(57)【要約】本開示は、トランスジェニック細胞の産生および選択のためのスプリットインテイン選択可能マーカー系を提供する。本開示は、一部の実施形態では、真核生物細胞を含む組成物に、２つまたはそれを上回るベクターを送達することを含む方法であって、それぞれのベクターが、（ｉ）Ｎ末端インテインタンパク質断片および／またはＣ末端インテインタンパク質断片に連結された選択可能マーカータンパク質断片をコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｉｉ）目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含み、インテインタンパク質断片が、フレーム内で結合されて全長機能タンパク質を形成すると、選択可能マーカータンパク質断片の結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、方法を提供する。
2020537646.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
真核生物細胞に、
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉ）前記選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片の上流にある、前記インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと
を送達することを含む方法であって、
前記インテインの前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片の結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、方法。
【請求項２】
前記真核生物細胞を、前記第１および第２のベクターの前記真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記全長選択可能マーカータンパク質を含む前記トランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記選択可能マーカータンパク質が、抗生物質耐性タンパク質である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシン、フレオマイシンＤ１、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記抗生物質耐性タンパク質が、ｈｙｇＢ遺伝子、ｂｓｒ遺伝子、ｐａｃ遺伝子、またはｎｅｏ遺伝子によってコードされる、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記選択可能マーカータンパク質が、蛍光タンパク質である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記蛍光タンパク質が、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴａｇＣＦＰ２、Ｃｚｕｒｉｔｅ、ＥＣＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ｃ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、モノマーＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、モノマーＣｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ、モノマーＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＣｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、およびｉＲＦＰから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記インテインが、スプリットインテインである、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記スプリットインテインが、天然のスプリットであり、必要に応じて、天然のスプリットインテインが、ＤｎａＥインテインから選択され、必要に応じて、前記ＤｎａＥインテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインから選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記スプリットインテインが、操作されたスプリットインテインであり、必要に応じて、前記操作されたスプリットインテインが、ＤｎａＢインテインまたはＧｙｒＢインテインから操作され、必要に応じて、前記操作されたスプリットインテインが、ＳｓｐＤｎａＢ  Ｓ１インテインまたはＳｓｐＧｙｒＢ  Ｓ１１インテインである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１および／または第２の分子が、タンパク質または非コーディングリボ核酸（ＲＮＡ）であり、必要に応じて、前記非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、請求項１から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１および／または第２のベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉ）前記選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片の上流にある、前記インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
前記インテインの前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片の結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、真核生物細胞。
【請求項１６】
キットであって、
（ａ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）前記選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片の上流にある、前記インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターとを含み、
前記インテインの前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片の結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、キット。
【請求項１７】
真核生物細胞に、
（ａ）（ｉ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、
（ｃ）（ｉ）前記選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターと
を送達することを含む方法であって、
前記第１のインテインの前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記中央断片への結合を触媒し、前記第２のインテインの前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記Ｃ末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、方法。
【請求項１８】
前記真核生物細胞を、前記第１、第２、および第３のベクターの前記真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項１９】
前記全長選択可能マーカータンパク質を含む前記トランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）（ｉ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、
（ｃ）（ｉ）前記選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
前記第１のインテインの前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記中央断片への結合を触媒し、前記第２のインテインの前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記Ｃ末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、真核生物細胞。
【請求項２１】
キットであって、
（ａ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、
（ｃ）前記選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、前記第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターとを含み、
前記第１のインテインの前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記中央断片への結合を触媒し、前記第２のインテインの前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片が、前記選択可能マーカータンパク質の中央断片の、前記選択可能マーカータンパク質の前記Ｃ末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、合衆国法典第３５巻第１１９条（ｅ）のもとに、２０１８年１月１１日に出願された米国仮出願第６２／６１６，２８１号、２０１７年１２月２０日に出願された米国仮出願第６２／６０８，４７８号、２０１８年１月３１日に出願された米国仮出願第６２／６２４，６２９号、２０１７年１０月１２日に出願された米国仮出願第６２／５７１，６７２号の利益を主張し、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、コンピュータ可読形式の配列表を含み（ファイル名：Ｊ０２２７７０００７ＷＯ００−ＳＥＱ−ＨＪＤ、１．５０ＭＢのＡＳＣＩＩテキストファイル、２０１８年１０月３日に作成）、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれ、本開示の一部をなす。
【背景技術】
【０００３】
選択可能マーカーは、遺伝子導入およびゲノム編集において、所望される遺伝子型を有する操作された細胞を選択するために、広く採用されている。抗生物質耐性遺伝子（抗生物質耐性タンパク質をコードする）は、特定の抗生物質に対する耐性をもたらすため、これらの耐性遺伝子を発現する細胞のみが、生き残り、増殖する。真核生物細胞における使用に利用可能な抗生物質耐性遺伝子／抗生物質としては、ｈｙｇＢ／ハイグロマイシン、ｎｅｏ／Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ（登録商標）／Ｇ４１８、ｐａｃ／ピューロマイシン、Ｓｈ  ｂｌａ／フレオマイシンＤ１（Ｚｅｏｃｉｎ（商標））、およびｂｓｄ／ブラストサイジンが挙げられる。蛍光タンパク質、たとえば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、たとえば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）技法または蛍光顕微鏡検査による、細胞選択の別の手段を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
真核生物（たとえば、哺乳動物）細胞における使用に利用可能な抗生物質耐性遺伝子／抗生物質の数は限られており、したがって、複数の導入遺伝子を含む細胞を特定するための選択スキームは限られている。真核生物細胞において抗生物質耐性を付与する異なる遺伝子の数が限られているだけでなく、３種類程度の異なる抗生物質耐性遺伝子を同時に使用することは、トランスジェニック細胞の健康状態に悪影響を及ぼし得る。抗生物質による選択は、連続的に行うことができるが、このプロセスは、時間がかかる。トランスジェニック細胞を特定するための選択スキームに対するこれらの制限は、（たとえば、トランスジェニック生物、たとえば、動物モデル、たとえば、マウスモデルを生成するために）複数の導入遺伝子が導入されている細胞を特定する必要がある場合には、問題がある。
【０００５】
たとえば、２つまたはそれを上回る導入遺伝子を有する（たとえば、二重トランスジェニック、三重トランスジェニックなどの）細胞および／または生物の産生および／または特定に有用な方法、組成物、およびキットが、本明細書に提供される。たとえば、組成物およびキットは、２つ、３つ、または４つの導入遺伝子を有する細胞および／または生物の産生および／または特定に使用することができる。この技術は、少なくとも部分的に、インテインオートプロセシングドメインによって開始されるタンパク質スプライシング機序に基づき、これは、特に、複数の（たとえば、２つ、３つ、または４つの）別個の選択可能マーカータンパク質断片の多重トランスジェニック細胞（二重トランスジェニック細胞、三重トランスジェニック細胞、または四重トランスジェニック細胞）における結合（コンジュゲーション）を促進する。多重トランスジェニック細胞における２つ、３つ、４つ、またはそれを上回る別個の選択可能マーカータンパク質断片の結合により、たとえば、抗生物質耐性を付与する全長選択可能マーカータンパク質（抗生物質耐性タンパク質）、または適切な波長光下での蛍光が可能な全長選択可能マーカータンパク質（蛍光タンパク質）が得られる。全長抗生物質耐性遺伝子を発現する細胞は、対応する抗生物質の存在下において生き残り、したがって、多重トランスジェニック（たとえば、二重トランスジェニック、三重トランスジェニック、または四重トランスジェニック）細胞として選択される。同様に、全長機能性蛍光タンパク質を発現する細胞は、適切な波長光下において、蛍光を発し、したがって、多重トランスジェニック（たとえば、二重トランスジェニック、三重トランスジェニック、または四重トランスジェニック）細胞として選択される。
【０００６】
したがって、本開示は、一部の実施形態では、真核生物細胞を含む組成物に、２つまたはそれを上回るベクターを送達することを含む方法であって、それぞれのベクターが、（ｉ）Ｎ末端インテインタンパク質断片および／またはＣ末端インテインタンパク質断片に連結された選択可能マーカータンパク質断片をコードするヌクレオチド配列、ならびに（ｉｉ）目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含み、インテインタンパク質断片が、フレーム内で結合されて全長機能タンパク質を形成すると、選択可能マーカータンパク質断片の結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、方法を提供する。たとえば、２つのベクターが細胞の集団に送達されると（たとえば、トランスフェクション条件下において）、一部の細胞は、第１のベクターを取り込み（ベクターが、細胞に導入される）、一部の細胞は、第２のベクターを取り込み、一部の細胞は、両方のベクターを取り込む。両方のベクターを取り込んだ細胞だけが、全長機能性選択可能マーカータンパク質を発現する能力を有するため、これらの細胞のみが、二重トランスジェニック細胞として選択される。
【０００７】
一部の実施形態では、真核生物細胞を含む組成物に、（ａ）（ｉ）Ｎ末端インテインタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列の上流の、第１の選択可能マーカータンパク質断片（たとえば、抗生物質耐性タンパク質断片または蛍光タンパク質断片）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、（ｂ）（ｉ）第２の選択可能マーカータンパク質断片（たとえば、抗生物質耐性タンパク質断片または蛍光タンパク質断片）の上流の、Ｃ末端インテインタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターとを送達することを含む本明細書における方法であって、Ｎ末端インテインタンパク質断片およびＣ末端インテインタンパク質断片が、第１の選択可能マーカータンパク質断片の、第２の選択可能マーカータンパク質断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、方法。２つのベクターが細胞の集団に送達されると（たとえば、トランスフェクション条件下において）、一部の細胞は、第１のベクターを取り込み（ベクターが、細胞に導入される）、一部の細胞は、第２のベクターを取り込み、一部の細胞は、両方のベクターを取り込む。両方のベクターを取り込んだ細胞だけが、全長機能性選択可能マーカータンパク質を発現する能力を有するため、これらの細胞のみが、二重トランスジェニック細胞として選択される。
【０００８】
他の実施形態では、方法は、真核生物細胞に、（ａ）（ｉ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質（たとえば、抗生物質耐性タンパク質または蛍光タンパク質）のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、（ｂ）（ｉ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、（ｃ）（ｉ）選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターとを送達することを含み、第１のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片の、選択可能マーカータンパク質の中央断片への結合を触媒し、第２のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、選択可能マーカータンパク質の中央断片の、選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する。３つのベクターが、細胞の集団に送達されると（たとえば、トランスフェクション条件下において）、一部の細胞は、第１のベクターを取り込み（ベクターが、細胞に導入される）、一部の細胞は、第２のベクターを取り込み、一部の細胞は、第３のベクターを取り込み、一部の細胞は、２つの異なるベクターを取り込み、一部の細胞は、３つすべてのベクターを取り込む。３つすべてのベクターを取り込んだ細胞だけが、全長機能性選択可能マーカータンパク質を発現する能力を有するため、これらの細胞のみが、三重トランスジェニック細胞として選択される。
【０００９】
さらに他の実施形態では、方法は、真核生物細胞に、（ａ）（ｉ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質（たとえば、抗生物質耐性タンパク質または蛍光タンパク質）のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、（ｂ）（ｉ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質の第１の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、（ｃ）（ｉ）第３のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質の第２の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターと、（ｄ）（ｉ）選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第３のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第４のベクターとを送達することを含み、第１のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片の、選択可能マーカータンパク質の第１の中央断片への結合を触媒し、第２のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、選択可能マーカータンパク質の第１の中央断片の、選択可能マーカータンパク質の第２の中央断片への結合を触媒し、第３のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、選択可能マーカータンパク質の第２の中央断片の、選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する。４つのベクターが、細胞の集団に送達されると（たとえば、トランスフェクション条件下において）、一部の細胞は、第１のベクターを取り込み（ベクターが、細胞に導入される）、一部の細胞は、第２のベクターを取り込み、一部の細胞は、第３のベクターを取り込み、一部の細胞は、第４のベクターを取り込み、一部の細胞は、２つの異なるベクターを取り込み、一部の細胞は、３つの異なるベクターを取り込み、一部の細胞は、４つすべてのベクターを取り込む。４つすべてのベクターを取り込んだ細胞だけが、全長機能性選択可能マーカータンパク質を発現する能力を有するため、これらの細胞のみが、四重トランスジェニック細胞として選択される。
【００１０】
実施例または本明細書の１つの節にしか開示されていないものを含め、本明細書に記載される任意の１つの実施形態は、別途明示的に排除されない限り、任意の１つまたは複数の他の実施形態と組み合わせることができることを意図することを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】２つの別個のトランスジェニックベクターの抗生物質による同時選択のためのスプリットされた選択可能マーカー。（図１Ａ）選択可能マーカーのコーディング配列を、Ｎ末端断片（ＭａｒＮ）とＣ末端断片（ｋｅｒＣ）とにスプリットし、それぞれが異なる導入遺伝子を有する２つの異なるベクターにおいて、それぞれ、スプリットインテインのＮ末端断片（ＩｎｔＮ）の上流およびスプリットインテインのＣ末端断片（ＩｎｔＣ）の下流に別個にクローニングする。これらのベクターを、細胞に送達して、ベクターのうちのいずれか一方またはベクターの両方を含む細胞の部分集団を得る。両方のベクターを有する細胞のみにおいて、２つのインテイン−スプリットされた選択可能マーカー断片（「マーカートロン」）の発現が、タンパク質のトランススプライシングを受け、全長選択可能マーカーが再構成され、二重トランスジェニック細胞の特異的な選択および富化が可能となる。（図１Ｂ）抗生物質耐性遺伝子のインテインに適合性のスプリット点をスクリーニングするために、本発明者らは、試験するインテインの種類の接合部要件に応じて、可能性のあるスプリット点を特定し、次いで、対応するＮ末端断片およびＣ末端断片を、ＴａｇＢＦＰ２またはｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質を備えるレンチウイルスベクターにおいて、スプリットインテイン足場にクローニングし、これが、選択効率を評価するための試験導入遺伝子としての機能を果たす。これらを、レンチウイルス形質導入によって細胞に送達する。細胞を、次いで、複製プレートに分け、１つを抗生物質による選択に供し、他方は、非選択培地に維持した。抗生物質による選択の後に、複製培養物を、フローサイトメトリーによって分析した。
【図１Ｂ】同上。
【００１２】
【図２Ａ】インテイン−スプリットされた耐性（Ｉｎｔｒｅｓ）遺伝子（選択可能マーカー遺伝子とも称される）のスプリット点およびプラスミドの詳細。（図２Ａ）ハイグロマイシン耐性タンパク質（配列番号１）のスプリット点である。ハイグロマイシン耐性タンパク質のアミノ酸配列を、この研究において特徴付けたスプリット点を表す吹き出しとともに提示する。ラベル内で、上の段は、表１に対応するプラスミド番号を示す。下の段は、Ｎ末端断片の最後のアミノ酸の残基番号、使用されるインテイン種、およびＣ末端断片の最初のアミノ酸の残基番号を示す。「＾Ｃ」は、システインの挿入を示す。（図２Ｂ）ピューロマイシン耐性タンパク質（配列番号２）のスプリット点である。ピューロマイシン耐性タンパク質のアミノ酸配列を、この研究において特徴付けたスプリット点を表す吹き出しとともに提示する。ラベル内で、上の段は、表１に対応するプラスミド番号を示す。下の段は、Ｎ末端断片の最後のアミノ酸の残基番号、使用されるインテイン種、およびＣ末端断片の最初のアミノ酸の残基番号を示す。「＾Ｃ」は、システインの挿入を示す。（図２Ｃ）ネオマイシン耐性タンパク質（配列番号３）のスプリット点である。ネオマイシン耐性遺伝子のアミノ酸配列を、この研究において特徴付けたスプリット点を表す吹き出しとともに提示する。ラベル内で、上の段は、表１に対応するプラスミド番号を示す。下の段は、Ｎ末端断片の最後のアミノ酸の残基番号、使用されるインテイン種、およびＣ末端断片の最初のアミノ酸の残基番号を示す。（図２Ｄ）ブラストサイジン耐性タンパク質（配列番号４）のスプリット点である。ブラストサイジン耐性遺伝子のアミノ酸配列を、この研究において特徴付けたスプリット点を表す吹き出しとともに提示する。ラベル内で、上の段は、表１に対応するプラスミド番号を示す。下の段は、Ｎ末端断片の最後のアミノ酸の残基番号、使用されるインテイン種、およびＣ末端断片の最初のアミノ酸の残基番号を示す。（図２Ｅ）緑色蛍光タンパク質（配列番号５）のスプリット点である。（図２Ｆ）ｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光タンパク質（配列番号６）のスプリット点である。ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のアミノ酸配列を、この研究において特徴付けたスプリット点を表す吹き出しとともに提示する。ラベル内で、上の段は、表１に対応するプラスミド番号を示す。下の段は、Ｎ末端断片の最後のアミノ酸の残基番号、使用されるインテイン種、およびＣ末端断片の最初のアミノ酸の残基番号を示す。「＾Ｃ」は、システインの挿入を示す。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図２Ｄ】同上。
【図２Ｅ】同上。
【図２Ｆ】同上。
【００１３】
【図３】２マーカートロンのハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏ）のインテイン−スプリットされた耐性（Ｉｎｔｒｅｓ）遺伝子。上の概略図は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の試験したスプリット点を示す。Ｎ末端断片の最後の残基を、ロリポップ（ｌｏｌｌｉｐｏｐ）の上に示す。円形のロリポップは、ＮｐｕＤｎａＥインテインを使用したスプリット点を表すが、一方で四角形のロリポップは、ＳｓｐＤｎａＢインテインを使用したものを表す。斜線および陰影付きのロリポップは、ハイグロマイシン耐性を有する細胞をもたらすことができなかったスプリット対を示す。下のカラムプロットは、フローサイトメトリーによって分析した、非選択培養物（白色のカラム）および選択培養物（青色のカラム）における二重トランスジェニック細胞（ＢＦＰ＋  ｍＣｈｅｒｒｙ＋）の割合を示す。
【００１４】
【図４】２マーカートロンのピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）Ｉｎｔｒｅｓ遺伝子。上の概略図は、ピューロマイシン耐性遺伝子の試験したスプリット点を示し、一方で下のカラムプロットは、非選択培養物（白色のカラム）および選択培養物（茶色のカラム）における二重トランスジェニック細胞の割合を示す。
【００１５】
【図５】２マーカートロンのネオマイシン（Ｎｅｏ）耐性遺伝子。上の概略図は、ネオマイシン耐性遺伝子の試験したスプリット点を示し、一方で下のカラムプロットは、非選択培養物（白色のカラム）および選択培養物（オレンジ色のカラム）における二重トランスジェニック細胞の割合を示す。
【００１６】
【図６】２マーカートロンのブラストサイジン（Ｂｌａｓｔ）Ｉｎｔｒｅｓ遺伝子。上の概略図は、ブラストサイジン耐性遺伝子の試験したスプリット点を示し、一方で下のカラムプロットは、非選択培養物（白色のカラム）および選択培養物（シアンのカラム）における二重トランスジェニック細胞の割合を示す。
【００１７】
