(57)【要約】  本発明は、HLAアレルが対象の腫瘍において失われているかを決定する方法に関し、前記方法は、前記腫瘍中の前記HLAアレルの特異的コピー数を決定するステップを含む。本発明はまた、対象のがんを治療する方法であって、前記対象の腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にすることを含む方法にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
HLAアレルが対象の腫瘍において失われているか否かを決定する方法であって、前記腫瘍の前記HLAアレルの特異的コピー数を決定するステップを含む方法。
【請求項２】
配列ベースの方法である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
対象の腫瘍試料の配列情報について実施される、請求項1又は請求項2に記載の方法。
【請求項４】
対象の腫瘍試料のHLA配列情報について実施される、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
(i)対象の腫瘍試料のHLAアレル配列情報を、前記対象のHLAタイプに基づくHLAアレル基準配列とアラインメントさせるステップ、
(ii)相同HLAアレルにおけるミスマッチ位置を決定し、各HLAアレルのミスマッチカバレッジを決定するステップ、
(iii)ステップ(ii)において決定されたミスマッチ及びカバレッジに基づいて、各HLAアレルの比及びアレル頻度を決定するステップ、
(iv)ステップ(iii)において決定された比及びアレル頻度に基づいて、腫瘍試料における各HLAアレルのコピー数を決定するステップ、
のうちの1つ以上のステップを含む、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
ステップ(i)〜(iv)の全てを含む、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
ステップ(i)が、次世代配列決定(NGS)によって得られた情報を使用して実施される、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ(ii)が、Smith-Watermanアルゴリズム又はBiostrings Rパッケージを使用して実施される、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ(iii)が、SAMtoolsを使用して実施される、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ(iv)が、ASCAT又はFACETを使用して実施される、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
HLA配列情報が、RNA配列情報又はDNA配列情報である、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
対象のがんを治療又は予防する方法であって、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にすることを含み、前記HLAアレルが失われているかを決定することが、前記腫瘍中の前記HLAアレルの特異的コピー数を決定するステップを含む、方法。
【請求項１３】
前記HLAアレルが失われているかを決定することが、配列ベースの方法によって実施される、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
対象の腫瘍試料のHLA配列情報について実施される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
前記ネオアンチゲンがクローン性ネオアンチゲンである、請求項12から14のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記対象に、
(i)腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲン、
(ii)腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識する免疫細胞、又は
(iii)腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識する抗体
を投与することを含む、請求項12から15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
免疫細胞が、T細胞、B細胞又は樹状細胞である、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
免疫細胞がT細胞である、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項16に記載の方法。
【請求項２０】
がんが、膀胱がん、胃がん、食道がん、乳がん、結腸直腸がん、子宮頸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、腎がん(腎細胞)、肺がん(小細胞、非小細胞及び中皮腫)、脳腫瘍(神経膠腫、星状細胞腫、神経膠芽種)、黒色腫、リンパ腫、小腸がん(十二指腸及び空腸)、白血病、膵がん、肝胆道腫瘍、胚細胞がん、前立腺がん、頭頸部がん、甲状腺がん及び肉腫から選択される、請求項12から19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
がんが肺がんである、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
対象がヒトである、請求項12から21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ネオアンチゲン、ネオアンチゲン特異的免疫細胞又はネオアンチゲンに特異的な抗体を含む組成物であって、前記ネオアンチゲンが、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測され、前記HLAアレルが失われているかを決定することが、前記腫瘍中の前記HLAアレルの特異的コピー数を決定するステップを含む、組成物。
【請求項２４】
前記免疫細胞がT細胞である、請求項23に記載の組成物。
【請求項２５】
腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするT細胞が濃縮されている、請求項24に記載の組成物。
【請求項２６】
対象の腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするT細胞集団を提供する方法であって、
i)対象からT細胞の集団を単離するステップ、及び
ii)T細胞の集団を拡大して、前記ネオアンチゲンを標的にするT細胞の数又は相対的割合を増加させるステップを含み、
前記HLAアレルが失われているかを決定することが、前記腫瘍中の前記HLAアレルの特異的コピー数を決定するステップを含む、方法。
【請求項２７】
請求項26に記載の方法により得られる又は得ることが可能であるT細胞の集団を含む、組成物。
【請求項２８】
腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを含む免疫原性組成物又はワクチンであって、前記HLAアレルが失われているかを決定することが、前記腫瘍中の前記HLAアレルの特異的コピー数を決定するステップを含む、組成物又はワクチン。
【請求項２９】
ネオアンチゲンが、ペプチド、タンパク質、ペプチド若しくはタンパク質をコードするDNA若しくはRNA分子である、又は細胞に包含されている、請求項28に記載の組成物又はワクチン。
【請求項３０】
ネオアンチゲン分子若しくはその一部を表面に発現する細胞又はその集団であって、前記ネオアンチゲン分子若しくはその一部が、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測され、前記HLAアレルが失われているかを決定することが、前記腫瘍中の前記HLAアレルの特異的コピー数を決定するステップを含む、細胞又はその集団。
【請求項３１】
対象のがんの治療又は予防に使用されるネオアンチゲン、ネオアンチゲンを認識する免疫細胞又はネオアンチゲンを認識する抗体であって、前記ネオアンチゲンが、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測され、前記HLAアレルが失われているかを決定することが、前記腫瘍中の前記HLAアレルの特異的コピー数を決定するステップを含む、ネオアンチゲン、免疫細胞又は抗体。
【請求項３２】
対象のがんの治療又は予防に使用される医薬の製造におけるネオアンチゲン、ネオアンチゲンを認識する免疫細胞又はネオアンチゲンを認識する抗体の使用であって、前記ネオアンチゲンが、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測され、前記HLAアレルが失われているかを決定することが、前記腫瘍中の前記HLAアレルの特異的コピー数を決定するステップを含む、使用。
【請求項３３】
前記HLAアレルが失われているかが、請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法によって決定される、請求項1〜32のいずれか一項に記載の方法、組成物、ネオアンチゲン特異的免疫細胞若しくはネオアンチゲンに特異的な抗体又はそれらの使用。
【請求項３４】
対象のがんを治療又は予防する方法であって、腫瘍において、コピー数消失を受けて失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲを標的にすることを含み、
(a)腫瘍において、コピー数消失を受けて失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを、以下の方法:
(i)対象の腫瘍試料のHLAアレル配列情報を、前記対象のHLAタイプに基づくHLAアレル基準配列とアラインメントさせること、
(ii)相同HLAアレルにおけるミスマッチ位置を決定し、各HLAアレルのミスマッチカバレッジを決定すること、
(iii)ステップ(ii)において決定されたミスマッチ及びカバレッジに基づいて各HLAアレルの比及びアレル頻度を決定すること、
(iv)ステップ(iii)において決定された比及びアレル頻度に基づいて、腫瘍試料における各HLAアレルのコピー数を決定すること、
により選択するステップ、
(b)前記対象に、
(i)腫瘍において失われていないことがステップ(a)において決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲン、
(ii)腫瘍において失われていないことがステップ(a)において決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識する免疫細胞、又は
(iii)腫瘍において失われていないことがステップ(a)において決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識する抗体
を投与するステップ
を含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、HLAアレルが対象の腫瘍において失われているかを決定する方法に関し、前記方法は、前記腫瘍中の前記HLAアレルの特異的コピー数を決定するステップを含む。本発明は、対象のがんを治療する方法であって、前記対象の腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲン(neoantigen)を標的にすることを含む方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫回避はがんの特徴となっている。がん細胞は、T細胞認識を避けるため、様々な機構を用いて免疫系を逃れる。がん免疫療法は、バランスを免疫活性化に好ましいようにシフトさせて、がん細胞の排除を可能にすることによって、この免疫回避に対抗することが目的である。しかし、患者のサブセットのみが免疫療法から利益を得ており、免疫回避を支えているゲノム及び分子決定基を同定する必要性が強調される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
免疫の重要な一面は、ヒト白血球抗原(HLA)系である。HLA遺伝子は、免疫系に抗原を提示するタンパク質をコードする。
【０００４】
これらのHLA遺伝子の下方制御は、抗原提示の低減をもたらし、それによって免疫回避を促進することがある。HLAの下方制御は、免疫組織化学によって特徴付けられ、一連のがんタイプにわたって普遍的であること、及び転帰不良にも関連していることが見いだされている。母方又は父方のいずれかのHLAハプロタイプの消失（loss）は、免疫療法の効力に影響を及ぼすこともある。
【０００５】
しかし、抗腫瘍免疫性、クローン性拡大及びネオアンチゲンの予測に対するHLAハプロタイプ消失の影響は、HLA遺伝子座の多形性がヒト基準ゲノムへの配列読み取りデータ(sequencing read)のアラインメント及びコピー数の推測を妨げるので、系統的に探求されてこなかった。このHLA遺伝子座の多形性は、特定のHLA消失を決定する配列ベースの方法に対する障害となっている。事実、過去に使用された以前の方法は、HLAタイプを検出するために抗体を用いていた。例えば、Hiraki et al. (Anticancer Research 24:1525-1528, 2004)を参照すること。ここでは、アレル特異的HLAクラスIの発現は、モノクローナル抗体のパネルを使用して分析された。そのような方法は、明らかに労働集約的であり、費用がかかり、大規模な使用又は診療所における使用にとって有効ではない。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、特異的HLAコピー数プロファイルを決定することができない現行の配列ベースの方法に固有の制約を克服する方法を開発した。本発明は、どの特定のHLAアレルが失われているかを決定することを可能にする。
【０００７】
従って本発明は、HLA特異的コピー数消失の簡単で迅速な都合の良い正確な決定を促進し、日常的に使用することができ、診療所の設定で使用することができる点において、当分野に重要な貢献をもたらす。本発明は、実験室ベースの方法より労働集約的ではなく、大きな費用対効果があり、患者の腫瘍からの過去の配列決定情報を使用することができ、それによって患者が2回目の生検を受ける必要がないという追加的な利点をもたらす。
【０００８】
このように、本発明以前は、がんとの関連においてHLA消失の普遍性及び複雑性を分析することが可能ではなかった。既存の方法は、腫瘍中のHLA遺伝子座のハプロタイプ特異的コピー数を推測することができない。がんの状況においてネオアンチゲンを標的にする療法を設計する場合、HLAアレルが失われているか否かを高度な確実性を持って知ることが、免疫系に実際に提示されるネオアンチゲンを標的にするために重要である。以前の方法では、そのような決定は可能ではない。
【０００９】
ここで本発明は、HLAアレルが腫瘍において失われているか否かを決定する正確な方法を提供する。重要なことには、本方法は、どのHLAアレルが各HLA遺伝子において消失するかの特異的決定を可能にする。本方法は、腫瘍内のHLAアレルプロファイルの正確な決定を可能にし、このことは、がんにおけるネオアンチゲンを標的にする改善された療法の設計を促進する。
【００１０】
特定のHLAアレルのコピー数を決定できることは、存在するHLAアレルによりコードされた特異的HLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にする療法を設計するために重要である。腫瘍において、どの特異的HLAアレルタイプが失われるかを知ることは重要であるが、どの特異的HLAアレルタイプが存在するかを知ることも、療法が、存在するその特定のHLAアレルによりコードされるHLA分子により提示されたネオアンチゲンを標的にするように設計され得るようにするために重要である。本発明は、対象における特異的HLAアレルのコピー数消失を決定する改善された方法を提供する。
【００１１】
当分野で既知の方法、例えばPolysolverは、突然変異による機能的HLA消失のみを決定し、コピー数消失を評価しない。例えば治療法を設計する場合、突然変異による機能性の消失よりもコピー数の消失を決定することが有益であり、それは、突然変異による機能性の消失が腫瘍の非常に小さな割合でしか生じず、一方、コピー数の消失は、より大きな割合(40%)の腫瘍において生じるからである(例えば、本明細書の図4、並びにMcGranahan et al. Cell 171:1259-1271 2017及びShukla et al. Nature Biotechnology 33:1152-1158 2015も参照すること)。
【００１２】
本発明は対象のがんを治療する方法であって、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にすることを含む方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１−１】腫瘍におけるHLAクラスIアレル特異的コピー数の推測のためのLOHHLAの概要及び確証である。A)LOHHLAアルゴリズムの概略図である。B)ASCATとLOHHLAのマイナー(minor)アレルコピー数の比較である。C)HLA遺伝子座におけるアレルの不均衡を推測するためにLOHHLAとASCATの比較を例示するVennダイアグラムである。D)HLA遺伝子座におけるLOHを推測するためにLOHHLAとASCATの比較を例示するVennダイアグラムである。
【図１−２】図１−１の続き。
【図２−１】図1に関連したLOHHLAとASCATの比較である。A)ASCATメジャー(major)コピー数とLOHHLAメジャーコピー数の比較を示すプロットである。B〜C)アレル不均衡(B)及びLOH(C)に関する調和性及び不調和性腫瘍領域の要約である。D)ASCATが、HLAコピー数又はどのHLA対遺伝子が消失するかを、どのようにして直接的に推測できないかを示す概略図である。対照的にLOHHLAは、HLA遺伝子を網羅するSNPを使用して、HLAコピー数を直接的に推測する。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３−１】図1に関連した、フラグメント分析を使用したLOHHLAのバリデーションである。A)CRUK0010の生殖細胞系列、並びに腫瘍領域R1及びR2についてApplied BiosystemsソフトウエアGeneMapper v5を使用した、各アレルの曲線下面積である。B)式  (At/Bt)/(An/Bn)を使用して決定された正規化アレル比である。注目すべきことに、領域R1は、アレル不均衡及びおそらくはLOHの明確な証拠を示し、一方、領域R2は生殖細胞系列に類似していると思われる。C)LOHHLAで分類して、LOH及びアレル不均衡のいずれか、LOHではなくアレル不均衡であること、又はLOH若しくはアレル不均衡がないことを示す、腫瘍領域の正規化アレル比である。注目すべきことに、高い正規化アレル比を有する外れ値腫瘍は、LOHHLAによるミラーサブクローン性アレル不均衡を示すものして分類されている。D)ASCATで分類して、LOH及びアレル不均衡のいずれか、LOHではなくアレル不均衡であること、又はLOH若しくはアレル不均衡がないことを示す、腫瘍領域の正規化アレル比である。TITAN(E及びG)及びSequenza(F及びH)で分類して、LOH及びアレル不均衡のいずれか、LOHではなくアレルが不均衡であること、又はLOH若しくはアレル不均衡がないことを示す、腫瘍領域の正規化アレル比であり、P値はウィルコクソン順位和検定に対応する。
【図３−２】図３−１の続き。
【図４】NSCLCにおけるHLA LOHの頻度及びタイミングである。(A)HLA遺伝子座においてHLA非同義突然変異、HLAアレル不均衡又はLOHを示すTRACERx患者の総数が示されている。(B)NSCLCにおいて同定されたHLAアレル不均衡及びHLA LOHのサブタイプの割合である。濃縮の有意性をフィッシャーの正確検定を使用して試験した。
【図５】NSCLCにおけるHLA LOHの頻度及びタイミングである。(A〜B)円グラフは、肺腺癌(A)と肺扁平上皮細胞癌(B)について多領域情報を使用してHLA LOH事象のタイミングを示す。個別のHLA A/B/C遺伝子座における事象は、考慮されるあらゆる領域で見いだされた場合にはクローン性であると考えられ、腫瘍領域のサブセットにのみ見いだされた場合にはサブクローン性であると考えらた。患者試料は、その患者で個別の遺伝子座の全てがクローン的に失われた場合には、クローン性HLA LOHを有すると考えられた。コピー数分析に利用可能な単一領域のみを有する2人の肺扁平上皮細胞癌患者は、示されていない。
【図６】NSCLCにおけるHLA LOHの頻度及びタイミングである。HLA LOHの証拠を示す各肺腺癌腫瘍の系統樹に、HLA LOH事象の最も可能性のあるタイミングの注釈が付けられている。HLA LOHが実現可能ではないホモ接合体HLAアレルは、星印によって示されている。系統樹のクラスターは、クローン性(青色)又はサブクローン性(赤色)として示されている。HLA LOH事象が、系統樹上に可能なクローンをマッピングできない場合、追加の灰色サブクローンが含められた。
【図７−１】NSCLCにおけるHLA LOHの頻度及びタイミングである。HLA LOHの証拠を示す各肺扁平上皮細胞癌腫瘍の系統樹に、HLA LOH事象の最も可能性のあるタイミングの注釈が付けられている。HLA LOHが実現可能ではないホモ接合体HLAアレルは、星印によって示されている。系統樹のクラスターは、クローン性(青色)又はサブクローン性(赤色)として示されている。HLA LOH事象が、系統樹上に可能なクローンをマッピングできない場合、追加の灰色サブクローンが含められた。(G)HLA LOHなし(灰色)、原発性腫瘍及び脳転移の両方にHLA LOH(緑色)、原発性腫瘍のみにHLA LOH(赤色)、又は脳転移のみにHLA LOH(青色)を示す、利用可能な一対の原発性/脳転移配列決定データにを有する、NSCLC患者の数である。原発性腫瘍及びあらゆる脳転移の両方のHLA遺伝子座にわたって一貫して同定されるHLA LOHを有する患者は、クローン性HLA LOHを有すると考えられた。LOHを受ける不整合なHLA遺伝子座又は原発性若しくは脳転移試料にのみ同定されるHLA LOHを有する患者は、サブクローン性HLA LOHを有すると考えられた。(H)HLA LOH事象のタイミングが示されている。クローン性HLA LOH事象は、原発性腫瘍試料及び脳転移の両方(緑色)に生じ、一方、サブクローン性HLA LOH事象は、脳転移(青色)に生じるか、又は脳転移をしない原発性腫瘍のサブクローン(赤色)に生じた。全体として、HLA LOHの増加が、原発性腫瘍と比較して脳転移試料に観察され(27%対43%)、対応した減少が、HLA LOHを示していない脳転移試料に観察される(73%対57%)。
