(57)【要約】酵素欠損症を治療するための組成物および方法が開示されている。内部移行エフェクター結合ドメインとリソソーム補充酵素活性とを含むマルチドメイン治療用タンパク質が開示されている。マルチドメイン治療用タンパク質は、細胞に進入し、リソソームに隔離され、リソソームに補充酵素活性を送達することができる。マルチドメイン治療用タンパク質は、マルチドメイン治療用タンパク質のコード配列を含む遺伝子療法ベクター、例えばウイルスベクター、裸のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド複合体などを介して、細胞に送達することができ、それはex  vivoでもin  vivoでもあり得る。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
送達ドメインと酵素ドメインと医薬的に許容可能な担体とを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、医薬での使用のための組成物。
【請求項２】
前記送達ドメインが抗原結合タンパク質である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
前記送達ドメインが単鎖可変断片（scFv）である、請求項1または請求項2に記載の組成物。
【請求項４】
前記送達ドメインが内部移行エフェクターに結合する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項５】
前記送達ドメインが、CD63、インテグリンアルファ-7（ITGA7）、MHC-1、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、トランスフェリン受容体、LDL受容体、LDL関連タンパク質1受容体、ASGR1、ASGR2、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質2（APLP2）、アペリン受容体（APLNR）、MAL（Myelin  And  Lymphocyteタンパク質（MAL））、IGF2R、液胞型H+ATPアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3、およびCD36からなる群から選択される内部移行エフェクターに結合する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項６】
前記送達ドメインが内部移行エフェクターCD63に結合する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項７】
前記送達ドメインが、配列番号2のアミノ酸配列、または表11に記載されるHCVRのアミノ酸配列、表11に記載されるLCVRのアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR1のアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR2のアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR3のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR1のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR2のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR3のアミノ酸配列、配列番号  14/22、配列番号  30/38、配列番号46/54、もしくは配列番号62/70に記載されるHCVR/LCVR  アミノ酸ペア、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、任意選択的に、前記HCVR/LCVRアミノ酸ペアが、N末端からC末端まで、HCVR、任意選択的なリンカー、およびLCVRを含み、ならびに／または任意選択的に、酵素ドメインが、LCVRのC末端に（例えばリンカーを介して）付加している、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項８】
前記酵素ドメインがヒドロラーゼを含む、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項９】
前記酵素ドメインがグリコシラーゼを含む、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記酵素ドメインがグリコシダーゼを含む、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記酵素ドメインがアルファ-グルコシダーゼを含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１２】
前記酵素ドメインが、配列番号1、配列番号13、配列番号78のアミノ酸配列またはその断片を含む、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ポリヌクレオチドが、ウイルス核酸配列をさらに含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドが、ウイルス核酸配列をさらに含み、前記ウイルス核酸配列が、アデノ関連ウイルス（AAV）核酸配列である、請求項1〜13のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが、ウイルス核酸配列および任意選択的に遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、前記ウイルス核酸配列が、アデノ関連ウイルス（AAV）核酸配列であり、前記AAV  核酸配列が、内部末端反復配列を含み、任意選択的に、肝特異的プロモーターなどの組織特異的調節因子を含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ポリヌクレオチドが、ウイルス核酸配列および任意選択的に遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、前記ウイルス核酸配列が、配列番号6、配列番号7、または両方と、任意選択的に、肝特異的プロモーターなどの組織特異的調節因子とを含む内部末端反復配列を含むアデノ関連ウイルス（AAV）核酸配列である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号8、配列番号9、またはその両方として記載される配列を含む組織特異的調節因子をさらに含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１８】
配列番号11の核酸配列を含み、および／または配列番号10または配列番号78として記載されるアミノ酸配列をコードする、請求項1〜17のいずれか1項に記載の組成物。
【請求項１９】
請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクター。
【請求項２０】
請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含むウイルスベクターであって、任意選択的に天然ウイルス、工学的に操作されたウイルス、またはキメラウイルスである、ウイルスベクター、
請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む裸のポリヌクレオチド、
任意選択的に請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドおよび脂質を含む脂質ナノ粒子である、ポリヌクレオチド複合体、ならびに  
それらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される、請求項19に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項２１】
前記遺伝子療法ベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、またはアデノ関連ウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである、請求項19または請求項20に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項２２】
前記遺伝子療法ベクターが、AAV2/8キメラおよび／または特定の組織、例えば肝臓に対してAAVシュードタイプである、請求項19〜21のいずれか1項に記載の遺伝子療法ベクター。
【請求項２３】
送達ドメインおよび酵素ドメインを含む組み換えマルチドメイン治療用タンパク質であって、請求項1〜18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項２４】
前記送達ドメインが抗原結合タンパク質である、請求項23に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項２５】
前記送達ドメインが単鎖可変断片（scFv）である、請求項23または請求項24に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項２６】
前記送達ドメインが内部移行エフェクターに結合する、請求項23〜25のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項２７】
前記送達ドメインが、CD63、インテグリンアルファ-7（ITGA7）、MHC-1、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、トランスフェリン受容体、LDL受容体、LDL関連タンパク質1受容体、ASGR1、ASGR2、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質2（APLP2）、アペリン受容体（APLNR）、MAL（Myelin  And  Lymphocyteタンパク質（MAL））、IGF2R、液胞型H+ATPアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3、およびCD36からなる群から選択される内部移行エフェクターに結合する、請求項23〜26のいずれか1項に記載の組換えマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項２８】
前記送達ドメインが前記内部移行エフェクターCD63に結合する、請求項23〜27のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項２９】
前記送達ドメインが、配列番号2のアミノ酸配列、または表11に記載されるHCVRのアミノ酸配列、表11に記載されるLCVRのアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR1のアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR2のアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR3のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR1のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR2のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR3のアミノ酸配列、配列番号  14/22、配列番号  30/38、配列番号46/54、もしくは配列番号62/70に記載されるHCVR/LCVR  アミノ酸ペア、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、任意選択的に、前記HCVR/LCVRアミノ酸ペアが、N末端からC末端まで、HCVR、任意選択的なリンカー、およびLCVRを含み、ならびに／または任意選択的に、酵素ドメインが、LCVRのC末端に（例えばリンカーを介して）付加している、請求項23〜28のいずれか1項に記載の組換えマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項３０】
前記酵素ドメインがヒドロラーゼを含む、請求項23〜29のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項３１】
前記酵素ドメインがグリコシラーゼを含む、請求項23〜30のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項３２】
前記酵素ドメインがグリコシダーゼを含む、請求項23〜31のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項３３】
前記酵素ドメインがアルファ-グルコシダーゼ（GAA）またはその一部分を含む、請求項23〜32のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項３４】
前記酵素ドメインが、配列番号1、配列番号13、配列番号78のアミノ酸配列またはその断片を含み、任意選択的に、前記マルチドメイン治療用タンパク質が、配列番号79として記載されるアミノ酸配列を含む、請求項23〜33のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
【請求項３５】
送達ドメインおよび酵素ドメインを含む組み換えマルチドメイン治療用タンパク質をin  vivo細胞で発現する方法であって、
a.  前記組換えマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子療法ベクターに前記細胞を接触させること、
ｂ.  前記ポリヌクレオチドを前記細胞のゲノム遺伝子座に組み込ませること、および
ｃ.  前記細胞に前記組み換えマルチドメイン治療用タンパク質を産生させること、を含み、
前記遺伝子療法ベクターが、請求項19〜22のいずれか1項による、方法。
【請求項３６】
前記遺伝子療法ベクターが、アデノ関連ウイルス（AAV）ベクターである、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞のゲノム遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、請求項35または請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
ゲノム遺伝子座が、EESYR  遺伝子座、SARS遺伝子座、ヒト第1番染色体の188,083,272  位もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、ヒト第10番染色体の3,046,320位もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、ヒト第17番染色体の67,  328,980もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、染色体上のアデノ関連ウイルス部位1  (AAVS1)  、ヒト第19番染色体上のAAV  ウイルスの天然発生の組込みの部位もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、ケモカイン受容体5  (CCR5)遺伝子、HIV-1共受容体をコードするケモカイン受容体遺伝子、またはマウスRosa26遺伝子座もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、およびヒトアルブミン  (alb)遺伝子座からなる群から選択される、遺伝子座にあるかまたは近い、請求項35〜37のいずれか1項に記載の方法。
【請求項３９】
前記送達ドメインが抗原結合タンパク質である、請求項35〜38のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４０】
前記送達ドメインが単鎖可変断片（scFv）である、請求項35〜39のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４１】
前記送達ドメインが前記内部移行エフェクターに結合する、請求項35〜40のうちいずれか1項に記載の方法。
【請求項４２】
前記送達ドメインが、CD63、インテグリンアルファ-7（ITGA7）、MHC-1、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、トランスフェリン受容体、LDL受容体、LDL関連タンパク質1受容体、ASGR1、ASGR2、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質2（APLP2）、アペリン受容体（APLNR）、MAL（Myelin  And  Lymphocyteタンパク質（MAL））、IGF2R、液胞型H+ATPアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3、およびCD36からなる群から選択される内部移行エフェクターに結合する、請求項35〜41のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４３】
前記送達ドメインが内部移行エフェクターCD63に結合する、請求項35〜42のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４４】
前記送達ドメインが、配列番号2のアミノ酸配列、または表11に記載されるHCVRのアミノ酸配列、表11に記載されるLCVRのアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR1のアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR2のアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR3のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR1のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR2のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR3のアミノ酸配列、配列番号  14/22、配列番号  30/38、配列番号46/54、もしくは配列番号62/70に記載されるHCVR/LCVR  アミノ酸ペア、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、任意選択的に、前記HCVR/LCVRアミノ酸ペアが、N末端からC末端まで、HCVR、任意選択的なリンカー、およびLCVRを含み、ならびに／または任意選択的に、酵素ドメインが、LCVRのC末端に（例えばリンカーを介して）付加している、請求項35〜43のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４５】
前記酵素ドメインがヒドロラーゼを含む、請求項35〜44のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４６】
前記酵素ドメインがグリコシラーゼを含む、請求項35〜45のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４７】
前記酵素ドメインがグリコシダーゼを含む、請求項35〜46のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４８】
前記酵素ドメインがアルファ-グルコシダーゼを含む、請求項35〜47のいずれか1項に記載の方法。
【請求項４９】
前記酵素ドメインが、配列番号1、配列番号13、配列番号78のアミノ酸配列またはその任意の断片を含む、請求項35〜48のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリヌクレオチドが、配列番号11の核酸配列を含む、請求項35〜49のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞がex  vivoである、請求項35〜50のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞がヒト細胞である、請求項35〜51のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞がマウス細胞である、請求項35〜51のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が肝臓細胞である、請求項35〜53のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５５】
請求項1〜18のいずれか1項に記載の組成物または請求項19〜21のいずれか1項に記載の遺伝子療法ベクターを患者に投与することを含む、それを必要とする患者の組織中のグリコーゲン蓄積を減少させる方法。
【請求項５６】
前記組織が、心臓、肝臓、および骨格筋からなる群から選択される、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
前記マルチドメイン治療用タンパク質が、抗CD63  scFv-GAAを含み、任意選択的に、前記抗CD63scFvが、配列番号  14/22、配列番号  30/38、配列番号46/54、もしくは配列番号62/70に記載されるHCVR/LCVR  アミノ酸ペアを含み、任意選択的に、前記HCVR/LCVRアミノ酸ペアが、N末端からC末端まで、HCVR、任意選択的なリンカー、およびLCVRを含み、任意選択的に、酵素ドメインが、LCVRのC末端に、例えばリンカーを介して付加しており、任意選択的に、前記GAAが、配列番号1または配列番号78のアミノ酸配列を含み、および／または任意選択的に、抗CD63scFv-GAAが、配列番号10もしくは配列番号79として記載される配列を含む、請求項55または請求項56に記載の方法。
【請求項５８】
高いGAAの血清レベルが少なくとも12週間維持される、請求項55〜57のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５９】
12週間でのGAAの血清レベルが、抗CD63  scFv送達ドメインを含まずGAAをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターを投与された対象中のGAAの血清レベルよりも約2.5〜3倍高い、請求項55〜58のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６０】
心臓、骨格筋、および肝臓の組織のグリコーゲンレベルが、野生型レベルまで低減される、請求項55〜59のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６１】
前記組織中のグリコーゲンレベルが、前記遺伝子療法ベクターの投与の3か月後に野生型レベルで維持される、請求項55〜60のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６２】
請求項19〜22のいずれか1項に記載の遺伝子療法ベクターを患者に投与することを含む、それを必要とする患者で酵素欠損症を治療するおよび／または欠損した前記酵素に対して患者を寛容にする方法であって、前記遺伝子療法ベクターが、酵素ドメインおよび送達ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードする、方法。
【請求項６３】
前記酵素欠損症がグリコシダーゼ酵素の欠損である、請求項62に記載の方法。
【請求項６４】
前記酵素欠損症がアルファ-グルコシダーゼの欠損である、請求項62または請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
前記マルチドメイン治療用タンパク質が、抗CD63  scFv-GAAであり、任意選択的に、前記抗CD63  scFv-GAAが、配列番号10または配列番号79として記載されるアミノ酸配列を含む、請求項62〜64のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６６】
高いGAAの血清レベルが、前記遺伝子療法ベクターの投与後少なくとも12週間、患者で維持される、請求項62〜65のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６７】
前記遺伝子療法ベクターの投与の12週間後のGAAの血清レベルが、抗CD63  scFv送達ドメインを含まずGAAをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターを投与された対象中のGAAの血清レベルよりも約2.5〜3倍高い、請求項62〜66のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６８】
前記患者の心臓、骨格筋、および肝臓の組織における前記グリコーゲンレベルが、野生型レベルまで低減される、請求項62〜67のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６９】
前記患者の心臓、骨格筋、および肝臓の組織におけるグリコーゲンレベルが、前記遺伝子療法ベクターの投与の3ヵ月後に野生型レベルで維持される、請求項62〜68のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７０】
治療後の前記患者の筋強度が、野生型レベルまで復元される、請求項62〜69のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７１】
前記患者がポンペ病である、請求項62〜70のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７２】
前記患者は、前記送達ドメインの非存在下で前記酵素ドメインを受けた対照患者と比較して、前記酵素に対する抗体が減少し低減されている、請求項62〜71のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７３】
一つまたは複数の免疫抑制剤を用いて前記患者を免疫抑制することをさらに含む、請求項62〜71のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７４】
前記欠損している酵素を前記患者に投与することを最後のステップとしてさらに含む、請求項62〜73のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７５】
前記患者が、マルチドメイン治療用タンパク質を介して、欠損している酵素を投与され、任意選択的に、前記マルチドメイン治療剤が、抗CD63抗体またはその抗原結合部分を含む、請求項74に記載の方法。
【請求項７６】
前記患者が、治療有効量のポリヌクレオチドを投与され、その治療有効量のポリヌクレオチドは、GAA、その一部、またはGAAを含むマルチドメイン治療用ポリペプチドもしくはその一部を、前記患者へさらに投与することを不要とする、請求項35〜75のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７７】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、表11に記載されるようなHCVR/LCVRアミノ酸配列ペアを含む参照抗体と、ヒトCD63との結合について競合する、単離された抗CD63抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７８】
前記参照抗体が、配列番号  14/22、配列番号  30／38、配列番号46／54、または配列番号  62／70からなる群から選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列ペアを含む、請求項77に記載の抗CD63抗体または抗原結合断片。
【請求項７９】
前記抗体またはその抗原結合性断片が、表11に記載されるようなHCVR/LCVRアミノ酸配列ペアを含む参照抗体としてヒトCD63上の同じエピトープに結合する、請求項77または請求項78に記載の抗CD63抗体または抗原結合断片。
【請求項８０】
請求項19〜22のいずれか1項に記載の遺伝子療法ベクターおよび医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2018年5月17日出願の米国仮特許出願第62/673,098号、2017年10月19日出願の第62/574,719号、および2017年6月7日出願の第62/516,656号の35  U.S.C.  §  119(e)下の利益を主張するものであり、それぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、全体として、リソソーム蓄積症を治療するための組成物および方法を対象とする。本出願は、特に、補充酵素を含有する標的タンパク質複合体と、リソソーム蓄積症の治療におけるそれらの使用とを対象とする。
【背景技術】
【０００３】
リソソーム蓄積症は、リソソームにおける種々の基質の分解に影響を及ぼす希少疾患の一種である。それらの基質には、スフィンゴ脂質類、ムコ多糖類、糖タンパク質類、グリコーゲン、およびオリゴ糖類が含まれ、これらが疾患を有する者の細胞に蓄積して細胞死をもたらし得る。リソソーム蓄積症によって冒される器官として、中枢神経系（CNS）、末梢神経系（PNS）、肺、肝臓、骨、骨格筋および心筋、ならびに細網内皮系が挙げられる。
【０００４】
リソソーム蓄積症の治療に対する選択肢として、酵素補充療法（ERT）、基質減少療法、薬理学的シャペロン介在療法、造血幹細胞移植療法、および遺伝子療法が挙げられる。基質減少療法の例として、ゴーシェ病1型を治療するためのミグルスタットまたはエリグルスタットの使用が挙げられる。これらの薬剤は、シンターゼ活性を遮断することによって作用し、その結果、基質の産生を低減する。造血幹細胞療法（HSCT）は、例えば、MPSの一部の型の患者において、陰性の中枢神経系の表現型を寛解および遅延させるのに用いられる。R.M.  Boustany,  “Lysosomal  storage  diseases--the  horizon  expands,”  9(10)  Nat.  Rev.  Neurol.  583-98,  Oct.  2013を参照されたい。表1には、一部のリソソーム蓄積症と、その関連酵素または他のタンパク質の一覧表を示す。
表1：リソソーム蓄積症
【表１】
2020523321.tif 000003
【０００５】
最もよく見られるLSDのうち2種は、ポンペ病とファブリー病である。10,000人に1人の推定発生率を有するポンペ病は、欠陥のあるリソソーム酵素アルファ-グルコシダーゼ（GAA）によって引き起こされ、その結果、リソソーム内のグリコーゲンのプロセシングが欠損する。リソソーム内のグリコーゲンの蓄積は、主に骨格組織、心臓組織、および肝組織に生じる。乳児期のポンペ病の発症は、通例2歳になる前に、心肥大、筋緊張低下、肝腫大を引き起こし、また心肺不全による死亡をもたらす。成人期のポンペ病の発症は、10代から50代になっても起こり、通例、骨格筋にのみ関係する。現在利用可能な治療としては、GenzymeのMYOZYME（登録商標）/LUMIZYME（登録商標）（アルグルコシダーゼアルファ）が挙げられるが、これはCHO細胞で生産されて静脈内注入によって投与される組換えヒトアルファ-グルコシダーゼである。
【０００６】
軽度の遅発型の発症例を含めて全体で3,000人に1人の推定発生率を有するファブリー病は、欠陥のあるリソソーム酵素アルファ-ガラクトシダーゼA（GLA）により引き起こされ、その結果、血管、ならびに他の組織および器官内にグロボトリアオシルセラミドが蓄積する。ファブリー病に付随する症状として、神経損傷および／または小血管閉塞による疼痛、腎機能不全および腎不全、高血圧および心筋症などの心合併症、被角血管腫の形成などの皮膚症状、無汗症または多汗症、ならびに渦巻き状角膜、放射状白内障、ならびに結膜異常および網膜血管異常などの眼の疾患が挙げられる。現在利用可能な治療としては、CHO細胞で生産されて静脈内注入によって投与される組換えヒトアルファ-ガラクトシダーゼAであるGenzymeのFABRAZYME（登録商標）（アガルシダーゼベータ）；ヒト線維芽細胞で生産されて静脈内注入によって投与される組換えヒトアルファ-ガラクトシダーゼAであるShireのREPLAGAL（登録商標）（アガルシダーゼアルファ）；および異常なアルファ-ガラクトシダーゼAを機能的な立体構造へフォールディングをシフトさせる経口投与用低分子ペャロンであるAmicusのGALAFOLD（商標）（ミガラスタット、1-デオキシガラクトノジリマイシン）が挙げられる。
【０００７】
