(57)【要約】  幾つかの実施形態は、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を用いて、骨格筋ミオパチー、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を治療する方法であって、治療有効量のＣＤＣを標的とする異栄養性骨格筋に送達する方法を提供する。幾つかの実施形態は、標的とする異栄養性骨格筋を治療するため、単回用量又は頻回用量で、骨格筋での直接的な筋肉内注射、又は全身投与、例えば静脈内注射を介する治療有効量のＣＤＣの送達を可能とする。幾つかの実施形態は、ＤＭＤ患者において運動能力を改善する方法を提供する。非コーディングＲＮＡのエキソソーム媒介移行に関する更なる実施形態は、心筋及び骨格筋においてジストロフィンを回復することにより、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを改善する。ＣＤＣ由来エキソソームでみられる非コーディングＲＮＡ種の送達は、ＣＤＣ及びＣＤＣ由来エキソソームの能力を模倣し、ジストロフィンタンパク質レベルを増加させる。【選択図】図４Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、前記対象に治療有効量の心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を投与することを含む、筋ジストロフィーを治療する方法。
【請求項２】
前記治療有効量のＣＤＣが、前記対象の異栄養性骨格筋を治療するのに十分である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記骨格の筋ジストロフィーが骨格筋のジストロフィン異常症を伴うデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記骨格筋ジストロフィーが骨格筋のジストロフィン異常症を伴うベッカー型筋ジストロフィーである、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記異栄養性骨格筋が、横隔膜、腕又は脚の骨格筋である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記治療有効量のＣＤＣが異栄養性骨格筋における筋肉注射を介して前記対象に投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記治療有効量のＣＤＣが、前記対象に全身投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記治療有効量のＣＤＣの全身投与が静脈注射を介する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療有効量のＣＤＣの全身投与が右心室への注射を介する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記治療有効量のＣＤＣの全身投与が左心室への注射を介する、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記治療有効量のＣＤＣの投与が２回以上の投与を介する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記ＣＤＣの２回以上の投与が、標的とされる骨格筋に治療有効量のＣＤＣを送達するため、約３カ月の間隔で与えられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＤＣの２回以上の投与が、標的とされる骨格筋に治療有効量のＣＤＣを送達するため、０週、６週、及び１２週に与えられる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療有効量のＣＤＣの投与が単回の投与を介する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
心筋症の治療を必要とする対象において心筋症を治療する方法であって、治療有効量の心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を前記対象に全身投与することを含む、心筋症を治療する方法。
【請求項１６】
前記心筋症が異栄養性心筋症であり、前記治療有効量のＣＤＣが前記対象の異栄養性心臓を治療するのに十分である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記異栄養性心筋症が慢性筋ジストロフィーに続発する心不全である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記慢性筋ジストロフィーがデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記慢性筋ジストロフィーが、ベッカー型筋ジストロフィーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療有効量のＣＤＣの全身投与が静脈内の注射又は注入を介する、請求項１５〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記治療有効量のＣＤＣの全身投与が単回投与を介する、請求項１５〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記治療有効量のＣＤＣの全身投与が２回以上の投与を介する、請求項１５〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＤＣの２回以上の投与が、前記心臓の標的組織に治療有効量のＣＤＣを送達するため、約３か月の間隔で与えられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＤＣの２回以上の投与が、標的とされる骨格筋に治療有効量のＣＤＣを送達するため、０週、６週、及び１２週に与えられる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記治療有効量のＣＤＣが約７５×１０６個、又は少なくとも約７５×１０６個のＣＤＣである、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記治療有効量のＣＤＣが約１５０×１０６個、又は少なくとも約１５０×１０６個のＣＤＣである、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記治療有効量のＣＤＣが約３００×１０６個、又は少なくとも約３００×１０６個のＣＤＣである、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記治療有効量のＣＤＣが約３５０×１０６個、又は少なくとも約３５０×１０６個のＣＤＣである、請求項１〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記治療有効量のＣＤＣが約４００×１０６個、又は少なくとも約４００×１０６個のＣＤＣである、請求項１〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記治療有効量のＣＤＣが約４５０×１０６個、又は少なくとも約４５０×１０６個のＣＤＣである、請求項１〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
前記治療有効量のＣＤＣが約５００×１０６個、又は少なくとも約５００×１０６個のＣＤＣである、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記治療有効量のＣＤＣが約５５０×１０６個、又は少なくとも約５５０×１０６個のＣＤＣである、請求項１〜３１のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
前記治療有効量のＣＤＣが約６００×１０６個、又は少なくとも約６００×１０６個のＣＤＣである、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記ＣＤＣが同種ヒトＣＤＣであり、前記対象がヒト対象である、請求項１〜３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
ジストロフィン異常症を治療する方法であって、
ジストロフィン異常症に罹患した小児対象に治療有効量のエキソソームを投与することにより、前記対象を治療することを含む、ジストロフィン異常症を治療する方法。
【請求項３６】
前記複数のエキソソームが、無血清培地で成長させた心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から単離される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ジストロフィン異常症がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記ジストロフィン異常症がベッカー型筋ジストロフィーである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
組成物の投与が、単回用量に約１ｍｇ〜約１００ｍｇのエキソソームタンパク質を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
前記対象への各単回用量の頻回投与を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
組成物の投与が注射を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４２】
注射が骨格筋注射を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
注射が腹腔内注射を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
組成物の投与が動脈内又は静脈内の注入を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象の治療がジストロフィン発現の増加をもたらす、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
ジストロフィンの増加が四肢の骨格筋において起こる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ジストロフィン発現の増加が横隔膜において起こる、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記小児対象が心筋症に罹患している、請求項３５に記載の方法。
【請求項４９】
前記小児対象が心筋症と診断される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
小児対象が、心不全ではなく心筋症に罹患している、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記小児対象が３歳〜１１歳である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５２】
前記小児対象が１２歳〜１８歳である、請求項３５に記載の方法。
【請求項５３】
ジストロフィン異常症を治療する方法であって、
ジストロフィン異常症に罹患した小児対象に治療有効量の心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を投与することにより、前記対象を治療することを含む、ジストロフィン異常症を治療する方法。
【請求項５４】
前記ジストロフィン異常症がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ジストロフィン異常症がベッカー型筋ジストロフィーである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
組成物の投与が注射を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５７】
前記注射が骨格筋注射を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記注射が腹腔内注射を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
組成物の投与が動脈内又は静脈内の注入を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項６０】
前記対象の治療がジストロフィン発現の増加をもたらす、請求項５３に記載の方法。
【請求項６１】
ジストロフィン発現の増加が四肢の骨格筋において起こる、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ジストロフィン発現の増加が横隔膜において起こる、請求項２６に記載の方法。
【請求項６３】
前記対象が心筋症に罹患している、請求項５３に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象が心筋症と診断される、請求項５３に記載の方法。
【請求項６５】
前記対象が心不全ではなく心筋症に罹患している、請求項５３に記載の方法。
【請求項６６】
前記小児対象が３歳〜１１歳である、請求項５３に記載の方法。  
【請求項６７】
前記小児対象が１２歳〜１８歳である、請求項５３に記載の方法。
【請求項６８】
異栄養性骨格筋を治療する方法であって、
心筋球由来細胞（ＣＤＣ）及び／又はＣＤＣ由来エキソソーム（ＣＤＣ−ＸＯ）をジストロフィン異常症に罹患した対象に投与することにより、前記異栄養性骨格筋を治療することを含み、
ここで、前記ＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯは心臓ではない部位において対象に投与され、
前記異栄養性骨格筋は標的とされる異栄養性骨格筋であり、前記標的とされる異栄養性骨格筋は治療有効量のＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯを投与される、異栄養性骨格筋を治療する方法。
【請求項６９】
前記複数のＣＤＣ−ＸＯが無血清培地で成長させたＣＤＣから単離される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ジストロフィン異常症がデュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７１】
前記ジストロフィン異常症がベッカー型筋ジストロフィーである、請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記ＣＤＣ−ＸＯが、単回用量で約１ｍｇ〜約１００ｍｇのエキソソーム材料を含む組成物として投与される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７３】
前記対象への各単回用量の頻回投与を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯの投与が注射又は注入によって提供される、請求項６８に記載の方法。
【請求項７５】
前記注射又は注入が骨格筋に対するものである、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記注射又は注入が腹腔内である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記注射又は注入が動脈内又は静脈内の注入である、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記対象の治療がジストロフィン発現の増加をもたらす、請求項６８に記載の方法。
【請求項７９】
ジストロフィン発現の増加が四肢の骨格筋において起こる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
ジストロフィン発現の増加が横隔膜において起こる、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記対象が小児対象である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８２】
前記小児対象が心筋症に罹患している、又は心筋症と診断される、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記小児対象が心不全に罹患していない、請求項６８に記載の方法。
【請求項８４】
前記対象の年齢が３歳〜１１歳又は１２歳〜１８歳である、請求項６８に記載の方法。
【請求項８５】
組成物であって、
ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ由来細胞外小胞（ＣＤＣ−ＥＶ）に由来する単離されたＲＮＡポリヌクレオチド、又は前記ＲＮＡポリヌクレオチドをコードするベクターを含み、
ここで、前記ＲＮＡポリヌクレオチドが短い非コードＲＮＡである、組成物。
【請求項８６】
前記ＲＮＡポリヌクレオチド配列が、ＤＭＤに由来する短い非コードＲＮＡ（ｓｒＤＭＤ）に対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のパーセンテージ同一性を含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８７】
前記短い非コードＲＮＡがｓｒＤＭＤを含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８８】
前記短い非コードＲＮＡがマイクロＲＮＡを含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項８９】
前記マイクロＲＮＡが５’末端又は３’末端にＧＣＧを含む、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９０】
前記ＲＮＡポリヌクレオチドが、ｍｉＲ−１４８ａに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のパーセンテージ同一性を含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項９１】
前記マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１４８ａを含む、請求項８８に記載の組成物。
【請求項９２】
前記ベクターがウイルスである、請求項８５に記載の組成物。
【請求項９３】
前記ウイルスがアデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスである、請求項９２に記載の組成物。
【請求項９４】
請求項８５に記載の組成物と、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物。
【請求項９５】
治療有効量のＲＮＡポリヌクレオチド又は前記ＲＮＡポリヌクレオチドをコードするベクターを含む、請求項８５に記載の組成物。
【請求項９６】
ジストロフィン異常症を治療する方法であって、
請求項８５〜９５のいずれか一項に記載の組成物を、ジストロフィン異常症に罹患した対象に投与することにより、前記対象を治療することを含む、ジストロフィン異常症を治療する方法。
【請求項９７】
前記ＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯの投与が注射又は注入によって提供される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記注射又は注入が骨格筋に対するものである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記注射又は注入が腹腔内である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記注射又は注入が動脈内又は静脈内の注入である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０１】
前記対象の治療がジストロフィン発現の増加をもたらす、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
ジストロフィン発現の増加が四肢の骨格筋において起こる、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０３】
ジストロフィン発現の増加が横隔膜において起こる、請求項９６〜１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記対象が小児対象である、請求項９６〜１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記小児対象が心筋症に罹患している、及び／又は心筋症と診断される、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０６】
前記小児対象が心不全ではなく心筋症に罹患している、請求項１０４に記載の組成物。
【請求項１０７】
前記対象の年齢が３歳〜１１歳又は１２歳〜１８歳である、請求項９６〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
治療有効量の前記ＲＮＡポリヌクレオチド又は前記ＲＮＡポリヌクレオチドをコードするベクターを含む、請求項９６〜１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
骨格筋ジストロフィーの治療を必要とする対象において骨格筋ジストロフィーを治療する方法であって、
治療有効量の心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を含む組成物の第１の用量を前記対象に投与すること、
（ここで、前記治療有効量の第１の用量が約１×１０７個〜約１×１０９個の範囲のＣＤＣである）；
前記第１の用量の投与後に第１の期間を待つこと
（ここで、前記第１の期間は約１カ月〜６カ月である）；
治療有効量の心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を含む組成物の第２の用量を前記対象に投与すること
（ここで、前記治療有効量の第２の用量は約１×１０７個〜約１×１０９個の範囲のＣＤＣである）；
前記第２の用量の投与後に第２の期間を待つこと
（ここで、前記第２の期間は約１カ月〜６カ月である）；
少なくとも１つの追加用量の治療有効量の心筋球由来細胞胞（ＣＤＣ）を含む組成物を前記対象に投与すること
（ここで、少なくとも１つの追加用量の治療有効量は約１×１０７個〜約１×１０９個の範囲のＣＤＣである）；
前記少なくとも１回の追加用量の投与後に少なくとも１回の追加期間を待つこと
（ここで、前記第２の期間は約１カ月〜６カ月である）；
を含み、
前記投与は、運動能力又は筋肉機能における改善をもたらし、
前記ＣＤＣは前記対象に関して同種であり、
前記投与は前記対象の著しい免疫応答を誘導せず、
前記投与は全身投与を含む、
骨格筋ジストロフィーを治療する方法。
【請求項１１０】
前記全身投与が静脈内注射を介する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記投与がＴ細胞の活性化又は増殖の１つ以上のマーカーの発現を変更する、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記Ｔ細胞の活性化又は増殖の１つ以上のマーカーがＣＤ６９及びＨＬＡ−ＤＲを含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１３】
前記骨格筋ジストロフィーが骨格筋のジストロフィン異常症を伴うデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１４】
前記骨格筋ジストロフィーは骨格筋のジストロフィン異常症を伴うベッカー型筋ジストロフィーである、請求項１０９又は請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１５】
前記異栄養性骨格筋が横隔膜、腕又は脚の骨格筋である、請求項１０９〜１１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１１６】
前記治療有効量のＣＤＣの全身投与が右心室への注射を介する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記治療有効量のＣＤＣの全身投与が左心室への注射を介する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１８】
各投与が前記対象に対してステロイドを投与することを更に含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１９】
１回のＣＤＣの投与においてのみ、前記対象に対してステロイドを投与することを更に含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１２０】
前記投与が、心機能における改善、又は心臓の線維化若しくは組織損傷の減少をもたらす、請求項１０９〜１１９のいずれかに記載の方法。
【請求項１２１】
前記投与間の時間が約６週間である請求項１０９〜１２０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２２】
筋ジストロフィーの治療を必要とする対象において筋ジストロフィーを治療する方法であって、
少なくとも２回の用量の治療有効量の心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を前記対象に投与することを含み、
ここで、前記少なくとも２回の用量が互いに約１カ月〜６カ月隔てられて投与され、
前記少なくとも２回の用量の治療有効量のＣＤＣを前記対象に投与することが、前記対象において著しい免疫応答を誘導しない、筋ジストロフィーを治療する方法。
【請求項１２３】
前記筋ジストロフィーが骨格筋のジストロフィン異常症を伴うデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記筋ジストロフィーが骨格筋のジストロフィン異常症を伴うベッカー型筋ジストロフィーを含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２５】
前記異栄養性骨格筋が横隔膜、腕又は脚の骨格筋を含む、請求項１２３又は１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
少なくとも２回の用量の治療有効量のＣＤＣを前記対象に投与することが前記対象の異栄養性骨格筋での筋肉内注射を含む、請求項１２２〜１３５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２７】
少なくとも２回の用量の治療有効量のＣＤＣを前記対象に投与することが全身投与を含む、請求項１２２〜１２５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２８】
前記全身投与が静脈内注射を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記全身投与が、前記対象の心臓の右心室への注射を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３０】
前記全身投与が、前記対象の心臓の左心室への注射を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
前記少なくとも２回の用量が互いに約６週間隔てられて投与される、請求項１２２〜１３０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３２】
前記筋ジストロフィーが心筋症を含む、請求項１２２〜１３０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３３】
前記心筋症が心不全を含む、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記治療有効量のＣＤＣが約１×１０７個〜約１×１０９個のＣＤＣを含む、請求項１２２〜１３３のいずれかに記載の方法。
【請求項１３５】
前記ＣＤＣが同種ヒトＣＤＣであり、対象がヒトである、請求項１２２〜１３４のいずれかに記載の方法。
【請求項１３６】
ＣＤＣ及び／又はＣＤＣエキソソームを含む組成物の使用であって、前記組成物が、骨格筋ジストロフィーを有する対象に対する全身投与に適しており、前記組成物の投与が前記骨格筋ジストロフィーを治療する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
【０００２】
本出願は、２０１７年４月１９日付で出願された米国仮出願番号第６２／４８７３９３号、２０１７年４月１９日付で出願された米国仮出願番号第６２／４８７４０２号、及び２０１７年４月１９日付で出願された米国仮出願番号第６２／４８７４０８号、及び２０１７年７月２１日付で出願された米国仮出願番号第６２／５３５６７２号に対する優先権を主張する。また、本出願は、２０１７年１０月６日に出願された米国仮出願番号第６２／５６９，４４０号、及び２０１８年１月８日に出願された米国仮出願番号第６２／６１４，７５３号に対する優先権も主張する。先の出願はいずれも、参照することによりそれらの全体が本明細書の一部をなす。
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
【０００３】
本発明は、国立衛生研究所から支給された助成金番号ＨＬ１２４０７４のもと政府支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
技術分野
【０００４】
幾つかの実施形態は、ジストロフィン異常症（筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、及びベッカー型筋ジストロフィー）、及びそれと関連する症状又は疾患状態（デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関連する骨格筋ミオパチーを含む）の治療のための心筋球由来細胞及びそれに由来する細胞外小胞（例えばエキソソーム等）と並んで、その単離された分子カーゴ（例えば、核酸、短い非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及び／又は変異体及びその合成類縁体）の使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
米国では、約２００００人の少年及び青年がデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に罹患している。主要な原因は、ジストロフィン複合体の遺伝子異常であり、骨格筋及び心臓組織の二次的損傷を伴う。ジストロフィンは、細胞内骨格と細胞外マトリクスの間に物理的連結を提供する大きな桿状の筋鞘タンパク質である。ジストロフィン欠損により、筋鞘は不安定となり、筋線維は反復する収縮により物理的損傷を受けやすい。この壊滅的なＸ連鎖筋減少症には特定の治療がない。誕生する男児３５００人に１人が罹患し、ＤＭＤは筋ジストロフィーの全症例の８０％を占める。異栄養性筋肉はミオパチー（筋線維における細胞膜の損害）を経て、非常に若い年齢で歩行の喪失に結び付き、後に呼吸筋力低下及び心不全を伴う。小児対象では、骨格筋衰弱は発症から３年〜５年で始まり、進行性衰弱が起こって、発症からおよそ１３年の時点で車椅子依存を伴う。重要なことに、心筋症は発症から１３年未満では患者の１／３で発症し、発症から１８年未満では１／２の患者まで増加し、１８年以降では全ての患者で発症することが観察されている。ＤＭＤに起因する及び／又はそれに続発する、特に後期での心不全（ＨＦ−ＤＭＤ）は、重大な排他的疾患を示し、症候性又は進行した心不全（ＨＦ）を上回る後期心不全に対しては細胞、組織、心臓又は機械的な移植は選択肢となり得ない。患者は、血管機能不全、更には胃腸及び尿路系の関与を含む平滑筋ミオパチーに更に罹患している場合がある。共通する予後は、呼吸機能不全又は心筋症による死亡である。
【０００６】
これらの臨床的特徴の根底にあるのはジストロフィン遺伝子突然変異（欠失）であり、ジストロフィンの喪失が細胞膜損傷及び細胞外Ｃａ２＋の細胞内への漏出をもたらす。細胞内カルシウムレベルの上昇は、最終的には、酸化及び／又はニトロソ化のストレス及び炎症の増加、並びにカルパインの活性化をもたらす。これらの効果の組み合わせは、筋肉のタンパク質分解及びアポトーシスをもたらし、上に記載される変性の特徴に結びつく。現在の治療は副腎皮質ステロイド及びその疾患の効果を緩和する心保護剤の使用に制限されているが、疾患それ自体を治療せず、その進行の遅延もしない。したがって、当該技術分野において、初期の介入が後期の併存症の出現を予防し得る小児患者を含めて、治療に対する大いなる要求が今も存在している。
【発明の概要】
【０００７】
ジストロフィン異常症及び／又はそれと関連する疾患状態に苦しむ患者に対して、治療有効量の心筋球細胞（ＣＤＣ：ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌ）、ＣＤＣに由来するエキソソームＣＤＣ（ＣＤＣ−ＸＯ）及び／又はそれらの組み合わせを投与することによる、ジストロフィン異常症及び／又はそれに関連する１つ若しくは複数の疾患状態を治療する方法が本明細書に記載される。幾つかの実施形態では、ジストロフィン異常症が、デュシェンヌ筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及び／又はベッカー型筋ジストロフィーの１つ以上である。幾つかの実施形態では、治療される疾患状態は、骨格ミオパチー（例えば、骨格筋のＤＭＤ又は骨格筋のベッカー型筋ジストロフィー）である。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯの投与は、ジストロフィン異常症を有する対象において、筋肉機能不全（骨格筋機能不全におけるものを含む）の発症を遅延させる、及び／又は筋肉機能及び完全性（骨格筋におけるものを含む）を維持する、改善する、及び／又は回復する。幾つかの実施形態では、治療される患者の異栄養性骨格筋としては、横隔膜、四肢の筋肉（例えば、腕及び／又は脚における）及び／又は体幹の筋肉の１つ以上が挙げられる。
【０００８】
簡潔に表現するため、幾つかの実施形態がＣＤＣ−ＸＯ及びＣＤＣに関して具体的に開示される。しかしながら、本明細書に開示される１つ以上の治療は、ＣＤＣに由来する細胞外小胞（本明細書ではＣＤＣ−ＥＶと称され、ＣＤＣ由来微小胞（ＣＤＣ−ＭＶ：ＣＤＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅ）を含み得る）、ＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ−ＥＶの単離された分子カーゴ、及びそれらの組み合わせによって達成されることが理解されるべきである。したがって、幾つかの実施形態では、本明細書に記載される治療方法は、ＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ、ＣＤＣ−ＸＯの単離及び／又は精製された分子カーゴ、ＣＤＣ−ＥＶの単離及び／又は精製された分子カーゴ、及び／又はそれらの組み合わせの１つ以上を使用して行われ得る。
【０００９】
幾つかの実施形態では、治療方法は、対象（例えば、ジストロフィン異常症又はそれに関連する病状に苦しむ患者）に治療有効量のＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶを投与することを含む。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶは、対象に対して自己由来又は同種である（例えば、自身の組織、別の対象の組織及び／又は別の動物種の組織に由来する）。幾つかの実施形態では、治療方法は、治療有効量のＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶ（ＣＤＣ由来微小胞（ＣＤＣ−ＭＶ）を含む）に由来する分子カーゴを対象に投与することを含む。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ−ＥＶの分子カーゴは単離及び／又は合成され、その分子カーゴ（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチド及び／又は短い非コードＲＮＡを含む、特定の分子及び／又は種々の分子の組み合わせ）を、それを必要とする対象（例えば、ジストロフィン異常症及び／又はその疾患状態を有する対象）に投与する。幾つかの実施形態では、治療方法は、治療有効量の単離されたＲＮＡポリヌクレオチド、又はＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶに見られるＲＮＡポリヌクレオチドをコードする（及び／又は含む）ベクターを対象に投与することを含む。
【００１０】
幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯは、対象の全身に送達される。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯは、対象の全身に又は局所に送達される。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯは、対象の局所ではなく全身に送達される。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯは、対象の全身と局所（ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ  ｌｏｃａｌｌｙ）に送達される。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯは、対象に全身ではなく局所に送達される。幾つかの実施形態では、治療有効量のＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯを投与する方法の非限定的な例としては、全身投与（例えば、静脈内、動脈内、心室内、大動脈内及び／又は腹腔内の注射及び／又は注入）が挙げられる。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯは静脈内で注射又は注入される。幾つかの実施形態では、治療有効量のＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯは筋肉の注射及び／又は注入によって患者に投与される。幾つかの実施形態では、治療有効量のＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯは、局所部位（例えば、異栄養性骨格筋及び／又は治療が望まれる標的部位へと若しくはその付近に）に直接注入によって患者に投与される。幾つかの実施形態では、有効量のＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯは、心臓内ではない身体の領域の注射及び／又は注入により全身に送達される。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯの静脈内投与としては、頸静脈及び／又は大腿静脈の注射及び／又は注入が挙げられる。
【００１１】
幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯのそれを必要とする対象への投与は、単回用量及び／又は頻回用量（例えば、２回、４回、６回、８回、１０回以上の用量）を含む。幾つかの実施形態では、頻回用量が使用される場合、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯの投与は、毎日、毎週、２週間毎、３週間毎、毎月、６カ月毎、又は毎年行われる。幾つかの実施形態では、投薬スケジュールは、例えば、２週間、１カ月、２カ月、３カ月、５カ月、６カ月、１年、５年、又は上述の値を含む及び／又はその期間に及ぶ範囲の期間に亘って行われる。実例として、幾つかの実施形態では、時間間隔は１カ月〜５カ月の間隔で２回用量〜１０回用量の投与を含む。幾つかの実施形態では、投薬スケジュールは、各投薬の間が約３カ月の３回の投薬である。幾つかの実施形態では、投薬スケジュールは、各投薬を約１週間あける５回の投薬である。幾つかの実施形態では、投薬スケジュールは、０週、６週及び９週の３回の投与（例えば、異なる時に３回の単回用量）である。幾つかの実施形態では、時間間隔スケジュールを使用し、投薬の期間、及び投薬の期間の間の休止の期間（例えば、１カ月間の毎週の投薬に続いて５カ月の休止期間、その後に続く１カ月間の毎週の投薬等）がある。幾つかの実施形態では、単回用量は、治療有効量のＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶを含む。幾つかの実施形態では、投薬期間及び／又は時間間隔スケジュールは、患者の一生を通じて行われる。幾つかの実施形態では、各単回用量の頻回投与が対象に提供される。様々な実施形態では、本明細書において他に開示されるように、投与は、２回、３回、４回、４回以上に順次適用される用量等の反復投与であってもよい。
【００１２】
幾つかの実施形態では、治療有効量ＣＤＣは、少なくとも約７５×１０６個〜５００×１０６個のＣＤＣを含む。幾つかの実施形態では、治療有効量のＣＤＣは、約：７５×１０６個以上のＣＤＣ、１５０×１０６個以上のＣＤＣ、３００×１０６個以上のＣＤＣ、４００×１０６個以上のＣＤＣ、５００×１０６個以上ＣＤＣ、又は上述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲を含む。幾つかの実施形態では、治療有効量のＣＤＣは、約：７５×１０６個以下のＣＤＣ、１５０×１０６個以下のＣＤＣ、３００×１０６個以下のＣＤＣ、４００×１０６個以下のＣＤＣ、５００×１０６個以下のＣＤＣ、又は上述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲を含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、各用量（単回又は頻回の用量が使用される場合）及び／又は一連の治療レジメンに亘って投与されるＣＤＣ−ＥＶ又はＣＤＣ−ＸＯの数は、以下に等しい又は少なくとも約：１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個、１×１０１１個、１×１０１２個、又は上述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲である。幾つかの実施形態では、各用量（単回又は頻回の用量が使用される場合）及び／又は一連の治療レジメンに亘って投与されるＣＤＣ−ＥＶ又はＣＤＣ−ＸＯの量は、１×１０６〜１×１０７、１×１０７〜１×１０８、１×１０８〜１×１０９、１×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜１×１０１１、１×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２以上の範囲である。
【００１４】
幾つかの実施形態では、或る容量（又は投薬レジメン）において対象に送達されるＣＤＣ−ＸＯ（又はＣＤＣ−ＥＶ）の数は、細胞療法の方法において臨床的に有効な量で使用され得るＣＤＣの数に基づいて決定される。例えば、幾つかの実施形態では、７５×１０６個〜５００×１０６個のＣＤＣが骨格ミオパチーの治療的処置に対する有効量である場合、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてそれらのＣＤＣによって放出され得る当量のＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ−ＭＶを使用することは、「無細胞」治療法で患者に適用され得る。言い換えれば、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＭＶのＣＤＣ当量を使用することができる。実例として、幾つかの実施形態では、３ｍＬ／３×１０８個のＣＤＣは治療上の利益を提供することができる。したがって、それらのＣＤＣが体内に留まる時間経過と共に、その数のＣＤＣに由来し得る複数のＣＤＣ−ＸＯが使用される。幾つかの実施形態では、患者に送達されるＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ−ＥＶの量は、以下に等しい又は少なくとも約：７５×１０６個のＣＤＣ、約１５０×１０６個のＣＤＣ、約３００×１０６個のＣＤＣ、約４００×１０６個のＣＤＣ、約５００×１０６個のＣＤＣ、又は上述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲の注射を介して放出され得るＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ−ＥＶの量である。幾つかの実施形態では、任意の単回用量で投与されるＣＤＣの数は、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個、１×１０１０個、１×１０１１個、１×１０１２個（又は上述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲）である。幾つかの実施形態では、患者に送達されるＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ−ＥＶの量は、以下に等しい又は少なくとも約：１×１０５個のＣＤＣ、約１×１０６個のＣＤＣ、約１×１０７個のＣＤＣ、約１×１０８個のＣＤＣ、約１×１０９個のＣＤＣ、約１×１０１０個のＣＤＣ、約１×１０１１個のＣＤＣ、約１×１０１２個のＣＤＣ、又は上述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲の注射を介して放出され得るＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ−ＥＶの量である。幾つかの実施形態では、ＣＤＣの用量は、約１０個〜９０００万個、約１０個〜約２０００万個、約２０個〜約３０００万個、約３０個〜約５０００万個、約５０個〜約６０００万個、約６０個〜約７０００万個、約７０個〜約７５００万個、約７５００万個〜約８０００万個、約８０００万個〜約９０００万個、並びに上述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲を含む範囲である。幾つかのかかる用量は、冠状動脈による送達に特に好都合である。幾つかの実施形態では、ＣＤＣの用量は、約３０００万個〜約４５００万個、約４０００万個〜約５０００万個、約５０００万個〜約５０００万個、約６０個〜約７５００万個、約７５個〜約１０億個、約９０００万個〜約１１億個、約１０億個〜１２億５０００万個、約１２億５０００万個〜約１５億個、並びに上述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲を含む、約３０００万個〜約１５億個の範囲である。特定の理論に拘束されないが、注入された場合、ＣＤＣは対象に一時的に留まると考えられる。実施形態に応じて、ＣＤＣの定着の程度は変化する。例えば、幾つかの実施形態では、定着率は、約０．０１％〜約０．０５％、約０．０５％〜約０���１％、約０．１％〜約０．５％、約０．５％〜約１．０％、約１．０％〜約２．５％、約２．５％〜約５％、約５％〜約１０％、並びに上述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲を含む約０．０１％〜１０％である。したがって、幾つかの実施形態では、患者に送達されるＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ−ＥＶの当量は、約１週間、約２週間、約３週間以上の体内にＣＤＣが滞在する所与の時間に亘って、開示される量のＣＤＣの投与（例えば、注射又は注入）により放出され得る、ＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ−ＥＶの量として計算される。特定の例では、投与量は、体重に対して割り当てられ得る（１０００００Ｍ〜１Ｍ  ＣＤＣ／体重ｋｇの範囲の総ＣＤＣ用量）。幾つかの実施形態では、心臓への注射に関して、投与されるＣＤＣの数としては、ＸＯ又はＥＶの投与量に対する別のベースラインとして、冠状動脈当たり２５００万個のＣＤＣ（すなわち、合計７５００万個のＣＤＣ）が挙げられる。