【図７−２】図７−１の続き。
【図８−１】HLA LOHはNSCLCの選択を反映する。肺腺癌(A)及び肺扁平上皮細胞癌(B)における限局性LOHの頻度である。限局性LOHは染色体アームの<75%と定義される。矢印は、HLA遺伝子座の位置を示す。水平破線は、シミュレーションを使用した、p=0.05での有意な限局性LOHを示す。クローン性LOHは青色で示され、サブクローン性LOHは赤色で示されている。染色体アームのLOH及び限局性サブクローン性LOHは、図11に示されている。(C)HLA LOHの平行進化であり、アレル特異的HLA消失が系統樹上に示されている。
【図８−２】図８−１の続き。
【図９−１】図8に関連した、ゲノムにわたるアームレベル及び限局性サブクローン性LOHである。A〜B)肺腺癌(A)及び肺扁平上皮細胞癌(B)のゲノムにわたるアームレベルのLOHである。アームレベルのLOHは染色体アームの>75%と定義される。矢印は、HLA遺伝子座の位置を示す。水平破線は、シミュレーションを使用した、p=0.05での有意な限局性LOHを示す。クローン性LOHは青色で示され、サブクローン性LOHは赤色で示されている。C〜D)肺腺癌(C)及び肺扁平上皮細胞癌(D)のゲノムにわたる限局性サブクローン性LOHである。限局性LOHは染色体アームの<75%と定義される。矢印は、HLA遺伝子座の位置を示す。
【図９−２】図９−１の続き。
【図１０−１】非同義突然変異負荷量がHLA LOHと関連し、ネオアンチゲンが消失アレルとより頻繁に結合する。(A)非同義突然変異の総数が、肺腺癌(薄青色)及び肺扁平上皮細胞癌(マゼンタ色)について異なる分類のHLA LOHにわたってプロットされている。腫瘍は、HLA LOHを有さない、事象のタイミングを考慮しない任意のHLA LOH事象を有する、サブクローン性HLA LOHを有する、又はクローン性HLA LOHを有する、と分類され得る。総非同義突然変異最下四分位は、赤色破線によって示され、それより大きい又は小さい総非同義突然変異負荷量を有する腫瘍の割合は、各HLA LOH分類群について円グラフにより示されている。(B)クローン性非同義突然変異の数が、肺腺癌(薄青色)及び肺扁平上皮細胞癌(マゼンタ色)について異なる分類のHLA LOHにわたってプロットされている。クローン性非同義突然変異最下四分位は、赤色破線によって示され、それより大きい又は小さいクローン性非同義突然変異負荷量を有する腫瘍の割合は、各HLA LOH分類群の円グラフにより示されている。(C)サブクローン性非同義突然変異の数が、肺腺癌(薄青色)及び肺扁平上皮細胞癌(マゼンタ色)について異なる分類のHLA LOHにわたってプロットされている。サブクローン性非同義突然変異最下四分位は、赤色破線によって示され、それより大きい又は小さいサブクローン性非同義突然変異負荷量を有する腫瘍の割合は、各HLA LOH分類群の円グラフにより示されている。(D)HLA LOHを有さない別の分枝からのクローンにおける非同義突然変異の数と比較した、HLA LOH事象を有するクローンにおいて見いだされた非同義突然変異の数である。(E)消失HLAアレル又は保持HLAアレルのいずれかに結合すると予測されるサブクローン性ネオアンチゲンの数が、HLA LOHを示す全てのNSCLC腫瘍、HLA LOHを有する全ての肺腺癌腫瘍及びHLA LOHを有する全ての肺扁平上皮腫瘍について示されている。p値は、対応のあるウィルコクソン検定を使用して計算される。(F)消失アレルへのバインダーをもたらすと予測される突然変異の総数が、少なくとも1つのHLA LOH事象を有する全ての患者について示されている。突然変異のクローン性も、クローン性(薄青色)又はサブクローン性(薄赤色)のいずれかとして示されている。
【図１０−２】図１０−１の続き。
【図１１−１】図10に関連した、ネオアンチゲン及び領域性LOHの関連性である。
【図１１−２】図１１−１の続き。
【図１２】図10に関連した、シグネチャーLOHの関連性である。
【図１３】A)クローン性HLA LOHを有する、サブクローン性HLA LOHを有する、及びHLA LOHが観察されない腫瘍からのFFPE診断ブロックの抗PD-L1染色である。免疫細胞ベースの染色及び腫瘍細胞染色が示されている。(B)HLA LOHを有さないもの、及びクローン性HLA LOHを有するものという、2つの代表的な腫瘍の染色が示されている。(C)HLA LOH事象を全ての遺伝子座に含有する腫瘍と、HLA LOH事象を有さない腫瘍との中央値のlog比が、公開された免疫微小環境測定値及びシグネチャーにおいて示されている。HLA LOHによる免疫測定値の増加が赤色で示され、減少が青色で示されている。HLA LOH群間における免疫測定値の分布を比較するFDR(q)値が、星印(*)により示されている。表S1も参照すること。
【図１４】TCGAデータにおけるHLAアレル不均衡とHLA LOHの関連性である。(A)NSCLCにおいて同定されたHLAアレル不均衡及びHLA LOHのサブタイプによる割合である。濃縮の有意性をフィッシャーの正確検定を使用して試験した。(B)非同義突然変異の総数が、肺腺癌(薄青色)及び肺扁平上皮細胞癌(マゼンタ色)について異なる分類のHLA LOHにわたってプロットされている。腫瘍は、HLA LOHを有さない、HLA-A、HLA-B若しくはHLA-C遺伝子座のいずれかにHLA LOHを有する、又はHLAクラスIの3つの遺伝子座の全てにHLA LOHを有すると分類され得る。総非同義突然変異最下四分位は、赤色破線によって示され、それより大きい又は小さい総非同義突然変異負荷量を有する腫瘍の割合は、各HLA LOH分類群の円グラフにより示されている。(C)百万個あたりの転写物(TPM)におけるGZMA及びPRF1発現のlog平均(幾何平均)と定義される細胞溶解活性(CYT)スコアが、肺腺癌(薄青色)及び肺扁平上皮細胞癌(マゼンタ色)について示されている。
【図１５−１】NSCLCにおけるHLAアレル特異的消失のモデルである。モデルは、HLA LOHが腫瘍においてどのように免疫回避をもたらし得るかを説明している。腫瘍が進化する間に、ネオアンチゲンの蓄積がCD8 T細胞を含む局所免疫浸潤物を誘導することがある。局所免疫浸潤物は、腫瘍の選択的バリアとして作用する。HLA LOHを有するサブクローンはCD8 T細胞認識を避けることにより殺滅から逃れることができるので、選択され得る。あるいは、他のサブクローンは、免疫阻害分子を放出することによって、殺滅から逃れ得る。
【図１５−２】図１５−１の続き。
【図１６】腫瘍におけるHLAクラスIIアレル特異的コピー数の推測のためのLOHHLAの用途である。A)HLA-DRB1アレルにおけるLOHHLAのアレル特異的アラインメントである。B)2つのHLA-DRB1アレルにおけるアレル特異的logR比である。C)同定されたヘテロ接合性位置におけるlogRでのペアの差(paired difference)である。D)HLA DRB1のアレル特異的コピー数である。注目すべきことに、HLA DRB1:01:01:01はゼロ個のコピーでの存在として同定され、HLA消失事象を示している。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、HLAアレルが腫瘍において失われているか否かを決定する方法を提供する。HLA発現の知識は、消失していないHLAアレルによりコードされたHLA分子により提示されると予測される特定の抗原、例えば本明細書に記載されているネオアンチゲンを標的にする治療法の設計に情報を提供することができ、すなわち、免疫系に提示されず、腫瘍に対する免疫応答を誘発しないネオアンチゲンを標的にする治療法の設計を避けるために情報を提供することができる。
【００１５】
HLAアレルが腫瘍において失われているか否かを決定する方法
一態様において、本発明はHLAアレルが腫瘍において失われているか否かを決定する方法を提供し、前記方法は、前記腫瘍由来の試料中の前記HLAアレルの特異的コピー数を決定するステップを含む。本明細書に考察されたように、本発明は腫瘍中の特異的HLAアレルのコピー数を決定する有効な方法を可能にし、このことは、本方法において重要なステップを表す。
【００１６】
本方法は、対象由来の腫瘍試料の配列情報によって実施してもよい。一態様において、本方法は、対象由来の腫瘍試料のHLA配列情報によって実施してもよい。
【００１７】
本明細書で使用されるとき、「消失（loss）」とは、突然変異に起因する機能の消失ではなく、HLAアレルのコピー数の消失又は欠損を意味する。
【００１８】
HLAアレル特異的コピー数の決定は、例えば、腫瘍においてHLAアレルの比又はアレル不均衡のみを分析する場合と異なり、腫瘍におけるHLAアレル消失に関する高レベルの確実性を生成するために重要である。本発明は、腫瘍におけるHLA消失の驚くべき普遍性及び複雑性の観点から、HLAアレル特異的コピー数を決定することが、免疫系に提示されるネオアンチゲンを標的にする可能性の高い療法を設計するために重要であるとういう事実に基づいている。本発明による方法は、腫瘍におけるHLAアレル特異的コピー数の分析を初めて可能にし、従って、特定のHLAアレルが失われているかについての正確な決定を可能にする。
【００１９】
一態様において、本発明による方法は、
(i)対象の腫瘍試料のHLAアレル配列情報を、前記対象のHLAタイプに基づくHLAアレル基準配列とアラインメントさせるステップ、
(ii)相同HLAアレルにおけるミスマッチ位置を決定し、各HLAアレルのミスマッチカバレッジを決定するステップ、
(iii)ステップ(ii)において決定されたミスマッチ及びカバレッジに基づいて各HLAアレルの比及びアレル頻度を決定するステップ、
(iv)ステップ(iii)において決定された比及びアレル頻度に基づいて、腫瘍試料における各HLAアレルのコピー数を決定するステップ
のうちの1つ以上を含んでもよい。
【００２０】
当業者は、そのようなステップを実施する方法を認識している。
【００２１】
例えば、ステップ(i)に記載される配列情報は、標準的な核酸配列決定方法によって得てもよい。本発明者らは、例えば、Mardis, 2013 Annu. Rev. Anal. Chem. 6:287-303を参照している。
【００２２】
HLAタイプの決定方法も、当分野において知られており、例えば、Shukla, 2016 Nature Biotechnology 33, 1152-1158、Szolek, 2014 Bioinformatics 30, 3310-3316及びWarren, 2012 Genome Medicine 4, 95に記載されている。
【００２３】
個人のHLAプロファイルは、HLA血清型判定及び/又はHLA遺伝子配列決定によって決定されてもよい。単一の特異的プライマー-PCR(SSP-PCR)によるHLA表現型決定は、個人のHLAプロファイルを決定する代替的戦略である。個人のHLAプロファイルは、HLA遺伝子座の配列決定及びプロセシングによって、例えば、HLAタイプを決定するためにOptitype予測アルゴリズムを使用して決定してもよい。
【００２４】
一態様において、ステップ(i)は、実施例1に記載されている、すなわち第1及び第2のバイオインフォマティクスステップを包含する方法に従って実施してもよい。従って、上記のステップ(i)は、HLA読み取りデータを抽出すること及びHLAアレル特異的BAMファイルを作成することを包含してもよい。
【００２５】
ステップ(ii)は、Smith-Watermanアルゴリズム又はBiostrings Rパッケージを使用して実施してもよい。
【００２６】
ステップ(iii)は、当分野で既知の方法を使用して実施してもよく、例えば、Li 2009 Bioinformatics 25, 2078-2079及びLi 2011 Bioinformatics 27, 2987-2993 (SAMtools)に記載されている。「カバレッジ」とは、配列が決定された回数を意味する。これは、本発明の技術分野において標準的な用語であり、当業者に理解される。
【００２７】
ステップ(iv)は、腫瘍の純度及び/又は倍数性を考慮して、特異的コピー数状態を推測する当分野で既知の方法、例えば、ASCAT (Van Loo 2010, PNAS 107, 16910-16915)、FACET (Shen 2016, Nucleic Acids Res 44, e131.)を使用して実施してもよい。「腫瘍の純度」とは、配列決定されている試料中の他の細胞に対するがん細胞の割合を意味する。「腫瘍の倍数性」とは、細胞が有するゲノムコピー(又は染色体セット)の数を意味する。
【００２８】
HLAアレル特異的コピー数の決定は、HLAアレルが腫瘍において失われているか否かを決定できるようにする。
【００２９】
本発明による方法は、HLA遺伝子座のHLAハプロタイプ特異的コピー数の推測、従って、どの特異的HLAハプロタイプが腫瘍において消失し得るかの推測を可能にする。
【００３０】
一態様において、本方法は、本明細書の実施例に記載されているように実施してもよい。
【００３１】
試料
本明細書において言及されるとき、「生殖細胞系列」試料は、非腫瘍試料、例えば、対象由来の血液試料、組織試料又は末梢血単核細胞を指す。
【００３２】
一態様において、試料は、血液試料であり得る。この試料は、血液画分を含有してもよく(例えば、血清試料若しくは血漿試料)、又は全血であってもよい。対象から試料を採取する技術は、当分野において良く知られている。
【００３３】
本明細書において言及されるとき、「腫瘍試料」は、腫瘍に由来する又は腫瘍から得た試料を指す。腫瘍は、固形腫瘍又は非固形若しくは血液系腫瘍であってもよい。
【００３４】
腫瘍からの生検及び試料の単離は、当分野で一般的に実施されており、任意の適切な方法に従って実施することができ、そのような方法は当業者に知られている。
【００３５】
腫瘍試料は、対象からの原発性腫瘍試料、腫瘍関連リンパ節試料又は転移部位の試料であってもよい。
【００３６】
ある特定の実施形態において、試料は、腫瘍関連体液又は組織である。
【００３７】
適切には、試料は、循環腫瘍DNA、循環腫瘍細胞又は腫瘍DNAを含むエクソソームであり得る。循環腫瘍DNA、循環腫瘍細胞又は腫瘍DNAを含むエクソソームは、当分野で既知の方法を使用して、対象から得た血液試料から単離され得る。
【００３８】
腫瘍試料及び非がん性組織試料は、当分野で既知の任意の方法に従って得ることができる。例えば、腫瘍試料及び非がん性試料は、切除を受けたがん患者から得ることができ、又は皮下針を使用した抽出によって、顕微解剖によって若しくはレーザーキャプチャーによって得ることができる。対照(非がん性)試料は、例えば、非生体ドナーから又は健康なドナーから得ることができる。ctDNA及び循環腫瘍細胞は、例えば、Nature.2017 Apr 26;545(7655):446-451又はNat Med.2017 Jan;23(1):114-119に従って、血液試料から単離され得る。
【００３９】
下流配列決定に適したDNA及び/又はRNAは、当分野で既知の方法を使用して試料から単離することができる。例えば、DNA及び/又はRNAの単離は、フェノールベースの抽出を使用して実施してもよい。フェノールベースの試薬は、変性剤及びRNase阻害剤の組合せを、細胞及び組織破壊、その後の夾雑物質からのDNA又はRNAの分離のために含有する。例えば、抽出手順、例えば、DNAzol(商標)、TRIZOL(商標)又はTRI REAGENT(商標)を使用する手順を使用してもよい。DNA及び/又はRNAは、固相抽出法(例えば、スピンカラム)、例えば、PureLink(商標)Genomic DNA Mini Kit又はQIAGEN RNeasy(商標)の方法を使用して、更に単離され得る。単離されたRNAを、当分野で既知の方法(RT-PCR)を使用して、下流配列決定のためにcDNAに変換してもよい。
【００４０】
一態様において、1個を超える試料、例えば2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の試料が得られ、分析される。
【００４１】
一態様において、原発性腫瘍部位及び1つ以上の転移部位の両方からの試料を試験することが必要であり得る。一態様において、原発性腫瘍部位からの試料は、転移部位のがん細胞を代表しないことがある。従って、本明細書に記載されている発明の方法及び使用は、腫瘍の原発性部位と転移部位の両方におけるHLA消失の決定を伴っていてもよい。
【００４２】
HLA及びネオアンチゲンの提示
ヒト白血球抗原(HLA)系は、ヒトの主要組織適合性複合体(MHC)タンパク質をコードする遺伝子複合体である。これらの細胞表面タンパク質は、ヒトの免疫系を調節する。HLA遺伝子複合体は、染色体6p21内の3Mbpストレッチ上にある。HLA遺伝子は高度に多形性であり、これは多くの異なるアレルを有することを意味し、これらが適応免疫系を微調整することを可能にする。例えば、Shiina et al. Journal of Human Genetics (2009) 54, 15-39に記載されているように、各HLA遺伝子座において、可能なアレルが数千も存在することがある。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、用語「HLAアレル」は、HLA遺伝子座における任意のアレルを指すことが意図される。
【００４４】
MHCクラスI(A、B及びC)に対応するHLAは、細胞内部に由来するペプチドを提示する。これらのペプチドは、プロテアソームにおいて分解された、消化されたタンパク質から産生される。一般に、ペプチドは小さなポリマーであり、約8〜11個のアミノ酸長である。MHCクラスIにより提示された異種抗原は、細胞を破壊するキラーT細胞を誘引する。
【００４５】
一態様において、本発明は、がん性細胞内のペプチドがMHCクラスIタンパク質により細胞表面に提示され得る点において、HLAクラスIに関連する。
【００４６】
本明細書に記載されている発明の一態様において、HLAはクラスI HLAである。一態様において、HLAは、HLA-Aである。一態様において、HLAは、HLA-Bである。一態様において、HLAは、HLA-Cである。一態様において、HLAは、HLA-A、HLA-B及びHLA-Cから選択されるクラスI HLAである。
【００４７】
HLAクラスIには、HLA-E、HLA-F及びHLA-Gも挙げられる。
【００４８】
MHCクラスII(DP、DM、DOA、DOB、DQ及びDR)に対応するHLAは、細胞の外部からの抗原をTリンパ球に対して提示する。MHCクラスII分子は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞、単核食細胞、一部の内皮細胞、胸腺上皮細胞及びB細胞に通常見いだされる。これらの細胞は免疫応答を開始するのに重要である。これらの分子は、また、インターフェロンγによって他の細胞上においても誘導され得る。
【００４９】
一態様において、HLAは、例えば、HLA-DP、HLA-DM、HLA-DOA、HLA-DOB、HLA-DQ及びHLA-DRから選択されるクラスIIのHLAであってもよい。一態様において、HLAは、HLA-DPである。一態様において、HLAは、HLA-DMである。一態様において、HLAは、HLA-DOAである。一態様において、HLAは、HLA-DOBである。一態様において、HLAは、HLA-DQである。一態様において、HLAは、HLA-DRである。
【００５０】
HLA型判定の方法は、当分野で知られており、例えば、本明細書に記述されているPolysolver又はOptiTypeである。
【００５１】
HLA系により提示される抗原は、ネオアンチゲンであり得る。ネオアンチゲンは、以前に免疫系に提示されていない、新たに形成された抗原である。ネオアンチゲンは、腫瘍特異的抗原であり、がん細胞内の突然変異の結果として生じる。従って、ネオアンチゲンは健康体(即ち、非腫瘍細胞)によって発現されない。ネオアンチゲンは、MHC分子の環よによって提示された場合、T細胞により認識され得る特有のペプチドを生成するようにプロセシングされ得る。本明細書に記載されているように、ネオアンチゲンをがん療法の基礎として使用してもよい。
【００５２】
ネオアンチゲンを同定又は予測する方法は、当分野で知られており、例えば、Nielsen, 2016、Hoof, 2009及びHundal, 2016に記載されている。
【００５３】
（特定のHLAアレルによりコードされた）特定のMHC分子へのネオアンチゲンの結合は、当分野で既知の方法を使用して予測され得る。MHC結合を予測する方法の例には、Lundegaard et al. (Nucleic Acids Res. 2008:W509-12.2008 & Bioinformatics. 2008 Jun 1;24(11):1397-8)及びShen et al. (Proteome Sci. 2013 Nov 7;11(Suppl 1):S15)に記載されているものが挙げられる。本発明の実施例において、ネオアンチゲンのMHC結合は、netMHC及びnetMHCpanアルゴリズムを使用して予測される。
【００５４】
ネオアンチゲンペプチド配列へのMHC分子の予測結合親和性は、500nM以下（below）であり得る。「高い親和性」とは、0〜50nMの結合親和性を意味し得る。他の実施形態において、ネオアンチゲンペプチドは、中程度の親和性の50〜150nMの結合親和性又は低い親和性の150〜500nMの結合親和性でMHC分子に結合すると予測され得る。
【００５５】
特定のMHC分子に結合すると予測されたネオアンチゲンは、それによって、前記MHC分子により細胞表面に提示されると予測される。
【００５６】
一態様において、本発明は、ネオアンチゲンが腫瘍により提示されると予測されるか否かを決定する方法であって、
(i)腫瘍においてネオアンチゲンを同定するステップ、及び
(ii)前記ネオアンチゲンが、前記腫瘍において失われていないHLAアレルによりコードされたHLA分子により提示されると予測されるか否かを決定するステップ
を含む方法を提供する。
【００５７】
第2のステップは、本明細書に記載されている発明の方法により実施してもよい。
【００５８】
一態様において、本発明は、がん療法の標的ネオアンチゲンを同定する方法であって、
(i)腫瘍においてネオアンチゲンを同定するステップ、
(ii)前記ネオアンチゲンが、前記腫瘍において失われているHLAアレルによりコードされたHLA分子により提示されると予測されるか否かを決定するステップ、及び
