(57)【要約】  本開示は、いくつかの側面において、異常なリソソーム機能に関連する疾患、例えばパーキンソン病およびゴーシェ病を処置するための、組成物および方法に関する。いくつかの態様において、本開示は、ＳＣＮＡまたはその一部、ＴＭＥＭ１０６Ｂまたはその一部、または前述の任意の組み合わせを標的とする１つ以上の阻害性核酸をコードする導入遺伝子を含む、発現構築物を提供する。いくつかの態様において、本開示は、かかる発現構築物をそれを必要とする対象に投与することによる、パーキンソン病の方法を提供する。
2020537542.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接したα−Ｓｙｎの発現または活性を阻害する阻害性核酸をコードする発現構築物を含む、単離された核酸であって、ここで、少なくとも１つのＩＴＲが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号１６）と比べて修飾された「Ｄ」配列を含む、前記単離された核酸。
【請求項２】
阻害性核酸が、配列番号１に示される配列の少なくとも６つの連続したヌクレオチドに相補的である、請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
阻害性核酸が、配列番号３〜８または７〜１２のいずれか１つに示される核酸配列を含む阻害性ＲＮＡである、請求項１または２に記載の単離された核酸。
【請求項４】
阻害性核酸が、配列番号１７〜２２のいずれか１つに示される配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項５】
修飾された「Ｄ」領域が、発現構築物に対してＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項６】
修飾された「Ｄ」配列を含むＩＴＲが、３’ＩＴＲである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項７】
ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）が隣接したＴＭＥＭ１０６Ｂの発現または活性を阻害する阻害性核酸をコードする発現構築物を含む、単離された核酸であって、ここで、少なくとも１つのＩＴＲが、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（配列番号１６）と比べて修飾された「Ｄ」配列を含む、前記単離された核酸。
【請求項８】
阻害性核酸が、配列番号２に示される配列の少なくとも６つの連続したヌクレオチドに相補的である、請求項７に記載の単離された核酸。
【請求項９】
阻害性核酸が、配列番号９または１０に示される核酸配列を含む阻害性ＲＮＡである、請求項７または８に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
阻害性核酸が、配列番号１１または１２に示される配列を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
修飾された「Ｄ」領域が、発現構築物に対してＩＴＲの外側に位置する「Ｄ」配列である、請求項７〜１０のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１２】
修飾された「Ｄ」配列を含むＩＴＲが、３’ＩＴＲである、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１３】
第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む単離された核酸であって、ここで、各遺伝子産物が独立して、表１に示される遺伝子産物またはその一部から選択される、前記単離された核酸。
【請求項１４】
第１の遺伝子産物が、Ｇｃａｓｅタンパク質またはその一部である、請求項１３に記載の単離された核酸。
【請求項１５】
第２の遺伝子産物が、ＳＮＣＡを標的とする阻害性核酸である、請求項１３または請求項１４に記載の単離された核酸。
【請求項１６】
干渉核酸が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、またはｄｓＲＮＡであり、任意にここで、干渉核酸がα−Ｓｙｎタンパク質の発現を阻害する、請求項１５に記載の単離された核酸。
【請求項１７】
１つ以上のプロモーターをさらに含み、任意にここで、１つ以上のプロモーターのそれぞれが独立して、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーターである、請求項１３〜１６のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１８】
内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をさらに含み、任意にここで、ＩＲＥＳが第１の遺伝子産物と第２の遺伝子産物との間に位置する、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項１９】
自己切断型ペプチドコード配列をさらに含み、任意にここで、自己切断型ペプチドがＴ２Ａである、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項２０】
発現構築物が、第１の遺伝子産物と第２の遺伝子産物が隣接する２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項２１】
配列番号１〜１２および１７〜３５のいずれか１つに示される配列を有する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離された核酸。
【請求項２２】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項２３】
ベクターがプラスミドである、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２４】
ベクターがウイルスベクターであり、任意にここで、ウイルスベクターが、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターまたはバキュロウイルスベクターである、請求項２２に記載のベクター。
【請求項２５】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のベクターを含む、組成物。
【請求項２６】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離された核酸または請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２７】
以下を含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）：
（ｉ）カプシドタンパク質；および
（ｉｉ）請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離された核酸、または請求項２２に記載のベクター。
【請求項２８】
カプシドタンパク質が血液脳関門を通過することができ、任意にここで、カプシドタンパク質がＡＡＶ９カプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である、請求項２７に記載のｒＡＡＶ。
【請求項２９】
ｒＡＡＶが、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞および非神経細胞を形質導入する、請求項２７または請求項２８に記載のｒＡＡＶ。
【請求項３０】
パーキンソン病を有するかまたは有する疑いのある対象を処置する方法であって、対象に、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の単離された核酸、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載のベクター、請求項２５に記載の組成物、または請求項２６〜２９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶを投与することを含む、前記方法。
【請求項３１】
投与が、対象のＣＮＳへの直接注射を含み、任意にここで、直接注射が、脳内注射、実質内注射、髄腔内注射、大槽内注射またはそれらの任意の組み合わせである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
対象のＣＮＳへの直接注射が、対流強化送達（ＣＥＤ）を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
投与が末梢注射を含み、任意にここで、末梢注射が静脈内注射である、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、35 U.S.C. 119(e)の下で、２０１７年１０月３日に提出された米国仮出願第62/567,303号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」、および２０１７年１０月３日に提出された第62/567,305号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」の利益を主張する；これら各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
背景
ゴーシェ病は、リソソーム酸β−グルコセレブロシダーゼ（Ｇｃａｓｅ、「ＧＢＡ」）の欠損による、スフィンゴ糖脂質代謝の稀な先天性異常である。患者は、非ＣＮＳ症状ならびに、肝脾腫および、汎血球減少症、肺障害／線維症および骨欠損につながる骨髄不全を含む所見に苦しむ。さらに、かなりの数の患者が神経症状にも苦しみ、これには、断続性眼球運動と注視の異常、発作、認知障害、発達遅延、およびパーキンソン病を含む運動障害が含まれる。
【０００３】
末梢疾患および造血骨髄と内臓の主な臨床症状に対処するいくつかの治療法が存在し、これには、以下に記載の酵素補充療法、欠陥Ｇｃａｓｅに結合して安定性を改善するシャペロン様小分子薬、およびゴーシェ病において蓄積して症状や所見をもたらす基質の生成をブロックする基質抑制療法などが含まれる。しかし、ゴーシェ病の他の側面（特に、骨格および脳に影響を与えるもの）は、処置に不応性のようである。
【発明の概要】
【０００４】
概要
ゴーシェ病患者（ＧＢＡ１遺伝子の両方の染色体アレルに変異がある患者）に加えて、ＧＢＡ１の一方のアレルのみに変異がある患者は、パーキンソン病（ＰＤ）のリスクが非常に高くなる。ＰＤ症状−歩行困難、安静時の振戦、硬直、および多くの場合うつ病、睡眠困難、認知機能低下など−の重症度は、酵素活性の低下の程度と相関する。したがって、ゴーシェ病患者は最も重篤な経過をたどり、一方ＧＢＡ１に単一の軽度の変異を有する患者は、典型的にはより良性の経過をたどる。突然変異保有者は他のＰＤ関連疾患のリスクも高く、これには、実行機能障害、精神病、およびＰＤ様の運動障害を特徴とするレビー小体型認知症、および特徴的な運動および認知障害を伴う多系統萎縮症が含まれる。これらの疾患の容赦のない経過を変える治療法は存在しない。
【０００５】
いくつかの態様において、本開示は、ＰＤ関連遺伝子（例えば、α−シヌクレイン（α−Ｓｙｎ）、膜貫通タンパク質１０６Ｂ（ＴＭＥＭ１０６Ｂ）、リボソームタンパク質ｓ２５（ＲＰＳ２５）、微小管関連タンパク質タウ（ＭＡＰＴ）、またはそれらの組み合わせ）を標的とする１つ以上の阻害性ＲＮＡ（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）をコードする、発現構築物に基づく。いくつかの側面において、本開示は、Ｇｃａｓｅ（またはその一部）およびＰＤ関連遺伝子（例えば、α−Ｓｙｎ）からの１つ以上の追加の遺伝子産物をコードする発現構築物（例えば、ベクター）に基づく。特定の理論に束縛されることを望まないが、本明細書に記載の遺伝子産物の組み合わせは、対象において発現された場合に、一緒に（例えば相乗的に）作用してＰＤの１つ以上の兆候および症状を軽減する。