リソソーム蓄積症に対して現在行われている治療は、至適なものではない。例えば、ERTを一般的には高頻度および高用量で、例えば、隔週に最大40mg/kgまで投与しなければならない。さらに、一部の補充酵素は免疫学的に交差反応性（CRIM）があり、対象におけるIgGの産生を刺激するため、マンノース-6-リン酸（M6P）受容体を介したリソソームへの酵素の送達を妨げることがある。IgGは、補充酵素のM6P残基を遮蔽する可能性があり、抗原-IgG-抗体複合体は、Fc受容体を介して細胞のリソソームに取り込まれ得るが、それによって、補充酵素が優先的にマクロファージの方へ送られる。
【０００８】
適切な罹患組織への補充酵素の送達は非効率でもある（表2、およびDesnick  &  Schuchman,  “Enzyme  replacement  therapy  for  lysosomal  diseases:  lessons  from  20  years  of  experience  and  remaining  challenges,”  13  Annu.  Rev.  Genomics  Hum.  Genet.  307-35,  2012を参照）。例えば、乳児型ポンペに対し長期の酵素補充療法を受けている患者は、開鼻音、持続性筋力低下、下垂、骨減少症、難聴、誤嚥リスク、嚥下障害、心不整脈、および嚥下障害をさらに患う場合がある。補充酵素の用量は多くの場合、毎週または隔週、経時的に40  mg/kgまで増加させなければならない。
表2：ERTの非効率な組織標的指向性
【表２】
2020523321.tif 000004
【０００９】
内因性マンノース-6リン酸受容体（MPR）は、大部分の組換え酵素のリソソームへの輸送を媒介する。MPRには、カチオン非依存性（CI-MPR）およびカチオン依存性（CD-MPR）の二つの相補的な形態がある。いずれの形態のノックアウトも、リソソーム酵素の輸送異常を来す。リソソームヒドロラーゼは小胞体で合成され、シスゴルジネットワークに移動し、そこでマンノース-6-リン酸（M6P）基の付加によって共有結合修飾される。このマーカーの構成は、以下の二つのリソソーム酵素の逐次作用に依存する：UDP-N-アセチルグルコサミン-1-ホスホトランスフェラーゼ（G1cNac-ホスホトランスフェラーゼ)、およびN-アセチルグルコサミン-1-ホスホジエステル-α-N-アセチル-グルコサミニダーゼ（脱被覆酵素（uncovering  enzyme））。GlcNac-ホスホトランスフェラーゼは、G1cNAc-1-リン酸残基を、UDP-G1cNAcから、ヒドロラーゼの高マンノース型オリゴ糖にある選択されたマンノースのC6位に転移させる触媒作用を及ぼす。次いで、脱被覆酵素は、末端のG1cNAcを除去し、M6P認識シグナルを露出する。トランスゴルジネットワークでは、このM6Pシグナルは、リソソームヒドロラーゼが、M6P受容体への選択的結合を介して他の全ての種のタンパク質から分離することを可能にする。産生したクラスリン被覆小胞は、トランスゴルジネットワークから出芽し、後期エンドソームと融合する。後期エンドソームの低pHで、ヒドロラーゼはM6P受容体から解離し、空の受容体はさらなる輸送を繰り返すためにゴルジ装置へ再循環される。
【００１０】
マンノース受容体を介して送達されるβ-グルコセレブロシダーゼを除いて、組換えリソソーム酵素は、M6P糖鎖修飾を含み、主にCI-MPR/IGF2Rを介してリソソームに送達される。しかし、糖鎖修飾／CI-MPR-媒介性の酵素補充送達は、臨床的に意義のある全ての組織に到達するわけではない（表2）。酵素補充療法の改良は、（i）β2-アゴニストのクレンブテロールを用いてCI-MPRの表面発現を増加させること（Koeberl  et  al.,  “Enhanced  efficacy  of  enzyme  replacement  therapy  in  Pompe  disease  through  mannose-6-phosphate  receptor  expression  in  skeletal  muscle,”  103(2)  Mol.  Genet.  Metab.  107-12,  2011）、（ii）酵素上のM6P残基の量を増加させること（Zhu  et  al.,  “Conjugation  of  mannose-6-phosphate-containing  oligosaccharides  to  acid  alpha-glucosidase  improves  the  clearance  of  glycogen  in  Pompe  mice,”  279(48)  J.  Biol.  Chem.  50336-41,  2004）、または（iii）IGF-IIドメインを酵素に融合させること（Maga  et  al.,  “Glycosylation-independent  lysosomal  targeting  of  acid  alpha-glucosidase  enhances  muscle  glycogen  clearance  in  Pompe  mice,”  288(3)  J.  Biol.  Chem.  1428-38,  2013）によって、CI-MPR送達を改善することを中心に据えている。
数多くのリソソーム蓄積症が酵素補充療法または遺伝子療法により不十分に治療されているが、これは、主として、関連する組織または器官への補充酵素の標的指向性が乏しいこと、レシピエント宿主の負の免疫学的反応があること、および血清半減期が短いことに起因する。酵素のさらに良好な組織生体内分布とリソソーム取り込みとを強化し促進する改良型酵素補充療法に対するニーズがある。出願人らは、CI-MPRとは独立して起こる、標的罹患組織のリソソームへの酵素の抗体誘導型送達を用いた、改良型酵素補充療法を開発してきた。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】R.M.  Boustany,  “Lysosomal  storage  diseases--the  horizon  expands,”  9(10)  Nat.  Rev.  Neurol.  583-98,  Oct.  2013
【非特許文献２】Desnick  &  Schuchman,  “Enzyme  replacement  therapy  for  lysosomal  diseases:  lessons  from  20  years  of  experience  and  remaining  challenges,”  13  Annu.  Rev.  Genomics  Hum.  Genet.  307-35,  2012
【非特許文献３】Koeberl  et  al.,  “Enhanced  efficacy  of  enzyme  replacement  therapy  in  Pompe  disease  through  mannose-6-phosphate  receptor  expression  in  skeletal  muscle,”  103(2)  Mol.  Genet.  Metab.  107-12,  2011
【非特許文献４】Zhu  et  al.,  “Conjugation  of  mannose-6-phosphate-containing  oligosaccharides  to  acid  alpha-glucosidase  improves  the  clearance  of  glycogen  in  Pompe  mice,”  279(48)  J.  Biol.  Chem.  50336-41,  2004
【非特許文献５】Maga  et  al.,  “Glycosylation-independent  lysosomal  targeting  of  acid  alpha-glucosidase  enhances  muscle  glycogen  clearance  in  Pompe  mice,”  288(3)  J.  Biol.  Chem.  1428-38,  2013
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
出願人は、補充酵素が、マルチドメイン治療用タンパク質の一部として送達ドメインと係合された際に、標的細胞内に効果的に送達できることを発見している。マルチドメイン治療用タンパク質は、マルチドメイン治療用タンパク質のコード配列を含む遺伝子療法ベクター、例えばウイルスベクター、裸のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド複合体などを介して、細胞に送達することができ、それはex  vivoでもin  vivoでもあり得る。
【００１３】
一態様では、本発明は、マルチドメイン治療用タンパク質をコードする核酸配列を含有するポリヌクレオチドを提供する。一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、酵素ドメインおよび送達ドメインを含有する。一実施形態では、ポリヌクレオチドはまた、ウイルスベクター核酸配列を含有する。特定の一実施形態では、ポリヌクレオチドはまた、アデノ関連ウイルス（AAV）核酸配列を含有する。
【００１４】
一実施形態では、酵素ドメインは、グリコシラーゼ、例えばアルファ-グルコシダーゼ（GAA）またはアルファ-ガラコシダーゼA（GLA）などのグリコシダーゼなどのヒドロラーゼ活性を有する。一部の実施形態では、酵素ドメインは、配列番号1として記載されるアミノ酸配列またはその生物学的活性部分を含む。一部の実施形態では、酵素ドメインは、配列番号78として記載されるアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、酵素ドメインは、配列番号78として記載されるアミノ酸配列から本質的になる。一部の実施形態では、酵素ドメインは、配列番号78として記載されるアミノ酸配列からなる。一実施形態では、送達ドメインは、内部移行エフェクターに結合する抗原結合タンパク質である。一実施形態では、内部移行エフェクターは、エンドサイトーシスされてリソソームに輸送される細胞表面分子である。特定の一実施形態では、内部移行エフェクターはCD63分子である。一実施形態では、内部移行エフェクターはITGA7分子である。特定の実施形態では、送達ドメインは、抗体、抗体断片、または単鎖可変断片（scFv）、例えばCD63またはITGA7に結合するscFvなどである（例えば、  図1A、パネルG）。
【００１５】
一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、二つの送達ドメインを含有する（例えば、  図1A、パネルH）。一実施形態では、第一の送達ドメインは、適正な標的細胞または標的細胞内区画への酵素の送達を促進するために内部移行エフェクターに結合し、また第二の送達ドメインは、肺胞膜、肝臓内皮、血液脳関門などの生理学的障壁を横断するマルチドメイン治療用タンパク質の輸送を促進するためにトランスサイトーシスエフェクターに結合する。特定の一実施形態では、第二の送達ドメインは、抗トランスフェリン受容体（TfR）scFvドメインである。特定の一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、GAA酵素ドメイン、抗CD63  scFvの第一の送達ドメイン、および抗TFr  scFvの第二の送達ドメインを含む。別の実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、GAA酵素ドメイン、抗ITGA7  scFvの第一の送達ドメイン、および抗CD63  scFvの第二の送達ドメインを含む。
【００１６】
一態様では、本発明は、酵素ドメインおよび送達ドメインを含有するマルチドメイン治療用タンパク質をコードする核酸配列を含む、AAV  ベクター、裸のポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド複合体などの遺伝子療法ベクターを提供する。
【００１７】
一実施形態では、酵素ドメインは、グリコシラーゼ、例えばアルファ−グルコシダーゼまたはアルファ−ガラコシダーゼＡなどのグリコシダーゼなどのヒドロラーゼ活性を有する。一実施形態では、送達ドメインは、内部移行エフェクターに結合する抗原結合タンパク質である。一実施形態では、内部移行エフェクターは、エンドサイトーシスされてリソソームに輸送される細胞表面分子である。特定の一実施形態では、内部移行エフェクターはCD63分子である。一実施形態では、内部移行エフェクターはITGA7分子である。特定の一実施形態では、送達ドメインは、抗体、抗体断片、またはscFv、例えばCD63またはITGA7に結合する単鎖可変断片（scFv）などである。
【００１８】
一態様では、本発明は、酵素ドメインおよび送達ドメインを含有するマルチドメイン治療用タンパク質を提供する。一実施形態では、酵素ドメインは、グリコシラーゼ、例えばアルファ−グルコシダーゼまたはアルファ−ガラコシダーゼＡなどのグリコシダーゼなどのヒドロラーゼ活性を有する。一実施形態では、送達ドメインは、内部移行エフェクターに結合する抗原結合タンパク質である。一実施形態では、内部移行エフェクターは、エンドサイトーシスされてリソソームに輸送される細胞表面分子である。特定の一実施形態では、内部移行エフェクターはCD63分子である。別の実施形態では、内部移行エフェクターはITGA7分子である。特定の一実施形態では、送達ドメインは、抗体、抗体断片、またはscFv、例えばCD63またはITGA7に結合する単鎖可変断片（scFv）などである。
【００１９】
一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、酵素補充療法を必要とする患者を治療するために使用される。
【００２０】
一態様では、本発明は、細胞内に酵素ドメインおよび送達ドメインを含有するマルチドメイン治療用タンパク質を産生する方法を提供する。一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、マルチドメイン治療用タンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子療法ベクターに細胞を接触させることによって産生される。続いて、核酸配列は細胞のゲノム遺伝子座内に組み込まれ、ここから、核酸配列がDNAである場合には核酸配列が転写および翻訳されるか、または核酸がRNAである場合には翻訳されて、マルチドメイン治療用タンパク質が産生される。一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなど、細胞トランスフェクションで一般的に使用されるものである。一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、裸のポリヌクレオチドである。一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ポリヌクレオチド複合体、例えば脂質ナノ粒子である。一実施形態では、ゲノム遺伝子座は、マルチドメイン治療用タンパク質の高発現を可能にする一方で、必須遺伝子の発現に干渉しないか、または癌遺伝子もしくはその他の有害遺伝子の発現を促進しない、セーフハーバー遺伝子座である。一実施形態では、ゲノム遺伝子座は、アデノ関連ウイルス部位である。
【００２１】
一実施形態では、細胞は、哺乳類細胞、例えばヒト細胞またはマウス細胞などである。一実施形態では、細胞は、ex  vivo、例えばHEK293細胞株などである。別の実施形態では、細胞は、in  vivoであり、マルチドメイン治療用タンパク質をコードする核酸配列を含有する遺伝子療法ベクターは、ヒトまたは非ヒト対象に投与される。
【００２２】
一実施形態では、酵素ドメインは、グリコシラーゼ、例えばアルファ-グルコシダーゼ（GAA）またはアルファ-ガラコシダーゼA（GLA）などのグリコシダーゼなどのヒドロラーゼ活性を有する。一実施形態では、送達ドメインは、内部移行エフェクターに結合する抗原結合タンパク質である。一実施形態では、内部移行エフェクターは、エンドサイトーシスされてリソソームに輸送される細胞表面分子である。特定の一実施形態では、内部移行エフェクターはCD63分子である。特定の一実施形態では、送達ドメインは、抗体、抗体断片、または単鎖可変断片（scFv）、例えばCD63に結合するscFvなど（例えば配列番号2）である。一部の実施形態では、マルチドメイン治療ポリペプチドは、GAA（配列番号1として記載される）またはその生物学的活性部分（配列番号78として記載される）に動作可能に連結されたCD63に結合するscFv（例えば、配列番号2として記載されるアミノ酸配列を含むscFv）を含む。一部の実施形態では、マルチドメイン治療ポリペプチドは、配列番号10または配列番号79として記載される配列を含む。
【００２３】
特定の一実施形態では、scFv-ヒドロラーゼ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するAAVベクターが、ヒトまたは非ヒト対象に投与される。続いて、ポリヌクレオチドはゲノム遺伝子座に組み込まれ、コードされた融合タンパク質が産生される。特定の一実施形態では、融合タンパク質とは、抗CD63scFv-GAA融合タンパク質（例えば、配列番号10または配列番号79に記載されるような）または抗ITGA7scFv-GAA融合タンパク質であり、ヒトまたは非ヒト対象が内因性GAA活性を欠乏しており、GAA活性が対象において効果的に復元される。
【００２４】
一態様では、本発明は、送達ドメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードする核酸配列を含有する遺伝子療法ベクターを患者に投与することによって、酵素欠損を有する患者（ヒトまたは非ヒト）を治療する方法を提供する。一実施形態では、酵素ドメインは、グリコシダーゼ、例えばＧＡＡ（例えば配列番号1）もしくはその生物学的活性部分（例えば配列番号78）またはGLA（例えばUniProtKB番号P06280、aa32〜429、配列番号13）を含み、患者は、ポンペ病またはファブリー病を有する。一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質の送達ドメインは、CD63またはITGA7などの内部移行エフェクターに結合する、抗原結合タンパク質である。一実施形態では、送達ドメインは、ＣＤ63に結合するscFv分子である。一実施形態では、送達ドメインは、ＩＴＧＡ7に結合するscFv分子である。別の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗CD63-GAA融合マルチドメイン治療用タンパク質（例えば配列番号10または配列番号79）をコードする核酸配列を含有するAAVベクターを含む。別の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗ITGA7-GAA融合マルチドメイン治療用タンパク質をコードする核酸配列を含むAAVベクターである。別の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗CD63-GAA融合マルチドメイン治療用タンパク質（例えば配列番号10または配列番号79）をコードする核酸配列を含む裸のポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗ITGA7-GAA融合マルチドメイン治療用タンパク質をコードする核酸配列を含む裸のポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗CD63-GAA融合マルチドメイン治療用タンパク質（例えば配列番号10または配列番号79）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド複合体を含む。別の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗ITGA7-GAA融合マルチドメイン治療用タンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド複合体を含む。
【００２５】
一態様では、本発明は、医薬品で使用するための本発明による組成物に関する。一実施形態では、本組成物、例えば医薬組成物は、送達ドメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子療法ベクターを含むことがある。一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質の送達ドメインは、CD63またはITGA7などの内部移行エフェクターに結合する、抗原結合タンパク質である。一実施形態では、送達ドメインは、ＣＤ63に結合するscFv分子である。一実施形態では、送達ドメインは、ＩＴＧＡ7に結合するscFv分子である。別の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗CD63-GAA融合マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するAAVベクターである。別の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗ITGA7-GAA融合マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するAAVベクターである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば遺伝子療法ベクターは、組織特異的調節因子を含む。一部の実施形態では、組織特異的調節因子は、配列番号8、配列番号9、またはその両方として記載される配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば遺伝子療法ベクターは、配列番号11の核酸配列を含む。
【００２６】
一態様では、記載されるのは、酵素欠損症に罹った患者（ヒトもしくは非ヒト）の治療で使用するための、および／またはヒトもしくは非ヒト対象の組織中のグリコーゲン蓄積の減少に使用するための、送達ドメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードする遺伝子を含有する遺伝子療法ベクターを含む組成物である。一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質の送達ドメインは、CD63またはITGA7などの内部移行エフェクターに結合する、抗原結合タンパク質である。一実施形態では、送達ドメインは、ＣＤ63に結合するscFv分子である。一実施形態では、送達ドメインは、ＩＴＧＡ7に結合するscFv分子である。別の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗CD63-GAA融合マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するAAVベクターである。別の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗ITGA7-GAA融合マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するAAVベクターである。酵素欠損症を含意する臨床的適応症は、以下に限定されないが、例えばポンペ病またはファブリー病であり得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば遺伝子療法ベクターは、組織特異的調節因子を含む。一部の実施形態では、組織特異的調節因子は、配列番号8、配列番号9、またはその両方として記載される配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えば遺伝子療法ベクターは、配列番号11の核酸配列を含む。
【００２７】
一態様では、記載されるのは、酵素欠損を有する患者（ヒトもしくは非ヒト）の治療などの治療用途のための、および／またはヒトもしくは非ヒト対象の組織におけるグリコーゲン蓄積を減少させるための、医薬の製造に用いる本発明による医薬組成物の使用である。組成物は、例えば、送達ドメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードする遺伝子を含有する遺伝子療法ベクターを含みうる。一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質の送達ドメインは、CD63またはITGA7などの内部移行エフェクターに結合する、抗原結合タンパク質である。一実施形態では、送達ドメインは、ＣＤ63に結合するscFv分子である。一実施形態では、送達ドメインは、ＩＴＧＡ7に結合するscFv分子である。別の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗CD63-GAA融合マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するAAVベクターである。別の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、抗ITGA7-GAA融合マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有するAAVベクターである。酵素欠損症を含意する臨床的適応症は、以下に限定されないが、例えばポンペ病またはファブリー病であり得る。
【００２８】
一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、GAA酵素ドメインを含み、高いGAAの血清レベルが、遺伝子療法ベクターの投与後少なくとも12週間、患者の血清中に維持される。一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、GAA酵素ドメインを含み、患者の心臓、骨格筋、および肝臓の組織におけるグリコーゲンレベルは、遺伝子療法ベクターの投与の3か月後に野生型レベルで維持される。一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、GAA酵素ドメインを含み、治療後の患者の筋力は、野生型レベルまで復元される。
【００２９】
一態様では、本発明は、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子療法ベクターを投与することによって、ヒトまたは非ヒト対象の組織内のグリコーゲンの蓄積を減少させる方法を提供する。一実施形態では、組織は肝臓、心臓、または骨格筋である。一実施形態では、ヒトまたは非ヒト対象は、ポンペ病を有する。一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、抗CD63  scFv-GAA融合タンパク質を含む。別の実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、抗ITGA7  scFv-GAA融合タンパク質を含む。
【００３０】
一態様では、本明細書に記載されるのは、酵素に欠損を有する患者（ヒトまたは非ヒト）において酵素に対する交差反応性免疫学的物質を低減する方法であって、前記方法は、補充酵素のみをコードするかまたは送達ドメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードする遺伝子を含有する、遺伝子療法ベクターを患者に投与することを含む。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、AAV  ベクターであり、それはキメラAAV  ベクター（例えば、AAV2/8）であってもよい。一部の実施形態では、酵素ドメインは、GAA（例えば、  配列番号1）またはGLA（例えば、  UniProtKB番号P06280、aa32〜429、配列番号13）などのグリコシダーゼを含み、患者は、ポンペ病またはファブリー病を有し、送達ドメインは、内部移行エフェクターに結合する抗原結合タンパク質である。一部の実施形態では、交差反応性免疫学的物質が低減するか、または交差反応性免疫学的物質が検出可能な量で生成されないように、遺伝子療法ベクターが、GAAの血清レベルを増加させるのに十分な量で投与される。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、GAAの血清レベルをある期間にわたって増加させるために十分な量で投与される。一部の実施形態では、患者に、遺伝子療法ベクターを含むウイルス（例えばAAV）を感染させるが、任意選択的に、ウイルスは、GALT、肝臓、造血幹細胞、赤血球、もしくはそれらの組み合わせからなる群から選択される組織もしくは細胞を特異的に標的とするシュードタイプであり、ならびに／または遺伝子療法ベクターは、細胞もしくは組織に特異的なエンハンサーおよび／もしくはプロモーター、例えば肝特異的エンハンサー（例えばセルピナ1）および／もしくは肝特異的プロモーター（例えばTTR）を含む。一実施形態では、内部移行エフェクターは、エンドサイトーシスされてリソソームに輸送される細胞表面分子である。特定の一実施形態では、内部移行エフェクターはCD63分子である。特定の一実施形態では、送達ドメインは、抗体、抗体断片、または単鎖可変断片（scFv）、例えばCD63に結合するscFvなど（例えば配列番号2）である。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるような遺伝子療法ベクターを、少なくとも一つの免疫抑制剤と組み合わせて患者に投与することを含み、前記遺伝子療法ベクターおよび免疫抑制剤は、同時および／または逐次的に投与される。一部の実施形態では、患者は、免疫抑制剤の一定レベルを維持する。
【００３１】
一態様では、本明細書に記載されるのは、酵素に欠損を有する患者（ヒトまたは非ヒト）において酵素に対する寛容を誘導する方法（すなわち、患者を酵素に対し寛容にする方法であって、本方法は、交差反応性免疫学的物質を低減すること、例えば、補充酵素のみをコードするかまたは送達ドメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードする遺伝子を含有する遺伝子療法ベクターを、患者に投与することを含む。一部の実施形態では、開示されるのは、酵素に欠損を有する患者において酵素に対する寛容を誘導する方法であって、本方法は、補充酵素のみをコードするかまたは送達ドメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードする遺伝子を含有する遺伝子療法ベクターを、検出可能な交差反応性免疫学的物質の増加が患者に生じないように、ある期間にわたって患者に投与することを含む。一部の実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、送達ドメインおよび酵素ドメインを含む。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、AAV  ベクターであり、それは、キメラAAV  ベクター（例えばAAV2/8）および／または工学的に操作されたAAV  ベクター（例えば、細胞または組織、例えば肝細胞もしくは肝臓、粘膜組織、赤血球、造血系幹細胞などによって優先的または排他的に発現される受容体またはマーカーを標的とするために有用な向性を改変された組換えウイルスベクター）としてもよく、任意選択的に、遺伝子は、例えば肝特異的プロモーターなどの細胞または組織に特異的なエンハンサーおよび／またはプロモーターの制御下で発現される。一部の実施形態では、酵素ドメインは、GAA（例えば配列番号1）またはGLA（例えばUniProtKB番号P06280、aa32〜429、配列番号13）などのグリコシダーゼを含み、患者は、ポンペ病またはファブリー病を有し、送達ドメインは、内部移行エフェクターに結合する抗原結合タンパク質である。一実施形態では、内部移行エフェクターは、エンドサイトーシスされてリソソームに輸送される細胞表面分子である。特定の一実施形態では、内部移行エフェクターはCD63分子である。特定の一実施形態では、送達ドメインは、抗体、抗体断片、または単鎖可変断片（scFv）、例えばCD63に結合するscFvなど（例えば配列番号2）である。一部の実施形態では、酵素欠損症を持つ患者を治療する方法は、酵素（例えば、ポンペ病の患者のGAA、例えばscFv63::GAA、GAA、最適化されたGAA、またはそれらの組合せ）の組み換え型形態および／またはアイソザイムを患者に投与することを含み、患者は、酵素に対して寛容であり、例えば、本明細書に開示される方法による酵素に対して寛容にされている。したがって、一部の実施形態では、酵素を欠損した患者にそれを投与する方法は、例えば酵素または酵素を含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードする遺伝子療法ベクターを投与することによって、患者を酵素に対し寛容にすることを含み、好ましくは、交差反応性免疫学的物質が酵素を欠損していない患者に見られるものに匹敵するレベルとなるように、酵素の血清レベルを増加させるのに充分な量で投与され、任意選択的に、遺伝子療法ベクターは、肝臓を特異的に標的とする、ならびに／または肝特異的エンハンサーおよび／もしくはプ���モーターを含む。一部の実施形態では、本方法は、遺伝子ターゲティングベクターの投与後、酵素および／またはその組み換えバリアントをさらに投与することをさらに含み、そのようなバリアントとしては、酵素を含むマルチドメイン治療用タンパク質が挙げられる。