(iii)前記腫瘍において失われているHLAアレルによりコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを、標的として無視するステップ
を含む方法を提供する。
【００５９】
一態様において、がん療法の標的ネオアンチゲンを同定する方法であって、
(i)腫瘍のネオアンチゲンが、前記腫瘍において失われているHLAアレルによりコードされたHLA分子により提示されると予測されるか否かを決定するステップ、及び
(ii)前記腫瘍において失われているHLAアレルによりコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを、標的として無視するステップ
を含む方法が提供される。
【００６０】
ネオアンチゲンが、1つのHLAアレルは腫瘍において失われ得るが、他のHLAアレルは腫瘍において失われていない、1つを超えるHLAアレルに結合すると予測することができる場合がある。その場合、ネオアンチゲンは依然としてがん療法の標的であってもよく、無視する必要はない。
【００６１】
従って、上記の方法は、前記腫瘍において失われているHLAアレルによってのみ提示されると予測されるネオアンチゲンを、標的として無視するステップを含んでもよい。ネオアンチゲンは、腫瘍において失われていない少なくとも1つのHLAアレルにより提示されると予測される場合、標的として保持されてもよい。
【００６２】
一態様において、がん療法の標的ネオアンチゲンを同定する方法であって、
(i)腫瘍のネオアンチゲンが、前記腫瘍において失われているHLAアレルによりコードされたHLA分子により提示されると予測されるかを決定するステップ、及び
(ii)前記腫瘍において失われているHLAアレルによってのみ提示されると予測されるネオアンチゲンを、標的として無視するステップを含み、腫瘍において失われていないHLAアレルによりコードされた少なくとも1つのHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンが、標的として無視されない、上記方法が提供される。
【００６３】
言い換えると、ネオアンチゲンは、腫瘍において失われていないHLAアレルによりコードされた少なくとも1つのHLA分子により提示されると予測される場合、がん療法の標的として同定されてもよい。
【００６４】
本明細書の方法により同定された標的ネオアンチゲンは、本明細書に記載されている発明に従う任意の治療方法及び対応する使用の標的であり得る。
【００６５】
本明細書における方法の一態様において、失われていない(又はネオアンチゲンが無視される場合は、失われている)HLAアレルは、腫瘍由来の少なくとも1個の試料において失われていないと決定される。一態様において、前記HLAは、前記腫瘍由来の2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の試料において失われていないと決定される。
【００６６】
ネオアンチゲンの標的化
本発明によると、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンは、対象のがんの治療又は予防における治療的又は予防的介入の標的を表してもよい。
【００６７】
本明細書における「ネオアンチゲン」の言及は、ネオアンチゲン由来のペプチドも含むことが意図される。
【００６８】
本発明の方法は、in vitro又はin vivoで、例えば、その後に対象への処置済細胞の投与が続くin situ処置又はexo vivo処置のいずれかのために使用することができる。
【００６９】
「ネオアンチゲンを標的にする」とは、治療的又は予防的介入がそのようなネオアンチゲンに基づいていることを意味する。
【００７０】
このことは、下記において更に詳述されるが、簡潔には、能動免疫療法の手法、例えば、ネオアンチゲンを含む免疫原性組成物又はワクチンを対象に投与することを含むことができる。あるいは、受動免疫療法の手法、例えば、養子T細胞移入又はB細胞移入を行ってもよく、ネオアンチゲンを認識するT若しくはB細胞、又はT及びB細胞は、腫瘍又は他の体組織(リンパ節、血液若しくは腹水が含まれるが、これらに限定されない)から単離され、exo vivo又はin vitroで拡大され、対象に再投与される。
【００７１】
更なる代替案では、ネオアンチゲンを認識する抗体を対象に投与してもよい。当業者は、ネオアンチゲンが細胞表面抗原である場合、本明細書において言及される抗体は、ネオアンチゲンを認識することを理解する。ネオアンチゲンが細胞内抗原である場合、抗体はネオアンチゲンペプチド:MHC複合体を認識する。本明細書において言及されるとき、ネオアンチゲンを「認識する」抗体は、これらの可能性を両方とも包含する。
【００７２】
従って、一態様において、本発明は、対象のがんを治療又は予防する方法であって、前記対象に、
(i)腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲン、
(ii)腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識する免疫細胞、又は
(iii)腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識する抗体
を投与することを含む、上記方法を対象とする。
【００７３】
別の態様では、本発明は、対象のがんの治療又は予防における使用のための、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを提供する。言い換えると、本発明は、対象のがんの治療又は予防に使用される医薬の製造における、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンの使用を提供する。更なる代替案では、本発明は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンの、対象のがんの治療又は予防における使用を提供する。
【００７４】
更なる態様では、本発明は、対象のがんの治療又は予防における使用のための、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識する免疫細胞、好ましくはT細胞を提供する。言い換えると、本発明は、対象のがんの治療又は予防に使用される医薬の製造における、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識する免疫細胞、好ましくはT細胞の使用を提供する。更なる代替案では、本発明は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識する免疫細胞、好ましくはT細胞の、対象のがんの治療又は予防における使用を提供する。
【００７５】
「免疫細胞」への言及は、免疫系の細胞、例えば、T細胞、NK細胞、NKT細胞、B細胞及び樹状細胞を包含することが意図される。好ましい実施形態において、免疫細胞は本明細書で考察されるT細胞である。
【００７６】
更なる態様では、本発明は、対象のがんの治療又は予防における使用のための、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識する抗体を提供する。言い換えると、本発明は、対象のがんの治療又は予防に使用される医薬の製造における、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識する抗体の使用を提供する。更なる代替案では、本発明は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識する抗体の、対象のがんの治療又は予防における使用を提供する。
【００７７】
一態様において、特異的HLAアレルは、配列ベースの方法によって失われていると決定される又は決定されている。「配列ベースの方法」とは、遺伝子配列情報を伴う方法、すなわち、遺伝子配列情報を、例えば、大規模並列配列決定、深部配列決定、ハイスループット配列決定、次世代配列決定(NGS)、第二世代配列決定又は当分野で既知の任意の適切な方法によって提供する方法を意味する。
【００７８】
一態様において、特異的HLAアレルは、前記対象のHLAアレル配列情報に実施された配列ベースの方法によって失われていると決定される又は決定されている。本方法は、本明細書に記載されている発明による方法であってもよい。
【００７９】
ネオアンチゲン
「ネオアンチゲン」は、がん細胞内の突然変異の結果として生じる腫瘍特異的抗原である。従って、ネオアンチゲンは、対象の健康な細胞によって発現されない。
【００８０】
本明細書に記載されているネオアンチゲンは、野生型の健康な細胞によって発現される非突然変異タンパク質と比較して、がん細胞によって発現されるタンパク質を変更する非サイレント突然変異によって生じ得る。例えば、突然変異タンパク質は、転座又は融合であり得る。
【００８１】
「突然変異」は、同じ個体からの健康な細胞と比較した、腫瘍細胞におけるヌクレオチド配列(例えば、DNA又はRNA)の差を指す。ヌクレオチド配列の差は、同じ個体からの健康な細胞によって発現されていないタンパク質の発現をもたらし得る。
【００８２】
例えば、突然変異は、単一のヌクレオチド変異体(SNV)、多数のヌクレオチド変異体、欠失突然変異、挿入突然変異、転座、ミスセンス突然変異又はアミノ酸配列における変化をもたらすスプライス部位突然変異(コード突然変異)であり得る。
【００８３】
突然変異は、エクソーム配列決定、RNA配列決定、全ゲノム配列決定及び/又は標的遺伝子パネル配列決定及び又は単一遺伝子の日常的なサンガー配列決定によって同定され得る。適切な方法は当分野で知られている。
【００８４】
エクソーム配列決定及びRNA配列決定の記載は、Boa et al. (Cancer Informatics. 2014;13(Suppl 2):67-82.)及びAres et al. (Cold Spring Harb Protoc. 2014 Nov 3;2014(11):1139-48)にそれぞれ提供されている。標的遺伝子パネル配列決定の記載は、例えば、Kammermeier et al. (J Med Genet. 2014 Nov; 51(11):748-55)及びYap KL et al. (Clin Cancer Res. 2014. 20:6605)に見いだすことができる。Meyerson et al., Nat. Rev. Genetics, 2010及びMardis, Annu Rev Anal Chem, 2013も参照すること。標的遺伝子配列決定パネルは、市販もされている(例えば、Biocompare (http://www.biocompare.com/Editorial-Articles/161194-Build-Your-Own-Gene-Panels-with-These-Custom-NGS-Targeting-Tools/)に要約されている)。
【００８５】
非腫瘍試料のDNA及び/又はRNAと比較した腫瘍試料のDNA及び/又はRNAにおけるヌクレオチドの差(例えば、SNV)を同定するための配列アラインメントは、当分野で既知の方法を使用して実施してもよい。例えば、基準試料と比較したヌクレオチドの差は、Koboldt et al. (Genome Res. 2012; 22: 568-576)に記載されている方法を使用して実施してもよい。基準資料は、生殖細胞系列DNA及び/又はRNA配列であってもよい。
【００８６】
一態様において、ネオアンチゲンは、クローン性ネオアンチゲンであり得る。
【００８７】
「クローン性」ネオアンチゲンは、ある腫瘍全体にわたって有効に発現され、かつ本質的にあらゆる腫瘍細胞内でコードされているネオアンチゲンである。「サブクローン性」ネオアンチゲンは、腫瘍中の細胞又は領域のサブセット又は一部において発現されるネオアンチゲンである。
【００８８】
「腫瘍全体にわたって存在する」、「腫瘍全体にわたって有効に発現している」及び「本質的にあらゆる腫瘍細胞内でコードされている」は、クローン性ネオアンチゲンが、試料が分析される腫瘍の全ての領域で発現されることを意味し得る。
【００８９】
突然変異が「本質的にあらゆる腫瘍細胞内でコードされている」という決定は、統計的計算を指し、従って統計的分析及び閾値に付されることが理解されるであろう。
【００９０】
同様に、クローン性ネオアンチゲンが「腫瘍全体にわたって有効に発現している」という決定は、統計的計算を指し、従って統計的分析及び閾値に付される。
【００９１】
本質的にあらゆる腫瘍細胞において又は本質的に全ての腫瘍細胞において有効に発現しているとは、突然変異が、適切な統計方法を使用して決定すると、試料中の分析された全ての腫瘍細胞に存在することを意味する。
【００９２】
例として、がん細胞画分(CCF)は、突然変異を有するがん細胞の割合を記載し、突然変異がクローン性であるかサブクローン性であるかを決定するために使用され得る。例えば、がん細胞画分は、Landau et al. (Cell. 2013 Feb 14;152(4):714-26)に記載されているように、変異体アレルの頻度をコピー数及び純度推定値と積分することによって決定してもよい。
【００９３】
適切には、CCF値は、分析されるあらゆる腫瘍領域内の一つ一つで同定された全ての突然変異について計算され得る。1つの領域のみ(すなわち、単一試料のみ)が使用される場合、1セットのCCF値のみが得られる。このことは、その突然変異がその腫瘍領域内の全ての腫瘍細胞に存在するという情報を提供し、それによって、突然変異がクローン性であるかサブクローン性であるかの指標を提供する。
【００９４】
記述されたように、クローン性突然変異の決定は、統計的分析及び閾値に付される。従って、突然変異は、95%信頼区間で≧0.75、例えば、0.80、0.85、0.90、0.95、1.00又は>1.00のCCFを有すると決定される場合、クローン性であると同定され得る。逆に、突然変異は、分析された任意の試料において95%信頼区間で≦0.75、例えば、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.01のCCFを有すると決定される場合、サブクローン性であると同定され得る。
【００９５】
クローン性突然変異を同定する方法の精度は、腫瘍から単離された1つを超える試料においてクローン性突然変異を同定することによって上昇することが理解されるであろう。
【００９６】
一実施形態において、方法は、複数の、すなわち1個を超えるクローン性ネオアンチゲンを同定することを伴ってもよい。
【００９７】
一実施形態において、クローン性ネオアンチゲンの数は、2〜1000個である。例えば、クローン性ネオアンチゲンの数は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950又は1000個であってもよく、例えば、クローン性ネオアンチゲンの数は、2〜100個であってもよい。
【００９８】
一態様において、本明細書に記載されている方法は、複数のT細胞又はT細胞の集団、すなわち、1個を超えるT細胞を提供してもよく、複数のT細胞は、クローン性ネオアンチゲンを認識するT細胞及び異なるクローン性ネオアンチゲンを認識するT細胞を含む。従って、方法は、異なるクローン性ネオアンチゲンを認識する複数のT細胞を提供する。
【００９９】
好ましい実施形態において、複数のT細胞により認識されるクローン性ネオアンチゲンの数は、2〜1000個である。例えば、認識されるクローン性ネオアンチゲンの数は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950又は1000個であってもよく、例えば、認識されるクローン性ネオアンチゲンの数は、2〜100個であってもよい。
【０１００】
一態様において、複数のT細胞は同じクローン性ネオアンチゲンを認識する。
【０１０１】
一態様において、ネオアンチゲンは、本明細書に記載されているサブクローン性ネオアンチゲンであってもよい。
【０１０２】
上記に記載されたように、クローン性ネオアンチゲンは、本質的にあらゆる腫瘍細胞内でコードされるものであり、すなわち、ネオアンチゲンをコードする突然変異が、本質的にあらゆる腫瘍細胞内に存在する。しかし、本明細書に記載されているように、クローン性ネオアンチゲンは、腫瘍において失われているHLAアレルによりコードされたHLA分子により提示されると予測され得る。この場合、クローン性ネオアンチゲンは、実際には本質的にあらゆる腫瘍細胞上で提示されないことがある。従って、ネオアンチゲンの提示は、クローン性ではないことがあり、すなわち、本質的にあらゆる腫瘍細胞において提示されるとは限らない。
【０１０３】
本明細書に記載されている本発明の一態様において、ネオアンチゲンは、本質的にあらゆる腫瘍細胞において提示されると予測される(すなわち、ネオアンチゲンの提示はクローン性である)。
【０１０４】
一態様において、ネオアンチゲンは、本質的にあらゆる腫瘍細胞において提示されるわけではないと予測され、つまり、ネオアンチゲンの提示はサブクローン性である。従って、クローン性ネオアンチゲンは、サブクローン的に提示され得る。
【０１０５】
ネオアンチゲンがクローン的又はサブクローン的に提示されるかは、クローン性突然変異の決定に関して上記に記載された方法を使用して決定することができる。すなわち、CCF画分は、特定のネオアンチゲンを提示するがん細胞の割合を代替的に記載することができ、ネオアンチゲンの提示がクローン性又はサブクローン性であるかを決定するために使用され得る。
【０１０６】
記述されたように、クローン性提示の決定は、統計的分析及び閾値に付される。従って、提示は、95%信頼区間で≧0.75、例えば、0.80、0.85、0.90、0.95、1.00又は>1.00のCCFを有すると決定される場合、クローン性であると同定され得る。逆に、提示は、分析された任意の試料において95%信頼区間で≦0.75、例えば、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15、0.10、0.05、0.01のCCFを有すると決定される場合、サブクローン性であると同定され得る。
【０１０７】
一態様において、ネオアンチゲンは、インデル(indel)突然変異(インデルネオアンチゲン)の結果であり得る。
【０１０８】
「インデル突然変異」は、本明細書で言及されるとき、生物体のヌクレオチド配列(例えば、DNA又はRNA)における塩基の挿入及び/又は欠失を指す。典型的には、インデル突然変異は、生物体のDNA、好ましくはゲノムDNAに生じる。適切には、インデル突然変異は、対象の腫瘍細胞のゲノムDNAに生じる。適切には、インデルは挿入突然変異であり得る。適切には、インデルは欠失突然変異であり得る。
【０１０９】
適切には、インデルは、1〜100個の塩基、例えば、1〜90個、1〜50個、1〜23個、又は1〜10個の塩基であってもよい。
【０１１０】
一態様において、インデル突然変異は、フレームシフトインデル突然変異であってもよい。フレームシフトインデル突然変異は、1個以上のヌクレオチドの挿入又は欠失により引き起こされるヌクレオチド配列のリーディングフレームにおける変化である。そのようなフレームシフトインデル突然変異は、典型的には、対象の対応する健康な細胞における非突然変異DNA/RNAによりコードされたポリペプチドと極めて異なる新規のオープンリーディングフレームを生成し得る。
【０１１１】
フレームシフト突然変異は、典型的には、オープンリーディングフレームに中途終止コドン(PTC)を導入し、得られたmRNAは、ナンセンス変異依存分解機構(nonsense mediated decay)(NMD)の標的となる。
【０１１２】
一態様において、インデルフレームシフト突然変異は、NMDの標的であっても、なくてもよい。
【０１１３】
一態様において、インデルネオアンチゲンは、クローン性ネオアンチゲンである。すなわち、インデル突然変異は、クローン性インデルネオアンチゲンを生じる。クローン性インデルネオアンチゲンは、フレームシフト、すなわち、クローン性フレームシフトインデルネオアンチゲンであってもよい。
【０１１４】
一態様において、インデルは非フレームシフトインデルである。
【０１１５】
ネオアンチゲンペプチド
用語「ネオアンチゲン」は、本明細書で使用されるとき、免疫原性であるネオアンチゲンの任意の部分を包含することが意図される。これには、ネオアンチゲン由来のペプチドが含まれる。「抗原性」分子は、本明細書で言及されるとき、それ自体又はその一部が、適切な方法によって免疫系又は免疫細胞に提示された場合、免疫応答を刺激することができる分子である。
【０１１６】
ネオアンチゲンペプチドは、当分野で既知の方法を使用して合成され得る。
【０１１７】
用語「ペプチド」は、典型的には、隣接するアミノ酸のα-アミノ基とカルボキシル基のペプチド結合により互いに連結されている一連の残基、典型的にはL-アミノ酸を意味するために通常の意味で使用される。この用語には、修飾ペプチド及び合成ペプチド類縁体が含まれる。
【０１１８】
ペプチドは、化学的方法(Peptide Chemistry, A practical Textbook.Mikos Bodansky, Springer-Verlag, Berlin.)を使用して作製され得る。例えば、ペプチドは、固相技術(Roberge JY et al (1995) Science 269: 202-204)によって合成され、樹脂から切断され、及び分取高速液体クロマトグラフィー(例えば、Creighton (1983) Proteins Structures And Molecular Principles, WH Freeman and Co, New York NY)によって精製することができる。自動合成は、例えば、ABI 43 1 A Peptide Synthesizer (Perkin Elmer)を製造会社により提供された取扱い説明書に従って使用して達成することができる。
【０１１９】
ペプチドは、組み換え方法により又はネオアンチゲンである若しくはネオアンチゲンを含むポリペプチドから切断により代替的に作製され得る。ペプチドの組成は、アミノ酸分析又は配列決定(例えば、エドマン分解手順)により確かめることができる。
【０１２０】
ネオアンチゲンペプチドは、がん細胞特異的突然変異(例えば、単一ヌクレオチド変異体(SNV)でコードされた非サイレントアミノ酸置換)を、ペプチド内の任意の残基位置に含むことができる。例として、MHCクラスI分子に結合することができるペプチドは、典型的には7〜13個のアミノ酸長である。従って、アミノ酸置換は、13個のアミノ酸を含むペプチド中の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13の位置に存在し得る。
【０１２１】
