(57)【要約】  Ｘ連鎖無γグロブリン血症（XLA）を治療、抑制または緩和するための治療法の恩恵を受け得る対象として特定または選択された対象において、XLAを治療、抑制または緩和するための組成物および方法を開示する。代表的な実施形態は、ブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）の発現を回復または増加させる遺伝子療法用構築物および遺伝子療法の方法を含む。
2020517268.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）の発現維持用ポリヌクレオチドであって、
遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をコードする第１の配列；
プロモーターをコードする第２の配列；および
BTKをコードする第３の配列
を含むポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記UCOEが、２ｋｂ、１．５ｋｂ、１ｋｂ、０．７５ｋｂ、０．５ｋｂもしくは０．２５ｋｂ、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の長さ（ｋｂ）である、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
第１の配列が、配列番号１および／または配列番号２に示される核酸配列を含む、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記プロモーターがBTKプロモーターである、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記BTKプロモーターが、配列番号５に示される核酸配列を含む、請求項４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
第３の配列が、ヒトにおける発現用にコドン最適化されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
第３の配列が、配列番号６または配列番号７に示される配列を含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記プロモーターがＢ細胞特異的プロモーターである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記Ｂ細胞特異的プロモーターが、Ｂ細胞特異的プロモーターB29を含む、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記Ｂ細胞特異的プロモーターが内在性プロモーターである、請求項８または９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
１つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
前記１つ以上のエンハンサーエレメントが、少なくとも１つのDNase高感受性領域（DHS）を含む、請求項１１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記DNase高感受性領域が、DNase高感受性領域１（DHS1）、DNase高感受性領域２（DHS2）、DNase高感受性領域３（DHS3）、DNase高感受性領域４（DHS4）および／またはDNase高感受性領域５（DHS5）である、請求項１２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記DNase高感受性領域が、配列番号３に示される配列を含む、請求項１２または１３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記１つ以上のエンハンサーエレメントが、少なくとも１つのイントロン領域を含む、請求項１１〜１４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのイントロン領域が、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座に由来するものである、請求項１５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのイントロン領域が、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座のイントロン４、イントロン５および／またはイントロン１３である、請求項１５または１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記イントロン領域が、配列番号９に示される配列（イントロン４）、配列番号１０に示される配列（イントロン５）および／または配列番号１１に示される配列（イントロン１３）を含む、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記１つ以上のエンハンサーエレメントが、配列番号４（配列番号４：イントロン４〜５）に示される配列を含む、請求項１５または１６に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記１つ以上のエンハンサーエレメントが、配列番号１４または配列番号１５に示される配列を含む、請求項１５または１６に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記UCOEが逆方向または順方向である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記UCOEが順方向である、請求項２１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
前記１つ以上のエンハンサーエレメントが、配列番号１６に示される配列、配列番号１７に示される配列、配列番号１８に示される配列、配列番号１９に示される配列、および／または配列番号２０に示される配列を含む、請求項１１〜２２のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２４】
BTKプロモーターの上流の遺伝子をさらに含む、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
BTKプロモーターの上流の前記遺伝子が、BTKエンハンサーである、請求項２４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２６】
前記BTKエンハンサーが、配列番号２１または配列番号２２に示される配列を含む、請求項２５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２７】
細胞におけるブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）の発現維持用ベクターであって、
遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をコードする第１の配列；
プロモーターをコードする第２の配列；および
BTKをコードする第３の配列
を含むベクター。
【請求項２８】
第１の配列が、配列番号１および／または配列番号２に示される核酸配列を含む、請求項２７に記載のベクター。
【請求項２９】
前記プロモーターがBTKプロモーターである、請求項２７または２８に記載のベクター。
【請求項３０】
前記プロモーターが、配列番号５に示される核酸配列を含む、請求項２７〜２９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３１】
第３の配列が、ヒトにおける発現用にコドン最適化されている、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３２】
第３の配列が、配列番号６または配列番号７に示される配列を含む、請求項３１に記載のベクター。
【請求項３３】
Ｂ細胞特異的プロモーターをさらに含む、請求項２７〜３２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３４】
前記Ｂ細胞特異的プロモーターが、Ｂ細胞特異的プロモーターB29を含む、請求項３３に記載のベクター。
【請求項３５】
前記Ｂ細胞特異的プロモーターが内在性プロモーターである、請求項３３または３４に記載のベクター。
【請求項３６】
１つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含む、請求項２７〜３５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項３７】
前記１つ以上のエンハンサーエレメントが、少なくとも１つのイントロン領域を含む、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３８】
前記１つ以上のエンハンサーエレメントが、DNase高感受性領域（DHS）を含む、請求項３６に記載のベクター。
【請求項３９】
前記DNase高感受性領域が、DNase高感受性領域１（DHS1）、DNase高感受性領域２（DHS2）、DNase高感受性領域３（DHS3）、DNase高感受性領域４（DHS4）および／またはDNase高感受性領域５（DHS5）である、請求項３８に記載のベクター。
【請求項４０】
前記DNase高感受性領域が、配列番号３に示される配列を含む、請求項３８または３９に記載のベクター。
【請求項４１】
前記少なくとも１つのイントロン領域が、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座に由来するものである、請求項３７に記載のベクター。
【請求項４２】
前記少なくとも１つのイントロン領域が、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座のイントロン４、イントロン５および／またはイントロン１３である、請求項４１に記載のベクター。
【請求項４３】
前記イントロン領域が、配列番号９に示される配列（イントロン４）、配列番号１０に示される配列（イントロン５）および／または配列番号１１に示される配列（イントロン１３）を含む、請求項４２に記載のベクター。
【請求項４４】
前記１つ以上のエンハンサーエレメントが、配列番号４に示される配列を含む、請求項３６に記載のベクター。
【請求項４５】
前記１つ以上のエンハンサーエレメントが、配列番号１４または配列番号１５に示される配列を含む、請求項３６に記載のベクター。
【請求項４６】
前記UCOEが逆方向または順方向である、請求項２７〜４５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４７】
前記UCOEが順方向である、請求項４６に記載のベクター。
【請求項４８】
Ｂ細胞系特異的レンチウイルスベクターを用いたベクターである、請求項２７〜４７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項４９】
前記細胞がＢ細胞である、請求項２７〜４８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５０】
前記細胞が骨髄系細胞である、請求項２７〜４８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５１】
前記細胞が造血幹細胞である、請求項２７〜４８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５２】
前記細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項５１に記載のベクター。
【請求項５３】
前記１つ以上のエンハンサーエレメントが、配列番号１６に示される配列、配列番号１７に示される配列、配列番号１８に示される配列、配列番号１９に示される配列、および／または配列番号２０に示される配列を含む、請求項３６〜５２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５４】
BTKプロモーターの上流の遺伝子をさらに含む、請求項２７〜５３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５５】
BTKプロモーターの上流の前記遺伝子が、BTKエンハンサーである、請求項５４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５６】
前記BTKエンハンサーが、配列番号２１または配列番号２２に示される配列を含む、請求項５５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５７】
ブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）発現用細胞であって、
遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をコードする第１の配列；
プロモーターをコードする第２の配列；および
BTKをコードする第３の配列
を含むポリヌクレオチドを含む細胞。
【請求項５８】
前記ポリヌクレオチドがベクターに組み込まれている、請求項５７に記載の細胞。
【請求項５９】
前記ベクターがレンチウイルスベクターである、請求項５７または５８に記載の細胞。
【請求項６０】
Ｂ細胞である、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６１】
骨髄系細胞である、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６２】
造血幹細胞である、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６３】
ＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の細胞。
【請求項６４】
Ｂ細胞の生存、増殖および／または分化の促進を必要とする対象において、Ｂ細胞の生存、増殖および／または分化を促進する方法であって、
請求項５７〜６３のいずれか１項に記載の細胞、または請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドもしくは請求項２７〜５６のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞を前記対象に投与すること、
任意で、前記細胞を投与する前に、Ｂ細胞の生存、増殖および／もしくは分化を促進し得る治療法の恩恵を受け得る対象として前記対象を特定すること、ならびに／または
任意で、前記対象もしくは該対象から得られた生体試料において、Ｂ細胞の生存、増殖および／もしくは分化を測定すること
を含む方法。
【請求項６５】
前記細胞が前記対象から得られたものであり、該細胞が、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２７〜５６のいずれか１項に記載のベクターを導入することによって遺伝子組換えされている、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記投与が養子細胞移入によって行われる、請求項６４または６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記細胞がＢ細胞である、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞が骨髄系細胞である、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞が造血幹細胞である、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項６４〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記対象が雄性である、請求項６４〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記対象が、Ｘ連鎖無γグロブリン血症（XLA）に罹患している、請求項６４〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象が、γグロブリン置換療法を受けるべき対象として選択された対象である、請求項６４〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記対象が、標的化抗微生物剤を投与すべき対象として選択された対象である、請求項６４〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
Ｘ連鎖無γグロブリン血症（XLA）またはXLAに伴う症状の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、XLAまたはXLAに伴う症状を治療、抑制または緩和する方法であって、
請求項５７〜６３のいずれか１項に記載の細胞、または請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドもしくは請求項２７〜５６のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞を前記対象に投与すること、
任意で、XLAもしくはXLAに伴う症状に対する治療法の恩恵を受け得る対象として前記対象を特定すること、および／または
任意で、前記対象において、XLAの進行の改善もしくはXLAに伴う症状の改善を測定すること
を含む方法。
【請求項７６】
前記細胞が前記対象から得られたものであり、該細胞が、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２７〜５６のいずれか１項に記載のベクターを導入することによって遺伝子組換えされている、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記投与が養子細胞移入によって行われる、請求項７５または７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞がＢ細胞である、請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞が骨髄系細胞である、請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞が造血幹細胞である、請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞がＣＤ３４＋造血幹細胞である、請求項７５〜７７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記対象が雄性である、請求項７５〜８１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記対象が、γグロブリン置換療法を受けるべき対象として選択された対象である、請求項７５〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記対象が、標的化抗微生物剤を投与すべき対象として選択された対象である、請求項７５〜８３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
優先出願の参照による引用
本出願は、2017年4月21日に出願された米国仮特許出願第62/488,523号に基づく優先権を主張するものである。この出願に開示された内容は、参照によりその全体が本明細書に明示的に援用される。
【０００２】
連邦資金に関する陳述
本発明は、米国国立衛生研究所傘下の米国国立アレルギー感染症研究所によって付与された助成金第AI084457号に基づく支援を受けてなされたものである。
【０００３】
配列表の参照
本願は電子形式の配列表とともに出願されたものである。この配列表は、Sequence Listing SCRI.148WO.txtというファイル名で2018年4月17日に作成された140kbのファイルとして提供されたものである。この電子形式の配列表に記載の情報は、参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００４】
本発明の態様は、Ｘ連鎖無γグロブリン血症（XLA）を治療、抑制または緩和するための治療法の恩恵を受け得る対象として特定または選択された対象において、XLAを治療、抑制または緩和するための組成物および方法に関する。代表的な態様は、ブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）の発現を回復または増加させる遺伝子療法用構築物および遺伝子療法の方法を含む。
【背景技術】
【０００５】
Ｘ連鎖無γグロブリン血症（XLA）は、ブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）遺伝子の変異に起因する稀なＸ連鎖性遺伝子疾患である。BTK遺伝子に変異を起こした個体では、成熟Ｂ細胞が発生せず、成熟が停止したＢ細胞は、Ｂ細胞抗原受容体の結合やその他の細胞シグナルに応答性を示さない。XLAに罹患した男性は、病原体の攻撃に対して感染防御抗体による応答を惹起することができず、最終的にはウイルス感染症や細菌性感染症により死亡してしまう。現在の治療法は過去50年間で変化しておらず、免疫グロブリン置換療法と標的化抗微生物剤からなる治療が行われている。この治療法を実施しても、XLA患者は慢性感染症に頻繁に罹り、疾患を引き起こしたり命に関わったりするような様々な合併症のリスクが増加している。稀にではあるが、コンディショニングを行わずに、あるいは強度減弱コンディショニングを行ってXLA患者に幹細胞を移植する治療がなされているが、そのアウトカムは一定しない。XLAを抑制、治療または緩和するためのさらなる治療法が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
プロモーター、インスレーターおよびエンハンサーの各候補、ならびにコドン最適化したヒトBTK cDNA構築物の設計と試験を繰り返し、この結果に基づき、（マウスまたはヒトの）造血幹細胞に由来するＢ細胞および骨髄系細胞においてBTKの発現を維持することが可能な、レンチウイルス（LV）を用いた新規ベクター構築物を特定し、これを作製した。この新規ベクター構築物については、本発明の実施形態において述べている。本発明の実施形態によるベクター構築物を、エクスビボにおいてBTK欠損宿主に形質導入および移植したところ、驚くべきことに、BTKの発現が維持され、Ｂ細胞の発生が回復することが示された。本明細書に記載の代表的な実施形態のいずれかに示すように、本明細書に記載の構築物は、末端切断型遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）と、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座のイントロン領域に由来する保存されたエンハンサーエレメントとを利用しており、コドン最適化されたヒトBTK cDNAの発現を誘導することができる。
【０００７】
この構築物を使用したレンチウイルス（LV）ベクターは、マウス遺伝子療法実験の一次移植レシピエントおよび二次移植レシピエントにおいて、ウイルスによる毒性を認めることなく、Ｂ細胞および骨髄系細胞におけるBTKの発現を維持し、Ｂ細胞の発生および機能を回復させることが示された。したがって、この構築物は、ヒトXLAを治療、抑制または緩和するための、遺伝子療法用のユニークなLVベクターである。
【０００８】
第１の態様において、ブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）の発現維持用ポリヌクレオチドであって、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；およびBTKをコードする第３の配列を含むポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態において、前記UCOEは、２ｋｂ、１．５ｋｂ、１ｋｂ、０．７５ｋｂ、０．５ｋｂもしくは０．２５ｋｂ、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の長さ（ｋｂ）である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、配列番号１および／または配列番号２に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはBTKプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記BTKプロモーターは、配列番号５に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第３の配列は、ヒトにおける発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第３の配列は、配列番号６または配列番号７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはＢ細胞特異的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは、Ｂ細胞特異的プロモーターB29を含む。いくつかの実施形態において、前記B29プロモーター配列は、配列番号４６に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは内在性プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは１つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、少なくとも１つのDNase高感受性領域（DHS）を含む。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、DNase高感受性領域１（DHS1）、DNase高感受性領域２（DHS2）、DNase高感受性領域３（DHS3）、DNase高感受性領域４（DHS4）および／またはDNase高感受性領域５（DHS5）である。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、配列番号３に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、少なくとも１つのイントロン領域を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座に由来するものである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座のイントロン４、イントロン５および／またはイントロン１３である。いくつかの実施形態において、前記イントロン領域は、配列番号９に示される配列（イントロン４）、配列番号１０に示される配列（イントロン５）および／または配列番号１１に示される配列（イントロン１３）を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、配列番号４、配列番号１４または配列番号１５に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記UCOEは逆方向または順方向である。いくつかの実施形態において、前記UCOEは順方向である。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、配列番号１６に示される配列、配列番号１７に示される配列、配列番号１８に示される配列、配��番号１９に示される配列、および／または配列番号２０に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、BTKプロモーターの上流の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、BTKプロモーターの上流の前記遺伝子は、BTKエンハンサーである。いくつかの実施形態において、前記BTKエンハンサーは、配列番号２１または配列番号２２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、0.7UCOEは、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記エンハンサーは、配列番号３または配列番号４に示される配列を含む。
【０００９】
第２の態様において、細胞におけるBTKの発現維持用ベクターであって、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；およびBTKをコードする第３の配列を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態において、第１の配列は、配列番号１および／または配列番号２に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはBTKプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、配列番号５に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第３の配列は、ヒトにおける発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第３の配列は、配列番号６または配列番号７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはＢ細胞特異的プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは、Ｂ細胞特異的プロモーターB29を含む。いくつかの実施形態において、前記B29プロモーター配列は、配列番号４６に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは内在性プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは１つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、少なくとも１つのイントロン領域を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、DNase高感受性領域（DHS）を含む。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、DNase高感受性領域１（DHS1）、DNase高感受性領域２（DHS2）、DNase高感受性領域３（DHS3）、DNase高感受性領域４（DHS4）および／またはDNase高感受性領域５（DHS5）である。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、配列番号３に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座に由来するものである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座のイントロン４、イントロン５および／またはイントロン１３である。いくつかの実施形態において、前記イントロン領域は、配列番号９に示される配列（イントロン４）、配列番号１０に示される配列（イントロン５）および／または配列番号１１に示される配列（イントロン１３）を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、配列番号４、配列番号１４または配列番号１５に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記UCOEは逆方向または順方向である。いくつかの実施形態において、前記UCOEは順方向である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、Ｂ細胞系特異的レンチウイルスベクターを用いたベクターである。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、配列番号１６に示される配列、配列番号１７に示される配列、配列番号１８に示される配列、配列番号１９に示される配列、および／または配列番号２０に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、BTKプロモーターの上流の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、BTKプロモーターの上流の前記遺伝子は、BTKエンハンサーである。いくつかの実施形態において、前記BTKエンハンサーは、配列番号２１または配列番号２２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、0.7UCOEは、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記エンハンサーは、配列番号３または配列番号４に示される配列を含む。
【００１０】
第３の態様において、BTK発現用細胞であって、UCOEをコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；およびBTKをコードする第３の配列を含むポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ベクターに組み込まれている。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、0.7UCOEは、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記エンハンサーは、配列番号３または配列番号４に示される配列を含む。
【００１１】
第４の態様において、Ｂ細胞の生存、増殖および／または分化の促進または増強を必要とする対象において、Ｂ細胞の生存、増殖および／または分化を促進または増強する方法であって、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の細胞、または本発明の実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドもしくは本発明の実施形態のいずれか１つに記載のベクターを含む細胞を前記対象に投与すること、任意で、前記細胞を投与する前に、Ｂ細胞の生存、増殖および／もしくは分化を促進し得る治療法の恩恵を受け得る対象として前記対象を特定もしくは選択すること、ならびに／または任意で、前記細胞を投与した後に、前記対象もしくは該対象から得られた生体試料において、Ｂ細胞の生存、増殖および／もしくは分化を測定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は前記対象から得られたものであり、該細胞は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたは本発明の実施形態のいずれか１つに記載のベクターを導入することによって遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性である。いくつかの実施形態において、前記対象はＸ連鎖無γグロブリン血症（XLA）に罹患している。いくつかの実施形態において、前記対象は、γグロブリン置換療法を受けるべき対象として選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記対象は、標的化抗微生物剤を投与すべき対象として選択された対象である。いくつかの実施形態において、0.7UCOEは、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記エンハンサーは、配列番号３または配列番号４に示される配列を含む。
【００１２】
第５の態様において、Ｘ連鎖無γグロブリン血症（XLA）またはXLAに伴う症状の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、XLAまたはXLAに伴う症状を治療、抑制または緩和する方法であって、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の細胞、または本発明の実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドもしくは本発明の実施形態のいずれか１つに記載のベクターを含む細胞を前記対象に投与すること、任意で、XLAもしくはXLAに伴う症状に対する治療法の恩恵を受け得る対象として前記対象を特定もしくは選択すること、および／または任意で、前記対象において、XLAの進行の改善もしくはXLAに伴う症状の改善を測定することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、前記細胞は前記対象から得られたものであり、該細胞は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたは本発明の実施形態のいずれか１つに記載のベクターを導入することによって遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性である。いくつかの実施形態において、前記対象は、γグロブリン置換療法を受けるべき対象として選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記対象は、標的化抗微生物剤を投与すべき対象として選択された対象である。いくつかの実施形態において、0.7UCOEは、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記エンハンサーは、配列番号３または配列番号４に示される配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】XLA用に最適化された遺伝子送達プラットフォームを示す。
【００１４】
【図２】XLAの遺伝子療法用レンチウイルスベクターの最適化方法を示す。
【００１５】
【図３】前臨床モデルにおいて治療計画を実施する方法を示す。
【００１６】
【図４】いずれもヒトBTKを発現する0.7UCOEレンチウイルスベクターまたは0.7UCOE-I4,5レンチウイルスベクターを移入したXLAマウスから得た各リンパ球サブセット（骨髄（BM）Ｂ細胞、脾臓（SP）Ｂ細胞、腹腔液（PF）Ｂ細胞、単球および好中球）におけるBTKの発現をフローサイトメトリーで測定し、コントロールBTK+集団に対する割合（％）として示した。
【００１７】
【図５】Ｂ細胞の発生と機能の回復を示す。一次レシピエントから得た各Ｂ細胞サブセットにおいてBTKの発現を分析した結果を示す。脾臓の各Ｂ細胞サブセット（右のパネル）を最も未熟なサブセットから成熟したサブセットの順で示す。具体的には、早期Ｂ細胞の発生（プレＢ細胞、プロＢ細胞、未熟Ｂ細胞および成熟Ｂ細胞）から後期Ｂ細胞の発生（１型移行期（T1）Ｂ細胞、２型移行期（T2）Ｂ細胞、辺縁帯前駆（MZP）Ｂ細胞、辺縁帯（MZ）Ｂ細胞、および濾胞成熟（FM）Ｂ細胞）の順で示す。
【００１８】
【図６】0.7UCOE.BTKp.BTKベクターおよび0.7UCOE I-4,5 BTKp.BTKは、いずれもＢ細胞の発生と機能を回復することを示す。（Ａ）脾臓Ｂ細胞の絶対数を示す（右のパネル）。（Ｂ）IgM刺激に応答したＢ細胞の増殖を示す。ナイーブＢ細胞を可溶性IgMで刺激した。７２時間後における増殖BTK+Ｂ細胞の割合（％）をWT Mockで正規化して示す。
【００１９】
【図７】Ｔ細胞依存的抗原による免疫化に対する応答と自己抗体の産生を示す。（Ａ）アラム（Alum）を加えたNP-CGGで免疫化したマウスの血清中のNP特異的IgGをELISAで検出し、IgG標準品と比較してその濃度を定量し、累積データとして示した。ELISAを使用して、免疫前（−）、一次免疫後（10）および再投与すなわち二次免疫後（20）における高親和性NP特異的IgGの濃度を検出した。（Ｂ）実験のエンドポイントにおいて、各ベクターで処置したマウスの血清中の抗dsDNA IgG濃度および抗dsDNA IgG2c濃度をELISAで測定し、吸光度の測定値（OD450）として示した。ポジティブコントロールとして、自己免疫疾患WAS-/-キメラマウスから得た血清を使用する（黒色の三角）。
【００２０】
【図８】細胞１個あたりのウイルスの組み込み数を示す。（Ａ）一次移植マウスの細胞１個あたりのウイルスの平均組み込み数をqPCRで測定した。全骨髄細胞におけるウイルスの平均組み込み数を示し、脾臓CD43-細胞（Ｂ細胞）と脾臓CD43+細胞（非Ｂ細胞）とでウイルスの平均組み込み数を比較した。（Ｂ）一次移植マウスの脾臓CD43-Ｂ細胞集団において、BTK+Ｂ細胞の割合（％）を平均ウイルス組み込み数で除したものを示す。データは、６回の独立した実験の平均値±SEMを示し、n=9（WT Mock）、n=10（XLA Mock）、n=16（0.7UCOE.BTKp）、n=14（0.7UCOE.INT4,5 BTKp）とした。
【００２１】
【図９】４種のレンチウイルス（LV）構築物の発現プロファイルと、一次レシピエントマウスにおけるＢ細胞の発生と機能の回復を示す。（図９Ａ）マウス細胞においてヒトBTKを発現させるために使用した、RRLバックボーンを持つ各レンチウイルス構築物の模式図を示す。これらのレンチウイルス構築物は、BTKプロモーター（BTKp）、1.5kbの偏在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）またはEμエンハンサー、およびコドン最適化されたヒトBTK cDNA（co）を含んでいた。（図９Ｂ）遺伝子療法で処置したマウスの骨髄、脾臓および腹腔から得たＢ細胞および骨髄系細胞のBTKマーカーをフローサイトメトリーで測定し、BTK+集団の割合（％）として示した。（データは、１０回の独立した実験の平均値±SEMを示し、n=14（WT Mock）、n=12（KO Mock）、n=5（BTKp）、n=24（1.5kb.UCOE.BTKp）、n=18（1.5kb.UCOE.BTKp.co）、n=21（Eμ.BTKp）とした。）（図９Ｃ〜図９Ｅ）骨髄、脾臓および腹腔のＢ細胞（B220+）を、Ｂ細胞サブセットの表面マーカーで染色し、生リンパ球の数またはその割合（％）を分析した。（図９Ｃ）早期Ｂ細胞の発生（プロＢ細胞（CD43+、IgM-）、プレＢ細胞（CD43-、IgM-、IgD-）、未熟Ｂ細胞（CD43-、IgM+IgD-）および成熟Ｂ細胞（CD43-、IgM+、IgD+））を示す。（図９Ｄ）後期Ｂ細胞の発生（１型移行期（T1）Ｂ細胞（CD24hi、CD21-）、２型移行期（T2）Ｂ細胞（CD24hi、CD21int）、辺縁帯／辺縁帯前駆（MZ／MZP）Ｂ細胞（CD24hi、CD21hi）および濾胞成熟（FM）Ｂ細胞（CD24int、CD21int））を示す。（図９Ｅ）腹腔内Ｂ細胞（B2細胞（B220hi）、B1b細胞（B220lo、CD5-）およびB1a細胞（B220lo、CD5+））を示す。データは、１０回の独立した実験の平均値±SEMを示し、n=11（骨髄）、n=13（脾臓）、n=14（腹腔液）（WT Mock）；n=10（骨髄）、n=11（脾臓）、n=10（腹腔液）（KO Mock）；n=5（骨髄）、n=5（脾臓）、n=5（腹腔液）（BTKp）；n=20（骨髄）、n=21（脾臓）、n=22（腹腔液）（UCOE.BTKP）；n=14（骨髄）、n=14（脾臓）、n=17（腹腔液）（UCOE.BTKp.co）；n=18（骨髄）、n=19（脾臓）、n=20（腹腔液）（Eμ.BTKp）とした。（図９Ｆ）各ベクターで処置したマウスから得た全脾細胞を、培地のみ、抗マウスIgM、LPSまたはPMA／イオノマイシンで刺激し、３Ｈ−チミジンの取り込みにより増殖を測定し、３連のウェルを平均した１分間あたりのカウント数（cpm）として示した。データは、５回の独立した実験の平均値±SEMを示し、n=10（WT Mock）、n=7（KO Mock）、n=5（BTKp）、n=13（1.5kbUCOE.BTKp）、n=9（1.5kbUCOE.BTKp.co）、n=10（Eμ.BTKp）とした。（図９Ｇ〜図９Ｈ）各ベクターで処置したマウスの血清中の総IgG濃度（図９Ｇ）および総IgM濃度（図９Ｈ）をELISAで測定した。データは、４回の独立した実験の平均値±SEMを示し、n=9（WT Mock）、n=10（KO Mock）、n=2（BTKp）、n=19（1.5kb.UCOE.BTKp）、n=14（1.5kbUCOE.BTKp.co）、n=16（Eμ.BTKp）とした。（図９Ｉ）アラム（Alum）を加えたNP-CGGで免疫化したマウスの血清中のNP特異的IgG濃度をELISAで測定し、IgG標準品に対する相対量として示した。ELISAを使用して、免疫前（−）、免疫後（＋）およびその後の再投与後（＋＋）における低親和性NP特異的IgGの濃度（補足資料参照）および高親和性NP特異的IgGの濃度（ｉ）を検出した。データは、５回の独立した実験の平均値±SEMを示し、n=9（WT Mock）、n=10（KO Mock）、n=2（BTKp）、n=19（1.5.UCOE.BTKp）、n=14（1.5kb.UCOE.BTKp.co）、n=16（Eμ.BTKp）とした。図���示した実験群およびKO Mock群から得た全Ｂ細胞間またはＢ細胞サブセット間において、***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05とした。
【００２２】
【図１０】Eμ.BTKp遺伝子療法で処置したマウスが広範な特異性を有する様々な自己反応性IgG抗体を産生することを示す。（ａ）免疫化を行う前に、各ベクターで処置したマウスの血清中の抗dsDNA IgG濃度をELISAで測定し、吸光度の測定値（OD450）として示した。データは、１０回の独立した実験の平均値±SEMを示し、n=18（WT Mock）、n=16（KO Mock）、n=6（BTKp）、n=30（1.5kb.UCOE.BTKp）、n=18（1.5kb.UCOE.BTKp.co）、n=29（Eμ.BTKp）、n=2（WASpコントロール）とした。（ｂ）Eμ.BTKpで処置したマウス（n=23）において、抗dsDNA IgGのサブクラスのIgG2cおよびIgG3をELISAで測定した。（ｃ）Eμ.BTKpで処置した９匹のマウスの血清中における抗dsDNA IgGサブクラスの濃度をELISAで測定した。図に示した実験群間において、***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05とした。
【００２３】
【図１１】1.5kbUCOE.BTKpベクターおよび1.5kbUCOE.BTKp.coベクターは、一次レシピエントおよび二次レシピエントにおいて、コピー数が少なくてもBTKの発現を維持することを示す。二次移植マウスから得た脾臓の顆粒球（CD11b+、GR1hi）においてBTK+細胞が占める割合（％）をフローサイトメトリーで評価した。（ａ）二次移植レシピエントにおけるBTK+顆粒球の割合（％）を分析した結果を示すグラフである。データは、３回の独立した実験の平均値±SEMを示し、n=3（WT Mock）、n=2（KO Mock）、n=3（BTKp）、n=8（1.5.UCOE.BTKp）、n=7（Eμ.BTKp）とした。（ｂ）一次移植マウスの脾細胞において、BTK+顆粒球の割合（％）を平均ウイルス組み込み数で除したものを示す。（ｃ〜ｄ）一次移植マウスおよび二次移植マウスの骨髄（ｃ）および脾細胞（ｄ）における細胞１個あたりの平均ウイルス組み込み数をqPCRで測定した。データは、８回の一次移植実験および３回の二次移植実験の平均値±SEMを示し、n=5（一次移植実験）、n=3（二次移植実験）（BTKp）；n=18（一次移植実験）、n=8（二次移植実験）（UCOE.BTKp）；n=10（一次移植実験）、n=1（二次移植実験）（UCOE.BTKp.co）；n=18（一次移植実験）、n=7（二次移植実験）（Eμ.BTKp）とした。図に示した実験群間において、***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05とした。
【００２４】
【図１２】0.7kb UCOE.BTKp.coレンチウイルスを使用した遺伝子療法で処置したマウスでの、罹患した造血細胞系列におけるBTKの発現の回復と、該マウスにおけるＢ細胞の発生を示す。移植の１６〜２５週間後における、各Ｂ細胞サブセット中のBTK+細胞の割合と、再構成された各Ｂ細胞サブセットの細胞数を評価した。（ａ）0.7kbの偏在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を含むRRLバックボーンを持ち、コドン最適化されたヒトBTKを発現するレンチウイルス構築物の模式図を示す。（ｂ〜ｃ）遺伝子療法で処置した群から得た骨髄（ｂ）および脾臓（ｃ）の各リンパ球サブセット（好中球、単球、Ｂ細胞およびＴ細胞）におけるBTK+細胞の割合（％）をフローサイトメトリーで測定した。データは、７回の独立した実験の平均値±SDを示し、n=13（WT Mock）、n=12（KO Mock）、n=36（0.7kb.UCOE.BTKp.co）とした。（ｄ）脾臓から得た好中球（CD11b+GR1+）、単球（CD11b+）、Ｂ細胞（B220+）およびＴ細胞（CD4+CD8+）におけるBTKの発現を示した代表的なフローサイトメトリープロットを示す。（ｅ）腹腔内Ｂ細胞（CD19+）および各Ｂ細胞サブセット（B1a細胞（CD5-CD43+）、B1b細胞（CD5+CD43+）およびB2細胞（CD5-CD43-））におけるBTKの発現を示す。n=2（WT Mock）、n=2（KO Mock）、n=8（0.7kb.UCOE.BTKp.co）とした７回の独立した実験の代表的なデータを標準偏差（SD）とともに示す。（ｆ）各サブセットにおけるBTKの発現をフローサイトメトリーで測定したところ、BTKが発現したことによりＢ細胞の発生が回復したことが示された。早期Ｂ細胞の発生（プロＢ細胞（CD43+、IgM-）、プレＢ細胞（CD43-、IgM-、IgD-）、未熟Ｂ細胞（CD43-、IgM+IgD-）および成熟Ｂ細胞（CD43-、IgM+、IgD+））、ならびに後期Ｂ細胞の発生（１型移行期（T1）Ｂ細胞（CD24hi、CD21-）、２型移行期（T2）Ｂ細胞（CD24hi、CD21int）、辺縁帯／辺縁帯前駆（MZ/MZP）Ｂ細胞（CD24hi、CD21hi）、および濾胞成熟（FM）Ｂ細胞（CD24int、CD21int））を示す。n=13（WT Mock）、n=12（KO Mock）、n=36（0.7kb.UCOE.BTKp.co）とした７回の独立した実験の累積データを示す。（ｇ〜ｈ）骨髄（ｇ）および脾臓（ｈ）における各Ｂ細胞サブセットの総細胞数を示す。（ｉ）腹腔液中のリンパ球集団全体に占める各Ｂ細胞サブセットの割合（％）を示す。データは、２回の独立した実験の平均値±SDを示し、n=4（WT Mock）、n=4（KO Mock）、n=11（0.7kbUCOE.BTK.co）とした。アスタリスク（*）は、KO Mockと0.7kb.UCOE.BTK.coの間で有意差があることを示す。P値は、Sidak法を使用した一元配置分散分析により算出した（***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05）。
【００２５】