【０００６】
したがって、いくつかの側面において、本開示は、ＳＮＣＡ（例えば、ＳＣＮＡの一部）を標的としてα−Ｓｙｎの発現および／または活性を阻害する阻害性ＲＮＡをコードする、単離された核酸を提供する。いくつかの側面において、本開示は、第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供し、ここで各遺伝子産物は独立して、表１に示される遺伝子産物またはその一部から選択される。
【０００７】
したがって、いくつかの側面において、本開示は、ＴＭＥＭ１０６Ｂ（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂの一部）を標的としてＴＭＥＭ１０６Ｂの発現および／または活性を阻害する阻害性ＲＮＡをコードする、単離された核酸を提供する。いくつかの側面において、本開示は、第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供し、ここで各遺伝子産物は独立して、表１に示される遺伝子産物またはその一部から選択される。
【０００８】
したがって、いくつかの態様において、本開示は、ＲＰＳ２５をコードする遺伝子（例えば、ＲＰＳ２５をコードする遺伝子の一部）を標的としてＲＰＳ２５の発現および／または活性を阻害する阻害性ＲＮＡをコードする、単離された核酸を提供する。いくつかの側面において、本開示は、第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供し、ここで各遺伝子産物は独立して、表１に示される遺伝子産物またはその一部から選択される。
【０００９】
したがって、いくつかの態様において、本開示は、ＭＡＰＴ（例えば、ＭＡＰＴをコードする遺伝子の一部）を標的としてＭＡＰＴの発現および／または活性を阻害する阻害性ＲＮＡをコードする、単離された核酸を提供する。いくつかの側面において、本開示は、第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供し、ここで各遺伝子産物は独立して、表１に示される遺伝子産物またはその一部から選択される。
【００１０】
いくつかの態様において、第１の遺伝子産物または第２の遺伝子産物は、Ｇｃａｓｅタンパク質またはその一部である。いくつかの態様において、第１の遺伝子産物または第２の遺伝子産物は、干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）である。いくつかの態様において、干渉核酸は、α−シヌクレイン（α−シヌクレイン）の発現を阻害する。いくつかの態様において、第１の遺伝子産物はＧｃａｓｅタンパク質であり、第２の遺伝子産物は、α−Ｓｙｎの発現を阻害する干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）である（例えば、ＳＣＮＡを標的とする干渉核酸である）。
【００１１】
いくつかの態様において、干渉核酸は、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を阻害する。いくつかの態様において、第１の遺伝子産物はＧｃａｓｅタンパク質であり、第２の遺伝子産物は、ＴＭＥＭ１０６Ｂの発現を阻害する干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）である（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする干渉核酸である）。
いくつかの態様において、干渉核酸は、ＲＰＳ２５の発現を阻害する。いくつかの態様において、第１の遺伝子産物はＧｃａｓｅタンパク質であり、第２の遺伝子産物は、ＲＰＳ２５をコードする遺伝子の発現を阻害する干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）である（例えば、ＲＰＳ２５コード配列を標的とする干渉核酸である）。
【００１２】
いくつかの態様において、干渉核酸は、ＭＡＰＴの発現を阻害する。いくつかの態様において、第１の遺伝子産物はＧｃａｓｅタンパク質であり、第２の遺伝子産物は、ＭＡＰＴの発現を阻害する干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡなど）である（例えば、ＭＡＰＴを標的とする干渉核酸である）。
いくつかの態様において、発現構築物はさらに、１つ以上のプロモーターを含む。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩプロモーターまたはＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えばＵ６）である。
【００１３】
いくつかの態様において、発現構築物はさらに、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。いくつかの態様において、ＩＲＥＳは、第１の遺伝子産物と第２の遺伝子産物の間に位置する。
いくつかの態様において、発現構築物はさらに、自己切断型ペプチドコード配列を含む。いくつかの態様において、自己切断型ペプチドは、Ｔ２Ａペプチドである。
いくつかの態様において、発現構築物は、２つのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。いくつかの態様において、ＩＴＲ配列は、第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物に隣接する（例えば、５’末端から３’末端へと次のように配置される：ＩＴＲ−第１遺伝子産物−第２遺伝子産物−ＩＴＲ）。いくつかの態様において、単離された核酸のＩＴＲ配列の１つは、機能的な末端分解部位（ｔｒｓ）を欠いている。例えば、いくつかの態様において、ＩＴＲの１つはΔＩＴＲである。
【００１４】
本開示は、いくつかの側面において、修飾された「Ｄ」領域（例えば、野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ、配列番号１６と比べて修飾されたＤ配列）を有するＩＴＲを含むｒＡＡＶベクターに関する。いくつかの態様において、修飾Ｄ領域を有するＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターの５’ＩＴＲである。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域は、例えば配列番号１３に示されるような「Ｓ」配列を含む。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域を有するＩＴＲは、ｒＡＡＶベクターの３’ＩＴＲである。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域は３’ＩＴＲを含み、ここで「Ｄ」領域は、ＩＴＲの３’末端（例えば、ベクターの導入遺伝子インサートに対してＩＴＲの外側または末端）に位置する。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」領域は、配列番号１３または１４に示されるような配列を含む。
いくつかの態様において、単離された核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）は、ＴＲＹ領域を含む。いくつかの態様において、ＴＲＹ領域は、配列番号１６に示される配列を含む。
【００１５】
いくつかの態様において、本開示に記載の単離された核酸は、配列番号１〜６７のいずれか１つに示される配列を有するペプチドを含むか、またはそれからなる。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の単離された核酸を含むベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミドまたはウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターまたはバキュロウイルスベクターである。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターは一本鎖（例えば、一本鎖ＤＮＡ）である。
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の単離された核酸または本開示に記載のベクターを含む、宿主細胞を提供する。
いくつかの側面において、本開示は、カプシドタンパク質および本開示に記載の単離された核酸またはベクターを含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）を提供する。
【００１６】
いくつかの態様において、カプシドタンパク質は血液脳関門を通過することができ、例えば、ＡＡＶ９カプシドタンパク質またはＡＡＶｒｈ．１０カプシドタンパク質である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、中枢神経系（ＣＮＳ）の神経細胞および非神経細胞を形質導入する。
いくつかの側面において、本開示は、パーキンソン病を有するかまたは有すると疑われる対象を処置する方法を提供し、該方法は、対象に、本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を投与することを含む。
いくつかの態様において、投与は、対象のＣＮＳへの直接注射を含む。いくつかの態様において、直接注射は、脳内注射、実質内注射、髄腔内注射、大槽内注射、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対流強化送達（ＣＥＤ）を含む。
いくつかの態様において、投与は末梢注射を含む。いくつかの態様において、末梢注射は静脈内注射である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１またはその一部）およびＳＣＮＡを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むベクターの、一態様を示す概略図である。
【図２】図２は、ＳＣＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。
【図３】図３は、ＳＣＮＡを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＧｃａｓｅコード配列の間のイントロン内に配置されている。
【００１８】
【図４】図４は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）およびＳＣＮＡを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミの、一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＧｃａｓｅコード配列の間のイントロン内に配置されている。
【図５】図５は、Ｇｃａｓｅ（ＧＢＡ１）およびＳＣＮＡを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＧｃａｓｅコード配列の間のイントロン内に配置されている。
【図６】図６は、Ｇｃａｓｅ（ＧＢＡ１）およびＳＣＮＡを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＧｃａｓｅコード配列の間のイントロン内に配置されている。
【００１９】
【図７】図７は、Ｇｃａｓｅ（ＧＢＡ１）およびＳＣＮＡを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。３’ＩＴＲの「Ｄ」配列は、ベクターの「外側」に配置されている。
