(57)【要約】モノクローナル及び単一ドメイン抗体を含む、ＡＸＬ特異的抗体及びその使用が記載される。このような抗体は、ＡＸＬエクトドメインの免疫グロブリン様（ＩｇＬ）ドメインにおけるエピトープで細胞表面に発現したヒトＡＸＬに結合する。抗体は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）において、例えば、癌の処置、検出又は病期分類において使用され得る。抗体はバイパラトピックであり得る。【選択図】  図１８
2020533004.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＡＸＬエクトドメイン（ＥＣＤ）の免疫グロブリン様（ＩｇＬ）ドメインにおけるエピトープに特異的に結合する、単離又は精製された抗体。
【請求項２】
ＡＸＬ  ＥＣＤが配列番号７１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
エピトープがＡＸＬのＩｇＬ１又はＩｇＬ２に位置する、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
ＡＸＬを発現する腫瘍細胞への内在化が可能である、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
単一ドメイン抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、バイパラトピック抗体、二重特異性抗体、又はそれらのＡＸＬ結合抗体断片である、請求項１に記載の抗体。
【請求項６】
キメラ抗体が、ヒトＩｇＧ１由来のフレームワーク領域を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
キメラ抗体が、ヒトカッパ軽鎖及びヒトＩｇＧ重鎖由来のフレームワーク領域を含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ由来のフレームワーク領域を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項９】
全長ＩｇＧ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ’）２、ＶＨＨ、ＶＬ、又はＶＨを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１０】
ヒトＡＸＬエクトドメインに対して≦５０ｎＭの平衡解離定数（ＫＤ）を有する、請求項１に記載の抗体。
【請求項１１】
ＡＸＬ  ＥＣＤのＩｇＬドメインにおけるエピトープへの結合が、増殖停止特異的６（Ｇａｓ６）リガンドのＡＸＬへの結合と競合しない、請求項１に記載の抗体。
【請求項１２】
配列番号９８、９９、及び１００；
配列番号９２、９３及び９４；
配列番号１１０、１１１、及び１１２；
配列番号８６、８７、及び８８；
配列番号８０、８１、及び８２；
配列番号１０４、１０５、及び１０６；
配列番号１１６、１１７、及び１１８；及び
それと実質的に同一である配列
からなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む抗体又はその断片。
【請求項１３】
配列番号３８；
配列番号４０；
配列番号４２；
配列番号４４；
配列番号４６；
配列番号７４；
配列番号７６；及び
それと実質的に同一である配列
からなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む抗体又はその断片。
【請求項１４】
配列番号９５、９６、及び９７；
配列番号８９、９０及び９１；
配列番号１０７、１０８、及び１０９；
配列番号８３、８４、及び８５；
配列番号７７、７８、及び７９；
配列番号１０１、１０２、及び１０３；
配列番号１１３、１１４、及び１１５；及び
それと実質的に同一である配列
からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む抗体又はその断片。
【請求項１５】
配列番号３９；
配列番号４１；
配列番号４３；
配列番号４５；
配列番号４７；
配列番号７３；
配列番号７５；及び
それと実質的に同一である配列
からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む抗体又はその断片。
【請求項１６】
ＶＬ、配列番号９８〜１００；及びＶＨ、配列番号９５〜９７；
ＶＬ、配列番号９２〜９４；及びＶＨ、配列番号８９〜９１；
ＶＬ、配列番号１１０〜１１２；及びＶＨ、配列番号１０７〜１０９；
ＶＬ、配列番号８６〜８８；及びＶＨ、配列番号８３〜８５；
ＶＬ、配列番号８０〜８２；及びＶＨ、配列番号７７〜７９；
ＶＬ、配列番号１０４〜１０６；及びＶＨ、配列番号１０１〜１０３；
ＶＬ、配列番号１１６〜１１８；及びＶＨ、配列番号１１３〜１１５；及び
それと実質的に同一である配列
からなる群から選択される可変重鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列；並びに（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
【請求項１７】
配列番号１２７、１２８、及び１２９；
配列番号１３０、１３１、及び１３２；
配列番号１３３、１３４、及び１３５；
配列番号１３６、１３７、及び１３８；
配列番号１３９、１４０、及び１４１；
配列番号１４２、１４３、及び１４４；
配列番号１４５、１４６、及び１４７；
配列番号１４８、１４９、及び１５０；及び
それと実質的に同一である配列
からなる群から選択される単一ドメイン（ｓｄ）重鎖可変（ＶＨＨ）ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその断片。
【請求項１８】
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCTASASISSFDIMGWYRQAPGKQRELVAAITTLDIANYRDSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMDSLKPEDTARYHCAAFQSDQNYWGQGTQVTVSS(配列番号119);
QVQLVDSGGGLVQAGGSLRLSCATSTRTVSSAVMAWFRQAPEKVRDFVGFITNSGNILYDDSVKGRFTISRDNAQNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAAKWSFSSGYGDLRRAAMYDYWGQGTQVTVSS(配列番号120);
QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCAASGVTLDYTAIGWFRQAPGKERELVAAITSGGNTDYAESAKGRFRISRDNSKNTIYLQMNSLKPEDTGVYYCAARRGGARGEYDYWDQGTQVTVSS(配列番号121);
QVQLVESGGGVVQAGGSLRLSCAFSRGAFDTYEIGWFRQAPGKEREFVAAVTRNGDSVVYADSLKARFTASRNNAVNTAYLHMNILQPEDTATYYCAANWRPLRTSSGADDYADWGQGTQVTVSS(配列番号122);
QVKLEESGGGLAQAGGSLRLSCAASGSISSINTIGWFRQAPGKQRELVAASDSGANRNYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNNLKPEDTAIYYCRAWGTGTISTMYWGQGTQVTVSS(配列番号123);
QVKLEESGGGLVQAGASLRLSCVASESIFGFNTMGWYRQAPGNERELVASISNSKRTMYADSVKGRFTISRDNAKNTVNLQMNNLKPEDTAVYYCRAWGIITSATVYWGQGTQVTVSS(配列番号124);
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCATSTRTVSSAVMAWFRQAPEKERDFVGFISNSGSVYYDDSVKGRFTISRDNAQNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAIIWRTSDLTGRFNTWGQGTQVTVSS(配列番号125);
QVKLEESGGGLVQAGGSLRLSCAASGSSGMINTMGWYRQAPGKQRELVARRSTGGTTNYADSVKGRFTISRDDANNTVYLQMNSLKPEDTAVYYCAIIWRTSDLTGRFNTWGQGTQVTVSS(配列番号126);及び
それと実質的に同一である配列
からなる群から選択される単一ドメイン（ｓｄ）重鎖可変（ＶＨＨ）ドメイン配列を含む抗体又はその断片。
【請求項１９】
配列番号３９のＶＨ、及び配列番号３８のＶＬ；
配列番号４１のＶＨ、及び配列番号４０のＶＬ；
配列番号４３のＶＨ、及び配列番号４２のＶＬ；
配列番号４５のＶＨ、及び配列番号４４のＶＬ；
配列番号４７のＶＨ、及び配列番号４６のＶＬ；
配列番号７３のＶＨ、及び配列番号７４のＶＬ；
配列番号７５のＶＨ、及び配列番号７６のＶＬ；
配列番号１１９のＶＨＨ；
配列番号１２０のＶＨＨ；
配列番号１２１のＶＨＨ；
配列番号１２２のＶＨＨ；
配列番号１２３のＶＨＨ；
配列番号１２４のＶＨＨ；
配列番号１２５のＶＨＨ；
配列番号１２６のＶＨＨ；及び
それと８５％以上の同一性を有する配列
からなる群から選択される抗体又はその断片。
【請求項２０】
配列同一性が、≧９０％、≧９５％、又は≧９８％である、請求項１９に記載の抗体又は断片。
【請求項２１】
配列番号１、２、及び１１の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列；並びに配列番号３、４、及び５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含み、抗体は、ＡＸＬのＩｇＬ２ドメインではなくＩｇＬ１ドメインにあるエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２２】
配列番号１、６、及び１１の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列；並びに配列番号７、８、及び５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含み、抗体は、ＡＸＬのＩｇＬ２ドメインではなくＩｇＬ１ドメインにあるエピトープに結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項２３】
配列番号９、１０、及び１１の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列；並びに配列番号１２、１３、及び１４の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２４】
配列番号１５、１６、及び１１の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列：並びに配列番号１７、１８、及び１９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項２５】
ＡＸＬ結合についてＧａｓ６と競合しない、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
抗体がバイパラトピックであり、ｓｄ  Ａｂ００１／００５又はｓｄ  Ａｂ００１／００６を含む、請求項５に記載の抗体。
【請求項２７】
薬物部分にコンジュゲートしている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）。
【請求項２８】
薬物部分が抗癌剤である、請求項２７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項２９】
薬物部分がＤＭ１である、請求項２７に記載の抗体薬物コンジュゲート。
【請求項３０】
請求項２２に記載のＡＤＣ及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項３１】
請求項１に記載の抗体及びヒトＩｇＧ１  Ｆｃを含む融合タンパク質。
【請求項３２】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体をコードする核酸分子。
【請求項３３】
請求項３２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３４】
請求項３３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３５】
組換え微生物宿主細胞であるか又は哺乳動物細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３６】
請求項１に記載の抗体を生成する、請求項３２又は３３に記載の宿主細胞。
【請求項３７】
請求項１に記載の抗体を生成するハイブリドーマ又は生物。
【請求項３８】
表面に固定化されている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３９】
カーゴ分子に連結されている、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４０】
カーゴ分子が、検出可能な薬剤、治療剤、薬物、ペプチド、酵素、増殖因子、サイトカイン、受容体トラップ、その抗体、化学化合物、炭水化物部分、ＤＮＡベースの分子、細胞傷害性薬剤、又はウイルスベクターである、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４１】
カーゴ分子が、約１ｋＤａ〜約５００ｋＤａのサイズである、請求項３９に記載の抗体。
【請求項４２】
カーゴ分子が１つ又は複数のリポソーム又はナノキャリアに充填されている、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４３】
前記ナノキャリアが、１つ又は複数のナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、又は量子ドットを含む、請求項４２に記載の抗体。
【請求項４４】
ウイルスベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス又はレトロウイルスである、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４５】
ＤＮＡベースの分子が、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はプラスミドを含む、請求項４０に記載の抗体。
【請求項４６】
カーゴ分子が細胞傷害性薬剤である、請求項３９〜４２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４７】
ＡＸＬをインビトロで検出する方法であって、
ａ）試料を、検出可能な薬剤に連結された請求項１〜２４のいずれか一項に記載の１つ又は２つ以上の単離又は精製された抗体と接触させるステップと、
ｂ）試料中のＡＸＬに結合したその抗体に連結した検出可能な薬剤を検出するステップと
を含む方法。
【請求項４８】
方法が循環細胞中のＡＸＬを検出し、試料が血清試料である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
検出するステップが、光学的画像化、免疫組織化学、分子診断画像化、又はＥＬＩＳＡを使用して行われる、請求項４７又は４８に記載の方法。
【請求項５０】
対象におけるＡＸＬ発現をインビボで検出する方法であって、
ａ）検出可能な薬剤に連結された請求項１〜２４のいずれか一項に記載の１つ又は複数の抗体を対象に投与するステップと、
ｂ）ＡＸＬに結合したその抗体に連結した検出可能な薬剤を検出するステップと
を含む方法。
【請求項５１】
検出するステップが、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、又は蛍光画像化を使用して行われる、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
ＡＸＬを発現する細胞に目的の分子を輸送する方法であって、目的の分子に連結された請求項１に記載の１つ又は複数の抗体を対象に投与するステップを含み、抗体がＡＸＬを発現する対象の細胞に目的の分子を送達する方法。
【請求項５３】
目的の分子が、検出可能な薬剤、治療剤、薬物、ペプチド、酵素、増殖因子、サイトカイン、受容体トラップ、その抗体、化学化合物、炭水化物部分、ＤＮＡベースの分子、細胞傷害性薬剤、又はウイルスベクターである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
目的の分子が１つ又は複数のリポソーム又はナノキャリアに充填されている、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
ナノキャリアが、１つ又は複数のナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、又は量子ドットを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
目的の分子が細胞傷害性薬剤を含む、請求項５２〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
細胞傷害性薬剤が癌の処置における使用のためのものである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体を含む抗癌抗体薬物コンジュゲートを、それを必要とする対象に投与するステップを含む、癌を処置する方法。
【請求項５９】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体を含む細胞療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法、又は腫瘍溶解性ウイルスを投与するステップを含む、癌を処置する方法。
【請求項６０】
それを必要とする対象における癌を処置するための、抗癌抗体薬物コンジュゲートを含む医薬品を調製するための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【請求項６１】
それを必要とする対象における癌を処置するための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体を含む抗癌抗体薬物コンジュゲートの使用。
【請求項６２】
細胞療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法、又は腫瘍溶解性ウイルスを調製するための、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
[0001]本出願は、参照により本明細書に組み入れられる、２０１７年９月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／５５７，８７０号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
[0002]本開示は、ＡＸＬ特異的抗体及びその使用に関する。このような抗体は、細胞表面に発現したヒトＡＸＬに結合し、融合体又は抗体−薬物コンジュゲートにおいて使用され得る。
【背景技術】
【０００３】
[0003]ＡＸＬは、Ｔｙｒｏ３−ＡＸＬ−Ｍｅｒ（ＴＡＭ）受容体チロシンキナーゼサブファミリーのメンバーである。ＡＸＬドメイン構造の模式図を図１の先行技術の図に示す。ＡＸＬタンパク質の細胞外ドメイン（１００）が示され、エクソン（１〜２０）が示されている。ＡＸＬタンパク質（１００）は、２つの免疫グロブリン様ドメイン（１０２）及び２つのフィブロネクチンタイプＩＩＩ（ＦＮＩＩＩ）リピート（１０４）を含む。膜貫通ドメイン（１０６）は細胞膜に広がり、その後に細胞内キナーゼドメイン（１０８）が続く。スプライシング（１１０で示される）は、わずかに短い転写物を生成する。
【０００４】
[0004]増殖停止特異的６（Ｇａｓ６）、ビタミンＫ依存性タンパク質へのＡＸＬ細胞外ドメインの結合後、ＡＸＬは、複数の細胞型において、増殖、移動、凝集、及び抗炎症を含むいくつかの細胞機能に関与するシグナルを伝達することができる（Ｈｏｌｌａｎｄら、２００５年；Ｌｉら、２００９年）。ＡＸＬは元々、慢性骨髄性白血病の発癌遺伝子として同定された（Ｏ’Ｂｒｙａｎら、１９９１年）。その後、ＡＸＬの発現は、乳癌、胃癌、前立腺癌、卵巣癌、及び肺癌などの様々な癌において上方制御されることが報告されている（Ｌｉｎｇｅｒら、２００８年；Ｐａｃｃｅｚら、２０１４年）。
【０００５】
[0005]ＡＸＬはまた、上皮から間葉への移行（Ｇｊｅｒｄｒｕｍら、２０１０年）、悪性細胞の侵襲的運動性及び転移と密接に関連するプロセスに関与している。さらに、ＡＸＬ発現は、患者の生存と負に関連付けられることが示されている（Ｌｉｎｇｅｒら、２００８年；Ｇｊｅｒｄｒｕｍら、２０１０年）。最近のいくつかの研究では、ＡＸＬがいくつかの薬剤耐性の癌細胞株において過剰発現し、活性化されることが報告されている（Ａｓｉｅｄｕら、２０１４年；Ｍｅｙｅｒら、２０１３年；Ｔｈｏｍｓｏｎら、２０１１年）。これは、ＡＸＬは、化学療法及び他の分子標的療法への耐性に役割を果たす可能性があることを示唆している。最近、ＡＸＬ発現はまた、固形腫瘍がより大きくなり、より侵攻性になるにつれて頻繁に発生する状態である低酸素症（Ｒａｎｋｉｎら、２０１４年）の間に増加することが示されている。まとめると、これらのデータは、ＡＸＬを癌の有望な診断、予後、及び治療の標的として示唆する。
【０００６】
[0006]遺伝子ノックアウト又はＲＮＡｉを使用する最近の研究は、細胞株及びマウスモデルにおけるＡＸＬ阻害の治療的価値を検証している。さらに、いくつかの小分子ＡＸＬ阻害剤が開発され、販売されていて、ＳＫＩ−６０６としても公知であり、Ｐｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．の製品番号ＰＦ−５２０８７６３のＢＯＳＵＬＩＦ（商標）という名称でＰｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．から販売されているタンパク質チロシンキナーゼ阻害剤であるＢＯＳＵＴＩＮＩＢ（商標）（Ｌｅｅら、２０１４年）；製造番号ＸＬ１８４のＣＯＭＥＴＲＩＱ（商標）という名称でＥｘｅｌｉｘｉｓから販売されているチロシンキナーゼｃ−Ｍｅｔ及びＶＥＧＦＲ２の低分子阻害剤であるＣＡＢＯＺＡＮＴＩＮＩＢ（商標）（Ｙａｋｅｓら、２０１１年）；及び製造番号ＳＵ１１２４８のＳＵＴＥＮＴ（商標）の名称でＰｆｉｚｅｒ  Ｉｎｃ．から販売されているＳＵＮＩＴＩＮＩＢ（商標）（Ｋｉｔａｇａｗａら、２０１３年）が挙げられる。これらの薬物は複数のキナーゼを標的とし、それらの主要なキナーゼ標的よりもＡＸＬ活性を効果的に阻害しない（Ｆｅｎｅｙｒｏｌｌｅｓら、２０１４年）。
【０００７】
[0007]現在、ＡＸＬの最も強力な選択的阻害剤であるＢｅｒｇｅｎＢｉｏ（Ｂｅｒｇｅｎ、Ｎｏｒｗａｙ）のＢＧＢ３２４ＴＭ（以前はＲ４２８として公知であった）及びＲｉｇｅｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）などの他の小分子薬物は、臨床及び前臨床開発の初期段階にある。ＩＣ５０は１４ｎＭであり、試験した他のキナーゼよりもＡＸＬに対してかなり選択的であることが示された（Ｈｏｌｌａｎｄら、２０１０年）；しかしながら、それは、Ｔｉｅ−２、Ｆｌｔ−４、Ｆｌｔ−１、Ｒｅｔ、Ａｂｌ、並びにＴＡＭファミリーの他のメンバーであるＴｙｒｏ−３及びＭｅｒの活性をなおも示す。これは、前臨床の乳房動物モデルにおいて血管新生及び転移を促進するＡＸＬの機能を遮断し（Ｈｏｌｌａｎｄら、２０１０）、侵襲性及び転移性の癌の処置のために２０１３年に臨床第Ｉ相に入った。小分子ＡＸＬ阻害剤の開発は、ＡＸＬキナーゼドメインの３次元構造がない場合には困難であり、オフターゲット毒性の可能性は依然として主要な懸念事項である。
