(57)【要約】本発明は、１型または２型糖尿病のいずれかに罹患している被験体において、微小血管または大血管損傷のような被験体における血管障害性変化から生じるある種の糖尿病関連合併症を発生させるリスクまたはその進行の速度を決定するための方法を提供する。本発明はまた、２型または１型糖尿病のいずれかを有する被験体に由来する生物学的サンプルの取り扱い／貯蔵／保存のための方法を提供する。被験体に由来する生物学的サンプルを分析して、その被験体に由来する以前のサンプルから得られた結果、または集合サンプルから得た結果、または標準との比較において目的の１もしくはこれより多くの生体マーカーの量を決定するための方法がさらに提供される。ヘルスケア専門家が、ある種の糖尿病関連合併症を発生させるリスクまたはその進行の速度の分析に基づいて、被験体または被験体の群において糖尿病の管理を改善することを可能にする資料がさらに提供される。
2020523580.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
糖尿病関連心血管合併症を発生させる個体のリスクまたは速度を決定するための方法であって、該方法は、
生物学的サンプルから精製された２もしくはこれより多くの生体マーカーのレベルを決定する工程であって、ここで該生体マーカーは、リジン終末糖化産物、アルギニン終末糖化産物、および酸化産物を含む群から選択される工程；ならびに
該決定された生体マーカーレベルと標準値とを比較する工程であって、該生体マーカーのレベルは、糖尿病関連心血管疾患を発生させるリスクまたは速度を示す工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記生体マーカーは、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、Ｎε−カルボキシエチル−リジン（ＣＥＬ）、グリオキサールヒドロイミダゾロン（ＧＨ１）、メチルグリオキサールヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）、３−デオキシグルコソンヒドロイミダゾロン（３ＤＧＨ）、メチオニンスルホキシド（ＭｅｔＳＯ）、および３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記終末糖化産物は、Ｎε−カルボキシエチル−リジン（ＣＥＬ）、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、およびメチルグリオキサールヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生物学的サンプルを個体から得る工程、ならびに生体マーカーを精製および定量するために、前記１またはこれより多くの生体マーカーのレベルを、液体クロマトグラフィー／トリプル四重極質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して決定する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、イオン対形成薬剤を有するＣ１８を含む固定相をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルは、血液、尿、または血漿サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記血漿サンプルは、限外濾過液である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記イオン対形成薬剤は、ヘプタフルオロ酪酸である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記個体は、心血管疾患を発生させるリスクにあると決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
心血管疾患を発生させる前記リスクまたは速度を記載する報告を提供する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記個体に心血管疾患処置を推奨することを提供する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法を使用してサンプルを試験するにあたって使用するための試薬を含む、キット。
【請求項１３】
前記１またはこれより多くの生体マーカーのレベルを試験するための試薬を含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記生体マーカーのレベルを、液体クロマトグラフィー／トリプル四重極質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して決定するための試薬を含む、請求項１３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６２／６０３，７８７号（２０１７年６月１０日出願、発明の名称「心血管疾患管理を改善するための方法」）の優先権および利益を主張し、この出願は、全ての目的のためにその全体において本明細書に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、１型糖尿病または２型糖尿病のいずれかに罹患している被験体において、糖尿病関連微小血管および／もしくは大血管損傷から生じるある種の糖尿病関連合併症（例えば、糖尿病性腎症および他の関連障害）を発生させるリスク、および／またはその進行の速度を決定するための方法を提供する。本発明はまた、１型糖尿病または２型糖尿病のいずれかを有すると同定された被験体に由来する生物学的サンプル（例えば、血液、血漿、および／または尿）を取り扱う、貯蔵する、および保存するための方法を提供する。被験体に由来する生物学的サンプルを分析して、その被験体に由来する以前のサンプルから得られた結果、および／もしくは集合サンプルから得た結果、または標準との比較において目的の１もしくはこれより多くの生体マーカーの量を決定するための方法が、さらに提供される。ある種の糖尿病関連合併症を発生させるリスクおよび／またはその進行の速度の分析に基づいて、被験体または被験体の群において糖尿病の管理を改善するための方法が、さらに提供される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
糖尿病（ＤＭ）は、米国のみで３０００万人超の人々が罹患している。２０歳齢以上の年齢の約１９０万人の人々が、２０１０年に糖尿病を有すると新たに診断された。さらにより驚くほど考慮するべきことは、推定７９００万人の２０歳齢以上の年齢の人々が、糖尿病予備軍であると考えられ、２０歳齢以上の年齢の成人のうちの５％および６５歳齢以上の年齢の成人のうちの５０％を構成するということである（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｒｉｎｇｈｏｕｓｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，  ２０１１）。
【０００４】
糖尿病管理の罹患率およびコストの大部分は、例えば、長期の糖尿病関連合併症のケアおよび管理にあり、糖尿病は、成人のなかで、腎不全、非外傷性下肢切断、および新たな失明症例の原因第一位である。糖尿病はまた、心疾患および脳卒中の主要な原因である。集団の年齢および性差を調節した後に、糖尿病と診断された人々の間での平均的医療費は、糖尿病を有しない人々より２．３倍高かった。２００７年の糖尿病のコストは、１７５０億ドルであり、これは、過剰医療費１１６０億ドルおよび国内生産性の低減５８０億ドルを含む（Ｄａｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，  ３１（３）：５９６−６１５  （２００８））。
【０００５】
糖尿病および疾患の人口統計の最新の発生率に基づくと、糖尿病合併症の発症は、上昇しつつある。糖尿病性網膜症を有する米国人の数は、２０５０年までに１６００万人へと３倍になると予測されている。この国で末期腎疾患の割合が劇的に拡大している主な原因は、糖尿病性腎症の新たな症例に起因する。糖尿病は今や、米国および西洋諸国において腎不全および末期腎疾患（ＥＳＲＤ）の原因第１位である。糖尿病を有する人々はまた、心臓発作および脳卒中のリスクの劇的な増大を有する。主にこれらの壊滅的な血管合併症の処置が、糖尿病ケアのコストを２０１２年に２４５０億ドル（２００７年以来４５％増大）へと至らせた。
【０００６】
１型および２型ＤＭの両方と関連する血中グルコースレベルの慢性的上昇は、血管障害といわれる疾患状態を生じる血管の損傷をもたらす。血管障害性変化から生じる問題は、「微小血管障害」（小さな血管への損傷に起因）および「大血管障害」（動脈への損傷に起因）の下でグループ分けされる。小さな血管への損傷は、微小血管損傷（これは、糖尿病性網膜症および／または糖尿病性腎症を引き起こし得る）をもたらす。糖尿病状態と関連する他の優勢なかつ重篤な病的プロセスは、心血管疾患（「ＣＶＤ」）および脳血管疾患の増大したリスクを媒介するものであり、これは、１型糖尿病および２型糖尿病の両方で被験体に認められる。糖尿病と関連する血管障害は、小血管および大血管の両方を損傷し、共通の病因論が、糖尿病を有する患者において観察される代謝変化と関連する。
【０００７】
糖尿病性の微小血管および大血管の合併症は、高血糖の程度と明らかに関連するが、血糖管理が不十分である全ての糖尿病個体が必ずしも、腎臓の、進行した網膜の、または心血管の合併症を発生させるわけではない。逆に、いくらかの糖尿病患者は、多くのヘルスケア提供者が満足と考える範囲の血中グルコース濃度を有するにも拘わらず、重篤な合併症を発生させる。
【０００８】
当該技術分野の技術は、診断法の主題であった特定の分析物のいくつかの例を提供する。例えば、米国特許第６，３２３，０３８号は、糖尿病と関連する合併症または腎不全を検出するための診断試薬としてピリジニウム化合物を開示する。米国出願公開第２０１１／００７９０７７号は、単独で、または組み合わせにおいて早期ステージの糖尿病性腎症を診断するために使用され得る、尿および血清タンパク質およびそれらのフラグメントを開示する。にも拘わらず、糖尿病ケアにおいて使用される現在受け入れられている分析物、特に、高血糖を主に測定するヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）は、糖尿病性血管障害合併症を発生させることに関して「高リスク」にある下位群を積極的に同定することに関して重大な制限を有する。
【０００９】
糖尿病管理および合併症に関する治験（Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｔｒｉａｌ）（「ＤＣＣＴ」）は、ＨｂＡ１ｃ（Ａ１Ｃ）のみ（すなわち、被験体の血液中の糖化ヘモグロビンのレベルを直接示す）が、転帰のリスクを完全に決定するわけではないことを示した（Ｂｅｉｓｓｗｅｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ５４：  ３２７４−３２８１  （２００５））。糖尿病性腎症の自然経過の研究（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｉｃ  Ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ  Ｓｔｕｄｙ）（「ＮＨＤＮＳ」）は、１型糖尿病における進行性糸球体基底膜（「ＧＢＭ」）肥厚化のリスクのうちの９％が、ベースラインＡ１Ｃレベルによって説明されるに過ぎないことを示した。網膜の形態変化または定期検査の際のアルブミン尿の出現を含む、糖尿病性網膜症（「ＤＲ」）および糖尿病性腎症（「ＤＮ」）の進行に関する既存の分析物および臨床指標は、発生している場合には長い１０〜２０年の「無症候期間（ｓｉｌｅｎｔ  ｐｈａｓｅ）」の間に最も高いリスクにある人々を同定できないか、または腎臓、眼、および心疾患（「ＣＶ」）系への初期の損傷は、臨床的には明らかでない（Ｎａｔｈａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  ｏｆ  Ｍｅｄ．，  ３５３（２５）：  ｐ．  ２６４３−５３  （２００５））。これらの既に規定されたマーカーが陽性になるときまで、実質的な周皮細胞脱落のような顕著な損傷は既に頻繁に起こっており、無毛細血管（血管新生／形成）が網膜に存在する（Ａｈｍｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．，  ３１（Ｐｔ  ６）：１４１７−２２  （２００３））；同様に、実質的な不可逆的腎損傷がまた、微量アルブミン尿が起こるときまでに存在し得る（Ｎａｔｈａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  ｏｆ  Ｍｅｄ．，  ３５３（２５）：２６４３−５３  （２００５））。重篤かつ生命を脅かすような血管病変が徐々に蓄積しているにも関わらず、ＣＶ疾患が長年にわたって無症候性のままであることもあり得ることはまた、広く認識されている（Ｍａｕｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｒｅｎｉｎ−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，  ３：２６２−２６９  （２００２）；  Ａｌｍｕｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌ．，  １０９（１）：７−１５  （２００６））。不運なことに。その状況を悪化させるものは、アルブミン尿が検出される場合に代表的には開始される、糖尿病処置選択肢（例えば、ＡＣＥインヒビター（「ＡＣＥＩｓ」）およびアンギオテンシンレセプター遮断薬（「ＡＲＢｓ」）の投与のようなＤＮの積極的処置）の現状であり、腎アンギオテンシン系の研究（Ｒｅｎａｌ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｔｕｄｙ）（「ＲＡＳＳ」）によって示されたように、ＤＮまたはＤＮの進行をもたらす構造的な糸球体病変の進行を遅らせることはできない（Ｍａｕｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｒｅｎｉｎ  Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  Ｓｙｓｔ．  ３（４）：２６２−２６９  （２００２）；およびＭａｕｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，  ２；３６１（１）：４���−５１  （２００９））。既存の処置選択肢（例えば、ＡＣＥＩｓおよびＡＲＢｓ）が糖尿病合併症を治癒／改善することができないということは、高感受性個体での重篤な糖尿病合併症（例えば、ＤＮおよびＤＲ）の早期の認識および上流での防止が、糖尿病の治療および改変を始める前に糖尿病合併症の臨床発現を待つより遙かに優れたアプローチであるということを示唆する。処置選択肢の現状は、重篤な糖尿病合併症への進行に関する個々のリスクの密接に相関した予測、従って、その長い無症候期間の間にすら早期介入の上流開始の必要性を指摘する。
【００１０】
糖尿病関連合併症に関する被験体のリスクを正確に予測する必要性が長年存在しているにも拘わらず、当該分野が適切な予測法を考案できなかったことは、臨床処置の決定が、全ての糖尿病患者が合併症に等しく罹りやすいという誤った前提に基づいてなされるということを要求する。しかし、１型糖尿病または２型糖尿病と関連する潜在的合併症は変動し、これまでは予測不能であり、合併症の早期予測の適切な予測試験の欠如は、防止の大規模な失敗をもたらす。この大規模な失敗の理由としては、患者特異的予測情報の欠如、新たに発見される糖尿病の圧倒的な割合、適切なケアを提供することの多額の費用、十分かつ適切に訓練された医療提供者の欠如、およびリスクに関する正確な個別化予測情報の欠如から生じる不十分な処置コンプライアンスの潜在的な結果の患者による否定が挙げられる。糖尿病処置は、高価であるのみならず、いくらかには、高血糖および薬物副作用の高リスク、ならびに新たな処置（例えば、膵臓移植および発展中の人工膵臓）の費用およびリスクが付随するものもある。これらの考慮事項に基づけば、これらの治療の多くを、糖尿病を有する全ての患者に、個々のリスク  対  利益予測に関するよりよい情報なしに適用することは、ますます困難になっている。
【００１１】
その予測の隙間を埋めようとする試みにおいて、何名かは、糖尿病合併症の考えられる要因として、終末糖化産物（「ＡＧＥｓ」）および酸化産物（「ＯＰｓ」）を示唆した。しかし、近年になるまで、これらの産物の知識は、初期糖化産物（「ＥＧＰｓ」）、いくつかの終末酸化産物、およびわずかなＡＧＥｓに限定されていた。大部分の以前の研究は、限られた数のＡＧＥｓ（例えば、Ｙｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ４９（１０）：２４８８−９８  （２００６）；  Ｍｏｎｎｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  （２００８）；  （Ｂｅｉｓｓｗｅｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，  ９２（１）：２１２−７  （１９９３）；  Ｄｙｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９１（６）：  ２４６３−９  （１９９３）；およびＭｏｎｎｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １０４３：５６７−５８１  （２００５）を参照のこと）、特に、ペントシジンおよびカルボキシメチルリジン）を測定しているか、または酸化的ストレスを反映するいくつかの終末産物に焦点を当てていた（例えば、Ｙｕ，  ｅｔ  ａｌ．；およびＢａｙｎｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２８（１２）：１７０８−１６  （２０００）を参照のこと）。これらの分析のかなりの数が、概して定量的化学分析に対して検証されていない半定量的イムノアッセイとして行われた。これらの研究のうちのいくつかは、これらの産物のレベルと合併症との間で単純な相関関係を示した（Ｍｏｎｎｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １０４３：５６７−５８１  （２００５）を参照のこと）が、大規模な管理された糖尿病転帰研究においてそれらの予測値を誰も検証していない。例えば、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳにおいてＡＧＥｓおよび酸化的マーカーのレベルを測定するＰｅｒｋｉｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ７（４）：３３５−３５５（２０１２）による近年の研究は、血漿タンパク質のタンパク質損傷付加残基または関連する遊離付加物の濃度のいずれも、末期腎疾患をもたらすその後の早期糸球体濾過率（ＧＦＲ）減少との間には相関がないと結論づけた。