【図１３】0.7.UCOE.Bkp.coレンチウイルスを用いた遺伝子療法を実施後の、一次レシピエントにおけるＢ細胞の機能の再構成を示す。骨髄移植の１６〜２５週間後に実施したＢ細胞機能アッセイの結果を示す。スケールバーは平均値±SDを示す。（ａ）抗マウスIgM抗体、LPSまたはPMA／イオノマイシンを加えてＢ細胞（CD43-脾細胞）を７２時間インキュベートした後、１回以上細胞分裂したＢ細胞の割合（％）を示す（CFSEの希釈により測定し、フローサイトメトリーで分析した）。n=4（WT Mock）、n=3（KO Mock）およびn=5（0.7.UCOE.BTKp.BTK.co）とした１回の独立した実験の代表的なデータを示す。（ｂ）IgMで刺激した７２時間後に、CFSE標識Ｂ細胞（CD43-脾細胞）を、生細胞集団とB220+細胞集団でゲーティングしたフローサイトメトリー分析を示す（フローサイトメトリープロット作成中）。（ｃ）アラム（Alum）を加えたNP-CGGで免疫化したマウスの血清中の高親和性NP特異的IgG濃度をELISAで測定した結果を示す。各濃度は、免疫前（−）、免疫後（＋）およびその後の再投与後（＋＋）に測定する。データは、７回の独立した実験を示し、一次免疫（＋）では、n=11（WT Mock）、n=10（KO Mock）、n=13（0.7kb.UCOE.BTKp.co）とし、再投与（＋＋）では、n=3（WT Mock）、n=3（KO Mock）、n=3（0.7kb.UCOE.BTKp.co）とした。移植の１６〜２５週間後に、一次免疫化レシピエントの血清中の（ｄ）総IgG濃度および総IgM濃度ならびに（ｅ）抗dsDNA抗体濃度をELISAで測定した。データは、７回の独立した実験から得たものであり、n=10（WT Mock）、n=8（KO Mock）およびn=26（0.7.UCOE.BTKp.BTK.co.）とした。ポジティブコントロールとして、血清中の抗DNA抗体濃度が高い２種のWAS自己免疫キメラの血清を使用した（ｅ）。P値は、Sidak法を使用した一元配置分散分析により算出した（***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05）。
【００２６】
【図１４】遺伝子療法で処置した骨髄細胞をTBK-/-二次レシピエントに連続継代移植しても、ウイルスコピー数およびBTKの発現は維持されることを示す。一次レシピエントから得た骨髄を二次レシピエントに移植し、１６週間後に骨髄（ａ）および脾臓（ｂ）の罹患した細胞系列におけるBTK+発現細胞の割合（％）をフローサイトメトリーで測定した。データは、２回の独立した実験を示し、n=4（WT Mock）、n=4（KO Mock）、n=19（0.7UCOE.BTKp.BTKco）とした。（ｃ）一次レシピエントから得た全骨髄細胞、脾臓Ｂ細胞（CD43-）および脾臓非Ｂ細胞（CD43+）から抽出したゲノムDNAをqPCRで分析することによって測定したウイルスコピー数（VCN）を示す。（ｄ）二次レシピエントマウスから得た全骨髄細胞および脾細胞におけるウイルスコピー数を示す。各ドットは１匹のマウスを示す。データは、一次レシピエント（n=21、0.7.UCOE.BTKp.BTK.co）および二次レシピエント（n=11、0.7.UCOE.BTKp.BTK.co）に対して行った７回の独立した実験から得た。（ｅ）一次レシピエントおよび二次レシピエントの脾臓から抽出したゲノムDNAにおいてメチル化を評価した。一次レシピエントは、n=2（BTKp.BTK）、n=5（1.5kb UCOE.BTKp.BTK）、n=6（Eμ.BTKp.BTK）およびn=6（0.7kb.UCOE.BTKp.co）とした。二次レシピエントは、n=4（1.5kb.UCOE.BTKp.BTK）およびn=6（0.7UCOE.BTKp.co）とした。いずれのパネルも平均値±SDを示し、P値はKO Mockの平均値と0.7.UCOE.BTKp.BTK.coの平均値を比較したものである。P値は、Sidak法を使用した一元配置分散分析により算出した（***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05）。
【００２７】
【図１５】0.7UCOE.BTKp.coベクターが、XLAに罹患したCD34細胞において少ないコピー数でBTKの発現を持続することを示す。XLAに罹患したCD34細胞およびコントロールCD34細胞に、様々な感染多重度（MOI）で0.7UCOE.BTKp.coを形質導入し、インビトロで１５日間培養した。（ａ）正常CD34細胞およびXLAに罹患したCD34細胞へのレンチウイルスによる形質導入のプロトコルを示す模式図である。100ngのヒトTPO、ヒトSCFおよびヒトFlt3を添加したSCGM培地中で細胞を４８時間刺激した。0.7UCOE.BTKp.coを細胞に形質導入し、１５日間培養して増殖させた。１５日目に、BTKの発現およびウイルスコピー数について細胞を分析した。（ｂ）XLA患者から採取したCD34細胞を様々なMOIで形質導入し、１５日後にBTK染色した代表的なフローサイトメトリープロットを示す。（ｃ）形質導入の２４時間後にフローサイトメトリーで測定した形質導入細胞の生存率を示す。（ｄ）１５日間培養した後に回収した全細胞からゲノムDNAを抽出し、qPCRで分析することによって測定したウイルスコピー数（VCN）を示す。データは、２連のウェルで実施した３回の独立した実験から得た平均値±SDを示す。各ドットは、一人の健常ドナーまたはXLAドナーを示す。
【００２８】
【図１６】BTKプロモーターが、マウスにおいて内在性BTKの発現パターンを模倣することを示す。（ａ〜ｂ）骨髄、脾臓、腹腔洗浄液、末梢血および胸腺を野生型マウスから採取し、各細胞のＢ細胞マーカー、骨髄系細胞マーカー、Ｔ細胞マーカー、NK細胞マーカー、および細胞内BTKを染色し、フローサイトメーターで測定した。凡例に示すように、様々な組織から得た各試料を様々な形の記号で示す。各サブセットにおけるBTK+細胞の割合（％）（ａ）と、これらのBTK+細胞の蛍光強度の中央値（ｂ）を示す。（ｃ）B29プロモーター（上のパネル）または内在性BTKプロモーターBTKp（下のパネル）の制御下に、RRLバックボーン、EμエンハンサーおよびヒトBTK cDNAを組み込んだレンチウイルス構築物の模式図を示す。（ｄ〜ｅ）Eμ.B29またはEμ.BTKpを用いた遺伝子療法で処置したKOマウスから骨髄細胞、脾細胞および腹腔細胞を採取し、Ｂ細胞マーカー（CD11b-、B220+）、骨髄系細胞マーカー（CD11b+）、Ｔ細胞マーカー（CD11b-、CD3+）、細胞内BTKを染色し、フローサイトメトリーで分析した。（ｄ）BTK+細胞の割合（％）を示す。（ｅ）図に示した細胞集団におけるBTK染色の蛍光強度の中央値を示す。データは、n=4（EμB29）およびn=5（EμBTKp）とした２回の独立した実験の平均値±SEMを示す。Eμ.B29とEμ.BTKpの間において、***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05とした。
【００２９】
【図１７】（ａ）T2Aに連結されたGFPに融合した野生型またはコドン最適化されたヒトBTK cDNAとEμエンハンサーを含み、BTKプロモーターの制御下にあるレンチウイルス構築物の模式図を示す。（ｂ）ニワトリBTK-/-DT40細胞にBTK-GFP構築物またはcoBTK-GFP構築物を形質導入した。ヒストグラムはGFPおよびBTKの発現を示す。（ｃ）BTK-GFP形質導入細胞およびcoBTK-GFP形質導入細胞を、Indo-1エステルAM蛍光色素で染色し、抗IgMで刺激した。カルシウムの動員をフローサイトメトリーにより観察した。
【００３０】
【図１８】（ａ）遺伝子療法で処置したKOマウスから得た末梢血中のＢ細胞および骨髄系細胞におけるBTKの発現をフローサイトメトリーで分析した代表的なプロットを示す。（ｂ）遺伝子療法で処置したマウスの骨髄、脾臓および腹腔からＢ細胞および骨髄系細胞を採取し、各細胞のBTKマーカーをフローサイトメトリーで測定し、BTK+細胞の蛍光強度の中央値を示した。（データは、１０回の独立した実験の平均値±SEMを示し、n=14（WT Mock）、n=12（KO Mock）、n=5（BTKp）、n=24（1.5kb.UCOE.BTKp）、n=18（1.5kb.UCOE.BTKp.co）、n=21（Eμ.BTKp）とした。）（ｃ）遺伝子療法で処置したマウスの骨髄細胞を早期Ｂ細胞発生マーカーで染色した代表的なフローサイトメトリープロットを示す。（ｄ）Hardy分類に従った分画Ｉ（IgMlo、IgDhi）、分画II（IgMhi、IgDhi）、分画III（IgMhi、IgDlo）（この順で成熟度が低下する）に含まれるＢ細胞の割合（％）を示すグラフである。各層のリングは１匹のマウスを示し、各分画中のＢ細胞の割合の平均値（％）を円グラフの中に示す。データは、１１回の独立した実験の平均値±SEMを示し、n=18（WT Mock）、n=14（KO Mock）、n=7（BTKp）、n=43（1.5kb.UCOE.BTKp）、n=18（1.5kb.UCOE.BTKp.co）、n=23（Eμ.BTKp）とした。（ｅ〜ｆ）アラム（Alum）を加えたNP-CGGによる免疫化の前（−）およびその後（＋）において、各ベクターで処置したマウスの血清中のNP特異的IgG濃度をELISAで測定し、IgG標準品に対する相対量として示した。すべての群（ｅ）および各マウス（ｆ）における低親和性NP特異的抗体を示す。データは、５回の独立した実験の平均値±SEMを示し、n=9（WT Mock）、n=10（KO Mock）、n=2（BTKp）、n=19（1.5.UCOE.BTKp）、n=14（1.5kb.UCOE.BTKp.co）、n=16（Eμ.BTKp）とした。（ｇ）TNP-Ficolで免疫化したマウスの血清中のTNP特異的IgM濃度をELISAで測定し、IgM標準品に対する相対量として示した。データは、３回の独立した実験の平均値±SEMを示し、n=4（WT）、n=6（WT Mock）、n=4（KO）、n=3（KO Mock）、n=14（UCOE.BTKp）とした。各グラフに示した実験群とKO Mock群の間において、***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05とした。
【００３１】
【図１９】（ａ）高力価または低力価の抗dsDNA IgGを産生するEμ.BTKp一次移植マウスをコントロールと比較した生存曲線を示す。（ｂ）Eμ.BTKp一次移植マウスにおいて、フローサイトメトリーで測定したBTK+細胞におけるBTKのMFIとELISAで測定した抗dsDNA IgGの力価との間の相関関係を示す。
【００３２】
【図２０】WT Mockを導入したマウス（４匹）、1.5kb.UCOE.BTKpを導入したマウス（４匹）およびEμ.BTKpを導入したマウス（８匹）から得た血清を自己抗原アレイで分析し、88種のマウス抗原に対して反応性を示すIgMおよびIgGのレベルを調べたことを示す。各行のデータをＺスコアに変換した。Ｚスコアでは、最も低い反応性（赤色）から最も高い反応性（青色）までが比色定量スケールで示される。
【００３３】
【図２１】Ｂ細胞の発生とBTK酵素が関与する経路を示す。
【００３４】
【図２２】遺伝子療法用の最適なBTKレンチウイルスベクターの開発を示す。
【００３５】
【図２３】内在性BTKプロモーターを含むレンチウイルスベクターを示す。図に示すように、A2プロモーターが削除され、2kb CBX3-HNRPA2B1エレメント（1.5kbのUCOE）が挿入されているが、CBX3は逆方向で保持されている。
【００３６】
【図２４】内在性BTKプロモーターを含むレンチウイルスベクターの作製を示す。図に示すように、Ｂ細胞においてBtkのMFIが高くなることはEμと関連性がある。
【００３７】
【図２５】内在性BTKプロモーターを含むレンチウイルスベクターのFACSアッセイの結果を示す。
【００３８】
【図２６】ベクターで処置したマウスの脾細胞から得た骨髄系細胞におけるBTKの発現を示す。
【００３９】
【図２７】Ｂ細胞特異的プロモーターであるEμ.B29を含むBTK発現レンチウイルスを導入したＢ細胞におけるBTKの発現を測定した結果を示す。
【００４０】
【図２８】プロモーター領域としてBTKpro.BTKを含むレンチウイルスベクターから発現させた、Ｂ細胞および単球におけるBTKの発現を示す。
【００４１】
【図２９】プロモーター領域としてのBTKpro.BTKと遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を含むレンチウイルスベクターから発現させた、Ｂ細胞および単球におけるBTKの発現を示す。
【００４２】
【図３０】プロモーター領域としてのEμ.BTKpro.BTK（BTKプロモーター）とhuBTKを含むレンチウイルスベクターから発現させた、Ｂ細胞および単球におけるBTKの発現を示す。
【００４３】
【図３１】骨髄、脾臓および腹腔から得たＢ細胞および骨髄系細胞における、いくつかの種類のBTKプロモーターによるBTK発現プロファイルを示す。
【００４４】
【図３２】骨髄、脾臓および腹腔から得たＢ細胞および骨髄系細胞における、いくつかの種類のBTKプロモーターによるBTK発現プロファイルを示す。使用したベクターは、WT Mock、DKO Mock、BTKp、UCOE BTKp、UCOE.BTKp.coおよびEμBTKpであった。
【００４５】
【図３３】各成熟Ｂ細胞サブセットにおけるＢ細胞の発生の回復を示す。黒色の領域は、より成熟度の高い末梢Ｂ細胞集団を示す。
【００４６】
【図３４】各Ｂ細胞集団（骨髄、脾臓および腹腔）において再構成されて発生したＢ細胞の数を示す。１種類のベクターにつき最大で40匹のレシピエントマウスと、同様の数のコントロールから得た知見をまとめたデータを示す。
【００４７】
【図３５】４種のレンチウイルスベクター（Mock WT、DKO Mock、UCOE.BTKp含有レンチウイルスベクターおよびEμ.BTKpレンチウイルスベクター）のいずれかを発現した細胞におけるＢ細胞の増殖を示す。生細胞染色色素の希釈に対してBtk染色をプロットしたところ、UCOEを使用した実験では、WTマウスと非常に類似した結果が得られることが示された。
【００４８】
【図３６】WTベクター、WT Mockベクター、DKOベクター、DKO Mockベクター、UCOE.BTKpベクターまたはEμ.BTKpベクターで形質導入した細胞におけるＢ細胞の増殖を示す。
【００４９】
【図３７】WTベクター、WT Mockベクター、DKOベクター、DKO Mockベクター、BTKpベクター、UCOE.BTKpベクターまたはEμ.BTKpベクターで形質導入した細胞におけるIgMおよびIgGの産生を測定した結果を示す。下のパネルは、WTベクター、WT Mockベクター、DKOベクター、DKO Mockベクター、UCOE.BTKpベクター、WT-0ベクターまたはKO-0で形質導入した細胞におけるＴ非依存性免疫応答を示す。ここでも、Eμプロモーターを使用した場合のIgG量が、WT MockレシピエントにおけるIgG量をわずかに上回ったことには注目されたい。
【００５０】
【図３８】WTベクター、WT Mockベクター、DKOベクター、DKO Mockベクター、BTKpベクター、UCOE.BTKpベクター、UCOE.BTKp.coベクター、WT-0ベクター、Eμ.BTKpベクターまたはKO-0ベクターで形質導入した細胞におけるＴ依存性免疫応答を示す。
【００５１】
【図３９】Ｔ依存性免疫化後の親和性成熟を示す。UCOEを形質導入したマウスおよびコントロールにおける親和性成熟は非常によく似ていた。
【００５２】
【図４０】自己抗体が産生された証拠を示す。
【００５３】
【図４１】WT Mockベクター、UCOE.BTKpベクターまたはEμ.BTKpベクターを含む各細胞のヒートマップにより、自己抗体が産生された証拠を示す。この実験は、IgMおよびIgGの産生を調べるために実施した。
【００５４】
【図４２】BTKを発現したマウスの生存率（％）と抗体量の関連性を示す。
【００５５】
【図４３】二次レシピエントマウスにおいて、BTKを発現した好中球における長期的な幹細胞マーカーの発現を示す。
【００５６】
【図４４】Mockベクター、BTKpベクター、UCOE.BTKpベクター、UCOE.BTKp.coベクターまたはEμ.BTKpベクターを導入した一次レシピエントおよび二次レシピエントにおけるウイルスコピー数あたりの長期的な幹細胞マーカーの発現を示す。
【００５７】
【図４５】長期生存率に対するレンチウイルス療法の影響を示す。
【００５８】
【図４６】BTKプロモーターを含むレンチウイルスにおいて別のエンハンサーエレメントを使用した試験の概要を示す。
【００５９】
【図４７】0.7UCOE.BTKpおよび0.7UCOE.IE.BTKpがBTKの発現と脾臓Ｂ細胞の数を回復することを示す。
【００６０】
【図４８】0.7UCOE.BTKpおよび0.7UCOE.IE.BTKpがＢ細胞の機能を回復することを示す。
【００６１】
【図４９】0.7UCOE.IEの安全性プロファイルが0.7UCOEよりも改善していることを示す。
【００６２】
【図５０】DNase高感受性領域を含む新たなBTK構築物を示す。
【００６３】
【図５１】DNase高感受性領域の同定を示す。
【００６４】
【図５２】細胞においてBTKの発現を評価した構築物の模式図を示す。
【００６５】
【図５３】DNase高感受性領域（DHS）を含む構築物と0.7UCOEおよび0.7UCOE.IEとのインビボでの比較を示す。
【００６６】
【図５４】移植の１５週間後の末梢血リンパ球分布において、Ｂ細胞、Ｔ細胞、単球および好中球が占める割合を示す。また、放射線非照射KOベクター、KO Mockベクター、0.7UCOEベクター、0.7UCOE.IEベクター、0.7UCOE.DHS4ベクター、0.7UCOE.DHS12ベクター、0.7UCOE.DHS124ベクター、0.7UCOE1-5ベクター、WT Mockベクターおよび放射線非照射WTベクターの各ベクターを導入した細胞におけるリンパ球サブセットにおいてBTKの再構成が示された。
【００６７】
【図５５】KO Mockベクター、0.7UCOEベクター、0.7UCOE.IEベクター、0.7UCOE.DHS4ベクター、0.7UCOE.DHS12ベクター、0.7UCOE.DHS124ベクター、0.7UCOE1-5ベクターおよびWT Mockベクターを導入した細胞におけるBTK実験の要約を示す。
【００６８】
【図５６】UCOEエレメントまたはDHS4エレメントを含むベクターを導入した細胞におけるBTKの発現を示す。
【００６９】
【図５７】0.7UCOE.BTKp.coBTKベクター、KO Mockベクター、0.7UCOEベクター、DHS4ベクター、DHS1-5ベクターまたはWT Mockベクターを導入した細胞におけるBTK発現実験を示す。
【００７０】
【図５８】KO Mockベクター、WT Mockベクター、0.7UCOEベクター、DHS4ベクターまたはDHS1-5ベクターを導入した細胞を移植してから１２週間後における末梢血リンパ球の分布を示す。
【００７１】
【図５９】放射線非照射KOベクター、KO Mockベクター、0.7UCOEベクター、DHS4ベクター、DHS1-5ベクター、WT Mockベクターまたは放射線非照射WTベクターを導入した６週間後および１２週間後の末梢血リンパ球分布において、Ｂ細胞、単球および好中球が占める割合を示す。
【００７２】
【図６０】放射線非照射KOベクター、KO Mockベクター、0.7UCOEベクター、DHS4ベクター、DHS1-5ベクター、WT Mockベクターまたは放射線非照射WTベクターを導入した６週間後および１２週間後のＢ細胞、単球および好中球におけるBTKの発現を示す。
【００７３】
【図６１】細胞を移植してから１２週間後に採取した血液中の各細胞サブセットにおいてBTKが発現されていることを示す。
【００７４】
【図６２】当初のcoBTK（コドン最適化されたBTK）と新たなcoBTKをインビトロで比較するための実験セットアップを示す。
【００７５】
【図６３】TBK系統から得た陰性細胞に、同じ量にそろえたウイルスを添加したインビトロでの比較（７日目にBTK染色）を示す。
【００７６】
【図６４】BTK発現用のレンチウイルスベクターを様々な濃度で導入した細胞におけるBTK発現の割合（％）を示す。使用したベクターは、KO Mockベクター、0.7UCOEベクター、DHS4ベクター、0.7UCOE.newcoBTKベクター、0.7UCOE.newcoBTKベクターおよびWT脾臓ベクターであった。
【００７７】
【図６５】当初のcoBTKと新たなcoBTKのインビボでの比較を示す。
【００７８】
【図６６】UCOEエレメントを最適化してBTKの発現を増加または増強するための別の手法を示す。
【００７９】
【図６７】前記1.5kbのUCOEエレメントを最適化してBTKの発現を増加または増強するための別の手法を示す。
【００８０】
【図６８】ウイルス液量をそろえたインビトロ試験における0.7UCOE.BTKpと0.7UCOEfwd.BTKpの比較を示す。
【００８１】
【図６９】臨床用のBTK LV構築物の完成までのアウトラインを示す。
【００８２】
【図７０】臨床用のBTK LV構築物の完成までのアウトラインと、コドン最適化したBTKの最終的なインビボ試験の計画を示す。
【００８３】
【図７１】アフェレーシス療法が承認されたXLA患者の幹細胞を示す表である。
【００８４】
【図７２】NSGマウスにおけるヒトキメラを示す。
【００８５】
【図７３】骨髄および脾臓のＢ細胞におけるヒトリンパ球の再構成を示す。
【００８６】
【図７４】移植されたXLA罹患幹細胞の（脾臓における）表現型（IgDやIgMの発現など）を示す。
【００８７】
【図７５】移植されたXLA罹患幹細胞の（脾臓における）表現型（CD24やCD38の発現など）を示す。
【００８８】
【図７６】Ｂ細胞の発生停止（骨髄）を示し、XLA群と健常群の間でプロＢ細胞の割合（％）が等しいことを示す。
【００８９】
【図７７】Ｂ細胞の発生停止（骨髄）を示し、XLA患者は健常コントロールよりもプレＢ細胞の割合（％）が有意に高いことを示す。
【００９０】
【図７８】Ｂ細胞の発生停止（骨髄）を示し、XLA患者では、プレＢ細胞期で分化が停止することを示す。プレＢ細胞は脾臓に遊走することができる。CD179α/CD179β代替軽鎖は、シグナル伝達因子であるCD79α/CD79βヘテロダイマーとも会合して、膜結合型Igμ重鎖にジスルフィド結合し、いわゆるプレＢ細胞受容体（preBCR）と呼ばれるＢ細胞受容体様構造を形成する。
【００９１】
【図７９】Ｂ細胞の発生停止（骨髄）を示す。XLAに罹患したＢ細胞の発生は、プレＢ細胞期で停止する。プレＢ細胞は脾臓に遊走することができる。
【００９２】
【図８０】Ca2+の流入によってＢ細胞が機能することを示す。しかしながら、XLAに罹患したＢ細胞では、IgMが発現しているため、コントロール細胞と比較してCa2+を流入させることができない。
【００９３】
【図８１】Ｂ細胞発生経路の停止を示す。XLAの影響により、Ｂ細胞の発生がプレＢ細胞期で停止する。
【００９４】
【図８２】実験の結果と結論の概要を示す。
【００９５】
【図８３】レンチウイルスによるヒト幹細胞への形質導入の概要を示した図を示す。
【００９６】
【図８４】ヒト造血幹細胞（HSC）を用いた前臨床モデルの構築の概要を示した図を示す。
【００９７】
【図８５】レンチウイルスによりヒト幹細胞に形質導入した結果を示す。図に示すように、0.7UCOE.BTKp.BTKでは、DHS4と比べて生存率が70％となった。
【００９８】
【図８６】XLA P2患者における１５日目のBTKの発現を示す。図に示すように、非選択環境下において、0.7UCOE.BTKpBTKは、DHS4と比べてBTKの発現が高くなる。
【００９９】
【図８７】本実験と追跡実験の結論の概要を示す。
【０１００】
【図８８】ヒト造血幹細胞（HSC）の前臨床モデルの構築を示す。この実験では、MockベクターまたはUCOE.BTKp.coベクターを使用してCD34+細胞に形質導入する。
【０１０１】
【図８９】ヒト造血幹細胞（HSC）の前臨床モデルの構築を示す。UCOE.BTKpro.co-opBTK（UCOE.BTKp.co）GFPベクターを使用して細胞に形質導入した。
【０１０２】
【図９０】NSGレシピエントマウスに形質導入するための実験方法を示した図を示す。
【０１０３】
【図９１】形質転換したレシピエントマウスから得た結果を示す。具体的には、GFPの発現量（％）、骨髄細胞および脾細胞において発現したウイルスのコピー数、ならびにＢ細胞および骨髄系細胞における発現を示す。
【０１０４】
【図９２】マウスとヒトのBTK遺伝子配列を比較することによって、保存された非コード配列を同定した分析結果と、BTKの発現について試験したすべてのベクターを示す。保存された非コード配列は、BTKプロモーターの内部、BTKプロモーターの上流かつ隣接遺伝子（BTKエンハンサーすなわちBTKe）の近傍、イントロン１内の一部、イントロン４の内部、イントロン５の内部およびイントロン１３の内部に同定され、その位置が特定された。
【０１０５】
【図９３】1.5kbのUCOEの末端を切断して0.7kbとし、DNAエンハンサーエレメントとして機能しうる領域を特定することによって、レンチウイルス構築物の力価とBTKの発現を向上できる可能性があることを検討した結果を示す。（ａ）1.5kbの偏在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）の末端を切断して0.7kbとした結果を示す。UCOEエレメントは、ハウスキーピング遺伝子CBX3とハウスキーピング遺伝子HNRPA2B1が互いに外側に転写されるプロモーター領域にまたがる大きなCpGリッチ領域に存在し、タンパク質発現構築物において使用するために、従来から様々な研究グループによって1.5〜2.2kbの長さの領域になるように末端切断が行われている。本実験で使用する1.5kbのUCOEは、CBX3のエキソン１からCBX3の選択的エキソン１を超えて伸びている。この領域を0.7kbのサイズになるように末端切断すると、選択的エキソン１の下流の領域が除去される。（ｂ）ENCODEデータベースを利用して、BTK遺伝子のイントロン領域からDNase I高感受性領域（DHS）を同定し、UCSC Genome Browser on Human Feb. 2009 （GRCh37/hg19） Assemblyを使用して視覚化した。５つのDHSを同定し、DHS1、DHS2、DHS3、DHS4およびDHS5として順に示した（青色の四角）。ENCODEを利用したゲノムセグメンテーションによって、DHS4の周辺に、予測されたエンハンサーエレメントが同定された（黄色の四角）。エキソンは黒色の四角で示す。配列の長さは、各DHSの下に記載する。これらのDHS配列を様々に組み合わせて0.7UCOE.BTKp.coBTK構築物にクローニングし、インビトロで試験した（データ示さず）。（ｃ）インビトロにおいてマウス（TBK）系統由来の陰性細胞への形質導入実験を実施し、２種のコドン最適化BTKによるBTKの発現量を比較した。この２種のコドン最適化BTKとして、coBTK（図１〜２）と、Staalら（Leukemia 2010）によって報告されているコドン最適化BTK（本明細書においてco2BTKと呼ぶ）を使用した。形質導入の７日後のBTKの発現を代表的なフローサイトメトリープロットに示す。（ｄ）DHS構築物についてインビトロ試験を行った結果およびcoBTKとco2BTKを比較した結果に基づいて、インビボ試験に使用する４種の構築物を特定した。図に示すように、これらの構築物はRRLバックボーンを有するレンチウイルス構築物であり、いずれかの種類のコドン最適化ヒトBTK（coBTKまたはco2BTK）を発現し、0.7kbの遍在性クロマチンオープニングエレメント（0.7UCOE）を含み、その下流にDHS4が付加されているか、付加されていないものであった。
【０１０６】
【図９４】0.7UCOEベクターを使用した遺伝子療法で処置したマウスにおける、罹患した造血細胞系列でのBTK発現の回復と、Ｂ細胞の発生を示す。移植の１９〜２３週間後における、BTK+細胞の割合と、再構成された各Ｂ細胞サブセットの細胞数および各骨髄系細胞サブセットの細胞数を評価した。（図９４Ａ）エンドポイント分析での脾臓Ｂ細胞における細胞内BTK染色を示した代表的なフローサイトメトリープロットを示す。（ｂ〜ｄ）遺伝子療法で処置した群から得た骨髄（図９４Ｂ）、脾臓（図９４Ｃ）および腹腔（図９４Ｄ）中の各リンパ球サブセットにおけるBTK+細胞の割合（％）をフローサイトメトリーで測定した。各細胞サブセットを、好中球（CD11b+GR1+）、単球（CD11b+）およびＢ細胞（B220+）として定義する。（図９４Ｅ〜Ｆ）骨髄（図９４Ｅ）、脾臓（図９４Ｆ）および腹腔（図９４Ｇ）における各Ｂ細胞サブセットの平均細胞数を積み上げ棒グラフに示す。早期Ｂ細胞の発生（骨髄）、すなわち、プロＢ細胞＋プレＢ細胞（IgM-、IgD-）、未熟Ｂ細胞（IgM+IgD-）および成熟Ｂ細胞（IgM+、IgD+）を示す。後期Ｂ細胞の発生（脾臓）、すなわち、１型移行期（T1）Ｂ細胞（CD24hi、CD21-）、２型移行期（T2）Ｂ細胞（CD24hi、CD21int）、辺縁帯／辺縁帯前駆（MZ／MZP）Ｂ細胞（CD24hi、CD21hi）および濾胞成熟（FM）Ｂ細胞（CD24int、CD21int）を示す。腹腔内Ｂ細胞サブセット、すなわち、B1細胞（IgM+CD43+）およびB2細胞（CD43-）を示す。（図９４Ｈ）フローサイトメトリーで測定した各Ｂ細胞サブセットにおけるBTKの発現の回復を示す。（図９４Ｉ）各実験において、WT Mockで正規化したＢ細胞の発生過程におけるBTK+のMFIを示す。データは、４回の独立した実験の平均値±SDを示し、n=13（WT Mock）、n=13（KO Mock）、n=11（0.7UCOE.BTKp.co）、n=11（0.7UCOE.BTKp.co2）、n=16（0.7UCOE.DHS4.BTKp.co）、n=11（0.7UCOE.DHS4.BTKp.co2）およびn=6（0.7UCOE.DHS1-5.BTKp.co）とした。P値は、Sidak法を使用した一元配置分散分析により算出した（***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05）。
【０１０７】
【図９５】インビボおよびインビトロにおけるＢ細胞の機能の回復を示す。（図９５Ａ）移植の１２週間後に、アラム（Alum）を加えたNP-CGGでマウスを免疫化した。免疫化したマウスの血清中のNP特異的IgG濃度をELISAで測定し、IgG標準品に対する相対量として示した。免疫前（−）および一次免疫の１０日後（10）に、高親和性NP特異的IgGの血清中濃度を測定した。初回免疫の１ヶ月後に、PBSに加えたNP-CGGをマウスに再投与し、１０日後に血清を採取した（2o）。（図９５Ｂ〜Ｃ）エンドポイント分析（移植の２１〜２３週間後）において、各ベクターで処置したマウスの血清中の総IgG濃度（図９５Ｂ）および総IgM濃度（図９５Ｃ）をELISAで測定した。（図９５Ｄ〜Ｆ）エンドポイント分析において、CD43-細胞を磁気分離することによって脾細胞からＢ細胞を単離し、Cell Trace Violetで標識し、インビトロにおいてIgM、LPSまたは培地コントロールで刺激した。（図９５Ｄ）抗マウスIgM抗体、LPSまたは培地のみを加えて７２時間インキュベーション後に１回以上細胞分裂したBTK+Ｂ細胞の割合（％）を示す（フローサイトメトリーにより解析した）。（図９５Ｅ）WT Mockで正規化した、各細胞分裂（D0〜D4）後の細胞におけるBTK+のMFIを示す。（図９５Ｆ）IgMで刺激した７２時間後のＢ細胞におけるCell Trace試薬の希釈に対してBTK染色をプロットし、生細胞とB220+BTK+細胞でゲーティングした代表的なフローサイトメトリープロットである。データは、４回の独立した実験の平均値±SDを示し、n=13（WT Mock）、n=13（KO Mock）、n=11（0.7UCOE.BTKp.co）、n=11（0.7UCOE.BTKp.co2）、n=16（0.7UCOE.DHS4.BTKp.co）、n=11（0.7UCOE.DHS4.BTKp.co2）およびn=6（0.7UCOE.DHS1-5.BTKp.co）とした。P値は、Sidak法を使用した一元配置分散分析により算出した（***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05）。
【０１０８】
【図９６】ベクターの安全性に関する考察を示す。（図９６Ａ〜Ｂ）各ベクターで処置したマウスの血清中の抗dsDNA IgG濃度（図９６Ａ）および抗dsDNA IgG2c濃度（図９６Ｂ）をELISAで測定し、吸光度の測定値（OD450）として示した。ポジティブコントロールとして、自己免疫疾患傾向のある公知のWASキメラマウスモデルから得た血清、およびEμ.BTKpで処置したマウスから得た血清を使用した。（図９６Ｃ）エンドポイント分析において、全骨髄細胞および全脾細胞からゲノムDNAを単離し、細胞１個あたりのウイルスの組み込み数（ウイルスコピー数）をqPCRで定量した。データは、４回の独立した実験の平均値±SDを示し、n=13（WT Mock）、n=13（KO Mock）、n=11（0.7UCOE.BTKp.co）、n=11（0.7UCOE.BTKp.co2）、n=16（0.7UCOE.DHS4.BTKp.co）、n=11（0.7UCOE.DHS4.BTKp.co2）およびn=6（0.7UCOE.DHS1-5.BTKp.co）とした。P値は、Sidak法を使用した一元配置分散分析により算出した（***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05）。
【０１０９】
【図９７】トランスフェクションプロトコルの模式図を示す。
【０１１０】
【図９８】複数の処置群間で条件を同じにしてヒト造血細胞を骨髄に移植した結果を示す。遺伝子療法を行ったXLA患者由来ヒト幹細胞、または遺伝子療法を行っていないXLA患者由来ヒト幹細胞を、健常ドナー由来のヒト幹細胞と条件を同じにして骨髄に移植した。（図９８Ａ）ヒトおよびマウスのCD45（造血細胞マーカー）、CD33（骨髄系細胞）およびCD19（Ｂ細胞）、ならびにCD4およびCD8（Ｔ細胞）を含む、ヒト免疫細胞の様々なマーカーを示した代表的なフローサイトメトリープロットである。生きた全骨髄細胞をhCD45+およびmCD45-でゲーティングしてヒト造血細胞分画を得た後、hCD45+でゲーティングした細胞集団においてCD33マーカーおよびCD19マーカーを分析し、さらに、CD33-CD19-でゲーティングした細胞集団においてCD4およびCD8を分析した。（図９８Ｂおよび図９８Ｃ）骨髄に移植したヒトCD45細胞の割合（％）およびhCD45細胞の総数を示す。各コホート（XLA3、XLA3＋0.7UCOE.BTKp.BTKco2レンチウイルス、XLA3＋0.7UCOE.DHS4.BTKp.BTKco2レンチウイルスおよび健常ドナー）につきn=4とした。
【０１１１】
【図９９】XLA患者３の細胞を使用した前臨床モデルの構築を示す。移植の１２週間後に脾臓を分析した結果を示す。
【０１１２】
【図１００】XLA患者３の細胞を使用した前臨床モデルの構築を示す。0.7UCOE.BTKp BTKco2または0.7UCOE.DHS4.BTKp.BTKco2を使用した遺伝子療法でXLA患者３由来のHSCを処置し、このHSCをマウスレシピエントに投与してから１２週間後に脾臓を分析した結果を示す。
【０１１３】
【図１０１】Ｂ細胞の発生過程で見られる各サブセットを脾臓において調べた代表的なフローサイトメトリープロットを示す。各遺伝子療法コホートにおいて、ヒトＢ細胞の発生過程で見られる各サブセットを特定するための典型的なゲーティング方法を示す（右側に示す）。各パネルにおいて使用したマーカーを下に示す（Hist＝ヒストグラム）。あらかじめゲーティングを行った場合は、各列の上方に示す。
【０１１４】
【図１０２】XLA患者３由来のHSCをレンチウイルス（0.7UCOE.BTKp.BTKco2または0.7UCOE.DHS4 BTKp.BTKco2を使用）で形質導入し、レシピエントに移植すると、XLAコントロールと比べて、脾臓中の未熟Ｂ細胞（CD19+CD24+CD38+Ｂ細胞およびCD19+CD24+CD38+IgM+細胞を含む）の割合が増加することを示す。図４に示したフローサイトメトリーの結果を、特定の未熟Ｂ細胞の亜集団別にまとめたグラフを示す。Ａ：脾臓における未熟Ｂ細胞（CD24+CD38+）の割合（％）を示す。Ｂ：IgM+未熟Ｂ細胞の割合（％）を示す。Ｃ〜Ｄ：脾臓における未熟Ｂ細胞（CD24+CD38+）の総数およびCD24+hCD38+IgM+細胞の総数を示す。Ｅ：CD10のヒストグラムの重ね合わせを示し、健常ドナーと比べたCD10の平均蛍光強度（MFI）の変化を示す。各コホートにつきn=4とし、***P=0.0004；**P=0.0044；*P=0.4（一元配置分散分析）とした。
【０１１５】
【図１０３】XLA患者由来のHSCをレンチウイルス（0.7UCOE.BTKp.BTKco2または0.7UCOE.DHS4 BTKp.BTKco2）で形質導入し、レシピエントに移植すると、XLAコントロールと比べて、成熟Ｂ細胞（CD19+CD24lowCD38lowIgM+IgD+）の割合が増加することを示す。（図１０４Ａ〜Ｃ）脾臓における成熟Ｂ細胞（hCD24lowhCD38low）の割合（％）とIgM+成熟Ｂ細胞およびIgM+IgD+成熟Ｂ細胞の割合（％）を示す。（図１０３Ｄ〜Ｆ）脾臓成熟Ｂ細胞、IgM+成熟Ｂ細胞およびIgM+IgD+成熟Ｂ細胞の総数を示す。（図１０３Ｇ）CD10のヒストグラムの重ね合わせであり、CD10のMFIが健常ドナーと似ていることを示す。各コホートにつきN=4とし、***P=0.0004；**P=0.0044；*P=0.4（一元配置分散分析）とした。
【０１１６】
【図１０４】Ｂ細胞の発生過程で見られる各サブセットを骨髄において調べた代表的なフローサイトメトリープロットを示す。
【０１１７】
【図１０５】XLA患者由来のHSCをレンチウイルス（0.7UCOE BTKp BTKco2またはDHS4 BTKpBTK.co2を使用）で形質導入し、レシピエントに移植すると、XLAコントロールと比べて、CD19+CD24+CD38+IgM+未熟Ｂ細胞の割合が増加することを示す。
【０１１８】
【図１０６】XLA患者由来のHSCをレンチウイルス（0.7UCOE BTKp BTKco2を含むレンチウイルスまたは0.7UCOE.DHS4 BTKp.BTK.co2を含むレンチウイルスを使用）で形質導入し、レシピエントに移植すると、インビボにおいて細胞１個あたり０．２〜２のウイルスコピー数（VCN）で遺伝子が組み込まれることを示す。
【０１１９】
【図１０７】0.7UCOE.BTKp.BTKco2を含むレンチウイルスまたは0.7UCOE.DHS4.BTK.pBTKco2を含むレンチウイルスを使用した遺伝子療法でXLA患者３由来のHSCを処置し、このHSCをレシピエントに移植すると、インビボにおいてIgM分泌Ｂ細胞が産生されることを示す。
【０１２０】
【図１０８】0.7UCOE.BTKp.BTKco2を含むレンチウイルスまたは0.7UCOE.DHS4.BTKp.BTKco2を含むレンチウイルスでXLA患者３由来のHSCを形質導入し、このHSCをレシピエントに移植すると、Ｂ細胞受容体（BCR）の結合に応答したＢ細胞によるカルシウム流入が回復することを示す。
【０１２１】
【図１０９】Ｂ細胞分化誘導プロトコルを示す。
【０１２２】
【図１１０】インビトロにおけるＢ細胞クラススイッチを示した代表的なフローサイトメトリープロットを示す。
【０１２３】
【図１１１】XLA患者由来のHSCをレンチウイルス（0.7UCOE BTKp BTKco2またはDHS4 BTKpBTK.co2を使用）で形質導入し、レシピエントに移植すると、サイトカインおよびＴ細胞依存性シグナルに応答可能なＢ細胞が産生され、抗体が分泌されることを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２４】
用語の定義
別段の記載がない限り、本明細書で使用されている技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解される意味を有する。
【０１２５】
本明細書において「a」または「an」は、１つまたは１つ以上を意味してもよい。
【０１２６】
本明細書において「約」は、測定値について述べる場合、所定値から±２０％または±１０％の変動を含むことを意味し、より好ましくは±５％の変動、さらにより好ましくは±１％の変動、さらにより好ましくは±０．１％の変動を含むことを意味する。
【０１２７】
本明細書で述べる「ポリヌクレオチド」は、「核酸」または「核酸分子」を指し、たとえば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）、オリゴヌクレオチド、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により得られる断片、ライゲーション、切断、エンドヌクレアーゼ作用およびエキソヌクレアーゼ作用のいずれかにより得られる断片などが挙げられる。核酸分子は、天然のヌクレオチドモノマー（ＤＮＡ、ＲＮＡなど）、または天然のヌクレオチドの類似体（たとえば、天然のヌクレオチドのエナンチオマー）からなるモノマー、またはこれらの組み合わせから構成されていてもよい。修飾ヌクレオチドは、糖部分および／またはピリミジン塩基部分もしくはプリン塩基部分に修飾を有していてもよい。糖部分の修飾としては、たとえば、ハロゲン、アルキル基、アミンまたはアジド基による１つ以上のヒドロキシル基の置換が挙げられ、糖部分はエーテル化またはエステル化されていてもよい。さらに、糖部分全体が、立体構造的に類似の構造や電子的に類似の構造と置換されていてもよく、このような構造として、たとえば、アザ糖および炭素環式糖類似体が挙げられる。修飾塩基部分としては、アルキル化プリン、アルキル化ピリミジン、アシル化プリン、アシル化ピリミジン、およびその他の公知の複素環置換基が挙げられる。核酸モノマーは、ホスホジエステル結合またはこれと似た結合により連結することができる。ホスホジエステル結合と似た結合としては、ホスホロチオエート結合、ホスホロジチオエート結合、ホスホロセレノエート結合、ホスホロジセレノエート結合、ホスホロアニロチオエート（phosphoroanilothioate）結合、ホスホロアニリデート（phosphoranilidate）結合、ホスホロアミデート結合などが挙げられる。「核酸分子」は、いわゆる「ペプチド核酸」も包含し、これは、ポリアミド主鎖に付加された天然の核酸塩基または修飾核酸塩基を含む。核酸は、一本鎖であってもよく、二本鎖であってもよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸配列を提供する。いくつかの実施形態において、前記核酸はＲＮＡまたはＤＮＡである。
【０１２８】
「コードする」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド中の特定のヌクレオチド配列が、所定のアミノ酸配列などの別の巨大分子を合成するための鋳型として機能するという特性が挙げられるが、これに限定されない。このように、特定の遺伝子に対応するｍＲＮＡが転写および翻訳されて、細胞またはその他の生物系においてタンパク質が産生された場合、その遺伝子はこのタンパク質をコードすると言える。
【０１２９】
「ブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、ヒトではBTK遺伝子によってコードされる酵素が挙げられるが、これに限定されない。BTKは、Ｂ細胞の発生に重要な役割を果たすキナーゼである。たとえば、BTKは、Ｂ細胞の成熟に重要な役割を果たしており、さらに、高親和性のIgE受容体を介した肥満細胞の活性化にも重要な役割を果たしている。BTK遺伝子の変異は、原発性免疫不全疾患であるＸ連鎖無γグロブリン血症（ブルトン型無γグロブリン血症）（XLAと略されることもある）に関与している。XLAに罹患した患者の骨髄中のプレＢ細胞集団は正常であるが、これらのプレＢ細胞は成熟できず、循環系に入ることもできない。
【０１３０】
本明細書で述べる「Ｘ連鎖無γグロブリン血症（XLA）」は、感染症と戦う生体能力が影響を受ける遺伝子疾患である。無γグロブリン血症はＸ連鎖性であるため、男性に発症することが多い。XLAに罹患した人では、白血球の形成過程において成熟Ｂ細胞が発生せず、これによって、血流中のγグロブリンと呼ばれるタンパク質（抗体など）が完全に、またはほぼ完全に欠損している。Ｘ連鎖無γグロブリン血症（XLA）は、２歳までの罹患男児において再発性の細菌感染症が見られることを特徴とする。診断前に最も一般的に見られる感染症は再発性耳炎である。結膜炎、副鼻腔肺感染症、下痢および皮膚感染症も頻繁に見られる。生命を脅かすような重度の感染症（肺炎、蓄膿症、髄膜炎、敗血症、蜂巣炎、敗血症性関節炎など）を発症している場合、免疫不全を有していると認識され、免疫不全を有するXLA患者は約６０％に達する。
【０１３１】
「プロモーター」は、特定の遺伝子の転写を開始させるＤＮＡ領域である。プロモーターは、遺伝子転写開始部位の近傍に位置していてもよく、同じＤＮＡ鎖内の上流（センス鎖の５’領域）に位置していてもよい。プロモーターは、条件誘導型プロモーターであってもよく、構成的プロモーターであってもよい。プロモーターは、細菌細胞におけるタンパク質発現に特異的であってもよく、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現に特異的であってもよく、昆虫細胞におけるタンパク質発現に特異的であってもよい。いくつかの実施形態において、融合タンパク質をコードする核酸が提供される場合、該核酸はプロモーター配列をさらに含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、哺乳動物におけるタンパク質発現に特異的である。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、条件誘導型プロモーターまたは構成的プロモーターである。
【０１３２】
本明細書で述べる「遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）」は、普遍的に発現されるハウスキーピング遺伝子のプロモーター含有ＣｐＧアイランドに由来する制御因子である。このようなプロモーターに由来する制御因子は、クロマチンリモデリング機能を持つため、許容される構造内でクロマチンを維持し、近傍の遺伝子を一貫して高発現させることが提案されている。UCOEは、本来、比較的大きな因子（最大で１６ｋｂ）であるが、これよりも小さい新たな合成UCOEを使用することによって、導入遺伝子を高発現させることができると考えられる。遍在性クロマチンエレメントおよびその機能を図１に示す。いくつかの実施形態において、0.7UCOEは、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記エンハンサーは、配列番号３または配列番号４に示される配列を含む。
【０１３３】
「コドン最適化」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、特定のコドンを、タンパク質の発現効率を最大限まで上昇させることが知られている別のコドンに変更する設計プロセスが挙げられるが、これに限定されない。いくつかの実施形態において、ヒトにおける発現用にコドン最適化することが好ましく、このコドン最適化は、当業者に公知のアルゴリズムを使用して、ヒトにおいて高収率でｍＲＮＡおよびタンパク質を産生できるように最適化した合成遺伝子転写物を作製することによって実施することができる。ヒトのコドンを最適化するためのアルゴリズムを含んだプログラムは容易に入手可能である。このようなプログラムとして、たとえば、OptimumGeneTMアルゴリズムやGeneGPS（登録商標）アルゴリズムなどが挙げられる。さらに、コドンが最適化されたヒト配列は、たとえば、Integrated DNA Technologies社から市販品として入手できる。
【０１３４】
最適化することによって、ポリヌクレオチドの二次構造の形成を低下させることもできる。本発明の方法の実施形態のいくつかにおいて、前記ベクターに含まれる前記配列を最適化することによって、総ＧＣ／ＡＴ比を低下させることもできる。コドンの最適化を厳密に行うと、望ましくない二次構造が形成されたり、あるいは高ＧＣ含量となって二次構造が形成されるという望ましくない結果となる場合がある。二次構造はそれ自体が転写効率に影響を与える。コドン使用の最適化を行った後にGeneOptimizerなどのプログラムを使用することによって、二次構造の形成を回避したり、ＧＣ含量を最適化したりすることができる。このようなさらなるプログラムは、最初のコドン最適化を行った後にさらに最適化を実施したり、トラブルシューティングを行うために使用することができ、それによって、１回目の最適化の後で起こりうる二次構造の形成を制限することができる。最適化用の別のプログラムも容易に入手可能である。前記方法の実施形態のいくつかにおいて、前記ベクターは、二次構造の形成を回避できるように最適化された配列、および／または総ＧＣ／ＡＴ比が低下するように最適化された配列、および／またはヒトにおける発現用に最適化された配列を含む。いくつかの本発明の実施形態において、BTKをコードする前記遺伝子はコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、コドン最適化されたBTKは、配列番号６または配列番号７に示される配列を含む。
【０１３５】
本明細書で述べる「エンハンサーエレメント」は、タンパク質（アクチベーター）が結合することができる短いＤＮＡ領域であり、アクチベーターがエンハンサーエレメントに結合することによって特定の遺伝子の転写が起こる可能性を高めることができる。アクチベーターは、転写因子とも呼ばれる。エンハンサーは、シス作用性であってもよく、トランス作用性（遺伝子から離れた位置で作用する）であってもよく、標的遺伝子から最大で１Ｍｂｐ（1,000,000bp）離れて存在していてもよく、転写開始部位の上流または下流に存在していてもよく、順方向または逆方向のいずれであってもよい。エンハンサーのサイズは、５０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｂｐ、１１００ｂｐ、１２００ｂｐ、１３００ｂｐ、１４００ｂｐもしくは１５００ｂｐであってもよく、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の長さ（ｂｐ）であってもよい。
【０１３６】
本明細書で述べる「DNase I高感受性領域」は、DNase I酵素によって切断されやすいクロマチン領域である。ゲノム内のこの特定の領域では、凝集したクロマチン構造は失われており、ＤＮＡが露出することによって、ＤＮＡへのアクセスが容易となっている。この結果、DNase Iなどの酵素によりＤＮＡを分解することが可能となる。このようなクロマチンのリモデリングは、転写因子などのタンパク質の結合に必要とされることから、前述のアクセス可能なクロマチン領域は、転写活性と機能的に関連している。本発明の実施形態では、「Dnase I高感受性領域４」（DHS4）について述べている。DHS4は、εグロビンプロモーターから−１８ｋｂの位置にあるエンハンサーであり、赤血球特異的タンパク質に対する結合部位と遍在性タンパク質に対する結合部位を含んでいてもよく、制御因子として重要な役割を果たしている。本発明の実施形態のいくつかにおいて、前記BTK発現用ベクターは、少なくとも１つのDNase高感受性領域（DHS）を含む。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、DNase高感受性領域１（DHS1）、DNase高感受性領域２（DHS2）、DNase高感受性領域３（DHS3）、DNase高感受性領域４（DHS4）および／またはDNase高感受性領域５（DHS5）である。
【０１３７】
本明細書で述べる「イントロン」は、遺伝子における最終的なＲＮＡ産物の成熱過程でＲＮＡスプライシングによって除去されるあらゆるヌクレオチド配列を指す。本発明のベクターの実施形態のいくつかにおいて、該ベクターは、少なくとも１つのイントロン領域を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座に由来するものである。
【０１３８】
「ベクター」、「発現ベクター」または「構築物」は、細胞に異種核酸を導入するために使用される核酸であり、様々な制御因子を含むことから、細胞において異種核酸を発現させることができる。ベクターとしては、プラスミド、ミニサークル（minicircle）、酵母、およびウイルスゲノムが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記ベクターはウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【０１３９】
本明細書で述べる「Ｂ細胞」は、リンパ球サブタイプに属する白血球の一種である。Ｂ細胞は、Ｂリンパ球としても知られている。Ｂ細胞は、抗体を分泌することにより、獲得免疫系における液性免疫の構成成分として機能することができる。さらに、Ｂ細胞は抗原を提示し（Ｂ細胞は、専門の抗原提示細胞（APC）としても分類される）、サイトカインを分泌する。本明細書で提供される細胞の実施形態のいくつかにおいて、該細胞はＢ細胞である。
