(57)【要約】  【解決手段】  アミロイド沈着疾患、例えば遺伝性シスタチンＣアミロイド血管症および他の神経変性障害の治療のための組成物および方法が開示されている。  【選択図】      図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミロイド沈着症を治療する方法であって、有効量の少なくとも１つの抗酸化剤をアミロイド疾患を呈する患者に送達する工程を有し、前記薬剤は、前記アミロイド沈着を破壊し、それにより疾患症状を軽減する、方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記アミロイド疾患は、変異シスタチンＣによって引き起こされる遺伝性シスタチンＣアミロイド血管症（ＨＣＣＡＡ）である、方法。
【請求項３】
請求項２記載の方法において、前記変異シスタチンＣは、Ｌ６８ＱシスタチンＣを含む、方法。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記抗酸化剤は、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、またはそれらの誘導体からなる群から選択される、方法。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、ＮＡＣ−アミド、ＮＡＣ−エチルエステル、および亜鉛メルカプチドＮ−アセチルシステインカルボキシレート塩から選択される、方法。
【請求項６】
それを必要とするヒト対象における遺伝性シスタチンＣアミロイド血管症（ＨＣＣＡＡ）の治療のための方法であって、薬学的に許容される担体中の有効量のＮ−アセチルシステインまたはその機能的誘導体の投与を含み、前記投与はアミロイド−シスタチンタンパク質凝集体を減少させるのに効果的であり、それによりＨＣＣＡＡの症状を緩和し、前記ＮＡＣ誘導体はＮＡＣ−アミド、ＮＡＣ−エチルエステルおよび亜鉛メルカプチドＮ−アセチルシステインカルボキシレート塩から選択される、方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれかに記載の方法であって、さらに、皮膚中のアミロイド−シスタチンタンパク質凝集体の減少を評価するために、治療後に前記対象に対して皮膚生検を実施する工程を含む、方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれかに記載の方法において、イオノフォアの投与を含む、方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載の方法において、抗炎症剤の投与を含む、方法。
【請求項１０】
請求項９記載の方法において、前記抗炎症剤は、コルチコステロイド、アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク、トルメチン、インターロイキン（ＩＬ）−１受容体拮抗薬、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１のサイトカイン受容体、腫瘍壊死因子アルファ、ＩＬ−１８、およびそれらの誘導体およびバイオシミラーの１または複数からなる群から選択される、方法。
【請求項１２】
請求項１記載の方法において、グルタチオン、ｓｉＲＮＡ、モネンシン、パパイン、カテプシンＢ、およびファルシパインの１または複数の投与を含む、方法。
【請求項１３】
それを必要とするヒト対象における病原性細動タンパク質凝集体に関連する神経変性障害の治療のための方法であって、医薬的に許容される担体中の有効量のＮ−アセチルシステインまたはその機能的誘導体の投与を含み、前記投与は前記タンパク質凝集体を減少させるのに効果的であり、それにより前記神経変性障害の症状を緩和する、方法。
【請求項１４】
請求項１記載の方法において、前記障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト−ヤコブ病、ハンチントン病および他のＣＡＡから選択される、方法。
【請求項１５】
請求項１記載の方法であって、さらに、前記患者のアミロイド沈着レベルを観察する工程を含む、方法。
【請求項１６】
アミロイド−シスタチンタンパク質凝集体形成を変化させる治療薬を同定する方法であって、
ａ）変異型ｈＣＣタンパク質をコードする核酸を発現する細胞を提供する工程であって、前記変異型はアミロイド−シスタチンタンパク質凝集体の形成を引き起こす、前記細胞を提供する工程と、
ｂ）前記ｈＣＣ変異を欠くｈＣＣタンパク質を発現する細胞を提供する工程と、
ｃ）工程ａ）およびｂ）の前記細胞を試験剤と接触させる工程と、及び
ｄ）工程ｂ）の前記細胞と比較して、工程ａ）の前記細胞のアミロイド−シスタチンタンパク質凝集体形成を変化させるかどうかを分析する工程と、それによってアミロイド−シスタチンタンパク質凝集を変化させる薬剤を同定する工程と、
を含む、方法。
【請求項１７】
請求項１６記載の方法において、前記治療薬が、ＨＣＣＡＡまたは異常な原線維形成に関連する他の障害の治療に対して効力を有する、方法。
【請求項１８】
それを必要とする患者のＨＣＣＡＡの治療のための方法であって、請求項１６記載の前記薬剤の有効量の投与を含む、治療方法。
【請求項１９】
請求項１６記載の方法において、前記薬剤は、ＮＡＣまたはその機能的誘導体である、方法。
【請求項２０】
抗酸化剤として作用する有効量の薬剤および／またはアミロイド沈着症を治療するための還元剤を医薬的に許容される担体中に含む、医薬組成物。
【請求項２１】
請求項２０記載の医薬組成物において、前記薬剤がグルタチオン、Ｎ−アセチルシステインまたはそれらの誘導体である、医薬組成物。
【請求項２２】
請求項２１記載の医薬組成物において、前記誘導体が、ＮＡＣ−アミド、ＮＡＣ−エチルエステルおよび亜鉛メルカプチドＮ−アセチルシステインカルボキシレート塩から選択される、医薬組成物。
【請求項２３】
請求項２０記載の医薬組成物であって、さらに、イオノフォア、抗炎症剤またはプロテアーゼのうちの１または複数を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、２０１７年９月７日に出願された米国仮出願第６２／５５５，４９６号の優先権を主張し、その内容全体は、参照により完全に記載されるように本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、血管障害の分野に関し、最も顕著には、病原性原線維形成に関連する脳アミロイド血管症および神経変性障害を含む。より具体的には、本発明は、異常な線維形成に関連する疾患、特に遺伝性シスタチンＣアミロイド血管症（ＨＣＣＡＡ）およびアルツハイマー病の治療および管理に有用な組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
本発明が関係する最新技術を説明するために、本明細書を通じていくつかの刊行物および特許文献が引用される。これらの引用のそれぞれは、完全に記載されるように参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
遺伝性シスタチンＣアミロイド血管症（ＨＣＣＡＡ）は、ヒトシスタチンＣ（ｈＣＣ；Ｌ６８Ｑ−ｈＣＣ）のロイシン６８からグルタミンへの変異体によって引き起こされる優性遺伝疾患である。１ＨＣＣＡＡは、中枢神経系（ＣＮＳ）の血管壁にアミロイド沈着物が形成される疾患のグループである脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）として分類される。ＨＣＣＡＡは、その強い脳症状のためにＣＡＡ障害として正しく分類されるが、ｈＣＣ沈着は全身性であり、他の内臓にも見られる。突然変異のほとんどの保因者は、２０歳代の微小梗塞と脳出血を患い、若年成人の麻痺、認知症、死亡に至り、平均寿命は３０年である。２−６ヒトの死後研究では、ｈＣＣがすべての脳領域、灰白質、白質同様、最も顕著なのは動脈と細動脈である。
【０００５】
シスタチンスーパーファミリーに属するシステインプロテアーゼ阻害剤であるヒトシスタチンＣは、分泌型２シスタチンであり、すべての有核ヒト細胞で発現し、すべての組織および体液で、特に脳脊髄液で特に高濃度で検出される。２、７−９ｈＣＣは、特徴的なｈＣＣフォールドに起因する複数の結合モチーフを介した相互作用により、パパインやレグマインなどのシステインプロテアーゼを阻害する。９−１１その通常のコンフォメーションは、5本鎖のβシートに折りたたまれたポリペプチドで構成されており、中央のαヘリックスを部分的に包み込まれる。Ｎ末端セグメントと２つのヘアピンループがタンパク質のエッジを構築し、システインプロテアーゼの活性部位に結合し、タンパク質分解活性をブロックする。１２−１４ロイシン６８のグルタミン酸への変異により、ベータシートとアルファヘリックスの間のパッキングが不安定になり、分子が開くようになる。２つのこのような開いたｈＣＣ分子は互いに相互作用することができ、各分子のヘリックスは他方のベータシートと相互作用し、結果として生じる二量体は、ドメイン交換の産物であると言われる。１５−１７さらに、伝播ドメイン交換と呼ばれるプロセスにより、分子の長い鎖が構築され、各分子の遊離ドメインが新しいｈＣＣモノマーと相互作用する。１８タンパク質の凝集は、アミロイド線維と呼ばれる高度に秩序化された病原性線維凝集体の形成につながり、１９、２０ＨＣＣＡＡだけでなく、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病および他のＣＡＡｓなどの広範囲の神経変性疾患にも関与する。２０
【０００６】
シスタチンＣ沈着物で観察されるアミロイド成熟の程度は、組織間で異なることが示される（すなわち、脳よりも皮膚の成熟が顕著ではない）。２１皮膚の沈着物はアミロイド線維ではないが、突然変異保因者の皮膚は、症候性保因者が無症候性保因者よりも皮膚でｈＣＣ免疫反応性のレベルが有意に高いことを示した。皮膚のｈＣＣ沈着量がＣＮＳの疾患の進行と関連していたという事実は、皮膚生検が疾患の進行を評価するために使用でき、したがって治療的介入の評価に使用できることを示す。２２
【０００７】
異なる病原性アミロイド形成性タンパク質のタンパク質オリゴマーは、ＨＣＣＡＡおよび他の疾患の原線維形成段階に先行するが、ＨＣＣＡＡについては、そのようなオリゴマーが病原性原線維に直接つながるかどうか、または原線維の集合がモノマーから最も急速に発生するかどうかは不明である。２３アミロイド産生タンパク質の凝集を減少させる薬物は、いくつかのタイプのアミロイドーシスで発生することが知られている毒性オリゴマーの形成を減少させる可能性がある。２４、２５以前の調査では、ｈＣＣのドメインスワッピングの防止がＨＣＣＡＡの治療に使用される可能性があることが示唆されて来た。２４ＷＴ  ｈＣＣおよびＬ６Ｑ−ｈＣＣは、鎖内安定化ジスルフィド結合を有し、二量体またはアミロイド原線維のいずれかを形成する可能性のあるドメインスワッピングを防止する。２６これらの結果は、生理学的に正常で可溶性のタンパク質から有毒なオリゴマーおよび不溶性原線維への移行を引き起こす分子メカニズムの知識は、治療戦略の開発に不可欠であることを示唆する。
【０００８】
オストナーらはこれまでに、さまざまなアプローチを通じて、ｈＣＣモノマーの重合を防止すること、多量体種を破壊または除去することを試みてきた。２４修飾され安定化されたｈＣＣモノマーは、ドメインスワッピングの防止が凝集を防ぐことを実証するために使用されてきた。抗体は、ドメイン交換された二量体のｈＣＣに対して特異的に産生される。これらの抗体は、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、患者の血漿から単量体ではなくｈＣＣの二量体を特異的に除去することができた。２７化合物のハイスループットスクリーニングは、二量体化を防ぐ分子を見つけるために努力がなされ、ＵＳ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０４０のＦＤＡ承認化合物で構成され、（ワールドワイドウェブ．ｍｓｄｉｓｃｏｖｅｒｙ．ｃｏｍ／ｕｓｄｒｕｇ．ｈｔｍｌで見つけられる）。２４このアプローチでは、細菌で生成された大量の精製ｈＣＣタンパク質が必要であり、ダイマー形成を阻害するものとして特定された化合物の大部分は、生物での治療と見なすには高すぎる濃度で使用されていた。
【０００９】
明らかに、ＨＣＣＡＡを治療するための改善された方法および組成物が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、アミロイド沈着症を治療する方法は、有効量の少なくとも１つの抗酸化剤を患者に送達することを含み、前記抗酸化剤は前記アミロイド沈着を破壊し、それにより疾患症状を軽減する。アミロイド沈着症には、例えば、遺伝性シスタチンＣアミロイド血管症（ＨＣＣＡＡ）、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、およびオランダ型の脳アミロイド血管症などが含まれる。特定の実施形態では、アミロイド疾患は、変異シスタチンＣによって引き起こされるＨＣＣＡＡである。他の実施形態では、変異シスタチンＣは、Ｌ６８ＱシスタチンＣを含む。上記の方法で使用するための好ましい抗酸化剤には、グルタチオン、Ｎ−アセチルシステイン、またはその誘導体を含むがこれに限定されない。特定の実施形態では、誘導体は、ＮＡＣ−アミド、ＮＡＣ−エチルエステルおよび亜鉛メルカプチドＮ−アセチルシステインカルボキシレート塩から選択される。
【００１１】