【００１５】
幾つかの実施形態では、患者に送達されるＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶの量（例えば用量）は、（例えば、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶを取り巻く溶液及び／又は環境を除去又は実質的に除去した場合）ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶの重量（ｍｇ単位）により測定され得る。例えば、幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶの用量は、以下に等しい又は少なくとも：約０．００１〜約０．００５、約０．００５〜約０．０１、約０．０１〜約０．０５、約０．０５〜約０．１、約０．１〜約０．５、約０．５〜約１、約１〜約１０、約１０〜約２５、約２５〜約５０、約５０〜約７５、約７５〜約１００のｍｇ単位のおよその重量、又は上述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲を含んでもよい。本明細書においてさらに詳細に検討されるように、これらの質量は、実施形態に応じて対象に投薬されるＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶの数を表す。例えば、幾つかの実施形態では、或る用量のＣＤＣの数は、約５×１０４個〜約１×１０５個、約１×１０５個〜約２．５×１０５個、約２．５×１０５個〜約１×１０６個、約１×１０６個〜約１×１０７個、約１×１０７個〜約１×１０８個、約１×１０８個〜約１×１０９個、約１×１０９個〜約２×１０９個、約２×１０９個〜約５×１０９個、並びに上述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲を含む、約５×１０４個〜約２×１０９個の範囲であってもよい。同様に、実施形態に応じて、対象に投薬されるエキソソーム又は粒子（例えば小胞）の数は、約１×１０９個〜約２×１０９個、約２×１０９個〜約４×１０９個、約４×１０９個〜約１×１０１０個、約１×１０１０個〜約１×１０１１個、約１×１０１１個〜約１×１０１２個、約１×１０１２個〜約２×１０１２個、約２×１０１２個〜約２×１０１３個、約２×１０１３個〜約１×１０１４個、約１×１０１４個〜約２×１０１４個、並びに上述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲を含む範囲を含む、約１×１０９個〜約２×１０１４個の範囲であってもよい。幾つかの実施形態では、患者に送達されるＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶの量は、タンパク質重量（ｍｇ単位）によって測定されてもよく、及び／又は細胞若しくは小胞の総重量（例えば、水が細胞又は小胞の外側の区域から除去されている場合）によって測定されてもよい。幾つかの実施形態では、患者に送達されるＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶの量は、１ｍｇ〜１０ｍｇ、１０ｍｇ〜２５ｍｇ、２５ｍｇ〜５０ｍｇ、５０ｍｇ〜７５ｍｇ、７５ｍｇ〜１００ｍｇ、又は１００ｍｇ以上のタンパク質に等しい。幾つかの実施形態では、治療有効量の組成物の投与は、単回用量に約１ｍｇ〜約１００ｍｇのＸＯ及び／又はＥＶのタンパク質を含む。
【００１６】
幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯを含む製剤又は組成物が提供される。幾つかの実施形態では、製剤及び／又は組成物は薬学的に許容可能な担体を含む。幾つかの実施形態では、担体は、生理学的なｐＨの及び／又は等張な水である。幾つかの実施形態では、製剤又は組成物は、上述の方法に従って、ジストロフィン異常症（例えば、骨格筋ジストロフィー、異栄養性心筋症等）の治療に使用される。幾つかの実施形態では、製剤又は組成物は、治療有効量の、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣ−ＸＯを含む製剤及び／又は組成物が標的とされる異栄養性骨格筋に送達される、それを必要とする対象においてジストロフィン異常症を効果的及び／又は安全に治療するため使用される。
【００１７】
幾つかの実施形態では、本明細書において他に開示されるように、治療方法は、ミオパチーに罹患した対象（例えば患者）に対するものである。幾つかの実施形態では、筋肉のミオパチーは、細胞膜変性、間質性炎症、脂肪置換及び線維化の１つ以上を含み、そのうちの１つ以上が、本明細書に開示される治療の間に治療される及び／又は実質的に緩和される。
【００１８】
幾つかの実施形態では、本明細書において他に開示されるように、治療法は心筋症に罹患した対象（例えば患者）に対するものである。幾つかの実施形態では、対象は、心不全ではなく心筋症に罹患している。幾つかの実施形態では、対象は心筋症と診断される。幾つかの実施形態では、対象は、心不全ではなく心筋症と診断される。幾つかの実施形態では、心筋症は、左心室後底部線維化、異常ＡＶ結節伝導を伴うＳＶＴを含む心房内の伝導異常の１つ以上を含み、そのうちの１つ以上が、本明細書に開示される治療により治療される及び／又は実質的に緩和される。様々な実施形態では、心筋症は、進行期の心室拡大、呼吸困難、末梢性浮腫及び肝腫大を含み、そのうちの１つ以上が、本明細書に開示される治療により治療される及び／又は実質的に緩和される。様々な実施形態では、心不全（ＨＦ）は、心臓の構造及び機能が抑制される無症候性異常（ステージＢ）、顕性ＨＦ（ステージＣ）、そして進行性ＨＦ（ステージＤ）を含み、そのうちの１つ以上が、本明細書に開示される治療により治療される及び／又は実質的に緩和される。
【００１９】
様々な実施形態では、対象は、骨格筋ミオパチー、ＧＩ及び尿路系の合併症を更に含む血管系機能不全を含む平滑筋ミオパチーに罹患している。幾つかの実施形態では、これらの疾患状態の１つ以上が、本明細書に開示される方法によって治療される及び／又は実質的に緩和される。幾つかの実施形態では、ミオパチーは、細胞膜変性、間質性炎症、脂肪置換及び線維化の１つ以上を含み、そのうちの１つ以上が、本明細書に開示される治療により治療される及び／又は実質的に緩和される。
【００２０】
幾つかの実施形態では、対象の治療は、骨格筋組織における機能改善を含む、対象における機能改善を判断することを更に含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、筋肉組織の機能改善をもたらす。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、例えば、髄意筋収縮における機能改善をもたらす。幾つかの実施形態では、機能改善は、収縮力の増加、歩行能力の改善、座位から立ち上がる能力の改善、臥位若しくは背臥位から座る能力の改善、並びにマウスのポインティング及び／又はクリック等の手先の器用さの改善の１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、対象の治療は、神経損傷の治療に応答する認知、肺損傷の治療に応答する血液酸素運搬、及び損傷した免疫学関連組織の治療に応答する免疫機能を評価することを更に含む。
【００２１】
幾つかの実施形態では、ジストロフィン異常症の治療を必要とする上記対象は、ヒト対象である。幾つかの実施形態では、ヒト対象は、約：３歳以下、８歳以下、１１歳以下、１２歳以下、１５歳以下、１８歳以下、又は上述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲を含む範囲の年齢である。幾つかの実施形態では、ヒト対象は、例えば、約３歳〜１１歳、又は約１２歳〜１８歳の年齢の小児対象である。幾つかの実施形態では、対象は、列挙される年齢集団の１つ等の上記の１つ以上の特徴によって分類され、及び／又は上記の１つ以上の疾患状態（例えばミオパチー、心筋症及び／又は心不全）に罹患している及び／又は診断されている。幾つかの実施形態では、患者は、上に開示される１つ以上の疾患状態を患っているが、その他の疾患には罹患していない。例えば、３歳〜１１歳であり、心不全ではなく心筋症に罹患している及び／又は心筋症と診断されている対象。別の実例として、対象は８歳〜１５歳であってもよく、心筋症又は心不全ではなく骨格筋ミオパチーに罹患していてもよい
【００２２】
幾つかの実施形態では、本明細書において他に開示されるように、注入は動脈内又は静脈内であってもよい。動脈及び静脈は、脚、体幹（例えば、肺の又は肺周辺）、首等のものを含んでもよい。幾つかの実施形態では、注入は、身体の１つ以上の場所（例えば、注入部位又は注入部位から離れた場所）に治療有効用量のＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣを送達する。幾つかの実施形態では、注入は、平滑筋及び骨格筋の組織に対して治療的に有効な投薬量のエキソソームを送達する。幾つかの実施形態では、治療有効量の組成物の投与は注射を含む。幾つかの実施形態では、注射は、心筋内注射、心臓腔及び心室、それらと関連する血管を含む、心臓への注射を含む。幾つかの実施形態では、心臓、心臓腔及び心室、それらと関連する血管への注射は、平滑筋及び骨格筋の組織に対して治療的に有効な投薬量のエキソソームを送達することができる。幾つかの実施形態では、注射は全身送達の達成をもたらす及び／又は全身送達を達成するため行われる。幾つかの実施形態では、注射は、体内の１つ以上の標的とする場所（例えば、注射部位又は注射部位から離れていてもよい場所）に治療的容量のＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ及び／又はＣＤＣを送達する。幾つかの実施形態では、注射は、骨格筋注射（骨格筋への注射）を含む。幾つかの実施形態では、注射は、腹腔内注射を含む。幾つかの実施形態では、注射は、皮下注射を含む。
【００２３】
幾つかの実施形態によれば、筋ジストロフィーの治療必要とする対象における筋ジストロフィー（例えばジストロフィン異常症）の治療方法が本明細書において提供され、該方法は、治療有効量の心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を対象に投与することを含む。幾つかの実施形態では、心筋症の治療を必要とする対象における心筋症の治療方法も提供され、該方法は、治療有効量のＣＤＣを対象に投与することを含む。幾つかの実施形態では、心筋症は、異栄養性心筋症であり、幾つかの実施形態によれば、異栄養性心筋症は、慢性筋ジストロフィーに続発する心不全である。幾つかの実施形態では、上記方法は、ＣＤＣ自体に代えて又はそれに加えて、ＣＤＣに由来するエキソソームを用いる。幾つかの実施形態では、ジストロフィン異常症を治療する方法が提供され、該方法は、治療有効量のエキソソームをジストロフィン異常症に罹患した小児対象に投与することにより該対象を治療することを含む。幾つかの実施形態では、無血清培地で成長させた心筋球由来細胞（ＣＤＣ）から複数のエキソソームを単離する。幾つかの実施形態では、異栄養性骨格筋を治療する方法が提供され、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）及び／又はＣＤＣ由来エキソソーム（ＣＤＣ−ＸＯ）をジストロフィン異常症に罹患した対象に投与することにより、異栄養性骨格筋を治療することを含み、ここで、ＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯは心臓ではない部位で対象に投与され、異栄養性骨格筋は標的とされる異栄養性骨格筋であり、標的とされる異栄養性骨格筋は治療有効量のＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯを投与される。一実施形態では、骨格筋ジストロフィーの治療を必要とする対象において骨格筋ジストロフィーを治療する方法が提供され、該方法は、治療有効量の心筋球由来細胞（ＣＤＣ）を含む組成物の第１の用量を対象に投与すること（ここで、第１の用量の治療有効量は約１×１０７個〜約１×１０９個のＣＤＣの範囲である）、上記第１の用量の投与後第１の期間を待つこと（ここで、上記第１の期間は約１カ月〜６カ月である）、治療有効量のＣＤＣを含む第２の用量の組成物を対象に投与すること（ここで、第２の用量の治療有効量は約１×１０７個〜約１×１０９個のＣＤＣの範囲である）、上記第２の用量の投与後第２の期間を待つこと（ここで、上記第２の期間は約１カ月〜６カ月である）、治療有効量のＣＤＣを含む少なくとも１回の追加の用量の組成物を対象に投与すること（ここで、少なくとも１回の追加の用量の治療有効量は約１×１０７個〜約１×１０９個のＣＤＣの範囲である）、上記少なくとも１回の用量の投与後少なくとも１回の追加の期間を待つこと（ここで、上記第２の期間は約１カ月〜６カ月である）を含み、上記投与は運動能力又は筋肉機能の改善をもたらし、上記ＣＤＣは上記対象に関して同種であり、上記複数回の投与は対象において著しい免疫応答を誘導せず、上記複数回の投与は全身投与を含む。幾つかの実施形態では、ＣＤＣの投与（１回又は複数回）は、Ｔ細胞の活性化又は増殖の１つ以上のマーカーの発現を変更し、該マーカーはＣＤ６９及び／又はＨＬＡ−ＤＲを含む。
【００２４】
幾つかの実施形態では、治療有効量のＣＤＣは、幾つかの実施形態によれば、各々骨格筋のジストロフィン異常症を伴うデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）又はベッカー型筋ジストロフィーを患う対象の異栄養性骨格筋を治療するのに十分である。いずれの骨格筋も冒される可能性があるが、幾つかの実施形態によれば、異栄養性骨格筋は、横隔膜、腕又は脚の骨格筋である。
【００２５】
投与経路は、実施形態に応じて変化し得る。例えば、幾つかの実施形態ではＣＤＣは、異栄養性骨格筋において筋肉内注射（例えば、局所投与）により対象に投与される。幾つかの実施形態ではＣＤＣは、対象に全身投与され、その場合、幾つかの経路が自由に選択される。例えば、幾つかの実施形態では、全身投与は静脈内の注射又は注入による。幾つかの実施形態では、全身投与は右心室への注射によるが、一方で更なる実施形態では、全身の投与は左心室への注射による。
【００２６】
幾つかの実施形態では、ＣＤＣの投与は単回用量によるが、幾つかの実施形態では２以上の用量が投与される。幾つかの実施形態では、頻回用量によれば、投薬は、約３週間〜３カ月の間隔、例えば、３週間〜４週間、４週間〜５週間、５週間〜６週間、６週間〜８週間、８週間〜１２週間、又は終了点を含むその間の任意の時に与えられる。幾つかの実施形態では、その後の用量は、最初のＣＤＣ用量が投与された６週間後及び１２週間後に与えられる。実施形態に応じて、ＣＤＣの数及び／又は投与の場所は、反復用量の間変化してもよい。代替的には、投薬レジメンは該レジメンに亘り一定のＣＤＣの数及び位置を使用することができる。
【００２７】
例として、本明細書に開示される方法は、少なくとも約７５×１０６個のＣＤＣの用量（例えば、ＣＤＣの治療有効量）を採用することができる。より具体的には、幾つかの実施形態では、その容量は、少なくとも約１５０×１０６個のＣＤＣ、少なくとも約３００×１０６個のＣＤＣ、少なくとも約３５０×１０６個のＣＤＣ、少なくとも約４００×１０６個のＣＤＣ、少なくとも約４５０×１０６個のＣＤＣ、少なくとも約５００×１０６個のＣＤＣ、少なくとも約５５０×１０６個のＣＤＣ、少なくとも約６００×１０６個のＣＤＣ、又はそれらの間のいずれかの数である。エキソソームを利用するそれらの実施形態では、或るの実施形態は、単回用量に約１ｍｇ〜約１００ｍｇの用量のエキソソームタンパク質を含む。
【００２８】
幾つかの実施形態では、ＣＤＣ又はエキソソームは、ＣＤＣを投与される対象に関して同種である。
【００２９】
幾つかの実施形態では、ＣＤＣ又はエキソソームの投与は、結果的にジストロフィン発現の増加（例えば、「正常な」ジストロフィン発現、例えば対照集団又は疾患のより初期の時点に対する増加）をもたらす。幾つかの実施形態では、ジストロフィンの増加は、例えば、骨格筋及び／又は横隔膜において検出可能である。
【００３０】
幾つか実施形態では、上記方法は、ＣＤＣと共にステロイドを投与すると（例えば、別々に又は同時に投与すること）を更に含む。
【００３１】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される上記方法、使用及び、組成物は、結果的に筋肉機能における改善、又は筋線維化若しくは組織損傷の減少をもたらす。幾つか実施形態では、改善は骨格筋に関するものである。幾つかの実施形態では、改善は心筋に関するものである。
【００３２】
また、ＣＤＣ及び／又はＣＤＣエキソソームを含む組成物の使用が本明細書において提供され、ここで、該組成物は、筋ジストロフィーを有する対象に対する全身投与に適しており、上記組成物の投与は、上記筋ジストロフィーを治療する（例えば、骨格筋を治療する）。
【００３３】
幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ由来細胞外小胞（ＣＤＣ−ＥＶ）に由来する単離されたＲＮＡポリヌクレオチド又は該ＲＮＡポリヌクレオチドをコードするベクターを含む組成物が更に提供され、ここで、ＲＮＡポリヌクレオチドは短い非コードＲＮＡを含む。幾つか実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチド配列は、ＤＭＤに由来する短い非コードＲＮＡ（ｓｒＤＭＤ）に対して、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のパーセンテージ同一性を含む。幾つかの実施形態では、短い非コードＲＮＡはｓｒＤＭＤを含む。幾つかの実施形態では、短い非コードＲＮＡはマイクロＲＮＡを含む。実施形態に応じて、マイクロＲＮＡは、５’末端又は３’末端にＧＣＧを含んでもよい。幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４８ａに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のパーセンテージ同一性を含む。一実施形態では、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１４８ａを含む。幾つかの実施形態では、ベクターは、ウイルス（例えば、パルボウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス等）である。一実施形態では、アデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスである。
【００３４】
幾つかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、１つ以上の所望の患者の転帰を達成する。幾つかの実施形態では、対象の治療は、ジストロフィン発現の増加をもたらす。幾つかの実施形態では、ジストロフィン発現の増加が骨格筋に生じる。幾つかの実施形態では、骨格筋におけるジストロフィン発現の増加は、ヒラメ筋等の四肢（例えば、腕又は脚）の骨格筋を含む。幾つかの実施形態では、ジストロフィン発現の増加は横隔膜において生じる。幾つかの実施形態では、対象の治療は、線維化の減少、炎症の減少及び／又はミトコンドリア機能の増加をもたらす。幾つかの実施形態では、線維化の減少は、コラーゲン蓄積の減少を含む。幾つかの実施形態では、コラーゲンは、コラーゲンＩ及び／又はコラーゲンＩＩＩを含む。幾つかの実施形態では、炎症の減少は、細胞質核因子（赤血球由来２）様２（Ｎｒｆ２）の増加、脂肪酸過酸化最終生成物の減少、炎症細胞数の減少及び／又は抗酸化物質のアップレギュレートされた発現を含む。幾つかの実施形態では、アップレギュレートされる抗酸化物質は、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２（ＳＯＤ−２）及びグルタメート−システインリガーゼ触媒（ＧＣＬＣ）サブユニットの１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、ダウンレギュレートされる炎症細胞は、ＣＤ６８＋マクロファージ及びＣＤ３＋Ｔ細胞を含む。幾つかの実施形態では、ミトコンドリア機能の増加は、ミトコンドリアの超微細構造の増加及び／又はミトコンドリア生合成の増加を含む。幾つかの実施形態では、ミトコンドリア機能の増加は、核ＰＰＡＲ−γコアクチベーター−１（ＰＧＣ−１）発現の増加を含む。
【００３５】
幾つかの実施形態では、本明細書において他に開示されるように、ＣＤＣ−ＸＯの分子カーゴの１つ以上の単離された成分を含む治療用組成物は、本明細書に開示される方法において使用される。幾つかの実施形態では、治療用組成物はＣＤＣ−ＸＯ  ＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、本明細書において他に開示されるように、ＲＮＡは、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＭＶから単離され、再度組み合わされて（例えば、混合及び適合されて）治療方法における使用のための治療用混合物を提供する。幾つかの実施形態では、ＲＮＡの治療用混合物は、非コードＲＮＡを含む、単一のＲＮＡ又は複数のＲＮＡ（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のＲＮＡ）を含んでもよい。幾つかの実施形態では、非コードＲＮＡは、とりわけｔＲＮＡ、Ｙ  ＲＮＡ、ｒＴＮＡ、ｍｉｒＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ＳｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡを含み、更にそれらのフラグメントを含む。幾つかの実施形態では、治療用混合物は、マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８５、ｍｉＲ−２３ａ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−３３ａ、ｍｉＲ２０４、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ４５３２、ｍｉＲ−４７４２、ｍｉＲ−５８２、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−３１２５、ｍｉＲ−３６７７、ｍｉＲ−３７６ｂ、ｍｉＲ−４４４９、ｍｉＲ−４７７３、ｍｉＲ−４７８７、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−５００ａ、ｍｉＲ−５４８ａｈ、ｍｉＲ−５５０、ｍｉＲ−５４８ａｈ、ｍｉＲ−５５０ａ、ｍｉＲ−５５１ｎ、ｍｉＲ−５５８１、ｍｉＲ−６１６、若しくは図２９で豊富であると示される任意のその他のマイクロＲＮＡ、及び／又は前述のもののいずれかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のパーセンテージ同一性を有するポリヌクレオチドからなる群から選択される１つ以上のマイクロＲＮＡを含む。幾つかの実施形態では、治療用混合物は、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８−５ｐ、ｍｉＲ−１４８−３９、ｓｒＤＭＤ、及び／又は前述のものいずれかに対して少なくと約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のパーセンテージ同一性を有するポリヌクレオチドの１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、治療用混合物のマイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、及び／又は前述のものいずれかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のパーセンテージ同一性を有するポリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、及び／又は前述のもののいずれかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のパーセンテージ同一性を有するポリヌクレオチドを含む。様々な実施形態では、エキソソームは、ＤＭＤに��来する小さな非コードＲＮＡであるｓｒＤＭＤ、及び／又は前述のいずれかに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％のパーセンテージ同一性を有するポリヌクレオチドを含む。
【００３６】
幾つかの実施形態では、本明細書において他に開示される方法は、ＣＤＣ−ＸＯから単離された非コードＲＮＡを使用して遂行され得る。特定の理論に拘束されないが、非コードＲＮＡは、マイクロＲＮＡであると確認され指定された非コードＲＮＡ遺伝子を含む、高度に特異的な核酸認識を必要とする調節性の役割に非常に適していると考えられている。幾つかの実施形態では、単離されたＲＮＡポリヌクレオチドは、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８−５ｐ、ｍｉＲ−１４８−３９、ｓｒＤＭＤ、及び／又はｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８−５ｐ、ｍｉＲ−１４８−３９若しくはｓｒＤＭＤに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のパーセンテージ同一性を有するポリヌクレオチドの１つ以上から選択される。幾つかの実施形態では、ｍｉＲ−１４８ａのヌクレオチド配列は以下の通りである：
５’ＧＡＧＧＣＡＡＡＧＵＵＣＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＣＧＡＣＵＣＵＧＡＧＵＡＵＧＡＵＡＧＡＡＧＵＣＡＧＵＧＣＡＣＵＡＣＡＧＡＡＣＵＵＵＧＵＣＵＣ３’（配列番号１）；
ｍｉＲ−１４８−５ｐのヌクレオチド配列は以下の通りである：
５’ＡＡＡＧＵＵＣＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＣＧＡＣＵ３’（配列番号２）；
ｍｉＲ−１４８−３ｐのヌクレオチド配列は以下の通りである：
５’ＵＣＡＧＵＧＣＡＣＵＡＣＡＧＡＡＣＵＵＵＧＵ３’（配列番号３）；及び
ｓｒＤＭＤのヌクレオチド配列は以下の通りである：
５’ＵＧＵＡＣＡＣＡＧＡＧＧＣＵＧＡＵＣＧＡＵＵＣＵＣＣＣＵＧＡＡＣＡＧＣＣＵＡＵＵＡＣＧＧＡＧＧＣＡＣＵＧＣＡＧＡＵＣＡＡＧＣＣＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＧＧＵＧＧＡＧＵＵＵＣＡＡＧＡＧＵＣＣＣＵＵＣＣＵＧＧＵＵＣＡＣＣＧＵＣＵＣＣＵＵＵ３’（配列番号４）。
【００３７】
幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、及び／又はＣＤＣ−ＭＶの分子カーゴの１つ以上の単離された成分は、ウイルス又は非ウイルスのベクターを使用して細胞に送達される。幾つかの実施形態では、ベクターはウイルスである。幾つかの実施形態では、ウイルスはアデノウイルス又はアデノ随伴ウイルスである。
【００３８】
或る実施形の態では、それを必要とする対象において、効果的に及び／又は安全にジストロフィン異常症を治療する前述の方法に従った、骨格筋ジストロフィー及び／又は異栄養性心筋症の治療における使用のためのｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８−５ｐ、ｍｉＲ−１４８−３９、ｓｒＤＭＤ、及び／又はｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８−５ｐ、ｍｉＲ−１４８−３９若しくはｓｒＤＭＤに対して少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％のパーセンテージ同一性を有するポリヌクレオチドを含む製剤又は組成物。幾つかの実施形態では、それを必要とする対象において、効果的に及び／又は安全にジストロフィン異常症を治療する前述の方法に従って、骨格筋ジストロフィー及び／又は異栄養性心筋症を治療するための上述の製剤及び／又は組成物の使用が提供される。
【００３９】
幾つかの実施形態では、外植片へと培養され、外植片由来細胞へと更に培養され、更に心筋球形成細胞として培養された後に心筋球細胞として培養され、そしてその後、ＸＯ及びＥＶが単離されるＣＤＣとして培養された生検試料からＣＤＣが生成される。幾つかの実施形態では、ＣＤＣはヒトのものである。様々な実施形態では、ＣＤＣはジストロフィン異常症に罹患した対象から得られた生検試料から生成される。幾つかの実施形態では、約２４時間の期間に亘り低酸素条件下（例えば２％Ｏ２）でＣＤＣを培養する。幾つかの実施形態では、無血清条件下でＣＤＣを培養する。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１−図１J。ｍｄｘ心臓へのＣＤＣの移植。ｍｄｘマウスへのＣＤＣの移植によって改善された機能、生存率、抗酸化剤経路、炎症、ミトコンドリア機能不全、及びジストロフィン発現。図１Ａ：ベースライン（１０カ月齢）及び３カ月後の、注射に応答したＣＤＣ注射ｍｄｘマウス（Ｍｄｘ＋ＣＤＣ）及びビヒクル注射ｍｄｘマウス（Ｍｄｘ＋ビヒクル）における駆出率（ＥＦ）（ＣＴＬ：ｎ＝７；Ｍｄｘ＋ビヒクル及びＭｄｘ＋ＣＤＣ：それぞれｎ＝１２）。図１Ｂ：単回用量のＣＤＣ又はビヒクルの投与から３週間後に開始する毎週の高強度トレッドミル運動に供したマウスにおける運動能力（ＣＴＬ：ｎ＝７；Ｍｄｘ＋ビヒクル及びＭｄｘ＋ＣＤＣ：それぞれｎ＝１１）。異なる群の実験マウスのに対しては、心臓及びトレッドミルの実験を別々に行った。図１Ｃ：図１Ｃと同じ動物におけるカプラン・マイヤー分析は、ビヒクル処理ｍｄｘマウスでは、ＣＤＣ治療ｍｄｘマウス又は野生型対照よりも生存率がより低いことを示す（ｐ＜０．０１、ログランク検定）；しかしながら、後者の２つの群は統計学的に同等であった。図１Ｄ：ビヒクル又はＣＤＣを投与した３週間後のｍｄｘマウス心臓におけるＮｒｆ２の免疫組織化学画像。年齢適合野生型マウス（ＣＴＬ）は、対照としての役割を果たした。心臓を炎症細胞マーカーＣＤ６８、ＣＤ２０及びＣＤ３に対して染色する。黒矢印は、ＣＤ６８＋（上段）、ＣＤ２０＋（中段）及びＣＤ３＋（下段）の細胞を指す。図１Ｅ：ビヒクル又はＣＤＣの投与から３週間後のｍｄｘマウス心臓におけるマロンジアルデヒドタンパク質付加物（ＷＴ、ｎ＝４；Ｍｄｘ＋ビヒクル、ｎ＝６；及びＭｄｘ＋ＣＤＣ、ｎ＝６）。図１Ｆ：リン酸化−Ａｋｔ（Ａｋｔ−ｐＴ３０８、Ａｋｔ−ｐＳ４７３）、細胞質リン酸化−Ｎｒｆ２（Ｎｒｆ２−ｐＳ４０）、及び核Ｎｒｆ２ののタンパク質存在量のウエスタンブロット及びプールデータ。図１Ｇ：ｍｄｘマウス心臓における核ｐ６５、Ｐ−ＩκＢ（ＮＦ−κＢ経路）のタンパク質存在量のウエスタンブロット及びプールデータ。図１Ｈ：Ｎｒｆ２下流遺伝子産物、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）のタンパク質存在量のウエスタンブロット及びプールデータ。図１Ｉ：ｍｄｘマウス心臓におけるＭＣＰ１（単球走化性タンパク質１）のタンパク質存在量及び指定の炎症細胞の平均数を表すウエスタンブロット、プールデータ及び棒グラフ。図１Ｊ：ビヒクル又はＣＤＣの投与の３週間後のｍｄｘマウス心臓におけるＮｒｆ２免疫組織化学画像。プールデータは平均±ＳＥＭである；ＣＭ：心筋細胞；＊ｐ＜０．０５；＃ｐ＜０．００５；†ｐ＜０．０５；‡ｐ＜０．００２；スケールバー：１０μｍ。
【図２】図２Ａ−図２Ｂ。ミトコンドリア完全性の回復。図２Ａ：ビヒクル又はＣＤＣの投与の３週間後のｍｄｘマウス心臓の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像。年齢適合ＷＴマウスは対照としての役割を果たした。スケールバー：５μｍ。ミトコンドリア構造は、体系化された構造物の明らかな回復を示した。図２Ｂ：ＷＴ及びビヒクル／ＣＤＣ  ｍｄｘ心臓組織におけるミトコンドリア呼吸鎖サブユニットのウエスタンブロット及びプールデータ、並びに処理３週間後のＣＤＣ又はビヒクル処理ｍｄｘマウスの心臓から単離したミトコンドリアの酸素消費速度（ＯＣＲ）（ＷＴ、ｎ＝３；Ｍｄｘ＋ビヒクル及びＭｄｘ＋ＣＤＣ、それぞれｎ＝８）。示されている場合には、酸化的リン酸化の基質（ピルビン酸、リンゴ酸及びＡＤＰ）、選択的脱共役剤（ＦＣＣＰ）及び遮断剤（オリゴマイシン；アンチマイシン及びロテノン）を適用した。
【図３】図３Ａ−図３Ｂ。安定なコンピテントミトコンドリアによる再増殖。図３Ａ：最初の損傷ミトコンドリアのターンオーバーの後、健康なミトコンドリアによる再増殖が続く。図３Ｂ：群間で存在するミトコンドリア数が同じであるＴＥＭ画像によるミトコンドリア数、及びｍｄｘ心臓組織おける核ゲノム当たりのミトコンドリアＤＮＡコピー数。
【図４】図４Ａ−図４Ｂ。心臓のコラーゲン含有量及び線維化の減少。図４Ａ：心臓線維化の減少。野生型心臓、ビヒクル注射されたｍｄｘ心臓、及びＣＤＣ注射されたｍｄｘ心臓の代表的なマッソントリクローム画像、並びに形態計測分析のプールデータ。図４Ｂ：ｍｄｘ心臓におけるＣＤＣ注射の３週間後の心筋の心臓コラーゲンＩＡ１、ＩＩＩＡ１に関するウエスタンブロット及びプールデータ。データは平均±ＳＥＭである；†ｐ＜０．０５；＃ｐ＜０．０５。
【図５】図５Ａ−図５Ｂ。心筋形成。ｍｄｘマウスにおけるＣＤＣ注射の３週間後の心筋形成の増強は、代表的な免疫組織化学画像及びプールデータから明らかである。図５Ａ：免疫組織化学画像（Ｋｉ６７及びＡｕｒｏｒａＢに対して染色された野生型、ビヒクル処理、ＣＤＣ処理のｍｄｘマウスの心臓；１群当たりｎ＝４〜６）。矢印は、Ｋｉ６７＋（上段）及びＡｕｒｏｒａＢ＋（下段）の心筋細胞を指す。図５Ｂ：Ａｕｒｏｒａ  Ｂ＋及びｋｉ６７＋の染色の形態計測分析に関するプールデータ。データは平均±ＳＥＭである；†ｐ＜０．０５；スケールバー：１０μｍ。
【図６】筋細胞喪失、線維化、酸化ストレス、炎症、ミトコンドリアの無効／喪失、アポトーシス、線維化等を含む、筋ジストロフィーの病態形成を解除する（ｕｎｐｉｎｎｉｎｇ）様々な機構の図。
【図７】図７Ａ−図７Ｂ。ジストロフィン発現の回復。図７Ａ：ビヒクル又はＣＤＣ投与の３週間後のｍｄｘマウス心臓における、ジストロフィンアイソフォーム：ｄｐ４２７、ｄｐ２６０、ｄｐｌ４０、ｄｐｉ１６、ｄｐ７１、ｄｐ４０のタンパク質存在量に関する免疫組織化学画像、ウエスタンブロット及びプールデータ。ｍｄｘ心臓におけるＣＤＣ注射は、全ての測定されたアイソフォームに対してジストロフィン発現の回復をもたらした。図７Ｂ：追加の代表図。
【図８】筋ジストロフィーにおいて作用する病態生理学的機構、並びに筋細胞喪失、線維化、酸化ストレス、炎症、ミトコンドリアの無効／喪失、アポトーシス、線維化等を含む、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯによって動員される細胞機構の概要。
【図９】図９Ａ−図９Ｄ。ＣＤＣ−ＸＯは、ＣＤＣの効果を総括（ｒｅｃａｐ）する。ＣＤＣ−ＸＯの心筋内注射は、コラーゲンを減少させて野生型とほぼ同じレベルにする。図９Ａ：心臓コラーゲンＩＡ及びＩＩＩＡに関するウェスタンプロット及プールデータ。細胞膜の染色及び描写のためＷＧＡ（コムギ胚芽凝集素）を適用した。図９Ｂ：Ｋｉ６７及びＡｕｒｏｒａ  Ｂに対して染色したｍｄｘマウス心臓による免疫組織化学画像及びプールデータ（野生型、ｎ＝４；及びＣＤＣ−ＸＯ処理及びビヒクル処理、それぞれｎ＝６）。矢印は、Ｋｉ６７＋（上段）及びＡｕｒｏｒａ  Ｂ＋（下段）の心筋細胞を指す。図９Ｃ：ビヒクル、ＣＤＣ又はＣＤＣ−ＸＯの投与の３週間後のｍｄｘマウス心臓（ｎ＝４〜６）における、ジストロフィンアイソフォームのタンパク質：ｄｐ４２７、ｄｐ２６０、ｄｐｌ４０、ｄｐｉ１６、ｄｐ７１、ｄｐ４０の存在量に関するウエスタンブロット及びプールデータ。図９Ｄ：ｍｄｘ心臓へのＣＤＣ−ＸＯの注射は、駆出率の段階的な減少を遅らせた（ｎ＝１１）。データは平均±ＳＥＭである；＊ｐ＜０．０５；†ｐ＜０．０２；‡ｐ＜０．０１。スケールバー：１０μｍ
【図１０】図１０Ａ−図１０Ｂ。ＣＤＣ処理ｍｄｘマウスにおける心臓機能及び運動能力の不均衡な増加。これは、ＣＤＣ自体、生着したＣＤＣから分泌されたメディエータ（エキソソーム、ＥＶ、タンパク質等）、心臓セクレトームの調節及び／又は全身血行動態の改善に起因し得る。図１０Ａ：ＣＤＣ処理ｍｄｘマウスにおける心臓機能の不均衡な増加。図１０Ｂ：ＣＤＣ処理ｍｄｘマウスにおける運動能力の分均衡な増加。
【図１１】図１１Ａ−図１１Ｎ。ＣＤＣ−ＸＯの心室内注射。ＣＤＣ−ＸＯ投与は同様の有益な結果を実証した。図１１Ａ：ｍｄｘマウスの心室内注射後のＣＤＣ−ＸＯの全身生体内分布。ＣＤＣ−ＸＯを蛍光脂質染料で染色し、生物発光画像法を使用して６時間後に追跡した。図１１Ｂ：ＣＤＣ−ＸＯは、ＣＤＣを反映するように遺伝子発現を調節した。図１１Ｃ：非処理ｍｄｘマウス、又は心筋内ＣＤＣ若しくは静脈内ＣＤＣ−ＸＯ処理ｍｄｘマウスの心臓に由来する遺伝子を使用する、次元階層的クラスタリング。非処理ｍｄｘマウスにおいて対応する転写産物と少なくとも２倍の違いを有する遺伝子を含めた。図１１Ｄ：ＣＤＣ−ＸＯ心室内注射により改善された駆出率。図１１Ｅ：ＣＤＣ−ＸＯ心室内注射により改善された運動能力。図１１Ｆ：心筋内ＣＤＣ注射又は心室内ＣＤＣ−ＸＯ注射の３週間後の横隔膜における同じ遺伝子発現の倍率変化の相関。図１１Ｇ：非処理ｍｄｘマウス、及び心筋内ＣＤＣ又は心室内ＣＤＣ−ＸＯ処理ｍｄｘマウスの横隔膜に由来する遺伝子を使用する２次元階層的クラスタリング。非処理ｍｄｘマウスの対応する遺伝子と少なくとも２倍の違いがある遺伝子を含めた。図１１Ｈ：心室内ＣＤＣ−ＸＯ注射後３週間の横隔膜収縮特性。単収縮力及び比筋力の両方が心室内ＣＤＣ−ＸＯ注射により改善した。図１１Ｉ：遺伝子発現の結果について示されるように、これらの結果をヒラメ筋において更に観察した。図１１Ｊ：次元階層的クラスタリング。図１１Ｋ：心室内ＣＤＣ−ＸＯ注射の３週間後のヒラメ筋による収縮特性。単収縮力及び比筋力の両方が心室内ＣＤＣ−ＸＯ注射により改善した。図１１Ｌ：心臓、図１１Ｍ：横隔膜、図１１Ｎ：ヒラメ筋について示されるジストロフィンレベル。データは平均±ＳＥＭである；＊ｐ＜０．０５；†Ｐ＜０．０５。
【図１２】心室内ＣＤＣ−ＸＯ注射後の生体内分布。図１２は、ｍｄｘマウスにおける蛍光脂質染料によって染色されたＣＤＣ−ＸＯの分布を示す。
【図１３】図１３Ａ−図１３Ｊ。ＣＤＣ−ＸＯ筋肉注射は、筋成長、及び筋ジストロフィーの病態生理学的異常の逆転をもたらした。図１３Ａ：ＭｙｏＤに対して染色したヒラメ筋（野生型、ビヒクル処理及びＣＤＣ−ＸＯ処理ｍｄｘマウスのヒラメ筋）のＨ＆Ｅ及び免疫組織化学の画像。Ｈ＆Ｅ画像中の矢印は、直線的に配列された核（左カラム）及び筋線維（右カラム）を示す。免疫組織化学では、直接的に配列された核は、ＭｙｏＤ（中カラム）に対して陽性であった。図１３Ｂ及び図１３Ｃ：ｍｄｘヒラメ筋（ｎ＝５９）におけるビヒクル及びＣＤＣ−ＸＯ注射の３週間後の筋線維サイズ及び筋芽細胞（ＭｙｏＤ＋）の数の度数分布。図１３Ｄ〜図１３Ｆ：ヒラメ筋内のビヒクル及びＣＤＣ−ＸＯの注射（ｎ＝４〜６）後の３週間のｍｄｘヒラメ筋における、図１３Ｄ：ＭｙｏＤ及びミオゲニン、図１３Ｅ：ＩＧＦ１受容体、並びに図１３Ｆ：細胞質ｐ−ｐ６５のタンパク質存在量に関するウエスタンブロット及びプールデータ。図１３Ｇ：ＣＤＣ−ＸＯマイクロＲＮＡを筋形成の尺度として読む。図１３Ｈ：ｍｄｘヒラメ筋（ｎ＝５〜９）へのビヒクル及びＣＤＣ−ＸＯの投与の３週間後のｍｄｘヒラメ筋における代表的なマッソントリクローム画像及び形態測解析。図１３１：ビヒクル及びＣＤＣ−ＸＯ（ｎ＝４〜６）のヒラメ筋内注射の３週間後のｍｄｘマウスヒラメ筋におけるジストロフィンの免疫組織化学画像。年齢適合野生型のマウスは対照としての役割を果たした。ビヒクル及びＣＤＣ−ＸＯ（ｎ＝４〜６）投与の３週間後のｍｄｘマウスヒラメ筋におけるジストロフィンアイソフォームｄｐ４２７のタンパク質存在量に関するウエスタンブロット及びプールデータ。図１３Ｊ：ヒラメ筋収縮特性のｅｘ  ｖｉｖｏ測定：ｍｄｘヒラメ筋へのビヒクル及びＣＤＣ−ＸＯ注射の３週間後の単収縮力及び絶対筋力。プールデータは平均±ＳＥＭである；＊ｐ＜０．０５；†ｐ＜０．０５；‡ｐ＜０．００２；スケールバー：５μｍ（図１３Ａ、右カラム）、１０μｍ（図１３Ａ、中央カラム）、５０μｍ（図１３Ａ、左カラム）、２００μｍ（図１３Ｈ）、２０μｍ（図１３１）。
【図１４】図１４Ａ−図１４Ｃ。図１４Ａ：ＣＤＣ−ＸＯ注射は、横隔膜のトランスクリプトームを調節することができた。図１４Ｂ：ＣＤＣ−ＸＯによるプライミングの１週間後のヒトデュシェンヌ型心筋細胞（ＤＭＤ  ＣＭ）におけるジストロフィンアイソフォームのタンパク質存在量に関するウエスタンブロット及びプールデータ。１Ｈｚのバーストペーシング中に測定した正常及びＤＭＤ  ＣＭからのカルシウムトランジェント。デュシェンヌ心筋細胞を、評価１週間前にビヒクル（ＤＭＤ  ＣＭ）又はＣＤＣエキソソーム（ＤＭＤ  ＣＭ＋ＸＯ）でプライミングした。棒グラフは、カルシウムトランジェント交互脈（ａｌｔｅｒｎａｎｓ）（心拍間隔のカルシウムトランジェント振幅の変動）及びピーク到達時間のものである。３週間後のｍｄｘマウス心臓におけるジストロフィンアイソフォーム：ｄｐ４２７、ｄｐ２６０、ｄｐｌ４０、ｄｐｉ１６、ｄｐ７１、ｄｐ４０のタンパク質存在量に関するウエスタンブロット及びプールデータ。図１４Ｃ：酸素消費速度（ＯＣＲ）測定１週間前にＣＤＣ−ＸＯ又は正常ヒト真皮線維芽細胞由来ＥＶ（ＮＨＤＦ−ＸＯ）でプライムしたＤＭＤ  ＣＭにおけるＯＣＲ。正常及び非処理ＤＭＤ  ＣＭを並行して研究した。
【図１５】ＣＤＣ投与後の左室の拡張終期容積（ＬＶ  ＥＤＶ）及び収縮終期容量（ＬＶ  ＥＳＶ）。ＣＤＣ移植は、プラセボと比較して、ｍｄｘマウスにおける第１及び第２（３カ月間隔）の注射後、３カ月間に亘ってＬＶ  ＥＤＶ及びＬＶ  ＥＳＶの持続的な改善をもたらした。データは平均±ＳＥＭである；各群ｎ＝１２；＃ｐ＜０．０５。
【図１６】移植の１週間後、２週間後及び３週間後の心臓におけるＣＤＣのパーセンテージ生着。１週間のＣＤＣのパーセンテージ生着は約８％であり、２週間で１％未満であった。３週間には、生存するＣＤＣを検出することができなかった。各時間点でｎ＝３。
【図１７】図１７Ａ−図１７Ｄ。ＣＤＣ治療後３週間のｍｄｘ心臓トランスクリプトームの変化。図１７Ａ：ビヒクル治療とＣＤＣ治療のｍｄｘ心臓間の少なくとも２倍の差を伴う５６０個の遺伝子を使用する２次元階層的クラスタリング。各行はｍｄｘ心臓を表し、各列は遺伝子を表す。プローブセットシグナル値をｍｄｘ心臓の平均に対して正規化した。遺伝子発現の相対レベルを、上部に示されるスケールに従って、最低（緑）から最高（赤）まで表す。図１７Ｂ：ミトコンドリア完全性、図１７Ｃ：酸化ストレス、及び図１７Ｄ：炎症を含む、目的の様々な経路に関与する遺伝子の転写産物の倍率変化の例をここにプロットする。
【図１８】タンパク質存在量に関するウエスタンブロット及びプールデータ。ビヒクル又はＣＤＣ投与後３週間のｍｄｘマウス心臓におけるカタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２（ＳＯＤ−２）、及びグルタメートシステインリガーゼ（ＧＣＬＣ）の触媒サブユニットを含む測定。
【図１９】差次的に発現された遺伝子のＩＰＡ解析。ＣＤＣ又はビヒクルで処理されたｍｄｘマウス心臓の炎症に関与する遺伝子を表し、ＣＤＣ治療後３週間のｍｄｘ心臓における炎症細胞遊走の減少が付随する炎症反応の阻害を示す。青色は機能／応答の阻害を表し、赤色及び緑色はそれぞれアップレギュレーション及びダウンレギュレーションを表す。
【図２０】図２０Ａ−図２０Ｃ。免疫組織化学画像。図２０Ａ：ビヒクル処理ｍｄｘマウス、図２０Ｂ：ＣＤＣ処理ｍｄｘマウス、及び図２０Ｃ：対照としての野生型心臓を含む、炎症細胞マーカーＣＤ３に対して染色されたｍｄｘ心臓を、四角で囲んだ領域の拡大図と共に表す。
【図２１】図２１Ａ−図２１Ｂ。ミトコンドリア。図２１Ａ：ＴＥＭ像によるミトコンドリアの数。図２１Ｂ：治療後３週間の心臓組織における核ゲノム当たりのミトコンドリアＤＮＡコピー数。
【図２２】ＸＯ解析。超遠心分離によって得られた単離されたＸＯを、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００システム（英国のＮａｎｏＳｉｇｈｔ  Ｌｔｄ）を使用する、ナノ粒子追跡によって分析した。動画を収集し、最小予想粒子サイズ、最小トラック長及びぼかしの設定を全て自動に設定して、ＮＴＡソフトウェア（バージョン２．３）を使用して分析した。カメラシャッタースピードを３０．０１ミリ秒に固定し、カメラゲインを５００に設定した。カメラ感度及び検出閾値をそれぞれほぼ最大（１５又は１６）及び最小（３又は４）に設定して、小粒子を表示させた。周囲温度を手動で記録したところ、２４℃〜２７℃の範囲であった。各サンプルについて、記録間に１０秒間の遅延を入れた６０秒間のビデオを５回記録して、５つのリプリケートヒストグラムを作製し、これを平均化した。サイズ／濃度を示す代表的な５つのリプリケートヒストグラム。５つのレプリケートで計算した平均濃度の標準誤差を赤色で示す。
【図２３】ＣＤＣ−ＸＯ投与後のＬＶ拡張終期容積（ＬＶ  ＥＤＶ）及びＬＶ収縮終期容積（ＬＶ  ＥＳＶ）。ＣＤＣ−ＸＯ移植は、プラセボに比べて、ｍｄｘマウスにおける第１及び第２（３カ月間隔）の両方の注射後３カ月の間、ＬＶ  ＥＤＶ及びＬＶ  ＥＳＶの持続的な改善をもたらした。データは平均±ＳＥＭである；１群当たりｎ＝１１；＃ｐ＜０．０５。
【図２４】免疫グロブリン血清レベル。ｍｄｘマウスにおける、マウスＣＤＣ、ヒトＣＤＣ−ＸＯ及びビヒクルの第１の注射後６カ月及び反復注射後３カ月のＩｇＧ血清レベル。循環抗ドナーＩｇＧ抗体をフローサイトメトリーによってスクリーニングした。
【図２５】ＸＯのクラスリン依存性心筋取り込み。クロルプロマジン（ＣＰＺ）前処理をした又は前処理のないｍｄｘマウス心臓における心筋内注射されたＣＤＣ−ＸＯの分布。ＣＰＺはクラスリン依存性取り込みの阻害剤である。蛍光標識化ＸＯ（ＸｅｎｏＬｉｇｈｔ  ＤｉＲ、５μＭ、一晩インキュベーション；マサチューセッツ州ホプキントンのＣａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をｍｄｘマウス心尖に心筋内注射し；６時間後、心臓を採取して、固定し、ＸＯ分布の評価のため切片を作製した。各心臓の心尖領域（３個の切片；５０μｍ間隔）、中央領域（４個の切片；５０μｍ間隔）及び心底領域（３個の切片；５０μｍ間隔）から無作為に選択した１０個の各切片から細胞を１０視野で心筋細胞内ＸＯを計数することにより、心筋細胞の内部の標識化ＸＯの平均数（筋節性アクチニン［緑］及びＤＡＰＩ［青］について共染色することにより検証された）を計算した。心筋細胞の内部の蛍光標識化ＸＯの存在は、エンドサイトーシスによる取り込みの尺度であり；ＣＰＺによる前処理（５０μｇ／ｇ、ｉ．ｐ．単回用量、ＸＯ注射前の１時間）は、ＸＯの細胞内の存在の顕著な減少をもたらし、特にｍｄｘ心筋細胞におけるＣＤＣ−ＸＯの内部移行におけるクラスリン媒介取り込みの関与を示した。棒グラフは、ＣＰＺが投与された及び投与されていない心筋細胞の内部の標識化ＸＯ（紫）の数を表し、１つの高倍率視野（ＨＰＦ）当たりの心筋細胞の総数で割った心筋内の標識化ＸＯの数として表される。矢印は蛍光標識化エキソソームを指す。プールデータは平均±ＳＥＭである；†ｐ＜０．００１。