【０１４０】
「骨髄系細胞」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば、骨髄または脊髄に見られる顆粒球前駆細胞または単球前駆細胞や、骨髄または脊髄に見られるこれらと類似した細胞が挙げられるが、これらに限定されない。骨髄系細胞系列には、末梢血中を循環する単球、およびこれらの単球から成熟、分化および／または活性化した細胞集団が含まれる。このような細胞集団には、終末分化していない骨髄系細胞、骨髄由来免疫抑制細胞、および分化したマクロファージが含まれる。分化したマクロファージには、分極化していないマクロファージ、分極化マクロファージ、休止状態のマクロファージ、および活性化マクロファージが含まれる。骨髄系細胞系列には、さらに、顆粒球前駆細胞、多形核球由来免疫抑制細胞、分化した多形核白血球、好中球、顆粒球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、ミクログリア、骨髄由来免疫抑制細胞、樹状細胞および赤血球が含まれるが、これらに限定されない。ミクログリアは、たとえば骨髄系前駆細胞から分化することができる。本明細書で提供される細胞の実施形態のいくつかにおいて、該細胞は骨髄系細胞である。
【０１４１】
本明細書で述べる「造血幹細胞」すなわち「HSC」は、骨髄系細胞に分化することができる前駆細胞であり、該骨髄系細胞としては、たとえば、マクロファージ、単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞およびリンパ系細胞（たとえば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞など）が挙げられる。HSCは３種の幹細胞を含む異種細胞集団であり、これら３種の幹細胞は血液中のリンパ系子孫細胞と骨髄系子孫細胞の割合（Ｌ／Ｍ）によって区別される。本明細書で提供される細胞の実施形態のいくつかにおいて、該細胞は造血幹細胞である。「対象」または「患者」という用語は、本明細書に照らせば、一般的な通常の意味を有し、たとえば実験、診断、予防および／または治療を目的として、本明細書に記載の実施形態を使用または投与してもよい任意の生物が挙げられるが、これらに限定されない。対象または患者として、たとえば、動物が挙げられる。いくつかの実施形態において、前記対象は、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類およびヒトである。いくつかの実施形態において、前記対象は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、霊長類またはヒトである。いくつかの実施形態において、前記対象はヒト男性である。
【０１４２】
本明細書で述べる「養子細胞療法」または「養子細胞移入」は、細胞の移入を指し、最も一般的には、免疫系細胞を同じ患者に戻す細胞移入、または新たな宿主に免疫機能および免疫特性を移入する目的で免疫系細胞を新たなレシピエント宿主に移入することを指す。いくつかの実施形態において、養子細胞療法または養子細胞移入は、BTK発現用細胞を必要とする対象にBTK発現用細胞を投与することを含む。
【０１４３】
BTKは、Ｂ細胞および骨髄系細胞において発現され、これらの細胞系列において正常な機能的反応に寄与している。BTKが発現されないと、XLAを発症する。一方、活性化BTKまたは野生型BTKが過剰に発現されると、細胞の形質転換が起こったり、かつ／または細胞の発生が停止することがある（“Early arrest in B cell development in transgenic mice that express the E41K Bruton’s tyrosine kinase mutant under the control of the CD19 promoter region” J Immunol. 1999 Jun 1;162(11):6526-33；“Correction of B-cell development in Btk-deficient mice using lentiviral vectors with codon-optimized human BTK.” Leukemia. 2010 Sep;24(9):1617-30；これらの文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。また、野生型BTKの発現調節異常は、自己抗体の産生を促進し、自己免疫のリスクを増加させうる（“Enhanced Expression of Bruton’s Tyrosine Kinase in B Cells Drives Systemic Autoimmunity by Disrupting T Cell Homeostasis.” J Immunol. 2016 Jul 1;197(1):58-67；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。したがって、XLAにおける安全な臨床遺伝子療法を成功させるには、通常であれば免疫タンパク質を発現する各細胞系列においてBTKの発現を回復させること、および通常は免疫タンパク質を発現しない発生過程の各サブセットにおいて過剰発現を引き起こさないように発現を厳密に制御することが必要である。また、このような発現制御によって細胞機能の改変が促されてもよい。この課題を解決するため、本発明の実施形態で述べるように、XLAを有するヒト対象から得た造血幹細胞（HSC）を使用した新規ヒト細胞モデルおよびマウスXLA動物モデルにおいて、ウイルスベクター候補を包括的に評価した。プロモーター、インスレーターおよびエンハンサーの各候補、ならびにコドン最適化したヒトBTK cDNA構築物の設計と試験を繰り返し、この結果に基づき、エクスビボにおけるBTK欠損宿主への形質導入および移植を実施することによって、（マウスまたはヒトの）造血幹細胞に由来するＢ細胞および骨髄系細胞においてBTKの発現を維持することが可能な、レンチウイルス（LV）を用いた新規ベクター構築物を特定した。この新規ベクター構築物については、本発明の実施形態において述べている。本発明の実施形態によるこのユニークな構築物は、末端切断型遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）と、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座のイントロン領域に由来する保存されたエンハンサーエレメントとを利用しており、コドン最適化されたヒトBTK cDNAの発現を誘導することができる。代表的な実施形態のいずれか１つによるこの最適なレンチウイルス（LV）ベクターを、0.7 UCOE.DHS4.BTKpro.coBTKと呼ぶ。本発明の実施形態で述べる研究の一部において、この構築物を選択するに至った予想外の驚くべき一連の結果が得られた。これを以下に述べる。
１）いくつかの実施形態において示すように、BTK最小プロモーターのみを含むレンチウイルスでは、Ｂ細胞の発生またはその機能を回復させるには不十分であった。
２）いくつかの実施形態において示すように、Ｅμエンハンサーエレメントを利用したレンチウイルス（Ｂ細胞系列特異的プロモーターまたはBTK最小プロモーターを含む）は、クラススイッチを起こした病原性IgGアイソタイプなどの、高力価の自己抗体の産生を誘導したことから、このエンハンサーを使用すると安全性に顕著な懸念が生じることが示された。
３）二次レシピエント動物において使用した複数のレンチウイルスプラットフォーム候補において、レンチウイルスベクターの発現のサイレンシングが観察されたため、このようなサイレンシングに耐性を示すUCOEエレメントを利用することとした。
４）大きなUCOEエレメントを使用すると、力価が低くなったため、力価と機能を向上させるとともに、サイレンシングに対する耐性を維持可能な、０．７ｋｂの新規な末端切断型エレメントを設計し、試験を行った。
５）バイオインフォマティクスツールを利用して、BTK遺伝子座に由来する複数のエンハンサー候補を同定し、試験を行い、さらに有意性検定を実施後、ウイルス力価を低下させることなく、インビボにおいてBTKの発現を増加させる最適なエレメントとしてDHS4を特定した。
６）コドン最適化した別の複数のヒトBTK cDNAを試験し、最も良好にBTKの発現を回復することができる構築物を特定した。
７）XLAを有する複数の成人対象から造血幹細胞（HSC）を採取し、免疫欠損NSGマウスに移植した。この結果、これらのHSCによって、XLA対象で見られるＢ細胞の発生障害が再現された。
８）本発明の実施形態のいくつかにおいて、本明細書に記載の最適化された新たなレンチウイルス構築物を使用すると、XLA患者由来のHSCに効率的に形質導入できることが示された。
【０１４４】
Ｘ連鎖無γグロブリン血症（XLA）は、BTK（ブルトン型チロシンキナーゼ）遺伝子の変異によって引き起こされる遺伝的性のＸ連鎖免疫不全症である。この疾患は、男性100,000人に約１人の割合で生じる。臨床症状としては、成熟Ｂ細胞および血清中免疫グロブリンの欠損；莢膜を持つ細菌による肺感染症、副鼻腔感染症および皮膚感染症に対する易感染性；細菌性敗血症による急死のリスク；腸内ウイルスによる慢性感染症および全身感染症；慢性炎症性腸疾患；および悪性腫瘍（大腸癌やその他の種類のがん）のリスクの増加を挙げることができる。
【０１４５】
XLAの治療法として現在選択可能なものとして、プールされたヒト免疫グロブリン（免疫グロブリン大量静注療法（IVIg）または皮下注用免疫グロブリン製剤（SCIg））を３〜４週ごとに、生涯にわたって投与することを挙げることができる。しかしながら、これらの治療法は費用がかかり、このような現在の治療法でも、感染症や急死のリスクがある。
【０１４６】
遺伝子療法を実施する対象の候補として、１つの遺伝子を原因とする造血障害を有する対象が挙げられる。
【０１４７】
ブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）は、細胞内に見られる非受容体タンパク質チロシンキナーゼであり、Ｂ細胞受容体のシグナル伝達経路として主に機能する。BTKは、Ｂ細胞の生存、増殖および分化を促進する。また、BTKは、BCR（Ｂ細胞受容体）の結合により誘導されたカルシウムシグナルの維持を持続させることができ、これによりNF-κBの活性化を促進する。さらに、BTKは、サイトカイン、成長因子およびTLRのシグナル伝達経路においても一定の役割を果たしている。BTKの役割を図２１に示す。この図では、BTKがＢ細胞の発生を誘導することが示されている。また、図に示すように、XLAでは、プレＢ細胞期でＢ細胞の発生が停止する。BTKは、Ｂ細胞系列および骨髄系細胞系列で発現されるが、Ｔ細胞では発現されない。内在性BTKの発現プロファイルを図１６に示す。
【０１４８】
BTKに関連して、レンチウイルスベクターにおけるBTKプロモーターや本発明の実施形態によるさらなる修飾の使用を調査した報告はこれまでにない。プロモーターの機能に関する過去の研究では、BTKプロモーターやBTKの第１イントロンについて一部評価がなされているが、ヒトBTK遺伝子座に由来するエンハンサー候補（DHS4エレメントなど）について報告や試験を行った研究グループはない（“Analysis of the Bruton’s tyrosine kinase gene promoter reveals critical PU.1 and SP1 sites.” Blood. 1996 Feb 1;87(3):1036-44；“Cell specific expression of human Bruton’s agammaglobulinemia tyrosine kinase gene (Btk) is regulated by Sp1- and Spi-1/PU.1-family members.” Oncogene. 1996 Nov 7;13(9):1955-64；“Large-scale comparative sequence analysis of the human and murine Bruton’s tyrosine kinase loci reveals conserved regulatory domains.” Genome Res. 1997 Apr;7(4):315-29.；“Synergistic activation of the human Btk promoter by transcription factors Sp1/3 and PU.1.” Biochem Biophys Res Commun. 1999 Jun 7;259(2):364-9；“Btk expression is controlled by Oct and BOB.1/OBF.1.” Nucleic Acids Res. 2006 Mar 31;34(6):1807-15；“Proteasome-dependent autoregulation of Bruton tyrosine kinase (Btk) promoter via NF-kappaB.” Blood. 2008 May 1;111(9):4617-26.；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に明示的に援用される）。
【０１４９】
単独で単離されたコドン最適化BTK cDNAは過去に同定されている（“Correction of B-cell development in Btk-deficient mice using lentiviral vectors with codon-optimized human BTK.” Leukemia. 2010 Sep;24(9):1617-30；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）。レンチウイルスベクターにおけるUCOEエレメントの単独使用、またはUCOEエレメントと系統特異的プロモーターもしくは遍在性プロモーターとの併用は他の研究者によって調査されているが、この技術をBTKに適用した研究者はいない（“Lentiviral vectors containing an enhancer-less ubiquitously acting chromatin opening element (UCOE) provide highly reproducible and stable transgene expression in hematopoietic cells.” Blood. 2007 Sep 1;110(5):1448-57.；“A ubiquitous chromatin opening element (UCOE) confers resistance to DNA methylation-mediated silencing of lentiviral vectors.” Mol Ther. 2010 Sep;18(9):1640-9；“Physiological regulation of transgene expression by a lentiviral vector containing the A2UCOE linked to a myeloid promoter.” Gene Ther. 2012 Oct;19(10):1018-29；“Correction of murine Rag2 severe combined immunodeficiency by lentiviral gene therapy using a codon-optimized RAG2 therapeutic transgene.” Mol Ther. 2012 Oct;20(10):1968-80；“Promoter and lineage independent anti-silencing activity of the A2 ubiquitous chromatin opening element for optimized human pluripotent stem cell-based gene therapy.” Biomaterials. 2014 Feb;35(5):1531-42.；“A ubiquitous chromatin opening element prevents transgene silencing in pluripotent stem cells and their differentiated progeny.” Stem Cells. 2013 Mar;31(3):488-99；“Lentiviral MGMT(P140K)-mediated in vivo selection employing a ubiquitous chromatin opening element (A2UCOE) linked to a cellular promoter.” Biomaterials. 2014 Aug;35(25):7204-13；“Detailed comparison of retroviral vectors and promoter configurations for stable and high transgene expression in human induced pluripotent stem cells.” Gene Ther. 2017 Mar 27；これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に明示的に援用される）。
【０１５０】
本発明の実施形態に記載の最適化されたレンチウイルスベクターは、Ｘ連鎖無γグロブリン血症（XLA）を有する対象の遺伝子療法において使用され、この疾患において長期的な根治療法を実施できるように設計されている。遺伝子療法用の最適なBTKレンチウイルスベクターの開発における代表的な実施形態を図２２に示す。このレンチウイルスベクターによって、安全なウイルス送達プラットフォームを提供し、最適なタンパク質発現量を有する所望の細胞系列を発現させることができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態において、前記最適化されたBTKレンチウイルスベクターは、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）を含む。このUCOEは、組み込み部位に関係なく、導入遺伝子の安定な発現を誘導することができ、隣接したプロモーターにサイレンシングに対する耐性を付与することができる（図１参照）。
【０１５２】
さらに、BTK発現用の前記最適化されたレンチウイルスベクターは、細胞においてBTKの発現を増加させることが示された。いくつかの実施形態において使用した代表的なベクターのいくつかを図２３に示す。図２４に示すように、EμBTKpプロモーターを含むレンチウイルスベクターは、骨髄系細胞におけるBTKの発現も増加させた。
【０１５３】
DKO mock、BTKp、UCOE.BTKpまたはEμ.BTKpを形質導入した細胞において、BTKの発現を試験した。FACSアッセイの結果に示したように、BTK発現用のレンチウイルスベクターにEμを組み込むと、BTKpプロモーターのみを使用した場合やBTKpプロモーターとUCOEエレメントを併用した場合と比べて、Ｂ細胞および骨髄系細胞においてBTKの発現が最も増強されることも示された（図２５）。ノックアウト細胞と野生型細胞をＢ細胞および単球について比較した図２６に示すように、形質導入細胞におけるBTKの発現は、BTKを天然に発現する野生型細胞に匹敵するものである。
【０１５４】
このレンチウイルスベクターによって、根治療法、特にXLA遺伝子療法における根治療法が可能になると考えられる。
【０１５５】
本明細書に記載の実施形態で述べた遺伝子送達プラットフォームは、XLA治療法に特化したものである。この遺伝子送達プラットフォームによって、Ｂ細胞および骨髄系細胞において内在性BTKの発現を回復させることができ、XLAに罹患した対象における免疫応答を回復させることができる。さらに、ベクターの安全性プロファイルも評価した。過去に研究されたXLA用のレンチウイルスベクターは、BTKの最小プロモーター、免疫グロブリン重鎖μイントロンエンハンサー、１．５ｋｂの遍在性クロマチンオープニングエレメントなどの、プロモーターエレメントおよび転写エレメントを含むものであった。しかしながら、本発明の実施形態において示すように、Ｂ細胞および骨髄系細胞においてBTKの発現を向上させるためにはさらなる改良が必要であった。
【実施例】
【０１５６】
XLA用の遺伝子送達プラットフォームの最適化
本明細書の実施形態に示すように、いくつかの工程を実施して、遺伝子療法用のレンチウイルス（LV）ベクターの改良を行った。まず、１）UCOEエレメントのサイズを0.7kbまで減らしてウイルス力価を向上させ、次に、２）Ｂ細胞および骨髄系細胞において発現を向上させることが可能な、内在性ヒトBTK内の転写エレメントを同定し、BTKプロモーターの上流に含まれる保存された非コード配列（CNS）とともに発現させる試験を行った（図１）。本明細書に記載の実施形態において前臨床モデルで試験したレンチウイルスベクターとして、0.7UCOE.BTKp.BTKおよび0.7UCOE.I-4,5.BTKp.BTKが挙げられる（図２参照）。図３に示すように、XLAマウスから血液を採取し、Lin陰性細胞を回収した。次に、LC-huBTK-LVを使用して、この細胞に形質導入した。次に、形質導入した細胞をXLAマウスに投与し、細胞移入の２０〜２５週間後にマウスを分析した。BTKの発現は、フローサイトメトリーにより分析した。また、前記幹細胞を長期生着させるため、二次細胞移入を実施した（図３参照）。XLA遺伝子療法を検討するための前臨床マウスモデルを図３の模式図に示す。
【０１５７】
ヒトBTKを発現するどちらのベクター（0.7UCOEおよび0.7UCOE-I4,5）も、罹患した造血細胞におけるBTKの発現を回復させ、Ｂ細胞の発生と機能を回復し、免疫応答を回復させた（図４〜図７）。一方、0.7UCOE.I-45.BTIpBTKは、0.7UCOE.BTKp.BTKと同程度にBTKを効果的に発現したが、ウイルスの組み込み数は少ないことが示された（図８）。以上のことから、いくつかの結論が得られた。
【０１５８】
内在性BTKと関連する（BTKのイントロン４およびイントロン５に由来する）保存されたBTK制御エレメントを含むレンチウイルス（LV）ベクターは、ウイルス組み込みあたりのBTKの発現を向上させることができる。また、0.7UCOE.I4,5.BTKpBTKレンチウイルスベクターは、XLAの遺伝子療法のための効率的な候補を含んでいる。
【０１５９】
さらに拡充した前臨床試験では、ａ）毒性、安全性および有効性を十分に評価するためのマウスモデルの構築（二次移植の実施および組み込み部位の分析を含む）；ｂ）インビトロにおける不死化アッセイおよびトランス活性化アッセイ；ｃ）Ｂ細胞および骨髄系細胞においてBTKの発現を向上可能な、イントロン４およびイントロン５内の遺伝因子の精査；ならびにｄ）健常コントロールまたはXLA対象から得たCD34+幹細胞を使用したインビトロまたはNSGレシピエントマウスにおける0.7UCOE.I-4,5.BTKp.BTKの評価を実施する。
【０１６０】
UCOEをインスレーターとして用いたBTKプロモーターの利用によるマウスXLAモデルでのレンチウイルス遺伝子療法の安全性と有効性の向上
マウスにおけるレンチウイルス遺伝子療法の安全性と有効性を最適化するために、UCOEをインスレーターとして用いたBTKプロモーターを利用して実験を行った。この実験では、ベクター構築物として、WT Mock、KO Mock、BTKp、1.5.UCOE.BTKpおよびEμ.BTKpを使用した。
【０１６１】
４種のレンチウイルス（LV）構築物の発現プロファイルと、一次レシピエントマウスにおけるＢ細胞の発生と機能の回復を図９に示す。ベクターとして、BTKpro.BTK、1.5UCOE.BTKpro.BTK、1.5UCOE.BTKpro.coBTK（コドン最適化したヒトBTK）およびEμ.BTKpro.BTKを使用した。図９に示すように、Eμ.BTKp.hBTKベクターは、いずれの細胞でもBTKの発現を増加させることが示された。また、Eμ.BTKp.hBTKベクターは、図１０に示すように、いずれの細胞でもIgGの発現を増加させることが示された。さらに、Eμ.BTKp.hBTKベクターは、図１１に示すように、顆粒球、骨髄Ｂ細胞および脾臓Ｂ細胞においてもBTKの発現を増加させることが示された。また、1.5kbUCOE.BTKpベクターおよび1.5kbUCOE.BTKp.coベクターは、一次レシピエントおよび二次レシピエントにおいて、コピー数が少なくてもBTKの発現を維持することが示された（図１１）。
【０１６２】
0.7kb UCOE.BTKpro.coBTKレンチウイルスを使用した遺伝子療法で処置したマウスにおいて、罹患した造血細胞系列でBTKの発現の回復が見られ、Ｂ細胞が発生した（図１２）。
【０１６３】
また、0.7.UCOE.BTK.coレンチウイルスを用いた遺伝子療法でも、一次レシピエントの細胞においてＢ細胞の増殖とIgMおよびIgGの分泌増加が認められた（図１２）。
【０１６４】
さらに、0.7.UCOE.Bkp.coレンチウイルスを用いた遺伝子療法でも、一次レシピエントにおいてＢ細胞の機能の再構成が認められた（図１３）。
【０１６５】
遺伝子療法で処置した骨髄細胞をTBK-/-二次レシピエントに連続継代移植した後でも、ウイルスコピー数およびBTKの発現は維持される（図１４）。図に示すように、0.7UCOE.BTKp.coで形質導入した細胞は、骨髄および脾臓の好中球、単球、Ｂ細胞においてBTKを発現した。遺伝子転写を抑制する修飾であるDNAのメチル化も測定した。
【０１６６】
0.7UCOE.BTKp.coベクターは、XLAに罹患したCD34細胞において少ないコピー数でBTKの発現を持続することが示された（図１５）。XLAに罹患したCD34細胞およびコントロールCD34細胞に、様々な感染多重度（MOI）で0.7UCOE.BTKp.coを形質導入し、インビトロで１５日間培養した。図に示すように、XLAに罹患した細胞は、形質導入後に健常コントロール細胞と同様の生存率を示した。
【０１６７】
レンチウイルスベクターに含まれるBTKプロモーターを利用して、野生型マウスにおけるBTKの発現を評価した。図に示すように、BTKプロモーターは、マウスにおいて内在性BTKの発現パターンを模倣する（図１６）。
【０１６８】
次に、レンチウイルスベクターにおける発現の増強についてEμプロモーターを試験した。図１７Ａに示すように、Eμプロモーターを有する２種のベクターを試験した（T2Aに連結されたGFPに融合した野生型またはヒトコドン最適化されたヒトBTK cDNAとEμエンハンサーを含むベクター）。ニワトリBTK-/-DT40細胞にBTK-GFP構築物またはcoBTK-GFP構築物を形質導入した。ヒストグラムはGFPおよびBTKの発現を示す（図１７Ｂ）。BTK-GFP形質導入細胞およびcoBTK-GFP形質導入細胞をIndo-1エステルAM蛍光色素で染色し、抗IgMで刺激した。カルシウムの動員をフローサイトメトリーにより観察した。図に示すように、EμエンハンサーとヒトBTK cDNAを含み、BTKプロモーターの制御下にあるレンチウイルス構築物は、ニワトリ細胞においてBTK-GFPの発現を制御した。
【０１６９】
さらに、遺伝子療法で処置したKOマウスから得た末梢血中のＢ細胞および骨髄系細胞におけるBTKの発現をフローサイトメトリーで分析し、代表的なプロットに示した（図１８）。試験したベクターは、WT Mock、KO Mock、BTKp、1.5kb.UCOE.BTKp、1.5kb.UCOE.BTKp.coおよびEμ.BTKpであった。遺伝子療法で処置したマウスの骨髄細胞を早期Ｂ細胞発生マーカーで染色した代表的なフローサイトメトリープロットを図１８Ｃに示す。Hardy分類に従った分画I（IgMlo、IgDhi）、分画II（IgMhi、IgDhi）、分画III（IgMhi、IgDlo）（この順で成熟度が低下する）に含まれるＢ細胞の割合（%）を示すグラフを図１８Ｄに示す。各層のリングは１匹のマウスを示し、各分画中のＢ細胞の割合の平均値（％）を円グラフの中に示す。データは、１１回の独立した実験の平均値±SEMを示し、n=18（WT Mock）、n=14（KO Mock）、n=7（BTKp）、n=43（1.5kb.UCOE.BTKp）、n=18（1.5kb.UCOE.BTKp.co）、n=23（Eμ.BTKp）とした。グラフに示したように、Eμエンハンサーを含むベクターによって、Ｂ細胞と骨髄系細胞の両方でBTKの高発現とIgGの分泌増加が達成された。
【０１７０】
また、図１９に示すように、Eμ.BTKp一次移植マウスは、Mockベクターを形質導入した細胞で処置したコントロールXLAマウスと比べて生存率が延長した。
【０１７１】
WT Mockベクター、1.5kb.UCOE.BTKpベクターまたはEμ.BTKpベクターで形質導入した細胞で処置したマウスから得た血清を、自己抗原アレイで分析し、88種のマウス抗原に対して反応性を示すIgMおよびIgGのレベルを調べた。各行のデータをＺスコアに変換した。Ｚスコアでは、最も低い反応性（赤色）から最も高い反応性（青色）までが比色定量スケールで示される。図２０に示すように、最も高い反応性を示した血清は、Eμプロモーター（Eμ.BTKp）を含むレンチウイルスベクターで形質導入した細胞で処置したマウスから得られたものであった。
【０１７２】
Ｂ細胞および単球においてBTKの発現を増加させるためのベクターの設計
さらに、Ｂ細胞特異的プロモーターがBTKの産生に及ぼす影響について調べた。代表的な一実施形態に従って、ヒトBTK（huBTK）をコードする遺伝子に融合したＢ細胞特異的プロモーターB29とEμエンハンサーエレメントを含むレンチウイルスベクターを作製した（図２７）。図に示すように、このベクターは、Ｂ細胞におけるBTKの発現を増加した。これに対して、単球におけるBTKの発現はノックアウト細胞と同程度であった（図２７）。
【０１７３】
また、レンチウイルスベクターに含まれるBTKプロモーターがBTKの発現に及ぼす影響を評価するため、別の一実施形態においてBTKプロモーター領域を調べた。図２８に示すように、ヒトBTK（huBTK）をコードする遺伝子に融合したBTKプロモーター（BTKpro）を含むレンチウイルスベクターを作製した。図に示すように、BTKプロモーターはＢ細胞におけるBTKの発現を増加したが、野生型細胞における発現に及ぶものではなかった。単球では、前記BTKプロモーター領域を含むこのレンチウイルスベクターでは、BTKの発現を増加することはできず、BTKの発現はノックアウト細胞におけるものと同程度であった。
【０１７４】
ヒトBTKをコードする遺伝子に融合したBTKプロモーター（BTKpro）と偏在性クロマチンオープニングエレメントを含むレンチウイルスベクターを作製した（図２９）。図に示すように、これらのエンハンサーエレメントとプロモーターが協働して、Ｂ細胞と単球の両方においてBTKの発現を増加した。しかし、この発現は野生型細胞における発現に及ぶものではなかった。
【０１７５】
ヒトBTKをコードする遺伝子に融合したBTKプロモーター（BTKpro）とEμエンハンサーを含むレンチウイルスベクターを作製した（図３０）。図に示すように、これらのエンハンサーエレメントとプロモーターが協働して、Ｂ細胞と単球の両方においてBTKの発現を増加した。実験の結果、これらの形質導入細胞におけるBTKの発現量は、野生型細胞におけるBTKの発現量を超えていたことが示された。データから、試験したベクターからのBTKの発現の大部分は、Eμエンハンサーによるものであったことが示された。
【０１７６】
本明細書において使用した代表的な構築物を以下に示す。
1.  0.7UCOE.BTKp.coBTK.
2.  0.7UCOEfwd.BTKp.coBTK
3.  0.7UCOE.DHS4.BTKp.coBTK
4.  0.7UCOEfwd.DHS4.BTKp.coBTK
5.  0.7UCOE.IE.BTKp.coBTK
6.  0.7UCOEfwd.IE.BTKp.coBTK
7.  0.7UCOE.BTKp.co2BTK
8.  0.7UCOEfwd.BTKp.co2BTK
9.  0.7UCOE.DHS4.BTKp.co2BTK
10.  0.7UCOEfwd.DHS4.BTKp.co2BTK
11.  0.7UCOE.IE.BTKp.co2BTK
12.  0.7UCOEfwd.IE.BTKp.co2BTK
概して、これらの構築物には、３種のエレメント（0.7UCOE、エンハンサーまたはBTKコード配列；BTKプロモーターはいずれの構築物でも同じ）が様々な組み合わせで含まれている。
【表１】
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【０１７７】
ヒトコドンを最適化したBTK
BTKをコードする遺伝子のヒトコドンを最適化した。ヒトコドンの最適化は、当業者に公知のアルゴリズムを使用して、ヒトにおいて高収率でmRNAおよびタンパク質を産生できるように最適化された合成遺伝子転写物を作製することによって実施できる。図１７に示すように、細胞においてBTKの発現を増加させる能力について２種の構築物を試験した。これらのレンチウイルス構築物は、EμエレメントとBTKプロモーター領域を含んでいた。発現させる遺伝子として、BTKまたはヒトコドンを最適化したBTKを使用し、これらはいずれもGFP遺伝子転写物に融合させた。図１７に示すように、ヒトコドンを最適化したBTKによって、GFPが増加し（MFI：2288）、GFPも増加した。
【０１７８】
BTKレンチウイルスベクターの発現プロファイル
数種類のベクターの発現プロファイルを調べた。ベクターとして、WT Mock、DKO Mock、BTKp（BTKプロモーター）、UCOE.BTKp（偏在性クロマチンオープニングエレメント＋BTKプロモーター）、UCOE.BTKp.co（偏在性クロマチンオープニングエレメント＋BTKプロモーター＋コドン最適化したヒトBTK）およびEμ.BTKp（Eμエレメント＋BTKプロモーター）を使用した。図３１および図３２に示すように、EμエレメントとBTKプロモーターを含むBTK発現用レンチウイルスベクターで形質導入した場合に、骨髄、脾臓および腹腔から得たＢ細胞および骨髄系細胞におけるBTKの発現が最も高くなった。
【０１７９】
Ｂ細胞の発生および成熟Ｂ細胞サブセットの回復
さらに、各ベクターで形質導入した細胞について、成熟Ｂ細胞サブセットの回復を調べた。ベクターとして、WT Mock、DKO Mock、BTKp（BTKプロモーター）、UCOE.BTKp（偏在性クロマチンオープニングエレメント＋BTKプロモーター）、UCOE.BTKp.co（偏在性クロマチンオープニングエレメント＋BTKプロモーター＋コドン最適化したBTK）およびEμ.BTKp（Eμエレメント＋BTKプロモーター）を使用した。XLAでは、Ｂ細胞の発生はプレＢ細胞で停止する。これを踏まえて、プレＢ細胞以降の発生についてＢ細胞をさらに調べた。プレＢ細胞以降の発生は、BTKの量に依存する。図に示すように、EμエレメントとBTKプロモーターを含むBTK発現用レンチウイルスベクターで形質導入した場合に、末梢中成熟Ｂ細胞集団の特徴を有する細胞が得られ、このことから、形質導入細胞から産生されたBTKの量に応じて、マウスの成熟Ｂ細胞サブセットが回復することが示された（図３３）。
【０１８０】
また、BTK欠損マウスにBTK発現細胞を投与し、再構成された各Ｂ細胞集団の細胞数を調べた。各ベクターを細胞に導入した。ベクターとして、WT Mock、DKO Mock、BTKp（BTKプロモーター）、UCOE.BTKp（偏在性クロマチンオープニングエレメント＋BTKプロモーター）、UCOE.BTKp.co（偏在性クロマチンオープニングエレメント＋BTKプロモーター＋コドン最適化したヒトBTK）およびEμ.BTKp（Eμエレメント＋BTKプロモーター）を使用した。図３４は、BTKを発現させるために、形質導入細胞を投与した40匹のレシピエントマウスから得た知見をまとめたデータを示す。UCOE.BTKp.co、Eμ.BTKpまたはUCOE.BTKpを含むBTK発現ベクターで形質導入した細胞を投与したマウスでは、骨髄、脾臓および腹腔において成熟Ｂ細胞の発生が認められた。したがって、本発明の態様は、偏在性クロマチンオープニングエレメント、BTKプロモーターおよびコドン最適化したヒトBTKを含むレンチウイルスベクターに関し、このベクターは、XLAに罹患している対象において成熟Ｂ細胞の発生を促進する方法において使用することができる。
【０１８１】
また、偏在性クロマチンオープニングエレメントとBTKプロモーターを含むレンチウイルスベクター（UCOE.BTKp）またはBTKプロモーター領域に融合したEμエレメントを含むレンチウイルスベクター（Eμ.BTKp）で形質導入した細胞で処置したマウスでも、Ｂ細胞の増殖が示された（図３５）。コントロールとして、WT Mock細胞およびDKO Mock細胞を使用した。抗IgM抗体を使用して各細胞の蛍光活性化セルソーティングを行った。図に示すように、UCOE.BTKpおよびEμ.BTKpの２種のレンチウイルスベクターからBTKを発現した細胞は、Ｂ細胞から産生される基本的な抗体であるIgMを発現した。
【０１８２】
さらに、各細胞をPMAおよびロノマイシンで処理した。PMAは、プロテインキナーゼＣ（PKC）の活性化に使用され、ロノマイシンは、NFATのシグナル伝達に必要なカルシウム放出の誘導に使用される（図３５）。
【０１８３】
図３６に示すように、UCOE.BTKpおよびEμ.BTKpの２種のレンチウイルスベクターのいずれかで形質導入した細胞を、抗IgMまたはPMA／イオノマイシンで処理すると、野生型と比べて細胞分裂が増加した。また、これらの細胞では、BTKプロモーターのみを有するベクターや、UCOEエレメントとBTKプロモーターを有するベクターと比べて、IgMおよびIgGの総分泌量が増加することが示された（図３７）。
【０１８４】
Ｔ細胞依存性免疫応答
さらに、各形質導入細胞をマウスに投与し、Ｔ細胞依存性免疫応答を試験した。レンチウイルスベクターとして、WT Mock、DKO、DKO Mock、BTKp、UCOE.BTKp、UCOE.BTKp.co（コドン最適化したヒトBTK）、Eμ.BTKp.co（コドン最適化したヒトBTK）またはEμ.BTKpを使用して、細胞に形質導入した。その後、Ｔ細胞の免疫応答を評価した。図に示すように、Eμ.BTKpレンチウイルスベクターで形質導入した細胞では、IgGおよびIgMの発現量が増加した（図３８〜図４１）。
【０１８５】
また、抗体量は、BTKの発現と関連しており、マウスの生存率とも関連していた。図４２に示すように、Eμ.BTKpレンチウイルスベクターで形質導入した細胞を投与したマウスでは、DKO Mock細胞を投与したマウスよりも生存率が向上した。
【０１８６】
さらに、好中球および二次レシピエントマウスにおいてもBTKの発現を評価した。図４３に示すように、Eμ.BTKpレンチウイルスベクターで形質導入した細胞を二次レシピエントマウスに投与したところ、BTKの発現が増加した。これに対して、BTKpウイルスベクターを投与した二次レシピエントマウスでは、ウイルスコピー数が増加した（図４４）。長期生存に関してレンチウイルス療法を評価したところ、UCOE.BTKp.coベクター、UCOE.BTKpベクターおよびEμ.BTKpベクターによってマウスの生存率が延長するという証拠が得られた。
【０１８７】
BTKプロモーターに関して検討したところ、全体として、レンチウイルスベクターにBTKプロモーターが含まれていると、Ｂ細胞および骨髄系細胞においてBTKが顕著に発現することが実証された。UCOE.BTKproおよびEμ.BTKproによって、Ｂ細胞の発生、Ｂ細胞の絶対数、Ｂ細胞の増殖および免疫応答が回復する。また、UCOE.BTKproおよびEμ.BTKproによって、骨髄系細胞の発生も回復する。予想外にも、Eμを含むベクターは、自己抗体の産生を高力価で誘導するため、臨床使用に安全ではない可能性がある。UCOE-Btkp-Btkベクターは、UCOEを含まないベクターよりも、はるかに少ないウイルスコピー数で細胞の機能を回復させる。さらに、UCOE-Btkp-Btkベクターは、マウス造血幹細胞（HSC）およびヒト造血幹細胞（HSC）においてマーカーの発現を持続させた。したがって、UCOE.BTKp-coBTKレンチウイルスベクターは、改良されたユニークな臨床ベクタープラットフォームであり、さらに改変を加えることができる。
【０１８８】
別のエンハンサーエレメント
BTKプロモーターにおいて別のエンハンサーエレメントを使用し、細胞におけるBTKの発現を向上させるその能力について評価した。使用したレンチウイルス構築物を図４６に示す。図に示すように、1.5kbのUCOEを使用したところ、Ｂ細胞においてBTKプロモーターのみの場合よりも向上が見られた。しかしながら、ベクターのサイズが大きいため、そのサイズを縮小し、かつ低いウイルス力価を向上させるための、さらなる改良が必要であった（図４６）。
【０１８９】
1.5kbのUCOEの末端を切断して0.7kbのUCOEとし、0.7UCOE.BTKpレンチウイルスベクターを作製した（図２）。図２に示すように、エンハンサーとして機能しうるヒトBTKエンハンサーエレメントをさらに付加して、0.7UCOE.IE.BTKpを作製した。イントロン領域（IE）は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座に由来するイントロン４およびイントロン５を含んでいた。
【０１９０】
0.7UCOE.BTKpまたは0.7UCOE.IE.BTKpを細胞に形質導入し、図３に概要を示した方法を使用して、得られた細胞をマウスに投与した。図４７に示すように、0.7UCOE.BTKpまたは0.7UCOE.IE.BTKpを形質導入した細胞では、BTKの発現と脾臓Ｂ細胞の数が回復する。さらに、この細胞は、Ｂ細胞の機能をも回復することが示された（図４８）。
【０１９１】
さらに、0.7UCOE.IEを形質導入した細胞の安全性プロファイルは、0.7UCOEを形質導入した細胞よりも改善していることが示された（図４９参照）。図に示すように、0.7UCOEおよび0.7UCOE.IEが産生する自己抗体の力価は、自己免疫コントロール（および過去に報告されているBtkプロモーター非含有ベクター）によるものよりも低く、0.7UCOE.IEは、細胞１個あたりのウイルスの組み込み数が少ないにも関わらず同等の有効性を呈する。
【０１９２】
DNase高感受性領域を含むBTK構築物の試験
DNase高感受性領域（DHS）を使用してBTK発現用レンチウイルス構築物を設計した（図５０）。得られたベクターは、0.7UCOE.BTKp.coBTKベクター（0.7UCOEエンハンサー、BTKプロモーターおよびコドン最適化したヒトBTK）および0.7UCOE.IE4,5,.BTKp.coBTKベクター（0.7UCOEエレメント、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座のイントロン４およびイントロン５、BTKプロモーターおよびコドン最適化したヒトBTK）であった。
【０１９３】
図５１に示すように、様々なDNase高感受性領域が同定された。
【０１９４】
同定したイントロンおよびDNase高感受性領域に基づいて、イントロン候補およびDNase高感受性領域候補を含む構築物を構築した（図５２）。作製した構築物は、0.7UCOE.BTKp.coBTK、0.7UCOE.IE.BTKp.coBTK、0.7UCOE.DHS4.BTKp.coBTK、0.7UCOE.DHS1,2.BTKp.coBTK、0.7UCOE.DHS1,2,4.BTKp.coBTK、および0.7UCOE.DHS1-5.BTKp.coBTKであった。
【０１９５】
DNase高感受性領域を含む構築物と0.7UCOEベクターおよび0.7UCOE.IEベクターとをインビボで比較した。実験のセットアップでは、１×106個の細胞あたり40μlのウイルス（ウイルス数（ウイルスコピー数）がそれぞれ同じになるように最適化）を使用して、一晩かけて形質導入した。次に、（移植前に900ラドの放射線を照射した）TBKBPマウスに１条件あたり１×106個の細胞を眼窩後注射した。図に示すように、0.7UCOE.BTKp.coBTKで形質導入した細胞は、ウイルスコピー数が多く、BTKの発現量も多かった（図５３）。
【０１９６】
移植の１５週間後、Ｂ細胞の発生を評価し、末梢血リンパ球の分布を調べた。図５４に示すように、構築した前記ベクターで形質導入した細胞は、KO Mock細胞よりもＢ細胞が増加し、特に0.7UCOEレンチウイルスベクターではＢ細胞の増加が示された。しかしながら、0.7UCOEエレメントを含むレンチウイルスベクターで形質導入した細胞では、リンパ球サブセットにおいて再構成されたBTKの量は多かった。
【０１９７】
UCOEおよびイントロンエレメントを含むレンチウイルス構築物を、DNase高感受性領域を含む新たな構築物と比較するために実験を行った。100万個の細胞あたり40μLのウイルスを使用して、ウイルス液量をそろえた。図５５に示すように、0.7UCOEエレメントを含むレンチウイルスベクターで形質導入した細胞では、DNase高感受性領域を含むベクターよりも、組み込まれたウイルスのコピー数が多かった。また、この実験において、UCOEとDNase高感受性領域４（DHS4）の間でBTKの発現に有意差は認められなかったが、DHS4を使用した場合の脾臓におけるBTK/VCNの割合は、UCOEを使用した場合よりも有意に高かった（図５６）。
【０１９８】
別の一実施形態において、0.7UCOE.BTKp.coBTKベクター、0.7UCOE.DHS4.BTKp.coBTKベクターおよび0.7UCOE.DHS1-5.BTKp.coBTKベクターを使用して、インビボでのBTKの発現を調べた。この実験を実施するため、TBKドナーマウスからLin-細胞を採取した。形質導入を行うにあたって、100万個の細胞あたり10μlのウイルスを使用することによりウイルス液量をそろえ（目標：インビトロ試験からの予測に基づいて、組み込まれるウイルスコピー数を約３コピーでそろえる）、ポリブレンを添加したSCGM形質導入培地（mSCF、mTPO）において4×106個／mlの密度で１６時間かけて形質導入を行った。次に、マウス１匹につき1.5×106個の細胞を投与することにより細胞を移植した（レシピエント：TBKマウス、900ラドの放射線を照射した）（図５７）。図５７に示すように、0.6UCOE構築物で形質導入した細胞では、ウイルスコピー数が多かったが、BTKの発現量は、DHS4エレメントを含むレンチウイルス構築物を導入した場合と同程度であった。さらに、１２週間後に末梢血リンパ球分布を分析したところ、0.7UCOEレンチウイルスベクター、0.7UCOE.DHS4レンチウイルスベクターまたは0.7UCOE.DHS1-4レンチウイルスベクターで形質導入した細胞ではＢ細胞が増加したことから、これらのレンチウイルスベクターによってBTKの発現が誘導されたことによって、マウスにおいて成熟Ｂ細胞が発生したことが示された（図５８）。６週間後における末梢血リンパ球の分布を図５９に示す。図に示すように、0.7UCOE、0.7UCOE.DHS4または0.7UCOE.DHS1-4からBTKを発現した細胞では、Ｂ細胞の産生が増加した（図５９）。さらに、0.7UCOEレンチウイルスベクター、0.7UCOE.DHS4レンチウイルスベクターまたは0.7UCOE.DHS1-4レンチウイルスベクターを導入した細胞をマウスに投与し、６週間後および１２週間後に評価したところ、Ｂ細胞、単球および好中球においてBTKが発現したことが示された（図６０）。１２週間後の採血実験では、すべてのサブセットにおいてBTKが発現したことが示された（図６１）。
【０１９９】
コドン最適化した別のヒトBTK構築物の試験
コドン最適化したヒトBTK構築物がBTKの細胞発現に及ぼす影響を調べるため、実験を行った。コドン最適化したヒトBTKは、Ngら（“Correction of B cell development in Btk-deficient mice using lentiviral vectors with codon-optimized human BTK.” Leukemia. 2010 Sep;24(9):1617-30；この文献は参照によりその全体が本明細書に援用される）によって報告されている。
【０２００】
以下の実験は、コドン最適化した２種のヒトBTKを使用した場合のBTKの発現およびBTKの染色を比較することを目的とした。実験のセットアップには、TBKマウスからLin-細胞を単離すること；mSCF、mTPOおよびポリブレンを添加した完全SCGM形質導入培地において、１×106個（4×106個/ml）の細胞に対して5μl、10μlまたは20μlのウイルスを添加すること；インビトロで７日間培養すること；７日目にBTK染色およびウイルスコピー数を分析することが含まれていた。使用したレンチウイルス構築物は、0.7UCOE.BTKp.coBTK（力価：1.17×109）、0.7UCOE.DHS4.BTKp.coBTK（力価：1.09×109）、0.7UCOE.BTKp.newcoBTK（力価：1.81×108）および0.7UCOE.DHS4.BTKp.newcoBTK（力価：1.13×108）であった（図６２）。
【０２０１】
図６３に示すように、5μL、10μLまたは20μLのウイルスを加えることにより0.7UCOE.newcoBTKまたはDHS4.newcoBTKで形質導入した細胞では、BTKの発現が増加した。さらに、5μL、10μLまたは20μLのウイルスを加えることにより0.7UCOE.newcoBTKまたはDHS4.newcoBTKで形質導入した細胞においてMFIが増加した（図６４）。0.7UCOE.newcoBTKレンチウイルスベクターまたはDHS4.newcoBTKレンチウイルスベクターを10μL加えることによって形質導入した細胞では、細胞１個あたりにおいて最適なウイルスコピー数が示された（図６４）。
【０２０２】
コドン最適化した当初のヒトBTKとコドン最適化した新たなヒトBTKをインビボにおいて比較することも考慮される。実験群には、0.7UCOE.BTKp.coBTK（力価：1.17×109）（５匹のマウス）、0.7UCOE.DHS4.BTKp.coBTK（力価：1.09×109）（５匹のマウス）、0.7UCOE.BTKp.newcoBTK（力価：1.81×108）（５匹のマウス）、0.7UCOE.DHS4.BTKp.newcoBTK（力価：1.13×108）（５匹のマウス）、KO Mock（３匹のマウス）、WT Mock（５匹のマウス）および放射線非照射コントロール（１匹のマウス）が含まれる。形質導入のセットアップには、（これらのインビボ試験において一貫性をもたせるため）100万個の細胞あたり10μlとしてウイルス液量をそろえることが含まれる（図７１）。
【０２０３】
レンチウイルスベクターにおけるUCOEエレメントの方向性の選択に関する試験
UCOEエレメントの方向性がBTKの細胞発現に及ぼす影響を調べるために実験を行った（図６６）。UCOEの方向性がBTKの発現に影響を及ぼすかどうかを評価するため、図６７に示す構築物を作製した。
【０２０４】
この実験では、KO Mock、0.7UCOE.BTKp（7.52×107）、0.7UCOEfwd.BTKp col4（6.79×108）、0.7UCOEfwd.BTKp col6（1.79×109）およびWT Mockの４種のレンチウイルスベクターを試験した。図６８に示すように、0.7UCOE.BTKpレンチウイルスベクター（7.52×107）と0.7UCOEfwd.BTKp col4レンチウイルスベクター（6.79×108）と0.7UCOEfwd.BTKp col6レンチウイルスベクター（1.79×109）の間でのBTKの発現量は同程度であったが、ウイルス液量を増加させるとウイルスコピー数が増えた。
【０２０５】
実験から分かるように、BTKプロモーターは強力なプロモーターである。UCOEエレメントについて言えば、0.7kbのUCOEは、BTK発現のサイレンシングを効果的に防ぎ、ベクターの力価を増加させる。さらに、UCOEを順方向に配置すると、力価が有意に増加するが、BTKの発現量に変化は見られない。これは、逆方向のUCOEが高力価の構築物と同等に機能することを示している。さらに、エンハンサーエレメントに関して言えば、0.7UCOE.IE.Btkpは、0.7UCOE.Btkpよりも少ないウイルス組み込み数でBTKの発現能を回復させるが、短いエンハンサーエレメント（DHS領域）を付加しても、これよりも長いIE構築物と比べて力価は増加しないことが示された。
