(57)【要約】本発明は、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ならびに疾患および障害の処置における使用方法を提供する。本発明は、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）膜貫通タンパク質を標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびがんの処置におけるその使用方法を提供することにより、当技術分野における以前の欠点を克服する。本発明は、免疫療法を用いるがんの処置をはじめとする、がんの処置のための方法および組成物を提供する。特定の例では、免疫療法には、特定のがんを標的化するように操作されたＴリンパ球が含まれる。
2020528744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列：
【化６】
2020528744.tif 000008
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項２】
アミノ酸配列：
【化７】
2020528744.tif 000009
を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項３】
検出可能部分をさらに含む、請求項１または２のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
【請求項４】
薬物、毒素、小分子、抗体、サイトカイン、腫瘍溶解性ウイルス、酵素、ナノ粒子、バイオマテリアル、スキャフォールドおよびそれらの任意の組合せからなる群より選択されるエフェクター分子をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣＡＲ。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＡＲをコードする核酸分子。
【請求項６】
配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項７】
配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項５に記載の核酸分子。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＡＲを含む細胞。
【請求項１０】
請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸分子および／または請求項８に記載のベクターを含む細胞。
【請求項１１】
前記細胞が、αβＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔｈ１７細胞、γδＴ細胞およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項９または１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＡＲ、請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクターおよび／または請求項９〜１１のいずれか一項に記載の細胞を薬学的に許容され得る担体中に含む、組成物。
【請求項１３】
被験体においてＢ７−Ｈ３発現標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介免疫応答を刺激する方法であって、前記被験体に有効量の請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、および／または請求項９〜１１のいずれか一項に記載の細胞を投与し、それにより前記被験体において前記Ｂ７−Ｈ３発現標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介免疫応答を刺激することを含む、方法。
【請求項１４】
被験体に抗腫瘍免疫を提供する方法であって、前記被験体に有効量の請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、および／または請求項９〜１１のいずれか一項に記載の細胞を投与し、それにより前記被験体に抗腫瘍免疫を提供することを含む、方法。
【請求項１５】
Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）の発現の増加に関連する疾患または障害を有する被験体を、前記被験体の細胞によって処置する方法であって、前記被験体に有効量の請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、および／または請求項９〜１１のいずれか一項に記載の細胞を投与し、それによりＢ７−Ｈ３の発現の増加に関連する前記疾患または障害を有する前記被験体を前記被験体の前記細胞によって処置することを含む、方法。
【請求項１６】
被験体において遺伝子操作された細胞の集団を生成する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現するように遺伝子操作された細胞を前記被験体に投与することを含み、遺伝子操作された細胞の前記集団が投与後の一定期間、前記被験体において存続する、方法。
【請求項１７】
被験体において遺伝子操作された細胞の集団を拡大増殖する方法であって、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＡＲを発現するように遺伝子操作された細胞を前記被験体に投与することを含み、投与された前記遺伝子操作された細胞が前記被験体において子孫細胞の集団を生成する、方法。
【請求項１８】
被験体においてがんを処置する方法であって、前記被験体に有効量の請求項５〜７のいずれか一項に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、および／または請求項９〜１１のいずれか一項に記載の細胞を投与し、それにより前記被験体においてがんを処置することを含む、方法。
【請求項１９】
前記被験体が、がんの治療を受けたことがある、かつ／またはがんの治療を受けている、請求項１３〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）抗原を有するがん細胞および／またはがん始原細胞（ＣＩＣ）を標的化する方法であって、前記がん細胞および／または前記ＣＩＣに請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＡＲを含む細胞を提供することを含む、方法。
【請求項２１】
前記がん細胞および／またはＣＩＣが、インビトロまたはインビボにある、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記がん細胞および／または前記ＣＩＣが被験体内にある、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
細胞試料中のがん細胞および／またはがん始原細胞（ＣＩＣ）を検出する方法であって、
ａ）結合複合体が形成し得る条件下で前記細胞試料と請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＡＲとを接触させるステップと；
ｂ）前記結合複合体の形成を検出するステップであって、前記結合複合体の検出が、前記細胞試料中のがん細胞および／またはＣＩＣを示す、ステップと
を含む、方法。
【請求項２４】
被験体においてがん細胞および／またはがん始原細胞（ＣＩＣ）を検出する方法であって、
ａ）結合複合体が形成し得る条件下で前記被験体から得た細胞試料と請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＡＲとを接触させるステップと；
ｂ）前記結合複合体の形成を検出するステップであって、前記結合複合体の検出が、前記被験体におけるがん細胞および／またはＣＩＣの存在を示す、ステップと
を含む、方法。
【請求項２５】
前記細胞が、αβΤ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、Ｔｈ１７細胞、γδＴ細胞およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項１３〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が自己細胞である、請求項１３〜２２または２４〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）の発現の増加に関連する疾患または障害の処置における、請求項１または請求項２に記載のキメラ抗原受容体の使用。
【請求項２８】
被験体におけるＢ７−Ｈ３発現標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介免疫応答の刺激における、請求項１または請求項２に記載のキメラ抗原受容体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先権の陳述
本願は、米国特許法第３５条１１９条（ｅ）項の下、２０１７年６月２１日付で出願された米国特許仮出願第６２／５２３，１０５号の利益を主張する。この米国特許仮出願は参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）組成物およびがん免疫療法におけるそれらの使用方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、Ｔ細胞に対する阻害効果を有するリガンドのＢ７スーパーファミリーのメンバーである。Ｂ７−Ｈ３はいくつかのヒト悪性疾患で高度に発現し、その発現は不良な生存と相関している。Ｂ７−Ｈ３は、腫瘍細胞で発現するが、正常組織での分布が限定されているため、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）再指向化Ｔ細胞の標的として注目されている。Ｂ７−Ｈ３の広範な腫瘍発現を考えると、Ｂ７−Ｈ３の適用可能性に多くの関心が集まっている。ＣＡＲは、多くの固形および液性のヒト腫瘍の処置のための特定のモノクローナル抗体に由来する。本発明は、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）膜貫通タンパク質を標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のための組成物および方法を記載する。
【０００４】
本発明は、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）膜貫通タンパク質を標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびがんの処置におけるその使用方法を提供することにより、当技術分野における以前の欠点を克服する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、免疫療法を用いるがんの処置をはじめとする、がんの処置のための方法および組成物を提供する。特定の例では、免疫療法には、特定のがんを標的化するように操作されたＴリンパ球が含まれる。
【０００６】
よって、一実施形態では、本発明は、アミノ酸配列：
【化１】
2020528744.tif 000003
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【０００７】
もう一つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列：
【化２】
2020528744.tif 000004
を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【０００８】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子を提供し、それには、一部の実施形態では、配列番号１のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む配列番号３のヌクレオチド配列、および、一部の実施形態では、配列番号２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む配列番号４のヌクレオチド配列が含まれる。本発明はさらに、本発明の核酸分子を含むベクターおよび細胞を提供する。本発明は、配列番号５のヌクレオチド配列を有する核酸分子も提供する。
【０００９】
さらなる実施形態では、本発明は、被験体に有効量の本発明の核酸分子、ベクターおよび／または細胞を投与し、それにより被験体においてＢ７−Ｈ３発現標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介免疫応答を刺激することを含む、被験体においてＢ７−Ｈ３発現標的細胞集団または組織に対するＴ細胞媒介免疫応答を刺激する方法を提供する。
【００１０】
さらなる実施形態では、本発明は、被験体に有効量の本発明の核酸分子、ベクター、および／または細胞を投与し、それにより被験体に抗腫瘍免疫を提供することを含む、被験体に抗腫瘍免疫を提供する方法を提供する。
【００１１】
本発明は、被験体に有効量の本発明の核酸分子、ベクター、および／または細胞を投与し、それによりＢ７−Ｈ３の発現の増加に関連する疾患または障害を有する被験体を被験体の細胞によって処置することを含む、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）の発現の増加に関連する疾患または障害を有する被験体を被験体の細胞によって処置する方法をさらに提供する。
【００１２】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明のＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたＴ細胞を被験体に投与することを含む、被験体（例えば、がんと診断された被験体）において、遺伝子操作されたＴ細胞の持続性集団を生成する方法を提供し、ここで、遺伝子操作されたＴ細胞の持続性集団は、投与後に被験体において存続する。
【００１３】
さらなる実施形態では、本発明は、本発明のＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたＴ細胞を被験体に投与することを含む、被験体（例えば、がんと診断された被験体）において、遺伝子操作されたＴ細胞の集団を拡大増殖する（ｅｘｐａｎｄ）方法を提供し、ここで、投与された遺伝子操作されたＴ細胞は被験体において後代Ｔ細胞の集団を生成する。
【００１４】
さらなる実施形態では、本発明は、被験体に有効量の本発明の核酸分子、ベクターおよび／または細胞を投与し、それにより被験体においてがんを処置することを含む、被験体においてがんを処置する方法を提供する。
【００１５】
本発明はまた、がん細胞および／またはがん始原細胞（ｃａｎｃｅｒ  ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）（ＣＩＣ）を本発明のＣＡＲを含む細胞と接触させることを含む、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）抗原を有するがん細胞および／またはＣＩＣを標的化する方法も提供する。
【００１６】
また、ａ）結合複合体が形成し得る条件下で細胞試料と本発明のＣＡＲとを接触させるステップ；およびｂ）結合複合体の検出が細胞試料中のがん細胞および／またはＣＩＣを示す、結合複合体の形成を検出するステップを含む、細胞試料においてがん細胞および／またはがん始原細胞（ＣＩＣ）を検出する方法も本明細書において提供される。
【００１７】
本発明のもう一つの実施形態は、ａ）結合複合体が形成し得る条件下で、被験体から得た細胞試料と本発明のＣＡＲとを接触させるステップ；およびｂ）結合複合体の検出が被験体におけるがん細胞および／またはＣＩＣの存在を示す、結合複合体の形成を検出するステップを含む、被験体においてがん細胞および／またはがん始原細胞（ＣＩＣ）を検出する方法である。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態は、関連する核酸分子、組み換え発現ベクター、宿主細胞、細胞集団、抗体またはその抗原結合部分、抗体断片および本発明のＣＡＲに関連する医薬組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｃは、Ｂ７−Ｈ３が膵臓がんにおいて高度に発現していることを示す図である。（１Ａ）正常なヒト膵臓と、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の凍結組織の免疫組織化学。染色は、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲが由来した抗Ｂ７−Ｈ３  ｍＡｂ３７６．９６を使用して実施した。ｍＡｂの最終濃度は１μｇ／ｍＬであった。スケールバーは１００μｍである。ヒトＰＤＡＣ腫瘍細胞株（１Ｂ）およびＰＤＸ由来の原発性膵臓腫瘍細胞株（１Ｃ）も抗Ｂ７−Ｈ３  ｍＡｂ３７６．９６で染色し、抗原の発現をフローサイトメトリーによって評価した。
【図１Ｂ−Ｃ】図１Ａ〜Ｃは、Ｂ７−Ｈ３が膵臓がんにおいて高度に発現していることを示す図である。（１Ａ）正常なヒト膵臓と、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の凍結組織の免疫組織化学。染色は、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲが由来した抗Ｂ７−Ｈ３  ｍＡｂ３７６．９６を使用して実施した。ｍＡｂの最終濃度は１μｇ／ｍＬであった。スケールバーは１００μｍである。ヒトＰＤＡＣ腫瘍細胞株（１Ｂ）およびＰＤＸ由来の原発性膵臓腫瘍細胞株（１Ｃ）も抗Ｂ７−Ｈ３  ｍＡｂ３７６．９６で染色し、抗原の発現をフローサイトメトリーによって評価した。
【００２０】
【図２】図２は、正常ヒト組織におけるＢ７−Ｈ３の制限された発現を示す図である。正常なヒト組織の凍結マイクロアレイの免疫組織化学。染色は、抗Ｂ７−Ｈ３  ｍＡｂ３７６．９６を使用して実施した。Ａｂの最終濃度は１μｇ／ｍＬであった。代表的な顕微鏡写真が示されている。黒枠は拡大された切り抜き図を示す。データは、組織あたり少なくとも３つの切片を表す。スケールバーは２００μｍである。
【００２１】
【図３Ａ−Ｃ】図３Ａ〜Ｇは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞がヒトおよびマウスＢ７−Ｈ３を認識することを示す図である。（３Ａ）ＣＤ２８かまたは４−１ＢＢ共刺激ドメインのいずれかを含むＢ７−Ｈ３．ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターＳＦＧの模式的構造。（３Ｂ）形質導入されたヒトＴ細胞におけるＢ７−Ｈ３．ＣＡＲの代表的な発現。ＣＡＲ発現は、抗マウス−ＦＡＢ抗体を使用して検出し、フローサイトメトリーによって分析した。（３Ｃ）ヒトリンパ腫腫瘍細胞株Ｒａｊｉを、レトロウイルス遺伝子導入によって、Ｂ７−Ｈ３の２つのヒトアイソフォーム（２Ｉｇ−ｈＢ７−Ｈ３または４Ｉｇ−ｈＢ７−Ｈ３）かまたはマウスアイソフォーム（ｍＢ７−Ｈ３）のいずれかを発現するように操作した。次に、単一のクローンを選択した。抗Ｂ７−Ｈ３  ｍＡｂ３７６．９６は、フローサイトメトリーで評価されるように、ヒトとマウスの両方のＢ７−Ｈ３を認識する。（３Ｄ）野生型（ＷＴ）Ｒａｊｉ細胞と、ヒトまたはマウスのいずれかのＢ７−Ｈ３を発現するように改変されたＲａｊｉ細胞を、対照Ｔ細胞またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓのいずれかと共培養した（１：１比）。５日目までに、腫瘍細胞（ＣＤ１９＋）およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓ（ＣＤ３＋）をフローサイトメトリーで数えた。（３Ｅ）共培養の５日目までの腫瘍細胞頻度の統計（ｎ＝４）。ＥＬＩＳＡで測定した、Ｒａｊｉ細胞とともに２４時間共培養した後に、対照Ｔ細胞およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞によって放出されたＩＦＮγ（３Ｆ）およびＩＬ２（３Ｇ）（ｎ＝４）。