【０００８】
[0008]小分子の欠点のいくつかを回避するために、抗ＡＸＬ抗体が考慮され得る。Ｌｉら（２００９年）は、Ｇａｓ６結合を妨害せず、ＡＸＬ活性化を阻害し、ＡＸＬ下方制御を誘発し、及び皮下非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）モデルにおける腫瘍異種移植片の成長を減少させるＡＸＬに対するモノクローナル抗体（１２Ａ１１）を開発した。その後、Ｙｅら（２０１０年）は、ヒトとマウスの両方のＡＸＬの細胞外ドメインを認識し、Ｇａｓ６結合を遮断するモノクローナル抗体（ＹＷ３２７．６Ｓ２）を開発した。この抗体は、ＮＳＣＬＣモデル、並びに乳癌の同所性転移モデルにおける異種移植腫瘍の増殖を減少させることが示されている。さらに、ＹＷ３２７．６Ｓ２による処置は、ＮＳＣＬＣ腫瘍成長の減少におけるエルロチニブ及び化学療法の効果を高め、並びに乳癌及びＮＳＣＬＣマウス異種移植モデルにおける抗ＶＥＧＦ処置を強化した。Ｌｅｃｏｎｅｔら（２０１４年）は、Ｇａｓ６結合を妨害せず、ＡＸＬ活性化を阻害し、細胞表面からのその下方制御を誘発した抗ＡＸＬモノクローナル抗体について報告している。対象の抗体は、インビボで皮下と同所性膵腫瘍異種移植片の両方の増殖を減少させた。
【０００９】
[0009]ＡＸＬの活性を減少させる治療用抗体の１つの欠点は、感度の本質的な欠如による生来の性質、又は処置の選択圧中に生じるバイパスメカニズムによる後天的性質のいずれかで、治療抵抗に遭遇する可能性があるということである。したがって、オフターゲット効果が少なく、毒性又は治療耐性が減少し又は許容され得る、活性であり、特異的なＡＸＬ阻害剤が必要である。
【００１０】
[0010]抗体−薬物コンジュゲートは、典型的にはリンカーを介して抗体を薬物と組み合わせる非常に複雑な実体である。Ｇｅｎｍａｂ  Ａ／Ｓ（Ｃｏｐｅｎｈａｇｅｎ、Ｄｅｎｍａｒｋ）及びＳｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＵＳＡ）が開発中の抗体−薬物コンジュゲートであるＨＵＭＡＸ−ＡＸＬ−ＡＤＣ（商標）は、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）にコンジュゲートしたＧａｓ６結合と競合しないＡＸＬ特異的モノクローナル抗体を含む。ＨＵＭＡＸ−ＡＸＬ−ＡＤＣ（商標）は、ＮＳＣＬＣ異種移植片モデルで１ｍｇ／ｋｇの単回投薬後に腫瘍退縮を強力に誘発し、ＡＸＬ発現が不均一である患者由来の異種移植片モデルにおいて同様の効果を有した。Ｇａｓ６結合と競合しないＡＸＬに結合する抗体は、国際特許公開ＷＯ２０１６／００５５９３Ａ１（Ｂｒｅｉｊら）に記載されている。
【００１１】
[0011]抗ＡＸＬ抗体が強力な細胞傷害性薬物を送達するために使用される抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）アプローチは、薬物に応答する可能性がある患者集団を増加させる。抗体に対する耐性が獲得された場合でさえ、ＡＤＣが役立つ場合がある。
【００１２】
[0012]疾患の検出、病期分類及び／又は治療で使用するためのＡＸＬ特異的抗体が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
[0013]本開示の目的は、ＡＸＬ特異的抗体を提供することである。ＡＸＬ特異的モノクローナル及び単一ドメイン抗体、並びに抗体とも呼ばれる抗原結合断片、並びにそれらの使用が記載される。このようなＡＸＬ特異的抗体は、細胞表面に発現したヒトＡＸＬに結合する。抗体−薬物コンジュゲート及び融合体が記載される。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
[0014]本開示は、ヒトＡＸＬエクトドメイン（ＥＣＤ）の免疫グロブリン様（ＩｇＬ）ドメインのエピトープに特異的に結合する単離又は精製された抗体を提供する。
【００１５】
[0015]配列番号９８〜１００；配列番号９２〜９４；配列番号１１０〜１１２；配列番号８６〜８８；配列番号８０〜８２；配列番号１０４〜１０６；配列番号１１６〜１１８；及びそれと実質的に同一である配列からなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む抗体又はその断片もまた提供される。
【００１６】
[0016]本明細書では、配列番号３８；配列番号４０；配列番号４２；配列番号４４；配列番号４６；配列番号７４；配列番号７６；及びそれと実質的に同一である配列からなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む抗体又はその断片が提供される。
【００１７】
[0017]さらに、配列番号９５〜９７；配列番号８９〜９１；配列番号１０７〜１０９；配列番号８３〜８５；配列番号７７〜７９；配列番号１０１〜１０３；配列番号１１３〜１１５；及びそれと実質的に同一である配列からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含む抗体又はその断片が提供される。
【００１８】
[0018]本明細書では、配列番号３９；配列番号４１；配列番号４３；配列番号４５；配列番号４７；配列番号７３；配列番号７５；及びそれと実質的に同一である配列からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む抗体又はその断片が提供される。
【００１９】
[0019]さらに、配列番号１１９〜１２６、及びそれと実質的に同一である配列からなる群から選択される単一ドメイン（ｓｄ）重鎖可変（ＶＨＨ）ドメイン配列を含む抗体又はその断片が提供される。
【００２０】
[0020]配列番号３９のＶＨ、及び配列番号３８のＶＬ；配列番号４１のＶＨ、及び配列番号４０のＶＬ；配列番号４３のＶＨ、及び配列番号４２のＶＬ；配列番号４５のＶＨ、及び配列番号４４のＶＬ；配列番号４７のＶＨ、及び配列番号４６のＶＬ；配列番号７３のＶＨ、及び配列番号７４のＶＬ；配列番号７５のＶＨ、及び配列番号７６のＶＬ；配列番号１１９のＶＨＨ；配列番号１２０のＶＨＨ；配列番号１２１のＶＨＨ；配列番号１２２のＶＨＨ；配列番号１２３のＶＨＨ；配列番号１２４のＶＨＨ；配列番号１２５のＶＨＨ；配列番号１２６のＶＨＨ；及びそれと８５％以上の同一性を有する配列からなる群から選択される抗体又はその断片もまた提供される。
【００２１】
[0021]記載された抗体を含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）、医薬組成物、及び融合タンパク質が記載される。記載された抗体をコードする核酸分子、及びそれを含むベクター又は宿主細胞もまた提供される。
【００２２】
[0022]ＡＸＬをインビトロ及びインビボで検出する方法が記載される。目的の分子を、ＡＸＬを発現する細胞に輸送する方法が記載される。抗体薬物コンジュゲートを使用して、癌を処置するための方法、及び癌を処置するための記載された抗体の使用が提供される。
【００２３】
[0023]本開示の他の態様及び特徴は、添付の図面と併せて特定の実施形態の以下の説明を検討すると、当業者には明らかになる。
【００２４】
[0024]本開示の実施形態は、ここで、添付の図面を参照して、単なる例として記載される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】ＡＸＬドメイン構造の概略図である（先行技術）。
【図２】Ａ５４９細胞の生存における抗ＡＸＬ  ｍＡｂの効果の結果を示す図である。
【図３】Ｈ２９２細胞の細胞表面に発現したＡＸＬに対する抗ＡＸＬ  ｍＡｂの結合特性を決定するフローサイトメトリー実験の結果を示す図である。
【図４】Ｈ２９２腫瘍細胞株、Ａ５４９細胞株、ヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞株、及び不死化ＨａＣａＴケラチノサイト細胞における細胞生存率に対する抗ＡＸＬ−ＤＭ１コンジュゲートの活性の結果を示す。
【図５】ヒトＡＸＬタンパク質エクトドメイン（ｈＡＸＬ−ＥＣＤ）及び膜貫通ドメインの略図である。ドメイン結合は、ｈＡＸＬ−ＥＣＤの１０個のペプチド断片で示される。
【図６】抗ｒｈＡＸＬ  ＥＣＤ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を単離するための戦略の略図である。
【図７】太字の下線付きフォントで示される、ＩＭＧＴ定義を使用したＣＤＲを有するｍＡｂ  ＶＨ／ＶＬドメインのアミノ酸配列を示す図である。
【図８】太字の下線付きフォントで示される、ＩＭＧＴ定義を使用したＣＤＲを有するＶＨＨのアミノ酸配列を示す図である。
【図９】肺（Ｈ２９２）、乳房（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、卵巣（ＳＫＯＶ３）及び神経膠芽腫（Ｕ８７）細胞株における抗体結合能を示す図である。
【図１０】肺（ＮＣＩ−Ｈ２９２）、乳房（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、及び卵巣（ＳＫＯＶ３）細胞株における抗ＡＸＬ  ｈＩｇＧ及びｓｄＡｂｓの結合特性を測定するフローサイトメトリー実験の結果を示す図である。
【図１１】３つの腫瘍細胞株におけるｈＩｇＧ  Ａｂｓ及びｓｄＡｂｓの増殖阻害結合曲線を示す図である。
【図１２】Ｈ２９２細胞株におけるＧａｓ６の存在下及び非存在下でのｈＩｇＧ−Ｆ１１−５Ｅ９−ＤＭ１及びｈＩｇＧ−Ｆ１０７−１０Ｇ１−ＤＭ１の増殖阻害結合曲線を示す図である。
【図１３】ＳＫＯＶ３細胞株におけるモノパラトピック親ＡＤＣと比較した、抗ＡＸＬバイパラトピック構築物ＡＤＣの増殖阻害結合曲線を示す図である。
【図１４】選択された試験抗体によるＳＫＯＶ３腫瘍を有するマウスにおける腫瘍成長阻害を示す図である。
【図１５】選択された試験抗体によるＳＫＯＶ３腫瘍を有するマウスにおける腫瘍成長阻害を示す図である。
【図１６】実施例１７において、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｕｃ腫瘍を有するマウスにおける腫瘍成長測定のための研究設計及び時間点を示す図である。
【図１７】実施例１７において、処置開始後の３７日までの体重におけるｈＦ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１の効果を示す図である。
【図１８】実施例１７において、処置開始後の２８日までの腫瘍成長に対するｈＦ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１の効果を示す図である。
【図１９】実施例１８において評価されたＦＣ５Ｈｆｃ１Ｘ０（陽性対照）、ＴＷＩＮ２００−ｈＩｇＧ１（陰性対照）及び７つの抗ＡＸＬ  ｓｄＡｂのＰａｐｐ値を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
[0044]一般的に、本開示は、癌などの疾患の処置、同定／診断、及び病期分類／予後診断において使用するための抗ＡＸＬモノクローナル抗体及び単一ドメイン抗体を提供する。
【００２７】
[0045]ヒトＡＸＬエクトドメイン（ＥＣＤ）の免疫グロブリン様（ＩｇＬ）ドメインのエピトープに特異的に結合する、単離又は精製された抗体が記載される。ＡＸＬ  ＥＣＤは、例えば、配列番号７１のアミノ酸配列を有し得る。抗体のエピトープは、ＡＸＬのＩｇＬ１又はＩｇＬ２に位置し得る。抗体は、ＡＸＬを発現する腫瘍細胞に内在化することができる。
【００２８】
[0046]抗体は、単一ドメイン抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、バイパラトピック抗体、二重特異性抗体であり得るか又はそれらのＡＸＬ結合抗体断片であり得る。抗体がキメラ抗体である場合、それは、ヒトＩｇＧ１由来のフレームワーク領域を含み得、ヒトカッパ軽鎖及びヒトＩｇＧ重鎖由来のフレームワーク領域を含み得る。抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭ由来のフレームワーク領域を含み得る。
【００２９】
[0047]抗体は、全長ＩｇＧ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、又はＦ（ａｂ’）２、ＶＨＨ、ＶＬ、又はＶＨであり得る。抗体は、ヒトＡＸＬエクトドメインに対して５０ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）を有し得る。任意選択的に、ＡＸＬ  ＥＣＤのＩｇＬドメインのエピトープへの結合は、増殖停止特異的６（Ｇａｓ６）リガンドのＡＸＬへの結合と競合しないものであり得る。
【００３０】
[0048]抗体又は断片は、配列番号９８、９９、及び１００；配列番号９２、９３及び９４；配列番号１１０、１１１、及び１１２；配列番号８６、８７、及び８８；配列番号８０、８１、及び８２；配列番号１０４、１０５、及び１０６；配列番号１１６、１１７、及び１１８；及びそれと実質的に同一である配列からなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有し得る。
【００３１】
[0049]抗体又はその断片は、配列番号３８；４０；４２；４４；４６；７４；７６；及びそれと実質的に同一である配列からなる群から選択される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含むものであり得る。抗体又は断片は、配列番号９５〜９７；８９〜９１；１０７〜１０９；８３〜８５；７７〜７９；１０１〜１０３；１１３〜１１５；及びそれと実質的に同一である配列からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含み得る。
【００３２】
[0050]配列番号３９、４１、４３、４５、４７、７３、７５、及びそれと実質的に同一である配列からなる群から選択される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む抗体又はその断片が記載される。
【００３３】
[0051]抗体又はその断片は、ＶＬ、配列番号９８〜１００及びＶＨ、配列番号９５〜９７；ＶＬ、配列番号９２〜９４及びＶＨ、配列番号８９〜９１；ＶＬ、配列番号１１０〜１１２及びＶＨ、配列番号１０７〜１０９；ＶＬ、配列番号８６〜８８及びＶＨ、配列番号８３〜８５；ＶＬ、配列番号８０〜８２及びＶＨ、配列番号７７〜７９；ＶＬ、配列番号１０４〜１０６及びＶＨ、配列番号１０１〜１０３；ＶＬ、配列番号１１６〜１１８及びＶＨ、配列番号１１３〜１１５；及びそれと実質的に同一である配列からなる群から選択される可変重鎖（ＶＬ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列、並びに（ＶＨ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含むものであり得る。
【００３４】
[0052]記載される抗体は、配列番号１２７〜１２９；配列番号１３０〜１３２；配列番号１３３〜１３５；配列番号１３６〜１３８；配列番号１３９〜１４１；配列番号１４２〜１４４；配列番号１４５〜１４７；配列番号１４８〜１５０；及びそれと実質的に同一である配列からなる群から選択される単一ドメイン（ｓｄ）重鎖可変（ＶＨＨ）ドメインＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を含み得る。
【００３５】
[0053]配列番号１１９〜１２６、及びそれに実質的に同一である配列のいずれか１つからなる群から選択される単一ドメイン（ｓｄ）重鎖可変（ＶＨＨ）ドメイン配列を有する抗体又はその断片が記載される。
【００３６】
[0054]配列番号３９のＶＨ、及び配列番号３８のＶＬ；配列番号４１のＶＨ、及び配列番号４０のＶＬ；配列番号４３のＶＨ、及び配列番号４２のＶＬ；配列番号４５のＶＨ、及び配列番号４４のＶＬ；配列番号４７のＶＨ、及び配列番号４６のＶＬ；配列番号７３のＶＨ、及び配列番号７４のＶＬ；配列番号７５のＶＨ、及び配列番号７６のＶＬ；及び１１９〜１２６のＶＨＨ配列、並びにそれと８５％以上の同一性を有する配列からなる群から選択される抗体又はその断片が記載される。
【００３７】
[0055]例えば、抗体又はその断片は、本明細書に列挙される具体的に例示された配列と比較して、＞９０％、＞９５％、又は＞９８％の配列同一性を有し得る。
【００３８】
[0056]記載された抗体は、配列番号１、２、及び１１の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列；並びに配列番号３、４、及び５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み得、抗体は、ＡＸＬのＩｇＬ２ドメインではなくＩｇＬ１ドメインにあるエピトープに結合する。抗体は、配列番号１、６、及び１１の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列；並びに配列番号７、８、及び５の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み得、抗体は、ＡＸＬのＩｇＬ２ドメインではなくＩｇＬ１ドメインにあるエピトープに結合する。
【００３９】
[0057]抗体は、配列番号９、１０、及び１１の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列；並びに配列番号１２、１３、及び１４の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み得る。
【００４０】
[0058]或いは、抗体は、配列番号１５、１６、及び１１の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列；並びに配列番号１７、１８、及び１９の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含み得る。
【００４１】
[0059]抗体は、ＡＸＬ結合についてＧａｓ６と競合しないものであり得る。
【００４２】
[0060]抗体は、バイパラトピックであるものであり得る。このようなバイパラトピック抗体は、例えば、ｓｄＡｂ００１／００５又はｓｄＡｂ００１／００６であり得る。
【００４３】
[0061]薬物部分にコンジュゲートしている、本明細書に記載される抗体を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）が記載される。薬物部分は、例えば、抗癌剤であり得る。例示的な薬物部分はＤＭ１である。
【００４４】
[0062]ＡＤＣ及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が記載される。
【００４５】
[0063]本明細書に記載される抗体及びヒトＩｇＧ１  Ｆｃを含む融合タンパク質が記載される。
【００４６】
[0064]抗体をコードする核酸分子が記載される。核酸分子を含むベクターが記載される。ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス又はレトロウイルスであり得る。
【００４７】
[0065]上述のベクターを含み得る宿主細胞が記載される。宿主細胞は、組換え微生物宿主細胞であり得るか、又は哺乳動物細胞であり得、上記細胞は、本明細書に記載される抗体を生成し得る。
【００４８】
[0066]抗体を生成するハイブリドーマ又は生物もまた提供される。
【００４９】
[0067]一部の例では、抗体は表面に固定化され得る。さらに、抗体はカーゴ分子に連結され得る。任意選択的に、カーゴ分子は、検出可能な薬剤、治療剤、薬物、ペプチド、酵素、増殖因子、サイトカイン、受容体トラップ、その抗体、化学化合物、炭水化物部分、ＤＮＡ−ベースの分子、細胞傷害性薬剤、又はウイルスベクターであり得る。
【００５０】
[0068]抗体がカーゴ分子を有する場合、カーゴ分子の例示的なサイズは、約１〜約５００ｋＤａであり得る。カーゴ分子は、リポソーム又はナノキャリアに充填することができる。このようなナノキャリアは、１つ又は複数のナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、又は量子ドットを含み得る。カーゴ分子は細胞傷害性薬剤であり得る。
【００５１】
[0069]ＤＮＡベースの分子は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、又はプラスミドを含み得る。
【００５２】
[0070]ＡＸＬをインビトロで検出する方法であって、ａ）試料を、検出可能な薬剤に連結された１つ又は２つ以上の単離又は精製された抗体と接触させるステップと、ｂ）試料中のＡＸＬに結合したその抗体に連結した検出可能な薬剤を検出するステップとを含む方法が記載される。
【００５３】
[0071]試料が血清試料であり得る、循環細胞においてＡＸＬを検出するための方法が記載される。
【００５４】
[0072]このような方法において、検出するステップは、光学的画像化、免疫組織化学、分子診断画像化、又はＥＬＩＳＡを使用して行われ得る。
【００５５】
[0073]本明細書には、対象におけるＡＸＬ発現をインビボで検出する方法であって、ａ）検出可能な薬剤に連結された、本明細書に記載される１つ又は複数の抗体を対象に投与するステップと、ｂ）ＡＸＬに結合したその抗体に連結された検出可能な薬剤を検出するステップとを含む方法が記載される。
【００５６】
[0074]任意選択的に、検出するステップは、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、又は蛍光画像化を使用して行われ得る。
【００５７】
[0075]目的の分子を、ＡＸＬを発現する細胞に輸送する方法であって、目的の分子に連結された１つ又は複数の抗体を対象に投与するステップを含み、抗体が、ＡＸＬを発現する対象の細胞に目的の分子を送達する方法が記載される。検出可能な薬剤、治療剤、薬物、ペプチド、酵素、増殖因子、サイトカイン、受容体トラップ、その抗体、化学化合物、炭水化物部分、ＤＮＡベースの分子、細胞傷害性薬剤、又はウイルスベクターなどの目的の分子であり得る。このような方法では、目的の分子を１つ又は複数のリポソーム又はナノキャリア上又はその中に充填することができる。ナノキャリアは、１つ又は複数のナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、又は量子ドットを含み得る。さらに、目的の分子は、癌を処置するために使用される細胞傷害性薬剤などの細胞傷害性薬剤を含み得る。
【００５８】
[0076]抗癌抗体薬物コンジュゲート（本明細書に記載される抗体を含む）を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、癌を処置する方法が記載される。さらに、細胞療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法、又は腫瘍溶解性ウイルスを投与するステップを含む、癌を処置する方法が本明細書に記載される。
【００５９】
[0077]本明細書に記載される抗体の使用は、抗癌抗体薬物コンジュゲートを含む医薬品の調製のためであり得る。抗体は、それを必要とする対象における癌の処置に有用である。抗癌抗体薬物コンジュゲートが、それを必要とする対象の癌を処置するために使用される、さらなる使用が記載される。
【００６０】
[0078]このような抗体の使用が記載され、抗体は、細胞療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法、又は腫瘍溶解性ウイルスの調製に使用され得る。
【００６１】
