(57)【要約】  細胞培養容器（１００）は、壁と複数のマイクロキャビティ（１２０）を有する基板とを有しており、複数のマイクロキャビティの各マイクロキャビティは、凹状のウェルと、マイクロキャビティを液体で満たすことができる開口部とを備えている。マイクロキャビティのアレイを有する基板をフランジ（１７０）が取り囲んでいる。チャネル（１７５，１７６）がフランジを取り囲み、マイクロキャビティ基板の周りに堀を提供する。フランジは傾斜している。細胞培養容器内で細胞を培養する方法もまた提供される。
2020526219.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器において、
上部、底部、側壁、及び首のある開口部；
複数のマイクロキャビティを含む、前記容器の前記底部上の基板であって、前記複数のマイクロキャビティの各マイクロキャビティがウェル開口部と凹状のウェル底部とを備えている、基板；並びに
前記基板の外周を取り囲む傾斜したフランジ
を含み、
前記フランジが、前記基板に隣接した内面と前記基板とは反対側の外面とを有している、
細胞培養容器。
【請求項２】
前記基板が前記容器の前記底部に固定されている、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項３】
前記基板が前記容器の底面と一体化している、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項４】
前記フランジの前記外面が傾斜している、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項５】
前記フランジの前記外面が傾斜している、請求項２に記載の細胞培養容器。
【請求項６】
前記フランジの前記外面が傾斜している、請求項３に記載の細胞培養容器。
【請求項７】
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、請求項１に記載の細胞培養容器。
【請求項８】
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、請求項２に記載の細胞培養容器。
【請求項９】
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、請求項３に記載の細胞培養容器。
【請求項１０】
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、請求項４に記載の細胞培養容器。
【請求項１１】
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、請求項５に記載の細胞培養容器。
【請求項１２】
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、請求項６に記載の細胞培養容器。
【請求項１３】
請求項１に記載の細胞培養容器内で細胞を培養する方法であって、
前記細胞培養容器の前記フランジのネック側に液体を堆積させること；
液体が前記フランジを越えて複数のマイクロキャビティを含む前記基板上にこぼれるまで、前記容器を液体で満たすこと；及び
前記複数のマイクロキャビティ内で細胞を培養すること
を含む、方法。
【請求項１４】
培養後、前記細胞培養容器を傾けてチャネル内に細胞液を蓄積すること；
前記容器の開口に回収ポートを挿入し、該回収ポートを使用して前記チャネルから液体を除去すること
をさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、その内容が依拠され、その全体がここに参照することによって本願に援用される、「細胞培養容器及び細胞培養方法（Cell Culture Container and Methods of Culturing Cells）」と題された２０１８年３月１３日出願の米国仮特許出願第６２／６４２，４００号；「細胞培養容器及び細胞培養方法（Cell Culture Containers and Methods of Culturing Cells）」と題された２０１７年７月１４日出願の米国仮特許出願第６２／５３２，６３９号；「細胞培養容器及び細胞培養方法（Cell Culture Container and Methods of Culturing Cells）」と題された２０１７年７月１４日出願の米国仮特許出願第６２／５３２，６４８号；及び、「細胞培養容器及び細胞培養方法（Cell Culture Containers and Methods of Culturing Cells）」と題された２０１７年７月１４日出願の米国仮特許出願第６２／５３２，６７１号の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、概して、細胞培養容器及び細胞の培養方法に関し、より詳細には、三次元細胞を収容するための細胞培養容器及び該細胞培養容器内で三次元細胞を培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞培養容器に三次元細胞を収容することが知られている。細胞培養容器内で三次元細胞を培養することもまた知られている。
【発明の概要】
【０００４】
詳細な説明に記載される幾つかの例示的な実施形態の基本的な理解をもたらすために、本開示の簡略化された概要を以下に提示する。 
【０００５】
実施形態では、本開示は、細胞を三次元構造で培養するための、基板内にマイクロキャビティがアレイで存在しうる細胞培養容器を提供する。三次元構造内で増殖する細胞のアレイをスフェロイド又はオルガノイドとして増殖させるためには、すべての細胞をマイクロキャビティ内に維持する基板を細胞培養容器に提供することが重要である。細胞は、マイクロキャビティ内で成長すると、マイクロキャビティに閉じ込められ、サイズが制限されたスフェロイドを形成する。細胞がマイクロキャビティから逃げるか、あるいは細胞が所望の三次元構造で増殖するようにさせるように構造化及び配置されていない細胞培養容器内の表面に定着すると、細胞は制限されずに増殖する。細胞培養容器内の細胞が制限されずに増殖可能な場合、それらは不均質な細胞集団を形成する。
【０００６】
一部の用途では、細胞培養容器内でスフェロイドの均質な集団を増殖及び培養することが望ましい。例えば、一貫性のない細胞形態に起因する細胞生理機能の変化を制御するために、均質な細胞集団でアッセイを行うことが望ましい。また、細胞治療がスフェロイド培養の望ましい結果である場合には、制御された予測可能な治療結果を提供するためにも、均質な細胞が望ましい。
【０００７】
スフェロイドは、互いに接触すると集塊する傾向があり、大きく不均一な細胞構造を形成する。例えば、容器の内外への培地の流れによって乱流が生じ、スフェロイドをマイクロキャビティの領域から逃がしてしまう場合など、培地交換中に細胞がマイクロキャビティから逃げることがある。結果として、不規則な細胞凝集体が形成されうる。細胞培養容器の構造は、スフェロイドをマイクロキャビティから移動させて不規則な細胞構造を形成させることなく、細胞を所望の三次元構造で増殖するように制限するマイクロキャビティチャンバのアレイを提供する上で重要である。実施形態では、本開示は、フランジとチャネルとを提供し、堀を形成することにより、過度の乱流を生じることなく、容器を培地で穏やかに満たすことができる。
【０００８】
マイクロキャビティに加えて、細胞培養容器の内部が平坦な表面を有している場合、細胞は平坦な表面に定着し、均一なスフェロイドではなく不均一な細胞構造である構造へと増殖しうる。細胞培養容器が均一なスフェロイドの培養を推進する環境をもたらすことを確実にするために、実施形態では、平坦な表面が低減した細胞培養容器が提供される。複数のマイクロキャビティを取り囲む基板の外周として、傾斜したフランジとチャネルとを有する堀構造が設けられる。また、これらのチャネル又は堀構造では、細胞培養領域内に平坦な表面が低減している。幾つかの実施形態では、方法は、細胞培養容器で細胞を培養することを含みうる。
【０００９】
上記の実施形態は例示であり、本開示の範囲から逸脱することなく、単独で、又は本明細書で提供される１つ以上の任意の実施形態との任意の組合せで、提供することができる。さらには、前述の概要及び後述する詳細な説明はいずれも、本開示の実施形態を提示しており、説明及び特許請求される本実施形態の性質及び特徴を理解するための概観又は枠組みを提供することが意図されていることが理解されるべきである。添付の図面は、実施形態のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれて、その一部を構成する。図面は本開示のさまざまな実施形態を例証しており、その説明とともに、それらの原理及び動作を説明する役割を担う。
【００１０】
本開示のこれら及び他の特徴、実施形態、及び利点は、添付の図面を参照して読む場合に、さらに理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本開示の実施形態による、第１の例示的な細胞培養容器の概略的な側面図
【図２Ａ】図１に「２」で示される領域の拡大図の一実施形態を示す図
【図２Ｂ】図１に「２」で示される領域の拡大図の別の実施形態を示す図
【図３Ａ】図２Ａに示された平坦な構造上で増殖した細胞の立体構造の写真
【図３Ｂ】図２Ｂに示された平坦な構造上で増殖した細胞の立体構造の写真
【図４】本開示の実施形態による、フランジとチャネルとを含む図１の細胞培養容器の断面図の実施形態を示す図
【図５】本開示の実施形態による、フランジとチャネルとを含む線５−５による図１の細胞培養容器の断面図の実施形態を示す図
【図６】本開示の実施形態による、複数のマイクロキャビティを有する基板を示す、図５のビュー６による細胞培養容器の一部の拡大概略図
【図７】本開示の実施形態による、図６の複数のマイクロキャビティを有する基板を示す細胞培養容器の一部の断面図
【図８】本開示の実施形態による、図６の複数のマイクロキャビティを有する細胞培養容器の一部の断面図の代替となる例示的な実施形態を示す図
【図９】本開示の実施形態による、図４に示される領域「９」の拡大図
【図１０】本開示の実施形態による、第１の例示的な細胞培養容器で細胞を培養する方法を含む、図４の細胞培養容器の実施形態を示す図
【図１１】本開示の実施形態による、分配ポートを用いてチャネルに物質を加える方法を含む、図４の細胞培養容器の実施形態を示す図
【図１２】本開示の実施形態による、回収ポートを用いてチャネルから物質を取り出す方法を含む、図４の細胞培養容器の実施形態を示す図
【図１３】本開示の実施形態による、図４の細胞培養容器のチャネルから回収ポートを用いて物質を取り出す方法のステップを示す図
【図１４】本開示の実施形態による、図４の細胞培養容器のチャネルから回収ポートを用いて物質を取り出す方法のステップを示す図
【図１５】本開示の実施形態による、分配ポートを用いてチャネルに物質を加える方法を含む、図４の細胞培養容器の実施形態を示す図
【図１６】本開示の実施形態による、フランジ、チャネル、並びに分配ポートを用いてチャネルに物質を加える方法を含む、図１５のビュー１６による細胞培養容器の一部の一実施形態の拡大概略図
【図１７】本開示の実施形態による、フランジ、チャネル、並びに回収ポートを用いてチャネルから物質を取り出す方法を含む、図１５のビュー１６による細胞培養容器の一部の一実施形態の拡大概略図
【図１８Ａ】フランジ構造及びチャネル構造を有しないＴ１７５フラスコ内で増殖したスフェロイドの写真
【図１８Ｂ】実施形態による、フランジ構造及びチャネル構造を有するフラスコ内で増殖したスフェロイドの写真
【図１９Ａ】１４日間の培養後に対照フラスコから採取した細胞の写真
【図１９Ｂ】１４日間の培養後に対照フラスコから採取した細胞の写真
【図１９Ｃ】１４日間の培養後に例えば図４の実験フラスコから採取した細胞の写真
【図１９Ｄ】１４日間の培養後に例えば図４の実験フラスコから採取した細胞の写真
【発明を実施するための形態】
【００１２】
これより、本開示の例示的な実施形態が示される添付の図面を参照して、特徴をより詳細に説明する。可能な場合はいつでも、同一又は類似した部分についての言及には、図面全体を通して同じ参照番号が用いられる。しかしながら、本開示は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。
【００１３】
細胞培養容器（例えばフラスコ）は、細胞を培養するための無菌の細胞培養チャンバを提供することができる。幾つかの実施形態では、細胞の培養は、疾患及び毒物学の研究、薬物療法及び治療の有効性、腫瘍の特性、生物、遺伝学、並びに細胞及びそれに関連する他の科学的、生物学的、及び化学的原理に関する情報を提供することができる。細胞培養容器は、例えばアレイ状に配置された複数のマイクロキャビティ（例えば、マイクロキャビティ、マイクロメートルサイズのウェル、サブミリメートルサイズのウェル）を含む基板を備えうる。基板は、フラスコ内に配置することができ、あるいはフラスコの界壁の一部を形成することができる。すなわち、基板をフラスコと一体化させることができる。例えば、マイクロキャビティのアレイは、細胞培養容器の底部の内面に形成されうる。あるいは、マイクロキャビティのアレイを有する基板を細胞培養容器に挿入し、細胞培養容器の底面に置くか、若しくは接着、レーザー溶接、超音波溶接、又は他の幾つかの方法によって細胞培養容器の底面に固定することができる。基板は、複数のマイクロキャビティを形成する起伏する（例えば正弦波）の表面を含む、上面及び／又は底面を備えうる。幾つかの実施形態では、三次元細胞培養（例えば、細胞凝集体、スフェロイド）の増殖を促進する物質（例えば、培地、固体、液体、気体）でフラスコを満たすことができる。例えば、液体に懸濁された細胞を含む培地を容器の細胞培養チャンバに加えることができる。懸濁細胞は、複数のマイクロキャビティ内に集合することができ、細胞の群又はクラスターへと形成（例えば増殖）することができる。これらの群又はクラスターはスフェロイド又はオルガノイドである。
【００１４】
例えば、幾つかの実施形態では、単一のスフェロイドは、少なくとも重力に基づいて複数のマイクロキャビティの各マイクロキャビティ内に形成されてよく、液体に懸濁した１つ以上の細胞を、液体を通じて落下させ、各マイクロキャビティ内に堆積させることができる。マイクロキャビティの形状（例えば、ウェルを画成する凹面）、及び細胞が表面に付着するのを防ぐマイクロキャビティの表面コーティングもまた、各マイクロキャビティでの３次元細胞培養の増殖を促進することができる。すなわち、細胞はスフェロイドを形成し、マイクロキャビティの寸法によって制限されて特定のサイズへと増殖する。培養中、スフェロイドは培地（例えば、食物、栄養素）を消費し、副産物として代謝産物（例えば、老廃物）を生成しうる。よって、幾つかの実施形態では、培養中に食物培地を細胞培養チャンバに加えることができ、培養中に細胞培養チャンバから廃培地を除去することができる。培地の添加及び除去の際に、マイクロキャビティからのスフェロイドの移動を回避し、スフェロイドの望ましい細胞培養を促進する試みが行われうる。
【００１５】
二次元細胞培養と比較して、幾つかの実施形態では、三次元細胞培養は、実験室でシミュレートされた条件と比較して、より生理学的に正確で、現実の用途で細胞が存在及び増殖できる環境をより現実的に表す多細胞構造を生成することができる。例えば、三次元細胞培養は、「インビボ」での（すなわち、実際の生活環境での）細胞増殖をシミュレートする現実的な環境をより密接に提供することがわかっており；一方、二次元の細胞培養は、実験室の外で発生する実際の環境をあまり表していない「インビトロ」での（すなわち、実験室環境のガラス内での）細胞増殖をシミュレートする環境をもたらすことがわかっている。三次元細胞培養の特性及び挙動を相互作用させて観察することにより、例えば疾患及び毒物学の研究、薬物療法及び治療の有効性、腫瘍の特性、生物、遺伝学、並びに、細胞及びそれに関する他の科学的、生物学的、及び化学的原理などに関連する細胞の理解の進歩を達成することができる。
【００１６】
例示的な細胞培養容器１００の実施形態及び該例示的な細胞培養容器１００内で細胞を培養する方法が、図１〜１５を参照して説明される。例えば、図１は、上部１０１、底部１０８、及び端部壁１０７、ネック１１２、並びにキャップ１０４で覆われた図１に示される開口部又は開口１０５を有する細胞培養容器１００の側面図を概略的に示している。上部１０１、底部１０８、端部壁１０７、及びネックの各々は、内部表面を有している。すなわち、上部１０１は内部表面２０１を有し、底部は内部表面２０８を有し、ネック１１２は内部表面２１２を有し、端部壁１０７は内部表面２０７を有している。細胞培養チャンバ１０３は、容器の内部表面の内側に含まれる容器の領域である。実施形態では、底部１０８の内部表面２０８はマイクロキャビティのアレイ１１５を有している。
【００１７】
図２Ａ及び図２Ｂは、図１の円「２」で示される領域の概略図である。図２Ａ及び２Ｂは、不均質な細胞培養を結果的にもたらす、対照容器を示している。例えば、細胞培養チャンバ１０３内に、平坦な表面２０２が存在する、細胞が定着しうる領域が存在する場合、細胞２５０はマイクロキャビティ１２０内に定着する代わりに平坦な表面に集塊可能になり、細胞は不規則な細胞集塊８０１を形成しうる。例えば、マイクロキャビティのアレイの周囲にフレームがあり、マイクロキャビティのアレイを含む基板が平坦な棚である細胞培養チャンバ１０３の壁に付着する場合、細胞は、培地を通して落下し、表面に定着する際に、マイクロキャビティ１２０内に定着する代わりに平坦な表面に定着する可能性がある。これらの収容されていない不規則な細胞集塊８０１の例が図２Ａ及び図２Ｂに概略的に示されている。これらの細胞はまた、隣接するマイクロキャビティにも侵入し、マイクロキャビティ１２０に収容されるスフェロイド２５０の培養を混乱させる可能性がある。対照的に、マイクロキャビティ１２０内に収容される細胞は、規則的で均質なスフェロイド２５０を形成する（例えば図１８Ｂを参照）。
【００１８】
図３Ａ及び３Ｂは、以下に論じられる実施例１によれば、これらの平坦な部分が存在していた細胞培養容器の平坦な部分に形成された不規則な細胞の集塊の写真である。
【００１９】
図１に戻ると、幾つかの実施形態では、容器１００は、開口１０５を覆い、該開口１０５をシール及び遮断の少なくとも一方になるように配向され、それによって開口１０５を通る容器１００の外側から細胞培養チャンバ１０３への経路を妨害する、キャップ１０４を含むことができる。明確にするために、キャップ１０４は取り外されており、したがって、他の図面には示されていないが、幾つかの実施形態では、本開示の範囲から逸脱することなく、キャップ１０４を提供し、容器１００の開口部１０５に選択的に追加又は取り外しできることを理解されたい。幾つかの実施形態では、キャップ１０４は、容器１００の細胞培養チャンバ１０３の内外へのガスの移動を可能にするフィルタを含むことができる。例えば、幾つかの実施形態では、キャップ１０４は、細胞培養チャンバ１０３内のガスの圧力を調節し、それによって容器１００の外側の環境（例えば、大気）の圧力に対する細胞培養チャンバ１０３の加圧（例えば、過加圧）を防止するように配向されたガス透過性フィルタを含みうる。
【００２０】
図４及び図４の線５−５に沿った代替的な断面図を示す図５に示されるように、幾つかの実施形態では、細胞培養容器１００は、マイクロキャビティのアレイ１１５の少なくとも一部を取り囲むフランジ１７０を含みうる。図４及び図５では、マイクロキャビティのアレイ１１５（「基板」とも称される）は、個々のマイクロキャビティ１２０で構成される（図６〜８参照）。したがって、特に明記しない限り、実施形態では、基板１１５は、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ（図６〜８参照）の１つ以上の特徴を含みうるものと理解されたい。加えて、実施形態では、細胞培養容器１００は、フランジ１７０の少なくとも一部を取り囲むチャネル１７５を含みうる。チャネル１７５は開口部１７６を有している。図５に示されるように、幾つかの実施形態では、フランジ１７０は、マイクロキャビティのアレイ１１５のすべてのマイクロキャビティを取り囲むことができる。しかしながら、幾つかの実施形態では、フランジ１７０は、複数のマイクロキャビティ１２０のすべてより少ない（例えば少なくとも一部の）マイクロキャビティを取り囲みうる。同様に、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６は、フランジ１７０全体を取り囲むことができる；しかしながら、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６は、フランジ１７０の全体より少ない（例えば、少なくとも一部の）フランジ１７０を取り囲みうる。すなわち、チャネル１７５は、実施形態では、幾つかの領域で閉じられうる。幾つかの実施形態では、フランジ１７０及び／又はチャネル１７５は、細胞培養容器１００の一体的な構成要素として形成（例えば製造）することができる。あるいは、幾つかの実施形態では、フランジ１７０及び／又はチャネル１７５は、例えば、既存の細胞培養容器を改造することによって、本開示の実施形態によるフランジ１７０及びチャネル１７５の１つ以上の特徴を既存の細胞培養容器に提供するために、細胞培養容器１００に取り付けることができる、別個の構成要素として提供することができる。実施形態では、マイクロキャビティのアレイ１１５は、容器の底部１０８の内部表面２０８と一体化している。図４に示されるように、マイクロキャビティのアレイは、インサート、フラスコに導入された又はフラスコに固定された別個の材料によって提供することができる。例えば、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する基板を細胞培養容器１００に挿入し、細胞培養容器の底面に置くか、あるいは接着、レーザー溶接、超音波溶接、又は他の幾つかの方法によって細胞培養容器の底面に固定することができる。