【図３Ｄ】図３Ａ〜Ｇは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞がヒトおよびマウスＢ７−Ｈ３を認識することを示す図である。（３Ａ）ＣＤ２８かまたは４−１ＢＢ共刺激ドメインのいずれかを含むＢ７−Ｈ３．ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターＳＦＧの模式的構造。（３Ｂ）形質導入されたヒトＴ細胞におけるＢ７−Ｈ３．ＣＡＲの代表的な発現。ＣＡＲ発現は、抗マウス−ＦＡＢ抗体を使用して検出し、フローサイトメトリーによって分析した。（３Ｃ）ヒトリンパ腫腫瘍細胞株Ｒａｊｉを、レトロウイルス遺伝子導入によって、Ｂ７−Ｈ３の２つのヒトアイソフォーム（２Ｉｇ−ｈＢ７−Ｈ３または４Ｉｇ−ｈＢ７−Ｈ３）かまたはマウスアイソフォーム（ｍＢ７−Ｈ３）のいずれかを発現するように操作した。次に、単一のクローンを選択した。抗Ｂ７−Ｈ３  ｍＡｂ３７６．９６は、フローサイトメトリーで評価されるように、ヒトとマウスの両方のＢ７−Ｈ３を認識する。（３Ｄ）野生型（ＷＴ）Ｒａｊｉ細胞と、ヒトまたはマウスのいずれかのＢ７−Ｈ３を発現するように改変されたＲａｊｉ細胞を、対照Ｔ細胞またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓのいずれかと共培養した（１：１比）。５日目までに、腫瘍細胞（ＣＤ１９＋）およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓ（ＣＤ３＋）をフローサイトメトリーで数えた。（３Ｅ）共培養の５日目までの腫瘍細胞頻度の統計（ｎ＝４）。ＥＬＩＳＡで測定した、Ｒａｊｉ細胞とともに２４時間共培養した後に、対照Ｔ細胞およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞によって放出されたＩＦＮγ（３Ｆ）およびＩＬ２（３Ｇ）（ｎ＝４）。
【図３Ｅ−Ｇ】図３Ａ〜Ｇは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞がヒトおよびマウスＢ７−Ｈ３を認識することを示す図である。（３Ａ）ＣＤ２８かまたは４−１ＢＢ共刺激ドメインのいずれかを含むＢ７−Ｈ３．ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターＳＦＧの模式的構造。（３Ｂ）形質導入されたヒトＴ細胞におけるＢ７−Ｈ３．ＣＡＲの代表的な発現。ＣＡＲ発現は、抗マウス−ＦＡＢ抗体を使用して検出し、フローサイトメトリーによって分析した。（３Ｃ）ヒトリンパ腫腫瘍細胞株Ｒａｊｉを、レトロウイルス遺伝子導入によって、Ｂ７−Ｈ３の２つのヒトアイソフォーム（２Ｉｇ−ｈＢ７−Ｈ３または４Ｉｇ−ｈＢ７−Ｈ３）かまたはマウスアイソフォーム（ｍＢ７−Ｈ３）のいずれかを発現するように操作した。次に、単一のクローンを選択した。抗Ｂ７−Ｈ３  ｍＡｂ３７６．９６は、フローサイトメトリーで評価されるように、ヒトとマウスの両方のＢ７−Ｈ３を認識する。（３Ｄ）野生型（ＷＴ）Ｒａｊｉ細胞と、ヒトまたはマウスのいずれかのＢ７−Ｈ３を発現するように改変されたＲａｊｉ細胞を、対照Ｔ細胞またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓのいずれかと共培養した（１：１比）。５日目までに、腫瘍細胞（ＣＤ１９＋）およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓ（ＣＤ３＋）をフローサイトメトリーで数えた。（３Ｅ）共培養の５日目までの腫瘍細胞頻度の統計（ｎ＝４）。ＥＬＩＳＡで測定した、Ｒａｊｉ細胞とともに２４時間共培養した後に、対照Ｔ細胞およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞によって放出されたＩＦＮγ（３Ｆ）およびＩＬ２（３Ｇ）（ｎ＝４）。
【００２２】
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｆは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−ＴｓがインビトロでＰＤＡＣ細胞株を標的化することを示す図である。（４Ａ）６つのＰＤＡＣ細胞株を、対照（ＮＴ）またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓとともに、Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：５または１：１０で共培養した。ＰＤＡＣ腫瘍細胞株を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識した。７日目までに、ＰＤＡＣ（ＧＦＰ＋）およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＤ３＋）をフローサイトメトリーで数えた。（４Ｂ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：５の場合および（４Ｃ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：１０（ｎ＝４）の場合の腫瘍細胞頻度の統計。ＥＬＩＳＡで測定した、ＰＤＡＣと２４時間共培養した後に、対照およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓによって放出されたＩＦＮγ（４Ｄ）およびＩＬ２（４Ｅ）（ｎ＝４）。（４Ｆ）ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−ＴｓをＰＤＡＣとともに１：１の比で５日間共培養した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーによってＣＦＳＥ希釈により測定した。ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のみを対照として使用した。これは塗りつぶされた灰色のピークとして示されている。
【図４Ｂ−Ｃ】図４Ａ〜Ｆは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−ＴｓがインビトロでＰＤＡＣ細胞株を標的化することを示す図である。（４Ａ）６つのＰＤＡＣ細胞株を、対照（ＮＴ）またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓとともに、Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：５または１：１０で共培養した。ＰＤＡＣ腫瘍細胞株を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識した。７日目までに、ＰＤＡＣ（ＧＦＰ＋）およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＤ３＋）をフローサイトメトリーで数えた。（４Ｂ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：５の場合および（４Ｃ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：１０（ｎ＝４）の場合の腫瘍細胞頻度の統計。ＥＬＩＳＡで測定した、ＰＤＡＣと２４時間共培養した後に、対照およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓによって放出されたＩＦＮγ（４Ｄ）およびＩＬ２（４Ｅ）（ｎ＝４）。（４Ｆ）ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−ＴｓをＰＤＡＣとともに１：１の比で５日間共培養した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーによってＣＦＳＥ希釈により測定した。ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のみを対照として使用した。これは塗りつぶされた灰色のピークとして示されている。
【図４Ｄ−Ｅ】図４Ａ〜Ｆは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−ＴｓがインビトロでＰＤＡＣ細胞株を標的化することを示す図である。（４Ａ）６つのＰＤＡＣ細胞株を、対照（ＮＴ）またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓとともに、Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：５または１：１０で共培養した。ＰＤＡＣ腫瘍細胞株を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識した。７日目までに、ＰＤＡＣ（ＧＦＰ＋）およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＤ３＋）をフローサイトメトリーで数えた。（４Ｂ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：５の場合および（４Ｃ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：１０（ｎ＝４）の場合の腫瘍細胞頻度の統計。ＥＬＩＳＡで測定した、ＰＤＡＣと２４時間共培養した後に、対照およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓによって放出されたＩＦＮγ（４Ｄ）およびＩＬ２（４Ｅ）（ｎ＝４）。（４Ｆ）ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−ＴｓをＰＤＡＣとともに１：１の比で５日間共培養した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーによってＣＦＳＥ希釈により測定した。ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のみを対照として使用した。これは塗りつぶされた灰色のピークとして示されている。
【図４Ｆ】図４Ａ〜Ｆは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−ＴｓがインビトロでＰＤＡＣ細胞株を標的化することを示す図である。（４Ａ）６つのＰＤＡＣ細胞株を、対照（ＮＴ）またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓとともに、Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：５または１：１０で共培養した。ＰＤＡＣ腫瘍細胞株を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）で標識した。７日目までに、ＰＤＡＣ（ＧＦＰ＋）およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＤ３＋）をフローサイトメトリーで数えた。（４Ｂ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：５の場合および（４Ｃ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：１０（ｎ＝４）の場合の腫瘍細胞頻度の統計。ＥＬＩＳＡで測定した、ＰＤＡＣと２４時間共培養した後に、対照およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓによって放出されたＩＦＮγ（４Ｄ）およびＩＬ２（４Ｅ）（ｎ＝４）。（４Ｆ）ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−ＴｓをＰＤＡＣとともに１：１の比で５日間共培養した。ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖をフローサイトメトリーによってＣＦＳＥ希釈により測定した。ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のみを対照として使用した。これは塗りつぶされた灰色のピークとして示されている。
【００２３】
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｆは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞がＰＤＸに由来する原発性ＰＤＡＣ細胞株を標的化することを示す図である。（５Ａ）ＰＤＸ由来の３つの原発性ＰＤＡＣ細胞株を、対照Ｔ細胞（ＮＴ）またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞とともに、Ｔ細胞とＰＤＡＣの比１：５で共培養した。ＰＤＡＣ腫瘍細胞株をＧＦＰで標識した。７日目までに、腫瘍細胞（ＧＦＰ＋）およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＤ３＋）をフローサイトメトリーで数えた。（５Ｂ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：５の場合の、対照またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のいずれかとともに７日間の共培養した後の腫瘍細胞頻度の統計（ｎ＝６）、および（５Ｃ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：１０の場合の統計（ｎ＝４）。ＥＬＩＳＡで測定した、ＰＤＡＣと２４時間共培養した後に、Ｔ細胞またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓのいずれかによって放出されたＩＦＮγ（５Ｄ）およびＩＬ２（５Ｅ）（ｎ＝４）。（５Ｆ）ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞をＰＤＡＣとともに１：１の比で５日間共培養した。Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ希釈により測定し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のみを対照として使用した。これは塗りつぶされた灰色のピークとして示されている。
【図５Ｂ−Ｃ】図５Ａ〜Ｆは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞がＰＤＸに由来する原発性ＰＤＡＣ細胞株を標的化することを示す図である。（５Ａ）ＰＤＸ由来の３つの原発性ＰＤＡＣ細胞株を、対照Ｔ細胞（ＮＴ）またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞とともに、Ｔ細胞とＰＤＡＣの比１：５で共培養した。ＰＤＡＣ腫瘍細胞株をＧＦＰで標識した。７日目までに、腫瘍細胞（ＧＦＰ＋）およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＤ３＋）をフローサイトメトリーで数えた。（５Ｂ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：５の場合の、対照またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のいずれかとともに７日間の共培養した後の腫瘍細胞頻度の統計（ｎ＝６）、および（５Ｃ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：１０の場合の統計（ｎ＝４）。ＥＬＩＳＡで測定した、ＰＤＡＣと２４時間共培養した後に、Ｔ細胞またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓのいずれかによって放出されたＩＦＮγ（５Ｄ）およびＩＬ２（５Ｅ）（ｎ＝４）。（５Ｆ）ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞をＰＤＡＣとともに１：１の比で５日間共培養した。Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ希釈により測定し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のみを対照として使用した。これは塗りつぶされた灰色のピークとして示されている。
【図５Ｄ−Ｅ】図５Ａ〜Ｆは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞がＰＤＸに由来する原発性ＰＤＡＣ細胞株を標的化することを示す図である。（５Ａ）ＰＤＸ由来の３つの原発性ＰＤＡＣ細胞株を、対照Ｔ細胞（ＮＴ）またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞とともに、Ｔ細胞とＰＤＡＣの比１：５で共培養した。ＰＤＡＣ腫瘍細胞株をＧＦＰで標識した。７日目までに、腫瘍細胞（ＧＦＰ＋）およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＤ３＋）をフローサイトメトリーで数えた。（５Ｂ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：５の場合の、対照またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のいずれかとともに７日間の共培養した後の腫瘍細胞頻度の統計（ｎ＝６）、および（５Ｃ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：１０の場合の統計（ｎ＝４）。ＥＬＩＳＡで測定した、ＰＤＡＣと２４時間共培養した後に、Ｔ細胞またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓのいずれかによって放出されたＩＦＮγ（５Ｄ）およびＩＬ２（５Ｅ）（ｎ＝４）。（５Ｆ）ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞をＰＤＡＣとともに１：１の比で５日間共培養した。Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ希釈により測定し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のみを対照として使用した。これは塗りつぶされた灰色のピークとして示されている。
【図５Ｆ】図５Ａ〜Ｆは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞がＰＤＸに由来する原発性ＰＤＡＣ細胞株を標的化することを示す図である。（５Ａ）ＰＤＸ由来の３つの原発性ＰＤＡＣ細胞株を、対照Ｔ細胞（ＮＴ）またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞とともに、Ｔ細胞とＰＤＡＣの比１：５で共培養した。ＰＤＡＣ腫瘍細胞株をＧＦＰで標識した。７日目までに、腫瘍細胞（ＧＦＰ＋）およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＤ３＋）をフローサイトメトリーで数えた。（５Ｂ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：５の場合の、対照またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のいずれかとともに７日間の共培養した後の腫瘍細胞頻度の統計（ｎ＝６）、および（５Ｃ）Ｔ細胞とＰＤＡＣの比が１：１０の場合の統計（ｎ＝４）。ＥＬＩＳＡで測定した、ＰＤＡＣと２４時間共培養した後に、Ｔ細胞またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓのいずれかによって放出されたＩＦＮγ（５Ｄ）およびＩＬ２（５Ｅ）（ｎ＝４）。（５Ｆ）ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞をＰＤＡＣとともに１：１の比で５日間共培養した。Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖をＣＦＳＥ希釈により測定し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＦＳＥ標識されたＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のみを対照として使用した。これは塗りつぶされた灰色のピークとして示されている。
【００２４】
【図６Ａ−Ｂ】図６Ａ〜Ｊは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓが異種移植片モデルにおいて抗腫瘍活性を示したことを示す図である。（６Ａ）同所性マウスモデルのスキーマ。ＦＦｌｕｃ標識されたＰａｎｃ−１（２×１０５／マウス）またはＢｘＰＣ−３（１×１０５／マウス）ヒトＰＤＡＣ腫瘍細胞株を、ＮＳＧマウスの膵臓に植込んだ。１２日目までに、対照ＣＤ１９．ＣＡＲ−Ｔ細胞か、あるいはＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激ドメインのいずれかをコードするＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のいずれかをマウスに注入した（静脈内（ｉ．ｖ．）経路で１０７細胞／マウス）。腫瘍増殖は、Ｔ細胞注入後に毎週、発光イメージングによってモニタリングされた。（６Ｂ）Ｐａｎｃ−１同所性モデルの生物発光。（６Ｃ）ＣＤ１９．ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍移植後５０日目までのＰａｎｃ−１の代表的な超音波（ＵＳ）測定。（６Ｄ）Ｐａｎｃ−１の生物発光シグナル測定。（６Ｅ）ＢｘＰＣ−３同所性モデルの生物発光。（６Ｆ）ＢｘＰＣ−３の生物発光シグナル測定。（６Ｇ）ＢｘＰＣ−３同所性モデルのカプラン・マイヤー生存曲線分析。（６Ｈ）Ｐａｎｃ−１の転移モデルのスキーマ。（６Ｉ）Ｐａｎｃ−１転移モデルの生物発光。（６Ｊ）転移性Ｐａｎｃ−１の生物発光シグナル測定。
