(57)【要約】  本発明は、それを必要とするヒト対象に呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する安全な免疫応答を誘導する方法であって、配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質をコードする核酸を含む組換えアデノウイルス、及び薬学的に許容される担体を含む組成物をその対象に、約１×１０１０〜約２×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）の総用量で投与することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
それを必要とするヒト対象に呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する安全な免疫応答を誘導する方法であって、配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質をコードする核酸を含む組換えアデノウイルス、及び薬学的に許容される担体を含む組成物を前記対象に、約１×１０１０〜約２×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）の総用量で投与することを含む方法。
【請求項２】
前記組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質をコードする核酸を含む組換えアデノウイルス、及び薬学的に許容される担体を、約５×１０１０〜約１×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）の総用量で含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記免疫応答は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合する抗体の誘導を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫応答は、ＲＳＶ中和抗体の誘導を含む、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
前記免疫応答は、融合前コンフォメーションの前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的な抗体、及び融合後コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的な抗体の誘導を含み、且つ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的な抗体の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の増加は、融合後コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的な抗体の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の増加よりも大きい、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項６】
ＥＬＩＳＡで測定される融合後Ｆ特異的抗体の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の増加とＶＮＡアッセイで測定される中和抗体の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の増加との比は、前記組成物の投与後、前記組成物の投与前の前記比と比較して減少する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫応答は、前記配列番号１のＲＳＶ  Ｆタンパク質をカバーするペプチドプールでの刺激に応答してＩＦＮｙ  ＥＬＩＳＰＯＴで測定されるＩＦＮガンマ産生Ｔ細胞によって示される細胞応答、並びに／又は、前記配列番号１のＲＳＶ  Ｆタンパク質をカバーするペプチドプールでの刺激後の細胞内染色（ＩＣＳ）によるＩＦＮγ、ＩＬ−２及びＴＮＦαを発現するＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞サブセットの測定によって示される細胞応答をさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記対象は６０歳以上のヒトである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする前記核酸は、配列番号２の核酸配列を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えアデノウイルスはヒトアデノウイルスである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記アデノウイルスは血清型２６又は３５のアデノウイルスである、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＲＳＶに対する有効な免疫を安全に誘導する方法に関する。
特に、本発明は、ヒト対象においてＲＳＶの複数の株に対する免疫の安全な誘導を提供するＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現するアデノウイルス２６血清型発現ベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、毎年約２００，０００人の小児死亡の原因であると考えられている気道の伝染性が高い小児病原体である。２歳未満の小児では、ＲＳＶは呼吸器感染症による入院の約５０％を占め、入院のピークは月齢２〜４ヶ月で生じる。ほとんど全ての小児が２歳までにＲＳＶ感染を経験し、生涯にわたる反復感染は自然免疫の低さに起因すると報告されている。高齢者では、ＲＳＶ疾患の負担は、一般的なインフルエンザＡ感染によって引き起こされるものと類似している。
【０００３】
ＲＳＶは、ニューモウイルス亜科（ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｉｎａｅ）に属するパラミクソウイルスである。そのゲノムは、中和抗体の主要な抗原標的であるＲＳＶ糖タンパク質（Ｇ）及びＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質として知られる膜タンパク質を含む種々のタンパク質をコードする。
【０００４】
ＲＳＶ  Ｇタンパク質とは異なり、Ｆタンパク質はＲＳＶ株間で保存されており、そのことで、広く中和抗体を誘発することができる魅力的なワクチン候補となっている。Ｆタンパク質は膜貫通タンパク質であり、ウイルスの出芽中に細胞膜からビリオン膜に取り込まれる。ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、ウイルス膜と宿主細胞膜とを融合させることによって感染を促進する。融合プロセスにおいて、Ｆタンパク質は、不安定な融合前コンフォメーションから安定な融合後コンフォメーションに不可逆的にリフォールディングする。タンパク質前駆体Ｆ０は、細胞内成熟の間にフーリン様プロテアーゼによって切断される必要がある。２つのフーリン部位があり、その切断によりｐ２７ペプチドが除去され、２つのドメイン、Ｎ末端Ｆ２ドメイン及びＣ末端Ｆ１ドメインが形成される（図１）。Ｆ２及びＦ１ドメインは、２つのシスチン架橋によって結合される。融合タンパク質に対する抗体は、細胞へのウイルス取り込みを防止することができ、したがって、中和作用を有する。中和抗体の標的であることに加えて、ＲＳＶ  Ｆは、細胞傷害性Ｔ細胞エピトープを含む（Ｐｅｍｂｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．６８：２１７７−２１８２）。
【０００５】
５０年間の研究にもかかわらず、ＲＳＶに対するワクチンにはまだ認可されたものがない。ワクチン開発の大きな障害の１つは、１９６０年代の臨床試験において、ホルマリン不活化（ＦＩ）ＲＳＶワクチンによる、疾患のワクチン増強があったことが受け継がれていることである。ＦＩ−ＲＳＶワクチン接種を受けた小児は、自然感染から防御されず、感染した小児は、ワクチン接種を受けなかった小児よりも、２人の死亡を含む重篤な病気を経験した。この現象は「疾患の増強」と呼ばれる。
【０００６】
ＦＩ−ＲＳＶワクチンによる試験以来、ＲＳＶワクチンを作製するための種々のアプローチが追求されてきた。試みには、ＲＳＶの古典的生弱毒化低温継代株又は温度感受性変異株、（キメラ）タンパク質サブユニットワクチン、ペプチドワクチン、及びアデノウイルスベクターなどの組換えウイルスベクターから発現されるＲＳＶタンパク質が含まれる。これらのワクチンのいくつかは、有望な前臨床データを示したが、安全性の懸念又は有効性の欠如により、いずれのワクチンもヒトへの使用に対しては認可されなかった。
【０００７】
最も強力なＲＳＶ中和抗体は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質上の特定の部位（ゼロ部位）に結合するが、この部位はＲＳＶタンパク質がその融合前コンフォメーションにある場合にのみ露出され、このことがこの特定のコンフォメーションをワクチン抗原とし非常に魅力的なものにしている。しかしながら、その融合前コンフォメーションにあるＦタンパク質は非常に不安定であり、融合後コンフォメーションへの主要なコンフォメーションシフトを容易に受ける。したがって、融合前コンフォメーションは、その不安定性のために、成熟する前に、より安定な融合後コンフォメーションへとリフォールドする傾向を有する。この現象は、溶液中及びビリオン表面上のいずれの場合にも現れる、このタンパク質に固有の特徴である。
【０００８】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質に基づくワクチン候補は、安定性、純度、再現性、及び効力などの問題のために、これまで失敗してきている。実際、融合前形態のＲＳＶ  Ｆタンパク質を含有するＲＳＶワクチンを製造するために多くの努力がなされてきたにもかかわらず、ヒトで試験された安定な融合前ＲＳＶ  Ｆポリペプチドは報告されていない。
【０００９】
したがって、ＲＳＶに対する安全で効果的なワクチン及びＲＳＶに対するワクチン接種方法が依然として必要とされている。本発明は、安全な方法でＲＳＶに対するワクチンを接種するためのそのような方法を提供することを目的とする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、融合前コンフォメーションで安定化されたＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現する組換えアデノウイルスが、ヒト対象に投与された場合に、ＲＳＶに対する安全且つ有効な（免疫原性の）免疫応答を誘導することが初めて示された。
【００１１】
したがって、本発明は、それを必要とするヒト対象に呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する安全な免疫応答を誘導する方法であって、配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質をコードする核酸を含む組換えアデノウイルス、及び薬学的に許容される担体を含む組成物をその対象に、約１×１０１０〜約２×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）のアデノウイルスの総用量で投与することを含む方法を提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする対象に呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する安全な免疫応答を誘導する方法に使用するための、配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質をコードする核酸を含む組換えアデノウイルス、及び薬学的に許容される担体を含む、総用量が約１×１０１０〜約２×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）のワクチン組成物を提供する。
【００１３】
本発明の特定の実施形態では、アデノウイルスの総用量は約５×１０１０〜約１×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）である。特定の実施形態では、用量はアデノウイルスが約５×１０１０又は約１×１０１１ｖｐである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＲＳＶ  Ｆタンパク質の模式図。タンパク質前駆体は、Ｆ２及びＦ１ドメイン、並びにフーリン様プロテアーゼによる切断によって成熟タンパク質から除去されるｐ２７ペプチドを含む。切断部位を矢印で示す。ボックスの上の数字は、シグナルペプチドを除く完全長タンパク質のアミノ酸の位置を示す。Ｆ１には、構造要素が示されている：融合ペプチド（ＦＰ）、ヘプタドリピートＡ（ＨＲＡ）を含むリフォールディング領域１（ＲＲ１）、及びヘプタドリピートＢ（ＨＲＢ）を含むリフォールディング領域２（ＲＲ２）。
【図２】Ｆタンパク質変異体の相対的表面発現。Ｆタンパク質の完全長変異体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させた。抗ＲＳＶ  Ｆ抗体（ＣＲ９５０３）で細胞を染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を計算し、対照のＦ野生型（Ｆｗｔ）トランスフェクト細胞試料のＭＦＩに対して正規化した。ＦｗｔのＭＦＩを１とした。バーは平均値を意味し、エラーバーは値の範囲を表す。
【図３】細胞表面の融合前Ｆタンパク質の画分。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でＦタンパク質の完全長変異体を発現させた。抗ＲＳＶ  Ｆ抗体ＣＲ９５０３及び抗融合前ＲＳＶ  Ｆ抗体ＣＲ９５０１で細胞を染色し、フローサイトメトリーで分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を計算し、ＣＲ９５０１によって測定されたＭＦＩを、ＣＲ９５０３によって測定されたＭＦＩに対して正規化した。正規化されたＭＦＩ値は、細胞表面上のｐｒｅ−Ｆの画分を示す。バーは平均値を意味し、エラーバーは値の範囲を表す。