【図２６】収縮特性。心筋内ＣＤＣ注射後の長指伸筋（ＥＤＬ）収縮特性を表す：ｍｄｘ心臓のＣＤＣ／ビヒクル治療後３週間のＥＬＤの収縮特性、絶対単収縮力及び最大強縮力のｉｎ  ｓｉｔｕ測定。
【図２７】差次的に発現された遺伝子のＩＰＡ解析。ＣＤＣ又はビヒクルで心筋内処理されたｍｄｘマウスの肝臓の炎症に関与する遺伝子を表し、心筋内ＣＤＣ注射後３週間のｍｄｘ肝臓におけるＮＦ−κＢ炎症経路の阻害を示す。青色は機能／応答の阻害を表し、赤色及び緑色はそれぞれアップレギュレーション及びダウンレギュレーションを表す。
【図２８】酸素正常条件下で成長させたＣＤＣに由来するＸＯと比べた、低酸素培養したＣＤＣに由来するＸＯにおけるミトコンドリア関連マイクロＲＮＡの倍率変化。−６〜６倍のｌｏｇ２倍率変化（２３０個のマイクロＲＮＡ）を示すマイクロＲＮＡを使用する２−次元階層的クラスタリングを表す。マイクロＲＮＡの相対的なｌｏｇ２倍率変化は、上部に示されるスケールによれば、最低（赤（底部）、−６）から最高（緑（上部）、＋６）まで表される。各行はＸＯ調製物を表し、各列はマイクロＲＮＡ種を表す。低酸素ＸＯで検出された３８９個のマイクロＲＮＡのうち、２４８個が以前にミトコンドリア関連マイクロＲＮＡであると報告されている。
【図２９】異なる培養状態下でのマイクロＲＮＡの倍率変化。正常酸素馴化培地から単離したＣＤＣ−ＸＯと比較した、低酸素順化培地（２％Ｏ２）から単離したＣＤＣ−ＸＯの特性を表す：１０超かつ−２０未満の倍率変化を含んだ。ＸＯから抽出した低分子ＲＮＡのｍｉＲＮＡ配列ライブラリー調製のため、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅ  ｋｉｔ（マサチューセッツ州イプスウィッチのＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）を使用した。ｍｉＲＮｅａｓｙ  Ｓｅｒｕｍ／Ｐｌａｓｍａ  Ｋｉｔ（メリーランド州ジャーマンタウンのＱＩＡＧＥＮ）を使用して、ＸＯからＲＮＡを抽出した。
【図３０】図３０Ａ−図３０Ｂ。ＣＤＣ−ＸＯ及びｍｉＲ−１４８投与後の生理学的特性。図３０Ａ：ｍｄｘマウスにおけるベースライン及びＣＤＣ−ＸＯ及びＮＨＤＦ−ＸＯの心筋内注射の３週間後のＬＶ駆出率。図３０Ｂ：ｍｄｘマウスにおけるベースライン及びｍｉＲ−１４８及びマイクロＲＮＡ模倣対照の心筋内注射の３週間後のＬＶ駆出率。データは平均±ＳＥＭである；１群当たりｎ＝５。
【図３１】図３１Ａ−図３１Ｂ。ｍｄｘ心臓におけるジストロフィン発現の加齢性変化。図３１Ａ：若年（８週）及び高齢（１０カ月）のｍｄｘ心臓におけるジストロフィン発現。図３１Ｂ：第１の心筋内ＣＤＣ注射の３週間後及び３カ月後、並びに心筋への第２の（反復）ＣＤＣ注射の３カ月後の野生型対照マウス心臓及びｍｄｘマウス心臓におけるジストロフィンタンパク質のウエスタンブロット。全ての心臓はベースラインで１０カ月齢のものであった。ＣＳ：クエン酸シンターゼ。
【図３２】図３２Ａ−図３２Ｄ。心臓以外の兆候ＣＤＣ又はＣＤＣ−ＸＯ注射。図３２Ａ：心筋内ＣＤＣ注射の３週間後のｍｄｘ肝臓におけるＮＦ−κＢ炎症性経路の阻害を示す、ＣＤＣ又はビヒクルを心筋内に注入されたｍｄｘマウスの肝臓における炎症に関与する差次的に発現された遺伝子の本発明の経路分析。青色は機能／応答の阻害を表し、赤色及び緑色はそれぞれアップレギュレーション及びダウンレギュレーションを表す。図３２Ｂ：染色したヒトＣＤＣ−ＸＯの全身注射後のｍｄｘマウス器官の生物発光画像法。ｍｄｘマウスの左心室腔へのＸＯの全身注射の６時間後に指定される臓器を解剖し、ＩＶＩＳ分子イメージングシステム（米国マサチューセッツ州ホプキントンのＣａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して画像化した。図３２Ｃ：第１の心室内ＣＤＣ−ＸＯ注射後１週間、３週間及び３カ月、並びに第２の（反復）ＣＤＣ−ＸＯ注射後３カ月の野生型マウス心臓及びｍｄｘマウス心臓におけるジストロフィンタンパク質のウエスタンブロット。図３２Ｄ：心室内注射によるＣＤＣ−ＸＯ全身送達の３週間後の野生型対照及びｍｄｘマウスの心臓、視床下部、横隔膜、ヒラメ筋、前脛骨筋及び長指伸筋におけるジストロフィンのタンパク質含有量を示すウエスタンブロット。ＣＳ：クエン酸シンターゼローディング対照。ジストロフィン発現はＥＤＬでは明らかではないが、心筋内ＣＤＣ注射後にＥＤＬにおいて収縮力が増加され、ジストロフィン再発現が骨格筋における唯一の有益な機構ではない可能性があることを示唆した。
【図３３】ジストロフィン発現及びその結果。ＸＯにおけるジストロフィンの欠如。ジストロフィン探査のため野生型心臓溶解物を陽性対照として使用した。
【図３４】図３４Ａ−図３４Ｄ。ここで研究されたＸＯの生体活性が、特性評価されたエキソソームに起因し得ることの検証。エキソソームを線形のイオジキサノール密度勾配で浮遊させ（これは、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって小胞、及びタンパク質の存在を実証した）、生物学的作用が関連する小胞であることを示した。図３４Ａ：線形イオジキサノール密度勾配によって精製して（Ｅｘｏｌ、左）及精製せずに（Ｅｘｏ２、右）連続遠心分離されたエキソソームのＴＥＭ像は、いずれの状態でも小胞を示す。小胞はサイズ及び形態学が可変であり、先の研究と一致する。図３４Ｂ：エキソソームのキータンパク質（ｋｅｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の特徴に関して、溶解されたエキソソーム：ＣＤ６３、ＣＤ８１及びＴＳＧに対するウエスタンブロット。図３４Ｃ、図３４Ｄ：Ｅｘｏｌ及びＥｘｏ２の生物活性を、ｍｄｘヒラメ筋への注射、及び注射の３週間後のｍｄｘヒラメ筋トランスクリプトームの評価によって比較した。図３４Ｃ：Ｅｘｏｌ及びＥｘｏ２注射の３週間後のｍｄｘヒラメ筋トランスクリプトームの変化。ｍｄｘヒラメ筋におけるビヒクル／Ｅｘｏｌ及びビヒクル／Ｅｘｏ２の間の少なくとも２倍の差を有する３３２個の遺伝子を使用する２次元の階層的クラスタリング。図３４Ｄ：ｍｄｘヒラメ筋におけるＥｘｏｌ及びＥｘｏ２注射の３週間後の同じ遺伝子の発現の倍率変化の相関。Ｅｘｏｌ及びＥｘｏ２の効果の類似性は、デフォルトプロトコルによって単離した小胞の生物活性は真にエキソソームに起因し、超遠心分離によって同時精製された可能性のあるその他の種類の小胞に起因するものではないという概念を支持する。スケールバー：５０μｍ（Ｅｘｏ１）；１００ｎｍ（Ｅｘｏ２）。
【図３５】図３５Ａ−図３５Ｃ。ｍｄｘ心臓へのｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及びｓｒＤＭＤの移植。図３５Ａ：ｓｒＤＭＤの明らかな二次構造の描写と共に、酸素正常状態の順化培地（ｎ＝２）から単離したＣＤＣ−ＸＯと比較した、低酸素順化培地（２％Ｏ２）から単離したＣＤＣ−ＸＯにおけるｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及びｓｒＤＭＤの差次的発現。図３５Ｂ：ビヒクル、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ（ｎ＝４〜６）、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ又はｓｒＤＭＤの心筋内注射の３週間後のｍｄｘマウス心臓における、ジストロフィンアイソフォーム：ｄｐ４２７、ｄｐ２６０、ｄｐｌ４０、ｄｐｉ１６、ｄｐ７１、ｄｐ４０のタンパク質存在量に関するウエスタンブロット及びプールデータ。図３５Ｃ：ビヒクル、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ（ｎ＝４〜６）、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及びｓｒＤＭＤの心筋内注射の３週間後のｍｄｘマウス心臓における、ジストロフィンアイソフォーム：ｄｐ４２７、ｄｐ２６０、ｄｐｌ４０、ｄｐｉ１６、ｄｐ７１、ｄｐ４０のタンパク質存在量に関するウエスタンブロット及びプールデータ。
【図３６】図３６Ａ−図３６Ｂ。エクソンスキッピング／選択的スプライシングの排除。図３６Ａ：ｍｉＲ−１４８ａはＮＦκＢ  ｐ６５及びリン酸化−Ａｋｔの両方のレベルの減少をもたらす。図３６Ｂ：ジストロフィンのエクソン２３に隣接するプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ。ビヒクル、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及びｓｒＤＭＤで処理したマウス（ｎ＝４〜６）に由来するｍｄｘ心臓において発現されたジストロフィンのエクソン２３封入を評価するため使用した。ビヒクル、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ又はｓｒＤＭＤで治療したｍｄｘ心臓に由来するジストロフィンに対するＲＮＡ−ｓｅｑデータのＳａｓｈｉｍｉ  ｐｌｏｔは、エクソン２３に及ぶジャンクションリード（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅａｄ）を表さない。データは全て平均±ＳＥＭである；†ｐ＜０．０３。
【図３７】図３７Ａ−図３７Ｂ。ジストロフィンのウエスタンブロット検出。図３７Ａ：野生型マウス心臓及びｓｒＤＭＤの心筋内注射の３週間後のｓｒＤＭＤ処理ｍｄｘマウスにおけるジストロフィンのタンパク質含有量を表すウエスタンブロット。図３７Ｂ：ジストロフィン遺伝子のエクソン２３における点突然変異又はジストロフィン遺伝子のエクソン５０の欠失があるデュアルレポーターコンストラクトを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３  ＮＴ細胞におけるＣＤＣ−ＸＯ、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ又はｓｒＤＭＤによる処理後のビヒクル（ＰＢＳ）と比べたジストロフィン／ｅＧＦＰ発現のパーセンテージ増加。
【図３８】図３８Ａ−図３８Ｂ。ジストロフィン発現及びその結果。図３８Ａ：ベースライン及びｍｄｘマウスにおけるｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ又はマイクロＲＮＡ模倣対照の心筋内注射の３週間後の駆出率。参照のため野生型ＥＦ値を示す；１群当たりｎ＝５。図３８Ｂ：野生型マウス心臓、及び心筋内注射の３週間後のビヒクル、変異体ｓｒＤＭＤ又はｓｒＤＭＤを注射したｍｄｘマウス心臓におけるジストロフィンタンパク質含有量を表すウエスタンブロット。
【図３９】図３９Ａ−図３９Ｂ。図３９Ａ：哺乳動物発現ベクターにクローニングした合成ＤＮＡコンストラクトのプラスミドマップ。全長ヒトジストロフィンを野生型、又は２つの変異体：エクソン２３中のＵＡＡの中途終止コドン（ＰＴＣ）、又はエクソン５０欠失（エクソン５０Δ）のうちの１つとしてＯＲＦにクローンニングした。コンストラクトは、緑色蛍光をジストロフィン発現のレポーターとみなすことができるように、ｅＧＦＰを含むインフレームで全長ジストロフィンの融合タンパク質を作製する。トランスフェクション効率に対して正規化するため恒常的ルシフェラーゼ発現（ＳＶ４０プロモータによって独立して駆動される）を使用した。図３９Ｂ：全長（ＷＴ）、ＰＴＣ又はエクソン５０ΔコンストラクトでトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３ＮＴ細胞のジストロフィン／ｅＧＦＰ発現。総細胞溶解物の蛍光及び発光を９６ウェル分光光度計においてウェルベースで定量し；また、各ウェルにおける蛍光を、同様の播種密度及び溶解体積のトランスフェクトされていない細胞を用いて定量した。
【図４０】図４０Ａ−図４０Ｄ。１０カ月齢〜１２カ月齢のｍｄｘマウスを以下の通り処理した：大腿静脈への静脈注射による、単回用量のビヒクル（ｍｄｘ）、２．５×１０５個の同系ＣＤＣ、又は２．０×１０９個のヒトＣＤＣ−エキソソーム（ＣＤＣ−ＸＯ）。図４０Ａは、治療前（ベースライン）及び治療の３週間後の最大運動能力（１群当たりｎ＝８〜１０）を示し、図４０Ｂは、治療前（ベースライン）及び治療の３週間後のｉｎ  ｖｉｖｏ心臓駆出率１群当たりｎ＝６〜８）を示す。図４０Ｃは、ビヒクル（上段パネル）、ＣＤＣ（中段パネル）、又はＸＯ（下段パネル）で処理したｍｄｘマウスのマッソントリクローム顕微鏡写真を示す。図４０Ｄは、心臓線維化（１群当たりｎ＝５〜６）のマーカーとして赤色染色（細胞質）に対し、青色染色（コラーゲン）の区域を分析するプールデータを示す。データを平均±ＳＥＭとして表す。＊は、ビヒクル治療とは統計学的に差があることを示す。統計的有意差をＰ＜０．０５に設定した。
【図４１】図４１Ａ−図４１Ｄ。図４０に記載されるように、動物を処理した。図４１Ａは、ＲＮＡシーケンシングデータによる心臓の全トランスクリプトーム解析を示す。Ｐ＜０．０５を伴う２以上倍の変化で転写産物が差次的に発現したとみなし、パネルＡにおいてヒートマップで表した。ｍｄｘ列を年齢適合性野生型マウス心臓と比較したのに対し、ＣＤＣ及びＸＯの列をそれぞれｍｄｘマウス心臓と比較した。図４１Ｂは、野生型（ＷＴ）、ビヒクル（ｍｄｘ）、ＣＤＣ又はＸＯで処理したマウスにおけるリン酸化ＮＦκＢタンパク質レベルを探査した代表的なウエスタンブロット及びプールデータを示す。図４１Ｃは、図４１Ｄのｍｄｘ、ＣＤＣ又はＸＯで処理した心臓からのＣＤ６８の免疫蛍光画像（１群当たりｎ＝３）によるプールデータを示す。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊はビヒクル治療とは統計学的に差があることを示す。統計的有意差をＰ＜０．０５に設定した。
【図４２】図４２Ａ−図４２Ｄ。図４０に記載されるように動物を処理した。図４２Ａ。ＷＴ、ｍｄｘ、ＣＤＣ又はＸＯで処理した心臓によるミトコンドリアの電子伝達径複合体（１群当たりｎ＝６）のウエスタンブロット分析によるプールデータ。図４２Ｂ。ＷＴ、ｍｄｘ、ＣＤＣ又はＸＯで処理した心臓におけるタンパク質−カルボニル付加物形成（１群当たりｎ＝８〜１０）。図４２Ｃ。Ｋｉ−６７の免疫蛍光画像（１群当たりｎ＝３）によるプールデータ。図４２Ｄ  ｍｄｘ、ＣＤＣ又はＸＯで治療した心臓による。データは平均±ＳＥＭとして表される。＊はビヒクル治療とは統計学的に差があることを示す。統計的有意差をＰ＜０．０５に設定した。
【図４３】図４３Ａ−図４３Ｆ。図４０に記載されるように、動物を処理した。図４３Ａ。ＷＴ（円）、ｍｄｘ（正方形）、ＣＤＣ（上向き三角形）又はＸＯ（下向き三角形）によるヒラメ筋（１群当たりｎ＝５〜８）の力−収縮頻度関係。ＷＴ、ｍｄｘ、ＣＤＣ又はＸＯで処理したマウスによるヒラメ筋によって発生した図４３Ｂ単収縮力及び図４３Ｃ強縮力。図４３Ｄ。ＷＴ（円）、ｍｄｘ（正方形）、ＣＤＣ（上向き三角形）又はＣＤＣ−ＸＯ（下向き三角形）による横隔膜（１群当たりｎ＝５〜６）の力−収縮頻度関係。ＷＴ、ｍｄｘ、ＣＤＣ又はＣＤＣ−ＸＯで治療したマウスによる横隔膜によって発生した図４３Ｅ単収縮力及び図４３Ｆ強縮力。図４３Ｇ。ｍｄｘ（左パネル）、ＣＤＣ（中央パネル）又はＣＤＣ−ＸＯ（右パネル）で処理したマウスのマッソントリクローム顕微鏡写真。図４３Ｈ。ヒラメ筋（１群当たりｎ＝５〜６）における骨格筋線維化のマーカーとしての赤色染色（細胞質）に対する青色染色（コラーゲン）の面積を分析するプールデータ。図４３Ｉ。ヒラメ筋（１群当たりｎ＝５〜６）の全筋切片当たりの筋線維の数の定量。データを平均±ＳＥＭとして表す。＊はビヒクル治療とは統計学的に差があることを示す。統計的有意差をＰ＜０．０５に設定した。
【図４４】図４４Ａ−図４４Ｄ。図４０に記載されるように、動物を処理した。図４４Ａ。ＲＮＡシーケンシングデータによる心臓の全トランスクリプトーム解析。Ｐ＜０．０５の２以上倍の変化で転写産物が差次的に発現したとみなし、パネルＡにおいてヒートマップで表した。ｍｄｘ列を年齢適合性野生型マウスヒラメ筋と比較したのに対し、ＣＤＣ及びＸＯの列をそれぞれｍｄｘマウスヒラメ筋と比較した。図４４Ｂ。ＣＤＣ−ＸＯで処理したヒラメ筋のＫｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ解析。列挙される経路は、ｍｄｘヒラメ筋と比べてアップレギュレートされているとみなされ、多くは炎症に関与する。ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯ処理によってヒラメ筋において変更された図４４ＣのＴＮＦ及び図４４ＤのＮＦκＢのシグナル伝達に関与することが知られている遺伝子の倍率変化。
【図４５】図４５Ａ−図４５Ｃ。図４０に記載されるように動物を処理した。図４５Ａ。野生型（ＷＴ）、ビヒクル（ｍｄｘ）、ＣＤＣ又はＣＤＣ−ＸＯで処理したマウスによるヒラメ筋におけるリン酸化ＮＦκＢタンパク質レベル（１群当たりｎ＝３）を探査する代表的なウエスタンブロット及びプールデータ。図４５Ｂ。ＣＤ６８免疫蛍光画像（１群当たりｎ＝３）によるプールデータ。図４５Ｃ、ｍｄｘ、ＣＤＣ、又はＣＤＣ−ＸＯで処理した心臓による。データを平均±ＳＥＭとして表す。＊はビヒクル治療とは統計学的に差があることを示す。統計的有意差をＰ＜０．０５に設定した。
【図４６】図４６Ａ−図４６Ｂ。図４０に記載されるように、動物を処理した。ビヒクル（ｍｄｘ）、ＣＤＣ、ＧＷ４８６９で処理したＣＤＣ、及びＣＤＣ−ＸＯで処理したマウスによる図４６Ａヒラメ筋及び図４６Ｂ横隔膜における全長ジストロフィンを探査するウエスタンブロット。左の２列は、ＷＴジストロフィンの相対レベルを表す（例えば５％及び１％）。
【図４７】図４７は、ＤＭＤマウスモデル（ｍｄｘマウス）を使用して運動能力を改善するため、ＣＤＣの静脈内投与の用量を拡大する有効性を評価するために使用した概要プロトコルを表し、ここで、ｍｄｘマウスは、０週に治療又は対照ビヒクルを投与され、週１回運動し、６週に屠殺された。
【図４８】図４８Ａ−図４８Ｂ。４８Ａ及び図４８Ｂは、７５０００個、１５００００個又は２５００００個（図中、「７５Ｋ」、「１５０Ｋ」及び「２５０Ｋ」と称される）のＣＤＣ対リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）対照を注入したｍｄｘマウスの運動能力に対するＣＤＣの静脈内（ＩＶ）投与の効果をグラフで示す。
【図４９】図４９は、７５Ｋ〜２５０Ｋ  ＣＤＣ対ＰＢＳ対照で注射したマウスの横隔膜筋肉機能に対するＣＤＣの頸部ＩＶ投与の効果をグラフで示す。
【図５０】図５０Ａ−図５０Ｂ。図５０Ａ及び図５０Ｂは、３７Ｋ〜１５０Ｋ  ＣＤＣ対ＰＢＳ対照を注射したｍｄｘマウスの体重に対するＣＤＣの頸部ＩＶ投与の効果をグラフで示す。
【図５１】図５１は、本明細書に開示される幾つかの実施形態に従って投与されたＣＤＣが、ｍｄｘマウスの心臓の線維化を減少することを示す（線維化の指標であるコラーゲン染色が示される）。
【図５２Ａ】図５２Ａは、心エコー検査を使用して、心臓駆出率に対するＣＤＣ処理の効果を評価するため使用された概要プロトコルを表す。
【図５２Ｂ】図５２Ｂは、１５０Ｋ  ＣＤＣ対ＰＢＳ対照を注射したｍｄｘマウスの心臓駆出率に対するＣＤＣの頸部ＩＶ投与の効果をグラフで示す。
【図５３】図５３は、ＰＢＳの対照に対して、頸部ＩＶ注射により１５０Ｋ  ＣＤＣ、又は大腿部ＩＶ注射により２５０Ｋ  ＣＤＣを注射したｍｄｘマウスの心臓組織切片のマッソントリクローム染色を表す。
【図５４】図５４は、全身注射による３００ＫのＣＤＣ（大腿ＩＶ注射又は右心室への注射による１００ＫのＣＤＣ）、対心筋内注射による１００ＫのＣＤＣ、対ＰＢＳ対照による心筋梗塞のマウスモデルにおける心臓（左心室）駆出率に対するＩＶ投与の効果をグラフで示す。
【図５５Ａ】図５５Ａは、精製ヒトＣＤＣのＤＮＡに対して行われたｑＰＣＲを検証したことをグラフで示す。
【図５５Ｂ】図５５Ｂは、試験される各組織について調製されたマウス組織ＤＮＡにスパイクされたヒトＣＤＣ  ＤＮＡの標準曲線をグラフで示す。
【図５６Ａ】図５６Ａは、ヒトＡｌｕ配列ｑＰＣＲ法による、頸静脈投与後の野生型（ＷＴ）マウスにおけるヒトＣＤＣの生体内分布を判定するための概要プロトコルを表す。
【図５６Ｂ】図５６Ｂは、肺、肝臓、血液、心臓、ヒラメ筋、横隔膜及び脾臓の組織における、頸静脈注射後１０分及び２４時間のＷＴマウスにおけるヒトＣＤＣの生体内分布をグラフで示す。
【図５７Ａ】図５７Ａは、ｍヒトＡｌｕ配列ｑＰＣＲ法による、頸静脈投与後の重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）マウスにおけるヒトＣＤＣの生体内分布及びクリアランスを判定するための概要プロトコルを表す。
【図５７Ｂ】図５７Ｂは、肺組織において、頸静脈注射後の２４時間、１週間及び３週間のＳＣＩＤマウスにおけるヒトＣＤＣの生体内分布を示す。
【図５７Ｃ】図５７Ｃは、肝臓、血液、心臓、ヒラメ筋、横隔膜、脾臓及び精巣の組織における、頸静脈注射後、２４時間、１週間、３週間のＳＣＩＤマウスにおけるヒトＣＤＣの生体内分布をグラフで示す。
【図５８】図５８は、ブタ急性心筋梗塞モデルにおける高用量のＣＤＣの安全性を評価するための組織病理学的解析用の肺サンプル収集を概略的に説明する。
【図５９】図５９は、５０００万個、１億個又は２億個（それぞれ「５０Ｍ」、「１００Ｍ」又は「２００Ｍ」）のＣＤＣで治療したブタにおける血清トロポニンＩ（ＴｎＩ）レベルの変化をグラフで示す。
【図６０】図６０は、５０００万個、１億個又は２億個のＣＤＣで処理したブタにおける平均リスク面積（ＡＡＲ）を示す。
【図６１】図６１は、５０００万個、１億個又は２億個ＣＤＣで処理したブタの心筋血管閉塞（ＭＶＯ）を示す、ノーリフロー（ｎｏ  ｒｅｆｌｏｗ）（非染色）とリスク面積の平均比をグラフで示す。
【図６２】図６２は、５０００万個、１億個又は２億個ＣＤＣで処理したブタにおいて瘢痕サイズ示す、トリフェニルテトラゾリウムクロリド（ＴＴＣ）染色とリスク面積の平均比をグラフで示す。
【図６３】図６３は、５０００万個、１億個又は２億個のＣＤＣで処理したブタにおいて、処理又は非処理の動物について計算したΔＥＦをグラフで示す。
【図６４】図６４は、定常状態のＣＤＣによるＴ及びナチュラルキラー（ＮＫ）免疫応答に関与する免疫分子の発現をグラフで示す。陽性細胞のパーセンテージ及び幾何平均蛍光強度を示す。
【図６５】図６５は、目的に合わせたＭＬＲ培養の代表的な画像を示す。
【図６６】図６６は、ＣＤＣによるＴ細胞の活性化をグラフで示す。３名の異なるＰＢＭＣ（ドナーＡ、Ｃ及びＤ）に由来するＣＤ４＋（黒）及びＣＤ８＋（白）Ｔ細胞による、ＣＤ６９（左パネル）及びＨＬＡ−ＤＲ（右パネル）の発現。結果は３回反復の平均値±ＳＤである。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図６７】図６７Ａ−図６７Ｃ。ＣＤＣに応答した未分画ＰＢＭＣに由来するＴ細胞の増殖をグラフで示す。図６７Ａは、代表的等ットプロット（ドナーＡによる）を示す。図６７Ｂは、３名の異なるＰＢＭＣドナーに由来するＴ細胞の増殖を示す。図６７Ｃは、３名の異なるドナーに由来するＴ細胞の増殖を示す。図６７Ｂについて、結果は、３回反復による平均値±ＳＤである。図６７Ｃについて、結果は、それぞれ３回反復で３名の異なるドナーから得られた平均値±ＳＤである。
【図６８】図６８は、ＣＤＣに応答した精製Ｔ細胞の活性化及び増殖をグラフで示す。結果は、各ドナー（上段及び中段のパネル）に対する応答（２回反復）から得られた平均値±ＳＤであり、及びそれぞれ３回反復して両方のドナーから得られた平均値±ＳＤである（下段パネル）。
【図６９】図６９は、ＣＤＣによるフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）誘導性Ｔ細胞増殖の免疫調節を示す。代表的な培養物及びヒストグラム（上段）、並びに３回反復してそれぞれ行われた３名の異なるドナーによる平均パーセンテージ±ＳＤとして提示される結果。
【図７０】図７０は、ＰＨＡ誘導性ＣＤ６９及びＨＬＡ−ＤＲ発現の調節、並びにＣＤＣによるＰＨＡ誘導性Ｔ細胞増殖をグラフで示す。各ドナーに関する結果を、３回反復して得られた平均値±ＳＤとして提示する。下段パネルは、活性化マーカー発現の減少（ＣＤ６９）又は増加（ＨＬＡ−ＤＲ）の平均値±ＳＤ（左及び中間のパネル）、並びにそれぞれ３回反復して行われた両方のドナーから得られた増殖阻害のパーセンテージを提示する。
【図７１】図７１は、認識されたエキソソームマーカーのＣＤＣ−ＥＶの含有量を示すウエスタンブロットである。
【図７２】図７２は、ＣＤＣ−ＥＶに対するＴ及びナチュラルキラー（ＮＫ）免疫応答に関与する免疫分子の発現をグラフで示す。
【図７３】図７３Ａ−図７３Ｂ。ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶによるＴ細胞の活性化を示す。図７３Ａは、目的に合わせたＭＬＲ培養の代表的な画像を示す。図７３Ｂは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞によるＣＤ６９及びＨＬＡＤＲの発現を示す。
【図７４】図７４Ａ−図７４Ｂ。ＣＤＣ及びＥＶに応答したＴ細胞の増殖をグラフで示す。図７４Ａは、代表的等ットプロットを示す。図７４Ｂは、３回反復による平均値±ＳＤとして提示される３名の異なるドナーに由来するＴ細胞の増殖を示す。
【図７５】図７５は、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶに応答した精製Ｔ細胞活性化及び増殖をグラフでに示す。結果は、２名の異なるドナーによる応答（２回反復）から得られた平均値±ＳＤとして提示される。
【図７６】図７６は、ＥＶの存在下及び不在下でのＩＤＣ培養、並びに関連する免疫分子の発現（下段パネル）を示す。
【図７７】図７７は、ｉＤＣによって提示されるＣＤＣ−ＥＶによる精製Ｔ細胞の活性化及び増殖をグラフで示す。結果は３回反復による平均値±として提示される。
【図７８】図７８は、ＥＶの存在下及び不在下でのｍＤＣ培養（上段パネル）並びに関連する免疫分子の発現（下段パネル）を示す。
【図７９】図７９は、ｍＤＣ及びｍＤＣ−ＥＶによる精製Ｔ細胞の活性化及び増殖をグラフで示す。結果は３回反復による平均値±として提示される。
【図８０】図８０は、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶによるＰＨＡ誘導性Ｔ細胞増殖の免疫調節を示す。結果は、それぞれ３回反復して行われた３名のドナーによる平均パーセンテージ値±ＳＥＭである。
【図８１】図８１は、ＰＨＡ誘導性ＣＤ６９のダウンレギュレーション及び／又はＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶによるＨＬＡ−ＤＲ発現をグラフで示す。結果は３回反復による平均パーセンテージ値±ＳＥＭである。
【図８２】図８２は、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶがＰＨＡ誘導性Ｔ細胞増殖をダウンレギュレートすることをグラフで示す。３回反復による平均値±ＳＤである。
【図８３】図８３は、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶによるＰＨＡ誘導性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖の免疫調節をグラフで示す。結果は、それぞれ３回反復して行われた２名のドナーによる平均パーセンテージ値±ＳＥＭである。
【図８４Ａ】図８４Ａは、同系ＣＤＣ（Ｃ５７ＢＬ／１０マウスに由来）又はＰＢＳ対照の複数回の投与による運動能力のベースラインからの変化のグラフ式表示である。
【図８４Ｂ】図８４Ｂは、同種ＣＤＣ（Ｃ３Ｈマウスに由来）又はＰＢＳ対照の複数回の投与後の運動能力のベースラインからの変化のグラフ式表示である。
【図８４Ｃ】図８４Ｃは、図８４Ａと図８４Ｂを１つに合わせたグラフである。
【図８５Ａ】図８５Ａは、同種ＣＤＣ（Ｃ３Ｈマウス由来）、ステロイド及び／又はＰＢＳビヒクルの２回の投与による運動能力のベースラインからの変化のグラフ表示である。
【図８５Ｂ】図８５Ｂは、様々な遺伝子マーカーに陽性細胞のパーセントのグラフである。
【図８５Ｃ】図８５Ｃは、ＩｇＧ抗体の量を示すグラフである。
【図８６】図８６は、ＣＤＣの投与に応答した（ＰＢＳと比較される）抗体産生の評価に関するデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
発明の詳細な説明
【００４２】
本明細書に開示される幾つかの実施形態は、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ、ＣＤＣの単離された分子カーゴ（例えば、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、及び／又はＣＤＣ−ＥＶに由来する個々の分子又は分子の組み合わせ）；及び／又は前述の組み合わせを使用して、疾患、疾患状態、及び／又は疾患の症状を治療する方法に関する。幾つかの実施形態では、疾患はジストロフィン異常症である。幾つかの実施形態では、疾患状態は異栄養性障害である。幾つかの実施形態では、ジストロフィン異常症は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）及び／又はベッカー型筋ジストロフィーのうちの１つ以上を含む。幾つかの実施形態では、疾患状態はミオパチーである。幾つかの実施形態では、ミオパチーは骨格筋ミオパチーである。幾つかの実施形態では、この方法は、治療有効量のＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ、ＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ−ＥＶの分子カーゴ及び／又は前述の組み合わせを、疾患を患っている対象（例えば患者）に投与することにより、疾患及び／又はその症状を治療することを含む。本明細書で提供される方法及び組成物の幾つかの実施形態は、とりわけ、ｍｄｘマウスへのＣＤＣの静脈内投与が、投与されたＣＤＣの少なくとも一部が肺に蓄積するという知見にもかかわらず、本書に提示されている様々なデータが示すように、骨格筋ジストロフィーを患うヒト対象に治療有効量のＣＤＣを投与することによって異栄養性骨格筋の機能改善が達成され、それにより骨格筋ジストロフィー、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）を患っているヒト対象の効果的な治療を可能にする、という驚くべき発見に基づく。
【００４３】
本明細書で使用される「及び／又は」は、１つ以上の関連する列挙項目のあらゆる組み合わせと並んで、代替として（「又は」）解釈される場合の組み合わせの欠如を指す。
【００４４】
「治療する」又は「治療すること」又は「治療」とは、調節効果を与える任意の種類の作用を指し、これは、例えば、障害、疾患、又は病気に苦しんでいる対象にとって有益な効果である可能性があり、状態と関連する病状の発現の予防、対象の状態の改善（１つ以上の症状又は疾患等）、病状の進行の遅延若しくは減少、及び／又は臨床パラメーター、疾患若しくは病気の変化、病気の治癒等を含む。
【００４５】
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、障害、疾患又は病気に苦しんでいる対象に対して、例えば、有益な効果となり得る、対象の状態の改善（例えば、１つ以上の症状の調節）、状態の進行の遅延若しくは減少、障害の発症の予防若しくは遅延、及び／又は臨床パラメーター、疾患若しくは病気の変化等を含む、調節効果を与える治療薬（例えば、ＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ、ＣＤＣ、ＸＯ及びＥＶの分子カーゴ、又はそれらの組み合わせ）の量を指す。例えば、幾つかの実施形態では、有効量は、対象における状態を、少なくとも５％、例えば少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも１００％改善する組成物、化合物、又は薬剤の量を指す場合がある。開示される主題の活性組成物中の有効成分及び薬剤の実際の投薬量レベルは、特定の対象及び／又は用途に対して所望の応答を達成するのに有効な量の活性剤（複数の場合もある）を投与するように変更されてもよい。選択される投薬量のレベルは、組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物又は治療との組み合わせ、治療されている状態の重症度、並びに治療されている対象の身体状態及び以前の病歴を含むが、これらに限定されない様々な要因に依存する。本明細書では、有効用量の決定及び調整と並んで、そのような調整を行う時期及び方法の評価が企図される。「治療有効量」という用語は、標的とされる異栄養性骨格筋において、ジストロフィンの再発現及び／又は骨格筋機能を永続的に（例えば、実質的に不可逆的に）回復するのに十分なＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ、ＣＤＣ、及び／又は分子カーゴＸＯ及びＥＶの量を意味する。
【００４６】
本明細書で使用される「標的とされる異栄養性骨格筋」という用語は、異栄養性骨格筋の部位での或る量のＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ、ＣＤＣ、分子カーゴＣＤＣ−ＸＯ及びＣＤＣ−ＥＶ、及び／又はそれらの組み合わせの送達である。幾つかの実施形態では、標的送達は、標的部位へのＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ、ＣＤＣ、及び／又はＣＤＣ−ＸＯ及びＣＤＣ−ＥＶの分子カーゴの偶然の、偶発的な、又は不注意による送達は含まれない。幾つかの実施形態では、標的送達には全身送達は含まれない。幾つかの実施形態では、標的送達には、異栄養性骨格筋の部位における、ジストロフィン異常症を治療するには不十分となり得る量のＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ、ＣＤＣ、及び／又はＣＤＣ−ＸＯ及びＣＤＣ−ＥＶの分子カーゴの偶然の、偶発的な、又は不注意による送達は含まれない。
【００４７】
本明細書で使用される「異栄養性」という用語は、ジストロフィンの欠如又は欠乏である（例えば、骨格筋及び／又は心筋における）。
【００４８】
細胞は、エキソソーム（ＸＯ）及び微小胞（ＭＶ）と称されるエンドソーム及び原形質膜を起源とする多様な種類の細胞外小胞（ＥＶ）を細胞外環境に放出する。ＥＶは、細胞間コミュニケーションの重要な様式であり、細胞間及び細胞膜を通過する分子カーゴ（例えば、１つ以上の細胞質タンパク質、脂質、及びＲＮＡ）の移行の媒体としてはたらく。豊富な生物学的因子の環境を含む分泌脂質小胞であるＸＯは、強力なパラクリンシグナルを提供し、これによって、幹細胞が疾患又は損傷細胞を含む近隣の細胞に対する生物学的効果を増強する。タンパク質、生物活性脂質、及び核酸カーゴの封入及び移行により、これらの天然の送達装置は、再生プログラムの活性化につながるレシピエント細胞の顕著な表現型及び機能の変化を誘導することができる。国際公開第２０１６／０５４９１号において、ＸＯの投与は、ｍｄｘマウスの心不全を治療することが実証されており、その全体が参照されることより本明細書の一部をなす。
【００４９】
本明細書に開示される幾つかの実施形態は、治療用途の方法におけるＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯの使用に関する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるジストロフィン異常症の治療方法は、治療有効量のＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯを、ジストロフィン異常症を患っている又はそれを有する対象に投与し、それによって対象を治療する工程を含む。幾つかの実施形態において、対象は、ジストロフィン異常症を患う小児対象である。幾つかの実施形態では、ＸＯはＣＤＣから単離される。幾つかの実施形態では、ＣＤＣは無血清培地で増殖される。幾つかの実施形態では、ジストロフィン異常症はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。他の実施形態では、ジストロフィン異常症はベッカー型筋ジストロフィーである。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ、ＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ−ＥＶの分子カーゴ、ＸＯ及びＥＶを産生するＣＤＣ、及び／又は上記の組み合わせは、ジストロフィンの再発現を達成する方法で使用される。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ−ＥＶの全身心室内注射による、また同様にｍｄｘマウスの骨格筋へのＣＤＣ−ＥＶの直接筋肉内注射による、ＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ、ＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣ−ＥＶの分子カーゴ、ＸＯ及びＥＶを産生するＣＤＣ、及び／又は組み合わせによって、本発明者らは、本明細書に初めて記載された新規の治療方法、例えば、単回又は複数回の全身投与で治療有効量のＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＥＶＳを投与することによる骨格ＤＭＤの治療方法を想到した。幾つかの実施形態では、疾患は筋ジストロフィーである。
【００５０】
本明細書に開示されるデータ及び実験は、ジストロフィン発現の誘導におけるＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、及び／又はＣＤＣ−ＥＶの予想外の利点を実証している。本明細書で他に示されるように、ｍｄｘマウスの心臓へのＣＤＣの注射は、心臓と骨格筋の両方において全長ジストロフィンタンパク質レベルをブーストし、心機能、歩行能力及び生存率を劇的かつ永続的に改善する。同様の結果は、ヒトのデュシェンヌ型心筋細胞でも実証されている。正の因子は、ＣＤＣによって生成される細胞ＸＯに存在するようであり、ＣＤＣは、多小胞エンドソームが原形質膜と融合したときに細胞によって分泌される脂質二重層ナノ小胞である。
【００５１】
幾つかの実施形態では、ヒトＣＤＣによって分泌されるＸＯ（及びＥＶ）は、ｍｄｘマウス及びヒトデュシェンヌ型心筋細胞においてＣＤＣの利点を再現することが実証されている。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ−ＸＯ（例えば、ｍｉＲ−１４８ａ）に見られる非コードＲＮＡ種の送達は、転写産物の長さやエクソン／イントロンの接合部に影響を与えることなく、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、及び／又はＣＤＣ−ＥＶがジストロフィンタンパク質レベルを増加させる能力を模倣する。幾つかの態様において、ＣＤＣ−ＸＯが媒介する非コードＲＮＡの移行は、心臓及び骨格筋のジストロフィンを回復させることによりＤＭＤを改善する。
【００５２】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載される結果は、ジストロフィン異常症の治療選択肢としてのＣＤＣ及びそれらのＸＯ（及び／又はＥＶ）を実証する。ＣＤＣ及びそれらの分泌されたＸＯ（及び／又はＥＶ）は、心臓と骨格筋のジストロフィンレベルを確実に増加させる。幾つかの実施形態において、心臓及び骨格筋におけるジストロフィンレベルの増加は、身体へのＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、及び／又はＣＤＣ−ＥＶの注射後（例えば、全身又は局所、骨格筋への局所を含む）の大きな持続性の全身的利益に結び付く。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるように、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、及び／又はＣＤＣ−ＥＶは、再生性であるだけでなく、抗炎症性及び抗線維性でもある。ＣＤＣは、血管新生を促進し、内因性の前駆細胞を動員し、生存する心臓細胞をうまく増殖させる拡散因子を分泌し；また、移植されたＣＤＣは、不適応なリモデリング及びアポトーシスを抑制する。幾つかの実施形態では、ＣＤＣは、間接経路により（ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶを介して）動作する；そらは、マイクロＲＮＡ（分子カーゴの構成要素）を含む非コードＲＮＡを含むＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶの分泌を介して間接的に作用する。幾つかの実施形態では、同種ＣＤＣは数週間以内に完全に排除されるが、それらの機能的及び構造的な利点は少なくとも６カ月持続する。これらの多様なメカニズムは、マイクロＲＮＡを含む非コードＲＮＡによるＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶの分泌を介して媒介される。
【００５３】
特定の理論に拘束されることなく、上記のメカニズムは、ベッカー型筋ジストロフィー等の類似の筋ジストロフィーへの適用により、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＥＶ、又はＣＤＣ−ＸＯにＤＭＤを治療する能力もたらす。幾つかの実施形態において、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、及び／又はＣＤＣ−ＥＶは、再生細胞を動員し、線維化を逆転させ、炎症を標的とすることにより、ジストロフィンを置き換え、ジストロフィン欠失の病態生理学的結果を相殺する。幾つかの実施形態では、小児患者のＤＭＤの中心的欠陥を逆転させ、本明細書の方法は、疾患の進行を未然に防ぐか又は予防することができ、それらの患者が治療的介入の選択肢を著しく制限する可能性のある併存疾患を回避できるようにする。
【００５４】
本明細書に開示される方法は、患者へのＣＤＣの送達に関与するものを含むが、幾つかの実施形態では、細胞ではなくＣＤＣにより分泌されるＣＤＣ−ＥＶ（例えばＣＤＣ−ＸＯ）を使用することにより、移植及び細胞自体の送達と比較した場合に有利な点を提供し得る。幾つかの実施形態では、ＣＤＣによって生成されるものを含むＣＤＣ−ＥＶ及びＣＤＣ−ＸＯは、「無細胞」療法を開発するための強力で豊富なソースを提供することができる。ＣＤＣ−ＸＯベースの「無細胞」療法は、細胞療法とは対照的に、再生医療において以下の利点の１つ以上を提供する。幾つかの実施形態では、免疫原性又は腫瘍原性の可能性が低い又は存在しない生存不能な実体として、これらの特徴は特定の安全性の問題を有意に取り除く。幾つかの実施形態において、幹細胞由来のエキソソーム（及び／又はＣＤＣ−ＸＯ）は、ＭＨＣ複合体分子を含む膜結合タンパク質の含有量が低いため、親細胞よりも免疫原性が低くなる可能性がある。幾つかの実施形態では、脂質小胞内の生物活性成分のＣＤＣ−ＸＯ封入により、ｉｎ  ｖｉｖｏでの分解から内容物を保護することができ、それによって、サイトカイン、成長因子、転写因子、ＲＮＡ等の可溶性分子の送達としばしば関連する障害を潜在的に無効にすることができる。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＥＶの投与（及び／又は保管）の容易さにより、最終的に患者への繰り返しかつ持続的な送達が可能となり、それによって疾患及び／又は機能不全組織の再生及び修復の可能性が最大化される。
【００５５】
幾つかの実施形態では、ＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯを使用して、免疫調節プロセス、血管新生、及び内皮細胞の遊走を含む多数の細胞、組織及び生理学的プロセスを刺激することができる。本明細書に開示されるように、酸化及び／又はニトロソ化ストレスの増加、炎症の増加、アポトーシス促進及びリモデリング状態の環境を含む、ＤＭＤ患者の病態生理に基づいて、細胞によって分泌されるＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯを含む治療アプローチは、疾患の経過（及び前述の疾患状態及び／又は症状の１つ以上）を逆転させるのに大きな利点を提供する。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、及び／又はＣＤＣ−ＥＶは、抗酸化、抗炎症、抗アポトーシス、抗リモデリング効果を促進する。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、及び／又はＣＤＣ−ＥＶは、疾患細胞及び組織の再生能力を高める。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、及び／又はＣＤＣ−ＥＶの投与は、ＤＭＤの遅延及び／又は逆転に有益であり、ＣＤＣに由来するエキソソーム集団は、これらの利益がもたらされることを可能にする。小児対象への早期治療介入は、心不全等の後期疾患の併存疾患を予防又は回避する永続的かつ全身的な利益を提供する。幾つかの実施形態において、それらの持続する利益は、以下に等しいか、少なくともおよそ：３カ月、６カ月、１２カ月、又は前述の値を含む範囲及び／又は前述の値に及ぶ範囲である。
【００５６】
エキソソームの幾つかの実施形態。ＸＯは、サイトカイン、増殖因子、転写因子、脂質、コーディング核酸及び非コーディング核酸等の様々な生物学的因子に富む脂質二重層小胞である。ＸＯは、血液、尿、羊水、間質腔及び細胞外空間に見られる。エンドソーム起源のこれらのエキソサイトーシス小胞は、４０ｎｍ〜１００ｎｍのサイズを含む、３０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲のサイズであり、電子顕微鏡で明らかにされるように、カップ状の形態を有する。それらの初期形成は、細胞膜の内向きの出芽から始まり、エンドソームを形成し、その後、後期エンドソームの制限膜の陥入が続き、多胞体（ＭＶＢ）を形成する。ＭＶＢと原形質膜の融合は、その後エキソソームとして知られる小胞の形成により、細胞外空間に内部小胞の放出をもたらす。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるＸＯは、エキソサイトーシスされた及び／又はエンドソーム起源の細胞外小胞である。幾つかの実施形態では、本明細書に記載のＸＯは、以下に等しいか、少なくともおよそ：３０ｎｍ、５０ｎｍ、１００ｎｍ、１５０ｎｍ、２００ｎｍ、又は前述の値を含む範囲及び／又は前述の値に及ぶ範囲の直径を有することができる。
【００５７】
本明細書に記載されるように、ＸＯの「カーゴ」内容物は、形成時の親細胞の細胞調節状態を含む、親細胞起源に関連する生物学的因子の異なるサブセットを含むように親細胞起源を反映する。エキソソーム内のサイトカイン及び成長因子、脂質、コーディングＲＮＡ分子及び非コーディングＲＮＡ分子を含む様々なタンパク質の豊富な生物学的環境はいずれも、必然的に親細胞に由来する。細胞質誘導体の豊富なアレイを含むことに加えて、エキソソームは、膜の表面で膜結合受容体の細胞外ドメインを更に発現する。
【００５８】
幾つかの実施形態では、記載されるカプセル化及び形成プロセスは、親細胞起源及び形成時の調節状態に基づいてＸＯ組成物に不均一性を作り出す。それにもかかわらず、幾つかの実施形態では、一般的な出芽形成及び放出メカニズムは、エンドソーム関連タンパク質（Ｒａｂ  ＧＴＰａｓｅ、ＳＮＡＲＥ、アネキシン、フロチリン等）原形質膜又はエンドソームでミクロドメインにクラスター化することが知られているタンパク質（４つの膜貫通ドメインであるテトラスパニン、例えばＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ５３、及びＣＤ３７）、脂質ラフト関連タンパク質（例、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー型タンパク質及びフロチリン）、コレステロール、スフィンゴミエリン、及びヘキソシルセラミド等のそれらの起源の結果として共通する一組の性質を確立する。