【図７Ａ】２マーカートロンのＩｎｔｒｅｓマーカーを有するＧａｔｅｗａｙ適合性レンチウイルスデスティネーションベクター。（図７Ａ）それぞれのスプリットされたＩｎｔｒｅｓマーカーのＧａｔｅｗａｙ適合性レンチウイルスデスティネーションベクターキットは、ＮベクターおよびＣベクターからなる。Ｎベクターは、ウイルスＬＴＲ、ＣＡＧＧＳプロモーター、ｇａｔｅｗａｙデスティネーションカセットＡｔｔＬ、ｃｃｄＢ遺伝子、導入遺伝子を有するＧａｔｅｗａｙドナーベクターのＬＲクロナーゼに媒介される組換えを可能にするクロラムフェニコール耐性遺伝子、続いて、Ｎマーカートロンのポリシストロニック発現を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む。同様に、Ｃベクターは、Ｃマーカートロンを含み、別の導入遺伝子の組換えを可能にする。（図７Ｂ）ＴａｇＢＦＰ２（導入遺伝子１として）およびｍＣｈｅｒｒｙ（導入遺伝子２として）を、Ｇａｔｅｗａｙ組換えによって２マーカートロンのＩｎｔｒｅｓプラスミドにクローニングし、レンチウイルス形質導入によって細胞に送達し、続いて、抗生物質による選択およびフローサイトメトリー分析を行った。カラムプロットは、選択培養物における、２マーカートロンのハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏ、青色のカラム）、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏ、茶色のカラム）、およびネオマイシン（Ｎｅｏ、オレンジ色のカラム）実験により得られたＢＦＰ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋二重陽性細胞の割合を、それらの対応する非選択培養物（白色のカラム）と対比して、示す。（図７Ｃ）ＧＦＰ蛍光で核を標識したＮＬＳ−ＧＦＰ（導入遺伝子１として）およびｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光でＦアクチンを標識したｌｉｆｅＡｃｔ−ｍＳｃａｒｌｅｔ（導入遺伝子２として）を、全長のスプリットされていないハイグロマイシン耐性遺伝子を発現するレンチウイルスベクター、または２マーカートロンのハイグロマイシンＩｎｔｒｅｓ遺伝子を有するレンチウイルスベクターに組み換えて、これを使用して、Ｕ２ＯＳ細胞に形質導入し、二重標識細胞を作製した。代表的な蛍光顕微鏡画像は、２週間のハイグロマイシンによる選択後の細胞のＧＦＰ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、および統合したチャネルを示す。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【００１８】
【図８】２つの別個のトランスジェニックベクターの蛍光に媒介される同時選択のためのスプリットされたｍＳｃａｒｌｅｔ。（図８Ａ）２マーカートロンのｍＳｃａｒｌｅｔタンパク質である。上の概略図は、ｍＳｃａｒｌｅｔの試験したスプリット点を示す。Ｎ末端断片の最後の残基を、ロリポップの上に示す。（図８Ｂ）ｍＳｃａｒｌｅｔのＮｐｕＤｎａＥインテイン適合性スプリット点をスクリーニングするために、本発明者らは、ＮｐｕＤｎａＥインテインの接合部要件に応じて、可能性のあるスプリット点を特定し、次いで、対応するＮ末端断片およびＣ末端断片を、ＴａｇＢＦＰ２またはＥＧＦＰ蛍光タンパク質を備えるレンチウイルスベクターにおいて、スプリットインテイン足場にクローニングし、これが、選択効率を評価するための試験導入遺伝子としての機能を果たす。これらを、レンチウイルス形質導入によって細胞に送達する。両方のレンチウイルスを有する細胞は、全長ｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光タンパク質を再構成するのに必要なタンパク質スプライシング機構およびｍＳｃａｒｌｅｔ断片を含み、ならびにＴａｇＢＦＰ２およびＥＧＦＰ導入遺伝子を発現する。細胞を、ＦＡＣＳ分析に供した。箱型の概略図は、プラスミド対３３＋３４のＦＡＣＳ分析の例を示す。Ｐ１集団を、生存しているシングレット細胞の順方向散乱および側方向散乱についてゲーティングした。そこから、細胞の１７．８％が、ＴａｇＢＦＰおよびＥＧＦＰ導入遺伝子の二重陽性である。Ｐ１細胞を、ｍＳｃａｒｌｅｔ陽性（ｍＣｈｅｒｒｙチャネル）についてさらにゲーティングした場合、細胞の９９．４％が、ＴａｇＢＦＰおよびＥＧＦＰの二重陽性である。（図８Ｃ）下のカラムプロットは、示されるスプリット点のそれぞれのｍＳｃａｒｌｅｔ陽性細胞の割合を示す。上のカラムプロットは、Ｐ１細胞のうちのＴａｇＢＦＰ＋  ＥＧＦＰ＋細胞の割合（白色のカラム）およびＰ１細胞のｍＳｃａｒｌｅｔ陽性サブセットの割合（赤色のカラム）を示す。
【００１９】
【図９−１】３つまたはそれを上回るトランスジェニックベクターの同時選択のための多重スプリットされた選択可能マーカー。（図９Ａ）選択可能マーカーを、３つの断片（Ｍ１、Ｍ２、およびＭ３）に分割する。第１のマーカー断片（Ｍ１）を、第１のスプリットインテインのＮ末端断片（ＩＮ１）の上流に融合する。第２のマーカー断片（Ｍ２）を、第１のスプリットインテインのＣ末端断片（ＩＣ１）の下流および第２のスプリットインテインのＮ末端断片（ＩＮ２）の上流に融合する。第３のマーカー断片（Ｍ３）を、第２のスプリットインテインのＣ末端断片（ＩＣ２）の下流に融合する。第１のスプリットインテインは、Ｍ１のＭ２への結合を触媒し、一方で、第２のスプリットインテインは、Ｍ２のＭ３への結合を触媒し、全長選択可能マーカーを効率的に再構成する。（図９Ｂ）「インテイン連鎖」機序によるｋ個にスプリットされた選択可能マーカーの設計である。３つにスプリットされるシナリオと同様に、選択可能マーカーは、ｋ個の断片に分割し、介在するスプリットインテインにより媒介されるタンパク質のトランススプライシングを通じて再構成される。（図９Ｃ）２つにスプリットされた選択可能マーカーから特定したスプリット点を組み合わせて使用して、３つにスプリットされた選択可能マーカーを産生した。対応する断片を、レンチウイルスベクターにクローニングして、３つにスプリットされた選択可能マーカー構造およびベクターごとのレポーター蛍光導入遺伝子を得た。細胞に、次いで、これらのベクターから調製したウイルスを形質導入し、選択培地または非選択培地に分けた。適切な選択期間の後に、培養物を、フローサイトメトリーによって分析した。（図９Ｄ）３マーカートロンのハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏ）Ｉｎｔｒｅｓである。上の概略図は、ハイグロマイシン耐性遺伝子の試験したスプリット点を、それぞれＮｐｕＤｎａＥおよびＳｓｐＤｎａＢインテインを表す円形または四角形のロリポップの上に示されるＮ末端断片の最後のアミノ酸の残基番号とともに示す。６つの３マーカートロンのハイグロマイシンＩｎｔｒｅｓを試験し、それぞれを、それぞれの場合に使用した２つのスプリット点を示す円形または四角形とともに、番号付けした線で示す。下のカラムプロットは、下部の番号によって示される３マーカートロンのハイグロマイシンＩｎｔｒｅｓの非選択培養物（白色のカラム）および選択培養物（青色のカラム）から得られた三重トランスジェニック（ＢＦＰ＋  ＧＦＰ＋  ｍＣｈｅｒｒｙ＋）細胞の割合を示す。
【図９−２】同上。
【図９−３】同上。
【００２０】
【図１０Ａ】３マーカートロンのハイグロマイシンＩｎｔｒｅｓ遺伝子を有するＧａｔｅｗａｙ適合性レンチウイルスデスティネーションベクター。（図１０Ａ）ウイルスＬＴＲ、ＣＡＧＧＳプロモーター、ｇａｔｅｗａｙデスティネーションカセットＡｔｔＬ、ｃｃｄＢ遺伝子、導入遺伝子を有するＧａｔｅｗａｙドナーベクターのＬＲクロナーゼに媒介される組換えを可能にするクロラムフェニコール耐性遺伝子、続いて、３つの３つにスプリットされたハイグロマイシンマーカートロンのそれぞれのポリシストロニック発現を可能にする内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有する、Ｇａｔｅｗａｙ適合性レンチウイルスデスティネーションベクターである。（図１０Ｂ）ＴａｇＢＦＰ２（導入遺伝子１として）およびＥＧＦＰ（導入遺伝子２として）およびｍＣｈｅｒｒｙ（導入遺伝子３として）を、Ｇａｔｅｗａｙ組換えによって３つにスプリットされたＩｎｔｒｅｓプラスミドにクローニングし、レンチウイルス形質導入によって細胞に送達し、続いて、抗生物質による選択およびフローサイトメトリー分析を行った。（図１０Ｃ）カラムプロットは、ハイグロマイシンでの選択培養物（青色のカラム）とその対応する非選択培養物（白色のカラム）とを対比した、ＢＦＰ＋ＧＦＰ＋ｍＣｈｅｒｒｙ＋三重陽性細胞の割合を示す。
【図１０Ｂ】同上。
【図１０Ｃ】同上。
【００２１】
【図１１】４つにスプリットされたＨｙｇｒｏ  ｉｎｔｒｅｓ。（ａ）４つの異なるプラスミドによって発現される、４つにスプリットされたｈｙｇｒｏ  ｉｎｔｒｅｓのマーカートロンである。プラスミド１１５は、ハイグロマイシン耐性遺伝子のアミノ酸１〜８９［Ｈｙｇｒｏ（１〜８９）］を、ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）およびロイシン（leuzine）ジッパーＡモチーフ（ＬＺＡ）に融合させることによって作製されるマーカートロンを発現する。プラスミド１１６は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ロイシンジッパーＢモチーフ（ＬＺＢ）−ＮｐｕＤｎａＧＥＰ（Ｃ）、Ｈｙｇｒｏ（９０〜２００）、およびＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ）を融合させることによって作製されるマーカートロンを発現する。プラスミド１１７は、Ｎ末端からＣ末端の方向で、ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ）、Ｈｙｇｒｏ（２０１〜２４０）、ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＬＺＡを融合させることによって作製されるマーカートロンを発現する。プラスミド１１８は、ＬＺＢ−ＮｐｕＤｎａＧＥＰ（Ｃ）をＨｙｇｒｏ（２４１〜３４１）に融合させることによって作製されるマーカートロンを発現する。
【００２２】
【図１２Ａ】ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓに媒介されるノックイン実験により得られた両アレル標的化細胞の富化を可能にするＩｎｔｒｅｓマーカー。ＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座の相同性アームを含む標的化構築物対を、全長（ＦＬ）のスプリットされていないかまたはスプリットされたＩｎｔｒｅｓマーカーを含むように設計し、抗生物質による選択を通じて両アレル標的化細胞を富化する能力について試験した。（図１２Ａ）プラスミド１０７および１０８は、ＡＡＶＳ１遺伝子座における内在性ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃプロモーターによって作動されるＦＬネオマイシン（Ｎｅｏ）耐性遺伝子、ＥＦ１ａプロモーターによって作動されるＦＬハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏ）遺伝子およびｒｔＴＡ  Ｄｏｘ応答性トランス活性化因子、ならびにｄｏｘ誘導性ＴｅｔＯプロモーターによって発現されるＦＬブラストサイジン（Ｂｌａｓｔ）ならびにＥＧＦＰ（プラスミド１０７）およびｍＳｃａｒｌｅｔ（プラスミド１０８）を含む。プラスミド１０６は、Ｃａｓ９、およびＡＡＶＳ遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡを含む。２Ａ：自己切断型２Ａペプチドである。プラスミド１０６、１０７、および１０８を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランスフェクトし、ｄｏｘを含むハイグロマイシン、ブラストサイジン、または非選択培地に分け、そこで２週間継代させ、フローサイトメトリーによって分析し、両アレル標的化の効率をアッセイした。（図１２Ｂ）プラスミド１０９および１１０は、プラスミド１０７および１０８と類似の構造を含むが、ＦＬ  Ｂｌａｓｔの代わりに、スプリットされたＢｌａｓｔ  Ｉｎｔｒｅｓを有する。（図１２Ｃ）プラスミド１１１および１１２は、ＥＦ１ａにより作動されるＦＬ  Ｂｌａｓｔ、および２Ａペプチドによって分離された、ＴｅｔＯにより作動されるＦＬ  Ｈｙｇｒｏ、ニトロ還元酵素（ＮＴＲ）、蛍光タンパク質（ＥＧＦＰまたはｍＣｈｅｒｒｙ）を含む。（図１２Ｄ）プラスミド１１３および１１４は、プラスミド１１１および１１２に類似であるが、ＦＬ  Ｈｙｇｒｏの代わりにＨｙｇｒｏ  Ｉｎｔｒｅｓを有する。（図１２Ｅ）ｄｏｘを含む非選択培地（選択：なし）、ブラストサイジン選択培地（Ｂｌａｓｔ）、およびハイグロマイシン選択培地（Ｈｙｇｒｏ）において培養した２週間後の、プラスミド１０６（Ｃａｓ９＋ＡＡＶＳ−ｓｇＲＮＡ）および示される標的化構築物対をトランスフェクトした細胞のフローサイトメトリー分析である。
【図１２Ｂ】同上。
【図１２Ｃ】同上。
【図１２Ｄ】同上。
【図１２Ｅ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
一部の態様では、１つを上回る導入遺伝子（または他の遺伝子エレメント）が導入された、トランスジェニック（たとえば、多重トランスジェニック、たとえば、二重トランスジェニックまたは三重トランスジェニック）生物を産生する方法が、本明細書に提供される。図１Ａに示されるように、本開示の例示的な方法は、細胞の集団に、（ａ）Ｎ末端インテインタンパク質断片の上流の第１の選択可能マーカータンパク質断片および第１の目的の導入遺伝子をコードするベクター、ならびに（ｂ）第２の選択可能マーカータンパク質断片の上流のＣ末端インテインタンパク質断片および第２の（異なる）目的の導入遺伝子をコードする別のベクターを送達することを含む。集団の一部の細胞は、単一のベクター（インテインの断片、選択可能マーカータンパク質の断片、および単一の導入遺伝子のみを有する）を取り込むが、一方で、集団の他の細胞は、両方のベクター（したがって、両方のインテインの断片、両方の選択可能マーカータンパク質断片、および両方の目的の導入遺伝子）を取り込む。両方のベクターを取り込んだ細胞では、翻訳後に、インテインタンパク質断片は、自発的かつ非共有結合的にインテイン構造へとアセンブリされて（協働的にフォールディングして）、第１の選択可能マーカータンパク質断片の、第２の選択可能マーカータンパク質断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生し、これにより、二重トランスジェニック細胞の特異的な選択が可能となる。たとえば、選択可能マーカータンパク質が、抗生物質耐性タンパク質である場合、全長（機能性）抗生物質耐性タンパク質を発現する二重トランスジェニック細胞のみが、特定の抗生物質の存在下における選択を生き残ることになる。別の例として、選択可能マーカータンパク質が、蛍光タンパク質である場合には、全長（機能性）蛍光タンパク質を発現する二重トランスジェニック細胞のみが、検出可能なシグナルを放出することになり、その結果、そのシグナルを放出する細胞のみが選択される。
【００２４】
本開示の別の例示的な方法は、細胞の集団に、（ａ）（ｉ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、（ｂ）（ｉ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、（ｃ）（ｉ）抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターとを送達することを含む。集団の一部の細胞は、単一のベクター（インテインの断片、選択可能マーカータンパク質の断片、および単一の導入遺伝子のみを有する）を取り込むが、一方で、集団の他の細胞は、２つのベクターまたは３つすべてのベクター（したがって、すべてのインテイン断片、すべての選択可能マーカータンパク質断片、およびすべての目的の導入遺伝子）を取り込む。３つすべてのベクターを取り込んだ細胞では、翻訳後に、インテインタンパク質断片は、自発的かつ非共有結合的にインテイン構造へとアセンブリされて（協働的にフォールディングして）、選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片の中央断片への結合、および選択可能マーカータンパク質の中央断片のＣ末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生し、これにより、三重トランスジェニック細胞の特異的な選択が可能となる。たとえば、選択可能マーカータンパク質が、抗生物質耐性タンパク質である場合、全長（機能性）抗生物質耐性タンパク質を発現する三重トランスジェニック細胞のみが、特定の抗生物質の存在下における選択を生き残ることになる。別の例として、選択可能マーカータンパク質が、蛍光タンパク質である場合には、全長（機能性）蛍光タンパク質を発現する三重トランスジェニック細胞のみが、検出可能なシグナルを放出することになり、その結果、そのシグナルを放出する細胞のみが選択される。
インテイン
【００２５】
インテイン（介在タンパク質）は、２つのペプチド結合の切断によってより大きな前駆体ポリペプチドから自身を切除する、タンパク質スプライシングとして公知の固有のオートプロセシング事象を行い、このプロセスにおいて、新しいペプチド結合の形成を通じて、隣接するエクステイン（外部タンパク質）配列をライゲーションする。インテイン遺伝子は、他のタンパク質コーディング遺伝子内でフレームに埋め込まれた状態で見出されるため、この再構成は、翻訳後に（または可能性としては、翻訳中に）生じる。さらに、インテインに媒介されるタンパク質スプライシングは、自発性であり、外部因子もエネルギー源も必要とせず、インテインドメインのフォールディングのみを必要とする。本質的に、前駆体タンパク質は、Ｎエクステイン（タンパク質のＮ末端部分）、その後にインテイン、その後にＣエクステイン（タンパク質のＣ末端部分）という３つのセグメントを含む。スプライシング後に、結果として得られるタンパク質は、Ｃエクステインに連結されたＮエクステインを含む。
【００２６】
２種類のインテインがあり、シススプライシングインテインは、宿主タンパク質に埋め込まれた単一のポリペプチドであり、一方でトランススプライシングインテイン（スプリットインテインと称される）は、インテイン片およびそのタンパク質カーゴが会合した後にタンパク質スプライシングを媒介する別個のポリペプチドである（たとえば、Paulus,  H  Annu  Rev  Biochem  69:447-496  (2000)およびSaleh  L,  Perler  FB  Chem  Rec  6:183-193  (2006)を参照されたい）。スプリットインテインは、一連の化学的再構成を触媒するが、これには、インテインが正しくアセンブリされ、フォールディングされる必要がある。スプライシングにおける第１のステップは、Ｎエクステインポリペプチドが、インテインの最初の残基の側鎖へと移される、Ｎ−Ｓアシル転移を伴う。これには、次いで、このアシル単位がＣエクステインの最初の残基（これは、セリン、スレオニン、またはシステインのいずれかである）へと移される、トランス（チオ）エステル化反応が続いて、分岐した中間体が形成される。プロセスの最後から２番目のステップでは、この分岐した中間体が、インテインのＣ末端アスパラギン残基が関与するトランスアミド化反応によって、インテインから切断される。これにより、次いで、２つのエクステイン間に通常のペプチド結合を作製するためのＳ−Ｎアシル転移を伴うプロセスの最後のステップが設定される（Lockless,  SW,  Muir,  TW  PNAS  106(27):  10999-11004  (2009)）。
【００２７】
現在、少なくとも７０個の異なるインテインアレルが存在し、インテインが埋め込まれている宿主遺伝子の種類だけでなく、宿主遺伝子内の組込み点によっても区別されている（Perler,  FB  Nucleic  Acids  Res.  30:  383-384  (2002)、Pietrokovski,  S  Trends  Genet.  17:  465-472  (2001)）。特定されているインテイン遺伝子のうちのごくわずか（５％未満）が、スプリットインテインをコードする。より一般的な連続的インテインとは異なり、スプリットインテインは、ＮインテインおよびＣインテインという２つの別個のポリペプチドとして転写および翻訳され、それぞれが１つのエクステインに融合される。翻訳の際に、インテイン断片は、自発的かつ非共有結合的に、カノニカルインテイン構造へとアセンブリされて（協働的にフォールディングして）、トランスでタンパク質スプライシングを実行する。特徴付けしようとする最初の２つのスプリットインテインは、ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａであるＳｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ種ＰＣＣ６８０３（Ｓｓｐ）およびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ  ＰＣＣ７３１０２（Ｎｐｕ）に由来し、ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩのαサブユニット（ＤｎａＥ）に挿入された状態で天然に見出されるオルソログである。Ｎｐｕは、著しく高速なタンパク質のトランススプライシング速度に起因して、特に注目すべきである（３０℃においてｔ１／２＝５０秒）。この半減期は、Ｓｓｐ（３０℃においてｔ１／２＝８０分）よりも有意に短い（Shah,  NH  et  al.  J.  Am.  Chem.  Soc.  135:  5839  (2013)）。
【００２８】
本明細書では、スプリットインテインを使用して、選択可能マーカータンパク質、たとえば、抗生物質耐性タンパク質または蛍光タンパク質の２つの断片（たとえば、Ｎ末端断片およびＣ末端断片）の結合を触媒して、機能的な全長タンパク質を産生する（たとえば、図１Ａおよび１Ｂ）。
【００２９】
スプリットインテインは、天然のスプリットインテインであってもよく、または操作されたスプリットインテインであってもよい。天然のスプリットインテインは、様々な異なる生物に天然に存在する。スプリットインテインのもっとも大きな公知のファミリーは、少なくとも２０個のラン藻種のＤｎａＥ遺伝子に見出される（Caspi  J,  et  al.  Mol.  Microbiol.  50:  1569-1577  (2003)）。したがって、本開示の一部の実施形態では、天然のスプリットインテインは、ＤｎａＥインテインから選択される。ＤｎａＥインテインの非限定的な例としては、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインが挙げられる。
【００３０】
一部の実施形態では、スプリットインテインは、操作されたスプリットインテインである。操作されたスプリットインテインは、連続的なインテインから産生され得るか（連続したインテインが人工的にスプリットされる場合）、またはたとえば効率的なタンパク質精製、ライゲーション、改変、および環化を促進する改変された天然のスプリットインテインであってもよい（たとえば、Stevens,  AJ  PNAS  114(32):  8538-8543  (2017)によって記載されている、ＮｐｕＧＥＰおよびＣｆａＧＥＰ）。スプリットインテインを操作するための方法は、たとえば、Aranko,  AS  et  al.  Protein  Eng  Des  Sel.  27(8):  263-271  (2014)によって記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、操作されたスプリットインテインは、ＤｎａＢインテインから操作される（Wu,  H,  et  al.  Biochim  Biophys  Acta  1387(1-2):  422-432  (1998)）。たとえば、操作されたスプリットインテインは、ＳｓｐＤｎａＢ  Ｓ１インテインであってもよい。一部の実施形態では、操作されたスプリットインテインは、ＧｙｒＢインテインから操作される。たとえば、操作されたスプリットインテインは、ＳｓｐＧｙｒＢ  Ｓ１１インテインであってもよい。
【００３１】
一部の実施形態では、三重トランスジェニックを産生する場合、たとえば、第１のインテインは、第２のインテインと同じであってもよい（たとえば、両方がＤｎａＥインテインである）。他の実施形態では、２つの異なるインテインを使用してもよい（たとえば、ＤｎａＥインテインおよびＤｎａＢインテイン）。一部の実施形態では、第１のインテインは、ＮｐｕＤｎａＥインテインであり、第２のインテインは、ＮｐｕＤｎａＥインテインである。
選択可能マーカータンパク質
【００３２】
本開示のトランスジェニック（たとえば、二重および／または三重トランスジェニック）細胞は、全長選択可能マーカータンパク質の発現に基づいて選択される。選択可能マーカータンパク質は、一般に、人工的選択に好適な特徴を付与する。選択可能マーカータンパク質の例としては、抗生物質耐性タンパク質および蛍光タンパク質が挙げられる。
【００３３】
抗生物質耐性遺伝子は、特定の抗生物質または抗生物質のクラスに対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子である。真核生物細胞において使用するための抗生物質耐性遺伝子の非限定的な例としては、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシン、フレオマイシンＤ１、またはブラストサイジンに対する耐性を付与するタンパク質をコードするものが挙げられる。原核生物細胞において使用するための抗生物質耐性遺伝子の非限定的な例としては、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシン、フレオマイシンＤ１、ブラストサイジン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＤ、テトラサイクリン、およびクロラムフェニコールに対する耐性を付与するタンパク質をコードするものが挙げられる。
【００３４】
ハイグロマイシンＢは、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓによって産生される抗生物質である。これは、タンパク質合成を阻害することによって、細菌、真菌、およびより高次の真核生物細胞を殺滅させる、アミノグリコシドである。もともとはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉに由来するｈｐｔ遺伝子（ｈｐｈまたはａｐｈＩＶ遺伝子とも称される）によってコードされるハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）は、アミノシクリトール抗生物質ハイグロマイシンＢを無毒化する。したがって、一部の実施形態では、本開示の選択可能マーカー遺伝子は、ｈｐｔ遺伝子である。
【００３５】
Ｇ４１８（ＧＥＮＥＴＩＣＩＮ（登録商標））は、ゲンタマイシンＢ１に構造が類似しているアミノグリコシド抗生物質である。これは、Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｒｈｏｄｏｒａｎｇｅａによって産生される。Ｇ４１８は、原核生物細胞および真核生物細胞の両方において、伸長ステップを阻害することによって、ポリペプチド合成を遮断する。Ｇ４１８に対する耐性は、アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼ、ＡＰＴ  ３’ＩＩをコードするＴｎ５に由来するｎｅｏ遺伝子によって付与される。Ｇ４１８は、ネオマイシン硫酸塩の類似体であり、ネオマイシンと類似の機序を有する。したがって、一部の実施形態では、本開示の選択可能マーカー遺伝子は、ｎｅｏ遺伝子である。
【００３６】
ピューロマイシンは、リボソームにおいて翻訳が起こっている間に早期連鎖終結を引き起こす、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｏｎｉｇｅｒに由来するアミノヌクレオシド抗生物質である。ピューロマイシンは、原核生物または真核生物のいずれかに選択的である。ピューロマイシンに対する耐性は、ピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ（ｐａｃ）遺伝子の発現を通じて付与される。したがって、一部の実施形態では、本開示の選択可能マーカー遺伝子は、ｐａｃ遺伝子である。
【００３７】
フレオマイシンＤ１（たとえば、ＺＥＯＣＩＮ（登録商標））は、糖ペプチド抗生物質であり、ブレオマイシン抗生物質ファミリーに属するＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｓに由来するフレオマイシンのうちの１つである。これは、ほとんどの細菌、糸状菌、酵母、植物、および動物細胞に対して有効である広範な抗生物質である。これは、ＤＮＡにインターカレートすることにより細胞死を引き起こし、ＤＮＡの二本鎖切断を誘導する。フレオマイシンＤ１に対する耐性は、Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｕｓから最初に単離されたＳｈ  ｂｌｅ遺伝子の産物によって付与される。したがって、一部の実施形態では、本開示の選択可能マーカー遺伝子は、Ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子である。
