(57)【要約】  Ｋ−Ｒａｓ遺伝子の状態に関連したＣＫ８陽性がんの治療。本発明は、（１）野生型Ｋ−Ｒａｓを有するＣＫ８を発現する固形腫瘍（本明細書に開示されるように変異していない）を治療するための、および（２）本明細書に開示されるＫ−Ｒａｓ変異を有するＣＫ８を発現する固形腫瘍を治療するための、抗ＣＫ８抗体の単独または併用療法（別の抗体および／または化学療法剤との併用）の使用に関する。本発明はまた、内在化特性を有する抗ＣＫ８抗体の使用にも関し、野生型Ｋ−Ｒａｓ（本明細書に開示されるように変異していない）、または本明細書に開示されるＫ−Ｒａｓ突然変異を有する、ＣＫ８陽性固形腫瘍の治療のための抗体に結合した細胞毒性薬を送達することを可能にする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下から選択される抗ＣＫ８モノクローナル抗体であって、ＣＫ８を発現し、Ｋ−Ｒａｓに以下の変異：Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ６１Ｈ、Ｇ１２ＶまたはＡ１４６Ｔの少なくとも１つを有する腫瘍の治療における使用のための抗体：
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号８の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号９の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号１０の配列を含む；重鎖、および
以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体、
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１’、ＣＤＲ−Ｈ２’およびＣＤＲ−Ｈ３’を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１’は配列番号１１の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２’は配列番号１２の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３’は配列番号１０の配列を含む；重鎖、および以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１’、ＣＤＲ−Ｌ２’およびＣＤＲ−Ｌ３’を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１’は配列番号１３の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２’は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３’は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体。
【請求項２】
以下から選択される抗ＣＫ８モノクローナル抗体：
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号８の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号９の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号１０の配列を含む；重鎖、および
以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体、
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１’、ＣＤＲ−Ｈ２’およびＣＤＲ−Ｈ３’を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１’は配列番号１１の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２’は配列番号１２の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３’は配列番号１０の配列を含む；重鎖、および以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１’、ＣＤＲ−Ｌ２’およびＣＤＲ−Ｌ３’を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１’は配列番号１３の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２’は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３’は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体、
およびＣＫ８を発現する頭頚部がんの治療における併用のための化学療法剤、好ましくはシスプラチン。
【請求項３】
以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４９の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５０の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号５１の配列を含む；重鎖、および
以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５２の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号４７の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号５３の配列を含む；軽鎖を含む、抗ＣＫ８モノクローナル抗体。
【請求項４】
配列番号３８のＶＨ配列、および配列番号３６のＶＬ配列を有する、請求項３に記載の抗体。
【請求項５】
配列番号１８の重鎖定常ドメイン（Ｈｅａｖｙ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）、および／または配列番号２０の軽鎖定常領域（カッパ）をさらに含む、請求項３または４に記載の抗体。
【請求項６】
ＣＫ８を発現する腫瘍、具体的にはＣＫ８を発現する直腸結腸腫瘍（ＣＲＣ）、頭頚部腫瘍（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺腫瘍（ＰＣ）、乳腺腫瘍（Ｂ）、肺腫瘍（Ｌ）、膵腫瘍（ＰＲＣ）、または腎腫瘍（Ｒ）の治療における使用のための、請求項３〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４３の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号４４の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号４５の配列を含む；重鎖、および
以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号４６の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号４７の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号４８の配列を含む；軽鎖を含む、抗ＣＫ８モノクローナル抗体。
【請求項８】
配列番号４２のＶＨ配列、および配列番号４０のＶＬ配列を有する、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
配列番号１８の重鎖定常ドメイン、および／または配列番号２０の軽鎖定常領域（カッパ）をさらに含む、請求項７または８に記載の抗体。
【請求項１０】
ＣＫ８を発現する腫瘍、具体的にはＣＫ８を発現する直腸結腸腫瘍（ＣＲＣ）、頭頚部腫瘍（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺腫瘍（ＰＣ）、乳腺腫瘍（Ｂ）、肺腫瘍（Ｌ）、膵腫瘍（ＰＲＣ）、または腎腫瘍（Ｒ）の治療における使用のための、請求項７〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
請求項３〜５、および７〜９のいずれか一項に記載の抗体、および薬学的に許容される媒体を含む、医薬組成物。
【請求項１２】
ＣＫ−８発現固形がんにおいて使用するための、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＣＫ８を発現し、Ｋ−Ｒａｓに以下の変異：Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ６１Ｈ、Ｇ１２ＶまたはＡ１４６Ｔの少なくとも１つを有するがんを治療する方法であって、それを必要とする患者に請求項１に記載の抗ＣＫ８抗体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１４】
ＣＫ８を発現する頭頚部がんを治療する方法であって、それを必要とする患者に請求項２に記載の抗ＣＫ８抗体の有効量および化学療法剤、好ましくはシスプラチンの有効量を投与することを含む方法。
【請求項１５】
ＣＫ８を発現するがんを治療する方法であって、それを必要とする患者に請求項３〜５、または７〜９のいずれか一項に記載の抗ＣＫ８抗体の有効量を投与することを含む、方法。
【請求項１６】
請求項１４または１５に記載の方法であって、ここで前記がんは、直腸結腸がん（ＣＲＣ）、頭頚部がん（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺がん（ＰＣ）、乳がん（Ｂ）、肺がん（Ｌ）、膵がん（ＰＲＣ）、または腎がん（Ｒ）からなる群から選択される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗体、または抗体および化学療法剤を使用する治療の分野に関する。具体的には、本発明は、ＣＫ８陽性固形腫瘍の治療における抗ＣＫ８抗体の使用に関する。本発明は、ＣＫ８を発現するＫ−Ｒａｓ変異固形腫瘍に対する抗ＣＫ８抗体の使用に関する。本発明はまた、Ｋ−Ｒａｓ野生型（Ｋ−Ｒａｓ変異なし）との併用療法における抗ＣＫ８抗体の使用に関する。併用療法は、Ｋ−Ｒａｓ突然変異を伴う、または伴わないＣＫ８陽性固形腫瘍の治療における、別の標的に対する抗体、および／または化学療法剤との併用療法であってもよい。本発明は、ＣＫ８陽性固形腫瘍の治療のために、具体的には抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の形態で、前記抗体に結合した細胞毒性薬を送達する内在化特性を有する新規抗ＣＫ８抗体にも関する。
【背景技術】
【０００２】
手術、化学療法、ホルモン療法、および／または放射線療法は、がんと闘うための一般的な治療アプローチである。過去数十年で、生物学的療法、または免疫療法の利用も採用された。それでもやはり、多くの腫瘍は既存療法に部分的にしか反応せず、抵抗性の症例も発生する。したがって、代替のがん療法への強いニーズがある。
【０００３】
ゲノムワイド関連研究の発展により、がんに関連し、発がんに関与する、または治療結果を予測するバイオマーカーと呼ばれる遺伝子パターンの発見が可能になった。
【０００４】
バイオマーカーは、多くの場合、予後バイオマーカー、薬力学バイオマーカーまたは予測バイオマーカーとして分類される。予後バイオマーカーは、治療の有効性を予測するのに役立ち、場合によってはさらなる治療が必要かどうかを決定する。薬力学バイオマーカーは、病気に対する薬物の効果を測定する。予測バイオマーカーは、安全性、および／または有効性の観点から、所与の治療の有効性を予測する。腫瘍学で日常的に使用される予測バイオマーカーの数はまだかなり限られている。
【０００５】
最良の例は、乳房腫瘍におけるＨＥＲ２過剰発現であり、これは抗ＨＥＲ２  ＭＡｂであるトラスツズマブの有効性を予測する。他の例は、変異がセツキシマブ（抗ＥＧＦＲ  ＭＡｂ）の無効性を予測するＫ−ＲＡＳ、イマチニブに対する反応性のためのＢＲＣ−ＡＢＬ遺伝子転座、黒色腫におけるベムラフェニブの有効性を予測するためのＢＲＡＭ変異Ｖ６００Ｅ、および非小細胞肺がんにおけるクリゾチニブの有効性を予測するためのＡＬＫ再配置である。
【０００６】
細胞外膜結合サイトケラチン８（ＣＫ８）またはサイトケラチン８の一部は、たとえば乳がん（Ｇｏｄｆｒｏｉｄ  ｅｔ  ａｌ，  １９９１，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ９９：５９５−６０７）、上部消化管がん(Ｇｉｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，  ３２８：  １１５４−１１６２）、直腸結腸がん（国際公開第２０１０／１３６５３６号）、頭頚部がん（Ｇｉｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００６，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３４３：２５２−２５９）、および非小細胞肺がん（Ｇｈａｒｉｂ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２，  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ，  ５：４４０−４４８）のような、いくつかの腫瘍の細胞で検出されている。
【０００７】
外在化したＣＫ８（ｅＣＫ８）を標的とすることは、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、および他の種類の腫瘍に対する新規の治療アプローチとして示唆されてきた。実際、正常細胞ではなく腫瘍の外膜でのＣＫ８の選択発現は、ＣＫ８を抗がん療法の有望な標的にする。国際公開第２０１６／０２０５５３号は、ＣＫ８を発現するがん、たとえば結腸直腸がんの治療に有用な抗ＣＫ８モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を開示している。
【０００８】
結腸直腸がん（ＣＲＣ）は、世界的にがんによる死亡の４番目に主な原因である。ＣＲＣの発生頻度は２０１２年に１４０万症例と推定され、７０万人が死亡した。患者の５０％は転移を起こし、これらの患者の５年生存率は１０〜２０％である。ＣＲＣ患者の２０％以上が診断されている先進国では、発生率と死亡率の緩やかな低下が最近認められた。代わりに、ヨーロッパ、アジア、および南アメリカで経済成長を遂げている国では、ＣＲＣの発生率と死亡率の急激な増加が認められた。世界的に、ＣＲＣの負荷（ｂｕｒｄｅｎ）は６０％増加し、２０３０年には最大２２０万症例に上り、１１０万人が死亡すると推定されている。
【０００９】
過去１０年間で、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を標的とするモノクローナル抗体の使用は、ＣＲＣに苦しむ患者の予後を著しく改善した。ＥＧＦＲは、ＣＲＣの６０％〜８０％を含むさまざまな腫瘍で過剰発現しており、疾患の発症および進行、治療への抵抗性、および予後不良に直接関与している（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ，  ２００４．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ３５１：３３７−３４５．)。キメラＩｇＧ１モノクローナル抗体であるセツキシマブは、不活性型でＥＧＦＲに結合する。これは、ＲＡＳ−ＲＡＦ−ＭＡＰＫ、およびＰＩ３Ｋ−ＡＫＴ−ｍＴＯＲシグナル伝達カスケードを介して発生する、ＥＧＦＲのリガンド誘導シグナル伝達カスケードの下流（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ，  ２００５，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ；  ７：３０１−１１）を妨げる。ＥＧＦＲシグナル伝達をブロックすることにより、セツキシマブはＥＧＦＲを介した腫瘍の増殖、浸潤、移動を阻害する（Ｃｉａｒｄｉｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ｎ．  Ｅｎｇｌ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  ３５８：１１６０−７４）。