【００２１】
図５は、実施形態における容器の上面図である。図５は、実施形態では、フランジ１７０がマイクロキャビティアレイ１１５を取り囲み、チャネル１７５がフランジ１７０を取り囲むことを示している。
【００２２】
図６〜８は、本開示の実施形態による複数のマイクロキャビティ１２０を有する基板を示す、図５のビュー６による細胞培養容器の一部の拡大概略図、図６の線７に沿った上面斜視図及び断面斜視図（図７及び図８）を示している。図６〜８に示されるように、幾つかの実施形態では、複数のマイクロキャビティ１２０の各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃを画成する凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃを含みうる（図７及び図８参照）。さらには、各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、液体及び細胞がマイクロウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに入ることを可能にする開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃを（例えば、基板１１５の第１の側１２５に）含むことができる。図７に示されるように、幾つかの実施形態では、基板１１５の第１の側１２５は、非線形（例えば、波状、正弦波）のプロファイルを含むことができ、基板１１５の第２の側１２６は、平面（例えば、平坦な）プロファイルを含むことができる。同様に、図８に示されるように、幾つかの実施形態では、基板１１５の第１の側１２５及び第２の側１２６はいずれも、非平面（例えば、波状、正弦波）のプロファイルを含みうる。
【００２３】
基板１１５の第１の側１２５が非線形（例えば、波状、正弦波）プロファイルを含み、基板１１５の第２の側１２６が平面（例えば、平坦）プロファイルを含む図７に示される基板１１５を、基板１１５の第１の側１２５及び第２の側１２６のいずれも非平面（例えば、波状、正弦波）のプロファイルを含む図８に示される基板１１５と比較すると、幾つかの実施形態では、基板１１５の第１の側１２５及び第２の側１２６のいずれも非平面（例えば、波状、正弦波）のプロファイルを含む基板１１５の厚さを低減することができることがわかる。したがって、幾つかの実施形態では、基板１１５の第１の側１２５及び第２の側１２６の両方に非平面（例えば、波状、正弦波）のプロファイル（図８）を提供することにより、基板１１５の製造に用いられる材料の量を減らすことができ、例えば、基板１１５の第１の側１２５は非線形（例えば、波状、正弦波）プロファイルを含み、基板１１５の第２の側１２６は平面（例えば、平坦）プロファイルを含む（図７）マイクロキャビティアレイ１１５を有する基板よりも壁が薄いマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃを含むマイクロキャビティアレイ１１５を有する基板を提供することができる。幾つかの実施形態では、壁がより薄いマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、細胞培養中にウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに出入りするガスをより多く提供するように、基板のより高速でのガス移動（例えば、透過性）を可能にすることができる。したがって、幾つかの実施形態では、基板１１５の第１の側１２５及び第２の側１２６の両方に非平面（例えば、波状、正弦波）プロファイル（図８）を提供することにより、より健康な細胞培養環境をもたらすことができ、それによって、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内での細胞の培養を改善することができる。
【００２４】
幾つかの実施形態では、基板１１５は、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレン共重合体、フッ素重合体、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレンブタジエン共重合体、完全水素化スチレン重合体、ポリカーボネートＰＤＭＳ共重合体、並びにポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン共重合体、及び環状オレフィン共重合体などのポリオレフィンを含むがこれらに限定されない、ポリマー材料を含みうる。加えて、幾つかの実施形態では、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃによって画成されるウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの少なくとも一部を超低結合材料でコーティングすることができ、それによってウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの少なくとも一部を細胞に対して非付着性にすることができる。例えば、幾つかの実施形態では、過フッ素化ポリマー、オレフィン、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシドなどのポリエーテル、ポリビニルアルコールなどのポリオール、又はそれらの混合物のうちの１つ以上を、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃによって画成されるウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの少なくとも一部に適用することができる。
【００２５】
さらには、幾つかの実施形態では、複数のマイクロキャビティ１２０の各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、本開示の範囲から逸脱することなく、さまざまな特徴及びそれらの特徴の変形を含むことができる。例えば、幾つかの実施形態では、複数のマイクロキャビティ１２０は、線形アレイ（図示）、対角アレイ、長方形アレイ、円形アレイ、放射状アレイ、六角形最密配置などを含むアレイ状に配置することができる。加えて、幾つかの実施形態では、開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、さまざまな形状を含みうる。幾つかの実施形態では、開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、円、楕円、長方形、四辺形、六角形、及び他の多角形形状のうちの１つ以上を含みうる。加えて、幾つかの実施形態では、開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、約１００マイクロメートル（μｍ）〜約５０００μｍの寸法（例えば、直径、幅、正方形又は長方形の対角線など）を含むことができる。例えば、幾つかの実施形態では、開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、９５０μｍ、１０００μｍ、１５００μｍ、２０００μｍ、２５００μｍ、３０００μｍ、３５００μｍ、４０００μｍ、４５００μｍ、５０００μｍの寸法、及び約１００μｍ〜約５０００μｍの範囲内に包含される寸法のうち任意の寸法又は範囲を含みうる。
【００２６】
幾つかの実施形態では、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃによって画成されるウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃは、さまざまな形状を含みうる。幾つかの実施形態では、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃによって画成されるウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃは、円形、楕円形、放物線、双曲線、山形、傾斜、又は他の断面輪郭形状の１つ以上を含みうる。加えて、幾つかの実施形態では、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの深さ（例えば、開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃによって画成される平面から凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃまでの深さ）は、約１００マイクロメートル（μｍ）〜約５０００μｍの寸法を含みうる。例えば、幾つかの実施形態では、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの深さは、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、９５０μｍ、１０００μｍ、１５００μｍ、２０００μｍ、２５００μｍ、３０００μｍ、３５００μｍ、４０００μｍ、４５００μｍ、５０００μｍの寸法、約１００μｍ〜約５０００μｍの範囲内に包含される寸法のうちの任意の寸法又は範囲を含みうる。
【００２７】
幾つかの実施形態では、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で培養することができる三次元細胞１５０（例えば、スフェロイド、オルガノイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ）は、約５０μｍ〜約５０００μｍの寸法（例えば直径）、及び約５０μｍ〜約５０００μｍの範囲内に包含される寸法のうちの任意の寸法又は範囲を含みうる。幾つかの実施形態では、開示された明示的寸法よりも大きい又は小さい寸法を提供することができ、したがって、特に明記しない限り、開示された明示的寸法よりも大きい又は小さい寸法は本開示の範囲内であるとみなされる。例えば、幾つかの実施形態では、開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃの１つ以上の寸法、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの深さ、及び三次元細胞１５０（例えば、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ）の寸法は、本開示の範囲から逸脱することなく、開示された明示的寸法よりも大きい又は小さい場合がある。
【００２８】
フランジ１７０及びチャネル１７５の例示的な部分を含む、図４の領域「９」における細胞培養容器１００の拡大図が図９に示されている。例えば、幾つかの実施形態では、フランジ１７０は、複数のマイクロキャビティ１２０の各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃの凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃ（図６〜８参照）から離れる方向にチャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３まで、基板１１５から延在する内面１７１を含みうる。図５に戻ると、幾つかの実施形態では、内面１７１は複数のマイクロキャビティ１２０のすべてのマイクロキャビティを取り囲むことができる；しかしながら、幾つかの実施形態では、内面１７１は、複数のマイクロキャビティ１２０のすべてより少ない（例えば、少なくとも一部の）マイクロキャビティを取り囲みうる。同様に、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６は、内面１７１全体を取り囲むことができる；しかしながら、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６は、全体より少ない（例えば、少なくとも一部の）内面１７１を取り囲みうる。
【００２９】
図９に示されるように、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３は、複数のマイクロキャビティ１２０の各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃの凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃ（図６〜８参照）から離れる方向に、基板１１５の一部分１２３から距離「ｄ８」だけ離間されうる。幾つかの実施形態では、距離「ｄ８」は、約２ミリメートル（ｍｍ）〜約８ｍｍ、例えば、約４ｍｍ〜約８ｍｍの範囲内でありうるが、他の実施形態では、他の値（例えば、２ｍｍ未満又は８ｍｍ超）が、本開示の範囲から逸脱することなく、提供されうる。加えて、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３は、基板１１５の一部分１２３に向かう方向に、壁１０１の内面１０２から距離「ｄ９」だけ離間されうる。したがって、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６は、端部壁１０７の内面２０７と周囲１７３との間に画成されうる。幾つかの実施形態では、チャネル１７５は、複数のマイクロキャビティ１２０の各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃの凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃ（図６〜８参照）に向かう方向にチャネル１７５のベース１７４までチャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３から延在する外面１７２を含みうる。図５に示されるように、幾つかの実施形態では、外面１７２は、複数のマイクロキャビティ１２０のすべてのマイクロキャビティを取り囲むことができる；しかしながら、幾つかの実施形態では、外面１７２は、複数のマイクロキャビティ１２０のすべてよりも少ない（例えば、少なくとも一部の）マイクロキャビティを取り囲んでもよい。同様に、幾つかの実施形態では、チャネル１７５のベース１７４は、外面１７２全体を取り囲むことができる；しかしながら、幾つかの実施形態では、チャネル１７５のベース１７４は、全体より少ない（例えば、少なくとも一部の）外面１７２を取り囲んでもよい。
【００３０】
これより、フランジ１７０とチャネル１７５とを備えた細胞培養容器１００内で細胞を培養する方法を、図１０〜１７を参照して説明する。例えば、図１０に示されるように、幾つかの実施形態では、本方法は、所定量の液体１８０の液体がチャネル１７５に接触することなく、細胞培養チャンバ１０３の領域１４２に所定量の液体１８０を収容することを含みうる。幾つかの実施形態では、領域１４２は、少なくとも一部にはフランジ１７０及び基板１１５に基づいて画成されうる。例えば、幾つかの実施形態では、領域１４２は、少なくとも一部にはフランジ１７０の内面１７１及び基板１１５の一部分１２３に基づいて画成されうる。幾つかの実施形態では、本方法のこの段階で、所定量の液体１８０の液体がチャネル１７５に接触するのを防ぐことにより、例えば、細胞１５０の改善された培養を促進する幾つかの利点を提供することができる。例えば、幾つかの実施形態では、所定量の液体１８０の少なくとも一部は、液体に懸濁された固体粒子（例えば、細胞）を含む液体を含む培養溶液又は培地を含みうる。したがって、幾つかの実施形態では、本方法は、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃに所定量の液体１８０の液体１４０（図１０参照）を堆積させること、及び少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内に液体１４０を堆積させた後に、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０（例えば、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ）を培養することを含みうる。専ら説明を目的として、特に明記しない限り、幾つかの実施形態では、基板１１５の１つ以上の特徴（図６〜８参照）は、本開示の範囲から逸脱することなく、単独で又は第１の例示的な細胞培養容器１００の１つ以上の特徴と組み合わせて提供することができるという理解の下で、複数のマイクロキャビティ１２０を含むマイクロキャビティのアレイ１１５の構造は、図１０〜１７では省略されている。
【００３１】
図９に戻ると、幾つかの実施形態では、フランジ１７０の内面１７１は、垂直方向を含むことができる（例えば、実質的に重力方向に延在する）；しかしながら、幾つかの実施形態では、内面１７１を重力方向に対して傾斜させて、例えば、細胞をマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃの開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃに向けることができる（図６〜８を参照）。さらには、幾つかの実施形態では、マイクロキャビティ１２０ａの開口部１２３ａは、例えば、フランジ１７０の内面１７１に当接するように配置することができる。例えば、幾つかの実施形態では、チャネル１７５のベース１７４を含むがこれに限定されない容器１００の表面に定着又は付着することなく、液体に懸濁した細胞が（例えば少なくとも重力に基づいて）落下し及び／又は内面１７１によってマイクロキャビティ１２０ａのリザーバ１２２ａへと導かれるように、マイクロキャビティ１２０ａの開口部１２３ａは、フランジ１７０の内面１７１と同一平面にすることができる。
【００３２】
幾つかの実施形態では、チャネル１７５のベース１７４を含むがこれに限定されない容器１００の表面に定着又は付着する細胞は、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃの外側に蓄積及び成長（例えば増殖）する場合があり、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内の三次元細胞の所望の成長に関する問題を引き起こしうる。例えば、幾つかの実施形態では、リザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに（少なくとも重力に基づいて）落下せず、チャネル１７５のベース１７４を含むがこれに限定されない容器１００の他の表面に蓄積又は付着する細胞は、リザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの外側で成長し、リザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内での三次元細胞の所望の成長を妨害（例えば、阻止、変更、減速、又は防止）しうる。同様に、幾つかの実施形態では、チャネル１７５のベース１７４を含むがこれに限定されない容器１００の他の表面に蓄積又は付着する細胞は、成長し、リザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内の三次元細胞を移動させる可能性があり、それによってリザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内の三次元細胞の所望の成長を攪乱又は破壊し、細胞の所望のサイズ均一性を変えてしまう場合がある。したがって、幾つかの実施形態では、所定量の液体１８０の液体がチャネル１７５に接触することなく、細胞培養チャンバ１０３の領域１４２に所定量の液体１８０を含めることにより、液体内に浮遊しているすべての細胞をリザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに向けることができ、それによって、チャネル１７５のベース１７４を含むがこれに限定されないリザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの外側の容器１００の表面に細胞が付着した場合に起こりうる問題を軽減及び排除することができる。
【００３３】