【００３８】
ブラストサイジンＳは、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓによって産生される抗生物質である。ブラストサイジンは、翻訳の終結ステップおよびリボソームによるペプチド結合形成（程度は低い）を阻害することによって、真核生物細胞および原核生物細胞の両方の成長を防止する。ブラストサイジンに対する耐性は、以下の少なくとも３つの異なる遺伝子によって付与される：Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｕｍ  ｓｐｐ．に由来するｂｌｓ（アセチルトランスフェラーゼ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓに由来するｂｓｒ（ブラストサイジン−Ｓデアミナーゼ）（他のｂｓｒ遺伝子も同様に公知である）、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓに由来するｂｓｄ（別のデアミナーゼ）。したがって、一部の実施形態では、本開示の選択可能マーカー遺伝子は、ｂｌｓ遺伝子、ｂｓｒ遺伝子、またはｂｓｄ遺伝子である。
【００３９】
本明細書に提供されるように使用することができる蛍光タンパク質の非限定的な例としては、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴａｇＣＦＰ２、Ｃｚｕｒｉｔｅ、ＥＣＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ｃ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、モノマーＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、モノマーＣｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ、モノマーＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＣｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、およびｉＲＦＰが挙げられる。
【００４０】
全長選択可能マーカー遺伝子は、一部の実施形態では、２つの選択可能マーカー遺伝子断片を、同じ細胞において結合させることによって、産生される。一部の実施形態では、任意の全長タンパク質に関して、断片のうちの１つは、Ｎ末端断片（Ｎエクステイン）であり、他方の断片は、Ｃ末端断片（Ｃエクステイン）である。したがって、一部の実施形態では、第１の抗生物質耐性タンパク質断片は、Ｎ末端抗生物質耐性タンパク質断片であり、第２の抗生物質耐性タンパク質断片は、Ｃ末端抗生物質耐性タンパク質断片である。他の実施形態では、第１の蛍光タンパク質断片は、Ｎ末端蛍光タンパク質断片であり、第２の蛍光タンパク質断片は、Ｃ末端蛍光タンパク質断片である。
【００４１】
他の実施形態では、全長選択可能マーカー遺伝子は、３つまたはそれを上回る選択可能マーカー遺伝子断片を、同じ細胞において結合させることによって産生される。一部の実施形態では、任意の全長タンパク質に関して、断片のうちの１つは、Ｎ末端断片であり、断片のうちの１つまたは複数（たとえば、１つ、２つ、または３つ）は、中央断片であり、断片のうちの１つは、Ｃ末端断片である。
【００４２】
Ｎ末端断片は、全長タンパク質の遊離アミン基（−ＮＨ２）を含む任意のタンパク質断片であり得る。Ｃ末端断片は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を含む任意のタンパク質断片であり得る。中央断片は、全長タンパク質のＮ末端断片とＣ末端断片との間に位置する任意のタンパク質断片であり得る。
【００４３】
たとえば、ハイグロマイシンをコードする遺伝子（３４１アミノ酸のタンパク質）のアミノ酸１〜８９を、Ｎ末端タンパク質断片と称することができ、一方で、アミノ酸９０〜３４１を、Ｃ末端断片と称することができる。同様に、図５を参照すると、ハイグロマイシンをコードする遺伝子のアミノ酸１〜２００を、Ｎ末端タンパク質断片と称することができ、一方で、アミノ酸２０１〜３４１を、Ｃ末端断片と称することができる。図６は、アミノ酸１〜５３、１〜２４０、または１〜２９２が、それぞれのＣ末端断片としてアミノ酸５４〜３４１、２４１〜３４１、または２９３〜３４１を含む全長ハイグロマイシンのＮ末端タンパク質断片と考えられる、追加の例を示す。
【００４４】
別の例として、ハイグロマイシンをコードする遺伝子（３４１アミノ酸のタンパク質）のアミノ酸１〜５２を、Ｎ末端タンパク質断片と称することができ、アミノ酸５３〜８９を、中央タンパク質断片と称することができ、アミノ酸９０〜３４１をＣ末端断片と称することができる。同様に、ハイグロマイシンをコードする遺伝子のアミノ酸１〜８９を、Ｎ末端タンパク質断片と称することができ、アミノ酸９０〜２４０を、中央断片と称することができ、アミノ酸２４１〜３４１を、Ｃ末端断片と称することができる。
導入遺伝子および他の目的の分子
【００４５】
本開示の方法および組成物は、一部の実施形態では、多重トランスジェニック（たとえば、二重および／または三重トランスジェニック）細胞および／または生物を産生するために使用される。したがって、一部の実施形態では、方法は、第１の分子（第１の目的の分子）をコードする１つのベクター、および第２の分子（第２の目的の分子）をコードする別のベクターを使用する。一部の実施形態では、方法は、第３の目的の分子をコードするさらに別のベクターを使用する。追加のベクター（たとえば、選択可能マーカータンパク質の追加の中央断片をコードする）は、追加の目的の分子をコードし得る。目的の分子は、たとえば、ポリペプチド（たとえば、タンパク質およびペプチド）またはポリヌクレオチド（たとえば、核酸、たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）であり得る。
【００４６】
一部の実施形態では、第１の分子（たとえば、第１のベクターに位置する）は、タンパク質である。一部の実施形態では、第２の分子（たとえば、第２のベクターに位置する）は、タンパク質である。一部の実施形態では、第３の分子（たとえば、第３のベクターに位置する）は、タンパク質である。目的のタンパク質の例としては、酵素、サイトカイン、転写因子、ホルモン、増殖因子、血液因子、抗原、および抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
一部の実施形態では、第１の分子は、ペプチドである。一部の実施形態では、第２の分子は、ペプチドである。一部の実施形態では、第３の分子は、ペプチドである。
【００４８】
一部の実施形態では、第１の分子は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。一部の実施形態では、第２の分子は、ｍＲＮＡである。一部の実施形態では、第３の分子は、ｍＲＮＡである。ｍＲＮＡは、一部の実施形態では、ワクチンまたは他の抗原性分子をコードする。
【００４９】
一部の実施形態では、第１の分子は、非コーディングＲＮＡ（タンパク質をコードしないＲＮＡ）である。一部の実施形態では、第２の分子は、非コーディングＲＮＡである。一部の実施形態では、第３の分子は、非コーディングＲＮＡである。非コーディングＲＮＡの例としては、ＲＮＡ干渉分子、たとえば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
ベクター
【００５０】
本開示の方法は、少なくとも２つまたは少なくとも３つの異なるベクターの使用を含む。ベクターは、外因性（外来性）遺伝子材料を細胞内に運ぶビヒクルとして使用することができる任意の核酸である。ベクターは、一部の実施形態では、インサート（たとえば、導入遺伝子）、およびベクターの骨格としての機能を果たすより大きな配列を含む、ＤＮＡ配列である。ベクターの非限定的な例としては、プラスミド、ウイルス／ウイルスベクター、コスミド、および人工染色体が挙げられ、これらのいずれも、本明細書に提供されるように使用することができる。一部の実施形態では、ベクターは、ウイルスベクター、たとえば、ウイルス粒子である。一部の実施形態では、ベクターは、ＲＮＡに基づくベクター、たとえば、自己複製ＲＮＡベクターである。一部の実施形態では、第１のベクターはプラスミドである、第２のベクターはプラスミドである、および／または第３のベクターはプラスミドである。ベクターは、本明細書に提供される場合、インテインの断片および選択可能マーカータンパク質の断片をコードする核酸に作動可能に連結したプロモーターを含む。一部の実施形態では、ベクターはまた、目的の分子をコードする核酸、たとえば、導入遺伝子に作動可能に連結したプロモーターを含む。
【００５１】
一部の実施形態では、一方のベクター（たとえば、第１のベクター）は、Ｎ末端インテインタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列の上流の、第１の選択可能マーカータンパク質断片をコードするヌクレオチド配列を含み、一方で、他方のベクター（たとえば、第２のベクター）は、第２の抗生物質耐性タンパク質断片の上流の、Ｃ末端インテインタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列を含む（たとえば、図１Ａを参照されたい）。この構成は、一方のベクター（たとえば、第１のベクター）が、第１の選択可能マーカータンパク質断片をコードするヌクレオチド配列の下流の、Ｎ末端インテインタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列を含み、他方のベクター（たとえば、第２のベクター）が、Ｃ末端インテインタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列の下流の、第２の抗生物質耐性タンパク質断片を含むことと同等である。「上流」および「下流」という用語は、核酸における相対的な位置を指す。それぞれの核酸は、５’末端および３’末端を有し、これは、デオキシリボース（またはリボース）環における炭素の位置によりそのように命名される。二本鎖ＤＮＡについて考える場合、たとえば、上流は、コーディング鎖の５’末端の方向であり、下流は、３’末端の方向である。
【００５２】
一部の実施形態では、（ａ）第１のベクターは、第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含み、（ｂ）第２のベクターは、第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含み、（ｃ）第３のベクターは、抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む。この構成は、（ａ）第１のベクターが、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の下流にある、第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含み、（ｂ）第２のベクターが、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の下流にある、抗生物質耐性タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の下流にある、第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含み、（ｃ）第３のベクターが、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の下流にある、抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片を含むことと同等である。
細胞
【００５３】
本開示の方法は、宿主細胞に、本明細書に記載されるベクター（たとえば、第１および第２のベクター）を導入することによって、トランスジェニック細胞および生物の産生に使用することができる。ベクターを導入する細胞は、真核生物のものであってもよく、または原核生物のものであってもよい。一部の実施形態では、細胞は、真核生物のものである。本明細書に提供される使用のための真核生物細胞の例としては、哺乳動物細胞、植物細胞（たとえば、作物細胞）、昆虫細胞（たとえば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、および真菌細胞（たとえば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）が挙げられる。哺乳動物細胞は、たとえば、ヒト細胞（幹細胞または樹立細胞株に由来する細胞）、霊長類細胞、ウマ細胞、ウシ細胞、ブタ細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、またはげっ歯類細胞（たとえば、マウスまたはラット）であり得る。本明細書に提供される使用のための哺乳動物細胞の例としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、およびＮＳ０細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、細胞は、原核生物のものである。本明細書に提供される使用のための原核生物細胞の例としては、細菌細胞が挙げられる。細菌細胞は、たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｉｂｉｒｒｈｏｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、Ｂａｃｉｌｌｉｓ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｂａｃｉｌｌｉｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｉｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｎｏｖｙｉｉ）、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｐｅｓｔｉｓ）、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｍａｌｌｅｉ）、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ  ｃｏｒｒｏｄｅｎｓ）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｃｒｅｙｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ａｅｇｙｐｔｉｕｓ）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｍｉｃｄａｄｅｉ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｂｏｚｅｍａｎｉ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、またはＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．（たとえば、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｌｉｖｉｄａｎｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｌｂｕｓ）であり得る。
送達および選択の方法
【００５４】
本開示の方法は、一部の実施形態では、ベクターを、細胞を含む組成物に送達し、細胞への核酸（たとえば、第１、第２、および第３のベクター）の導入を許容し、細胞における核酸の発現を許容する条件下において、組成物を維持して、真核生物細胞を産生させることを含む。細胞への核酸（たとえば、ベクター）の導入に必要な条件は、周知である。これらの条件としては、たとえば、形質転換（原核生物細胞の）条件、トランスフェクション（真核生物細胞の）条件、形質導入（ウイルス／ウイルスベクターによる）条件、およびエレクトロポレーション条件が挙げられ、これらのいずれも、本明細書に提供されるように使用することができる。したがって、一部の実施形態では、本開示の方法は、真核生物（たとえば、哺乳動物）細胞にトランスフェクトすることを含み、一方で、他の実施形態では、方法は、原核生物（たとえば、細菌）細胞を形質転換することを含む。
【００５５】
トランスジェニック、たとえば、多重トランスジェニック細胞、たとえば、二重、三重、および／または四重トランスジェニック細胞の選択は、使用される選択可能マーカーの種類に依存する。たとえば、選択可能マーカータンパク質が、抗生物質耐性タンパク質である場合、選択ステップには、細胞を、特定の抗生物質に曝露し、生き残った細胞のみを選択することが含まれ得る。選択可能マーカータンパク質が、蛍光タンパク質である場合、選択ステップは、単純に、細胞を顕微鏡下で確認し、蛍光を発する細胞を選択することを含み得るか、または選択ステップは、他の蛍光選択方法、たとえば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）による選別を含み得る。
【００５６】
一部の実施形態では、細胞に、本明細書に記載される核酸を有するウイルスベクター（たとえば、ウイルス）が形質導入される。一部の実施形態では、形質導入（または他のトランスフェクション方法）の前に、細胞を、たとえば、１ウェル当たり１×１０４〜１×１０６の密度でウェルプレート（たとえば、１２ウェルプレート）に播種する。一部の実施形態では、１００μＬ〜５００μＬ、たとえば、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、または５００μＬのそれぞれのウイルスベクターが、各ウェルに添加される。
キット
【００５７】
本開示はまた、たとえば、トランスジェニック細胞および／または生物の産生およびスクリーニングに使用することができる、キットも提供する。キットは、本明細書に記載される任意の２つまたはそれを上回る構成要素を含み得る。たとえば、キットは、（ａ）Ｎ末端インテインタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列の上流の、第１の選択可能マーカータンパク質断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、（ｂ）第２の選択可能マーカータンパク質断片の上流の、Ｃ末端インテインタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターとを含み得、Ｎ末端インテインタンパク質断片およびＣ末端インテインタンパク質断片が、第１の選択可能マーカータンパク質断片の、第２の選択可能マーカータンパク質断片への結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する。
【００５８】
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載される任意の２つまたはそれを上回る構成要素を含む。たとえば、キットは、（ａ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、（ｂ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、（ｃ）抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターとを含み得、第１のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片の、抗生物質耐性タンパク質の中央断片への結合を触媒し、第２のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、抗生物質耐性タンパク質の中央断片の、抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する。
【００５９】
一部の実施形態では、キットは、以下の構成要素のうちの任意の１つまたは複数をさらに含む：緩衝液、塩、クローニング酵素（たとえば、ＬＲクロナーゼ）、コンピテント細胞（たとえば、コンピテント細菌細胞）、トランスフェクション試薬、抗生物質、および／または本明細書に記載される方法を実行するための説明書。
【００６０】
追加の実施形態
本開示の追加の実施形態は、以下の番号付けした段落に包含される。
１．真核生物細胞に、
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉ）抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片およびＣ末端断片の結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、方法。
２．真核生物細胞を、第１および第２のベクターの真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、段落１に記載の方法。
３．全長抗生物質耐性タンパク質を含むトランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、段落２に記載の方法。
４．真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落１から３のいずれか１つに記載の方法。
５．抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシン、フレオマイシンＤ１、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落１から４のいずれか１つに記載の方法。
６．インテインが、スプリットインテインである、段落１から５のいずれか１つに記載の方法。
７．スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落６に記載の方法。
８．天然のスプリットインテインが、ＤｎａＥインテインから選択される、段落７に記載の方法。
９．ＤｎａＥインテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインから選択される、段落８に記載の方法。
１０．スプリットインテインが、操作されたスプリットインテインである、段落６に記載の方法。
１１．操作されたスプリットインテインが、ＤｎａＢインテインから操作される、段落１０に記載の方法。
１２．操作されたスプリットインテインが、ＳｓｐＤｎａＢ  Ｓ１インテインである、段落１１に記載の方法。
１３．操作されたスプリットインテインが、ＧｙｒＢインテインから操作される、段落１２に記載の方法。
１４．操作されたスプリットインテインが、ＳｓｐＧｙｒＢ  Ｓ１１インテインである、段落１３に記載の方法。
１５．第１および／または第２の分子が、タンパク質である、段落１から１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．第１および／または第２の分子が、非コーディングリボ核酸（ＲＮＡ）である、段落１から１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、段落１６に記載の方法。
１８．第１および／または第２のベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落１から１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．真核生物細胞に、
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子を含む、第２のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼを産生する、方法。
２０．第２のｈｙｇＢ遺伝子断片によってコードされるタンパク質断片の最初のアミノ酸が、システインである、段落１９に記載の方法。
２１．ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸１〜８９によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸９０〜３４１によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸１〜２００によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸２０１〜３４１によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸１〜５３によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸５４〜３４１によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸１〜２４０によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸２４１〜３４１によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸１〜２９２によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸２９３〜３４１によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落２３に記載の方法。
２２．インテインのＮ末端断片が、配列番号１６によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１７によって特定される、
インテインのＮ末端断片が、配列番号７によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号８によって特定される、または
インテインのＮ末端断片が、配列番号１８もしくは配列番号９によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１９もしくは配列番号１０によって特定される、段落２３から２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．真核生物細胞に、
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｂｓｒ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）ｂｓｒ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子を含む、第２のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｂｓｒ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｂｓｒ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ブラストサイジン−Ｓデアミナーゼを産生する、方法。
２４．ｂｓｒ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号４のアミノ酸１〜１０２によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｂｓｒ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号４のアミノ酸１０３〜１４０によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落２３に記載の方法。
２５．インテインのＮ末端断片が、配列番号１６によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１７によって特定される、
インテインのＮ末端断片が、配列番号７によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号８によって特定される、または
インテインのＮ末端断片が、配列番号１８もしくは配列番号９によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１９もしくは配列番号１０によって特定される、段落２２または２３に記載の方法。
２６．真核生物細胞に、
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｐａｃ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）ｐａｃ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子を含む、第２のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｐａｃ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｐａｃ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼを産生する、方法。