【００１０】
無作為化臨床試験は、野生型Ｋ−Ｒａｓ遺伝子を有する患者においてのみセツキシマブの有効性の明確な証拠を提供した。このため、セツキシマブで治療する患者を選択するために、規制当局によってＫ−Ｒａｓ変異のスクリーニングが義務付けられている（Ｖａｎ  Ｃｕｔｓｅｍ  ｅｔ  ａｌ，  ２００９，  Ｎ．  Ｅｎｇ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．；  ３６０：１４０８−１４１７）。Ｋ−Ｒａｓは、リガンド依存性受容体の活性化をＥＧＦＲシグナル伝達カスケードの細胞内経路にリンクする低分子量Ｇタンパク質（ｓｍａｌｌ  Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードする。
【００１１】
遺伝子内の重要な部位、一般にコドン１２および１３における突然変異は、Ｋ−Ｒａｓ関連シグナル伝達の構成的活性化を引き起こす（突然変異は、Ｋ−Ｒａｓの活性化突然変異と言われる）。Ｋ−Ｒａｓ変異は、ヒトのがんの９〜３０％（Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１４，  ＮＡＴ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  １３（１１）：８２８−５１）、およびＣＲＣの４０％（Ｋａｒａｐｅｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ３５９：１７５７−１７６５）において認められる。したがって、Ｋ−Ｒａｓに活性化変異を有する転移性ＣＲＣに苦しむ患者の患者の治療には大きな医療ニーズが存在する。
【００１２】
ＣＫ８関連腫瘍、たとえば結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵がん（ＰＣ）、頭頸部がん（Ｈ＆Ｎ）を患っている患者において腫瘍の退縮、および／または寛解を誘発することができる組み合わせ治療の強いニーズも依然として存在する。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、（１）野生型Ｋ−Ｒａｓ（本明細書に開示されるように変異していない）を有するＣＫ８を発現する固形腫瘍を治療するための、および（２）本明細書に開示されるＫ−Ｒａｓ突然変異を有するＣＫ８を発現する固形腫瘍を治療する、抗ＣＫ８抗体の単独、または併用療法（別の抗体、および／または化学療法剤との併用）における使用に関する。本発明はまた、内在化特性を有する抗ＣＫ８抗体の使用にも関し、野生型Ｋ−Ｒａｓ（本明細書に開示されるように変異していない）または本明細書に開示されるＫ−Ｒａｓ突然変異を有するＣＫ８陽性固形腫瘍の治療のための抗体に結合した細胞毒性薬の送達を可能にする。
【００１４】
ＣＫ８を発現し、Ｋ−Ｒａｓ変異を有する腫瘍は、腫瘍成長を制御することにより抗ＣＫ８抗体治療に特に感受性があることが見出されている。たとえば、ヒト化モノクローナル抗体ＨｚＭＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）は、Ｋ−Ｒａｓ変異（Ｋ−Ｒａｓに活性化変異を有する）を有する腫瘍の成長を阻害することが見出されている。したがって、本発明は、抗ＣＫ８抗体、たとえばＣＫ８を発現し、Ｋ−Ｒａｓ変異を有する固形腫瘍の治療における使用のためのＨｚＭＲ０２２  （Ｄ−Ａ１０）に関する。
【００１５】
本発明はまた、化学療法剤、たとえば特に本明細書に開示されるＫ−Ｒａｓ変異を有する、または腫瘍成長を特に阻害または減少させるＫ−Ｒａｓ変異を特に有しないＣＫ８を発現する固形腫瘍の治療のためのシスプラチンとのモノクローナル抗体抗ＣＫ８併用療法に関する。予期しないことに、本発明の抗体はシスプラチンのエスケープを反転（ｒｅｖｅｒｓｅ）し、シスプラチンと併用した場合に予想外の長期の腫瘍成長制御を提供する。したがって、本発明は特に化学療法剤のエスケープを反転（ｒｅｖｅｒｓｅ）させるために使用され、および／または特に薬物がプラチン塩、たとえばシスプラチンである場合、化学療法剤と組み合わせると予想外の長期の腫瘍成長制御を提供する。
【００１６】
本発明はまた、ＣＫ８陽性固形腫瘍の腫瘍成長を阻害するための細胞毒性薬を送達するためのモノクローナル抗体抗ＣＫ８の内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｉｎｇ）の使用に関する。
【００１７】
一つの実施形態では、抗体、またはその抗体断片は、配列番号６６のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合する。抗体は、以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖を含んでもよく、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号８の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号９の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号１０の配列を含む。抗体は、以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖を含んでもよく、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号７の配列を含む。抗体は、好ましくはこれらの重鎖および軽鎖を含む。定常領域として、抗体は配列番号１８の重鎖定常ドメイン（Ｈｅａｖｙ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）、および／または配列番号２０の軽鎖定常領域（カッパ）を含んでもよい。
【００１８】
一つの実施形態では、抗体、またはその抗体断片は、配列番号６６のアミノ酸配列を有するペプチドに特異的に結合するヒト化抗体、またはその抗体断片である。ヒト化抗体は、以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１’、ＣＤＲ−Ｈ２’およびＣＤＲ−Ｈ３’を含む重鎖を含んでもよく、ここでＣＤＲ−Ｈ１’は配列番号１１の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２’は配列番号１２の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３’は配列番号１０の配列を含む。ヒト化抗体は、以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１’、ＣＤＲ−Ｌ２’およびＣＤＲ−Ｌ３’を含む軽鎖を含んでもよく、ここでＣＤＲ−Ｌ１’は配列番号１３の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２’は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３’は配列番号７の配列を含む。抗体は、好ましくはこれらの重鎖および軽鎖を含む。定常領域として、抗体は配列番号１８の重鎖定常ドメイン、および／または配列番号２０の軽鎖定常領域（カッパ）を含んでもよい。
【００１９】
一つの実施形態では、抗体は、以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖を含んでもよく、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４３の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号４４の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号４５の配列を含む。抗体は、以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖を含んでもよく、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号４６の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号４７の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号４８の配列を含む。抗体は、好ましくはこれらの重鎖および軽鎖を含む。定常領域として、抗体は配列番号１８の重鎖定常ドメイン、および／または配列番号２０の軽鎖定常領域（カッパ）を含んでもよい。
【００２０】
本発明はまた、このｍＲ０２２（Ｄ−Ｆ５）抗体、ならびに当該抗体および薬学的に許容される媒体または賦形剤を含む医薬組成物に関する。このモノクローナル抗ＣＫ８抗体は、配列番号４２のＶＨ配列および配列番号４０のＶＬ配列を有する。定常領域として、抗体は配列番号１８の重鎖定常ドメイン、および／または配列番号２０の軽鎖定常領域（カッパ）を含んでもよい。
【００２１】
一つの実施形態では、抗体は、以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖を含んでもよく、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４９の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５０の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号５１の配列を含む。抗体は、以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖を含んでもよく、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５２の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号４７の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号５３の配列を含む。定常領域として、抗体は配列番号１８の重鎖定常ドメイン、および／または配列番号２０の軽鎖定常領域（カッパ）を含んでもよい。
【００２２】
本発明はまた、このｍＲ０２２（Ｄ−Ｄ６）抗体、ならびに当該抗体および薬学的に許容される媒体または賦形剤を含む医薬組成物に関する。このモノクローナル抗ＣＫ８抗体は、配列番号３８のＶＨ配列および配列番号３６のＶＬ配列を有する。定常領域として、抗体は配列番号１８の重鎖定常ドメイン、および／または配列番号２０の軽鎖定常領域（カッパ）を含んでもよい。
【００２３】
これらの抗体は、ＶＨおよびＶＬのＣＤＲによって規定される。しかしながら、それらの特異的な標的も開示されている。したがって、当業者は、ＶＨ、およびＶＬ配列の親和性および機能性を維持しながら、ＣＤＲ中のいくつかのアミノ酸のバリエーションが許容され得ることを理解し得る。結果として、本発明は、アミノ酸ＣＤＲ配列のそれらのバリエーションを包含する。具体的には、配列との最適なアラインメント後の少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有する配列は、定型的試験（ｒｏｕｔｉｎｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）により許容および決定可能であってもよい。また、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、または一般的なナンバリング法を使用して、本明細書で開示されるように定義されてもよい。
【００２４】
したがって、本発明は、本明細書に開示されるモノクローナル抗体、および薬学的に許容される媒体または担体を含む医薬組成物に関する。一つの実施形態では、組成物は、本明細書で提供されるように、ｍＲ０２２（Ｄ−Ｆ５）またはｍＲ０２２（Ｄ−Ｄ６）のＣＤＲ配列を有する抗体、またはこれらの抗体自体の１つを含む。
【００２５】
したがって、本発明は、特に、ＣＫ８を発現し、Ｋ−Ｒａｓ変異（Ｋ−Ｒａｓに活性化変異を有する）を有する固形腫瘍、たとえば、それを必要とする患者における、ＣＫ８を発現し、Ｋ−Ｒａｓ変異を有する直腸結腸腫瘍（ＣＲＣ）、頭頚部腫瘍（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺腫瘍（ＰＣ）、乳腺腫瘍（Ｂ）、肺腫瘍（Ｌ）、膵腫瘍（ＰＲＣ）、または腎腫瘍（Ｒ）の治療における使用のための、抗ＣＫ８抗体、たとえば本明細書に開示されるもの、またはこの抗体および薬学的に許容される媒体に関する。本発明はまた、これらの腫瘍を治療するための医薬組成物の製造のためのそのような抗体の使用に関する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、治療される腫瘍は、Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ６１Ｈ、Ｇ１２ＶまたはＡ１４６Ｔ変異から選択されるＫ−Ｒａｓ変異を有する（Ｃｏｘら、２０１４、Ｋ−Ｒａｓ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ，  ＮＡＴ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  １３（１１）：８２８−５１；（Ｋａｒａｐｅｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，  ２００８，．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．  ３５９：１７５７−１７６５））。Ｋ−Ｒａｓ変異を有することは、ＣＫ８＋腫瘍細胞もＫ−Ｒａｓに少なくとも１つの変異、具体的には、特に、ＣＫ８陽性腫瘍を抗ＣＫ８抗体療法に対して感受性にする可能性のある、列挙された変異またはその他のＫ−Ｒａｓ変異の少なくとも１つを有する。抗ＣＫ８抗体療法に対する感受性に関するＫ−Ｒａｓ状態の本開示、および実施例部分で提供される方法に基づいて、当業者は、本発明のこの態様に従って、そのような治療のために腫瘍を限定する（ｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ことができるＫ−Ｒａｓ変異を決定することができる。
【００２７】
本発明はまた、オーダーメイド医療にも関し、ここで患者はＣＫ８の発現、および／またはＫ−Ｒａｓ変異の検査を受ける。患者は、特に上記の群のＫ−Ｒａｓ変異について検査される。腫瘍がＣＫ８発現および／またはＫ−Ｒａｓ変異、特に本明細書に記載または提供されるＫ−Ｒａｓ変異について陽性反応が出る、好ましくはＣＫ８およびＫ−Ｒａｓ変異の両方について陽性反応が出る場合、患者は抗ＣＫ８抗体による治療のために選択される。選択されれば、患者は抗ＣＫ８抗体、特に本明細書で開示される抗体の１つで治療されてもよい。
【００２８】
したがって、本発明は、それを必要とする患者に、ＣＫ８を発現し、Ｋ−Ｒａｓ変異を有する固形腫瘍、より具体的には直腸結腸腫瘍（ＣＲＣ）、頭頚部腫瘍（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺腫瘍（ＰＣ）、乳腺腫瘍（Ｂ）、肺腫瘍（Ｌ）、膵腫瘍（ＰＲＣ）、または腎腫瘍（Ｒ）を治療するための有効量の抗ＣＫ８抗体を投与することを含む抗がん療法に関する。一つの実施形態では、患者は、治療前にＣＫ８発現および／またはＫ−Ｒａｓ変異について検査され、腫瘍がＣＫ８発現および／またはＫ−Ｒａｓ変異について陽性反応が出る場合、抗ＣＫ８抗体で治療される。一つの実施形態では、本発明によりＣＫ８発現およびＫ−Ｒａｓ変異について陽性反応が出た患者は、本明細書に開示されるモノクローナル抗ＣＫ８抗体の少なくとも１つで治療される。検査は、Ｋ−ｒａｓ変異Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ６１Ｈ、Ｇ１２ＶまたはＡ１４６Ｔの１つに対する検査を含んでもよい。
【００２９】
