロリットルを、ピペットを使用して投与した。
【表１９】
2020526192.tif 000043
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２４２】
群２〜７においてＴｒｉ−ＳＭ６．１と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図６に示される構造を有する。
【０２４３】
各群において５匹のラットに投与した（ｎ＝５）。ラットを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表２０】
2020526192.tif 000044
【０２４４】
上の表２０に示されるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤はそれぞれ、対照と比較してラットにおいてｍＲＮＡ発現の低下を示した。
【０２４５】
（実施例１２）
ラットにおける上皮細胞標的化リガンドにコンジュゲートされたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの口腔咽頭吸引投与
試験１日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、口腔咽頭（「ＯＰ」）吸引投与により、表２１に記載される以下の投薬群に従って、ピペットを使用して２００マイクロリットルを投与した。
【表２１】
2020526192.tif 000045
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２４６】
群２〜１３においてＴｒｉ−ＳＭ６．１と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図６に示される構造を有する。
【０２４７】
各群において４匹のラットに投与した（ｎ＝４）。ラットを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表２２】
2020526192.tif 000046
【０２４８】
上の表２２に示されるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤はそれぞれ、対照と比較してラットにおいてｍＲＮＡ発現の低下を示した。
【０２４９】
（実施例１３）
ラットにおける上皮細胞標的化リガンドにコンジュゲートされたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の口腔咽頭吸引投与の用量範囲試験
試験１日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、口腔咽頭（「ＯＰ」）吸引投与により、表２３に記載される以下の投薬群に従って、ピペットを使用して２００マイクロリットルを投与した。
【表２３】
2020526192.tif 000047
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２５０】
群２〜８においてＴｒｉ−ＳＭ６．１と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図６に示される構造を有する。
【０２５１】
群１、２、３、４、７および８のそれぞれにおいては、６匹のラットに投与した（ｎ＝５）。群５および６においては、４匹のラットに投与した（ｎ＝４）。ラットを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表２４】
2020526192.tif 000048
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２５２】
上の表２４に示されるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３は、投与された投薬レベルのそれぞれで、対照と比較してラットにおいてｍＲＮＡ発現の低下を示した。
【０２５３】
（実施例１４）
マウスにおけるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの気管内投与
試験１日目および２日目に、オスのＩＣＲマウスに、対照としての使用のための等張性食塩水ビヒクル、または等張性食塩水中で製剤化された、コンジュゲートリガンドを含まない５ｍｇ／ｋｇの以下のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤（すなわち、「裸のＲＮＡｉ剤」）：ＡＤ０４０２５、ＡＤ０４５２６、ＡＤ０４５２７、ＡＤ０４５２８、ＡＤ０４５２９、ＡＤ０４５３０、ＡＤ０４５３１、ＡＤ０４５３６、もしくはＡＤ０４５３７のうちの１つのいずれかの５０マイクロリットルを、マイクロスプレーデバイス（Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を介して投与した。１群あたり４匹のマウスに投与した（ｎ＝４）。マウスを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表２５】
2020526192.tif 000049
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２５４】
上の表２５に示されるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤はそれぞれ、対照と比較してラットにおいてｍＲＮＡ発現の低下を示した。
【０２５５】
（実施例１５）
マウスにおけるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの気管内投与