２７．ｐａｃ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号２のアミノ酸１〜６３によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｐａｃ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号２のアミノ酸６４〜１９９によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｐａｃ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号２のアミノ酸１〜１１９によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｐａｃ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号２のアミノ酸１２０〜１９９によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｐａｃ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号２のアミノ酸１〜１００によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｐａｃ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号２のアミノ酸１０１〜１９９によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落２６に記載の方法。
２８．インテインのＮ末端断片が、配列番号１６によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１７によって特定される、
インテインのＮ末端断片が、配列番号７によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号８によって特定される、または
インテインのＮ末端断片が、配列番号１８もしくは配列番号９によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１９もしくは配列番号１０によって特定される、段落２６または２７に記載の方法。
２９．真核生物細胞に、
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｎｅｏ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）ｎｅｏ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子を含む、第２のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｎｅｏ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｎｅｏ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼを産生する、方法。
３０．ｎｅｏ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号３のアミノ酸１〜１３３によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｎｅｏ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号３のアミノ酸１３４〜２６７によって特定されるアミノ酸配列を含む、または
ｎｅｏ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号３のアミノ酸１〜１９４によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｎｅｏ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号３のアミノ酸１９５〜２６７によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落２９に記載の方法。
３１．インテインのＮ末端断片が、配列番号１６によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１７によって特定される、
インテインのＮ末端断片が、配列番号７によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号８によって特定される、または
インテインのＮ末端断片が、配列番号１８もしくは配列番号９によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１９もしくは配列番号１０によって特定される、段落２９または３０に記載の方法。
３２．真核生物細胞を含む組成物に、
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）蛍光タンパク質のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、蛍光タンパク質のＮ末端断片の、蛍光タンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長蛍光タンパク質を産生する、方法。
３３．真核生物細胞を、第１および第２のベクターの真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、段落５１に記載の方法。
３４．全長蛍光タンパク質を含むトランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、段落３３に記載の方法。
３５．真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落３２から３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．蛍光タンパク質が、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴａｇＣＦＰ２、Ｃｚｕｒｉｔｅ、ＥＣＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ｃ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、モノマーＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、モノマーＣｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ、モノマーＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＣｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、およびｉＲＦＰから選択される、段落３２から３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．インテインが、スプリットインテインである、段落３２から３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落３７に記載の方法。
３９．天然のスプリットインテインが、ＤｎａＥインテインから選択される、段落３８に記載の方法。
４０．ＤｎａＥインテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインから選択される、段落３９に記載の方法。
４１．スプリットインテインが、操作されたスプリットインテインである、段落４０に記載の方法。
４２．操作されたスプリットインテインが、ＤｎａＢインテインから操作される、段落４１に記載の方法。
４３．操作されたスプリットインテインが、ＳｓｐＤｎａＢ  Ｓ１インテインである、段落４２に記載の方法。
４４．操作されたスプリットインテインが、ＧｙｒＢインテインから操作される、段落４２に記載の方法。
４５．操作されたスプリットインテインが、ＳｓｐＧｙｒＢ  Ｓ１１インテインである、段落４４に記載の方法。
４６．第１および／または第２の分子が、タンパク質である、段落３２から４５のいずれか１つに記載の方法。
４７．第１および／または第２の分子が、非コーディングリボ核酸（ＲＮＡ）である、段落３２から４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、段落４７に記載の方法。
４９．第１および／または第２のベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落３２から４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．真核生物細胞に、
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｅｇｆｐ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）ｅｇｆｐ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子を含む、第２のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｅｇｆｐ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｅｇｆｐ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ＥＧＦＰタンパク質を産生する、方法。
５１．ｅｇｆｐ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号５のアミノ酸１〜１７５によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｅｇｆｐ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号５のアミノ酸１７５〜２３９によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落５０に記載の方法。
５２．インテインのＮ末端断片が、配列番号１６によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１７によって特定される、
インテインのＮ末端断片が、配列番号７によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号８によって特定される、または
インテインのＮ末端断片が、配列番号１８もしくは配列番号９によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１９もしくは配列番号１０によって特定される、段落５０または５１に記載の方法。
５３．真核生物細胞に、
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子を含む、第２のベクターと
を送達することを含む方法であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ｍＳｃａｒｌｅｔタンパク質を産生する、方法。
５４．ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜４６によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸４７〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜４８によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸４９〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜５１によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸５２〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜７５によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸７６〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜１２２によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１２３〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜１４０によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１４１〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜１６３によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１６４〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落５３に記載の方法。
５５．インテインのＮ末端断片が、配列番号１６によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１７によって特定される、
インテインのＮ末端断片が、配列番号７によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号８によって特定される、または
インテインのＮ末端断片が、配列番号１８もしくは配列番号９によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１９もしくは配列番号１０によって特定される、段落５３または５４に記載の方法。
５６．（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉ）抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片およびＣ末端断片の結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、真核生物細胞。
５７．真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落５６に記載の細胞。
５８．抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシン、フレオマイシンＤ１、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落５６または５７に記載の細胞。
５９．インテインが、スプリットインテインである、段落５６から５８のいずれか１つに記載の細胞。
６０．スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落５９に記載の細胞。
６１．天然のスプリットインテインが、ＤｎａＥインテインから選択される、段落６０に記載の細胞。
６２．ＤｎａＥインテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインから選択される、段落６１に記載の細胞。
６３．スプリットインテインが、操作されたスプリットインテインである、段落５９に記載の細胞。
６４．操作されたスプリットインテインが、ＤｎａＢインテインから操作される、段落６３に記載の細胞。
６５．操作されたスプリットインテインが、ＳｓｐＤｎａＢ  Ｓ１インテインである、段落６４に記載の細胞。
６６．操作されたスプリットインテインが、ＧｙｒＢインテインから操作される、段落６５に記載の細胞。
６７．操作されたスプリットインテインが、ＳｓｐＧｙｒＢ  Ｓ１１インテインである、段落６６に記載の細胞。
６８．第１および／または第２の分子が、タンパク質である、段落５６から６７のいずれか１つに記載の細胞。
６９．第１および／または第２の分子が、非コーディングリボ核酸（ＲＮＡ）である、段落５６から６８のいずれか１つに記載の細胞。
７０．非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、段落６９に記載の細胞。
７１．第１および／または第２のベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落５６から７０のいずれか１つに記載の細胞。
７２．（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子を含む、第２のベクターとを含む細胞であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼを産生する、細胞。
７３．第２のｈｙｇＢ遺伝子断片によってコードされるタンパク質断片の最初のアミノ酸が、システインである、段落７２に記載の細胞。
７４．ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸１〜８９によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸９０〜３４１によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸１〜２００によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸２０１〜３４１によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸１〜５３によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸５４〜３４１によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸１〜２４０によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸２４１〜３４１によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸１〜２９２によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号１のアミノ酸２９３〜３４１によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落７３に記載の細胞。
７５．インテインのＮ末端断片が、配列番号１６によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１７によって特定される、
インテインのＮ末端断片が、配列番号７によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号８によって特定される、または
インテインのＮ末端断片が、配列番号１８もしくは配列番号９によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１９もしくは配列番号１０によって特定される、段落７２から７４のいずれか１つに記載の細胞。
７６．（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｂｓｒ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）ｂｓｒ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子を含む、第２のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｂｓｒ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｂｓｒ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ブラストサイジン−Ｓデアミナーゼを産生する、真核生物細胞。
７７．ｂｓｒ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号４のアミノ酸１〜１０２によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｂｓｒ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号４のアミノ酸１０３〜１４０によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落７６に記載の細胞。
７８．インテインのＮ末端断片が、配列番号１６によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１７によって特定される、
インテインのＮ末端断片が、配列番号７によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号８によって特定される、または
インテインのＮ末端断片が、配列番号１８もしくは配列番号９によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１９もしくは配列番号１０によって特定される、段落７６または７７に記載の細胞。
７９．
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｐａｃ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）ｐａｃ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子を含む、第２のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｐａｃ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｐａｃ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼを産生する、真核生物細胞。
８０．ｐａｃ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号２のアミノ酸１〜６３によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｐａｃ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号２のアミノ酸６４〜１９９によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｐａｃ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号２のアミノ酸１〜１１９によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｐａｃ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号２のアミノ酸１２０〜１９９によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｐａｃ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号２のアミノ酸１〜１００によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｐａｃ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号２のアミノ酸１０１〜１９９によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落７９に記載の細胞。
８１．インテインのＮ末端断片が、配列番号１６によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１７によって特定される、
インテインのＮ末端断片が、配列番号７によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号８によって特定される、または
インテインのＮ末端断片が、配列番号１８もしくは配列番号９によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１９もしくは配列番号１０によって特定される、段落７９または８０に記載の細胞。
８２．
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｎｅｏ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）ｎｅｏ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子を含む、第２のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｎｅｏ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｎｅｏ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長アミノグリコシド３’−ホスホトランスフェラーゼを産生する、真核生物細胞。
８３．ｎｅｏ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号３のアミノ酸１〜１３３によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｎｅｏ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号３のアミノ酸１３４〜２６７によって特定されるアミノ酸配列を含む、または
ｎｅｏ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号３のアミノ酸１〜１９４によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｎｅｏ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号３のアミノ酸１９５〜２６７によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落８２に記載の細胞。
８４．インテインのＮ末端断片が、配列番号１６によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１７によって特定される、
インテインのＮ末端断片が、配列番号７によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号８によって特定される、または
インテインのＮ末端断片が、配列番号１８もしくは配列番号９によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１９もしくは配列番号１０によって特定される、段落８２または８３に記載の細胞。
８５．
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）蛍光タンパク質のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、蛍光タンパク質のＮ末端断片の、蛍光タンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長蛍光タンパク質を産生する、真核生物細胞。
８６．真核生物細胞を、第１および第２のベクターの真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、段落８５に記載の細胞。
８７．全長蛍光タンパク質を含むトランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、段落８６に記載の細胞。
８８．真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落８５から８７のいずれか１つに記載の細胞。
８９．蛍光タンパク質が、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴａｇＣＦＰ２、Ｃｚｕｒｉｔｅ、ＥＣＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ｃ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、モノマーＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、モノマーＣｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ、モノマーＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＣｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、およびｉＲＦＰから選択される、段落８５から８８のいずれか１つに記載の細胞。