[0079]抗ＡＸＬ抗体薬物コンジュゲートは、癌治療薬としての使用について本明細書に記載される。強力であり、選択的な抗癌活性を有する免疫療法剤及び免疫コンジュゲートを提供することが望ましい。癌標的としてのＡＸＬに基づく癌の処置のための抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、コンジュゲートで機能することができる抗体の開発を必要とする。ＡＸＬは、受容体チロシンキナーゼのＴＡＭファミリーに属し、その過剰発現は幅広いヒトの癌で検出されている。いくつかの細胞株癌モデルにおける２５０を超えるモノクローナル抗体（ｍＡｂｓ）の代理ＡＤＣスクリーニング、及び毒性試験のためのカニクイザル由来のＡＸＬタンパク質との交差反応に一部基づいて決定された、ＡＸＬ  ＡＤＣに適した抗体が本明細書に記載される。ＡＤＣ開発用の抗ＡＸＬ抗体が記載され、Ｇａｓ６競合及び単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の特徴付けデータを本明細書に提供する。
【００６２】
[0080]Ｇａｓ６競合。抗ＡＸＬ  ＡＤＣでは、ＡＸＬへの抗体の結合を遮断するＧａｓ６（ＡＸＬリガンド）の能力は、ＡＸＬ  ＡＤＣ選択にとって重要な機能である。この能力は、本明細書においてＧａｓ６競合と呼ばれる。全身又は腫瘍微小環境に存在する高濃度のＧａｓ６リガンド（しかし、培養で増殖した腫瘍細胞株には見られない）は、インビボ対インビトロで見られる抗体結合活性の不一致の原因となり得る。したがって、Ｇａｓ６によって影響を受けないか又は弱く影響を受ける活性を有する抗体の選択は、抗体結合がインビボでＧａｓ６によって妨害されないことを確実にする。
【００６３】
[0081]モノクローナル抗体（ｍＡｂ）。抗ＡＸＬマウスｍＡｂライブラリー内からＡＸＬ  ＡＤＣをスクリーニングして、Ｇａｓ６の存在に影響されない活性を有する強力なＡＤＣインターナライザー（ＩＣ５０＜１ｎＭ）を同定した。
【００６４】
[0082]単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂｓ）。ＡＸＬ  ＡＤＣ候補は、ファージ提示ライブラリーからパニングすることにより、分離された抗ＡＸＬ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂｓ、重鎖可変ドメインＶＨＨのみ）から同定される。本明細書において、ｓｄＡｂの評価に使用される技術には、内在化アッセイ及び競合結合アッセイが含まれる。Ｇａｓ６競合及びｓｄＡｂ特徴付けデータが得られた。一般的に、単一ドメイン抗体は、重鎖抗体の１つの可変ドメイン（ＶＨ）を含み、長さが最大約１１０アミノ酸であり得る。ｓｄＡｂはＦｃ領域を欠いているため、したがって、ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合体が調製され得る。
【００６５】
[0083]エピトープ。エピトープ及び／又は結合ドメインは、本明細書に記載されている。
【００６６】
[0084]用語「抗体」は、当該技術分野では「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも呼ばれ、本明細書で使用される場合、対になった重ポリペプチド鎖と軽ポリペプチド鎖から構築されたタンパク質を指す；ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの様々なＩｇアイソタイプが存在する。単一ドメインｓｄＡｂ並びにモノクローナル抗体ｍＡｂは本明細書に記載されている。抗体が正しく折りたたまれた場合、各鎖は折りたたまれて、より線状のポリペプチド配列によって接続された多数の異なる球状ドメインになる。例えば、免疫グロブリン軽鎖は、可変（ＶＬ）ドメイン及び定常（ＣＬ）ドメインに折りたたまれるが、一方、重鎖は、可変（ＶＨ）ドメイン及び３つの定常（ＣＨ、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインに折りたたまれる。重鎖及び軽鎖可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）の相互作用により、抗原結合領域（Ｆｖ）が形成される。各ドメインは、当業者が精通している十分に確立された構造を有する。
【００６７】
[0085]「抗体」という用語はまた、免疫グロブリン分子の断片、又は免疫グロブリンについて観察される典型的な匹敵する期間、抗原に特異的に結合する能力を保持する分子の誘導体を指すために使用され得る。抗体の結合領域又は結合ドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖と軽鎖の両方の可変領域を含み得るか、又は単一ドメイン（ＶＨＨ）分子であり得る。「抗体」という用語は、抗原結合を保持する抗体のこのような断片（本明細書では「抗体断片」又は単に「断片」と呼ばれる場合がある）を包含するために使用される。結合能力を保持する断片には、Ｆａｂ’又はＦａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有することができる一価断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、バイパラトピック断片、二価断片、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄ断片、ラクダ科抗体、ナノボディ、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、リンカーによって接続された複数の断片、及び他のこのような分子を含み得る。
【００６８】
[0086]用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一ドメイン抗体、抗体様ポリペプチド、ヒト化抗体、キメラ抗体分子、二重特異性抗体又は二重パラトピック抗体、及び抗原結合することができる、本明細書で特に言及されていない任意の断片を包含する。抗体断片は、天然に存在する抗体断片であり得、天然に存在する抗体の操作によって、又は組換え法を使用することによって得ることができ、天然に存在しない抗体又は断片であり得る。例えば、抗体断片には、限定されないが、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ；ペプチドリンカーで接続されたＶＬ及びＶＨからなる分子）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びこれらのいずれかの多価表示が含まれ得る。前述されたものなどの抗体断片は、断片の異なる部分を連結するために、リンカー配列、ジスルフィド結合、又は他のタイプの共有結合を必要とする場合がある；当業者は、様々なアプローチに精通している。単一ドメイン抗体断片及びモノクローナル抗体断片は、「抗体」という用語に包含される。
【００６９】
[0087]非限定的な例では、抗体断片は、天然に存在する供給源に由来するｓｄＡｂであり得る。ラクダ科由来の重鎖抗体は軽鎖を欠いているため、それらの抗原結合部位はＶＨＨと呼ばれる１つのドメインで構成される。ｓｄＡｂはまたサメにおいて観察されていて、ＶＮＡＲと呼ばれる。他のｓｄＡｂは、ヒトＩｇ重鎖及び軽鎖配列に基づいて操作され得る。本明細書で使用される場合、「ｓｄＡｂ」という用語は、ファージ提示又は他の技術を通じて任意の起源のＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ、又はＶＮＡＲリザーバーから直接単離されたｓｄＡｂ、前述のｓｄＡｂに由来するｓｄＡｂ、組換え生成されたｓｄＡｂ、並びにヒト化、親和性成熟、安定化、可溶化、ラクダ化、又は抗体操作の他の方法によって、このようなｓｄＡｂのさらなる修飾を通じて生成されたｓｄＡｂを含む。ｓｄＡｂの抗原結合機能及び特異性を保持するホモログ、誘導体、又は断片もまた包含される。
【００７０】
[0088]ＳｄＡｂは、高い熱安定性、高い界面活性剤耐性、プロテアーゼに対する比較的高い耐性及び高い生産収率などの抗体分子にとって望ましい特性を有する。それらはまた、免疫ライブラリーからの単離によって、又はインビトロ親和性成熟によって、非常に高い親和性を有するように操作され得る。非標準的なジスルフィド結合の導入などの、安定性を高めるためのさらなる変更もまたｓｄＡｂにもたらすことができる。
【００７１】
[0089]単一ドメイン抗体の構造は確立されており、周知である。ｓｄＡｂは、免疫グロブリンの折りたたみを保持する単一の免疫グロブリンドメインを含む；最も注目すべきは、３つのＣＤＲ／超可変ループのみが抗原結合部位を形成することである。しかしながら、抗原との結合にすべてのＣＤＲが必要なわけではあり得ない。例えば、限定することなく、１つ、２つ、又は３つのＣＤＲは、本明細書に記載されるｓｄＡｂによる抗原の結合及び認識に寄与し得る。ｓｄＡｂ又は可変ドメインのＣＤＲは、本明細書ではＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３と呼ばれる。
【００７２】
[0090]記載された抗体（その断片を含む）は、受容体チロシンキナーゼサブファミリーの一部であるＡＸＬに特異的である。ＡＸＬ（Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：５５８）は、２つの免疫グロブリン様ドメイン及び２つのフィブロネクチンタイプＩＩＩリピートを含む細胞外ドメイン；膜貫通ドメイン；及びチロシンキナーゼドメインを含む細胞内ドメインに編成された８９４個のアミノ酸を含む（先行技術の図１を参照されたい）。ＡＸＬタンパク質は、ビタミンＫ依存性タンパク質であるリガンドＧａｓ６に結合する。ＡＸＬは、通常、多くの細胞型で発現するが、多数の病状では発現レベルが増加する。
【００７３】
[0091]抗体は高度の内在化を示すべきである。「高度の内在化」という用語は、ＡＸＬを発現することが公知である２つ以上の腫瘍細胞株において、サポリン又はＤＭ１をコンジュゲートした二次抗体細胞傷害性スクリーニングアッセイで抗体がサブｎＭ（ＩＣ５０）の効力を示すことを意味する。現在記載されている抗体は、細胞表面ＡＸＬ受容体の細胞外ドメインに結合する。次に、抗体は細胞によって内在化され、エンドソーム及びリソソームを含む細胞内小器官に送達され得る。抗体はまた、中和機能を含み得、すなわち、それは、ＡＸＬ受容体を介するシグナル伝達を遮断し得る。
【００７４】
[0092]軽鎖及び重鎖可変領域は、標的抗原の結合に関与し、したがって、抗体間の有意な配列多様性を示すことができる。定常領域は、小さい配列の多様性を示し、多数の天然タンパク質を結合して、重要な生化学的イベントを誘発することに関与する。抗体の可変領域は、分子の抗原結合決定因子を含み、したがって、その標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。配列の可変性の大部分は、６つの超可変領域で生じ、可変重（ＶＨ）ドメイン及び軽（ＶＬ）ドメインごとに３つずつである；超可変領域は、合わさって抗原結合部位を形成し、抗原決定基の結合及び認識に寄与する。抗体の抗原に対する特異性及び親和性は、超可変領域の構造、並びにそれらが抗原に存在する表面のサイズ、形状、及び化学的性質によって決定される。超可変性の領域を同定するための様々なスキームが存在する。そのうちの１つ（Ｋａｂａｔスキーム）は、ＶＨ及びＶＬドメインの抗原結合領域での配列可変性に基づいて「相補性決定領域」（ＣＤＲ）を定義する。別の（Ｃｌｏｔｈｉａスキーム）は、ＶＨ及びＶＬドメインにおける構造ループ領域の位置に基づいて「超可変ループ」（Ｈ又はＬ）を定義する。これらの個々のスキームは、隣接又は重複するＣＤＲ及び超可変ループ領域を定義するため、抗体の技術分野における当業者は、しばしば、「ＣＤＲ」及び「超可変ループ」という用語を交換可能に利用し、それらは本明細書においてそのように使用され得る。国際免疫遺伝情報システム（ＩＭＧＴ）が本明細書において使用され、Ｋａｂａｔ番号付けもまた示される。ＩＭＧＴ番号付けシステムは、可変ドメインの比較を容易にするために開発された。このシステムでは、保存されたアミノ酸（Ｃｙｓ２３、Ｔｒｐ４１、Ｃｙｓ１０４、Ｐｈｅ／Ｔｒｐ１１８、及び８９位の疎水性残基など）は常に同じ位置にある。さらに、フレームワーク領域（ＦＲ１：１〜２６位、ＦＲ２：３９〜５５位、ＦＲ３：６６〜１０４位、及びＦＲ４：１１８〜１２９位）及びＣＤＲ（ＣＤＲ１：２７〜３８、ＣＤＲ２：５６〜６５、ＣＤＲ３：１０５〜１１７）の標準化された区切りが提供される。
【００７５】
[0093]本明細書では、ＩＭＧＴとして示されるＣＤＲ配列は、−Ａが続く記述名によって識別され、一方、カバット配列の記述名は−Ｂが続く。
【００７６】
[0094]ＣＤＲ／ループは、本明細書では、ＣＤＲ  Ｈ１についてはＣｈｏｔｈｉａスキームに従って、及び他のすべてのＣＤＲについてはＫａｂａｔスキームに従って言及される。本明細書に記載される抗体のＣＤＲは、軽鎖のＣＤＲについてはＣＤＲ  Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、及び重鎖のＣＤＲについてはＣＤＲ  Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３と呼ばれる。
【００７７】
[0095]配列番号７２は、公知のＡＸＬ全長Ｈｉｓ６配列を提供し、情報のみのために提供される。
【００７８】
[0096]コンジュゲート又は結合した細胞傷害性薬剤の内在化及び活性化を引き起こすことに加えて、抗体は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）又は補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）をもたらし得る。当業者に公知であるように、ＡＤＣＣ及びＣＤＣ活性は、様々な抗体構造に存在する定常ドメインを通じて媒介される。
【００７９】
[0097]抗体は、任意の供給源、ヒト、マウス、又は他に由来し得；ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含む任意のアイソタイプであり得；限定されないが、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２を含む任意のタイプの断片であり得る。
【００８０】
[0098]抗体はまた、キメラであり得、２つ以上の種に由来するタンパク質配列の組み合わせとして形成され得る。当業者に公知であるように、キメラ抗体は、非ヒト供給源（例えば、限定されないが、マウス）からの遺伝物質をヒト由来の遺伝物質と組み合わせることにより作製される。例えば、ヒト定常ドメインは、マウスＶＨ及びＶＬ配列に融合され得る。
【００８１】
[0099]抗体は、当該技術分野において公知である任意の適切な方法、例えば、限定されないが、ＣＤＲグラフト及びベニアリングを使用して「ヒト化」され得る。抗体のヒト化は、抗原結合能力又は特異性を失うことなく、ヒトコンセンサス配列に見られるように、配列中のアミノ酸をそのヒト対応物で置換することを含む；このアプローチは、ヒト対象に導入した場合、抗体の免疫原性を減少させる。ＣＤＲグラフトのプロセスでは、本明細書に定義される１つ又は２つ以上の重鎖ＣＤＲをヒト可変領域（ＶＨ又はＶＬ）に、或いは他のヒト抗体（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）若しくは断片フレームワーク領域（Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ）又はＣＤＲを移植できる類似のサイズ及び性質のタンパク質（例えば、Ｎｉｃａｉｓｅら、２００４年を参照されたい）に融合又はグラフトすることができる。このような場合、上記の１つ又は２つ以上の超可変ループの立体構造は、維持される可能性があり、その標的（すなわち、ＡＸＬ）に対する抗体の親和性及び特異性は、影響が最小限である可能性がある。ＣＤＲグラフトは当該技術分野において公知である。このようなヒト化抗体の１つの非限定的な例では、マウス供給源からの上記のＣＤＲをヒト軽鎖及び重鎖フレームワーク領域に移植することができる。
【００８２】
[00100]当該技術分野において「可変領域リサーフェシング」とも呼ばれるベニアリングは、抗体の溶媒露出された位置をヒト化することを伴う。したがって、ＣＤＲ立体構造にとって重要であり得る、埋められた非ヒト化残基は保持され、一方、溶媒曝露された領域に対する免疫学的反応の可能性は最小限に抑えられる。ベニアリングは、当該技術分野において公知であり、本質的に、天然抗体又はその断片のフレームワーク領域の曝露された残基を、それらのヒト対応物中のアミノ酸残基で置換することを含む（Ｐａｄｌａｎ、１９９１年；Ｇｏｎｚａｌｅｓら、２００５年）。
【００８３】
[00101]当業者はまた、このようなヒト化抗体断片を調製する方法及びアミノ酸位置をヒト化する方法を十分に精通している。例えば、Ｖｉｎｃｋｅら、２００９年を参照されたい。当業者に公知であるように、結合及び特異性を保持するために、特定の天然アミノ酸残基をヒトフレームワークに組み込むことが必要な場合がある。ＣＤＲグラフトによるヒト化は、当該技術分野において公知であり（例えば、Ｔｓｕｒｕｓｈｉｔａら、２００５年；Ｊｏｎｅｓら、１９８６年；Ｔｅｍｐｅｓｔら、１９９１年；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８；Ｑｕｅｅｎら、１９８９年；Ｇｏｎｚａｌｅｓら、２００５年を参照されたい）、したがって、当業者は、このようなヒト化抗体又はその断片を調製する方法を十分に精通している。
【００８４】
[00102]上記で定義されたＶＨ及びＶＬ、並びにヒトＩｇＧ１フレームワークを含むキメラ抗体であり得る、ＡＸＬに特異的な単離又は精製された抗体。例えば、ヒトＩｇＧ１フレームワークは、ヒトカッパ軽鎖及びヒトＩｇＧ１重鎖を含み得る。
【００８５】
[00103]モノクローナル抗体
[00104]ＡＸＬに対する高親和性モノクローナル抗体（ｍＡｂ）が記載される。ｍＡｂは、遺伝子免疫によって（すなわち、ｒｈＡＸＬ−ＥＣＤをコードするＤＮＡを注入することによって）生成された。ｍＡｂは、高度な内在化を示す抗体を同定するために設計された機能アッセイを使用してスクリーニングされた。
【００８６】
[00105]同定された５つの抗ｈＡＸＬ  ｍＡｂは、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）としての可能性について機能的に特徴付けられた。これらの抗体は、本明細書ではＦ１０７−７Ｈ５、Ｆ１０７−８Ｄ１２、Ｆ１１１−５Ｅ９、Ｆ１１１−３Ｃ８、及びＦ１０７−１０Ｇ１と呼ばれる。これらの抗ヒトＡＸＬ抗体が選択された。これは、以下の細胞株：Ｕ８７膠芽腫、Ａ５４９肺胞腺癌、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳腺癌の少なくとも２つにおいて、サポリンをコンジュゲートした二次抗体ベースの細胞傷害性スクリーニングアッセイでサブｎＭ（ＩＣ５０）効力を示したためである。それらはまた、ＤＭ１にコンジュゲートした場合、Ｈ２９２肺癌細胞、Ａ５４９細胞及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して毒性を示した。エピトープビニング分析により、コンジュゲートした二次抗体スクリーニングアッセイにおける効力に基づく、これらの抗体の選択により、次のエピトープ：ＡＸＬのＩｇ様ドメイン１（Ｆ１０７−７Ｈ５及びＦ１０７−８Ｄ１２）に位置した２つ、及びＩｇ様ドメイン２（Ｆ１１１−３Ｃ８及びＦ１１１−５Ｅ９）に位置した１つに５つのｍＡｂがすべて結合することが示された。Ｆ１０７−１０Ｇ１の結合はまたＩｇ様ドメイン１にあるが、Ｆ１０７−７Ｈ５及びＦ１０７−８Ｄ１２とは異なる部位にあることに留意されたい。
【００８７】
[00106]配列同一性及び特徴
[00107]実質的に同一の配列は、１つ又は複数の保存的なアミノ酸突然変異を含み得る。参照配列に対する１つ又は複数の保存的なアミノ酸突然変異が、参照配列と比較して生理学的、化学的、物理化学的又は機能的特性に実質的な変化がない変異ペプチドを生じ得ることが当該技術分野において公知である；このような場合、参照配列及び変異配列は、「実質的に同一」のポリペプチドと見なされる。保存的なアミノ酸置換は、類似の化学的性質（例えば、サイズ、電荷、又は極性）を有する別のアミノ酸残基でのアミノ酸残基の置換として本明細書において定義される。これらの保存的なアミノ酸突然変異は、上記で列挙されたＣＤＲ配列及び抗体の全体的な構造を維持しながら、抗体のフレームワーク領域に対して行うことができる；したがって、抗体の特異性及び結合が維持される。
【００８８】
[00108]非限定的な例では、保存的な突然変異はアミノ酸置換であり得る。このような保存的アミノ酸置換は、塩基性、中性、疎水性、又は酸性アミノ酸を同じグループの別のものに置換することができる。「塩基性アミノ酸」という用語は、典型的には、生理的ｐＨで正に帯電する、７を超える側鎖のｐＫ値を有する親水性アミノ酸を意味する。塩基性アミノ酸には、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、及びリジン（Ｌｙｓ又はＫ）が含まれる。「中性アミノ酸」（「極性アミノ酸」とも呼ばれる）という用語は、生理学的ｐＨでは荷電していないが、２つの原子で共通に共有されている電子対が原子の１つによってより密接に保持されている少なくとも１つの結合を有する、側鎖を有する親水性アミノ酸を意味する。極性アミノ酸には、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、及びグルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）が含まれる。用語「疎水性アミノ酸」（「非極性アミノ酸」もまた）は、正規化されたコンセンサス疎水性スケールによれば、ゼロより大きい疎水性を示すアミノ酸を含むことを意味する。疎水性アミノ酸には、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、バリン（Ｖａｌ又はＶ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、及びグリシン（Ｇｌｙ又はＧ）が含まれる。「酸性アミノ酸」は、典型的には、生理学的ｐＨで負に帯電している、７未満の側鎖ｐＫ値を有する親水性アミノ酸を指す。酸性アミノ酸には、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、及びアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）が含まれる。
【００８９】
[00109]配列同一性は、２つの配列の類似性を評価するために使用される；それは、２つの配列が残基の位置間の最大対応のために整列された場合に同じである残基のパーセントを計算することによって決定される。任意の公知の方法を使用して、配列同一性を計算することができる；例えば、コンピュータソフトウェアを使用して、配列の同一性を計算することができる。配列同一性は、例えば、スイス生物研究所によって維持されるＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ２サービス、ＢＬＡＳＴ−Ｐ、Ｂｌａｓｔ−Ｎ、若しくはＦＡＳＴＡ−Ｎ、又は当該技術分野で公知である他の適切なソフトウェアなどのソフトウェアによって計算することができる。
【００９０】
[00110]実質的に同一の配列は、本明細書に記載されるように、少なくとも９０％同一であり得る；別の例では、実質的に同一の配列は、アミノ酸レベルで、本明細書に記載される配列と少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、若しくは１００％同一であるか、又はその間の任意のパーセンテージであり得る。重要なことに、実質的に同一の配列は、参照配列の活性及び特異性を保持する。非限定的な実施形態では、配列同一性の差異は、保存的アミノ酸変異（複数可）による可能性がある。非限定的な例では、本明細書に記載される特定の配列と少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％又は９９％同一の配列を含む抗体が包含される。