別の態様では、それを必要とするヒト対象における遺伝性シスタチンＣアミロイド血管症（ＨＣＣＡＡ）の治療方法が提供される。例示的な方法は、薬学的に許容される担体中の有効量のＮ−アセチルシステインまたはその機能的誘導体の対象への投与を含み、投与はアミロイド−シスタチンタンパク質凝集体を減少させ、それによりＨＣＣＡＡの症状を緩和するのに有効である。特定の実施形態において、ＮＡＣ誘導体は、ＮＡＣ−アミド、ＮＡＣ−エチルエステルおよび亜鉛メルカプチドＮ−アセチルシステインカルボキシレート塩から選択される。本方法は、皮膚のアミロイド−シスタチンタンパク質凝集体の減少を評価するために、または血清または血漿中のシスタチンＣモノマー、ダイマーまたはオリゴマー、または尿中に排出されたモノマーの量を測定するために、治療後に前記対象に対して皮膚生検を実施することを任意で伴い得る。
【００１２】
別の態様では、この方法は、アミロイド沈着症状を緩和する追加の薬剤の投与を伴うことがある。これらには、１またはそれ以上のイオノフォア、１またはそれ以上の抗炎症剤、および１またはそれ以上のプロテアーゼが含まれるが、これらに限定されない。他の実施形態において、シスタチンＣコード配列に向けられたｓｉＲＮＡは、変異対立遺伝子を選択的にブロックするために投与される。
【００１３】
本発明の別の態様では、それを必要とするヒト対象における病原性細動タンパク質凝集体に関連する神経変性障害の治療方法が開示される。例示的な方法は、有効量のＮ−アセチルシステインまたはその機能的誘導体を薬学的に許容される担体に入れて対象に投与することを含み、投与は前記タンパク質原線維凝集体を減少させ、それにより神経変性障害の症状を緩和するのに有効である。特定の実施形態では、障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病、およびオランダ型などの脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）の他の型から選択される。
【００１４】
特定の実施形態では、上記の方法は、アミロイド沈着レベルについて前記患者を監視することを含む。
【００１５】
本発明のさらに別の態様では、アミロイド−シスタチンタンパク質凝集体形成を変化させる治療薬を同定する方法が提供される。変異体ｈＣＣタンパク質をコードする核酸を発現する細胞を提供することを含む例示的な方法であり、前記変異体はアミロイド−シスタチンタンパク質凝集体の形成を引き起こし、ｈＣＣ変異を欠くｈＣＣタンパク質を発現する細胞を提供する。両方の細胞集団を試験薬と接触させ、その薬が野生型タンパク質を発現する細胞と比較して変異体を発現する細胞のアミロイド−シスタチンタンパク質凝集体の形成を変化させるかどうかを判断するために評価され、それによりアミロイド−シスタチンタンパク質の凝集を変化させる薬剤を特定する。そのように特定された薬剤は、ＨＣＣＡＡまたは異常な原線維形成に関連する他の障害の治療に対して効力を有するべきである。
【００１６】
また、薬学的に許容される担体中に、抗酸化剤として作用する薬剤、またはアミロイド沈着疾患の治療のための還元剤の有効量を含む医薬組成物も提供される。組成物で治療される疾患には、例えば、ＨＣＣＡＡ、アルツハイマー病、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、ハンチントン病および他のＣＡＡが含まれる。一実施形態では、薬剤はグルタチオン、Ｎ−アセチルシステインまたはその誘導体である。好ましい実施形態では、薬剤は誘導体であり、ＮＡＣ−アミド、ＮＡＣ−エチルエステルおよび亜鉛メルカプチドＮ−アセチルシステインカルボキシレート塩から選択される。本発明の本発明の組成物はまた、イオノフォア、抗炎症剤またはプロテアーゼのうちの１つまたは複数を含み得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１Ａ】図１Ａは、遺伝子操作されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、非還元条件下でオリゴマー化できるｈＣＣ（ＷＴまたはＬ６８Ｑ）を検出および分泌する。図１Ａ  ＷＴおよびＬ６８Ｑ変異体ｈＣＣタンパク質の模式図である。破線は、タンパク質分解を受けるＮ末端シグナルペプチドを表す。赤い長方形は、Ｃ末端に追加されたＭｙｃタグを表す。
【図１Ｂ】図１Ｂ（左パネル）ｈＣＣ  ＷＴまたはＬ６８Ｑ変異体または上清を安定して発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞のライセート（右パネル）を、還元剤ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールの有無にかかわらず、２％ＳＤＳと混合した。サンプルを電気泳動にかけ、ＣＳＴ３レベルを抗シスタチンＣ抗体を使用したウェスタンブロット手順で調べた。図１Ｂ：グルタチオンとのインキュベーションは、細胞抽出物および上清中のシスタチンＣジ／オリゴマー化を損なう（生物学的レプリカ）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、図２に示した実験に関連する生物学的複製であり、上澄みと細胞抽出物をグルタチオンの存在下で、指定濃度の３７℃で１時間インキュベートした。電気泳動の前に還元剤を含まない２％ＳＤＳとサンプルを混合し、抗シスタチンＣ抗体ＷＢによってタンパク質レベルを検出した。
【図２Ａ】図２Ａ：グルタチオンとのインキュベーションは、細胞抽出物および上清のシスタチンＣのジ／オリゴマー化を阻害する。上清および細胞抽出物を、指定濃度のグルタチオンの存在下、３７℃で１時間インキュベートした。電気泳動の前に還元剤を含まない２％ＳＤＳとサンプルを混合し、シスタチンＣのウエスタンブロットによりタンパク質レベルを検出した（Ｎ＝３；＊未処理（ＨＭＷ）に対してＰ＜０．０５で有意；Ｐ＜で有意未処理（モノマー）に関して０．０５）。
【図２Ｂ】図２Ｂ：グルタチオンとＮ−アセチルシステインは、分泌されたシスタチンＣ  Ｌ６８Ｑのオリゴマー化を損なう（生物学的複製）。図３に示す実験に関連する生物学的複製は、グルタチオンまたはＮＡＣの存在下、３７℃で１時間、指定の濃度で上清をインキュベートした。電気泳動の前に還元剤を含まない２％ＳＤＳとサンプルを混合し、抗シスタチンＣ抗体ＷＢによってタンパク質レベルを検出した。
【図３Ａ】グルタチオンとN-アセチルシステインは分泌されたシスタチンＣ  Ｌ６８Ｑのオリゴマー化を損なう。上清を指定濃度のグルタチオンまたはＮＡＣの存在下で３７℃で１時間インキュベートした。電気泳動の前に還元剤を含まない２％ＳＤＳとサンプルを混合し、抗シスタチンＣ抗体によってタンパク質レベルを検出した。ヒストグラムは、未処理サンプルまたはＤＴＴ処理サンプルに対するモノマー（Ｍｏｎｏ）に対する高分子量画分（ＨＭＷ）のウエスタンブロットバンドの濃度測定による定量化を表す。ｈＣＣ  ＷＴを安定して発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞の上清にはＨＭＷ画分は検出されなかった。（＊未処理（ＨＭＷ）に関してＰ＜０．０５で有意；＋未処理（モノマー）に関してＰ＜０．０５で有意）。
【図３Ｂ】図３Ｂ：Ｎ−アセチルシステインは、分泌シスタチンＣ  Ｌ６８Ｑのオリゴマー化を損ないます少量の上清を細胞から除去し、示された時間にウエスタンブロットで分析した。２日目と３日目に、Ｌ６８Ｑ上清のみを分析した。電気泳動の前に還元剤を含まない２％ＳＤＳとサンプルを混合し、抗シスタチンＣ抗体ＷＢによってタンパク質レベルを検出した。
【図４】図４は、ＮＡＣは分泌されたｈＣＣ  Ｌ６８Ｑのオリゴマー化を損ないます。ＷＴまたはＬ６８ＱシスタチンＣを発現する２９３Ｔ細胞を、指定量のＧＳＨまたはＮＡＣのいずれかを含む培地とともに２４時間、４８時間または７２時間インキュベートした。少量の上清を細胞から除去し、示された時間にウエスタンブロットで分析した。２日目と３日目に、ｈＣＣ  Ｌ６８Ｑ変異体を発現する細胞の上清のみを分析した。電気泳動の前に還元剤を含まない２％ＳＤＳとサンプルを混合し、抗シスタチンＣ抗体によってタンパク質レベルを検出した。ヒストグラムは、未処理サンプルまたはＤＴＴ処理サンプルに対するモノマー（Ｍｏｎｏ）に対する高分子量画分（ＨＭＷ）のウエスタンブロットバンドの濃度測定による定量化を表す。（＊未処理（ＨＭＷ）に関してＰ＜０．０５で有意；＋未処理（モノマー）に関してＰ＜０．０５で有意）。
【図５】図５は、ＧＳＨまたはＮＡＣの活性低下は、オリゴマーを分泌シスタチンＣ  Ｌ６８Ｑのモノマーに分解するために重要である。上清を酸化（ＧＳＳＧ）または還元グルタチオン（ＧＳＨ）、ＮＡＣまたはその不活性類似体（ＮＡＳ）の存在下で、指定濃度の３７℃で１時間インキュベートした。電気泳動の前に還元剤を含まない２％ＳＤＳとサンプルを混合し、抗シスタチンＣ抗体によってタンパク質レベルを検出した。
【図６】図６．ＮＡＣ−アミドおよびＮＡＣ−エチル−エステルは、細胞内および分泌シスタチンＣ  Ｌ６８のオリゴマー化を損なう。上清および細胞抽出物を、ＮＡＣ、ＮＡＣ−アミドおよびＮＡＣ−メチルエステルの存在下で、指定濃度の３７℃で１時間インキュベートした。電気泳動の前に還元剤を含まない２％ＳＤＳとサンプルを混合し、抗シスタチンＣ抗体によってタンパク質レベルを検出した。
【図７】図７．Ｃｙｓｔ−Ｃ  Ｌ６８Ｑの高分子量複合体は、トランスジェニックマウスで検出できる。ＮＡＣの短いインキュベーションは、血液および脳抽出物上のＣｙｓｔ−Ｃ  Ｌ６８Ｑのオリゴマー化を損なう。血漿または脳抽出物は、ＮＡＣの存在下で、指定の濃度で３７℃で１時間インキュベートした。サンプルは、電気泳動の前に還元剤を含まない２％ＳＤＳと混合し、タンパク質レベルはストレプトアビジン−ＨＲＰが続くビオチン化抗シスタチンＣ抗体によって検出された。
【図８Ａ】図８Ａ：ＨＣＣＡＡ患者におけるＮＡＣ療法の効果。シスタチンＣ免疫染色（茶色の染色）は、ウサギ抗ヒトシスタチンＣ抗体を使用して、ｈＣＣ  Ｌ６８ＱバリアントのキャリアであるＨＣＣＡＡファミリーの２人のメンバーから、背中の同じ場所から得られた３つの別々の皮膚生検で行われた。各左パネルの生検（図８Ａおよび図８Ｂの皮膚生検１）は、この作業を開始する２年以上前にそのファミリーが研究に参加したときに得られたものである。中央の図のパネルの生検（図８Ａおよび図８Ｂの皮膚生検２）は、約１８か月後に取得された。両方の被験者の右パネルの生検（図８Ａおよび図８Ｂの皮膚生検＃３）は、ＮＡＣによる６か月の治療後のシスタチンＣタンパク質複合体の沈着を示す。６か月のＮＡＣ療法後、発端者（パネルＡ）と親（パネルＢ）で顕著な減少が見られた。パネルＡ：発端者からの皮膚生検のシスタチンＣ免疫染色。パネルＢ：親からの皮膚生検のシスタチンＣ免疫染色。
【図８Ｂ】図８Ｂ：ＨＣＣＡＡ患者におけるＮＡＣ療法の効果。シスタチンＣ免疫染色（茶色の染色）は、ウサギ抗ヒトシスタチンＣ抗体を使用して、ｈＣＣ  Ｌ６８ＱバリアントのキャリアであるＨＣＣＡＡファミリーの２人のメンバーから、背中の同じ場所から得られた３つの別々の皮膚生検で行われた。各左パネルの生検（図８Ａおよび図８Ｂの皮膚生検１）は、この作業を開始する２年以上前にそのファミリーが研究に参加したときに得られたものである。中央の図のパネルの生検（図８Ａおよび図８Ｂの皮膚生検２）は、約１８か月後に取得された。両方の被験者の右パネルの生検（図８Ａおよび図８Ｂの皮膚生検＃３）は、ＮＡＣによる６か月の治療後のシスタチンＣタンパク質複合体の沈着を示す。６か月のＮＡＣ療法後、発端者（パネルＡ）と親（パネルＢ）で顕著な減少が見られた。パネルＡ：発端者からの皮膚生検のシスタチンＣ免疫染色。パネルＢ：親からの皮膚生検のシスタチンＣ免疫染色。
【図８Ｃ】図８Ｃ．Ｃｙｓｔ−Ｃモノマーは、Ｌ６８Ｑ変異を保有する被験者の血中濃度が低下している状態で検出できる。ＮＡＣを服用しない１キャリアに高分子量複合体が存在するようである。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
化合物がその毒性についてある程度の洞察を得ながら、ｈＣＣ多量体化に影響を与える能力をテストするシステムを作成するために、野生型または変異型ｈＣＣを大量に発現する細胞株を作成した。細胞株、およびそれらが作成する単量体および多量体のｈＣＣの特性を調べ、変異タンパク質の凝集を無毒に妨害する実験に使用した。さらに、ＨＣＣＡＡのヒト被験者を治療するためにＮＡＣを使用したバイオマーカー研究が実施された。
【００１９】
このシステムは、分子が変異型ｈＣＣの凝集を妨げる能力の評価を促進すると同時に、細胞または生物に対する毒性に関する情報も提供する。野生型または変異型ｈＣＣを過剰発現する２９３Ｔ細胞のクローンが生成された。これらの細胞は、検出可能なレベルのｈＣＣを生成および分泌する。重要なのは、野生型タンパク質の同等の量を発現する細胞には存在しない変異型ｈＣＣを発現する細胞の溶解物と上清の両方で形成される高分子複合体の検出を可能にする条件を確立したことである。非還元条件下でのウエスタンブロッティングにより、変異体ｈＣＣの高分子量複合体を検出できる。興味深いことに、溶解物または上清のいずれかを、還元型グルタチオン（ＧＳＨ）またはＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の２つの還元剤のいずれかと短時間インキュベートすると、変異体のオリゴマーがモノマーに分解される。さらに、ＮＡＣまたはＧＳＨのいずれかでＬ６８Ｑ  ｈＣＣ発現細胞を処理すると、分泌されたｈＣＣ  Ｌ６８Ｑのオリゴマー化が２４、４８、および７２時間で減少する。ＨＣＣＡＡの患者は、その後６か月間ＮＡＣで治療された。応答のバイオマーカーとして、皮膚生検が得られ、アミロイドシスタチンＣ複合体の染色が治療後の皮膚で減少したかどうかを判定した。発端者は最高用量であり、肺の粘液栓を治療するために９か月間ＮＡＣを使用し、ＮＡＣを開始する前の９か月間に３回の主要な脳卒中を以前に経験しており、アミロイド染色が約７５％減少した皮膚に浸透し、ＮＡＣ療法の１８か月間はイベントフリーだった。
【００２０】