【図８】図８は、Ｇｃａｓｅ（ＧＢＡ１）およびＳＣＮＡを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＧｃａｓｅコード配列の間のイントロン内に配置されている。
【図９】図９は、Ｇｃａｓｅ（ＧＢＡ１）およびＳＣＮＡを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＧｃａｓｅコード配列の間のイントロン内に配置されている。
【００２０】
【図１０】図１０は、Ｇｃａｓｅ（ＧＢＡ１）およびＳＣＮＡを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。
【図１１】図１１は、Ｇｃａｓｅ（ＧＢＡ１）およびＳＣＮＡを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＧｃａｓｅコード配列の間のイントロン内に配置されている。
【図１２】図１２は、Ｇｃａｓｅ（ＧＢＡ１）およびＳＣＮＡを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＧｃａｓｅコード配列の間のイントロン内に配置されている。
【００２１】
【図１３】図１３は、Ｇｃａｓｅ（ＧＢＡ１）およびプログラニュリン（ＰＧＲＮ）、およびＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＧｃａｓｅコード配列の間のイントロン内に配置されている。
【図１４】図１４は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上）およびα−Ｓｙｎアッセイ（下）による、in vitroでのＳＣＮＡの成功したサイレンシングを示す代表的なデータを示す。
【図１５】図１５は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上）およびα−Ｓｙｎアッセイ（下）による、in vitroでのＴＭＥＭ１０６Ｂの成功したサイレンシングを示す代表的なデータを示す。
【００２２】
【図１６】図１６は、ＩＴＲの「外側」（例えば、導入遺伝子インサートまたは発現構築物と比べてＩＴＲの末端の近位）に位置する「Ｄ」領域を含むｒＡＡＶベクター（上）、およびＩＴＲをベクターの「内側」（例えば、ベクターの導入遺伝子インサートの近位）に有する野生型ｒＡＡＶベクターを示す概略図である。
【図１７】図１７は、野生型（丸）のＩＴＲ、または「Ｄ」配列の代替（例えば、「外側」；四角）配置のＩＴＲを有するｒＡＡＶを使用した、ＨＥＫ２９３細胞の形質導入のデータを示す。「外側」に配置されたＩＴＲを有するｒＡＡＶは、野生型ＩＴＲを有するｒＡＡＶと同程度に効率的に、細胞を形質導入することができた。
【００２３】
【図１８】図１８は、ＲＰＳ２５を標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。
【図１９】図１９は、ＲＰＳ２５を標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。
【図２０】図２０は、ＭＡＰＴを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。
【図２１】図２１は、ＭＡＰＴを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。
【００２４】
【図２２】図２２は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）およびＭＡＰＴを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＰＧＲＮコード配列の間のイントロン内に配置されている。
【図２３】図２３は、ＭＡＰＴを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。
【図２４】図２４は、プログラニュリン（ＰＧＲＮ）およびＭＡＰＴを標的とする阻害性ＲＮＡをコードする発現構築物を含むｒＡＡＶベクターを含むプラスミドの、一態様を示す概略図である。阻害性ＲＮＡは、プロモーター配列とＰＧＲＮコード配列の間のイントロン内に配置されている。
【００２５】
詳細な説明
本開示は部分的に、対象におけるＰＤ関連遺伝子産物の組み合わせの発現のための、組成物および方法に基づく。遺伝子産物は、タンパク質、タンパク質の断片（例えば、一部）、ＰＤ関連遺伝子を阻害する干渉核酸などであり得る。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＰＤ関連遺伝子によってコードされるタンパク質またはタンパク質断片である。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＰＤ関連遺伝子を阻害する干渉核酸（例えば、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）である。
【００２６】
ＰＤ関連遺伝子とは、遺伝的、生化学的または機能的にＰＤに関連する遺伝子産物をコードする遺伝子を指す。例えば、ＧＢＡ１遺伝子（これはタンパク質Ｇｃａｓｅをコードする）に変異のある個体は、ＧＢＡ１に変異がない個体と比べて、ＰＤ発症のリスクが高いことが観察されている。別の例において、ＰＤは、α−シヌクレイン（α−Ｓｙｎ）タンパク質を含むタンパク質凝集体の蓄積に関連する；したがって、ＳＣＮＡ（これはα−Ｓｙｎをコードする）は、ＰＤ関連遺伝子である。いくつかの態様において、本明細書に記載の発現カセットは、ＰＤ関連遺伝子（またはそのコード配列）の野生型または非変異型形態をコードする。ＰＤ関連遺伝子の例を、表１に列挙する。
【００２７】
【表１】
2020537542.tif 000003
【００２８】
単離された核酸およびベクター
単離された核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。いくつかの態様において、本開示は、１つ以上のＰＤ関連遺伝子、例えばＳＣＮＡ、ＴＭＥＭ１０６Ｂ、ＲＰＳ２５、およびＭＡＰＴを標的とする１つ以上の阻害性核酸をコードする単離された核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）を提供する。いくつかの態様において、単離された核酸はさらに、タンパク質をコードする配列、例えば、Ｇｃａｓｅ（例えば、ＧＢＡ１）またはプログラニュリン（例えば、ＰＧＲＮ）をコードする核酸配列を含む。
【００２９】
一般に、本明細書に記載の単離された核酸は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の阻害性核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードすることができる。いくつかの態様において、単離された核酸は、１０を超える阻害性核酸をコードする。いくつかの態様において、１つ以上の阻害性核酸のそれぞれが、異なる遺伝子または遺伝子の一部を標的とする（例えば、第１のｍｉＲＮＡは、遺伝子の第１の標的配列を標的とし、第２のｍｉＲＮＡは、該遺伝子の第１の標的配列とは異なる第２の標的配列を標的とする）。いくつかの態様において、１つ以上の阻害性核酸のそれぞれは、同じ遺伝子の同じ標的配列を標的とする（例えば、単離された核酸は、同じｍｉＲＮＡの複数のコピーをコードする）。
【００３０】
本開示の側面は、α−シヌクレインタンパク質（例えば、ＳＣＮＡの遺伝子産物）を標的とする１つ以上の干渉核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。α−シヌクレインタンパク質は、シナプス小胞をクラスター化してドーパミンの放出を調節することにより、シナプス前終末でのシナプス小胞の供給を維持する役割を果たす、脳組織に見られるタンパク質を指す。ヒトにおいて、ＳＣＮＡ遺伝子は４番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＳＣＮＡ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_001139527.1によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、ＳＣＮＡ遺伝子は、配列番号１に示される配列を含む。
【００３１】
ＳＣＮＡを標的とする阻害性核酸は、長さが６〜５０ヌクレオチドである相補性の領域（例えば、ＳＣＮＡなどの標的遺伝子にハイブリダイズする阻害性核酸の領域）を含み得る。いくつかの態様において、阻害性核酸は、長さが約６〜３０、約８〜２０、または約１０〜１９ヌクレオチドの、ＳＣＮＡと相補的な領域を含む。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ＳＣＮＡ配列の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の連続したヌクレオチドと相補的である。
【００３２】
本開示の側面は、ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質（例えば、ＳＣＮＡ遺伝子の遺伝子産物）を標的とする１つ以上の干渉核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＴＭＥＭ１０６Ｂタンパク質は、樹状突起の形態形成とリソソーム輸送の調節に関与するタンパク質である、膜貫通タンパク質１０６Ｂを指す。ヒトにおいて、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子は７番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_060844.2によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、ＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子は、配列番号２に示される配列を含む。
【００３３】
ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする阻害性核酸は、６〜５０ヌクレオチド長である相補性の領域（例えば、ＴＭＥＭ１０６Ｂなどの標的遺伝子にハイブリダイズする阻害性核酸の領域）を含み得る。いくつかの態様において、阻害性核酸は、長さが約６〜３０、約８〜２０、または約１０〜１９ヌクレオチドの、ＴＭＥＭ１０６Ｂと相補的な領域を含む。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ＴＭＥＭ１０６Ｂ配列の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の連続したヌクレオチドと相補的である。
【００３４】
本開示の側面は、リボソームタンパク質ｓ２５（ＲＰＳ２５）（例えば、ＲＰＳ２５の遺伝子産物）を標的とする１つ以上の干渉核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＲＰＳ２５タンパク質は、タンパク質合成に関与するタンパク質複合体であるｓ４０リボソームのサブユニットである、リボソームタンパク質を指す。ヒトにおいて、ＲＰＳ２５遺伝子は１１番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＲＰＳ２５遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_001019.1によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、ＲＰＳ２５遺伝子は、配列番号３６に示される配列を含む。
【００３５】
ＲＰＳ２５を標的とする阻害性核酸は、６〜５０ヌクレオチド長である相補性の領域（例えば、ＲＰＳ２５などの標的遺伝子にハイブリダイズする阻害性核酸の領域）を含み得る。いくつかの態様において、阻害性核酸は、長さが約６〜３０、約８〜２０、または約１０〜１９ヌクレオチドの、ＲＰＳ２５と相補的な領域を含む。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ＲＰＳ２５配列の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したヌクレオチドと相補的である。
