(57)【要約】  ＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされる逆転写酵素（ＲＴ）、またはレトロエレメントの転写活性化に関与できるあらゆるＲＴを阻害するよう機能する、ＲＴ活性阻害剤の投与による抗癌治療および抗加齢治療の手法を提供する。ＲＴを阻害できる新規化合物の発見への手法を提供する。本方法は、癌細胞集団、前癌細胞集団、体細胞集団での使用に適用できる。医薬品に対する耐性の発生を阻害する治療の有効性をモニタリングするための方法、細胞分裂とは独立した遺伝子変異を自然発生することができる体細胞の蓄積と相関する病状の予防および／または治療のための方法を提供する。遺伝子不安定性を示す細胞を選択的に死滅させることができる薬剤を投与することによって個体において加齢に伴う病態を治療および／または予防するための方法を提供する。ＲＴ阻害剤を投与することによって癌細胞を化学療法薬に対して感作させる方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核細胞集団において遺伝子不安定性を減少させる方法であって、前記細胞中のＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされるＲＴの活性（前記ＲＴをＲＴＬＩＮＥと呼ぶ）が阻害されるように前記細胞に逆転転写酵素（ＲＴ）阻害剤を導入することを含み、それによって前記細胞が遺伝子不安定性の減少を示す、方法。
【請求項２】
前記細胞集団が癌細胞、前癌細胞、体細胞、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＴ阻害剤を前記細胞集団の子孫に導入することを含み、前記細胞集団の子孫が前記遺伝子不安定性の減少を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記遺伝子不安定性の減少が、少ない点変異、少ない染色体挿入、少ない染色体欠失、少ない増幅、転移能力の減少、不死化能力の減少、または１種もしくは複数種の医薬品への耐性発生の減少のうちの少なくとも１つを示す前記細胞を含み、遺伝子不安定性の前記減少が対照との比較である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ｉ）前記点変異が少なくとも一部は前記ＲＴのインテグラーゼ成分のエンドヌクレアーゼ活性に起因し；ｉｉ）前記挿入が１または複数の反復配列の新たなコピーの組込み、もしくは新たな偽遺伝子の組込み、もしくはそれらの組み合わせを含み；ｉｉｉ）前記欠失が、反復配列の組み込まれたコピーに囲まれた染色体のセグメントの喪失を含み；ｉｖ）前記増幅が反復配列の新たに組み込まれたコピーに囲まれた１または複数の機能遺伝子を含むゲノムフラグメントの新たなコピーを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞集団および／または前記細胞の子孫の少なくとも一部の細胞が、対照と比較してｉ）医薬品に対する耐性が少ない；および／またはｉｉ）転移能力が低下、もしくはｉｉｉ）加齢のエビデンスが少ない、のうちの少なくとも１つを示す、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記対照が、前記ＲＴの活性が阻害されてない細胞から取得した遺伝子不安定性の値を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞集団がｉｎ  ｖｉｔｒｏにあるか、または多細胞生物中に存在する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞集団が哺乳類細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳類細胞がヒト細胞である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞集団がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染しておらず、前記集団中の細胞が組み込まれたＨＩＶプロウイルスを含まない、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞集団が固形腫瘍に含まれるか、または前記細胞集団が血液癌細胞を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞集団が個体において癌細胞を含み、ｉ）前記癌細胞が一定期間中に前記個体に同様に投与される化学療法薬に対して耐性を発生しない、および／またはｉｉ）前記癌細胞が一定期間中に前記個体に同様に投与される化学療法薬に対して、対照と比較して少ない耐性を発生する、その期間に、前記ＲＴ阻害剤を導入することが行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞集団が個体において体細胞を含み、前記個体のフレイル指標が改善するか、または前記個体のフレイル指標の悪化が対照と比較して遅くなる期間に、前記ＲＴ阻害剤を導入することが行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
試験薬剤（複数可）が請求項１１に記載の方法において逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤として使用する候補であるか否かにかかわらず特性を明らかにする方法であって、
ｉ）ＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされるＲＴ（ＲＴＬＩＮＥ）を発現する細胞を１種または複数の試験薬剤と接触させることと、
ｉｉ）前記細胞における遺伝子不安定性の変化を試験することと、
ｉｉｉ）前記細胞および／またはそれらの子孫における遺伝子不安定性が対照と比較して減少したかを決定することによって試験薬剤が候補であるかを決定することか、
ｉｉｉ）前記細胞および／またはそれらの子孫における遺伝子不安定性が対照と比較して減少していない、もしくは増加したかを決定することによって前記試験薬剤が候補でないことを決定することと
を含む、方法。
【請求項１６】
遺伝子不安定性の前記減少が対照と比較して、少ない点変異、少ない染色体挿入、少ない染色体欠失、少ない増幅、転移能力の減少、不死化能力の減少、または１種もしくは複数種の医薬品への耐性発生の減少のうちの少なくとも１つを示す前記細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記方法が、前記ＲＴ阻害剤が化学療法薬に対する耐性の発生を阻害するか否かを決定するために、前記細胞を前記化学療法薬と接触させることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子不安定性の前記変化が検出可能なレポーターを用いて決定され、前記検出可能なレポーターがＤＮＡ損傷応答を示す、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
遺伝子不安定性を示す細胞を減少させる方法であって、前記遺伝子不安定性を示す前記細胞を選択的に死滅させることができる１種または複数種の薬剤を含む組成物を、それを必要とする個体に投与することを含み、前記遺伝子不安定性を示す前記細胞が機能ＬＩＮＥ１の発現によって特定される、方法。
【請求項２０】
前記１種または複数種の薬剤がＬＩＮＥ１配列（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）によってコードされる１〜２個のタンパク質のすべてもしくはセグメントを含み、あるいは前記１種または複数種の薬剤が前記１〜２個のタンパク質もしくはそのセグメント（複数可）をコードする発現ベクター（複数可）を含み、前記タンパク質（複数可）もしくはそのセグメント（複数可）が前記遺伝子不安定性を示す前記細胞に対する免疫応答を刺激することができる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記１種または複数種の薬剤を含む前記組成物が１種または複数種の免疫アジュバントおよび／もしくは免疫調節薬、ならびに／または前記１種または複数種の免疫アジュバントおよび／もしくは免疫調節薬をコードする前記発現ベクター（複数可）をさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記１種または複数種の薬剤がヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤またはヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤を含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記１種または複数種の薬剤がスタブジンもしくはラミブジンまたはそれらの組み合わせを含む、請求項２２の記載の方法。
【請求項２４】
遺伝子不安定性を発生させる刺激を特定する方法であって、細胞を試験刺激に曝すことと、ＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされるＲＴ（ＲＴＬＩＮＥ）の活性の増加について前記細胞を試験することとを含み、前記ＲＴの活性における増加が、前記刺激が遺伝子不安定性を発生させることを示す、方法。
【請求項２５】
ＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされる逆転写酵素（ＲＴ）（ＲＴＬＩＮＥ）の阻害剤による、または機能ＬＩＮＥ１の発現によって特定され得る遺伝子不安定性を示す細胞に対する免疫応答の発現を刺激するワクチンによる治療の候補として個体を特定するための方法であって、前記方法が遺伝子不安定性の尺度を決定するために前記個体由来の試料を試験することと、対照と前記遺伝子不安定性の尺度を比較することとを含み、前記対照と比較して多い遺伝子不安定性によって前記個体が前記治療の候補であることを示す、方法。
【請求項２６】
遺伝子不安定性の尺度が点変異、染色体挿入、染色体欠失、遺伝子増幅、個体由来の細胞の転移能力、個体由来の細胞の不死化能力、または個体由来の細胞中のＬＩＮＥ１  ＤＮＡ反復配列の発現について少なくとも１つの値を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記個体に前記ＲＴ阻害剤および／または前記ワクチンを投与することをさらに含む、請求項２５または請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
医薬品による治療に対する耐性の発生を阻害するための治療の有効性をモニタリングするための方法であって、前記方法が前記個体由来の細胞試料を前記治療中の第１の時点での遺伝子不安定性の尺度について試験することと、前記尺度を対照と比較することとを含み、前記対照と比較して前記遺伝子不安定性に増加がないことが前記治療の適切な有効性を示す、方法。
【請求項２９】
前記第１の時点での前記遺伝子不安定性の増加が前記治療の不適切な有効性を示す、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記治療の投与量を調節することと、前記投与量の調節が前記耐性の発生を阻害するのに適切であるか否かを決定するために、前記遺伝子不安定性の尺度について前記個体由来の第２の細胞試料を試験することとを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療が癌治療であり、前記薬剤が化学療法薬またはワクチンである、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
細胞分裂とは独立した遺伝子変異を自然発生することができる体細胞の蓄積と相関する病状の予防および／または治療の方法であって、そのような細胞が機能ＬＩＮＥ１配列の発現によって特徴づけられることができ、前記方法が、前記体細胞中のＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされる逆転写酵素（ＲＴ）（ＲＴＬＩＮＥ）の活性が阻害されるように前記個体にＲＴ阻害剤を投与すること、および／または前記体細胞への免疫応答が刺激されるようにワクチンを前記個体に投与することを含む、方法。
【請求項３３】
前記病状が、骨髄異形成症候群もしくは良性腫瘍から選択される増殖障害である癌、または加齢および／または体細胞の悪性形質転換を開始もしくは加速する炎症の誘発および／または悪化である異常な免疫調節、を含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記病状が自然加齢、ならびに／または加齢および／もしくは自然加齢に伴う１または複数の病態を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記病状の変化が前記個体についてのフレイル指標の変化を決定することによって検出され得る、請求項３２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記フレイル指標の前記変化が予防方法および／または治療方法の有効性を評価するために異なる時点で測定される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
個体における加齢に伴う病態を治療および／または予防するための方法であって、遺伝子不安定性を示す前記細胞を選択的に死滅させることができる１種または複数種の薬剤を含む組成物を、それを必要とする個体に投与することを含み、前記遺伝子不安定性を示す前記細胞が機能ＬＩＮＥ１の発現によって特定され得る、方法。
【請求項３８】
前記１種または複数種の薬剤がＬＩＮＥ１配列（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）によってコードされる１〜２個のタンパク質のすべてもしくはセグメントを含み、あるいは前記１種または複数種の薬剤が前記１〜２個のタンパク質もしくはそのセグメント（複数可）をコードする発現ベクター（複数可）を含み、前記タンパク質（複数可）もしくはそのセグメント（複数可）が前記遺伝子不安定性を示す前記細胞に対して免疫応答を刺激することができる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記１種または複数種の薬剤を含む前記組成物が１種または複数種の免疫アジュバントおよび／もしくは免疫調節薬をさらに含み、ならびに／または前記発現ベクター（複数可）が前記１種または複数種の免疫アジュバントおよび／もしくは免疫調節薬をコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記１種または複数種の薬剤がヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤またはヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤を含む、請求項３７〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
癌細胞を化学療法薬に対して感作させる方法であって、前記癌細胞を前記化学療法薬および逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤に導入することを含み、前記癌細胞がヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染されておらず、前記癌細胞が組み込まれたＨＩＶプロウイルスを含んでいない、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１月２３日出願の米国仮特許出願第６２／４４９，３８０号の優先権を主張し、その開示を参照により本明細書に組み込む。
【背景技術】
【０００２】
癌治療の大きな課題は、悪性特性の獲得および治療に対する抵抗をもたらす腫瘍の可塑性と適応性である。癌治療は、例えば非拘束増殖、代謝変化、血管新生の増加、免疫監視への耐性および転移能力などの新生細胞と正常細胞との間の表現型の違いに伝統的に焦点を合わせてきた。すべての腫瘍特異的形質は腫瘍細胞内の高レベルのゲノム不安定性に起因する。これは自然選択のために限りない数の変化した変異体を生み出す。腫瘍発生および進行のそれほど根本的な要因であるにもかかわらず、ゲノム不安定性は、「創薬につながる」標的がなく、主要経路（ＤＮＡ修復、複製制御、損傷細胞の増殖を制限する機構など）の欠損の結果として常にみなされてきたので、それ自体が治療標的として考えられたことはなかった。したがって、ゲノム不安定性に関連がある癌および他の望ましくない結果の治療への手法において変化を求める必要性が継続して満たされずに存在している。本開示は、この必要性および他の必要性に関連する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、抗癌治療および抗加齢治療のための新規の手法に関し、その一実施形態は全体的に図１にまとめる。本開示の実施形態は、種々の癌および他の加齢に伴う病態のための予防方法および／または治療方法を含む。該方法は、他の効果の中で、逆転写酵素（ＲＴ）阻害剤が投与されないときよりも、従来の抗癌剤（逆転写阻害剤でない）が不適切、または効果的でない場合の結果を改善するために、ＲＴ活性阻害剤の投与を含む。実施形態において、ＲＴ阻害剤は、ＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされるＲＴ、またはレトロエレメントの転写活性化に関与できるあらゆるＲＴを阻害するよう機能する。本開示は、新規化合物の発見への手法を含み、例えば、以下にさらに記述するように、ＲＴ阻害剤に他の薬剤および／または他の医療介入を組み合わせることによって癌および他の治療手法を改善するために、そのようなＲＴ阻害剤による治療から恩恵を被る個人を特定する。
【０００４】
一手法において、本開示は、真核細胞の集団において遺伝子不安定性を減少させる方法を提供し、該方法は、細胞中のＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされるＲＴの活性（ＲＴはＲＴＬＩＮＥと呼ばれる）が阻害されるように、ＲＴ阻害剤の細胞への導入を含み、それにより投与後に細胞は遺伝子不安定性の減少を示す。遺伝子不安定としては、正常細胞中では発現されると考えられない、ＲＴＬＩＮＥによって少なくとも一部は引き起こされる染色体挿入、染色体増幅／欠失、および点変異が挙げられるが、これらに必ずしも限定されない。したがって、本開示は、活性化機能ＬＩＮＥ配列によって細胞を根絶するために薬物によるＲＴＬＩＮＥ活性を阻害すること、または免疫系を刺激することのいずれかによって体細胞集団におけるゲノム不安性の抑制を含む。したがって、本開示は、癌細胞、前癌細胞、体細胞、およびそれらの組み合わせの集団における使用に関する。特定の態様において、ＲＴ阻害剤は、細胞集団の子孫に導入されることができ、それによって減少した遺伝子不安定性を含む細胞集団の子孫を得ることができる。特定の実施例では、本明細書に記載のＲＴ阻害剤の使用は、少ない点変異、少ない染色体挿入、少ない染色体欠失、少ない増幅、転移能力の減少、不死化能力の減少、または１種もしくは複数種の医薬品への耐性発現の減少のうちの少なくとも１つをもたらし、遺伝子不安定性の減少は対照との比較である。そのような効果は、細胞集団で実現され得る。そのような効果を測定する任意の適切な対照を用いることができ、そのような対照は本開示の恩恵を受ける当業者には明白であろう。非限定的な実施形態において、対照は、ＲＴの活性が阻害されていない細胞から得られる遺伝子不安定性の値を含む。
