(57)【要約】  本発明は、ウィザニアソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（アシュワガンダ）の抽出物、並びにそのＮｒｆ２活性化成分ウィザフェリンＡ、１２−デオキシウィザストラモノリド、及びＱｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａを使用することによる全身解毒に関する。細胞内解毒経路における重要な要素である転写因子Ｎｒｆ２は、摂取した場合、潜在的に毒性の化合物の排除をもたらす。同時に、炎症性サイトカインの発現は低下する。したがって、この抽出物を使用して、一般に、心血管障害、呼吸器疾患、及び空中浮遊粒子と接触する組織の慢性炎症を含めた大気汚染の有害作用（特に、微粒子による大気汚染の有害作用）を低下させることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
大気汚染の有害作用を予防する又は改善するために使用するための、
ａ）Ｎｒｆ２活性化有効量のウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリドを含むウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物；
ｂ）ウィザフェリンＡ；
ｃ）１２−デオキシウィザストラモノリド；
ｄ）Ｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ；及び
ｄ）これらの混合物
からなる群から選択される活性成分を含む経口用組成物。
【請求項２】
前記大気汚染が、微粒子による大気汚染である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記有害作用が、心血管障害、呼吸器疾患、及び空中浮遊粒子と接触する組織の慢性炎症からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記微粒子による大気汚染が、タバコの煙によるものである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ビタミンＥ、水溶性のトマト抽出物、レスベラトロール、レスベラトロールを含有する植物抽出物、ビタミンＤ、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、ヒドロキシチロソール、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、ビタミンＡ、及びそれらの混合物からなる群から選択される活性成分をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物を含む、栄養医薬品、機能性食品、又は栄養補助食品。
【請求項７】
大気汚染への曝露の有害作用を改善する方法であって、
ａ）Ｎｒｆ２活性化有効量のウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリドを含むウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物；
ｂ）ウィザフェリンＡ；
ｃ）１２−デオキシウィザストラモノリド；
ｄ）Ｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ；及び
ｄ）これらの混合物
からなる群から選択される活性成分を含む有効量の組成物を、大気汚染に曝露される又は曝露のリスクがあるヒト又は動物に投与することを含む方法。
【請求項８】
前記大気汚染が、微粒子による大気汚染である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記有害作用が、心血管障害、呼吸器疾患、及び空中浮遊粒子と接触する組織の慢性炎症からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記微粒子による大気汚染が、タバコの煙によるものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ビタミンＥ、水溶性のトマト抽出物、レスベラトロール、レスベラトロールを含有する植物抽出物、ビタミンＤ、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、ヒドロキシチロソール、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、ビタミンＡ、及びそれらの混合物からなる群から選択される活性成分をさらに含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が、栄養医薬品、機能性食品、又は栄養補助食品である、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
解毒、及び／又は体の浄化能力を増大させることに使用するための、
ａ）Ｎｒｆ２活性化有効量のウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリドを含むウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物；
ｂ）ウィザフェリンＡ；
ｃ）１２−デオキシウィザストラモノリド；
ｄ）Ｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ；及び
ｄ）これらの混合物
からなる群から選択される活性成分を含む経口用組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）（アシュワガンダ）の抽出物、並びにそのＮｒｆ２活性化成分ウィザフェリンＡ、１２−デオキシウィザストラモノリド（１２−ｄｅｏｘｙｗｉｔｈａｓｔｒａｍｏｎｏｌｉｄｅ）、及びｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａを使用することによる全身解毒に関する。細胞内解毒経路における重要な要素である転写因子Ｎｒｆ２は、摂取した場合、潜在的に毒性の化合物の排除をもたらす。同時に、炎症性サイトカインの発現は低下する。したがって、この抽出物を使用して、一般に、心血管障害、呼吸器疾患、及び空中浮遊粒子と接触する組織の慢性炎症を含めた大気汚染の有害作用（特に、微粒子による大気汚染の有害作用）を低下させることができる。
【０００２】
［発明の背景］
大気汚染は、主に肺疾患及び心血管疾患に起因して、罹患率及び死亡率と関連している（Ｍｉｙａｔａ，ｅｔ  ａｌ．２０１１  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１１  ２５７（２）：２０９−２６；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ＳＳ，ｅｔ  ａｌ  ２０１４  ＩｎｔＪ  Ｈｙｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ２１７（２−３）：１３３−４４）。
【０００３】
細胞解毒経路の増強は、加齢、心血管疾患、及び肺疾患（慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）など）などの状態において有益であると考えられている。同様に、細胞解毒経路の増強は、大気汚染によって引き起こされる障害を改善するはずである。赤血球系転写因子２関連転写因子２（Ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ２−ｒｅｌａｔｅｄ  ｆａｃｔｏｒ  ２）（Ｎｒｆ２）は、解毒タンパク質をコードする遺伝子を活性化する転写因子である。これは、その不活性な状態では、６９ｋＤａのセンサータンパク質であるＫｅｌｃｈ様ＥＣＨ結合タンパク質１（ＫＥＡＰ１）（これは、２７個のシステイン残基を含有し、二量体として働いて、Ｎｒｆ２とＥ３ユビキチンリガーゼＣｕｌ３の両方と結合する）との細胞質内複合体の一部である。
【０００４】
Ｎｒｆ２は、塩基性ロイシンジッパー転写因子のｃａｐ‘ｎ’ｃｏｌｌａｒファミリーに属する。Ｎｒｆ２は、ＫＥＡＰｌのＳＨ基の修飾及び核への転位置を介して活性化されるようになり、核では、Ｎｒｆ２は、小ＭＡＦタンパク質と共に、その標的遺伝子のプロモーター内のその抗酸化応答配列（ＡＲＥ）に結合する。Ｎｒｆ２の標的遺伝子は、抗酸化応答、フェーズＩＩ反応、及び輸送に関与する。ヒトＣＯＰＤ患者では、Ｎｒｆ２の活性化が、肺胞マクロファージによる食作用を回復させることができることが示されている。
【０００５】