９０．インテインが、スプリットインテインである、段落８５から８９のいずれか１つに記載の細胞。
９１．スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落９０に記載の細胞。
９２．天然のスプリットインテインが、ＤｎａＥインテインから選択される、段落９１に記載の細胞。
９３．ＤｎａＥインテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインから選択される、段落９２に記載の細胞。
９４．スプリットインテインが、操作されたスプリットインテインである、段落９３に記載の細胞。
９５．操作されたスプリットインテインが、ＤｎａＢインテインから操作される、段落９４に記載の細胞。
９６．操作されたスプリットインテインが、ＳｓｐＤｎａＢ  Ｓ１インテインである、段落９５に記載の細胞。
９７．操作されたスプリットインテインが、ＧｙｒＢインテインから操作される、段落９５に記載の細胞。
９８．操作されたスプリットインテインが、ＳｓｐＧｙｒＢ  Ｓ１１インテインである、段落９７に記載の細胞。
９９．第１および／または第２の分子が、タンパク質である、段落８５から９８のいずれか１つに記載の細胞。
１００．第１および／または第２の分子が、非コーディングリボ核酸（ＲＮＡ）である、段落８５から９９のいずれか１つに記載の細胞。
１０１．非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、段落１００に記載の細胞。
１０２．第１および／または第２のベクターが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落８５から１０１のいずれか１つに記載の細胞。
１０３．
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｅｇｆｐ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）ｅｇｆｐ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子を含む、第２のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｅｇｆｐ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｅｇｆｐ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ＥＧＦＰタンパク質を産生する、真核生物細胞。
１０４．ｅｇｆｐ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号５のアミノ酸１〜１７５によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｅｇｆｐ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号５のアミノ酸１７５〜２３９によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落１０３に記載の細胞。
１０５．インテインのＮ末端断片が、配列番号１６によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１７によって特定される、
インテインのＮ末端断片が、配列番号７によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号８によって特定される、または
インテインのＮ末端断片が、配列番号１８もしくは配列番号９によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１９もしくは配列番号１０によって特定される、段落１０３または１０４に記載の細胞。
１０６．
（ａ）（ｉ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉｉ）ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子を含む、第２のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ｍＳｃａｒｌｅｔタンパク質を産生する、真核生物細胞。
１０７．ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜４６によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸４７〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜４８によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸４９〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜５１によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸５２〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜７５によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸７６〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜１２２によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１２３〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜１４０によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１４１〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、
ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１〜１６３によって特定されるアミノ酸配列を含み、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片が、配列番号６のアミノ酸１６４〜２３２によって特定されるアミノ酸配列を含む、段落１０６に記載の細胞。
１０８．インテインのＮ末端断片が、配列番号１６によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１７によって特定される、
インテインのＮ末端断片が、配列番号７によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号８によって特定される、または
インテインのＮ末端断片が、配列番号１８もしくは配列番号９によって特定され、インテインのＣ末端断片が、配列番号１９もしくは配列番号１０によって特定される、段落１０６または１０７に記載の細胞。
１０９．段落８５から１０８のいずれか１つに記載の細胞を含む、組成物。
１１０．キットであって、
（ａ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターとを含み、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片およびＣ末端断片の結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、キット。
１１１．抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシン、フレオマイシンＤ１、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落１１０に記載のキット。
１１２．キットであって、
（ａ）インテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）蛍光タンパク質のＣ末端断片の上流にある、インテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターとを含み、
インテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、蛍光タンパク質のＮ末端断片の、蛍光タンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長蛍光タンパク質を産生する、キット。
１１３．蛍光タンパク質が、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴａｇＣＦＰ２、Ｃｚｕｒｉｔｅ、ＥＣＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ｃ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、モノマーＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、モノマーＣｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ、モノマーＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＣｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、およびｉＲＦＰから選択される、段落１１２に記載のキット。
１１４．インテインが、スプリットインテインである、段落１１０から１１３のいずれか１つに記載のキット。
１１５．スプリットインテインが、天然のスプリットインテインまたは操作されたスプリットインテインである、段落１１４に記載のキット。
１１６．天然のスプリットインテインが、ＤｎａＥインテインから選択される、段落１１５に記載のキット。
１１７．ＤｎａＥインテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインから選択される、段落１１６に記載のキット。
１１８．操作されたスプリットインテインが、ＤｎａＢインテインまたはＧｙｒＢインテインから操作される、段落１１５に記載のキット。
１１９．操作されたスプリットインテインが、ＳｓｐＤｎａＢ  Ｓ１インテインである、段落１１８に記載のキット。
１２０．操作されたスプリットインテインが、ＳｓｐＧｙｒＢ  Ｓ１１インテインである、段落１１８に記載のキット。
１２１．以下の構成要素：緩衝液、塩、クローニング酵素、コンピテント細胞、トランスフェクション試薬、抗生物質、および／または本明細書に記載される方法を実行するための説明書のうちのいずれか１つまたは複数をさらに含む、段落１１２から１２０のいずれか１つに記載のキット。
１２２．真核生物細胞に、
（ａ）（ｉ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、
（ｃ）（ｉ）抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターと
を送達することを含む方法であって、
第１のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片の、抗生物質耐性タンパク質の中央断片への結合を触媒し、第２のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、抗生物質耐性タンパク質の中央断片の、抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、方法。
１２３．真核生物細胞を、第１、第２、および第３のベクターの真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、段落１１２に記載の方法。
１２４．全長抗生物質耐性タンパク質を含むトランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、段落１２３に記載の方法。
１２５．真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落１１２から１２４のいずれか１つに記載の方法。
１２６．抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシン、フレオマイシンＤ１、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落１１２から１２５のいずれか１つに記載の方法。
１２７．抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する、段落１２６に記載の方法。
１２８．第１のインテインが、スプリットインテインである、段落１１２から１２７のいずれか１つに記載の方法。
１２９．第２のインテインが、スプリットインテインである、段落１１２から１２８のいずれか１つに記載の方法。
１３０．スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落１２８または１２９に記載の方法。
１３１．天然のスプリットインテインが、ＤｎａＥインテインから選択される、段落１３０に記載の方法。
１３２．ＤｎａＥインテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインから選択される、段落１３１に記載の方法。
１３３．第１のインテインが、ＮｐｕＤｎａＥインテインであり、第２のインテインが、ＮｐｕＤｎａＥインテインである、段落１３２に記載の方法。
１３４．第１の目的の分子、第２の目的の分子、第３の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、タンパク質である、段落１１２から１３３のいずれか１つに記載の方法。
１３５．第１の目的の分子、第２の目的の分子、第３の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、非コーディングリボ核酸（ＲＮＡ）である、段落１１２から１３３のいずれか１つに記載の方法。
１３６．非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、段落１３５に記載の方法。
１３７．第１のベクター、第２のベクター、第３のベクター、またはこれらの任意の組合せが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落１１２から１３６のいずれか１つに記載の方法。
１３８．真核生物細胞に、
（ａ）（ｉ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｈｙｇＢ遺伝子の中央断片の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、
（ｃ）（ｉ）ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターと
を送達することを含む方法であって、
第１のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｈｙｇＢ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｈｙｇＢ遺伝子の中央断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒し、第２のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｈｙｇＢ遺伝子の中央断片によってコードされるタンパク質断片の、ｈｙｇＢ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼを産生する、方法。
１３９．第１のベクターが、配列番号２９によって特定される配列をコードし、第２のベクターが、配列番号６１によって特定される配列をコードし、第３のベクターが、配列番号２３によって特定される配列をコードする、段落１３８に記載の方法。
１４０．第１のベクターが、配列番号２１によって特定される配列をコードし、第２のベクターが、配列番号６１によって特定される配列をコードし、第３のベクターが、配列番号３５によって特定される配列をコードする、段落１３８に記載の方法。
１４１．
（ａ）（ｉ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、
（ｃ）（ｉ）抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
第１のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片の、抗生物質耐性タンパク質の中央断片への結合を触媒し、第２のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、抗生物質耐性タンパク質の中央断片の、抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、真核生物細胞。
１４２．哺乳動物細胞である、段落１１２に記載の真核生物細胞。
１４３．抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシン、フレオマイシンＤ１、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落１４１または１４２に記載の真核生物細胞。
１４４．抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する、段落１４３に記載の真核生物細胞。
１４５．第１のインテインが、スプリットインテインである、段落１４１から１４４のいずれか１つに記載の真核生物細胞。
１４６．第２のインテインが、スプリットインテインである、段落１４２から１４５のいずれか１つに記載の真核生物細胞。
１４７．スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落１４５または１４６に記載の真核生物細胞。
１４８．天然のスプリットインテインが、ＤｎａＥインテインから選択される、段落１４７に記載の真核生物細胞。
１４９．ＤｎａＥインテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインから選択される、段落１４８に記載の真核生物細胞。
１５０．第１のインテインが、ＮｐｕＤｎａＥインテインであり、第２のインテインが、ＮｐｕＤｎａＥインテインである、段落１４９に記載の真核生物細胞。
１５１．第１の目的の分子、第２の目的の分子、第３の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、タンパク質である、段落１４２から１５０のいずれか１つに記載の真核生物細胞。
１５２．第１の目的の分子、第２の目的の分子、第３の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、非コーディングリボ核酸（ＲＮＡ）である、段落１４２から１５０のいずれか１つに記載の真核生物細胞。
１５３．非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、段落１５２に記載の真核生物細胞。
１５４．第１のベクター、第２のベクター、第３のベクター、またはこれらの任意の組合せが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落１４２から１５３のいずれか１つに記載の真核生物細胞。
１５５．段落１４２から１５４のいずれか１つに記載の真核生物細胞を含む、組成物。
１５６．キットであって、
（ａ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、抗生物質耐性タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、
（ｃ）抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターとを含み、
第１のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、抗生物質耐性タンパク質のＮ末端断片の、抗生物質耐性タンパク質の中央断片への結合を触媒し、第２のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、抗生物質耐性タンパク質の中央断片の、抗生物質耐性タンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長抗生物質耐性タンパク質を産生する、キット。
１５７．抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシン、フレオマイシンＤ１、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落１５６に記載のキット。
１５８．抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシンに対する耐性を付与する、段落１５７に記載のキット。
１５９．第１のインテインが、スプリットインテインである、段落１５６から１５８のいずれか１つに記載のキット。
１６０．第２のインテインが、スプリットインテインである、段落１５６から１５９のいずれか１つに記載のキット。
１６１．スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落１５９または１６０に記載のキット。
１６２．天然のスプリットインテインが、ＤｎａＥインテインから選択される、段落１６１に記載のキット。
１６３．ＤｎａＥインテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインから選択される、段落１６２に記載のキット。
１６４．第１のインテインが、ＮｐｕＤｎａＥインテインであり、第２のインテインが、ＮｐｕＤｎａＥインテインである、段落１６３に記載のキット。
１６５．第１の目的の分子、第２の目的の分子、第３の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、タンパク質である、段落１５６から１６４のいずれか１つに記載のキット。
１６６．第１の目的の分子、第２の目的の分子、第３の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、非コーディングリボ核酸（ＲＮＡ）である、段落１５６から１６４のいずれか１つに記載のキット。
１６７．非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、段落１６６に記載のキット。
１６８．第１のベクター、第２のベクター、第３のベクター、またはこれらの任意の組合せが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落１５６から１６７のいずれか１つに記載のキット。
１６９．真核生物細胞に、
（ａ）（ｉ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、
（ｃ）（ｉ）蛍光タンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターと
を送達することを含む方法であって、
第１のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、蛍光タンパク質のＮ末端断片の、蛍光タンパク質の中央断片への結合を触媒し、第２のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、蛍光タンパク質の中央断片の、蛍光タンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長蛍光タンパク質を産生する、方法。
１７０．真核生物細胞を、第１、第２、および第３のベクターの真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、段落１６９に記載の方法。
１７１．全長蛍光タンパク質を含むトランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、段落１７０に記載の方法。
１７２．真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落１６９から１７１のいずれか１つに記載の方法。
１７３．蛍光タンパク質が、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴａｇＣＦＰ２、Ｃｚｕｒｉｔｅ、ＥＣＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ｃ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、モノマーＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、モノマーＣｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ、モノマーＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＣｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、およびｉＲＦＰから選択される、段落１６９から１７２のいずれか１つに記載の方法。
１７４．蛍光タンパク質が、ｍＳｃａｒｌｅｔである、段落１７３に記載の方法。
１７５．第１のインテインが、スプリットインテインである、段落１６９から１７４のいずれか１つに記載の方法。
１７６．第２のインテインが、スプリットインテインである、段落１６９から１７５のいずれか１つに記載の方法。
１７７．スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落１７５または１７６に記載の方法。
１７８．天然のスプリットインテインが、ＤｎａＥインテインから選択される、段落１７７に記載の方法。
１７９．ＤｎａＥインテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインから選択される、段落１７８に記載の方法。
１８０．第１のインテインが、ＮｐｕＤｎａＥインテインであり、第２のインテインが、ＮｐｕＤｎａＥインテインである、段落１７９に記載の方法。
１８１．第１の目的の分子、第２の目的の分子、第３の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、タンパク質である、段落１６９から１７０のいずれか１つに記載の方法。
１８２．第１の目的の分子、第２の目的の分子、第３の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、非コーディングリボ核酸（ＲＮＡ）である、段落１６９から１８０のいずれか１つに記載の方法。
１８３．非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、段落１８２に記載の方法。
１８４．第１のベクター、第２のベクター、第３のベクター、またはこれらの任意の組合せが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落１６９から１８３のいずれか１つに記載の方法。
１８５．真核生物細胞に、
（ａ）（ｉ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子の中央断片の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、
（ｃ）（ｉ）ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターと
を送達することを含む方法であって、
第１のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＮ末端断片によってコードされるタンパク質断片の、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子の中央断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒し、第２のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子の中央断片によってコードされるタンパク質断片の、ｍＳｃａｒｌｅｔ遺伝子のＣ末端断片によってコードされるタンパク質断片への結合を触媒して、全長ｍＳｃａｒｌｅｔタンパク質を産生する、方法。
１８６．第１のベクターが、配列番号１２１によって特定される配列をコードし、第２のベクターが、配列番号１２３によって特定される配列をコードし、第３のベクターが、配列番号１２５によって特定される配列をコードする、段落１８５に記載の方法。