【図４】Ｆタンパク質変異体の相対表面発現。膜貫通領域及び細胞質領域を欠失させた可溶性バージョン（Ｆｓｌ）及びＦタンパク質の完全長変異体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させた。可溶性タンパク質の発現レベルを、培養上清中でオクテットにより測定し、完全長変異体を、抗ＲＳＶ  Ｆ抗体（ＣＲ９５０３）を用いた細胞染色で試験し、フローサイトメトリーで分析した。平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を計算し、対照のＦ野生型（Ｆｗｔ）トランスフェクト細胞試料のＭＦＩに対して正規化した。ＦｗｔのＭＦＩを１とした。バーは平均値を意味し、エラーバーは値の範囲を表す。
【図５】Ｆタンパク質変異体の温度安定性。Ｆタンパク質の完全長変異体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞で発現させた。熱ショックを加えた後、抗ＲＳＶ  Ｆ抗体で細胞を染色し（ＣＲ９５０１−実線及びＣＲ９５０３−破線）、フローサイトメトリーで分析した。染色に対する陽性細胞のパーセンテージを測定した。記号は平均値を意味し、エラーバーは値の範囲を表す。（Ａ）染色に対する陽性細胞のパーセンテージを測定した。（Ｂ）平均蛍光強度（ＭＦＩ）値を計算し、３７Ｃ細胞試料のＭＦＩに対して正規化した。３７℃試料のＭＦＩを１とした。点線は、６０℃のバックグラウンド染色に対応する。
【図６】Ｆタンパク質の安定性。ＰｒｅＦは、熱ストレスアッセイにおいて、細胞表面上での融合前コンフォメーションでＦＡ２タンパク質よりも安定である。インサートＦＡ２（ｗｔ  ＲＳＶ  Ｆ、灰色のバー）又は融合前Ｆ安定化インサート（ｐｒｅＦ２．２、黒色のバー）を含むＡｄ２６及びＡｄ３５を、表示のＭＯＩでＡ５４９細胞に感染させた。染色前に１５分間、表示の温度で細胞を温度処理した。上：表面に融合前Ｆを示す細胞のパーセント（ＣＲ９５０１抗体により検出）；下：融合前及び融合後の任意の形態のＦタンパク質を示す細胞のパーセント（ＣＲ９５０３抗体により検出）。値は３７℃の試料に対して正規化した。全てのバーは、単一の測定値を表す。
【図７】Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１及びＦ２．２は、単回投与後、マウスに細胞性免疫応答を誘発する。横棒は、群内の応答の幾何平均を示す。バックグラウンドレベルは、非刺激脾細胞で観察されたスポット形成単位（ＳＰＵ）の９５％パーセンタイルとして計算し、点線で示す。
【図８】Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１及びＦ２．２は、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２と比べ、単回の免疫付与後、マウスにより多くのウイルス中和抗体を誘導した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群当たりｎ＝４）に、１０８〜１０１０個のウイルス粒子（ｖｐ）、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２又はＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１又はＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２を表示用量で、又は製剤緩衝液で免疫を付与し、免疫付与から８週後に単離した血清中の体液性免疫応答を測定した。（Ａ）ＥＬＩＳＡベースの読み取りを行うマイクロ中和アッセイを用いて、ＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇに対するウイルス中和抗体を決定した。力価をＩＣ５０のｌｏｇ２値として示す。（Ｂ）融合前又は融合後のＦ抗体力価をＥＬＩＳＡによって決定し、定量下限（ＬＬｏＱ）を上回る融合前及び融合後Ｆ力価を示した全ての試料について、融合前と融合後のＦ抗体の比を計算した。（Ｃ）コーティング試薬として融合後ＲＳＶ  Ｆ  Ａ２を用いてサブクラスＥＬＩＳＡを行い、ＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比（ｌｏｇ１０）をプロットする。Ｔｈ１（ＲＳＶ  Ｆ発現アデノウイルスベクターで免疫付与した動物由来の血清）及びＴｈ２（ＦＩ−ＲＳＶで免疫付与した動物由来の血清）参照試料で観察された比を破線で示す。ＬＬｏＱを点線で示し（パネルＡ）、横バーは群の平均応答を表す。
【図９】Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２は、広範囲のＲＳＶ分離株を中和する抗体応答を誘発する。ウイルス粒子（ｖｐ）が１０１０個のＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２（ｎ＝３）又はＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ（ｎ＝４）又は製剤緩衝液（ｎ＝２）で免疫付与したＢａｌｂ／ｃマウス由来の血清を、表示のＲＳＶ  Ａ株（上部パネル）及びＢ株（下部パネル）のウイルス中和アッセイ（ＥＬＩＳＡベースの読み取りを行うマイクロ中和アッセイ）で使用した。力価をＩＣ５０のｌｏｇ２値で示し、横バーは１群当たりの平均応答を表す。ＬＬｏＱは破線で示す。
【図１０】コットンラットは、低用量のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２又はＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２による単回の免疫付与により、同種ＲＳＶ  Ａ２によるチャレンジから保護される。コットンラット（シグモドン・ヒスピドゥス（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ））（１群あたりｎ＝７〜９）に、表示の用量（ｖｐ／動物）のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２（左パネル）、Ａｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２又はＡｄ３５．ＲＳＶ．ＦＡ２（右パネル）を単回筋肉投与して免疫を付与した。対照免疫付与は、製剤緩衝液、ＦＩ−ＲＳＶ、又は低用量ＲＳＶ  Ａ２の鼻腔内投与により行った。免疫付与から７週後、動物の鼻腔に１０５ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２によるチャレンジを行った。チャレンジの５日後、プラークアッセイにより肺（Ａ−Ｂ）及び鼻（Ｃ−Ｄ）のウイルス力価を決定した。（Ｅ−Ｆ）チャレンジ直前に採取した血清を使用して、ＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇ株のウイルス中和アッセイを行った（ＥＬＩＳＡベースの読み取りを行うマイクロ中和アッセイ）。点線は、定量下限（ＬＬｏＱ）を表す。横バーは群当たりの平均力価を表す。
【図１１】コットンラットにＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２又はＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２で免疫付与を行うと、ＲＳＶ  Ａ２チャレンジ後に肺胞炎のスコアは増加しない。コットンラット（シグモドン・ヒスピドゥス（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ））（１群あたりｎ＝７〜９）に、表示の用量（ｖｐ／動物）のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２（上パネル）、Ａｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２又はＡｄ３５．ＲＳＶ．ＦＡ２（下パネル）を単回筋肉内投与して免疫を付与した。対照免疫付与は、製剤緩衝液、ＦＩ−ＲＳＶ、又は低用量ＲＳＶ  Ａ２の鼻腔内投与により行った。免疫付与から７週後、動物の鼻腔に１０５ｐｆｕのＲＳＶ  Ａ２によるチャレンジを行った。チャレンジの５日後に、１つの肺葉について組織病理学検査を行い、肺胞炎を０〜４の非線形スケールでスコア付けした。水平の点線は、ＥＲＤに至らないＲＳＶへの自然曝露を再現するために、チャレンジ前にＲＳＶ−Ａ２に予め曝露した対照動物の最大スコアを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
ＲＳＶ（呼吸器合胞体ウイルス）は生涯を通じて人々に感染するが、ほとんどの人々は長期にわたる防御免疫応答を持つことができない。さらに、高齢者では、免疫応答の低下によりＲＳＶ感染後の重篤な疾患に対する感受性が増加し、罹患率及び死亡率を大きく増加させる。文献には、中和抗体及びＴ細胞媒介防御の両方がＲＳＶ感染を予防する役割を果たすことが示されている。したがって、良好なＲＳＶワクチンは、特に高齢者によって、強力な中和抗体レベルを増加させ、強力なＴ細胞応答を誘導すると考えられる。
【００１６】
ＲＳＶ感染は、主に融合（Ｆ）タンパク質に対するウイルス特異的抗体を誘導する。ヒト血清中で見出された最も強力なＲＳＶ中和抗体は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質上の特定の部位（Φ部位又はゼロ部位）に結合するが、この部位はＲＳＶタンパク質がその融合前コンフォメーションにある場合にのみ露出され、このことがこの特定のコンフォメーションをワクチン抗原とし非常に魅力的なものにしている。しかしながら、その融合前コンフォメーションにあるＦタンパク質は非常に不安定であり、融合後コンフォメーションへの主要なコンフォメーションシフトを容易に受ける。
【００１７】
本発明につながった研究では、ＲＳＶ  Ａ２株（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣＯ８３３０１．１）由来の野生型ＲＳＶ  Ｆ抗原と比較して、特有のアミノ酸変異を有する安定化ＲＳＶ  Ｆタンパク質が調製された。融合前特異抗体へのインビトロでの特異的結合を示すことによって、融合前コンフォメーションの安定化ＲＳＶ  Ｆ抗原が実際に得られたことが示された。
【００１８】
本発明によれば、安定化ＲＳＶ  Ｆタンパク質がインビボでその融合前コンフォメーションを維持し、免疫原性であり、そしてそれを必要とするヒト対象に安全に投与され得ることが今や示された。
【００１９】
したがって、本発明によれば、それを必要とするヒト対象にＲＳＶに対する安全な免疫応答を誘導する方法であって、配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質をコードする核酸を含む組換えアデノウイルス、及び薬学的に許容される担体を含む組成物をその対象に、約１×１０１０〜約２×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）のアデノウイルスの総用量で投与することを含む方法が提供される。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする対象において呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する安全な免疫応答を誘導する方法に使用するための、配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質をコードする核酸を含む組換えアデノウイルス、及び薬学的に許容される担体を含む、総用量が約１×１０１０〜約２×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）のワクチン組成物を提供する。
【００２１】
本発明の特定の実施形態では、組成物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質をコードする核酸を含む組換えアデノウイルス、及び薬学的に許容される担体を、アデノウイルスの総用量が約５×１０１０〜約１×１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）で含む。
【００２２】
特定の実施形態では、用量はアデノウイルスが約５×１０１０又は約１×１０１１ｖｐである。
【００２３】
本発明によれば、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質（特に、配列番号１のＲＳＶ  Ｆタンパク質）をコードするアデノウイルスは、高い免疫原性を有することが示された。融合前コンフォメーションで安定化されず、発現の際に融合後コンフォメーションに素早く移行する可能性のある野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする同用量のアデノウイルスと比較して、体液性免疫応答が増加する。
【００２４】
特定の実施形態では、免疫応答はＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する抗体の誘導を含む。したがって、特定の実施形態によれば、免疫応答は、ＥＬＩＳＡによる測定で、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合する抗体の誘導を含む。
【００２５】
特定の実施形態では、免疫応答はＲＳＶ中和抗体の誘導を含む。特定の実施形態では、中和抗体はＲＳＶ  Ａ株及びＲＳＶ  Ｂ株を中和することができる。特定の実施形態では、免疫応答は、ＶＮＡアッセイにおいてＲＳＶ  Ａ株及びＲＳＶ  Ｂ株を中和することができる抗体の誘導を含む。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「抗体の誘導」は、配列番号１のＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現する組換えアデノウイルスを含む組成物の投与後に測定される抗体のレベルが、前記該組成物の投与前の抗体のレベルより高いことを意味する。
【００２７】