様々なＮｒｆ２活性化剤が、医薬品として開発中である。バルドキソロンメチル、すなわち合成のオレアナントリテルペノイド化合物が、肺疾患の治療について臨床研究中である。また、抗酸化及び抗炎症活性を有する合成トリテルペノイドＲＴＡ  ４０８が、ヒト皮膚に局所適用されており、健康なヒトボランティアによって十分な耐容性が示されている。
【０００６】
老化は、酸化ストレス、すなわち酸化、及びそれによる細胞分子の損傷に、ある程度起因する。多くの慢性疾患は、老化に伴う。Ｎｒｆ２は、解毒に関する、また、抗酸化的生体防御に関する中心的因子であるので、老化を遅らせるのを助けることができる。これは、様々な十分に確立された動物モデルにおいて示されており、長寿命のヒトでは、Ｎｒｆ２が恒常的に活性化されているのではないかと思われている（Ｂｒｕｎｓ  ｅｔ  ａｌ，２０１５  Ｏｘｉｄ  Ｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｏｎｇｅｖ．２０１５：７３２５９６）。
【０００７】
グルコラファニン、すなわちＮｒｆ２活性化剤スルフォラファンの前駆体が豊富なブロッコリースプラウトは、ディーゼル排気微粒子に対する鼻アレルギー反応を和らげた（Ｈｅｂｅｒ  Ｄ．ｅｔ  ａｌ．２０１４  Ｆｏｏｄ  Ｆｕｎｃｔ．５（１）：３５−４１．ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ３ｆｏ６０２７７ｊ）。最近のヒト調査研究では、ブロッコリースプラウトが、いくつかの空中浮遊汚染物質の解毒を増強したことが示され、ここでは、ベンゼン及びアクロレインのグルタチオン由来の抱合体、すなわちフェーズＩＩ代謝産物の、より多くの発生を、尿中に認めることができた（Ｅｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ  Ｒｅｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ＯｎｌｉｎｅＦｉｒｓｔ  Ｊｕｎｅ  ９，２０１４）。
【０００８】
Ｎｒｆ２活性化剤は、オゾン治療によって媒介される上気道粘膜における炎症を低減させる可能性を有する（Ｐｅｃｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２６７（１）：３０−４０．）。
【０００９】
炎症は、大気汚染の微粒子状物質によって誘発される疾患の発生における主要なプロセスであり、インターロイキン８（ＩＬ−８）は、自然免疫系の一部であり、且つ免疫応答の開始において重要であるが、気道内の動員された好中球の過剰刺激及び得られる機能障害は、肺組織の保護ではなく損傷をもたらす炎症促進性分子の放出をもたらす可能性がある。
【００１０】
インターロイキン６（ＩＬ−６）は、Ｔリンパ球及びマクロファージによって分泌され、及び、免疫応答を刺激するのを助ける。ＩＬ−６は、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）及びインターロイキン−１（ＩＬ−１）の作用を阻害する。ＩＬ−６は、主に抗炎症作用と関連しているが、いくつかの炎症促進性機能とも関連している。したがって、その阻害に関する利益は、感染の状態に依存する。慢性炎症では、ＩＬ−６の発現を低下させることが有益である。
【００１１】
単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）は、単球、メモリーＴリンパ球、及び樹状細胞を、炎症の部位に動員する。また、慢性炎症、又は大気汚染によって媒介される炎症では、ＭＣＰＯ−１発現を低下させることが有利である可能性がある。
【００１２】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、ブラジキニン又はヒスチジンのような他の炎症メディエーターによって引き起こされる疼痛を増大させる炎症性サイトカインである。これはまた、他のサイトカインと共に、発熱の誘発に関与する。さらに、これは、多くの組織において、他の複雑な機能を有する。ＰＧＥ２は、炎症に対する一般的マーカーとして承認されている（Ｇｒｏｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ  ２０１７  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２０１７  Ｊａｎ；２６（ｌ）：５１−６１．）。
【００１３】
ウィザニナ・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉｎａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）は、一般にはアシュワガンダ、インドニンジン（Ｉｎｄｉａｎ  ｇｉｎｓｅｎｇ）、毒スグリ（ｐｏｉｓｏｎ  ｇｏｏｓｅｂｅｒｒｙ）、及びホオズキとして知られている。その液果は、腫瘍及び潰瘍の治療としてアーユルヴェーダ医学において外用で使用される。従来の医学では、その根からの粉末を、温めた牛乳及びハチミツと混合し、就寝前に摂取する。イエメンでは、熱傷及び創傷を治療するために、乾燥した葉が使用されている。ウィザニア（Ｗｉｔｈａｎｉａ）の臨床適用の可能性は、Ｗｈｉｔｅ，ｅｔ  ａｌ  ２０１６  Ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  Ｎｕｒｔａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ａｎｄ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓに論じられている（Ｓ．Ｃ．Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｔ’ｌ  Ｐｕｂ  ３２９−３７３）。
【００１４】
大気汚染から防護する栄養医薬品、医薬品、又は食品添加物として使用することができる、天然の化合物又は抽出物を有することが望ましいであろう。
【００１５】
［発明の詳細な説明］
本発明によれば、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物が、強力なＮｒｆ２経路活性化剤であり、したがってスルフォラファンのような一般的な解毒剤として使用することができることが判明している。好ましいことには、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物は、大気汚染、特に微粒子による大気汚染に曝露される又は曝露のリスクがあるヒト又は動物の、心臓、肺、及び呼吸器系を防護するために使用することができる。さらに、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物は、体の浄化能力を増大させる健康推進計画の一部としての解毒のために、及び、一般的な生体保護又は遮蔽剤として使用することができる。さらに、これは、体の防御系を増強することができる。本発明は、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物又はその活性成分（下に記載）を、上述のことの達成を望むヒトに投与することを含む、上述のことを達成する方法に関する。
【００１６】
有意な活性を有する抽出物の成分が、ウィザフェリンＡ、１２−デオキシウィザストラモノリド、及びｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａと特定されたことも判明した。
【００１７】
したがって、本発明の一態様は、大気汚染の有害作用から防護するために使用するための、以下からなる群から選択される活性成分を含む経口用組成物である：
ａ）ウィザフェリンＡ、及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド、及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａを含む、Ｗ．ソムニフェラ（Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物（以下、「ＷＳＥ」と称する）
ｂ）ウィザフェリンＡ、
ｃ）１２−デオキシウィザストラモノリド、
ｄ）ｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ；及び
ｅ）これらの混合物。
【００１８】
ＷＳＥは、抽出物中のその濃度を増大させるために、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ中で濃縮させることができる。
【００１９】