１８７．
（ａ）（ｉ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）（ｉ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、
（ｃ）（ｉ）蛍光タンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターと
を含む真核生物細胞であって、
第１のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、蛍光タンパク質のＮ末端断片の、蛍光タンパク質の中央断片への結合を触媒し、第２のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、蛍光タンパク質の中央断片の、蛍光タンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長蛍光タンパク質を産生する、真核生物細胞。
１８８．哺乳動物細胞である、段落１８７に記載の真核生物細胞。
１８９．蛍光タンパク質が、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴａｇＣＦＰ２、Ｃｚｕｒｉｔｅ、ＥＣＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ｃ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、モノマーＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、モノマーＣｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ、モノマーＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＣｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、およびｉＲＦＰから選択される、段落１８７または１８８に記載の真核生物細胞。
１９０．蛍光タンパク質が、ｍＳｃａｒｌｅｔである、段落１８９に記載の真核生物細胞。
１９１．第１のインテインが、スプリットインテインである、段落１８７から１９０のいずれか１つに記載の真核生物細胞。
１９２．第２のインテインが、スプリットインテインである、段落１８５から１９１のいずれか１つに記載の真核生物細胞。
１９３．スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落１９１または１９２に記載の真核生物細胞。
１９４．天然のスプリットインテインが、ＤｎａＥインテインから選択される、段落１９３に記載の真核生物細胞。
１９５．ＤｎａＥインテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインから選択される、段落１９４に記載の真核生物細胞。
１９６．第１のインテインが、ＮｐｕＤｎａＥインテインであり、第２のインテインが、ＮｐｕＤｎａＥインテインである、段落１９５に記載の真核生物細胞。
１９７．第１の目的の分子、第２の目的の分子、第３の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、タンパク質である、段落１８５から１９６のいずれか１つに記載の真核生物細胞。
１９８．第１の目的の分子、第２の目的の分子、第３の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、非コーディングリボ核酸（ＲＮＡ）である、段落１８５から１９６のいずれか１つに記載の真核生物細胞。
１９９．非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、段落１９８に記載の真核生物細胞。
２００．第１のベクター、第２のベクター、第３のベクター、またはこれらの任意の組合せが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落１８５から１９９のいずれか１つに記載の真核生物細胞。
２０１．段落１８５から２００のいずれか１つに記載の真核生物細胞を含む、組成物。
２０２．キットであって、
（ａ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、
（ｂ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、蛍光タンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、
（ｃ）蛍光タンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターとを含み、
第１のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、蛍光タンパク質のＮ末端断片の、蛍光タンパク質の中央断片への結合を触媒し、第２のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、蛍光タンパク質の中央断片の、蛍光タンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長蛍光タンパク質を産生する、キット。
２０３．蛍光タンパク質が、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴａｇＣＦＰ２、Ｃｚｕｒｉｔｅ、ＥＣＦＰ２、ｍＫａｌａｍａ１、Ｓｉｒｉｕｓ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＳＣＦＰ３Ｃ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２、モノマーＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ、ＴａｇＣＦＰ、ｍＴＦＰ１、ＥＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、モノマーＣｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＴａｇＧＦＰ２、ｍＵＫＧ、ｍＷａｓａｂｉ、Ｃｌｏｖｅｒ、ｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ、ＥＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＳＹＦＰ２、ＴａｇＹＦＰ、モノマーＫｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＫＯκ、ｍＳｃａｒｌｅｔ、ｍＫＯ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ｍＣｐｐｌｅ、ｍＲｕｂｙ、ｍＲｕｂｙ２、ｍＰｌｕｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＫａｔｅ２、ｍＮｅｐｔｕｎｅ、ＮｉｒＦＰ、ＴａｇＲＦＰ６５７、ＩＦＰ１．４、およびｉＲＦＰから選択される、段落２０２に記載のキット。
２０４．蛍光タンパク質が、ｍＳｃａｒｌｅｔである、段落２０３に記載のキット。
２０５．第１のインテインが、スプリットインテインである、段落２０２から２０４のいずれか１つに記載のキット。
２０６．第２のインテインが、スプリットインテインである、段落２０２から２０５のいずれか１つに記載のキット。
２０７．スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落２０６に記載のキット。
２０８．天然のスプリットインテインが、ＤｎａＥインテインから選択される、段落２０７に記載のキット。
２０９．ＤｎａＥインテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインから選択される、段落２０８に記載のキット。
２１０．第１のインテインが、ＮｐｕＤｎａＥインテインであり、第２のインテインが、ＮｐｕＤｎａＥインテインである、段落２０９に記載のキット。
２１１．第１の目的の分子、第２の目的の分子、第３の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、タンパク質である、段落２０２から２１０のいずれか１つに記載のキット。
２１２．第１の目的の分子、第２の目的の分子、第３の目的の分子、またはこれらの任意の組合せが、非コーディングリボ核酸（ＲＮＡ）である、段落２０２から２１０のいずれか１つに記載のキット。
２１３．非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、または短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である、段落２１２に記載のキット。
２１４．第１のベクター、第２のベクター、第３のベクター、またはこれらの任意の組合せが、プラスミドベクターまたはウイルスベクターである、段落２０２から２１３のいずれか１つに記載のキット。
２１５．以下の構成要素：緩衝液、塩、クローニング酵素、コンピテント細胞、トランスフェクション試薬、抗生物質、および／または本明細書に記載される方法を実行するための説明書のうちのいずれか１つまたは複数をさらに含む、段落２０２から２１４のいずれか１つに記載のキット。
２１６．トランスジェニック選択方法であって、真核生物細胞を含む組成物に、（ａ）（ｉ）Ｎ末端インテインタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列の上流の、第１の選択可能マーカータンパク質断片（たとえば、抗生物質耐性タンパク質断片または蛍光タンパク質断片）をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、（ｂ）（ｉ）第２の選択可能マーカータンパク質断片（たとえば、抗生物質耐性タンパク質断片または蛍光タンパク質断片）の上流の、Ｃ末端インテインタンパク質断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターとを送達することを含み、Ｎ末端インテインタンパク質断片およびＣ末端インテインタンパク質断片が、第１の選択可能マーカータンパク質断片の、第２の選択可能マーカータンパク質断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、トランスジェニック選択方法。
２１７．トランスジェニック選択方法であって、真核生物細胞に、（ａ）（ｉ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質（たとえば、抗生物質耐性タンパク質または蛍光タンパク質）のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、（ｂ）（ｉ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、（ｃ）（ｉ）選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターとを送達することを含み、第１のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片の、選択可能マーカータンパク質の中央断片への結合を触媒し、第２のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、選択可能マーカータンパク質の中央断片の、選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、トランスジェニック選択方法。
２１８．トランスジェニック選択方法であって、真核生物細胞に、（ａ）（ｉ）第１のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質（たとえば、抗生物質耐性タンパク質または蛍光タンパク質）のＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第１の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第１のベクターと、（ｂ）（ｉ）第２のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質の第１の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第１のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第２の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第２のベクターと、（ｃ）（ｉ）第３のインテインのＮ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、選択可能マーカータンパク質の第２の中央断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第２のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第３のベクターと、（ｄ）（ｉ）選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列の上流にある、第３のインテインのＣ末端断片をコードするヌクレオチド配列、および（ｉｉ）第３の目的の分子をコードするヌクレオチド配列を含む、第４のベクターとを送達することを含み、第１のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、選択可能マーカータンパク質のＮ末端断片の、選択可能マーカータンパク質の第１の中央断片への結合を触媒し、第２のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、選択可能マーカータンパク質の第１の中央断片の、選択可能マーカータンパク質の第２の中央断片への結合を触媒し、第３のインテインのＮ末端断片およびＣ末端断片が、選択可能マーカータンパク質の第２の中央断片の、選択可能マーカータンパク質のＣ末端断片への結合を触媒して、全長選択可能マーカータンパク質を産生する、トランスジェニック選択方法。
２１９．真核生物細胞を、ベクターの真核生物細胞への導入を許容する条件下で維持して、トランスジェニック真核生物細胞を産生することをさらに含む、段落２１６から２１８のいずれか１つに記載の方法。
２２０．全長選択可能マーカータンパク質を含むトランスジェニック真核生物細胞を選択することをさらに含む、段落２１９に記載の方法。
２２１．真核生物細胞が、哺乳動物細胞である、段落２１６から２２０のいずれか１つに記載の方法。
２２２．抗生物質耐性タンパク質が、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、ピューロマイシン、フレオマイシンＤ１、またはブラストサイジンに対する耐性を付与する、段落２１６から２２１のいずれか１つに記載の方法。
２２３．インテインが、スプリットインテインである、段落２１６から２２２のいずれか１つに記載の方法。
２２４．スプリットインテインが、天然のスプリットインテインである、段落２２３に記載の方法。
２２５．天然のスプリットインテインが、ＤｎａＥインテインから選択される、段落２２４に記載の方法。
２２６．ＤｎａＥインテインが、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ  ｓｐ．ＤｎａＥ（ＳｓｐＤｎａＥ）インテインおよびＮｏｓｔｏｃ  ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ（ＮｐｕＤｎａＥ）インテインから選択される、段落２２５に記載の方法。
２２７．スプリットインテインが、操作されたスプリットインテインである、段落２２３に記載の方法。
２２８．操作されたスプリットインテインが、ＤｎａＢインテインから操作される、段落２２７８に記載の方法。
２２９．操作されたスプリットインテインが、ＳｓｐＤｎａＢ  Ｓ１インテインである、段落２２８に記載の方法。
２３０．操作されたスプリットインテインが、ＧｙｒＢインテインから操作される、段落２２９に記載の方法。
２３１．操作されたスプリットインテインが、ＳｓｐＧｙｒＢ  Ｓ１１インテインである、段落２３０に記載の方法。
２３２．分子が、タンパク質から選択される、段落２１６から２３１のいずれか１つに記載の方法。
２３３．分子が、非コーディングリボ核酸（ＲＮＡ）から選択される、段落２１６から２３１のいずれか１つに記載の方法。
２３４．非コーディングＲＮＡが、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスＲＮＡ、短い干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から選択される、段落２３３に記載の方法。
２３５．ベクターが、プラスミドベクターおよびウイルスベクターから選択される、段落２１６から２３４のいずれか１つに記載の方法。
【実施例】
【００６１】
本開示は、以下の実施例によってさらに例証される。これらの実施例は、本開示の理解を補助するために提供されるものであり、その制限と解釈されるものではない。
（実施例１）
抗生物質耐性マーカー
【００６２】
遺伝子操作において、所望される遺伝子型を有する細胞を単離するために選択可能マーカーが使用されることが多い［１］。しかしながら、真核生物細胞において使用するための十分に特徴付けられている抗生物質耐性遺伝子の数は限られており、通常の研究室にある機器によってスペクトルを明確に区別することができる蛍光タンパク質の数も限られている。研究者は、選択可能マーカーが、複数の導入遺伝子を細胞に組み込むためのものである場合、選択可能マーカーの十分な選択肢がないという問題に出くわすことが多い。一方で、複数の抗生物質での同時の選択は、細胞にとって過酷であることが多い。「選択可能マーカーの再利用」は、回避策を提供し得るが、しかしながら、複数回の遺伝子導入、選択、および選択マーカーの除去を必要とする［２］。複数の導入遺伝子を、１回の選択スキームによって同時に選択することを可能にするために、本発明者らは、スプリットされた抗生物質耐性タンパク質遺伝子および蛍光タンパク質遺伝子を作製したが、これは、抗生物質耐性タンパク質または蛍光タンパク質をコードする遺伝子が、２つまたはそれを上回るセグメントにスプリットされ、インテインに融合されており（「マーカートロン」）、これらを、タンパク質のトランススプライシングによって再結合させることができる［３］（図１Ａ）。それぞれのマーカートロンを、特定の導入遺伝子を有するトランスジェニックベクターに挿入する。マーカートロンのセットを含むトランスジェニックベクターの送達により、マーカートロンのサブセットまたは完全なセットを有する細胞が得られる。マーカートロンの完全なセットを含む細胞だけが、タンパク質スプライシングによって完全に再構成されたマーカータンパク質を産生するため、選択を通過するが、一方でマーカートロンの部分的なセットを有する細胞は排除され、すべての意図される導入遺伝子を含む細胞の同時選択が達成される。
【００６３】
本発明者らは、二重遺伝子導入のために、２マーカートロンのインテイン−スプリットされた耐性（Ｉｎｔｒｅｓ）遺伝子を操作することから開始した。隣接する残基および局所的なタンパク質フォールディングは、インテインに媒介されるトランススプライシングの効率に影響を及ぼし得るため、本発明者らは、ＮｐｕＤｎａＥ［４、５］およびＳｓｐＤｎａＢ［６］に由来する２つの十分に特徴付けられているスプリットインテインと適合性のある４つの一般的に使用されている抗生物質耐性遺伝子のそれぞれにおいて、スプリット点を特定することに着手した。二重トランスジェニック選択の有効性の評価を容易にするために、マーカートロンを、試験導入遺伝子としてＴａｇＢＦＰ２またはｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質を発現するレンチウイルスベクターにクローニングした（図１Ｂ）。ウイルス調製物を、Ｕ２ＯＳ細胞に形質導入し、これを、次いで、非選択培地または選択培地を有する複製プレートに分けた。抗生物質選択に適した継代の後に、２つの細胞培養物を、フローサイトメトリーによって分析した。ハイグロマイシン（Ｈｙｇｒｏ）耐性遺伝子については、隣接残基「ＧＳ」を有する１つの「ネイティブ」ＳｓｐＤｎａＢスプリット点（Ｇ２００：Ｓ２０１）、および「ＹＣ」残基を有する１つの「ネイティブ」ＮｐｕＤｎａＥスプリット点（Ｙ８９：Ｃ９０）を、試験した。いずれも、ＮマーカートロンおよびＣマーカートロンの両方が形質導入されたた場合には選択が成功し、非選択培養物での１０％未満の二重陽性細胞と比較して、選択培養物では、９９％を上回るＢＦＰ＋  ｍＣｈｅｒｒｙ＋二重トランスジェニック細胞が得られた（図３、プラスミド対３、４および５、６）。２つのマーカートロンのうちのいずれかが形質導入された細胞は、ハイグロマイシン選択に生き残らなかった。対照的に、従来的な全長のスプリットされていないハイグロマイシンベクターによる二重遺伝子導入は、ＢＦＰ＋  ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞の約２０％の富化を可能にするだけである（プラスミド対９７、９８）。ＮｐｕＤｎａＥについて、Ｃエクステイン接合部に強制的なシステイン残基を有し、以前の報告７において実質的なトランススプライシング活性を補助した残基をＮエクステイン接合部に有する、３つの追加の可能性のあるスプリット点（５２Ｓ：５３Ｃ）、（２４０Ａ：２４１Ｃ）、および（２９２Ｒ：２９３Ｃ）をスクリーニングした。本発明者らはまた、異所的な部位におけるスプライシングに対応するために、「人工的な」システインをＣエクステイン接合部に挿入し、追加のスプリット点をもたらすことによって、６つの追加のＮｐｕＤｎａＥスプリット点を組み込んだ。まとめると、試験した１１のスプリット点のうちの８つが、ハイグロマイシン選択に対応した（図３）。同様に、ピューロマイシン（Ｐｕｒｏ）（図４）、ネオマイシン（Ｎｅｏ）（図５）、およびブラストサイジン（Ｂｌａｓｔ）（図６）耐性遺伝子について、本発明者らは、それぞれ、４つ、２つ、および１つの機能的Ｉｎｔｒｅｓ対を特定した。これらの事例のすべてにおいて、いずれかのマーカートロンが形質導入された細胞は、選択に生き残らなかったが、両方が形質導入された細胞では、非選択培養物で��５０％未満と比較して、選択培養物では９５％を上回る二重トランスジェニック細胞が得られたが、ブラストサイジン（１０２）のＩｎｔｒｅｓでは、９１％の二重トランスジェニック細胞という低いが依然として有意な富化が達成されたことを除く（図３〜６）。Ｉｎｔｒｅｓ遺伝子のスプリット点およびプラスミドの詳細を、図２Ａ〜２Ｄおよび表１に提示する。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【００６４】
（実施例２）
Ｇａｔｅｗａｙ適合性レンチウイルスベクター
Ｉｎｔｒｅｓマーカーの採用を促進するために、本発明者らは、導入遺伝子の便宜的な制限−ライゲーション非依存性ＬＲクロナーゼ組換えのためのＧａｔｅｗａｙ適合性レンチウイルスベクターを作製した８（図７Ａ）。ＴａｇＢＰＦ２およびｍＣｈｅｒｒｙを、それぞれ、Ｎ−およびＣ−Ｉｎｔｒｅｓベクターに組み換えることによって、これらのベクターの機能性を試験し、二重トランスジェニック細胞の強固な選択が見出された（図７Ｂ）。Ｉｎｔｒｅｓベクターの１つの有望な有用性は、異なる蛍光マーカーを細胞に組み入れて、異なる細胞内コンパートメントを標識することである。そのような有用性を探究するために、それぞれ、核およびＦ−アクチンを標識するＮＬＳ−ＧＦＰおよびＬｉｆｅＡｃｔ−ｍＳｃａｒｌｅｔ  ９を、従来的な全長（ＦＬ）のスプリットされていないハイグロマイシン選択可能ベクターまたは２マーカートロンのハイグロマイシンＩｎｔｒｅｓベクターへのＧａｔｅｗａｙ組換えによってクローニングし、細胞に、いずれかのプラスミドセットを形質導入し、続いて、抗生物質による選択を行った（図７Ｃ）。スプリットされていない選択可能プラスミドを形質導入した試料は、単一に標識された細胞および二重に標識された細胞の両方を含んでいたが、一方で、Ｉｎｔｒｅｓプラスミドを形質導入した細胞は、すべてが二重に標識されていた（図７Ｃ）。
【００６５】
（実施例３）
蛍光マーカー
スプリットされた蛍光マーカーを、導入遺伝子の選択に使用することができるかどうかを試験するために、ｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光タンパク質についてＮｐｕＤｎａＥスプリット点をスクリーニングし（図８Ａ）、非ゲーティング集団における２０％未満の二重トランスジェニック細胞と比較して、９６％を上回る二重トランスジェニック細胞の富化を可能にする４つのスプリット点、および６０％を上回る二重トランスジェニック細胞の富化を可能にする３つの他のスプリット点を特定した（図８Ｂ）。
【００６６】
（実施例４）
より高度なスプリットマーカー
２マーカートロンのＩｎｔｒｅｓ遺伝子に関して特定されたスプリット点を用いて、本発明者らは、より高度なスプリットマーカーの操作に着手した。２つを上回る「連結されていない」導入遺伝子を１つの抗生物質で同時に選択することを可能にするために、マーカー遺伝子を３つまたはそれを上回るマーカートロンに分割するスプリット点の組合せを試験した（図９Ａ〜９Ｂ）。そのような「Ｉｎｔｒｅｓ連鎖」を可能にするスプリット点の対を特定するために、３つにスプリットされたマーカートロンを、それぞれが、３つの蛍光導入遺伝子ＴａｇＢＦＰ２、ＥＧＦＰ、またはｍＣｈｅｒｒｙのうちの１つを有する、３つのレンチウイルスベクターにクローニングし、これにより、フローサイトメトリーによって選択の有効性を評価することが可能となる（図９Ｃ）。ハイグロマイシン耐性遺伝子がもっとも長く、試験のためのスプリット点をもっとも多く提供するため、３マーカートロンのハイグロマイシンＩｎｔｒｅｓを操作することに焦点を当てた。３マーカートロンのハイグロマイシンＩｎｔｒｅｓ  ２つを、２つの介在ＮｐｕＤｎａＥインテインを使用して試験し、第１のインテインにＮｐｕＤｎａＥおよび第２のインテインにＳｓｐＤｎａＢを使用して２つを試験し、ならびに第１のインテインにＳｓｐＤｎａＢおよび第２のインテインにＮｐｕＤｎａＥを使用して２つを試験した（図９Ｄ）。非選択培養物での１５％未満の三重トランスジェニック細胞と比較して、ハイグロマイシン選択培養物では、これらの６つの３マーカートロンのハイグロマイシンＩｎｔｒｅｓのうちの５つが、９７％を上回る三重トランスジェニック選択を可能にし、残りの１つが８０％の三重トランスジェニック選択を可能にした。１個抜きの形質導入を行った試料は、ハイグロマイシン選択後にいずれの生存細胞も得られず、一方でスプリットされていないハイグロマイシンベクターを形質導入した細胞では、選択後にたった７％の三重トランスジェニック細胞しか得られなかった。
【００６７】
３マーカートロンのＩｎｔｒｅｓの使用を容易にするために、これらのマーカーを有するＧａｔｅｗａｙ適合性レンチウイルスベクターを作製した（図１０Ａ）。３セットのこれらのベクターを、それぞれ、ＴａｇＢＦＰ（導入遺伝子１として）、ＥＧＦＰ（導入遺伝子２として）、およびｍＣｈｅｒｒｙ（導入遺伝子３として）を、Ｎ−、Ｍ−、およびＣ−Ｉｎｔｒｅｓ  Ｇａｔｅｗａｙデスティネーションベクターに組み換えることによって試験し、これを使用してＵ２ＯＳ細胞に形質導入し、次いでこれを分けて、ハイグロマイシン選択培地または非選択培地において培養した（図１０Ｂ）。選択の２週間後に、細胞を、フローサイトメトリーによって分析した。３マーカートロンのハイグロマイシンＩｎｔｒｅｓプラスミドは、３セットすべてが、非選択培養物における２５％未満と比較して、９９％を上回る三重トランスジェニック細胞の選択に対応する（図１０Ｃ）。
【００６８】
本発明者らは、４マーカートロンのハイグロマイシンＩｎｔｒｅｓ遺伝子の実行可能性をさらに試験した（図１１）。ここでは、ロイシンジッパーモチーフ１１と融合した、ＮｐｕＤｎａＧＥＰ  １０として公知のＮｐｕＤｎａＥインテインの強化バリアントを、ＳｓｐＤｎａＢインテインと組み合わせて使用した。構成物マーカートロンを含む４つすべてのプラスミドの形質導入により、ハイグロマイシン選択に生き残る細胞が得られたが、１個抜きの形質導入では、いずれの生存ももたらされなかった（表２）。
【表２】
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【００６９】
（実施例５）
ＡＡＶＳ１遺伝子座における両アレルノックイン