【００１２】
過去２０〜３０年にわたって糖尿病合併症の早期検出のために同定された新たな生物学的分析物（例えば、生体マーカー）は実質的になかった。糖尿病合併症を発生させる「高リスク」にある人々を同定しようと試みるために使用される既存の分析物は、継続して顕著な制限を有する。糖尿病による腎損傷の最初の徴候のうちの１つは、尿中のタンパク質の存在である（微量アルブミン尿または顕性アルブミン尿）。アルブミン尿は、臨床検査または単純なディップスティック検査を使用して評価され得る。この検査は、重大な欠点を有する。なぜなら顕性アルブミン尿を発生させる人々においておこなった研究は、彼らのうちの全てが重篤な腎疾患に移行するわけではないことを実際には示すからである。彼らのうちの４０％までは、正常アルブミン尿（ｎｏｒｍｏａｌｂｕｍｉｎｕｒｉａ）に戻ることを示す。別の３０〜４０％は、腎機能の低下を示すことなく継続して微量アルブミン尿を有し（アルブミン／クレアチニン比にして３０〜２９９ｍｇ／ｇｍ  クレアチニン）、残りはより重篤な腎疾患へと進行する。腎生検（これは、ＤＮの診断の至適基準である）を使用する場合ですら、尿中の微量アルブミンのレベルとの不十分な相関関係が公知である（Ｆｉｏｒｅｔｔｏ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ４３，  １３５８−６４  （１９９４））。
【００１３】
アルブミン尿の制限された予測値が原因で、患者の糸球体濾過率を計算するために使用される血清クレアチニンレベルは、進行性の糖尿病性腎症を検出するためにより正確な検査を今や考慮する。さらに、これらの既存の検査に依拠するには、重大な制限が存在する。なぜならそれらが検出されるときまでに、かなりの腎損傷が既に起こってしまっているからである。糖尿病管理の分野で必要とされるものは、有効な処置および管理ストラテジーが潜在的糖尿病関連合併症（例えば、糖尿病性腎症および他の合併症）を防止するかまたは遅らせるために実行され得る場合に、十分早期の段階で予測可能な、早期診断および／または予測検査である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】米国特許第６，３２３，０３８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１１／００７９０７７号明細書
【非特許文献】
【００１５】
【非特許文献１】Ｄａｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，  ３１（３）：５９６−６１５  （２００８）
【非特許文献２】Ｂｅｉｓｓｗｅｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ５４：  ３２７４−３２８１  （２００５）
【非特許文献３】Ｎａｔｈａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  ｏｆ  Ｍｅｄ．，  ３５３（２５）：  ｐ．  ２６４３−５３  （２００５）
【非特許文献４】Ａｈｍｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  Ｔｒａｎｓ．，  ３１（Ｐｔ  ６）：１４１７−２２  （２００３）
【非特許文献５】Ｍａｕｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｒｅｎｉｎ−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，  ３：２６２−２６９  （２００２）
【非特許文献６】Ａｌｍｕｔｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌ．，  １０９（１）：７−１５  （２００６）
【非特許文献７】Ｍａｕｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，  ２；３６１（１）：４０−５１  （２００９）
【非特許文献８】Ｙｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ４９（１０）：２４８８−９８  （２００６）
【非特許文献９】Ｍｏｎｎｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  （２００８）
【非特許文献１０】Ｂｅｉｓｓｗｅｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，  ９２（１）：２１２−７  （１９９３）
【非特許文献１１】Ｄｙｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．，  ９１（６）：  ２４６３−９  （１９９３）
【非特許文献１２】Ｍｏｎｎｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １０４３：５６７−５８１  （２００５）
【非特許文献１３】Ｂａｙｎｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，  ２８（１２）：１７０８−１６  （２０００）
【非特許文献１４】Ｐｅｒｋｉｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ，  ７（４）：３３５−３５５（２０１２）
【非特許文献１５】Ｆｉｏｒｅｔｔｏ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ４３，  １３５８−６４  （１９９４））
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１６】
発明の要旨
本発明は、１型糖尿病または２型糖尿病のいずれかに罹患している被験体において、ある種の糖尿病関連合併症（例えば、糖尿病性腎症および他の関連障害（心血管疾患が挙げられるが、これに限定されない））を発生させるリスク、および／またはその進行の速度を決定するための方法を提供する。これらの検査は、被験体における根底にある糖尿病関連血管障害性変化（例えば、微小血管および／もしくは大血管損傷）を検出する。本発明はまた、２型糖尿病または１型糖尿病のいずれかを有する、合併症のリスクにある被験体に由来する生物学的サンプル（例えば、血液、血漿、尿）を、取り扱う、貯蔵する、または保存するための方法を提供する。被験体に由来する生物学的サンプルを分析して、集合サンプルから得た結果と、および／またはデータベースもしくは他において維持されようが、標準と比較される目的の１またはこれより多くの生体マーカーの量を決定するための方法が、さらに提供される。ある種の糖尿病関連合併症を発生させるリスクおよび／またはその進行の速度の分析に基づいて、被験体または被験体の群における糖尿病管理を改善するための方法が、さらに提供される。
【００１７】
好ましい実施形態は、生物学的サンプル（１またはこれより多くの血漿、血漿限外濾過液、または尿サンプルが挙げられるが、これらに限定されない）中の生体マーカー、具体的には、終末糖化産物（ＡＧＥｓ）および酸化産物（ＯＰｓ）のレベルを決定するための方法を提供する。これらの方法は、１またはこれより多くの生物学的サンプルから、生体マーカー（例えば、Ｎε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）；Ｎε−カルボキシエチル−リジン（ＣＥＬ）；グリオキサールヒドロイミダゾロン（ＧＨ１）；メチルグリオキサールヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）；３−デオキシグルコソンヒドロイミダゾロン（３ＤＧＨ）；メチオニンスルホキシド（ＭｅｔＳＯ）；および３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）、ジチロシン、ならびに／または２−アミノアジピン酸のレベルを検出するにあたって有用である。好ましい実施形態において、サンプル中の生体マーカーレベルは、好ましくは、液体クロマトグラフィー／トリプル四重極質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって決定される。生体マーカーをＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定するための１つの好ましい実施形態において、その固定相は、好ましくは、イオン対形成薬剤として使用されるヘプタフルオロ酪酸を有するＣ１８である。これは、その分析が２つのカラムを要求するものとは対照的に、単一のカラムで行われることを可能にする。本発明は、本発明のある種の他の方法とともに適用をさらに見出すさらなるカラムタイプおよび仕様をさらに企図する。例えば、そのより長い鎖長が原因で、１つのこのような実施形態において、ペルフルオロヘプタン酸を、ＬＣシステムにおいて、Ｃ１８  Ｓｙｎｅｒｇｉ  ＲＰカラムを使用して、イオン対形成薬剤として試験した。しかし予測外なことに、ペルフルオロヘプタン酸は、モデル試験系において、重要化合物の保持の喪失に起因して、ヘプタフルオロ酪酸ほどの成功裡の結果を生じなかった。
【００１８】
ある種の実施形態において、対イオンは、本発明のそのサンプル取り扱い、調製、および／または試験段階において含まれる。例えば、一実施形態において、ギ酸アンモニウムを、この対イオンが、ＰＦＨＡとともに使用される場合にクロマトグラフィーに対して有益な効果を有し得ることを示す最初の評価に基づいて対イオンとして試験したところ、それによって、遅く溶離してくる化合物の保持時間を短くし、このシステムの選択性を改善した。対イオンとしてギ酸アンモニウムを使用することの有望な仮説にも拘わらず、その特定のシステムは、予測外にも、他の試験した方法論よりあまり成功しなかった。
【００１９】
被験体がＤＮまたはＤＮと関連する障害を発生させるリスクを決定するための方法がまた、開発されている。上記方法は、糖尿病（例えば、１型糖尿病または２型糖尿病）を有すると診断された被験体から試験サンプルを得る工程、Ｎε−カルボキシルエチルリジン（ＣＥＬ）、メチルグリオキサールヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）およびＮε−カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）のうちの１またはこれより多くのレベルを測定する工程、ならびに上記値と、糖尿病性腎症の進行または非進行のいずれかと関連することが示された代謝産物レベルとを比較する工程を包含する。これらの実施形態のうちのある種のものにおいて、目的のさらなる生体マーカー（例えば、メチオニンスルホキシド（ＭｅｔＳＯ）、２−アミノアジピン酸（ＡＡＡ）、３−デオキシグルコソンヒドロイミダゾロン（３−ＤＧＨ）、グリオキサールヒドロイミダゾロン（Ｇ−Ｈ１）、３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）、および／またはジチロシン（ＤｉＴｙｒ））のレベルは、さらに測定され、糖尿病性腎症の進行および非進行のいずれかと関連することが示された代謝産物と比較される。
【００２０】
糖尿病のケアおよび治療（例えば、薬物療法、行動変容プラン、外科的介入ならびに器官および細胞移植など）を行うおよび／または予定するための方法がまた提供され、上記方法は、糖尿病患者が糖尿病関連腎疾患および／または他の糖尿病関連合併症を発生させるリスクを決定する工程ならびに上記患者の処置レジメンを調節する工程を包含する。処置レジメンとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：血糖降下剤、レニン−アンギオテンシン系を改変する薬物療法を含むさらなる処置、または糖尿病関連合併症（例えば、腎臓、眼または心血管の疾患）を遅らせるかもしくはその重篤度を低減することが意図された、低レベルのＡＧＥｓおよび／もしくは酸化産物を有する特別食。本発明のさらなる実施形態は、糖尿病関連合併症を発生させるリスクにあるか、または現在罹患しているかのいずれかである１名またはこれより多くの患者に対して具体的な分析ベースの個別化処置レジメンを開発するための方法を提供する。
【００２１】
なおさらなる実施形態において、糖尿病もしくは糖尿病関連合併症に現在罹患しているか、または糖尿病関連合併症を発生させるリスクにある１名またはこれより多くの患者において目的の１またはこれより多くの生体マーカー（例えば、ＣＭＬ、ＣＥＬおよび／またはＭＧ−Ｈ１、ＭｅｔＳＯなど）に関連する被験体由来データを取り扱うおよび／または分析する（例えば、相関させる）ための方法が、提供される。
【００２２】
別の実施形態において、本発明は、被験体由来生物学的サンプル（血漿、血漿限外濾過液、血液、尿、細胞、および／または組織などが挙げられるが、これらに限定されない）を取り扱うための方法を提供し、その結果、上記サンプル中の目的の１またはこれより多くの生体マーカーが、約１時間、２時間、３時間、…１０時間、１５時間、２０時間、２５時間、…５０時間、１００時間、１５０時間、数ヶ月、数日、または数年（適用可能な場合）の期間にわたって、本明細書で記載される方法に対して適切にアッセイ可能な状態、または容易にアッセイ可能にされる状態において維持される。これらの実施形態のうちのある種のものにおいて、上記生物学的サンプルは、１またはこれより多くのイオン対形成薬剤、キレート化剤（例えば、ヘプタフルオロ酪酸）、対イオン（例えば、ギ酸アンモニウム）、緩衝液、賦形剤、安定化剤、低温貯蔵条件、ならびに／または凍結乾燥技術および薬剤などとともに使用して、さらにアッセイ可能な状態において維持される。
【００２３】
好ましい実施形態において、本発明は、患者が既知の徴候および／または器官疾患もしくは他の糖尿病関連合併症のマーカーを示す前に、上記患者が糖尿病関連合併症（例えば、ＤＮおよび／またはＤＲが挙げられるが、これらに限定されない）を発生させるリスクを予測するために使用され得る生体マーカーを提供する。本発明は、多くの患者が経験する疾患の無症候期間の間に、糖尿病関連合併症に関して患者が発生させるリスク、またはその進行の速度を予測するための方法をさらに提供する。より具体的には、本発明は、糖尿病被験体（例えば、１型または２型）が腎疾患および／または心血管疾患を発生させるリスクを決定するために有用な１またはこれより多くの生体マーカーを提供する。
【００２４】
本発明は、高ＭｅｔＳＯレベルが、上記ＤＣＣＴ／ＥＤＩＣ研究の間に低いＣＶＤ発生率と関連したことを示す。提供される方法は、旧来のリスク因子の観察と比較して、糖尿病ヘルスケアにおいて予測可能な値を顕著に改善する。ある種の実施形態において、ＡＧＥであるＣＥＬのベースラインレベルは、心血管疾患のリスクおよび／または心血管疾患へのより遅い進行の速度を予測する。従って、１型糖尿病における心血管疾患リスクの早期の同定は、早期予防治療およびより良好な患者転帰を促進するために企図される。
【００２５】
なお他の実施形態において、本発明は、被験体において心血管疾患を発生させるリスクまたはその発生の速度を決定するための方法を提供し、上記方法は、上記被験体から得られた生物学的サンプル中に存在する目的の１またはこれより多くの生体マーカー（ＯＰｓ（例えば、ＭｅｔＳＯ）および／またはＡＧＥｓ（例えば、ＣＥＬ）が挙げられるが、これらに限定されない）のレベルを決定する工程を包含する。これらの実施形態のうちのいくつかにおいて、上記生物学的サンプルは、血液、血漿、血清、尿、および／または組織生検物のうちの１またはこれより多くを含む。ある種の好ましい実施形態において、上記サンプルは、血漿を含む。
【００２６】
本発明の心血管疾患／事象関連予測方法は、１またはこれより多くの既存の心疾患関連診断技術および／またはデバイス（心電図（ＥＣＧ）およびホルターモニタリングデバイス、心エコー図、心臓カテーテル検査、心臓コンピューター断層撮影法（ＣＴ）、ならびに／または心臓核磁気共鳴画像診断（ＭＲＩ）が挙げられるが、これらに限定されない）と組み合わされ得る。
【００２７】
なお他の実施形態において、心血管疾患のマーカーのレベルを決定するための１またはこれより多くのさらなる方法は、当該分野で公知であるように、被験体が１またはこれより多くの心血管疾患事象を発生させるリスクまたは速度を決定するために、本発明の予測法との組み合わせにおいて（例えば、その使用前に、同時に、またはその後に使用され得る。その１またはこれより多くのさらなるマーカーは、心血管疾患の存在の診断に役立つ、タンパク質もしくはポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、および核酸、脂質、リポペプチド、リポタンパク質、ならびに／またはサッカリド／炭水化物（例えば、モノサッカリド、ジサッカリド、オリゴサッカリド、およびポリサッカリド）、ならびにこれらの（例えば、２またはこれより多くの）組み合わせであり得る。例えば、種々のこのようなマーカーのレベルを決定するための診断検査は、Ｃ−反応性タンパク質、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド（例えば、ｐｒｏＢＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＢＮＰ、およびＢＮＰ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（例えば、ｐｒｏＡＮＰ、ＮＴ−ｐｒｏＡＮＰ、およびＡＮＰ）、心筋トロポニンＩ／Ｔ、Ｃ−反応性タンパク質、クレアチニン、血中尿素窒素（ＢＵＮ）、肝機能酵素、アルブミン、ならびに／または細菌エンドトキシンのレベルを決定するための市販の検査（しかしこれらに限定されない）である。心血管疾患のさらなる非限定的マーカーは、米国特許出願公開番号２００７／０２４８９８１；  ２０１１／００５３１７０；  ２０１０／０００９３５６；  ２０１０／００５５６８３；  および２００９／０２６４７７９（これらの各々は、参考として援用される）に記載される。
【００２８】
