(57)【要約】腫瘍を有する対象を処置するための方法が開示される。これらの方法は、対象に治療有効量のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を投与するステップを含む。腫瘍細胞抗原に特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸を単離するための方法も開示される。これらの方法は、腫瘍細胞抗原を発現する腫瘍を有する対象由来の試料から、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を単離するステップと、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞から、ＴＣＲをコードする核酸分子をクローニングするステップとを含む。さらに、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を増やすための方法が開示される。追加的な実施形態では、腫瘍を有する対象がチェックポイント阻害剤に応答するかどうかを決定するための方法が開示される。方法は、対象由来の生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の存在を検出するステップを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞抗原に特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸を単離する方法であって、
前記腫瘍細胞抗原を発現する腫瘍を有する対象由来の試料から、ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するステップと、
前記ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞から、ＴＣＲをコードする核酸分子をクローニングするステップと
を含み、それにより、前記ＴＣＲをコードする核酸分子を単離する、方法。
【請求項２】
前記腫瘍が、頭頸部扁平上皮細胞癌、肺がん、黒色腫、卵巣がん、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、肝がん、前立腺がん、乳がん、神経膠芽腫または直腸がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料が、末梢血または腫瘍生検材料である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｔ細胞受容体をクローニングする前に、前記ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増やすステップ
をさらに含む、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記対象がヒトである、請求項１から４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法によって作製される、ＴＣＲをコードする核酸分子。
【請求項７】
請求項１から５までのいずれか一項に記載の方法によって作製されるＴＣＲをコードする核酸分子によってコードされるＴＣＲ。
【請求項８】
請求項６に記載の核酸分子がトランスフェクトされた、単離された宿主Ｔ細胞。
【請求項９】
前記ＴＣＲが、前記対象にとって自己である、請求項８に記載の宿主Ｔ細胞。
【請求項１０】
前記ＴＣＲが、前記対象にとって同種である、請求項８に記載の単離された宿主Ｔ細胞。
【請求項１１】
腫瘍を有する対象を処置する方法であって、前記対象に治療有効量のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を投与するステップを含み、それにより、前記腫瘍を有する前記対象を処置する、方法。
【請求項１２】
治療有効量のプログラム死（ＰＤ）−１アンタゴニスト、プログラム死リガンド（ＰＤ−Ｌ１）アンタゴニスト、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）アンタゴニスト、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）アンタゴニスト、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３）アンタゴニスト、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）アンタゴニスト、または４−１ＢＢアゴニストを前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）前記ＰＤ−１アンタゴニストが、ＰＤ−１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；ｂ）前記ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストが、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；ｃ）前記ＣＴＬＡ−４アンタゴニストが、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；ｄ）前記ＢＴＬＡアンタゴニストが、ＢＴＬＡに特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；ｅ）前記ＴＩＭ−３アンタゴニストが、ＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片であり；ｅ）前記ＬＡＧ３アンタゴニストが、ＬＡＧ３に特異的に結合する抗体またはその抗原結合性断片である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＰＤ−１に特異的に結合する前記抗体、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する前記抗体、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する前記抗体、ＢＴＬＡに特異的に結合する前記抗体、ＴＩＭ−３に特異的に結合する前記抗体またはＬＡＧ３に特異的に結合する前記抗体が、ヒトモノクローナル抗体またはヒト化モノクローナル抗体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＤ−１アンタゴニスト、前記ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、前記ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、前記ＢＴＬＡアンタゴニスト、前記ＴＩＭ−３アンタゴニスト、または前記ＬＡＧ３アンタゴニストが、低分子阻害ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、小分子またはドミナントネガティブタンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍が、固形腫瘍である、請求項１１から１５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記固形腫瘍が、頭頸部扁平上皮細胞癌、肺がん、黒色腫、卵巣がん、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、肝がん、前立腺がん、乳がん、神経膠芽腫または直腸がんである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞が、自己である、請求項１１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象における前記腫瘍を切除するステップをさらに含む、請求項１１から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象がヒトである、請求項１１から１９までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を増やす方法であって、
ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を、グルタミン、血清、および抗生物質を含む組織培養培地中で培養して、初代培養物を形成するステップと、
前記初代培養物を、有効量の照射された同種フィーダー細胞およびインターロイキン（ＩＬ）−１５で刺激して、刺激されたＴ細胞を形成するステップと、
前記刺激されたＴ細胞を、組織培養培地および有効量のＩＬ−１５中で培養するステップと
を含み、それにより、前記ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を増やす、方法。
【請求項２２】
前記初代培養物を、約５ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５中で刺激するステップ、および／または前記Ｔ細胞のクラスターを、約５ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５中で培養するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記初代培養物を、約１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５中で刺激するステップ、および／または前記Ｔ細胞のクラスターを、約１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５中で培養するステップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記初代培養物を、有効量の照射された同種フィーダー細胞で刺激するステップが、約１，０００〜約２，０００個のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を、約１００，０００〜約３００，０００個の同種フィーダー細胞で刺激することを含む、請求項２１から２３までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
約１，０００〜約２，０００個のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋細胞を、約２００，０００個の同種フィーダー細胞で刺激する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
腫瘍を有する対象がチェックポイント阻害剤または放射線に応答するかどうかを決定する方法であって、
前記対象由来の生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の存在を検出するステップ
を含み、
前記生体試料中の前記ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の存在が、前記チェックポイント阻害剤または放射線が前記対象における前記腫瘍の処置に有効であることを示す、方法。
【請求項２７】
前記チェックポイント阻害剤または放射線を前記対象に投与するステップをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
腫瘍を有する対象ががん治療剤に応答するかどうかを決定するための方法であって、
前記対象に前記がん治療剤の第１の用量を投与するステップと、
前記対象由来の生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の数を決定するステップ
を含み、
前記生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の数が対照と比較して増加することは、前記がん治療剤の前記第１の用量が前記対象における前記腫瘍の処置に有効であることを示す、方法。
【請求項２９】
腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、
対象にがん治療剤の第１の用量を投与するステップと、
前記対象由来の生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の数を決定するステップであって、
前記生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の量が対照と比較して増加することは、前記がん治療剤の前記第１の用量が前記対象における前記腫瘍の処置に有効であることを示す、ステップと、
前記がん治療剤の第２の用量を投与するステップであって、前記第１の用量が前記第２の用量と同じである、または前記第２の用量が前記第１の用量よりも低い、ステップと
を含む方法。
【請求項３０】
腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、
前記対象にがん治療剤の第１の用量を投与するステップと、
前記対象由来の生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の数を決定するステップであって、
前記生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の量が対照と比較して減少することまたは変化がないことは、前記がん治療剤の前記第１の用量が前記対象における前記腫瘍の処置に有効でないことを示す、ステップと、
前記がん治療剤の第２の用量を投与するステップであって、前記第２の用量が前記第１の用量よりも高い、または前記第２の用量が前記第１の用量と同じである、ステップと
を含む方法。
【請求項３１】
前記対照が、前記対象から前記がん治療剤を用いた処置の前に得た生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の数であるか、または前記対照が、標準値である、請求項２９または３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記がん治療剤が、チェックポイント阻害剤である、請求項２７から３１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記がん治療剤が、化学療法剤である、請求項２７から３２までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記チェックポイント阻害剤が、前記対象に対するプログラム死（ＰＤ）−１アンタゴニスト、プログラム死リガンド（ＰＤ−Ｌ）１アンタゴニスト、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）アンタゴニスト、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）アンタゴニスト、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３）アンタゴニスト、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）アンタゴニスト、または４−１ＢＢアゴニストである、請求項２８または請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料が、末梢血試料または腫瘍生検材料である、請求項２７から３４までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記対象が、ヒトである、請求項３７から３５までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記腫瘍が、固形腫瘍である、請求項２７から３６までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記固形腫瘍が、頭頸部扁平上皮細胞癌、肺がん、黒色腫、卵巣がん、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、肝がん、前立腺がん、乳がん、神経膠芽腫または直腸がんである、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月９日に出願された米国仮出願第６２／５１７，６１２号の便益を主張し、この仮出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、がんの分野、具体的には、腫瘍を処置するための、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞などの細胞の養子移入の使用、およびＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞に由来するものなどのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の使用に関し、また、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を測定することによってなどで、処置を評価するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
腫瘍細胞を認識し、死滅させることにおいては免疫系が主要な役割を果たし、新しい治療手法は、がん患者におけるその機能をブーストし、かつ／または回復させることに焦点が当てられてきた。有効な免疫応答は、がん細胞を特異的に認識し、細胞傷害性分子およびサイトカインを放出することによって死滅させることができる重要なプレーヤーがＣＤ８  Ｔ細胞であるいくつかの異なる細胞型の協調作用を伴う（Klebanoff  CA  et  al.,  211:214-24,  Immunol.  Rev.,  2006）。腫瘍浸潤性ＣＤ８  Ｔ細胞は、腫瘍性病変において過剰発現される自己抗原、ならびに腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍に特異的な変異の結果として生じる新抗原を含み得る腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を認識する（Finn  OJ,  Cancer  Immunol  Res,  2017）。現行のパラダイムによると、腫瘍特異的ＣＤ８  Ｔ細胞は、腫瘍流入領域リンパ節において初回抗原刺激を受け、次いで、血液を介して腫瘍に移動して、それらのエフェクター機能を発揮する。以前の研究により、腫瘍浸潤性ＣＤ８  Ｔ細胞が腫瘍特異的Ｔ細胞ならびに腫瘍特異性を有さないバイスタンダーＴ細胞で構成される不均質な細胞の集団であることが示されている。後者は、腫瘍増悪（増殖、血管新生および転移）に関連する炎症によって腫瘍部位に動員される。しかし、養子移入の有効性／効率が増大した免疫療法が未だに必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】Klebanoff  CA  et  al.,  211:214-24,  Immunol.  Rev.,  2006
【非特許文献２】Finn  OJ,  Cancer  Immunol  Res,  2017
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
腫瘍反応性ＣＤ８  Ｔ細胞の表現型および機能を評価し、ＣＤ１０３およびＣＤ３９の共発現により、腫瘍微小環境において特異的に誘導される腫瘍浸潤性ＣＤ８  Ｔ細胞の集団が同定されることが確認された。腫瘍内で慢性的に刺激されているこれらの細胞は、腫瘍反応性が高度に富化されており、自己腫瘍細胞を死滅させる能力を有した。ヒト腫瘍におけるＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の頻度が高いことが、全生存期間の延長と相関した。ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の存在は、治療法が腫瘍の処置に有効であることを示し得ることが決定された。さらに、腫瘍を処置するためにＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を対象に養子移入することができる。
【０００６】
腫瘍を有する対象を処置するための方法であって、対象に治療有効量のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を投与するステップを含み、それにより、腫瘍を有する対象を処置する、方法が開示される。一部の実施形態では、方法は、治療有効量のプログラム死（ＰＤ）−１アンタゴニスト、プログラム死リガンド（ＰＤ−Ｌ）１アンタゴニスト、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）アンタゴニスト、Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）アンタゴニスト、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３）アンタゴニスト、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）アンタゴニスト、または４−１ＢＢアゴニストを対象に投与するステップを含む。
【０００７】
一部の実施形態では、腫瘍細胞抗原に特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸配列を単離するための方法が開示される。これらの方法は、腫瘍細胞抗原を発現する腫瘍を有する対象からＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を単離するステップと、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞から、ＴＣＲ分子をコードする核酸配列をクローニングして、それにより、腫瘍に特異的なＴＣＲをコードする核酸配列を単離するステップとを含む。
【０００８】
追加的な実施形態では、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を増やすための方法が開示される。これらの方法は、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を、グルタミン、血清、および抗生物質を含む組織培養培地中で培養するステップと、単離されたＴ細胞を有効量の照射された同種フィーダー細胞およびサイトカインで刺激するステップと、刺激されたＴ細胞を、組織培養培地および有効量のサイトカイン中で培養するステップとを含む。
【０００９】
さらに他の実施形態では、腫瘍を有する対象が、チェックポイント阻害剤、生物学的反応修飾物質（例えば、サイトカインおよびケモカイン）、がんワクチン、化学療法および／または放射線などのがん治療剤（a  cancer  therapeutic）に応答するかどうかを決定するための方法が開示される。対象が外科処置に応答するかどうかを決定するための方法も開示される。方法は、対象由来の生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の存在を検出するステップを含み、生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の存在は、がん治療剤または外科処置が対象における腫瘍の処置に有効であることを示す。一部の非限定的な実施例では、方法は、がん治療剤を対象に投与する、または外科処置を実施するステップも含み得る。
【００１０】
さらなる実施形態では、腫瘍を有する対象ががん治療剤に応答するかどうかを決定するための方法が開示される。方法は、対象に第１の用量のがん治療剤を投与するステップと、対象由来の生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の数を決定するステップとを含む。生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の数が対照と比較して増加することは、第１の用量のがん治療剤が対象における腫瘍の処置に有効であることを示す。
【００１１】
さらなる実施形態では、腫瘍を有する対象を処置するための方法が開示される。方法は、対象に第１の用量のがん治療剤を投与するステップと、対象由来の生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の数を決定するステップとを含む。生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の量が対照と比較して増加することは、第１の用量のがん治療剤が対象における腫瘍の処置に有効であることを示す。第２の用量のがん治療剤を対象に投与し、ここで、第１の用量は第２の用量と同じである、または、第２の用量は第１の用量よりも低い。
【００１２】
他の実施形態では、腫瘍を有する対象を処置するための方法が開示される。方法は、対象に第１の用量のがん治療剤を投与するステップと、対象由来の生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の数を決定するステップとを含む。生体試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の量が対照と比較して減少することまたは変化がないことは、第１の用量のがん治療剤が対象における腫瘍の処置に有効でないことを示す。第２の用量のがん治療剤を対象に投与し、ここで、第２の用量は第１の用量よりも高い、または、第２の用量は、第１の用量と同じである。
【００１３】
前述のおよび他の本発明の目的、特徴、および利点は、添付図を参照して進める以下の詳細な説明からより明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｆ。腫瘍浸潤性ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞はエクトヌクレオチダーゼＣＤ３９を共発現する。（Ａ）頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）に浸潤するＴ細胞のフローサイトメトリー分析についての代表的なゲーティング戦略。プロット内の数字は、それぞれのゲートにおける細胞のパーセントを示す。（Ｂ）（Ａ）に示されているＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞に関してゲーティングした腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）のｖｉＳＮＥ分析。ゲートにより、ＣＤ３９の発現が最も高いＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞が同定される。ゲートは、ＰＤ−１、ＣＤ６９およびＣＤ１２７の発現レベルを示す全てのプロットに適用される。（Ｃ）ＨＮＳＣＣ、黒色腫、卵巣がんおよびＣＲＬＭがん患者から単離されたＣＤ８  ＴＩＬのフローサイトメトリー分析。各四分円内の数字は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞における、ＣＤ３９および／またはＣＤ１０３について陽性の細胞のパーセントを示す。（Ｄ）異なる固形悪性病変を有する患者の間でのＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋（ＤＰ）ＣＤ８  ＴＩＬの頻度の要約。ＨＮＳＣＣ患者４０名、肺がん患者２名、黒色腫患者６名、卵巣がん患者２名、直腸がん患者３名、結腸がんを有する患者３名およびＣＲＬＭを有する患者６名が示されている。赤色の円は、マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）をもたらすリンチ症候群を有する結腸患者１名を強調したものである。（Ｅ）ＨＮＳＣＣ患者１名由来の末梢血、正常ＬＮ、原発腫瘍および転移性ＬＮにおけるＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞のパーセンテージに関するフローサイトメトリー分析。各四分円内の数字は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞における、ＣＤ３９および／またはＣＤ１０３について陽性の細胞のパーセントを示す。データは、分析されたＨＮＳＣＣ患者４０名を表す（正常ＬＮおよび転移性ＬＮについては９名の患者のみ）。パーセンテージが（Ｆ）に要約されている。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図１Ｄ】同上。
【図１Ｅ】同上。
【図１Ｆ】同上。
【００１５】
【図２ＡＢ】図２Ａ〜２Ｄ。ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＴＩＬの遺伝子発現プロファイリングにより、ＴＲＭ細胞を暗示するプロファイルが明らかになる。（Ａ）ＨＮＳＣＣ患者３名および卵巣がん患者２名から単離された、選別されたＤＮ  ＣＤ８  ＴＩＬ、ＳＰ  ＣＤ８  ＴＩＬおよびＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬの遺伝子発現に関する主成分分析（ＰＣＡ）。本分析は、ダブルポジティブ（ＤＰ）ＣＤ８  ＴＩＬとダブルネガティブ（ＤＮ）ＣＤ８  ＴＩＬの間で差次的に発現される遺伝子（ｎ＝３７２）に対して実施した。（Ｂ）ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬとＤＮ  ＣＤ８  ＴＩＬの間で差次的に発現される遺伝子３７２種を使用した試料の教師なしクラスタリング。濃い灰色は下方調節される遺伝子を示し、薄い灰色は上方調節される遺伝子を示す。（Ｃ）ウォーターフォールプロットは、ＤＰサブセットとＤＮサブセットとにおける、最も上方調節される遺伝子および下方調節される遺伝子の倍率変化（ｌｏｇ２）を表す。薄い灰色により、慢性活性化シグネチャーを有する遺伝子が識別される；濃い灰色は、ＴＲＭ表現型に関連する遺伝子を示す。（Ｄ）分析された患者５名のそれぞれにおける上位の差次的に発現される遺伝子の発現。上の列はＴＲＭ表現型に関連する遺伝子を示し、下の列は慢性活性化シグネチャー遺伝子を示す。各符号は患者を表し、それらが線でつながっている。
【図２Ｃ】同上。
【図２Ｄ】同上。
【００１６】
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｅ。ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬ、ＳＰ  ＣＤ８  ＴＩＬおよびＤＮ  ＣＤ８  ＴＩＬの表現型および機能的性質。（Ａ）ＣＤ８  ＴＩＬにおけるＴＲＭ表現型を描写する、表面タンパク質ＣＤ６９、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７およびＣＤ２８の発現のｅｘ  ｖｉｖｏ表現型分析（上）。数名のがん患者の間での上記のマーカーの頻度の要約（ｎ＝６〜１３、下）。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡ）。（Ｂ）ＣＤ８  ＴＩＬにおける活性化された／慢性的に刺激される表現型を図で表す、表面および細胞内タンパク質ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、４−１ＢＢおよびＫｉ−６７の発現に関するｅｘ  ｖｉｖｏ表現型分析（上）。数名のがん患者の間での上記のマーカーの頻度の要約（ｎ＝５〜１７、下）。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１（ＡＮＯＶＡ）。（Ｃ）ＰＭＡ／イオノマイシンを用いて４時間にわたって刺激したＣＤ８  ＴＩＬサブセットによるＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生に関する代表的なフローサイトメトリー分析。各四分円内の数字は、ＣＤ３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞に関してＩＦＮ−γおよび／またはＴＮＦ−αについて陽性の細胞のパーセントを示す。（Ｄ）ＣＤ８  ＴＩＬサブセットによるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ／ＴＮＦ−αダブルポジティブ細胞の頻度。データは、ＨＮＳＣＣ患者６名からのものである。（Ｅ）ＣＤ８  ＴＩＬによるグランザイムＢ産生に関する代表的なフローサイトメトリー分析（左）および６名の異なるＨＮＳＣＣ患者に関する要約（右）。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１（ＡＮＯＶＡ）。
【図３Ｂ】同上。
【図３ＣＤ】同上。
【図３Ｅ】同上。
【００１７】
【図４】図４。ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ３９およびＣＤ１０３の発現にはＴＧＦ−βが豊富な環境での持続的な刺激が必要である。末梢血由来の選別されたナイーブＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ３９、ＣＤ１０３およびＰＤ−１発現のカイネティクス。細胞を、ＴＧＦ−β（２ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、ＣＤ３／ＣＤ２８でコーティングされたビーズをビーズ：Ｔ細胞比１：２で用いて刺激し、示されている時点でＣＤ３９、ＣＤ１０３およびＰＤ−１の発現をフローサイトメトリーによって分析した。データは、４回の独立した実験を表す。
【００１８】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄ。ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬは高度にクローン性であり、他のいずれのＣＤ８  Ｔ細胞サブセットともほとんど重複しない。（Ａ）血中メモリーＣＤ８  Ｔ細胞、ＤＮ  ＣＤ８  ＴＩＬ、ＳＰ  ＣＤ８  ＴＩＬおよびＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬ内のＴＣＲβレパートリーの多様性。ＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ患者およびＨＰＶ−ＨＮＳＣＣ患者および１名の卵巣がん患者について、最も頻度が高いクローン型、２番目から５番目に頻度が高いクローン型、６番目から３０番に頻度が高いクローン型、および残りのクローン型の頻度が示されている。（Ｂ）５００種の最も頻度が高いＣＤ８  ＴＩＬクローン型がＤＮ  ＣＤ８  ＴＩＬサブセット、ＳＰ  ＣＤ８  ＴＩＬサブセットおよびＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬサブセットにおけるそれらの頻度に基づいてプロットされている。各ドットが別個のＴＣＲクローン型を表す。軸上のドットは、単一のレパートリー内で検出されたクローン型を示す。（Ｃ）血中および正常ＬＮ中のメモリーＣＤ８  Ｔ細胞における上位５００種のクローン型の頻度とＤＮ  ＣＤ８  ＴＩＬサブセットおよびＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬサブセットにおける上位５００種のクローン型の頻度を比較した、（Ｂ）におけるものと同じ分析。（Ｄ）Ｍｏｒｉｓｉｔａ−Ｈｏｒｎ指数を使用して分析された、ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬと、血中メモリーＣＤ８  Ｔ細胞、ＤＮ  ＣＤ８  ＴＩＬおよびＳＰ  ＣＤ８  ＴＩＬとの間のＴＣＲβ配列の重複。ＴＣＲβ配列の重複が１であることは、２つの集団間の類似性が１００％であることを示す。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【００１９】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｆ。ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬは自己腫瘍細胞を認識し、死滅させる、そして、それらの頻度は全生存の改善と相関する。（Ａ）増やしたＣＤ８  ＴＩＬを、漸増数の自己腫瘍細胞と共に２０時間培養し、４−１ＢＢ発現の頻度（黒塗りの記号）およびＩＦＮ−γ分泌（白抜きの記号）を測定することによって認識を評価することにより、腫瘍反応性について試験した。３名のがん患者についての結果が示されている。（Ｂ）自己腫瘍細胞を、ＭＨＣ−Ｉ遮断抗体、同種腫瘍細胞、およびプレートに結合させた抗ＣＤ３を伴ってまたは伴わずに培養することにより、ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬの反応性を確認した。３名のがん患者についての２０時間後の４−１ＢＢの上方調節が示されている。（Ｃ）腫瘍細胞殺滅を、２０時間の期間にわたって毎時モニタリングしたウェル当たりのカスパーゼ３／７＋事象の量を評価することによって測定した。（Ｄ）共培養の最初（Ｔ＝０）および最後（Ｔ＝２０時間）に取得したＤＮ  ＣＤ８  ＴＩＬおよびＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬについての代表的な画像。（Ｅ）外科手術時の総ＣＤ８  ＴＩＬの中でのＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬの頻度に基づいたＨＮＳＣＣ患者６２名のコホートについての全生存期間。（Ｆ）ＨＰＶ陰性ＨＮＳＣＣ患者３０名のコホートに対して実施した同様の分析。
【図６ＢＣ】同上。
【図６Ｄ】同上。
【図６ＥＦ】同上。
【００２０】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｃ。ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬは腫瘍反応性細胞に富み、原発腫瘍ＴＣＲレパートリーは同じ個体内の転移性ＬＮ  ＴＣＲレパートリーと重複する。（Ａ）および（Ｂ）ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬを選別し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増やした。増やした後、ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬを自己腫瘍細胞と共に２４時間共培養した。培養の最後に、細胞を４−１ＢＢおよびＣＤ２５の発現に基づいて選別した。共培養前のＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬのＴＣＲレパートリーを４−１ＢＢ＋ＣＤ２５＋ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬ（腫瘍反応性）のＴＣＲレパートリーと比較した。共培養前のＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬにおける上位１５種のクローン型が、腫瘍細胞との共培養の前後のそれらそれぞれの頻度と共に示されている。２名のがん患者からの結果が示されている。（Ｃ）５００種の最も頻度が高いＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬクローン型が原発腫瘍および転移性ＬＮにおけるそれらの頻度に基づいてプロットされている。２名のＨＮＳＣＣ患者からの結果が示されている。図７Ａに、配列番号１〜１５が上（配列番号１）から下（配列番号１５）までの順で示されている。図７Ｂに、配列番号１６〜３０が上（配列番号１６）から下（配列番号３０）までの順で示されている。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２において定義されている通り、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。各核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、示されている鎖への言及のいずれにも相補鎖が含まれると理解されたい。配列表は、ＡＳＣＩＩテキストファイル［Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ、２０１８年５月４日、７，１１３バイト］として提出され、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表中：
配列番号１〜３０は、例示的なＴＣＲＢ  ＣＤＲ３領域のヌクレオチド配列である。
詳細な説明
【００２２】
がん患者に対する免疫療法および養子Ｔ細胞移入の有効性を改善する必要性、ならびに、特定の亜集団を診断方法に使用するために、抗腫瘍応答に関与するＣＤ８  Ｔ細胞を特徴付ける必要性がある。ＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞およびＣＤ３９＋ＣＤ１０３−ＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む。腫瘍反応性ＣＤ８  Ｔ細胞の表現型および機能が決定されたことが本明細書に開示され、また、ＣＤ１０３およびＣＤ３９の共発現により、腫瘍微小環境において特異的に誘導される独特の腫瘍浸潤性ＣＤ８  Ｔ細胞の集団が同定されることが実証された。腫瘍内で慢性的に刺激されているこれらの細胞は、腫瘍反応性が高度に富化されており、自己腫瘍細胞を死滅させる能力を有する。ヒト腫瘍におけるＣＤ１０３＋ＣＤ３９＋ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度が高いことが、全生存期間の延長と相関し、これにより、生体試料中のこれらの細胞の評価により、処置の有効性を決定するため、および腫瘍を有する対象が処置に応答するかどうかを評価するための方法がもたらされることが示される。
用語
【００２３】
特に断りのない限り、技術用語は、従来の使用に従って使用されている。分子生物学における一般用語の定義は、Benjamin  Lewin,  Genes  V,  published  by  Oxford  University  Press,  1994  (ISBN  0-19-854287-9)；Kendrew  et  al.  (eds.),  The  Encyclopedia  of  Molecular  Biology,  published  by  Blackwell  Science  Ltd.,  1994  (ISBN  0-632-02182-9)；およびRobert  A.  Meyers  (ed.),  Molecular  Biology  and  Biotechnology:  a  Comprehensive  Desk  Reference,  published  by  VCH  Publishers,  Inc.,  1995  (ISBN  1-56081-569-8)において見出すことができる。
【００２４】
本開示の種々の実施形態についての再調査を容易にするために、以下の特定の用語の説明を提示する：
【００２５】
４−１ＢＢ：ＣＤ１３７およびＴＮＦＲＳＦ９とも称される膜貫通タンパク質であり、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳ）のタンパク質である。４−１ＢＢの発現は、一般に、活性化依存的であり、活性化されたＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞、調節性Ｔ細胞、活性化されたＣＤ４  Ｔ細胞およびＣＤ８  Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、刺激された肥満細胞、分化している骨髄細胞、単球、好中球、ならびに好酸球を含めた、免疫細胞の広範なサブセットに存在する（Wang,  2009,  Immunological  Reviews  229:  192-215）。４−１ＢＢ発現は、腫瘍脈管構造（Broll,  2001,  Amer.  J.  Clin.  Pathol.  115(4):543-549；Seaman,  2007,  Cancer  Cell  11:  539-554）および炎症部位またはアテローム硬化性内皮（Drenkard,  2007  FASEB  J.  21:  456-463；Olofsson,  2008,  Circulation  117:  1292-1301）においても実証されている。４−１ＢＢを刺激するリガンド、すなわち、４−１ＢＢリガンド（４−１ＢＢＬ）は、活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）、骨髄系前駆細胞、および造血幹細胞において発現される。ヒト４−１ＢＢは、２５５アミノ酸のタンパク質である（２０１７年６月１日に利用可能な参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ受託番号ＮＭ＿００１５６１およびＮＰ＿００１５５２を参照されたい）。４−１ＢＢのアゴニスト抗体は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３３７，８５０号において開示されている。
【００２６】
レベルの変更：特定の細胞型の細胞の数、または核酸配列もしくはアミノ酸配列（例えば、ポリペプチド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、遺伝子）の産生もしくは発現のレベルの、対照レベルと比較した増加または低下のいずれかによる変化。
【００２７】
アンチセンス、センス、およびアンチジーン：ＤＮＡは、プラス鎖と称される５’→３’鎖およびマイナス鎖と称される３’→５’鎖の２本の逆平行鎖を有する。ＲＮＡポリメラーゼにより核酸が５’→３’方向に付加されるので、ＤＮＡのマイナス鎖は、転写の間のＲＮＡの鋳型としての機能を果たす。したがって、ＲＮＡ転写物は、マイナス鎖と相補的な配列、およびプラス鎖と同一の配列（ＴがＵに置換される以外）を有する。
【００２８】
アンチセンス分子は、ＲＮＡまたはＤＮＡのプラス鎖のいずれかに特異的にハイブリダイズ可能または特異的に相補的な分子である。センス分子は、ＤＮＡのマイナス鎖に特異的にハイブリダイズ可能または特異的に相補的な分子である。アンチジーン分子は、ＤＮＡ標的に向けられたアンチセンス分子またはセンス分子のいずれかである。アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）は、センス（コード）核酸分子と相補的なＲＮＡの分子である。
【００２９】
抗体：ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３または４−１ＢＢポリペプチド、またはその断片などの抗原のエピトープを認識し、それに結合する（例えば、特異的に認識し、特異的に結合する）少なくとも軽鎖または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンド。免疫グロブリン分子は、重鎖および軽鎖で構成され、そのそれぞれが、可変重鎖（ＶＨ）領域および可変軽鎖（ＶＬ）領域と称される可変領域を有する。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、一緒になって、抗体によって認識される抗原との結合に関与する。
【００３０】
抗体は、インタクトな免疫グロブリン、ならびに当技術分野で周知の抗体のバリアントおよび一部、例えば、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨドメイン抗体）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、単鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）、およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）などを含む。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域と免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合した融合タンパク質であり、一方、ｄｓＦｖは、鎖の会合を安定化させるためにジスルフィド結合が導入されるように鎖を変異させたものである。この用語は、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）などの、遺伝子操作された形態も包含する。Pierce  Catalog  and  Handbook,  1994-1995  (Pierce  Chemical  Co.,  Rockford,  IL)；Kuby,  J.,  Immunology,  3rd  Ed.,  W.  H.  Freeman  &  Co.,  New  York,  1997も参照されたい。
