(57)【要約】  例えば、ＨＢＶに対する、本開示のＧａｌＮＡｃ部分を含む修飾オリゴヌクレオチドを、製造及び使用方法と共に開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１本のオリゴヌクレオチド鎖を含むコンストラクトであって、前記鎖に結合している少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ部分を有し、各ＧａｌＮＡｃ部分が、独立して、ＧａｌＮＡｃ１〜ＧａｌＮＡｃ１３から選択されるコンストラクト。
【請求項２】
前記ＧａｌＮＡｃ部分が、ＧａｌＮＡｃ−２である、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項３】
前記ＧａｌＮＡｃ部分が、ＧａｌＮＡｃ−６である、請求項１に記載のコンストラクト。
【請求項４】
前記少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ部分が、リンカーを介して前記オリゴヌクレオチド鎖のうちの少なくとも１本にコンジュゲートしている、請求項１〜３のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項５】
前記リンカーが、Ｃ６−ＮＨ２リンカーである、請求項４に記載のコンストラクト。
【請求項６】
オリゴヌクレオチド配列が、ＨＢＶ  ＲＮＡ転写物に対して親和性を有するか又は実質的に相補的である、請求項１〜５のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項７】
一本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項８】
二本鎖オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜７のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項９】
前記ＧａｌＮＡｃ部分が、前記オリゴヌクレオチド鎖の３’末端及び５’末端に化学的に結合している、請求項１〜９のいずれかに記載のコンストラクト。
【請求項１０】
式（Ｉ）又は（ＩＩ）：
【化１】
2020533009.tif 000077
［式中、Ｒ１は、
【化２】
2020533009.tif 000078
であり、
Ｒ８は、Ｃ３〜Ｃ１０アルキル部分、１〜５個の酸素原子を有するＣ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分、又は
【化３】
2020533009.tif 000079
であり、
Ｒ２は、Ｃ３〜Ｃ１０アルキル部分又は１〜５個の酸素原子を有するＣ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分であり、
Ｒ３は、Ｈ、ＰＧ’、
【化４】
2020533009.tif 000080
であり、
Ｒ４は、Ｈであり、
Ｒ５は
【化５】
2020533009.tif 000081
である
（式中、Ｒ６は、保護基、あるいは任意のリンカー及び／又はホスホルアミダート若しくはホスホジエステル結合を介したオリゴヌクレオチドへの結合であり、
Ｒ７は、Ｈ、固体支持体リンカー、又は−ＰＨ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＮである）、
あるいは、Ｒ４及びＲ５は、所望によりＣＨ２ＯＰＧによって置換された５又は６員環を一緒に形成し、
ＰＧは、アルコール保護基であり、
ＰＧ’は、保護基であり、
Ｌは、リンカー部分であり、
ａは、１〜３の整数であり、
ｂは、１〜４の整数であり、
ｃは、３〜７の整数であり、
ｄは、０〜４の整数である］
の構造を有する化合物。
【請求項１１】
Ｒ２が、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、又はＣ１０アルキルである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ８が、２〜５個のエチレンオキシド部分を含むＣ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１３】
前記リンカーが、Ｃ６−ＮＨ２リンカーである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１４】
ａが、１である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１５】
ａが、３である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１６】
ｂが、２又は３である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１７】
ＰＧが、ＤＭＴｒである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１８】
式（Ｉ）の化合物である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項１９】
式（ＩＩ）の化合物である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項２０】
Ｒ８が、
【化６】
2020533009.tif 000082
である、請求項１１に記載の化合物。
【請求項２１】
ＰＧが、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（ＴＢＭＤＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリイソプロピルシリルエーテル（ＴＩＰＳ）、モノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、又はトリトリルから選択される、請求項１１に記載の化合物。
【請求項２２】
Ｒ６が、リンカー及び／又はホスホルアミダート若しくはホスホジエステル結合を介したオリゴヌクレオチドである、請求項１１に記載の化合物。
【請求項２３】
Ｒ６が、ホスホルアミダート結合を含む、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２４】
Ｒ６が、ホスホジエステル結合を含む、請求項２２に記載の化合物。
【請求項２５】
５’末端及び３’末端の両方に、ＧａｌＮＡｃ１及び１３から選択される２つのＧａｌＮＡｃ部分を含有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２６】
末端のうちの一方におけるＧａｌＮＡｃ１〜１３から選択されるＧａｌＮＡｃ部分と、任意のリンカーを介して他方の末端に連結されたトコフェロール、パルミトイル、又はコレステロールなどの親油性部分と、を含有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
ジヌクレオチドリンカーを介してファーマコフォアアンチセンスオリゴヌクレオチドに連結された、１〜１３から選択されるＧａｌＮａｃ部分をいずれかに含有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２８】
エチレングリコール繰り返し部分を介してファーマコフォアアンチセンスオリゴヌクレオチドに連結された、１〜１３から選択されるＧａｌＮａｃ部分をいずれかに含有するオリゴヌクレオチド。
【請求項２９】
式（Ｉ）の構造
【化７】
2020533009.tif 000083
［式中、Ｒ１は、
【化８】
2020533009.tif 000084
であり、
Ｒ８は、
【化９】
2020533009.tif 000085
であり（式中、ｃは４であり、ｄは１である）、
ａは、３であり、
Ｒ２は、Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３は、
【化１０】
2020533009.tif 000086
であり（式中、Ｒ４は、Ｈである）、
Ｒ５は、
【化１１】
2020533009.tif 000087
であり（式中、Ｒ６は、保護基であり、前記保護基は４，４’−ジメトキシトリチルであり、
Ｒ７は、固体支持体リンカーであり、前記リンカーは、スクシネートである）、
ｂは、１である］
を有する、請求項１０に記載の化合物。
【請求項３０】
式（Ｉ）の構造
【化１２】
2020533009.tif 000088
［式中、Ｒ１は、
【化１３】
2020533009.tif 000089
であり、
Ｒ８は、
【化１４】
2020533009.tif 000090
であり（式中、ｃは４であり、ｄは１である）、
ａは、３であり、
Ｒ２は、Ｃ８アルキルであり、
Ｒ３は、ＰＧ’であり、ＰＧ’は、
【化１５】
2020533009.tif 000091
である（式中、ｆは、５である）］
を有する、請求項１０に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０１７年９月１４日出願の米国特許仮出願第６２／５５８，７７３号に対する優先権の利益を主張する米国特許出願である。
【背景技術】
【０００２】
アンチセンスオリゴヌクレオチド療法は、ウイルス性疾患、神経疾患、神経変性疾患、線維性疾患、過剰増殖性疾患などの様々な疾患及び状態の治療又は予防に検討されてきた。
【０００３】
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）などの特定のウイルス性疾患は、従来の治療法では依然として対処しにくく、かつ推定２億４千万人が感染（少なくとも６ヶ月間のＨＢＶ表面抗原陽性と定義）し続けており、毎年６８６，０００人超の死亡の原因となっている。テノホビル又はエンテカビルなどの経口抗ウイルス性ヌクレオチドアナログによる治療を含む従来治療は、ウイルスの複製を抑制するにすぎず、ＨＢＶ感染を治癒させない。したがって、現在のＨＢＶ療法で治療したとしても、その治療を生涯にわたって継続しなければならない。
【０００４】
オリゴヌクレオチドは、相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ配列に結合できる。この特徴により、代謝、分化、増殖、及び複製などの細胞内プロセス、並びにウイルス複製、例えば、ＨＢＶの複製に特定の観点において関与する特定の核酸標的に、オリゴヌクレオチドを結合させることが可能になる。
【０００５】
Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）は、オリゴヌクレオチドをその意図される細胞標的に導き、当該オリゴヌクレオチドの当該細胞への取り込みを改善するのを支援するために、直接又はリンカーを介してオリゴヌクレオチドにコンジュゲートする。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
当該技術分野では、その投与における特異性及び効率性が改善された新規療法を発見及び開発する必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本開示は、ＧａｌＮＡｃ部分、作製方法、及び当該部分がコンジュゲートされるオリゴヌクレオチドの肝細胞などの細胞に対するターゲティングにおいて使用する方法に関する。
【０００８】
本開示は、少なくとも１本のオリゴヌクレオチド鎖を含むコンストラクトであって、当該鎖に結合している少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ部分を有し、各ＧａｌＮＡｃ部分が、独立して、ＧａｌＮＡｃ１〜ＧａｌＮＡｃ１３から選択されるコンストラクトに関する。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、ＧａｌＮＡｃ−２である。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、ＧａｌＮＡｃ−６である。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＧａｌＮＡｃ部分は、リンカーを介してオリゴヌクレオチド鎖のうちの少なくとも１本にコンジュゲートしている。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃ６−ＮＨ２リンカーである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド配列は、ＨＢＶ  ＲＮＡ転写物に対して親和性を有するか又は実質的に相補的である。いくつかの実施形態では、当該コンストラクトは、一本鎖オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、当該コンストラクトは、二本鎖オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端及び５’末端に化学的に結合している。
【０００９】
また、本開示は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の構造を有する化合物に関する：
【００１０】
【化１】
2020533009.tif 000002
［式中、Ｒ１は、
【００１１】
【化２】
2020533009.tif 000003
であり、Ｒ８は、Ｃ３〜Ｃ１０アルキル部分、１〜５個の酸素原子を有するＣ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分、又は
【００１２】
【化３】
2020533009.tif 000004
であり、Ｒ２は、Ｃ３〜Ｃ１０アルキル部分又は１〜５個の酸素原子を有するＣ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分であり、Ｒ３は、Ｈ、ＰＧ’、
【００１３】
【化４】
2020533009.tif 000005
であり（式中、ＰＧ’は、保護基である）、Ｒ４は、Ｈであり、Ｒ５は、
【００１４】
【化５】
2020533009.tif 000006
である（式中、Ｒ６は、保護基、あるいは任意のリンカー及び／又はホスホルアミダート若しくはホスホジエステル結合を介したオリゴヌクレオチドへの結合であり、Ｒ７は、Ｈ、固体支持体リンカー（例えば、スクシネート）、又は−ＰＨ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＮである）、あるいは、Ｒ４及びＲ５は、所望によりＣＨ２ＯＰＧによって置換された５又は６員環を一緒に形成し、ＰＧは、アルコール保護基であり、Ｌは、リンカー部分であり、ａは、１〜３の整数であり、ｂは、１〜４の整数である］。いくつかの実施形態では、Ｒ２は、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、又はＣ１０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｒ８は、２〜５個のエチレンオキシド部分を含むＣ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分である。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｃ６−ＮＨ２リンカーである。いくつかの実施形態では、ａは、１である。いくつかの実施形態では、ａは、３である。いくつかの実施形態では、ｂは、２又は３である。いくつかの実施形態では、ＰＧは、ＤＭＴｒである。いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｉ）の化合物である。いくつかの実施形態では、化合物は、式（ＩＩ）の化合物である。いくつかの実施形態では、Ｒ８は、である。
【００１５】
【化６】
2020533009.tif 000007
いくつかの実施形態では、ＰＧは、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（ＴＢＭＤＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリイソプロピルシリルエーテル（ＴＩＰＳ）、モノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、又はトリトリルから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ６は、リンカー及び／又はホスホルアミダート若しくはホスホジエステル結合を介したオリゴヌクレオチドへの結合である。いくつかの実施形態では、Ｒ６は、ホスホルアミダート結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ６は、ホスホジエステル結合を含む。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本開示は、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートしている１つ以上のＧａｌＮＡｃ部分を目的とする。本開示は、更に、ＧａｌＮＡｃ部分及びそのオリゴヌクレオチドへのコンジュゲーションを使用及び調製する方法を目的とする。
【００１７】
ＧａｌＮＡｃ部分のいくつかの実施形態は、式（Ｉ）又は（ＩＩ）の化合物を含む：
【００１８】
【化７】
2020533009.tif 000008
［式中、
Ｒ１は、
【００１９】
【化８】
2020533009.tif 000009
であり、
Ｒ８は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル部分、１〜５個の酸素原子を有するＣ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分、
【００２０】
【化９】
2020533009.tif 000010
であり、
Ｒ２は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル部分又は１〜５個の酸素原子を有するＣ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分であり、
Ｒ３は、Ｈ、ＰＧ’、
【００２１】
【化１０】
2020533009.tif 000011
であり、
Ｒ４は、Ｈであり、
Ｒ５は
【００２２】
【化１１】
2020533009.tif 000012
であり（式中、
Ｒ６は、保護基、あるいは任意のリンカー及び／又はホスホルアミダート若しくはホスホジエステル結合を介したオリゴヌクレオチドへの結合であり、
Ｒ７は、Ｈ、固体支持体リンカー（例えば、スクシネート）、又は−ＰＨ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２ＣＮである）、
Ｒ９は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル部分又は１〜５個の酸素原子を有するＣ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分であり、
Ｒ１０は、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル部分又は１〜５個の酸素原子を有するＣ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分であり、
あるいは、Ｒ４及びＲ５は、所望によりＣＨ２ＯＰＧによって置換された５又は６員環を一緒に形成し、
ＰＧは、アルコール保護基であり、
ＰＧ’は、保護基であり、
Ｌは、リンカー部分であり、
ａは、１〜３の整数であり、
ｂは、１〜４の整数であり、
ｃは、３〜７の整数であり、
ｄは、０〜４の整数である）。
【００２３】
いくつかの実施形態では、Ｒ２、Ｒ９、及び／又はＲ１０は、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、又はＣ１０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｃ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分は、２〜５個のエチレンオキシド部分を含む。例えば、Ｃ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分は、以下の繰り返し部分：
【００２４】
【化１２】
2020533009.tif 000013
と、所望により追加のアルキレン部分（式中、ｅは１〜５である）を含み得る。いくつかの実施形態では、ｅは、１、２、３、４、又は５である。いくつかの実施形態では、Ｒ８は、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、又はＣ１０アルキルである。いくつかの実施形態では、Ｃ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分は、２〜５個のエチレンオキシド部分を含む。例えば、Ｃ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分は、以下の繰り返し部分：
【００２５】
【化１３】
2020533009.tif 000014
と、所望により追加のアルキレン部分（式中、ｅは１〜５である）を含み得る。いくつかの実施形態では、ａは、１である。いくつかの実施形態では、ａは、３である。いくつかの実施形態では、ｂは、２又は３である。いくつかの実施形態では、ｅは、１、２、３、４、又は５である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、Ｒ８は、
【００２７】
【化１４】
2020533009.tif 000015