さらなる実施形態は、患者が１またはこれより多くの糖尿病関連合併症を発生させるリスクまたはその進行の速度を記載する報告を準備するためにさらに提供される。報告は、さらにまたは単独で、患者が心血管疾患を発生させるリスクまたはその進行の速度を記載することに関し得る。適切な報告は、技術者によって手書きで、および／または１またはこれより多くのデータベースおよび電子情報源から少なくとも一部、電子的に編集されるかのいずれかで作成され得る。上記報告は、１またはこれより多くのレシピエントまたはレシピエントの群（患者、患者の後見人もしくは他の被指名人、医師もしくは他の臨床医、および／または医療（例えば、糖尿病もしくは心血管疾患）のカウンセラーもしくはケア提供者、病院および／もしくはケア施設、滞在型もしくはリハビリ用ケア施設、保険業者などが挙げられるが、これらに限定されない）へと発送され得るおよび／または送信され得る（例えば、電子的にまたは別の方法で）。本発明は、個々の報告のレポジトリを維持することをさらに企図する。ここでは将来的なアクセスが管理され得、そのデータ、報告、または送信へのアクセスに関して料金（例えば、サブスクリプション、ライセンス、および／または販売）の受け取りが付随し得る。
【００２９】
なおさらなる実施形態は、適切な患者サンプル（例えば、血液、血漿、尿など）の入手後に、本発明の記載される方法を実施するために必要な材料のうちの１またはこれより多く、好ましくは全てを含むキットを提供する。好ましいキットは、本発明の方法を実施するための説明書および／または証拠資料をさらに含む。
【００３０】
本発明はまた、他の実施形態において、糖尿病関連合併症（例えば、腎疾患、眼疾患、または心血管疾患が挙げられるが、これらに限定されない）を発生させるリスクにある被験体を同定するための方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、生体マーカーの化学構造を示す（ＦＬ＝Ｎε−フルクトシルリジン；  ＣＭＬ＝Ｎε−カルボキシメチルリジン；  ＣＥＬ＝Ｎε−カルボキシルエチルリジン；  Ｇ−Ｈ１＝グリオキサールヒドロイミダゾロン；  ＭＧ−Ｈ１＝メチルグリオキサールヒドロイミダゾロン；  ３ＤＧ−Ｈ＝３−デオキシグルコソンヒドロイミダゾロン；  ＭｅｔＳＯ＝メチオニンスルホキシド；  ３−ＮＴ＝３−ニトロチロシン（３−Ｄｉｔｒｏｔｙｒｏｓｉｎｅ））。
【００３２】
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ〜２Ｄは、各生体マーカーを、ＤＮの「速い」進行（ＦＰ）として被験体の分類の確率に関連付ける予測式を展開するために使用されるロジスティック回帰モデルを示す。ＣＭＬおよびＭＧ−Ｈ１の値を、予測因子として使用される場合に対数変換し、次いで、予測確率プロットを作成する場合に変換を戻した。その３種の生体マーカーに関して（しかし同時に測定したＨｂＡ１Ｃ（ｐ＝０．２８）に関してではない）、ＦＰとしての分類の確率に有意な関係があった（ＣＭＬ  ｐ＝０．０２；  ＣＥＬ  ｐ＝０．０３；  ＭＧ−Ｈ１  ｐ＝０．０４８）。ＨｂＡ１ｃに関しては、その関係性は、５年を経てサンプル全体（ｎ＝１８６）に適合させた場合に有意であった（ｐ＝０．００６）。
【図２Ｃ−Ｄ】図２Ａ〜２Ｄは、各生体マーカーを、ＤＮの「速い」進行（ＦＰ）として被験体の分類の確率に関連付ける予測式を展開するために使用されるロジスティック回帰モデルを示す。ＣＭＬおよびＭＧ−Ｈ１の値を、予測因子として使用される場合に対数変換し、次いで、予測確率プロットを作成する場合に変換を戻した。その３種の生体マーカーに関して（しかし同時に測定したＨｂＡ１Ｃ（ｐ＝０．２８）に関してではない）、ＦＰとしての分類の確率に有意な関係があった（ＣＭＬ  ｐ＝０．０２；  ＣＥＬ  ｐ＝０．０３；  ＭＧ−Ｈ１  ｐ＝０．０４８）。ＨｂＡ１ｃに関しては、その関係性は、５年を経てサンプル全体（ｎ＝１８６）に適合させた場合に有意であった（ｐ＝０．００６）。
【００３３】
【図３】図３は、ロジスティック回帰モデルから計算されるように、その３種の有益な生体マーカー（ＣＭＬ、ＣＥＬ、およびＭＧ−Ｈ１）、およびＨｂＡ１ｃにおける１標準偏差の変化についてのオッズ比（および９５％  信頼区間）のフォレストプロットである。例えば、ＣＥＬにおける１  ＳＤ増大は、その速い進行群において存在するオッズ比の１．７２増大をもたらす。これらのプロットのｐ値は、図２Ａ〜Ｄに示されるものと関連付けられる。
【００３４】
【図４】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、および４Ｄは、それぞれ、皮質間質体積分率（４Ａ）；メサンギウム体積分率（４Ｂ）；全球性糸球体硬化（４Ｃ）；および全濾過表面（４Ｄ）を示す。
【００３５】
【図５】図５Ａおよび５Ｂは、それぞれ、ＭＧＨ１および皮質間質体積分率を示す。
【００３６】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、年齢、性別、処置割り当て、糖尿病継続期間、ＨｂＡ１ｃ、ＭＡＰ、ＧＦＲ、およびＡＣＲに関して調節した場合の、メサンギウム体積分率分析の部分残差プロットを示す。
【００３７】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、年齢、性別、処置割り当て、糖尿病継続期間、ＨｂＡ１ｃ、ＭＡＰ、ＧＦＲ、およびＡＣＲに関して調節した場合の、全濾過表面積分析の部分残差プロットを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、用語「糖尿病性腎症と関連する障害（または状態）（ｄｉｓｏｒｄｅｒ  （ｏｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）」とは、腎糸球体における毛細管の血管障害から生じる障害をいう。関連障害の非限定的な例としては、ネフローゼ症候群、慢性腎不全、および末期腎疾患が挙げられ得る。「糖尿病性腎症（ｄｉａｂｅｔｉｃ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）」とは、本明細書で使用される場合、腎糸球体における毛細管の血管障害によって特徴づけられる障害をいう。その用語は、キンメルスチール−ウィルソン症候群、結節性糖尿病性糸球体硬化症および毛細血管間糸球体腎炎（ｉｎｔｅｒｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）を包含する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、用語「心血管疾患（ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）」とは、心臓および血管の障害に言及し、動脈、静脈、細動脈、細静脈、および毛細管の障害を含む。心血管疾患の非限定的な例としては、心肥大、心筋梗塞、脳卒中、動脈硬化症、確認されたアンギナ、うっ血性心不全、および冠血流再建が挙げられる。心血管疾患のさらなる例は、当該分野で公知である。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「上昇した（ｅｌｅｖａｔｅｄ）」または「上昇（ｅｌｅｖａｔｉｏｎ）」とは、差異、例えば、目的の生体マーカー（例えば、ＯＰｓおよび／またはＡＧＥｓ）の決定もしくは測定されたレベルにおいて、１もしくはこれより多くの疾患の症状もしくは徴候を有しない、疾患を発生させる傾向を、または認識される医学的状態を有する被験体において同じ生体マーカーの参照レベルと比較して、統計的に有意なもしくは検出可能な増大の存在を意味される。いくつかの実施形態において、その参照は、閾値レベルであり、上回る任意のレベルは、「上昇した」と考えられる。同様に、おなじ生体マーカーのレベルより下回るかまたはそのレベル未満の、目的の生体マーカーの測定されたレベルは、「下がった（ｄｅｐｒｅｓｓｅｄ）」、「減少した（ｄｅｃｒｅａｓｅｄ）」または「低下した（ｌｅｓｓｅｎｅｄ）」などである。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「参照レベル（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｌｅｖｅｌ）」または「標準値（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｖａｌｕｅ）」とは、閾値レベルまたはコントロール被験体もしくはコントロール患者集団におけるレベルを意味することが意味される。参照レベルは、行われるアッセイに依存し、目的の有意な集団に対して、当該分野で公知の適切な方法およびアッセイを使用して、または本発明の方法を使用して、当業者によって決定され得る。
【００４２】
本明細書で使用される場合、用語「高トリグリセリド血症（ｈｙｐｅｒｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅｍｉａ）」は、１８０ｎｇ／ｍＬより大きいかまたはこれに等しい（例えば、≧  ２００ｎｇ／ｍＬ）トリグリセリドレベルが意味される。
【００４３】
本明細書で使用される場合、用語「高コレステロール血症（ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）」とは、被験体におけるコレステロールまたは総コレステロールのうちの少なくとも一方の形態の増大したレベルが意味される。例えば、高コレステロール血症を有する被験体は、≧  ４０ｍｇ／ｄＬ（例えば、≧  ５０ｍｇ／ｄＬまたは≧  ６０ｍｇ／ｍＬ）の高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）レベル、１３０ｍｇ／ｄＬ（例えば、≧  １６０ｍｇ／ｄＬまたは≧  ２００ｍｇ／ｄＬ）の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）レベル、および／または≧  ２００ｍｇ／ｄＬ（例えば、２４０ｍｇ／ｄＬ）の総コレステロールレベルを有し得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「高血圧症（ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ）」とは、収縮期および／または拡張期血圧の増大したレベルを意味される。例えば、高血圧症を有する被験体は、≧  １２０ｍｍＨｇ（例えば、≧  １４０ｍｍＨｇもしくは≧  １６０ｍｍＨｇ）である収縮期血圧および／または≧  ８０ｍｍＨｇ（例えば、≧  ９０ｍｍＨｇまたは≧  １００ｍｍＨｇ）である拡張期血圧を有し得る。
【００４５】
用語「患者（ｐａｔｉｅｎｔ（ｓ））」および「被験体（ｓｕｂｊｅｃｔ（ｓ））」とは、本明細書で使用される場合、特定の場合が示すとおりの単一の個体および個体の群（すなわち、２またはこれより多く）を含むことが理解される。適切な患者および／または被験体としては、哺乳動物が挙げられる。適切な哺乳動物患者および／または被験体は、ヒトが挙げられるが、これに限定されないことが理解される。よって、適切な哺乳動物患者および／または被験体は、コンパニオンアニマル（例えば、イヌ、ネコ、および／またはウマなど）ならびに生産動物（例えば、ウシ、および／またはブタなど）をさらに含む。
【００４６】
本明細書で使用される場合、用語「データベース（ｄａｔａｂａｓｅ）」とは、１またはこれより多くの構造化または非構造化情報レポジトリの任意の組み合わせを含む。ある種の好ましい実施形態において、データベースは全体としてまたは部分的に、サンプルまたはサンプルの集団（例えば、糖尿病を有すると診断されたまたは診断されていない１名またはこれより多くのヒト被験体に由来する生物学的サンプル）における目的の１またはこれより多くの生体マーカーの標準値を含む。コンピューター読み取り可能な媒体「上に」または「中に」データベースが配置されているか否かの間に意図した区別はない。好ましい実施形態において、データベースは、コンピューター読み取り可能な媒体からアクセス可能であるか、またはその中に永久的にまたは半永久的に記憶される。
【００４７】
ＩＩ．患者が糖尿病性腎症を発生させるリスクを予測するための方法
Ａ．評価されるべきマーカー
特定の終末化学産物は、実証された腎症および網膜症を有する臨床集団における具体的な糖化および酸化経路の活性化の調査に基づく注意深く実証された転帰研究において同定されている。これらの経路は、初期糖化産物（ＥＧＰｓ）のある範囲の形成をもたらす（化学的に反応性のαジカルボニル化合物、メチルグリオキサール（ＭＧ）、３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）、およびグリオキサール（Ｇ）が挙げられる）。そのα−ジカルボニルは、次に、後の段階の化学反応の形成をもたらして、ＨｂＡ１ｃ形成とは無関係のプロセスにおいて、終末糖化産物（ＡＧＥｓ）を形成する。増大したグルコース誘導性酸化的ストレス（ＯＳ）はまた、細胞酸化機構を制御するプロセスにおける本質的な差異によって引き起こされ得、その機構は、糖尿病合併症を生じる主要経路を直接的にかつ無関係に活性化し得る。ジカルボニルストレスおよびＯＳはともに、糖尿病合併症に罹りやすい人々（すなわち、高リスク部分集団）において選択的に活性化され、糖化タンパク質および酸化タンパク質ならびに脂質副生成物のより高いレベルを生じるが、ＨｂＡ１ｃにおける変化に直接的傾向はないことが見出された。
【００４８】
本発明は、測定をより正確にするために開発された、これらの化学的経路の選択された終末糖化産物および酸化産物の血中レベルおよび尿レベルを評価するアッセイを提供する。いかなる特定の作用機構にも限定されないが、これらの終末産物（すなわち、ＡＧＥｓおよびＯＰｓ）が糖化経路および酸化経路のゆっくりとターンオーバーする終末産物を表すことから、臨床転帰研究におけるそれらの使用は、１またはこれより多くの生物学的サンプル（例えば、血液、血漿、および／または尿サンプル）中でチェックされる場合に、長期の生成過剰を必ずしも反映しない短時間作用性の化学前駆物質の測定より優れていることが企図される。
【００４９】
これらの研究において、１型糖尿病においてインビボで定量的に最も高いＡＧＥｓは、メチルグリオキサール（ＭＧ）、３−デオキシグルコソン（３ＤＧ）、およびグリオキサールによって改変されるアルギニン残基に由来するヒドロイミダゾロン（ＨＩ）である（それらの個々の合成経路から同様に生成される）ことが見出された。これらの研究における他の定量可能なＡＧＥｓとしては、グリオキサール−リジン由来のカルボキシメチル（ＣＭＬ）、およびＭＧ−リジン産物カルボキシルエチルリジン（ＣＥＬ）が挙げられる。酸化およびニトロ化のマーカー（メチオニンの酸化によって形成されるメチオニンスルホキシド（ＭｅｔＳＯ）、リジン残基から形成される２−アミノアジピン酸が挙げられる）、ならびに３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）およびジチロシンの生成をもたらすニトロソ化損傷（ｎｉｔｒｏｓｉｖｅ  ｄａｍａｇｅ）の他のマーカーがまた、測定されている。糖尿病集団とコントロール集団との間に実質的な差異が存在する（約５〜１５倍）ことが見出された。糖尿病のＡＧＥｓおよびＯＰｓにおいて観察された前例のない増大、および個体間で観察されたその実質的な差異は、これらの生体マーカーレベルが、単独でまたはＨｂＡ１ｃに加えて、糖尿病関連合併症を発生させるリスクが非常に高い被験体を、そのリスクが非常に低い被験体に対して区別する能力を顕著に鋭くする潜在的可能性を有することを示す。合併症を最も予測する目的の重要なＡＧＥｓおよびＯＰｓ（ヒドロイミダゾロンおよびＭｅｔＳＯが挙げられる）は、ＨｂＡ１ｃとの相関はないことが示された。このことは、それらが合併症に関連するが、個々の患者の特性に基づく糖血症のレベルに特有に応答する化学経路によって生成されることを示唆する。
【００５０】
好ましい実施形態において、ＡＧＥｓおよびＯＰｓ生体マーカーは、患者が糖尿病性腎症または他の合併症を発生させるリスクを評価するために、血漿および／または尿サンプル中で測定される。注意深く規定された腎症へと進行する者および進行しない者におけるレベルを比較することによって、具体的なＡＧＥｓのレベルが、糖尿病被験体が糖尿病関連ＤＮまたはＤＮと関連する障害を発生させるリスクの決定を可能にする。より好ましい実施形態において、３種のＡＧＥｓ（すなわち、Ｎε−カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）；  Ｎε−カルボキシルエチルリジン（ＣＥＬ）、および／またはメチルグリオキサールヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１））の血漿濾液レベルは、単独でまたはＨｂＡ１ｃとの組み合わせにおいて、ＤＮの早期進行の指標である。さらにより好ましい実施形態において、ＭＧ−Ｈ１レベルのみが、被験体がＤＮを発生させるリスクの独立予測因子である。本明細書で記載される方法は、以下の生成物（図１に示される）を定量するために使用され得る。
【００５１】
アルギニン由来ＡＧＥｓ：  これらの生体マーカーとしては、ヒドロイミダゾロン（ＨＩ）（これは、グリオキサール、ＭＧ、および３−ＤＧによって改変されるアルギニン残基に由来するＡＧＥである）が挙げられ、それぞれ、ＧＨ１（グリオキサールヒドロイミダゾロン）、ＭＧ−Ｈ１（メチルグリオキサールヒドロイミダゾロン）、および３ＤＧ−Ｈ（３−デオキシグルコソンヒドロイミダゾロン）を含む。
【００５２】
リジン由来ＡＧＥｓ：  測定され得る他のＡＧＥｓは、リジンベースであり、グリオキサール由来のＮε−カルボキシメチル−リジン（ＣＭＬ）、およびＭＧ由来のＮε−カルボキシルエチルリジン（ＣＥＬ）が挙げられる（Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ３７５（Ｐｔ  ３）：５８１−９２  （２００３））。測定され得る他のＡＧＥｓとしては、より旧来の生成物であるペントシジン（これは、ＨＰＬＣおよび蛍光検出によって測定される）が挙げられる（Ｓｅｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ４０（Ｓｕｐｐｌ  Ｉ）：３０２Ａ  （１９９１）を参照のこと）。
【００５３】
タンパク質に対する酸化的損傷の定量的マーカーがまた、測定され得、メチオニン上のスルフヒドリル基の酸化によって形成されるメチオニンスルホキシド（ＭｅｔＳＯ）が挙げられる（Ｙｕ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ４９（１０）：２４８８−９８  （２００６））。チロシン架橋、ジチロシン、ならびにタンパク質に対する複合的酸化的／ニトロ化損傷の広く研究されているマーカー、３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）はまた、他の実施形態において測定され得る（Ｇｅｉｂａｕｆ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，  ３８９：１３６−１４０  （１９９６））。糖尿病合併症の発生における酸化的ストレスの役割に関して得られる情報を拡充するために、別の特有の酸化産物である２−アミノアジピン酸（リジル残基の金属触媒酸化から生じる生成物）（Ｓｅｌｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊ．，  ４０４（２）：２６９−７７  （２００７））は、なおさらなる実施形態においてさらに測定される。