要約すると、この研究は、ＨＣＣＡＡの治療のための新しい治療法をテストするための新しい細胞モデルを提供し、変異体ｈＣＣがＮＡＣのような還元剤の薬理学的標的であることを明確に証明する。最も重要なことは、データは、ＨＣＣＡＡを有する３人の患者からの皮膚バイオマーカーの結果に基づき、この破壊的な疾患を治療するための潜在的に有用な治療法としてＮＡＣが関係することである。
【００２１】
以下の定義は、本発明とみなされる主題の理解を補足するために提供される。
【００２２】
本発明において、「ａ」または「ａｎ」は、文脈により明確に示されない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」などを意味する。「または」という用語は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。ただし、複数の従属クレームの場合、「または」という用語の使用は、代替案のみで複数の先行クレームを指す。
【００２３】
本明細書で使用される「ヒトシスタチンＣ（ｈＣＣ）」は、シスタチンスーパーファミリーに属するシステインプロテアーゼ阻害剤として機能するタンパク質を指す。ｈＣＣは分泌型２シスタチンであり、すべての有核ヒト細胞で発現する。Ｌ６８Ｑ−ｈｃｃは、６８の位置でロイシンがグルタミン変異体に置換されている変異ｈＣＣを指す。
【００２４】
用語「薬剤」および「試験化合物」は、本明細書で互換的に使用され、化学化合物、化合物の混合物、生体高分子、または細菌、植物、真菌、または動物（特に哺乳類）、細胞または組織などの生物学的材料から作られた抽出物を示す。生体高分子には、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド／ＤＮＡ複合体、およびｈＣＣの活性を調節する能力を示す核酸ベースの分子が含まれる。例示的な薬剤には、単独でおよび組み合わせて使用されるＮＡＣおよびその誘導体などの還元剤が含まれる。他の有用な薬剤には、グルタチオン、モネンシン、パパイン、カテプシンＢ、およびファルシパインが含まれるが、これらに限定されない。そのような薬剤の生物活性は、本明細書で以下に記載されるスクリーニングアッセイで評価され得る。
【００２５】
本明細書で使用される「治療」は、ヒトを含む哺乳動物における疾患の治療薬の投与または適用を包含し、疾患または疾患の進行の阻害、疾患またはその進行の阻害または遅延、その発達の停止、疾患の部分的または完全な緩和、疾患の発症の予防、または疾患の症状の再発の予防を指す。例示的な治療には、少なくとも１つのＮＡＣ誘導体の有効用量での投与が含まれる。
【００２６】
「阻害」または「阻害する」という用語は、何らかの事象（原線維形成など）の減少または停止、表現型特性の減少または停止、またはその発生率、程度、または可能性の減少または停止を指す特性を指す。「低減する」または「阻害する」とは、基準と比較して、活動、機能、および／または量を減少、減少、または阻止することである。必ずしも抑制または低減が完全である必要はない。例えば、特定の実施形態では、「低減する」または「阻害する」とは、２０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を指す。別の実施形態では、「低減する」または「阻害する」とは、全体的な５０％以上の減少を引き起こす能力を指す。さらに別の実施形態において、「低減する」または「阻害する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％、またはそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を指す。
【００２７】
「阻害剤」という用語は、特定の化学反応、シグナル伝達経路、または他のプロセスを減速または防止する薬剤、または特定の反応物、触媒、または酵素の活性を低下させる薬剤を指す。
【００２８】
「患者」および「被験者」という用語は、人間を含む哺乳類を意味するために互換的に使用される。
【００２９】
「Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）」は、ＨＣＣＡＡやアルツハイマー病などの神経変性疾患に存在する原線維形成に関連するジスルフィド結合を減少させるシステインの誘導体である。本明細書ではＮＡＣおよびエステル誘導体が例示されるが、他のＮＡＣ誘導体は当技術分野で公知であり、以下の特許文書、ＵＳ３２４２０５２、ＵＳ３５９１６８６、ＵＳ３６４７８３４、ＵＳ３７４９７７０、ＵＳ４０１６２８７、ＵＳ４１３２８０３、ＵＳ４２７６２８４、ＵＳ４３３１６４８、ＵＳ４７０８９６５、ＵＳ４７１１７８０、ＵＳ４７２１７０５、ＵＳ４７２４２３９、ＵＳ４８２７０１６、ＵＳ４８５９６５３、ＵＳ４８６８１１４、ＵＳ４８７６２８３、ＤＥ１５０６９４Ｃ、ＥＰ０２１９６０５Ａ２、ＥＰ０２１９４５５Ａ２、ＥＰ０２６９０１７Ａ２、ＥＰ０２８０６０６Ａ１、ＥＰ０３０４０１７Ａ２、及びＥＰ０３３９５０８Ａ１に記載される。
【００３０】
本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡまたはＲＮＡ分子、および一本鎖の場合、その相補配列の分子が線状または環状のいずれかを指す。核酸分子の議論において、特定の核酸分子の配列または構造は、５'から３'方向の配列を提供する通常の慣例に従って本明細書に記載され得る。
【００３１】
本発明の核酸に関して、「単離された核酸」という用語が時々使用される。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、それが由来する生物の自然発生ゲノムですぐに連続する配列から分離されたＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに挿入された、または原核生物または真核生物の細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。
【００３２】
ＲＮＡに適用される場合、「単離された核酸」という用語は、主に上記で定義された単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子を指す。あるいは、この用語は、その自然状態（すなわち、細胞または組織）で関連する他の核酸から十分に分離されたＲＮＡ分子を指しても良い。単離された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）は、生物学的または合成的手段によって直接産生され、その産生中に存在する他の成分から分離された分子をさらに表しても良い。
【００３３】
「レプリコン」とは、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスなどの遺伝的要素で、主にそれ自体の制御下で複製が可能である。レプリコンはＲＮＡでもＤＮＡでも良く、一本鎖でも二本鎖でも良い。
【００３４】
「ベクター」とは、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスなどのレプリコンであり、別の遺伝子配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を結合し、結合した配列または要素の複製を引き起こすことができる。本発明の例示的なベクターには、アデノウイルスベースのベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【００３５】
「発現オペロン」とは、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの転写および翻訳制御配列を保有し、促進する核酸セグメントを指し、宿主細胞または生物におけるポリペプチドコード配列の発現を促進する。
【００３６】
用語「単離タンパク質」または「単離および精製タンパク質」は、本明細書で時々使用される。この用語は、主に、本発明の単離された核酸分子の発現により産生されるタンパク質を指す。あるいは、この用語は、「実質的に純粋な」形態で存在するように、自然に関連する他のタンパク質から十分に分離されたタンパク質を指しても良い。「単離された」とは、他の化合物または材料との人工または合成混合物、または基本的な活性を妨害せず、例えば不完全な精製、安定剤の添加、または、例えば、免疫原性製剤または薬学的に許容される製剤への配合により存在する可能性がある不純物の存在を除外することを意味しない。
【００３７】
「実質的に純粋」という用語は、少なくとも５０〜６０重量％の所定の材料（例えば、核酸、オリゴヌクレオチド、タンパク質など）を含む調製物を指す。より好ましくは、調製物は、少なくとも７５重量％、最も好ましくは９０〜９５重量％の所定の化合物を含む。純度は、所定の化合物に適した方法（例えば、クロマトグラフィー法、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、ＨＰＬＣ分析など）によって測定される。
【００３８】
「タグ」、「タグ配列」または「タンパク質タグ」という用語は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸、ペプチドまたはタンパク質または他の化学物質のいずれかの化学部分を指し、別の配列に追加されると追加の有用性、または、特に検出または分離において、そのシーケンスに有用なプロパティを提供する。したがって、例えば、ホモポリマー核酸配列または捕捉オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列をプライマーまたはプローブ配列に加えて、伸長産物またはハイブリダイズ産物のその後の単離を促進しても良い。タンパク質タグの場合、ヒスチジン残基（４〜８個の連続したヒスチジン残基など）をタンパク質のアミノまたはカルボキシ末端に追加して、金属クロマトグラフィーをキレート化することによりタンパク質の分離を促進することができる。あるいは、特定の抗体分子または他の分子と反応するエピトープまたは結合決定因子を表すアミノ酸配列、ペプチド、タンパク質または融合パートナー（例えば、フラグエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡウイルスヘマグルチニンタンパク質の膜貫通エピトープ、タンパク質Ａ、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳトランスフェラーゼなど）をタンパク質に追加して、アフィニティークロマトグラフィーや免疫アフィニティークロマトグラフィーなどの手順によるタンパク質分離を促進することができる。化学タグ部分には、ビオチンなどの分子が含まれ、これは核酸またはタンパク質のいずれかに追加でき、アビジン試薬などとの相互作用による分離または検出を容易にする。多数の他のタグ部分は、訓練された職人に知られており、想像することができ、この定義の範囲内にあると考えられる。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「レポーター」、「レポーターシステム」、「レポーター遺伝子」、または「レポーター遺伝子産物」は、核酸が発現時にレポーターを産生する産物をコードする遺伝子を含む作動可能な遺伝子系、例えば、生物学的アッセイ、イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、または比色法、蛍光法、化学発光法、または他の方法により、容易に測定可能なシグナルを意味するものとする。核酸は、ＲＮＡまたはＤＮＡ、線状または環状、一本鎖または二本鎖、アンチセンスまたはセンス極性のいずれかであり、レポーター遺伝子産物の発現に必要な制御要素に機能的に連結される。必要な制御要素は、レポーターシステムの性質とレポーター遺伝子がＤＮＡかＲＮＡかどうかによって異なるが、プロモーター、エンハンサー、翻訳制御配列、ポリ付加シグナル、転写終結シグナルなどなどの要素が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
「形質転換」、「トランスフェクト」、「形質導入」という用語は、核酸を細胞または宿主生物に導入し、同じ意味を伝えるために交換可能に使用できる任意の方法または手段を指すものとする。そのような方法には、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＰＥＧ融合などが含まれるが、これらに限定されない。
【００４１】
導入された核酸は、レシピエント細胞または生物の核酸に組み込まれても（共有結合されなくても）良い。例えば、細菌、酵母、植物および哺乳動物細胞では、導入された核酸は、エピソーム要素またはプラスミドなどの独立したレプリコンとして維持され得る。あるいは、導入された核酸は、レシピエント細胞または生物の核酸に組み込まれ、その細胞または生物内で安定に維持され、レシピエント細胞または生物の子孫細胞または生物にさらに受け継がれるか、または遺伝する。他の方法では、導入された核酸は、レシピエント細胞または宿主生物に一時的にのみ存在し得る。
【００４２】
「クローン」または「クローン細胞集団」は、有糸分裂による単一の細胞または共通の祖先に由来する細胞の集団である。
【００４３】
「細胞株」とは、多くの世代にわたってｉｎ  ｖｉｔｒｏで安定した成長が可能な初代細胞または細胞集団のクローンである。
【００４４】
ＨＣＣＡＡおよびその他の神経変性障害の治療方法および使用
本明細書には、有効量のＮＡＣまたはその機能的誘導体を投与することを含む、対象のＨＣＣＡＡおよび他の神経変性障害を治療する方法が含まれる。本明細書で使用される「治療」という用語は、対象の疾患または障害の治療薬の投与または適用、疾患の阻害、その発症の停止、疾患の症状の緩和、または発生または再発の防止を含む病気または病気の症状を含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、治療方法は、ＨＣＣＡＡの原因となるｈＣＣに遺伝的変化を有する対象を特定または診断し、特定または診断された対象にＮＡＣまたはその機能的誘導体を投与することを含む。他の実施形態において、対象は、アルツハイマー病を含むがこれに限定されない、病理学的原線維形成に関連する異なる疾患を有する。