したがって、本発明の別の態様は、大気汚染に曝露される又は曝露のリスクがあるヒトの心血管系、肺、及び呼吸器系に対する有害作用のリスクを改善するための、経口のＷＳＥ、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａの使用である。好ましい実施態様では、防護する汚染の型は、空中微粒子である。
【００２０】
本発明の別の態様は、微粒子による大気汚染への曝露に起因する、肺及び呼吸器系、又は他の組織に対する有害作用を和らげる方法であって、有効量のＷＳＥ、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａを、それを必要とするヒトに投与することを含む方法である。
【００２１】
［定義］
「ＷＳＥ」は、最低でも有効なＮｒｆ２経路活性化剤となる量のウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａを含有する、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）の抽出物を意味する。
【００２２】
「健康なヒト」は、ａ）次の疾患又は状態のいずれかの症状と診断されていない、又はこれらの症状を経験していないヒトを意味する：心血管疾患（非致死性心臓発作、不整脈、及び循環系障害を有していたことが含まれる）、２型糖尿病、及び呼吸器疾患、喘息若しくは喘息増悪、肺機能低下、又は呼吸困難をもたらす他の状態。
【００２３】
「微粒子による大気汚染」は、ナノ粒子に分類される、又はＰＭ２．５以下の粒径を有する粒子を含有する空気を意味する。これらのサイズの粒子は、火山放出物、砂嵐、森林火災、野焼き（ｇｒａｓｓｌａｎｄ  ｆｉｒｅ）等による煙などの「自然発生源」の結果である、又は自動車排出物、製造業による排出物、又は喫煙を含めた他の活動などのヒトの活動の結果としてのものである可能性がある。
【００２４】
「心血管の健康」は、関節硬化、心筋梗塞、血栓症、末梢動脈疾患、又は脳血流量低下、並びに糖尿病（１型又は２型）及びその随伴する心血管障害などの異常な心血管機能を伴う状態がないことと定義される。この特許の目的では、脳卒中は、検討対象から特別に除外される。
【００２５】
「呼吸器の健康」は、喘息、肺気腫、気管支炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、花粉症（ｈａｙ  ｆｅｖｅｒ）型アレルギー、刺激による咳、肺感染症、通常の風邪症状、及び慢性副鼻腔炎などの異常な呼吸器機能を伴う状態がないことと定義される。
【００２６】
「大気汚染」は、本明細書で使用する場合、潜在的に有害な微粒子、生体分子、又は他の物質が、空気に導入されている状態を指す。汚染物質のカテゴリーの例としては、以下が挙げられる：
・石炭及び石油燃焼の結果として生じたものなどの硫黄酸化物；
・二酸化窒素（より重要な大気汚染物質の１つ、特徴的な鼻を刺すような臭いをもつ赤茶色の気体）を含めた、高温燃焼から生じたものなどの窒素酸化物；
・燃料及び自動車排出ガスの不完全燃焼によって生じる可能性がある一酸化炭素；
・揮発性有機化合物には、メタン又は非メタン型化合物を含めることができ、しばしば、温室効果ガスと称される；
・大気中に浮遊している小さい固体又は液体粒子である微粒子（微粒子状物質又はＰＭとも呼ばれる）。起源は、火山放出物、砂嵐、又は森林火災及び野焼きによるものなど「天然」である可能性、又はヒトの活動の結果である可能性もある。
・「吸入性（ｒｅｓｐｉｒａｂｌｅ）微粒子状物質」と呼ばれるとても小さい粒子の形態である、すす、気体、及び他の物質の形態の汚染。吸入性微粒子状物質は、１０若しくは２．５ミクロン未満の空気動力学径（それぞれＰＭ１０若しくはＰＭ２．５）などサイズによって、又はナノ粒子（直径１００ｎｍ未満、若しくはＰＭ０．１）として分類される。これらの粒子は、しばしば、自動車排出物、特にディーゼル燃料に、又はディーゼル駆動の機械類に由来する。
・有害状態の「リスクを改善すること」は、状態の発生から防護すること；状態の発生を予防すること；状態の開始を遅延させること；既に発生している状態の重症度を和らげること；状態が持続する時間を短くすること；及び／又は状態の消失を意味する。
【００２７】
ヒトの活動による微粒子は、心疾患、及び肺癌を含めた有害呼吸器状態を含めた、多くの健康ハザードと関連している。脳卒中の予防、治療、又は改善は、本発明から特別に除外されない。
【００２８】
本発明のさらに別の態様は、大気汚染、好ましくは微粒子による大気汚染の有害作用のリスクを改善するための使用のための、ＷＳＥ、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド、ｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ、又は抽出物を含む、経口用医薬品、栄養医薬品、栄養補助食品、又は食品成分である組成物である。本発明の別の態様は、有効量のＷＳＥ、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａを、リスクがあるヒトに投与することを含む、大気汚染の有害作用のリスクを改善する方法である。
【００２９】
組成物中のＷＳＥ、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａが、単に香料又は着色料として存在するのではないが、生理活性成分、すなわちＮｆｒ２活性化剤として有効であるような量で存在することも、本発明の重要な部分である。いくつかの実施態様では、組成物中の単独の活性成分である。
【００３０】
タバコの煙も、汚染された大気中にやはり見られる他の化学物質と同様に、ＰＭを含有する。したがって、本発明の別の態様は、タバコの煙に曝露される又は曝露のリスクがあるヒトを防護するための、ＷＳＥ、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａの使用である。別の態様は、有効量のＷＳＥ、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａを、リスクがあるヒトに投与することを含む、タバコの煙に曝露されるヒトにおける有害状態のリスクを和らげる方法である。
【００３１】
ＰＭには、粉塵、ほこり、すす、及び煙が含まれる。「吸入可能粗大粒子」と呼ばれる粒子は、直径が２．５マイクロメートルよりも大きいが、１０マイクロメートルよりも小さい。「微小粒子」は、より小さく、直径が２．５マイクロメートル未満である。微小粒子は、典型的には、視界不良及び煙霧の原因である。微小粒子の多くは、発電設備、自動車、及び他の産業活動によって二酸化硫黄及び窒素酸化物が放出された場合に生じる、大気中の化学反応の最終産物である「二次的な粒子」である。微小粒子は、肺及び血流に深く入り込み、以下を含めた重大な健康問題を潜在的に引き起こす可能性があるので、特に厄介である：
心疾患又は肺疾患を有する人々における若年死亡、
非致死性心臓発作
不整脈
喘息若しくは喘息増悪
肺機能低下
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の急性増悪
気道の過敏、咳嗽、及び／又は呼吸困難などの呼吸器症状の増大。
【００３２】
したがって、本発明の別の態様は、大気汚染、好ましくは微粒子状物質による大気汚染への曝露に起因する心血管及び／又は呼吸器有害状態のリスクを防ぐ、改善する、又は和らげるための、ＷＳＥ、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａの使用であり、ここでは、有害状態は、心疾患又は肺疾患を有する人々における若年死亡、非致死性心臓発作、不整脈、喘息若しくは喘息増悪、肺機能低下、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の急性増悪、及び気道の過敏、咳嗽、及び／又は呼吸困難などの呼吸器症状の増大からなる群から選択される。別の態様は、大気汚染に曝露されるヒトにおける有害状態のリスクを和らげる方法であって、有効量のＷＳＥ、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａを、それを必要とするヒトに投与することを含み、且つ、ここでは、有害状態が、心疾患又は肺疾患を有する人々における若年死亡、非致死性心臓発作、不整脈、喘息若しくは喘息増悪、肺機能低下、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の急性増悪、及び呼吸器症状の増大、気道の過敏、咳嗽、及び／又は呼吸困難からなる群から選択される方法である。
【００３３】