更なる態様において、より長いペプチド、例えば、21〜31merを使用してもよく、突然変異は、任意の位置、例えばペプチドの中央、例えば、13、14、15又は16の位置であってもよく、ネオアンチゲンを認識するCD4細胞及びCD8細胞の両方を刺激することもできる。
【０１２２】
T細胞及びT細胞集団
本明細書に記載されるように、本発明は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識するT細胞の治療的有用性を包含し、そのようなT細胞又はその集団を提供する方法も包含する。
【０１２３】
本発明は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンに特異的なT細胞を提供する方法を包含し、前記方法は、
i)腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを同定するステップ、及び
iv)前記ネオアンチゲンを認識するT細胞又はT細胞の集団を提供するステップ
を含む。
【０１２４】
一態様において、HLA消失の決定は、本明細書に記載されている発明の方法によって実施してもよい。
【０１２５】
本明細書に記載されている発明の一態様において、突然変異は、腫瘍から単離された複数の試料によって決定してもよい。
【０１２６】
T細胞集団を拡大して、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを、認識又は標的にするT細胞の数を増加させることができる。T細胞の拡大は、当分野で既知の方法を使用して実施してもよい。
【０１２７】
例えば、T細胞は、T細胞に分裂促進的刺激をもたらすことが知られている条件下においてexo vivo培養によって拡大され得る。例として、T細胞は、サイトカイン、例えばIL-2と共に又は分裂促進抗体、例えば抗CD3及び/若しくはCD28と共に培養してもよい。T細胞は、照射されていることもある抗原提示細胞(APC)と共培養してもよい。APCは樹状細胞又はB細胞であってもよい。樹状細胞は、単一刺激物質又は刺激ネオアンチゲンペプチドのプールと同定されたネオアンチゲンを含有するペプチドでパルスされていてもよい。T細胞の拡大は、当分野で既知の方法を使用して実施してもよく、例えば、追加の共刺激シグナルを提供する人工抗原提示細胞(aAPC)及び適切なペプチドを提示する自己PBMCの使用が挙げられる。自己PBMCは、単一刺激物質、あるいは刺激ネオアンチゲンのプールとして本明細書に記載されたネオアンチゲンを含有するペプチドでパルスされてもよい。
【０１２８】
一態様において、本発明は、対象のがんの治療に使用されるT細胞集団を拡大する方法であって、T細胞集団は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするものであり、
a)前記ネオアンチゲンを特異的に認識することができるT細胞を含むT細胞集団を提供するステップ、及び
b)T細胞集団を、ネオアンチゲンを含む組成物と共培養するステップ
を含む、上記方法を提供する。
【０１２９】
一態様において、拡大は、T細胞とネオアンチゲン及び抗原提示細胞との共培養によって実施してもよい。抗原提示細胞は樹状細胞であってもよい。ネオアンチゲンは、クローン性ネオアンチゲンであってもよい。拡大は、ネオアンチゲンに特異的であるT細胞の選択的拡大であってもよい。
【０１３０】
本発明は、抗原提示細胞及びネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドを含む組成物を産生する方法を提供し、前記ネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドは、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるものである。ネオアンチゲンは、本発明の方法によって同定され得る。一実施形態において、前記方法は、
(a)腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを同定するステップ、及び
b)前記ネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチド及び抗原提示細胞を含む組成物を産生するステップ
を含む。
【０１３１】
本発明は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞及びネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドを含む組成物も提供し、前記ネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドは、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるものである。
【０１３２】
組成物は、本明細書に記載されている方法によって産生してもよい。組成物を、本明細書に記載されている発明の方法、例えば、本明細書に記載されているT細胞又はT細胞集団又は組成物を産生する方法に使用することもできる。
【０１３３】
本明細書に記載されている組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を追加的に含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、1種以上の更なる薬学的に活性なポリペプチド及び/又は化合物を任意選択で含んでもよい。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であり得る。
【０１３４】
一態様において、拡大は、T細胞集団をIL-2又は抗CD3及び/又はCD28抗体と共に培養することを伴ってもよい。
【０１３５】
本明細書に記載されている発明の一態様において、T細胞集団は、治療される患者から、例えば、前記患者から得た腫瘍試料から単離される。
【０１３６】
T細胞集団は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含んでもよい。
【０１３７】
前記T細胞集団が濃縮されており、対象から単離された初期T細胞集団と比較して、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするT細胞の数が増加しているT細胞組成物が、提供される。
【０１３８】
対象のがんに特徴的なネオアンチゲンを標的にするように選択的に拡大されたT細胞を含む、対象のがんの治療に有用なT細胞組成物も提供され、前記ネオアンチゲンは、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測される。
【０１３９】
本明細書に記載されているT細胞組成物は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンに特異的なT細胞が濃縮され得る。
【０１４０】
本明細書に記載されているT細胞組成物において、ネオアンチゲン反応性T細胞の拡大集団は、ネオアンチゲンペプチドで再刺激したT細胞集団の応答によって測定すると、拡大されなかったT細胞の集団より高い活性を有することがある。活性は、サイトカイン産生によって測定してもよく、高い活性とは、活性の5〜10倍又はそれ以上の上昇である。
【０１４１】
本明細書に記載されているT細胞、T細胞集団又はT細胞組成物は、本明細書に記載されているいずれかの方法によって得てもよい又は得ることが可能であり得る。
【０１４２】
本明細書に記載されているT細胞、T細胞集団又はT細胞組成物は、がんの治療に使用され得る。
【０１４３】
本発明は、対象のがんを治療する方法であって、本明細書に記載されているT細胞組成物を対象に投与することを含む方法を包含する。本発明は、がん治療の医薬の製造における使用のための本明細書に記載されているT細胞組成物も包含する。
【０１４４】
本方法は、
(i)対象の試料からT細胞集団を単離するステップ、
(ii)腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするT細胞集団を、拡大するステップ、及び
(iii)(ii)のT細胞集団を対象に投与するステップ
を含んでもよい。
【０１４５】
本方法は、
(i)対象の試料からT細胞を単離するステップ、
(ii)本明細書に記載されている前記ネオアンチゲンを認識するCAR又はTCRを発現するようにT細胞を改変して、ネオアンチゲンを標的にするT細胞集団を提供するステップ、及び
(iii)(ii)のT細胞集団を対象に投与するステップ
を含んでもよい。
【０１４６】
一態様において、前記T細胞は、複数のネオアンチゲンを使用して選択的に拡大され、前記ペプチドは、それぞれ異なる突然変異を含む。前記の複数とは、2〜250個、3〜200個、4〜150個又は5〜100個のネオアンチゲン、例えば、5〜75個又は10〜50個のネオアンチゲンであり得る。
【０１４７】
本発明の方法は、最初に、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを同定すること、次いで、T細胞集団を拡大して、ネオアンチゲンを標的にすることを含んでもよい。
【０１４８】
従って、一態様では、本発明は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするT細胞集団を提供する方法を提供し、前記方法は、
(a)腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを同定するステップ、及び
(b)T細胞の集団を拡大して、ネオアンチゲンを標的にするT細胞集団を提供するステップ
を含む。
【０１４９】
ネオアンチゲンは、前記腫瘍から単離された複数の試料において決定されてもよい。
【０１５０】
拡大の後、得られたT細胞集団は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするT細胞の数の増加を伴って(例えば、対象から単離された試料と比較して)、濃縮される。
【０１５１】
従って、一態様では、本発明は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識するT細胞を提供する。更なる態様では、本発明は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識するT細胞の集団、又は本明細書に記載されているT細胞の集団に関する。
【０１５２】
好ましい実施形態において、本発明は、複数のT細胞又はT細胞の集団、すなわち、1個を超えるT細胞を提供し、複数のT細胞は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識するT細胞、及び腫瘍において失われていないことが決定されているHLAにより提示され得る異なるネオアンチゲンを認識するT細胞を含む。従って、本発明は、異なるネオアンチゲンを認識する複数のT細胞を提供する。複数又は集団における異なるT細胞は、同じネオアンチゲンを認識する異なるTCRを有していてもよい。
【０１５３】
好ましい実施形態において、複数のT細胞により認識されるネオアンチゲンの数は、2〜1000個である。例えば、認識されるネオアンチゲンの数は、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950又は1000個、好ましくは、2〜100個であってもよい。異なるTCRを有するが、同じネオアンチゲンを認識する複数のT細胞が存在してもよい。
【０１５４】
T細胞集団は、全て若しくは主にCD8+ T細胞から構成される、又は全て若しくは主にCD8+ T細胞及びCD4+ T細胞の混合物から構成される、又は全て若しくは主にCD4+ T細胞から構成される。
【０１５５】
特定の実施形態において、T細胞集団は、腫瘍を有する対象から単離されたT細胞から生成される。
【０１５６】
例えば、T細胞集団は、腫瘍を有する対象から単離された試料におけるT細胞から生成されてもよい。試料は、腫瘍試料、末梢血試料又は対象の他の組織からの試料であってもよい。
【０１５７】
特定の実施形態において、T細胞集団は、ネオアンチゲンが同定されている腫瘍の試料から生成される。換言すると、T細胞集団は、治療される患者の腫瘍由来の試料から単離される。
【０１５８】
一実施形態において、T細胞集団は、腫瘍浸潤リンパ球(TIL)を含む。
【０１５９】
T細胞は、当分野で周知の方法を使用して単離してもよい。例えば、T細胞は、CD3、CD4又はCD8の発現に基づいて試料から生成された単一細胞懸濁液から精製してもよい。T細胞は、フィコール-パック(Ficoll-paque)勾配を通して試料から濃縮され得る。
【０１６０】
本発明は、対象の腫瘍におけるネオアンチゲンを標的にするT細胞集団を提供する方法であって、
i)対象から単離された試料から、T細胞又はT細胞の集団を単離するステップ、及び
ii)T細胞又はT細胞の集団を拡大して、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするT細胞の数又は相対的割合を増加させるステップ
を含む、上記方法も提供する。
【０１６１】
本発明により産生されるT細胞集団は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測される1個以上のネオアンチゲンを標的にする、増加した数又は割合のT細胞を有する。例えば、本発明のT細胞集団は、対象から単離された試料中のT細胞と比較して、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にする増加した数のT細胞を有する。
【０１６２】
つまり、T細胞集団の組成物は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするT細胞の率又は割合が増加しているであろう点において、「ネイティブの」T細胞集団(すなわち、本明細書に記載されている拡大ステップを受けない集団)の組成物と異なる。腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にする集団内のT細胞と、そのようなネオアンチゲンを標的にしないT細胞との比は高くなっており、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAにより提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするT細胞のほうが多い。
【０１６３】
本発明によるT細胞集団は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするT細胞を、少なくとも約0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95又は100%有していてもよい。例えば、T細胞集団は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするT細胞を、約0.2%〜5%、5%〜10%、10〜20%、20〜30%、30〜40%、40〜50%、50〜70%又は70〜100%有していてもよい。一態様において、T細胞集団は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするT細胞を少なくとも約1、2、3、4又は5%有し、例えば、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にするT細胞を少なくとも約2%又は少なくとも2%有する。
【０１６４】
言い換えると、T細胞集団は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示され得るネオアンチゲンを標的にしないT細胞を、約5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、99.1、99.2、99.3、99.4、99.5、99.6、99.7又は99.8%以下有していてもよい。例えば、T細胞集団は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示され得るネオアンチゲンを標的にしないT細胞を、約95%〜99.8%、90%〜95%、80〜90%、70〜80%、60〜70%、50〜60%、30〜50%又は0〜30%以下有していてもよい。一態様において、T細胞集団は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にしないT細胞を約99、98、97、96又は95%以下有し、例えば、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを標的にしないT細胞を約98%又は95%以下有する。
【０１６５】
拡大されたネオアンチゲン反応性T細胞集団は、例えば、ネオアンチゲンペプチドを使用して拡大されなかったT細胞集団より高い活性を有することがある。「活性」への言及は、ネオアンチゲンペプチド、例えば、拡大に使用されたペプチドに対応するペプチド、又はネオアンチゲンペプチドの混合物による再刺激に対するT細胞集団の応答を表すことがある。応答をアッセイする適切な方法は、当分野で知られている。例えば、サイトカイン産生を測定し得る(例えば、IL2又はIFNγ産生を測定し得る)。「高い活性」への言及には、例えば、活性の1〜5、5〜10、10〜20、20〜50、50〜100、100〜500、500〜1000倍の上昇が含まれる。一態様において、活性は、1000倍を超えて高いものであり得る。
【０１６６】
T細胞の集団は、CD8+ T細胞、CD4+ T細胞、又はCD8+及びCD4+ T細胞を含んでもよい。
【０１６７】
ヘルパーT細胞(TH細胞)は、形質細胞及びメモリーB細胞へのB細胞の成熟、並びに細胞障害性T細胞及びマクロファージの活性化を含む免疫プロセスにおいて他の白血球を助ける。TH細胞は、表面にCD4を発現する。TH細胞は、MHCクラスII分子によりペプチド抗原が抗原提示細胞(APC)の表面上に提示される場合に活性化される。これらの細胞は、異なるサイトカインを分泌して、異なるタイプの免疫応答を促すTH1、TH2、TH3、TH17、Th9又はTFHを含むいくつかのサブタイプの1つに分化することができる。
【０１６８】
細胞障害性T細胞(TC細胞又はCTL)は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶反応にも関与する。CTLはCD8を表面に発現する。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面に存在するMHCクラスIに関連して抗原に結合することによって標的を認識する。調節性T細胞により分泌されたIL-10、アデノシン及び他の分子を介して、CD8+細胞は不活性化される可能性があり、このことが自己免疫疾患を予防する。
【０１６９】
本明細書に記載されているT細胞は、改変（engineered）T細胞であってもよい。
【０１７０】
本明細書に記載されているネオアンチゲン特異的T細胞は、ネオアンチゲン若しくはネオアンチゲンペプチドに特異的に結合するキメラ抗原受容体(CAR)若しくはT細胞受容体(TCR)、又はネオアンチゲン若しくはネオアンチゲンペプチドに特異的に結合する親和性増強T細胞受容体(TCR)(本明細書下記に更に記載される)を発現してもよい。例えば、T細胞は、ネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドに特異的に結合するキメラ抗原受容体(CAR)又はT細胞受容体(TCR)(例えば、ネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドに特異的に結合する親和性増強T細胞受容体(TCR))を発現してもよい。
【０１７１】
CARは、通常のフォーマットにおいて、モノクローナル抗体(mAb)の特異性をT細胞のエフェクター機能に移植するタンパク質である。通常の形態は、T細胞生存及び活性化シグナルを伝達する化合物エンドドメイン(compound endodomain)に抗原認識アミノ末端、スペーサー、膜貫通ドメインが全て接続されているI型膜貫通ドメインタンパク質である。
【０１７２】
これらの分子の最も一般的な形態は、標的抗原を認識するモノクローナル抗体由来の単鎖可変フラグメント(scFv)を使用する。scFvは、スペーサー及び膜貫通ドメインを介して、シグナル伝達エンドドメインに融合している。そのような分子は、scFvによる標的の認識に応答して、T細胞の活性化をもたらす。T細胞がそのようなCARを発現する場合、T細胞は標的抗原を発現する標的細胞を認識し、死滅させる。いくつかのCARが腫瘍関連抗原に対して開発され、そのようなCAR発現T細胞を使用する養子移入手法が、様々ながん治療のために現在臨床試験中である。
【０１７３】
TCR及び親和性増強TCRの生成方法は、当分野で知られている。親和性増強TCRは、ペプチド-MHC複合体への増強された親和性(例えば、患者試料(例えば、患者の末梢血又はTIL)からのTCRをコードするTCR遺伝子の単離が挙げられる)を有する、及びTCR配列の改変(例えば、in vitro突然変異誘発及び親和性増強(又は親和性成熟)TCRの選択による)を介したペプチド-MHC複合体へのTCR親和性の改善を有するTCRである。そのようなTCR遺伝子をT細胞に導入する方法は、当分野で知られている。多様なヒトTCRレパートリーを有する抗原陰性ヒト化トランスジェニックマウス(例えば、TCR/MHCヒト化マウス、例えばABabDIIマウス)を、抗原により免疫化すること、及びそのような免疫化トランスジェニックマウスから抗原特異的TCRを単離することを伴う最適親和性TCRの同定方法も、当分野で知られている(例えば、Obenaus M et al., Nat Biotechnol. 33(4):402-7, 2015を参照すること)。
【０１７４】
T細胞は、高い親和性のTCRを有することがあり、従って親和性の増強が必要ではないこともある。高親和性TCRは、対象のT細胞から単離されることもあり、親和性の増強を必要としないことがある。
【０１７５】
本明細書に記載されているネオアンチゲンペプチドに結合することができる候補T細胞クローンは、例えば、ネオアンチゲンペプチドを含むMHC多量体を使用して同定してもよい。
【０１７６】
ネオアンチゲンペプチド又はネオアンチゲンを特異的に標的にする同定されたTCR及び/又はCARは、当分野で既知の方法を使用して、例えば、ウイルスベクターを用いる形質導入、DNA又はRNAを用いるトランスフェクションを含む多くの方法の1つにより、TCR又はCARをコードするDNA又はRNAを導入することによって、対象からの自己T細胞中で発現され得る。
【０１７７】
本発明は、本明細書に記載されているT細胞、例えば改変T細胞を包含する。
【０１７８】
