(57)【要約】ヒトｉＰＳＣ由来の神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイトを前例のない効率および機能性で誘導する新規の方法。本発明の核心は、多能性から、外胚葉、神経外胚葉、これらからＮＰＣ、これからＯＰＣ、これからオリゴデンドロサイトへの経路に沿った重要な複数の分化決定点における、これまでに未知の様式の、実験により発見された転写因子の使用である。本開示は、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイトへの、動態学的に制御された細胞成長プロセスによる多能性幹細胞の分化カスケードを、細胞密度の特定の組合せおよび範囲、試薬濃度、ならびにｍＲＮＡの特定の組合せを利用して、誘導および／または方向づけることに関する。
2020526212.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および／または胚性幹細胞（ＥＳＣ）の神経前駆細胞（ＮＰＣ）への分化を誘導するための方法であって、
ａ）ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、培地を含むコーティングされた非組織処理培養容器に蒔くステップと、
ｂ）１つまたは複数の細胞運命因子をコードするｍＲＮＡを個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡとしてステップａ）の前記細胞にトランスフェクションするステップと、
ｃ）ステップｂ）の前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、前記細胞がＮＰＣに分化するまで培養するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｎｇｎ２、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｂｒｎ２およびＦｏｘＯファミリー因子のうちの１つまたは複数からなる群から、個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡトランスフェクションとして選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｎｇｎ２である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｐａｘ６である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｓｏｘ２である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｂｒｎ２である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、ＦｏｘＯファミリー因子である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）の前記細胞運命因子のうちの１つまたは複数が、トランス活性化ドメインと融合している、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
ステップｃ）の前記細胞を、前記細胞がステップｃ）の前記細胞運命因子のうちの１つまたは複数を発現するまで培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＢ４３５４２、ＬＤＮ１９３１８９およびＰＤ１７３０７４のうちの１つまたは複数を、ステップｃ）の前記細胞に加えるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップａ）〜ｃ）の培養条件が、約２％〜約６％の酸素濃度におけるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップａ）〜ｃ）において使用する前記培地が、最小必須培地アルファ（ＭＥＭａ）またはダルベッコ改変イーグル培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）またはＢ２７サプリメントを有するＤＭＥＭからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
使用する前記培地がまた、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記培地がさらに、ｂＦＧＦ、Ｎ２もしくはＢ２７、ＢＳＡもしくはＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）のうちの１つまたは複数からなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養容器が、マトリゲルおよび／またはＰＬＯ−ラミニンでコーティングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップａ）の前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ステップｃ）の前記細胞を、約３〜約１０日間培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｂ）の前記トランスフェクションを、少なくとも１回反復する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を神経前駆細胞から生成するための方法であって、
ａ）培地を含むコーティングされた細胞培養容器にＮＰＣを蒔くステップと、
ｂ）１つまたは複数の細胞運命因子をコードするｍＲＮＡを個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡとしてステップａ）の前記細胞にトランスフェクションして、神経前駆細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるステップと、
ｃ）ステップｃ）の前記細胞を、前記ＮＰＣの形態がＯＰＣの形態に変化するまで培養するステップと
を含む、方法。
【請求項２０】
ステップａ）の前記ＮＰＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップｂ）のトランスフェクションに使用する前記ｍＲＮＡが、Ｏｌｉｇｏ２、ＮＫＸ２．２、ＳＯＸ１０およびＯｌｉｇｏ１のｍＲＮＡからなる群のうちの１つまたは複数から個別にまたは組み合わせて選択される細胞運命因子をコードする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｍＲＮＡが、Ｏｌｉｇｏ２をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｍＲＮＡが、ＮＫＸ２．２をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｍＲＮＡが、Ｓｏｘ１０をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｍＲＮＡが、Ｏｌｉｇｏ１をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
６ウェル培養プレートを使用し、ステップｂ）の前記トランスフェクションのための用量が１細胞運命因子あたり約２０ｎｇである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
最初のトランスフェクション後、トランスフェクションを、少なくともさらに２回反復する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
ステップａ）〜ｄ）の培養条件が、約２％〜約６％の酸素濃度におけるものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記培養容器のプレートが、マトリゲルおよびＰＬＯ−ラミニンでコーティングされている、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
ステップａ）〜ｃ）に使用する前記培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭおよびＭＥＭａからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
ＫＳＲ、アスコルビン酸、ＳＡＧ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、Ｔ３、インスリン、ＲＡ、Ｂ２７、ＣＡＭＰおよびビオチンのうちの１つまたは複数を前記培地に補充する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ａ）培地を含むコーティングされた細胞培養容器にＯＰＣを蒔くステップと、
ｂ）細胞が、樹状分枝様突起を伴って出現するか、またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を生成するまで、ステップａ）の前記細胞を培養するステップと
を含む、オリゴデンドロサイトをＯＰＣから生成するための方法。
【請求項３３】
ステップａ）〜ｃ）に使用する前記培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭおよびＭＥＭａからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＫＳＲ、アスコルビン酸、Ｎ２、Ｂ２７、ビオチン、ＣＡＭ、Ｔ３およびインスリンからなる群から選択される培地サプリメントのうちの１つまたは複数を前記培地に補充する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ステップａ）の前記ＯＰＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
ステップｂ）の前記細胞を約７〜約３０日間培養する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
ステップａ）における前記細胞培養容器が、マトリゲルおよび／またはＰＬＯ−ラミニンでコーティングされている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１、１９または３２に記載の方法において得られる細胞。
【請求項３９】
請求項３８に記載の細胞を含む、疾患、障害または形成異常を処置するための組成物。
【請求項４０】
請求項３８に記載の細胞および／または前記組成物を、疾患、障害、および／または形成異常を処置することを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患、障害、および／または形成異常を処置する方法。
【請求項４１】
幹細胞のＮＰＣ、ＯＰＣ、オリゴデンドロサイトへの分化を逐次的または直接的に誘導するための方法であって、請求項１に記載のステップ、その後、請求項１９に記載のステップ、その後、請求項３２に記載のステップを実施することを含む、方法。
【請求項４２】
幹細胞のＮＰＣ、ＯＰＣ、オリゴデンドロサイトへの分化を逐次的または直接的に誘導するための方法であって、
ａ）ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、コーティングされた培養容器に蒔くステップであって、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）をいずれも有する最小培地アルファ（ＭＥＭａ）またはダルベッコ改変イーグル培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）またはＢ２７サプリメントを有するＤＭＥＭを含む培地中に、前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種するステップと、
ｂ）Ｎｇｎ２、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｂｒｎ２およびＦｏｘＯファミリー因子のうちの１つまたは複数からなる群から、個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡトランスフェクションとして選択される、細胞運命因子をコードするｍＲＮＡをステップａ）の前記細胞にトランスフェクションするステップと、
ｃ）ステップｂ）の前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、前記細胞がＮＰＣに分化するまで培養するステップと、
ｄ）前記ＮＰＣをステップｃ）から単離するステップと、
ｅ）コーティングされた細胞培養容器にＮＰＣを蒔くステップであって、ＫＳＲ、ならびにアスコルビン酸、ＳＡＧ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、Ｔ３、インスリン、ＲＡ、Ｂ２７、ＣＡＭＰおよびビオチンからなる群から選択される培地サプリメントのうちの１つまたは複数をいずれも有するＭＥＭａまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥＭを含む培地中に、前記ＮＰＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種するステップと、
ｆ）Ｏｌｉｇｏ２、ＮＫＸ２．２、ＳＯＸ１０およびＯｌｉｇｏ１のｍＲＮＡからなる群のうちの１つまたは複数を個別にまたは組み合わせて、トランスフェクション試薬を使用して、ステップｅ）の前記細胞にトランスフェクションするステップと、
ｇ）ステップｅ）の前記トランスフェクションを少なくともさらに２回反復するステップと、
ｈ）ステップｇ）の前記細胞を、前記細胞の形態がＮＰＣ細胞からＯＰＣ細胞の形態に変化するまで培養するステップと、
ｉ）前記ＯＰＣをステップｈ）から単離するステップと、
ｊ）ステップｊ）から単離したＯＰＣをコーティングされた細胞培養容器に蒔くステップであって、ＫＳＲ、ならびにアスコルビン酸、Ｎ２、Ｂ２７、ビオチン、Ｃａｍ、Ｔ３およびインスリンからなる群から選択される培地サプリメントのうちの１つまたは複数をいずれも有するＭＥＭａまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥＭを含む培地中に、前記ＯＰＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種するステップと、
Ｋ）オリゴデンドロサイト細胞が、樹状分枝様突起を伴って出現する、および／またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を生成するまで、少なくとも約１週間、前記細胞を培養するステップと
を含む、方法。
【請求項４３】
前記ＮＰＣが、レシピエント対象に由来するものである、請求項１、１９、４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
開始細胞が体液または体組織から採取されたものである、請求項１、１９、４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
開始細胞がレシピエントから採取されたものである、請求項１、１９、４１または４２に記載の方法。
【請求項４６】
次のステップｄ）：
ｄ）ステップｃ）の前記ＮＰＣを、コーティングされていない超低接着プレートに移すことにより増やすステップ
をさらに含む、請求項１または１９に記載の方法。
【請求項４７】
６ウェル培養プレートを使用し、前記トランスフェクションの用量が、約１０ｎｇ／細胞運命因子〜約２００ｎｇ／細胞運命因子のｍＲＮＡの用量である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４８】
ステップｃ）の前記細胞を、約４〜約２０日間培養する、請求項１９に記載の方法。
【請求項４９】
有効量の請求項１に記載のＮＰＣを、細胞または組織をｉｎ  ｖｉｖｏで再生させることを必要とする対象に投与するステップであって、前記ＮＰＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境において移植または投与後に形質転換し、これにより前記細胞または組織を再生させる、ステップを含む、細胞または組織をｉｎ  ｖｉｖｏで再生させるための方法。
【請求項５０】
請求項１に記載のＮＰＣを含む医薬組成物。
【請求項５１】