本発明の別の態様は、大気汚染、好ましくは微粒子状物質による大気汚染への曝露に起因する心血管及び／又は呼吸器有害状態（ここでは、有害状態は、心疾患又は肺疾患を有する人々における若年死亡、非致死性心臓発作、不整脈、喘息又は喘息増悪、肺機能低下、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の急性増悪、及び気道の過敏、咳嗽、及び／又は呼吸困難などの呼吸器症状の増大からなる群から選択される）のリスクを防ぐ、改善する、又は和らげる方法であって、それを必要とするヒトに、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド、及び／又はＱｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａを有効量で投与することを含む方法である。
【００３４】
［他の活性成分との組み合わせ］
本発明のＷＳＥ、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａは、有益な結果が得られる組成物を製造するために、他の活性成分と組み合わせることができる。さらなる活性成分の例としては、ビタミンＥ、水溶性のトマト抽出物、レスベラトロール、レスベラトロールを含有する植物抽出物、ビタミンＤ、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、ヒドロキシチロソール、多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）、ビタミンＡ、及びそれらの混合物が挙げられる。したがって、本発明には、次の成分の組み合わせも含まれる：
Ｗ．ソムニフェラ（Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド、及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ、並びにビタミンＥ
Ｗ．ソムニフェラ（Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド、及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ、並びに水溶性のトマト抽出物（ＤＳＭ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手できるＦＲＵＩＴＦＬＯＷ（登録商標）など）
Ｗ．ソムニフェラ（Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド、及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ、並びにレスベラトロール、又はレスベラトロールを含有する植物抽出物
Ｗ．ソムニフェラ（Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド、及び／又はＱｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ、並びにビタミンＤ
Ｗ．ソムニフェラ（Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−エオキシウィザストラモノリド、及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ、並びに２５−ＯＨビタミンＤ３
Ｗ．ソムニフェラ（Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド、及び／又はＱｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ、並びにヒドロキシチロソール、又は３−ヒドロキシチロソールを含有する植物抽出物
Ｗ．ソムニフェラ（Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド、及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ、並びに多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）
Ｗ．ソムニフェラ（Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド、及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａ、並びにビタミンＡ。
【００３５】
上の場合のそれぞれにおいて、Ｗ．ソムニフェラ（Ｗ．ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物、ウィザフェリンＡ及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド、及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａの量は、本明細書に詳述される通りであり、第２の成分の量は、各成分についての当技術分野で公知の最大１日量で存在する。
【００３６】
［投薬量］
推奨される１日用量は、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物の十分な量であり、成人について最大２グラム／日であろう；ここでは、この抽出物は、少なくとも下に詳述した通りの投薬量のウィゼラフェリン（ｗｉｔｈｅｒａｆｅｒｉｎ）Ａ、及び／又は１２−デオキシウィザストラモノリド、及び／又はｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａを含有する。
【００３７】
単独の活性成分としてのウィザフェリンＡについては、１日用量は、０．１ｍｇから５０ｍｇ；好ましくは０．５から２０ｍｇ／日、より好ましくは１〜１０ｍｇ／日である。
【００３８】
単独の活性成分としての１２−デオキシウィザストラモノリドについては、１日用量は、０．１ｍｇから１０ｍｇ；好ましくは０．５から８ｍｇ／日、より好ましくは１〜６ｍｇ／日である。
【００３９】
単独の活性成分としてのＱｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａについては、１日用量は、０．１ｍｇから１０ｍｇ；好ましくは０．５から８ｍｇ／日、より好ましくは１〜６ｍｇ／日である。
【００４０】
活性成分の組み合わせについては、投薬量は、組み合わせられた成分の投薬量が、少なくとも０．１から１０ｍｇ／日であり、ただし、３０ｍｇ／日を超えないように調節することができる。
【００４１】
所望される場合、１日の摂取量を、１日２回の錠剤などの２つ以上の投薬量に分けることができる。非ヒト動物については、上のヒト投薬量は、動物の体重に対して調節することができる。
【００４２】
［製剤］
本発明の組成物は、ヒトを含めた動物のための、栄養強化食品、栄養強化飼料、栄養強化食品、又は栄養強化飲料などの栄養組成物の形態、又は栄養強化液状食品／飼料（ドリンク若しくはショット（ｓｈｏｔ）など）、丸剤又はカプセルの形態であることが好ましい。
【００４３】
本発明による食品組成物及び医薬組成物は、ヒトの体を含めた動物の体に投与するのに適している、あらゆるガレノス形態、特に、経口投与にとって通常である、あらゆる形態、例えば、食品又は飼料（用の添加物／補助食品）、食品又は飼料プレミックス、栄養強化食品又は飼料、錠剤、丸剤、顆粒剤、糖衣錠、カプセル、及び発泡製剤（散剤及び錠剤など）などの固体形態、又は、例えば飲料、ペースト、及び油性懸濁剤としての液剤、乳剤、又は懸濁剤などの液体形態であり得る。ペーストは、例えば（魚、ブタ、家禽、ウシ）ゼラチン、植物タンパク質、又はスルホン酸リグニンのマトリックスを特徴とするハード又はソフトシェルカプセルに封入することができる。他の適用形態の例は、経皮、非経口、又は注射による投与のための形態である。食品組成物及び医薬組成物は、制御（遅延）放出製剤の形態であり得る。本発明の組成物は、経鼻経路への適用など、局所的に投与されない。
【００４４】
本発明による食品組成物は、保護用の親水コロイド（ガム、タンパク質、加工デンプンなど）、結合剤、被膜形成剤、封入剤／材料、壁／シェル材料、マトリックス化合物、コーティング、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、ワックス、レシチンなど）、吸着材、担体、充填剤、補助化合物（ｃｏ−ｃｏｍｐｏｕｎｄ）、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶媒）、流動剤（ｆｌｏｗｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、矯味剤、増量剤、ゼリー化剤（ｊｅｌｌｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、ゲル形成剤、酸化防止剤、及び抗菌剤をさらに含有することができる。