したがって、本発明はまた、特に本明細書に開示されているように、具体的には腫瘍の成長を阻害または低減する、ＣＫ８を発現し、Ｋ−Ｒａｓ変異を有しないもしくはＫ−Ｒａｓ変異を有する固形腫瘍を治療するための化学療法剤、たとえばシスプラチンとのモノクローナル抗体抗ＣＫ８併用療法にも関する。また、この組み合わせは、本明細書では、特に薬物がプラチン塩、たとえばシスプラチンである場合、化学療法剤のエスケープを反転させ、および／または化学療法薬と組み合わせると予想外の長期腫瘍成長制御を提供するために使用される。
【００３０】
本発明は、特に、化学療法剤との併用療法の一部としてそれを必要とする患者において、ＣＫ８を発現する固形腫瘍、より具体的にはＣＫ８を発現する直腸結腸腫瘍（ＣＲＣ）、頭頚部腫瘍（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺腫瘍（ＰＣ）、乳腺腫瘍（Ｂ）、肺腫瘍（Ｌ）、膵腫瘍（ＰＲＣ）、または腎腫瘍（Ｒ）の治療における使用のための、本明細書に開示されるような抗ＣＫ８モノクローナル抗体、またはこの抗体および薬学的に許容される媒体を含む医薬組成物に関する。一つの実施形態では、腫瘍はＫ−Ｒａｓ変異（Ｋ−Ｒａｓに活性化変異を有する）、特に上記に列挙した変異の１つを有する。本発明はまた、このような化学療法剤と組み合わせてこれらの腫瘍を治療するための医薬組成物の製造のためのこのような抗体の使用に関する。
【００３１】
一つの実施形態では、この抗ＣＫ８抗体は、ＣＫ８を発現し、Ｋ−Ｒａｓ変異を有しないＨＡＮがんの治療における使用のためのものである。より具体的には、この抗体は、別の薬剤、たとえば化学療法剤との併用療法における使用のためのものである。たとえば、化学療法剤はシスプラチンであってもよい。本発明はまた、Ｋ−Ｒａｓ変異を有しないＣＫ８陽性腫瘍、たとえば直腸結腸腫瘍（ＣＲＣ）、頭頚部腫瘍（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺腫瘍（ＰＣ）、乳腺腫瘍（Ｂ）、肺腫瘍（Ｌ）、膵腫瘍（ＰＲＣ）、または腎腫瘍（Ｒ）の治療のための抗体の使用に関する。
【００３２】
本発明はまた、本発明による抗ＣＫ８抗体および本明細書に開示される化学療法剤、特にシスプラチンを用いた、細胞がＣＫ８タンパク質を発現し、おそらくＫ−Ｒａｓ変異を持たない腫瘍、特にＨ＆Ｎがんに対する併用療法に関する。抗ＣＫ８抗体、および化学療法剤は、細胞がＣＫ８タンパク質を発現し、Ｋ−Ｒａｓ変異を有しない腫瘍、特にＨＡＮがんの治療において使用される。使用方法または抗がん療法は、それを必要とする患者に、本発明による十分な量の抗ＣＫ８抗体、および十分な量の化学療法剤、たとえばシスプラチンを投与することを含む。抗体、および薬物は、同時に、別々に、または連続して投与してもよい。また、この組み合わせは、化学療法剤のエスケープを反転させるために本明細書で使用され、および／または化学療法剤と組み合わせた場合、特に薬物がプラチン塩、たとえばシスプラチンである場合、予想外の効果を提供する。
【００３３】
本発明はまた、特にＣＫ８を発現し、おそらくＫ−Ｒａｓ変異を有しない腫瘍、具体的にはＨＡＮがんの治療における使用のための、本発明による抗ＣＫ８抗体を含む第一の組成物、および好適な医薬担体、ならびに本明細書に開示される化学療法剤、具体的にはシスプラチン、および好適な医薬担体を含む第二の組成物を含むキットまたは医薬組成物に関する。第一、および第二の組成物は、それを必要とする患者に同時に、別々に、または連続して投与されるものであってもよい。
【００３４】
したがって、本発明はまた、ＣＫ８を発現し、おそらくＫ−Ｒａｓ変異を有する腫瘍およびＫ−Ｒａｓ変異を有しない腫瘍、具体的にはＣＲＣの治療における使用のための、内在化抗ＣＫ８モノクローナル抗体、特にｍＲ０２２（Ｄ−Ａ１０、Ｄ−Ｄ６、またはＤ−Ｆ５）の使用に関する。
【００３５】
本発明は特に、ＣＫ８を発現し、おそらくＫ−Ｒａｓ変異を有するまたはＫ−Ｒａｓ変異を有しない腫瘍、具体的には直腸結腸腫瘍（ＣＲＣ）、頭頚部腫瘍（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺腫瘍（ＰＣ）、乳腺腫瘍（Ｂ）、肺腫瘍（Ｌ）、膵腫瘍（ＰＲＣ）、または腎腫瘍（Ｒ）の治療における使用のための、モノクローナル抗体ｍＲ０２２（Ｄ−Ａ１０、Ｄ−Ｄ６、またはＤ−Ｆ５）、またはこのｍＲ０２２（Ｄ−Ａ１０、Ｄ−Ｄ６、またはＤ−Ｆ５）のＣＤＲを含むモノクローナル抗体、またはこの抗体および薬学的に許容される媒体を含む医薬組成物に関する。一つの実施形態では、内在化モノクローナル抗体抗ＣＫ８、たとえばｍＲ０２２（Ｄ−Ａ１０、Ｄ−Ｄ６、またはＤ−Ｆ５）を使用して、細胞毒性剤を送達して、ＣＫ８陽性固形腫瘍の腫瘍成長を阻害する。
【００３６】
本発明はまた、ＣＫ８を発現し、おそらくＫ−Ｒａｓ変異を有するまたはＫ−Ｒａｓ変異を有しない腫瘍、具体的には直腸結腸腫瘍（ＣＲＣ）、頭頚部腫瘍（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺腫瘍（ＰＣ）、乳腺腫瘍（Ｂ）、肺腫瘍（Ｌ）、膵腫瘍（ＰＲＣ）、または腎腫瘍（Ｒ）の治療における使用のための、モノクローナル抗体ｍＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）、またはＨｚＲ０２２（ＤＡ１０）、またはそのＣＤＲを含むモノクローナル抗体、またはこの抗体および薬学的に許容される媒体を含む医薬組成物に関する。
【００３７】
また、本発明は、本発明によるこの抗ＣＫ８抗体の有効量を、それを必要とする患者、具体的には直腸結腸腫瘍（ＣＲＣ）、頭頚部腫瘍（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺腫瘍（ＰＣ）、乳腺腫瘍（Ｂ）、肺腫瘍（Ｌ）、膵腫瘍（ＰＲＣ）、または腎腫瘍（Ｒ）を有する患者に投与することを含む、使用方法または抗がん療法に関する。上記抗体のヒト化バージョンの使用が好ましい。一つの実施形態では、この内在化モノクローナル抗体抗ＣＫ８、たとえばｍＲ０２２（Ｄ−Ｄ６）を使用して、細胞毒性剤を送達して、ＣＫ８陽性固形腫瘍の腫瘍成長を阻害する。
【００３８】
本発明は、本明細書に開示されるＣＤＲ配列によって特徴づけられるいくつかのモノクローナル抗体を提供する。本発明は、そのような抗体、またはその有効な抗体断片、および好適な薬剤溶媒または担体を含む医薬組成物に関する。これらの組成物は、特にがんの治療における使用のため、および／または腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する薬剤として、特に細胞がＣＫ８タンパク質を発現し、本明細書に開示されているＫ−Ｒａｓ変異を有し、または有しない腫瘍の治療における使用のためのものである。
【００３９】
本発明はまた、本発明による抗ＣＫ８抗体を含む第一の組成物、および好適な医薬担体、ならびに本明細書に開示される別の抗体（ＣＫ８とは別の標的に対する抗体）、または本明細書に開示されている化学療法剤、および好適な医薬担体を含む第二の組成物を含む、キットまたは医薬組成物に関する。このキットまたは医薬組成物は、特にＣＫ８を発現している腫瘍の治療における使用のためのもの、特にＣＫ８を発現しており、本発明によるＫ−Ｒａｓ変異を有し、または有さない直腸結腸腫瘍（ＣＲＣ）、頭頚部腫瘍（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺腫瘍（ＰＣ）、乳腺腫瘍（Ｂ）、肺腫瘍（Ｌ）、膵腫瘍（ＰＲＣ）、または腎腫瘍（Ｒ）の治療における使用のためのものである。それはまた、神経膠芽腫、または前立腺がんを治療するのに使用されてもよい。第一、および第二の組成物は、それを必要とする患者に同時に、別々に、または連続して投与されるものであってもよい。
【００４０】
本発明はまた、ＣＫ８を発現する腫瘍を治療する方法、具体的にはＣＫ８を発現しており、本発明によるＫ−Ｒａｓ変異を有し、または有さない直腸結腸腫瘍（ＣＲＣ）、頭頚部腫瘍（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺腫瘍（ＰＣ）、乳腺腫瘍（Ｂ）、肺腫瘍（Ｌ）、膵腫瘍（ＰＲＣ）、または腎腫瘍（Ｒ）を治療する方法に関し、ここで本発明による抗体、または本明細書に開示されているようにその抗体を含む医薬組成物は、有効量で患者に投与される。一つの実施形態では、患者は同一の腫瘍細胞の別の標的に対する別の抗体、および／または化学療法剤、たとえばシスプラチンの投与を受ける。
【００４１】
本発明はまた、これらの腫瘍の治療のための医薬組成物の製造のための、そのような抗体の使用に関する。
【００４２】
発明の詳細な説明
抗ＣＫ８抗体
ＣＤＲ配列は、ＩＭＧＴ、Ｋａｂａｔ、またはＩＭＧＴおよびＫａｂａｔに共通している配列を保持する一般的なナンバリング法で定義される。本発明の抗体の、具体的にはｍＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）  ＭａｂのＣＤＲを、この表に示す。
【００４３】
【表１】
2020533278.tif 000002
【００４４】
本発明のヒト化抗体の、具体的にはＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）  ＭａｂのＣＤＲを、この表に要約する。
【００４５】
【表２】
2020533278.tif 000003
【００４６】
本発明の抗体、具体的にはｍＲ０２２（Ｄ−Ｆ５）  ＭａｂのＣＤＲ配列を、この表に要約する。
【００４７】
【表３】
2020533278.tif 000004
本発明の抗体、具体的にはｍＲ０２２（Ｄ−Ｄ６）  ＭａｂのＣＤＲ配列を、この表に要約する。
【００４８】
【表４】
2020533278.tif 000005
【００４９】
定義によれば、これらのＣＤＲは、１つまたは複数のアミノ酸の欠失、置換、または付加による変異ＣＤＲを含み、変異型は元のＣＤＲ、可変領域または抗体特異性の特異性を保持する。一般的なナンバリング法は、最短のアミノ酸配列または最小のＣＤＲ定義（ＣＤＲ  ｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ）を有するＣＤＲ定義を提供する。
【００５０】
特徴によれば、本発明の抗ＣＫ８抗体は、哺乳動物細胞で産生されてもよく、または産生されていてもよい。哺乳動物細胞は、野生型細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、げっ歯類細胞、具体的にはＣＨＯ細胞であってもよい。げっ歯類細胞は野生型細胞、具体的には野生型ＣＨＯであってもよい。抗体は、その細胞における産生から生じるグリコシル化プロファイルを有する。野生型はその通常の意味で使用され、たとえば自然界で発生する種の定型の表現型に関連している。
【００５１】
一つの実施形態では、本発明の抗体の重鎖は、本明細書に開示されている可変ＶＨドメイン、およびＣＨ１ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む定常ドメインを含む。この定常ドメインは、好ましくは配列番号１８に示され、または配列番号１９のヌクレオチド配列によってコードされている。
【００５２】
一つの実施形態では、本発明の軽鎖は、本明細書に開示されている可変ＶＨドメイン、および定常ＣＬドメインを含む。この定常ドメインは、好ましくは特に配列番号２０に示され、または配列番号２１のヌクレオチド配列によってコードされるカッパ鎖である。
【００５３】
抗体を産生する方法は当業者に知られている。
【００５４】
本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。上記モノクローナル抗体は、マウス、キメラ、またはヒト化、二重特異性、多価、またはＡＤＣ抗体であってもよい。それらは、当業者に周知の標準的な方法によって得られてもよい。
【００５５】
本発明の抗ＣＫ８抗体を産生するために、哺乳動物細胞、好ましくはげっ歯類細胞、たとえばＣＨＯ細胞、好ましくは野生型細胞（たとえば野生型ＣＨＯ細胞）に１つまたはいくつかの発現ベクターをトランスフェクトしてもよい。好ましくは、細胞に、軽鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター、および重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターで共トランスフェクトしてもよい。本発明において有用な抗体の産生に関して、当業者は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１６／０２０５５３号を参照してもよい。
【００５６】
特にマウス起源のモノクローナル抗体は、マニュアルＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  （Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  ＮＹ，  ｐｐ．  ７２６，  １９８８）に記載されている技術に従って調製、またはハイブリドーマから調製してもよい。そのような技術は、当業者に周知である。
【００５７】
あるいは、本発明のモノクローナル抗体は、たとえば、国際公開第２０１６／０２０５５３に開示されているヒトCK8タンパク質フラグメントで免疫化された動物の細胞から得てもよい。本発明によるモノクローナル抗体は、たとえば、好適なヒトＣＫ８フラグメントの前に固定化されたアフィニティーカラムで精製することができる。他の精製技術、たとえばアフィニティーカラムでの精製は周知である。
【００５８】
遺伝子組換え技術を使用してキメラ抗体を作製することができる。たとえば、キメラ抗体は、プロモーター、ならびに非ヒト、具体的にはマウスモノクローナル抗体の可変領域をコードする配列、およびヒト抗体の定常領域をコードする配列を有する組換えDNAをクローニングすることにより産生することができる。そのような組換え遺伝子によってコードされる本発明のキメラ抗体、たとえば、マウス−ヒトキメラであり、この抗体の特異性はマウスＤＮＡに由来する可変領域によって決定され、そのアイソタイプはヒトＤＮＡ胃に由来する定常領域によって決定される。キメラ抗体を産生する方法は、文献に広く記載されている。
【００５９】
ヒト化抗体は、当業者に公知の技術（たとえば、Ｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎ．，  １５０：２８４４−２８５７，  １９９２；  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｅｎｇ．  Ｒｅｖ．，  １０：１−１４２，  １９９２；  ａｎｄ  Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  １０：１６９−１７５，  １９９２に記載されている技術）によって作製することができる。他のヒト化技術も、当業者に知られている。たとえば、欧州特許第０６８２０４０号、欧州特許第０９３９１２７号、欧州特許第０５６６６４７号、米国特許第６，１８０，３７０号、米国特許第５，５８５，０８９号、米国特許第５，６９３，７６１号、米国特許第６，０５４，２９７、および米国特許第５，８７７，２９３号である。
【００６０】
抗Ｖ領域応答を最小限にするために、モノクローナルヒト化抗体は、特異性決定残基（ＳＤＲ）、すなわちＭａｂおよびその抗原の表面相補性（ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ）に不可欠な残基のみをヒト鋳型に移植することによって作製されてもよい。そのために、マウス抗体は、その相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト免疫グロブリン分子の可変軽（ＶＬ）および可変重（ＶＨ）フレームワークに移植することによってヒト化することができるが、抗原結合部位の完全性に不可欠と考えられるマウスフレームワーク残基を保持する。しかしながら、ヒト化抗体の異種ＣＤＲは、患者において抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）応答を誘発する可能性があるため、本発明のヒト化抗体またはその断片は、抗Ｉｄ応答を最小化する技術によって作製できる。これらの技術の例は、特異性決定残基（ＳＤＲ）、すなわち抗体−リガンド相互作用において最も重要なＣＤＲ残基のみのヒトフレームワークへの移植を含む。ＳＤＲは、既知の構造の抗原抗体複合体の三次元構造のデータベースの助けを借りて、または抗原結合部位の変異解析によって識別される。より多くのＣＤＲ残基の保持を含むヒト化への代替アプローチは、「短縮」ＣＤＲの移植、すなわちすべてのＳＤＲを含むＣＤＲ残基のストレッチに基づく。