【００３１】
一般には、天然に存在する免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続した重（Ｈ）鎖と軽（Ｌ）鎖を有する。軽鎖には２つの型、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）がある。抗体分子の機能活性を決定する主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）が５種存在する：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥ。
【００３２】
重鎖および軽鎖それぞれが、定常領域および可変領域を含有する（領域は、「ドメイン」としても公知である）。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は組み合わさって抗原に特異的に結合する。軽鎖可変領域および重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも称される超可変領域が３つ間に入った「フレームワーク」領域を含有する。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、Kabatら（Kabat  et  al.,  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,  U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services,  1991を参照されたい）およびImMunoGeneTicsデータベース（ＩＭＧＴ）（Lefranc,  Nucleic  Acids  Res  29:207-9,  2001；およびimgt.cines.fr/IMGT_vquest/vquest?_livret=0&Option=humanIgを参照されたい）に従って定義されている。Ｋａｂａｔデータベースはオンライン（ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）で維持されている。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、ヒトなどの種内では比較的保存されている。構成物である軽鎖および重鎖のフレームワーク領域の組合せである抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを３次元空間に位置付け、整列させる働きをする。
【００３３】
ＣＤＲは、抗原のエピトープへの結合に主に関与する。各鎖のＣＤＲは、一般には、Ｎ末端から開始して逐次的に番号を付し、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称され、また、一般には、特定のＣＤＲが位置する鎖によっても識別される。したがって、ＶＨ  ＣＤＲ３（またはＨ−ＣＤＲ３）はそれが見いだされる抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、ＶＬ  ＣＤＲ１（またはＬ−ＣＤＲ１）は、それが見いだされる抗体の軽鎖の可変ドメイン由来のＣＤＲ１である。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２に結合する抗体は、例えば、特異的なＶＨ領域配列およびＶＬ領域配列、したがって、特異的なＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原に対する異なる結合部位（combining  site））を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。ＣＤＲは抗体によって変動するが、抗原との結合に直接関与するのはＣＤＲ内の限られた数のアミノ酸位のみである。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と称される。
【００３４】
「ＶＨ」または「ＶＨ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂの可変領域を含めた、免疫グロブリン重鎖の可変領域を指す。「ＶＬ」または「ＶＬ」への言及は、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖまたはＦａｂの可変領域を含めた、免疫グロブリン軽鎖の可変領域を指す。
【００３５】
「モノクローナル抗体」は、Ｂリンパ球の単一のクローンによって、または単一の抗体の軽鎖および／もしくは重鎖遺伝子がトランスフェクトされた細胞によって産生される抗体である。モノクローナル抗体は、当業者に公知の方法によって、例えば、骨髄腫細胞と免疫脾臓細胞の融合物からハイブリッド抗体形成細胞を作製することによって産生される。モノクローナル抗体は、ヒト化モノクローナル抗体を含む。
【００３６】
「キメラ抗体」は、ヒトなどの１つの種に由来するフレームワーク残基と、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３または４−１ＢＢポリペプチドに特異的に結合するマウス抗体などの別の種に由来するＣＤＲ（一般に、抗原結合性を付与する）とを有する。
【００３７】
「ヒト」抗体（「完全ヒト」抗体とも称される）は、ヒトフレームワーク領域およびヒト免疫グロブリンに由来するＣＤＲの全てを含む抗体である。一実施例では、フレームワークおよびＣＤＲは、同じ起源のヒト重鎖および／または軽鎖アミノ酸配列に由来する。しかし、１つのヒト抗体に由来するフレームワークを、異なるヒト抗体に由来するＣＤＲを含むように工学的に操作することができる。「ヒト化」免疫グロブリンは、ヒトフレームワーク領域と、非ヒト（例えば、マウス、ラット、または合成）免疫グロブリン由来の１つまたは複数のＣＤＲとを含む免疫グロブリンである。ＣＤＲを提供する非ヒト免疫グロブリンは「ドナー」と称され、フレームワークを提供するヒト免疫グロブリンは「アクセプター」と称される。一実施形態では、ヒト化免疫グロブリンにおけるＣＤＲ全てがドナー免疫グロブリンに由来する。定常領域は存在する必要はないが、存在する場合には、ヒト免疫グロブリン定常領域と実質的に同一、すなわち、少なくとも約８５〜９０％、例えば約９５％またはそれよりも大きく同一でなければならない。したがって、ヒト化免疫グロブリンの部分は全て、恐らくＣＤＲ以外は、天然のヒト免疫グロブリン配列の対応する部分と実質的に同一である。「ヒト化抗体」は、ヒト化軽鎖およびヒト化重鎖免疫グロブリンを含む抗体である。ヒト化抗体は、ＣＤＲを提供するドナー抗体と同じ抗原に結合する。ヒト化免疫グロブリンまたは抗体のアクセプターフレームワークは、ドナーフレームワークから取得されたアミノ酸による限られた数の置換を有し得る。ヒト化または他のモノクローナル抗体は、抗原との結合や他の免疫グロブリン機能に実質的に影響を及ぼさない追加的な保存的アミノ酸置換を有し得る。ヒト化免疫グロブリンは、遺伝子工学によって構築することができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。
【００３８】
抗原：動物に注射されるまたは吸収される組成物を含めた、動物における抗体の産生またはＴ細胞応答を刺激することができる化合物、組成物、または物質。抗原は、異種免疫原によって誘導されるものを含めた特異的な体液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。「抗原」という用語は、関連する抗原エピトープ全てを含む。「エピトープ」または「抗原決定基」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。一実施形態では、Ｔ細胞は、エピトープがＭＨＣ分子と併せて提示された場合にエピトープに応答する。エピトープは、連続したアミノ酸で形成される場合もあり、タンパク質の三次折り畳みによって並置する連続していないアミノ酸で形成される場合もある。連続したアミノ酸で形成されるエピトープは、一般には変性溶媒に曝露しても保持されるが、一方、三次折り畳みによって形成されるエピトープは、一般には変性溶媒で処理すると失われる。エピトープは、一般には、少なくとも３アミノ酸、より通常には少なくとも５アミノ酸、約９アミノ酸、または約８〜１０アミノ酸を独特の空間コンフォメーションで含む。エピトープの空間コンフォメーションを決定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶構造解析および２次元核磁気共鳴が挙げられる。
【００３９】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）：ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子と結合した抗原をＴ細胞に提示することができる細胞。ＡＰＣとしては、これだけに限定されないが、単球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞およびランゲルハンス細胞が挙げられる。抗原を他のＴ細胞（ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋  Ｔ細胞を含む）に提示することができるＴ細胞は抗原提示Ｔ細胞（Ｔ−ＡＰＣ）である。
【００４０】
Ｂリンパ球およびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）：ＣＤ２７２としても公知のタンパク質。ＢＴＬＡ発現はＴ細胞の活性化の間に誘導され、ＢＴＬＡは、Ｔｈ１細胞上に発現したままになる。ＢＴＬＡは、Ｂ７ホモログであるＢ７Ｈ４と相互作用し、腫瘍壊死ファミリー受容体との相互作用を介してＴ細胞阻害において役割を果たす。ＢＴＬＡは、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）としても公知の腫瘍壊死因子（受容体）スーパーファミリー、メンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）のリガンドである。ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ複合体は、Ｔ細胞免疫応答を負に制御する。特定の非限定的なＢＴＬＡアミノ酸配列、およびＢＴＬＡをコードするｍＲＮＡ配列は、参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１０８５３５７、２０１６年９月１日で提供される。ＢＴＬＡアンタゴニストは、ＢＴＬＡの発現もしくは活性を低減する、または、例えば、ＢＴＬＡに特異的に結合し、ＢＴＬＡの腫瘍壊死因子受容体への結合を阻害することによってＢＴＬＡのＴ細胞阻害機能を阻害する作用剤を含む。例示的な化合物としては、抗体（例えば、抗ＢＴＬＡ抗体）、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、およびドミナントネガティブタンパク質が挙げられる。
【００４１】
結合または安定な結合（オリゴヌクレオチド）：オリゴヌクレオチドは、その結合の検出が可能になるのに十分な量のオリゴヌクレオチドがその標的核酸と塩基対を形成するまたはハイブリダイズする場合、標的核酸に結合するまたは安定に結合する。結合は、標的：オリゴヌクレオチド複合体の物理的性質または機能的性質のいずれかによって検出することができる。標的とオリゴヌクレオチドの結合は、機能的結合アッセイおよび物理的結合アッセイの両方を含めた、当業者に公知の任意の手順によって検出することができる。例えば、結合が、例えば遺伝子の発現、ＤＮＡ複製、転写、翻訳などの生合成プロセスに対して観察可能な影響を及ぼすかどうかを決定することにより、結合を機能的に検出することができる。
【００４２】
ＤＮＡまたはＲＮＡの相補鎖の結合を検出するための物理的方法は当技術分野で周知であり、それらとして、ＤＮａｓｅ  Ｉまたは化学的フットプリント、ゲルシフトおよび親和性切断アッセイ、ノーザンブロット法、ドットブロッティングおよび光吸収検出手順などの方法が挙げられる。例えば、単純であり信頼できることから広く使用されている１つの方法は、温度をゆっくりと上昇させてオリゴヌクレオチド（または類似体）および標的核酸を含有する溶液の２２０〜３００ｎｍにおける光吸収の変化を観察することを伴う。オリゴヌクレオチドまたは類似体がその標的に結合している場合、特有の温度でオリゴヌクレオチド（または類似体）と標的が互いから解離する、または融解するので吸収が突然増加する。
【００４３】
オリゴマーとその標的核酸の結合は、オリゴマーの５０％がその標的から融解する温度（Ｔｍ）によってしばしば特徴付けられる。（Ｔｍ）がより高いことは、複合体が、（Ｔｍ）がより低い複合体と比べてより強力またはより安定であることを意味する。
【００４４】
結合親和性：抗体の抗原に対する親和性。一実施形態では、Frankel  et  al.,  Mol.  Immunol.,  16:101-106,  1979により記載されたスキャッチャード法の改変版によって親和性を算出する。別の実施形態では、抗原／抗体解離速度によって結合親和性を測定する。別の実施形態では、競合ラジオイムノアッセイによって高結合親和性を測定する。別の実施形態では、ＥＬＩＳＡによって結合親和性を測定する。抗原（ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３または４−１ＢＢポリペプチドなど）に「特異的に結合する」抗体とは、抗原に高親和性で結合し、他の無関係の抗原には有意には結合しない抗体である。
【００４５】
がん治療剤：対象におけるがんを処置するために有用な任意の作用剤。がん治療剤としては、チェックポイント阻害剤、生物学的反応修飾物質（例えば、サイトカインおよびケモカイン）、がんワクチン、化学療法および／または放射線が挙げられる。
【００４６】
化学療法剤：異常な細胞成長を特徴とする疾患の処置において治療有用性がある任意の化学薬剤。そのような疾患としては、腫瘍、新生物、およびがん、ならびに乾癬などの過形成性の成長を特徴とする疾患が挙げられる。一実施形態では、化学療法剤は、放射性化合物である。当業者は、有用な化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、Slapak  and  Kufe,  Principles  of  Cancer  Therapy,  Chapter  86  in  Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine,  14th  edition；Perry  et  al.,  Chemotherapy,  Ch.  17  in  Abeloff,  Clinical  Oncology  2nd  ed.,  (C)  2000  Churchill  Livingstone,  Inc；Baltzer,  L.,  Berkery,  R.  (eds.):  Oncology  Pocket  Guide  to  Chemotherapy,  2nd  ed.  St.  Louis,  Mosby-Year  Book,  1995；Fischer,  D.S.,  Knobf,  M.F.,  Durivage,  H.J.  (eds):  The  Cancer  Chemotherapy  Handbook,  4th  ed.  St.  Louis,  Mosby-Year  Book,  1993を参照されたい）。併用化学療法は、がんを処置するために１種よりも多くの作用剤を投与することである。１つの例は、細胞、放射性化合物、または化学化合物と組み合わせて使用される、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＣＴＬＡ−４ポリペプチドに結合する抗体の投与である。
【００４７】
ＣＤ３９（ＥＮＴＰＤ１）：２つの膜貫通ドメインと大きな細胞外領域とを有する内在性膜タンパク質（Maliszewski  et  al,  1994）。ＣＤ３９（ＥＮＴＰＤ１）は、ヒトリンパ球上に活性化マーカーとしておよび血管エクト−ＡＤＰａｓｅとして最初に同定された（Kaczmarek  E  et  al.  (1996)  Biol  Chem）。「ＣＤ３９」という用語は、エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ−１（ＥＮＴＰＤ１）とも称されるＣＤ３９タンパク質を指す。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＣＤ３９は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）、Ｂ細胞およびいくつかの自然免疫細胞上で発現される。ＣＤ３９は、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）およびアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）のアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）への加水分解によって免疫抑制において重要な役割を果たし、次いでアデノシン一リン酸（ＡＭＰ）はエクト−５’−ヌクレオチダーゼであるＣＤ７３によってアデノシンにプロセシングされる。アデノシンは、Ｔ細胞上のＡ２Ａ受容体に結合することにより細胞内ｃＡＭＰの蓄積を増強し、それにより、Ｔ細胞活性化を防止する強力な免疫調節因子である（Deaglio  S  et  al.,  JEM,  2007）。いくつかのヒト固形悪性病変ではＣＤ３９およびＣＤ７３の両方の発現が増加する（Antonioli  Luca  et  al.,  Trends  Mol  Med,  2013）。両方の酵素の上方調節は低酸素環境内において有利であり、それらの逐次的な協調作用は腫瘍免疫エスケープにおいて役割を果たし得る（Eltzschig  HK  et  al.,  Blood  2009；Ghiringhelli  F  et  al.,  J  Biomed  Biotech,  2012）。特定の非限定的なＣＤ３９アミノ酸配列およびＣＤ３９をコードするｍＲＮＡ配列は、参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１７７６、２０１７年５月１日で提供される。
【００４８】
ＣＤ１０３：インテグリンアルファＥ（ＩＴＧＡＥ）として公知であり、ＣＤ１０３は、インテグリンベータ７（β７−ＩＴＧＢ７）と結合して、ヘテロ二量体インテグリン分子であるαＥβ７を形成する。αＥβ７の主要なリガンドは、上皮細胞上に見いだされる接着分子であるＥ−カドヘリンである。これは、腸の部位へのＴ細胞ホーミングおよび組織内の組織常在性メモリー（ＴＲＭ）細胞の保持のために重要である。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＣＤ１０３は、消化管内の樹状細胞のサブセットおよび組織常在性メモリー細胞（ＴＲＭ）として特徴付けられる末梢組織上に存在するＴ細胞の集団において発現される（Schenkel  JM  et  al.,  Immunity,  2014；Mueller  SN  et  al.,  Nat  Rev  Immunol,  2015）。ＣＤ１０３はまた、高悪性度の漿液性卵巣がん、肺がん、膀胱の尿路上皮細胞癌および子宮内膜癌におけるＣＤ８  Ｔ細胞のサブセットにおいても発現される（Webb  JR  et  al.,  Clin  Cancer  Res,  2014；Webb  JR  et  al.,  Cancer  Immunol  Res,  2015；Komdeur  FL  et  al.,  Oncotarget,  2016；Djenidi  F  et  al.,  J  Immunol,  2015；Wang  B  et  al.,  J  Urol,  2015；Workel  HH  et  al,  EJC,  2015）。これらの悪性病変では、ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞は腫瘍内に優先的に局在し、したがって、腫瘍細胞との直接相互作用に好都合である。ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞は、活性化／疲弊表面分子であるＰＤ−１を高レベルで発現し、ＰＤ−１は、そのリガンドであるＰＤ−Ｌ１と相互作用するとＴ細胞の増殖、生存およびエフェクター機能の阻害をもたらす（Webb  JR  et  al.,  Cancer  Immunol  Res,  2015）。特定の非限定的なＣＤ１０３アミノ酸配列およびＣＤ１０３をコードするｍＲＮＡ配列は、参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００２２０８、２０１７年５月２０日で提供される。
【００４９】
保存的バリアント：「保存的」アミノ酸置換は、抗体などのタンパク質の親和性に実質的に影響を及ぼさず、それを低下させない置換である。例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４または４−１ＢＢに特異的に結合するヒト抗体は、最大で約１カ所、最大で約２カ所、最大で約５カ所、および最大で約１０カ所、または最大で約１５カ所の保存的置換を含み、かつ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４または４−１ＢＢポリペプチドに特異的に結合することができる。保存的バリエーションという用語は、抗体がＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４または４−１ＢＢポリペプチドに特異的に結合するのであれば、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することも含む。非保存的置換は、活性またはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４、もしくは４−１ＢＢポリペプチドへの結合を低減する置換である。
【００５０】
機能的に類似したアミノ酸が提示されている保存的アミノ酸置換表が当業者には周知である。以下の６つの群は、互いに保存的置換であるとみなされるアミノ酸の例である：
１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００５１】
接触させること：直接物理的に関連するように置くことであり、固体の形態および液体の形態のどちらも包含する。
【００５２】
対照レベル（免疫パラメーター）：免疫パラメーターのベースラインレベル。一部の実施形態では、対照レベルは、治療剤の非存在下での、免疫系の成分、例えば特定の型の細胞のレベルである。対照レベルは、目的の作用剤を用いた処置を受けていない対象由来の試料、または対照作用剤を用いた処置を受けた対象由来の試料において測定することができる。対照レベルはまた、経時的に多数の試料の平均から決定される値などの標準値であってもよい。対照レベルはまた、特定の用量の治療剤を用いた処置を受けた対象由来の試料において測定することもでき、ここで、その用量は、対象が目下評価中の時点では対象に投与されていない。対照は、評価中の対象に由来する場合もあり、異なる対象に由来する場合もある。
【００５３】
細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）：ＣＤ１５２としても公知のタンパク質。ＣＴＬＡ−４は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ−４は、免疫チェックポイントとして機能し、したがって、免疫応答を下方調節するタンパク質受容体である。ＣＴＬＡ−４は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）において構成的に発現され、従来のＴ細胞において活性化後に上方調節される。ＣＬＴＡ４は、抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０またはＣＤ８６に結合し、Ｔ細胞の阻害因子である。ＣＴＬＡ−４タンパク質およびＣＴＬＡ−４をコードするｍＲＮＡの特定の非限定的な例は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００１０３７６３１、２０１６年１０月７日において開示されている。ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４の発現もしくは活性を低減する、または、例えばＣＴＬＡ−４に特異的に結合し、ＣＴＬＡ−４が抗原提示細胞上の表面のＣＤ８０もしくはＣＤ８６に結合するのを阻害することによってＣＴＬＡ−４のＴ細胞阻害機能を阻害する作用剤を含む。例示的な化合物としては、抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体）、ＲＮＡｉ分子、アンチセンス分子、およびドミナントネガティブタンパク質が挙げられる。
【００５４】
検出すること（ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）または検出（ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）（細胞または生体分子）：調査中の生体分子またはＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞などの特定の細胞型の存在を定量的または定性的に決定することを指す。例えば、対象由来の試料中のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の存在を定量的または定性的に決定すること。一般に、タンパク質、核酸などの生体分子の検出、または特定の細胞型もしくは細胞増殖を検出することには、単純な観察ではなく、生物学的アッセイを実施することが必要である。例えば、抗体または核酸プローブ（どちらも標識されていてよい）を利用するアッセイが、あるいはタンパク質または細胞をそれぞれ検出するために使用され得る。チェックポイント阻害剤によるなどの処置の有効性を診断すること（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）またはその診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）には、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞などの細胞または生体分子における有意な変化を検出することが伴う。
【００５５】
ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）：ＤＮＡは、大多数の生きている生物体の遺伝子材料を含む長鎖ポリマーである（一部のウイルスは、リボ核酸（ＲＮＡ）を含む遺伝子を有する）。ＤＮＡポリマー内の反復単位は４つの異なるヌクレオチドであり、そのそれぞれが４種の塩基、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンのうちの１種を含み、当該塩基が、リン酸基が結合したデオキシリボース糖と結合している。ヌクレオチドのトリプレット（コドンと称される）がポリペプチド内の各アミノ酸または停止シグナルをコードする。コドンという用語は、ＤＮＡ配列が転写されるｍＲＮＡにおける３ヌクレオチドの対応する（および相補的な）配列に対しても使用される。
【００５６】
別段の指定がない限り、ＤＮＡ分子へのいかなる言及も、そのＤＮＡ分子の逆相補物を含むものとする。本明細書において一本鎖であることが求められる場合以外は、ＤＮＡ分子は、一本鎖のみを示すように書かれていても、二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖を包含する。
【００５７】
診断：これだけに限定されないが、腫瘍などの病態の存在または性質を同定すること。診断方法は、それらの感度および特異度が異なる。診断アッセイの「感度」は、検査陽性であり、疾患にかかっている個体のパーセンテージである（真陽性のパーセント）。診断アッセイの「特異度」は、１から偽陽性率を引いたものであり、ここで、偽陽性率は、検査陽性であり、疾患を有さない個体の割合と定義される。特定の診断方法により状態の決定的な診断がもたらされるとは限らないが、方法により診断の助けとなる前向きの指標がもたらされれば十分である。「予後」は、腫瘍または転移などの病態の発症の確率（例えば、重症度）である。
【００５８】
コードする：ポリヌクレオチドは、その天然の状態で、または当業者に周知の方法によって操作された場合に、それが転写および／または翻訳されて、ポリペプチドもしくはその断片のためのｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドもしくはその断片を産生することができれば、ポリペプチドをコードするといえる。アンチセンス鎖はそのような核酸の相補物であり、それらからコード配列を推定することができる。
【００５９】
フィーダー細胞：例えば培養皿の底部の細胞の層。フィーダー細胞は、栄養分、成長因子および／またはサイトカインを培養培地に放出し、Ｔ細胞などの他の細胞が相互作用できる基質を提供することができる。当該細胞は照射され得る。一実施形態では、フィーダー細胞は、照射された同種末梢血単核細胞である。
【００６０】
免疫チェックポイント阻害剤：特定の型の免疫系細胞、例えばこれだけに限定されないがＴ細胞、および一部のがん細胞における生物学的経路を遮断する作用剤の一種。これらの阻害剤は、Ｔ細胞によるがん細胞の殺滅を阻害する。チェックポイント阻害剤が遮断されると、免疫系に対する「阻害」が低減し、Ｔ細胞ががん細胞に対して活性化される。Ｔ細胞またはがん細胞上に見いだされるチェックポイントタンパク質の例としては、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３が挙げられる。
【００６１】
免疫応答：刺激に対するＢ細胞、Ｔ細胞、または単球などの免疫系の細胞の応答。一実施形態では、応答は、特定の抗原に対して特異的である（「抗原特異的応答」）。一実施形態では、免疫応答は、ＣＤ４＋応答またはＣＤ８＋応答などのＴ細胞応答である。別の実施形態では、応答はＢ細胞応答であり、特異的抗体の産生がもたらされる。
【００６２】
「不応答性（unresponsiveness）」は、免疫細胞に関しては、活性化している受容体またはサイトカインによる刺激などの刺激に対する免疫細胞の不応性を含む。不応答性は、例えば、免疫抑制剤への曝露または高用量の抗原への曝露が原因で生じ得る。本明細書で使用される場合、「アネルギー」または「寛容（tolerance）」という用語は、活性化している受容体媒介性刺激に対する不応性を含む。そのような不応性は、一般に、抗原特異的であり、寛容化抗原（tolerizing  antigen）への曝露が停止した後も持続する。例えば、Ｔ細胞におけるアネルギー（不応答性とは対照的に）は、サイトカイン産生（例えば、ＩＬ−２）の欠如を特徴とする。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原に曝露し、第１のシグナル（Ｔ細胞受容体またはＣＤ３媒介性シグナル）を第２のシグナル（共刺激シグナル）の非存在下で受けた場合に生じる。これらの条件下では、細胞は、同じ抗原に再曝露しても（曝露が共刺激分子の存在下で生じるとしても）サイトカインを産生できず、したがって、増殖できない。しかし、アネルギー性Ｔ細胞は、無関係の抗原に対しては応答を開始することができ、また、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）と共に培養した場合、増殖することができる。例えば、Ｔ細胞アネルギーは、また、ＥＬＩＳＡによってまたはインジケーター細胞株を使用した増殖アッセイによって測定される場合のＴリンパ球によるＩＬ−２産生の欠如によっても観察され得る。あるいは、レポーター遺伝子構築物を使用することができる。例えば、アネルギー性Ｔ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサーの制御下にある異種プロモーターによって、またはエンハンサー内に見いだすことができるＡＰ１配列の多量体によって誘導されるＩＬ−２遺伝子転写を開始することができない（Kang  et  al.  Science  257:1134,  1992）。アネルギー性抗原特異的Ｔ細胞は、対応する対照抗原特異的Ｔ細胞と比べて細胞傷害活性が少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには１００％低下し得る。
【００６３】
疾患の阻害または処置：腫瘍成長などの疾患の阻害とは、疾患の完全な発症を阻害することまたは疾患過程の生理学的影響を緩和することを指す。いくつかの実施例では、疾患の阻害または処置は、腫瘍または病原体による感染の症状の緩和を指す。例えば、がんの処置により、がんを有することが分かっている人における腫瘍随伴症候群の発症を防止すること、または腫瘍の徴候もしくは症状を緩和することができる。別の実施形態では、感染の処置とは、感染の発症を阻害することまたは感染の症状を緩和することを指し得る。「処置」は、疾患または疾患に関連する病態の徴候または症状を好転させる治療介入を指す。治療的ワクチン接種は、病原体にすでに感染している対象に作用剤を投与することを指す。対象は無症候性の場合があり、したがって、処置により症状の発症が防止される。
【００６４】
単離された：「単離された」生物学的成分、例えば核酸、タンパク質（抗体を含む）または細胞は、当該成分が天然に存在する環境（例えば、他の細胞）中の他の生物学的成分、すなわち、他の染色体ＤＮＡおよびＲＮＡおよび染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質および細胞小器官から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸およびタンパク質は、標準の精製方法によって精製された核酸およびタンパク質を含む。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸およびタンパク質ならびに化学的に合成された核酸も包含する。
【００６５】
リンパ球：体の免疫防御に関与する白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）の一種。２つの主要な型のリンパ球：Ｂ細胞およびＴ細胞が存在する。
【００６６】
リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）：ＣＤ２２３とも称される、ヒトにおいてＬＡＧ３遺伝子によってコードされるタンパク質。ＬＡＧ−３は、Ｔ細胞機能に対して多様な生物学的効果を有する細胞表面分子であり、免疫チェックポイント受容体である。ＬＡＧ３は、Ｔ細胞の細胞増殖、活性化、および恒常性を負に調節し、Ｔｒｅｇ抑制機能において役割を果たすことが報告されている。例示的なアミノ酸およびヒトＬＡＧ３をコードするｍＲＮＡは、参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００２２８６．５、２０１７年４月９日で提供される。
【００６７】
哺乳動物：この用語は、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方を含む。同様に、「対象」という用語は、ヒトおよび獣医学的対象の両方を含む。
【００６８】
平均蛍光強度（フローサイトメトリー）：フローサイトメトリーは、散乱レーザー光であるか蛍光色素から放出される蛍光であるかにかかわらず、細胞または粒子の光強度の測定に関係する。光電子増倍管（ＰＭＴ）によって光が検出され、その光は増幅器を介して元の蛍光強度に比例する電圧とＰＭＴの電圧に変換される。連続分布であるこれらの電圧は、各シグナルを蛍光のレベルに応じて特定のチャネルに入れるアナログデジタル変換器（ＡＤＣ）によって不連続分布に変換される。ＡＤＣの分解能が大きいほど、これは、連続分布をより密接に反映する。
【００６９】
フローサイトメトリーデータは、リニアスケールまたはログスケールのいずれかを使用して表示することができる。分布が右側に歪む大多数の生物学的状況ではログスケールの使用が指示される。この場合、効果は分布を正規化することである−それは対数正規と言われ、データが対数変換されている。線形シグナルは線形増幅器によって得られるが、対数変換は、対数増幅器によってまたはルックアップテーブル（ＬＵＴ）を使用することによって実現することができる。分析用血球計算器における大多数のＡＤＣは１０ビットであり、すなわち、データが２ｅ１０または１０２４チャネルに分割されるが、データのより大きな分解能をもたらすために１２ビットまたは１４ビットＡＤＣが使用される傾向が高まっている。
【００７０】
単一のデータチャネルからのデータ（散乱または蛍光）は、ｘ軸が１０２４チャネルに分割される（１０ビットＡＤＣについて）ヒストグラムとして表示される。データがリニアスケールである場合、チャネル番号およびそのチャネルについての線形値が容易に得られる。ログスケールでは、ｘ軸は１０２４チャネルに分割されるにもかかわらず、５ｌｏｇ１０（log  decade）スケールとして表示される（一般に、５ｌｏｇ１０が使用される）。
【００７１】
フローサイトメトリーデータを定量するために、集団の分布の尺度を利用する。一般に、代表値（measures  of  central  tendency）は平均値（mean）および中央値である。平均値は、「平均（average）」であり、算術平均値または幾何平均値であり得る。算術平均値はＳｉｇｍａ（ｘ）／ｎとして算出され、幾何平均値はｎ乗根（ａ１×ａ２×ａ３．．．．ａｎ）として算出される。一般に、幾何平均値ではデータ分布の重み付けが考慮されるので、対数増幅データでは幾何平均値が使用され、算術平均値は線形データまたはリニアスケールで表示されるデータに対して使用される。中央値は中央の値、すなわち、値の半分が上にあり半分が下にある５０パーセンタイルである。「高」発現および「低」発現を有する細胞を集団全体の蛍光に応じて比較して決定することができる；これらのパラメーターは、フローサイトメトリーデータのプロット上に容易に視覚化される。
【００７２】
培地（組織培養物または細胞培養物）：特定の細胞の集団の成長（細胞増殖／拡大）を支持するために必要な栄養分を用いる培養条件の合成セット。培地は、一般に、炭素源、窒素源およびｐＨを維持するための緩衝剤を含む。一実施形態では、成長培地は、細胞成長を増強するために種々の栄養分を補充したＲＰＭＩなどの最小必須培地を含有する。さらに、最小必須培地には、ヒト、仔ウシまたはウシ胎仔血清などの添加物を補充することができる。
【００７３】
新形成、悪性病変、がんまたは腫瘍：新生物は、過剰な細胞分裂に起因する組織または細胞の異常な成長である。新生物の成長により、腫瘍が生じ得る。「がん」または「腫瘍」は、分化の喪失、成長速度の増加、周囲組織への浸潤を伴う特徴的な退形成を受けており、かつ、転移することが可能な新生物である。個体における腫瘍の量は、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる「腫瘍量」である。転移しない腫瘍は「良性」と称される。周囲組織に浸潤し、かつ／または転移し得る腫瘍は「悪性」と称される。転移性がんは、体内の、転移性がんが由来する元の（原発性）がんの起点部位以外の１つまたは複数の部位におけるがんである。
【００７４】
血液腫瘍の例としては、急性白血病（例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病ならびに骨髄芽球性白血病、前骨芽球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病および赤白血病）、慢性白血病（例えば、慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病など、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ球性白血病）を含めた白血病、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性および高悪性度の形態）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病および脊髄形成異常症が挙げられる。
【００７５】
肉腫および癌などの固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、および他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ系悪性腫瘍、膵がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーマ、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、およびＣＮＳ腫瘍（例えば、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（menangioma）、黒色腫、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫）が挙げられる。
【００７６】
いくつかの実施例では、腫瘍は、頭頸部扁平上皮細胞癌、肺がん、黒色腫、卵巣がん、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、肝がん、前立腺がん、乳がん、神経膠芽腫または直腸がんである。
【００７７】
非経口：腸の外側への投与、例えば、消化管を経由しない投与。一般に、非経口製剤は、経口摂取以外の任意の可能性のある方式で投与される製剤である。この用語は、特に、静脈内投与であるか、くも膜下腔内投与であるか、筋肉内投与であるか、腹腔内投与であるか、関節内投与であるか、または皮下投与であるかにかかわらず、注射、ならびに、例えば鼻腔内適用、皮内適用、および局部適用を含めた種々の表面への適用を指す。
【００７８】
医薬品：対象または細胞に適正に投与された場合に所望の治療効果または予防効果を誘導することができる化学化合物または組成物。
【００７９】
薬学的に許容される担体：有用な薬学的に許容される担体は、従来のものである。Remington's  Pharmaceutical  Sciences,  by  E.W.  Martin,  Mack  Publishing  Co.,  Easton,  PA,  15th  Edition,  1975に、本明細書において開示されている抗体の医薬送達に適した組成物および製剤が記載されている。
【００８０】
一般に、担体の性質は、使用される特定の投与形式に依存する。例えば、非経口製剤は、通常、例えば水、生理的食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的にかつ生理的に許容される流体をビヒクルとして含む注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉剤・散剤（powder）、丸剤、錠剤、またはカプセル剤の形態）に関しては、従来の無毒性固体担体として、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを挙げることができる。生物学的に中性の担体に加えて、投与される医薬組成物は、微量の無毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートを含み得る。
【００８１】
ポリヌクレオチド：ポリヌクレオチドまたは核酸配列という用語は、少なくとも１０塩基の長さであるポリマー形態のヌクレオチドを指す。組換えポリヌクレオチドは、それが由来する生物体の天然に存在するゲノムではすぐ接しているコード配列（一方が５’末端上にあり一方が３’末端上にある）のどちらともすぐ接してはいないポリヌクレオチドを含む。したがって、この用語は、例えば、ベクターに組み入れられる；自律複製性プラスミドもしくはウイルスに組み入れられる；もしくは原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに組み入れられる、または他の配列とは独立した別々の分子（例えば、ｃＤＮＡ）として存在する、組換えＤＮＡを含む。ヌクレオチドは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのヌクレオチドの修飾された形態であり得る。この用語は、ＤＮＡの一本鎖形態および二本鎖形態を包含する。
【００８２】
ポリペプチド：長さにも翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にもかかわらず、あらゆるアミノ酸の鎖。ポリペプチドは、３アミノ酸から３０アミノ酸の間の長さであり得る。一実施形態では、ポリペプチドは、約７アミノ酸から約２５アミノ酸までの長さである。さらに別の実施形態では、ポリペプチドは、約８アミノ酸から約１０アミノ酸までの長さである。さらに別の実施形態では、ペプチドは、約９アミノ酸の長さである。ポリペプチドに関しては、「含む」とは、追加的なアミノ酸配列または他の分子が分子に含まれ得ることを示し、「から本質的になる」とは、追加的なアミノ酸配列は分子に含まれないが、他の作用剤（例えば、標識または化学化合物）が含まれ得ることを示し、「からなる」とは、追加的なアミノ酸配列および追加的な作用剤が分子に含まれないことを示す。
【００８３】
疾患を防止すること、処置すること、または好転させること：疾患を「防止すること（ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ）」とは、腫瘍などの疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」とは、腫瘍量の減少または転移の数もしくはサイズ（the  number  of  size）の低減など、疾患または病態の徴候または症状をそれが発症し始めた後に好転させる治療介入を指す。「好転させること（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｎｇ）」は、がんなどの疾患の徴候または症状の数または重症度の低減を指す。
【００８４】
プログラム細胞死タンパク質（ＰＤ）−１：ＰＤ−１分子は、免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーである。ヒトＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリードメイン、膜貫通ドメイン、および免疫受容体抑制性チロシンモチーフ（ＩＴＩＭ）を含む細胞内領域を含有する細胞外領域を有する（（Ishida  et  al.,  EMBO  J.  11:3887,  1992；Shinohara  et  al.,  Genomics  23:704,  1994；米国特許第５，６９８，５２０号、参照により本明細書に組み込まれる）。これらの特徴により、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、およびキラー抑制性受容体（ＫＩＲ）も含む、免疫抑制性受容体と称される分子のより大きなファミリーも定義される（Vivier  and  Daeron  (1997)  Immunol.  Today  18:286）。理論に束縛されることなく、これらの受容体のチロシルリン酸化ＩＴＩＭモチーフは、Ｓ１１２ドメインを含有するホスファターゼと相互作用し、それにより阻害シグナルがもたらされると考えられている。これらの免疫抑制性受容体のサブセットは、ＫＩＲなどの主要組織適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）は、Ｂ７−１およびＢ７−２に結合する。ヒトでは、ＰＤ−１は、活性化誘導性アポトーシスを受けたＴ細胞株において最初に同定された５０〜５５ｋＤａのＩ型膜貫通型受容体である。ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージにおいて発現される。ＰＤ−１のリガンドは、Ｂ７ファミリーメンバーであるＰＤ−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ１としても公知）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣとしても公知）である。
【００８５】
ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＰＤ−１は活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および単球において発現される。実験データから、ＰＤ−１とそのリガンドの相互作用が中枢および末梢免疫応答の下方調節に関係づけられる。具体的には、ＰＤ−Ｌ１の存在下で、野生型Ｔ細胞の増殖は阻害されるが、ＰＤ−１欠損Ｔ細胞の増殖は阻害されない。さらに、ＰＤ−１欠損マウスは、自己免疫性の表現型を示す。例示的なヒトＰＤ−１のアミノ酸配列は、Ishida  et  al.,  EMBO  J.  11:3887,  1992；Shinohara  et  al.  Genomics  23:704,1994；米国特許第５，６９８，５２０号）に記載されている。
【００８６】
ＰＤ−１の会合（例えば、架橋によるまたは凝集による）により、免疫細胞における阻害シグナルの伝達がもたらされ、その結果、免疫細胞アネルギーが増大すると同時に免疫応答が低下する。ＰＤ−１は、２種のリガンド、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２に結合し、これらはどちらも、ポリペプチドのＢ７ファミリーのメンバーである、ヒトＰＤ−１リガンドポリペプチドである。
【００８７】
ＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤリガンド１（ＰＤ−Ｌ１）もしくはＰＤリガンド２（ＰＤ−Ｌ２）の発現もしくは活性を低減するまたはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１もしくはＰＤ−Ｌ２の相互作用を低減する作用剤を含む。例示的な化合物としては、抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＰＤ−Ｌ２抗体）、ＲＮＡｉ分子（例えば、抗ＰＤ−１  ＲＮＡｉ分子、抗ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡｉ、および抗ＰＤ−Ｌ２  ＲＮＡｉなど）、アンチセンス分子（例えば、抗ＰＤ−１アンチセンスＲＮＡ、抗ＰＤ−Ｌ１アンチセンスＲＮＡ、および抗ＰＤ−Ｌ２アンチセンスＲＮＡ）、ドミナントネガティブタンパク質（例えば、ドミナントネガティブＰＤ−１タンパク質、ドミナントネガティブＰＤ−Ｌ１タンパク質、およびドミナントネガティブＰＤ−Ｌ２タンパク質）が挙げられる。例えば、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第２００８／０８３１７４号を参照されたい。
【００８８】
増殖：後代を生じるための細胞の分裂であり、当技術分野で公知のいくつものやり方で測定することができる。このやり方としては、これだけに限定されないが、細胞の総数を計数するアッセイ、特定の細胞型の細胞の数を計数するアッセイ、Ｋｉ−６７アッセイ、チミジン組み入れ、およびブロモデオキシウリジンアッセイが挙げられる。
【００８９】
精製された：精製されたという用語は、絶対的な純度を要求するものではなく、相対語として意図されている。したがって、例えば、精製されたペプチド調製物は、ペプチドまたはタンパク質が、そのペプチドまたはタンパク質が細胞におけるその天然の環境中にあるよりも富化されている調製物である。一実施形態では、タンパク質またはペプチドが調製物の総ペプチドまたはタンパク質含有量の少なくとも５０％に相当するように調製物を精製する。実質的な精製とは、他のタンパク質または細胞成分からの精製を示す。実質的に精製されたタンパク質は、少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９８％純粋である。したがって、特定の非限定的な一実施例では、実質的に精製されたタンパク質は、９０％は他のタンパク質や細胞成分を含まない。
【００９０】
試料（生体試料）：流体、組織、細胞、およびＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質などのその小成分を含有する生体試料を含む。例えば、一般的な試料は、腫瘍生検材料、骨髄、脾臓、リンパ節、血液、例えば、末梢血を含む（しかし、組織生検材料、摘出検体、穿刺吸引物、剖検材料などを含めた、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を単離することができる任意の他の供給源も含み得る）。
【００９１】
特異的結合剤：実質的に定義された標的のみに結合する作用剤。一実施形態では、特異的結合剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３または４−１ＢＢポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
【００９２】
「特異的に結合する」という用語は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３または４−１ＢＢポリペプチドなどの抗原に関しては、抗体または他のリガンドが、全体または部分で、その抗原を有する細胞または組織に優先的に会合し、その抗原を欠く細胞または組織には会合しないことを指す。当然、分子と非標的細胞または組織との間に、ある特定の程度の非特異的相互作用が生じ得ることが認識される。それにもかかわらず、特異的結合は、抗原の特異的認識により媒介されるので、区別することができる。選択的に反応性の抗体は抗原に結合するが、低親和性での結合であり得る。特異的結合では、抗体（または他のリガンド）と抗原を有する細胞との間に、抗体（または他のリガンド）と抗原を欠く細胞との間におけるよりもはるかに強力な会合がもたらされる。特異的結合により、一般には、ポリペプチドを欠く細胞または組織と比較して、２倍よりも大きな、例えば、５倍よりも大きな、１０倍よりも大きな、または１００倍よりも大きな、ポリペプチドを有する細胞または組織に結合した抗体または他のリガンドの量の増加（単位時間当たり（per  unit  time））がもたらされる。そのような条件下でのタンパク質に対する特異的結合には、特定のタンパク質に対する特異性について選択された抗体が必要である。特定のタンパク質に対して特異的に免疫反応性である抗体または他のリガンドを選択するために種々のイムノアッセイ形式が適している。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイが、タンパク質に対して特異的に免疫反応性であるモノクローナル抗体を選択するために常套的に使用される。特異的な免疫反応性を決定するために使用することができるイムノアッセイ形式および条件の説明に関しては、Harlow  &  Lane,  Antibodies,  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Publications,  New  York  (1988)を参照されたい。
【００９３】
対象：ヒトおよび非ヒト哺乳動物を含めたヒトおよび獣医学的対象の両方を含むカテゴリーである、生きている多細胞の脊椎動物生物体。
【００９４】
Ｔ細胞：免疫応答に重要な白血球。Ｔ細胞としては、これだけに限定されないが、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞が挙げられる。ＣＤ４＋Ｔリンパ球は、その表面上に「表面抗原分類４」（ＣＤ４）として公知のマーカーを有する免疫細胞である。これらの細胞は、ヘルパーＴ細胞としても公知であり、抗体応答ならびにキラーＴ細胞応答を含めた免疫応答の調整に役立つ。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、「表面抗原分類８」（ＣＤ８）マーカーを有する。一実施形態では、ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球である。別の実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、サプレッサーＴ細胞である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞上に提示された目的の特異的な抗原に応答し得る場合、「活性化されている」。
【００９５】
Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン含有−３（ＴＩＭ−３）：ヒトにおいてＨＡＶＣＲ２遺伝子によってコードされるタンパク質。ＴＩＭ３は、マクロファージの活性化を調節し、マウスにおける実験的自己免疫性脳脊髄炎の重症度を増強するＴｈ１特異的細胞表面タンパク質である免疫チェックポイントである。Ｔｉｍ−３経路は、がんにおける消耗したＣＤ８＋  Ｔ細胞においてＰＤ−１経路と相互作用し得る。ヒトＴＩＭ−３についての例示的なｍＲＮＡおよびタンパク質配列は、参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＭ＿０３２７８２．４、２０１７年４月３０日で提供される。
【００９６】
治療有効量：処置される対象において所望の効果を実現するために十分である特定の物質の量。例えば、治療有効量は、腫瘍の成長を阻害または抑制するために必要な量であり得る。一実施形態では、治療有効量は、腫瘍を排除するため、腫瘍のサイズを縮小するため、または腫瘍の転移を防止するために必要な量である。対象に投与する場合、一般に、所望のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける効果が実現されることが示されている標的組織中濃度（例えば、腫瘍中濃度）が実現される投与量を使用する。
【００９７】
特に説明がなければ、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、本開示が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数の用語「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈によりそうでないことが明らかでない限り、複数の指示対象を包含する。同様に、「または」という単語は、文脈によりそうでないことが明白に示されない限り、「および」を含むものとする。したがって、「ＡまたはＢを含む」は、ＡもしくはＢを含むこと、または、ＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドについて示される全ての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、および全ての分子量または分子質量の値は、おおよそであり、説明のために提示されていることもさらに理解されるべきである。本明細書に記載のものと同様または同等である方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を下に記載する。本明細書において言及されている全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参照により組み込まれる。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号は全て、２０１７年６月１日にデータベースにあるものとして参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、用語の説明を含めた本明細書が支配する。さらに、材料、方法および実施例は単に例示的なものであり、それに限定されるものではない。
処置方法：養子免疫療法
【００９８】
腫瘍を有する対象などの目的の対象を処置するための方法が本明細書に開示される。方法は、治療有効量のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の投与を含む。対象における免疫応答を増大させる、例えば免疫系を増強するための方法が本明細書に開示される。本明細書に開示される精製されたＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の投与により、対象の、腫瘍に対するなどの免疫応答を引き出す能力が増大する。したがって、対象由来の精製された選択されたＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の集団をｅｘ  ｖｉｖｏで精製および生成し、これらの細胞の治療量を導入することにより、レシピエント対象の免疫応答が増強される。以下に考察する通り、追加的な作用剤を対象に投与することもできる。対象は、ヒトまたは獣医学的対象であり得る。
【００９９】
一実施例では、方法は、ドナーからＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞（例えば、腫瘍生検材料由来の末梢血単核細胞またはＴ細胞）を含むドナー細胞の集団を単離するステップと、必要に応じて、細胞を増やすステップとを含む。治療有効量のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞をレシピエントに投与し、それにより、レシピエントにおいて腫瘍に対する免疫応答を生じさせる。そのようなＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞は、腫瘍関連抗原を含有する細胞を死滅させるまたは他の免疫細胞を補助することができる。一部の実施形態では、化学療法剤などの追加的ながん治療剤を投与することができる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、方法は、治療有効量のＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニストおよび／または４−１ＢＢアゴニストを対象に投与するステップも含む。ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニストおよび／または４−１ＢＢアゴニストの投与は、下に詳細に記載されている。治療量のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞および治療有効量のＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニストおよび／または４−１ＢＢアゴニストの投与は、レシピエントの腫瘍の再発を防止するため、または腫瘍の再燃を処置するために、予防的に使用することができる。
【０１０１】
一般に、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞は、自己である。しかし、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞は同種ドナー由来の適合するＭＨＣとも反応し得る。一般に、Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ３９、およびＣＤ１０３の発現について陽性である。例えば、異なるように染めた抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ３９抗体および抗ＣＤ１０３抗体を使用することにより、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用して、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ３９およびＣＤ１０３について陽性の細胞の集団を同定すること（および所望であれば選別すること）ができる。簡単に述べると、腫瘍生検材料由来の末梢血単核細胞またはＴ細胞などの細胞の集団を、抗ＣＤ１０３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ３９抗体および必要に応じて抗ＣＤ３抗体（それぞれに異なるフルオロフォアが結合している）の存在下で、抗体が細胞に結合するのに十分な時間にわたってインキュベートする。結合していない抗体を除去した後、細胞を、常套的な方法を使用してＦＡＣＳによって分析する。特定の実施例では、得られるＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の集団は、ＣＤ８＋陽性細胞の総集団と比べて、少なくとも３０％純粋である、例えば、ＣＤ８陽性細胞の総集団と比べて少なくとも約５０％純粋、少なくとも約６０％純粋、少なくとも約７０％純粋、少なくとも約８０％純粋、少なくとも約９０％純粋、少なくとも約９５％純粋、または少なくとも約９６％、約９７％、約９８％または約９９％純粋である。したがって、投与される異種細胞はほんの限られた数だけである。細胞を１ラウンドよりも多くの細胞選別で処理することができる。Ｔ細胞の集団を、凍結保存前またはレシピエントへの注入前に、マイコプラズマ、無菌性、内毒素ならびに機能および純度に関する品質管理について試験することができる。
【０１０２】
一実施形態では、１つまたは複数の細胞表面マーカーを特異的に向けられた標識抗体を使用して、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞および追加的なマーカーを発現するこれらの細胞の集団を同定、定量、および／または単離する。抗体は、これだけに限定されないが、酵素、磁気ビーズ、コロイド磁気ビーズ、ハプテン、蛍光色素、金属化合物、放射性化合物または薬物を含めた他の化合物とコンジュゲートすることができる。抗体とコンジュゲートすることができる酵素としては、これだけに限定されないが、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ウレアーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが挙げられる。抗体とコンジュゲートすることができる蛍光色素としては、これだけに限定されないが、フルオレセインイソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、フィコエリトリン、アロフィコシアニンおよびテキサスレッドが挙げられる。抗体とコンジュゲートすることができる追加的な蛍光色素に関しては、Haugland,  R.  P.,  Handbook  of  Fluorescent  Probes  and  Research  Products,  published  by  Molecular  Probes,  9th  Edition  (2002)を参照されたい。抗体とコンジュゲートすることができる金属化合物としては、これだけに限定されないが、フェリチン、コロイド金、および特に、コロイド超常磁性ビーズが挙げられる。抗体とコンジュゲートすることができるハプテンとしては、これだけに限定されないが、ビオチン、ジゴキシゲニン、オキサゾロン（oxazalone）、およびニトロフェノールが挙げられる。抗体とコンジュゲートすることまたは抗体に組み入れることができる放射性化合物は当技術分野で公知であり、それらとして、これだけに限定されないが、テクネチウム９９（９９Ｔｃ）、１２５Ｉ、ならびに、これだけに限定されないが、１４Ｃ、３Ｈおよび３５Ｓを含めた任意の放射性核種を含むアミノ酸が挙げられる。
【０１０３】
一部の実施例では、末梢血試料または腫瘍試料などの生体試料由来の細胞を適切に標識された抗体と接触させることによってＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を単離する。しかし、有効性が異なる他の技法を使用して所望の細胞の集団を精製および単離することができる。使用する分離技法は、収集される細胞の画分の生存能力の保持を最大にするものであるべきである。使用される特定の技法は、当然、分離の効率、方法の細胞傷害性、分離の容易さおよびスピード、ならびにどのような機器および／または技術的技能が要求されるかに依存する。
【０１０４】
フローサイトメーターによって生成されるデータを、１次元にプロットしてヒストグラムを作成すること、または２次元ドットプロットにおいてまたはさらには３次元にプロットすることができる。これらのプロット上の領域を、蛍光強度に基づいて、「ゲート」と称される一連のサブセット抽出を行うことによって逐次的に分離することができる。特定のゲーティングプロトコールが当技術分野で公知である。プロットは、一般に、ログスケールでなされる。異なる蛍光色素の発光スペクトルが重複するので、検出器におけるシグナルは電子的におよびコンピュータにより補正される。フローサイトメーターを使用して蓄積したデータは、ＦＬＯＷＪＯ（登録商標）またはＢＤ  ＦＡＣＳＤｉｖａ（登録商標）などのソフトウェアを使用して解析することができる。解析は、別のコンピュータで行われることが最も多い。目的のタンパク質を高レベルまたは低レベルで発現する細胞の同定を可能にするゲーティングの原理は当技術分野で周知である。ゲートを確立するための学習に関するチュートリアルが、例えばＦＬＯＷＪＯ（登録商標）ウェブサイトにおいて提供される。一般に、当業者はあらゆるＦＡＣＳ機械およびゲートを確立するためのデータ解析用のコンピュータプログラムを容易に使用して、特定のマーカーを発現する細胞を分離することができる。例として、当業者は、ＣＤ８の発現がない（ＣＤ８−）細胞、ＣＤ８の発現がある（ＣＤ８＋）細胞を容易に同定することができる。
【０１０５】
追加的な分離手順は、抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用する磁気分離、アフィニティークロマトグラフィー、モノクローナル抗体と結合させるかまたは補体と併せて使用する細胞傷害性剤、および固体マトリックスに結合させたモノクローナル抗体を利用する「パニング」、または別の慣習的な技法を含み得る。磁気ビーズおよび、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空繊維膜およびプラスチックペトリ皿などの他の固体マトリックスに結合させた抗体により、直接分離が可能になる。抗体が結合した細胞は、単に固体支持体を細胞懸濁液から物理的に分離することにより、細胞懸濁液から取り出すことができる。固相に連結した抗体と細胞とのインキュベーションの正確な条件および持続時間は、システムに特異的ないくつかの因子に依存する。しかし、適切な条件の選択は当技術分野において周知である。
【０１０６】
次いで、目的のマーカー（例えば、これだけに限定されないが、ＣＤ８、ＣＤ３９、ＣＤ１０３、および必要に応じてＣＤ３）を発現する細胞が固相に連結した抗体に結合するのを可能にするのに十分な時間後に、結合していない細胞を、生理的緩衝液を用いて溶出させるまたは洗い流すことができる。次いで、結合した細胞を、主に、使用される固相および抗体の性質に応じて、任意の適切な方法によって固相から分離し、当技術分野で周知の方法を使用して定量する。特定の非限定的な一実施例では、固相から分離した結合した細胞をＦＡＣＳによって定量する（上記を参照されたい）。
【０１０７】
抗体を、支持体に結合させたアビジンもしくはストレプトアビジンを用いてその後に取り出すことができるビオチン、または蛍光色素とコンジュゲートすることができ、当技術分野で公知の通り、それらをＦＡＣＳで使用して、細胞の分離および定量を可能にする。
【０１０８】
別の実施形態では、自動アフェレーシス計器（例えば、ＣＳ−３０００血液細胞分離器、Ｂａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｃａｒｅ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ、または同等の機械）を使用するアフェレーシス手順を使用して対象から細胞を収集することができる。特定の非限定的な実施例では、１つまたは複数の細胞表面マーカーに特異的に向けられた標識抗体を使用して、本明細書に開示される細胞などのＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を同定し、定量する。
【０１０９】
一部の実施形態では、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を、対象に投与する前にｉｎ  ｖｉｔｒｏで増やす。拡大培養法（expansion  method）は下に開示する。
【０１１０】
本開示は、富化された（例えば、精製された）ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞および必要に応じてＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニストおよび／または４−１ＢＢアゴニストを含む治療用組成物も提供する。組成物は、これだけに限定されないが、腫瘍を有する対象の処置などの、本明細書に開示される方法において有用である。特定の実施例では、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の集団を、それらを必要とする対象に投与するための治療用量形態にする。ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニストおよび／または４−１ＢＢアゴニストも、処置を必要とする対象に投与するための治療用量形態で提供される。
【０１１１】
治療有効量のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を対象に投与する。治療有効量のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の特定の非限定的な例としては、対象１キログラム当たり細胞約１×１０５個から対象１キログラム当たり細胞約１×１０９個、例えば、１キログラム当たり細胞約１×１０６個から１キログラム当たり細胞約１×１０８個、例えば、１キログラム当たり細胞約５×１０６個から１キログラム当たり細胞約７５×１０６個、例えば、１キログラム当たり細胞約２５×１０６個、または１キログラム当たり細胞約５０×１０６個の用量で投与される精製されたＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞が挙げられる。
【０１１２】
精製されたＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞は、臨床医によって決定される通り、単回用量または複数回用量で投与することができる。例えば、細胞を、所望の応答および得られた応答に応じて、およそ１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間または毎月の間隔で投与することができる。一部の実施例では、所望の応答が得られたら、さらなるＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞は投与しない。しかし、レシピエントが腫瘍に関連する１つまたは複数の症状を示す場合、その時点で治療有効量のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を投与することができる。
【０１１３】
投与は、局所的または全身性であり得る。一部の実施形態では、対象を化学療法で処置した後に細胞を静脈内投与する。他の実施形態では、投与された細胞の増殖を支持するために、対象にＩＬ−２および／またはＩＬ−１５などのサイトカインも投与する。
【０１１４】
本明細書に開示される精製されたＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を食塩水などの薬学的に許容される担体と共に投与することができる。ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニストおよび／または４−１ＢＢアゴニストも下記の通り薬学的に許容される担体中に製剤化することができる。これらは、単一の組成物として製剤化することもでき、２つの別々の組成物として製剤化することもできる。一部の実施例では、他の治療剤をＴ細胞と共に投与する。他の治療剤は、所望の効果に応じて、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の投与前、投与中、または投与後に投与することができる。例示的な治療剤としては、これだけに限定されないが、抗菌剤、インターフェロン−アルファなどの免疫刺激薬、化学療法剤またはＴ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで刺激するために使用されるペプチドワクチンが挙げられる。特定の例では、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を含有する組成物は、１つまたは複数の治療剤も含む。ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞の使用により、腫瘍体積、腫瘍転移、腫瘍再発を低減することができる。
【０１１５】
一般に、方法は、良性腫瘍または悪性腫瘍などの腫瘍を有する対象を選択するステップと、対象に、治療有効量の（１）ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞および（２）必要に応じて、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニスト、もしくはＣＴＬＡ−４アンタゴニストなどのチェックポイント阻害剤アンタゴニスト、または４−１ＢＢアゴニストを投与するステップとを含む。ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニストもしくはＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、または４−１ＢＢアゴニストは、一部の非限定的な実施例では、それぞれＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、または４−１ＢＢに特異的に結合する抗体（またはその抗原結合性断片）であり得る。ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞は、腫瘍を処置するため、例えば、腫瘍体積を縮小させるため、転移を低減もしくは防止するため、良性腫瘍の悪性腫瘍への変換を予防するため、および／または腫瘍の再発を防止もしくは阻害するために有用である。投与は、局所的または全身性であり得る。適切な投与方法は臨床医には公知である。
【０１１６】
一部の実施形態では、本明細書で提供される方法の利点は、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞とＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニストおよび／もしくはＣＴＬＡ−４アンタゴニストなどのチェックポイント阻害剤、または４−１ＢＢアゴニストとを組み合わせることにより、がん治療のための活性薬剤の投与量を減少させることが可能になると同時に、治療のあらゆる対応する望ましくない副作用（例えば、細胞傷害性）も低減することが可能になる。さらなる実施形態では、本明細書で提供される方法の別の利点は、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞とＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニストおよび／もしくはＣＴＬＡ−４アンタゴニストなどのチェックポイント阻害剤、または４−１ＢＢアゴニストとを組み合わせることにより、腫瘍を処置すること、例えば、腫瘍体積を縮小させること、転移を低減もしくは防止すること、良性腫瘍の悪性腫瘍への転換を予防すること、および／または腫瘍の再発を防止もしくは阻害することが可能になる。追加的な実施形態では、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞とＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニストおよび／もしくはＣＴＬＡ−４アンタゴニストなどのチェックポイント阻害剤、または４−１ＢＢアゴニストとを組み合わせることにより、生存を増加させることが可能になる。
【０１１７】
例えば、これだけに限定されないが、がん治療剤の追加的な作用剤を目的の対象に投与することもできる。例えば、これだけに限定されないが、腫瘍の外科的切除の追加的な処置を対象に施行することもできる。
【０１１８】
対象を処置のために選択することができる。例えば、診断アッセイ（例えば、免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイ）を腫瘍（または腫瘍の試料）に対して実施して、対象が、開示されている処置方法に応答する可能性がある対象であると同定することができる。選択の方法は下に開示する。
【０１１９】
さらなる実施形態では、腫瘍がＩＨＣアッセイによりＰＤ−Ｌ１発現またはＰＤ−Ｌ２発現について検査陽性である場合に、対象を処置のために選択する。ＰＤ−Ｌ１発現について検査陽性である腫瘍を検出するための例示的なアッセイは、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれるTopalian  et  al.  2012.  Safety,  activity,  and  immune  correlates  of  anti-PD-1  antibody  in  cancer.  N.  Engl.  J.  Med.  366:2443-2454；Wolchok  et  al.  2013.  Nivolumab  plus  ipilimumab  in  advanced  melanoma.  N.  Engl.  J.  Med.  369:122-133；Herbst  et  al.  2014.  Predictive  correlates  of  response  to  the  anti-PD-L1  antibody  MPDL3280A  in  cancer  patients.  Nature.  515:563-567；Garon  et  al.  2015.  Pembrolizumab  for  the  treatment  of  non-small-cell  lung  cancer.  N.  Engl.  J.  Med.  372:2018-2028；およびReck  et  al.  Pembrolizumab  versus  chemotherapy  for  PD-L1-positive  non-small-cell  lung  cancer.  N.  Engl.  J.  Med.  375:1823-1833において提供される。
【０１２０】
腫瘍は、良性または悪性であり得る。腫瘍は、これだけに限定されないが、頭頸部扁平上皮細胞癌、肺がん、黒色腫、卵巣がん、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、肝がん、前立腺がん、乳がん、神経膠芽腫または直腸がんを含めた任意の目的の腫瘍であり得る。肺がんは、小細胞肺癌または非小細胞肺癌であり得る。肝がんは、肝癌であり得る。乳がんは、トリプルネガティブ乳がんであり得る。一部の実施形態では、腫瘍は、鼻腔、副鼻腔、上咽頭、口腔、中咽頭、喉頭、下咽頭、唾液腺の腫瘍および傍神経節腫などの頭頸部腫瘍である。さらなる例は、皮膚腫瘍、脳腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、胃腸管腫瘍、泌尿生殖器系腫瘍、婦人科系腫瘍、内分泌系腫瘍、軟部組織および骨の肉腫、中皮腫、黒色腫、中枢神経系の新生物、または白血病である。他の実施形態では、腫瘍は、非小細胞肺がんまたは小細胞肺がんなどの肺腫瘍である。さらなる実施形態では、腫瘍は、食道、胃、膵臓、肝臓、胆樹、小腸、結腸、直腸および肛門領域のがんなどの胃腸管の腫瘍であり得る。さらに他の実施形態では、腫瘍は、腎臓、尿道、膀胱、前立腺、尿道、陰茎および精巣のがんなどの泌尿生殖器系の腫瘍であり得る。一部の実施形態では、腫瘍は、子宮頸部、膣、外陰部、子宮体、妊娠性絨毛疾患、卵巣、卵管、腹膜、または乳房のがんなどの婦人科の腫瘍である。他の実施形態では、腫瘍は、甲状腺腫瘍、副甲状腺の腫瘍、副腎皮質腫瘍、膵臓内分泌腫瘍、カルチノイド腫瘍およびカルチノイド症候群などの内分泌系腫瘍である。腫瘍は、軟部組織および骨の肉腫、中皮腫、皮膚のがん、皮膚黒色腫および眼内黒色腫を含めた黒色腫、中枢神経系の新生物、網膜芽細胞腫を含めた小児期のがん、ウィルムス腫瘍、神経線維腫症、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、横紋筋肉腫であり得る。腫瘍は、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、およびホジキン病を含めたリンパ腫であり得る。腫瘍は、急性白血病、慢性骨髄性白血病およびリンパ球性白血病などの白血病であり得る。腫瘍は、形質細胞新生物、原発部位不明がん、腹膜癌腫症、カポジ肉腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連原発性中枢神経系リンパ腫、ＡＩＤＳ関連ホジキン病およびＡＩＤＳ関連肛門生殖器のがん、肝臓への転移性がん、骨への転移性がん、悪性胸膜および心膜滲出ならびに悪性腹水であり得る。
【０１２１】
一部の実施形態では、腫瘍の処置は、腫瘍の診断後、または前兆の状態（例えば、異形成または良性腫瘍の発生）の開始後に開始される。処置は、がんの初期に開始することができ、例えば、対象に状態の症状が顕在化する前、例えばステージＩの診断中または異形成が診断されたもしくはｉｎ  ｓｉｔｕにおける増殖性の状態が診断された時点に開始することができる。しかし、処置は、疾患の任意のステージ、例えば、これだけに限定されないが、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩおよびステージＩＶのがんにおいて開始することができる。一部の実施例では、悪性腫瘍またはさらには転移性腫瘍に転換する可能性がある良性腫瘍を有するこれらの対象に処置を施行する。
【０１２２】
状態が発症する前の処置、例えば、異形成または初期の（良性の）前兆の状態が検出されたときの処置は、本明細書では、状態が発症する「リスクがある」対象の処置と称される。一部の実施形態では、組成物の投与を、本明細書に記載の状態の発生中または発生後に実施することができる。腫瘍が発生するリスクがある対象に組成物を投与することができる。
【０１２３】
腫瘍の存在は、当技術分野で公知の方法によって決定することができ、一般には、細胞学的評価および形態学的評価を含む。腫瘍は、確立された腫瘍であり得る。細胞は、生検材料から得た細胞を含めた、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおけるものであり得る。
【０１２４】
悪性のがんなどの状態の発症後に開始される処置では、状態のうちの１つの症状の重症度の低下、または症状の完全な除去、または転移、腫瘍体積もしくは腫瘍の数の低減をもたらすことができる。一部の実施例では、処置後に腫瘍が検出されなくなる。
【０１２５】
本開示の一態様では、転移などの腫瘍の形成が遅延する、防止されるまたは低減する。別の態様では、原発腫瘍のサイズが縮小する。さらなる態様では、腫瘍の症状が低減する。さらに別の態様では、腫瘍体積が減少する。さらに別の態様では、腫瘍の再発が、例えば、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２カ月、２２カ月、２３カ月、もしくは２４カ月にわたって、または１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、または１０年にわたって遅延するまたは防止される。
【０１２６】
一部の実施形態では、免疫応答を測定することができ、腫瘍体積を測定することができ、転移性病変の数を測定することができ、かつ／または腫瘍の症状を測定することができる。治療有効用量により、免疫応答を増大させること、腫瘍体積を減少させること、転移の数および／またはサイズを低減すること、および／または腫瘍の１つまたは複数の症状を低減することができる。
【０１２７】
本開示の方法および組成物は一般にヒト対象を処置するために使用されるが、他の霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシなどの他の脊椎動物における同様または同一の疾患を処置するためにも使用することができる。適切な投与形式は、医療実践者により各対象に対して個別に決定されることが最良であろう。種々の薬学的に許容される担体およびそれらの製剤は、標準の製剤専門書、例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences、E.  W.  Martin著に記載されている。Wang,  Y.  J.  and  Hanson,  M.  A.,  Journal  of  Parenteral  Science  and  Technology,  Technical  Report  No.  10,  Supp.  42:  2S,  1988も参照されたい。医薬組成物の剤形は、選択される投与形式によって決定される。
【０１２８】
ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞は、局所的にまたは全身的に、任意の経路によって投与することができる。例えば、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を、腫瘍内に、腹腔内に、静脈内に投与することができる。１つの非限定的な例では、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を静脈内に投与することができる。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ−４アンタゴニスト（または４−１ＢＢアゴニスト）も、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、腹腔内、胸骨内、もしくは関節内注射もしくは注入、または舌下、経口、局部、鼻腔内、もしくは経粘膜投与によるもの、または肺吸入によるものを含めた任意の経路によって投与することができる。一部の実施形態では、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞および／またはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ−４アンタゴニストを、腫瘍が位置する組織に投与する、または腫瘍に直接投与する（腫瘍内）。例えば注射または注入用の非経口組成物を提供する場合、活性薬剤は、一般に、水性担体、例えば、ｐＨ約３．０〜約８．０、好ましくはｐＨ約３．５〜約７．４、３．５〜６．０、または３．５〜約５．０の等張性緩衝液中に懸濁させる。有用な緩衝液としては、クエン酸ナトリウム−クエン酸およびリン酸ナトリウム−リン酸、および酢酸ナトリウム−酢酸緩衝液が挙げられる。治療有効量の調製物が、経皮注射または送達後に数時間または数日間にわたり血流中に送達されるようにレポジトリーまたは「デポー」型の緩徐放出調製物の形態を使用することができる。
【０１２９】
ある特定の実施形態では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、またはＣＴＬＡ−４アンタゴニスト（例えば、これだけに限定されないが、抗体または抗原結合性断片）、または４−１ＢＢアゴニストを、約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、１〜３ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ、０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、毎日、１週間当たり２回もしくは３回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月などを限定することなく含めた投与の投薬スケジュール、または処置にあたる医師により適当であるとみなされる他の用量および投薬スケジュールに従って投与することができる。投与スケジュールが、治療的利益をもたらすために十分な生理的濃度の作用剤をもたらすものである限りは、併用療法の一部として、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を対象に、追加的な作用剤の前、その後、またはそれと同時に投与することができる。
【０１３０】
一部の実施形態では、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト（例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片）を、約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、１〜３ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ、０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、毎日、１週間当たり２回もしくは３回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月などを限定することなく含めた投与の投薬スケジュール、または処置にあたる医師により適当であるとみなされる他の用量および投薬スケジュールに従って投与することができる。投与スケジュールが、治療的利益をもたらすために十分な生理的濃度の作用剤をもたらすものである限りは、併用療法の一部として、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を対象に、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１アンタゴニストの前、その後、またはそれと同時に投与することができる。ある特定の実施形態では、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト（例えば、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片）を、約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、１〜３ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ、０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、毎日、１週間当たり２回もしくは３回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月などを限定することなく含めた投与の投薬スケジュール、または処置にあたる医師により適当であるとみなされる他の用量および投薬スケジュールに従って投与することができる。投与スケジュールが、治療的利益をもたらすために十分な生理的濃度の作用剤をもたらすものである限りは、併用療法の一部として、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を、対象に、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストの前、その後、またはそれと同時に投与することができる。さらなる実施形態では、ＢＴＬＡアンタゴニスト（例えば、ＢＴＬＡに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片）を、約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、１〜３ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ、０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、毎日、１週間当たり２回もしくは３回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月などを限定することなく含めた投与の投薬スケジュール、または処置にあたる医師により適当であるとみなされる他の用量および投薬スケジュールに従って投与することができる。投与スケジュールが、治療的利益をもたらすために十分な生理的濃度の作用剤をもたらすものである限りは、併用療法の一部として、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を対象に、ＢＴＬＡアンタゴニストの前、その後、またはそれと同時に投与することができる。追加的な実施形態では、ＬＡＧ３またはＴＩＭ−３アンタゴニスト（例えば、ＬＡＧ３またはＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または抗原結合性断片）を、約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、１〜３ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ、０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、毎日、１週間当たり２回もしくは３回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月などを限定することなく含めた投与の投薬スケジュール、または処置にあたる医師により適当であるとみなされる他の用量および投薬スケジュールに従って投与することができる。投与スケジュールが、治療的利益をもたらすために十分な生理的濃度の作用剤をもたらすものである限りは、併用療法の一部として、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を対象に、ＬＡＧ３またはＴＩＭ−３アンタゴニストの前、その後、またはそれと同時に投与することができる。さらに他の実施形態では、４−１ＢＢアゴニスト（例えば、４−１ＢＢに特異的に結合する抗体または抗原結合性断片）を、約０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜１ｍｇ／ｋｇ、０．０１〜０．１ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜５ｍｇ／ｋｇ、１〜３ｍｇ／ｋｇ、０．５〜１．０ｍｇ／ｋｇ、０．０５〜０．５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で、毎日、１週間当たり２回もしくは３回、毎週、２週間ごと、３週間ごと、毎月などを限定することなく含めた投与の投薬スケジュール、または処置にあたる医師により適当であるとみなされる他の用量および投薬スケジュールに従って投与することができる。投与スケジュールが、治療的利益をもたらすために十分な生理的濃度の作用剤をもたらすものである限りは、併用療法の一部として、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を対象に、４−１ＢＢアゴニストの前、その後、またはそれと同時に投与することができる。