本明細書に記載されている発明のある特定の態様において、T細胞又はT細胞集団は、例えば、本明細書に記載されているT細胞の単離及び拡大の後に対象に再注入される。これを達成するのに適した方法は、当業者に知られている。例えば、T細胞を生成、選択及び拡大する方法は、当分野で知られている。例えば、Dudley J Immunother. 2003; 26(4): 332-342及びRosenberg et al. 2011 Clin Cancer Res:17(13):4550-7を参照すること。T細胞を再注入する方法は、Dudley et al. Clin Cancer Res. 2010 Dec 15; 16(24): 6122-6131及びRooney et al. Blood. 1998 Sep 1;92(5):1549-55に記載されている。本発明のT細胞、T細胞集団又はT細胞組成物を、本明細書に記載されている発明に従ってがんの治療又は予防に使用することができる。
【０１７９】
一態様において、本発明は、対象のがんを治療する方法であって、本発明のT細胞又はT細胞集団を対象に投与することを含む方法に関する。
【０１８０】
方法は、
(i)T細胞含有試料を対象から単離するステップ、
(ii)本明細書に定義されているネオアンチゲンを標的にするT細胞集団を拡大するステップ、及び
(iii)(ii)から得た細胞を対象に投与するステップ
を含んでもよい。
【０１８１】
一態様において、T細胞は、本明細書に記載されているCAR又は親和性増強TCRを発現するように改変され得る。
【０１８２】
本発明は、がんを有する患者を治療する方法であって、前記患者に本明細書に定義されているT細胞又はT細胞集団を投与することを含む方法も提供する。
【０１８３】
ネオアンチゲン、T細胞又はT細胞集団は、本明細書に記載されている発明のいずれかの態様に従って同定又は産生され得る。
【０１８４】
拡大は、exo vivo又はin vitroにおけるものであってよく、当分野で既知の方法によって実施してもよい。
【０１８５】
本発明は、抗原提示細胞及び本明細書に記載されているネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドを含む組成物も提供する。
【０１８６】
一態様において、抗原提示細胞には、前記ペプチドがパルスされている又はロードされている。
【０１８７】
本発明は、本明細書に記載されているネオアンチゲン特異的T細胞の集団を含むT細胞組成物も提供し、前記ネオアンチゲン特異的T細胞の集団は、T細胞と、ネオアンチゲンペプチドを提示する抗原提示細胞とを共培養することによって産生される。
【０１８８】
本明細書に記載されている組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を追加的に含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、1種以上の更なる薬学的に活性なポリペプチド及び/又は化合物を任意選択で含んでもよい。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であり得る。
【０１８９】
一態様において、抗原提示細胞は樹状細胞である。一態様において、抗原提示細胞は照射される。一態様では、抗原提示細胞は、例えば正しいHLAとの関連で、関連するペプチドを提示することができる細胞である。そのような細胞は、自己HLA分子を発現する自己活性化PBMC、又は適合したHLAのアレイを発現する非自己細胞であってもよい。一態様では、人工抗原提示細胞が照射される。
【０１９０】
T細胞は、外来性APCの存在下又は非存在下でのネオアンチゲンによるTILの初期刺激、並びにそれに続く、サイトカイン、例えばIL-2による又は分裂促進抗体、例えば抗CD3及び/若しくはCD28によるポリクローン性刺激及び拡大によっても濃縮され得る。そのような方法は当分野で知られている。例えば、Forget et al. J Immunother. 2014 Nov-Dec;37(9):448-60、Donia et al. Cytotherapy. 2014 Aug;16(8):1117-20、Donia et al. Scand J Immunol. 2012 Feb;75(2):157-67及びYe et al. J Transl Med. 2011 Aug 9;9:131を参照すること。
【０１９１】
MHC多量体
T細胞の混合出発集団におけるネオアンチゲン特異的T細胞の同定は、当分野で既知の方法を使用して実施してもよい。例えば、そのようなT細胞は、本明細書に記載されているネオアンチゲンペプチドを含むMHC多量体を使用して同定してもよい。
【０１９２】
MHC多量体は、MHC分子のオリゴマー形態であり、関連のないT細胞の大きな群の中で特異的抗原に高い親和性を有するT細胞を同定及び単離するように設計される。多量体は、MHCクラスI、MHCクラスII又は非古典的分子(例えば、CD1d)に結合した抗原を提示するために使用してもよい。
【０１９３】
最も一般的に使用されるMHC多量体は、四量体である。これらは、典型的には、可溶性MHCモノマーをビオチン化することによって産生され、可溶性MHCモノマーは、典型的には、真核細胞又は細菌細胞において組み換え的に産生される。次いで、これらのモノマーは、骨格、例えばストレプトアビジン又はアビジンに結合して、四価構造を作成する。これらの骨格は、続いて例えばフローサイトメトリーを介して結合T細胞を単離するために、蛍光色素とコンジュゲートさせる。
【０１９４】
本発明は、ネオアンチゲンペプチドを含むMHC多量体を提供し、前記ネオアンチゲンは、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAにより提示され得る。
【０１９５】
本発明のMHC多量体は、本明細書に記載されているT細胞、T細胞集団又は組成物を同定する、単離する、拡大する、そうでなければ産生する方法に使用してもよい。ネオアンチゲンペプチドは、当分野で既知の方法を使用して合成してもよい。
【０１９６】
組成物
本発明は、ネオアンチゲン若しくはペプチド、ネオアンチゲン特異的T細胞、又はネオアンチゲンを認識する抗体を含む組成物を更に提供し、前記ネオアンチゲンは、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示され得る。
【０１９７】
本明細書に記載される組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を追加的に含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、1種以上の更なる薬学的に活性なポリペプチド及び/又は化合物を任意選択で含んでもよい。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であり得る。
【０１９８】
抗体
本発明の一態様では、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを認識する抗体が、提供される。
【０１９９】
適切なネオアンチゲンが、例えば、本発明の方法により同定されると、当分野で既知の方法を使用して、抗体を生成することができる。
【０２００】
「抗体」(Ab)には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)及び所望の生物学的活性を示す抗体フラグメントが含まれる。用語「免疫グロブリン」(Ig)は、「抗体」と交換可能に使用され得る。
【０２０１】
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部分を含み、好ましくはインタクト抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例には、Fab、Fab'、F(ab')2及びFvのフラグメント、線状抗体、一本鎖抗体分子、並びに抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が含まれる。
【０２０２】
「Fc」フラグメントは、ジスルフィドにより一緒に保持された両方のH鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能は、Fc領域の配列によって決定され、この領域は、特定のタイプの細胞上に見いだされるFc受容体(FcR)によって認識される部分でもある。
【０２０３】
抗体はヒト抗体であり得る。「ヒト抗体」は、ヒトに天然に存在する抗体、その機能性フラグメント、又はヒト化抗体、すなわち、一部分(例えば、Fc領域)が天然に生じるヒト抗体に由来する遺伝子改変抗体を指す。「ヒト化抗体」は、非ヒト源から導入された1個以上のアミノ酸残基を有するヒト抗体であることが一般に考慮される。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合に「インポート（import）」残基と称され、インポート超可変領域の配列をヒト抗体の対応する配列と置換することによって、典型的には「インポート」可変ドメインから取られる。従って、このような「ヒト化」抗体は、インタクトなヒト可変ドメインより実質的に少ないものが、非ヒト種の対応する配列に置換されているキメラ抗体である。更に、キメラ抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体に見られない残基を含んでも良い。これらの改変は、抗体の性能を更に改良するために行われる。
【０２０４】
好ましい態様において、抗体はモノクローナル抗体である。本明細書で使用されるとき、「モノクローナル抗体」は、実質的に同種抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個別の抗体は、微量で存在し得る天然に生じる突然変異の可能性を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、それぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法論(Kohler et al., Nature, 256:495 (1975))により調製され得る、又は組み換えDNA方法を細菌、真核動物若しくは植物細胞に使用して作製され得る。モノクローナル抗体は、例えば、Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)に記載された技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【０２０５】
モノクローナル抗体はまた、当分野で既知の組み換えDNA方法によっても産生され得る。適切なモノクローナル抗体をコードするDNAは、従来の手順を使用して(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用して)単離及び配列決定され得る。
【０２０６】
in vitro方法は、一価抗体の調製にも適している。抗体を消化して、そのフラグメント、特にFabフラグメントを産生することは、当分野で既知の日常的な技術を使用して達成することができる。例えば、消化はパパインを使用して実施することができる。パパイン消化の例は、WO 94/29348に記載されている。抗体のパパイン消化は、典型的には、それぞれ単一の抗原結合部位を有するFabフラグメントと呼ばれる2つの同一の抗原結合フラグメント、及び残りのFcフラグメントを生じる。ペプシン処理は、F(ab')2フラグメント及びpFc'フラグメントを生じる。
【０２０７】
モノクローナル抗体には、同じ生物学的活性を示す限り、重鎖及び/又は軽鎖の一部分が特定の種に由来する抗体又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であり、一方、残りの鎖(複数可)は、別の種に由来する抗体又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体、並びにそのような抗体のフラグメント中の対応する配列と同一又は相同である「キメラ」抗体を含めることができる。
【０２０８】
抗体フラグメントは、特定の領域又は特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換又は他の選択された改変を含むこともできるが、フラグメントの結合活性が非改変抗体又は抗体フラグメントと比較して、有意に変更されない又は損なわれないことが条件である。
【０２０９】
これらの改変は、いくつかの追加的な特性、例えば、ジスルフィド結合を可能にするアミノ酸の除去/付加、生体寿命(bio-longevity)の増加、分泌特性の変更などを提供することができる。いずれの場合も、抗体フラグメントは、生体活性特性、例えば、結合活性、結合ドメインでの結合の調節などを保持しなければならない。抗体の機能領域又は活性領域は、タンパク質の特定の領域の突然変異誘発、続いて、発現したポリペプチドの発現及び試験によって同定され得る。そのような方法は、当業者に知られており、抗体フラグメントをコードする核酸の部位特異的突然変異誘発を挙げることができる。
【０２１０】
抗体は、ヒト化抗体又はヒト抗体であり得る。非ヒト(例えば、マウス)抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリン由来の最低限の配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖又はそのフラグメント(例えば、Fv、Fab、Fab'若しくは抗体の他の抗原結合部分配列)である。
【０２１１】
ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含み、レシピエント抗体の相補性決定領域(CDR)の残基が所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)、例えば、マウス、ラット又はウサギのCDRの残基に置き代えられている。一部の場合において、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク(FR)残基が、対応する非ヒト残基に置き代えられている。ヒト化抗体は、また、レシピエント抗体にもインポートCDR又はフレームワーク配列にも見いだされない残基を含むこともできる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインを実質的に全て含み、全て又は実質的に全てのCDR領域は非ヒト免疫グロブリンのCDR領域に対応し、全て又は実質的に全てのFR領域はヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は、典型的にはヒト免疫グロブリンの、免疫グロブリン定常領域(Fc)の少なくとも一部分を含んでもよい。
【０２１２】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当分野で知られている。一般に、ヒト化抗体は、非ヒト源から導入された1個以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「インポート」残基と称され、インポート残基は、典型的には「インポート」可変ドメインから取られる。ヒト化は、齧歯類CDR又はCDR配列を、ヒト抗体の対応する配列に置換することによって、本質的に実施することができる。従って、「ヒト化」抗体は、インタクトヒト可変ドメインより実質的に少ないものが、非ヒト種の対応する配列に置換されているキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部のCDR残基及び可能であれば一部のFR残基が齧歯類抗体の類似部位の残基に置換されているヒト抗体である。
【０２１３】
トランスジェニック動物(例えば、マウス)を使用して、内因性免疫グロブリン産生の非存在下で全レパートリーのヒト抗体を産生することができる。例えば、キメラ及び生殖細胞系列突然変異マウスの抗体重鎖連結領域遺伝子のホモ接合型欠失が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。そのような生殖細胞系列突然変異マウスへのヒト生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子アレイの移入は、抗原チャレンジによるヒト抗体の産生をもたらす。ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリーにより産生することもできる。
【０２１４】
「合成抗体」は、本明細書で使用されるとき、組み換えDNA技術、例えば、本明細書に記載されているバクテリオファージにより発現された抗体を使用して生成される抗体を意味する。この用語は、また、抗体をコードするDNA分子の合成により生成される抗体を意味すると解釈されるべきであり、DNA分子は、抗体タンパク質、又は抗体を特定するアミノ酸配列を発現し、DNA又はアミノ酸配列は、利用可能であり、かつ当分野で周知である合成DNA又はアミノ酸配列技術を使用して得られる。
【０２１５】
免疫原性組成物
本発明は、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAにより提示され得るネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドを含む免疫原性組成物又はワクチンを提供する。免疫原性組成物又はワクチンは、本発明に従ってがんを治療又は予防する、いずれかの方法に使用され得る。従って、本発明は、対象のがんを治療又は予防する方法であって、本発明の免疫原性組成物又はワクチンを対象に投与することを含む方法を包含する。
【０２１６】
「免疫原性組成物」とは、対象に免疫応答を誘導することができる組成物を意味する。免疫原性組成物は、ワクチン組成物であってもよい。「ワクチン組成物」とは、対象に免疫応答を誘導することができ、治療される状態に治療的又は予防的効果を有する組成物を意味する。
【０２１７】
免疫原性組成物又はワクチンは、1個を超えるネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドを含んでもよい。
【０２１８】
一態様において、免疫原性組成物又はワクチンは、1個を超える異なるネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチド、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の異なるネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドを含んでもよい。ネオアンチゲンはまた、タンパク質の形態であってもよい。
【０２１９】
一実施形態において、免疫原性組成物又はワクチンは、本明細書に定義されているネオアンチゲンを含むポリペプチドを含んでもよい。本発明の一実施形態において、免疫原性組成物又はワクチンは、それぞれネオアンチゲンを含む1個を超える異なるポリペプチドを含んでもよく、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個の異なるポリペプチドを含んでもよい。
【０２２０】
免疫原性組成物又はワクチンは、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を追加的に含む医薬組成物であってもよい。医薬組成物は、1種以上の更なる薬学的に活性なポリペプチド及び/又は化合物を任意選択で含んでもよい。そのような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であり得る。例えば、がんワクチンの考察についてはButterfield, BMJ. 2015 22;350を参照すること。
【０２２１】
特に、免疫原性組成物又はワクチンは、アジュバントを追加的に含んでもよい。アジュバントの例には、アルミニウム塩、オイルエマルション及び細菌構成成分(例えば、LPS及びリポソーム)が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、アジュバントはポリICLCであってもよく、ポリICLCは、カルボキシメチルセルロース、ポリイノシン酸-ポリシチジン酸及びポリ-L-リジン二本鎖RNAの合成複合体である。
【０２２２】
ペプチドの適切な用量は、当業者によって決定され得る。用量は、使用されるペプチドに依存し得る。ペプチドのin vivo使用では、0.1〜4000μg、例えば、0.1〜2000μg、0.1〜1000μg又は0.1〜500μg、例えば、0.1〜100μgのin vivo用量を用いることができる。
【０２２３】
本明細書に記載されている発明の免疫原性組成物又はワクチンは、対象に免疫応答の生成をもたらし得る。生成され得る「免疫応答」は、体液性及び/又は細胞媒介性免疫、例えば、抗体産生の刺激又は細胞障害性若しくはキラー細胞の刺激であってもよく、これらは、その表面上にワクチンにおける抗原に対応する抗原を発現する細胞を認識及び破壊(そうでなければ、排除)し得る。従って、用語「免疫応答を刺激する」は、全てのタイプの免疫応答及びこれらを刺激する機構を含み、本発明の好ましい態様を形成するCTLの刺激を包含する。好ましくは、刺激される免疫応答は、細胞障害性CD8+ T細胞及びヘルパーCD4+ T細胞である。免疫応答の程度は、免疫応答のマーカー、例えば、分泌分子、例えばIL-2若しくはIFNγ、又は抗原特異的T細胞の産生によって評価され得る。
【０２２４】
加えて、ネオアンチゲンは、細胞の形態、例えば抗原提示細胞、例えば樹状細胞の形態で送達され得る。抗原提示細胞、例えば樹状細胞に、ネオアンチゲン若しくはネオアンチゲンペプチドをパルス若しくは負荷して、又は(DNA若しくはRNA移入により)遺伝子修飾して、1個、2個又はそれ以上のネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチド(例えば、Butterfield 2015 上掲、Palucka 2013 上掲を参照すること)、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドを発現させてもよい。樹状細胞、免疫原性組成物又はワクチンを調製する方法は、当分野で知られている。
【０２２５】
あるいは、本明細書に定義されている1個以上のネオアンチゲン、又はそれに由来するペプチド若しくはタンパク質をコードするDNA又はRNAは、例えば、対象に直接注射することによって免疫原性組成物又はワクチンに使用され得る。例えば、2、3、4、5、6、7、8、9又は10個のネオアンチゲン、又はそれに由来するペプチド若しくはタンパク質をコードするDNA又はRNAである。1個以上のネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドは、1個以上のネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドをコードするDNA又はRNA配列を含有する細菌又はウイルスベクターを介して送達され得る。