請求項５０に記載の医薬組成物および使用のための指示を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年７月１３日出願の米国仮特許出願第６２／５３２，２４６号の優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイトへの、動態学的に制御された細胞成長プロセスによる多能性幹細胞の分化カスケードを、細胞密度の特定の組合せおよび範囲、試薬濃度、ならびにｍＲＮＡの特定の組合せを利用して、誘導および／または方向づけることに関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒト幹細胞の生成および後の分化への最近の取組みは、細胞運命の柔軟性、ヒト疾患のためのモデル、および臨床治療に関するパラダイムを変えた。胚性幹細胞（ＥＳＣ）および体細胞から作製する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）はともに、益々増加するリストに挙がる、その対応する初代細胞と識別不能な特定細胞型に分化し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明は、細胞成長動態および関連するパラメータをモジュレートし、これにより細胞密度の特定の組合せ、試薬濃度、およびｍＲＮＡの組合せを使用して、分化／誘導の方向性を制御することにより、幹細胞を誘導および分化させるための方法を提供する。一態様では、本開示の１つの実利は、機能的で成熟したオリゴデンドロサイトとなり得る神経前駆細胞（ＮＰＣ）およびオリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を提供し、ならびに種々の型の髄鞘関連疾患および傷害に関与する治療にオリゴデンドロサイトを直接提供する、新たに開発したプロトコールである。
【０００５】
本開示は、高度に効率的かつ適切に管理された、組織特異的分化におけるマスター制御遺伝子または重要な転写因子の発現を利用する分化方法を提供する。より詳細には、このような因子は、本開示により実証する、適切に改変かつ精製したｍＲＮＡ分子の形態で多能性幹細胞に導入する。
【０００６】
一態様では、本開示は、幹細胞を種々の細胞型に方向づけるために最適化した、重要な細胞運命因子、およびトランス活性化ドメインを有する従来の転写因子（ＴＦ）間の融合物を利用するステップと、このような因子を合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、好ましい密度で、適切なレベルの導入遺伝子発現を生じる方法により、培養した多能性幹細胞に導入するステップと、最適条件下で細胞を維持して特定の分化効率を高め、これにより幹細胞または前駆細胞の多能性状態または前駆状態を特定の系列または組織細胞型に誘導するステップとを含む、細胞分化を誘導する方法を提供する。
【０００７】
別の態様では、本開示は、幹細胞を種々の細胞型に方向づけるために最適化した、重要な細胞運命因子、およびトランス活性化ドメインを有する従来の転写因子（ＴＦ）間の融合物を含む、重要な細胞運命遺伝子を発現する幹細胞（まとめて幹細胞と呼ぶ）を生成するステップと、このような因子を合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、好ましい密度で、適切なレベルの導入遺伝子発現を生じる方法により、培養した多能性幹細胞に導入するステップと、最適条件下で細胞を維持して特定の分化効率を高めるステップとのうちの少なくとも１つを含む、幹細胞または前駆細胞の多能性状態または前駆状態を特定の系列または組織の細胞型に変化させるための方法を提供する。
【０００８】
別の態様では、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および／または胚性幹細胞（ＥＳＣ）の神経前駆細胞（ＮＰＣ）への分化を誘導するための方法であって、
ａ）ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、コーティングされた非組織処理培養プレートに蒔くステップと、
ｂ）１つまたは複数の細胞運命因子をコードするｍＲＮＡを個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡとしてステップａ）の細胞にトランスフェクションするステップと、
ｃ）ステップｂ）の前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、細胞がＮＰＣに分化するまで培養するステップと、
ｄ）多数のＮＰＣを必要とする場合、細胞をコーティングされていない超低接着条件に移して懸濁液中に成長させることにより、ｃ）のＮＰＣを増やし得るステップと
を含む、方法を本明細書において開示する。本態様の実施形態では、ステップｂ）の細胞運命因子は、Ｎｇｎ２、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｂｒｎ２およびＦｏｘＯファミリー因子のうちの１つまたは複数からなる群から、個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡトランスフェクションとして選択される。一部の実施形態では、トランスフェクションするＲＮＡの量は、６ウェルプレートの１ウェルあたり約１０ｎｇ〜約２００ｎｇもしくは約２０ｎｇ〜約２００ｎｇであるか、または他のタイプのプレートもしくは培養フラスコを使用する場合、容器の面積もしくは培養培地量の容量に基づいて比例的に調整する。一部の実施形態では、トランスフェクションは、少なくともさらに１回反復する。トランスフェクションは、約２４時間間隔で反復し得る。別の実施形態では、細胞運命因子は、トランス活性化ドメイン、例えば、それらに限定されないがＭｙｏＤまたはＶＰ１６と融合させ得る。一部の実施形態では、ステップｃ）の細胞は、細胞がステップｃ）の細胞運命因子のうちの１つまたは複数を発現するまで培養する。細胞因子が発現するかどうかの決定は、イムノアッセイおよび／またはｑｔ−ＰＣＲを使用して行うことができるが、これらに限定されない。さらに他の実施形態では、ＳＢ４３５４２、ＬＤＮ１９３１８９およびＰＤ１７３０７４のうちの１つまたは複数を、必要に応じて、ステップｃ）の細胞に加え得る。一部の実施形態では、ステップａ）〜ｃ）の培養条件は、約２％〜約６％の酸素濃度におけるものである。本開示の実施形態では、ステップａ）〜ｃ）において使用する培地は、最小必須培地アルファ（ＭＥＭａ）、ダルベッコ改変イーグル培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）またはＢ２７サプリメントを有するＤＭＥＭから選択される。培地はまた、他の成分、例えば、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、およびｂＦＧＦ、Ｎ２もしくはＢ２７、ＢＳＡまたはＨＳＡのうちの１つまたは複数を含み得る。別の実施形態では、培養容器は、マトリゲルおよび／またはＰＬＯ−ラミニンでコーティングされている。本方法の実施形態では、ステップａ）のｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣは、６ウェルプレートにおいて約０．７５×１０５細胞〜約１．５×１０６細胞／ウェルで播種する。他のサイズの培養容器を使用することもできる。６ウェルプレート以外の培養容器のための播種密度は、約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用し、細胞数を培養容器の成長面積で割ることに基づいて、例えば、表２に示すように決定することができる。一部の実施形態では、ステップｃ）の細胞は、約３〜約１０日間培養し、この時に細胞がアストロサイト様またはニューロン様形態を有する。約３〜約１０日後、約１００％に近いが約７５％よりも多くの細胞が、ＮＰＣ細胞特有の形態を有する。一部の実施形態では、約４０〜６０％の細胞が、ＮＰＣ細胞特有の形態を有する。約４０％よりも少ない細胞がＮＰＣ細胞特有の形態を有する場合、細胞選別を使用して細胞を単離することができる。懸濁培養システムを使用してさらに培養すると、さらなる選択が可能となる。一部の実施形態では、ＮＰＣの確認は、細胞運命因子のうちの１つ、例えば���Ｐａｘ６の発現により示すことができる。
【０００９】
本開示の別の態様は、オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）をＮＰＣから生成するための方法であって、前記方法は、
ａ）培地を含むコーティングされた培養容器（coatedculture  vessel）にＮＰＣを蒔くステップと、
ｂ）１つまたは複数の細胞運命因子をコードするｍＲＮＡを個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡとしてステップａ）の細胞にトランスフェクションして、神経前駆細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるステップと、
ｃ）ステップｃ）の細胞を、ＮＰＣの形態がＯＰＣの形態に変化するまで培養するステップと、
ｄ）多数のＯＰＣを必要とする場合、ｃ）のＯＰＣをコーティングされていない超低接着条件に移して懸濁液中に成長させることにより、増大させ得るステップと
を含む。本方法の実施形態では、ステップａ）において、６ウェルプレートのウェルには、約０．７５×１０５細胞／ウェル〜約１．５×１０６細胞／ウェルで播種する。他のサイズの培養容器を使用することもできる。６ウェルプレート以外の培養容器のための播種密度は、約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用し、細胞数を培養容器の成長面積で割ることに基づいて、例えば、表２に示すように決定することができる。別の実施形態では、ステップｂ）のトランスフェクションに使用するｍＲＮＡは、Ｏｌｉｇｏ２、ＮＫＸ２．２、ＳＯＸ１０およびＯｌｉｇｏ１のｍＲＮＡからなる群のうちの１つまたは複数から個別にまたは組み合わせて選択される細胞運命因子をコードする。別の実施形態では、ステップｂ）におけるトランスフェクションのための用量は、６ウェル培養プレートを使用する場合、１細胞運命因子あたり約２０ｎｇ〜約１００ｎｇであるか、または他のタイプのプレートもしくは培養フラスコを使用する場合、容器の面積もしくは培養培地量の容量に基づいて、比例的に調整する。別の実施形態では、最初のトランスフェクション後、トランスフェクションは、６ウェル培養プレートを使用する場合、約１０ｎｇ／細胞運命因子〜約２００ｎｇ／細胞運命因子のｍＲＮＡの用量で少なくともさらに２回反復するか、または他のタイプのプレートもしくは培養フラスコを使用する場合、容器の面積もしくは培養培地量の容量に基づいて、比例的に調整する。別の実施形態では、培養容器プレートは、マトリゲルおよび／またはＰＬＯ−ラミニンでコーティングされている。別の実施形態では、ステップａ）〜ｃ）に使用する培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭおよびＭＥＭａから選択される。一部の実施形態では、培地には、ＫＳＲ、アスコルビン酸、ＳＡＧ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、Ｔ３、インスリン、ＲＡ、Ｂ２７、ＣＡＭＰおよび／またはビオチンのうちの１つまたは複数を補充する。本方法の実施形態では、ステップａ）〜ｄ）の培養条件は、約２％〜約６％の酸素濃度におけるものである。別の実施形態では、ステップｃ）の細胞は、ＯＰＣの形態特性を有する細胞が観察されるまで約４〜約２０日間培養する。別の実施形態では、ＯＰＣ生成は、双極性形態および／または細胞運命因子のうちの１つの発現に基づいて確認することができる。約４〜約２０日後、約１００％に近いが約７５％よりも多くの細胞が、ＯＰＣ細胞特有の形態を有する。一部の実施形態では、約４０〜６０％の細胞が、ＯＰＣ細胞特有の形態を有する。約４０％よりも少ない細胞がＯＰＣ細胞特有の形態を有する場合、細胞選別を使用して細胞を単離することができる。懸濁培養システムを使用してさらに培養すると、さらなる選択が可能となる。一部の実施形態では、ＯＰＣの確認は、細胞運命因子のうちの１つ、例えば、Ｏｌｉｇｏ２またはＳｏｘ１０の発現により示すことができる。
【００１０】
本開示の別の態様は、次のステップ：
ａ）培地を含むコーティングされた培養容器にＯＰＣを蒔くステップと、
ｂ）細胞が、分枝細胞突起（branched  cell  process）を伴って出現する、および／またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を生成するまで、ステップａ）の細胞を培養するステップと
に基づいて、オリゴデンドロサイトをＯＰＣから生成するための方法である。本方法の実施形態では、ステップａ）〜ｃ）に使用する培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭまたはＭＥＭａから選択される。培地には、ＫＳＲ、アスコルビン酸、Ｎ２、Ｂ２７、ビオチン、ＣＡＭ、Ｔ３およびインスリンからなる群から選択される培地サプリメントのうちの１つまたは複数を補充し得る。別の実施形態では、ステップａ）のＯＰＣは、６ウェルプレートを使用して１ウェルあたり約０．７５×１０５細胞〜約１．５×１０６細胞で播種する。６ウェルプレート以外の培養容器のための播種密度は、約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用し、細胞数を培養容器の成長面積で割ることに基づいて、例えば、表２に示すように決定することができる。別の実施形態では、ステップｂ）の細胞は、約７〜約３０日間培養し、この時に分枝細胞突起を有する細胞が存在する。別の実施形態では、ステップａ）の細胞培養容器は、マトリゲルおよび／またはＰＬＯ−ラミニンでコーティングされている。
【００１１】
本開示の別の態様は、幹細胞、例えば、ｉＰＳＣまたは胚性幹細胞のＮＰＣ、ＯＰＣ、オリゴデンドロサイトへの分化を、次のステップ：
ａ）ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、コーティングされた培養容器に蒔くステップであって、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）をいずれも有する最小培地アルファ（ＭＥＭａ）またはダルベッコ改変イーグル培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）またはＢ２７サプリメントを有するＤＭＥＭを含む（comprising  containing）培地中に、ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、６ウェルプレートの１ウェルあたり約０．７５×１０５細胞〜約１．５×１０６細胞で、または他の培養容器を使用する場合、比例的に調整して、播種するステップと、
ｂ）Ｎｇｎ２、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｂｒｎ２およびＦｏｘＯファミリー因子のうちの１つまたは複数からなる群から、個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡトランスフェクションとして選択される、細胞運命因子をコードするｍＲＮＡをステップａ）の細胞にトランスフェクションするステップと、
ｃ）ステップｂ）の前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、細胞がＮＰＣに分化するまで培養するステップと、
ｄ）ＮＰＣをステップｃ）から単離するステップと、
ｅ）ＮＰＣをコーティングされた細胞培養容器に蒔くステップであって、ＫＳＲ、ならびにアスコルビン酸、ＳＡＧ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、Ｔ３、インスリン、ＲＡ、Ｂ２７、ＣＡＭＰおよびビオチンからなる群から選択される培地サプリメントのうちの１つまたは複数をいずれも有するＭＥＭａまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥＭを含む培地中に、ＮＰＣを、６ウェルプレートの１ウェルあたり約０．７５×１０５細胞〜約１．５×１０６細胞で、または他の培養容器を使用する場合、比例的に調整して、播種するステップと、
ｆ）Ｏｌｉｇｏ２、ＮＫＸ２．２、ＳＯＸ１０およびＯｌｉｇｏ１のｍＲＮＡからなる群のうちの１つまたは複数を個別にまたは組み合わせて、トランスフェクション試薬を使用して、ステップｅ）の細胞にトランスフェクションするステップと、
ｇ）ステップｅ）のトランスフェクションを、約１０ｎｇ〜約２００ｎｇの用量（６ウェルプレートにおいて１ウェルあたり）で少なくともさらに２回反復するステップと、
ｈ）ステップｇ）の細胞を、細胞の形態がＮＰＣ細胞からＯＰＣ細胞の形態に変化するまで培養するステップと、
ｉ）ＯＰＣをステップｈ）から単離するステップと、
ｊ）ステップｊ）から単離したＯＰＣをコーティングされた細胞培養容器に蒔くステップであって、ＫＳＲ、ならびにアスコルビン酸、Ｎ２、Ｂ２７、ビオチン、Ｃａｍ、Ｔ３およびインスリンからなる群から選択される培地サプリメントのうちの１つまたは複数をいずれも有するＭＥＭａまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥＭを含む培地中に、ＯＰＣを、６ウェルプレートの１ウェルあたり約０．７５×１０５細胞〜約１．５×１０６細胞で、または他の培養容器を使用する場合、比例的に調整して、播種するステップと、
Ｋ）オリゴデンドロサイト細胞が、樹状分枝様突起（tree  branch-looking  process）を伴って出現する、および／またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を生成するまで、少なくとも約１週間、細胞を培養するステップと