【００４５】
食品の例は、シリアルバー、ヨーグルトなどの乳製品、並びにケーキ及びクッキーなどのベーカリー製品である。栄養強化食品の例は、シリアルバー、及びベーカリー製品、例えばパン、ロールパン、ベーグル、ケーキ、及びクッキーなどである。健康補助食品の例は、錠剤、丸剤、顆粒剤、糖衣錠、カプセル、及び発泡製剤；ソフトドリンク、フルーツジュース、レモネード、ニアウォーター飲料、茶、及び牛乳を主成分とする飲料などのノンアルコール飲料の形態、スープ及び乳製品（ミューズリー（ｍｕｅｓｌｉ）ドリンク）などの液状食品の形態である。
【００４６】
飲料は、ノンアルコール及びアルコール飲料、並びに飲料水及び液状食品に添加されることとなる液体調製物を包含する。ノンアルコールドリンクは、例えば、ソフトドリンク、スポーツドリンク、フルーツジュース、野菜ジュース（例えばトマトジュース）、レモネード、茶、及び牛乳を主成分とする飲料である。液状食品は、例えば、スープ及び乳製品（例えばミューズリードリンク）である。
【００４７】
本発明による医薬組成物は、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物に加えて、限定はされないが、水、あらゆる起源のゼラチン、植物ガム、スルホン酸リグニン、タルク、糖、デンプン、アラビアゴム、植物油、ポリアルキレングリコール、着香料、保存剤、安定剤、乳化剤、緩衝液、滑沢剤、着色料、湿潤剤、充填剤などを含めて、従来の医薬添加剤及び補助剤、賦形剤、又は希釈剤をさらに含有することができる。
【００４８】
以下の非限定的な実施例は、本発明をより十分に説明するために示される。
【実施例】
【００４９】
［実施例１］
［Ｎｒｆ２経路の活性化］
［方法：］
［Ｈ４ＩＩＥ−ＡＲＥ８Ｌ細胞を使用するルシフェラーゼレポーターアッセイ：］
Ｈ４ＩＩＥ−ＡＲＥ８Ｌ細胞は、８回反復される抗酸化応答配列（ＡＲＥ）によって制御されるルシフェラーゼレポーター遺伝子が安定に遺伝子導入されたラット肝細胞癌細胞株である（Ｋｒａｔｓｃｈｍａｒ  ＤＶ，ｅｔ  ａｌ  ２０１２．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（５）：ｅ３６７７４）。
【００５０】
Ｈ４ＩＩＥ−ＡＲＥ８Ｌ細胞のための培地は、熱失活させた１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（高グルコース）であった。培地は、２から３日ごとに交換した。ＤＭＥＭアッセイ培地は、活性炭処理済みＦＢＳ（ＤＭＥＭｃｔ）を使用した。トランス活性化アッセイは、９６ウェルプレートで実施した。このプレートに、ウェルあたり１００μｌ  ＤＭＥＭｃｔ内におよそ４０，０００細胞を播種し、３７℃で一晩インキュベートした。次いで、試験化合物をＤＭＥＤｃｔで希釈し、下に記載する通りに細胞に与えた。細胞を、３７℃及び５％  ＣＯ２で、少なくともさらに１６時間インキュベートした。細胞を室温に平衡化した。ウェルあたり０．５ｍＭ  ＤＴＴを含有する１００μｌの溶解液、Ｓｔｅａｄｙ−Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼバッファーを、製造者（Ｐｒｏｍｅｇａ）に従って添加することによって、細胞の溶解を行い、軽くゆすりながら、室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後２時間以内に、ルミノメーター（Ｍｉｔｈｒａｓ，Ｂｅｒｔｈｏｌｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で発光を測定した。
【００５１】
陽性対照は、０．５％  ＤＭＳＯ中の５μΜ  Ｒ−スルフォラファン（ＬＫＴ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｃａｔ．Ｓ８０４６）（それぞれ最終濃度）であった。陰性対照は、０．５％  ＤＭＳＯ中の細胞であった。Ｈ４ＩＩＥ−ＡＲＥ８Ｌ細胞の細胞生存アッセイを、製造者のプロトコルに従ってＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅ（登録商標）細胞生存率判定試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。Ｎｒｆ２−活性アッセイについて、抽出物、分画、及び単一の化合物の非毒性濃度を選択した。
【００５２】
試験されたウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）試料は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＭＦＧ  Ｃｏｒｐ．（ＵＳＡ）（試料ＩＤ：ＮＩＧ−０１８９０９）及びＡｐｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，ＵＫ（試料ＩＤ：ＮＩＧ−０１８９１１）からの原薬エキス（ｂｕｌｋ  ｅｘｔｒａｃｔ）であった。
【００５３】
［ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を使用する内在性Ｎｒｆ２活性化アッセイ：］
ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）からのヒト気管支上皮細胞株ＢＥＡＳ−２Ｂを、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）表面プラスチックフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に入れた気管支上皮細胞増殖培地（ＢＥＧＭ，Ｌｏｎｚａ，Ｗａｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で培養した。ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、６ウェルＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）表面培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）に、ウェルあたり１×１０６細胞で播種し、５％  ＣＯ２と共に３７℃で２４時間インキュベートした。
【００５４】
１００ｍＭ  Ｒ−スルフォラファンストック溶液を、ＤＭＳＯ中で調製した（ＡＢＣＡＭ，Ｃａｔ．Ｎｏ．ａｂｌ４１９７１，Ｌｏｔ  ＧＲ３０３０４１−２）。Ｒ−スルフォラファンストックを、ＤＭＳＯで希釈して、所望の最終濃度を得た。ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物（ＮＩＧ−０１８９１１）ストック溶液を、ＤＭＳＯ中で調製した。
【００５５】
２４時間後、細胞を、異なる濃度のウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物（５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ）、Ｒ−スルフォラファン（２μΜ、５μΜ、１０μΜ）、又はＤＭＳＯ（０．１％）で処理し、５％  ＣＯ２と共に３７℃で４時間又は２４時間インキュベートした。それぞれの処理は、３連で行った。
【００５６】
ＲＮＡ抽出、ｃＤＮＡ合成、及びＴａｑＭａｎに基づくリアルタイムＰＣＲ：４時間及び２４時間後、細胞を、ＲＬＴ緩衝液中に回収し、ＱｉａｇｅｎからのＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｃａｔ．Ｎｏ．７４１０６）を使用してＲＮＡ単離を行った。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ＲＴ−ＰＣＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｔ．Ｎｏ．１１９０４−０１８）を使用して、２５００ｎｇの全ＲＮＡを用いて、ｃＤＮＡを調製した。
【００５７】
２０μｌ  ＰＣＲ反応において、５０ｎｇ／ｍＬのｃＤＮＡの総インプットを、ＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ．Ｎｏ．４４４４５５７）、１８Ｓ  ｒＲＮＡ内部対照のための５０ｎＭプライマー、及び（ＶＩＣ−ＴＡＭＲＡ標識された）１００ｎＭプローブ