【００６１】
機能的抗体フラグメントは、たとえばペプシンまたはパパインによる酵素消化によって、および／または化学還元によるジスルフィド架橋の切断によって、本明細書に記載の抗体から得ることができる。あるいは、本発明の抗体フラグメントは、遺伝子組換え技術によって、またはペプチド合成によって、得ることができる。これらの方法は、当業者に周知である。
【００６２】
本発明の抗体または抗体フラグメントは、好ましくはマウス、キメラ、ヒト化二価（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｂｉｖａｌｅｎｔ）、多価、またはＡＤＣ抗体から選択される抗体または抗体フラグメントであり、好ましくは最適化配列を有する。
【００６３】
本発明の抗体、またはその抗体フラグメントは、本明細書に開示されるＶＨおよびＶＬ配列、または本明細書に開示されるそれらの全重および軽配列、または最適アラインメント後の少なくとも８０％、好ましくは８５％、９０％、９５％、および９８％の同一性を有するそれらの変異配列を含んでもよい。
【００６４】
併用療法
本明細書で使用される用語「併用（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」は、その最も広い意味で使用され、対象が少なくとも２つの治療レジメン、または医薬組成物、または薬物で治療されることを意味する。本明細書で使用される用語「薬物」は、状況に応じて適宜、抗体、および化学療法剤を包含してもよい。
【００６５】
したがって、ＣＫ８陽性腫瘍を治療するための「併用抗体療法」は、対象が少なくとも２つの抗体、それぞれにモノクローナル抗体を含む医薬組成物、または抗体レジメン、より具体的には、本発明による少なくとも１つの抗ＣＫ８抗体、および腫瘍細胞上の別の標的または受容体に対する少なくとも１つの別の抗体で治療されることを意味する。異なる抗体／組成物／レジメンの投与のタイミングは、これらの抗体の併用の有益な効果が達成される限り変えることができる。２つの抗体での治療は、同時に（たとえば、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）または同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ））、または異なる時間に（たとえば、連続的に（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅｌｙ）または連続的に（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ））、またはそれらの組み合わせであってもよい。「併用療法」は、ＣＫ８および他の標的または受容体を標的とする二重特異性抗体を使用して達成してもよい。
【００６６】
また、ＣＫ８陽性腫瘍を治療するための「併用療法」は、対象が少なくとも２つの薬物レジメンで、より具体的には、本発明による少なくとも１つの抗ＣＫ８抗体と組み合わせた、少なくとも１つの化学療法剤、たとえばシスプラチンと、または同じものを含む医薬組成物で、治療されることを意味することを意図している。異なるレジメンの投与のタイミングは、これらの薬物の併用の有益な効果が達成される限り変えることができる。抗ＣＫ８抗体と組み合わせた、化学療法剤、たとえばシスプラチンによる治療は、同時に（たとえば、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）または同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ））、または異なる時間に（たとえば、連続的に（ｃｏｎｓｅｃｕｔｉｖｅｌｙ）または連続的に（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ））、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００６７】
本開示の目的のために、同時に（たとえば、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ））投与することは、同じ製剤または別々の製剤で薬物を一緒に投与することを指し、ここで投与は数分から数時間間隔であってもよいが、１日以内である。本明細書で使用されるように、異なる時間に（たとえば、連続的に（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ））投与することは、併用療法の薬物を数時間から数日、数週間、さらには数か月間隔で投与することを指す。
【００６８】
したがって、特定の実施形態では、併用療法を受けている対象は、両方の薬物の併用の治療効果が治療を受けている対象においてもたらされる限り、両方の薬物を同時に（たとえば、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ））、または異なる時間に（たとえば、連続的に（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ）、いずれかの順序で、同じ日に、または異なる日に）受けることができる。いくつかの実施形態では、薬物の組み合わせは１回の投与で同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）投与することができるが、他の投与は、いずれかの順序で、同じ日の、または異なる日の連続的投与を含むことができる。２つの薬物が同時に投与する場合、それらは、組み合わせのいずれかの薬物を含む別々の医薬組成物として投与してもよく、またはこれらの薬物の両方を含む単一の医薬組成物として投与してもよい。
【００６９】
これらの組み合わせで使用できる薬剤の例は、標的療法のためのいわゆる薬剤であってもよい。これらの薬剤は、腫瘍の発症および／または進行に関与する特定の分子メカニズムを損なうことにより、腫瘍の成長を妨げる。標的療法の薬剤は小分子または抗体であってもよく、一般的に分子標的に従って分類される。標的療法の分子標的の例は、細胞シグナル伝達、アポトーシス、遺伝子転写、ＤＮＡ修復、細胞周期の進行および／またはチェックポイント、血管新生、浸潤および転移に関与するタンパク質である。
【００７０】
既存の化学療法治療と組み合わせて本発明の抗体でＣＫ８を標的化することは、化学療法単独よりも腫瘍細胞を殺すのにより効果的であろう。
【００７１】
本発明の組み合わせで使用できる化学療法剤は、それらの作用機序に従ってグループに分類することができる。化学療法クラスの完全に網羅されていないリストは以下のとおりである：アルキル化剤（たとえば、シクロホスファミド）、アントラサイクリン（たとえば、ドキソルビシン）、細胞骨格破壊剤（たとえば、パクリタキセル）、エポチロン（たとえば、イクサベピロン）、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（たとえば、ボリノスタット）、トポイソメラーゼ阻害剤（たとえば、イリノテカン）、キナーゼ阻害剤（たとえば、イマチニブ）、ヌクレオチド類似体および前駆体アナログ（たとえば、アザシチジン）、ペプチド抗生物質（たとえば、ブレオマイシン）、白金製剤（ｐｌａｔｉｎｕｍ−ｂａｓｅｄ  ａｇｅｎｔ；たとえば、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン）、レチノイド（たとえば、トレチノイン）、ビンカアルカロイドおよび誘導体。
【００７２】
一般にホルモン療法の薬剤として分類されるがん療法に用いられる他の薬剤は、ホルモン、ホルモン合成阻害剤、ホルモン受容体拮抗薬を含む。
【００７３】
１つのアプローチでは、がん患者の治療において、少なくとも２つの抗体の組み合わせを含む抗体療法またはレジメンを標準化学療法のレジメンに追加してもよい。
【００７４】
抗体、および追加の抗がん剤が、がん細胞に対して相乗効果を発揮するそれらの組み合わせについて、追加の薬剤の投与量は、単独で投与する場合の第２の薬剤の標準投与量と比較して減少しうる。抗体は、がん細胞の感受性を高めるのに有効な量の抗がん剤（抗体を含む）とともに同時投与されてもよい。
【００７５】
本発明の一方法において、ＣＫ８を標的とする抗体は、化学療法剤の投与と同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、または同時に（ａｔ  ｔｈｅ  ｓａｍｅ  ｔｉｍｅ）患者に投与される。１つの代替方法は、抗体を投与する前に化学療法剤を投与することを含む。別の代替方法は、化学療法剤を投与する前に抗体を投与することを含む。
【００７６】
本発明の方法は、少なくとも１つの他の治療方法、たとえば照射、小分子または抗体を用いた化学療法の使用を含む治療レジメンへの包含を提供しうる。本発明の方法は、ヒトを含む哺乳動物に対して本発明の抗体の同時、個別、または連続投与のために、別の標的、および／または少なくとも１つの化学療法剤（たとえば小分子）に対する十分な量の少なくとも１つのさらなる抗体の投与を直接的に含んでもよい。この組み合わせは、より一般的には、薬物単独または本発明の抗体（複数または１つ）単独での治療に十分に反応せず、組み合わせが相乗効果をもたらすがん（特に攻撃的ながん）に有用である。
【００７７】
本発明の抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、二重特異性抗体（たとえば、ＣＫ８および別の抗原に対する）、少なくとも２つの抗体の会合、多価抗体組成物、抗体薬物複合体、または少なくとも１つもしくは２つの特異性を有する抗体フラグメントであってもよい。「ヒト化抗体」、または「キメラヒト化抗体」は、非ヒト抗体、典型的にはマウス抗体由来の抗体であって、親の非ヒト抗体の抗原結合特性を保持、または実質的に保持するが、ヒトでは免疫原性が低い抗体を意味するものとする。
【００７８】
治療活性（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）、および治療レジメン
腫瘍反応は、臨床医および検査室が自由に使える通常の技術、たとえばスクリーニング技術、たとえば磁気共鳴画像（ＭＢＳ）スキャン、Ｘ線画像（ｘ−ｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ）、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャン、ＣＫ８陽性腫瘍フローサイトメトリーもしくはＣＫ８陽性腫瘍蛍光励起セルソーター（ＦＡＣＳ）分析、生物発光イメージング、たとえばルシフェラーゼイメージング、骨スキャンイメージング、および骨髄穿刺（ＢＭＡ）を含む腫瘍生検サンプリングを使用して、腫瘍形態の変化（たとえば、全体的な腫瘍負荷、腫瘍サイズ等）または腫瘍の消失について評価することができる。本開示の方法は、特に本発明によるＫ−Ｒａｓ変異を伴うＣＫ８陽性腫瘍の治療を必要とする対象に、陽性治療反応を与える併用療法を使用することを含む。別の抗原抗体および抗ＣＫ８抗体を使用する（たとえば、ＣＫ８陽性腫瘍を治療するために）、または抗ＣＫ８抗体および化学療法剤、たとえばシスプラチン（たとえば、特に本発明によるＫ−Ｒａｓ変異を伴わないＣＫ８陽性腫瘍を治療するために）を使用する、併用療法に関する陽性治療反応は、これらの薬物の抗腫瘍活性に関連する疾患の改善、および／または疾患に関連する症状の改善を意味することを意図している。すなわち、増殖抑制効果、さらなる腫瘍成長の予防、腫瘍サイズの減少、がん細胞数の減少が確認できる。したがって、たとえば、疾患の改善は完全寛解（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）として特徴づけられうる。
【００７９】
用語「退縮」は、腫瘤のサイズの減少を意味する。腫瘍の転移侵襲性の減少；腫瘍成長の速度の減少；患者の生存率の増加、および／または予後改善、たとえば腫瘍浸潤リンパ球の増加および腫瘍血管新生の減少の、観察された臨床的相関の増加；等。退縮は、「部分寛解（ｐａｒｔｉａｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）」、つまり、新しい病変がなく、少なくとも１カ月間持続する場合、測定可能なすべての腫瘍負荷（たとえば、対象に存在する腫瘍細胞の数）の少なくとも約５０％の減少とみなすことができる。
【００８０】
用語「寛解」は、腫瘍または腫瘍細胞がもはや検出可能ではないことを意味する。寛解は「完全寛解」、つまり以前の異常な放射線学的検査の正常化を伴う臨床的に検出可能な疾患がない、とみなすことができる。そのような反応は、本開示の方法による治療後少なくとも１カ月間持続しなければならない。
【００８１】
本発明の医薬組成物または組み合わせは、併用療法として、および／または放射線療法とさらに組み合わせて、哺乳動物、特にヒトのがん細胞の成長を阻害する「治療組成物」として使用することができる。有効量の医薬組成物を投与して、ＣＫ８を発現するがんの進行を阻害または逆行させる（ｒｅｖｅｒｓｅ）、またはそうでなければコントロールによる治療と比較して、寛解に統計的に有意な増加、無増悪生存（すなわち、治療中および治療後、患者が前記標的がん、すなわち、悪化しない、ＣＫ８陽性腫瘍またはＫ−Ｒａｓ変異を有するもしくは有しないＣＫ８陽性腫瘍とともに生きている時間の長さ）または全生存（「生存率」ともいい、すなわちがんと診断または治療された後、一定期間生存している、試験群または治療群の人々の割合）をもたらすことが好ましい。
【００８２】
本発明の抗体または組成物は、治療上有効量で投与される。用語「治療上有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）」、「治療上有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」、または「有効量」は、ＣＫ８陽性腫瘍および本発明によるＫ−Ｒａｓ変異を有するもしくは有しないＣＫ８陽性腫瘍の対象の治療に関して陽性治療反応をもたらす抗ＣＫ８抗体の量を意図している。
【００８３】
別の抗体（たとえば、おそらく本発明によるＫ−Ｒａｓ変異を伴うまたは変異を伴わないＣＫ８陽性腫瘍の治療において）、または化学療法剤（たとえば、おそらく本発明によるＫ−Ｒａｓ変異を伴うＣＫ８陽性腫瘍の治療において）の量と組み合わせて投与する場合、用語「治療上有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）」、「治療上有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」、または「有効量」は、ＣＫ８陽性腫瘍および本発明によるＫ−Ｒａｓ変異を有するもしくは有しないＣＫ８陽性腫瘍の対象の治療に関して陽性治療反応をもたらす抗ＣＫ８抗体の量を意図している。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本発明の抗ＣＫ８抗体および／または他の抗体または化学療法剤の治療上有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇの範囲、たとえば約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇである。いくつかの実施形態では、用量は、１、３、５、１０、１５、２０、２５、または３０ｍｇ／ｋｇであってもよい。本発明は、少なくとも２つの異なる抗体、または少なくとも１つの抗体、および少なくとも１つの化学療法剤との併用療法またはレジメンを提供する。この結果、所与の治療効果に必要な１つの薬物（抗体または化学療法剤）の治療上有効量は、単独で使用される場合より低くなる可能性があるため、所与の低用量値（たとえば、６０ｍｇ／ｋｇ以下）は十分な量でありうる。たとえば、１、３、５、１０、１５、２０、２５、または３０ｍｇ／ｋｇでありうる。
【００８５】
このような「治療上有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｓｅ）」、「治療上有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」、または「有効量」は、当業者によって日常的に決定することができる。実際に投与される化合物の量は、典型的には、治療すべき健康状態、選択された投与経路、投与される実際の化合物、年齢、体重、および個々の患者の反応、患者の症状の重症度等を含む、関連する状況の観点から、医師によって決定される。容量は投与されるペプチドの安定性に依存している可能性があることを、当該技術分野で停滞している人々は理解するだろう。