したがって、幾つかの実施形態では、本方法は、フランジ１７０によって取り囲まれたマイクロキャビティのアレイ１１５に所定量の液体１８０の液体１４０（図１０参照）を堆積させることを含みうる。このように、マイクロキャビティのアレイ１１５上に液体１４０を堆積させた後に、マイクロキャビティアレイ１１５内の複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ、及び少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０（例えば、図７及び図８に示されるスフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ）を培養すること。さらには、幾つかの実施形態では、培養中に、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃは、培地（例えば、食物、栄養素）を消費し、副産物として代謝産物（例えば、老廃物）を生成しうる。したがって、幾つかの実施形態では、培養中に食物培地を細胞培養チャンバ１０３に添加することができ、培養中に細胞培養チャンバ１０３から廃培地を除去することができる。以下にさらに詳細に説明するように、幾つかの実施形態では、培地を添加及び除去する際に、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃからのスフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃの移動を回避し、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃの所望の細胞培養を促進する試みを行うことができる。 
【００３４】
さらには、幾つかの実施形態では、基板１１５の単位面積（例えば、１つ以上の細胞を培養できる、それぞれの表面を提供する単位面積）に関して、三次元細胞培養は、例えば同等の二次元細胞培養よりも多くの培地（例えば、食物、栄養素）を消費し、副産物としてより多くの培地（例えば、老廃物）を生成する。したがって、幾つかの実施形態では、例えば、同等の二次元細胞培養と比較して、本開示の実施形態による三次元細胞培養は、同等の期間にわたり、より頻繁な培地交換（例えば、食物、栄養素の添加及び／又は老廃物の除去）を含みうる。加えて又は代替的に、幾つかの実施形態では、例えば、同等の二次元細胞培養と比較して、本開示の実施形態による三次元細胞培養は、同等の期間にわたり、より大きい培地体積（例えば、より多くの食物、栄養素の消費、及び／又はより多くの老廃物の生成）を含みうる。したがって、幾つかの実施形態では、以下にさらに詳細に説明するように、細胞培養容器１００及び該細胞培養容器１００内で細胞を培養する方法１５０の１つ以上の特徴は、培地交換の頻度並びに培地の体積（容器１００の細胞培養チャンバ１０３内に含まれるもの、細胞培養チャンバ１０３に添加されるもの、及び細胞培養チャンバ１０３から除去されるもののうちの１つ以上でありうる）に関して利点を提供することができ、それによって、三次元細胞を培養するための望ましい効果的な環境をもたらすことができる。
【００３５】
例えば、図１１に示されるように、幾つかの実施形態では、本方法は、分配ポート１８１を開口１０５に挿入することにより、容器１００の外側から細胞培養チャンバ１０３に物質（例えば、食物、栄養素）を加えること、及び物質１８２を分配ポートからチャネル１７５の開口部１７６に分配することを含みうる。加えて、幾つかの実施形態では、本方法は、分配ポート１８１を開口１０５に挿入することにより、容器１００の外側から細胞培養チャンバ１０３に物質（例えば、食物、栄養素）を加えること、及び、所定量の液体１８０の液体がチャネル１７５に接触することなく、細胞培養チャンバ１０３の領域１４２に所定量の液体１８０を収容した後、物質１８２を分配ポートからチャネル１７５の開口部１７６に分配することを含みうる。したがって、幾つかの実施形態では、本方法は、分配ポート１８１からチャネル１７５の開口部１７６内へと物質１８２を分配しつつ、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０内で細胞１５０を培養することを含みうる。
【００３６】
図１２は、例えば、所定量の液体１８０に含まれる細胞１５０に、培養している間に細胞１５０が消費しうる食物培地を提供するために、細胞培養チャンバ１０３に加えられる物質１８２を概略的に示している。同様に、図１２に示されるように、幾つかの実施形態では、本方法は、回収ポート１８３を開口１０５に挿入することによって、細胞培養チャンバ１０３から容器１００の外側に物質（例えば、老廃物）を除去すること、及び回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収することを含みうる。加えて、幾つかの実施形態では、本方法は、回収ポート１８３を開口１０５に挿入することにより、細胞培養チャンバ１０３から物質（例えば、老廃物）を除去すること、及び物質（例えば、食物、栄養素）を細胞培養チャンバ１０３に加えた後に、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収することを含みうる。したがって、幾つかの実施形態では、本方法は、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収しつつ、複数のマイクロキャビティ１２０のうちの少なくとも１つのマイクロキャビティ（図７及び図８参照）内で細胞１５０を培養することを含みうる。
【００３７】
図１３は、例えば、所定量の液体１８０及び物質１８２から、培養している間に細胞１５０が生成しうる廃培地を除去するために、細胞培養チャンバ１０３から除去される物質１８４を概略的に示している。例えば、幾つかの実施形態では、培養中に、細胞１５０は、細胞培養チャンバ１０３に加えられた食物培地（例えば、物質１８２）のすべて又は一部を消費することができ、細胞培養チャンバ１０３から除去される廃培地（例えば、物質１８４）のすべて又は一部を生成（例えば、副産物として代謝）しうる。幾つかの実施形態では、細胞１５０を培養している間に、食物培地１８２を細胞培養チャンバ１０３に加え（図１１及び図１２参照）、細胞培養チャンバ１０３から廃培地１８４を除去する（図１２及び図１３参照）方法により、細胞１５０を培養できる健康的な環境をもたらすことができる。例えば、幾つかの実施形態では、食物培地１８２を細胞培養チャンバ１０３に加え（図１１及び図１２参照）、細胞培養チャンバ１０３から廃培地１８４を除去する（図１２及び図１３参照）本開示の実施形態による方法は、食物培地が添加されていない又は廃培地が除去されていない細胞培養環境と比較して、少なくとも一部には、細胞培養プロセスの品質、期間、及び有効性の１つ以上を増加させることができる。同様に、幾つかの実施形態では、容器１００の１つ以上の特徴並びに食物培地１８２を細胞培養チャンバ１０３に加え（図１１及び図１２参照）、細胞培養チャンバ１０３から廃培地１８４を除去する（図１２及び図１３参照）本開示の実施形態による方法は、例えば、本開示の１つ以上の特徴を含まない細胞培養容器、並びに本開示の１つ以上のステップを含まない方法と比較して、少なくとも一部には、培地の体積（細胞培養プロセス中に容器１００の細胞培養チャンバ１０３内に含まれるもの、細胞培養チャンバ１０３に加えられるもの、及び細胞培養チャンバ１０３から除去されるもののうちの１つ以上でありうる）に関してより頻繁に、より効果的に行うことができる。
【００３８】
加えて、幾つかの実施形態では、本方法は、容器１００を移動させること、及び回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収することを含みうる。例えば、幾つかの実施形態では、容器１００を移動させることは、容器１００を、第１の配向（例えば、図１３に提供される配向）から第２の配向（例えば、図１４に提供される配向）へと平行移動させること及び回転させることの少なくとも一方を含みうる。幾つかの実施形態では、第１の配向（例えば、図１３に提供される配向）は、重力方向「ｇ」に対してほぼ垂直に延びる軸１１０を容器１００に提供することができるが、第１の配向を画成する他の実施形態では、重力方向「ｇ」に対して他の配向の軸１１０を提供することができる。同様に、幾つかの実施形態では、第２の配向（例えば、図１４に提供される配向）は、重力方向「ｇ」に対して実質的に非垂直な角度で延びる軸１１０を容器１００に提供することができるが、第２の配向を画成する他の実施形態では、重力方向「ｇ」に対して他の配向の軸１１０を提供することができる。
【００３９】
幾つかの実施形態では、第１の配向は、第２の配向によって提供される重力方向「ｇ」に対する軸１１０の第２の角度とは異なる、重力方向「ｇ」に対する第１の角度で軸１１０を提供することができる。加えて、幾つかの実施形態では、細胞培養チャンバ１０３の領域１４２に所定量の液体１８０を含む（図１０参照）、物質１８２を細胞培養チャンバ１０３に追加する（図１１参照）、及び細胞培養チャンバ１０３から物質１８４を除去する（図１２及び図１３参照）のうちの１つ以上の間に、容器１００の軸１１０は、重力方向「ｇ」にほぼ垂直に延在しうる。例えば、幾つかの実施形態では、容器１００は、例えば、重力方向「ｇ」に垂直な主面を画成する水平面（図示せず）上に配置することができ、容器１００の軸１１０は、重力方向「ｇ」に対して水平面（図示せず）の主面にほぼ平行に延在している。加えて又は代替的に、幾つかの実施形態では、容器１００は、重力方向「ｇ」に対してほぼ垂直に延在する軸１１０を有する１つ以上の構造（例えば、フレーム、マウント、人間の手など）によって支持（例えば、保持、懸架）することができる。同様に、幾つかの実施形態では、例えば、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収する前及び／又はその最中に容器１００（図１４参照）を移動した結果として、容器１００は、重力方向「ｇ」に対して実質的に非垂直な角度で延在する軸１１０を有する１つ以上の構造（例えば、フレーム、マウント、人間の手など）によって支持（例えば、保持、懸架）することができる。
【００４０】
したがって、図１４に概略的に示されるように、幾つかの実施形態では、本方法は、容器１００を動かすこと、並びに所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部が領域１４２からフランジ１７０を越えて（例えば、チャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３を越えて）流れ、チャネル１７５内に堆積するようにすることを含みうる。例えば、幾つかの実施形態では、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収する間（図１３参照）、少なくとも一部には、領域１４２内の所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部がチャネル１７５に流入するのを防ぐ容器１００の配向及びフランジ１７０の存在に基づいて、所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部を細胞培養チャンバ１０３の領域１４２内に維持することができる。したがって、幾つかの実施形態では、容器１００を動かして、所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部が領域１４２からフランジ１７０を越えて流れ、チャネル１７５内に堆積するようにすることにより、老廃物１８４の除去を制御することができ、幾つかの実施形態では、例えば、容器１００を動かさない方法と比較して増加させることができる。幾つかの実施形態では、容器１００の第２の配向によって画成される重力方向「ｇ」に対する軸１１０の角度（図１４参照）は、例えば、所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部が領域１４２からフランジ１７０を越えて流れ、複数のマイクロキャビティ１２０内で培養されている細胞１５０が移動することなくチャネル１７５内に堆積し、それによって細胞培養プロセスを改善するように選択することができる。
【００４１】
したがって、幾つかの実施形態では、本開示の実施形態による容器１００を動かして、所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部が領域１４２からフランジ１７０を越えて流れ、チャネル１７５内に堆積するようにすること、並びに、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収することにより、容器１００を動かさない（例えば、静止したままの）方法を含むがこれに限定されない他の方法と比較して、細胞培養チャンバ１０３からすべて又は少なくともより多くの量の老廃物１８４を除去することができる。幾つかの実施形態では、容器１００の軸１１０の配向（例えば、重力方向「ｇ」に対する）は、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収している間、ある持続期間にわたり、変化しないままでありうる。あるいは、幾つかの実施形態では、容器１００の軸１１０の配向（例えば、重力方向「ｇ」に対する）は、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収している間、ある持続期間内に１回以上変更することができる。
【００４２】
加えて、図１５に示されるように、幾つかの実施形態では、本方法は、分配ポート１８１を開口１０５に挿入することにより、細胞培養チャンバ１０３に物質（例えば、食物、栄養素）を加えること、及び細胞培養チャンバ１０３から物質１８４（例えば、老廃物）を除去した後に、物質１８５を分配ポートからチャネル１７５の開口部１７６に分配すること（図１２〜１４参照）を含みうる。例えば、図１５は、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収した後（図６９参照）及び容器１００を動かして、所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部を領域１４２からフランジ１７０を越えて流れるようにし、チャネル１７５内に堆積させた後（図１４参照）に、細胞培養チャンバ１０３から除去された老廃物１８４を概略的に示している。幾つかの実施形態では、添加物質１８５は、例えば、細胞１５０が消費及び／又は枯渇させた食物及び栄養素を細胞培養環境に補充することができる。したがって、幾つかの実施形態では、物質１８２及び物質１８５は、容器１００内で行われている細胞の培養タイプに応じて、同じ又は同様の組成物を含んでいても、異なる組成物を含んでいてもよい。さらには、幾つかの実施形態では、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃが培地（例えば、食物、栄養素）を継続的に（例えば、繰り返し）消費し、及び／又は細胞培養プロセス中の副産物として代謝物（例えば、老廃物）を生成するため、細胞１５０を培養している間に、物質１８２（例えば、食物、栄養素）を加える（図１１参照及び図１２）、物質１８４（例えば、老廃物）を除去する（図１２〜１４参照）、及びさらなる物質１８５（例えば、食物、栄養素）を加える（図１５参照）方法を、１回又は複数回、選択的に実行することができる。
【００４３】
幾つかの実施形態では、フランジ１７０及びチャネル１７５の１つ以上の特徴は、培地を加える際及び除去する際に利点を提供し（図１１〜１５参照）、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃからのスフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃの移動を回避し、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃの所望の細胞培養を促進することができる（図７及び図８参照）。例えば、図１６は、開口１０５に分配ポート１８１を挿入することにより、物質１８５（例えば、食物、栄養素）を加え、分配ポート１８１からチャネル１７５の開口部１７６に物質１８５を分配する方法を含む、図１５のビュー１６による細胞培養容器１００の一部の拡大概略図を示している。同様に、図７３は、開口１０５に回収ポート１８３を挿入することにより、細胞培養チャンバ１０３から物質１８４（例えば、老廃物）を取り出し、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収する方法を含む、図６８のビュー７３による細胞培養容器１００の一部の拡大概略図を示している。
【００４４】
図１６に示されるように、幾つかの実施形態では、開口１０５に分配ポート１８１を挿入することにより、物質１８５（例えば、食物、栄養素）を加えて、分配ポートからチャネル１７５の開口部１７６に物質１８５を分配する方法は、第１の流路１８５ａ、１８５ｂに沿った物質１８５の流れを妨げることを含みうる。例えば、幾つかの実施形態では、第１の流路１８５ａ、１８５ｂに沿った流れを妨げることは、フランジ１７０で第１の流路１８５ａ、１８５ｂに沿って流れをそらすことを含みうる。幾つかの実施形態では、フランジ１７０で第１の流路１８５ａ、１８５ｂに沿って流れをそらすことは、例えば、第１の流路１８５ａに沿ってチャネル１７５を物質１８５で満たし、次に、チャネル１７５から細胞培養チャンバ１０３の領域１４２に第１の流路１８５ｂに沿って物質１８５を流すことを含みうる。例えば、幾つかの実施形態では、物質１８５は、分配ポート１８１からチャネル１７５の開口部１７６に分配されて、チャネル１７５のベース１７４からチャネル１７５の外面１７２に沿ったチャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３まで、第１の流路１８５ａに沿って、チャネル１７５を物質１８５で徐々に満たすことができる。加えて、幾つかの実施形態では、チャネル１７５が物質１８５で満たされると、物質１８５は、チャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３を越えて、第１の流路１８５ｂに沿って細胞培養チャンバ１０３の領域１４２に流れ込むことができる。
【００４５】
したがって、幾つかの実施形態では、物質１８５が分配ポート１８１からチャネル１７５の開口部１７６に分配される間に、領域１４２の少なくとも一部（少なくとも一部にはフランジ１７０の内面１７１及び基板１１５の一部分１２３に基づいて画成される）並びに細胞培養チャンバ１０３の少なくとも一部を物質１８５で徐々に満たすことができる。物質１８５を細胞培養チャンバ１０３に加えることに関して説明されているが、特に明記しない限り、領域１４２の少なくとも一部（少なくとも一部にはフランジ１７０の内面１７１及び基板１１５の一部分１２３に基づいて画成される）並びに細胞培養チャンバ１０３の少なくとも一部は、図１１に示されるように、物質１８２が分配ポート１８１からチャネル１７５の開口部１７６に分配される間に、物質１８２で徐々に満たすことができるものと理解されたい。
【００４６】
同様に、図１７に示されるように、幾つかの実施形態では、開口１０５に回収ポート１８３を挿入することにより、細胞培養チャンバ１０３から物質（例えば、老廃物）を取り出し、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収する方法は、第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿って物質１８４の流れを妨げることを含みうる。例えば、幾つかの実施形態では、第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿って流れを妨げることは、フランジ１７０で第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿って流れをそらすことを含みうる。幾つかの実施形態では、フランジ１７０で第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿って流れをそらすことは、例えば、第２の流路１８４ｂに沿って物質１８４を流しつつ、第２の流路１８４ａに沿ってチャネル１７５から物質１８４を除去することを含みうる。幾つかの実施形態では、第２の流路１８４ｂは、細胞培養チャンバ１０３の領域１４２からチャネル１７５内へと延びうる。加えて又は代替的に、例えば、少なくとも一部には細胞培養チャンバ１０３内に含まれる物質１８０、１８２、１８４の体積に基づいて、幾つかの実施形態では、第２の流路１８４ｂは、細胞培養チャンバ１０３（例えば、領域１４２の外側）からチャネル１７５内へと延びうる。
【００４７】
したがって、幾つかの実施形態では、物質１８４は、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から回収することができ、第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿ってチャネル１７５から物質１８４を徐々に除去することができる。加えて、幾つかの実施形態では、例えば、容器１００を動かして、所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部を領域１４２からフランジ１７０を越えて流し、チャネル１７５内に堆積させた後（図１４参照）、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収することができ、第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿ったチャネル１７５から物質１８４を徐々に除去することができる。例えば、物質１８４は、チャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３からチャネル１７５の外面１７２に沿ってチャネル１７５のベース１７４まで、第２の流路１８４ａに沿ってチャネル１７５から徐々に除去することができる。したがって、幾つかの実施形態では、物質１８４がチャネル１７５から回収ポート１８３を用いて回収される間に、細胞培養チャンバ１０３の少なくとも一部並びに領域１４２（少なくとも一部にはフランジ１７０の内面１７１及び基板１１５の一部分１２３に基づいて画成される）の少なくとも一部から、物質１８４を徐々に除去することができる。