【０１３１】
徐放性組成物を利用することができる。徐放性組成物の適切な例としては、適切なポリマー材料（例えば、造形品、例えばフィルムもしくはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスなど）、適切な疎水性材料（例えば、許容される油中エマルションなど）またはイオン交換樹脂、およびわずかに可溶の誘導体（例えば、わずかに可溶の塩など）が挙げられる。徐放性製剤は、腫瘍の場所に応じて、経口的に、直腸に、非経口的に、槽内に（intracistemally）、膣内に、腹腔内に、局部に（粉剤・散剤、軟膏剤、ゲル剤、滴剤または経皮パッチによってなど）、頬側に、または経口もしくは経鼻スプレーとして投与することができる。
【０１３２】
開示されている方法において有用な薬学的に許容される担体および賦形剤は、従来のものである。例えば、非経口製剤は、通常、例えば水、生理的食塩水、他の平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどの薬学的にかつ生理的に許容される流体ビヒクルである注射可能な流体を含む。含めることができる賦形剤は、例えば、ヒト血清アルブミンまたは血漿調製物などのタンパク質である。所望であれば、投与される医薬組成物は、微量の無毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートも含んでよい。そのような剤形の実際の調製方法は公知である、または当業者には明らかである。
【０１３３】
キットも提供される。ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞および／またはＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、ＢＴＬＡ、またはＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、的確な投与量の個々の投与に適した単位剤形に製剤化することができる。投与される活性化合物（複数可）の量は、処置される対象、苦痛の重症度、および投与の様式に依存し、処方を行う臨床医の判断に委ねることが最良である。これらの縛りの中で、投与される製剤は、ある量の活性成分（複数可）を処置される対象において所望の効果を実現するために有効な量で含有する。例えば、慢性的投与が実現されるように、毎日、隔週、毎週、隔月または毎月などの定義された時間間隔にわたって、複数の処置が想定される。
【０１３４】
サイトカイン、ケモカイン、または化学療法剤などの追加的な作用剤を投与することができる。これらを開示される医薬組成物に含めることができる。インターロイキン２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）などのサイトカイン、またはインターフェロン（ＩＦＮ）βなどのインターフェロンを投与することができる。一実施例では、がんを防止および処置するために、外科的処置を対象に施行することができる。一実施例では、この施行は、逐次的なものである。他の実施例では、この施行は、同時になされるものである。
【０１３５】
化学療法剤の例は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、天然物、またはホルモンおよびそれらのアンタゴニストである。アルキル化剤の例としては、ナイトロジェンマスタード（例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタードまたはクロラムブシル）、スルホン酸アルキル（例えば、ブスルファン）、ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジン）が挙げられる。代謝拮抗薬の例としては、葉酸類似体（例えば、メトトレキサート）、ピリミジン類似体（例えば、５−ＦＵまたはシタラビン）、およびメルカプトプリンまたはチオグアニンなどのプリン類似体が挙げられる。天然物の例としては、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシン）、エピポドフィロトキシン（例えば、エトポシドまたはテニポシド）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシン（mitocycin）Ｃ）、および酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）が挙げられる。種々雑多な作用剤の例としては、白金配位錯体（例えば、シスプラチンとしても公知のシス−ジアミン−ジクロロ白金ＩＩ）、置換尿素（例えば、ヒドロキシウレア）、メチルヒドラジン誘導体（例えば、プロカルバジン）、および副腎皮質抑制薬（例えば、ミトタンおよびアミノグルテチミド）が挙げられる。ホルモンおよびアンタゴニストの例としては、副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン）、プロゲスチン（例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール（magestrol））、エストロゲン（例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール）、抗エストロゲン薬（例えば、タモキシフェン）、およびアンドロゲン（例えば、テストステロンプロピオン酸エステルおよびフルオキシメステロン）が挙げられる。最も一般的に使用される化学療法薬の例としては、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチナム、シスプラチナム、シトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキサート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（またはドセタキセルなどの他のタキサン）、ベルバン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６が挙げられ、いくつかのより新しい薬物として、ゲムシタビン（ジェムザール）、ハーセプチン、イリノテカン（カンプトサー、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサン、ＳＴＩ−５７１、タキソテレ、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼヴァリンおよびカルシトリオールが挙げられる。使用することができる免疫調節物質の非限定的な例としては、ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆ��ａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｉｍｒｅｇ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ，Ｌａ．製）、ＳＫ＆Ｆ  １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。一部の実施形態では、対象にソラフェニブを投与する。
【０１３６】
追加的な化学療法剤は、抗体であり得る。抗体は、凍結乾燥形態で提供し、投与前に滅菌水で再水化することができるが、既知濃度の滅菌溶液としても提供される。次いで、抗体溶液を、０．９％塩化ナトリウム、ＵＳＰを含有する注入バッグに添加し、一般には、体重１ｋｇ当たり０．５〜１５ｍｇの投与量で投与する。米国において１９９７年のＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）の承認以来販売されてきた抗体薬物の投与における相当の経験が当技術分野において利用可能である。抗体は、プログラム死（ＰＤ）−１またはプログラム死リガンド（ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合し得る（以下を参照されたい）。抗体は、静脈内プッシュまたはボーラスではなく、緩徐な注入によって投与することができる。一実施例では、より高い負荷用量を投与し、その後、維持用量をより低いレベルで投与する。例えば、４ｍｇ／ｋｇである最初の負荷用量をおよそ９０分にわたって注入し、その後、前の用量の忍容性が良好であった場合には、毎週の維持用量を４〜８週間にわたり、２ｍｇ／ｋｇで３０分の期間にわたって注入する。
【０１３７】
処置レジメンは、外科手術、化学療法、放射線、または、ＣＡＭＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体治療、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、および照射などの他の免疫除去剤（immunoablative  agent）、Izumoto  et  al.  2008  J  Neurosurg  108:963-971に記載されているものなどのペプチドワクチンとの組合せも含む。例示的な化学療法剤としては、アントラサイクリン（例えば、ドキソルビシン（例えば、リポソーム化ドキソルビシン））、ビンカアルカロイド（例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、デカルバジン、メルファラン、イホスファミド、テモゾロミド）、免疫細胞抗体（例えば、アレムツズマブ（alemtuzamab）、ゲムツズマブ、リツキシマブ、トシツモマブ）、代謝拮抗薬（例えば、葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体およびアデノシンデアミナーゼ阻害剤（例えば、フルダラビン）を含む）、ｍＴＯＲ阻害剤、ＴＮＦＲグルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質（ＧＩＴＲ）アゴニスト、プロテアソーム阻害剤（例えば、アクラシノマイシンＡ、グリオトキシンまたはボルテゾミブ）、サリドマイドまたはサリドマイド誘導体（例えば、レナリドミド）などの免疫調節物質が挙げられる。
【０１３８】
併用療法における使用が考慮される一般的な化学療法剤としては、アナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ（登録商標））、ビカルタミド（ＣＡＳＯＤＥＸ（登録商標））、ブレオマイシン硫酸塩（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ（登録商標））、ブスルファン（ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、ブスルファン注射液（ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標））、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、Ｎ４−ペントキシカルボニル−５−デオキシ−５−フルオロシチジン、カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標））、カルムスチン（ＢＩＣＮＵ（登録商標））、クロラムブシル（ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））、シスプラチン（ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標））、クラドリビン（ＬＥＵＳＴＡＴＩＮ（登録商標））、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）またはＮＥＯＳＡＲ（登録商標））、シタラビン、シトシンアラビノシド（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ（登録商標））、シタラビンリポソーム注射（ＤＥＰＯＣＹＴ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標））、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、コスメガン（Ｃｏｓｍｅｇａｎ））、ダウノルビシン塩酸塩（ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））、ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム注射（ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、デキサメタゾン、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標））、ドキソルビシン塩酸塩（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＲＵＢＥＸ（登録商標））、エトポシド（ＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標））、リン酸フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ（登録商標））、５−フルオロウラシル（ＡＤＲＵＣＩＬ（登録商標）、ＥＦＵＤＥＸ（登録商標））、フルタミド（ＥＵＬＥＸＩＮ（登録商標））、テザシチビン、ゲムシタビン（ジフルオロデオキシシチジン）、ヒドロキシウレア（ＨＹＤＲＥＡ（登録商標））、イダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ（登録商標））、イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ（登録商標））、Ｌ−アスパラギナーゼ（ＥＬＳＰＡＲ（登録商標））、ロイコボリンカルシウム、メルファラン（ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標））、６−メルカプトプリン（ＰＵＲＩＮＥＴＨＯＬ（登録商標））、メトトレキサート（ＦＯＬＥＸ（登録商標））、ミトキサントロン（ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））、マイロターグ、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標））、フェニックス（イットリウム９０／ＭＸ−ＤＴＰＡ）、ペントスタチン、カルムスチンインプラントを伴うポリフェプロサン２０（ＧＬＩＡＤＥＬ（登録商標））、クエン酸タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ（登録商標））、テニポシド（ＶＵＭＯＮ（登録商標））、６−チオグアニン、チオテパ、チラパザミン（ＴＩＲＡＺＯＮＥ（登録商標））、注射用トポテカン塩酸塩（ＨＹＣＡＭＰＴＩＮ（登録商標））、ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、およびビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））が挙げられる。例示的なアルキル化剤としては、限定することなく、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、スルホン酸アルキル、ニトロソ尿素およびトリアゼン）：ウラシルマスタード（ＡＭＩＮＯＵＲＡＣＩＬ  ＭＵＳＴＡＲＤ（登録商標）、ＣＨＬＯＲＥＴＨＡＭＩＮＡＣＩＬ（登録商標）、ＤＥＭＥＴＨＹＬＤＯＰＡＮ（登録商標）、ＤＥＳＭＥＴＨＹＬＤＯＰＡＮ（登録商標）、ＨＡＥＭＡＮＴＨＡＭＩＮＥ（登録商標）、ＮＯＲＤＯＰＡＮ（登録商標）、ＵＲＡＣＩＬ  ＮＩＴＲＯＧＥＮ  ＭＵＳＴＡＲＤ（登録商標）、ＵＲＡＣＩＬＬＯＳＴ（登録商標）、ＵＲＡＣＩＬＭＯＳＴＡＺＡ（登録商標）、ＵＲＡＭＵＳＴＩＮ（登録商標）、ＵＲＡＭＵＳＴＩＮＥ（登録商標））、クロルメチン（ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（登録商標））、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標）、ＣＬＡＦＥＮ（登録商標）、ＥＮＤＯＸＡＮ（登録商標）、ＰＲＯＣＹＴＯＸ（登録商標）、ＲＥＶＩＭＭＵＮＥ（商標））、イホスファミド（ＭＩＴＯＸＡＮＡ（登録商標））、メルファラン（ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標））、クロラムブシル（ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））、ピポブロマン（ＡＭＥＤＥＬ（登録商標）、ＶＥＲＣＹＴＥ（登録商標））、トリエチレンメラミン（ＨＥＭＥＬ（登録商標）、ＨＥＸＹＬＥＮ（登録商標）、ＨＥＸＡＳＴＡＴ（登録商標））、トリエチレンチオホスホラミン、テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標））、チオテパ（ＴＨＩＯＰＬＥＸ（登録商標））、ブスルファン（ＢＵＳＩＬＶＥＸ（登録商標）、ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、カルムスチン（ＢｉＣＮＵ（登録商標））、ロムスチン（ＣＥＥＮＵ（登録商標））、ストレプトゾシン（ＺＡＮＯＳＡＲ（登録商標））、およびダカルバジン（ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標））が挙げられる。追加的な例示的なアルキル化剤としては、限定することなく、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ（登録商標））；テモゾロミド（ＴＥＭＯＤＡＲ（登録商標）およびＴＥＭＯＤＡＬ（登録商標））；ダクチノマイシン（アクチノマイシン−Ｄ、ＣＯＳＭＥＧＥＮ（登録商標）としても公知）；メルファラン（Ｌ−ＰＡＭ、Ｌ−サルコリシン（ｓａｒｃｏｌｙｓｉｎ）、およびフェニルアラニンマスタード、ＡＬＫＥＲＡＮ（登録商標）としても公知）；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、ＨＥＸＹＬＥＮ（登録商標）としても公知）；カルムスチン（ＢＩＣＮＵ（登録商標））；ベンダムスチン（ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標））；ブスルファン（ＢＵＳＵＬＦＥＸ（登録商標）およびＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））；カルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ（登録商標））；ロムスチン（ＣＣＮＵ、ＣＥＥＮＵ（登録商標）としても公知）；シスプラチン（ＣＤＤＰ、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標）およびＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標）−ＡＱとしても公知）；クロラムブシル（ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））；シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）およびＮＥＯＳＡＲ（登録商標））；ダカルバジン（ＤＴＩＣ、ＤＩＣおよびイミダゾールカルボキサミド、ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ（登録商標）としても公知）；アルトレタミン（ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、ＨＥＸＹＬＥＮ（登録商標）としても公知）；イホスファミド（ＩＦＥＸ（登録商標））；プレドニムスチン（Prednumustine）；プロカルバジン（ＭＡＴＵＬＡＮＥ（登録商標））；メクロレタミン（ナイ��ロジェンマスタード、ムスチンおよび塩酸メクロレタミン、ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ（登録商標）としても公知）；ストレプトゾシン（ＺＡＮＯＳＡＲ（登録商標））；チオテパ（チオホスホアミド、ＴＥＳＰＡおよびＴＳＰＡ、ＴＨＩＯＰＬＥＸ（登録商標）としても公知）；シクロホスファミド（ＥＮＤＯＸＡＮ（登録商標）、ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）、ＮＥＯＳＡＲ（登録商標）、ＰＲＯＣＹＴＯＸ（登録商標）、ＲＥＶＩＭＭＵＮＥ（登録商標））；およびベンダムスチンＨＣｌ（ＴＲＥＡＮＤＡ（登録商標））が挙げられる。例示的なｍＴＯＲ阻害剤としては、例えば、テムシロリムス；リダフォロリムス（正式にはデフォロリムス（deferolimus）、（１Ｒ，２Ｒ，４Ｓ）−４−［（２Ｒ）−２［（１Ｒ，９Ｓ，１２Ｓ，１５Ｒ，１６Ｅ，１８Ｒ，１９Ｒ，２１Ｒ，２３Ｓ，２４Ｅ，２６Ｅ，２８Ｚ，３０Ｓ，３２Ｓ，３５Ｒ）−１，１８−ジヒドロキシ−１９，３０−ジメトキシ−１５，１７，２１，２３，２９，３５−ヘキサメチル−２，３，１０，１４，２０−ペンタオキソ−１１，３６−ジオキサ−４−アザトリシクロ［３０．３．１．０４，９］ヘキサトリアコンタ−１６，２４，２６，２８−テトラエン−１２−イル］プロピル］−２−メトキシシクロヘキシルジメチルホスフィネートとして公知であり、ＡＰ２３５７３およびＭＫ８６６９としても公知であり、ＰＣＴ公開ＷＯ０３／０６４３８３号に記載されている）；エベロリムス（ＡＦＩＮＩＴＯＲ（登録商標）またはＲＡＤ００１）；ラパマイシン（ＡＹ２２９８９、ＳＩＲＯＬＩＭＵＳ（登録商標））；セマピモド（simapimod）（ＣＡＳ１６４３０１−５１−３）；エムシロリムス、（５−｛２，４−ビス［（３Ｓ）−３−メチルモルホリン−４−イル］ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７−イル｝−２−メトキシフェニル）メタノール（ＡＺＤ８０５５）；２−アミノ−８−［トランス−４−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロヘキシル］−６−（６−メトキシ−３−ピリジニル）−４−メチル−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン−７（８Ｈ）−オン（ＰＦ０４６９１５０２、ＣＡＳ１０１３１０１−３６−４）；ならびにＮ２−［１，４−ジオキソ−４−［［４−（４−オキソ−８−フェニル−４Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）モルホリニウム−４−イル］メトキシ］ブチル］−Ｌ−アルギニルグリシル−Ｌ−α−アスパルチルＬ−セリン−、分子内塩（ＳＦ１１２６、ＣＡＳ  ９３６４８７−６７−１）、およびＸＬ７６５が挙げられる。例示的な免疫調節物質としては、例えば、アフツズマブ（ＲＯＣＨＥ（登録商標）から入手可能）；ペグフィルグラスチム（ＮＥＵＬＡＳＴＡ（登録商標））；レナリドミド（ＣＣ−５０１３、ＲＥＶＬＩＭＩＤ（登録商標））；サリドマイド（ＴＨＡＬＯＭＩＤ（登録商標））、アクチミド（ＣＣ４０４７）；およびＩＲＸ−２（インターロイキン１、インターロイキン２、およびインターフェロンγを含むヒトサイトカインの混合物、ＣＡＳ９５１２０９−７１−５、ＩＲＸ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから入手可能）が挙げられる。例示的なアントラサイクリンとしては、例えば、ドキソルビシン（Ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ（登録商標）およびＲＵＢＥＸ（登録商標））；ブレオマイシン（ＬＥＮＯ���ＡＮＥ（登録商標））；ダウノルビシン（ダウノルビシン塩酸塩、ダウノマイシン、およびルビドマイシン塩酸塩、ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ（登録商標））；ダウノルビシンリポソーム（ダウノルビシンクエン酸塩リポソーム、ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））；ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ（登録商標））；エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ（商標））；イダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ（登録商標）、ＩＤＡＭＹＣＩＮ  ＰＦＳ（登録商標））；マイトマイシンＣ（ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ（登録商標））；ゲルダナマイシン；ハービマイシン；ラビドマイシン（ｒａｖｉｄｏｍｙｃｉｎ）；およびデスアセチルラビドマイシン（ｄｅｓａｃｅｔｙｌｒａｖｉｄｏｍｙｃｉｎ）が挙げられる。例示的なビンカアルカロイドとしては、例えば、酒石酸ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ（登録商標））、およびビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ（登録商標）））；ビンブラスチン（硫酸ビンブラスチン、ビンカロイコブラスチンおよびＶＬＢ、ＡＬＫＡＢＡＮ−ＡＱ（登録商標）およびＶＥＬＢＡＮ（登録商標）としても公知）；ならびにビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ（登録商標））が挙げられる。例示的なプロテオソーム阻害剤としては、ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ（登録商標））；カーフィルゾミブ（ＰＸ−１７１−００７、（Ｓ）−４−メチル−Ｎ−（（Ｓ）−１−（（（Ｓ）−４−メチル−１−（（Ｒ）−２−メチルオキシラン−２−イル）−１−オキソペンタン−２−イル）アミノ）−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル）−２−（（Ｓ）−２−（２−モルホリノアセトアミド）−４−フェニルブタンアミド）−ペンタンアミド）；マリゾミブ（ＮＰＩ−００５２）；イキサゾミブクエン酸エステル（ＭＬＮ−９７０８）；デランゾミブ（ＣＥＰ−１８７７０）；およびＯ−メチル−Ｎ−［（２−メチル−５−チアゾリル）カルボニル］−Ｌ−セリル−Ｏ−メチル−Ｎ−［（１Ｓ）−２−［（２Ｒ）−２−メチル−２−オキシラニル］−２−オキソ−１−（フェニルメチル）エチル］−Ｌ−セリンアミド（ＯＮＸ−０９１２）が挙げられる。例示的なＧＩＴＲアゴニストとしては、例えば、ＧＩＴＲ融合タンパク質および抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、二価抗ＧＩＴＲ抗体）、例えば、米国特許第６，１１１，０９０号、欧州特許第０９
０５０５号Ｂ１、米国特許第８，５８６，０２３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／００３１１８号および同第２０１１／０９０７５４号に記載されているＧＩＴＲ融合タンパク質、または、例えば、米国特許第７，０２５，９６２号、欧州特許第１９４７１８３号Ｂ１、米国特許第７，８１２，１３５号、米国特許第８，３８８，９６７号、米国特許第８，５９１，８８６号、欧州特許第ＥＰ１８６６３３９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０２８６８３号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０３９９５４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７１９０号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／１３３８２２号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／０５５８０８号、ＰＣＴ公開ＷＯ１９９９／４０１９６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０３７２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ１９９９／２０７５８号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０８３２８９号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００５／１１５４５１号、米国特許第７，６１８，６３２号、およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１１／０５１７２６号に記載されている抗ＧＩＴＲ抗体などが挙げられる。
ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を増やす方法
【０１３９】
ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増やすことができる。一部の実施形態では、対象から単離したＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞を、グルタミン、血清、および抗生物質を含む組織培養培地中で培養して、初代培養物を形成することができる。一般に、細胞を適切な培養容器中に播種する。細胞（複数可）を培養するために使用される培養容器としては、これだけに特には限定されないが、その中でＴ細胞を培養することが可能である限りは、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリ皿、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバースライド、チューブ、トレー、ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバー、培養バッグ、およびローラーボトルを挙げることができる。細胞は、培養に関する必要性に応じて、少なくともまたは約０．２、０．５、１、２、５、１０、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、またはその中で導き出せる任意の範囲の体積で培養することができる。一部の実施形態では、培養容器は、組織培養プレート、例えば、６ウェル、２４ウェル、または９６ウェルプレートであり得る。他の実施形態では、培養容器はバイオリアクターであり得、これは、細胞を繁殖させることができるように生物学的に活性な環境を支持する、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける任意のデバイスまたはシステムを指し得る。バイオリアクターは、少なくともまたは約２、４、５、６、８、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、５００リットル、１、２、４、６、８、１０、１５立法メートル、またはその中で導き出せる任意の範囲の体積を有し得、細胞の集団の成長を支持するために必要な栄養分と共に培養することができる。
【０１４０】
一般に、細胞は、炭素源、窒素源およびｐＨを維持するためのバッファを含む成長培地中で培養される。培地はまた、脂肪酸または脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン（複数可）、成長因子、サイトカイン、抗酸化剤物質、ピルビン酸、緩衝剤、および無機塩も含有し得る。例示的な成長培地は、Ｔ細胞成長を増強するために非必須アミノ酸およびビタミンなどの種々の栄養分を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）またはＥＳＳＥＮＴＩＡＬ  ８（商標）（Ｅ８（商標））培地などの最小必須培地を含有する。最小必須培地の例としては、これだけに限定されないが、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）Ａｌｐｈａ培地、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ロズウェルパーク記念研究所培地（ＲＰＭＩ）−１６４０培地、１９９培地、およびＦ１２培地が挙げられる。必要に応じて、これだけに限定されないが、ペニシリン、ストレプトマイシン、またはテトラサイクリンなどの抗生物質を培地に添加することができる。組織培養培地にグルタミンを添加することもできる。抗生物質およびアミノ酸などの添加物は、当技術分野で公知である。
【０１４１】
さらに、最小必須培地に、ヒト、ウシ胎仔またはウシ血清などの追加的な添加物を補充することができる。血清は、例えば、１０〜１５％（体積／体積）の濃度で、例えば、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１１％、約１２％、約１３％、約１４％、または約１５％血清で含めることができる。血清は、ウシ胎仔血清であってよい。他の実施形態では、血清は、ヒトＡＢ血清などのヒト血清である。
【０１４２】
あるいは、培地は無血清であってよい。他の場合では、成長培地は、血清代替物を含有し得る。例示的な血清代替物は、当技術分野で公知である。例えば、ＫＮＯＣＫＯＵＴ（商標）血清代替物が、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２００２／００７６７４７号に開示されている。血清に対する代替物としては、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン、組換えアルブミンなどのアルブミン置換体、植物デンプン、デキストランおよびタンパク質加水分解産物）、トランスフェリン（または他の鉄輸送体）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２−メルカプトエタノール、３’−チオグリセロール（thiolgiycerol）、またはそれに対する等価物を適切に含有する材料を挙げることができる。血清に対する代替物は、例えば国際公開ＷＯ９８／３０６７９号に開示されている方法によって調製することができる。
【０１４３】
培養物は、「ゼノフリー（ＸＦ）」であり得、これは、異種動物由来の成分を基本的に含まない培地または培養条件を指す。ヒト細胞の培養に関しては、マウスなどの非ヒト動物のあらゆるタンパク質が異種由来成分（xeno  component）になる。したがって、一部の実施形態では、開示される条件は、ゼノフリーである。したがって、ヒト細胞の培養に関しては、ヒトＡＢ血清を含む培養物は「ゼノフリー」であり得る。
【０１４４】
他の培養条件を適切に定義することができる。例えば、培養温度は、約３０〜４０℃、例えば、少なくともまたは約３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃であってよいが、それらに特に限定されない。一実施形態では、細胞を３７℃で培養する。ＣＯ２濃度は、約１〜１０％、例えば、約２％〜５％、またはその中で導き出せる任意の範囲であり得る。１つの非限定的な例では、約５％のＣＯ２濃度を利用する。
【０１４５】
初代培養物を、有効量の照射された同種フィーダー細胞およびインターロイキン（ＩＬ）−１５またはＩＬ−２などのサイトカインで刺激して、刺激されたＴ細胞を形成する。フィーダー細胞は、例えば、同種の照射末梢血単核細胞であってよい。ヒトフィーダー細胞を含めたフィーダー細胞は、例えば、４０００ｒａｄのガンマ照射で照射されたものであってよい。
【０１４６】
一部の実施形態では、細胞を、フィトヘマグルチニンなどのポリクローナルＴ細胞刺激物質でも刺激する。一部の非限定的な実施例では、１μｇ／ｍｌ〜２μｇ／ｍｌの濃度を利用する。さらなる実施形態では、ＩＬ−１５および／またはＩＬ−２などのサイトカインとＰＨＡの両方を利用する。
【０１４７】
一部の実施形態では、約１，０００〜約２，０００個のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞が照射同種ＰＢＭＣなどの約１００，０００〜約３００，０００個の同種フィーダー細胞で刺激されるような比率を使用する。他の実施形態では、約１，０００〜約２，０００個のＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞が約２００，０００個の同種フィーダー細胞で刺激されるような比率を使用する。
【０１４８】
ＩＬ−２またはＩＬ−１５などのサイトカインを培養物に含めることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５を約５ｎｇ／ｍｌ〜約１５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５の濃度で使用することができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５を約７ｎｇ／ｍｌ〜約１２ｎｇ／ｍｌの濃度で、例えば、約７ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ、約９ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１１ｎｇ／ｍｌ、または約１２ｎｇ／ｍｌの濃度で培養物に含める。１つの非限定的な例では、ＩＬ−１５を約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で含める。
【０１４９】
次いで、刺激されたＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞培養物に新鮮な組織培養培地およびＩＬ−１５および／またはＩＬ−２などのサイトカインをｉｎ−ｖｉｔｒｏにおける拡大培養（expansion）全体を通して補給する。ＩＬ−１５をこの組織培養培地に約５ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５、例えば、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約５０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１５の濃度で含めることができる。一部の実施形態では、ＩＬ−１５を培養物に約７ｎｇ／ｍｌ〜約１２ｎｇ／ｍｌの濃度、例えば、約７ｎｇ／ｍｌ、約８ｎｇ／ｍｌ、約９ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ、約１１ｎｇ／ｍｌ、または約１２ｎｇ／ｍｌの濃度で含める。１つの非限定的な例では、ＩＬ−１５を約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で含める。他の例では、ＩＬ−１５を約２０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ、または約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含める。
【０１５０】
細胞培養物は、任意の期間にわたって維持することができる。一部の実施形態では、１５〜３０日間培養した後、増えたＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞を収集する。
Ｔ細胞受容体をコードする核酸を単離し、使用する方法
【０１５１】
腫瘍細胞抗原に特異的に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする核酸を単離するための方法が提供される。これらの方法は、腫瘍細胞抗原を発現する腫瘍を有する対象由来の試料から、ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を単離するステップを含む。一部の実施形態では、腫瘍は、頭頸部扁平上皮細胞癌、肺がん、黒色腫、卵巣がん、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、肝がん、前立腺がん、乳がん、神経膠芽腫または直腸がんなどの固形腫瘍である。対象は、ヒト対象または獣医学的対象であり得る。試料は、これだけに限定されないが、末梢血試料または腫瘍生検材料を含めた対象由来の任意の試料であり得る。ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ８＋ＣＤ３９＋Ｔ細胞を単離するための方法は上に開示されている。
【０１５２】
一部の実施形態では、方法は、ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ８＋ＣＤ３９＋Ｔ細胞を増やすステップを含む。ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ８＋ＣＤ３９＋Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増やす方法も上に開示されている。他の実施形態では、ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などの初代ＣＤ８＋ＣＤ３９＋Ｔ細胞を利用し、ここでは、その細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増やさない。
【０１５３】
方法は、ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ８＋ＣＤ３９＋Ｔ細胞からＴＣＲをコードする核酸分子をクローニングするステップをさらに含む。ＴＣＲをクローニングするための方法は、当技術分野で公知である、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，６９７，８５４号を参照されたい。ＴＣＲは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであり、通常、α−サブユニットおよびβ−サブユニットからなる。これらは、Ｎ末端免疫グロブリン（Ｉｇ）可変（Ｖ）ドメイン１つ、Ｉｇ定常（Ｃ）ドメイン１つ、膜貫通／細胞膜にまたがる領域、およびＣ末端の短い細胞質尾部を有する。ＴＣＲ  α−鎖およびβ−鎖のどちらの可変ドメインも超可変または相補性決定領域（ＣＤＲ）を３つ有するが、β−鎖の可変領域は、通常は抗原に接触せず、したがって、ＣＤＲとはみなされない追加的な超可変性の領域（ＨＶ４）を有する。
【０１５４】
ＣＤＲ３はプロセシングされた抗原を認識する主要なＣＤＲであるが、アルファ鎖のＣＤＲ１も抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することが示されている。β−鎖のＣＤＲ１もペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣを認識すると考えられる。β−鎖のＣＤＲ４は、抗原認識には関与しないと考えられるが、超抗原と相互作用することが示されている。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基が、２つの鎖間の連結を形成するジスルフィド結合を形成する短い接続配列からなる。特異的な抗原に対するＴＣＲの親和性により、それらが治療的に有用なものになる。例えば、腫瘍は、特異的なＴＣＲを発現するＴ細胞を用いた養子免疫療法を使用することによって有効に処置することができる。ＴＣＲをクローニングするため、およびＴＣＲをトランスフェクトした細胞を使用した養子免疫療法を使用するための方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ２００６／０３１２２１号、米国特許第５，９０６，９３６号；ＰＣＴ公開ＷＯ９７／３２６０３号；ＰＣＴ公開ＷＯ２００７／０６５９５７号、およびＰＣＴ公開ＷＯ２００８／０３９８１８号に開示されている。ＴＣＲをコードする核酸分子およびそのような受容体を含むＴ細胞（またはＮＫ細胞）を生成する方法は、例えば、そのそれぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる、Brentjens  et  al.,  2010,  Molecular  Therapy,  18:4,  666-668；Morgan  et  al.,  2010,  Molecular  Therapy,  published  online  February  23,  2010,  pages  1  -9；Till  et  al.,  2008,  Blood,  1  12:2261  -2271；Park  et  al.,  Trends  Biotechnol.,  29:550-557,  2011；Grupp  et  al.,  N  Engl  J  Med.,  368:1509-1518,  2013；Han  et  al.,  J.  Hematol  Oncol.,  6:47,  2013；ＰＣＴ公開ＷＯ２０１２／０７９０００号、同ＷＯ２０１３／１２６７２６号；および米国特許公開第２０１２／０２１３７８３号に開示されている。
【０１５５】
一部の実施形態では、単一細胞ＲＮＡ配列をＴ細胞受容体またはｐａｉｒ−ｓｅｑ（Ａｄａｐｔｉｖｅ）のために使用する。１つの非限定的な例では、精製されたＴ細胞を、ｆｌｕｉｄｉｇｍまたは１０×ゲノミクス計器を使用して単離して単一細胞にする。次いで、Ｔ細胞ＤＮＡを増幅し、配列決定する。このプロセスのためにＴ細胞を抗原刺激する必要も抗原が提示されている必要もない。
【０１５６】
適切なクローニングおよび配列決定技法のさらなる例、ならびに当業者を多くのクローニング訓練に方向付ける十分な指示は公知である（例えば、Sambrook  et  al.  (Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual,  4th  ed,  Cold  Spring  Harbor,  New  York,  2012)およびAusubel  et  al.  (In  Current  Protocols  in  Molecular  Biology,  John  Wiley  &  Sons,  New  York,  through  supplement  104,  2013)を参照されたい）。生物学的試薬および実験機器の製造者による製品情報からも有用な情報がもたらされる。そのような製造者としては、ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ならびに多くの他の当業者に公知の商業的供給源が挙げられる。