である（式中、アルキレン鎖は、以下の数の炭素原子（ｃ、ｄ）を含有する：（３、０）、（３、１）、（３、２）、（３、３）、（３、４）、（４、０）、（４、１）、（４、２）、（４、３）、（４、４）、（５、０）、（５、１）、（５、２）、（５、３）、（５、４）、（６、０）、（６、１）、（６、２）、（６、３）、（６、４）、（７、０）、（７、１）、（７、２）、（７、３）、又は（７、４）。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＰＧは、アルコール保護基、例えば、シリル保護基（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（ＴＢＭＤＳ）、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル（ＴＢＤＰＳ）、トリイソプロピルシリルエーテル（ＴＩＰＳ））、又はモノメトキシトリチル（ＭＭＴｒ）、又は４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴｒ）、又はトリトリル、又はＷｕｔｓ，Ｐｅｔｅｒ  ＧＭ，ａｎｄ  Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ．Ｇｒｅｅｎｅ’ｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２００６におけるものなどの任意の他の好適な保護基を含み得る。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＰＧ’は保護基であり、例えば、いくつかの例では、ＰＧ’は、
【００３０】
【化１５】
2020533009.tif 000016
を含み得る（式中、ｆは１〜５の整数である）。いくつかの実施形態では、ｆは、１、２、３、４、又は５である。
【００３１】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、
【００３２】
【化１６】
2020533009.tif 000017
である。オリゴは、特に限定されず、アンチセンスオリゴヌクレオチド又はｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドなどの任意のオリゴヌクレオチドであってよい。いくつかの実施形態では、任意のリンカーは、Ｃ１〜Ｃ８−ＮＨ２リンカー、例えば、Ｃ６−ＮＨ２リンカーである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、Ｒ６は、リンカー及び／又はホスホルアミダート若しくはホスホジエステル結合を介したオリゴヌクレオチドへの結合である。いくつかの実施形態では、Ｒ６は、ホスホルアミダート結合を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ６は、ホスホジエステル結合を含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は以下のうちの１つであり、理解されるとおり、波線（squiggled line）は、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドとカップリングした後の最終切断点を表し、したがって、化合物の残りの部分は、最終的なＧａｌＮＡｃ置換オリゴヌクレオチドには存在しない。これは、実施例に示される。
【００３５】
【化１７】
2020533009.tif 000018
【００３６】
【化１８】
2020533009.tif 000019
【００３７】
【化１９】
2020533009.tif 000020
【００３８】
【化２０】
2020533009.tif 000021
【００３９】
いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、スクシネート部分又は固体支持体リンカーを含む。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、フルオロフェニルエステル（例えば、ペンタフルオロフェニルエステル）を含み、オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端は化学的に結合されていてもよい。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、Ｈ−ホスホネートを含み、オリゴヌクレオチドの３’又は５’末端は化学的に結合されていてもよい。これらの部分の更なる詳細は、実施例に見出すことができる。
【００４０】
コンジュゲートしたＧａｌＮＡｃ
実施形態では、オリゴヌクレオチドは、アミノアルキルリンカー（例えば、Ｃ６−ＮＨ２）などのリンカーを介してターゲティング部分に連結される。例えば、ＧａｌＮＡｃ１〜１３又は式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）は、この種のリンカーを介してオリゴヌクレオチドに連結され得る。例えば、実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’末端は、以下のコンストラクトに示すとおり、ＧａｌＮＡｃ１〜１３などのＧａｌＮＡｃ又は式（Ｉ）若しくは（ＩＩ）に更に連結されたＣ６−アミノリンカーに、ホスホルアミダート又はホスホジエステル結合を介して結合される。
【００４１】
【化２１】
2020533009.tif 000022
【００４２】
本開示のＧａｌＮＡｃ部分を含むオリゴヌクレオチドは、その全体が参照により本明細書に援用される国際公開第２０１８／０５３１８５号に記載されているものなどの修飾又は非修飾オリゴヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
【００４３】
本開示のＧａｌＮＡｃ部分を含む例示的なオリゴヌクレオチドとしては、実施例に列挙されるものが挙げられる。
【００４４】
本開示の態様では、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド配列は、所望によりリンカー部分を介して結合している本開示のＧａｌＮＡｃ部分によって、一方又は両方の末端でコンジュゲート又は修飾される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド鎖は、任意のリンカーを介して５’及び／又は３’末端でコンジュゲートしている本開示のＧａｌＮＡｃ部分を含む。いくつかの実施形態では、本開示のＧａｌＮＡｃ部分は、オリゴヌクレオチド鎖の３’末端でコンジュゲートされる。本開示の連結部分は、ＨＥＧリンカー又はＣ６アミノリンカーを含んでいてもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃ部分は、肝細胞などの特定の細胞型によるオリゴヌクレオチドの活性、細胞内分布、又は細胞内取り込みを増強する。
【００４６】
本発明の組成物及び方法の特定の実施形態では、リガンドは、結合している１つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体、例えば、それぞれ二価又は三価の分岐リンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合している２つ又は３つのＧａｌＮＡｃ誘導体である。
【００４７】
組成物
本開示はまた、本開示のＧａｌＮＡｃ置換オリゴヌクレオチドを含む医薬組成物も包含する。一実施形態は、本開示のオリゴヌクレオチドと、医薬的に許容される希釈剤又は担体と、を含む、医薬組成物である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本開示のＧａｌＮＡｃ置換オリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、非経口送達による全身投与用に製剤化される。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、又は筋肉内への注射又は注入を含み、また、例えば、埋込型デバイスを介した、真皮下投与も行われる。好ましい実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、皮下（ＳＣ）又は静脈内（ＩＶ）送達用に製剤化される。非経口投与用の製剤として滅菌水溶液を挙げることができ、これには、緩衝剤、希釈剤、及び当業者に理解されるようなその他薬学的に許容される添加剤を含んでもよい。静脈内用途には、溶質の総濃度を制御して、製剤に等張にすることができる。
【００４９】
本開示のＧａｌＮＡｃ置換オリゴヌクレオチドを含有する医薬組成物は、例えば、ＨＢＶ遺伝子の発現又は活性に関連する疾患又は障害の治療に有用である。
【００５０】
使用方法
本技術の一態様は、ＨＢＶ感染及び／又はＨＢＶ関連疾患を有する疑いがある、又はそのリスクがあると診断された対象を治療する方法を含む。治療用途では、本技術のＧａｌＮＡｃ置換オリゴヌクレオチドを含む組成物は、このような疾患の疑いがあるか又はこのような疾患に既に罹患している（例えば、対象の血清及び／若しくは肝臓中のＨＢＶ抗原表面及びエンベロープ抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇ）などが存在、又は高ＨＢＶ  ＤＮＡ若しくはＨＢＶウイルス量レベル）対象に、疾患の発症における合併症及び中間の病理学的表現型を含む、疾患の症状を治癒させるか又は少なくとも部分的に抑止するのに十分な量で投与される。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本技術のＧａｌＮＡｃ置換オリゴヌクレオチドは、以下の表Ａ中の領域又はＨＢＶ  ＲＮＡ転写物のうち少なくとも１つに対して親和性を示す。
【００５２】
【表１】
2020533009.tif 000023
【００５３】
ＨＢＶ感染及び／又はＨＢＶ関連疾患に罹患している対象は、当該技術分野において既知の診断又は予後アッセイのいずれか又は組み合わせによって同定することができる。例えば、ＨＢＶ感染及び／又はＨＢＶ関連疾患の典型的な症状として、血清及び／又は肝ＨＢＶ抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇ）の存在、ＡＬＴの上昇、ＡＳＴの上昇、抗ＨＢＶ抗体の非存在又は低濃度、肝障害、肝硬変、Ｄ型肝炎、急性Ｂ型肝炎、急性Ｂ型劇症肝炎、慢性Ｂ型肝炎、肝線維症、末期肝疾患、肝細胞癌、血清病様症候群、食欲不振、悪心、嘔吐、微熱、筋肉痛、易疲労感、味覚力及び嗅覚異常（食物及びタバコへの嫌悪感）、右上腹部及び心窩部痛（断続的、軽度から中程度）、肝性脳症、傾眠、睡眠パターン障害、精神錯乱、昏睡、腹水、消化管出血、凝固障害、黄疸、肝腫大（ゆっくりと拡大、軟肝臓）、脾腫、手掌紅斑、くも状母斑、筋消耗、くも状血管腫、血管炎、静脈りゅう出血、末梢性浮腫、女性化乳房、精巣萎縮、腹部側副静脈（メズサの頭）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）の高レベル（１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬの範囲内）、ＡＳＴ値より高いＡＬＴ値、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）及び／又はアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）濃度の上昇、アルブミン濃度の低下、血清鉄濃度の上昇、白血球減少（すなわち、顆粒球減少）、リンパ球増加、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）の上昇、赤血球寿命の短縮、溶血、血小板減少症、国際標準化比（ＩＮＲ）の延長、血清ＨＢＶ  ＤＮＡの存在、アミノトランスフェラーゼの上昇（ＵＬＮの５倍未満）、ビリルビン濃度の上昇、プロトロンビン時間（ＰＴ）の延長、高グロブリン血症、抗平滑筋抗体（ＡＳＭＡ）又は抗核抗体（ＡＮＡ）などの組織非特異的抗体の存在、甲状腺に対する抗体などの組織特異的抗体の存在、リウマチ因子（ＲＦ）の濃度上昇、高ビリルビン血症、血小板数及び白血球数の低値、ＡＬＴ値より高いＡＳＴ値、変性及び新生肝細胞の変化を伴う小葉性炎症、及び大部分の小葉中心壊死が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本技術のオリゴヌクレオチド組成物で治療された対象は、次の状態又は症状、すなわち、血清及び／又は肝ＨＢＶ抗原（例えば、ＨＢｓＡｇ及び／又はＨＢｅＡｇ）の存在、抗ＨＢＶ抗体の非存在又は低濃度、肝障害、肝硬変、Ｄ型肝炎、急性Ｂ型肝炎、急性Ｂ型劇症肝炎、慢性Ｂ型肝炎、肝線維症、末期肝疾患、肝細胞癌、血清病様症候群、食欲不振、悪心、嘔吐、微熱、筋肉痛、易疲労感、味覚力及び嗅覚異常（食物及びタバコへの嫌悪感）、右上腹部及び心窩部痛（断続的、軽度から中程度）、肝性脳症、傾眠、睡眠パターン障害、精神錯乱、昏睡、腹水、消化管出血、凝固障害、黄疸、肝腫大（ゆっくりと拡大、軟肝臓）、脾腫、手掌紅斑、くも状母斑、筋消耗、くも状血管腫、血管炎、静脈りゅう出血、末梢性浮腫、女性化乳房、精巣萎縮、腹部側副静脈（メズサの頭）、ＡＳＴ値より高いＡＬＴ値、白血球減少（すなわち、顆粒球減少）、アルブミン濃度の低下、血清鉄濃度の上昇、リンパ球増加、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）の上昇、赤血球寿命の短縮、溶血、血小板減少症、国際標準化比（ＩＮＲ）の延長、血清ＨＢＶ  ＤＮＡの存在、プロトロンビン時間（ＰＴ）の延長、高グロブリン血症、抗平滑筋抗体（ＡＳＭＡ）又は抗核抗体（ＡＮＡ）などの組織非特異的抗体の存在、甲状腺に対する抗体などの組織特異的抗体の存在、高ビリルビン血症、血小板数及び白血球数の低値、ＡＬＴ値より高いＡＳＴ値、変性及び新生肝細胞の変化を伴う小葉性炎症、及び大部分の小葉中心壊死のうち、１つ以上の改善又は排除を示す。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本技術のオリゴヌクレオチド組成物で治療された対象は、ＨＢＶ感染及び／又はＨＢＶ関連疾患に罹患している未治療の対象と比較して、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、γ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、ビリルビン、及びリウマチ因子（ＲＦ）の中から選択される１つ以上のバイオマーカーの発現レベルの低下を示す。
【００５６】
本開示は、有効量の本技術のオリゴヌクレオチド組成物を対象に投与することを含む、ＨＢＶ感染及び／又はＨＢＶ関連疾患を有すると診断された又はその疑いのある対象を治療するための方法を提供する。
【００５７】
本開示のオリゴヌクレオチド及び組成物は、アンチセンス療法で使用できる。例えば、オリゴヌクレオチドは、例えばＨＢＶの既知のウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ配列である標的核酸配列に相補的つまりハイブリダイズする核酸塩基配列を含有してもよい。
【００５８】
いくつかの実施形態は、標的核酸を本開示のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス化合物と接触させることによって、標的の発現を調節する方法を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、例えば、ヒトなどの動物において細胞内に存在する。
【００５９】
いくつかの実施形態は、本開示のオリゴヌクレオチドを含むアンチセンス化合物を動物に投与することを含む、動物における標的ＲＮＡの発現を阻害する方法を含む。オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡの一部に相補的でありつまりハイブリダイズすることができる。
【００６０】
いくつかの実施形態は、治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物を、ウイルス負荷の低減を必要とする対象に投与することを含み、それにより、対象におけるウイルスのウイルス負荷を低減する、ウイルスに感染した対象におけるウイルス負荷の低減方法を含む。オリゴヌクレオチドは、ウイルス中の標的ＲＮＡの一部に相補的でありつまりハイブリダイズすることができる。
【００６１】
いくつかの実施形態は、細胞を本開示のオリゴヌクレオチド若しくは組成物と接触させること、又は、治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチド若しくは組成物を、ウイルス遺伝子発現の阻害を必要とする対象に投与することを含む、細胞又は対象におけるウイルス遺伝子発現の阻害方法を含む。オリゴヌクレオチドは、ウイルス中の標的ＲＮＡの一部に相補的でありつまりハイブリダイズすることができる。
【００６２】
他の実施形態は、治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物を、ウイルス抗原レベルの低減を必要とする対象に投与することを含み、それにより、対象内のウイルス抗原レベルを低減させる、ウイルスに感染した対象におけるウイルス抗原レベルの低減方法を含む。オリゴヌクレオチドは、ウイルス中の標的ＲＮＡの一部に相補的でありつまりハイブリダイズすることができる。
【００６３】
本開示のオリゴヌクレオチド及び組成物を用いて、例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）遺伝子の発現を阻害若しくは低減する、又は、ＨＢＶウイルスの複製を阻害する、又は、ＨＢＶを有する対象を治療する、又は、ＨＢＶに感染した対象におけるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のウイルス負荷を低減することができる。実施形態では、開示されるキメラオリゴヌクレオチドを用いて、標的遺伝子においてＲＮａｓｅ  Ｈ活性を誘導する。
【００６４】
本開示のオリゴヌクレオチド及び組成物を用いて、例えば、ＨＣＶ  ＲＮＡに対するマイクロＲＮＡ結合部位を競合させ、それによって複製を阻害できる。
【００６５】
本開示はまた、対象に送達するためのオリゴヌクレオチドを安定化する方法も目的とする。オリゴヌクレオチドの安定化は、本明細書では、オリゴヌクレオチドの融点、つまり温度Ｔｍを上昇させることを特徴とする［定量化される］。
【００６６】
開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、単独で、又は標的化された疾患のための１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて投与されてもよい。開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、単独で、又はＨＢＶ感染のための１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて投与されてもよい。併用療法では、オリゴヌクレオチドコンストラクト及びＨＢＶ感染向けの１つ以上の追加の治療法薬を、同じ組成物若しくは別個の組成物で同時に投与されてもよく、又は別々に、同時若しくは連続的に投与されてもよいことが理解される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、ＨＢＶ複製阻害剤若しくは免疫調節剤と組み合わせて、又はＨＢＶ複製阻害剤及び免疫調節剤の両方と抗ＨＢＶオリゴヌクレオチド剤を組み合わせる投薬計画で投与される。実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、ＨＢＶ感染のための標準治療法と組み合わせて投与される。ＨＢＶ感染の標準治療法として、ヌクレオチド／ヌクレオチドアナログ（例えば、ラミブジン、テルビブジン、エンテカビル、アデホビル、テノホビル、及びクレブジン、テノホビル・アラフェナミド（ＴＡＦ）、ＣＭＸ１５７、及びＡＧＸ−１００９）及びインターフェロン（例えば、Ｐｅｇ−ＩＦＮ−２ａ及びＩＦＮ−ａ−２ｂ、インターフェロンラムダ）などのウイルスポリメラーゼの阻害剤を挙げることができる。実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、同時投与（併用）又は連続投与のいずれかの後に、１種以上のオリゴヌクレオチドと組み合わせて投与される。オリゴヌクレオチドとして、ＡＬＮ−ＨＢＶ、ＡＲＢ−１４６７、ＡＲＣ−５２０及びＡＲＣ−５２１などのｓｉＲＮＡ、ＲＧ６００４（ＬＮＡ  ＨＢＶ）、Ｉｏｎｉｓ−ＨＢＶＲｘ及びＩｏｎｉｓ−ＨＢＶ−ＬＲｘなどのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡ模倣物若しくは阻害剤、アプタマー、立体的遮断剤、ｓａＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、免疫調節剤、並びに／又は、ＲＥＰ  ２１３９及びＲＥＰ  ２１６５オリゴヌクレオチドなどのＨＢｓＡｇ放出阻害剤を挙げることができる。実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、ウイルス複製阻害剤などの１種以上の抗ウイルス剤と組み合わせて投与される。実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、ＨＢＶカプシド阻害剤と組み合わせて投与される。ＨＢＶカプシド阻害剤として、ＮＶＲ  ３−７７８、ＡＢ−４２３、ＧＬＳ−４、Ｂａｙｅｒ  ４１−４１０９、ＨＡＰ−１、及びＡＴ−１を挙げることができる。実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、ＴＬＲアゴニストなどの１種以上の免疫調節剤と組み合わせて投与される。ＴＬＲアゴニストとして、ＧＳ−９６２０、ＡＲＢ−１５９８、ＡＮＡ９７５、ＲＧ７７９５（ＡＮＡ７７３）、ＭＥＤＩ９１９７、ＰＦ−３５１２６７６、及びＩＭＯ−２０５５を挙げることができる。実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、ＨＢＶワクチンと組み合わせて投与される。ＨＢＶワクチンとして、Ｈｅｐｌｉｓｌａｖ、ＡＢＸ２０３、及びＩＮＯ−１８００を挙げることができる。実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドコンストラクトは、組み合わせて投与される。
【００６８】
いくつかの実施形態は、細胞を本開示のオリゴヌクレオチド若しくは組成物と接触させること、又は、治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチド若しくは組成物を、ＨＢＶ遺伝子発現の阻害を必要とする対象に投与することを含む、細胞又は対象におけるＨＢＶ遺伝子発現の阻害を含む。
【００６９】
いくつかの実施形態は、治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物を、ＨＢＶ遺伝子の発現又は活性化に関連する疾患又は障害の治療を必要とする対象に投与することを含む、ＨＢＶ遺伝子の発現又は活性化に関連する疾患又は障害の治療を含む。