【０００５】
特定の実施形態において、本開示は、少なくとも一部はＲＴのインテグラーゼ成分のエンドヌクレアーゼ活性に起因する点変異の抑制；および／または１または複数の反復配列の新たなコピーの組込み、もしくは新たな偽遺伝子の組込み、もしくはその組み合わせを含む挿入；および／または反復配列が組み込まれたコピーに囲まれた染色体のセグメントの喪失を含む欠失；および／または反復配列が新たに組み込まれたコピーに囲まれた１または複数の機能遺伝子を含むゲノムフラグメントの新たなコピーを含む遺伝子増幅に関連する。実施形態において、本開示は、細胞集団および／または上記細胞の子孫の少なくとも一部の細胞が、対照と比較してｉ）医薬品に対する耐性が少ない、および／またはｉｉ）転移能力が低下、もしくはｉｉｉ）加齢のエビデンスが少ない、これらのうちの少なくとも１つを示すように、細胞集団へのＲＴ投与に関する。
【０００６】
本開示の方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持されるか、または多細胞生物中に生存する細胞集団のために実行され、したがってヒト細胞を含むがこれに必ずしも限定されない哺乳類細胞を含むことができる。実施形態において、細胞集団は、固形腫瘍に含まれているか、または血液癌細胞である。
【０００７】
特定の実施例において、細胞集団はヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、または他のレトロウイルスに感染しておらず、集団中の細胞は組み込まれたＨＩＶプロウイルス、もしくはレトロウイル由来の別の組み込まれたプロウイルスを含まない。
【０００８】
非限定的な実施形態において、細胞集団は、個体において癌細胞を含み、ｉ）癌細胞が一定期間中に個体に同様に投与される化学療法薬に対して耐性を発生しない、および／またはｉｉ）癌細胞が一定期間中に個体に同様に投与される化学療法薬に対して、対照と比較して少ない耐性を発生する、その期間に、ＲＴ阻害剤の投与が行われる。
【０００９】
別の非限定的な実施形態において、細胞集団は個体において体細胞を含み、個体のフレイル指標が改善する、または個体のフレイル指標の悪化が対照と比較して遅くなる期間に、ＲＴ阻害剤の投与が行われる。
【００１０】
別の態様において、本開示は、試験薬剤（複数可）がＲＴ阻害剤として使用する候補であるか否かにかかわらず特徴付ける方法を提供し、該方法は、
ｉ）ＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされるＲＴ（ＲＴＬＩＮＥ）を発現する細胞を１種または複数の試験薬剤と接触させることと、
ｉｉ）細胞における遺伝子不安定性の変化を試験することと、
ｉｉｉ）細胞および／またはそれらの子孫における遺伝子不安定性が対照と比較して減少したかを決定することによって試験薬剤が候補であるかを決定することか、
ｉｉｉ）細胞および／またはそれらの子孫における遺伝子不安定性が対照と比較して減少していない、もしくは増加したかを決定することによって試験薬剤が候補でないことを決定することと
を含む。この態様は、ＲＴ阻害剤が化学療法薬に対する耐性の発生を阻害するか否かを決定するために、細胞を化学療法薬と接触させることをさらに含む。そのような測定は、ＤＮＡ損傷応答を示す検出可能なレポーターを用いて決定される遺伝子不安定性の変化を測定することによるなどの任意の適切な手法を用いて行うことができる。
【００１１】
本開示の一態様では、遺伝子不安定性を示す細胞を減少させる／死滅させる方法が提供される。該方法は、遺伝子不安定性を示し、細胞を選択的に死滅させることができる１種または複数種の薬剤を含む組成物を、それを必要とする個体に投与することを含み、遺伝子不安定性を示す細胞は機能ＬＩＮＥ１の発現によって特定され得る。この手法の特定の実施例において、１種または複数種の薬剤がＬＩＮＥ１配列（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）によってコードされる１〜２個のタンパク質のすべてもしくはセグメントを含み、あるいは１種または複数種の薬剤が１〜２個のタンパク質もしくはそのセグメント（複数可）をコードする発現ベクター（複数可）を含み、タンパク質（複数可）もしくはそのセグメント（複数可）が遺伝子不安定性を示す細胞に対して免疫応答を刺激することができる。一実施形態において、個体に投与される組成物は、１種または複数種の免疫アジュバントおよび／もしくは免疫調節薬、ならびに／または１種または複数種の免疫アジュバントおよび／もしくは免疫調節薬をコードする発現ベクター（複数可）をさらに含む。
【００１２】
本開示のいずれの実施形態において、ＲＴ阻害剤は、ヌクレオシド類似体ＲＴ阻害剤、もしくはヌクレオチド類似体ＲＴ阻害剤、またはそれらの組み合わせであり得る。適切なＲＴ阻害剤の非限定例としては、スタブジンとラミブジンが挙げられ、および適切なＲＴ阻害剤のさらなる例は、後述する。
【００１３】
別の態様では、本開示は、遺伝子不安定性を発生させる刺激を特定する方法を含む。この手法は、真核細胞を試験刺激に曝すことと、ＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされるＲＴ（ＲＴＬＩＮＥ）の活性の増加について細胞を試験することとを含み、ＲＴの活性における増加が、刺激が遺伝子不安定性を発生させることを示す。
【００１４】
別の態様において、本開示は、ＲＴ阻害剤（ＲＴはＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされる（ＲＴＬＩＮＥ））による治療の候補として、および／または機能ＬＩＮＥ１の発現によって特定され得る遺伝子不安定性を示す細胞に対する免疫応答の発現を刺激するワクチンによる治療の候補として、個体を特定する方法を提供する。これらの手法は、遺伝子不安定性の尺度を決定するために個体由来の試料を試験することと、対照と遺伝子不安定性の尺度を比較することとを含み、対照と比較して遺伝子不安定性が多いことは、その個体が治療の候補であることを示す。本開示のこの実施形態および他の実施形態において、遺伝子不安定性の尺度は、点変異、染色体挿入、染色体欠失、遺伝子増幅、個体由来の細胞の転移能力、個体由来の細胞の不死化能力、個体由来の細胞中のＬＩＮＥ１  ＤＮＡ反復配列の発現および／または存在、ならびにこれらの尺度の組み合わせのうちの少なくとも１つの値を含む。一実施形態において、本開示は、ＲＴ阻害剤による治療の候補として個体を特定すること、またはそのような特定による試験結果を受け取ること、および個体にＲＴの阻害剤および／またはワクチンを投与することを含む。
【００１５】
別の態様において、本開示は、医薬品による治療への耐性の発生を阻害するために、治療の有効性をモニタリングする方法を含む。該方法は、個体由来の細胞試料を治療中の第１の時点での遺伝子不安定性の尺度について試験することと、尺度を対照と比較することとを含み、対照と比較して遺伝子不安定性に増加がないことは治療の適切な有効性を示す。あるいは、第１の時点での遺伝子不安定性の増加は、治療の不適切な有効性を示す。したがって、本開示は、治療の投与量を調節することと、投与量の調節が耐性の発生を阻害するのに適切であるか否かを決定するために遺伝子不安定性の尺度について個体由来の第２の細胞試料を試験することとを含む。そのような手法は、例えば、癌治療の有効性を決定することに適用でき、その薬剤は化学療法薬またはワクチンである。
【００１６】
別の実施形態において、本開示は、細胞分裂とは独立した遺伝子変異を自然発生することができる体細胞の蓄積と相関する病状の予防および／または治療のための方法を提供し、そのような細胞は機能ＬＩＮＥ１配列の発現によって特徴づけることができる。該方法は、体細胞中のＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされるＲＴ（ＲＴＬＩＮＥ）の活性が阻害されるように個体に１種または複数種のＲＴ阻害剤を投与すること、および／または体細胞への免疫応答が刺激されるようにワクチンを個体に投与することを含む。この手法の特定の実施例において、症状は、癌もしくは他の増殖障害（骨髄異形成症候群もしくは良性腫瘍など）、または異常な免疫調節（加齢および／または体細胞の悪性形質転換を開始もしくは加速し得る炎症の誘発および／または悪化など）を含む。実施形態において、症状は、自然加齢、および／または加齢および／もしくは自然加齢に伴う１または複数の病態を含む。実施形態において、病状の変化は、個体についてのフレイル指標の変化を決定することによって検出され得る。例えば、フレイル指標の変化は、該方法の有効性を評価するために異なる時点で測定することができる。
【００１７】