特定の実施形態では、免疫応答は、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的な抗体、及び融合後コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的な抗体の誘導を含み、但し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）において、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的な抗体の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）の増加は、融合後コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的な抗体のＧＭＴの増加よりも大きい。したがって、本発明の方法では、融合後コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合する抗体と比較して、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合する抗体をより増加させる。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、融合前特異的抗体はＲＳＶウイルスの中和においてより有効であり、それによってＲＳＶ感染の予防により有効であると考えられるので、これはより効果的な免疫応答をもたらすと考えられる（Ｇｉｌｍａｎ  ＭＳ、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏｓ  ＣＡ、Ｃｈｅｎ  Ｍ、Ｎｇｗｕｔａ  ＪＯ、Ｇｏｏｄｗｉｎ  Ｅ、Ｍｏｉｎ  ＳＭ、Ｍａｓ  Ｖ、Ｍｅｌｅｒｏ  ＪＡ、Ｗｒｉｇｈｔ  ＰＦ、Ｇｒａｈａｍ  ＢＳ、ＭｃＬｅｌｌａｎ  ＪＳ、Ｗａｌｋｅｒ  ＬＭ．Ｓｃｉ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６  Ｄｅｃ  １６；１（６）．ｐｉｉ：ｅａａｊ１８７９．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｉｍｍｕｎｏｌ．ａａｊ１８７９．Ｅｐｕｂ  ２０１６  Ｄｅｃ  ９．Ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ＲＳＶ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｅｍｏｒｙ  Ｂ  ｃｅｌｌｓ  ｏｆ  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ａｄｕｌｔ  ｄｏｎｏｒｓ）。特定の実施形態では、ＥＬＩＳＡで測定される融合後Ｆ特異的抗体のＧＭＴ増加と、ＶＮＡアッセイで測定される中和抗体の幾何平均抗体価の増加との間の比は、前記組成物の投与前の前記比と比較して、前記組成物の投与後に減少する。したがって、本発明の方法は、結合抗体よりも中和抗体に有利なＲＳＶ特異的体液性応答のより好ましい組成物をもたらす。
【００２８】
特定の実施形態では、免疫応答は、配列番号１のＦタンパク質をカバーするペプチドプールでの刺激に応答してＩＦＮｙ  ＥＬＩＳＰＯＴで測定されるＩＦＮガンマ産生Ｔ細胞によって示されるような細胞応答、並びに／又は配列番号１のＲＳＶ  Ｆタンパク質をカバーするペプチドプールでの刺激後の細胞内染色（ＩＣＳ）によるＩＦＮγ、ＩＬ−２及びＴＮＦαを発現するＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞サブセットの測定によって示されるような細胞応答をさらに含む。ＲＳＶ特異的Ｔ細胞は感染の予防を支援し、疾患を抑えることができることが示唆されており、このことは、細胞応答が年齢と共に減少し得ることが報告されているので、高齢者にとっては特に有益であろう（Ｏｐｅｎｓｈａｗ  ＰＪＭ，Ｃｈｉｕ  Ｃ，Ｃｕｌｌｅｙ  ＦＪ，Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ  Ｃ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１７  Ａｐｒ  ２６；３５：５０１−５３２．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ−ｉｍｍｕｎｏｌ−０５１１１６−０５２２０６．Ｅｐｕｂ  ２０１７  Ｆｅｂ  ６．Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｍｆｕｌ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｏ  ＲＳＶ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）。
【００２９】
安全で且つ免疫原性の免疫応答を誘導することによって、本発明の方法は、入院に至る重篤な下気道疾患を予防し、対象におけるＲＳＶ感染及び複製による肺炎及び細気管支炎のような合併症の頻度を減少させるために使用され得る。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、核酸、核酸分子、核酸又はヌクレオチド配列、及びポリヌクレオチドという用語は、同義で使用され、いずれも、ＤＮＡ及びＲＮＡを含むヌクレオチドから作られる線状生体高分子（鎖）を指す。多数の異なる核酸分子が、遺伝子コードの縮重の結果として、同じポリペプチドをコードし得ることは、当業者に理解されている。また、当業者がルーチンの手法を用いて、記述されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行って、ポリペプチドが発現する任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映し得ることも理解されている。したがって、特記されない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸配列」には、互いの縮重型であり、且つ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質をコード化するヌクレオチド配列及びＲＮＡは、イントロンを含み得る。本明細書の配列は、当該技術分野における慣習として、５’から３’の方向に示される。
【００３１】
特定の実施形態では、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質をコードする核酸分子は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞での発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化の方法は知られており、既に報告されている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。好ましい実施形態では、ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質をコードする核酸分子は、配列番号２の核酸配列を含む。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸は、配列番号２の核酸配列からなる。
【００３２】
本発明によれば、それを必要とする対象は、ヒト対象である。好ましくは、対象は、高齢の対象、すなわち６０歳以上のヒトである。本発明によれば、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を含む組換えアデノウイルスの投与は安全で且つ免疫原性がある、すなわち免疫系の働きが低下している可能性のある高齢の対象においても、強力な体液性及び細胞性応答を生じることが示された。
【００３３】
特定の実施形態では、組換えアデノウイルス（アデノウイルスベクターとも呼ばれる）は、ヒト組換えアデノウイルスである。組換えアデノウイルスベクターの調製は、当該技術分野でよく知られている。本明細書で使用される、アデノウイルスに関する用語「組換え」は、アデノウイルスが人為的に改変されていること、例えば、その中に能動的にクローン化された改変末端を有し、且つ／又は異種遺伝子を含む、すなわち、天然に存在する野生型アデノウイルスではないことを含意する。
【００３４】
特定の実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域、例えばＥ１ａ領域及び／又はＥ１ｂ領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスは、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。特定の実施形態では、アデノウイルスは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能と、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。アデノウイルスベクターは、「多重欠損」であり得、これはアデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれにおいて、１つ以上の必須遺伝子機能が欠損していることを意味する。例えば、前述のＥ１−欠損又はＥ１−、Ｅ３−欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子、及び／又はＥ２領域の少なくとも１つの必須遺伝子（例えば、Ｅ２Ａ領域及び／又はＥ２Ｂ領域）がさらに欠損していてよい。
【００３５】
特定の実施形態では、アデノウイルスはセロタイプ２６又は３５のヒトアデノウイルスである。これらのセロタイプに基づく本発明のワクチンは、先行技術に記載されている、Ａｄ５に基づいたものより強力であると思われる。というのも、これらは単回筋肉内投与後にＲＳＶチャレンジの複製に対する完全な防御を提供できなかったからである（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ，２０１０，Ｖａｃｃｉｎｅ  ２８：３８０１−３８０８；Ｋｏｈｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，２００９，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ８３：１２６０１−１２６１０；Ｋｒａｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１１，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ８：３７５）。本発明のセロタイプは、一般に、ヒト集団において低い血清陽性率、及び／又は低い既存の中和抗体力価をさらに有する。異なる導入遺伝子を有する、これらのセロタイプの組換えアデノウイルスベクターは、臨床試験において評価されており、これまでのところ、卓越した安全性プロファイルを有することが示されている。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレット及びＡｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００７）Ｖｉｒｏｌ  ８１（９）：４６５４−６３に記載されている。Ａｄ２６のゲノム配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＦ１５３４７４及び国際公開第２００７／１０４７９２号パンフレットの配列番号１の中に見出される。ｒＡｄ３５ベクターの調製については、例えば、米国特許第７，２７０，８１１号明細書、国際公開第００／７００７１号パンフレット、及びＶｏｇｅｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７７（１５）：８２６３−７１に記載されている。Ａｄ３５のゲノム配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣ＿００００１９、及び国際公開第００／７００７１号パンフレットの図６の中に見出される。
【００３６】
本発明による組換えアデノウイルスは、複製コンピテント又は複製欠損であり得る。特定の実施形態では、アデノウイルスは複製欠損であり、例えば、これはこのアデノウイルスがゲノムのＥ１領域に欠失を含むためである。当業者に知られているように、アデノウイルスゲノムからの必須領域の欠失の場合、これらの領域でコード化された機能は、好ましくはプロデューサー細胞によってトランスに提供される必要がある。すなわちＥ１、Ｅ２及び／又はＥ４領域の一部又は全部がアデノウイルスから欠失した場合、これらはプロデューサー細胞内に、例えばそのゲノムに組み込まれて、又はいわゆるヘルパーアデノウイルス若しくはヘルパープラスミドの形態で存在する必要がある。アデノウイルスは、Ｅ３領域内の欠失も有し得るが、これは複製に不要であるため、そのような欠失は補完される必要がない。
【００３７】
Ａｄ３５（亜群Ｂ）又はＡｄ２６（亜群Ｄ）など、亜群ＣでないＥ１欠損アデノウイルスについては、これらの亜群ＣでないアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６コード配列を、Ａｄ５などの亜群ＣのアデノウイルスのＥ４−ｏｒｆ６と交換することが好ましい。これにより、例えば、２９３細胞又はＰＥＲ．Ｃ６細胞などの、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現する、よく知られた補完細胞株内で、そうしたアデノウイルスの増殖が可能になる（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；国際公開第０３／１０４４６７号パンフレット（これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）。特定の実施形態では、使用することができるアデノウイルスは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗原をコードする核酸がクローニングされている、Ｅ１領域中に欠失を有し、且つＡｄ５のＥ４  ｏｒｆ６領域を有する、セロタイプ３５のヒトアデノウイルスである。特定の実施形態では、本発明のワクチン組成物中のアデノウイルスは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗原をコードする核酸がクローニングされている、Ｅ１領域中に欠失を有し、且つＡｄ５のＥ４  ｏｒｆ６領域を有する、セロタイプ２６のヒトアデノウイルスである。
【００３８】
代替の実施形態では、アデノウイルスベクター中に異種Ｅ４ｏｒｆ６領域（例えば、Ａｄ５の）を配置する必要はないが、代わりに、Ｅ１欠失の亜群ＣでないベクターをＥ１及び両立可能なＥ４ｏｒｆ６の両者を発現する細胞株、例えば、Ａｄ５からＥ１及びＥ４ｏｒｆ６の両方を発現する２９３−ＯＲＦ６細胞株中で増殖させる（例えば、２９３−ＯＲＦ６細胞の生成について記載があるＢｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０：６４９７−５０１；そのような細胞株を用いて、Ｅ１欠失の亜群Ｃでないアデノウイルスベクターの生成についてそれぞれ記載があるＡｂｒａｈａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１：８９４６−５１及びＮａｎ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １０：３２６−３６を参照）。