【００３２】
別の態様では、本発明は、ヒトCD63に結合する抗体およびその抗原結合断片を提供する。本発明のこの態様による抗体は、とりわけ、例えばGAAまたはGLAなどの酵素の内部移行および／またはリソソーム輸送を特異的に向けるために、有用である。したがって、本発明のこの態様は、ヒトCD63に結合する二重特異性抗体、その抗原結合断片、および抗体-タンパク質融合構築物（例えば図1Aを参照）も提供する。
【００３３】
本発明の例示的な抗CD63抗体を表11に列挙する。表11は、例示的な抗CD63抗体の重鎖可変領域（HCVR）および軽鎖可変領域（LCVR）、ならびに重鎖相補性決定領域（HCDR1、HCDR2、およびHCDR3）および軽鎖相補性決定領域（LCDR1、LCDR2、およびLCDR3）のアミノ酸および核酸配列の識別子を記載する。
【００３４】
本発明は、表11に列挙されるHCVRアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含むHCVR、またはそれと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似したその配列を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００３５】
本発明はまた、表11に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似した配列を含むＬＣＶＲを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００３６】
本発明はまた、表11に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかとペアリングされた、表11に列挙されるＨＣＶアミノ酸配列のいずれかを含むHCVRとLCVRとのアミノ酸配列ペア（ＨＣVR／ＬＣＶＲ）を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある実施形態によれば、本発明は、表11に列挙された例示的な抗CD63抗体のいずれかの中に含有されるHCVR/LCVRアミノ酸配列ペアを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある実施形態では、HCVR/LCVRアミノ酸配列ペアは、配列番号  14/22、配列番号  30/38、配列番号46/54、および配列番号  62／70からなる群から選択される。
【００３７】
本発明はまた、表11に列挙されるＨＣＤＲ1アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ1（ＨＣＤ1）、またはそれらと少なくとも90％、少なくとも95%、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００３８】
本発明はまた、表11に列挙されるＨＣＤＲ2アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ2（ＨＣＤ2）、またはそれらと少なくとも90％、少なくとも95%、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００３９】
本発明はまた、表11に列挙されるＨＣＤＲ3アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ3（ＨＣＤ3）、またはそれらと少なくとも90％、少なくとも95%、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００４０】
本発明はまた、表11に列挙されるＬＣＤＲ1アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ1（ＬＣＤ1）、またはそれらと少なくとも90％、少なくとも95%、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００４１】
本発明はまた、表11に列挙されるＬＣＤＲ2アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ2（ＬＣＤ2）、またはそれらと少なくとも90％、少なくとも95%、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００４２】
本発明はまた、表11に列挙されるＬＣＤＲ3アミノ酸配列のいずれかから選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ3（ＬＣＤ3）、またはそれらと少なくとも90％、少なくとも95%、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む、抗体またはその抗原結合性断片を提供する。
【００４３】
本発明はまた、表11に列挙されたＬCDR3アミノ酸配列のいずれかとペアリングされた表11に列挙されたＨCDR3アミノ酸配列のいずれかを含む、HCDR3およびLCDR3のアミノ酸配列ペア（HCDR3/LCDR3）を含む、抗体またはその抗原結合断片も提供する。ある実施形態によれば、本発明は、表11に列挙された例示的な抗CD63抗体のいずれかの中に含有されるHCDR3/LCDR3アミノ酸配列ペアを含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。ある実施形態では、HCDR3/LCDR3アミノ酸配列ペアは、配列番号  配列番号  20／28、配列番号  36／44、配列番号52／60、および配列番号  68/76からなる群から選択される。
【００４４】
本発明はまた、表11に列挙される例示的な抗CD63抗体のいずれかの中に含有される6個のCDR（すなわちHCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。特定の実施形態では、ＨＣＤＲ1−ＨＣＤＲ2−ＨＣＤＲ3−ＬＣＤＲ1−ＬＣＤＲ2−ＬＣＤＲ3のアミノ酸配列セットは、配列番号:16−18−20−24−26−28、配列番号:  32-34-36-40-42-44、配列番号48-50-52-56-58-60、および配列番号  64-66-68-72-74-76からなる群から選択される。
【００４５】
関連の実施形態では、本発明は、表11に列挙される例示的な抗CD63抗体のいずれかにより定義されるHCVR/LCVRアミノ酸配列ペア内に含有される6個のCDRのセット（すなわちHCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3)を含む、抗体またはその抗原結合断片を提供する。例えば、本発明は、配列番号14／22、配列番号  30／38、配列番号46／54、および配列番号  62／70からなる群から選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列ペア内に含有されるHCDR1-HCDR2-HCDR3-LCDR1-LCDR2-LCDR3アミノ酸配列ペアを含む、抗体またはその抗原結合断片を含む。HCVRおよびLCVRのアミノ酸配列内のCDRを特定するための方法および技法は、当技術分野では周知であり、本明細書に開示される指定されたHCVRおよび／またはLCVRのアミノ酸配列内のCDRを特定するために使用することができる。CDRの境界を特定するために使用できる例示的な規則としては、  例えば、、Kabat定義、Chothia定義、およびAbM定義が挙げられる。一般論としては、Kabat定義は、配列の変動性に基づき、Chothia定義は、構造ループ領域の場所に基づき、AbM定義は、KabatとChothiaのアプローチの折衷である。例えば、Kabat,  "Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest,"  National  Institutes  of  Health,  Bethesda,  Md.  (1991);  Al-Lazikani  et  al.,  J.  Mol.  Biol.  273:927-948  (1997);およびMartin  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  86:9268-9272  (1989)を参照されたい。公的データベースは、抗体内のCDR配列を特定するためにも利用可能である。
【００４６】
本発明は、抗CD63抗体またはその一部をコードする核酸分子も提供する。例えば、本発明は、表11に列挙されるＨＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、表11に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも90%、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００４７】
本発明はまた、表11に列挙されるＬＣＶＲアミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、表11に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも90%、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００４８】
本発明はまた、表11に列挙されるＨＣＤＲ1アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、表11に列挙されるＨＣＤＲ1核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも90%、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００４９】
本発明はまた、表11に列挙されるＨＣＤＲ2アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、表11に列挙されるＨＣＤＲ2核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも90%、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００５０】
本発明はまた、表11に列挙されるＨＣＤＲ3アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、表11に列挙されるＨＣＤＲ3核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも90%、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００５１】
本発明はまた、表11に列挙されるＬＣＤＲ1アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、表11に列挙されるＬＣＤＲ1核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも90%、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００５２】
本発明はまた、表11に列挙されるＬＣＤＲ2アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、表11に列挙されるＬＣＤＲ2核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも90%、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００５３】
本発明はまた、表11に列挙されるＬＣＤＲ3アミノ酸配列のいずれかをコードする核酸分子を提供し、ある実施形態では、表11に列挙されるＬＣＤＲ3核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれらと少なくとも90%、少なくとも95％、少なくとも98％、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列を含む。
【００５４】
本発明はまた、HCVRをコードする核酸分子を提供し、そこでは、HCVRは、三つのＣＤＲ（すなわちＨＣＤＲ1−ＨＣＤＲ2−ＨＣＤＲ3）のセットを含み、ＨＣＤＲ1−ＨＣＤＲ2−ＨＣＤＲ3アミノ酸配列のセットは、表11に列挙された例示的な抗CD63抗体のいずれかによって定義される。
【００５５】
本発明はまた、LCVRをコードする核酸分子を提供し、そこでは、LCVRは、三つのＣＤＲ（すなわちＬＣＤＲ1−ＬＣＤＲ2−ＬＣＤＲ3）のセットを含み、ＬＣＤＲ1−ＬＣＤＲ2−ＬＣＤＲ3アミノ酸配列のセットは、表11に列挙された例示的な抗CD63抗体のいずれかによって定義される。
【００５６】
本発明はまた、HCVRとLCVRの両方をコードする核酸分子を提供し、そこでは、HCVRは、表11に列挙されるHCVRアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含み、LCVRは、表11に列挙されたLCVRアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、核酸分子は、表11に列挙されるＨＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列と、表11に列挙されるＬＣＶＲ核酸配列のいずれかから選択されるポリヌクレオチド配列、またはそれと少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、もしくは少なくとも99%の配列同一性を有する実質的に類似の配列とを含む。本発明のこの態様によるある実施形態では、核酸分子は、HCVRおよびLCVRをコードし、HCVRおよびLCVRは両方とも、表11に列挙された同じ抗CD63抗体から誘導される。
【００５７】
本発明はまた、抗CD63抗体の重鎖可変領域または軽鎖可変領域を含むポリペプチドを発現することができる組み換え型発現ベクターを提供する。例えば、本発明は、上述の核酸分子、すなわち、表11に記載されるようなＨＣＶＲ配列、ＬＣＶＲ配列、および／またはCDR配列のいずれかをコードする核酸分子のいずれかを含む、組み換え型発現ベクターを含む。また、本発明の範囲内に含まれるのは、そのようなベクターが導入されている宿主細胞、ならびに抗体または抗体断片の産生を可能にする条件下で宿主細胞を培養することによって抗体またはその一部分を生産する方法ならびにそうして生産された抗体および抗体断片を回収する方法である。
【００５８】
いくつかの態様では、本発明は、改変グリコシル化パターンを有する抗CD63抗体などの抗体またはその抗原結合断片を含む。一部の実施形態では、望ましくないグリコシル化部位を除去する改変が有用であることがあるか、または、オリゴ糖鎖上に存在するフコース部分を欠失している抗体が、例えば、細胞毒性が望ましい場合に、抗体依存性細胞障害（ADCC）機能を増加させるために有用であることがある（Shields  et  al.  (2002)  JBC  277:26733を参照されたい）。他の用途では、ガラクトシル化の修飾を、補体依存性細胞障害活性（CDC）を改変するために行うことができる。
【００５９】
別の態様では、本発明は、CD63および医薬的に許容可能な担体に特異的に結合する組換えヒト抗体またはその断片を含む医薬組成物を提供する。関連の態様では、本発明は、抗CD63抗体と第二の治療剤との組み合わせである組成物を特徴とする。一実施形態では、第二の治療剤は、抗CD63抗体と有利に組み合わされる任意の薬剤である。本発明の抗CD63抗体が関与する追加的な併用療法および合剤は、本明細書の他の場所で開示されている。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１Ａ】図1A  は、概略的にマルチドメイン治療用タンパク質を表す。パネルAは、二重特異性抗体（ii）と補充酵素（i）とを含むマルチドメイン治療用タンパク質を図示する。パネルBは、内部移行エフェクター特異的半抗体（ii）と会合して、マルチドメイン治療用タンパク質を形成している酵素-Fc融合ポリペプチド（i）を図示する。パネルCは、抗内部移行エフェクター抗体の重鎖のC末端に共有結合した補充酵素（六角形）を示す。パネルDは、抗内部移行エフェクター抗体の重鎖のN末端に共有結合した補充酵素（六角形）を示す。パネルEは、抗内部移行エフェクター抗体の軽鎖のC末端に共有結合した補充酵素（六角形）を示す。パネルFは、抗内部移行エフェクター抗体の軽鎖のN末端に共有結合した補充酵素（六角形）を示す。パネルＧは、VH領域（影付きバー）及びVL領域（オープンバー）を含有する単鎖可変断片（scFv）のC末端に共有結合で連結された補充酵素（六角形）を図示する。パネルHは、二つのscFvドメインに共有結合で連結された補充酵素（六角形）を図示し、第一のscFv（i）は、第一の送達ドメインとしての機能を果たし、第二のscFv（ii）は、第二の送達ドメインとしての機能を果たす。
【００６１】
【図１Ｂ】図1Bは、パネルに表されるマルチドメイン治療用タンパク質をコードするAAV  遺伝子療法ベクターの非限定的な例示の図説であり、scFvは抗ヒトCD63  scFvであり、補充酵素はGAAである（例えば、抗hCD63scFv::hGAA；例えば配列番号10として記載されるアミノ酸配列を参照）。配列番号10のアミノ酸1〜119は、H5C6抗体の重鎖可変ドメイン（VH）のアミノ酸配列を提供し、配列番号10のアミノ酸120〜134は、H5C6の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインとの間のアミノ酸リンカー配列を提供し、配列番号10のアミノ酸135〜245は、H5C6抗体の軽鎖可変ドメイン（VL）のアミノ酸配列を提供し、配列番号10のアミノ酸136〜250は、抗hCD63scFvとGAAとの間のアミノ酸リンカー配列を提供し、配列番号10のアミノ酸251〜1133はGAAのアミノ酸配列を提供する。例示的な5’ITRおよび3’ITRの配列は、それぞれ配列番号6および配列番号7として記載されている。例示的な肝特異的エンハンサー（セルピナ1）は、配列番号9として記載されている。例示的な肝特異的プロモーター（TTR）は、配列番号8として記載されている。抗CD63抗体またはその抗原結合部分を含むマルチドメイン治療用タンパク質を構築するために使用されうる、追加の例示的な抗CD63VＨ  およびVL  のアミノ酸配列（および同じものをコードするヌクレオチド配列）を、表11に示す。
【００６２】
【図２】図2  は、送達された酵素の機能として組織ミリグラム当たりのマイクログラムで貯蔵グリコーゲンの量を図示する棒グラフである。X軸はCD63ｈｕ／ｈｕ；GAA-/-  マウス由来の組織を図示し、左から右まで:心臓、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、ヒラメ筋、長指伸筋（EDL）筋肉である。黒いボックス（「1」）は、未処置のマウスポンペ病モデルにおける貯蔵グリコーゲンの量を図示する。オレンジ色のボックス（「2」）は、未処置の野生型マウスモデルにおける貯蔵グリコーゲンの量を図示する。ライムグリーンのボックス（「3」）は、1010  vgの用量でAAV-hGAA（ヒトGAAをコードする遺伝子を含有するアデノ関連ウイルスベクター）を処置されたマウスポンペ病モデルにおける貯蔵グリコーゲンの量を図示する。フォレストグリーンのボックス（「4」）は、1011  vgの用量でAAV-hGAAで処置されたマウスポンペ病モデルにおける貯蔵グリコーゲンの量を図示する。ライトブルーのボックス（「5」）は、1010  vgの用量でAAV-抗hCD63scFv::hGAA（ヒトＧＡＡに連結された抗ヒトCD63  scFvドメインをコードする遺伝子を含有するアデノ関連ウイルスベクター）で処置された貯蔵グリコーゲンの量を図示する。ダークブルーのボックス（「6」）は、1011  vgの用量でAAV-抗hCD63scFv::hGAAで処理されたマウスポンペ病モデルにおける貯蔵グリコーゲンの量を図示する。
【００６３】
【図３】図3は、AAV注射の3ヵ月後での各マウスの骨格筋組織中の平均グリコーゲン測定値（μg/mg）を図示する棒グラフである。各測定値を、特定の投与量で特定の酵素構築物を用いて処理されたマウス当たりのGAA曝露（すなわち血清レベル）の関数としてプロットしている。黒正方形は、1010  vg用量でのAAV-hGAAを表す。黒三角形は、1011  vg用量でのAAV-hGAAを表す  黒逆三角形は、1010  vg用量でのAAV-抗hCD63scFv::hGAAを表す。黒斜方形は、1011  vg用量でのAAV-抗hCD63scFv::hGAAを表す。
【００６４】
【図４】図4は、AAV注射の3ヵ月後に心臓組織中で測定された平均心筋グリコーゲン（μg/mg）を、特定の投与量で特定の酵素構築物を用いて処置されたマウス当たりのGAA曝露（すなわち血清レベル）の関数として示すドットプロットである。黒正方形は、1010  vg用量でのAAV-hGAAを表す。黒三角形は、1011  vg用量でのAAV-hGAAを表す  黒逆三角形は、1010  vg用量でのAAV-抗hCD63scFv::hGAAを表す。黒斜方形は、1011  vg用量でのAAV-抗hCD63scFv::hGAAを表す。
【００６５】
【図５】図5は、特定の投与量で特定の酵素構築物で処置されたマウス当たりのGAA曝露（すなわち血清レベル）の関数として、AAV  注射の3か月後の抗ＧＡＡ抗体の力価を図示するドットプロットである。白正方形は、1010  vg用量でのAAV-hGAAを表す。白丸は、1011  vg用量でのAAV-hGAAを表す。白斜方形は、1010  vg用量でのAAV-抗hCD63scFv::hGAAを表す。六角形は、1011  vg用量でのAAV-抗hCD63scFv::hGAAを表す。
【００６６】
【図６】図6  は、AAV注射の3ヵ月後での抗GAA抗体の力価を、酵素構築物および用量の関数として図示するドットプロットである。丸は、空のAAV  ベクターを受けている対照マウスを表す。正方形は、1010  vg用量でのAAV-hGAAを表す。三角形は、1011  vg用量でのAAV-hGAAを表す。逆三角形は、1010  vg用量でのAAV-抗hCD63scFv::hGAAを表す  斜方形は、1011vg用量でのAAV-抗hCD63scFv::hGAAを表す。
【００６７】
【図７Ａ】図7Ａ  は、遺伝子療法ベクターの注射後、週での時間の関数としてGAA（任意単位「a.u.」；y軸）の血清レベルを図示する線グラフである。正方形は、1010  vg用量でのAAV-hGAAを表す。三角形は、1011  vg用量でAAV-hGAAを表す。逆三角形は、1010  vg用量でのAAV-抗hCD63scFv::hGAAを表す  斜方形は、1011vg用量でのAAV-抗hCD63scFv::hGAAを表す。
【００６８】
【図７Ｂ】図7Ｂ  は、以下のようなCD63  HumIn  GAA  KOマウス（GAA-/-,  CD63hu/huマウス）またはGAA  +/+,  CD63hu/hu  マウスにおけるAAV  構築物の投与後のmRNA比（mGADPH  mRNAに対するhGAA  mRNA）を図示する棒グラフである:（1)  未処置対照、(2)  AAV-肝特異的プロモーター-hGAA  (1e10vg)、(3)  AAV-肝特異的プロモーター-hGAA  (1e11vg)、(4)  AAV-肝特異的プロモーター-抗hCD63::hGAA  (1e10vg)、(5)  AAV-肝特異的プロモーター-  抗hCD63::hGAA  (1e11vg)、または(6)  未処理処置対照  (GAA+/+,  CD63hu/hu)。AAV構築物の全ての注射について、肝臓でのGAAの発現が検出された。
【００６９】
【図７Ｃ】図7Ｃは、融合タンパク質（正方形）をコードするAAVを受けているマウスおよびGAAをコードするAAVを受けているマウス（どちらの構築物も、発現を駆動するための肝特異的プロモーター（LSP）を配された）について、血清GAAレベルとRNA発現レベルとを比較した点グラフである。
【００７０】
【図７Ｄ】図7Ｄは、  hGAA、抗hCD63  scFv::GAA（融合構築物）、または非結合融合構築物scFv::GAA対照をコードする肝特異的プロモーター駆動性構築物を一過的にトランスフェクションされたHuh-7ヒト肝細胞を示す棒グラフである。どちらのscFv::GAA融合構築物も、トランスフェクションの3日後に、分泌上清におけるタンパク質の比率がhGAAのみよりも高かった。CI-MPR媒介性取り込みを軽減するために、実験期間中に上清中にM6Pを追加したことは、比率に影響を及ぼさなかった。（*=p<0.05、n=3）。
【００７１】
【図８−１】図8は、核を明らかにするためにDAPIで対比染色されたマウス筋線維における、lamp1染色リソソームを図示する蛍光顕微鏡写真である。パネルAおよびA1は、未処理の野生型（GAA+/+）マウスに由来し、lamp1（パネルA）および核（パネルA1）について染色した、四頭筋細胞を図示する。パネルBおよびB1は、未処理GAAヌル（GAA-/-）マウスに由来し、lamp1（パネルB）および核（パネルB1）について染色した、四頭筋細胞を図示する。パネルCおよびC1は、AAV-hGAA構築物で処置されたGAA-/-マウスに由来し、lamp1（パネルC）および核（パネルC1）について染色した、四頭筋細胞を図示する。パネルDおよびD1は、AAV-hCD63scFv::hGAA構築物で処置されたGAA-/-マウスに由来し、lamp1（パネルD）および核（パネルD1）について染色した、四頭筋細胞を図示する。
【図８−２】同上。
【００７２】
【図９】図9は、AAV-LSP  hGAAまたはAAV-LSP抗hCD63::hGAAのいずれかで処置されたマウスの握力強度およびロータロッド試験性能を示す線グラフを図示する。野生型GAAマウス（逆三角形）、未処理対照（正方形）、AAV-LSP-hGAA処理（1e11vg/マウス）（三角形）、またはAAV-LSP-抗hCD63::hGAA治療（1e11vg/マウス）（丸）のロータロッド測定値（A）および前肢の握力強度測定値（B）を、1ヶ月間隔で6ヶ月間取得した。エラーバーは+/-標準偏差である。全ての群に対してN=8〜10。
【００７３】
【図１０Ａ】図10Ａおよび図10Ｂは、ガイドとしての他の膜タンパク質、例えばGAAをガイドするための抗ITGA7（インテグリンアルファ-7）scFv融合タンパク質などの使用を図示する。図10Ａ  は、5mM  M6Pの存在下または非存在下で、抗マウスCD63-GAAまたは抗マウスITGA7-GAAと共に一晩インキュベーションされたC2C12マウス筋芽細胞のGAA活性（y軸）を示す。図10Ｂは、流体力学的送達（HDD）によってscFv::GAA型の抗hCD63::GAA（2）または完全長IgG4::GAA型の抗マウスインテグリンアルファ7(3)  をコードするプラスミドを与えられ、次いで、HDDの3週間後に組織のグリコーゲンレベルを測定された、CD63をヒト化されたGAA  KOマウス（GAA-/-；CD63hu/hu）を示す。未処置対照マウス、GAA-/-;CD63hu/hu  (1)、および未処置野生型GAA対照マウス、GAA  +/+;CD63hu/hu(4)も、同じ組織のグリコーゲンレベルについて試験した。
【図１０Ｂ】同上。
【００７４】
【図１１】図11は、酵素構築物および用量の関数としての関数としてのAAV注射の1ヶ月後でのGAAの血清レベル（任意単位「a.u.」；y軸）を図示するドットプロットである。正方形は、AAV-LSP-Δ8GAAを表す。三角形は、AAV-抗hCD63scFv::GAAを表す。どちらの構築物も、発現)を駆動するための肝特異的プロモーター（LSP）を提供した。用量は、マウスのキログラム（kg）当たりのウイルスゲノム（vg）として示される。
【００７５】
【図１２】図12は、GAA血清レベルの関数としての組織（心臓、四頭筋、横隔膜、または三頭筋）のミリグラム当たりのマイクログラムでのグリコーゲンのレベルを図示するドットプロットを示す。正方形は、AAV-LSP-Δ8GAAを表す。三角形は、AAV-抗hCD63scFv::GAAを表す。どちらの構築物も、発現)を駆動するための肝特異的プロモーター（LSP）を提供した。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
本発明は、記載された特定の実施形態、組成物、方法、および実験条件に限定されるものではないが、それはこうした実施形態、組成物、方法、および条件が異なる場合があるからである。本発明の範囲が添付の特許請求の範囲のみによって制限されるものとなることから、本明細書に使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのみにあり、制限することを意図するものではない。
【００７７】
本明細書に記載された方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料を、本発明の実践または試験に使用することができるが、一部の好適な方法および材料をこれより記載する。本明細書で引用された全ての出版物は、その記述全体が参照により本明細書に組み込まれる。別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。
【００７８】
「酵素欠損症の疾患」としては、非リソソーム蓄積症、例えばクラッベ病(ガラクトシルセラミダーゼ)、フェニルケトン尿症、ガラクトース血症、メープルシロップ尿症、ミトコンドリア障害、フリードライヒ運動失調症、ツェルウェーガー症候群、副腎脳白質ジストロフィー、ウィルソン病、ヘモクロマトーシス、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症、メチルマロン酸血症、プロピオン酸血症、およびリソソーム蓄積症が挙げられる。「リソソーム蓄積症」は、リソソームの機能の欠陥の結果として生じる任意の障害を含む。現在およそ50種のリソソーム蓄積障害が特定されており、その最もよく知られているものとしては、テイ・サックス病、ゴーシェ病、およびニーマン・ピック病が挙げられる。これらの疾患の病因は、タンパク質機能の喪失に通常は起因して、不完全な分解産物がリソソーム内に蓄積することにあると考えられている。リソソーム蓄積症は、正常な機能ではリソソーム含有物を分解するかまたは分解を調整するタンパク質における、機能喪失型または減弱型のバリアントによって引き起こされる。リソソーム蓄積症と密接に関連するタンパク質としては、酵素、受容体、および他の膜貫通タンパク質（例えばNPC1）、翻訳後修飾タンパク質（例えばスルファターゼ）、膜輸送タンパク質、ならびに非酵素性補助因子および他の可溶性タンパク質（例えばGM2ガングリオシド活性化因子）が挙げられる。そのため、リソソーム蓄積症は、欠陥のある酵素それ自体によって引き起こされる前述の障害が包含されるだけでなく、任意の分子的な欠陥によって引き起こされる任意の障害も含まれる。したがって、本明細書で使用される場合、用語「酵素」は、リソソーム蓄積症に関連する前述の他のタンパク質を包含することが意図される。
【００７９】
分子的な損傷の性質は、多くの場合、疾患の重症度に影響を及ぼすが、換言すれば、完全な機能喪失は、胎児または新生児の発症に付随する傾向にあり、重度の症状を伴い、そして部分的な機能喪失は、（比較的）軽度の遅発型疾患に付随する。一般的に、欠損細胞における代謝的な欠陥を修正すべき際には、ごく僅かなパーセンテージの活性のみを回復させることが求められる。表1には、よく見られるリソソーム蓄積症の一部と、それらに関連する機能喪失タンパク質の一覧を示す。リソソーム蓄積症は、概してDesnick  and  Schuchman,  2012に記載されている。
【００８０】
リソソーム蓄積症は、欠陥のあるリソソーム内に蓄積する産物の種類によって分類され得る。スフィンゴ脂質蓄積症は、脂肪族アミノアルコールに連結された脂肪酸を含有する脂質であるスフィンゴ脂質の代謝に影響を及ぼす疾患の1種である（S.  Hakomori,  “Glycosphingolipids  in  Cellular  Interaction,  Differentiation,  and  Oncogenesis,”  50  Annual  Review  of  Biochemistry  733-764,  July  1981に概説されている）。スフィンゴ脂質蓄積症の蓄積産物としては、ガングリオシド（例えばテイ・サックス病）、糖脂質（例えばファブリー病）、およびグルコセレブロシド（例えばゴーシェ病）が挙げられる。
【００８１】