【００５９】
幾つかの実施形態では、小胞の起源を反映する成分に加えて、ＸＯは、シグナル伝達プロセスに関連するｍＲＮＡ及びマイクロＲＮＡの両方を含有し、カーゴｍＲＮＡはレシピエント細胞で翻訳可能であるか、又はマイクロＲＮＡはレシピエント細胞で標的ｍＲＮＡを機能的に分解する。幾つかの実施形態では、遺伝子発現に影響を与えることが可能な他の非コードＲＮＡもＸＯに存在し得る。ｍＲＮＡ又はマイクロＲＮＡの集団のＸＯへの選択的取り込みを支配するプロセスは完全には理解されておらず、特定の理論に拘束されることはないが、他のエキソソーム及びそれらの起源細胞のＲＮＡプロファイルと比較した場合、ＸＯカーゴＲＮＡの濃縮によって実証されるように、ＲＮＡ分子はＸＯにランダムにではなく、選択的に取り込まれると考えられている。幾つかの実施形態では、理論に拘束されることなく、ＲＮＡ分子が疾患の病因及び再生プロセスでの可能性のある役割を考慮すれば、ＸＯ中のＲＮＡ分子の存在及び標的レシピエント細胞に影響を及ぼす際の明らかな効力により、本明細書で他に開示されるように、ＸＯ及びそれらの分子カーゴが治療的に有効となる。
【００６０】
幾つかの実施形態では、エキソソームの天然の二重膜カプセル化は、カーゴ内容物が血流中又は組織内で分解することなく持続又は移動できるように保護され、制御された内部微小環境も提供する。幾つかの実施形態では、細胞外環境へのこのカーゴのその後の放出により、脂質リガンド受容体相互作用、エンドサイトーシス取り込みを介する内在化、又は小胞と細胞膜の直接融合によって媒介される、細胞表面への接着を介するレシピエント細胞との相互作用が可能になる。これらのプロセスにより、エキソソームカーゴ内容物が標的細胞に放出される。
【００６１】
幾つかの実施形態では、ＸＯ細胞相互作用は、抗原提示、転写因子、サイトカイン、成長因子、ｍＲＮＡ及びマイクロＲＮＡ等の核酸の移行を含む、幾つかの異なる機構のいずれかによって誘導されるように、標的レシピエント細胞の遺伝的経路を調節することができる。
【００６２】
エキソソームの単離及び調製。幾つかの実施形態では、ＸＯ単離は、分離及び分析のためのそれらの一般的な生化学的及び生物物理学的な特徴を使用して達成され得る。幾つかの実施形態では、分画超遠心法が、分泌されたＸＯを培養細胞の上清から単離する技術として使用され得る。幾つかの実施形態では、このアプローチは、比較的低い浮遊密度を活用することにより、非膜状粒子からのＸＯの分離を可能にする。幾つかの実施形態では、サイズ排除により、生化学的に類似しているが生物物理学的に異なるＭＶからの分離が可能になり、ＭＶは最大１０００ｎｍのより大きな直径を持つ。幾つかの実施形態では、ＭＶはまた、ＸＯと共に治療混合物に含まれる（ＥＶがＸＯ及びＭＶの両方を含む場合）、及び／又はＭＶはＸＯから除去されない。他の実施形態では、ＸＯが濃縮され、及び／又はＭＶが実質的に含まれないように、ＸＯをＭＶから単離することができる。幾つかの実施形態では、浮揚速度の違いにより、異なるサイズのエキソソームの分離がさらに可能になる。幾つかの実施形態では、ＸＯサイズは、４０ｎｍ〜１００ｎｍのサイズを含む３０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の直径を有する。幾つかの実施形態では、開示されるＭＶ及びＥＶは、約：１０００ｎｍ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、４００ｎｍ、３００ｎｍ、２５０ｎｍ、２００ｎｍ以上の、又は前述の値を含む範囲及び／又は前述の値に及ぶ範囲のサイズ（ｎｍ単位）を有する。
【００６３】
幾つかの実施形態では、目的の特定のエキソソームの具体的な特性に基づいて、ＸＯの更なる精製を実施することができる。これには、例えば、目的のタンパク質を用いた免疫吸着の使用が含まれ、エキソプラズマ又は外向きの特定の小胞を選択する。
【００６４】
幾つかの実施形態では、示差遠心分離、不連続密度勾配、免疫親和性、限外濾過及び高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）のいずれか１つを使用してＸＯ（及び／又はＭＶ）を単離できるが、示差超遠心分離が使用される。幾つかの実施形態では、この手法は、２０００×ｇから１００００×ｇの遠心力の増加を利用して、１０００００×ｇでエキソソームペレットから中型及び大型の粒子及び細胞破片を分離する。遠心分離だけで馴化培地からのＸＯの顕著な分離／収集が可能になるが、幾つかの実施形態では、超遠心分離も、様々なタンパク質凝集体、遺伝物質、一般的な汚染物質である培地や細胞片に由来する粒子を除去し得る。幾つかの実施形態では、エキソソーム精製の特異性の増強は、エキソソーム調製物のより高い純度（浮選密度１．１ｇ／ｍｌ〜１．２ｇ／ｍｌ）又は調製中に個別のシュガークッション（ｓｕｇａｒ  ｃｕｓｈｉｏｎ）の適用を提供するため、限外濾過と組み合わせた連続遠心分離、又はスクロース密度勾配における平衡密度勾配遠心分離を展開し得る。
【００６５】
幾つかの実施形態では、限外濾過を使用して、生物活性を損なうことなくエキソソームを精製することができる。幾つかの実施形態では、膜は、約：２００ｋＤａ、１００ｋＤａ、７５ｋＤａ、５０ｋＤａ以下の、又は前述の値を含む範囲及び／又は前述の値に及ぶ範囲の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）等種々の細孔サイズを有する。幾つかの実施形態では、ゲル濾過は、小さい粒子を排除するため、代替的に又は追加して使用されてもよい。幾つかの実施形態において、メンブレン（例えば、透析、限外濾過等）及び／又はゲル濾過は、実質的な生理学的ｐＨを使用して及び／又は実質的な生理学的塩濃度で行われる（例えば、非中性ｐＨ又は非生理学的塩濃度の使用を避ける）。幾つかの実施形態では、接線流濾過（ＴＦＦ）システムが使用される。幾つかの実施形態では、ＴＦＦシステムはスケーラブル（１００００Ｌ超まで）であり、ＸＯ画分を精製するだけでなく濃縮することもできる。幾つかの実施形態において、かかるアプローチは、有利には、示差遠心分離よりも時間がかからない。幾つかの実施形態では、ＨＰＬＣを使用してＸＯを精製する。幾つかの実施形態では、ＨＰＬＣを使用して、エキソソームを均一なサイズの粒子に精製し、調製物が生理学的ｐＨ及び塩濃度に維持されるようにそれらの生物活性を維持することもできる。
【００６６】
幾つかの実施形態では、化学的方法を使用してＸＯを単離する。幾つかの実施形態において、これらの化学的方法は、沈殿手法における異なる溶解度による分離を含む。幾つかの実施形態では、沈殿試薬をＸＯの溶液に加えてＸＯを精製する。幾つかの実施形態において、これらの化学的方法は、体積排除ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等）への添加による分離を含む。幾つかの実施形態では、これらの化学的方法を、追加のラウンドの遠心分離又は濾過等と組み合わせることができる。幾つかの実施形態では、例えば、エキソソームの集団を即座に及び迅速に沈殿させるために、沈殿試薬、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（登録商標）を馴化細胞培地に添加する。幾つかの実施形態では、フローフィールドフローフラクショネーション（Ｆ１ＦＦＦ：ｆｌｏｗ  ｆｉｅｌｄ−ｆｌｏｗ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）は、高分子（例えば、タンパク質）及びナノサイズからマイクロサイズの粒子（例えば、オルガネラ及び細胞）を分離及び特性評価するために使用される溶出に基づく手法であり、培養培地からのエキソソームの分画に適用される。
【００６７】
幾つかの実施形態では、ＸＯの生化学的及び生物物理学的な特徴に依存して、本明細書で他に開示される技術を超えて、焦点があてられる技術が目的の単離された特定のエキソソームに適用され得る。幾つかの実施形態では、抗体の免疫親和性を使用して、ＸＯ関連抗原を認識する。幾つかの態様において、ＸＯは、親細胞の膜の表面で膜結合受容体の細胞外ドメインを発現する。幾つかの実施形態では、この発現は、共有される抗原プロファイルに基づいて、親細胞の起源に関連してＸＯを単離及び分離することを可能にする。幾つかの実施形態では、磁気ビーズへの複合化、クロマトグラフィーマトリクス、プレート若しくはマイクロ流体デバイス、及び／又はかかる技術と本明細書に開示される他の技術との組み合わせは、（例えば、目的の親細胞又は関連する細胞の調節状態に関連する可能性がある）目的の特定のＸＯ又はＭＶの集団の単離を可能にする。他の親和性捕捉方法では、ＸＯ表面の特定の糖残基に結合するレクチンを使用する。
【００６８】
エキソソームに基づく治療法。幾つかの実施形態では、本明細書で他に開示されるように、ＸＯに基づく治療法は、潜在的な「無細胞」療法を有利に可能にする（例えば、ＣＤＣ等がＣＤＣ−ＸＯ等から分離される）。「無細胞」療法の使用は、リスクを低減した細胞療法の潜在的な利点を保持し、及び／又は細胞療法が利用できない（及び／又は不可能な）状況で使用され得る。幾つかの実施形態では、本明細書で他に記載されるように、ＣＤＣ等の細胞に基づく治療法の治療上の利点は、内因性の起源から生じる再生組織を伴う間接的な機構により生じ得る。幾つかの実施形態では、ＣＤＣによって産生される細胞ＸＯは、疾患の進行を改善するだけでなく、疾患及び／又は機能不全の組織を修復及び再生する方法で、新たな治療アプローチのための増殖因子、転写因子、サイトカイン及び核酸の産生及び送達を可能にし得る。これに関して、ＣＤＣ由来エキソソームは、相乗機構を動員して内因性幹細胞を心筋損傷部位に引き付け、細胞分化を促進し、デュシェンヌ型筋ジストロフィー等の慢性疾患の病態生理を逆転させることにより、主な満たされていない医学的ニーズに効果的に対処することができる。幾つかの実施形態において、ＣＤＣは、ＸＯ（及び／又はＥＶ）の製造所として使用され得て、有利には、患者においてＣＤＣの滞在期間を通してＸＯの持続的な供給源を提供する。
【００６９】
幾つかの実施形態では、特に、ＤＭＤ等の慢性状態の場合、ＸＣを産生するＣＤＣ−ＸＯ又はＣＤＣの患者への反復送達及び持続送達は、細胞に基づく治療法を使用する場合よりもより容易で、潜在的により安全となり得る方法で、疾患組織及び／又は機能不全組織の再生及び修復の可能性を高め得る。投薬レジメン及びスケジュールは、本明細書で他に更に詳細に開示される。
【００７０】
幾つかの実施形態では、本明細書の他の箇所で開示されるように、患者に提供されるＸＯ及び／又はＣＤＣの投与方法及び量は、治療用量を送達する様々な方法で提供され得る。幾つかの実施形態では、例えば、ＸＯの投与のための組成物及び／又は溶液を投与は、単回投与で約１ｍｇ〜約１００ｍｇのＣＤＣ−ＸＯタンパク質を含む。幾つかの実施形態では、ＣＤＣ−ＥＶ（例えば、ＣＤＣ−ＸＯ）の用量は、以下に等しい又は少なくとも約：１ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、２００ｍｇ、又は前述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲のＥＶ又はＸＯ（ｍｇ単位）を含んでもよい。幾つかの実施形態では、投与方法は、対象への各単回用量の複数回投与を含む。幾つかの実施形態では、組成物（例えば、ＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ、ＣＤＣ、又はそれらの組み合わせを含む組成物）の投与には注射が含まれる。幾つかの実施形態では、注射は骨格筋注射を含む。幾つかの実施形態では、注射は腹腔内注射を含む。幾つかの実施形態では、組成物の投与には、動脈内又は静脈内の注入が含まれる。幾つかの実施形態では、対象の治療（例えば、ＣＤＣ−ＸＯ及び／又はＣＤＣ−ＸＯを放出するＣＤＣの単回又は複数回用量の送達による）は、ジストロフィン発現の増加をもたらす。幾つかの実施形態では、ジストロフィン発現の増加は、四肢（例えば、腕又は脚のうちの１つ以上）の骨格筋で生じる。幾つかの実施形態では、横隔膜でジストロフィン発現の増加が起こる。幾つかの実施形態では、本明細書の他の箇所で開示される治療を受けている患者は、心筋症を患う小児患者である。幾つかの実施形態では、小児対象は心筋症と診断されている。幾つかの実施形態では、小児対象は心筋症に罹患しているが、心不全には罹患していない。幾つかの実施形態では、小児対象は３歳〜１１歳である。他の実施形態では、小児対象は１２歳〜１８歳である。幾つかの実施形態では、ヒト対象は、約：３、６、１１、１２、１５、１８以下、又は前述の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲の年齢の小児対象である。
【００７１】
幾つかの実施形態では、本明細書で他に開示されるように、組成物（例えば、ＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、又はＣＤＣ−ＥＶを含むもの）の投与には注射が含まれる。幾つかの実施形態では、注射は骨格筋注射を含む。幾つかの実施形態では、注射は腹腔内注射を含む。幾つかの実施形態では、組成物の投与は、動脈内又は静脈内注入を含む。幾つかの実施形態では、対象の治療は、ジストロフィン発現の増加をもたらす。幾つかの実施形態では、ジストロフィン発現の増加は、四肢の骨格筋で起こる。他の実施形態では、ジストロフィン発現の増加は横隔膜で起こる。他の実施形態において、対象は心筋症に罹患している。他の実施形態では、対象は心筋症と診断されている。他の実施形態では、対象は心筋症に罹患しているが、心不全には罹患していない。他の実施形態では、対象は３歳〜１１歳である。他の実施形態では、対象は１２歳〜１８歳である。
【００７２】
本明細書に記載されるのは、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯを介した損傷組織又は疾患組織の修復又は再生において顕著な利益を提供する組成物及び方法である。特定の支援技術は、例えば、米国特許出願第１１／６６６，６８５号、同第１２／６２２，１４３号、同第１２／６２２，１０６号、同第１４／４２１，３５５号、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５４７３２号、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５３８５３号、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０５４３０１号、及び同ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０３５５６１に記載され、これらは参照することにより完全に本明細書の一部をなす。
【００７３】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるのは、治療有効量のＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯを対象に投与し、それにより該対象を治療することを含む、骨格筋疾患の治療方法である。本明細書に更に記載されるのは、ＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯを含む治療有効量の組成物を対象に投与し、それにより該対象を治療することを含む、骨格筋疾患の治療方法である。他の実施形態では、組成物は薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書に更に記載されるのは、複数のＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯを含む治療有効量の組成物を対象に投与し、それにより該対象を治療することを含む、慢性筋肉疾患の治療方法である。様々な実施形態において、複数のＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＸＯは、無血清培地で増殖されたＣＤＣから単離される。様々な実施形態において、エキソソームは約９０ｎｍ〜約２００ｎｍの直径を有し、ＣＤ８１＋、ＣＤ６３＋、又はそれらの両方である。他の実施形態では、慢性筋疾患にはジストロフィン異常症が含まれる。様々な実施形態において、ジストロフィン異常症には、デュシェンヌ型筋ジストロフィーが含まれる。様々な実施形態において、ジストロフィン異常症にはベッカー型筋ジストロフィーが含まれる。様々な実施形態において、対象は１８歳未満の小児患者である。様々な実施形態において、対象は１３歳未満の思春期前の患者である。様々な実施形態において、対象は１２歳未満の思春期前の患者である。様々な実施形態において、対象は１１歳未満の思春期前の患者である。様々な実施形態において、対象は１０歳未満の思春期前の患者である。様々な実施形態において、対象は３歳〜１１歳である。様々な実施形態において、対象は１２歳〜１８歳である。
【００７４】
本明細書の幾つかの実施形態は、治療有効量のＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ、及び／又はＸＯ放出ＣＤＣを対象に投与し、それにより該対象を治療することを含む、骨格筋疾患の治療方法である。幾つかの実施形態は、ＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ、及び／又はＸＯ放出ＣＤＣを含む治療有効量の組成物を対象に投与し、それにより該対象を治療することを含む、骨格筋疾患の治療方法に関する。幾つかの実施形態では、組成物は薬学的に許容される担体を含む。本明細書にさらに記載されるのは、ＣＤＣ−ＸＯ、ＣＤＣ−ＥＶ、及び／又はＸＯ放出ＣＤＣを含む治療有効量の組成物を対象に投与し、それにより該対象を治療することを含む、慢性筋疾患の治療方法である。幾つかの実施形態では、慢性筋疾患にはジストロフィン異常症が含まれる。他の実施形態において、ジストロフィン異常症は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである。幾つかの実施形態では、ジストロフィン異常症には、ベッカー型筋ジストロフィーが含まれる。様々な実施形態において、対象は１８歳未満の小児患者である。様々な実施形態において、対象は１３歳未満の思春期前の患者である。様々な実施形態において、対象は１２歳未満の思春期前の患者である。様々な実施形態において、対象は１１歳未満の思春期前の患者である。様々な実施形態において、対象は１０歳未満の思春期前の患者である。様々な実施形態において、対象は３歳〜１１歳である。様々な実施形態において、対象は１２歳〜１８歳である。
【００７５】
様々な実施形態において、対象は心筋症に罹患している。様々な実施形態において、対象は心筋症に罹患しているが、心不全には罹患していない。様々な実施形態において、対象は心筋症と診断されている。様々な実施形態において、対象は、心不全ではなく心筋症と診断されている。
【００７６】
様々な実施形態において、心筋症には、細胞膜分解、間質性炎症、脂肪置換、及び線維化のうちの１つ以上が含まれる。様々な実施形態において、心筋症には左心室後心底線維化；異常な房室結節伝導を伴うＳＶＴを含む、心房内の伝導異常が含まれる。様々な実施形態において、心筋症は、心室拡大、呼吸困難、末梢性浮腫及び肝腫大の進行した段階が含まれる。様々な実施形態において、心不全（ＨＦ）は、心臓の構造及び機能が抑制される無症候性異常（ステージＢ）、顕性ＨＦ（ステージＣ）、そして進行性ＨＦ（ステージＤ）を含む。様々な実施形態において、対象は、ＧＩ及び尿路系の関与を更に含む、血管機能不全を含む平滑筋ミオパチーに罹患している。
【００７７】
幾つかの実施形態では、対象は、上記の年齢群の１つ等上記の１つ以上であり、心筋症及び／又は心不全に罹患及び／又は診断されている。これには、例えば、心不全ではなく、３歳〜１１歳で心筋症に罹患した及び／又は診断された対象が含まれる。
【００７８】
他の実施形態において、治療有効量の組成物を投与することは、単回用量で約１×１０５個〜約１×１０８個以上のＣＤＣを含む。別の例では、投与されるＣＤＣの数としては、エキソソーム投薬量の別のベースラインとして、冠動脈当たり２５００万個のＣＤＣ（すなわち、合計７５００万個のＣＤＣ）が含まれる。様々な実施形態において、ＣＤＣの数は、エキソソーム投薬量の別のベースラインとして、単回用量に１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、１×１０９個のＣＤＣを含む。特定の例では、これは体重に案分されてもよい（１０００００ＣＤＣ／ｋｇ体重〜１Ｍ  ＣＤＣ／ｋｇ体重の範囲の総ＣＤＣ用量）。様々な実施形態において、投与は、２回、３回、４回、４回以上等の連続的に適用される用量の反復投薬であってもよい。
【００７９】
他の実施形態では、治療有効量の組成物の投与には、動脈内及び静脈内の注入を含む注入が含まれる。他の実施形態では、注入は全身送達をもたらす。他の実施形態では、注入は、治療有効量のエキソソームを体内の１つ以上の場所に送達することができる。他の実施形態において、注入は、治療有効用量のエキソソームを平滑筋組織又は骨格筋組織に送達することができる。他の実施形態では、治療有効量の組成物の投与には注射が含まれる。他の実施形態では、注射は、心筋内注射、心臓腔及び心内腔、ならびにそれらに関連する血管を含む、心臓への注射を含む。他の実施形態では、心臓、心臓腔及び心内腔、それらに関連する血管への注射は、平滑筋又は骨格筋組織に治療的に有効な投薬量のエキソソームを送達することができる。他の実施形態では、注射は骨格筋注射を含む。他の実施形態では、注射は腹腔内注射を含む。他の実施形態では、注射は経皮注射を含む。
【００８０】
他の実施形態では、対象の治療は、ジストロフィン発現の増加をもたらす。他の実施形態では、ジストロフィン発現の増加は骨格筋で起こる。これには、ヒラメ筋等の四肢の骨格筋が含まれる。他の実施形態において、ジストロフィン発現の増加は横隔膜で生じる。他の実施形態において、対象の治療は、線維化の減少、炎症の減少、及び／又はミトコンドリア機能の増加をもたらす。他の実施形態では、線維化の減少には、コラーゲン蓄積の減少が含まれる。他の実施形態では、コラーゲンにはコラーゲンＩ及び／又はコラーゲンＩＩＩが含まれる。他の実施形態において、炎症の減少には、細胞質核因子（赤血球由来２）様２（Ｎｒｆ２）の増加、脂肪酸過酸化最終産物の減少、炎症細胞の数の減少、及び／又は抗酸化物質の発現亢進が含まれる。他の実施形態では、抗酸化剤には、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２（ＳＯＤ−２）、及びグルタミン酸システインリガーゼ触媒（ＧＣＬＣ）サブユニットが含まれる。他の実施形態では、炎症細胞には、ＣＤ６８＋マクロファージ及びＣＤ３＋Ｔ細胞が含まれる。他の実施形態では、ミトコンドリア機能の増加には、ミトコンドリア超微細構造の増加及び／又はミトコンドリア生合成の増加が含まれる。他の実施形態では、ミトコンドリア機能の増加には、核ＰＰＡＲ−γコアクチベーター−１（ＰＧＣ−１）発現の増加が含まれる。
【００８１】
様々な実施形態において、ＣＤＣは、外植片へと培養された生検サンプルから生成され、外植片由来細胞に更に培養され、更に心筋球形成細胞として培養され、その後心筋球として培養され、続いて培養される。他の実施形態では、ＣＤＣはヒトのものである。様々な実施形態において、ＣＤＣは、ジストロフィン異常症に罹患した対象から得られた生検サンプルから生成される。
【００８２】
他の実施形態では、対象の治療は、骨格筋組織の機能改善を含む、対象の機能改善を評価することを更に含む。様々な実施形態において、機能改善には、収縮強度の増加、歩行能力の改善、座位から立ち上がる能力の改善、臥位若しくは背臥位から座る能力の改善、並びにマウスのポインティング及び／又はクリック等の手先の器用さの改善の１つ以上が含まれる。他の実施形態では、対象の治療は、神経損傷の治療に応答する認知、肺損傷の治療に応答する血液酸素移行、及び損傷した免疫学的関連組織の治療に応答する免疫機能を評価することを更に含む。
【００８３】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるのは、対象から生検標本を単離し、外植片として生検標本を培養し、外植片由来細胞（ＥＤＣ）を生成し、ＥＤＣを心筋球に培養し、心筋球由来細胞（ＣＤＣ）の形成を誘導することを含む方法である。他の実施形態では、この方法は、ＣＤＣを対象に投与することを含む。他の実施形態では、本方法は、ＣＤＣからエキソソームを単離すること、及びＣＤＣ由来エキソソームを対象に投与することを含む。種々の実施形態において、外植片として生検標本を培養することは、生検標本を細かく刻み、フィブロネクチン被覆容器上で培養することを含む。様々な実施形態において、ＥＤＣの生成には、外植片から細胞を単離することが含まれる。様々な実施形態において、外植片から単離された細胞には、緩く付着した細胞及び／又は間質様細胞が含まれる。様々な実施形態において、ＥＤＣを心筋球に培養することは、ポリ−Ｄ−リジンプレート上でＥＤＣを培養することを含む。種々の実施形態において、ＣＤＣの形成には、フィブロネクチン被覆容器上で剥離された心筋球を培養することが含まれる。ＣＤＣ生成のための更なる例及び実施形態は、米国特許出願公開第６，２１７，４１５号に記載されており、参照することにより完全に本明細書の一部をなす。様々な実施形態において、ＣＤＣ由来エキソソームを単離することは、本明細書に記載される技術のいずれかの使用を含む。様々な実施形態において、ＣＤＣを対象に投与することは、本明細書に記載される技術のいずれかの使用を含む。様々な実施形態において、ＣＤＣ又はＣＤＣ由来エキソソームを対象に投与することは、本明細書に記載される技術のいずれかの使用を含む。様々な実施形態において、生検標本は、ＣＤＣ又はＣＤＣ由来エキソソームを投与された同じ対象から単離される。様々な実施形態において、生検標本は、ＣＤＣ由来エキソソームを投与される対象とは異なる対象から単離される。様々な実施形態において、対象は慢性筋肉疾患に罹患している。他の実施形態では、慢性筋疾患にはジストロフィン異常症が含まれる。他の実施形態において、ジストロフィン異常症は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである。他の実施形態において、ジストロフィン異常症は、ベッカー型筋ジストロフィーを含む。様々な実施形態において、慢性筋疾患に罹患している対象は、１８歳未満の小児対象である。様々な実施形態において、対象は１２歳未満の思春期前の対象である。
【００８４】
幾つかの実施形態では、ＣＤＣ由来エキソソーム（例えば、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、又は以前は機能が不明の小さな１１５ヌクレオチドＲＮＡであるｓｒＤＭＤ）に見られる非コードＲＮＡ種の送達は、ＣＤＣ及びＣＤＣ由来エキソソームの能力を模倣して、転写産物の長さやエクソン／イントロン接合に影響を与えることなく、ジストロフィンのタンパク質レベルを増加させる。幾つかの実施形態では、これらの非コードＲＮＡは、心臓及び骨格筋のジストロフィンを回復することにより、デュシェンヌ型筋ジストロフィーを改善する。幾つかの実施形態では、本明細書に開示されるのは、ジストロフィンを置き換えて、ジストロフィン欠失の病態生理学的結果を相殺することができる因子である。幾つかの実施形態では、該因子は、ジストロフィン発現に影響を与えるためにレシピエント細胞に移行されて、初めて、ＤＭＤの治療選択肢として核酸を確立するｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及びｓｒＤＭＤの１つ以上を含む。
【００８５】
幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、その配列が、本明細書で他に言及されるマイクロＲＮＡ又は短い非コードＲＮＡに対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるものが使用される。本明細書で使用される場合、「同一」（すなわち、「配列同一性」）という用語は、２つのポリヌクレオチド配列が比較のウインドウに亘り（すなわち、ヌクレオチド毎に）同じであることを意味する。配列同一性のパーセンテージ（すなわち、「Ｘ％同一」、「同一性パーセント」である配列）を参照する場合、「同一」のパーセンテージは、比較のウインドウにわたって最適に配列された配列を含む２つの整列された配列を比較し、一致する位置の数を得るために、両方の配列で同一の核酸塩基（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、又はＩ）が生じる位置の数を決定し、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数（すなわち、ウインドウサイズ）で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性の割合を求めることによって計算される。幾つかの実施形態では、少なくとも１５ヌクレオチド位置、頻繁には、少なくとも１５個〜５０個、５０個〜１００個、又は１００個以上のヌクレオチドのウインドウに亘る比較ウインドウであって、配列同一性のパーセンテージは、参照配列を目的のポリヌクレオチド配列と比較することにより計算される。幾つかの実施形態では、参照と目的のポリヌクレオチド配列の不連続セグメントを含む目的のポリヌクレオチド配列との間の１つ以上の比較ウインドウを組み合わせ、転座を説明する配列同一性のパーセンテージを計算してもよい。幾つかの実施形態では、目的のポリヌクレオチド配列は、比較のウインドウに亘って参照配列の合計２０パーセント以下の欠失又は付加を含んでもよい。幾つかの実施形態において、本発明のマイクロＲＮＡは、少なくとも、最大で、又は約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の追加のヌクレオチドを、５’末端、３’末端、又は５’と３’の両方の末端に含んでもよい。これには、例えば、５’末端又は３’末端にＧＣＧが追加されたＧＣＧ改変ｍｉＲ−１４８ａの追加が含まれる。
【００８６】
幾つかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、本明細書の他の箇所で開示される１つ以上のベクターにコードされる。幾つかの実施形態では、１つ以上のベクターは、遺伝子送達ビヒクルを介して細胞に導入される。幾つかの実施形態では、送達媒体は、アデノウイルスベクター等のウイルスベクター及び（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）を含む。幾つかの実施形態では、送達媒体は発現ベクター及び送達媒体を含む。幾つかの実施形態では、ポリヌクレオチドは放出因子又はリボソーム自体に作用することができる。幾つかの態様において、１つ以上のポリヌクレオチドは、ジストロフィン転写物のリードスルーを増強することができる。
【００８７】
幾つかの実施形態では、治療用組成物はＣＤＣ、ＣＤＣ−ＸＯ、及び／又はＣＤＣ−ＥＶを含むことができるが、他の実施形態では、治療用組成物はＣＤＣ及び／又は小胞を欠いてもよく、代わりに有効量のＲＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドをコードするベクターを含む組成物を含む。幾つかの実施形態では、ＲＮＡ治療薬の有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。幾つかの実施形態では、治療有効量は単一の単位用量である。幾つかの実施形態では、有効量には、０．１ｎＭ〜１０Ｍの範囲の濃度が含まれる。幾つかの実施形態では、濃度は０．３ｎＭ〜４００ｎＭ、及び／又は１ｎＭ〜２００ｎＭの範囲である。幾つかの実施形態では、有効量は、例えば、心筋及び骨格筋組織を含む１つ以上の組織におけるジストロフィン発現を増加させることができる量を含む。幾つかの実施形態では、短い非コードＲＮＡ及びマイクロＲＮＡは、少なくとも、最大で、又は約６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、５０個、１００個、１５０個、又は２００個のヌクレオチド（その間で導かれ得る全ての整数又は範囲、並びに上述の値を含む及び／若しくはそれに及ぶ範囲を含む）の長さのＲＮＡポリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、本明細書に開示される任意の投与と同様に、投薬レジメンにおける治療有効量の投与は、治療される対象に依存し、患者のサイズに基づいて外挿されてもよい（マウスモデルから外挿して、より大きな患者では増加され、より小さな患者では減少される、（マウスの用量に、少なくとも約１５００、２０００、２５００、３０００、又はそれに等しい、及び／又は上記の値を含む及び／又はそれに及ぶ範囲の係数を掛ける等）。幾つかの実施形態では、投薬レジメンにおける投与は、単回投薬であってもよく、又は１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、及び／又は１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間以上、及び／又は１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日以上の期間に亘る投薬の頻回投与であってもよい。幾つかの実施形態において、投与は、製剤及び／又は投与様式により実施される、時間放出又は持続放出機構によるものであってもよい。
【００８８】
幾つかの実施形態では、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドは生物活性を持つ。幾つかの実施形態では、生物活性は、目的のペプチド又はタンパク質の翻訳のリードスルーの増強を含んでもよい。これには、例えば、異種発現システムでのペプチド又はタンパク質の発現を使用した生物活性の評価が含まれる。幾つかの実施形態では、ジストロフィン−ｅＧＦＰ等の異種発現融合タンパク質システムを使用して、生物活性を評価するための翻訳リードスルーの増強の尺度として野生型又は突然変異タンパク質を細胞にトランスフェクトしてもよい。幾つかの実施形態では、生物活性は、野生型又は突然変異タンパク質と比較した場合、ビヒクルのみに対して正規化された蛍光のパーセンテージとして評価され得る。幾つかの実施形態では、Ｇ４１８は陽性対照としての役割を果たす。幾つかの実施形態では、生物活性を評価するための蛍光のパーセンテージには、変異体と比較して蛍光シグナルの約１０％〜２５％、２５％〜５０％、５０％〜７５％、７５％〜１００％又は１００％の増加が含まれる。幾つかの実施形態では、生物活性を評価するための蛍光のパーセンテージには、野生型ペプチド若しくはタンパク質発現、又はＧ４１８陽性対照の蛍光の０％〜２５％、２５％〜５０％、５０％〜７５％、７５％〜１００％又は１００％、が含まれる。
【００８９】
幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチド組成物の投与には、動脈内、静脈内、及び心筋内の注入を含む注入が含まれる。幾つかの実施形態では、組成物の投与には注射が含まれる。幾つかの実施形態では、注入は、心筋内注入、心臓腔及び心内腔、それに関連する血管を含む、心臓への注入を含む。幾つかの実施形態では、注射は骨格筋注射を含む。幾つかの実施形態では、注射には腹腔内注射が含まれる。幾つかの実施形態では、注射には経皮注射が含まれる。幾つかの実施形態では、組成物の投与には吸入が含まれる。
【００９０】
幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチド組成物による対象の治療は、ジストロフィン発現の増加をもたらす。幾つかの実施形態では、ジストロフィン発現の増加は骨格筋で起こる。幾つかの実施形態では、これには、ヒラメ筋等の四肢の骨格筋が含まれる。幾つかの実施形態では、ジストロフィン発現の増加は横隔膜で生じる。幾つかの実施形態では、対象の治療は、線維化の減少、炎症の減少、及び／又はミトコンドリア機能の増加をもたらす。幾つかの実施形態では、線維化の減少には、コラーゲン蓄積の減少が含まれる。幾つかの実施形態では、コラーゲンにはコラーゲンＩ及び／又はコラーゲンＩＩＩが含まれる。幾つかの実施形態では、炎症の減少には、細胞質核因子（赤血球由来２）様２（Ｎｒｆ２）の増加、脂肪酸過酸化最終産物の減少、炎症細胞の数の減少、及び／又は抗酸化物質の発現のアップレギュレーションが含まれる。幾つかの実施形態では、抗酸化剤には、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２（ＳＯＤ−２）、及びグルタミン酸システインリガーゼ触媒（ＧＣＬＣ）サブユニットが含まれる。幾つかの実施形態において、炎症細胞には、ＣＤ６８＋マクロファージ及びＣＤ３＋Ｔ細胞が含まれる。幾つかの実施形態では、ミトコンドリア機能の増加には、ミトコンドリア超微細構造の増加及び／又はミトコンドリア生合成の増加が含まれる。幾つかの実施形態では、ミトコンドリア機能の増加には、核ＰＰＡＲ−γコアクチベーター−１（ＰＧＣ−１）発現の増加が含まれる。
【００９１】
幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドによる対象の治療は、骨格筋組織の機能改善を含む、対象の機能改善を更に含む。幾つかの実施形態では、機能的改善には、収縮力の増加、歩行能力の改善、座位から立ち上がる能力の改善、臥位若しくは背臥位から座る能力の改善、並びにマウスのポインティング及び／又はクリック等の手先の器用さの改善等の１つ以上が含まれる。幾つかの実施形態では、対象の治療は、神経損傷の治療に応答する認知、肺損傷の治療に応答する血液酸素移行、及び損傷した免疫学的関連組織の治療に応答する免疫機能の改善を更に含む。
【００９２】
幾つかの実施形態では、本明細書において他に開示されるように、本明細書に記載されるのは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上のＲＮＡポリヌクレオチド等の１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含むＲＮＡポリヌクレオチド組成物である。幾つかの態様において、組成物は、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上のＲＮＡポリヌクレオチド等の１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドを含む。幾つかの態様において、ＲＮＡには非コードＲＮＡが含まれる。幾つかの態様において、非コードＲＮＡには、とりわけ、それらの断片を更に含む、ｔＲＮＡ、ｙＲＮＡ、ｒＴＮＡ、ｍｉｒＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡが含まれる。幾つかの態様において、１つ以上のＲＮＡポリヌクレオチドはマイクロＲＮＡである。幾つかの態様において、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−２１５、ｍｉＲ−３３ａ、ｍｉＲ２０４、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ４５３２、ｍｉＲ−４７４２、ｍｉＲ−５８２、ｍｉＲ−６２９、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−３１２５、ｍｉＲ−３６７７、ｍｉＲ−３７６ｂ、ｍｉＲ−４４４９、ｍｉＲ−４７７３、ｍｉＲ−４７８７、ｍｉＲ−４９１、ｍｉＲ−４９５、ｍｉＲ−５００ａ、ｍｉＲ−５４８ａｈ、ｍｉＲ−５５０、ｍｉＲ−５４８ａｈ、ｍｉＲ−５５０ａ、ｍｉＲ−５５１ｎ、ｍｉＲ−５５８１、ｍｉＲ−６１６、又は図２９に濃縮されると示される他のマイクロＲＮＡからなる群から選択される。幾つかの態様において、マイクロＲＮＡは、マイクロＲＮＡ  ｍｉＲ−１４６ａ、ｍｉＲ１４８ａ、ｍｉＲ−２２、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２１０、ｍｉＲ−１５０、ｍｉＲ−１４０−３ｐ、ｍｉＲ−１９ａ、ｍｉＲ−２７ｂ、ｍｉＲ−１９ｂ、ｍｉＲ−２７ａ、ｍｉＲ−３７６ｃ、ｍｉＲ−１２８、ｍｉＲ−３２０ａ、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−１３０ａ、ｍｉＲ−９、ｍｉＲ−１８５、及びｍｉＲ−２３ａからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１４８ａ−３ｐを含む。幾つかの実施形態では、エキソソームは、ＤＭＤに由来する小さな非コードＲＮＡ、すなわちｓｒＤＭＤを含む。幾つかの態様において、１つ以上のポリヌクレオチドは、対象のジストロフィン発現を増加させることができる。幾つかの実施形態において、１つ以上のポリヌクレオチド又は１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターは、薬学的に受容可能な担体を添加することにより、薬学的に活性な混合物又は組成物に組み込まれ得る。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、１つ以上のポリヌクレオチド及び／又は１つ以上のポリヌクレオチドをコードするウイルスベースのベクターと、薬学的に許容可能な担体とを含む。幾つかの態様において、１つ以上のポリヌクレオチド及び／又は１つ以上のポリヌクレオチドをコードするベクターと、薬学的に許容される担体又は賦形剤とを含む医薬組成物は、１つ以上のポリヌクレオチドを送達する複合体、小胞及び／又はリポソームを形成可能な賦形剤、及び／又は細胞膜を通して小胞若しくはリポソームに複合化又は捕捉されたオリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、賦形剤は、ポリエチレンイミン及び誘導���、又はポリプロピレンイミン又はポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）及び誘導体を含む類似のカチオン性ポリマー、合成両親媒性物質、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、かかる１つ以上のポリヌクレオチドを送達できる粒子への自己集合が可能である、ＤＯＴＡＰ及び／又はウイルスキャプシドタンパク質の１つ以上を含む。
【００９３】
幾つかの態様において、１つ以上のポリヌクレオチドの濃度は０．１ｎＭ〜１０Ｍの範囲である。様々な実施形態において、濃度は、０．３ｎＭ〜４００ｎＭ、１ｎＭ〜２００ｎＭより多く及び／又はその間の範囲である。幾つかの態様において、１つ以上のポリヌクレオチドは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、及び／又は０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で使用され得る。幾つかの実施形態では、１つ以上のポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの総濃度又は添加された各ポリヌクレオチドの濃度を指す濃度を含む。
【００９４】
幾つかの実施形態では、本明細書において他に記載されるように、ＲＮＡポリヌクレオチドはマイクロＲＮＡ（及び／又はマイクロＲＮＡの組み合わせ）である。幾つかの態様において、マイクロＲＮＡにはｍｉＲ−１４８ａが含まれる。幾つかの実施形態において、ｍｉＲ−１４８ａマイクロＲＮＡは、以下の配列５’ＧＡＧＧＣＡＡＡＧＵＵＣＵＧＡＧＡＡＣＡＣＵＧＣＧＡＣＵＣＵＧＡＧＵＡＵＧＡＵＡＧＡＡＧＵＣＡＧＵＧＣＡＣＵＡＣＡＧＡＡＣＵＵＵＧＵＣＵＣ３’［配列番号１］を有する。幾つかの実施形態では、マイクロＲＮＡを接尾辞「５Ｐ」又は「３Ｐ」によって表すことができ、「５Ｐ」は成熟マイクロＲＮＡが前駆体の５’末端に由来することを示し、対応する「３Ｐ」は前駆体の３’末端に由来することを示す。幾つかの実施形態では、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１４８−５ｐを含み、その配列は５’ＡＡＡＧＵＵＣＵＧＡＧＡＣＡＣＵＣＣＧＡＣＵ３’［配列番号２］である。幾つかの実施形態では、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１４８ａ−３ｐを含み、その配列は５’ＵＣＡＧＵＧＣＡＣＵＡＣＡＧＡＡＣＵＵＵＧＵ３’［配列番号３］である。様々な実施形態において、マイクロＲＮＡは、その配列がｍｉＲ−１４８ａ、ｍｉＲ−１４８−５ｐ及び／又はｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、及び／又は前述のいずれかの断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＲＮＡポリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、例えば、少なくとも１５ヌクレオチド位置、頻繁には、少なくとも１５個〜５０個、５０個〜１００個、又は１００個以上のヌクレオチドのウインドウに亘る比較ウインドウであって、配列同一性のパーセンテージは、参照配列を目的のポリヌクレオチド配列と比較することにより計算される。幾つかの実施形態では、参照と目的のポリヌクレオチド配列の不連続セグメントを含む目的のポリヌクレオチド配列との間の１つ以上の比較ウインドウを組み合わせ、転座を説明する配列同一性のパーセンテージを計算してもよい。幾つかの実施形態では、目的のポリヌクレオチド配列は、比較のウインドウに亘って参照配列の合計２０パーセント以下の欠失又は付加を含んでもよい。幾つかの実施形態において、本発明のマイクロＲＮＡは、少なくとも、最大で、又は約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又はそれ以上の追加のヌクレオチドを、５’末端、３’末端、又は５’と３’の両方の末端に含んでもよい。これには、例えば、５’末端又は３’末端にＧＣＧが追加されたＧＣＧ改変ｍｉＲ−１４８ａの追加が含まれる。
【００９５】
幾つかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは、配列５’ＵＧＵＡＣＡＣＡＧＡＧＧＣＵＧＡＵＣＧＡＵＵＣＵＣＣＣＵＧＡＡＣＡＧＣＣＵＡＵＵＡＣＧＧＡＧＧＣＡＣＵＧＣＡＧＡＵＣＡＡＧＣＣＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＧＧＵＧＧＡＧＵＵＵＣＡＡＧＡＧＵＣＣＣＵＵＣＣＵＧＧＵＵＣＡＣＣＧＵＣＵＣＣＵＵＵ３’［配列番号４］であるデュシェンヌ型ジストロフィー（ｄｙｓｒｏｐｈｙ）（ＤＭＤ）に由来する短い非コードＲＮＡ、すなわちｓｒＤＭＤである。
【００９６】