【００４６】
１つまたは複数の合計治療用量（２つ以上のターゲットを調整する場合）は、単回投与として被験者に投与するか、複数回／別々の用量をより長期間にわたって、例えば、一日の投与量の投与を可能にするための一日の期間にわたって、または所望の期間にわたって投与量を投与するためのより長い期間にわたって投与する分割治療プロトコルを使用し投与することが可能である。当業者であれば、対象において有効な用量を得るために必要な治療薬の量が、対象の年齢、体重、および一般的な健康、ならびに投与経路および数を含む多くの要因に依存することがわかるだろう。投与される治療。これらの要因を考慮して、当業者は、ＨＣＣＡＡを有する個体を治療するための有効な用量を得るために特定の用量を調整するだろう。
【００４７】
治療薬の有効量は、投与方法と治療対象の個人の体重に依存する。本明細書に記載の投与量は一般に平均的な成人の投与量であるが、子供の治療のために調整することができる。用量は一般に約０．００１ｍｇから約１０００ｍｇの範囲になる。
【００４８】
より重症の形態の疾患を患っている個体では、治療薬の投与は、例えばそのような疾患を治療するための従来の薬剤と組み合わせて投与される場合に特に有用であり得る。当業者は、治療薬を単独または組み合わせて投与し、神経学的または肺機能の決定、放射線学的または免疫学的アッセイ、または示される場合には組織病理学的方法などの日常的な方法を使用して、そのような治療の有効性を監視するだろう。
【００４９】
医薬製剤の投与は、好ましくは「有効量」であり、これは個体に利益を示すのに十分である。この量は、患者のＨＣＣＡＡ症状の重症度を予防、緩和、減少、または低減する。有効な量のＮＡＣまたはその機能的誘導体によるＨＣＣＡＡを有する患者の治療は、神経機能、呼吸機能の改善、併用薬物使用の漸減、または生存の増加をもたらし得る。
【００５０】
医薬製剤は、投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与単位形態で処方される。本明細書で使用される投薬単位形態は、治療を受ける患者に適切な医薬製剤の物理的に別個の単位を指す。各投与量には、選択された医薬担体に関連して所望の効果が得られるように計算された有効成分の量を含める必要がある。適切な投与単位を決定する手順は、当業者に周知である。
【００５１】
投与単位は、患者の体重に基づいて比例的に増減する場合がある。特定の病的状態を緩和するための適切な濃度は、当技術分野で知られるように、用量濃度曲線の計算によって決定することができる。
【００５２】
本発明の方法において有用な医薬組成物は、非経口、経口固体および液体製剤、皮下、皮内、筋肉内、舌下、局所、腹腔内、鼻腔内、経皮、呼吸器、眼科、座薬、エアロゾル、局所または他の既知の投与経路で投与され得る。ＨＣＣＡＡを治療するのに有用な薬剤に加えて、医薬組成物は、薬剤投与を促進および促進することが知られる薬学的に許容される担体および他の成分を含むことができる。したがって、そのような組成物は、必要に応じて、アジュバント、例えば水酸化アルミニウムおよび水酸化マグネシウムの水性懸濁液、および／または生理食塩水などの他の薬学的に許容される担体などの他の成分を含んでも良い。ナノ粒子、リポソーム、再封された赤血球、および免疫学に基づいたシステムなどの他の可能な製剤も、本発明の方法に従って患者に適切な薬剤を送達／投与するために使用され得る。そのような薬剤を送達するためのナノ粒子の使用、および使用可能な細胞膜透過性ペプチド担体は、Ｃｒｏｍｅｚ  ｅｔ  ａｌ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｖ３５：ｐ４４（２００７）に記載される。
【００５３】
医薬組成物は、アミロイド疾患の症状をさらに緩和するための同時投与用の抗炎症剤も含むことができる。これらには、コルチコステロイド、アスピリン、セレコキシブ、ジクロフェナク、ジフルニサル、エトドラク、イブプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、ナブメトン、ナプロキセン、オキサプロジン、ピロキシカム、サルサレート、スリンダク、トルメチン、インターロイキン、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１３、ＩＬ−１のサイトカイン受容体、腫瘍壊死因子−α、ＩＬ−１８およびその誘導体とバイオシミラーを含むが、これらに限定されない。
【００５４】
本発明の実施を容易にするために、以下の材料および方法が提供される。
【００５５】
細胞およびｈＣＣ  ＷＴとＬ６８Ｑバリアント発現コンストラクト
ヒト胎児腎臓２９３（ＨＥＫ−２３９Ｔ）細胞はＡＴＣＣ（バージニア州、マナッサス）から入手し、１０％ウシ胎児血清を添加したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）で３７°Ｃで成長させた。ＣＳＴ３のｃＤＮＡを含むプラスミドは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ）から入手した。完全長コーディング配列は、順方向プライマーＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＧＣＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）及び逆プライマー、ＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＣＴＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＡＧＡＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＧＧＣＧＴＣＣＴＧＡＣＡＧＧＴＧＧＡＴＴＴＣＧ  （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）およびＮｏｔＩ部位のライゲーションを使用したＰＣＲによってｃ末端Ｍｙｃタグで増幅されたＣＭＶ−Ｐｕｒｏ．５８  Ｌ６８Ｑ突然変異は、プライマーＧＴＧＡＡＣＴＡＣＴＴＣＴＴＧＧＡＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＧＧＣＣＧＡＡＣＣＡＣＧＴＧＴＡＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）及びＧＧＴＡＣＡＣＧＴＧＧＴＴＣＧＧＣＣＣＴＧＣＴＣＧＡＣＧＴＣＣＡＡＧＡＡＧＴＡＧＴＴＣＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）すべての配列は、サンガー配列決定によって確認された。メーカーのプロトコルに従って、Ｆｕｇｅｎｅ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州、マディソン）を使用して、３μｇのＤＮＡと９μｌのトランスフェクション試薬を使用して、野生型および変異体コンストラクトをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後、細胞をピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）含む新鮮な培地で３週間インキュベートした。選択後、限界希釈により各トランスフェクタントの安定したクローンが作成された。抗ｈＣｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ抗体ＭＡＢ１１９６（Ｒ&Ｄ、ミネソタ州、ミネアポリス）を使用したウエスタンブロットにより、クローンをスクリーニングした。
【００５６】
ウエスタンブロット法
ｈＣＣ  ＷＴまたはＬ６８Ｑバリアントを発現するＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を氷冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄し、５０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭβ−グリセロリン酸、１０％グリセロール（ｗ／ｖ）、１％ＮＰ−４０（ｗ／ｖ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＮａＶＯ４、および完全なＥＤＴＡフリーのタンパク質阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｇｅｒｍａｎｙ）溶解バッファー１ｍＬあたり２０μｌを含む新たに調製した氷冷細胞溶解バッファーを使用して氷上で溶解した。遠心分離（１０分、２１，０００×ｇ、４℃）で細胞ライセートを除去した後、上清を回収し、ウエスタンブロッティングに使用した。ＳＤＳ、グリセロール、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、およびブロモフェノールブルーを含むサンプルバッファーを２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０２％ブロモフェノールブルーの最終濃度まで各サンプルに加えた。減少したサンプルでは、ＤＴＴ（最終濃度５０ｍＭ）またはβ−メルカプトエタノール（最終濃度５％）を添加した。等量のライセートまたは上清サンプルを、加熱／沸騰せずに、ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ウォルサムマサチューセッツ州）にロードした。タンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、マサチューセッツ州、ビレリカ）に転写し、抗ｈＣｙｓｔａｔｉｎ  Ｃでブロットし、化学発光の強化（ＥＣＬ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により発色させた。ＥＣＬフィルムをスキャンし、Ｆｉｊｉ．５９のゲル分析機能を使用してバンドの密度を決定した。
【００５７】
薬物治療
ＨＥＫ−２３９Ｔ細胞を６ウェルプレートに播種し、２日間培養し、その時点で還元型グルタチオン（ＧＳＨ）（シグマ、ミズーリ州、セントルイス）またはＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（シグマ）を指定濃度に添加した。細胞を化合物とともに７２時間インキュベートし、上清のサンプル１００μｌを２４、４８、および７２時間で除去した。上清を遠心分離（１０分、２１，０００×ｇ、４°Ｃ）で除去した。ＳＤＳ、グリセロール、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、およびブロモフェノールブルーを含むサンプルバッファーを２％ＳＤＳ、１０％グリセロール、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．０２％ブロモフェノールブルーの最終濃度まで各サンプルに加えた。指示された場合、細胞をＰＢＳで洗浄し、溶解し、ウェスタンブロット分析によりシスタチンＣレベルを決定した。
【００５８】
統計分析
データの平均と標準偏差が計算されました。片側Ｔ検定を使用して、未処理のサンプルに関する有意性のレベルを決定し、ｐ＜０．０５は統計的に有意と見なされた。
【００５９】
ＮＡＣによるＨＣＣＡＡ患者の治療
背中からの３つの４ｍｍ皮膚生検は、３人の研究された個人のそれぞれから採取された。皮膚生検はホルマリン固定およびパラフィン包埋された。これらを免疫組織化学用に３μｍの切片に切断し、前述のＥｎＶｉｓｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを使用してウサギポリクローナルシスタチンＣ抗体（Ｓｉｇｍａ、ＨＰＡ０１３１４３）で免疫染色した。２２キャリア皮膚生検におけるｈＣＣ免疫反応性は、前述のＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用した半自動画像分析によって定量化された。２２キャリアからの各セクションの明視野画像は、×２０／０．３ＮＡ対物レンズを使用してキャプチャーされた。セクションのＲＧＢカラー画像がＩｍａｇｅＪにインポートされた。各画像で、長方形の２０００×２０００ピクセルの関心領域（ＲＯＩ）が定義された。各ＲＯＩ内のｈＣＣ免疫反応性の％領域カバレッジを生成する後続の処理は、前述のように実行された。２２最初の生検は研究開始の約２年前に行われた歴史的な生検で、発端者は３回目の脳卒中後に肺の粘液詰まりを治療するＮＡＣ療法（１日あたり４００ｍｇ４回）を９か月以上経験した。２回目の生検は、家族全員がＮＡＣ治療（６００ｍｇのＮＡＣを１日３回、６か月間）を開始する直前に行われた。３回目の生検は、ＮＡＣ療法の１日あたり６００ｍｇの６か月後に３回行われた。
【００６０】
発端者は、９か月間１日あたり４回４００ｍｇのＮＡＣを受け、その後６か月間１日あたり６００ｍｇの３ｘを受けた。親は、６ヶ月のコースで１日あたり６００ｍｇを３回のみ摂取した。発端者は決して線量を逃さず、親は週に２〜３回中用量を逃した。
【００６１】
試験の承認
Ｌ６８Ｑ−ＣＳＴ３キャリアの皮膚生検の使用に必要なすべての許可、およびサンプルおよび医療情報に関連する記録は、アイスランドの国立生物倫理委員会、参照番号０４−０４６−Ｓ２および１５−０６０−Ｓ１から取得した。両方のファミリーメンバーが情報を含む同意書に署名した。ＮＡＣ療法は発端者の肺無気肺を治療するための粘液溶解療法として臨床的および偶然に処方された。他のファミリーは栄養補助食品としてＮＡＣを摂取した（つまり、ＡｍａｚｏｎからＮＡＣをオンラインで購入した）。