【０２０６】
順方向のUCOEはIEの力価を増加させ、その増加量は１logを上回ることから、順方向のUCOEはすべての構築物において力価を増加させることが示された。
【０２０７】
たとえば、0.7UCOE.DHS4.Btkpは、0.7UCOE.IE.Btkproよりも強力に、Ｂ細胞および骨髄系細胞におけるBTKの発現を増加させることが示された。このことから、0.7UCOE.DHS4.Btkpベクターは、特に強力なベクターであることが示された。
【０２０８】
コドン最適化したヒトBTKに関して言えば、前述の新たな構築物は、当初のco-Btk構築物よりもBTKの発現を有意に増加させる。
【０２０９】
ヒト造血幹細胞（HSC）におけるIgG、IgM、NP特異的Ig／Mの試験−コントロールおよびXLA対象：
レンチウイルスベクターを使用して、インビボにおけるＢ細胞の発生の回復と、XLAに罹患した細胞の機能の回復を調べた。NSGマウスにおいてXLA患者のＢ細胞表現型を再現することができるかどうかを評価するために実験を行った。さらに、前記方法において、前述の臨床用レンチウイルスベクターを使用して、XLAに罹患した幹細胞に形質導入することにより、インビボでＢ細胞の発生を回復させることができるかどうかも検討した。この治療を実施するために選択されたXLA患者を示した表を図７１に示す。
【０２１０】
XLAにおける末梢Ｂ細胞の表現型として、Ｂ細胞の割合（％）が著しく低いこと、移行期Ｂ細胞／未熟Ｂ細胞（CD38+CD24+CD10high）の割合（％）が高いこと、および成熟Ｂ細胞（CD38-CD24-CD10low）が欠損していることが挙げられる。
【０２１１】
NSGマウスにおけるヒトキメラを、図７２のXLA P2患者、P3患者およびP4患者に示した。図に示すように、骨髄では同程度の数のhCD45細胞の生着が見られたが、分化したhCD45細胞の割合（％）は末梢において有意に少なかった。
【０２１２】
ヒトリンパ球の再構成については、XLA P2患者、P3患者およびP4患者のいずれにおいてもＢ細胞の割合（％）は骨髄では同程度であったが、脾臓では有意に低い割合（％）となり、骨髄系細胞およびＴ細胞が相対的に増加していた（図７３）。
【０２１３】
移植したXLA罹患幹細胞の（脾臓における）表現型を、図７４のXLA P2患者、P3患者およびP4患者に示す。図に示すように、各患者における成熟Ｂ細胞の割合は少なかったが、未熟Ｂ細胞の割合は同程度であった（図７５）。
【０２１４】
移植したXLA罹患幹細胞の（脾臓における）表現型を、図７６のXLA P2患者、P3患者およびP4患者に示す。図に示すように、XLA群と健常群の間で患者におけるプロＢ細胞の割合（％）が等しいことが示された。
【０２１５】
すべてのXLA患者についてＢ細胞の発生停止を調べた。図７７に示すように、BTKによって、プロＢ細胞から成熟Ｂ細胞への分化が可能となる。hCD19+、CD22+およびCD179a+の発現について細胞を分析した。図に示すように、XLA患者は、健常コントロールよりもプレＢ細胞の割合（％）が有意に高かった。このように、XLAに罹患したＢ細胞は、脾臓に遊走可能となるプレＢ細胞期で分化が停止している（図７８および図８５）。
【０２１６】
XLAに罹患した細胞において、Ca2+の流入によるＢ細胞の機能を調べた（図８０）。図に示すように、XLAに罹患したＢ細胞では、IgMが発現しているため、コントロールと比較してCa2+を流入させることができなかった。
【０２１７】
XLAに罹患したＢ細胞を評価したところ、XLAに罹患した細胞では、プレＢ細胞期でＢ細胞の発生が停止することが示された（図８１）。
【０２１８】
図に示すように、XLA患者では、脾臓におけるＢ細胞の数と割合（％）は少なくなっている。さらに、骨髄においてＢ細胞の発生はプレＢ細胞期で停止する。次の段階として、NSGマウスにおいてXLA患者のＢ細胞表現型を再現して、BTKを発現するレンチウイルスベクター系の効果を調べた。
【０２１９】
0.7UCOE.BTKp.coBTKベクターおよび0.7UCOE.DHS4.BTKp.coBTKベクターを使用し、図８３および図９０に示す方法に従って、レンチウイルスによるヒト幹細胞への形質導入を行った。
【０２２０】
レンチウイルスでヒト幹細胞に形質導入したところ、0.7UCOEBTKp.BTKでは、第４のDNase高感受性領域を含むベクターと比べて生存率が70％となった（図８５）。
【０２２１】
また、0.7UCOE.BTK.pBTKレンチウイルスベクターによりXLA P2患者由来の細胞に形質導入したところ、BTKの発現が観察された。非選択環境下での実験で示されたように、0.7UCOE.BTKpBKでは、第４のDNase高感受性領域を含むレンチウイルスベクターと比べてBTKの発現が高かった（図８６）。
【０２２２】
前記実験の結果、XLAに罹患した幹細胞は、0.7UCOE.BTKp.BTKおよび0.7UCOEにより形質導入することができたと結論付けられた。DHS4.BTKp.BTKは、MOI＝10において１〜２コピー数で導入され、このウイルスコピー数は臨床的に意義がある。したがって、インビボにおいて、XLAに罹患した幹細胞にレンチウイルスで形質導入することによって、Ｂ細胞の発生を回復させることができると考えられる。
【０２２３】
ヒト造血幹細胞（HSC）の前臨床モデルの構築
T2Aリンカーで自己切断可能な、GFPタンパク質に融合したコドン最適化ヒトBTKを発現するレンチウイルスベクターを使用して、ヒト造血幹細胞（HSC）の前臨床モデルの構築を評価した（図８８参照）。図に示すように、試験した構築物は、UCOEエレメント、BTKプロモーター、コドン最適化したヒトBTK遺伝子およびT2A-GFPマーカータンパク質を含む。インビトロにおいて前記レンチウイルスベクターでCD34+HSCの形質導入を行ったところ、形質導入細胞においてGFPが増加した（図８８）。次いで、図９０に示すように、この細胞をNSGレシピエントマウスに投与した。６ヶ月後のインビボ分析では、Ｂ細胞だけでなく骨髄系細胞も増加していることが示された（図８９および図９７）。
【０２２４】
図９２に示す構築物を使用したさらなる試験も考えられる。ENCODEゲノムワイドデータベースから入手可能な、特定の細胞系列の制御マーカーに関する情報を利用して、バイオインフォマティクスによるアプローチを行った。保存された非コード配列情報を使用してエンハンサー候補を同定するという流れで制御マーカーを見出した。
【０２２５】
組織特異的なBTKの発現を向上させるため、ヒトとマウスの非コード配列を比較し、高度に保存された領域を同定することによって、保存された非コード配列を同定した。保存された非コード配列をBTKpのすぐ上流にクローニングし、BTKプロモーター（BTKp）と協働して発現を向上することができるかどうかを確認する。最初の読み取りでは、GFPレポーターを使用して発現を追跡した。発現が改善されると、GFPのシグナルすなわち「MFI」が増加する。イントロン４およびイントロン５はMFIを増加させ、イントロン４、イントロン５およびイントロン１３を含むコンティグもMFIを増加させることが分かった。GFPは、配列番号８に示される配列によってコードされていた。図９２のセット１に示す配列は、配列番号２３〜３０で示される。GFPをコードする試験配列は、配列番号３１、配列番号３２、および配列番号３６〜４０に示す。
【０２２６】
次に、GFPを使用して、イントロン４、イントロン５およびイントロン１３を含むコンティグと、イントロン４とイントロン５のみを含むコンティグをインビトロで再度試験して、これらの比較を行った。イントロン４とイントロン５のみを含むコンティグの方が高いMFIを示した。
【０２２７】
マウス遺伝子療法モデルを使用して、イントロン４とイントロン５のみを含むコンティグをインビボで試験した。イントロン４とイントロン５のみを含むコンティグを、イントロンエンハンサー4,5またはIE4-5と呼ぶ。この研究では、エンハンサーエレメント／プロモーターエレメントを使用して、コドン最適化したヒトBTKコード配列の発現を促進した。この研究の結果、IE4-5を導入することによって、１ウイルスコピー数あたりのBTKの発現が向上することが示された。
【０２２８】
BTKを発現させるための配列をコードするポリペプチドを、配列番号３３〜３５および配列番号４１〜４５に示す。
【０２２９】
ENCODEデータベースの情報を利用したエンハンサー候補の精査
IE4-5において、エンハンサー活性を発揮するDNAエレメントをより厳密に定義にするため、ENCODEデータベースを使用して、これらのイントロンに含まれるDNase高感受性領域を探索したところ、各イントロンに１つずつDNase高感受性領域が見出されたが、これらのDNase高感受性領域はＢ細胞および骨髄系細胞では見出されるものの、非関連組織に常に存在するわけではなかった。これらのDNase高感受性領域をそれぞれDHS4およびDHS5と呼ぶ。DHS4およびDHS5は、これらが含まれていたイントロン領域よりもそれぞれ725bpおよび1077bp短かった。Ｂ細胞および骨髄系細胞においても、イントロン１内にDNase高感受性領域（DHS1、DHS2およびDHS3）が同定され、イントロン１がインビトロにおいてMFIを増加させる可能性があるという証拠があったことから、これらについても試験を行った。ENCODEを利用したセグメンテーション解析の結果、DHS3およびDHS4が、Ｂ細胞において転写エンハンサーとしての特性を有することが特定された。また、DHS5は、CTCF結合部位およびインスレーター候補として特定された。
【０２３０】
DHS領域１〜５の様々な組み合わせについても試験した。
【０２３１】
図９２に示す「1kb」および「3kb」は、エンハンサーのサイズを調節するためのイントロン１の非保存配列である。
【０２３２】
1.5kbのUCOEの末端を切断して0.7kbとし、DNAエンハンサーエレメントとして機能しうる領域を同定することによって、レンチウイルス構築物の力価とBTKの発現を向上できる可能性がある
1.5kbの偏在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）の末端を切断して0.7kbとした結果を図９３Ａに示す。UCOEエレメントは、ハウスキーピング遺伝子CBX3とハウスキーピング遺伝子HNRPA2B1が互いに外側に転写されるプロモーター領域にまたがる大きなCpGリッチ領域に存在し、タンパク質発現構築物において使用するために、従来から様々な研究グループによって1.5〜2.2kbの長さの領域になるように末端切断が行われている。本実験で使用する1.5kbのUCOEは、CBX3のエキソン１からCBX3の選択的エキソン１を超えて伸びている。この領域を0.7kbのサイズになるように末端切断すると、選択的エキソン１の下流の領域が除去される。（図９３Ｂ）ENCODEデータベースを利用して、BTK遺伝子のイントロン領域からDNase I高感受性領域（DHS）を同定し、UCSC Genome Browser on Human Feb. 2009 (GRCh37/hg19) Assemblyを使用して視覚化した。５つのDHSを同定し、DHS1、DHS2、DHS3、DHS4およびDHS5として順に示した（青色の四角）。ENCODEを利用したゲノムセグメンテーションによって、DHS4の周辺に、予測されたエンハンサーエレメントが同定された（黄色の四角）。エキソンは黒色の四角で示す。配列の長さは、各DHSの下に記載する。これらのDHS配列を様々に組み合わせて0.7UCOE.BTKp.coBTK構築物にクローニングし、以下のようにしてインビトロで試験した（データ示さず）。以下に示す様々な発現カセットを含むレンチウイルス（LV）でマウスBtk-/-Tec-/-骨髄細胞に形質導入した。次いで、導入遺伝子の発現の平均蛍光強度をフローサイトメトリーで比較した。（図９３Ｃ）インビトロにおいてマウス（TBK）系統由来の陰性細胞への形質導入実験を実施し、２種のコドン最適化BTKによるBTKの発現量を比較した。この２種のコドン最適化BTKとして、coBTK（図１〜２）と、Staalら（Leukemia 2010）によって報告されているコドン最適化BTK（本明細書においてco2BTKと呼ぶ）を使用した。形質導入の７日後のBTKの発現を代表的なフローサイトメトリープロットに示す。（図９３Ｄ）DHS構築物についてインビトロ試験を行った結果およびcoBTKとco2BTKを比較した結果に基づいて、インビボ試験に使用する４種の構築物を特定した。図に示すように、これらの構築物はRRLバックボーンを有するレンチウイルス構築物であり、いずれかの種類のコドン最適化ヒトBTK（coBTKまたはco2BTK）を発現し、0.7kbの遍在性クロマチンオープニングエレメント（0.7UCOE）を含み、その下流にDHS4が付加されているか、付加されていないものであった。
【０２３３】
0.7UCOEベクターを使用した遺伝子療法で処置したマウスにおいて、罹患した造血細胞系列でのBTK発現の回復と、Ｂ細胞の発生が示された結果を図９４に示す。移植の１９〜２３週間後において、BTK+細胞の割合と、再構成された各Ｂ細胞サブセットの細胞数および各骨髄系細胞サブセットの細胞数を評価した。（図９４Ａ）エンドポイント分析での脾臓Ｂ細胞における細胞内BTK染色を示した代表的なフローサイトメトリープロットを示す。（図９４Ｂ〜Ｄ）遺伝子療法で処置した群から得た骨髄（図９４Ｂ）、脾臓（図９４Ｃ）および腹腔（図９４Ｄ）中の各リンパ球サブセットにおけるBTK+細胞の割合（％）をフローサイトメトリーで測定した。各細胞サブセットを、好中球（CD11b+GR1+）、単球（CD11b+）およびＢ細胞（B220+）として定義する。（図９４Ｅ〜Ｆ）骨髄（図９４Ｅ）、脾臓（図９４Ｆ）および腹腔（図９４Ｇ）における各Ｂ細胞サブセットの平均細胞数を積み上げ棒グラフに示す。早期Ｂ細胞の発生（骨髄）、すなわち、プロＢ細胞＋プレＢ細胞（IgM-、IgD-）、未熟Ｂ細胞（IgM+IgD-）および成熟Ｂ細胞（IgM+、IgD+）を示す。後期Ｂ細胞の発生（脾臓）、すなわち、１型移行期（T1）Ｂ細胞（CD24hi、CD21-）、２型移行期（T2）Ｂ細胞（CD24hi、CD21int）、辺縁帯／辺縁帯前駆（MZ/MZP）Ｂ細胞（CD24hi、CD21hi）および濾胞成熟（FM）Ｂ細胞（CD24int、CD21int）を示す。腹腔内Ｂ細胞サブセット、すなわち、B1細胞（IgM+CD43+）およびB2細胞（CD43-）を示す。（図９４Ｈ）フローサイトメトリーで測定した各Ｂ細胞サブセットにおけるBTKの発現の回復を示す。（図９４Ｉ）各実験において、WT Mockで正規化した、Ｂ細胞の発生過程におけるBTK+のMFIを示す。データは、４回の独立した実験の平均値±SDを示し、n=13（WT Mock）、n=13（KO Mock）、n=11（0.7UCOE.BTKp.co）、n=11（0.7UCOE.BTKp.co2）、n=16（0.7UCOE.DHS4.BTKp.co）、n=11（0.7UCOE.DHS4.BTKp.co2）およびn=6（0.7UCOE.DHS1-5.BTKp.co）とした。P値は、Sidak法を使用した一元配置分散分析により算出した（***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05）。
【０２３４】
インビボおよびインビトロにおけるＢ細胞の機能の回復を図９５に示す。（図９５Ａ）移植の１２週間後に、アラム（Alum）を加えたNP-CGGでマウスを免疫化した。免疫化したマウスの血清中のNP特異的IgG濃度をELISAで測定し、IgG標準品に対する相対量として示した。免疫前（−）および一次免疫の１０日後（10）に、高親和性NP特異的IgGの血清中濃度を測定した。初回免疫の１ヶ月後に、PBSに加えたNP-CGGをマウスに再投与し、１０日後に血清を採取した（20）。（図９５Ｂ〜Ｃ）エンドポイント分析（移植の２１〜２３週間後）において、各ベクターで処置したマウスの血清中の総IgG濃度（図９５Ｂ）および総IgM濃度（図９５Ｃ）をELISAで測定した。（図９５Ｄ〜Ｆ）エンドポイント分析において、CD43-細胞を磁気分離することによって脾細胞からＢ細胞を単離し、Cell Trace Violetで標識し、インビトロにおいてIgM、LPSまたは培地コントロールで刺激した。（図９５Ｄ）抗マウスIgM抗体、LPSまたは培地のみを加えて７２時間インキュベーション後に１回以上細胞分裂したBTK+Ｂ細胞の割合（%）を示す（フローサイトメトリーにより解析した）。（図９５Ｅ）WT Mockで正規化した、各細胞分裂（D0〜D4）後の細胞におけるBTK+のMFIを示す。（図９５Ｆ）IgMで刺激した７２時間後のＢ細胞におけるCell Trace試薬の希釈に対してBTK染色をプロットし、生細胞とB220+BTK+細胞でゲーティングした代表的なフローサイトメトリープロットである。データは、４回の独立した実験の平均値±SDを示し、n=13（WT Mock）、n=13（KO Mock）、n=11（0.7UCOE.BTKp.co）、n=11（0.7UCOE.BTKp.co2）、n=16（0.7UCOE.DHS4.BTKp.co）、n=11（0.7UCOE.DHS4.BTKp.co2）およびn=6（0.7UCOE.DHS1-5.BTKp.co）とした。P値は、Sidak法を使用した一元配置分散分析により算出した（***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05）。
【０２３５】
ベクターの安全性に関する考察を図９６に示す。各ベクターで処置したマウスの血清中の抗dsDNA IgG濃度（図９６Ａ）および抗dsDNA IgG2c濃度（図９６Ｂ）をELISAで測定し、吸光度の測定値（OD450）として示した。ポジティブコントロールとして、自己免疫疾患傾向のある公知のWASキメラマウスモデルから得た血清、およびEμ.BTKpで処置したマウスから得た血清を使用した。（図９６Ｃ）エンドポイント分析において、全骨髄細胞および全脾細胞からゲノムDNAを単離し、細胞１個あたりのウイルスの組み込み数（ウイルスコピー数）をqPCRで定量した。データは、４回の独立した実験の平均値±SDを示し、n=13（WT Mock）、n=13（KO Mock）、n=11（0.7UCOE.BTKp.co）、n=11（0.7UCOE.BTKp.co2）、n=16（0.7UCOE.DHS4.BTKp.co）、n=11（0.7UCOE.DHS4.BTKp.co2）およびn=6（0.7UCOE.DHS1-5.BTKp.co）とした。P値は、Sidak法を使用した一元配置分散分析により算出した（***P<0.001；**P=0.001〜0.01；*P=0.01〜0.05）。
【０２３６】
XLA患者から得たヒト造血幹細胞（HSC）においてレンチウイルス（LV）ベクターを使用した前臨床モデルの構築
以下の実験は、免疫不全NSGマウスに遺伝子療法用ベクターを移植した場合に、XLAに罹患したヒト造血幹細胞（HSC）からのＢ細胞の発生を回復できるかどうかを評価することを目的として行った。CD34細胞は、XLA患者３（ミスセンス突然変異）および健常ドナーNo.15から得た。形質導入プロトコルは、SCGM培地（TPO、FLT3およびSCF（各100ng/ml）中であらかじめ細胞を４８時間刺激後、レンチウイルスを１回添加することを含む。レンチウイルスはMOI＝５で使用した。使用したレンチウイルスは、0.7 UCOE.BTKp.BTK.co2（力価：7×108）およびDHS4.co2（力価：1×109）であった。
【０２３７】
実験マウス：４匹のマウス＝健常ドナーNo.15（HD）
【０２３８】
３匹のマウス＝Mock処理XLA P3患者（XLAP3）
【０２３９】
５匹のマウス＝0.7UCOE.BTKp.BTK.co2（0.7UCOE）
【０２４０】
４匹のマウス＝0.7UCOE.DHS4.BTKp.BTK.co2（DHS4）
【０２４１】
移入の１２週間後に分析した（図９７）。
【０２４２】
複数の処置群間で条件を同じにしてヒト造血細胞を骨髄に移植した結果を図９８に示す。遺伝子療法を行ったXLA患者由来ヒト幹細胞、または遺伝子療法を行っていないXLA患者由来ヒト幹細胞を、健常ドナー由来のヒト幹細胞と条件を同じにして骨髄に移植した。ヒトおよびマウスのCD45（造血細胞マーカー）、CD33（骨髄系細胞）およびCD19（Ｂ細胞）、ならびにCD4およびCD8（Ｔ細胞）を含む、ヒト免疫細胞の様々なマーカーを示した代表的なフローサイトメトリープロットを示す。生きた全骨髄細胞をhCD45+およびmCD45-でゲーティングしてヒト造血細胞分画を得た後、hCD45+でゲーティングした細胞集団においてCD33マーカーおよびCD19マーカーを分析し、さらに、CD33-CD19-でゲーティングした細胞集団においてCD4およびCD8を分析した。（図９８Ｂおよび図９８Ｃ）骨髄に移植したヒトCD45細胞の割合（％）およびhCD45細胞の総数を示す。各コホート（XLA3、XLA3+0.7UCOE.BTKp.BTKco2レンチウイルス、XLA3+0.7UCOE.DHS4.BTKp.BTKco2レンチウイルスおよび健常ドナー）につきn=4とした。
【０２４３】
図９９は、0.7UCOE.BTKp BTKco2または0.7UCOE.DHS4.BTKp.BTKco2を使用した遺伝子療法でXLA患者３由来のHSCを処置し、このHSCを投与したマウスレシピエントの結果を示す。この結果から、脾臓においてヒト造血細胞の数が有意に増加していることが分かる。（図９９Ａ）ヒトおよびマウスのCD45（造血細胞マーカー）、CD33（骨髄系細胞）およびCD19（Ｂ細胞）、ならびにCD4およびCD8（Ｔ細胞）を含む、ヒト免疫細胞の様々なマーカーを示した代表的なフローサイトメトリープロットである。hCD45+およびmCD45-をゲーティングしてヒト造血細胞分画を得た後、hCD45+でゲーティングした細胞集団においてCD33マーカーおよびCD19マーカーを分析し、さらに、CD33-CD19-でゲーティングした細胞集団においてCD4およびCD8を分析した。（図９９Ｂおよび図９９Ｃ）hCD45+脾細胞の割合（％）およびその総数を示す。各コホートにつきn=4とし、**P=0.004（一元配置分散分析）とした。図１００は、XLA患者由来のHSCをレンチウイルス（0.7UCOE BTKp BTKco2またはDHS4 BTKpBTK.co2を使用）で形質導入し、このHSCを投与したレシピエントの結果を示す。この結果から、XLA患者由来の非処置細胞と比べて脾臓Ｂ細胞（CD19+細胞）の割合が増加していることが分かる。図２に示したフローサイトメトリーの結果を、ヒト免疫細胞の種類別にまとめる。Ａ〜Ｃ：脾臓のヒトCD45+細胞中のＢ細胞（CD19+）、骨髄系細胞（CD33+）およびＴ細胞（CD4+またはCD8+）の割合（％）を示す。Ｄ〜Ｆ：脾臓のヒトCD45+細胞中のＢ細胞（CD19+）、骨髄系細胞（CD33+）およびＴ細胞（CD4+またはCD8+）の総数を示す。各コホートにつきn=4とし、**P=0.0044（一元配置分散分析）とした。
【０２４４】
Ｂ細胞の発生過程で見られる各サブセットを脾臓において調べた代表的なフローサイトメトリープロットを図１０１に示す。各遺伝子療法コホートにおいて、ヒトＢ細胞の発生過程で見られる各サブセットを特定するための典型的なゲーティング方法を示す（右側に示す）。各パネルにおいて使用したマーカーを下に示す（Hist＝ヒストグラム）。あらかじめゲーティングを行った場合は、各列の上方に示す。ヒトCD19+細胞からヒトCD24細胞およびhCD38細胞をゲーティングした。未熟Ｂ細胞（hCD24+hCD38+）はIgM+IgD-CD10highであり、成熟Ｂ細胞（CD24lowCD38low）はIgM+IgD+CD10lowである。
【０２４５】
XLA患者３由来のHSCをレンチウイルス（0.7UCOE.BTKp.BTKco2または0.7UCOE.DHS4 BTKp.BTKco2を使用）で形質導入し、このHSCをレシピエントに移植した結果を図１０２に示す。図に示すように、このレシピエントでは、XLAコントロールと比べて、脾臓中の未熟Ｂ細胞（CD19+CD24+CD38+Ｂ細胞およびCD19+CD24+CD38+IgM+細胞を含む）の割合が増加している。図４に示したフローサイトメトリーの結果を、特定の未熟Ｂ細胞の亜集団別にまとめたグラフを示す。Ａ：脾臓における未熟Ｂ細胞（CD24+CD38+）の割合（％）を示す。Ｂ：IgM+未熟Ｂ細胞の割合（％）を示す。Ｃ〜Ｄ：脾臓における未熟Ｂ細胞（CD24+CD38+）の総数およびCD24+hCD38+IgM+細胞の総数を示す。Ｅ：CD10のヒストグラムの重ね合わせを示し、健常ドナーと比べたCD10の平均蛍光強度（MFI）の変化を示す。各コホートにつきn=4とし、***P=0.0004；**P=0.0044；*P=0.4（一元配置分散分析）とした。
【０２４６】
XLA患者由来のHSCをレンチウイルス（0.7UCOE.BTKp.BTKco2または0.7UCOE.DHS4 BTKp.BTKco2）で形質導入し、レシピエントに移植すると、XLAコントロールと比べて、成熟Ｂ細胞（CD19+CD24lowCD38lowIgM+IgD+）の割合が増加することを図１０３に示す。（図１０４Ａ〜Ｃ）脾臓における成熟Ｂ細胞（hCD24lowhCD38low）の割合（％）とIgM+成熟Ｂ細胞およびIgM+IgD+成熟Ｂ細胞の割合（％）を示す。（図１０３Ｄ〜Ｆ）脾臓成熟Ｂ細胞、IgM+成熟Ｂ細胞およびIgM+IgD+成熟Ｂ細胞の総数を示す。（図１０３Ｇ）CD10のヒストグラムの重ね合わせであり、CD10のMFIが健常ドナーのものと似ていることを示す。各コホートにつきN=4とし、***P=0.0004；**P=0.0044；*P=0.4（一元配置分散分析）とした。
【０２４７】
Ｂ細胞の発生過程で見られる各サブセットを骨髄において調べた代表的なフローサイトメトリープロットを図１０４に示す。各遺伝子療法コホートにおいて、ヒトＢ細胞の発生過程で見られる各サブセットを骨髄において特定するためのゲーティング方法を示す（右側に示す）。各パネルにおいて使用したマーカーを下に示す（Hist＝ヒストグラム）。あらかじめゲーティングを行った場合は、各列の上方に示す。ヒトCD19+細胞からヒトCD24細胞およびhCD38細胞をゲーティングした。骨髄中の未熟Ｂ細胞（hCD24+hCD38+）はIgM+IgD-CD10highである。
【０２４８】
XLA患者由来のHSCをレンチウイルス（0.7UCOE BTKp BTKco2またはDHS4 BTKpBTK.co2を使用）で形質導入し、レシピエントに移植すると、XLAコントロールと比べて、CD19+CD24+CD38+IgM+未熟Ｂ細胞の割合が増加することを図１０５に示す。図７に示したゲーティング方法に基づくフローサイトメトリー分析をまとめたものをグラフに示す。各ドットは、１匹のマウスを示す。（Ａ〜Ｄ）未熟Ｂ細胞（CD24+CD38+）およびIgM+未熟Ｂ細胞の割合（％）とその数を示す。（Ｅ）CD10のヒストグラムの重ね合わせを示し、健常ドナーと比べたCD10のMFIの変化を示す。青色は、0.7.UCOE.BTKp.BTKco2を使用したレンチウイルスで処置した個々のマウスを示し、橙色は0.7UCOE.DHS4.UCOE.BTKp.BTKco2を使用したレンチウイルスで処置した個々のマウスを示す。各コホートにつきn=4とした。一元配置分散分析によって統計学的有意差を算出し、***P=0.0004；**P=0.0044；*P=0.4とした。
【０２４９】
XLA患者由来のHSCをレンチウイルス（0.7UCOE BTKp BTKco2を含むレンチウイルスまたは 0.7UCOE.DHS4 BTKp.BTK.co2を含むレンチウイルスを使用）で形質導入し、レシピエントに移植すると、インビボにおいて細胞１個あたり０．２〜２のウイルスコピー数（VCN）で遺伝子が組み込まれることを図１０６に示す。骨髄（Ａ）および脾臓（Ｂ）ならびに移植前のCD34細胞（Ｃ）に組み込まれたウイルスを定量PCRで測定し、細胞１個あたりのウイルス組み込み数を算出した。0.7UCOE.Co2.BTKp.BTKとDHS4.BTKp.BTKCo2との間に有意差は見られない。各ドットは１匹のマウスを示す（ＡおよびＢ：N=4、Ｃ：N=1）。
【０２５０】
0.7UCOE.BTKp.BTKco2を含むレンチウイルスまたは0.7UCOE.DHS4.BTKp.BTKco2を含むレンチウイルスを使用した遺伝子療法でXLA患者３由来のHSCを処置し、このHSCをレシピエントに移植すると、インビボにおいてIgM分泌Ｂ細胞が産生されることを図１０７に示す。移植の１２週間後に得た血清中の総IgM濃度をELISAで定量した。IgM濃度（μg/mL）は、ヒトIgM標準品を使用して決定した。各ドットは、１匹のマウスの結果を示し、各コホートにつきN=4とした。
【０２５１】
0.7UCOE.BTKp.BTKco2を含むレンチウイルスまたは0.7UCOE.DHS4.BTKp.BTKco2を含むレンチウイルスでXLA患者３由来のHSCを形質導入し、このHSCをレシピエントに移植すると、Ｂ細胞受容体（BCR）の結合に応答したＢ細胞によるカルシウム流入が回復することを図１０８に示す。各コホートのマウスから得た全脾細胞5×106個をそれぞれプールし、Ｂ細胞受容体（BCR）のシグナル伝達に応答した脾細胞によるカルシウム流入を分析した。Ｂ細胞受容体（BCR）のシグナル伝達に応答したカルシウム流入は、BTK活性化の下流の重要な事象である。図１０８Ａは、カルシウム流入を評価するための、ヒトCD19+細胞のゲーティング方法を示す代表的なフローサイトメトリープロットである。図１０８Ｂは、Ｂ細胞受容体（BCR）がヒトIgM抗体と結合した後の、フローサイトメトリーによる細胞内カルシウム濃度の動態解析を示す。
【０２５２】
インビトロにおけるＢ細胞クラススイッチを示した代表的なフローサイトメトリープロットを図１１０に示す。レシピエントマウスの脾細胞をＢ細胞分化誘導プロトコルで培養し（前のスライド）、血漿中Ｂ細胞の同定用マーカーを染色した。また、培地上清を回収し、ELISAでヒトIgM濃度およびヒトIgG濃度を測定した。
【０２５３】
XLA患者由来のHSCをレンチウイルス（0.7UCOE BTKp BTKco2またはDHS4 BTKpBTK.co2を使用）で形質導入し、レシピエントに移植すると、サイトカインおよびＴ細胞依存性シグナルに応答可能なＢ細胞が産生され、抗体が分泌されることを図１１１に示す。0.5×106個の全脾細胞（各コホートのマウスから得た全脾細胞をそれぞれプールしたもの）を、IMDM＋10％FBS＋２−メルカプトエタノール培地で培養した。第Ｉ相では、MegaCD40L（100ng/ml）＋CpG ODN 2006（1μg/ml）＋IL-2（50ng/ml）＋IL-10（50ng/ml）＋IL-15（10ng/ml）の存在下で細胞を７日間培養した。第Ｉ相の終了後、細胞をPBSで２回洗浄し、第II相培地（IL-2（50ng/ml）＋IL-6（50ng/ml）＋IL-10（50ng/ml）＋IL-15（10ng/ml）を添加したIMDM＋10％FBS＋BME）中で３日間培養し、次いで第III相培地（IL-6（50ng/ml）＋IL-15（10ng/ml）＋IFN-α2B（100U/ml）を添加したIMDM＋10％FBS＋BME）に培地交換し４日間培養した。培養終了後、培地上清を回収し、ヒトIgM標準品およびヒトIgG標準品を使用したELISAにより、ヒトIgG濃度（Ａ）およびヒトIgM濃度（Ｂ）を測定した。
【０２５４】
さらなる実施形態
本明細書で述べるように、ブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）の発現維持用ポリヌクレオチドを提供する。該ポリヌクレオチドは、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；およびBTKをコードする第３の配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、前記UCOEは、２ｋｂ、１．５ｋｂ、１ｋｂ、０．７５ｋｂ、０．５ｋｂもしくは０．２５ｋｂ、またはこれらの数値のいずれか２つによって定義される範囲内の長さ（ｋｂ）である。いくつかの実施形態において、第１の配列は、配列番号１および／または配列番号２に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはBTKプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記BTKプロモーターは、配列番号５に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第３の配列は、ヒトにおける発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第３の配列は、配列番号６または配列番号７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはＢ細胞特異的プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは、Ｂ細胞特異的プロモーターB29を含む。いくつかの実施形態において、前記B29プロモーター配列は、配列番号４６に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは内在性プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは１つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、少なくとも１つのDNase高感受性領域（DHS）を含む。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、DNase高感受性領域１（DHS1）、DNase高感受性領域２（DHS2）、DNase高感受性領域３（DHS3）、DNase高感受性領域４（DHS4）および／またはDNase高感受性領域５（DHS5）である。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、配列番号３に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、少なくとも１つのイントロン領域を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座に由来するものである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座のイントロン４、イントロン５および／またはイントロン１３である。いくつかの実施形態において、前記イントロン領域は、配列番号９に示される配列（イントロン４）、配列番号１０に示される配列（イントロン５）および／または配列番号１１に示される配列（イントロン１３）を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、配列番号４、配列番号１４または配列番号１５に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記UCOEは逆方向または順方向である。いくつかの実施形態において、前記UCOEは順方向である。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、配列番号１６に示される配列、配列番号１７に示される配列、配列番号１８に示��れる配列、配列番号１９に示される配列、および／または配列番号２０に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、BTKプロモーターの上流の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、BTKプロモーターの上流の前記遺伝子は、BTKエンハンサーである。いくつかの実施形態において、前記BTKエンハンサーは、配列番号２１または配列番号２２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号３３、３４、３５、４１、４２、４３、４４または４５に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、0.7UCOEは、配列番号１に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、0.7UCOEは、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記エンハンサーは、配列番号３または配列番号４に示される配列を含む。
【０２５５】
さらに、細胞におけるブルトン型チロシンキナーゼ（BTK）の発現維持用ベクターを提供する。該ベクターは、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；およびBTKをコードする第３の配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、第１の配列は、配列番号１および／または配列番号２に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはBTKプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、配列番号５に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第３の配列は、ヒトにおける発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第３の配列は、配列番号６または配列番号７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはＢ細胞特異的プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは、Ｂ細胞特異的プロモーターB29を含む。いくつかの実施形態において、前記B29プロモーター配列は、配列番号４６に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは内在性プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは１つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、少なくとも１つのイントロン領域を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、DNase高感受性領域（DHS）を含む。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、DNase高感受性領域１（DHS1）、DNase高感受性領域２（DHS2）、DNase高感受性領域３（DHS3）、DNase高感受性領域４（DHS4）および／またはDNase高感受性領域５（DHS5）である。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、配列番号３に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座に由来するものである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座のイントロン４、イントロン５および／またはイントロン１３である。いくつかの実施形態において、前記イントロン領域は、配列番号９に示される配列（イントロン４）、配列番号１０に示される配列（イントロン５）および／または配列番号１１に示される配列（イントロン１３）を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、配列番号４、配列番号１４または配列番号１５に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記UCOEは逆方向または順方向である。いくつかの実施形態において、前記UCOEは順方向である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、Ｂ細胞系特異的レンチウイルスベクターを用いたベクターである。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、配列番号１６に示される配列、配列番号１７に示される配列、配列番号１８に示される配列、配列番号１９に示される配列、および／または配列番号２０に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、BTKプロモーターの上流の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、BTKプロモーターの上流の前記遺伝子は、BTKエンハンサーである。いくつかの実施形態において、前記BTKエンハンサーは、配列番号２１または配列番号２２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドまたはベクターは、配列番号３３、３４、３５、４１、４２、４３、４４または４５に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、0.7UCOEは、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記エンハンサーは、配列番号３または配列番号４に示される配列を含む。
【０２５６】
いくつかの実施形態において、BTK発現用細胞であって、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；およびBTKをコードする第３の配列を含むポリヌクレオチドを含む細胞を提供する。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、ベクターに組み込まれている。該ベクターは、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；およびBTKをコードする第３の配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、第１の配列は、配列番号１および／または配列番号２に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはBTKプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、配列番号５に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第３の配列は、ヒトにおける発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第３の配列は、配列番号６または配列番号７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはＢ細胞特異的プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは、Ｂ細胞特異的プロモーターB29を含む。いくつかの実施形態において、前記B29プロモーター配列は、配列番号４６に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは内在性プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは１つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、少なくとも１つのイントロン領域を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、DNase高感受性領域（DHS）を含む。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、DNase高感受性領域１（DHS1）、DNase高感受性領域２（DHS2）、DNase高感受性領域３（DHS3）、DNase高感受性領域４（DHS4）および／またはDNase高感受性領域５（DHS5）である。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、配列番号３に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座に由来するものである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座のイントロン４、イントロン５および／またはイントロン１３である。いくつかの実施形態において、前記イントロン領域は、配列番号９に示される配列（イントロン４）、配列番号１０に示される配列（イントロン５）および／または配列番号１１に示される配列（イントロン１３）を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、配列番号４（配列番号４：イントロン４〜５）、配列番号１４または配列番号１５に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記UCOEは逆方向または順方向である。いくつかの実施形態において、前記UCOEは順方向である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、Ｂ細胞系特異的レンチウイルスベクターを用いたベクターである。いくつかの��施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、配列番号１６に示される配列、配列番号１７に示される配列、配列番号１８に示される配列、配列番号１９に示される配列、および／または配列番号２０に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、BTKプロモーターの上流の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、BTKプロモーターの上流の前記遺伝子は、BTKエンハンサーである。いくつかの実施形態において、前記BTKエンハンサーは、配列番号２１または配列番号２２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、0.7UCOEは、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記エンハンサーは、配列番号３または配列番号４に示される配列を含む。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、Ｂ細胞の生存、増殖および／または分化の促進を必要とする対象において、Ｂ細胞の生存、増殖および／または分化を促進する方法であって、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の細胞、または本発明の実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドもしくは本発明の実施形態のいずれか１つに記載のベクターを含む細胞を前記対象に投与すること、任意で、前記細胞を投与する前に、Ｂ細胞の生存、増殖および／もしくは分化を促進し得る治療法の恩恵を受け得る対象として前記対象を特定すること、ならびに／または任意で、前記対象もしくは該対象から得られた生体試料において、Ｂ細胞の生存、増殖および／もしくは分化を測定することを含む方法を提供する。前記ベクターは、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；およびBTKをコードする第３の配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、第１の配列は、配列番号１および／または配列番号２に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはBTKプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、配列番号５に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第３の配列は、ヒトにおける発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第３の配列は、配列番号６または配列番号７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはＢ細胞特異的プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは、Ｂ細胞特異的プロモーターB29を含む。いくつかの実施形態において、前記B29プロモーター配列は、配列番号４６に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは内在性プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは１つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、少なくとも１つのイントロン領域を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、DNase高感受性領域（DHS）を含む。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、DNase高感受性領域１（DHS1）、DNase高感受性領域２（DHS2）、DNase高感受性領域３（DHS3）、DNase高感受性領域４（DHS4）および／またはDNase高感受性領域５（DHS5）である。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、配列番号３に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座に由来するものである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座のイントロン４、イントロン５および／またはイントロン１３である。いくつかの実施形態において、前記イントロン領域は、配列番号９に示される配列（イントロン４）、配列番号１０に示される配列（イントロン５）および／または配列番号１１に示される配列（イントロン１３）を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメ��トは、配列番号４（配列番号４：イントロン４〜５）、配列番号１４または配列番号１５に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記UCOEは逆方向または順方向である。いくつかの実施形態において、前記UCOEは順方向である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、Ｂ細胞系特異的レンチウイルスベクターを用いたベクターである。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、配列番号１６に示される配列、配列番号１７に示される配列、配列番号１８に示される配列、配列番号１９に示される配列、および／または配列番号２０に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、BTKプロモーターの上流の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、BTKプロモーターの上流の前記遺伝子は、BTKエンハンサーである。いくつかの実施形態において、前記BTKエンハンサーは、配列番号２１または配列番号２２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞は前記対象から得られたものであり、該細胞は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたはベクターを導入することによって遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性である。いくつかの実施形態において、前記対象はＸ連鎖無γグロブリン血症（XLA）に罹患している。いくつかの実施形態において、前記対象は、γグロブリン置換療法を受けるべき対象として選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記対象は、標的化抗微生物剤を投与すべき対象として選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドまたはベクターは、配列番号３３、３４、３５、４１、４２、４３、４４または４５に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドまたはベクターは、配列番号３３、３４、３５、４１、４２、４３、４４または４５に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、0.7UCOEは、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記エンハンサーは、配列番号３または配列番号４に示される配列を含む。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、Ｘ連鎖無γグロブリン血症（XLA）またはXLAに伴う症状の治療、抑制または緩和を必要とする対象において、XLAまたはXLAに伴う症状を治療、抑制または緩和する方法であって、本発明の実施形態のいずれか１つに記載の細胞、または本発明の実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドもしくは本発明の実施形態のいずれか１つに記載のベクターを含む細胞を前記対象に投与すること、任意で、XLAもしくはXLAに伴う症状に対する治療法の恩恵を受け得る対象として前記対象を特定すること、および／または任意で、前記対象において、XLAの進行の改善もしくはXLAに伴う症状の改善を測定することを含む方法を提供する。前記ベクターは、遍在性クロマチンオープニングエレメント（UCOE）をコードする第１の配列；プロモーターをコードする第２の配列；およびBTKをコードする第３の配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、第１の配列は、配列番号１および／または配列番号２に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはBTKプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記プロモーターは、配列番号５に示される核酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第３の配列は、ヒトにおける発現用にコドン最適化されている。いくつかの実施形態において、第３の配列は、配列番号６または配列番号７に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターはＢ細胞特異的プロモーターをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは、Ｂ細胞特異的プロモーターB29を含む。いくつかの実施形態において、前記B29プロモーター配列は、配列番号４６に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記Ｂ細胞特異的プロモーターは内在性プロモーターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターは１つ以上のエンハンサーエレメントをさらに含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、少なくとも１つのイントロン領域を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、DNase高感受性領域（DHS）を含む。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、DNase高感受性領域１（DHS1）、DNase高感受性領域２（DHS2）、DNase高感受性領域３（DHS3）、DNase高感受性領域４（DHS4）および／またはDNase高感受性領域５（DHS5）である。いくつかの実施形態において、前記DNase高感受性領域は、配列番号３に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座に由来するものである。いくつかの実施形態において、前記少なくとも１つのイントロン領域は、ヒトBTK近位プロモーターと関連するヒトBTK遺伝子座のイントロン４、イントロン５および／またはイントロン１３である。いくつかの実施形態において、前記イントロン領域は、配列番号９に示される配列（イントロン４）、配列番号１０に示される配列（イントロン５）および／または配列番号１１に示される配列（イントロン１３）を含む。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、配列番号４（配列番号４：イントロン４〜５）、配列番号１４または配列番号１５に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記UCOEは逆方向または順方向である。いくつかの実施形態において、前記UCOEは順方向である。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、Ｂ細胞系特異的レンチウイルスベクターを用いたベクターである。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記１つ以上のエンハンサーエレメントは、配列番号１６に示される配列、配列番号１７に示される配列、配列番号１８に示される配列、配列番号１９に示される配列、および／または配列番号２０に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ポリヌクレオチドは、BTKプロモーターの上流の遺伝子をさらに含む。いくつかの実施形態において、BTKプロモーターの上流の前記遺伝子は、BTKエンハンサーである。いくつかの実施形態において、前記BTKエンハンサーは、配列番号２１または配列番号２２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記ベクターは、Ｂ細胞系特異的レンチウイルスベクターを用いたベクターである。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は前記対象から得られたものであり、該細胞は、本発明の実施形態のいずれか１つに記載のポリヌクレオチドまたは本発明の実施形態のいずれか１つに記載のベクターを導入することによって遺伝子組換えされている。いくつかの実施形態において、前記投与は養子細胞移入によって行われる。いくつかの実施形態において、前記細胞はＢ細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は骨髄系細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞は造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記細胞はＣＤ３４＋造血幹細胞である。いくつかの実施形態において、前記対象は雄性である。いくつかの実施形態において、前記対象は、γグロブリン置換療法を受けるべき対象として選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記対象は、標的化抗微生物剤を投与すべき対象として選択された対象である。いくつかの実施形態において、前記ポリペプチドまたはベクターは、配列番号３３、３４、３５、４１、４２、４３、４４または４５に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、0.7UCOEは、配列番号２に示される配列を含む。いくつかの実施形態において、前記エンハンサーは、配列番号３または配列番号４に示される配列を含む。