【００７０】
いくつかの実施形態は、治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物を、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のウイルス負荷の低減を必要とする対象に投与することを含み、それにより、対象におけるＨＢＶのウイルス負荷を低減する、ＨＢＶに感染した対象におけるＨＢＶのウイルス負荷の低減方法を含む。いくつかの実施形態はまた、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）に感染した対象におけるＨＤＶのウイルス負荷の低減方法も提供する。
【００７１】
他の実施形態は、治療有効量の本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物を、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）抗原レベルの低減を必要とする対象に投与することを含み、それにより、対象におけるＨＢＶ抗原レベルを低減する、ＨＢＶウイルスに感染した対象におけるＨＢＶウイルス抗原レベルの低減方法を含む。いくつかの実施形態はまた、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）に感染した対象におけるＨＤＶ抗原レベルの低減方法も提供する。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ抗原は、ＨＢｓＡｇ又はＨＢｅＡｇである。
【００７２】
一実施形態では、ＨＢＶを標的とする本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物は、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ及びＨＤＶ両方の感染、並びに／又はＨＢＶ関連疾患を有する対象に投与され、本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物が対象に投与されると、例えば、対象の細胞、組織、血液、又は他の組織若しくは流体内の、１つ以上のＨＢＶ遺伝子の発現、ＨＢＶ  ｃｃｃＤＮＡレベル、ＨＢＶ抗原レベル、ＨＢＶウイルス負荷レベル、ＡＬＴ、及び／又はＡＳＴが、少なくとも約２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは少なくとも約９９％以上、又は、これらの数のうちの２つの間の値で低下する。いくつかの実施形態では、ＨＢＶ抗原レベルは、上記量低減する。いくつかの実施形態では、抗原は、ＨＢｓＡｇ又はＨＢｅＡｇである。いくつかの実施形態では、ＨＢＶウイルス負荷レベルは、上記量低減する。
【００７３】
一実施形態では、ＨＢＶを標的とする本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物は、ＨＢＶ感染又はＨＢＶ及びＨＤＶ両方の感染、並びに／又はＨＢＶ関連疾患を有する対象に投与され、本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物が対象に投与されるとき、例えば、対象の細胞、組織、血液、又は他の組織若しくは流体内の、抗ＨＢＶ抗体レベルが、少なくとも約２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６２％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは少なくとも約９９％以上、又は、これらの数のうちの２つの間の値で上昇する。
【００７４】
本開示の方法及び使用による本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物の投与は、ＨＢＶ感染、又はＨＢＶ及びＨＤＶ両方の感染、並びに／又はＨＢＶ関連疾患を有する患者における、かかる疾患又は障害の重篤度、徴候、症状、及び／又はマーカーの低減をもたらし得る。この文脈において「低減」とは、かかるレベルの統計的に有意な減少を意味する。低減は、例えば、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、若しくは約１００％、又はこれらの数のうちの２つの間の値であり得る。
【００７５】
本開示のオリゴヌクレオチド又は組成物の量は、医療専門家によって決定され得る。製品の１日用量は、ヒト成人につき１日当たり０．００１〜１，０００ｍｇ、又はこの内の任意の範囲の幅広い範囲で異なり得る。経口投与については、好ましくは、処置すべき患者への投薬量の対症調整のために０．０１、０．０５、０．１、０．５、１．０、２．５、５．０、１０．０、１５．０、２５．０、５０．０、１００、１５０、２００、２５０、及び５００ミリグラムの活性成分を含有する錠剤の形態で組成物を提供する。薬物の有効量は、通常、１日当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重、又はこの内の任意の範囲の投薬量レベルで供給される。好ましくは、範囲は、１日当たり約０．０１〜約５０．０ｍｇ／ｋｇ体重、又はこの内の任意の範囲である。より好ましくは、１日当たり約０．０１〜約１０．０ｍｇ／ｋｇ体重、又はこの内の任意の範囲である。より好ましくは、１日当たり約０．０１〜約１．０ｍｇ／ｋｇ体重、又はこの内の任意の範囲である。オリゴヌクレオチドは、１日当たり１〜４回の投薬計画で投与されてもよい。例えば、本開示のオリゴヌクレオチドは、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの１回以上の用量で投与されてもよい。例えば、開示されるオリゴヌクレオチドは、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３１、３２、３３、３４、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５又は約１００ｍｇ／ｋｇの用量で投与されてもよい。列挙された値の中間の値及び範囲もまた、本開示の一部であることが意図される。これらの値は、点滴静注及び／又は皮下送達に適用され得る。本明細書に記載される他の形態の送達もまた、これらの用量で投与されてもよい。用量は、患者の要求条件、治療を行う状態の重篤度、及び使用されるオリゴヌクレオチドに応じて異なり得る。連日投与又は間欠投与のいずれを用いてもよい。
【００７６】
本開示のオリゴヌクレオチドは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は約２５分間などの時間をかけて、点滴静注によって投与することができる。投与は、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、又はそれ以上にわたり、例えば週１回、２週間に１回（すなわち、２週間毎）定期的に繰り返してもよい。初期治療の投薬計画後、頻度を減らして治療薬を投与してもよい。例えば、３ヶ月にわたり週１回又は２週間に１回投与した後、６ヶ月又は１年以上にわたって、月１回の投与を繰り返してよい。
【００７７】
本開示のオリゴヌクレオチドはまた、皮下送達によっても投与され得る。投与は、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、又はそれ以上にわたり、例えば週１回、２週間に１回（すなわち、２週間毎）定期的に繰り返してもよい。初期治療の投薬計画後、頻度を減らして治療薬を投与してもよい。例えば、３ヶ月にわたり週１回又は２週間に１回投与した後、６ヶ月又は１年以上にわたって、月１回の投与を繰り返してよい。
【００７８】
疾患の治療又は予防の有効性は、例えば、疾患の進行、疾患の寛解、症状の重篤度、疼痛の低減、生活の質、治療効果を維持するために必要な薬剤の量、疾患マーカーのレベル、又は、治療又は予防の標的とされているある疾患に対して適切な任意のその他測定可能なパラメータを測定することによって評価することができる。このようなパラメータのいずれか１つ、又はパラメータの任意の組み合わせを測定することによって、治療又は予防の有効性をモニタリングすることは、十分に当業者の能力の範囲内である。例えば、ＣＨＢの治療の有効性は、例えば、ウイルス負荷及びトランスアミナーゼレベルの定期的なモニタリングによって評価できる。初期値とその後の値を比較することによって、処置が有効であるかどうかの指標が提供される。
【００７９】
定義
本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的でのみ使用され、本発明の範囲を制限することを意図しないと理解すべきである。以下の定義は、別途記載のない限り適用されるものとする。
【００８０】
本明細書で使用するとき、用語「相補的」又は「相補性」は、ポリヌクレオチド（すなわち、オリゴヌクレオチド又は標的核酸などのヌクレオチドの配列）に関して、塩基対合則を指す。本明細書で使用するとき、核酸配列の相補体は、１つの配列の５’末端が他方の３’末端と対になるように核酸配列と位置合わせされると、「逆平行に会合」するオリゴヌクレオチドを指す。例えば、配列「５’−Ａ−Ｇ−Ｔ−３’」は、配列「３’−Ｔ−Ｃ−Ａ−５’」に相補的である。天然に存在する核酸中に通常見られない特定の塩基は、本明細書に記載の核酸に含まれてもよい。これらには、例えば、イノシン、７−デアザグアニン、ロックド核酸（ＬＮＡ）、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。相補性は、完全である必要はなく、安定な二本鎖は、ミスマッチ塩基対、変性又は不一致塩基を含有してもよい。核酸技術の当業者は、例えば、オリゴヌクレオチドの長さ、塩基組成、及びオリゴヌクレオチドの配列、イオン強度、及び不適正塩基対の頻度などの多くの変数を経験的に考慮して、二本鎖の安定性を判断することができる。相補配列はまた、ＤＮＡ配列又はその相補配列に相補的なＲＮＡ配列であってよく、またｃＤＮＡであってもよい。
【００８１】
本明細書で使用するとき、用語「ハイブリダイズ」は、２本の実質的に相補的な核酸鎖（少なくとも１４〜２５ヌクレオチドにわたって少なくとも約６５％相補的、少なくとも約７５％、又は少なくとも約９０％相補的）が、適切にストリンジェントな条件下で互いにアニーリングし、相補的塩基対間の水素結合の形成によって二本鎖又はヘテロ二本鎖を形成するプロセスを指す。ハイブリダイゼーションは、典型的にはかつ好ましくは、プローブ長の核酸分子、好ましくは長さ１５〜１００ヌクレオチド、より好ましくは長さ１８〜５０ヌクレオチドで実施される。核酸ハイブリダイゼーションの手法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．を参照されたい。ハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、使用する条件のストリンジェンシー、及び形成されるハイブリッド体の熱融点（Ｔｍ）などの因子によって影響される。当業者は、少なくとも所望のレベルの相補性を有する配列が安定的にハイブリダイズする一方で、より低い相補性を有するものはハイブリダイズしないように、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーを推定及び調節する方法を理解している。ハイブリダイゼーション条件及びパラメータの例については、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．１９９４，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｓｅｃａｕｃｕｓ，Ｎ．Ｊを参照されたい。いくつかの実施形態では、特定のハイブリダイゼーションは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で起こる。標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド（例えば、プローブ又はプライマー）は、好適な条件下で標的核酸に「ハイブリダイズ」する。
【００８２】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、本明細書で使用するとき、少なくとも以下と同程度ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を指す：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ６．８、０．５％  ＳＤＳ、０．１ｍｇ／ｍＬ超音波処理済みサケ精子ＤＮＡ、及び５×デンハルト溶液中において４２℃で一晩ハイブリダイゼーション；２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳによる４５℃での洗浄；並びに０．２×ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳによる４５℃での洗浄。別の例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、２０個の連続ヌクレオチドにわたって３つ以上の塩基が異なる、２本の核酸のハイブリダイゼーションを可能にしてはならい。
【００８３】
本明細書で使用するとき、用語「実質的に相補的」は、２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味する。当業者であれば、実質的に相補的な配列は、その全長に沿ってハイブリダイズする必要がないことを理解するであろう。具体的には、実質的に相補的な配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズする塩基の連続配列に対して３’又は５’に配置される、標的配列にハイブリダイズしない連続配列の塩基を含んでよい。
【００８４】
「薬学的に許容される」とは、生物学的又は別の理由で望ましくないわけではない材料を指し、すなわち、材料は、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、又は含有される組成物の他の成分のいずれかと有害に相互作用することなく、患者に投与される医薬組成物に組み込まれてもよい。「薬学的に許容される」という用語が、医薬キャリア又は賦形剤を指すために使用される場合、キャリア又は賦形剤は、毒性試験及び製造試験の必要な基準を満たすか、又はそのキャリアが、米国医薬品局によって作製されたＩｎａｃｔｉｖｅ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｇｕｉｄｅに含まれることを意味する。
【００８５】
オリゴヌクレオチドの「コンストラクト」は、本開示のオリゴヌクレオチド、及び、例えば、（１）コンジュゲート部分、例えば本明細書に記載されるもの（標的部分）又は（２）修飾／未修飾ヌクレオチドのドメイン、例えば一部のキメラオリゴヌクレオチドを指すことができる。
【００８６】
「キメラオリゴヌクレオチド」は、例えば、式（ＶＩ）及び（ＶＩＩ）によって例示されるような、２つ以上のドメインを有するオリゴヌクレオチドを指す。キメラオリゴヌクレオチドは、追加の構成要素、例えば、リガンド標的化基又はファーマコフォア又は追加のヌクレオチド、リンカーなどを含んでもよい。
【００８７】
「修飾ヌクレオシド」は、独立して、修飾された糖部分及び／又は修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを指す。ヌクレオシドは、サブユニット間結合、例えば、リン酸ジエステルサブユニット間結合、チオリン酸サブユニット間結合、ホスホロアミダートサブユニット間結合、及びチオホスホロアミダートサブユニット間結合を介して連結され、「改変ヌクレオチド」は、ヌクレオシドとサブユニット間結合を共に指し得ると理解される。
【００８８】
「未修飾」又は「天然」核酸塩基として、プリン塩基であるアデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、並びにピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。「修飾核酸塩基」として、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン、及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシン及びピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（シュードウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン及び３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンなどの、その他合成及び天然核酸塩基が挙げられる。更なる修飾核酸塩基として、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−ｃｌａｍｐ、例えば、置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−ａｍ−ｏｅｌｈｏｘｙ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾオキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３，２，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）などの三環式ピリミジンが挙げられる。修飾核酸塩基はまた、プリン塩基又はピリミジン塩基が他のヘテロ環で置換されたもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、及び２−ピリドンを含んでもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態では、修飾核酸塩基は、５−メチルシトシン、２，６−ジアミノプリン、５−メチルウラシル、及びｇ−ｃｌａｍｐからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｇ−ｃｌａｍｐは、
【００９０】
【化２２】
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である。
【００９１】
「リガンド標的化基」は、受容体結合を介して、ＨＢＶに感染した肝細胞へのオリゴヌクレオチドの送達を促進する部分を指す。これらの基としては、細胞表面受容体であるＡＳＧＰＲ及び細胞表面上のＬＤＬ受容体をそれぞれ標的とする、ＧａｌＮＡｃなどの「受容体標的化リガンド」が挙げられる。細胞表面上のこれらの受容体を標的とする他の受容体標的リガンドもまた、この用語の範囲内である。
【００９２】
「ファーマコフォア」は、ＨＢＶ／ＨＤＶ又はＨＢＶ感染細胞内でＨＢＶのＤＮＡ又はＲＮＡ分子と相互作用し、抗ウイルス応答を引き起こすオリゴヌクレオチド薬物配列を指す。
【００９３】
「立体配置的に制限されたヌクレオシド」は、架橋された又は二環式の糖構造を有するヌクレオシドを指し、ヌクレオシドの立体構造は、特定の立体配置に固定されてもよい。例えば、立体配置的に制限されたヌクレオシドとして、固定されたＣ３’エンド型の糖パッカリングを有するものが挙げられる。例示的実施形態として、架橋核酸（ＢＮＡ）、例えば、α−Ｌ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、β−Ｄ−メチレンオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−２’）ＬＮＡ、エチレンオキシ（４’−（ＣＨ２）２−Ｏ−２’）ＥＮＡ、２’，４’−ＢＮＡＮＣ［ＮＨ］、２’，４’−ＢＮＡＮＣ［ＮＭｅ］、２’，４’−ＢＮＡＮＣ［ＮＢｎ］、アミノオキシ（４’−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’）ＢＮＡ、及びオキシアミノ（４’−ＣＨ２−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’）ＢＮＡなどの２’、４’−ＢＮＡヌクレオシドが挙げられる。別の例示的なＢＮＡ構造体として、糖の４’と２’の位置の間に少なくとも１つの架橋を有するオリゴヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されず、このとき架橋のそれぞれは、独立して、−［Ｃ（Ｒ１）（Ｒ２）］ｎ−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｃ（Ｒ２）−、−Ｃ（Ｒ１）＝Ｎ−、−Ｃ（＝ＮＲ１）−、−Ｃ（＝Ｏ）−、−Ｃ（＝Ｓ）−、−Ｏ−、−Ｓｉ（Ｒ１）２−、−Ｓ（＝Ｏ）ｘ−及び−Ｎ（Ｒ１）−から独立して選択される、１つ又は２〜４つの連結基を含み、式中、ｘは０、１、又は２であり、ｎは、１、２、３、又は４であり、各Ｒ１及びＲ２は、独立して、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、Ｃ５〜Ｃ７脂環ラジカル、置換Ｃ５〜Ｃ７脂環ラジカル、ハロゲン、ＯＪ１、ＮＪ１Ｊ２、ＳＪ１、Ｎ３、ＣＯＯＪ１、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、ＣＮ、スルホニル（Ｓ（＝Ｏ）２−Ｊ１）、又はスルホキシル（Ｓ（＝Ｏ）−Ｊ１）であり、各Ｊ１及びＪ２は、独立して、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アルキル、Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルケニル、Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、置換Ｃ２〜Ｃ１２アルキニル、Ｃ５〜Ｃ２０アリール、置換Ｃ５〜Ｃ２０アリール、アシル（Ｃ（＝Ｏ）−Ｈ）、置換アシル、複素環ラジカル、置換複素環ラジカル、Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、置換Ｃ１〜Ｃ１２アミノアルキル、又は保護基である。ある種のＢＮＡは、特許文献及び科学文献において調製及び開示されている（例えば、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許第７，０５３，２０７号、同第６，２６８，４９０号、同第６，７７０，７４８号、同第６，７９４，４９９号、同第７，０３４，１３３号、同第６，５２５，１９１号、同第７，６９６，３４５号、同第７，５６９，５７５号、同第７，３１４，９２３号、同第７，２１７，８０５号、及び同第７，０８４，１２５号を参照）。「立体配置的に制限されたヌクレオチド」は、サブユニット間結合を介して連結された、立体配置的に制限されたヌクレオシドを指す。