【００３９】
或いは、増殖させるべきセロタイプ由来のＥ１を発現する補完細胞を使用することができる（例えば、国際公開第００／７００７１号パンフレット、国際公開第０２／４０６６５号パンフレットを参照）。
【００４０】
Ｅ１領域に欠失を有するＡｄ３５などの亜群Ｂアデノウイルスでは、例えば、ｐＩＸ開始コドンのすぐ上流の２４３ｂｐ断片（Ａｄ３５ゲノム中のＢｓｕ３６Ｉ制限部位によって５’末端で標識される）などの、ｐＩＸオープンリーディングフレームのすぐ上流の１６６ｂｐ又はこれを含む断片など、アデノウイルスのＥ１Ｂ  ５５Ｋオープンリーディングフレームの３’末端を保持することが好ましいが、これはｐＩＸ遺伝子のプロモーターがこの領域に部分的に存在することから、アデノウイルスの安定性を高めるためである（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；国際公開第２００４／００１０３２号パンフレット（これらは参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。
【００４１】
配列番号１のＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸は、例えば、標準的な分子生物学的手法によってアデノウイルスに導入することができる。これは、例えば、アデノウイルスベクターの欠失Ｅ１又はＥ３領域にクローン化され得る。核酸（又は導入遺伝子）は、一般に、発現制御配列と作動可能に連結される。これは、例えば、ＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸をプロモーターの制御下に置くことで実施され得る。さらなる調節配列を加えることもできる。導入遺伝子の発現のために、多数のプロモーターを使用することができ、それらは当業者に知られている。真核細胞内での発現を得るのに適したプロモーターの非限定的な例として、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，３８５，８３９号明細書）、例えばＣＭＶ最初期プロモーター、例えばＣＭＶ最初期遺伝子エンハンサー／プロモーターからのｎｔ．−７３５〜＋９５を含むものが挙げられる。ポリアデニル化シグナル、例えばウシ成長ホルモンのポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号明細書）を導入遺伝子の後に存在させることができる。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明の組換えアデノベクターは、５’末端ヌクレオチドとしてヌクレオチド配列ＣＴＡＴＣＴＡＴを含む。これらの実施形態は、元の５’末端配列（一般に、ＣＡＴＣＡＴＣＡ）を有するベクター（また、国際公開第２０１３／１３５６１５号パンフレット及び米国特許第８，９３２，６０７号明細書（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照）と比較して、そのようなベクターは生産プロセスにおいて改良された複製を示し、改良された均質性を有するアデノウイルスのバッチを生じるので有利である。
【００４３】
特定の実施形態では、組換えアデノウイルスを含む組成物は、１つ以上のアジュバントをさらに含むか、又は一緒に投与される。アジュバントは、適用される抗原決定基に対する免疫応答をさらに増大させることが当該技術分野で知られており、アデノウイルス及び好適なアジュバントを含む医薬組成物は、例えば、国際公開第２００７／１１０４０９号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。「アジュバント」及び「免疫刺激剤」という用語は、本明細書では同義的に使用され、免疫系の刺激を引き起こす１種又は複数種の物質と定義される。これに関連して、アジュバントは、本発明のＲＳＶ融合前Ｆタンパク質に対する免疫応答を増強するために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸アルミニウム塩などのアルミニウム塩；ＭＦ５９などのスクアレン−水エマルションをはじめとする油エマルション組成物（又は水中油型組成物）（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；例えば、ＱＳ２１及び免疫賦活性錯体（ＩＳＣＯＭＳ）などのサポニン製剤（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書；国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照）；その例が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴなどである、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰリボース化細菌毒素又はそれらの変異体などの細菌又は微生物派生物が挙げられる。また、例えば、Ｃ４−結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー化ドメインと目的の抗原との融合物をコードする異種核酸を使用することにより、ベクターにコードされたアジュバントを使用することも可能である（例えば、Ｓｏｌａｂｏｍｉ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７６：３８１７−２３）。特定の実施形態では、本発明の組成物は、例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カリウムアルミニウム、又はそれらの組み合わせの形態のアルミニウムを、１用量当たり０．０５〜５ｍｇ、例えば０．０７５〜１．０ｍｇのアルミニウム含有量となる濃度で、アジュバントとして含む。
【００４４】
組成物の投与は、標準的な投与経路を用いて行うことができる。非限定的な実施形態は、注射などによる非経口投与、例えば皮内、筋内など、又は皮下、経皮、又は粘膜投与、例えば鼻腔内、経口などを含む。鼻腔内投与は、一般に、ＲＳＶに対するワクチンの好ましい経路と見なされている。生鼻腔内法の最も重要な利点は、局所呼吸器免疫の直接刺激及び付随する疾患増強の欠如である。鼻腔内投与は、本発明によれば同様に適切な好ましい経路である。筋内投与の利点は、簡単で且つ十分に確立されていることである。本発明の一実施形態では、組成物は、例えば、腕の三角筋、又は大腿の外側広筋への筋肉内注射によって投与される。当業者は、ワクチン中の抗原に対する免疫応答を誘導するために、組成物、例えばワクチンを投与する様々な可能性を認識している。
【００４５】
組換えアデノウイルスは、アデノウイルスで感染させた宿主細胞の細胞培養を含む、よく知られた方法に従って宿主細胞内で調製及び増殖され得る。細胞培養は、付着細胞培養、例えば培養容器の表面又はマイクロキャリアに付着した細胞、及び懸濁培養を含む、いかなるタイプの細胞培養であってもよい。
【００４６】
大抵の大規模懸濁培養は、操作及びスケールアップが最も簡単であるため、バッチ法又は流加法として操作される。最近、灌流原理に基づいた連続法がより一般的となり始め、好適でもある（例えば、国際公開第２０１０／０６０７１９号パンフレット及び国際公開第２０１１／０９８５９２号パンフレットを参照。これらには大量の組換えアデノウイルスの獲得及び精製に好適な方法が記載されており、いずれも参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４７】
プロデューサー細胞は培養されて、細胞及びウイルスの数、並びに／又はウイルス力価を増大させる。細胞の培養は、本発明による目的ウイルスの代謝、及び／又は成長、及び／又は分裂、及び／又は生成を可能にするように行われる。これは、当業者によく知られた方法により達成することができ、限定はされないが、例えば適切な培養培地中で細胞に栄養素を供給することを含む。好適な培養培地は当業者によく知られており、一般に、商業的供給源から大量に得られ、又は標準的なプロトコルに従ってカスタムメイドすることができる。培養は、例えば、バッチ、流加、連続系などを使用して、シャーレ、ローラーボトル又はバイオリアクター内で行うことができる。細胞を培養するための好適な条件は知られている（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｋｒｕｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｔｅｒｓｏｎ，ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）、及びＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｂａｓｉｃ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ  Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ  ０−４７１−３４８８９−９を参照）。
【００４８】
使用することができるプロデューサー細胞（当該技術分野及び本明細書では、「パッケージング細胞」又は「補完細胞」又は「宿主細胞」と呼ばれることがある）は、所望のアデノウイルスを増殖させることができればいかなるプロデューサー細胞であってよい。例えば、組換えアデノウイルスベクターの増殖は、アデノウイルス内の欠損を補完するプロデューサー細胞内で行われる。このようなプロデューサー細胞は、好ましくはそれらのゲノム内に少なくとも１つのアデノウイルスＥ１配列を有し、それによりＥ１領域内に欠失を有する組換えアデノウイルスを補完することができる。Ｅ１を補完する任意のプロデューサー細胞、例えば、Ｅ１により不死化されたヒト網膜細胞、例えば９１１細胞又はＰＥＲ．Ｃ６細胞（米国特許第５，９９４，１２８号明細書を参照）、Ｅ１で形質転換された羊膜細胞（欧州特許第１２３０３５４号明細書を参照）、Ｅ１で形質転換されたＡ５４９細胞（例えば、国際公開第９８／３９４１１号パンフレット、米国特許第５，８９１，６９０号明細書を参照）、ＧＨ３２９：ＨｅＬａ（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：２１３−２１９）、２９３などを使用することができる。特定の実施形態では、プロデューサー細胞は、例えばＨＥＫ２９３細胞、又はＰＥＲ．Ｃ６細胞、又は９１１細胞、又はＩＴ２９３ＳＦ細胞などである。
【００４９】
通常、アデノウイルスは、培養物中の適切なプロデューサー細胞に暴露され、ウイルスが取り込まれる。通常、最適な撹拌は約５０〜３００ｒｐｍ、典型的には約１００〜２００、例えば約１５０であり、典型的なＤＯは２０〜６０％、例えば４０％であり、最適ｐＨは６．７〜７．７であり、最適温度は３０〜３９℃、例えば３４〜３７℃であり、最適ＭＯＩは５〜１０００、例えば約５０〜３００である。典型的には、アデノウイルスはプロデューサー細胞に自然に感染し、細胞を感染させるのには、プロデューサー細胞をｒＡｄ粒子と接触させれば十分である。一般に、アデノウイルスのシードストックを培養液に加えて感染を開始させ、その後、アデノウイルスはプロデューサー細胞内で増殖する。これらは全て当業者にはルーチン的である。
【００５０】
アデノウイルスの感染後、ウイルスは細胞内で複製し、それにより増幅され、このプロセスは、本明細書ではアデノウイルスの増殖と称される。アデノウイルス感染は最終的には、感染した細胞の溶解をもたらす。したがってアデノウイルスの溶解特性はウイルス産生の２つの異なるモードを可能にする。第１のモードは、細胞を溶解するのに外部因子を使用し、細胞溶解に先立ってウイルスを回収することである。第２のモードは、生成されたウイルスによって（殆ど）完全に細胞が溶解した後に、ウイルス上清を回収することである（例えば、外部因子によって宿主細胞を溶解しないアデノウイルスの回収を記載している米国特許第６，４８５，９５８号明細書を参照）。外部因子を使用して、細胞を積極的に溶解してアデノウイルスを回収することが好ましい。
【００５１】
積極的な細胞溶解に使用することができる方法は、当業者に知られており、例えば、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．２８−３５に論じられている。これに関する有用な方法は、例えば、凍結融解、固体せん断、高張及び／又は低張溶解、液体せん断、超音波処理、高圧押出、洗浄剤溶解、上記の組み合わせなどである。本発明の一実施形態では、細胞は、少なくとも１種の洗浄剤を使用して溶解する。溶解のための洗浄剤の使用は、方法が容易であること、及び容易に拡大可能であることの利点を有する。
【００５２】
使用できる洗浄剤、及びその使用方法は、一般に当業者に知られている。いくつかの例が、例えば、国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ２９−３３で論じられている。洗浄剤としては、陰イオン性、陽イオン性、双性イオン性及び非イオン性洗浄剤を挙げることができる。洗浄剤の濃度は、例えば約０．１％〜５％（ｗ／ｗ）の範囲内で変動してもよい。一実施形態では、使用する洗浄剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００５３】
ヌクレアーゼを使用して、混入核酸、すなわち、ほとんどがプロデューサー細胞由来の核酸を除去することができる。本発明での使用に好適なヌクレアーゼの例としては、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）、Ｐｕｌｍｏｚｙｍｅ（登録商標）、又は当該技術分野内で一般に使用されている任意のその他のＤＮａｓｅ及び／又はＲＮａｓｅが挙げられる。好ましい実施形態では、ヌクレアーゼはＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）であり、これは特定のヌクレオチド間の内部リン酸ジエステル結合の加水分解によって核酸を迅速に加水分解し、それにより細胞溶解産物の粘度を低下させる。Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）は、Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡから商業的に入手し得る（コードＷ２１４９５０）。ヌクレアーゼが使用される濃度は、好ましくは１〜１００単位／ｍｌの範囲内である。ヌクレアーゼ処理の代替として、又はヌクレアーゼ処理に加えて、アデノウイルスの精製中に、ドミフェン臭化物などの選択的沈澱剤を使用して、アデノウイルス調製物から宿主細胞ＤＮＡを選択的に沈殿除去することも可能である（例えば、米国特許第７，３２６，５５５号明細書；Ｇｏｅｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｖｏｌ．９１：１２−２１；国際公開第２０１１／０４５３７８号パンフレット；国際公開第２０１１／０４５３８１号パンフレットを参照）。