幾つかの実施形態では、短い非コードＲＮＡは、その配列がｓｒＤＭＤ及び／又はその断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＲＮＡポリヌクレオチドを含む。これには、例えば、配列が５’ＵＧＵＡＣＡＣＧＧＵＧＧＡＧＵＵＵＣＡＡＧＡＧＵＣＣＣＵＵＣＣＵＧＧＵＵＣＡＣＣＧＵＣＵＣＣＵＵＵＡＧＡＧＧＣＵＧＡＵＣＧＡＵＵＣＵＣＣＣＵＧＡＡＣＡＧＣＣＵＡＵＵＡＣＧＧＡＧＧＣＡＣＵＧＣＡＧＡＵＣＡＡＧＣＣＣＧＣＣＵＧＧＡ３’［配列番号５］であるｓｒＤＭＤの１１３ヌクレオチド長バリアント（ｓｒＤＭＤバリアント）が含まれる。別の例には、５’ＵＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＵＧＡＵＣＧＡＵＵＣＵＣＣＣＵＧＡＡＣＡＧＣＣＵＣＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＣＵＧＣＡＧＡＵＣＡＡＧＣＣＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＧＧＵＧＧＡＧＵＵＵＣＡＡＧＡＧＵＣＣＣＵＵＣＣＵＧＧＵＵＣＡＣＣＧＵＣＵＣＣＵＵＵ３’［配列番号６］であるｓｒＤＭＤ変異体が含まれる。幾つかの実施形態において、マイクロＲＮＡを含む短い非コードＲＮＡは、少なくとも、又は最大で１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２、個３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５１個、５２個、５３個、５４個、５５個、５６個、５７個、５８個、５９個、６０個、６１個、６２個、６３個、６４個、６５個、６６個、６７個、６８個、６９個、７０個、７１個、７２個、７３個、７４個、７５個、７６個、７７個、７８個、７９個、８０個、８１個、８２個、８３個、８４個、８５個、８６個、８７個、８８個、８９個、９０個、９１個、９２個、９３個、９４個、９５個、９６個、９７個、９８個、９９個、１００個、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個、１０６個、１０７個、１０８個、１０９個、１１０個、１１１個、１１２個、１１３個、１１４個、１１５個、１１６個、１１７個、１１８個、１１９個、１２０個、１２１個、１２２個、１２３個、１２４個、１２５個、１２６個、１２７個、１２８個、１２９個、１３０個、１４０個、１４５個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個以上（その間で導かれ得る全ての整数又は範囲を含む）の残基長の長さを含む。幾つかの実施形態では、マイクロＲＮＡを含む短い非コードＲＮＡは、少なくとも、最大で、又は約６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、５０個、１００個、１５０個、又は２００個のヌクレオチド（その間で導かれ得る全ての整数又は範囲を含む）の長さのＲＮＡポリヌクレオチドを指す。
【００９７】
幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは生物活性を有する。幾つかの実施形態では、生物活性は、目的のペプチド又はタンパク質の翻訳のリードスルーの増強を含んでもよい。これには、例えば、異種発現系でのペプチド又はタンパク質の発現を使用した生物活性の評価が含まれる。例えば、ジストロフィン−ｅＧＦＰ等の異種発現融合タンパク質システムを使用して、生物活性を評価するための翻訳リードスルーの増強手段として、野生型の又は変異体タンパク質を細胞にトランスフェクトすることができる。様々な実施形態において、生物活性は、野生型又は変異体タンパク質と比較した場合、ビヒクルのみに対して正規化された蛍光のパーセンテージとして評価されてもよい。様々な実施形態において、Ｇ４１８は陽性対照としての役割を果たす。様々な実施形態において、生物活性を評価するための蛍光のパーセンテージは、変異体と比較して蛍光シグナルの約１０％〜２５％、２５％〜５０％、５０％〜７５％、７５％〜１００％又は１００％以上の増加を含む。様々な実施形態において、生物活性を評価するための蛍光のパーセンテージには、野生型ペプチド若しくはタンパク質発現、Ｇ４１８陽性対照の蛍光の０％〜２５％、２５％〜５０％、５０％〜７５％、７５％〜１００％又は１００％が含まれる。
【００９８】
幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは合成のものである。例えば、核酸は、リン酸トリエステル、亜リン酸、又はホスホルアミダイト化学及び固相技術により合成され得る。様々な実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドは組換え法で産生される。例えば、これにはベクター（ウイルス及び非ウイルス）、プラスミド、コスミド、及び（大量の所望のＲＮＡ分子を生成するため）宿主細胞等の細胞に核酸を送達するためのその他のビヒクルの使用が含れる。
【００９９】
幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドをコードするベクターは、アデノウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルスベクター）等のウイルスベクターである。様々な実施形態において、ベクターは非ウイルス発現ベクターである。
【０１００】
幾つかの実施形態では、ＲＮＡの有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、及び／又は０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。幾つかの実施形態では、治療有効量は単一の単位用量である。幾つかの実施形態では、ＲＮＡの有効量には、０．１ｎＭ〜１０Ｍの間の範囲の濃度が含まれる。幾つかの態様において、ＲＮＡの濃度は０．３ｎＭ〜４００ｎＭ、又は１ｎＭ〜２００ｎＭの範囲である。幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチド又はベクターは、添加されるＲＮＡポリヌクレオチド又はベクターの総濃度を指す濃度を含む。幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡベクターの量は、特定の結果に対して有効な量であり、特定の細胞特性（複数の場合もある）を誘導する等、所望の目標を達成するために必要な量を指す。様々な実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドの有効量には、例えば心筋及び骨格筋組織を含む１つ以上の組織におけるジストロフィン発現を増加させることができる量が含まれる。
【０１０１】
幾つかの実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドをコードするベクターは、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を添加することにより、薬学的に活性な混合物又は組成物に組み込まれる。幾つかの実施形態では、医薬組成物は、ＲＮＡポリヌクレオチド及び／又はＲＮＡポリヌクレオチドをコードするウイルスベースのベクター及び薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を含む。幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチド及び／又はＲＮＡポリヌクレオチドをコードするベクター、及び薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む医薬組成物は、ＲＮＡポリヌクレオチドを送達する複合体、小胞及び／又はリポソームを形成できる賦形剤、及び／又は細胞膜をにより小胞又はリポソームに複合化若しくは捕捉されたオリゴヌクレオチドを含む。これらの賦形剤の多くは当業者に知られており、ポリエチレンイミン及び誘導体、又はポリプロピレンイミン又はポリエチレンイミンコポリマー（ＰＥＣ）及び誘導体を含む類似のカチオン性ポリマー、合成両親媒性物質、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標）、かかるＲＮＡポリヌクレオチドを送達できる粒子への自己集合が可能である、ＤＯＴＡＰ及び／又はウイルスキャプシドタンパク質を含む。他の実施形態において、ＲＮＡポリヌクレオチドはエキソソーム内に含まれる。幾つかの態様において、エキソソーム内に含まれるＲＮＡポリヌクレオチドは、細胞に由来するエキソソーム内のＲＮＡポリヌクレオチドと比較して濃縮されている。幾つかの実施形態において、濃縮は、細胞に由来するエキソソーム内のＲＮＡポリヌクレオチドと比較した場合、１０％〜１００％、１００％〜２００％、２００％〜４００％、４００％〜１０００％高いレベルのＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。
【０１０２】
幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドをコードするベクターを投与することを含む、慢性筋疾患を治療する方法が提供される。幾つかの実施形態では、組成物の投与は、対象の慢性筋疾患を治療する。幾つかの実施形態では、慢性筋疾患はジストロフィン異常症である。幾つかの実施形態では、ジストロフィン異常症はデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。幾つかの実施形態では、ジストロフィン異常症はベッカー型筋ジストロフィーである。幾つかの態様において、ＲＮＡポリヌクレオチドはマイクロＲＮＡである。様々な実施形態において、マイクロＲＮＡはｍｉＲ−１４８ａ［配列番号１］を含む。一部の実施形態では、マイクロＲＮＡは、ｍｉＲ−１４８−５ｐ［配列番号２］、及び／又はｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ［配列番号３］を含む。幾つかの実施形態では、マイクロＲＮＡは、その配列が、ｍｉＲ−１４８ａ［配列番号１］及び／又はその断片（例えば、［配列番号２］、［配列番号３］）に対して、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一（すなわちパーセント同一性）であるＲＮＡポリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、マイクロＲＮＡは、少なくとも、多くても、又は約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上のヌクレオチドの５’、３’、又は５’と３’の両方の末端の追加のヌクレオチドを含んでもよい。これには、例えば、５’末端又は３’末端にＧＣＧが付加されたＧＣＧ修飾ｍｉＲ−１４８ａの追加が含まれる。幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチドは、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ｄｙｓｒｏｐｈｙ）（ＤＭＤ）由来の短い非コードＲＮＡ、ｓｒＤＭＤである。幾つかの態様において、短い非コードＲＮＡは、その配列が、ｓｒＤＭＤ［配列番号４］及び／又はその断片に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるＲＮＡポリヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、短い非コードＲＮＡには、ｓｒＤＭＤ変異体［配列番号５］及び／又はｓｒＤＭＤ変異体［配列番号６］が含まれる。
【０１０３】
幾つかの実施形態では、組成物の投与には、有効量のＲＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドをコードするベクターを含む組成物が含まれる。幾つかの実施形態では、ＲＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドをコードするベクターの有効量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、及び／又は０．５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲である。幾つかの実施形態では、治療有効量は単一の単位用量である。幾つかの実施形態では、有効量には、０．１ｎＭ〜１０Ｍの範囲の濃度が含まれる。幾つかの実施形態では、濃度は０．３ｎＭ〜４００ｎＭ、及び／又は１ｎＭ〜２００ｎＭの範囲である。幾つかの実施形態では、有効量は、例えば、心筋及び骨格筋組織を含む１つ以上の組織におけるジストロフィン発現を増加させることができる量を含む。幾つかの実施形態では、短い非コードＲＮＡ及びマイクロＲＮＡは、少なくとも、最大で、又は約６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、５０個、１００個、１５０個、又は２００個のヌクレオチド（その間で導かれ得る全ての整数又は範囲を含む）の長さのＲＮＡポリヌクレオチドを含む。
【０１０４】
幾つかの実施形態では、投薬レジメンにおける治療有効量の投与は、治療される対象に依存する。幾つかの実施形態では、投薬レジメンにおける投与は、単回投与、又は１０分、２０分、３０分、４０分、５０分、６０分、及び／又は１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間以上、及び／又は１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日以上に及ぶ期間に亘る投与の複数回投与であってもよい。さらに、投与は、製剤及び／又は投与様式により実施される、時間放出又は持続放出メカニズムによるものであってもよい。
【０１０５】
幾つかの実施形態では、組成物の投与には、動脈内、静脈内、及び心筋内の注入を含む注入が含まれる。幾つかの実施形態では、組成物の投与には注射が含まれる。幾つかの実施形態では、注射は、心筋内注射、心臓腔及び心内腔、それに関連する血管を含む、心臓への注射を含む。幾つかの実施形態では、注射は骨格筋注射を含む。幾つかの実施形態では、注射には腹腔内注射が含まれる。幾つかの実施形態では、注射には経皮注射が含まれる。幾つかの実施形態では、組成物の投与には吸入が含まれる。
【０１０６】
幾つかの実施形態において、対象の治療は、ジストロフィン発現の増加をもたらす。幾つかの実施形態において、ジストロフィン発現の増加は骨格筋で起こる。幾つかの実施形態では、これには、ヒラメ筋等の四肢の骨格筋が含まれる。他の実施形態において、ジストロフィン発現の増加は横隔膜で生じる。幾つかの実施形態では、対象の治療は、例えばジストロフィンを含むタンパク質のリードスルー翻訳の増強をもたらす。幾つかの実施形態では、対象の治療は、骨格筋組織の機能改善を含む、対象の機能改善を評価することを更に含む。幾つかの実施形態では、機能的改善には、収縮力の増加、歩行能力の改善、座位から立ち上がる能力の改善、臥位若しくは背臥位から座る能力の改善、並びにマウスのポインティング及び／又はクリック等の手先の器用さの改善等の１つ以上が含まれる。幾つかの実施形態では、対象の治療は、神経損傷の治療に応答する認知、肺損傷の治療に応答する血液酸素移行、及び損傷した免疫学的関連組織の治療に応答する免疫機能を評価することを更に含む。
【実施例】
【０１０７】
本明細書の実施形態は、ＣＤＣ及びＣＤＣ由来ＸＯが、ｍｄｘマウスにおいて、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの重要な病態生理学的特徴を回復させるため使用され得ることを実証する。ヒトＣＤＣによって分泌されるエキソソームは、ｍｄｘマウスにおいてＣＤＣの利益を再現し、ヒトデュシェンヌ型心筋細胞におけるカルシウムサイクリング及びミトコンドリア呼吸の異常を回復させる。ＣＤＣ及びそれらのエキソソームはいずれも、ｍｄｘマウスにおいて心機能を改善する；ＣＤＣの単回注射は、最大運動能力を増加させ、生存率を改善するのに十分である。ＣＤＣ由来エキソソーム（例えばｍｉＲ−１４８ａ）で見出された非コーディングＲＮＡ種の送達は、転写産物の長さ又はエクソン／イントロン接合に影響することなく、ＣＤＣ及びＣＤＣ由来エキソソームの能力を模倣してジストロフィンタンパク質レベルを増加させる。よって、ＣＤＣ及びＣＤＣ由来エキソソームは、シグナル伝達分子のエキソソーム媒介輸送を介してデュシェンヌ型筋ジストロフィーの特徴を改善する。
実施例１
動物研究
【０１０８】
本発明者らは、１０カ月齢からＤＭＤ（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ−Ｄｍｄｍｄｘ／Ｊ）のｍｄｘマウスモデル、及び野生型系統適合マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎＪ野生型マウス心臓）（米国のＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を研究した。ＣＤＣ移植のプロセスを最適化するため、予備の用量応答実験を行ったところ、有効用量として１回目の注射に１×１０５個の細胞、及び２回目の注射に１×１０４個の細胞（１回目の注射後３カ月）を確認し、虚血及び非虚血のマウスモデルにおける先の用量決定実験と一致した。合計１×１０５細胞／４０μＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ：１回目の注射）、又は１×１０４細胞／４０μＬ  ＰＢＳ（２回目の注射）、又はＰＢＳ単独を記載される通り４部位に等しく分けた左心室（ＬＶ）心筋に注射した。ＬＶを３つの区域：心底部、中央部及び心尖部に視覚的に分け、心底部に１回の注射、中央部に２回の注射及び心尖部に１回の注射を行った。１０カ月齢のＣＤＣ／ｍｄｘ及びビヒクル／ｍｄｒマウスをＣＤＣ（Ｍｄｘ＋ＣＤＣ、ｎ＝１２）又はビヒクル［プラセボ：Ｍｄｘ＋ビヒクル（ＰＢＳ）、ｎ＝１２］で、それぞれ２回（３カ月間隔）注射した。開胸術の間に２８−１／２ゲージ針により注射を行った。動物が全身麻酔（デクスメデトミジン（０．５ｍｇ／ｋ）／ケタミン（７５ｍｇ／ｋｇ）；ＩＰ；手術前に１回）の状態にある間に全ての外科手術の手順を行った。ＣＤＣ由来エキソソーム、ＮＨＤＦ由来エキソソーム（対照として）、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  カタログ番号ＨＭＩ０２３７）、マイクロＲＮＡ模倣対照（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＨＭＣ０００２）、ｓｒＤＭＤ、及び変異体ｓｒＤＭＤの注射のため、同様のプロトコルを使用した。ＣＤＣ由来エキソソーム［（１０．３２±３．２８）×１０９／１５０μＬ  ＰＢＳ］又はＰＢＳ単独のＬＶ腔への心室内単回注射を、２８−１／２ゲージ針により開胸術の間に行った。首の頸動脈を経るＰＥ−１０カテーテル（ＡＬＺＥＴ；カリフォルニア州クパチーノ）を使用して、ＣＤＣ（ｌ×ｌＯ４細胞／４０μＬ  ＰＢＳ）又はＰＢＳの動脈内注射を実施した。３１ゲージ針を備えた２５μｌハミルトンシリンジ（０．５μｌの印付き）を使用して、筋肉の下１／３の単一の部位でヒラメ筋（ＳＯＬ）の筋肉へのエキソソームの筋肉内注射を行った。針を筋肉の上部１／３まで進行させ、次いでエキソソーム［（２０．６４±２．１２）×ｌ０７／３μＬ］を注射しながら、筋腹を通ってゆっくりと引き抜いた。
実施例２
ＣＤＣ、ＣＤＣ由来エキソソーム、ＮＨＤＦ由来エキソソーム、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ、ｍｉＲ模倣対照、ｓｒＤＭＤ及び変異体ｓｒＤＭＤ
【０１０９】
記載される通り、野生型系統適合マウス心臓（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎＪ野生型マウス心臓）からマウスＣＤＣを増殖させた。簡潔に言えば、心室組織を約１ｍｍの外植片に細かく刻み、部分的に酵素消化し、接着性（フィブロネクチンコーティング）培養皿に播種した。これらの外植片が自然に生じた増殖細胞（外植片由来細胞）をもたらし、それをコンフルエント後に採取し、懸濁培養液に播種（ポリ−Ｄ−リジンコーティングディッシュ上に細胞１０５個／ｍＬ）して、三次元心筋球の自己集合を可能にした。続いて、心筋球を接着性培養皿上に再度播種してＣＤＣを得て、これを、全ての実験において１継代目で使用した。ＣＤＣ由来エキソソーム：培養したヒトＣＤＣによって一晩（２４時間）順化した無血清培地からエキソソームを単離した。低酸素（２％Ｏ２；デフォルト条件）又は酸素正常状態（２０％Ｏ２、単独でエキソソームのＲＮＡ含量を比較する研究のため）における（ＣＤＣ由来エキソソーム）［又は対照としての正常ヒト皮膚線維芽細胞（ＮＨＤＦ）］。３００ｇ（１０分間）及び１００００ｇ（３０分間）の連続する遠心分離、並びに０．２２ミクロンフィルタによる濾過後の順化培地からエキソソームを単離するため、超遠心分離（１時間に亘り１０００００ｇ）を使用した。単離されたエキソソームをＰＢＳに再懸濁し（ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの実験のため）、タンパク質に対するエキソソームの比を、Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｃｏｕｎｔｅｒ及びＭｉｃｒｏ  ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれ使用して測定した。予備用量応用研究は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ（心筋内ＣＤＣ由来エキソソーム注射）実験に対して、それぞれ［（２．２４±１．３４）×ｌ０７］及び［６．１９±３．６８×１０８］の低酸素ＣＤＣ由来エキソソームを有効用量と確認した。
【０１１０】
総容量４０μｌで室温にて３０分間のＲＮＡｉＭＡＸトランスフェクション試薬（ニューヨーク州グランドアイランドのｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と混合したｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ模倣対照及びｍｉＲ模倣対照（ｈｓａ−ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及びｍｉＲＮＡ陰性対照１；それぞれ２μｇ；ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、短い非コードＲＮＡ、ｓｒＤＭＤ又はｓｒＤＭＤ変異体（それぞれ１２μｇ；コロラド州ラファイエットのＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を、上に記載される通り、１つの心臓当たり４つのポイントに注射した。
【０１１１】
ｓｒＤＭＤ変異体のヌクレオチド配列は、５’ＵＣＣＣＣＡＣＡＧＡＧＧＣＵＧＡＵＣＧＡＵＵＣＵＣＣＣＵＧＡＡＣＡＧＣＣＵＣＣＵＣＣＧＧＡＧＧＣＡＣＵＧＣＡＧＡＵＣＡＡＧＣＣＣＧＣＣＵＧＧＡＧＡＧＧＵＧＧＡＧＵＵＵＣＡＡＧＡＧＵＣＣＣＵＵＣＣＵＧＧＵＵＣＡＣＣＧＵＣＵＣＣＵＵＵ３’（配列番号６）である。
実施例３
心エコー検査
【０１１２】
Ｖｅｖｏ  ７７０イメージングシステム（カナダ国トロントのＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）を使用して、１回目のＣＤＣ／ＣＤＣ由来エキソソームまたはビヒクル注射の２日前（ベースライン）及び３週間後、２カ月後及び３カ月後に、並びに２回目のＣＤＣ／ＣＤＣ−ＸＯ注射の３週間後、２カ月後及び３カ月後に、心エコー検査研究を実施した。同じイメージングシステムを使用して、ベースライン（２日前）及び選択したＲＮＡ（又は対照）の注射の３週間後に、心エコー検査研究を実施した。軽い全身麻酔の誘導後に、最大ＬＶ径のレベルで、心臓をイメージングした。Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｏｎｉｃｓバージョン１．３．８ソフトウェアを用いて、２次元長軸像から、ＬＶ駆出率（ＬＶＥＦ）を測定した。
【０１１３】
ＣＤＣ注射後の左心室（ＬＶ）拡張終期容積及び収縮終期容積の変化。１回目及び２回目のＣＤＣ移植は、プラセボと比べて、少なくとも６カ月間に亘るｍｄｘマウスにおけるＬＶ拡張終期容積（ＬＶ  ＥＤＶ）及び収縮終期容積（ＬＶ  ＥＳＶ）の持続的改善をもたらした。
実施例４
トレッドミル運動試験及び生存率分析
【０１１４】
術前１週間及びＣＤＣ／ビヒクル注射３週間後からＥｘｅｒ−３／６オープントレッドミル（オハイオ州コロンバスのＣｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、運動能力を週１回評価した（術前１週間にｍｄｘマウスのサブセットにおいて測定した運動能力は、術後３週間にＭｄｘ＋ビヒクル群において測定したものと同等であった）。順応期間（１０ｍ／分で２０分間）後、トレッドミル運動中は、マウスが疲労するまで、平均速度の段階的な増加（１ｍ／分）を２分間毎に適用した（ショッカーにおいて１０秒超を費やす；トレッドミル中は、マウスがトラックに留まるのを支援するために、軽く押し続けた）。続いて、マウスをケージに戻し、合計距離を記録した。トレッドミルプロトコールは、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙのガイドラインに準拠していた。週１回の運動を３カ月間行った後に、死亡率の評価のために、ＣＤＣ／ビヒクルｍｄｘマウスを、野生型年齢適合性マウスと一緒に追跡した（図１Ｃ）。
実施例５
骨格筋のｉｎ  ｖｉｔｒｏ等尺性収縮特性
【０１１５】
ケタミン／キシラジン（８０ｍｇ／体重ｋｇ及び１０ｍｇ／体重ｋｇのＩＰ）でマウスに深く麻酔をかけ、ヒラメ筋（ＳＯＬ）及び／又は長指伸筋（ＥＤＬ）及び／又は横隔膜（ＤＩＡ）の筋肉を迅速に摘除し、動物を安楽死させた。簡潔に言えば、下腿側面の正中皮膚切開の後、ＳＯＬ及び／又はＥＤＬの筋肉を切開し、単離して、その起始腱及び停止腱を絹縫合糸（３−０）で締め、迅速に摘除した。ＳＯＬ又はＥＤＬの筋肉を、以下の組成：（ｍＭ単位）１３７  ＮａＣｌ、５  ＫＣ１、２  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＳＯ４、１  ＮａＨ２ＰＯ４、２４  ＮａＨＣＯ３、１１  グルコースの哺乳動物リンガー溶液を含む組織浴に垂直に取り付けた。その溶液を、ｐＨを７．３５及び温度２４℃に維持しながら９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２で絶えず通気した。横隔膜の研究のため、左肋弓下縁皮膚及び筋肉切開に続いて、肋弓下（ｍｉｄｃｏｓｔａｌ）半横隔膜の切片を、冷リンガー液を含む予備Ｓｙｌｇａｒ裏打ちディッシュに移し、線維を肋骨に付着させ、また絹縫合糸で締めて、組織浴に垂直に取り付けられた腱中心を無傷のままにして、３ｍｍ〜４ｍｍの幅の狭い横隔膜の条片を単離した。ＳＯＬ、ＥＤＬ又はＤＩＡの一端をディッシュ底のクランプに固定し、もう一端を較正済みの力変換器（マサチューセッツ州ウォータータウンのＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍｏｄｅｌ  ３００Ｂ）に取り付けた。システムに連結されたマイクロマニピュレーターを、筋長を調整するために使用した。筋肉の両側に置いた白金プレート電極を、過最大強度で送達される定電流の０．２ミリ秒持続時間単相矩形パルスを使用する直接筋肉刺激（マサチューセッツ州クインシーのＧｒａｓｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓ８８刺激装置）に使用した。最大等尺性単収縮応答が得られるまで筋長を調整した。等尺性収縮特性を最適な長さ（Ｌｏ）で決定した。ピーク単収縮力（Ｐｔ）を一連のシグナルパルスから決定した。力／頻度関係を１秒当たり５パルス〜１５０パルス（ＰＰＳ）の範囲の刺激頻度で測定した。刺激を、各刺激列の間を少なくとも１分隔てる間隔で、１秒の継続期間の刺激列で提示した。Ｐｔ及び最大強縮力（Ｐｏ）を含む発生した筋力を、筋板の推定される生理学的断面積（ＣＳＡ）に対して正規化し（ＣＳＡ＝筋肉重量／１．０５６×Ｌｏ；式中、１．０５６ｇ／ｃｍ３が筋肉の密度を表す）、ニュートン（Ｎ）／ｃｍ２で表した。ＳＯＬ及びＥＤＬに関し、筋肉の比筋力を推定する際に、Ｌｏも筋線維長に対して正規化した（それぞれ、０．７１及び０．４４のＬｏ）。ＳＯＬ及びＥＤＬによって発生した絶対筋力も報告する（ｍＮ）。
実施例６
ｉＰＳＣ由来心筋細胞
【０１１６】
尿由来細胞を５００００細胞／ウェルでマトリゲル（カリフォルニア州サンホセのＢＤ）被覆１２ウェルプレートに蒔き、一晩付着させた（０日目）。２日目、３時間、８μｇ／ｍｌポリブレンの存在下で、細胞を高力価ＯＳＫＭウイルス上清により形質導入した。ウイルス上清を新鮮なＵＳＣ培地で置き換え、３日後にｍＴｅＳＲｌ培地（ブリティッシュコロンビア州バンクーバーのＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で置き換え、毎日交換した。ｉＰＳＣ様コロニーが経時的に出現すると、それらを実態解剖顕微鏡（イリノイ州バッファローグローブのＬｅｉｃａ  Ｍ２０５Ｃ）下でガラス毛細管ピペットを使用して採取し、更なる増殖のため新たなマトリゲル被覆プレートに移した。修正を含む確立されたプロトコルに従って、尿由来ｉＰＳＣを心筋細胞に分化させた。簡潔に言えば、ｉＰＳＣコロニーをＶｅｒｓｅｎｅ（カリフォルニア州カールスバッドのＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に１０分間インキュベートすることによって剥離させ、単一細胞浮遊液にトリチュレートして、ＴｅＳＲ１培地中２５００００細胞／ｃｍ２の密度でマトリゲル被覆プラスチックディッシュに蒔き、更に４日間培養した。次に、培地を、２％インスリン減少Ｂ２７（（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び新鮮なＬ−グルタミンで補足したＲＰＭＩ−１６４０培地に入れ替えて、分化を開始した。
実施例７
組織学
【０１１７】
１回目のＣＤＣ／ＣＤＣ由来エキソソーム注射３週間後（ＣＴＬ：ｎ＝４；Ｍｄｘ＋ビヒクル：ｎ＝６；Ｍｄｘ＋ＣＤＣ／Ｍｄｘ＋ＣＤＣ由来エキソソーム：それぞれｎ＝６）又は３カ月後（ＣＴＬ：ｎ＝４；Ｍｄｘ＋ビヒクル：ｎ＝６；Ｍｄｘ＋ＣＤＣ／Ｍｄｘ＋ＣＤＣ由来エキソソーム：ｎ＝６）及びｍｉＲ−１４８注射３週間後（ｎ＝６）に、マウスを屠殺した。組織学のため、各心臓の心尖部、中央部及び心底部由来のパラフィン包埋切片を使用した。線維化の評価のために、マッソントリクローム染色（ＨＴ１５  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ  Ｓｔａｉｎ［Ｍａｓｓｏｎ］Ｋｉｔ；ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を実施した。それぞれマウスＣＤ３、ＣＤ２０及びＣＤ６８に対する抗体による免疫染色によって、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージを評価し、各心臓の心尖領域（３個の切片；５０μｍ間隔）、中央領域（４個の切片；５０μｍ間隔）及び心底領域（３個の切片；５０μｍ間隔）から無作為に選択した１０個の各切片から１０視野（倍率２０倍）の細胞を数え、各心臓における平均細胞数を計算した。データを細胞／ｍｍ２視野の数として提示した。活性なサイクリング（Ｋｉ６７＋）及び増殖（Ａｕｒｏｒａ  Ｂ＋）心筋細胞、並びにジストロフィンに対して陽性の心筋細胞を同様に数え、記載されているように、Ｋｉ６７＋、Ａｕｒｏｒａ  Ｂ＋及びジストロフィン＋心筋細胞の数を強拡大視野（ＨＰＦ）当たりの心筋細胞の総数で割ったものとして、サイクリング画分及び増殖画分、並びにジストロフィン陽性心筋細胞をそれぞれ表した。各心臓について、測定結果を平均化した。
【０１１８】
免疫蛍光染色：低又は高ｐＨ緩衝液（カリフォルニア州カーピンテリアのＤＡＫＯ）中で熱誘導性エピトープ回復を行い、続いて１％サポニン（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ；３％サポニンを含有するタンパク質ブロッキング溶液をＫｉ６７の免疫蛍光染色に適用した）を含有するタンパク質ブロッキング溶液で２時間透過処理／ブロッキングした。続いて、各心臓の心尖部、中央部及び心底部由来の５μｍ切片の免疫蛍光染色のため、一次抗体のタンパク質ブロッキング溶液を４℃で一晩適用した。ＰＢＳで３回洗浄（各１０分間）した後に、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ二次抗体（ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を検出に使用した。Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ５  Ｘ共焦点顕微鏡システムによって、画像を撮影した。マウスジストロフィン（１μｇ／ｍｌ；カリフォルニア州フリーモントのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｋｉ−６７（ＳＰ６；１：５０；カリフォルニア州フリーモントのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＷＧＡ（コムギ胚芽凝集素；１：２００；ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｎｒｆ２（Ｃ２０；１：５０；カリフォルニア州サンタクルスのＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ａｕｒｏｒａ  Ｂ（１：２５０；カリフォルニア州サンホセのＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に対する抗体を使用して、免疫蛍光染色を行った。
【０１１９】
免疫ペルオキシダーゼ染色：Ｖｅｎｔａｎａ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ（アリゾナ州ツーソン；ＣＤ６８）及びＣｅｌｌ  Ｍａｒｑｕｅ（カリフォルニア州ロックリン；ＣＤ３、ＣＤ２０）の予め希釈されているウサギモノクローナル抗体を使用して、ＣＤ３、ＣＤ２０及びＣＤ６８の免疫組織化学的検出を５μｍ切片で実施した。高ｐＨ  ＥＲ２緩衝液（イリノイ州バッファローグローブのＬｅｉｃａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中でオンボード熱誘導性エピトープ回復法を使用して、Ｌｅｉｃａ  Ｂｏｎｄ−Ｍａｘ  Ｖｅｎｔａｎａ自動スライド染色機（イリノイ州シカゴ）によって、染色を行った。Ｄａｋｏ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋ウサギ検出システム及びＤａｋｏ  ＤＡＢ（カリフォルニア州カーピンテリア）を使用して、染色を可視化した。続いて、メイヤーヘマトキシリンでスライドを１分間対比染色し、カバーガラスで覆った。
【０１２０】
電子顕微鏡法：１ｍｍ３の立方体を２％グルタルアルデヒドに浸漬することによって、各心臓由来の後壁の心尖部（１つの立方体）、中央部（右側サブ部分、中央サブ部分及び左側サブ部分から３つの立方体）及び心底部（右側サブ部分、中央サブ部分及び左側サブ部分から３つの立方体）（ＣＴＬ：ｎ＝３；Ｍｄｘ＋ビヒクル：ｎ＝３；Ｍｄｘ＋ＣＤＣ：ｎ＝３）を固定し、オスミウムで後固定し、エポンに包埋した。切片を銀厚で切断し、酢酸ウラニル及びクエン酸塩で染色し、ＡＭＴデジタルカメラシステムを備えるＪＥＯＬ  １０１０を用いて観察した。
実施例８
ウエスタンブロット
【０１２１】
ウエスタンブロットを実施して、Ｎｒｆ２シグナル伝達［Ｎｒｆ２、リン酸化Ｎｒｆ２（Ｎｒｆ２−ｐｓ４０）及びＮｒｆ２下流遺伝子産物：ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２（ＳＯＤ−２）、及びグルタミン酸−システインリガーゼ（ＧＣＬＣ）の触媒サブユニット］、Ｎｒｆ２リン酸化［リン酸化Ａｋｔ（Ａｋｔ−ｐ３０８）］、酸化的リン酸化［ＣＩ（ＮＤＵＦＢ８サブユニット）、ＣＩＩ（ＳＤＨＢサブユニット）、ＣＩＶ（ＭＴＣＯｌサブユニット）、ＣＩＩＩ（ＵＱＣＲＣ２サブユニット）及びＣＶ（ＡＴＰＳＡサブユニット）］、ミトコンドリア生合成（ＰＧＣ−１）、マイトファジー（ＰＩＮＫ１）、炎症（ＮＦ−κΒ及びＭＣＰ−１）及び線維化（コラーゲンＩＡ１及びコラーゲンＩＩＩＡ１）に寄与するジストロフィン及び標的タンパク質の心筋存在量を比較した。ウエスタンブロッティング（ＷＢ）によって、酸化ストレスのマーカーであるマロンジアルデヒドタンパク質付加物の心筋密度も測定した。各心臓の心尖部、中央部及び心底部由来のサンプル（各１ｍｍ厚の横断面）を混合し、均質化し、製造業者の指示（ＣｅｌＬｙｔｉｃ  ＮｕＣＬＥＡＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に従って、核画分及び細胞質画分を抽出した。呼吸測定の欄に記載されているように、新鮮な全心臓（ＣＴＬ：ｎ＝３；Ｍｄｘ＋ビヒクル：ｎ＝８；Ｍｄｘ＋ＣＤＣ：ｎ＝８）からミトコンドリアを抽出した。ＷＢ分析のための細胞質抽出物、核抽出物及びミトコンドリア抽出物を−８０℃で保存した。マイクロＢＣＡタンパク質アッセイキット（ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって、抽出物中のタンパク質濃度を決定した。以下の抗体を使用してウエスタンブロット分析によって、細胞質画分、核画分及びミトコンドリア画分の標的タンパク質を測定した：マウスＮｒｆ２、ＨＯ−１、カタラーゼ、ＳＯＤ−２、ＧＣＬＣ、コラーゲンＩＡ１及びコラーゲンＩＩＩＡ１、並びにＰＧＣ−１に対する抗体を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（カリフォルニア州サンタクルス）から購入し、リン酸化Ｎｒｆ２（Ｎｒｆ２−ｐｓ４０；カリフォルニア州サンフランシスコのＢｉｏｒｂｙｔ）、呼吸鎖サブユニット（全ＯＸＰＨＯＳ齧歯類ＷＢ抗体カクテル抗体）、マロンジアルデヒド、クエン酸シンターゼ及びＴＢＰ（Ａｂｅａｍ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）、Ａｋｔ及びＡｋｔ−ｐＴ３０８、ΙκΒ−α、ｐ−ΙκΒ−α（カリフォルニア州デンバーのＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＰＩＮＫ１、ＭＣＰ−１及びＮＦ−κΒｐ６５（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）抗体を、引用されている供給業者から購入した。核（ＴＢＰ）、細胞質ゾル及びミトコンドリア（クエン酸シンターゼ）標的タンパク質のハウスキーピングタンパク質の測定のために、ＴＢＰ（ＴＡＴＡ結合タンパク質）及びクエン酸シンターゼに対する抗体を使用した。
【０１２２】
ウエスタンブロット法：簡潔に言えば、８％、１０％及び４％〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で、２０μｇのタンパク質を含有するアリコートを１２０Ｖで２時間分画し、ＰＶＤＦ膜（ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に転写した。ブロッキング緩衝液（１×ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０及び５％脱脂乳）中で膜を１時間インキュベートし、次いで、最適希釈で所定の抗体を含有する同じ緩衝液中で一晩インキュベートした。メンブレンを、セイヨウワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギＩｇＧ、抗マウスＩｇＧ（コロラド州デンバーのＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び抗ヤギＩｇＧ（ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１：１０００〜３０００希釈で含むバッファー（ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０及び３％脱脂乳）中で２時間インキュベートする前に、１×ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中で５分間、３回洗浄した。メンブレンを１×ＴＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０中で５分間、３回洗浄し、ＥＣＬ化学発光物質（Ｓｕｐｅｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ；ニューヨーク州グランドアイランドのＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してオートルミノグラフィーにより発色させた。クエン酸シンターゼ及びＴＢＰを、それに対して目的のタンパク質の発現が正規化されるハウスキーピングタンパク質として使用した。リン酸化されたＡｋｔ、Ｎｒｆ２及びＩκＢ−αを、Ａｋｔ、Ｎｒｆ２及びＩκＢ−αの合計に対して正規化した。コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＩＩのウエスタンブロット解析を、非還元、非変性条件下で行った。
実施例９
統計分析
【０１２３】
平均±ＳＤとして提示される代替データに対する結果を除いて、全てのプールデータを平均±ＳＥＭとして提示する。それぞれコルモゴロフ・スミルノフ検定及びレーベン検定を使用して、データセットの正規性及び等分散性を試験した。両方とも確認された場合、ｔ検定又は分散分析とそれに続くボンフェローニ事後検定を統計的有意性の決定に使用した；正規性又は等分散性のいずれかが保証されなかった場合、ノンパラメトリック検定（ウイルコクソン検定又はクラスカル・ワリス検定とそれに続くダン事後検定）を適用した（ＳＰＳＳ  ＩＩ、イリノイ州シカゴのＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．）。検出力分析について、予備データは利用不可能であった。パイロットプロジェクトの結果から、本発明者らは、その後の研究を行うことができた。本研究は、記載されているように、臨床前報告基準に準拠していた。年齢適合マウスを、コンピューターに生成された無作為化スケジュールを使用して実験群に無作為に割り付けた。実験の実施、並びに結果及び転帰の解析を盲検法（割り付けの隠匿及び盲検評価）で行った。非盲検の前の解析後にマウス又はデータの事後の排除はなかった。
【０１２４】
駆出率データ：ベースライン、及びｍｄｘ及び対応する野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎＪ）における細胞又はビヒクル対照による処理の３週間後の駆出率を測定する、１群当たり５匹の動物のパイロット研究から予備データを収集した。測定された治療効果は、およそ１単位の時間効果、３．５単位の群標準偏差を伴って、およそ４単位であった。本発明者らは、測定された分散の増加の可能性がある、より後の時間点について、群間のより大きな差を予想した。したがって、複合対称性共分散構造、経時的な動物の測定間の相関０．７、及び両側α００５を仮定する（Ｐｏｗｅｒ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｖｉａ  ＰＡＳＳ  ｖ．  １１．０．）、経時的に動物１匹当たり６回の測定を含む研究計画で、各ｍｄｘ群において１処理群当たり１２匹の動物、及び７匹の野生型対照動物により、研究は、治療効果において４．５単位以上及び時間効果において１．４単位以上の違いを検出するための少なくとも８０％の検定力を有していた。
【０１２５】
トレッドミルデータ：ベースライン、及びｍｄｘ及び対応する野生型マウスにおける細胞又はビヒクル対照による処理の３週間後のトレッドミル距離（すなわち、以下に記載されるように、疲労する前に歩行した距離）を測定する、１群当たり５匹の動物のパイロット研究から予備データを収集した。測定された処理効果は、およそ１５０メートルであり、非処理群では経時的な観察の差が限定的であった。群標準偏差はおよそ７５メートルであり、処理後に観察されたより大きな偏差を伴っていた。本発明者らは、測定された分散の増加の可能性があるより後の時間点について、群間のより大きな差を予想した。したがって、複合対称性共分散構造、経時的な動物の測定間の相関０．７、及び両側α００５を仮定する（Ｐｏｗｅｒ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｖｉａ  ＰＡＳＳ  ｖ．１１．０．）、動物１匹当たり１２回の経時的な測定を含む研究計画で、各トランスジェニック群において１処理群当たり１１匹の動物、及び７匹の野生型対照動物により、研究は、治療効果において１００メートル以上の違い、及び経時的に少なくとも３０メートルの変化を検出するための少なくとも８０％の検定力を有していた。
実施例１０
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応によるＣＤＣの生着の評価
【０１２６】
細胞生着を評価するため、ＣＤＣ注射の１週間後、２週間後及び３週間後に定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行った。ＴａｑＭａｎアッセイ（カリフォルニア州フォスターシティのＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、生着のマーカーとしてＹ染色体上に位置するＳＲＹ遺伝子の検出を可能とするため、雄性ＣＤＣを雌性ｍｄｘマウスに注射した。マウス心臓全体を採取し、計量して、均質化した。注射したＣＤＣから単離されたゲノムＤＮＡの複数の希釈物を用いて標準曲線を作成した。全てのサンプルを、対照として注射していないマウス心臓に由来する等量のゲノムＤＮＡでスパイクした。各反応について、５０ｎｇのゲノムＤＮＡを使用した。リアルタイムＰＣＲを３回反復して行った。
【０１２７】
標準曲線より生着を定量した。１週間目のＣＤＣのパーセンテージ生着は約８％であり、２週間目には１％未満であった。３週間には生存するＣＤＣを検出することはできなかった。
実施例１１
呼吸測定
【０１２８】
イソフルラン麻酔後に、頸部脱臼によってマウスを屠殺した。心臓を直ちに摘出し、ＰＢＳですすぎ、１ｍＬの氷冷ＨＥＳ緩衝液（２５０ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４）中でポリトロンによって均質化した。溶解物を４℃、１０００ｇで５分間スピンダウンして、破砕されていない細胞及び大きな残屑を除去した。次いで、上清を４℃、７０００ｇで１０分間スピンダウンして、粗細胞質ゾルからミトコンドリアが豊富な画分を分離した。ペレットを１ｍＬのＨＥＳ緩衝液（ＷＢ用の溶解緩衝液の一部）に再懸濁した。タンパク質の定量を実施し、ＨＥＳ緩衝液で調整して、５０μＬの緩衝液中に１０μｇのタンパク質を含有するサンプルを得て、これを２４ウェルＳｅａｈｏｒｓｅ細胞培養プレートにロードし、これを４℃、２０００ｇで２０分間スピンダウンして、プレート表面へのミトコンドリア接着を可能とした。次いで、Ｓｅａｈｏｒｓｅ  ＸＦ２４ミトコンドリアストレス試験の前に、４５０μＬ  ＭＡＳ緩衝液（７０ｍＭスクロース、２２０ｍＭマンニトール、５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．２％脂肪酸不含ＢＳＡ、ｐＨ７．４）を添加した。５ｍＭ／５ｍＭピルビン酸／リンゴ酸及び０．２５ｍＭ  ＡＤＰを使用し、続いて、１μＭオリゴマイシン、１μＭ  ＦＣＣＰ、１μＭアンチマイシン、５００ｎＭロテノンの混合物を使用して、ミトコンドリアの酸化的リン酸化を刺激した。サンプル溶解物中でクエン酸シンターゼ活性を測定して、試験のためにロードした実際のミトコンドリアの量について正規化した。記載されるように、Ｓｅａｈｏｒｓｅ（商標）ＸＦ９６  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｘ分析器を使用して、正常及びヒトデュシェンヌｉＰｓ細胞由来心筋細胞に対するＳｅａｈｏｒｓｅ呼吸測定を実施した。
実施例１２
蛍光標識付化ＣＤＣ由来エキソソームの全身注射後のｍｄｘマウス器官の生物発光撮像
【０１２９】
ｍｄｘマウス左心室腔への蛍光標識されたＣＤＣ由来エキソソームの全身的な注射の６時間後、マウスを屠殺し、器官を解剖して、ＩＶＩＶＳ分子イメージングシステム（米国マサチューセッツ州ホプキントンのＣａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して撮像した。
【０１３０】