【０２２６】
本明細書に記載されている免疫原性組成物又はワクチンは、いずれかの適切な方法で投与され得る。例えば、当分野で既知のいずれかの適切な送達機構によって送達され得る。組成物は、ベクター送達系の使用を伴ってもよい、又はベクター送達系が必要ないこともある。ベクターはウイルス又は細菌であり得る。適切なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス又はポックスウイルスに由来し得る。リポソームを送達系として使用してもよい。リステリアワクチン又は電気穿孔を使用することもできる。
【０２２７】
細胞ベースの免疫原性組成物又はワクチンは、exo vivoで調製され、次いで対象に投与され得る。
【０２２８】
本発明は、本明細書に定義されているネオアンチゲン又はその一部を表面に発現する細胞、又はその集団を更に提供し、細胞は、本明細書の方法のいずれかによって得ることが可能である(又は得られる)。そのような細胞を、がんの治療又は予防のために使用することができる。
【０２２９】
従って、本発明は、本明細書に定義されているネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドを表面(又は細胞内)に発現する細胞、又はそのような集団を更に提供し、細胞又は集団は、本明細書に定義されている方法によって得ることが可能である(又は得られる)。好ましい実施形態において、細胞は、抗原提示細胞、例えば樹状細胞である。
【０２３０】
本明細書に記載されている細胞のin vivo投与では、当分野で一般的又は標準的である、細胞集団の任意の投与様式、例えば注射又は注入を、適切な経路によって使用してもよい。一態様において、1×104個〜1×108個の細胞が、対象の1kg毎に投与される(例えば、ヒト1kgあたり1.4×104個〜2.8×106個)。一態様において、対象の1kgあたり約107個又は107個以下の細胞が投与される。従って、例えば、ヒトにおいて、対象の1kgあたり0.1〜20×107個の細胞の用量が1用量で、すなわち、1用量毎に、例えば、T細胞の用量又はワクチン用量として投与され得る。一態様において、対象の1kgあたり1×104個〜1×105個の細胞、1×105個〜1×106個の細胞、1×106個〜1×107個の細胞、又は1×107個〜1×108個の細胞が投与される。ワクチン接種用途では、1用量あたり1〜20×106個の細胞を使用してもよい。投与は、必要であれば後で繰り返すことができる。
【０２３１】
本発明の免疫原性組成物又はワクチンを、がんの治療に使用してもよい。
【０２３２】
本発明は、対象のがんを治療する方法であって、本明細書に記載されている免疫原性組成物又はワクチンを前記対象に投与することを含む方法も提供する。この方法は、がんを有する対象を同定するステップを追加的に含んでもよい。
【０２３３】
更なる態様では、本発明は、ネオアンチゲンペプチド又はネオアンチゲンを含む免疫原性組成物又はワクチンを産生する方法であって、前記ネオアンチゲンが、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示され得る方法を提供し、前記方法は、
(a)腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを同定するステップ、及び
(b)前記ネオアンチゲンペプチド又はネオアンチゲンタンパク質を有する免疫原性組成物又はワクチンを産生するステップ
を含む。
【０２３４】
本発明の一態様において、ワクチンの産生は、樹状細胞ワクチンの調製を伴い、前記樹状細胞は、本明細書に定義されているネオアンチゲン又はネオアンチゲンペプチドを提示する。
【０２３５】
ネオアンチゲンタンパク質は、免疫原性組成物又はワクチン、及び本発明のワクチン接種に関連する方法にも使用され得る。
【０２３６】
更なる態様において、本発明は、ネオアンチゲンペプチド又はネオアンチゲンをコードするDNA又はRNA分子を含む免疫原性組成物又はワクチンを産生する方法を提供し、前記方法は、
(a)腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンを同定するステップ、
(b)ネオアンチゲンペプチド又はネオアンチゲンをコードするDNA又はRNA分子を産生するステップ、及び
(c)前記DNA又はRNA分子を有する免疫原性組成物又はワクチンを産生するステップ
を含む。
【０２３７】
免疫原性組成物又はワクチンは、本明細書前記に記載されている適切な方法によって送達され得る。
【０２３８】
一態様において、ワクチン接種は治療的ワクチン接種である。この態様において、免疫原性組成物又はワクチンは、がんを有する対象に、がんを治療するために投与される。
【０２３９】
更なる態様において、ワクチン接種は予防的ワクチン接種である。この態様において、免疫原性組成物又はワクチンは、がんを発症する危険性のあり得る対象に投与される。
【０２４０】
一態様において、免疫原性組成物又はワクチンは、以前にがんを有した対象及びがんを再発する危険性のある対象に投与される。
【０２４１】
免疫原性組成物又はワクチンは、また、1個又は数個のネオアンチゲンペプチド又はタンパク質をコードするDNA又はRNAの形態であってもよく、ウイルスベクター、抗原提示細胞及び電気穿孔が含まれるが、これらに限定されない追加的な方法によって送達されてもよい。
【０２４２】
対象
本発明の好ましい実施形態において、対象は哺乳動物、好ましくは、ネコ、イヌ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ又はモルモットであるが、最も好ましくは、対象はヒトである。
【０２４３】
本明細書で定義されるとき、「治療」は、治療前の症状と比べて、治療される疾患の1つ以上の症状を低減、軽減又は排除することを指す。
【０２４４】
「予防(prevention)」(又は予防(prophylaxis))は、疾患の症状の発症を遅延又は防止することを指す。予防は、絶対的(疾患が全く生じないように)であってもよく、又は一部の個体若しくは限定された時間においてのみ有効であってもよい。
【０２４５】
がん
適切には、がんは、卵巣がん、乳がん、子宮内膜がん、腎がん(腎細胞)、肺がん(小細胞、非小細胞及び中皮腫)、脳腫瘍(神経膠腫、星状細胞腫、神経膠芽種)、黒色腫、メルケル細胞癌、腎明細胞癌(ccRCC)、リンパ腫、小腸がん(十二指腸及び空腸)、白血病、膵がん、肝胆道腫瘍、胚細胞がん、前立腺がん、頭頸部がん、甲状腺がん及び肉腫であり得る。
【０２４６】
一態様において、がんは肺がんである。一態様において、肺がんは肺腺癌である。一態様において、がんは肺扁平上皮細胞癌である。
【０２４７】
一態様において、がんは黒色腫である。
【０２４８】
一態様において、がんは、黒色腫、メルケル細胞癌、腎がん、非小細胞肺がん(NSCLC)、膀胱の尿路上皮癌(BLAC)、頭頸部扁平上皮細胞癌(HNSC)及び高頻度マイクロサテライト不安定性(MSI)がんから選択され得る。
【０２４９】
一態様において、がんは非小細胞肺がん(NSCLC)であり得る。
【０２５０】
一態様において、がんは高頻度MSIがんであり得る。
【０２５１】
一態様において、がんは、DNA修復経路に突然変異を有するものであり得る。
【０２５２】
一実施形態において、がんは、DNA修復経路に突然変異を有するものであり得る。
【０２５３】
一実施形態において、がんは高頻度MSIがんであり得る。
【０２５４】
本発明の組成物及び方法を使用した治療は、また、循環腫瘍細胞及び/又は腫瘍由来の転移を標的にすることを包含してもよい。
【０２５５】
本明細書で記載されるとき、転移性腫瘍細胞は、原発性腫瘍部位の細胞と異なる抗原プロファイルを有してもよい。本明細書に記載されている発明のいずれかの態様では、腫瘍において失われていないことが決定されているHLAアレルによってコードされたHLA分子により提示されると予測されるネオアンチゲンは、原発性部位と1つ以上の転移性部位の両方で標的になり得る。
【０２５６】
一態様では、どのネオアンチゲンが原発性部位及び転移性部位で提示されると予測されるかに応じて、転移性部位と比較して異なるネオアンチゲンが、原発性部位で標的になり得る。本発明による治療は、原発性部位及び転移性部位の両方の治療を包含することができる。
【０２５７】
1個以上のネオアンチゲンを標的にする本発明の治療は、標準的な手法により生じ得る治療抵抗性腫瘍細胞への進化を防止する助けとなり得る。
【０２５８】
他のがん治療との組合せ
本発明によるがんを治療するための方法及び使用は、追加的ながん療法と組み合わせて実施してもよい。特に、本発明によるT細胞組成物は、免疫チェックポイント介入、共刺激抗体、化学療法及び/又は放射線療法、標的化治療又はモノクローナル抗体療法と組み合わせて投与されてもよい。
【０２５９】
免疫チェックポイント分子には、阻害性分子及び活性化分子の両方が含まれ、介入を、いずれかの又は両方のタイプの分子に適用することができる。免疫チェックポイント阻害剤には、例えば、PD-1阻害剤、PD-L1阻害剤、Lag-3阻害剤、Tim-3阻害剤、TIGIT阻害剤、BTLA阻害剤及びCTLA-4阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。共刺激抗体は、ICOS、CD137、CD27 OX-40及びGITRが挙げられるが、これらに限定されない免疫調節受容体を介して、陽性シグナルを送達する。好ましい実施形態において、チェックポイント阻害剤はCTLA-4阻害剤である。
【０２６０】
免疫細胞活性の阻害を防止する、低減する又は最小限にするのに適した免疫チェックポイント介入の例には、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、トレメリムマブ及びイピリムマブが含まれる。
【０２６１】
一態様において、腫瘍の微小環境は、免疫活性化の増大を示すことがある。図13は、腫瘍微小環境におけるT細胞、NK細胞、PDL1及びCLTA4の上方制御を示す。
【０２６２】
例えば、一態様において、PDL1のレベルは、腫瘍微小環境において増大し得る(例えば、図13を参照すること)。従って、一態様において、本発明によるがんを治療するための方法及び使用は、PDL1介入、例えば、PD-L1阻害剤又はPD-1阻害剤と組み合わせて実施してもよい。一態様において、本発明によるがんを治療するための方法及び使用は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ又はアベルマブと組み合わせて実施してもよい。一態様において、本発明によるがんを治療するための介入、方法及び使用は、ペムブロリズマブ又はニボルマブと組み合わせて実施してもよい。
【０２６３】
一態様において、CTLA-4のレベルは、腫瘍微小環境において増大し得る。従って、一態様において、本発明によるがんを治療するための方法及び使用は、CTLA-4介入、例えばCTLA-4阻害剤と組み合わせて実施してもよい。一態様において、本発明によるがんを治療するための方法及び使用は、トレメリムマブ又はイピリムマブと組み合わせて実施してもよい。
【０２６４】
一態様において、がんは肺腺癌であり得る。
【０２６５】
化学療法実体は、本明細書で使用されるとき、細胞に対して破壊的である実体を指し、すなわち、実体は細胞の生存力を低減する。化学療法実体は細胞障害性薬物であり得る。意図される化学療法剤には、限定されることなく、アルキル化剤、アントラサイクリン、エポチロン、ニトロソ尿素、エチレンイミン/メチルメラミン、アルキルスルホネート、アルキル化剤、抗代謝剤、ピリミジン類縁体、エピポドフィロトキシン(epipodophylotoxin)、酵素、例えばL-アスパラギナーゼ、生体応答修飾物質、例えば、IFNα、IL-2、G-CSF及びGM-CSF、白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン、アントラセンジオン、置換尿素、例えばヒドロキシ尿素、N-メチルヒドラジン(MIH)及びプロカルバジンを含むメチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、例えばミトタン(o,p'-DDD)及びアミノグルテチミド、アドレノコルチコステロイドアンタゴニストを含むホルモン及びアンタゴニスト、例えばプレドニゾン及び等価物、デキサメタゾン及びアミノグルテチミド、プロゲスチン、例えばヒドロキシプロゲステロンカプロネート、メドロキシプロゲステロンアセテート及びメゲストロールアセテート、エストロゲン、例えばジエチルスチルベストロール及びエチニルエストラジオール等価物、抗エストロゲン剤、例えばタモキシフェン、テストステロンプロピオネート及びフルオキシメステロン/等価物を含むアンドロゲン、抗アンドロゲン剤、例えば、フルタミド、ゴナドトロピン放出ホルモン類縁体及びリュープロリド、並びに非ステロイド性抗アンドロゲン剤、例えばフルタミドが含まれる。
【０２６６】
「組み合わせて」は、本発明によるT細胞組成物の投与の前に、と同時に、又は後に、追加の療法を投与することを指し得る。
【０２６７】
チェックポイント遮断との組合せへの追加又は代替案として、本発明によるT細胞組成物を、TALEN及びCrispr/Casが含まれるが、これらに限定されない遺伝子編集技術の使用により遺伝子修飾して、免疫チェックポイントに抵抗性にすることもできる。そのような方法は当分野で知られている。例えばUS20140120622を参照すること。遺伝子編集技術を使用して、PD-1、Lag-3、Tim-3、TIGIT、BTLA CTLA-4及びこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない、T細胞により発現される免疫チェックポイントの発現を、防止することができる。T細胞は、本明細書で考察されるとき、これらの方法のいずれかにより修飾されていてもよい。
【０２６８】
本発明によるT細胞を遺伝子修飾して、腫瘍へのホーミングの増加した分子を発現させること、及び又はサイトカイン、可溶性免疫調節受容体及び/又はリガンドが含まれるがこれらに限定されない炎症性媒介物質を腫瘍微小環境に送達することもできる。
【０２６９】
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本開示が属する分野の当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。Singleton, et al., DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY, 20 ED., John Wiley and Sons, New York (1994)及びHale & Marham, THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY, Harper Perennial, NY (1991)は、当業者に本開示に使用される用語のうちの多くについて一般的な辞典を提供している。
【０２７０】
本開示は、本明細書に開示されている例示的な方法及び材料に限定されず、本明細書に記載されているものに類似又は同等のあらゆる方法及び材料を、本開示の実施形態の実施又は試験に使用することができる。数値範囲は、範囲を画定している数字を含む。特に指示さない限り、任意の核酸配列は、左から右に5'から3'の方向で、アミノ酸配列は、左から右にアミノからカルボキシ基の方向で、それぞれ書かれている。
【０２７１】
本明細書に提示されている表題は、本開示の様々な態様又は実施形態の限定ではなく、明細書全体への参照により理解することができる。従って、直ぐ下に定義されている用語は、明細書全体への参照によってより完全に定義される。
【０２７２】
アミノ酸は、アミノ酸の名称、3文字の略語又は1文字の略語を使用して本明細書に記載される。
【０２７３】
用語「タンパク質」には、本明細書で使用されるとき、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドが含まれる。
【０２７４】
用語の他の定義は、明細書全体にわたって現れることがある。例示的な実施形態がより詳細に記載される前に、本開示は記載されている特定の実施形態に限定されないこと、従って、当然のことながら変わり得ることが、理解されるべきである。また、本明細書に使用される用語は、特定の実施態様を記載する目的のためのみであり、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ制限されるので、限定的であることを意図しないことが理解されるべきである。
【０２７５】
値の範囲が提供される場合、その範囲の上限及び下限の間のそれぞれの介在値は、文脈から明白に異なる指示のない限り、下限の単位の十分の一まで特定的に開示されることも理解される。記述された範囲における任意の記述値又は介在値、及びその記述された範囲における任意の他の記述又は介在値の間のそれぞれの小さな範囲は、本開示内に包含される。これらの小さい範囲の上限及び下限は、独立して、範囲に含まれても、範囲から除外されてもよく、それぞれの範囲は、小さな範囲に、いずれかの限界が含まれる、どちらの限界も含まれない又は両方の限界が含まれる場合でも、記述された範囲の任意の特定の排除限界に従って、本開示の範囲内に包含される。記述された範囲が、一方又は両方の限界を含む場合、これらの含まれた限界のいずれか又は両方を除外する範囲も、本開示に含まれる。
【０２７６】
本明細書及び添付の請求の範囲で使用されるとき、単数形「a」、「an」及び「the」は、特に文脈から明白に異なることを示されない限り、複数の言及を含むことに注意しなければならない。
【０２７７】
用語「含む(comprising)」、「含む(comprises)」及び「構成される(comprised of)」は、本明細書で使用されるとき、「含む(including)」、「含む(includes)」又は「含有する(containing)」及び「含有する(contains)」と同義語であり、包括的又は開放型であり、追加の非列挙メンバー、要素又は方法ステップを除外しない。用語「含む(comprising)」、「含む(comprises)」及び「構成される(comprised of)」はまた、用語「からなる(consisting of)」を含む。
【０２７８】
本明細書において考察されている刊行物は、単に本出願の出願日の前の開示として提供されている。そのような刊行物が、添付の特許請求の範囲に対して先行技術を構成することを認めていると解釈すべきものは、本明細書に存在しない。
【０２７９】
本発明は、ここで、例示目的だけのために以下の実施例を参照して記載される。
【実施例】
【０２８０】
[実施例1]
方法の詳細
LOHHLA(ヒト白血球抗原におけるヘテロ接合性の消失)アルゴリズム
入力として、LOHHLAは、腫瘍及び生殖細胞系列BAM、HLA推測ツール(例えば、POLYSOLVER (Shukla, 2015)又はOptitype (Szolek 2014))で予測される患者特異的HLAコール、HLA fastaファイルの位置、コピー数ツール(例えば、ASCAT (Van Loo, 2015)又はFACETS (Shen, 2016))で予測される純度及び倍数性の推定値を必要とする。
【０２８１】
HLA LOHをコールするため、LOHHLAは、4つの計算ステップに依存する。
【０２８２】
ステップ1:HLA読み取りデータを抽出する
最初に、ゲノム(chr6:29909037-29913661、chr6:31321649-31324964及びchr6:31236526-31239869)、並びに6番染色体のコンティグ(chr6_cox_hap2、chr6_dbb_hap3、chr6_mann_hap4、chr6_mcf_hap5、chr6_qbl_hap6、chr6_ssto_hap7)のHLA領域にマップされる腫瘍及び生殖細胞系列の読み取りデータを、samtools viewの使用によって抽出する。このステップの不対メイト(unpaired mates)が除去され、出力はFASTQフォーマットに変換される。
【０２８３】
ステップ2:HLAアレル特異的BAMファイルを作成する
それぞれの患者のヘテロ接合性HLAアレルについて、患者特異的参照fastaを作成する。前のステップで生成されたFASTQファイルを使用し、読み取りデータが複数のHLAアレルにマッピングされることを可能にするマッピングパラメーターを使用し、以前に出版されたもの(Shukla, 2015)に類似したマッピングパラメーターを使用して、HLA特異的BAMファイルを生成する。異なるアレルにマッピングされたメイトの読み取りデータ、並びに、基準HLAアレルと比較して1個を超える挿入、欠失又はミスマッチ事象を含む任意の読み取りデータが廃棄されるように、アラインメント後フィルタリングを実施した。それぞれのフィルター済み腫瘍/生殖細胞系列HLAアレル特異的BAMファイルについて、カバレッジをsamtools mpileupの使用によって計算した。
【０２８４】
ステップ3:相同HLAアレル間のミスマッチ位置のカバレッジを決定する
それぞれのHLA遺伝子座について、ペアワイズローカルアラインメントを、R Biostringsパッケージの使用によって2個の相同HLAアレル間で実施した。ペアワイズアラインメントから、2個の相同体間の全てのミスマッチ位置を抽出した。ステップ2で計算されたHLA特異的カバレッジを使用して、それぞれのミスマッチ位置でのカバレッジの差を決定した。1つを超えるミスマッチ位置にわたる読み取りデータの過剰計数を避けるために、各読み取りデータを1回だけ計数して、あらゆるミスマッチ位置でのカバレッジを含む追加のファイルを生成した。
【０２８５】
ステップ4:HLA特異的logR及びBAFを得る
各HLA遺伝子のlogRは、腫瘍及び正常の両方において、150塩基対間隔で両方の相同アレルに及ぶカバレッジをビニング(binning)することによって得た。各ビンでは、腫瘍/正常のカバレッジ比に、生殖細胞系列における特有のマップ済読み取りデータの数に対応する倍増率Mを掛け、腫瘍領域における特有のマップ済読み取りデータの数で割った。
【０２８６】
BAFは、各多形部位において計算され、単純に、HLAアレル1のカバレッジを、HLAアレル1のカバレッジ+HLAアレル2のカバレッジで割ったものを反映した。
【０２８７】
ステップ5:HLAハプロタイプ特異的コピー数を決定する
各多形部位では、メジャー及びマイナーアレルコピー数の推定値を以下の方程式の使用によって取得し、多形部位が存在することが見いだされた対応するビンのlogR値及び多形部位のBAFを利用した。
【０２８８】
【数１】