試験１日目および２日目に、オスのＩＣＲマウスに、対照としての使用のための等張性食塩水ビヒクル、または等張性食塩水中で製剤化された、コンジュゲートリガンドを含まない５ｍｇ／ｋｇの以下のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤（すなわち、「裸のＲＮＡｉ剤」）：ＡＤ０４０２５、ＡＤ０４５３８、ＡＤ０４５３９、ＡＤ０４５３２、ＡＤ０４５３３、ＡＤ０４５３４、ＡＤ０４５３５、もしくはＡＤ０４５４０のうちの１つのいずれかの５０マイクロリットルを、マイクロスプレーデバイス（Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を介して投与した（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）。
【０２５６】
１群あたり４匹のマウスに投与した（ｎ＝４）。マウスを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表２６】
2020526192.tif 000050
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２５７】
上の表２６に示されるように、それぞれのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の基礎となる配列は、達成されるＥＮａＣ遺伝子の阻害レベルに影響する。例えば、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０４０２５は、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の９７２位を標的とするように設計されるアンチセンス鎖配列を含む（すなわち、アンチセンス鎖のヌクレオチド１〜１９は、９７２〜９９０位でアルファ−ＥＮａＣ遺伝子（配列番号１）と少なくとも部分的に相補的であるように設計される）。ＡＤ０４５２５は、本実施例で試験されたＲＮＡｉ剤の最も高いレベルの阻害を達成し、対照と比較して遺伝子発現の約５５％のノックダウン（０．４４８）を示した。残りのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０４５３８（遺伝子９７３位を標的とする）、ＡＤ０４５３９（遺伝子９９９位を標的とする）、ＡＤ０４５３２（遺伝子１０００位を標的とする）、ＡＤ０４５３３（また遺伝子９７３位を標的とする）、ＡＤ０４５３４（また遺伝子９９９位を標的とする）、ＡＤ０４５３５（遺伝子１２９１位を標的とする）、およびＡＤ０４５４０（遺伝子７６３位を標的とする）を含む、遺伝子上の異なる位置を標的とするように設計された。上に示されるように、異なる位置で遺伝子を標的化するように設計されるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、異なる阻害活性を有してもよい（例えば、ＡＤ０４０２５（９７２位）と、ＡＤ０４５３８（９７３位）およびＡＤ０４５３３（９７３位）とのアルファ−ＥＮａＣ  ｍＲＮＡノックダウンレベルを比較されたい）。さらに、同じ位置でアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を比較する場合（例えば、ＡＤ０４５３９およびＡＤ０４５３４）、両方の配列が同じ位置（例えば、遺伝子９９９位）で遺伝子を阻害するように設計された基礎となる核酸塩基を有するにも拘わらず、基礎となる塩基配列のわずかな改変および／または異なる改変ヌクレオチドの含有は、少なくとも数値的に異なる阻害活性をもたらし得る。
【０２５８】
（実施例１６）
ラットにおけるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの気管内投与
試験１日目および２日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、対照としての使用のための等張性食塩水ビヒクル、または等張性食塩水中で製剤化された、コンジュゲートリガンドを含まない約３ｍｇ／ｋｇの以下のアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤（すなわち、「裸のＲＮＡｉ剤」）：ＡＤ０４８３５、ＡＤ０４０２２、ＡＤ０５１１６、ＡＤ０５１１７、ＡＤ０５１１８、もしくはＡＤ０５１１９のうちの１つのいずれかの２００マイクロリットルを、マイクロスプレーデバイス（Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を介して投与した（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）。
【０２５９】
１群あたり５匹のラットに投与した（ｎ＝５）。ラットを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表２７】
2020526192.tif 000051
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２６０】
上の表２７は、それぞれのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の基礎となる配列が、達成されるＥＮａＣ遺伝子の阻害レベルに影響することを示すさらなるデータを提供する。例えば、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０４０２５およびＡＤ０４８３５はそれぞれ、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子の９７２位を標的とするように設計されるアンチセンス鎖配列を含む（すなわち、アンチセンス鎖のヌクレオチド１〜１９は、９７２〜９９０位でアルファ−ＥＮａＣ遺伝子（配列番号１）と少なくとも部分的に相補的であるように設計される）。本実施例で試験されたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のうち、これらの２つのＲＮＡｉ剤は、７０％より高い最も高いレベルのノックダウンを示した。残りのアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤は、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５１１６（遺伝子９４４位を標的とする）、ＡＤ０５１１７（遺伝子９４５位を標的とする）、ＡＤ０５１１８（遺伝子１２８９位を標的とする）、およびＡＤ０５１１９（遺伝子１５７９位を標的とする）を含む、遺伝子上の異なる位置を標的とするように設計された。