【００９４】
いくつかの実施形態では、立体配置的に制限されたヌクレオシドは、任意に置換されたＬＮＡ又は任意に置換されたＥＮＡから選択される。任意に置換されたＬＮＡ又はＥＮＡは、−ＣＨ２−部分のうちの１つがアルキル部分、例えば、メチル又はエチルによって置換されてもよい。
【００９５】
「発現を阻害する」とは、発現又は活性の低下又は遮断を指し、必ずしも発現又は活性の完全な消失を示すものではない。
【００９６】
「ウイルスの複製を阻害する」とは、ウイルスの複製の低下又は遮断を指し、必ずしもウイルスの複製の完全な消失を示すものではない。
【００９７】
「対象／被検体」は哺乳類を指し、ヒト及び非ヒト哺乳類を含む。いくつかの実施形態では、対象はヒト、例えば成人である。
【００９８】
対象における疾患を「治療する」又は疾患の「治療」とは、（１）その疾患にかかりやすい若しくはその疾患の症状をまだ呈していない対象において疾患が発生するのを防ぐこと、（２）疾患を阻害すること、すなわち、その発症を止めること、又は（３）疾患を寛解させる若しくは退行を引き起こすことを指す。
【００９９】
「治療有効量」とは、対象に治療効果を提供する医薬品の量を意味する。
【０１００】
「薬学的に許容される塩」は、本開示の化合物の生理学的かつ薬学的に許容される塩、すなわち、親オリゴヌクレオチド／化合物の所望の生物学的活性を保持し、かつ望まれない毒性作用を付与しない塩を意味する。
【０１０１】
以下の略語を本開示で用いる。２’−Ｈ（デオキシリボース）ヌクレオシドは、核酸塩基に対応する大文字で、例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ及びＴと称される。２’−ＯＨ（リボース）ヌクレオシドは、小文字ｒと核酸塩基に対応する大文字で、例えば、ｒＡ、ｒＣ、ｒＧ及びｒＵと称される。２’−Ｏ−Ｍｅヌクレオシドは、小文字ｍと核酸塩基に対応する大文字で、例えば、ｍＡ、ｍＣ、ｍＧ、及びｍＵと称される。２’−ＭＯＥヌクレオシドは、小文字「ｍｏｅ」と核酸塩基に対応する大文字で、例えば、ｍｏｅＡ、ｍｏｅＣ、ｍｏｅＧ及びｍｏｅＵと称される。２’−リボ−Ｆヌクレオシドは、小文字「ｆ」と核酸塩基に対応する大文字で、例えば、ｆＡ、ｆＣ、ｆＧ及びｆＵと称される。２’アラビノ−Ｆヌクレオシドは、小文字「ａｆ」と核酸塩基に対応する大文字で、例えば、ａｆＡ、ａｆＣ、ａｆＧ及びａｆＵと称される。ｍＡ＊は、３’−アミノ−２’−ＯＭｅ−２，６−ジアミノプリンである。Ａ＊は、３’−アミノ−２−デオキシ−２，６−ジアミノプリンである。ｆＡ＊は、３’−アミノ−２’−Ｆ−２，６−ジアミノプリンである。ＬＮＡヌクレオシドは、「Ｌ」と核酸塩基に対応する大文字で、例えばＬＡ、ＬＣ、ＬＧ、ＬＴＡと称される。
【０１０２】
ヌクレオチドの主鎖又はサブユニット間結合について、リン酸ジエステルサブユニット間結合は、「ＰＯ」と称されるか、又は一般に配列の詳細には含まれない。チオリン酸サブユニット間結合は、小文字「ｐｓ」と略記される。ホスホロアミダートサブユニット間結合は、小文字「ｎｐ」と略記される。チオホスホロアミダートサブユニット間結合は、小文字「ｎｐｓ」と略記される。
【０１０３】
Ｎ３’→Ｐ５’は、３’部分がＮを含有し（例えば、ＮＨ）、Ｐを介して連結される、サブユニット間結合を有する修飾ヌクレオチドを指す。例えば、以下の構造は、Ｎ３’→Ｐ５’結合を有する：
【０１０４】
【化２３】
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【０１０５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される場合、他に明記されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示物を含むことに留意すること。特許請求の範囲は、いずれかの任意要素を除外するように起案される場合もあることに更に留意されたい。したがって、この記載は、特許請求の範囲の要素の列挙に関連する「だけ」、「のみ」などの排他的な用語の使用、又は「否定的」限定の使用に対する先行的限定の根拠として機能することを意図する。
【０１０６】
用語「約」は、当業者には理解されるものであり、この用語が用いられる文脈によってある程度異なる。用いられるある文脈において当業者には明らかでなく用語が使用されている場合、「約」は、特定の用語の最大プラスマイナス１０％を意味するであろう。特定の範囲は、本明細書では、「約」という用語が先行する数値で示される。用語「約」は、本明細書では、それが先行する正確な数、並びにその用語が先行する近似する又は大凡の数の文字どおりの根拠を提供するために使用される。数が具体的に挙げられた数に近似するか、又はその大凡であるかどうかを判定する際には、近似する又は大凡の挙げられていない数は、それが提示される文脈において、具体的に挙げられた数に実質的に相当するものを提供する数であり得る。
【０１０７】
「リンカー部分」は、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル部分又は１〜５個の酸素原子を有するＣ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分を含み得る。また、このリンカーは、リンカーの末端に、又はリンカー内部、例えば、Ｃ２〜Ｃ１０アルキル部分若しくはＣ３〜Ｃ１０アルキルオキシド部分の内部に、１つ以上のアミン部分を含み得る。
【０１０８】
「固体支持体リンカー」は、化合物を樹脂などの固体支持体に連結させる化学部分として当業者に理解されるであろう。固体支持体リンカーは、合成の最後に特定の条件下で容易に切断することができなければならない。一般的なリンカーはスクシニルリンカーであり、これは、濃水酸化アンモニウムで処理することによって容易に切断することができる。固体支持体リンカーという用語は、化学物質が固体支持体に結合している実施形態、及び固体支持体リンカーが固体支持体を含まない実施形態を含む。
【０１０９】
本明細書に記載される疾患又は病状の治療又は予防の様々な様式は、完全な治療又は予防を含むが、完全な治療又は予防に満たず、ある程度の生物学的又は医学的に関連する結果が達成される「実質的」なものを意味することが意図されることも理解されたい。治療は、慢性疾患の治療のための継続的な長期治療であっても、急性状態の治療のための単回又は数回の投与であってもよい。
【０１１０】
ある範囲の値が提供される場合、その間の各値（文脈により明確に示されない限り、その範囲及び他に記載された範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１まで、つまり、その記載された範囲の間の各値）は、本発明に包含されると理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、独立してその小さい範囲に含まれる場合もあり、記載された範囲から任意の限界値が具体的に除外され得るものとして、やはり本発明の範囲に含まれるものとする。記載された範囲が限界値の一方又は両方を含む場合、これらの含まれた限界値の一方又は両方を除外する範囲もやはり本発明に含まれるものとする。
【０１１１】
本開示は、記載される特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって変更可能である。本明細書に使用される専門用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、制限されることを意図せず、本発明の範囲は添付の請求項によってのみ制限されることが理解されるべきである。
【０１１２】
本開示を読むことによって当業者には明白となるように、本明細書に記載し例示される個々の実施形態はそれぞれ、本開示の範囲及び趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のいずれかの特徴から容易に分離されるか、又はそれらの特徴と組み合わされ得る、別個の構成要素及び特徴を有する。説明したいずれの方法も、説明した事象の順序で、又は論理的に可能な他の任意の順序で実施することができる。
【０１１３】
本明細書に引用される全ての刊行物及び特許は、各個々の刊行物又は特許が、参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているかのように参照により本明細書に組み込まれ、その文献が引用されている方法及び／又は材料に関連して開示及び説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も、出願日前に開示されているがためであり、本発明が先行発明のおかげでそのような刊行物を先行する権利を持たないことを容認するものとして解釈されるべきではない。更に記載される刊行物の日付は実際に公開された日付とは異なる可能性があり、これは別個に確認を要する場合がある。
【実施例】
【０１１４】
以下の実施例は、当業者による本開示の実施を助けるための、本開示の特定の実施形態を例示する。したがって、実施例は、決して本開示の範囲を限定するものとみなされない。
【０１１５】
製造方法
乾燥剤を用いて、全てのモノマーを真空デシケーター内で乾燥させた（ＫＯＨ及びＰ２Ｏ５、ＲＴ、２４時間）。第１の５’残基に結合した合成固体担体（ＣＰＧ）を市販の供給元から得た。その他全ての合成試薬及び溶媒を市販の供給元から入手し、そのように使用した。合成後ワークフロー用の化学物質及び溶媒を市販の供給元から購入し、精製又は処理をなんら行わずに使用した。合成中、溶媒（アセトニトリル）及び溶液（アミダイト及び活性剤）をモレキュラーシーブ上で保存した。
【０１１６】
この試験で使用した、対照であるヌクレアーゼ安定化３’−ＧａｌＮＡｃコンジュゲートアンチセンスオリゴヌクレオチドを、例えば表に示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、製造業者によって提示される標準的な９３段階サイクルを用いてＡＢＩ−３９４合成装置で合成した。固体担体は制御された細孔ガラスとし、モノマーは標準的な保護基を含有していた。各オリゴヌクレオチドを、市販の５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−３’−Ｏ−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ＤＮＡ、並びに又は、６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン（ＡＢｚ）、４−Ｎ−アセチルシチジン（ＣＡｃ）、２−Ｎ−イソブチリルグアノシン（ＧｉＢｕ）、及びチミジン（Ｔ）の２’−Ｏ−Ｍｅホスホロアミダイトモノマーを用い、標準的な固相オリゴヌクレオチド合成プロトコールに従って個々に合成した。ホスホロアミダイトは、市販の供給元から購入した。２’Ｏ−Ｍｅ−２，６−ジアミノプリンホスホロアミダイトは、市販の供給元から購入した。ＤＤＴＴ（（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾリン−３−チオンを、オリゴリボヌクレオチドホスホロチオエートの合成のためのイオウ移動剤として使用した。ＣＨ３ＣＮ中、５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性剤の存在下におけるホスホロアミダイトの０．１Ｍ溶液の固体結合オリゴヌクレオチドへの延長カップリング、続いて標準的なキャッピング、酸化及び脱保護を用いて、修飾オリゴヌクレオチドを得た。全ての修飾ホスホロアミダイトの段階的なカップリング効率は、９８％超であった。オリゴヌクレオチド担持固体担体を、アンモニア／エタノール（３：１）水溶液を用いて５５℃で８時間加熱し、塩基不安定な保護基を脱保護した。
【０１１７】
ＧａｌＮＡｃコンジュゲートＡＳＯは、ヒドロキシプロリノール−ＧａｌＮＡｃ固体担体から合成した。ＧａｌＮＡｃを、６−アミノヘキサノエート結合を介してトランス−４−ヒドロキシプロリノールにつないでヒドロキシプロリノール−ＧａｌＮＡｃ部分を得て、その後、固体担体を得るために官能化させた制御細孔ガラス（ＣＰＧ）に付着させた。
【０１１８】
未コンジュゲート及びＧａｌＮＡｃ修飾オリゴヌクレオチドを、陰イオン交換ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液は、１０％ＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５（緩衝液Ａ）及び１０％ＣＨ３ＣＮ、１．８Ｍ  ＮａＢｒ中２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５（緩衝液Ｂ）とした。完全長のオリゴヌクレオチドを含有する画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥した。
【０１１９】
【化２４】
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【０１２０】
ＧａｌＮＡｃ合成
【０１２１】
【化２５】
2020533009.tif 000027
【０１２２】
オキサン−２，６−ジオン（１０００ｇ、８．７６ｍｏｌ、１．００当量）、４−ジメチルアミノピリジン（５３．５ｇ、４３７．９ｍｍｏｌ、０．０５当量）のジクロロメタン（１００００ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、室温で撹拌しながらフェニルメタノール（９００ｇ、８．３２モル、０．９５当量）を滴下して加えた。得られた溶液を一晩、室温で撹拌した。得られた混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。水層のｐＨ値を、１０％塩酸で１に調節した。得られた溶液を、３×２０００ｍＬの酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせた。得られた混合物を、２×３０００ｍＬの飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。これにより、１２４０ｇ（６４％）のＧ−１を無色油として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：２２３。
【０１２３】
【化２６】
2020533009.tif 000028
【０１２４】
Ｇ−１（５８．５ｇ、２６３．２３ｍｍｏｌ、１．２０当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３４ｇ、２６３．５７ｍｍｏｌ、１．２０当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６００ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（１００ｇ、２６３．６９ｍｍｏｌ、１．２０当量）を室温で加えた。得られた溶液を、室温で１時間撹拌した。続いて、（２Ｒ）−３−アミノプロパン−１，２−ジオール（２０ｇ、２１９．５２ｍｍｏｌ、１．００当量）を室温で加えた。得られた溶液を撹拌しながら、室温で一晩反応させた。得られた溶液を、２０００ｍＬの酢酸エチルで希釈した。得られた混合物を、２×１０００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。混合物を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラム適用した。これにより、３８．７ｇ（６０％）のＧ−２を明黄色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：２９６。
【０１２５】
【化２７】
2020533009.tif 000029
【０１２６】
Ｇ−２（１０ｇ、３３．８６ｍｍｏｌ、１．００当量）のピリジン（１００ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、１−［クロロ（４−メトキシフェニル）ベンジル］−４−メトキシベンゼン（１２．６３ｇ、３７．２８ｍｍｏｌ、１．１０当量）を室温で加えた。得られた溶液を一晩、室温で撹拌した。次いで、メタノール（１０ｍＬ）の添加によって反応を停止させた。得られた混合物を減圧下で濃縮した。得られた溶液を、１０００ｍＬの酢酸エチルで希釈した。得られた混合物を、２×５００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。混合物を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラム適用した。これにより、１０．２ｇ（５０％）のＧ−３を明黄色油として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋（ＥＳＩ）：６２０。
【０１２７】
【化２８】
2020533009.tif 000030
【０１２８】
Ｇ−３（１０ｇ、１６．７３ｍｍｏｌ、１．００当量）のメタノール（１００ｍＬ）溶液に、１０％パラジウム活性炭（１ｇ）を室温で加えた。フラスコを排気し、水素で５回フラッシュした。得られた溶液を、室温で４時間撹拌した。固形物を濾別した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。これにより、７．６ｇ（８９％）のＧ−４を白色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋（ＥＳＩ）：５３０。
【０１２９】
【化２９】
2020533009.tif 000031
【０１３０】
Ｇ−４（８．９０ｇ、１７．５３ｍｍｏｌ、１．０５当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３００ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６．４７ｇ、５０．１６ｍｍｏｌ、３．００当量）を室温で加えた。これに、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ−エトラメチル（etramethyl）−ウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（７．１０ｇ、１８．７３ｍｍｏｌ、１．１２当量）を室温で加えた。得られた溶液を１５分間、室温で撹拌した。この混合物に、Ｇ−５  Ｒｅｆ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１４，４２，（１３）８７９６−８８０７）、（３０ｇ、１６．７２ｍｍｏｌ、１．００当量）を室温で加えた。得られた溶液を撹拌しながら、室温で一晩反応させた。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、２０．１ｇ（５３％）のＧ−６を白色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：２２８３。
【０１３１】
【化３０】
2020533009.tif 000032
【０１３２】
Ｇ−６（２５ｇ、１０．９６ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（７５０ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、トリエチルアミン（４．９８ｇ、４９．２１ｍｍｏｌ、４．４９当量）を室温で加えた。これに、４−ジメチルアミノピリジン（１．３３ｇ、１０．８９ｍｍｏｌ、０．９９当量）を室温で加えた。この混合物に、オキソラン−２，５−ジオン（３．２９ｇ、３２．８８ｍｍｏｌ、３．００当量）を室温で加えた。得られた溶液を一晩、室温で撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、１５．８３ｇ（６１％）のＧ−７を白色固形物として、アンモニウム塩として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ／２＋ＮＨ４］＋（ＥＳＩ）：１２１０。
【０１３３】
【化３１】
2020533009.tif 000033
【０１３４】
ＨＢＴＵ／ＴＥＡを使用し、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．，１９８８  Ｓｅｐ；６（８）：７６８−７５に記載の手順に従ってＧ−７をＣＰＧにロードして、ＧａｌＮＡｃ−２−ＣＰＧ（５３μｍｏｌ／ｇ）を得た。
【０１３５】
【化３２】
2020533009.tif 000034
【０１３６】
Ｇ３−０（１２．８ｇ、２４．５７ｍｍｏｌ、１．００当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５００ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（９．０ｇ、６９．６４ｍｍｏｌ、３．００当量）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ−エトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（９．９ｇ、２７．０３ｍｍｏｌ、１．１０当量）を加えた。得られた溶液を、室温で２時間撹拌した。次いで、Ｇ３−１（４４ｇ、２４．５７ｍｍｏｌ、１．００当量）を加えた。得られた溶液を、室温で１６時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、２２ｇ（４１％）のＧ３−２を明黄色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−（ＥＳＩ）：２２９５．Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：７．７９−７．８３（ｍ，６Ｈ），７．７０−７．７３（ｍ，４Ｈ），７．３３−７．３５（ｍ，２Ｈ），７．２６−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．１９−７．２２（ｍ，５Ｈ），７．０１（ｓ，１Ｈ），６．８４−６．８７（ｍ，４Ｈ），５．１９−５．２０（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，３Ｈ），４．９３−４．９７（ｍ，３Ｈ），４．５８−４．５９（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４６−４．４８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．９５−４．０４（ｍ，９Ｈ），３．８２−３．８９（ｍ，３Ｈ），３．６７−３．７１（ｍ，９Ｈ），３．４５−３．６１（ｍ，１２Ｈ），３．３６−３．４１（ｍ，３Ｈ），２．９４−３．０９（ｍ，１６Ｈ），２．２４−２．２７（ｍ，６Ｈ），２．００−２．０８（ｍ，２９Ｈ），１．８７（ｓ，９Ｈ），１．７５（ｓ，９Ｈ），１．６３−１．６９（ｍ，３Ｈ），１．４１−１．５１（ｍ，１９Ｈ）。