【００５４】
尿クレアチニンレベルはまた、生成物／クレアチニン尿分析物含有量の特有の発現を提供するために決定され得る。尿および血清の「遊離画分（ｆｒｅｅ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）」決定は、各分析物の腎クリアランス速度の計算を可能にする。
【００５５】
１型糖尿病での画期的転帰研究において得られたデータは、２型糖尿病を有する患者に適用可能である。主要な臨床試験が、ＤＣＣＴおよびイギリス糖尿病前向き研究（Ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｓｔｕｄｙ）（「ＵＫＰＤＳ」）において示されたように、１型糖尿病および２型糖尿病の両方において、血糖管理とＤＮおよびＤＲの進行との間の類似の顕著な関係を示していることは十分に認識される（ＤＣＣＴ／ＥＤＩＣ，  ＪＡＭＡ，  ２８７（１９）：２５６３−９  （２００２）；  Ｈｏｌｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．，  ３５９（１５）：１５７７−８９  （２００８））。このことは、両方の糖尿病タイプに関する病因の類似性を示唆する。これらの考慮事項は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ（ＡＤＡ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｉｓｔｓ（ＡＡＣＥ）、およびＥｕｒｏｐｅａｎ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ（ＥＡＳＤ）を、類似のＨｂＡ１ｃガイドラインを推奨して、１型糖尿病および２型糖尿病の両方においてＤＲおよびＤＮを防止するするように導いた（例えば、Ｎａｔｈａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，  ３１（１）：１７３−５  （２００８）；およびＲｏｄｂａｒｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，  １４（６）：７９１−５．  （２００８）を参照のこと）。
【００５６】
Ｂ．サンプル収集
好ましくは、サンプルの収集、貯蔵、および処理の方法は、本明細書で記載されるように厳密に制御される。なぜなら不適切な取り扱いは、人工的なサンプル酸化をもたらし得るからである。貯蔵された血漿サンプルで測定される多くのＡＧＥｓが、数年にわたって安定であることが見出されている。受容可能な安定性は、−８０℃において１０〜１５年間貯蔵された血漿サンプルにおけるレベルと、糖尿病被験体から新たに採取された血漿中のものと比較した場合に、類似の分析物レベルを観察することによって確認された。
【００５７】
好ましくは、サンプル調製の間に、人工物の形成を避ける手段がとられる。例えば、以下の工程のうちの１またはこれより多くが、サンプル収集、貯蔵、および／または試験前の調製に関して企図される：４℃での血漿からの赤血球の迅速な分離；血液サンプル中でのキレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）の使用；保存剤もしくは抗酸化剤（例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ））の添加；即座の急速凍結（例えば、ドライアイス上で）；ならびに／または−８０℃での貯蔵は、人工物の形成を最小限にするためにとられ得る工程の例示である。
【００５８】
１つの好ましい実施形態において、血漿サンプルは、注意深く規定されたプロトコルによって収集される（ＥＤＴＡ中での収集、即座に遠心分離して赤血球（ＲＢＣｓ）を沈殿させること、４℃において血漿をＲＢＣから分離すること、続いて、即座に凍結および−８０℃での長期貯蔵を含む）。一実施形態において、このプロセスを使用すると、ＭｅｔＳＯレベルは、血清中で人工的ＯＳを示した、適宜扱われなかった同じサンプルと比較した場合、予測された範囲にあった。
【００５９】
これらの観察に基づいて、好ましい実施形態において、血漿の生物学的サンプルは、貯蔵されたサンプル中でのＯＰおよびＡＧＥｓの測定に好ましい。なぜならそれは、キレート化剤（ＥＤＴＡ）を含み、収集後に即座に遠心分離されかつＲＢＣから分離され、急速凍結されるからである。血清は、他方で、分離および貯蔵の前に室温において凝固を受けねばならず、従って、タンパク質を白血球ミエロペルオキシダーゼおよび他の酸化促進酵素に曝露することになる。血清はまた、微量金属（ＦｅおよびＣｕ（これらはともに、自発的なインビトロでの酸化的ストレスを促進し得る））のキレート剤を含まない。
【００６０】
好ましい方法において、血漿サンプルは、１型糖尿病または２型糖尿病のいずれかと診断された被験体から収集され、その生体マーカーのうちの１またはこれより多くのレベルがその後決定される。その好ましいサンプルは、血漿限外濾過液である。この遊離画分は、マイクロスピンフィルタ（１０，０００  ＭＷフィルタカットオフ，  ５０μｌ  アリコート）を通して４℃で遠心分離することによって調製され得る。酸化および糖化によって損傷を受けるタンパク質の分解および置換によって、タンパク質の質および機能的完全性を細胞が維持することは、この画分を測定するための道理である（Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ３７５（Ｐｔ  ３）：５８１−９２  （２００３）およびＧｏｌｄｂｅｒｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ４２６（６９６８）：８９５−９  （２００３）を参照のこと）。これは、タンパク質分解、その酸化した、糖化した、およびニトロ化したアミノ酸を遊離付加物として遊離することによって起こり、続いて、血漿へと放出され、尿中に排泄される（Ｔｈｏｒｎａｌｌｅｙ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ３７５（Ｐｔ  ３）：５８１−９２  （２００３）を参照のこと）。これらの遊離付加物は、ＡＧＥｓの組織破壊が起こるにつれて血漿へと放出されることから、血漿濃度の変化は、高血糖の有害な影響を示す新たなマーカーを提供すると同時に、糖尿病における組織損傷を反映する。
【００６１】
付加物残基は、血漿タンパク質と化学的に反応し結合される。よって、いくつかの実施形態において、その生成物のうちのいくらかが酸に不安定であることから、化学的に結合した生成物は、適切な酵素を使用して徹底的な連続的酵素消化後に決定される。使用され得る酵素の例としては、ペプシン、プロナーゼＥ、アミノペプチダーゼおよびプロリダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。血漿タンパク質に化学的に結合した生成物を消化するための方法は、Ａｈｍｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ３６４（Ｐｔ  １）：１−１４  （２００２）に記載される。
【００６２】
試験される生物学的サンプルが尿を含むある種の実施形態において、その尿中の生体マーカーは、好ましくは、マイクロスピンフィルタ（１０，０００  ＭＷフィルタカットオフ）を通して４℃での遠心分離によって調製される尿濾液から測定される。尿濾液を調製するための方法は、例えば、Ａｈｍｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ４８：１５９０−１６０３  （２００５）に記載される。
【００６３】
超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）用の１２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，  ＤＥ）を伴うＡｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  ６４９０  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＭＳ  Ｓｙｓｔｅｍのようなシステムは、他の機器を超える、分析物感度において約１０００倍の増大、およびサンプルスループットにおいて４倍の改善を提供することが見出されている。イオン対形成薬剤および技術を使用するＨＰＬＣ方法論は、化合物の複雑な混合物を分離するために使用され得るが、それらは、考慮される必要があるいくつかの欠点を有し得る。例えば、イオン対形成薬剤は、ＨＰＬＣポンプ性能に伴う困難を引き起こす傾向があるので、用心および頻繁なポンプ洗浄が、そのシステムを適切に機能させ続けるために必要とされ、イオン対形成システムは、長い再平衡化時間を要求し、これはハイスループット環境をデザインすることをより困難にし、最終的に、イオン対形成薬剤は、標的化合物のシグナルのイオン抑制および潜在的なシグナル喪失を引き起こし得る。本発明は、ある種の実施形態においてイオン対形成薬剤を成功裡に使用するための最適化された方法を提供する。本発明の教示の利益を有する当業者は、最適な予測結果のためにイオン対形成薬剤および試験条件を選択し得ると思われる。
【００６４】
なお他の実施形態において、別の有用な方法論は、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）である。順相クロマトグラフィーのように、化合物の溶離の順序は逆になり、疎水性の化合物ほどが早期に溶離し、親水性の化合物ほどカラムに保持され、化合物の混合物中に存在する親水性化合物の増強された保持および以前は同時に溶離しているピークのうちのいくつかを分離するのを助け得る特有の選択性を含むいくつかの利点を提供する。このシステムにおいて使用される緩衝液は、ＭＳ／ＭＳ検出にとって理想的である（低バックグラウンドおよびイオン抑制）。そのシステムのｐＨを変更すると、そのシステムの選択性を改変するための代替の方法が与えられ得る。ある種の実施形態において、進化したコア−シェル型技術またはＵＨＰＬＣ構成を含み、ハイスループット適用（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｓｈｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，  Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，  ＣＡ）を含む）を施しやすいカラムは、本発明の種々の実施形態において都合良く使用される。
【００６５】
本発明のさらなる実施形態は、Ｃ１８固定相（これは、好ましくは、異なる選択性および極性化合物の増強された保持に関して適切に改変されている）を利用する方法を提供する。これらの代替のシステムのうちのいくつかに伴う緩衝液ｐＨの改変は、より良好な保持および異なる化合物選択性をもたらすはずである。この技術のうちのいくつかの例としては、イオン対形成なしに極性化合物の保持のためのエーテル連結フェニル基を有するＳｙｎｅｒｇｉ  Ｐｏｌａｒ−ＲＰ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．，  Ｔｏｒｒａｎｃｅ，  ＣＡ）、または極性選択性および弱アニオン交換能力のための、ある種の実施形態において極性化合物の保持を増大するためにより高い緩衝液ｐＨで利用され得るＬｕｎａ  ＮＨ２相（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｉｎｃ．）が挙げられる。
【００６６】
ＨＰＬＣ方法論における混合モード固定相は、さらなる実施形態における使用に関してさらに企図される。例示的なカラムは、Ｃ１８および１つのユニット（カラム）へのイオン交換能力を併せ持つ。そのイオン交換能力を何倍にもすることで、イオン対形成薬剤の効果を模倣し得る。よって、カチオン交換能力を有する混合モードカラムは、いくつかの実施形態において具体的に企図される。
【００６７】
Ｃ．生体マーカーアッセイおよびＤＮを発生させるリスクの決定
１つの好ましい実施形態において、上記で考察されるように調製される血漿および尿中の生体マーカーのレベルは、液体クロマトグラフィー／トリプル四重極質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって決定される。注意深く改変された条件を含む方法を利用すると、その目的の生体マーカーは、安定な同位体置換された標準物質による内部標準化を利用して測定される。
【００６８】
血漿および尿生体マーカーの各々の代表的概算値を経時的に提供するために必要とされる最適なサンプル数を決定するために、多数の測定値を使用して、各分析物の受容可能な定量的概算値を計算した。このアプローチによる代表的計算は、５年間にわたって、１０名の患者につき４〜６サンプル／糖尿病被験体において尿ＡＧＥであるペントシジンの測定に基づいて生じる。これらの測定のために、個人間分散＝７．６４×１０−７および個人内分散＝２．０６×１０−６を決定した。従って、全分散＝個人間分散＋個人内分散＝７．６４×１０−７＋２．０６×１０−６＝２．８２×１０−６。そうすると、同じ個人からのＮ回の観察の平均に関して、平均分散は、＝個人間分散＋個人内分散／Ｎまたは７．６４×１０−７＋２．０６×１０−６／Ｎ。
【００６９】
これらの計算に基づくと、個人内の平均分散が個人間構成要素未満であるか否かが決定され得る。以下の表1に示されるように、Ｎ＝３は、この目的を達成する。なぜなら２．０６×１０−６／３＝６．８７×１０−７であり、これは、１．４５×１０−６  平均分散値（表の３行目）未満だからである。４より大きいサンプルサイズに関しては各さらなる観察が、サンプルサイズ１からの＜５％  全低減を与えることから、分析数を増大することによってこれらの研究ではほとんど何も得られない。
【００７０】
データベースは、腎疾患または他の合併症を発生させるリスクにある患者を示す種々の生体マーカーのレベルから編集されている。非糖尿病レベルは、表１に示されるように、糖尿病において認められるものの約１／３〜１／４である。一実施形態において、ＣＥＬ  ＜０．０４２（０．０２０〜０．０４２）、ＭＧ−Ｈ１  ＜０．１０３（０．０３０〜０．１０３）およびＣＭＬ  ＜０．０６２（０．０３３〜０．０６２）というレベルは、その個体がＤＮから保護される９４％の可能性を示す（変化の下方の三分位において）。
【００７１】
その３種の生成物のレベルを、非進行者と比較して、速い進行者において有意に高かった（ＧＢＭ変化の上方の四分位）。この分析を、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ法によって行った。
【００７２】
【表１】
2020523580.tif 000003
【００７３】
ＧＢＭの進行性の肥厚化（ＤＮ進行）に対する任意の生成物の線形回帰分析は、Ｒ二乗（相関係数）（これは、各生体マーカーの予測の程度の尺度である）が、ＨｂＡ１ｃ単独と比較して、その３種の生体マーカーとＨｂＡ１ｃに関してより大きかったことを示す。例えば、表２において、ＨｂＡ１ｃは、予測値４．７％（０．０４７）、ＣＭＬ  ０．０２６％などを説明する。その３種の生体マーカー＋Ａ１ｃの合計は、１１．６％であった。生体マーカーを一度に測定する値は、Ａ１ｃに対する加算である。
【００７４】
【表２】
2020523580.tif 000004
【００７５】
別のタイプの分析は、オッズ比を計算することを可能にするロジスティック回帰分析である。これは、各生成物のレベルに対して線形的様式で、ｄＮへの進行のリスクの増大を予測することを可能にする。一実施形態において、これは、おそらく定量的リスク予測に最も近いとして企図され、本明細書で記載される場合、約１０〜５０％  リスクを予測する。
【００７６】
その３種の生体マーカーの値の下位の三分位は、ＣＥＬ＜０．０４２（０．０２０〜０．０４２）、ＭＧ−Ｈ１＜０．１０３（０．０３０〜０．１０３）およびＣＭＬ＜０．０６２（０．０３３〜０．０６２）に関しては、その個体がＤＮから保護される可能性が９４％であることを示した（変化の下位の三分位において）。
【００７７】
その３種の生体マーカーの各々は、ＨｂＡ１ｃとの組み合わせにおいて、ＤＮへの進行を個々に予測し、腎臓変化（ＧＭＢ幅の増大）の増大した予測力の合計は、Ａ１ｃの１つの測定値に関する４．７％からその３種の生体マーカーに関する１１．６％へと増大される。これは、ＨｂＡ１ｃ単独より２．５倍であるかまたは２４７％大きい、７．９％の増大を表す。
【００７８】
ロジスティック回帰によって行われる分析は、ＨｂＡ１ｃ（図２Ａ）と比較して、その３種の生体マーカーのレベル（Ｘ軸）に対してＤＮの進行のオッズ（ｙ軸）を示す（図２Ｂ〜２Ｄ）。ＣＥＬ、ＭＧ−Ｈ１およびＣＭＬの生体マーカーに関する進行のオッズ比は、変化の各１標準偏差に関して６８〜９２％であり、以下の表３に提供される。
【００７９】
【表３】
2020523580.tif 000005
【００８０】
１０種の天然のおよび内部安定重同位体（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔａｂｌｅ  ｈｅａｖｙ  ｉｓｏｔｏｐｅ）置換されたＡＧＥおよびＯＰ標準物質を、データベースを作成するために、市販の供給源からまたはカスタム合成によって獲得した。市販の標準物質としては、ＣＭＬ、ＣＥＬ、Ｇ−ＨＩ、ＭＧ−Ｈ１、および３ＤＧ−Ｈが挙げられる。終末酸化産物（ＯＰｓ）としては、ＭｅｔＳＯ、３−ＮＴ、ＡＡＡ、およびＤｉＴｙｒが挙げられた。
【００８１】
これらの精密診断検査は、個々の糖尿病患者が彼らの疾患と関連する特定の合併症を発生させるリスクを評価する。これらの精密診断検査は、好ましくは、主要な臨床検査施設に提出された生物学的サンプル（例えば、血液サンプル）に対して行われる。好ましい実施形態において、その試験は、１〜１０種のＡＧＥｓおよびＯＰｓ生体マーカー（生体分子）の存在および量を同定する。糖尿病合併症の発生のリスクプロフィールは、疾患なしの個体および種々の確認された疾患ステージにある個体から得られるデータとの比較に基づいて、構築される。この情報は、処置を、個々の患者のプロフィールにまたは患者ケアシステムおよび支援ネットワークの中の他のものに対して具体的に調節することによって、改善されたケアを届けるために、発注している医師に送られる。あるいは、単純化した、または詳細な報告は、患者に直接送られ得る。患者に対して個別化したコスト効果的な処置プランにますます焦点が当てられていることから、この情報へのアクセスは、ますます価値あるものとなり、市場において必要なものとなると思われる。