【００３６】
本開示の側面は、微小管関連タンパク質タウ、ＭＡＰＴ（例えば、ＭＡＰＴ遺伝子の遺伝子産物）を標的とする１つ以上の干渉核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ａｍｉＲＮＡなど）をコードする発現構築物を含む、単離された核酸に関する。ＭＡＰＴタンパク質は、微小管安定化に関与するタンパク質である微小管関連タンパク質タウを指す。ヒトにおいて、ＭＡＰＴ遺伝子は１７番染色体上に位置する。いくつかの態様において、ＭＡＰＴ遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列NP_005901.2によって表されるペプチドをコードする。いくつかの態様において、ＭＡＰＴ遺伝子は、配列番号３７に示される配列を含む。
【００３７】
ＭＡＰＴを標的とする阻害性核酸は、６〜５０ヌクレオチド長である相補性の領域（例えば、ＭＡＰＴなどの標的遺伝子にハイブリダイズする阻害性核酸の領域）を含み得る。いくつかの態様において、阻害性核酸は、長さが約６〜３０、約８〜２０、または約１０〜１９ヌクレオチドの、ＭＡＰＴと相補的な領域を含む。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ＭＡＰＴ配列の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５の連続したヌクレオチドと相補的である。
【００３８】
いくつかの側面において、本開示は、第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物をコードする発現構築物を含む、単離された核酸を提供し、ここで各遺伝子産物は独立して、表１に示される遺伝子産物またはその一部から選択される。
【００３９】
いくつかの態様において、遺伝子産物は、天然に存在する遺伝子のコード部分（例えば、ｃＤＮＡ）によってコードされる。いくつかの態様において、第１の遺伝子産物は、ＧＢＡ１遺伝子によってコードされるタンパク質（またはその断片）である。いくつかの態様において、遺伝子産物は、ＰＤ関連遺伝子（例えばＳＣＮＡ）を標的とする（これにハイブリダイズする、またはこれと相補的な領域を含む）阻害性核酸である。当業者は、第１の遺伝子産物（例えば、Ｇｃａｓｅ）および第２の遺伝子産物（例えば、ＳＣＮＡを標的とする阻害性ＲＮＡ）の発現の順序は、一般的に逆転され得ることを認識する（例えば、阻害性ＲＮＡが第１の遺伝子産物であり、Ｇｃａｓｅが第２の遺伝子産物である）。いくつかの態様において、遺伝子産物は、表１に列挙された遺伝子の断片（例えば、一部）である。タンパク質断片は、表１に列挙された遺伝子によってコードされるタンパク質の、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％または約９９％を含み得る。いくつかの態様において、タンパク質断片は、表１に列挙された遺伝子によってコードされるタンパク質の５０％〜９９．９％（例えば、５０％〜９９．９％の間の任意の値）を含む。いくつかの態様において、遺伝子産物（例えば、阻害性ＲＮＡ）は、標的遺伝子の一部にハイブリダイズする（例えば、ＳＣＮＡなどの標的遺伝子の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、またはそれ以上の連続したヌクレオチドに相補的である）。
【００４０】
いくつかの態様において、発現構築物はモノシストロニックである（例えば、発現構築物は、第１の遺伝子産物および第２の遺伝子産物を含む単一の融合タンパク質をコードする）。いくつかの態様において、発現構築物はポリシストロニックである（例えば、発現構築物は、２つの異なる遺伝子産物、例えば２つの異なるタンパク質またはタンパク質断片をコードする）。
【００４１】
ポリシストロニックな発現ベクターは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、またはそれ以上）のプロモーターを含み得る。任意の適切なプロモーター、例えば、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、内因性プロモーター、組織特異的プロモーター（例えば、ＣＮＳ特異的プロモーター）などを使用することができる。いくつかの態様において、プロモーターは、ニワトリベータ−アクチンプロモーター（ＣＢＡプロモーター）、ＣＡＧプロモーター（例えば、Alexopoulou et al. (2008) BMC Cell Biol. 9:2; doi: 10.1186/1471-2121-9-2に記載のもの）、ＣＤ６８プロモーター、またはＪｅＴプロモーター（例えばTornoe et al. (2002) Gene 297(1-2):21-32に記載のもの）である。いくつかの態様において、プロモーターは、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、または第１の遺伝子産物と第２の遺伝子産物をコードする核酸配列に、作動可能に連結されている。いくつかの態様において、発現カセットは１つ以上の追加の調節配列を含み、これには、限定することなく、転写因子結合配列、イントロンスプライス部位、ポリ（Ａ）付加部位、エンハンサー配列、リプレッサー結合部位、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００４２】
いくつかの態様において、第１の遺伝子産物をコードする核酸配列と第２の遺伝子産物をコードする核酸配列は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする核酸配列によって分離されている。ＩＲＥＳ部位の例は、例えば、Mokrejs et al. (2006) Nucleic Acids Res. 34(Database issue):D125-30に記載されている。いくつかの態様において、第１の遺伝子産物をコードする核酸配列と第２の遺伝子産物をコードする核酸配列は、自己切断型ペプチドをコードする核酸配列によって分離されている。自己切断型ペプチドの例には、限定はされないが、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、Ｅ２Ａ、Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ ２Ａ、およびＢｍＩＦＶ ２Ａ、およびLiu et al. (2017) Sci Rep. 7: 2193に記載されたものが含まれる。いくつかの態様において、自己切断型ペプチドはＴ２Ａペプチドである。
【００４３】
病理学的には、ＰＤおよびゴーシェ病などの疾患は、α−シヌクレイン（α−Ｓｙｎ）タンパク質で主に構成されるタンパク質凝集体の蓄積に関連する。したがって、いくつかの態様において、本明細書に記載の単離された核酸は、α−Ｓｙｎタンパク質の発現を低減または防止する阻害性核酸を含む。阻害性核酸をコードする配列は、発現ベクターの非翻訳領域（例えば、イントロン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲなど）に配置され得る。
【００４４】
いくつかの態様において、阻害性核酸は、発現構築物のイントロン、例えば、第１の遺伝子産物をコードする配列の上流のイントロンに配置される。阻害性核酸は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、人工ｍｉＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）、またはＲＮＡアプタマーであることができる。一般に阻害性核酸は、標的ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）に隣接する約６〜約３０（例えば、両端を含む６〜３０の間の任意の整数）のヌクレオチドに結合する（例えば、ハイブリダイズする）。いくつかの態様において、阻害性核酸分子は、ｍｉＲＮＡまたはａｍｉＲＮＡ、例えば、ＳＮＣＡ（α−Ｓｙｎタンパク質をコードする遺伝子）を標的とするｍｉＲＮＡである。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡは、それがハイブリダイズするＳＮＣＡのｍＲＮＡの領域とのいかなるミスマッチも含まない（例えば、ｍｉＲＮＡは「完全」である）。いくつかの態様において、阻害性核酸は、ｓｈＲＮＡ（例えば、ＳＮＣＡを標的とするｓｈＲＮＡ）である。
【００４５】
いくつかの態様において、阻害性核酸は、人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）である。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は典型的には、植物および動物に見られる小さな非コードＲＮＡを指し、遺伝子発現の転写および翻訳後調節に機能する。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されて、プリｍｉＲＮＡと呼ばれるヘアピンループ構造を形成する；これは、その後酵素（Drosha、Pasha、スプライセオソームなど）によって処理されてプレｍｉＲＮＡヘアピン構造を形成し、これは次にダイサーにより処理されて、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖（＊はｍｉＲＮＡ二重鎖のパッセンジャー鎖を示す）を形成し、その一方の鎖は次にＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれる。いくつかの態様において、本明細書に記載の阻害性ＲＮＡは、ＳＣＮＡまたはＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とするｍｉＲＮＡである。
【００４６】
いくつかの態様において、ＳＣＮＡを標的とする阻害性核酸は、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖は、配列番号３〜８のいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のｍｉＲＮＡ＊鎖は、配列番号３〜８のいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれからなる。
【００４７】
いくつかの態様において、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする阻害性核酸は、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖を含む。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のｍｉＲＮＡ鎖は、配列番号９または１０に示される配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの態様において、ｍｉＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ＊二重鎖のｍｉＲＮＡ＊鎖は、配列番号９または１０に示される配列を含むか、またはそれからなる。
【００４８】