【図６Ｃ−Ｄ】図６Ａ〜Ｊは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓが異種移植片モデルにおいて抗腫瘍活性を示したことを示す図である。（６Ａ）同所性マウスモデルのスキーマ。ＦＦｌｕｃ標識されたＰａｎｃ−１（２×１０５／マウス）またはＢｘＰＣ−３（１×１０５／マウス）ヒトＰＤＡＣ腫瘍細胞株を、ＮＳＧマウスの膵臓に植込んだ。１２日目までに、対照ＣＤ１９．ＣＡＲ−Ｔ細胞か、あるいはＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激ドメインのいずれかをコードするＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のいずれかをマウスに注入した（静脈内（ｉ．ｖ．）経路で１０７細胞／マウス）。腫瘍増殖は、Ｔ細胞注入後に毎週、発光イメージングによってモニタリングされた。（６Ｂ）Ｐａｎｃ−１同所性モデルの生物発光。（６Ｃ）ＣＤ１９．ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍移植後５０日目までのＰａｎｃ−１の代表的な超音波（ＵＳ）測定。（６Ｄ）Ｐａｎｃ−１の生物発光シグナル測定。（６Ｅ）ＢｘＰＣ−３同所性モデルの生物発光。（６Ｆ）ＢｘＰＣ−３の生物発光シグナル測定。（６Ｇ）ＢｘＰＣ−３同所性モデルのカプラン・マイヤー生存曲線分析。（６Ｈ）Ｐａｎｃ−１の転移モデルのスキーマ。（６Ｉ）Ｐａｎｃ−１転移モデルの生物発光。（６Ｊ）転移性Ｐａｎｃ−１の生物発光シグナル測定。
【図６Ｅ−Ｆ】図６Ａ〜Ｊは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓが異種移植片モデルにおいて抗腫瘍活性を示したことを示す図である。（６Ａ）同所性マウスモデルのスキーマ。ＦＦｌｕｃ標識されたＰａｎｃ−１（２×１０５／マウス）またはＢｘＰＣ−３（１×１０５／マウス）ヒトＰＤＡＣ腫瘍細胞株を、ＮＳＧマウスの膵臓に植込んだ。１２日目までに、対照ＣＤ１９．ＣＡＲ−Ｔ細胞か、あるいはＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激ドメインのいずれかをコードするＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のいずれかをマウスに注入した（静脈内（ｉ．ｖ．）経路で１０７細胞／マウス）。腫瘍増殖は、Ｔ細胞注入後に毎週、発光イメージングによってモニタリングされた。（６Ｂ）Ｐａｎｃ−１同所性モデルの生物発光。（６Ｃ）ＣＤ１９．ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍移植後５０日目までのＰａｎｃ−１の代表的な超音波（ＵＳ）測定。（６Ｄ）Ｐａｎｃ−１の生物発光シグナル測定。（６Ｅ）ＢｘＰＣ−３同所性モデルの生物発光。（６Ｆ）ＢｘＰＣ−３の生物発光シグナル測定。（６Ｇ）ＢｘＰＣ−３同所性モデルのカプラン・マイヤー生存曲線分析。（６Ｈ）Ｐａｎｃ−１の転移モデルのスキーマ。（６Ｉ）Ｐａｎｃ−１転移モデルの生物発光。（６Ｊ）転移性Ｐａｎｃ−１の生物発光シグナル測定。
【図６Ｇ−Ｈ】図６Ａ〜Ｊは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓが異種移植片モデルにおいて抗腫瘍活性を示したことを示す図である。（６Ａ）同所性マウスモデルのスキーマ。ＦＦｌｕｃ標識されたＰａｎｃ−１（２×１０５／マウス）またはＢｘＰＣ−３（１×１０５／マウス）ヒトＰＤＡＣ腫瘍細胞株を、ＮＳＧマウスの膵臓に植込んだ。１２日目までに、対照ＣＤ１９．ＣＡＲ−Ｔ細胞か、あるいはＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激ドメインのいずれかをコードするＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のいずれかをマウスに注入した（静脈内（ｉ．ｖ．）経路で１０７細胞／マウス）。腫瘍増殖は、Ｔ細胞注入後に毎週、発光イメージングによってモニタリングされた。（６Ｂ）Ｐａｎｃ−１同所性モデルの生物発光。（６Ｃ）ＣＤ１９．ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍移植後５０日目までのＰａｎｃ−１の代表的な超音波（ＵＳ）測定。（６Ｄ）Ｐａｎｃ−１の生物発光シグナル測定。（６Ｅ）ＢｘＰＣ−３同所性モデルの生物発光。（６Ｆ）ＢｘＰＣ−３の生物発光シグナル測定。（６Ｇ）ＢｘＰＣ−３同所性モデルのカプラン・マイヤー生存曲線分析。（６Ｈ）Ｐａｎｃ−１の転移モデルのスキーマ。（６Ｉ）Ｐａｎｃ−１転移モデルの生物発光。（６Ｊ）転移性Ｐａｎｃ−１の生物発光シグナル測定。
【図６Ｉ−Ｊ】図６Ａ〜Ｊは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓが異種移植片モデルにおいて抗腫瘍活性を示したことを示す図である。（６Ａ）同所性マウスモデルのスキーマ。ＦＦｌｕｃ標識されたＰａｎｃ−１（２×１０５／マウス）またはＢｘＰＣ−３（１×１０５／マウス）ヒトＰＤＡＣ腫瘍細胞株を、ＮＳＧマウスの膵臓に植込んだ。１２日目までに、対照ＣＤ１９．ＣＡＲ−Ｔ細胞か、あるいはＣＤ２８または４−１ＢＢ共刺激ドメインのいずれかをコードするＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞のいずれかをマウスに注入した（静脈内（ｉ．ｖ．）経路で１０７細胞／マウス）。腫瘍増殖は、Ｔ細胞注入後に毎週、発光イメージングによってモニタリングされた。（６Ｂ）Ｐａｎｃ−１同所性モデルの生物発光。（６Ｃ）ＣＤ１９．ＣＡＲ−Ｔ細胞で処置したマウスの腫瘍移植後５０日目までのＰａｎｃ−１の代表的な超音波（ＵＳ）測定。（６Ｄ）Ｐａｎｃ−１の生物発光シグナル測定。（６Ｅ）ＢｘＰＣ−３同所性モデルの生物発光。（６Ｆ）ＢｘＰＣ−３の生物発光シグナル測定。（６Ｇ）ＢｘＰＣ−３同所性モデルのカプラン・マイヤー生存曲線分析。（６Ｈ）Ｐａｎｃ−１の転移モデルのスキーマ。（６Ｉ）Ｐａｎｃ−１転移モデルの生物発光。（６Ｊ）転移性Ｐａｎｃ−１の生物発光シグナル測定。
【００２５】
【図７−１】図７は、ＣＡＲのＣＤ２８バージョンをコードするプラスミドのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列（配列番号３）と、アミノ酸配列（配列番号１）への翻訳を示す図である。
【図７−２】図７は、ＣＡＲのＣＤ２８バージョンをコードするプラスミドのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列（配列番号３）と、アミノ酸配列（配列番号１）への翻訳を示す図である。
【図７−３】図７は、ＣＡＲのＣＤ２８バージョンをコードするプラスミドのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列（配列番号３）と、アミノ酸配列（配列番号１）への翻訳を示す図である。
【図７−４】図７は、ＣＡＲのＣＤ２８バージョンをコードするプラスミドのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列（配列番号３）と、アミノ酸配列（配列番号１）への翻訳を示す図である。
【図７−５】図７は、ＣＡＲのＣＤ２８バージョンをコードするプラスミドのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列（配列番号３）と、アミノ酸配列（配列番号１）への翻訳を示す図である。
【００２６】
【図８−１】図８は、ＣＡＲの４−１−ＢＢバージョンをコードするプラスミドのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列（配列番号４）と、アミノ酸配列（配列番号２）への翻訳を示す図である。
【図８−２】図８は、ＣＡＲの４−１−ＢＢバージョンをコードするプラスミドのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列（配列番号４）と、アミノ酸配列（配列番号２）への翻訳を示す図である。
【図８−３】図８は、ＣＡＲの４−１−ＢＢバージョンをコードするプラスミドのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列（配列番号４）と、アミノ酸配列（配列番号２）への翻訳を示す図である。
【図８−４】図８は、ＣＡＲの４−１−ＢＢバージョンをコードするプラスミドのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列（配列番号４）と、アミノ酸配列（配列番号２）への翻訳を示す図である。
【図８−５】図８は、ＣＡＲの４−１−ＢＢバージョンをコードするプラスミドのプラスミドマップおよびヌクレオチド配列（配列番号４）と、アミノ酸配列（配列番号２）への翻訳を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明を以下でさらに詳細に説明する。この説明は、本発明を実施することのできるすべての異なる方法の詳細なカタログ、または本発明に追加することのできるすべての特徴であることを意図していない。例えば、一実施形態に関して例示される特徴は、他の実施形態に組み込まれてもよく、特定の実施形態に関して例示される特徴はその実施形態から削除されてもよい。その上、本発明から逸脱しない本開示に照らして、本明細書中で提案される様々な実施形態に対する多数の変形および追加が当業者には明らかであろう。したがって、以下の明細書は、本発明のいくつかの特定の実施形態を例示することを意図し、そのすべての置換、組合せ、および変形を網羅的に指定することを意図していない。
【００２８】
文脈がそうでないことを示していない限り、本明細書に記載される本発明の様々な特徴は任意の組み合わせで使用され得ることが特に意図される。さらに、本発明は、本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載の任意の特徴または特徴の組み合わせが除外または省略され得ることも企図する。
【００２９】
以下の説明では、本明細書に開示される本実施形態の完全な理解を提供するために、特定の量、サイズなどの特定の詳細が示される。しかしながら、このような特定の詳細がなくても本開示を実施することができることは当業者には明らかであろう。多くの場合、そのような詳細などは、本開示の完全な理解を得るために必要ではなく、関連技術分野の当業者の技術の範囲内にあるため、そのような考慮事項などに関する詳細は省略されている。
【００３０】
本発明は、Ｂ７−Ｈ３抗原を有するがん細胞および／またはがん始原細胞（ＣＩＣ）を標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発見に基づく。したがって、本発明は、Ｂ７−Ｈ３抗原を有するがん細胞および／またはＣＩＣを標的化するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供し、ここで、ＣＡＲは、本明細書に記載される成分を含む、それから本質的になる、かつ／またはそれからなる。
【００３１】
よって、一実施形態では、本発明は、アミノ酸配列：
【化３】
2020528744.tif 000005
（ＣＤ２８共刺激ドメインを含むＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【００３２】
もう一つの実施形態では、本発明は、アミノ酸配列：
【化４】
2020528744.tif 000006
（４−１ＢＢ共刺激ドメインを含むＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ）を含む、それから本質的になる、またはそれからなるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。
【００３３】
特定の実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、１、２、３、４、またはそれを超える成分を有し、一部の実施形態では、１、２、３、４またはそれを超える成分は、Ｂ７−Ｈ３抗原を含むがん細胞および／またはＣＩＣに対するＣＡＲの標的化および／または結合を促進するが、場合によっては、１またはそれを超える成分は、ＣＡＲを含む細胞の成長および／または成熟を促進かつ／または維持するのに有用であり得る。
【００３４】
本発明はさらに、本発明のＣＡＲをコードする核酸分子を提供する。一部の実施形態では、核酸分子は、ＣＤ２８共刺激ドメインを含むＢ７−Ｈ３  ＣＡＲをコードする配列番号３のヌクレオチド配列を含むことができる。一部の実施形態では、核酸分子は、４−１ＢＢ共刺激ドメインを含むＢ７−Ｈ３  ＣＡＲをコードする配列番号４のヌクレオチド配列を含むことができる。
【００３５】
本明細書でさらに提供されるのは、本発明の核酸分子を含むベクターである。
【００３６】
一部の実施形態では、本発明は、本発明のＣＡＲを含む細胞を提供し、一部の実施形態では、本発明は、本発明の核酸分子を含む細胞を提供する。
【００３７】
本発明の細胞の限定されない例としては、αβΤ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔｈ１７細胞、γδＴ細胞、およびそれらの任意の組合せが挙げられる。
【００３８】
一部の実施形態では、本発明は、Ｂ７−Ｈ３抗原を認識して結合するＣＡＲを含む細胞傷害性Ｔリンパ球を提供する。細胞傷害性Ｔリンパ球は、ウイルスベクターで形質導入するか、あるいは本発明のＣＡＲをコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは核酸構築物でトランスフェクトすることができ、一部の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号３および／または配列番号４であり得る。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明には、Ｂ７−Ｈ３、細胞質シグナル伝達ドメインの一部または全部、および／あるいは１またはそれを超える共刺激分子の一部または全部(例えば共刺激分子のエンドドメイン)に特異的な抗体、抗原結合断片および／または操作された抗体を有するキメラ抗原受容体を含むように操作されたＴリンパ球が含まれる。具体的な実施形態では、Ｂ７−Ｈ３に対する抗体は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、特定の態様では、抗体は、例えばＨＥＲ２またはＣＤ１９などの細胞表面上の他の標的抗原に指向され得る。特定の実施形態では、細胞質シグナル伝達ドメイン、例えばＴ細胞受容体ζ鎖に由来するものなどを、キメラ抗原受容体と標的抗原の係合（engagement）の後にＴリンパ球の増殖およびエフェクター機能の刺激シグナルを生成するために、キメラ抗原受容体の少なくとも一部として含めることができる。例としては、限定されるものではないが、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＯＸ４０などの共刺激分子由来のエンドドメイン、またはインターロイキン７（ＩＬ７）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）およびインターロイキン１２（ＩＬ１２）などのサイトカイン受容体のシグナル伝達成分が含まれることになる。特定の実施形態では、共刺激分子は、抗原係合の後にＣＡＲによって産生されるＴ細胞の活性化、増殖、および／または細胞毒性を高めるために用いられる。具体的な実施形態では、共刺激分子は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、および４−１ＢＢならびにサイトカイン受容体であり得る。本発明のサイトカイン受容体の限定されない例としては、ＩＬ７およびＩＬ１５が挙げられる。
【００４０】
腫瘍指向性キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させるためのヒトＴリンパ球の遺伝子操作により、タンパク質−抗原のプロセシングおよび提示の異常に起因する腫瘍免疫エスケープ機構を迂回する抗腫瘍エフェクター細胞を産生することができる。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明は、Ｂ７−Ｈ３抗原に特異的な細胞を提供し、前記細胞は、Ｂ７−Ｈ３特異的抗体３７６．９６由来の細胞外抗原結合ドメインを、Ｔ細胞受容体ζ鎖由来の細胞質シグナル伝達ドメイン、および限定されない例として、共刺激分子ＣＤ２８および／または４−１ＢＢのエンドドメインと連結することにより生成される、キメラ抗原受容体を細胞表面に有する。
【００４２】
一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、Ｔ細胞受容体ζ鎖のエフェクタードメインまたはＴ細胞受容体由来の関連するシグナル伝達エンドドメインを含む、それから本質的になる、かつ／またはそれからなることができる。一部の実施形態では、キメラ抗原受容体は配列番号３または配列番号４のヌクレオチド配列にコードされる。よって、本発明は、配列番号３および／または配列番号４のヌクレオチド配列を含むベクター（例えば、ウイルスベクター）をさらに提供し、本発明のＴリンパ球は、キメラ抗原受容体がＴリンパ球で産生される条件下で、配列番号３および／または配列番号４のヌクレオチド配列を含むウイルスベクターで形質導入することができる。
【００４３】
本明細書において使用される、用語「共刺激分子」とは、抗原特異的受容体の係合の後のＴ細胞の活性化、増殖およびエフェクター機能を促進する分子成分を指す。一部の実施形態では、本発明のＣＡＲは、１またはそれを超える（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０など）共刺激分子および／またはその活性断片を含むことができ、その限定されない例には、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢまたは現在公知であるかまたは後に同定される任意のその他の共刺激分子および／またはその活性断片が単独でまたは任意の組合せで含まれる。
【００４４】
さらなる実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、当技術分野で公知であるような検出可能部分および／またはエフェクター分子をさらに含むことができ、その限定されない例には、薬物、毒素、小分子、抗体、および／または抗体断片が単独でまたは任意の組合せで含まれる。
【００４５】
本明細書において使用される、用語「細胞質シグナル伝達ドメイン」とは、細胞の内部に存在し、細胞の内部代謝過程に対して受け取った外部シグナルを伝達し、それによりその表現型および機能を変える役割を担う、共刺激分子またはサイトカイン受容体の成分を指す。
【００４６】
本発明の一部の実施形態では、がん細胞によるＢ７−Ｈ３の過剰発現により、これらの細胞はインビトロおよびインビボでＢ７−Ｈ３  ＣＡＲ発現Ｔ細胞によって標的化されることが可能になり、一部の実施形態では、エンドドメイン（例えば、ＣＤ２８とＯＸ４０分子の両方に由来、および／またはＣＤ２８に由来、および／または４−１ＢＢに由来）の取り込みにより、Ｔリンパ球の共刺激が媒介され、Ｔ細胞の活性化、増殖、ならびに／あるいはＢ７−Ｈ３陽性のがんおよび／またはＣＩＣ細胞に対する細胞毒性が誘導される。
【００４７】
本発明の特定の実施形態では、抗原Ｂ７−Ｈ３に指向されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する遺伝子操作されたＴ細胞を使用してがん細胞を死滅させるための方法がある。一部の実施形態では、このＣＡＲの係合（抗原結合）は、連結されたＴ細胞受容体Ｃ鎖と、共刺激分子ＣＤ２８および４−１ＢＢの活性化を導く。
【００４８】
本発明の特定の実施形態では、ＣＡＲ受容体は、Ｂ７−Ｈ３を認識する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。当業者は、ｓｃＦｖが、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であり、１０〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続されていることを認識する。リンカーは、可撓性のためにグリシンが豊富であることがあり、かつ／あるいは特定の例では溶解度のためにセリンまたはトレオニンを含むことがある。特定の実施形態では、３７６．９６ｓｃＦｖ抗体が本発明のＣＡＲで使用される。ｓｃＦｖは、当技術分野で公知の方法によって作製してよい。
【００４９】
特定の態様では、サイトカイン細胞外ドメイン、または細胞外ドメインとしてその他のリガンド／受容体分子を使用して、腫瘍細胞への標的化をもたらすことができる。
【００５０】