を使用して逐次的または直接的に誘導するための方法である。
【００１２】
本発明の別の態様では、本明細書に開示する方法の開始細胞は、レシピエントから、例えば、体液または体組織から採取する。
【００１３】
本開示の別の態様は、本開示の方法により得られるＮＰＣ、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトである。この態様の実施形態では、細胞は、医薬組成物として使用して疾患、障害または形成異常を処置し得る。このような疾患、障害および形成異常は、神経変性状態、例えば、急性神経変性状態、例えば、脳損傷（局所性またはびまん性脳損傷）、脊髄損傷または末梢神経損傷、例えば、物理的または化学的熱傷、深い切り傷または肢切断、脳血管不全に起因するものを含み得るが、これらに限定されない。他の実施形態では、これは、慢性または進行性神経変性状態、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、腫瘍、または慢性末梢神経傷害、ピック病、びまん性レビー小体病、進行性核上麻痺（スティール・リチャードソン症候群（Steel-Richardson  syndrome））、多系統変性症（シャイ・ドレーガー症候群（Shy-Drager  syndrome））、神経変性と関連する慢性てんかん状態、筋萎縮性側索硬化症を含む運動ニューロン疾患、変性運動失調、大脳皮質基底核変性症、グアムのＡＬＳパーキンソン認知症複合症、亜急性硬化性全脳炎、シヌクレイン症（多系統萎縮症を含む）、原発性進行性失語症、線条体黒質変性症、マシャド・ジョセフ病（Machado-Joseph  disease）／脊髄小脳失調症３型およびオリーブ橋小脳変性症、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット病（Gilles  De  La  Tourette's  disease）、球麻痺および偽性球麻痺、脊髄性および脊髄延髄性筋萎縮症（ケネディ病）、原発性側索硬化症、家族性痙性対麻痺、ウェルドニッヒ・ホフマン病（Werdnig-Hoffmann  disease）、クーゲルベルク・ヴェランダー病（Kugelberg-Welander  disease）、テイ・サックス病、サンドホフ病、家族性痙性疾患、ウォルファルト・クーゲルベルク・ヴェランダー病（Wohlfart-Kugelberg-Welander  disease）、痙性対麻痺、進行性多病巣性白質脳症、家族性自律神経障害（ライリー・デイ症候群）、ならびにプリオン病（クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、クールー病および致死性家族性不眠症を含むが、これらに限定されない）である。さらに他の実施形態では、これは、脱髄と関連する疾患、例えば、多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、視神経脊髄炎、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ギラン・バレー症候群、橋中心髄鞘崩壊症（central  pontine  myelinosis）、遺伝性脱髄疾患、例えば、白質萎縮症、シャルコー・マリー・トゥース病（Charcot-Marie-Tooth  disease）およびカナバン病である。
【００１４】
本開示の態様は、ここで、以下に記載する図面に関して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】神経前駆細胞（ＮＰＣ）誘導の例示的な実施形態。
【００１６】
【図２】オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）誘導の例示的な実施形態。
【００１７】
【図３】オリゴデンドロサイト誘導の例示的な実施形態。
【００１８】
【図４】オリゴデンドロサイトのさらなる培養および成熟の例示的な実施形態。
【００１９】
【図５】特異的細胞マーカーを示す、ヒトｉＰＳＣに由来するオリゴデンドロサイトの例示的な実施形態。
【００２０】
【図６】重要な種々のＴＦｍＲＮＡレベルを、分化する細胞内で達成する、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓに基づく遺伝子発現調節因子の使用の例示的な実施形態。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本開示を説明する場合、本明細書において定義しないすべての用語は、当技術分野において認識されている、その一般的な意味を有する。以下の説明が本発明の詳細な実施形態または特定の使用についての説明である限りにおいて、これは、例示のみを意図し、特許請求される本発明を限定していない。以下の説明は、本発明の趣旨および範囲に含まれる、すべての代替物、修飾形態および均等物を包含することを意図する。
【００２２】
ｉＰＳＣは、細胞の無限の利用可能性、細胞を得る方法の非侵襲性、および個別の患者に対する各処置に免疫適合する可能性のため、個別化医療の分野において特定の可能性を示し、免疫抑制薬からの解放をかなえる。
【００２３】
細胞置換療法は、種々の傷害を処置し、これまでに真の処置法を有しなかった、種々のヒト疾患を処置または予防する新たな希望を提供する。例えば、事故に起因する脊髄傷害、他の脊髄状態、例えば、多発性硬化症および種々の白質萎縮症は、現在、髄鞘およびその神経機能の喪失を修復する手段もなく、病院において処置されている。ＮＰＣ、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトの信頼性のある供給路を見出すことは、克服すべき高いハードルのままである。脊髄傷害または脊椎疾患を患う者に役立ち得る細胞の明確な必要性が存在するが、研究者および企業の取組みによっても、成熟形態を有する十分に機能的なオリゴデンドロサイトの生成を可能とする方法は、これまでに提供されていない。ＮＰＣまたはＯＰＣを使用して脊髄状態を処置するにしても、このような前駆体が、成熟した機能的な正常オリゴデンドロサイトを生じる能力は、依然として医療処置に使用するその可能性の重要な尺度である。
【００２４】
機能
的組織細胞を多能性幹細胞から誘導するための最新のプロトコールでは、医学的に適用可能なＮＰＣ、ＯＰＣまたはオリゴデンドロサイトを生成する、分化カスケードに沿った各ステップにおいて、成長因子、ホルモン、サイトカイン、シグナルペプチドおよび他の細胞間シグナル分子の組合せ（本開示においては便宜上まとめて「成長因子」と呼ぶ）の使用を必要とする。残念ながら、精製したポリペプチドとして供給した場合、成長因子は、一般に高価で不安定であり、バッチ毎に一貫しないため、これらの使用は困難なものとなっている。その上、成長因子が高度に特異的かつ組合せ的方法で機能するため、分化の各段階は、様々な成長因子のセットにより規定され、これら成長因子のセットは、最適化が困難かつコストが高い。本明細書に開示するように、重要な運命変化点において適切な用量および送達条件でｍＲＮＡを組み合わせることにより、大量の成長因子を使用することなく、非常に高い効率かつ低いコストで、ＮＰＣ、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトを実現することができる。
【００２５】
コストの負荷および非一貫性を軽減するために、成長因子受容体のアゴニストまたはアンタゴニストとしてシグナル経路に影響し、これにより、ある程度成長因子の代わりとなり得る低分子の発見に、当業者が頼ることが多い。低分子は、一般的に、成長因子よりも非常に安価である。しかし、低分子の主要な１つの不利益は、これらが意図しない標的、例えば、細胞膜結合受容体、細胞内小器官、またはゲノム成分等に及ぼし得る非特異的影響である。本開示はまた、低分子をまったく使用しない、または使用頻度を削減した細胞運命決定を達成する新規の方法を提供する。
【００２６】
おそらくは、各ステージを通じて細胞の分化を進める、成長因子および低分子を含めた詳細なロードマップは、冗長な実験を通じてまだ描かれていないため、たとえあったとしても、多能性幹細胞をはるばる最終的なオリゴデンドロサイトへ分化させる方法についての非常に限られた情報しか、これまでのところ存在していない。ｍＲＮＡが、機能的タンパク質をコードすることにより、細胞的および発生的事象の方向づけにおいて、より特異的であるため、本開示の方法は、一次オリゴデンドロサイト様細胞を作製し、脊髄の傷害、欠損、疾患、および髄鞘ならびに他の関連する健康問題の処置におけるヒト治療に道を開く上で、いかなる公知の方法よりもはるかに堅牢である。
【００２７】
典型的な分化プロトコールの別の重要な成分は、細胞を培養するための培地であり、これは、栄養素（脂質、アミノ酸、炭水化物、ビタミン等）、適切な濃度の塩、ｐＨ緩衝剤、必須元素、および一般的タンパク質因子、例えば、インスリンまたは血清アルブミンから構成され得る。異なる細胞型は、栄養素および培地成分の異なる要件を有し、細胞型特異的成長因子およびシグナル伝達のための低分子によりさらに複雑となる。したがって、一成分を一度に除去または添加することにより、特別の「分化培地」を丹念に試験することが多い。本開示の主な利点は、適切に供給した分化方向づけ遺伝子のｍＲＮＡの使用により、分化培地の確立が単純であることである。しかし、ｍＲＮＡと適切な培地の最適な組合せは、そのプロセスにさらに利点をもたらすことができ、本開示の不可欠な要素である。
【００２８】
幹細胞由来組織細胞の臨床適用では、確立された分化培地のほとんどの成分は、現行の優良医薬品製造基準（current  good  manufacturing  practice、ｃＧＭＰ）の規則による個別の認証を必要とし、例えば、成長因子は、特別の方法により生成される必要があり、個別の認証を必要とする。同様に、特定の分化培地に加える一部の低分子は、純度、安定性、および毒性が異なる、特別の化学合成プロセスにより生成する。幹細胞培養の分野では、これまでに公開された一部のプロトコールはまた、血清またはマトリゲルのような動物性生成物に依拠する。本開示の背後にある別の誘因は、均一な認証および品質管理プロセスに適する、単一型の分子に主に基づく新たな方法を創製することである。
【００２９】
細胞密度および分裂率を管理して所望の分化結果を達成し得る方法を含むプロセスを本明細書において開示する。さらに、開示では、ＲＮＡのトランスフェクション中の、タイミングの最適化、添加の順序、ＲＮＡ用量および種々のＲＮＡ間の比率、ならびにその持続時間または反復回数を教示する。本開示はさらに、培養容器の表面および環境条件、例えば、酸素濃度の選択に関する。本発明はさらに、所望の細胞の選択または全集団におけるその割合の増強の方法、ならびに分化細胞の凍結保存および再培養の方法を含む。
【００３０】
「マスター制御」遺伝子、すなわち、一つの重要な遺伝子（典型的には転写因子遺伝子、場合により、ともに作用する少数の遺伝子）の概念では、細胞および組織の運命、ならびに最終的には発生の間の器官全体の形成を決定することができ、筋肉（ＭｙｏＤ）、眼（Ｐａｘ６）、および発生生物学の他の分野の研究に基づいて、広く認められている。幹細胞において発現する転写因子の選択群をウイルスにより送達して発現させることによって、分化細胞を多能性状態に戻すことができるという山中伸弥（Shinya  Yamanaka）の発見では、数少ない重要な転写因子の能力を、長期にわたる多段階の運命変化を通して細胞を駆動させることによって実証した。他のグループによるｉＰＳＣ生成についての研究は、再プログラミング因子の選択を拡張させ、ある程度の変更が、再プログラミングの目的のための転写因子の選択において許容され得ることを示した。山中の最初の研究では、細胞の形質転換に作用させるために、このような因子の長時間にわたる発現が必要とされるため、ゲノム内に組み込むウイルスベクターを適用することにより、再プログラミング因子の発現を達成した。付随するゲノムの改変は、ｉＰＳＣの治療的適用に対する重要なハードルを表し、その上、組み込んだウイルスカセットからの発現が再活性化する可能性は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究においても懸念事項である。本発明者グループにより最新に開示する、ｍＲＮＡトランスフェクションの再プログラミングへの適用は、このシステムが、細胞培養培地にどの転写物を加えるかを単純に変更することにより、短い時間枠で、再プログラミングカクテルとさらには個別の構成因子の発現をモジュレートすることを可能とするため、特に魅力的である。特定因子のトランスフェクションが終了すると、細胞質のｍＲＮＡが急速に減衰するため、標的細胞内の異所発現が、すぐに停止する。標的細胞においてｍＲＮＡは持続しないが、細胞質において直接翻訳されるその能力は、トランスフェクションしたＤＮＡおよび組み込んでいるウイルスベクターの場合のような律速となる核移行の必要がなく、ｍＲＮＡの短い半減期を単に補って余りあり、高度に効率的な発現を、しかし十分に短い時間ウインドウ内で生じ、これは、細胞運命決定に重要である。
【００３１】
持続性ＤＮＡベクター、例えば、エピソームプラスミドは、細胞運命の変更に使用する場合、ランダムにゲノムが組み込まれる、いかなるリスクをも減少させるように慣れさせる（weaning）必要がある。ＲＮＡウイルスまたはウイルス誘導体、例えば、センダイウイルス（Sendai  virus）またはベネズエラウマ脳炎（Venezuelan  equine  encephalitis、ＶＥＥ）ウイルスは、非伝染性ＲＮＡレプリコンに改変後であっても、ウイルスエレメントを依然として保有し、宿主ゲノムに隠れたウイルスエレメントと組み換わる傾向がある。ネガティブデータの形式の証拠を探し出す面倒を伴わずには、細胞がウイルスベクターを取り除くことを完全に確実にすることは、常に困難である。本開示では、ｍＲＮＡに基づく細胞運命決定の利点を適用して、分化を方向づけることを目的とした、複数の発明ステップを開示する。要約すると、本開示は、単一または複数ラウンドの異所転写因子発現を、細胞分化を方向づける合理化した方法により教示する。
【００３２】
それにもかかわらず、ｍＲＮＡに基づく幹細胞分化に対する技術的障壁が存在する。すべての幹細胞型および培養培地が、効率的なｍＲＮＡ送達を等しく促すとは限らず、これは、現在、ｍＲＮＡに基づく分化に対する障害となっている。さらに、幹細胞、特にほとんどのヒト幹細胞株は、トランスフェクション耐性パッチを形成せずに培養することが幾分困難である。本明細書に開示するように、多能性幹細胞は、ほとんどの細胞にｍＲＮＡをトランスフェクション可能な条件下で成長させることができる。別の実施形態では、ＲＮＡおよびトランスフェクション試薬（その両方が毒性を伴う）の用量は、マスター制御遺伝子作用を及ぼし、その上、細胞運命変更プロセスにより生じる、アポトーシス促進力および細胞増殖抑制力に直面しても標的細胞の生存率を維持することが可能なレベルで、細胞に供給される。
【００３３】
したがって、これまでに公知の幹細胞分化方法と関連する問題を考慮して、本明細書に記載の新規の方法、材料、およびプロトコールでは、ｉＰＳＣまたは胚性幹細胞（ＥＳＣ）から、プロセスの効率および生成細胞の質が向上した、種々の細胞型を生成する。本開示では、標的幹細胞に送達するＴＦｍＲＮＡを増強することによる有意な向上を示す。本開示はまた、フィーダー細胞も他のいかなる潜在的に異種由来成分が混入した試薬をも使用することなく、ヒト幹細胞からフットプリントフリー組織細胞を生成するのに役立つ新規のプロトコールを提供する。新たなプロトコールは、改変ｍＲＮＡの利点を拡張し、幹細胞誘導技術の治療的適用に対して残存する障壁の解決に役立つ。
【００３４】
多能性状態から最終的分化状態への分化では、複数のステップを踏むことが多く、数週間から数カ月もの時間枠を必要とすることを考慮すると、成長因子に基づく段階的戦略は、本質的に非効率かつ冗長である。したがって、本開示の実施形態は、神経前駆細胞からオリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイト細胞へと生成を導く成長因子の必要性を基本的に除去する。
【００３５】