【００４８】
幾つかの実施形態では、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０を培養しつつ、フランジ１７０で第１の流路１８５ａ、１８５ｂに沿った物質１８５の流れを妨げ、フランジ１７０で第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿った物質１８４の流れを妨げることにより、細胞１５０の培養に干渉することなく、容器１００の細胞培養チャンバ１０３から物質をそれぞれ追加及び除去することができる。例えば、図７２に示されるように、幾つかの実施形態では、分配ポート１８１は、第１の流路１８５ａ、１８５ｂに沿ってある速度で物質１８５を分配ポート１８１からチャネル１７５に流す（例えば、分配、吹き込み、吸引する）ことにより、細胞培養チャンバ１０３に材１８５を加えることができ、それによって、チャネル１７５内及びその周囲に正の圧力を生成しうる。同様に、図７３に示されるように、幾つかの実施形態では、回収ポート１８３は、チャネル１７５から回収ポート１８３に第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿ってある速度で物質を流す（例えば、回収する、吸引する）ことにより、細胞培養チャンバ１０３から物質１８４を除去することができ、それによってチャネル１７５内及びその周囲に負圧が生成しうる。したがって、幾つかの実施形態では、フランジ１７０は、それぞれ、第１の流路１８５ａ、１８５ｂ及び第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿って流れる物質１８５、１８４の速度を遅くすることができ、それによって、チャネル１７５内及びその周囲の正の圧力及び負の圧力をそれぞれ減少させることができる
例えば、幾つかの実施形態では、開口１０５に分配ポート１８１を挿入することによって、細胞培養チャンバ１０３に物質（例えば、食物、栄養素）を加え、分配ポートからチャネル１７５の開口部１７６に物質１８５を分配する（図１６参照）方法は、例えば、フランジ１７０及びチャネル１７５の１つ以上の特徴を含まない方法又は細胞培養容器と比較して、細胞培養チャンバ１０３に物質１８５のゆっくりとした連続的な制御された（例えば、乱流のない）流れを提供することができる。同様に、幾つかの実施形態では、開口１０５に回収ポート１８３を挿入することにより、細胞培養チャンバ１０３から物質（例えば、老廃物）を取り出し、チャネル１７５から物質１８４を回収する（図１７参照）方法は、例えば、フランジ１７０及びチャネル１７５の１つ以上の特徴を含まない方法又は細胞培養容器と比較して、細胞培養チャンバ１０３からの物質１８４のゆっくりとした連続的な制御された（例えば、乱流のない）流れを提供することができる。第１の流路１８５ａ、１８５ｂ及び第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿ってそれぞれ流れる物質１８５、１８４の速度を低下させることにより、幾つかの実施形態では、フランジ１７０及びチャネル１７５は、したがって、複数のマイクロキャビティ１１５の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で培養されている細胞１５０が移動するのを防ぐことができる。例えば、幾つかの実施形態では、物質の流れによって１つ以上の細胞１５０が移動する場合、１つ以上のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、複数のスフェロイドを含んでも、スフェロイドを含まなくてもよい。したがって、幾つかの実施形態では、本開示の方法及び実施形態に従って、少なくとも一部にはフランジ１７０及びチャネル１７５の１つ以上の特徴に基づいて、物質のゆっくりとした連続的な制御された（例えば、乱流のない）流れを提供することによって、容器１００内で培養されている細胞１５０が移動する可能性を低減することができ、より質の高い細胞培養及び細胞培養に関するより正確な科学的結果を得ることができる。
【実施例】
【００４９】
実施例１：細胞増殖
結腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６を、完全なマッコイ５ａ培地（１０単位／ｍＬのペニシリン／１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む１０％ウシ胎児血清）のフラスコで約８０％コンフルエンシーまで増殖させ、トリプシン処理して表面から細胞を分離させた。次に、細胞をカウントし、マイクロキャビティあたり１０００細胞の最終細胞濃度で完全なマッコイ培地に再懸濁した（Ｔ−７５マイクロキャビティフラスコでは、約６．５×１０５細胞／ｍＬの最終濃度で１５ｍＬの細胞を加える）。細胞がマイクロキャビティフラスコの表面に定着するように、マイクロキャビティフラスコを室温に置く。室温でのインキュベーション後、実験期間中に、フラスコを５％ＣＯ２及び９５％相対湿度の３７℃インキュベータに入れる。スフェロイドの形成は最初の２４時間以内に起こる。
【００５０】
対照フラスコ：ＨＴＣ１１６細胞を、フラスコの底面を切り取り、マイクロキャリアのアレイを有する物質をフラスコの底部に付着させることにより調製したＴ７５フラスコに播種した。フラスコが切り取られたため、材料の「へり」がフラスコの底面の内周に残った。マイクロキャビティのアレイの周囲のこの平坦な表面は、対照容器での培養中に存在していた。
【００５１】
実験フラスコ：ＨＴＣ１１６細胞を、例えば図４及び５に示されるフランジ及びチャネル構造を有するＴ７５フラスコにも播種した。
【００５２】
浮遊細胞を含む培地を内側の領域に加えた後、フラスコを室温で１５分間、静的条件下に置き、細胞をマイクロウェルに定着させた。この１５分間のインキュベーションのステップは、均一な細胞播種を確実にし、その後のインキュベータチャンバへの容器の配置時のエッジ効果を最小限に抑えるために、細胞培養生物学研究室で用いられる。細胞がマイクロキャビティ内に定着した後、追加量の細胞培養培地をフラスコに加えた。対照フラスコでは、培地をピペットでフラスコの底面の中心中央（mid-center）に加えた。実験フラスコでは、例えば、図１６に示すように培地を加えた。次いで、フラスコを細胞培養インキュベータに入れ、１４日間培養した。この培養期間中に、９０％の培地交換効率で合計７回の培地交換を行った。
【００５３】
図１８Ａは、対照Ｔ７５フラスコ内で増殖したスフェロイドの写真である。スフェロイドは不規則であり、一部のマイクロキャビティから欠落している（培地交換中に外れた可能性がある）。加えて、図３Ａ及び３Ｂに示されるような不規則な細胞集塊が、対照フラスコに見られた。図１８Ｂは、１４日間の培養後の実験フラスコ内のスフェロイドを示す写真である。スフェロイドはサイズが似ているように見え、すべてのウェルがスフェロイドで満たされている。図１８Ｂは、培地交換を伴う実験計画に従って組み立てられたフラスコ内での１００％のスフェロイドの保持を実証している。
【００５４】
１４日間の培養後、対照フラスコ（図１９Ａ及び１９Ｂ）及び例えば図４の実験フラスコ（図１９Ｃ及び図１９Ｄ）からスフェロイドを採取した。図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、及び１９Ｄは採取した細胞の写真である。図１９Ａに示されるように、細胞は、細胞培養領域に平坦な表面を有する容器内に細胞の「ロープ」を形成した（白矢印を参照）。他の不規則な細胞集塊は、図１９Ｂに見ることができる。対照的に、図１９Ｃ及び図１９Ｄに示されるように、図４による実験フラスコ内で増殖したスフェロイドは、規則的かつ均質であった。
【００５５】
細胞培養容器及び細胞培養方法の多くの態様が本明細書に開示されている。選択した幾つかの態様の概要を以下に提示する。
【００５６】
実施形態では、本開示は、第１の態様において、上部、底部、側壁、及び首のある開口部；複数のマイクロキャビティを含む、容器の底部上の基板であって、該複数のマイクロキャビティの各マイクロキャビティがウェル開口部と凹状のウェル底部とを含む、基板；基板の外周を取り囲む傾斜したフランジであって、基板に隣接した内面と基板とは反対側の外面とを有するフランジ、を有する細胞培養容器を提供する。
【００５７】
第２の態様では、本開示は、基板が容器の底部に固定される、態様１の細胞培養容器を提供する。
【００５８】
第３の態様では、本開示は、基板が容器の底面と一体化している、態様１の細胞培養容器を提供する。
【００５９】
第４の態様では、本開示は、基板が容器の底面と一体化している、態様１の細胞培養容器を提供する。
【００６０】
第４の態様では、本開示は、フランジの外面が傾斜している、態様１の細胞培養容器を提供する。
【００６１】
第５の態様では、本開示は、フランジの外面が傾斜している、態様２の細胞培養容器を提供する。
【００６２】
第６の態様では、本開示は、フランジの外面が傾斜している、態様３の細胞培養容器を提供する。
【００６３】
第７の態様では、本開示は、フランジの外側で基板の周りに堀を形成する、傾斜したフランジの外周を取り囲むチャネルをさらに含む、態様１の細胞培養容器を提供する。
【００６４】
第８の態様では、本開示は、フランジの外側で基板の周りに堀を形成する、傾斜したフランジの外周を取り囲むチャネルをさらに含む、態様２の細胞培養容器を提供する。
【００６５】
第９の態様では、本開示は、フランジの外側で基板の周りに堀を形成する、傾斜したフランジの外周を取り囲むチャネルをさらに含む、態様３の細胞培養容器を提供する。
【００６６】
第１０の態様では、本開示は、フランジの外側で基板の周りに堀を形成する、傾斜したフランジの外周を取り囲むチャネルをさらに含む、態様４の細胞培養容器を提供する。
【００６７】
第１１の態様では、本開示は、フランジの外側で基板の周りに堀を形成する、傾斜したフランジの外周を取り囲むチャネルをさらに含む、態様５の細胞培養容器を提供する。
【００６８】
第１２の態様では、本開示は、フランジの外側で基板の周りに堀を形成する、傾斜したフランジの外周を取り囲むチャネルをさらに含む、態様６の細胞培養容器を提供する。
【００６９】
第１３の態様では、本開示は、細胞培養容器のフランジのネック側に液体を堆積させること；液体がフランジを越えて複数のマイクロキャビティを含む基板上にこぼれるまで、容器を液体で満たすこと；複数のマイクロキャビティ内で細胞を培養すること、を含む、態様１の細胞培養容器内で細胞を培養する方法を提供する。
【００７０】
第１４の態様では、本開示は、培養後、細胞培養容器を傾けて、チャネル内に細胞液を蓄積すること；回収ポートを容器の開口に挿入し、回収ポートを用いてチャネルから液体を除去することをさらに含む、態様１３の方法を提供する。
【００７１】
本開示を通して、「物質」、「液体」、及び「気体／ガス」という用語は、例えば、細胞培養容器で細胞を培養するときに用いられる物質の特性を説明するために使用することができる。特に明記しない限り、本開示の目的では、「物質」は、流体物質（例えば、液体又は気体）を含みうる。加えて、物質は、液体に懸濁された固体粒子（例えば、細胞）を含む、液体を含む培養液又は培地を含みうる。特に明記しない限り、本開示の目的では、「液体」は、洗浄液又はすすぎ液、水溶液、若しくは、例えば、細胞培養チャンバの洗浄、基板及び容器の１つ以上の特徴の滅菌、細胞増殖及び液体の他の使用のための基板の準備のために容器に追加又は容器から除去することができる他の液体を含みうる。加えて、液体は、該液体に懸濁された固体粒子（例えば、細胞）を含む液体を含む、培養溶液又は培地を含みうる。特に明記しない限り、本開示の目的では、「ガス」には、空気、ろ過又は処理された空気、若しくは他のガスが含まれうる。
【００７２】
本開示全体にわたって、「非透過性」、「ガス透過性」、及び「多孔性」という用語は、基板の１つ以上の特徴の特性（例えば、物質の特性、特徴、パラメータ）を説明するために使用することができる。
【００７３】
特に明記しない限り、本開示の目的では、「非透過性」基板（例えば、非透過性基板の物質）は、通常の条件下では（例えば、圧力及び力を含むがこれに限定されない外部影響なしに）固体、液体、及び気体に対して不透過性であるとみなされ、したがって、通常の条件下では、非透過性基板内へ、該基板を通じた、又は該基板から外への、固体、液体、又は気体の移動は許されない。幾つかの実施形態では、非透過性基板は、容器の壁の一部を形成することができる。加えて、細菌は非透過性基板を通過できないことから、非透過性基板が容器の壁の一部を形成する場合、容器の細胞培養チャンバは無菌であると見なされる。しかしながら、基板の複数のマイクロキャビティに物質を充填する場合、液体の表面張力に基づいて非透過性基板のマイクロキャビティ内にガスが閉じ込められる可能性があり、それにより、幾つかの実施形態では、物質がマイクロキャビティを満たすのを妨げ、スフェロイドの増殖を妨げる可能性がある。
【００７４】
特に明記しない限り、本開示の目的では、「ガス透過性」基板（例えば、ガス透過性基板の物質）は、固体及び液体に対して不透過性であり、通常の条件下でガスに対して透過性であると見なされる。したがって、ガス透過性基板は、ガス透過性基板の内、中、又は外への固体及び液体の移動を許さず、ガス透過性基板の内、中、又は外へのガスの移動を可能にする。幾つかの実施形態では、ガス透過性基板は容器の壁の一部を形成することができる。加えて、細菌は例えばガス透過性基板を合理的に通過できないことから、ガス透過性基板が容器の壁の一部を形成する場合、容器の細胞培養チャンバは無菌であると見なされる。しかしながら、基板はガス透過性であるが、ガス透過性基板を通るガス透過速度は通常の動作条件下でキャビティからガスを移動させるのに必要な速度よりも遅くなる可能性があり、したがって、基板を透過するのに許容できないほど長い時間がかかる可能性があることから、ガスは物質の充填中にマイクロキャビティ内に閉じ込められる可能性がある。したがって、幾つかの実施形態では、マイクロキャビティにゆっくりと充填することにより、液体の前部が各マイクロキャビティにある角度で入ることが可能になり、それによって、液体をマイクロキャビティに充填するときにガスが移動する。幾つかの実施形態では、キャビティを液体で満たした後、ガスはガス透過性基板を（ゆっくりと）透過しうる。
【００７５】
特に明記しない限り、本開示の目的では、「多孔性」基板（例えば、多孔性基板の物質）は、固体に対して不透過性であり、通常の条件下で液体及びガスに対して透過性であると見なされる。したがって、多孔性基板は、多孔性基板の内、中、又は外への固体の移動を許さず、多孔性基板の内、中、又は外への液体及びガスの移動を可能にする。細菌が多孔性基板を通過する可能性があることから、多孔性基板は容器の一部を形成することができず、したがって細胞培養チャンバ内で無菌性の問題が生じる。よって、多孔性基板を使用する場合、基板は容器の無菌細胞培養チャンバ内に封入（完全に封入）する必要がある。しかしながら、マイクロキャビティに物質を充填する間、ガスは多孔性基板を通って逃げる（例えば、通過する）ことができる。よって、マイクロキャビティへのガスの閉じ込めを懸念することなく、マイクロキャビティの充填を迅速に行うことができる。幾つかの実施形態では、液体は、圧力又は物理的接触が加えられ、基板が乱された状態の多孔質基板のみ、通過することができる。よって、幾つかの実施形態では、基板が追加の圧力又は物理的接触及び乱れにさらされない限り、液体を含む物質を基板のマイクロキャビティに収容することができる。例えば、幾つかの実施形態では、多孔性基板を細胞培養チャンバ内で支持して、充填中並びに培養中にガスが基板を通過できるようにし、加えられた圧力又は物理的接触及び外力（例えば、細胞培養チャンバー外）による乱れから基板を隔離することができる。
【００７６】
さまざまな開示される実施形態は、その特定の実施形態に関連して記載される特定の特徴、要素、又は工程を含みうることが認識されよう。また、特定の特徴、要素、又は工程は、特定の一実施形態に関連して説明されているが、図示されていないさまざまな組合せ又は順列の代替的な実施形態と交換又は組み合わせることができることも認識されよう。
【００７７】
本明細書で用いられる場合、用語「ｔｈｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」は、「少なくとも１つ」を意味し、明示的に反対の指示がない限り、「１つのみ」に限定されるべきではないことが理解されるべきである。よって、例えば、「ある１つの（ａ）構成要素」への言及は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、そのような構成要素を２つ以上有する実施形態を含む。
【００７８】
本明細書では、範囲は、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表現することができる。このような範囲が表現される場合、実施形態は、その１つの特定の値から及び／又は他方の特定の値までを含む。同様に、例えば先行詞「約」の使用によって、値が近似値として表される場合、その特定の値は別の態様を形成することが理解されよう。さらには、範囲の各々の端点は、他の端点に関連して、及び他の端点とは独立してのいずれにおいても重要であることが理解されよう。
【００７９】
特に明記しない限り、本明細書に記載の任意の方法は、その工程が特定の順序で実行されることを必要とすると解釈されることは、決して意図していない。したがって、方法クレームがその工程が従うべき順序を実際に列挙していないか、または工程が特定の順序に限定されるべきであることが特許請求の範囲または明細書に具体的に述べられていない場合には、いかなる特定の順序も、推測されることは、決して意図していない。
【００８０】
特定の実施形態のさまざまな特徴、要素、又は工程は、「含む」という移行句を使用して開示されうるが、「〜からなる」又は「〜から実質的になる」という移行句を使用して説明されうるものを含む代替的な実施形態態が暗示されることが理解されるべきである。したがって、例えば、Ａ＋Ｂ＋Ｃを含む装置の暗黙の代替的な実施形態には、装置がＡ＋Ｂ＋Ｃからなる実施形態と、装置が実質的にＡ＋Ｂ＋Ｃからなる実施形態とが含まれる。
【００８１】
本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、本開示に対してさまざまな修正及び変形がなされうることは、当業者にとって明白であろう。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内にある限り、本開示の修正及び変形を包含することが意図されている。
【００８２】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【００８３】
実施形態１
細胞培養容器において、
上部、底部、側壁、及び首のある開口部；
複数のマイクロキャビティを含む、前記容器の前記底部上の基板であって、前記複数のマイクロキャビティの各マイクロキャビティがウェル開口部と凹状のウェル底部とを備えている、基板；並びに
前記基板の外周を取り囲む傾斜したフランジ
を含み、
前記フランジが、前記基板に隣接した内面と前記基板とは反対側の外面とを有している、
細胞培養容器。
【００８４】
実施形態２
前記基板が前記容器の前記底部に固定されている、実施形態１に記載の細胞培養容器。
【００８５】
実施形態３
前記基板が前記容器の底面と一体化している、実施形態１に記載の細胞培養容器。
【００８６】
実施形態４
前記フランジの前記外面が傾斜している、実施形態１に記載の細胞培養容器。
【００８７】
実施形態５
前記フランジの前記外面が傾斜している、実施形態２に記載の細胞培養容器。
【００８８】
実施形態６
前記フランジの前記外面が傾斜している、実施形態３に記載の細胞培養容器。
【００８９】
実施形態７
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、実施形態１に記載の細胞培養容器。
【００９０】
実施形態８
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、実施形態２に記載の細胞培養容器。
【００９１】
実施形態９
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、実施形態３に記載の細胞培養容器。
【００９２】
実施形態１０
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、実施形態４に記載の細胞培養容器。
【００９３】
実施形態１１
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、実施形態５に記載の細胞培養容器。
【００９４】
実施形態１２