【００８２】
ＩＩＩ．糖尿病のケア方法
本明細書で記載される方法は、ヘルスケア提供者が、血糖管理の適切なレベルを達成して、糖尿病関連合併症（例えば、ＤＮ、ＤＲ、および／または心血管疾患）を遅らせるまたは防止するために、糖尿病個体にとってリスクおよびコストが適切な治療レジメンを選択することを可能にする。本発明の生体マーカーおよび関連方法は、現行の「至適基準」（ヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）である）と比較して、腎臓合併症の予測値の３倍超であることが企図される。さらに、目的の生体マーカーが、網膜症、血管疾患へと進行する傾向（またはこれらを発生させるリスク）、ならびに心臓発作および脳卒中のリスクの早期の予測因子であり得ることは、さらに企図される。これらの合併症の早期進行を症状の前に予測する診断検査は、医師および患者が、転帰を有意に改善し得る処置および行動における個々の調節を行うことを目に見えて可能にする。高められた転帰は、生活を改善し、年間数十億ドルものヘルスケア費用を節約する。
【００８３】
糖尿病ケアの現在のパラダイムは、「画一的（ｏｎｅ  ｓｉｚｅ  ｆｉｔｓ  ａｌｌ）」のものである。パラメーターは、全ての患者に対して設定され、積極的な専門化した処置は、その処置の支払いが可能である者または重大な合併症を既に経験している者のいずれかに提供される。糖尿病の処置は、既に起こってしまったものについての後ろ向き情報を提供する検査に伴ってしばしば行われ、続いて、やって来る問題を防止する積極的な個別化処置よりむしろ、それら問題に対処する「キャッチアップ（ｃａｔｃｈ−ｕｐ）」処置が行われる。高感受性個体に必要とされる積極的な糖尿病処置は、長い目で見ればコスト効果的であり得るが、目先だけ見ればそれらはときおりより高価であり、低血糖および薬物副作用というより高いリスクが付随する可能性がある。従って、高リスク個体の早期同定は、増大したリスクおよび新たな薬理学的因子および新たに進化している高度技術処置の費用に対して潜在的な利益とバランスをとる必要がある。糖化／酸化ベースの診断アッセイは、糖尿病の最も早期のステージの間に、糖尿病合併症の高リスク、中程度リスク、並の（ｍｏｄｅｒａｔｅ）リスク、または低リスクにある者の同定を可能にすることによって、予防的介入を顕著に変化させるはずである。本発明の方法は、血管障害による損傷の実際の蓄積および下流で生じる合併症の前に、糖尿病関連合併症を発生させる高リスク（または上昇したリスク）にある者のために、その処置パラダイムをある時点に費用効果的にシフトする基礎を提供する。リスクおよびコストが適切な治療レジメンは、次いで、血糖管理の適切なレベルを達成するために実行され得る。例えば、合併症に最も罹りやすいと同定された者は、集中的なインスリン送達およびモニタリングシステム、膵臓移植または糖尿病発症に近い人工膵臓を開始することによって、一般に達成されるより厳密な血糖管理目標（ＨｂＡ１ｃ＜６．０％）を有し得る。これらのリスクのある目標は、この正常に近い血糖を有する個体が、遺伝的素因とは無関係に、糖尿病合併症を発生させないという観察によって正当化され得る。
【００８４】
他の血管リスク因子の早期のより積極的な処置、または低レベルのＡＧＥｓおよび／またはＯＰｓを伴う特別食はまた、考慮され得る。その検査に伴って検出される個体の高リスクプロフィールを考慮すると、新たな治療剤のリスクに関して異なるガイドラインが、同様に正当化され得る。不都合な毒性の化学経路を遮断して、合併症を遅らせ得るまたは停止し得る治療アプローチの開発はまた、これらの方法によって提供される情報、ならびに糖尿病合併症の原因となる基礎的な生化学的機構および経路に関するその後のさらなる研究によって刺激され得る。
【００８５】
他の実施形態において、これらの個体は、レニン−アンギオテンシン系を改変する薬物療法を投与され得（例えば、Ｍａｕｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｅｎｉｎ−Ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ−Ａｌｄｏｓｔｅｒｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍ，  ３：２６２−２６９  （２００２）を参照のこと）、コレステロールおよびＶＬＤＬレベルが着手され得る（例えば、Ａｌｍｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，  １０９（１）：７−１５  （２００６）；  Ｄｅｇｅｎｈａｒｄｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ４４（７）：１１３９−４５  （１９９８）；  およびＲｏｓａｒｉｏ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ６（６）：４５５−６２  （２００６）を参照のこと）。代わりに、またはさらに、低レベルのＡＧＥｓまたは酸化産物を伴う特別食（Ｋｏｓｃｈｉｎｓｋｙ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９４（１２）：６４７４−６４７９  （１９９７））は、本発明の方法を使用して測定される目的の生体マーカーの観察されるレベルに基づいて使用され得る。糖尿病合併症の原因となる基礎的な生化学的機構および経路に関するこれらの研究によって提供される情報はまた、不都合な毒性の化学経路を改変して、ＤＮ、ＤＲ、および／またはＣＶＤを遅らせ得るまたは停止し得る治療アプローチの開発を刺激し得る。
【００８６】
被験体が糖尿病関連合併症（例えば、ＤＮ）を発生させるリスクに基づく糖尿病管理を改変するために使用され得る薬物の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：  メトホルミン（Ｂｅｉｓｓｗｅｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，  ２９：６Ｓ９５−６Ｓ１０３  （２００３）；およびＢｅｉｓｓｗｅｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ４８：１９８−２０２  （１９９９））；アミノグアニジン（Ｌｏ，  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，  ５：１７２  （１９９３）；  Ｈｉｒｓｈ，  Ｊ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃａｒｂｏｈｙｄ．  Ｒｅｓ．，  ２３２：１２５−１３０  （１９９２）；  Ｂｒｏｗｎｌｅｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ，  １５（１２）：１８３５−４３  （１９９２）；およびＨａｍｍｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．，  ８８：１１５５５−１１５５８  （１９９１））；ならびにチアミンおよび／またはベンフォチアミン（Ｈａｍｍｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．，  ９（３）：２９４−２９９  （２００３））。さらなる薬物、生物薬剤、および現在認可されているかまたは開発中の薬剤は、本発明の改良法における使用がさらに見出される。
【００８７】
糖化および酸化的ストレスの生体マーカーのレベルは、進行した糖尿病性網膜症（ＤＲ）および糖尿病性腎症（ＤＮ）の発生およびこれらへの進行の経時的な速度に関するリスク因子である。規定された転帰に対する糖化および酸化の生化学的生体マーカーの効果は、ＤＲ、ＤＮおよびＣＶＤ症例ならびにコントロールを含む症例コホートデザインを使用して評価され得る。各選択された被験体に関しては、多数の特定された時点で得られた生物学的サンプル（例えば、血漿および／または尿）を使用するが、例えば、ＤＣＣＴ無作為化；ＤＣＣＴ  １年訪問；ＤＣＣＴ閉鎖（＝ＥＤＩＣベースライン）；および糖尿病介入および合併症の疫学治験（Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｔｒｉａｌ）（ＥＤＩＣ）１年に限定されない。これは、適切なサンプル数および分布を提供して、目的の各生体マーカーを表すことが企図される。
【００８８】
１つの企図された実施形態において、本発明の方法は、１型糖尿病において微小血管および大血管の疾患の進行に関するリスク因子を評価するために使用され得る。３つの主な転帰は、以下である：進行した網膜症の発生；（眼底撮影または汎網膜光凝固術（レーザー）の要件を介して検出可能な増殖性糖尿病性網膜症（「ＰＤＲ」）、腎症；（（顕性）アルブミン尿（＞３００ｍｇ  アルブミン／２４時間）もしくは末期腎疾患（「ＥＳＲＤ」）の発生）；ならびに心血管疾患事象の発生。アルブミン排泄率は、ＤＣＣＴの間に年間のアルブミン排泄率の４時間の測定およびＥＤＩＣの間の１年おきの（半年（ｈａｌｆ／ｙｅａｒ））測定から評価される。複合心血管転帰としては、致命的なもしくは非致命的な心筋梗塞もしくは脳卒中、虚血性アンギナ、血管再建、または年１回のＥＣＧで検出される無症候性ＭＩが挙げられる。さらに、症例対照デザインは、その３つの転帰（症例定義）の各々に関して上記の目的を試験するために効率的な方法を提供する。しかし、その治験終了時にそれらの事象なしの間からのコントロールの単純な無作為サンプルは、その症例より長い平均曝露継続時間のために偏りがある。ネスト化症例対照研究（ｎｅｓｔｅｄ  ｃａｓｅ−ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｔｕｄｙ）は、各選択された症例が観察されたときにリスクにある者の間からコントロールを無作為にサンプリングすることによってこの偏りを回避する。次いで、そのデータは、症例対照セットによって層化された条件付き回帰モデル、または等しく、層化されたようなＣｏｘ比例ハザードモデルを使用して分析される。各転帰に関して、１２５症例と２５０コントロールは、８５％検出力を提供して、両側で０．０５レベルでのＳＤ差あたりオッズ比  １．３９を検出する。３つの別個の症例定義を用いれば、３つの別個のネスト化症例対照下位研究が、３×３７５＝１１２５被験体までを要求できた。あるいは、症例コホートアプローチが使用され得、その中で単一ベースラインの無作為にサンプリングされた「下位コホート」は、各症例定義に関するコントロールの基礎を提供するように、完全コホートから選択される。所定の症例対照サンプルサイズのこのデザインの効率（検出力）は、同じサイズのネスト化症例対照研究のものに等しい。従って、各症例定義に関しておよそ２５０コントロールをもたらす症例コホートデザインは、生体マーカーとこれらの転帰の各々との意味ある関連付けを検出する優れた検出力を提供する。
【００８９】
１つの現在の研究において、２：１比の二次コホート  対  一次コホート被験体を有する３５０被験体の症例コホートを、無作為に選択した。なぜなら各タイプの約２倍程度の症例が、一次コホートより二次コホートにおいて起こったからである。これは、ＤＲ、ＤＮおよびＣＶＤのいくつかの症例を提供した。各タイプのさらなる症例を、各タイプのうちの少なくとも１２５症例を得るために必要な残りの１０９１被験体から選択した。１つの基準による症例であったいくらかの被験体はまた、別の基準からの症例でもあったことから、そのように正確には選択できなかった。次いで、各症例定義に関して、２５０名程度のコントロールをサンプリングした。表４は、一次コホートおよび二次コホート内の症例およびコントロールの数、ならびに選択した合計を提供する。
【００９０】
【表４】
2020523580.tif 000006
【００９１】
１つの転帰に関する多くの症例およびコントロールがまた、別の転帰に関する症例およびコントロールでもあることから、症例およびコントロールの３セットでの全ての研究は、合計わずか５４６被験体（一次予防コホートから２００名、および二次介入コホートから３４６名）を含む。それは、サンプルが引き抜かれた時点で観察されたＣＶＤの全症例およびその時点で観察されたＤＲおよびＤＮ症例のうちの１２５の無作為サンプルを含む。その３つの症例定義の各々に関して、症例コホートサンプリングに関するＣｏｘ比例ハザードモデルの改変は、ＨｂＡ１ｃの相当する縦断的測定ありまたはなしのモデルに個々に加えられる場合に、各時点での生体マーカーのＳＤごとの相対的リスクを評価するために使用される。好ましくは、モデルはまた、一次／二次コホート、登録の際の糖尿病の継続期間、およびＨｂＡ１ｃの登録時レベルに関して調節される。モデルは、生体マーカーのちょうどベースラインレベルを使用して、次いで、時間依存的共変量として３つのさらなる時点でその生体マーカーの値を使用しても、適合される。後者は、そのベースライン生体マーカー単独で、その縦断的ＨｂＡ１ｃとは無関係に、さらなるリスクが付与されるか否かを評価するために使用される。
【００９２】
さらに、モデルはまた、生体マーカーのセットの効果を共同で評価するために使用され得る。そのようにする前に、共線性診断（ｃｏｌｌｉｎｅａｒｉｔｙ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）は、予測において分散拡大をもたらす線形従属性（内部相関（ｉｎｔｅｒ−ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ））の程度が存在しないことを担保するために適用される。そうであれば、関連マーカーの各群内で、最強の効果を有するものは、他の群のものと共同で使用される。次いで、尤度比検定は、生体マーカーの最終的なセットが、縦断的なＨｂＡ１ｃ値をも含むモデルに顕著に寄与するか否かを評価する。
【００９３】
ＩＶ．患者が心血管疾患を発生させるリスクを予測するための方法
本発明はまた、被験体が心血管疾患を発生させるリスクまたはその速度を決定するための方法を提供し、上記方法は、目的の１またはこれより多くの生体マーカー（その被験体から得られた生物学的サンプルに存在するＯＰｓ（例えば、ＭｅｔＳＯ）および／またはＡＧＥｓ（例えば、ＣＥＬ）が挙げられるが、これらに限定されない）のレベルを決定する工程を包含する。被験体のＭｅｔＳＯレベルが、心血管疾患（ＣＶＤ）の発生率に強く逆に関連することが、驚くべきことに決定された。
【００９４】
より具体的には、Ｃｏｘ比例ハザードモデル（本明細書で記載される方法論）を使用すると、ＭｅｔＳＯにおけるおよそ２０％増大（ＥＤＩＣベースラインにおいてＨＲ＝０．５８）が、リスク調節共変量モデル化（例えば、年齢、ＨｂＡ１ｃ、ボディーマス指数［ＢＭＩ］、高密度リポタンパク質［ＨＤＬ］ｍ低密度リポタンパク質［ＬＤＬ］、性別、収縮期血圧［ＳＢＰ］、および／または拡張期血圧［ＤＢＰ］）に基づいて、ＣＶＤ転帰におけるおよそ４２％減少を示す一方で、ＭｅｔＳＯレベルにおけるおよそ２０％減少（ＨＲ  １．７２）が、ＣＶＤリスクにおけるおよそ７２％増大を示すことを決定した。さらなる全調節した時間依存性モデルに基づくと、（ＨＲ＝０．６１）ＭｅｔＳＯレベルにおけるおよそ２０％増大が、ＣＶＤエンドポイントにおけるおよそ３９％減少を示す一方で、ＭｅｔＳＯにおけるおよそ２０％減少が、ＣＶＤリスクにおけるおよそ６４％増大を示すことを決定した。
【００９５】
予測Ｃ統計量モデル化を使用すると、ＭｅｔＳＯを加えることはまた、上記で言及した共変量に加えた場合に、ｃ統計量の予測力を、０．７１１から０．７８３へと有意に増大させる（ｐ＜０．００１）ことを決定した。これらのモデルにおいて使用される場合の曲線下面積（ＡＵＣ）は、そのモデルの予測力を記載し、ＣＶＤ事象を経験した被験体が、ＣＶＤ事象を経験したことがない被験体より高いリスクスコアを有する確率である。旧来の心血管疾患リスクモデル化因子のみを使用するとすると、従って、ＭｅｔＳＯレベルを考慮しないとすると、ＣＶＤ関連転帰を予測する古典的確率は、およそ０．７１１である。よって、そのリスクスコアが旧来のリスク因子のみを使用する場合のおよそ７１．１％は、ＣＶＤ事象なしの被験体におけるよりＣＶＤ事象を有する被験体において大きい。本発明は、ＣＶＤリスクモデル化における予測値が、ＭｅｔＳＯのレベルが含まれる場合におよそ７８．３％に増大され得ることを決定した。
【００９６】
Ｖ．心血管疾患ケアの方法
糖尿病関連合併症（例えば、糖尿病性網膜症および／または糖尿病性腎症、微小血管または大血管損傷）ならびに／または他の心血管疾患および合併症の進行を改善、処置、および／または防止することに関連する本明細書で記載される方法のうちのいずれかにおいて、その被験体は、治療モダリティーまたは処置（ライフスタイルの変容（例えば、食事法および運動）、医療的介入、および／または薬理学的因子が挙げられる）を投与され得る。
【００９７】
心血管疾患に関する治療的な薬理学的因子および処置の非限定的な例としては、以下の薬剤：スタチン、抗炎症剤、抗血栓薬剤、抗凝固剤、抗血小板剤、脂質低下剤、直接トロンビンインヒビター、グリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩｂレセプターインヒビター、カルシウムチャネル遮断薬、βアドレナリンレセプター遮断薬、シクロオキシゲナーゼ−２インヒビター、およびレニン−アンギオテンシン−アルドステロン系（ＲＡＡＳ）インヒビター、のうちの１またはこれより多くの投与が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
被験体において心血管疾患を（単独で、または他の治療および薬理学的因子との組み合わせにおいて）処置するために使用され得る脂質低下剤の非限定的な例としては、スタチン、ゲムフィブロジル、コレスチラミン（ｃｈｏｌｙｓｔｙｒａｍｉｎｅ）、コレスチポール、ニコチン酸、およびプロブコールが挙げられる。スタチンは、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼの活性を阻害し得る分子である。心血管疾患を有する被験体に（単独で、または他の治療および薬理学的因子との組み合わせにおいて）投与され得るスタチンの非限定的な例としては、アトロバスタチン、セリバスタチン（ｃｉｒｉｖａｓｔａｔｉｎ）、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、およびシンバスタチンが挙げられる。スタチンおよび他の脂質低下剤のさらなる例は、当該分野で公知である。
【００９９】