別の態様において、本開示は、遺伝子不安定性を示す細胞を選択的に死滅させることができる１種または複数種の薬剤を含む組成物を、それを必要とする個体に投与することによって個体における加齢に伴う病態を治療および／または予防するための方法を含み、遺伝子不安定性を示す細胞は機能ＬＩＮＥ１の発現によって特定され得る。１種または複数種の薬剤は、ＬＩＮＥ１配列（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）によってコードされる１〜２個のタンパク質のすべてもしくはセグメントを含むことができ、あるいは１種または複数種の薬剤は１〜２個のタンパク質もしくはそのセグメント（複数可）をコードする発現ベクター（複数可）を含み、タンパク質（複数可）もしくはそのセグメント（複数可）は、遺伝子不安定性を示す細胞に対して免疫応答を刺激することができる。実施形態において、１種または複数種の薬剤を含む組成物は、１種または複数種の免疫アジュバントおよび／もしくは免疫調節薬をさらに含み、ならびに／または発現ベクター（複数可）は１種または複数種の免疫アジュバントおよび／もしくは免疫調節薬をコードし、あるいは、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤またはヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤をさらに含んでもよい。
【００１８】
別の態様において、本開示は、癌細胞を化学療法薬に対して感作させる方法を提供する。該方法は、癌細胞を化学療法薬およびＲＴ阻害剤に導入することを含み、癌細胞はＨＩＶ、または別のレトロウイルスに感染しておらず、癌細胞は組み込まれたＨＩＶプロウイルス、または別の組み込まれたプロウイルスもしくはレトロウイルス由来を含んでいない。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＬＩＮＥ１ファミリーの配列によってコードされる逆転写酵素（ＬＩＮＥ１  ＲＴ）を発現する細胞の薬理学的標的化および免疫療法的標的化に基づく抗癌治療および抗加齢治療についての新パラダイムを模式的説明図で示す。
【図２】Ｍｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．１９９６  ８７（５）：９１７−２７に記載のＬＩＮＥ１レトロ転位アッセイについてのワークフローを表す（左側枠内に示す）。プレートアッセイのために、ＨｅＬａ細胞をレポータープラスミドで遺伝子導入した。ネオ耐性コロニーの出現は、レトロ転位イベントを意味している。上段のプレート画像は、スタブジンが５ｍＭを超える濃度で効果的であることを示す。下段のパネルは、表示濃度でスタブジンがＨｅＬａ細胞の細胞増殖性に対して効果がないことを示している。
【図３】代表的なＲＴ阻害剤のスタブジン（ＳＴＶ）およびアジドチミジン（ＡＺＴ）の使用から得られた結果の要約をグラフ（左側パネル）で示し、およびプレートアッセイの画像（右側パネル）を示す。これらは、結腸直腸癌細胞ＨＣＴ１１６の集団において薬剤耐性細胞変異体の獲得を抑制することを示す。
【図４】代表的なＨＩＶ  ＲＴ阻害剤のスタブジンがｐ５３ヌルＣ５７ＢＬ６／ｊオスマウスの無腫瘍生存を延長かせることを示す結果の要約をグラフで示す。
【図５】代表的なＲＴ阻害剤のスタブジンが自然発生の神経芽細胞腫マウスモデルにおいて標準化学療法に対する初期反応後に発生を遅らせ、腫瘍再発の発生率を低下させることを示す結果の要約をグラフで示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本明細書において別の定義がされない限り、本明細書で用いるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。
【００２１】
反対の指定がない限り、本明細書全体を通して記載されるあらゆる最大数値限定は、それより小さいあらゆる数値限定を、そのような小さい数値限定が本明細書に明白に記載されているかのように含むことが意図される。本明細書全体を通して記載されるあらゆる最大数値限定は、それより大きいあらゆる数値限定を、そのような大きい数値限定が本明細書に明白に記載されているかのように含むことになる。本明細書全体を通して記載されるあらゆる数値範囲は、そのような広い数値範囲内に入るそれよりも狭いあらゆる数値範囲を、そのようなより狭い数値範囲がすべて本明細書に明白に記載されているかのように含むことになる。
【００２２】
本開示は、一般に、レトロエレメントの転写活性化が自発的に、または特定のストレス（すなわち、遺伝毒性の状態）の後のいずれかで哺乳類生物のまれな体細胞に起こり得るという概念に関する。本開示の非限定的な実施形態は、図１に模式的に示し、さらに実施例で論じる。より詳細に、およびいかなる特定の理論に束縛されるものではないが、この「脱サイレンシング」はＬＩＮＥ１配列によってコードされる内在性逆転写酵素（ＲＴ）の発現をもたらし、これによって種々のＲＮＡのｃＤＮＡコピーの合成（すなわち、ＬＩＮＥ１  ＲＮＡ、ＳＩＮＥ配列のＲＮＡ、タンパク質コーディングｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡなど）、次いで細胞ＤＮＡのランダム位置への組込みを引き起こすと考えられる。これは、遺伝子不活性化または異常産物の合成（オープンリーディングフレームへの組込み）、発現の調節（調節領域への組込み）、遺伝子増幅（類似する反復配列が特定の遺伝子の周辺に組み込まれると、相同組換えが促進される）などに関連する挿入変異になる。さらに、ＬＩＮＥ１のＲＴは、そのエンドヌクレアーゼ活性を介してＤＮＡ切断を生成し、それによって点変異が誘発される。このプロセスは、体細胞集団における高度のゲノム不安定性をもたらし、癌発生リスクの増加と、特性が変化した細胞の蓄積と、正常機能への影響を引き起こし、それによって年齢と共に観察される生物の機能的活動の全体的な低下の一因となる。本開示は、これらのプロセスのすべてがＬＩＮＥ１配列の内在性ＲＴに少なくとも一部依存しているために、標的化ＲＴおよび／もしくはこのＲＴを発現する細胞を使用して、阻害するおよび／または予防することができる手法に一部基づいている。したがって、種々の実施形態において、本開示は癌進行の抑制のための、癌、加齢と加齢に伴う疾患の阻害および／または予防に関する。したがって、実施形態において、本開示は、例えば、遺伝子不安定性、表現型可塑性、および適応性が上昇した細胞、ならびに本明細書により詳しく説明する他の特徴を有する遺伝子改変細胞の出現を低下させる方法を含む。実施形態において、本開示は、癌細胞などの細胞集団におけるそのような遺伝子改変細胞を減少させることに関する。一般に、この開示の方法は、そのような細胞を１種または複数種のＲＴ阻害剤に曝すことおよび／またはそのような細胞に対するワクチン接種を含む。
【００２３】
特定の手法において本開示は、癌細胞集団中の遺伝子改変細胞由来の遺伝子改変変異体の発生を阻止する方法を含み、該細胞は、機能ＬＩＮＥ１  ＤＮＡ反復配列を発現する細胞などの高度の遺伝子不安定性をすでに獲得している。特定の態様において、本開示は、ＲＴ阻害剤および／またはワクチンで遺伝子改変細胞を標的にすること、または他の免疫調節剤で遺伝子改変細胞を選択的に標的にすることを含む。
【００２４】
実施形態において、「遺伝子改変細胞」とは、ＲＴの活性に少なくとも一部起因する点変異、挿入、欠失、および増殖のうちの少なくとも１つを獲得した細胞を含む。遺伝子改変細胞は、新規処理された偽遺伝子を得た細胞、およびそれらの遺伝子修飾のために、癌治療に耐性を有するようになる細胞か、またはそのような細胞に選択有利性を付与する他の特性を得る細胞を含むことができる。遺伝子改変細胞としては、黒色腫細胞、神経芽細胞腫細胞、もしくは、例えば、ＭＹＣファミリー遺伝子（すなわち、ＣＭＹＣ、ＮＭＹＣ）の癌原遺伝子の増幅を獲得した他の癌細胞、および増幅ＨＥＲ２／ＮＥＵ遺伝子を獲得した乳癌細胞、卵巣癌細胞または前立腺癌細胞、およびアンドロゲン受容体遺伝子において増幅または点変異を獲得し、それによって去勢抵抗性になった前立腺癌の細胞、ならびに治療耐性癌細胞の他の例が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されるものではない。遺伝子改変細胞としては、集団において他の細胞から区別される染色体異常を有する細胞、クロモスリプシスを有する細胞などが挙げられる。特定の態様において、本開示は、１種または複数種の癌治療に対して耐性を発生した細胞に関する。これは、化学療法薬（複数可）、標的抗癌剤（複数可）、進行中の免疫治療、または放射線治療（これらに対して細胞が耐性を発生している）の存在下で、細胞が増殖を継続する能力を有することを意味する。本開示の実施形態において、そのような耐性の発生は、本明細書に記載のＲＴ阻害剤の投与によって阻害および／または予防される。
【００２５】