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、実施形態６に記載の細胞培養容器。
【００９５】
実施形態１３
実施形態１に記載の細胞培養容器内で細胞を培養する方法であって、
前記細胞培養容器の前記フランジのネック側に液体を堆積させること；
液体が前記フランジを越えて複数のマイクロキャビティを含む前記基板上にこぼれるまで、前記容器を液体で満たすこと；及び
前記複数のマイクロキャビティ内で細胞を培養すること
を含む、方法。
【００９６】
実施形態１４
培養後、前記細胞培養容器を傾けてチャネル内に細胞液を蓄積すること；
前記容器の開口に回収ポートを挿入し、該回収ポートを使用してチャネルから液体を除去すること
をさらに含む、実施形態１３に記載の方法。
【符号の説明】
【００９７】
１００細胞培養容器
１０１  上部／壁
１０２  内面
１０３  細胞培養チャンバ
１０４  キャップ
１０５  開口
１０７  端部壁
１０８  底部
１１０  軸
１１２  ネック
１１５  マイクロキャビティのアレイ／基板
１２０  複数のマイクロキャビティ
１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ  各マイクロキャビティ
１２１ａ，１２１ｂ，１２１ｃ  凹面
１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ  ウェル
１２３ａ，１２３ｂ，１２３ｃ  開口部
１２５  第１の側
１２６  第２の側
１４２  領域
１５０  細胞
１７０  フランジ
１７１  内面
１７２  外面
１７３  周囲
１７４  ベース
１７５  チャネル
１７６  開口部
１８０  液体
１８２  物質
１８３  回収ポート
１８４  老廃物
２０１，２０７，２０８，２１２  内部表面
２０２  平坦な表面
２５０  細胞／スフェロイド
８０１  細胞集塊
【図１】
2020526219.tif 000003
【図２Ａ】
2020526219.tif 000004
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
2020526219.tif 000022
【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月3日(2020.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、その内容が依拠され、その全体がここに参照することによって本願に援用される、「細胞培養容器及び細胞培養方法（Cell Culture Container and Methods of Culturing Cells）」と題された２０１８年３月１３日出願の米国仮特許出願第６２／６４２，４００号；「細胞培養容器及び細胞培養方法（Cell Culture Containers and Methods of Culturing Cells）」と題された２０１７年７月１４日出願の米国仮特許出願第６２／５３２，６３９号；「細胞培養容器及び細胞培養方法（Cell Culture Container and Methods of Culturing Cells）」と題された２０１７年７月１４日出願の米国仮特許出願第６２／５３２，６４８号；及び、「細胞培養容器及び細胞培養方法（Cell Culture Containers and Methods of Culturing Cells）」と題された２０１７年７月１４日出願の米国仮特許出願第６２／５３２，６７１号の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、概して、細胞培養容器及び細胞の培養方法に関し、より詳細には、三次元細胞を収容するための細胞培養容器及び該細胞培養容器内で三次元細胞を培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞培養容器に三次元細胞を収容することが知られている。細胞培養容器内で三次元細胞を培養することもまた知られている。
【発明の概要】
【０００４】
詳細な説明に記載される幾つかの例示的な実施形態の基本的な理解をもたらすために、本開示の簡略化された概要を以下に提示する。 
【０００５】
実施形態では、本開示は、細胞を三次元構造で培養するための、基板内にマイクロキャビティがアレイで存在しうる細胞培養容器を提供する。三次元構造内で増殖する細胞のアレイをスフェロイド又はオルガノイドとして増殖させるためには、すべての細胞をマイクロキャビティ内に維持する基板を細胞培養容器に提供することが重要である。細胞は、マイクロキャビティ内で成長すると、マイクロキャビティに閉じ込められ、サイズが制限されたスフェロイドを形成する。細胞がマイクロキャビティから逃げるか、あるいは細胞が所望の三次元構造で増殖するようにさせるように構造化及び配置されていない細胞培養容器内の表面に定着すると、細胞は制限されずに増殖する。細胞培養容器内の細胞が制限されずに増殖可能な場合、それらは不均質な細胞集団を形成する。
【０００６】
一部の用途では、細胞培養容器内でスフェロイドの均質な集団を増殖及び培養することが望ましい。例えば、一貫性のない細胞形態に起因する細胞生理機能の変化を制御するために、均質な細胞集団でアッセイを行うことが望ましい。また、細胞治療がスフェロイド培養の望ましい結果である場合には、制御された予測可能な治療結果を提供するためにも、均質な細胞が望ましい。
【０００７】
スフェロイドは、互いに接触すると集塊する傾向があり、大きく不均一な細胞構造を形成する。例えば、容器の内外への培地の流れによって乱流が生じ、スフェロイドをマイクロキャビティの領域から逃がしてしまう場合など、培地交換中に細胞がマイクロキャビティから逃げることがある。結果として、不規則な細胞凝集体が形成されうる。細胞培養容器の構造は、スフェロイドをマイクロキャビティから移動させて不規則な細胞構造を形成させることなく、細胞を所望の三次元構造で増殖するように制限するマイクロキャビティチャンバのアレイを提供する上で重要である。実施形態では、本開示は、フランジとチャネルとを提供し、堀を形成することにより、過度の乱流を生じることなく、容器を培地で穏やかに満たすことができる。
【０００８】
マイクロキャビティに加えて、細胞培養容器の内部が平坦な表面を有している場合、細胞は平坦な表面に定着し、均一なスフェロイドではなく不均一な細胞構造である構造へと増殖しうる。細胞培養容器が均一なスフェロイドの培養を推進する環境をもたらすことを確実にするために、実施形態では、平坦な表面が低減した細胞培養容器が提供される。複数のマイクロキャビティを取り囲む基板の外周として、傾斜したフランジとチャネルとを有する堀構造が設けられる。また、これらのチャネル又は堀構造では、細胞培養領域内に平坦な表面が低減している。幾つかの実施形態では、方法は、細胞培養容器で細胞を培養することを含みうる。
【０００９】
上記の実施形態は例示であり、本開示の範囲から逸脱することなく、単独で、又は本明細書で提供される１つ以上の任意の実施形態との任意の組合せで、提供することができる。さらには、前述の概要及び後述する詳細な説明はいずれも、本開示の実施形態を提示しており、説明及び特許請求される本実施形態の性質及び特徴を理解するための概観又は枠組みを提供することが意図されていることが理解されるべきである。添付の図面は、実施形態のさらなる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれて、その一部を構成する。図面は本開示のさまざまな実施形態を例証しており、その説明とともに、それらの原理及び動作を説明する役割を担う。
【００１０】
本開示のこれら及び他の特徴、実施形態、及び利点は、添付の図面を参照して読む場合に、さらに理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本開示の実施形態による、第１の例示的な細胞培養容器の概略的な側面図
【図２Ａ】図１に「２」で示される領域の拡大図の一実施形態を示す図
【図２Ｂ】図１に「２」で示される領域の拡大図の別の実施形態を示す図
【図３Ａ】図２Ａに示された平坦な構造上で増殖した細胞の立体構造の写真
【図３Ｂ】図２Ｂに示された平坦な構造上で増殖した細胞の立体構造の写真
【図４】本開示の実施形態による、フランジとチャネルとを含む図１の細胞培養容器の断面図の実施形態を示す図
【図５】本開示の実施形態による、フランジとチャネルとを含む線５−５による図１の細胞培養容器の断面図の実施形態を示す図
【図６】本開示の実施形態による、複数のマイクロキャビティを有する基板を示す、図５のビュー６による細胞培養容器の一部の拡大概略図
【図７】本開示の実施形態による、図６の複数のマイクロキャビティを有する基板を示す細胞培養容器の一部の断面図
【図８】本開示の実施形態による、図６の複数のマイクロキャビティを有する細胞培養容器の一部の断面図の代替となる例示的な実施形態を示す図
【図９】本開示の実施形態による、図５の線９に沿った拡大図
【図１０】本開示の実施形態による、第１の例示的な細胞培養容器で細胞を培養する方法を含む、図４の細胞培養容器の実施形態を示す図
【図１１】本開示の実施形態による、分配ポートを用いてチャネルに物質を加える方法を含む、図４の細胞培養容器の実施形態を示す図
【図１２】本開示の実施形態による、回収ポートを用いてチャネルから物質を取り出す方法を含む、図４の細胞培養容器の実施形態を示す図
【図１３】本開示の実施形態による、図４の細胞培養容器のチャネルから回収ポートを用いて物質を取り出す方法のステップを示す図
【図１４】本開示の実施形態による、図４の細胞培養容器のチャネルから回収ポートを用いて物質を取り出す方法のステップを示す図
【図１５】本開示の実施形態による、分配ポートを用いてチャネルに物質を加える方法を含む、図４の細胞培養容器の実施形態を示す図
【図１６】本開示の実施形態による、フランジ、チャネル、並びに分配ポートを用いてチャネルに物質を加える方法を含む、図１５のビュー１６による細胞培養容器の一部の一実施形態の拡大概略図
【図１７】本開示の実施形態による、フランジ、チャネル、並びに回収ポートを用いてチャネルから物質を取り出す方法を含む、図１５のビュー１６による細胞培養容器の一部の一実施形態の拡大概略図
【図１８Ａ】フランジ構造及びチャネル構造を有しないＴ１７５フラスコ内で増殖したスフェロイドの写真
【図１８Ｂ】実施形態による、フランジ構造及びチャネル構造を有するフラスコ内で増殖したスフェロイドの写真
【図１９Ａ】１４日間の培養後に対照フラスコから採取した細胞の写真
【図１９Ｂ】１４日間の培養後に対照フラスコから採取した細胞の写真
【図１９Ｃ】１４日間の培養後に例えば図４の実験フラスコから採取した細胞の写真
【図１９Ｄ】１４日間の培養後に例えば図４の実験フラスコから採取した細胞の写真
【発明を実施するための形態】
【００１２】
これより、本開示の例示的な実施形態が示される添付の図面を参照して、特徴をより詳細に説明する。可能な場合はいつでも、同一又は類似した部分についての言及には、図面全体を通して同じ参照番号が用いられる。しかしながら、本開示は、多くの異なる形態で具体化することができ、本明細書に記載される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。
【００１３】
細胞培養容器（例えばフラスコ）は、細胞を培養するための無菌の細胞培養チャンバを提供することができる。幾つかの実施形態では、細胞の培養は、疾患及び毒物学の研究、薬物療法及び治療の有効性、腫瘍の特性、生物、遺伝学、並びに細胞及びそれに関連する他の科学的、生物学的、及び化学的原理に関する情報を提供することができる。細胞培養容器は、例えばアレイ状に配置された複数のマイクロキャビティ（例えば、マイクロキャビティ、マイクロメートルサイズのウェル、サブミリメートルサイズのウェル）を含む基板を備えうる。基板は、フラスコ内に配置することができ、あるいはフラスコの界壁の一部を形成することができる。すなわち、基板をフラスコと一体化させることができる。例えば、マイクロキャビティのアレイは、細胞培養容器の底部の内面に形成されうる。あるいは、マイクロキャビティのアレイを有する基板を細胞培養容器に挿入し、細胞培養容器の底面に置くか、若しくは接着、レーザー溶接、超音波溶接、又は他の幾つかの方法によって細胞培養容器の底面に固定することができる。基板は、複数のマイクロキャビティを形成する起伏する（例えば正弦波）の表面を含む、上面及び／又は底面を備えうる。幾つかの実施形態では、三次元細胞培養（例えば、細胞凝集体、スフェロイド）の増殖を促進する物質（例えば、培地、固体、液体、気体）でフラスコを満たすことができる。例えば、液体に懸濁された細胞を含む培地を容器の細胞培養チャンバに加えることができる。懸濁細胞は、複数のマイクロキャビティ内に集合することができ、細胞の群又はクラスターへと形成（例えば増殖）することができる。これらの群又はクラスターはスフェロイド又はオルガノイドである。
【００１４】
例えば、幾つかの実施形態では、単一のスフェロイドは、少なくとも重力に基づいて複数のマイクロキャビティの各マイクロキャビティ内に形成されてよく、液体に懸濁した１つ以上の細胞を、液体を通じて落下させ、各マイクロキャビティ内に堆積させることができる。マイクロキャビティの形状（例えば、ウェルを画成する凹面）、及び細胞が表面に付着するのを防ぐマイクロキャビティの表面コーティングもまた、各マイクロキャビティでの３次元細胞培養の増殖を促進することができる。すなわち、細胞はスフェロイドを形成し、マイクロキャビティの寸法によって制限されて特定のサイズへと増殖する。培養中、スフェロイドは培地（例えば、食物、栄養素）を消費し、副産物として代謝産物（例えば、老廃物）を生成しうる。よって、幾つかの実施形態では、培養中に食物培地を細胞培養チャンバに加えることができ、培養中に細胞培養チャンバから廃培地を除去することができる。培地の添加及び除去の際に、マイクロキャビティからのスフェロイドの移動を回避し、スフェロイドの望ましい細胞培養を促進する試みが行われうる。
【００１５】
二次元細胞培養と比較して、幾つかの実施形態では、三次元細胞培養は、実験室でシミュレートされた条件と比較して、より生理学的に正確で、現実の用途で細胞が存在及び増殖できる環境をより現実的に表す多細胞構造を生成することができる。例えば、三次元細胞培養は、「インビボ」での（すなわち、実際の生活環境での）細胞増殖をシミュレートする現実的な環境をより密接に提供することがわかっており；一方、二次元の細胞培養は、実験室の外で発生する実際の環境をあまり表していない「インビトロ」での（すなわち、実験室環境のガラス内での）細胞増殖をシミュレートする環境をもたらすことがわかっている。三次元細胞培養の特性及び挙動を相互作用させて観察することにより、例えば疾患及び毒物学の研究、薬物療法及び治療の有効性、腫瘍の特性、生物、遺伝学、並びに、細胞及びそれに関する他の科学的、生物学的、及び化学的原理などに関連する細胞の理解の進歩を達成することができる。
【００１６】
例示的な細胞培養容器１００の実施形態及び該例示的な細胞培養容器１００内で細胞を培養する方法が、図１〜１５を参照して説明される。例えば、図１は、上部１０１、底部１０８、及び端部壁１０７、ネック１１２、並びにキャップ１０４で覆われた図１に示される開口部又は開口１０５を有する細胞培養容器１００の側面図を概略的に示している。上部１０１、底部１０８、端部壁１０７、及びネックの各々は、内部表面を有している。すなわち、上部１０１は内部表面２０１を有し、底部は内部表面２０８を有し、ネック１１２は内部表面２１２を有し、端部壁１０７は内部表面２０７を有している。細胞培養チャンバ１０３は、容器の内部表面の内側に含まれる容器の領域である。実施形態では、底部１０８の内部表面２０８はマイクロキャビティのアレイ１１５を有している。
【００１７】
図２Ａ及び図２Ｂは、図１の円「２」で示される領域の概略図である。図２Ａ及び２Ｂは、不均質な細胞培養を結果的にもたらす、対照容器を示している。例えば、細胞培養チャンバ１０３内に、平坦な表面２０２が存在する、細胞が定着しうる領域が存在する場合、細胞２５０はマイクロキャビティ１２０内に定着する代わりに平坦な表面に集塊可能になり、細胞は不規則な細胞集塊８０１を形成しうる。例えば、マイクロキャビティのアレイの周囲にフレームがあり、マイクロキャビティのアレイを含む基板が平坦な棚である細胞培養チャンバ１０３の壁に付着する場合、細胞は、培地を通して落下し、表面に定着する際に、マイクロキャビティ１２０内に定着する代わりに平坦な表面に定着する可能性がある。これらの収容されていない不規則な細胞集塊８０１の例が図２Ａ及び図２Ｂに概略的に示されている。これらの細胞はまた、隣接するマイクロキャビティにも侵入し、マイクロキャビティ１２０に収容されるスフェロイド２５０の培養を混乱させる可能性がある。対照的に、マイクロキャビティ１２０内に収容される細胞は、規則的で均質なスフェロイド２５０を形成する（例えば図１８Ｂを参照）。
【００１８】
図３Ａ及び３Ｂは、以下に論じられる実施例１によれば、これらの平坦な部分が存在していた細胞培養容器の平坦な部分に形成された不規則な細胞の集塊の写真である。
【００１９】
図１に戻ると、幾つかの実施形態では、容器１００は、開口１０５を覆い、該開口１０５をシール及び遮断の少なくとも一方になるように配向され、それによって開口１０５を通る容器１００の外側から細胞培養チャンバ１０３への経路を妨害する、キャップ１０４を含むことができる。明確にするために、キャップ１０４は取り外されており、したがって、他の図面には示されていないが、幾つかの実施形態では、本開示の範囲から逸脱することなく、キャップ１０４を提供し、容器１００の開口部１０５に選択的に追加又は取り外しできることを理解されたい。幾つかの実施形態では、キャップ１０４は、容器１００の細胞培養チャンバ１０３の内外へのガスの移動を可能にするフィルタを含むことができる。例えば、幾つかの実施形態では、キャップ１０４は、細胞培養チャンバ１０３内のガスの圧力を調節し、それによって容器１００の外側の環境（例えば、大気）の圧力に対する細胞培養チャンバ１０３の加圧（例えば、過加圧）を防止するように配向されたガス透過性フィルタを含みうる。
【００２０】
図４及び図４の線５−５に沿った代替的な断面図を示す図５に示されるように、幾つかの実施形態では、細胞培養容器１００は、マイクロキャビティのアレイ１１５の少なくとも一部を取り囲むフランジ１７０を含みうる。図４及び図５では、マイクロキャビティのアレイ１１５（「基板」とも称される）は、個々のマイクロキャビティ１２０で構成される（図６〜８参照）。したがって、特に明記しない限り、実施形態では、基板１１５は、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ（図６〜８参照）の１つ以上の特徴を含みうるものと理解されたい。加えて、実施形態では、細胞培養容器１００は、フランジ１７０の少なくとも一部を取り囲むチャネル１７５を含みうる。チャネル１７５は開口部１７６を有している。図５に示されるように、幾つかの実施形態では、フランジ１７０は、マイクロキャビティのアレイ１１５のすべてのマイクロキャビティを取り囲むことができる。しかしながら、幾つかの実施形態では、フランジ１７０は、複数のマイクロキャビティ１２０のすべてより少ない（例えば少なくとも一部の）マイクロキャビティを取り囲みうる。同様に、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６は、フランジ１７０全体を取り囲むことができる；しかしながら、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６は、フランジ１７０の全体より少ない（例えば、少なくとも一部の）フランジ１７０を取り囲みうる。すなわち、チャネル１７５は、実施形態では、幾つかの領域で閉じられうる。幾つかの実施形態では、フランジ１７０及び／又はチャネル１７５は、細胞培養容器１００の一体的な構成要素として形成（例えば製造）することができる。あるいは、幾つかの実施形態では、フランジ１７０及び／又はチャネル１７５は、例えば、既存の細胞培養容器を改造することによって、本開示の実施形態によるフランジ１７０及びチャネル１７５の１つ以上の特徴を既存の細胞培養容器に提供するために、細胞培養容器１００に取り付けることができる、別個の構成要素として提供することができる。実施形態では、マイクロキャビティのアレイ１１５は、容器の底部１０８の内部表面２０８と一体化している。図４に示されるように、マイクロキャビティのアレイは、インサート、フラスコに導入された又はフラスコに固定された別個の材料によって提供することができる。例えば、マイクロキャビティのアレイ１１５を有する基板を細胞培養容器１００に挿入し、細胞培養容器の底面に置くか、あるいは接着、レーザー溶接、超音波溶接、又は他の幾つかの方法によって細胞培養容器の底面に固定することができる。
【００２１】
図５は、実施形態における容器の上面図である。図５は、実施形態では、フランジ１７０がマイクロキャビティアレイ１１５を取り囲み、チャネル１７５がフランジ１７０を取り囲むことを示している。
【００２２】