（ｈｌ８ｓ  ｒＲＮＡフォワード  ５’→３’ＣＧＧＣＴＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＡＧＧ（配列番号ｌ）；
ｈｌ８ｓ  ｒＲＮＡリバース  ５’→３’ＣＧＧＧＴＣＧＧＧＡＧＴＧＧＧＴ（配列番号２）；
ｈｌ８ｓ  ｒＲＮＡプローブ  ５’→３’ＴＴＧＣＧＣＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＴ）（配列番号３），
並びに問題とするヒトＮＱＯ１の遺伝子のための３００ｎＭプライマー及び（ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ標識された）１００ｎＭプローブ
ＮＱＯ１（ｈＮＱＯ１フォワード  ５’→３’ＣＣＡＧＡＴＡＴＴＧＴＧＧＣＴＧＡＡＣＡＡＡＡＧ（配列番号４）；
ｈＮＱＯ１リバース  ５’→３’ＴＣＣＴＡＴＧＡＡＣＡＣＴＣＧＣＴＣＡＡＡＣＣ（配列番号５）；
ｈＮＱＯ１プローブ  ５’→３’ＣＡＧＡＣＣＴＴＧＴＧＡＴＡＴＴＣＣＡＧＴＴＣＣＣＣＣＴＧ）（配列番号６）及び
ヒトＨＭＯＸ（ｈＨＭＯＸフォワード  ５’→３’ＧＧＡＴＧＧＡＧＣＧＴＣＣＧＣＡ（配列番号７）；
ｈＨＭＯＸリバース  ５’→３’ＧＣＣＧＴＣＴＣＧＧＧＴＣＡＣＣＴ（配列番号８）；及び
ｈＨＭＯＸプローブ  ５’→３’ＣＣＣＧＡＣＡＧＣＡＴＧＣＣＣＣＡＧＧＡ）（配列番号９）
を使用して、ＡＢＩ  ７９００  ＨＴリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で増幅した。
【００５８】
熱循環プロフィールは、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ活性化のための５０℃で２分、ポリメラーゼ活性化のための２０秒間の９５℃、それに続く４０サイクルの１秒間の９５℃と２０秒間の６０℃でのプライマーアニーリングで構成されていた。
【００５９】
標的遺伝子の閾値サイクル（ＣＴ）からリボソームＲＮＡについてのＣＴを引くこと（ΔＣＴ）によって、相対的な遺伝子発現を実施した。次いで、相対的なｍＲＮＡレベルを、２−ΔΔＣＴ（ここでは、ΔΔＣＴは、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物又はＲ−スルフォラファンで処理された細胞のΔＣＴからＤＭＳＯで処理された細胞のΔＣＴを引いたものを指す）として算出した。
【００６０】
［結果：］
［Ｈ４ＩＩＥ−ＡＲＥ８Ｌ細胞を使用するルシフェラーゼレポーターアッセイ：］
本発明者らは、ルシフェラーゼレポーター遺伝子の前に８個のタンデムＡＲＥ配列を含有するコンストラクトが安定に導入されたラット肝細胞癌細胞株（Ｈ４ＩＩＥ−ＡＲＥ８Ｌ）を使用した（Ｋｒａｔｓｃｈｍａｒ  ＤＶ，ｅｔ  ａｌ  ２０１２．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１２；７（５）：ｅ３６７７４）。すべての抽出物、分画、及び純粋な化合物を、毒性を誘発する濃度について試験した。次いで、方法セクションに記載した通りに細胞を処理するための非毒性濃度を選択した。
【００６１】
本発明者らの組換えＮｒｆ−２活性化アッセイを用いる種々の抽出物、分画、及び純粋な化合物のスクリーニングでは、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物が、陽性対照スルフォラファンと比較して２倍高い活性を示した。このスクリーニングに含まれるウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物の４つの試験された分画はすべて、スルフォラファンと比較して１２０から１７０％の活性を与えた（データは示さない）。スルフォラファン活性の少なくとも５０％を示すスクリーニングのすべての試料をまとめると、このアッセイのヒット率は１９％であった。ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物ＮＩＧ−０１８９１１は、陽性のヒットであった。
【００６２】
ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）ＮＩＧ−０１８９１１抽出物のＮｒｆ−２活性は、陽性対照スルフォラファンの活性と比較して再び２倍高かった。
【００６３】
ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）の抽出物におけるＮｒｆ２活性化の有効な原理は、現在、分かっていない。ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物の段階希釈は、Ｎｒｆ２活性化の一次従属を示したので（データは示さない）、Ｎｒｆ２活性化は、死細胞における活性に起因するものではなかった。試験された抽出物及び成分はすべて、使用された濃度で、Ｈ４ＩＩＥ−ＡＲＥ８Ｌ細胞に対して毒性ではなかった。
【００６４】
［ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を使用する内在性Ｎｒｆ２活性化アッセイ：］
次の疑問は、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物が、ヒト肺細胞株におけるＮｒｆ２標的の発現を活性化することが可能かどうかということであった。本発明者らは、標的としてのＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシドレダクターゼ１（ＮＱＯ１）及びヘムオキシゲナーゼ１（ＨＯ１）（Ｌｅｗｉｓ  ＫＮ  ｅｔ  ａｌ．２０１０  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｂｉｏｌ．５０（５）：８２９−４３）、並びにＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を選択した。内在性Ｎｒｆ２活性化についての陽性対照は、スルフォラファン、すなわち十分に説明されているＮｒｆ２活性化剤であった（Ｂｏｄｄｕｐａｌｌｉ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１２  Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３：７）。ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物ＮＩＧ−０１８９１１での処理は、それぞれ、４及び２４時間であった。濃度は、それぞれ、表１Ａ及びＩＢに示す。使用された濃度では毒性は認められなかった。どちらのＮｒｆ２標的遺伝子の発現も、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物ＮＩＧ−０１８９１１での処理によって有意に増大した。
【００６５】
ＮＱＯ１のｍＲＮＡ発現についてのデータを、表１Ａに示す。スルフォラファンと比較して、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物によるＨＭＯＸ  ｍＲＮＡの誘発は低かったが、試験されたすべての濃度での２４時間で、及び１０μｇ／ｍｌを超える濃度での４時間で、有意であった。ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物の最高の誘発は、２４時間で、２５μｇ／ｍｌで、３．７倍であった。
【００６６】
ＨＯ１をコードするＨＭＯＸ遺伝子のｍＲＮＡ発現についてのデータを、表１Ｂに示す。やはり、スルフォラファン又はウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物は、ＮＱＯ１  ｍＲＮＡ発現の増大をもたらした。
【００６７】
この場合、効果は、処置の４時間で、より強かった。２５μｇ／ｍｌの濃度では、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物は、４時間で、１７．５倍の増大を示した。
【００６８】
これは、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）の抽出物が、ヒト肺細胞におけるＮｒｆ２の内在性標的の発現を増大させ、それによって細胞内解毒及び抗酸化経路を活性化することができることを示す。これは、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）の抽出物が、ヒト肺細胞におけるＮｒｆ２の内在性標的の発現を増大させ、それによって細胞内解毒及び抗酸化経路を活性化することができることを示す。
【００６９】
【表１】
2020517594.tif 000002