人工マイクロＲＮＡ（ａｍｉＲＮＡ）は、天然のｍｉＲＮＡを修飾して、プレｍＲＮＡの天然の標的化領域を目的の標的化領域で置き換えることにより誘導される。たとえば、天然に発現するｍｉＲＮＡを足場または骨格（たとえば、プリｍｉＲＮＡ足場）として使用でき、ステム配列を、目的遺伝子を標的とするｍｉＲＮＡのそれに置き換える。人工前駆体マイクロＲＮＡ（プレａｍｉＲＮＡ）は、通常、単一の安定した低分子ＲＮＡが優先的に生成されるように処理される。いくつかの態様において、本明細書に記載のｓｃＡＡＶベクターおよびｓｃＡＡＶは、ａｍｉＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの態様において、ａｍｉＲＮＡのプリｍｉＲＮＡ足場は、プリＭＩＲ−２１、プリＭＩＲ−２２、プリＭＩＲ−２６ａ、プリＭＩＲ−３０ａ、プリＭＩＲ−３３、プリＭＩＲ−１２２、プリＭＩＲ−３７５、プリＭＩＲ−１９９、プリＭＩＲ−９９、プリＭＩＲ−１９４、プリＭＩＲ−１５５、およびプリＭＩＲ−４５１からなる群から選択されるプリｍｉＲＮＡに由来する。いくつかの態様において、ａｍｉＲＮＡは、例えばFowler et al. Nucleic Acids Res. 2016 Mar 18; 44(5): e48に記載されているように、ＳＣＮＡまたはＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とする核酸配列、およびｅＳＩＢＲ ａｍｉＲＮＡ足場を含む。
【００４９】
いくつかの態様において、ＳＣＮＡを標的とするａｍｉＲＮＡは、配列番号１７〜２２のいずれか１つに示される配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様において、ＴＭＥＭ１０６Ｂを標的とするａｍｉＲＮＡは、配列番号１１または１２に示される配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様において、ＲＰＳ２５を標的とするａｍｉＲＮＡは、配列番号３８〜４５に示される配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様において、ＭＡＰＴを標的とするａｍｉＲＮＡは、配列番号４６〜６１に示される配列を含むかまたはそれからなる。
【００５０】
本明細書に記載の単離された核酸は、それ自体で、またはベクターの一部として存在し得る。一般にベクターは、プラスミド、コスミド、ファージミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはウイルスベクター（例えば、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、バキュロウイルスベクターなど）である。いくつかの態様において、ベクターは、プラスミド（例えば、本明細書に記載の単離された核酸を含むプラスミド）である。いくつかの態様において、ベクターは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターである。いくつかの態様において、ベクターは、バキュロウイルスベクター（例えば、Autographa californica核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクター）である。
【００５１】
典型的には、ｒＡＡＶベクター（例えば、ｒＡＡＶゲノム）は、２つのＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接した、導入遺伝子（例えば、以下の各々の１つ以上を含む発現構築物：プロモーター、イントロン、エンハンサー配列、タンパク質コード配列、阻害性ＲＮＡコード配列、ポリＡテール配列など）を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子は、本開示に記載の単離された核酸を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターの２つのＩＴＲ配列のそれぞれは、完全長ＩＴＲ（例えば、長さが約１４５ｂｐであり、機能的Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を含む）である。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターのＩＴＲの１つは、切断されている（例えば、短縮されているかまたは完全長ではない）。いくつかの態様において、切断型ＩＴＲは、機能的末端分解部位（ｔｒｓ）を欠き、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶベクター）の生成のために使用される。いくつかの態様において、切断型ＩＴＲは、例えば、McCarty et al. (2003) Gene Ther. 10(26):2112-8に記載のΔＩＴＲである。
【００５２】
本開示の側面は、野生型ＡＡＶ ＩＴＲと比べて、例えば野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲ（例えば、配列番号１６）と比べて、１つ以上の修飾（例えば、核酸の追加、欠失、置換など）を有するＩＴＲを含む、単離された核酸（例えば、ｒＡＡＶベクター）に関する。野生型ＡＡＶ２ ＩＴＲの構造を、図１６に示す。一般に野生型ＩＴＲは、自己アニーリングして回文構造の二本鎖Ｔ型ヘアピン構造（これは、２つのクロスアーム（それぞれＢ／Ｂ’およびＣ／Ｃ’と呼ばれる配列によって形成される）、より長いステム領域（配列Ａ／Ａ’によって形成される）、および「Ｄ」領域と呼ばれる一本鎖末端領域からなる）を形成する、１２５ヌクレオチドの領域を含む（図１６）。一般に、ＩＴＲの「Ｄ」領域は、Ａ／Ａ’配列によって形成されるステム領域と、ｒＡＡＶベクターの導入遺伝子を含むインサートの間に配置される（例えば、ＩＴＲの末端に対してＩＴＲの「内側」に配置されるか、またはｒＡＡＶベクターの導入遺伝子インサートもしくは発現構築物の近位に配置される）。いくつかの態様において、「Ｄ」領域は、配列番号１４に示される配列を含む。「Ｄ」領域は、例えば、Ling et al. (2015) J Mol Genet Med 9(3)に開示されるように、カプシドタンパク質によるｒＡＡＶベクターのカプシド形成において重要な役割を果たすことが観察されている。
【００５３】
本開示は、部分的に、ＩＴＲの「外側」に位置する「Ｄ」領域（例えば、導入遺伝子インサートまたは発現構築物に対してＩＴＲの末端に近い）を含むｒＡＡＶベクターが、修飾されていない（例えば、野生型の）ＩＴＲを有するｒＡＡＶベクターよりも、ＡＡＶカプシドタンパク質によって効率的にカプシド化されるという、驚くべき発見に基づいている。いくつかの態様において、修飾された「Ｄ」領域を有するｒＡＡＶベクターは、野生型ＩＴＲ配列を有するｒＡＡＶベクターと比べて、毒性が減少している。
【００５４】
いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号１４）と比べて、少なくとも１つのヌクレオチド置換を含む。修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号１４）と比べて、少なくも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチド置換を有し得る。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号１３）と比べて、少なくも１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、または１９のヌクレオチド置換を含む。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、野生型「Ｄ」配列（例えば、配列番号１４）と、約１０％〜約９９％（例えば、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％）同一である。いくつかの態様において、修飾「Ｄ」配列は、Wang et al. (1995) J Mol Biol 250(5):573-80に記載のように、「Ｓ」配列とも呼ばれる配列番号１３に示される配列を含む。
【００５５】
本開示に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶベクターはさらに、例えば、配列番号１５に示されるような、またはFrancois, et al. 2005. The Cellular TATA Binding Protein Is Required for Rep-Dependent Replication of a Minimal Adeno-Associated Virus Type 2 p5 Element. J Virolに記載のような「ＴＲＹ」配列を含み得る。いくつかの態様において、ＴＲＹ配列は、単離された核酸またはｒＡＡＶベクターのＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）と発現構築物（例えば、導入遺伝子をコードするインサート）との間に配置される。
【００５６】
いくつかの側面において、本開示は、本開示に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶベクターを含む、バキュロウイルスベクターに関する。いくつかの態様において、バキュロウイルスベクターは、例えばUrabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43およびSmith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896に記載されるような、Autographa californica核多角体病（ＡｃＮＰＶ）ベクターである。
【００５７】
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の単離された核酸またはベクターを含む、宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。例えば宿主細胞は、哺乳動物細胞、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞などであり得る。いくつかの態様において、宿主細胞は哺乳動物細胞、例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は細菌細胞、例えば大腸菌細胞である。
【００５８】
ｒＡＡＶ
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の核酸をコードする導入遺伝子を含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）に関する（例えば、本明細書に記載のｒＡＡＶベクター）。「ｒＡＡＶ」という用語は一般に、１つ以上のＡＡＶカプシドタンパク質によってカプシド化されたｒＡＡＶベクターを含む、ウイルス粒子を指す。本開示に記載のｒＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶ１０から選択される血清型を有するカプシドタンパク質を含み得る。いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、非ヒト宿主由来のカプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．３９などのアカゲザルＡＡＶカプシドタンパク質を含む。いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶは、野生型カプシドタンパク質のバリアントであるカプシドタンパク質を含み、これは例えば、それが由来する野生型ＡＡＶカプシドタンパク質に対して、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０より多く（例えば、１５、２０、２５、５０、１００など）のアミノ酸置換（例えば、変異）を含む、カプシドタンパク質バリアントである。
【００５９】
いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶは、特にＣＳＦ空間にまたは直接脳実質に導入された場合に、ＣＮＳを通して容易に広がる。したがって、いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶは、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができるカプシドタンパク質を含む。例えば、いくつかの態様において、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ．１０血清型を有するカプシドタンパク質を含む。ｒＡＡＶの生成は、例えば、Samulski et al. (1989) J Virol. 63(9):3822-8 and Wright (2009) Hum Gene Ther. 20(7): 698-706に記載されている。
【００６０】
いくつかの態様において、本開示に記載のｒＡＡＶ（例えば、ＡＡＶカプシドタンパク質によってカプシド化されてｒＡＡＶカプシド粒子を形成する、組換えｒＡＡＶゲノムを含むもの）は、バキュロウイルスベクター発現系（ＢＥＶＳ）で生成される。ＢＥＶＳを使用したｒＡＡＶの生成は、例えば以下に記載されている：Urabe et al. (2002) Hum Gene Ther 13(16):1935-43、Smith et al. (2009) Mol Ther 17(11):1888-1896、米国特許第8,945,918号、米国特許第9,879,282号、および国際ＰＣＴ公開WO 2017/184879。しかしながらｒＡＡＶは、任意の適切な方法を使用して（例えば、組換えｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を使用して）生成され得る。
【００６１】
医薬組成物
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に記載の単離された核酸またはｒＡＡＶおよび薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物を提供する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容し得る」という用語は、化合物の生物活性または特性を無効にせず、比較的非毒性である担体または希釈剤などの材料を指し、例えば材料は、望ましくない生物学的影響を引き起こしたり、またはそれが含まれている組成物の任意の成分と有害な様式で相互作用したりすることなく、個体に投与し得る。
【００６２】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容し得る担体」とは、薬学的に許容し得る材料、組成物または担体、例えば、液体または固体の充填剤、安定剤、分散剤、懸濁剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶媒または封入材料などであって、本発明内で有用な化合物をそれが意図する機能を果たすことができるように患者内にまたは患者に運ぶかまたは輸送することに関連するものを、意味する。本発明の実施において使用される医薬組成物に含まれ得るさらなる成分は、当該分野で知られており、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA)に記載されている；これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
本明細書で提供される組成物（例えば、医薬組成物）は、以下を含む任意の経路で投与することができる：経腸（例えば、経口）、非経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、皮下、脳室内、経皮、皮内、直腸、膣内、腹腔内、局所的（粉末、軟膏、クリーム、および／または滴剤による）、粘膜、鼻腔、頬側、舌下；気管内注入、気管支注入、および／または吸入；および／または経口スプレー、鼻スプレー、および／またはエアロゾルとして。具体的に企図される経路は、経口投与、静脈内投与（例えば、全身静脈内注射）、血液および／またはリンパ供給による局所投与、および／または罹患部位への直接投与である。一般に、最も適切な投与経路は、様々な因子、例えば薬剤の性質（例えば、胃腸管の環境におけるその安定性）、および／または対象の状態（例えば、対象が経口投与に耐えることができるかどうか）などに依存するであろう。特定の態様において、本明細書に記載の化合物または医薬組成物は、対象の眼への局所投与に適している。
【００６４】
方法
本開示は、部分的に、パーキンソン病を処置するために一緒に（例えば、相乗的に）作用する、対象におけるＰＤ関連遺伝子産物の組み合わせの発現のための組成物に基づく。本明細書で使用される場合、「処置する」または「処置すること」とは、（ａ）パーキンソン病の発症を予防または遅延させること；（ｂ）パーキンソン病の重症度を軽減すること；（ｃ）パーキンソン病に特徴的な症状の発症を軽減または防止すること；（ｄ）パーキンソン病に特徴的な症状の悪化を防ぐこと、を指す。パーキンソン病の症状には、例えば、運動機能障害（例えば、震え、硬直、動きの鈍さ、歩行困難）、認知機能障害（例えば、認知症、うつ病、不安症）、感情的および行動的機能障害が含まれる。
【００６５】
したがって、いくつかの側面において、本開示は、パーキンソン病を有するかまたは有すると疑われる対象を処置する方法を提供し、該方法は、対象に、本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）を投与することを含む。
【００６６】
いくつかの態様において、組成物は、対象のＣＮＳに直接、例えば対象の脳および／または脊髄への直接注射によって、投与される。ＣＮＳ直接投与法の例には、限定はされないが、脳内注射、脳室内注射、大槽内注射、実質内注射、髄腔内注射、および前述の任意の組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対象の中脳、線条体および／または大脳皮質における、導入遺伝子発現（例えば、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、および該当する場合は第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。いくつかの態様において、ＣＮＳへの直接注射は、対象の脊髄および／またはＣＳＦにおける、導入遺伝子発現（例えば、第１の遺伝子産物、第２の遺伝子産物、および該当する場合は第３の遺伝子産物の発現）をもたらす。
【００６７】
いくつかの態様において、対象のＣＮＳへの直接注射は、対流強化送達（ＣＥＤ）を含む。対流強化送達は、脳の外科的露出および小径カテーテルを脳の標的領域に直接配置し、続いて治療剤（例えば、本明細書に記載の組成物またはｒＡＡＶ）を対象の脳に直接注入することを含む、治療戦略である。ＣＥＤは、例えば、Debinski et al. (2009) Expert Rev Neurother. 9(10):1519-27に記載されている。
【００６８】
いくつかの態様において、組成物は、例えば末梢注射により、対象の末梢に投与される。末梢注射の例には、皮下注射、静脈内注射、動脈内注射、腹腔内注射、またはこれらの任意の組み合わせが含まれる。いくつかの態様において、末梢注射は、動脈内注射、例えば対象の頸動脈への注射である。
【００６９】
いくつかの態様において、本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、対象のＣＮＳに末梢および直接の両方で投与される。例えば、いくつかの態様において、対象は、動脈内注射（例えば、頸動脈への注射）および実質内注射（例えば、ＣＥＤによる実質内注射）によって、組成物を投与される。いくつかの態様において、ＣＮＳへの直接注射および末梢注射は同時である（例えば、同時に起こる）。いくつかの態様において、直接注射は、末梢注射の前（例えば、１分から１週間の間、またはそれより前）に行われる。いくつかの態様において、直接注射は、末梢注射の後（例えば、１分から１週間の間、またはその後）に行われる。
【００７０】
対象に投与される本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）の量は、投与方法に応じて変化するであろう。例えば、いくつかの態様において、本明細書に記載のｒＡＡＶは、対象に、約１０９ゲノムコピー（ＧＣ）／ｋｇと約１０１４ＧＣ／ｋｇの間（例えば、約１０９ＧＣ／ｋｇ、約１０１０ＧＣ／ｋｇ、約１０１１ＧＣ／ｋｇ、約１０１２ＧＣ／ｋｇ、約１０１２ＧＣ／ｋｇ、または約１０１４ＧＣ／ｋｇ）の力価で投与される。いくつかの態様において、対象は、高力価（例えば、＞１０１２ゲノムコピーＧＣ／ｋｇのｒＡＡＶ）を、ＣＳＦ空間への注射により、または実質内注射により投与される。
【００７１】
本開示に記載の組成物（例えば、単離された核酸またはベクターまたはｒＡＡＶを含む組成物）は、対象に１回または複数回（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、またはそれ以上）投与され得る。いくつかの態様において、組成物は対象に継続的に（例えば、慢性的に）、例えば注入ポンプを介して、投与される。
【実施例】
【００７２】
例１：ｒＡＡＶベクター
ＡＡＶベクターは、トリプルプラスミドトランスフェクション用のＨＥＫ２９３細胞などの細胞を使用して生成される。ＩＴＲ配列は、目的の各導入遺伝子のプロモーター／エンハンサー要素、３’ポリＡシグナル、およびＷＰＲＥ要素等の翻訳後シグナルを含む発現構築物に隣接している。複数の遺伝子産物、例えばＧＢＡ１および1つ以上の阻害性核酸（例えば、ＳＣＮＡを標的とする阻害性核酸）などを、例えば２つの別々の発現カセットでの発現により、同時に発現させることができる。発現された遺伝子の上流で効率的にスプライシングされる短いイントロン配列の存在は、発現レベルを改善することができる。ｓｈＲＮＡおよび他の調節ＲＮＡは、これらの配列内に含まれる可能性がある。本開示に記載の発現構築物の例を、図１〜１３および１８〜２４、ならびに下の表２に示す。
【００７３】
【表２】
2020537542.tif 000004
【００７４】
例２：ＧＢＡ欠損細胞へのウイルス形質導入の、細胞ベースのアッセイ
ＧＢＡ１が欠損した細胞は、例えばＧＤ患者からの線維芽細胞、単球、またはｈＥＳ細胞、または患者由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）として取得される。これらの細胞は、グルコシルセラミドおよびグルコシルスフィンゴシン（ＧｌｕＣｅｒおよびＧｌｕＳｐｈ）などの基質を蓄積する。野生型または変異培養細胞株のＣＢＥなどのＧｃａｓｅ阻害剤による処理も、ＧＢＡ欠損細胞を得るために使用される。
【００７５】
かかる細胞モデルを使用して、リソソームの欠陥（lysosomal defects）を、α−シヌクレインなどのタンパク質凝集体の蓄積の観点からこのタンパク質に対する抗体またはホスホ−αＳｙｎを用いて定量化し、続いて蛍光顕微鏡を使用して画像化する。ＬＡＭＰ１、ＬＡＭＰ２、ＬＩＭＰ１、ＬＩＭＰ２などのタンパク質マーカーのＩＣＣによる、またはLysotrackerなどの色素を使用した、または蛍光デキストランもしくは他のマーカーのエンドサイトーシスコンパートメントを介した取り込みによる、リソソーム異常の画像化も実施する。ＬＣ３などのリソソームとの融合の欠陥によるオートファジーマーカーの蓄積の画像化も、実施可能である。ウエスタンブロッティングおよび／またはＥＬＩＳＡを使用して、これらのマーカーの異常な蓄積を定量化する。また、糖脂質基質およびＧＢＡ１の産物の蓄積は、標準的なアプローチを使用して測定する。
治療のエンドポイント（ＰＤ関連の病状の軽減など）は、ＡＡＶベクターの形質導入の発現の文脈において測定し、活性および機能を確認および定量化する。Ｇｃａｓｅは、タンパク質ＥＬＩＳＡ測度を使用して、または標準のＧｃａｓｅ活性アッセイによっても定量化することができる。
【００７６】
例３：変異マウスを使用したin vivoアッセイ