【００６２】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態を例示するために提供される。決して本発明を限定することは意図しない。
【実施例１】
【００６３】
前述のように、ＨＣＣＡＡは、ヒトシスタチンＣのロイシン６８からグルタミンへの変異体（ｈＣＣ；Ｌ６８Ｑ−ｈＣＣ）によって引き起こされる優性遺伝疾患である（参照）。突然変異のほとんどの保因者は、２０代でマイクロ梗塞および脳出血を患い、平均寿命は３０歳（１−５）で、若年成人の麻痺、認知症および死に至る。ヒトの死後研究は、ｈＣＣがすべての脳領域、灰白質、同様に、動脈および細動脈で最も顕著に沈着したことを示す。これらの沈着物は、ｈＣＣからなるアミロイド線維で構成される。これは、偏光下でアミロイド構造に複屈折を示すコンゴレッド染色で死後組織を染色することで実証できる（６）。
【００６４】
化合物の毒性を調べながらｈＣＣの多量体化に影響を与える能力をテストするシステムを作成するために、野生型または変異型ｈＣＣを大量に発現する細胞株を作成した。この例では、細胞株およびそれらが作成する単量体および多量体のｈＣＣの特性評価、変異タンパク質の凝集を無毒に妨害する試み、およびＮＣＣを使用してＨＣＣＡＡの被験者を治療するパイロットバイオマーカー研究について説明する。
【００６５】
遺伝子操作されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、非還元条件下でオリゴマー化できるｈＣＣ（ｗｔまたはＬ６８Ｑ）を産生および分泌する。
Ｌ６８Ｑ  ｈＣＣのオリゴマーとフィブリルの産生を停止できる治療薬を特定するために、野生型（ＷＴ）またはＬ６８Ｑ変異体ｈＣＣのいずれかの発現を持つ遺伝子組み換えＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を生成した。タンパク質は、ｃ末端でｍｙｃタグでタグ付けされ、シグナルペプチドの切断またはｎ末端タギングから生じる可能性のある産生タンパク質の分泌との干渉を避けるために、ｃ末端タギングを選択した。これらのコンストラクトをＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に安定的に組み込んだ後、ｈＣＣ  ＷＴとＬ６８Ｑバリアントの分泌レベルと細胞内定常状態レベルの両方をモニターした。ｈＣＣの分析は、低分子量および高分子量のオリゴマー（ＬＭＷおよびＨＭＷ）の形成と検出を可能にするＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動システムによって開発された。図１Ａに示すように、細胞は、非還元条件下（レーン＃１および３）でオリゴマー化できるｈＣＣ  ＷＴまたはバリアントＬ６８Ｑの両方の検出可能なレベルを生成および分泌する。ＷＴおよびＬ６８Ｑ発現細胞には、ライセートに同程度のｈＣＣタンパク質が含まれており、同様の発現レベルを示す。ただし、Ｌ６８Ｑ発現細胞の調整上清には、ＷＴ発現細胞の上清よりもはるかに少ないｈＣＣタンパク質が含まれる。これは、以前の報告（１７、１８）と一致して、Ｌ６８Ｑバリアントタンパク質がＷＴほど効率的に細胞から分泌されないことを示す。細胞内ｈＣＣ  ＷＴは主に単量体として存在し、二量体の割合が低い（それぞれ９９％と１％）が、細胞内ｈＣＣ  Ｌ６８Ｑバリアントは、モノマー、ダイマーを形成することがわかったが、オリゴマーを形成する傾向が増加したため、ＬＭＷおよびＨＭＷ種も予想通りに形成された（１９）。興味深いことに、分泌型のｈＣＣ  ＷＴは細胞内フラクションと同様に振る舞い、主に単量体として発見される。これに対して、分泌されたｈＣＣ  Ｌ６８ＱはＨＭＷとしてのみ検出される。注目すべきことに、ＷＴおよびＬ６８Ｑバリアントの両方のタンパク質のオリゴマー化は、還元剤ＤＴＴまたはｂ−メルカプトエタノールの存在下で完全に廃止される。どちらも典型的なジスルフィド結合の還元を引き起こす強力な還元剤である。
【００６６】
非トランスフェクションまたはＷＴおよびＬ６８Ｑ発現２９３Ｔ細胞におけるｈＣＣタンパク質のレベルを検出するために、免疫蛍光アッセイを実施した。ｈＣＣタンパク質は主に細胞質で発現した。これは、後期エンドソーム／プレリソソーム、およびゴルジ／ＥＲ／初期エンドソーム区画で以前に報告された局在と一致する細胞内分布を示し、後者は分泌タンパク質の典型的な特性と大きく一致する（２０）。
【００６７】
グルタチオンとのインキュベーションは、細胞抽出物および上清のｈＣＣジ／オリゴマー化を損なう
ＤＴＴまたはβ−メルカプトエタノールの存在下でのＬＭＷおよびＨＭＷの枯渇は、二量化／オリゴマー化プロセスにおけるジスルフィド結合の重要性を強調する。したがって、他の還元剤で処理すると二量体化が損なわれるという仮説を立てる。ｈＣＣ  ＷＴおよびＬ６８Ｑバリアントの分泌レベルと細胞内レベルの両方の二量体化／オリゴマー化レベルに対する還元剤の影響を広範囲に特徴付けた。上清と細胞抽出物を異なる濃度のＧＳＨで３７℃で１５分間処理した。特に、図２Ａに示すように、３または１０ｍＭのＧＳＨで処理すると、ｈＣＣ  ＷＴまたはＬ６８Ｑバリアントの分泌画分と細胞内画分の両方で観察されるダイマーおよび／またはＨＭＷオリゴマーの量が大幅に減少した。デンシトメトリーによるこれらの結果の定量は、３ｍＭのＧＳＨが分泌画分でＨＭＷの約９０％の阻害を示し、Ｌ６８Ｑ  ｈＣＣ変異体の細胞内画分で約５０％の阻害を示した（図２Ａおよび図１Ｂ）。
【００６８】
ＮＡＣまたはグルタチオンとのインキュベーションは、分泌されたｈＣＣ  Ｌ６８Ｑの二量体化を損なう
酸化／還元グルタチオンペアは、酸化ストレスと戦うために重要であり、図２に示すように、ｈＣＣのダイマーとＨＭＷオリゴマーを効果的に破壊できる。したがって、一般的に使用される栄養補助食品ＮＡＣ（ＧＳＨと同様の抗酸化効果を持つ）が、分泌されたｈＣＣのオリゴマー化／二量化に影響するかどうかを分析した。上清は、３７℃で６０分間、異なる濃度のＧＳＨとＮＡＣで処理された。図３Ａが示すように、３または１０ｍＭのグルタチオンまたはＮＡＣで処理すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分泌されたｈＣＣ  Ｌ６８Ｑバリアントのオリゴマー化／二量化レベルが大幅に低下する。定量により、ＧＳＨまたはＮＡＣのいずれかの３ｍＭ濃度でのＨＭＷのほぼ完全な除去が示された（図３Ａおよび図２Ｂ）。この結果は、ＧＳＨまたはＮＡＣがｈＣＣ  Ｌ６８Ｑの病原性バージョンのオリゴマー化レベルを低下させ、患者ＨＣＣＡＡの治療に使用できる可能性があることを明確に示す。
【００６９】
ＧＳＨまたはＮＡＣの存在により、２４、４８、及び７２時間で分泌されたシスタチンＣ  Ｌ６８Ｑのオリゴマー化が減少する。
ＮＡＣまたはＧＳＨの効果が、ｉｎ  ｖｉｖｏ生物学をより反映した細胞系で分泌ｈＣＣ  Ｌ６８Ｑのオリゴマー化を減少させるかどうかを調べるために、ｈＣＣ  ＷＴまたはＬ６８Ｑを発現する細胞を両方の薬剤で処理した。細胞をプレートに播種し、４８時間ｈＣＣを分泌させ、その時点でＧＳＨまたはＮＡＣの濃度を増加させて培養液に加えた。細胞を還元剤の存在下で７２時間培養し、上清のサンプルを２４、４８、および７２時間後に除去した。ｈＣＣのオリゴマー化状態は、各時点でウエスタンブロットにより決定された。細胞は、すべての濃度（最大１０ｍＭ）の両方の還元剤の存在下で、実験期間中生存可能だった。細胞の増殖は、最高の１０ｍＭ濃度でわずかに影響を受けた（データは示さない）。図４（および図３Ｂ）に示すように、１０ｍＭのＧＳＨまたはＮＡＣで細胞を処理すると、２４時間と４８時間の時点でＨＭＷとＬＭＷの存在が完全になくなり、ＨＭＷとＬＭＷのかなりの、しかし不完全な減少が７２時間で持続した。低用量のＮＡＣまたはＧＳＨによる治療は、２４時間および４８時間で不完全にしか効果がなく、７２時間後に有意な効果は検出されなかった。
【００７０】
ＮＡＣなどの還元剤または上澄みまたはヒトシスタチンＣ（Ｃｙｓｔ−Ｃ）の変異体バージョンを過剰発現するように設計された細胞株の細胞抽出物のいずれかの還元グルタチオンによる処理は、Ｌ６８Ｑ変異体Ｃｙｓｔ−Ｃの高分子複合体の形成を低減することは明らかである。ＮＡＣおよびＧＳＨの効果が還元剤としての能力または化合物の他の特性によるものかどうかを判断するために、上清および細胞抽出物を、還元活性を欠くＮＡＣおよびＧＳＨと構造的に類似した化合物で処理した。図５に示すように、ＮＡＣの還元性スルフヒドリル基がヒドロキシル基で置換されたｎ−アセチルセリン（ＮＡＳ）、またはグルタチオンの酸化型（ＧＳＳＨ）での処理は、Ｌ６８Ｑ  Ｃｙｓｔ−Ｃ、両方の還元剤で有意な減少が観察された。ＮＡＣまたはＧＳＨのいずれかの還元活性は、Ｃｙｓｔ−Ｃオリゴマー化に対する効果に必要である。
【００７１】
改善された還元活性とバイオアベイラビリティー、ならびに血液／脳関門を通過する能力を示すＮＡＣの複数の誘導体が生成された。２つのＮＡＣ誘導体は、当社の細胞培養システムでテストされる。図６に示すように、ＮＡＣのアミドおよびメチルエステル誘導体は両方とも、上清または細胞抽出物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで処理すると、Ｌ６８Ｑ  Ｃｙｓｔ−Ｃの高分子量複合体を破壊する能力を保持する。高分子信号の損失が１０ｍＭのＮＡＣで見られるものと同等の１ｍＭの誘導体で観察されたため、我々のデータは、両方の誘導体がオリゴマー化を破壊する能力においてわずかに強力かもしれないことも示す。
【００７２】
ニューヨーク大学の共同研究者Ｅｕｆｒａｔ  Ｌｅｖｙから得たトランスジェニックマウスから追加の結果が生成された。これらのマウスは、Ｃｙｓｔ−Ｃのコード配列を含むヒトゲノムＤＮＡで形質転換されるが、発現レベルに影響を与える可能性のある遺伝子の非コード部分はない。マウスはＨＣＣＡＡの表現型に匹敵する表現型を表示しない。しかし、図７に示すように、トランスジェニック動物の脳と血液の両方に高分子量のＣｙｓｔ−Ｃ複合体の存在を示すことができた。マウス組織抽出物からのウェスタンブロットは、検出に使用する抗体がマウスで発生したため、細胞系からのブロットほどきれいではない。この合併症にもかかわらず、トランスジェニックマウス（番号６０２８および６０１９）と非トランスジェニックＣ５７Ｂｌ６動物の比較は、トランスジェニックヒトＣｙｓｔ−Ｃによって引き起こされるかなりのシグナルを示す。非トランスジェニックサンプルではいくつかの非特異的な高分子量バンドが観察されるが、トランスジェニック動物では明確な高分子量の「スミア」が見られ、細胞培養システムの上清で観察されるものと一致する。ＮＡＣで処理すると、このスメアが減少し、モノマーの出現を引き起こす。これは、ＮＡＣが生体試料のオリゴマー化を低減できることを示す。
【００７３】
ＨＣＣＡＡ患者におけるＮＡＣ療法の効果
アイスランドには、ＨＣＣＡＡに苦しむ（つまり、２０代前半に大きな脳卒中に苦しむ）患者が数百人あり、それらはすべて１５００年代初期の創始者の突然変異に起因する。３つの多重家族からの３０人の被験者にＲＮＡｓｅｑを実行し、冠動脈疾患、脳卒中、およびアテローム性動脈硬化症に関与する遺伝子がシスタチンＣの突然変異キャリアで上方制御されることを示した。病気のプロセスを逆転させることは、アイスランド薬局によって容易に承認されるだろう。アミロイド線維の二量体化は、中小サイズの脳動脈へのアミロイド沈着プロセスにおける重要なステップである。細胞ベースのアッセイでは、野生型タンパク質と変異タンパク質の両方が発現し、変異タンパク質の発現が二量化することが示す。これは阻害されるプロセスである。したがって、アミロイド線維の二量体化をブロックする薬物は、アミロイド沈着の予防および疾患過程の進行の停止に効果的であると予想され、それにより効果的な治療法が提示される。
【００７４】
図８Ａは、ＮＡＣ療法の６か月後に２年前に３人全員で得られた生検１、６か月前に得られた生検２、２週間前に得られた生検３からの染色の変化を示す。全体として、この薬は皮膚のバイオマーカー（アミロイド−シスタチンタンパク質凝集体）の強度を低下させており、以前に実証されたように、他の臓器におけるアミロイドの沈殿も減少することを示唆する（２１）。
【００７５】
皮膚のアミロイド−シスタチンタンパク質複合体凝集体を測定する染色結果に基づいて、最初の皮膚生検で非常に高レベルのアミロイド−シスタチン染色を有する発端者は、有意な方法で進行していないことが明らかになった（シミ）皮膚生検＃１と＃２の間、彼女の父親と彼女の兄弟（両方ともＬ６８Ｑ変異体の保因者でもある）は、ＮＡＣ療法の非存在下で時間とともに、皮膚のアミロイド複合体の沈殿の増加を反映して、シミの強度に有意な進行を示した。発端者が彼女の肺を治療するために約９ヶ月間ＮＡＣ薬を服用していたことは注目に値する。彼女は二回目の生検の数ヶ月前から治療を中止した。２回目の生検は、その後のＮＡＣ療法に対するバイオマーカー応答として機能するベースラインとして最初に実行された。
【００７６】
各個人の３つの生検は、合法的な比較のためにすべて同時に染色された。リード発端者（９か月で３回脳卒中）は、１日あたり６００ｍｇのＮＡＣ療法に１００％準拠しており、彼女は元の皮膚生検と比較してアミロイド染色の非常に目に見える減少を示し,
それは６か月の前向き治療の終了時に75％の減少に達した（図８Ａ）。彼女の父親の染色の減少は５０％であり、妹の生検の染色の減少は、材料と方法のセクションで示されるように、ＮＡＣの服用量が少なかったため、それほど明白ではなかった。
【００７７】