【０１５７】
ＴＣＲをコードする核酸配列は、任意の適切な方法によって調製することができる。配列全体がクローニングされ、分かったら、Narang  et  al.,  Meth.  Enzymol.  68:90-99,  1979のホスホトリエステル法；Brown  et  al.,  Meth.  Enzymol.  68:109-151,  1979のホスホジエステル法；Beaucage  et  al.,  Tetra.  Lett.  22:1859-1862,  1981のジエチルホスホロアミダイト（diethylphosphoramidite）法；例えば、例えばNeedham-VanDevanter  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.12:6159-6168,  1984に記載の自動合成機を使用する、Beaucage  &  Caruthers,  Tetra.  Letts.  22(20):1859-1862,  1981に記載の固相ホスホロアミダイトトリエステル法；ならびに、米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持法などの方法による直接化学合成により調製することもできる。化学合成により一本鎖オリゴヌクレオチドが生成される。これを、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、または一本鎖を鋳型として使用したＤＮＡポリメラーゼによる重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換することができる。
【０１５８】
核酸は、増幅法によって調製することもできる。増幅法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、自家持続配列複製系（３ＳＲ）が挙げられる。多種多様なクローニング方法、宿主細胞、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅法体系が当業者に周知である。本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸に、その生物学的活性を低下させることなく修飾を行うことができる。いくつかの修飾は、標的とする分子のクローニング、発現、または融合タンパク質への組み入れを容易にするために行われ得る。そのような修飾は当業者には周知であり、それらとして、例えば、終結コドン、開始部位をもたらすための、アミノ末端に付加されたメチオニン、慣習的に配置される制限部位を作製するための、いずれかの末端に置かれた追加的なアミノ酸、または精製ステップを補助するための追加的なアミノ酸（例えば、ポリＨｉｓ）が挙げられる。
【０１５９】
ＴＣＲをコードする核酸分子を異種プロモーターに作動可能に連結することができる。ＴＣＲをコードする核酸分子を、宿主細胞において発現させるためにベクター（例えば、レンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクター）に含めることができる。例示的な細胞は哺乳動物細胞であり、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）などのＴ細胞およびＮＫ細胞を含む。特定の非限定的な実施例では、細胞は、ＣＤ３＋Ｔ細胞などのＴ細胞である。ＣＤ３＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。
【０１６０】
核酸分子を、細菌、植物、酵母、昆虫および哺乳動物細胞などの組換え操作された細胞において発現させることもできる。ＴＣＲを融合タンパク質として発現させることもできる。抗体および抗原結合性断片の発現および精製の方法は公知であり、本明細書にさらに記載されている（例えば、Al-Rubeai  (ed),  Antibody  Expression  and  Production,  Springer  Press,  2011を参照されたい）。当業者は、Ｅ．ｃｏｌｉ、他の細菌宿主、酵母、およびＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞株などの種々の高等真核細胞を含めた、タンパク質を発現させるために利用可能な多数の発現系に関する知識がある。「宿主細胞」という用語は、主題の宿主細胞の任意の後代も含む。複製中に変異が生じ得るので、全ての後代が親細胞と同一でない可能性があることが理解される。安定な移入、つまり、外来ＤＮＡを宿主において継続的に維持する方法は、当技術分野で公知である。本明細書に開示される通り、本開示の特定の実施形態は、ＴＣＲを発現するヒトＴ細胞およびヒトＮＫ細胞などのＴ細胞を含む。これらのＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのＣＤ３＋Ｔ細胞であり得る。
【０１６１】
プロモーター（構成的または誘導性のいずれか）に対するＴＣＲをコードする核酸の発現、その後の発現カセットへの組み入れ。プロモーターは、サイトメガロウイルスプロモーターおよびヒトＴ細胞リンパ球向性ウイルスプロモーター（ＨＴＬＶ）−１を含めた任意の目的のプロモーターであってよい。必要に応じて、サイトメガロウイルスエンハンサーなどのエンハンサーを構築物に含める。カセットは、原核生物または真核生物のいずれかにおける複製および組込みに適したものであってよい。典型的な発現カセットは、タンパク質をコードするＤＮＡの発現の調節に有用な特定の配列を含有する。例えば、発現カセットは、適切なプロモーター、エンハンサー、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、タンパク質をコードする遺伝子の前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするためにその遺伝子の正しい読み枠を維持するための配列、および終止コドンを含み得る。ベクターは、薬物耐性（例えば、アンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性）をコードするマーカーなどの選択マーカーをコードし得る。
【０１６２】
クローニングされた遺伝子の高レベルの発現を得るために、最小限で、転写を導くための強力なプロモーター、翻訳開始のためのリボソーム結合性部位（内部リボソーム結合配列）、および転写／翻訳ターミネーターを含有する発現カセットを構築することが望ましい。真核細胞に関しては、制御配列は、例えば免疫グロブリン遺伝子、ＨＴＬＶ、ＳＶ４０またはサイトメガロウイルスに由来するプロモーターおよび／またはエンハンサー、ならびにポリアデニル化配列を含み得、スプライスドナーおよび／またはアクセプター配列（例えば、ＣＭＶおよび／またはＨＴＬＶスプライスアクセプターおよびドナー配列）をさらに含み得る。
【０１６３】
宿主が真核生物の場合、リン酸カルシウム共沈、微量注射、エレクトロポレーション、リポソームに包まれたプラスミドまたはウイルスベクターの挿入などの従来の機械的な手順などの、ＤＮＡのトランスフェクション方法を使用することができる。カセットにより形質転換された細胞は、ａｍｐ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｎｅｏ遺伝子およびｈｙｇ遺伝子などのカセット中に含有される遺伝子によって付与される抗生物質に対する耐性によって選択することができる。
【０１６４】
真核細胞は、ＴＣＲをコードするポリヌクレオチド配列と、単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子とを共形質転換することもできる。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、レンチウイルスまたはウシパピローマウイルスなどの真核生物ウイルスベクターを使用して、真核細胞を一過性に感染させるまたは形質転換し、タンパク質を発現させることである（例えば、Viral  Expression  Vectors,  Springer  press,  Muzyczka  ed.,  2011を参照されたい）。当業者は、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞株などの高等真核細胞を含めた細胞におけるタンパク質の産生に有用なプラスミドおよびベクターなどの発現系を容易に使用することができる。
【０１６５】
一部の実施形態では、ＴＣＲを発現させるためにウイルスベクターを利用する。ウイルスベクターとしては、これだけに限定されないが、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルスベクター、およびガンマレトロウイルスなどのレトロウイルスが挙げられる。レトロウイルスベクターにより、真核細胞に遺伝子移入するための高度に効率的な方法がもたらされる。さらに、レトロウイルスによる組込みは制御された様式で起こり、細胞当たり１つまたは少数のコピーの新しい遺伝情報の安定な組込みがもたらされる。理論に束縛されることなく、レンチウイルスベクターは、肝細胞などの非増殖性細胞に形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルスに由来するベクターに勝る利点を有する。レンチウイルスベクターは、免疫原性が低いというさらなる利点も有する。ＴＣＲを発現させるためのレンチウイルスベクターの使用は当技術分野で公知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第２０１４／００５０７０８号に開示されている。トランスポゾンを使用することができる。
【０１６６】
一部の実施形態では、目的の対象に導入するための宿主細胞を産生する。宿主細胞は、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）もしくは末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、精製されたＴ細胞、または精製されたＮＫ細胞であり得る。Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞、例えば、初代Ｔ細胞、または培養されたＴ細胞株由来のＴ細胞、例えば、Ｊｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１など、または哺乳動物（例えば、ＴＣＲ−Ｔ細胞が後で投与されるヒト患者）から得たＴ細胞などの任意のＴ細胞であってよい。ヒト対象などの哺乳動物の対象から得る場合、Ｔ細胞は、これだけに限定されないが、血液、骨髄、リンパ節、胸腺、または他の組織または流体を含めた多数の供給源から得ることができる。Ｔ細胞を精製のために富化するまたは精製することもできる。Ｔ細胞は、これだけに限定されないが、ＣＤ３＋細胞、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋ダブルポジティブＴ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例えば、Ｔｈ１細胞およびＴｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤性細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞などを含めた、任意の型のＴ細胞であってよく、任意の発生段階のＴ細胞であってよい。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞などのＣＤ３＋Ｔ細胞であってよい。代替の実施形態では、細胞は、ＴＣＲ−ＮＫ細胞が後で投与される対象と同じ対象から得たＮＫ細胞などのＮＫ細胞であってよい。一部の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。他の実施形態では、細胞は、獣医学的対象に由来するものである。
【０１６７】
本明細書に記載の少なくとも１つの宿主細胞を含む細胞の集団も提供される。細胞の集団は、ＴＣＲをコードする組換え発現ベクターのいずれかを含む宿主細胞、少なくとも１つの他の細胞に加えて、例えば、いかなる組換え発現ベクターも含まない宿主細胞（例えば、Ｔ細胞）、またはＴ細胞以外の細胞、例えば、Ｂ細胞、マクロファージ、好中球、赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）などを含む異種集団であってよい。あるいは、細胞の集団は、集団がＴＣＲをコードする組換え発現ベクターを含む宿主細胞を主に含む（例えば、それから本質的になる）、実質的に均質な集団であってよい。集団は、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む単一の宿主細胞のクローンであり、したがって、集団の全ての細胞が組換え発現ベクターを含む、細胞のクローン集団であってもよい。本発明の一実施形態では、細胞の集団は、本明細書に記載の組換え発現ベクターを含む宿主細胞を含むクローン集団である。Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞などのＣＤ３＋  Ｔ細胞であってよい。細胞はＮＫ細胞であってもよい。
【０１６８】
細胞は、レシピエントに対して自己であってよい。レシピエントは、腫瘍を有するまたは腫瘍を有するリスクがあるレシピエントであってよい。レシピエントは、腫瘍に対する前処置を受けていてよい。腫瘍は、頭頸部扁平上皮細胞癌、肺がん、黒色腫、卵巣がん、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、肝がん、前立腺がん、乳がん、神経膠芽腫または直腸がんなどの固形腫瘍であってよい。一部の実施形態では、自己Ｔ細胞またはＮＫ細胞をヒト対象などの対象から単離し、単離されたＴＣＲをこれらの細胞に導入する。次いで、これらの形質転換された細胞を対象に再導入する。このシナリオでは、ドナーとレシピエントは同じ対象である。対象は、ヒトであってよい。一部の実施形態では、対象に、クローニングされたＴＣＲを発現するＴ細胞および／またはＮＫ細胞を治療有効量で投与する。特定の実施形態では（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４０２７１６３５号Ａ１参照）、拡大培養および遺伝子改変の前に、Ｔ細胞の供給源を対象から得る。
【０１６９】
一部の実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は自己である。他の実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、同種である。次いで、上に開示されている通り、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入する。一実施形態では、形質導入の４日後、５日後、６日後、７日後、８日後、９日後、１０日後、１１日後、１２日後、１３日後、１４日後、１５日後に細胞がベクターを一過性に発現する。１つの非限定的な例では、エレクトロポレーションによってベクターをＴ細胞に形質導入する。
【０１７０】
「対象」という用語は、免疫応答を引き出すことができる、生きている生物体（例えば、哺乳動物）を含むものとする。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ブタ（および他の獣医学的対象）ならびに非ヒト霊長類が挙げられる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含めたいくつもの供給源から得ることができる。他の実施形態では、任意の数の、当技術分野において利用可能なＴ細胞株を使用することができる。一部の実施形態では、対象に白血球アフェレーシスを行うことができ、ここで、白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）を採取し、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて富化または枯渇させて、目的の細胞、例えば、Ｔ細胞およびまたはＮＫ細胞を選択および／または単離する。これらの細胞単離物を当技術分野で公知の方法によって増やし、ＴＣＲ構築物が導入されるように処理し、それにより、クローニングされたＴＣＲを発現する自己細胞を作製することができる。一態様では、これだけに限定されないが、レンチウイルスウイルスベクターなどのウイルスベクターを使用してＴＣＲ発現細胞を生成する。一部の非限定的な実施例では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの任意の数の当業者に公知の技法を使用して対象から採取した血液の単位から得ることができる、または、細胞をアフェレーシスによって得ることができる。アフェレーシス産物は、一般には、Ｔ細胞を含めたリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、他の有核白血球、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）、および血小板を含有する。
【０１７１】
アフェレーシスによって採取された細胞を、血漿画分を除去するため、および細胞をその後の処理ステップのために適切な緩衝液または培地に入れるために洗浄することができる。一部の非限定的な実施例では、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的な実施例では、洗浄溶液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠き得るまたは全てではないが多くの二価カチオンを欠き得る。カルシウムの非存在下での最初の活性化ステップにより、拡大された活性化がもたらされ得る。洗浄ステップは、半自動「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ  ＣＹＴＯＭＡＴＥ（登録商標）、またはＨＡＥＭＯＮＥＴＩＣＳ  ＣＥＬＬ  ＳＡＶＥＲ  ５（登録商標））を製造者の指示に従って使用することによるものなどの当技術分野で公知の方法によって実現することができる。洗浄後、細胞を、バッファを伴うまたは伴わない食塩溶液などの種々の生体適合性緩衝液に再懸濁させることができる。あるいは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を直接培養培地に再懸濁させることができる。
【０１７２】
一部の実施形態では、Ｔ細胞を末梢血リンパ球から負の選択によって単離する。ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ２８＋ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋  Ｔ細胞、ナイーブおよび／またはメモリーＴ細胞などの特定のＴ細胞の亜集団を正の選択または負の選択技法によってさらに単離することができる。例えば、Ｔ細胞を、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔ、またはＣＤ３／ＩＬ−２などの、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８とコンジュゲートしたビーズと一緒に、所望のＴ細胞の正の選択のために十分な期間にわたってインキュベートすることによって単離することができる。例えば、米国特許出願公開第２０１４０２７１６３５号Ａ１を参照されたい。非限定的な実施例では、期間は、約２４〜約７２時間およびその間の全ての整数値である。別の非限定的な実施例では、期間は、少なくとも２４時間、３６時間、４８時間であるまたはそれよりも長い。例えば免疫無防備状態の個体からの単離など、他の細胞型と比較してＴ細胞がわずかであるあらゆる状況においてＴ細胞を単離するために、より長いインキュベーションの時間を使用することができる。複数のラウンドの選択を使用することもできる。
【０１７３】
負の選択によるＴ細胞集団の富化は、負に選択される細胞に独特の表面マーカー向けられた抗体の組合せを用いて実現することができる。１つの方法は、負に選択される細胞上に存在する細胞表面マーカー向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する負の磁気免疫粘着（magnetic  immunoadherence）またはフローサイトメトリーによる細胞選別および／または選択である。例えば、ＣＤ４＋細胞を負の選択によって富化するためには、モノクローナル抗体カクテルは、一般には、ＣＤ８ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１３２、ＴＣＲγ／δ、およびＣＤ２３５ａ（グリコホリンＡ）に対する抗体を含む。ＣＤ８＋細胞を負の選択によって富化するためには、モノクローナル抗体カクテルは、ＣＤ４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ３６、ＣＤ５６、ＣＤ１２３、ＴＣＲ  γ／δ、およびＣＤ２３５ａに対する抗体を含有する。１つまたは複数のサイトカインを発現するＴ細胞集団を選択することができる。細胞発現をスクリーニングするための方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／１２６７１２号に開示されている。
【０１７４】
正の選択または負の選択による所望の細胞の集団の単離に関しては、細胞とビーズの最大の接触を確実にするために、細胞および表面（例えば、ビーズなどの粒子）の濃度を変動させることができる。一部の実施形態では、１ｍｌ当たり細胞１００万個の濃度を使用する。さらなる実施形態では、１ｍｌ当たり細胞１億個よりも多くを使用する。他の実施形態では、１ｍｌ当たり細胞１，０００万個、１，５００万個、２，０００万個、２，５００万個、３，０００万個、３，５００万個、４，０００万個、４，５００万個、５，０００万個、６，５００万個、７，０００万個、７，５００万個、８，０００万個、８，５００万個、９，０００万個、９，５００万個、または１億個の濃度を使用する。理論に束縛されることなく、高濃度を使用することにより、細胞収量の増加、細胞活性化、および細胞拡大をもたらすことができる。より低い濃度の細胞を使用することもできる。理論に束縛されることなく、Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズなどの粒子）の混合物を有意に希釈することにより、粒子と細胞との相互作用が最小化される。これにより、粒子に結合する所望の抗原を大量に発現する細胞が選択される。一部の実施形態では、使用される細胞の濃度は、１ｍｌ当たり５×１０６個である。他の実施形態では、使用される濃度は、１ｍｌ当たり約１×１０５個から１ｍｌ当たり１×１０６個まで、および間の任意の整数値であり得る。
【０１７５】
細胞を、ローテータにおいて、スピードを変動させ、２〜１０℃または室温のいずれかで、様々な時間の長さにわたってインキュベートすることができる。刺激のためのＴ細胞は洗浄ステップ後に凍結させることもできる。理論に束縛されることなく、凍結およびその後の解凍ステップにより、細胞集団内の顆粒球およびいくらかの程度までの単球が除去されることによってより均一な産物がもたらされる。血漿および血小板を除去する洗浄ステップ後、細胞を凍結用溶液に懸濁させることができる。多くの凍結用溶液およびパラメーターが、当技術分野で公知であり、この状況において有用であるが、方法の１つは、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミンおよび７．５％ＤＭＳＯ、または３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、および７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、または、例えば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａを含有する他の適切な細胞凍結培地を使用し、次いで、細胞を１分あたり１℃の速度で−８０℃まで凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの気相中に保管することを伴う。制御された凍結の他の方法ならびに−２０℃でのまたは液体窒素中での制御されない即座の凍結を使用することができる。米国特許出願公開第２０１４−０２７１６３５号Ａ１を参照されたい。
【０１７６】
血液試料またはアフェレーシス産物は、本明細書に記載のとおり増やした細胞が必要になり得るときよりも前の期間に対象から採取することができる。そのように、増やす予定の細胞の供給源を必要な任意の時点で収集し、Ｔ細胞などの所望の細胞を単離し、本明細書に記載のものなどのＴ細胞療法が有益である任意の数の疾患または状態に対するＴ細胞療法において後に使用するために凍結することができる。一態様では、血液試料またはアフェレーシスを、一般に、健康な対象から取得する。ある特定の態様では、血液試料またはアフェレーシスを、一般に、腫瘍などの疾患が発症するリスクがあるが、まだ疾患が発症していない健康な対象から取得し、目的の細胞を単離し、後で使用するために凍結する。ある特定の態様では、Ｔ細胞を増やし、凍結し、後の時点で使用することができる。ある特定の態様では、本明細書に記載のとおり腫瘍などの特定の疾患の診断の直後であるが任意の処置の前に、患者から試料を収集する。別の態様では、任意の数の関連する処置モダリティ前の対象由来の血液試料またはアフェレーシスから細胞を単離する。ある特定の態様では、凍結保存された細胞を本明細書に記載の通り解凍し、洗浄し、室温で１時間静置した後に使用する。血液試料またはアフェレーシス産物を必要な時に対象から収集し、凍結しない場合もある。一部の実施形態では、自己腫瘍を有するＴ細胞をその後のトランスフェクションおよび注入のために個体から単離する。
【０１７７】
Ｔ細胞は、一般に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号；同第６，５３４，０５５号；同第６，９０５，６８０号；同第６，６９２，９６４号；同第５，８５８，３５８号；同第６，８８７，４６６号；同第６，９０５，６８１号；同第７，１４４，５７５号；同第７，０６７，３１８号；同第７，１７２，８６９号；同第７，２３２，５６６号；同第７，１７５，８４３号；同第５，８８３，２２３号；同第６，９０５，８７４号；同第６，７９７，５１４号；同第６，８６７，０４１号；および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号に記載されている方法を使用して活性化し、増やすことができる。Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体に関連するシグナルを刺激する作用剤およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが結合した表面と接触させることによって増やすことができる。Ｔ細胞はＰＨＡを使用して増やすこともできる、または、バルクＰＢＭＣはＣＤ３／２８またはＣＤ３／ＩＬ２をトランスフェクトすることができる。一部の非限定的な実施例では、Ｔ細胞集団を、例えば、表面上に固定化した抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合性断片、もしくは抗ＣＤ２抗体と接触させることによって、またはカルシウムイオノフォアと併せてプロテインキナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）と接触させることによって、本明細書に記載の通り刺激することができる。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激のために、アクセサリー分子を結合するリガンドを使用する。例えば、Ｔ細胞の集団を、Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。ＣＤ４＋  Ｔ細胞またはＣＤ８＋  Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、一般に当技術分野で公知の他の方法で使用できるのと同様に使用することができる（Berg  et  al.,  Transplant  Proc.  30(8):3975-3977,  1998；Haanen  et  al.,  J.  Exp.  Med.  190(9):13191328,  1999；Garland  et  al.,  J.  Immunol.  Meth.  227(1-2):53-63,  1999）。他の方法は、同種の照射ＰＢＭＣを、Ｔ細胞増殖を刺激するためにフィトヘマグルチニンと共に使用することを含む。
【０１７８】
ＴＣＲが単離されたら、様々なアッセイを使用して、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルおよび動物モデルにおける分子の活性、例えば、これだけに限定されないが、抗原刺激後にＴ細胞を増やす能力、再刺激の非存在下でＴ細胞拡大を持続させる能力、および抗がん活性を評価することができる。一部の実施形態では、これだけに限定されないが、１−１ＢＢなどの活性化マーカーの上方調節を、フローサイトメトリーによってなどで評価する。
【０１７９】
方法は、対象に、医薬組成物の細胞、例えば、クローニングされたＴＣＲを発現するＴ細胞および／またはＮＫ細胞を治療有効量で投与することを含む。腫瘍を有する対象などの、それを必要とする対象に、その後、化学療法または外科手術（がんに対して）または抗ウイルス剤（ＨＩＶ感染に対して）を用いた標準の処置を受けさせることができる。異種ＴＣＲを発現する宿主細胞の投与により、腫瘍体積の減少、転移の減少、または腫瘍の徴候もしくは症状の低減などの、腫瘍の処置がもたらされ得る。
【０１８０】
医薬組成物は、ＴＣＲ発現宿主細胞、例えば、本明細書に記載の複数のＴＣＲ発現宿主細胞を、１つまたは複数の薬学的にまたは生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含み得る。ＴＣＲ発現宿主細胞は、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞などのＣＤ３＋Ｔ細胞などのＴ細胞、および／またはＮＫ細胞であり得る。そのような組成物は、例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；  ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および防腐剤を含み得る。
【０１８１】
細胞に関しては、細胞の導入のために種々の水性担体、例えば、緩衝食塩水などを使用することができる。これらの溶液は、滅菌されており、一般に、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技法によって滅菌することができる。組成物は、必要な場合、生理的条件に近づけるために、例えばｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどの薬学的に許容される補助物質を含有し得る。これらの製剤中の濃度は、広範に変動し得、特定の選択される投与形式および対象の必要性に応じて主に液量、粘度、体重などに基づいて選択される。
【０１８２】
一実施形態では、医薬組成物は、内毒素、マイコプラズマ、複製コンピテントレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ−Ｇ核酸、ＨＩＶ  ｇａｇ、抗ＣＤ８／抗ＣＤ３９／抗ＣＤ１０３でコーティングされたビーズ残留物、マウス抗体、プールされたヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培養培地成分、ベクターパッケージング細胞またはプラスミド成分、細菌および真菌などの夾雑物を実質的に含まない、例えば、それが検出可能なレベルで存在しない。
【０１８３】
投与すべき組成物の的確な量は、医師が年齢、重量、腫瘍サイズ、転移の程度、および患者（対象）の状態の個体差を考察して決定することができる。一般に、本明細書に記載のＴ細胞（および／またはＮＫ細胞）を含む医薬組成物を、範囲内の全ての整数値を含めて体重１ｋｇ当たり細胞１０４〜１０９個、例えば、体重１ｋｇ当たり細胞１０５〜１０６個の投与量で投与することができると明言することができる。例示的な用量は、１ｋｇ当たり細胞１０６個〜１ｋｇ当たり細胞約１×１０８個まで、例えば、１ｋｇ当たり細胞約５×１０６個から１ｋｇ当たり細胞約７．５×１０７個まで、例えば、１ｋｇ当たり細胞約２．５×１０７個、または１ｋｇ当たり細胞約５．０×１０７個である。
【０１８４】
組成物は、これらの投与量で１回または複数回、例えば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、８回、９回、または１０回、投与することができる。組成物は、一般に、免疫療法において公知の注入技法を使用することによって投与することができる（例えば、Rosenberg  et  al.,  New  Eng.  J.  of  Med.  319:1676,  1988を参照されたい）。組成物は、毎日、毎週、隔月または毎月、投与することができる。一部の非限定的な実施例では、組成物を静脈内投与用に製剤化し、複数回投与する。投与の量および頻度は、対象の状態、ならびに対象の疾患の型および重症度などの因子によって決定されるが、適切な投与量は、治験によって決定することができる。
【０１８５】
一実施形態では、ＴＣＲをＴ細胞またはＮＫ細胞などの細胞に導入し、対象が細胞の最初の投与、および１回または複数回のその後の細胞の投与を受け、ここで、１回または複数回のその後の投与は、前の投与後１５日未満、例えば、前の投与の１４日後、１３日後、１２日後、１１日後、１０日後、９日後、８日後、７日後、６日後、５日後、４日後、３日後、または２日後に行う。一実施形態では、１週間当たり１回よりも多くの細胞の投与を対象（例えば、ヒト）にもたらし、１週間当たり、例えば、２回、３回、または４回のＴＣＲ発現細胞の投与を行う。一実施形態では、対象は、１週間当たり１回よりも多くのＴ細胞の投与を受け（例えば、１週間当たり２回、３回または４回の投与）（サイクルとも称される）、その後、１週間投与を行わず、次いで、対象にＴＣＲ発現細胞の１回または複数回の追加的な投与（例えば、１週間当たり１回よりも多くの細胞の投与）を行う。別の実施形態では、対象（例えば、ヒト対象）は、１サイクルよりも多くのサイクルのＴＣＲ発現細胞を受け、各サイクル間の時間は、１０日未満、９日未満、８日未満、７日未満、６日未満、５日未満、４日未満、または３日未満である。一実施形態では、ＴＣＲ発現細胞を１日おきに、１週間当たり３回の投与で投与する。別の実施形態では、ＴＣＲ発現細胞を少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間またはそれよりも多くの週にわたって投与する。患者に投与される上記の処置の投与量は、処置される状態および処置のレシピエントの的確な性質によって変動する。ヒト投与に関する投与量のスケーリングは技術分野で認められている慣例に従って実施することができる。
【０１８６】
一部の実施形態では、ＴＣＲ改変Ｔ細胞をｉｎ  ｖｉｖｏにおいて複製して、長期間にわたり持続させることができ、それにより持続的な腫瘍制御をもたらすことができる。種々の態様では、対象に投与されるＴ細胞、またはこれらの細胞の後代は、対象において少なくとも４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１２カ月、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２１カ月、２２カ月、２３カ月、または対象へのＴ細胞の投与後数年にわたって持続する。他の実施形態では、細胞およびそれらの後代は、対象へのＴ細胞の投与後６カ月未満、５カ月未満、４カ月未満、３カ月未満、２カ月未満、または１カ月未満、例えば、３週間、２週間、１週間にわたって存在する。
【０１８７】
主題の組成物の投与は、注射、輸血、埋め込みまたは移植によるものを含めた任意の慣習的な様式で行うことができる。開示された組成物は経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、結節内に、髄内、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）注射によって、または腹腔内に患者に投与することができる。一部の実施形態では、組成物を患者に皮内または皮下注射によって投与する。他の実施形態では、本発明の組成物をｉ．ｖ．注射によって投与する。組成物を腫瘍またはリンパ節に直接注射することもできる。
【０１８８】
一実施形態では、単離された細胞の集団を含有する組成物は、１つまたは複数の追加的な医薬品、例えば、１つまたは複数の抗菌剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤および抗真菌剤）、抗腫瘍剤（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、パクリタキセル、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン、もしくはビンクリスチン）、枯渇剤（例えば、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン、もしくはビンクリスチン）、またはアセチルサリチル酸、イブプロフェンもしくはナプロキセンナトリウムなどの非ステロイド性抗炎症剤、サイトカイン（例えば、インターロイキン２）、またはワクチンも含有し得る。多くの化学療法剤が現在当技術分野で公知である。一実施形態では、化学療法剤は、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗薬、インターカレーティング抗生物質、成長因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤、生物学的反応修飾物質、抗ホルモン薬、例えば、抗アンドロゲン薬、および抗血管新生剤からなる群から選択される。
【０１８９】
悪性病変の処置に関しては、方法は、対象に治療有効量の追加的ながん治療剤（化学療法剤および放射線を含む）を投与するまたは外科手術を施行することも含み得る。
【０１９０】
ＴＣＲを発現する細胞を外科手術、放射線、化学療法、または免疫療法と併せて投与することができる。適切な化学療法剤は、上に開示されている。ＴＣＲを発現する細胞を下で詳細に開示されている通りＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡアンタゴニストおよび／または４−１ＢＢアゴニストと共に投与することもできる。
検出および処置の方法
【０１９１】
ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の投与が診断および処置において有用であることが本明細書に開示される。これらの実施形態では、対象由来の生体試料中のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定する。一部の実施形態では、試料は、末梢血試料または腫瘍生検材料である。対象は、ヒトまたは獣医学的対象などの任意の対象であり得る。さらなる実施形態では、対象は、腫瘍を有する、腫瘍を有する疑いがある、または腫瘍を有するリスクがある。腫瘍は固形腫瘍であり得る。一部の非限定的な実施例では、固形腫瘍は、頭頸部扁平上皮細胞癌、肺がん、黒色腫、卵巣がん、腎細胞癌、膀胱がん、子宮頸がん、肝がん、前立腺がん、乳がん、神経膠芽腫または直腸がんである。
【０１９２】
一部の実施形態では、腫瘍を有する対象が、これだけに限定されないが、生物学的反応修飾物質（例えば、サイトカインおよびケモカイン）、がんワクチン、化学療法剤、免疫療法剤、および放射線を含むがん治療剤に応答するかどうかを決定するための方法が開示される。一部の実施形態では、がん治療剤は、チェックポイント阻害剤、４−１ＢＢアゴニストおよび／または放射線であり得る。がん治療剤は、化学物質（chemical）であり得る。当該方法を、対象が外科手術に応答するかどうかを検出するために使用することもできる。
【０１９３】
これらの方法は、対象由来の生体試料中のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在を検出するステップを含み、生体試料中のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在は、これだけに限定されないが、チェックポイント阻害剤、４−１ＢＢアゴニスト、および／または放射線などのがん治療剤が対象における腫瘍の処置に有効であることを示す。当該方法により、対象が切除などの外科処置に応答することも示され得る。当該方法は、がん治療剤を対象に投与するステップ、または外科処置を実施するステップも含み得る。一部の非限定的な実施例では、がん治療剤は、チェックポイント阻害剤であり、これは、これだけに限定することなく、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニストまたはＬＡＧ３アンタゴニストであり得る。適切なアンタゴニストは、以下に詳細に開示されている。適切な４−１ＢＢアゴニストも以下に開示される。
【０１９４】
他の実施形態では、腫瘍を有する対象ががん治療剤を含むものなどの治療レジメンに応答するかどうかを決定するための方法が開示される。がん治療剤は、化学療法剤または放射線であり得る。がん治療剤は、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニストもしくはＬＡＧ３アンタゴニストなどのチェックポイント阻害剤であり得る、または４−１ＢＢアゴニストであり得る。一部の実施形態では、方法は、対象に第１の用量のがん治療剤を投与するステップと、対象由来の生体試料中のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を決定するステップとを含む。生体試料中のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の量が対照と比較して増加することは、第１の用量のがん治療剤が対象における腫瘍の処置に有効であることを示す。
【０１９５】
さらなる実施形態では、腫瘍を有する対象ががん治療剤に応答するかどうかを決定するための方法が開示される。がん治療剤は、化学療法剤または放射線であり得る。がん治療剤は、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニストもしくはＬＡＧ３アンタゴニストなどのチェックポイント阻害剤であり得る、または４−１ＢＢアゴニストであり得る。これらの方法は、対象に第１の用量のがん治療剤を投与するステップと、対象由来の生体試料中のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を決定するステップとを含み、生体試料中のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の量が対照と比較して増加することは、第１の用量のがん治療剤が対象における腫瘍の処置に有効であることを示す。追加的な実施形態では、方法は、第２の用量のがん治療剤を対象に投与するステップであって、第１の用量が第２の用量と同じである、または第２の用量が第１の用量よりも低い、ステップをさらに含む。
【０１９６】
さらに他の実施形態では、腫瘍を有する対象を処置するための方法が開示される。これらの方法は、対象に第１の用量のがん治療剤を投与するステップと、対象由来の生体試料中のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数を決定するステップとを含む。生体試料中のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の量が対照と比較して減少するまたは変化がないことは、第１の用量のがん治療剤が対象における腫瘍の処置に有効でないことを示す。第２の用量のがん治療剤を対象に投与し、ここで、第２の用量は第１の用量よりも高い、または第２の用量は第１の用量と同じである。
【０１９７】
一部の実施形態では、上記で考察した通り、対象は、腫瘍を有する、または腫瘍を発症するリスクがある。これらの対象は、医師などの当業者が適切な標準の方法によって同定することができる。開示されている方法は、目的の対象を選択するステップと、これだけに限定されないが、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニストまたはＬＡＧ３アンタゴニストなどのチェックポイント阻害剤を含めた目的のがん治療剤を投与するステップとを含む。対象に４−１ＢＢアゴニストを投与することもできる。当該方法により、外科処置に応答する対象を検出することができる。
【０１９８】
追加的な実施形態では、対象に、治療有効量のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、および治療有効量のがん治療剤、例えば、これだけに限定されないが、チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニストまたはＬＡＧ３アンタゴニストを投与する。追加的な実施形態では、対象に４−１ＢＢアゴニストを投与することができる。本明細書に開示されるＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などの精製されたＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびチェックポイント阻害剤または４−１ＢＢアゴニストの投与により、腫瘍などの病態を克服する対象の能力が増大する。細胞およびチェックポイント阻害剤は、単一の医薬組成物に含めることもでき、別々の医薬組成物に含めることもできる。したがって、対象からｅｘ  ｖｉｖｏにおいてＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を精製し、精製された集団を生成し、これらの細胞のを導入することにより、レシピエント対象の免疫応答が増強される。治療有効量のチェックポイント阻害剤または４−１ＢＢアゴニストの投与によってもレシピエントの免疫応答が増強される。したがって、化学療法剤または放射線が有効であるかどうかを決定するための本明細書に開示される方法は、上記の任意の治療法と組み合わせて（および任意の対象において）使用することができる。
【０１９９】
当該方法を使用して、対象に対して治療的に有効であるがん治療剤の用量を評価することもできる。例えば、本明細書に開示される方法を使用して、目的の対象に投与される用量を低減することができるかどうか、およびそれでもなお有効であるかどうかを決定することができる。本明細書に開示される方法を使用して、対象に投与される用量が低すぎ、したがって治療的に有効になるように増加させなければならないかどうかを決定することもできる。
【０２００】
開示されている方法のいずれも、Ｂ細胞および／またはＴ細胞などの他の細胞型を測定するステップを含み得る。開示されている方法は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３またはＬＡＧ３などのマーカーの発現を測定するステップも含み得る。ＣＤ８、ＣＤ３９および／またはＣＤ１０３の発現を評価する。
【０２０１】
一部の実施形態では、ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を測定する。生体試料由来のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が対照と比較して増加することは、当該用量のがん治療剤が対象の処置に有用であることを示し、ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数に対照と比較した有意な変更がないことは、当該用量のがん治療剤が対象を処置するために有用でないことを示す。対照は、以前に決定された標準値、またはがん治療剤の投与前の対象由来の試料中のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の量、または対象が対照物質を投与された場合の対象由来の試料中のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の量であり得る。
【０２０２】
一般に、ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の数の測定は、対象由来のＴ細胞を含む試料を得ること、および試料中のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の存在または数を決定することを含む。一部の実施例では、試料は、生検試料、血液試料、または末梢血単核細胞の試料である。方法は、免疫組織化学的検査および／またはフローサイトメトリーを含む。