細胞内Ｃａ２＋の記録：５μＭの蛍光カルシウム感受性色素Ｃａｌ−５２０（カリフォルニア州サニーベールのＡＡＴ  Ｂｉｏｑｕｅｓｔ）をｉＰＳ由来心筋細胞に３０分間ロードし、チャンバー底部の両側に配置した２本の白金線（約１ｃｍ離間）を介して２０Ｖの振幅と共に０．２ミリ秒二乗の電圧パルスを送達するＩｏｎ−Ｏｐｔｉｘ  Ｍｙｏｐａｃｅｒ（ＩｏｎＯｐｔｉｘ  Ｃｏｒｐ）を使用して、周波数１Ｈｚの電場刺激によってペーシングした。本発明者らは、Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ５−ＩＩ（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．；ドイツ国ヴェツラー）のｘｙｔモード（２Ｄ）を使用して、細胞内Ｃａ２＋をイメージングした。４８８ｎｍレーザーでＣａｌ５２０を励起し、視野サイズに応じて３６ミリ秒／フレーム〜７ミリ秒／フレームのスキャン速度で、１０倍対物レンズ（Ｌｅｉｃａ：Ｎ  ＰＬＡＮ  １０×／０．２５）を用いて、その発光（５０５ｎｍ超）を収集した。Ｃａ２＋濃度に比例する蛍光強度（Ｆ）を、ベースライン蛍光Ｆ０（Ｆ／Ｆ０）に対して正規化した。ソフトウェアＣｌａｍｐｆｉｔ（ｖｅｒ．１０．２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、ピーク到達時間及びＣａ２＋トランジェント振幅（Ｆ／Ｆ０）を分析した。各群における心拍間隔の交互脈を、１Ｈｚペーシングの５秒〜１０秒間隔で計算した。ペーシング中に各細胞の各トランジェント振幅（各群でｎ＝細胞１０個）を測定し、平均及び標準偏差を計算し、群間で比較した。
【０１３１】
ＲＮＡシーケンシング及び２次元階層的クラスタリング：ランダム及びポリ（Ｔ）プライミングの混合物を使用して二本鎖ｃＤＮＡを作製するためＮｕｇｅｎ  Ｏｖａｔｉｏｎ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｖ２  ｋｉｔを使用した。Ｋａｐａ  ＬＴＰ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｋｉｔ（マサチューセッツ州ウィルミントンのＫａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してシーケンシングライブラリを作製した。ワークフローは、本鎖ｃＤＮＡの断片化、平滑末端を生成する末端修復、Ａ−テーリング、アダプタライゲーション及びＰＣＲ増幅からなる。１つのレーンにおけるサンプルのマルチプレクシングには異なるアダプタを使用した。シーケンシングを、ペアリード１００ランに対してＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００で行った。データの質のチェックをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＳＡＶ上で行った。デマルチプレクシングをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＣＡＳＡＶＡ  １．８．２で行った。リードを、最初にＢｏｗｔｉｅ２バージョン２．１．０を使用して最新のＵＣＳＣトランスクリプトセットに対してマッピングし、遺伝子発現レベルをＲＳＥＭ  ｖｌ．２．１５を使用して推定した。ＴＭＭ（Ｍ値のトリム平均）を、遺伝子発現を正規化するため使用した。差次的に発現された遺伝子を、ｅｄｇｅＲプログラムを使用して同定した。ｐ＜０．０５を伴う発現の変更及び２超の倍率変化を示す遺伝子を、差次的に発現されたとみなした。経路及びネットワークの解析を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ（ＩＰＡ）を使用して行った。ＩＰＡは、供給されたフォーカス遺伝子セットの適合度に従って各ネットワークのスコアを算定する。これらのスコアは、偶然得られたものに対して、ネットワークに属するフォーカス遺伝子の可能性を示す。２超のスコアは、フォーカス遺伝子ネットワークは単に偶然に生成されたのではないという約９９％信頼を示す。ＩＰＡによって作製される正規の経路は、アップロードされたデータセットに最も有意である。ＦＤＲオプションを用いるフィッシャーの正確確率検定を、正規の経路の重要性を計算するために使用した。２次元階層的クラスタリングは、ビヒクル／ＣＤＣ又はビヒクル／ＣＤＣ由来エキソソーム（静脈内注射）ｍｄｘ心臓、横隔膜、ヒラメ筋及びＥＤＬ筋の間で少なくとも２倍の倍率変化を有する遺伝子を使用した。各行はｍｄｘ分析された組織、各列は遺伝子を表す。プローブセットシグナル値をｍｄｘ分析された組織の平均に対して正規化した。遺伝子発現の相対レベルを、示されるスケールに従って、最低（緑）から最高（赤）で表す：目的の様々な経路に関与する遺伝子の転写産物の倍率変化の例をプロットする。
【０１３２】
心筋内ＣＤＣ注射後の心臓ミトコンドリア：各心臓の心尖部、中央部及び心底部に由来するＴＥＭ画像を、ＣＴＬ（野生型）及びＣＤＣ／ビヒクルｍｄｘマウス心臓におけるミトコンドリアの平均数の計算に使用した。全心臓組織から抽出されたＤＮＡ（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ、メリーランド州ジャーマンタウンのＱＩＡＧＥＮ）を、製造業者の説明書によりＰＣＲフォーマット（ＮｏｖａＱＵＡＮＴ（商標）Ｍｏｕｓｅ  Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔｏ  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒａｔｉｏキット、マサチューセッツ州ビレリカのＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して核ＤＮＡに対するミトコンドリア比を測定するため使用した。
実施例１３
ｍｄｘ心臓におけるＣＤＣ移植
【０１３３】
ＣＤＣの心筋内注射に続いて、図１Ａに示されるように心機能の改善、図１Ｂに示されるように運動能力の増加、及び図１Ｃに示されるように生存率の増加が観察された。酸化ストレス及び炎症もＤＭＤにおける主な役者と確認された。ＣＤＣ投与は、図１Ｄに示されるように炎症細胞浸潤の減少、及び図１Ｅ、図１Ｆ及び図１Ｇに示されるように酸化ストレスの減少をもたらした。
【０１３４】
これらの結果は、さらに、ミトコンドリア完全性の回復を含んだ。ミトコンドリア構造は、図２Ａに示されるように組織的構造の明らかな回復を示し、図２Ｂに示されるようにサブユニット測定によって確認された。安定したコンピテントミトコンドリアによる再増殖が更に観察された。図３Ａに示されるように、損傷したミトコンドリアの最初のターンオーバーの後、健全なミトコンドリアを伴う再増殖が続いた。図３Ｂに示されるように、群間で同じ数のミトコンドリアが存在した。
【０１３５】
さらに、図４Ａに示される顕微鏡画像に示されるように心臓コラーゲン含有量及び線維化の減少が観察され、図４Ｂに示されるようにコラーゲンタンパク質の検出が確認された。図５Ａに示されるように、また図５ＢにおいてＡｕｒｏｒａ  Ｂ＋及びｋｉ６７＋の染色により心筋形成における更なる改善が観察された。
【０１３６】
この態様では、ＣＤＣは、骨格筋ミオパチー、筋細胞喪失をもたらす心筋症、線維化、酸化ストレス、炎症、ミトコンドリア無効／喪失、アポトーシス及び線維化を含む、ＤＭＤの主要な特徴を改善するのに効果的であると示される。
【０１３７】
より具体的には、ｍｄｘマウスの心臓へのＣＤＣの第１及び第２（より低用量）の用量の心筋内注射は、少なくとも６カ月に亘って、プラセボと比べた左心室機能（駆出率［ＥＦ］に現れる）及び容積を改善した。ＥＦにおけるＣＤＣ誘導性の改善は、ｍｄｘ心臓における生存ＣＤＣの検出ができなくなる時点を越えて持続した（ＣＤＣ送達の３週間後）。ＥＦの改善に加えて、ＣＤＣ注射は歩行機能を増強した。１０カ月齢の野生型マウス（ＣＴＬ）及びｍｄｘマウス（その他の実験で研究されたｍｄｘマウスとは別の）を単回用量のＣＤＣ又はビヒクル投与の３週間後に開始する、週１回の高強度トレッドミル運動に供した。ＣＤＣ処理ｍｄｘマウスは、運動能力を測定した３カ月間に亘って、ビヒクル処理ｍｄｘマウスと比べて、最大運動能力の実質的な増加を示した；生存率も２つの群で異なっていた。約２３カ月齢までに、全てのビヒクル処理ｍｄｘマウスが死亡したのに対し、５０％超のＣＤＣ処理ｍｄｘマウスが生存したままであった。機構の調査において、本発明者らは、最初に、ＣＤＣの抗酸化、抗炎症、抗線維化及び心筋形の効果を研究した。ＣＤＣ注射は、酸化ストレス、炎症及びミトコンドリア完全性に関連する遺伝子の発現の大きな変化に結び付いた。Ｎｒｆ２抗酸化経路が、ＣＤＣ処理ｍｄｘ心臓において活性化された。Ｎｒｆ２は、通常Ｋｅａｐ  １によって抑制されるが、酸化ストレス（同様に、Ａｋｔ等のタンパク質キナーゼによるＮｒｆ２リン酸化）は、Ｎｒｆ２−Ｋｅａｐｌ複合体の解離を引き起こし、Ｎｒｆ２の核移行及び抗酸化酵素の転写活性化に達する。ｍｄｘ心臓では、リン酸化Ａｋｔ、全Ｎｒｆ２及び各Ｎｒｆ２のレベルが高い（予想通り、酸化ストレスに応答して）；ＣＤＣ処理は、それらのタンパク質及びそれらの下流遺伝子産物（ヘムオキシゲナーゼ−１［ＨＯ−１］、カタラーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ−２［ＳＯＤ−２］及びグルタメートシステインリガーゼ［ＧＣＬＣ］の触媒サブユニット）のレベルを更に増加させた。付随して、マロンジアルデヒド付加物の明らかな減少によって証明されるように、酸化ストレスが減弱された。組織学的分析は、ビヒクル処理ｍｄｘ心臓における広範囲の線維化を明らかにしたが、ＣＤＣ処理ｍｄｘ心臓でははるかに少なかった（年齢適合野生型［ＷＴ］対照に匹敵する）。同様に、ＣＤＣ処理は、処理の３週間後にｍｄｘ心臓組織におけるコラーゲンＩ及びＩＩＩの蓄積を大きく回復した。ＣＤＣは、ｍｄｘ心筋症に特徴的な炎症及びミトコンドリア機能不全を阻害した。炎症促進性のサイトカイン及びケモカインのマスター調節因子であるＮＦκＢが、ビヒクルｍｄｘ心臓において活性化された。リン酸化ＩκＢ及び各ｐ６５の増加はＭＣＰ１（単球走化性タンパク質１）のアップレギュレーション、並びにＣＤ６８＋マクロファージ及びＣＤ３＋Ｔ細胞の蓄積を伴っていた。ＣＤＣ注射の３週間後では、ＣＤＣ処理は、ｍｄｘ心臓においてＮＦκＢの活性化を逆転させ、炎症細胞数を減少させた。ミトコンドリアの構造及び機能は、筋ジストロフィー関連心不全において異常である。全トランスクリプトーム解析は、ｍｄｘ心臓のミトコンドリア完全性に関連する遺伝子発現の大きな変化を明らかにした。この知見と���致して、ＣＤＣは、ミトコンドリア超微細構造を回復し、ミトコンドリアＤＮＡコピー数を増加（ミトコンドリアの数ではない）させ、呼吸鎖サブユニットレベルを増大させ、単離されたｍｄｘミトコンドリアの不完全な肺活量を正常化させた。注目すべきことに、ｍｄｘマウス心臓においてＣＤＣ処理３週間後に観察されたミトコンドリア完全性の改善及びミトコンドリアターンオーバーの減少は、抗酸化酵素のアップレギュレーション、並びに酸化ストレス及び炎症の減少に関連していた。また、本発明者らは、心筋形成に対するＣＤＣの効果を探査した。ビヒクル処理ｍｄｘ心臓は、恐らくは進行中の心筋細胞喪失の代償として、サイクリング（Ｋｉ６７＋）及び増殖（ａｕｒｏｒａ  Ｂ＋）心筋細胞の数の数倍の増加を示した。ＣＤＣは、虚血モデル及び非虚血モデルにおける内因性心筋形成を増加させることが知られている。同様の効果がｍｄｘ心臓においてみられた：ＣＤＣ処理は、Ｋｉ６７＋及びａｕｒｏｒａ  Ｂ＋心筋細胞の顕著な増加によって証明されるように、心筋形成を促進した。
【０１３８】
興味深いことに、本発明者らは、ＣＤＣ処理ｍｄｘ心臓（１９．８±２．７％ジストロフィン陽性心筋細胞）における免疫組織化学（ＩＨＣ）による明らかなジストロフィン染色を見つけた。ウエスタンブロット（ジストロフィンのＣ末端に対する抗体を使用する）は、ビヒクル処理ｍｄｘ心臓におけるジストロフィンの実質的な不在を明らかにしたが、ＣＤＣ注射後でははるかに高いレベルであった。ジストロフィンの天然起源の全てのアイソフォームはＣＤＣによって増大された；生理学的に関連する全長アイソフォームを、平均でウエスタンブロットデンシトメトリーによる対照レベルの２０．１±０．８％まで回復した。ＩＨＣ又はより定量的に信頼できる免疫ブロットのいずれかによって測定されたジストロフィン回復に関する値は、この範囲のジストロフィン発現のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９媒介回復として重要であり、より低い値であっても実質的に機能上の利益をもたらすのに十分である。心筋内ＣＤＣ注射（ＬＶ４注射部位）は、図７Ｂに示されるように全ての測定されたアイソフォームに対するものを含めて、図７Ａに示されるようにジストロフィン発現の増加をもたらした。
実施例１４
ｍｄｘ心臓におけるＣＤＣ由来エキソソーム移植
【０１３９】
分泌された小胞エキソソームにを介してそれらの治療効果を媒介するＣＤＣに関する報告と一致する、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの遅延又は回復におけるＣＤＣ及びＣＤＣ由来エキソソームの役割の描写を図８に示す。ＣＤＣは、ＣＤＣ由来エキソソームにより媒介されるように、筋細胞喪失を防止し、アポトーシス、線維化及び炎症を減少させる。興味深いことに、心筋内エキソソームはＣＤＣの効果をリキャップする。心筋内ＣＤＣ由来エキソソーム注射は、図９Ａに示されるように、コラーゲンを野生型とほぼ同じレベルまで減少させる。さらに、心筋内エキソソームは、図９Ｂ及び図９Ｃに示されるように、ＣＤＣの効果をリキャップする。エキソソームの注射は、図９Ｄに示されるように、駆出率の段階的な減少を遅らせることができた。
【０１４０】
ＣＤＣ処理ｍｄｘマウスにおける心臓機能及び運動能力の不均衡な増加。これは、ＣＤＣ自体、生着したＣＤＣから分泌されるメディエータ（エキソソーム、ＥＣＶ、タンパク質等）、調節された心臓セクレトーム、及び／又は改善された全身の血行力学に起因し得る。ＣＤＣ処理されたｍｄｘマウスにおける、図１０Ａに示される心臓機能及び図１０Ｂに示される運動能力の不均衡な増加。
【０１４１】
ＣＤＣによって分泌されたエキソソーム（すなわち、ＣＤＣ由来エキソソーム）は、心筋梗塞の齧歯類モデルにおいてＣＤＣの機能的及び構造的な利益を模倣する。ｍｄｘマウスでも同様に、ＣＤＣの利益は、低酸素ＣＤＣによって順化された培地から単離されたエキソソーム（直径約３０ｎｍ〜２００ｎｍ）により再現された。ヒトＣＤＣ由来エキソソームの２回の反復投薬（３カ月間隔）は、ビヒクル注射と比べて、非免疫抑制ｍｄｘマウスにおいて最小であるが検出可能なホルモン応答を伴って、ＥＦの持続的な改善に結び付いた。コラーゲンＩ及びＩＩＩのレベルは減少したが、サイクリング（Ｋｉ６７＋）及び増殖（ａｕｒｏｒａ  Ｂ＋）心筋細胞の数は、ＣＤＣ由来エキソソーム注射ｍｄｘマウスにおいて増加した。ＣＤＣ由来エキソソームの効果は、少なくとも部分的には、周辺の心筋によるクラスリン媒介取り込みを介して媒介されていた。親ＣＤＣと同様に、心筋内ＣＤＣ由来エキソソーム注射は、ｍｄｘ心臓においてジストロフィン発現を増加した。ジストロフィンタンパク質アップレギュレーションの程度は、ＣＤＣ又はＣＤＣ由来エキソソームによる処理後と同等であった。
実施例１５
全身的なＣＤＣ由来エキソソーム注射
【０１４２】
全身の利益を媒介するエキソソームの可能性を更に評価するため、本発明者らはｍｄｘ心臓の左心室腔にＣＤＣ由来エキソソームを注射した。
【０１４３】
ＣＤＣ由来エキソソームの心室内注射は、図１１Ａに示されるように心臓において同様の有益な結果を実証した。ＣＤＣ由来エキソソームは、図１１Ｂに示されるようにＣＤＣ自体を反映する方法で、図１１Ｃに示されるように高い相関度で遺伝子発現を調節することができた。さらに図１１Ｄ及び図１１Ｅにおいてそれぞれ示されるように、ＣＤＣ由来エキソソーム注射により駆出率及び距離の両方が改善した。これらの結果は、図１１Ｆ及び図１１Ｇの遺伝子発現の結果について示されるように、横隔膜において更に観察された。図１１Ｈに示されるように、ＣＤＣ由来エキソソーム注射によって、単収縮力及び比筋力の両方が改善した。これらの結果は、図１１Ｉ及び図１１Ｊの遺伝子発現の結果について示されるように、ヒラメ筋において更に観察された。図１１Ｋに示されるように、ＣＤＣ由来エキソソーム注射によって、単収縮力及び比筋力の両方が改善した。心室内ＣＤＣ由来エキソソーム注射後の生体内分布は、多くの組織型に亘り幅広い分布を示した。
【０１４４】
注射の６時間後、蛍光標識されたＣＤＣ由来エキソソームは、心臓及び骨格筋のみならず、脳、肝臓、肺、脾臓、腸及び腎臓でも明らかであった。心室内ＣＤＣ由来エキソソーム注射の３週間後のｍｄｘ心臓、横隔膜及びヒラメ筋における変化は、心筋内ＣＤＣ注射後のこれらの器官で見られた変更を模倣した。ｍｄｘ心臓では、ＣＤＣ由来エキソソームの注射の３週間後、本発明者らは、心筋内ＣＤＣ注射後に見られる変化を反映する大きなトランスクリプトームの変化を見出した。その間に、心臓のジストロフィンレベルは増加し、ＥＦが改善して及び運動能力が増大され、横隔膜は同様に広範囲なトランスクリプトーム変化を示し、これは、ジストロフィンレベルの増加と同様に、心筋内ＣＤＣ注射後にｍｄｘ横隔膜で見られたものと十分に相関した。横隔膜の機能は、実質的には、心室内ＣＤＣ由来エキソソーム注射の３週間後に正常化された。同様に、ヒラメ筋は、遺伝子発現の特徴的な変化、ジストロフィンのロバストな回復、及び筋肉機能の増強を示す。結果は、心筋内ＣＤＣ注射のメディエータとしてＣＤＣ由来エキソソームを集合的に関係づける。
実施例１６
ｍｄｘ骨格筋へのＣＤＣ由来エキソソーム注射
【０１４５】
骨格筋に対する主な効果を調べるため、発明者らは、ｍｄｘマウスのヒラメ筋に直接ＣＤＣ由来エキソソームを注射した。上の結果は、骨格筋組織の効果において観察された効果が、少なくとも部分的にはＣＤＣ由来エキソソームを介することを示した。ヒラメ筋への直接のＣＤＣ由来エキソソーム注射の結果を、図１３Ａ、図１３Ｂ及び図１３Ｃに示す。ＭｙｏＤ及びミオゲニンのレベルの更なる改善を図１３Ｄに示す。図１３Ｆ及び図１３Ｇにおいて、ＩＧＦ１Ｒ及びｐ−ｐ６５のレベルは野生型とほぼ同じに達する。図１３Ｈに示されるヒラメ筋質量、並びに図１３１に示されるジストロフィン発現及び分布には目に見える改善が観察された。これらの改善は、図１３Ｊに示されるように単収縮及び絶対筋力の改善において更に測定された。
【０１４６】
ｍｄｘマウスにおけるＣＤＣの動脈弓内注射では、ＣＤＣ由来エキソソーム注射は、図１４Ａに示されるように横隔膜のトランスクリプトームを調節することができた。ｉＰＳＣ細胞に由来するヒトデュシェンヌ心筋細胞を評価する場合、図１４Ｂ及び図１４Ｃに示されるように、ジストロフィンタンパク質発現における同様の改善が観察された。
【０１４７】
組織学的解析は、野生型と比べて、ビヒクル注射ｍｄｘヒラメ筋に生存する少数の筋線維を明らかにし、残ったものは肥大型であった。ＣＤＣ由来エキソソームは筋線維の総数を著しく増加させて、サイズ分布をより小さな直径にシフトさせ、これは注射の３週間後の筋線維増殖の指標である。この解釈と一致して、筋芽細胞及び筋線維の分化を編成する主な転写因子である、ＭｙｏＤ及びミオゲニンの組織レベルの増加と共にＭｙｏＤ＋細胞の数はＣＤＣ由来エキソソーム注射後に増大された。生理学的な筋肉成長では、ＩＧＦ−１は、上流のシグナルとして一般的に関係があるとされるが、ｍｄｘヒラメ筋に対するＣＤＣ由来エキソソームの効果はＩＧＦ−１受容体に依存しなかった。増強された筋肉再生と共に、ヒラメ筋内のＣＤＣ由来エキソソーム注射は、ｍｄｘヒラメ筋におけるジストロフィンタンパク質の発現を増加させながら（免疫組織化学及びウエスタンブロットの両方によって明らか）、炎症及び線維化を減少させた。正味の影響は、ＣＤＣ由来エキソソームを注射したヒラメ筋にける収縮力の十分な回復であった。
実施例１７
ｉＰＳＣ細胞由来ヒトデュシェンヌ心筋細胞におけるＣＤＣ由来エキソソーム
【０１４８】
ＤＭＤの複数のモデルにおける有効性の証明は、ＣＤＣ由来エキソソームが実行可能な処理の候補物質の可能性があるという概念を支持し得る。デュシェンヌヒトｉＰＳ由来心筋細胞（ＤＭＤ  ＣＭ）は、ｍｄｘ心臓のミトコンドリアにおいて観察されたものを思い起こさせる酸素消費速度（ＯＣＲ）の減少、及び異常なカルシウムサイクリングを含む、ＤＭＤに特徴的な多くの表現型の欠陥を示す。１週間前にＣＤＣエキソソームでＤＭＤ  ＣＭをプライミングするとジストロフィン発現を増加し（ここでは、ｍｄｘ心臓におけるよりも更に大きく、対照レベルの２７．２±１．１％まで）、１Ｈｚのバーストペーシング中の心拍間隔のカルシウムトランジェントの変化（催不整脈性の尺度）を抑制し、ＯＣＲを正常化した。２つＤＭＤモデルにおける実験結果の一致は注目すべきである：ｍｄｘマウスはマウスジストロフィン遺伝子のエクソン２３中にミスセンス突然変異を有しているのに対し、そのｉＰＳＣ細胞が研究されたＤＭＤ患者はジストロフィン遺伝子に根本的に異なる遺伝病変を有している（フレームシフトによるエクソン５０欠失）。したがって、ＣＤＣ由来エキソソームの有効成分は、単一のジストロフィン突然変異、又は単一のクラスのジストロフィン突然変異に特異的ではない。
実施例１８
無血清低酸素条件下で調製されたＣＤ由来エキソソーム
【０１４９】
図２８に示されるように、低酸素培養ＣＤＣに由来するエキソソームのマイクロＲＮＡは、酸素正常状態のもとで成長させたＣＤＣに由来するエキソソームと比べて豊富である。−６倍〜６倍のｌｏｇ２倍率変化（２３０個のマイクロＲＮＡでマイクロＲＮＡを使用する２次元階層的クラスタリングを表す。低酸素エキソソームにおいて３８９個の検出されたマイクロＲＮＡ（無血清低酸素培地で２４時間培養されたＣＤＣに由来する）のうち、２４８個は、以前にミトコンドリア関連マイクロＲＮＡと報告されていた。目的のエキソソームの更なる描写を図２９に示す。この態様では、無血清低酸素エキソソームの元でのＣＤＣの培養は、正常酸素条件等の代替の培養条件と比較した場合、そこから由来するエキソソームによる効力を高め、有益な利益を改善する可能性がある。
実施例１９
異種発現系
【０１５０】
ＨＥＫ−２９３ＮＴ細胞を、ＭＥＭ−ＮＥＡＡ及びｌ０ｍＭ  Ｌ−グルタミンで補足されたＤＭＥＭ（ピルビン酸ナトリウムを含まない）中の１０％ＦＢＳを用いて成長させた。細胞を採取し、３継代目に６ウェル組織培養処理プレートの１ウェル当たり３．５×１０５個の細胞密度で蒔いた。細胞を一晩接着させた後、次の日に製造業者のプロトコルに従ってＲｏｃｈｅ  ＨＰ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用してトランスフェクトした。簡潔に言えば、全ての試薬を室温にした。次いで、各ウェルについて、１μｇのプラスミドＤＮＡを１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭに懸濁し、該溶液に４μＬのトランスフェクション試薬を添加した。この反応物を室温で３０分間インキュベートし、次いで１００μＬを各ウェルに滴下して添加した。細胞をトランスフェクション溶液と共に３０℃で２４時間インキュベートしてタンパク質の翻訳を刺激し、次いで、実験処理物を直接各ウェルに加えた。処理物は以下からなる：ＵｌｔｒａＰｕｒｅ蒸留水（ＤＮアーゼ及びＲＮアーゼを含まない）中に再構成されたｌｍｇ  Ｇ４１８硫酸塩（Ｇｉｂｃｏ）、１２５ｎｇのｍｉＲ−１４８ａ模倣物又は１．２５μｇのｓｒＤＭＤ。ビヒクル処理物は、上に列挙される各処理物に使用される容量に対応する等量のＰＢＳからなる。２４時間の処理期間に続いて、ＧＦＰ蛍光及びルシフェラーゼ活性の解析のため細胞を採取した。簡潔には、６ウェルプレートを氷上に置き、各ウェルを氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。次に１ｍＬの氷冷非変性溶解バッファー（ＰＢＳ中、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣ１  ｐＨ８、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ及び１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を各ウェルに添加し、氷上で１５分間インキュベートした。次に細胞溶解物を、細胞スクレーパーを使用して微小遠心管に移し、１２０００ＲＰＭで４℃にて１時間遠心分離した。上清を新しい予め冷やした微小遠心管に移し、氷上で維持した。各サンプルについて、２００μＬの細胞溶解物を、黒色／透明底９６ウェルプレートの１つのウェルに移した。このプレートを使用して、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー上でＧＦＰ蛍光を測定した。次いで、２０μＬの細胞溶解物をそれらの各ウェルから取り、黒色／透明底９６ウェルプレートに移した。室温に平衡化したルシフェラーゼ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ：ＦＵＣ−１）を、製造業者のプロトコルに従って各ウェルに添加し、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダー（トップリード、１ｓ積分時間）上で蛍光を測定した。ルシフェラーゼ基質の添加と蛍光の測定の間に２０秒以上経過しないことを確実にするため、交代でルシフェラーゼ測定を行った。各実験について、トランスフェクトされていない対照の生ＧＦＰ蛍光測定値（ＲＦＵ単位）を、全てのトランスフェクトサンプルに関する蛍光測定値から引いた。次いで、これらの補正値を、対応するルシフェラーゼ活性測定値によって割り算した。最後に、正規化された値を、指数関数を使用して変換した。
【０１５１】
生ＧＦＰ蛍光測定値を、対応するルシフェラーゼ活性によって補正し、次いで指数関数（等式１）を使用して変換した。Ｙ軸上、１はトランスフェクトされていないウェルの蛍光レベルである。生ＧＦＰ蛍光測定を、対応するルシフェラーゼ活性によって補正し、次いで指数関数（等式１）を使用して形質転換した。Ｙ軸上、１はトランスフェクトされていないウェルの蛍光レベルである。
【数１】
2020517601.tif 000003
野生型に対するＰＴＣ及びエクソン５０Δ発現のベースレベル間の非直線の関係は、飽和度関数（ｓａｔｕｒａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ）によって最も良く説明され、発現の増加（例えば小胞体ストレスに起因する）３に伴って全長融合タンパク質の分解が増加するという仮定と一致している。ＰＴＣ：ビヒクル（ｎ＝１５）、Ｇ４１８（ｎ＝７）、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ（ｎ＝４）及びｓｒＤＭＤ（ｎ＝４）；エクソン５０Δ：ビヒクル（ｎ＝８）、Ｇ４１８（ｎ＝３）、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ（ｎ＝４）及びｓｒＤＭＤ（ｎ＝３）；＊Ｐ＜０．０５対ビヒクル。野生型：ＣＭＶプロモータ＋Ｃ−ｅＧＦＰタグ＋ＳＣ４０ホタルｌｕｃ（Ｃ−ｅＧＦＰの前にネオマイシン及び停止コドンはない）を含む哺乳動物発現ベクターにおけるヒトＤＭＤバリアントＤｐ４２７ｍ［ＢＣ１１１５８７．２］ＰＴＣ：ＣＭＶプロモータ＋Ｃ−ｅＧＦＰタグ＋ＳＣ４０ホタルｌｕｃ（Ｃ−ｅＧＦＰの前にネオマイシン及び終始コドンはない）を含む哺乳動物発現ベクターにおけるヒトＤＭＤバリアントＤｐ４２７ｍ［ＢＣ１１１５８７．２、ＵＡＡ終始コドンを導入するためトランスフェクト配列に基づいて６８６３位にＧをＵに変異］エクソン５０Δ：ＣＭＶプロモータ＋Ｃ−ｅＧＦＰタグ＋ＳＶ４０−ホタルｌｕｃ（Ｃ−ｅＧＦＰの前にネオマイシン及び終始コドンなし）を含む哺乳動物発現ベクターにおけるヒトＤＭＤバリアントＤｐ４２７ｍ［ＢＣ１１１５８７．２，ｄｅｌ  ｅｘｏｎ  ５０］
実施例２０
ｍｄｘ心臓へのｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及びｓｒＤＭＤの移植
【０１５２】
図３５Ａでは。ｓｒＤＭＤの明らかな二次構造の描写と共に、正常酸素順化培地から単離されたＣＤＣ由来エキソソームと比較した場合の、低酸素順化培地（２％Ｏ２）から単離されたＣＤＣ由来エキソソームにおけるｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及びｓｒＤＭＤの差次的発現を観察した。図２８及び図２９に示される培養条件下での変化の更なる結果。図３５Ｂに示される、ビヒクル、又はｍｉＲ−１４８ａ−３ｐの模倣物若しくはｓｒＤＭＤの心筋内注射の３週間後のｍｄｘマウス心臓における、ジストロフィンアイソフォーム：ｄｐ４２７、ｄｐ２６０、ｄｐｌ４０、ｄｐｉ１６、ｄｐ７１、ｄｐ４０のタンパク質存在量に関するウエスタンブロット及びプールデータ。さらに、図３５Ｃでは、ビヒクル、又はｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ若しくはｓｒＤＭＤの模倣物の心筋内注射の３週間後のｍｄｘマウス心臓における、ジストロフィンアイソフォーム：ｄｐ４２７、ｄｐ２６０、ｄｐｌ４０、ｄｐｉ１６、ｄｐ７１、ｄｐ４０のタンパク質存在量、及びジストロフィン発現のレベルに関するウエスタンブロット及びプールデータ。
実施例２１
エクソンスキッピング／選択的スプライシングの排除
【０１５３】
図３６では、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐはＮＦ−κＢｐ６５及びリン酸化−Ａｋｔの両方のレベルの減少をもたらした。ＮＦ−κＢｐ６５及びＡｋｔはｍｉＲ−１４８ａ−３ｐの既知の標的である。図３６Ｂでは、ジストロフィンのエクソン２３に隣接するプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲ。上記ＲＴ−ＰＣＲをビヒクル、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ又はｓｒＤＭＤで処理したマウス（ｎ＝４〜６）に由来するｍｄｘ心臓において発現されたジストロフィンにおけるエクソン２３の包含を評価するため使用した。ビヒクル、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ又はｓｒＤＭＤで処理したマウス心臓に由来するジストロフィンに関するＲＮＡ−ＳｅｑデータのＳａｓｈｉｍｉプロットは、エクソン２３に亘るジャンクションリード（ｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅａｄ）を表さない。全てのデータは平均±ＳＥＭである。‡Ｐ＜０．００２対ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及びｓｒＤＭＤ；†Ｐ＜０．０３対ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及びＣＴＬ（野生型）。
【０１５４】
図３７Ｂにおける、ジストロフィン遺伝子（ＰＴＣ）のエクソン２３中の点突然変異又はジストロフィン遺伝子エクソン５０の欠失（エクソン５０Δ）を持つ、デュアルレポーターコンストラクトを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３  ＮＴ細胞におけるｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ又はｓｒＤＭＤによる処理後のジストロフィン／ｅＧＦＰ発現のパーセンテージ増加［ビヒクル（ＰＢＳ）と比較］。
実施例２２
ジストロフィン発現及びその結果
【０１５５】
図３８Ａにおける、ｍｄｘマウスのベースライン、及びｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ又はマイクロＲＮＡ模倣対照［ｍｉＲＭｉｍｉｃ（ＣＴＬ）］の心筋内注射の３週間後の駆出率（ＥＦ）。参照のため野生型（ＷＴ）ＥＦ値も示す、１群当たりｎ＝５。図３８Ｂにおける、心筋内注射の３週間後の野生型（ＷＴ）マウス心臓、及びビヒクル（Ｖｅｈ．）、変異体ｓｒＤＭＤ及びｓｒＤＭＤ注射（ｓｒＤＭＤ）ｍｄｘマウス心臓のタンパク質存在量を表すウエスタンブロット。
実施例２３
異種発現を使用する機構的研究
【０１５６】
図３９Ａに示されるように、全長ヒトジストロフィンを、野生型又は２つの変異体：エクソン２３（ＰＴＣ）中のＵＡＡ中途終止コドン、又はエクソン５０欠失（エクソン５０Δ）のうちの１つとしてＯＲＦにクローニングした。コンストラクトは、緑色蛍光をジストロフィン発現のレポーターとみなすことができるように、ｅＧＦＰとインフレームで全長ジストロフィンの融合タンパク質を構築する。恒常的ルシフェラーゼ発現（ＳＶ４０プロモータによって独立して駆動される）をトランスフェクション効率に対して正規化するため使用した。
【０１５７】
図３９Ｂに示されるように、全長（ＷＴ）、ＰＴＣ又はエクソン５０ΔのコンストラクトでトランスフェクトしたＨＥＫ−２９３ＮＴ細胞のジストロフィン／ｅＧＦＰ発現。９６ウェル分光光度計においてウェル毎に全細胞溶解物の蛍光及び発光を定量した；等価な播種密度及び溶解体積で非トランスフェクト細胞を用いて各々ウェルにおける蛍光も定量した。応答は、アミノグリコシドＧ４１８に対するものを模倣し、両方の突然変異に対して性質上類似している。いかなる特定の理論にも拘束されないが、これらの知見は、短い非コードＲＮＡが終結因子又はリボソーム自体に作用するという考えを支持する。
実施例２４
ジストロフィン再発現のエフェクターとしてのｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及びｓｒＤＭＤ
【０１５８】
本発明者らは、機構を探索するため、新規なデュアルレポーターコンストラクト（ｅＧＦＰに対してインフレームで融合された野生型及び突然変異型のジストロフィン、及び独立して発現されるルシフェラーゼ）の異種発現を利用した。応答は、アミノグリコシドＧ４１８に対するものを模倣し、両方の突然変異に対して性質上類似する。両方の種類の突然変異に対する有効性を考慮すれば、短い非コードＲＮＡは、読み替え（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）を増強するため、遊離因子又はリボソーム自体に作用することによって間接的にジストロフィン発現を増加させる可能性が最も高い。
【０１５９】
より具体的には、ＰＴＣのリードスルー及びリボソームフレームシフトは、特定の遺伝子エラーの転写効率を高める、天然の「読み替え」プロセスである；いずれも、アミノグリコシド抗生物質（ｉｎ  ｖｉｖｏでは毒性となり得る濃度にもかかわらず）によって増強される。翻訳を定量するため、本発明者らは、ｅ−ＧＦＰにインフレームで融合された全長ヒトジストロフィンを発現するデュアルレポータープラスミドを構築し、ルシフェラーゼはアッセイトランスフェクション効率とは独立して共発現させた。本発明者らは、野生型ジストロフィン又は２つの変異体：ｍｄｘ突然変異を模倣するためにＰＴＣを導入するエクソン２３中の点突然変異、及びヒトＤＭＤ突然変異を複製するエクソン５０の欠失を有する別の変異体の各々をコードするプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３ＮＴ細胞において、ジストロフィン−ｅＧＦＰが翻訳された場合にのみ見られる緑色蛍光を比較した。ビヒクルのみに対してパーセント増強として表される正規化された蛍光は、両方の変異体において陽性対照としてのアミノグリコシドＧ４１８による適切な増加を示した。ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ模倣物又はｓｒＤＭＤの適用は、同様に、両方の変異体においてジストロフィンｅＧＦＰ発現を増強した。
【０１６０】
エキソソームの効果は、それらのＲＮＡペイロードに寄与するという確たる証拠がある。ジストロフィントランスクリプトは、ＲＮＡ−ｓｅｑにより不在であり、ＣＤＣ由来エキソソームでは定量的ＰＣＲにより検出不可能であったため、ジストロフィン回復はそのＲＮＡの細胞−細胞移入に起因しない。それにもかかわらず、調節性ＲＮＡは、不完全なエクソンを除去するためのスプライシング、又は未成熟終始コドンのリードスルーにより、ジストロフィン発現を直接又は間接に増加させるように作用し得る。本発明者らの条件下（２４時間の無血清低酸素培地）で成長させたＣＤＣ由来エキソソームのＲＮＡ−ｓｅｑは、酸素正常状態のＣＤＣ由来エキソソームと比較して、未知の機能のＤＭＤ（ｓｒＤＭＤ）試料に由来するｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及び小型ＲＮＡの１４４倍及び３３７倍の増大をそれぞれ含む、大きな違いを明らかにした。エキソソームにおいて配列決定された小型ＲＮＡ（２５ｂｐ〜２００ｂｐ）のうち、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐが、その濃縮を考慮すると調査するにふさわしいように見える。この検討に加えて、ｓｒＤＭＤがＵＡＡ（ｍｄｘマウスのジストロフィンのエクソン２３中の未成熟終始コドン）を含む同族の配列を有し、ナンセンスサプレッサーＲＮＡがリードスルーを促進するように機能し得ることを示唆することから、本発明者らの注意を引いた。ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ又はｓｒＤＭＤの心筋内注射は、投与の３週間後にｍｄｘ心臓におけるジストロフィンの発現を回復した。ジストロフィンタンパク質レベルに対するｍｉＲ−１４８ａ−３ｐの予想外の生体活性は、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐの既知の効果（ＮＦκＢｐ６５及びリン酸化Ａｋｔの両方のレベルの減少）と並行して起こった。ｓｒＤＭＤの効果は、これまでのところこの短いＲＮＡが既知の機能を有していないことから際立っていた。同族ＵＡＡ部位を変更するためのｓｒＤＭＤの変異導入は、ｓｒＤＭＤを無効にした。ナンセンス抑制活性と一致するものの、これらの知見はその機構を証明するには十分ではない。しかしながら、本発明者らは、有力因子としてエクソンスキッピングを除外した：ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ又はｓｒＤＭＤ注射ｍｄｘ心臓に由来する配列決定されたジストロフィンｍＲＮＡのジャンクションリード解析はエクソン２３に及ぶリードがないことを明らかにした。選択的スプライシングに不利な証拠は、排除により、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ又はｓｒＤＭＤの投与によってみられるジストロフィン発現の増加の根底にある可能性のある機構としてリードスルーの増強を残す。図２８及び図２９は、低酸素条件下で濃縮される様々なその他のＲＮＡポリヌクレオチド及び処理剤の可能性がある候補物質を収載する。
【０１６１】
前述の作用を担う可能性のあるエキソソームの含有量を比較するため、ｓｒＤＭＤと比較してｍｉＲ−１４８ａ−３ｐを測定し、それらはいずれも同様の活性レベル及びジストロフィン発現レベルを示した。
【０１６２】
本発明者らは、機構を探索するため、新規なデュアルレポーターコンストラクト（ｅＧＦＰに対してインフレームで融合された野生型及び突然変異型のジストロフィン、及び独立して発現されるルシフェラーゼ）の異種発現を利用した。データは、それらの個々の構成要素であるｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及びｓｒＤＭＤが行うように、エキソソームがジストロフィン変異体の翻訳を増加させるという考えを支持する。応答は、アミノグリコシドＧ４１８に対するものを模倣し、両方の突然変異に対して性質上類似する。両方の種類の突然変異に対する有効性を考慮すれば、ＣＤＣエキソソームは、読み替えを増強するため、遊離因子又はリボソーム自体に作用することによって間接的にジストロフィン発現を増加させる可能性が最も高い。
【０１６３】
より具体的には、ＰＴＣのリードスルー（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）及びリボソームフレームシフトは、特定の遺伝子エラーの転写効率を高める、天然の「読み替え」プロセスである；いずれも、アミノグリコシド抗生物質によって増強される（ｉｎ  ｖｉｖｏでは毒性となり得る濃度にもかかわらず）。翻訳を定量するため、本発明者らは、ｅ−ＧＦＰにインフレームで融合された全長ヒトジストロフィンを発現するデュアルレポータープラスミドを構築し、ルシフェラーゼはアッセイトランスフェクション効率とは独立して共発現した。本発明者らは、野生型ジストロフィン又は２つの変異体：ｍｄｘ突然変異を模倣するためにＰＴＣを導入するエクソン２３中の点突然変異、及びヒトＤＭＤ突然変異を複製するエクソン５０の欠失を有する別の変異体の各々をコードするプラスミドでトランスフェクトされたＨＥＫ−２９３ＮＴ細胞において、ジストロフィン−ｅＧＦＰが翻訳された場合にのみ見られる緑色蛍光を比較した。ビヒクルのみに対してパーセント増強として表される正規化された蛍光は、両方の変異体において陽性対照としてのアミノグリコシドＧ４１８による適切な増加を示した。ＣＤＣ−エキソソーム（ＸＯ）、ｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ模倣物又はｓｒＤＭＤの適用は、同様に、両方の変異体においてジストロフィンｅＧＦＰ発現を増強した。両方の種類の突然変異に対する有効性を考慮すれば、ＣＤＣエキソソーム及びそれらの内容物は、遊離因子又はリボソーム自体に作用することにより間接的にジストロフィン発現を増加させる可能性が最も高い。対照的に、非異栄養性ＨＥＫ−２９３ＮＴ細胞におけるジストロフィン−ｅＧＦＰ翻訳の観察された増大は、酸化ストレスの緩和による翻訳抑制解除と相反する。ここでは発現ベクターはイントロンを含まないジストロフィンに対するオープンリーディングフレームを使用し、有益な機構としてのスプライシングを更に排除した。データは、それらの構成要素であるｍｉＲ−１４８ａ−３ｐ及びｓｒＤＭＤが行うように、エキソソーム自体がジストロフィン変異体の翻訳有効性を増加させるという考えを支持する
実施例２５
更なる目的の短い非コードのＲＮＡの識別及び検証プラットフォーム
【０１６４】
ｅＧＦＰ及びルシフェラーゼを使用するデュアルレポーター系の構築は、翻訳効率を増強する生理活性を持つ可能性がある新たな短い非コードＲＮＡを同定するためのロバストなプラットフォームを提供する。この態様では、治療活性を持つ細胞のＲＮＡプロファイリングを、濃縮されたＲＮＡを同定するため不活性な細胞と比較することができる。代替的には、治療活性を有する同じ細胞を、繰り返しになるが濃縮されたＲＮＡを同定するため、処理活性を増強する又は縮小する変更可能な培養条件に対して比較することができる。これらのアプローチによって同定された短い非コードＲＮＡを、次に、デュアルレポーター系を発現する細胞との接触によって検証することができる。具体的には、融合インフレームタンパク質（ジストロフィン−ｅＧＦＰ）が翻訳された場合に見られる緑色蛍光を測定することによる。対照としてのアミノグリコシドとの更なる比較により、翻訳を増強する短い非コードＲＮＡの生体活性を同定することができる。
実施例２６
ｍｄｘ心臓におけるＣＤＣ移植の遠隔効果
【０１６５】
ＣＤＣ及びそれらのエキソソームの心筋内注射は、ｍｄｘマウス心臓においてジストロフィンを増加させること及び主要な病態生理学的プロセスを回復させることにより、デュシェンヌ型心筋症を改善した。これらの変化は、運動能力の実質的な増加と関連し、これは、心機能におけるＣＤＣと関連する改善に対して不相応に見える：ＥＦは１０％未満増加したのに対し、歩行能力は２倍になった。ＣＤＣ処理ｍｄｘマウスにおける運動能力の増強機構を更に評価するため、本発明者らは、ＣＤＣ又はビヒクルの心筋内注射の３週週間後に、３つの異なる骨格筋：横隔膜（ＤＩＡ、重要な呼吸筋）、及び２つの四肢の筋肉（ヒラメ筋及び長指伸筋［ＥＤＬ］、それぞれ遅筋及び速筋を代表する）を検査した。
【０１６６】
上の効果におけるＣＤＣ由来エキソソームの寄与を理解するため、本発明者らは、心筋内ＣＤＣ注射の３週間後に骨格筋、横隔膜及びヒラメ筋を評価した。心筋内ＣＤＣ注射後の横隔膜遺伝子発現に対する二次的効果はＣａ２＋の違いを実証した。追加の結果を、炎症経路及び応答において観察した。心筋内ＣＤＣ由来エキソソーム注射は、示される野生型とほぼ同じレベルまで酸化ストレスマーカーであるＭＤＡの減少をもたらした。炎症マーカーであるｐ６５及びｌｋＢの更なる減少を観察した。炎症細胞の減少と同様に線維化の減少が観察された。横隔膜力発生及びヒラメ筋の改善を観察した。同様に、ヒラメ筋及びＥＤＬは、トランスクリプトームと機能の両方のレベルにおいて注目すべき改善を示した：ヒラメ筋収縮力は完全に正常化された。遺伝子発現の変化は、横隔膜及びヒラメ筋において有意に相関した。
【０１６７】
全身の利益を媒介するエキソソームの可能性を更に評価するため、本発明者らは、ｍｄｘ心臓の左心室腔にＣＤＣ由来エキソソームを注射した。ＣＤＣ由来エキソソームの心室内注射は、示されるように心臓において同様の有益な結果を実証した。ＣＤＣ由来エキソソームは、ＣＤＣ自体を反映する方法で遺伝子発現を調節することができた。さらに、駆出率及び距離の両方がＣＤＣ及びＣＤＣ由来エキソソーム注射によって改善した。これらの結果が横隔膜において更に観察され、ＣＤＣ由来エキソソーム注射によって強縮力及び比筋力の両方が改善した。これらの結果は、遺伝子発現について示されるヒラメ筋で更に観察され、ここでもＣＤＣ由来エキソソーム注射によって強縮力及び比筋力の両方が改善した。
実施例２７
動物及び注射
【０１６８】
全て動物の処置が、シーダーズ−サイナイ医療センター動物実験委員会によって承認された。１０カ月齢〜１２カ月齢のｍｄｘ（Ｃ５７ＢＬ１０／ＳｃＳｎ−ＤＭＤｍｄｘ／Ｊ）及び野生型の系統適合（Ｃ５７ＢＬ１０／ＳｃＳｎ／Ｊ）動物をこの研究に使用した。マウスを、１２時間の光周期で温度管理された部屋において無菌条件下で飼育した。最大運動能力及びｉｎ  ｖｉｖｏ心機能のベースライン測定を注射の前に記録した。ＣＤＣ（２．５×１０５個）及びＣＤＣ−ｅｘｏｓ（２×１０９個）を１００μＬのＤＰＢＳに懸濁し、ｍｄｘマウスの大腿静脈に注射した。ビヒクル処理ｍｄｘマウスは、大腿静脈に同じ容量のＤＰＢＳ注射を受けた。マウスを、注射後３週間に最大運動能力及びｉｎ  ｖｉｖｏ心機能について再度評価し、次いで、組織を採取し、筋肉生理学実験、組織学及び免疫組織化学のため処理するか、又は液体窒素で凍結させて−８０℃に保存した。
心筋球由来細胞培養物及びエキソソーム精製
【０１６９】
マウスＣＤＣを、８週齢の系統適合野生型ドナーから増殖させた。心室を１ｍｍ３未満の断片に切断し、洗浄して、部分的にトリプシン（０．０５％；Ｇｉｂｃｏ）で消化した。これらの断片を個別にフィブロネクチン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）被覆培養ディッシュに蒔き、成長培地［イスコフ改変ダルベッコ培地（ＧＩＢＣＯ）、２０％ウシ胎児血清（Ａｔｌａｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）、及びＩＸ  ２−メルカプトエタノール（ＧＩＢＣＯ）］で培養した。変動可能な増殖期間の後、細胞の単層が外植片から出現し、高輝度（ｐｈａｓｅ  ｂｒｉｇｈｔ）細胞が増殖した。外植片を囲んで緩く接着している細胞（外植片由来細胞と称される）を、穏やかな酵素消化（ＴｒｙｐＬＥ；ＧＩＢＣＯ）を使用して採取し、ポリ−Ｄ−リジン被覆培養フラスコ（超低接着）に３日間播種した。懸濁培養において、外植片由来細胞は、心筋球と称される三次元クラスターを自然に形成し、これを採取し、フィブロネクチン被覆培養フラスコに播種した。接着培養では、本明細書において他にも開示されるように、心筋球はＣＤＣと称される単層の細胞を形成する。ＣＤＣを３継代〜５継代まで増殖させ、これを全ての実験に使用した。エキソソームの生合成を遮断するため、コンフルエントのＣＤＣをＤＰＢＳで洗浄し、培地を無血清培地に取り換えた。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験に使用されるＣＤＣを洗浄し、接着培養皿から酵素により解離させ、計数してＤＰＢＳに懸濁した。エキソソームを生成するため、ヒトＣＤＣを５継代目にコンフルエントになるまで培養した。細胞をＤＰＢＳで洗浄し、培地を無血清培地に取り換えた。次いで、ＣＤＣを、生理学的に低酸素（２％Ｏ２）で２４時間培養した。次いで、順化培地を収集し、０．４５μｍフィルタを使用して滅菌濾過し、その後使用するまで凍結した。その後、順化培地を解凍し、エキソソームを３ｋＤａの遠心フィルタ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用する遠心分離により限外濾過によって精製し濃縮した。濾液のエキソソーム濃度を、ナノ粒子トラッキング解析（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００）によって測定した。次いで、エキソソームを使用する準備ができているチューブに等分し、凍結して、その後使用するまで−８０℃で保管した。