ムコ多糖症は、グリコサミノグリカン（GAGSまたはムコ多糖類）の代謝に影響を及ぼす疾患の一群であり、このグリコサミノグリカンは、骨、軟骨、腱、角膜、皮膚、および結合組織の構築に役立つ二糖の反復した非分岐長鎖である（J.  Muenzer,  “Early  initiation  of  enzyme  replacement  therapy  for  the  mucopolysaccharidoses,”  111(2)  Mol.  Genet.  Metab.  63-72  (Feb.  2014)；Sasisekharan  et  al.,  “Glycomics  approach  to  structure-function  relationships  of  glycosaminoglycans,”  8(1)  Ann.  Rev.  Biomed.  Eng.  181-231  (Dec.  2014)に概説されている）。ムコ多糖症の蓄積産物としては、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、コンドロイチン硫酸の様々な形態、およびヒアルロン酸が挙げられる。例えば、モルキオ症候群Aは、リソソーム酵素であるガラクトース-6-硫酸スルファターゼの欠陥により生じ、結果として、リソソーム内でのケラチン硫酸およびコンドロイチン6-硫酸の蓄積をもたらす。
【００８２】
グリコーゲン蓄積症（別名、糖原病）は、細胞がグリコーゲンを代謝（生成または分解）することができないことに起因する。グリコーゲン代謝は、グルコース-6-ホスファターゼ、酸性アルファグルコシダーゼ、グリコーゲン脱分枝酵素、グリコーゲン分枝酵素、筋グリコーゲンホスホリラーゼ、肝グリコーゲンホスホリラーゼ、筋ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グルコーストランスポーター、アルドラーゼA、ベータエノラーゼ、およびグリコーゲンシンターゼ含めた様々な酵素または他のタンパク質により調整される。典型的なリソソーム蓄積／グリコーゲン蓄積症はポンペ病であり、ポンペ病では、酸性アルファグルコシダーゼの欠陥によりグリコーゲンがリソソーム内に蓄積される。症状として、肝腫大、筋力低下、心不全、また乳児バリアントの場合には、2歳までの死亡が挙げられる（DiMauro  and  Spiegel,  “Progress  and  problems  in  muscle  glycogenosis,”  30(2)  Acta  Myol.  96-102  (Oct.  2011)を参照）。
【００８３】
「マルチドメイン治療用タンパク質」は、（i）二つ以上の機能ドメインを含有する単一タンパク質、（ii）二つ以上のポリペプチド鎖を含有するタンパク質、および（iii）二つ以上のタンパク質または二つ以上のポリペプチドの混合物を含む。ポリペプチドという用語は、通例、ペプチド結合を介して連結されている単鎖のアミノ酸を意味するものとされる。タンパク質という用語は、ポリペプチドという用語を包含するだけでなく、さらに複雑な構造をも含む。すなわち、単一ポリペプチドとは、タンパク質であり、タンパク質は、より高次の構造に会合した一つまたは複数のポリペプチドを含有ことができる。例えば、ヘモグロビンは、四つのポリペプチド、すなわち二つのアルファグロビンポリペプチドと二つのベータグロビンポリペプチドとを含有するタンパク質である。ミオグロビンもタンパク質であるが、これは単一のミオグロビンポリペプチドのみを含有する。
【００８４】
マルチドメイン治療用タンパク質は、一つまたは複数のポリペプチドと、二つの機能を付与する少なくとも二つのドメインとを含む。これらのドメインのうちの一方は、酵素欠損症に関連する欠陥タンパク質の活性の補充をもたらす「酵素ドメイン」である。これらのドメインのうちの他方は、内部移行エフェクターとの結合をもたらす「送達ドメイン」である。そのため、酵素補充活性と内部移行エフェクター（別名、内部移行エフェクター結合タンパク質に結合する能力（送達ドメイン活性）とを付与する単一のポリペプチドは、マルチドメイン治療用タンパク質である。また、一方のタンパク質が酵素機能を付与し、別のタンパク質が内部移行エフェクター結合活性を付与する、タンパク質の混合物も、マルチドメイン治療用タンパク質である。図1Ａは、マルチドメイン治療用タンパク質の様々な典型例を図示する。一例（図1A、パネルA）では、マルチドメイン治療用タンパク質は、酵素（六角形により表される）と、酵素（破線）および内部移行エフェクター（実線）を結合する二重特異性抗体（IE-BP）とを含有する。ここで、二重特異性抗体の一方のアームは、酵素に非共有結合し、他方のアームは、内部移行エフェクターに非共有結合し、それによって、補充酵素を細胞内または細胞内小区画内に内部移行させることができる。別の例（パネルB）では、マルチドメイン治療用タンパク質は、二つのポリペプチドを含有する単一タンパク質を含み、その一方のポリペプチドは酵素機能を有し、他方は送達ドメイン機能を有する。ここで、酵素は、イムノグロブリンFcドメインまたは重鎖定常領域に融合され、これが、酵素半抗体のFcドメインと会合して、二機能性マルチドメイン治療用タンパク質を形成する。パネルBに図示された実施形態は、酵素が、半抗体のイムノグロブリン可変ドメインでの抗原抗体相互作用を介するのではなく半抗体の一方に共有結合で付加されていることを除いて、パネルAの実施形態と類似している。
【００８５】
他の実施例では、マルチドメイン治療用タンパク質は、送達ドメインに（直接的にまたはリンカーを介して間接的に）共有結合で連結された酵素から成る。一実施形態では、酵素は、イムノグロブリン分子（例えば、重鎖または代替的に軽鎖）のC末端に付加されている。別の実施形態では、酵素は、イムノグロブリン分子（例えば、重鎖または代替的に軽鎖）のN末端に付加されている。これらの典型例では、イムノグロブリン分子は、送達ドメインである。さらに別の実施形態では、酵素は、内部移行エフェクターに結合するscFv分子のC末端に付加される。
【００８６】
一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、二つの送達ドメインを含む。一実施形態では、第一の送達ドメインは、リソソーム輸送分子またはその他の内部移行エフェクター（例えばCD63）と結合する。別の実施形態では、第二の送達ドメインは、トランスサイトーシスエフェクターと結合して、マルチドメイン治療用タンパク質の経細胞輸送を推進する。一実施形態では、トランスサイトーシスエフェクターは、特にLDL受容体、IgＡ受容体、トランスフェリン受容体、または新生児Fc受容体（FcRn）である。特定の実施形態では、トランスサイトーシス送達ドメインは、トランスフェリン受容体に結合する分子、例えば、  抗トランスフェリン受容体抗体または抗トランスフェリン受容体scFv分子などを含む。Tuma  and  Hubbard、“Transytosis:  Crossing  Cellular  Barriers,”  Physiological  Reviews,  83(3):  871-935（2003年7月1日）は、本発明の実践において有用なトランスサイトーシスを媒介する細胞表面受容体について、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
「酵素ドメイン」または「酵素」とは、酵素欠損症の病因または生理学的効果に関連する任意のタンパク質を意味する。酵素としては、実在の酵素、輸送タンパク質、受容体、または、欠陥がありかつ疾患の原因となった分子的損傷があると考えられる他のタンパク質が挙げられる。酵素としてはまた、疾患の分子的損傷を補充もしくは迂回するのに類似したまたは十分な生化学的または生理学的活性を付与することのできる任意のタンパク質も含まれる。例えば、「アイソザイム」を酵素として用いてもよい。リソソーム蓄積症関連タンパク質の例としては、表1に「関与酵素／タンパク質」として列挙されたもの、および酵素欠損症の分子的欠陥を迂回する任意の既知のもしくは後に発見されるタンパク質または他の分子が挙げられる。
【００８８】
一部の実施形態では、酵素とはヒドロラーゼであり、そのようなものとしては、エステラーゼ、グリコシラーゼ、エーテル結合に作用するヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、リニアアミダーゼ、ジホスファターゼ、ケトンヒドロラーゼ、ハロゲナーゼ、ホスホアミダーゼ、スルホヒドロラーゼ、スルフィナーゼ、デスルフィナーゼなどが挙げられる。一部の実施形態では、酵素とはグリコシラーゼであり、そのようなものとしては、グリコシダーゼおよびN-グリコシラーゼが挙げられる。一部の実施形態では、酵素とはグリコシダーゼであり、そのようなものとしては、アルファ-アミラーゼ、ベータ−アミラーゼ、グルカン1,4-アルファ-グルコシダーゼ、セルロース、エンド-1,3(4)-ベータ-グルカナーゼ、イヌリナーゼ、エンド-1,4-ベータ-キシラナーゼ、エンド-1,4-b-キシラナーゼ、デキストラナーゼ、キチナーゼ、ポリガラクツロニダーゼ、リソザイム、エクソ-アルファ-シアリダーゼ、アルファ-グルコシダーゼ、ベータ-グルコシダーゼ、アルファ-ガラクトシダーゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ、アルファ-マンノシダーゼ、ベータ-マンノシダーゼ、ベータ-フルクトフラノシダーゼ、アルファ,アルファ-トレハロース、ベータ-グルクロニダーゼ、キシランエンド-1,3-ベータ-キシロシダーゼ、アミロ-アルファ-1,6-グルコシダーゼ,  ヒアルロノグルコサミニダーゼ、ヒアルロノグルクロニダーゼなどが挙げられる。
【００８９】
分子的欠陥がα-グルコシダーゼ活性における欠陥であるポンペ病の場合には、酵素としては、ヒトアルファ-グルコシダーゼ、および「アイソザイム」類、例えば他のアルファ-グルコシダーゼ類、工学的に操作された組換えアルファ-グルコシダーゼ、他のグルコシダーゼ類、組換えグルコシダーゼ類、非還元末端1-4結合アルファ-グルコース残基を加水分解して単一アルファグルコース分子を放出するように工学的に操作された任意のタンパク質、任意のEC  3.2.1.20酵素、グリコーゲンまたはデンプン用の天然または組換えの低pH糖質加水分解酵素、およびグルコシルヒドロラーゼ、例えば、スクラーゼ・イソマルターゼ、マルターゼ・グルコアミラーゼ、グルコシダーゼII、および中性アルファ-グルコシダーゼなどが挙げられる。
【００９０】
「内部移行エフェクター」は、細胞内へ内部移行できるタンパク質か、または逆行性膜輸送に関与もしくは寄与するタンパク質を含む。いくつかの例において、内部移行エフェクターは、トランスサイトーシスを経るタンパク質である；すなわち、該タンパク質は、細胞の一方の側で内部移行され、細胞の他方の側へ輸送される（例えば頂端から基底へ）。多くの実施形態において、内部移行エフェクタータンパク質は、細胞表面発現タンパク質または可溶性細胞外タンパク質である。しかし、本発明はまた、内部移行エフェクタータンパク質がエンドソーム、小胞体、ゴルジ、リソソームなどの細胞内区画内で発現する実施形態についても考慮する。例えば、逆行性膜輸送（例えば、初期／再循環エンドソームからトランスゴルジネットワークへの経路）に関与するタンパク質は、本発明の様々な実施形態において、内部移行エフェクタータンパク質として機能を果たすことがある。いずれの場合も、送達ドメインが内部移行エフェクタータンパク質に結合することによって、マルチドメイン治療用タンパク質全体およびそれらに関連する任意の分子（例えば酵素）も、細胞内へ内部移行されるようになる。下記に説明する通り、内部移行エフェクタータンパク質は、細胞内へ直接的に内部移行されるタンパク質、ならびに細胞内へ間接的に内部移行されるタンパク質を含む。
【００９１】
細胞内へ直接的に内部移行される内部移行エフェクタータンパク質は、細胞性の内部移行を経る少なくとも一つの細胞外ドメイン（例えば、膜貫通タンパク質、GPIアンカータンパク質など)を有する膜結合性分子を含み、好ましくは、細胞内分解経路および／または再循環経路を介してプロセシングされる。細胞内に直接的に内部移行される内部移行エフェクタータンパク質の具体的かつ非限定的な例としては、例えば、CD63、MHC-I（例えばHLA-B27）、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、トランスフェリン受容体、LDL受容体、LDL関連タンパク質1受容体、ASGR1、ASGR2、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質2（APLP2）、アペリン受容体（APLNR）、MAL（Myelin  And  Lymphocyteタンパク質、別名VIP17）、IGF2R、液胞型H+ATPアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体（例えばSCARA1-5、SCARB1-3、CD36）などが挙げられる。
【００９２】
ある実施形態において、内部移行エフェクターは、プロラクチン受容体（PRLR）である。PRLRは、ある特定の治療用途の標的であるだけでなく、その高速の内部移行および代謝回転に基づく有効な内部移行エフェクタータンパク質でもあることが見出された。内部移行エフェクタータンパク質としてのPRLRの可能性は、例えば、国際特許出願公開第2015/026907号に記載されており、とりわけ抗PRLR抗体がin  vitroにてPRLR発現細胞により効果的に内部移行されることが示されている。
【００９３】
ある実施形態では、内部移行エフェクターは、腎臓特異的インターナライザーであり、例えば、CDH16（Cadheri-16）、CLDN16（Claudn-16）、KL（Klotho）、PTH1R（副甲状腺ホルモン受容体）、SLC22A13（溶質輸送体ファミリー22メンバー13）、SLC5A2（ナトリウム／グルコース共輸送体2）、およびUMOD（ウロモジュリン）などである。他のある特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、筋特異的インターナライザーであり、例えば、BMPR1A（骨形態形成タンパク質受容体1A）、m-カドヘリン、CD9、MuSK（筋特異的キナーゼ）、LGR4/GPR48（Gタンパク質共役受容体48）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ1、CDH15（Cadheri-15）、ITGA7（インテグリンアルファ-7）、CACNG1（L型カルシウムチャネルサブユニットガンマ-1）、CACNAlS（L型カルシウムチャネルサブユニットアルファ-15）、CACNG6（L型カルシウムチャネルサブユニットガンマ-6）、SCN1B（ナトリウムチャネルサブユニットベータ-1）、CHRNA1（ACh受容体サブユニットアルファ）、CHRND（ACh受容体サブユニットデルタ）、LRRC14B（ロイシンリッチリピート含有タンパク質14B）、ジストログリカン  (DAG1)、およびPOPDC3（ポパイ（Popeye）ドメイン含有タンパク質3）などである。いくつかの特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、ITGA7、CD9、CD63、APLP2、ASGR1、ASGR2、またはPRLRである。
【００９４】
内部移行エフェクター（IE）を細胞内に直接的に内部移行させる実施形態において、送達ドメインは、例えば、IEと特異的に結合する抗体もしくは抗体の抗原結合断片、またはIEと特異的に相互作用するリガンドもしくはリガンドの一部であり得る。例えば、IEがKremen-1またはKremen-2である場合、送達ドメインは、Kremenリガンド（例えばDKK1）またはそのKremen結合部分を含むか、またはそれからなることがある。別の例として、IEがASGR1などの受容体分子である場合、送達ドメインは、受容体（例えば、アシアロオロソムコイド[ASOR]またはベータ-Ga1NAc）またはその受容体結合部分に特異的なリガンドを含むか、またはそれからなることがある。
【００９５】
細胞内へ間接的に内部移行される内部移行エフェクタータンパク質としては、それら自身では内部移行しないが、細胞内へ直接的に内部移行される第二のタンパク質またはポリペプチドと結合またはその他会合した後に細胞内へ内部移行されてゆく、タンパク質およびポリペプチドが挙げられる。細胞内へ間接的に内部移行されるタンパク質としては、例えば、内部移行する細胞の表面に発現される受容体分子と結合できる可溶性リガンドを挙げることができる。内部移行する細胞の表面に発現される受容体分子とのその相互作用を介して細胞内へ（間接的に）内部移行される、可溶性リガンドの非限定的な例は、トランスフェリンである。IEがトランスフェリン（または別の間接的に内部移行されるタンパク質）である実施形態において、送達ドメインとIEとの結合、およびIEとトランスフェリン受容体（または内部移行する細胞の表面に発現される別の受容体分子）との相互作用により、送達ドメイン全体およびそれと関連する任意の分子（例えば酵素）が細胞内へ内部移行されるようになり、同時にIEとその結合パートナーが内部移行される。
【００９６】
IEが細胞内に間接的に内部移行される実施形態において、送達ドメインは、例えば、IEと特異的に結合する抗体、抗体の抗原結合断片、もしくはscFv、または可溶性エフェクタータンパク質と特異的に相互作用する受容体もしくは受容体の一部であり得る。例えば、IEがサイトカインである場合、送達ドメインは、対応するサイトカイン受容体またはそのリガンド結合部分を含むか、またはそれからなることがある。
【００９７】
IEの典型例はCD63であり、それは細胞膜を4回貫通する細胞表面タンパク質のテトラスパニンスーパーファミリーのメンバーである。CD63は、ほぼ全ての組織で発現し、シグナル伝達複合体の形成および安定化に関与していると考えられている。CD63は、細胞膜、リソソーム膜、および後期エンドソーム膜に局在化している。CD63は、インテグリンと会合することが知られており、また上皮間葉転移に関与している可能性がある。H.  Maecker  et  al.,  “The  tetraspanin  superfamily:  molecular  facilitators,”  11(6)  FASEB  J.  428-42,  May  1997;  and  M.  Metzelaar  et  al.,  “CD63  antigen.  A  novel  lysosomal  membrane  glycoprotein,  cloned  by  a  screening  procedure  for  intracellular  antigens  in  eukaryotic  cells,”  266  J.  Biol.  Chem.  3239-3245,  1991を参照されたい。
【００９８】
IEの別の典型例は、アミロイドベータ（A4）前駆体様タンパク質2（「APLP2」）であり、これはAPP（アミロイド前駆体タンパク質）ファミリーの遍在発現メンバーである。APLP2は、主要組織適合複合体（MHC）クラスI分子（例えばKd）と相互作用することが知られている膜結合タンパク質である。それは細胞表面でKdと結合し、クラスリン依存的にKdと共に牽引されて内部移行される。Tuli  et  al.,  “Mechanism  for  amyloid  precursor-like  protein  2  enhancement  of  major  histocompatibility  complex  class  I  molecule  degradation,”  284  The  Journal  of  Biological  Chemistry  34296  -34307  (2009)を参照されたい。
【００９９】
IEの別の典型例は、プロラクチン受容体（PRLR）である。プロラクチン受容体は、I型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーであり、リガンドに結合しそれに続いて二量体化すると、「チロシンキナーゼのJak2、Fyn、およびTec、ホスファターゼSHP-2、グアニンヌクレオチド交換因子Vav、ならびにシグナル伝達抑制因子SOCS」を活性化する（Clevenger  and  Kline,  “Prolactin  receptor  signal  transduction,”  10(10)  Lupus  706-18  (2001),  要約を参照）。プロラクチン受容体は、エンドサイトーシス再循環を経て、リソソーム画分内で見出され得る。Genty  et  al.,  “Endocytosis  and  degradation  of  prolactin  and  its  receptor  in  Chinese  hamster  ovary  cells  stably  transfected  with  prolactin  receptor  cDNA,”  99(2)  Mol.  Cell  Endocrinol.  221-8  (1994);  and  Ferland  et  al.,  “The  effect  of  chloroquine  on  lysosomal  prolactin  receptors  in  rat  liver,”  115(5)  Endocrinology  1842-9  (1984)を参照されたい。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「免疫反応」は、通例、外部または「非自己」のタンパク質に対する患者の免疫学的応答を意味する。免疫学的応答は、アレルギー反応、および補充酵素の有効性を妨げる抗体の発生を含む。一部の患者は、非機能性タンパク質のいずれも産生することはなく、それゆえ補充酵素を「異種」タンパク質にする場合がある。例えば、GLAが欠乏しているファブリー病患者への組換えGLA（rGLA）の反復注射は、アレルギー反応を引き起こすことが多い。他の患者では、rGLAに対する抗体の産生により、疾患の治療における補充酵素の有効性が減少することが示されている。例えば、改変NAGAを「アイソザイム」として使用してGLAを補充することについて論じている、Tajima  et  al.  （“Use  of  a  Modified  α-N-Acetylgalactosaminidase  (NAGA)  in  the  Development  of  Enzyme  Replacement  Therapy  for  Fabry  Disease,”  85(5)  Am.  J.  Hum.  Genet.  569-580  (2009)）を参照されたい。改変NAGAは、GLAとの免疫学的交差反応性を有さず、「組換えGLAを用いて繰り返し治療されているファブリー病患者由来の血清に対して反応しなかった」  （前掲の文献、要約）。
【０１０１】
「免疫抑制剤」は、全般的な免疫抑制を結果として生じる薬物および／またはタンパク質を含み、ポンペ病またはファブリー病を有する患者において、補充酵素、例えばそれぞれGAAまたはGLAに対する交差反応性免疫学的物質（CRIM）を防ぐために使用されうる。免疫抑制剤の非限定的な例としては、メトトレキサート、ミコフェノール酸モフェチル、シクロホスファミド、ラパマイシンDNAアルキル化剤、抗CD20抗体、抗BAFF  抗体、抗CD3抗体、抗CD4抗体、およびそれらの任意の組み合わせが挙げられる。
【０１０２】
調節因子、例えば、例として肝臓などの組織に特異的なプロモーターは、その調節因子の特異的である組織において、そのような調節因子の制御下で、核酸配列、例えば遺伝子の発現を増強する。肝特異的な調節因子、例えば肝特異的プロモーターの非限定的な例は、Chuah  et  al.  (2014)  Mol.  Ther.  22:1605-13に見出されよう。
【０１０３】
用語「タンパク質」は、アミド結合を介して共有結合で連結されている約20個を超えるアミノ酸を有する任意のアミノ酸ポリマーを意味する。タンパク質は、一般に当該技術分野で「ポリペプチド」として知られる一つまたは複数のアミノ酸ポリマー鎖を含む。したがって、ポリペプチドは、タンパク質であってもよく、タンパク質は、複数のポリペプチドを含有して、単一機能性生体分子を形成することがある。ジスルフィド架橋（すなわち、シスチンを形成するようなシステイン残基間の）が、一部のタンパク質に存在することがある。これらの共有結合による連結が、単一のポリペプチド鎖内にあっても、二つの個々のポリペプチド鎖間にあってもよい。例えば、ジスルフィド架橋は、インスリン、イムノグロブリン類、およびプロタミンなどの適正な構造および機能に不可欠である。ジスルフィド結合形成の最近の総説として、Oka  and  Bulleid,  “Forming  disulfides  in  the  endoplasmic  reticulum,”  1833(11)  Biochim  Biophys  Acta  2425-9  (2013)を参照されたい。
【０１０４】
本明細書で使用される際に、「タンパク質」は、生物学的治療用タンパク質、研究または治療法で使用される組換えタンパク質、トラップタンパク質および他のFc融合タンパク質、キメラタンパク質、抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、二重特異性抗体、抗体断片、ナノボディ、組換え抗体キメラ、scFv融合タンパク質、サイトカイン、ケモカイン、ならびにペプチドホルモンなどを含む。タンパク質は、組換え細胞ベースの生産系、例えば、昆虫バキュロウイルス系、酵母系（例えばピキア属）、哺乳類系（例えば、CHO細胞、およびCHO-K1細胞などのCHO派生物）を用いて生産されてもよい。生物学的治療用タンパク質とその生産について論じている最近の総説として、Ghaderi  et  al.,  “Production  platforms  for  biotherapeutic  glycoproteins.  Occurrence,  impact,  and  challenges  of  non-human  sialylation,”  28  Biotechnol  Genet  Eng  Rev.  147-75  (2012)を参照されたい。
【０１０５】
用語「抗体」には、本明細書で使用される場合、四つのポリペプチド鎖、すなわちジスルフィド結合によって相互接続した二つの重（H）鎖と二つの軽（L）鎖とを含む、イムノグロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではHCVRまたはVHと省略される）と重鎖定常領域とを含む。重鎖定常領域は、CH1、CH2、およびCH3の三つのドメインを含む。軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではLCVRまたはVLと省略される）と軽鎖定常領域とを含む。軽鎖定常領域は、一つのドメインCLを含む。VH領域およびVL領域は、相補性決定領域（CDR）と称される超可変性の領域にさらに細分化することができ、CDRは、フレームワーク領域（FR）と称されるさらに保存的な領域を挿し込まれている。各VHおよびVLは、三つのCDRおよび四つのFRから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端まで、以下の順序で配列される：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4（重鎖CDRは、HCDR1、HCDR2、およびHCDR3として省略されることがあり、軽鎖CDRは、LCDR1、LCDR2、およびLCDR3として省略されることがある）。用語「高親和性」抗体は、それらの標的への結合親和性が、表面プラズモン共鳴、例えばBIACORE（商標）  または溶液親和性ELISAによって測定された場合に、少なくとも10-9M、少なくとも10-10M、少なくとも10-11M、または少なくとも10-12Mである抗体を指す。用語「抗体」は、例えば、モノクローナルまたはポリクローナルなどの任意のタイプの抗体を包含し得る。さらに、抗体は、例えば、哺乳類または非哺乳類など、任意の起源であり得る。一実施形態では、抗体は、哺乳類であってもよいし鳥類であってもよい。さらなる実施形態では、抗体は、ヒト由来であってもよく、さらにヒトモノクローナル抗体であってもよい。
【０１０６】
語句「二重特異性抗体」は、二つ以上のエピトープを選択的に結合することができる抗体を含む。二重特異性抗体は、通例二つの異なる重鎖を含み、各重鎖は、異なるエピトープ―二つの異なる分子（例えば抗原）上または同一の分子（例えば同一の抗原）上のどちらかの―を特異的に結合する。二重特異性抗体が二つの異なるエピトープ（第一のエピトープおよび第二のエピトープ）を選択的に結合することができる場合、第一のエピトープに対する第一の重鎖の親和性は、一般的に、第二のエピトープに対する第一の重鎖の親和性よりも少なくとも1桁から2桁、または3桁もしくは4桁低く、その逆もまた同様である。二重特異性抗体により認識されるエピトープは、同一の標的の上にも異なる標的の上にも（例えば、同一のタンパク質の上にも異なるタンパク質の上にも）あり得る。二重特異性抗体は、例えば、同一の抗原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作製することができる。例えば、同一の抗原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合可能であり、こうした配列は、イムノグロブリン軽鎖を発現する細胞内で発現することができる。典型的な二重特異性抗体は、各々が三つの重鎖CDRとそれに続いて（N末端からC末端へ）CH1ドメイン、ヒンジ、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを有する二つの重鎖と、抗原結合特異性を付与しないが各重鎖と会合可能であるか、または各重鎖と会合できかつ重鎖抗原結合領域により結合される一つまたは複数のエピトープを結合できるか、または各重鎖と会合できかつ重鎖の一方もしくは両方をエピトープの一方もしくは両方に結合させることができるイムノグロブリン軽鎖とを有する。
【０１０７】
語句「重鎖」または「イムノグロブリン重鎖」は、任意の生物由来のイムノグロブリン重鎖定常領域配列を含み、別段に指定のない限り、重鎖可変ドメインを含む。別段の指定のない限り、重鎖可変ドメインは、三つの重鎖CDRと四つのFR領域とを含む。重鎖の断片としては、CDR、CDRおよびFR、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。典型的な重鎖は、可変ドメインに続いて（N末端からC末端へ）、CH1ドメイン、ヒンジ、CH2ドメイン、およびCH3ドメインを有する。重鎖の機能性断片としては、抗原を特異的に認識する（例えば、抗原をマイクロモル濃度、ナノモル濃度、またはピコモル濃度の範囲のKDで認識する）ことが可能であり、かつ細胞から発現および分泌することが可能であり、かつ少なくとも一つのCDRを含む、断片が挙げられる。
【０１０８】
語句「軽鎖」は、任意の生物由来のイムノグロブリン軽鎖定常領域配列を含み、別段の指定のない限り、ヒトカッパ軽鎖およびヒトラムダ軽鎖を含む。軽鎖可変（VL）ドメインは、別段の指定のない限り、典型的には三つの軽鎖CDRと四つのフレームワーク（FR）領域とを含む。一般に、完全長の軽鎖は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4を含むVLドメインと、軽鎖定常ドメインとを含む。本発明で使用可能な軽鎖は、例えば、抗原結合タンパク質が選択的に結合する第一の抗原と第二の抗原のどちらにも選択的に結合しない軽鎖を含む。適切な軽鎖としては、既存の抗体ライブラリー（ウェットライブラリーまたはin  silico）で最も一般的に採用される軽鎖をスクリーニングすることによって特定できるものが挙げられ、この軽鎖は、抗原結合タンパク質の抗原結合ドメインの親和性および／または選択性に実質的に干渉しない。適切な軽鎖としては、抗原結合タンパク質の抗原結合領域が結合するエピトープの一方または両方を結合できる軽鎖が挙げられる。
【０１０９】
語句「可変ドメイン」は、以下のアミノ酸領域をN末端からC末端の配列に（別段に明記されない限り）含む、（所望通りに改変済みの）イムノグロブリン軽鎖または重鎖のアミノ酸配列を含む：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。「可変ドメイン」は、2連のベータシート構造を有する標準ドメイン（VHまたはVL）内にフォールディングできるアミノ酸配列を含み、このベータシートは、第一のベータシートと第二のベータシートの残基間をジスルフィド結合によって連結されている。
【０１１０】
語句「相補性決定領域」または用語「CDR」は、生物のイムノグロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、この配列は、通常（すなわち野生型動物では）イムノグロブリン分子（例えば、抗体またはT細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域における二つのフレームワーク領域の間に見られる。CDRは、例えば生殖系列配列または再構成もしくは非再構成の配列によってコードされ、例えば、ナイーヴB細胞もしくは成熟B細胞またはT細胞によってコードされ得る。一部の状況（例えばCDR3について）では、CDRは、二つ以上の配列（例えば生殖系列配列）によってコードでき、それらの配列は（例えば、再構成されていない核酸配列では）連続していないが、B細胞の核酸配列では、例えば、配列のスプライシングまたは接続（例えば、重鎖CDR3を形成するためのV-D-J再構成）の結果として、連続している。
【０１１１】