【００７０】
【表２】
2020517594.tif 000003
【００７１】
【表３】
2020517594.tif 000004
【００７２】
［実施例２］
［ディーゼル粒子によって誘発される炎症マーカーの減少］
［方法：］
ヒト気管支上皮細胞株ＢＥＡＳ−２Ｂは、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）からのものであり、ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）表面プラスチックフラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）に入れた気管支上皮細胞増殖培地（ＢＥＧＭ，Ｌｏｎｚａ，Ｗａｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）中で培養した。腺癌のヒト肺胞基底上皮Ａ５４９細胞株を、ＡＴＣＣから入手し、１０％  ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ−Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加したＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２培地のＫａｉｇｈｎ改変培地（Ｆ−１２Ｋ培地）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＳＡ）中で培養した。これらの細胞は、５％  ＣＯ２を含有する加湿雰囲気中で、３７℃で培養した。
【００７３】
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞を、１２ウェルＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）表面培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）に、ウェルあたり３から４×１０５細胞で播種した。Ａ５４９細胞を、ウェルあたり２×１０５細胞で１２ウェルプレートに播種した。
【００７４】
８０ｍｇ／ｍｌ（ＤＭＳＯ（１００％））のディーゼル微粒子状物質（Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  ＳＲＭ  １６５０ｂ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ＆Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＮＩＳＴ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を、５分間、超音波処理し、その後、培地で４００倍希釈した。この希釈物を、アッセイのためにさらに２倍希釈した。
【００７５】
２４時間後、細胞を、１００μｇ／ｍｌの希釈したディーゼル微粒子状物質で、示された通りの異なる濃度のウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物、他の植物抽出物、分画、及び化合物の存在下で処理した。最終のＤＳＭＯ濃度は、０．１７５％であった。
【００７６】
処理していない細胞、又は０．１７５％  ＤＭＳＯで処理した細胞を、対照として使用した。２４時間後、細胞上清を収集した。
【００７７】
上清中のＩＬ−６及びＩＬ−８の濃度を、Ｌｕｍｉｎｅｘキット（ＢＩＯ−  ＲＡＤ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって決定し、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  ＩＳ  ２００（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に使用した。データを、ＬｉｑｕｉＣｈｉｐ  Ａｎａｌｙｓｅｒソフトウェア（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて評価した。
【００７８】
ＢＥＡＳ−２Ｂ及びＡ５４９細胞の細胞生存アッセイを、製造者のプロトコルに従ってＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）細胞生存率判定試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて実施した。このアッセイについて、抽出物、分画、及び単一の化合物の非毒性濃度を選択した。
【００７９】
分泌されたＰＧＥ２は、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ａｎｎ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｗｌ）によって決定した。
【００８０】
スチューデントｔ検定での平均値、標準偏差、及びｐ値を、Ｅｘｃｅｌを用いて計算した。０．０５を超えるＰ値は、有意性の指標とみなされた。
【００８１】
［結果：］
数種の植物抽出物、分画、及び純粋な化合物を、ヒト肺細胞株におけるディーゼル微粒子状物質（ＰＭ）によって誘発されるＩＬ−６分泌を阻害するその能力について試験した。ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）の抽出物は、Ｎｒｆ２を活性化することが可能であった。スルフォラファンは、周知のＮｒｆ２活性化剤である。
【００８２】
溶媒ＤＭＳＯは、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞のＩＬ−６分泌のわずかな減少を示したので、試験された抽出物及び化合物のすべての値は、ＤＭＳＯの存在下でＰＭ対照と比較しなければならない。ＴｉＯ２粒子は、ＩＬ−６分泌の増加をもたらさなかった。これは、この粒子の物理的効果が、これらの効果の原因ではないことを示す。リポ多糖（ＬＰＳ）、すなわちＩＬ−６の公知の誘発因子は、強力な効果を有しており；これは、ＰＭ及びＤＭＳＯよりも４０倍超、強力であった。処理していない細胞は、ＩＬ−６を分泌しなかった。
【００８３】
Ｎｒｆ２活性化剤スルフォラファンは、ＰＭによって誘発されるＩＬ−６分泌を有意に減少させた。したがって、Ｎｒｆ２活性化は、サイトカイン分泌をもたらす、ＰＭによって誘発される経路に対して作用することができる。
【００８４】
本発明者らは、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）の、市販品として入手可能な２種の抽出物試料を試験した。これらの抽出物は、ＰＭによって誘発されるＩＬ−６分泌を減少させることが可能であった。より高い濃度では、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）ＮＩＧ−０１８９０９及びＮＩＧ−０１８９１１は、より活性になった。
【００８５】
ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）中に存在すると記載されている純粋な化合物ウィザノリドＡ、１２−デオキシウィザストラモノリド、ウィザフェリンＡ、及びｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａを、ＩＬ−６アッセイにおいて試験した。これらの純粋な化合物のうち、ウィザフェリンＡは、０．３μｇ／ｍｌという非常に低い濃度で、ＰＭによって誘発されるＩＬ−６分泌を低下させた。より高い濃度では、ウィザフェリンＡは、ＢＥＡＤ−２Ｂ細胞に対して毒性となり始めた。本発明者らは、ウィザフェリンＡが、ウィザニア抽出物中の活性な化合物の１つである可能性が非常に高いと結論し、ウィザフェリンＡは、非常に低い濃度でウィザニア・ソミンフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｉｎｆｅｒａ）中に存在するはずであるので、他にも特定されるべきものが残っている。
【００８６】
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞に対してと同様、Ｎｒｆ２−活性化剤スルフォラファンは、ＰＭによって誘発されるＩＬ−６分泌を約２分の１低下させた。Ａ５４９細胞においても、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物が、最も活性なものであった。
【００８７】