【０１３７】
Ｇ３−２（２２ｇ、９．５８ｍｍｏｌ、１．００当量）、ＴＥＡ（４．４ｇ、４．５０当量）、４−ジメチルアミノピリジン（１．１５ｇ、１．００当量）のジクロロメタン（２２０ｍＬ）溶液に、オキソラン−２，５−ジオン（２．８７ｇ、２８．６８ｍｍｏｌ、３．００当量）を室温で加えた。得られた溶液を、室温で１８時間撹拌した。得られた混合物を、真空下で濃縮した。粗生成物をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、１５．０１ｇ（６５％）のＧ３−３を白色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−（ＥＳＩ）：２３９５．Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：７．９６−８．１６（ｍ，１０Ｈ），７．２８−７．３６（ｍ，４Ｈ），７．２１−７．２３（ｍ，６Ｈ），６．８６−６．８９（ｍ，４Ｈ），５．２１−５．２２（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，３Ｈ），４．９７−５．０３（ｍ，４Ｈ），４．５１−４．５３（ｄ，Ｊ＝８Ｈｚ，３Ｈ），４．０３（ｍ，９Ｈ），３．８５−３．９２（ｍ，３Ｈ），３．６９−３．７４（ｍ，９Ｈ），３．５２−３．５９（ｍ，１２Ｈ），３．３８−３．４４（ｍ，４Ｈ），２．９５−３．０４（ｍ，１５Ｈ），２．２３−２．２９（ｍ，１０Ｈ），２．１０（ｓ，９Ｈ），２．０４−２．０７（ｍ，９Ｈ），２．００（ｓ，９Ｈ），１．８９（ｓ，９Ｈ），１．７８（ｓ，１０Ｈ），１．６３−１．６８（ｍ，３Ｈ），１．４５−１．５４（ｍ，１８Ｈ）。
【０１３８】
【化３３】
2020533009.tif 000035
【０１３９】
Ｇ４−０（１０．１３ｇ、１７．５３ｍｍｏｌ、１．０５当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３００ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６．４７ｇ、５０．０６ｍｍｏｌ、２．９９当量）を室温で加えた。これに、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ−エトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（７．１０ｇ、１８．７２ｍｍｏｌ、１．１２当量）を室温で加えた。得られた溶液を１５分間、室温で撹拌した。この混合物に、Ｇ４−１（３０ｇ、１６．７２ｍｍｏｌ、１．００当量）を室温で加えた。得られた溶液を撹拌しながら、室温で一晩反応させた。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物（３０ｇ）をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、２２．３ｇ（５７％）のＧ４−２を白色固形物として得た。
【０１４０】
Ｇ４−２（１５ｇ、６．３８ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（４５０ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、トリエチルアミン（２．９０ｇ、２８．６６ｍｍｏｌ、４．４９当量）を室温で加えた。これに、４−ジメチルアミノピリジン（７７７ｍｇ、６．３６ｍｍｏｌ、１．００当量）を室温で加えた。この混合物に、オキソラン−２，５−ジオン（１．９１ｇ、１９．０９ｍｍｏｌ、２．９９当量）を室温で加えた。得られた溶液を一晩、室温で撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物（１５ｇ）をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、１０．８０４７ｇ（６９％）のＧ４−３を明黄色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：２４５３。１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００Ｈｚ，ｐｐｍ）：８．１０−７．９２（ｍ，１０Ｈ），７．３５−７．３０（ｍ，４Ｈ），７．２４−７．２２（ｍ，５Ｈ），７．１０−７．０１（ｍ，１Ｈ），６．８９−６．８７（ｍ，４Ｈ），５．２２−５．２１（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，３Ｈ），４．００−４．９７（ｍ，４Ｈ），．４．５３−４．５１（ｍ，３Ｈ），４．０４−３．９０（ｍ，９Ｈ），３．８７−３．３．８０（ｍ，３Ｈ），３．７４−３．７０（ｍ，１０Ｈ），３．６９−３．３９（ｍ，１６Ｈ），３．０５−３．０２（ｍ，１６Ｈ），２．５１−２．５０（ｍ，２Ｈ），２．３０−２．２７（ｍ，８Ｈ），２．１１−１．９９（ｍ，２９Ｈ），１．８９（ｓ，９Ｈ），１．７７（ｓ，９Ｈ），１．５２−１．３２（ｍ，２２Ｈ），１．２０（ｓ，９Ｈ）。
【０１４１】
【化３４】
2020533009.tif 000036
【０１４２】
Ｇ５−０（１０ｇ、１６．９０ｍｍｏｌ、１．０６当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３００ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（６．１８ｇ、４７．９６ｍｍｏｌ、３．０当量）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ−エトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（６．８４ｇ、１８．０４ｍｍｏｌ、１．１３当量）を加えた。得られた溶液を室温で５分間攪拌した。次いで、Ｇ５−１（２８．６８ｇ、１５．９９ｍｍｏｌ、１．００当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（３００ｍＬ）溶液を加えた。得られた溶液を撹拌しながら、室温で一晩反応させた。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物（２０ｇ）をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、２０．４４ｇ（５４％）のＧ５−２を白色固形物として得た。
【０１４３】
Ｇ５−２（１２．５ｇ、５．２８ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（３７５ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、４−ジメチルアミノピリジン（６５０ｍｇ、５．３２ｍｍｏｌ、１．０１当量）、トリエチルアミン（２．４ｇ、２３．７６ｍｍｏｌ、４．５０当量）、及びオキソラン−２，５−ジオン（１．５９ｇ、１５．８９ｍｍｏｌ、３．０１当量）を順に加えた。得られた溶液を一晩、室温で撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物（１５ｇ）をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、９．０ｇ（７３％）のＧ５−３を白色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−（ＥＳＩ）：２４６５．１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００Ｈｚ）：８．１０−７．９０（ｍ，１０Ｈ），７．３６−７．２０（ｍ，９Ｈ），７．１０（ｓ，１Ｈ），６．８８−６．８５（ｍ，４Ｈ），５．２２−５．２０（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，３Ｈ），４．９９−４．９５（ｍ，４Ｈ），４．５２−４．４９（ｍ，３Ｈ），４．０２−３．８９（ｓ，９Ｈ），３．８５−３．７３（ｍ，３Ｈ），３．７０−６８（ｍ，９Ｈ），３．６５−３．５２（ｍ，１２Ｈ），３．５２−３．３８（ｍ，６Ｈ），３．０２−２．９４（ｍ，１５Ｈ），２．３０−２．２５（ｍ，１０Ｈ），２．０９−１．９９（Ｍ，２９Ｈ），１．８８−（ｓ，９Ｈ），１．７７（ｓ，１１Ｈ），１．５２−１．４５（ｍ，２２Ｈ），１．２３−１．１９（ｍ，９Ｈ）。
【０１４４】
【化３５】
2020533009.tif 000037
【０１４５】
【化３６】
2020533009.tif 000038
【０１４６】
デカン二酸（１００ｇ、４９４．４ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（２０００ｍＬ）溶液に、４−ジメチルアミノピリジン（１８．１ｇ、１４８．２ｍｍｏｌ、０．３０当量）を室温で加えた。これに、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（１１４ｇ、５９４．７ｍｍｏｌ、１．２０当量）を室温で加えた。得られた溶液を、室温で１時間撹拌した。混合物に、ベンジルアルコール（６４．１ｇ）を、０℃で撹拌しながら滴下した。得られた溶液を撹拌しながら、室温で一晩反応させた。得られた混合物を、塩化ナトリウム飽和水で洗浄した。混合物を、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、減圧下で濃縮した。粗生成物（１００ｇ）をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、６０．７ｇ（４２％）のＧ−８を白色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：２９３。
【０１４７】
【化３７】
2020533009.tif 000039
【０１４８】
Ｇ−８（４．４８ｇ、１５．３２ｍｍｏｌ、１．５０当量）のアセトニトリル（３２０ｍＬ）溶液に、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ−エトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（５．８４ｇ、１５．４０ｍｍｏｌ、１．５０当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．９６ｇ、３０．６４ｍｍｏｌ、３．００当量）を加えた。得られた溶液を、２５℃で１時間攪拌した。これに続き、Ｇ−９（１８．４ｇ、１０．２６ｍｍｏｌ、１．００当量）を加えた。得られた溶液を２５℃で１６時間撹拌し、次いで真空下で濃縮した。粗生成物をフラッシュにより精製した。これにより、１２ｇ（５７％）のＧ−１０を白色固形物として得た。Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ，ｐｐｍ）：７．７４−７．８３（ｍ，９Ｈ）、７．３１−７．３７（ｍ，５Ｈ）、６．９７（ｓ，１Ｈ）、５．２１（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，３Ｈ）、５．０７（ｓ，２Ｈ）、４．９８（ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，３．４Ｈｚ，３Ｈ）、４．４９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，３Ｈ）、４．０４（ｓ，９Ｈ）、３．８３−３．９９（ｍ，３Ｈ）、３．６７−３．７２（ｍ，３Ｈ）、３．５２−３．５５（ｍ，１２Ｈ）、３．３７−３．４３（ｍ，３Ｈ）、２．９９−３．０５（ｍ，１２Ｈ）、２．２５−２．３５（ｍ，８Ｈ）、２．１２（ｓ，９Ｈ）、１．９９−２．１１（ｍ，１７Ｈ）、１．９２（ｓ，９Ｈ）、１．７７（ｓ，９Ｈ）、１．４０−１．５３（ｍ，２２Ｈ）、１．１９−１．２５（ｍ，８Ｈ）。
【０１４９】
【化３８】
2020533009.tif 000040
【０１５０】
Ｇ−１０（５ｇ、２．４５ｍｍｏｌ、１．００当量）のメタノール／酢酸エチル（１００ｍＬ、ｖ／ｖ＝１：１）溶液に、１０％パラジウム炭素（１．５ｇ、１０％）を加えた。フラスコを排気し、水素で５回フラッシュした。混合物を、室温にて水素雰囲気下で２時間撹拌した。固形物を濾別した。得られた混合物を、真空下で濃縮した。これにより、４ｇ（８２％）のＧ−１１を白色固形物として得た。
【０１５１】
【化３９】
2020533009.tif 000041
【０１５２】
Ｇ−１１（６．３ｇ、３．１８ｍｍｏｌ、１．００当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（６３ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．０ｇ、７．９５ｍｍｏｌ、２．５０当量）を加えた。この後、０℃で撹拌しながら、ペンタフルオロフェニル２，２，２−トリフルオロアセテート（１．３３ｇ、４．７７ｍｍｏｌ、１．５０当量）を滴下した。得られた溶液を、２５℃で３時間攪拌した。得られた混合物を、真空下で濃縮した。粗生成物を、以下の条件でフラッシュにより精製した：Ｃ１８ゲルカラム、溶離液Ａ水、溶離液Ｂアセトニトリル；勾配：１５分間以内に２０％から８０％まで、３分間１００％で維持、検出器、ＵＶ２１０ｎｍ。これにより、５ｇ（７３％）のＧａｌＮＡｃ−６を白色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ／２＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：１０７３；Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ、３００ＭＨｚ，ｐｐｍ）：７．７１−７．８０（ｍ，９Ｈ）、６．９８（ｓ，１Ｈ）、５．２２（ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ，３Ｈ）、４．９９（ｄｄ，Ｊ＝１１．１Ｈｚ，３．３Ｈｚ，３Ｈ）、４．５０（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，３Ｈ）、４．０２（ｓ，９Ｈ）、３．８２−３．９２（ｍ，３Ｈ）、３．６９−３．７４（ｍ，３Ｈ）、３．５２−３．５６（ｍ，１２Ｈ）、３．３９−３．４４（ｍ，３Ｈ）、３．０３（ｓ，１２Ｈ）、２．７５−２．７９（ｍ，２Ｈ）、２．２８（ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ，６Ｈ）、２．００−２．１０（ｍ，２６Ｈ）、１．８９（ｓ，９Ｈ）、１．７７（ｓ，９Ｈ）、１．６４−１．６８（ｍ，２Ｈ）、１．２５−１．５３（ｍ，２８Ｈ）；Ｆ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，１６２ＭＨｚ，ｐｐｍ）：−１５３．６０、−１５３．６７、−１５３．６８、−１５３．６９、−１５８．０５、−１５８．１４、−１５８．２２、−１６２．５３、−１６２．６０、−１６２．６２、−１６２．６９、−１６２．７０。
【０１５３】
【化４０】
2020533009.tif 000042
【０１５４】
窒素の不活性雰囲気でパージ及び維持された５０００ｍＬの四つ口丸底フラスコに、オキサン−２，６−ジオン（２５０ｇ、２．１９ｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（２．５Ｌ）溶液、４−ジメチルアミノピリジン（１１．１ｇ、９０．９１ｍｍｏｌ、０．０５当量）を入れた。この後、フェニルメタノール（２２５ｇ、２．０８ｍｏｌ、０．９５当量）を、撹拌しながら滴下した。得られた溶液を、２５℃で１６時間撹拌した。得られた溶液を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で抽出し、水層を合わせた。溶液のｐＨ値を、塩化水素（１ｍｏｌ／Ｌ）で１に調整した。得られた溶液を、酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。これにより、２３０ｇ（４７％）のＧ７−１を得た。
【０１５５】
窒素の不活性雰囲気でパージ及び維持された５Ｌの三つ口丸底フラスコに、Ｇ７−１（１００ｇ、４４９．９７ｍｍｏｌ、１．００当量）のテトラヒドロフラン（２．０Ｌ）溶液を入れた。この後、（ジメチル−３−スルファニル）ボラヌイド（４１ｇ、５３９．６９ｍｍｏｌ、１．２０当量）を、撹拌しながら滴下した。得られた溶液を、２５℃で３時間撹拌した。次いで、２００ｍＬのメタノールを添加することにより反応を停止し、真空下で濃縮した。粗生成物をヘキサンから再結晶化することにより精製した。これにより、５８ｇ（６２％）のＧ７−２を得た。
【０１５６】
窒素の不活性雰囲気でパージ及び維持された１００００ｍＬの四つ口丸底フラスコに、（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−３−アミノ−６−（ヒドロキシメチル）オキサン−２，４，５−トリオールヒドロクロリド（３５０ｇ、１．６２ｍｏｌ、１．００当量）のピリジン（３５００ｍＬ）溶液を入れた。この後、２５℃で無水酢酸（１２４６ｇ、１２．２ｍｏｌ、７．５２当量）を滴下した。得られた溶液を、２５℃で１６時間撹拌した。得られた混合物を、真空下で濃縮した。粗生成物を水／氷から再結晶化することにより精製した。固形物を濾過により回収した。これにより、５０７ｇ（８０％）のＧ７−３を得た。
【０１５７】
窒素の不活性雰囲気でパージ及び維持された５０Ｌの三つ口丸底フラスコに、Ｇ７−３（２２０ｇ、５６５ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（２２Ｌ）溶液を入れた。この後、塩化第二鉄（２７５ｇ）を２５℃で少しずつ添加した。得られた溶液を、２５℃で２時間撹拌した。次いで、１７Ｌの水／氷を添加することにより反応を停止した。得られた溶液を、水及び飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄した。混合物を無水硫酸ナトリウム上で乾燥させ、真空下で濾過及び濃縮した。これにより、１２１ｇ（６５％）のＧ７−４を得た。
【０１５８】
窒素の不活性雰囲気でパージ及び維持された２０００ｍＬの丸底フラスコに、Ｇ７−４（１１１ｇ、３３７．１ｍｍｏｌ、１．００当量）及びベンジル５−ヒドロキシペンタノエート（７０．２ｇ、４３８．２ｍｍｏｌ、１．３当量）の１，２−ジクロロエタン（１１００ｍＬ）溶液、及び２２ｇの分子ふるいタイプ４Ａを入れた。得られた溶液を、２５℃で３０分間攪拌した。この後、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（２２．４８ｇ、１０１．１２ｍｍｏｌ、０．３当量）を１０分間で撹拌しながら滴下した。得られた溶液を、２５℃で１５時間撹拌した。得られた溶液をジクロロメタンで希釈し、水、飽和重炭酸ナトリウム水溶液、及び飽和塩化ナトリウム水溶液でそれぞれ洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。残渣を、フラッシュにより精製した。これにより、１１０ｇ（５７％）のＧ７−５を得た。
【０１５９】
５０００ｍＬの丸底フラスコに、Ｇ７−５（３３０ｇ、６１４ｍｍｏｌ、１．００当量）の酢酸エチル（３３００ｍＬ）溶液、１０％無水パラジウム炭素（１００ｇ）（３０％ｗ／ｗ）を入れた。フラスコを排気し、水素で５回フラッシュした。混合物を、水素雰囲気下において室温で３時間撹拌した。固形物を濾過して取り除き、濾液を真空下にて濃縮した。これにより、１８４ｇ（６７％）のＧ７−６を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：４４８；Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤ３Ｃｌ，３００Ｈｚ，ｐｐｍ）：δ  ５．９９（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，１Ｈ），５．３６（ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ，１Ｈ），５．２９（ｄｄ，Ｊ＝１０．６，３．０Ｈｚ，１Ｈ），４．６９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），３．９１−４．２１（ｍ，５Ｈ），３．５１−３．５６（ｍ，１Ｈ），２．３１−２．５２（ｍ，２Ｈ），１．９１−２．２１（ｍ，１２Ｈ），１．７１（ｓ，４Ｈ）。
【０１６０】
窒素の不活性雰囲気でパージ及び維持された１００ｍＬの三つ口丸底フラスコに、Ｇ７−６（５ｇ、１１．１７ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液、ジクロロメタン（５０ｍＬ）、ＤＩＥＡ（２．１７ｇ、１６．７９ｍｍｏｌ、１．５０当量）を入れた。この後、０℃で撹拌しながら、ペンタフルオロフェニル２，２，２−トリフルオロアセテート（４．６９ｇ、１６．７５ｍｍｏｌ、１．５０当量）を滴下した。得られた溶液を、２５℃で３時間撹拌した。得られた混合物を、真空下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラム適用した。これにより、４ｇ（５８％）のＧ７−８を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：６１４；Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００Ｈｚ，ｐｐｍ）：δ  ７．８５（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），５．２３（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．９９（ｄｄ，Ｊ＝１１．２，３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．５２（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０４（ｓ，３Ｈ），３．８７−３．９４（ｍ，１Ｈ），３．７４．３．７９（ｍ，１Ｈ），３．４５−３．５１（ｍ，１Ｈ），２．７８−２．８１（ｍ，２Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．０６（ｓ，３Ｈ），１．９０（ｓ，３Ｈ），１．８４（ｓ，３Ｈ），１．６６−１．７７（ｍ，４Ｈ）；Ｆ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００Ｈｚ，ｐｐｍ）：δ−１５３．６１，−１５３．６６，−１５８．０４，−１５８．１６，−１６２．５８，−１６２．６４，−１６２．７１。