【０２５９】
配列
本発明の実施形態で使用される配列を以下に示す。
【表２】
2020517268.tif 000004
【０２６０】
>0.7UCOE（配列番号1）
(配列番号1）Cgcgtgtggcatctgaagcaccaccagcgagcgagagctagagagaaggaaagccaccgacttcaccgcctccgagctgctccgggtcgcgggtctgcagcgtctccggccctccgcgcctacagctcaagccacatccgaagggggagggagccgggagctgcgcgcggggccgctggggggaggggtggcaccgcccacgccgggcggccacgaagggcggggcagcgggcgcgcgcccggcggggggaggggccgcgcgccgcgcccgctgggaattggggccctagggggagggcggaggcgccgacgaccgcggcacttaccgttcgcggcgtggcgcccggtggtccccaaggggagggaagggggaggcggggcgaggacagtgaccggagtctcctcagcggtggcttttctgcttggcagcctcagcggctggcgccaaaaccggactccgcccacttcctcgcccctgcggtgcgagggtgtggaatcctccagacgctgggggagggggagttgggagcttaaaaactagtacccctttgggaccactttcagcagcgaactctcctgtacaccaggggtcagttccacagacgcgggccaggggtgggtcattgcggcgtgaacaataatttgactagaagttgattcgggtgttt
【０２６１】
>0.7UCOEfwd（配列番号2）
（配列番号2）Cgcaaacacccgaatcaacttctagtcaaattattgttcacgccgcaatgacccacccctggcccgcgtctgtggaactgacccctggtgtacaggagagttcgctgctgaaagtggtcccaaaggggtactagtttttaagctcccaactccccctcccccagcgtctggaggattccacaccctcgcaccgcaggggcgaggaagtgggcggagtccggttttggcgccagccgctgaggctgccaagcagaaaagccaccgctgaggagactccggtcactgtcctcgccccgcctcccccttccctccccttggggaccaccgggcgccacgccgcgaacggtaagtgccgcggtcgtcggcgcctccgccctccccctagggccccaattcccagcgggcgcggcgcgcggcccctccccccgccgggcgcgcgcccgctgccccgcccttcgtggccgcccggcgtgggcggtgccacccctccccccagcggccccgcgcgcagctcccggctccctcccccttcggatgtggcttgagctgtaggcgcggagggccggagacgctgcagacccgcgacccggagcagctcggaggcggtgaagtcggtggctttccttctctctagctctcgctcgctggtggtgcttcagatgccacac
【０２６２】
>DHS4
（配列番号3）aattctatcatagtgtgtcttgtctatgataactgcattgagaaagatgctctgcttgttgagtgagcatttcacttccttctggttctgactatctgtctaatagtggtcatgtgggttgaaaagatagaaaaggggagtagtattaggaagttcagtatgaggaagacttattagacttatgcataaacctaaattctgttgtaatctggaagagctgaagtgccacatatgcatctgtttaggagagcaagaactacaaatttggtcttcagtttggcttgcttacatcctgagaactctgtaggccacatgtcgtgaatatagcagcctctgcaacagtgaaagccagaaaaggaagtggaaagtctcaggggagggggctttctgtcatggatttatgagcacagcaagactaacaagcaaaaagaaaaatgtaaaaggatcttgttcgt
【０２６３】
>IE4-5
（配列番号4）acatctttgagcttcagtttcctcatctgtaaataggggaataatacatacttcttaaggctactgcaaagatcaaataagtaatacatttgaagcacttgggacagagcctgctacatagtaagtgctcattaagtgttagttatcattgttgttgtttttaggccaaggttgttgtgaaaattaaatgagataatatataaaaggtatttagctcaatatctggcacatagcaataattgaatagatgatccttcatcttcgttcctcctgttccctttcagtttgaaagacttggctaatataattttgaccaaccaaacttgcattcaagggagtgtacaaggctggtatagccagccagtgagtatcagaatctaaatgtttattaagacaaagggctgtcatgcaataacccaaccataccattatcagtctgccatccttcctgtttctctaggcagcctttcctgatgtcaactcaaccagttaatctctcagtcacttgacatgtggctatatatacacacaaatatgtgtgcatgcatcctgtgctgcaagcatttacagtcaagtttatctgaacacactgtatggttgatgtgaaatgctgaaactgttcaagtttaggtcctcacaaagcaaggaatatgaaatatttccttgggaaatatttatccacaacaaagagatgtacagtgctttcgtatacagtgatttacagttttccatgtgcttttacatgtattattacttcatttgatccttacaacaaccccagaggtagatgtggcatgaattaccattattctcctttgagaagaagaaactgagcatcaaagaagcttgttggccttcttgccagaaatcacccagtttgtaaatggtaaaagagggcttgaaaccaggttctctgactctgacttcaagcactctcatacatcatctatttaattttttggagctaggtattttatacttaggattctaaatattgcataaccattgaatgccacaccacccttgtattcagtgcaaaaaatgggacttttcttaataaatagagaaatggaggtgcctaaaattacaaaattgcactagagagatagtgatagaactgggaaactcttagtctaatattttatcttttattcatatgatggaatactaagctcaatggcagaatcttcagtcagcaatggtgttcaggttatgtgaactatctgaaggattcctgaactcttcatatctaggaatgtagcgtttaaaagctcttagaatttttcatactcttaggtcctcctgacttgtgcttcaattcatgcataaacttattttataaggtctccgtctgcccttgctggagataacatttttgtttatccaacaaagggtattttatcttattattaaattctgactttgtatagaagagaaatgaagtgataatctatataaattaagtcttgattagtacatatgggttattcacttggataatatggagtaaaattttaattcatggctaattacctccacctccactacctagtggcctcccctcaccaatattagccaaaataaatcaaatttggaactacaaacctacttcaaaaagggtaaggtatataataagcaatatcatcaagtcaaatagtatttttttaaccatgtacaaggcatcatgctaggtgttacgaagatgcatgaaatatataagatgtggttccaaccctcacagagtttatagacatcacataataaattctgaagtcaaatataaattaatttaaaattatctgctgttcagcattgttcactagtgcagccaaacaatgtcatcttgttgaaaggcattggtagtaaaaactgtgtctgaaatacccctctttcaaaggtttcgtaaatttgatatagtcagggacacgaacaagatccttttacatttttctttttgcttgttagtcttgctgtgctcataaatccatgacagaaagccccctcccctgagactttccacttccttttctggctttcactgttgcagaggctgctatattcacgacatgtggcctacagagttctcaggatgtaagcaagccaaactgaagaccaaatttgtagttcttgctctcctaaacagatgcatatgtggcacttcagctcttccagattacaacagaatttaggtttatgcataagtctaataagtcttcctcatactgaacttcctaatactactccccttttctatcttttcaacccacatgaccactattagacagatagtcagaaccagaaggaagtgaaatgctcactcaacaagcagagcatctttctcaatgcagttatcatagacaagacacactatgatagaattggtgctgctatgtattctttttga
【０２６４】
>BTKp
（配列番号5）Tgcatttcctaggagaatccctgggggaatcattgcagttggagcataatgtagggggcccctgagaaaacctccaggcttcaagtgacatacctagtctgctttaccggtttacaggactcaagagaaaggtggacattgagagttaatccctgaggccaaatcttaaatggagaaagtcaacatccacagaaaatggggaagggcacaagtatttctgtgggcttatattccgacatttttatctgtaggggaaaaatgctttcttagaaaatgactcagcacggggaagtcttgtctctacctctgtcttgttttgtcctttggggtcccttcactatcaagttcaactgtgtgtccctgagactcctctgccccggaggacaggagactcgaaaaacgctcttcctggccagtctctttgctctgtgtctgccagcccccagcatctctcctctttcctgtaagcccctctccctgtgctgactgtcttcatagtactttaggtatgttgtccctttacctctgggaggatagcttgatgacctgtctgctcaggccagccccatctagagtctcagtggccccagtcatgttgagaaaggttctttcaaagatagactcaagatagtagtgtcagaggtcccaagcaaatgaagggcggggacagttgagggggtggaatagggacggcagcagggaaccagatagcatgctgctgagaagaaaaaaagacattggtttaggtcaggaagcaaaaaaagggaactgagtggctgtgaaagggtggggtttgctcagactgtccttcctctctggactgtaagaattagtctc
【０２６５】
>coBTK
（配列番号6）atggccgctgtgatcctggagagcattttcctgaagaggtcccagcagaaaaagaaaacctctcccctgaactttaagaaaagactgttcctgctgacagtgcacaagctgtcttactatgagtacgactttgagcggggccgccgaggatcaaaaaaggggagcatcgatgtggagaagattacatgcgtggagaccgtggtccctgaaaagaatccaccccctgagaggcagatcccaagacggggcgaggagtcctctgagatggagcagattagtatcattgagcgcttcccctatccttttcaggtggtgtacgacgagggaccactgtatgtgttctcacccacagaggagctgagaaagaggtggattcaccagctgaagaacgtgattagatacaatagcgatctggtgcagaagtatcacccttgtttttggatcgacgggcagtacctgtgctgttcccagacagctaagaacgctatgggatgccagattctggaaaatcggaacggatctctgaaaccagggagttcacaccgcaagaccaaaaagcccctgcctccaacacccgaggaggatcagatcctgaaaaagcctctgccacccgagcctgctgcagccccagtcagcacttccgaactgaaaaaggtggtggctctgtatgactacatgcccatgaatgctaacgatctgcagctgagaaagggcgacgagtatttcattctggaagagtctaatctgccttggtggagggccagagataagaacggacaggaggggtacatcccatctaattatgtgaccgaggctgaggactctattgagatgtacgagtggtatagcaagcacatgacacggtcccaggctgagcagctgctgaagcaggagggcaaagagggagggtttatcgtgcgcgattctagtaaggccggcaaatacactgtgtcagtgttcgctaagagcaccggagacccccagggcgtgatcagacactatgtggtgtgttccacacctcagtctcagtactatctggctgagaagcacctgtttagtacaatcccagagctgattaactaccaccagcacaattctgccggcctgatcagcaggctgaagtatcccgtctcccagcagaacaaaaatgctccttctaccgctggactggggtacggcagttgggagattgatccaaaggacctgacattcctgaaggagctgggaactgggcagtttggcgtggtgaagtatggaaaatggagagggcagtacgatgtggccatcaagatgatcaaggagggctcaatgagcgaggacgagttcatcgaggaggctaaggtcatgatgaacctgtcccacgagaaactggtgcagctgtatggagtgtgcaccaagcagcggcccatttttatcattacagagtacatggctaatgggtgtctgctgaactatctgcgcgagatgagacacagattccagacacagcagctgctggaaatgtgcaaggatgtgtgtgaggctatggagtacctggagtctaagcagtttctgcaccgggacctggctgctcgcaattgcctggtgaacgatcagggcgtggtgaaggtgagtgacttcggactgtcaaggtatgtgctggatgacgagtacaccagctccgtgggctctaagtttcctgtgagatggtctccacccgaggtgctgatgtatagcaagttctcctctaagagcgatatctgggcctttggcgtgctgatgtgggaaatctacagcctgggcaagatgccttacgagcggttcacaaattccgagacagctgagcacatcgcccagggcctgcgcctgtaccggccacatctggcctctgagaaggtgtacaccatcatgtacagctgttggcacgagaaggccgacgagagacccacattcaagatcctgctgtccaacattctagatgtgatggacgaggagagctga
【０２６６】
>co2BTK
（配列番号7）atggccgccgtgatcctggaaagcatcttcctgaagcggagccagcagaagaagaaaaccagccccctgaacttcaagaagcggctgttcctgctgaccgtgcacaagctgtcctactacgagtacgacttcgagcggggcagacggggcagcaagaagggcagcatcgacgtcgagaagatcacctgcgtggagaccgtggtgcccgagaagaacccccctcccgagcggcagatccccagacggggcgaggaaagcagcgagatggaacagatcagcatcatcgagcggttcccttacccattccaagtggtgtacgacgagggccccctgtacgtgttcagccccaccgaggaactgcggaagcggtggattcaccagctgaagaacgtgatccggtacaacagcgacctggtgcagaagtaccacccctgcttttggatcgacggccagtacctgtgctgcagccagaccgccaagaacgctatgggctgccagattctggaaaaccggaacggcagcctgaagcccggcagcagccacagaaagaccaagaagcccctgccccccacccccgaagaggaccagatcctgaagaagcctctgcctcccgagcccgccgctgcacctgtgagcaccagcgagctgaagaaagtggtggccctgtacgactacatgcccatgaacgccaacgacctgcagctgcggaagggcgacgagtacttcatcctggaagaaagcaacctgccctggtggcgggccagggacaagaacggccaggaaggctacatccccagcaactacgtgaccgaggccgaggactccatcgagatgtacgagtggtacagcaagcacatgaccagaagccaggccgaacagctgctgaagcaggaaggcaaagagggcggcttcatcgtccgggacagcagcaaggccggcaagtacaccgtgagcgtgttcgccaagagcaccggcgacccccagggcgtgatccggcactacgtggtgtgcagcaccccccagagccagtactacctggccgagaagcacctgttcagcaccatccccgagctgatcaactatcaccagcacaacagcgctggactgatttctcggctgaagtaccccgtgtcccagcagaacaaaaacgcccccagcacagccggcctgggctacggcagctgggagatcgaccccaaggacctgaccttcctgaaagagctgggcaccggccagttcggcgtggtgaagtacggcaagtggaggggccagtacgacgtggccatcaagatgatcaaggaaggcagcatgagcgaggacgagttcatcgaggaagccaaagtgatgatgaacctgagccacgagaagctggtgcagctgtacggcgtgtgcaccaagcagcggcccatcttcatcatcaccgagtacatggccaacggctgcctgctgaactacctgcgggagatgcggcacaggttccagacacagcagctgctcgaaatgtgcaaggacgtgtgcgaggctatggaatacctggaatccaagcagttcctgcaccgggacctggccgccagaaactgcctggtgaacgaccagggggtggtgaaggtgtccgacttcggcctgagcagatacgtgctggacgacgagtacaccagcagcgtgggcagcaagttccccgtgcggtggagcccccctgaggtgctgatgtacagcaagttcagcagcaagagcgacatctgggccttcggcgtgctgatgtgggagatctacagcctgggcaagatgccctacgagcggttcaccaacagcgagaccgccgagcacatcgcccagggcctgcggctgtacaggccccacctggccagcgagaaggtgtacaccatcatgtacagctgctggcacgagaaggccgacgagaggcccaccttcaagatcctgctgtccaacatcctggacgtgatggacgaggaaagctga
【０２６７】
図９２に関連する配列（前述していないもの）−以下の構築物は、前述の配列を特定するプロセスの一部において、臨床遺伝子療法用ベクターの上位候補として試験したものである。
【０２６８】
>GFP
（配列番号8）atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa
【０２６９】
>イントロン4
（配列番号9）ctcaaaaagaatacatagcagcaccaattctatcatagtgtgtcttgtctatgataactgcattgagaaagatgctctgcttgttgagtgagcatttcacttccttctggttctgactatctgtctaatagtggtcatgtgggttgaaaagatagaaaaggggagtagtattaggaagttcagtatgaggaagacttattagacttatgcataaacctaaattctgttgtaatctggaagagctgaagtgccacatatgcatctgtttaggagagcaagaactacaaatttggtcttcagtttggcttgcttacatcctgagaactctgtaggccacatgtcgtgaatatagcagcctctgcaacagtgaaagccagaaaaggaagtggaaagtctcaggggagggggctttctgtcatggatttatgagcacagcaagactaacaagcaaaaagaaaaatgtaaaaggatcttgttcgtgtccctgactatatcaaatttacgaaacctttgaaagaggggtatttcagacacagtttttactaccaatgcctttcaacaagatgacattgtttggctgcactagtgaacaatgctgaacagcagataattttaaattaatttatatttgacttcagaatttattatgtgatgtctataaactctgtgagggttggaaccacatcttatatatttcatgcatcttcgtaacacctagcatgatgccttgtacatggttaaaaaaatactatttgacttgatgatattgcttattatataccttaccctttttgaagtaggtttgtagttccaaatttgatttattttggctaatattggtgaggggaggccactaggtagtggaggtggaggtaattagccatgaattaaaattttactccatattatccaagtgaataacccatatgtactaatcaagacttaatttatatagattatcacttcatttctcttctatacaaagtcagaatttaataataagataaaataccctttgttggataaacaaaaatgttatctccagcaagggcagacggagaccttataaaataagtttatgcatgaattgaagcacaagtcaggaggacctaagagtatgaaaaattctaagagcttttaaacgctacattcctagatatgaagagttcaggaatccttcagatagttcacataacctgaacaccattgctgactgaagattctgcc
【０２７０】
>イントロン5
（配列番号10）Ccatcatatgaataaaagataaaatattagactaagagtttcccagttctatcactatctctctagtgcaattttgtaattttaggcacctccatttctctatttattaagaaaagtcccattttttgcactgaatacaagggtggtgtggcattcaatggttatgcaatatttagaatcctaagtataaaatacctagctccaaaaaattaaatagatgatgtatgagagtgcttgaagtcagagtcagagaacctggtttcaagccctcttttaccatttacaaactgggtgatttctggcaagaaggccaacaagcttctttgatgctcagtttcttcttctcaaaggagaataatggtaattcatgccacatctacctctggggttgttgtaaggatcaaatgaagtaataatacatgtaaaagcacatggaaaactgtaaatcactgtatacgaaagcactgtacatctctttgttgtggataaatatttcccaaggaaatatttcatattccttgctttgtgaggacctaaacttgaacagtttcagcatttcacatcaaccatacagtgtgttcagataaacttgactgtaaatgcttgcagcacaggatgcatgcacacatatttgtgtgtatatatagccacatgtcaagtgactgagagattaactggttgagttgacatcaggaaaggctgcctagagaaacaggaaggatggcagactgataatggtatggttgggttattgcatgacagccctttgtcttaataaacatttagattctgatactcactggctggctataccagccttgtacactcccttgaatgcaagtttggttggtcaaaattatattagccaagtctttcaaactgaaagggaacaggaggaacgaagatgaaggatcatctattcaattattgctatgtgccagatattgagctaaataccttttatatattatctcatttaattttcacaacaaccttggcctaaaaacaacaacaatgataactaacacttaatgagcacttactatgtagcaggctctgtcccaagtgcttcaaatgtattacttatttgatctttgcagtagccttaagaagtatgtattattcccctatttacagatgaggaaactgaagctcaaagatgt
【０２７１】
>イントロン13
（配列番号11）ggtagggtggactggccagttgcaaaaactacctttgctggccttgccttagggagtgtccttgaggtacactgttctgcagcagctgcctcaaggacgctcaagacagatccaagcaaaagttattcactgattttcttcctctagtggctacgactgggactgcaaaaacatagattcataaagggctttgtcgttgtcttgggtctttttgtcttttatttttaattgtgggaaaattttcagtactatccctgagttcattaactaccatcactaacataatcataaagggatttggggaggttgcttagtctatcttcttgccttatggccaccttgaacctaaaattcccagattcctctaaccaatgaatcccgtttctgagattgacttaagcaaagacagattagtacttctaaaaatttcccttttactagttttcctatttctaccccagtagggatttttgtctattgtaagaattatacattcatgaccccaaagaatcacaccaagacttta
【０２７２】
>1kb
【０２７３】
>CONTIG
（配列番号14）tcaaaaagaatacatagcagcaccaattctatcatagtgtgtcttgtctatgataactgcattgagaaagatgctctgcttgttgagtgagcatttcacttccttctggttctgactatctgtctaatagtggtcatgtgggttgaaaagatagaaaaggggagtagtattaggaagttcagtatgaggaagacttattagacttatgcataaacctaaattctgttgtaatctggaagagctgaagtgccacatatgcatctgtttaggagagcaagaactacaaatttggtcttcagtttggcttgcttacatcctgagaactctgtaggccacatgtcgtgaatatagcagcctctgcaacagtgaaagccagaaaaggaagtggaaagtctcaggggagggggctttctgtcatggatttatgagcacagcaagactaacaagcaaaaagaaaaatgtaaaaggatcttgttcgtgtccctgactatatcaaatttacgaaacctttgaaagaggggtatttcagacacagtttttactaccaatgcctttcaacaagatgacattgtttggctgcactagtgaacaatgctgaacagcagataattttaaattaatttatatttgacttcagaatttattatgtgatgtctataaactctgtgagggttggaaccacatcttatatatttcatgcatcttcgtaacacctagcatgatgccttgtacatggttaaaaaaatactatttgacttgatgatattgcttattatataccttaccctttttgaagtaggtttgtagttccaaatttgatttattttggctaatattggtgaggggaggccactaggtagtggaggtggaggtaattagccatgaattaaaattttactccatattatccaagtgaataacccatatgtactaatcaagacttaatttatatagattatcacttcatttctcttctatacaaagtcagaatttaataataagataaaataccctttgttggataaacaaaaatgttatctccagcaagggcagacggagaccttataaaataagtttatgcatgaattgaagcacaagtcaggaggacctaagagtatgaaaaattctaagagcttttaaacgctacattcctagatatgaagagttcaggaatccttcagatagttcacataacctgaacaccattgctgactgaagattctgccattgagcttagtattccatcatatgaataaaagataaaatattagactaagagtttcccagttctatcactatctctctagtgcaattttgtaattttaggcacctccatttctctatttattaagaaaagtcccattttttgcactgaatacaagggtggtgtggcattcaatggttatgcaatatttagaatcctaagtataaaatacctagctccaaaaaattaaatagatgatgtatgagagtgcttgaagtcagagtcagagaacctggtttcaagccctcttttaccatttacaaactgggtgatttctggcaagaaggccaacaagcttctttgatgctcagtttcttcttctcaaaggagaataatggtaattcatgccacatctacctctggggttgttgtaaggatcaaatgaagtaataatacatgtaaaagcacatggaaaactgtaaatcactgtatacgaaagcactgtacatctctttgttgtggataaatatttcccaaggaaatatttcatattccttgctttgtgaggacctaaacttgaacagtttcagcatttcacatcaaccatacagtgtgttcagataaacttgactgtaaatgcttgcagcacaggatgcatgcacacatatttgtgtgtatatatagccacatgtcaagtgactgagagattaactggttgagttgacatcaggaaaggctgcctagagaaacaggaaggatggcagactgataatggtatggttgggttattgcatgacagccctttgtcttaataaacatttagattctgatactcactggctggctataccagccttgtacactcccttgaatgcaagtttggttggtcaaaattatattagccaagtctttcaaactgaaagggaacaggaggaacgaagatgaaggatcatctattcaattattgctatgtgccagatattgagctaaataccttttatatattatctcatttaattttcacaacaaccttggcctaaaaacaacaacaatgataactaacacttaatgagcacttactatgtagcaggctctgtcccaagtgcttcaaatgtattacttatttgatctttgcagtagccttaagaagtatgtattattcccctatttacagatgaggaaactgaagctcaaagatgttatccttatttctctggggtagggtggactggccagttgcaaaaactacctttgctggccttgccttagggagtgtccttgaggtacactgttctgcagcagctgcctcaaggacgctcaagacagatccaagcaaaagttattcactgattttcttcctctagtggctacgactgggactgcaaaaacatagattcataaagggctttgtcgttgtcttgggtctttttgtcttttatttttaattgtgggaaaattttcagtactatccctgagttcattaactaccatcactaacataatcataaagggatttggggaggttgcttagtctatcttcttgccttatggccaccttgaacctaaaattcccagattcctctaaccaatgaatcccgtttctgagattgacttaagcaaagacagattagtacttctaaaaatttcccttttactagttttcctatttctaccccagtagggatttttgtctattgtaagaattatacattcatgaccccaaagaatcacaccaagacttta
【０２７４】
>revCONTIG
（配列番号15）taacaataaagtcttggtgtgattctttggggtcatgaatgtataattcttacaatagacaaaaatccctactggggtagaaataggaaaactagtaaaagggaaatttttagaagtactaatctgtctttgcttaagtcaatctcagaaacgggattcattggttagaggaatctgggaattttaggttcaaggtggccataaggcaagaagatagactaagcaacctccccaaatccctttatgattatgttagtgatggtagttaatgaactcagggatagtactgaaaattttcccacaattaaaaataaaagacaaaaagacccaagacaacgacaaagccctttatgaatctatgtttttgcagtcccagtcgtagccactagaggaagaaaatcagtgaataacttttgcttggatctgtcttgagcgtccttgaggcagctgctgcagaacagtgtacctcaaggacactccctaaggcaaggccagcaaaggtagtttttgcaactggccagtccaccctaccccagagaaataaggataacatctttgagcttcagtttcctcatctgtaaataggggaataatacatacttcttaaggctactgcaaagatcaaataagtaatacatttgaagcacttgggacagagcctgctacatagtaagtgctcattaagtgttagttatcattgttgttgtttttaggccaaggttgttgtgaaaattaaatgagataatatataaaaggtatttagctcaatatctggcacatagcaataattgaatagatgatccttcatcttcgttcctcctgttccctttcagtttgaaagacttggctaatataattttgaccaaccaaacttgcattcaagggagtgtacaaggctggtatagccagccagtgagtatcagaatctaaatgtttattaagacaaagggctgtcatgcaataacccaaccataccattatcagtctgccatccttcctgtttctctaggcagcctttcctgatgtcaactcaaccagttaatctctcagtcacttgacatgtggctatatatacacacaaatatgtgtgcatgcatcctgtgctgcaagcatttacagtcaagtttatctgaacacactgtatggttgatgtgaaatgctgaaactgttcaagtttaggtcctcacaaagcaaggaatatgaaatatttccttgggaaatatttatccacaacaaagagatgtacagtgctttcgtatacagtgatttacagttttccatgtgcttttacatgtattattacttcatttgatccttacaacaaccccagaggtagatgtggcatgaattaccattattctcctttgagaagaagaaactgagcatcaaagaagcttgttggccttcttgccagaaatcacccagtttgtaaatggtaaaagagggcttgaaaccaggttctctgactctgacttcaagcactctcatacatcatctatttaattttttggagctaggtattttatacttaggattctaaatattgcataaccattgaatgccacaccacccttgtattcagtgcaaaaaatgggacttttcttaataaatagagaaatggaggtgcctaaaattacaaaattgcactagagagatagtgatagaactgggaaactcttagtctaatattttatcttttattcatatgatggaatactaagctcaatggcagaatcttcagtcagcaatggtgttcaggttatgtgaactatctgaaggattcctgaactcttcatatctaggaatgtagcgtttaaaagctcttagaatttttcatactcttaggtcctcctgacttgtgcttcaattcatgcataaacttattttataaggtctccgtctgcccttgctggagataacatttttgtttatccaacaaagggtattttatcttattattaaattctgactttgtatagaagagaaatgaagtgataatctatataaattaagtcttgattagtacatatgggttattcacttggataatatggagtaaaattttaattcatggctaattacctccacctccactacctagtggcctcccctcaccaatattagccaaaataaatcaaatttggaactacaaacctacttcaaaaagggtaaggtatataataagcaatatcatcaagtcaaatagtatttttttaaccatgtacaaggcatcatgctaggtgttacgaagatgcatgaaatatataagatgtggttccaaccctcacagagtttatagacatcacataataaattctgaagtcaaatataaattaatttaaaattatctgctgttcagcattgttcactagtgcagccaaacaatgtcatcttgttgaaaggcattggtagtaaaaactgtgtctgaaatacccctctttcaaaggtttcgtaaatttgatatagtcagggacacgaacaagatccttttacatttttctttttgcttgttagtcttgctgtgctcataaatccatgacagaaagccccctcccctgagactttccacttccttttctggctttcactgttgcagaggctgctatattcacgacatgtggcctacagagttctcaggatgtaagcaagccaaactgaagaccaaatttgtagttcttgctctcctaaacagatgcatatgtggcacttcagctcttccagattacaacagaatttaggtttatgcataagtctaataagtcttcctcatactgaacttcctaatactactccccttttctatcttttcaacccacatgaccactattagacagatagtcagaaccagaaggaagtgaaatgctcactcaacaagcagagcatctttctcaatgcagttatcatagacaagacacactatgatagaattggtgctgctatgtattctttttga
【０２７５】
>ABCD
【０２７６】
（配列番号16）ctggggtatggcaggggctgggcagcagcagcaatgtaccttgcttgggacccctaaaaaccagagagacagcatggctggtgccatttatcagctagtggaggaggctgacggagggtgggagtgtcatcagcacaaggccctggcagtcccttctggtgattagagaggccgaaagggtcctttccgacaagggctgagggtgggcggaacaggaagagaaaaatgtgacatgaggtgaccatccgaacaggtagcaaatgttagaaaggggtacctctggcaaacttagtggaaaagtaatattgcagggagcagtcagataaaaacaagcccttctgtcaaatagtgcttgaagactcaatagggatacatgggtcaatgaagcctttagaaaaagaaatactaagaggcagattctctgagaacatggtaaaagctcacgctccacgttatgaagttgacctttgtgagctagggaaaggcctggctaggccagggtgtaggctacctgccttgagctgtaccaggccaaatgtcgccagggtcagagctggcttattaaaggactgtgtggaagctgtgccaacctcgtggtaacaatgggtaaaagactgggccaggagaaagcagcctctgcctcagcccagacagtgcggccaacccttgaggttgtggcaaaggtttctcctcttaccattgccctccatgtgcatggcttgcttttctcttgtcttcattatttctcctttcctttcctcggatccacgcgtgaattctttgtaaactccttatggtgcgaactaatgtaactttccatccagttatgggggattggtgcaattttaaattatcactatgatttgctatttccatttgagcaaatttcctatagagtttcctttcagtggactagacccatatcaggaagtgacttaggtataaagggaagatacagctttcgaaaaccaaagtttgggcgttctccaaagagttatcagatacccccttctacacccacaatgatctgattgctgagatctgattgctaactactgaaaataaggaagaactagaattttcagtgacacagtgctcagcaagaagctagaaaagaggccttgacatatttgactccaaagctacttggttatgcatgaagccatctggggaggggaaggaggagggagaactcctctgaggaccctgaaacaattgggccacgtgtgactttcagtttctatggagattcatgtgcagtggctgagggcaatctgagagcattggaaacccagaagctttaaacgcgtaggaaagacagggaatggccagaatcttcctagccaattgagtagtgctttcaaggagaaatcaagagaaaacactacttcttggatattttggctaagtagtcatttgaagtacagttgactggttattttattttaaatcatatctcatagactcttcccaatcataggctggctgtgtagttttctgaattttgctctggtattcttcttcttttttttttttatttttattttttattttttttttgagactccaggctggagtgcagtgtcacgatcttggctcactgcaacctccgcctcccgagttcaagcgattctcctgcctcagcctcctgagttgctgggactacaggcgcctgtcaccacgcccggctaattttttgtattttaatagagacgggatttcaccatgttggccaggctggtctctaactcctgacctcaagtgatccgccagcctcagcctcccaaagtgctgggattacgggcatgagccactgcgcctggacttattattcttaatagtattttatcttatgagcgaagataagagcccaagatggtttagtttactgattctgcaagtgctatttctattaattccttggcatactgcagtttgtatgatggctgcactcttgttaataagcttcgtctttctgaattctgttgctccatagggagctgggaggctgcaaaaggtggccctgtaaaaatctttgcatttataatttaataattacagaccccagtgggacaatgtttgaaaaattatattcaccgtctaggaaattgggaactgaaagtccaatatctgcctcagtggagttctggcacctgcattatcccttctgggtatatcaagatcaacagctgcacagatacttttgcttttcacagattctacacatatcatataaaggtgaatagtgtaaagctacctctacaccttaccaagcacacagg