この例では、変異マウスを使用したＡＡＶベクターのin vivoアッセイについて記載する。変異マウスにおける上記のようなＡＡＶベクターのin vivo研究は、例えば、Liou et al. (2006) J. Biol. Chem. 281(7): 4242-4253、Sun et al. (2005) J. Lipid Res. 46:2102-2113、およびFarfel-Becker et al. (2011) Dis. Model Mech. 4(6):746-752に記載されたアッセイを使用して実施する。
ビヒクル対照およびＡＡＶベクターの髄腔内または脳室内送達（例えば、２×１０１１ｖｇ／マウスの用量）は、濃縮ＡＡＶストックを使用して、例えば５〜１０μＬの注入量で行う。対流強化送達による実質内送達を行う。
処置は、症状の発症前、または発症後に開始する。測定するエンドポイントは、ＣＮＳおよびＣＳＦにおける基質の蓄積、ＥＬＩＳＡによるＧｃａｓｅ酵素の蓄積、および酵素活性の蓄積、運動および認知エンドポイント、リソソーム機能障害、およびα−シヌクレインモノマー、プロトフィブリルまたはフィブリルの蓄積である。
【００７７】
例４：疾患の化学的モデル
この例では、ゴーシェ病の化学的誘発マウスモデル（ＣＢＥマウスモデルなど）を使用した、ＡＡＶベクターのin vivoアッセイについて記載する。これらのＡＡＶベクターのin vivo研究は、例えばVardi et al. (2016) J Pathol. 239(4):496-509に記載のように、ゴーシェ病の化学的誘発マウスモデルで実施される。
ビヒクル対照とＡＡＶベクターの髄腔内または脳室内送達（例えば、２×１０１１ｖｇ／マウスの用量）は、濃縮されたＡＡＶストックを使用して、例えば５〜１０μＬの注入量で行う。対流強化送達による実質内送達を行う。末梢送達は、尾静脈注射によって達成する。
処置は、症状の発症前、または発症後に開始する。測定するエンドポイントは、ＣＮＳおよびＣＳＦにおける基質の蓄積、ＥＬＩＳＡによるＧｃａｓｅ酵素の蓄積、および酵素活性の蓄積、運動および認知エンドポイント、リソソーム機能障害、およびα−シヌクレインモノマー、プロトフィブリルまたはフィブリルの蓄積である。
【００７８】
例５：ＰＤ、ＬＢＤ、ゴーシェ病の患者の臨床試験
いくつかの態様において、特定の形態のゴーシェ病（例えば、ＧＤ１）を有する患者は、パーキンソン病（ＰＤ）またはレビー小体型認知症（ＬＢＤ）を発症するリスクが高い。この例では、ゴーシェ病、ＰＤおよび／またはＬＢＤを有する患者における、本開示に記載のｒＡＡＶの安全性および有効性を評価するための臨床試験を記載する。
ゴーシェ病、ＰＤおよび／またはＬＢＤの処置のためのかかるベクターの臨床試験は、Grabowski et al. (1995) Ann. Intern. Med. 122(1):33-39に記載されているものと同様の研究デザインを使用して実施する。
【００７９】
例６：末梢疾患の処置
いくつかの態様において、特定の形態のゴーシェ病を有する患者は、例えば、Biegstraaten et al. (2010) Brain 133(10):2909-2919に記載のように、末梢神経障害の症状を示す。
この例は、ゴーシェ病（例えば、１型ゴーシェ病）に関連する末梢神経障害の処置のための、本明細書に記載のＡＡＶベクターのin vivoアッセイを記載する。簡潔に述べると、末梢神経障害の兆候または症状を有すると同定された１型ゴーシェ病患者に、本開示に記載のようにｒＡＡＶを投与する。いくつかの態様において、対象の末梢神経障害の兆候および症状を、例えば、Biegstraatenらに記載されている方法を使用して、ｒＡＡＶの投与後に監視する。
患者（例えば、患者の血清、末梢組織（例えば、肝臓組織、脾臓組織など））に存在する本開示に記載の形質導入された遺伝子産物のレベルを、例えばウエスタンブロット分析、酵素機能アッセイ、または画像検査によりアッセイする。
【００８０】
例７：ＣＮＳ型の処置
この例では、ＣＮＳ型ゴーシェ病の処置のための、本明細書に記載のｒＡＡＶのin vivoアッセイを記載する。簡潔に述べると、ＣＮＳ型のゴーシェ病（例えば、２型または３型ゴーシェ病）を有すると同定されたゴーシェ病患者に、本開示に記載のようにｒＡＡＶを投与する。患者のＣＮＳ（例えば、患者のＣＮＳの血清中、患者の脳脊髄液（ＣＳＦ）中、または患者のＣＮＳ組織中）に存在する本開示に記載の形質導入された遺伝子産物のレベルを、例えばウエスタンブロット分析、酵素機能アッセイ、または画像検査によりアッセイする。
【００８１】
例８：ＳＣＮＡおよびＴＭＥＭ１０６Ｂ ｓｈＲＮＡ構築物の試験
ＨＥＫ２９３細胞
ヒト胚性腎臓２９３細胞株（ＨＥＫ２９３）をこの研究で使用した（#85120602, Sigma-Aldrich）。ＨＥＫ２９３細胞は、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（#15140122, Thermo Fisher Scientific）を含有する培地（Ｄ−ＭＥＭ［#11995065, Thermo Fisher Scientific］に１０％ウシ胎児血清［ＦＢＳ］［#10082147, Thermo Fisher Scientific］を補充）で維持した。
【００８２】
プラスミドトランスフェクション
プラスミドのトランスフェクションを、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬（#11668019, Thermo Fisher Scientific）を使用し、製造元の指示に従って実施した。簡潔に述べると、ＨＥＫ２９３細胞（#12022001, Sigma-Aldrich）を、３×１０５細胞／ｍｌの密度で抗生物質を含まない培地にプレーティングした。翌日、プラスミドおよびLipofectamine 2000試薬をOpti-MEM溶液（#31985062, Thermo Fisher Scientific）に混合した。５分後、混合物をＨＥＫ２９３培養物に加えた。７２時間後、細胞を、ＲＮＡまたはタンパク質の抽出のために回収するか、または画像解析を行った。画像分析のために、プレートを０．０１％のポリ−Ｌ−リジン溶液（P8920, Sigma-Aldrich）で、細胞をプレーティングする前にプレコートした。
【００８３】
定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）による遺伝子発現解析
相対遺伝子発現レベルは、Power SYBR Green Cells-to-CTキット（#4402955, Thermo Fisher Scientific）を使用した定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により、製造元の指示に従って決定した。候補プラスミドを、４８ウェルプレート（７．５×１０４細胞／ウェル）にプレーティングしたＨＥＫ２９３細胞に、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬（５０μｌのOpti-MEM溶液中、０．５μｇのプラスミドおよび１．５μｌの試薬）を使用して、一時的にトランスフェクションした。７２時間後、ＲＮＡを細胞から抽出し、製造元の指示に従って逆転写に使用してｃＤＮＡを合成した。定量的ＰＣＲ分析では、２〜５μｌのｃＤＮＡ産物を、遺伝子特異的プライマーペア（最終濃度２５０ｎＭ）を使用して、Power SYBR Green PCR Master Mix（#4367659, Thermo Fisher Scientific）でデュプリケートに増幅した。ＳＮＣＡ、ＴＭＥＭ１０６Ｂ、およびＧＡＰＤＨ遺伝子のプライマー配列は以下である：ＳＮＣＡについて、５’−ＡＡＧ ＡＧＧ ＧＴＧ ＴＴＣ ＴＣＴ ＡＴＧ ＴＡＧ ＧＣ−３’（配列番号６４）、５’−ＧＣＴ ＣＣＴ ＣＣＡ ＡＣＡ ＴＴＴ ＧＴＣ ＡＣＴ Ｔ−３’（配列番号６５）；ＴＭＥＭ１０６Ｂについて、５’−ＡＣＡ ＣＡＧ ＴＡＣ ＣＴＡ ＣＣＧ ＴＴＡ ＴＡＧ ＣＡ−３’（配列番号６６）、５’−ＴＧＴ ＴＧＴ ＣＡＣ ＡＧＴ ＡＡ ＴＴＧ ＣＡＴ ＣＡ−３’（配列番号６７）；およびＧＡＰＤＨについて、５’−ＣＴＧ ＧＧＣ ＴＡＣ ＡＣＴ ＧＡＧ ＣＡＣ Ｃ−３’（配列番号６８）、５’−ＡＡＧ ＴＧＧ ＴＣＧ ＴＣＧ ＡＧＧ ＧＣＡ ＡＴＧ−３’（配列番号６９）。定量的ＰＣＲは、QuantStudio 3リアルタイムＰＣＲシステム（Thermo Fisher Scientific）で実施した。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨによって正規化し、比較ＣＴ法を使用して算出した。
【００８４】
蛍光画像分析
ヒトＳＮＣＡ遺伝子の３’−ＵＴＲをＥＧＦＰコード領域の下流に含むＥＧＦＰレポータープラスミドを使用して、ＳＮＣＡおよびＴＭＥＭ１０６Ｂノックダウンプラスミドを検証した。ＥＧＦＰレポータープラスミドおよび候補ノックダウンプラスミドを、ポリ−Ｌ−リジンを被覆した９６ウェルプレート（３．０×１０４細胞／ウェル）上にプレーティングしたＨＥＫ２９３細胞に、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬（１０μｌのOpti-MEM溶液中、０．０４μｇのレポータープラスミド、０．０６μｇのノックダウンプラスミドおよび０．３μｌの試薬）を使用して、同時にトランスフェクトした。７２時間後、ＥＧＦＰシグナルの蛍光強度を、励起４８８ｎｍ／発光５１２ｎｍで、Varioskan LUXマルチモードリーダー（Thermo Fisher Scientific）を使用して測定した。細胞を、４％ＰＦＡで室温で１０分間固定し、４０μｇ／ｍｌの７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）を含むＤ−ＰＢＳで、室温で３０分間インキュベートした。Ｄ−ＰＢＳで洗浄した後、７−ＡＡＤシグナルの蛍光強度を、励起５４６ｎｍ／発光６４７ｎｍでVarioskanリーダーを使用して測定し、細胞数を定量化した。７−ＡＡＤシグナルレベルあたりの正規化ＥＧＦＰシグナルを、対照のノックダウン試料と比較した。
【００８５】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ヒトＳＮＣＡ遺伝子またはＴＭＥＭ１０６Ｂ遺伝子の３’−ＵＴＲをＳＮＣＡコード領域の下流に含む、α−シヌクレインレポータープラスミドを使用して、タンパク質レベルでのノックダウンプラスミドを検証した。α−シヌクレインタンパク質のレベルを、ＨＥＫ２９３細胞から抽出した細胞溶解物を使用して、ＥＬＩＳＡ（#KHB0061, Thermo Fisher Scientific）で測定した。候補プラスミドを、４８ウェルプレート（７．５×１０４細胞／ウェル）にプレーティングしたＨＥＫ２９３細胞に、Lipofectamine 2000トランスフェクション試薬（２５μｌのOpti-MEM溶液中、０．１μｇのレポータープラスミド、０．１５μｇのノックダウンプラスミド、および０．７５μｌの試薬）を使用して、一時的にトランスフェクトした。７２時間後、細胞を、プロテアーゼ阻害剤カクテル（#P8340, Sigma-Aldrich）を補充したラジオイムノ沈降アッセイ（ＲＩＰＡ）バッファー（#89900, Thermo Fisher Scientific）に溶解し、数秒間超音波処理した。氷上で３０分間インキュベートした後、細胞溶解物を２０，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質レベルを定量化した。プレートを、Varioskanプレートリーダーで４５０ｎｍで読み取り、SoftMax Pro 5ソフトウェアを使用して濃度を算出した。測定されたタンパク質濃度は、ビシンコニン酸アッセイ（#23225, Thermo Fisher Scientific）で決定した総タンパク質濃度に対して正規化した。
【００８６】