【０１６１】
【化４１】
2020533009.tif 000043
【０１６２】
デカン−１，１０−ジオール（１２５ｇ、７１７．２３ｍｍｏｌ、５．００当量）のジクロロメタン／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（２５０ｍＬ／２５０ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（２１．８ｇ、２１５．４４ｍｍｏｌ、１．５０当量）を加えた。この後、４−トルオルスルホニルクロリド（２７．３ｇ、１４３．１９ｍｍｏｌ、１．００当量）を２５℃で加えた。得られた溶液を、２５℃で１６時間撹拌した。得られた混合物を真空下で濃縮し、５００ｍＬのジクロロメタンで希釈した。固形物を濾別した。得られた溶液を、３×５００ｍＬの水及び３×５００ｍＬの飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラム適用した。これにより、４１ｇ（８７％）のＧ９−１を無色油状物として得た。
【０１６３】
Ｇ９−１（３２．８ｇ、９９．８６ｍｍｏｌ、１．００当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１５０ｍＬ）溶液に、アジ化ナトリウム（１３．０ｇ、１９９．９７ｍｍｏｌ、２．００当量）を加えた。得られた溶液を、油浴中９０℃で３時間撹拌した。固形物を濾別した。得られた溶液を５００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、３×５００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム及び３×５００ｍＬの飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラム適用した。これにより、１８ｇ（８３％）のＧ９−２を黄色油状物として得た。
【０１６４】
Ｇ９−２（１０ｇ、５０．１８ｍｍｏｌ、１．００当量）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）溶液に、トリフェニルホスフィン（１４．４ｇ、５４．９０ｍｍｏｌ、１．１０当量）を加えた。得られた溶液を、２５℃で１６時間撹拌した。得られた混合物を、真空下で濃縮した。得られた溶液を５０ｍＬの水で希釈し、３×５０ｍＬのトルエンで洗浄した。水性層を真空下で濃縮し、シリカゲルカラムに適用した。これにより、８ｇ（８６％）のＧ９−３を明黄色固形物として得た。
【０１６５】
Ｇ９−３（９．９ｇ、２２．１３ｍｍｏｌ、１．００当量）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）溶液、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３ｇ、２２．２０ｍｍｏｌ、１．００当量）に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（５．６ｇ、４４．３７ｍｍｏｌ、２．００当量）を加えた。この後、０℃で撹拌しながら１０−アミノデカン−１−オール（５ｇ、２８．８５ｍｍｏｌ、１．３０当量）を加えた。得られた溶液を、２５℃で１６時間撹拌した。得られた混合物を、真空下で濃縮した。粗生成物をフラッシュにより精製した。これにより、９．３ｇ（６９％）のＧ９−４を白色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：６０３，１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００Ｈｚ，ｐｐｍ）：δ  ７．８１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６９（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２２（ｓ，１Ｈ），４．９８（ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．３３（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．０２（ｓ，３Ｈ），３．８６−３．８８（ｍ，１Ｈ），３．６９−３．７２（ｍ，１Ｈ），３．３４−３．４１（ｍ，３Ｈ），２．９７−３．０２（ｍ，２Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．００−２．０４（ｍ，５Ｈ），１．８９（ｓ，３Ｈ），１．７７（ｓ，３Ｈ），１．３６−１．５０（ｍ，８Ｈ），１．２４（ｓ，１２Ｈ）。
【０１６６】
Ｇ９−４（３ｇ、４．９８ｍｍｏｌ、１．００当量）のアセトン（３０ｍＬ）溶液に、０℃で撹拌しながら、Ｊｏｎｅｓ試薬（３．６ｍＬ、１．８７当量）を滴下した。得られた溶液を、０℃で２時間撹拌した。溶液のｐＨ値を、飽和重炭酸ナトリウム水溶液で６に調整した。固形物を濾過し、濾液を３×５００ｍＬの飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。粗生成物をフラッシュにより精製した。これにより、２ｇ（６５％）のＧ９−５を白色固形物として得た。
【０１６７】
Ｇ９−５（４ｇ、６．４９ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（４０ｍＬ）溶液、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（２．１ｇ、１６．２５ｍｍｏｌ、２．００当量）に、ペンタフルオロフェニル２，２，２−トリフルオロアセテート（２．７３ｇ、９．７５ｍｍｏｌ、１．５０当量）を０℃で撹拌しながら滴下した。得られた溶液を、２５℃で３時間撹拌した。得られた混合物を、真空下で濃縮した。粗生成物をフラッシュにより精製した。これにより、３ｇ（５９％）のＧ９−６を白色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：７８３．１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００Ｈｚ，ｐｐｍ）δ  ７．８１（ｄ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，１Ｈ），７．６８（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，１Ｈ），５．２１（ｓ，１Ｈ），４．９８（ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，３．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４９（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，１Ｈ），４．０２（ｓ，３Ｈ），３．８３−３．９０（ｍ，１Ｈ），３．６７−３．７３（ｍ，１Ｈ），３．３７−３．４３（ｍ，１Ｈ），２．９７−３．０２（ｍ，２Ｈ），２．７５−２．７９（ｍ，２Ｈ），２．１０（ｓ，３Ｈ），１．９９−２．０４（ｍ，５Ｈ），１．８９（ｓ，３Ｈ），１．７７（ｓ，３Ｈ），１．６２−１．６９（ｍ，２Ｈ），１．２５−１．５０（ｍ，１６Ｈ）；Ｆ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００Ｈｚ，ｐｐｍ）：δ−１５３．６５，−１５３．６６，−１５３．７１，−１５８．０９，−１５８．１５，−１５８．２１，−１６２．５８，−１６２．６３，−１６２．６４，−１６２．７０，−１６２．７１。
【０１６８】
【化４２】
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【０１６９】
２−［２−［２−（２−ヒドロキシエトキシ）エトキシ］エトキシ］エタン−１−オール（１９４ｇ、９９８．８４ｍｍｏｌ、１０．００当量）のジクロロメタン（１２０ｍＬ）溶液に、トリエチルアミン（１５．１５ｇ、１４９．７２ｍｍｏｌ、１．５０当量）を加えた。この後、４−トルオルスルホニルクロリド（１９．１ｇ、１００．１８ｍｍｏｌ、１．００当量）を２５℃で添加した。得られた溶液を、１６℃で一晩攪拌した。得られた溶液を、１００ｍＬの水で希釈した。得られた溶液を、３×２００ｍＬのジクロロメタンで抽出し、有機層を合わせた。得られた混合物を、３×１００ｍＬの５％クエン酸水溶液で洗浄した。有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラム適用した。これにより、３５ｇ（９３％）のＧ１０−１を白色固形物として得た。
【０１７０】
Ｇ１０−１（３４．８ｇ、９９．８８ｍｍｏｌ、１．００当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（１８０ｍＬ）溶液に、アジ化ナトリウム（１３．０ｇ、１９９．９７ｍｍｏｌ、２．００当量）を加えた。得られた溶液を、油浴中９０℃で３時間撹拌した。固形物を濾別した。得られた溶液を５００ｍＬの酢酸エチルで希釈し、３×５００ｍＬの飽和重炭酸ナトリウム及び３×５００ｍＬの飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラム適用した。これにより、１７ｇ（７１％）のＧ１０−２を明黄色油状物として得た。
【０１７１】
Ｇ１０−２（２．２ｇ、１０．０３ｍｍｏｌ、１．００当量）のテトラヒドロフラン（２０ｍＬ）溶液に、トリフェニルホスフィン（２．８８ｇ、１０．９８ｍｍｏｌ、１．１０当量）を加えた。得られた溶液を、２５℃で１２時間撹拌した。得られた溶液を５０ｍＬの水で希釈し、３×５０ｍＬのトルエンで洗浄した。水性層を真空下で濃縮した。これにより、１．７ｇ（８１％）のＧ１０−３を明黄色油状物として得た。
【０１７２】
Ｇ１０−３（１０ｇ、２２．３５ｍｍｏｌ、１．００当量）のテトラヒドロフラン（１００ｍＬ）溶液に、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３ｇ、２２．２０ｍｍｏｌ、１．００当量）、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルカルボジイミド（５．６２ｇ、４４．５３ｍｍｏｌ、２．００当量）を加えた。この後、０℃で撹拌しながら、２−［２−［２−（２−アミノエトキシ）エトキシ］エトキシ］エタン−１−オール（５．６ｇ、２８．９８ｍｍｏｌ、１．３０当量）を加えた。得られた溶液を、２５℃で１６時間撹拌した。得られた混合物を、真空下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラム適用した。粗生成物をフラッシュにより精製した。これにより、８ｇ（５８％）のＧ１０−４を明黄色油状物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：６２３．，１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００Ｈｚ，ｐｐｍ）：δ  ７．８２（ｄ，Ｊ＝４．４Ｈｚ，２Ｈ），５．２２（ｓ，１Ｈ），４．９８（ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，３．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５８（ｔ，Ｊ＝５．２Ｈｚ，１Ｈ），４．４９（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ），４．０１（ｓ，３Ｈ），３．８３−３．９１（ｍ，１Ｈ），３．６７−３．７３（ｍ，１Ｈ），３．４８−３．５１（ｍ，１０Ｈ），３．３７−３．４２（ｍ，５Ｈ），３．１９−３．２０（ｍ，２Ｈ），２．１１（ｓ，３Ｈ），２．０８−２．１０（ｍ，２Ｈ），２．０８（ｓ，３Ｈ），１．８９（ｓ，３Ｈ），１．７７（ｓ，３Ｈ），１．４０−１．６０（ｍ，４Ｈ）。
【０１７３】
Ｇ１０−４（６ｇ、９．６４ｍｍｏｌ、１．００当量）のアセトン（６０ｍＬ）溶液に、０℃で撹拌しながら、Ｊｏｎｅｓ試薬（６．７ｍＬ）を滴下した。得られた溶液を、０℃で３時間撹拌した。溶液のｐＨ値を、重炭酸ナトリウムの飽和水溶液で５に調整した。固形物を濾過し、濾液を３×５００ｍＬの飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、真空下で濃縮した。粗生成物をフラッシュにより精製した。これにより、３ｇ（４９％）のＧ１０−５を固形物として得た。
【０１７４】
Ｇ１０−５（１ｇ、１．５７ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（１０ｍＬ）溶液に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロリド（３６０ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ、１．２０当量）、２，３，５，６−テトラフルオロフェノール（３１０ｍｇ、１．８７ｍｍｏｌ、１．２０当量）。得られた溶液を、２５℃で３時間撹拌した。得られた混合物を、真空下で濃縮した。粗生成物をフラッシュにより精製した。得られた溶液をクロロホルムで抽出し、有機層を合わせた。有機層を、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。これにより、０．５ｇ（４１％）が得られ、他のバッチの生成物を合わせて、５．０４２２ｇのＧ１０−６を明黄色油状物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：７８５．，１Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，４００Ｈｚ，ｐｐｍ）：δ  ７．３０−７．４０（ｍ，１Ｈ），６．４８−６．６０（ｍ，２Ｈ），５．３０（ｓ，１Ｈ），５．０４（ｄｄ，Ｊ＝１１．２Ｈｚ，３．６Ｈｚ，１Ｈ），４．５２−４．５９（ｍ，３Ｈ），４．０８−４．１３（ｍ，２Ｈ），３．９５−３．９９（ｍ，２Ｈ），３．７６−３．７８（ｍ，３Ｈ），３．６０−３．６７（ｍ，６Ｈ），３．４８−３．５９（ｍ，３Ｈ），３．３０−３．４８（ｍ，２Ｈ），２．１４−２．１６（ｍ，５Ｈ），２．１２（ｓ，３Ｈ），１．９３（ｓ，３Ｈ），１．８８（ｓ，３Ｈ），１．５０−１．６０（ｍ，４Ｈ）．Ｆ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＣＮ，４００Ｈｚ，ｐｐｍ）：δ−１４０．７６，−１４０．７９，−１４０．８２，−１４０．８４，−１５４．５２，−１５４．５４，−１５４．５７，−１５４．６０。
【０１７５】
【化４３】
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【０１７６】
【化４４】
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【０１７７】
オキサン−２，６−ジオン（１０００ｇ、８．７６ｍｏｌ、１．００当量）、４−ジメチルアミノピリジン（５３．５ｇ、４３７．９ｍｍｏｌ、０．０５当量）のジクロロメタン（１００００ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、室温で撹拌しながらフェニルメタノール（９００ｇ、８．３２ｍｏｌ、０．９５当量）を滴下した。得られた溶液を一晩、室温で撹拌した。得られた混合物を飽和重炭酸ナトリウム溶液で洗浄した。水層のｐＨ値を、１０％塩酸で１に調節した。得られた溶液を酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせた。得られた混合物を、飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。これにより、１２４０ｇ（６４％）のＧ１１−１を無色油状物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：２２３。
【０１７８】
Ｇ１１−１（５００ｇ、２．２４ｍｏｌ、１．００当量）のテトラヒドロフラン（４０００ｍＬ）溶液に、０℃で撹拌しながら、ホウ素−メチルスルフィド錯体（２７０ｍＬ、１．２０当量）を滴下した。得られた溶液を、室温で２時間撹拌した。次いで、２００ｍＬのメタノールを添加することにより反応を停止した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラム適用した。これにより、３１２ｇ（６７％）のＧ１１−２を黄色油状物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：２０９。
【０１７９】
（３Ｒ，４Ｒ，５Ｒ，６Ｒ）−２，４，５−トリヒドロキシ−６−（ヒドロキシメチル）オキサン−３−アミニウムクロリド（１０００ｇ、４．６３ｍｏｌ、１．００当量）のピリジン（１００００ｍＬ）溶液に、無水酢酸（３５６０ｇ、３４．９ｍｏｌ、７．５０当量）を室温で加えた。得られた溶液を一晩、室温で撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物を氷／水から再結晶化することにより精製した。これにより、１４５０ｇ（８０％）のＧ１１−３を白色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：３９０。
【０１８０】
Ｇ１１−３（１００ｇ、２５６．８４ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（１０Ｌ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、塩化鉄（ＩＩＩ）（１２５ｇ、７７１．６０ｍｍｏｌ、３．００当量）を室温で加えた。得られた溶液を、室温で３時間撹拌した。得られた混合物を、水及び飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。これにより、５２ｇ（６１％）のＧ１１−４を茶色油状物として得た。その生成物を更に精製することなく、次工程で直接用いた。
【０１８１】
Ｇ１１−４（５２ｇ、１５７．９１ｍｍｏｌ、１．００当量）、ベンジル５−ヒドロキシペンタノエート（４２．７ｇ、２０５．０４ｍｍｏｌ、１．３０当量）の１，２−ジクロロエタン（５００ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、０℃で撹拌しながらトリメチルシリルトリフルオロメタンスルホネート（１０．５ｇ、４７．２４ｍｍｏｌ、０．３０当量）を滴下した。得られた溶液を、室温で１時間撹拌した。氷／水を添加することにより反応を停止した。得られた溶液を、ジクロロメタンで抽出し、有機層を合わせた。得られた混合物を、水及び飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラム適用した。粗生成物をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、４６．４ｇ（５５％）のＧ１１−５を明黄色油状物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：５３８。
【０１８２】
Ｇ１１−５（１０ｇ、１８．６０ｍｍｏｌ、１．００当量）の酢酸エチル（１００ｍＬ）溶液に、１０％パラジウム活性炭（１ｇ）を加えた。フラスコを排気し、水素で５回フラッシュした。得られた溶液を、室温で３時間撹拌した。固形物を濾過し、メタノールで洗浄し、高真空下で一晩乾燥させた。これにより、６．８２ｇ（８２％）のＧ１１−６を白色固形物として得た。
【０１８３】
２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール（３００ｇ、２．４８ｍｏｌ、１．００当量）のＤＭＳＯ（５００ｍＬ）溶液に、１５℃の窒素の不活性雰囲気下で、５．０Ｍ水酸化ナトリウム（４９．５ｍＬ、０．２４８ｍｏｌ、０．１当量）を加えた。この後、ｔｅｒｔ−ブチルアクリレート（１０７９ｇ、８．４ｍｏｌ、３．４当量）を、撹拌しながら滴下した。得られた溶液を、２５℃で２４時間撹拌した。得られた溶液を、４×３０００ｍＬの酢酸エチルで抽出し、有機層を合わせた。得られた混合物を、水及び飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラム適用した。これにより、５２６ｇ（４２％）のＧ１１−７を明黄色油状物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：５０６．６。
【０１８４】
Ｇ１１−７（５０ｇ、９９．０ｍｍｏｌ、１．００当量）のＣＨ２Ｃｌ２（７５０ｍＬ）溶液に、３６５ｍＬの２５％Ｎａ２ＣＯ３水溶液を撹拌しながら加えた。この後、ベンジルクロロホルメート（５０．５ｇ、０．２９７ｍｍｏｌ、３．００当量）を、室温で撹拌しながら滴下した。得られた溶液を一晩、室温で撹拌した。得られた溶液を、ジクロロメタンで抽出し、有機層を合わせた。有機層を飽和塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラム適用した。これにより、４２．４ｇ（６７％）のＧ１１−８を明黄色油状物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：６４０．４。
【０１８５】