当業者は、Ｔ細胞が、完全に活性化した状態になるために、抗原非特異的である共刺激シグナルを利用することを認識する。特定の場合、それらは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の膜に発現される共刺激分子とＴ細胞との相互作用によって提供される。具体的な実施形態では、キメラ抗原受容体の１またはそれを超える共刺激分子は、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリー、ＴＮＦスーパーファミリー、またはシグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭ）ファミリーに由来する。例となる共刺激分子には、以下の１または複数が任意の組合せで含まれる：Ｂ７−１／ＣＤ８０；ＣＤ２８；Ｂ７−２／ＣＤ８６；ＣＴＬＡ−４；Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１；ＩＣＯＳ；Ｂ７−Ｈ２；ＰＤ−１；Ｂ７−Ｈ３；ＰＤ−Ｌ２；Ｂ７−Ｈ４；ＰＤＣＤ６；ＢＴＬＡ；４−１ＢＢ／ＴＮＦＲＳＦ９／ＣＤ１３７；ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５；４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９；ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８；ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ；ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８；ＢＡＦＦＲ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ；ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４；ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７；ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４；ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７；ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４；ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８；ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４；ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８；ＴＡＣｌ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ；ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５；２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４；ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５；ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８；ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３；ＣＤ２ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７；ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９；ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６；ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２；ＳＬＡＭ／ＣＤ１５０；ＣＤ５８／ＬＦＡ−３；ＣＤ２；イカロス；ＣＤ５３；インテグリンα４／ＣＤ４９ｄ；ＣＤ８２／Ｋａｉ−１；インテグリンα４β１；ＣＤ９０／Ｔｈｙ１；インテグリンα４β７／ＬＰＡＭ−１；ＣＤ９６；ＬＡＧ−３；ＣＤ１６０；ＬＭＩＲ１／ＣＤ３００Ａ；ＣＲＴＡＭ；ＴＣＬ１Ａ；ＤＡＰ１２；ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ；デクチン−１／ＣＬＥＣ７Ａ；ＴＩＭ−４；ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６；ＴＳＬＰ；ＥｐｈＢ６；ＴＳＬＰ  Ｒ；およびＨＬＡ−ＤＲ。
【００５１】
エフェクタードメインは、Ｔリンパ球を部分的に活性化する細胞内シグナルに受容体リガンドが結合する事象を伝達するシグナル伝達ドメインである。適切な共刺激シグナルがなければ、この事象は有用なＴ細胞活性化および増殖には不十分である。本発明のエフェクタードメインの限定されない例は、Ｔ細胞受容体ζ鎖のエフェクタードメインである。
【００５２】
本発明は、アミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列が、本明細書に記載されるアミノ酸配列および／またはヌクレオチド配列と少なくとも６０％（例えば、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４  ９５、９６、９７、９８、９９または１００％）の同一性を有する本発明のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列の実施形態をさらに提供する。本発明はさらに、本明細書に記載されるアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列を包含する。
【００５３】
さらなる実施形態では、本発明は、薬学的に許容され得る担体中の本発明のＣＡＲ、本発明の核酸分子、本発明のベクターおよび／または本発明の細胞を含む、それから本質的になる、および／またはそれからなる組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。
【００５４】
本発明はまた、本発明のＣＡＲを用いる方法を提供する。よって、一実施形態では、本発明は、被験体に有効量の本発明のＣＡＲ、本発明の核酸分子、本発明のベクター、および／または本発明の細胞を投与し、それにより被験体においてＢ７−Ｈ３発現標的細胞集団および／または組織に対するＴ細胞媒介免疫応答を刺激することを含む、被験体においてＢ７−Ｈ３発現標的細胞集団および／または組織に対するＴ細胞媒介免疫応答を刺激する方法を提供する。
【００５５】
もう一つの実施形態では、本発明は、被験体に有効量の本発明のＣＡＲ、本発明の核酸分子、本発明のベクター、および／または本発明の細胞を投与し、それにより被験体に抗腫瘍免疫を提供することを含む、被験体に抗腫瘍免疫（例えば、腫瘍細胞に対する免疫応答）を提供する方法を提供する。
【００５６】
さらなる実施形態では、本発明は、被験体に有効量の本発明のＣＡＲ、本発明の核酸分子、本発明のベクター、および／または本発明の細胞を投与し、それによりＢ７−Ｈ３の発現の増加に関連する疾患または障害を有する被験体を被験体の細胞によって処置することを含む、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）の発現の増加に関連する疾患または障害を有する被験体を被験体の細胞によって処置する方法を提供する。
【００５７】
その上、本発明は、被験体に本発明のＣＡＲを発現するように遺伝子操作されたＴ細胞を投与することを含む、遺伝子操作されたＴ細胞の集団を被験体（例えば、がんと診断された被験体および／または他の点でそれを必要とする被験体）において生成する方法を提供し、ここで、遺伝子操作されたＴ細胞の集団は、被験体への投与後に一定期間（例えば、少なくとも１週間、１カ月間  ２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、９カ月間、１年間、２年間、５年間など）被験体において存続する。
【００５８】
本明細書でさらに提供されるのは、本発明のＣＡＲを発現するように遺伝子操作された細胞を被験体に投与することを含む、遺伝子操作された細胞の集団を被験体（例えば、がんと診断された被験体および／またはそれを必要とする被験体）において拡大増殖する方法であり、ここで、投与された遺伝子操作された細胞は被験体において後代細胞集団を生成する。
【００５９】
本発明のさらなる実施形態では、被験体に有効量の本発明のＣＡＲ、本発明の核酸分子、本発明のベクター、および／または本発明の細胞を投与し、それにより被験体においてがんを処置することを含む、被験体（例えば、それを必要とする被験体）においてがんを処置する方法が提供される。一部の実施形態では、この方法の被験体は、がんの治療を受けたことがある、かつ／またはがんの治療を受けている。
【００６０】
よって、本発明のさらなる実施形態では、本発明は、被験体に、がん細胞および／またはがん始原細胞（ＣＩＣ）の表面のＢ７−Ｈ３抗原を認識するキメラ抗原受容体を有する細胞傷害性Ｔリンパ球を投与することを含む、被験体においてがんを処置する方法を提供する。
【００６１】
本発明のさらなる実施形態では、被験体に有効量の本発明のＣＡＲ、本発明の核酸分子、本発明のベクター、および／または本発明の細胞を投与し、それにより被験体においてがんを予防することを含む、被験体（例えば、それを必要とする被験体）においてがんを処置する方法が提供される。
【００６２】
一実施形態では、本発明は、がん細胞および／またはがん始原細胞（ＣＩＣ）に本発明のＣＡＲを含む細胞を提供すること、あるいはがん細胞および／またはＣＩＣと本発明のＣＡＲを含む細胞を接触させることを含む、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）抗原を有するがん細胞および／またはＣＩＣを標的化する方法を提供する。
【００６３】
本発明の一部の実施形態では、本発明の細胞（例えば、αβΤ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔｈ１７細胞、γδＴ細胞）は、処置が投与される被験体由来の自己細胞であり得る。一部の実施形態では、本発明の細胞は、処置を受ける被験体と同じ種の異なる個体に由来してもよいし、処置を受ける被験体とは異なる種の個体に由来してもよい。
【００６４】
本発明の方法において、がん細胞および／またはＣＩＣは、インビトロ、エクスビボ、および／またはインビボであり得る。一部の実施形態では、細胞は被験体内にあり得る。一部の実施形態では、細胞は自己細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞は自己細胞ではない。一部の実施形態では、細胞は被験体と同じ種の細胞である。一部の実施形態では、被験体の種とは異なる種の細胞である。
【００６５】
さらなる実施形態では、本発明は、ａ）結合複合体が形成し得る条件下で細胞試料と本発明のＣＡＲとを接触させるステップ；およびｂ）結合複合体の検出が細胞試料中のがん細胞および／またはＣＩＣを示す、結合複合体の形成を検出するステップを含む、細胞試料においてがん細胞および／またはがん始原細胞（ＣＩＣ）を検出する方法を提供する。
【００６６】
もう一つの実施形態では、本発明は、ａ）結合複合体が形成し得る条件下で、被験体から得た細胞試料と本発明のＣＡＲとを接触させるステップ；およびｂ）結合複合体の検出が被験体におけるがん細胞および／またはＣＩＣの存在を示す、結合複合体の形成を検出するステップを含む、被験体においてがん細胞および／またはがん始原細胞（ＣＩＣ）を検出する方法を提供する。
【００６７】
本発明の方法において、細胞は、αβΤ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｔｈ１７細胞、γδＴ細胞およびそれらの任意の組合せであり得る。一部の実施形態では、細胞は自己細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞は被験体と同じ種の細胞であり得、一部の実施形態では、細胞は被験体の種とは異なる種の細胞であり得る。
【００６８】
一部の実施形態では、本発明のがんは、Ｂ７−Ｈ３抗原の発現増加または過剰発現に関連するがんであり得、一部の実施形態では、本発明のがん細胞およびＣＩＣは、Ｂ７−Ｈ３抗原の発現増加または過剰発現に関連しないがんの非がん性細胞またはがん細胞と比較してＢ７−Ｈ３抗原を過剰発現し得る。
【００６９】
一部の実施形態では、本発明のがん細胞および／またはＣＩＣは、本発明のＣＡＲとの接触の前、最中および／または後に、ソニックヘッジホッグホモログ（ＳＨＨ）経路の阻害剤であるＬＤＥ２２５と接触させることができる。
【００７０】
本明細書で使用される用語「がん」は、異常な細胞の急速かつ制御されない増殖を特徴とする疾患として定義される。がん細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を介して身体の他の部分に広がることができる、
【００７１】
本発明の方法に従って処置することのできるがんの限定されない例としては、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、骨髄腫、白血病、造血系新生物、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺がん、肝がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、皮膚がん、子宮がん、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、子宮内膜がん、腺癌、乳がん、膵臓がん、結腸直腸がん、肛門がん、肺がん、腎がん、膀胱がん、肝がん、前立腺がん、卵巣がん、原発性または転移性黒色腫、扁平上皮癌、基底細胞癌、脳がん、血管肉腫（ａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、血管肉腫（ｈｅｍａｎｇｉｏｓａｒｃｏｍａ）、頭頚部癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、骨肉腫、精巣がん、胃腸がん、および現在公知であるかまたは後に同定される任意のその他のがんが挙げられる（例えば、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ（１９９６）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．４７：４８１−４９１参照）。
【００７２】
本明細書において使用される用語「自己免疫疾患」は、自己免疫応答から生じる障害として定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切で過剰な反応の結果である。自己免疫疾患の例としては、限定されるものではないが、アディソン（Ａｄｄｉｓｉｏｎ）病、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ  ｇｒｅａｔａ）、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（１型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症状群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症状群、脊椎関節症、甲状腺炎、血管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が特に挙げられる。
【００７３】
本発明の特定の実施形態では、臨床態様のための本発明の方法は、抗がん剤などの過剰増殖性疾患の処置に有効な他の薬剤と組み合わされる。「抗がん」剤は、例えば、がん細胞を死滅させる、がん細胞においてアポトーシスを誘発する、がん細胞の増殖速度を低下させる、転移の発生率または数を低下させる、腫瘍サイズを縮小する、腫瘍増殖を阻害する、腫瘍またはがん細胞への血液供給を減少させる、がん細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進する、がんの進行を防ぐまたは阻害する、および／またはがんを有する被験体の寿命を延長することによって、被験体においてがんに悪影響を及ぼすことができる。より一般的には、これらの他の組成物は、がん細胞を死滅させるかまたはその増殖を阻害するために有効な組み合わせ量で提供されることになる。このプロセスは、がん細胞と、本発明の核酸分子、ベクターおよび／または細胞、ならびに１または複数の薬剤あるいは１または複数の因子とを同時に接触させることを伴うことがある。これは、両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的製剤と細胞とを接触させることによるか、あるいは２つの別個の組成物または製剤と細胞とを同時に接触させることによって達成することができ、ここで、一方の組成物には本発明の核酸分子、ベクターおよび／または細胞が含まれ、他方の組成物には１または複数の第２の薬剤が含まれる。
【００７４】
化学療法剤および放射線療法剤に対する腫瘍細胞の耐性は、臨床腫瘍学における主要な問題を表す。現在のがん研究の１つの目標は、化学療法および放射線療法の有効性を、遺伝子療法と組み合わせることによって改善する方法を見出すことである。例えば、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＨＳ−ｔＫ）遺伝子は、レトロウイルスベクター系によって脳腫瘍に送達されると、抗ウイルス剤ガンシクロビルに対する感受性の誘導に成功した。本発明の状況において、細胞治療は、他のアポトーシス促進剤または細胞周期調節剤に加えて、化学療法、放射線療法、または免疫療法の介入と併用して同様に使用され得ると企図される。
【００７５】
あるいは、本発明の治療法は、数分から数週間の範囲の間隔で１回または複数回の他の薬剤処置の前および／または後に行うことができる。他の薬剤と本発明が別々に個体に適用される実施形態では、一般に、薬剤と本発明の治療法が細胞に対して有利な併用効果をなお発揮することが可能なように、各送達の時間の間にかなりの時間が経って期限が過ぎないようにするものである。そのような場合、互いに約１２〜２４時間以内、より好ましくは、互いに約６〜１２時間以内に細胞を複数のモダリティと接触させ得ることが企図される。しかし、一部の状況では、それぞれの投与の間に数日（２、３、４、５、６または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週間）が経過する場合には、処置の期間を大幅に延長することが望ましいことがある。
【００７６】
処置サイクルは、必要に応じて繰り返されると予測される。また、様々な標準的治療、ならびに外科的介入を本発明の細胞治療と組み合わせて適用することができることも企図される。
【００７７】
がん治療には、化学に基づく処置および放射線に基づく処置の両方と組み合わせた多様な併用療法も含まれる。併用化学療法には、例えば、アブラキサン、アルトレタミン、ドセタキセル、ハーセプチン、メトトレキサート、ノバントロン、ゾラデックス、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア（ｎｉｔｒｏｓｕｒｅａ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ｐｌｉｃｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン（ｇｅｍｃｉｔａｂｉｅｎ）、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ（ｔａｎｓｆｅｒａｓｅ）阻害剤、トランス白金（transplatinum）、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、あるいは前述の任意の類似体または誘導改変体が含まれる。
【００７８】
具体的な実施形態では、Ｂ７−Ｈ３陽性がんのための化学療法は本発明と併用して、例えば本発明の投与の前、最中および／または後に用いられる。
【００７９】
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範に使用されているその他の因子には、ガンマ線、Ｘ線、および／または腫瘍細胞への放射性同位体の指向性送達として一般に公知のものが含まれる。マイクロ波および紫外線照射などのＤＮＡ損傷因子のその他の形態も企図される。これらの因子はすべて、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に対する広範囲の損傷に影響を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）に対する５０〜２００レントゲンの一日線量から２０００〜６０００レントゲンの単回線量までの範囲である。放射性同位体の線量範囲は大きく異なり、同位体の半減期、放出される放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【００８０】