【０２７７】
>DCBA
（配列番号17）cctgtgtgcttggtaaggtgtagaggtagctttacactattcacctttatatgatatgtgtagaatctgtgaaaagcaaaagtatctgtgcagctgttgatcttgatatacccagaagggataatgcaggtgccagaactccactgaggcagatattggactttcagttcccaatttcctagacggtgaatataatttttcaaacattgtcccactggggtctgtaattattaaattataaatgcaaagatttttacagggccaccttttgcagcctcccagctccctatggagcaacagaattcagaaagacgaagcttattaacaagagtgcagccatcatacaaactgcagtatgccaaggaattaatagaaatagcacttgcagaatcagtaaactaaaccatcttgggctcttatcttcgctcataagataaaatactattaagaataataagtccaggcgcagtggctcatgcccgtaatcccagcactttgggaggctgaggctggcggatcacttgaggtcaggagttagagaccagcctggccaacatggtgaaatcccgtctctattaaaatacaaaaaattagccgggcgtggtgacaggcgcctgtagtcccagcaactcaggaggctgaggcaggagaatcgcttgaactcgggaggcggaggttgcagtgagccaagatcgtgacactgcactccagcctggagtctcaaaaaaaaaataaaaaataaaaataaaaaaaaaaaagaagaagaataccagagcaaaattcagaaaactacacagccagcctatgattgggaagagtctatgagatatgatttaaaataaaataaccagtcaactgtacttcaaatgactacttagccaaaatatccaagaagtagtgttttctcttgatttctccttgaaagcactactcaattggctaggaagattctggccattccctgtctttcctacgcgtttaaagcttctgggtttccaatgctctcagattgccctcagccactgcacatgaatctccatagaaactgaaagtcacacgtggcccaattgtttcagggtcctcagaggagttctccctcctccttcccctccccagatggcttcatgcataaccaagtagctttggagtcaaatatgtcaaggcctcttttctagcttcttgctgagcactgtgtcactgaaaattctagttcttccttattttcagtagttagcaatcagatctcagcaatcagatcattgtgggtgtagaagggggtatctgataactctttggagaacgcccaaactttggttttcgaaagctgtatcttccctttatacctaagtcacttcctgatatgggtctagtccactgaaaggaaactctataggaaatttgctcaaatggaaatagcaaatcatagtgataatttaaaattgcaccaatcccccataactggatggaaagttacattagttcgcaccataaggagtttacaaagaattcacgcgtggatccgaggaaaggaaaggagaaataatgaagacaagagaaaagcaagccatgcacatggagggcaatggtaagaggagaaacctttgccacaacctcaagggttggccgcactgtctgggctgaggcagaggctgctttctcctggcccagtcttttacccattgttaccacgaggttggcacagcttccacacagtcctttaataagccagctctgaccctggcgacatttggcctggtacagctcaaggcaggtagcctacaccctggcctagccaggcctttccctagctcacaaaggtcaacttcataacgtggagcgtgagcttttaccatgttctcagagaatctgcctcttagtatttctttttctaaaggcttcattgacccatgtatccctattgagtcttcaagcactatttgacagaagggcttgtttttatctgactgctccctgcaatattacttttccactaagtttgccagaggtacccctttctaacatttgctacctgttcggatggtcacctcatgtcacatttttctcttcctgttccgcccaccctcagcccttgtcggaaaggaccctttcggcctctctaatcaccagaagggactgccagggccttgtgctgatgacactcccaccctccgtcagcctcctccactagctgataaatggcaccagccatgctgtctctctggtttttaggggtcccaagcaaggtacattgctgctgctgcccagcccctgccataccccag
【０２７８】
>AB
（配列番号18）ctggggtatggcaggggctgggcagcagcagcaatgtaccttgcttgggacccctaaaaaccagagagacagcatggctggtgccatttatcagctagtggaggaggctgacggagggtgggagtgtcatcagcacaaggccctggcagtcccttctggtgattagagaggccgaaagggtcctttccgacaagggctgagggtgggcggaacaggaagagaaaaatgtgacatgaggtgaccatccgaacaggtagcaaatgttagaaaggggtacctctggcaaacttagtggaaaagtaatattgcagggagcagtcagataaaaacaagcccttctgtcaaatagtgcttgaagactcaatagggatacatgggtcaatgaagcctttagaaaaagaaatactaagaggcagattctctgagaacatggtaaaagctcacgctccacgttatgaagttgacctttgtgagctagggaaaggcctggctaggccagggtgtaggctacctgccttgagctgtaccaggccaaatgtcgccagggtcagagctggcttattaaaggactgtgtggaagctgtgccaacctcgtggtaacaatgggtaaaagactgggccaggagaaagcagcctctgcctcagcccagacagtgcggccaacccttgaggttgtggcaaaggtttctcctcttaccattgccctccatgtgcatggcttgcttttctcttgtcttcattatttctcctttcctttcctcggatccacgcgtgaattctttgtaaactccttatggtgcgaactaatgtaactttccatccagttatgggggattggtgcaattttaaattatcactatgatttgctatttccatttgagcaaatttcctatagagtttcctttcagtggactagacccatatcaggaagtgacttaggtataaagggaagatacagctttcgaaaaccaaagtttgggcgttctccaaagagttatcagatacccccttctacacccacaatgatctgattgctgagatctgattgctaactactgaaaataaggaagaactagaattttcagtgacacagtgctcagcaagaagctagaaaagaggccttgacatatttgactccaaagctacttggttatgcatgaagccatctggggaggggaaggaggagggagaactcctctgaggaccctgaaacaattgggccacgtgtgactttcagtttctatggagattcatgtgcagtggctgagggcaatctgagagcattggaaacccagaagctttaa
【０２７９】
>A
（配列番号19）ctggggtatggcaggggctgggcagcagcagcaatgtaccttgcttgggacccctaaaaaccagagagacagcatggctggtgccatttatcagctagtggaggaggctgacggagggtgggagtgtcatcagcacaaggccctggcagtcccttctggtgattagagaggccgaaagggtcctttccgacaagggctgagggtgggcggaacaggaagagaaaaatgtgacatgaggtgaccatccgaacaggtagcaaatgttagaaaggggtacctctggcaaacttagtggaaaagtaatattgcagggagcagtcagataaaaacaagcccttctgtcaaatagtgcttgaagactcaatagggatacatgggtcaatgaagcctttagaaaaagaaatactaagaggcagattctctgagaacatggtaaaagctcacgctccacgttatgaagttgacctttgtgagctagggaaaggcctggctaggccagggtgtaggctacctgccttgagctgtaccaggccaaatgtcgccagggtcagagctggcttattaaaggactgtgtggaagctgtgccaacctcgtggtaacaatgggtaaaagactgggccaggagaaagcagcctctgcctcagcccagacagtgcggccaacccttgaggttgtggcaaaggtttctcctcttaccattgccctccatgtgcatggcttgcttttctcttgtcttcattatttctcctttcctttcctc
【０２８０】
>B
（配列番号20）gaattctttgtaaactccttatggtgcgaactaatgtaactttccatccagttatgggggattggtgcaattttaaattatcactatgatttgctatttccatttgagcaaatttcctatagagtttcctttcagtggactagacccatatcaggaagtgacttaggtataaagggaagatacagctttcgaaaaccaaagtttgggcgttctccaaagagttatcagatacccccttctacacccacaatgatctgattgctgagatctgattgctaactactgaaaataaggaagaactagaattttcagtgacacagtgctcagcaagaagctagaaaagaggccttgacatatttgactccaaagctacttggttatgcatgaagccatctggggaggggaaggaggagggagaactcctctgaggaccctgaaacaattgggccacgtgtgactttcagtttctatggagattcatgtgcagtggctgagggcaatctgagagcattggaaacccagaagctttaa
【０２８１】
>BTKe
（配列番号21）tccatcacctactagatatatcagtgcagtgaaaacttcgctaaactaacgctatacctatatcatgaagtgtgtggactagagacaagtgcatatccttacggcaattaactgggaaacgtcaaatagtaactaccactcacctttttccggaaaatcggcttagtttgcccaccatagccactctgcttcctgtcataacgccgctttcctgggaaaacgaattggtatttgttataaaatactgaagatcagcaagtaagtcttacaggttttatcttaatttcgcagcagaaatattaacgctcaagccaggcgtggagggagagagacccggactcgtatgttattctacaacacaaatgtcacattaacaccaaattatgcggaatccatcttaccctgggcgtacagagaatccttgcccttcttgtactgtgtcactttatggggttggtgcttgccacacttcttacagaaagtccggcgggttttagggacgttaacctagtaaagaaacagttcagaacgtgcaatgttatttgaccacaatggcacaacgccctaccttacccagctaaagctgaggcactccaggaggactcctcattacttgctacctctgactacagggtgggccagccccatgtgcttcaagcagagcttcctccctccgtcgagccccaaagagggaagagacctcattaactccacccccggctaactctacctctttgaacccatcacttcaattcctggccccgtagcccggtccctttagggttgatcccggcaagattgggttgctctgatatatcgagtccacacaggagcctggacccatcccggcatagcacgggcgacgaagggggggaaagattaagctggatgttactcggcccccaccagcaagtcctaccatgcttgcgtgagcgctatcggcgcggaaagaaagaaaccgcgaggcaaacggaagtatataggaggttcccgatcgcacttcctcatgggagtcggtaggagcaatcatagagtgtaaggctcagcgcagcgccctcgggcggctgagaggactcagttcggagccgcgggcgggagcttaaggaaggactccgcctaaagggtggtccactcaccccgacttcctcccgccccgcagctttcaacgtttcgtcactttatctcttttggtggactctgctacgtagtggcgttcagtgaagggagcagtgtttttcccagatcctctggcctccccgtccccgagggaagccaggactagggtcgaatgaaggggtcctccacctccacgttccattcctgttccacctcaaggtcactgggaacacctttcgcagcaaactgctaattcaatgaagacctggagggagccaattgttccagttcatctatcacatggccagttggtccattcaacaaatggttattggatgcccattatgtggcaggcactgttccgggggagaggtacagtaatctaataggcttataaatgtgcaattatgaactaagtactttgaagaaaaggaacaatgattggcattaaagcagcacccttctgttgagggagtaagtcagcagctctaggttctgaaaagtgacaatgaaattgtttggctcctgt
【０２８２】
>BTKeΔMyc
（配列番号22）tgttactcggcccccaccagcaagtcctaccatgcttgcgtgagcgctatcggcgcggaaagaaagaaaccgcgaggcaaacggaagtatataggaggttcccgatcgcacttcctcatgggagtcggtaggagcaatcatagagtgtaaggctcagcgcagcgccctcgggcggctgagaggactcagttcggagccgcgggcgggagcttaaggaaggactccgcctaaagggtggtccactcaccccgacttcctcccgccccgcagctttcaacgtttcgtcactttatctcttttggtggactctgctacgtagtggcgttcagtgaagggagcagtgtttttcccagatcctctggcctccccgtccccgagggaagccaggactagggtcgaatgaaggggtcctccacctccacgttccattcctgttccacctcaaggtcactgggaacacctttcgcagcaaactgctaattcaatgaagacctggagggagccaattgttccagttcatctatcacatggccagttggtccattcaacaaatggttattggatgcccattatgtggcaggcactgttccgggggagaggtacagtaatctaataggcttataaatgtgcaattatgaactaagtactttgaagaaaaggaacaatgattggcattaaagcagcacccttctgttgagggagtaagtcagcagctctaggttctgaaaagtgacaatgaaattgtttggctcctgt
【０２８３】
以下の遺伝子発現カセットの配列は、pRRLSIN.cppt.PGK-GFP.WPRE［PGK-GFPを除去］（Addgene #12252）のpRRLバックボーンにクローニングする。
【０２８４】
GFP配列を有するプロモーターを含む核酸を以下に示す（BTKp.GFP）。
【０２８５】
（配列番号23）
gcatttcctaggagaatccctgggggaatcattgcagttggagcataatgtagggggcccctgagaaaacctccaggcttcaagtgacatacctagtctgctttaccggtttacaggactcaagagaaaggtggacattgagagttaatccctgaggccaaatcttaaatggagaaagtcaacatccacagaaaatggggaagggcacaagtatttctgtgggcttatattccgacatttttatctgtaggggaaaaatgctttcttagaaaatgactcagcacggggaagtcttgtctctacctctgtcttgttttgtcctttggggtcccttcactatcaagttcaactgtgtgtccctgagactcctctgccccggaggacaggagactcgaaaaacgctcttcctggccagtctctttgctctgtgtctgccagcccccagcatctctcctctttcctgtaagcccctctccctgtgctgactgtcttcatagtactttaggtatgttgtccctttacctctgggaggatagcttgatgacctgtctgctcaggccagccccatctagagtctcagtggccccagtcatgttgagaaaggttctttcaaagatagactcaagatagtagtgtcagaggtcccaagcaaatgaagggcggggacagttgagggggtggaatagggacggcagcagggaaccagatagcatgctgctgagaagaaaaaaagacattggtttaggtcaggaagcaaaaaaagggaactgagtggctgtgaaagggtggggtttgctcagactgtccttcctctctggactgtaagaattagtctcgaggccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa
INT4.BTKp.GFP（配列番号24）
GCATTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCCTCAAAAAGAATACATAGCAGCACCAATTCTATCATAGTGTGTCTTGTCTATGATAACTGCATTGAGAAAGATGCTCTGCTTGTTGAGTGAGCATTTCACTTCCTTCTGGTTCTGACTATCTGTCTAATAGTGGTCATGTGGGTTGAAAAGATAGAAAAGGGGAGTAGTATTAGGAAGTTCAGTATGAGGAAGACTTATTAGACTTATGCATAAACCTAAATTCTGTTGTAATCTGGAAGAGCTGAAGTGCCACATATGCATCTGTTTAGGAGAGCAAGAACTACAAATTTGGTCTTCAGTTTGGCTTGCTTACATCCTGAGAACTCTGTAGGCCACATGTCGTGAATATAGCAGCCTCTGCAACAGTGAAAGCCAGAAAAGGAAGTGGAAAGTCTCAGGGGAGGGGGCTTTCTGTCATGGATTTATGAGCACAGCAAGACTAACAAGCAAAAAGAAAAATGTAAAAGGATCTTGTTCGTGTCCCTGACTATATCAAATTTACGAAACCTTTGAAAGAGGGGTATTTCAGACACAGTTTTTACTACCAATGCCTTTCAACAAGATGACATTGTTTGGCTGCACTAGTGAACAATGCTGAACAGCAGATAATTTTAAATTAATTTATATTTGACTTCAGAATTTATTATGTGATGTCTATAAACTCTGTGAGGGTTGGAACCACATCTTATATATTTCATGCATCTTCGTAACACCTAGCATGATGCCTTGTACATGGTTAAAAAAATACTATTTGACTTGATGATATTGCTTATTATATACCTTACCCTTTTTGAAGTAGGTTTGTAGTTCCAAATTTGATTTATTTTGGCTAATATTGGTGAGGGGAGGCCACTAGGTAGTGGAGGTGGAGGTAATTAGCCATGAATTAAAATTTTACTCCATATTATCCAAGTGAATAACCCATATGTACTAATCAAGACTTAATTTATATAGATTATCACTTCATTTCTCTTCTATACAAAGTCAGAATTTAATAATAAGATAAAATACCCTTTGTTGGATAAACAAAAATGTTATCTCCAGCAAGGGCAGACGGAGACCTTATAAAATAAGTTTATGCATGAATTGAAGCACAAGTCAGGAGGACCTAAGAGTATGAAAAATTCTAAGAGCTTTTAAACGCTACATTCCTAGATATGAAGAGTTCAGGAATCCTTCAGATAGTTCACATAACCTGAACACCATTGCTGACTGAAGATTCTGCCGGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
INT5.BTKp.GFP（配列番号25）
GCATTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCCATCATATGAATAAAAGATAAAATATTAGACTAAGAGTTTCCCAGTTCTATCACTATCTCTCTAGTGCAATTTTGTAATTTTAGGCACCTCCATTTCTCTATTTATTAAGAAAAGTCCCATTTTTTGCACTGAATACAAGGGTGGTGTGGCATTCAATGGTTATGCAATATTTAGAATCCTAAGTATAAAATACCTAGCTCCAAAAAATTAAATAGATGATGTATGAGAGTGCTTGAAGTCAGAGTCAGAGAACCTGGTTTCAAGCCCTCTTTTACCATTTACAAACTGGGTGATTTCTGGCAAGAAGGCCAACAAGCTTCTTTGATGCTCAGTTTCTTCTTCTCAAAGGAGAATAATGGTAATTCATGCCACATCTACCTCTGGGGTTGTTGTAAGGATCAAATGAAGTAATAATACATGTAAAAGCACATGGAAAACTGTAAATCACTGTATACGAAAGCACTGTACATCTCTTTGTTGTGGATAAATATTTCCCAAGGAAATATTTCATATTCCTTGCTTTGTGAGGACCTAAACTTGAACAGTTTCAGCATTTCACATCAACCATACAGTGTGTTCAGATAAACTTGACTGTAAATGCTTGCAGCACAGGATGCATGCACACATATTTGTGTGTATATATAGCCACATGTCAAGTGACTGAGAGATTAACTGGTTGAGTTGACATCAGGAAAGGCTGCCTAGAGAAACAGGAAGGATGGCAGACTGATAATGGTATGGTTGGGTTATTGCATGACAGCCCTTTGTCTTAATAAACATTTAGATTCTGATACTCACTGGCTGGCTATACCAGCCTTGTACACTCCCTTGAATGCAAGTTTGGTTGGTCAAAATTATATTAGCCAAGTCTTTCAAACTGAAAGGGAACAGGAGGAACGAAGATGAAGGATCATCTATTCAATTATTGCTATGTGCCAGATATTGAGCTAAATACCTTTTATATATTATCTCATTTAATTTTCACAACAACCTTGGCCTAAAAACAACAACAATGATAACTAACACTTAATGAGCACTTACTATGTAGCAGGCTCTGTCCCAAGTGCTTCAAATGTATTACTTATTTGATCTTTGCAGTAGCCTTAAGAAGTATGTATTATTCCCCTATTTACAGATGAGGAAACTGAAGCTCAAAGATGTTAGGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
INT13.BTKp.GFP（配列番号26）
GCATTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCGGTAGGGTGGACTGGCCAGTTGCAAAAACTACCTTTGCTGGCCTTGCCTTAGGGAGTGTCCTTGAGGTACACTGTTCTGCAGCAGCTGCCTCAAGGACGCTCAAGACAGATCCAAGCAAAAGTTATTCACTGATTTTCTTCCTCTAGTGGCTACGACTGGGACTGCAAAAACATAGATTCATAAAGGGCTTTGTCGTTGTCTTGGGTCTTTTTGTCTTTTATTTTTAATTGTGGGAAAATTTTCAGTACTATCCCTGAGTTCATTAACTACCATCACTAACATAATCATAAAGGGATTTGGGGAGGTTGCTTAGTCTATCTTCTTGCCTTATGGCCACCTTGAACCTAAAATTCCCAGATTCCTCTAACCAATGAATCCCGTTTCTGAGATTGACTTAAGCAAAGACAGATTAGTACTTCTAAAAATTTCCCTTTTACTAGTTTTCCTATTTCTACCCCAGTAGGGATTTTTGTCTATTGTAAGAATTATACATTCATGACCCCAAAGAATCACACCAAGACTTTAGGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
1kb.BTKp.GFP（配列番号27）
GCATTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCAAACTGTAGTCTGTTAGCTCACCCTAGAAGAAGGAAATTCTAGAGTCAAGAGAAGTTAAGTTTTAGACAAGCTGGAAGTTGGAATATACTGGAGTTTAAGATCATTGACTCAATGAAAAAAAAAAAAGATTTGTCTGCAGTAAAACCAGAGTTTTAAAAATGATTAGAAATGGACCAGAAAAGAGATAAGGATAATGAGAAAGGGGGCTCTCTAAAACTATTTGGAACTGAAATTGGGACAATGTTTCTGGAAACTATTTTGGCAGTATGTATCAAAATGCAAAATGCACATACTTTTTTGACTCTGGAAATGATGCTTGTATAGAGATCCTAATAACATGGGAAAATAATTAGGAATAATGTTAAATAAGAACATTAGATCTTTTTTTGGAAAAAGGTACCTTGAACGGATGGATGGATGGATAGATACATACATACATGCATACATACATACATAGATGTTACGAAAAATAGGTAAATTAACTGAATGTGCAATATGATCTCAAATATTATAAGAAACACACACAGAAAAAAATGGAAGGAATATGCCGATATATTAATGCCTCTGGATGAGTTTATGAATGATTTTTTCTTTTTTATATCCCTGTACTTGACATATTTTCTACAATAAGCATGTTTTATTTTACTATATTTTGTTTTATTTTGAGATGGGGGTCTCCCTATGTTTCTCAGGCTGACCTTGAACTCTTGGGCTCAAGCAATCCTCCAATATCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGACTACAGGTGCACCCCACTGCACCCAGCTGCGTGTGTTATTTTGATATCGATGGAAAAAATAAATAAAATGTTTAAGCCAAGGAAAACAAAAACTAGGTTGAAAAAGAAGGCCAAAAGGGCACACAAGTCCAGAGTGAAAGACAGACACCCCAGCAGTCACCCTCAGAGCAGAGGGAGAATATTGAAAGTATTACCACTGATCTGATCTGGCACTGACTATAAACTTGCAGATTGGCTCTCTGGCTCTCCTTCCATCATCAGTTGGCCAGAAGGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
CONTIG.BTKp.GFP（配列番号28）
GCATTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCCTCAAAAAGAATACATAGCAGCACCAATTCTATCATAGTGTGTCTTGTCTATGATAACTGCATTGAGAAAGATGCTCTGCTTGTTGAGTGAGCATTTCACTTCCTTCTGGTTCTGACTATCTGTCTAATAGTGGTCATGTGGGTTGAAAAGATAGAAAAGGGGAGTAGTATTAGGAAGTTCAGTATGAGGAAGACTTATTAGACTTATGCATAAACCTAAATTCTGTTGTAATCTGGAAGAGCTGAAGTGCCACATATGCATCTGTTTAGGAGAGCAAGAACTACAAATTTGGTCTTCAGTTTGGCTTGCTTACATCCTGAGAACTCTGTAGGCCACATGTCGTGAATATAGCAGCCTCTGCAACAGTGAAAGCCAGAAAAGGAAGTGGAAAGTCTCAGGGGAGGGGGCTTTCTGTCATGGATTTATGAGCACAGCAAGACTAACAAGCAAAAAGAAAAATGTAAAAGGATCTTGTTCGTGTCCCTGACTATATCAAATTTACGAAACCTTTGAAAGAGGGGTATTTCAGACACAGTTTTTACTACCAATGCCTTTCAACAAGATGACATTGTTTGGCTGCACTAGTGAACAATGCTGAACAGCAGATAATTTTAAATTAATTTATATTTGACTTCAGAATTTATTATGTGATGTCTATAAACTCTGTGAGGGTTGGAACCACATCTTATATATTTCATGCATCTTCGTAACACCTAGCATGATGCCTTGTACATGGTTAAAAAAATACTATTTGACTTGATGATATTGCTTATTATATACCTTACCCTTTTTGAAGTAGGTTTGTAGTTCCAAATTTGATTTATTTTGGCTAATATTGGTGAGGGGAGGCCACTAGGTAGTGGAGGTGGAGGTAATTAGCCATGAATTAAAATTTTACTCCATATTATCCAAGTGAATAACCCATATGTACTAATCAAGACTTAATTTATATAGATTATCACTTCATTTCTCTTCTATACAAAGTCAGAATTTAATAATAAGATAAAATACCCTTTGTTGGATAAACAAAAATGTTATCTCCAGCAAGGGCAGACGGAGACCTTATAAAATAAGTTTATGCATGAATTGAAGCACAAGTCAGGAGGACCTAAGAGTATGAAAAATTCTAAGAGCTTTTAAACGCTACATTCCTAGATATGAAGAGTTCAGGAATCCTTCAGATAGTTCACATAACCTGAACACCATTGCTGACTGAAGATTCTGCCATTGAGCTTAGTATTCCATCATATGAATAAAAGATAAAATATTAGACTAAGAGTTTCCCAGTTCTATCACTATCTCTCTAGTGCAATTTTGTAATTTTAGGCACCTCCATTTCTCTATTTATTAAGAAAAGTCCCATTTTTTGCACTGAATACAAGGGTGGTGTGGCATTCAATGGTTATGCAATATTTAGAATCCTAAGTATAAAATACCTAGCTCCAAAAAATTAAATAGATGATGTATGAGAGTGCTTGAAGTCAGAGTCAGAGAACCTGGTTTCAAGCCCTCTTTTACCATTTACAAACTGGGTGATTTCTGGCAAGAAGGCCAACAAGCTTCTTTGATGCTCAGTTTCTTCTTCTCAAAGGAGAATAATGGTAATTCATGCCACATCTACCTCTGGGGTTGTTGTAAGGATCAAATGAAGTAATAATACATGTAAAAGCACATGGAAAACTGTAAATCACTGTATACGAAAGCACTGTACATCTCTTTGTTGTGGATAAATATTTCCCAAGGAAATATTTCATATTCCTTGCTTTGTGAGGACCTAAACTTGAACAGTTTCAGCATTTCACATCAACCATACAGTGTGTTCAGATAAACTTGACTGTAAATGCTTGCAGCACAGGATGCATGCACACATATTTGTGTGTATATATAGCCACATGTCAAGTGACTGAGAGATTAACTGGTTGAGTTGACATCAGGAAAGGCTGCCTAGAGAAACAGGAAGGATGGCAGACTGATAATGGTATGGTTGGGTTATTGCATGACAGCCCTTTGTCTTAATAAACATTTAGATTCTGATACTCACTGGCTGGCTATACCAGCCTTGTACACTCCCTTGAATGCAAGTTTGGTTGGTCAAAATTATATTAGCCAAGTCTTTCAAACTGAAAGGGAACAGGAGGAACGAAGATGAAGGATCATCTATTCAATTATTGCTATGTGCCAGATATTGAGCTAAATACCTTTTATATATTATCTCATTTAATTTTCACAACAACCTTGGCCTAAAAACAACAACAATGATAACTAACACTTAATGAGCACTTACTATGTAGCAGGCTCTGTCCCAAGTGCTTCAAATGTATTACTTATTTGATCTTTGCAGTAGCCTTAAGAAGTATGTATTATTCCCCTATTTACAGATGAGGAAACTGAAGCTCAAAGATGTTATCCTTATTTCTCTGGGGTAGGGTGGACTGGCCAGTTGCAAAAACTACCTTTGCTGGCCTTGCCTTAGGGAGTGTCCTTGAGGTACACTGTTCTGCAGCAGCTGCCTCAAGGACGCTCAAGACAGATCCAAGCAAAAGTTATTCACTGATTTTCTTCCTCTAGTGGCTACGACTGGGACTGCAAAAACATAGATTCATAAAGGGCTTTGTCGTTGTCTTGGGTCTTTTTGTCTTTTATTTTTAATTGTGGGAAAATTTTCAGTACTATCCCTGAGTTCATTAACTACCATCACTAACATAATCATAAAGGGATTTGGGGAGGTTGCTTAGTCTATCTTCTTGCCTTATGGCCACCTTGAACCTAAAATTCCCAGATTCCTCTAACCAATGAATCCCGTTTCTGAGATTGACTTAAGCAAAGACAGATTAGTACTTCTAAAAATTTCCCTTTTACTAGTTTTCCTATTTCTACCCCAGTAGGGATTTTTGTCTATTGTAAGAATTATACATTCATGACCCCAAAGAATCACACCAAGACTTTAGGGCCCGTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
3kb.BTKp.GFP（配列番号29）
GCATTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCAAACTGTAGTCTGTTAGCTCACCCTAGAAGAAGGAAATTCTAGAGTCAAGAGAAGTTAAGTTTTAGACAAGCTGGAAGTTGGAATATACTGGAGTTTAAGATCATTGACTCAATGAAAAAAAAAAAAGATTTGTCTGCAGTAAAACCAGAGTTTTAAAAATGATTAGAAATGGACCAGAAAAGAGATAAGGATAATGAGAAAGGGGGCTCTCTAAAACTATTTGGAACTGAAATTGGGACAATGTTTCTGGAAACTATTTTGGCAGTATGTATCAAAATGCAAAATGCACATACTTTTTTGACTCTGGAAATGATGCTTGTATAGAGATCCTAATAACATGGGAAAATAATTAGGAATAATGTTAAATAAGAACATTAGATCTTTTTTTGGAAAAAGGTACCTTGAACGGATGGATGGATGGATAGATACATACATACATGCATACATACATACATAGATGTTACGAAAAATAGGTAAATTAACTGAATGTGCAATATGATCTCAAATATTATAAGAAACACACACAGAAAAAAATGGAAGGAATATGCCGATATATTAATGCCTCTGGATGAGTTTATGAATGATTTTTTCTTTTTTATATCCCTGTACTTGACATATTTTCTACAATAAGCATGTTTTATTTTACTATATTTTGTTTTATTTTGAGATGGGGGTCTCCCTATGTTTCTCAGGCTGACCTTGAACTCTTGGGCTCAAGCAATCCTCCAATATCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGACTACAGGTGCACCCCACTGCACCCAGCTGCGTGTGTTATTTTGATATCGATGGAAAAAATAAATAAAATGTTTAAGCCAAGGAAAACAAAAACTAGGTTGAAAAAGAAGGCCAAAAGGGCACACAAGTCCAGAGTGAAAGACAGACACCCCAGCAGTCACCCTCAGAGCAGAGGGAGAATATTGAAAGTATTACCACTGATCTGATCTGGCACTGACTATAAACTTGCAGATTGGCTCTCTGGCTCTCCTTCCATCATCAGTTGGCCAGAATATATTGTCGCTAATGCAAGACAAAAAGAGATGATGAATCACAGAGACCTAGAAGTTTCCAAAACCACAGAAGAAAAATGTAAAATGCTAAAAACATAAGGCCAGGCGCGGTGGCTCAAGCCTGTAATCCCAGCATTTTGGGAGGCCGAGGCAGGTGTCATGGTGTGCGGCTGTAGTCCAAGCTACTCAGGAGGCTGAGGCAAGAGAATTGCTTGAAACTGGGAGGTAGCGATTGCAGTGAGCCAAGATTGCGCTACTGTACCGAAGCCTGGATGACAGAGCGAGACTCTGTCTCAAAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAATAAAACATGAACTGCTGTGGAAGAACCAGAGAGCCCTAAGGCCTCCTGTAAATGACTACAGCAGGAGAGTTTCCCTGGTCAGCATGCAGCTTTCGAAAATTGAGTTTGGCTTGATGCCTTCATCACAAATTTGGTCCCCTGTAGCCTTGACTATGAAGCTTATCATAAAATAATTGGGTTTCACTGGGGCCCGAACAAAAGCATCTTGGGAATTTAACAAGATTAAAGGTTGCTTTGTTGCTGTGGGTATGATTTTTTTTTCTTTTTTCTTTTTTTTTTTTTTTGAGACGGAGTCTGACTCTGTCACCCAGGCTGGAGTGCAGTGGCACGATCTCGGCTCACTGCAACCTCCGCCTCCTGGGTTCAAGCAATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTAACTGGGATTACAGGTGCGCGCCACCACGCCAGGCTAATTTTTGTATTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCTCCATGTTGGTCAGGCTGGCTGCTCTCAAACTCCTGACCTTGCCATCCAGCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCATGAGCTACCACACGTGGCCATATGTAAATTTTAAACATGTAAACCAATACTGTATATCTTTTATAGATATTTACATCTGTAATGATAATATGAAAACGTACCTAGGAATGATAAACACCAAATTCAAGATATTGGTAATCTCTAAGGAGGGAGAAGACTAAGATTTTGGAGTACATAAAGGGGTCTTGATTATATAGATAGTATTTCAGTTCTTAACACGTTCTCTTCTGGTCCCAAGGCCAAGGAATTCTCAATTGAAATCTCAGTTAGAACGTGAAGGATGCTTCTTGGGACTGGGAAGAGATTTTCCGTAGGCCAAATTTAACCTCCCACTAGAGATAGTTGATAATTCTACCACATTTCATAGTGAAGCATCAGGAAGACAGGACTGAAAAGGCAAGAAGGAATGATGCAAATTGCATAGTCCAAAAGATAAGCTGGACCTAGGTTTGCCAGTTTGTCTAAGTAACTGAGAATTCATTCTGAGATCAAAAAATCAAAATAATGTTCACAGCAGCATTGTTTATCACTGAAAGCAAACAACCTAAATGTCCATCAACAGGAGAATGAATAAATATATTGGAATGTATTCATCATATAGAATATTTTATGCATATAAAAATGAATTAAAACATATGAAGTAGAACTAGCCAGATAAATAAATCCTAACATATTATATTGAGGGGAAAAAAGCAAGTTGCTGGAGAATGTGTACCATATATATATATATAAATTTTCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGCGACCGAGTTTCACTCTTGTTGCCCAGGCTGGAGTGCAATGGCAAGATCTCGGCTCACTGCAACCTCTGCCTCCCGGGTTCAAGGGATTCTCCCGCCTCAGCCTCCTGAGTAGCTGGGAGAGTAGCGTTGGCCCAGCTAGTTTTTGTATTTTTAGTAGAGACAGGGTTTCTCCATGTTGGTCAGGCTGGCTGCTCTCAAACTCCTGACCTTGTCATCCACCCGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACAGGCCTGAGTTACCGCACGGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
revCONTIG.BTKp.GFP（配列番号30）
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IE.BTKp.GFP（配列番号31）
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0.7UCOE.IE.BTKp.GFP（配列番号32）
GCATTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCGCGTGTGGCATCTGAAGCACCACCAGCGAGCGAGAGCTAGAGAGAAGGAAAGCCACCGACTTCACCGCCTCCGAGCTGCTCCGGGTCGCGGGTCTGCAGCGTCTCCGGCCCTCCGCGCCTACAGCTCAAGCCACATCCGAAGGGGGAGGGAGCCGGGAGCTGCGCGCGGGGCCGCCGGGGGGAGGGGTGGCACCGCCCACGCCGGGCGGCCACGAAGGGCGGGGCAGCGGGCGCGCGCCCGGCGGGGGGAGGGGCCGCGCGCCGCGCCCGCTGGGAATTGGGGCCCTAGGGGGAGGGCGGAGGCGCCGACGACCGCGGCACTTACCGTTCGCGGCGTGGCGCCCGGTGGTCCCCAAGGGGAGGGAAGGGGGAGGCGGGGCGAGGACAGTGACCGGAGTCTCCTCAGCGGTGGCTTTTCTGCTTGGCAGCCTCAGCGGCTGGCGCCAAAACCGGACTCCGCCCACTTCCTCGCCCCTGCGGTGCGAGGGTGTGGAATCCTCCAGACGCTGGGGGAGGGGGAGTTGGGAGCTTAAAAACTAGTACCCCTTTGGGACCACTTTCAGCAGCGAACTCTCCTGTACACCAGGGGTCAGTTCCACAGACGCGGGCCAGGGGTGGGTCATTGCGGCGTGAACAATAATTTGACTAGAAGTTGATTCGGGTGTTTGCGGCCCACATCTTTGAGCTTCAGTTTCCTCATCTGTAAATAGGGGAATAATACATACTTCTTAAGGCTACTGCAAAGATCAAATAAGTAATACATTTGAAGCACTTGGGACAGAGCCTGCTACATAGTAAGTGCTCATTAAGTGTTAGTTATCATTGTTGTTGTTTTTAGGCCAAGGTTGTTGTGAAAATTAAATGAGATAATATATAAAAGGTATTTAGCTCAATATCTGGCACATAGCAATAATTGAATAGATGATCCTTCATCTTCGTTCCTCCTGTTCCCTTTCAGTTTGAAAGACTTGGCTAATATAATTTTGACCAACCAAACTTGCATTCAAGGGAGTGTACAAGGCTGGTATAGCCAGCCAGTGAGTATCAGAATCTAAATGTTTATTAAGACAAAGGGCTGTCATGCAATAACCCAACCATACCATTATCAGTCTGCCATCCTTCCTGTTTCTCTAGGCAGCCTTTCCTGATGTCAACTCAACCAGTTAATCTCTCAGTCACTTGACATGTGGCTATATATACACACAAATATGTGTGCATGCATCCTGTGCTGCAAGCATTTACAGTCAAGTTTATCTGAACACACTGTATGGTTGATGTGAAATGCTGAAACTGTTCAAGTTTAGGTCCTCACAAAGCAAGGAATATGAAATATTTCCTTGGGAAATATTTATCCACAACAAAGAGATGTACAGTGCTTTCGTATACAGTGATTTACAGTTTTCCATGTGCTTTTACATGTATTATTACTTCATTTGATCCTTACAACAACCCCAGAGGTAGATGTGGCATGAATTACCATTATTCTCCTTTGAGAAGAAGAAACTGAGCATCAAAGAAGCTTGTTGGCCTTCTTGCCAGAAATCACCCAGTTTGTAAATGGTAAAAGAGGGCTTGAAACCAGGTTCTCTGACTCTGACTTCAAGCACTCTCATACATCATCTATTTAATTTTTTGGAGCTAGGTATTTTATACTTAGGATTCTAAATATTGCATAACCATTGAATGCCACACCACCCTTGTATTCAGTGCAAAAAATGGGACTTTTCTTAATAAATAGAGAAATGGAGGTGCCTAAAATTACAAAATTGCACTAGAGAGATAGTGATAGAACTGGGAAACTCTTAGTCTAATATTTTATCTTTTATTCATATGATGGAATACTAAGCTCAATGGCAGAATCTTCAGTCAGCAATGGTGTTCAGGTTATGTGAACTATCTGAAGGATTCCTGAACTCTTCATATCTAGGAATGTAGCGTTTAAAAGCTCTTAGAATTTTTCATACTCTTAGGTCCTCCTGACTTGTGCTTCAATTCATGCATAAACTTATTTTATAAGGTCTCCGTCTGCCCTTGCTGGAGATAACATTTTTGTTTATCCAACAAAGGGTATTTTATCTTATTATTAAATTCTGACTTTGTATAGAAGAGAAATGAAGTGATAATCTATATAAATTAAGTCTTGATTAGTACATATGGGTTATTCACTTGGATAATATGGAGTAAAATTTTAATTCATGGCTAATTACCTCCACCTCCACTACCTAGTGGCCTCCCCTCACCAATATTAGCCAAAATAAATCAAATTTGGAACTACAAACCTACTTCAAAAAGGGTAAGGTATATAATAAGCAATATCATCAAGTCAAATAGTATTTTTTTAACCATGTACAAGGCATCATGCTAGGTGTTACGAAGATGCATGAAATATATAAGATGTGGTTCCAACCCTCACAGAGTTTATAGACATCACATAATAAATTCTGAAGTCAAATATAAATTAATTTAAAATTATCTGCTGTTCAGCATTGTTCACTAGTGCAGCCAAACAATGTCATCTTGTTGAAAGGCATTGGTAGTAAAAACTGTGTCTGAAATACCCCTCTTTCAAAGGTTTCGTAAATTTGATATAGTCAGGGACACGAACAAGATCCTTTTACATTTTTCTTTTTGCTTGTTAGTCTTGCTGTGCTCATAAATCCATGACAGAAAGCCCCCTCCCCTGAGACTTTCCACTTCCTTTTCTGGCTTTCACTGTTGCAGAGGCTGCTATATTCACGACATGTGGCCTACAGAGTTCTCAGGATGTAAGCAAGCCAAACTGAAGACCAAATTTGTAGTTCTTGCTCTCCTAAACAGATGCATATGTGGCACTTCAGCTCTTCCAGATTACAACAGAATTTAGGTTTATGCATAAGTCTAATAAGTCTTCCTCATACTGAACTTCCTAATACTACTCCCCTTTTCTATCTTTTCAACCCACATGACCACTATTAGACAGATAGTCAGAACCAGAAGGAAGTGAAATGCTCACTCAACAAGCAGAGCATCTTTCTCAATGCAGTTATCATAGACAAGACACACTATGATAGAATTGGTGCTGCTATGTATTCTTTTTGAGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
0.7UCOE.BTKp.coBTK（配列番号33）