【００９１】
[00111]配列を比較した場合、ｍＡｂ  ３Ｃ７、８Ｄ１２及び７Ｈ５として示される本抗体は、約９０％以上の類似性（又は≧９０％同一性）で互いに関連している。それにもかかわらず実質的に同一の活性をもたらす配列の変動は、実質的に同一の配列と見なされる。
【００９２】
[00112]ヒト化などの変更による配列の変化は、予測可能であり、当業者に理解される方法で配列を変更することができる。したがって、このような変更された配列は、より多くの数の変更された残基を有する可能性があり、その結果、同一性は上記の９０％の値を下回る。配列の変化は、実質的に同一の結合が達成されるという条件で、ＣＤＲの外側の領域に存在し得、又はＣＤＲ内にあり得る。
【００９３】
[00113]抗体はまた、組換え抗体の発現、検出又は精製を補助するための追加の配列を含み得る。当業者に公知である任意のこのような配列又はタグを使用することができる。例えば、抗体は、ターゲティング又はシグナル配列（例えば、限定されないが、ｏｍｐＡ）、検出／精製タグ（例えば、限定されないが、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈｉｓ５、Ｈｉｓ６、又はＨｉｓ８Ｇ）、又はそれらの組み合わせを含み得る。別の例では、シグナルペプチドは、ＭＶＬＱＴＱＶＦＩＳＬＬＬＷＩＳＧＡＹＧ（配列番号５９）又はＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＴＨＡ（配列番号６０）であり得る。さらなる例では、追加の配列は、ビオチン認識部位であり得る。また、当業者に公知であるように、リンカー配列は、追加の配列又はタグとともに使用され得、又は検出／精製タグとして機能し得る。
【００９４】
[00114]多量体化、連結、及びカーゴ
[00115]抗体は、本明細書では多価表示とも呼ばれる多価提示形式であり得る。多量体化は、当該技術分野において公知である任意の適切な方法によって達成することができる。例えば、いかなる方法にも限定されないが、多量体化は、自己組織化分子を使用して、及び／又は抗体とＡＢ５毒素ファミリーのＢサブユニットの五量体化ドメインとを含む融合タンパク質を発現させることにより五体を生成することによって達成することができる。次に、五量体化ドメインが集合して五量体になる。多量体はまた、多量体化分子をもたらすコイルド−コイルペプチドとの抗体の融合を説明するために「複合体」形態と呼ばれ得る多量体化ドメインを使用して形成され得る。他の形態の多価提示はまた本明細書に含まれる。例えば、限定することなく、抗体は、二量体、三量体、又は任意の他の適切なオリゴマーとして提示され得る。これは、当該技術分野において公知である方法によって、例えば、ノブ−イントゥ−ホール相互作用を使用して、直接的な連結接続、ｃ−ｊｕｎ／Ｆｏｓ相互作用を用いて達成することができる。
【００９５】
[00116]上記の多量体の各サブユニットは、同じ又は異なる特異性を有し得る同じ又は異なる抗体を含み得る。さらに、多量体化ドメインは、必要に応じて、リンカーを使用して抗体に連結させることができる；このようなリンカーは、２つの分子の柔軟な付着を提供するのに十分な長さ及び適切な組成であるべきであるが、抗体の抗原結合特性を妨げるべきではない。例えば、限定することなく、抗体はカーゴ分子に連結され得る。カーゴ分子は、任意の適切な分子であり得る。例えば、カーゴ分子は、検出可能な薬剤、治療剤、薬物、ペプチド、酵素、増殖因子、サイトカイン、受容体トラップ、抗体又はその断片（例えば、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ＶＨＨ、ＶＨ、ＶＬなど）、化学化合物、炭水化物部分、ＤＮＡベースの分子（アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、プラスミド）、細胞傷害性薬剤、ウイルスベクター（アデノ−、レンチ−、レトロ−）、前述のタイプのカーゴ分子のいずれかを充填した１つ若しくは複数のリポソーム若しくはナノキャリア、又は１つ若しくは複数のナノ粒子、ナノワイヤ、ナノチューブ、若しくは量子ドットであり得る。抗体は、当該技術分野において公知である任意の方法（組換え技術、化学的コンジュゲーションなど）を使用してカーゴ分子に連結することができる。
【００９６】
[00117]非限定的な一例では、カーゴ分子は、検出可能な標識、放射性同位元素、ガドリニウム又は酸化鉄などの常磁性標識、フルオロフォア、蛍光剤、近赤外線（ＮＩＲ）蛍光色素又は色素、例えばＣｙ５．５、エコー源性マイクロバブル、親和性標識（例えば、ビオチン、アビジンなど）、検出可能なタンパク質ベースの分子、ヌクレオチド、量子ドット、ナノ粒子、ナノワイヤ、若しくはナノチューブ、又は画像化法によって検出され得る他の適切な薬剤であり得る。特定の非限定的な例では、抗ＡＸＬ抗体は、近赤外線蛍光（ＮＩＲＦ）画像化色素、例えばＣｙ５．５、Ａｌｅｘａ６８０、Ｄｙｌｉｇｈｔ６８０、又はＤｙｌｉｇｈｔ８００に連結され得る。
【００９７】
[00118]本明細書に記載される抗体は、細胞療法、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法、腫瘍溶解性ウイルス、及びこれらの調製及び他の治療組成物に使用され得る。
【００９８】
[00119]別の特定の非限定的な実施形態では、抗体は薬物に連結され、したがって、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を提供する。薬物は、任意のタイプの薬物、例えば、限定されないが、細胞傷害性薬剤又は化学療法剤であり得る。細胞傷害性薬剤又は化学療法剤には、限定されないが、微小管阻害剤（メイタンシン及びオーリスタチンなど）、ＤＮＡ損傷剤（カリケアマイシン及びデュオカルミジンなど）、ＲＮＡポリメラーゼ阻害剤（アルファ−アマンチンなど）、代謝拮抗剤、ＤＮＡと反応する薬剤（アルキル化剤、配位化合物、白金錯体、ＤＮＡ架橋化合物など）、転写酵素の阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡ副溝結合化合物、抗有糸分裂剤（ビンカアルキロイド及びタキサンなど）、抗腫瘍抗生物質、ホルモン、酵素、及び他の強力な薬物が含まれ得る。当業者に公知であるように、抗体−薬物コンジュゲートは、薬物の標的化送達を可能にし、それにより全身曝露を制限する。この構築物では、抗体は、細胞表面のＡＸＬ受容体の細胞外ドメインに結合する。したがって、抗体に連結した薬物は内在化され、細胞内に送達される。次に、薬剤は、細胞内で直接活性化するか、又はエンドソームを介して最初に活性化されて、細胞に作用することができる
[00120]本明細書に記載されるカーゴ分子は、当該技術分野において公知である任意の適切な方法によって、本明細書では「コンジュゲートした」とも呼ばれ、抗体に連結され得る。例えば、限定することなく、カーゴ分子は、共有結合又はイオン相互作用によってペプチドに連結され得る。連結は、化学的架橋反応によって、又は細菌、酵母若しくは哺乳動物細胞ベースのシステムなどの任意のペプチド発現システムと組み合わせた組換えＤＮＡ方法論を用いる融合によって達成することができる。カーゴ分子を抗体にコンジュゲートする場合、適切なリンカーを使用することができる。抗体を治療薬又は検出可能な薬剤などのカーゴ分子に連結する方法は、当業者に周知である。
【００９９】
[00121]本明細書に記載される分子をコードする核酸配列もまた包含される。遺伝暗号の縮重が与えられると、当業者には容易に理解されるように、多数のヌクレオチド配列は、所望のポリペプチドをコードする効果を有する。核酸配列は、様々な微生物における発現のためにコドン最適化され得る。前述された核酸を含むベクターもまた含まれる。さらに、記載されるような核酸及び／又はベクターを含む細胞が包含される。
【０１００】
[00122]単離又は精製された抗体は、様々な方法論を使用して表面に固定化され得る；例えば、抗体は、Ｈｉｓタグカップリング、ビオチン結合、共有結合、吸着を介して、又は他の経路によって、表面に連結又はカップリングされ得る。抗体の固定化は、タンパク質を捕捉、精製、又は単離するための様々なアプリケーションで役立つことがある。固体表面は、任意の適切な表面、例えば、限定されないが、マイクロタイタープレートのウェル表面、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）センサーチップのチャネル、膜、ビーズ（磁気ベース若しくはセファロースベースのビーズ、又は他のクロマトグラフィーレジンなど）、ガラス、プラスチック、ステンレス鋼、フィルム、又はナノ粒子、ナノワイヤ及びカンチレバー表面などの他の有用な表面であり得る。表面に固定化された精製抗体は、診断方法を含む様々な方法で使用することができる。
【０１０１】
[00123]ＡＸＬを検出するインビトロ方法であって、試料を、検出可能な薬剤に連結された１つ又は２つ以上の単離又は精製された抗体と接触させるステップを含む方法が記載される。次に、当該技術分野において公知である検出及び／又は画像化技術を使用して、ＡＸＬ−抗体複合体を検出することができる。前述された方法における試料は、任意の適切な組織試料、例えば、限定されないが、血清試料、血管組織試料、又は腫瘍組織試料であり得る；試料はヒト又は動物の対象由来であり得る。接触ステップは、抗体とＡＸＬの複合体の形成のために、当業者に公知である適切な条件下で行われる。検出するステップは、当該技術分野において公知である任意の適切な方法、例えば、限定されないが、光学画像化、免疫組織化学、分子診断画像化、ＥＬＩＳＡ、又は他の適切な方法によって達成することができる。例えば、検出可能な薬剤に連結された単離又は精製された抗体は、限定されないが、酵素ＩＡ（ＥＩＡ）、ＥＬＩＳＡ、「迅速な抗原捕捉」、「迅速なクロマトグラフィーＩＡ」、及び「迅速なＥＩＡ」などのイムノアッセイ（ＩＡ）において使用され得る。特定の非限定的な実施形態では、インビトロ方法は、循環細胞中のＡＸＬを検出するためのものであり、試料は血清試料である。
【０１０２】
[00124]ＡＸＬ検出及び疾患診断
[00125]対象におけるＡＸＬ発現をインビボで検出する方法が記載される。本方法は、検出可能な薬剤に連結された１つ又は２つ以上の単離又は精製された抗体を対象に投与するステップと、次にＡＸＬに結合した標識抗体を検出するステップとを含む。検出するステップは、当該技術分野において公知である任意の適切な方法、例えば、限定されないが、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、又は蛍光画像化、又は任意の他の適切な方法を含むことができる。前述された方法は、組織、例えば、限定されないが、腫瘍組織におけるＡＸＬの発現を検出するのに有用であり得る。
【０１０３】
[00126]上述の方法におけるインビボ検出ステップは、疾患の進行又は処置レジメンに対する宿主応答を評価するための定量的方法での、診断目的の全身画像化、又は限定されないが固形腫瘍成長の部位など特定部位での局所画像化であり得る。上記される方法における検出ステップは、免疫組織化学、又は非侵襲性（分子）診断画像化技術であり得、限定されないが、光学的画像化；陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）、検出可能な薬剤は１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ及び６８Ｇａなどの同位体であり、１８Ｆが最も臨床的に利用されている；単一光子放出コンピュータ断層撮影（ＳＰＥＣＴ）、検出可能な薬剤は、特定の用途に応じて、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、２０１Ｔｌ、１３３Ｘｅなどの放射性トレーサーである；磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、検出可能な薬剤は、例えば、限定されないが、ガドリニウム、酸化鉄ナノ粒子及び炭素被覆鉄コバルトナノ粒子であり得、それにより、プラークの検出のためのＭＲＩの感度を高める；或いは、造影超音波検査（ＣＥＵＳ）又は超音波、検出可能な薬剤は、少なくとも１つの音響的に活性でガスが充填されたマイクロバブルである、が含まれる。超音波は、ヒト疾患のスクリーニング及び早期発見のための普及した技術であり、ＭＲＩ又はシンチグラフィーよりも安価であり、放射線を伴わないため、放射性核種画像化などの分子画像化モダリティよりも安全である。
【０１０４】
[00127]ＡＸＬを発現する細胞への分子の送達
[00128]ＡＸＬを発現する細胞に目的の分子を輸送する方法が記載される。本方法は、抗体に連結された分子を対象に投与するステップを含む。分子は、前述のように、カーゴ分子を含む任意の所望の分子であり得る；分子は、限定されないが、融合タンパク質としてのコンジュゲーション又は発現を含む、任意の適切な方法を使用して抗体に「連結」され得る。投与は、任意の適切な方法、例えば、限定されないが、静脈内（ｉｖ）、皮下（ｓｃ）、及び筋肉内（ｉｍ）投与を含む非経口投与によるものであり得る。この方法では、抗体が、所望の分子を標的化された方法で細胞に送達させる。
【０１０５】
[00129]組成物
[00130]１つ又は２つ以上の単離又は精製された抗体を含む組成物が提供される。組成物は、上記の単一の抗体を含み得るか、又は抗体の混合物であり得る。さらに、抗体の混合物を含む組成物において、抗体は同じ特異性を有し得るか、又はそれらの特異性が異なり得る；例えば、組成物は、ＡＸＬ（同じ又は異なるエピトープ）に特異的な抗体を含み得る。抗体はバイパラトピックであり得る。組成物はまた、１つ又は２つ以上のカーゴ分子に連結された１つ又は複数の抗体を含み得る。例えば、組成物は、本明細書に記載されるように、１つ又は２つ以上のＡＤＣを含み得る。
【０１０６】
[00131]抗ＡＸＬ抗体が強力な細胞傷害性薬物を送達するために使用される抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）アプローチは、薬物に応答する可能性が高い患者集団を増加させる。理論に縛られることなく、これは主に、進行中のＡＸＬ活性の要件ではなくむしろ、ＡＸＬ発現の増加の要件に大きく起因する可能性がある。別の利点は、抗体に対する耐性が獲得された場合にＡＤＣが頻繁に与えられ得ることである。
【０１０７】
[00132]抗体が提供される組成物はまた、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含み得る。希釈剤、賦形剤、又は担体は、当該技術分野において公知である任意の適切な希釈剤、賦形剤、又は担体であり得、組成物中の他の成分と、組成物を送達する方法と適合しなければならず、組成物の受容者に有害であってはならない。組成物は、任意の適切な形態であり得る；例えば、組成物は、懸濁形態、粉末形態（例えば、限定されないが、凍結乾燥又はカプセル化）、カプセル又は錠剤の形態で提供され得る。例えば、組成物が懸濁形態で提供される場合、担体は、溶解度及び／又は安定性を改善するために、水、生理食塩水、適切な緩衝液、又は添加剤を含み得る；懸濁液を生成するための再構成は、抗体の生存率を確保するために適切なｐＨの緩衝液中で行われる。乾燥粉末はまた、安定性を改善するための添加剤、及び／又はバルク／体積を増加させるための担体を含み得る；例えば、乾燥粉末組成物は、スクロース又はトレハロースを含み得る。特定の非限定的な例では、組成物は、抗体を対象の胃腸管に送達するように処方することができる。したがって、組成物は、カプセル化、徐放、又は抗体の送達のための他の適切な技術を含み得る。本化合物を含む適切な組成物を調製することは、当業者の能力の範囲内である。
【０１０８】
[00133]抗体は、ＡＸＬ発現が調節不全である疾患若しくは状態の処置において使用され得るか、又はこのような使用のための医薬品の調製において使用され得る。抗体は、カーゴ分子に連結され得るか、又は組成物に含まれ得る。本明細書に記載される抗体を使用して処置され得る疾患及び状態には、限定されないが、固形癌腫瘍、例えば、乳癌、腎臓癌、子宮内膜癌、卵巣癌、甲状腺癌、及び非小細胞肺癌、黒色腫、前立腺癌、肉腫、胃癌及びブドウ膜黒色腫が挙げられ；液性腫瘍、例えば、限定されないが、白血病（特に骨髄性白血病）及びリンパ腫が挙げられ；子宮内膜症、血管疾患／損傷（限定されないが、再狭窄、アテローム性動脈硬化症及び血栓症を含む）、乾癬；黄斑変性症による視覚障害；糖尿病性網膜症及び未熟児の網膜症；腎疾患（限定されないが、糸球体腎炎、糖尿病性腎症及び腎移植拒絶が含まれる）、関節リウマチ；変形性関節症、骨粗鬆症及び白内障が含まれる。処置され得る疾患及び状態には、以下の生物学的プロセスによって影響を受けるものも含まれ得る：癌に現れる浸潤、移動、転移、又は薬剤耐性；癌に現れる幹細胞生物学；浸潤、移動、癒着、又は血管新生；血管リモデリング；骨ホメオスタシス；ウイルス感染；又は肥満に現れる分化。式（Ｉ）の化合物はまた、敗血症を処置すること、ワクチンアジュバントとして作用すること、及び／又は免疫無防備状態の患者における免疫応答を増強することにより、炎症過程を調節するために使用され得る。非限定的な一例では、疾患又は状態は転移性癌であり得る。
【０１０９】
[00134]本発明は、以下の実施例においてさらに説明される。しかしながら、これらの実施例は、例示目的のみのためであり、いかなる方法でも本発明の範囲を限定するために使用されるべきではないことが理解されるべきである。
【実施例】
【０１１０】
[00135]
[00136]実施例１：抗ＡＸＬ抗体の生成
[00137]ＡＸＬに対するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、組換えヒトＡＸＬタンパク質（ｒｈＡＸＬ−ＥＣＤ；配列番号５８）の細胞外ドメインでマウスを免疫することによって、並びに遺伝子免疫化によって生成された。
【０１１１】
[00138]ｒｈＡＸＬ−ＥＣＤの生成：Ｃ末端でのＨｉｓ８タグ付き組換えヒト（ｒｈ）ＡＸＬ細胞外ドメイン（ＥＣＤ；配列番号７１）の合成した組換え断片を含むｐＴＴ５構築物をＣＨＯ細胞で発現させ、Ｎｉ−アガロースによって精製され、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで検証した（データを示していない）。
【０１１２】
[00139]免疫化：マウスｍＡｂは、遺伝子免疫化によって生成された。遺伝子免疫のために、マウスから採血し（免疫前血清）、可溶性ｒｈＡＸＬ−ＥＣＤの発現のために１００μｇのｐＴＴ４０発現プラスミドを使用して、流体力学的尾静脈送達技術（ＨＴＶ）によって０日目と４２日目に免疫した。７〜１０日後にマウスから採血し、血清力価をＥＬＩＳＡで測定した。４〜５か月後、１００μｇのｐＴＴ４０−ＡＸＬ−Ｈ８Ｇを使用したブースター注射が、融合実験の３〜４日前にＨＴＶによって行われた。
【０１１３】
[00140]融合実験及びハイブリドーマの選択。すべての操作は無菌条件下で行われた。脾臓細胞をＩＭＤＭ（Ｈｙ−Ｃｌｏｎｅ）で回収し、ＰＥＧ融合プロトコールを使用してＮＳ０骨髄腫細胞株に融合させた。この目的のために、脾臓細胞及び骨髄腫細胞をＩＭＤＭで洗浄し、ＲＢＣ溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）でカウントし、５：１比で一緒に混合した。ペレット化した細胞は、ＰＢＳ中のＰＥＧ  ４０００（ＥＭＤ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の５０％溶液１ｍｌを１分かけて滴下することによって一緒に融合され、３７℃でさらに９０秒間インキュベートされた。２２℃で２分間かけて３０ｍｌのＩＭＤＭを添加することにより反応を停止させた。１０分間のインキュベーション後、新たに融合した細胞を２３３×ｇで１０分間遠心した。細胞は、１０％熱不活化ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を補足したＩＭＤＭで１回洗浄し、２０％熱不活化ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、１ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−６（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、ＨＡＴ培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ）及びＬ−グルタミンを含むＨＡＴ選択培地（ＩＭＤＭ）に１ｍｌあたり２×１０５個のインプット骨髄腫細胞の濃度で懸濁し、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされた。翌日、ハイブリドーマ細胞を洗浄し、５％熱不活性化ＦＢＳ、１ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−６及び１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−Ｆａｂ’２ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ）を補足した半固形培地Ｄ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）に１ｍｌあたり２×１０５個のインプット骨髄腫細胞の濃度で懸濁した。細胞混合物をペトリディッシュ（Ｇｅｎｅｔｉｘ）にプレーティングし、さらに３７℃、５％ＣＯ２で６〜７日間インキュベートした。次に、分泌型クローンは、哺乳動物細胞クローンピッカー（ＣＬＯＮＥＰＩＸ  ＴＭ  ＦＬ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、２０％熱不活性化ＦＢＳ、ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ）、１ｎｇ／ｍｌマウスＩＬ−６（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）、ＨＴ培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ）及びＬ−グルタミンを含むＩＭＤＭの２００μｌを含む滅菌９６−ｗプレート（Ｃｏｓｔａｒ）に移され、３７℃、５％ＣＯ２で２〜３日間インキュベートされた。
【０１１４】
[00141]ハイブリドーマ上清を回収し、ｒｈＡＸＬ−ＥＣＤタンパク質への結合についてＥＬＩＳＡによって評価した。このために、９６ｗハーフエリアプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌのｒｈＡＸＬ−ＥＣＤの２５μｌで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。マイクロプレートをＰＢＳで３回洗浄し、１％のＰＢＳ−ＢＳＡでブロックし、２５μｌのハイブリドーマ上清を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。プレートを０．０５％のＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ（商標）２０で４回洗浄し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間、ブロッキング緩衝液で１／３０００に希釈した２５μｌの二次抗体アルカリホスファターゼをコンジュゲートしたＦ（ａｂ）’２ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートした。０．０５％のＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ（商標）２０で４回洗浄した後、２５μｌの１ｍｇ／ｍｌのｐＮＰＰ基質溶液を添加し、さらに３７℃で１時間インキュベートした。ＯＤ４０５ｎｍの測定は、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ３４０  ＰＣ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して行われた。