【０２６１】
（実施例１７）
ラットにおける上皮細胞標的化リガンドにコンジュゲートされたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の口腔咽頭吸引投与の複数用量の用量範囲試験
試験１日目、試験２日目、および試験３日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、口腔咽頭（「ＯＰ」）吸引投与により、表２８に記載される以下の投薬群に従って、ピペットを使用して２００マイクロリットルを投与した。
【表２８】
2020526192.tif 000052
（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）。本明細書で指摘されるように、本実施例における同じＲＮＡｉ剤−三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドコンジュゲート構造（すなわち、Ｔｒｉ−ＳＭ６．１−ＡＤ０５４５３）を、ＡＤ０５４５３に示されるような、末端アミノ基への合成後付加の代わりに、ＡＤ０５９２４に示されるようにトリ−アルキン官能化連結基（ＴｒｉＡｌｋ１４）を使用することによって選択的に合成することができる（実施例１も参照されたい）。
【０２６２】
群２〜７においてＴｒｉ−ＳＭ６．１と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図６に示される構造を有する。
【０２６３】
群１、２、３、４、５および６のそれぞれにおいては、７匹のラットに投与し（ｎ＝７）、群７においては６匹のラットに投与した（ｎ＝６）。ラットを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表２９】
2020526192.tif 000053
【０２６４】
上の表２９に示されるように、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３は、投与された投薬レベルのそれぞれで、対照と比較してラットにおいてｍＲＮＡ発現の低下を示した。さらに、複数のＯＰ用量投与は、同じアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤を使用する場合、単回用量と比較してｒＥＮａＣ  ｍＲＮＡ発現のさらなるノックダウンの兆候を示した（例えば、実施例１７の群７と、実施例１３の群５とを比較されたい）。
【０２６５】
（実施例１８）
マウスおよびヒトのＣＯＰＤ痰安定性評価におけるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの気管内投与
公知の先行技術の二本鎖の活性および安定性を評価し、本明細書に開示されるＲＮＡｉ剤と比較するために、Ｎｏｖａｒｔｉｓらの国際特許出願公開第ＷＯ２００８／１５２１３１（その中の表１Ｃ、ＮＤ−９２０１を参照されたい）に開示された、以下の改変構造を有する二本鎖を合成した：
アンチセンス鎖配列（５’→３’）：ＧＡＵＵＵＧＵＵＣＵＧＧＵＵＧｃＡｃＡｄＴｓｄＴ（配列番号２９１）
センス鎖配列（５’→３’）：ｕＧｕＧｃＡＡｃｃＡＧＡＡｃＡＡＡｕｃｄＴｓｄＴ（配列番号２９２）
（以後、ＮＤ−９２０１と呼ぶ）。ＷＯ２００８／１５２１３１によれば、ＮＤ−９２０１は、アルファ−ＥＮａＣ遺伝子発現の同等に強力なｉｎ  ｖｉｔｒｏでの阻害を示した。
【０２６６】
まず、アルファ−ＥＮａＣ阻害活性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するための試験を行った。試験１日目および２日目に、オスのＩＣＲマウスに、対照としての使用のための等張性グルコース（Ｄ５Ｗ）ビヒクル、またはＤ５Ｗ中で製剤化された、約１０ｍｇ／ｋｇのＮＤ−９２０１のいずれかを、マイクロスプレーデバイス（Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を介して投与した。マウスを９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した。比較のために、試験１日目および２日目に、オスのＩＣＲマウスに、対照としての使用のためのＤ５Ｗビヒクル、またはＤ５Ｗ中で製剤化された、本明細書に開示された約５ｍｇ／ｋｇのＲＮＡｉ剤ＡＤ０４０２５のいずれかを、マイクロスプレーデバイス（Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｕｒｙ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ）を介して投与した（例えば、ＡＤ０４０２５の化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）。マウスを９日目に同様に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した。
【０２６７】