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓは、近年、ゲノム操作および編集の強力な技術として出現した。ＮＨＥＪに媒介される挿入／欠失（インデル）に基づく遺伝子ノックアウトは、高い頻度で発生するが、外因性修復鋳型（標的化構築物としても公知である）を使用した相同組換え修復（ＨＤＲ）に基づく正確な編集およびノックインは、不十分である。本発明者らは、スプリットされた選択可能マーカーを、ＡＡＶＳ１遺伝子座における両アレルノックインを有する細胞の富化に使用することができるかどうかを試験した。マーカートロンを宿主遺伝子ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃのイントロン１内に捕捉するために、標的部位に隣接する相同性アーム、およびスプライシングアクセプター−２Ａペプチドを有する標的化構築物を構築した。しかしながら、これらの標的化構築物を使用したＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓノックイン実験および２週間の抗生物質による選択後に、いずれの生存細胞も得られなかった（データは示されない）。本発明者らは、宿主遺伝子ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃの内在性プロモーターが、抗生物質の作用に対抗するのに十分な抗生物質耐性タンパク質を再構成するためのマーカートロンの十分な発現を作動させなかった可能性があると疑った。したがって、活性をドキシサイクリン（ｄｏｘ）濃度によって滴定することができるＴｅｔＯプロモーターによって、Ｉｎｔｒｅｓマーカートロンを発現させる代替的な戦略を試験した。Ｉｎｔｒｅｓにより媒介される両アレル選択と、全長（ＦＬ）のスプリットされていない選択可能マーカーとの比較を可能にするために、複数の異なる標的化構築物設計を実装した。まず、全長（ＦＬ）耐性遺伝子（たとえば、Ｈｙｇｒｏ）を、構成的ＥＦ１ａプロモーター下においてｒｔＴＡと一緒に発現させ、ｄｏｘ誘導性ＴｅｔＯプロモーター下において別個の試験Ｉｎｔｒｅｓ（たとえば、Ｂｌａｓｔ  Ｉｎｔｒｅｓ）を発現させる（図１２Ｂ、プラスミド１０９および１１０）。これにより、同じ構築物内で、全長およびスプリットされた選択可能マーカーの比較が可能となる。同じＴｅｔＯプロモーターによって作動される全長マーカーとスプリットされたマーカーとの公平な比較を可能にするために、２つの類似のプラスミド１０７および１０８（プラスミド１０９および１１０を参照）を構築し、ここで、全長抗生物質耐性遺伝子（Ｂｌａｓｔ）を、ＴｅｔＯプロモーターの下流に置く（図１２Ａ）。両アレル標的化の単一細胞定量を可能にするため、および２つの導入遺伝子を２つのＡＡＶＳ１アレルに組み込むことの実行可能性を示すために、ＥＧＦＰおよびｍＳｃａｒｌｅｔ蛍光遺伝子を、自己切断型２Ａペプチドを介して、試験するスプリットされたマーカーまたはスプリットされていないマーカーの下流に付加した。同様に、Ｈｙｇｒｏ  Ｉｎｔｒｅｓを試験するために、ＥＦ１ａおよびＴｅｔＯにより作動されるマーカーを入れ換え、ＦＬ  ＨｙｇｒｏまたはＨｙｇｒｏ  Ｉｎｔｒｅｓを、ＴｅｔＯの下流に置き、ＦＬ  ＢｌａｓｔをＥＦ１ａの下流に置いた（図１２Ｃ〜１２Ｄ、プラスミド１１１〜１１４）。Ｃａｓ９およびＡＡＶＳ１を標的とするｓｇＲＮＡを含むｐＸ３３０−ＡＡＶＳ１（プラスミド１０６）と、異なる標的化構築物対とを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にコトランス��ェクトし、次の継代で、抗生物質なし、ブラストサイジンあり、またはハイグロマイシンありで、三連のドキシサイクリン含有培地に分けた。選択の２週間後に、本発明者らは、ＧＦＰおよびＲＦＰ蛍光のフローサイトメトリー測定によって、両アレル標的化に関して、培養物を分析した（図１２Ｅ）。予測した通り、非選択培養物は、ごく僅かな（１％未満）両アレルノックインＧＦＰ＋／ＲＦＰ＋細胞を有した（図１２Ｅ、選択＝なし）。対応するＦＬ抗生物質耐性遺伝子が標的化構築物に存在する場合の抗生物質による選択では、３０％未満の両アレルノックイン細胞が得られた（図１２Ｅ、Ｂｌａｓｔ：ＴＣ  ａ、ｃ、ｄ；Ｈｙｇｒｏ：ＴＣ  ａ、ｂ、ｃ）。対照的に、対応するＩｎｔｒｅｓが標的化構築物に存在する場合の抗生物質による選択では、７５％（図６ｅ、Ｂｌａｓｔ  Ｉｎｔｒｅｓ：ＴＣ  ｂ）および８８％（図６ｅ、Ｈｙｇｒｏ  Ｉｎｔｒｅｓ：ＴＣ  ｄ）の両アレルノックイン細胞が得られた。
【００７０】
上記の実施例では、２つまたはそれを上回る「連結されていない」導入遺伝子の選択を可能にし得る、スプリットされた抗生物質耐性タンパク質遺伝子および蛍光タンパク質遺伝子を操作した。非天然の残基を選択可能マーカーに挿入することにより、新規な高効率のスプリット点を利用することができ、操作に利用可能な位置を拡大することができることを示した。本発明者らは、スプリットされた選択可能マーカーを、レンチウイルスベクターまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集実験では遺伝子標的化構築物に組み込んで、二重遺伝子導入または両アレルノックインを有する細胞の富化を可能にすることができることを実証した。２つまたはそれを上回るスプリット点を組み合わせることによって、３つおよび４つにスプリットされたマーカーを生成して、より高度なトランスジェニック選択を可能にすることができることを示した。さらに高度なスプリットされた選択可能マーカーのさらなる開発により、数１０個の導入遺伝子または標的化されたノックインを有する細胞の「超操作（ｈｙｐｅｒ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）」が可能となり得る。
【００７１】
材料および方法
クローニング
それぞれのマーカートロンの試験プラスミドを生成するために、まず、そのＯＲＦを含むＧａｔｅｗａｙドナープラスミドを生成し、次いで、ピューロマイシン耐性遺伝子を除去しＧａｔｅｗａｙカセットの下流にＩＲＥＳ−蛍光遺伝子を挿入することによってｐＬＸ３０２（ａｄｄｇｅｎｅ．ｏｒｇ／２５８９６／）から導出した、ＴａｇＢＦＰ２（プラスミド９４：ｐＬＸ−ＤＥＳＴ−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２）、ＥＧＦＰ（プラスミド９５：ｐＬＸ−ＤＥＳＴ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ）、またはｍＣｈｅｒｒｙ（プラスミド９６：ｐＬＸ−ＤＥＳＴ−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ）レポーターを有するレンチウイルスデスティネーションベクターへと組み換えた。マーカートロン−ＯＲＦ  Ｇａｔｅｗａｙドナープラスミドを、インテインを選択可能マーカーの断片のコーディング配列と組み合わせた後に、配列およびライゲーション独立クローニング（ＳＬＩＣ）（Li,  M.Z.  &  Elledge,  S.J.  SLIC:  a  method  for  sequence-and  ligation-independent  cloning.  Gene  Synthesis:  Methods  and  Protocols,  51-59  (2012)）によりｐＣＲ８−ＧＷ−ＴＯＰＯプラスミドに挿入するネスト融合ＰＣＲ手順によって、または選択可能マーカーの関連する断片をＰＣＲ増幅した後に、ＳＬＩＣによりインテインを含む「足場」プラスミド（プラスミド２７〜３２）に挿入することによってのいずれかで、生成した。インテインをコードするＤＮＡ配列を、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓのためにコドン最適化し、ＧＢｌｏｃｋ（ＩＤＴ）として合成し、ＡＣ１９４７ＧＢは、ＮｐｕＤｎａＥインテインをコードし、ＡＣ１９４９ＧＢは、ＳｓｐＤｎａＢインテインをコードする。選択可能マーカー断片を、これらのマーカーを含むプラスミドから増幅した。プラスミドについては、表１を参照されたい。
【００７２】
細胞培養物
すべての細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｌｏｎｚａ）、４％Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｓｉｇｍａ）において培養した。インキュベーター条件は、３７℃および５％ＣＯ２であった。
【００７３】
ウイルス産生
ｐＬＰ１、ｐＬＰ２、およびＶＳＶ−Ｇのウイルスパッケージングミックスを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００を使用して、それぞれのレンチウイルスベクターとともに、前日に６ウェルプレートにおいて１ウェル当たり１．２×１０６個の細胞の濃度で播種したＬｅｎｔｉ−Ｘ  ２９３Ｔ細胞（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）にコトランスフェクトした。培地を、トランスフェクションの６時間後に交換し、次いで、一晩インキュベートした。トランスフェクションの２８時間後に、ウイルスを含有する培地上清を、４５ｕＭ  ＰＥＳフィルターを使用して濾過した後、使用するまで、−８０℃で保管した。
【００７４】
形質導入
形質導入の前日に、標的細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ、ＭＣＦ７、Ｕ２−ＯＳ）を、１２ウェルプレートに、１ウェル当たり１．５×１０５個の細胞の密度で、播種した。形質導入の前に、培地を、１ウェル当たり１ｍＬの、１０μｇ／ｍＬポリブレンを含有する培地に交換した。それぞれ２５０μＬのウイルス（２つのウイルスを添加した実験試料については、合計５００μＬ）を、それぞれのウェルに添加し、一晩インキュベートした。培地を、感染の２４時間後に交換した。感染の４日後に、細胞を、二連のプレートに分けた。感染の５日後に、抗生物質（ハイグロマイシン）を有する培地を、１つの複製プレートのそれぞれのウェルに添加した（他方は、選択なし下で維持した）。抗生物質による選択を２週間継続した後、ＦＡＣＳで分析した。
【００７５】
蛍光活性化細胞選別
細胞に、トリプシン処理を行い、培地中に懸濁させた後、ＨＰ  Ｚ２３０ワークステーションにおいて、ＦＡＣＳＤｉＶａソフトウェア、バージョン８を使用して、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）フローサイトメーターで分析した。５万個の事象が、それぞれの実行で収集された。
構築物および配列
【化１】
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【化２】
2020537646.tif 000008
プラスミド３：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ（１−８９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−８９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号２０）
アミノ酸配列（配列番号２１）
プラスミド４：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（９０−３４１）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（９０−３４１）
ベクター配列（配列番号２２）
アミノ酸配列（配列番号２３）
プラスミド５：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ（１−２００）−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−２００）−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号２４）
アミノ酸配列（配列番号２５）
プラスミド６：ｐＬＸ−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（２０１−３４１）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（２０１−３４１）
ベクター配列（配列番号２６）
アミノ酸配列（配列番号２７）
プラスミド７：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ（１−５２）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−５２）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号２８）
アミノ酸配列（配列番号２９）
プラスミド８：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（５３−３４１）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（５３−３４１）
ベクター配列（配列番号３０）
アミノ酸配列（配列番号３１）
プラスミド９：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ（１−２４０）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−２４０）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号３２）
アミノ酸配列（配列番号３３）
プラスミド１０：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（２４１−３４１）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（２４１−３４１）
ベクター配列（配列番号３４）
アミノ酸配列（配列番号３５）
プラスミド１１：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ（１−２９２）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−２９２）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号３６）
アミノ酸配列（配列番号３７）
プラスミド１２：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（２９３−３４１）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（２９３−３４１）
ベクター配列（配列番号３８）
アミノ酸配列（配列番号３９）
プラスミド１３：ｐＬＸ−Ｂｌａｓｔ（１−１０２）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｂｌａｓｔ（１−１０２）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号４０）
アミノ酸配列（配列番号４１）
プラスミド１４：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｂｌａｓｔ（１０３−１４０）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｂｌａｓｔ（１０３−１４０）
ベクター配列（配列番号４２）
アミノ酸配列（配列番号４３）
プラスミド１７：ｐＬＸ−Ｐｕｒｏ（１−１１９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｐｕｒｏ（１−１１９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号４４）
アミノ酸配列（配列番号４５）
プラスミド１８：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（ｉｎｓＣｙｓ；１２０−１９９）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（ｉｎｓＣｙｓ；１２０−１９９）
ベクター配列（配列番号４６）
アミノ酸配列（配列番号４７）
プラスミド１９：ｐＬＸ−Ｐｕｒｏ（１−１００）−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ−Ｓ０）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｐｕｒｏ（１−１００）−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ−Ｓ０）
ベクター配列（配列番号４８）
アミノ酸配列（配列番号４９）
プラスミド２０：ｐＬＸ−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ−Ｓ０）−Ｐｕｒｏ（１０１−１９９）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ−Ｓ０）−Ｐｕｒｏ（１０１−１９９）
ベクター配列（配列番号５０）
アミノ酸配列（配列番号５１）
プラスミド２１：ｐＬＸ−Ｎｅｏ（１−１３３）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｎｅｏ（１−１３３）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号５２）
アミノ酸配列（配列番号５３）
プラスミド２２：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｎｅｏ（１３４−２６７）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｎｅｏ（１３４−２６７）
ベクター配列（配列番号５４）
アミノ酸配列（配列番号５５）
プラスミド２３：ｐＬＸ−Ｎｅｏ（１−１９４）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｎｅｏ（１−１９４）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号５６）
アミノ酸配列（配列番号５７）
プラスミド２４：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｎｅｏ（１９５−２６７）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｎｅｏ（１９５−２６７）
ベクター配列（配列番号５８）
アミノ酸配列（配列番号５９）
プラスミド２５：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）＿Ｈｙｇｒｏ（５３−８９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）＿Ｈｙｇｒｏ（５３−８９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号６０）
アミノ酸配列（配列番号６１）
プラスミド２６：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）＿Ｈｙｇｒｏ（５３−２３９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）＿Ｈｙｇｒｏ（５３−２３９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号６２）
アミノ酸配列（配列番号６３）
プラスミド２７：ｐＣＲ８−ＢｓａＩ−＞ｃｃｄｂＣａｍ＜−ＢｓａＩ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＭＤ１−６８−１５（配列番号６４）
プラスミド２８：ｐＣＲ８−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）＿ＢｓａＩ−＞ｃｃｄｂＣａｍ＜−ＢｓａＩ−ＭＤ１−６８−１８（配列番号６５）
プラスミド２９：ｐＣＲ８−ＢｓａＩ−＞ｃｃｄｂＣａｍ＜−ＢｓａＩ−ＳｓｐＤｎａＥ（Ｎ）−ＭＤ１−６８−１２（配列番号６６）
プラスミド３０：ｐＣＲ８−ＳｓｐＤｎａＥ（Ｃ）＿ＢｓａＩ−＞ｃｃｄｂＣａｍ＜−ＢｓａＩ−ＭＤ１−６８−１３（配列番号６７）
プラスミド３１：ｐＣＲ８−ＢｓａＩ−＞ｃｃｄｂＣａｍ＜−ＢｓａＩ−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ−Ｓ０）−２５−１３５−１８（配列番号６８）
プラスミド３２：ｐＣＲ８−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ−Ｓ０）＿ＢｓａＩ−＞ｃｃｄｂＣａｍ＜−ＢｓａＩ−２５−１５５−４１（配列番号６９）
プラスミド３３：ｐＬＸ−ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−４６）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−４６）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ
ベクター配列（配列番号７０）
アミノ酸配列（配列番号７１）
プラスミド３４：ｐＬＸ−ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；４７−２３２）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；４７−２３２）
ベクター配列（配列番号７２）
アミノ酸配列（配列番号７３）
プラスミド３５：ｐＬＸ−ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−４８）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−４８）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ
ベクター配列（配列番号７４）
アミノ酸配列（配列番号７５）
プラスミド３６：ｐＬＸ−ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；４９−２３２）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ
タンパク質＝ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；４９−２３２）
ベクター配列（配列番号７６）
アミノ酸配列（配列番号７７）
プラスミド３７：ｐＬＸ−ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−５１）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ  −ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−５１）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ
ベクター配列（配列番号７８）
アミノ酸配列（配列番号７９）
プラスミド３８：ｐＬＸ−ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；５２−２３２）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ
タンパク質＝ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；５２−２３２）
ベクター配列（配列番号８０）
アミノ酸配列（配列番号８１）
プラスミド３９：ｐＬＸ−ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−７５）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−７５）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ
ベクター配列（配列番号８２）
アミノ酸配列（配列番号８３）
プラスミド４０：ｐＬＸ−ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；７６−２３２）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ
タンパク質＝ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；７６−２３２）
ベクター配列（配列番号８４）
アミノ酸配列（配列番号８５）
プラスミド４１：ｐＬＸ−ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−１２２）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−１２２）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ
ベクター配列（配列番号８６）
アミノ酸配列（配列番号８７）
プラスミド４２：ｐＬＸ−ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；１２３−２３２）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ
タンパク質＝ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；１２３−２３２）
ベクター配列（配列番号８８）
アミノ酸配列（配列番号８９）
プラスミド４３：ｐＬＸ−ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−１４０）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−１４０）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ
ベクター配列（配列番号９０）
アミノ酸配列（配列番号９１）
プラスミド４４：ｐＬＸ−ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；１４１−２３２）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ
タンパク質＝ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；１４１−２３２）
ベクター配列（配列番号９２）
アミノ酸配列（配列番号９３）
プラスミド４５：ｐＬＸ−ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−１６３）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−１６３）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ
ベクター配列（配列番号９４）
アミノ酸配列（配列番号９５）
プラスミド４６：ｐＬＸ−ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；１６４−２３２）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ
タンパク質＝ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（ｉｎｓＣｙｓ；１６４−２３２）
ベクター配列（配列番号９６）
アミノ酸配列（配列番号９７）
プラスミド４７：ｐＣＲ８−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝ＴａｇＢＦＰ２
ベクター配列（配列番号９８）
アミノ酸配列（配列番号９９）
プラスミド４８：ｐＣＲ８−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ｍＣｈｅｒｒｙ
ベクター配列（配列番号１００）
アミノ酸配列（配列番号１０１）
プラスミド４９：ｐＬＸ−ＤＥＳＴ−ＩＲＥＳ−Ｈｙｇｒｏ（１−８９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−８９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１０２）
アミノ酸配列（配列番号１０３）
プラスミド５０：ｐＬＸ−ＤＥＳＴ−ＩＲＥＳ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（９０−３４１）
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（９０−３４１）
ベクター配列（配列番号１０４）
アミノ酸配列（配列番号１０５）
プラスミド５１：ｐＬＸ−［ＴａｇＢＦＰ２］−ＩＲＥＳ−Ｈｙｇｒｏ（１−８９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１０６）
プラスミド５２：ｐＬＸ−［ｍＣｈｅｒｒｙ］−ＩＲＥＳ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（９０−３４１）
ベクター配列（配列番号１０７）
プラスミド５３：ｐＬＸ−ＤＥＳＴ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ（１−１１９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