【０１１５】
[00142]ＥＬＩＳＡ陽性抗体を選択し（クローンＦ１０７−７Ｈ５、Ｆ１０７−８Ｄ１２、Ｆ１１１−５Ｅ９、Ｆ１１１−３Ｃ８、及びＦ１０７−１０Ｇ１を含む）、１０ｍｌ体積のハイブリドーマ上清で小規模精製を行った。ｍＡｂをＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｍａｇ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｅｘｔｒａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃２８−９６７０−７０）に吸着させて精製し、ＰＢＳで洗浄し、２００μｌのグリシン  ２００ｍＭ  ｐＨ２．５で２回溶出し、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ  １Ｍ  ｐＨ９．０で中和した。精製された抗体は、ＰＢＳであらかじめ平衡化されたＺｅｂａ  Ｓｐｉｎレジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して脱塩し、０．２２μＭメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過滅菌した。抗体溶液の最終濃度は、ナノドロップ（＃ＮＤ−１０００）で決定した。
【０１１６】
[00143]実施例２：抗ＡＸＬ  ｍＡｂの交差反応性評価
[00144]組換えＡＸＬエクトドメインについての実施例１で精製された抗ｈＡＸＬモノクローナル抗体の交差反応性結合特性を評価した。
【０１１７】
[00145]ＴＡＭ受容体チロシンキナーゼサブファミリーの他のメンバーに対するｍＡＢの交差反応性を評価するために、ｍＡｂのｒｈＡＸＬ−ＥＣＤ、ｒｈＭＥＲ−ＥＣＤ、ｒｈＴｙｒｏ−３及びＢＳＡ（陰性対照）への結合をＥＬＩＳＡにより測定した。９６−ｗハーフエリアプレート（Ｃｏｓｔａｒ）を、ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌのｒｈＡＸＬ−ＥＣＤ、ｒｈＭＥＲ−ＥＣＤ、ｒｈＴｙｒｏ−３又はＢＳＡ  ２５μｌで被覆し、４℃で一晩インキュベートした。マイクロプレートをＰＢＳで３回洗浄し、１％のＰＢＳ−ＢＳＡでブロックし、１％のＰＢＳ−ＢＳＡで希釈した１０μｇ／ｍｌの２５μｌを添加し、３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。プレートを０．０５％のＰＢＳ−ＴＷＥＥＮ（商標）２０で４回洗浄し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間、ブロッキング緩衝液で１／５０００に希釈した２５μｌの二次抗体アルカリホスファターゼをコンジュゲートしたＦ（ａｂ）’２ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）とともにインキュベートした。０．０５％のＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０で４回洗浄した後、２５μｇの１ｍｇ／ｍｌ  ｐＮＰＰ基質溶液を添加し、さらに３７℃で１時間インキュベートした。ＯＤ４０５ｎｍの測定は、マイクロプレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  ３４０  ＰＣ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して行われた。
【０１１８】
[00146]表１は、同じタンパク質ファミリー由来の他の標的に対する抗ＡＸＬモノクローナル抗体の交差反応性評価の結果を提供する。ＯＤ４０５ｎｍでの測定値を示す。
【表１】
2020533004.tif 000003
【０１１９】
[00147]交差反応性評価の結果は、５つのｍＡｂがＡＸＬの細胞外ドメインに特異的に結合する、すなわち、それらがＢＳＡ又はＴＡＭファミリーの他のメンバー、すなわちＴｙｒｏ３及びＭＥＲの細胞外ドメインと交差反応しないことを示している。
【０１２０】
[00148]実施例３：ＡＤＣポテンシャルの機能的特徴付け
[00149]実施例１で精製された抗ｈＡＸＬ−ＥＣＤモノクローナル抗体を、ＡＤＣ代替スクリーニングアッセイにおいて、それらの内在化能力及び抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）ポテンシャルについて評価した。非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）Ａ５４９細胞、乳癌ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１細胞、又は膠芽腫Ｕ８７ＭＧ細胞が使用され、これらはすべて中程度から高レベルのＡＸＬを発現する。目的の腫瘍標的（すなわち、ＡＸＬ）を発現することが公知である２つ以上の腫瘍細胞株において、二次的にコンジュゲートしたサポリンベースの細胞傷害性スクリーニングで低い又はサブｎＭ（ＩＣ５０）効力を示すｍＡｂが選択された。
【０１２１】
[00150]細胞培養。次の細胞株は、ＡＴＣＣから取得され、供給業者の推奨に従って培養された：Ａ５４９ヒト非小肺癌（ＮＳＣＬＣ）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性（ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２低）乳癌（ＴＮＢＣ）、及びＵ８７ＭＧ膠芽腫細胞株。一般的に、細胞は、週に１〜２回継代され、すべての実験で４〜６週間以内に使用された。
【０１２２】
[00151]抗体−薬物コンジュゲートとしての抗体媒介性細胞傷害の評価。一次マウス抗体（典型的には濃度１ｎＭ）は、細胞死を引き起こすために内在化する必要があるリボソーム不活化酵素であるサポリン毒素（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と化学的にコンジュゲートした等モル濃度の抗マウス二次抗体とともにインキュベートされた。次に、抗体複合体は、示された細胞型（３重にしてプレーティングされた）に追加され、細胞生存率へのそれらの影響が、３７℃での３日間のインキュベーション後に測定された。一次抗体なし（二次抗体のみ）又は無関係な一次抗体（対照ヒトＩｇＧ）とのインキュベーションを使用して、非標的指向性細胞傷害を評価した。細胞の生存率及び代謝は、アラマーブルーのようなレズリジン色素、又はスルホローダミンＢなどのタンパク質含有量を測定する試薬を使用するなど、従来の方法を使用して測定された。
【０１２３】
[00152]Ａ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞は、９６ウェルプレート中のＲＰＭＩ−５％ＦＢＳ中に、１００μｌのＲＰＭＩ−５％ＦＢＳ中、２０００細胞／ウェルの密度でプレーティングされた。翌日、２０ｎＭの抗ＡＸＬ  ｍＡｂを２０ｎＭのＭａｂ−Ｚａｐ二次抗体（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と混合し、３０分間、室温でインキュベートした；１ｎＭの最終濃度の抗ＡＸＬ  ｍＡｂ（Ｆ１０７−７Ｈ５、Ｆ１０７−８Ｄ１２、Ｆ１１１−５Ｅ９、Ｆ１１１−３Ｃ８、又はＦ１０７−１０Ｇ１）とサポリンをコンジュゲートした抗マウス二次抗体（Ｍａｂ−Ｚａｐ）の１：１複合体が細胞とインキュベートされるように、１１μｌのこの混合物を細胞に３重にして添加した。７２時間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２、加湿インキュベーター）の後、アラマーブルーを使用して製造元（ＢＩＯＳＯＵＲＣＥ）の指示に従って細胞生存率を決定した。続いて、１ｎＭの濃度でＡ５４９細胞の生存率を５０％を超えて低下させた抗体はまた、上記の方法を使用して乳癌ＭＤＡ−ＭＢ  ２３１細胞、又は神経膠芽腫Ｕ８７ＭＧ細胞株における細胞傷害性の影響を試験された。
【０１２４】
[00153]図２は、抗ｈＡＸＬ−ＥＣＤ  ｍＡｂについてのＡＤＣ代理スクリーニングアッセイの結果を示す。アッセイの抗体は、二次コンジュゲートのみ（Ｍａｂ−Ｚａｐ）で処理された細胞と比較して、Ａ５４９細胞の生存率を著しく低下させた。提示されているのは、３重の実験の平均値＋ＳＥＭである。
【０１２５】
[00154]図２では、細胞の生存は、ｍＡｂ−ＺＡＰ二次コンジュゲートのみの生存（１００％として示されている）と比較して表されている。選択したｍＡｂクローン（Ｆ１０７−７Ｈ５、Ｆ１０７−８Ｄ１２、Ｆ１０７−１０Ｇ１、Ｆ１１１−３Ｃ８、及びＦ１１１−５Ｅ９）は、Ａ５４９細胞及び少なくとも１つ以上の細胞株で生存率を５０％を超えて低下させ、高細胞傷害性薬物ＤＭ１への直接コンジュゲーションのために選択された。試験された２５０を超える一次マウスｍＡｂの中から、これらの５つの抗体に関連する高度の細胞傷害性（ＩＣ５０＜１ｎＭ）は、それらが高度の内在化及び適切な細胞内ルーティングを示し、サポリン毒素の活性化を達成し、それらをＡＤＣ開発に理想的なものにすることを実証する。当然のことながら、このスクリーニングで同定された抗体はすべて、腫瘍細胞の表面でＡＸＬへのかなりの結合を示した（図３）。
【０１２６】
[00155]図３は、細胞表面に発現されたＡＸＬに対する抗ＡＸＬ  ｍＡｂの結合特性を決定するフローサイトメトリー実験の結果を示す。パネルＡは線形スケールの用量−反応曲線を示し、パネルＢは対数スケールの用量−反応曲線を示す。
【０１２７】
[00156]実施例４：ＤＭ１コンジュゲーション及びＡＤＣ試験
[00157]実施例１で精製された抗ｈＡＸＬ−ＥＣＤモノクローナル抗体は、リジン残基を介して、Ｎ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）に結合したスクシンイミジルトランス−４−［マレイミジルメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）にコンジュゲートした。生成物の純度及び薬物：抗体比は、ＵＰＬＣベースのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって決定された。
【０１２８】
[00158]コンジュゲーション：精製された抗ｈＡＸＬ−ＥＣＤ  ｍＡｂ（Ｆ１０７−７Ｈ５、Ｆ１０７−８Ｄ１２、Ｆ１１１−５Ｅ９、Ｆ１１１−３Ｃ８、又はＦ１０７−１０Ｇ１；実施例１）は、コンジュゲーション緩衝液（１００ｍＭリン酸ナトリウム、２０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．２）に、事前平衡化したスピン脱塩カラムを使用して緩衝液交換された。各ｍＡｂの濃度は、コンジュゲーション緩衝液で２ｍｇ／ｍＬに調整され、各々合計２００μｇがコンジュゲーションに使用された。ＳＭＣＣ−ＤＭ１の原液をジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）で調製した。ＤＭＡ原液からのＳＭＣＣ−ＤＭ１を各ｍＡｂに添加して、ＳＭＣＣ−ＤＭ１：ｍＡｂのモル比を１０．０にした。溶液を完全に混合し、３７℃で３時間インキュベートした。反応は、０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート−２０を添加したコンジュゲーション緩衝液で平衡化した２つのスピン脱塩カラムに反応混合物を通すことで停止された。
【０１２９】
[00159]薬物−抗体比（ＤＡＲ）は、２８０ｎｍと２５２ｎｍの両方でのＵＰＬＣ−ＳＥＣクロマトグラムからの単量体ピークを積分し、これらを同じ波長での非コンジュゲート抗体及び遊離薬物の減衰係数の比と比較することにより決定された。単量体パーセントは、クロマトグラムで観察された単量体、高分子量種、及び低分子量種の合計面積から決定された。結果を表２に示す。これは、ＤＭ１にコンジュゲートしたＦ１０７−７Ｈ５、Ｆ１０７−８Ｄ１２、Ｆ１１１−５Ｅ９、Ｆ１１１−３Ｃ８、及びＦ１０７−１０Ｇ１についてＵＰＬＣ−ＳＥＣによって決定された薬物抗体比及び凝集体パーセントを提供する。
【表２】
2020533004.tif 000004
【０１３０】
[00160]細胞培養。ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＡ５４９ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性（ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２低）乳癌（ＴＮＢＣ）細胞株をＡＴＣＣから入手し、供給業者の推奨に従って培養した。ＨａＣａＴ細胞は、自然発生的に不死化されたヒトのケラチノサイト株であり、皮膚の生物学及び分化の研究に広く使用されている。この細胞株をＣｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＤＫＦＺ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙから入手し、供給業者の推奨に従って培養した。一般的に、細胞は週に１〜２回継代され、すべての実験で４〜６週間以内に使用された。
【０１３１】
[00161]ＡＤＣ試験：上記で調製した抗ＡＸＬ  ＡＤＣは、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ＮＣＩ−Ｈ２９２及びＡ５４９細胞株、ヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞株、並びに不死化されたケラチノサイトを含む、ＡＸＬを発現することが公知である様々な培養細胞株の生存率における影響について試験された。５日間の曝露後、スルホローダミンＢ試薬を使用して細胞増殖／生存率を評価し、用量−反応曲線を作成して、ｌｏｇ（阻害剤）対応答−−ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６．０ソフトウェアの可変勾配（４つのパラメーター）モデルを使用して、効力（ＩＣ５０）及び有効性（最大阻害％）を測定した。
【０１３２】
[00162]図４は、ＡＸＬを表現する、Ｈ２９２腫瘍細胞株、Ａ５４９細胞株、ヒト乳腺癌ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞株、並びに不死化されたＨａＣａＴケラチノサイト細胞の細胞生存率における抗ＡＸＬ−ＤＭ１コンジュゲートの活性の結果を示す。
【０１３３】
[00163]非標的化非関連ヒトＩｇＧ−ＤＭ１コンジュゲート陰性対照と比較して分析された腫瘍細胞株において、ＤＭ１をコンジュゲートした抗ＡＸＬ抗体は、良好な効力（５５〜７４％の最大増殖阻害）及び強力な有効性（ＩＣ５０＜０．１ｎＭ）を実証した。対照的に、ＡＸＬを発現する、非腫瘍形成性の不死化されたＨａＣａＴケラチノサイト細胞では、毒性はほとんど見られなかった。
【０１３４】
[00164]表３は、抗ＡＸＬ抗体のＡＤＣ試験の結果を提供する。最大阻害％＝最大阻害のパーセント。
【表３】
2020533004.tif 000005
【０１３５】
[00165]実施例５：フローサイトメトリーによる細胞表面結合
[00166]実施例１で精製された抗ｈＡＸＬ−ＥＣＤモノクローナル抗体の細胞表面上のＡＸＬへの結合特性は、抗ｈＡＸＬ−ＥＣＤ  ｍＡｂによる強力な阻害により、Ｈ２９２細胞株を用いたフローサイトメトリーによって評価された（実施例２を参照されたい）。
【０１３６】
[00167]フローサイトメトリーによる表面ＡＸＬへの抗体結合の検出。分析の前に、細胞は分析の日に８０％以下のコンフルエントになるようにプレーティングされた。細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞解離緩衝液（Ｓｉｇｍａ）を添加して回収した。２．５×１０５細胞を含む細胞懸濁液（５００μｌの対応する細胞培養培地中）を様々な濃度（０．０１〜１０ｎＭ）の抗ＡＸＬ抗体と４℃で２時間（内在化を防ぐため）インキュベートした。細胞培養培地で１回洗浄した後、一次抗体を１００μｌの培地中で２μｇのＤＹＬＩＧＨＴ（商標）４８８をコンジュゲートしたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  ４８８二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）とともに１時間、４℃でインキュベートした。分析前に、細胞ペレットを３００〜５００μｌの培地に再懸濁し、５０μｍナイロンメッシュフィルターで濾過して細胞凝集体を除去した。フローサイトメトリー分析は、ＢＤ  ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）及びＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）取得ソフトウェアを備えた標準フィルターセットを使用して、製造元の指示に従って、前方散乱、側方散乱パラメーター、及びヨウ化プロピジウム色素排除でゲートをかけた１０，０００個の生存細胞について行われた。
【０１３７】
[00168]抗体結合の特異的検出は、一次抗体の非存在下（しかし検出抗体を含む）での結合の平均蛍光強度をバックグラウンドレベルで差し引いた後、各々の一次抗体への結合の平均蛍光強度として計算された。次に、結合パラメーターＢｍａｘ（受容体飽和時の最大蛍光シグナル）、及びＫＤ（見かけの細胞結合定数）をＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６．０のヒルスロープモデルによる１部位−特異的結合を使用して決定した。
【０１３８】
[00169]結果を図３及び表４に示す。これらの結果は、ｍＡｂ  ７Ｈ５、８Ｄ１２、及び５Ｅ９が、陰性結合対照（３００ｎＭマウスＩｇＧ）と比較して、強く結合したことを示した（見かけの結合定数はＫＤ≦１ｎＭである）。
【０１３９】
[00170]表４は、Ｈ２９２細胞上の細胞ベースのＡＸＬへの抗ＡＸＬ  ｍＡｂの結合特性を提供する。
【表４】
2020533004.tif 000006
【０１４０】
[00171]実施例６：エピトープビニング実験
[00172]実施例１の抗ｈＡＸＬ−ＥＣＤ  ｍＡｂが同じエピトープ領域に結合するかどうかを評価するために、表面プラズモン共鳴エピトープビニング実験を行った。
【０１４１】
[00173]抗体は、チップ表面（「ｍＡｂ１」）上に直接固定化され、その後、ｒｈＡＸＬ  ＥＣＤが流され、続いて同じ又は異なる抗体（「ｍＡｂ２」）が流された。すべての実験は、泳動緩衝液としてＰＢＳＴ（０．０５％ｖ／ｖのＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ）を使用して、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６バイオセンサーで行われた。ＧＬＭセンサーチップ及びカップリング試薬（１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＳＮＨＳ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミンポルピル）−カルボジアミド塩酸塩（ＥＤＣ）、及びエタノールアミド）は、ＢｉｏＲａｄ、Ｉｎｃから購入した（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。
【０１４２】
[00174]抗体アレイの作製。抗体（Ｍａｂ１）をＧＬＭチップ表面に３０μｌ／分で固定化した。活性化試薬（水中で０．４Ｍ  ＥＤＣ及び０．１Ｍ  ＳＮＨＳのストック濃度）をそれぞれ、水中で２０倍に希釈した。上部（Ａ１）の水平チャネル（Ｐｒｏｔｅｏｎ制御ソフトウェアのＡｎａｌｙｔｅチャネル）を、希釈した活性化試薬で３分間活性化した。次に、ｍＡｂ（実施例１）をそれぞれ１０ｍＭ酢酸塩ｐＨ４．５で２０μｇ／ｍｌに希釈し、別々の垂直（Ｌ１〜Ｌ６）チャネル（Ｐｒｏｔｅｏｎ制御ソフトウェアのリガンドチャネル）で３分間注入した後、反応性スポットをブロックするためにエタノールアミンを３分間注入した。次に、マルチチャネルモジュール（ＭＣＭ）を回転させ、活性化された水平チャネル（Ａ１）でエタノールアミンをさらに３分間注入した。次に、この４ステップの「活性化−結合−及び−２×脱活性化」の手順を各水平チャネル（Ａ２〜Ａ６）で繰り返した。
【０１４３】
[00175]サンドイッチエピトープビニング。２ステップのサンドイッチエピトープビニングは、検体の配向で３０μｌ／分で行われた。１００ｎＭ  ｒｈＡＸＬ−ＥＣＤタンパク質を３分間注入し、すぐに１００ｎＭでｍＡｂ２を３分間注入した。固定化されたｍＡｂ（ｍＡｂ１）表面は、０．８５％リン酸を１００μｌ／分で１８秒間注入することにより再生された。この２段階の注入（ｒｈＡＸＬ−ＥＣＤ−ｍＡｂ２）は、個々のｍＡｂ２ごとに繰り返された。各ｍＡｂはまた、ｍＡｂ１（チップ上に固定化）及びｍＡｂ２（溶液中）として同時に試験された。固定化されたｍＡｂ１からのＡＸＬ解離をモニタリングするために、ｍＡｂ２の代わりにＰＢＳＴを注入した。
【０１４４】
[00176]表５は、ｍＡｂのエピトープビニング結果を提供する。「ｎｃ」というラベルの付いた細胞は競合がないことを示し、「ｓｃ」の細胞は自己競合を示し、「Ｃ」の細胞は競合を示す。
【表５】
2020533004.tif 000007
【０１４５】
[00177]表５に示される結果から、ｍＡｂのうちの４つが２つのエピトープビンに分類され、すなわち、それらがＡＸＬへの結合について互いに競合することが分かり得る；７Ｈ５は８Ｄ１２と競合し、その逆も同様であり、３Ｃ８は５Ｅ９と競合し、その逆も同様である。１０Ｇ１は他のｍＡｂと競合しない。対照的に、ＡＤＣサロゲートアッセイで内在化する能力に基づいて選択されなかった抗ＡＸＬ  ｍＡｂは、多数のビンにそれ自体を分散する傾向があった（データを示していない）。このデータは、抗体を内在化するための機能的選択が、ＡＸＬ細胞外ドメインの３つの主要な部位に選択的に結合するサブセットをもたらすことを示唆する。さらに、同様の方法を使用した追加のＳＰＲ結合研究により、これらの部位が免疫グロブリン様ドメイン１及び２内の領域に対応することが実証された。個々のＡＸＬ細胞外サブドメイン（免疫グロブリン様ドメイン又はフィブロネクチンタイプＩＩＩ様ドメイン）を用いて行われたエピトープビニング実験（上記と同じ方法）により、ｍＡｂ  Ｆ１０７−１０Ｇ１が免疫グロブリン様ドメイン１の配列に結合し、試験された他のすべてのＩｇＬ１結合抗体と競合しないことを示し、これは、完全なＡＸＬエクトドメインを利用した結果と一致する。これらの結果は、ＡＤＣ  ｍＡｂが相互作用する免疫グロブリン様ドメイン１内に少なくとも２つの別個のエピトープがあることを示している。
【０１４６】
[00178]実施例７：酵母表面提示によるエピトープマッピング
[00179]酵母表面提示を使用して、実施例１の抗ｈＡＸＬ−ＥＣＤ  ｍＡｂが結合する配列をマッピングした。
【０１４７】
[00180]エピトープマッピング。ｈＡＸＬエクトドメイン（ＥＣＤ）及びその断片は、酵母表面提示法（Ｆｅｌｄｈａｕｓら、２００３年）を使用して、酵母細胞の表面に発現され、共有結合で提示された。ＹＳＤベクター（ｐＰＮＬ６）は、米国太平洋北西国立研究所からのものである。ｈＡＸＬ−ＥＣＤ全体（図５）をカバーするｈＡＸＬ断片は、酵母細胞表面で融合タンパク質（Ａｇａ２−ＨＡ−（ｈＡＸＬ）−ＭＹＣ）として発現された。提示されたｈＡＸＬ断片を使用して、実施例１の抗ｈＡＸＬ−ＥＣＤ  ｍＡｂが結合するｈＡＸＬのドメインをマッピングした。酵母細胞へのｍＡｂの結合は、全酵母細胞ＥＬＩＳＡを使用して行われた。提示された融合タンパク質の相対量は、抗ＭＹＣ抗体、続いてＨＲＰをコンジュゲートした二次抗体でプローブすることにより測定され、実施例１のｍＡｂの結合シグナルを正規化するために使用された。