用語「抗体断片」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の一つまたは複数の断片を指す。用語「抗体断片」の中に包含される結合断片の例としては、（i）VLドメイン、VHドメイン、CLドメイン、およびCH1ドメインからなる一価断片であるFab断片；（ii）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された二つのFab断片を含む二価断片であるF(ab')2断片；（iii）VHドメインおよびCH1ドメインからなるFd断片；（iv）抗体の単一アームのVLドメインおよびVHドメインからなるFv断片、（v）VHドメインからなるdAb断片（Ward  et  al.  (1989)  Nature  241:544-546）、（vi）単離されたCDR、ならびに（vii）Fv断片の二つのドメインであるVLおよびVHからなり、合成リンカーによって接続されて単一タンパク質鎖を形成し、その鎖ではVL領域とVH領域とがペアリングして一価分子を形成している、scFvが挙げられる。ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態も、用語「抗体」の下に包含される（例えば、Holliger  et  al.  (1993)  PNAS  USA  90:6444-6448;  Poljak  et  al.  (1994)  Structure  2:1121-1123を参照）。
【０１１２】
語句「Fc含有タンパク質」は、イムノグロブリンのCH2領域およびCH3領域の少なくとも機能性部分を含む、抗体、二重特異性抗体、イムノアドヘシン、および他の結合タンパク質を含む。「機能性部分」は、Fc受容体（例えば、FcyRまたはFcRn、すなわち胎児性Fc受容体）を結合できる、および／または補体の活性化に関与できるCH2領域およびCH3領域を指す。CH2領域およびCH3領域が、任意のFc受容体を結合不能にしかつ補体の活性化も不能にする欠失、置換、および／もしくは挿入、または他の修飾を含有する場合、CH2領域およびCH3領域は、機能的ではない。
【０１１３】
Fc含有タンパク質は、イムノグロブリンドメインに改変を含むことができ、そのような改変は、当該改変が結合タンパク質の一つまたは複数のエフェクター機能に影響を及ぼす場合（例えば、FcyR結合、FcRn結合、ならびにそれゆえ半減期および／またはCDC活性に影響を及ぼす改変）を含む。そのような改変としては、以下に限定されないが、イムノグロブリン定常領域のEU付番を参照して、以下の改変およびそれらの組み合わせが挙げられる：238、239、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438、および439。
【０１１４】
例えば、限定を意図されず、結合タンパク質は、Fc含有タンパク質であり、（記載された改変を含まない同一のFc含有タンパク質と比較して）血清半減期の改善を示し、250位（例えば、EもしくはQ）；250位および428位（例えば、LもしくはF）；252位（例えば、L/Y/F/WもしくはT）、254位（例えば、SもしくはT）、および256位（例えば、S/R/Q/E/DもしくはT）での改変；または428位および／もしくは433位（例えば、L/R/SI/P/QもしくはK）および／もしくは434位（例えば、H/FもしくはY）での改変；または250位および／もしくは428位での改変；または307位もしくは308位（例えば、308F、V308F）、および434位での改変を有する。別の例では、改変は、428L（例えば、M428L）および434S（例えば、N434S）の改変；428L、2591（例えば、V259I）、および308F（例えば、V308F）の改変；433K（例えば、H433K）および434（例えば、434Y）の改変；252、254、および256（例えば、252Y、254T、および256E）の改変；250Qおよび428Lの改変（例えば、T250QおよびM428L）；307および／または308の改変（例えば、308Fもしくは308P）を含み得る。
【０１１５】
用語「抗原結合タンパク質」は、本明細書で使用される場合、抗原、例えば細胞特異的抗原および／または本発明の標的抗原などのエピトープを、特異的に認識するポリペプチドまたはタンパク質（機能単位で複合体化した一つまたは複数のポリペプチド）を指す。抗原結合タンパク質は、多重特異性であってもよい。抗原結合タンパク質に関連する用語「多重特異性」は、そのタンパク質が同一の抗原上または異なる抗原上のどちらかにおいて異なるエピトープを認識することを意味する。本発明の多重特異性抗原結合タンパク質は、単一の多機能性ポリペプチドであり得るか、または相互に共有結合でまたは非共有結合で会合した二つ以上のポリペプチドの多量体複合体であり得る。用語「抗原結合タンパク質」は、別の機能性分子、例えば、別のペプチドまたはタンパク質と連結し得るかまたは共発現し得る、本発明の抗体またはその断片を含む。例えば、抗体またはその断片は、一つまたは複数の他の分子実体、例えばタンパク質またはその断片などに、（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合による会合、またはその他により）機能的に連結して、第二の結合特異性を有する二重特異性または多重特異性の抗原結合分子を産生することができる。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、用語「エピトープ」は、多重特異性抗原結合ポリペプチドによって認識される抗原の一部分を指す。単一抗原（抗原ポリペプチドなど）が、二つ以上のエピトープを有していてもよい。エピトープは、構造的または機能的として定義され得る。機能的エピトープは一般に、構造的エピトープのサブセットであり、抗原結合ポリペプチドと抗原との間の相互作用の親和性に直接的に寄与する残基として定義される。エピトープはまた、高次構造的、すなわち、非直線状アミノ酸で構成されていてもよい。特定の実施形態では、エピトープは、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基、またはスルホニル基などの分子の化学的活性表面基である決定基を含んでもよく、特定の実施形態では、特定の3次元構造特性および／または特定の荷電特性を有してもよい。連続したアミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への露出に際して保持されるのに対して、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒による処理に際して損なわれる。
【０１１７】
用語「ドメイン」は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の部分を指す。好ましくは、本発明のドメインは、細胞特異的抗原または標的抗原に結合する。細胞特異的抗原ドメインまたは標的抗原結合ドメインなどは、本明細書で使用される場合、天然に発生したか、酵素的に入手可能であるか、合成であるか、または遺伝子改変されており、かつ抗原を特異的に結合する、任意のポリペプチドまたは糖タンパク質を含む。
【０１１８】
用語「半抗体（half-body）」または「半抗体（half-antibody）」は、互換的に用いられ、一つの重鎖と一つの軽鎖とを本質的に含有する抗体の半分を指す。抗体重鎖は、二量体を形成することができ、それゆえ一つの半抗体の重鎖は、異なる分子（例えば、別の半抗体）または別のFc含有ポリペプチドと会合している重鎖と会合することができる。二つの僅かに異なるFcドメインは、二重特異性抗体、または他のヘテロ二量体、ヘテロ三量体、およびヘテロ四量体などの形成にあるように「ヘテロ二量体化」し得る。Vincent  and  Murini,  “Current  strategies  in  antibody  engineering:  Fc  engineering  and  pH-dependent  antigen  binding,  bispecific  antibodies  and  antibody  drug  conjugates,”  7  Biotechnol.  J.  1444-1450  (20912);  and  Shimamoto  et  al.,  “Peptibodies:  A  flexible  alternative  format  to  antibodies,”  4(5)  MAbs  586-91  (2012)を参照されたい。
【０１１９】
一実施形態では、半抗体可変ドメインは内部移行エフェクターを特異的に認識し、半抗体のFcドメインは補充酵素（例えば、ペプチボディ）を含むFc融合タンパク質と二量体化する（同上文献の586ページ）。
【０１２０】
「単鎖可変断片」または「scFv」という用語は、イムノグロブリン重鎖可変領域（VH）およびイムノグロブリン軽鎖可変領域（VL）を含有する単鎖融合ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、VH及びVLは、10から25アミノ酸のリンカー配列によって接続される。ScFvポリペプチドは、CL領域またはCH1領域などの他のアミノ酸配列も含みうる。ScFv分子は、ファージディスプレイによって製造されてもよいし、ハイブリドーマまたはB細胞から重鎖および軽鎖を直接的にサブクローニングすることによって作製してもよい。Ahmad  et  al.,  Clinical  and  Developmental  Immunology,  volume  2012,  article  ID  98025は、ファージディスプレイおよび抗体ドメインクローニングによりscFv断片を作製する方法について、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
「アルファ-グルコシダーゼ」（または「α-グルコシダーゼ」）、「α-グルコシダーゼ活性」、「GAA」、および「GAA活性」は互換的に用いられ、グリコーゲンおよびデンプンの1,4-アルファ結合を加水分解してグルコースにすることを促進する任意のタンパク質を意味する指す。GAAは、特に、EC  3.2.1.20、マルターゼ、グルコインべルターゼ、グルコシドスクラーゼ、マルターゼ・グルコアミラーゼ、アルファ-グルコピラノシダーゼ、グルコシドインベルターゼ、アルファ-D-グルコシダーゼ、アルファ-グルコシドヒドロラーゼ、アルファ-1,4-グルコシダーゼ、およびアルファ-D-グルコシドグルコヒドロラーゼとしても知られている。GAAは、リソソーム内、および小腸の刷子縁に見出され得る。ポンペ病に罹患している患者は、機能性リソソームα-グルコシダーゼが欠乏している。S.  Chiba,  “Molecular  mechanism  in  alpha-glucosidase  and  glucoamylase,”  61(8)  Biosci.  Biotechnol.  1233-9  (1997)；およびHesselink  et  al.,  “Lysosomal  dysfunction  in  muscle  with  special  reference  to  glycogen  storage  disease  type  II,”  1637(2)  Biochim.  Biophys.  Acta.  164-70  (2003)を参照されたい。
【０１２２】
「アルファ-ガラクトシダーゼA」（または「α-ガラクトシダーゼA」）、「α-ガラクトシダーゼA活性」、「α-ガラクトシダーゼ」、「α-ガラクトシダーゼ活性」、「GLA」、および「GLA活性」は、互換的に用いられ、糖脂質および糖タンパク質由来の末端α-ガラクトシル部分の加水分解を促進し、またα-D-フコシドを加水分解する任意のタンパク質を意味する。GLAは、特に、EC  3.2.1.22、メリビアーゼ、α-D-ガラクトシダーゼ、α-ガラクトシダーゼA、α-ガラクトシドガラクトヒドロラーゼ、α-D-ガラクトシドガラクトヒドロラーゼとしても知られている。GLAは、X連鎖GLA遺伝子によりコードされるリソソーム酵素である。GLAの欠陥によりファブリー病が引き起こされ得るが、その場合、グロボトリアオシルセラミド（別名Gb3、GL-3、またはセラミドトリヘキソシド）として知られる糖脂質が血管内に蓄積し（すなわち、隆起血管障害）、その結果、疼痛や、腎臓、心臓、皮膚、および／または脳血管組織、ならびに他の組織および器官の機能に障害をもたらす。例えば、Prabakaran  et  al.  “Mannose  6-phosphate  receptor  and  sortilin  mediated  endocytosis  of  α-galactosidase  A  in  kidney  endothelial  cells,”  7(6)  PLoS  One  e39975  pp.  1-9  (2012)を参照されたい。
【０１２３】
一態様では、本発明は、リソソーム蓄積症に罹患している患者（または対象）に「マルチドメイン治療用タンパク質」を投与することによって、該患者を治療する方法を提供する。マルチドメイン治療用タンパク質は、患者の細胞に入り、LSDに関連のある酵素（すなわち「内因性酵素」）または酵素活性を補充する酵素または酵素活性（すなわち「補充酵素」）をリソソームに送達する。一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子療法ベクターを介して患者に送達される。
【０１２４】
LSDとしては、スフィンゴ脂質蓄積症、ムコ多糖症、およびグリコーゲン蓄積症が挙げられる。一部の実施形態では、LSDは、ファブリー病、ゴーシェ病I型、ゴーシェ病II型、ゴーシェ病III型、ニーマン・ピック病A型、ニーマン・ピック病B型、GM1-ガングリオシドーシス、サンドホフ病、テイ・サックス病、GM2-活性化因子欠損症、GM3-ガングリオシドーシス、異染性白質ジストロフィー、スフィンゴ脂質活性化因子欠損症、シャイエ病、ハーラー・シャイエ病、ハーラー病、ハンター病、サンフィリポA、サンフィリポB、サンフィリポC、サンフィリポD、モルキオ症候群A、モルキオ症候群B、マロトー・ラミー病、スライ病、MPS  IX、およびポンペ病のうちの任意の一つまたは複数である。特定の一実施形態では、LSDはファブリー病である。別の実施形態では、LSDはポンペ病である。
【０１２５】
一部の実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、（a）補充酵素と、（b）内部移行エフェクターを結合する分子実体（送達ドメイン）とを含む。一部の実施形態では、補充酵素は、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、サポシン-C活性化因子、セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、β-ヘキソサミニダーゼ、GM2活性化因子、GM3シンターゼ、アリールスルファターゼ、スフィンゴ脂質活性化因子、α-イズロニダーゼ、イズロニダーゼ-2-スルファターゼ、ヘパリンN-スルファターゼ、N-アセチル-α-グルコサミニダーゼ、α-グルコサミドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン-6-スルファターゼ、N-アセチルガラクトサミン-6-硫酸スルファターゼ、N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ、β-グルクロニダーゼ、およびヒアルロニダーゼのうちの任意の一つまたは複数である。
【０１２６】
場合によっては、患者は、補充酵素が患者によって「非自己」として認識されるのに十分なタンパク質を作製しないことがあり、補充酵素の投与後に続いて免疫反応が起こる。これは望ましくないことである。したがって、一部の実施形態では、補充酵素は、対象における免疫反応の誘導を回避するように設計または生産される。そのような解決策の一つは、補充酵素として「アイソザイム」を用いることである。アイソザイムは、患者の「自己」タンパク質に十分類似しているが、LSDの症状を緩和するのに十分な補充酵素活性を有する。
【０１２７】
LSDがポンペ病でありかつ内因性酵素がα-グルコシダーゼ（GAA）である特定の一実施形態では、アイソザイムは、酸性α-グルコシダーゼ、スクラーゼ・イソマルターゼ（SI）、マルターゼ・グルコアミラーゼ（MGAM）、グルコシダーゼII（GANAB）、および中性α-グルコシダーゼ（C  GNAC）のうちの任意の一つであり得る。LSDがファブリー病でありかつ内因性酵素がα-ガラクトシダーゼA（GLA）である特定の別の実施形態では、アイソザイムは、GLA活性を持つように工学的に操作されたα-N-アセチルガラクトサミニダーゼであり得る。
【０１２８】
本明細書に提供されるのは、補充酵素に対する交差反応性免疫学的物質（CRIM）を低減させるための、アイソザイムの使用以外の方法である。図5および図6に示されるように、内部移行エフェクター結合ドメインと酵素ドメインとを含むマルチドメイン治療用タンパク質の（例えば遺伝子療法ベクターを介した）投与は、対照の治療用タンパク質（内部移行エフェクタードメインを欠く、酵素ドメインを含む）の投与に含めて、補充酵素に対するCRIMのレベルを低減させる。したがって、一実施形態では、または、酵素の欠損を有する患者で酵素に対するCRIMを低減させることは、患者にマルチドメイン治療用タンパク質（または同一物をコードする核酸、例えば、マルチドメイン治療用タンパク質をコードする遺伝子を含有する遺伝子療法ベクターを投与することを含み、その場合、マルチドメイン治療用タンパク質は、送達ドメイン（例えば内部移行エフェクター結合タンパク質）および酵素ドメインとを含む。
【０１２９】
マルチドメイン治療用タンパク質は、補充酵素の細胞内への取り込みを可能にする内部移行エフェクター結合タンパク質成分を有する。したがって、一部の実施形態では、内部移行エフェクターは、CD63、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、トランスフェリン受容体、LDL-受容体、LDL関連タンパク質1受容体、ASGR1、ASGR2、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質-2（APLP2）、アペリン受容体（APLNR）、PRLR（プロラクチン受容体）、MAL（Myelin  And  Lymphocyteタンパク質、別名VIP17）、IGF2R、液胞型H+ATPアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体、SCARA1-5、SCARB1-3、およびCD36であり得る。ある実施形態では、内部移行エフェクターは、腎臓特異的インターナライザーであり、例えば、CDH16（Cadheri-16）、CLDN16（Claudn-16）、KL（Klotho）、PTH1R（副甲状腺ホルモン受容体）、SLC22A13（溶質輸送体ファミリー22メンバー13）、SLC5A2（ナトリウム／グルコース共輸送体2）、およびUMOD（ウロモジュリン）などである。他のある特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、筋特異的インターナライザーであり、例えば、BMPR1A（骨形態形成タンパク質受容体1A）、m-カドヘリン、CD9、MuSK（筋特異的キナーゼ）、LGR4/GPR48（Gタンパク質共役受容体48）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ1、CDH15（Cadheri-15）、ITGA7（インテグリンアルファ-7）、CACNG1（L型カルシウムチャネルサブユニットガンマ-1）、CACNAlS（L型カルシウムチャネルサブユニットアルファ-15）、CACNG6（L型カルシウムチャネルサブユニットガンマ-6）、SCN1B（ナトリウムチャネルサブユニットベータ-1）、CHRNA1（ACh受容体サブユニットアルファ）、CHRND（ACh受容体サブユニットデルタ）、LRRC14B（ロイシンリッチリピート含有タンパク質14B）、ジストログリカン  (DAG1)、およびPOPDC3（ポパイ（Popeye）ドメイン含有タンパク質3）などである。一部の特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、ITGA7、CD9、CD63、APLP2、ASGR1、ASGR2、またはPRLRである。
【０１３０】
一部の実施形態では、内部移行エフェクター結合タンパク質は、抗原結合タンパク質を含み、そのようなものとしては、例えば、受容体融合分子、トラップ分子、受容体Fc融合分子、抗体、Fab断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、一本鎖Fv（scFv）分子、dAb断片、単離相補性決定領域（CDR）、CDR3ペプチド、拘束FR3-CDR3-FR4ペプチド、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ、一価ナノボディ、二価ナノボディ、小モジュラー免疫薬（SMIP：small  modular  immunopharmaceutical）、ラクダ抗体（VHH重鎖ホモ二量体抗体）、およびサメ可変IgNARドメインが挙げられる。
【０１３１】
一実施形態では、内部移行エフェクターを結合する分子実体は、抗体、抗体断片、または他の抗原結合タンパク質である。例えば、分子実体は、二重特異性抗体とすることができ、そこでは、一方のアームが内部移行エフェクター（例えば、ITGA7、CD9、CD63、PRLR、APLP2、ASGR1、ASGR2）を結合し、他方のアームが補充酵素を結合する。ここで、マルチドメイン治療用タンパク質は、二重特異性抗体と補充酵素とを含む（図1Ａ）。特定の実施形態では、治療される疾患はファブリー病であり、マルチドメイン治療用タンパク質は、GLAと、GLAおよびCD63を結合する二重特異性抗体とを含む。特定の実施形態では、治療される疾患はファブリー病であり、マルチドメイン治療用タンパク質は、GLAと、GLAおよびITGA7を結合する二重特異性抗体とを含む。特定の別の実施形態では、治療される疾患はポンペ病であり、マルチドメイン治療用タンパク質は、GAAと、GAAおよびCD63を結合する二重特異性抗体とを含む。特定の別の実施形態では、治療される疾患はポンペ病であり、マルチドメイン治療用タンパク質は、GAAと、GAAおよびITGA7を結合する二重特異性抗体とを含む。
【０１３２】
別の実施形態では、内部移行エフェクターを結合する分子実体は、半抗体と、Fcドメインを含有する補充酵素（酵素-Fc融合ポリペプチド）とを含む。一実施形態では、酵素-Fc融合ポリペプチドのFcドメインが、内部移行エフェクター特異的半抗体のFcドメインと会合して、マルチドメイン治療用タンパク質を形成する（図1Ｂ）。
【０１３３】
他の実施形態では、補充酵素は,内部移行エフェクター結合タンパク質に共有結合で連結されている。前のパラグラフで述べた酵素-Fc融合：半抗体の実施形態（図1Ｂも参照）は、このクラスに属するが、それは、そのFc二量体を一つまたは複数のジスルフィド架橋を介して固定することができるためである。酵素活性ドメインまたはポリペプチドと、内部移行-結合ドメインまたはポリペプチドとの間の共有結合による連結は、任意の種類の共有結合、すなわち電子の共有に関与した任意の結合であってもよい。場合によっては、共有結合は、二つのアミノ酸の間のペプチド結合であり、それゆえに、補充酵素と内部移行エフェクター結合タンパク質とは、全体としてまたは部分的に、融合タンパク質にあるような連続ポリペプチド鎖を形成する。場合によっては、補充酵素部分と内部移行エフェクター結合タンパク質とが直接的に連結されている。他の場合では、リンカーを用いて二つの部分を繋ぐ。Chen  et  al.,  “Fusion  protein  linkers:  property,  design  and  functionality,”  65(10)  Adv  Drug  Deliv  Rev.  1357-69  (2013)を参照されたい。
【０１３４】
特定の実施形態では、補充酵素は、抗内部移行エフェクター抗体の重鎖のC末端に（図1Ｃを参照）、または軽鎖のC末端に（図1Ｅ）、共有結合で連結される。特定の別の実施形態では、補充酵素は、抗内部移行エフェクター抗体の重鎖のN末端に（図1Ｄを参照）、または軽鎖のN末端に（図1Ｆ）共有結合で連結される。別の特定の実施形態では、酵素は、抗内部移行エフェクターscFvドメインのC末端に連結される（図1G）。
【０１３５】
一部の場合では、特に補充酵素がリソソーム内で正常にタンパク質分解によりプロセシングされない場合には、切断可能なリンカーが、抗体-酵素融合体を含むマルチドメイン治療用タンパク質の実施形態に追加される。一部の実施形態では、a）立体的に大きな抗体を除去することによってできる限り酵素活性の保持の助けとするために、かつb）酵素のリソソーム内半減期をできる限り増加するために、カテプシン切断可能リンカーを抗体と補充酵素との間に挿入して、リソソーム内での抗体の除去を容易にする。
【０１３６】
特定の一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子療法ベクターで患者または細胞に送達される。一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、送達ドメインおよび酵素ドメインを含む。一部の実施形態では、送達ドメインは、内部移行エフェクター例えば、CD63、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、トランスフェリン受容体、LDL受容体、LDL関連タンパク質1受容体、ASGR1、ASGR2、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質2（APLP2）、アペリン受容体（APLNR）、MAL（Myelin  And  Lymphocyteタンパク質(MAL)、IGF2R、液胞型H+ATPアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体A1-5（SCARA1-5）、SCARB1-3、またはCD36などと結合する。一実施形態では、送達ドメインは、CD63に結合する単鎖可変断片（scFv）（すなわち抗CD63  scFv)である。別の実施形態では、送達ドメインは、ITGA7に結合する単鎖可変断片（scFv）（すなわち抗ITGA7  scFv)である。
【０１３７】
特定の一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質の酵素ドメインは、ヒドロラーゼを含む。特定の実施形態では、酵素ドメインは、グリコシラーゼであるヒドロラーゼを含む。より具体的な実施形態では、酵素ドメインは、グリコシダーゼであるグリコシラーゼを含む。より具体的な実施形態では、酵素ドメインは、アルファ-グルコシダーゼであるグリコシダーゼである。
【０１３８】
一般的に、本明細書に開示されるのは、例えば、ポンペ病の患者におけるグリコーゲンの減少および／またはGAAに対する免疫寛容の増強のための、リソソーム蓄積症の治療における内部移行エフェクタードメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド、例えば、(m)RNA、DNA、およびそれらの修飾形態を含む組成物およびその使用である。
【０１３９】
「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも一つのポリペプチドをコードするヌクレオチド（例えば、RNAまたはDNA）のポリマーを含み、そのようなポリペプチドとしては、融合ポリペプチド、例えば、内部移行エフェクタードメインおよび酵素ドメインを含むマルチドメイン治療ポリペプチドが挙げられる。本明細書で使用される際に、ポリヌクレオチドは、修飾および非修飾の両方のヌクレオチドを含むポリマーを包含する。ポリヌクレオチドは、一つまたは複数のコード領域および非コード領域を含有してもよい。ポリヌクレオチドは、天然源から精製され、組み換え発現系を用いて製造され、任意選択的に精製され、化学的に合成されることなどがあり得る。適切な場合、例えば、化学的に合成された分子の場合、ポリヌクレオチドは、化学修飾された塩基類または糖類を有する類似体、骨格修飾などのヌクレオチド類似体を含むことができる。別段の指示がない限り、ポリヌクレオチド配列は、5’から3’の方向に提示される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然のヌクレオシド類  (例えば、  アデノシン、  グアノシン、  シチジン、  ウリジン);  ヌクレオシド類似体  (例えば、  2-アミノアデノシン、  2-チオチミジン、イノシン、  ピロロ-ピリミジン、  3-メチル  アデノシン、  5-メチルシチジン、  C-5  プロピニル-シチジン、  C-5  プロピニル-ウリジン、  2-アミノアデノシン、  C5-ブロモウリジン、  C5-フルオロウリジン、  C5-ヨードウリジン、  C5-プロピニル-ウリジン、  C5-プロピニル-シチジン、  C5-メチルシチジン、  2-アミノアデノシン、  7-デアザアデノシン、  7-デアザグアノシン、  8-オキソアデノシン、  8-オキソグアノシン、  O(6)-メチルグアニン、  および  2-チオシチジン);  化学修飾塩基類;  生物学的修飾塩基類  (例えば、  メチル化塩基);  介在塩基類;  修飾糖類(例えば、  2'-フルオロリボース、  リボース、  2'-デオキシリボース、アラビノース、  およびヘキソース);ならびに／または修飾リン酸基類(例えば、ホスホロチオエートおよび5'-N-ホスホロアミダイト結合)であるかまたはそれを含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、一つまたは複数の非標準ヌクレオチド残基を含む。非標準ヌクレオチド残基は、例えば、5-メチル-シチジン（"5mC"）、シュードウリジン（".psi.U"）、および／または2-チオ-ウリジン（"2sU"）を含み得る。例えば、それぞれがそのような残基とポリヌクレオチド内へのそれらの組み込みの議論について参照によりその全体を組み込まれる、米国特許第8,278,036号または国際特許出願公開第2011012316号を参照されたい。非標準ヌクレオチド残基の存在によって、ポリヌクレオチドは、対照よりも、すなわち同じ配列を有するが標準残基のみを含有するポリヌクレオチドよりも、安定なおよび／または免疫原性の低いものとなり得る。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、イソシトサイン、シュードシトシン、5-ブロモウラシル、5-プロピニルウラシル、6-アミノプリン、2-アミノプリン、イノシン、ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンシトシン、ならびにこれらの修飾および他の核酸塩基の修飾の組合せから選択される一つまたは複数の非標準ヌクレオチド残基を含みうる。特定の実施形態は、フラノース環または核酸塩基への追加的な修飾をさらに含みうる。追加的な修飾としては、例えば、糖の修飾または置換を含みうる（例えば、一つまたは複数の2'-O-アルキル修飾であるロックされた核酸（ＬＮＡ）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、追加のポリヌクレオチドおよび／またはペプチドポリヌクレオチド（ＰＮＡ）と複合体を形成していてもよいし、ハイブリダイズしていてもよい。糖の修飾が2'-O-アルキル修飾である実施形態では、そのような修飾としては、以下に限定されないが、2'-デオキシ-2'-フルオロ修飾、2'-O-メチル修飾、2'-O-メトキシエチル修飾、および2'-デオキシ修飾が挙げられる。ある特定の実施形態では、これらの修飾のいずれかは、ヌクレオチドの0%〜100%に、例えば、個別でまたは組み合わせで成分ヌクレオチドの0%、1%、10%、25%、50%、75%、85%、90%、95%、または100%に、存在することがある。  一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、メッセンジャーRNA（mRNA）分子を含み、それは、その安定性を増加させるためのおよび／またはその免疫原性を減少させるための周知の方法によって、修飾されていることもいないこともあり、例えば、修飾ヌクレオチドを含むことも含まないこともある。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、DNA分子を含み、それは、その安定性を増加させるためのおよび／またはその免疫原性を低下させるための周知の方法によって、修飾されていることもいないこともあり、例えば、修飾ヌクレオチドを含むことも含まないこともある。