【００８６】
医薬組成物は、注射により、すなわち、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、十二指腸内または腹腔内に投与することができる。他の薬剤送達システム、たとえばリポソームを使用することもできる。
【００８７】
本発明の抗ＣＫ８モノクローナル抗体（またはそれを含む組成物）は、本発明による特異的な第２のモノクローナル抗体または化学療法剤の前および／または後に（まとめると「連続処置（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」）、および／または同時に（「併用療法」）投与することができる。組み合わせの連続処置（たとえば、前処置、後処置、または重複処置）は、薬物を交互に投与するレジメン、または一方の成分を長期投与し、他方の成分を断続的に投与するレジメンも含む。組み合わせの成分は、同じまたは別々の組成物で、同じまたは異なる投与経路で投与されてもよい。
【００８８】
任意の化合物について、細胞培養アッセイまたは動物モデル、たとえばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ、またはサルのいずれかで、治療上有効量を最初に推定することができる。動物モデルを使用して、適切な濃度範囲、および投与経路を決定することもできる。次に、そのような情報は、ヒトへの投与に有用な用量および経路を決定するために使用できる。正確な投与量は、治療を必要とする対象に関連する要因を考慮して決定される。用量および投与は、十分なレベルの活性化合物を提供するため、または所望の効果を維持するために調整される。考慮される可能性のある要因には、病状の重症度、対象の全般的な健康状態、対象の年齢、体重、および性別、投与の時間および頻度、合剤、反応感度、および治療反応性が含まれる。長時間作用型の医薬組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率に応じて、３〜４日ごと、毎週、または隔週に投与してもよい。投与頻度は、使用する製剤中の分子の薬物動態パラメーターに依存する。典型的には、組成物は、所望の効果を達成する用量に達するまで投与される。したがって、組成物は、単回投与として、または経時的に（同じまたは異なる濃度／用量で）複数回投与として、または継続投与として投与することができる。適切な用量のさらなる改良が日常的に行われている。適切な用量は、適切な用量反応データを使用して確認できる。
【００８９】
医薬組成物
医薬組成物は、本発明による本発明による少なくとも１つのモノクローナル抗体、および医薬的に許容される媒体または担体を含む。
【００９０】
本発明の医薬組成物は、たとえば、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解速度もしくは放出速度、吸着、または組成物の浸透を変更、維持（ｍａｉｎｔａｉｎ）または維持（ｐｒｅｓｅｒｖｅ）するための製剤材料を含んでもよい。
【００９１】
医薬組成物中の主要な媒体または担体は、本質的に水性または非水性のいずれかでありうる。たとえば、適切な媒体または担体は、場合により、非経口投与用の組成物に一般的な他の材料が補充されている、注射用水または生理食塩水であってもよい。中性緩衝生理食塩水、または血清アルブミンと混合した生理食塩水は、さらなる例示的な媒体である。他の例示的な医薬組成物は、約ｐＨ７．０〜８．５のトリス緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、これらはソルビトールまたはそのための好適な代替物をさらに含んでもよい。本発明の一つの実施形態では、結合剤組成物は、所望の純度を有する選択された組成物を、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意の製剤化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、上記を参照）と混合することにより、貯蔵用に調製できる。さらに、結合剤生成物は、適切な賦形剤、たとえばスクロースを使用して凍結乾燥物として製剤化されてもよい。
【００９２】
製剤成分は、投与部位に許容される濃度で存在する。たとえば、緩衝液を使用して、組成物を生理的ｐＨ、またはわずかに低いｐＨ、典型的には約５〜約８のｐＨ範囲内に維持する。非経口投与に特に好適な媒体は、結合剤が、適切に保存された無菌の等張液として処方される、滅菌蒸留水である。さらに別の製剤は、製品の制御または持続放出を提供する持続性薬剤を用いた所望の分子の製剤化を含んでもよく、その後、デポー注射（たとえば注射可能な微粒子、生体分解可能な粒子、高分子化合物（ポリ乳酸、ポリグリコール酸）、ビーズ、またはリポソーム）を介して送達されてもよい。
【００９３】
別の態様では、非経口投与に好適な医薬製剤は、水溶液、好ましくは、生理学的に適合性の緩衝液、たとえばハンクス液、リンガー液、または整理緩衝食塩水で製剤化することができる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質、たとえばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストランを含んでもよい。持続送達製剤または制御送達製剤に結合剤分子を含む製剤を含む追加の医薬組成物は、当業者には明らかであろう。
【００９４】
様々な他の持続または制御送達手段を製剤化する技術、たとえばリポソーム担体、生体分解可能な微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射も当業者に知られている。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物は、典型的には無菌でなければならない。これは、滅菌ろ過膜を介したろ過により達成されうる。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用する滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後に行われてもよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態または溶液で保存されてもよい。さらに、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、たとえば皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
【００９５】
医薬組成物が製剤化されると、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアルに保存することができる。そのような製剤は、すぐに使用できる形態で、または投与前に再構成を必要とする形態（たとえば、凍結乾燥）で保存することができる。
【００９６】
本発明において有用なモノクローナル抗体：
これらの抗体のＣＤＲは上記において上記の表で開示されている。
【００９７】
マウスモノクローナル抗体Ｄ−Ａ１０の可変領域は、本明細書では「ｍ−Ｒ０２２（Ｄ−Ａ１０）  Ｍａｂ」と呼ばれる：
【００９８】
ＶＬ  ｍＤ−Ａ１０  −  Ｍａｂ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  1：
【００９９】
【化１】
2020533278.tif 000006
【０１００】
ＶＬ  ｍＤ−Ａ１０  −  Ｍａｂ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  2  ：
【０１０１】
【化２】
2020533278.tif 000007
【０１０２】
ＶＨ  ｍＤ−Ａ１０  Ｍａｂ  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３：
【０１０３】
【化３】
2020533278.tif 000008
【０１０４】
ＶＨ  ｍＤ−Ａ１０  Ｍａｂ  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４  ：
【０１０５】
【化４】
2020533278.tif 000009
【０１０６】
ヒト化モノクローナル抗体Ｄ−Ａ１０の可変領域は、本明細書において「Ｈｚ  Ｒ０２２（Ｄ−Ａ１０  Ｍａｂ）」と呼ばれる：
【０１０７】
ＶＬ−  ＨｚＤ−Ａ１０  Ｍａｂ  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １４：
【０１０８】
【化５】
2020533278.tif 000010
【０１０９】
ＶＨ−  ＨｚＤ−Ａ１０  Ｍａｂ  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １５  ：
【０１１０】
【化６】
2020533278.tif 000011
【０１１１】
ＶＨ−  ＨｚＤ−Ａ１０  Ｍａｂ  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １６：
【０１１２】
【化７】
2020533278.tif 000012
【０１１３】
ＶＬ−  ＨｚＤ−Ａ１０  Ｍａｂ  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １７：
【０１１４】
【化８】
2020533278.tif 000013
【０１１５】
モノクローナル抗体ｍ−Ｒ０２２（Ｄ−Ｄ６）の可変領域：
【０１１６】
ＶＬ−ｍＲ０２２  （Ｄ−Ｄ６）  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３５
【化９】
2020533278.tif 000014
【０１１７】
ＶＬ−ｍＲ０２２  （Ｄ−Ｄ６）  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３６
【０１１８】
【化１０】
2020533278.tif 000015
【０１１９】
ＶＨ−ｍＲ０２２  （Ｄ−Ｄ６）  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３７
【０１２０】
【化１１】
2020533278.tif 000016
【０１２１】
ＶＨ−ｍＲ０２２  （Ｄ−Ｄ６）  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３８
【０１２２】
【化１２】
2020533278.tif 000017
【０１２３】
モノクローナル抗体ｍ−Ｒ０２２（Ｄ−Ｆ５）の可変領域：
【０１２４】
ＶＬ−ｍＲ０２２  （Ｄ−Ｆ５）  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３９
【０１２５】
【化１３】
2020533278.tif 000018
【０１２６】
ＶＬ−ｍＲ０２２  （Ｄ−Ｆ５）  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４０
【０１２７】
【化１４】
2020533278.tif 000019
【０１２８】
ＶＨ−ｍＲ０２２  （Ｄ−Ｆ５）  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４１
【０１２９】
【化１５】
2020533278.tif 000020
【０１３０】
ＶＨ−ｍＲ０２２  （Ｄ−Ｆ５）  −  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ４２
【０１３１】
【化１６】
2020533278.tif 000021
【０１３２】
本発明の種々の抗体で使用される定常ドメイン：
【０１３３】
配列番号１８は、定常ヒト重鎖のアミノ酸配列である：
【０１３４】
【化１７】
2020533278.tif 000022
【０１３５】
配列番号１９は、定常ヒト重鎖のヌクレオチド配列である：
【０１３６】
【化１８】
2020533278.tif 000023
【０１３７】
配列番号２０は、本発明の様々な抗体において使用される定常ヒト軽鎖のアミノ酸配列である：
【０１３８】
【化１９】
2020533278.tif 000024
【０１３９】
配列番号２１は、使用される定常ヒト軽鎖のヌクレオチド配列である：
【０１４０】
【化２０】
2020533278.tif 000025
【０１４１】
ここで、図面を参照して非限定的な例を使用して、本発明をより詳細に説明する。
【０１４２】
表の簡単な説明
表１は、フローサイトメトリーにより分析されたＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）細胞染色を示す。標識細胞の割合（％）および平均強度（ＭＦＩ）の平均値±標準偏差は、様々な細胞株がん、たとえば直腸結腸がん（ＣＲＣ）、頭頚部がん（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器がん（Ｕ）、前立腺がん（ＰＣ）、乳がん（Ｂ）、肺がん（Ｌ）、膵がん（ＰＲＣ）、または腎がん（Ｒ）で示される。
【０１４３】
表２は、結腸直腸ＰＤＸ異種移植モデルの免疫組織化学により分析されたＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）細胞染色を示す。
【０１４４】
表３は、膵ＰＤＸ異種移植モデルの免疫組織化学により分析されたＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）細胞染色を示す。
【０１４５】
表４は、ＭＡｂ抗ｅＣＫ８／ＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）を用いたＰＤＸ異種移植片モデル直腸結腸腫瘍Ｋ−ｒａｓ野生型の腫瘍成長のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害のレビュー−５つのＰＤＸモデルのレビューを示す。
【０１４６】
表５は、ＭＡｂ抗ｅＣＫ８／ＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）を用いたＰＤＸ異種移植片モデル直腸結腸腫瘍Ｋ−ｒａｓ変異型の腫瘍成長のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害のレビュー−６つのＰＤＸモデルのレビューを示す。
【０１４７】
概念のｉｎ  ｖｉｖｏ証明
【図面の簡単な説明】
【０１４８】
【図１】図１は、ＭＡｂ抗ｅＣＫ８／ＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）を用いたＰＤＸ異種移植片ＣＲ００２９モデル直腸結腸腫瘍Ｋ−ｒａｓ野生型の腫瘍成長のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害−代表的な実験を示す。
【図２】図２は、ＭＡｂ抗ｅＣＫ８／ＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）を用いたＰＤＸ異種移植片ＣＲ０４５５モデル直腸結腸腫瘍Ｋ−ｒａｓ変異型の腫瘍成長のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害−代表的な実験を示す。
【図３】図３は、細胞株ＢＩＣＲ１８由来のシスプラチンと組み合わせたＭＡｂ抗ｅＣＫ８／ＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）を用いた喉頭がんなどの頭頚部がんＣＤＸモデルの腫瘍成長のｉｎ  ｖｉｖｏ阻害を示す。結合した抗体薬物に関連する内在化のためのＭＡｂ能力
【図４−１】図４は、細胞株ＨＣＴ１１６由来の結腸直腸がん（Ａ）、細胞株Ｕ８７ＭＧ由来の神経膠芽腫（Ｂ）、細胞株ＢｉＣＲ５６由来の頭頚部がん（Ｃ）、細胞株ＢｘＰＣ３由来の膵がん（Ｄ）、細胞株ＤＵ１４５由来の前立腺がん（Ｅ）としての固形腫瘍のＤ−Ａ１０  ＭＡｂの内在化を示す。細線：４℃−太線：３７℃−点線：未処理。