【０１４８】
[00181]図５は、ヒトＡＸＬエクトドメイン及び膜貫通ドメインの略図である。抗ＡＸＬ  ｍＡｂの結合エピトープをマッピングするために、ｈＡＸＬ−ＥＣＤ全体をカバーする１０個のペプチドが酵母膜上で発現された。ペプチドが示され、１〜１０の番号が付けられている。
【０１４９】
[00182]表６は、提示された酵母細胞上のＡＸＬ細胞外ドメインの様々な領域への抗ＡＸＬ  ｍＡｂ結合の結果を示す。実施例１のｍＡｂは２つの領域に結合する：免疫グロブリン様ドメイン１（ＩｇＬ１、ａａ２６〜１３８に対応する）又は免疫グロブリン様ドメイン２（ＩｇＬ２、ａａ１３５〜２２６に対応する）。これらの結果は、実施例６で得られた結果と一致している。
【表６】
2020533004.tif 000008
【０１５０】
[00183]エピトープの性質。ｍＡｂのエピトープが連続的（線形）であるか又は非連続的（立体構造的）であるかを決定するために、ＩｇＬ１又はＩｇＬ２ドメインのいずれかの様々な断片を酵母細胞に発現して提示させ、上記のように細胞ＥＬＩＳＡを使用してｍＡｂへの結合をアッセイした。いずれのＩｇＬドメインのサブ断片も、実施例１のいずれかのｍＡｂに有意に結合しないが、これらのサブ断片は、抗ＭＹＣシグナルのシグナルで判断すると、酵母細胞の表面によく提示される。これらの結果は、実施例１のｍＡｂのエピトープがＩｇＬドメインの完全な配列情報を必要とし、したがって大部分が立体構造的であることを強く示唆する。
【０１５１】
[00184]実施例８：抗体配列決定
[00185]実施例１の抗ｈＡＸＬ  ｍＡｂのＶＨ及びＶＬドメインを配列決定し、分析した。
【０１５２】
[00186]ＶＨ及びＶＬドメイン並びにＣＤＲ領域の配列を表７に示す。ＶＨ及びＶＬ鎖のＣＤＲ１−３領域のコンセンサス結合配列の配列分析は、ウェブベースのソフトウェアを使用して行われた。この分析の結果は、ｍＡｂ  Ｆ１０７−７Ｈ５のＶＨ領域とＶＬ領域の両方のＣＤＲ領域がＦ１０７−８Ｄ１２のＣＤＲ領域と非常に類似していることを示している（２アミノ酸の変化）。これらの抗体は一緒にクラスター化し、ＩｇＬ１内の共通の線形エピトープを認識する。対照的に、Ｆ１０７−１０Ｇ１（選択されたＩｇＬ１結合抗体の大部分とは異なるＩｇＬ１上の部位に結合する）を除いて、残りの抗体は、より小さな分化クラスターを形成する傾向があり、その大部分はＩｇＬ２に結合する。
【表７】
2020533004.tif 000009
【０１５３】
[00187]実施例９：組換え抗体の生成及び精製
[00188]大規模なｍＡｂ生成及び生成間の一貫性を促進するために、実施例８で同定された抗ｈＡＸＬ−ＥＣＤ  ｍＡｂをＣＨＯ細胞中で組換えにより生成した。
【０１５４】
[00189]ＶＨ及びＶＬ領域（実施例８を参照されたい）は、ヒトＩｇＧ１定常領域（それぞれヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトカッパ軽鎖）との融合体としてｐＴＴ５ベクターにクローニングされ、それによりキメラｍＡｂを生成した。
【０１５５】
[00190]表８は、キメラｍＡｂ：ｈＦＣ−Ｆ１０７−７Ｈ５、ｈＦＣ−Ｆ１０７−８Ｄ１２、ｈＦＣ−Ｆ１１１−５Ｅ９、ｈＦＣ−Ｆ１１１−３Ｃ８、及びｈＦＣ−Ｆ１０７−１０Ｇ１の各々の配列を提供する。さらに、すべての軽鎖配列は、Ｎ末端にシグナル配列ＭＶＬＱＴＱＶＦＩＳＬＬＬＷＩＳＧＡＹＧ（配列番号５９）を含み、一方、重鎖配列は、Ｎ末端にシグナル配列ＭＤＷＴＷＲＩＬＦＬＶＡＡＡＴＧＴＨＡ（配列番号６０）を含んだ。
【表８】
2020533004.tif 000010
【０１５６】
[00191]キメラｍＡｂ発現は、２ｍＬの発現スカウトを介して検証された：ＣＨＯ細胞は、ＶＬ及びＶＨ含有構築物（１：１比）で一過性にトランスフェクトされた；馴化培地（ＣＭ）を７日目に回収し、ｍＡｂ発現レベルをＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した（データを示していない）。キメラｍＡｂは十分に発現し、小規模生成（５０ｍＬ）は、同じ構築比でＣＨＯ細胞を一過性にトランスフェクトすることにより開始された。７日目に馴化培地（ＣＭ）を回収し、キメラｍＡｂを精製（ＰｒｏｔＡ）して定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。データは、５つすべてのキメラｍＡｂが一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞によって十分に発現されたことを示した。
【０１５７】
[00192]組換え的に発現されたキメラｍＡｂがハイブリドーマ発現されたｍＡｂと同様に挙動することを確認するために、ＳＰＲ結合実験は、ＡＸＬ結合が損なわれないことを確実にするために行われる。
【０１５８】
[00193]実施例１０：抗ＡＸＬ  ｍＡｂ及びｓｄＡｂの単離
[00194]この実施例では、ヒトＡＸＬエクトドメインに対して指向されたラマｓｄＡｂの単離が行われる。
【０１５９】
[00195]材料及び方法
[00196]組換えヒトＡＸＬエクトドメイン（ｒｈＡＸＬ  ＥＣＤ）の生成。Ｃ末端でのＨｉｓ８タグ付き組換えヒトＡＸＬ細胞外ドメインの合成した組換え断片を含む哺乳動物発現ベクター（ｐＴＴ５）をＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトし、Ｎｉ−ａｇａｒｏｓｅで精製し、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥで検証した（データを示していない）。
【０１６０】
[00197]ラマ単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）の生成。ラマｓｄＡｂｓ（ＶＨＨ）は、ラマをｒｈＡＸＬ  ＥＣＤタンパク質で免疫し、続いて、末梢血リンパ球から構築された、ファージ提示されたＶＨＨライブラリーをパニングすることによって生成された。簡単に言うと、一頭のラマ（ラマグラマ）を、０、２１、２８、３５、及び４２日目に１００μｇのｒｈＡＸＬで免疫した。抗原は、０日目にフロイント完全アジュバントとともに、並びに２１、２８、３５及び４２日目にフロイント不完全アジュバントとともに混合された。血清は、０日目（免疫前）の最初の免疫化前、並びに３５及び４９日目に採取され、次に、プロテインＡ及びプロテインＧアフィニティークロマトグラフィーを使用して、重鎖ＩｇＧ（ｈｃＩｇＧ）から別々の従来のＩｇＧ（ｃＩｇＧ）に分画された。非分画及び分画の血清におけるｒｈＡＸＬに対するＥＬＩＳＡを行った。簡単に言えば、ＰＢＳで希釈した１μｇのｒｈＡＸＬを９６ウェルＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）プレート（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＮＹ）に一晩（１００μｌ／ウェル、１８時間、４℃）被覆した。プレートを５％スキムミルク／ＰＢＳＴでブロックし、ＰＢＳ−Ｔ（ＰＢＳ＋０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０）で洗浄し、免疫前の総（未分画）血清、免疫後の総血清（３５及び４９日目）並びに分画された血清（４９日目；１００μｇ／ｍｌの開始濃度）の連続希釈物を適用した。室温で１．５時間インキュベートし、ＰＢＳ−Ｔで洗浄した後、ヤギ抗ラマＩｇＧ−ＨＲＰ（ＰＢＳで１：１０，０００）を３７℃で１時間添加した。最後のＰＢＳ−Ｔ洗浄は、１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を１０分間添加する前に行われた。反応を１００μｌ／ウェルの１Ｍ  Ｈ３ＰＯ４で停止し、ＢｉｏＲａｄプレートリーダー（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）で４５０ｎｍにて読み取った。
【０１６１】
[00198]ファージ提示されたＶＨＨライブラリー構築のために、ＱＩＡａｍｐ  ＲＮＡ血液ミニキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、免疫後の３５日目及び４９日目に収集された約５×１０７個のリンパ球からＲＮＡを単離した。約１０μｇの総ＲＮＡは、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｂａｉｅ−ｄ’Ｕｒｆｅ、ＱＣ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、オリゴｄＴプライマーを用いた第１鎖ｃＤＮＡ合成のテンプレートとして使用された。ｃＤＮＡは、３つの可変領域特異的センスプライマー（ＭＪ１、ＭＪ２、及びＭＪ３）及び２つのアンチセンスＣＨ２特異的プライマー（ＣＨ２及びＣＨ２ｂ３）の等モルの混合物によってＰＣＲ増幅された。簡単に言うと、ＰＣＲ反応混合物は、５０μｌの合計容量で、次の成分を用いてセットアップされた：５μｌのｃＤＮＡ、５ｐｍｏｌのＭＪ１−３プライマー混合物、５ｐｍｏｌのＣＨ２又はＣＨ２ｂ３プライマー、５μｌの１０×反応緩衝液、１  μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ及び２．５ユニットのＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）。ＰＣＲプロトコールは、９４℃で３分間の最初のステップ、続いて９４℃で３０秒間、５７℃で４５秒間、７２℃で１分間の３０サイクル、及び７２℃で１０分間の最終の伸長ステップで構成された。増幅されたＰＣＲ産物を２％アガロースゲルで泳動し、２つの主要なバンド：従来のＩｇＧに対応する約８５０ｂｐのバンド、及び重鎖抗体（ｈｃＩｇＧ）に対応する約６００ｂｐのバンドが観察された。小さいバンドは、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して切断及び精製され、１μｌのＤＮＡテンプレート、各５ｐｍｏｌのＭＪ７プライマー及びＭＪ８プライマー、５μｌの１０×反応緩衝液、１μｌの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、及び２．５ユニットのＰｌａｔｉｎｕｍ（登録商標）Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用して、５０μｌの合計体積で２回目のＰＣＲで再増幅された。ＰＣＲプロトコールは、９４℃で３分間の最初のステップ、続いて９４℃で３０秒、５７℃で３０秒、及び７２℃で１分間の３０サイクル、並びに７２℃で７分間の最終の伸長ステップで構成された。３４０ｂｐ〜４２０ｂｐの範囲であり、ｈｃＩｇＧのＶＨＨ断片に対応する増幅されたＰＣＲ産物は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製され、ＳｆｉＩ制限酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ、Ｐｉｃｋｅｒｉｎｇ、ＯＮ、Ｃａｎａｄａ）で消化され、同じキットを使用して再精製された。５０μｇのｐＭＥＤ１ファージミドを５０℃にて一晩ＳｆｉＩで消化した。
【０１６２】
[00199]自己連結を最小限にするために、２０ユニットのＸｈｏＩ及びＰｓｔＩ制限酵素を添加し、消化反応を３７℃でさらに２時間インキュベートした。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びそのプロトコールを使用して、２０μｇの消化されたファージミドＤＮＡを６μｇの消化されたＶＨＨ断片と３時間、室温で連結した。連結された材料を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを使用して１００μｌの最終体積に精製し、５μｌの割合で市販のエレクトロコンピテントＴＧ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）に記載されるようにエレクトロポレーションした。ライブラリーのサイズは、記載されるように決定された。ライブラリーは、２％（ｗ／ｖ）グルコースの存在下、３７℃、２５０ｒｐｍで２時間増殖させた。細菌細胞をペレット化し、３５％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む２ｘＹＴ／Ａｍｐ／Ｇｌｕ（１００μｇ／ｍｌアンピシリン及び２％（ｗ／ｖ）グルコースを含む２×ＹＴ培地）に再懸濁し、少量ずつ−８０℃で保存した。
【０１６３】
[00200]ファージ提示されたライブラリーは、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを使用してレスキューされた。ＡＸＬ特異的ＶＨＨは、２つの戦略を使用してライブラリーから選択された。第１の戦略では、ライブラリーは、Ｚｈｏｕら、２０１０年に記載されるように、固定化されたｒｈＡＸＬ  ＥＣＤ及びＡ５４９腫瘍細胞に対して同時にパニングされた。２番目の戦略では、ライブラリーは、ｒｈＡＸＬ  ＥＣＤに対してパニングされ、ＶＨＨを提示するファージは、Ｈｅｎｒｙら、２０１６年に記載されるように、ＡＸＬ特異的マウスｍＡｂ（５Ｅ９及び１０Ｇ１）と競合的に溶出された。ライブラリーファージ及びパニングから溶出されたファージは、Ｈｅｎｒｙら、２０１６年に記載されるように、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ次世代ＤＮＡシーケンスを使用して調査された。
【０１６４】
[00201]結果
[00202]ｒｈＡＸＬ  ＥＣＤに対して向けられたＶＨＨは、免疫されたラマからファージ提示されたＶＨＨライブラリーを構築し、上記の方法セクションに記載されるようにライブラリーの様々な選択を行うことにより同定された。インプット（ライブラリー）ＶＨＨを提示するファージ及びアウトプット（溶出される）ＶＨＨを提示するファージの配列決定が行われ、特定の選択で選択的に濃縮された個々のＶＨＨ配列が同定された。
【０１６５】
[00203]図６は、抗ｒｈＡＸＬ  ＥＣＤ  ｓｄＡｂの単離のための戦略を図示する。パネルＡ及びＣでは、ｒｈＡＸＬ−ＥＣＤで免疫されたラマから構築されたファージ提示されたＶＨＨライブラリーは、固定化されたｒｈＡＸＬ、及びＡＸＬ＋Ａ５４９腫瘍細胞上で同時にパニングされた。ｈＡＸＬ  ＥＣＤへの結合及びＡ５４９細胞への内在化が同時に強化されたＶＨＨ（ＮＲＣ−ｓｄＡｂ００１、配列番号１１９；ＮＲＣ−ｓｄＡｂ００２、配列番号１２０）、並びにＡ５４９細胞への内在化のみが強化されたＶＨＨ（ＮＲＣ−ｓｄＡｂ００３、配列番号１２１；ＮＲＣ−ｓｄＡｂ００４、配列番号１２２）が同定された。パネルＢ及びＤでは、ｒｈＡＸＬ−ＥＣＤで免疫されたラマから構築されたファージ提示されたＶＨＨライブラリーがｒｈＡＸＬ  ＥＣＤに対してパニングされ、ＶＨＨがＡＸＬ特異的ｍＡｂｓ  ５Ｅ９又は８Ｄ１２を使用して競合的に溶出された。この選択戦略を使用して濃縮されたＶＨＨは、次世代ＤＮＡシーケンシングを使用して同定された。
【０１６６】
[00204]実施例１１：抗ＡＸＬ  ｍＡｂ及びｓｄＡｂのＤＮＡ及びアミノ酸配列の決定
[00205]この実施例では、抗ＡＸＬ  ｍＡｂ及びｓｄＡｂ（実施例１０に従って単離された）のＤＮＡ及びアミノ酸配列が記載される。
【０１６７】
[00206]材料及び方法
[00207]マウスｍＡｂ配列決定のために、ハイブリドーマクローン（Ｑｉａｇｅｎ、ＲＮＥａｓｙ）から総ＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）。ＶＨ及びＶＬドメインをコードするＤＮＡは、ＦＲ１でアニーリングする縮退フォワードプライマーとＣＨ１でアニーリングする単一のリバースプライマーの混合物（Ｎｏｖａｇｅｎ／ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号６９８３１−３）を使用して、ＰＣＲ増幅（Ｐｌａｔｉｎｕｍ  Ｔａｑ又は同等のもの）された。得られたアンプリコンをサブクローニングし（ＴＯＰＯ−ＴＡ）、ＡＢＩ  ３７３０ｘｌ装置でサンガー法を使用して配列決定した。
【０１６８】
[00208]ラマＶＨＨ  ＤＮＡ配列の決定のために、ファージ提示されたＶＨＨライブラリーは、様々なインビトロ選択（実施例１０に記載される）に供され、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ機器で２×２５０ｂｐの読み取りを使用して配列決定された。目的のＶＨＨ配列は、従来と比較して選択後の頻度を上げることにより同定された。ＶＨＨをコードするＤＮＡ構築物を商業的に合成し（Ｇｅｎｅａｒｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、細菌発現ベクターにサブクローニングし、ＡＢＩ  ３７３０ｘｌ機器でサンガー法を使用して再度確認した。
【０１６９】
[00209]結果
[00210]７つのマウスｍＡｂのＶＨ及びＶＬドメインのＤＮＡ配列は、ハイブリドーマ細胞に由来するアンプリコンのサンガー配列決定によって決定された。ｍＡｂ  ＶＨ／ＶＬドメインをコードするＤＮＡ構築物は、断片の結晶化可能領域（Ｆｃ領域）を含む哺乳動物発現ベクターで商業的に合成され、サンガー配列決定によって検証された。
【０１７０】
[00211]図７は、太字の下線付きフォントで表された国際的なＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）情報システム定義を使用したＣＤＲを伴うｍＡｂ  ＶＨ／ＶＬドメインのアミノ酸配列を示す。本明細書においてＣＤＲ配列を参照する場合、ＩＭＧＴ定義が使用される。ＣＤＲのＫａｂａｔ定義は、主に目的のみのために、ＩＭＧＴの代替定義として、図７で陰影付きフォントとして示されている。ＣＤＲのＩＭＧＴ定義には、Ｎ末端配列がわずかに多く含まれている場合があるが、Ｋａｂａｔ定義では、ＣＤＲが後で始まり、Ｃ末端にさらに拡張するように示す。
【０１７１】
[00212]８つのラマＶＨＨのＤＮＡ配列は、イルミナのＭｉＳｅｑ機器で２×２５０ｂｐの読み取りを使用して決定された（配列は、実施例１０に記載されるように、これらのＶＨＨの単離の一部として決定された）。ＶＨＨをコードするＤＮＡ構築物は、細菌発現ベクターで商業的に合成され（ＧｅｎｅＡｒｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、それらの配列はサンガー配列決定を使用して確認された。
【０１７２】
[00213]図８は、ＩＭＧＴ定義を使用した、ＣＤＲを伴うＶＨＨのアミノ酸配列を示し、太字の下線付きフォントで表される。本明細書においてＣＤＲ配列を参照する場合、ＩＭＧＴ定義が使用される。ＣＤＲのＫａｂａｔ定義は、ＩＭＧＴの代わりとして、図８の影付きフォントで示される。ＮＲＣ−ｓｄＡｂ００１〜ＮＲＣ−ｓｄＡｂ００８として参照される配列が示される。
【０１７３】
[00214]実施例１２：組換えＡＸＬ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）へのｍＡｂ及びｓｄＡｂの結合
[00215]この実施例の目的は、組換えＡＸＬ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）へのｍＡｂ／ｓｄＡｂの結合を特徴付け、親和性及び動態、種交差反応性、並びにドメイン及びエピトープマッピングを評価することである。
【０１７４】
[00216]材料及び方法
[00217]マウスｍＡｂの生成。マウスｍＡｂは、ハイブリドーマの上清から直接精製されるか、又はＣＨＯ細胞の一過性トランスフェクションにより（ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を使用して）組換えで生成された。１０ｍＬのハイブリドーマ上清からの小規模精製では、ｍＡｂｓをＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｍａｇ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）Ｅｘｔｒａ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  ２０  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ＃２８−９６７０−７０）への吸着により精製し、ＰＢＳで洗浄し、２００μｌのグリシン２００ｍＭ  ｐＨ２．５で２回溶出し、及びＴＲＩＳ−ＨＣｌ  １Ｍ  ｐＨ９．０で中和した。精製されたｍＡｂは、ＰＢＳで事前に平衡化されたＺｅｂａ  Ｓｐｉｎレジン（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して脱塩され、０．２２μＭメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で滅菌濾過された。ｍＡｂの最終濃度は、ナノドロップ（＃ＮＤ−１０００）によって決定された。組換え生成のために、ＤＮＡ構築物をＣＨＯ細胞に一過性にトランスフェクトし、Ｒａｙｍｏｎｄら（２０１５年）に記載されているように精製した。
【０１７５】
[00218]ＶＨＨ及びＶＨＨ−Ｆｃの生成。ＶＨＨは、Ｂａｒａｌら（２０１３年）によって以前に記述されたように、大腸菌で６×Ｈｉｓ及びＭｙｃタグ付き単量体として生成された。ＶＨＨ−Ｆｃｓは、Ｚｈａｎｇら、２００９に記載されているように、ヒトＩｇＧ１  ＦｃのＮ末端に融合したＶＨＨをコードするＤＮＡでＨＥＫ２９３細胞を一過性にトランスフェクションすることにより生成された。
【０１７６】
[00219]表面プラズモン共鳴。マウスｍＡｂについて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置を使用して、ヒト及びカニクイザルＡＸＬ  ＥＣＤへの結合を評価した。簡単に言えば、抗マウス又は抗ヒトＦｃ抗体のいずれかを、酢酸緩衝液中のアミンカップリングを使用して、研究グレードのＣＭ５シリーズＳセンサーチップに固定化した。マウス又は組換えキメラマウス−ヒトｍＡｂ（マウスＶＨ／ＶＬ；ヒト定常領域）を捕捉し、組換えヒト又はカニクイザルＡＸＬ  ＥＣＤは、抗体に応じて異なる濃度範囲（０．１〜５００ｎＭ）で表面全体に流した。泳動緩衝液はＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ−２０であり、流速は１００μＬ／分であった。すべての結合研究は２５℃で行われた。１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を使用して表面を再生した。
【０１７７】
[00220]ＶＨＨ及びＶＨＨ−Ｆｃについて、ヒト及びカニクイザルＡＸＬ  ＥＣＤへの結合は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器又はＢｉａｃｏｒｅ  ３０００機器のいずれかを使用して評価された。ヒトＡＸＬ  ＥＣＤ抗体又は抗ヒトＦｃ抗体のいずれかは、研究グレードのＣＭ５シリーズＳセンサーチップ（Ｔ２００、ｒｈＡＸＬ  ＥＣＤ）又はＣ１センサーチップ（３０００、抗ヒトＦｃ）に、酢酸緩衝液でアミンカップリングを使用して固定化された。ＶＨＨ−Ｆｃは、抗ヒトＦｃ表面に捕捉された。単量体ＶＨＨ（ｒｈＡＸＬ  ＥＣＤ表面の場合）又はヒト及びカニクイザルＡＸＬ  ＥＣＤ（ＶＨＨ−Ｆｃ表面の場合）のいずれかを異なる濃度範囲で表面全体に流した。泳動緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ（３０００）及びＨＢＳ−ＥＰ＋（Ｔ２００）であった。流速は１０〜４０μｌ／分であった。すべての結合研究は２５℃で行われた。１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５を使用して表面を再生した。
【０１７８】