CCGCGTGTGGCATCTGAAGCACCACCAGCGAGCGAGAGCTAGAGAGAAGGAAAGCCACCGACTTCACCGCCTCCGAGCTGCTCCGGGTCGCGGGTCTGCAGCGTCTCCGGCCCTCCGCGCCTACAGCTCAAGCCACATCCGAAGGGGGAGGGAGCCGGGAGCTGCGCGCGGGGCCGCTGGGGGGAGGGGTGGCACCGCCCACGCCGGGCGGCCACGAAGGGCGGGGCAGCGGGCGCGCGCCCGGCGGGGGGAGGGGCCGCGCGCCGCGCCCGCTGGGAATTGGGGCCCTAGGGGGAGGGCGGAGGCGCCGACGACCGCGGCACTTACCGTTCGCGGCGTGGCGCCCGGTGGTCCCCAAGGGGAGGGAAGGGGGAGGCGGGGCGAGGACAGTGACCGGAGTCTCCTCAGCGGTGGCTTTTCTGCTTGGCAGCCTCAGCGGCTGGCGCCAAAACCGGACTCCGCCCACTTCCTCGCCCCTGCGGTGCGAGGGTGTGGAATCCTCCAGACGCTGGGGGAGGGGGAGTTGGGAGCTTAAAAACTAGTACCCCTTTGGGACCACTTTCAGCAGCGAACTCTCCTGTACACCAGGGGTCAGTTCCACAGACGCGGGCCAGGGGTGGGTCATTGCGGCGTGAACAATAATTTGACTAGAAGTTGATTCGGGTGTTTGCGGCCGGGGCTAGCTACGACGCGTTCCGGAATTCGCCCTTGCATTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGAAAGAAGCCACCATGGCCGCTGTGATCCTGGAGAGCATTTTCCTGAAGAGGTCCCAGCAGAAAAAGAAAACCTCTCCCCTGAACTTTAAGAAAAGACTGTTCCTGCTGACAGTGCACAAGCTGTCTTACTATGAGTACGACTTTGAGCGGGGCCGCCGAGGATCAAAAAAGGGGAGCATCGATGTGGAGAAGATTACATGCGTGGAGACCGTGGTCCCTGAAAAGAATCCACCCCCTGAGAGGCAGATCCCAAGACGGGGCGAGGAGTCCTCTGAGATGGAGCAGATTAGTATCATTGAGCGCTTCCCCTATCCTTTTCAGGTGGTGTACGACGAGGGACCACTGTATGTGTTCTCACCCACAGAGGAGCTGAGAAAGAGGTGGATTCACCAGCTGAAGAACGTGATTAGATACAATAGCGATCTGGTGCAGAAGTATCACCCTTGTTTTTGGATCGACGGGCAGTACCTGTGCTGTTCCCAGACAGCTAAGAACGCTATGGGATGCCAGATTCTGGAAAATCGGAACGGATCTCTGAAACCAGGGAGTTCACACCGCAAGACCAAAAAGCCCCTGCCTCCAACACCCGAGGAGGATCAGATCCTGAAAAAGCCTCTGCCACCCGAGCCTGCTGCAGCCCCAGTCAGCACTTCCGAACTGAAAAAGGTGGTGGCTCTGTATGACTACATGCCCATGAATGCTAACGATCTGCAGCTGAGAAAGGGCGACGAGTATTTCATTCTGGAAGAGTCTAATCTGCCTTGGTGGAGGGCCAGAGATAAGAACGGACAGGAGGGGTACATCCCATCTAATTATGTGACCGAGGCTGAGGACTCTATTGAGATGTACGAGTGGTATAGCAAGCACATGACACGGTCCCAGGCTGAGCAGCTGCTGAAGCAGGAGGGCAAAGAGGGAGGGTTTATCGTGCGCGATTCTAGTAAGGCCGGCAAATACACTGTGTCAGTGTTCGCTAAGAGCACCGGAGACCCCCAGGGCGTGATCAGACACTATGTGGTGTGTTCCACACCTCAGTCTCAGTACTATCTGGCTGAGAAGCACCTGTTTAGTACAATCCCAGAGCTGATTAACTACCACCAGCACAATTCTGCCGGCCTGATCAGCAGGCTGAAGTATCCCGTCTCCCAGCAGAACAAAAATGCTCCTTCTACCGCTGGACTGGGGTACGGCAGTTGGGAGATTGATCCAAAGGACCTGACATTCCTGAAGGAGCTGGGAACTGGGCAGTTTGGCGTGGTGAAGTATGGAAAATGGAGAGGGCAGTACGATGTGGCCATCAAGATGATCAAGGAGGGCTCAATGAGCGAGGACGAGTTCATCGAGGAGGCTAAGGTCATGATGAACCTGTCCCACGAGAAACTGGTGCAGCTGTATGGAGTGTGCACCAAGCAGCGGCCCATTTTTATCATTACAGAGTACATGGCTAATGGGTGTCTGCTGAACTATCTGCGCGAGATGAGACACAGATTCCAGACACAGCAGCTGCTGGAAATGTGCAAGGATGTGTGTGAGGCTATGGAGTACCTGGAGTCTAAGCAGTTTCTGCACCGGGACCTGGCTGCTCGCAATTGCCTGGTGAACGATCAGGGCGTGGTGAAGGTGAGTGACTTCGGACTGTCAAGGTATGTGCTGGATGACGAGTACACCAGCTCCGTGGGCTCTAAGTTTCCTGTGAGATGGTCTCCACCCGAGGTGCTGATGTATAGCAAGTTCTCCTCTAAGAGCGATATCTGGGCCTTTGGCGTGCTGATGTGGGAAATCTACAGCCTGGGCAAGATGCCTTACGAGCGGTTCACAAATTCCGAGACAGCTGAGCACATCGCCCAGGGCCTGCGCCTGTACCGGCCACATCTGGCCTCTGAGAAGGTGTACACCATCATGTACAGCTGTTGGCACGAGAAGGCCGACGAGAGACCCACATTCAAGATCCTGCTGTCCAACATTCTAGATGTGATGGACGAGGAGAGCTGA
IE.BTKp.coBTK（配列番号34）
GCATTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCACATCTTTGAGCTTCAGTTTCCTCATCTGTAAATAGGGGAATAATACATACTTCTTAAGGCTACTGCAAAGATCAAATAAGTAATACATTTGAAGCACTTGGGACAGAGCCTGCTACATAGTAAGTGCTCATTAAGTGTTAGTTATCATTGTTGTTGTTTTTAGGCCAAGGTTGTTGTGAAAATTAAATGAGATAATATATAAAAGGTATTTAGCTCAATATCTGGCACATAGCAATAATTGAATAGATGATCCTTCATCTTCGTTCCTCCTGTTCCCTTTCAGTTTGAAAGACTTGGCTAATATAATTTTGACCAACCAAACTTGCATTCAAGGGAGTGTACAAGGCTGGTATAGCCAGCCAGTGAGTATCAGAATCTAAATGTTTATTAAGACAAAGGGCTGTCATGCAATAACCCAACCATACCATTATCAGTCTGCCATCCTTCCTGTTTCTCTAGGCAGCCTTTCCTGATGTCAACTCAACCAGTTAATCTCTCAGTCACTTGACATGTGGCTATATATACACACAAATATGTGTGCATGCATCCTGTGCTGCAAGCATTTACAGTCAAGTTTATCTGAACACACTGTATGGTTGATGTGAAATGCTGAAACTGTTCAAGTTTAGGTCCTCACAAAGCAAGGAATATGAAATATTTCCTTGGGAAATATTTATCCACAACAAAGAGATGTACAGTGCTTTCGTATACAGTGATTTACAGTTTTCCATGTGCTTTTACATGTATTATTACTTCATTTGATCCTTACAACAACCCCAGAGGTAGATGTGGCATGAATTACCATTATTCTCCTTTGAGAAGAAGAAACTGAGCATCAAAGAAGCTTGTTGGCCTTCTTGCCAGAAATCACCCAGTTTGTAAATGGTAAAAGAGGGCTTGAAACCAGGTTCTCTGACTCTGACTTCAAGCACTCTCATACATCATCTATTTAATTTTTTGGAGCTAGGTATTTTATACTTAGGATTCTAAATATTGCATAACCATTGAATGCCACACCACCCTTGTATTCAGTGCAAAAAATGGGACTTTTCTTAATAAATAGAGAAATGGAGGTGCCTAAAATTACAAAATTGCACTAGAGAGATAGTGATAGAACTGGGAAACTCTTAGTCTAATATTTTATCTTTTATTCATATGATGGAATACTAAGCTCAATGGCAGAATCTTCAGTCAGCAATGGTGTTCAGGTTATGTGAACTATCTGAAGGATTCCTGAACTCTTCATATCTAGGAATGTAGCGTTTAAAAGCTCTTAGAATTTTTCATACTCTTAGGTCCTCCTGACTTGTGCTTCAATTCATGCATAAACTTATTTTATAAGGTCTCCGTCTGCCCTTGCTGGAGATAACATTTTTGTTTATCCAACAAAGGGTATTTTATCTTATTATTAAATTCTGACTTTGTATAGAAGAGAAATGAAGTGATAATCTATATAAATTAAGTCTTGATTAGTACATATGGGTTATTCACTTGGATAATATGGAGTAAAATTTTAATTCATGGCTAATTACCTCCACCTCCACTACCTAGTGGCCTCCCCTCACCAATATTAGCCAAAATAAATCAAATTTGGAACTACAAACCTACTTCAAAAAGGGTAAGGTATATAATAAGCAATATCATCAAGTCAAATAGTATTTTTTTAACCATGTACAAGGCATCATGCTAGGTGTTACGAAGATGCATGAAATATATAAGATGTGGTTCCAACCCTCACAGAGTTTATAGACATCACATAATAAATTCTGAAGTCAAATATAAATTAATTTAAAATTATCTGCTGTTCAGCATTGTTCACTAGTGCAGCCAAACAATGTCATCTTGTTGAAAGGCATTGGTAGTAAAAACTGTGTCTGAAATACCCCTCTTTCAAAGGTTTCGTAAATTTGATATAGTCAGGGACACGAACAAGATCCTTTTACATTTTTCTTTTTGCTTGTTAGTCTTGCTGTGCTCATAAATCCATGACAGAAAGCCCCCTCCCCTGAGACTTTCCACTTCCTTTTCTGGCTTTCACTGTTGCAGAGGCTGCTATATTCACGACATGTGGCCTACAGAGTTCTCAGGATGTAAGCAAGCCAAACTGAAGACCAAATTTGTAGTTCTTGCTCTCCTAAACAGATGCATATGTGGCACTTCAGCTCTTCCAGATTACAACAGAATTTAGGTTTATGCATAAGTCTAATAAGTCTTCCTCATACTGAACTTCCTAATACTACTCCCCTTTTCTATCTTTTCAACCCACATGACCACTATTAGACAGATAGTCAGAACCAGAAGGAAGTGAAATGCTCACTCAACAAGCAGAGCATCTTTCTCAATGCAGTTATCATAGACAAGACACACTATGATAGAATTGGTGCTGCTATGTATTCTTTTTGAGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGAAAGAAGCCACCATGGCCGCTGTGATCCTGGAGAGCATTTTCCTGAAGAGGTCCCAGCAGAAAAAGAAAACCTCTCCCCTGAACTTTAAGAAAAGACTGTTCCTGCTGACAGTGCACAAGCTGTCTTACTATGAGTACGACTTTGAGCGGGGCCGCCGAGGATCAAAAAAGGGGAGCATCGATGTGGAGAAGATTACATGCGTGGAGACCGTGGTCCCTGAAAAGAATCCACCCCCTGAGAGGCAGATCCCAAGACGGGGCGAGGAGTCCTCTGAGATGGAGCAGATTAGTATCATTGAGCGCTTCCCCTATCCTTTTCAGGTGGTGTACGACGAGGGACCACTGTATGTGTTCTCACCCACAGAGGAGCTGAGAAAGAGGTGGATTCACCAGCTGAAGAACGTGATTAGATACAATAGCGATCTGGTGCAGAAGTATCACCCTTGTTTTTGGATCGACGGGCAGTACCTGTGCTGTTCCCAGACAGCTAAGAACGCTATGGGATGCCAGATTCTGGAAAATCGGAACGGATCTCTGAAACCAGGGAGTTCACACCGCAAGACCAAAAAGCCCCTGCCTCCAACACCCGAGGAGGATCAGATCCTGAAAAAGCCTCTGCCACCCGAGCCTGCTGCAGCCCCAGTCAGCACTTCCGAACTGAAAAAGGTGGTGGCTCTGTATGACTACATGCCCATGAATGCTAACGATCTGCAGCTGAGAAAGGGCGACGAGTATTTCATTCTGGAAGAGTCTAATCTGCCTTGGTGGAGGGCCAGAGATAAGAACGGACAGGAGGGGTACATCCCATCTAATTATGTGACCGAGGCTGAGGACTCTATTGAGATGTACGAGTGGTATAGCAAGCACATGACACGGTCCCAGGCTGAGCAGCTGCTGAAGCAGGAGGGCAAAGAGGGAGGGTTTATCGTGCGCGATTCTAGTAAGGCCGGCAAATACACTGTGTCAGTGTTCGCTAAGAGCACCGGAGACCCCCAGGGCGTGATCAGACACTATGTGGTGTGTTCCACACCTCAGTCTCAGTACTATCTGGCTGAGAAGCACCTGTTTAGTACAATCCCAGAGCTGATTAACTACCACCAGCACAATTCTGCCGGCCTGATCAGCAGGCTGAAGTATCCCGTCTCCCAGCAGAACAAAAATGCTCCTTCTACCGCTGGACTGGGGTACGGCAGTTGGGAGATTGATCCAAAGGACCTGACATTCCTGAAGGAGCTGGGAACTGGGCAGTTTGGCGTGGTGAAGTATGGAAAATGGAGAGGGCAGTACGATGTGGCCATCAAGATGATCAAGGAGGGCTCAATGAGCGAGGACGAGTTCATCGAGGAGGCTAAGGTCATGATGAACCTGTCCCACGAGAAACTGGTGCAGCTGTATGGAGTGTGCACCAAGCAGCGGCCCATTTTTATCATTACAGAGTACATGGCTAATGGGTGTCTGCTGAACTATCTGCGCGAGATGAGACACAGATTCCAGACACAGCAGCTGCTGGAAATGTGCAAGGATGTGTGTGAGGCTATGGAGTACCTGGAGTCTAAGCAGTTTCTGCACCGGGACCTGGCTGCTCGCAATTGCCTGGTGAACGATCAGGGCGTGGTGAAGGTGAGTGACTTCGGACTGTCAAGGTATGTGCTGGATGACGAGTACACCAGCTCCGTGGGCTCTAAGTTTCCTGTGAGATGGTCTCCACCCGAGGTGCTGATGTATAGCAAGTTCTCCTCTAAGAGCGATATCTGGGCCTTTGGCGTGCTGATGTGGGAAATCTACAGCCTGGGCAAGATGCCTTACGAGCGGTTCACAAATTCCGAGACAGCTGAGCACATCGCCCAGGGCCTGCGCCTGTACCGGCCACATCTGGCCTCTGAGAAGGTGTACACCATCATGTACAGCTGTTGGCACGAGAAGGCCGACGAGAGACCCACATTCAAGATCCTGCTGTCCAACATTCTAGATGTGATGGACGAGGAGAGCTGA
0.7UCOE.IE.BTKp.coBTK（配列番号35）
CCGCGTGTGGCATCTGAAGCACCACCAGCGAGCGAGAGCTAGAGAGAAGGAAAGCCACCGACTTCACCGCCTCCGAGCTGCTCCGGGTCGCGGGTCTGCAGCGTCTCCGGCCCTCCGCGCCTACAGCTCAAGCCACATCCGAAGGGGGAGGGAGCCGGGAGCTGCGCGCGGGGCCGCTGGGGGGAGGGGTGGCACCGCCCACGCCGGGCGGCCACGAAGGGCGGGGCAGCGGGCGCGCGCCCGGCGGGGGGAGGGGCCGCGCGCCGCGCCCGCTGGGAATTGGGGCCCTAGGGGGAGGGCGGAGGCGCCGACGACCGCGGCACTTACCGTTCGCGGCGTGGCGCCCGGTGGTCCCCAAGGGGAGGGAAGGGGGAGGCGGGGCGAGGACAGTGACCGGAGTCTCCTCAGCGGTGGCTTTTCTGCTTGGCAGCCTCAGCGGCTGGCGCCAAAACCGGACTCCGCCCACTTCCTCGCCCCTGCGGTGCGAGGGTGTGGAATCCTCCAGACGCTGGGGGAGGGGGAGTTGGGAGCTTAAAAACTAGTACCCCTTTGGGACCACTTTCAGCAGCGAACTCTCCTGTACACCAGGGGTCAGTTCCACAGACGCGGGCCAGGGGTGGGTCATTGCGGCGTGAACAATAATTTGACTAGAAGTTGATTCGGGTGTTTGCGGCCGGGGCTAGCACATCTTTGAGCTTCAGTTTCCTCATCTGTAAATAGGGGAATAATACATACTTCTTAAGGCTACTGCAAAGATCAAATAAGTAATACATTTGAAGCACTTGGGACAGAGCCTGCTACATAGTAAGTGCTCATTAAGTGTTAGTTATCATTGTTGTTGTTTTTAGGCCAAGGTTGTTGTGAAAATTAAATGAGATAATATATAAAAGGTATTTAGCTCAATATCTGGCACATAGCAATAATTGAATAGATGATCCTTCATCTTCGTTCCTCCTGTTCCCTTTCAGTTTGAAAGACTTGGCTAATATAATTTTGACCAACCAAACTTGCATTCAAGGGAGTGTACAAGGCTGGTATAGCCAGCCAGTGAGTATCAGAATCTAAATGTTTATTAAGACAAAGGGCTGTCATGCAATAACCCAACCATACCATTATCAGTCTGCCATCCTTCCTGTTTCTCTAGGCAGCCTTTCCTGATGTCAACTCAACCAGTTAATCTCTCAGTCACTTGACATGTGGCTATATATACACACAAATATGTGTGCATGCATCCTGTGCTGCAAGCATTTACAGTCAAGTTTATCTGAACACACTGTATGGTTGATGTGAAATGCTGAAACTGTTCAAGTTTAGGTCCTCACAAAGCAAGGAATATGAAATATTTCCTTGGGAAATATTTATCCACAACAAAGAGATGTACAGTGCTTTCGTATACAGTGATTTACAGTTTTCCATGTGCTTTTACATGTATTATTACTTCATTTGATCCTTACAACAACCCCAGAGGTAGATGTGGCATGAATTACCATTATTCTCCTTTGAGAAGAAGAAACTGAGCATCAAAGAAGCTTGTTGGCCTTCTTGCCAGAAATCACCCAGTTTGTAAATGGTAAAAGAGGGCTTGAAACCAGGTTCTCTGACTCTGACTTCAAGCACTCTCATACATCATCTATTTAATTTTTTGGAGCTAGGTATTTTATACTTAGGATTCTAAATATTGCATAACCATTGAATGCCACACCACCCTTGTATTCAGTGCAAAAAATGGGACTTTTCTTAATAAATAGAGAAATGGAGGTGCCTAAAATTACAAAATTGCACTAGAGAGATAGTGATAGAACTGGGAAACTCTTAGTCTAATATTTTATCTTTTATTCATATGATGGAATACTAAGCTCAATGGCAGAATCTTCAGTCAGCAATGGTGTTCAGGTTATGTGAACTATCTGAAGGATTCCTGAACTCTTCATATCTAGGAATGTAGCGTTTAAAAGCTCTTAGAATTTTTCATACTCTTAGGTCCTCCTGACTTGTGCTTCAATTCATGCATAAACTTATTTTATAAGGTCTCCGTCTGCCCTTGCTGGAGATAACATTTTTGTTTATCCAACAAAGGGTATTTTATCTTATTATTAAATTCTGACTTTGTATAGAAGAGAAATGAAGTGATAATCTATATAAATTAAGTCTTGATTAGTACATATGGGTTATTCACTTGGATAATATGGAGTAAAATTTTAATTCATGGCTAATTACCTCCACCTCCACTACCTAGTGGCCTCCCCTCACCAATATTAGCCAAAATAAATCAAATTTGGAACTACAAACCTACTTCAAAAAGGGTAAGGTATATAATAAGCAATATCATCAAGTCAAATAGTATTTTTTTAACCATGTACAAGGCATCATGCTAGGTGTTACGAAGATGCATGAAATATATAAGATGTGGTTCCAACCCTCACAGAGTTTATAGACATCACATAATAAATTCTGAAGTCAAATATAAATTAATTTAAAATTATCTGCTGTTCAGCATTGTTCACTAGTGCAGCCAAACAATGTCATCTTGTTGAAAGGCATTGGTAGTAAAAACTGTGTCTGAAATACCCCTCTTTCAAAGGTTTCGTAAATTTGATATAGTCAGGGACACGAACAAGATCCTTTTACATTTTTCTTTTTGCTTGTTAGTCTTGCTGTGCTCATAAATCCATGACAGAAAGCCCCCTCCCCTGAGACTTTCCACTTCCTTTTCTGGCTTTCACTGTTGCAGAGGCTGCTATATTCACGACATGTGGCCTACAGAGTTCTCAGGATGTAAGCAAGCCAAACTGAAGACCAAATTTGTAGTTCTTGCTCTCCTAAACAGATGCATATGTGGCACTTCAGCTCTTCCAGATTACAACAGAATTTAGGTTTATGCATAAGTCTAATAAGTCTTCCTCATACTGAACTTCCTAATACTACTCCCCTTTTCTATCTTTTCAACCCACATGACCACTATTAGACAGATAGTCAGAACCAGAAGGAAGTGAAATGCTCACTCAACAAGCAGAGCATCTTTCTCAATGCAGTTATCATAGACAAGACACACTATGATAGAATTGGTGCTGCTATGTATTCTTTTTGAACGCGTTCCGGAATTCGCCCTTGCATTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGAAAGAAGCCACCATGGCCGCTGTGATCCTGGAGAGCATTTTCCTGAAGAGGTCCCAGCAGAAAAAGAAAACCTCTCCCCTGAACTTTAAGAAAAGACTGTTCCTGCTGACAGTGCACAAGCTGTCTTACTATGAGTACGACTTTGAGCGGGGCCGCCGAGGATCAAAAAAGGGGAGCATCGATGTGGAGAAGATTACATGCGTGGAGACCGTGGTCCCTGAAAAGAATCCACCCCCTGAGAGGCAGATCCCAAGACGGGGCGAGGAGTCCTCTGAGATGGAGCAGATTAGTATCATTGAGCGCTTCCCCTATCCTTTTCAGGTGGTGTACGACGAGGGACCACTGTATGTGTTCTCACCCACAGAGGAGCTGAGAAAGAGGTGGATTCACCAGCTGAAGAACGTGATTAGATACAATAGCGATCTGGTGCAGAAGTATCACCCTTGTTTTTGGATCGACGGGCAGTACCTGTGCTGTTCCCAGACAGCTAAGAACGCTATGGGATGCCAGATTCTGGAAAATCGGAACGGATCTCTGAAACCAGGGAGTTCACACCGCAAGACCAAAAAGCCCCTGCCTCCAACACCCGAGGAGGATCAGATCCTGAAAAAGCCTCTGCCACCCGAGCCTGCTGCAGCCCCAGTCAGCACTTCCGAACTGAAAAAGGTGGTGGCTCTGTATGACTACATGCCCATGAATGCTAACGATCTGCAGCTGAGAAAGGGCGACGAGTATTTCATTCTGGAAGAGTCTAATCTGCCTTGGTGGAGGGCCAGAGATAAGAACGGACAGGAGGGGTACATCCCATCTAATTATGTGACCGAGGCTGAGGACTCTATTGAGATGTACGAGTGGTATAGCAAGCACATGACACGGTCCCAGGCTGAGCAGCTGCTGAAGCAGGAGGGCAAAGAGGGAGGGTTTATCGTGCGCGATTCTAGTAAGGCCGGCAAATACACTGTGTCAGTGTTCGCTAAGAGCACCGGAGACCCCCAGGGCGTGATCAGACACTATGTGGTGTGTTCCACACCTCAGTCTCAGTACTATCTGG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ABCD.BTKp.GFP（配列番号36）
TTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCGGATCCCTGGGGTATGGCAGGGGCTGGGCAGCAGCAGCAATGTACCTTGCTTGGGACCCCTAAAAACCAGAGAGACAGCATGGCTGGTGCCATTTATCAGCTAGTGGAGGAGGCTGACGGAGGGTGGGAGTGTCATCAGCACAAGGCCCTGGCAGTCCCTTCTGGTGATTAGAGAGGCCGAAAGGGTCCTTTCCGACAAGGGCTGAGGGTGGGCGGAACAGGAAGAGAAAAATGTGACATGAGGTGACCATCCGAACAGGTAGCAAATGTTAGAAAGGGGTACCTCTGGCAAACTTAGTGGAAAAGTAATATTGCAGGGAGCAGTCAGATAAAAACAAGCCCTTCTGTCAAATAGTGCTTGAAGACTCAATAGGGATACATGGGTCAATGAAGCCTTTAGAAAAAGAAATACTAAGAGGCAGATTCTCTGAGAACATGGTAAAAGCTCACGCTCCACGTTATGAAGTTGACCTTTGTGAGCTAGGGAAAGGCCTGGCTAGGCCAGGGTGTAGGCTACCTGCCTTGAGCTGTACCAGGCCAAATGTCGCCAGGGTCAGAGCTGGCTTATTAAAGGACTGTGTGGAAGCTGTGCCAACCTCGTGGTAACAATGGGTAAAAGACTGGGCCAGGAGAAAGCAGCCTCTGCCTCAGCCCAGACAGTGCGGCCAACCCTTGAGGTTGTGGCAAAGGTTTCTCCTCTTACCATTGCCCTCCATGTGCATGGCTTGCTTTTCTCTTGTCTTCATTATTTCTCCTTTCCTTTCCTCGGATCCACGCGTGAATTCTTTGTAAACTCCTTATGGTGCGAACTAATGTAACTTTCCATCCAGTTATGGGGGATTGGTGCAATTTTAAATTATCACTATGATTTGCTATTTCCATTTGAGCAAATTTCCTATAGAGTTTCCTTTCAGTGGACTAGACCCATATCAGGAAGTGACTTAGGTATAAAGGGAAGATACAGCTTTCGAAAACCAAAGTTTGGGCGTTCTCCAAAGAGTTATCAGATACCCCCTTCTACACCCACAATGATCTGATTGCTGAGATCTGATTGCTAACTACTGAAAATAAGGAAGAACTAGAATTTTCAGTGACACAGTGCTCAGCAAGAAGCTAGAAAAGAGGCCTTGACATATTTGACTCCAAAGCTACTTGGTTATGCATGAAGCCATCTGGGGAGGGGAAGGAGGAGGGAGAACTCCTCTGAGGACCCTGAAACAATTGGGCCACGTGTGACTTTCAGTTTCTATGGAGATTCATGTGCAGTGGCTGAGGGCAATCTGAGAGCATTGGAAACCCAGAAGCTTTAAACGCGTAGGAAAGACAGGGAATGGCCAGAATCTTCCTAGCCAATTGAGTAGTGCTTTCAAGGAGAAATCAAGAGAAAACACTACTTCTTGGATATTTTGGCTAAGTAGTCATTTGAAGTACAGTTGACTGGTTATTTTATTTTAAATCATATCTCATAGACTCTTCCCAATCATAGGCTGGCTGTGTAGTTTTCTGAATTTTGCTCTGGTATTCTTCTTCTTTTTTTTTTTTATTTTTATTTTTTATTTTTTTTTTGAGACTCCAGGCTGGAGTGCAGTGTCACGATCTTGGCTCACTGCAACCTCCGCCTCCCGAGTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCTGAGTTGCTGGGACTACAGGCGCCTGTCACCACGCCCGGCTAATTTTTTGTATTTTAATAGAGACGGGATTTCACCATGTTGGCCAGGCTGGTCTCTAACTCCTGACCTCAAGTGATCCGCCAGCCTCAGCCTCCCAAAGTGCTGGGATTACGGGCATGAGCCACTGCGCCTGGACTTATTATTCTTAATAGTATTTTATCTTATGAGCGAAGATAAGAGCCCAAGATGGTTTAGTTTACTGATTCTGCAAGTGCTATTTCTATTAATTCCTTGGCATACTGCAGTTTGTATGATGGCTGCACTCTTGTTAATAAGCTTCGTCTTTCTGAATTCTGTTGCTCCATAGGGAGCTGGGAGGCTGCAAAAGGTGGCCCTGTAAAAATCTTTGCATTTATAATTTAATAATTACAGACCCCAGTGGGACAATGTTTGAAAAATTATATTCACCGTCTAGGAAATTGGGAACTGAAAGTCCAATATCTGCCTCAGTGGAGTTCTGGCACCTGCATTATCCCTTCTGGGTATATCAAGATCAACAGCTGCACAGATACTTTTGCTTTTCACAGATTCTACACATATCATATAAAGGTGAATAGTGTAAAGCTACCTCTACACCTTACCAAGCACACAGGGGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
DBCA.BTKp.GFP（配列番号37）
TTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCCCTGTGTGCTTGGTAAGGTGTAGAGGTAGCTTTACACTATTCACCTTTATATGATATGTGTAGAATCTGTGAAAAGCAAAAGTATCTGTGCAGCTGTTGATCTTGATATACCCAGAAGGGATAATGCAGGTGCCAGAACTCCACTGAGGCAGATATTGGACTTTCAGTTCCCAATTTCCTAGACGGTGAATATAATTTTTCAAACATTGTCCCACTGGGGTCTGTAATTATTAAATTATAAATGCAAAGATTTTTACAGGGCCACCTTTTGCAGCCTCCCAGCTCCCTATGGAGCAACAGAATTCAGAAAGACGAAGCTTATTAACAAGAGTGCAGCCATCATACAAACTGCAGTATGCCAAGGAATTAATAGAAATAGCACTTGCAGAATCAGTAAACTAAACCATCTTGGGCTCTTATCTTCGCTCATAAGATAAAATACTATTAAGAATAATAAGTCCAGGCGCAGTGGCTCATGCCCGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGAGGCTGGCGGATCACTTGAGGTCAGGAGTTAGAGACCAGCCTGGCCAACATGGTGAAATCCCGTCTCTATTAAAATACAAAAAATTAGCCGGGCGTGGTGACAGGCGCCTGTAGTCCCAGCAACTCAGGAGGCTGAGGCAGGAGAATCGCTTGAACTCGGGAGGCGGAGGTTGCAGTGAGCCAAGATCGTGACACTGCACTCCAGCCTGGAGTCTCAAAAAAAAAATAAAAAATAAAAATAAAAAAAAAAAAGAAGAAGAATACCAGAGCAAAATTCAGAAAACTACACAGCCAGCCTATGATTGGGAAGAGTCTATGAGATATGATTTAAAATAAAATAACCAGTCAACTGTACTTCAAATGACTACTTAGCCAAAATATCCAAGAAGTAGTGTTTTCTCTTGATTTCTCCTTGAAAGCACTACTCAATTGGCTAGGAAGATTCTGGCCATTCCCTGTCTTTCCTACGCGTTTAAAGCTTCTGGGTTTCCAATGCTCTCAGATTGCCCTCAGCCACTGCACATGAATCTCCATAGAAACTGAAAGTCACACGTGGCCCAATTGTTTCAGGGTCCTCAGAGGAGTTCTCCCTCCTCCTTCCCCTCCCCAGATGGCTTCATGCATAACCAAGTAGCTTTGGAGTCAAATATGTCAAGGCCTCTTTTCTAGCTTCTTGCTGAGCACTGTGTCACTGAAAATTCTAGTTCTTCCTTATTTTCAGTAGTTAGCAATCAGATCTCAGCAATCAGATCATTGTGGGTGTAGAAGGGGGTATCTGATAACTCTTTGGAGAACGCCCAAACTTTGGTTTTCGAAAGCTGTATCTTCCCTTTATACCTAAGTCACTTCCTGATATGGGTCTAGTCCACTGAAAGGAAACTCTATAGGAAATTTGCTCAAATGGAAATAGCAAATCATAGTGATAATTTAAAATTGCACCAATCCCCCATAACTGGATGGAAAGTTACATTAGTTCGCACCATAAGGAGTTTACAAAGAATTCACGCGTGGATCCGAGGAAAGGAAAGGAGAAATAATGAAGACAAGAGAAAAGCAAGCCATGCACATGGAGGGCAATGGTAAGAGGAGAAACCTTTGCCACAACCTCAAGGGTTGGCCGCACTGTCTGGGCTGAGGCAGAGGCTGCTTTCTCCTGGCCCAGTCTTTTACCCATTGTTACCACGAGGTTGGCACAGCTTCCACACAGTCCTTTAATAAGCCAGCTCTGACCCTGGCGACATTTGGCCTGGTACAGCTCAAGGCAGGTAGCCTACACCCTGGCCTAGCCAGGCCTTTCCCTAGCTCACAAAGGTCAACTTCATAACGTGGAGCGTGAGCTTTTACCATGTTCTCAGAGAATCTGCCTCTTAGTATTTCTTTTTCTAAAGGCTTCATTGACCCATGTATCCCTATTGAGTCTTCAAGCACTATTTGACAGAAGGGCTTGTTTTTATCTGACTGCTCCCTGCAATATTACTTTTCCACTAAGTTTGCCAGAGGTACCCCTTTCTAACATTTGCTACCTGTTCGGATGGTCACCTCATGTCACATTTTTCTCTTCCTGTTCCGCCCACCCTCAGCCCTTGTCGGAAAGGACCCTTTCGGCCTCTCTAATCACCAGAAGGGACTGCCAGGGCCTTGTGCTGATGACACTCCCACCCTCCGTCAGCCTCCTCCACTAGCTGATAAATGGCACCAGCCATGCTGTCTCTCTGGTTTTTAGGGGTCCCAAGCAAGGTACATTGCTGCTGCTGCCCAGCCCCTGCCATACCCCAGGGATCCGGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
AB.BTKp.GFP（配列番号38）
TTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCGGATCCCTGGGGTATGGCAGGGGCTGGGCAGCAGCAGCAATGTACCTTGCTTGGGACCCCTAAAAACCAGAGAGACAGCATGGCTGGTGCCATTTATCAGCTAGTGGAGGAGGCTGACGGAGGGTGGGAGTGTCATCAGCACAAGGCCCTGGCAGTCCCTTCTGGTGATTAGAGAGGCCGAAAGGGTCCTTTCCGACAAGGGCTGAGGGTGGGCGGAACAGGAAGAGAAAAATGTGACATGAGGTGACCATCCGAACAGGTAGCAAATGTTAGAAAGGGGTACCTCTGGCAAACTTAGTGGAAAAGTAATATTGCAGGGAGCAGTCAGATAAAAACAAGCCCTTCTGTCAAATAGTGCTTGAAGACTCAATAGGGATACATGGGTCAATGAAGCCTTTAGAAAAAGAAATACTAAGAGGCAGATTCTCTGAGAACATGGTAAAAGCTCACGCTCCACGTTATGAAGTTGACCTTTGTGAGCTAGGGAAAGGCCTGGCTAGGCCAGGGTGTAGGCTACCTGCCTTGAGCTGTACCAGGCCAAATGTCGCCAGGGTCAGAGCTGGCTTATTAAAGGACTGTGTGGAAGCTGTGCCAACCTCGTGGTAACAATGGGTAAAAGACTGGGCCAGGAGAAAGCAGCCTCTGCCTCAGCCCAGACAGTGCGGCCAACCCTTGAGGTTGTGGCAAAGGTTTCTCCTCTTACCATTGCCCTCCATGTGCATGGCTTGCTTTTCTCTTGTCTTCATTATTTCTCCTTTCCTTTCCTCGGATCCACGCGTGAATTCTTTGTAAACTCCTTATGGTGCGAACTAATGTAACTTTCCATCCAGTTATGGGGGATTGGTGCAATTTTAAATTATCACTATGATTTGCTATTTCCATTTGAGCAAATTTCCTATAGAGTTTCCTTTCAGTGGACTAGACCCATATCAGGAAGTGACTTAGGTATAAAGGGAAGATACAGCTTTCGAAAACCAAAGTTTGGGCGTTCTCCAAAGAGTTATCAGATACCCCCTTCTACACCCACAATGATCTGATTGCTGAGATCTGATTGCTAACTACTGAAAATAAGGAAGAACTAGAATTTTCAGTGACACAGTGCTCAGCAAGAAGCTAGAAAAGAGGCCTTGACATATTTGACTCCAAAGCTACTTGGTTATGCATGAAGCCATCTGGGGAGGGGAAGGAGGAGGGAGAACTCCTCTGAGGACCCTGAAACAATTGGGCCACGTGTGACTTTCAGTTTCTATGGAGATTCATGTGCAGTGGCTGAGGGCAATCTGAGAGCATTGGAAACCCAGAAGCTTTAAACGCGTAGGGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
A.BTKp.GFP（配列番号39）
TTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCGGATCCCTGGGGTATGGCAGGGGCTGGGCAGCAGCAGCAATGTACCTTGCTTGGGACCCCTAAAAACCAGAGAGACAGCATGGCTGGTGCCATTTATCAGCTAGTGGAGGAGGCTGACGGAGGGTGGGAGTGTCATCAGCACAAGGCCCTGGCAGTCCCTTCTGGTGATTAGAGAGGCCGAAAGGGTCCTTTCCGACAAGGGCTGAGGGTGGGCGGAACAGGAAGAGAAAAATGTGACATGAGGTGACCATCCGAACAGGTAGCAAATGTTAGAAAGGGGTACCTCTGGCAAACTTAGTGGAAAAGTAATATTGCAGGGAGCAGTCAGATAAAAACAAGCCCTTCTGTCAAATAGTGCTTGAAGACTCAATAGGGATACATGGGTCAATGAAGCCTTTAGAAAAAGAAATACTAAGAGGCAGATTCTCTGAGAACATGGTAAAAGCTCACGCTCCACGTTATGAAGTTGACCTTTGTGAGCTAGGGAAAGGCCTGGCTAGGCCAGGGTGTAGGCTACCTGCCTTGAGCTGTACCAGGCCAAATGTCGCCAGGGTCAGAGCTGGCTTATTAAAGGACTGTGTGGAAGCTGTGCCAACCTCGTGGTAACAATGGGTAAAAGACTGGGCCAGGAGAAAGCAGCCTCTGCCTCAGCCCAGACAGTGCGGCCAACCCTTGAGGTTGTGGCAAAGGTTTCTCCTCTTACCATTGCCCTCCATGTGCATGGCTTGCTTTTCTCTTGTCTTCATTATTTCTCCTTTCCTTTCCTCGGATCCACGCGTAGGGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
B.BTKp.GFP（配列番号40）
TTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCGGATCCACGCGTGAATTCTTTGTAAACTCCTTATGGTGCGAACTAATGTAACTTTCCATCCAGTTATGGGGGATTGGTGCAATTTTAAATTATCACTATGATTTGCTATTTCCATTTGAGCAAATTTCCTATAGAGTTTCCTTTCAGTGGACTAGACCCATATCAGGAAGTGACTTAGGTATAAAGGGAAGATACAGCTTTCGAAAACCAAAGTTTGGGCGTTCTCCAAAGAGTTATCAGATACCCCCTTCTACACCCACAATGATCTGATTGCTGAGATCTGATTGCTAACTACTGAAAATAAGGAAGAACTAGAATTTTCAGTGACACAGTGCTCAGCAAGAAGCTAGAAAAGAGGCCTTGACATATTTGACTCCAAAGCTACTTGGTTATGCATGAAGCCATCTGGGGAGGGGAAGGAGGAGGGAGAACTCCTCTGAGGACCCTGAAACAATTGGGCCACGTGTGACTTTCAGTTTCTATGGAGATTCATGTGCAGTGGCTGAGGGCAATCTGAGAGCATTGGAAACCCAGAAGCTTTAAACGCGTAGGGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGGCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA
0.7UCOE.AB.BTKp.coBTK（配列番号41）
TTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCGCGTGTGGCATCTGAAGCACCACCAGCGAGCGAGAGCTAGAGAGAAGGAAAGCCACCGACTTCACCGCCTCCGAGCTGCTCCGGGTCGCGGGTCTGCAGCGTCTCCGGCCCTCCGCGCCTACAGCTCAAGCCACATCCGAAGGGGGAGGGAGCCGGGAGCTGCGCGCGGGGCCGCCGGGGGGAGGGGTGGCACCGCCCACGCCGGGCGGCCACGAAGGGCGGGGCAGCGGGCGCGCGCCCGGCGGGGGGAGGGGCCGCGCGCCGCGCCCGCTGGGAATTGGGGCCCTAGGGGGAGGGCGGAGGCGCCGACGACCGCGGCACTTACCGTTCGCGGCGTGGCGCCCGGTGGTCCCCAAGGGGAGGGAAGGGGGAGGCGGGGCGAGGACAGTGACCGGAGTCTCCTCAGCGGTGGCTTTTCTGCTTGGCAGCCTCAGCGGCTGGCGCCAAAACCGGACTCCGCCCACTTCCTCGCCCCTGCGGTGCGAGGGTGTGGAATCCTCCAGACGCTGGGGGAGGGGGAGTTGGGAGCTTAAAAACTAGTACCCCTTTGGGACCACTTTCAGCAGCGAACTCTCCTGTACACCAGGGGTCAGTTCCACAGACGCGGGCCAGGGGTGGGTCATTGCGGCGTGAACAATAATTTGACTAGAAGTTGATTCGGGTGTTTGCGGCCCTGGGGTATGGCAGGGGCTGGGCAGCAGCAGCAATGTACCTTGCTTGGGACCCCTAAAAACCAGAGAGACAGCATGGCTGGTGCCATTTATCAGCTAGTGGAGGAGGCTGACGGAGGGTGGGAGTGTCATCAGCACAAGGCCCTGGCAGTCCCTTCTGGTGATTAGAGAGGCCGAAAGGGTCCTTTCCGACAAGGGCTGAGGGTGGGCGGAACAGGAAGAGAAAAATGTGACATGAGGTGACCATCCGAACAGGTAGCAAATGTTAGAAAGGGGTACCTCTGGCAAACTTAGTGGAAAAGTAATATTGCAGGGAGCAGTCAGATAAAAACAAGCCCTTCTGTCAAATAGTGCTTGAAGACTCAATAGGGATACATGGGTCAATGAAGCCTTTAGAAAAAGAAATACTAAGAGGCAGATTCTCTGAGAACATGGTAAAAGCTCACGCTCCACGTTATGAAGTTGACCTTTGTGAGCTAGGGAAAGGCCTGGCTAGGCCAGGGTGTAGGCTACCTGCCTTGAGCTGTACCAGGCCAAATGTCGCCAGGGTCAGAGCTGGCTTATTAAAGGACTGTGTGGAAGCTGTGCCAACCTCGTGGTAACAATGGGTAAAAGACTGGGCCAGGAGAAAGCAGCCTCTGCCTCAGCCCAGACAGTGCGGCCAACCCTTGAGGTTGTGGCAAAGGTTTCTCCTCTTACCATTGCCCTCCATGTGCATGGCTTGCTTTTCTCTTGTCTTCATTATTTCTCCTTTCCTTTCCTCGGATCCACGCGTGAATTCTTTGTAAACTCCTTATGGTGCGAACTAATGTAACTTTCCATCCAGTTATGGGGGATTGGTGCAATTTTAAATTATCACTATGATTTGCTATTTCCATTTGAGCAAATTTCCTATAGAGTTTCCTTTCAGTGGACTAGACCCATATCAGGAAGTGACTTAGGTATAAAGGGAAGATACAGCTTTCGAAAACCAAAGTTTGGGCGTTCTCCAAAGAGTTATCAGATACCCCCTTCTACACCCACAATGATCTGATTGCTGAGATCTGATTGCTAACTACTGAAAATAAGGAAGAACTAGAATTTTCAGTGACACAGTGCTCAGCAAGAAGCTAGAAAAGAGGCCTTGACATATTTGACTCCAAAGCTACTTGGTTATGCATGAAGCCATCTGGGGAGGGGAAGGAGGAGGGAGAACTCCTCTGAGGACCCTGAAACAATTGGGCCACGTGTGACTTTCAGTTTCTATGGAGATTCATGTGCAGTGGCTGAGGGCAATCTGAGAGCATTGGAAACCCAGAAGCTTTAAGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGAAAGAAGCCACCATGGCCGCTGTGATCCTGGAGAGCATTTTCCTGAAGAGGTCCCAGCAGAAAAAGAAAACCTCTCCCCTGAACTTTAAGAAAAGACTGTTCCTGCTGACAGTGCACAAGCTGTCTTACTATGAGTACGACTTTGAGCGGGGCCGCCGAGGATCAAAAAAGGGGAGCATCGATGTGGAGAAGATTACATGCGTGGAGACCGTGGTCCCTGAAAAGAATCCACCCCCTGAGAGGCAGATCCCAAGACGGGGCGAGGAGTCCTCTGAGATGGAGCAGATTAGTATCATTGAGCGCTTCCCCTATCCTTTTCAGGTGGTGTACGACGAGGGACCACTGTATGTGTTCTCACCCACAGAGGAGCTGAGAAAGAGGTGGATTCACCAGCTGAAGAACGTGATTAGATACAATAGCGATCTGGTGCAGAAGTATCACCCTTGTTTTTGGATCGACGGGCAGTACCTGTGCTGTTCCCAGACAGCTAAGAACGCTATGGGATGCCAGATTCTGGAAAATCGGAACGGATCTCTGAAACCAGGGAGTTCACACCGCAAGACCAAAAAGCCCCTGCCTCCAACACCCGAGGAGGATCAGATCCTGAAAAAGCCTCTGCCACCCGAGCCTGCTGCAGCCCCAGTCAGCACTTCCGAACTGAAAAAGGTGGTGGCTCTGTATGACTACATGCCCATGAATGCTAACGATCTGCAGCTGAGAAAGGGCGACGAGTATTTCATTCTGGAAGAGTCTAATCTGCCTTGGTGGAGGGCCAGAGATAAGAACGGACAGGAGGGGTACATCCCATCTAATTATGTGACCGAGGCTGAGGACTCTATTGAGATGTACGAGTGGTATAGCAAGCACATGACACGGTCCCAGGCTGAGCAGCTGCTGAAGCAGGAGGGCAAAGAGGGAGGGTTTATCGTGCGCGATTCTAGTAAGGCCGGCAAATACACTGTGTCAGTGTTCGCTAAGAGCACCGGAGACCCCCAGGGCGTGATCAGACACTATGTGGTGTGTTCCACACCTCAGTCTCAGTACTATCTGGCTGAGAAGCACCTGTTTAGTACAATCCCAGAGCTGATTAACTACCACCAGCACAATTCTGCCGGCCTGATCAGCAGGCTGAAGTATCCCGTCTCCCAGCAGAACAAAAATGCTCCTTCTACCGCTGGACTGGGGTACGGCAGTTGGGAGATTGATCCAAAGGACCTGACATTCCTGAAGGAGCTGGGAACTGGGCAGTTTGGCGTGGTGAAGTATGGAAAATGGAGAGGGCAGTACGATGTGGCCATCAAGATGATCAAGGAGGGCTCAATGAGCGAGGACGAGTTCATCGAGGAGGCTAAGGTCATGATGAACCTGTCCCACGAGAAACTGGTGCAGCTGTATGGAGTGTGCACCAAGCAGCGGCCCATTTTTATCATTACAGAGTACATGGCTAATGGGTGTCTGCTGAACTATCTGCGCGAGATGAGACACAGATTCCAGACACAGCAGCTGCTGGAAATGTGCAAGGATGTGTGTGAGGCTATGGAGTACCTGGAGTCTAAGCAGTTTCTGCACCGGGACCTGGCTGCTCGCAATTGCCTGGTGAACGATCAGGGCGTGGTGAAGGTGAGTGACTTCGGACTGTCAAGGTATGTGCTGGATGACGAGTACACCAGCTCCGTGGGCTCTAAGTTTCCTGTGAGATGGTCTCCACCCGAGGTGCTGATGTATAGCAAGTTCTCCTCTAAGAGCGATATCTGGGCCTTTGGCGTGCTGATGTGGGAAATCTACAGCCTGGGCAAGATGCCTTACGAGCGGTTCACAAATTCCGAGACAGCTGAGCACATCGCCCAGGGCCTGCGCCTGTACCGGCCACATCTGGCCTCTGAGAAGGTGTACACCATCATGTACAGCTGTTGGCACGAGAAGGCCGACGAGAGACCCACATTCAAGATCCTGCTGTCCAACATTCTAGATGTGATGGACGAGGAGAGCTGA