図１４および表３は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上）およびα−Ｓｙｎアッセイ（下）による、in vitroでのＳＣＮＡの成功したサイレンシングを示す代表的なデータを示す。図１５および表４は、ＧＦＰレポーターアッセイ（上）およびα−Ｓｙｎアッセイ（下）による、in vitroでのＴＭＥＭ１０６Ｂの成功したサイレンシングを示す代表的なデータを示す。
【表３】
2020537542.tif 000005
【００８７】
【表４】
2020537542.tif 000006
【００８８】
例９：ＩＴＲ「Ｄ」配列の配置および細胞の形質導入
ＩＴＲ「Ｄ」配列の配置の、ｒＡＡＶベクターの細胞の形質導入に対する効果を調べた。ＨＥＫ２９３細胞は、ＧｃａｓｅをコードするｒＡＡＶであって、図２０に示すように１）野生型ＩＴＲ（例えば、導入遺伝子インサートの近位でＩＴＲの末端から遠位の「Ｄ」配列）、または２）ベクターの「外側」に位置する「Ｄ」配列（例えば、ＩＴＲの末端の近位で、導入遺伝子インサートの遠位に位置する「Ｄ」配列）を有するＩＴＲ、を有するものを用いて形質導入した。驚くべきことにデータは、「外側」の位置にある「Ｄ」配列を有するｒＡＡＶが、パッケージングされる能力を保持し、細胞を効率的に形質導入することを示している（図１７）。
【００８９】
均等物
本出願には、以下の文献の内容全体が参照により組み込まれる：２０１８年１０月３日に提出された代理人整理番号P1094.70002WO00により参照される国際ＰＣＴ出願；２０１８年１０月３日に提出された代理人整理番号P1094.70003WO00により参照される国際ＰＣＴ出願；２０１７年１０月３日に提出された米国仮出願第62/567,296号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」；２０１７年１０月３日に提出された第62/567,311号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」；２０１７年１０月３日に提出された第62/567,319号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」；２０１８年１０月３日に提出された第62/567,301号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」；２０１７年１０月３日に提出された第62/567,310号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」；２０１７年１０月３日に提出された第62/567,303号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」；および２０１７年１０月３日に提出された第62/567,305号、表題「ライソゾーム病の遺伝子治療」。
【００９０】
本発明の少なくとも１つの態様のいくつかの側面をこのように説明してきたが、様々な変更、修正、および改善が当業者には容易に思い浮かぶであろうことを理解されたい。かかる変更、修正、および改善は、この開示の一部であることが意図されており、本発明の精神および範囲の内にあることが意図されている。したがって、前述の説明および図面は、例示としてのみのものである。
【００９１】
本明細書では本発明のいくつかの態様を説明および図示してきたが、当業者は、本明細書に記載の機能を実行し、および／または結果および／または1つ以上の利点を取得するための、さまざまな他の手段および／または構造を容易に思い浮かべるであろうし、かかる変更および／または修正のそれぞれは、本発明の範囲内であると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成は、本発明の教示が使用される特定の用途（単数または複数）に依存することを、容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。したがって、前述の態様は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内で、本発明は、具体的に記載されおよび特許請求された以外の方法で実施できることを理解されたい。本発明は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、および／または方法を対象とする。さらに、２つ以上のかかる特徴、システム、物品、材料、および／または方法の任意の組み合わせは、かかる特徴、システム、物品、材料、および／または方法が相互に矛盾しない場合、本発明の範囲内に含まれる。
【００９２】
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「a」および「an」は、明確に逆が示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。
本明細書および特許請求の範囲で使用される「および／または」という語句は、そのように結合された要素の「いずれかまたは両方」、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素を意味すると理解すべきである。明確に逆が示されない限り、任意に他の要素も、「および／または」節で具体的に識別された要素以外に、具体的に識別された要素に関連するかどうかに関係なく存在し得る。したがって非限定的な例として、「含む」などのオープンエンドの言語と組み合わせて使用される場合の「Ａおよび／またはＢ」への言及は、一態様では、ＢなしでＡを指す（任意にＢ以外の要素を含む）ことができ；別の態様では、ＡなしでＢを指す（任意にＡ以外の要素を含む）ことができ；さらに別の態様では、ＡおよびＢの両方を指す（任意に他の要素を含む）ことができる；など。
【００９３】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「または」は、上記で定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分ける場合、「または」または「および／または」は、包括的、すなわち要素の数またはリストの少なくとも１つを含み、さらにまた複数も含み、および任意にリストされていない追加の項目を含むものとして解釈される。明確に逆の用語が示されている場合、例えば「１つのみ」または「正確に１つ」など、または特許請求の範囲で使用されている場合の「からなる」は、要素の数またはリストの正確に１つを含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「または」という用語は、排他性の用語、例えば「いずれか」、「１つ」または「１つのみ」、または「正確に１つ」が先行する場合には、排他的選択肢（すなわち、一方または他方だが、両方ではない）を指すとして解釈されるべきである。特許請求の範囲で使用される場合の「から本質的になる」は、特許法の分野で使用される通常の意味を有するものとする。
【００９４】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、１つ以上の要素のリストに関して「少なくとも１つ」という語句は、要素のリストの任意の１つ以上の要素から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されたい；ただし、要素のリスト内に具体的にリストされているすべてのそれぞれの要素の少なくとも１つを必ずしも含む必要はなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外することもない。この定義により、「少なくとも１つ」という句が参照する要素のリスト内で具体的に識別された要素以外の要素が、具体的に識別された要素に関連するかどうかに関係なく、任意に存在可能とされる。したがって、非限定的な例として、「ＡおよびＢの少なくとも１つ」（または、同等に、「ＡまたはＢの少なくとも１つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１つ」）は、一態様では、少なくとも１つ、任意に複数のＡを含み、Ｂが存在しない（および任意にＢ以外の要素を含む）；別の態様では、少なくとも１つ、任意に複数のＢを含み、Ａが存在しない（任意にＡ以外の要素を含む）；さらに別の態様では、少なくとも１つ、任意に複数のＡを含み、および少なくとも１つ、任意に複数のＢを含む（および任意に他の要素を含む）；など。
【００９５】
特許請求の範囲、および上記の明細書において、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「保持する（carrying）」、「有する」、「含有する」、「含む（involving）」、「保有する（holding）」などのすべての移行句は、オープンエンドとして、すなわち、限定することなく含むことを意味すると理解されたい。「からなる」および「本質的にからなる」という移行句のみが、米国特許庁の特許審査手続きマニュアルのSection 2111.03に記載されているように、それぞれクローズまたはセミクローズの移行句とする。
「第１」、「第２」、「第３」などの順序を示す用語の、クレーム要素を修飾するためのクレームにおける使用は、それ自体では、あるクレーム要素の他に対する優先権、先行、もしくは順序、または方法の行為が実行される時間的な順序を示すものではなく、しかし、特定の名前を有する一定のクレーム要素を、同じ名前（ただし順序用語のみが異なる）の別の要素から区別するためのラベルとしてのみ使用されて、クレーム要素を区別する。
明確に逆が示されない限り、１つ以上のステップまたは行為を含む本明細書で特許請求される任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は必ずしも、方法のステップまたは行為が示されている順序に限定されないことも、理解されるべきである。
【００９６】
配列
いくつかの態様において、１つ以上の遺伝子産物（例えば、第１、第２および／または第３の遺伝子産物）をコードする単離された核酸、ｒＡＡＶベクター、または遺伝子発現カセットは、配列番号１〜６９のいずれか１つに示される配列を含むか、またはそれからなる（または該配列を有するポリペプチドをコードする）。いくつかの態様において、遺伝子産物は、配列番号１〜６９のいずれか１つの一部（例えば、断片）によってコードされる。
【図１】
2020537542.tif 000007
【図２】
2020537542.tif 000008
【図３】
2020537542.tif 000009
【図４】
2020537542.tif 000010
【図５】
2020537542.tif 000011
【図６】
2020537542.tif 000012
【図７】
2020537542.tif 000013
【図８】
2020537542.tif 000014
【図９】
2020537542.tif 000015
【図１０】
2020537542.tif 000016
【図１１】
2020537542.tif 000017
【図１２】
2020537542.tif 000018
【図１３】
2020537542.tif 000019
【図１４】
2020537542.tif 000020
【図１５】
2020537542.tif 000021
【図１６】
2020537542.tif 000022
【図１７】
2020537542.tif 000023
【図１８】
2020537542.tif 000024
【図１９】
2020537542.tif 000025
【図２０】
2020537542.tif 000026
【図２１】
2020537542.tif 000027
【図２２】
2020537542.tif 000028
【図２３】
2020537542.tif 000029
【図２４】
2020537542.tif 000030
【配列表】
2020537542000001.app
【国際調査報告】
2020537542.tif 000031
2020537542.tif 000032
2020537542.tif 000033
2020537542.tif 000034