タンパク質＝Ｐｕｒｏ（１−１１９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１０８）
アミノ酸配列（配列番号１０９）
プラスミド５４：ｐＬＸ−ＤＥＳＴ−ＩＲＥＳ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（１２０−１９９）
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（１２０−１９９）
ベクター配列（配列番号１１０）
アミノ酸配列（配列番号１１１）
プラスミド５５：ｐＬＸ−［ＴａｇＢＦＰ２］−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏ（１−１１９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１１２）
プラスミド５６：ｐＬＸ−［ｍＣｈｅｒｒｙ］−ＩＲＥＳ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（１２０−１９９）
ベクター配列（配列番号１１３）
プラスミド５７：ｐＬＸ−ＤＥＳＴ−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ（１−１９４）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
タンパク質＝Ｎｅｏ（１−１９４）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１１４）
アミノ酸配列（配列番号１１５）
プラスミド５８：ｐＬＸ−ＤＥＳＴ−ＩＲＥＳ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｎｅｏ（１９５−２６７）
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｎｅｏ（１９５−２６７）
ベクター配列（配列番号１１６）
アミノ酸配列（配列番号１１７）
プラスミド５９：ｐＬＸ−［ＴａｇＢＦＰ２］−ＩＲＥＳ−Ｎｅｏ（１−１９４）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１１８）
プラスミド６０：ｐＬＸ−［ｍＣｈｅｒｒｙ］−ＩＲＥＳ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｎｅｏ（１９５−２６７）
ベクター配列（配列番号１１９）
プラスミド６１：ｐＬＸ−ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−５１）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＬＺＡ−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝ｍＳｃａｒｌｅｔ（１−５１）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＬＺＡ
ベクター配列（配列番号１２０）
アミノ酸配列（配列番号１２１）
プラスミド６２：ｐＬＸ−ＬＺＢ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（＾Ｃ，５２−１６３）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ
タンパク質＝ＬＺＢ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（＾Ｃ；５２−１６３）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ
ベクター配列（配列番号１２２）
アミノ酸配列（配列番号１２３）
プラスミド６３：ｐＬＸ−ＬＺＢ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（＾Ｃ；１６４−２３２）−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ
タンパク質＝ＬＺＢ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ｍＳｃａｒｌｅｔ（＾Ｃ；１６４−２３２）
ベクター配列（配列番号１２４）
アミノ酸配列（配列番号１２５）
プラスミド６４：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ（１−６９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−６９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１２６）
アミノ酸配列（配列番号１２７）
プラスミド６５：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（＾Ｃ；７０−３４１）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（＾Ｃ；７０−３４１）
ベクター配列（配列番号１２８）
アミノ酸配列（配列番号１２９）
プラスミド６６：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ（１−１３１）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−１３１）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１３０）
アミノ酸配列（配列番号１３１）
プラスミド６７：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（＾Ｃ；１３２−３４１）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（＾Ｃ；１３２−３４１）
ベクター配列（配列番号１３２）
アミノ酸配列（配列番号１３３）
プラスミド６８：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ（１−１７１）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−１７１）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１３４）
アミノ酸配列（配列番号１３５）
プラスミド６９：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（＾Ｃ；１７２−３４１）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（＾Ｃ；１７２−３４１）
ベクター配列（配列番号１３６）
アミノ酸配列（配列番号１３７）
プラスミド７０：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ（１−２１８）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−２１８）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１３８）
アミノ酸配列（配列番号１３９）
プラスミド７１：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（＾Ｃ；２１９−３４１）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（＾Ｃ；２１９−３４１）
ベクター配列（配列番号１４０）
アミノ酸配列（配列番号１４１）
プラスミド７２：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ（１−２５９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−２５９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１４２）
アミノ酸配列（配列番号１４３）
プラスミド７３：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（＾Ｃ；２６０−３４１）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（＾Ｃ；２６０−３４１）
ベクター配列（配列番号１４４）
アミノ酸配列（配列番号１４５）
プラスミド７４：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ（１−２７７）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−２７７）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１４６）
アミノ酸配列（配列番号１４７）
プラスミド７５：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（＾Ｃ；２７８−３４１）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（＾Ｃ；２７８−３４１）
ベクター配列（配列番号１４８）
アミノ酸配列（配列番号１４９）
プラスミド７６：ｐＬＸ−Ｐｕｒｏ（１−３２）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｐｕｒｏ（１−３２）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１５０）
アミノ酸配列（配列番号１５１）
プラスミド７７：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（＾Ｃ；３３−１９９）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（＾Ｃ；３３−１９９）
ベクター配列（配列番号１５２）
アミノ酸配列（配列番号１５３）
プラスミド７８：ｐＬＸ−Ｐｕｒｏ（１−８４）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｐｕｒｏ（１−８４）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１５４）
アミノ酸配列（配列番号１５５）
プラスミド７９：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（＾Ｃ；８５−１９９）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（＾Ｃ；８５−１９９）
ベクター配列（配列番号１５６）
アミノ酸配列（配列番号１５７）
プラスミド８０：ｐＬＸ−Ｐｕｒｏ（１−１３７）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｐｕｒｏ（１−１３７）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ファイル＝ｐＬＸ−［ＰｕｒｏＫＣ３（Ｎ）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−２５−１３１−２９”］−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２−２５−１３３−６
ベクター配列（配列番号１５８）
アミノ酸配列（配列番号１５９）
プラスミド８１：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（＾Ｃ；１３８−１９９）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（＾Ｃ；１３８−１９９）
ベクター配列（配列番号１６０）
アミノ酸配列（配列番号１６１）
プラスミド８２：ｐＬＸ−Ｐｕｒｏ（１−１５８）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｐｕｒｏ（１−１５８）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１６２）
アミノ酸配列（配列番号１６３）
プラスミド８３：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（＾Ｃ；１５９−１９９）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（＾Ｃ；１５９−１９９）
ベクター配列（配列番号１６４）
アミノ酸配列（配列番号１６５）
プラスミド８４：ｐＬＸ−Ｐｕｒｏ（１−１８０）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｐｕｒｏ（１−１８０）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１６６）
アミノ酸配列（配列番号１６７）
プラスミド８５：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（＾Ｃ；１８１−１９９）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｐｕｒｏ（＾Ｃ；１８１−１９９）
ベクター配列（配列番号１６８）
アミノ酸配列（配列番号１６９）
プラスミド８６：ｐＬＸ−Ｂｌａｓｔ（１−５８）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｂｌａｓｔ（１−５８）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１７０）
アミノ酸配列（配列番号１７１）
プラスミド８７：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｂｌａｓｔ（５９−１４０）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｂｌａｓｔ（５９−１４０）
ベクター配列（配列番号１７２）
アミノ酸配列（配列番号１７３）
プラスミド８８：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−ＨｙｇｒｏＢＡ−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ−Ｓ０）−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（５３−２００）−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ−Ｓ０）
ベクター配列（配列番号１７４）
アミノ酸配列（配列番号１７５）
プラスミド８９：ｐＬＸ−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ−Ｓ０）−Ｈｙｇｒｏ（２０１−３４１）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ−Ｓ０）−Ｈｙｇｒｏ（２０１−３４１）
ベクター配列（配列番号１７６）
アミノ酸配列（配列番号１７７）
プラスミド９０：ｐＬＸ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（９０−２００）−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ−Ｓ０）−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ
タンパク質＝ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（９０−２００）−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ−Ｓ０）
ベクター配列（配列番号１７８）
アミノ酸配列（配列番号１７９）
プラスミド９１：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ（１−２００）−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ−Ｓ０）−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−２００）−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ−Ｓ０）
ベクター配列（配列番号１８０）
アミノ酸配列（配列番号１８１）
プラスミド９２：ｐＬＸ−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ−Ｓ０）−Ｈｙｇｒｏ（２０１−２４０）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ
タンパク質＝ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ−Ｓ０）−Ｈｙｇｒｏ（２０１−２４０）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１８２）
アミノ酸配列（配列番号１８３）
プラスミド９３：ｐＬＸ−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ−Ｓ０）−Ｈｙｇｒｏ（２０１−２９２）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ
タンパク質＝ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ−Ｓ０）−Ｈｙｇｒｏ（２０１−２９２）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１８４）
アミノ酸配列（配列番号１８５）
プラスミド９４：ｐＬＸ−ＤＥＳＴ−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２（配列番号１８６）
プラスミド９５：ｐＬＸ−ＤＥＳＴ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（配列番号１８７）
プラスミド９６：ｐＬＸ−ＤＥＳＴ−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ（配列番号１８８）
プラスミド９７：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
ベクター配列（配列番号１８９）
プラスミド９８：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
ベクター配列（配列番号１９０）
プラスミド９９：ｐＬＸ−Ｐｕｒｏ−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
ベクター配列（配列番号１９１）
プラスミド１００：ｐＬＸ−Ｐｕｒｏ−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
ベクター配列（配列番号１９２）
プラスミド１０１：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ−ＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ
ベクター配列（配列番号１９３）
プラスミド１０２：ｐＬＸ−ＮＬＳ＿ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｈｙｇｒｏ
ベクター配列（配列番号１９４）
プラスミド１０３：ｐＬＸ−ＬｉｆｅＡｃｔ＿ｍＣｈｅｒｒｙ−ＩＲＥＳ−Ｈｙｇｒｏ
ベクター配列（配列番号１９５）
プラスミド１０４：ｐＬＸ−ＮＬＳ＿ＧＦＰ−ＩＲＥＳ−Ｈｙｇｒｏ（１−８９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）
ベクター配列（配列番号１９６）
プラスミド１０５：ｐＬＸ−ＬｉｆｅＡｃｔ＿ｍＳｃａｒｌｅｔ−ＩＲＥＳ−  ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（９０−３４１）
ベクター配列（配列番号１９７）
プラスミド１０６：ｐＸ３３０−ＡＡＶＳ１
ｓｇＲＮＡスペーサー配列：ｇＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡ（最初のｇは、ゲノムと一致しない）（配列番号１９８）
ベクター配列（配列番号１９９）
プラスミド１０７：ｐＡＡＶＳ１−Ｎｓｔ−ＥＦ１ａＨｙｇｒｏ２ＡｒｔＴＡ３（−）＿ＴｅｔＯ−Ｂｌａｓｔ−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ
ベクター配列（配列番号２００）
プラスミド１０８：ｐＡＡＶＳ１−Ｎｓｔ−ＥＦ１ａＨｙｇｒｏ２ＡｒｔＴＡ３（−）＿ＴｅｔＯ−Ｂｌａｓｔ−Ｐ２Ａ−ｍＳｃａｒｌｅｔ
ベクター配列（配列番号２０１）
プラスミド１０９：ｐＡＡＶＳ１−Ｎｓｔ−ＥＦ１ａＨｙｇｒｏ２ＡｒｔＴＡ３（−）＿ＴｅｔＯ−Ｂｌａｓｔ（１−１０２）＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ
ベクター配列（配列番号２０２）
プラスミド１１０：ｐＡＡＶＳ１−Ｎｓｔ−ＥＦ１ａＨｙｇｒｏ２ＡｒｔＴＡ３（−）＿ＴｅｔＯ−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）＿Ｂｌａｓｔ（１０３−１４０）−Ｐ２Ａ−ｍＳｃａｒｌｅｔ
ベクター配列（配列番号２０３）
プラスミド１１１：ｐＡＡＶＳ１−Ｎｓｔ−ＥＦ１ａＢｌａｓｔ２ＡｒｔＴＡ３（−）＿ＴｅｔＯ−Ｈｙｇｒｏ−Ｐ２Ａ−ＮＴＲ−Ｅ２Ａ−ＥＧＦＰ
ベクター配列（配列番号２０４）
プラスミド１１２：ｐＡＡＶＳ１−Ｎｓｔ−ＥＦ１ａＢｌａｓｔ２ＡｒｔＴＡ３（−）＿ＴｅｔＯ−Ｈｙｇｒｏ−Ｐ２Ａ−ＮＴＲ−Ｅ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ
ベクター配列（配列番号２０５）
プラスミド１１３：ｐＡＡＶＳ１−Ｎｓｔ−ＥＦ１ａＢｌａｓｔ２ＡｒｔＴＡ３（−）＿ＴｅｔＯ−  Ｈｙｇｒｏ（１−８９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−Ｐ２Ａ−ＮＴＲ−Ｅ２Ａ−ＥＧＦＰ
ベクター配列（配列番号２０６）
プラスミド１１４：ｐＡＡＶＳ１−Ｎｓｔ−ＥＦ１ａＢｌａｓｔ２ＡｒｔＴＡ３（−）＿ＴｅｔＯ−  ＮｐｕＤｎａＥ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（９０−３４１）−Ｐ２Ａ−ＮＴＲ−Ｅ２Ａ−ｍＣｈｅｒｒｙ
ベクター配列（配列番号２０７）
プラスミド１１５：ｐＬＸ−Ｈｙｇｒｏ（１−８９）＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ−ＩＲＥＳ−ＴａｇＢＦＰ２
タンパク質＝Ｈｙｇｒｏ（１−８９）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＬＺＡ
ベクター配列（配列番号２０８）
アミノ酸配列（配列番号２０９）
プラスミド１１６：ｐＬＸ−ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＧＥＰ（Ｃ）＿Ｈｙｇｒｏ（９０−２００）＿ＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ−Ｓ０）−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ
タンパク質＝ＬＺＢ−ＮｐｕＤｎａＧＥＰ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（９０−２００）−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｎ−Ｓ０）
ベクター配列（配列番号２１０）
アミノ酸配列（配列番号２１１）
プラスミド１１７：ｐＬＸ−ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ−Ｓ０）＿Ｈｙｇｒｏ（２０１−２４０）＿ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）＿ＬＺＡ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ
タンパク質＝ＳｓｐＤｎａＢ（Ｃ−Ｓ０）−Ｈｙｇｒｏ（２０１−２４０）−ＮｐｕＤｎａＥ（Ｎ）−ＬＺＡ
ベクター配列（配列番号２１２）
アミノ酸配列（配列番号２１３）
プラスミド１１８：ｐＬＸ−ＬＺＢ＿ＮｐｕＤｎａＧＥＰ（Ｃ）＿Ｈｙｇｒｏ（２４１−３４１）−ＩＲＥＳ−ｍＣｈｅｒｒｙ
タンパク質＝ＬＺＢ−ＮｐｕＤｎａＧＥＰ（Ｃ）−Ｈｙｇｒｏ（２４１−３４１）
ベクター配列（配列番号２１４）
アミノ酸配列（配列番号２１５）
ＡＣ１９４７ＧＢ（配列番号２１６）
ＡＣ１９４９ＧＢ（配列番号２１７）
ｐＣＲ８−ｃｃｄｂＣａｍ（配列番号２１８）
参考文献
【化３】
2020537646.tif 000009
【００７６】
本明細書に開示されるすべての参考文献、特許、および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して、参照により組み込まれ、一部の事例では、文書の全体が包含され得る。
【００７７】
不定冠詞「１つの（ａ）」および「１つの（ａｎ）」は、本明細書および特許請求の範囲において、本明細書で使用される場合、そうでないことが明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されたい。
【００７８】
そうでないことが明確に示されない限り、本明細書において特許請求される１つを上回るステップまたは作業を含む任意の方法において、方法のステップまたは作業の順序は、かならずしも、方法のステップまたは作業が列挙されている順序に限定されるものではないこともまた、理解されたい。
【００７９】
特許請求の範囲、ならびに上記の明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「から構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」などのすべての移行句は、拡張可能である、すなわち、含むが限定されないことを意味すると理解されたい。United  States  Patent  Office  Manual  of  Patent  Examining  Procedures,  Section  2111.03に記載されるように、「からなる」および「から本質的になる」という移行句のみが、それぞれ、限定的または半限定的な移行句となる。
【００８０】
数値に先行する「約」および「実質的に」という用語は、列挙された数値の±１０％を意味する。
【００８１】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限と下限との間のそれぞれの値が、本明細書において具体的に企図され、記載される。
【図１Ａ】
2020537646.tif 000010
【図１Ｂ】
2020537646.tif 000011
【図２Ａ】
2020537646.tif 000012
【図２Ｂ】
2020537646.tif 000013
【図２Ｃ】
2020537646.tif 000014
【図２Ｄ】
2020537646.tif 000015
【図２Ｅ】
2020537646.tif 000016
【図２Ｆ】
2020537646.tif 000017
【図３】
2020537646.tif 000018
【図４】
2020537646.tif 000019
【図５】
2020537646.tif 000020
【図６】
2020537646.tif 000021
【図７Ａ】
2020537646.tif 000022
【図７Ｂ】
2020537646.tif 000023
【図７Ｃ】
2020537646.tif 000024
【図８】
2020537646.tif 000025
【図９−１】
2020537646.tif 000026
【図９−２】
2020537646.tif 000027
【図９−３】
2020537646.tif 000028
【図１０Ａ】
2020537646.tif 000029
【図１０Ｂ】
2020537646.tif 000030
【図１０Ｃ】
2020537646.tif 000031
【図１１】
2020537646.tif 000032
【図１２Ａ】
2020537646.tif 000033
【図１２Ｂ】
2020537646.tif 000034
【図１２Ｃ】
2020537646.tif 000035
【図１２Ｄ】
2020537646.tif 000036
【図１２Ｅ】
2020537646.tif 000037
【配列表】
2020537646000001.app
【国際調査報告】
2020537646.tif 000038
2020537646.tif 000039