AB.BTKp.coBTK（配列番号42）
TTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCTGGGGTATGGCAGGGGCTGGGCAGCAGCAGCAATGTACCTTGCTTGGGACCCCTAAAAACCAGAGAGACAGCATGGCTGGTGCCATTTATCAGCTAGTGGAGGAGGCTGACGGAGGGTGGGAGTGTCATCAGCACAAGGCCCTGGCAGTCCCTTCTGGTGATTAGAGAGGCCGAAAGGGTCCTTTCCGACAAGGGCTGAGGGTGGGCGGAACAGGAAGAGAAAAATGTGACATGAGGTGACCATCCGAACAGGTAGCAAATGTTAGAAAGGGGTACCTCTGGCAAACTTAGTGGAAAAGTAATATTGCAGGGAGCAGTCAGATAAAAACAAGCCCTTCTGTCAAATAGTGCTTGAAGACTCAATAGGGATACATGGGTCAATGAAGCCTTTAGAAAAAGAAATACTAAGAGGCAGATTCTCTGAGAACATGGTAAAAGCTCACGCTCCACGTTATGAAGTTGACCTTTGTGAGCTAGGGAAAGGCCTGGCTAGGCCAGGGTGTAGGCTACCTGCCTTGAGCTGTACCAGGCCAAATGTCGCCAGGGTCAGAGCTGGCTTATTAAAGGACTGTGTGGAAGCTGTGCCAACCTCGTGGTAACAATGGGTAAAAGACTGGGCCAGGAGAAAGCAGCCTCTGCCTCAGCCCAGACAGTGCGGCCAACCCTTGAGGTTGTGGCAAAGGTTTCTCCTCTTACCATTGCCCTCCATGTGCATGGCTTGCTTTTCTCTTGTCTTCATTATTTCTCCTTTCCTTTCCTCGGATCCACGCGTGAATTCTTTGTAAACTCCTTATGGTGCGAACTAATGTAACTTTCCATCCAGTTATGGGGGATTGGTGCAATTTTAAATTATCACTATGATTTGCTATTTCCATTTGAGCAAATTTCCTATAGAGTTTCCTTTCAGTGGACTAGACCCATATCAGGAAGTGACTTAGGTATAAAGGGAAGATACAGCTTTCGAAAACCAAAGTTTGGGCGTTCTCCAAAGAGTTATCAGATACCCCCTTCTACACCCACAATGATCTGATTGCTGAGATCTGATTGCTAACTACTGAAAATAAGGAAGAACTAGAATTTTCAGTGACACAGTGCTCAGCAAGAAGCTAGAAAAGAGGCCTTGACATATTTGACTCCAAAGCTACTTGGTTATGCATGAAGCCATCTGGGGAGGGGAAGGAGGAGGGAGAACTCCTCTGAGGACCCTGAAACAATTGGGCCACGTGTGACTTTCAGTTTCTATGGAGATTCATGTGCAGTGGCTGAGGGCAATCTGAGAGCATTGGAAACCCAGAAGCTTTAAGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGAAAGAAGCCACCATGGCCGCTGTGATCCTGGAGAGCATTTTCCTGAAGAGGTCCCAGCAGAAAAAGAAAACCTCTCCCCTGAACTTTAAGAAAAGACTGTTCCTGCTGACAGTGCACAAGCTGTCTTACTATGAGTACGACTTTGAGCGGGGCCGCCGAGGATCAAAAAAGGGGAGCATCGATGTGGAGAAGATTACATGCGTGGAGACCGTGGTCCCTGAAAAGAATCCACCCCCTGAGAGGCAGATCCCAAGACGGGGCGAGGAGTCCTCTGAGATGGAGCAGATTAGTATCATTGAGCGCTTCCCCTATCCTTTTCAGGTGGTGTACGACGAGGGACCACTGTATGTGTTCTCACCCACAGAGGAGCTGAGAAAGAGGTGGATTCACCAGCTGAAGAACGTGATTAGATACAATAGCGATCTGGTGCAGAAGTATCACCCTTGTTTTTGGATCGACGGGCAGTACCTGTGCTGTTCCCAGACAGCTAAGAACGCTATGGGATGCCAGATTCTGGAAAATCGGAACGGATCTCTGAAACCAGGGAGTTCACACCGCAAGACCAAAAAGCCCCTGCCTCCAACACCCGAGGAGGATCAGATCCTGAAAAAGCCTCTGCCACCCGAGCCTGCTGCAGCCCCAGTCAGCACTTCCGAACTGAAAAAGGTGGTGGCTCTGTATGACTACATGCCCATGAATGCTAACGATCTGCAGCTGAGAAAGGGCGACGAGTATTTCATTCTGGAAGAGTCTAATCTGCCTTGGTGGAGGGCCAGAGATAAGAACGGACAGGAGGGGTACATCCCATCTAATTATGTGACCGAGGCTGAGGACTCTATTGAGATGTACGAGTGGTATAGCAAGCACATGACACGGTCCCAGGCTGAGCAGCTGCTGAAGCAGGAGGGCAAAGAGGGAGGGTTTATCGTGCGCGATTCTAGTAAGGCCGGCAAATACACTGTGTCAGTGTTCGCTAAGAGCACCGGAGACCCCCAGGGCGTGATCAGACACTATGTGGTGTGTTCCACACCTCAGTCTCAGTACTATCTGGCTGAGAAGCACCTGTTTAGTACAATCCCAGAGCTGATTAACTACCACCAGCACAATTCTGCCGGCCTGATCAGCAGGCTGAAGTATCCCGTCTCCCAGCAGAACAAAAATGCTCCTTCTACCGCTGGACTGGGGTACGGCAGTTGGGAGATTGATCCAAAGGACCTGACATTCCTGAAGGAGCTGGGAACTGGGCAGTTTGGCGTGGTGAAGTATGGAAAATGGAGAGGGCAGTACGATGTGGCCATCAAGATGATCAAGGAGGGCTCAATGAGCGAGGACGAGTTCATCGAGGAGGCTAAGGTCATGATGAACCTGTCCCACGAGAAACTGGTGCAGCTGTATGGAGTGTGCACCAAGCAGCGGCCCATTTTTATCATTACAGAGTACATGGCTAATGGGTGTCTGCTGAACTATCTGCGCGAGATGAGACACAGATTCCAGACACAGCAGCTGCTGGAAATGTGCAAGGATGTGTGTGAGGCTATGGAGTACCTGGAGTCTAAGCAGTTTCTGCACCGGGACCTGGCTGCTCGCAATTGCCTGGTGAACGATCAGGGCGTGGTGAAGGTGAGTGACTTCGGACTGTCAAGGTATGTGCTGGATGACGAGTACACCAGCTCCGTGGGCTCTAAGTTTCCTGTGAGATGGTCTCCACCCGAGGTGCTGATGTATAGCAAGTTCTCCTCTAAGAGCGATATCTGGGCCTTTGGCGTGCTGATGTGGGAAATCTACAGCCTGGGCAAGATGCCTTACGAGCGGTTCACAAATTCCGAGACAGCTGAGCACATCGCCCAGGGCCTGCGCCTGTACCGGCCACATCTGGCCTCTGAGAAGGTGTACACCATCATGTACAGCTGTTGGCACGAGAAGGCCGACGAGAGACCCACATTCAAGATCCTGCTGTCCAACATTCTAGATGTGATGGACGAGGAGAGCTGA
BTKe.AB.BTKp.coBTK（配列番号43）
TTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCTCCATCACCTACTAGATATATCAGTGCAGTGAAAACTTCGCTAAACTAACGCTATACCTATATCATGAAGTGTGTGGACTAGAGACAAGTGCATATCCTTACGGCAATTAACTGGGAAACGTCAAATAGTAACTACCACTCACCTTTTTCCGGAAAATCGGCTTAGTTTGCCCACCATAGCCACTCTGCTTCCTGTCATAACGCCGCTTTCCTGGGAAAACGAATTGGTATTTGTTATAAAATACTGAAGATCAGCAAGTAAGTCTTACAGGTTTTATCTTAATTTCGCAGCAGAAATATTAACGCTCAAGCCAGGCGTGGAGGGAGAGAGACCCGGACTCGTATGTTATTCTACAACACAAATGTCACATTAACACCAAATTATGCGGAATCCATCTTACCCTGGGCGTACAGAGAATCCTTGCCCTTCTTGTACTGTGTCACTTTATGGGGTTGGTGCTTGCCACACTTCTTACAGAAAGTCCGGCGGGTTTTAGGGACGTTAACCTAGTAAAGAAACAGTTCAGAACGTGCAATGTTATTTGACCACAATGGCACAACGCCCTACCTTACCCAGCTAAAGCTGAGGCACTCCAGGAGGACTCCTCATTACTTGCTACCTCTGACTACAGGGTGGGCCAGCCCCATGTGCTTCAAGCAGAGCTTCCTCCCTCCGTCGAGCCCCAAAGAGGGAAGAGACCTCATTAACTCCACCCCCGGCTAACTCTACCTCTTTGAACCCATCACTTCAATTCCTGGCCCCGTAGCCCGGTCCCTTTAGGGTTGATCCCGGCAAGATTGGGTTGCTCTGATATATCGAGTCCACACAGGAGCCTGGACCCATCCCGGCATAGCACGGGCGACGAAGGGGGGGAAAGATTAAGCTGGATGTTACTCGGCCCCCACCAGCAAGTCCTACCATGCTTGCGTGAGCGCTATCGGCGCGGAAAGAAAGAAACCGCGAGGCAAACGGAAGTATATAGGAGGTTCCCGATCGCACTTCCTCATGGGAGTCGGTAGGAGCAATCATAGAGTGTAAGGCTCAGCGCAGCGCCCTCGGGCGGCTGAGAGGACTCAGTTCGGAGCCGCGGGCGGGAGCTTAAGGAAGGACTCCGCCTAAAGGGTGGTCCACTCACCCCGACTTCCTCCCGCCCCGCAGCTTTCAACGTTTCGTCACTTTATCTCTTTTGGTGGACTCTGCTACGTAGTGGCGTTCAGTGAAGGGAGCAGTGTTTTTCCCAGATCCTCTGGCCTCCCCGTCCCCGAGGGAAGCCAGGACTAGGGTCGAATGAAGGGGTCCTCCACCTCCACGTTCCATTCCTGTTCCACCTCAAGGTCACTGGGAACACCTTTCGCAGCAAACTGCTAATTCAATGAAGACCTGGAGGGAGCCAATTGTTCCAGTTCATCTATCACATGGCCAGTTGGTCCATTCAACAAATGGTTATTGGATGCCCATTATGTGGCAGGCACTGTTCCGGGGGAGAGGTACAGTAATCTAATAGGCTTATAAATGTGCAATTATGAACTAAGTACTTTGAAGAAAAGGAACAATGATTGGCATTAAAGCAGCACCCTTCTGTTGAGGGAGTAAGTCAGCAGCTCTAGGTTCTGAAAAGTGACAATGAAATTGTTTGGCTCCTGTCTGGGGTATGGCAGGGGCTGGGCAGCAGCAGCAATGTACCTTGCTTGGGACCCCTAAAAACCAGAGAGACAGCATGGCTGGTGCCATTTATCAGCTAGTGGAGGAGGCTGACGGAGGGTGGGAGTGTCATCAGCACAAGGCCCTGGCAGTCCCTTCTGGTGATTAGAGAGGCCGAAAGGGTCCTTTCCGACAAGGGCTGAGGGTGGGCGGAACAGGAAGAGAAAAATGTGACATGAGGTGACCATCCGAACAGGTAGCAAATGTTAGAAAGGGGTACCTCTGGCAAACTTAGTGGAAAAGTAATATTGCAGGGAGCAGTCAGATAAAAACAAGCCCTTCTGTCAAATAGTGCTTGAAGACTCAATAGGGATACATGGGTCAATGAAGCCTTTAGAAAAAGAAATACTAAGAGGCAGATTCTCTGAGAACATGGTAAAAGCTCACGCTCCACGTTATGAAGTTGACCTTTGTGAGCTAGGGAAAGGCCTGGCTAGGCCAGGGTGTAGGCTACCTGCCTTGAGCTGTACCAGGCCAAATGTCGCCAGGGTCAGAGCTGGCTTATTAAAGGACTGTGTGGAAGCTGTGCCAACCTCGTGGTAACAATGGGTAAAAGACTGGGCCAGGAGAAAGCAGCCTCTGCCTCAGCCCAGACAGTGCGGCCAACCCTTGAGGTTGTGGCAAAGGTTTCTCCTCTTACCATTGCCCTCCATGTGCATGGCTTGCTTTTCTCTTGTCTTCATTATTTCTCCTTTCCTTTCCTCGGATCCACGCGTGAATTCTTTGTAAACTCCTTATGGTGCGAACTAATGTAACTTTCCATCCAGTTATGGGGGATTGGTGCAATTTTAAATTATCACTATGATTTGCTATTTCCATTTGAGCAAATTTCCTATAGAGTTTCCTTTCAGTGGACTAGACCCATATCAGGAAGTGACTTAGGTATAAAGGGAAGATACAGCTTTCGAAAACCAAAGTTTGGGCGTTCTCCAAAGAGTTATCAGATACCCCCTTCTACACCCACAATGATCTGATTGCTGAGATCTGATTGCTAACTACTGAAAATAAGGAAGAACTAGAATTTTCAGTGACACAGTGCTCAGCAAGAAGCTAGAAAAGAGGCCTTGACATATTTGACTCCAAAGCTACTTGGTTATGCATGAAGCCATCTGGGGAGGGGAAGGAGGAGGGAGAACTCCTCTGAGGACCCTGAAACAATTGGGCCACGTGTGACTTTCAGTTTCTATGGAGATTCATGTGCAGTGGCTGAGGGCAATCTGAGAGCATTGGAAACCCAGAAGCTTTAAGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGAAAGAAGCCACCATGGCCGCTGTGATCCTGGAGAGCATTTTCCTGAAGAGGTCCCAGCAGAAAAAGAAAACCTCTCCCCTGAACTTTAAGAAAAGACTGTTCCTGCTGACAGTGCACAAGCTGTCTTACTATGAGTACGACTTTGAGCGGGGCCGCCGAGGATCAAAAAAGGGGAGCATCGATGTGGAGAAGATTACATGCGTGGAGACCGTGGTCCCTGAAAAGAATCCACCCCCTGAGAGGCAGATCCCAAGACGGGGCGAGGAGTCCTCTGAGATGGAGCAGATTAGTATCATTGAGCGCTTCCCCTATCCTTTTCAGGTGGTGTACGACGAGGGACCACTGTATGTGTTCTCACCCACAGAGGAGCTGAGAAAGAGGTGGATTCACCAGCTGAAGAACGTGATTAGATACAATAGCGATCTGGTGCAGAAGTATCACCCTTGTTTTTGGATCGACGGGCAGTACCTGTGCTGTTCCCAGACAGCTAAGAACGCTATGGGATGCCAGATTCTGGAAAATCGGAACGGATCTCTGAAACCAGGGAGTTCACACCGCAAGACCAAAAAGCCCCTGCCTCCAACACCCGAGGAGGATCAGATCCTGAAAAAGCCTCTGCCACCCGAGCCTGCTGCAGCCCCAGTCAGCACTTCCGAACTGAAAAAGGTGGTGGCTCTGTATGACTACATGCCCATGAATGCTAACGATCTGCAGCTGAGAAAGGGCGACGAGTATTTCATTCTGGAAGAGTCTAATCTGCCTTGGTGGAGGGCCAGAGATAAGAACGGACAGGAGGGGTACATCCCATCTAATTATGTGACCGAGGCTGAGGACTCTATTGAGATGTACGAGTGGTATAGCAAGCACATGACACGGTCCCAGGCTGAGCAGCTGCTGAAGCAGGAGGGCAAAGAGGGAGGGTTTATCGTGCGCGATTCTAGTAAGGCCGGCAAATACACTGTGTCAGTGTTCGCTAAGAGCACCGGAGACCCCCAGGGCGTGATCAGACACTATGTGGTGTGTTCCACACCTCAGTCTCAGTACTATCTGGCTGAGAAGCACCTGTTTAGTACAATCCCAGAGCTGATTAACTACCACCAGCACAATTCTGCCGGCCTGATCAGCAGGCTGAAGTATCCCGTCTCCCAGCAGAACAAAAATGCTCCTTCTACCGCTGGACTGGGGTACGGCAGTTGGGAGATTGATCCAAAGGACCTGACATTCCTGAAGGAGCTGGGAACTGGGCAGTTTGGCGTGGTGAAGTATGGAAAATGGAGAGGGCAGTACGATGTGGCCATCAAGATGATCAAGGAGGGCTCAATGAGCGAGGACGAGTTCATCGAGGAGGCTAAGGTCATGATGAACCTGTCCCACGAGAAACTGGTGCAGCTGTATGGAGTGTGCACCAAGCAGCGGCCCATTTTTATCATTACAGAGTACATGGCTAATGGGTGTCTGCTGAACTATCTGCGCGAGATGAGACACAGATTCCAGACACAGCAGCTGCTGGAAATGTGCAAGGATGTGTGTGAGGCTATGGAGTACCTGGAGTCTAAGCAGTTTCTGCACCGGGACCTGGCTGCTCGCAATTGCCTGGTGAACGATCAGGGCGTGGTGAAGGTGAGTGACTTCGGACTGTCAAGGTATGTGCTGGATGACGAGTACACCAGCTCCGTGGGCTCTAAGTTTCCTGTGAGATGGTCTCCACCCGAGGTGCTGATGTATAGCAAGTTCTCCTCTAAGAGCGATATCTGGGCCTTTGGCGTGCTGATGTGGGAAATCTACAGCCTGGGCAAGATGCCTTACGAGCGGTTCACAAATTCCGAGACAGCTGAGCACATCGCCCAGGGCCTGCGCCTGTACCGGCCACATCTGGCCTCTGAGAAGGTGTACACCATCATGTACAGCTGTTGGCACGAGAAGGCCGACGAGAGACCCACATTCAAGATCCTGCTGTCCAACATTCTAGATGTGATGGACGAGGAGAGCTGA
BTKe.BTKp.coBTK（配列番号44）
TTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCTCCATCACCTACTAGATATATCAGTGCAGTGAAAACTTCGCTAAACTAACGCTATACCTATATCATGAAGTGTGTGGACTAGAGACAAGTGCATATCCTTACGGCAATTAACTGGGAAACGTCAAATAGTAACTACCACTCACCTTTTTCCGGAAAATCGGCTTAGTTTGCCCACCATAGCCACTCTGCTTCCTGTCATAACGCCGCTTTCCTGGGAAAACGAATTGGTATTTGTTATAAAATACTGAAGATCAGCAAGTAAGTCTTACAGGTTTTATCTTAATTTCGCAGCAGAAATATTAACGCTCAAGCCAGGCGTGGAGGGAGAGAGACCCGGACTCGTATGTTATTCTACAACACAAATGTCACATTAACACCAAATTATGCGGAATCCATCTTACCCTGGGCGTACAGAGAATCCTTGCCCTTCTTGTACTGTGTCACTTTATGGGGTTGGTGCTTGCCACACTTCTTACAGAAAGTCCGGCGGGTTTTAGGGACGTTAACCTAGTAAAGAAACAGTTCAGAACGTGCAATGTTATTTGACCACAATGGCACAACGCCCTACCTTACCCAGCTAAAGCTGAGGCACTCCAGGAGGACTCCTCATTACTTGCTACCTCTGACTACAGGGTGGGCCAGCCCCATGTGCTTCAAGCAGAGCTTCCTCCCTCCGTCGAGCCCCAAAGAGGGAAGAGACCTCATTAACTCCACCCCCGGCTAACTCTACCTCTTTGAACCCATCACTTCAATTCCTGGCCCCGTAGCCCGGTCCCTTTAGGGTTGATCCCGGCAAGATTGGGTTGCTCTGATATATCGAGTCCACACAGGAGCCTGGACCCATCCCGGCATAGCACGGGCGACGAAGGGGGGGAAAGATTAAGCTGGATGTTACTCGGCCCCCACCAGCAAGTCCTACCATGCTTGCGTGAGCGCTATCGGCGCGGAAAGAAAGAAACCGCGAGGCAAACGGAAGTATATAGGAGGTTCCCGATCGCACTTCCTCATGGGAGTCGGTAGGAGCAATCATAGAGTGTAAGGCTCAGCGCAGCGCCCTCGGGCGGCTGAGAGGACTCAGTTCGGAGCCGCGGGCGGGAGCTTAAGGAAGGACTCCGCCTAAAGGGTGGTCCACTCACCCCGACTTCCTCCCGCCCCGCAGCTTTCAACGTTTCGTCACTTTATCTCTTTTGGTGGACTCTGCTACGTAGTGGCGTTCAGTGAAGGGAGCAGTGTTTTTCCCAGATCCTCTGGCCTCCCCGTCCCCGAGGGAAGCCAGGACTAGGGTCGAATGAAGGGGTCCTCCACCTCCACGTTCCATTCCTGTTCCACCTCAAGGTCACTGGGAACACCTTTCGCAGCAAACTGCTAATTCAATGAAGACCTGGAGGGAGCCAATTGTTCCAGTTCATCTATCACATGGCCAGTTGGTCCATTCAACAAATGGTTATTGGATGCCCATTATGTGGCAGGCACTGTTCCGGGGGAGAGGTACAGTAATCTAATAGGCTTATAAATGTGCAATTATGAACTAAGTACTTTGAAGAAAAGGAACAATGATTGGCATTAAAGCAGCACCCTTCTGTTGAGGGAGTAAGTCAGCAGCTCTAGGTTCTGAAAAGTGACAATGAAATTGTTTGGCTCCTGTGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGAAAGAAGCCACCATGGCCGCTGTGATCCTGGAGAGCATTTTCCTGAAGAGGTCCCAGCAGAAAAAGAAAACCTCTCCCCTGAACTTTAAGAAAAGACTGTTCCTGCTGACAGTGCACAAGCTGTCTTACTATGAGTACGACTTTGAGCGGGGCCGCCGAGGATCAAAAAAGGGGAGCATCGATGTGGAGAAGATTACATGCGTGGAGACCGTGGTCCCTGAAAAGAATCCACCCCCTGAGAGGCAGATCCCAAGACGGGGCGAGGAGTCCTCTGAGATGGAGCAGATTAGTATCATTGAGCGCTTCCCCTATCCTTTTCAGGTGGTGTACGACGAGGGACCACTGTATGTGTTCTCACCCACAGAGGAGCTGAGAAAGAGGTGGATTCACCAGCTGAAGAACGTGATTAGATACAATAGCGATCTGGTGCAGAAGTATCACCCTTGTTTTTGGATCGACGGGCAGTACCTGTGCTGTTCCCAGACAGCTAAGAACGCTATGGGATGCCAGATTCTGGAAAATCGGAACGGATCTCTGAAACCAGGGAGTTCACACCGCAAGACCAAAAAGCCCCTGCCTCCAACACCCGAGGAGGATCAGATCCTGAAAAAGCCTCTGCCACCCGAGCCTGCTGCAGCCCCAGTCAGCACTTCCGAACTGAAAAAGGTGGTGGCTCTGTATGACTACATGCCCATGAATGCTAACGATCTGCAGCTGAGAAAGGGCGACGAGTATTTCATTCTGGAAGAGTCTAATCTGCCTTGGTGGAGGGCCAGAGATAAGAACGGACAGGAGGGGTACATCCCATCTAATTATGTGACCGAGGCTGAGGACTCTATTGAGATGTACGAGTGGTATAGCAAGCACATGACACGGTCCCAGGCTGAGCAGCTGCTGAAGCAGGAGGGCAAAGAGGGAGGGTTTATCGTGCGCGATTCTAGTAAGGCCGGCAAATACACTGTGTCAGTGTTCGCTAAGAGCACCGGAGACCCCCAGGGCGTGATCAGACACTATGTGGTGTGTTCCACACCTCAGTCTCAGTACTATCTGGCTGAGAAGCACCTGTTTAGTACAATCCCAGAGCTGATTAACTACCACCAGCACAATTCTGCCGGCCTGATCAGCAGGCTGAAGTATCCCGTCTCCCAGCAGAACAAAAATGCTCCTTCTACCGCTGGACTGGGGTACGGCAGTTGGGAGATTGATCCAAAGGACCTGACATTCCTGAAGGAGCTGGGAACTGGGCAGTTTGGCGTGGTGAAGTATGGAAAATGGAGAGGGCAGTACGATGTGGCCATCAAGATGATCAAGGAGGGCTCAATGAGCGAGGACGAGTTCATCGAGGAGGCTAAGGTCATGATGAACCTGTCCCACGAGAAACTGGTGCAGCTGTATGGAGTGTGCACCAAGCAGCGGCCCATTTTTATCATTACAGAGTACATGGCTAATGGGTGTCTGCTGAACTATCTGCGCGAGATGAGACACAGATTCCAGACACAGCAGCTGCTGGAAATGTGCAAGGATGTGTGTGAGGCTATGGAGTACCTGGAGTCTAAGCAGTTTCTGCACCGGGACCTGGCTGCTCGCAATTGCCTGGTGAACGATCAGGGCGTGGTGAAGGTGAGTGACTTCGGACTGTCAAGGTATGTGCTGGATGACGAGTACACCAGCTCCGTGGGCTCTAAGTTTCCTGTGAGATGGTCTCCACCCGAGGTGCTGATGTATAGCAAGTTCTCCTCTAAGAGCGATATCTGGGCCTTTGGCGTGCTGATGTGGGAAATCTACAGCCTGGGCAAGATGCCTTACGAGCGGTTCACAAATTCCGAGACAGCTGAGCACATCGCCCAGGGCCTGCGCCTGTACCGGCCACATCTGGCCTCTGAGAAGGTGTACACCATCATGTACAGCTGTTGGCACGAGAAGGCCGACGAGAGACCCACATTCAAGATCCTGCTGTCCAACATTCTAGATGTGATGGACGAGGAGAGCTGA
【０２８６】
BTKeΔMyc.BTKp.coBTK（配列番号45）
TTTCCTAGGAGAATCCCTGGGGGAATCATTGCAGTTGGAGCATAATGTAGGGGGCCCTGTTACTCGGCCCCCACCAGCAAGTCCTACCATGCTTGCGTGAGCGCTATCGGCGCGGAAAGAAAGAAACCGCGAGGCAAACGGAAGTATATAGGAGGTTCCCGATCGCACTTCCTCATGGGAGTCGGTAGGAGCAATCATAGAGTGTAAGGCTCAGCGCAGCGCCCTCGGGCGGCTGAGAGGACTCAGTTCGGAGCCGCGGGCGGGAGCTTAAGGAAGGACTCCGCCTAAAGGGTGGTCCACTCACCCCGACTTCCTCCCGCCCCGCAGCTTTCAACGTTTCGTCACTTTATCTCTTTTGGTGGACTCTGCTACGTAGTGGCGTTCAGTGAAGGGAGCAGTGTTTTTCCCAGATCCTCTGGCCTCCCCGTCCCCGAGGGAAGCCAGGACTAGGGTCGAATGAAGGGGTCCTCCACCTCCACGTTCCATTCCTGTTCCACCTCAAGGTCACTGGGAACACCTTTCGCAGCAAACTGCTAATTCAATGAAGACCTGGAGGGAGCCAATTGTTCCAGTTCATCTATCACATGGCCAGTTGGTCCATTCAACAAATGGTTATTGGATGCCCATTATGTGGCAGGCACTGTTCCGGGGGAGAGGTACAGTAATCTAATAGGCTTATAAATGTGCAATTATGAACTAAGTACTTTGAAGAAAAGGAACAATGATTGGCATTAAAGCAGCACCCTTCTGTTGAGGGAGTAAGTCAGCAGCTCTAGGTTCTGAAAAGTGACAATGAAATTGTTTGGCTCCTGTGGCCCCTGAGAAAACCTCCAGGCTTCAAGTGACATACCTAGTCTGCTTTACCGGTTTACAGGACTCAAGAGAAAGGTGGACATTGAGAGTTAATCCCTGAGGCCAAATCTTAAATGGAGAAAGTCAACATCCACAGAAAATGGGGAAGGGCACAAGTATTTCTGTGGGCTTATATTCCGACATTTTTATCTGTAGGGGAAAAATGCTTTCTTAGAAAATGACTCAGCACGGGGAAGTCTTGTCTCTACCTCTGTCTTGTTTTGTCCTTTGGGGTCCCTTCACTATCAAGTTCAACTGTGTGTCCCTGAGACTCCTCTGCCCCGGAGGACAGGAGACTCGAAAAACGCTCTTCCTGGCCAGTCTCTTTGCTCTGTGTCTGCCAGCCCCCAGCATCTCTCCTCTTTCCTGTAAGCCCCTCTCCCTGTGCTGACTGTCTTCATAGTACTTTAGGTATGTTGTCCCTTTACCTCTGGGAGGATAGCTTGATGACCTGTCTGCTCAGGCCAGCCCCATCTAGAGTCTCAGTGGCCCCAGTCATGTTGAGAAAGGTTCTTTCAAAGATAGACTCAAGATAGTAGTGTCAGAGGTCCCAAGCAAATGAAGGGCGGGGACAGTTGAGGGGGTGGAATAGGGACGGCAGCAGGGAACCAGATAGCATGCTGCTGAGAAGAAAAAAAGACATTGGTTTAGGTCAGGAAGCAAAAAAAGGGAACTGAGTGGCTGTGAAAGGGTGGGGTTTGCTCAGACTGTCCTTCCTCTCTGGACTGTAAGAATTAGTCTCGAGAAAGAAGCCACCATGGCCGCTGTGATCCTGGAGAGCATTTTCCTGAAGAGGTCCCAGCAGAAAAAGAAAACCTCTCCCCTGAACTTTAAGAAAAGACTGTTCCTGCTGACAGTGCACAAGCTGTCTTACTATGAGTACGACTTTGAGCGGGGCCGCCGAGGATCAAAAAAGGGGAGCATCGATGTGGAGAAGATTACATGCGTGGAGACCGTGGTCCCTGAAAAGAATCCACCCCCTGAGAGGCAGATCCCAAGACGGGGCGAGGAGTCCTCTGAGATGGAGCAGATTAGTATCATTGAGCGCTTCCCCTATCCTTTTCAGGTGGTGTACGACGAGGGACCACTGTATGTGTTCTCACCCACAGAGGAGCTGAGAAAGAGGTGGATTCACCAGCTGAAGAACGTGATTAGATACAATAGCGATCTGGTGCAGAAGTATCACCCTTGTTTTTGGATCGACGGGCAGTACCTGTGCTGTTCCCAGACAGCTAAGAACGCTATGGGATGCCAGATTCTGGAAAATCGGAACGGATCTCTGAAACCAGGGAGTTCACACCGCAAGACCAAAAAGCCCCTGCCTCCAACACCCGAGGAGGATCAGATCCTGAAAAAGCCTCTGCCACCCGAGCCTGCTGCAGCCCCAGTCAGCACTTCCGAACTGAAAAAGGTGGTGGCTCTGTATGACTACATGCCCATGAATGCTAACGATCTGCAGCTGAGAAAGGGCGACGAGTATTTCATTCTGGAAGAGTCTAATCTGCCTTGGTGGAGGGCCAGAGATAAGAACGGACAGGAGGGGTACATCCCATCTAATTATGTGACCGAGGCTGAGGACTCTATTGAGATGTACGAGTGGTATAGCAAGCACATGACACGGTCCCAGGCTGAGCAGCTGCTGAAGCAGGAGGGCAAAGAGGGAGGGTTTATCGTGCGCGATTCTAGTAAGGCCGGCAAATACACTGTGTCAGTGTTCGCTAAGAGCACCGGAGACCCCCAGGGCGTGATCAGACACTATGTGGTGTGTTCCACACCTCAGTCTCAGTACTATCTGGCTGAGAAGCACCTGTTTAGTACAATCCCAGAGCTGATTAACTACCACCAGCACAATTCTGCCGGCCTGATCAGCAGGCTGAAGTATCCCGTCTCCCAGCAGAACAAAAATGCTCCTTCTACCGCTGGACTGGGGTACGGCAGTTGGGAGATTGATCCAAAGGACCTGACATTCCTGAAGGAGCTGGGAACTGGGCAGTTTGGCGTGGTGAAGTATGGAAAATGGAGAGGGCAGTACGATGTGGCCATCAAGATGATCAAGGAGGGCTCAATGAGCGAGGACGAGTTCATCGAGGAGGCTAAGGTCATGATGAACCTGTCCCACGAGAAACTGGTGCAGCTGTATGGAGTGTGCACCAAGCAGCGGCCCATTTTTATCATTACAGAGTACATGGCTAATGGGTGTCTGCTGAACTATCTGCGCGAGATGAGACACAGATTCCAGACACAGCAGCTGCTGGAAATGTGCAAGGATGTGTGTGAGGCTATGGAGTACCTGGAGTCTAAGCAGTTTCTGCACCGGGACCTGGCTGCTCGCAATTGCCTGGTGAACGATCAGGGCGTGGTGAAGGTGAGTGACTTCGGACTGTCAAGGTATGTGCTGGATGACGAGTACACCAGCTCCGTGGGCTCTAAGTTTCCTGTGAGATGGTCTCCACCCGAGGTGCTGATGTATAGCAAGTTCTCCTCTAAGAGCGATATCTGGGCCTTTGGCGTGCTGATGTGGGAAATCTACAGCCTGGGCAAGATGCCTTACGAGCGGTTCACAAATTCCGAGACAGCTGAGCACATCGCCCAGGGCCTGCGCCTGTACCGGCCACATCTGGCCTCTGAGAAGGTGTACACCATCATGTACAGCTGTTGGCACGAGAAGGCCGACGAGAGACCCACATTCAAGATCCTGCTGTCCAACATTCTAGATGTGATGGACGAGGAGAGCTGA
【０２８７】
配列番号46：B29プロモーター配列：
【０２８８】
AGGAGGGCCATCATGGCCAAGTTGACCAGTGCTGTCCCAGTGCTCACAGCCAGGGATGTGGCTGGAGCTGTTGAGTTCTGGACTGACAGGTTGGGGTTCTCCAGAGATTTTGTGGAGGATGACTTTGCAGGTGTGGTCAGAGATGATGTCACCCTGTTCATCTCAGCAGTCCAGGACCAGGTGGTGCCTGACAACACCCTGGCTTGGGTGTGGGTGAGAGGACTGGATGAGCTGTATGCTGAGTGGAGTGAGGTGGTCTCCACCAACTTCAGGGATGCCAGTGGCCCTGCCATGACAGAGATTGGAGAGCAGCCCTGGGGGAGAGAGTTTGCCCTGAGAGACCCAGCAGGCAACTGTGTGCACTTTGTGGCAGAGGAGCAGGACTGA
【０２８９】
当業者であれば、本明細書に記載の用語、特に添付の請求項（たとえば添付の請求項の本体部）に記載の用語は、通常、「オープンエンドな」用語であることを理解できるであろう（たとえば、「含んでいる（including）」という用語は、「含んでいるが、これらに限定されない」と解釈されるべきであり、「有する（having）」という用語は、「少なくとも有する」と解釈されるべきであり、「含む（include）」という用語は「含むが、これらに限定されない」と解釈されるべきである）。さらに、特定の数が請求項に記載されている場合、前述のような意図も請求項に明確に記載されており、特定の数が記載されていない場合はそのような意図も存在しないことも、当業者であれば理解できるであろう。具体的に説明をすれば、たとえば、後述の特許請求の範囲では、請求項を定義するために、「少なくとも１つ」や「１つ以上」といった前置きが記載されている場合がある。しかしながら、このような前置きが記載されているからといって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」を使用して構成要素が記載された請求項を、１つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではなく、たとえ同じ請求項内に「１つ以上」または「少なくとも１つ」といった前置きと「ａ」または「ａｎ」といった不定冠詞とが含まれていたとしても、１つのみの構成要素を含む実施形態に限定すべきではない（たとえば、「ａ」および／または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味すると解釈すべきである）。これは、定冠詞を使用して記載された請求項でも同じである。また、請求項に特定の数が明確に記載されていたとしても、「少なくとも」記載されたその数であるということを当業者であれば理解するであろう（たとえば、修飾語を伴わない「２つ」という記載は、「少なくとも２つ」または「２つ以上」を意味する）。さらに、「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つ」といった慣用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば「Ａ、ＢおよびＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。また、「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つ」といった慣用語句が使用されている場合、通常、そのような語句は、当業者がその語句を通常理解する意味で記載されている（たとえば「Ａ、ＢまたはＣのうちの少なくとも１つを有するシステム」は、Ａのみを有するシステム、Ｂのみを有するシステム、Ｃのみを有するシステム、ＡとＢを有するシステム、ＡとＣを有するシステム、ＢとＣを有するシステム、ならびに／またはＡ、ＢおよびＣを有するシステムなどを包含するが、これらに限定されない）。さらに、２つ以上の選択肢を表すための選言的用語および／または選言的語句は、明細書、特許請求の範囲または図面のいずれにおいても、記載された用語のうちの１つ、記載された用語のいずれか、または記載された用語の両方を含む場合があると当業者であれば理解するであろ��。たとえば「ＡまたはＢ」という表現は、「ＡまたはＢ」または「ＡおよびＢ」を含む場合がある。
【０２９０】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ形式で記載されている場合、当業者であれば、マーカッシュ形式で記載された各メンバーまたはそれらからなるサブグループについても記載されていると理解できるであろう。
【図１】
2020517268.tif 000005
【図２】
2020517268.tif 000006
【図３】
2020517268.tif 000007
【図４】
2020517268.tif 000008
【図５】
2020517268.tif 000009
【図６】
2020517268.tif 000010
【図７】
2020517268.tif 000011
【図８】
2020517268.tif 000012
【図９Ａ−Ｂ】
2020517268.tif 000013
【図９Ｃ−Ｆ】
2020517268.tif 000014
【図９Ｇ−Ｉ】
2020517268.tif 000015
【図１０】
2020517268.tif 000016
【図１１Ａ】
2020517268.tif 000017
【図１１Ｂ−Ｄ】
2020517268.tif 000018
【図１２Ａ−Ｂ】
2020517268.tif 000019
【図１２Ｃ−Ｄ】
2020517268.tif 000020
【図１２Ｅ−Ｉ】
2020517268.tif 000021
【図１３】
2020517268.tif 000022
【図１４】
2020517268.tif 000023
【図１５】
2020517268.tif 000024
【図１６Ａ−Ｂ】
2020517268.tif 000025
【図１６Ｃ−Ｄ】
2020517268.tif 000026
【図１７】
2020517268.tif 000027
【図１８Ａ】
2020517268.tif 000028
【図１８Ｂ−Ｃ】
2020517268.tif 000029
【図１８Ｄ−Ｆ】
2020517268.tif 000030
【図１８Ｇ】
2020517268.tif 000031
【図１９】
2020517268.tif 000032
【図２０−１】
2020517268.tif 000033
【図２０−２】
2020517268.tif 000034
【図２１】
2020517268.tif 000035
【図２２】
2020517268.tif 000036
【図２３】
2020517268.tif 000037
【図２４】
2020517268.tif 000038
【図２５】
2020517268.tif 000039
【図２６】
2020517268.tif 000040
【図２７】
2020517268.tif 000041
【図２８】
2020517268.tif 000042
【図２９】
2020517268.tif 000043
【図３０】
2020517268.tif 000044
【図３１】
2020517268.tif 000045
【図３２】
2020517268.tif 000046
【図３３】
2020517268.tif 000047
【図３４】
2020517268.tif 000048
【図３５】
2020517268.tif 000049
【図３６】
2020517268.tif 000050
【図３７】
2020517268.tif 000051
【図３８】
2020517268.tif 000052
【図３９】
2020517268.tif 000053
【図４０】
2020517268.tif 000054
【図４１】
2020517268.tif 000055
【図４２】
2020517268.tif 000056
【図４３】
2020517268.tif 000057
【図４４】
2020517268.tif 000058
【図４５】
2020517268.tif 000059
【図４６】
2020517268.tif 000060
【図４７】
2020517268.tif 000061
【図４８】
2020517268.tif 000062
【図４９】
2020517268.tif 000063
【図５０】
2020517268.tif 000064
【図５１−１】
2020517268.tif 000065
【図５１−２】
2020517268.tif 000066
【図５２】
2020517268.tif 000067
【図５３】
2020517268.tif 000068
【図５４】
2020517268.tif 000069
【図５５】
2020517268.tif 000070
【図５６】
2020517268.tif 000071
【図５７−１】
2020517268.tif 000072
【図５７−２】
2020517268.tif 000073
【図５８】
2020517268.tif 000074
【図５９】
2020517268.tif 000075
【図６０】
2020517268.tif 000076
【図６１】
2020517268.tif 000077
【図６２】
2020517268.tif 000078
【図６３−１】
2020517268.tif 000079
【図６３−２】
2020517268.tif 000080
【図６３−３】
2020517268.tif 000081
【図６３−４】
2020517268.tif 000082
【図６３−５】
2020517268.tif 000083
【図６４】
2020517268.tif 000084
【図６５】
2020517268.tif 000085
【図６６】
2020517268.tif 000086
【図６７】
2020517268.tif 000087
【図６８−１】
2020517268.tif 000088
【図６８−２】
2020517268.tif 000089
【図６９】
2020517268.tif 000090
【図７０】
2020517268.tif 000091
【図７１】
2020517268.tif 000092
【図７２】
2020517268.tif 000093
【図７３】
2020517268.tif 000094
【図７４】
2020517268.tif 000095
【図７５】
2020517268.tif 000096
【図７６−１】
2020517268.tif 000097
【図７６−２】
2020517268.tif 000098
【図７７−１】
2020517268.tif 000099
【図７７−２】
2020517268.tif 000100
【図７８】
2020517268.tif 000101
【図７９】
2020517268.tif 000102
【図８０−１】
2020517268.tif 000103
【図８０−２】
2020517268.tif 000104
【図８１】
2020517268.tif 000105
【図８２】
2020517268.tif 000106
【図８３】
2020517268.tif 000107
【図８４】
2020517268.tif 000108
【図８５】
2020517268.tif 000109
【図８６−１】
2020517268.tif 000110
【図８６−２】
2020517268.tif 000111
【図８７】
2020517268.tif 000112
【図８８】
2020517268.tif 000113
【図８９】
2020517268.tif 000114
【図９０】
2020517268.tif 000115
【図９１−１】
2020517268.tif 000116
【図９１−２】
2020517268.tif 000117
【図９２−１】
2020517268.tif 000118
【図９２−２】
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【図９２−３】
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【図９２−４】
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【図９３】
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【図９４Ａ−Ｄ】
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【図９４Ｅ−Ｇ】
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【図９４Ｈ】
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【図９４Ｉ】
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【図９５Ａ−Ｃ】
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【図９５Ｄ−Ｅ】
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【図９５Ｆ】
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【図９６】
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【図９７】
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【図９８Ａ】
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【図９８Ｂ−Ｃ】
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【図９９Ａ】
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【図９９Ｂ−Ｃ】
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【図１００】
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【図１０１−１】
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【図１０１−２】
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【図１０２】
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【図１０３Ａ−Ｆ】
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【図１０３Ｇ】
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【図１０４】
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【図１０５】
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【図１０６】
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【図１０７】
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【図１０８Ａ】
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【図１０８Ｂ】
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【図１０９】
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【図１１０】
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【図１１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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