図６〜８は、本開示の実施形態による複数のマイクロキャビティ１２０を有する基板を示す、図５のビュー６による細胞培養容器の一部の拡大概略図、図６の線７に沿った上面斜視図及び断面斜視図（図７及び図８）を示している。図６〜８に示されるように、幾つかの実施形態では、複数のマイクロキャビティ１２０の各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃを画成する凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃを含みうる（図７及び図８参照）。さらには、各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、液体及び細胞がマイクロウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに入ることを可能にする開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃを（例えば、基板１１５の第１の側１２５に）含むことができる。図７に示されるように、幾つかの実施形態では、基板１１５の第１の側１２５は、非線形（例えば、波状、正弦波）のプロファイルを含むことができ、基板１１５の第２の側１２６は、平面（例えば、平坦な）プロファイルを含むことができる。同様に、図８に示されるように、幾つかの実施形態では、基板１１５の第１の側１２５及び第２の側１２６はいずれも、非平面（例えば、波状、正弦波）のプロファイルを含みうる。
【００２３】
基板１１５の第１の側１２５が非線形（例えば、波状、正弦波）プロファイルを含み、基板１１５の第２の側１２６が平面（例えば、平坦）プロファイルを含む図７に示される基板１１５を、基板１１５の第１の側１２５及び第２の側１２６のいずれも非平面（例えば、波状、正弦波）のプロファイルを含む図８に示される基板１１５と比較すると、幾つかの実施形態では、基板１１５の第１の側１２５及び第２の側１２６のいずれも非平面（例えば、波状、正弦波）のプロファイルを含む基板１１５の厚さを低減することができることがわかる。したがって、幾つかの実施形態では、基板１１５の第１の側１２５及び第２の側１２６の両方に非平面（例えば、波状、正弦波）のプロファイル（図８）を提供することにより、基板１１５の製造に用いられる材料の量を減らすことができ、例えば、基板１１５の第１の側１２５は非線形（例えば、波状、正弦波）プロファイルを含み、基板１１５の第２の側１２６は平面（例えば、平坦）プロファイルを含む（図７）マイクロキャビティアレイ１１５を有する基板よりも壁が薄いマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃを含むマイクロキャビティアレイ１１５を有する基板を提供することができる。幾つかの実施形態では、壁がより薄いマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、細胞培養中にウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに出入りするガスをより多く提供するように、基板のより高速でのガス移動（例えば、透過性）を可能にすることができる。したがって、幾つかの実施形態では、基板１１５の第１の側１２５及び第２の側１２６の両方に非平面（例えば、波状、正弦波）プロファイル（図８）を提供することにより、より健康な細胞培養環境をもたらすことができ、それによって、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内での細胞の培養を改善することができる。
【００２４】
幾つかの実施形態では、基板１１５は、ポリスチレン、ポリメチルメタクリレート、ポリ塩化ビニル、ポリカーボネート、ポリスルホン、ポリスチレン共重合体、フッ素重合体、ポリエステル、ポリアミド、ポリスチレンブタジエン共重合体、完全水素化スチレン重合体、ポリカーボネートＰＤＭＳ共重合体、並びにポリエチレン、ポリプロピレン、ポリメチルペンテン、ポリプロピレン共重合体、及び環状オレフィン共重合体などのポリオレフィンを含むがこれらに限定されない、ポリマー材料を含みうる。加えて、幾つかの実施形態では、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃによって画成されるウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの少なくとも一部を超低結合材料でコーティングすることができ、それによってウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの少なくとも一部を細胞に対して非付着性にすることができる。例えば、幾つかの実施形態では、過フッ素化ポリマー、オレフィン、アガロース、ポリアクリルアミドなどの非イオン性ヒドロゲル、ポリエチレンオキシドなどのポリエーテル、ポリビニルアルコールなどのポリオール、又はそれらの混合物のうちの１つ以上を、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃによって画成されるウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの少なくとも一部に適用することができる。
【００２５】
さらには、幾つかの実施形態では、複数のマイクロキャビティ１２０の各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、本開示の範囲から逸脱することなく、さまざまな特徴及びそれらの特徴の変形を含むことができる。例えば、幾つかの実施形態では、複数のマイクロキャビティ１２０は、線形アレイ（図示）、対角アレイ、長方形アレイ、円形アレイ、放射状アレイ、六角形最密配置などを含むアレイ状に配置することができる。加えて、幾つかの実施形態では、開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、さまざまな形状を含みうる。幾つかの実施形態では、開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、円、楕円、長方形、四辺形、六角形、及び他の多角形形状のうちの１つ以上を含みうる。加えて、幾つかの実施形態では、開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、約１００マイクロメートル（μｍ）〜約５０００μｍの寸法（例えば、直径、幅、正方形又は長方形の対角線など）を含むことができる。例えば、幾つかの実施形態では、開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃは、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、９５０μｍ、１０００μｍ、１５００μｍ、２０００μｍ、２５００μｍ、３０００μｍ、３５００μｍ、４０００μｍ、４５００μｍ、５０００μｍの寸法、及び約１００μｍ〜約５０００μｍの範囲内に包含される寸法のうち任意の寸法又は範囲を含みうる。
【００２６】
幾つかの実施形態では、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃによって画成されるウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃは、さまざまな形状を含みうる。幾つかの実施形態では、凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃによって画成されるウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃは、円形、楕円形、放物線、双曲線、山形、傾斜、又は他の断面輪郭形状の１つ以上を含みうる。加えて、幾つかの実施形態では、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの深さ（例えば、開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃによって画成される平面から凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃまでの深さ）は、約１００マイクロメートル（μｍ）〜約５０００μｍの寸法を含みうる。例えば、幾つかの実施形態では、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの深さは、１００μｍ、１５０μｍ、２００μｍ、２５０μｍ、３００μｍ、３５０μｍ、４００μｍ、４５０μｍ、５００μｍ、５５０μｍ、６００μｍ、６５０μｍ、７００μｍ、７５０μｍ、８００μｍ、８５０μｍ、９００μｍ、９５０μｍ、１０００μｍ、１５００μｍ、２０００μｍ、２５００μｍ、３０００μｍ、３５００μｍ、４０００μｍ、４５００μｍ、５０００μｍの寸法、約１００μｍ〜約５０００μｍの範囲内に包含される寸法のうちの任意の寸法又は範囲を含みうる。
【００２７】
幾つかの実施形態では、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で培養することができる三次元細胞１５０（例えば、スフェロイド、オルガノイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ）は、約５０μｍ〜約５０００μｍの寸法（例えば直径）、及び約５０μｍ〜約５０００μｍの範囲内に包含される寸法のうちの任意の寸法又は範囲を含みうる。幾つかの実施形態では、開示された明示的寸法よりも大きい又は小さい寸法を提供することができ、したがって、特に明記しない限り、開示された明示的寸法よりも大きい又は小さい寸法は本開示の範囲内であるとみなされる。例えば、幾つかの実施形態では、開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃの１つ以上の寸法、ウェル１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの深さ、及び三次元細胞１５０（例えば、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ）の寸法は、本開示の範囲から逸脱することなく、開示された明示的寸法よりも大きい又は小さい場合がある。
【００２８】
フランジ１７０及びチャネル１７５の例示的な部分を含む、図５の線９に沿った細胞培養容器１００の拡大図が図９に示されている。例えば、幾つかの実施形態では、フランジ１７０は、複数のマイクロキャビティ１２０の各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃの凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃ（図６〜８参照）から離れる方向にチャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３まで、基板１１５から延在する内面１７１を含みうる。図５に戻ると、幾つかの実施形態では、内面１７１は複数のマイクロキャビティ１２０のすべてのマイクロキャビティを取り囲むことができる；しかしながら、幾つかの実施形態では、内面１７１は、複数のマイクロキャビティ１２０のすべてより少ない（例えば、少なくとも一部の）マイクロキャビティを取り囲みうる。同様に、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６は、内面１７１全体を取り囲むことができる；しかしながら、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６は、全体より少ない（例えば、少なくとも一部の）内面１７１を取り囲みうる。
【００２９】
図９に示されるように、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３は、複数のマイクロキャビティ１２０の各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃの凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃ（図６〜８参照）から離れる方向に、基板１１５の一部分１２３から距離「ｄ８」だけ離間されうる。幾つかの実施形態では、距離「ｄ８」は、約２ミリメートル（ｍｍ）〜約８ｍｍ、例えば、約４ｍｍ〜約８ｍｍの範囲内でありうるが、他の実施形態では、他の値（例えば、２ｍｍ未満又は８ｍｍ超）が、本開示の範囲から逸脱することなく、提供されうる。加えて、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３は、基板１１５の一部分１２３に向かう方向に、壁１０１の内面１０２から距離「ｄ９」だけ離間されうる。したがって、幾つかの実施形態では、チャネル１７５の開口部１７６は、端部壁１０７の内面２０７と周囲１７３との間に画成されうる。幾つかの実施形態では、チャネル１７５は、複数のマイクロキャビティ１２０の各マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃの凹面１２１ａ、１２１ｂ、１２１ｃ（図６〜８参照）に向かう方向にチャネル１７５のベース１７４までチャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３から延在する外面１７２を含みうる。図５に示されるように、幾つかの実施形態では、外面１７２は、複数のマイクロキャビティ１２０のすべてのマイクロキャビティを取り囲むことができる；しかしながら、幾つかの実施形態では、外面１７２は、複数のマイクロキャビティ１２０のすべてよりも少ない（例えば、少なくとも一部の）マイクロキャビティを取り囲んでもよい。同様に、幾つかの実施形態では、チャネル１７５のベース１７４は、外面１７２全体を取り囲むことができる；しかしながら、幾つかの実施形態では、チャネル１７５のベース１７４は、全体より少ない（例えば、少なくとも一部の）外面１７２を取り囲んでもよい。
【００３０】
これより、フランジ１７０とチャネル１７５とを備えた細胞培養容器１００内で細胞を培養する方法を、図１０〜１７を参照して説明する。例えば、図１０に示されるように、幾つかの実施形態では、本方法は、所定量の液体１８０の液体がチャネル１７５に接触することなく、細胞培養チャンバ１０３の領域１４２に所定量の液体１８０を収容することを含みうる。幾つかの実施形態では、領域１４２は、少なくとも一部にはフランジ１７０及び基板１１５に基づいて画成されうる。例えば、幾つかの実施形態では、領域１４２は、少なくとも一部にはフランジ１７０の内面１７１及び基板１１５の一部分１２３に基づいて画成されうる。幾つかの実施形態では、本方法のこの段階で、所定量の液体１８０の液体がチャネル１７５に接触するのを防ぐことにより、例えば、細胞１５０の改善された培養を促進する幾つかの利点を提供することができる。例えば、幾つかの実施形態では、所定量の液体１８０の少なくとも一部は、液体に懸濁された固体粒子（例えば、細胞）を含む液体を含む培養溶液又は培地を含みうる。したがって、幾つかの実施形態では、本方法は、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃに所定量の液体１８０の液体１４０（図１０参照）を堆積させること、及び少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内に液体１４０を堆積させた後に、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０（例えば、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ）を培養することを含みうる。専ら説明を目的として、特に明記しない限り、幾つかの実施形態では、基板１１５の１つ以上の特徴（図６〜８参照）は、本開示の範囲から逸脱することなく、単独で又は第１の例示的な細胞培養容器１００の１つ以上の特徴と組み合わせて提供することができるという理解の下で、複数のマイクロキャビティ１２０を含むマイクロキャビティのアレイ１１５の構造は、図１０〜１７では省略されている。
【００３１】
図９に戻ると、幾つかの実施形態では、フランジ１７０の内面１７１は、垂直方向を含むことができる（例えば、実質的に重力方向に延在する）；しかしながら、幾つかの実施形態では、内面１７１を重力方向に対して傾斜させて、例えば、細胞をマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃの開口部１２３ａ、１２３ｂ、１２３ｃに向けることができる（図６〜８を参照）。さらには、幾つかの実施形態では、マイクロキャビティ１２０ａの開口部１２３ａは、例えば、フランジ１７０の内面１７１に当接するように配置することができる。例えば、幾つかの実施形態では、チャネル１７５のベース１７４を含むがこれに限定されない容器１００の表面に定着又は付着することなく、液体に懸濁した細胞が（例えば少なくとも重力に基づいて）落下し及び／又は内面１７１によってマイクロキャビティ１２０ａのリザーバ１２２ａへと導かれるように、マイクロキャビティ１２０ａの開口部１２３ａは、フランジ１７０の内面１７１と同一平面にすることができる。
【００３２】
幾つかの実施形態では、チャネル１７５のベース１７４を含むがこれに限定されない容器１００の表面に定着又は付着する細胞は、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃの外側に蓄積及び成長（例えば増殖）する場合があり、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内の三次元細胞の所望の成長に関する問題を引き起こしうる。例えば、幾つかの実施形態では、リザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに（少なくとも重力に基づいて）落下せず、チャネル１７５のベース１７４を含むがこれに限定されない容器１００の他の表面に蓄積又は付着する細胞は、リザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの外側で成長し、リザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内での三次元細胞の所望の成長を妨害（例えば、阻止、変更、減速、又は防止）しうる。同様に、幾つかの実施形態では、チャネル１７５のベース１７４を含むがこれに限定されない容器１００の他の表面に蓄積又は付着する細胞は、成長し、リザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内の三次元細胞を移動させる可能性があり、それによってリザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃ内の三次元細胞の所望の成長を攪乱又は破壊し、細胞の所望のサイズ均一性を変えてしまう場合がある。したがって、幾つかの実施形態では、所定量の液体１８０の液体がチャネル１７５に接触することなく、細胞培養チャンバ１０３の領域１４２に所定量の液体１８０を含めることにより、液体内に浮遊しているすべての細胞をリザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃに向けることができ、それによって、チャネル１７５のベース１７４を含むがこれに限定されないリザーバ１２２ａ、１２２ｂ、１２２ｃの外側の容器１００の表面に細胞が付着した場合に起こりうる問題を軽減及び排除することができる。
【００３３】
したがって、幾つかの実施形態では、本方法は、フランジ１７０によって取り囲まれたマイクロキャビティのアレイ１１５に所定量の液体１８０の液体１４０（図１０参照）を堆積させることを含みうる。このように、マイクロキャビティのアレイ１１５上に液体１４０を堆積させた後に、マイクロキャビティアレイ１１５内の複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０（例えば、図７及び図８に示されるスフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃ）を培養するために増殖を促進させる。さらには、幾つかの実施形態では、培養中に、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃは、培地（例えば、食物、栄養素）を消費し、副産物として代謝産物（例えば、老廃物）を生成しうる。したがって、幾つかの実施形態では、培養中に食物培地を細胞培養チャンバ１０３に添加することができ、培養中に細胞培養チャンバ１０３から廃培地を除去することができる。以下にさらに詳細に説明するように、幾つかの実施形態では、培地を添加及び除去する際に、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃからのスフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃの移動を回避し、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃの所望の細胞培養を促進する試みを行うことができる。 
【００３４】