より詳細には、本開示は、幹細胞を種々の細胞型に方向づけるために最適化した、重要な細胞運命因子、ならびにトランス活性化ドメイン、例えば、ＭｙｏＤまたはＶＰ１６、および強力な転写活性化活性をもたらす、当分野において一般に公知の他の多くのトランス活性化ドメインを有する従来の転写因子（ＴＦ）間の融合物を含む、重要な細胞運命遺伝子を発現させ；このような因子を合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、好ましい密度で、適切なレベルの導入遺伝子発現を生じる方法により、培養した多能性幹細胞に導入し；最適条件下で細胞を維持して、これまでに達成し得なかった特定の分化効率を生じることにより、幹細胞または前駆細胞（まとめて幹細胞と呼ぶ）の多能性状態または前駆状態を、特定の系列または組織の細胞型に変化させることに関する。ｍＲＮＡの導入により発現する因子はまた、成長因子、サイトカイン、ホルモン、シグナルペプチド、および他の細胞運命に影響する分泌因子または修飾酵素を含むことができる。マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）または他のタンパク質非コードＲＮＡが、ＴＦを制御または影響し、ＴＦｍＲＮＡの直接的トランスフェクションと同一の作用を本質的にもたらすことができるため、類似の方法を使用して、このような非コードＲＮＡを細胞状態の遷移下で細胞に導入することにより、分化を方向づけることができる。さらに、操作を加えたＣａｓ９（例えば、非切断Ｃａｓ９）または他のＣａｓファミリーメンバータンパク質を、転写活性化ドメイン（および一部の場合では、所望のＴＦの逆の作用によりＴＦを抑制するための転写抑制ドメイン）、クロマチン修飾酵素もしくはその酵素ドメイン、または他の後成的修飾酵素もしくはその酵素ドメインに融合させた改変ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムを、このような作用ドメインを染色体上の標的ＴＦ遺伝子の近傍に方向づけるガイドＲＮＡ（複数可）とともに使用することによって、実施例に記載する、分化に重要なＴＦを活性化することができる。ゲノム配列を変更する鋳型としてＤＮＡ分子を必要とする場合を除いて、上記と同一の利点のために、標的細胞内に送達する分子として好ましくはＲＮＡのみを使用した、細胞分化のためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムを本明細書において開示する。当技術分野において公知の他の方法と比較して、本明細書に開示する方法は、幹細胞のＮＰＣ、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトへの分化に必要とされる時間、コスト、および労力を飛躍的に削減する。
【００３６】
本明細書の開示は、幹細胞を種々の細胞型に方向づけるために最適化した、重要な細胞運命因子を含む重要な細胞運命遺伝子を発現させるステップと、このような因子を合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として、好ましい密度で、適切なレベルの導入遺伝子発現を生じる方法により、培養した多能性幹細胞に導入するステップと、最適条件下で細胞を維持して特定の分化効率を高めるステップとのうちの少なくとも１つを含む、幹細胞または前駆細胞の多能性状態または前駆状態を、特定の系列または組織の細胞型に変化させる方法を特に詳細に記載する。
【００３７】
ある特定の実施形態では、十分に安定し、増やしたヒトＥＳＣまたはｉＰＳＣを提供する。
【００３８】
ある特定の実施形態では、単離後に１０回以上継代できるｉＰＳＣエピソームまたはＲＮＡウイルス（例えば、センダイ）の除去を必要としない。
【００３９】
ある特定の実施形態では、プロセスは、フィーダーフリーである。
【００４０】
ある特定の実施形態では、プロセスは、異種由来成分不含有であり、あらゆる合成またはヒト試薬を含み、非ヒト動物由来成分を含まない。
【００４１】
ある特定の実施形態では、プロセスは、フットプリントフリーであり、ＤＮＡのゲノムへのランダムな組込み（エピソームＤＮＡ構築物に発生することが多い）を有しない。
【００４２】
ある特定の実施形態では、ｍＲＮＡの機能は、非コードＲＮＡ（ｍｉＲＮＡを含む）またはガイドＲＮＡ／Ｃａｓ融合システムを使用することにより達成することができ、どのＴＦの活性が、以下の実施例に開示する特定の分化ステップに重要であるかの理解を伴う。
【００４３】
ある特定の実施形態では、プロセスは、患者固有の開始組織および／またはゲノム編集を介して、完全にカスタマイズされた遺伝的バックグラウンドをもたらす。
定義
【００４４】
本明細書において使用する場合、用語「約」は、２０％以内、より好ましくは１０％以内、最も好ましくは５％以内を意味する。用語「約」は、日についての文脈において使用する場合、１日または２日前後を意味する。したがって、細胞培養物を約３〜約１０日間培養する場合、これは、３〜１０日、１〜１２日または２〜１１日を意味し得る。
【００４５】
用語「オリゴデンドロサイト様細胞」は、オリゴデンドロサイトと特徴を共有する細胞を意味することを意図する。オリゴデンドロサイト様細胞は、形態的特性により、ならびに特定のマーカー特性によりさらに定義する。人工多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト様細胞が、一次オリゴデンドロサイトと類似の特性（マーカーおよびホルモン特性を含む）を共有するため、人工多能性由来（induced  pluripotent  derived）オリゴデンドロサイト様細胞は、人工多能性幹細胞由来オリゴデンドロサイト、または単にオリゴデンドロサイトと互換的に使用し得る。
【００４６】
「胚様体」は、多能性細胞に由来する細胞の凝集体を指し、この場合、細胞凝集は、細胞が表面に接着して典型的なコロニー増殖を成すことを防ぐ任意の方法により惹起することができる。本明細書において使用する場合、「胚様体」は、多能性幹細胞の３次元球状凝集体を指し、哺乳動物供給源由来の胚盤胞期の胚に由来する胚性幹細胞を含むが、これに限定されない。胚様体は、当技術分野において一般に公知の任意の技術により得られる胚性幹細胞から形成することができ、これは、体細胞核移植または体細胞を再プログラミングして人工多能性幹細胞を得ることを含むがこれらに限定されない。
【００４７】
本明細書において使用する場合、用語「人工多能性幹細胞」は、体細胞（例えば、成体体細胞）に由来する多能性幹細胞を指す。人工多能性幹細胞は、任意の成体細胞型を形成するその分化能において胚性幹細胞に類似しているが、胚、すなわち、複数の細胞型に分化可能な細胞には由来せず、非多能性細胞から人工的に誘導する（非天然由来）。
【００４８】
本明細書において使用する場合、「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」は、後代を含む。すべての後代が、計画的または偶発的変異のため、ＤＮＡ含量において正確には同一ではない可能性があることがまた理解される。最初に形質転換した細胞においてスクリーニングしたものと同一の機能または生物学的特性を有する、バリアント後代を含む。
【００４９】
本明細書において使用する場合、「組成物」は、活性剤と、不活性（例えば、検出可能な剤または標識）または活性の少なくとも１つの他の化合物または分子、例えば、アジュバントとの組合せを指す。本開示の文脈においては、組成物はまた、本明細書に記載の方法により生成する分化細胞を含み、ＮＰＣ、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイト細胞を含み得る。
【００５０】
本明細書において使用する場合、「培養すること」は、細胞の集団として、これらが増殖し、老化を回避し得る条件下で細胞を維持することを指す。「培養すること」は、細胞がまた、あるいは分化する条件をも含み得る。
【００５１】
本明細書において使用する場合、「差次的に発現する」は、正常または対照細胞の同一の遺伝子またはレギュレーター領域（regulator  region）によるＲＮＡの生成レベルと比較した場合の、遺伝子またはゲノムの調節領域（regulatory  region）から転写された、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡおよびｐｉＲＮＡまたは遺伝子によりコードされるタンパク質生成物を含むが、これらに限定されないＲＮＡの差次的生成を指す。別の文脈においては、「差次的に発現する」はまた、正常または対照細胞と比較した場合に、異なる時間的および／または空間的発現プロファイルを有する、細胞または組織のヌクレオチド配列またはタンパク質を指す。
【００５２】
本明細書において使用する場合、「高発現した」または「高発現」は、正常または対照細胞におけるＲＮＡまたはタンパク質生成物の発現レベルと比較した場合の、遺伝子によりコードされるＲＮＡまたはタンパク質生成物の発現レベルの増加を指す。
【００５３】
本明細書において使用する場合、「低発現した」または「低発現」は、正常または対照細胞におけるＲＮＡまたはタンパク質生成物の発現レベルと比較した場合の、遺伝子によりコードされるＲＮＡまたはタンパク質生成物の発現レベルの低下を指す。
【００５４】
本明細書において使用する場合、「分化する」または「分化」は、前駆体または前駆細胞（すなわち、神経前駆細胞）が特定の細胞型、例えば、オリゴデンドロサイトに分化するプロセスを指す。
【００５５】
本明細書において使用する場合、「有効量」は、細胞、組織、系、動物、またはヒトの有益または所望の生物学的、情動的、医学的、または臨床的応答をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与、適用、または投薬により投与することができる。用語はまた、その範囲内で、正常な生理学的機能を増強するのに有効な量を含む。
【００５６】
本明細書において使用する場合、「増大（expansion）」または「増やした（expanded）」は、細胞についての文脈において、最初の細胞の集団からの、同一であり得るか、もしくは同一でない可能性のある、特徴的な１つまたは複数の細胞型の数の増加を指す。増大に使用する最初の細胞は、増大により生成される細胞と同一である必要はない。例えば、増やした細胞は、最初の細胞の集団のｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖および分化により生成され得る。
【００５７】
本明細書において使用する場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがＲＮＡ転写物に転写されるプロセスを指す。ｍＲＮＡおよび他の翻訳されたＲＮＡ種についての文脈においては、「発現」はまた、転写されたＲＮＡが後続してペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される、１つまたは複数のプロセスを指す。
【００５８】
本明細書において使用する場合、「非組込みｉＰＳ細胞」は、非多能性細胞のゲノムに組み込まれた外因性導入遺伝子を含まないｉＰＳ細胞を指す。
【００５９】
本明細書において使用する場合、「単離した」は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片が、天然に、普通は会合する、構成成分、細胞およびその他から分離したことを意味する。天然に存在しないポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、それをその天然に存在する対応物から識別するのに「単離」を必要としない。本明細書に記載するＮＰＣ、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトに関しては、単離したは、非分化細胞から分離したこと、および目的の細胞の純粋集団を単離することを意味する。
【００６０】
本明細書において使用する場合、「濃縮した」は、これらに限定されないが、細胞、特定の細胞型、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片を含む分子を指し、これは、１容量あたりの分子の濃度または数が、その天然に存在する対応物の１容量あたりの分子の濃度または数よりも大きいという点で、その天然に存在する対応物から識別可能である。
【００６１】
本明細書において使用する場合、「希釈した」は、これらに限定されないが、細胞、特定の細胞型、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片を含む分子を指し、これは、１容量あたりの分子の濃度または数が、その天然に存在する対応物の１容量あたりの分子の濃度または数よりも小さいという点で、その天然に存在する対応物から識別可能である。
【００６２】
本明細書において使用する場合、「分離した」は、最初の供給源または集団から物理的に分割して、分離した化合物、細胞、薬剤、粒子、または分子が、最初の供給源または集団の一部であると、もはやみなすことができない状態を指す。
【００６３】
本明細書において使用する場合、処置目的のための「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物を指し、ヒト、飼育動物および農場動物、非ヒト霊長類、および動物園の動物、競技用動物、ならびに愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、およびウシを含むが、これらに限定されない。
【００６４】
本明細書において使用する場合、「幹細胞」は、任意の自己複製する全能性、多能性細胞あるいは複能性細胞または前駆細胞（progenitor  cell）もしくは前駆体細胞（precursor  cell）を指し、これは、複数の細胞型に分化可能である。
【００６５】
本明細書において使用する場合、「全能性」は、生物のすべての細胞型に加えて胚体外細胞または胎盤細胞に分化し、それらを生じることが可能な細胞を指す。
【００６６】
本明細書において使用する場合、「多能性」は、生物を構成する細胞型のうちのすべてに分化し、それらを生じさせることが可能な細胞を指し、胚体外細胞または胎盤細胞を除く、任意の胎児細胞型または成体細胞型を含む。
【００６７】
本明細書において使用する場合、「複能性」は、２つ以上の細胞型に発生し得るが、それらが発生し得る細胞型において多能性細胞よりも限定される細胞を指す。
【００６８】
本明細書において互換的に使用する場合、「対象」、「個体」または「患者」は、脊椎動物の生物を指す。
【００６９】
本明細書において使用する場合、「実質的に純粋な細胞集団」は、全細胞集団を構成する細胞の約５０％、好ましくは約７５〜８０％、より好ましくは約８５〜９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％の特定の細胞マーカー特性および分化潜在能を有する細胞の集団を指す。したがって、「実質的に純粋な細胞集団」は、特定のマーカー特性および分化潜在能を指定のアッセイ条件下で呈さない細胞を約５０％よりも少なく、好ましくは約２０〜２５％よりも少なく、より好ましくは約１０〜１５％よりも少なく、最も好ましくは約５％よりも少なく含む細胞の集団を指す。
【００７０】
本明細書において使用する場合、「プレ分化」は、最終的なエフェクター細胞（例えば、オリゴデンドロサイト）へのさらに分化する潜在能を有する、前駆体または前駆細胞（例えば、多能性幹細胞）が中間細胞型、例えば、神経前駆細胞またはオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化するプロセスを指す。
【００７１】
本明細書において使用する場合、「治療的」は、疾患、障害、状態、もしくは副作用の処置、治癒および／もしくは回復、または疾患、障害、状態、もしくは副作用の進行率の低下を指す。用語はまた、その範囲内で、正常な生理学的機能、対症処置（pallative  treatment）、および疾患、障害、状態、または副作用の部分的治療の増強を含む。
【００７２】
用語「処置すること」および「処置」は、本明細書において使用する場合、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを一般的に指す。効果は、その疾患、症状もしくは状態の防止もしくは部分的防止に関して予防的であり得、および／または疾患、状態、症状、もしくは疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒に関して治療的であり得る。用語「処置」は、本明細書において使用する場合、哺乳動物、特にヒトにおける任意の処置を包含し、（ａ）疾患の素因を有し得るが、それを有するとまだ診断されていない対象における疾患の発生の防止、（ｂ）疾患の阻害、すなわち、その進行の抑止、あるいは（ｃ）疾患の緩和、すなわち、疾患および／またはその症状もしくは状態の軽減または回復を含む。用語「処置」は、本明細書において使用する場合、治療的処置と予防または防止手段の両方を指す。処置を必要とする対象は、障害を既に有する対象、ならびに障害を防止すべき対象を含む。
【００７３】
本明細書において使用する場合、「予防的」は、診断未確定であっても、疾患もしくは状態が発生する前に、または疾患もしくは状態がまだ無症状期である間に、疾患または状態を妨害または停止することを指す。
【００７４】
本明細書において使用する場合、「活性剤」は、生物学的に活性であるか、または他の方法で生物学的もしくは生理学的効果を、それを投与する対象に対して誘導する、物質、化合物、または分子を指す。本開示の文脈においては、本明細書に記載の方法により生成する、ＮＰＣ、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトは、「活性剤」である。
【００７５】
本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、活性剤、本開示の軟骨細胞、または本開示のオリゴデンドロサイトを含む組成物と併せて投与し、動物および／またはヒトにおける使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されているか、または米国薬局方もしくは一般に認められた他の薬局方に列挙されている、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。
【００７６】