最後に、Ｌ６８Ｑ突然変異の保因者であることが知られるアイスランド人の家族の７人のメンバーから血液サンプルを取得した。家族のうち５人は既知の変異状態であり（３つのＬ６８Ｑ保因者、２つの野生型）、すべての個体からのＤＮＡは既知の状態を確認し、以前に検査されていない個体の状態を決定するためにサンガー配列決定され、そのうちの１人は突然変異を運ぶことが発見された。このファミリーの変異状態と発端者との関係を図８Ｂに示す。還元条件下での血漿ランのウェスタンブロッティングにより、Ｌ６８Ｑ突然変異の成人キャリア（発端者、兄弟、父親）の総Ｃｙｓｔ−Ｃ量の減少が示された。保育者はタンパク質の量の減少を示さず、潜在的な加齢に関連した影響を示した（また、どの治療にも影響しない）。非還元サンプルのブロッティングにより、チャイルドキャリア内の高分子量複合体の検出が示された。他の被験者では、これらの結果の解釈は、突然変異の成人保因者がすべてＮＡＣを定期的に摂取しているという事実によって複雑になっている。ＮＡＣを服用していない成人Ｌ６８Ｑキャリアでオリゴマーが検出される可能性がある。
【００７８】
両方のＮＡＣ誘導体は、ヒドロキシル基をより極性の低い置換基で置換するため、膜透過性が向上することが提案される。膜透過性の増加は、しばしば血液脳関門の良好な通過と相関する。誘導体化合物の膜透過性にアクセスするために、生細胞をＮＡＣまたは誘導体で処理した。化合物が細胞膜を通過する場合、Ｌ６８Ｑ  Ｃｙｓｔ−Ｃの細胞内オリゴマーの蓄積に対する誘導体の影響が予想される。図６に示すように、化合物は上清中の高分子量Ｃｙｓｔ−Ｃの量を減らした。細胞内物質への影響が少ないのは、タイミングの問題による可能性がある。細胞は過剰発現レベルでＬ６８Ｑ  Ｃｙｓｔ−Ｃを連続的に産生し、細胞に入る化合物はすぐに消費される可能性があり、培養を続けると失われる初期の効果がある。
【００７９】
討論
ｈＣＣの二量体化とアミロイド線維の形成を減少させる能力を持つ薬剤の同定は、ＨＣＣＡＡに関連するアミロイド形成と致死的な脳出血の治療および／または予防のための薬剤の開発の鍵である。ｈＣＣバリアントはＨＣＣＡＡの原因であり、脳出血による早期死を避けるための治療法はない。ここでは、非還元条件下でオリゴマー化できる検出可能なレベルのｈＣＣ（ｗｔまたはＬ６８Ｑ）を生成および分泌する細胞を最初に作成し、ＧＳＨまたはＮＡＣのいずれかとの短いインキュベーションがオリゴマーを細胞内および分泌ｈＣＣのモノマーに分解することを示すＬ６８Ｑ。ＮＡＣまたはＧＳＨのいずれかの治療により、２４、４８、および７２時間で分泌ｈＣＣ  Ｌ６８Ｑのオリゴマー化が減少し、ヒト患者のＮＡＣによる治療が皮膚におけるアミロイドの進行中の沈殿を防止するだけでなく、以前に沈殿したアミロイドを有意に減少させることを示す方法では、忍容性が良好で有害事象のない経口療法の６か月後に７５％以上の減少が観察された。
【００８０】
開発された細胞システムは、ｗｔシスタチンＣとＬ６８Ｑバリアントの両方の「ｉｎ  ｖｉｖｏ」でのｈＣＣ二量体化とアミロイド線維形成を減少させる薬剤を同定するために構築された。ｈＣＣの二量体化の研究のための以前のシステムは開発されたが、十分な量の単量体Ｌ６８Ｑ−シスタチンＣを生産することは非常に難しいため、それらのほとんどは主に野生型シスタチンＣで行われた（１４）。ｃ末端タグ付きｗｔおよびＬ６８Ｑ  ｈＣＣの両方の発現を持つ遺伝子組み換えＨＥＫ−２９３Ｔ細胞は、ｗｔおよびＬ６８Ｑ  ｈＣＣの分泌レベルと細胞内レベルの両方での小分子の影響を研究および特性評価する優れたモデルを提供する。特に、Ｌ６８Ｑ−ｈＣＣバリアントにおいて、挙動が異なるため、オリゴマー化を低減する薬剤の研究と特性評価を両方の画分で行う必要があることを強調することが重要である。この変異体は、主に細胞内画分でＬＭＷオリゴマーとして発見されたが、主に細胞外区画でＨＭＷを形成する。これらは、分泌プロセスがＬ６８Ｑバリアントのオリゴマー化を誘導するか、細胞外コンパートメントの環境条件がこのバリアントのオリゴマー化を促進するか、オリゴマー化がタンパク質の半減期を延長するためである。
【００８１】
Ｌ６８ＱシスタチンＣは高度にアミロイド形成性であり、対応する突然変異を有する被験者は、大脳アミロイドーシスに罹患しており、成人期の初期に脳出血と死に至る（１６）。アルツハイマー病、パーキンソン病、およびＨＤなどの他のアミロイド疾患は、同様のアミロイド起源を持ち、それらは誤って折り畳まれたタンパク質の蓄積によっても引き起こす。タンパク質毒性ストレスのこの広範なスペクトル効果は、神経変性疾患の「タンパク質障害」という用語につながる。興味深いことに、これらの神経変性疾患のいずれかを得るリスクは、おそらく、タンパク質の誤った折りたたみストレスの増加、プロテアソーム活性の低下と、誤って折りたたまれたタンパク質の細胞外蓄積を促進する抗酸化防御の減少（２２）の結果として、年齢とともに劇的に増加する（２２）。プロテアソームおよびオートファジーリソソーム経路は、細胞内凝集クリアランスの主要な経路である。しかし、細胞外で機能する対応するメカニズムや、ヒトのこれらの疾患に起因する神経変性を遅らせるまたは防ぐための効果的な戦略についてはほとんど知られていない（２３）。
【００８２】
グルタチオン（ＧＳＨ）は、前駆体アミノ酸であるグルタミン酸、システイン、グリシンからサイトゾルで合成され、細胞内の主要な内因性抗酸化物質と考えられる。細胞質には異なる濃度で存在し、細胞質上に高濃度で存在し、ＥＲ内に非常に低濃度で存在する細胞内コンパートメントに応じて、最大１０ｍＭになることがある（２４）。ＧＳＨが高濃度であるため、細胞質ゾルでタンパク質ジスルフィド結合はめったに形成されないが、対照的に、小胞体（ＥＲ）および細胞外コンパートメントの内腔には比較的高い濃度の酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）が含まれる（２５）。このＧＳＨの異なる分布により、ジスルフィド結合の形成だけでなく、非ネイティブジスルフィド結合の異性化を含む複雑なプロセスを通じて、ＥＲでのネイティブジスルフィド結合の形成が可能になる。私たちの免疫蛍光研究と以前の報告は、ｈＣＣが後期エンドソーム／プレリソソームとゴルジ体／ＥＲ／初期エンドソーム区画に局在することを示す（２０）。この局在は分泌タンパク質の典型的な特性と一致しており、ＧＳＨへの曝露が減少することにより凝集が増加するこれらのコンパートメントでＬ６８Ｑ  ｈＣＣが重合し、それにより細胞外コンパートメントで放出された凝集体を説明するという仮説と一致する。
【００８３】
通常の条件下では、ＧＳＨレベルは２つの主要なメカニズムによって、その合成速度と細胞からの輸出速度を制御することによって制御される。ただし、ＧＳＨレベルは、グルタチオンＳ共役体または複合体の形成につながるチオールレドックス状態を変更するエージェントまたは条件、および／またはさまざまな細胞内オルガネラ間のＧＳＨの分布を混乱させる条件によっても影響を受ける。さらに、ＧＳＨレベルは栄養状態とホルモン／ストレスレベルの影響を受け、発達および日内変動を示し、妊娠や運動などの特定の生理学的状態の影響を受ける（２６−３３）。血液中のＧＳＨの生理学的レベルは、タンパク質の細胞外蓄積を回避する適切な抗酸化環境を提供する必要があるが、栄養状態や年齢の結果として、ｈＣＣ  Ｌ６８Ｑのような変異の存在やＧＳＨレベルの欠損は、誤って折り畳まれたタンパク質の望ましくない蓄積を引き起こす可能性がある（３）。さらに、ＧＳＨ欠乏、またはＧＳＨ／グルタチオンジスルフィド（ＧＳＳＧ）比の減少は、酸化ストレスに対する感受性の増加によって主に現れることが知られており、その結果生じる損傷はパーキンソン病などの疾患に関与すると考えられる、およびアルツハイマー病であり、それは他の加齢関連の病状と強く関連する（３４、３５）。この研究で示された結果は、ＮＡＣがアミロイドタンパク質の蓄積の減少により、ＨＣＣＡＡなどのアミロイド疾患に対する興味深い治療アプローチを表すことができることを示す。
【００８４】
アセチルシステインは、抗酸化酵素グルタチオンの前駆体である内因性アミノ酸Ｌ−システインの合成Ｎ−アセチル誘導体である。ＧＳＨとＮＡＣはどちらもすでにヒトでの使用が承認されており、有害な副作用なしに長期間にわたって高用量で投与される。それらは直接活性酸素種（ＲＯＳ）スカベンジャーとして、またＳＨグループのソースとして働き、ＧＳＨ合成を刺激し、１）非タンパク質および２）タンパク質ＳＨグループの存在を増加させる。加えて、アセチルシステインは、ＧＳＨの肝臓貯蔵も再生する。これらの効果は、ＮＡＣにジスルフィド結合を減らす能力を与え、ＮＡＣが粘液の粘性と弾力性を他の用途の中でも減らすために広く使用されている理由である。私たちのデータは、ＧＳＨやＮＡＣ（およびＤＴＴまたはｂｅｔａ−ＭｅｔＯＨ）などの抗酸化剤による治療がｈＣＣオリゴマー化を無効にすることを示す。この効果は、ジスルフィド結合の形成がオリゴマー化プロセスに不可欠であることを示す。ジスルフィド結合は二量化プロセスに直接関与しているようには見えないが（１６）、ヒトシスタチンＣには２つのジスルフィド結合が存在し（すべてのタイプ２シスタチンと同様）、二量体構造でのそれらの保存は二量化プロセスでその重要な役割を示す（１６）。分子内ジスルフィド結合は、ｈＣＣモノマーの正しい折り畳みと、ダイマーの２つのサブユニット間の３次元「サブドメイン」の交換とオリゴマー化を無効にするために不可欠であると仮定する。
【００８５】
私たちのデータは、ＮＡＣでの治療がＧＳＨ産生を増加させ、両方の抗酸化物質が分泌されたｈＣＣのオリゴマー化を減少させ、ＨＣＣＡＡ患者の脳のアミロイド形成を減少させることを示す。ＧＳＨによる治療は効果的かもしれないが、その低い生物学的利用能は、ＨＣＣＡＡ患者の治療のための治療薬としての可能性を制限する。ＮＡＣは、ＧＳＨレベルの復元における役割、抗酸化特性、および（３６）でレビューされたジスルフィド結合を破壊する能力があるため、完璧な候補として表示される。さらに、ＮＡＣ補給は冠動脈および末梢血管拡張を大幅に改善した（３７）。脳障害に特化したＮＡＣは、アルツハイマー病の患者にある程度の有効性をもって投与されており（３８）、我々のデータはそれがＨＣＣＡＡの優れた代替品となりうることを示す。
【００８６】
細胞膜は、血液脳関門とともに、ＮＡＣに対する透過性の低下を示すため、細胞外ＮＡＣ処理は、Ｌ６８Ｑ  ｈＣＣの細胞内レベルの二量体化状態に影響を与えないようである（データ参照無し）。したがって、限定するものではないが、Ｎ−アセチルシステインエチルエステル（ＮＡＣＥＴ）またはＮ−アセチルシステインメチルエステルを含むＮＡＣ誘導体の効果が投与される。これらの新規な親油性細胞透過性膜システイン誘導体は、ＨＣＣＡＡのようなアミロイド疾患の治療におけるＨ２Ｓプロデューサーとしての経口使用に適した候補を提供するはずである（３９）。
【００８７】
ＮＡＣ治療による皮膚生検でのアミロイド染色で観察された減少は、非常に有望であり、この治療法がＨＣＣＡＡ患者の治療に効果があることを示す。アミロイドはすべての器官で沈殿するため、皮膚で減少が観察された場合、脳内でアミロイドの沈殿および蓄積が継続していると信じる理由はない。より可能性が高いのは、脳血管や脳を含む他の身体器官にも同様の減少があることである。３人の個人のいずれにも新たな事象は発生しておらず、全員が治療を継続しており、発端者は現在、３回目および最後の脳卒中の約２年後である。
【００８８】
アイスランドのかなりの数のＨＣＣＡＡ患者が臨床的脳卒中を経験することは決してなく、幼い頃に認知症を呈するだけであることは注目に値する。アミロイド沈殿の疾患プロセスはＨＣＣＡＡ患者ではアルツハイマー病に匹敵するため、アミロイド線維の二量体化および重合能力のブロック（Ｌ６８Ｑ−シスタチンＣ創始者変異症例により強化される）は、アミロイド関連認知症のアルツハイマー病患者を助ける可能性がある。したがって、ＮＡＣ療法またはＮＡＣ様化合物は、アルツハイマー病に有益である可能性がある。
【００８９】
ここでの類推は家族性複合高コレステロール血症（ＦＣＨ）である。スタチン薬はこの家族性状態を治療するために開発されたためです（ＦＣＨの患者は２０代に脳卒中と心筋梗塞を発症する）。その後、コレステロールの上昇は有害であり、ＭＩおよび脳卒中の主要な危険因子であり、ＣＶ危険因子を持つ患者はスタチン治療の恩恵を受けることが明らかになった。ＨＣＣＡＡは、アミロイドの沈殿を促進するもので、人生の初期に発生し、２０代および早期認知症の壊滅的な出来事につながる。このプロセスはやや匹敵するが、アルツハイマー病ではより遅いため、認知症は通常６０代半ばから後半または７０代まで続くが、治療は同じである。
【００９０】
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１０．Ｈｅｎｓｋｅｎｓ，Ｙ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ａｎｄ  ｐａｒｏｔｉｄ  ｓａｌｉｖａ．Ｊ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌ  ６７，２０５−２１２（１９９６）．
１１．Ｔｕｒｋ，Ｖ．&Ｂｏｄｅ，Ｗ．Ｔｈｅ  ｃｙｓｔａｔｉｎｓ：ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ２８５，  ２１３−２１９（１９９１）．
１２．Ｂｏｄｅ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ２．０  Ａ  Ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｃｈｉｃｋｅｎ  ｅｇｇ  ｗｈｉｔｅ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｍｏｄｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ．ＥＭＢＯ  Ｊ  ７，２５９３−２５９９  （１９８８）．