【０１４１】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはまた、「遺伝子座ターゲティング核酸配列」を含む。遺伝子座を標的とする配列は、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドをレシピエント宿主細胞のゲノムへ組み込むことを可能にする。一部の実施形態では、遺伝子座ターゲティング配列は、相同組み換えを可能にするための隣接する相同アームを含む。一部の実施形態では、遺伝子座ターゲティング配列は、組み込みを推進するガイドRNA配列およびII型Cas酵素（すなわち、  CRISPR-Cas9法）を含む。一部の実施形態では、遺伝子座ターゲティング配列は、組込みを推進するためのガイドジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）認識配列を含む。一部の実施形態では、遺伝子座ターゲティング配列は、組込みを推進するための転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）認識配列を含む。さらに他の実施形態では、遺伝子座ターゲティング配列は、組込みを推進するためのBuD由来ヌクレアーゼによって使用される単一の残基対ヌクレオチドコードを含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドが組み込まれているゲノム遺伝子座は、「セーフハーバー遺伝子座」である。一実施形態では、「セーフハーバー遺伝子」は、マルチドメイン治療用タンパク質の高い発現を可能にする一方で、必須遺伝子の発現に干渉しないか、または癌遺伝子もしくは他の有害遺伝子の発現を促進しない。一実施形態では、ゲノム遺伝子座は、肝臓で発現されるアルブミン(Alb)遺伝子座、EESYR  遺伝子座、SARS遺伝子座、ヒト第1番染色体の188,083,272  位もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、ヒト第10番染色体の3,046,320位もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、ヒト第17番染色体の67,  328,980もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、染色体上のアデノ関連ウイルス部位1  (AAVS1)  、ヒト第19番染色体上のAAV  ウイルスの天然発生の組込み部位もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、ケモカイン受容体5  (CCR5)遺伝子、HIV-1共受容体をコードするケモカイン受容体遺伝子、またはマウスRosa26遺伝子座もしくはその非マウス哺乳動物のオルソログである。一実施形態では、ゲノム遺伝子座は、アデノ関連ウイルス部位である。一実施形態では、組込みのためのゲノム遺伝子座は、遺伝子療法ベクターの組込みに用いるセーフハーバーゲノム遺伝子座のステップワイズ選択のために参照により本明細書に組み込まれるPapapetrou  and  Schambach,  J.  Molecular  Therapy,  vol.  24  (4):678-684、2016年4月の方法に従って選択されるが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる肝臓発現アルブミン(Alb)遺伝子座内のプロモーターレス遺伝子ターゲティングについてのBarzel  et  al.  Nature、vol.  517:360-364も参照されたい。
【０１４３】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド、例えばDNAは、マルチドメイン治療用タンパク質をコードする核酸配列に動作可能に連結されたプロモーターも含有する。特定の実施形態では、プロモーターは、特定の組織における遺伝子発現を駆動する組織特異的プロモーターである。一実施形態では、組織特異的プロモーターは、セルピナ1（例えば配列番号9）および／またはＴＴＲプロモーター（配列番号8）由来の肝特異的なエンハンサー／プロモーターである。他の実施形態では、プロモーターはCMVプロモーターである。他の実施形態では、プロモーターはユビキチンCプロモーターである
【０１４４】
一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質をコードする「遺伝子療法ベクター」は、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを宿主、例えば患者などに送達することが可能な任意のベクターである。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、例えば、局所送達、例えば組織特異的送達のために、特定の宿主細胞または器官を標的とする。典型的には、局所送達は、主に器官、例えば肝臓でおよび／またはそれにより翻訳および発現される、mRNAによってコードされるタンパク質（例えばマルチドメイン治療用タンパク質）を必要とし、それによってデポ、例えばタンパク質の産生（および分泌）のための肝臓デポを形成する。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、患者の肝臓にマルチドメイン治療用タンパク質のポリヌクレオチドを送達して肝臓デポを形成する。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるDerosa  et  al.  Gene  Therapy,  vol.  10:699-707を参照されたい。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、患者においてマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを筋組織に送達する。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、マルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを患者の脳に送達する。
【０１４５】
既知のまたは将来的に開発される遺伝子療法送達ベクターを、天然のものでも工学的に操作されたものでも、本発明の実践に用いることができる。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ウイルスベクターであり、例えば、ウイルス、ウイルスキャプシド、ウイルスゲノムなどを含む。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、裸のポリヌクレオチド、例えばエピソームである。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ポリヌクレオチド複合体を含む。遺伝子療法ベクターとして使用するための例示的で非限定的なポリヌクレオチド複合体としては、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリペックス、デンドリマー、無機ナノ粒子（例えば、ポリヌクレオチド被覆金、シリカ、酸化鉄、リン酸カルシウムなど）が挙げられる。一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子療法ベクターは、ウイルスベクター、裸のポリヌクレオチド、およびポリヌクレオチド複合体の組み合わせを含む。
【０１４６】
一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、ウイルスであり、そのようなものとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、またはアデノ関連ウイルスが挙げられる。一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、アデノ関連ウイルス（AAV）であり、そのようなものとしては、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、およびAAV11、またはそれらの工学的に操作されたもしくは天然の選択されたバリアントが挙げられる。
【０１４７】
一実施形態では、ポリヌクレオチドはまた、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）核酸配列を含有する。一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、二つ以上の血清型に由来する遺伝子因子を含有するキメラアデノ関連ウイルスである。例えば、AAV1由来のrep遺伝子とAAV2由来のcap遺伝子とを有するAAVベクター（AAV1/2またはAAV  RC1/2とよぶ）が、マルチドメイン治療用タンパク質のポリヌクレオチドを細胞または必要とする患者の細胞に送達するための遺伝子療法ベクターとして、使用されてもよい。一実施形態では、遺伝子療法ベクターは、AAV1/2、AAV1/3、AAV1/4、AAV1/5、AAV1/6、AAV1/7、AAV1/8、AAV1/9、AAV1/10、AAV1/11、AAV2/1、AAV2/3、AAV2/4、AAV2/5、AAV2/6、AAV2/7、AAV2/8、AAV2/9、AAV2/10、AAV2/11、AAV3/1、AAV3/2、AAV3/4、AAV3/5、AAV3/6、AAV3/7、AAV3/8、AAV3/9、AAV3/10、AAV3/10、AAV4/1、AAV4/2、AAV4/3、AAV4/5、AAV4/6、AAV4/7、AAV4/8、AAV4/9、AAV4/10、AAV4/11、AAV5/1、AAV5/2、AAV5/3、AAV5/4、AAV5/6、AAV5/7、AAV5/8、AAV5/9、AAV5/10、AAV5/11、AAV6/1、AAV6/2、AAV6/3、AAV6/4、AAV6/5、AAV6/7、AAV6/8、AAV6/9、AAV6/10、AAV6/10、AAV7/1、AAV7/2、AAV7/3、AAV7/4、AAV7/5、AAV7/6、AAV7/8、AAV7/9、AAV7/10、AAV7/11、AAV8/1、AAV8/2、AAV8/3、AAV8/4、AAV8/5、AAV8/6、AAV8/7、AAV8/9、AAV8/10、AAV8/11、AAV9/1、AAV9/2、AAV9/3、AAV9/4、AAV9/5、AAV9/6、AAV9/7、AAV9/8、AAV9/10、AAV9/11、AAV10/1、AAV10/2、AAV10/3、AAV10/4、AAV10/5、AAV10/6、AAV10/7、AAV10/8、AAV10/9、AAV10/11、AAV11/1、AAV11/2、AAV11/3、AAV11/4、AAV11/5、AAV11/6、AAV11/7、AAV11/8、AAV11/9、AAV11/10、それらのキメラビリオンまたは誘導体である。Gao  et  al.,  “Novel  adeno-associated  viruses  from  rhesus  monkeys  as  vectors  for  human  gene  therapy,”  PNAS  99(18):  11854-11859、Sep.  3、2002は、遺伝子療法ベクターとして有用なAAVベクターおよびキメラビリオン、ならびにそれらの構築対および使用のために、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１４８】
より具体的な実施形態では、遺伝子療法ベクターは、血清型2のrep遺伝子配列および血清型8のcap配列（「AAV2/8」または「AAV  RC2/8）を有するキメラAAV  ベクターである。
【０１４９】
一部の実施形態では、遺伝子療法ベクターは、特定の細胞、例えば肝細胞を標的とするためにシュードタイプ化されてきた（例えば、工学的に操作されてきた）ウイルスベクターである。ウイルスベクターを使用した標的遺伝子療法の進歩の多くは、ウイルスベクターの組換えによらない（遺伝子によらない）または組換えによる（遺伝子による）改変であり、その結果、ウイルスベクターの天然の向性のシュードタイプ化、拡張、および／または再標的化がもたらされるものとして、まとめられ得る。(Nicklin  and  Baker  (2002)  Curr.  Gene  Ther.  2:273-93;  Verheiji  and  Rottier  (2012)  Advances  Virol  2012:1-15に概説されている）。遺伝子によらないアプローチは、典型的には、野生型（非修飾型）ウイルス表面タンパク質と標的細胞との両方を認識するアダプターを利用する。可溶性シュード受容体（野生型ウイルスに対する）、ポリエチレングリコールなどのポリマー、および抗体またはその一部が、アダプターのウイルス結合ドメインとして使用されてきたが、一方で、天然ペプチドまたはビタミンリガンド、ならびに抗体およびその一部が、上記のアダプターの細胞結合ドメインに使用されてきた。例えば、標的細胞へのウイルスベクターの再標的化は、ベクター:アダプター複合体を、標的細胞の表面に発現されたタンパク質、例えば細胞表面タンパク質に結合すると達成され得る。そのようなアプローチは、AAV（Bartlett  et  al.  (1999)  Nat.  Biotechnol.  74:  2777-2785)、アデノウイルス（Hemminki  et  al.  (2001)  Cancer  Res.  61:  6377-81;  van  Beusechem  et  al.  (2003)  Gene  Therapy  10:1982-1991;  Einfeld,  et  al.  (2001)  J.    Virol.  75:11284-91;  Glasgow  et  al.  (2009)  PLOS  One  4:e8355)、ヘルペスウイルス(Nakano  et  al.  (2005)  Mol.  Ther.  11:617-24）、およびパラミキソウイルス（Bian  et  al.  (2005)  Cancer  Gene  Ther.  12:295-303;  Bian  et  al.  (2005)  Int.  J.  Oncol.  29:1359-69）、コロナウイルス（Haijema  et  al.  (2003)  J.  Virol.  77:4528-4538;  Wurdinger  et  al.  (2005)  Gene  Therapy  12:1394-1404）について使用されてきた。
【０１５０】
より一般的なアプローチは、ウイルスキャプシドタンパク質の組換えによる遺伝子改変であり、ゆえにウイルスキャプシドの表面の組換えによる遺伝子改変である。間接的な組み換えアプローチでは、ウイルスキャプシドは、異種の「スキャフォールド」により修飾され、次いでアダプターに連結する。アダプターは、スキャフォールドおよび標的細胞に結合する。(Arnold  et  al.  (2006)  Mol.  Ther.  5:125-132;  Ponnazhagen  et  al.  (2002)  J.  Virol.  76:12900-907;  WO  97/05266も参照)    スキャフォールド、例えば(1)  抗体アダプターのFcに結合するFc結合分子(例えばFc受容体、プロテインAなど)、(2)  ビオチン化されたアダプターに結合する(ストレプト)アビジン、(3)(ストレプト)アビジンに融合されたアダプターに結合するビオチン、および(4)  SpyTag化アダプターに結合するSpyCatcherなど、等尺のペプチド結合を形成するタンパク質：タンパク質結合対などが、Ad(Pereboeva  et  al.  (2007)  Gene  Therapy  14:  627-637;  Park  et  al.  (2008)  Biochemical  and  Biophysical  Research  Communications  366:  769-774;  Henning  et  al.  (2002)  Human  Gene  Therapy  13:1427-1439;  Banerjee  et  al.  (2011)  Bioorganic  and  Medicinal  Chemistry  Letters  21:4985-4988)、  AAV  (Gigout  et  al.  (2005)  Molecular  Therapy  11:856-865;  Stachler  et  al.  (2008)  Molecular  Therapy  16:1467-1473)、およびトガウイルス(Quetglas  et  al.  (2010)  Virus  Research  153:179-196;  Ohno  et  al.  (1997)  Nature  Biotechnology  15:763-767;  Klimstra  et  al.  (2005)  Virology  338:9-21)に組み込まれている    
【０１５１】
直接的な組み換え型ターゲティングアプローチでは、ターゲティングリガンドは、ウイルスキャプシドの中に直接的に挿入されるかまたは結合される、すなわち、タンパク質ウイルスキャプシドが異種リガンドを発現するように改変される。リガンドは、標的細胞上で優先的にまたは独占的に発現される受容体またはマーカーを向け直す、例えば結合する。(Stachler  et  al.  (2006)  Gene  Ther.  13:926-931;  White  et  al.  (2004)  Circulation  109:513-519.).  直接的な組み換えによるアプローチは、AAV（Park  et  al.,  (2007)  Frontiers  in  Bioscience  13:2653-59;  Girod  et  al.  (1999)  Nature  Medicine  5:1052-56;  Grifman  et  al.  (2001)  Molecular  Therapy  3:964-75;  Shi  et  al.  (2001)  Human  Gene  Therapy  12:1697-1711;  Shi  and  Bartlett  (2003)  Molecular  Therapy  7:515-525）、レトロウイルス（Dalba  et  al.  Current  Gene  Therapy  5:655-667;  Tai  and  Kasahara  (2008)  Frontiers  in  Bioscience  13:3083-3095;  Russell  and  Cosset  (1999)  Journal  of  Gene  Medicine  1:300-311;  Erlwein  et  al.  (2002)  Virology  302:333-341;  Chadwick  et  al.  (1999)  Journal  of  Molecular  Biology  285:485-494;  Pizzato  et  al.  (2001)  Gene  Therapy  8:1088-1096）、ポックスウイルス（Guse  et  al.  (2011)  Expert  Opinion  on  Biological  Therapy  11:595-608;  Galmiche  et  al.  (1997)  Journal  of  General  Virology  78:3019-3027;    Paul  et  al.  (2007)  Viral  Immunology  20:664-671）、パラミキソウイルス（Nakamura  and  Russell  (2004)  Expert  Opinion  on  Biological  Therapy  4:1685-1692;  Hammond  et  al.  (2001)    Journal  of  Virology  75:2087-2096;  Galanis  (2010)  Clinical  Pharmacology  and  Therapeutics  88:620-625;  Blechacz  and  Russell  (2008)  Current  Gene  Therapy  8:162-175;  Russell  and  Peng  (2009)  Current  Topics  in  Microbiology  and  Immunology  330:213-241）、およびヘルペスウイルス（Shah  and  Breakefield  (2006)  Current  Gene  Therapy  6:361-370;  Campadelli-Fiume  et  al.  (2011)  Reviews  in  Medical  Virology  21:213-226）で使用されている。
【０１５２】
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子療法ベクターは、調節応答、例えば補充酵素に対する例えば寛容を生じるのに特に適している組織に、シュードタイプ化される。そのような組織としては、以下に限定されないが、粘膜組織、例えば、腸関連リンパ組織（GALT）、造血幹細胞、および肝臓が挙げられる。一部の実施形態では、遺伝子療法ベクター、または本明細書に記載されるマルチドメイン治療用タンパク質をコードする遺伝子は、例えば、肝特異的プロモーターなど、それらの組織に特異的なプロモーターの制御下で発現される。
【０１５３】
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子療法ベクターは、裸のポリヌクレオチドを含む。例えば、一部の実施形態では、マルチドメイン治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば筋肉内に、デポの形成のために直接的に器官内に、静脈内に、注射されることがある。裸のポリヌクレオチドの送達の増強のための周知の追加の方法としては、以下に限定されないが、電気穿孔、超音波穿孔、ポリヌクレオチド被覆金粒子を射出するための遺伝子銃の使用、磁気粒子、および水力学的送達が挙げられる。
【０１５４】
一部の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子療法ベクターは、ポリヌクレオチド複合体、例えば、以下に限定されないが、ナノ粒子（例えば、ポリヌクレオチド自己組織化ナノ粒子、ポリマー系自己組織化ナノ粒子、無機ナノ粒子、脂質ナノ粒子、半導体性／金属ナノ粒子）、ゲルおよびハイドロゲル、カチオンおよびアニオンを含むポリヌクレオチド複合体、マイクロ粒子、およびそれらの任意の組み合わせなどを含む。
【０１５５】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、自己組織化ナノ粒子として製剤化されうる。非限定的な例として、ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのための送達システムで使用されうるナノ粒子を作製するために使用されてもよい（例えば、参照によりその全体を本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第2012125987号を参照）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド自己組織化ナノ粒子は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドのコアおよびポリマーシェルを含みうる。ポリマーシェルは、本明細書に記載されるポリマーのいずれであってもよく、当該技術分野で既知である。追加的な実施形態では、ポリマーシェルは、コア内のポリヌクレオチドを保護するために使用されうる。
【０１５６】
一部の実施形態では、これらの自己組織化ナノ粒子は、長いポリマーのポリヌクレオチドヘアピンで形成されたマイクロスポンジであることがあり、そのポリヌクレオチドヘアピンは、結晶質の「ひだのある」シートへと形成された後、マイクロスポンジへ自己組織化される。これらのマイクロスポンジは、高密度充填されたスポンジ様のマイクロ粒子であり、それらの粒子は、効率の良い担体として機能し、積荷を細胞に送達できることがある。マイクロスポンジは、直径が1μmから300nmでありうる。マイクロスポンジは、当技術分野で公知の他の薬剤と複合体化されてさらに大きなマイクロスポンジを形成してもよい。非限定的な例として、マイクロスポンジは、外層を形成して細胞による取り込みを促進するための薬剤、例えばポリカチオン性ポリエチレンイメ（PEI）などと複合体化されることがある。この複合体は、高温（150℃）で安定した状態を保つことができる250nm直径の粒子を形成することができる（Grabow  and  Jaegar,  Nature  Materials  2012,  11:269-269;  参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、これらのマイクロスポンジは、リボヌクレアーゼによる分解からの並外れた程度の保護を発揮できることがある。別の実施形態では、ポリマーベースの自己組織化ナノ粒子、例えば、以下に限定されないがマイクロスポンジなどは、完全にプログラム可能なナノ粒子であることがある。ナノ粒子の幾何学的形状、サイズおよび化学量論は、積荷を送達するための最適なナノ粒子、例えば、以下に限定されないがポリヌクレオチドなどを作り出すために、正確に制御されうる。
【０１５７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、無機ナノ粒子（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第8,257,745号）に製剤化されうる。無機ナノ粒子は、水で膨潤可能な粘土性物質を含みうるが、これに限定されない。非限定的な例として、無機ナノ粒子は、単純なケイ酸塩から作製される合成スメクタイト粘土を含みうる（例えば、それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれる米国特許第5,585,108号および第8,257,745号を参照）。  
【０１５８】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、半導性材料または金属材料を含む水分散性ナノ粒子（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第20120228565号）で製剤化されてもよいし、磁気ナノ粒子（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第20120265001号および第20120283503号）で形成されてもよい。水分散性ナノ粒子は、疎水性ナノ粒子であっても親水性ナノ粒子であってもよい。
【０１５９】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、被験者に注入された時にゲルを形成しうる、当技術分野で公知の任意のハイドロゲルに封入されうる。ハイドロゲルは、親水性のポリマー鎖のネットワークであり、水が分散媒体であるコロイドゲルとして見出されることがある。ハイドロゲルは、吸収性の高い（99%超の水を含有可能である）天然または合成のポリマーを含みうる。ハイドロゲルは、かなり多くの水分含量があるために、天然組織と非常に類似した柔軟性も有する。本明細書に記載のハイドロゲルは、生体適合性、生分解性、および／または多孔性の脂質ナノ粒子を封入するために使用されうる。
【０１６０】
非限定的な例として、ハイドロゲルは、アプタマー官能化ハイドロゲルであってもよい。アプタマー官能化ハイドロゲルは、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションを使用して一つまたは複数のポリヌクレオチドを放出するようにプログラムされていてもよい。(Battig  et  al.,  J.  Am.  Chem.  Society.  2012  134:12410-12413;  参照によりその全体が本明細書に組み込まれる)。  一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、脂質ナノ粒子内に封入されてもよく、次いで、脂質ナノ粒子がハイドロゲル内に封入されてもよい。
【０１６１】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、フィブリンゲル、フィブリンハイドロゲル、またはフィブリン接着剤内に封入されてもよい。別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、フィブリンゲル、フィブリンハイドロゲル、またはフィブリン接着剤内に封入される前に、脂質ナノ粒子または急速排除性脂質ナノ粒子に製剤化されてもよい。さらに別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、フィブリンゲル、ハイドロゲル、またはフィブリン接着剤に封入される前に、リポプレックスとして製剤化されてもよい。フィブリンゲル、ハイドロゲル、および接着剤は、二つの構成成分、すなわちフィブリノゲン溶液とカルシウムに富むトロンビン溶液とを含む（例えば、それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれるSpicer  and  Mikos,  Journal  of  Controlled  Release  2010.  148:  49-55;  Kidd  et  al.  Journal  of  Controlled  Release  2012.  157:80-85を参照）。フィブリンゲル、ハイドロゲル、および／または接着剤の構成成分の濃度は、ゲル、ハイドロゲルおよび／または接着剤の特性、ネットワークのメッシュサイズ、および／または分解特性を変化させるように変更することができ、例えば、以下に限定されないが、フィブリンゲル、ハイドロゲル、および／または接着剤の放出特性を変化させるなどができる。（例えば、それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれる、Spicer  and  Mikos、Journal  of  Controlled  Release  2010.  148:  49-55;  Kidd  et  al.  Journal  of  Controlled  Release  2012.  157:80-85;  Catelas  et  al.  Tissue  Engineering  2008.  14:119-128を参照されたい）。この特徴は、本明細書に開示されたポリヌクレオチドを送達するために使用される場合に有利でありうる。（例えば、それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれる、Kidd  et  al.  Journal  of  Controlled  Release  2012.  157:80-85；Catelas  et  al.  Tissue  Engineering  2008.  14:119-128を参照されたい）。
【０１６２】
一部の実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、カチオンまたはアニオンを含みうる。一実施形態では、製剤は、金属カチオン、例えば、以下に限定されないが、Zn2+、Ca2+、  Cu2+、Mg+  およびそれらの組み合わせなどを含む。非限定的な例として、製剤は、ポリマーと、金属カチオンと複合体化されたポリヌクレオチドとを含みうる（例えば、それぞれが参照によりその全体を本明細書に組み込まれる米国特許第6,265,389号および第6,555,525号を参照）。
【０１６３】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ナノ粒子および／またはマイクロ粒子に製剤化しうる。これらのナノ粒子および／またはマイクロ粒子は、任意のサイズの形状および化学に成形されうる。一例として、ナノ粒子および／またはマイクロ粒子は、LIQUIDA  TECHNOLOGIES.RTM（Morrisville,  N.C.）によるPRINT（登録商標）技術を使用して作製されうる  （参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際特許出願公開第2007024323号を参照）。
【０１６４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、Keystone  Nano（ステートカレッジ、ペンシルバニア州）によって、ナノジャケットおよびナノリポソームで製剤化されうる。ナノジャケットは、カルシウム、リン酸塩を含めた体内で天然に見出される化合物か、または少量のケイ酸塩も含む化合物から作製される。ナノジャケットは、5から50nmのサイズに及ぶことがあり、以下に限定されないがポリヌクレオチド、主要構築物および／またはポリヌクレオチドなどの親水性化合物および疎水性化合物を送達するために使用されうる。  ナノリポソームは、脂質から作製され、例えば、以下に限定されないが体内で天然に発生する脂質から作製される。ナノリポソーム  は、60〜80nmのサイズに及ぶことがあり、親水性および疎水性の化合物、例えば、以下に限定されないがポリヌクレオチド、主要構築物および／または  ポリヌクレオチドを送達するために使用されうる。一態様では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、以下に限定されないがセラミドナノリポソームなどのナノリポソームで製剤化されている。