本明細書において使用する場合、「ＦｏｘＯ」は、フォークヘッド転写因子ファミリーメンバーのサブクラスを指す。本明細書に開示の実験では、ＦｏｘＯファミリーメンバー、例えば、ＦｏｘＯ１、ＦｏｘＯ２、ＦｏｘＯ３ａおよびＦｏｘＯ４のうちの１つまたは複数由来のｍＲＮＡを使用し得る。
【００７７】
本明細書において他に定義しない限り、本明細書において使用する、すべての技術的および科学的用語は、当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００７８】
細胞型：細胞型の例としては、例えば、外胚葉細胞、神経前駆細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、オリゴデンドロサイトが挙げられ得る。
【００７９】
ｉＰＳＣ用の培養容器に適する表面の例としては、ビトロネクチン（Vitronetin）、Ｅカドヘリン、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩまたはマトリゲルが挙げられるが、これらに限定されない。神経外胚葉および神経前駆体に適する表面としては、マトリゲル、ＰＬＯ−ラミニンが挙げられるが、これらに限定されない。神経前駆体およびオリゴデンドロサイト前駆細胞およびオリゴデンドロサイトに適する表面としては、マトリゲルまたはＰＬＯ−ラミニンまたはコラーゲンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８０】
一態様では、体細胞を脱分化または再プログラミングするための方法の例としては、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、ｃＭｙｃ、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８から選択される合成ｍＲＮＡ再プログラミング因子ならびにトランス活性化ドメインのうちのいずれか１つまたは複数の使用を挙げることができ、これにより、体細胞を再プログラミングまたは脱分化させる。ｉＰＳＣのモジュレーションのための方法および組成物は、米国特許出願第１３／８９３，１６６号および第１４／２９２，３１７号に記載されており、このようなｉＰＳＣは、本明細書に記載の方法に使用することができる。その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８１】
懸濁システムは、使用可能な場合、臨床適用のための大規模生成において、より実用的である。したがって、本プロトコールでは、各段階において、細胞が懸濁液中で十分に増大可能かどうかを見るために試験した。ある特定の実施形態では、懸濁細胞培養、ならびにこのような懸濁培養に使用し得る、低細胞接着培養プレートおよび容器の使用のためのプロトコールが存在する。
【００８２】
ある特定の実施形態では、環境条件、例えば、酸素濃度は、最適誘導条件にモジュレートすることができる。
【００８３】
ある特定の実施形態では、所望の細胞の選択、または全細胞培養集団におけるその密集率もしくは細胞密度の増強のプロセスおよび方法を提供する。
【００８４】
ある特定の実施形態では、ＮＰＣ、ＯＰＣまたはオリゴデンドロサイト様細胞の凍結保存方法を提供する。分化細胞の一部は、保存中の最適な細胞生存率のために凍結保存する必要があり得る。例えば、２．５％のＨＳＡに１０％のＤＭＳＯを培養培地中で加えたものを使用し得る。保存中の生存率をさらに向上させるために、この適用を使用して、細胞数を最適化することができる。
【００８５】
分化細胞を再培養する方法をまた提供する。細胞は、ほとんどの培養容器、例えば、Ｔ７５フラスコ、Ｔ２５フラスコ、４ウェルプレート、６ウェルプレート、８ウェルプレート、２４ウェルプレート、４８ウェルプレート、および９６ウェルプレートにおいて再培養することができるが、これらに限定されない。細胞は、様々な適用のために様々な細胞密度で再培養することができる。
【００８６】
ある特定の実施形態では、本開示はまた、細胞に対する物理的ストレスを管理し、これにより分化プロセスを通じた処理中の生存率を向上させるための方法を提供する。ある特定の細胞型は、分化において、ｉＰＳＣのように非常に小型である。このような小型の細胞は、遠心分離力に非常に感受性である。維持するためには、このような細胞は、コロニーとして培養し、次いで、単一細胞ではなく、クラスターとして解離させ得る。分化させるためには、単一細胞が必要である場合、解離を終了させた後に細胞を剥離し、解離溶液を除去して、残留する解離溶液により細胞をさらに解離させ得る。このプロトコールは、細胞培養において一般に用いられている。ｉＰＳＣは、過剰な遠心分離力に非常に感受性である。一部の細胞型は、分化において、ｉＰＳＣのように非常に粘着性である。このような細胞は、ずり力（sheer  force）に非常に感受性である。このような細胞を処理する場合、いかなる小さな先端部の使用をも避け、細胞をピペットで繰り返し上下させることを回避するために、１０ｍＬのピペットを使用した。オリゴデンドロサイトは、多くの分枝、軸索に付着する能力を有する突起を含む、独特の細胞形態を有する。オリゴデンドロサイトをある容器から別の容器へ移すには、慎重な操作、および本開示の発明者らが試行錯誤することにより身に付けた、非一般的技術を必要とする。
【００８７】
本開示の方法により生成したＮＰＣ、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトは、脊椎傷害および他の傷害の処置に使用することができる。例えば、本発明の方法を使用して生成した、高度に濃縮または精製したＮＰＣ、ＯＰＣおよび／またはオリゴデンドロサイトの集団は、脳および脊髄の疾患および傷害の様々な状態への移植に使用することができ、背景情報については、（Liu  K,.et  al.,  "Neuronal  Intrinsic  Mechanisms  of  Axon  Regeneration."  Annu  Rev  Neurosci.  2011;  34:131-152）、Tuszynski  MH,  Steward  O.,  Concepts  and  Methods  for  the  Study  of  Axonal  Regeneration  in  the  CNS.  Neuron.  2012;  74:777-791）、（Gage,  "Mammalian  Neural  Stem  Cells,"  Science  287:1433-1438  (2000)、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、（Goldman,  "Adult  Neurogenesis:  From  Canaries  to  the  Clinic,"  J.  Neurobiology  36:267-286  (1998)；Pincus  et  al.,  "Neural  Stem  and  Progenitor  Cells:  A  Strategy  for  Gene  Therapy  and  Brain  Repair,"  Neurosurgery  42:858-868  (1998)；Svendsen  et  al.,  "Neural  Stem  Cells  in  the  Developing  Central  Nervous  System:  Implications  for  Cell  Therapy  Through  Transplantation,"  Prog.  Brain  Res.  127:13-34  (2000)；およびSvendsen  et  al.,  "New  Prospects  for  Human  Stem-Cell  Therapy  in  the  Nervous  System,"  Trends  Neurosci.  22:357-364  (1999)、これらはすべて、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、（Snyder  et  al.,  "Multipotent  Neural  Precursors  Can  Differentiate  Toward  Replacement  of  Neurons  Undergoing  Targeted  Apoptotic  Degeneration  in  Adult  Mouse  Neocortex,"  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  94:11663-11668  (1997)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、ならびに、いずれかの化学物質により脱髄化した脳の再有髄化領域については、（Windrem  et  al.,  "Progenitor  Cells  Derived  from  the  Adult  Human  Subcortical  White  Matter  Disperse  and  Differentiate  as  Oligodendrocytes  Within  Demyelinated  Regions  of  the  Rat  Brain,"  J.  Neurosci.  Res.  69:966-975  (2002)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、または自己免疫による脱髄化については、（Pluchino  et  al.,  "Injection  of  Adult  Neurospheres  Induces  Recovery  in  a  Chronic  Model  of  Multiple  Sclerosis,"  Nature  422:688-694  (2003)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）、（Yandava  et  al.,  "Global  Cell  Replacement  is  Feasible  Via  Neural  Stem  Cell  Transplantation:  Evidence  from  the  Dysmyelinated  Shiverer  Mouse  Brain,"  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  96:7029-7034  (1999)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００８８】
一部の実施形態では、本開示に従って生成および投与する細胞は、ニューロン、オリゴデンドロサイト、およびアストロサイトに分化し、これにより、傷害された脳および脊髄の失った細胞要素を再構成する。一部の実施形態では、本開示のＮＰＣ、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトの患部への移植は、構造の再生および修復を媒介する。これは、脳卒中および傷害により失われた脳組織の再構成を含み得るが、これに限定されない。加えて、神経幹細胞は、周産期脳において高度に移動性であり、結果として、遺伝性および代謝性疾患により欠損または変異した酵素を補充するためにも使用し得る。
【００８９】
これまで、神経幹細胞および前駆細胞生着の実験による治療的研究では、ほとんどが、胎児組織または成体組織を神経幹細胞および前駆細胞の供給源として使用して行われている。このようなアプローチは、新たな胎児組織および成体組織を、動物およびヒトの両方のドナーから持続的に得ることを必要とした。後者は、特に、供給源として問題があり、これは、ヒト組織由来細胞が、胎児または成体起源にかかわらず、入手困難であり、標準化しスケールアップすることが、より困難であるためである（Keyoung  et  al.,  "Specific  Identification,  Selection  and  Extraction  of  Neural  Stem  Cells  from  the  Fetal  Human  Brain,"  Nature  Biotech.  19:843-850  (2001)；Pincus  et  al.,  "Fibroblast  Growth  Factor-2/Brain-Derived  Neurotrophic  Factor-Associated  Maturation  of  New  Neurons  Generated  from  Adult  Human  Subependymal  Cells,"  Ann.  Neurol.  43:576-585  (1998)；Roy  et  al.,  "Promoter-Targeted  Selection  and  Isolation  of  Neural  Progenitor  Cells  from  the  Adult  Human  Ventricular  Zone,"  J.  Neurosci.  Res.  59:321-331  (2000)；およびRoy  et  al.,  "In  Vitro  Neurogenesis  by  Progenitor  Cells  Isolated  from  the  Adult  Human  Hippocampus,"  Nature  Med.  6:271-277  (2000)、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。対照的に、本開示の方法を使用して生成するＮＰＣ、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトは、神経幹細胞および前駆細胞を迅速に得ること、拡張可能に増大させること、および分化を方向づけることを可能とする。
【００９０】
さらに、本開示によって、自家ＮＰＣ、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトを、一部の実施形態において使用することができる。あるいは、異種ＮＰＣ、ＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトを、本開示の処置方法のいずれかにおいて使用することができる。マウスおよびヒト両方の起源の、ＥＳ細胞由来の神経幹細胞および前駆細胞により、ＥＳ由来グリア細胞およびオリゴデンドロサイトの場合の再有髄化と、ＥＳ由来中脳ドーパミン作動性ニューロンの場合の実験的パーキンソン病におけるドーパミン系補充との両方が可能であることが既に見出されている。現在では、ＥＳ細胞培養物からの神経幹細胞の精製が実現されており、本発明により、その使用の信頼性と安全性の両方が実質的に増加し、したがって、ヒト組織を得る必要性を除去することができる。
【００９１】
本開示の別の態様は、神経変性状態を有する対象を処置する方法であって、上記の産後由来細胞を神経変性状態の処置に有効な量で、患者に投与するステップを含む、方法を特徴とする。ある特定の実施形態では、神経変性状態は、急性神経変性状態、例えば、脳損傷（局所性またはびまん性脳損傷）、脊髄損傷または末梢神経損傷、例えば、物理的または化学的熱傷、深い切り傷または肢切断、脳血管不全に起因するものである。他の実施形態では、これは、慢性または進行性神経変性状態、例えば、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、腫瘍、または慢性末梢神経傷害、ピック病、びまん性レビー小体病、進行性核上麻痺（スティール・リチャードソン症候群）、多系統変性症（シャイ・ドレーガー症候群）、神経変性と関連する慢性てんかん状態、筋萎縮性側索硬化症を含む運動ニューロン疾患、変性運動失調、大脳皮質基底核変性症、グアムのＡＬＳパーキンソン認知症複合症、亜急性硬化性全脳炎、シヌクレイン症（多系統萎縮症を含む）、原発性進行性失語症、線条体黒質変性症、マシャド・ジョセフ病／脊髄小脳失調症３型およびオリーブ橋小脳変性症、ジル・ドゥ・ラ・トゥレット病、球麻痺および偽性球麻痺、脊髄性および脊髄延髄性筋萎縮症（ケネディ病）、原発性側索硬化症、家族性痙性対麻痺、ウェルドニッヒ・ホフマン病、クーゲルベルク・ヴェランダー病、テイ・サックス病、サンドホフ病、家族性痙性疾患、ウォルファルト・クーゲルベルク・ヴェランダー病、痙性対麻痺、進行性多病巣性白質脳症、家族性自律神経障害（ライリー・デイ症候群）、ならびにプリオン病（クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、クールー病および致死性家族性不眠症を含むが、これらに限定されない）である。
【００９２】
さらに他の実施形態では、これは、脱髄と関連する疾患、例えば、多発性硬化症、急性散在性脳脊髄炎、視神経脊髄炎、横断性脊髄炎、慢性炎症性脱髄性多発神経炎、ギラン・バレー症候群、橋中心髄鞘崩壊症、遺伝性脱髄疾患、例えば、白質萎縮症、シャルコー・マリー・トゥース病およびカナバン病である。
【００９３】
ある特定の実施形態では、本開示のｉＰＳＣ、ＥＳＣ、ＮＰＣ、ＯＰＣ、オリゴデンドロサイトは、別々に、ともに、または２つもしくはそれよりも多くを組み合わせて投与することができる。さらに他の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの他の薬剤、例えば、神経治療のための薬物、または別の有益な補助剤、例えば、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤もしくは成長因子とともに投与する。