トレッドミル運動試験
【０１７０】
ショックプレートを装備したＥｘｅｒ−３／６齧歯類トレッドミル（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）の内部にマウスを入れた。順化期間中、ショックプレートを非働化して、ベルト速度を１０ｍ／分に設定し、マウスを環境に順応させるため２０分間干渉せずに置いた。順化期間の後、運動プロトコルに従事させた（０．１５ｍＡで１ショック／秒の頻度でショックプレートを稼働させた）。プロトコルは、毎分１ｍ／分でベルト速度を加速することによって、意欲の消耗（ｖｏｌｉｔｉｏｎａｌ  ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）を誘導することを意図している。軽く押しながら、１０秒超に亘ってショックプレート上で休息しているマウスを、最大運動能力に達したとみなし（累積移動距離を記録する）、運動試験を終了する。
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの単離された骨格筋生理学
【０１７１】
マウスをイソフルラン吸入で深く麻酔し、ヒラメ筋又は横隔膜の筋肉を素早く摘出した。簡潔に言えば、下腿側面の正中皮膚切開の後、ヒラメ筋を切り開いて、単離して、その起始腱及び停止腱を絹縫合糸（３−０）で締め、迅速に摘出した。ヒラメ筋を、以下の組成：（ｍＭ単位）１３７  ＮａＣｌ、５  ＫＣ１、２  ＣａＣｌ２、１  ＭｇＳＯ４、１  ＮａＨ２ＰＯ４、２４  ＮａＨＣＯ３、１１  グルコースの哺乳動物リンガー溶液を含む組織浴に垂直に取り付けた。その溶液を、ｐＨを７．３５及び温度２４℃に維持しながら９５％Ｏ２及び５％ＣＯ２で絶えず通気した。左肋弓下縁皮膚及び筋肉の切開に続いて、肋弓下半横隔膜の切片を通気した冷リンガー液を含む予備Ｓｙｌｇａｒ裏打ちディッシュに移し、線維を肋骨に付着させ、また絹縫合糸で締められ及び組織浴に垂直に取り付けられた腱中心を無傷のままにして、３ｍｍ〜４ｍｍの幅の狭い横隔膜の条片を単離した。ヒラメ筋の一端をディッシュ底のクランプに固定し、もう一端を較正済みの力変換器（マサチューセッツ州ウォータータウンのＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍｏｄｅｌ  ３００Ｂ）に取り付けた。システムに連結されたマイクロマニピュレーターを、筋長を調整するために使用した。筋肉の両側に配置されたプラチナプレート電極を、過最大強度で送達される定電流の０．２ミリ秒持続時間単相矩形パルスを使用する直接の筋肉刺激（マサチューセッツ州クインシーのＧｒａｓｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓ８８刺激装置）に使用した。最大等尺性単収縮応答に達するまで筋肉前負荷を増加的に調整した。Ｌｏを、デジタルノギス（日本、Ｍｉｔｕｔｏｙｏ）を使用して０．１ｍｍ精度で測定した。次いで、ピーク単収縮力（Ｐｔ）、収縮時間（すなわちＰｔまでの時間）、及び半弛緩時間（すなわちＰｔが１／２最大値になるまでの時間）を一連のシグナルパルスから決定した。力／頻度関係を１秒当たり５パルス〜１８０パルスの範囲の刺激頻度で測定した。刺激を、各刺激列の間を少なくとも１分隔てる間隔で、１秒の継続期間のパルス列で提示した。Ｐｔ及び最大強縮力（Ｐｏ）を含む発生した筋力を、筋板の推定される生理学的横断面積（ＣＳＡ）に対して正規化し（ＣＳＡ＝筋肉重量／１．０５６×Ｌｏ；式中、１．０５６ｇ／ｃｍ３が筋肉の密度を表す）、ニュートン（Ｎ）／ｃｍ２で表した。ヒラメ筋に関し、筋肉の比筋力を推定する際に、Ｌｏも筋線維長に対して正規化した（０．７１のＬｏ）。発生する絶対筋力も報告する（ｍＮ）。
【０１７２】
図４０は、ｍｄｘマウスにおける同系心筋球由来細胞（ＣＤＣ）及びヒトＣＤＣ由来エキソソーム（ＣＤＣ−ＸＯ）の単回静脈内投薬による心呼吸系に対する機能的改善を実証する。１０カ月齢〜１２カ月齢の野生型（ＷＴ）及びｍｄｘマウスを、心エコー検査によって最大運動能力及びｉｎ  ｖｉｖｏ心機能のベースライン評価に供した。この年齢では、ｍｄｘマウスは、左心室駆出率が損なわれたことにより運動に耐える能力が著しく減少していた（図４０Ａ）。ＣＤＣ又はＣＤＣ−ＸＯの単回静脈内投薬は、処理の３週間後のｍｄｘマウスの最大運動能力を劇的に改善した。運動能力の改善に加えて、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯ処理は、ビヒクル処理ｍｄｘマウスと比べて、左心室の機能（駆出率によって証明される）を促進した（図４０Ｂ）。心機能におけるロバストな改善は、間質性線維化の有意な減少を伴って（図４０Ｄ）、ｍｄｘ心臓の組織病理学における全体的な減少（図４０Ｃ；ビヒクル：上段パネル、ＣＤＣ：中段パネル、及びＣＤＣ−ＸＯＣＤＣ−ＸＯ：下段パネル）により反映される。
実施例２８
【０１７３】
実施例２７に記載される通り動物を処理した。図４１及び図４２は、ｍｄｘ心臓のトランスクリプトーム、炎症、酸化ストレス及び再生に対するＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯの効果を明らかにする。ＲＮＡシーケンシングデータの全トランスクリプトーム解析は、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯが、ｍｄｘ心臓のトランスクリプトームプロファイルを部分的に回復し、ＷＴ心臓へと遺伝子発現を歪めることを実証した（図４１Ａ）。７２２個の差次的に調節される遺伝子のＫｙｏｔｏ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  （ＫＥＧＧ）濃縮分析は、サイトカイン−受容体相互作用、補体及び凝固カスケード、並びにＮＦ−κＢ等の炎症に関与する幾つかの経路における著しいアップレギュレーションを示す（データは示していない）。したがって、炎症促進性遺伝子の宿主のマスター転写調節因子であるＮＦ−κＢの活性化（リン酸化）を探査した。ｍｄｘ心臓において、ＮＦ−κＢは強力に活性化される（図４１Ｂ）。逆に、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯ処理は、リン酸化ＮＦ−κＢのタンパク質レベルを減少させ（図４１Ｂ）、炎症促進性シグナル伝達の減少を示した。ＮＦ−κＢシグナル伝達の減少がｍｄｘ心臓における炎症に対して生理学的効果を有するかどうかを判断するため、ビヒクル（対照：標識化ｍｄｘ）、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯ処理マウスに由来するｍｄｘ心臓の凍結切片を、活性化マクロファージマーカーであるＣＤ６８に対して免疫染色し、共焦点顕微鏡によって免疫蛍光を可視化した。ビヒクル処理ｍｄｘ心臓と比較して、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯ処理ｍｄｘ心臓は、有意に少ないＣＤ６８＋マクロファージ（図４１Ｃ及びＤ）を含み、ｍｄｘ心臓において炎症を調節するＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯの直接的な効果を実証した。ｍｄｘマウス由来の心臓は以前にミトコンドリア機能不全を有すると記載されていることから、電子輸送及び酸化的リン酸化に関与する複合体のタンパク質発現に対するアッセイを行った。一貫して、中程度であるが有意な、ほとんどの電子伝達連鎖複合体及びＡＴＰ合成酵素（複合体Ｖ）の減少が実証された（図４２Ａ）。対照的に、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯ処理は、電子伝達連鎖複合体及びＡＴＰ合成酵素のタンパク質発現を回復した（図４２Ａ）。ミトコンドリア機能不全は、細胞の酸化ストレスの増加と関係している。重篤な酸化剤ストレスによって引き起こされるタンパク質への不可逆酸化修飾である、タンパク質−カルボニル付加物の形成を試験した。ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯによる処理はカルボニル化されたタンパク質蓄積をＷＴ心臓と一致するレベルまで減少した（図４２Ｂ）。最後に、静脈内で送達された場合、ＣＤＣ又はＣＤＣ−ＸＯが、心臓再生のマーカーである心筋細胞の増殖を誘導することができるかどうか判断するため試験を行った。ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯ処理ｍｄｘ心臓は、ビヒクル処理ｍｄｘ心臓と比較して、Ｋｉ−６７＋心筋細胞（細胞分裂中に排他的に発現されるタンパク質）が２．５倍〜３倍多かった（図４２Ｃ及びＤ）。
実施例２９
【０１７４】
実施例２７に記載される通り動物を処理した。図４３は、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯの静脈内送達の治療上の利益は、ｍｄｘ心臓に限定的ではなく、骨格筋機能の改善にも有効であることを示す。ｍｄｘマウスの骨格筋がｍｄｘ心臓と共通の病態生理学的プロセスを共有するならば、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯの全身送達は、ｍｄｘマウスの骨格筋の利益となるかどうかを試験した。ビヒクル処理ｍｄｘマウスは、それぞれ主要な呼吸及び自発運動の筋肉である横隔膜（図４３Ａ〜図４３Ｃ）及びヒラメ筋（図４３Ｄ〜図４３Ｆ）の等尺性の単収縮力及び強縮力の著しい減少を示した。ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯの静脈内送達は、横隔膜及びヒラメ筋によってもたらされる等尺性の力を強力に促進した（図４３Ａ〜図４３Ｆ）。ｍｄｘ心臓のように、これらの改善は、組織病理学（図４３Ｇ；ビヒクル：左パネル、ＣＤＣ：中パネル、及びＣＤＣ−ＸＯ：右パネル）及び関連する線維化（図４３Ｈ）の減少によって反映される。並行して、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯ処理は、ｍｄｘマウスのヒラメ筋を含む筋線維の数を増加した（図４３Ｉ）。
実施例３０
【０１７５】
実施例２７に記載される通り動物を処理した。図４４及び図４５は、トランスクリプトームに対するＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯの効果、並びにｍｄｘマウスのヒラメ筋の炎症を示す。ｍｄｘの心臓のように、全トランスクリプトーム分析は、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯがｍｄｘマウスのヒラメ筋のトランスクリプトームプロファイルを部分的に逆転させることを示す（図４４Ａ）。ＫＥＧＧ濃縮は、ＣＤＣ（データは示していない）及びＣＤＣ−ＸＯ（図４４Ｂ）で処理したｍｄｘヒラメ筋の炎症に関与する経路の劇的なアップレギュレーションを示す。ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯ処理による、ＴＮＦ及びＮＦ−κＢシグナル伝達に関与する遺伝子の倍率変化（ビヒクル処理ｍｄｘヒラメ筋に対する）をそれぞれ図４３Ｃ及び図４３Ｄに示す。一貫して、ビヒクルで処理されたｍｄｘ心臓では、リン酸化ＮＦ−κＢは、ＷＴヒラメ筋よりもビヒクルで処理されたｍｄｘヒラメ筋で有意に大きかった（図４５Ａ）。次に、ビヒクル、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯで処理されたｍｄｘヒラメ筋凍結切片のＣＤ６８免疫組織化学を探査した。ビヒクル処理されたｍｄｘ心臓のように、ヒラメ筋にもＣＤ６８＋マクロファージが浸潤していた。しかしながら、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯで処理されたｍｄｘ心臓とは異なり、これらの処理はヒラメ筋におけるＣＤ６８＋マクロファージ蓄積を促進するようであり、これはＲＮＡシーケンシングデータと一致する観察結果である（図４５及び図４５Ｃ）。これらの筋肉の束状配列（図４５Ｃ中、α−サルコメリックアクチン［緑色］チャネル）を注意深く調べると、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯの処理に起因するＣＤ６８＋マクロファージの蓄積の増加は病的ではないようであることを明らかにする。実際、これらの処理は筋肉の収縮機能を高め（図４３Ｄ〜図４３Ｆ）、タンパク質−カルボニル付加物を減衰させる（データは示していない）。
【０１７６】
図４６は、単回投与の３週間後のヒラメ筋（図４６Ａ）及び横隔膜（図４６Ｂ）における全長ジストロフィンアイソフォームのタンパク質発現を適度に増加させるＣＤＣ及びＣＤＣ−ＸＯ（静脈内送達時）の能力を示す。
更なる背景及び実施例
上で検討されるように、本明細書で提供される方法及び組成物の幾つかの実施形態は、ｍｄｘマウスへの心球由来細胞（ＣＤＣ）の静脈内投与がそれらの肺におけるＣＤＣの大部分の蓄積をもたらすという発見にもかかわらず、本書に提示される様々なデータが示すように、治療有効量のＣＤＣを骨格筋ジストロフィーに苦しむヒト対象に投与することにより、異栄養性骨格筋の機能改善が達成され、それによって筋ジストロフィー、例えばＤＭＤに苦しむヒト対象の効果的な治療を可能にするという驚くべき発見に基づく。
【０１７７】
肺に蓄積されたＣＤＣは、例えば脚等の異栄養性骨格筋との直接的な相互作用、又は間接的な機構（免疫調節反応や慢性炎症の軽減等）によりエキソソーム及び微小胞を含む細胞外小胞（ＥＶ）と並んでパラクリン因子を放出し、それを必要とする対象を治療する治療有効量に達した可能性がある。したがって、この文脈では、理論に拘束されることを望まないが、「治療有効量のＣＤＣ」とは、対象において骨格筋機能を増加及び／又は回復し、慢性炎症性免疫応答を免疫調節するために、対象の標的異栄養性骨格筋への十分な量のＥＶの送達をもたらす、対象に投与されるＣＤＣを意味する。
【０１７８】
したがって、幾つかの実施形態の一態様は、治療有効量の自己又は同種ＣＤＣ及び／又はＥＶ、例えばエキソソーム及び微小胞を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において骨格筋ジストロフィーを安全に処理する方法を提供する。特に、ＣＤＣ及び／又はＥＶの治療有効量は、対象の標的とされる異栄養性骨格筋を処理又は緩和するのに十分である。この文脈において「標的とされる異栄養性骨格筋」とは、異栄養性骨格筋の部位でジストロフィン異常症を治療するのに十分な量ではないかもしれないＣＤＣ及び／又はＣＤＣから分泌され得るＥＶの偶発的又は不注意による送達ではなく、治療有効量のＣＤＣ及び／又はＥＶが、異栄養性骨格筋の部位で対象の特定の異栄養性骨格筋のジストロフィン異常症を治療又は軽減する、及び／又は骨格筋機能を回復するのに十分であることを意味する。
【０１７９】
上記骨格筋ジストロフィーの非限定的な例として、ＤＭＤ及びベッカー型筋ジストロフィーが挙げられ、ここで、例えば横隔膜、腕及び／又は脚の１つ以上の骨格筋がジストロフィーである。この文脈で治療有効量のＣＤＣ及び／又はＥＶを投与する手段の非限定的な例には、単回投与又は頻回投与による異栄養性骨格筋への直接の筋肉内注射又は注入、及び全身投与が含まれる。
【０１８０】
別の態様は、異栄養性心筋症を安全に治療する方法を提供し、該方法は、治療有効量のＣＤＣを対象に全身投与することを含む。特に、ＣＤＣの治療有効量は、対象のジストロフィー心筋を治療又は緩和するのに十分である。上記異栄養性心筋症の非限定的な例としては、急性又は慢性の筋ジストロフィー、例えばＤＭＤ又はベッカー型筋ジストロフィーに続発する、又は関連する心不全が含まれる。
【０１８１】
上で検討されるように、異栄養性組織には、骨格筋及び／又は心筋におけるジストロフィンの欠如又は不足が含まれる。
【０１８２】
幾つかの実施形態では、上記対象はヒト等の哺乳動物である。上記ＣＤＣの全身投与の非限定的な例としては、血管内投与（例えば、静脈内又は動脈内の注射又は注入）、大動脈内投与、心室内投与（例えば、右心室若しくは左心室又は心房への注射又は注入）、脊髄内投与、及び腹腔内投与が挙げられる。前記ＣＤＣの静脈内投与の非限定的な例には、頸静脈及び／又は大腿静脈の注射及び／又は注入が含まれる。頻回投与によるＣＤＣの上記投与の非限定的な例には、１カ月〜５カ月の間隔で２回〜１０回の投与、例えば、約３カ月の間隔で３回の投与、又は約１週間の間隔で５回の投与が含まれる。頻回投薬によるＣＤＣの上記投与の非限定的な例には、０週、６週及び１２週での３回の投与が含まれる。前記治療有効量のＣＤＣの非限定的な例としては、少なくとも約７５×１０６個〜５００×１０６個のＣＤＣ、例えば約７５×１０６個のＣＤＣ、約１５０×１０６個のＣＤＣ、約３００×１０６個のＣＤＣ、４００×１０６個のＣＤＣ、及び５００×１０６個のＣＤＣが挙げられる。
【０１８３】
幾つか実施形態は、前述の方法による骨格筋ジストロフィー及び／又はジストロフィー心筋症の治療に使用するためのＣＤＣを含む製剤を提供する。
【０１８４】
幾つかの実施形態は、前述の方法に従って骨格筋ジストロフィー及び／又は異栄養性心筋症を治療するため、前述の製剤を使用する。
心筋球
幾つかの実施形態では、心筋球は、それらの開示が参照により全体が本明細書の一部をなす、国際公開第２００５／０１２５１０号、及びＭｅｓｓｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔ  Ｃａｒｄｉａｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｈｅａｒｔ，”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ９５：９１１−９２１（２００４）に記載される、心臓組織に由来し、自己接着クラスターとして成長する未分化の心臓細胞を含む。
【０１８５】
簡潔に言えば、手術又は心臓生検の間に患者から心臓組織を収集することができる。心臓組織は、左心室、右心室、中隔、左心房、右心房、分界稜、右心室内膜、中隔又は心室壁、心耳、又はそれらの組み合わせから採取され得る。生検は、例えば、特許出願公開第２００９／０１２４２２号及び同第２０１２／００３９８５７号に記載されるように経皮生検鉗子を使用することにより得ることができ、それらの開示は、参照によりその全体が本明細書の一部をなす。次に、組織を直接培養するか、あるいは心臓組織を凍結、解凍してから培養することができる。組織を、コラゲナーゼ、トリプシン等のプロテアーゼ酵素で消化することができる。心臓組織は、線維芽細胞様細胞及び心筋球形成細胞を含む細胞が外植片から成長するように、外植片として培養され得る。幾つかの例では、外植片は、細胞外マトリクスの１つ以上の成分（例えば、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン、又は他の細胞外マトリクスタンパク質）で被覆された培養容器で培養される。組織外植片を、心筋球形成細胞を収集する前に、約１週間、２週間、３週間、４週間、又はそれ以上の間培養してもよい。線維芽細胞様細胞の層は、心筋球形成細胞が現れる外植片から成長し得る。心筋球形成細胞は、位相差顕微鏡下では小さく丸い位相の明るい（ｐｈａｓｅ−ｂｒｉｇｈｔ）細胞として出現し得る。心筋球形成細胞を含む外植片を取り巻く細胞は、手作業の方法又は酵素消化によって収集され得る。収集された心筋球形成細胞は、心筋球の形成を促進する条件下で培養され得る。幾つかの態様では、細胞は、緩衝培地、アミノ酸、栄養素、血清又は血清代替物、ＥＧＦ及びｂＦＧＦを含むがこれらに限定されない増殖因子、カルジオトロフィンを含むがこれらに限定されないサイトカイン、並びにトロンビン等の他の心筋球促進因子を含む心筋球成長培地で培養される。心筋球形成細胞は、約２００００細胞／ｍＬ〜１０００００細胞／ｍＬ等、心臓球形成に必要な適切な密度で播種され得る。細胞は、ポリ−Ｄ−リジン、又は細胞がディッシュの表面に付着するのを妨げる他の天然又は合成分子で被覆された滅菌ディッシュで培養され得る。心筋球は、心筋球形成細胞を播種した後、約２日〜７日又はそれ以上で自然に現れる。
心筋球由来細胞（ＣＤＣ）
【０１８６】
幾つか実施形態では、ＣＤＣは、例えば米国特許出願公開第２０１２／０３１５２５２号に記載される方法で心筋球を操作することにより生成された細胞の集団を含み、その開示は全体を参照することにより本明細書の一部をなす。例えば、ＣＤＣは、フィブロネクチン、ヒドロゲル、ポリマー、ラミニン、血清、コラーゲン又はゼラチン等の培養容器の固体表面への細胞の付着を促進する物質で被覆された固体表面に心筋球を播種すること、及び接着単層培養としてそれを増殖することによって生成され得る。ＣＤＣは、標準的な細胞培養方法に従って、繰り返し継代することができ、例えば、２回以上継代することができる。
細胞外小胞（ＥＶ）
【０１８７】
幾つかの実施形態において、エキソソーム及び微小小胞を含むＥＶは、細胞の原形質膜の多胞体又はエンドソーム関連領域を含む特定の細胞内経路を介して形成される小胞を含む。ＥＶは、例えば直径が約２０ｎｍ〜１５０ｎｍの範囲のサイズである。幾つかの場合には、ＥＶは、約１．１ｇ／ｍＬ〜１．２ｇ／ｍＬの特徴的な浮力密度及び、特徴的な脂質組成を有する。それらの脂質膜はコレステロールが豊富で、スフィンゴミエリン、セラミド、脂質ラフト、及び露出したホスファチジルセリンを含む場合がある。ＥＶは、インテグリンや細胞接着分子等の特定のマーカータンパク質を発現するが、一般的にはリソソーム、ミトコンドリア、又はカベオラのマーカーを欠いている。幾つかの実施形態では、ＥＶは、タンパク質、ＤＮＡ及びＲＮＡ（例えば、マイクロＲＮＡ及び非コード化ＲＮＡ）等であるがこれらに限定されない細胞由来成分を含む。幾つかの実施形態では、ＥＶを、エキソソームのレシピエントに対して同種、自己、異種、又は同系の供給源から得られた細胞から得ることができる。
【０１８８】
幾つかの実施形態では、特定の種類のＲＮＡ、例えばマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）はＥＶによって運ばれる。ｍｉＲＮＡは、多くの場合、標的メッセンジャーＲＮＡ転写産物（ｍＲＮＡ）上の相補配列に対する結合により転写後調節因子として機能し、それにより翻訳抑制、標的ｍＲＮＡ分解及び／又は遺伝子サイレンシングをもたらす。例えば、国際公開第２０１４／０２８４９３号に記載されるように、正常なヒト皮膚線維芽細胞から単離されたＥＶと比較して、ｍｉＲ１４６ａはＣＤＣにおいて２５０倍超の発現増加を示し、ｍｉＲ２１０はおよそ３０倍アップレギュレートされる。
【０１８９】
心筋球及びＣＤＣに由来するＥＶの例は、例えば、国際公開第２０１４／０２８４９３号に記載され、その開示は全体を参照することにより本明細書の一部をなす。ＥＶの調製方法には、馴化培地で循環心筋球又はＣＤＣを培養する工程、馴化培地から細胞を単離する工程、連続遠心分離等によりＥＶを精製する工程、及び任意に密度勾配、例えばスクロース密度勾配でＥＶを清澄化する工程が含まれる。幾つかの場合には、単離及び精製されたＥＶは、心筋球又はＣＤＣの成分等の非エキソソーム成分を本質的に含まない。ＥＶは、０．０１％〜１％のヒト血清アルブミンを含む滅菌ＰＢＳバッファー等のバッファーに再懸濁されてもよい。ＥＶを将来使用するため凍結して保管することができる。
実施例３１：マウスＣＤＣの調製
【０１９０】
本明細書で提供される組成物及び方法の幾つかの実施形態には、マウス又はヒト等の哺乳動物から調製されたＣＤＣが含まれる。マウスＣＤＣを使用する例では、例えば、Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｆｒｏｍ  ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｅｎｄｏｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｂｉｏｐｓｙ  ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１５，８９６−９０８（２００７）に記載される通り、野生型系統適合マウス心臓（Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎＪ野生型マウス心臓）からマウスＣＤＣを増殖させた。簡潔に言えば、心室組織を約１ｍｍの外植片に切り刻み、酵素で部分的に消化し、接着性（フィブロネクチン被覆）培養皿に播種した。これらの外植片は自発的に成長細胞（外植片由来細胞）を生成し、一旦コンフルエントで採取され、懸濁培養（ポリ−Ｄ−リジン被覆ディッシュに１０５細胞／ｍＬ）に播種して、３次元心筋球の自己組織化を可能とした。その後、接着培養皿に心筋球を再播種すると、３継代目、４継代目、又は５継代目で使用されるＣＤＣが得られた。
実施例３２：ｍｄｘマウスの運動能力
【０１９１】
図４７に示すように、処理前に、８カ月齢〜１０カ月齢のｍｄｘマウスにおける左心室駆出率のベースライン測定値を心エコー検査によって得て、トレッドミル運動を使用して運動能力を測定した。ＣＤＣ処理又はビヒクル対照をｔ＝０週に与えた。ＣＤＣ処理は、７５０００細胞（頸静脈に静脈内注射）、１５００００細胞（特に指定のない限り頸静脈に静脈注射）、又は２５００００細胞（大腿静脈に静脈注射）の３種類のＣＤＣの用量のいずれか１つを含んだ。ビヒクル対照はＰＢＳ（頸静脈に静脈内注射）を含んだ。左心室駆出率を、処理の３週間後に測定した。運動能力を、処理後６週間にわたり週１回測定した。研究の終わりに、マウスを屠殺し、分離した筋肉機能を各マウスのヒラメ筋及び横隔膜で測定し、マッソントリクローム染色により心臓組織を分析してコラーゲン沈着を測定した。図４７に示される実験プロトコルを使用して、図４８Ａ、図４８Ｂ、図４９及び図５０Ａ〜図５４、並びに実施例３２Ａ〜３６Ｂに記載されるデータを生成した。
【０１９２】
一実験では、投与経路が運動能力に影響を与えたかどうかを判断するため、ｍｄｘマウスの頸静脈又は大腿静脈のいずれかにＣＤＣを静脈内投与した。マウスは、０週間で頸静脈（ｎ＝４）若しくは大腿静脈（ｎ＝４）により１５００００個のＣＤＣで処理されるか、又はＣＤＣを含まないＰＢＳビヒクル（ｎ＝１０）を投与された。運動能力を週１回評価し、図４８Ａに示す。Ｅｘｅｒ−３／６オープントレッドミル（オハイオ週コロンバスのＣｏｌｕｍｂｕｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で運動能力を評価した。各マウスについて、順応期間（２０分で１０ｍ／分）の後、マウスが疲労するまでトレッドミル運動中に２分ごとに平均速度の段階的な増加（２ｍ／分）を適用した（ショッカーにおいて１０秒超を費やすまで；トレッドミル中は、マウスがトラックに留まるのを支援するために、軽く押し続けた）。その後、マウスをケージに戻し、トレッドミル上を移動した合計距離を記録した。両方の処理経路（頸部及び大腿部）は、６週間の研究期間中に同様の運動能力の増加をもたらした。＊＝対照に対してｐ＜０．０５。したがって、幾つか実施形態では、全身投与によるＣＤＣ処理は、骨格筋のジストロフィン異常症を伴う、ＤＭＤ又はベッカー型筋ジストロフィー等の筋ジストロフィーを有す対象の運動能力を改善する。治療上有効な投与には、頸静脈又は大腿静脈等の血管又は静脈への静脈内注射が含まれる。
【０１９３】
運動能力、筋肉機能、体重、並びに心臓の線維化、構造及び機能に対する様々なＣＤＣ用量の効果を判断するため、一連の実験を行った（実施例３２〜実施例３６Ｂに記載）。マウスを０週に７５０００個のＣＤＣ（ｎ＝８）、１５００００個のＣＤＣ（ｎ＝８）若しくは２５００００個のＣＤＣ（ｎ＝４）、又はＰＢＳビヒクル（ｎ＝１２）のＩＶ投与で処理し、Ｅｘｅｒ−３／６オープントレッドミルで運動能力を毎週評価した。各マウスについて、順応期間（２０分で１０ｍ／分）の後、マウスが疲労するまでトレッドミル運動中に２分ごとに平均速度の段階的な増加（２ｍ／分）を適用した（ショッカーにおいて１０秒超を費やすまで；トレッドミル中は、マウスがトラックに留まるのを支援するために、軽く押し続けた）。その後、マウスをケージに戻し、マウスが移動した合計距離を記録した。結果を図４８Ｂにグラフで示す。処理後１週間〜３週間で運動能力が最初に増加した後、７５ＫのＣＤＣで処理されたマウスの運動能力はＰＢＳ処理マウスの運動能力に戻った。１５０Ｋ及び２５０ＫのＣＤＣで処理されたマウスは、７５Ｋ又はＰＢＳで処理されたマウスと比較して、６週間の研究の間、運動能力の増加を示し、用量応答を示した。＊＝対照に対してｐ＜０．０５。これらの結果はいずれも、一部の実施形態では、約７５０００個、１０００００個、１２５０００個、１５００００個、２０００００個、２５００００個のＣＤＣ、又は約５０００００個若しくは１×１０６個のＣＤＣ等の用量が、骨格筋のジストロフィン異常症を伴う、ＤＭＤ又はベッカー型筋ジストロフィー等の筋ジストロフィーを有する対象の運動能力を改善するのに治療上有効であることを示す。これらの結果はまた、幾つかの実施形態では、前述の数のＣＤＣを含む及び／又はそれに及ぶ範囲が、骨格筋のジストロフィン異常症を伴う、ＤＭＤ又はベッカー型筋ジストロフィー等の筋ジストロフィーを有する対象の運動能力を改善するのに治療上有効であることを示している。これらの結果はまた、幾つかの実施形態では、約１５００００個、２０００００個、２５００００個、５０００００個、又は１×１０６個のＣＤＣの用量、又はより多くのＣＤＣが７５０００個のＣＤＣの用量よりも更に有効となり得ることを示す。したがって、幾つかの実施形態では、約７５０００個〜約２５００００個のＣＤＣ、又は約１５００００個〜約２５００００個のＣＤＣの全身投与を使用して、ランニング能力を含む対象の運動能力を改善する可能性がある。
【０１９４】
本明細書及び他の実施例で例示される治療有効用量は、治療される対象のサイズ及び／又は体重に応じて増加又は調整されてもよい。例えば、約７５０００個〜約２５００００個のＣＤＣがマウスに治療上有効である場合、ヒトの治療有効用量も約７５０００個〜約２５００００個のＣＤＣであるが、平均的なヒトの体重に応じて調整して、約１．８６×１０８個〜約６．２×１０８個のＣＤＣ（一般的なマウスの体重２５ｇから平均的な人間の体重６２ｋｇに調整するため）等の用量を含めてもよい。
実施例３３：ｉｎ  ｖｉｔｒｏで単離された筋肉の機能
【０１９５】
全身投与された様々な用量のＣＤＣの筋肉機能に対する効果も判断した。図４８Ｂに示すデータを生成するため使用したのと同じマウスを、ケタミン／キシラジン（８０ｍｇ／ｋｇ体重及び１０ｍｇ／ｋｇ体重の腹腔内投与）で深く麻酔した。各マウスについて、横隔膜の筋肉を素早く摘除し、動物を安楽死させた。左肋弓下縁皮膚及び筋肉の切開に続いて、肋弓下半横隔膜の切片を、冷リンガー液を含む予備Ｓｙｌｇａｒ裏打ちディッシュに移し、線維を肋骨に付着させ、絹縫合糸で締めて組織浴に垂直に取り付けた腱中心を無傷のままにして、３ｍｍ幅〜４ｍｍの幅の狭い横隔膜の条片を単離した。横隔膜の一端をディッシュ底のクランプに固定し、もう一端を較正済みの力変換器（マサチューセッツ州ウォータータウンのＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍｏｄｅｌ  ３００Ｂ）に取り付けた。システムに連結されたマイクロマニピュレーターを使用して、筋肉の長さを調整した。筋肉の両側に配置されたプラチナプレート電極を、最大強度で送達される定電流の０．２ミリ秒持続時間単相矩形パルスを使用する直接筋肉刺激（マサチューセッツ州クインシーのＧｒａｓｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓ８８刺激装置）に使用した。最大等尺性単収縮力応答の測定値が得られるまで、筋肉の長さを調整した。等尺性収縮特性を最適な長さ（Ｌｏ）で決定した。ピーク単収縮力（Ｐｔ）を、一連の単一パルスから決定した。力／周波数の関係を、５パルス／秒〜１５０パルス／秒（ｐｐｓ）の範囲の刺激周波数で測定した。刺激を、各刺激トレインの間に少なくとも１分の間隔を置いて、１秒間のトレインで提示した。生成されたＰｔ及び最大強縮力（Ｐｏ）を含む筋肉力を、筋肉セグメントの推定生理学的断面積（ＣＳＡ）に対して正規化し（ＣＳＡ＝筋肉重量／１．０５６×Ｆｏ；１．０５６ｇ／ｃｍ３は筋肉の密度を表す）、ニュートン（Ｎ）／ｃｍ２で表す。図４９に示すように、横隔膜筋機能は、ＰＢＳビヒクル（ｎ＝６）と比較して７５Ｋ（ｎ＝８）、１５０Ｋ（ｎ＝８）で処理したマウスで増加する傾向があった。２５０Ｋ（ｎ＝４）ＣＤＣは、１５０Ｋ  ＣＤＣ及び７５Ｋ  ＣＤＣと比較して横隔膜筋機能により大きな影響を与え、用量応答を示した。２５０Ｋ用量のデータは、ＰＢＳ対照処理と比較して統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）。したがって、幾つか実施形態では、ＣＤＣの全身投与は、骨格筋のジストロフィン異常症を伴う、ＤＭＤ又はベッカー型筋ジストロフィー等の筋ジストロフィーを有する対象において、骨格筋機能を含む筋肉機能を改善する。筋肉機能を改善するための治療有効用量としては、限定されないが、約７５０００個〜約２５００００個のＣＤＣ、約１５００００個〜約２５００００個のＣＤＣ、又は約２５００００個以上のＣＤＣが挙げられる。
実施例３４：Ｍｄｘマウスの体重
【０１９６】
ＣＤＣで処理したマウスの体重を運動直後に毎週測定し、ＣＤＣ処理が体重に何らかの影響を与えたかどうかを判定した。体重データを図５０Ａ〜図５０Ｂに示す。群間の体重の差は観察されなかった。したがって、幾つかの実施形態では、ＣＤＣの治療有効用量は、対象の体重又は体重に影響を与えることなく全身投与され得る。
実施例３５：ＰＢＳ又はＣＤＣ処理マウスに由来するｍｄｘマウス心臓のマッソントリクローム染色
【０１９７】
実施例３１に記載されるように、ＣＤＣで処理されたマウスを、処理の６週間後に屠殺した。各心臓のパラフィン包埋切片を組織学に使用して、心臓線維化に対するＣＤＣ処理の効果を識別した。マッソントリクローム染色（ＨＴ１５  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ  Ｓｔａｉｎ［Ｍａｓｓｏｎ］Ｋｉｔ；ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を線維化の評価のために実施した。図５１に示す通り、ＰＢＳ処理マウスの左心室心臓組織は、ＣＤＣ処理マウス心臓切片の青色の減少によって示されるように、１５０ＫのＣＤＣで処理したマウスと比較して、より多くの線維化及びコラーゲン沈着を示した。したがって、幾つかの実施形態では、ＣＤＣの全身投与は、骨格筋のジストロフィン異常症を伴う、ＤＭＤ又はベッカー型筋ジストロフィー等の筋ジストロフィーを有する対象の心臓又は左心室の線維化を含む線維化を減少又は予防する。心臓線維化を軽減又は予防するための治療有効量には、少なくとも１５００００個のＣＤＣが含まれる。
【０１９８】
図５１の画像を生成するために使用された組織学スライドを再切断して、マッソントリクロームで再染色した。再切断及び再染色されたスライドの心臓全体の切片を図５３に示す。図５１に示す画像と同じように、図５３に示す心臓全体の切片でも同様の結果が見られた。したがって、幾つか実施形態では、ＣＤＣの全身投与は、心臓全体を通して線維化を予防又は減少させる。心臓全体の線維化を予防又は減少するための治療有効量には、約７５０００個〜約２５００００個のＣＤＣ、約１５００００〜約２５００００個のＣＤＣ、又は約２５００００個のＣＤＣが含まれる。さらに、ＣＤＣで処理したマウスの心臓では、全体的な心臓構造に対する悪影響は見られなかった。したがって、幾つかの実施形態では、治療有効量のＣＤＣは、対象の心臓構造に悪影響を及ぼさない。
実施例３６：ｍｄｘマウスの駆出率のベースラインから注射の３週間後までの変化
【０１９９】
図５２Ａ（また図４７）に示すように、Ｖｅｖｏ  ３１００  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（カナダ、トロントのＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓ）を使用して、処理の１日前〜３日前、及び処理の３週間後に心エコー研究を行ってＣＤＣの心機能に対する効果を判断した。軽い全身麻酔の導入後、心臓を最大左心室（ＬＶ）径のレベルで撮像した。ＬＶ駆出率（ＥＦ）を、２次元長軸断面からＶｉｓｕａｌＳｏｎｉｃｓバージョン３．０．０ソフトウェアで測定した。１５００００個のＣＤＣによる処理は、駆出率を減少しなかった（図５２Ｂ）。したがって、幾つかの実施形態では、治療有効量のＣＤＣを、対象の心機能に悪影響を与えることなく骨格筋のジストロフィン異常症を伴うＤＭＤ又はベッカー型筋ジストロフィー等の筋ジストロフィーの対象に投与することができる。
実施例３７：永続的なＬＡＤ結紮によるＳＣＩＤマウスの駆出率の変化
【０２００】
様々な投与経路が心臓機能に有益に影響を及ぼし得るかどうかを判断するため、ヒトＣＤＣを筋肉内（ＩＭ）、大腿静脈、又は右心室の３つの別々の投与経路によりＳＣＩＤマウスに投与した。３つ全ての経路による投与は、左心室駆出率の肯定的な変化をもたらした（図５４）。変化は、対照処理を受けたマウスと比較して、３つ全ての群で統計学的に有意であった。筋肉内及び静脈内の投与経路は同様に効果的であり、静脈内投与による有効性を示した。したがって、幾つか実施形態では、ヒトＣＤＣによる処理は、ＳＣＩＤを有する対象の心機能を改善する。処理用の投与経路としては、筋肉内注射、大腿静脈への全身静脈内注射、又は右心室注射等の心臓注射が挙げられる。
実施例３８：ヒトＡｌｕシーケンスｑＰＣＲ法を使用して評価された野生型マウスにおける頸静脈投与後のＣＤＣの体内分布
【０２０１】
この実施例における研究の１つの目的は、全身送達後のＣＤＣの生体内分布を判断することであった。ヒトＣＤＣを、頸静脈への静脈注射により野生型マウスに全身投与した。体内分布の決定には、ほとんどのヒトＤＮＡに豊富で、一般にマウスＤＮＡには存在しない転移因子であるヒトＡｌｕ配列を含むＤＮＡの存在量の測定を含めた。ＣＤＣ投与の１０分後と２４時間後に収集した組織でｑＰＣＲを使用して、ヒトＡｌｕ配列を含むＤＮＡの存在量を決定した。
ＣＤＣの調製
【０２０２】
ヒトＣＤＣを、上記のマウスＣＤＣと同様の方法で得た。細胞溶液中の培地の量に等しい量の培地でフラスコをすすいだ後、細胞溶液を１０００ｒｐｍ（１９７×ｇ）で５分間遠心分離して、細胞溶液中の細胞をペレット化した。ＣＤＣをイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）に再懸濁し、フェノールレッド及び追加の補充を行わずに、ｉＮＣＹＴＯ  Ｃチップ使い捨て血球計を使用して計数した。フェノールレッド及び追加のサプリメントを添加せずに、ＩＭＤＭでＣＤＣを１．５×１０６細胞／ｍＬに希釈した。ＣＤＣを、注射前に氷上で保管し、又は組織スパイク研究のため細胞ペレットを−２０℃で凍結した。
ｑＰＣＲ法の検証
【０２０３】
ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、５継代目に１×１０６個のＣＤＣからゲノムＤＮＡを単離した。ＣＤＣ  ＤＮＡの１０倍連続希釈液を滅菌水で調製し、カスタムＡｌｕプライマーとカスタムＡｌｕプローブ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ製）を含むＴａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してｑＰＣＲを行った。プローブとプライマーのＤＮＡ配列は以下の通りである：
【０２０４】
フォワード：５’−ＧＴＣＡＧＧＡＧＡＴＣＧＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴ−３’、
【０２０５】
リバース：５’−ＡＧＴＧＧＣＧＣＡＡＴＣＴＣＧＧＣ−３’、
【０２０６】
プローブ：５’−６−ＦＡＭ−ＡＧＣＴＡＣＴＣＧＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＣＡＧＧＡ−ＭＧＢ−３’
【０２０７】
ｑＰＣＲ反応を、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ６  ＦｌｅｘリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で行った。Ｃｔ値を、各ｑＰＣＲサンプルのＣＤＣ数の対数に対してプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用して線形回帰分析を行い、直線の勾配を使用し、式：％効率＝−ｌ＋１０（”１／ｓｌｏｐｅ）×１００を用いてｑＰＣＲの効率を計算した。
組織スパイク曲線
【０２０８】
ヒトＣＤＣから単離されたＤＮＡの希釈物を、生後８週齢〜１２週齢のナイーブＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス組織から単離されたＤＮＡにスパイクし、ｑＰＣＲを１μＬのスパイクＤＮＡを用いてＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ  ６  Ｆｌｅｘ  ＲＴ−ＰＣＲシステムで３回実行した。ｑＰＣＲ反応にはＴａｑｍａｎ  Ｆａｓｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ、及びＡｌｕ配列の「ｑＰＣＲ法の検証」で上に記載されるものと同じプライマー／プローブが含まれ、マウスβ−アクチン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｍｍ００６０７９３９＿ｓｌ）Ｔａｑｍａｎプライマーを、Ｃｔ値を正規化するためのハウスキーピング遺伝子として使用した。ΔＣｔを、各サンプルによるＡｌｕのＣｔ値からβ−アクチンのＣｔ値を引くことで計算した。１μＬのｑＰＣＲサンプルの既知の細胞数に対してΔＣｔをプロットした。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５を使用して、線形回帰分析を行った。
マウス注射と組織採取
【０２０９】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（８週齢〜１２週齢、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、ＩＭＤＭ中１００μＬのヒトＣＤＣ（１．５×１０６細胞／ｍＬ）を、吸入イソフルランによる麻酔下で頸静脈に注射した。利用されたこの用量のＣＤＣは、頸静脈注射により投与された場合、ｍｄｘマウスに有効であった。１０分後（ｎ＝８）又は２４時間後（ｎ＝８）、頸椎脱臼によりマウスを屠殺した。顎下静脈から血液を採取した後、心臓、肺、脾臓、肝臓、横隔膜、及びヒラメ筋を摘除した。組織を、細胞注入を受けなかった２匹の対照マウスからも収集した。組織をＰＢＳで洗浄した後、−８０℃で凍結した。−８０℃で凍結する前に、０．０５Ｍの最終濃度のＥＤＴＡを抗凝固剤として血液に添加した。
Ａｌｕ及びβ−アクチンのｑＰＣＲ
【０２１０】
組織サンプルを解凍し、計量し、均質化するため小片に切断した。平均組織重量、均質化に使用される組織の量、及びＤＮＡ分離に使用される組織の量を表１に示す。ＤＮｅａｓｙ  Ｋｉｔの製造業者の指示に従って、ＤＮｅａｓｙ  Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＤＮＡを単離した。ＤＮＡを、１００μＬの溶出バッファーでＤＮｅａｓｙカラムから溶出した。組織スパイク曲線について上に記載されるようにｑＰＣＲを行った。
データ分析
ΔＣｔを、各サンプルのＡｌｕのＣｔ値からβ−アクチンのＣｔ値を引くことで計算した。標準曲線からの傾きとｙ切片を使用して、ｑＰＣＲサンプルの細胞数の対数を計算した。組織１グラムあたりの細胞数は、ＤＮＡ単離に使用した組織の量及び溶出したＤＮＡの最終量を考慮して、ｑＰＣＲサンプルの細胞数に組織に固有の係数を掛けて計算した（表１）。３回の実施を平均し、組織１グラム当たりの細胞を各時点の各器官についてグラフ化した。有意性をｐ≦０．０５の片側スチューデントのＴ検定を使用して決定した。
【０２１１】
表１を参照して、各組織の重量を測定し、組織重量に近似するように平均を取った。ほとんどの場合、他の組織よりも大きい肝臓を除いて、組織全体が均質化された。ホモジナイズされた組織から、１０ｍｇ〜２５ｍｇに相当する量をＤＮＡ分離に使用した。組織１グラムあたりのＣＤＣの計算に使用される係数は、１００μＬの精製ＤＮＡのうちｑＰＣＲに使用される１μＬと、ＤＮＡの分離に使用される組織の量とに基づく。
【表１】
2020517601.tif 000004
ｑＰＣＲ法の検証
【０２１２】
ｑＰＣＲプライマーを検証し、アッセイの比例領域を評価するため、既知の数の細胞からヒトＣＤＣ  ＤＮＡを単離した。連続希釈液を調製し、Ａｌｕプライマーを使用してｑＰＣＲを行った。図５５Ａに示すように、このアッセイは１つのｑＰＣＲサンプル当たり０．００２５個〜２５００個の細胞の範囲で直線であり、全ての研究サンプルを網羅でき、１個未満の細胞からＤＮＡを検出することができる。
組織スパイク曲線−結果
【０２１３】
各組織のβ−アクチンレベルに起因するいかなる組織特異的な変動も除去するため、目的の各組織でスパイク研究を行った。図５５Ｂに示すように、既知の量のＣＤＣ  ＤＮＡをナイーブ組織ＤＮＡにスパイクすることにより、肺、肝臓、心臓、脾臓、横隔膜、血液、及びヒラメ筋の標準曲線を作成し、表２に、各ラインの傾き、切片、及びＲ２を要約する。これらの標準曲線を使用して、研究サンプルのｑＰＣＲにおけるＣＤＣ  ＤＮＡの量を計算した。
【表２】
2020517601.tif 000005
頸静脈投与の１０分後及び２４時間後のＷＴマウスにおけるＣＤＣ生体内分布
【０２１４】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、頸静脈投与により１５００００個のヒトＣＤＣを注射した。注射後１０分（ｎ＝８）又は２４時間（ｎ＝８）に各マウスを安楽死させ、組織を摘除した（図５６Ａ）。組織をホモジナイズし、ＤＮＡを単離し、上に記載されるＡｌｕ配列とマウスβ−アクチンプライマーを使用してｑＰＣＲを行った。
【０２１５】
図５６Ｂに示されるように、ヒトＣＤＣの大部分が肺で見られた（１０分間で１５５０００±１２５００細胞／ｇ組織）。注入されたＣＤＣＳの１％未満が他の全ての組織に分布しており、ＣＤＣ注入の１０分後に肝臓に１２０±４７ＣＤＣ／ｇ組織が分布していた。血液、心臓、及びヒラメ筋にも、バックグラウンドレベル（それぞれ６７±１５細胞／ｇ組織、１９±４細胞／ｇ組織、１４±２細胞／ｇ組織）を超えるＣＤＣＳが含まれていたが、肺ほど高くはなかった。投与の２４時間後、肺にＣＤＣの約２３％が残っていた（３６０００±７９００細胞／ｇ組織）。低レベルのＣＤＣが、肝臓、血液、心臓、脾臓、及びヒラメ筋にそれぞれ残っていた（それぞれ３１±４細胞／ｇ組織、１５±６細胞／ｇ組織、１１±４細胞／ｇ組織、１７±５細胞／ｇ組織、及び２３±１１細胞／ｇ組織）。細胞の急速なクリアランスは、ＷＴマウスによる免疫系のクリアランスに一部起因する可能性があるが、この仮説を確認するには更に研究が必要である。
【０２１６】
頸静脈投与後、ヒトＣＤＣはマウス肺に急速に捕捉され、注入された細胞の１％未満が残りの試験組織に残った。ＣＤＣは急速に排除され、２４時間後には、１０分後に肺、肝臓、又は血液中にあった細胞の２２％〜２６％しか残っていなかった。より低いＣＤＣクリアランス比が、心臓（投与の１０分後に見られた細胞の５８％が２４時間後に残っている）及びヒラメで観察された。実際、ヒラメ筋において細胞送達後１０分後よりも２４時間後に、組織１グラム当たりにより多くの細胞が見られた。これらの結果は、幾つかの実施形態では、ＣＤＣの全身投与により大部分のＣＤＣが肺に入るにもかかわらず、幾つかのＣＤＣが心臓、並びにヒラメ筋及び横隔膜等の骨格筋に到達することを示している。したがって、幾つかの実施形態では、全身ＣＤＣ投与の心臓及び骨格筋に対する少なくとも幾つかの治療上の効果は、心臓及び骨格筋に対するそれらの組織内での直接的な効果によるものである可能性がある。