用語「接触させる」、「提供される」および「曝露させる」は、細胞に適用される場合、本明細書において、例えば、標的細胞内および／または標的細胞上の標的抗原へのＣＡＲとの結合を促進する条件下で、治療薬（例えば、ＣＡＲ）が標的細胞に送達され、かつ／または標的細胞と直接並置されるプロセスを説明するために使用される。一部の実施形態では、化学療法および／または放射線療法は、細胞の死滅または静止を達成するためのステップとの接触または曝露または提供の前、後および／または最中に含めることもでき、ここで、両方の薬剤は、細胞を死滅させるかまたは細胞が分裂することを防ぐのに有効な合計量で細胞に送達される。
【００８１】
免疫療法は一般に、がん細胞を標的化して破壊するために免疫エフェクター細胞および分子の使用に依拠する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上の一部のマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は、単独で治療のエフェクターとして働く場合もあれば、細胞の死滅に実際に影響を及ぼすために他の細胞を動員する場合もある。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）とコンジュゲートされ、単に標的化剤として働く場合がある。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を保有するリンパ球であってよい。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。
【００８２】
免疫療法は、従って本発明の細胞治療と併用して併用療法の一部として用いることができ得る。併用療法の一般的なアプローチは本明細書において考察されている。一般に、腫瘍細胞は、標的化に適している、すなわち他の細胞の大部分には存在しない、いくつかのマーカーを有していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれもが、本発明の状況での標的化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーとしては、癌胎児抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂおよびｐ１５５が挙げられる。
【００８３】
本発明のがんのための免疫療法には、例えば、インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターフェロン（ＩＦＮ）が含まれてよい。
【００８４】
さらに別の実施形態では、二次処置は、治療用ポリヌクレオチドが本発明の臨床的実施形態の前、後、および／または同時に投与される遺伝子療法であり得る。細胞増殖の誘導因子、細胞増殖の阻害因子、またはプログラム細胞死の調節因子をはじめとする、多様な発現産物が本発明の範囲内に包含される。
【００８５】
がんを有する人の約６０％は何らかの種類の手術を受けることになる、それには予防手術、診断的または病期決定手術、根治手術および待期手術が含まれる。根治手術は、他の治療法、例えば本発明の処置、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替療法などと併用して使用されてよいがんの処置である。
【００８６】
根治手術には、がん性組織の全部または一部を物理的に除去、切除、および／または破壊する切除術が含まれる。腫瘍切除術とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を指す。腫瘍切除術に加えて、手術による処置には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡制御手術（モース術）が含まれる。本発明は、表在性がん、前がん、または偶発的な量の正常組織の除去と併用して使用され得ることがさらに企図される。
【００８７】
がん性細胞、組織、または腫瘍のすべての一部を切除すると、体内に空洞が形成されることがある。処置は、追加の抗がん療法による領域の灌流、直接注射、または局所適用によって達成されてよい。そのような処置は、例えば、１、２、３、４、５、６、または７日ごと、あるいは１、２、３、４、および５週ごと、あるいは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２カ月ごとに繰り返すことができる。これらの処置も同様に様々な投与量のものであってよい。
【００８８】
処置の治療効果を改善するために、他の薬剤を本発明と組み合わせて使用され得ることが企図される。これらの追加の薬剤としては、免疫調節剤、細胞表面受容体およびギャップジャンクションのアップレギュレーションに影響を及ぼす薬剤、細胞分裂阻害剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、またはアポトーシス誘導物質に対する過剰増殖性細胞の感受性を高める薬剤が挙げられる。免疫調節剤としては、腫瘍壊死因子；インターフェロンα、β、およびγ；ＩＬ−２およびその他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよび他のサイトカイン類似体；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、およびその他のケモカインが挙げられる。さらに、細胞表面受容体またはそれらのリガンド（例えば、Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬ）のアップレギュレーションは、過剰増殖性細胞に対するオートクリンまたはパラクリン効果の確立によって本発明のアポトーシス誘導能を増強することになることが企図される。ギャップジャンクションの数を増やすことによって細胞間シグナル伝達を増加させると、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖効果が増加することになる。その他の実施形態では、細胞分裂阻害剤または分化剤を本発明と組み合わせて使用して、処置の抗過剰増殖効力を改善することができる。細胞接着の阻害剤は、本発明の有効性を改善することが企図される。細胞接着阻害剤の例は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。さらに、アポトーシスに対する過増殖性細胞の感受性を増加させる他の薬剤、例えば抗体ｃ２２５などを、本発明と組み合わせて使用して、処置効力を改善することができ得ることが企図される。
【００８９】
定義
本明細書において使用される、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、使用される文脈に応じて、１つまたは複数を意味し得る。例えば、「１つの」細胞は、１個の細胞または複数個の細胞を意味し得る。
【００９０】
また、本明細書において使用される、「および／または」とは、１またはそれを超える関連するリスト項目のありとあらゆる可能性のある組合せと、もう一つの選択肢（「または」）で解釈される場合の組合せの欠如を指し、包含する。
【００９１】
さらに、本発明の化合物または薬剤の量、用量、時間、温度などの測定可能な値に言及する場合に本明細書において使用される用語「約」は、指定された量の±２０％、±１０％、±５％、±１％、±０．５％、またはさらには±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００９２】
本明細書において使用される、移行句「から本質的になる」は、特許請求の範囲が、特許請求される本発明の請求項に列挙された特定の材料またはステップ、「および１または複数の基本的かつ新規な特性に実質的に影響を及ぼさない材料またはステップ」を包含すると解釈されるべきであることを意味する。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ，５３７  Ｆ．２ｄ  ５４９，５５１−５２，１９０  ＵＳＰＱ  ４６１，４６３（ＣＣＰＡ  １９７６）（オリジナルの強調）を参照されたい；ＭＰＥＰ§２１１１．０３も参照されたい。よって、本発明の請求項で使用される場合の用語「から本質的になる」は、「含む」と同等であると解釈されることを意図しない。
【００９３】
また、本明細書において使用される、「１またはそれを超える」とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などを意味する。
【００９４】
本発明により治療され得る被験体には、医学的および／または治療目的のヒト被験体と、獣医学および薬物スクリーニングおよび開発目的の動物被験体の両方が含まれる。その他の適切な動物被験体は、一般に、霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ類、げっ歯類（例えば、ラットおよびマウス）などの哺乳動物被験体である。ヒト被験体が最も好ましい。ヒト被験体には、胎児、新生児、乳幼児、若年、成人および老年被験体が含まれる。
【００９５】
用語「抗腫瘍効果」とは、本明細書において、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞の数の減少、増殖速度の低下、転移数の減少、平均余命の増加、および／またはがん性状態に関連する様々な生理学的症状の改善によって表されることのできる生物学的効果を指す。「抗腫瘍効果」は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞および抗体が最初に腫瘍の発生を予防および／または遅延させる能力によっても表され得る。
【００９６】
用語「自己抗原」とは、本発明によれば、免疫系によって異物と誤って認識される任意の自己抗原を意味する。自己抗原は、限定されるものではないが、細胞タンパク質、リンタンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、および糖タンパク質（細胞表面受容体を含む）を含む。
【００９７】
本明細書において使用される、用語「自己」は、その物質が後に再導入される同じ個体に由来する任意の物質を指すことを意味する。
【００９８】
「同種」とは、同じ種の異なる動物に由来する移植片を指す。
【００９９】
「異種」とは、異なる種の動物に由来する移植片を指す。
【０１００】
本明細書において使用される「処置する」または「処置すること」とは、疾患または障害を有するか、あるいは疾患または障害を有するかまたは発症するリスクのある被験体に利益を与えるあらゆる種類の処置を指し、それには、例えば、被験体の状態（例えば、１またはそれを超える症状）の改善および／または症状の進行の減速などが含まれる。
【０１０１】
本明細書において使用される、「予防する」、「予防すること」または「予防」には、例えば、障害に関連する症状の発現の欠如または遅延によって決定される、障害の発症または進展を予防するための被験体の予防的処置が含まれる。本明細書において使用される、「予防する」、「予防すること」または「予防」は、必ずしも症状の完全な消滅を意味しない。
【０１０２】
本明細書において使用される「処置有効量」、「有効量」、「処置するために有効な量」または同種のものは、本発明の疾患、障害および／または状態を有する患者に望ましい効果をもたらすのに十分な、本発明の抗体またはその断片またはＣＡＲまたは細胞の量を意味する。これには、患者の状態（例えば、１またはそれを超える症状）の改善、疾患の進行の遅延などが含まれる。
【０１０３】
本明細書において使用される「薬学的に許容され得る」は、化合物または組成物が、疾患の重症度および処置に必要性に照らして過度に有害な副作用なく、本明細書に記載される処置を達成するための被験体への投与に適していることを意味する。
【０１０４】
１つまたは複数の「抗体」とは、本明細書において、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを含むすべての種類の免疫グロブリンを指す。用語「免疫グロブリン」には、これらの免疫グロブリンのサブタイプ、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４などが含まれる。抗体は、（例えば）マウス、ラット、ウサギ、ウマ、またはヒトを含む任意の種の起源のものであってもよく、あるいはキメラまたはヒト化抗体であってもよい。本明細書において使用される用語「抗体」には、標的抗原との結合能を保持する抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、ならびにＩｇＧ以外の抗体から得られた対応する断片が含まれる。そのような断片は、既知の技法によっても生成される。一部の実施形態では、抗体は、既知の技術に従って、検出可能基または治療基にカップリングまたはコンジュゲートされ得る。
【０１０５】
さらに、用語「抗体」は、本明細書において、ジスルフィド結合によって相互接続された４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を指すことが意図される。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶＨと略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶＬと略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（ＣＬ１）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化され得る。本発明の抗体またはその抗原結合断片の様々な実施形態では、ＦＲは、ヒト生殖系列配列と同一であってもよいし、天然または人工的に改変されていてもよい。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲで構成され、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端に配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【０１０６】
一般的に、本発明の抗体およびその抗原結合断片は、非常に高い親和性を有し、一般に、細胞表面に提示された抗原との結合によって測定した場合に、約１０−８から約１０−１２Ｍまたはそれより高い、例えば、少なくとも１０−８Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１１Ｍ、または少なくとも１０−１２ＭのＫＤ値を有する。
【０１０７】
本発明の抗体およびその抗原結合断片は、非常に高い親和性を有し、一般に、細胞表面に提示された抗原との結合によって測定した場合に、約１０−８から約１０−１２Ｍまたはそれより高い、例えば、少なくとも１０−８Ｍ、少なくとも１０−９Ｍ、少なくとも１０−１０Ｍ、少なくとも１０−１１Ｍ、または少なくとも１０−１２ＭのＥＣ５０値を有する。
【０１０８】
抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」（または単に「抗体部分」または「抗体断片」）という用語は、本明細書において、抗原と特異的に結合する能力を保持する抗体の１またはそれを超える断片、部分またはドメインを指す。全長抗体の断片は、抗体の抗原結合機能を行うことができることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ１およびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦ（ａｂ）’断片を含む二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ２４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組み換え法を使用して、ＶＬ領域とＶＨ領域が対になって一価分子を形成している単一の連続鎖として作製することを可能にする合成リンカーによって連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎら（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照）。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含されることが意図される。一本鎖抗体のその他の形態、例えばダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）なども包含される（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８を参照）。
【０１０９】
用語「エピトープ」とは、パラトープとして公知の抗体分子の可変領域の特定の抗原結合部位と相互作用する抗原決定基を指す。１つの抗原は、２またはそれを超えるエピトープを有することがある。エピトープはコンフォメーションまたは線状のいずれかであってよい。コンフォメーションエピトープは、１つ（または複数）の線状ポリペプチド鎖の異なるセグメント由来の、空間的に並置されたアミノ酸によって生成される。線状エピトープは、ポリペプチド鎖中の隣接するアミノ酸残基によって生成されるエピトープである。特定の実施形態では、エピトープには、他の部分、例えば糖類、ホスホリル基、またはスルホニル基などが抗原上に含まれてよい。
【０１１０】
用語「抗体断片」とは、無傷の抗体の一部分を指し、無傷の抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片、線状抗体、ｓｃＦｖ抗体、および抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【０１１１】
「抗体重鎖」とは、本明細書において、その天然に存在するコンフォメーションにあるすべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの大きい方を指す。
【０１１２】
「抗体軽鎖」とは、本明細書において、その天然に存在するコンフォメーションにあるすべての抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖のうちの小さい方を指し、κおよびλ軽鎖とは、２つの主な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【０１１３】
本明細書において使用される「合成抗体」という用語は、例えば本明細書に記載されるバクテリオファージによって発現される抗体などの組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を意味する。この用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成され、そのＤＮＡ分子が抗体タンパク質、または抗体を特定するアミノ酸配列を発現する抗体を意味すると解釈されるべきであり、ここで、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、利用可能であって当技術分野で周知の合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を使用して得られている。
【０１１４】
本明細書において使用される用語「抗原」または「Ａｇ」は、免疫応答を誘発する分子と定義される。この免疫応答には、抗体産生、または特定の免疫学的に適格な細胞の活性化、またはその両方のいずれかが含まれ得る。実質的にすべてのタンパク質またはペプチドを含むどんな高分子も抗原として働くことができることを当業者は理解するであろう。さらに、抗原は、組み換えＤＮＡまたはゲノムＤＮＡに由来し得る。免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、そのため、その用語が本明細書において使用される「抗原」をコードすることを当業者は理解するであろう。さらに、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列によってのみコードされる必要がないことを当業者は理解するであろう。本発明が、限定されるものではないが、複数の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用を含むこと、およびこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を誘発するために様々な組合せで配置されることは容易に明らかである。さらに、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要が全くないことを当業者は理解するであろう。抗原を合成によって生成することができること、または生体試料から誘導することができることは容易に明らかである。そのような生体試料としては、限定されるものではないが、組織試料、腫瘍試料、細胞または生物学的流体を挙げることができる。
【０１１５】
本明細書で使用されるアミノ酸とは、遊離カルボキシル基および遊離非置換アミノ基をα炭素上に有する化合物を指し、これはペプチド結合により連結されて、本明細書に記載されるペプチド活性剤を形成することができる。アミノ酸は、標準または非標準、天然または合成であってよく、例（およびその略語）としては、限定されるものではないが、以下が含まれる：
Ａｓｐ＝Ｄ＝アスパラギン酸