【００９４】
ある特定の実施形態では、細胞は、患者の中枢神経系または末梢神経系の所定の部位に投与する。これは、注射もしくは注入により投与するか、または植込み型デバイスに被包するか、または細胞を含むマトリックスもしくは足場を植え込むことにより投与することができる。
【００９５】
本発明の別の態様は、本開示の細胞型のうちの１つまたは複数および薬学的に許容される担体を含む、神経変性状態を有する患者を処置するための医薬組成物を特徴とする。処置する神経変性状態は、急性神経変性状態であり得るか、または、慢性もしくは進行性状態であり得る。
【００９６】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの他の薬剤、例えば、神経治療のための薬物、または別の有益な補助剤、例えば、抗炎症剤、抗アポトーシス剤、抗酸化剤もしくは成長因子を含む。
【００９７】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、注射または注入による投与のために製剤化する。あるいは、これは、細胞を被包する植込み型デバイス、または細胞を含むマトリックスもしくは足場を含み得る。医薬組成物は、他の物質、例えば、天然生体物質、例えば、ゼラチン、コラーゲン、カルボキシメチルセルロースを含み得る。注射による送達では、塩水ビヒクルを使用し得る。
【実施例】
【００９８】
本発明は、ここで、以下の実施例を参照して説明する。このような実施例は、例示のみの目的のために提供し、本発明は、このような実施例に限定されず、むしろ、本明細書に提示する教示の結果として明らかな、すべての変形形態を包含する。以下の表は、一部の実施形態における使用のための実験条件を含み、実験により検証された条件を含む。以下の表または本明細書に提示する、パラメータ、パラメータの範囲または例示的なパラメータのうちのいずれか１つは、以下の表または本明細書に提示する、パラメータ、パラメータの範囲または例示的なパラメータのうちの他のいずれか１つとともに使用することができる。
【００９９】
【表１−１】
2020526212.tif 000003
【表１−２】
2020526212.tif 000004
【０１００】
一部の実施形態では、播種に使用する細胞数は、例えば、約（７．１２５０×１０４、１．１８７５００×１０６、２．３７５０００×１０６、４．７５００００×１０６、７．１２５０００×１０６、９．５０００００×１０６、１．１８７５０００×１０７もしくは１．４２５００００×１０７）または列挙した細胞数のうちのいずれか２つの間の任意の細胞数であり得る。細胞数／ｃｍ２としてのこのような播種密度は、任意の培養容器について、細胞数を培養容器の成長面積で割ることにより決定することができ（表２参照）、例えば、９．５ｃｍ２の成長面積を有する６ウェルプレートを使用すると、播種密度は、６ウェルプレートあたり約（０．７５×１０５、１×１０５、１．２５×１０５、２．５０×１０５、５．００×１０５、７．５０×１０５、１×１０６、１．２５×１０６もしくは１．５×１０６細胞／ｃｍ２）、または列挙した密度のうちのいずれか２つの間の任意の密度となり得る。このように、任意の培養容器に必要とされる細胞密度は、類似の方法で決定することができる。
【表２−１】
2020526212.tif 000005
【表２−２】
2020526212.tif 000006
【０１０１】
一部の実施形態では、酸素濃度は、例えば、約（２、２．２５、２．５、２．７５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５、４．７５、５、５．２５、５．５、５．７５もしくは６．０％）の酸素または列挙した百分率のうちのいずれか２つの間の任意の範囲であり得る。
（実施例１）
ｉＰＳＣからの神経前駆細胞の生成
【０１０２】
ｉＰＳＣを標準サイズの６ウェル細胞培養プレート（成長面積約９．５ｃｍ２／ウェル）または標準サイズの１２ウェル細胞培養プレート（成長面積約３．８ｃｍ２／ウェル）に蒔いて、分化を開始した。他のサイズの培養容器も、必要に応じて適用可能であり、試薬および時間の使用の効率が高いため、６ウェルまたは１２ウェルプレートより大きいものが、より好ましい場合もあり得る。出願人は、開示の方法が、他のサイズの培養容器においても使用可能であることを確認している。
【０１０３】
６ウェルプレートでは、１ウェルあたり約１×１０５〜約１×１０６の集団サイズの細胞は、首尾よく使用されている。輪郭がはっきりと鮮明に確定され、細胞が緻密である、十分な典型的ｉＰＳＣコロニーが存在し、コロニーが過剰成長していない場合、ｉＰＳＣは、いつでも分化する状態になっていると考えた。出願人が、他の研究者により非ｍＲＮＡ方法を使用して作製されたｉＰＳＣ、例えば、ＮＩＨ／Ｌｏｎｚａにより作製されたＮＣＬ２ｉＰＳＣ株を首尾よく誘導できたが（データ非提示）、このような基準を使用して生成した本発明のｉＰＳＣの品質は、本発明のｉＰＳＣ株を、他者により他の方法を使用して生成したｉＰＳＣ株と比較した場合、分化に重要であることが証明された。一方では、開示する技術はまた、例えば、ＮＰＣから開始して、ＯＰＣ、アストロサイト、もしくは他のグリア細胞へと誘導するか、またはＯＰＣから開始して、アストロサイトもしくは他のグリア細胞へと誘導するプロセス中のいかなる段階においても適用することができる。例示的な一実験では、出願人は、提供された組織から単離した一次ＮＰＣを使用して、同一のプロトコールを使用し、ｉＰＳＣから直接分化したＮＰＣと並行して、それらをＯＰＣおよびオリゴデンドロサイトにさらに分化させた。ＮＰＣの２つの異なる供給源を使用した結果は、概して類似しており、ｉＰＳＣ由来ＮＰＣは、効率がわずかに高く、出願人が、その段階において懸濁液で細胞の成長を試みた場合、球状を形成する傾向が高かった（データ非提示）。
【０１０４】
この段階のｉＰＳＣは、外胚葉系列細胞に分化するよう誘導された。分化のためのほとんどの現在のプロトコールが、接着した単層細胞の使用をむしろ好むとしても、懸濁培養システムが、この段階における規模拡大に非常に有用であることを、本発明者らは発見した。誘導のため、懸濁液で成長させたｉＰＳＣが、化学毒性に対してより耐性であり、後の段階において再度蒔くことがより容易であることを本発明者らは見出した。懸濁培養経路を特定の分化の「実行（run）」のために選択した場合、本発明者らは、Ｕｌｔｒａ−Ｌｏｗ  Ａｔｔａｃｈｍｅｎｔプレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）または他の低接着プレートを使用して、ｉＰＳＣ懸濁細胞成長を促進した。
【０１０５】
ｉＰＳ細胞を継代する必要がある場合、細胞毒性が低く、より小さいｉＰＳＣクラスターを生じるプロトコールによりｉＰＳＣコロニーを解離することが重要であった。これにより、懸濁培養が望ましい場合に球状を急速に形成することが可能である。ｉＰＳＣは、ＴｒｉｐＬＥ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、Ａｃｃｕｔａｓｅ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）またはＥＤＴＡを使用して、ＤＰＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に約０．１ｍＭ、場合により約０．５ｍＭまたは約１ｍＭのＥＤＴＡを用いて約３７℃で５分間解離させることにより解離した。このステップに約１〜約２分、場合により約１０〜約２０分を含む、種々の解離時間を首尾よく使用した。一部の実施形態では、解離時間は、約（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）または列挙した時間のうちのいずれか２つの間の任意の時間の範囲であり得る。
【０１０６】
培地については、本発明者らは、５％のＫＳＲを含むＭＥＭａまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥＭ＋Ｂ２７を試験し、この分化段階において望み通りの結果を達成することができた。また、培地サプリメントであるＮ２、ＢＳＡまたはＨＡＳおよびｂＦＧＦを、この段階で使用する基本培地に応じて、培地において使用した。次いで、ｉＰＳＣは、多能性段階を脱し、必要に応じたステップとして、例えば、約（５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ）または列挙した濃度のうちのいずれか２つの間の任意の範囲のＳＢ４３１５４２、ＬＤＮ１９３１８９、ＰＤ１７３０７４の存在により外胚葉へと分化するように誘導した。ＬＤＮ−１９３１８９は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型受容体ＡＬＫ２およびＡＬＫ３の高度に強力な低分子阻害剤である。ＬＤＮ１９３１８９は、選択的転写活性骨形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型受容体阻害剤である。これは、アクチビン受容体様キナーゼ２（ＡＬＫ２）およびＡＬＫ３を阻害する。ＳＢ４３１５４２は、ＴＧＦ−β／アクチビン／ＮＯＤＡＬ経路の選択的および強力な阻害剤であり、ＡＬＫ５の強力および選択的阻害剤である。ＰＤ１７３０７４は、強力なＦＧＦＲ１阻害剤であり、ＶＥＧＦＲ２をも阻害する。他の実施形態では、このような経路の他の阻害剤をまた使用し得る。
【０１０７】
一実験では、次いで、細胞にＮｇｎ２、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｂｒｎ２、ＦｏｘＯ（サブクラスのうちの１つまたは複数のメンバー）のｍＲＮＡを個別にまたは組み合わせて、６ウェルプレートを使用して１ウェルあたり２０ｎｇの用量で、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）または他のトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクションした。ｍＲＮＡ用量は、他のタイプの培養プレートを使用する場合は、培養容器の面積または培養培地量の容量に基づいて、比例的に調整することができる。このトランスフェクションは、場合により約１０倍高いｍＲＮＡ用量で、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔまたは他の市販のトランスフェクション試薬を使用して３、４、５または６回反復した。本明細書に開示する実施例における反復トランスフェクションは、最初のトランスフェクションから約２４時間プラスマイナス２〜３時間後、または最初のトランスフェクションから一晩、または最初のトランスフェクションの後、約（６〜２４時間、７〜２４時間、８〜２４時間、９〜２４時間、１０〜２４時間、１１〜２４時間、１２〜２４時間、１３〜２４時間、１４〜２４時間、１５〜２４時間、１６〜２４時間、１７〜２４時間、１８〜２４時間、１９〜２４時間、２０〜２４時間、２１〜２４時間、２２〜２４時間）もしくは２つの列挙した時点の間のすべての範囲で実施し得る。この段階の細胞は、間葉細胞よりも神経前駆細胞に近い形態を示したが、ＴＦの発現により生成された、このようなＮＰＣは、主に化学物質に基づく他の方法により生成されたＮＰＣと比較して、オリゴデンドロサイト経路において、より高い細胞収量を得たようであった。この段階のＮＰＣは、抗体染色によりＰａｘ６陽性であり、神経前駆体系列におけるその属性（identity）を実証した（図１）。Ｎｇｎ２、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｂｒｎ２、ＦｏｘＯのｍＲＮＡ、ＤＮＡおよびタンパク質配列は、当技術分野、例えば、ＧｅｎＢａｎｋにおいて公知である。本明細書に記載の方法における使用のためのトランスフェクション用のｍＲＮＡを調製するための方法、例えば、米国特許出願第１３／８９３，１６６号および第１４／２９２，３１７号（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）は、当技術分野において公知である。
（実施例２）
神経前駆細胞からのオリゴデンドロサイト前駆細胞の生成
【０１０８】
神経前駆細胞、すなわちＮＰＣを市販の細胞培養容器に蒔いた。６ウェルプレートを図２に示す実験に使用したが、他のウェルサイズも適用可能である。プレートを、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＰＬＯ−ラミニンで予めコーティングし、次いで、約１×１０５〜１×１０６細胞を、ＫＳＲならびにアスコルビン酸、ＳＡＧ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、Ｔ３、インスリン、ＲＡ、Ｂ２７、ＣＡＭＰ、ビオチンを一般に使用する濃度で補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥＭまたはＭＥＭ３に蒔いた。当分野において一般的に公知の、化学物質に基づくプロトコールの使用により生成したＮＰＣをまた使用して、以下のステップにおいてＯＰＣを生成し、ＴＦ活性の導入により生成したＮＰＣによって、より多くのはるかに優れたＯＰＣが生成されることを観察した。
【０１０９】
一実験では、次いで、細胞にＯｌｉｇｏ２、ＮＫＸ２．２、ＳＯＸ１０およびＯｌｉｇｏ１のｍＲＮＡのうちの１つまたは種々の組合せを個別にまたは組み合わせて、１ウェルあたり／１細胞運命因子あたり約２０ｎｇの用量で、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を用いて培養培地中でトランスフェクションし、１ウェルあたり低くて約１０ｎｇ、高くて約２００ｎｇの用量で、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔまたは他の市販のトランスフェクション試薬を使用して約２４時間に２、３、４回またはそれよりも多く反復した。この段階の細胞は、ＮＰＣの典型的形態からＯＰＣの典型的形態に変化したようであり、Ａ２Ｂ５およびＯ４に対して陽性に染色された（図２）。
（実施例３）
ＯＰＣからのオリゴデンドロサイトの生成
【０１１０】
オリゴデンドロサイト前駆細胞を、マトリゲル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）および／またはＰＬＯ−ラミニンで予めコーティングされた６ウェルプレートまたは他のプレートで、ＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＭＥＭａまたはＤＭＥＭ  Ｂ２７中に培養した。類似の他の接着細胞培養培地も使用に適する。培地に、アスコルビン酸、Ｎ２、Ｂ２７、ビオチン、ＣＡＭＰ、Ｔ３、インスリン、およびＫＳＲを一般に使用する濃度で典型的に補充した。細胞を約１週間、場合により約２、約３またはさらには約４週間培養し、この間、成熟したように見えるオリゴデンドロサイトが出現してＯＰＣクラスターから遊走し、次いで、空間に拡散し、そこでは、これらは、数を増加させた樹状分枝様突起を形成した（図３）。
（実施例４）
さらなる培養においてオリゴデンドロサイトは新たなクラスターを形成する
【０１１１】
段階２のオリゴデンドロサイト様細胞の成長を約１週〜さらに約４週間、またはそれよりもなお長く継続させた場合、これらは、重なり合う突起を有する新たなクラスターを形成し、ｉｎ  ｖｉｖｏで鞘形成をいくらか模倣する（図４）。
（実施例５）
特異的細胞マーカーを示す、ヒトｉＰＳＣに由来するオリゴデンドロサイトの例示的な実施形態
【０１１２】
ヒト多能性幹細胞に由来するオリゴデンドロサイトが成熟オリゴデンドロサイトであることを実証するために、これらを分化培養プレートから化学的または物理的手段によって取り出して球状にし、固定して抗ＭＢＰ抗体で染色した。このように生成した、すべての細胞が、一般に公知の成熟オリゴデンドロサイトマーカーであるＭＢＰに対して陽性に染色されたようであった（図５）。
（実施例６）
動物モデルにおけるｉＰＳＣ由来オリゴデンドロサイトの機能
【０１１３】
本発明に従って生成した成熟オリゴデンドロサイトの機能をさらに試験するために、ｉＰＳＣ由来オリゴデンドロサイトの脊髄修復機能を、Ｍａｒｋ  Ｔｕｓｚｙｎｓｋｉのグループ等により記載されたモデルなどの脊髄傷害ラットモデルにおいて試験することができた。オリゴデンドロサイトは、細胞、細胞シート、細胞クラスターとして、孤立細胞型として、または他の細胞、例えば、ＯＰＣもしくはＮＰＣと組み合わせて送達することができた。本開示の方法によりｉＰＳＣから誘導したＯＰＣもまた、脊髄傷害または（or  or）他の中枢神経疾患および状態を処置する治療候補として試験する。別の実施形態では、オリゴデンドロサイト、ＯＰＣ、ＮＰＣまたはそれらの組合せは、ヒドロゲル上に提示することができ、一部の場合では、細胞栄養因子、例えば、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ等の存在下で提示することができた。
【０１１４】