【０１６５】
一実施形態では、マルチドメイン治療用タンパク質は、抗CD63  scFv-GAA融合タンパク質または抗ITGA7  scFv-GAA融合タンパク質である。抗CD63  scFv-GAA融合タンパク質または抗ITGA7  scFv-GAA融合タンパク質のAAV-送達を介した投与は、マルチドメイン治療用タンパク質を内包する遺伝子療法ベクターの投与後の患者の血清中のGAAの長期安定性をもたらす。一実施形態では、レシピエント患者の血清中のGAAのレベルは、マルチドメイン治療用タンパク質を内包する遺伝子療法ベクターの投与後の1ヶ月後、3ヶ月、4ヶ月後、5か月後、または6か月後、送達ドメインの連結のないGAAを受けた患者の血清レベルよりも、≧1.5倍から100倍、≧1.5倍から10倍、≧2.5倍、2.5倍〜3倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3.0倍、3.1倍、3.2倍  、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、  3.9倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、または10倍高い。
【０１６６】
一実施形態では、抗CD63  scFv-GAA融合タンパク質または抗ITGA7  scFv-GAA融合タンパク質のAAV送達を介した投与は、ポンペ病患者における貯蔵グリコーゲンレベルの長期にわたる安定な低減をもたらす。一実施形態では、患者の心臓、骨格筋、および肝臓の組織におけるグリコーゲンレベルは、野生型（非疾患）レベルに低減される。一実施形態では、患者の心臓、骨格筋、および肝臓の組織におけるグリコーゲンレベルは、マルチドメイン治療用タンパク質を内包する遺伝子療法ベクターの投与後、1ヵ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、または6ヵ月、野生型レベルで維持される。
【０１６７】
一実施形態では、抗CD63  scFv-GAA融合タンパク質または抗ITGA7  scFv-GAA融合タンパク質のAAV送達を介した投与は、ポンペ病患者における筋力の長期にわたる回復をもたらす。一実施形態では、握力強度によって測定される患者の強度は、マルチドメイン治療用タンパク質を内包する遺伝子療法ベクターの投与後、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、4ヶ月、5ヶ月、または6ヵ月、正常（すなわち疾患のない正常なレベル）に復元される。
【０１６８】
別の態様では、本発明は、酵素活性と抗原結合タンパク質とを含む組成物を提供し、その場合、酵素は、酵素欠損症（LSD）と内部移行エフェクター結合タンパク質とに関連する。リソソーム蓄積症に関連する酵素（それ自体で触媒性ではないタンパク質を含む）としては、例えば、α-ガラクトシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-グルコシダーゼ、β-グルコシダーゼ、サポシン-C活性化因子、セラミダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、β-ヘキソサミニダーゼ、GM2活性化因子、GM3シンターゼ、アリールスルファターゼ、スフィンゴ脂質活性化因子、α-イズロニダーゼ、イズロニダーゼ-2-スルファターゼ、ヘパリンN-スルファターゼ、N-アセチル-α-グルコサミニダーゼ、α-グルコサミドN-アセチルトランスフェラーゼ、N-アセチルグルコサミン-6-スルファターゼ、N-アセチルガラクトサミン-6-硫酸スルファターゼ、N-アセチルガラクトサミン-4-スルファターゼ、β-グルクロニダーゼ、およびヒアルロニダーゼなどのうちいずれかおよび全てが挙げられる。
【０１６９】
内部移行エフェクター結合タンパク質には、例えば、受容体融合分子、トラップ分子、受容体Fc融合分子、抗体、Fab断片、F(ab')2断片、Fd断片、Fv断片、一本鎖Fv（scFv）分子、dAb断片、単離相補性決定領域（CDR）、CDR3ペプチド、拘束FR3-CDR3-FR4ペプチド、ドメイン特異的抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン欠失抗体、キメラ抗体、CDR移植抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニボディ、ナノボディ、一価ナノボディ、二価ナノボディ、小モジュラー免疫薬（SMIP：small  modular  immunopharmaceutical）、ラクダ抗体（VHH重鎖ホモ二量体抗体）、サメ可変IgNARドメイン、および他の抗原結合タンパク質などが含まれる。
【０１７０】
内部移行エフェクターとしては、例えば、CD63、MHC-I、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、トランスフェリン受容体、LDL受容体、LDL関連タンパク質1受容体、ASGR1、ASGR2、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質2（APLP2）、アペリン受容体（APLNR）、PRLR（プロラクチン受容体）、MAL（Myelin  And  Lymphocyteタンパク質、別名VIP17）、IGF2R、液胞型H+ATPアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体、SCARA1-5、SCARB1-3、およびCD36が挙げられる。ある実施形態では、内部移行エフェクターは、腎臓特異的インターナライザーであり、例えば、CDH16（Cadheri-16）、CLDN16（Claudn-16）、KL（Klotho）、PTH1R（副甲状腺ホルモン受容体）、SLC22A13（溶質輸送体ファミリー22メンバー13）、SLC5A2（ナトリウム／グルコース共輸送体2）、およびUMOD（ウロモジュリン）などである。他のある特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、筋特異的インターナライザーであり、例えば、BMPR1A（骨形態形成タンパク質受容体1A）、m-カドヘリン、CD9、MuSK（筋特異的キナーゼ）、LGR4/GPR48（Gタンパク質共役受容体48）、コリン作動性受容体（ニコチン性）アルファ1、CDH15（Cadheri-15）、ITGA7（インテグリンアルファ-7）、CACNG1（L型カルシウムチャネルサブユニットガンマ-1）、CACNAlS（L型カルシウムチャネルサブユニットアルファ-15）、CACNG6（L型カルシウムチャネルサブユニットガンマ-6）、SCN1B（ナトリウムチャネルサブユニットベータ-1）、CHRNA1（ACh受容体サブユニットアルファ）、CHRND（ACh受容体サブユニットデルタ）、LRRC14B（ロイシンリッチリピート含有タンパク質14B）、ジストログリカン  (DAG1)、およびPOPDC3（ポパイ（Popeye）ドメイン含有タンパク質3）などである。一部の特定の実施形態では、内部移行エフェクターは、ITGA7、CD9、CD63、APLP2、ASGR1、ASGR2、またはPRLRである。
【０１７１】
一部の実施形態では、酵素は、抗原結合タンパク質に共有結合で連結されている（すなわち、電子が原子間で共有されている）。特定の一実施形態では、内部移行エフェクター結合タンパク質は、半抗体からなるかまたはそれを含有し、酵素は、Fc融合ドメインに（例えばC末端で）融合されている。そして、酵素に共有結合で連結されているFcドメインは、抗原結合タンパク質のFcドメインと会合し、その結果その会合は、一つまたは複数のジスルフィド架橋を含有する。この特定の実施形態を図1AのパネルＢに概略的に図示する。
【０１７２】
特定の別の実施形態では、内部移行エフェクター結合タンパク質（送達ドメイン）は、抗体または抗体断片からなるかまたはそれを含有し、酵素は、抗体または抗体断片に共有結合で連結されている。特定の実施形態では、送達ドメインは抗体であり、酵素は、抗体の重鎖または軽鎖のC末端に（ペプチド結合を介して直接的にまたはリンカーを介して間接的に）共有結合で連結されている（それぞれ図1AのパネルＣまたはパネルＥ）。特定の別の実施形態では、送達ドメインは抗体であり、酵素は、抗体の重鎖または軽鎖のN末端に（ペプチド結合を介して直接的にまたはリンカーを介して間接的に）共有結合で連結されている（それぞれ図1ＡのパネルＤまたはパネルＦ）。
【０１７３】
一部の実施形態では、酵素と送達ドメインとは共有結合で連結されていないが、混合物中に組み合わされている。送達ドメインと酵素とは、非共有結合力により会合して複合体を形成することができる。例えば、特定の一実施形態では、送達ドメインは二重特異性抗体であり、その抗体の一方のアームが内部移行エフェクターを結合し、他方のアームが酵素を結合する。この実施形態を図1ＡのパネルAに概略的に図示する。
【０１７４】
一部の実施形態では、酵素は、GAAであるか、またはGAA活性（例えば、GAA活性を有するアイソザイム）を含み、内部移行エフェクターは、ITGA7、CDH15、CD9、CD63、APLP2、ASGR1、ASGR2  またはPRLRである。特定の実施形態では、酵素は、GAAであるか、またはGAA活性を含み、内部移行ドメインは、CD63であり、送達ドメインは、CD63およびGAAに対する特異性を有する二重特異性抗体である。特定の実施形態では、酵素はGAAであるか、またはGAA活性を含み、内部移行ドメインは、ITGA7であり、送達ドメインは、ITGA7およびGAAに対する特異性を有する二重特異性抗体である。
【０１７５】
一部の実施形態では、酵素は、GLAであるか、またはGLA活性（例えば、GAA活性を有するアイソザイム）を含み、内部移行エフェクターは、ITGA7、CD9、CD63、APLP2、ASGR1、ASGR2、またはPRLRである。特定の実施形態では、酵素は、GLAであるか、またはGLA活性を含み、内部移行ドメインは、CD63であり、送達ドメインは、CD63およびGLAに対する特異性を有する二重特異性抗体である。特定の実施形態では、酵素は、GLAであるか、またはGLA活性を含み、内部移行ドメインは、ITGA7であり、送達ドメインは、ITGA7およびGLAに対する特異性を有する二重特異性抗体である。
医薬組成物およびその投与
【０１７６】
医薬製剤は、医薬的に許容可能な賦形剤を追加的に含んでいてもよく、そのようなものとしては、本明細書で使用される場合、所望の特定の剤形に適するような溶媒、分散媒体、希釈剤、またはその他の液体媒体、分散剤または懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤、固体結合剤、潤滑剤などのうちいずれかまたは全てが挙げられる。Remington's  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、21.sup.st  Edition、A.  R.  Gennaro  (Lippincott、Williams  &  Wilkins,  Baltimore、Md.,  2006；その全体が参照により本明細書に組み込まれる）は、医薬組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤とその調製のための公知技術とを開示している。任意の従来の賦形媒体が、例えば、医薬組成物の任意の他の構成成分との有害な様式で任意の望ましくない生物学的効果を生じるかまたはその他相互作用することにより、物質またはその誘導体に不適合である場合を除いて、その使用は本発明の範囲内にあることが考慮されている。
【０１７７】
いくつかの  実施形態では、医薬的に許容可能な賦形剤は、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%純粋である。一部の実施形態では、賦形剤は、ヒトでの使用および獣医学的使用のために承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されている。一部の実施形態では、賦形剤は医薬グレードである。一部の実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（USP）、欧州薬局方（EP）、英国薬局方、および／または国際薬局方の基準を満たしている。
【０１７８】
医薬組成物の製造に使用される薬学的に許容可能な賦形剤としては、以下に限定されないが、不活性希釈剤、分散剤および／もしくは造粒剤、界面活性剤および／もしくは乳化剤、崩壊剤、結合剤、保存剤、緩衝剤、潤滑剤、ならびに／または油が挙げられる。そのような賦形剤は、任意選択的に医薬組成物中に含まれてもよい。
【０１７９】
例示的な希釈剤としては、以下に限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウムラクトース、スクロース、セルロース、微結晶セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末糖など、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１８０】
例示的な造粒剤および／または分散剤としは、以下に限定されないが、ジャガイモデンプン、トウモロコシデンプン、タピオカデンプン、デンプングリコール酸ナトリウム、粘土、アルギン酸、グアーガム、シトラスパルプ、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、炭酸カルシウム、ケイ酸塩類、炭酸ナトリウム、架橋ポリ(ビニルピロリドン)(クロスポビドン)、カルボキシメチルデンプンナトリウム(デンプングリコール酸ナトリウム)、カルボキシメチルセルロース、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム(クロスカルメロース)、メチルセルロース、アルファ化デンプン(デンプン1500)、微結晶デンプン、水不溶性デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウム、ケイ酸アルミニウムマグネシウム(ビーガム（VEEGUM）（登録商標）)、ラウリル硫酸ナトリウム、四級アンモニウム化合物など、ならびに／またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１８１】
代表的な界面活性剤および／または乳化剤としては、以下に限定されないが、天然乳化剤（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、トラガカント、コンドラックス（chondrux）、コレステロール、キサンタン、ペクチン、ゼラチン、卵黄、カゼイン、羊毛脂、コレステロール、ワックス、およびレシチン）、コロイド粘土（例えば、ベントナイト［ケイ酸アルミニウム］およびビーガム（VEEGUM）（登録商標）［ケイ酸マグネシウムアルミウニム］）、長鎖状アミノ酸誘導体、高分子量アルコール（例えば、ステアリルアルコール、セチルアルコール、オレイルアルコール、トリアセチンモノステアレート、エチレングリコールジステアレート、グリセリルモノステアレート、およびプロピレングリコールモノステアレート、ポリビニルアルコール）、カルボマー（例えば、カルボキシポリメチレン、ポリアクリル酸、アクリル酸ポリマー、およびカルボキシビニルポリマー）、カラギーナン、セルロース系誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、粉末セルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メチルセルロース）、ソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート［トゥイーン（TWEEN）（登録商標）20］、ポリオキシエチレンソルビタン［トゥイーン（TWEEN）（登録商標）60］、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート［トゥイーン（TWEEN）（登録商標）80］、ソルビタンモノパルミテート［スパン（SPAN）（登録商標）40］、ソルビタンモノステアレート［スパン（SPAN）（登録商標）60］、ソルビタントリステアレート［スパン（SPAN）（登録商標）65］、グリセリルモノオレエート、ソルビタンモノオレエート［スパン（Ｓｐａｎ）（登録商標）80］）、ポリオキシエチレンポリオキシエチレンモノステアレート［ミルジ（MYRJ）（登録商標）45］、ポリオキシエチレン水素添加ヒマシ油、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリオキシメチレンステアレート、およびソルトール（SOLUTOL）（登録商標））、スクロース脂肪酸エステル、ポリエチレングリコール脂肪酸エステル（例えば、クレモフォア（CREMOPHOR）（登録商標））、ポリオキシエチレンエーテル（例えば、ポリオキシエチレンラウリルエーテル［ブリジ（BRIJ）（登録商標）30］）、ポリ（ビニルピロリドン）、ジエチレングリコールモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、オレイン酸ナトリウム、オレイン酸カリウム、オレイン酸エチル、オレイン酸、ラウリン酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、プルロニック（PLUORINC）（登録商標）Ｆ68、ポロキサマー（POLOXAMER）（登録商標）188、臭化セトリモニウム、塩化セチルピリジニウム、塩化ベンザルコニウム、ドクセートナトリウムなど、ならびに／またはそれらの組合せを含む。
【０１８２】
例示的な結合剤としては、以下に限定されないが、デンプン（例えば、トウモロコシデンプンおよびデンプン糊）；ゼラチン；糖類（例えば、スクロース、グルコース、デキストロース、デキストリン、糖蜜、ラクトース、ラクチトール、マンニトール）；天然および合成のガム（例えば、アカシア、アルギン酸ナトリウム、トチャカ抽出物、パンワール（panwar）ガム、ガティガム、イサポール（isapol）皮粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、微結晶セルロース、セルロースアセテート、ポリ（ビニルピロリドン）、ケイ酸マグネシウムアルミウニム（ビーガム（Veegum）（登録商標））、およびカラマツアラボガラクタン）；アルギン酸塩；ポリエチレンオキシド；ポリエチレングリコール；無機カルシウム塩；ケイ酸；ポリメタクリレート類；ワックス類；水；アルコール、などならびにそれらの組合せを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１８３】
例示的な防腐剤としては、以下に限定されないが、抗酸化剤、キレート剤、抗菌保存剤、抗真菌保存剤、アルコール保存剤、酸性保存剤、および／または他の保存剤が挙げられる。例示的な酸化防止剤としては、以下に限定されないが、アルファトコフェロール、アスコルビン酸、パルミチン酸アスコルビル、ブチルヒドロキシアニソール、ブチルヒドロキシトルエン、モノチオグリセロール、ピロ亜硫酸カリウム、プロピオン酸、没食子酸プロピル、アスコルビン酸ナトリウム、硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、および／または硫酸ナトリウムが挙げられる。例示的なキレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸一水和物、エデト酸二ナトリウム、エデト酸二カリウム、エデト酸、フマル酸、リンゴ酸、リン酸、エデト酸ナトリウム、酒石酸、および／またはエデト酸三ナトリウムが挙げられる。例示的な抗菌保存剤としては、以下に限定されないが、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、ベンジルアルコール、ブロノポール、セトリミド、塩化セチルピリジニウム、クロルヘキシジン、クロロブタノール、クロロクレゾール、クロロキシレノール、クレゾール、エチルアルコール、グリセリン、ヘキセチジン、イミドウレア、フェノール、フェノキシエタノール、フェニルエチルアルコール、硝酸フェニル水銀、プロピレングリコール、および／またはチメロサールが挙げられる。例示的な抗真菌保存剤としては、以下に限定されないが、ブチルパラベン、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸、ヒドロキシ安息香酸、安息香酸カリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、および／またはソルビン酸が挙げられる。例示的なアルコール保存剤としては、以下に限定されないが、エタノール、ポリエチレングリコール、フェノール、フェノール化合物、ビスフェノール、クロロブタノール、ヒドロキシベンゾエート、および／またはフェニルエチルアルコールが挙げられる。例示的な酸性保存剤としては、以下に限定されないが、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＥ、ベータ-カロテン、クエン酸、酢酸、デヒドロ酢酸、アスコルビン酸、ソルビン酸、および／またはフィチン酸が挙げられる。他の保存剤としては、以下に限定されないが、トコフェロール、酢酸トコフェロール、デテロキシム（deteroxime）メシレート、セトリミド、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン化（ＢＨＴ）、エチレンジアミン、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ラウリルエーテル硫酸ナトリウム（ＳＬＥＳ）、重亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸カリウム、ピロ亜硫酸カリウム、グライダント（GLYDANT  PLUS）（登録商標）、フェノニップ（PHENONIP）（登録商標）、メチルパラベン、ジェルマール（GERMALL）（登録商標）115、ゲルマベン（GERMABEN）（登録商標）ＩＩ、ネオロン（NEOLONE）（商標）、ケーソン（KATHON）（商標）、および／またはオイクシール（EUXYL）（登録商標）が挙げられる。
【０１８４】
例示的な緩衝剤としては、以下に限定されないが、クエン酸緩衝溶液、酢酸緩衝溶液、リン酸緩衝溶液、塩化アンモニウム、炭酸カルシウム、塩化カルシウム、クエン酸カルシウム、グルビオン酸カルシウム、グルセプト酸カルシウム、グルコン酸カルシウム、Ｄ-グルコン酸、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、プロパン酸、レブリン酸カルシウム、ペンタン酸、第二リン酸カルシウム、リン酸、第三リン酸カルシウム、水酸化リン酸カルシウム、酢酸カリウム、塩化カリウム、グルコン酸カリウム、カリウム混合物、リン酸水素二カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸カリウム混合物、酢酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、リン酸水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸ナトリウム混合物、トロメタミン、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、アルギン酸、パイロジェン不含水、等張生理食塩水、リンゲル溶液、エチルアルコールなど、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１８５】
例示的な滑沢剤としては、以下に限定されないが、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、シリカ、タルク、麦芽、ベヘン酸グリセリル、水素添加植物油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムなど、およびそれらの組合せが挙げられる。
【０１８６】
代表的な油としては、以下に限定されないが、アーモンド油、キョウニン油、アボカド油、ババス油、ベルガモット油、クロフサスグリ油、ルリジサ油、カデ油、カモミール油、カノーラ油、キャラウェー油、カルナウバ油、ヒマシ油、シナモン油、ココアバター油、ヤシ油、タラ肝油、コーヒー油、トウモロコシ油、綿実油、エミュー油、ユーカリ油、マツヨイグサ油、魚油、アマニ油、ゲラニオール油、ヒョウタン油、ブドウ種子油、ハシバミ油、ヒソップ油、ミリスチン酸イソプロピル、ホホバ油、ククイナッツ油、ラバンジン油、ラベンダー油、レモン油、アオモジ油、マカダミアナッツ油、ゼニアオイ油、マンゴー種子油、メドウフォーム種子油、ミンク油、ナツメグ油、オリーブ油、オレンジ油、オレンジラフィー油、パーム油、パーム核油、トウニン油、ラッカセイ油、ケシの実油、カボチャ種子油、ナタネ油、コメヌカ油、ローズマリー油、ベニバナ油、ビャクダン油、サスクアナ（sasquana）油、セイボリー油、シーバックソーン油、ゴマ油、シアバター、シリコーン、ダイズ油、ヒマワリ油、ティーツリー油、アザミ油、ツバキ油、ベチベルソウ油、クルミ油、およびコムギ胚芽油が挙げられる。例示的な油としては、ステアリン酸ブチル、カプリル酸トリグリセリド、カプリン酸トリグリセリド、シクロメチコン、セバシン酸ジエチル、ジメチコン360、ミリスチン酸イソプロピル、鉱油、オクチルドデカノール、オレイルアルコール、シリコーン油、および／またはそれらの組合せが挙げられる。
【０１８７】
賦形剤、例えばココアバターおよび座薬ろう、着色剤、被覆剤、甘味剤、香味剤、および／または芳香剤などは、調合者の判断に従って組成物中に存在し得る。
【０１８８】
送達
【０１８９】
本開示は、可能性のある薬物送達の科学の進歩を考慮した任意の適切な経路による遺伝子療法ベクター（例えばポリヌクレオチド）の送達を包含する。送達は、裸であるかまたは製剤化されうる。
【０１９０】
裸の送達
【０１９１】
本発明のポリヌクレオチドは、裸で細胞に送達されうる。本明細書で使用される場合、「裸の」とは、トランスフェクションを促進する薬剤を含まないポリヌクレオチドを送達することを指す。例えば、細胞に送達されるポリヌクレオチドは、修飾を含有していなくてもよい。裸のポリヌクレオチドは、当該技術分野で公知でありかつ本明細書に記載される投与経路を用いて、細胞に送達されてもよい。
【０１９２】
製剤化による送達
【０１９３】
ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の方法を使用して製剤化されうる。製剤は、ポリヌクレオチドを含有していてもよく、以下に限定されないが、細胞浸透剤、医薬的に許容可能な担体、送達剤、生体分解可能なまたは生体適合性のポリマー、溶媒、および徐放性送達デポをさらに含んでいてもよい。製剤化されたポリヌクレオチドmRNAは、当技術分野で公知でありかつ本明細書に記載される投与経路を用いて、細胞に送達されうる。
【０１９４】
投与
【０１９５】
本発明のポリヌクレオチドは、治療上有効なアウトカムを結果としてもたらす任意の経路によって投与されうる。これらには、以下に限定されないが、経腸、経消化器、硬膜外、経口、経皮、硬膜外(硬膜周囲)、脳内(大脳の中に)、脳室内(脳室の中に)、皮膚上(皮膚の上に適用)、皮内、(皮膚自体の中に)、皮下(皮膚の下に)、鼻投与(鼻を通じて)、静脈内(静脈の中に)、動脈内(動脈の中に)、筋肉内(筋肉の中に)、心臓内(心臓の中に)、骨内注入(骨髄の中に)、くも膜下腔内(脊柱管の中に)、腹腔内、(腹膜の中への注入および注射)、膀胱内注入、硝子体内、(眼を通じて)、空洞内注射、(陰茎の基部の中に)、膣内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮(全身分布のための無傷の皮膚を通じた拡散)、経粘膜(粘膜を通じた拡散)、ガス注入(吸引)、舌下、唇下、注腸、点眼(結膜の上に)、または点耳が含まれる。特定の実施形態では、組成物は、血液脳関門、血管障壁、または他の上皮障壁を横断することが可能になるような方法で、投与されうる。本発明のポリヌクレオチド、主要構築物、またはmRNAについての非限定的な投与経路を下記に記載する。
【０１９６】
非経口投与および注射投与
【０１９７】
非経口投与のための液体剤形としては、以下に限定されないが、医薬的に許容可能なエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ、および／またはエリキシルが挙げられる。活性成分に加えて、液体剤形は、本技術分野でよく使用される不活性希釈剤を含んでいてもよく、そのようなものとしては、例えば、水または他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油類(具体的には綿実油、地下結実油,  トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油)、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール類、およびソルビタンの脂肪酸エステル類、ならびにそれらの混合物などがある。不活性希釈剤に加えて、口腔組成物は、アジュバント、例えば湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤、甘味剤、香味剤、および／または芳香剤などを含みうる。非経口投与のためのある実施形態では、組成物は、CREMOPHOR（登録商標）、アルコール、油、改質油、グリコール、ポリソルベート、シクロデキストリン、ポリマー、および／またはこれらの組み合わせなどの可溶化剤と混合される。
【０１９８】
注射用調製物、例えば、滅菌された注射用の水性または油脂性の懸濁液は、適した分散剤、湿潤剤、および／または懸濁剤を用いて公知の技術に従って製剤化されることがある。滅菌された注射用調製物は、非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤および／または溶媒での滅菌された注射用溶液、懸濁液、および／またはエマルジョン、例えば1,3-ブタンジオールの溶液などでありうる。採用され得る許容可能な媒体および溶媒には、水、リンゲル溶液、U.S.P.、および等張性塩化ナトリウム溶液がある。滅菌された固定油は、従来より溶媒または懸濁媒体として採用されている。この目的のために、任意のブランドの固定油を合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含めて採用することができる。オレイン酸などの脂肪酸は、注射剤の調製に使用できる。
【０１９９】
注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターを通した濾過によって、および／または使用前に滅菌水もしくは他の滅菌された注射用の媒体中に溶解または分散できる滅菌された固体組成物の形態で滅菌剤を組み込むことによって、滅菌することができる。
【０２００】
活性成分の効果を延長するために、多くの場合、皮下注射または筋肉内注射からの活性成分の吸収を遅くすることが望ましい。これは、水溶性に乏しい結晶性または非晶質の材料の液体懸濁液を使用することによって達成されうる。その後、薬剤の吸収速度は、その溶解速度に依存し、溶解速度は、ひいては結晶サイズおよび結晶形態に依存しうる。あるいは、非経口的に投与される薬剤形態の遅延吸収は、油媒体中に薬剤を溶解または懸濁することによって達成される。注射用のデポ形態は、ポリ乳酸-ポリグリコール酸などの生分解性ポリマー中に薬剤のマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作製される。薬剤とポリマーとの比率および採用される特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御することができる。他の生分解性ポリマーの例としては、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が挙げられる。デポ注射用製剤は、体組織に適合性のあるリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬剤を入れることによって調製される。
【０２０１】
デポ投与  
【０２０２】
本明細書で記載したように、一部の実施形態では、組成物は、持続放出のためにデポに製剤化される。一般に、特定の器官または組織（「標的組織」）が、投与のための標的とされる。
【０２０３】
本発明の一部の態様では、ポリヌクレオチドは、標的組織内または標的組織の近位に空間的に保持される。提供されるのは、組成物が、具体的には組成物の核酸構成成分が、実質的に標的細胞に保持されるような条件下で、すなわち少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、または99.99%以上の組成物が標的細胞中に保持されることを意味する条件下で、標的組織（一つまたは複数の標的細胞を含有する）を組成物に接触させることによって、哺乳類対象の標的組織に組成物を提供する方法である。有利なことに、保持は、一つまたは複数の標的細胞に入る組成物中に存在する核酸の量を測定することによって決定される。例えば、被験者に投与された核酸の少なくとも1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%、99.99%、または99.99%以上が、投与後のある期間にわたって細胞内に存在する。例えば、哺乳類対象への筋肉内注射は、ポリヌクレオチドとトランスフェクション試薬とを含有する水性組成物を使用して実施され、組成物の保持は、筋細胞に存在するリボ核酸の量を測定することによって決定される。