Ａｌａ＝Ａ＝アラニン
Ａｒｇ＝Ｒ＝アルギニン
Ａｓｎ＝Ｎ＝アスパラギン
Ｃｙｓ＝Ｃ＝システイン
Ｇｌｙ＝Ｇ＝グリシン
Ｇｌｕ＝Ｅ＝グルタミン酸
Ｇｌｎ＝Ｑ＝グルタミン
Ｈｉｓ＝Ｈ＝ヒスチジン
Ｉｌｅ＝Ｉ＝イソロイシン
Ｌｅｕ＝Ｌ＝ロイシン
Ｌｙｓ＝Ｋ＝リジン
Ｍｅｔ＝Ｍ＝メチオニン
Ｐｈｅ＝Ｆ＝フェニルアラニン
Ｐｒｏ＝Ｐ＝プロリン
Ｓｅｒ＝Ｓ＝セリン
Ｔｈｒ＝Ｔ＝トレオニン
Ｔｒｐ＝Ｗ＝トリプトファン
Ｔｙｒ＝Ｙ＝チロシン
Ｖａｌ＝Ｖ＝バリン
Ｏｒｎ＝オルニチン
Ｎａｌ＝２−ナフチルアラニン
Ｎｖａ＝ノルバリン
Ｎｌｅ＝ノルロイシン
Ｔｈｉ＝２−チエニルアラニン
Ｐｃｐ＝４−クロロフェニルアラニン
Ｂｔｈ＝３−ベンゾチエニルアラニン（ｂｅｎｚｏｔｈｉｅｎｙａｌａｎｉｎｅ）
Ｂｉｐ＝４，４’−ビフェニルアラニン
Ｔｉｃ＝テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸
Ａｉｂ＝アミノイソ酪酸
Ａｎｂ＝α−アミノノルマル酪酸
Ｄｉｐ＝２，２−ジフェニルアラニン
Ｔｈｚ＝４−チアゾリルアラニン
【０１１６】
本明細書において言及されるすべてのペプチド配列は、Ｎ末端アミノ酸が左側にあり、Ｃ末端アミノ酸が右側にある通常の慣例に従って書かれている。２つのアミノ酸残基間の短い線（または線なし）は、ペプチド結合を示す。
【０１１７】
塩基性アミノ酸」とは、ｐＨ６．０で正に帯電している任意のアミノ酸を指し、それには、限定されるものではないが、Ｒ、Ｋ、およびＨが挙げられる。
【０１１８】
芳香族アミノ酸」とは、α炭素に結合した側鎖に芳香族基を有する任意のアミノ酸を指し、それには、限定されるものではないが、Ｆ、Ｙ、Ｗ、およびＨが挙げられる。
【０１１９】
疎水性アミノ酸」とは、α炭素に結合した疎水性側鎖を有する任意のアミノ酸を指し、それには、限定されるものではないが、Ｉ、Ｌ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、ＷおよびＣ、最も好ましくはＩ、Ｌ、およびＶが挙げられる。
【０１２０】
中性アミノ酸」とは、非荷電アミノ酸、例えばＭ、Ｆ、Ｗ、ＣおよびＡなどを指す。
【０１２１】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的な類似性」または「実質的に類似している」という用語は、２つのペプチド配列が、デフォルトのギャップ重みを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適にアライメントされた場合に、少なくとも９５％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％の配列同一性を共有することを意味する。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の化学的性質（例えば、電荷または疎水性）をもつ側鎖（Ｒ基）を有する別のアミノ酸残基で置換されるものである。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能特性を実質的に変更しない。２またはそれを超えるアミノ酸配列が保存的置換によって互いに異なる場合、類似性のパーセントまたは程度を上方に調整して、置換の保存的性質を修正することができる。この調整を行う手段は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９４）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３３１を参照されたい。同様の化学的性質をもつ側鎖を有するアミノ酸の基の例としては、１）脂肪族側鎖：グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン；２）脂肪族ヒドロキシル側鎖：セリンおよびトレオニン；３）アミド含有側鎖：アスパラギンおよびグルタミン；４）芳香族側鎖：フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファン；５）塩基性側鎖：リジン、アルギニン、およびヒスチジン；６）酸性側鎖：アスパラギン酸およびグルタミン酸、ならびに７）硫黄含有側鎖：システインおよびメチオニンが挙げられる。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。あるいは、保存的置換は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｏｎｎｅｔら（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：１４４３  ４５に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度行列において正の値を持つ任意の変更である。「適度に保存的な」置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度行列において負ではない値を持つ任意の変更である。
【０１２２】
ポリペプチドの配列類似性は、一般に、配列分析ソフトウェアを使用して測定される。タンパク質分析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含む、様々な置換、欠失、およびその他の修飾に割り当てられた類似性の尺度を使用して、類似の配列をマッチさせる。例えば、ＧＣＧソフトウェアには、ＧＡＰおよびＢＥＳＴＦＩＴなどのプログラムが含まれており、これらのプログラムは、異なる種の生物由来の相同ポリペプチドなどの密接に関連したポリペプチド間、あるいは野生型タンパク質とその変異タンパク質との間の配列相同性または配列同一性を決定するためにデフォルトパラメータと共に使用することができる。例えば、ＧＣＧバージョン６．１を参照されたい。ポリペプチド配列は、ＦＡＳＴＡを使用してデフォルトパラメータまたは推奨パラメータと比較することもできる（ＧＣＧバージョン６．１のプログラム）。ＦＡＳＴＡ（例えば、ＦＡＳＴＡ２およびＦＡＳＴＡ３）は、クエリ配列と検索配列との間の最良のオーバーラップ領域のアライメントおよび配列同一性パーセントを提供する（ピアソン（２０００）前出）。本発明の配列を異なる生物由来の多数の配列を含むデータベースと比較する場合のもう一つの好ましいアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用するコンピュータプログラムＢＬＡＳＴ、特にＢＬＡＳＴＰまたはＴＢＬＡＳＴＮである。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３  ４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９  ４０２を参照されたい。これらの各々は、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
「治療基」とは、任意の適した治療基を意味し、それには、限定されるものではないが、放射性核種、化学療法剤および細胞傷害性薬剤が含まれる。
【０１２４】
本明細書に記載される「放射性核種」は、治療線量の放射線を腫瘍またはがん細胞に送達するのに適した任意の放射性核種であってよく、それには、限定されるものではないが、２２７Ａｃ、２１１Ａｔ、１３１Ｂａ、７７Ｂｒ、１０９Ｃｄ、５１Ｃｒ、６７Ｃｕ、１６５Ｄｙ、１５５Ｅｕ、１５３Ｇｄ、１９８Ａｕ、１６６Ｈｏ、１１３ｍＩｎ、１１５ｍＩｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８９Ｉｒ、１９１Ｉｒ、１９２Ｉｒ、１９４Ｉｒ、５２Ｆｅ、５５Ｆｅ、５９Ｆｅ、１７７Ｌｕ、１０９Ｐｄ、３２Ｐ、２２６Ｒａ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、４６Ｓｃ、４７Ｓｃ、７２Ｓｅ、．７５Ｓｅ、１０５Ａｇ、８９Ｓｒ、３５Ｓ、１７７Ｔａ、１１７ｍＳｎ、１２１Ｓｎ、１６６Ｙｂ、１６９Ｙｂ、９０Ｙ、２１２Ｂｉ、１１９Ｓｂ、１９７Ｈｇ、９７Ｒｕ、１００Ｐｄ、１０１ｍＲｈ、および２１２Ｐｂが含まれる。
【０１２５】
本明細書において使用される「細胞傷害性薬剤」には、限定されるものではないが、リシン（またはより具体的にはリシンＡ鎖）、アクラシノマイシン、ジフテリア毒素が含まれる。モネンシン、ベルカリンＡ、アブリン、ビンカアルカロイド、トリコテセン、およびシュードモナス外毒素Ａ。
【０１２６】
本明細書において使用される「検出可能基」には、当技術分野で周知であり、既知技法に従って使用される、任意の適した検出可能基、例えば放射性標識（例、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、緑色蛍光タンパク質など）などが含まれる。
【０１２７】
製剤および投与
以下に記載される使用方法で投与するために、活性剤（例えば、本発明の抗体またはその抗原結合断片、細胞、核酸分子および／またはベクター）は、一般に、投与前に、無毒の薬学的に許容され得る担体物質（例えば、生理食塩水またはリン酸緩衝食塩水）と混合され、任意の医学的に適切な手順、例えば、静脈内または動脈内注射などによる非経口投与（例えば、注射）を使用して投与されることになる。
【０１２８】
上記の活性剤は、既知技法に従って薬学的担体での投与のために処方され得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（最新版）を参照されたい。本発明による薬学的製剤の製造では、活性化合物（その生理学的に許容され得る塩を含む）は、一般に、とりわけ許容され得る担体と混合される。担体は、当然、製剤中の任意のその他の構成成分と適合性があるという意味で許容され得なければならず、被験体に有害であってはならない。担体は液体であってもよく、好ましくは、０．０１重量％または０．５重量％〜９５重量％または９９重量％の活性化合物を含有し得る単位用量製剤として化合物とともに処方される。担体は、無菌であるか、他の点で被験体への投与または送達に望ましくない汚染物質を含まないであろう。
【０１２９】
非経口投与に適した本発明の製剤は、活性化合物の無菌の水性および非水性注射液を含み、その調製物は、好ましくは対象とする被験体の血液と等張である。これらの調製物は、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および製剤を、対象とする被験体の血液と等張にする溶質を含有してよい。
【０１３０】
活性剤は、任意の医学的に適切な手順、例えば、通常の静脈内または動脈内投与により投与することができる。特定の例では、腫瘍および／または体腔、開口部および／または腫瘍を含有する組織への直接投与が望ましいことがある。
【０１３１】
活性剤は、無菌の（ｓｔｅｒｉｌｅ  ａｓｅｐｔｉｃ）容器に凍結乾燥形態で提供されてもよいし、無菌発熱物質非含有水または無菌発熱物質非含有生理食塩溶液などの薬学的に許容され得る担体と組み合わせた医薬製剤で提供されてもよい。
【０１３２】
本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞はまた、本発明の被験体におけるエクスビボ免疫化および／またはインビボ治療法のための一種のワクチンとして働くことができる。
【０１３３】
エクスビボ免疫化を伴う一部の実施形態では、細胞を被験体に投与する前に、以下の少なくとも１つがインビトロで行われる：ｉ）細胞の拡大増殖、ｉｉ）本発明のＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入、および／またはｉｉｉ）細胞の凍結保存。
【０１３４】
エクスビボ手順は当技術分野で周知であり、以下でさらに詳しく考察される。手短に言えば、細胞を哺乳動物（好ましくはヒト）から単離し、本発明のＣＡＲを発現しているベクターを用いて遺伝的に改変する（すなわちインビトロで形質導入またはトランスフェクトする）。得られるＣＡＲ改変細胞を本発明の被験体に投与して、治療的利益を提供することができる。一部の実施形態では、被験体はヒトであり得、ＣＡＲ改変細胞は、ＣＡＲ改変細胞のレシピエントである被験体に関して自己であり得る。あるいは、細胞は、ＣＡＲ改変細胞のレシピエントである被験体に関して同種、同系または異種であり得る。
【０１３５】
エクスビボ免疫のための細胞系ワクチンの使用に加えて、本発明はまた、本発明の被験体の抗原に指向される免疫応答を誘発および／または増強するインビボ免疫化のための組成物および方法も提供する。
【０１３６】
一般に、本明細書に記載されるように活性化および拡大増殖させた細胞は、被験体（例えば、免疫無防備状態であるか、免疫無防備状態になるリスクのある被験体）に生じる疾患および／または障害の処置および／または予防に使用することができる。
【０１３７】
本発明のＣＡＲ改変Ｔ細胞は、単独で、あるいは希釈剤と、かつ／またはＩＬ−２および／または他のサイトカイン類および／または細胞集団などの他の成分と組み合わせて医薬組成物として投与されてよい。手短に言えば、本発明の医薬組成物は、本明細書に記載される標的細胞集団を、１またはそれを超える薬学的にまたは生理的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤を組み合わせて含むことができる。そのような組成物は、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水、滅菌食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡおよび／またはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）および／または保存料を、単独でまたは任意の組合せで含んでよい。
【０１３８】
本発明の医薬組成物は、処置および／または予防される疾患に適切な方法で投与することができる。投与の量および頻度は、被験体の状態、ならびに被験体の疾患の種類および重症度などの要因によって決定されることになるが、一部の実施形態では、適切な投与量は、臨床試験によって決定される場合がある。
【０１３９】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」、または「治療量」が示されている場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および患者（被験体）の状態の個々の差を考慮して医師が決定することができる。一部の実施形態では、本発明の細胞を含む医薬組成物は、約１０３〜約１０１０細胞／ｋｇ体重の投与量で投与することができ、一部の実施形態では、投与量は、約１０５〜約１０６細胞／ｋｇ体重であり得る（その範囲内のすべての整数値（例えば、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９）を含む）。
【０１４０】
本発明の細胞組成物は、これらの投与量で複数回投与することもできる（例えば、１時間ごと、１日４回、１日３回、１日２回、毎日、週２回、週３回、毎週、毎月、隔月、半年ごと、毎年など）。
【０１４１】
本発明の細胞は、免疫療法で一般的に公知の注入技法を使用することによって投与され得る（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：１６７６（１９８８）を参照）。特定の被験体に対する最適な投与量および処置レジメンは、被験体を疾患の徴候についてモニタリングし、それに応じて処置を調整することにより、医学分野の当業者によって容易に決定することができる。
【０１４２】
一部の実施形態では、活性化Ｔ細胞を被験体に投与し、その後に再び採血（またはアフェレシスを実施）し、本明細書に記載されるようにそこからＴ細胞を活性化し、これらの活性化し拡大増殖したＴ細胞を被験体に再注入することが望ましいことがある。このプロセスは、複数回、例えば、毎週または数週間ごとに実行することができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、約１０ｃｃ〜約４００ｃｃの採血から活性化することができる。特定の実施形態では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または１００ｃｃの採血から活性化される。理論に縛られるものではないが、この複数回の採血／複数回の再注入プロトコルを使用することは、Ｔ細胞の特定の集団を選択するのに役立ち得る。
【０１４３】
本発明の組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸血、植込みおよび／または移植を含む、任意の方法で行うことができる。本発明の組成物は、患者の皮下、皮内、腫瘍内（ｍｔｒａｔｕｍｏｒａｌｌｙ）、結節内、髄内、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、かつ／または腹腔内に投与することができる。一部の実施形態では、本発明のＴ細胞組成物は、皮内または皮下注射により被験体に投与することができる。もう一つの実施形態では、本発明のＴ細胞組成物は、ｉ．ｖ．注射により投与することができる。一部の実施形態では、Ｔ細胞の組成物は、腫瘍、リンパ節および／または感染部位に直接注射することができる。
【０１４４】
本発明の一部の実施形態では、本明細書に記載される方法、またはＴ細胞が治療レベルまで拡大増殖される当技術分野で公知の他の方法を用いて活性化および拡大増殖された細胞は、任意の数の関連する処置様式と併用して（例えば、その前、それと同時および／またはその後に）被験体に投与することができる。
【０１４５】
一部の実施形態では、本発明のＴ細胞は、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレート、およびＦＫ５０６など、抗体、またはＣＡＭ  ＰＡＴＨなどのその他の免疫アブレーション剤、抗ＣＤ３抗体またはその他の抗体療法、細胞毒素、フルダラビン（ｆｌｕｄａｒｉｂｉｎｅ）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに／または（ａｎｄ／ｏ）照射法と組み合わせて使用することができる。
【０１４６】
一部の実施形態では、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、フルダラビンなどのいずれかの化学療法剤を使用するＴ細胞除去療法、外部照射放射線療法（ｅｘｔｅｒｎａｌ−ｂｅａｍ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）（ＸＲＴ）、シクロホスファミド、または抗体、例えば、ＯＫＴ３またはＣＡＭＰＡＴＨと併用して（例えば、その前、それと同時および／またはその後に）患者に投与することができる。もう一つの実施形態では、本発明の細胞組成物は、ＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンなどのＢ細胞除去療法の後に投与することができる。例えば、一実施形態では、被験体は、高用量化学療法とそれに続く末梢血幹細胞移植による標準的な処置を受ける場合がある。特定の実施形態では、移植の後、被験体は本発明の拡大増殖された免疫細胞の注入を受けることができる。さらなる実施形態では、拡大増殖された細胞は、手術の前および／または後に投与することができる。
【０１４７】
がんまたは腫瘍の処置において、本発明のＣＡＲおよび／またはＣＡＲをコードする核酸分子は、必要に応じて、本明細書に記載される障害または状態の処置に有用な、他の異なる細胞傷害性薬剤、例えば、化学療法剤または抗腫瘍性化合物または放射線療法と併用して投与されてよい（例えば、化学療法剤または抗腫瘍性化合物）。その他の化合物が、本発明の抗体またはその抗原結合断片の投与の前に、同時におよび／または後に投与されてもよい。本明細書において使用される、「同時に」という語は、併用効果を生じるほど十分に時間が近いことを意味する（すなわち、同時には、同時点であってもよいし、互いに前後する２またはそれを超える投与であってもよい）。
【０１４８】
本明細書において、語句「放射線療法」には、限定されるものではないが、ビームなどの外部から適用される線源から送達されるか、または小型の放射性線源の植込みによって送達される、Ｘ線またはガンマ線が含まれる。
【０１４９】