サルおよびチンパンジーなどの非ヒト霊長類モデルはまた、中枢神経系のオリゴデンドロサイトのようなヒト細胞を、安全性および有効性に関して、免疫抑制因子とともに、または対応する非ヒト霊長類ｉＰＳＣ由来ＮＰＣ、ＯＰＣもしくはオリゴデンドロサイトとともに、本明細書に開示の方法と本質的に同一の方法を使用して試験するために使用することができた。
（実施例７）
脊髄傷害または他の中枢神経疾患および状態を有するヒト患者の処置におけるｉＰＳＣ由来オリゴデンドロサイト
【０１１５】
ヒトｉＰＳＣ由来オリゴデンドロサイト、ＯＰＣ、ＮＰＣ、ニューロンまたは上記の組合せを使用し、ｃＧＭＰ手順下、適合するように適応させた開示のプロトコールを使用した治験は、他の細胞治療に関する動物試験に従って実施される。製造した細胞は、脊髄、またはおそらくは脳のようなヒト中枢神経系の他の部分に送達することができる。
（実施例８）
重要な遺伝子の発現を駆動し、これにより細胞内転写によって生成したｍＲＮＡを使用して細胞運命を決定するためのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムの使用
【０１１６】
機能的タンパク質を、Ｃａｓ９融合により、ｇＲＮＡにより方向づけてゲノム内の目的の領域に局在させ得ることを示す例として、図６に示すように、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ非活性化バージョン（deactivated  version）であるｄＣａｓ９を、蛍光タンパク質であるｍＮｅｏｎＧｒｅｅｎ（Ａｌｌｅｌｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に結合させた。同一の戦略を機能ドメイン、タンパク質、ペプチド等に適用して、遺伝子発現（すなわち、運命決定される細胞となる細胞内のｍＲＮＡ生成）を駆動することができ、例としては、図６に示すＭｙｏＤ転写活性化ドメインであり、他の例としては、ＶＰ１６および他の多くのこのようなドメインであり得る。このような転写活性化融合Ｃａｓ９融合タンパク質を、重要なＴＦ、例えば、Ｎｇｎ２またはＰａｘ６またはＳｏｘ２またはＢｒｎ２またはＦｏｘＯまたはＯｌｉｇｏ２またはＮＫＸ２．２またはＳＯＸ１０をオンにする領域にｇＲＮＡによって配置すると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡのトランスフェクションの結果を達成することができる。同一の戦略は、染色体上の特定の領域（複数可）を後成的に、例えば、ＤＮＡ（シトシン−５）−メチルトランスフェラーゼ１またはＤＭＮＴ１を使用して修飾することにより遺伝子発現に影響し得る酵素的に活性なドメインまたはタンパク質に適用することができる。Ｃａｓ９に融合しているヌクレオチド変換酵素を使用して、特定のヌクレオチドを別のヌクレオチドに切り替え、これにより、コードされるタンパク質を変化させるか、またはタンパク質生成の早期終了を生じさせることができた。変更した遺伝子が上に列挙した遺伝子や他の遺伝子等の重要なＴＦである場合、本出願において開示する一般戦略に従って、このように細胞の遺伝子発現プロファイルを変更し、細胞運命を決定することができる。
【０１１７】
ヌクレアーゼ非活性化Ｃａｓ９、ならびにガイドＲＮＡを使用して転写活性化ドメインと標的とを融合させる方法は、当技術分野において公知である（Didovyk  et  al.,  Current  Opinion  in  Biotechnology  (2016),  40:177-184）（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）。細胞運命因子プロモーターを標的とするガイドＲＮＡ配列の調製は、Balboa  et  al.,  Stem  Cell  Reports  (2015)  5:448-459（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）にあるように調製することができる。
【図１】
2020526212.tif 000007
【図２】
2020526212.tif 000008
【図３】
2020526212.tif 000009
【図４】
2020526212.tif 000010
【図５】
2020526212.tif 000011
【図６】
2020526212.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月13日(2020.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および／または胚性幹細胞（ＥＳＣ）の神経前駆細胞（ＮＰＣ）への分化を誘導するための方法であって、
ａ）ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、培地を含むコーティングされた非組織処理培養容器に蒔くステップと、
ｂ）１つまたは複数の細胞運命因子をコードするｍＲＮＡを個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡとしてステップａ）の前記細胞にトランスフェクションするステップと、ｃ）ステップｂ）の前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、前記細胞がＮＰＣに分化するまで培養するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｎｇｎ２、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｂｒｎ２およびＦｏｘＯファミリー因子のうちの１つまたは複数からなる群から、個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡトランスフェクションとして選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｎｇｎ２である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｐａｘ６である、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｓｏｘ２である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｂｒｎ２である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、ＦｏｘＯファミリー因子である、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
ステップｂ）の前記細胞運命因子のうちの１つまたは複数が、トランス活性化ドメインと融合している、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
ステップｃ）の前記細胞を、前記細胞がステップｂ）の前記細胞運命因子のうちの１つまたは複数を発現するまで培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
ＳＢ４３５４２、ＬＤＮ１９３１８９およびＰＤ１７３０７４のうちの１つまたは複数を、ステップｃ）の前記細胞に加えるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
ステップａ）〜ｃ）の培養条件が、約２％〜約６％の酸素濃度におけるものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ステップａ）〜ｃ）において使用する前記培地が、最小必須培地アルファ（ＭＥＭａ）またはダルベッコ改変イーグル培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）またはＢ２７サプリメントを有するＤＭＥＭからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
使用する前記培地がまた、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記培地がさらに、ｂＦＧＦ、Ｎ２もしくはＢ２７、ＢＳＡもしくはＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）のうちの１つまたは複数を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記培養容器が、マトリゲルおよび／またはＰＬＯ−ラミニンでコーティングされている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ステップａ）の前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ステップｃ）の前記細胞を、約３〜約１０日間培養する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｂ）の前記トランスフェクションを、少なくとも１回反復する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を神経前駆細胞から生成するための方法であって、
ａ）培地を含むコーティングされた細胞培養容器にＮＰＣを蒔くステップと、
ｂ）１つまたは複数の細胞運命因子をコードするｍＲＮＡを個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡとしてステップａ）の前記細胞にトランスフェクションして、神経前駆細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるステップと、
ｃ）ステップｂ）の前記細胞を、前記ＮＰＣの形態がＯＰＣの形態に変化するまで培養するステップと
を含む、方法。
【請求項２０】
ステップａ）の前記ＮＰＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ステップｂ）のトランスフェクションに使用する前記ｍＲＮＡが、Ｏｌｉｇｏ２、ＮＫＸ２．２、ＳＯＸ１０およびＯｌｉｇｏ１のｍＲＮＡからなる群のうちの１つまたは複数から個別にまたは組み合わせて選択される細胞運命因子をコードする、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ｍＲＮＡが、Ｏｌｉｇｏ２をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｍＲＮＡが、ＮＫＸ２．２をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記ｍＲＮＡが、Ｓｏｘ１０をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記ｍＲＮＡが、Ｏｌｉｇｏ１をコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
６ウェル培養プレートを使用し、ステップｂ）の前記トランスフェクションのための用量が１細胞運命因子あたり約２０ｎｇである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
最初のトランスフェクション後、トランスフェクションを、少なくともさらに２回反復する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
ステップａ）〜ｃ）の培養条件が、約２％〜約６％の酸素濃度におけるものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２９】
前記培養容器が、マトリゲルおよびＰＬＯ−ラミニンでコーティングされている、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
ステップａ）〜ｃ）に使用する前記培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭおよびＭＥＭａからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
ＫＳＲ、アスコルビン酸、ＳＡＧ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、Ｔ３、インスリン、ＲＡ、Ｂ２７、ＣＡＭＰおよびビオチンのうちの１つまたは複数を前記培地に補充する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ａ）培地を含むコーティングされた細胞培養容器にＯＰＣを蒔くステップと、
ｂ）細胞が、樹状分枝様突起を伴って出現するか、またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を生成するまで、ステップａ）の前記細胞を培養するステップと
を含む、オリゴデンドロサイトをＯＰＣから生成するための方法。
【請求項３３】
ステップａ）〜ｂ）に使用する前記培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭおよびＭＥＭａからなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＫＳＲ、アスコルビン酸、Ｎ２、Ｂ２７、ビオチン、ＣＡＭ、Ｔ３およびインスリンからなる群から選択される培地サプリメントのうちの１つまたは複数を前記培地に補充する、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ステップａ）の前記ＯＰＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
ステップｂ）の前記細胞を約７〜約３０日間培養する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
ステップａ）における前記細胞培養容器が、マトリゲルおよび／またはＰＬＯ−ラミニンでコーティングされている、請求項３２に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１、１９または３２に記載の方法において得られる細胞。
【請求項３９】
請求項３８に記載の細胞を含む、疾患、障害または形成異常を処置するための組成物。
【請求項４０】
請求項３８に記載の細胞を含む、疾患、障害、および／または形成異常を処置するための組成物。
【請求項４１】
幹細胞のＮＰＣ、ＯＰＣ、オリゴデンドロサイトへの分化を逐次的または直接的に誘導するための方法であって、請求項１に記載のステップ、その後、請求項１９に記載のステップ、その後、請求項３２に記載のステップを実施することを含む、方法。
【請求項４２】
幹細胞のＮＰＣ、ＯＰＣ、オリゴデンドロサイトへの分化を逐次的または直接的に誘導するための方法であって、
ａ）ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、コーティングされた培養容器に蒔くステップであって、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）をいずれも有する最小培地アルファ（ＭＥＭａ）またはダルベッコ改変イーグル培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）またはＢ２７サプリメントを有するＤＭＥＭを含む培地中に、前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種するステップと、
ｂ）Ｎｇｎ２、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｂｒｎ２およびＦｏｘＯファミリー因子のうちの１つまたは複数からなる群から選択される細胞運命因子をコードするｍＲＮＡを、個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡトランスフェクションとしてステップａ）の前記細胞にトランスフェクションするステップと、
ｃ）ステップｂ）の前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、前記細胞がＮＰＣに分化するまで培養するステップと、
ｄ）前記ＮＰＣをステップｃ）から単離するステップと、
ｅ）コーティングされた細胞培養容器にＮＰＣを蒔くステップであって、ＫＳＲ、ならびにアスコルビン酸、ＳＡＧ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、Ｔ３、インスリン、ＲＡ、Ｂ２７、ＣＡＭＰおよびビオチンからなる群から選択される培地サプリメントのうちの１つまたは複数をいずれも有するＭＥＭａまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥＭを含む培地中に、前記ＮＰＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種するステップと、
ｆ）Ｏｌｉｇｏ２、ＮＫＸ２．２、ＳＯＸ１０およびＯｌｉｇｏ１のｍＲＮＡからなる群のうちの１つまたは複数を個別にまたは組み合わせて、トランスフェクション試薬を使用して、ステップｅ）の前記細胞にトランスフェクションするステップと、
ｇ）ステップｆ）の前記トランスフェクションを少なくともさらに２回反復するステップと、
ｈ）ステップｇ）の前記細胞を、前記細胞の形態がＮＰＣ細胞からＯＰＣ細胞の形態に変化するまで培養するステップと、