2020526209.tif 000002
【０２８９】
【数２】
2020526209.tif 000003
式中、ρ=腫瘍純度;γ=正規化定数、エクソーム配列決定データでは1、更なる詳細についてASCATを参照すること;φ=腫瘍の倍数性。ρ及びφは、下記に記載のようにASCAT(van Loo, 2010)を使用して推定した。
【０２９０】
各ビンでは、次いで、アレル1及びアレル2のコピー数の中央値を決定した。アレル1のコピー数を推定するため、ビンの中央値を計算した。同様に、アレル2のコピー数を推定するため、ビンの中央値を計算した。
【０２９１】
コピー数<0.5を、消失を受けていると分類した。加えて、LOHのオーバーコールを避けるため、本発明者らは、それぞれのHLA遺伝子のアレル不均衡に関するp値を計算した。このp値は、2つのHLA相同体のミスマッチ部位におけるlogR値の差に対応し、配列決定読み取りデータが1箇所を超えるミスマッチ部位に及ぶ場合、それぞれの配列決定読み取りデータを計数するように調整した。2つの分布の対応のあるスチューデントt検定を使用して、P<0.01である場合に、アレル不均衡であると決定した。
【０２９２】
TRACERx 100コホート
考慮されるTRACERx試料は、{Jamal-Hanjani, 2017 #11854}から得た。3箇所のHLA遺伝子座の全てにおけるホモ接合性又はHLAアレル間の少なすぎるミスマッチ位置のために、4人の患者を除外した。肺腺癌及び肺扁平上皮細胞癌の腫瘍を下流分析のために考慮した。7個の腫瘍を別個の病理学を有するものと分類した。これらのうち、1個の癌肉腫はHLA LOHを示し、3個の腺扁平上皮癌、1個の癌肉腫、1個の大細胞癌及び1個の大細胞神経内分泌腫瘍は、HLA LOHを示さなかった。
【０２９３】
ASCATを使用したコピー数の推定
ASCATコピー数を以前に記載されたように推定した(Jamal-Hanjani, 2017)。ASCATを使用してHLAアレルのコピー数を直接推測することが可能でなかったので、HLA遺伝子座と重複するセグメントを使用した又は代替的には最も近傍のセグメントを使用した。
【０２９４】
TRACERx突然変異データ
TRACERx突然変異表は、(Jamal-Hanjani, 2017)から得た。
【０２９５】
ASCATとLOHHLAの比較
ASCATとLOHHLAを比較するため、本発明者らは、それぞれの腫瘍領域を別個の試料として処理し、初期設定のLOHHLAパイプラインに通した。
【０２９６】
HLA遺伝子座の予測コピー数状態を評価するため、本発明者らは、HLA遺伝子座と重複しているゲノムセグメントのコピー数状態を決定した。HLA遺伝子座と重複するゲノムセグメントが見出されない場合、最も近傍のセグメントを選択した。
【０２９７】
アレル不均衡推定値を比較するため、ASCATが遺伝子座においてアレル不均衡を予測し、LOHHLAを使用して少なくとも1個のHLA遺伝子がアレル不均衡を持つことが見いだされた場合に、腫瘍領域が調和性であると考えた。同様に、LOHについて、ASCATがマイナーアレル0を予測し、このことが少なくとも1個のHLA遺伝子においても予測された場合に、ASCAT及びLOHHLA推定値が調和性であると考えた。
【０２９８】
逆に、アレル不均衡が、LOHHAを使用して任意のHLA遺伝子において予測され、ASCATでは予測されない場合に、アレル不均衡推定値を不調和性であると分類した。同様に、LOHについて、LOHHLAを使用して任意のHLA遺伝子がマイナーアレル0を示し、ASCATを使用してLOHなしが同定された場合に、不調和性であると分類した。
【０２９９】
LOHHLAの結果のフラグメント分析によるバリデーション
HLA遺伝子座に近い6番染色体の短アーム上に位置する4つの多形Sequence-Tagged Site (STR)マーカー(D6S2852、D6S2872、D6S248及びD6S1022)を使用してアレル不均衡をバリデートした。20ngの患者生殖細胞系列及び腫瘍領域DNAを、PCRを使用して増幅した。PCRは、95℃で45秒間の変性、続いて55℃のアニーリング温度で45秒間を35サイクル、次いで72℃で45秒間のPCR伸長から構成された。PCR産物を、ABI 3730xl DNA分析器により分離した。各アレルのフラグメント長及び曲線下面積は、Applied BiosystemsソフトウエアGeneMapper v5を使用して決定した。2個の別個のアレルが特定のマーカーについて同定される場合、フラグメントは、式(At/Bt)/(An/Bn)を使用してアレル不均衡について分析することができる。この式の出力を正規化アレル比と定義した。
【０３００】
HLAタイプ、HLA突然変異及び予測されるネオアンチゲンバインダー
正常組織BAMファイルを入力として使用し、ベイズ分類機を用いて遺伝子型を決定するPOLYSOLVER (POLYmorphic loci reSOLVER)を使用して、各試料における4桁のHLAタイプを推測した(Shukla, 2015)。各腫瘍領域におけるHLA突然変異も、POLYSOLVERを使用して評価した。
【０３０１】
試料に存在する同定された非サイレント突然変異から生じ得る新規の9〜11merのペプチド(Jamal-Hanjani, 2017)を決定した。400,000個の無作為天然ペプチドのセットと比較した予測親和性のランクを表す、予測されるIC50結合親和性及びランクパーセンテージスコア(rank percentage score)は、netMHCpan-2.8及びnetMHC-4.0を使用して患者のHLAアレルのそれぞれに結合する全てのペプチドで計算した(Andreatta 2016、Nielsen 2003、Hoof 2009、Nielsen 2009)。推定ネオアンチゲンバインダーは、予測結合親和性が<500nM又はランクパーセンテージスコアが<2%のペプチドであった。
【０３０２】
系統樹へのHLA LOHのマッピング及び平行進化の同定
試験したあらゆる腫瘍領域に検出されたLOH事象は、クローン性事象と考慮され、系統樹の幹にマッピングした。異質LOH事象では、HLAアレル消失の領域性コピー数を、Rパッケージquadprogを使用した二次計画法において、患者木構造及びサブクローンがん細胞画分と共に使用して、LOH事象の最良の配置を決定した。
【０３０３】
これは、二次計画方程式を解くことによって達成した。
分(-d^T b + 1/2 b^T D b)
制約:
A^T b >= bvec
【０３０４】
LOH事象を各枝で試験した。それぞれの可能性について、系統樹は2つに分けられ、一方はLOH事象後の全てのクローンを含み、他方は、ツリーの残りから構成された。nが試料採取された領域の数である2×nマトリックスを、サブツリーにおける各サブクローンのがん細胞画分の領域合計及び残りのツリーにおけるサブクローンのがん細胞画分の領域合計を含むように構築した。領域性がん細胞画分マトリックスに、その転置行列を掛けて、quadprog function solve.QPへの入力(Dmat)のために2×2マトリックスを生成した。最小限にされるべきベクター(dvec)は、各領域のLOHHLAを計算したHLAアレルコピー数に、領域性がん細胞画分マトリックスの転置行列を掛けることによって得た。最後に、全ての結果が陽性になるような制約マトリックスAmat、及び残りのツリーのHLAアレルの推定コピー数が少なくとも0.5になるような制約ベクターbvecを使用して、solve.QP関数をDmat及びdvecによりコールした。各枝にLOH事象を配置することにより観察及び予測コピー数値の誤差を出力し、最少誤差をもたらす解法を選択した。
【０３０５】
それぞれのマップ済事象を検査し、系統樹に当てはまらなかった又は大きな誤差値を有した事象は、追加のサブクローンの存在又は複数の独立したHLA LOH事象の存在を示しており、手作業で調整した。
【０３０６】
限局性及びアームレベルのLOHの有意性の評価
HLA LOHが偶然に予想されるより多く生じるか否かを評価するため、本発明者らは、それぞれのLOH事象が天然において限局性であるか、又はアームレベルであるかを考慮した。簡潔には、LOHをアームレベル又は限局性であると分類するため、本発明者らは、ゲノムにわたるマイナーアレル頻度に注目した。最初に、同一のマイナーアレルコピー数を有する任意のセグメント(ASCATにより予測された)を合わせた。続いて、所定の染色体アームの≧75%の長さに及ぶセグメントを、「アームレベル」と分類し、一方、<75%であったセグメントを限局性と考えた。
【０３０７】
各腫瘍について限局性事象の有意性を評価するため、限局性マイナーアレル消失を受けるゲノムの割合を決定した。この値は、各腫瘍における限局性マイナーアレル消失の確率を反映すると想定された。この確率に基づいて、本発明者らは、各試料について個別に異常状態(消失又は消失なし)を生成し、消失を示す試料の割合を決定した。本発明者らは、この処理を10,000回繰り返して、各試料における消失の確率を考慮して消失を観察する可能性を反映するバックグラウンド分布を得た。HLA遺伝子座において見られるマイナーアレル消失のレベルを観察する可能性を反映するp値は、観察されたものより高い割合の消失を示すシミュレーションのパーセンテージを計数することによって決定した。
【０３０８】
各腫瘍におけるアームレベルアレル特異的消失の観察された頻度を使用し、同じ手順をアームレベル事象について実施した。
【０３０９】
突然変異シグネチャー分析
突然変異シグネチャーを、以前に記載されたdeconstructSigs Rパッケージ(Jamal-Hanjani, 2017)を使用して推定した。
【０３１０】
ネオアンチゲンが消失HLAアレルに優先的に結合するか否かについての評価
ネオアンチゲンが消失HLAアレルに優先的に結合するか否かを評価するため、本発明者らは、6個の別々のHLAアレル(すなわち、生殖細胞系列における任意のアレルにホモ接合性がない)及び少なくとも1つの腫瘍領域に1つのHLAハプロタイプの消失(3個の親アレル)を示す腫瘍に注目した。
【０３１１】
ネオアンチゲン(上記に定義された)を、IC50結合スコアに従ってランク付けした。二重突然変異を除去して、各ネオアンチゲンが任意の所定の突然変異について最高の結合スコア(最低IC50値)を反映することを確実にした。本発明者らは、突然変異リストを更にフィルタリングして、消失事象を有する腫瘍領域に生じるサブクローン性突然変異(以前に記載されたように定義された(Jamal-Hanjani, 2017))のみを含めた(>5% VAF)。次いで、各ハプロタイプに結合するサブクローン性ネオアンチゲンの数を、各腫瘍について決定した。対応のあるウィルコクソン検定を使用して、保持されたハプロタイプと比較して、消失ハプロタイプに結合するサブクローン性ネオアンチゲンの数を比較した。
【０３１２】
PD-L1免疫組織化学
4μm厚のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織切片を、GCP準拠中央研究所(Targos Molecular Pathology GmbH)において、OptiView DAB IHC Detection Kit及びOptiView Amplification Kit (Ventana Medical Systems Inc.)と共に自動染色プラットフォーム(Benchmark; Ventana)上で抗ヒトPD-L1ウサギモノクローナル抗体(クローンSP142、Ventana, Tucson, AZ)を用いてPD-L1について染色した。PD-L1発現を、腫瘍細胞及び腫瘍浸潤性免疫細胞について評価した。腫瘍細胞では、PD-L1陽性細胞の割合を総腫瘍細胞のパーセンテージとして推定した。腫瘍浸潤性免疫細胞では、腫瘍に占めるPD-L1陽性腫瘍浸潤性免疫細胞のパーセンテージを記録した。スコア付けは、熟練の組織病理学者により実施した[以前に公開されたスコア付け基準(Herbst, 2014)に準じた]。
【０３１３】
TCGAを使用したRNA配列発現の分析
RNA配列決定データをTCGAデータポータルからダウンロードした。各LUAD及びLUSC試料において、全ての利用可能な「レベル_3」遺伝子レベルデータを得た。生読み取りデータ計数を、分析のためにRパッケージDESeq2への入力として使用した。FDRカットオフ0.05を使用して、有意に異なって発現した遺伝子を決定した。
【０３１４】
定量化及び統計的分析
全ての分析をR統計環境バージョン≧3.2.1で実施した。全ての統計的検定は、特に明確に記述されない限り、両側であり、特に記述されない限り、P値が0.05未満であった場合に統計的有意性を決定した。比較は、図3に関して上記に記載されたように図2Bはフィッシャーの正確検定、図4A〜Cは対応のないウィルコクソン検定及び図4D〜Eは対応のあるウィルコクソン検定を使用して行った。
【０３１５】
データ及びソフトウエアの利用可能性
TRACERx 100コホートは、肺TRACERx研究により前向き分析された最初の100人の患者(https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01888601、独立したResearch Ethics Committeeにより承認済み、13/LO/1546)を含み、(Jamal-Hanjani, 2017)に記載された前向き100人患者コホートに類似する。
【０３１６】
配列データは、The European Bioinformatics Institute (EBI)及びthe Centre for Genomic Regulation (CRG)が主催するEuropean Genome-phenome Archive (EGA)からアクセッション番号EGAS00001002247(原発性腫瘍データ)により入手可能である。EGAについての更なる情報は、https://ega-archive.org(the European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research)において見いだすことができる。
【０３１７】
肺腺癌(LUAD、n=397)及び肺扁平上皮細胞癌(LUSC、n=350)の両方におけるTCGA腫瘍及びマッチド生殖細胞系列エクソーム配列決定BAMファイルは、https://cghub.ucsc.eduを介してCancer Genome Atlas (TCGA, http://cancergenome.nih.gov/)から得た。データを以前に記載されたように処理した(Jamal Hanjani, 2017)。
【０３１８】
結果
LOHHLAを使用した腫瘍試料におけるHLA LOHの推測及び不均衡
アレル特異的コピー数を決定するため、大部分のコピー数ツールは、ゲノム又はエクソームにおける腫瘍及び適合した正常中の単一ヌクレオチド多形(SNP)の相対的カバレッジ及び変異体アレル頻度に依存する（Van Loo; Shen, 2016; Carter, 2012）。しかし、HLA遺伝子座のコピー数状態を推測することは、領域の不十分なカバレッジ及び多形的性質のため問題がある。高度に多形的である読み取りデータはアラインメントされず、従って廃棄されるので、ヒト基準ゲノムにアラインメントされている配列決定データを使用して、HLA遺伝子座においてSNPを容易に同定することができない。事実、ヒトゲノムの最も多形的な領域の一つであるにもかかわらず、最新式SNPコーラーPlatypus (Rimmer, 2014)を使用して、3個のHLAクラスI遺伝子で平均して1個未満(平均0.84、範囲0〜7)の情報価値のあるヘテロ接合性SNPが、TRACERxコホートの97人の患者において同定された(Jamal-Hanjani, 2017)。これらのデータは、従来のコピー数コーリングアルゴリズムが、HLA遺伝子座のハプロタイプ特異的コピー数を直接推測することに適していないことを示唆している。
【０３１９】
本発明者らは、ヒト基準ゲノムではなく個人の生殖細胞系列HLAアレルに特異的にマップされる読み取りデータを利用することによって、HLAハプロタイプ特異的コピー数を正確に決定することが可能になると推論した。これを達成するため、本発明者らはLOHHLA(図1A)を開発した。LOHHLAの実行は、5つのステップに依存している。最初に、コンティグを含むゲノム及び6番染色体のHLA領域にマップされる腫瘍及び生殖細胞系列読み取りデータが抽出される。第2に、腫瘍及び生殖細胞系列HLAアレル特異的.bamファイルが読み取りデータを患者特異的HLAアレル(HLA血清型判定又は推測ツール、例えばPolysolver (Shukla, 2015)若しくはOptitype (Szolek)により得た)にアラインメントさせることによって生成される。第3に、相同HLAアレル間の多形部位を同定する。第4に、生殖細胞系列(logR)及びbアレルの頻度(BAF)に対する腫瘍カバレッジを、同定された多形部位を使用して、各HLA遺伝子座において推測する。最後に、腫瘍純度及び倍数性を説明するHLAアレル特異的コピー数(コピー数コーラー、例えばASCAT (Van Loo, 2010)又はFACETs (Shen, 2016)によって得る)を、各HLA遺伝子について決定する。
【０３２０】
本発明者らの知る限り、HLA遺伝子座のハプロタイプ特異的コピー数を推測する他の方法は、現在存在せず、従って、LOHHLAコピー数の推定又はどのHLAハプロタイプが消失を受けるかの推測を比較できるゴールドスタンダードの方法は存在しない。
【０３２１】
従って、HLAコピー数推定の精度を検査するため、HLA遺伝子座に隣接するゲノムセグメントが、HLA遺伝子座それ自体と同じコピー数プロファイルを示すことが多いであろうという仮説を立てた。これは高度に限局性のHLA事象を有さない場合、当てはまる(図2D)。本発明者らは、ASCAT(Van Loo, 2010)を使用して、97人の患者からの303個のTRACERx NSCLCエクソームにおいて、HLA遺伝子座を囲むゲノム領域のアレル不均衡及びLOHの頻度を推定し(Jamal-Hanjani, 2017)、これらを、LOHHLAコピー数推定と比較した。注目すべきことに、ASCATがどのHLAハプロタイプが消失を受ける又は不均衡であるかを推測するように設計されていないので、この分析では、ASCAT及びLOHHLAが調和性コピー数プロファイルを示すか否かを比較することだけが可能であり、調和性ハプロタイプが失われると予測されるか否かを比較することができない。
【０３２２】
本発明者らは、LOHHLA及びASCATによって得たマイナー及びメジャーアレルコピー数推定値の極めて有意な関係性を観察し(P<0.001、rho=0.70、スピアマンの順位検定、図1B、図2A)、このことは、コピー数及びLOHを正確に推定するLOHHLAの有用性を支持している。本発明者らは、調和性アレル不均衡推定値を246/288箇所の腫瘍領域において見いだした(図1C及び図2B〜C)。腫瘍領域における34個の追加のアレル不均衡が、LOHHLAによって発見され、一方、LOHHLAではなくASCATの使用により、僅か8箇所の腫瘍領域がアレル不均衡の証拠を示した。多くの場合、ASCATとLOHHLAの差異は、考察されたように、ASCATがHLA遺伝子座でハプロタイプ特異的コピー数を直接推測できず、従って、5'又は3'に隣接するセグメントのいずれかのコピー数がHLA遺伝子座を網羅すると誤って推定されるという事実によって説明することができる(図2D)。
【０３２３】
調和性LOH推測は、264/288箇所の腫瘍領域において観察され、追加のLOHは、21箇所の腫瘍領域において同定されたLOHHLAによって定義され、一方、僅か9箇所の腫瘍領域が、LOHHLAではなくASCATによって、消失ハプロタイプを持つと同定された(図1D及び図2C)。
【０３２４】
本発明者らの手法を更にバリデートするため、本発明者らは、27個の腫瘍からの82箇所の腫瘍領域におけるHLA遺伝子座に近接する、高度に多形性のDNA伸長のフラグメント分析を実施した（図３）。分析された腫瘍領域は、全ての遺伝子座(HLA-A、HLA-B及びHLA-C)がLOHを受けている又はいずれの遺伝子座も影響を受けていないと予測された。LOHを正確に分類するLOHHLAの有用性を支持するため、本発明者らは、LOHを示す、LOHを有さないでアレル不均衡を示す、又は観察可能な不均衡を示さないと分類された腫瘍の正規化アレル比における有意な差を観察した(p=1.07e-19[LOH対不均衡なし]、p=4.57e-05 [LOH対アレル不均衡]、図3)。更に、これらの3つの分類の区別は、コピー数ツールASCAT (Van Loo, 2010)、Sequenza (Favero, 2015)又はTITAN (Ha, 2014)よりLOHHLAを使用した方が明確であった。
【０３２５】
まとめると、これらのデータは、LOHHLAが腫瘍試料におけるアレル不均衡とLOHの両方を正確に推測できることを示唆している。大部分の場合では、HLA遺伝子座がアレル不均衡及び/又はLOHを受けるか否かを、コピー数ツール、例えばASCAT (Van Loo)を使用して推測することが可能であり得るが、LOHHLAは、これらの異常を高度に限局性であっても検出することに追加的な感度及び特異性を提供する。決定的なことは、LOHHLAはまた、どのHLAアレル相同対が3個のHLA遺伝子のそれぞれにおいて消失を受けるかを特異的に推測し、これは、本発明者らの知る限り、現在、任意の他のツールによって可能ではない。
【０３２６】
NSCLCにおけるHLA不均衡及び消失の普遍性及びタイミング
ネオアンチゲン-MHC結合を破綻させる能力を有するHLA突然変異は、NSCLCを含む多くのがんタイプにおいて以前に記載されている(Shukla, 2015)。しかし、がん及び免疫回避に関連しているにもかかわらず、HLA遺伝子の突然変異は、たまにしか検出されていない(Lawrence, 2014;Shukla, 2015)。本発明者らの100 TRACERx患者のコホートでは、Polysolverを使用して、3人の患者の腫瘍のみがHLA遺伝子に非同義的突然変異を有していた(Shukla, 2015)(図4)。1個の肺腺癌腫瘍は、MHCクラスIの発現及びペプチド結合安定性にとって重要であるβ-2ミクログロブリン(B2m)にも突然変異を有していた。抗原提示又はMHCクラスI複合体を破綻させると予測される更なる突然変異は、このコホートにおいて同定されなかった。同様に、TCGAからの174人の肺扁平上皮細胞癌及び223人の肺腺癌の患者によるより広範囲の研究では、それぞれ僅か8%及び5%の腫瘍がHLA突然変異を有すると分類された(Shukla, 2015)。
【０３２７】