【００５４】
プロデューサー細胞の培養物からアデノウイルスを回収する方法は、国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレットに広範に記載されている。
【００５５】
特定の実施形態では、回収されたアデノウイルスは、さらに精製される。アデノウイルスの精製は、数工程で行うことができ、例えば国際公開第０５／０８０５５６号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている清澄化、限外ろ過、ダイアフィルトレーション又はクロマトグラフィーを用いた分離を含む。清澄化は、ろ過工程により行うことができ、細胞溶解物から細胞デブリ及び他の不純物を除去する。限外ろ過は、ウイルス溶液の濃縮に使用される。限外ろ過装置を使用するダイアフィルトレーション、又は緩衝液交換は、塩、糖などの除去及び交換のための一方法である。当業者は、各精製工程の最適な条件を見出す方法を知っている。国際公開第９８／２２５８８号パンフレット（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）も、アデノウイルスベクターの生成及び精製方法を記載している。これらの方法は、宿主細胞を成長させ、この宿主細胞をアデノウイルスで感染させ、この宿主細胞を回収及び溶解し、粗溶解物を濃縮し、粗溶解物の緩衝液を交換し、この溶解物をヌクレアーゼで処理し、クロマトグラフィーを用いてウイルスをさらに精製することを含む。
【００５６】
好ましくは、精製には、例えば国際公開第９８／２２５８８号パンフレット、ｐ．６１−７０に論じられているように、少なくとも１つのクロマトグラフィー工程が使用される。アデノウイルスのさらなる精製に関して多数のプロセスが記載されており、当該プロセスにはクロマトグラフィー工程が含まれている。当業者は、これらのプロセスを知っており、プロセスを最適化するために、クロマトグラフ工程の厳密な使用法を変更することができる。例えば、アニオンイオン交換クロマトグラフィー工程によりアデノウイルスを精製することが可能であり、例えば、国際公開第２００５／０８０５５６号パンフレット、及びＫｏｎｚ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １６：１３４６−１３５３を参照されたい。多数の他のアデノウイルス精製方法が報告されており、これらは当業者の手の届く範囲にある。アデノウイルスを生成及び精製するさらなる方法は、例えば（国際公開第００／３２７５４号パンフレット；国際公開第０４／０２０９７１号パンフレット；米国特許第５，８３７，５２０号明細書；米国特許第６，２６１，８２３号明細書；国際公開第２００６／１０８７０７号パンフレット；Ｋｏｎｚ  ｅｔ  ａｌ，２００８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ４３４：１３−２３；Ａｌｔａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ，２００５，Ａｄｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｅｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ９９：１９３−２６０）に開示されており、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【００５７】
ヒトに投与するために、本発明は、組換えアデノウイルスと薬学的に許容される担体又は賦形剤含む医薬組成物を用い得る。この場合、「薬学的に許容される」という用語は、担体又は賦形剤が、使用する投与量及び濃度で、それらを投与する対象に望ましくない影響も悪影響も何ら引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体及び賦形剤は、当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照）。精製された組換えアデノウイルスは、好ましくは滅菌溶液として処方されて投与されるが、凍結乾燥製剤を利用することも可能である。滅菌溶液は、滅菌ろ過又は当該技術分野でそれ自体知られている他の方法によって調製される。その後、溶液は凍結乾燥されるか、又は医薬投与容器に充填される。溶液のｐＨは、一般にｐＨ３．０〜９．５、例えばｐＨ５．０〜７．５の範囲内である。組換えアデノウイルスは、通常、好適な薬学的に許容される緩衝剤を含む溶液中にあり、組換えアデノウイルスの溶液は塩を含有することもある。任意選択により、アルブミンなどの安定剤が含まれる。特定の実施形態では、洗浄剤が添加される。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは注射用調製物として製剤してもよい。これらの製剤は有効量のアデノウイルスｒＡｄを含み、滅菌液体溶液、液体懸濁液又は凍結乾燥バージョンのいずれかであり、任意選択により安定剤又は賦形剤を含有する。アデノウイルスワクチンはまた、鼻腔内投与用にエアロゾル化されてもよい（例えば、国際公開第２００９／１１７１３４号パンフレットを参照）。
【００５８】
例えば、アデノウイルスは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  Ｗｏｒｌｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｈｏｇａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｓｔａｂｌｅ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｍａｒｃｈ  ２００２，ｐ．４３−４８）にも使用される緩衝液：２０ｍＭ  トリス  ｐＨ８、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５％グリセロール中に保存することができる。ヒトへの投与に好適な他の有用な製剤緩衝液は、２０ｍＭのトリス、２ｍＭのＭｇＣｌ２、２５ｍＭのＮａＣｌ、１０％ｗ／ｖのスクロース、０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０である。他の多くの緩衝液を使用できることは明らかであり、保存、及び精製（アデノ）ウイルス調製物の医薬品としての投与に好適な製剤の例は、例えば欧州特許第０８５３６６０号明細書、米国特許第６，２２５，２８９号明細書、及び国際特許出願の国際公開第９９／４１４１６号パンフレット、国際公開第９９／１２５６８号パンフレット、国際公開第００／２９０２４号パンフレット、国際公開第０１／６６１３７号パンフレット、国際公開第０３／０４９７６３号パンフレット、国際公開第０３／０７８５９２号パンフレット、国際公開第０３／０６１７０８号パンフレットに見出すことができる。
【００５９】
本発明の特定の実施形態では、国際公開第２０１５／０４０００２号パンフレットに記載のアデノウイルス製剤が使用される。したがって、好ましい実施形態では、配列番号１のＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする核酸を含むアデノウイルスベクターを含む組成物は、組換えアデノウイルスに加えて、クエン酸緩衝液（ここで、クエン酸濃度は約５ｍＭ〜３０ｍＭの範囲である）；ヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン（ＨＢＣＤ）（ここで、ＨＢＣＤの濃度は約１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲である）；塩（例えば、約２０ｍＭ〜約２００ｍＭの濃度の塩化ナトリウム）；及び非イオン性洗浄剤（例えば、約０．００５％（ｗ／ｗ）〜約０．５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のポリソルベート−８０）を含み、前記製剤は、５．５〜６．５の範囲のｐＨを有する。
【００６０】
特定の実施形態では、組成物は、約５．７〜６．３の範囲のｐＨを有し、約５〜３０ｍＭの範囲の濃度のクエン酸塩；１％（ｗ／ｗ）〜１０％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のＨＢＣＤ；２０ｍＭ〜２００ｍＭの範囲の濃度のＮａＣｌ；約０．０１％（ｗ／ｗ）〜０．０５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度のポリソルベート−８０を含む。
【００６１】
特定の実施形態では、組成物は、約１５ｍＭの濃度のクエン酸塩；約５％（ｗ／ｗ）の濃度のＨＢＣＤ；約７５ｍＭの濃度のＮａＣｌ及び約０．０３％（ｗ／ｗ）の濃度のポリソルベート−８０を含む。
【００６２】
特定の実施形態では、組成物は、エタノールをさらに含み、そのエタノール濃度は約０．１％（ｗ／ｗ）〜１％（ｗ／ｗ）の範囲である。
【００６３】
好ましい実施形態では、組成物は、約１５ｍＭの濃度のクエン酸塩；約５％（ｗ／ｗ）の濃度のＨＢＣＤ；約７５ｍＭの濃度のＮａＣｌ、約０．０３％（ｗ／ｗ）の濃度のポリソルベート−８０及び約０．４％（ｗ／ｗ）の濃度のエタノールを含む。
【００６４】
以下の非限定的な実施例で本発明をさらに説明する。
【実施例】
【００６５】
実施例１．ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションでの安定化
塩基性ＲＳＶ  Ｆ配列をコードするプラスミドを合成し、部位特異的変異誘発によりアミノ酸置換をタンパク質に導入した。タンパク質変異体を、ＨＥＫ２９３細胞内で一時的に発現させた。細胞表面上の相対的なタンパク質発現を、フローサイトメトリーによって評価した。融合前コンフォメーションでのＦタンパク質の安定性を、熱安定性アッセイで評価した。
【００６６】
ＲＳＶ  Ａ２  Ｆタンパク質変異体に使用したタンパク質配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＣＯ８３３０１．１から読み出した。アミノ酸置換を部位特異的変異誘発によって配列に導入した（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ  ＩＩ  ＸＬ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ、Ａｇｉｌｅｎｔ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）。変異誘発プライマーを、オンラインツールＰｒｉｍｅｒＸを用いて設計した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＣＲＬ−１１２６８）をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入し、標準的な細胞培養条件下（３７℃、１０％ＣＯ２）で培養した。
【００６７】
完全長ヒトＩｇＧ１抗ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗体ＣＲ９５０１及びＣＲ９５０３を、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）可変領域を単一のＩｇＧ１発現ベクターにクローニングすることによって構築した。ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）をＩｇＧ１発現コンストラクトでトランスフェクトし、ＰＯＲＯＳ  Ｍａｂｃａｐｔｕｒｅ  Ａクロマトグラフィー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、培養物上清からの発現抗体を精製し、その後、緩衝液を５０ｍＭ  ＮａＡｃ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５に交換した。抗体濃度を２８０ｎｍでの光吸収によって測定した。抗体の質も、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び等電点電気泳動によって確認した。抗体ＣＲ９５０１は、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質に特異的に結合し、融合後コンフォメーションには結合しない５８Ｃ５（ＷＯ２０１１／０２００７９に記載されているような）のＶＨ及びＶＬ領域を含む。ＣＲ９５０３は、ＲＳＶ  Ｆの融合前及び融合後コンフォメーションの両方を認識するモタビズマブのＶＨ及びＶＬ領域を含む。
【００６８】
タンパク質の発現及び温度処理：
供給業者の推奨に従って２９３ｆｅｃｔｉｎｅ（カタログ番号１２３４７−０１９）トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用し、接着性ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にプラスミドを一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後、ＥＤＴＡ含有ＦＡＣＳ緩衝液（トリプシン含まず、次の節を参照）で剥離することによって細胞を回収し、温度安定性実験のために、水浴又はＰＣＲブロックで１０分間、細胞懸濁液を熱処理した。熱処理後、細胞をフローサイトメトリー分析のために調製した。
【００６９】
アデノ発現Ｆタンパク質の分析のために、Ａｄ２６ウイルスを１００００又は５０００ＭＯＩで、またＡｄ３５ウイルスを５０００、２５００又は１２５０ＭＯＩで、Ａ５４９細胞に感染させた。４８時間後、細胞を剥離し、３７℃、５０℃及び５６℃で１５分間熱処理した。熱処理終了後、ＣＲ９５０１−Ａｌｅｘａ６４７又はＣＲ９５０３−Ａｌｅｘａ６４７及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を用いて細胞を染色した。染色後、細胞を固定し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ  ＩＩ細胞分析器を用いて分析した。
【００７０】
フローサイトメトリー分析：
それぞれの染色には、以下の対照を含めた：１）陰性対照試料。すなわち、いかなる処理にも供されず、フルオロフォアで標識されたいかなる抗体でも染色されなかった細胞；２）陽性対照試料、すなわち、１つのフルオロフォア（実験のために使用されるものの１つ）でのみ染色された細胞。