ｉ）前記ＯＰＣをステップｈ）から単離するステップと、
ｊ）ステップｈ）から単離したＯＰＣをコーティングされた細胞培養容器に蒔くステップであって、ＫＳＲ、ならびにアスコルビン酸、Ｎ２、Ｂ２７、ビオチン、Ｃａｍ、Ｔ３およびインスリンからなる群から選択される培地サプリメントのうちの１つまたは複数をいずれも有するＭＥＭａまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥＭを含む培地中に、前記ＯＰＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種するステップと、
ｋ）オリゴデンドロサイト細胞が、樹状分枝様突起を伴って出現する、および／またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を生成するまで、少なくとも約１週間、前記細胞を培養するステップと
を含む、方法。
【請求項４３】
前記ＮＰＣが、レシピエント対象に由来するものである、請求項１、１９、４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
開始細胞が体液または体組織から採取されたものである、請求項１、１９、４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
開始細胞がレシピエントから採取されたものである、請求項１、１９、４１または４２に記載の方法。
【請求項４６】
次のステップｄ）：
ｄ）ステップｃ）の前記ＮＰＣまたは前記ＯＰＣを、コーティングされていない超低接着プレートに移すことにより増やすステップ
をさらに含む、請求項１または１９に記載の方法。
【請求項４７】
６ウェル培養プレートを使用し、前記トランスフェクションの用量が、約１０ｎｇ／細胞運命因子〜約２００ｎｇ／細胞運命因子のｍＲＮＡの用量である、請求項２７に記載の方法。
【請求項４８】
ステップｃ）の前記細胞を、約４〜約２０日間培養する、請求項１９に記載の方法。
【請求項４９】
請求項１に記載のＮＰＣを含む、細胞または組織をｉｎ  ｖｉｖｏで再生させるための組成物であって、前記ＮＰＣが、移植または投与後にｉｎ  ｖｉｖｏ環境において変化し、これにより前記細胞または組織を再生させる、組成物。
【請求項５０】
請求項１に記載のＮＰＣを含む医薬組成物。
【請求項５１】
請求項５０に記載の医薬組成物および使用のための指示を含むキット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１７】
ヌクレアーゼ非活性化Ｃａｓ９、ならびにガイドＲＮＡを使用して転写活性化ドメインと標的とを融合させる方法は、当技術分野において公知である（Didovyk  et  al.,  Current  Opinion  in  Biotechnology  (2016),  40:177-184）（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）。細胞運命因子プロモーターを標的とするガイドＲＮＡ配列の調製は、Balboa  et  al.,  Stem  Cell  Reports  (2015)  5:448-459（その内容は参照により本明細書に組み込まれる）にあるように調製することができる。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および／または胚性幹細胞（ＥＳＣ）の神経前駆細胞（ＮＰＣ）への分化を誘導するための方法であって、
ａ）ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、培地を含むコーティングされた非組織処理培養容器に蒔くステップと、
ｂ）１つまたは複数の細胞運命因子をコードするｍＲＮＡを個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡとしてステップａ）の前記細胞にトランスフェクションするステップと、ｃ）ステップｂ）の前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、前記細胞がＮＰＣに分化するまで培養するステップと
を含む、方法。
（項目２）
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｎｇｎ２、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｂｒｎ２およびＦｏｘＯファミリー因子のうちの１つまたは複数からなる群から、個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡトランスフェクションとして選択される、項目１に記載の方法。
（項目３）
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｎｇｎ２である、項目２に記載の方法。
（項目４）
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｐａｘ６である、項目２に記載の方法。
（項目５）
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｓｏｘ２である、項目２に記載の方法。
（項目６）
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、Ｂｒｎ２である、項目２に記載の方法。
（項目７）
ステップｂ）の前記細胞運命因子が、ＦｏｘＯファミリー因子である、項目２に記載の方法。
（項目８）
ステップｂ）の前記細胞運命因子のうちの１つまたは複数が、トランス活性化ドメインと融合している、項目２に記載の方法。
（項目９）
ステップｃ）の前記細胞を、前記細胞がステップｂ）の前記細胞運命因子のうちの１つまたは複数を発現するまで培養する、項目１に記載の方法。
（項目１０）
ＳＢ４３５４２、ＬＤＮ１９３１８９およびＰＤ１７３０７４のうちの１つまたは複数を、ステップｃ）の前記細胞に加えるステップをさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目１１）
ステップａ）〜ｃ）の培養条件が、約２％〜約６％の酸素濃度におけるものである、項目１に記載の方法。
（項目１２）
ステップａ）〜ｃ）において使用する前記培地が、最小必須培地アルファ（ＭＥＭａ）またはダルベッコ改変イーグル培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）またはＢ２７サプリメントを有するＤＭＥＭからなる群から選択される、項目１に記載の方法。
（項目１３）
使用する前記培地がまた、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）を含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
前記培地がさらに、ｂＦＧＦ、Ｎ２もしくはＢ２７、ＢＳＡもしくはＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）のうちの１つまたは複数を含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
前記培養容器が、マトリゲルおよび／またはＰＬＯ−ラミニンでコーティングされている、項目１に記載の方法。
（項目１６）
ステップａ）の前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種する、項目１に記載の方法。
（項目１７）
ステップｃ）の前記細胞を、約３〜約１０日間培養する、項目１に記載の方法。
（項目１８）
ステップｂ）の前記トランスフェクションを、少なくとも１回反復する、項目１に記載の方法。
（項目１９）
オリゴデンドロサイト前駆細胞（ＯＰＣ）を神経前駆細胞から生成するための方法であって、
ａ）培地を含むコーティングされた細胞培養容器にＮＰＣを蒔くステップと、
ｂ）１つまたは複数の細胞運命因子をコードするｍＲＮＡを個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡとしてステップａ）の前記細胞にトランスフェクションして、神経前駆細胞をオリゴデンドロサイト前駆細胞に分化させるステップと、
ｃ）ステップｂ）の前記細胞を、前記ＮＰＣの形態がＯＰＣの形態に変化するまで培養するステップと
を含む、方法。
（項目２０）
ステップａ）の前記ＮＰＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
ステップｂ）のトランスフェクションに使用する前記ｍＲＮＡが、Ｏｌｉｇｏ２、ＮＫＸ２．２、ＳＯＸ１０およびＯｌｉｇｏ１のｍＲＮＡからなる群のうちの１つまたは複数から個別にまたは組み合わせて選択される細胞運命因子をコードする、項目１９に記載の方法。
（項目２２）
前記ｍＲＮＡが、Ｏｌｉｇｏ２をコードする、項目２１に記載の方法。
（項目２３）
前記ｍＲＮＡが、ＮＫＸ２．２をコードする、項目２１に記載の方法。
（項目２４）
前記ｍＲＮＡが、Ｓｏｘ１０をコードする、項目２１に記載の方法。
（項目２５）
前記ｍＲＮＡが、Ｏｌｉｇｏ１をコードする、項目２１に記載の方法。
（項目２６）
６ウェル培養プレートを使用し、ステップｂ）の前記トランスフェクションのための用量が１細胞運命因子あたり約２０ｎｇである、項目１９に記載の方法。
（項目２７）
最初のトランスフェクション後、トランスフェクションを、少なくともさらに２回反復する、項目１９に記載の方法。
（項目２８）
ステップａ）〜ｃ）の培養条件が、約２％〜約６％の酸素濃度におけるものである、項目１９に記載の方法。
（項目２９）
前記培養容器が、マトリゲルおよびＰＬＯ−ラミニンでコーティングされている、項目１９に記載の方法。
（項目３０）
ステップａ）〜ｃ）に使用する前記培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭおよびＭＥＭａからなる群から選択される、項目１９に記載の方法。
（項目３１）
ＫＳＲ、アスコルビン酸、ＳＡＧ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、Ｔ３、インスリン、ＲＡ、Ｂ２７、ＣＡＭＰおよびビオチンのうちの１つまたは複数を前記培地に補充する、項目３０に記載の方法。
（項目３２）
ａ）培地を含むコーティングされた細胞培養容器にＯＰＣを蒔くステップと、
ｂ）細胞が、樹状分枝様突起を伴って出現するか、またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を生成するまで、ステップａ）の前記細胞を培養するステップと
を含む、オリゴデンドロサイトをＯＰＣから生成するための方法。
（項目３３）
ステップａ）〜ｂ）に使用する前記培地が、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭおよびＭＥＭａからなる群から選択される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
ＫＳＲ、アスコルビン酸、Ｎ２、Ｂ２７、ビオチン、ＣＡＭ、Ｔ３およびインスリンからなる群から選択される培地サプリメントのうちの１つまたは複数を前記培地に補充する、項目３３に記載の方法。
（項目３５）
ステップａ）の前記ＯＰＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種する、項目３２に記載の方法。
（項目３６）
ステップｂ）の前記細胞を約７〜約３０日間培養する、項目３２に記載の方法。
（項目３７）
ステップａ）における前記細胞培養容器が、マトリゲルおよび／またはＰＬＯ−ラミニンでコーティングされている、項目３２に記載の方法。
（項目３８）
項目１、１９または３２に記載の方法において得られる細胞。
（項目３９）
項目３８に記載の細胞を含む、疾患、障害または形成異常を処置するための組成物。
（項目４０）
項目３８に記載の細胞および／または前記組成物を、疾患、障害、および／または形成異常を処置することを必要とする対象に投与するステップを含む、疾患、障害、および／または形成異常を処置する方法。
（項目４１）
幹細胞のＮＰＣ、ＯＰＣ、オリゴデンドロサイトへの分化を逐次的または直接的に誘導するための方法であって、項目１に記載のステップ、その後、項目１９に記載のステップ、その後、項目３２に記載のステップを実施することを含む、方法。
（項目４２）
幹細胞のＮＰＣ、ＯＰＣ、オリゴデンドロサイトへの分化を逐次的または直接的に誘導するための方法であって、
ａ）ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、コーティングされた培養容器に蒔くステップであって、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）をいずれも有する最小培地アルファ（ＭＥＭａ）またはダルベッコ改変イーグル培地：Ｎｕｔｒｉｅｎｔ  Ｍｉｘｔｕｒｅ  Ｆ−１２（ＤＭＥＭ／Ｆ１２）またはＢ２７サプリメントを有するＤＭＥＭを含む培地中に、前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種するステップと、
ｂ）Ｎｇｎ２、Ｐａｘ６、Ｓｏｘ２、Ｂｒｎ２およびＦｏｘＯファミリー因子のうちの１つまたは複数からなる群から選択される細胞運命因子をコードするｍＲＮＡを、個別のｍＲＮＡまたは組み合わせたｍＲＮＡトランスフェクションとしてステップａ）の前記細胞にトランスフェクションするステップと、
ｃ）ステップｂ）の前記ｉＰＳＣおよび／またはＥＳＣを、前記細胞がＮＰＣに分化するまで培養するステップと、
ｄ）前記ＮＰＣをステップｃ）から単離するステップと、
ｅ）コーティングされた細胞培養容器にＮＰＣを蒔くステップであって、ＫＳＲ、ならびにアスコルビン酸、ＳＡＧ、ＰＤＧＦ、ＨＧＦ、ＩＧＦ１、Ｔ３、インスリン、ＲＡ、Ｂ２７、ＣＡＭＰおよびビオチンからなる群から選択される培地サプリメントのうちの１つまたは複数をいずれも有するＭＥＭａまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥＭを含む培地中に、前記ＮＰＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種するステップと、
ｆ）Ｏｌｉｇｏ２、ＮＫＸ２．２、ＳＯＸ１０およびＯｌｉｇｏ１のｍＲＮＡからなる群のうちの１つまたは複数を個別にまたは組み合わせて、トランスフェクション試薬を使用して、ステップｅ）の前記細胞にトランスフェクションするステップと、
ｇ）ステップｆ）の前記トランスフェクションを少なくともさらに２回反復するステップと、
ｈ）ステップｇ）の前記細胞を、前記細胞の形態がＮＰＣ細胞からＯＰＣ細胞の形態に変化するまで培養するステップと、
ｉ）前記ＯＰＣをステップｈ）から単離するステップと、
ｊ）ステップｈ）から単離したＯＰＣをコーティングされた細胞培養容器に蒔くステップであって、ＫＳＲ、ならびにアスコルビン酸、Ｎ２、Ｂ２７、ビオチン、Ｃａｍ、Ｔ３およびインスリンからなる群から選択される培地サプリメントのうちの１つまたは複数をいずれも有するＭＥＭａまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥＭを含む培地中に、前記ＯＰＣを、１培養フラスコまたは１培養ウェルプレートあたり約７０，０００細胞〜約１４，０００，０００細胞を使用して播種するステップと、
ｋ）オリゴデンドロサイト細胞が、樹状分枝様突起を伴って出現する、および／またはミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）を生成するまで、少なくとも約１週間、前記細胞を培養するステップと
を含む、方法。
（項目４３）
前記ＮＰＣが、レシピエント対象に由来するものである、項目１、１９、４１または４２に記載の方法。
（項目４４）
開始細胞が体液または体組織から採取されたものである、項目１、１９、４１または４２に記載の方法。
（項目４５）
開始細胞がレシピエントから採取されたものである、項目１、１９、４１または４２に記載の方法。
（項目４６）
次のステップｄ）：
ｄ）ステップｃ）の前記ＮＰＣまたは前記ＯＰＣを、コーティングされていない超低接着プレートに移すことにより増やすステップ
をさらに含む、項目１または１９に記載の方法。
（項目４７）
６ウェル培養プレートを使用し、前記トランスフェクションの用量が、約１０ｎｇ／細胞運命因子〜約２００ｎｇ／細胞運命因子のｍＲＮＡの用量である、項目２７に記載の方法。
（項目４８）
ステップｃ）の前記細胞を、約４〜約２０日間培養する、項目１９に記載の方法。
（項目４９）
有効量の項目１に記載のＮＰＣを、細胞または組織をｉｎ  ｖｉｖｏで再生させることを必要とする対象に投与するステップであって、前記ＮＰＣが、ｉｎ  ｖｉｖｏ環境において移植または投与後に形質転換し、これにより前記細胞または組織を再生させる、ステップを含む、細胞または組織をｉｎ  ｖｉｖｏで再生させるための方法。
（項目５０）
項目１に記載のＮＰＣを含む医薬組成物。
（項目５１）
項目５０に記載の医薬組成物および使用のための指示を含むキット。
【国際調査報告】
2020526212.tif 000013
2020526212.tif 000014