被験体における心血管疾患を（単独で、または他の治療および薬理学的因子との組み合わせにおいて）処置するために使用され得る抗炎症剤の非限定的な例としては、以下が挙げられる：アルクロフェナク、ジプロピオン酸アルクロメタゾン、アルゲストンアセトニド（Ａｌｇｅｓｔｏｎｅ  Ａｃｅｔｏｎｉｄｅ）、αアミラーゼ、アムシナファル、アムシノニド（Ａｍｃｉｎａｆｉｄｅ）、アンフェナクナトリウム、塩酸アミプリローズ、アナキンラ、アニロラク、アニトラザフェン（Ａｎｉｔｒａｚａｆｅｎ）、アパゾン、バルサラジド二ナトリウム、ベンダザック、ベノキサプロフェン、塩酸ベンジダミン、ブロメライン、ブロペラモール（Ｂｒｏｐｅｒａｍｏｌｅ）、ブデソニド、カルプロフェン、シクロプロフェン、シンタゾン、クリプロフェン、プロピオン酸クロベタゾール、酪酸クロベタゾン、クロピラック、プロピオン酸クロチカソン、コルメタソンアセテート、コルトドキソン、デフラザコルト、デソニド、デスオキシメタソン、ジプロピオン酸デキサメタゾン、ジクロフェナクカリウム、ジクロフェナクナトリウム、ジフロラゾンジアセテート、ジフルミドンナトリウム、ジフルニサール、ジフルプレドナート、ジフタロン、ジメチルスルホキシド、ドロシノニド、エンドリソン、エンリモマブ（Ｅｎｌｉｍｏｍａｂ）、エノリカムナトリウム（Ｅｎｏｌｉｃａｍ  Ｓｏｄｉｕｍ）、エピリゾール、エトドラク、エトフェナメート、フェルビナク、フェナモール、フェンブフェン、フェンクロフェナク、フェンクロラック、フェンドサール、フェンピパロン、フェンチアザク、フラザロン、フルアザコート、フルフェナム酸、フルミゾール、酢酸フルニソリド、フルニキシン、フルニキシンメグルミン、フルオコルチンブチル、酢酸フルオロメトロン、フルクアゾン、フルルビプロフェン、フルレトフェン、プロピオン酸フルチカゾン、フラプロフェン、フロブフェン、ハルシノニド、ハロベタソールプロピオナート、酢酸ハロプレドン、イブフェナク、イブプロフェン、イブプロフェンアルミニウム、イブプロフェンピコノール、イロニダップ、インドメタシン、インドメタシンナトリウム、インドプロフェン、インドキソール、イントラゾール、イソフルプレドンアセタート、イソキセパック、イソキシカム、ケトプロフェン、塩酸ロフェミゾール、ロルノキシカム、ロテプレドノールエタボナート、メクロフェナム酸ナトリウム、メクロフェナム酸、メクロリゾンジブチラート、メフェナム酸、メサラミン、メセクラゾン、メチルプレドニゾロンスレプタナート、モルニフルマート、ナブメトン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、ナプロキソール、ニマゾン、オルサラジンナトリウム、オルゴテイン、オルパノキシン、オキサプロジン、オキシフェンブタゾン、塩酸パラニリン、ペントサンポリ硫酸ナトリウム、フェンブタゾングリセリン酸ナトリウム（Ｐｈｅｎｂｕｔａｚｏｎｅ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｇｌｙｃｅｒａｔｅ）、ピリフェニドン、ピロキシカム、ケイ皮酸ピロキシカム、ピロキシカムオラミン、ピルプロフェン、プレドナザート（Ｐｒｅｄｎａｚａｔｅ）、プリフェロン（Ｐｒｉｆｅｌｏｎｅ）、プロドール酸、プロクアゾン、プロキサゾール、プロキサゾールクエン酸塩、リメキソロン��ロマザリット、サルコレックス（Ｓａｌｃｏｌｅｘ）、サルナセジン（Ｓａｌｎａｃｅｄｉｎ）、サルサラート、サリチレート、サングイナリウムクロリド、セクラゾン、セルメタシン、スドキシカム、スリンダク、スプロフェン、タルメタシン、タルニフルマート、タロサラート、テブフェロン、テニダップ、テニダップナトリウム、テノキシカム、テシカム、テシミド、テトリダミン、チオピナック、チキソコルトールピバラート、トルメチン、トルメチンナトリウム、トリクロニド、トリフルミダート、ジドメタシン、グルココルチコイド、およびゾメピラックナトリウム。１つの好ましい抗炎症剤はアスピリンである。抗炎症剤のさらなる例は、当該分野で公知である。
【０１００】
被験体における心血管疾患を（単独で、または他の治療および薬理学的因子との組み合わせにおいて）処置するために使用され得る抗血栓薬剤の非限定的な例としては、以下が挙げられる：プラスミノゲンプロアクチベーター、組織プラスミノゲンアクチベーター、アニソール化プラスミノゲン−ストレプトキナーゼアクチベーター複合体（Ａｎｉｓｏｙｌａｔｅｄ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ  Ｃｏｍｐｌｅｘ）、プロウロキナーゼ（Ｐｒｏ−ＵＫ）、ｒＴＰＡ（組換えアルテプラーゼまたはアクチバーゼ）、組換えＰｒｏ−ＵＫ、アボキナーゼ、エミナーゼ（Ｅｍｉｎａｓｅ）、ストレプターゼアナグレリド塩酸塩（Ｓｒｅｐｔａｓｅ  Ａｎａｇｒｅｌｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ビバリルジン、ダルテパリンナトリウム、ダナパロイドナトリウム、塩酸ダゾキシベン、硫酸エフェガトラン、エノキサパリンナトリウム、イフェトロバン、イフェトロバンナトリウム、チンザパリンナトリウム、レテプラーゼ（Ｒｅｔａｐｌａｓｅ）、トリフェナグレル、ワルファリン、およびデキストラン。抗血栓薬剤のさらなる例は、当該分野で公知である。
【０１０１】
被験体における心血管疾患を（単独で、または他の治療および薬理学的因子との組み合わせにおいて）処置するために使用され得る抗凝固剤の非限定的な例としては、アンクロッド、抗凝固性クエン酸デキストロース溶液、抗凝固性クエン酸リン酸デキストロースアデニン溶液、抗凝固性クエン酸リン酸デキストロース溶液、抗凝固性ヘパリン溶液、抗凝固性クエン酸ナトリウム溶液、アルデパリンナトリウム（Ａｒｄｅｐａｒｉｎ  Ｓｏｄｉｕｍ）、ビバリルジン、ブロミンジオン、ダルテパリンナトリウム、デシルジン（Ｄｅｓｉｒｕｄｉｎ）、ジクマロール、ヘパリンカルシウム、ヘパリンナトリウム、リアポレートナトリウム（Ｌｙａｐｏｌａｔｅ  Ｓｏｄｉｕｍ）、メシル酸ナファモスタット、フェンプロクモン、チンザパリンナトリウム、およびワルファリンナトリウムが挙げられる。抗凝固剤のさらなる例は、当該分野で公知である。
【０１０２】
被験体における心血管疾患を（単独で、または他の治療および薬理学的因子との組み合わせにおいて）処置するために使用され得る抗血小板剤の非限定的な例としては、クロピドグレル（Ｃｌｏｐｒｉｄｏｇｒｅｌ）、スルフィンピラゾン、アスピリン、ジピリダモール、クロフィブラート、ピリジノールカルバメート、プロスタグランジンＥ、グルカゴン、抗セロトニン薬、カフェイン、テオフィリンペントキシフェリン（Ｔｈｅｏｐｈｙｌｌｉｎ  Ｐｅｎｔｏｘｉｆｙｌｌｉｎ）、チクロピジン、およびアナグレリドが挙げられる。抗血小板剤のさらなる例は、当該分野で公知である。
【０１０３】
被験体における心血管疾患を（単独で、または他の治療および薬理学的因子との組み合わせにおいて）処置するために使用され得る直接トロンビンインヒビターの非限定的な例としては、ヒルジン、ヒルゲン（ｈｉｒｕｇｅｎ）、ヒルログ、アルガトロバン（ａｇａｔｒｏｂａｎ）、ＰＰＡＣＫ、およびトロンビンアプタマーが挙げられる。トロンビンインヒビターのさらなる例は、当該分野で公知である。
【０１０４】
被験体における心血管疾患を（単独で、または他の治療および薬理学的因子との組み合わせにおいて）処置するために使用され得るグリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩｂレセプターインヒビターの非限定的な例としては、レオプロ（アブシキシマブ（ａｂｃｉｘａｍａｂ））、ラミフィバン、およびチロフィバンが挙げられる。グリコプロテインＩＩｂ／ＩＩＩｂレセプターインヒビターのさらなる例は、当該分野で公知である。
【０１０５】
被験体における心血管疾患を（単独で、または他の治療および薬理学的因子との組み合わせにおいて）処置するために使用され得るカルシウムチャネル遮断薬の非限定的な例としては、ジヒドロピリジン（例えば、ニフェジピン）；フェニルアルキルアミン（例えば、ベラパミル）；およびベンゾチアゼピン（例えば、ジルチアゼム）が挙げられる。カルシウムチャネル遮断薬のさらなる非限定的な例としては、アムリノン、アムロジピン、ベンシクラン、フェロジピン、フェンジリン、フルナリジン、イスラジピン、ニカルジピン、ニモジピン、ペルヘキシリン（ｐｅｒｈｅｘｉｌｅｎｅ）、ガロパミル、チアパミル、チアパミルアナログ（例えば、１９９３ＲＯ−１１−２９３３）、フェニトイン、バルビツレート、ならびにペプチドであるダイノルフィン、ω−コノトキシン、およびω−アガトキシンなど、ならびに／またはその薬学的に受容可能な塩が挙げられる。カルシウムチャネル遮断薬のさらなる例は、当該分野で公知である。
【０１０６】
被験体における心血管疾患を（単独で、または他の治療および薬理学的因子との組み合わせにおいて）処置するために使用され得るβアドレナリンレセプター遮断薬の非限定的な例としては、以下が挙げられる：アテノロール、アセブトロール、アルプレノロール、ベフノロール、ベタキソロール、ブニトロロール、カルテオロール、セリプロロール、ヘドロキサロール（ｈｅｄｒｏｘａｌｏｌ）、インデノロール、ラベタロール、レボブノロール、メピンドロール、メチプラノロール（ｍｅｔｈｙｐｒａｎｏｌ）、メチンドール（ｍｅｔｉｎｄｏｌ）、メトプロロール、メトリゾラノロール（ｍｅｔｒｉｚｏｒａｎｏｌｏｌ）、オクスプレノロール、ピンドロール、プロプラノロール、プラクトロール、ソタロルナドロール（ｓｏｔａｌｏｌｎａｄｏｌｏｌ）、チプレノロール、トマロロール（ｔｏｍａｌｏｌｏｌ）、チモロール、ブプラノロール、ペンブトロール、トリメプラノール、２−（３−（１，１−ジメチルエチル）−アミノ−２−ヒドロキシプロポキシ）−３−ピリデンカルボニトリルＨＣｌ、１−ブチルアミノ−３−（２，５−ジクロロフェノキシ）−２−プロパノール、１−イソプロピルアミノ−３−（４−（２−シクロプロピルメトキシエチル）フェノキシ）−２−プロパノール、３−イソプロピルアミノ−１−（７−メチルインダン−４−イルオキシ）−２−ブタノール、２−（３−ｔ−ブチルアミノ−２−ヒドロキシ−プロピルチオ）−４−（５−カルバモイル−２−チエニル）チアゾール、および７−（２−ヒドロキシ−３−ｔ−ブチルアミンプロポキシ）フタリド。上記のβアドレナリンレセプター遮断薬は、異性体混合物として、またはそれらそれぞれの左旋性形態または右旋性形態において使用され得る。βアドレナリンレセプター遮断薬のさらなる例は、当該分野で公知である。
【０１０７】
被験体における心血管疾患を（単独で、または他の治療および薬理学的因子との組み合わせにおいて）処置するために使用され得るシクロオキシゲナーゼ−２インヒビターの非限定的な例としては、以下に記載されるものが挙げられる：米国特許第５，４７４，９９５号；同第５，５２１，２１３号；同第５，５３６，７５２号；同第５，５５０，１４２号；同第５，５５２，４２２号；同第５，６０４，２５３号；同第５，６０４，２６０号；同第５，６３９，７８０号；同第５，６７７，３１８号；同第５，６９１，３７４号；同第５，６９８，５８４号；同第５，７１０，１４０号；同第５，７３３，９０９号；同第５，７８９，４１３号；同第５，８１７，７００号；同第５，８４９，９４３号；同第５，８６１，４１９号；同第５，９２２，７４２号；同第５，９２５，６３１号；同第５，６４３，９３３号；同第５，４７４，９９５号；および同第５，５４３，２９７号；ＷＯ  ９５／００５０１、およびＷＯ  ９５／１８７９９（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）。シクロオキシゲナーゼ−２インヒビターのさらなる例は、当該分野で公知である。
【０１０８】
被験体における心血管疾患を（単独で、または他の治療および薬理学的因子との組み合わせにおいて）処置するために使用され得るレニン−アンギオテンシン−アルドステロン系（ＲＡＡＳ）インヒビターとしては、アンギオテンシンＩＩの機能および合成または異化に干渉する薬剤が挙げられる。ＲＡＡＳ薬剤としては、アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、アンギオテンシンＩＩレセプター遮断薬、アンギオテンシンＩＩの異化を活性化する薬剤、アンギオテンシンＩ（これからアンギオテンシンＩＩが最終的に得られる）の合成を防止する薬剤、およびアルドステロンアンタゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。そのＲＡＡＳは、血行動態、ならびに水および電解質バランスの調節に関与する。血液体積、腎灌流圧、または血漿中のＮａ＋の濃度を下げる因子は、その系を活性化する傾向にある一方で、これらのパラメーターを増大する因子は、その機能を抑制する傾向にある。ＲＡＡＳインヒビターは、アンギオテンシノゲンもしくはアンギオテンシンＩからのアンギオテンシンＩＩの生成に干渉するかまたはアンギオテンシンＩＩの活性に干渉するように作用する化合物である。このようなインヒビターは、当該分野で周知であり、アンギオテンシンＩＩの最終的な生成に関与する酵素を阻害するように作用する化合物（レニンおよびＡＣＥが挙げられる）を含む。それらはまた、いったん生成された後にアンギオテンシンＩＩの活性に干渉する化合物を含む。
【０１０９】
アンギオテンシンＩＩレセプター遮断薬としては、アンギオテンシンＩＩレセプターに結合することによってアンギオテンシンＩＩの活性に干渉し、それらの活性に干渉するアンギオテンシンＩＩアンタゴニストが挙げられる。アンギオテンシンＩＩレセプター遮断薬は周知であり、ペプチド化合物および非ペプチド化合物を含む。大部分のアンギオテンシンＩＩレセプター遮断薬は、８位のフェニルアラニンをいくつかの他のアミノ酸で置換することによってアゴニスト活性が弱められた、わずかに改変された同属種である。アンギオテンシンＩＩレセプター遮断薬の例としては、以下が挙げられる：ペプチド化合物（例えば、サララシン、［（Ｓａｎ１）（Ｖａｌ５）（Ａｌａ８）］アンギオテンシン−（１−８）オクタペプチド、および関連アナログ）；Ｎ−置換されたイミダゾール−２−オン（米国特許第５，０８７，６３４号）；イミダゾールアセテート誘導体（２−Ｎ−ブチル−４−クロロ−１−（２−クロロベンジル）（２−Ｎ−ｂｕｔｙｌ−４−ｃｈｌｏｒｏ−１−（２−ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｉｌｅ））、イミダゾール−５−酢酸（Ｌｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｅｘｐ．  Ｔｈｅｒ．  ２４７：１−７，  １９８８を参照のこと）が挙げられる）；４，５，６，７−テトラヒドロ−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］ピリジン−６−カルボン酸、およびこれらの誘導体（米国特許第４，８１６，４６３号）；Ｎ２−テトラゾール  β−グルクロニドアナログ（米国特許第５，０８５，９９２号）；置換されたピロール、ピラゾール、およびトリアゾール（ｔｒｙａｚｏｌｅ）（米国特許第５，０８１，１２７号）；フェノールおよび複素環式誘導体（例えば、１，３−イミダゾール（米国特許第５，０７３，５６６号））；イミダゾ縮合７員環複素環（米国特許第５，０６４，８２５号）；ペプチド（例えば、米国特許第４，７７２，６８４号）；アンギオテンシンＩＩに対する抗体（例えば、米国特許第４，３０２，３８６号）；ならびにアラルキルイミダゾール化合物（例えば、ビフェニル−メチル置換されたイミダゾール（例えば、ＥＰ  ２５３，３１０）；Ｎ−モルホリノアセチル−（−１−ナフチル）−Ｌ−アラニル−（４，  チアゾリル）−Ｌ−アラニル（３５，４５）−４−アミノ−３−ヒドロキシ−５−シクロ−ヘキサペンタノイル−Ｎ−ヘキシルアミド；ＳＫＦ１０８５６６（Ｅ−α−２［２−ブチル−１−（カルボキシフェニル）メチル］１Ｈ−イミダゾール−５−イル［メチレン］−２−チオフェンプロパン酸）；ロサルタン；レミキリン（Ｒｅｍｉｋｉｒｉｎ）；およびＡ２アゴニスト。
【０１１０】
ＡＣＥインヒビターの非限定的な例としては、以下が挙げられる：アシルメルカプトおよびメルカプトアルカノイルプロリン（例えば、カプトプリル（米国特許第４，１０５，７７６号）およびゾフェノプリル（米国特許第４，３１６，９０６号））；カルボキシアルキルジペプチド（例えば、エナラプリル（米国特許第４，３７４，８２９号）、リシノプリル（米国特許第４，３７４，８２９号）、キナプリル（米国特許第４，３４４，９４９号）、ラミプリル（米国特許第４，５８７，２５８号）、およびペリンドプリル（米国特許第４，５０８，７２９号）；カルボキシアルキルジペプチド模倣物（例えば、シラザプリル（米国特許第４，５１２，９２４号）およびベナゼプリル（ｂｅｎａｚａｐｒｉｌ）（米国特許第４，４１０，５２０号）；ならびにホスフィニルアルカノイルプロリン（例えば、フォシノプリル（米国特許第４，３３７，２０１号）およびトランドラプリル（ｔｒａｎｄｏｌｏｐｒｉｌ）。
【０１１１】
ＲＡＡＳインヒビターのさらなる非限定的な例としては、以下が挙げられる：ペプチドの誘導体（米国特許第５，１１６，８３５号）；非ペプチド結合によって接続されたアミノ酸（米国特許第５，１１４，９３７号）；ジペプチドおよびトリペプチド誘導体（米国特許第５，１０６，８３５号）；アミノ酸およびその誘導体（米国特許第５，１０４，８６９号および同第５，０９５，１１９号）；ジオールスルホンアミドおよびスルフィニル（米国特許第５，０９８，９２４号）；改変されたペプチド（米国特許第５，０９５，００６号）；ペプチジルβ−アミノアシルアミノジオールカルバメート（米国特許第５，０８９，４７１号）；ピロールイミダゾロン（ｐｙｒｏｌｉｍｉｄａｚｏｌｏｎｅｓ）（米国特許第５，０７５，４５１号）；フッ素および塩素スタチンまたはスタトン（ｓｔａｔｏｎｅ）含有ペプチド（米国特許第５，０６６，６４３号）；ペプチジルアミノジオール（米国特許第５，０６３，２０８号および同第４，８４５，０７９号）；Ｎ−モルホリノ誘導体（米国特許第５，０５５，４６６号）；ペプスタチン誘導体（米国特許第４，９８０，２８３号）；Ｎ−複素環式アルコール（米国特許第４，８８５，２９２号）；レニンに対するモノクローナル抗体（米国特許第４，７８０，４０１号）；ならびに種々の他のペプチドおよびそれらのアナログ（米国特許第５，０７１，８３７号、同第５，０６４，９６５号、同第５，０６３，２０７号、同第５，０３６，０５４号、同第５，０３６，０５３号、同第５，０３４，５１２号、および同第４，８９４，４３７号）（これらの各々は、参考として援用される）。
【０１１２】
ＲＡＡＳインヒビターのさらなる例としては、アルドステロンアンタゴニストが挙げられる。アルドステロンアンタゴニストの非限定的な例としては、スピロノラクトン、エプレレノン、カンレノン（カンレノ酸カリウム）、プロレノン（Ｐｒｏｒｅｎｏｎｅ）（プロレノアートカリウム）、およびメクスレノン（メクスレノ酸カリウム）が挙げられる。