【図４−２】図４は、細胞株ＨＣＴ１１６由来の結腸直腸がん（Ａ）、細胞株Ｕ８７ＭＧ由来の神経膠芽腫（Ｂ）、細胞株ＢｉＣＲ５６由来の頭頚部がん（Ｃ）、細胞株ＢｘＰＣ３由来の膵がん（Ｄ）、細胞株ＤＵ１４５由来の前立腺がん（Ｅ）としての固形腫瘍のＤ−Ａ１０  ＭＡｂの内在化を示す。細線：４℃−太線：３７℃−点線：未処理。
【図５−１】図５は、細胞株ＨＣＴ１１６由来の結腸直腸がん（Ａ）、細胞株Ｕ８７ＭＧ由来の神経膠芽腫（Ｂ）、細胞株ＢｉＣＲ５６由来の頭頚部がん（Ｃ）、細胞株ＢｘＰＣ３由来の膵がん（Ｄ）、細胞株ＤＵ１４５由来の前立腺がん（Ｅ）としての固形腫瘍のＤ−Ｄ６  ＭＡｂの内在化を示す。細線：４℃−太線：３７℃−点線：未処理。
【図５−２】図５は、細胞株ＨＣＴ１１６由来の結腸直腸がん（Ａ）、細胞株Ｕ８７ＭＧ由来の神経膠芽腫（Ｂ）、細胞株ＢｉＣＲ５６由来の頭頚部がん（Ｃ）、細胞株ＢｘＰＣ３由来の膵がん（Ｄ）、細胞株ＤＵ１４５由来の前立腺がん（Ｅ）としての固形腫瘍のＤ−Ｄ６  ＭＡｂの内在化を示す。細線：４℃−太線：３７℃−点線：未処理。
【図６−１】図６は、細胞株ＨＣＴ１１６由来の結腸直腸がん（Ａ）、細胞株Ｕ８７ＭＧ由来の神経膠芽腫（Ｂ）、細胞株ＢｉＣＲ５６由来の頭頚部がん（Ｃ）、細胞株ＢｘＰＣ３由来の膵がん（Ｄ）、細胞株ＤＵ１４５由来の前立腺がん（Ｅ）としての固形腫瘍のＤ−Ｆ５  ＭＡｂの内在化を示す。細線：４℃−太線：３７℃−点線：未処理。
【図６−２】図６は、細胞株ＨＣＴ１１６由来の結腸直腸がん（Ａ）、細胞株Ｕ８７ＭＧ由来の神経膠芽腫（Ｂ）、細胞株ＢｉＣＲ５６由来の頭頚部がん（Ｃ）、細胞株ＢｘＰＣ３由来の膵がん（Ｄ）、細胞株ＤＵ１４５由来の前立腺がん（Ｅ）としての固形腫瘍のＤ−Ｆ５  ＭＡｂの内在化を示す。細線：４℃−太線：３７℃−点線：未処理。
【発明を実施するための形態】
【０１４９】
実施例
以下の実施例は、例示するために提供されるものであり、請求項に係る発明を限定するものではない。
【０１５０】
実施例１：マウス抗ＣＫ抗体の調製
ＣＫ８に特異的なマウスモノクローナル抗体は、標準的なハイブリドーマ技術を使用して産生された（Ｚｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｕｓｔ  Ｊ．  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ．  １９８１；  ５９：３０３−６）。国際公開第２０１６／０２０５５３号に記載されているように、２つの異なるＣＫ関連ペプチドが合成され、マウスの免疫付与に使用された。ハイブリドーマのクローニング後、ｍＤ−Ａ１０、ｍＤ−Ｆ５およびｍＤ−Ｄ６と呼ばれる３つのマウスＭａｂが得られた。各クローンをヌードマウスの腹膜に注入した。マウス腹水からのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  クロマトグラフィー。マウスの腹水を平衡化バッファー  ０．１Ｍトリス、および１．５Ｍ硫酸アンモニウムでｐＨ８．３に調整し、次にｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，  Ｓａｉｎｔ  Ｃｙｒ  ａｕ  Ｍｏｎｔ  ｄ’ｏｒ，フランス）にロードする。非結合タンパク質は、平衡化バッファーを用いた数回の洗浄で流れ、除去される。ＭＡｂ抗ＣＫ８は、ｐＨ３．５の溶出バッファー  ０．１Ｍクエン酸ナトリウムを用いて溶出される。濃縮後、ＩｇＧを含むＰＢＳ溶液をろ過し、２８０ｎｍでＭＡｂ濃度を測定した。
【０１５１】
実施例２：ＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）ＭＡｂ産生およびＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ精製
哺乳類細胞は、ヒトへの適用に最も適合性のある形でタンパク質をグリコシル化する能力があるため、治療用糖タンパク質の産生に好適な宿主である（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １９９６；  １４：９７５−８１）。使用できる哺乳類宿主細胞は、ヒトのＨｅｒａ、２８３、およびＪｕｒｋａｔ細胞、マウスのＮＩＨ３Ｔ３およびＣ１２７細胞、アフリカミドリザルのＣｏｓ１、Ｃｏｓ７およびＣＶ１細胞、ウズラのＱＣ１−３細胞、マウスのＬ細胞、ならびにチャイニーズハムスター卵巣細胞を含む。細菌がタンパク質をグリコシル化することは非常にまれであり、他のタイプの一般的な宿主、たとえば酵母、糸状菌、昆虫、および植物細胞と同様に、血流からの急速なクリアランスに関連するグリコシル化パターンを生じる。
【０１５２】
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、遺伝的に安定な、高生産性のクローン細胞株の一貫した生成を可能にする。それらは、無血清培地を使用したシンプルなバイオリアクター内で高密度に培養でき、安全で再現性のあるバイオプロセスの開発を可能にする。他の一般的に使用される動物細胞は、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、ＮＳＯおよびＳＰ２／０マウス骨髄腫細胞を含む。トランスジェニック動物からの産生も試験されている（Ｊｅｎｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮＡＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １９９６；  １４：９７５−８１）。
【０１５３】
典型的な哺乳動物発現ベクターは、ｍＲＮＡの転写の開始を媒介するプロモーターエレメント（ＳＶ４０の初期および後期プロモーター、レトロウイルス、たとえばＲＳＶ、ＨＴＬＶ１、ＨＩＶ１由来の長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）、およびサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ、ｈＣＭＶ）の初期プロモーター））、タンパク質コード配列、ならびに転写の終結および転写産物のポリアデニル化に必要なシグナル（ＢＧＨ  ｐｏｌｙＡ、単純ヘルペスウイルスのヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子のｐｏｌｙＡ（ＴＫｐａ）、Ｌａｔｅ  ＳＶ４０  ｐｏｌｙＡ、および３’  ＵＴＲ＿Ｂｅｔａ＿Ｇｌｏｂｉｎ＿ｐｏｌｙＡ）を含む。付加的なエレメントは、エンハンサー（Ｅμ、ｈＩＥ１）、Ｋｏｚａｋ配列、シグナルペプチド、ならびにＲＮＡスプライシングのためのドナーおよびアクセプター部位に隣接する介在配列を含む。実際に本発明を実行する上での使用のための好適な発現ベクターは、たとえば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐｃＤＮＡ３．３、ｐＯｐｔｉＶＥＣ、ｐＲＳＶ、ｐＥμＭＣＭＶ、ｐＭＣＭＶＨＥ−ＵＴＲ−ＢＧ、ｐＨＣＭＶＨＥ−ＵＴＲ−ＢＧ、ｐＭＣＭＶ−ＵＴＲ−ＢＧ、ｐＨＣＭＶ−ＵＴＲ−ＢＧ、ｐＭＣＭＶＨＥ−ＳＶ４０、ｐＨＣＭＶＨＥ−ＳＶ４０、ｐＭＣＭＶ−ＳＶ４０、ｐＨＣＭＶ−ＳＶ４０、ｐＭＣＭＶＨＥ−ＴＫ、ｐＨＣＭＶＨＥ−ＴＫ、ｐＭＣＭＶ−ＴＫ、ｐＨＣＭＶ−ＴＫ、ｐＭＣＭＶＨＥ−ＢＧＨ、ｐＨＣＭＶＨＥ−ＢＧＨ、ｐＭＣＭＶ−ＢＧＨ、ｐＨＣＭＶ−ＵＴＲ−ＢＧＨ）等のベクターを含む。
【０１５４】
空のＣＨＯ  Ｅａｓｙ  Ｃ細胞（ＣＣＴ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎによって購入）を、本研究室で確立された一過性または安定なトランスフェクション手順に従って、軽鎖および重鎖に対するＭＡｂ発現ベクターで同時トランスフェクトした。Ｈ鎖及びＬ鎖の分泌は、それぞれのヒトＩｇＨリーダー配列により可能になった。Ｍａｂ抗ＣＫ８の軽鎖及び重鎖に対するコード領域を、多重クローニング部位においてＭＡｂ発現ベクター中に導入する。形質転換体を、正しい方向およびリーディングフレームに対して分析し、発現ベクターをＣＨＯ細胞株にトランスフェクトしてもよい。
【０１５５】
回収したＣＨＯ細胞培養液からのＰｒｏｔｅｉｎ  Ａクロマトグラフィー。ＣＨＯ細胞から生成され、回収された細胞培養液を、ｐＨ７．２のリン酸緩衝生理食塩水で平衡化したＨｉ  Ｔｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｓａｉｎｔ  Ｃｙｒ  ａｕ  Ｍｏｎｔ  ｄ’Ｏｒ，フランス）にロードする。非結合タンパク質は、その後、ＰＢＳバッファーで数回洗浄することにより流れ、除去される。ＭＡｂ抗ＣＫ８は、ｐＨ３．０で０．１Ｍクエン酸を溶出するステップを使用して、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａカラムから溶出される。カラム溶離液はＡ２８０によってモニターされる。抗ＣＫ８  Ｍａｂのピークをプールする。
【０１５６】
実施例３：細胞培養
このようなアッセイ手順において、様々な腫瘍由来細胞株が、ＭＡｂ抗ＣＫ８で染色されうる標的細胞の中にある。
【０１５７】
細胞株。樹立されたヒト神経膠腫細胞Ｈ４、ＨＳ６８３、Ｕ３７３またはＡ１７２（ＡＴＣＣから入手可能）；樹立されたヒト結腸直腸細胞ＨＴ２９；樹立されたヒト膵臓細胞ＰＡＮＣ１またはＭＩＡ−ＰＡ−ＣＡ２；樹立されたヒト腎腺がん細胞Ａ７０４またはＡＣＨＮおよび樹立されたヒト肺腺がん細胞Ａ５４９は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、４  ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、および１００  Ｕ／ｍＬ、１００  μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）で培養された。樹立されたヒト神経膠芽腫星状細胞腫細胞Ｕ８７ＭＧまたはＴ９８Ｇ、ヒト頭頚部がん細胞ＦａＤｕまたはＤｅｔｒｏｉｔ５６２、ヒト泌尿器がん細胞ＵＭ−ＵＣ−３、Ｊ８２、ＨＴ１１９７またはＨＴ１３７６、およびヒト前立腺がん細胞ＤＵ１４５は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、４  ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、および１００  Ｕ／ｍＬ、１００  μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）を添加したイーグル最小必須培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）で培養された。樹立されたヒト乳腺がん細胞ＭＤＡＭＢ２３１、ＭＣＦ−７またはＨＢＬ１００およびヒト直腸結腸がん細胞ＨＣＴ１１６は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、４  ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、および１００  Ｕ／ｍＬ、１００  μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）を添加したダルベッコ変法イーグル培地Ｇｌｕｔａｍａｘ低グルコース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔ  Ａｕｂｉｎ，フランス）で培養した。樹立されたヒト直腸結腸がん細胞ＨＣＴ１５またはＳＷ４８０、およびヒト頭頚部がん細胞ＴＲ１４６は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、４  ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、および１００  Ｕ／ｍＬ、１００  μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）を添加したダルベッコ変法イーグル培地Ｇｌｕｔａｍａｘ高グルコース（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔ  Ａｕｂｉｎ，フランス）で培養した。樹立したヒト頭頚部がん細胞ＢＩＣＲ１６、ＢＩＣＲ１８またはＢＩＣＲ５６は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、４  ���Ｍ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、および１００  Ｕ／ｍＬ、１００  μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）および０．４  μｇ／ｍＬヒドロコルチゾンＳｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）を添加したダルベッコ変法イーグル培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）で培養された。樹立したヒト頭頚部がん細胞ＳＣＣ９、ＳＣＣ４、またはＳＣＣ１５は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、４  ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、１００  Ｕ／ｍＬ、１００  μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）および０．４  μｇ／ｍＬヒドロコルチゾンＳｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）を添加したダルベッコ変法イーグル培地／Ｆ１２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔ  Ａｕｂｉｎ，フランス）で培養された。樹立されたヒト膀胱がん細胞５６３７、ヒト前立腺がん細胞ＬＮＣａｐ  ｃｌｏｎｅ  ＦＧＣ、樹立されたヒト肺腺がん細胞ＮＣＩＨ１７０３またはＮＣＩＨ２９２、ヒト膵がん細胞ＰＳＮ１またはＢｘＰＣ３、およびヒト腎腺がん細胞Ｃａｋｉ１は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、４  ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、および１００  Ｕ／ｍＬ、１００  μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）で培養された。樹立されたヒト神経膠腫４２ＭＧＢＡ（ＤＳＭＺから入手可能）は、２０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、４  ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、および１００  Ｕ／ｍＬ、１００  μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地およびイーグル最小必須培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）の１：１の８０％混合物で培養された。確立されたヒト神経膠腫細胞８ＭＧＢＡは、２０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、４  ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、および１００  Ｕ／ｍＬ、１００  μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）を添加したイーグル最小必須培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）で培���された。樹立されたヒト泌尿器がん細胞ＴＣＣＳＵＰおよびヒト膵がん細胞ＨｕＰＴ３は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、４  ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、１００  Ｕ／ｍＬ、１００  μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、および１％非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、を添加したイーグル最小必須培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）で培養された。ヒト膵がん細胞ＡｓＰＣ１は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、４  ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、１００  Ｕ／ｍＬ、１００  μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、１％ピルビン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、および１％非必須アミノ酸（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、を添加したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）で培養された。ヒト膵がん細胞ＣＦＰＡＣ１は、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、４  ｎＭ  Ｌ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）、および１００  Ｕ／ｍＬ、１００  μｇ／ｍＬペニシリン−ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）を添加したイスコフ改変ダルベッコ培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）で培養された。