さらには、幾つかの実施形態では、基板１１５の単位面積（例えば、１つ以上の細胞を培養できる、それぞれの表面を提供する単位面積）に関して、三次元細胞培養は、例えば同等の二次元細胞培養よりも多くの培地（例えば、食物、栄養素）を消費し、副産物としてより多くの培地（例えば、老廃物）を生成する。したがって、幾つかの実施形態では、例えば、同等の二次元細胞培養と比較して、本開示の実施形態による三次元細胞培養は、同等の期間にわたり、より頻繁な培地交換（例えば、食物、栄養素の添加及び／又は老廃物の除去）を含みうる。加えて又は代替的に、幾つかの実施形態では、例えば、同等の二次元細胞培養と比較して、本開示の実施形態による三次元細胞培養は、同等の期間にわたり、より大きい培地体積（例えば、より多くの食物、栄養素の消費、及び／又はより多くの老廃物の生成）を含みうる。したがって、幾つかの実施形態では、以下にさらに詳細に説明するように、細胞培養容器１００及び該細胞培養容器１００内で細胞を培養する方法１５０の１つ以上の特徴は、培地交換の頻度並びに培地の体積（容器１００の細胞培養チャンバ１０３内に含まれるもの、細胞培養チャンバ１０３に添加されるもの、及び細胞培養チャンバ１０３から除去されるもののうちの１つ以上でありうる）に関して利点を提供することができ、それによって、三次元細胞を培養するための望ましい効果的な環境をもたらすことができる。
【００３５】
例えば、図１１に示されるように、幾つかの実施形態では、本方法は、分配ポート１８１を開口１０５に挿入することにより、容器１００の外側から細胞培養チャンバ１０３に物質（例えば、食物、栄養素）を加えること、及び物質１８２を分配ポートからチャネル１７５の開口部１７６に分配することを含みうる。加えて、幾つかの実施形態では、本方法は、分配ポート１８１を開口１０５に挿入することにより、容器１００の外側から細胞培養チャンバ１０３に物質（例えば、食物、栄養素）を加えること、及び、所定量の液体１８０の液体がチャネル１７５に接触することなく、細胞培養チャンバ１０３の領域１４２に所定量の液体１８０を収容した後、物質１８２を分配ポートからチャネル１７５の開口部１７６に分配することを含みうる。したがって、幾つかの実施形態では、本方法は、分配ポート１８１からチャネル１７５の開口部１７６内へと物質１８２を分配しつつ、少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０内で細胞１５０を培養することを含みうる。
【００３６】
図１２は、例えば、所定量の液体１８０に含まれる細胞１５０に、培養している間に細胞１５０が消費しうる食物培地を提供するために、細胞培養チャンバ１０３に加えられる物質１８２を概略的に示している。同様に、図１２に示されるように、幾つかの実施形態では、本方法は、回収ポート１８３を開口１０５に挿入することによって、細胞培養チャンバ１０３から容器１００の外側に物質（例えば、老廃物）を除去すること、及び回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収することを含みうる。加えて、幾つかの実施形態では、本方法は、回収ポート１８３を開口１０５に挿入することにより、細胞培養チャンバ１０３から物質（例えば、老廃物）を除去すること、及び物質（例えば、食物、栄養素）を細胞培養チャンバ１０３に加えた後に、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収することを含みうる。したがって、幾つかの実施形態では、本方法は、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収しつつ、複数のマイクロキャビティ１２０のうちの少なくとも１つのマイクロキャビティ（図７及び図８参照）内で細胞１５０を培養することを含みうる。
【００３７】
図１３は、例えば、所定量の液体１８０及び物質１８２から、培養している間に細胞１５０が生成しうる廃培地を除去するために、細胞培養チャンバ１０３から除去される物質１８４を概略的に示している。例えば、幾つかの実施形態では、培養中に、細胞１５０は、細胞培養チャンバ１０３に加えられた食物培地（例えば、物質１８２）のすべて又は一部を消費することができ、細胞培養チャンバ１０３から除去される廃培地（例えば、物質１８４）のすべて又は一部を生成（例えば、副産物として代謝）しうる。幾つかの実施形態では、細胞１５０を培養している間に、食物培地１８２を細胞培養チャンバ１０３に加え（図１１及び図１２参照）、細胞培養チャンバ１０３から廃培地１８４を除去する（図１２及び図１３参照）方法により、細胞１５０を培養できる健康的な環境をもたらすことができる。例えば、幾つかの実施形態では、食物培地１８２を細胞培養チャンバ１０３に加え（図１１及び図１２参照）、細胞培養チャンバ１０３から廃培地１８４を除去する（図１２及び図１３参照）本開示の実施形態による方法は、食物培地が添加されていない又は廃培地が除去されていない細胞培養環境と比較して、少なくとも一部には、細胞培養プロセスの品質、期間、及び有効性の１つ以上を増加させることができる。同様に、幾つかの実施形態では、容器１００の１つ以上の特徴並びに食物培地１８２を細胞培養チャンバ１０３に加え（図１１及び図１２参照）、細胞培養チャンバ１０３から廃培地１８４を除去する（図１２及び図１３参照）本開示の実施形態による方法は、例えば、本開示の１つ以上の特徴を含まない細胞培養容器、並びに本開示の１つ以上のステップを含まない方法と比較して、少なくとも一部には、培地の体積（細胞培養プロセス中に容器１００の細胞培養チャンバ１０３内に含まれるもの、細胞培養チャンバ１０３に加えられるもの、及び細胞培養チャンバ１０３から除去されるもののうちの１つ以上でありうる）に関してより頻繁に、より効果的に行うことができる。
【００３８】
加えて、幾つかの実施形態では、本方法は、容器１００を移動させること、及び回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収することを含みうる。例えば、幾つかの実施形態では、容器１００を移動させることは、容器１００を、第１の配向（例えば、図１３に提供される配向）から第２の配向（例えば、図１４に提供される配向）へと平行移動させること及び回転させることの少なくとも一方を含みうる。幾つかの実施形態では、第１の配向（例えば、図１３に提供される配向）は、重力方向「ｇ」に対してほぼ垂直に延びる軸１１０を容器１００に提供することができるが、第１の配向を画成する他の実施形態では、重力方向「ｇ」に対して他の配向の軸１１０を提供することができる。同様に、幾つかの実施形態では、第２の配向（例えば、図１４に提供される配向）は、重力方向「ｇ」に対して実質的に非垂直な角度で延びる軸１１０を容器１００に提供することができるが、第２の配向を画成する他の実施形態では、重力方向「ｇ」に対して他の配向の軸１１０を提供することができる。
【００３９】
幾つかの実施形態では、第１の配向は、第２の配向によって提供される重力方向「ｇ」に対する軸１１０の第２の角度とは異なる、重力方向「ｇ」に対する第１の角度で軸１１０を提供することができる。加えて、幾つかの実施形態では、細胞培養チャンバ１０３の領域１４２に所定量の液体１８０を含む（図１０参照）、物質１８２を細胞培養チャンバ１０３に追加する（図１１参照）、及び細胞培養チャンバ１０３から物質１８４を除去する（図１２及び図１３参照）のうちの１つ以上の間に、容器１００の軸１１０は、重力方向「ｇ」にほぼ垂直に延在しうる。例えば、幾つかの実施形態では、容器１００は、例えば、重力方向「ｇ」に垂直な主面を画成する水平面（図示せず）上に配置することができ、容器１００の軸１１０は、重力方向「ｇ」に対して水平面（図示せず）の主面にほぼ平行に延在している。加えて又は代替的に、幾つかの実施形態では、容器１００は、重力方向「ｇ」に対してほぼ垂直に延在する軸１１０を有する１つ以上の構造（例えば、フレーム、マウント、人間の手など）によって支持（例えば、保持、懸架）することができる。同様に、幾つかの実施形態では、例えば、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収する前及び／又はその最中に容器１００（図１４参照）を移動した結果として、容器１００は、重力方向「ｇ」に対して実質的に非垂直な角度で延在する軸１１０を有する１つ以上の構造（例えば、フレーム、マウント、人間の手など）によって支持（例えば、保持、懸架）することができる。
【００４０】
したがって、図１４に概略的に示されるように、幾つかの実施形態では、本方法は、容器１００を動かすこと、並びに所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部が領域１４２からフランジ１７０を越えて（例えば、チャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３を越えて）流れ、チャネル１７５内に堆積するようにすることを含みうる。例えば、幾つかの実施形態では、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収する間（図１３参照）、少なくとも一部には、領域１４２内の所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部がチャネル１７５に流入するのを防ぐ容器１００の配向及びフランジ１７０の存在に基づいて、所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部を細胞培養チャンバ１０３の領域１４２内に維持することができる。したがって、幾つかの実施形態では、容器１００を動かして、所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部が領域１４２からフランジ１７０を越えて流れ、チャネル１７５内に堆積するようにすることにより、老廃物１８４の除去を制御することができ、幾つかの実施形態では、例えば、容器１００を動かさない方法と比較して増加させることができる。幾つかの実施形態では、容器１００の第２の配向によって画成される重力方向「ｇ」に対する軸１１０の角度（図１４参照）は、例えば、所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部が領域１４２からフランジ１７０を越えて流れ、複数のマイクロキャビティ１２０内で培養されている細胞１５０が移動することなくチャネル１７５内に堆積し、それによって細胞培養プロセスを改善するように選択することができる。
【００４１】
したがって、幾つかの実施形態では、本開示の実施形態による容器１００を動かして、所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部が領域１４２からフランジ１７０を越えて流れ、チャネル１７５内に堆積するようにすること、並びに、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収することにより、容器１００を動かさない（例えば、静止したままの）方法を含むがこれに限定されない他の方法と比較して、細胞培養チャンバ１０３からすべて又は少なくともより多くの量の老廃物１８４を除去することができる。幾つかの実施形態では、容器１００の軸１１０の配向（例えば、重力方向「ｇ」に対する）は、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収している間、ある持続期間にわたり、変化しないままでありうる。あるいは、幾つかの実施形態では、容器１００の軸１１０の配向（例えば、重力方向「ｇ」に対する）は、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収している間、ある持続期間内に１回以上変更することができる。
【００４２】
加えて、図１５に示されるように、幾つかの実施形態では、本方法は、分配ポート１８１を開口１０５に挿入することにより、細胞培養チャンバ１０３に物質（例えば、食物、栄養素）を加えること、及び細胞培養チャンバ１０３から物質１８４（例えば、老廃物）を除去した後に、物質１８５を分配ポートからチャネル１７５の開口部１７６に分配すること（図１２〜１４参照）を含みうる。例えば、図１５は、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収した後（図６９参照）及び容器１００を動かして、所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部を領域１４２からフランジ１７０を越えて流れるようにし、チャネル１７５内に堆積させた後（図１４参照）に、細胞培養チャンバ１０３から除去された老廃物１８４を概略的に示している。幾つかの実施形態では、添加物質１８５は、例えば、細胞１５０が消費及び／又は枯渇させた食物及び栄養素を細胞培養環境に補充することができる。したがって、幾つかの実施形態では、物質１８２及び物質１８５は、容器１００内で行われている細胞の培養タイプに応じて、同じ又は同様の組成物を含んでいても、異なる組成物を含んでいてもよい。さらには、幾つかの実施形態では、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃが培地（例えば、食物、栄養素）を継続的に（例えば、繰り返し）消費し、及び／又は細胞培養プロセス中の副産物として代謝物（例えば、老廃物）を生成するため、細胞１５０を培養している間に、物質１８２（例えば、食物、栄養素）を加える（図１１参照及び図１２）、物質１８４（例えば、老廃物）を除去する（図１２〜１４参照）、及びさらなる物質１８５（例えば、食物、栄養素）を加える（図１５参照）方法を、１回又は複数回、選択的に実行することができる。
【００４３】
幾つかの実施形態では、フランジ１７０及びチャネル１７５の１つ以上の特徴は、培地を加える際及び除去する際に利点を提供し（図１１〜１５参照）、マイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃからのスフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃの移動を回避し、スフェロイド１５０ａ、１５０ｂ、１５０ｃの所望の細胞培養を促進することができる（図７及び図８参照）。例えば、図１６は、開口１０５に分配ポート１８１を挿入することにより、物質１８５（例えば、食物、栄養素）を加え、分配ポート１８１からチャネル１７５の開口部１７６に物質１８５を分配する方法を含む、図１５のビュー１６による細胞培養容器１００の一部の拡大概略図を示している。同様に、図１７は、開口１０５に回収ポート１８３を挿入することにより、細胞培養チャンバ１０３から物質１８４（例えば、老廃物）を取り出し、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収する方法を含む、図１２のビュー１４による細胞培養容器１００の一部の拡大概略図を示している。
【００４４】
図１６に示されるように、幾つかの実施形態では、開口１０５に分配ポート１８１を挿入することにより、物質１８５（例えば、食物、栄養素）を加えて、分配ポートからチャネル１７５の開口部１７６に物質１８５を分配する方法は、第１の流路１８５ａ、１８５ｂに沿った物質１８５の流れを妨げることを含みうる。例えば、幾つかの実施形態では、第１の流路１８５ａ、１８５ｂに沿った流れを妨げることは、フランジ１７０で第１の流路１８５ａ、１８５ｂに沿って流れをそらすことを含みうる。幾つかの実施形態では、フランジ１７０で第１の流路１８５ａ、１８５ｂに沿って流れをそらすことは、例えば、第１の流路１８５ａに沿ってチャネル１７５を物質１８５で満たし、次に、チャネル１７５から細胞培養チャンバ１０３の領域１４２に第１の流路１８５ｂに沿って物質１８５を流すことを含みうる。例えば、幾つかの実施形態では、物質１８５は、分配ポート１８１からチャネル１７５の開口部１７６に分配されて、チャネル１７５のベース１７４からチャネル１７５の外面１７２に沿ったチャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３まで、第１の流路１８５ａに沿って、チャネル１７５を物質１８５で徐々に満たすことができる。加えて、幾つかの実施形態では、チャネル１７５が物質１８５で満たされると、物質１８５は、チャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３を越えて、第１の流路１８５ｂに沿って細胞培養チャンバ１０３の領域１４２に流れ込むことができる。
【００４５】
したがって、幾つかの実施形態では、物質１８５が分配ポート１８１からチャネル１７５の開口部１７６に分配される間に、領域１４２の少なくとも一部（少なくとも一部にはフランジ１７０の内面１７１及び基板１１５の一部分１２３に基づいて画成される）並びに細胞培養チャンバ１０３の少なくとも一部を物質１８５で徐々に満たすことができる。物質１８５を細胞培養チャンバ１０３に加えることに関して説明されているが、特に明記しない限り、領域１４２の少なくとも一部（少なくとも一部にはフランジ１７０の内面１７１及び基板１１５の一部分１２３に基づいて画成される）並びに細胞培養チャンバ１０３の少なくとも一部は、図１１に示されるように、物質１８２が分配ポート１８１からチャネル１７５の開口部１７６に分配される間に、物質１８２で徐々に満たすことができるものと理解されたい。
【００４６】
同様に、図１７に示されるように、幾つかの実施形態では、開口１０５に回収ポート１８３を挿入することにより、細胞培養チャンバ１０３から物質（例えば、老廃物）を取り出し、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収する方法は、第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿って物質１８４の流れを妨げることを含みうる。例えば、幾つかの実施形態では、第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿って流れを妨げることは、フランジ１７０で第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿って流れをそらすことを含みうる。幾つかの実施形態では、フランジ１７０で第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿って流れをそらすことは、例えば、第２の流路１８４ｂに沿って物質１８４を流しつつ、第２の流路１８４ａに沿ってチャネル１７５から物質１８４を除去することを含みうる。幾つかの実施形態では、第２の流路１８４ｂは、細胞培養チャンバ１０３の領域１４２からチャネル１７５内へと延びうる。加えて又は代替的に、例えば、少なくとも一部には細胞培養チャンバ１０３内に含まれる物質１８０、１８２、１８４の体積に基づいて、幾つかの実施形態では、第２の流路１８４ｂは、細胞培養チャンバ１０３（例えば、領域１４２の外側）からチャネル１７５内へと延びうる。
【００４７】
したがって、幾つかの実施形態では、物質１８４は、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から回収することができ、第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿ってチャネル１７５から物質１８４を徐々に除去することができる。加えて、幾つかの実施形態では、例えば、容器１００を動かして、所定量の液体１８０及び添加物質１８２（老廃物１８４を含む）の少なくとも一部を領域１４２からフランジ１７０を越えて流し、チャネル１７５内に堆積させた後（図１４参照）、回収ポート１８３を用いてチャネル１７５から物質１８４を回収することができ、第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿ったチャネル１７５から物質１８４を徐々に除去することができる。例えば、物質１８４は、チャネル１７５の開口部１７６の周囲１７３からチャネル１７５の外面１７２に沿ってチャネル１７５のベース１７４まで、第２の流路１８４ａに沿ってチャネル１７５から徐々に除去することができる。したがって、幾つかの実施形態では、物質１８４がチャネル１７５から回収ポート１８３を用いて回収される間に、細胞培養チャンバ１０３の少なくとも一部並びに領域１４２（少なくとも一部にはフランジ１７０の内面１７１及び基板１１５の一部分１２３に基づいて画成される）の少なくとも一部から、物質１８４を徐々に除去することができる。
【００４８】
幾つかの実施形態では、複数のマイクロキャビティ１２０の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で細胞１５０を培養しつつ、フランジ１７０で第１の流路１８５ａ、１８５ｂに沿った物質１８５の流れを妨げ、フランジ１７０で第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿った物質１８４の流れを妨げることにより、細胞１５０の培養に干渉することなく、容器１００の細胞培養チャンバ１０３から物質をそれぞれ追加及び除去することができる。例えば、図１６に示されるように、幾つかの実施形態では、分配ポート１８１は、第１の流路１８５ａ、１８５ｂに沿ってある速度で物質１８５を分配ポート１８１からチャネル１７５に流す（例えば、分配、吹き込み、吸引する）ことにより、細胞培養チャンバ１０３に材１８５を加えることができ、それによって、チャネル１７５内及びその周囲に正の圧力を生成しうる。同様に、図１７に示されるように、幾つかの実施形態では、回収ポート１８３は、チャネル１７５から回収ポート１８３に第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿ってある速度で物質を流す（例えば、回収する、吸引する）ことにより、細胞培養チャンバ１０３から物質１８４を除去することができ、それによってチャネル１７５内及びその周囲に負圧が生成しうる。したがって、幾つかの実施形態では、フランジ１７０は、それぞれ、第１の流路１８５ａ、１８５ｂ及び第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿って流れる物質１８５、１８４の速度を遅くすることができ、それによって、チャネル１７５内及びその周囲の正の圧力及び負の圧力をそれぞれ減少させることができる。