逆転写酵素のいずれの阻害剤も本開示の方法において使用することができる。したがって、ＬＩＮＥ配列によってコードされる逆転写酵素に対するポリメラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ活性に対する阻害活性を有する任意の医薬品（複数可）を使用することができる。実施形態において、ＲＴは、哺乳類ゲノム中に存在するＬＩＮＥ１配列のＯＲＦ２によってコードされる、またはＬＩＮＥ２配列のＯＲＦ２によってコードされる。適切なＲＴ阻害剤としては、ＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされるＲＴ（すなわちスタブジン）と交差反応性を有するＨＩＶのＲＴ阻害剤が挙げられるがこれに限定されるものいではない。適切な薬剤も、ＨＩＶのインテグラーゼの阻害剤を含み、したがって、ＬＩＮＥ１のＯＲＦ２によってコードされるＲＴのエンドヌクレアーゼ活性との交差反応性を有する。特定の手法において、ＲＴ阻害剤は、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体ＲＴ阻害剤、または非ヌクレオシドＲＴ阻害剤、もしくは非ヌクレオチドＲＴ阻害剤であり得る。実施形態において、ＲＴ阻害剤は、ＲＴおよびインテグラーゼに対して二重阻害効果を有する化合物または化合物の複合体を含むことができる。したがって、種々の実施形態において、本開示は、ヌクレオシド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮＡＲＴＩもしくはＮＲＴＩ）またはヌクレオチド類似体逆転写酵素阻害剤（ＮｔＡＲＴＩもしくはＮｔＲＴＩ）として機能する１種または複数種の化合物を、それを必要とする個体に投与することを含む。そのような化合物の非限定的な例としては、ＡＺＴ（ジドブジン）、ジダノシン、ザルシタビン、スタブジン、ラミブジン、アバカビル、エムトリシタビン、エンテカビル、テノホビル、アデホビル、ザルシタビン（ｄｄＣ）、ラミブジン（３ＴＣ）、エムトリシタビン（ＦＴＣ）、アバカビル（ＡＢＣ）、エンテカビル（ＥＴＶ）、ジダノシン（ｄｄＩ）、テノホビル（ＴＤＦ）、およびアデホビル（ＡＤＶ）が挙げられる。特定の実施形態において、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害薬（ＮＮＲＴＩ）を使用することができ、その非限定例としては、エファビレンツ、ネビラピン、デラビルジン、エトラビリン、およびリルピビリンが挙げられる。一実施形態では、本開示はポートマントー阻害剤を投与することを含む。
【００２６】
あらゆる既知のＲＴ阻害剤の包括的使用に加えて、本開示は、ＲＴ  ＬＩＮＥ１のエンドヌクレアーゼ活性の新しい阻害剤を特定する方法であって、ＲＴを阻害するその能力ついて、および／またはＤＮＡ損傷応答（例えば、ＤＮＡ損傷応答を意味しているあらゆる種類のレポーター（すなわち、ｐ５３応答レポーター）を保有する培養で実験的に生成された細胞における）を遮断するその能力について、候補薬剤のスクリーニングを含む、方法を含む。
【００２７】
特定の実施形態において、本開示は、細胞分裂とは独立した遺伝子変異を自然発生することができる哺乳類体細胞変異体の正常な体細胞集団での蓄積から生じる病理学的結果の阻害および／または予防のための薬理学的手法および免疫療法的手法に関する。そのような細胞の共通の特性は、機能ＬＩＮＥ１配列の発現である。そのような病理学的結果は、癌、他の増殖障害（すなわち、骨髄異形成症候群、良性腫瘍）ならびに加齢および悪性形質転換の一因となり得る免疫調節（すなわち炎症の誘発）を含み得る。本開示の実施形態が取り組む病理学的結果は、自然加齢から生じる高齢ヒトおよび非ヒト動物の自然に生じるフレイルも含む。したがって、治療有効性は、一態様において、個体のフレイル指標の測定によって決定され得る。フレイル指標（ＦＩ）の決定は、既知の手法によって行われることができる。特定の実施形態において、フレイル指標は、測定された欠損の総数と、割り当てたＦＩスコアの比率、例えば０（無欠損＝適合）と１（すべての欠損が存在＝フレイル）の間のＦＩスコア、を含むいくつかのパラメータを算出することができる。したがって、一例において、高いＦＩは、生物の健康が悪いことを示し、および／または生物の生物学的年齢が低いことを示す。一般に、および理論に束縛されるものではないが、フレイルは有害事象に対する脆弱性が増加した状態であると考えられる。本開示のＦＩ指標は、任意の適切な数の累積欠損、例えば５〜３０の欠損を測定することを含み得る。実施形態において、Ｓｅａｒｌｅ，ｅｔ  ａｌ．，（２００８）ＤＯＩ：１０．１１８６／１４７１−２３１８−８−２４に記載のフレイル指標を使用することができ、その開示は参照により本明細書に組み込まれている。実施形態において、フレイル指標は、米国特許公開第２０１５０２８５８２３号に記載のとおり算出され、同特許からのフレイル指標、フレイル指標パラメータ、およびフレイル指標決定の記載は参照により本明細書に組み込まれている。フレイル指標パラメータとしては、体重、握力、血圧、全血球数、およびサイトカイン分析を挙げることができるが、これらに限定されるものではない。
【００２８】
ＲＴ阻害剤および免疫原性組成物を含む、本開示の組成物を投与する方法は、非経口投与、腹腔内投与、肺内投与、経口投与、粘膜投与、および局所投与を含むことができる。非経口注入は、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、および皮下投与を含む。組成物に含めるおよび／または本方法で使用するＲＴ阻害剤および／または免疫原性薬剤（もしくはそれをコードするポリヌクレオチド）および他の活性薬剤の量は、本開示の恩恵を受ける当業者が決定することができる。したがって、一実施形態において、本発明の組成物の有効量が投与される。有効量は、癌、加齢および／または加齢に伴う疾患の症状を軽減する量であり得る。免疫原性組成物について、有効量は、ワクチン接種の結果としてＲＴを発現するおよび／または本明細書に記載の遺伝子不安定性を含む少なくとも一部の細胞が個体から除去されるような量である。ＲＴ阻害剤の有効量は、本明細書に記載する遺伝子不安定性の作成を減少させる、または除去するためにＲＴ機能を阻害する量である。
【００２９】
特定の実施形態において、ワクチンおよび／またはＲＴ阻害剤を含む組成物は、それを必要とする個体に投与される。個体は、あらゆる癌、および／またはあらゆる加齢に伴う病態と診断され得る、これらを有すると推測され得る、またはこれらのリスクがあり得る。特定の実施例において、本開示は、加齢に伴う疾患、例えば、アルツハイマー病、ＩＩ型糖尿病、黄斑変性、慢性炎症に基づく症状（例えば、関節炎）の予防および／もしくは治療のためであり、ならびに／または加齢に伴うことが知られている癌型（例えば、前立腺癌、黒色腫、肺癌、結腸癌など）の発症を予防することであり、ならびに／または放射線または化学療法による癌治療の転帰を向上させることを目的としている。特定の実施形態において、本開示の手法を用いて治療を受ける個体は、遺伝子不安定性を含む細胞を有することに少なくとも一部基づいて選択され、遺伝子不安定性は本明細書にさらに記述される。実施形態において、個体はレトロウイルス感染症に感染していない、および／またはレトロウイルス感染症に罹患したことがない。実施形態において、個体はＨＩＶ＋ではなく、ＨＩＶ＋と診断されていない。実施形態において、個体は、ＨＩＶ感染症または別のレトロウイルス感染症を罹患するリスクが低いとみなされている。実施形態において、個体は、フレイル指標の決定に基づいた本発明に従って、および／またはゲノム不安定性を示す本明細書に記載の１または複数のパラメータを決定することによって治療を選択される。実施形態において、個体は、本明細書の記載のＲＴ阻害剤による最初の治療の前に、ＲＴ阻害剤を投与されていない。
【００３０】
本開示に従って投与された組成物の有効量は、医薬製剤方法、投与方法、患者の実年齢または算出年齢、体重、性別、健康全般、癌が治療中である場合、癌型とステージ、食事、投与時間、投与経路、および当業者には明らかな他の要因によって異なる。組成物は単回、または一連の投与にわたって投与されることができ、ゲノム安定性を維持するように、および／またはゲノム安定性を向上させるように長期的に投与され得る。したがって、実施形態において、本開示は、ＲＴ阻害剤（複数可）を長期間にわたり投与することを含み、したがってＲＴ ＬＩＮＥ１のポリメラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ機能を抑制することができる有効量の薬剤を長期投与することを含み得る。上述のように免疫治療方法は、機能ＬＩＮＥ１を発現する細胞を選択的に死滅させることを促進することを含み、したがって、ワクチン接種手法を含む。本開示のワクチンは、ＬＩＮＥ１配列（ＯＲＦ１およびＯＲＦ２）によってコードされる一方または両方のタンパク質を含む組成物を含むことができ、その免疫原性フラグメントを含み得る。タンパク質は、ミョウバンおよび／または自然免疫受容体のアゴニストを含むが、これらに限定されるものではない任意の適切な免疫アジュバント（複数可）と組み合わせることができ、非共有結合および共有結合を含むそのような組成物に関連して得ることができる。別の手法において、免疫応答の刺激は、ＬＩＮＥ１の一方または両方のタンパク質方をコードする任意の適切な組換えベクター（複数可）、および／またはその免疫原性フラグメントを使用して達成することができる。適切な組換えベクターとしては、アデノウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されるものではない。そのようなベクターは、免疫アジュバントとして免疫調節薬（すなわち、細菌フラジェリン）をさらに発現することができる。特定の実施形態において、本開示により刺激された免疫系によって標的化され、減少し、または体細胞集団から除去される細胞としては、ＬＩＮＥ１を発現する細胞、または新規のプロセス偽遺伝子を獲得した、もしくは染色体異常がある細胞が挙げられる。
【００３１】