【０２０３】
方法は、対象由来の生体試料に対するものなどの免疫組織化学的方法を含み得る。試料は、腫瘍試料であり得る。一部の実施形態では、ＣＤ８、ＣＤ３９またはＣＤ１０３に結合する抗体などの抗体（または抗原結合性断片）を検出可能な標識で直接標識する。別の実施形態では、ＣＤ８、ＣＤ３９またはＣＤ１０３に結合する抗体（または抗原結合性断片）（第１の抗体）を標識せず、第１の抗体に結合する抗体に結合し得る第２の抗体または他の分子を利用する。当業者には周知である通り、特定の種およびクラスの第１の抗体に特異的に結合することができる第２の抗体を選択する。例えば、第１の抗体がヒトＩｇＧである場合、二次抗体は、抗ヒト−ＩｇＧであり得る。抗体に結合し得る他の分子としては、限定することなく、プロテインＡおよびプロテインＧが挙げられ、どちらも商業的に入手可能である。
【０２０４】
抗体または二次抗体に対する適切な標識は、上記されており、種々の酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、磁気作用剤および放射性材料が挙げられる。適切な酵素の非限定的な例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。適切な補欠分子族複合体の非限定的な例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられる。適切な蛍光材料の非限定的な例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｉｎｙｌａｍｉｎｅ）フルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられる。非限定的な例示的な発光材料はルミノールであり、非限定的な例示的な磁気作用剤はガドリニウムであり、非限定的な例示的な放射性標識としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０２０５】
フローサイトメトリーを使用して細胞を定量化することもできる。追加的な実施形態では、例えば、ＣＤ８  Ｔ細胞またはＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞を分離するために、試料を精製することができる。一部の実施形態では、方法は、ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の量を測定するステップを含む。一部の実施例では、生体試料中のＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の量を対照と比較する。適切な対照は上記されている。
【０２０６】
一部の実施例では、細胞懸濁液を腫瘍試料から作製する。１つの非限定的な例では、滅菌条件下で、腫瘍を小片にカットし、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、ＤＮａｓｅならびにヒト血清アルブミンを含むＲＰＭＩ−１６４０中で消化する。細胞を、例えば、室温で１時間、磁気撹拌子で撹拌しながら消化することができる。細胞懸濁液を、細胞フィルターを通して濾過する。腫瘍浸潤性リンパ球を、密度勾配溶液を用いて遠心分離によって富化することができる。
【０２０７】
Ｔ細胞を単離、検出、および／または定量化するための方法が当技術分野で公知であり、例示的なプロトコールが本明細書に提示される。Ｔ細胞の増殖を測定するための方法も当技術分野で公知である。これらの方法は、一般に、分子および／または生化学的技法の使用を伴い、単純な視覚的観察は伴わない。一部の実施例の細胞では、蛍光活性化細胞分析（ＦＡＣＳ）を利用する。ＦＡＣＳを使用して、細胞を適切に標識された抗体で染色することによってＴ細胞などの細胞を選別する（単離する）ことができる。一実施形態では、いくつかの抗体（例えば、ＣＤ８、ＣＤ３９およびＣＤ１０３に結合する抗体）およびＦＡＣＳ選別を使用して、実質的に精製されたＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を作製することができる。任意のＦＡＣＳ技法を使用することができる。例えば、米国特許第５，０６１，６２０号に開示されているＦＡＣＳの方法を参照されたい。
【０２０８】
しかし、有効性が異なる他の技法を使用して所望の細胞の集団を精製および単離することができる。使用される分離技法は、採取される細胞の画分の生存能力の保持を最大にするものであるべきである。使用される特定の技法は、当然、分離の効率、方法の細胞傷害性、分離の容易さおよびスピード、ならびにどのような機器および／または技術的技能が要求されるかに依存する。
【０２０９】
分離手順としては、抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用する磁気分離、モノクローナル抗体と結合させるかまたは補体と併せて使用する細胞傷害性剤、および固体マトリックスに結合させたモノクローナル抗体を利用する「パニング」、または別の慣習的な技法が挙げられる。磁気ビーズおよび、アガロースビーズ、ポリスチレンビーズ、中空繊維膜およびプラスチックペトリ皿などの他の固体マトリックスに結合させた抗体により、直接分離が可能になる。抗体が結合した細胞は、単に固体支持体を細胞懸濁液から物理的に分離することにより、細胞懸濁液から取り出すことができる。固相に連結した抗体と細胞とのインキュベーションの正確な条件および持続時間は、使用されるシステムに特異的ないくつかの因子に依存する。しかし、適切な条件の選択は、十分に当技術分野の技能の範囲内である。
【０２１０】
次いで、目的のマーカー（例えば、ＣＤ３９またはＣＤ１０３）を発現する細胞が固相に連結した抗体に結合するのに十分な時間後に、結合していない細胞を、生理的緩衝液を用いて溶出させるまたは洗い流すことができる。次いで、結合した細胞を、主に、使用される固相および抗体の性質に応じて、任意の適切な方法によって固相から分離する。
【０２１１】
抗体を、支持体に結合させたアビジンもしくはストレプトアビジンを用いてその後に取り出すことができるビオチン、または蛍光色素とコンジュゲートすることができ、当技術分野で公知の通り、ＦＡＣＳで使用して、細胞の分離を可能にする。
【０２１２】
例えば、ＣＤ８またはＣＤ３を発現する細胞を最初に、ＣＤ８またはＣＤ３の細胞表面発現によって他の細胞から分離する。次いで、単離されたＣＤ８＋細胞またはＣＤ３＋細胞の純度を、それが所望であれば、例えばＢＤ  ＬＳＲＦＯＲＴＥＳＳＡ（登録商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて確認する。一実施形態では、細胞の集団のＦＡＣＳ選別などのさらなる精製ステップを実施する。一実施例では、この選別を、ＣＤ３９、ＣＤ１０３、およびＣＤ８の発現を検出するために実施することができる。
【０２１３】
方法は、細胞増殖を測定するステップも含み得る。細胞増殖の評価などの細胞増殖を分析するための方法は当技術分野で公知である。例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて目的の細胞を蛍光色素で化学的標識することを含む膜色素希釈手法を利用することができる。トリチウム標識されたヌクレオシド類似体（一般に、３Ｈ−チミジンデオキシリボヌクレオシド、３Ｈ−ＴｄＲ）またはブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を用いた標識を利用することができる。ＢｒｄＵ組み入れを測定するためにＦＡＣＳ分析が利用可能である。ＤＮＡ含有量および細胞周期関連タンパク質などの増殖の代理マーカーを使用することもできる。
【０２１４】
一実施例では、Ｋｉ６７またはＰＣＮＡの測定を利用することができる。Ｋｉ６７抗原は、活動性細胞周期の全ての期（Ｇ１、Ｓ、Ｇ２およびＭ期）の増殖している細胞によって発現されるプロトタイプ細胞周期関連核タンパク質である。静止（Ｇ０）細胞には存在しない。Ｋｉ６７抗体は、増殖の確立において有用である。Ｋｉ６７抗体を使用して、増殖している細胞および静止細胞を定量することができる（Ｋｉ６７指数）。Ｋｉ６７は、細胞周期進行および増殖のマーカーとして常套的に使用される；Ｋｉ６７に対する抗体は、例えばＡＢＣＡＭ（登録商標）から市販されており、これらの抗体を免疫組織化学的およびＦＡＣＳ分析において使用するための方法が入手可能である。
【０２１５】
他の方法を使用して、サンプリングの時点で活動性細胞周期にある細胞を検出することができる。ＣＤ３９＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、例えば、ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞などのリンパ球の増殖を、細胞を含めた生体試料中のＤＮＡを標識するために安定な同位元素を利用する方法を使用することによって測定することもできる。ＤＮＡは新規の合成経路によって均一にかつ高度に標識される。使用される安定な同位元素標識、例えば、２Ｈ−グルコースまたは重水（２Ｈ２ＯまたはＨ２１８Ｏ）は動物およびヒトに対して無毒性であり、一般に、米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（ＦＤＡ）により安全であるとみなされている（米国特許出願公開第２００９／０１５５１７９号を参照されたい）。リンパ球ＤＮＡへの安定な同位元素標識の組み入れの測定は、以下のステップを含む：（ｉ）ＤＮＡの抽出またはさらなる単離を伴わないクロマチンからのＤＮＡの放出、ＤＮＡのデオキシリボヌクレオチドへの加水分解、（ｉｉ）プリンデオキシリボヌクレオチドからのデオキシリボースの選択的放出、（ｉｉｉ）プリンデオキシリボースの、ガスクロマトグラフィー／質量分析（ＧＣ／ＭＳ）による分析に適した揮発性誘導体（例えば、ペンタンテトラアセテート、ペンタフルオロベンジルテトラアセチル誘導体、または別の適切な誘導体）への誘導体化、（ｉｖ）前記誘導体のＧＣ／ＭＳ分析、（ｖ）前記誘導体の質量アイソトポマー存在量のパターンの分析、および（ｖｉ）前記パターンからの、安定な同位元素組み入れの尺度である過剰な富化値の算出。これらの方法のそれぞれの特定の実施形態が教示されている（米国特許第５，９１０，４０号を参照されたい）。
ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡアンタゴニストおよび４−１ＢＢアゴニスト
【０２１６】
ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニストおよび／またはＢＴＬＡアンタゴニストなどのチェックポイント阻害剤は、例えば、ＣＤ８＋ＣＤ３９＋ＣＤ１０３＋Ｔ細胞と組み合わせて、本明細書に開示される方法において有用である。４−１ＢＢアゴニストも本明細書に開示される方法において有用である。ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニスト、ＴＩＭ−３アンタゴニスト、ＢＴＬＡアンタゴニスト、および／または４−１ＢＢアゴニストは化学的または生物学的化合物であり得る。作用剤は、これだけに限定されないが、キメラ、ヒト化、またはヒト抗体を含めた抗体であり得る。適切なアンタゴニストおよびアゴニストは、これらの抗体の抗原結合性断片も含む（抗原結合性断片の説明については上記を参照されたい）。アンタゴニストは、例えば、阻害剤核酸分子または小分子、例えば、９００ダルトン未満または８００ダルトン未満の分子であり得る。
【０２１７】
ＰＤ−１アンタゴニストは、細胞上に発現されるＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２と免疫細胞（Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫＴ細胞）上に発現されるヒトＰＤ−１との結合を遮断する任意の化学化合物または生体分子であり得る。ＰＤ−１およびそのリガンドの代替名または同義語として、ＰＤ−１についてはＰＤＣＤ１、ＰＤ１、ＣＤ２７９およびＳＬＥＢ２；ＰＤ−Ｌ１についてはＰＤＣＤ１Ｌ１、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７Ｈ１、Ｂ７−４、ＣＤ２７４およびＢ７−Ｈ；ならびにＰＤ−Ｌ２についてはＰＤＣＤ１Ｌ２、ＰＤＬ２、Ｂ７−ＤＣ、ＢｔｄｃおよびＣＤ２７３が挙げられる。例示的なヒトＰＤ−１アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号：ＮＰ＿００５００９に見いだすことができる。例示的なヒトＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２アミノ酸配列は、参照により組み込まれるＮＣＢＩ受託番号：それぞれＮＰ＿０５４８６２およびＮＰ＿＿０７９５１５、２０１７年４月２８日に見いだすことができる。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＰＤ−１は、活性化Ｔ細胞、Ｂ細胞、および単球上に発現される。ヒトでは、ＰＤ−１は、活性化誘導性アポトーシスを受けるＴ細胞株において最初に同定された５０〜５５ｋＤａのＩ型膜貫通型受容体である。ＰＤ−１は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびマクロファージ上に発現される。ＰＤ−１のリガンドは、Ｂ７ファミリーメンバーであるＰＤ−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ１としても公知）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣとしても公知）である。ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２阻害剤を本明細書に開示される方法において使用することができる。
【０２１８】
実験データによりＰＤ−１とそのリガンドの相互作用が中心および末梢免疫応答の下方調節に関係づけられる。具体的には、ＰＤ−Ｌ１の存在下で、野生型Ｔ細胞の増殖は阻害されるが、ＰＤ−１欠損Ｔ細胞の増殖は阻害されない。（例えば、参照により本明細書に組み込まれるIshida  et  al.,  EMBO  J.  11:3887,  1992；Shinohara  et  al.  Genomics  23:704,1994；米国特許第５，６９８，５２０号を参照されたい）。
【０２１９】
追加的なＰＤ−１アミノ酸配列は、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，８０８，７１０号および米国特許出願公開第２００４／０１３７５７７号、同第２００３／０２３２３２３号、同第２００３／０１６６５３１号、同第２００３／００６４３８０号、同第２００３／００４４７６８号、同第２００３／００３９６５３号、同第２００２／０１６４６００号、同第２００２／０１６００００号、同第２００２／０１１０８３６号、同第２００２／０１０７３６３号、および同第２００２／０１０６７３０号に開示されている。
【０２２０】
ＰＤ−１は、ＰＤ−Ｌ１に結合するその能力に基づいて、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーの分子のメンバーである。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、ＣＴＬＡ−４と同様に、ＰＤ−１は抗ＣＤ３に応答してＴ細胞の表面上に急速に誘導される（Agata  et  al.  Int.  Immunol.  8:765,  1996）。Ｔ細胞疲弊は、ＰＤ−１発現の誘導と同時である。参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開第２００８／０８３１７４号を参照されたい。Ｔ細胞の細胞傷害性は、Ｔ細胞を、ＰＤ−１の発現または活性を低減する作用剤と接触させることによって増加させることができる。ＰＤ−１の発現または活性を低減する作用剤を使用して、腫瘍に対する免疫応答などの免疫応答を増加させることができる。理論に束縛されることなく、ＰＤ−１発現または活性の低減により、細胞傷害性Ｔ細胞活性の増加がもたらされ、特異的な免疫応答が増加する。
【０２２１】
ＰＤ−１ファミリーメンバーは、抗原提示細胞上のＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２などの１つまたは複数の受容体に結合する。ＰＤ−Ｌ１の例示的なアミノ酸配列は、２０００年１０月４日に利用可能なとおりの参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＧ１８５０８として提供される。例示的なＰＤ−Ｌ２前駆体アミノ酸配列は、２００２年４月８日に利用可能なとおりの参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＡＡＫ１５３７０として提供される。例示的なバリアントであるＰＤ−Ｌ２前駆体アミノ酸配列は、２００６年１２月１２日に利用可能なとおりの参照により本明細書に組み込まれるＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号Ｑ９ＢＱ５１として提供される。
【０２２２】
本明細書に開示される方法において有用なアンタゴニストは、ＰＤリガンド１（ＰＤ−Ｌ１）もしくはＰＤリガンド２（ＰＤ−Ｌ２）の発現もしくは活性を低減するまたはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用もしくはＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２の相互作用を低減する作用剤を含み、これらは、ＰＤ−アンタゴニストである。例示的な化合物としては、抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、および抗ＰＤ−Ｌ２抗体）、ＲＮＡｉ分子（例えば、抗ＰＤ−１  ＲＮＡｉ分子、抗ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡｉ、および抗ＰＤ−Ｌ２  ＲＮＡｉ）、アンチセンス分子（例えば、抗ＰＤ−１アンチセンスＲＮＡ、抗ＰＤ−Ｌ１アンチセンスＲＮＡ、および抗ＰＤ−Ｌ２アンチセンスＲＮＡ）、ドミナントネガティブタンパク質（例えば、ドミナントネガティブＰＤ−１タンパク質、ドミナントネガティブＰＤ−Ｌ１タンパク質、およびドミナントネガティブＰＤ−Ｌ２タンパク質）、ならびに小分子阻害剤が挙げられる。これらのＰＤ−１アンタゴニストのいずれも、本明細書に開示される方法において有用である。
【０２２３】
他の抗体も本明細書に開示される方法において有用である（例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、および抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ−３抗体または抗ＢＴＬＡ抗体）、ＲＮＡｉ分子（例えば、抗ＣＴＬＡ−４  ＲＮＡｉ分子、抗ＬＡＧ３  ＲＮＡｉ、抗ＴＩＭ−３  ＲＮＡｉおよび抗ＢＴＬＡ  ＲＮＡｉ）、アンチセンス分子（例えば、抗ＣＴＬＡ−４アンチセンスＲＮＡ、抗ＬＡＧ３アンチセンスＲＮＡ、抗ＴＩＭ−３アンチセンスＲＮＡおよび抗ＢＴＬＡアンチセンスＲＮＡ）。同じく有用なドミナントネガティブタンパク質は、ドミナントネガティブＣＴＬＡ−４タンパク質、ドミナントネガティブＬＡＧ３タンパク質、ドミナントネガティブＬＡＧ−３タンパク質およびドミナントネガティブＢＴＬＡタンパク質である。これらのアンタゴニストのいずれも、本明細書に開示される方法において有用である。さらに、４−１ＢＢに結合する抗体およびＲＮＡアプタマーなどの４−１ＢＢアゴニストが本明細書に開示される方法において有用である。ＴＧＦ−β受容体阻害タンパク質またはドミナントネガティブタンパク質も有用である。
【０２２４】
アンタゴニストは、細胞における標的の発現または活性を低減する能力を有する作用剤である。一部の実施形態では、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４またはＢＴＬＡ発現または活性が、対照におけるそのような発現または活性と比較して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％低減する。例示的な活性の低減は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または検出可能な活性が完全に存在しないことである。一実施例では、対照は、ＰＤ−１アンタゴニストで処理されていない細胞である。別の例では、対照は、標準値、または活性に影響を及ぼさないことが分かっている担体などの作用剤と接触させた細胞である。発現または活性は、当技術分野における任意の標準方法によって決定することができる。１つの非限定的な例では、ＰＤ−１アンタゴニストにより、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、またはその両方への結合が阻害されるまたは低減する。１つの非限定的な例では、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストにより、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１の結合が低減する。
【０２２５】
アゴニストは、細胞における標的の発現または活性を増加させる能力を有する作用剤である。一部の実施形態では、４−１ＢＢ発現または活性が対照におけるそのような発現または活性と比較して少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％増加する。例示的な活性の増加は、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または検出可能な活性が完全に存在しないことである。一実施例では、対照は、４−１ＢＢアゴニストで処理されていない細胞である。別の例では、対照は、標準値、または活性に影響を及ぼさないことが分かっている担体などの作用剤と接触させた細胞である。発現または活性は、当技術分野における任意の標準方法によって決定することができる。１つの非限定的な例では、４−１ＢＢアゴニストにより、結合が刺激されるまたは増加する。
Ａ．抗体
【０２２６】
一部の実施形態では、アンタゴニストは、抗体である。ＰＤ−１に結合する抗体の例示的なアミノ酸配列は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０２１０５６７号において開示されている。ＰＤ−１に結合する抗体は、同じく参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／００３４８２６号にも開示されている。ＰＤ−１に結合する抗体は、米国特許第７，４８８，８０２号、米国特許第７，５２１，０５１号、米国特許第８，００８，４４９号、米国特許第８，３５４，５０９号、米国特許第８，１６８，７５７号、およびＰＣＴ公開ＷＯ２００４／００４７７１号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０７２２８６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０５６８７５号、および米国特許出願公開第２０１１／０２７１３５８号にも開示されている。抗体は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）（ペムブロリズマブ）であってよい。抗体は、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８）またはＯｎｏ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓからのＯＰＤＩＶＯ（登録商標）などの抗ＰＤ−１抗体であってよい。ＰＤ−Ｌ１結合性アンタゴニストとしては、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＤＸ−１１０５およびＭＥＤＩ  ４７３６が挙げられる。米国特許出願公開第２０１７／００４４２５６号を参照されたい。ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するものであり、本開示の方法および組成物において有用であるモノクローナル抗体の例は、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１３／０１９９０６号、ＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／０７７６３４号Ａ１および米国特許第８，３８３，７９６号に開示されている。ＰＤ−１に対するチェックポイント阻害剤抗体（例えば、ニボルマブ、ピジリズマブ、およびペムブロリズマブ）またはＰＤ−Ｌ１に対するチェックポイント阻害剤抗体（例えば、デュルバルマブ、アテゾリズマブ、およびアベルマブ）は、本明細書に開示される方法のいずれにおいても有用である。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−１に結合する抗体は、特許第８，５５２，１５４号にも開示されている。いくつかの実施例では、抗体は、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２に少なくとも１０７Ｍ−１、例えば、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１または少なくとも１０９Ｍ−１などの親和定数で特異的に結合する。これらの抗体および抗原結合性断片はいずれも本明細書に開示される方法において有用である。
【０２２７】
ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する例示的な抗体は、ＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０１４４２４号、ＰＣＴ公開ＷＯ２００４／０３５６０７号、米国特許出願公開第２００５／０２０１９９４号、欧州特許第ＥＰ１１４１０２８号、および欧州特許第ＥＰ１２１２４２２Ｂ１号に開示されている。追加的なＣＴＬＡ−４抗体は、米国特許第５，８１１，０９７号、米国特許第５，８５５，８８７号、米国特許第６，０５１，２２７号、米国特許第６，９８４，７２０号、米国特許第６，６８２，７３６号、米国特許第６，２０７，１５６号、米国特許第５，９７７，３１８号、米国特許第６，６８２，７３６号、米国特許第７，１０９，００３号、米国特許第７，１３２，２８１号、米国特許第７，４５２，５３５号、および米国特許第７，６０５，２３８号；ＰＣＴ公開ＷＯ０１／１４４２４号、ＰＣＴ公開ＷＯ００／３７５０４号、ＰＣＴ公開ＷＯ９８／４２７５２号、米国特許出願公開第２０００／０３７５０４号、米国特許出願公開第２００２／００３９５８１号、および米国特許出願公開第２００２／０８６０１４号に開示されている。ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体は、Hurwitz  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA,  95(17):10067-10071  (1998)；Camacho  et  al.,  J.  Clin.  Oncol.,  22(145):  Abstract  No.  2505  (2004)  (antibody  CP-675206)；Mokyr  et  al.,  Cancer  Res.,  58:5301-5304  (1998)にも開示されている。一部の実施形態では、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、イピリムマブ（Ipilmumab）（ＭＤＸ−０１０およびＭＤＸ−１０１およびＹＥＲＶＯＹ（登録商標）としても公知）であり、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２００１／０１４４２４号を参照されたい。これらの抗体および抗原結合性断片は、本明細書に開示される方法において有用である。
【０２２８】
さらなる実施形態では、ＢＴＬＡアンタゴニストを本明細書に開示される方法において利用する。ＢＴＬＡに特異的に結合する抗体は、例えば、全て参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１６／０２２２１１４号、米国特許出願公開第２０１５／０１４７３４４号、および米国特許出願公開第２０１２／０２８８５００号において開示されている。ＢＴＬＡ活性をモジュレートする生物学的作用物質（biological  agent）、特にヘルペスウイルス侵入メディエーター（ＨＶＥＭ）シス複合体を使用するものが、どちらも参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１４／０２２００５１号および米国特許出願公開第２０１０／０１０４５５９号に開示されている。さらに他の実施形態では、抗体は、ＴＳＲ−０２２などのＴＩＭ−３に特異的に結合する。さらなる実施形態では、抗体は、ＢＭＳ−９８６０１６、ＧＳＫ２８３１７８１、または、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２０１５０４２２４６号Ａ１に開示されている抗体などの、ＬＡＧ３に特異的に結合する。インターネットでｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖにおいて利用可能であり、参照により本明細書に組み込まれる"Safety  Study  of  Anti-LAG-3  With  and  Without  Anti-PD-1  in  the  Treatment  of  Solid  Tumors"に関して治験番号ＮＣＴ０１９６８１０９も参照されたい。これらの抗体および抗原結合性断片は、本明細書に開示される方法において有用である。
【０２２９】
４−１ＢＢアゴニスト抗体も有用である。適切な抗体は、例えば、どちらも参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，３３７，８５０号およびＰＣＴ公開ＷＯ２０１５１７９２３６号Ａ１において開示されている。開示されている方法のいずれかにおいて有用な抗体として、ウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）およびＰＦ−  ０５０８２５６６（Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。
【０２３０】
開示されている方法において有用な抗体は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、脱免疫抗体（例えば、ヒト−抗マウス応答を低減するため）、キメラ抗体、および免疫グロブリン（Ｉｇ）融合タンパク質を含む。これらの抗体の抗原結合性断片も本明細書に開示される方法において有用である。ポリクローナル抗体は、適切な対象（例えば、獣医学的対象）を免疫原で免疫することによってなどで当業者が調製することができる。免疫された対象における抗体価を、固定した抗原を使用した酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を用いてなど、標準の技法によって経時的にモニタリングすることができる。一実施例では、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２（またはこれらの組合せ）に特異的に結合する抗体を哺乳動物（例えば、血清から）から単離し、当業者に公知の技法によってさらに精製することができる。例えば、抗体を、プロテインＡクロマトグラフィーを使用して精製して、ＩｇＧ抗体を単離することができる。
【０２３１】
抗体産生細胞を対象から得、標準の技法によってモノクローナル抗体を調製するために使用することができる（Kohler  and  Milstein  Nature  256:495  49,  1995；Brown  et  al.,  J.  Immunol.  127:539  46,  1981；Cole  et  al.,  Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy,  Alan  R.  Liss,  Inc.,  pp.  77  96,  1985；Gefter,  M.  L.  et  al.  (1977)  Somatic  Cell  Genet.  3:231  36；Kenneth,  R.  H.  in  Monoclonal  Antibodies:  A  New  Dimension  In  Biological  Analyses.  Plenum  Publishing  Corp.,  New  York,  N.Y.  (1980)；Kozbor  et  al.  Immunol.  Today  4:72,  1983；Lerner,  E.  A.  (1981)  Yale  J.  Biol.  Med.  54:387  402；Yeh  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  76:2927  31,  1976）。一実施例では、不死細胞株（一般には骨髄腫）とＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡまたはＣＴＬＡ−４を用いて免疫した哺乳動物由来のリンパ球（一般には脾細胞）とを融合し、得られたハイブリドーマ細胞の培養上清をスクリーニングして、目的のポリペプチドに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定する。
【０２３２】
一実施形態では、ハイブリドーマを作製するために、不死細胞株（例えば、骨髄腫細胞株）をリンパ球と同じ哺乳動物種から得る。例えば、マウスハイブリドーマを、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または４−１ＢＢペプチドを用いて免疫したマウス由来のリンパ球を不死化マウス細胞株と融合することによって作製することができる。一実施例では、ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含有する培養培地（「ＨＡＴ培地」）に対して感受性であるマウス骨髄腫細胞株を利用する。例えば、Ｐ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４骨髄腫株を含めたいくつもの骨髄腫細胞株のいずれかを標準の技法に従って融合パートナーとして使用することができ、これらは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍｄから入手可能である。ＨＡＴ感受性マウス骨髄腫細胞とマウス脾細胞を、ポリエチレングリコール（「ＰＥＧ」）を使用して融合することができる。次いで、融合の結果生じたハイブリドーマ細胞を、融合していない（および無効に融合した）骨髄腫細胞を死滅させるＨＡＴ培地を使用して選択する。目的のモノクローナル抗体を産生させるハイブリドーマ細胞を、例えば、免疫学的アッセイ（例えば、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））を使用することによってハイブリドーマ培養上清をＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ２または４−１ＢＢ分子に結合する抗体の産生についてスクリーニングすることによって検出することができる。
【０２３３】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製することの代替として、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）を、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２または４−１ＢＢを用いてスクリーニングして、ポリペプチドに特異的に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することにより、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２または４−１ＢＢに特異的に結合するモノクローナル抗体を同定し、単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを生成し、スクリーニングするためのキットが市販されている（例えば、これだけに限定されないが、ＰｈａｒｍａｃｉａおよびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ）。抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングの使用に特に適している方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０２８０９号；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／１７２７１号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１８６１９号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／２０７９１号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／１５６７９号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０１０４７号；ＰＣＴ公開ＷＯ９３／０１２８８号；ＰＣＴ公開ＷＯ９２／０９６９０号；Barbas  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  88:7978  7982,  1991；Hoogenboom  et  al.,  Nucleic  Acids  Res.  19:4133  4137,  1991に見いだすことができる。
【０２３４】
一実施例では、各ＣＤＲの特異性決定領域の配列を決定する。ＳＤＲ（非リガンド接触部位）の外側の残基を置換する。例えば、上記の表中のＣＤＲ配列のいずれかにおいて、多くて１アミノ酸、２アミノ酸または３アミノ酸を置換することができる。１つの抗体由来のフレームワーク領域および異なる抗体由来のＣＤＲを含むキメラ抗体の産生は当技術分野において周知である。例えば、ヒト化抗体を常套的に産生することができる。抗体または抗体断片は、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または４−１ＢＢに結合するドナーモノクローナル抗体由来の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒトアクセプター免疫グロブリン重鎖および軽鎖フレームワーク由来の免疫グロブリン重鎖および軽鎖可変領域フレームワークとを有するヒト化免疫グロブリンであってよい。ヒト化モノクローナル抗体は、ドナーマウス免疫グロブリン（ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２または４−１ＢＢ特異的抗体など）の可変重鎖および可変軽鎖由来のドナー相補性決定領域（ＣＤＲ）をヒト可変ドメインに移入し、次いで、親和性を保持するために必要であればフレームワーク領域内のヒト残基を置換することによって産生させることができる。ヒト化モノクローナル抗体に由来する抗体成分を使用することにより、ドナー抗体の定常領域の免疫原性に関連する潜在的な問題が未然に防がれる。ヒト化モノクローナル抗体を産生させるための技法は、例えば、Jones  et  al.,  Nature  321:522,  1986；Riechmann  et  al.,  Nature  332:323,  1988；Verhoeyen  et  al.,  Science  239:1534,  1988；Carter  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  89:4285,  1992；Sandhu,  Crit.  Rev.  Biotech.12:437,  1992；およびSinger  et  al.,  J.  Immunol.150:2844,  1993によって記載されている。抗体は、任意のアイソタイプのものであってよいが、いくつかの実施形態では、抗体は、これだけに限定されないが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含めたＩｇＧである。一部の実施形態では、ヒト化免疫グロブリンは、目的の抗原（例えば、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または４−１ＢＢ）に、少なくとも１０７Ｍ−１、例えば、少なくとも１０８Ｍ−１、少なくとも５×１０８Ｍ−１または少なくとも１０９Ｍ−１の親和定数で特異的に結合する。
【０２３５】
一実施形態では、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークの配列は、ドナー免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークの配列と少なくとも約６５％同一であり得る。したがって、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークの配列は、ドナー免疫グロブリン重鎖可変領域フレームワークの配列と少なくとも約７５％、少なくとも約８５％、少なくとも約９９％または少なくとも約９５％同一であり得る。ヒトフレームワーク領域、およびヒト化抗体フレームワーク領域においてなされ得る変異は当技術分野で公知である（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，５８５，０８９号を参照されたい）。
【０２３６】
マウスモノクローナル抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体などの抗体は、全長分子、ならびに、重鎖および軽鎖可変領域を含み、特異的なエピトープ決定基に結合することができる、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖなどのその断片を含む。これらの抗体断片は、それらの抗原または受容体に選択的に結合するいくらかの能力を保持する。これらの断片としては、
（１）Ｆａｂ、抗体分子の一価抗原結合性断片を含有する断片であり、抗体全体を酵素パパインで消化して、インタクトな軽鎖および１つの重鎖の一部をもたらすことによって作製することができる；
（２）Ｆａｂ’、抗体全体をペプシンで処理し、その後、還元してインタクトな軽鎖および重鎖の一部をもたらすことによって得ることができる抗体分子の断片；抗体分子当たり２つのＦａｂ’断片が得られる；
（３）（Ｆａｂ’）２、抗体全体を酵素ペプシンで処理し、その後の還元を行わないことによって得ることができる抗体の断片；Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって保持される２つのＦａｂ’断片の二量体である；
（４）Ｆｖ、２本の鎖として発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された断片；ならびに
（５）単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、遺伝的に融合した単鎖分子として、適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作された分子と定義される
が挙げられる。
【０２３７】
これらの抗原結合性断片を作製する方法は、当技術分野で公知である（例えば、Harlow  and  Lane,  Antibodies:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  New  York,  1988を参照されたい）。いくつかの実施例では、可変領域は、個々のポリペプチドとして発現される軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含む。Ｆｖ抗体は、一般には、約２５ｋＤａであり、各重鎖および各軽鎖当たり３つのＣＤＲを有する完全な抗原結合性部位を含有する。これらの抗体を作製するために、ＶＨおよびＶＬを宿主細胞において２つの個々の核酸構築物から発現させることができる。ＶＨとＶＬが隣接せずに発現される場合、Ｆｖ抗体の鎖は、一般には、非共有結合性の相互作用によって保持される。しかし、これらの鎖は、希釈されると解離する傾向があり、したがって、鎖をグルタルアルデヒド、分子間ジスルフィド、またはペプチドリンカーによって架橋結合させるための方法が開発されている。したがって、一実施例では、Ｆｖは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域がジスルフィド結合によって化学的に連結したジスルフィド安定化Ｆｖ（ｄｓＦｖ）であり得る。
【０２３８】
追加的な実施例では、Ｆｖ断片は、ペプチドリンカーによって接続されたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖抗原結合性タンパク質（ｓｃＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによって接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、それをその後、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は、２つのＶドメインを架橋結合させるリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓｃＦｖを作製するための方法は当技術分野で公知である（Whitlow  et  al.,  Methods:  a  Companion  to  Methods  in  Enzymology,  Vol.  2,  page  97,  1991；Bird  et  al.,  Science  242:423,  1988；米国特許第４，９４６，７７８号；Pack  et  al.,  Bio/Technology  11:1271,  1993；およびSandhu,  上掲を参照されたい）。
【０２３９】
抗体断片を、抗体のタンパク質分解性加水分解によって、または断片をコードするＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させることによって調製することができる。抗体断片を、抗体全体を従来の方法によってペプシンまたはパパイン消化することにより得ることができる。例えば、抗体断片を、抗体をペプシンで酵素的切断して、Ｆ（ａｂ’）２で表される５Ｓ断片をもたらすことによって作製することができる。この断片を、チオール還元剤、および必要に応じてジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基のブロック基を用いてさらに切断して、３．５Ｓ  Ｆａｂ’一価断片を作製することができる。あるいは、ペプシンを使用した酵素的切断により、一価Ｆａｂ’断片２つとＦｃ断片が直接生じる（米国特許第４，０３６，９４５号および米国特許第４，３３１，６４７号、およびその中に含有される参考文献；Nisonhoff  et  al.,  Arch.  Biochem.  Biophys.  89:230,  1960；Porter,  Biochem.  J.  73:119,  1959；Edelman  et  al.,  Methods  in  Enzymology,  Vol.  1,  page  422,  Academic  Press,  1967；およびColigan  et  al.  at  sections  2.8.1-2.8.10  and  2.10.1-2.10.4を参照されたい）。
【０２４０】
重鎖を分離して一価の軽鎖−重鎖断片を形成すること、断片をさらに切断すること、または他の酵素的、化学的、もしくは遺伝学的技法などの、抗体を切断する他の方法も、断片がインタクトな抗体によって認識される抗原に結合する限りは使用することができる。
【０２４１】