【００７１】
細胞をフローサイトメトリー（ＦＣ緩衝液、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ＰＢＳ中１％ＦＢＳ）に再懸濁し、蓋付き９６ウェルプレート（Ｕ底又はＶ底プレート）に１ウェルあたり５０μｌの体積の細胞懸濁液を分配した。２段階又は１段階の手順で染色した。
【００７２】
２段階手順の場合、５０μｌの第１のＡｂ（又は陰性対照では緩衝液）をウェルに添加し、ＲＴで３０分間インキュベートした。ビオチン化ＣＲ９５０１及びＣＲ９５０３を２μｇ／ｍｌで使用した（ウェル中の最終濃度は１μｇ／ｍｌ）。インキュベーション後、ＦＣ緩衝液で細胞を２回洗浄した。その後、５０μｌのストレプトアビジン−ＡＰＣ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓカタログ番号ＳＡ１００５、０．１ｍｇ／ｍｌを１：１００で使用）又は陰性対照では緩衝液をウェルに添加し、ＲＴで３０分間インキュベートした。インキュベーション後、再度、ＦＣ緩衝液で細胞を２回洗浄した。最後の洗浄後、細胞を１００μｌのＦＣ緩衝液＋／−ライブ−デッド染色液（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎからのＰＩ、カタログ番号Ｐ１３０４ＭＰ、２μｇ／ｍｌで使用）に再懸濁し、ＲＴで１５分間インキュベートした。細胞を２００Ｇ（１０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離し、ＰＩを含む緩衝液を除去し、１５０μｌのＦＣ緩衝液に細胞を再懸濁させた。
【００７３】
１段階手順の場合、製造業者の使用説明書に従って、ＣＲ９５０１及びＣＲ９５０３抗体を蛍光プローブＡｌｅｘａ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ａ−２０１８６）で標識した。ストレプトアビジン−ＡＰＣ工程を除いて、細胞を上記手順に従って染色した。
【００７４】
生細胞集団から、ＣＲ９５０１／ＣＲ９５０３抗体結合が陽性の細胞のパーセンテージを決定した。ＣＲ９５０３結合が陽性の細胞は、それらの表面にＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現する。ＣＲ９５０１結合が陽性の細胞は、それらの表面に融合前ＲＳＶ  Ｆを発現する。
【００７５】
抗体染色の強度（メジアン蛍光強度−ＭＦＩ）は、細胞表面上のＦタンパク質の量に比例する。Ｆタンパク質を発現する生細胞集団からＭＦＩを計算した。
【００７６】
結果：
完全長Ｆタンパク質変異体の表面細胞発現：
融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質外部ドメインの発現又は安定性を増加させることが以前に同定された変異のサブセットを、野生型完全長ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ配列（アクセッション番号Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣＯ８３３０１）に導入した。変異を単独で、又は複数の組み合わせで導入し、タンパク質の発現及び安定性に対する効果を評価した。
【００７７】
タンパク質の発現レベルを、融合前及び融合後の両Ｆタンパク質を認識するＣＲ９５０３抗体で染色した後、フローサイトメトリーにより平均蛍光強度（ＭＦＩ）として測定した。可溶性ＲＳＶ  ｐｒｅ−Ｆタンパク質の安定化について以前に記載された２つのアミノ酸置換（すなわち、Ｎ６７Ｉ及びＳ２１５Ｐ）の組み合わせは、また、野生型完全長ＲＳＶ  Ｆと比較して、完全長ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現レベルを２．３倍増加させた（図２）。
【００７８】
発現の顕著な増加は、３つのアミノ酸置換の組み合わせを有する変異体で観察された。興味深いことに、１つの変異体に４つ以上の変異を組み合わせても、タンパク質発現をさらに増加させることはなかった。これは、Ｆタンパク質の多数のコピーを収容する細胞膜の容量が限られていることに起因しているのかもしれない。
【００７９】
細胞表面の融合前Ｆの量を、融合前特異的抗体ＣＲ９５０１で染色することにより評価した（図３）。全てのＦ変異体の細胞へのトランスフェクションは、細胞表面上に多かれ少なかれ類似した量の融合前Ｆタンパク質をもたらした。膜貫通ドメインの存在は完全長タンパク質をある程度安定化し、したがって、融合前安定性の差異は、周囲条件下では完全長Ｆタンパク質間で明らかでない。したがって、以下に記載するように、完全長変異体の安定性をより良く識別するために、熱安定性アッセイを開発した。
【００８０】
以前に報告したＦタンパク質変異体の親配列として使用されたＡ２株（国際公開第２０１４／１７４０１８号パンフレット及び国際公開第２０１４／２０２５７０号パンフレット）は、２つの特有且つ稀な変異（すなわち、リジン６６及びイソロイシン７６の）を蓄積した細胞株適合実験室株である。本発明では、これら２つの残基を、天然の臨床分離株（Ｋ６６Ｅ、Ｉ７６Ｖ）に適合するように変異させた。選択されたタンパク質の設計にＫ６６Ｅ及びＩ７６Ｖの変異を含めた。Ｌｙｓ６６及びＩｌｅ７６を有する変異体と比較して、６６位にグルタミン酸を有する変異体（Ｋ６６Ｅ）は、わずかに高く発現する傾向を有する。残基７６でのバリンの付加（Ｋ６６Ｅ及びＩ７６Ｖの二重置換）は、Ｋ６６Ｅ置換のみを有する変異体と比較した場合、発現レベルに影響を与えない（図４）。
【００８１】
細胞表面の完全長Ｆタンパク質変異体の安定性：
短時間スケールの周囲条件では、安定化変異の異なる組み合わせを有する完全長Ｆ変異体間で、融合前コンフォメーションの安定性に有意差は観察されなかった。温度を上げることは、融合前コンフォメーションから融合後コンフォメーションへとＲＳＶ  Ｆタンパク質をリフォールディングするための効率的なインビトロトリガーとして働くことが知られている。したがって、熱ショックアッセイを確立し、膜結合完全長タンパク質の安定性を評価するために使用した。簡単に言えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＦタンパク質コンストラクトでトランスフェクトし、トランスフェクションの４８時間後にアッセイで使用した。細胞を細胞培養皿から剥離し、細胞懸濁液を、温度を上げながら１０分間熱処理した。熱処理後、細胞を抗ＲＳＶ  Ｆ抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析した。フローサイトメトリーデータを２つの異なる方法で分析した。抗Ｆ抗体による染色に対して陽性である細胞のパーセンテージを分析し、陽性細胞の平均蛍光強度（ＭＦＩ）も計算した（図５）。
【００８２】
フローサイトメトリーアッセイでは、ＣＲ９５０１（融合前Ｆタンパク質のみを認識する抗体）及びＣＲ９５０３（融合前Ｆタンパク質及び融合後Ｆタンパク質の両方を認識する抗体）による染色の両方を使用した。ＣＲ９５０３抗体を陽性対照とした。Ｆタンパク質が融合前のコンフォメーションを失って、なお細胞表面上に存在する場合、そのタンパク質は依然ＣＲ９５０３抗体で検出される。両方の抗体による染色の喪失は、タンパク質が、例えば凝集により、細胞表面上で抗体結合に利用できないことを示す。
【００８３】
３つ以上のアミノ酸置換を有する完全長タンパク質をアッセイで試験し、野生型ＲＳＶ  Ｆと比較した。これらの変異体の発現が最も高く、したがってこれらの変異体は好ましい候補であった。全てのタンパク質はＮ６７Ｉ及びＳ２１５Ｐ置換を含み、１つ又は２つの追加の安定化変異を加えた。
【００８４】
改変されていない野生型タンパク質は、ＣＲ９５０３抗体でかなり安定に染色された。ＣＲ９５０３染色のＭＦＩは高い温度ほど上昇したが、値の広がりも非常に大きかった。これは、熱ショック後にタンパク質の凝集が起こらなかったことを示した。融合前コンフォメーションの半分は約５５℃での細胞のインキュベーション後に失われ、６０℃でのインキュベーション後には、高温熱ショック後の野生型Ｆ試料へのＣＲ９５０１結合の減少が示すように、全ての融合前コンフォメーションは失われた。
【００８５】
試験した全ての融合前Ｆタンパク質変異体は、ＣＲ９５０１染色の大部分がより高い温度での処理後も保持されており、野生型ＲＳＶ  Ｆよりも安定であった（図５及び６）。Ｋ４９８Ｒアミノ酸置換を有するタンパク質は、他のものよりも安定性が低かった。さらに、Ｋ６６Ｅ変異の付加は、Ｋ４９８Ｒアミノ酸置換を有する変異体も他のものと同程度に安定になるのと同じく、タンパク質を安定化させ、６０℃での融合前コンフォメーションの損失は観察されなかった。組み合わされたＫ６６Ｅ及びＩ７６Ｖを含む、安定化変異の選択された組み合わせのみを試験した。陽性細胞のパーセントの分析では、試験した４つのタンパク質は全て安定であったが、ＭＦＩの分析では、Ｋ４９８Ｒを有する変異体は６０℃での処理後にＣＲ９５０１結合に明らかな減少を示し、この変異体は温度ストレスアッセイで評価した場合、安定が低いことが示された。
【００８６】
結論として、３つの安定化変異の組み合わせ（Ｎ６７Ｉ及びＳ２１５Ｐを含む）が、高い発現レベル及び安定性に十分であると考えられた。Ｄ４８６Ｎ変異が、タンパク質構造におけるそれらの位置を理由に、第３の安定化変異として選択された。Ｋ６６Ｅ及びＩ７６Ｖは、タンパク質の発現及び安定性に対して負の効果を有さず、天然に存在するものにより近い配列を作製するので、含められた。
【００８７】
変異Ｋ６６Ｅ、Ｎ６７Ｉ、Ｉ７６Ｖ、Ｓ２１５Ｐ及びＤ４８６Ｎを有する融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質（Ｆ２．２）（配列番号１）を、アデノウイルスベクターを構築するために選択した。このタンパク質は、６０℃までの温度安定性アッセイにおいて、融合前コンフォメーションが安定であることが示され、且つ高レベルで発現することができた。
【００８８】
実施例２．アデノウイルスベクターの調製
Ａｄ３５及びＡｄ２６のＥ１領域へのＲＳＶ  Ｆ遺伝子のクローニング：
本発明の融合前Ｆタンパク質をコードする核酸配列は、Ｇｅｎｅａｒｔにより、ヒトでの発現のために遺伝子が最適化され、合成された。コザック配列（５’ＧＣＣＡＣＣ３’）をＡＴＧ開始コドンの直前に含め、２つの停止コドン（５’ＴＧＡ  ＴＡＡ３’）をＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆコード配列の終端に付加した。ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ及びＸｂａＩ部位を介して、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵプラスミド及びｐＡｄＡｐｔ２６プラスミドに挿入した。
【００８９】
細胞培養：
ＰＥＲ．Ｃ６細胞（Ｆａｌｌａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：１９０９−１９１７）を、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。
【００９０】
アデノウイルスの生成、感染、及び継代：
全てのアデノウイルスを、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞中で、単一の相同組換えにより生成し、以前に報告されているように生成した（ｒＡｄ３５では：Ｈａｖｅｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８７：２１３５−２１４３；ｒＡｄ２６では：Ａｂｂｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：４６５４−４６６３）。簡単に記すと、ＰＥＲ．Ｃ６細胞に、製造業者（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が提供する説明書に従い、リポフェクタミンを使用して、Ａｄベクタープラスミドをトランスフェクトした。例えば、ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆ導入遺伝子発現カセットを有するＡｄ３５ベクターのレスキューでは、ｐＡｄＡｐｔ３５ＢＳＵ．ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆプラスミド及びｐＷＥ／Ａｄ３５．ｐＩＸ−ｒＩＴＲ．ｄＥ３．５ｏｒｆ６コスミドを使用し、ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆ導入遺伝子発現カセットを有するＡｄ２６ベクターでは、ｐＡｄＡｐｔ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅ−Ｆプラスミド及びｐＷＥ．Ａｄ２６．ｄＥ３．５ｏｒｆ６．コスミドを使用した。細胞を、完全なＣＰＥの１日後に回収し、凍結融解し、３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、−２０℃で保存した。次に、ウイルスをプラーク精製し、マルチウェル２４組織培養プレートの単一ウェル上で培養したＰＥＲ．Ｃ６中で増幅させた。Ｔ２５組織培養フラスコ及びＴ１７５組織培養フラスコを使用して培養したＰＥＲ．Ｃ６中でさらに増幅させた。Ｔ１７５粗溶解物のうちの３〜５ｍｌを使用して、７０％コンフルエント層のＰＥＲ．Ｃ６細胞を含有する２０×Ｔ１７５三層組織培養フラスコに接種した。ウイルスを、２段階ＣｓＣｌ精製法を使用して精製した。最終的に、ウイルスを一定分量に分割して−８５℃で保存した。
【００９１】
実施例３．インビボでの融合前ＲＳＶ  Ｆを発現する組換えアデノウイルスセロタイプ２６及び３５を用いたＲＳＶ  Ｆに対する免疫の誘導。
Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１及びＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ．２．２の免疫原性をマウスで評価し、細胞性及び体液性免疫応答を、同一用量のＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２（すなわち、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現）によって誘導される応答と比較した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（１群当たりｎ＝４）を、１０８〜１０１０個のウイルス粒子（ｖｐ）、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２又はＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１又はＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２の示された用量で、又は製剤緩衝液で免疫を付与した。初回免疫から８週後に、ＥＬＩＳｐｏｔを用い、１０６脾細胞当たりＲＳＶ  Ｆ  Ａ２特異的ＩＦＮγスポット形成単位（ＳＦＵ）数を決定した。Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２と比較すると、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１及びＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ．２．２では、広い中和能を有し、且つ細胞応答を維持しながらマウスの体液性免疫応答の誘導が増加することが示された。Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１及びＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ．２．２による単回筋肉内免疫付与は、ＩＦＮγ、ＩＬ２及び／又はＴＮＦαに対して陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導によって特徴付けられる（データは示さず）細胞応答を誘発した（図７）。
【００９２】
細胞応答の量及び質は、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ．２．２及びＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２の間で同等であった。対照的に、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１及びＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ．２．２は、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２よりも有意に高いＲＳＶ中和抗体力価を誘導した。抗体応答のより厳密な分析により、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．１及びＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ．２．２は、融合前Ｆに対するより高いレベルの抗体を誘導したが、一方で、融合後Ｆの力価はＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２と同等の値に留まり、その結果、ｐｒｅＦ／ｐｏｓｔＦの抗体比は有意に増加することが示された。さらに、抗体応答のＩｇＧ２ａ／ＩｇＧ１比は変化しないままであり、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２について以前に示されたのと同様の体液性応答のＴｈ１優位を示した（図８）。
【００９３】
さらに、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２では、誘発された抗体はＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２で観察されたのと同様に、種々のＲＳＶ  Ａ及びＢ株、実験室株、並びに臨床分離株を中和し得ることが示された（図９）。
【００９４】
続いて、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２及びＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２ベクターコンストラクトの有効性及び免疫原性を、コットンラットモデルで評価した。これらの動物はヒトＲＳＶの複製を許容し、肺におけるＲＳＶ力価は４日目及び５日目にピークに達する。低用量のＲＳＶ  Ａ２で鼻腔内感染させ、それによって自然曝露を模倣した群、並びにＦＩ−ＲＳＶで免疫付与した群を実験の対照群として含め、臨床研究において、コットンラットで重症呼吸器疾患強（ＥＲＤ）を誘導することが示された希釈で、ＥＲＤを誘導したオリジナルロット１００を使用した。
【００９５】
用量が１０５〜１０８ｖｐ／動物の範囲のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２、又は用量が１０６〜１０９ｖｐ／動物の範囲のＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２を用いて、動物の単回筋肉内免疫付与を行うと、１０５ｖｐのＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２で免疫付与した３匹の動物を除いて、ワクチン相同ＲＳＶ  Ａ２株による感染から肺を完全に防御した（図１０Ａ及び１０Ｂ）。両ベクターで、ＲＳＶ複製に対する鼻の用量依存的防御が観察された。これは、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２では１０８ｖｐ／動物での完全防御から、１０５ｖｐでの部分防御までの範囲にわたったが、Ａｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２では１０９ｖｐで免疫付与した動物の鼻部はＲＳＶ  Ａ２から完全に防御され、１０６ｖｐでは部分防御が得られた（図１０Ｃ及び１０Ｄ）。用量に関して分析すると、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２及びＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２で免疫付与した動物の鼻部は、両者それぞれの野生型Ｆの対応物であるＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２及びＡｄ３５．ＲＳＶ．ＦＡ２で免疫付与した場合よりもＲＳＶ  Ａ２からの防御が良好であった（ｐ＝０．０００３及びｐ＝０．０００１）。ＲＳＶ感染からの防御は、ＲＳＶ  Ａ  Ｌｏｎｇに対するウイルス中和力価の用量依存的誘導を伴うが、これは最低用量のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２又はＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２の適用により既に誘発されている（図１０Ｅ及び１０Ｆ）。ＶＮＡ  Ａ  Ｌｏｎｇの力価について用量に関して統計的な比較を行うと、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２はＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２より免疫原性が高い（ｐ＝０．０４１４）が、ＶＮＡ力価の誘発はＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２とＡｄ３５．ＲＳＶ．ＦＡ２との間で有意差はなかった。
【００９６】
さらに、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ及びＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦは、試験したいずれの濃度でも、ＲＳＶ  Ａ２チャレンジ後に重症呼吸器疾患（ＥＲＤ）の組織病理学的徴候を誘導しないことが示された。コットンラットは、ＥＲＤをモニターするのに最も多く使用され、最もよく研究されているモデルである。この動物モデルで、ＦＩ−ＲＳＶによるワクチン接種は、ＲＳＶチャレンジ後にＥＲＤを一貫して誘導し、これは、主に好中球浸潤物からなる肺胞炎、及び主にリンパ球浸潤物からなる細気管支周囲炎のようなパラメータについて、感染した肺の切片の組織病理学的分析を行うことによって可視化される。コットンラットでは、これらのパラメータに対するＦＩ−ＲＳＶ誘導スコアは、ＲＳＶ感染後１日目から観察することができ、ＲＳＶチャレンジ後４〜５日目にピークに達する。
【００９７】
ＲＳＶ  Ａ２チャレンジ後の５日間、肺の炎症変化（細気管支周囲炎、血管周囲炎、間質性肺炎、肺胞炎）の４つのパラメータをスコア化することによって、ＥＲＤを分析した。ＦＩ−ＲＳＶによる免疫付与は、ほとんどの組織病理学的マーカーについてスコアの増加をもたらし、これは肺胞炎について特に明らかであり（図１１）、このマーカーは、以前にＥＲＤに対して最も識別性のあるマーカーであることが示されたものである。初回免疫のみのレジメンで、ＲＳＶチャレンジ後にＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２又はＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２により免疫を付与した動物では、低親和性及び／又は低レベルの抗体を誘導し得る低ワクチン用量でさえ、肺胞炎又は任意の他のＥＲＤ組織病理学的マーカーの増加は観察されなかった（図１１）。これは、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２及びＡｄ３５．ＲＳＶ．ＦＡ２ベクターを用いた我々の先の結果を確認するものである。
【００９８】
したがって、本発明によれば、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２及びＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２は、融合前コンフォメーションで安定化されるＲＳＶ  Ｆ  Ａ２を発現する、強力なアデノウイルスベクターであることが示された。これらのベクターは、強力な体液性及び細胞性免疫応答を誘導する。誘発された免疫応答は、ＲＳＶ  Ａ２のチャレンジに対して保護的であり、ＲＳＶの臨床分離株及び実験室分離株に対してインビトロで広範囲のウイルス中和を提供する。ワクチン接種した動物のＲＳＶ曝露後に、コットンラットでＥＲＤ誘導は観察されず、したがって、野生型ＲＳＶ  Ｆ  Ａ２抗原をコードするＡｄ２６及びＡｄ３５で得られたデータが裏付けられた。マウスでもコットンラットでも、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２又はＡｄ３５．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ２．２の注射後に反応原性の明白な徴候を示さなかった。
【００９９】
実施例４．ヒトにおいて融合前ＲＳＶ  Ｆを発現するＲＳＶワクチン組換えアデノウイルス血清型２６の研究
１年をあけて行うＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦの２回のワクチン接種の安全性、忍容性及び免疫原性を評価するため、無作為化二重盲検ファースト・イン・ヒューマン第１相試験を、安定した健康状態にある６０歳以上の成人を対象に実施した。本試験は、ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖに識別番号ＮＣＴ０２９２６４３０で登録されている。
【０１００】
目的：
本研究の主な目的には、６０歳超の成人に５×１０１０ウイルス粒子［ｖｐ］又は１×１０１１ｖｐの単回用量で２回筋肉内投与した場合のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦの安全性及び忍容性を評価することが含まれた。第２の目的には、ウイルス中和アッセイ（ＶＮＡ）、Ｆタンパク質結合抗体（ｐｒｅ−Ｆ及びｐｏｓｔ−Ｆ  ＥＬＩＳＡ）及び細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）によって測定される体液性及び細胞性免疫応答を評価することが含まれた。
【０１０１】
試験デザイン
これは、６０歳以上の安定した健康状態にある７２人の男女の対象に１年をあけて投与した２回のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦワクチン接種の安全性、忍容性及び免疫原性を評価する、単一施設無作為化プラセボ対照二重盲検第１相試験である。対象は１２ヶ月をあけて試験ワクチンの２回の単回筋肉内（ＩＭ）注射を受けるために、５群の１つに対して１：１：１：１：２の比で並行して無作為化された（表１）。
【０１０２】
安全性の結果：
最初のワクチン接種の２８日後に中間解析を行った。１日目に５×１０１０ｖｐのＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦを受けた対象を一緒にプールし（グループ１及び２）、１×１０１１ｖｐのＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦを受けた対象も同様にした（グループ３及び４）。７２人全ての対象の最初の投与後の一次中間解析は、このワクチンが両方の投与レベルで十分に忍容されることを示す。非自発的有害事象（ＡＥ）期間の中央値は、一般的には１〜３．５日の範囲であった。ワクチンに関連した重篤なＡＥ（ＳＡＥ）は認められず、試験中止に至ったＡＥはなかった。使用した２つのワクチン用量の間で反応原性に明らかな差はなかった。中間データでは、安全性に及ぼす用量の影響を明らかにはならなかった。
【０１０３】
結論として、ワクチン接種後に報告された非自発的有害事象及び自発的有害事象は全体的に大多数の対象で軽度であり、本質的に一過性であり、後遺症を残すことなく解消された。以上より、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦの両用量は安全であり、両用量群の参加者に十分に忍容されるものであったと結論した。
【０１０４】
免疫原性アッセイ
Ｐｒｅ−Ｆ  ＥＬＩＳＡ
（ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣＯ８３３０１．１に基づき）ｐｒｅ−Ｆ安定化コンフォメーションに対する全ＩｇＧレベルを評価した。ｐｒｅ−Ｆタンパク質をビオチン化し、ストレプトアビジンをコーティングしたプレートにより９６ウェルマイクロタイタープレートに連続的に捕捉させた。段階希釈した試験試料をインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させ、続いて化学発光反応させた抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてｐｒｅ−Ｆ特異的抗体を検出した。ＩＣ５０を結合力価として報告した。
【０１０５】
Ｐｏｓｔ−Ｆ  ＥＬＩＳＡ