１３．Ｏｒｌｉｋｏｗｓｋａ，Ｍ．，Ｊａｎｋｏｗｓｋａ，Ｅ．，Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊｃｚｙｋ，Ｒ．，Ｊａｓｋｏｌｓｋｉ，Ｍ．&Ｓｚｙｍａｎｓｋａ，Ａ．Ｈｉｎｇｅ−ｌｏｏｐ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃａｎ  ｂｅ  ｕｓｅｄ  ｔｏ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ３Ｄ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｗａｐｐｉｎｇ  ａｎｄ  ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ．Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １７３，４０６−４１３（２０１１）．
１４．Ｋｏｌｏｄｚｉｅｊｃｚｙｋ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ  Ｊ  ２７７，１７２６−１７３７  （２０１０）．
１５．Ｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ，  ａｎ  ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ，ｄｉｍｅｒｉｚｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｗａｐｐｉｎｇ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ８，３１６−３２０（２００１）．
１６．Ｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｒ．，Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ，Ｍ．，Ｇｒｕｂｂ，Ａ．&Ｊａｓｋｏｌｓｋｉ，Ｍ．Ｄｏｍａｉｎ  ｓｗａｐｐｉｎｇ  ｉｎ  Ｎ−ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３４１，１５１−１６０（２００４）．
１７．Ｊａｎｏｗｓｋｉ，Ｒ．，Ｋｏｚａｋ，Ｍ．，Ａｂｒａｈａｍｓｏｎ，Ｍ．，Ｇｒｕｂｂ，Ａ．&  Ｊａｓｋｏｌｓｋｉ，Ｍ．３Ｄ  ｄｏｍａｉｎ−ｓｗａｐｐｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ｗｉｔｈ  ａｍｙｌｏｉｄｌｉｋｅ  ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｅｔａ−ｓｈｅｅｔｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ６１，５７０−５７８（２００５）．
１８．Ｗａｈｌｂｏｍ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｂｒｉｌｌｏｇｅｎｉｃ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ａｒｅ  ｆｏｒｍｅｄ  ｂｙ  ｐｒｏｐａｇａｔｅｄ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｗａｐｐｉｎｇ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８２，１８３１８−１８３２６（２００７）．
１９．Ｔｓｉｏｌａｋｉ，Ｐ．Ｌ．，Ｌｏｕｒｏｓ，Ｎ．Ｎ．，Ｈａｍｏｄｒａｋａｓ，Ｓ．Ｊ．&  Ｉｃｏｎｏｍｉｄｏｕ，Ｖ．Ａ．Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ'ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ−ｐｒｏｎｅ'  ｃｏｒｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ：Ａ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｓｔｕｄｙ．  Ｊ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １９１，  ２７２−２８０（２０１５）．
２０．Ｓｉｐｅ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｉｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ：  ２０１２  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．Ａｍｙｌｏｉｄ  １９，１６７−１７０（２０１２）．
２１．Ｐａｌｓｄｏｔｔｉｒ，Ａ．，Ｓｎｏｒｒａｄｏｔｔｉｒ，Ａ．Ｏ．&Ｔｈｏｒｓｔｅｉｎｓｓｏｎ，Ｌ．  Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ：ｇｅｎｅｔｉｃ，ｃｌｉｎｉｃａｌ，ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ  １６，５５−５９（２００６）．
２２．Ｓｎｏｒｒａｄｏｔｔｉｒ，Ａ．Ｏ．ｅｔ  ａｌ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｂａｓｅｍｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｒｍａｌ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｖｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｏｆ  ｓｋｉｎ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ．Ｌａｂ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９７，３８３−３９４（２０１７）．
２３．Ｐｅｒｌｅｎｆｅｉｎ，  Ｔ．Ｊ．，Ｍｅｈｌｈｏｆｆ，Ｊ．Ｄ．&Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｍ．Ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ｏｌｉｇｏｍｅｒ  ａｎｄ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｂｅｔａ−ａｍｙｌｏｉｄ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２９２，１１４８５−１１４９８（２０１７）．
２４．Oｓｔｎｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ｄｒｕｇ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ  ａｎｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ｄｉｍｅｒｓ  ｔｏ  ｉｄｅｎｔｉｆｙ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ．Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ  ７１，６７６−６８２（２０１１）．
２５．Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，Ａ．Ｈ．，Ｋｏｅｈｌｅｒ，Ａ．Ｎ．&Ｈｅｃｈｔ，Ｍ．Ｈ．Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｅｎａｂｌｅ  ｔｈｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔｈａｔ  ｂｉｎｄ  ｔｈｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  Ａｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅ  ｉｔｓ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  １３２，１７０１５−１７０２２  ２０１０）．
２６．Ｎｉｌｓｓｏｎ，Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｍａｉｎ  ｓｗａｐｐｉｎｇ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｉｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ：ｕｓｅ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｒｉｄｇｅｓ，ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａｎｄ  ｃａｒｂｏｘｙｍｅｔｈｙｌｐａｐａｉｎ  ｔｏ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅ  ｔｈｅ  ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  ｆｏｒｍ  ｏｆ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９（２００４）．
２７．Ｏｓｔｎｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  Ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  Ａｍｙｌｏｉｄ  Ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８８，１６４３８−１６４５０（２０１３）．
２８．Ｐｏｌｌａｋ，Ｊ．，Ｓｚｙｍａｎｓｋａ，Ａ．，Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，  Ｖ．&  Ｇｒｕｂｂ，Ａ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  Ｗｉｌｄ  Ｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ  Ｍｕｔａｎｔｓ．ＥＪＩＦＣＣ  ２０，１６６−１７０（２０１０）．
２９．Ｂｊａｒｎａｄｏｔｔｉｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  Ｌ６８Ｑ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ｉｎ  ＮＩＨ／３Ｔ３  ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌ  Ｐａｔｈｏｌ  ５１，３１７−３２６（１９９８）．
３０．Ｂｅｎｅｄｉｋｚ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ｗｉｔｈ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ，Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ  ｔｙｐｅ．Ａｍｙｌｏｉｄ  ６，１７２−１８２  （１９９９）．
３１．Ｔｈｏｒｓｔｅｉｎｓｓｏｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｏｎ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ａｍｙｌｏｉｄ  ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ  １０８，１２１−１２８  （１９９２）．
３２．Ｗｅｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ  ｗｉｔｈ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ，Ｉｃｅｌａｎｄｉｃ  ｔｙｐｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，１１８０６−１１８１４  （１９９８）．
３３．Ｍｅｒｚ，Ｇ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ｆｏｒｍｓ  ａｎ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  ｄｉｍｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １７３，４２３−４３２（１９９７）．
３４．Ｘｕ，Ｙ．，Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，Ｐ．，Ｖｅｇａ−Ｒａｍｏｓ，Ｊ．，Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｇ．&Ｖｉｌｌａｄａｎｇｏｓ，Ｊ．Ａ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｍｙｌｏｉｄｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８９，９７３０−９７４０（２０１４）．