５μｇ／ｍｌでは、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）ＮＩＧ−０１８９１１の抽出物は活性であったが、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）ＮＩＧ−０１８９０９は活性ではなかった。やはり、これらの抽出物は、より高い濃度で使用されるべきである。
【００８８】
また、前述同様、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）中に存在すると記載されている純粋な化合物ウィザノリドＡ、１２−デオキシウィザストラモノリド、ウィザフェリンＡ、及びｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａを、Ａ５４９細胞でのＩＬ−６アッセイにおいて試験した。ウィザノリドＡ、１２−デオキシウィザストラモノリド、ウィザフェリンＡ、及びｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａは、非常に低いｐ値を伴ってＩＬ−６分泌の減少を示した。Ａ５４９細胞では、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞と対照的に、ｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａも、より低い値のＩＬ−６濃度を示した。
【００８９】
ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞と対照的に、Ａ５４９細胞は、ＰＭでの刺激後にＩＬ−８を分泌した。対照、ＰＭ、及びＤＭＳＯにおけるＩＬ−８濃度は、ＩＬ−６濃度よりも約２５倍高かった。ＤＭＳＯは、いかなる有意な効果も示さなかった。ＬＰＳによって刺激されるＩＬ−８分泌は、ＰＭによって誘発されるＩＬ−８分泌と同じ範囲であった、又はそれよりも高かった。また、スルフォラファンは、ＰＭによって誘発されるＩＬ−６分泌をほぼ２分の１に低下させた。
【００９０】
抽出物ＮＩＧ−０１８９０９及びＮＩＧ−０１８９１１は、低濃度では、ＩＬ−８分泌に対して活性ではなかった。やはり、可能ならば、より高い濃度が使用されるべきである。
【００９１】
ウィザノリドＡは、Ａ５４９細胞のＩＬ−８分泌に対する効果を有しなかった。１２−デオキシウィザストラモノリド及びＱｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａは、有意な阻害を示し；１２−デオキシウィザストラモノリドは、非常に低いｐ値を有していた。０．３１μｇ／ｍｌのウィザフェリンＡ−より高い濃度は細胞に対して毒性であった−は、０に近いｐ値を伴って、純粋な化合物の最も高い阻害を示した。
【００９２】
しかし、サイトカイン分泌の阻害の全体的パターンも同様である。
【００９３】
Ａ５４９細胞は、ＬＰＳ又はＰＭでの処理時に、ＭＣＰ−１も分泌する。したがって、本発明者らは、本発明者らの抽出物、及び純粋な化合物を、ＰＭによって誘発されるＭＣＰ−１放出の阻害について試験した。ＬＰＳ又はＰＭの両方で、培地におけるＭＣＰ−１濃度の増大は明らかであったが、０．５を超えるｐ値を伴い、有意ではなかった。ＤＭＳＯは、影響を有しなかった。スルフォラファンは、非常に低いｐ値を伴い、ＭＣＰ−１分泌の明らかな阻害を示した。
【００９４】
同じウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物を、Ａ５４９細胞のＭＣＰ−１分泌に対するその効果について試験した。有意な変化は検出できなかった。ＩＬ−６及びＩＬ−８で認められる効果と比較して、その理由は、ＭＣＰ−１分泌の、ＰＭによって誘発される増加である可能性がある。
【００９５】
ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物中に存在する、試験された４種の単一の化合物のうち、１２−デオキシウィザストラモノリド及びウィザフェリンＡは、ＭＣＰ−１の有意な減少をもたらした。ウィザノリドＡ及びｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａは、ＭＣＰ−１の低いが有意ではない減少を示した。これらの純粋な化合物の弱い効果に起因して、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物分画に対する有意な効果を検出することは期待できない可能性がある。
【００９６】
次いで、本発明者らは、ＰＭ処理されたＢＥＡＳ−２Ｂ細胞の上清中の分泌されたＰＧＥ２の濃度を測定した。いくつかの場合では、本発明者らは、本発明者らの抽出物の存在下で、減少するＰＧＥ２分泌の傾向を認めた。ＰＭは、ＬＰＳとしてのわずかに強いＰＥＧ２分泌を引き起こした。試験されたすべての植物抽出物のうち、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）ＮＩＧ−０１８９１１が、対照（ＤＭＳＯを用いるＰＭ）と比較して、ＰＯＧＥ２分泌の有意な減少をもたらした。試験された単一の化合物からは、１２−デオキシウィザストラモノリドが、ＰＧＥ分泌の有意な減少を示した。ｑｕｒｅｓｉｍｉｎｅ  Ａでの結果は、境界域であった。
【００９７】
次の実験では、本発明者らは、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）ＮＩＧ−０１８９１１抽出物が、ＢＥＡＳ−２Ｂ細胞において、ＬＰＳによって誘発される抗炎症性サイトカイン分泌を阻害することができるかどうかを知りたいと思っていた。ＬＰＳ処理は、増殖培地中のＩＬ−６（表１１、ａ）、ＩＬ−８（表１１、ｂ）、及びＭＣＰ−１（表１１、ｃ）濃度の強力な増大をもたらした。３つすべての場合において、この分泌は、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）ＮＩＧ−０１８９１１抽出物によって有意に阻害され；ｐ値は、それぞれ、０．００２未満であった（表１１）。したがって、ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）ＮＩＧ−０１８９１１抽出物は、ＰＭだけでなくＬＰＳによっても誘発される炎症パラメータを阻害することが可能である。ウィザニア・ソムニフェラ（Ｗｉｔｈａｎｉａ  ｓｏｍｎｉｆｅｒａ）抽出物の成分のいくつかについて、この抗炎症活性は、既に示されている（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．９２８，（２０１６），３２９−３７３）。さらに、本発明者らは、ＴＬＲ−４が、ＬＰＳに対する受容体である（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｏｈｙｄｒ．Ｐｏｌｙｍ．１４９，（２０１６），１８６−２０６）ことから、ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ−４）が、ＰＭによって誘発される炎症に関与するのではないかと疑っており、本発明者らの実験状況では、両方の誘発因子、ＰＭ又はＬＰＳが、同様の結果をもたらす。
【００９８】
【表４】
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【００９９】
【表５】
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【０１００】
【表６】
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【０１０１】
【表７】
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【０１０２】
【表８】
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【０１０３】
【表９】
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【０１０４】
【表１０】
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【０１０５】
【表１１】
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【０１０６】
【表１２】
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【０１０７】
【表１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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