本明細書に記載される抗体または抗原結合断片、細胞、核酸分子および／またはベクターとともに投与されてよい適した化学療法剤の限定されない例としては、ダウノマイシン、シスプラチン、ベラパミル、シトシンアラビノシド、アミノプテリン、デメコルチン（ｄｅｍｏｃｏｌｃｉｎｅ）、タモキシフェン、アクチノマイシンＤ、アルキル化剤（限定されないが、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソウレアおよびトリアゼンを含む）：ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（シトキサン（登録商標））、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ピポブロマン、トリエチレン−メラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン、およびテモゾロミド；代謝拮抗剤（限定されないが、葉酸拮抗剤、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含む）：メトトレキサート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、およびゲムシタビン、天然産物およびそれらの誘導体（例えば、ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカインおよびエピポドフィロトキシン）：ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、Ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（パクリタキセルは、タキソール（登録商標）として市販されている）、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（特にＩＦＮ−ａ）、エトポシド、およびテニポシドが挙げられる；その他の抗増殖性細胞傷害性薬剤は、ナベルビン（ｎａｖｅｌｂｅｎｅ）、ＣＰＴ−１１、アナストラゾール、レトラゾール（ｌｅｔｒａｚｏｌｅ）、カペシタビン、レロキサフィン（ｒｅｌｏｘａｆｉｎｅ）、シクロホスファミド、イホスファミド（ｉｆｏｓａｍｉｄｅ）、およびドロロキサフィン（ｄｒｏｌｏｘａｆｉｎｅ）である。さらなる抗増殖性細胞傷害性薬剤としては、限定されるものではないが、メルファラン、ヘキサメチルメラミン、チオテパ、シタラビン、エダトレキサート（ｉｄａｔｒｅｘａｔｅ）、トリメトレキサート、ダカルバジン、Ｌ−アスパラギナーゼ、カンプトテシン、トポテカン、ビカルタミド、フルタミド、ロイプロリド、ピリドベンゾインドール誘導体、インターフェロン、およびインターロイキンが挙げられる。好ましいクラスの抗増殖性細胞傷害性薬剤は、ＥＧＦＲ阻害剤、Ｈｅｒ−２阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、およびハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）である。（例えば、米国特許第６，５３７，９８８号；米国特許第６，４２０，３７７号を参照されたい）。そのような化合物は、その投与に関して現在公知の技法に従って与えられてよい。
【０１５０】
本発明の抗体には、抗体がその結合部位と特異的に結合することが共有結合によって妨げられないように、改変された、すなわち、任意の種類の分子と抗体との共有結合によって改変された抗体が含まれる。例えば、本発明の抗体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化によって、またはその他の保護基／ブロッキング基、タンパク質分解性切断、細胞リガンドまたは他のタンパク質との連結などによって改変されてよい。多数の化学修飾のいずれかが既知技法によって実行されてよく、それには、限定されるものではないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などが含まれる。さらに、抗体は、１またはそれを超える非古典的アミノ酸を含有し得る。
【０１５１】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術、またはそれらの組み合わせの使用を含む幅広い種類の技法を使用して調製することができる。例えば、モノクローナル抗体は、例えば、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；およびＨａｍｍｅｒｌｉｎｇら、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１）に教示されるものを含む、ハイブリドーマ法を使用して産生することができる。本明細書において使用される用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって産生される抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核生物、原核生物、またはファージクローンを含む単一のクローンに由来する抗体を指し、それが産生される方法ではない。
【０１５２】
ハイブリドーマ技術を使用して特定の抗体を産生し、それについてスクリーニングするための方法は日常的であり、公知である。手短に言えば、マウスを抗原またはかかる抗原を発現する細胞で免疫化する。免疫応答が検出されると、例えば、抗原に特異的な抗体がマウス血清中で検出されると、マウス脾臓を回収し、脾細胞を単離する。次に、脾細胞を既知技法によって任意の適した骨髄腫細胞、例えばＡＴＣＣより入手可能な細胞株ＳＰ２０由来の細胞と融合させる。ハイブリドーマを選択し、限界希釈によってクローニングする。次に、ハイブリドーマクローンを、本発明のポリペプチドまたは抗原に結合することのできる抗体を分泌する細胞について当技術分野で公知の方法によりアッセイする。一般に高レベルの抗体を含有する腹水は、マウスを陽性のハイブリドーマクローンで免疫化することによって生成することができる。
【０１５３】
一本鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）および抗体を産生するために使用することのできる技法の例としては、米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２５８，４９８号；Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２０３：４６−８８（１９９１）；Ｓｈｕら、ＰＮＡＳ  ９０：７９９５−７９９９（１９９３）；およびＳｋｅｒｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１０３８−１０４０（１９８８）に記載されるものが挙げられる。
【０１５４】
本明細書において使用される用語「ヒト化」とは、ヒトで自然に産生される抗体改変体との類似性を高めるためにそのアミノ酸配列が改変されている非ヒト種由来の抗体を指す。よって、ヒト化抗体は、望ましい抗原に結合する非ヒト種抗体由来の抗体分子であり、非ヒト種由来の１またはそれを超える相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する。しばしば、ヒトフレームワーク領域のフレームワーク残基は、ドナー抗体由来の対応する残基で置換されて、被験体におけるヒト化抗体の抗原結合を変化させ、好ましくは改善し、かつ／あるいは免疫原性を低下させる。これらのフレームワーク置換は、抗原結合および／または免疫原性および特定の位置の異常なフレームワーク残基を識別するための配列比較に重要なフレームワーク残基を識別するために、当技術分野で周知の方法によって、例えば、ＣＤＲとフレームワーク残基の相互作用をモデリングすることによって識別される。（例えば、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｑｕｅｅｎら、米国特許第５，５８５，０８９号；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３  （１９８８）を参照。）  抗体は、例えば、ＣＤＲグラフティング（例えば、米国特許第５，２２５，５３９号；同第５，５３０，１０１号；および同第５，５８５，０８９号参照。）、ベニアリング(veneering)またはリサーフェシング(resurfacing)（例えば、欧州特許第５９２，１０６号；欧州特許第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２８（４／５）：４８９−４９８（１９９１）；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７（６）：８０５−８１４（１９９４）；Ｒｏｇｕｓｋａら、ＰＮＡＳ  ９１：９６９−９７３（１９９４）参照）、および鎖シャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）をはじめとする当技術分野で公知の多様な技法を使用してヒト化することができる。本発明のヒト化モノクローナル抗体の産生および特徴付けの詳細な説明は、本明細書中の実施例の項に記載されている。
【０１５５】
ヒト被験体の治療的処置、診断、および／または検出には、完全ヒト抗体が望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを使用して、上記のファージディスプレイ法を含む、当技術分野で公知の多様な方法によって作製することができる。例えば、米国特許第４，４４４，８８７号および同第４，７１６，１１１号を参照されたい。
【０１５６】
ヒト抗体は、機能的な内因性免疫グロブリンを発現することはできないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することのできるトランスジェニックマウスを使用して産生することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、ランダムに、または相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入してもよい。あるいは、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚性幹細胞に導入してもよい。マウスの重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別々にまたは同時に非機能性にすることができる。特に、ＪＨ領域のホモ接合型欠失は、内因性の抗体産生を妨げる。改変された胚性幹細胞は拡大増殖され、胚盤胞に微量注入されて、キメラマウスを生成する。次に、キメラマウスを交配させて、ヒト抗体を発現するホモ接合子孫を生成する。トランスジェニックマウスは、選択された抗原、例えば本発明のポリペプチドの全部または一部によって通常の方法で免疫化される。抗原に対して指向されるモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を使用して、免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞の分化中に再配列し、その後クラススイッチングと体細胞変異を受ける。よって、そのような技法を使用して、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ（１９９５，Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３）を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術ならびにそのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細な考察については、例えば、米国特許第５，４１３，９２３号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６６１，０１６号；同第５，５４５，８０６号；同第５，８１４，３１８号および同第５，９３９，５９８号を参照されたい。
【０１５７】
選択されたエピトープを認識する完全ヒト抗体は、「ガイド付き選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる技法を使用して生成することができる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体、例えばマウス抗体を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択をガイドする。（Ｊｅｓｐｅｒｓら、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１２：８９９−９０３（１９８８））。
【０１５８】
さらに、今度は本発明のポリペプチドに対する抗体を利用して、当業者に周知の技法を使用して本発明のポリペプチドを「模倣する」抗イディオタイプ抗体を生成することができる。（例えば、Ｇｒｅｅｎｓｐａｎ  ＆  Ｂｏｎａ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７（５）：４３７−４４４；（１９８９）およびＮｉｓｓｉｎｏｆｆ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（８）：２４２９−２４３８（１９９１）を参照）。例えば、結合して、ポリペプチドの多量体化および／または本発明のポリペプチドとリガンドとの結合を競合的に阻害する抗体を使用して、ポリペプチドの多量体化および／または結合ドメインを「模倣」し、その結果、ポリペプチドおよび／またはそのリガンドに結合して中和する抗イディオタイプを生成することができる。そのような中和抗イディオタイプまたはそのような抗イディオタイプのＦａｂ断片は、ポリペプチドリガンドを中和するための治療レジメンで使用することができる。例えば、そのような抗イディオタイプ抗体を使用して、本発明のポリペプチドに結合し、かつ／またはそのリガンド／受容体に結合し、それによりその生物活性を遮断することができる。
【０１５９】
本発明はさらに、上記の本発明のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。当技術分野で公知の任意の方法によって、ポリヌクレオチドを得ることができ、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が決定され得る。例えば、キメラ抗原受容体の成分のヌクレオチド配列が既知の場合、成分をコードするポリヌクレオチドは、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから組み立てられてよく、それには、キメラ抗原受容体の成分をコードする配列の部分を含有する重複オリゴヌクレオチドの合成、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーション、その後のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるライゲーションされたオリゴヌクレオチドの増幅を伴う。あるいは、キメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドは、適した供給源からの核酸から生成され得る。次に、ＰＣＲによって生成された増幅核酸は、当技術分野で周知の任意の方法を使用して複製可能なクローニングベクターにクローニングされ得る。
【０１６０】
本発明は、以下の限定されない実施例においてさらに詳細に説明される。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより完全に例示するために提示される。しかし、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６１】
実施例１．
Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６）は、Ｉ型膜貫通タンパク質であり、Ｔ細胞に対する阻害効果を有するリガンドのＢ７スーパーファミリーのメンバーである。Ｂ７−Ｈ３はいくつかのヒト悪性疾患で高度に発現し、その発現は不良な生存と相関している。Ｂ７−Ｈ３は、腫瘍細胞で発現するが、正常組織での分布が限定されているため、本発明者らはＢ７−Ｈ３をキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）再指向化Ｔ細胞の標的として選択した。注目すべきは、Ｂ７−Ｈ３特異的ＣＡＲを誘導したｍＡｂ  ３７６．９６は、正常組織では検出できない規定のＢ７−Ｈ３エピトープを標的化するため、「標的ではあるが腫瘍以外」の認識に起因する潜在的な副作用をさらに最小限に抑える。さらに、このエピトープは、がん始原細胞および腫瘍関連脈管構造および線維芽細胞で高度に発現される。本発明者らは、ｍＡｂ３７６．９６から得た一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）からＣＡＲを生成した。Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲは遺伝子導入されるとヒトＴリンパ球によって安定して発現されることができ、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ改変Ｔ細胞はＢ７−Ｈ３陽性細胞を特異的に認識して効率的に排除し、ヒトおよびマウスＢ７−Ｈ３の両方と交差反応することができることを本発明者らは見出した。本発明者らは、Ｂ７−Ｈ３が膵臓がん（ＰＤＡＣ）細胞株で高度に発現し、インビトロでＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓによって効率的に除去され得る（ＣＤ２８または４−１−ＢＢのいずれかを共刺激ドメインとして使用）ことを見出した。インビボ実験では、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＮＳＧマウスの全身性転移モデルと同所性膵臓モデルの両方で膵臓腫瘍細胞を有効に標的化することが示された。Ｂ７−Ｈ３の広範な腫瘍発現を考慮して、本発明者らは、多くの種類の固形および液性ヒト腫瘍の処置のための、ｍＡｂ３７６．９６に由来するＢ７−Ｈ３．ＣＡＲの適用可能性を見込んでいる。
【０１６２】
細胞株。ヒト膵臓腫瘍細胞株Ｐａｎｃ−１、ＢｘＰＣ−３、Ｐａｎｃ−１０．０５、Ｃａｐａｎ−１、Ｈｐａｆ−ＩＩおよびＡｓＰＣ−１を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）より購入した。２９３Ｔ、Ｐｈｅｎｉｘ  ＥｃｏおよびＣａｐａｎ−１細胞株は、１０％  ＦＢＳ（シグマ）、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘ（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ、インビトロジェン）で培養した。ＢｘＰＣ−３、Ｐａｎｃ−１０．０５、ＫＰＣ−４６６２は、１０％  ＦＢＳおよび２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘを補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ＡｓＰＣ−１は、１０％  ＦＢＳ、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘおよび１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。Ｐａｎｃ−１細胞は、１０％  ＦＢＳおよび２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘを補充したＤＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）で培養した。Ｈｐａｆ−ＩＩは、１０％  ＦＢＳおよび２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭａｘを補充したＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）で培養した。ペニシリン（１００単位／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）（Ｇｉｂｃｏ）をすべての細胞培養培地に添加した。細胞は、３７℃の、５％ＣＯ２を含有する加湿雰囲気下で維持された。Ｐａｎｃ−１、Ｐａｎｃ−１０．０５、ＢｘＰＣ−３、Ｈｐａｆ−ＩＩ、Ｃａｐａｎ−１およびＡｓｐｃ−１細胞は、ｅＧＦＰをコードするレトロウイルスベクターで形質導入し、Ｒａｊｉ細胞は、ヒトまたはマウスＢ７−Ｈ３ｃｄｎａのいずれかをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。マウス膵臓腫瘍細胞株ＫＰＣ−４６６２は、マウスＢ７−Ｈ３ｃｄｎａをコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。Ｐａｎｃ−１およびＢｘＰＣ−３細胞も、ｅＧＦＰ−ホタル−ルシフェラーゼ（ｅＧＦＰ−ＦＦｌｕｃ）遺伝子をコードするレトロウイルスベクターで形質導入した。すべての細胞株は実験の過程で日常的にチェックされ、常にマイコプラズマがないことが見いだされ、必要に応じて表面マーカーのフローサイトメトリーおよび機能的読み出しによって日常的に検証された。
【０１６３】