19/32個(61%)の肺扁平上皮細胞癌及び17/59個(29%)の肺腺癌において、LOHHLAがHLA LOHを同定し、母方又は父方のHLAアレルのいずれか一方が失われ、HLAホモ接合性をもたらしていた。HLA突然変異が肺扁平上皮細胞癌においてより頻繁に生じるので(Shukla, 2015)、肺腺癌と比較して、肺扁平上皮細胞癌におけるHLA LOHの濃縮も観察した(p=0.004)(図4A〜B)。HLA LOHが生じる頻度の増加及び以前の抗原性ペプチドがもはや消失アレル上に提示されない可能性は、HLA LOHが、HLA又はB2M突然変異より優位な免疫破壊機構である能力を有することを示唆している。
【０３２８】
HLAアレル特異的消失が、あらゆるがん細胞にクローン的に存在する腫瘍の進化の初期事象であるか、又はがん細胞のサブセットにのみサブクローン的に存在し、進化の後期に生じること及び免疫認識と回避の平衡におけるシフトに応答する可能性を示すかを調査するため、TRACERxデータセットの高い深度及び多領域性を利用した。HLA LOHは、両方の組織学的サブタイプにサブクローン的に頻繁に生じると思われ、13/17個の肺腺癌及び9/17個の肺扁平上皮細胞癌が、がん細胞のサブセットでHLAアレルの消失を示した(図5A〜B)。系統樹分析は、HLA LOH事象を、腫瘍の進化樹からの、ほぼ確実なサブクローンにマッピングすることを可能にした(図6〜7)(Jamal-Hanjani, 2017)。これらのデータは、免疫系からの選択圧が、腫瘍が進展するにつれて増加し得ること、また、多領域配列決定を用いないと、HLA LOHの普遍性が有意に過小評価され得ることを示唆している。
【０３２９】
NSCLC腫瘍進化におけるHLA LOHのタイミングに更に光を当てるため、適合する脳転移を有する37個のNSCLC原発性腫瘍の配列決定データを得た(Brastianos, 2015)。初期段階NSCLCのデータに一致して、17/37個(46%)の腫瘍にHLA LOHを同定し、LOH事象が11/17(65%)の症例にサブクローン的に生じたことを見いだした(図7G)。更に、同じ患者から採取した原発性及び転移性の試料を比較した場合、適合する原発性腫瘍と比較して転移性部位にHLA LOHの濃縮が観察され(P=0.08)、7人の患者が転移性試料のみにHLA LOHを持ち、僅か1人の患者で逆のことが観察され、原発性腫瘍のみにHLA LOHを有した(図7H)。これらの結果は、HLA LOHが、がん進化の後期に生じるという概念を支持し、後期段階の疾患において免疫回避機構が選択され得ることを示している。
【０３３０】
HLA消失はNSCLCにおいて正に選択される
免疫回避とHLA遺伝子におけるクローン性及びサブクローン性LOHの両方の高い発生率との関連性を考慮して、HLA LOHが偶然として予想されるより有意により頻繁であるか否かを問うた。あらゆる腫瘍におけるLOHの頻度を考慮して、限局性事象及びアームレベル事象の両方の予想される頻度をシミュレートした。アームレベルではなく、限局性のHLA LOHの観察された頻度は、偶然に予想されるより有意に多く生じていた(図8、P<0.001及び図9)。事実、両方の組織学的サブタイプでHLA遺伝子座を中心にして限局性LOHの明確なピークが観察され、HLA遺伝子座がNSCLC進化の際に選択圧をうけることを強く示唆している。このピークは、分析をサブクローン性LOHに限定するとより顕著であり(図9)、腫瘍進化の後期における強い選択圧と一致している。
【０３３１】
更に、腫瘍進化の後期におけるHLA消失に対する強い選択圧と一致して、4個の腫瘍において、腫瘍の系統樹の別個の枝における別々の事象として生じる、HLAハプロタイプの消失が観察され、HLA消失に集束する平行進化を示している。例えば、双方が肺腺癌のLTX080及びLTX050において、同じハプロタイプが別々のサブクローン内で消失している証拠を見いだした(図6及び図8C)。注目すべきことに、平行進化が観察された4つの症例の全てにおいて、同じアレルが別々の枝において消失を受け、これらのアレルの消失は、サブクローン性拡大に特異的に必要であった可能性があることを示している。本発明者らは、特定の症例(例えば、LTX041)において、僅か1個のHLA遺伝子がアレル特異的消失を受けており、この遺伝子に特異的に関連するネオアンチゲン提示への摂動の選択的利益を示唆していることにも注目した。
【０３３２】
腫瘍におけるHLA遺伝子の有意な突然変異頻度についての最近の記載(Shukla, 2015)と合わせると、これらのデータは、HLA LOHが肺がん進化における免疫回避の一般的な機構であることを意味し、更に、免疫系が分枝する腫瘍進展の際に強力な選択圧として作用することを示唆している。
【０３３３】
HLA LOHが37個の腫瘍で同定されたが、本発明者らは、HLAのホモ接合性欠失を示す腫瘍を同定しなかったことも注目される。この観察と一致して、HLA遺伝子において同定された突然変異の変異体アレルの頻度は、ヘテロ接合性状態を示す(Shukla, 2015)。これらのデータは、HLAハプロタイプの単一コピーが、NK媒介標的細胞溶解を避けるために必須であり得るという概念を支持する(Moretta, 2014)。
【０３３４】
HLA消失は免疫編集を反映し、サブクローン性突然変異の濃縮に関連する
おそらく、HLAハプロタイプを持つ相同染色体のうちの1つがコピー数消失を受けると、T細胞に提示される推定ネオアンチゲンの数が低減される。従って、HLAハプロタイプの消失は、サブクローン性拡大に許容的であり得る及び上昇した突然変異/ネオアンチゲン負荷量に関連すると仮定した。
【０３３５】
最初に、HLA遺伝子座にLOHを有する及び有さない腫瘍試料に存在する非同義的突然変異及びネオアンチゲンの数を、HLA LOH事象のタイミング又はクローン性を考慮に入れることなく比較した。全体として、いずれかのHLA LOHを示す腫瘍試料における非同義的突然変異(図10A)及びネオアンチゲン(図11A)の数に有意な増加が観察されたが、これは、サブタイプが別個に考慮される場合には有意でなくなった。(NSCLC p=0.016、肺腺癌  p=0.07、肺扁平上皮細胞癌  p=0.82、ウィルコクソン検定)。しかし、注目すべきことに、HLA LOHを有さない21/54個の腫瘍と比較して、低い突然変異負荷量(NSCLC突然変異負荷量の最下四分位により定義した)を示した、HLA LOHを有する僅か3/36個の腫瘍が観察された。
【０３３６】
突然変異のクローン性を考慮する場合、HLA LOHを有する腫瘍のうち、クローン性ではなく、サブクローン性の非同義的突然変異(図10B〜C)(NSCLC p=0.008、肺腺癌  p=0.01、肺扁平上皮細胞癌  p=0.6、ウィルコクソン検定)及びネオアンチゲン(図11B〜C)の数に、有意な増加があることを見いだした。この観察は、分枝のサブクローン性事象として頻繁に生じるHLA LOHと一致しており、HLA LOHが、潜在的に抗原性のサブクローン性突然変異の蓄積を可能にし得ることを示している(図10C)。このことに一致して、HLA LOHが腫瘍の系統樹の幹にクローン性事象として生じる場合、これは、クローン性(NSCLC p=0.002、肺腺癌  p=0.01、肺扁平上皮細胞癌  p=0.29、ウィルコクソン検定)及びサブクローン性(NSCLC p=0.03、肺腺癌  p=0.004、肺扁平上皮細胞癌  p=0.89、ウィルコクソン検定)の非同義的突然変異及びネオアンチゲン負荷量の両方の上昇に有意に関連していることが見いだされた(図10B、図11B)。
【０３３７】
領域レベルでHLA LOH事象を考慮すると、HLA LOHの証拠を有さない患者からの腫瘍領域と比較して、HLA消失を示す腫瘍領域間のサブクローン性突然変異に有意な増加も観察された(図11D、NSCLC p=1.9e-05、肺腺癌  p=0.009、肺扁平上皮細胞癌  p=0.07)。興味深いことに、腫瘍全体ではHLA LOHの証拠があるが、HLA LOHを有していない腫瘍領域では、HLA LOHの証拠がない腫瘍由来の腫瘍領域と比較して、有意に高いサブクローン性突然変異の負荷量が観察された(図11D)。従って、HLA LOHは、後に続くサブクローン性拡大を可能にし得る一方、高い突然変異負荷量を有する腫瘍は、HLA LOH事象に有利な増加した選択圧下に置かれている可能性がある。
【０３３８】
本発明者らは次に、HLA LOH事象が生じる特定のがんサブクローンを考慮することで、がん細胞における非同義的突然変異及びネオアンチゲン負荷量へのHLA LOHの影響を、より直接的に評価することを可能にした(図11E)。サブクローン性HLA LOHを有する腫瘍において、HLA消失を有するがんサブクローンと、同じ祖先がん細胞の子孫であるがHLA消失を有さない姉妹サブクローンとの突然変異負荷量を直接比較した。HLA LOHを有するサブクローンは、HLA LOHを有さない対応物と比較して、組織学的サブタイプにかかわらず、高い非同義的突然変異負荷量を一貫して示した(図10D、NSCLC p=4e-04、肺腺癌  p=0.018、肺扁平上皮細胞癌  p=0.008)。事実、HLA LOHを有さない姉妹サブクローンより少ない非同義的突然変異を有するHLA LOHを有するサブクローンは、僅か2例であった。この結果は、HLA LOHが、HLA LOHを有する腫瘍において観察されたサブクローン性非同義的突然変異の増加に直接的に寄与することを示唆している。
【０３３９】
HLA LOH事象を有する腫瘍で突然変異負荷量が低いのは僅か3例であり(図10A)、HLA LOHを有するサブクローンにおける突然変異負荷量の増加が両方のがんタイプに観察されたが、HLAアレルの消失を有する腫瘍領域における非同義的突然変異負荷量の有意な増加が、肺腺癌においてのみ観察されたことに注目した。このことは、HLA LOHがサブクローン性突然変異の取得を可能にし得るが、肺扁平上皮癌の追加的な機構が、HLA LOHを有さない腫瘍において観察された高いサブクローン性突然変異負荷量に寄与することを示唆している。
【０３４０】
特定の突然変異のプロセスがHLA LOHを有する腫瘍に存在するサブクローン性突然変異負荷量に寄与するか否かについて対処するため、各腫瘍に存在する突然変異シグネチャーを調べた(Alexandrov, 2013、Rosenthal, 2015)。いずれかのHLA LOHを示す肺腺癌腫瘍において、APOBEC突然変異誘発性シグネチャー(シグネチャー2及びシグネチャー13)に有意な増加が観察されたが(NSCLC p=0.03、肺腺癌  p=0.003、肺扁平上皮細胞癌  p=0.63)、このコホートに見いだされる他のシグネチャー(シグネチャー1A、4及び5)において、群間で異なって寄与すると思われるものはなかった(図12)。
【０３４１】
保持されたHLAアレルに結合するネオアンチゲンのみが、免疫系に提示される。従って、HLA LOHが、がん免疫編集を反映するなら、保持されたHLAアレルと比較して、消失HLAアレルに結合すると予測されるサブクローン性ネオアンチゲンの濃縮が観察されると予想されると推論した。従って、少なくとも1箇所の腫瘍領域における、6個の別々のHLAアレル及び1個のHLAハプロタイプ(3個のアレル)の消失を有する腫瘍を更に調査した(n=20、9個の肺腺癌及び11個の肺扁平上皮細胞癌)。免疫編集を示し、サブクローン性ネオアンチゲンの蓄積を促進するHLA遺伝子座のLOHと一致して、保持されたアレルと比較して、消失HLAアレルに結合すると予測されるサブクローン性ネオアンチゲンの有意な濃縮が観察された(図10E)(P=0.0083、対応のあるウィルコクソン検定)。このことは、分析を肺扁平上皮細胞癌に限定した場合には依然として有意であったが、肺腺癌では有意ではなかった(肺腺癌、P=0.29、肺扁平上皮細胞癌、P=0.02)。1個の腫瘍、肺腺癌のLTX083では、ネオアンチゲンを生じると予測される合計で1220個の突然変異が観察され、そのうちの92%が消失HLAアレルに結合すると予測された。
【０３４２】
どのネオアンチゲンが免疫系に提示されるかに対してHLA LOHが有し得る影響をより一般的に決定するため、いずれかのHLA LOHを示す37人の患者の完全コホートにおいて、消失アレルに結合すると予測されるネオアンチゲンを同定した(図10F)。全ての患者が、今は失われているHLAアレルに結合すると予測される突然変異を有することが見いだされ、臨床設定において、例えば、個別化ネオアンチゲンワクチン手法を介して、推定ネオアンチゲンの標的化に対してHLA LOHが有し得る潜在的な影響力を強調している(Ott, 2017、Sahin, 2017)。注目すべきは、この分析はHLAハプロタイプ特異的コピー数推定値なしでは可能ではないことである。
【０３４３】
HLA消失及び免疫表現型
次に、HLA消失が特定の腫瘍微小環境に関連するか否かを調査するため、免疫組織化学分析を実施して、腫瘍と免疫細胞の両方におけるPDL1の発現を決定した。PDL1は、免疫阻害性受容体PD1のリガンドであり、その発現は、活性免疫系に対するがんの適応免疫応答を反映し得る。
【０３４４】
クローン性HLA LOHを示す腫瘍は、HLA LOHを有さない腫瘍と比較して、有意に上昇した免疫細胞のPDL1染色によって特徴付けられ(P=0.029)、腫瘍細胞における上昇したPDL1染色の傾向が観察された(P=0.14)。これらのデータは、HLA LOHが活性免疫微小環境に応答して免疫回避を促進し得るという概念と一致している。
【０３４５】
最後に、本発明者らの知見をより大きいコホートでバリデートし、HLA LOHが免疫表現型と関連するか否かを探求するため、383個の肺腺癌及び309個の肺扁平上皮細胞癌の試料をTCGAから得た(Campbell, 2016)。
【０３４６】
TRACERxコホートによる結果と一致して、HLA LOHが肺扁平上皮細胞癌(133/309個)及び肺腺癌(118/383個)腫瘍において極めて普遍的であり、ここでも、肺扁平上皮細胞癌により一般的な事象であることが見いだされた(p=0.001、フィッシャーの正確検定)(図13A)。TCGAからの増大した標本サイズによって、HLA LOHを単一遺伝子座に有する試料(56個の肺扁平上皮細胞癌、56個の肺腺癌)又はHLA LOHを3個のHLA遺伝子座全てに有する試料(77個の肺扁平上皮細胞癌、62個の肺腺癌)を更に分析することもできた。TRACERx試料と一致して、HLA LOHが単一遺伝子座(p=0.002、ウィルコクソン検定)又は3個のHLA遺伝子座全て(p=0.003、ウィルコクソン検定)に影響を与えたかにかかわらず、有意に高い非同義的突然変異負荷量が、HLA LOHを示す肺腺癌腫瘍(p=0.0001、ウィルコクソン検定)に観察された(図13B)。注目すべきは、RNA配列が入手可能であったこのデータセットでは、HLA-LOHを有する及び有さない腫瘍におけるHLA-A、B又はCのRNA配列発現に有意な差は観察されなかったことであり、LOHHLAを使用するハプロタイプ特異性を考慮することなしには、RNAは信頼性をもってHLA LOHを同定するために使用できないことを示している。
【０３４７】
以前の研究は、免疫活性及び/又は免疫細胞浸潤を示す免疫シグネチャーを同定している(Rooney, 2015、Li, 2016、Davoli, 2017)。これらのシグネチャーを使用して、HLA消失が特定の免疫表現型に関連するか否かを調査することができた。3個全ての遺伝子座にHLA LOHを有する肺腺癌において、以前に公表された方法(Li)により推定すると、CD8+ T細胞の存在量の増加が観察された(p=0.04、ウィルコクソン検定)。加えて、HLA LOHを有する肺腺癌及び肺扁平上皮細胞癌の両方において、CD8+ T細胞の活性化によって上方制御される2個の遺伝子、グランザイムA(GZMA)及びパーフォリン(PRF1)のレベルを測定する細胞溶解性活性スコアの有意な上昇が同定された(Rooney)(図13C)。3個全ての遺伝子座にHLA LOHを有する肺腺癌において、CD8+ T細胞の存在量の増加及び改善されたチェックポイント遮断応答に関連する発現プロファイルが観察された(Li, 2016、Rooney, 2015、Tumeh, 2014、Herbst, 2014、Ribas, 2015、Piha-Paul, 2016)。加えて、NK細胞の増加が同定され、HLA LOH単独で阻害性NK細胞/MHC相互作用を遮断し得ることを示唆している(図13C)。LOHを有する及び有さない腫瘍における差次的発現分析は、HLA LOHを有する肺腺癌におけるPD-L1及びエフェクター分子、例えば、グランザイム-A、B及びH、並びにSTAT1及びIFNγの増加を確認したが、肺扁平上皮細胞癌では確認されなかった。これらのデータは、HLA消失を有する肺腺癌腫瘍が、より活性な免疫微小環境を有すること、及び抗原提示の破綻が、免疫系を逃れる機構として作用し得ることを示唆している。
【０３４８】
【表１】
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【０３４９】
考察
増殖性腫瘍ネオアンチゲンを提示する能力の消失は、免疫捕食からの回避をもたらし得る。ネオアンチゲン提示の不可欠な部分は、HLAクラスI分子であり、これはT細胞に対して、細胞表面上にエピトープを提示する。従って、HLAアレルの消失は、HLAホモ接合性をもたらし、免疫回避の機構となり得る(図14)。
【０３５０】
しかし、HLA遺伝子座の多形性は、従来のコピー数ツールを使用した正確なコピー数コーリングを排除する。ここで、本発明者らは、次世代配列決定データを使用した、肺がん進化におけるHLA消失の普遍性及び重要性を系統的に評価するツールであるLOHHLAを提示する(図1)。
【０３５１】
本発明者らは、2つの独立した方法を使用して、LOHHLAの実施を評価した。本発明者らは、LOHHLA LOH及びアレル不均衡の推定値が、最新のコピー数ツールであるASCAT(Van Loo, 2010)を使用して隣接ゲノムセグメントから推測されたものと一貫して一致したことを見いだした。DNAの多形ストレッチのフラグメント分析は、LOHHLAの精度をバリデートした。重要なことに、LOHHLAは、どの特異的HLAハプロタイプがコピー数消失を受けるかを決定することもでき、これは従来のコピー数ツールの使用では可能ではないことである。
【０３５２】
LOHHLAを使用して、本発明者らは、HLA消失が初期段階NSCLCの40%に生じることを見いだしている。シミュレーションを使用して予測されたものを超えた限局性及び高頻度は、HLA LOH及び免疫編集がNSCLC進化において強く選択されることを示唆している。腫瘍の系統樹の枝のがん細胞のサブセットに生じるHLA消失のサブクローン性頻度は、それが多くの場合に腫瘍進化の後期事象であること、及び局所領域特異的免疫微小環境が、分枝した腫瘍進化を形作る主要な選択力として作用し得ることを示唆している。このことに一致して、4個の腫瘍において、HLA消失の平行進化の証拠が観察され、免疫捕食からの回避が、腫瘍進化に有意な制約を課すことを示唆している。これらの結果は、ホモ接合性HLAアレルを有する患者は、ヘテロ接合性HLAアレルを有する患者と比較して急速なAIDSへの進行を示す(Martin及びCarrington, 2013)という、HIVにおける観察と似ている。
【０３５３】
肺腺癌と肺扁平上皮細胞癌の両方において、HLA LOHを有するサブクローンは、同じ祖先がん細胞の子孫であるが、HLA LOHを有さないサブクローンと比較して、有意に上昇したサブクローン性非同義的突然変異/ネオアンチゲン負荷量と関連していた。更に、HLA LOHは、免疫活性化のRNAシグネチャーと関連し、HLA LOHを有する腫瘍は、消失HLAアレルと結合すると予測されるネオアンチゲンの濃縮を示すことが見いだされた。これらのデータは、HLAアレルの消失が、免疫捕食の選択圧下において、サブクローン性拡大に許容的であり得ること、及び以前の抗原突然変異を免疫系に対して有効に不可視にし得ることを示唆している。
【０３５４】
HLA LOHを有さない腫瘍であっても、肺扁平上皮細胞腫瘍における高い突然変異負荷量及び低いレベルのHLA発現(McGranahan, 2016)は、免疫回避の代替的な機構、例えば、免疫抑制分子(例えば、PD-1、LAG3)の上方制御 (Spranger 2013)及び/又は他の機構(例えば、B2M若しくはNLRC5への突然変異)(del Campo 2014、Yoshihama, 2016)を介したネオアンチゲン提示の破綻が、このがんのサブセットに生じ得ることを示唆している。この点において、LOHHLAを拡張して、ハプロタイプ判定を受けた任意のゲノムセグメントに対してハプロタイプ特異的コピー数を実施することができる。例えば、HLAクラスII型判定が実施されている場合、LOHHLAを利用して、腫瘍進化におけるHLAクラスIIの消失の発生程度を評価し、かつどのハプロタイプが消失するかを評価することができる。
【０３５５】
結論として、LOHHLAは、ハプロタイプ特異的HLA消失の正確な評価を可能にし、HLA LOHが免疫回避及びサブクローン性遺伝子進化を促進するNSCLCの一般的な特徴であることを明白にする。
【０３５６】
[実施例2]
LOHHLAアルゴリズムを実行して、HLAクラスII LOHを探求することもできる。
【０３５７】
図16に示されるように、提供されているHLAクラスII型判定が実施されており、LOHHLAは、アレル特異的コピー数の評価を可能にする。この場合、HLA-DRB1遺伝子座のHLA型判定は、xHLA [Xie, PMDI: 28674023]を使用して実施し、患者が2個の別々のアレル、DRB1:10:01:01:01及びDRB1:01:01:01を持つことを明らかにした。
【０３５８】
LOHHLAを(実施例1に概説されたように)使用した、正常及び腫瘍配列の読み取りデータと、患者特異的HLAアレルとのアラインメントは、HLAアレルの不均衡を実証している(図16A〜C)。純度及び倍数推定値の組み込みは、HLA-DRB1:01:01:01の消失と、HLA-DRB1:10:01:01:01の1個のコピーが残っていることを明らかにした。
【０３５９】
参考文献:
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【０３６０】
上記の明細書に記述された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。記載された本発明の方法及びシステムの様々な改変及び変形は、本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、当業者に明白である。本発明は、特定の好ましい実施態様と関連して記載されてきたが、特許請求される発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。事実、本発明を実施するために記載された様式の様々な改変は、生化学及び生物工学又は関連分野の当業者に明白であり、以下の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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