[00221]エピトープビニング実験のために、２つの試験品（ＶＨＨ又はｍＡｂ）を最初に別々に注入し（５０ｎＭ  ｍＡｂ；ＶＨＨ単量体について２５倍のＫＤ）、解離させた。次に、ｍＡｂ（５０ｎＭ）を再度注入し、応答のピーク時に、ＶＨＨ（２５倍のＫＤ）とｍＡｂ（５０ｎＭ）の混合物を注入して、追加の結合を観察した。
【０１７９】
[00222]ＥＬＩＳＡ。ヒト、カニクイザル、及びマウスのＡＸＬ  ＥＣＤに対するＥＬＩＳＡは、Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐマイクロプレートのウェルに１００  ｎｇの各タンパク質を一晩固定化することにより行われた。ヒトＡＸＬ（ａａ１−４５１）及びカニクイザルＡＸＬ（ａａ１−４４９）は、実施例１０に記載されるように組換えにより生成された。マウスＡＸＬは、Ｓｉｎｏ（カタログ５１０２６−Ｍ０８Ｈ）から購入した。翌日、プレートをＰＢＳ中の５％（ｗ／ｖ）粉ミルクでブロックした。マウスｍＡｂ（ハイブリドーマ又は組換えで生成した）又はＶＨＨ−Ｆｃｓを、１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで希釈し、室温で２時間ウェルに添加した。ウェルを、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで５回洗浄し、次に、ＨＲＰ標識したプロテインＡ（１％ＢＳＡ及び０．１％Ｔｗｅｅｎ（商標）−２０を含むＰＢＳで１：１０００に希釈した）を室温で１時間ウェルに添加した。ウェルを再びＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で５回洗浄し、ＴＭＢ基質を使用して発色させた。吸光度を４５０ｎｍで測定した。マウスＡＸＬ結合の陽性対照として、市販の抗マウスＡＸＬ  ｍＡｂ（クローン１７５１２８、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＭＡＢ８５４１、ラットＩｇＧ２Ａ）を使用し、ロバ抗マウス：ＨＲＰ二次抗体で検出した。
【０１８０】
[00223]酵母表面提示。ヒトＡＸＬ、Ｔｙｒｏ３及びＭｅｒの細胞外ドメインの酵母表面提示を行った。簡単に言えば、酵母は、Ａｇａ２ｐタンパク質に融合したｍｙｃタグ付きＴＡＭファミリーＲＴＫエクトドメインをコードするＤＮＡ構築物で形質転換された。構築物は、完全なＡＸＬ  ＥＣＤ（ａａ１−４４９）又は個々のサブドメイン（Ｎ末端からＣ末端にＩｇ１、Ｉｇ２、Ｆｎ１、Ｆｎ２）をコードするように設計された。微細なエピトープマッピングについて、ＡＸＬ  ＥＣＤの個々のアミノ酸を構築物でＡｌａに置換した。ＡＸＬ、Ｔｙｒｏ３及びＭｅｒの細胞外ドメインを部分的又は完全に発現する得られた酵母細胞をマイクロウェルプレートに吸着させ、ｍＡｂｓ／ＶＨＨ−Ｆｃｓの結合をＥＬＩＳＡで評価し、ヤギ抗ヒトＦ（ａｂ’）２−ＨＲＰを使用して検出した。抗ＡＸＬ  ｍＡｂ／ＶＨＨ−Ｆｃ結合は、発現レベルを制御するための抗ｍｙｃ抗体の結合レベルに対して正規化された。
【０１８１】
[00224]結果
[00225]マウスｍＡｂのヒト及びカニクイザルＡＸＬ  ＥＣＤへの結合は、組換えにより生成されたキメラマウス−ヒトｍＡｂを使用してＳＰＲで評価された。ヒト及びカニクイザルＡＸＬ  ＥＣＤへのラマＶＨＨの結合は、単量体ＶＨＨとキメラ組換えＶＨＨ−ｈＩｇＧ１  Ｆｃ融合体の両方を使用してＳＰＲで評価された。
【０１８２】
[00226]ＳＰＲによる親和性決定。組換えヒト及びカニクイザルＡＸＬ  ＥＣＤに対するマウスｍＡｂの親和性及び動態を表９に示す。
【表９】
2020533004.tif 000011
【０１８３】
[00227]表１０のデータは、組換えヒト及びカニクイザルＡＸＬ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対するラマＶＨＨの親和性及び動態を示す。
【表１０】
2020533004.tif 000012
【０１８４】
[00228]カニクイザル及びマウスＡＸＬの交差反応性を決定し、結果を以下の表１１に示す。これらのデータは、ＥＬＩＳＡにおける組換えヒト及びマウスＡＸＬ  ＥＣＤへのｍＡｂ／ｓｄＡｂ結合の最大半量有効濃度ＥＣ５０を示す。
【表１１】
2020533004.tif 000013
【０１８５】
[00229]酵母表面提示を使用したＴＡＭファミリーＲＴＫ（Ｍｅｒ、Ｔｙｒｏ３）に対する交差反応性が決定され、結果が表１２に示される。
【表１２】
2020533004.tif 000014
【０１８６】
[00230]エピトープビニングを評価し、データを表１３にまとめられている。抗ＡＸＬ  ｍＡｂ／ｓｄＡｂにより標的化されたエピトープビンを示す。酵母表面提示を使用したドメインマッピングを評価した。
【表１３】
2020533004.tif 000015
【０１８７】
[00231]実施例１３：腫瘍細胞株への結合の特徴付け
[00232]この実施例の目的は、Ｋｄ及び最大抗体結合（Ｂｍａｘ）に関して中程度から高レベルのＡＸＬを発現する腫瘍細胞株へのｍＡｂ／ｓｄＡｂの結合を特徴付けることである。
【０１８８】
[00233]材料及び方法
[00234]細胞培養。ＮＣＩ−Ｈ２９２ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）及びＳＫＯＶ３（ヒト卵巣腺癌）細胞株をＡＴＣＣから入手し、供給業者の推奨に従って培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性（ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２低）乳癌（ＴＮＢＣ）は、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ  ＮＣ、ＵＳＡから購入した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有する安定した形質転換体が生成された。この細胞株をＲＰＭＩ−１６４０＋５％ＦＢＳで培養した。実施例３で上述したように、Ｕ８７膠芽腫細胞を使用した。細胞を週に２回継代し、すべての細胞株について４〜６週間以内に使用した。
【０１８９】
[00235]ＦＡＣＳ結合アッセイ。付着細胞を非酵素的Ｓｉｇｍａ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（製品番号Ｃ５７８９）で分離した。細胞懸濁液をポリプロピレンのＶ底９６ウェルプレートに添加し、１００ｎＭ〜０．００１ｎＭの範囲の濃度で、又は１００ｎＭの単回用量（非特異的対照用）で１次抗体とともに氷上で２時間インキュベートした。インキュベーション及び洗浄後、細胞を氷上で１時間、蛍光標識された二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎカタログ番号７０９−５４６−０９８のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）４８８抗ヒトＩｇＧ）とともにインキュベートし、次に、洗浄した。細胞生存率は、Ｆｉｘａｂｌｅ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ  ４５０（氷上で２０分）を使用して決定した。染色された細胞を４℃にて１％ホルムアルデヒドで固定し、翌日行われる取得まで４℃で保存した。
【０１９０】
[00236]データ取得は、ＦＡＣＳ  Ｄｉｖａソフトウェア及びＨＴＳユニット（９６ウェルプレートにおける自動サンプリング）を備えたＬＳＲ−Ｆｏｒｔｅｓｓｓａフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行われた。ＦＡＣＳデータをＥｘｃｅｌデータファイルにエクスポートし、ＡＦ４８８で染色された生存（単一細胞）ピークのＭＦＩ（蛍光強度中央値）を計算に採用した。二次抗体の非存在下でインキュベートした細胞のＭＦＩ値を使用して、すべてのウェルについてバックグラウンド減算を計算した。
【０１９１】
[00237]バックグラウンドを差し引いたデータを、Ｈｉｌｌ勾配非線形回帰曲線適合モデルを用いた１部位特異的結合を使用してＧｒａｐｈＰａｄ（商標）６．０で分析し、試験品の各々について見かけのＢｍａｘ及びＫｄを決定した。使用されたモデルは、式Ｉに従った。
[00238]
【数１】
2020533004.tif 000016
[00239]Ｂｍａｘは、Ｙと同じ単位での最大特異的結合である。
[00240]Ｋｄは、Ｘと同じ単位で表される、平衡で最大結合の半分を達成するのに必要なリガンド濃度である。
[00241]変数「ｈ」は丘の斜面である。
【０１９２】
[00242]ＡＸＬ受容体密度測定。１０μｌのＨｕｍａｎ  ＡＸＬ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ＭＡｂ（クローン１０８７２４）を使用して、Ｑｕａｎｔｕｍ（商標）Ｓｉｍｐｌｙ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｅａｄｓ（カタログ番号８１４、Ｂａｎｇｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を４℃で３０分間、又はＡＸＬを発現する細胞株（１０００００細胞／試験）を４℃で２時間標識した。
【０１９３】
[00243]ビーズ及び細胞のデータ取得は、同一のＦＡＣＳ設定の下で行われ、ＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェアを使用して分析された。ＧｅｏＭｅａｎを使用して標準曲線を作成し、各細胞型の値を補間した。ブランクのビーズの値が検出閾値と見なされ、染色されていない細胞の値が各々の場合のＧｅｏＭｅａｎ値から差し引かれた。得られた抗体結合能力は、試験した各々の細胞株の受容体密度の尺度として使用された。
【０１９４】
[00244]結果
[00245]組換えキメラＡｂの３つの細胞株への結合は、上記のようにＦＡＣＳにより評価された。見かけのＢｍａｘ及びＫｄの決定を以下の表１４に示す。
【表１４】
2020533004.tif 000017
【０１９５】
[00246]図９は、以下の細胞株：Ｈ２９２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＳＫＯＶ、及びＵ８７神経膠芽腫における受容体密度（受容体／細胞）に基づく、ＡＸＬの抗体結合能力を図示する。
【０１９６】
[00247]図１０は、肺癌、乳癌及び卵巣癌についての３つの細胞株におけるヒト（ｈ）ＩｇＧ  Ａｂ及びｓｄＡｂのＦＡＣＳ結合曲線を図示する。非特異的結合（ｘ）は、すべての例で無視できることが示されているが、ｈＩｇＧ曲線（Ｆ１０７−１０Ｇ１、Ｆ１０７−７Ｈ５、Ｆ１１１−５Ｅ９）は、いくつかの場合において、ｓｄＡｂｓ（ｓｄＡＢ００１、ｓｄＡｂ００８、ｓｄＡｂ００６）よりもわずかに高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。
【０１９７】
[00248]実施例１４：インビトロ細胞傷害アッセイ
[00249]この実施例では、抗ＡＸＬモノクローナル抗体は、効力（ＩＣ５０）及び最大パーセンテージ増殖阻害（有効性）の観点から、ＡＸＬを発現する細胞における増殖阻害アッセイでの内在化能力及び抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）ポテンシャルについて評価された。
【０１９８】
[00250]材料及び方法
[00251]細胞培養。ＮＣＩ−Ｈ２９２ヒト非小肺癌（ＮＳＣＬＣ）及びＳＫＯＶ３（ヒト卵巣腺癌）細胞株をＡＴＣＣから入手し、供給業者の推奨に従って培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性（ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２低）乳癌（ＴＮＢＣ）株をＣｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｓから購入した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有する安定した形質転換体は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒによって生成された。この細胞株をＲＰＭＩ−１６４０＋５％ＦＢＳで培養した。細胞は週２回継代され、すべての細胞株に対して４〜６週間以内に使用された。
【０１９９】
[00252]増殖阻害アッセイ。抗ＡＸＬ  ＡＤＣは、ＮＣＩ−Ｈ２９２（非小細胞肺癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳腺癌）及びＳＫＯＶ３（卵巣癌）を含む、ＡＸＬを発現することが公知である様々な培養細胞株の生存率における影響について試験された。細胞は、３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）３８４ウェルホワイトフラットボトムポリスチレンＴＣ処理したマイクロプレート、カタログ番号３５７０）の３つの細胞株に対してそれぞれ１２５、２００、２００細胞／ウェルで播種された。細胞は、１００ｎＭ〜０．００１７ｎＭの範囲の試験品又はベンチマーク対照の連続希釈の存在下、及びＧａｓ６リガンド（２μｇ／ｍＬ、Ｒ＆Ｄ  ＣＦ８８５）の存在下又は非存在下で５日間増殖させた。５日後（３７℃、５％ＣＯ２、加湿インキュベーター）、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒＧｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ）を使用して、各ウェルに存在する、代謝的に活性な細胞の存在を示す、ＡＴＰの定量に基づいて、培養中の生存細胞の数を決定した。
【０２００】
[00253]シグナル出力は、０．１秒の積分時間に設定されたルミネセンスプレートリーダー（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で測定された。積分時間は、高ＡＴＰ濃度でのシグナル飽和を最小限に抑えるように調整される。
【０２０１】
[00254]データ分析。各濃度ポイント（Ｓ）は陰性対照ウェル（ＮＣ）に対して正規化され、式ＩＩに従って計算された生存率（％）として表される。
[00255]
【数２】
2020533004.tif 000018
[00256]生存％対ｌｏｇ濃度の用量−応答曲線は、ＩＣ５０及び最大効力を推定するための４つのパラメーターロジスティックモデルを用いたＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｐｒｉｓｍ  ６．０を使用して適合された。モデルＹは、式ＩＩＩによる計算に使用された。
[00257]
【数３】
2020533004.tif 000019
[00258]ＩＣ５０は、下部と上部の間の中間の応答を与えるアゴニストの濃度である。
[00259]ＨｉｌｌＳｌｏｐｅは、曲線の急勾配を記述する。
[00260]上部及び下部は、Ｙ軸の単位のプラトーである。
【０２０２】
[00261]結果
[00262]３つの細胞株における、ＤＭ１又はＭＭＡＥにコンジュゲートした組換えキメラＡｂの増殖阻害活性を上記のように評価した。
【０２０３】
[00263]表１５に示されるように、直接薬物コンジュゲートとしての細胞傷害性を評価した。３つのＡＸＬを発現する細胞株における抗ＡＸＬ  ＡＤＣの効力（ＩＣ５０）及び有効性（最大阻害％）。結果は、平均＋／−ｓｔｄｅｖ（Ｎ）として表される。
【表１５】
2020533004.tif 000020
【０２０４】
[00264]Ｇａｓ６感度の評価。Ｇａｓ６リガンド（２μｇ／ｍＬ）の存在下又は非存在下でのＮＣＩ−Ｈ２９２における抗ＡＸＬ  ＡＤＣの効力（ＩＣ５０）を評価した。結果は、平均値＋／−ｓｔｄｅｖ（Ｎ）として表１６に表される。
【表１６】
2020533004.tif 000021
【０２０５】
[00265]増殖阻害を評価し、３つの腫瘍細胞株におけるｈＩｇＧ  Ａｂ及びｓｄＡｂの増殖阻害結合曲線を図１１に示す。肺、乳房及び卵巣の細胞株（それぞれＨ２９２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ルシフェラーゼ、及びＳＫＯＶ３）が示される。生存率（５ｄ）が評価される。
【０２０６】
[00266]クラス１では、ｈＩｇＧ−Ｆ１０７−１０Ｇ１−ＤＭ１対非特異的結合がすべての細胞について示され、ｓｄＡｂ００１はまたＨ２９２について評価された。
【０２０７】
[00267]クラス２では、ｈＩｇＧ−Ｆ１０７−７Ｈ５−ＤＭ１及びｈＩｇＧ−Ｆ１０７−８Ｄ１２−ＤＭ１対非特異的結合曲線が、ＭＤａ−ＭＢ−２３１ルシフェラーゼ及びＳＫＯＶ３細胞について示される。ｓｄＡｂ００８及びｈＩｇＧ−Ｆ１０７−７Ｈ５−ＤＭ１は、Ｈ２９２の非特異的結合に対して評価された。
【０２０８】
[00268]クラス３では、ｈＩｇＧ−Ｆ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１及びｈＩｇＧ−Ｆ１１１−５Ｅ９−ＭＭＡＥ対非特異的結合がすべての細胞について示され、ｓｄＡｂ００６はまたＨ２９２について評価された。
【０２０９】
[00269]図１２は、非特異的結合と比較した、Ｈ２９２細胞株におけるＧａｓ６の存在下及び非存在下でのｈＩｇＧ−Ｆ１１−５Ｅ９−ＤＭ１及びｈＩｇＧ−Ｆ１０７−１０Ｇ１−ＤＭ１の増殖阻害結合曲線を示す。
【０２１０】
[00270]実施例１５：バイパラトピック／一価抗ＡＸＬ抗体の活性の評価
[00271]この実施例では、バイパラトピック／一価抗ＡＸＬ抗体を調製し、効力及び有効性について評価した。
【０２１１】
[00272]２つの非重複エピトープを標的とするバイパラトピック抗体は、標的クラスター形成を誘導することができ、これは、順に、ＨＥＲ２を含む受容体標的の強力な内部移行、リソソーム輸送を促進する（Ｌｉら、２０１６年）。この実施例では、単一ドメインの抗ＡＸＬ抗体のバイパラトピック（同じ標的上の２つのエピトープ）の組み合わせのＡＤＣ効力を評価する。ヒトＦｃ含有バイパラトピック抗体は、Ｓｔｒｏｐら（２０１２）により公開された方法に従って構築された。そこでは、相補的点突然変異（ＲＲＲ、ＥＥＥ）がヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域において操作されて、単量体の半分の交換を促進し、二重特異性抗体を安定化させる。目的の２つの抗体を別々に発現及び精製し、適切なレドックス条件下で混合すると、安定した二重特異性抗体の形成をもたらす。すべての場合において、バイパラトピックＡＤＣの活性は、それらが由来するホモ二価モノパラトピックｓｄＡｂベースのＡＤＣの効力と比較された。
【０２１２】
[00273]表１７は、ＳＫＯＶ３細胞株におけるモノパラトピック（二価）親ＡＤＣと比較した抗ＡＸＬバイパラトピック構築物ＡＤＣの効力（ＩＣ５０）及び有効性（最大阻害％）を示す。可能な場合、結果は平均＋／−ｓｔｄｅｖ（Ｎ）として表される。
【表１７】
2020533004.tif 000022
【０２１３】
[00274]予備的な結果は、ドメイン１Ａ／ドメイン２に見られるバイパラトピックｓｄＡｂｓ指向性エピトープを含むＡＤＣの両方（ｓｄＡｂ  ００１Ｒ／００５Ｅ−ＤＭ１、ｓｄＡｂ  ００１Ｒ／００６Ｅ−ＤＭ１）が、対応する二価Ｆｃ含有ｓｄＡｂｓに由来するＡＤＣよりもはるかに効力が高い（７〜１００倍）ように見えることを示す。この実施例で試験された他のバイパラトピックの組み合わせは、効力の増加を示さなかった。
【０２１４】
[00275]図１３は、ＳＫＯＶ３細胞株におけるモノパラトピック／二価の親ＡＤＣと比較した抗ＡＸＬバイパラトピック／一価の構築物ＡＤＣの増殖阻害結合曲線を示す。５日後の生存率を対数濃度（ｎＭ）としてプロットする。パネルＡは、ＳＫＯＶ３の組み合わせ００８Ｒ／００５Ｅのチャートを提供し、ｓｄＡｂ００８−ＤＭ１（四角形）、ｓｄＡｂ００５−ＤＭ１（三角形）、及びバイパラトピック００８／００５（星形）が比較される。パネルＢは、図示されたＳＫＯＶ３の組み合わせ００８Ｒ／００６Ｅチャートを提供し、ｓｄＡｂ００６−ＤＭ１（菱形）、ｓｄＡｂ００８−ＤＭ１（四角形）、及びバイパラトピック００８／００６（中空円形）が比較される。パネルＣは、ｈＦｃ／ｓｄＡｂ００１Ｒ／００５Ｅのチャートを提供し、ｓｄＡｂ００５−ＤＭ１（三角形）、ｓｄＡｂ００１−ＤＭ１（黒色円形）、及びバイパラトピック００１／００５構築物（「Ｘ」として示される）が比較される。パネルＤは、ＳＫＯＶ３の組み合わせ００１Ｒ／００６Ｅのチャートを提供し、ｓｄＡｂ００１−ＤＭ１（黒色円形）、ｓｄＡｂ００６−ＤＭ１（菱形）、及びバイパラトピック００１／００６構築物（大きなアスタリスク）が比較される。
【０２１５】
[00276]実施例１６：ＳＫＯＶ３腫瘍異種移植マウスモデルにおけるＡＤＣによるインビボでの腫瘍成長阻害
[00277]この実施例では、インビトロ細胞傷害性は、ＳＫＯＶ３細胞における腫瘍成長阻害の阻害を使用して評価される。抗ｈＡＸＬ抗体−薬物コンジュゲートＡＤＣは、ＡＸＬを発現する異種移植モデルで腫瘍成長阻害を引き起こす能力について評価された。
【０２１６】
[00278]材料及び方法
[00279]プロトコール。この研究における動物の世話及び使用に関連するプロトコール及び手順は、オタワ−ＮＲＣ動物保護委員会（プロトコール番号２０１４．０２）によって審理及び承認された。６週齢の１８〜２０グラムの雌ＣＤ１  Ａｌｂｉｎｏマウス（Ｃｒｌ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｃａｎａｄａ（Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）に注文した。動物は、カナダ動物保護協議会（ＣＣＡＣ）のガイドラインに従って世話され、使用された。
【０２１７】
[00280]抗ｈＡＸＬ−ＥＣＤモノクローナル抗体は、実施例１に概説されるように精製され、リジン残基を介して、実施例４に示されるＮ２’−デアセチル−Ｎ２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）に連結されたスクシンイミジルトランス−４−［マレイミジルメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）にコンジュゲートした。
【０２１８】
[00281]細胞培養及び腫瘍成長測定。ＳＫＯＶ３（ヒト卵巣腺癌）細胞は、ＡＴＣＣから入手し、供給業者の推奨に従って培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１三重陰性（ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２低）乳癌（ＴＮＢＣ）は、ＡＴＣＣ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｓ）から購入した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有する安定した形質転換体は、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒによって生成された。この細胞株をＲＰＭＩ−１６４０＋５％ＦＢＳで培養した。
【０２１９】
[00282]細胞を週２回継代し、すべての細胞株について４〜６週間以内に使用した。無菌条件下でイソフルラン麻酔したヌードマウス（ｎ＝８）の左側腹部に、細胞を皮下接種した（注射部位あたり０．１ｍＬのＰＢＳ体積で５×１０６細胞）。腫瘍を８０〜１００ｍｍ３の体積まで成長させ、その後、投薬日の前日に動物を無作為化して、各コホートに様々な腫瘍サイズを有する動物が含まれるようにした。各動物に適切な量の試験品／対照品を投薬日に調製し、静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。マウスには、０日目と４日目（９６時間の間隔）に５ｍｇ／ｋｇの試験品を尾静脈から注射した。対照群は、生理食塩水で処置された。