【０１５８】
実施例４：フローサイトメトリーによる抗体結合アッセイ
本実施例は、フローサイトメトリーにより分析される細胞表面でのＣＫ８細胞発現を研究する方法を記載する。
【０１５９】
ＣＫ８細胞発現のフローサイトメトリー実験。簡単に述べると、９６ウェルあたり２．１０5個の細胞を５  μｇ／ｍＬの非結合ヒト化抗ＣＫ８  ＨＺＭＲ０２２／Ｄ−Ａ１０  ＭＡｂの希釈液とともに４℃でインキュベートし、その後１／２に希釈する。使用されたネガティブコントロールＭＡｂは、ヒトＩｇＧ１カッパＳｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）であった。非結合抗体を、１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）を添加したＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔ  Ａｕｂｉｎ，フランス）で洗い流した。その後、細胞を遠心分離し（４００  ｇで５分間）、結合抗体をフィコエリトリン（ＰＥ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）で４℃で３０分間検出する。検出試薬を洗い流し、細胞を遠心分離し（４００  ｇで５分間）、３００  μＬのＰＢＳに懸濁する。結合検出抗体を、ＦＡＣＳＣＡＮ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｒｕｎｇｉｓ，フランス）(ＦＬ２チャネル、取得あたり２０００イベント)で定量化する。実験中、非特異的な結合イベントを除外するために、それぞれのアイソタイプコントロールが含まれる。
【０１６０】
実験の結果を表１に示す（５  μｇ／ｍＬで）。様々ながん細胞株は、ＨＺＭＲ０２２／Ｄ−Ａ１０で同定されたＣＫ８エピトープを発現する。発現パターンは細胞株ごとに異なる。本研究では、ＣＫ８は細胞サブセットの中で、試験したすべての細胞株で発現した。
【０１６１】
実施例５  免疫組織化学による抗体結合アッセイ
本実施例は、免疫組織化学により細胞表面でのＣＫ８細胞発現を研究する方法を説明する。クエン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）で９５℃で３０分間インキュベートした後、抗原回復を実施した。ＭＡｂ抗ＣＫ８を室温（ＲＴ）で１時間インキュベートした。ヤギ抗ヒトとしての二次抗体を室温で１時間インキュベートし、その後、ウサギポリクローナル抗ＦＩＴＣとともに室温で３０分間インキュベートした。その後、室温でｕｌｔｒａｖｉｓｉｏｎ  ＬＰ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（一次抗体エンハンサー  １０分、ＨＲＰポリマー  １５分）を使用し、続いて室温で３分間、ＤＡＢとインキュベートすることにより、ＭＡｂ  ＩＨＣ染色が明らかにされた。
【０１６２】
１１個のＣＲＣ  ＰＤＸモデルをＣＲ０００４、ＣＲ００１２、ＣＲ００２９、ＣＲ０１２６、ＣＲ０１９６、ＣＲ０２０５、ＣＲ０４５５、ＣＲ１５３０、ＣＲ３０５６、ＣＲ３１５０、およびＣＲ６２５４として評価した。
【０１６３】
実験の結果を表２に示す。ＣＲＣ  ＰＤＸモデルはすべて、ＩＨＣによって検出されたＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）エピトープを発現した。異なるＩＨＣスコアは、強い場合は２＋、中程度の強度のＩＨＣ染色の場合は１＋として観察された。
【０１６４】
４個のＰＣ  ＰＤＸモデルをＰＡＮ−００１、ＰＡＮ−００３、ＰＡＮ−００４、およびＰＡＮ−０３５として評価した。
【０１６５】
実験の結果を表３に示す。ＰＣ  ＰＤＸモデルはすべて、ＩＨＣによって検出されたＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）エピトープを発現した。ＩＨＣスコアは、膜強度および細胞質強度に従って決定された。ＩＨＣスコア４がそれらすべてで観察され、強いＩＨＣ染色から非常に強いＩＨＣ染色が示された。
【０１６６】
実施例６：ＣＲＣのＰＤＸモデルに関するｉｎ  ｖｉｖｏ研究
各マウスの右側腹部に、腫瘍形成のために、１つの原発性ヒト腫瘍異種移植片モデル（ＣＲ００００４、ＣＲ００１２、ＣＲ００２９、ＣＲ０１２６、ＣＲ０１９６、ＣＲ０２０５、ＣＲ０４５５、ＣＲ１５３０、ＣＲ３０５６、ＣＲ３１５０、またはＣＲ６２５４）の腫瘍断片（直径２〜３ｍｍ）を皮下接種した。平均または個々の腫瘍サイズが１００~２５０  ｍｍ３に達すると、マウスはランダムに（必要に応じて段階的組み入れ（ｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｎｒｏｌｌｍｅｎｔ）が行われる）４つの群に割り当てられた。各群は１匹のマウスを含んでいた。群化および投与開始の日を０日と示した。投与量を体重に合わせて調整した（投与量＝５  μＬ／ｇ）。腫瘍接種後、罹患率と死亡率について動物を毎日確認した。日常的モニタリングの時点で、動物は、腫瘍成長、および正常な行動、たとえば運動、食物および水の消費、体重の増加／減少、目／毛のつや消し、その他の異常な効果に対する治療の効果について確認された。死亡および観察された臨床症状は、各サブセット内の動物の数に基づいて記録された。最終処置後、２週間の投薬なしの観察が適用された。媒体群の動物は、腫瘍体積（ＴＶ）が３０００ｍｍ3を超えたため、研究終了前に屠殺された。腫瘍の大きさは、ノギスで二次元で週に２回測定された。腫瘍体積は、式を使用してｍｍ３で表された：ＴＶ  ＝  ０．５  ａ×ｂ２  ここで、ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径である。体重は週に２回測定された。個々のマウスの体重減少が１５％以上の場合、体重が体重減少に回復するまで、マウスに投薬休暇（ｄｏｓｉｎｇ  ｈｏｌｉｄａｙ（ｓ））を与えた。次の条件下で、個々の動物または群全体の生存実験は、人間の安楽死により、死亡の前に、または昏睡状態に達する前に終了した。
【０１６７】
【表５】
2020533278.tif 000026
【０１６８】
ＣＲＣ患者派生物由来のＫ−Ｒａｓ野生型ｉｎ  ｖｉｖｏ概念実証（ＰＤＸモデル）
５つのＨｕＰｒｉｍｅ（登録商標）ＣＲＣ  Ｋ−ｒａｓ  ｗｔ異種移植モデル（ＣＫ８  ＩＨＣ陽性検出後にＣＲＯ細胞バンクで選択）をＣＲ０００４、ＣＲ００２９、ＣＲ０１９６、ＣＲ０２０５、またはＣＲ３０５６として選択した。
【０１６９】
ＣＲＣ  ＰＤＸ  Ｋ−Ｒａｓ  ｗｔモデル  ＣＲ０２０５を除き、Ｋ−Ｒａｓ  ｗｔ  ＣＲＣのすべては、ＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）ＭＡｂに応答しなかった。表４に示すように、４／５のＣＲＣ  ＰＤＸ  Ｋ−ｒａｓ  ｗｔモデルでは、３０  ｍｇ／ｋｇで腫瘍進行の制御は認められなかった。
【０１７０】
ＣＲＣ患者派生物由来のＫ−Ｒａｓ変異型ｉｎ  ｖｉｖｏ概念実証（ＰＤＸモデル）
６つのＨｕＰｒｉｍｅ（登録商標）ＣＲＣ  Ｋ−ｒａｓ変異型異種移植モデル（ＣＫ８  ＩＨＣ陽性検出後にＣＲＯ細胞バンクで選択）をＣＲ００１２、ＣＲ０１２６、ＣＲ０４５５、ＣＲ１５３０、ＣＲ３１５０、またはＣＲ６２５４として選択した。表５に示すように、６／６のＣＲＣ  ＰＤＸ  Ｋ−Ｒａｓ変異型モデルでは、３０  ｍｇ／ｋｇでＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）を介した腫瘍の進行が認められた。
【０１７１】
実施例７：ＨＡＮ  ＣＤＸモデルのｉｎ  ｖｉｖｏ研究
【０１７２】
ヒトＨＡＮ喉頭細胞株ＢＩＣＲ１８を注射（２００  μＬ）あたり細胞１．１０6個の濃度でＳＣＩＤマウスに皮下注射した。腫瘍が９つの群（合計４５匹のマウス）で約１００ｍｍ3の平均体積に達したとき、マウスを無作為化した。製品の毒性効果を検出するために、すべてのマウスを観察した。エンドポイントは、動物倫理により、腫瘍の直径が１８ｍｍを超える、有意な体重減少、または動物の健康の変化として定義された。腫瘍化に対する化合物の有効性を評価するために、腫瘍体積を週に２回測定した。ノギスを使用して原発腫瘍のサイズを測定し、２つの測定値から平均半径を計算することにより、式ＴＶ＝  ４／３  π×ｒ3を使用して、腫瘍体積（ＴＶ）を球に外挿した。各群の中央値および標準偏差も計算した。極値を除外するため、中央値を指すのが好適である（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｔｏ  ｍｅａｎ）。ＭＡｂ治療は、１０または１  ｍｇ／ｋｇの用量で３週間の間に週２回、腹腔内注射により投与された。シスプラチン（Ｍｙｌａｎｄ）治療は、１、２．５、または５ｍｇ／ｋｇの用量で３週間、週に１回、腹腔内注射により投与された。製品はスポンサーのガイドラインに従って調製された。つまり、ＰＢＳで希釈された。腫瘍が最大体積１６００  ｍｍ3に達したときにマウスを屠殺した。エンドポイントは、治験倫理により、腫瘍の直径が１８  ｍｍを超える、または体重の１０％を超える体重減少、または腫瘍がマウスにとって危険な場合（壊死）として定義された。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して統計分析を行った。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍは、科学的グラフ作成、包括的な曲線近似、理解可能な統計（ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄａｂｌｅ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）、およびデータ編成を兼ね備えた。ｔ検定（両側検定）は、屠殺の日に測定された腫瘍体積値（ｍｍ3）で行われた。
【０１７３】
【表６】
2020533278.tif 000027
【０１７４】
図３に示す結果は、併用治療が、シスプラチンと組み合わせたＭＡｂ抗ＣＫ８／ＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）がＨＡＮの腫瘍成長に対して相乗的細胞毒性をもたらした。ＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）単独で腫瘍成長制御を引き起こしたが、ＨｚＭＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）およびシスプラチンの組み合わせは、腫瘍のシスプラチン感受性エスケープをさらに反転させる。シスプラチン群における急速なシスプラチンエスケープを考慮すると、ＨｚＭＲ０２２／Ｄ−Ａ１０およびシスプラチンの組み合わせが長期にわたって腫瘍制御を示すことは、非常に予想外である。
【０１７５】
実施例８：フローサイトメトリーによる抗体内在化アッセイ
本実施例は、フローサイトメトリーにより分析された細胞表面でのＣＫ８検出後のＨｚＲ０２２（Ｄ−Ａ１０）の内在化を研究する方法を説明する。
【０１７６】
ＭＡｂ内在化のためのフローサイトメトリー実験。９６ウェルあたり２．１０5個の細胞を５０  μｇ／ｍＬの非結合マウス抗ＣＫ８  ＭＡｂの希釈液とともに４℃対３７℃で２４時間インキュベートし、その後１／２に希釈する。試験されたＭａｂ抗ＣＫ８は、ｉＤＤ  ｂｉｏｔｅｃｈ  ＭＡｂパネルのＤ−Ａ１０（ＩｇＧ２ｂ）、Ｄ−Ｆ５（ＩｇＧ２ａ）、またはＤ−Ｄ６（ＩｇＧ１）であった。使用したアイソタイプ適合Ｍａｂは、Ｂ−Ｚ１（ＩｇＧ１）、Ｂ−Ｚ２（ＩｇＧ２ａ）またはＢ−Ｅ４（ＩｇＧ２ｂ）（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，ブザンソン，フランス）であった。非結合抗体を、１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ  Ｑｕｅｎｔｉｎ  Ｆａｌｌａｖｉｅｒ，フランス）を添加したＰＢＳ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔ  Ａｕｂｉｎ，フランス）で洗い流した。その後、細胞を遠心分離し（４００  ｇで５分間）、結合抗体をフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）結合ヤギ（Ｆａｂ’）2ポリクローナル抗マウスＩｇ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，  Ｉｌｌｋｉｒｃｈ，フランス）で４℃で３０分間検出する。検出試薬を洗い流し、細胞を遠心分離し（４００  ｇで５分間）、３００  μＬのＰＢＳに懸濁する。結合検出抗体を、ＦＡＣＳＣＡＮ  （ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｒｕｎｇｉｓ，フランス）（ＦＬ１チャネル、取得あたり３０００イベント）で定量化する。実験中、非特異的な結合イベントを除外するために、それぞれのアイソタイプコントロールが含まれる。図４にＤ−Ａ１０  Ｍａｂ（０．７８または０．３９  μｇ／ｍＬ）、図５にＤ−Ｄ６（０．７８または０．３９  μｇ／ｍＬ）、図６にＤ−Ｆ５（０．７８または０．３９  μｇ／ｍＬ）の実験結果を示す。ＨＣＴ１１６細胞株からのＣＲＣ、Ｕ８７ＭＧ細胞株からのＧＢＭ、ＢＩＲＣ５６細胞株からのＨＡＮ、ＢｘＰＣ３からのＰＣ、またはＤＵ１４５からのＰＲＣの１つの例が示された。
【０１７７】
ＭＡｂ  Ｄ−Ｆ５が、より低い内在化能を示したとしても、最高の内在化能はＤ−Ａ１０、またはＤ−Ｄ６  ＭＡｂ抗ＣＫ８について観察された。
【０１７８】
【表７】
2020533278.tif 000028
【０１７９】
【表８】
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【０１８０】
【表９】
2020533278.tif 000030
【０１８１】
【表１０】
2020533278.tif 000031
【０１８２】
【表１１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月14日(2020.4.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下から選択される抗ＣＫ８モノクローナル抗体であって、ＣＫ８を発現し、Ｋ−Ｒａｓに以下の変異：Ｇ１３Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ６１Ｈ、Ｇ１２ＶまたはＡ１４６Ｔの少なくとも１つを有する腫瘍の治療のための抗体：