抗体の保存的バリアントを作製することができることが当業者には理解されよう。ｄｓＦｖ断片またはｓｃＦｖ断片におけるなどの抗体断片に使用されるそのような保存的バリアントは、ＶＨ領域とＶＬ領域の間の正しいフォールディングおよび安定化に必要なアミノ酸残基を保持し、また、分子の低ｐＩおよび低毒性を保存するために残基の電荷特性を保持する。ＶＨ領域およびＶＬ領域にアミノ酸置換（例えば、多くて１アミノ酸、多くて２アミノ酸、多くて３アミノ酸、多くて４アミノ酸、または多くて５アミノ酸の置換）を作製して、収量を増加させることができる。したがって、当業者は、目的の抗体のアミノ酸配列を容易に見直し、アミノ酸の１つまたは複数を上記の簡単な表でつきとめ、保存的置換を同定し、周知の分子技法を使用して保存的バリアントを作製することができる。
【０２４２】
治療用部分、診断用部分、または検出用部分などのエフェクター分子を、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または４−１ＢＢに特異的に結合する抗体を、当業者に公知の任意の数の手段を使用して連結することができる。共有結合性の付着による手段および非共有結合性の付着による手段のどちらも使用することができる。抗体にエフェクター分子を結合させるための手順は、エフェクターの化学構造に応じて変動する。ポリペプチドは、一般には、エフェクター分子の結合をもたらすための抗体上の適切な官能基との反応に利用可能である種々の官能基；例えば、カルボン酸（ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ２）またはスルフヒドリル（−ＳＨ）基を含有する。あるいは、抗体を誘導体化して、追加的な反応性官能基を露出または結合させる。誘導体化は、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから入手可能なものなどのいくつものリンカー分子のいずれかの結合を伴い得る。リンカーは、抗体とエフェクター分子を結合するために使用される任意の分子であってよい。リンカーは、抗体とエフェクター分子の両方に共有結合を形成することができる。適切なリンカーは当業者には周知であり、それらとしては、これだけに限定されないが、直鎖または分枝鎖炭素リンカー、複素環式炭素リンカー、またはペプチドリンカーが挙げられる。抗体およびエフェクター分子がポリペプチドである場合、リンカーを構成成分のアミノ酸にそれらの側鎖を通じて（例えば、システインにジスルフィド連結を通じて）または末端アミノ酸のアルファ炭素アミノおよびカルボキシル基に結合することができる。
【０２４３】
抗体をコードする核酸配列を、例えば、適切な配列のクローニング、または、Narang  et  al.,  Meth.  Enzymol.  68:90-99,  1979のホスホトリエステル法；Brown  et  al.,  Meth.  Enzymol.  68:109-151,  1979のホスホジエステル法；Beaucage  et  al.,  Tetra.  Lett.  22:1859-1862,  1981のジエチルホスホロアミダイト法；例えば、例えばNeedham-VanDevanter  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.  12:6159-6168,  1984に記載されている自動合成機を使用する、Beaucage  &  Caruthers,  Tetra.  Letts.  22(20):1859-1862,  1981によって記載されている固相ホスホロアミダイトトリエステル法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体法などの方法による直接化学合成によるものを含めた任意の適切な方法によって調製することができる。化学合成により、一本鎖オリゴヌクレオチドが生じる。これを、相補配列とのハイブリダイゼーションによって、または一本鎖を鋳型として使用したＤＮＡポリメラーゼを用いた重合によって二本鎖ＤＮＡに変換することができる。ＤＮＡの化学合成は一般に約１００塩基の配列に限定されるが、短い配列をライゲーションすることによってより長い配列を得ることができることが当業者には理解されよう。
【０２４４】
ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または４−１ＢＢに特異的に結合する抗体をコードする例示的な核酸コード配列をクローニング技法によって調製することができる。適切なクローニングおよび配列決定技法の例、および当業者を多くのクローニング訓練に導く十分な指示はSambrook  et  al.,  上掲、Berger  and  Kimmel  (eds.),  上掲、およびAusubel,  上掲において見いだされる。生物学的試薬および実験機器の製造者による製品情報によっても有用な情報がもたらされる。そのような製造者としては、ＳＩＧＭＡ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、ＣＬＯＮＴＥＣＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）、Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐ．、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．、ＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｃａ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｋａ  Ａｎａｌｙｔｉｋａ（Ｆｌｕｋａ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＡＧ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）、およびＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、ならびに当業者に公知の多くの他の商業的供給源が挙げられる。
【０２４５】
核酸は、増幅法によって調製することもできる。増幅法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写に基づく増幅系（ＴＡＳ）、自家持続配列複製系（３ＳＲ）が挙げられる。多種多様なクローニング方法、宿主細胞、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅法体系は当業者には周知である。
【０２４６】
一実施例では、有用な抗体は、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または４−１ＢＢに特異的に結合する抗体由来の可変領域をコードするｃＤＮＡを、エフェクター分子（ＥＭ）をコードするｃＤＮＡを含むベクターに挿入することによって調製される。挿入は、可変領域とＥＭがインフレームで読み取られるようになされ、したがって、１つの連続的なポリペプチドが作製される。したがって、コードされるポリペプチドは、機能的なＦｖ領域および機能的なＥＭ領域を含有する。一実施形態では、検出可能なマーカー（例えば、酵素）をコードするｃＤＮＡをｓｃＦｖに、マーカーがｓｃＦｖのカルボキシル末端に位置するようにライゲーションする。別の例では、検出可能なマーカーはｓｃＦｖのアミノ末端に位置する。別の実施例では、検出可能なマーカーをコードするｃＤＮＡを、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または４−１ＢＢに特異的に結合する抗体の重鎖可変領域に、マーカーが重鎖可変領域のカルボキシル末端に位置するようにライゲーションする。その後、重鎖−可変領域をＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または４−１ＢＢに特異的に結合する抗体の軽鎖可変領域にジスルフィド結合を使用してライゲーションすることができる。さらに別の実施例では、マーカーをコードするｃＤＮＡを、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または４−１ＢＢに結合する抗体の軽鎖可変領域に、マーカーが軽鎖可変領域のカルボキシル末端に位置するようにライゲーションする。その後、軽鎖−可変領域をＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または４−１ＢＢに特異的に結合する抗体の重鎖可変領域にジスルフィド結合を使用してライゲーションすることができる。
【０２４７】
抗体またはその機能性断片をコードする核酸を単離し、クローニングしたら、タンパク質を細菌、植物、酵母、昆虫および哺乳動物細胞などの組換え操作された細胞において発現させることができる。適切な宿主細胞にＤＮＡを移入することにより、抗体またはその機能性断片をコードする１つまたは複数のＤＮＡ配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて発現させることができる。細胞は、原核細胞であっても真核細胞であってもよい。この用語は、主題の宿主細胞の任意の後代も含む。複製中に変異が生じ得るので、全ての後代が親細胞と同一でない可能性があることが理解される。安定な移入、つまり、外来ＤＮＡを宿主において継続的に維持する方法は、当技術分野で公知である。
【０２４８】
抗体またはその機能性断片をコードするポリヌクレオチド配列を発現制御配列に作動的に連結することができる。コード配列に作動的に連結した発現制御配列を、発現制御配列と適合する条件下でコード配列の発現が実現されるようにライゲーションする。発現制御配列としては、これだけに限定されないが、適切なプロモーター、エンハンサー、転写ターミネーター、タンパク質をコードする遺伝子の前の開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、ｍＲＮＡの適切な翻訳を可能にするためのその遺伝子の正しい読み枠の維持、および終止コドンが挙げられる。
【０２４９】
抗体またはその機能性断片をコードするポリヌクレオチド配列を、これだけに限定されないが、配列の挿入または組み入れが可能になるように操作することができ、原核生物または真核生物のいずれかにおいて発現させることができるプラスミド、ウイルスまたは他のビヒクルを含めた発現ベクターに挿入することができる。宿主としては、微生物、酵母、昆虫および哺乳動物生物体を挙げることができる。真核生物の配列またはウイルスの配列を有するＤＮＡ配列を原核生物において発現させる方法は当技術分野で周知である。宿主において発現および複製することができる生物学的に機能的なウイルスおよびプラスミドＤＮＡベクターは、当技術分野で公知である。
【０２５０】
組換えＤＮＡを用いた宿主細胞の形質転換は、当業者に周知の従来の技法によって行うことができる。宿主がＥ．ｃｏｌｉなどの原核生物である場合、ＤＮＡを取り込むことができるコンピテント細胞を、指数関数成長期後に収集し、その後、当技術分野で周知の手順を使用してＣａＣｌ２法によって処理した細胞から調製することができる。あるいは、ＭｇＣｌ２またはＲｂＣｌを使用することができる。所望であれば宿主細胞のプロトプラストの形成後に、またはエレクトロポレーションにより、形質転換を実施することもできる。
【０２５１】
宿主が真核生物である場合、リン酸カルシウム共沈、微量注射、エレクトロポレーションなどの従来の機械的な手順、リポソームに包まれたプラスミドの挿入、またはウイルスベクターなどのＤＮＡのトランスフェクションの方法を使用することができる。真核細胞を抗体またはその機能性断片（antibody  of  functional  fragment  thereof）をコードするポリヌクレオチド配列および単純ヘルペスチミジンキナーゼ遺伝子などの選択可能な表現型をコードする第２の外来ＤＮＡ分子で共形質転換することもできる。別の方法は、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）またはウシパピローマウイルスなどの真核生物ウイルスベクターを使用して、真核細胞を一過性に感染させるまたは形質転換し、タンパク質を発現させることである（例えば、Eukaryotic  Viral  Vectors,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  Gluzman  ed.,  1982を参照されたい）。当業者は、有用なプラスミドおよびベクターなどの発現系をＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよび骨髄腫細胞株などの高等真核細胞を含めた細胞におけるタンパク質の産生に容易に使用することができる。
【０２５２】
組換えによって発現させたポリペプチドの単離および精製を分取クロマトグラフィーおよび免疫学的分離を含めた従来の手段によって行うことができる。組換え抗体を発現させたら、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティーカラム、カラムクロマトグラフィーなどを含めた当技術分野の標準の手順に従って精製することができる（一般に、R.  Scopes,  Protein  Purification,  Springer-Verlag,  N.Y.,  1982を参照されたい）。少なくとも約９０〜９５％均質性である実質的に純粋な組成物が本明細書に開示され、９８〜９９％またはそれよりも大きな均質性を有する組成物を製薬目的で使用することができる。治療的に使用する場合、部分的にまたは所望の均質性まで精製されたら、ポリペプチドは内毒素を実質的に含まないはずである。
【０２５３】
Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌由来の単鎖抗体を含めた単鎖抗体を発現させ、かつ／または適切な活性形態までリフォールディングさせるための方法が記載されており、周知であり、本明細書に開示される抗体に適用可能である。全て参照により本明細書に組み込まれるBuchner  et  al.,  Anal.  Biochem.  205:263-270,  1992；Pluckthun,  Biotechnology  9:545,  1991；Huse  et  al.,  Science  246:1275,  1989およびWard  et  al.,  Nature  341:544,  1989を参照されたい。
【０２５４】
多くの場合、Ｅ．ｃｏｌｉまたは他の細菌由来の機能的な異種タンパク質は封入体から単離され、強力な変性剤を使用した可溶化、およびその後のリフォールディングが必要である。可溶化ステップの間には、当技術分野で周知の通り、ジスルフィド結合を分離するために還元剤が存在しなければならない。還元剤を伴う例示的な緩衝液は、０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８、６Ｍのグアニジン、２ｍＭのＥＤＴＡ、０．３ＭのＤＴＥ（ジチオエリトリトール）である。ジスルフィド結合の再酸化は、参照により本明細書に組み込まれるSaxena  et  al.,  Biochemistry  9:  5015-5021,  1970に記載されている通り、特に、Buchner  et  al.,  上掲に記載されている通り、還元型および酸化型の低分子量チオール試薬の存在下で行うことができる。
【０２５５】
再生は、一般には、変性し、還元されたタンパク質をリフォールディング緩衝液中に希釈（例えば、１００倍）することによって実現される。例示的な緩衝液は、０．１ＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０、０．５ＭのＬ−アルギニン、８ｍＭの酸化型グルタチオン（ＧＳＳＧ）、および２ｍＭのＥＤＴＡである。
【０２５６】
２鎖抗体精製プロトコールに対する改変として、重鎖および軽鎖領域を別々に可溶化し、還元し、次いで、リフォールディング溶液中で組み合わせる。例示的な収量は、これらの２つのタンパク質を、一方のタンパク質の他方のタンパク質に対するモル過剰が５倍を超えないようなモル比で混合した場合に得られる。酸化還元−シャッフリングが完了した後、過剰な酸化型グルタチオンまたは他の酸化性低分子量化合物をリフォールディング溶液に添加することが望ましい。
【０２５７】
組換え方法に加えて、本明細書に開示される抗体およびその機能性断片も、標準のペプチド合成を使用して全体的にまたは部分的に構築することができる。約５０アミノ酸未満の長さのポリペプチドの固相合成は、配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に結合させ、その後、配列内の残りのアミノ酸を逐次的に付加することによって実現することができる。固相合成のための技法は、Barany  &  Merrifield,  The  Peptides:  Analysis,  Synthesis,  Biology.  Vol.  2:  Special  Methods  in  Peptide  Synthesis,  Part  A.  pp.  3-284；Merrifield  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Soc.  85:2149-2156,  1963、およびStewart  et  al.,  Solid  Phase  Peptide  Synthesis,  2nd  ed.,  Pierce  Chem.  Co.,  Rockford,  Ill.,  1984に記載されている。短い断片のアミノ末端およびカルボキシル末端の縮合によってより長いタンパク質を合成することもできる。カルボキシル末端の活性化によって（例えば、カップリング試薬Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（N,  N'-dicycylohexylcarbodimide）を使用することによって）ペプチド結合を形成する方法は当技術分野で周知である。
Ｂ．阻害核酸
【０２５８】
ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の発現および／または活性を低減する阻害核酸を本明細書に開示される方法において使用することもできる。一実施形態は、標的遺伝子の発現に干渉するまたはそれを阻害するための低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２をコードする核酸配列は、全て参照により組み込まれる２０１７年４月２８日に入手可能な、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）受託番号ＮＭ＿００５０１８、ＡＦ３４４４２４、ＮＰ＿０７９５１５、およびＮＰ＿０５４８６２に開示されている。
【０２５９】
一般に、ｓｉＲＮＡは、比較的長い二本鎖ＲＮＡ分子のダイサーまたはＤＣＬ酵素による切断によって生成される（Zamore,  Science,  296:1265-1269,  2002；Bernstein  et  al.,  Nature,  409:363-366,  2001）。動物および植物では、ｓｉＲＮＡはＲＩＳＣ中にアセンブリされ、ＲＩＳＣの配列特異的リボ核酸分解活性（ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）をガイドし、それにより、細胞質におけるｍＲＮＡまたは他のＲＮＡ標的分子の切断がもたらされる。核において、ｓｉＲＮＡによりヘテロクロマチン関連ヒストンおよびＤＮＡメチル化もガイドされ、それにより、個々の遺伝子または大きなクロマチンドメインの転写サイレンシングがもたらされる。ＰＤ−１  ｓｉＲＮＡは、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃなどから市販されている。
【０２６０】
本開示は、標的遺伝子の発現の干渉または阻害に適したＲＮＡであって、各鎖上に０〜５ヌクレオチドの３’および／または５’突出部を含有する約１５〜約４０ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡを含むＲＮＡを提供する。ＲＮＡの配列は、発現の干渉または阻害が望まれるＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２などの標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物の一部と実質的に同一である。本開示の目的に関して、発現の干渉または阻害が望まれる標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物の特定の一部と「実質的に同一の」ＲＮＡの配列は約３０パーセント以下が異なり、一部の実施形態では、標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物の特定の一部と約１０パーセント以下が異なる。特定の実施形態では、ＲＮＡの配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡまたは転写物の特定の一部と正確に同一である。
【０２６１】
したがって、本明細書に開示されるｓｉＲＮＡは、約１５〜約４０ヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡおよび各鎖上の０〜５ヌクレオチドの長さを有する３’または５’突出部を含み、ここで、二本鎖ＲＮＡの配列は、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２をコードする核酸のｍＲＮＡまたは転写物の一部と実質的に同一である（上記を参照されたい）。特定の実施例では、二本鎖ＲＮＡは、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２をコードする核酸と実質的に同一である約１９〜約２５ヌクレオチド、例えば、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、または２２ヌクレオチドを含有する。さらなる実施例では、二本鎖ＲＮＡは、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２をコードする核酸と１００％同一である約１９〜約２５ヌクレオチドを含有する。この文脈において、「約」は、整数量だけを指すものではないはずである。一実施例では、「約」２０ヌクレオチドは、１９〜２１ヌクレオチドの長さのヌクレオチドを指す。
【０２６２】
二本鎖ＲＮＡ上の突出部に関しては、１つの突出部の長さは他の鎖の突出部の長さに依存しないので、突出部の長さは２つの鎖間で独立している。特定の実施例では、３’または５’突出部の長さは、少なくとも１つの鎖において０ヌクレオチドであり、一部の場合では、両方の鎖において０ヌクレオチドである（したがって、平滑ｄｓＲＮＡ）。他の例では、３’または５’突出部の長さは、少なくとも一方の鎖において１ヌクレオチド〜５ヌクレオチドである。より詳細には、一部の実施例では、３’または５’突出部の長さは、少なくとも一方の鎖において２ヌクレオチドである、または両方の鎖において２ヌクレオチドである。特定の実施例では、ｄｓＲＮＡ分子は、両方の鎖において２ヌクレオチドの３’突出部を有する。
【０２６３】
したがって、１つの特定の提供されるＲＮＡ実施形態では、二本鎖ＲＮＡは、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、または２２ヌクレオチドを含有し、３’突出部の長さは、両方の鎖において２ヌクレオチドである。本明細書に提示されるＲＮＡの実施形態では、二本鎖ＲＮＡは、約４０〜６０％アデニン＋ウラシル（ＡＵ）および約６０〜４０％グアニン＋シトシン（ＧＣ）を含有する。より詳細には、特定の実施例では、二本鎖ＲＮＡは、ＡＵを約５０％およびＧＣを約５０％含有する。
【０２６４】
本明細書には、例えば二本鎖ＲＮＡのセンス鎖に少なくとも１つの修飾されたリボヌクレオチドをさらに含むＲＮＡも記載されている。特定の実施例では、修飾されたリボヌクレオチドは、少なくとも１つの鎖の３’突出部、より具体的にはセンス鎖の３’突出部にある。修飾されたリボヌクレオチドの例は、検出可能な標識（例えば、ローダミンまたはＦＩＴＣなどのフルオロフォア）を含むリボヌクレオチド、チオホスフェートヌクレオチド類似体、デオキシヌクレオチド（基本分子がリボ核酸であるので、修飾体とみなされる）、２’−フルオロウラシル、２’−アミノウラシル、２’−アミノシチジン、４−チオウラシル、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−（３−アミノアリル）−ウラシル、イノシン、または２’Ｏ−Ｍｅヌクレオチド類似体を含むことが特に意図されている。
【０２６５】
ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２のアンチセンスおよびリボザイム分子も本明細書に開示される方法において有用である。アンチセンス核酸は、特定のｍＲＮＡ分子の少なくとも一部分と相補的なＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である（Weintraub,  Scientific  American  262:40,  1990）。細胞において、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡとハイブリダイズし、二本鎖分子を形成する。細胞は二本鎖であるｍＲＮＡを翻訳しないので、アンチセンス核酸はｍＲＮＡの翻訳に干渉する。約１５ヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーが好ましく、これは、当該アンチセンスオリゴマーは容易に合成され、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を産生する標的細胞に導入した場合に大きな分子よりも問題を引き起こす可能性が低いからである。遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳を阻害するためのアンチセンス法の使用は当技術分野において周知である（例えば、Marcus-Sakura,  Anal.  Biochem.  172:289,  1988を参照されたい）。
【０２６６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ヌクレオチドの長さであり得る。アンチセンス核酸は、当技術分野で公知の手順を使用し、化学合成および酵素によるライゲーション反応を使用して構築することができる。例えば、アンチセンス核酸分子を、天然に存在するヌクレオチドを使用して化学的に合成することもでき、分子の生物学的安定性が増加するように、またはアンチセンス核酸とセンス核酸の間で形成される二重鎖の物理的安定性が増大増加するように設計された多様に修飾されたヌクレオチド、例えばホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドを使用することもできる。アンチセンス核酸を生成するために使用することができる修飾されたヌクレオチドの例としては、とりわけ、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン−ｅ，５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルケオシン（beta-D-galactosylqueosine）、イノシンが挙げられる。
【０２６７】
転写を止めるためのオリゴヌクレオチドの使用は、ブルーマー（bloomer）が２重ヘリックスＤＮＡの周りに巻き付き、それにより３本鎖へリックスを形成するため、三重鎖戦略として公知である。したがって、これらの三重鎖化合物を、選択された遺伝子上の独特の部位を認識するように設計することができる（Maher,  et  al.,  Antisense  Res.  and  Dev.  1(3):227,  1991；Helene,  C.,  Anticancer  Drug  Design  6(6):569,  1991）。この型の阻害オリゴヌクレオチドも本明細書に開示される方法において有用である。
【０２６８】
他の一本鎖ＲＮＡをＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと類似した様式で特異的に切断する能力を有するＲＮＡ分子であるリボザイムも有用である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾により、ＲＮＡ分子内の特異的なヌクレオチド配列を認識し、それを切断する分子を工学的に作製する（engineer）ことが可能になる（Cech,  J.  Amer.  Med.  Assn.  260:3030,  1988）。この手法の主要な利点は、配列特異的であるので、特定の配列を有するｍＲＮＡのみが不活化されることである。
【０２６９】
２種の基本的な型のリボザイム、すなわち、テトラヒメナ型（Hasselhoff,  Nature  334:585,  1988）および「ハンマーヘッド」型が存在する。テトラヒメナ型リボザイムは、４塩基の長さの配列を認識し、一方、「ハンマーヘッド」型リボザイムは、１１〜１８塩基の長さの塩基配列を認識する。認識配列が長いほど、当該配列が標的ｍＲＮＡ種に排他的に存在する可能性が大きくなる。したがって、特定のｍＲＮＡ種を不活化するためにはハンマーヘッド型リボザイムがテトラヒメナ型リボザイムよりも好ましく、１８塩基の認識配列がより短い認識配列よりも好ましい。
【０２７０】
種々の送達系が公知であり、ｓｉＲＮＡおよび他の阻害核酸分子を治療薬として投与するために使用することができる。そのような系としては、例えば、リポソーム、微小粒子、マイクロカプセル、ナノ粒子、治療用分子（複数可）を発現することができる組換え細胞への封入（例えば、Wu  et  al.,  J.  Biol.  Chem.  262,  4429,  1987を参照されたい）、レトロウイルスベクターまたは他のベクターの一部としての治療用核酸の構築などが挙げられる。
Ｃ．小分子
【０２７１】
ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２アンタゴニスト、および４−１ＢＢアゴニストは、天然物もしくは合成（もしくは半合成）抽出物の大きなライブラリーまたは化学的ライブラリーの両方から当技術分野で公知の方法に従って同定される分子を含む。ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の活性の低下を検出するスクリーニング方法（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２についての細胞死の検出）が、活性に関して種々の供給源から化合物を同定するために有用である。４−１ＢＢ活性の増加を検出するスクリーニング方法も、そのような供給源から化合物を同定するために有用である。最初のスクリーニングは、化合物の多様なライブラリー、種々の他の化合物および化合物ライブラリーを使用して実施することができる。したがって、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２に結合する分子、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の発現を阻害する分子、およびＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の活性を阻害する分子を同定することができる。４−１ＢＢの発現および／または活性を増加させる分子も同定することができる。これらの小分子は、コンビナトリアルライブラリー、天然物ライブラリー、または他の小分子ライブラリーから同定することができる。さらに、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２アンタゴニスト、および４−１ＢＢアゴニストを化合物として商業的供給源ならびに市販の同定された阻害剤の類似体から同定することができる。一部の実施形態では、小分子は、９００ダルトン未満、または８００ダルトン未満である。
【０２７２】
試験抽出物または化合物の厳密な供給源はアンタゴニストの同定に重要ではない。したがって、事実上任意の数の化学的抽出物または化合物からアンタゴニストを同定することができる。アンタゴニストになり得るそのような抽出物または化合物の例としては、これだけに限定されないが、植物に基づく抽出物、真菌に基づく抽出物、原核生物に基づく抽出物または動物に基づく抽出物、発酵ブロス、および合成化合物、ならびに既存の化合物の改変が挙げられる。これだけに限定されないが、糖類に基づく化合物、脂質に基づく化合物、ペプチドに基づく化合物、および核酸に基づく化合物を含めた任意の数の化学化合物のランダム合成または定方向合成（例えば、半合成または全合成）を生じさせるためにも多数の方法が利用可能である。合成化合物ライブラリーは、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ、Ｎ．Ｈ．）およびＡｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）から市販されている。Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（Ｔｒｅｖｉｌｌｅｔ、Ｃｏｒｎｗａｌｌ、ＵＫ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、Ｎ．  Ｊ．）、Ｂｒａｎｄｏｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ、Ｎ．Ｈ．）、およびＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ（Ｎｅｗ  Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）を含めたいくつもの会社から市販されている合成化合物ライブラリーからアゴニストおよびアンタゴニストを同定することができる。Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、Ｗｉｓ．）から入手可能なライブラリーなどの希少な化学的ライブラリーからＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２アンタゴニスト、または４−１ＢＢアゴニストを同定することができる。Ｂｉｏｔｉｃｓ（Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）、Ｘｅｎｏｖａ（Ｓｌｏｕｇｈ、ＵＫ）、Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｒａｎｃｈ  Ｏｃｅａｎｇｒａｐｈｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｆｔ．Ｐｉｅｒｃｅ、Ｆｌａ．）、およびＰｈａｒｍａＭａｒ、Ｕ．Ｓ．Ａ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）を含めたいくつもの供給源から市販されている、細菌抽出物、真菌抽出物、植物抽出物および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーにおいて、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、およびＰＤ−Ｌ２アンタゴニスト、または４−１ＢＢアゴニストを同定することができる。天然および合成で作製したライブラリーおよび化合物を従来の化学的手段、物理的手段、および生化学的手段によって容易に改変する。
【０２７３】
有用な化合物は多数の化学的クラス内に見いだすことができるが、一般には、有用な化合物は、小さな有機化合物を含めた有機化合物である。５０ダルトンよりも大きいが約２，５００ダルトン未満、例えば、約７５０ダルトン未満または約３５０ダルトン未満の分子量を有する小さな有機化合物を本明細書に開示される方法において利用することができる。例示的なクラスとしては、複素環、ペプチド、糖類、ステロイドなどが挙げられる。化合物を、有効性、安定性、医薬適合性などが増強されるように改変することができる。いくつかの実施形態では、有用な化合物は、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２に対して１ｎＭ未満、１０ｎｍ未満、１μＭ未満、１０μＭ未満、または１ｍＭ未満のＫｄを有する。
Ｄ．ペプチドバリアント
【０２７４】
ヒトＣＴＬＡ−４、ヒトＢＴＬＡ、ヒトＴＩＭ−３、ヒトＬＡＧ３、ヒトＰＤ−１、ヒトＰＤ−Ｌ１、またはヒトＰＤ−Ｌ２に特異的に結合するイムノアドヘシン（immunoadhesin）も利用することができる。イムノアドヘシンは、免疫グロブリン分子のＦｃ領域などの定常領域と融合したタンパク質の細胞外部分または結合性部分を含有する融合タンパク質である。ＰＤ−１に特異的に結合する免疫接着分子（immunoadhesion  molecule）の例は、どちらも参照により組み込まれるＰＣＴ公開ＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＷＯ２０１１／０６６３４２号に開示されている。これらの免疫接着分子としては、ＰＤ−Ｌ２−ＦＣ融合タンパク質であるＡＭＰ−２２４（Ｂ７−ＤＣＩｇとしても公知）が挙げられる。融合タンパク質である追加的なＰＤ−１アンタゴニストは、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１４／０２２７２６２号において開示されている。
【０２７５】
一実施形態では、開示されている方法において有用なＬＡＧ３アンタゴニストは、樹状細胞を活性化するために使用されている、可溶性ＬＡＧ３であるＩＭＰ３２１である。別の実施形態では、開示されている方法において有用な（if  use）ＴＩＭ−３アンタゴニストは、ＣＡ−３２７（Ｃｕｒｉｓ）である。
【０２７６】
ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ドミナントネガティブタンパク質またはイムノアドヘシンであり得る。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１６／０２６４６４３号を参照されたい。追加的な抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニストとしては、これだけに限定されないが、ＣＴＬＡ−４のその同類のリガンドに結合する能力を阻害し得る、Ｂ７のＣＴＬＡ−４に結合する能力（the  ability  of  B7  to  CTLA-4）を破壊し得る、ＣＤ８０のＣＴＬＡ−４に結合する能力を破壊し得る、ＣＤ８６のＣＴＬＡ−４に結合する能力を破壊し得る小分子を含めた任意の阻害剤が挙げられる。
【０２７７】
一実施形態では、アンタゴニストとして機能するＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２タンパク質のバリアントを、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２タンパク質の点変異体または切断変異体などの変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして、アンタゴニスト活性を有するタンパク質を同定することによって同定することができる。一実施例では、アンタゴニストは、可溶性タンパク質である。
【０２７８】
さらなる実施形態では、アゴニストとして機能する４−１ＢＢのバリアントを、点変異または切断変異体などの４−１ＢＢ変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングして、アゴニスト活性を有するタンパク質を同定することによって同定することができる。アゴニストは、可溶性タンパク質であり得る。
【０２７９】
したがって、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または４−１ＢＢバリアントのライブラリーを核酸レベルでコンビナトリアル変異誘発によって生成することができ、これは変化に富んだ遺伝子ライブラリーによってコードされるものである。ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２または４−１ＢＢバリアントのライブラリーを、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的にライゲーションし、その結果、潜在的な配列の縮重セットを個々のポリペプチドとして、あるいは目的の配列のセットを含有するより大きな融合タンパク質のセットとして（例えば、ファージディスプレイのために）発現できるようにすることによって作製することができる。
【０２８０】
縮重オリゴヌクレオチド配列から潜在的なＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２または４−１ＢＢバリアントのライブラリーを作製するために使用することができる種々の方法が存在する。縮重遺伝子配列の化学合成を自動ＤＮＡ合成機で実施し、次いで、合成された遺伝子を適切な発現ベクターにライゲーションすることができる。遺伝子の縮重セットの使用により、潜在的なＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２または４−１ＢＢ配列の所望のセットをコードする配列の全てを１つの混合物として提供することが可能になる。縮重オリゴヌクレオチドを合成するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Narang,  et  al.,  Tetrahedron  39:3,  1983；Itakura  et  al.  Annu.  Rev.  Biochem.  53:323,  1984；Itakura  et  al.  Science  198:1056,  1984を参照されたい）。
【０２８１】
さらに、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２または４−１ＢＢタンパク質コード配列の断片のライブラリーを使用して、指定のアンタゴニスト（または４−１ＢＢの場合にはアゴニスト）のバリアントのスクリーニングおよびその後の選択のための断片の集団を生成することができる。一実施形態では、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または４−１ＢＢコード配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、分子当たり約１回のみニッキングが生じる条件下でヌクレアーゼを用いて処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを再生させて異なるニック産物のセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成し、一本鎖部分を再形成された二重鎖からＳ１ヌクレアーゼを用いた処理により除去し、得られた断片ライブラリーを発現ベクターにライゲーションすることにより、コード配列断片のライブラリーを生成することができる。この方法により、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、または４−１ＢＢの種々のサイズのＮ末端、Ｃ末端および内部の断片をコードする発現ライブラリーを得ることができる。
【０２８２】
点変異または短縮によって作製されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするため、およびｃＤＮＡライブラリーを選択された性質を有する遺伝子産物についてスクリーニングするための技法がいくつか当技術分野で公知である。そのような技法は、タンパク質のコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応できる。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット分析に適用できる、最も広く使用されている技法は、一般には、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、適切な細胞を得られたベクターのライブラリーで形質転換すること、および、コンビナトリアル遺伝子を、所望の活性の検出により、産物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下で発現させることを含む。再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）をスクリーニングアッセイと組み合わせて使用して、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、もしくはＰＤ−Ｌ２アンタゴニスト、または４−１ＢＢアゴニストを同定することができる（Arkin  and  Youvan,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  89:7811  7815,  1992；Delagrave  et  al.,  Protein  Eng.  6(3):327  331,  1993）。
【０２８３】
一実施形態では、細胞に基づくアッセイを活用して、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２バリアントのライブラリーを分析することができる。例えば、発現ベクターのライブラリーを、通常ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２を合成し、分泌する細胞株にトランスフェクトすることができる。次いで、トランスフェクトされた細胞を、ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２および特定のＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２（それぞれ）バリアントが分泌されるように培養する。変異体の発現の、細胞または上清における活性に対する効果を、例えば、機能アッセイのいずれかによってなどで検出することができる。次いで、内因性活性が阻害された細胞からプラスミドＤＮＡを回収し、個々のクローンをさらに特徴付けることができる。
【０２８４】
ペプチド模倣体をＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２アンタゴニストとして使用することもできる。ペプチド類似体は、医薬品産業において、鋳型ペプチドと類似した性質を有する非ペプチド薬物として一般に使用される。これらの型の非ペプチド化合物は、通常、コンピュータ化された分子モデリングを利用して開発される。治療的に有用なペプチドと構造的に類似したペプチド模倣体を使用して、同等の治療効果または予防効果を生じさせることができる。一般に、ペプチド模倣体は、パラダイムポリペプチド（例えば、ＰＤ−１生物学的活性を有するポリペプチド）と構造的に類似しているが、必要に応じて−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−−、−−ＣＨ２−−ＣＨ２−−、−−ＣＨ．＝．ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、−−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−−ＣＨ２ＳＯ−連結で置き換えられる１つまたは複数のペプチド連結を有する。これらのペプチド連結は、当技術分野で公知の方法によって置き換えることができる（例えば、Morley,  Trends  Pharm.  Sci.  pp.  463  468,  1980；Hudson  et  al.  Int.  J.  Pept.  Prot.  Res.  14:177  185,  1979；Spatola,  Life  Sci.  38:1243  1249,  1986；Holladay,  et  al.  Tetrahedron  Lett.  24:4401  4404,  1983を参照されたい）。ペプチド模倣体は、経済的に得ることができ、安定であり、かつ、半減期（have-life）または吸収が増加し得る。ペプチド模倣体の標識は、通常、１つまたは複数の標識を、直接またはスペーサーを通じて（例えば、アミド基によって）、定量的構造−活性データおよび／または分子モデリングによって予測されるペプチド模倣体上の干渉されない位置（複数可）に共有結合により付着することを伴う。そのような干渉されない位置は、一般に、ペプチド模倣体が結合して治療効果を生じさせる巨大分子（複数可）との直接的な接触を形成しない位置である。ペプチド模倣体の誘導体化は、ペプチド模倣体の所望の生物学的なまたは薬理活性に実質的に干渉しないものであるべきである。