Ｇ１１−８（３００ｇ、４６８．９ｍｍｏｌ、１．００当量）の溶液に、ギ酸（３Ｌ、９６％）を添加した。得られた溶液を、２５℃で１６時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮した。溶液のｐＨ値を、水酸化ナトリウム（１ｍｏｌ／Ｌ）で１２に調整した。得られた溶液を、３×６Ｌのエーテルで抽出し、水層を合わせた。塩化水素（２ｍｏｌ／Ｌ）を用いて、水層のｐＨを４に調整した。得られた溶液を、４酢酸エチルで抽出した。有機層を合わせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。これにより、１９８．９６ｇ（９０％）のＧ１１−９を黄色油状物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：４７２。
【０１８６】
Ｇ１１−９（２６４ｇ、５６０．５１ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン／アセトニトリル（１４００ｍＬ／１４００ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（５７８．４ｇ、４．４８４ｍｏｌ、８当量）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ−エトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（８４８ｇ、２．２３１ｍｏｌ、４．００当量）を順に加えた。得られた溶液を、２５℃で３０分間撹拌した。この後、ｔｅｒｔ−ブチルＮ−（３−アミノプロピル）カルバメート（３９０ｇ、２．２３８ｍｍｏｌ、４．００当量）を２５℃で加えた。得られた溶液を、２５℃で６時間撹拌した。得られた溶液を減圧下で濃縮した。残渣を、３０００ｍＬのジクロロメタンで希釈した。有機層を飽和重炭酸ナトリウム溶液、飽和塩化アンモニウム、及び飽和塩化ナトリウムでそれぞれ洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。残渣を、シリカゲルカラム適用した。これにより、３３６ｇ（７０％）のＧ１１−１０を白色泡状物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：９４１。
【０１８７】
Ｇ１１−１０（３５０ｇ、３７２．３ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（１．４Ｌ）溶液に、トリフルオロ酢酸（３５０ｍＬ）を加えた。得られた溶液を、２５℃で４時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。これにより、４７０ｇ（粗）のＧ１１−１１を赤色油状物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：６４１。
【０１８８】
Ｇ１１−６（６６ｇ、１４７．５１ｍｍｏｌ、３．５０当量）及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３７ｇ、２８６．２９ｍｍｏｌ、６．７８当量）のジクロロメタン／アセトニトリル（２００ｍＬ／２００ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（２４．５ｇ、１８１．４８ｍｍｏｌ、４．３０当量）及びＯ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ−エトラメチル（etramethyl）−ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（５６ｇ、１４７．６６ｍｍｏｌ、３．５０当量）を室温で加えた。得られた溶液を３０分間、室温で撹拌した。この後、ベンジルＧ１１−１１（４１．４ｇ、４２．２０ｍｍｏｌ、１．００当量）を、室温で加えた。得られた溶液を撹拌しながら、室温で一晩反応させた。得られた混合物を減圧下で濃縮した。得られた溶液を、ジクロロメタンで希釈した。得られた混合物を、飽和重炭酸ナトリウム及び飽和塩化ナトリウムでそれぞれ洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。粗物質をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、４１．２ｇ（５１％）のＧ１１−１２を明黄色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ／２＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：９６５。
【０１８９】
Ｇ１１−１２（２０ｇ、１０．３７ｍｍｏｌ、１．００当量）のメタノール（２００ｍＬ）溶液に、１０％パラジウム活性炭（２ｇ）を室温で加えた。フラスコを排気し、水素で５回フラッシュした。得られた溶液を、室温で４時間撹拌した。固形物を濾別した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。これにより、１６．５ｇ（８９％）のＧ１１−１３を白色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ／２＋Ｈ］＋（ＥＳＩ）：８９８。
【０１９０】
Ｇ１１−０（１２．８ｇ、２４．５７ｍｍｏｌ、１．００当量）のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（５００ｍＬ）溶液に、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（９．０ｇ、６９．６４ｍｍｏｌ、３．００当量）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ−エトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロホスフェート（９．９ｇ、２７．０３ｍｍｏｌ、１．１０当量）を加えた。得られた溶液を、室温で２時間撹拌した。次いで、Ｇ１１−１３（４４ｇ、２４．５７ｍｍｏｌ、１．００当量）を添加した。得られた溶液を、室温で１６時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、２２ｇ（４１％）のＧ１１−１４を明黄色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−（ＥＳＩ）：２２９５．Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：７．７９−７．８３（ｍ，６Ｈ），７．７０−７．７３（ｍ，４Ｈ），７．３３−７．３５（ｍ，２Ｈ），７．２６−７．３０（ｍ，２Ｈ），７．１９−７．２２（ｍ，５Ｈ），７．０１（ｓ，１Ｈ），６．８４−６．８７（ｍ，４Ｈ），５．１９−５．２０（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，３Ｈ），４．９３−４．９７（ｍ，３Ｈ），４．５８−４．５９（ｄ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，１Ｈ），４．４６−４．４８（ｄ，Ｊ＝８．０Ｈｚ，３Ｈ），３．９５−４．０４（ｍ，９Ｈ），３．８２−３．８９（ｍ，３Ｈ），３．６７−３．７１（ｍ，９Ｈ），３．４５−３．６１（ｍ，１２Ｈ），３．３６−３．４１（ｍ，３Ｈ），２．９４−３．０９（ｍ，１６Ｈ），２．２４−２．２７（ｍ，６Ｈ），２．００−２．０８（ｍ，２９Ｈ），１．８７（ｓ，９Ｈ），１．７５（ｓ，９Ｈ），１．６３−１．６９（ｍ，３Ｈ），１．４１−１．５１（ｍ，１９Ｈ）。
【０１９１】
Ｇ１１−１４（２ｇ、０．８７ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、ビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィン（７８６．７ｍｇ、１．６２ｍｍｏｌ、３．００当量）を室温で加えた。この後、ピリジントリフルオロアセテート（３３６．３ｍｇ、１．７４ｍｍｏｌ、２．００当量）を室温で加えた。得られた溶液を、室温で２時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。これにより、２．０ｇ（粗）のＧ１１−１５を黄色油状物として得た。その生成物を更に精製することなく、次工程で直接用いた。
【０１９２】
Ｇ１１−１５（２ｇ、０．８０ｍｍｏｌ、１．００当量）のアセトニトリル（２０ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、水（４３ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ、３．００当量）及び４，５−ジシアノイミダゾール（１１３ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ、１．２０当量）を室温で加えた。得られた溶液を、室温で２時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗物質をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。生成物画分を、ジクロロメタンで抽出した。得られた混合物を、飽和塩化ナトリウムで洗浄した。有機層を、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。これにより、１．０２５ｇ（５３％）のＧ１１−１６を白色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−（ＥＳＩ）：２４１２．１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００Ｈｚ）：８．１０−７．９０（ｍ，１Ｈ），７．８５−７．７．８１（ｍ，６Ｈ），７．７５−７．７２（ｍ，３Ｈ），７．３５−７．２２（ｍ，９Ｈ），７．０５−７．００（ｍ，１Ｈ），６．８９−６．８７（ｍ，４Ｈ），５．２１−５．２０（ｄ，Ｊ＝３．２Ｈｚ，３Ｈ），４．９８−４．９５（ｍ，３Ｈ），４．５０（ｓ，１Ｈ），４．４７−４．４０（ｍ，３Ｈ），４．０４−４．０１（ｓ，１１Ｈ），３．８８−３．８５（ｍ，３Ｈ），３．７３−３．６９（ｍ，９Ｈ），３．５５−３．５２（ｍ，１２Ｈ），３．４１−３．３９（ｍ，３Ｈ），３．２０（ｓ，２Ｈ），３．０４−３．００（ｍ，１４Ｈ），２．８５−２．７５（ｍ，２Ｈ），２．４９−２．２９（ｍ，６Ｈ），２．１０−１．９９（ｍ，２８Ｈ），１．８９−１．７７（ｍ，１１Ｈ），１．７７−１．７０（ｍ，９Ｈ），１．７０−１．６５（ｍ，２Ｈ），１．５２−１．４５（ｍ，１８Ｈ）．Ｐ  ＮＭＲ（ＣＤ３ＯＤ，４００Ｈｚ）：７．９５７，７．９２７。
【０１９３】
【化４５】
2020533009.tif 000047
【０１９４】
Ｇ１２−１（４．０ｇ、１．７０ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（４０ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、ビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィン（９２２．６ｍｇ、３．０６ｍｍｏｌ、１．８０当量）を室温で加えた。これに、ピリジントリフルオロアセテート（５２５ｍｇ、２．７２ｍｍｏｌ、１．６０当量）を室温で加えた。得られた溶液を、室温で１時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。これにより、３．０ｇ（粗）のＧ１２−２を黄色油状物として得た。
【０１９５】
Ｇ１２−２（３．０ｇ、１．１８ｍｍｏｌ、１．００当量）のアセトニトリル（３０ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、水（１６６ｍｇ、９．２２ｍｍｏｌ、７．８５当量）を室温で加えた。これに、４，５−ジシアノイミダゾール（６３．４ｇ、０．５４ｍｍｏｌ、０．４６当量）を室温で加えた。得られた溶液を、室温で１時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物（２．５ｇ）をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、２．０５４２ｇ（７１％）のＧ１２−３を白色固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］−（ＥＳＩ）：２４６８．１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００Ｈｚ）：７．９１−７．８０（ｍ，７Ｈ），７．７４−７．７１（ｍ，３Ｈ），７．３８−７．３１（ｍ，４Ｈ），７．２９−７．２３（ｍ，５Ｈ），６．９７（ｓ，１Ｈ），６．８７−６．８１（ｍ，４Ｈ），５．２１（ｓ，３Ｈ），４．９８−４．９４（ｍ，３Ｈ），４．６０（ｓ，１Ｈ），４．４９−４．４７（ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，３Ｈ），４．２５−４．１０（ｍ，２Ｈ），４．０２（ｓ，９Ｈ），３．８８−３．８５（ｍ，３Ｈ），３．７３−３．６８（ｍ，９Ｈ），３．５５−３．５２（ｍ，１１Ｈ），３．５２−３．４１（ｍ，３Ｈ），３．２０（ｓ，３Ｈ），３．０４−２．９２（ｍ，１３Ｈ），２．９０−２．８９（ｍ，２Ｈ），２．２９−２．１０（ｍ，６Ｈ），２．０９−１．９９（ｍ，２８Ｈ），１．８９−１．８０（ｍ，９Ｈ），１．７７−１．７１（ｍ，９Ｈ），１．５２−１．３７（ｍ，２３Ｈ），１．１９（ｓ，９Ｈ）．Ｐ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，４００Ｈｚ）：８．４５６。
【０１９６】
【化４６】
2020533009.tif 000048
【０１９７】
Ｇ１３−１（４．０ｇ、１．７０ｍｍｏｌ、１．００当量）のジクロロメタン（４０ｍＬ）溶液に、窒素の不活性雰囲気下で、ビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィン（６９０ｍｇ、２．２９ｍｍｏｌ、１．８０当量）を室温で加えた。これに、ピリジントリフルオロアセテート（３９０ｍｇ、２．０２ｍｍｏｌ、１．６０当量）を室温で加えた。得られた溶液を、室温で２時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。これにより、２．５ｇ（粗）のＧ１３−２を黄色油状物として得た。
【０１９８】
Ｇ１３−２（２．３ｇ、０．９０ｍｍｏｌ、１．００当量）のアセトニトリル（２２ｍＬ）溶液及び水（５０ｍｇ、２．７８ｍｍｏｌ、３．００当量）に、４，５−ジシアノイミダゾール（０．１２ｇ、１０１．６９ｍｍｏｌ、１．２０当量）を室温で加えた。得られた溶液を、室温で２時間撹拌した。得られた混合物を減圧下で濃縮した。粗生成物（２．３ｇ）をフラッシュ分取ＨＰＬＣにより精製した。これにより、２．０７６ｇ（９４％）のＧ１３−３をオフホワイト固形物として得た。ＭＳ  ｍ／ｚ［Ｍ＋Ｎａ］＋（ＥＳＩ）：２５０６．１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００Ｈｚ）：８．０５−７．９０（ｍ，１Ｈ），７．８０−７．７１（ｍ，９Ｈ），７．３８−７．２２（ｍ，９Ｈ），６．９５（ｓ，１Ｈ），６．８９−６．８６（ｍ，４Ｈ），５．２１（ｓ，３Ｈ），４．９９−４．９４（ｍ，３Ｈ），４．６５−４．４０（ｍ，４Ｈ），４．０２（ｓ，１１Ｈ），３．８８−３．８５（ｍ，３Ｈ），３．７３−３．６８（ｍ，９Ｈ），３．５６−３．５１（ｍ，１２Ｈ），３．４２−３．３８（ｍ，３Ｈ），３．３２（ｓ，２Ｈ），３．０４（ｓ，１４Ｈ），２．８４−２．８２（ｍ，２Ｈ），２．２９−２．２２（ｍ，６Ｈ），２．１０−１．９９（ｍ，２８Ｈ），１．８９（ｓ，１０Ｈ），１．７７（ｓ，１０Ｈ），１．５２−１．４５（ｍ，２２Ｈ），１．２２（ｓ，９Ｈ）．Ｐ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６，３００Ｈｚ）：７．８６７。
【０１９９】
ＧａｌＮＡｃコンジュゲーション
次の修飾：２’−Ｆ−ＮＰＳ−ＰＳ−２’−Ｆ−ＮＰＳ；２’−Ｆ−ＮＰ−ＰＳ−２’−Ｆ−ＮＰ；２’−ＯＭｅ−ＮＰ−ＰＳ−２’−ＯＭｅ−ＮＰ；２’−ＯＭｅ−ＮＰＳ−ＤＮＡ−ＰＳ−２’−ＯＭｅ−ＮＰＳ、２’−ＯＥｔ−ＮＰＳ−ＤＮＡ−ＰＳ−２’−ＯＥｔ−ＮＰＳ、及び２’−ＭＯＥ−ＮＰＳ−ＤＮＡ−ＰＳ−２’−ＭＯＥ−ＮＰＳを有する５’ＧａｌＮＡｃコンジュゲートオリゴマーの作製には、１０〜２００μＭのスケールで、５’から３’方向に、無水ＣＨ３ＣＮで０．１Ｍの濃度に希釈した５’−ホスホロアミダイトモノマーを、５−（ベンジルチオ）−１Ｈ−テトラゾール活性剤の存在下で用いて（カップリング時間２．０〜４．０分間）、ＧａｌＮａｃ  ２−ＣＰＧの合成を行った。変更したプロトコールでのカップリングサイクルに続いて、標準的なキャッピング、酸化、及び脱保護によって修飾オリゴヌクレオチドが得られた。段階的なカップリング効率は、９８％超であった。ＤＤＴＴ（ジメチルアミノ−メチリデン）アミノ）−３Ｈ−１，２，４−ジチアゾリン−３−チオンを、オリゴリボヌクレオチドホスホロチオエートの合成のためのイオウ移動剤として使用した。ルチジン：アセトニトリル（１：１）中０．２Ｍフェニルアセチルジスルフィド（ＰＡＤＳ）を大規模合成（Ａｋｔａ  ＯＰ−１００）において硫化剤として使用した。オリゴヌクレオチド担持固体担体を、振盪器内でアンモニア／メチルアミン（１：１）溶液を用いて室温で３時間加熱して、担体から切断し、塩基不安定な保護基を脱保護した。
【０２００】
【化４７】
2020533009.tif 000049
【０２０１】
３’−Ｃ６ＮＨ２−ＮＰＳ−ＰＳ−ＮＰＳ−（前駆体）合成
次の修飾：２’−Ｆ−ＮＰＳ−ＰＳ−２’−Ｆ−ＮＰＳ；２’−Ｆ−ＮＰ−ＰＳ−２’−Ｆ−ＮＰ；２’−ＯＭｅ−ＮＰ−ＰＳ−２’−ＯＭｅ−ＮＰ；２’−ＯＭｅ−ＮＰＳ−ＤＮＡ−ＰＳ−２’−ＯＭｅ−ＮＰＳ、２’−ＯＥｔ−ＮＰＳ−ＤＮＡ−ＰＳ−２’−ＯＥｔ−ＮＰＳ、及び２’−ＭＯＥ−ＮＰＳ−ＤＮＡ−ＰＳ−２’−ＭＯＥ−ＮＰＳを有する３’ＧａｌＮＡｃコンジュゲートオリゴマーの作製には、汎用支持体（ローディング６５μｍｏｌ／ｇ）を使用して、１０μｍｏｌスケールでＡＳＯを合成した。合成手順は、上記と同じである。３’末端においてＣ６−ＮＨ２リンカーを導入するために、０．１Ｍアセトニトリル中６−（４−モノメトキシトリチルアミノ）ヘキシル−（２−シアノエチル）−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスホロアミダイトを、カップリング時間１０分間で使用した。オリゴヌクレオチド担持固体支持体を、振盪器内でアンモニア／メチルアミン（１：１）水溶液を用いて室温で３時間加熱して、支持体から切断し、塩基不安定な保護基を脱保護した。ＩＥＸ精製及び脱塩後、Ｃ６−ＮＨ２修飾ＡＳＯを用いて、合成後コンジュゲーションを行うことができる。
【０２０２】
【化４８】
2020533009.tif 000050
【０２０３】
３’−ＧａｌＮＡｃ  ＮＰＳ−ＰＳ−ＮＰＳ−ＡＳＯ合成（合成後コンジュゲーション）
３’−Ｃ６−ＮＨ２修飾ＡＳＯを、０．２Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ８．５（０．０１５ｍＭ）に溶解し、ＤＭＳＯに溶解した５〜７モル当量のＧａｌＮＡｃ−６エステルを加えた。反応混合物を室温で４時間撹拌した。サンプルを分析して、任意の未反応のアミノ修飾ＡＳＯが存在するかを確認した。これに、アンモニア水溶液（２８重量％）を添加し（５×反応体積）、室温で２〜３時間撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣を水に溶解させ、強力な陰イオン交換カラムでＨＰＬＣにより精製した。
【０２０４】
【化４９】
2020533009.tif 000051
【０２０５】
【表２】
2020533009.tif 000052
【０２０６】
粗オリゴマーの定量又は原分析
サンプルを脱イオン水（１．０ｍＬ）に溶解させ、以下のとおり定量した：最初に水のみ（１．０ｍＬ）を用いてブランクを実施し、２０μＬのサンプル及び９８０μＬの水を微量遠心管内で十分に混合し、キュベットに移し、２６０ｎｍの吸光度読み出し値を得た。粗物質を乾燥させ、−２０℃で保管する。
【０２０７】
粗ＨＰＬＣ／ＬＣ−ＭＳ分析
粗試料の０．１ＯＤを、粗ＭＳ分析に供した。粗ＬＣ−ＭＳデータを確認した後、精製工程を行った。
【０２０８】
ＨＰＬＣ精製
ＧａｌＮＡｃコンジュゲートを含む及び含まないホスホロアミダート（ＮＰ）及びチオホスホロアミダート（ＮＰＳ）修飾オリゴヌクレオチドを、陰イオン交換ＨＰＬＣによって精製した。緩衝液は、１０％ＣＨ３ＣＮ中２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５（緩衝液Ａ）及び１０％ＣＨ３ＣＮ、１．８Ｍ  ＮａＢｒ中２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．５（緩衝液Ｂ）とした。完全長オリゴヌクレオチドを含有する画分をプールし、脱塩し、凍結乾燥した。
【０２０９】
精製オリゴマーの脱塩
次いで、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５  Ｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、精製した乾燥オリゴマーを脱塩した。カートリッジを、１０ｍＬの脱イオン水で３回コンディショニングした。最後に、ＲＮＡｓｅを含まない２．５ｍＬの水に完全に溶解した精製オリゴマーをカートリッジにアプライし、極めて低速で一滴ずつ溶出した。３．５ｍＬの脱イオン水を用いて、塩を含まないオリゴマーを直接スクリューキャップバイアルに溶出した。
【０２１０】
結合したオリゴヌクレオチドの安定性試験
実施形態では、開示されるオリゴヌクレオチドは、同じ配列の未修飾オリゴヌクレオチドと比較して、標的核酸配列に対する親和性の上昇を呈する。例えば、いくつかの配列において、開示されるオリゴヌクレオチドは、同じ配列の未修飾オリゴヌクレオチドよりも高い親和性で標的核酸配列に相補的でありつまりハイブリダイズする核酸塩基配列を有する。実施形態では、相補的標的核酸配列と複合体化した本開示のオリゴヌクレオチドは、＞３７℃の融解温度Ｔｍを有する。複合体は、生理的条件又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中などのほぼ生理的条件下で形成され得る。実施形態では、複合体のＴｍは＞５０℃である。実施形態では、複合体のＴｍは５０〜１００℃である。実施形態では、生理的条件又はほぼ生理的条件下で標的核酸配列と二本鎖形成した、本開示のオリゴヌクレオチドのＴｍは、＞５０℃である。