実施例３９：ヒトＡｌｕシーケンスｑＰＣＲ法を使用して評価したＳＣＩＤマウスにおける頸静脈投与後のＣＤＣの生体内分布とクリアランス
【０２１７】
この実施例における研究の１つの目的は、頸静脈への全身送達後の重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスにおけるＣＤＣの生体内分布及びクリアランスを判断することであった。ヒトＣＤＣの体内分布を、ヒトＡｌｕ配列を測定することにより決定した。ＣＤＣの生体内分布及びクリアランスを、ＳＣＩＤマウスに頸静脈を投与してから２４時間後、１週間後、及び３週間後に収集した組織でｑＰＣＲを使用して決定した（図５７Ａ）。免疫系の障害がヒトＣＤＣに対する免疫反応を制限し得ることから、この研究にＳＣＩＤマウスが選択され、免疫応答がＣＤＣをより早く体から除去すれば、より長い時間点を研究することが可能であった。
【０２１８】
この研究のためのＣＤＣ調製、ｑＰＣＲ法の検証、及び組織スパイク曲線に関する方法は、実施例３９に記載されているものと同じ方法で行われた。
マウス注射と組織採取
【０２１９】
８週齢〜１２週齢の雄性ＳＣＩＤマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に、イソフルラン吸入による麻酔下で、ＩＭＤＭ中１００μＬのＣＤＣ（１．５×１０６細胞／ｍＬ）を頸静脈注射した。２４時間後（ｎ＝４）、１週間後（ｎ＝８）、又は３週間後（ｎ＝８）、顎下静脈から血液を収集し、続いて心臓、肺、脾臓、肝臓、横隔膜、ヒラメ筋及び精巣を摘除した。細胞注入を受けなかった２匹の対照マウスからも組織を収集した。−８０℃で凍結する前に、組織をＰＢＳで洗浄した。−８０℃で凍結する前に、ＥＤＴＡを抗凝固剤として最終濃度０．０５Ｍまで血液に加えた。
【０２２０】
Ａｌｕ及びβ−アクチンｑＰＣＲに関連する方法、及びこの研究のためのデータ分析は、実施例３８、図５５Ａ〜５５Ｂ、及び表２に記載されるのと同じ方法で行われた。表３は、精巣に関するデータが表３に含まれているが表１には含まれていないことを除いて、表１と同じである。
【表３】
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頸静脈投与の２４時間後、１週間後、及び３週間後のＳＣＩＤマウスにおけるＣＤＣ生体内分布
【０２２１】
上に記載されるように、ＳＣＩＤマウスに頸静脈投与により１５００００個のヒトＣＤＣを注射した。注射の２４時間後（ｎ＝４）、１週間後（ｎ＝８）、３週間後（ｎ＝８）にマウスを屠殺し、組織を摘除した。組織を均質化し、ＤＮＡを単離し、実施例３８に記載されているＡｌｕ配列用のプライマー及びマウスβ−アクチンを使用してｑＰＣＲを実施した。
【０２２２】
図５７Ｂ及び図５７Ｃでは、ＣＤＣの大部分が肺に見られた（２４時間で２１７０００±７１０００ＣＤＣ／ｇ組織）。注入されたＣＤＣの１％未満が他の全ての組織に分布していることがわかった。肝臓及び血液には、ＣＤＣ投与の２４時間後に、バックグラウンドを超えるＣＤＣが含まれていた（それぞれ５０±１５細胞／ｇ組織、３９±８細胞／ｇ組織）。投与の１週間後、２４時間に肺で見られたＣＤＣの４％（８６００±１９００細胞／ｇ組織）が留まった。興味深いことに、投与の１週間後には、心臓（１週間で７７００±５０００対２４時間で１１０±５８）、横隔膜（１０７±８２対４２±１８）及び脾臓（１７０±８０対１０７±３７）において、投与後２４時間でこれらの組織で見つかるよりも多くのＣＤＣが見つかる傾向にあった。投与の１週間後にこれらの組織で見られるＣＤＣの増加は、幾つかの実施形態では、細胞は肺から解放されて他の組織に再分布され、特に肺静脈を経て肺を出た後に出会う最初の器官である心臓に特に留まるようになる。試験した組織のいずれも、ビヒクルと比較して、ＣＤＣ投与の３週間後に統計学的に有意な数の細胞を有しておらず、ほとんどのＣＤＣは送達後３週間以内に排除されることを示唆した。
【０２２３】
この研究は、ＣＤＣが肺に捕捉され、比較的少数のＣＤＣが他の組織に分布した、ＷＴマウスで実施された生体内分布研究（実施例３８を参照されたい）の知見を確認する。ＷＴマウスでの投与後２４時間と比較して、ＳＣＩＤマウスはＣＤＣを迅速に排除せず（ＷＴマウスで３６０００±７９００細胞／ｇ組織  対  ＳＣＩＤマウスで２１８０００±７１０００細胞／ｇ組織が２４時間で存在する）、おそらくＳＣＩＤマウスの免疫不全の性質によるものである。
【０２２４】
この研究は、頸静脈による細胞投与の２４時間後にＣＤＣが肺に捕捉されることを示している。同様のＣＤＣ生体内分布は、免疫不全ＳＣＩＤマウス及びＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて２４時間に観察され、免疫応答性マウスで観察されるより速いクリアランスの原因は免疫系にある可能性があるが、細胞分布に大きな影響は無いことが示唆された。
【０２２５】
頸静脈投与の２４時間後に肺に見られるＣＤＣの約４％が１週間後に留まっていた。この研究では、細胞送達後１週間以内に再分布する可能性が示されており、２４時間よりも１週間で心臓、脾臓、横隔膜において多くの細胞が見られた。したがって、結果は、幾つかの実施形態では、ＣＤＣの全身投与が肺へのＣＤＣの一部の進入に結び付くにもかかわらず、幾つかの実施形態によると、いくらかのＣＤＣが心臓及び骨格筋に到達することを示す（非限定的な例として、ヒラメ筋及び横隔膜）。したがって、幾つかの実施形態では、全身ＣＤＣ投与の心臓及び骨格筋に対する少なくともいくらかの治療上の効果は、それらの組織内に局在するＣＤＣによる心臓及び骨格筋に対する効果によるものである可能性がある。
実施例４０：静脈内投与を使用した急性心筋梗塞（ＡＭＩ）ブタモデルにおけるＣＤＣの用量依存的な安全性及び有効性
【０２２６】
この研究の目的は、ＣＤＣの最大耐量（ＭＴＤ：ｍａｘｉｍｕｍ  ｔｏｌｅｒａｂｌｅ  ｄｏｓｅ）及びＣＤＣの用量有効性応答（ｄｏｓｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を調査することであった。この非限定的な例では、ＡＭＩで広く使用されているＡＭＩブタモデルにおける静脈内投与を使用した。
ＣＤＣの調製
【０２２７】
シンクレアミニブタＣＤＣ（ｐＣＤＣ）を、上に記載されるマウスＣＤＣ及びヒトＣＤＣ（ｈＣＤＣ）と同様の方法で産生して製剤化した。ブタの心臓を採取して解剖した。心房及び中隔の両方の断片を分離し、刻んで外植片とした。これらの外植片を、２０％成長培地を含むｃｅｌｌ  ｂｉｎｄ  １−ｓｔａｃｋに播種した。３日〜４日後、外植片由来細胞（ＥＤＣ）は各外植片の周りで増殖し始めた。ＥＤＣを採取し、使用の準備が整うまで２ｍＬのクライオバイアルにおいてＣＳ１０中で凍結した。ＥＤＣは、バイアルに少量の氷が残るまで３７℃で解凍した。細胞溶液を少量の２０％培地（約１０ｍＬ）に滴下した。細胞を約２８０Ｇで５分間遠心分離して、残留ＣＳ１０を除去した。細胞を再懸濁し、計数し、フィブロネクチン被覆Ｎｕｎｃトリプルフラスコに１つのフラスコ当たり約３×１０６個〜６×１０６個の細胞で播種した。ｐＣＤＣを、Ｐ５及びＰ６までのハイクロン（ｈｙｃｌｏｎｅ）血清で補足した２０％培地で増殖させた。ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ  １０で細胞を浮かせて凍結させた。バイアルに少量の氷が残るまで、凍結細胞を３７℃で解凍した。細胞を以下の投与バッファーに再懸濁した：
・ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０（２２．５ｍＬ）、ヘパリン（２．５ｍＬ）、ニトログリセリン（２５０μＬ）；及び
・５％ヒト血清アルブミン（１０３ｍＬ）、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）（１３．５ｍＬ）、ＣＳ１０（１３．５ｍＬ）（この濃度は、ヒト等価用量に比例する。ＩＶ注射について１３０ｍＬの最適量が決定された後、量を変更した。）。
【０２２８】
細胞濃度を比較的一定に保つため、ほとんどの用量については４５分間に亘って細胞に適用した。また、１３０ｍＬの容量で送達された細胞を４５分かけて送達した。
動物モデル
【０２２９】
心筋梗塞は、先に記載されるように（Ｋａｎａｚａｗａ，Ｔｓｅｌｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）、血管形成バルーンを使用して左前下行（ＬＡＤ）動脈を９０分間閉塞した後、３０分間再灌流することによりユカタンミニブタで誘発された。次いで、動物はベースラインの左心室図（ＬＶグラム）を受けて、心機能の変化（駆出率の変化によって示される）が評価され、その後、ビヒクル（ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０、７２＝１０）又は同種ＣＤＣ（ｎ＝１８）を注入した。３種類のＣＤＣ用量：５０×１０６（ｎ＝８）、１００×１０６（ｎ＝３）、及び２００×１０６（ｎ＝３）を連続して投与した。注入を、右室流出路（ＲＶＯＴ）に配置されたスワンガンツカテーテル（６フレンチ〜８フレンチ）を使用して行った。追加の群（ｎ＝４）の動物に、大腿静脈注入を使用して２００×１０６個のＣＤＣを注射した。注入の２日後、動物はフォローアップＬＶグラムを受けた。心筋組織の損傷を特定するために、ベースライン及び４８時間でＡｂｂｏｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ｉ２０００ＳＲを用いる化学発光によってトロポニンＩ（Ｔｎｌ）レベルを評価した。簡潔に言えば、血液サンプルを遠心分離して血漿を収集し、一旦血漿を収集してＡｂｂｏｔ  Ａｒｃｈｉｔｅｃｔ  ｉ２０００ＳＲで分析した。投与の２４時間及び４８時間後に動物は身体検査を受けた。１匹の動物に大腿静脈注入により２００×１０６個のＣＤＣを投与し、２週間後にフォローアップした。この動物は、ＣＤＣの長期的な影響を示すことを目的としている。
組織病理学分析
【０２３０】
心臓及び肺組織を組織学的検査に供した。ゲンチアナバイオレット及びチオフラビンＴ色素を動物の屠殺の前に左心房に注入して、心臓のリスク領域（ＡＡＲ：ａｒｅａ  ａｔ  ｒｉｓｋ）及び微小血管閉塞（ＭＶＯ：ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）を評価した。切除された心臓をスライスし、塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）で染色して、梗塞サイズ（ＩＳ）を測定した。ビヒクル又は２００ＭのＣＤＣを注射した２匹のブタＲＶＯＴに由来する肺を収集し、４％パラホルムアルデヒドを注入した。図５８に示すように、４％ＰＦＡにおいて４８時間後、前部及び後部から組織サンプルを収集した）。各肺から１５個のサンプルを収集し、パラフィン包埋した。スライド上の５μｍ組織切片をＨ＆Ｅで染色した。
結果
【０２３１】
５０×１０６用量を注入した最初の動物には、後の全ての動物に使用された４５分とは対照的に、１５分間に亘って注入を行った。このブタは、注入の間、酸素飽和度の持続的な減少を経験した（ＳｐＣｂは１００％から７６％に減少した）。注入後２４時間の身体検査の間、胸部聴診により正常な肺音が明らかになった。４８時間のエンドポイントで、この動物はベースラインからのＳｐＣｈの減少（８５％）を示し続けた。その結果、後の全ての動物の注入時間を４５分に増加させた。１００×１０６の用量を注入した１匹の動物は、ＳｐＯ２の一時的な減少（９８％から８１％）を示し、注入の２０分後にベースラインに戻った。この動物は、フォローアップの身体検査では正常であった。２００×１０６の用量を注入した１匹の動物は、ＳｐＯ２のわずかな一時的減少（１００％から９４％）を示したが、ＳｐＯ２の正常範囲内に留まった。心臓酵素（すなわちＴｎｌ）の増加は中程度で、ビヒクル及びＣＤＣで処理した動物で同様であった。図５９に示すように、Ｔｎｌの増加はＣＤＣ用量と統計学的に相関しなかった。代わりに、ＣＤＣ処理はＴｎｌを減少させる傾向があり、幾つかの実施形態では、全身ＣＤＣ投与は心臓組織損傷を引き起こさず、心臓組織損傷を予防又は減少させる可能性があることを示した。図６０〜図６２に示すように、ＡＡＲ、ＮＲ／ＡＡＲ、ＴＴＣ／ＡＡＲは群間で類似していた。これは、注入後４８時間の心筋損傷の程度が、この研究のＣＤＣ処理によって悪影響を受けなかったという更なる証拠を提供する。図６３に示すように、ＣＤＣを１００×１０６及び２００×１０６の用量で投与すると、ＥＦは改善する傾向があった。しかしながら、２００×１０６個の細胞の大腿静脈投与では、ＥＦの減少が示された。全体として、これらの結果は、幾つかの実施形態では、例えばＲＶＯＴ又は大腿静脈へのＣＤＣの全身投与は、心臓組織の損傷又は機能不全を引き起こさず、心臓組織の損傷又は機能不全を予防又は減少させる可能性があることを示している。
【０２３２】
ビヒクル又は２００×１０６個のＣＤＣをＲＶＯＴへと注射したブタの肺を、虚血／再灌流事象及び製品投与の４８時間後に収集し、組織学的分析のためパラホルムアルデヒドで固定した。３２個のサンプルを得て、パラフィン包埋し、スライスして、Ｈ＆Ｅ染色後に分析した。肺表面と並んで切片表面には明らかな病変がないことがわかった。ビヒクル又は２００×１０６個ＣＤＣを注射した２頭のＲＶＯＴからの６８枚のスライドを、無関係の病理学者が分析した。ビヒクルを注射したブタ又はＣＤＣを注射したブタから分析されたＨ＆Ｅスライドは、明らかな組織学的異常を伴わず、正常な肺構造を示した。血液小胞又はその他の肺領域にはＣＤＣは見つからなかった。したがって、幾つかの実施形態では、ＣＤＣの全身投与は肺組織に悪影響を及ぼさない。
【０２３３】
投与された細胞の種々の用量のうち、ＣＤＣがＲＶＯＴによって送達されたときの最小有効用量は１００×１０６であり、より高い用量（２００×１０６）では、明らかな更なる利益が加わることはなかった。両方の用量は、ＡＭＩモデルの駆出率に同様の効果を示した。瘢痕の大きさは全ての条件で類似していた。ただし、２００×１０６個のＣＤＣを大腿静脈に注射したブタでは、ＥＦの改善が限定的であった。これは、幾つかの実施形態では、異なる経路を介した投与が異なる有効性を有する可能性があることを示唆している。
【０２３４】
肺サンプルの組織学的分析は、ＲＶＯＴを介して又は大腿静脈経路を使用して投与された２００×１０６個の細胞を有するブタにおいて組織損傷がないことを示した。ＲＶＯＴを介した細胞の投与は、例えば大腿静脈よりも心臓から肺へのより直接的な経路であり、その経路によるＣＤＣの投与は、幾つかの実施形態では、大腿静脈によるＣＤＣ投与により大きな影響を示すと予想される。
【０２３５】
この研究の結果は、ＣＤＣの全身投与は、少なくとも４００×１０６個（ブタの場合は２００×１０６個の用量）のヒト等価用量までは、合理的に安全であることを示している（すなわち、一般的に、注入中の数回を超える軽度の一時的な有害事象と関連しない）。
【０２３６】
この研究は、１００×１０６個の細胞を全身送達することにより、ＡＭＩブタモデルにおけるＥＦの有効な改善を示すことを示した。１００×１０６個又は２００×１０６個の細胞を投与したブタ間で、有効性の点で有意な差は観察されなかった。したがって、幾つかの実施形態では、治療有効用量には、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個、２×１０８個、５×１０８個、１×１０９個、又は１×１０１０個のＣＤＣが含まれ、心臓に傷害がある対象の心臓機能障害、並びに心臓及び／又は肺の組織損傷を予防又は減少させる。
【０２３７】
この実施例の研究における証拠は、幾つかの実施形態では、最大有効用量が１００×１０６個〜２００×１０６個のＣＤＣ（ヒト等価用量は２００×１０６個〜４００×１０６個のＣＤＣ）であってもよいという結論を支持する。さらに、これらの投与量を投与しても、該投与量が投与された対象の肺組織に何らの毒物学的影響も生じなかった。
実施例４１：ＣＤＣのヒトＴ細胞との相互作用
【０２３８】
この実施例における研究の１つの目的は、ヒト同種Ｔ細胞に連結されたＣＤＣの免疫学的活性を決定することであった。この研究は、ＰＢＭＣから分離された、ＨＬＡ遺伝子型が同定されたヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（ｎ＝３）及びヒトＣＤ３＋Ｔ細胞（ｎ＝２）を用いて行われた。ＣＤＣを上記の方法で調製した。
ＣＤＣ免疫表現型
【０２３９】
定常状態のＣＤＣ（１０５個の細胞）を、免疫関連分子又はそれらの各アイソタイプ対照に特異的な抗体で染色した。細胞をＣａｎｔｏ  ＩＩ  ＢＤ  ＦＡＣＳで取得し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで解析した。全ての細胞が有意なレベルのＨＬＡクラスＩ分子を発現したが、ＨＬＡ  ＩＩ分子は陰性であった（図６４）。
【０２４０】
中程度の割合の細胞が、非古典的ＨＬＡ  Ｉ分子であるＨＬＡ−Ｅ及びＨＬＡ−Ｇのかすかな発現を示した。かなりの割合の細胞が中程度のレベルの共刺激ＣＤ８６及び共刺激／調節ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）分子を発現したが、共刺激ＣＤ８０及び共刺激／調節ＣＤ２７５（ＩＣＯＳ−Ｌ）分子のわずかな発現を示した細胞はほとんどなかった。また、ＣＤＣの６５％近くが、受容体ＮＫＧ２Ｄリガンド（ＵＬＢＰ及びＭＩＣ−Ａ／Ｂ）を活性化するＮＫ細胞のかなりの発現を示した。したがって、幾つかの実施形態では、少なくとも幾つかの免疫刺激マーカー又は免疫調節マーカーがＣＤＣに存在する可能性がある。
同種環境でＴ細胞を刺激するＣＤＣの能力
【０２４１】
調整された一方向混合リンパ球培養物を使用して、ＣＤＣが同種Ｔ細胞を刺激する能力を調査した。簡潔に言えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配での遠心分離により、３名の異なる健康ドナーの血液サンプルからヒトＨＬＡ不適合ＰＢＭＣを調製した。カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（１０分間２．５μＭ）で標識された応答性未分画ＰＢＭＣ（１×１０ｓ）を、陽性対照として使用として使用されるＨＬＡ不適合マイトマイシンＣ処理刺激性ＰＢＭＣ（１×１０５）（ＡｌｌｏＰＢＭＣ）又はマイトマイシンＣ処理ＣＤＣ（１×１０４）のいずれかと共に、Ｕ底９６ウェルプレートにおいてＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ中で共培養した。
【０２４２】
５日間の共培養の終わりに、複合化された抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８−ＡＰＣ、抗ＣＤ６９、抗ＨＬＡ−ＤＲを用いる染色により２つのＴ細胞活性化マーカー、ＣＤ６９及びＨＬＡ−ＤＲの発現；ＣＦＳＥ標識の喪失によるＴ細胞増殖；及び７ＡＡＤ染色による細胞死をモニターした。図６６の結果は、ＣＤＣのわずかな染色を示すが、ＡｌｌｏＰＢＭＣ陽性対照ほど顕著ではない。したがって、幾つかの実施形態では、ＣＤＣは同種Ｔ細胞を刺激するわずかな能力を有する可能性がある。
【０２４３】
図６６に見られるように、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方のＴ細胞が、同種ＣＤＣに応答して２つの活性化マーカーの少なくとも１つを多少ともアップレギュレートした。ＨＦＡ−ＤＲのアップレギュレーションは、ＣＤ６９よりも顕著であった。したがって、幾つかの実施形態では、ＣＤＣは未分画ＰＢＭＣ中のＴ細胞を活性化することができる。しかしながら、同種ＰＢＭＣ誘導性活性化（陽性対照）と比較して、これらのマーカーの観察されたアップレギュレーションは、ドナーＡによるＨＦＡ−ＤＲの発現に関しては概して非常に弱い。
【０２４４】
次いで、この活性化がＴ細胞増殖をもたらすことができるかどうかを判断した。ＣＦＳＥをモニターすることにより、ＣＤＣは弱いＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖を誘発できる可能性があることが観察されたが、ドナー依存的であった。図６６に示すように、観察された増殖は活性化マーカーの発現と一致しているようである。図６７Ｂでは、未分画ＰＢＭＣドナーＡ由来のＴ細胞のみがＣＤ６９及びＨＦＡ−ＤＲの両方の有意な発現を示し、ＣＤＣに応答して増殖することが可能であった。未分画のＰＢＭＣドナーＣのＴ細胞は、ＨＦＡ−ＤＲの有意な発現のみを示したのに対し、ドナーＤはＣＤ６９もＨＦＡ−ＤＲも発現せず、また、いずれもＣＤＣへの応答による有意な増殖を示さなかった。図６７Ａ〜図６７Ｂに示すように、対照的に、ＣＤＣはＣＤ８＋Ｔ細胞において実質的な応答を誘発しなかった。まとめると、幾つかの実施形態では、ＣＤＣはＣＤ４＋Ｔ細胞において同種ＰＭＢＣ対照で観察されるよりもはるかに弱い応答を誘発するようである。図６７Ｃに示すように、応答はドナーによってある程度異なるが、幾つかの実施形態によれば、治療有効量のＣＤＣの全身投与は、ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋のＴ細胞も、いかなる有意な免疫応答も活性化しない。
【０２４５】
上記と同じ実験環境を使用して、精製ＣＤ３＋Ｔ細胞（ドナーＣ及びドナーＡ）のＣＤＣ誘導性の活性化及び増殖を評価した。簡潔に言えば、ＣＦＳＥ（２．５μＭ、１０分間）で標識された応答性同種Ｔ（１×１０５）を、ＨＬＡ不適合マイトマイシンＣ処理刺激ＰＢＭＣ（１×１０５）（ＡｌｌｏＰＢＭＣ）又はＣＤＣ（１×１０４）のいずれかと共にＵ底９６ウェルプレートにおいてＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳ中で共培養し、５日後、それらの活性化（ＣＤ６９及びＨＬＡ−ＤＲの発現）及び増殖（ＣＦＳＥ喪失）をモニターした。両方のドナーに由来するＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ６９ではなくＨＬＡ−ＤＲ活性化マーカーの発現を多かれ少なかれアップレギュレートした。しかしながら、図６８に示すように、この活性化はＣＤ４又はＣＤ８のＴ細胞の有意な増殖をもたらさなかった。したがって、幾つかの実施形態では、ＣＤＣの投与は、同種ＣＤＣに再曝露されているにもかかわらず、驚くほど弱い免疫応答若しくは免疫応答の欠如をもたらすか、又は免疫応答を活性化しない。
ＣＤＣによる免疫調節
【０２４６】
次いで、免疫応答の活性化の欠如がＣＤＣ処理に応答した副作用の減少を伴って改善された安全性プロファイルを示す可能性があるため、ＣＤＣが同種環境で進行中の免疫応答を調節する能力を調べた。この目的で、ＣＤＣがＵ底９６ウェルプレートでＰＨＡ刺激を強化し得るかどうかを確認するため、ＣＤＣ（１×１０４）の不在下又は存在下でＨＬＡ不適合未分画ＣＬＳＥ標識ＰＢＭＣ（１×１０５）をＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激し、ＣＦＳＥをモニターすることにより同種Ｔ細胞の増殖を評価した。図６９に示すように、ＣＤＣはＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方のＴ細胞のＰＨＡ誘導性増殖を大幅にダウンレギュレートした。これらの結果は、幾つかの実施形態では、ＣＤＣが免疫刺激を驚くほど減少させ、それを強化しないことを示している。
【０２４７】
したがって、同様の実験を、２名のドナー（ドナーＣ及びドナーＡ）に由来する精製ＣＤ３＋Ｔ細胞を使用して実施した。これらのＨＬＡ不適合Ｔ細胞でのＰＨＡ誘導性ＣＤ６９及びＨＬＡ−ＤＲの発現の調節と並んで、それらのＰＨＡ誘導性増殖の調節を評価した。
【０２４８】
ＰＨＡ誘導性ＣＤ６９を有意にダウンレギュレートする一方で、ＣＤＣはＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方のＴ細胞でＨＬＡ−ＤＲの発現を有意に増加させた。活性化マーカーのこの調節は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋の両方のＴ細胞増殖の強力な阻害をもたらした。ＣＤ４＋Ｔ細胞増殖の阻害は、ＣＤ８＋Ｔ細胞で観察された阻害よりも顕著であった。したがって、ドナー間の変動にもかかわらず、２名のドナーのみで得られた結果の限界内で、ＣＤＣは強力な免疫調節物質のようである。ＨＬＡ−ＤＲは、エフェクター制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）のマーカーである。したがって、観察されたＨＬＡ−ＤＲ発現の増加は、ＣＤＣの存在によって誘導される調節性Ｔ細胞の最終的な増殖を示唆している可能性があり、これは、観察された進行中のＴ細胞増殖の強い阻害を説明する可能性がある。これらの結果は、図７０に示すように、ＣＤＣによる同種Ｔ細胞の活性化及び増殖の誘導を分析する上記のデータと一致している。全体として、これらの結果は、幾つかの実施形態では、同種異系ＣＤＣの治療有効量が免疫応答を驚くほどダウンレギュレートできることを示す。
実施例４２：ＣＤＣ由来細胞外小胞（ＣＤＣ−ＥＶ）とＴ細胞との相互作用
この実施例における研究の１つの目的は、Ｔ細胞の活性化及び調節につながるＣＤＣ−ＥＶの免疫学的活性を判断することであった。
ＣＤＣ−ＥＶ及び免疫表現型の特性評価
エキソソームの有益なマーカーの発現を、ウエスタンブロッティングを使用してＣＤＣ−ＥＶで分析した。ＣＤＣ−ＥＶ（２０μｌ＝１０μｇ）をＲＩＰ  Ａバッファーを使用して溶解し、１０％ＳＤＳ−Ｐａｇｅゲルにロードし、ニトロセルロース膜に転写した。膜を５％ＢＳＡでブロックした後、ＨＳＰ７０、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＡＬＩＸ、ＨＬＡ  ＩＩ及びβ−アクチンに対する特異的抗体とハイブリダイズさせた。ＣＤＣ及び樹状細胞（ＤＣ）溶解物と並んで、エキソソーム不含上清（ＳＮ）を対照として使用した。ＣＤＣ−ＥＶは、予想されるエキソソームマーカーＣＤ８１、ＣＤ６３及びＡＬＩＸを発現したが、ＳＮは完全に陰性であった（図７１）。
【０２４９】
次に、免疫関連マーカーの表面発現についてＣＤＣ−ＥＶを分析した。ＣＤＣ−ＥＶ（３０μｌ＝１５μｇ）を５μｌラテックスビーズ（４μｍ）に結合させた。抗体との又はビーズとのこれらのＥＶ／ビーズの最終的な非特異的結合をブロックするため、ＣＤＣ−ＥＶ／ビーズを１００ｍＭグリシン及び２％ＢＳＡ緩衝液で連続的に処理した。洗浄後、ＥＶ／ビーズを、Ｃａｎｔｏ  ＩＩ  ＢＤ  Ｆａｃｓで取得した関連免疫分子に対する特異抗体で染色し、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。同量のそれぞれの抗体とインキュベートしたビーズを対照として使用した。
【０２５０】
ビーズ抗体対照と比較して、ＣＤＣ−ＥＶはＨＬＡクラスＩ分子及びＣＤ８６を発現したが、ＨＬＡ  ＩＩ分子及びＣＤ８０分子については陰性であった（図７２）。ＣＤＣ−ＥＶは、共刺激ＰＤ−Ｌ１分子を発現しているようだが、ＩＣＯＳ−Ｌは発現していないようである。ＮＫ活性化受容体リガンドは、ＣＤＣ−ＥＶで顕著に発現された。ＥＶマーカーＣＤ８１及びＣＤ６３の両方の有意な発現が検出された。したがって、幾つかの実施形態では、少なくとも幾つかの免疫刺激マーカー又は免疫調節マーカーがＣＤＣ−ＥＶに存在し得る。
同種環境でＴ細胞を活性化するＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶの能力
【０２５１】
ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配での遠心分離により３名の異なる健康ドナーの血液サンプルから調製し、種々の実験で使用するため凍結保存した。ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶに応答したＴ細胞の活性化及び増殖を、２つのＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９及びＨＬＡ−ＤＲの発現、並びにＣＦＳＥレベルをそれぞれフローサイトメトリーによってモニターすることで調査した。簡潔に言えば、ＣＦＳＥ（２．５μＭ、１０分間）で標識された応答しているＰＢＭＣ（１ｘ１０５）を、図７３Ａに示すように、指定されるＨＬＡ不適合マイトマイシンＣ処理刺激性ＰＢＭＣ（１ｘ１０５）若しくはＨＬＡ不適合ＣＤＣ（１×１０４）、又は種々の用量のＣＤＣ−ＥＶのいずれかと共にＵ底９６ウェルプレートのＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳで共培養した。複合化された抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８−ＡＰＣ、抗ＣＤ６９、抗ＨＬＡ−ＤＲ及び７ＡＡＤとの５日間の共培養染色の終わりに、Ｔ細胞の活性化、増殖、及び細胞死をモニターした。結果は、幾つかのＣＤＣ−ＥＶによる染色を示すが、ＡｌｌｏＰＢＭＣ陽性対照ほどではない。したがって、幾つかの実施形態では、ＣＤＣ−ＥＶは同種Ｔ細胞を刺激できる可能性がある。
【０２５２】
図７４に示すように、対照と比較して、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶは弱いＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を誘発できるように見えるが、ＣＤ８＋Ｔ細胞では実質的な応答を誘発しなかった。観察された応答は、同種異系のＰＭＢＣ対照で観察された応答よりもはるかに弱かった。
【０２５３】
したがって、精製されたＣＤ３＋Ｔ細胞（２名の異なるドナー）のＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶ誘導性の活性化及び増殖を、上記と同じ実験環境を使用して評価した。簡潔に言えば、ＣＦＳＥ（２．５μＭ、１０分間）で標識された応答性同種Ｔ（１×１０５）を、Ｕ底９６ウェルプレートのＲＰＭＩ−１０％ＦＢＳにおいて、指定される種々の用量のＨＬＡ不適合マイトマイシンＣ処理刺激性ＰＢＭＣ（１×１０５）又はＣＤＣ（１×１０４）又はＣＤＣ−ＥＶのいずれかと共に共培養した。図７５に示すように、ＣＤ４＋Ｔ細胞の弱い活性化及び増殖はＣＤＣ−ＥＶでのみ観察され、ＣＤＣでは観察されなかった。しかしながら、未分画ＰＢＭＣを使用した場合に得られたものと比べて、活性化及び増殖のいずれの大きさもかなり低かった。したがって、幾つかの実施形態では、ＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＥＶの投与は、驚くほど弱い免疫応答若しくは免疫応答の欠如をもたらすか、又は免疫応答を活性化しない。
【０２５４】
また、これらの結果を合わせると、幾つかの実施形態では、観察されるＣＤＣ−ＥＶ誘導性のＴ細胞の活性化及び増殖が主に単球／マクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ）等の抗原提示細胞が関与し得る間接経路を介して起こることを示す。
同種ＥＶに応答した間接的なＴ細胞の活性化及び増殖
【０２５５】
２名の異なる健康ドナーから得られた血液サンプルから単球を単離した。次いで、単離された単球を、ＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）とＩＬ４（２０ｎｇ／ｍｌ）の組み合わせで６日間刺激し、樹状細胞（ＤＣ）と分化させた。ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ４による単球の分化は、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の分子の中程度の発現、ＣＤ１６の欠如（単球／マクロファージのマーカー）、及びＴＬＲ−２の低発現を特徴とする未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を生成する。次いで、これらの単球由来ｉＤＣをＨＬＡ不適合ＣＤＣ−ＥＶと共に一晩インキュベートした。
【０２５６】
ＥＶで培養されたｉＤＣは、成熟ＤＣ（ｍＤＣ）の特徴を示した；図７６に示すように、それらはＨＬＡＩＩ、ＣＤ８０及びＣＤ８６分子をアップレギュレートし、これはｍＤＣ特性と認められる。次いで、１×１０４のｉＤＣ又はＥＶと接触していたｉＤＣ（ｉＤＣ−ＥＶ）を、Ｕ底９６ウェルプレートで更に６日間、自己Ｔ細胞（１×１０５）と共培養させた。ｉＤＣ又はｉＤＣ−ＥＶと共培養された自己Ｔ細胞を、ＣＤ６９及びＨＬＡ−ＤＲの発現及びそれらの増殖について分析した。図７７に示すように、２名の異なるドナーに由来するＴ細胞の応答は変動したが、ｉＤＣ−ＥＶ全体は、ｉＤＣ単独よりもＴ細胞の増殖を活性化及び誘導するのにより強力であった。直接的なＣＤＣ−ＥＶ誘導性Ｔ細胞増殖と比較して、間接的なＣＤＣ−ＥＶ誘導性Ｔ細胞増殖の大きさはかなり高かった。
【０２５７】
成熟ＤＣ（ｍＤＣ）により提示される場合のＴ細胞を刺激するＣＤＣ−ＥＶの能力を評価した。ｍＤＣの食作用は非常に低いことを考慮に入れ、ＥＶの適切な摂取を確保するため、アポトーシス体の食作用の以前の経験に基づいて、ｉＤＣ及びｉＤＣ−ＥＶを、ＤＣ成熟のインデューサーであると認識されているＩＦＮγ（５００ＩＵ／ｍｌ）で一晩処理することにより、ＤＣの成熟を誘導した。ｉＤＣと比較して、これらのｍＤＣは、ｍＤＣの特徴であるＨＬＡＩＩ、ＣＤ８０及びＣＤ８６のより高い発現、並びにＴＬＲ−２のより高い発現を示した。ｍＤＣへのｉＤＣ成熟中のＣＤＣ−ＥＶの存在は、図７８に示すように、ＨＬＡＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ８０、及びＴＬＲ−２分子を更にアップレギュレートし、ＣＤＣ−ＥＶがＤＣ成熟を促進し得ることを示した。
【０２５８】
次いで、ｍＤＣ又はｍＤＣ−ＥＶを自己Ｔ細胞（１×１０５）と共にＵ底９６ウェルプレートで６日間共培養し、それらの活性化（ＣＤ６９及びＨＬＡ−ＤＲの発現）及び増殖を分析した。ここでも２名のドナーによる応答は変動したが、ｍＤＣ−ＥＶ全体としては、ｍＤＣ単独よりもＴ細胞の増殖を活性化及び誘導するのにより強力であった。ｉＤＣ−ＥＶ誘発性応答と比較して、同じドナーのｍＤＣ−ＥＶ誘発性Ｔ細胞の活性化及び増殖は高かった。
【０２５９】
Ｔ細胞の活性化及び増殖に関するこれらの結果全体が、直接経路の少なくともいくらかの活性化を排除することなく、ＣＤＣ−ＥＶが間接経路を通じてＴ細胞の増殖を活性化及び誘導できることを示唆する。したがって、幾つかの実施形態では、間接経路が活性化される。他の実施形態では、直接経路は部分的に活性化される。更に追加の実施形態では、直接経路と間接経路の組み合わせが活性化される。
ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶによる免疫調節
【０２６０】
ＣＤＣ又はＣＤＣ−ＥＶは、ＤＣ成熟を増強する可能性があるが、これは、それらが対象内で必ずしも有害反応をもたらすことを意味するものではない。これを評価するため、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶが同種の環境において進行中の免疫応答を調節する能力を調査した。図８０の上段パネルに示すように、ＣＤＣ（１×１０４）又は様々な用量のＣＤＣ−ＥＶの不在下又は存在下において、ＨＬＡ不適合未分画ＣＦＳＥ標識ＰＢＭＣ（１×１０５）をＰＨＡ（１μｇ／ｍｌ）で刺激した。実験をＵ底９６ウェルプレートで実施し、同種Ｔ細胞増殖を、ＣＦＳＥをモニタリングすることにより評価した。ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶはいずれも、ＰＨＡ誘導性のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞増殖をダウンレギュレートすることができた。Ｔ細胞増殖のＣＤＣ−ＥＶ誘導性ダウンレギュレーションは用量依存的であり、最高使用量（２０×１０９粒子）では、図８０に示すように、ＣＤＣ−ＥＶは親細胞よりも進行中の応答のダウンレギュレーションにおいてより強力であった。
【０２６１】
ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶにより誘導される免疫調節は、同じ実験環境内でＰＢＭＣに代えて精製されたＣＤ３＋Ｔ細胞が使用された場合に同様の結果が得られたことから、直接効果による可能性が高い。実際、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶは、図８１に示すように、２名の異なるドナーから得られたＴ細胞上でＣＤＣ６９及び／又はＨＬＡ−ＤＲのＰＨＡ誘導性発現をダウンレギュレートすることができた。
【０２６２】
図８２に示すように、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶによるＴ細胞活性化マーカーのダウンモジュレーションは、ＰＨＡ誘導性ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ増殖の顕著なダウンレギュレーションをもたらした。同じく図８３に示すように、２名のみのドナーで得られたドナー間の変動にもかかわらず、結果の限界内で、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶはいずれも強力な免疫調節因子である。
【０２６３】
免疫調節を誘導するＣＤＣ−ＥＶの能力のこれらの研究は、それらが強力な免疫調節物質であることを実証した。したがって、幾つかの実施形態では、ＣＤＣ及び／又はＣＤＣ−ＥＶの投与は、全体的に免疫応答を驚くほど抑制する。
実施例４３：単回投与と比較した同種ＣＤＣの頻回投与による更なる改善
【０２６４】
幾つかの場合には、ＣＤＣ及びＣＤＣ−ＥＶは免疫応答を抑制し得ることから、免疫応答が治療上の効果を著しく弱めることなく、又は炎症応答を引き起こすことなく、対象に繰り返し投与され得る。この実施例の研究の目的の１つは、同種ＣＤＣを頻回全身投与すると、単回投与と比較して相加効果又は増強効果が得られるかどうかを評価することであった。例えば、ｍｄｘマウスでモデル化されているように、複数回の投与により、筋ジストロフィーの対象の筋肉活動及び運動能力の更なる改善が促進される可能性がある。したがって、目標は、同種ＣＤＣの頻回投与後の免疫応答を分析することであった。
【０２６５】
心臓外植片に由来する細胞を超低接着性プレートで培養して心筋球を得た後、フィブロネクチン被覆プレートに播種してＣＤＣを作製した。加齢ｍｄｘマウス（生後８カ月〜１０カ月）に３用量のＣＤＣを６週間おきにＩＶ投与し（０週目、６週目及び１２週目に頸静脈を介して全身投与）、１４週間に亘って運動能力を毎週分析した。この実験で使用した用量は、１５００００個の同系ＣＤＣ（ｎ＝８）、１５００００個の同種ＣＤＣ（ｎ＝６）、又は対照としてのＰＢＳ（ｎ＝６）であった。また、同種抗体の有無を分析して、ＣＤＣが引き起こした可能性がある免疫活性化の程度を判断した。
【０２６６】
同系又は同種ＣＤＣの全身投与を繰り返した結果、図８４Ａ〜図８４Ｃに示されるように、ｍｄｘマウスへの各投与後の運動能力の増加がもたらされた。これらの結果は、幾つかの実施形態では、複数の全身投与で送達される治療有効用量が、単回投与と比較した場合に処理上の利益を高めることを示している。驚くべきことに、ＣＤＣ投与は同種抗体の産生が弱い低免疫原性プロファイルをもたらし、幾つかの実施形態では、同系及び／又は同種のＣＤＣの頻回投与は免疫応答を生じないことを示す。或る施形態では、単回投与と比較した頻回投与の増強された利点は、低い免疫原性プロファイル及び／又はアロ抗体の弱い産生が、より多くのＣＤＣを体内に残すことができる、及び／又はＣＤＣを体内により長く残すことができるため、ＣＤＣの数が多くなる又は期間が長くなると、有益な効果がより大きく発揮され得ることから、弱い免疫原性プロファイル及び／又は弱い同種抗体の産生をもたらす。例えば、免疫応答が、ＣＤＣが有益な効果を発揮する前に、２回目の投与でＣＤＣを破壊した可能性があることから、強い免疫応答が２回目の投与による治療効果の向上を妨げた可能性がある。幾つかの実施形態では、ＣＤＣの数回の全身投与が行われ、追加の投与の少なくとも１回がＣＤＣの最初の投与の利益を高める。
【０２６７】
別の例では、同系ＣＤＣ及び／又は同種ＣＤＣの頻回投与は、ＣＤＣに対する免疫応答の欠如又は比較的弱い免疫応答の結果として少なくとも部分的に、単回のＣＤＣ投与と比較して、心臓線維化、心臓組織損傷及び心臓リモデリングの減少、並びに心臓又は心室機能の改善等の心臓に対してより有益な効果を発揮する。
【０２６８】
複数のＣＤＣ投与と免疫応答の相互作用を更に評価するため、免疫系と炎症を抑制する副腎皮質ステロイドの有無にかかわらずＣＤＣを投与する別の実験を含めた。８カ月齢〜１０カ月齢のｍｄｘマウスにＰＢＳビヒクル（ｎ＝６）、ＰＢＳビヒクル＋ステロイド（ｎ＝７）、ＣＤＣ（ｎ＝７）、又はＣＤＣ＋ステロイド（ｎ＝８）を投与した。ＣＤＣを、投与毎にマウス１匹当たり１５００００個のＣＤＣの用量で投与した。ステロイド（プレドニゾン、１ｍｇ／ｋｇ／日）をＣＤＣ及び／又はＰＢＳ投与の各週に５日間投与した。ステロイド、ＣＤＣ及び／又はビヒクルを０週に１回と６週に２回目の２回投与した。各投与には、頸静脈への全身静脈内注射を含めだ。図８５Ａに示すように、ステロイドの投与はＣＤＣの有効性に影響を与えず、ステロイドの有無にかかわらず運動能力の同様の改善が観察された。血液中のＣＤＣに対するアロ抗体をフローサイトメトリーによって測定した。図８５Ｂ及び図８５Ｃに示すように、ＣＤＣは、ステロイドの有無にかかわらず、免疫原性プロファイルが低かった（図８６も参照されたい）。これらの結果は、免疫応答が１回以上のＣＤＣ投与の治療上の利益を妨げ又は減少させた場合、ステロイドは、その免疫応答を低下させることによりＣＤＣの治療効果を高めると予想されていることから、全身ＣＤＣ投与に対する免疫応答の欠如と一致する。したがって、幾つかの実施形態では、免疫応答の欠如又は弱い免疫応答により、追加のＣＤＣを複数回投与することが可能になり、それによって、ＣＤＣに対する免疫反応が最小限又は存在しない状態で、単回投与と比較して増強された治療効果を発揮する。
【０２６９】
これらのデータは、ＣＤＣの反復投与がｍｄｘマウスの更なる運動改善に効果的であることを示している。同種ＣＤＣは免疫系によって認識されるが、それらの免疫原性プロファイル及び免疫調節能力が低いことにより、同種ＣＤＣを複数回効果的に投与され得る。
【０２７０】
上記は、明確化及び理解の目的で、例示及び実施例によってある程度詳細に記載されているが、本開示の趣旨から逸脱することなく修正がなされてもよいことが当業者によって理解されるであろう。したがって、本明細書に開示される形態は例示にすぎず、本開示の範囲を限定するものではなく、むしろ本発明の実施形態の真の範囲及び趣旨に沿った全ての修正及び代替も網羅することが明確に理解されるべきである。
【０２７１】
上に開示される実施形態の具体的な性質及び態様の様々な組み合わせ又はサブコンビネーションが作られてもよく、なおも本発明の１つ以上の範囲に含まれることが企図される。さらに、実施形態に関連する特定の性質、態様、方法、特性、特徴、品質、属性、要素等の本明細書における開示は、本明細書に記載される他の全ての実施形態で使用され得る。したがって、開示される発明の様々な様式を形成するため、開示される実施形態の様々な特徴及び態様を互いに組み合わせ、又は置換できることが理解されるべきである。よって、本明細書に開示される本発明の範囲は、上記の特定の開示される実施形態によって限定されるべきではないことが意図される。さらに、本発明は様々な修正及び代替の形態が可能であるが、その具体例は図面に示され、本明細書で詳細に説明される。しかしながら、本発明は、開示される特定の形態又は方法に限定されるものではないが、それとは対照的に、本発明は、記載される様々な実施形態及び添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲に含まれる全ての修正、同等物及び代替物を網羅するものであると理解されるべきである。開示されるどの方法も本明細書に列挙される順で行う必要はない。本明細書で開示される方法は、主治医によってとられる特定の行動を含むが、明示的又は暗示的にこれらの動作の任意の第三者の指示を含めることもできる。例えば、「抗原結合タンパク質の投与」等の動作には、「抗原結合タンパク質の投与の指示」が含まれる。さらに、本開示の特徴又は態様がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者は、それによってマーカッシュグループの個々のメンバー又はメンバーのサブグループに関しても本開示が記載されていることを認識するであろう。
【０２７２】
また、本明細書に開示される範囲は、任意の及び全ての重複、部分範囲及びそれらの組み合わせを包含する。「最大、まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」、「間」等の言語には列挙される数字が含まれる。「約」や「およそ」等の用語が前に付く数字には、記載されている数字が含まれる。例えば、「約９０％」には「９０％」が含まれる。幾つかの実施形態では、少なくとも９５％の相同性には、参照配列に対して９６％、９７％、９８％、９９％、及び１００％の相同性が含まれる。さらに、配列がヌクレオチド配列又はアミノ酸配列を「含む」と開示される場合、かかる言及には、特に明記しない限り列挙される配列を「含む」、「からなる」又は「から本質的になる」ことも含まれる。
【０２７３】
特に明示的に述べられていない限り、本出願、特に添付の特許請求の範囲で使用される用語及び語句、並びにその変形、限定ではなく非限定であると解釈されるべきである。前述のものの例として、「含む」という用語は、「限定されずに含む」、「を含むが、これらに限定されない」等を意味すると読まれるべきである。
【０２７４】
不定冠詞「１つの（ａ）」又は「１つの（ａｎ）」は複数を排除しない。例えば、分子量の値及び範囲を定義するための、本明細書で使用される「約」という用語は、表示の値及び／又は範囲の限界が±２０％内、例えば±１０％内で変動し得ることを意味する。数字の前の「約」の使用は、その数自体を含む。例えば、「約５」は、「５」の明示的な支持を提供する。重複する範囲及びその間の整数を含む範囲で提供される数字、例えば、１〜４及び５〜７の範囲は、例えば、１〜７、１〜６、１〜５、２〜５、２〜７、４〜７、１、２、３、４、５、６及び７を含む。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３５Ｃ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４２−３】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７−１】
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【図５７−２】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４−１】
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【図８４−２】
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【図８５Ａ】
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【図８５Ｂ】
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【図８５Ｃ】
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【図８６】
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【配列表】
2020517601000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月13日(2019.12.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020517601000001.app
【国際調査報告】
2020517601.tif 000131
2020517601.tif 000132
2020517601.tif 000133
2020517601.tif 000134