【０２８５】
ＣＴＬＡ−４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、またはＰＤ−Ｌ２の生物学的活性に干渉するドミナントネガティブタンパク質をコードするドミナントネガティブタンパク質または核酸も本明細書に開示される方法において使用することができる。ドミナントネガティブタンパク質は、ドミナントネガティブタンパク質が対応する野生型タンパク質の少なくとも１０アミノ酸、２０アミノ酸、３５アミノ酸、５０アミノ酸、１００アミノ酸、または１５０アミノ酸よりも多くに対して少なくとも５０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには９９％の配列同一性を有する配列を有する任意のアミノ酸分子である。例えば、ドミナントネガティブＰＤ−Ｌ１は、ネイティブな（野生型）ＰＤ−１よりも堅くＰＤ−１と結合するが、ＰＤ−１を通じたいかなる細胞シグナル伝達も活性化しない変異を有する。
【０２８６】
ドミナントネガティブタンパク質は、発現ベクターとして投与することができる。発現ベクターは、非ウイルスベクターまたはウイルスベクター（例えば、レトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、または組換えアデノウイルスベクター）であり得る。あるいは、ドミナントネガティブタンパク質を組換えタンパク質として直接全身的にまたは感染領域に、例えば微量注射技法を使用して投与することができる。
【０２８７】
ポリペプチドアンタゴニストは、原核生物または真核生物宿主細胞において、アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを、しばしばより大きなポリペプチド（ｒａｓまたは酵素などとの融合タンパク質）の一部として発現させることによって産生させることができる。あるいは、そのようなペプチドを化学的方法によって合成することができる。組換え宿主における異種タンパク質の発現、ポリペプチドの化学合成、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける翻訳のための方法は当技術分野で周知である（Maniatis  el  al.  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  (1989),  2nd  Ed.,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.；Berger  and  Kimmel,  Methods  in  Enzymology,  Volume  152,  Guide  to  Molecular  Cloning  Techniques  (1987),  Academic  Press,  Inc.,  San  Diego,  Calif.；Kaiser  et  al.,  Science  243:187,  1989；Merrifield,  Science  232:342,  1986；Kent,  Annu.  Rev.  Biochem.  57:957,  1988を参照されたい）。
【０２８８】
ペプチドは、例えば、直接化学合成によってで作製することができ、アンタゴニストとして使用することができる。ペプチドは、Ｎ末端および／またはＣ末端に非ペプチド部分が共有結合性の連結によって結合した修飾ペプチドとして作製することができる。ある特定の好ましい実施形態では、カルボキシ末端もしくはアミノ末端のいずれか、またはその両方が化学修飾されている。最も一般的な末端アミノ基およびカルボキシル基の修飾は、それぞれアセチル化およびアミド化である。アシル化（例えば、アセチル化）またはアルキル化（例えば、メチル化）などのアミノ末端修飾およびアミド化などのカルボキシ末端修飾、ならびに環化を含めた他の末端修飾を種々の実施形態に組み入れることができる。コア配列に対するある特定のアミノ末端および／またはカルボキシ末端修飾および／またはペプチド伸長により、例えば、安定性の増強、効力および／または有効性の増加、血清プロテアーゼに対する抵抗性、望ましい薬物動態特性など、有利な物理的性質、化学的性質、生化学的性質、および薬理学的性質をもたらすことができる。
【０２８９】
本開示を以下の非限定的な実施例によって例証する。
【実施例】
【０２９０】
（実施例１）
材料および方法
健康なドナーの血液試料ならびに患者の血液および組織試料：末梢血、関与しないリンパ節、転移性リンパ節および腫瘍試料を、ＨＮＳＣＣを有する個体、黒色腫を有する個体、結腸がんを有する個体、直腸がんを有する個体、肺がんを有する個体、結腸直腸肝転移を有する個体および卵巣がんを有する個体から得た。全ての対象が、施設のＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｅ  Ｐｏｒｔｌａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、ＩＲＢ）により承認された書面のインフォームドコンセントにサインした。
【０２９１】
試料採取時には、患者は治療を受けていなかった。以前には、患者は、化学療法、放射線療法、外科手術および免疫療法、または上記のいずれでもないものを含めた広範囲の治療を受けたことがあった。
【０２９２】
末梢血単核細胞を全血からＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）勾配で精製し、分析前に凍結保存した。
【０２９３】
腫瘍検体を以下の通り調製した：簡単に述べると、滅菌条件下で、腫瘍を小片にカットし、０．５ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ、１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（どちらもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、３０Ｕ／ｍｌのＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）ならびに最終濃度１．５％のヒト血清アルブミン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０中で消化した。細胞を室温で１時間、磁気撹拌子で撹拌しながら消化した。細胞懸濁液を７０μｍのフィルターを通して濾過した。腫瘍浸潤性リンパ球を上記の通りＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ密度遠心分離によって富化した。腫瘍単一細胞懸濁液を、さらに分析するまで凍結保存した。
【０２９４】
抗体およびフローサイトメトリー：蛍光標識抗体を以下の製造者から購入した：
Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４（ＯＫＴ−４またはＲＰＡ−Ｔ４）、ＣＤ８（ＲＰＡ−Ｔ８）、ＣＤ２５（ＢＣ９６）、ＣＤ３８（ＨＩＴ２）、ＣＤ４５ＲＡ（ＨＩ１００）、ＣＤ６９（ＦＮ５０）、ＨＬＡ−ＤＲ（Ｌ２４３）、ＣＴＬＡ−４（ＢＮＩ３）、４−１ＢＢ（４Ｂ４−１）、ＣＣＲ７（Ｇ０４３Ｈ７）、グランザイムＢ（ＧＢ１１）、ＩＦＮ−ｇ（４Ｓ．Ｂ３）、ＴＮＦ−ａ（Ｍａｂ１１）
ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：ＣＤ２７（Ｍ−Ｔ２７１）、ＣＤ１２７（ＨＩＬ−７Ｒ−Ｍ２１）、ＰＤ−１（ＥＨ１２）、Ｋｉ−６７（Ｂ５６）、
ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ：ＣＤ２８（ＣＤ２８．２）、ＣＤ３９（ｅＢｉｏＡ１）、ＣＤ１０３（Ｂｅｒ−ＡＣＴ８およびＢ−Ｌｙ７）、ＦＯＸＰ３（ＰＣＨ１０１）、ＩＣＯＳ（ＩＳＡ−３）
Ｒ＆Ｄ：ＴＩＭ−３（３４４８２３）
【０２９５】
固定可能な生／死色素を使用して生存細胞（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を区別した。細胞表面染色をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＢＳおよび０．０１％ＮａＮ３を補充したＰＢＳ）中で実施した。細胞内染色をｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＦｉｘ／Ｐｅｒｍキットを使用し、製造者の指示に従って実施した。末梢血単核細胞およびＴＩＬによるサイトカイン産生をｅｘ  ｖｉｖｏで分析するために、細胞をＰＭＡ（０．２μＭ）およびイオノマイシン（１μｇ／ｍｌ）で５時間刺激し、最後の２時間半はＢＦＡ（１０μｇ／ｍｌ）を存在させた。ＢＤ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅのＣｙｔｏＦｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍキットを使用し、製造者の指示に従って細胞内サイトカイン染色を実施した。染色された細胞を細胞選別のために、ＬＳＲＩＩおよびＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター、またはＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩ（全てＢＤ）で取得した。データをＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で解析した。
【０２９６】
細胞選別およびＴ細胞拡大：凍結保存されたＰＢＭＣおよびＴＩＬを解凍し、ＳｔｅｍｃｅｌｌのＴ細胞富化キットを使用してＴリンパ球を富化した。ＴＩＬ富化のために、Ｅｐｃａｍビーズ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）をカクテルに添加した。次いで、富化された画分を標識し、細胞選別後に目的の集団をＦＡＣＳ  ＡｒｉａＩＩ（ＢＤ）で９９％純度まで精製した。
【０２９７】
ＴＣＲ配列決定解析のために、細胞ペレットをさらに処理するまで凍結させた。
【０２９８】
ＤＮ  ＣＤ８＋ＴＩＬ、ＳＰ  ＣＤ８＋ＴＩＬおよびＤＰ  ＣＤ８＋ＴＩＬならびにＰＢＭＣ由来のナイーブおよびメモリーＣＤ８を増大させるために、Ｔ細胞を選別し、２ｍＭのグルタミン、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）非必須アミノ酸、１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ）および１０％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）を補充した完全なＲＰＭＩ−１６４０中で培養した。Ｔ細胞（細胞２０００〜５０００個／ウェル）を、９６ウェル丸底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ／Ｃｏｓｔａｒ）中、照射した（４０００ｒａｄ）同種フィーダー細胞（細胞２×１０５個／ウェル）および１０ｎｇ／ｍｌのｒｈ  ＩＬ−１５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）の存在下で１μｇ／ｍｌのＰＨＡ（Ｓｉｇｍａ）を用いてポリクローナル的に刺激した。１週間後、Ｔ細胞のクラスターが形成されたら、細胞を追加的な９６ウェルプレート、ＩＬ−１５を伴う完全培地中に分割し、これを２日後にまた繰り返し、その結果、４つの同一の反復をもたらした。次いで、１２日目に４つの反復を２４ウェルプレートのウェルにプールした。Ｔ細胞株を分析するまで維持した。
【０２９９】
マイクロアレイデータの取得：マイクロアレイ用の試料を、フロー分析と同様の方法で処理した。腫瘍消化を５０ｍｌ円錐管において磁気撹拌子を用い、室温で１時間、０．３％ヒトアルブミン（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ  ８２３０５１）および３０ｕ／ｍｌのＤＮＡＳＥ（Ｒｏｃｈｅ  ０４５３６２８２００１）を有するＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１１８７５−０９３）中１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｃ−５１３８）、０．５ｍｇ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ、Ｈ−６２５４）を用いて完了した。消化後、試料を７０μｍのフィルターを通して濾過した。次いで、試料をＲＰＭＩで１：２に希釈し、フィコール（ＧＥ、１７−１４４０−０２）上に重ねて、遠心分離ステップによってリンパ球を富化した。富化された細胞をＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ１０３、ＣＤ３９について染色し、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ細胞選別機を使用して選別した。選別された細胞を溶解させ、Ｄｉｒｅｃｔ−ｚｏｌ  ＲＮＡミニプレップキット（ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用してＲＮＡを精製し、次いで、ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、増幅した。増幅されたｃＤＮＡをＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｐｒｉｍｅ−Ｖｉｅｗ遺伝子チップ上にハイブリダイズさせた。
【０３００】
マイクロアレイデータ解析：Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｐｒｉｍｅｖｉｅｗ遺伝子発現アレイからＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｃｏｍｍａｎｄ  Ｃｏｎｓｏｌｅ（ＡＧＣＣ）ｖ．  ３．１．１およびＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｏｎｓｏｌｅ  ｖ．１．１ソフトウェアによって作成されたＣＨＰファイルを、ＢＲＢ  ＡｒｒａｙＴｏｏｌｓ、バージョン４．５．１（インターネット、brb_nci.nih.gov/BRB-ArrayTools/で入手可能）ソフトウェアを使用してローディングし、それらの試料型（すなわち、ＤＮ、ＳＰ、ＤＰ）でアノテートした。Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｃｏｎｔｒｏｌモジュールを実行して、発現結果が規格の範囲内であることを決定した（ＢｉｏＣｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｒ  ｍｏｄｕｌｅ：ａｆｆｙ／ａｆｆｙＱＣＲｅｐｏｒｔを適用）。試料型間の差次的な発現を、Ｃｌａｓｓ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ／Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｏｆ  Ａｒｒａｙｓ  ＢＲＢａｒｒａｙモジュールを使用し、単変量検定の設定有意性閾値（単変量検定のｐ値によって選別された最小二乗およびＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定の報告）を使用して決定した。次いで、試料モジュールの図表／可視化を使用して、選択された遺伝子を使用した３群の多次元的解析をもたらした（ＢＲＢａｒｒａｙ  Ｒ  モジュール：ＭＤＳ．Ｒを適用）。
【０３０１】
ｉｎ−ｖｉｔｒｏにおけるＴ細胞活性化：ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞サブセットを磁気ＣＤ８  Ｔ細胞富化（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）によって単離し、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＣＲ７に対する抗体で標識し、選別した。ナイーブＴ細胞１×１０５個を抗ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に、ビーズ：Ｔ細胞比１：２で、２ｎｇ／ｍｌのｒｈ  ＴＧＦβ−１（Ｒ＆Ｄ）の存在下または非存在下で培養した。２４時間後に、実験の半分のためにビーズを磁気捕捉によって取り出した。１日目、２日目、３日目、４日目、７日目および９日目に活性化および分化マーカーの発現を評価した。
【０３０２】
ＴＣＲ  ＶＢ遺伝子のディープＴＣＲシーケンシングおよびクローン性分析：選別されたＴ細胞集団のゲノムＤＮＡに対して、ＴＣＲβ遺伝子の可変Ｖ−ＪまたはＶ−Ｄ−Ｊ領域のディープシーケンシングを実施した。細胞１×１０４〜１×１０５個の範囲にわたる循環ＣＤ８  Ｔ細胞サブセットおよび腫瘍常在ＣＤ８  Ｔ細胞サブセットからＤＮＡを抽出した（ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ）。ＴＣＲβ  ＣＤＲ３領域のシーケンシングおよびマッピングを行った（ＩｍｍｕｎｏＳＥＱ、Ａｄａｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）。試料当たりのカバレッジは＞１０×であった。生産的再編成（productive  rearrangement）由来のデータのみをさらなる解析のためにＩｍｍｕｎｏＳＥＱ  Ａｎａｌｙｚｅｒプラットフォームから抽出した。異なるＴ細胞サブセットのクローン性を各サブセット内の５００種の最も豊富なクローンのヌクレオチド配列比較によって評価した。
【０３０３】
２つの所与の集団のＴＣＲ  Ｖβ重複（または類似性）を比較するために、本発明者らは、Ｍｏｒｉｓｉｔａの重複指数を使用した。Ｍｏｒｉｓｉｔａ−Ｈｏｒｎ類似性指数は、共通のクローン型の数およびクローン型サイズの分布の両方を説明するものであり、優性クローン型のクローンサイズに関して最も感度が高い（Venturi  et  al.,  J  Immunologi  Meth,  2008参照）。
【０３０４】
標的細胞認識の評価：４−１ＢＢおよびＣＤ２５の上方調節ならびにＩＦＮ−γ分泌：４−１ＢＢおよびＣＤ２５の上方調節ならびにＩＦＮ−γの放出を、増やした自己ＣＤ８  Ｔ細胞による腫瘍細胞の認識を評価するための尺度として使用した。最初の増大の１７〜２０日後に共培養実験を実施した。その前日に、増大させたＴ細胞を計数し、残りの４−１ＢＢおよびＣＤ２５の発現を下方調節するために、ＩＬ−１５を伴わない培地中で終夜、飢餓状態にした。次いで、増大させたＣＤ８  Ｔ細胞（１×１０５）を単独でまたは腫瘍細胞（自己および同種、Ｔ細胞：標的細胞の比＝１０：１）と共に培養した。一部の条件では、腫瘍細胞を３０ｕｇ／ｍｌの抗ＭＨＣクラスＩ遮断抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＷ６／３２）と共に３時間プレインキュベートした後、Ｔ細胞を添加した。陽性対照として、Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ３）でコーティングし、Ｔ細胞を添加した。全ての条件について３連でプレーティングした。２４時間後、上清を収集し、サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）分析によって分析した。細胞を各条件についてプールし、生存能力色素で標識し、その後、ＣＤ３９、ＣＤ１０３、ＣＤ２５および４−１ＢＢ細胞表面染色を行った。細胞をフローサイトメトリーによって分析した。ＣＢＡに関しては、製造者のプロトコールに従った。具体的には、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを分析した。
【０３０５】
生標的細胞殺滅アッセイ：Ｔ細胞媒介性標的細胞殺滅アッセイを、３７℃／５％ＣＯ２の細胞インキュベーターの内側に収容したＩｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  Ｓｙｓｔｅｍで、製造者のプロトコール（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）に基づいて実施した。自己腫瘍細胞のＴ細胞による殺滅を評価するために、５０００〜１００００個の腫瘍細胞（自己腫瘍細胞株および同種腫瘍細胞株）を３連で９６ウェル平底プレートへと播種し、１０％集密度に到達した。増大させた自己Ｔ細胞サブセットを計数し、外因性ＩＬ−１５を伴わずに終夜、飢餓状態にした。次いで、Ｔ細胞１×１０５個を自己腫瘍細胞および同種腫瘍細胞を伴って（Ｔ細胞：腫瘍細胞の比＝１０：１）または伴わずに培養した。一部の条件では、抗ＭＨＣクラスＩ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、クローンＷ６／３２）を添加した。全ての条件で、ＮｕｃＶｉｅｗ  ４８８カスパーゼ３／７基質（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を添加して、活性なカスパーゼ３／７をモニタリングした。プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、１時間毎に３つの実験反復から４つの画像を１０×対物レンズを使用して捕捉して、Ｔ細胞殺滅およびカスパーゼ３／７活性（緑色蛍光）を可視化した。緑色チャネル取得時間は４００ミリ秒であった。位相差に関して、小さなＴ細胞を排除するためにマスクを適用することによって細胞分割を実現した。エリアフィルターを適用して、１０００μｍ２を下回る物体を排除した。２０μｍの半径および２緑色補正単位の閾値を用いたバックグラウンド不均一性補正のＴｏｐ−Ｈａｔ法により、緑色バックグラウンドノイズを差し引いた。実験にマスクを適用した後に蛍光シグナルを定量した。Ｔ細胞殺滅／アポトーシスの量を、提供されたＺｏｏｍソフトウェア（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によって算出した。
【０３０６】
統計解析：Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）を使用して統計的検定を実施した。図の説明文に記載の通り、テューキーの補正を伴う一元配置ＡＮＯＶＡ分析によって有意性を決定した。
（実施例２）
結果
【０３０７】
がん患者における抗腫瘍応答のレベルおよび品質を評価するため、ならびに免疫療法などの新しいがん処置戦略の作用様式を理解するために、腫瘍反応性ＣＤ８  Ｔ細胞の同定が重要である。最近、高悪性度の漿液性卵巣がん（ＨＧＳＣ）および非小細胞肺がん（ＮＣＬＣ）におけるＣＤ１０３およびＰＤ−１の共発現により、ヒト腫瘍反応性ＣＤ８  Ｔ細胞が同定された。それらの性質および機能をさらに定義するために、２種のヒト卵巣腫瘍から腫瘍浸潤性ＣＤ８  Ｔ細胞（ＴＩＬ）をＣＤ１０３陽性サブセットおよびＣＤ１０３陰性サブセットへと選別し、それらの遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイによって決定した。この分析のために、フローサイトメトリーによって容易に検出することができる、差次的に発現される細胞表面分子に焦点を当てた。判定基準を満たした、遺伝子アレイ比較において観察された最大の差異の１つは、ＣＤ３９をコードし、細胞表面上に見いだされる遺伝子であるＥＮＴＰＤ１であった（表１）。遺伝子アレイ結果を確認し、腫瘍浸潤性ＣＤ８  Ｔ細胞の多様性をよりよく理解するために、頭頸部扁平上皮細胞癌（ＨＮＳＣＣ）患者から単離されたＣＤ８  Ｔ細胞を染色し、ＣＤ１０３＋集団に関してゲーティングした。ＣＤ３９、ならびに活性化／疲弊ならびに発生の状態に関連付けられる追加的な細胞表面マーカーを調査した。全てのフローサイトメトリーマーカーの同時分析の複雑さから、マスサイトメトリーデータのために広範に使用されるｔ分布型確率的近傍埋め込み法（ｔ−ＳＮＥ）と称される方法が必要であった。興味深いことに、ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ３９の高発現がＰＤ−１およびＣＤ６９の高発現レベルと重複した。逆に、ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞ではＩＬ−７Ｒが低レベルで発現され（ＣＤ１２７）（図１Ａおよび１Ｂ）、これにより、よりエフェクター様のＴ細胞表現型であることが示唆される。さらに、ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ１０３およびＣＤ３９の組合せ発現により、ＣＤ１０３−ＣＤ３９−（ダブルネガティブ（ＤＮ）ＣＤ８）、ＣＤ１０３＋ＣＤ３９−（シングルポジティブ（ＳＰ）ＣＤ８）およびＣＤ１０３＋ＣＤ３９＋（ダブルポジティブ（ＤＰ）ＣＤ８）を含む３つの別個の細胞集団の同定がもたらされた。ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞はＨＮＳＣＣ、肺がん、黒色腫、卵巣がん、および直腸がんを含めたいくつかのヒト固形悪性病変において比較的高い頻度で検出されたが（図１Ｃ）、これらの細胞の頻度は黒色腫で最も高かった。対照的に、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＨＮＳＣＣ患者のサブセットならびに結腸がんを有する患者および結腸直腸肝転移（ＣＲＬＭ）を有する患者の大多数では非常に低い頻度で存在していた（図１Ｃおよび１Ｄ）。驚いたことに、結腸がん患者１名由来のＴＩＬは、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞を非常に高い頻度で含有した。この患者は、高率の変異をもたらすミスマッチ修復遺伝子の変異によって引き起こされる稀な遺伝性障害であるリンチ症候群と診断された。興味深いことに、変異の頻度が高い腫瘍は、多数の新抗原を有する確率が高く、これらの患者は、無増悪生存期間が長期であることによって例示される通り、チェックポイント遮断免疫療法に対してより良好な転帰を有する（Le  DT,  N  Engl  J  Med  2015；Snyder  A,  N  Engl  J  Med  2014；Van  Allen  EM,  Science  2015；Rizvi  NA,  Science  2015）。
【０３０８】
次いで、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞が、腫瘍細胞が存在する部位においてのみ見いだされるかどうかを調査した。これを扱うために、本発明者らが、原発腫瘍、転移性リンパ節（ＬＮ）、関与しないＬＮおよび末梢血を利用する権利を得た数名のＨＮＳＣＣ患者を分析した。図１ｅには、代表的な患者からの結果が示されており、ＣＤ８  Ｔ細胞によるＣＤ３９およびＣＤ１０３の共発現は、原発腫瘍および転移性ＬＮにおいて特に見いだされたが、末梢血および関与しないＬＮにおけるＣＤ８  Ｔ細胞では存在しなかったかまたは非常に低い頻度で存在した。重要なことに、この発現プロファイルは、分析した大多数のＨＮＳＣＣ患者において確認された（図１Ｆ）。したがって、結果から、ＣＤ１０３＋ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ３９発現により、腫瘍微小環境内で特異的に誘導されるＣＤ８  Ｔ細胞の集団が同定されることが示される。
【０３０９】
ＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞、ＳＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞およびＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞の生物学をよりよく理解するために、３つの細胞集団を直接ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて選別し、それらの全般的遺伝子発現プロファイルをマイクロアレイによって決定した。この分析のために、Ｔ細胞を３件のＨＮＳＣＣおよび２件の卵巣腫瘍から単離した。ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞とＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞の比較により、これらの２つの細胞集団間で３７２種の差次的に発現される遺伝子が同定された。この選択された遺伝子一覧に対する主成分分析および教師なし階層クラスタリングから、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞とＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞は別個のｍＲＮＡプロファイルを有するが、ＳＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞は中間の遺伝子シグネチャーを示すことが明らかになった（図２ａおよびｂ）。この選択された遺伝子のセットに対する実施した主成分分析および教師なし階層クラスタリングから、遺伝子発現プロファイルが細胞型特異的であり、患者によって分離されるものではないことが明らかになった（図２Ａ、２Ｂ）。ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞由来の転写物をＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞に対して比較したところ、最大の増大のいくつかが、ＭＫＩ６７、ＴＮＦＲＳＦ９、ＣＴＬＡ−４、ＨＡＶＣＲ２、およびＧＺＭＢなどの活性化／疲弊表現型に関連付けられた。対照的に、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞においてＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞と比べて最も下方調節される遺伝子は、ＫＬＦ２、ＣＣＲ７、ＳＥＬＬ、Ｓ１ＰＲ１、ＫＬＦ２などの、Ｔ細胞再循環パターンに関与するものであった。この遺伝子発現プロファイルは、レジデントメモリーＴシグネチャーを暗示する（図２Ｃ）。重要なことに、これらの活性化および再循環に関連するｍＲＮＡの発現プロファイルは、５種の腫瘍の全てにわたって一貫した（図２Ｄ）。したがって、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞は、腫瘍組織の外での再循環の喪失ももたらし得る、腫瘍における抗原により駆動される刺激および活性化を受けている細胞の遺伝子発現シグネチャーを示す。
【０３１０】
腫瘍浸潤性ＣＤ８  Ｔ細胞の特定の性質をさらに評価するために、分化および活性化マーカーの発現をフローサイトメトリーによってタンパク質レベルで分析した。ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＳＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞またはＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞と比較して高レベルのＣＤ６９を発現した（図３Ａ）。ＣＤ６９は、Ｔ細胞刺激後に上方調節され、スフィンゴシン１−リン酸受容体１（Ｓ１ＰＲ１）に媒介される組織からの放出をアンタゴナイズする活性化分子である（Mackay  2015；Skon  2013）。ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞はまた、より低レベルのＣＣＲ７、ＩＬ７Ｒ（ＣＤ１２７）およびＣＤ２８も表し、これは、エフェクターメモリー表現型（ｒｅｆ）を示す。興味深いことに、ＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞およびＳＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞がＰＤ−１を発現したにもかかわらず、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞はこのタンパク質を有意に高いレベルで発現した（図３Ｂ）。さらに、ＣＴＬＡ−４、およびＴＩＭ−３は、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞集団内でほぼ排他的に発現された。したがって、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞は、特にＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞およびＳＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞と比較した場合に、高度に活性化されたエフェクターメモリー表現型を示した。さらに、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞集団内の４−１ＢＢおよびＫｉ−６７の頻度の増大により、これらの細胞が腫瘍内で最近活性化され、増殖していることが示唆され、これにより、最近の同族抗原認識が示される。
【０３１１】
ＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞、ＳＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞およびＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞のエフェクター機能を、それらのサイトカイン産生を単一細胞レベルで分析することによって直接ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて評価した。ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞では、ＩＦＮ−γおよびまたはＴＮＦ−αを産生することができる細胞の頻度がＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞およびＳＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞と比較して低く、ＨＮＳＣＣ患者６名において同様の結果が得られた（図３Ｃ、３Ｄ）。対照的に、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞では、グランザイムＢ陽性細胞の頻度が有意に高いことによって実証された通り、細胞毒性ポテンシャルが増大した（図３Ｅ）。
【０３１２】
ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞は腫瘍細胞が存在する部位においてのみ見いだされたことを考慮して、これらの細胞の発生をよりよく理解するために、この特定の表現型に関与する因子を同定した。ＴＧＦ−βによりＴ細胞におけるＣＤ１０３の発現が駆動されることが確立される。ＴＧＦ−βは、腫瘍微小環境内で産生され、がん増悪において、上皮間葉転換を誘導し、それにより運動性および浸潤の増強をもたらすことによって主要な役割を果たす。慢性ＬＣＭＶ感染のマウスモデルにおいて、ならびに慢性ＨＣＶおよびＨＩＶ感染を有する患者（Gupta  PK,  PLOS  Pathogen  2015）において、慢性的に刺激された／疲弊したＣＤ８  Ｔ細胞でＣＤ３９発現が見いだされ、これにより、持続的ＴＣＲ刺激のその発現における役割が裏付けられた。したがって、ナイーブＣＤ８  Ｔ細胞において、ＴＣＲ会合後に、ＴＧＦ−βの存在下または非存在下でＣＤ１０３およびＣＤ３９上方調節のカイネティクスを分析した（図４および補足的なデータ）。ＣＤ３９発現における持続的ＴＣＲ刺激の役割に取り組むために、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズで９日間連続的に刺激したか、または、ビーズを培養開始の２４時間後に取り出した。培養３日以内にＣＤ３９発現が検出され、その発現が９日目までに増大した。Ｔ細胞をＴＧＦ−βの存在下で刺激するとＣＤ１０３が上方調節され、７日後には８０％よりも多くの細胞が陽性であった。持続的ＴＣＲ刺激の後にのみ、最適なＣＤ１０３およびＣＤ３９上方調節が見いだされた。重要なことに、ＰＤ−１などの他の活性化マーカーの発現は細胞において急速に誘導されたので、持続的ＴＣＲ刺激の非存在下でのＣＤ３９上方調節の欠如はＴ細胞活性化の限定に起因するものではなかった（図４）。ＣＤ１０３発現とは対照的に、ＴＧＦ−βはｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養系においてＣＤ３９発現に影響を及ぼさなかった。したがって、持続的ＴＣＲ刺激およびＴＧＦ−βは、ＣＤ８  Ｔ細胞におけるＣＤ１０３およびＣＤ３９の発現を促進するために必要な因子である。したがって、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞は、ＴＧＦ−βリッチ環境における腫瘍内で慢性ＴＣＲシグナル伝達をもたらすそれらの同族抗原への繰り返し曝露でそれらの表現型を獲得するようである。
【０３１３】
このデータから、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞が腫瘍部位内のそれらの同族抗原を認識することが示唆された。これが正しい場合、優性ＴＣＲクローン型の選択的な拡大がもたらされ、その結果、他のＣＤ８  Ｔ細胞集団と比較してクローン性が増加すると思われる。これを扱うために、ＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞集団、ＳＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞集団およびＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞集団内の、ならびに対になる血液および関与しないＬＮ由来の総メモリーＣＤ８  Ｔ細胞のＴＣＲβクローン型を、ＴＣＲＢ遺伝子の高度に可変性のＣＤＲ３領域のシーケンシングを行うことによって評価した。ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞は、分析した他のＣＤ８  Ｔ細胞集団のいずれと比較しても、よりオリゴクローナルであった（図５Ａ）。各患者における最も頻度が高いクローン型３０種は、それぞれＨＰＶ＋ＨＮＳＣＣ腫瘍、ＨＰＶ−ＨＮＳＣＣ腫瘍、および卵巣腫瘍において、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞集団の５６％、６１％および６６％を占めたが、ＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞ではたった２６％および２３％および３８％であり、メモリー末梢ＣＤ８  Ｔ細胞では２０％未満であった。３０種の最も増えたＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞クローン型は、ＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞集団でははるかに頻度が低く、これらの３人の患者のＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞レパートリーの０．０６％未満であった。興味深いことに、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞と他の腫瘍浸潤性ＣＤ８  Ｔ細胞サブセットの間でＴＣＲクローン型はほとんど共有されなかった（図５Ｂ）。対照的に、より大きな数のＴＣＲクローン型がＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞とＳＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞の間で共有された。レジデントメモリーシグネチャーによって予測される通り（図２Ｄ）、ＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞に存在する大多数のＴＣＲクローン型も、腫瘍に関与しないＬＮ内のメモリーＣＤ８  Ｔ細胞ならびに末梢血中のメモリーＣＤ８  Ｔ細胞と共有され（それぞれＲ２＝０．７７１０および０．２０２２）、これにより、ＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞が再循環することができ、それらの同族抗原を最終的に認識せずに腫瘍環境を潜在的に感知することが示唆された（図５Ｃ）。比較すると、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞内に存在するクローン型が、関与しないＬＮまたは末梢血においてごくわずかに検出された。２つの集団間の重複を決定する、存在量に基づく類似性指数であるＭｏｒｉｓｉｔａ指数の算出により、本発明者らの結果がさらに裏付けられ、また、５つの患者試料にわたるこの所見の一貫性が示された（図５Ｄ）。集合的に、これらの結果から、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞が腫瘍部位内でそれらの同族抗原に遭遇し、それにより、それらの活性化および腫瘍特異的Ｔ細胞クローンの局所的拡大がもたらされることが示唆される。
【０３１４】
これが正しい場合、次には、ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬは、腫瘍反応性が富化されるはずである。したがって、４つの黒色腫腫瘍および２つのＨＮＳＣＣ腫瘍から自己腫瘍細胞株を生成し、ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬが腫瘍反応性および殺滅について富化されるかどうかを決定した。ＣＤ８  Ｔ細胞を、腫瘍消化物から直接ＣＤ１０３発現およびＣＤ３９発現に基づいて選別し、３つのＣＤ８  Ｔ細胞集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて増やした。増やした後、ＤＮ  ＣＤ８  ＴＩＬ、ＳＰ  ＣＤ８  ＴＩＬおよびＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬを４−１ＢＢ上方調節ならびにＩＦＮ−γ分泌によって評価される自己腫瘍細胞株に対する反応性についてスクリーニングした。試験した６名の患者全員において、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞がＤＮ  ＣＤ８  ＴＩＬおよびＳＰ  ＣＤ８  ＴＩＬと比較して腫瘍反応性について高度に富化されることが見いだされた（図６Ａ）。ＤＰ  ＣＤ８細胞の間での腫瘍反応性ＣＤ８  ＴＩＬの富化は、患者１について最も高い腫瘍とＴ細胞の比で反応性Ｔ細胞が８７％に至ったことにより例示された。自己腫瘍の認識は、ＭＨＣクラスＩ遮断後または細胞を同種腫瘍細胞株と共に培養した場合にはＤＰ  ＴＩＬサブセットにおける反応性は検出されなかったので、特異的であり、ＭＨＣクラスＩ拘束されたものであった（図６Ｂ）。腫瘍反応性ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞が自己腫瘍細胞を死滅させることができるかどうかを扱うために、増大させたＴ細胞サブセットを自己腫瘍細胞と共培養し、腫瘍に特異的な殺滅についてＩｎｃｕｃｙｔｅ生細胞分析系を使用してモニタリングした。この系により、カスパーゼ３／７依存性アポトーシスを３７℃においてリアルタイムで顕微鏡法によって可視化することが可能になる。４−１ＢＢ上方調節と一致して、漸増数のカスパーゼ３／７＋事象によって例示される通り、ＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞のみが自己腫瘍細胞を死滅させた（図６Ｃ、６Ｄ）。この殺滅は、ＭＨＣ−クラスＩ抗体Ｗ６／３２によりこの効果が遮断されたので、ＭＨＣ−クラスＩ依存的であった。対照的に、ＤＮ  ＣＤ８  Ｔ細胞による自己腫瘍細胞殺滅はわずかに観察されたか全く観察されなかった。
【０３１５】
最後に、ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬの頻度と患者生存の関係を外科試料において評価した。この分析は、ＨＮＳＣＣ患者の小さなコホート（ｎ＝６２）に焦点を当てた。外科手術後、原発腫瘍内の総ＣＤ８  ＴＩＬの間でのＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度をフローサイトメトリーによって決定し、次いで、患者は標準治療処置（複数可）を受けた。患者をＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞の頻度に基づいて、このコホートについてのＤＰ  ＣＤ８  Ｔ細胞の平均頻度と比べて高い群と低い群に分離した。この戦略を使用して、外科手術時に腫瘍のＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬのパーセンテージが高い患者は全生存期間（ＯＳ）の延長と相関し（図６Ｅ）、これにより、ＨＰＶ陰性サブグループにおける有意性がより大きいことが示されたことが見いだされた（図６Ｆ）。集合的に、ＣＤ１０３およびＣＤ３９の共発現により、腫瘍反応性ＣＤ８  ＴＩＬおよびそれらの頻度が強力に富化され、ＨＮＳＣＣ患者における全生存期間の延長と相関することが示された。
【０３１６】
これらの結果に基づいて、ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬにおいて高い頻度で存在するＴＣＲクローン型が実際に腫瘍に特異的であるかどうかに取り組んだ。ＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬを自己腫瘍細胞と２０時間にわたって共培養し、その後、４−１ＢＢ＋ＣＤ２５＋ＣＤ８  Ｔ細胞を選別した。これらのＴ細胞を自己腫瘍株と共培養した場合に、ｅｘ−ｖｉｖｏにおいて高頻度で存在する大多数のクローン型がＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬの４−１ＢＢ＋ＣＤ２５＋画分内に見いだされ、これにより、これらが腫瘍反応性であることが実証された（図７Ａ、７Ｂ）。データは、ＤＰ  ＣＤ８集団由来のＴＣＲを利用することが、養子移入の状況で治療的になることを意味する。注目すべきことに、２つの異なるＨＮＳＣＣ試料において、同じ患者内の原発腫瘍と転移性ＬＮの間でＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬ  ＴＣＲレパートリーの強力な重複が観察された（図７Ｃ）。この結果は、転移性ＬＮまたは原発腫瘍のいずれからも同じＤＰ  ＣＤ８  ＴＩＬ  ＴＣＲを単離し、ＴＣＲ治療に使用することができることを示唆するものであるので、重要である。
【０３１７】
開示されている発明の原理を適用することができる多くの可能性のある実施形態を考慮して、例示されている実施形態は単に本発明の好ましい例であり、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではないことが認識されるべきである。そうではなく、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および主旨に入る全てが本発明者らの発明であると主張する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２ＡＢ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３ＣＤ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６ＢＣ】
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【図６Ｄ】
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【図６ＥＦ】
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【図７Ａ】
2020523018.tif 000024
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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