３５．Ｂｅｎｅｄｉｋｚ，Ｅ．，Ｂｌｏｎｄａｌ，Ｈ．&Ｇｕｄｍｕｎｄｓｓｏｎ，Ｇ．  Ｓｋｉｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｓ  ｉｎ  ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  ｃｙｓｔａｔｉｎ  Ｃ  ａｍｙｌｏｉｄｏｓｉｓ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈ  Ａ  Ｐａｔｈｏｌ  Ａｎａｔ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ  ４１７，３２５−３３１（１９９０）．
３６．Ｕｎｎｉｔｈａｎ，  Ａ．Ｓ．，  Ｃｈｏｉ，Ｈ．Ｊ．，Ｔｉｔｌｅｒ，Ａ．Ｍ．，Ｐｏｓｉｍｏ，Ｊ．Ｍ．&Ｌｅａｋ，Ｒ．Ｋ．Ｒｅｓｃｕｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｔｗｏ  ｈｉｔ，ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  ６１，３５６−３６８  （２０１２）．
３７．Ｙｅｒｂｕｒｙ，Ｊ．Ｊ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｅ．Ｍ．，Ｗｙａｔｔ，Ａ．Ｒ．&Ｗｉｌｓｏｎ，Ｍ．Ｒ．Ｑｕａｌｉｔｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ｉｎ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐａｃｅ．ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ  ６，１１３１−１１３６（２００５）．
３８．Ｌａｉ，Ａ．Ｙ．&ＭｃＬａｕｒｉｎ，Ｊ．Ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ａｍｙｌｏｉｄ−ｂｅｔａ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｇｌｉａ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ：  ｔｈｅ  ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  ｗｈａｔ，ｗｈｅｎ  ａｎｄ  ｗｈｅｒｅ．Ｆｕｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｌ  ７，１６５−１７６  （２０１２）．
３９．Ｇｏ，  Ｙ．Ｍ．  &  Ｊｏｎｅｓ，  Ｄ．Ｐ．  Ｒｅｄｏｘ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １７８０，  １２７３−１２９０  （２００８）．
４０．Ｈｗａｎｇ，Ｃ．，  Ｓｉｎｓｋｅｙ，Ａ．Ｊ．&Ｌｏｄｉｓｈ，Ｈ．Ｆ．Ｏｘｉｄｉｚｅｄ  ｒｅｄｏｘ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７，１４９６−１５０２（１９９２）．
４１．Ｌａｕｔｗｅｉｎ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｓｔｉｍｕｌｉ  ｒｅｃｒｕｉｔ  ｃａｔｈｅｐｓｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ｌａｔｅ  ｅｎｄｏｓｏｍａｌ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３２，３３４８−３３５７（２００２）．
４２．ＤｅＬｅｖｅ，Ｌ．Ｄ．&Ｋａｐｌｏｗｉｔｚ，  Ｎ．  Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ  １０，２５１−２６６  （１９９０）．
４３．Ｈａｈｎ，  Ｒ．，Ｗｅｎｄｅｌ，Ａ．&Ｆｌｏｈｅ，Ｌ．Ｔｈｅ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ５３９，３２４−３３７（１９７８）．
４４．Ｉｓａａｃｓ，Ｊ．Ｔ．&  Ｂｉｎｋｌｅｙ，Ｆ．Ｃｙｃｌｉｃ  ＡＭＰ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒａｔ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ−ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ  ｒａｔｉｏ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ４９８，２９−３８（１９７７）．
４５．Ｋｅｍｐ，Ｍ．，Ｇｏ，Ｙ．Ｍ．&Ｊｏｎｅｓ，Ｄ．Ｐ．Ｎｏｎｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌ／ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｒｅｄｏｘ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ａ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ  ｏｎ  ｒｅｄｏｘ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｂｉｏｌｏｇｙ．  Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ&ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４４，９２１−９３７（２００８）．
４６．Ｌａｕｔｅｒｂｕｒｇ，Ｂ．Ｈ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｃ．Ｖ．，Ｈｕｇｈｅｓ，  Ｈ．  &Ｍｉｔｃｈｅｌｌ，Ｊ．Ｒ．  Ｂｉｌｉａｒｙ  ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ａｎｄ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｏｘｉｄａｔｉｖｅ  ｓｔｒｅｓｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ７３，１２４−１３３（１９８４）．
４７．Ｍｅｉｓｔｅｒ，Ａ．&Ｔａｔｅ，Ｓ．Ｓ．Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ：  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４５，５５９−６０４（１９７６）．
４８．Ｍｅｉｓｔｅｒ，Ａ．&  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｅ．Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５２，７１１−７６０（１９８３）．
４９．Ｕｈｌｉｇ，Ｓ．&Ｗｅｎｄｅｌ，  Ａ．  Ｔｈｅ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ５１，１０８３−１０９４（１９９２）．
５０．Ｂａｌｌａｔｏｒｉ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｅｔｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ３９０，１９１−２１４（２００９）．
５１．Ｓａｍｉｅｃ，Ｐ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ：ｄｅｃｌｉｎｅ  ｉｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｇｉｎｇ，ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ．Ｆｒｅｅ  ｒａｄｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ&ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２４，６９９−７０４（１９９８）．
５２．Ａｔｋｕｒｉ，Ｋ．Ｒ．，  Ｍａｎｔｏｖａｎｉ，Ｊ．Ｊ．，Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．&  Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ，Ｌ．Ａ．Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ−−ａ  ｓａｆｅ  ａｎｔｉｄｏｔｅ  ｆｏｒ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ／ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７，３５５−３５９（２００７）．
５３．Ａｉｔｉｏ，Ｍ．Ｌ．Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  −−  ｐａｓｓｅ−ｐａｒｔｏｕｔ  ｏｒ  ｍｕｃｈ  ａｄｏ  ａｂｏｕｔ  ｎｏｔｈｉｎｇ？  Ｂｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ６１，５−１５（２００６）．
５４．Ｂａｖａｒｓａｄ  Ｓｈａｈｒｉｐｏｕｒ，Ｒ．，Ｈａｒｒｉｇａｎ，Ｍ．Ｒ．&Ａｌｅｘａｎｄｒｏｖ，Ａ．Ｖ．Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ（ＮＡＣ）ｉｎ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ｂｒａｉｎ  Ｂｅｈａｖ  ４，１０８−１２２（２０１４）．
５５．Ａｎｄｒｅｗｓ，  Ｎ．Ｐ．，  Ｐｒａｓａｄ，  Ａ．  &  Ｑｕｙｙｕｍｉ，  Ａ．Ａ．  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ  ３７，  １１７−１２３  （２００１）．
５６．Ａｄａｉｒ，Ｊ．Ｃ．，Ｋｎｏｅｆｅｌ，Ｊ．Ｅ．&Ｍｏｒｇａｎ，Ｎ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｂａｂｌｅ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ'ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ５７，１５１５−１５１７（２００１）．
５７．Ｇｉｕｓｔａｒｉｎｉ，Ｄ．，Ｍｉｌｚａｎｉ，Ａ．，Ｄａｌｌｅ−Ｄｏｎｎｅ，Ｉ．，Ｔｓｉｋａｓ，Ｄ．&Ｒｏｓｓｉ，Ｒ．Ｎ−Ａｃｅｔｙｌｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｅｔｈｙｌ  ｅｓｔｅｒ（ＮＡＣＥＴ）：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｌｉｐｏｐｈｉｌｉｃ  ｃｅｌｌ−ｐｅｒｍｅａｂｌｅ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｒｅｍａｒｋａｂｌｅ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ８４，１５２２−１５３３（２０１２）．
５８．Ｃｏｈｅｎ，  Ｇ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ＨＩＶ−１  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ＨＩＶ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０，６６１−６７１（１９９９）．
５９．Ｓｃｈｉｎｄｅｌｉｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｊｉ：ａｎ  ｏｐｅｎ−ｓｏｕｒｃｅ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ−ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９，６７６−６８２（２０１２）．
【００９１】
本発明の特定の好ましい実施形態が上記で説明され、具体的に例示されたが、本発明がそのような実施形態に限定されることは意図されていない。添付の特許請求の範囲に記載されているように、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を行うことができることは当業者には明らかであろう。
【図１Ａ】
2020533294.tif 000003
【図１Ｂ】
2020533294.tif 000004
【図１Ｃ】
2020533294.tif 000005
【図２Ａ】
2020533294.tif 000006
【図２Ｂ】
2020533294.tif 000007
【図３Ａ】
2020533294.tif 000008
【図３Ｂ】
2020533294.tif 000009
【図４】
2020533294.tif 000010
【図５】
2020533294.tif 000011
【図６】
2020533294.tif 000012
【図７】
2020533294.tif 000013
【図８Ａ】
2020533294.tif 000014
【図８Ｂ】
2020533294.tif 000015
【図８Ｃ】
2020533294.tif 000016
【国際調査報告】
2020533294.tif 000017
2020533294.tif 000018
2020533294.tif 000019