より詳細には、およびいかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、腫瘍発生および進行のそれほど根本的な要因であるにもかかわらず、ゲノム不安定性は、「創薬につながる」標的がなく、主要経路（ＤＮＡ修復、複製制御、損傷細胞の増殖を制限する機構など）の欠損の結果としてみなされてきたので、それ自体が治療標的として考えられたことはなかったと思われる。本開示は、腫瘍細胞のゲノム不安定性が、哺乳類ゲノムのほぼ半分（通常、サイレント形態で）に含まれる反復レトロエレメントの脱サイレンシングおよび逆転写酵素による増幅を含む活動的なプロセスによって起こるという解釈に基づく代替パラダイムを導入する。このプロセスは、それらの機能性を保持するＬＩＮＥファミリーに属している反復配列のまれなコピーによってコードされる内在性逆転写酵素（ＲＴ）（ＲＴＬＩＮＥ）によってなされる。本開示は、レトロエレメントの転写脱サイレンシングが癌において頻繁に起こり、ｐ５３の喪失によって誘発され得るという観察に一部関連する。ｐ５３は通常、「ＤＮＡリピートーム」のエピジェネティックリプレッサーとして作用する。さらに、腫瘍は、初期胚発生および新生児脳の他に正常細胞で観察されない内在性ＲＴＬＩＮＥ発現の活性化を頻繁に獲得する。したがって、腫瘍は、挿入（反復配列の新しいコピーおよび新しいプロセス偽遺伝子の組込み）、増幅／欠失（新しく組み込まれた反復配列のコピー間の相同組換えによって誘発される）、および点変異（ＲＴＬＩＮＥのインテグラーゼのエンドヌクレアーゼ活性を介して）の３種類の変異を生じ得る「ゲノム不安定性のジェネレータ」（増幅のためのＲＴならびにＲＮＡ鋳型）のために必要なすべての成分を獲得することが多い。これらのイベントのすべてが正常細胞では発現されない単一酵素のＲＴＬＩＮＥによって引き起こされると考えられるので、本開示は、薬物によってＲＴＬＩＮＥ活性を阻害する、または活性化機能ＬＩＮＥ配列によって細胞を根絶するように免疫系を刺激する、のいずれかで体細胞集団におけるゲノム不安定性を抑制することに関する。これに関連して、ＨＩＶ治療で用いられる薬物であり、ＲＴＬＩＮＥ活性を阻害することができるスタブジンが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子増幅の頻度を大きく減少させ、腫瘍易発性ｐ５３欠損マウスの癌のない寿命を大幅に延ばしたことを本発明者らは示した。したがって、本開示は、（ｉ）ＲＴＬＩＮＥによるレトロエレメントの活性化は癌発生および進行の根底にあるゲノム不安定性への主要な一因である、および（ｉｉ）免疫療法（ワクチン接種）を介しての活性化ＲＴＬＩＮＥによる細胞の根絶を癌予防および本開示から当技術分野の当業者には明白であろう他の特徴のために用いることができる、という解釈に関する。特定の態様において、本開示は、生着の予防、およびマウスＬＩＮＥ１を発現する移植腫瘍の治療に対する試験が行われている、ＬＩＮＥ１発現細胞の抗原に対するワクチンを含む。ワクチンは、乳癌（ＭＭＴＶ−ｎｅｕ）、前立腺癌（ヘミ接合ＰＴＥＮ）、または多発癌（ｐ５３欠損、ｐ５３ヘミ接合＋照射）に遺伝的にかかりやすく、癌易発性マウスの４モデルにおいて癌予防有効性を示すことに成功した。
【００３２】
上述のように、特定の実施形態において、本開示はＤＮＡレトロエレメントを含み／発現する細胞を標的にすることを含む。これらの配列、すなわち短鎖散在反復配列および長鎖散在反復配列（ＳＩＮＥおよびＬＩＮＥ）は共にほとんどの哺乳類ゲノムのほぼ４０％を含む。６５００万年以上前、ＳＩＮＥおよびＬＩＮＥのすべての主要な種類は、逆転写酵素（ＲＴ）によって引き起こされた自然に生じるＰＣＲに似た機構によって哺乳類の先祖のゲノムに大量に侵入した。ＲＴ酵素の源は、わずかに２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）（そのうちの１つはＲＴをコードするＯＲＦ２）を有する古代の原始的ＲＮＡウイルスのＬＩＮＥ１配列によってもたらされている。ＳＩＮＥおよびＬＩＮＥの大量の増幅は、進化において哺乳類のすべての主要な原型の出現と同時に発生し、おそらく、挿入変異に起因する莫大な遺伝的多様性および表現型多様性による自然選択をもたらした。現在の哺乳類のゲノムにおいて、ＳＩＮＥおよびＬＩＮＥは転写をしておらず、ＲＴまたはＲＮＡ鋳型のいずれもレトロ転位のために利用できないので、それらの増幅は効果的にブロックされている。本発明者らは、レトロエレメントのエピジェネティックサイレンシングがｐ５３およびＤＮＡのメチル化によって協同的に制御されることを示した。両方とも欠乏している場合、ウイルス様ＲＮＡの大量転写は自滅的なインターフェロン応答を誘発する（Ｌｅｏｎｏｖａ，Ｋ．Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．ｐ５３  ｃｏｏｐｅｒａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａ  ｓｕｉｃｉｄａｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｍａｉｎｔａｉｎ  ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｐｅａｔｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１０，Ｅ８９−９８  （２０１３））。それにもかかわらず、ヒトゲノムまたはマウスゲノム中に存在するＬＩＮＥの約１００，０００のコピー中に残存する数個の機能配列によって腫瘍はＲＴＬＩＮＥの発現を獲得することが多いという分析から明らかなように、これらのすべての保護機構は、レトロエレメントの活性を完全に防止することができない。腫瘍は、一般にウイルス様ＲＮＡの転写も活性化し、したがってＲＴＬＩＮＥがレトロエレメントの増幅のプロセスを開始するＲＮＡ鋳型を提供する。一貫して、ＳＩＮＥおよびＬＩＮＥ両方の新しく組み込まれたコピーの出現は多くの腫瘍で示されており、ＲＴ活性化のスケールが腫瘍進行の段階と相関することが明らかにされている。
【００３３】
いかなる特定のモデルに限定されるものではないが、本開示は、レトロエレメント活性が癌発生および進行を引き起こすゲノム不安定性の主要な源であり、ゲノム不安定性に関与する他の機構（例えば、ＤＮＡ複製の間違い、ＤＮＡ修復の無効性など）とは異なり、創薬につながる可能性がある活動的に進行中のプロセスの一部であるという解釈に一部基づいている。この点に関しては、レトロエレメントの増幅は、ＬＩＮＥ１のいくつかの相同性の高いコピーによってコードされるＲＴの唯一の知られている内在源に完全に依存していると考えられる。本開示は、内在性ＲＴＬＩＮＥの小分子阻害剤がｉｎ  ｖｉｔｒｏで腫瘍細胞における遺伝子増幅の頻度を減らし、ｐ５３欠損マウスにおいて自然腫瘍発生を遅らせることを示す。したがって、本開示は、ＲＴ活性が実質的にゲノム安定性に影響を及ぼすことができ、その阻害により癌発生および進行が軽減され得る。したがって、本開示は癌予防へのパラダイムシフト戦略、ならびに加齢および加齢に伴う疾患に取り組むことを示し、その可塑性において癌および他の細胞は創薬につながる形質として取り組み、薬物耐性腫瘍細胞変異体の発生を抑制することによって、ならびに自然加齢および加齢に伴う疾患を予防するおよび／または阻害することによって現在の治療有効性の著しい改善をもたらすことができる。したがって、本開示は、ゲノム不安定性（癌の主要な特性であり、癌を無敵にする）が薬理学的標的化および免疫療法的（ワクチン）標的化に受け入れられる形質であることを初めて明らかにする。ＲＴ阻害の抗癌活性についての報告が発表されているが、それらはすべて、ＲＴが腫瘍細胞生存能力に必須であるという推測に基づいている。対照的に、特定の実施形態において、本開示は、腫瘍の生存能力（および、加齢および加齢に伴う障害に関与する他の細胞）を標的にしないが、むしろその「創造性」（遺伝子可塑性および表現型可塑性）を標的にする概念に関する。したがって、本開示は、癌発生および進行の予防のための薬物として、腫瘍学および加齢におけるＲＴ阻害剤の新しい役割を定義し、それには例えば、治療耐性の獲得、ならびに加齢および加齢に伴う病態の領域での関連手法および結果が含まれる。さらに、その概念上の新規性に加えて、本開示はいくつかの重要な技術革新を含む。例えば、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの使用およびトランスジェニックマウスの両方に適したレトロ転位依存性自滅的な配列を含む。有効な抗ＬＩＮＥワクチン接種のための一連の新たに合理的に設計された組換えタンパク質も、含む。本開示から生じるベクター、遺伝子修飾細胞株、およびトランスジェニックマウス（すなわち、異なるコンストラクト、分子ワクチンなどによってコードされる活性ＲＴを有する細胞株およびマウス）は、進化におけるレトロエレメントの生物学的役割の研究、癌予防、癌素因および癌の進行の研究において有用な新しいツールセットを形成することになる。これらの実施形態のすべては、本開示に包含されている。
【００３４】
前述から、ＬＩＮＥ  ＲＴによるレトロエレメントの増幅が、癌の発生と進行（薬物耐性、転移能力などの新しい特性の獲得）の両方に関与するゲノム不安定性の主要なドライバーであるという解釈に本開示が少なくとも一部基づいていることが認識される。本開示は、加齢および加齢に伴う障害に対するゲノム不安定性の影響の認識をさらに含む。本発明者らの解釈は、以下によって裏づけられるが、これは限定することを意図しない：（ｉ）哺乳類の進化において、爆発的な反復配列の増幅とすべての主要な形態学的原型の出現との間で証明された関連、（ｉｉ）レトロエレメントのエピジェネティックサイレンシングにおけるｐ５３の役割（およびｐ５３欠損細胞におけるそれらの頻繁な脱サイレンシング）、（ｉｉｉ）腫瘍における反復配列の脱サイレンシングおよび増幅の実証、および（ｉｖ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＩＮＥ  ＲＴ阻害を試験した我々の調査からのデータ。