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号８の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号９の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号１０の配列を含む；重鎖、および以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体；
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号２４の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号２６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号２７の配列を含む；重鎖、および以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号２２の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号２３の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体；
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号２５の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号９の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号１２７の配列を含む；重鎖、および以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体；
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１’、ＣＤＲ−Ｈ２’およびＣＤＲ−Ｈ３’を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１’は配列番号１１の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２’は配列番号１２の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３’は配列番号１０の配列を含む；重鎖、および以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１’、ＣＤＲ−Ｌ２’およびＣＤＲ−Ｌ３’を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１’は配列番号１３の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２’は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３’は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体；
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１’、ＣＤＲ−Ｈ２’およびＣＤＲ−Ｈ３’を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１’は配列番号２８の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２’は配列番号３０の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３’は配列番号３１の配列を含む；重鎖、および以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１’、ＣＤＲ−Ｌ２’およびＣＤＲ−Ｌ３’を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１’は配列番号３３の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２’は配列番号３４の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３’は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体；
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１’、ＣＤＲ−Ｈ２’およびＣＤＲ−Ｈ３’を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１’は配列番号２９の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２’は配列番号１２の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３’は配列番号３２の配列を含む；重鎖、および以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１’、ＣＤＲ−Ｌ２’およびＣＤＲ−Ｌ３’を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１’は配列番号１３の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２’は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３’は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体。
【請求項２】
以下から選択される抗ＣＫ８モノクローナル抗体：
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号８の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号９の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号１０の配列を含む；重鎖、および
以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体；
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号２４の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号２６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号２７の配列を含む；重鎖、および以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号２２の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号２３の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体；
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号２５の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号９の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号１２７の配列を含む；重鎖、および以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体；
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１’、ＣＤＲ−Ｈ２’およびＣＤＲ−Ｈ３’を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１’は配列番号１１の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２’は配列番号１２の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３’は配列番号１０の配列を含む；重鎖、および以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１’、ＣＤＲ−Ｌ２’およびＣＤＲ−Ｌ３’を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１’は配列番号１３の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２’は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３’は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体；
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１’、ＣＤＲ−Ｈ２’およびＣＤＲ−Ｈ３’を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１’は配列番号２８の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２’は配列番号３０の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３’は配列番号３１の配列を含む；重鎖、および以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１’、ＣＤＲ−Ｌ２’およびＣＤＲ−Ｌ３’を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１’は配列番号３３の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２’は配列番号３４の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３’は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体；
−以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１’、ＣＤＲ−Ｈ２’およびＣＤＲ−Ｈ３’を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１’は配列番号２９の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２’は配列番号１２の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３’は配列番号３２の配列を含む；重鎖、および以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１’、ＣＤＲ−Ｌ２’およびＣＤＲ−Ｌ３’を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１’は配列番号１３の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２’は配列番号６の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３’は配列番号７の配列を含む；軽鎖を含む抗体；
およびＣＫ８を発現する頭頚部がんの治療における併用のための化学療法剤。
【請求項３】
前記化学療法剤はシスプラチンである、請求項２に記載の抗ＣＫ８モノクローナル抗体。
【請求項４】
前記抗体は、以下を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗ＣＫ８モノクローナル抗体。
−配列番号２のＶＬ配列および配列番号４のＶＨ配列；または
−配列番号１４のＶＬ配列および配列番号１５のＶＨ配列。
【請求項５】
前記抗体は、配列番号１８の重定常領域および配列番号２０の軽定常領域を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＣＫ８モノクローナル抗体。
【請求項６】
以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４９の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号５０の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号５１の配列を含む；重鎖、および
以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号５２の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号４７の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号５３の配列を含む；軽鎖を含む、抗ＣＫ８モノクローナル抗体。
【請求項７】
配列番号３８のＶＨ配列、および配列番号３６のＶＬ配列を有する、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
配列番号１８の重鎖定常ドメイン（Ｈｅａｖｙ  ｃｏｎｓｔａｎｔ  ｄｏｍａｉｎ）、および／または配列番号２０の軽鎖定常領域（カッパ）をさらに含む、請求項６または７に記載の抗体。
【請求項９】
ＣＫ８を発現する腫瘍の治療のための請求項６〜８のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
前記腫瘍は、直腸結腸腫瘍（ＣＲＣ）、頭頚部腫瘍（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺腫瘍（ＰＣ）、乳腺腫瘍（Ｂ）、肺腫瘍（Ｌ）、膵腫瘍（ＰＲＣ）、および腎腫瘍（Ｒ）からなる群から選択される、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む重鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｈ１は配列番号４３の配列を含む；ＣＤＲ−Ｈ２は配列番号４４の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｈ３は配列番号４５の配列を含む；重鎖、および
以下の３つのＣＤＲ、それぞれＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含む軽鎖であって、ここでＣＤＲ−Ｌ１は配列番号４６の配列を含む；ＣＤＲ−Ｌ２は配列番号４７の配列を含む；およびＣＤＲ−Ｌ３は配列番号４８の配列を含む；軽鎖を含む、抗ＣＫ８モノクローナル抗体。
【請求項１２】
配列番号４２のＶＨ配列、および配列番号４０のＶＬ配列を有する、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
配列番号１８の重鎖定常ドメイン、および／または配列番号２０の軽鎖定常領域（カッパ）をさらに含む、請求項１１または１２に記載の抗体。
【請求項１４】
ＣＫ８を発現する腫瘍の治療のための、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
前記腫瘍は、直腸結腸腫瘍（ＣＲＣ）、頭頚部腫瘍（ＨＡＮ）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、泌尿器腫瘍（Ｕ）、前立腺腫瘍（ＰＣ）、乳腺腫瘍（Ｂ）、肺腫瘍（Ｌ）、膵腫瘍（ＰＲＣ）、および腎腫瘍（Ｒ）からなる群から選択される、請求項１４に記載の抗体。
【請求項１６】
請求項６〜８、および１１〜１３のいずれか一項に記載の抗体、および薬学的に許容される媒体を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
ＣＫ−８発現固形がんの治療のための、請求項１６に記載の組成物。
【国際調査報告】
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2020533278.tif 000044
2020533278.tif 000045
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