【００４９】
例えば、幾つかの実施形態では、開口１０５に分配ポート１８１を挿入することによって、細胞培養チャンバ１０３に物質（例えば、食物、栄養素）を加え、分配ポートからチャネル１７５の開口部１７６に物質１８５を分配する（図１６参照）方法は、例えば、フランジ１７０及びチャネル１７５の１つ以上の特徴を含まない方法又は細胞培養容器と比較して、細胞培養チャンバ１０３に物質１８５のゆっくりとした連続的な制御された（例えば、乱流のない）流れを提供することができる。同様に、幾つかの実施形態では、開口１０５に回収ポート１８３を挿入することにより、細胞培養チャンバ１０３から物質（例えば、老廃物）を取り出し、チャネル１７５から物質１８４を回収する（図１７参照）方法は、例えば、フランジ１７０及びチャネル１７５の１つ以上の特徴を含まない方法又は細胞培養容器と比較して、細胞培養チャンバ１０３からの物質１８４のゆっくりとした連続的な制御された（例えば、乱流のない）流れを提供することができる。第１の流路１８５ａ、１８５ｂ及び第２の流路１８４ａ、１８４ｂに沿ってそれぞれ流れる物質１８５、１８４の速度を低下させることにより、幾つかの実施形態では、フランジ１７０及びチャネル１７５は、したがって、複数のマイクロキャビティ１１５の少なくとも１つのマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃ内で培養されている細胞１５０が移動するのを防ぐことができる。例えば、幾つかの実施形態では、物質の流れによって１つ以上の細胞１５０が移動する場合、１つ以上のマイクロキャビティ１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃは、複数のスフェロイドを含んでも、スフェロイドを含まなくてもよい。したがって、幾つかの実施形態では、本開示の方法及び実施形態に従って、少なくとも一部にはフランジ１７０及びチャネル１７５の１つ以上の特徴に基づいて、物質のゆっくりとした連続的な制御された（例えば、乱流のない）流れを提供することによって、容器１００内で培養されている細胞１５０が移動する可能性を低減することができ、より質の高い細胞培養及び細胞培養に関するより正確な科学的結果を得ることができる。
【実施例】
【００５０】
実施例１：細胞増殖
結腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６を、完全なマッコイ５ａ培地（１０単位／ｍＬのペニシリン／１０μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを含む１０％ウシ胎児血清）のフラスコで約８０％コンフルエンシーまで増殖させ、トリプシン処理して表面から細胞を分離させた。次に、細胞をカウントし、マイクロキャビティあたり１０００細胞の最終細胞濃度で完全なマッコイ培地に再懸濁した（Ｔ−７５マイクロキャビティフラスコでは、約６．５×１０５細胞／ｍＬの最終濃度で１５ｍＬの細胞を加える）。細胞がマイクロキャビティフラスコの表面に定着するように、マイクロキャビティフラスコを室温に置く。室温でのインキュベーション後、実験期間中に、フラスコを５％ＣＯ２及び９５％相対湿度の３７℃インキュベータに入れる。スフェロイドの形成は最初の２４時間以内に起こる。
【００５１】
対照フラスコ：ＨＴＣ１１６細胞を、フラスコの底面を切り取り、マイクロキャリアのアレイを有する物質をフラスコの底部に付着させることにより調製したＴ７５フラスコに播種した。フラスコが切り取られたため、材料の「へり」がフラスコの底面の内周に残った。マイクロキャビティのアレイの周囲のこの平坦な表面は、対照容器での培養中に存在していた。
【００５２】
実験フラスコ：ＨＴＣ１１６細胞を、例えば図４及び５に示されるフランジ及びチャネル構造を有するＴ７５フラスコにも播種した。
【００５３】
浮遊細胞を含む培地を内側の領域に加えた後、フラスコを室温で１５分間、静的条件下に置き、細胞をマイクロウェルに定着させた。この１５分間のインキュベーションのステップは、均一な細胞播種を確実にし、その後のインキュベータチャンバへの容器の配置時のエッジ効果を最小限に抑えるために、細胞培養生物学研究室で用いられる。細胞がマイクロキャビティ内に定着した後、追加量の細胞培養培地をフラスコに加えた。対照フラスコでは、培地をピペットでフラスコの底面の中心中央（mid-center）に加えた。実験フラスコでは、例えば、図１６に示すように培地を加えた。次いで、フラスコを細胞培養インキュベータに入れ、１４日間培養した。この培養期間中に、９０％の培地交換効率で合計７回の培地交換を行った。
【００５４】
図１８Ａは、対照Ｔ７５フラスコ内で増殖したスフェロイドの写真である。スフェロイドは不規則であり、一部のマイクロキャビティから欠落している（培地交換中に外れた可能性がある）。加えて、図３Ａ及び３Ｂに示されるような不規則な細胞集塊が、対照フラスコに見られた。図１８Ｂは、１４日間の培養後の実験フラスコ内のスフェロイドを示す写真である。スフェロイドはサイズが似ているように見え、すべてのウェルがスフェロイドで満たされている。図１８Ｂは、培地交換を伴う実験計画に従って組み立てられたフラスコ内での１００％のスフェロイドの保持を実証している。
【００５５】
１４日間の培養後、対照フラスコ（図１９Ａ及び１９Ｂ）及び例えば図４の実験フラスコ（図１９Ｃ及び図１９Ｄ）からスフェロイドを採取した。図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、及び１９Ｄは採取した細胞の写真である。図１９Ａに示されるように、細胞は、細胞培養領域に平坦な表面を有する容器内に細胞の「ロープ」を形成した（白矢印を参照）。他の不規則な細胞集塊は、図１９Ｂに見ることができる。対照的に、図１９Ｃ及び図１９Ｄに示されるように、図４による実験フラスコ内で増殖したスフェロイドは、規則的かつ均質であった。
【００５６】
細胞培養容器及び細胞培養方法の多くの態様が本明細書に開示されている。選択した幾つかの態様の概要を以下に提示する。
【００５７】
実施形態では、本開示は、第１の態様において、上部、底部、側壁、及び首のある開口部；複数のマイクロキャビティを含む、容器の底部上の基板であって、該複数のマイクロキャビティの各マイクロキャビティがウェル開口部と凹状のウェル底部とを含む、基板；基板の外周を取り囲む傾斜したフランジであって、基板に隣接した内面と基板とは反対側の外面とを有するフランジ、を有する細胞培養容器を提供する。
【００５８】
第２の態様では、本開示は、基板が容器の底部に固定される、態様１の細胞培養容器を提供する。
【００５９】
第３の態様では、本開示は、基板が容器の底面と一体化している、態様１の細胞培養容器を提供する。
【００６０】
第４の態様では、本開示は、フランジの外面が傾斜している、態様１の細胞培養容器を提供する。
【００６１】
第５の態様では、本開示は、フランジの外面が傾斜している、態様２の細胞培養容器を提供する。
【００６２】
第６の態様では、本開示は、フランジの外面が傾斜している、態様３の細胞培養容器を提供する。
【００６３】
第７の態様では、本開示は、フランジの外側で基板の周りに堀を形成する、傾斜したフランジの外周を取り囲むチャネルをさらに含む、態様１の細胞培養容器を提供する。
【００６４】
第８の態様では、本開示は、フランジの外側で基板の周りに堀を形成する、傾斜したフランジの外周を取り囲むチャネルをさらに含む、態様２の細胞培養容器を提供する。
【００６５】
第９の態様では、本開示は、フランジの外側で基板の周りに堀を形成する、傾斜したフランジの外周を取り囲むチャネルをさらに含む、態様３の細胞培養容器を提供する。
【００６６】
第１０の態様では、本開示は、フランジの外側で基板の周りに堀を形成する、傾斜したフランジの外周を取り囲むチャネルをさらに含む、態様４の細胞培養容器を提供する。
【００６７】
第１１の態様では、本開示は、フランジの外側で基板の周りに堀を形成する、傾斜したフランジの外周を取り囲むチャネルをさらに含む、態様５の細胞培養容器を提供する。
【００６８】
第１２の態様では、本開示は、フランジの外側で基板の周りに堀を形成する、傾斜したフランジの外周を取り囲むチャネルをさらに含む、態様６の細胞培養容器を提供する。
【００６９】
第１３の態様では、本開示は、細胞培養容器のフランジのネック側に液体を堆積させること；液体がフランジを越えて複数のマイクロキャビティを含む基板上にこぼれるまで、容器を液体で満たすこと；複数のマイクロキャビティ内で細胞を培養すること、を含む、態様１の細胞培養容器内で細胞を培養する方法を提供する。
【００７０】
第１４の態様では、本開示は、培養後、細胞培養容器を傾けて、チャネル内に細胞液を蓄積すること；回収ポートを容器の開口に挿入し、回収ポートを用いてチャネルから液体を除去することをさらに含む、態様１３の方法を提供する。
【００７１】
本開示を通して、「物質」、「液体」、及び「気体／ガス」という用語は、例えば、細胞培養容器で細胞を培養するときに用いられる物質の特性を説明するために使用することができる。特に明記しない限り、本開示の目的では、「物質」は、流体物質（例えば、液体又は気体）を含みうる。加えて、物質は、液体に懸濁された固体粒子（例えば、細胞）を含む、液体を含む培養液又は培地を含みうる。特に明記しない限り、本開示の目的では、「液体」は、洗浄液又はすすぎ液、水溶液、若しくは、例えば、細胞培養チャンバの洗浄、基板及び容器の１つ以上の特徴の滅菌、細胞増殖及び液体の他の使用のための基板の準備のために容器に追加又は容器から除去することができる他の液体を含みうる。加えて、液体は、該液体に懸濁された固体粒子（例えば、細胞）を含む液体を含む、培養溶液又は培地を含みうる。特に明記しない限り、本開示の目的では、「ガス」には、空気、ろ過又は処理された空気、若しくは他のガスが含まれうる。
【００７２】
本開示全体にわたって、「非透過性」、「ガス透過性」、及び「多孔性」という用語は、基板の１つ以上の特徴の特性（例えば、物質の特性、特徴、パラメータ）を説明するために使用することができる。
【００７３】
特に明記しない限り、本開示の目的では、「非透過性」基板（例えば、非透過性基板の物質）は、通常の条件下では（例えば、圧力及び力を含むがこれに限定されない外部影響なしに）固体、液体、及び気体に対して不透過性であるとみなされ、したがって、通常の条件下では、非透過性基板内へ、該基板を通じた、又は該基板から外への、固体、液体、又は気体の移動は許されない。幾つかの実施形態では、非透過性基板は、容器の壁の一部を形成することができる。加えて、細菌は非透過性基板を通過できないことから、非透過性基板が容器の壁の一部を形成する場合、容器の細胞培養チャンバは無菌であると見なされる。しかしながら、基板の複数のマイクロキャビティに物質を充填する場合、液体の表面張力に基づいて非透過性基板のマイクロキャビティ内にガスが閉じ込められる可能性があり、それにより、幾つかの実施形態では、物質がマイクロキャビティを満たすのを妨げ、スフェロイドの増殖を妨げる可能性がある。
【００７４】
特に明記しない限り、本開示の目的では、「ガス透過性」基板（例えば、ガス透過性基板の物質）は、固体及び液体に対して不透過性であり、通常の条件下でガスに対して透過性であると見なされる。したがって、ガス透過性基板は、ガス透過性基板の内、中、又は外への固体及び液体の移動を許さず、ガス透過性基板の内、中、又は外へのガスの移動を可能にする。幾つかの実施形態では、ガス透過性基板は容器の壁の一部を形成することができる。加えて、細菌は例えばガス透過性基板を合理的に通過できないことから、ガス透過性基板が容器の壁の一部を形成する場合、容器の細胞培養チャンバは無菌であると見なされる。しかしながら、基板はガス透過性であるが、ガス透過性基板を通るガス透過速度は通常の動作条件下でキャビティからガスを移動させるのに必要な速度よりも遅くなる可能性があり、したがって、基板を透過するのに許容できないほど長い時間がかかる可能性があることから、ガスは物質の充填中にマイクロキャビティ内に閉じ込められる可能性がある。したがって、幾つかの実施形態では、マイクロキャビティにゆっくりと充填することにより、液体の前部が各マイクロキャビティにある角度で入ることが可能になり、それによって、液体をマイクロキャビティに充填するときにガスが移動する。幾つかの実施形態では、キャビティを液体で満たした後、ガスはガス透過性基板を（ゆっくりと）透過しうる。
【００７５】
特に明記しない限り、本開示の目的では、「多孔性」基板（例えば、多孔性基板の物質）は、固体に対して不透過性であり、通常の条件下で液体及びガスに対して透過性であると見なされる。したがって、多孔性基板は、多孔性基板の内、中、又は外への固体の移動を許さず、多孔性基板の内、中、又は外への液体及びガスの移動を可能にする。細菌が多孔性基板を通過する可能性があることから、多孔性基板は容器の一部を形成することができず、したがって細胞培養チャンバ内で無菌性の問題が生じる。よって、多孔性基板を使用する場合、基板は容器の無菌細胞培養チャンバ内に封入（完全に封入）する必要がある。しかしながら、マイクロキャビティに物質を充填する間、ガスは多孔性基板を通って逃げる（例えば、通過する）ことができる。よって、マイクロキャビティへのガスの閉じ込めを懸念することなく、マイクロキャビティの充填を迅速に行うことができる。幾つかの実施形態では、液体は、圧力又は物理的接触が加えられ、基板が乱された状態の多孔質基板のみ、通過することができる。よって、幾つかの実施形態では、基板が追加の圧力又は物理的接触及び乱れにさらされない限り、液体を含む物質を基板のマイクロキャビティに収容することができる。例えば、幾つかの実施形態では、多孔性基板を細胞培養チャンバ内で支持して、充填中並びに培養中にガスが基板を通過できるようにし、加えられた圧力又は物理的接触及び外力（例えば、細胞培養チャンバー外）による乱れから基板を隔離することができる。
【００７６】
さまざまな開示される実施形態は、その特定の実施形態に関連して記載される特定の特徴、要素、又は工程を含みうることが認識されよう。また、特定の特徴、要素、又は工程は、特定の一実施形態に関連して説明されているが、図示されていないさまざまな組合せ又は順列の代替的な実施形態と交換又は組み合わせることができることも認識されよう。
【００７７】
本明細書で用いられる場合、用語「ｔｈｅ」、「ａ」、又は「ａｎ」は、「少なくとも１つ」を意味し、明示的に反対の指示がない限り、「１つのみ」に限定されるべきではないことが理解されるべきである。よって、例えば、「ある１つの（ａ）構成要素」への言及は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、そのような構成要素を２つ以上有する実施形態を含む。
【００７８】
本明細書では、範囲は、「約」１つの特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値までとして表現することができる。このような範囲が表現される場合、実施形態は、その１つの特定の値から及び／又は他方の特定の値までを含む。同様に、例えば先行詞「約」の使用によって、値が近似値として表される場合、その特定の値は別の態様を形成することが理解されよう。さらには、範囲の各々の端点は、他の端点に関連して、及び他の端点とは独立してのいずれにおいても重要であることが理解されよう。
【００７９】
特に明記しない限り、本明細書に記載の任意の方法は、その工程が特定の順序で実行されることを必要とすると解釈されることは、決して意図していない。したがって、方法クレームがその工程が従うべき順序を実際に列挙していないか、または工程が特定の順序に限定されるべきであることが特許請求の範囲または明細書に具体的に述べられていない場合には、いかなる特定の順序も、推測されることは、決して意図していない。
【００８０】
特定の実施形態のさまざまな特徴、要素、又は工程は、「含む」という移行句を使用して開示されうるが、「〜からなる」又は「〜から実質的になる」という移行句を使用して説明されうるものを含む代替的な実施形態態が暗示されることが理解されるべきである。したがって、例えば、Ａ＋Ｂ＋Ｃを含む装置の暗黙の代替的な実施形態には、装置がＡ＋Ｂ＋Ｃからなる実施形態と、装置が実質的にＡ＋Ｂ＋Ｃからなる実施形態とが含まれる。
【００８１】
本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、本開示に対してさまざまな修正及び変形がなされうることは、当業者にとって明白であろう。したがって、本開示は、添付の特許請求の範囲及びそれらの等価物の範囲内にある限り、本開示の修正及び変形を包含することが意図されている。
【００８２】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【００８３】
実施形態１
細胞培養容器において、
上部、底部、側壁、及び首のある開口部；
複数のマイクロキャビティを含む、前記容器の前記底部上の基板であって、前記複数のマイクロキャビティの各マイクロキャビティがウェル開口部と凹状のウェル底部とを備えている、基板；並びに
前記基板の外周を取り囲む傾斜したフランジ
を含み、
前記フランジが、前記基板に隣接した内面と前記基板とは反対側の外面とを有している、
細胞培養容器。
【００８４】
実施形態２
前記基板が前記容器の前記底部に固定されている、実施形態１に記載の細胞培養容器。
【００８５】
実施形態３
前記基板が前記容器の底面と一体化している、実施形態１に記載の細胞培養容器。
【００８６】
実施形態４
前記フランジの前記外面が傾斜している、実施形態１に記載の細胞培養容器。
【００８７】
実施形態５
前記フランジの前記外面が傾斜している、実施形態２に記載の細胞培養容器。
【００８８】
実施形態６
前記フランジの前記外面が傾斜している、実施形態３に記載の細胞培養容器。
【００８９】
実施形態７
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、実施形態１に記載の細胞培養容器。
【００９０】
実施形態８
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、実施形態２に記載の細胞培養容器。
【００９１】
実施形態９
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、実施形態３に記載の細胞培養容器。
【００９２】
実施形態１０
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、実施形態４に記載の細胞培養容器。
【００９３】
実施形態１１
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、実施形態５に記載の細胞培養容器。
【００９４】
実施形態１２
前記傾斜したフランジの外周を取り囲み、前記フランジの外側で前記基板の周りに堀を形成するチャネルをさらに含む、実施形態６に記載の細胞培養容器。
【００９５】
実施形態１３
実施形態１に記載の細胞培養容器内で細胞を培養する方法であって、
前記細胞培養容器の前記フランジのネック側に液体を堆積させること；
液体が前記フランジを越えて複数のマイクロキャビティを含む前記基板上にこぼれるまで、前記容器を液体で満たすこと；及び
前記複数のマイクロキャビティ内で細胞を培養すること
を含む、方法。
【００９６】
実施形態１４
培養後、前記細胞培養容器を傾けてチャネル内に細胞液を蓄積すること；
前記容器の開口に回収ポートを挿入し、該回収ポートを使用してチャネルから液体を除去すること
をさらに含む、実施形態１３に記載の方法。
【符号の説明】
【００９７】
１００細胞培養容器
１０１  上部／壁
１０２  内面
１０３  細胞培養チャンバ
１０４  キャップ
１０５  開口
１０７  端部壁
１０８  底部
１１０  軸
１１２  ネック
１１５  マイクロキャビティのアレイ／基板
１２０  複数のマイクロキャビティ
１２０ａ，１２０ｂ，１２０ｃ  各マイクロキャビティ
１２１ａ，１２１ｂ，１２１ｃ  凹面
１２２ａ，１２２ｂ，１２２ｃ  ウェル
１２３ａ，１２３ｂ，１２３ｃ  開口部
１２５  第１の側
１２６  第２の側
１４２  領域
１５０  細胞
１７０  フランジ
１７１  内面
１７２  外面
１７３  周囲
１７４  ベース
１７５  チャネル
１７６  開口部
１８０  液体
１８２  物質
１８３  回収ポート
１８４  老廃物
２０１，２０７，２０８，２１２  内部表面
２０２  平坦な表面
２５０  細胞／スフェロイド
８０１  細胞集塊
【国際調査報告】
2020526219.tif 000028
2020526219.tif 000029
2020526219.tif 000030