【００３５】
上述のように、本開示は、自然の抗癌機構を逃れる癌の驚異的な可塑性および能力と、単一内在性酵素−ＲＴＬＩＮＥによる「創薬につながる」活動的なプロセスとしての応用治療とを明らかにする。ＲＴ依存的なゲノム不安定性は、おそらく以下の３種類のイベントを伴う：（１）ＬＩＮＥおよびそのＲＴによるＳＩＮＥの新しいコピーのゲノムの機能領域への組込みに起因する挿入変異、（２）新たに組み込まれた反復配列間の相同組換えによって誘発される欠失および増幅、ならびに（３）ＬＩＮＥ１  ＲＴ関連エンドヌクレアーゼの活性によって誘発される点変異。本開示は、様々な環境でＲＴＬＩＮＥの強制発現の体細胞のゲノム安定性に対する効果を評価することを含み、ＲＴＬＩＮＥの全体的な変異効果での各種類のゲノム不安定化イベントの寄与を決定して、ＲＴ発生の役割、ＯＲＦ１の寄与などに関する特定の機構問題に取り組む。
【００３６】
ヒトゲノムにおいて、約１００，０００の「デッド」ＬＩＮＥ１配列（多数の変異によって中断されるＯＲＦを有する）の中に、ＬＩＮＥ１の機能的に相同性の高いコピーを数個だけ残存している。初期胚発生の短期間および出生後の脳の成熟を除いて、それらは正常な体細胞においてエピジェネティックなレベルで深く発現停止されているが、腫瘍において転写活性および翻訳活性になることが多い。本開示は、これが腫瘍のゲノム不安定性の一因となるという解釈を含み、したがって癌発生および進行の予防を目標とする癌免疫療法のための標的抗原としてＲＴＬＩＮＥを強調する。したがって、本開示は、活性ＬＩＮＥ１によって細胞を除去することができるワクチンの開発を含む。したがって、本開示は、ワクチンを生成すること、ならびに（ｉ）腫瘍の実験モデルにおいて活性ＬＩＮＥ１によるワクチンの免疫治療の有効性、および（ｉｉ）癌易発性マウスのいくつかのモデルにおいてワクチンの免疫予防の有効性を決定することを含む。本開示は、加齢および／または加齢に伴う障害を阻害する方法においてＲＴ阻害剤およびそのようなワクチンの使用にも関する。
【００３７】
本開示は、（ｉ）レトロ転位、（ｉｉ）自発的な遺伝子増幅、および（ｉｉｉ）種々の遺伝子不活性化変異（点変異、欠失など）の頻度を定量的に評価するアッセイの使用を含む。第１のアッセイは、ＲＴＡＤ（ＲｅｔｒｏＴｒａｎｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒの略。レトロ転位活性検出器）と名付けられた、ＯＲＦＥＵＳ（これまでに、進行中のレトロ転位により細胞を検出するよう構築されたベクター）に類似する組換えベクターを使用する。ＲＴＡＤは、ＬＩＮＥ１転写とは反対の方向にクローン化されたユビキチンプロモータ下で、ＯＲＦ２がピューロマイシン耐性遺伝子およびヘルペスウイルスＴＫ（ガンシクロビル感受性）遺伝子からなるレポーターカセットによって交換されたマウス機能ＬＩＮＥ配列から作成されている。このレポーターカセットにおいて、プロモーターはイントロンによって不活性化されている。したがって、ピューロ（ピューロマイシン耐性遺伝子）およびヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＴＫ遺伝子の発現は、イントロンが切り出され、機能ｃＤＮＡのコピーがスプライスされたＲＮＡから合成される場合のみ、可能である。その後のステップでは逆転写を必要とするので、ＲＴＡＤはＲＴ活性の検出器として役立つ。ピューロマイシン耐性は、機能ＲＴを有する集団の細胞の発生頻度の指標を提供する。次いで、ガンシクロビル選択を用いて、そのような細胞を根絶させ、ゲノム不安定性へのＲＴ活性の影響を評価することができる。
【００３８】
遺伝子増幅は、Ｎ−ホスホノアセチル−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）（ＵＭＰ生合成に必須のＣＡＤタンパク質のアスパラギン酸トランスカルバミラーゼの小分子阻害剤）に耐性がある細胞変異体の出現頻度を測定することによって評価することができる。ヒト細胞において、ＰＡＬＡ耐性は、ＣＡＤ遺伝子の増幅によるＣＡＤ過剰発現だけにほぼ関連している。したがって、これは遺伝子増幅の定量的指標として機能し得る。通常、正常細胞で検出不可能であり、遺伝子増幅の出現頻度は、腫瘍細胞において１０−５と同じ高さであり得る。デシタビンによるｐ５３不活性化およびＤＮＡ脱メチル化は共に遺伝子増幅の頻度を大いに上げるという発見は、このプロセスにおけるレトロエレメントの関与（ｐ５３およびＤＮＡ脱メチル化によるエピジェネティックレベルで阻害される）の可能性を裏づけている。これと整合して、本発明者らは、非毒性濃度のＲＴ阻害剤のスタブジン（ＳＴＶ）またはアジドシチジン（ＡＺＴ）（両方ともＲＴＬＩＮＥ１に対して有効であることが知られている）の存在下で腫瘍細胞の培養がＰＡＬＡ耐性コロニーの発生を大いに減少させることを見出した。
【００３９】
遺伝子不活性化変異の出現頻度は、ピューロマイシン耐性とガンシクロビル感受性を付与する上述のピューロ−ＨＳＶ  ＴＫレポーターカセットを発現するレンチウイルスコンストラクトＰＵＲＴＫで形質導入された別の一連の検出の細胞株を用いて、決定することができる。細胞集団におけるガンシクロビル耐性クローンの出現度数は、変異によるＨＳＶ  ＴＫ遺伝子不活性化の定量的指標である。したがって、これらの細胞を用いて、異なる要因の自然発生変異原性に対する効果を評価することができる。
【００４０】
２種類のＲＴＬＩＮＥ１活性検出器ツール（ＲＴＡＤおよびＰＵＲＴＫによる）は、マウス腫瘍由来細胞株の同じセットから生成することができる。これらのツールを用いて、３種類のゲノム不安定性（挿入変異誘発、遺伝子増幅、および点変異）の依存性を以下の異なる源からのＲＴの活性について評価することができる：（ｉ）完全長ＬＩＮＥ（自然で強力なプロモーター−ＯＲＦ１およびＯＲＦ２の強制同時発現）、（ｉｉ）ＲＴＬＩＮＥ１単独（ＯＲＦ１の影響を決定するため）および（ｉｉｉ）異なる起源のＲＴ（ＭｏＭｕＬＶ  ＲＴ−単独、またはＯＲＦ２の代わりにＬＩＮＥ１内で）。選択される細胞の予想される変異イベントの性質は本明細書に記載のように分析することができる。
【００４１】
「修飾因子」コンストラクトのセットを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの自然形質転換を誘発するＲＴ発現の能力を評価することができる。本発明者らの以前の研究で効率よく用いた２つのモデル系を用いることになり、両系ともマウスＢａｌｂ／ｃ ３Ｔ３由来非形質転換線維芽細胞（クローン（１２）１および（１０）１）の形質転換した、足場非依存性腫瘍原性細胞への転換を含む。（１０）１細胞は、ｐ５３欠損であり、活性化変異Ｒａｓによる形質転換を受けやすいが、（１２）１細胞はｐ５３野生型であり、Ｒａｓ媒介形質転換のためにｐ５３不活性化を必要とする。両方とも、すべての修飾因子コンストラクト、単独（系統（１２）１）またはＳＶ４０プロモーター（系統（１２）１）下でＶ−Ｈａ−Ｒａｓとの組み合わせのいずれかで遺伝子導入することができる。優性な癌細胞を活性化する、またはｐ５３を抑制する（それぞれ（１０）１および（１２）１の場合）のいずれかで変異を獲得することにより、足場非依存性増殖が可能な形質導入集団において細胞の頻度を測定することができる。
【００４２】
ＲＴＡＤはレトロエレメントの活性をモニタリングするためでなく、活性化反復配列で細胞を根絶することにより細胞集団のゲノム安定性を制御するための強力で新たな遺伝子ツールを提供することが予想される。したがって、本開示は、癌予防、ならびに加齢および加齢に伴う障害の予防のためにＲＴＬＩＮＥ１発現細胞を根絶する実現可能性をｉｎ  ｖｉｖｏで評価するモデルとして使用するためにその生殖細胞系にＲＴＡＤを保有するトランスジェニックマウスを作製することを含む。
【００４３】
上述のように、本開示は活性レトロエレメントを有する細胞に対する適応免疫の誘導への手法、および癌予防と癌治療のそれらの有効性を評価する手法を包含する。本開示は、本開示の方法で機能することができるすべてのワクチンを包含する。特定の実施形態において、本開示は以下の２種類の異なるワクチンを提供する：（ｉ）タンパク質系（スプリットワクチン）、（ｉｉ）遺伝子系のアデノウイルスワクチン、および、例えば、プライム−ブーストレジメンでの用途用にそのような手法の組み合わせ。本開示は、免疫抑制性の制御性Ｔ細胞エピトープの除去、および抗原発現のレベルを向上させるようコドン内容の調節を含むことができるＬＩＮＥ１のＯＲＦ１とＯＲＦ２の構造最適化を含む。ＯＲＦ１およびＯＲＦ２の分泌型をコードする遺伝子配列は、例えば、確立された手法に従ってリーダーペプチドを加えることにより作成することができる。組換え型ＯＲＦ１およびＯＲＦ２の抗原に加えて、パターン認識受容体（ＴＬＲ７／８、ＮＯＤ１／２）のアゴニストを表している分子アジュバントの種々の組み合わせをスプリットワクチンに組み入れることができる。開発された遺伝子ベースのワクチンの免疫原性は、エントリモド（サルモネラ菌フラジェリンの誘導体、ＴＬＲ５のアゴニストであり、強力な免疫アジュバント）をコードするアデノウイルスベクターの追加ＯＲＦに追加することによって増加することができる。