ｐｏｓｔ−Ｆタンパク質（ＲＳＶ  Ａ２  Ｆ、Ｇｅｎｂａｎｋ  ＡＣＯ８３３０１．１）に対する全ＩｇＧレベルを評価した。ｐｏｓｔ−Ｆタンパク質を９６ウェルマイクロタイタープレート上にコーティングした。段階希釈した試験試料をインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させ、続いて化学発光反応させた抗ヒトＩｇＧ抗体を用いてｐｏｓｔ−Ｆ特異的抗体を検出した。ＩＣ５０を結合力価として報告した。
【０１０６】
ＲＳＶ中和アッセイ  Ａ２株（Ａ２−ＦＦＬ）又はＢ株（Ａ２−ＢＡＧｄｕｐ−Ｏ３６６３４．１Ｆ−ＦＦＬ）
Ａ５４９細胞、及びルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）を発現するＲＳＶ  Ａ２ウイルス（ＲＳＶ  Ａ２  ＦＦＬ又はＲＳＶ  Ｂ  ＦＦＬ）を用いたウイルス中和アッセイでウイルス中和抗体（ＶＮＡ）を測定することにより、ワクチン誘導抗体反応の機能性を調べた。ＲＳＶ  Ａ２−ＦＦＬ（又はＢ  Ｇｄｕｐ−ＦＦＬ）での１回の感染後のホタルＬｕｃレポーター遺伝子発現の減少の関数として、中和抗体をＡ５４９細胞において測定した。一定量のＲＳＶ  Ａ２  ＦＦＬ（又はＢ  Ｇｄｕｐ−ＦＦＬ）を段階希釈した臨床血清試料と混合した。１時間のインキュベーション後、Ａ５４９細胞を混合物に添加した。２０〜２１時間後、ＲＳＶ  Ａ２−ＦＦＬ（又はＢ  Ｇｄｕｐ  ＦＦＬ）の感染又は阻害を、Ｌｕｃレポーター遺伝子発現系によって測定した。ＩＣ５０を中和力価として報告した。
【０１０７】
ＥＬＩＳｐｏｔ
凍結ＰＢＭＣをＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって分析した。ＰＢＭＣを、ｐｒｅＦタンパク質ワクチンインサート（配列番号１）に一致したペプチドプールで刺激した。刺激したモックＰＢＭＣを差し引いた後のＳＦＣ／１０６刺激ＰＢＭＣの数を報告した。
【０１０８】
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答（ＩＣＳ）
ＩＦＮγ、ＩＬ−２及びＴＮＦαを発現するＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞サブセットの誘導又は追加免疫を、ＲＳＶ  Ｆタンパク質ペプチド刺激後にＩＣＳによって測定した。全サイトカイン応答は、少なくともＩＦＮγ、ＩＬ−２及び／又はＴＮＦαを産生するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のパーセンテージとして報告した。Ｔｈ１／Ｔｈ２バランスについては、ＩＦＮγ（Ｔｈ１）又はＩＬ−４（Ｔｈ２）を発現するＣＤ４細胞を報告した。ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦαを単一のサイトカインとして、又はそれらの任意の組み合わせで発現する、全応答（ｌｏｇ１０スケール）ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞を加え、報告する。
【０１０９】
免疫原性の結果
体液性免疫原性分析は、以下の一次免疫アッセイ（副次的目的）：ＲＳＶ  Ａ２株に対するＶＮＡ、並びに融合前及び融合後Ｆタンパク質に対する結合ＥＬＩＳＡを含んだ。また、ＲＳＶ  Ｂ株に対するＶＮＡを行った。細胞性免疫原性分析は、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイを含んだ。結果を表２〜７に示す。
【０１１０】
予想されたように、ＲＳＶ  Ｆ特異的体液性応答及び細胞性応答は、全ての対象においてベースライン（１日目）で検出され、生涯にわたるＲＳＶへの自然曝露の履歴を反映した（表２〜５）。
【０１１１】
表２は、ＲＳＶ  Ａ２株に対するＶＮＡ応答の結果を含み、実際の値及びベースラインからの上昇倍数（対応する９５％信頼区間（ＣＩ）を含む）の記述統計で提示されている。５×１０１０又は１×１０１１ｖｐでのＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦの１用量後のＲＳＶ  Ａ２中和抗体の幾何平均抗体価（ＧＭＴ）上昇倍数は、それぞれ２．５及び３．２であった。
【０１１２】
ＲＳＶ  Ｂ株に対するＶＮＡ応答の結果を表３に示す。これもまた、実際の値及びベースラインからの上昇倍数（対応する９５％ＣＩを含む）の記述統計を含む。５×１０１０又は１×１０１１ｖｐでのＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦの１用量後のＲＳＶ  Ｂ中和抗体のＧＭＴ上昇倍数は、それぞれ３．１及び３．４であった。このように、ＲＳＶ  Ａ２中和抗体及びＲＳＶ  Ｂ中和抗体はいずれも、ワクチン接種の２８日後には増加していた。１×１０１１ｖｐの用量でのＡｄ２６．ＲＳＶ  ｐｒｅＦは、５×１０１０ｖｐの用量と比較して、より高い中和抗体レベルをもたらした。
【０１１３】
Ｐｒｅ−Ｆ結合ＥＬＩＳＡはＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合前コンフォメーションへの抗体の結合を評価し、ｐｏｓｔ−Ｆ結合ＥＬＩＳＡは、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の融合後コンフォメーションへの抗体の結合を評価した。ｐｒｅ−Ｆタンパク質結合抗体応答（ＥＬＩＳＡ）及びｐｏｓｔ−Ｆタンパク質結合抗体応答（ＥＬＩＳＡ）の両方について、実際の値及び対応する９５％ＣＩを含むベースラインからの上昇倍数の記述統計が表２に示されている。全ｐｒｅＦ  ＩｇＧ結合抗体は２．２（５×１０１０ｖｐ）及び２．９（１×１０１１ｖｐ）のＧＭＴ上昇倍数を示し、一方、全ｐｏｓｔＦ  ＩｇＧ結合抗体は１．９（５×１０１０ｖｐ）又は２．１（１×１０１１ｖｐ）のＧＭＴ上昇倍数を示した。したがって、融合前コンフォメーションのＦタンパク質に結合する抗体（ｐｒｅＦ抗体）及びｐｏｓｔ  Ｆ抗体のレベルはいずれも１回のワクチン投与後に増加した。ｐｒｅＦ結合ＥＬＩＳＡの結果は、ＶＮＡアッセイと同じパターンであった。Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦを１×１０１１ｖｐの用量で投与された群で、最高レベルのｐｒｅＦ結合抗体が観察された。５×１０１０ｖｐ又は１×１０１１ｖｐのＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ投与によるｐｏｓｔＦ抗体の誘導では、用量応答は観察されなかった。
【０１１４】
Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦによって誘導されるＴ細胞応答を、ＰＢＭＣをｐｒｅＦタンパク質ペプチドで再刺激するＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔによって測定する。ワクチン接種前後のＲＳＶ−Ｆ特異的Ｔ細胞応答（ＩＦＮγ）の実際の値の記述統計を表４に示す。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴで測定したこれらの高齢対象の細胞応答中央値は、ベースライン時の１０３及び９５から、３２５及び３０５ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣ（それぞれ、５×１０１０ｖｐ及び１×１０１１ｖｐ）に上昇した。ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦαを単一サイトカインとして、又はそれらの任意の組み合わせで発現する全応答ＣＤ４＋Ｔ細胞を加え、表５に示す。Ａ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦのワクチン接種の２８日後にＣＤ４＋Ｔ細胞応答の増加が観察され、全サイトカイン応答中央値は、１日目で０．０３％及び０．０３％であったのに対し、免疫付与の２８日後は０．１３％及び０．１２％であった（それぞれ、５×１０１０ｖｐ及び１×１０１１ｖｐ）。ＩＦＮγ、ＩＬ−２、ＴＮＦαを単一サイトカインとして、又はそれらの任意の組み合わせで発現する、全応答ＣＤ８＋Ｔ細胞もまた、表５に示すが、全サイトカイン応答中央値は、１日目で０．０７％及び０．０４％であったのに対し、免疫付与の２８日後は０．１５％及び０．０６％であった（それぞれ、５×１０１０ｖｐ及び１×１０１１ｖｐ）。
【０１１５】
表６に示すように、Ａｄ２６．ｐｒｅＦの投与は、融合前Ｆに結合する抗体（ｐｒｅＦ抗体）と融合後Ｆに結合する抗体（ｐｏｓｔＦ抗体）との比を変化させた。Ａｄ２６．ｐｒｅＦワクチンの接種対象におけるｐｒｅＦ／ｐｏｓｔＦ比の幾何平均の上昇は、ベースライン時の１．５及び１．２から１．７〜１．８（それぞれ、５×１０１０ｖｐ及び１×１０１１ｖｐ）に見られた。このように、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦの投与は、明らかにｐｒｅＦ結合抗体をより上昇させた。
【０１１６】
Ａｄ２６．ｐｒｅＦワクチンの接種対象における幾何平均ｐｒｅＦ／ＶＮＡ比は、両グループ（５×１０１０ｖｐ及び１×１０１１ｖｐ）で類似しており、ベースラインで０．８、ワクチン接種の２８日後で０．７であり（表７）、一方、Ａｄ２６．ｐｒｅＦワクチンの接種対象における幾何平均ｐｏｓｔＦ／ＶＮＡ比は、ベースラインで０．５及び０．６、２９日目で０．４及び０．４（それぞれ、５×１０１０ｖｐ及び１×１０１１ｖｐ）であった（表８）。
【０１１７】
ＲＳＶ  Ａ２由来の野生型ＲＳＶ  Ｆを発現するプロトタイプＡｄ２６．ＲＳＶ  ＦＡ２  ＲＳＶを用いて以前に実施された臨床試験ＶＡＣ１８１９２ＲＳＶ１００１（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０２４４００３５）及びＶＡＣ１８１９２ＲＳＶ１００３（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別番号ＮＣＴ０２５６１８７１）においては、１８〜５０歳の健康な対象に５×１０１０ｖｐ用量でＡｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２を投与した。Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２を接種した２８日後に、体液性及び細胞性の両方の免疫応答が増加した。ＲＳＶ中和抗体の幾何平均上昇倍数は、ＲＳＶ  Ａ２及びＲＳＶ  Ｂでそれぞれ２．０及び１．９であった。全ｐｏｓｔＦ  ＩｇＧ結合抗体の平均上昇倍数は、３．０倍の幾何平均上昇を示したが、ｐｒｅＦ  ＩｇＧ結合の幾何平均上昇倍数は２．４の上昇倍数を示した。ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴによって測定したこれらの対象における細胞応答の中央値は、７６ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣから２９０ＳＦＵ／１０６ＰＢＭＣに増加した（データは示さず）。Ａｄ２６．ＲＳＶ．ＦＡ２を用いたこれらの臨床試験では、ｐｒｅＦ／ｐｏｓｔＦ比の増加は観察されなかった。より顕著には、幾何平均ｐｒｅＦ／ｐｏｓｔＦ比がベースラインで１．４であり、ワクチン接種の２８日後には１．１に減少した。幾何平均ｐｒｅＦ／ＶＮＡ比はベースラインで０．６、ワクチン接種の２８日後は０．７であり、一方、幾何平均ｐｏｓｔＦ／ＶＮＡ比はベースラインで０．４であり、ワクチン接種の２８日後には０．６にわずかに上昇した（表１０〜１２）。
【０１１８】
結論として、本発明によれば、Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ（すなわち、融合前コンフォメーションのＲＳＶ  Ｆタンパク質、特に配列番号１のＲＳＶ  Ｆタンパク質をコードする組換えアデノウイルス）の両用量レベルで、最初のワクチン投与の２８日後に、体液性免疫応答及び細胞性免疫応答の両方が大きく増加したことが示された。最も高い体液性応答は、１×１０１１ｖｐ用量で観察され、これは依然として安全であった。体液性免疫応答における追加免疫は、好ましくは、ベースラインからのｐｒｅＦ／ｐｏｓｔＦ結合抗体比のシフトによって示されるように、ｐｒｅ−Ｆエピトープに対して向けられる。Ａｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦの１用量は、より高用量の１×１０１１ｖｐのアデノウイルスであっても、この第１相試験において安全で、且つ十分に忍容性があり、ＲＳＶを経験した高齢の成人において有利な体液性及び細胞性応答を強めた。
【０１１９】
【表１】
2020533367.tif 000002
【０１２０】
【表２】
2020533367.tif 000003
【０１２１】
【表３】
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【０１２２】
【表４】
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【０１２３】
【表５】
2020533367.tif 000006
【０１２４】
【表６】
2020533367.tif 000007
【０１２５】
【表７】
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【０１２６】
【表８】
2020533367.tif 000009
【０１２７】
【表９】
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【０１２８】
【表１０】
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【０１２９】
【表１１】
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【０１３０】
【表１２】
2020533367.tif 000013
【０１３１】
配列表
ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質のアミノ酸配列（ＲＳＶ  Ａ２株と比較した変異は太字とされ、且つ下線を引いてある）
配列番号１：ＲＳＶ  ｐｒｅＦ２．２アミノ酸配列：
【化１】
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【０１３２】
配列番号２：ＲＳＶ  Ｆ  ｐｒｅ−Ｆ２．２融合前タンパク質をコードするコドン最適化核酸
【化２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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