【０２２０】
[00283]腫瘍成長は、処置後の２９日間、又はそれらが倫理上の理由で安楽死されるまで（人道的エンドポイント）、キャリパー測定によって３日ごとにモニタリングされた。
【０２２１】
[00284]腫瘍体積は、式ＩＶに従って計算された：
[00285]推定腫瘍体積［ｍｍ３］＝
[00286]π／６（長さ［ｍｍ］）×（幅［ｍｍ］×（高さ［ｍｍ］））（式ＩＶ）
[00287]各群の腫瘍体積は、平均±ＳＥＭとして示され、ＳＫＯＶ３細胞接種後の測定時間の関数としてプロットされる。腫瘍体積データの群比較は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン７．０を使用するＴｕｋｅｙの多重比較試験を使用した２因子分散分析を使用して行われた。処置群と対照群の差は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であった。
【０２２２】
[00288]結果
[00289]ビヒクル（ＰＢＳ対照）処置された動物と比較して、５ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）で投与されたＡＸＬ  ＡＤＣは、ＳＫＯＶ３腫瘍異種移植マウスモデルにおいて有意な腫瘍成長阻害を引き起こすことが示された（ｎ＝２）。腫瘍成長の高い再現性は、２つの別々の研究における対照群と処置群の両方で観察された（本明細書では「研究１５Ａ」と「研究１５ｂ」と称する）。これら２つの別々の研究からのデータを図１４及び図１５に示す。
【０２２３】
[00290]図１４は、５ｍｇ／ｋｇの選択されたＡＤＣで２回（０日目及び４日目に）処置されたＳＫＯＶ３腫瘍を保有するマウスについての研究１５ａにおける腫瘍成長阻害を示す。使用したＡＤＣは、次の通りであった：ｈＦ１０７−１０Ｇ１−ＤＭ１（２ａ）、ｈＦ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１（３ａ）；ｈＦ１０７−７Ｈ５−ＤＭ１（４ａ）；ｈＦ１０７−８Ｄ１２−ＤＭ１（５ａ）；ｍＦ１４９−４Ｇ４−ＤＭ１（６ａ）；生理食塩水との比較のためのｍＦ１５５−３Ｃ７−ＤＭ１（７ａ）（１ａ）。腫瘍体積（ｍｍ３）を３日ごとに記録した。各データポイントは平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝８）。
【０２２４】
[00291]図１５は、５ｍｇ／ｋｇの選択されたＡＤＣで２回（０日及び４日）処置されたＳＫＯＶ３腫瘍を保有するマウスについての研究１５ｂにおける腫瘍成長阻害を示す。使用したＡＤＣは、次の通りであった：ｈＦ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１（２ｂ）；ｈＦ１０７−７Ｈ５−ＤＭ１（３ｂ）；ｈＦ１０７−１０Ｇ１−ＤＭ１（４ｂ）；ｓｄＡｂ００１−ＤＭ１（６ｂ）；ｓｄＡｂ００６−ＤＭ１（７ｂ）；ｓｄＡｂ００８−ＤＭ１（８ｂ）；生理食塩水対照（１ｂ）との比較のためのｍＦ１４９−４Ｇ４−ＤＭ１（９ｂ）。腫瘍体積（ｍｍ３）は３日ごとに記録された。各データポイントは平均±ＳＥＭを表す（ｎ＝８）。
【０２２５】
[00292]ＡＤＣ処理群と生理食塩水処理群の間の腫瘍成長における統計的に有意な（ｐ＜０．０５）効果が１３〜１８日から２８日まで観察され、２８日目に腫瘍体積が３７．０％から６６．９％に減少した。
【０２２６】
[00293]表１８は、研究１５ａ及び１５ｂのデータについて、処置開始後の２８日目に対照群（生理食塩水）と比較した腫瘍体積減少のパーセンテージを示す（それぞれ図１４及び図１５を参照されたい）。対照と比較した腫瘍体積（ＴＶ）減少のパーセンテージは、減少％＝（ＴＶ対照−ＴＶ処理）／ＴＶ対照×１００（式Ｖ）として計算された。
【表１８】
2020533004.tif 000023
【０２２７】
[00294]実施例１７：反復静脈内投与後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｕｃ異種移植マウスにおける抗ＡＸＬ  ＡＤＣヒットの有効性の評価
[00295]ＡＸＬは、様々なタイプの癌で発現され、侵襲性、転移、並びに血管新生に関連する。生成された抗ＡＸＬ  ＡＤＣには、ＳＭＣＣリンカーを介して微小管阻害剤であるメルタンシン（ＤＭ１）にコンジュゲートした抗ＡＸＬ抗体がある。これらのＡＤＣは、様々な細胞株で有望なインビトロ有効性を示し、効力及びＧａｓ６感度に基づいて選択されている。この実施例では、いくつかの抗ＡＸＬ  ＡＤＣヒットがスクリーニングされ、抗ＡＸＬ  ＡＤＣのインビボでの有効性に対するＧａｓ６感度の役割が評価される。
【０２２８】
[00296]雌ＮＵ／ＮＵヌードマウスへの２回の静脈内ボーラス投与後の有効性及び薬物動態がいくつかの抗ＡＸＬ  ＡＤＣについて評価される。この実施例では、抗ＡＸＬ  ＡＤＣの有効性におけるＧａｓ６感度の役割をさらに調べる。
【０２２９】
[00297]方法
[00298]細胞株。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１は三重陰性（ＥＲ−、ＰＲ−、ＨＥＲ２−）ヒト乳腺腺癌細胞株であり、元々は５１歳の白人女性患者に由来する上皮付着細胞である。これらの細胞はヌードマウスにおいて腫瘍形成性であり、原発性卵巣腫瘍と一致する中程度に十分に分化した腺癌を形成している。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞は、上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）及び形質転換増殖因子アルファ（ＴＧＦα）を発現する腫瘍原性細胞である。これらの細胞は、ＡＬＳ処理されたＢＡＬＢ／ｃマウスでは低分化腺癌（グレードＩＩＩ）を形成し、ヌードマウスでは低分化腺癌（グレードＩＩＩ）を形成する。細胞株は、元々、アメリカンティッシュカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ）から入手した。
【０２３０】
[00299]細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ  ＳＨ３００７０．０３）を含むＡＴＣＣ処方のＲＰＭＩ  １６４０培地（ＡＴＣＣカタログ番号：３０−２００１）で最大８０％コンフルエンスまで増殖させた。細胞は、３７℃の加湿された５％ＣＯ２雰囲気で維持された。それらは、トリプシン処理（０．２５％トリプシン／ＥＤＴＡ、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  １５０９０−０４６）によって回収され、続いて冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で洗浄され、トリパンブルー色素を排除する能力によって生存率を評価した。マウスの異種移植片としての増殖のためのすべての細胞集団は、少なくとも９８％生存可能であった。
【０２３１】
[00300]動物管理：受領、順化、収容及び取り扱い。この研究における動物の世話及び使用に関連するプロトコール及び手順は、オタワ−ＮＲＣ動物保護委員会（プロトコール番号２０１４．０２）によって審理され及び承認された。動物の世話及び使用は、カナダ動物愛護評議会（ＣＣＡＣ）のガイドラインに従った。６週齢の１８〜２０グラムの雌ＣＤ１アルビノマウス（Ｃｒｌ：ＣＤ１−Ｆｏｘｎ１ｎｕ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｃａｎａｄａ（１８  ＬａＳａｌｌｅ、Ｓｔ−Ｃｏｎｓｔａｎｔ、Ｑｕｅｂｅｃ、Ｃａｎａｄａ）に注文した。到着すると、マウスは通常の健康状態を確保するためにスタッフメンバーによる一般的な身体検査を受けた。受け取った動物に明らかな異常は検出されなかった。マウスを少なくとも５日間順応させて、飼育環境に慣れさせた。マウスは、汚染を避けるためにフィルタートップを備えたトウモロコシの穂軸の寝具のポリカーボネートケージにケージあたり４匹収容された。各ケージは、プロトコール番号、主任研究者の名前、動物の数、性別を示す色分けされたケージカードで明確にラベル付けされた。各マウスは耳パンチを使用して一意に識別された。
【０２３２】
[00301]マウスを、以下の条件下で１時間あたり７５回の空気交換のために設定された陽圧のテクニプラストグリーンライン個別換気ケージ（ＩＶＣ）セットに収容した：温度：２３〜２４℃；湿度：５０％；光サイクル：１２時間点灯及び１２時間消灯。
【０２３３】
[00302]マウスを扱う場合、常に無菌技術を使用した。この研究で使用されたすべての機器は、使用前に７０％エタノールで滅菌された。動物は、使用前に毎回７０％エタノールでまた消毒された生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）の下で取り扱われた。マウスを扱うすべての個人は、蒸気滅菌ガウン、マスク、ヘアボンネット、滅菌手袋を着用した。１／８インチの照射済みトウモロコシ穂軸寝具（Ｅｎｖｉｇｏ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）と少量のＥｎｖｉｒｏ−ｄｒｉペーパー（Ｓｈｅｐｈｅｒｄｓ  Ｓｐｅｃｉａｌｉｔｙ  Ｐａｐｅｒｓ）で満たされたオートクレーブＩＶＣケージは、ＢＳＣで少なくとも週１回交換された。
【０２３４】
[00303]食餌。すべての動物は、食料及び水を自由に利用できた。ウォーターボトルに限外濾過水を入れ、キャップを付けて古いマウスシューボックスケージに別々に入れ、蒸気でオートクレーブした。オートクレーブにかけたら、ＢＳＣの範囲内で作業中にキャップを取り付けた。水のボトルが週に１回、又は水位が低いときはより頻繁に交換された。動物は、順化期間及び実験期間中に、ガンマ線を照射した維持げっ歯類食餌（２９１４  Ｔｅｋｌａｄグローバル１４％タンパク質維持食、Ｅｎｖｉｇｏ）を自由に給餌した。
【０２３５】
[00304]皮下異種移植腫瘍モデル。無菌条件下でイソフルラン麻酔ヌードマウス（ｎ＝８）の左側腹部に、細胞を皮下接種した（注射部位あたり０．１ｍＬのＰＢＳの容量で５×１０６細胞）。腫瘍を８０〜１００ｍｍ３の体積まで成長させ、その後、投与日の前日に動物を無作為化して、各コホートに様々な腫瘍サイズを有する動物が含まれるようにした。
【０２３６】
[00305]腫瘍モニタリング。腫瘍の成長は、処置後２９日間、又は倫理上の理由：１）４８時間以内に体重が回復せずに１０％以上の体重減少；２）２５００ｍｍ３を超える腫瘍体積；３）腫瘍潰瘍；及び４）不動及びグルーミングの減少などの苦痛の明確な兆候、により安楽死されるまで（人道的エンドポイント）、キャリパー測定によって３日ごとにモニタリングされた。
【０２３７】
[00306]腫瘍体積は、式ＩＶに従って計算された：
[00307]推定腫瘍体積［ｍｍ３］＝
[00308]π／６（長さ［ｍｍ］）×（幅［ｍｍ］×（高さ［ｍｍ］））（式ＩＶ）
[00309]試験品及びビヒクル。すべての試験品は、ＮＲＣモントリオールからオタワまで氷上で輸送され、投与前は４℃で保管された。ＡＤＣ、ｈＦ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１はバッチ番号として準備された：ＣＣ３１ＭＡＹ２０１６。薬物対抗体比（ＤＡＲ）：２．６２；濃度：１．３１ｍｇ／ｍＬ；アリコート体積：３．７ｍＬ；保管条件：４℃；エンドトキシンレベル：＜０．１５；Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、ＣａｎａｄａにあるＮＲＣ施設ＨＨＴモントリオールで準備された。
【０２３８】
[00310]処置のためのビヒクルは、以下の特徴を有するＡＤＣ緩衝液であった：無菌性：無菌濾過；保管条件：２０〜２５℃；供給業者：ＮＲＣ−ＨＨＴ  Ｍｏｎｔｒｅａｌ。
【０２３９】
[00311]用量製剤の調製。各製剤は投与日に調製された。５ｍｇ／ｋｇの用量レベルを得るために、試験／対照品の注入量は、それらのストック濃度及び動物の体重に基づいて計算された。最終的な投薬溶液の調製は、生理食塩水を添加して所望の体積を得ることにより、クリーンなＨＥＰＡ／ＵＶランプ生物学的フードの下で行われた。試験／対照品は、調製期間中４℃に保った。各動物に適切な体積の試験／対照品を静脈内注射した。
【０２４０】
[00312]臨床観察及び体重。すべての動物は、死亡率及び不健康状態の兆候について１日１回観察された。動物の個々の体重及び腫瘍の大きさを測定し、処置当日とその後３日ごとに記録した。
【０２４１】
[00313]処置。マウスには、０日目と４日目（９６時間の間隔）に５ｍｇ／ｋｇの試験品を尾静脈から注射した。対照群は生理食塩水で処置された。注射した日の動物の体重及び注射した量を記録した。
【０２４２】
[00314]試料の収集、処理及び保管。血液試料は、２回目の投薬後の１、２、４、６、２４、４８、９６、１２０、１６８、２１６、２６４、及び３３６時間の時間点で３匹の動物から下顎静脈を介して収集された。
【０２４３】
[00315]図１６は、血液試料が、２回目の投薬前、１時間、２時間、４時間、６時間、２４時間、４８時間、９６時間、１２０時間、１６８時間、２１６時間、２６４時間及び３３６時間で採取された場所を含む研究設計を示す。腫瘍体積測定が行われ、投薬は１日目と４日目に行われたが、腫瘍体積測定は示された間隔で行われた。図１６にも示されるように、研究設計の下に、研究のための動物数と時間点である。得られた血液の約８０〜１００μＬを室温で１５〜３０分間凝固させ、次に、１５００ｇで１０分間室温にて遠心分離した。遠心分離後、液体成分（血清）をラベル済みのチューブに即座に移し、ドライアイスで即座に瞬間凍結し、−８０℃で保存した。
【０２４４】
[00316]研究の終わりに、腫瘍が収集された。各腫瘍の半分を４％パラホルムアルデヒドで室温にて一晩固定し、ＰＢＳで洗浄してパラフィン包埋した。その後、パラフィン包埋腫瘍は、プロジェクトリーダーの裁量により、ＡＸＬ発現のために処理される。腫瘍の残りの半分は、ドライアイスを使用して急速に凍結し、さらに分析するために−８０℃で保存した。
【０２４５】
[00317]統計分析。各群の腫瘍体積は平均±ＳＥＭとして示され、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｕｃ細胞接種後の測定時間の関数としてプロットされる。腫瘍体積データの群比較は、ＧｒａｐｈＰａｄ（商標）Ｐｒｉｓｍバージョン７．０を使用したＴｕｋｅｙの多重比較試験を用いる２因子分散分析を使用して行われた。処置群と対照群の差は、Ｐ＜０．０５で統計的に有意であった。グラブス検定を使用して、対照／処置群内の外れ値を決定した（α＝０．０５）。
【０２４６】
[00318]結果及び考察
[00319]図１７は、体重における抗ＡＸＬ  ＡＤＣの効果を、５ｍｇ／ｋｇのｈＦ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１で２回（０日目及び４日目）の処置を受けた後のＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｕｃ担腫瘍マウスにおける初期体重（ＢＷ）のパーセンテージとして示す。ＡＤＣ緩衝液群（円形）及びｈＦ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１群（三角形）が示される。
【０２４７】
[00320]体重は、標的外の潜在的毒性の指標として測定された。対照動物（ＡＤＣ緩衝液群）とｈＦ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１処理動物の間に有意差は観察されなかった。実験期間中、両群のマウスの体重は約１０％増加した。
【０２４８】
[00321]図１８は、腫瘍体積として評価された、腫瘍成長における抗ＡＸＬ  ＡＤＣの効果を示す。ＡＤＣ緩衝液（ＣＴＲ）又は５ｍｇ／ｋｇのｈＦ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１のいずれかで２回（０日及び４日）処理されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１−Ｌｕｃ担腫瘍マウスの腫瘍成長曲線を示し、腫瘍体積（ｍｍ３）は３日ごとに記録される。各データポイントは、ＡＤＣ緩衝液群（円形）及びｈＦ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１群（三角形）の平均±ＳＥＭを表す。
【０２４９】
[00322]腫瘍成長における統計的に有意な（ｐ＜０．０５）効果が、８日目から２８日目まで、ｈＦ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１処理群とＡＤＣ緩衝液処理群の間で観察された。ｈＦ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１群の１匹の動物は、同じ群の残りの動物と比較して有意に高い腫瘍成長率を示した。この動物は、グラブス検定を使用して異常値としてさらに特定された（α＝０．０５）。
【０２５０】
[00323]２８日目に約９０〜３６０ｍｍ３の腫瘍成長を経験した対照群と比較して、ｈＦ１１１−５Ｅ９−ＤＭ１処置群における平均腫瘍体積減少は、約９０〜６０ｍｍ３であった。腫瘍体積の減少におけるこの著しい差は、抗ＡＸＬ  ＡＤＣｘが乳癌腫瘍モデルの腫瘍体積を減少できることを示す。
【０２５１】
[00324]実施例１８：インビトロで血液脳関門を通過する抗ＡＸＬ  ｓｄＡｂ能力の評価
[00325]この実施例では、抗ＡＸＬ抗体が血液脳関門を通過する能力を評価する。中枢神経系（ＣＮＳ）におけるＡＸＬの発現により、ＡＸＬを標的とし、毒素（例えば、ＤＭ１、ＭＭＡＥなど）に連結された抗体は、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができる場合、脳において非常に強力な標的毒性を示す可能性がある。したがって、特定の抗ＡＸＬ  ｓｄＡｂがＢＢＢを通過する能力は、ヒトのインビトロのＢＢＢモデルを使用して評価される。
【０２５２】
[00326]材料及び方法
[00327]ヒト血液脳関門モデル。幹細胞ベースのヒトＢＢＢモデルが使用される。モデルは、ヒト羊水由来の人工多能性幹細胞から生成された脳内皮細胞（ＢＥＣ）を利用する。このインビトロのヒト血液脳関門（ＢＢＢ）モデルは、将来のＢＢＢ浸透性化合物及びＣＮＳ標的化抗体の前臨床スクリーニングを可能にする。これらのＢＥＣは、十分に組織化された連続的なタイトジャンクション、高い経内皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）、流出及び受容体を介したトランスサイトーシス（ＲＭＴ）トランスポーターの極性発現などの実質的なバリア特性を示す。
【０２５３】
[00328]トランスウェルベースのインビトロＢＢＢモデル。Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ  ＢＢＢアッセイは、１２ウェルのコンパニオンプレートに配置されたゼラチン被覆された透過性Ｔｒａｎｓｗｅｌｌメンブレンインサートに播種されたＢＥＣで構成される。ＢＥＣは、ラット尾コラーゲン被覆された０．８３ｃｍ２のＦａｌｃｏｎ（商標）細胞インサート、１μｍポアサイズのフェノールレッドを含まない１ｍＬのＢＥＣ供給培地に５００，０００細胞／膜で播種された。１２ウェルの組織培養プレートのウェル（すなわち、輸送用の下部チャンバー）には、フェノールレッドを含まない２ｍＬのＢＥＣ培地が含まれた。ＴＥＥＲ値は各インサートについて測定され、ＴＥＥＲが３００Ωｃｍ２を超えるインサートのみがトランスサイトーシス研究に使用された。輸送実験は、輸送緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ｐＨ７．４）中の１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び０．０１％ＢＳＡ；１ｍＬの上部チャンバー及び２ｍＬの下部チャンバー）中で、各々１．２５μＭの試験抗体（表１９）と陰性対照（Ａ２０．１）の混合物を上部チャンバーに添加し、から１５、３０、６０及び９０分で下部チャンバーから１００μＬのアリコートを回収することによって（続いて、各アリコート回収後に下部チャンバー内に１００μＬの輸送緩衝液を置換することによって）「多重化」方式で、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳによりすべての試験抗体の同時定量化のために行われた（多重反応モニタリング−ＭＲＭ）。
【０２５４】
[00329]試験品及びＡ２０．１の特定のペプチドシグネチャーは、ＭＲＭ分析について決定された。試験抗体についてＦｃペプチド（ＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫ；配列番号１８７）、及び陰性対照についてＡ２０．１ペプチド（ＥＦＶＡＡＧＳＳＴＧＲ；配列番号１８８）がＭＲＭによって検出された。アッセイ期間中のＢＢＢの完全性は、各試験試料にＢＢＢ非交差ｓｄＡｂ（Ａ２０．１）を組み込むことによってモニターされた。ＦＣ５Ｈｆｃ１Ｘ０を陽性対照として使用し、ＴＷＩＮ２００−ｈＩｇＧ１を陰性対照として使用した。この研究において評価されたｓｄＡｂ及び対照の試験品を表１９に概説する。実験は３重にして行われた。
【表１９】
2020533004.tif 000024
【０２５５】
[00330]結果
[00331]ＦＣ５Ｈｆｃ１Ｘ０（陽性対照）、ＴＷＩＮ２００−ｈＩｇＧ１（陰性対照）及び７つの抗ＡＸＬ  ｓｄＡｂのインビトロでのＰａｐｐ値の比較を図１９に示す。様々な分子量１５．６ｋＤａ（Ａ２０．１）及び７９．０ｋＤａ（ＴＷＩＮ２００−ｈＩｇＧ１）の対照分子は、約９．０〜１５．０×１０−６ｃｍ／分の範囲の同様の低いＰａｐｐ値を示した；対照的に、ＦＣ５Ｈｆｃ１Ｘ０のＰａｐｐ値は、約１７５×１０−６ｃｍ／分であった（Ａ２０．１の１０倍を超える）。すべての抗ＡＸＬ  ｓｄＡｂは、陰性対照と同様のＰａｐｐ値を示し、これは、インビトロでのＢＢＢの有意な浸透性はないことを示す。ただし、それぞれの対照と比較して低いＰａｐｐ値（約２倍）を示すＮＲＣ−ｓｄＡｂ００４及びＮＲＣ−ｓｄＡｂ００５抗体を除く。チャートの下部にある灰色の線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。ＮＲＣ−ｓｄＡｂ００６−ｈＩｇＧ１のチャートに表示されているアスタリスクは、リークのある挿入ＡＯＲ１データが削除されたことを示す。
【０２５６】
[00332]表２０は、Ｐａｐｐデータを提供し、Ａ２０．１（陰性対照）と比較した、試験品のＰａｐｐ値の統計分析を示す。
【表２０】
2020533004.tif 000025
【０２５７】
[00333]前述の説明では、説明の目的で、実施形態の完全な理解を提供するために、多くの詳細が記述されている。しかしながら、これらの特定の詳細が必要とされないことは、当業者には明らかである。
【０２５８】
[00334]上記の実施形態は、例のみであることを意図している。当業者は、特定の実施形態に対して変更、修飾、及び変形を行うことができる。特許請求の範囲は、本明細書に記載された特定の実施形態によって限定されるべきではなく、全体として明細書と一貫した方法で解釈されるべきである。
【０２５９】
[00335]配列
[00336]本明細書で参照される配列の統合されたリストは表２１に見出される。
【表２１】
2020533004.tif 000026
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2020533004.tif 000037
2020533004.tif 000038
2020533004.tif 000039
【０２６０】
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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