ワクチン製剤は、免疫の細胞成分を活性化するその能力を、例えばＦＡＣＳベースのリンパ球活性化マーカー（ＣＤ１０７、ＣＤ６９、ＣＤ２５、ＣＤ４４）の検出によって、ＯＲＦ１およびＯＲＦ２の抗原によるそれらの刺激を受けて、抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔリンパ球の増殖応答およびサイトカイン産生（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ）の分析により試験することができる。遺伝子系製剤およびスプリットワクチン製剤の両方の抗腫瘍有効性は、例えば、ＲＴＡＤと共にＬＩＮＥ１のＯＲＦ１／ＯＲＦ２抗原を発現し、同系マウスにおいて皮下移植腫瘍として増殖した、上述の遺伝子修飾腫瘍細胞を含むｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍モデルを含むがこれに限定されるものではない、任意の適切な手法を用いて試験することができる。移植されたモデルでの実験ワクチンの機能的有効性は、他に記載の（例えばエントリモド系の抗癌ワクチンなど）予防モードおよび治療モードで試験され得る。自然発生癌の予防のための抗ＬＩＮＥ１ワクチンの有効性は、乳癌（ＭＭＴＶ−ｎｅｕ）、前立腺癌（ヘミ接合ＰＴＥＮ）または多発癌（ｐ５３欠損、全身照射によるｐ５３ヘミ接合体）にかかりやすいマウスで確立された遺伝子モデルで試験され得る。動物は１２週齢ごろにワクチン製剤で免疫化されることができ、プラセボ対照群と共に癌発生をモニターすることができる。動物は、標的器官における検出可能な過形成病変の時には中間分析のために確保される。これらの手法の実行は、抗ＬＩＮＥ１ワクチン（腫瘍のない寿命の延長、腫瘍増殖抑制または腫瘍縮小）の実質的な予防効果および治療効果を示すことが予想される。ＬＩＮＥ１抗原の発現は、ワクチン接種した動物および対照動物において増殖する腫瘍で比較することができる。
【００４４】
前述の説明を考慮して、本開示は、多数の実用的な医用応用を導き、現在、適切な治療手法または普遍的な標的がない、癌、加齢および加齢に伴う疾患と病態の治療および予防のための広く適用可能な解決策を提供することが予想されるのは明白である。
【００４５】
以下の実施例は、本発明を例示することを目的とし、限定することを目的としない。
【００４６】
実施例１
いかなる特定の理論にも束縛されるものではないが、図１は、ＬＩＮＥ１ファミリーの配列によってコードされる逆転写酵素（ＬＩＮＥ１  ＲＴ）を発現する細胞の薬理学的標的化および免疫療法標的化に基づく抗癌治療および抗加齢治療の新規の方法を記載する新規パラダイムの概略説明を示す。特に、図１は、ＬＩＮＥ１  ＲＴによって引き起こされる機構を介してゲノム内で内在性レトロトランスポゾンの自発的エピジェネティック抑制解除およびそれらの拡大の結果として、哺乳類における癌の発生と進行、ならびに加齢を模式的に示す。ＬＩＮＥ１  ＲＴは、ＬＩＮＥ１およびＳＩＮＥのレトロトランスポゾンのＲＮＡを含む種々の細胞ＲＮＡのｃＤＮＡコピーの合成および組込みを可能にする。このプロセスは、異なる種類の突然変異生成（挿入変異、欠損、増幅、点変異）および炎症の活性化（ＤＮＡ損傷応答およびインターフェロン誘導を介して）を引き起こす。ＬＩＮＥ１  ＲＴ誘発突然変異生成は、遺伝的に、および表現型的に変化した癌始原細胞の蓄積をもたらす。このプロセスが癌細胞集団で進行する場合、新規悪性および治療耐性特性の獲得を含む腫瘍進行を加速する。正常な体細胞の集団において、炎症誘発性特性を有する細胞（例えば、老化細胞）の蓄積となり、自然発生の無菌性全身性炎症の加齢性増加を引き起こす。健康な生物に適用すると、この多機能酵素のポリメラーゼおよび／またはエンドヌクレアーゼ活性を阻害することができる小分子を含むＬＩＮＥ１  ＲＴ阻害剤は、加齢および癌発生を抑制することが予想され、癌および加齢の予防に用いることができる。担癌生物に適用すると、そのような阻害剤はさらなる変異を蓄積する癌の能力を抑制し、それによって癌の進行を遅らせる。上述のように、治療耐性の獲得を抑制することによって治療をより効果的にするために、ＲＴ阻害剤は、任意の癌治療との併用に適することが予想される。
【００４７】
実施例２
本実施例を図２にまとめる。図２では、代表的な抗ＨＩＶ薬である、ＨＩＶ  ＲＴ阻害剤スタブジンの、濃度の非毒性範囲内でＬＩＮＥ１配列のレトロ転位を抑制する能力を示すエビデンスを示す。レトロ転位アッセイをＭｏｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．１９９６  ８７（５）：９１７−２７（スキームを左側に示す）に従って行った。ＨｅＬａ細胞をレポータープラスミドで遺伝子導入した。ネオ耐性コロニーの出現は、レトロ転位イベントを意味する。スタブジンは、５ｍＭを超える濃度で効果的である。下段のパネルは、表示濃度でのスタブジンがＨｅＬａ細胞の細胞増殖性に対して効果がないことを示している。したがって、他のＲＴ阻害剤が同様の有用性を有することが予想される。
【００４８】
実施例３
本実施例を図３にまとめる。図３では、ＬＩＮＥ１  ＲＴ（図２を参照されたい）に対して効果的であると本実施例で実証された代表的なＲＴ阻害剤のスタブジン（ＳＴＶ）およびアジドチミジン（ＡＺＴ）が、結腸直腸癌細胞ＨＣＴ１１６集団において薬剤耐性細胞変異体の獲得を抑制することを示す。特に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで獲得した薬物耐性のモデルとして、Ｎ−（ホスホノアセチル）−Ｌ−アスパラギン酸（ＰＡＬＡ）（多機能ＣＡＤ酵素のアスパラギン酸トランスカルバミラーゼ活性を特異的に阻害し、ＣＡＤ遺伝子（Ｓｔａｒｋ，Ｇ．Ｒ．，およびＷａｈｌ，Ｇ．Ｍ．１９８４．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：４４７−５０３）．Ｏｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８８９．２６４：３３９０−３３９６）の増幅のために選択する薬物）の存在下で細胞の選択を使用し、同系動物への注射後、ＰＡＬＡへの耐性になる細胞株の能力と、腫瘍を形成するこれらの同じ細胞の能力との間に著しい類似点を示した。表示濃度のＳＴＶおよびＡＺＴの存在下での細胞増殖により、ＰＡＬＡ耐性コロニーの数が劇的に減少し、ＬＩＮＥ１  ＲＴ阻害が薬剤耐性の獲得を抑制し、腫瘍細胞集団において最も腫瘍原性の腫瘍始原細胞を減少させることができることを示唆している。右側のパネルは、ＰＡＬＡの存在下、および非存在下で、ＲＴ阻害剤で処置した、および非処置の組織培養プレートの画像として、グラフ中に示したデータを示す。単独のＲＴ阻害剤に対するＨＣＴ１１６の感受性を、様々な濃度のＲＴ阻害剤の存在下での７２時間のインキュベーションに続いて接着細胞の定量化を用いて決定した（右側グラフに細胞生存率のスケールと共に曲線で示す）。
【００４９】
実施例４
本実施例を図４にまとめる。図４では、実施例においてＬＩＮＥ１  ＲＴを阻害できることを示すＨＩＶ  ＲＴ阻害剤のスタブジン（図２）は、ｐ５３ヌルＣ５７ＢＬ６／ｊオスマウスの無腫瘍生存を延ばすことを示す。腫瘍の自然発生に起因する長寿の減少のモデルとしてｐ５３ヌルマウスを用いた。マウスは、１０週齢から開始し、１．５ｍｇ／ｍlのスタブジン含有または不含非酸性化飲料水（それぞれ「スタブジン」群と「溶媒」群）で飼育し、自然死（または瀕死動物、もしくは許容限度を超える腫瘍量を有する動物の安楽死）を記録した。飲料水中のスタブジンは、寿命の中央値４３％を延ばしており、ＲＴ阻害剤の潜在的な抗癌活性および抗加齢活性を示した。非酸性化水を用いて、溶液中のスタブジンの安定性を維持した。
【００５０】
実施例５
本実施例を図５にまとめる。図５では、代表的なＲＴ阻害剤のスタブジンが自然発生の神経芽細胞腫マウスモデルにおいて標準化学療法に対する初期反応に続いて、発生を遅らせ、腫瘍再発の発生率を低下させることを示す。特に、ＭＹＣＮ導入遺伝子にホモ接合型であるＴｈ−ＭＹＣＮトランスジェニックマウス（１２９Ｘ１／ＳｖＪ−Ｔｇ（ＴＨ−ＭＹＣＮ）４１Ｗａｗ／Ｎｃｉ系統）は１００％、３０日齢ごろに腹部に自然発生の神経芽細胞腫を発生する。この導入遺伝子を保有するマウスは、従来の治療に対する感受性を含むヒト小児疾患の特徴を多く示す。指示治療は、触知可能な腫瘍の最初の出現時に開始した。マウスは、１．５ｍｇ／ｍlのスタブジン含有または不含非酸性化飲料水で継続的に、または指示期間中のいずれかで飼育した。グラフから明白なように、単独でのスタブジンには検出可能な抗腫瘍効果がなかった。シクロホスファミドとトポテカンの組み合わせによる治療は、マウスの腫瘍のない寿命を、平均で４週間延ばし、その後に腫瘍再増殖および危険な腫瘍の大きさのための動物の終焉が続いた。スタブジンによる連続治療は、腫瘍再発を有意に遅らせ、平均無腫瘍生存率をほぼ２倍延ばし、観察から１００日間以内に再発が検出されなかった無疾患動物の割合を有意に増加させた。これらの結果は、標準抗癌レジメンと併用して腫瘍進行を抑制するＲＴ阻害剤の前向きな使用を支持する。
【００５１】
実施形態は例示の目的で詳述してきたが、そのような詳細はただその目的だけであり、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく当業者によってバリエーションが本実施形態になされ得ることが理解されるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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