プラスミドの構築およびレトロウイルスの産生。全長ヒト２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３（受託番号ＮＭ＿００１３２９６２８）および４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３（受託番号ＮＭ＿００１０２４７３６）遺伝子を、Ｐａｎｃ−１細胞株から生成したｃＤＮＡからＰＣＲによって増幅し、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩ制限部位を使用してレトロウイルスベクターＳＦＧにクローニングした。マウスＢ７−Ｈ３（受託番号ＮＭ＿１３３９８３）を、ＩｎＶｉｖｏｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から得たプラスミドからＰＣＲによって増幅し、ＮｃｏＩおよびＭｌｕＩ制限部位を使用してレトロウイルスベクターＳＦＧにクローニングした。ヒトＢ７−Ｈ３に特異的なｓｃＦｖ．３７６．９６を、ＮｃｏＩおよびＭｌｕＩ制限部位を使用してレトロウイルスベクターＳＦＧにクローニングした。Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲのカセット全体を図３Ａに例示する。レトロウイルス上清を前述の通り調製した。手短に言えば、ＧｅｎｅＪｕｉｃｅトランスフェクション試薬（Ｎｏｖａｇｅｎ）を使用して、２９３Ｔ細胞に３つのプラスミド（レトロウイルス構築物、ｇａｇ−ｐｏｌをコードするＰｅｇ−Ｐａｍ−ｅ、およびＲＤ１１４エンベロープをコードするＲＤＦ）を同時導入し、４８時間および７２時間後に上清を回収した。
【０１６４】
Ｔ細胞の形質導入および拡大増殖。健康なドナーのバフィーコートは、テキサス州ヒューストンのガルフコースト地域血液センターから入手した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐ密度分離（Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ  Ｋａｂｉ  Ｎｏｒｇｅ）で分離し、１μｇ／ｍＬ  抗ＣＤ３（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）および１μｇ／ｍＬ  抗ＣＤ２８（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体被覆プレートを使用して活性化させた。３日目に、レトロネクチン被覆プレート（タカラバイオ株式会社、滋賀、日本）を使用して、Ｔリンパ球にレトロウイルス上清を形質導入した。レトロネクチンプレートから取り出した後、Ｔ細胞を、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍＬ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）およびＩＬ−１５（５ｎｇ／ｍＬ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含む、完全培地（４５％  ＲＰＭＩ−１６４０および４５％  クリック培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１０％ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ、１００単位／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン）で拡大増殖させ、２〜３日毎に培地を交換した。１２〜１４日目に、インビトロまたはインビボ実験のために細胞を回収した。Ｔ細胞を、ＩＬ−７／ＩＬ−１５枯渇培地で２日間培養し、その後機能アッセイを行った。
【０１６５】
免疫組織化学。凍結正常ヒト組織マイクロアレイおよび正常マウス組織マイクロアレイをＵＳ  Ｂｉｏｍａｘより購入した。凍結膵臓がん試料は、ＵＮＣラインバーガー総合がんセンターの組織調達施設から入手した。組織は、ノースカロライナ大学の組織学研究のコア施設で切片化された。スライドを、ＰＢＳ中４％  ＰＦＡで１５分間固定し、室温で３０分間乾燥させ、０．０５％  ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ中１％  ＢＳＡおよび１０％  ウマ血清（Ｃｏｍｐａｎｙ）でブロッキングした。スライドを、ヒトＢ７−Ｈ３に特異的な一次抗体（クローン３７６．９６、１：１０００希釈）を用いて４℃で一晩染色し、ＨＲＰポリマーをコンジュゲートしたヤギ抗マウス二次抗体（Ｄａｋｏ、コードＫ４０００、２５℃で１．５時間１：８希釈）でプローブした。ＤＡＢ色素原（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ）を使用してスライドを発色させ、ＣＡＴヘマトキシリン（Ｂｉｏｃａｒｅ  ｍｅｄｉｃａｌ）で対比染色し、エタノールで脱水し、キシレン（Ｆｉｓｈｅｒ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）で透徹した。組織封入剤（Ｆｉｓｈｅｒ、トルエン溶液）を使用してカバーガラスを加えた。染色したＴＭＡスライドを、Ａｐｅｒｉｏ  ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＸＴ（ライカ）を使用して、２０倍の対物レンズでデジタルイメージングした。組織マイクロアレイスライドの整列を解除して（ｄｅ−ａｒｒａｙ）個々のコアを可視化し、各コアを目視検査した。折り畳まれた組織は、ネガティブペン（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｅｎ）を使用する分析から除外され、他の全てのアーティファクトはＡｐｅｒｉｏ  Ｇｅｎｉｅソフトウェアで自動的に除外された。Ｂ７−Ｈ３染色は、Ａｐｅｒｉｏ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖ９（細胞定量化）アルゴリズムを使用して測定した。各強度レベル（負、低、中、高）でこのアルゴリズムで得た陽性細胞の百分率を使用して、次式を用いてＨスコアを計算した：Ｈスコア＝（１＋の％）＊１＋（２＋の％）＊２＋（３＋の％）＊３。Ｇｅｎｉｅ分類指標を用いるＡｐｅｒｉｏカラーデコンボリューションｖ９アルゴリズムも適用して、陽性染色の面積および強度を計算し、スコア（０〜３００）を生成した。
【０１６６】
ＥＬＩＳＡ  Ｔ細胞（５×１０５または１×１０５）を外因性サイトカインを含まない２４ウェルプレートで、腫瘍細胞（５×１０５）とともに共培養した。２４時間後、上清を回収し、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を製造業者の指示に従って使用することにより、サイトカイン（インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）およびインターロイキン２（ＩＬ２））を測定した。各上清は、三連で測定した。
【０１６７】
フローサイトメトリー。本発明者らは、ＢＶ４２１、ＡＦ４８８、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＰＥ−ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ−ｃｙ５．５、ＡＰＣ、およびＡＰＣ−ｃｙ７蛍光色素とコンジュゲートした、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ３、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ｈＢ７−Ｈ３（クローン７−５１７）、ｍＢ７−Ｈ３（クローンＭＩＨ３２）、ｍＣＤ３、ｍＣＤ４、ｍＣＤ８、ｍＣＤ１１ｂ、ｍＣＤ１１ｃ、ｍＬｙ６ｃＧ、ｍＣＤ１９（すべてＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、カリフォルニア州サンノゼ）およびＣＣＲ７（Ｅ＆Ｄ）に特異的なＡｂｓを使用してフローサイトメトリーを実施した。腫瘍細胞株におけるＢ７−Ｈ３の発現は、抗Ｂ７−Ｈ３特異的Ａｂ（ＢＤのクローン７−５１７、およびクローン３７６．９６）により評価した。Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲの発現は、Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｌ（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）および抗Ｆａｂ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）を使用して検出した。試料は、ＢＤ  Ｄｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＢＤ  ＦＡＣＳｃａｎｔｏ  ＩＩまたはＢＤ  ＦＡＣＳｆｏｒｔｅｓｓａで分析し、各試料について本発明者らは最低１０，０００個の事象を取得し、Ｆｌｏｊｏ  １０を使用してデータを分析した。
【０１６８】
長期インビトロ細胞傷害活性。腫瘍細胞を２４ウェルプレートに５×１０５／ウェルの濃度で播種した。Ｔ細胞を、外因性サイトカインを添加せずに異なる比（Ｅ：Ｔが１：１、１：５、または１：１０）で培養に添加した。細胞を５〜７日目までに分析して、残留腫瘍細胞およびＴ細胞をＦＡＣＳにより測定した。死細胞をＺｏｍｂｉｅ  Ａｑｕａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）染色によって除去し、Ｔ細胞および腫瘍細胞を、ＣＤ３、ＧＦＰ（膵臓がん細胞株および線維芽細胞）、ＣＤ１９（Ｒａｊｉ、Ｒａｊｉ−２ＩｇＢ７−Ｈ３、Ｒａｊｉ−４ＩｇＢ７−Ｈ３およびＲａｊｉ−ｍＢ７−Ｈ３）およびｍＢ７−Ｈ３（ＫＰＣ−４６６２およびＫＰＣ−４６６２−ｍＢ７−Ｈ３）の発現によって識別した。
【０１６９】
増殖アッセイ。Ｔ細胞を１．５ｍＭカルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；インビトロジェン）で標識し、腫瘍細胞標的を１：１のＥ：Ｔ比で蒔いた。ＣＦＳＥ希釈は、５日目までにフローサイトメトリーを使用してＣＤ３＋Ｔ細胞で測定した。
【０１７０】
異種マウスモデル。ＮＳＧマウスを使用して、対照および形質導入したＴ細胞のインビボ抗腫瘍効果を評価した。すべてのマウス実験は、ノースカロライナ大学チャペルヒル校の動物実験委員会によって承認された。全身性転移モデルに対し、８〜１０週齢の雄および雌ＮＳＧマウス（ＵＮＣ動物施設）に、ＦＦｌｕｃを形質導入したＰａｎｃ−１（１×１０６）かまたはＢｘＰＣ−３（１×１０６）腫瘍細胞を静脈内注射し、腫瘍細胞接種の１４日後に、形質導入していないＴ細胞、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−２８またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−ＢＢ  Ｔ細胞を静脈内注射した（マウスあたり１×１０７細胞）（図６Ｈ）。膵臓同所性モデルには、ＦＦｌｕｃを形質導入したＰａｎｃ−１（２×１０５）またはＢｘＰＣ−３（１×１０５）腫瘍細胞を、２５μＬ  ＤＰＢＳに懸濁し、２５μＬ  マトリゲル（コーニング）と混合し、次に２８ゲージ針を使用して、８〜１０週齢の雄マウスの膵臓に外科的に植込んだ。手短に言えば、左脇腹に切開を行い、２８ゲージ針を使用して、マトリゲルと混合した腫瘍細胞を膵臓の尾部に注入した。創傷は、連続する４−０のＶｉｃｒｙｌ、および創傷クリップまたは皮膚用のポリプロピレン縫合糸で２枚の層で閉じた。腫瘍細胞接種の１２日後、ＣＤ１９．ＣＡＲ−Ｔ（対照）またはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔ細胞を静脈注射した（マウスあたり１×１０７細胞）（図６Ａ）。ランダム化は使用しなかった。調査者は盲検化されていなかったが、マウスは対照群または処置群に割り当てる前に腫瘍細胞のシグナルに基づいて一致させた。腫瘍増殖は、ＩＶＩＳ  ｌｕｍｉｎａ  ＩＩインビボイメージングシステム（パーキンエルマー）を使用して、毎週、生物発光イメージングによってモニタリングした。マウスは、調査者によって不快感の徴候が検出された時、またはマウスを週３回モニタリングする獣医が推奨した時、または動物の生存を調べるルシフェラーゼシグナルが２×１０１１光子／秒／ｃｍ２に達した時に、安楽死させた。腫瘍標本を収集し、ＩＨＣ染色のために急速凍結してＢ７−Ｈ３発現を検出した。
【０１７１】
統計分析。特に断りのない限り、データは平均値±標準偏差として報告した。スチューデントのｔ検定（両側）を使用して、試料間の統計的有意差を決定した。Ｐ＜０．０５は有意差を示す。Ｐｒｉｓｍバージョン５．０ｄソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）を使用して、グラフ生成および統計分析を実施した。
【０１７２】
Ｂ７−Ｈ３は膵臓がん組織で高度に発現するが正常ヒト組織では発現しない。正常ヒト組織でのＢ７−Ｈ３の発現を評価するため、凍結正常ヒト組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）スライドを３７６．９６ｍＡｂで染色した。凍結ヒト膵管腺癌（ＰＤＡＣ）組織を陽性対照として使用した。図１Ａに示されるように、ＰＤＡＣ組織はＢ７−Ｈ３陽性であった。抗原は腫瘍細胞と間質線維芽細胞の両方で発現するが、正常膵臓はＢ７−Ｈ３陰性である。同様に、６つのヒトＰＤＡＣ腫瘍細胞株およびＰＤＸモデル由来の３つの原発性膵臓腫瘍細胞株は、Ｂ７−Ｈ３陽性である（図１Ｂ〜Ｃ）。心臓、肺、肝臓、腎臓、脾臓、筋肉、大脳、小脳、脊髄および末梢神経を含む正常ヒト組織は、Ｂ７−Ｈ３陰性であった（図２）。副腎、唾液腺、前立腺の上皮細胞、および皮膚の基底層で弱い陽性が検出された（図２）。
【０１７３】
Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓは、Ｂ７−Ｈ３陽性細胞を特異的に標的とし、ヒトおよびマウスＢ７−Ｈ３の両方と交差反応する。本発明者らは、３７６．９６ｍＡｂを使用してＢ７−Ｈ３．ＣＡＲを生成した。ハイブリドーマ３７６．９６から得たｓｃＦｖ配列を、ヒトＣＤ８αヒンジおよび膜貫通ドメイン、ＣＤ２８または４−１−ＢＢ細胞内共刺激ドメインおよびＣＤ３ζ細胞内シグナル伝達ドメインを含む、以前に検証済みのＣＡＲ形式にクローニングした。Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲカセットをレトロウイルスベクターＳＦＧにクローニングした。これを図３Ａに示す。Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓの形質導入効率は６５％〜８５％である（図３Ｂ）。Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓの特異性を検証するために、Ｂ７−Ｈ３陰性である腫瘍細胞株Ｒａｊｉを、ヒトＢ７−Ｈ３の２つのアイソフォーム（４Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３および２Ｉｇ−Ｂ７−Ｈ３）かまたは対応するマウスＢ７−Ｈ３（ｍＢ７−Ｈ３）のいずれかを発現するように遺伝的に改変した。これらの細胞の単細胞クローンを得た（図３Ｃ）。次に、対照と、Ｂ７−Ｈ３を発現しているＲａｊｉ細胞を、対照かまたはＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓとともに共培養した。図３Ｄに示されるように、ＣＤ２８かまたは４−１−ＢＢ共刺激ドメインのいずれかをコードするＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓは、Ｂ７−Ｈ３を発現しているＲａｊｉ細胞を特異的に標的化した。Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓはまた、ｍＢ７−Ｈ３を発現しているＲａｊｉ細胞も標的化し、３７６．９６ｍＡｂに由来するｓｃＦｖがヒトおよびマウスＢ７−Ｈ３分子の両方を標的化することを実証している（図３Ｄ〜Ｅ）。抗腫瘍効果は、ＩＦＮγおよびＩＬ−２の放出でも類似していた（図３Ｆ〜Ｇ）。
【０１７４】
Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−ＴｓがインビトロでＰＤＡＣ細胞株を標的化する。Ｂ７−Ｈ３を天然に発現する腫瘍細胞株に対するＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓの効果を評価するために、本発明者らは、６つのＰＤＡＣ細胞株を、ＣＤ１９．ＣＡＲ−Ｔｓ（陰性対照）およびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓとともに異なるＴ細胞：腫瘍細胞比で共培養した。図４Ａに示されるように、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓは、１：１０のＴ細胞：腫瘍細胞比であっても、ＰＤＡＣ細胞を有効に除去した（図４Ｂ〜Ｃ）。２つのＰＤＡＣ腫瘍細胞株、ＢｘＰＣ−３およびＰａｎｃ−１０．０５に関して、４−１ＢＢをコードするＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓは、ＣＤ２８をコードするＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓよりも効率的であるように思われた（図４Ｃ）。Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓの細胞溶解活性は、サイトカイン放出（ＩＦＮγおよびＩＬ２）（図４Ｄ〜Ｅ）および増殖（図４Ｆ）によって裏付けられた。Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−ＴｓをＰＤＸ由来のＰＤＡＣ細胞株と共培養した場合にも、同様の結果が得られた（図５Ａ〜Ｆ）。
【０１７５】
Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓは、異種移植片モデルにおける抗腫瘍活性を示す。インビボでのＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓの抗腫瘍効果を調べるために、ＦＦｌｕｃを形質導入したＰａｎｃ−１およびＢｘＰＣ−３腫瘍細胞を、膵臓同所性モデルについての手術によりＮＳＧマウスの膵臓に植込み、対照ＣＤ１９．ＣＡＲ−ＴｓおよびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓで処置した（図６Ａ）。図６Ｂ〜Ｄに示されるように、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓは、Ｐａｎｃ−１腫瘍細胞を有効に除去し、マウスは処置後８０日目まで腫瘍がないままであった。ＢｘＰＣ−３同所性モデルでは、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓも腫瘍を制御したが、このモデルでは４−１ＢＢをコードするＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−ＴｓはＣＤ２８をコードするＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓよりも有効であった（図６Ｅ〜Ｇ）。転移モデルでは、ＦＦｌｕｃを形質導入したＰａｎｃ−１腫瘍細胞を静脈注射によりＮＳＧマウスに植込んだ（図６Ｈ）。その後、マウスをＣＤ１９．ＣＡＲ−ＴｓおよびＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓによる尾静脈注射で処置した。図６Ｉ〜Ｊに示されるように、Ｂ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓは、実験が終了した処置後７０日目までＰａｎｃ−１腫瘍増殖を制御した。このモデルでは、ＣＤ２８かまたは４−１ＢＢのいずれかをコードするＢ７−Ｈ３．ＣＡＲ−Ｔｓの両方が同様の活性を示した。
【０１７６】
本明細書において引用したすべての刊行物、特許出願、特許、特許公報、およびその他の参考文献は、参照が提示されている文および／または段落に関連する教示について、参照によりその全文が組み込まれる。
【０１７７】
【化５】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ−Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−Ｃ】
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【図４Ｄ−Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−Ｃ】
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【図５Ｄ−Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ−Ｂ】
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【図６Ｃ−Ｄ】
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【図６Ｅ−Ｆ】
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【図６Ｇ−Ｈ】
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【図６Ｉ−Ｊ】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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