【０２１１】
特定の実施形態では、標的核酸配列は、ＨＢＶゲノムなどの既知のウイルスＤＮＡ又はＲＮＡ配列から選択してよい。
【０２１２】
実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＨＢＶゲノム若しくはそのＲＮＡ等価物の以下の６つの配列のうちの少なくとも１つに対して親和性を示す、及び／又はＨＢＶゲノム若しくはそのＲＮＡ等価物のうちの少なくとも１つと複合体化して安定性を示す。実施形態では、相補的ＨＢＶゲノムと複合体化したオリゴヌクレオチドは、＞３７℃の融解温度（Ｔｍ）を有する。ＨＢＶゲノムは、ＤＲ−１及び／又はＤＲ−２のＲＮＡ配列などのＲＮＡ配列であってもよい。複合体は、生理的条件又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中などのほぼ生理的条件下で形成され得る。実施形態では、複合体のＴｍは＞５０℃である。実施形態では、複合体のＴｍは５０〜１００℃である。実施形態では、生理学的条件又はほぼ生理学的条件下でＨＢＶ  ＲＮＡと二本鎖形成している、本開示のオリゴヌクレオチドのＴｍは、＞５０℃である。
【０２１３】
オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
２種類のＨＢＶ細胞株、ＨｅｐＧ２．２．１５（２２１５）及びＨｅｐＧ２．１１７（２１１７）を使用して、オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を評価した。ＨｅｐＧ２．２．１５細胞を使用して、組織培養上清（ｓｕｐ）中のＨＢｓＡｇの低下、並びに細胞毒性を測定した。上清及び細胞内画分におけるＨＢＶ  ＤＮＡの低下は、ＨｅｐＧ２．１１７細胞において測定した。
【０２１４】
ＨｅｐＧ２．２．１５細胞株は、４種類の組み込まれたＨＢＶゲノムを有する安定な細胞株である。１０％ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２％グルタミンを加えたダルベッコ改変イーグル培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で細胞を増殖させた。投与前日、細胞２．５×１０４個／ウェルを、コラーゲンをコーティングした９６ウェルプレートに撒き、一晩インキュベートした。投与日に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を製造業者のプロトコールに従って用い、段階的に希釈したオリゴマーを細胞にトランスフェクトした。各薬物濃度について２回実験を行い、各オリゴのＥＣ５０測定及びＣＣ５０測定の両方を設定した。トランスフェクションの３日後、上清（ｓｕｐ）を回収し、ＥＣ５０を計算するため、ＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡ（ＡｕｔｏＢｉｏ，Ｃｈｉｎａ）で使用した。ＣＣ５０測定には、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を製造業者の指示に従ってアッセイで使用した。
【０２１５】
ＨｅｐＧ２．１１７は、ＴｅｔＯＦＦの制御下（テトラサイクリン又はそのホモログであるドキシサイクリン非存在下での転写の誘導）で、組み込まれた１．０５コピーのＨＢＶゲノム（ａｙｗサブタイプ）を保有している安定な肝癌細胞株である。１０％ＦＣＳ、１００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、２％グルタミン、２５０μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８、及び２μｇ／ｍＬテトラサイクリンを添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、３７℃、５％ＣＯ２の雰囲気下で細胞を増殖させた。投与前日、テトラサイクリンを含む細胞培地を除去し、細胞を洗浄して残留するテトラサイクリンを除き、処理培地（Ｔｅｔシステムが認める２％のＦＢＳ  １００ＩＵ／ｍＬペニシリン、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン、及び２％グルタミンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ１２）と共に、２．５×１０４個の細胞／ウェルをコラーゲンをコーティングした９６ウェルプレートに播いた。次に、細胞を一晩インキュベートした。実験日に、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を製造業者のプロトコールに従って用い、段階的に希釈したオリゴマーを細胞にトランスフェクトした。各薬物濃度について２回実験を行い、ＥＣ５０測定及びＣＣ５０測定の両方について各オリゴを設定した。トランスフェクションの４日後、ＨＢＶ  ＤＮＡ  ｑＰＣＲに直接使用するため、上清を回収した。細胞由来のＨＢＶ  ＤＮＡを、ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｔｏｔａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で単離した後、テンプレートとしてｑＰＣＲに適用した。ＨＢＶサブタイプであるａｙｗのＤＮＡ（受入番号Ｖ０１４６０）配列を使用して、フォワードプライマー（５’−ＴＴＧ  ＣＣＴ  ＴＣＴ  ＧＡＣ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＴＣＴ−３’）、リバースプライマー（５’−ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＡＧＴ  ＧＣＴ  ＧＴＡ  ＴＧＧ  ＴＧＡ  Ｇ−３’）、及び５’をＦＡＭ（６−カルボキシフルオレスセイン）で、かつ３’をＴＡＭＲＡ（６−カルボキシテトラメチルローダミン）でラベルした蛍光を発するＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブ（５’−ＴＣＧ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＣＴＴ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＴＣＣ  ＴＧＡ−３’）を設計した（Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。これらのプライマー及びプローブを使用して、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いる定量的リアルタイムＰＣＲを行った。この反応の条件は次のとおりとした。１サイクル、９５℃１０分間で加熱開始、続いて変性５０サイクル（９５℃１５秒間）及びアニーリング／重合（５９℃１分間）。
【０２１６】
初代ヒト肝細胞における感染性ＨＢＶ系
凍結保存した初代ヒト肝細胞（ＰＨＨ）を解凍し、２００，０００個／ウェルで２４ウェルプレートに播種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で一晩回復させた。細胞を、ｍｏｉ５０〜１００のＨＢＶで一晩（３７℃／５％ＣＯ２）感染させた。一晩感染させた後、ウイルス接種材料を除去し、細胞を予熱した洗浄培地で３回洗浄する。次いで、新鮮なＰＨＨ培養培地を再補充する。培地を、４５０μＬの新鮮培地と交換する。５０μＬのトランスフェクト混合物を加える。オリゴマーをＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ＃：３１９８５−０７０）で２０×最終濃度まで希釈し、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ＃：１３７７８−１５０）を含有している等量のＯｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉと混合し、３回ピペッティングして、室温で１０〜２０分間インキュベートする。５０μＬのオリゴ：ＲＮＡｉＭＡＸ混合物をウェルに加え、手を使って数回プレートをタップする。プレートをインキュベーターに戻す。アッセイ日に、ＨＢｓＡｇ及びＨＢｅＡｇ  ＥＬＩＳＡアッセイについては上清を、細胞生存性アッセイについては細胞を回収する。ＨＢｓＡｇ  ＥＬＩＳＡは、上記の項に記載した。ＨＢｅＡｇには、Ａｕｔｏｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓの方法（ＣＬ０３１２−２）を使用した。
【０２１７】
オリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ＡＡＶ／ＨＢＶは、複製可能なＨＢＶゲノムを保有する組換えＡＡＶである。遺伝子型８のＡＡＶの肝臓指向性が高いという特徴を活かして、マウス肝細胞にＨＢＶゲノムを効率的に送達することができる。免疫適格性のあるマウスをＡＡＶ／ＨＢＶで感染させると、長期間のＨＢＶウイルス血症が生じ、患者における慢性ＨＢＶ感染症を再現する場合がある。ＡＡＶ／ＨＢＶモデルを使用して、様々な種類の抗ＨＢＶ薬のｉｎ  ｖｉｖｏ活性を評価することができる。マウスを、試験の−２８日目にＡＡＶ−ＨＢＶに感染させた。０、２及び４日目に３回、試験物質又は陰性対照（ＰＢＳ）を、指定した用量で皮下投与（別段の指定がない限り）した。又は、０日目に指定の用量で単回投与として注入してもよい。ＨＢＶ  ＤＮＡ（ＨＢＶ抗原ではない）に対する陽性対照であるエンテカビル（ＥＴＶ）を、毎日経口投与した。血清ＨＢＶ  Ｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）及びＥ抗原（ＨＢｅＡｇ）をＥＬＩＳＡによって、ＨＢＶ  ＤＮＡをリアルタイムＰＣＲによって評価した。ＥＬＩＳＡ法及びｑＰＣＲ法は、上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの項に記載されている。
【０２１８】
以下の記載は、表１〜２２のデータがどのように得られたかを説明するものである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＢｓＡｇ細胞株ＥＣ５０及びＣＣ５０データの全てについて、ＨｅｐＧ２．２．１５での方法を使用し、したがって、データが示されている列又は行には「２２１５」と示した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＢＶ  ＤＮＡ細胞株ＥＣ５０及びＣＣ５０データの全てについて、ＨｅｐＧ２．１１７での方法を使用し、したがって、データが示されている列又は行には「２１１７」と示した。ＨＢＶ／ＰＨＨ感染系で試験したｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＨＢｓＡｇ、並びにＨＢｅＡｇのＥＣ５０データの全てについて、ＰＨＨ法を使用し、したがって、データが示されている列又は行には「ＰＨＨ」と示した。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＡＶ−ＨＢＶマウスモデルの結果については、上記のｉｎ  ｖｉｖｏの項の方法を適用した。ＨＢｓＡｇ（又はＨＢｅＡｇ）の最大減少度は、ｎａｄｉｒ（単位Ｌｏｇ減少度）として記載され、データが示されている列又は行にはｎａｄｉｒと示した。２種類のＡＳＯは、多くの場合、それらのｎａｄｉｒについて比較した。ｎａｄｉｒ以外の値が比較された場合、本文中に示される。
【０２１９】
治療方法
ＨＢＶ感染症に罹患している成人に、本開示の治療に有効な化合物、例えば、表１〜２２から選択される化合物を静脈内投与する。ＨＢＶの１つ以上の症状が寛解するまで、又は例えば、血清ＨＢＶ  Ｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）及び／若しくはＥ抗原（ＨＢｅＡｇ）のレベルが低下するまで、治療を継続する。
【０２２０】
ＨＢＶ感染症に罹患している成人に、本開示の治療に有効な化合物、例えば、表１〜２２から選択される化合物を皮下投与する。ＨＢＶの１つ以上の症状が寛解するまで、又は例えば、血清ＨＢＶ  Ｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）及び／若しくはＥ抗原（ＨＢｅＡｇ）のレベルが低下するまで、治療を継続する。
【０２２１】
【表３】
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＊配列２６０及び２６１も試験し、同様の結果を得た。
【０２２２】
【表４】
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＊５’−ＧａｌＮａｃ２−ｍｏｅＧｎｐｓｍｏｅＣｎｐｓｍｏｅＡｎｐｓｍｏｅＧｎｐｓｍｏｅＡｎｐｓＧｐｓＧｐｓＴｐｓＧｐｓＡｐｓＡｐｓＧｐｓ（５ｍ）ＣｐｓＧｐｓＡｐｓｍｏｅＡｎｐｓｍｏｅＧｎｐｓｍｏｅＵｎｐｓｍｏｅＧｎｐｓｍｏｅＣｎ−３’
及び５’−ＧａｌＮａｃ１−ｍｏｅＧｎｐｓｍｏｅＣｎｐｓｍｏｅＡｎｐｓｍｏｅＧｎｐｓｍｏｅＡｎｐｓＧｐｓＧｐｓＴｐｓＧｐｓＡｐｓＡｐｓＧｐｓＣｐｓＧｐｓＡｐｓｍｏｅＡｎｐｓｍｏｅＧｎｐｓｍｏｅＵｎｐｓｍｏｅＧｎｐｓｍｏｅＣｎ−３’についても試験し、同様の結果が得られた。
【０２２３】
【表５】
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＊５’−ＧａｌＮＡｃ２−ｍＧｎｐｓｍＣｎｐｓｍＡｎｐｓｍＧｎｐｓｍＡｎｐｓＧｐｓＧｐｓＴｐｓＧｐｓＡｐｓＡｐｓＧｐｓ（５ｍ）ＣｐｓＧｐｓＡｐｓｍＡｎｐｓｍＧｎｐｓｍＵｎｐｓｍＧｎｐｓｍＣｎ−３’についても試験し、同様の結果が得られた。
【０２２４】
上記から分かるように、ＭＯＥ  ＮＰＳオリゴマーは、ｉｎ  ｖｉｖｏでＭＯＥ  ＰＳよりも活性が高く、ＯＭｅ  ＮＰＳはＭＯＥ  ＰＳオリゴマーと同様の活性であった。
【０２２５】
１つ目がＯＥｔ  ＮＰＳ置換を含み、２つ目がＭＯＥ  ＮＰＳを含む２種類のオリゴヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。以下の表４に、試験の結果を要約する。
【０２２６】
【表６】
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上記から分かるように、ＭＯＥ  ＮＰＳオリゴマーは、ＯＥｔ  ＮＰＳオリゴマーと同様の活性を有していた。
【０２２７】
１つ目はＭＯＥ  ＰＳ置換を含み、２つ目はＭＯＥ  ＮＰＳ置換を有し、３つ目はＯＭＥ  ＰＳ置換を有し、４つ目はＯＭＥ  ＮＰＳを有する４種類のオリゴヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験した。以下の表５に、試験の結果を要約する。
【０２２８】
【表７】
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【０２２９】
【表８】
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１つ目は５’ＧａｌＮＡｃ−２’−ＭＯＥ  ＮＰＳ置換を含有し、２つ目は５’−ＧａｌＮＡｃ−６：ＭＯＥ  ＰＳ置換を有する２種類のオリゴヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。以下の表６に、試験の結果を要約する。
【０２３０】
【表９】
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【０２３１】
【表１０】
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【０２３２】
１つ目は３’−ＧａｌＮＡｃ−２’−ＭＯＥ  ＮＰＳ置換を含有し、２つ目は３’−ＧａｌＮＡｃ−２’−ＭＯＥ  ＰＳ置換を有する２種類のオリゴヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。以下の表７に、試験の結果を要約する。
【０２３３】
【表１１】
2020533009.tif 000061
【０２３４】
【表１２】
2020533009.tif 000062
【０２３５】
１つ目はＯＭＥ  ＮＰＳ置換を含有し、２つ目はＯＭＥ  ＰＳ置換を有する２種類のオリゴヌクレオチドを、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。
【０２３６】
【表１３】
2020533009.tif 000063
【０２３７】
ＨＢＶマウスモデルにおいて、以下の配列を試験した。１×１０ｍｇ／ｋｇの用量で、３’ＧａｌＮａｃ  ＭＯＥ  ＮＰＳは、５’ＧａｌＮａｃ  ＭＯＥ  ＰＳよりも０．８ｌｏｇ（６倍）も良好な有効性を維持し、優位性は２１日間の試験のほとんどにわたって維持された。５’ＧａｌＮａｃ  ＭＯＥ  ＮＰＳは、５’ＧａｌＮａｃ  ＭＯＥ  ＰＳよりも０．４ｌｏｇ（２．５倍）もの良好な有効性が維持され、優位性は２１日間の試験のほとんどにわたって維持された。３×３．３ｍｇ／ｋｇの用量で、３’ＧａｌＮａｃ  ＭＯＥ  ＮＰＳ及び５’ＧａｌＮａｃ  ＭＯＥ  ＮＰＳは同様に作用し、両者とも５’ＧａｌＮａｃ  ＭＯＥ  ＰＳよりも０．６ｌｏｇ（４倍）も良好な有効性を維持し、優位性は２１日間の試験のほとんどにわたって維持された。
【０２３８】
【表１４】
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【０２３９】
ＨＢＶマウスモデルにおいて、以下の配列を試験した。
【０２４０】
【表１５】
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【０２４１】
ＨＢＶマウスモデルにおいて、以下の配列を試験した。右列の値は、３×１０ｍｇ／ｋｇで０、２、４日目に投与された、ＨＢｓＡｇの最大ＬＯＧ減少を示す。
【０２４２】
【表１６】
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【０２４３】
ＨＢＶマウスモデルにおいて、以下の配列を試験した。右列の値は、３×１０ｍｇ／ｋｇで０、２、４日目に投与された、ＨＢｓＡｇの最大ＬＯＧ減少を示す。
【０２４４】
【表１７】
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【０２４５】
【表１８】
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【０２４６】
【表１９】
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【０２４７】
【表２０】
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【０２４８】
【表２１】
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【０２４９】
【表２２】
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【０２５０】
【表２３】
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【０２５１】
【表２４】
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【０２５２】
Ｆ  ＮＰＳ化学物質を含有する３つのオリゴヌクレオチドをインビボで試験した。第１のオリゴヌクレオチドは、５’末端にトリＧａｌＮａｃ部分を有し、第２のオリゴヌクレオチドは、２つのトリＧａｌＮａｃ部分を有し、一方は５’末端に、他方は３’末端に存在する。第３のオリゴヌクレオチドは、５’末端にトリＧａｌＮａｃ部分を有し、３’末端にモノＧａｌＮａｃを有する。以下の表２１は、試験の結果を要約する。
【０２５３】
【表２５】
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【０２５４】
３×５ｍｋｐでは、５’末端及び３’末端の両方におけるＧａｌＮａｃコンジュゲーションは、特定の時点において、５’末端のみにおけるコンジュゲーションよりも明らかに優れており、インビボ活性が０．６ｌｏｇ良好である。
【０２５５】
１つが５’末端にトリＧａｌＮａｃ部分を含有し、２つ目が５’末端にトリＧａｌＮａｃ部分及び３’末端にトコフェロール部分を含有する、２つのオリゴヌクレオチドを３×１０ｍｐｋの用量でインビボにおいて試験した。
【０２５６】
【表２６】
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【０２５７】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドはまた、表１〜４３に列挙される配列の修飾とは無関係に、表１〜４３に列挙される核酸塩基配列から選択されるオリゴヌクレオチドも含む。本開示のオリゴヌクレオチドはまた、表１〜４３に列挙される配列の修飾とは無関係に、表１〜４３に列挙される配列から選択される核酸塩基配列と少なくとも９０％同一である配列を含むオリゴヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、表１〜４３に列挙される配列の修飾とは無関係に、表１〜４３に列挙される配列とは１、２、３、４、５個の核酸塩基が異なる。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドはまた、表１〜４３に列挙される配列の核酸塩基とは無関係に、表１〜４３に列挙されるヌクレオチド配列から選択されるオリゴヌクレオチドも含む。本開示のオリゴヌクレオチドはまた、表１〜４３に列挙される配列の核酸塩基とは無関係に、表１〜４３に列挙される配列から選択される核酸塩基配列と少なくとも９０％同一である配列を含むオリゴヌクレオチドも含む。いくつかの実施形態では、表１〜４３に列挙される配列の修飾とは無関係に、表１〜４３に列挙される配列とは１、２、３、４、５個の核酸塩基が異なる。
【国際調査報告】
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