【０１１３】
本発明は、以下の非限定的な例を参照することによってさらに理解される。
【実施例】
【０１１４】
実施例１
ＡＧＥｓおよびＯＰｓの血漿レベルと腎症進行／非進行との間の関係性
機器類：ＨＰＬＣ−−Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズバイナリーポンプ、オートサンプラー、脱気装置およびサーモスタット付きカラムチャンバ；ＱＱＱ−Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４１０。
【０１１５】
材料：ＭＳグレードの水およびメタノールは、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ（Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ，  ＵＳＡ）製である。ヘプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）  ＬＣグレード（Ｆｉｓｈｅｒ，  （Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）  ＃  ＰＩ−５３１０４．  ＨＰＬＣ  Ｃｏｌｕｍｎ−Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ  ３ｕ  Ｃ１８，  ４．６ｍｍ×２５０ｍｍ  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＃００Ｇ−４４５３−Ｅ０）。
【０１１６】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる９種の提唱される生体マーカーの分析は、１回の実行で行われ、正確な定量のために重同位体内部標準物質の添加を要することから、９種の生体マーカーのために必要とされる軽いおよび重い標準物質を以下のように得た：軽いおよび重い（Ｎ１５）  ３ＤＧ−ＨＩを、Ｏｒｇａｎｉｘ（Ｅｓｓｅｘ，  ＵＫ）から得た。重いＭＧ−Ｈ１およびＧ−ＨＩを、ＮｅｏＭＰＳ（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，  Ｆｒａｎｃｅ）によって生成した。メチオニンスルホキシドおよびジチロシンを合成し、その残りの５種の軽い生体マーカー（ペントシジン、ＣＥＬ、ＣＭＬ、ＭＧ−Ｈ１およびＧＨ）の軽いおよび重い標準物質を、市販の供給源から購入した。２−アミノアジピン酸、酸化的ストレスの優れた指標である安定なリジン由来終末産物を、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ  ＯＨにあるＣａｓｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＳｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｎｎｉｅｒから得た（Ｂｅｉｓｓｗｅｎｇｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ，  ５４：３２７４−３２８１  （２００５））。正確な定量のために重同位体内部標準物質を添加することは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるこれらの９種の提唱される生体マーカーの分析が１回の実行で行われることから必要とされる。
【０１１７】
生体マーカーの測定：  タンパク質糖化、酸化、および活性窒素損傷を示す生体マーカーの同時の定量的測定のために開発された方法（Ａｈｍｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ，  ３６４（Ｐｔ  １）：  １−１４  （２００２））を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  １２００  ＨＰＬＣ上での濃度０．２９％  ヘプタフルオロ酪酸を有するメタノール／Ｈ２Ｏ勾配の移動相を用いる単一の２．０×２５０ｍｍ  Ｓｙｎｅｒｇｙ  ４ミクロン８０Ａカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｍｏｄｅｌ  ６４１０トリプル四重極質量分析計（ＱＱＱ）上での全分析時間６０分で、ＡＧＥｓまたは酸化産物を測定するにあたって当該分野で使用されないアプローチを使用することによって改変した。
【０１１８】
ＡＧＥｓを測定するための公知の方法に対するこのプロトコルにおける新規な変更は、完全に異なる固定相を使用したこと、すなわち、Ｃ１８（例えば、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ４  ｍｉｃｒｏｎ  ８０Ａカラム）である。このカラムの変更は、先行技術の方法とは異なる移動相条件の使用、すなわち、イオン対形成薬剤としてのヘプタフルオロ酪酸の使用を生じた。カラムタイプおよび移動相の組み合わせはまた、２つのカラムを要することとは対照的に、サンプル分析が単一のカラムで行われることを可能にした。すなわち、サンプルは、１つのカラムを使用して成功裡に実行できた−２つのカラムは必要なかった。そのＨＰＬＣおよびＱＱＱ条件は、以下で示される。
【０１１９】
ＨＰＬＣ条件、移動相：  溶媒Ａ＝９５％が水中０．２９％  ＨＦＢＡ／５％がメタノール中０．２９％  ＨＦＢＡ。溶媒Ｂ＝メタノール中０．２９％  ＨＦＢＡ。流速＝０．２５ｍｌ／分  ポンプ時間（表５）。
【０１２０】
【表５】
2020523580.tif 000007
【０１２１】
ＱＱＱ獲得パラメーター：  ＥＳＩ源を装備したＡｇｉｌｅｎｔ  ６４１０  ＭＳ／ＭＳを、以下の条件下でポジティブモードにおいて作動させていた：  乾燥ガスは、３５０℃において流速１０Ｌ／分であった。ネブライザー圧は４０ｐｓｉであり、キャピラリー電圧を全化合物に関して４０００に設定した。詳細な化合物分析パラメーターを、表６に示す。同位体希釈分析を使用して、サンプルの定量を、相対的応答  対  重い標準物質に対する相対的濃度から導出される較正曲線から読むことによって達成した。重い標準物質を、予測される生理学的濃度および標準曲線の範囲に従って、最終濃度１〜６μＭで血漿または尿濾液に添加した。その化合物の溶離の順序は、表７に示されるとおりである。この表はまた、分析物の１日の測定間での反復に関する変動係数（ＣＯＶ）、ならびに各分析物の検出下限（ＬＬＯＤ）および定量下限（ＬＬＯＱ）を示す。
【０１２２】
【表６−１】
2020523580.tif 000008
【表６−２】
2020523580.tif 000009
【０１２３】
【表７】
2020523580.tif 000010
【０１２４】
サンプル調製の方法：血漿サンプル調製：  この研究において使用したサンプルの全てを、厳格なプロトコルによって、５年間の研究終了のＮＨＳ訪問時に収集し、ここで血液をＥＤＴＡ含有チューブの中に集め、直ぐに氷冷し、遠心分離した。遠心分離後、血漿を赤血球（ＲＢＣ）から直ぐに分離し、ドライアイス上で急速凍結し、その後、これらの分析を行うまでー８０℃で貯蔵した。
【０１２５】
限外濾過液（遊離付加物）：  ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を、１０ＫカットオフＡｍｉｃｏｎフィルタ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．，  Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）を通過させる遠心分離後の濾液として調製した血漿「遊離画分」に対して最初に行った。
【０１２６】
血漿タンパク質に化学的に結合した付加物残基：  その生成物のうちのいくつかは酸に不安定であるので、化学的に結合した生成物を、Ａｈｍｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．，  ３６４（Ｐｔ  １）：１−１４（２００２）によって記載されるように、プロテアーゼ自己分解に関するコントロールとともに、窒素下でペプシン、プロナーゼＥ、およびアミノペプチダーゼ／プロリダーゼ（５０μｇ  タンパク質当量）での徹底的な連続的酵素消化後に決定する。ＡＧＥ／ＯＰ分析を、窒素雰囲気下で、３種のタンパク質分解酵素での３６時間かけて広範囲にわたる連続的血漿消化の後に行って（Ａｈｍｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ４８：１５９０−１６０３  （２００５））、タンパク質「結合」画分を調査した。
【０１２７】
尿サンプル調製：  尿中の生体マーカーの分析のために、５年間のＮＨＳ研究にわたって与えられた被験体につき４つのサンプルを試験した。
【０１２８】
付加物の排泄を測定するための尿サンプルの調製：  尿中のＡＧＥおよびＯＰ生体マーカープロフィールの決定のために、Ａｈｍｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ４８：１５９０−１６０３  （２００５）によって記載されるようにマイクロスピンフィルタ（１０，０００ＭＷフィルタカットオフ）を通して４℃での遠心分離によって調製した濾液を、使用した。尿クレアチニンレベルを、生成物／クレアチニン尿分析物含有量の均一な発現を提供するために決定し得る。
【０１２９】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを、腎症へと進行する者（ｎ＝３７）、進行しない者（ｎ＝７０）からなる１０７名の被験体の初期全集団を提供したＮＨＳ尿サンプルに対して行った。その研究を、２４サンプル／週のスループットを利用して、１０週間の期間にわたって完了した（２２０（５５×４）追加分析）。その統計的検定を、両側のα＝０．０１で全サンプル（ｎ＝１０７被験体）に対して行った。仮説は、全研究サンプルにおけるＳＤがサブサンプル（Ｎ＝５２）と同じであることであった。尿および血清「遊離画分」決定はまた、各分析物の腎クリアランス率の計算を可能にする。
【０１３０】
結果
Ａ．血漿濾液（遊離画分）
それは、この１型糖尿病集団におけるＤＮの臨床的進行の最良の早期構造予測因子であることから、腎生検の電子顕微鏡写真において測定したＮＨＳ集団におけるベースラインから５年までの糸球体基底膜（ＧＢＭ）幅の変化を、一次エンドポイントとした。メサンギウム体積分率も測定した。速い進行者（ＦＰ）を、ＧＢＭ肥厚化の上位の四分位（ｎ＝２４）として、他をゆっくりと進行する者（ＳＰ）として定義した。ＡＧＥｓ（３−デオキシグルコソンおよびメチルグリオキサールヒドロイミダゾロン（ＤＧ３Ｈ１、ＭＧ−Ｈ１））ならびにカルボキシメチルおよびエチルリジン（ＣＭＬ、ＣＥＬ）、ならびに酸化産物（メチオニンスルホキシドおよび２  アミノアジピン酸）を、５年目に１０２サンプルで１０Ｋ  血漿濾液に対して液体クロマトグラフィー、トリプル四重極質量分析計によって測定した。ＭＧ−Ｈ１、ＣＥＬ、およびＣＭＬレベルは、ＳＰに対してＧＢＭ規定ＦＰにおいて有意に高いことが見出された。ＡＧＥまたはＯＰは、これらの研究においてメサンギウム拡張を予測しなかった。これらの結果は、臨床的に関連するＤＮ病変の進行の早期指標として、３種のＡＧＥｓを示す（表８；図３）。この研究において測定した他のＡＧＥおよび酸化的生体マーカーは、ＤＮ進行と相関しなかった（表７）。
【０１３１】
【表８】
2020523580.tif 000011
【０１３２】
早期糖尿病性腎症を予測するにあたってこれらの３種の生体マーカーの値を裏付けるさらなる分析は、５年目でのＨｂＡ１ｃがＧＢＭ幅における変動の４．７％を説明した（Ｒ２）が、説明したＧＢＭ幅における変動の割合が、ＭＧ−Ｈ１、ＣＥＬ、およびＣＭＬがそのモデルに加えられる場合に１１．６％へと増大した（７．９％  増大）という観察である。さらに、これらの分析は、ＧＢＭ増大の有意な独立した予測因子としてＭＧ−Ｈ１を明らかにした。
【０１３３】
これらの知見は、ＭＧ−Ｈ１、ＣＥＬ、およびＣＭＬが、進行から保護される者において一貫して低いことを示す；従って、その生体マーカーは、ＤＮから保護される者を同定するはずである。ＭＧ−Ｈ１の順序づけられたデータは、速く腎症へと進行する者の３１のＭＧ−Ｈ１値のうちの２つ（下位の三分位の６％）が、その順序づけられた値の下位３０％（１０３のうちの３１）にあるが、３１名のゆっくりと腎症へと進行する者のうちの２９名（９４％）のＭＧ−Ｈ１値が、この下位３０％を構成することを示す。これはまた、ＣＥＬおよびＣＭＬに関する知見にあてはまり、ここでその最低値の３２のうちの３０（９４％）が、両方の生体マーカーに関してゆっくりと進行する者において認められた。これらの３種の生体マーカーのレベルも、非進行者に関して以前に得られたレベルと比較した（Ａｈｍｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ４８：１５９０−１６０３  （２００５）；およびＡｈｍｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ４４（１２）：５２８７−９２  （２００３））。表９に示されるように、これらの研究は、保護された群（ＤＮへと進行しない者）の平均レベルが、非糖尿病コントロールにおいて認められレベルに類似であるかまたはそのレベルよりわずかに高いことを示す。
【０１３４】
【表９】
2020523580.tif 000012
【０１３５】
その結果は、いくつかの実施形態において、血漿濾液中の３種のＡＧＥｓ（しかしＯＰｓはなし）のレベルが、単独で、またはＨｂＡ１ｃの組み合わせに加えて、その３種の主要なＡＧＥｓが、ＤＮへの進行の臨床上関連する予測因子（いくつかの場合には、ＨｂＡ１ｃに加えて）であることを示す。
【０１３６】
Ｂ．生体マーカーのＤＮの進行との関連性を調査するための広範に消化した血漿サンプル中の生体マーカーに関する結果
類似の統計分析を行って、Ａｈｍｅｄ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，  ４８：１５９０−１６０３（２００５）によって記載されるように行ったＡＧＥｓおよびＯＰ（１０２サンプルの広範な血漿消化物に対して測定）が、ＧＢＭ肥厚化またはメサンギウム拡張によって規定されるＤＮの進行と何らかの相関を示すか否かを決定した。速い進行者（ＦＰ）を、ＧＢＭ肥厚化のうちの上位の四分位（ｎ＝２４）として定義し、その残りをゆっくりと進行する者（ＳＰ）として定義した。消化物に対して測定可能でなかった２−アミノアジピン酸（ＡＡＡ）および検出限界未満であったＧＨＩを除いて、同じ生成物を、「血漿濾液」に対して行ったように測定した（表７）を参照のこと。以下の表１０に示されるように、血漿消化物中の生体マーカーのレベルとＤＮの進行との間には相関関係がなかった。
【０１３７】
【表１０】
2020523580.tif 000013
【０１３８】
タンパク質に結合したＡＧＥｓおよびＯＰｓの上昇の程度は、血漿および尿いずれかの「遊離」画分において認められるものと比較して穏やかであった。これは、糖尿病では比較的短い半減期の血漿タンパク質の改変が少ないことを示唆する。表１１を参照のこと。
【０１３９】
【表１１】
2020523580.tif 000014
値を平均ｍｍｏｌｅｓ／ｍｏｌｅ  ＡＡとして表した
【０１４０】
表１２中のデータは、血漿中のこれらのタンパク質に結合したＡＧＥまたはＯＰ生体マーカーのいずれも、ＧＢＭ変化またはＭＥＳ変化の程度に基づいて、腎症への進行または非進行に関連したことを示す。
【０１４１】
Ｃ．尿のＡＧＥｓおよび酸化産物の分析の完了からの結果
これらの研究に関して、速い進行者（ＦＰ）を、ＧＢＭ肥厚化の最大の程度を有する上位３７名の被験体として定義し、ゆっくりと進行する者（ＳＰ）を残りとして定義した。その個人自体の個々の平均を＞２  ＳＤ超えた場合に値を排除した数名のアウトライアーに関して較正したデータベースに対して分析を行った。進行者（速い）／非進行者（ゆっくり）による８種の測定した生体マーカーの平均値を、表１２に示す。それら８種のうち、ＣＥＬの尿レベルのみ（ｐ＝０．０４）が、群間で有意差を示した。ＣＭＬが次に最も近く（ｐ＝０．１０）、次にＤｉＴｙｒ（ｐ＝０．１６）であり、全ての他のｐ値は、＞０．２５であった。これらの結果をさらに確認するために、その分析を、ノンパラメトリック法（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）を使用して反復したところ、ＣＥＬのみ（ｐ＝０．０２）が、群間で差異があった。生体マーカーは、５年間にわたってメサンギウム拡張の程度と相関がなかった。
【０１４２】
【表１２−１】
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【表１２−２】
2020523580.tif 000016
【０１４３】
統計的有意は、ＣＥＬで得られたが、これらの結果を、ＤＮ進行をもたらすことが公知の他の変数（性別、糖尿病継続期間、年齢、およびＨｂＡ１ｃ）に関して調節した場合、ＣＥＬとＤＮ  進行／非進行との間のこれらの相関は、もはや統計的に有意ではなかった（表１３）。
【０１４４】
【表１３】
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【０１４５】
これらの転帰は、注意深く定量した、特定の尿ＡＧＥｓおよび酸化的生体マーカーが、生検で判明した糖尿病性腎症の進行と統計的に有意な独立した関係性を示さないことを示す。
【０１４６】
実施例２
２型糖尿病患者の腎生検に対する、血清ＡＧＥ濃度と、腎機能の喪失および構造的病変との関連付け
本実施例は、２型糖尿病および早期ＤＮを有するピマインディアンにおける腎生検に関して、血清ＡＧＥ濃度と腎機能の喪失および構造的病変との間の関連付けを記載する。特定の終末産物のこれらの研究は、２型糖尿病での糖尿病性腎症の発生における上昇したメチルグリオキサールレベルの役割を確認し、１型糖尿病に集中した以前の知見を確認する。糖尿病性腎症の進行におけるこれらの特定のＡＧＥ生体マーカーの役割は、臨床転帰およびそれらの関連する形態的腎臓変化との相関を示すことによって確認された（表１９）。
【０１４７】