ＮＤ−９２０１については、１日目および２日目の１０ｍｇ／ｋｇ投薬で、ｍＥＮａＣ  ｍＲＮＡ発現の約２５％の阻害が、マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで達成された。
【０２６８】
ＡＤ０４０２５については、１日目および２日目の５ｍｇ／ｋｇ投薬のみで、ｍＥＮａＣ  ｍＲＮＡ発現の約６５％の阻害が、マウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで達成され、かくして、公知の先行技術の二本鎖ＮＤ−９２０１と比較して阻害活性の実質的な改善を示した。
【０２６９】
さらに、安定性試験を、ＣＯＰＤと診断された患者から採取したヒトの痰において、ＮＤ−９２０１およびＡＤ０４８５８を用いて行った（例えば、ＡＤ０４８５８の化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）。５０μＬの痰および３５０μＬの溶解緩衝液を含有する溶液をボルテックスし、１２．５μＬのＮＤ−９２０１またはＡＤ０４８５８を添加し、１時間毎に軽くボルテックスした。試料に対してＬＣＭＳを行って、分子のそれぞれのセンス鎖とアンチセンス鎖の両方の残存する完全長生成物を経時的に決定した。６時間後、ＡＤ０４８５８は、センス鎖とアンチセンス鎖の両方について存在する約２０〜３０％多い完全長生成物を有していたため、改善された安定性を示した。
【０２７０】
（実施例１９）
ラットにおける上皮細胞標的化リガンドにコンジュゲートされたアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の口腔咽頭吸引投与に関するｉｎ  ｖｉｖｏ試験
試験１日目および試験２日目に、オスのＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットに、口腔咽頭（「ＯＰ」）吸引投与により、表３０に記載される以下の投薬群を含む２００マイクロリットルを、ピペットを使用して投与した。
【表３０】
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（例えば、本実施例で使用される化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）
【０２７１】
群２〜７においてＴｒｉ−ＳＭ６．１と呼ばれる三座低分子αｖβ６上皮細胞標的化リガンドは、図６に示される構造を有する。
【０２７２】
各群において４匹のラットに投与した（ｎ＝７）。ラットを試験９日目に屠殺し、収集およびホモジナイゼーションの後、両方の肺から全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した（幾何平均、±９５％信頼区間）。
【表３１】
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【０２７３】
上の表３１において、アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５６２５およびＡＤ０５４５３は、それぞれ、９７２位で始まるアルファ−ＥＮａＣ遺伝子を標的とするように設計されたアンチセンス鎖を含んでいた（配列番号１を参照されたい）；ＡＤ０５８２９は、９４４位で始まるアルファ−ＥＮａＣ遺伝子を標的とするように設計されたアンチセンス鎖を含んでいた；ＡＤ０５８３１は、９７３位で始まるアルファ−ＥＮａＣ遺伝子を標的とするように設計されたアンチセンス鎖を含んでいた；ならびにＡＤ０１２８９は、１２８９位で始まるアルファ−ＥＮａＣ遺伝子を標的とするように設計されたアンチセンス鎖を含んでいた。アルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤はそれぞれ、遺伝子発現の阻害を示し、ＲＮＡｉ剤ＡＤ０５４５３は、アルファ−ＥＮａＣの比較的強力な阻害を示した。
【０２７４】
（実施例２０）
マウスにおけるアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤のｉｎ  ｖｉｖｏでの局所眼科的投与
眼表面上皮中でのアルファＥＮａＣ  ｍＲＮＡの発現を阻害するアルファ−ＥＮａＣ  ＲＮＡｉ剤の能力を評価するために、ＣＢ５７Ｂｌ／６マウス（ｎ＝３匹／群）に、１日２回、５日間にわたって両眼に食塩水ビヒクルまたは４００マイクログラムのＡＤ０４８５８（２マイクロリットル容量中）の局所点眼を投与した（例えば、ＡＤ０４８５８の化学的に改変された二本鎖に関する化学構造情報については、表３〜６を参照されたい）。試験５日目に、マウスを屠殺し、結膜上皮の試料を収集し、組織ホモジネートから全ＲＮＡを単離した。アルファ−ＥＮａＣ（ＳＣＮＮ１Ａ）ｍＲＮＡ発現を、プローブに基づく定量的ＰＣＲによって定量化し、ＧＡＰＤＨ発現に対して正規化し、ビヒクル対照群の割合として表した。
【０２７５】
ＡＤ０４８５８の５日間の１日２回の局所投薬後、処置されたマウスに由来する結膜試料は、ビヒクル処置された対照に由来する試料よりも、有意に少ない（約２４％）アルファＥＮａＣ  ｍＲＮＡを発現した。
【０２７６】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に説明してきたが、前記説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を例示することを意図するものであり、それを限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。他の態様、利点、および改変は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１５Ｅ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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