カラム選択：  多孔性シェル技術で達成された不満足な転帰に基づいて、好ましい実施形態（本明細書で記載され、本実施例に示されるとおり）は、Ｃ１８  ＲＰカラム技術およびイオン対形成薬剤（例えば、ヘプタフルオロ酪酸）を伴う調査へと戻した。よって、以下を含む多くのＬＣカラムを調査した：  Ｓｙｎｅｒｇｉ  Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ（登録商標）、４μｍ、２．０×２５０ｍｍ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，  Ｉｎｃ．）；  Ｇｅｍｉｎｉ−ＮＸ（登録商標）  Ｃ１８、３μｍ、２．０×２５０ｍｍ（（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ，  Ｉｎｃ．）；  Ｔｈｅｒｍｏ：  Ａｃｃｕｐｏｒｅ  Ｐｏｌａｒ  Ｐｒｅｍｉｅｒ（登録商標）、２．６μｍ、２．１×１５０ｍｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，  ＭＡ）；およびＷａｔｅｒｓ  Ｘ−ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）、２．５μｍ、２．１×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｉｌｆｏｒｄ，  ＭＡ）。広範な試験は、好ましい実施形態において、所望の特性の最適なバランスを提供するとしてＷａｔｅｒｓ  Ｘ−ｓｅｌｅｃｔ固定相の選択をもたらした。このカラムは、クロマトグラフィー分離を行うために必要とされる選択性を維持しながら、イオン抑制目的を補助するために、ＭｅｔＳＯに関して十分に保持性である。従って、このカラムを、さらなる検証のために選択した。
【０１４８】
そのカラムを、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘ−ｓｅｌｅｃｔカラムでの予備研究から得た情報に基づいて調製した標準曲線およびＩＳ溶液を使用してさらに試験した。標準曲線の濃度範囲および線形性にわたる再現性は、（例えば、イオン抑制への）さらなる評価を可能にした。そのカラムは、ＭｅｔＳＯと関連した目的のイオン抑制を適切に緩和した。そのカラムおよび関連する方法論を利用するＡｇｉｌｅｎｔ  ６４９０  ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ獲得の一実施形態のために開発されたさらなる機器類の詳細を、表１４、表１５、および表１６に詳述する。
【０１４９】
【表１４】
2020523580.tif 000018
【０１５０】
２つのバイナリポンプを、他方のカラムを他方のポンプで同時に再平衡化しながら、一方のポンプで分析実行を行い、それによって、途切れのない分析実行を可能にするように構成した。このクロマトグラフィー構成の詳細は、表１５および表１６にある。
【０１５１】
【表１５】
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【０１５２】
【表１６】
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１２９０シリーズオートサンプラー構成：  温度４℃；  注入体積  １μｌ；  １３１６Ｃカラムコンパートメント構成：温度２４℃；注入ポートバルブを全ての実行の終了時に位置を切り替えるように設定した
【０１５３】
標準物質の定性的および定量的評価を、本発明者らの方法の精度および再現性を最適化するためにさらに行った。
【０１５４】
液体クロマトグラフィー／トリプル四重極質量分析計：  液体クロマトグラフィー／トリプル四重極質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用して、安定な重同位体置換された標準物質による内部標準化を利用して、９つの特有の生体マーカー（すなわち、５種の終末糖化産物（ＡＧＥｓ）：  Ｎε−カルボキシメチルリジン（ＣＭＬ）、Ｎε−カルボキシルエチルリジン  ＣＥＬ、グリオキサールヒドロイミダゾロン（Ｇ−ＨＩ）、メチルグリオキサールヒドロイミダゾロン（ＭＧ−Ｈ１）；および３−デオキシグルコソンヒドロイミダゾロン（３−ＤＧＨ）；ならびに４種の終末酸化産物：メチオニンスルホキシド（ＭｅｔＳＯ）；３−ニトロチロシン（３−ＮＴ）、２−アミノアジピン酸（ＡＡＡ）；およびジチロシン（ＤｉＴｙｒ））のプロフィールを測定した。
【０１５５】
絶食患者の血清サンプルを、注意深く定義した迅速分離および急速凍結プロトコルによってベースライン時に収集し、目的の生体マーカーの分析のために−８０℃で貯蔵した。分析を、１０ＫカットオフＡｍｉｃｏｎフィルタを通して遠心分離後に濾液として調製した遊離画分に対して行った。
【０１５６】
表１７は、ベースラインおよび腎生検時の研究集団の臨床特徴を提供する。その研究集団は、２型糖尿病およびＤＮなしまたは早期ＤＮを有するピマネイティブアメリカンの患者を含んだ（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ  ｎｕｍｂｅｒ，  ＮＣＴ００３４０６７８を参照のこと）。本実施例において提供される全てのさらなる形態的、生化学的および病歴のデータは、上述のピマネイティブアメリカンの２型糖尿病治験から得た。
【０１５７】
【表１７】
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ＡＧＥｓおよび終末酸化産物を、１６８名の被験体においてベースライン時に一度、および腎生検を行うように進んだそれら個体のうちの１０６名において測定した。表１８は、ピマネイティブアメリカン研究被験体の生化学的特徴を記載する。
【０１５８】
【表１８】
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【０１５９】
表１９は、ピマネイティブアメリカン２型糖尿病研究への登録の６年後に研究参加者に対して行った腎生検に関する形態測定データを表す。
【０１６０】
【表１９】
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【０１６１】
ＡＧＥｓと各ＡＧＥの構造との間の関連を、共変量に関する調節ありおよびなしの線形回帰によって各腎構造変数に対して試験した。
【０１６２】
以下の共変量を、ベースラインおよび生検試験の平均として採用した：年齢、性別、処置割り当て、糖尿病継続期間、ＨｂＡ１ｃ、および平均動脈圧、ヨータラマートクリアランスによるＧＦＲ、およびアルブミン／クレアチニン比（ＡＣＲ）。
【０１６３】
図に示されるように、ＭＧ−Ｈ１、ＣＥＬおよびＧＨＩは、糖尿病性腎症の主要な構造パラメーターと有意に調節された関係を示した。
【０１６４】
ＡＧＥｓおよび腎構造変化：  腎生検を受け、かつＡＧＥ／ＯＰ濃度が腎生検時付近に入手可能であった９５名の参加者の特徴を、表１７に示す。腎生検を受けた者のうちの４９名（５２％）は、臨床試験への登録時に、ＡＣＲ＜３０ｍｇ／ｇを有し、４６名（４８％）は、ＡＣＲ＝３０〜２９９ｍｇ／ｇを有した。ＡＧＥ／ＯＰ濃度を、腎生検から８５（ＩＱＲ＝４３〜８７）日のメジアンで得た血清サンプル中で測定した。単変量モデル（表２０）において、全てのジカルボニル由来化合物は、全球性糸球体硬化の速度（ｒ＝０．２５〜０．３３、Ｐ＜０．００１〜０．０２）、糸球体あたりのメサンギウム体積分率（ｒ＝０．２５〜０．３０、Ｐ＜０．００１〜０．０１）、および皮質間質体積分率（ｒ＝０．２５〜０．３８、Ｐ＝０．００３〜０．０２）を伴って、有意にかつ正に相関した。全ＡＧＥｓ（３−デオキシグルコソンヒドロイミダゾロンを除く）は、糸球体あたりの全濾過表面と負に関連した（ｒ＝−０．３４〜−０．２６；Ｐ＜０．００１〜０．０１）。糸球体体積は、カルボキシルエチルリジンおよびメチルグリオキサールヒドロイミダゾロンと負に関連した（それぞれ、ｒ＝−０．２２、Ｐ＝０．０３およびｒ＝−０．２１、Ｐ＝０．０４）。濾過表面密度は、グリオキサールヒドロイミダゾロンと負に関連した（ｒ＝−０．２４、Ｐ＝０．０２）。有窓内皮細胞は、カルボキシメチルリジンと負に関連した（ｒ＝−０．２５、Ｐ＝０．０２）。ポドサイト足突起幅は、グリオキサールヒドロイミダゾロンと正に相関した（ｒ＝０．２１、Ｐ＝０．０４）。１名の参加者は、平均を上回る足突起幅６．５標準偏差を有した；このアウトライアーの除去は、グリオキサールヒドロイミダゾロンとの関連性を強化した（ｒ＝０．２９、Ｐ＝０．００４）。ＯＰｓはいずれも、いかなる構造測定値ともに関連しなかった。
【０１６５】
多変量調節（モデルＡおよびＢ）は、その観察された関係性のうちの多くを弱めた（表２０）が、全てのジカルボニル由来ＡＧＥｓは、全調節後に少なくとも１つの形態パラメーターと関連したままであった。モデルＢにおいて、カルボキシルエチルリジンおよびメチルグリオキサールヒドロイミダゾロンは、皮質間質体積分率（それぞれ、部分的ｒ＝０．２７、Ｐ＝０．０１および部分的ｒ＝０．２８、Ｐ＝０．００８）と、ならびにカルボキシメチルリジン、カルボキシルエチルリジンおよびメチルグリオキサールヒドロイミダゾロンは、メサンギウム体積分率（それぞれ、部分的ｒ＝０．２５、Ｐ＝０．０２、部分的ｒ＝０．２３、Ｐ＝０．０３および部分的ｒ＝０．３１、Ｐ＝０．００３）と正に相関した。グリオキシルヒドロイミダゾロンおよびメチルグリオキサールヒドロイミダゾロンは、糸球体あたりの全濾過表面と負に相関した（それぞれ、部分的ｒ＝−０．２６、Ｐ＝０．０１および部分的ｒ＝−０．２１、Ｐ＝０．０５）。３−デオキシグルコソンヒドロイミダゾロンは、全球性糸球体硬化のパーセンテージと正に相関した（部分的ｒ＝０．３０、Ｐ＝０．００５）。最後に、カルボキシメチルリジンは、有窓内皮細胞のパーセンテージと負に相関した。
【０１６６】
表２０において、Ｐ値は、ピアソンの相関係数の後に続く括弧の中で示される。Ｐ値＜０．０５は、太字で示される。モデルＡを、年齢、性別、処置割り当て、糖尿病継続期間、ＨｂＡ１ｃおよび平均動脈圧に関して調節した。モデルＢを、モデルＡ共変量＋糸球体濾過率に関して調節した。
【０１６７】
【表２０−１】
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【表２０−２】
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【０１６８】
分析物の略称は、以下のとおりである：  ＭｅｔＳＯ＝メチオニンスルホキシド；  ２−ＡＡＡ＝２−アミノアジピン酸；  ＣＭＬ＝カルボキシメチルリジン；  ＧＨ１＝グリオキサールヒドロイミダゾロン；  ＣＥＬ＝カルボキシルエチルリジン；  ＭＧＨ１＝メチルグリオキサールヒドロイミダゾロン；  ３ＤＧＨＩ＝３  デオキシグルコソンヒドロイミダゾロン、そして腎構造パラメーターに関しては：  ％ＧＳ＝％全球性糸球体硬化；ＶＧ＝平均糸球体体積（×１０６／μｍ３）；ＶｖＩｎｔ＝皮質間質体積分率（％）；ＶｖＭｅｓ＝メサンギウム体積分率（％）；ＳＶ＝糸球体濾過表面密度（μｍ２／μｍ３）；ＴＦＳ＝糸球体あたりの全濾過表面（×１０５／μｍ３）；ＧＢＭ＝糸球体基底膜幅（ｎｍ）；＃Ｅ＋Ｍ＝糸球体あたりの内皮細胞＋メサンギウム細胞の数；＃  Ｐｏｄｏ＝糸球体あたりのポドサイト数；ＦＰＷ＝足突起幅（ｎｍ）；％ＰＤ＝％ポドサイト脱離；％Ｆｅｎ＝％有窓内皮細胞。＊相関を、１つのアウトライアーを除いて分析した。
【０１６９】
各ＡＧＥ／ＯＰと関連する構造変数の部分的相関を、図に示す。図示に関して、メチルグリオキサールヒドロイミダゾロンと皮質間質体積分率および糸球体あたりの全濾過表面との部分的残差回帰プロット（図６）ならびにメサンギウム体積分率および全濾過表面を、図７に示す。本発明者らは、ロサルタン処置割り当てと、ＡＧＥｓ／ＯＰｓのうちのいずれかとの間に、相互作用を見出さなかった。これは、これらの生体マーカーと形態変数との間の関連性が処置によって改変されなかったことを示す。
【０１７０】
ＡＧＥｓおよび腎機能喪失：  ８．０（４．９〜１３．１）年間というメジアン追跡の間に、ＲＦＬの一次エンドポイント（ＧＦＲにおいて≧４０％減少）は、参加者のうちの１０４名（６２％）において起こった。単変量Ｃｏｘモデルでは、ベースライン時のメチルグリオキサールヒドロイミダゾロンの濃度が高いほど、ＲＦＬのリスクがより高いことと関連した（表２１）。多変数調節（モデルＣ）後に、カルボキシルエチルリジン（倍加あたりのＨＲ＝１．６０、９５％  ＣＩ  １．０８〜２．３７）およびメチルグリオキサールヒドロイミダゾロン（ＨＲ＝１．３０、９５％  ＣＩ  １．０２〜１．６５）は、各々ＲＦＬを予測した。ＧＦＲおよびＡＣＲ両方の調節は、モデルＡおよびモデルＢと比較して、これらの化合物とＲＦＬとの間の関連を強化した（表２１）。表２１は、研究参加者からのハザード比（９５％  信頼区間）として表される腎機能の喪失に関するデータを提供する。データは、ハザード比（９５％  信頼区間）として表される。表２１中のデータは、ハザード比（９５％  信頼区間）として表される。ハザード比は、ＡＧＥ変数の倍加ごとに与えられる。Ｐ値＜０．０５は、太字で示される。モデルＡを、年齢、性別、処置割り当て、糖尿病継続期間、ＨｂＡ１ｃおよび平均動脈圧に関して調節した。モデルＢを、モデルＡ  共変量＋糸球体濾過率に関して調節した。
【０１７１】
【表２１】
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【０１７２】
ＡＧＥｓおよび腎機能喪失の感度分析：  表２２は、残りの感度分析の結果を示す。ＥＳＲＤを発生させたが、ＲＦＬに関してＧＦＲ基準を満たさなかった５名の参加者を、ＲＦＬの原因として含めた場合、カルボキシメチルリジンは、カルボキシルエチルリジンおよびメチルグリオキサールヒドロイミダゾロンに加えて、各々、モデルＣにおいてＲＦＬを予測した（それぞれ、ＨＲ＝１．４４、９５％  ＣＩ＝１．０２〜２．０４；  ＨＲ＝１．６８、９５％  ＣＩ＝１．１４〜２．４６；およびＨＲ＝１．３２、９５％  ＣＩ＝１．０５〜１．６７）。ＲＦＬを線形帰属（ｌｉｎｅａｒ  ｉｍｐｕｔａｔｉｏｎ）によって確認した場合、同じ１０９名の参加者が、ＲＦＬエンドポイントに達し、その所見は、一次分析に等しかった。表２２中のデータは、ハザード比（９５％  信頼区間）として示される。ハザード比は、ＡＧＥ変数の１ＳＤ増大ごとに与えられる。Ｐ値＜０．０５を太字で示す。表２２のセクション４、５および６は、以下を包含する：（４）予め特定された転帰：その臨床試験からの予め特定された転帰は、≦６０ｍｌ／分へのＧＦＲの減少またはＧＦＲ＜１２０ｍｌ／分を有する、研究に登録した被験体のベースライン値を半減させることであった；（５）ＲＦＬなしのＥＳＲＤを症例とみなした：  研究試験においてＲＦＬエンドポイントに達することなくＥＳＲＤを発生させた５名の個体を、ＲＦＬの症例として含め、最後の既知の研究試験を、ＲＦＬの発症と見做した；そして（６）帰属法：線形ＧＦＲ傾きを、その事象に関して最も正確な日付を同定するために、各参加者において最後の２回のＧＦＲ測定から計算した。さらに表２２において、統計モデルを以下のようにデザインする：（１）モデルＡを、年齢、性別、処置割り当て、糖尿病継続期間、ＨｂＡ１ｃおよび平均動脈圧に関して調節した；（２）モデルＢを、モデルＡ  共変量＋糸球体濾過率に関して調節した；そして（３）モデルＣを、モデルＢ  共変量＋アルブミン／クレアチニン比に関して調節した。
【０１７３】
【表２２−１】
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【表２２−２】
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【０１７４】
好ましい実施形態において、特定の終末糖化産物（ＭＧ−Ｈ１、ＣＥＬ、およびＧＨＩ）の研究は、２型糖尿病での糖尿病性腎症の発生において上昇したジカルボニルレベルの役割を裏付ける；糖尿病性腎症の進行におけるこれらの特定のＡＧＥ生体マーカーの役割は、糖尿病性腎症の臨床的進行および特定の関連する形態的腎変化との相関を証明することによって確認される。これらのような新たな生体マーカーの臨床使用は、早期の個別化処置が合併症を防止することを可能にする。
【０１７５】
実施例３
血漿中のメチオニンスルホキシド（ＭＥＴＳＯ）レベルおよび１型糖尿病における心血管疾患（ＣＶＤ）転帰の予測
酸化産物（ＯＰｓ）および終末糖化産物（ＡＧＥｓ）の関連および予測値は、心血管関連疾患事象に関連するので、ＤＣＣＴ／ＥＤＩＣ治験データの３０年間のＣＶＤ事象を分析した。特に、メチオニンスルホキシド（ＭｅｔＳＯ）、カルボキシルエチルリジン（ＣＥＬ）、および３  デオキシグルコソンヒドロイミダゾロン（３ＤＧＨ）のレベルを、以下のとおりの症例対照デザインを使用して、上記で記載される方法に従って得、貯蔵し、処理し、分析した。
【０１７６】
上記の液体クロマトグラフィー／トリプル四重極質量分析計（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）の方法を使用して、ＤＣＣＴおよびＥＤＩＣ研究における４５９名の参加者からの血漿サンプルを分析した。９３名の参加者は、心血管疾患（ＣＶＤ）の症状を有した一方で、残りの３６６名の参加者は、非ＣＶＤコントロールであった。ＣＶＤは、致死的でない心筋梗塞（ＭＩ）および脳卒中（虚血性、出血性、および／または一過性虚血性発作）、ＣＶＤ関連死亡率、確認されたアンギナ、うっ血性心不全、および冠血流再建によって示された。その血漿サンプルを、研究のベースライン時、１年目、ＤＣＣＴ閉鎖、および１〜２年目に採取した。
【０１７７】
Ｃｏｘモデルを使用して、固定された（ベースラインおよび早期ＥＤＩＣ）または時間依存性（全４時点）の共変量およびＣＶＤ転帰として、生体マーカーの間での関連を調べた。
【０１７８】
予測改善を評価するために、Ｃ統計量を、全調節したモデルにおいて転帰と有意に関連する生体マーカーに関して計算した。
【０１７９】
ベースラインＣＥＬは、全共変量（すなわち、年齢、ＨｂＡ１ｃ、ボディーマスインデックス［ＢＭＩ］、高密度リポタンパク質［ＨＤＬ］、低密度リポタンパク質［ＬＤＬ］、性別、収縮期血圧［ＳＢＰ］、および拡張期血圧［ＤＢＰ］）について全調節した場合に、ＣＶＤと関連した（ｐ＝０．０３、ＨＲ  １．１５）が、ＥＤＩＣの開始時および時間依存性分析でのＭｅｔＳＯは、心血管転帰と逆に強く関連した（それぞれ、ｐ＜０．００１ならびにＨＲ  ０．５８および０．６１）。ＭｅｔＳＯをそのモデルに加えると、他の共変量（上述）に加えた場合に、予測ｃ統計量が０．７１１から０．７８３へと有意に増大した（ｐ＜０．００１）。
【０１８０】
別段定義されなければ、本明細書で記載される全ての技術用語および科学用語は、開示される発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で引用される刊行物およびこれらが引用される資料は、具体的に参考として援用される。
【０１８１】
当業者は、本明細書で記載される発明の具体的実施形態に対する多くの均等物を認識するかまたは慣用的な実験法のみを使用して確認し得る。このような均等物は、以下の請求項によって包含されることが意図される。
【図１】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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