【０２０４】
本発明の態様は、組成物が標的組織に実質的に保持されるような条件下で、（一つまたは複数の標的細胞を含有する）標的組織を組成物と接触させることによって、哺乳類対象の標的組織に組成物を提供する方法を対象とする。組成物は、目的のポリペプチドが少なくとも一つの標的細胞で産生されるように、有効量のポリヌクレオチドを含有する。組成物は、一般に、「裸の」核酸（細胞浸透剤や他の剤を含まない核酸など）も意図されるとはいえ、細胞浸透剤と、医薬的に許容可能な担体とを含有する。
【０２０５】
一部の状況では、組織内の細胞によって産生されるタンパク質の量は、望ましくは増加する。好ましくは、タンパク質産生のこの増加は、標的組織内の細胞へと空間的に制限される。したがって、提供されるのは、哺乳類対象の組織における目的のタンパク質の産生を増加させる方法である。組成物の単位量が、所定の体積の標的組織内に含有される実質的なパーセンテージの細胞で目的のポリペプチドを生産するように決定されていることを特徴とする、ポリヌクレオチドを含有する組成物が提供される。
【０２０６】
一部の実施形態では、組成物は、複数の異なるポリヌクレオチドを含み、ここでは、ポリヌクレオチドのうち一つまたは複数が、目的のポリペプチドをコードする。任意選択的に、組成物は、組成物の細胞内送達を支援するための細胞浸透剤も含有する。（一般に、所定の体積に隣接する組織で、または標的組織から遠位で、目的のポリペプチドの著しい産生を誘導することなく）所定の体積の標的組織内に含有される実質的なパーセンテージの細胞で目的のポリペプチドを産生するのに必要な組成物の用量について、決定がなされる。この決定に続いて、決定された用量が、哺乳類対象の組織中に直接的に導入される。
【０２０７】
一実施形態では、本発明は、2回以上の注射で、または分割用量注射によって、送達されるポリヌクレオチドを提供する。
【０２０８】
一実施形態では、本発明は、小さな使い捨ての薬物リーザバー、パッチポンプ、または浸透圧ポンプを使用して、標的組織の近くに保持されてもよい。パッチポンプの非限定的な例としては、BD（登録商標）（フランクリンレイクス、ニュージャージー州）、Insulet社（ベッドフォード、カリフォルニア州）、SteadyMed  Therapeutics（サンフランシスコ、カリフォルニア）、Medtronic（ミネアポリス、ミネソタ州）（例えばMiniMed）、Unilife  (ヨーク、ペンシルベニア州)、およびSpringLeaf  Therapeutics  (ボストン、マサチューセッツ州)によって製造および／または販売されるものが挙げられる。浸透圧ポンプの非限定的な例としては、DURECT（登録商標）（クパチーノ、カリフォルニア州）（例えば、DUROS（登録商標）およびALZET（登録商標））によって製造されるものが挙げられる。
【０２０９】
用量投与
【０２１０】
本発明は、マルチドメイン治療ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターを投与すること、および任意選択的に、続いて、それを必要とする対象にマルチドメイン治療ポリペプチドを投与することを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、マルチドメイン治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターを、それを必要とする患者に治療有効量で投与することを含み、その場合、治療有効量は、以降のマルチドメイン治療用ポリペプチドの投与を不要とするのに十分である。したがって、一部の実施形態では、酵素を欠きそれを必要とする患者を治療する方法、例えばポンペ病の患者でグリコーゲンレベルを低減するおよび／またはGAAに対するCRIMを低減する方法は、補充酵素、例えば抗CD63  scFv::GAA融合タンパク質、例えば配列番号11として記載された配列を含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターを、治療有効量で患者に投与することを含み、その場合、治療有効量は、以降の患者への補充酵素、例えばGAAまたはその誘導体の投与の必要性を、打ち消すものとなる。一部の実施形態では、酵素を欠きそれを必要とする患者を治療する方法、例えばポンペ病の患者でグリコーゲンレベルを低減するおよび／またはGAAに対するCRIMを低減する方法は、補充酵素、例えば抗CD63  scFv::GAA融合タンパク質、例えば配列番号11として記載された配列を含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターを、治療有効量で患者に投与することを含み、治療有効量の補充酵素を患者に投与することをさらに含む。核酸、タンパク質もしくは複合体、またはその医薬組成物、イメージング組成物、診断組成物、もしくは予防組成物は、疾患、障害、および／または状態（例えば、作業記憶の欠如に関連する疾患、障害、および／または状態）を予防、治療、診断、またはイメージングするために有効な任意の量および投与経路を使用して、対象に投与されうる。必要とされる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、具体的な組成、その投与様式、その活性の様式等に応じて、対象間で異なるものとなる。本発明による組成物は、典型的には、投与を容易にし投薬量を均一にするために、単位剤形で製剤化される。しかし、本発明の組成物の毎日の総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で主治医によって決定されうることが理解されよう。任意の特定の患者に対する具体的な治療的に有効な、予防的に有効な、または適切なイメージングの用量レベルは、種々の要因に依存するものとなるが、そのような要因としては、治療される障害および障害の重症度；採用される具体的な化合物の活性；採用される具体的な化合物；患者の年齢、体重、全身の健康状態、性別、および食事；採用される具体的な化合物の投与時間、投与経路、および排泄速度；治療期間；採用される具体的な化合物と組み合わせてまたは同時に使用される薬剤；および医学分野で周知の類似の要因が挙げられる。
【０２１１】
下記の実施例は、本発明の方法をさらに説明するために提供されている。これらの実施例は、説明のためだけのものであり、本発明の範囲を何ら制限することを意図するものではない。
【実施例】
【０２１２】
実施例1：抗hCD63  ScFv::GAAポリヌクレオチドおよび遺伝子療法ベクターの構築
ヒトGAA（hGAA；配列番号1；配列番号12により表される核酸配列）またはヒトGAAにそのC末端上で融合された抗ヒトCD63単鎖可変断片（ScFv）（抗hCD63  ScFv-hGAA；配列番号10；配列番号11により表される核酸）の発現をコードするAAV2/8ウイルスを、標準的な三重トランスフェクションプロトコールを使用して生成した（Gray  et  al.  2011;  “Production  of  recombinant  adeno-associated  viral  vectors  and  use  in  vitro  and  in  vivo  administration”,  Current  Protocols  in  Neuroscience,  John  Wiley  &  Sons,  New  York  (1999),  pp.  4.17.1-4.17.25,  Vol  1も参照)。生産のために、1×107個のHEK293細胞を15cmプレート上に播いた。翌日、（Ａ）肝特異的セルピナ1エンハンサー（配列番号9）を含みTTR駆動性ヒトGAAをコードする対照pAAVベクターと、肝特異的なセルピナ1のエンハンサー（配列番号9）を含みTTR駆動hCD63  ScFv-hGAA（図1Bを参照）をコードする試験pAAVとのいずれか8μｇ、  および（B）pAAV  RC2/8-由来ベクター（Gao、2002）と16  μgのpHelper（アジレント、カタログ番号240074）とを用いて、PEIpro（Polyplus  transfection、ニューヨーク、ニューヨーク州、カタログ番号115-100）媒介性トランスフェクションを1：1の比（1ul  PEIpro:1μg  DNA）で用いて、トランスフェクションした。トランスフェクションの72時間後に、細胞を採集し、標準的な凍結融解法を用いて20mM  Tris-HCl、1mM  MgCl2、2.5mM  KCl、100mM  NaClからなる緩衝液中で溶解した。次に、ベンゾナーゼ（シグマ、カタログ番号E1014-25KU）を終濃度0.5U/μLで試料に添加し、次いで、これを37℃で60分間インキュベーションした。次いで、ウイルスを、（Zolotukhin  et  al.、1999,  Gene  Ther  1999;6:973-985)に記載されるようにイオジキサノール勾配超遠心分離を用いて精製し、続いてqPCRによって滴定した。  
【０２１３】
AAV  試料を、DNaseI  (サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ番号EN0525)  を用いて37℃で1時間処理し、DNA  extract  All  Reagents(サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ番号4403319)をを使用して溶解した。QuantStudio  3リアルタイム  PCR  システム（サーモフィッシャーサイエンティフィック）を使用し、AAV2  ITRに向けたプライマーを使用して、キャプシド形成されたウイルスゲノムを定量した  。AAV2  ITRのプライマーの配列は5'-GGAACCCCTAGTGATGGAGTT-3'  (フォワードITR;  配列番号3）および5’-CGGCCTCAGTGAGCGA-3'（リバースITR；配列番号4）（Aurnhammer  et  al.,  2012）であり、AAVの左側内部逆反復（ITR）配列（配列番号6）およびAAVの右内部逆反復（ITR）配列（配列番号7）にそれぞれ由来する。AAV2  ITRのプローブの配列は5'-6-FAM-CACTCCCTCTCTGCGCGCTCG-TAMRA-3'（配列番号:5）（Aurnhammer  C.、Haase  M.、MuenerN.、et  al.、2012、Hum.  Gene  Ther.  Methods  23、18-28）である。95℃の活性化ステップで10分間の後、2ステップPCRサイクルを、95℃で15秒間、60℃で30秒間で40サイクル行った。Taqmanユニバーサル  PCR  Master  Mix  (サーモフィッシャーサイエンティフィック、カタログ番号4304437)をqPCRで使用した。DNAプラスミド（アジレント、カタログ番号240074）を標準として使用し、絶対力価を決定した。
【０２１４】
抗ヒトCD63抗体およびそれらの融合体には、H5C6マウス抗ヒトCD63可変ドメイン（配列番号10のアミノ酸1〜119はH5C6抗体の重鎖可変ドメイン(VH)のアミノ酸配列を提供し、配列番号10のアミノ酸135〜245は、H5C6抗体の軽鎖可変ドメイン  (VL)  のアミノ酸配列を提供する）を使用した。ここで使用された抗hCD63  ScFv（配列番号2）は、H5C6クローンに由来するが、このクローンは、マウス抗hCD63モノクローナルIgＧ1、カッパ軽鎖抗体である（H5C6は、August,  J.T.  /  Hildreth,  J.E.K.によってアイオワ大学の開発研究ハイブリドーマバンクに寄託された（DSHBハイブリドーマ製品H5C6;  DSHB  カタログ番号h5c6、RRID:AB_528158））。抗体のScFvバージョンは、重−軽の順に可変ドメインを用いて、グリシン-セリンリンカーを間に配して（5'-VH-Gly-Ser-VL-3’）クローニングした。
実施例2：AAV  後のマウスポンペモデルのグリコーゲン含量
【０２１５】
関連のグリコーゲン蓄積in  vivo  モデルにおける、AAV  により送達された抗hCD63  ScFv-GAA融合体とAAVにより送達されたGAAとの効果の対比を決定するために、両方の療法をポンペ病マウスモデルに送達した。このマウスは、マウスGAA遺伝子の欠失についてホモ接合性であり、マウスCD63の代わりにヒトCD63の発現についてホモ接合性であり、系統の背景が75%のC57BL/6、25%の  129SvJであった。これらのマウスは本明細書では、CD63  HumIn  GAA  KOマウスまたはCD63hu/hu;GAA-/-  マウスと呼称される。
【０２１６】
実験では、TTR肝特異的プロモーター駆動性のヒトGAA（AAV-hGAA；実施例1に記載）またはTTR肝特異的プロモーター駆動性のＣ末端でヒトGAAに融合された抗ヒトCD63  ScFv（AAV-抗hCD63  ScFv-hGAA；実施例1に記載）のどちらかをゲノムに含有するAAV2/8ウイルスを、尾静脈注射を介して、2ヶ月齢のCD63  HumIn  GAA  KOマウスに投与した。両方のAAV2/8ウイルスを、1e10vg/マウスまたは1e11vg/マウスの二つの用量のうちどちらか一つで送達した。対照として、未処置CD63  HumIn  GAA  KOマウスと、マウスGAA遺伝子が無傷である未処置CD63  HumInとを、アッセイに含めた。マウスを、処置後3ヵ月間収容し、この期間中にGAAレベルおよび抗GAA抗体の血清測定のため少しずつ（毎月）採血した。3ヶ月後、すべてのマウスを屠殺し、個々の組織をグリコーゲン測定、PAS-H染色、中心核の定量化、リソソーム増殖の測定、およびLC3b発現の測定のため採取した。マウスの群についての実験用量および処理プロトコールを表4に示す。
表4：マウスの群に対する実験用量および治療プロトコール
【表３】
2020523321.tif 000005
【０２１７】
結果は図2にも図示されており、この図は、抗hCD63scFv::GAAが、GAA単独とは異なり、骨格筋で野生型レベルまでグリコーゲンを低下させることを示している。2ドメイン型の抗hCD63scFv::GAAマルチドメイン治療用タンパク質を用いた処置の結果、単一ドメインのGAA補充酵素と比較して、貯蔵グリコーゲンの減少がはるかに大きくなった。個別のマウスについて3か月にわたる四頭筋のグリコーゲンレベル（図3）または心臓のグリコーゲンレベル（図4）をGAAまたはscfv-GAAの総血清発現量に対してプロットすることによって、抗hCD63scFv::GAA融合タンパク質は、同様の血清レベルであってもGAA酵素単独より多くのグリコーゲンを除去することが観察された（図3および4）。
実施例3：GAAに対する免疫応答
【０２１８】
抗ヒトGAA抗体の血清レベルを測定するために、製造業者の仕様書に従い血清分離チューブ（BD  バイオサイエンス、カタログ番号365967）を使用し、全ての処置群からの血清を、末期採血中に収集した血液から分離した。別途、96ウェル高タンパク質結合プレート（サーモフィッシャー、カタログ番号15041）を、PBSで希釈した20μgのhGAA（R&Dシステムズ、カタログ番号8329-GH-025）で一晩被覆した。プレートをPBS＋0.05%Tween（PBS-T）で3回洗浄した。プレートをPBS-T中0.5%BSAでブロッキングし、マウス血清の1:300から1:5.1e7に及ぶ希釈系列をプレートに一晩加えた。HRPコンジュゲートヤギ抗マウスIgG抗体（ジャクソンイムノリサーチ、カタログ番号115-035-164）およびBD  Opt  EIA基質キットを使用して、総抗マウスIgG（サブクラス1＋2a  +  2b  +  3）を測定した。1Nリン酸を使用して、比色反応を停止した。次いで、Spectramax  i3プレートリーダー（モレキュラーデバイス）にて450nmで吸光度を読み取った。希釈曲線をシグモイド曲線にフィッティングさせ、この曲線から力価を計算した。総IgG力価の平均+/-標準偏差として表した力価を表5に示す。
【０２１９】
表5に示すように、処置を受けなかったマウスは、平均レベル1.1E+03の平均バックグラウンド力価を示した。AAV-抗hCD63  ScFv-hGAAまたはAAV-hGAAのどちらかの低用量のウイルス（1e10  vg/マウス）で処置されたマウスは、高い力価を示したが、高用量（1e11  vg/マウス）で処置したマウスでは、力価がそれよりも低かった。最高レベルの血清中GAAを有していた1e11vgのAAV-抗hCD63  ScFv-hGAAで処置したマウスは、未処置マウスの範囲内の力価を有していた。
表5：血清抗GAA抗体レベル
【表４】
2020523321.tif 000006
【０２２０】
AAV投与後にGAAまたは抗hCD63scFv::GAAのレベルが高いことは、抗GAA力価がより低いことに対応する。高い力価または低い力価のAAV-抗hCD63scFv::GAAまたはAAV-GAAを処置したGAAヌルマウスの血清を、注射後3ヵ月の期間にわたって抗GAA抗体について評価した。図5は、血清中の抗GAA抗体力価とGAA曝露との対比（すなわち、  GAAまたはscfv-GAAの3ヵ月にわたる総血清中発現量）を個別のマウスについて図示する。この図は、GAAに対する抗体力価と血清曝露との間に負の相関があることを示し、この相関は、高いGAA曝露を伴うマウスがGAAに寛容であったことを示す。同様に、  図6は、GAAまたは抗hCD63scFv::GAAタンパク質をコードするAAVを感染させた様々な群について、抗GAA抗体力価をプロットしており、構築物の用量が高いほど抗GAAの力価が低かったことを示す。
実施例4：血清GAA
【０２２１】
実験の期間にわたってヒトGAA血清レベルを測定するために、試料を尾部出血を介して毎月採集した。製造業者の仕様書に従い血清セパレータチューブ（BDバイオサイエンス、カタログ番号365967）を使用して、血液から血清を分離した。次いで、1μLの単離血清を4%〜20%のNovex  wedgewellプレキャストゲルにロードし、220Vで45分間泳動し、標準手順書を使用して200mAで1時間、ニトロセルロース膜に転写した。次いで、ニトロセルロース膜を、1:2000希釈での使用による抗GAA一次抗体（アブカム、番号ab137068）、および1:1000希釈での使用による抗GAPDH抗体（アブカム、番号AB9484）を12mL用いてプロービングし、4℃で一晩インキュベーションした。一次抗体によるインキュベーションの後、膜を1回洗浄当たり1x  TBSTにより5分間で3回洗浄した。抗ウサギ  IgG（LiCor、926-32211）二次抗体および抗マウスIgG二次抗体（LiCor、925-68070）（Licor、リンカーン、ネブラスカ州）の1:15000の希釈物12mLを、次いで膜に添加し、室温で1時間インキュベートした。二次抗体のインキュベーション後、膜を1回洗浄当たり1x  TBSTにより5分間で2回、1×TBSにより5分間で1回、洗浄した。次いで、LiCor  Odyssey機器（LI-COR  バイオテクノロジー）を使用して、膜をイメージングし定量した。任意単位で平均±標準偏差（SD）として表したGAAの血清レベルを表6に示す。
【０２２２】
表6に示されるように、供試された高用量(1011  vg/マウス)の  AAV-抗hCD63  ScFv-hGAAまたはAAV-hGAAで処置されたCD63  HumIn  GAA  KOマウスは、実験期間にわたって血清中のGAAのレベルを保持し、AAV-抗hCD63  ScFv-hGAAで処置されたマウスでは、AAV-hGAAで処置されたマウスよりもいくらか高いGAAの血清レベルを有することが示された。低用量(1010  vg/マウス)  のAAV-抗hCD63  ScFv-hGAAまたはAAV-hGAAのどちらかで治療されたマウスでは、GAAのレベルが実験期間にわたって低下し、一部のマウスでは、12週間時点までに極めて僅かなレベルに達した。
表6：血清GAAレベル
【表５】
2020523321.tif 000007
【０２２３】
GAAまたは抗hCD63scfv::GAAの発現は、高用量のAAV（1011  vg/マウス）を受けたマウスにおいて経時的に維持されたが、それより低い用量（1010  vg/マウス）を受けたマウスでは低下した。図7Aは、GAA、またはGAAとの抗hCD63scfv融合体をコードするAAVを感染させた様々な群について、ウェスタンブロットによってプロービングされた際の、経時的なGAAの血清レベルをプロットしたグラフを図示する。融合タンパク質（scFv::GAA）は、送達ドメインを含まないGAA酵素よりも一貫して高いレベル（例えば2.5〜3倍）の血清GAAを示した（図7A）。
【０２２４】
注射の3か月後の肝臓、心臓、および四頭筋における発現のリアルタイムPCRによる定量を図7Bに示す。肝臓での発現は、全てのAAV構築物の注射について検出され、AAV-hGAAおよびAAV-抗hCD63::hGAAの両方（どちらも肝特異的プロモーターであるLSPによって駆動される）について、1e11vg/マウスの注射で最高レベルとなった。血清GAAレベルとGAAのRNA発現レベルとの比較も行ったところ（図7C）、その結果では、融合タンパク質をコードするAAVを受けたマウスが、3ヶ月では肝臓に限局して低いGAA  RNAの発現を提示したものの、GAAの血清レベルは、その特定のマウスでは高かったことが示されている。AAV-LSP-hGAA注射は、肝臓内でRNAレベルが低かった場合、高いGAAの血清レベルを示さなかった。図7Cを参照されたい。このデータは、融合タンパク質をコードする（および発現が肝特異的プロモーターによって駆動される）AAVが、GAAの分泌プロファイルの改善を達成することを示唆する。
【０２２５】
Huh-7肝細胞では、抗体::hGAA対hGAAのみの分泌と細胞内との比率がより高いことも観察された。ある実験では、Huh-7ヒト肝細胞は、hGAA、抗hCD63  scFv::GAA融合体、または非結合scFv::GAA融合体対照をコードする肝特異的プロモーター駆動型構築物を、一過的にトランスフェクションした。どちらのscFv::GAA融合構築物も、トランスフェクションの3日後、分泌上清中のタンパク質の比率がhGAAのみよりも高かった（統計的に有意なp<0.05、n=3）。CI-MPR媒介性取り込みを軽減するために実験期間中に上清にM6Pを添加したことは、この比率に影響を及ぼさなかった。
実施例5：グリコーゲンの組織測定および筋組織の組織学的特性評価
【０２２６】
グリコーゲンの組織測定：個々の組織のグリコーゲン含量を測定するために、心臓、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、ヒラメ筋、およびEDLの組織を、CO2で窒息させた直後の全ての群由来のマウスから切り出し、次いで液体窒素中で急速凍結して、-80℃で保存した。グリコーゲン測定のために、各組織約50mgを、ステンレス鋼ビーズにより蒸留水中1mg対25μLの水の比率で、ベンチトップ用ホモジナイザーで溶解した。グリコーゲン分析溶解物を105°で15分間加熱し、21000×gで遠心分離して破片を除去した。グリコーゲン測定は、蛍光アッセイについての製造業者の指示書に従い、グリコーゲンアッセイキット（シグマアルドリッチ、番号MAK016）を使用して実施した。各試料の蛍光を、535nmの励起および587nmの発光で、蛍光プレートリーダー（モレキュラーデバイス、Spectramax  i3）にて測定した。グリコーゲンの計算量は、製造業者により提供された以下の式を用いて計算した。次いで、各治療群の各組織由来のグリコーゲンの計算量の平均を取ったので、表7に平均±標準偏差（SD）として表す。
【０２２７】
表7に示されるように、  GAA  WTマウスと比較すると、測定された全ての組織にわたって、Gaaの喪失によって、平均グリコーゲンレベルの大きな増加が引き起こされている。AAV-抗hCD63  ScFv-hGAAを1011  vg/マウスで処置することによって、供試された全ての組織でグリコーゲンがWTレベルまたはWTに近いレベルに減少し、AAV-GAAによる処置が貯蔵グリコーゲンを部分的に減少させたのみであったこととは異なっていた。低用量のどちらのウイルスもグリコーゲンを減少させたが、高用量よりも程度が少なかった。1010  vg/マウス用量のAAV-抗hCD63  ScFv-hGAAは、1011  vg/マウス用量のAAV-GAAと同様にグリコーゲンレベルを減少させた。
表7：心臓、四頭筋、腓腹筋、横隔膜、ヒラメ筋、およびEDLで測定された平均±標準偏差のグリコーゲンレベル  
【表６】
2020523321.tif 000008
【０２２８】
組織病理学および定量のための四頭筋の採取:    低用量（1e10vg/マウス）処置群以外の各群からのマウスから得た四頭筋組織試料を、LC3b発現の定量のために切り出しの直後に液体窒素中で急速凍結して-80℃に保存するか、またはO.C.T培地（Tissue-Tek、番号4583）を含有するブロックの上に配した。
【０２２９】
O.C.T培地中の組織試料を、多糖類を検出するための切片作製および過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色のためにHistoserv社（ゲルマンタウン、メリーランド州）に送った。追加の切片を調製し、中心核およびリソソーム増殖の染色のために返された。
【０２３０】
PAS染色：PAS染色切片を、20×倍率でLeica  スライドスキャナーを用いてイメージングした。各治療群の代表的なマウスから結果として得られた画像を図8に示す。
【０２３１】
図8に示されるように、3か月では、AAV-抗hCD63  ScFv-hGAAを処置されたCD63  HumIn  GAA  KOは、処置のないCD63  HumIn  GAA  KOマウスおよびAAV-hGAAで処置されたCD63  HumIn  GAA  KOマウスの両方が高レベルのPAS染色を示したのに比較して、顕著な染色の減少を示した。このことはさらに、AAV-抗hCD63  ScFv-hGAAを用いた処置により、CD63  HumIn  GAA  KOマウスにおける多糖類の蓄積を低減することができ、またそれを筋線維中にわたって均一な様式で行うことができることを示す。
【０２３２】
中心核およびリソソームの増殖の定量：Histoservからの未染色切片を冷凍庫から取り出し、次いで染色チャンバー内で、ＰＢＳ中4%パラホルムアルデヒドを用いて15分間固定した。次いで、固定したスライドを2回、PBS中で5分間洗浄し、続いて、ブロッキング緩衝液（eBiosciences、00-4953-54）と共に室温で1時間インキュベーションした。次いで、スライドを、加湿染色チャンバー内で、ブロッキング緩衝液中1：50希釈のラット抗Lamp-1抗体（アブカム、番号AB25245）もしくはブロッキング緩衝液中1：1000希釈のウサギ抗ラミニン抗体（シグマ、番号L9393）のどちらか、または抗体を添加しないブロッキング緩衝液で染色し、次いで4℃に移して一晩インキュベーションした。翌日、次いでスライドを2回、PBS中で5分間洗浄し、続いて、染色チャンバーで、Alexa  Fluor  647（ライフテックサーモ、番号A27040）にコンジュゲートされたヤギ抗ウサギIgG（H  +L）superclonal二次抗体、またはAlexa  Fluor  555（ライフテックサーモ、番号A21434）にコンジュゲートされたヤギ抗ラットIgG（H  +L）交差吸着済み二次抗体のどちらかを用いて染色し、次いで、室温で1時間インキュベーションさせた。次いで、染色されたスライドを2回、PBS中で5分間洗浄した後、DAPIを含むFluoromount-G（ライフテックサーモ、番号00-4959-52）を用いてマウントし、Zeiss  LSM710機器（Carl  Zeiss  Mics  Gmbh）でイメージングした。中央に位置する核の数を、Haloソフトウェア（インディカラボ、ニューメキシコ州）を使用して定量し、中心核を示す線維のパーセンテージ±標準偏差として表8に表した。リソソームの増殖を図8に図示する。
表8：中心核の定量
【表７】
2020523321.tif 000009
【０２３３】
LC3b発現の定量：LC3b発現の定量のために、急速凍結試料を解凍し、ホモジナイズし、次いで、RIPA緩衝液中、1mgの組織に25μLのRIPA緩衝液の比率（150mM  NaCl、1.0%  IGEPAL（登録商標）CA-630、0.5%デオキシコール酸ナトリウム、0.1%SDS、50mM  Tris、pH8.0、シグマアルドリッチ、R0278）で、45秒間のビーズ衝突（MPバイオメディカル）によって溶解した。溶解物を21,000×gで遠心分離することにより不溶性材料を除き、次いで、RIPA緩衝液中の300μgの溶解物を4%〜20%のNovex  wedgewellプレキャストゲルにロードし、ニトロセルロース膜に転写し、血清GAAレベルの分析について以前に記載された同様のプロトコールを用いて、GAAに対する一次抗体の代わりにマウスLC3b-IおよびLC3b-IIを認識する一次抗体（シグマ、番号L7543）の使用に置き換えて、ウェスタンブロットによって分析した。次いで、LiCor  Odyssey機器（LI-COR  バイオテクノロジー）を使用して、膜をイメージングし定量した。任意単位で（平均±標準偏差）として表されたLC3b-IレベルおよびLC3b-IIレベルを表9に示す。
【０２３４】
表9に示すように、GAAを欠いたマウスでは、CD63  HumIn  GAA  WTマウスと比較して、平均のLC3b-IおよびLC3b-IIの両方のレベルが著しく増加していた。AAV-抗hCD63  ScFv-hGAAを用いた処置によって、CD63  HumIn  GAA  KOにおける平均のLC3b-IレベルおよびLC3b-IIレベルは、WTレベルまたはWTに近いレベルに減少した。AAV-hGAAを用いて処置されたCD63  HumIn  GAA  KOは、CD63  HumIn  GAA  KOマウスと比較して平均のLC3b-IレベルおよびLC3b-IIレベルの僅かな減少を示したが、この減少は、AAV-抗hCD63  ScFv-hGAAによる処置ほど顕著なものではなかった。
表9：マウスの四頭筋におけるLC3b-IレベルおよびLC3b-IIレベル
【表８】
2020523321.tif 000010
実施例6：AAV  抗hCD63::GAA処置は、筋力および筋協調性の試験で有意な増大を生じる
【０２３５】
AAV-LSP  hGAAまたはAAV-LSP抗hCD63::hGAAのいずれかを用いて処置したマウスの握力強度およびロータロッド試験性能。野生型GAAマウス、未処置対照、AAV-LSP-hGAA（1e11vg/マウス）またはAAV-LSP-抗hCD63::hGAA処置（1e11vg/マウス）の加速ロータロッド測定値（図9A）および前肢握力強度の測定値（図9B）を、1ヶ月間隔で6ヶ月間にわたって得た。エラーバーは+/-標準偏差である。全ての群に対してN=8〜10。
実施例7：GAAを組織に向ける「ガイド」としての他の膜タンパク質
【０２３６】
酵素欠損マウスにおいてGAAを補充するよう組織にGAAをガイドするため、抗ITGA7（インテグリンアルファ-7）融合タンパク質などの他の膜タンパク質を供試した。C2C12マウス筋芽細胞を、5mM  M6Pの存在下または非存在下で、抗mCD63-GAAまたは抗ITGA7-GAAと共に一晩インキュベーションした。両方の融合タンパク質について、活性GAA酵素が、経時的に筋芽細胞溶解物に検出された（図10A）。さらに別の実験では、CD63をヒト化されたGAA  KOマウス（GAA-/-;CD63hu/hu）に、scFv::GAA型の抗hCD63::GAAまたは完全長IgG4::GAA型の抗インテグリンアルファ−7をコードするプラスミドを、流体力学的送達（HDD）によって与え、HDDの3週間後にマウスを屠殺した。組織のグリコーゲンレベルを、心臓、四頭筋、腓腹筋、および横隔膜で測定した。未処置の対照マウスGAA-/-×CD63hu/hu、および未処置の野生型GAA対照マウスGAA  +/+;CD63hu/hu(4)も、同じ条件下で供試した。グリコーゲンレベルは、野生型マウスにあるように、抗hCD63::GAA処置マウス群および抗ITGA7::GAA処置マウス群の両方で、非常に低いレベルであった。図10Bを参照されたい。
実施例8：同等の血清レベルでは、AAV  抗CD63::GAA処置は、GAA構築物を最適化したAAV  よりも効果的である
【０２３７】
CD63  HumIn  GAA  KOマウス（GAA-/-×ＣＤ63ｈｕ／ｈｕ）に、抗hCD63::GAAマルチドメイン治療物（配列番号10）の発現を駆動する肝特異的エンハンサー（セルピナ1；配列番号9）および肝特異的プロモーター（LSP；TTR；配列番号8）を含有するAAVを感染させた。これらは、キモトリプシノーゲンB2のシグナルペプチド（SP7）を使用し、筋強度および筋協調の試験において有意な向上を示したヒトGAAのアミノ酸36〜952（Δ8GAA；配列番号78）を含有する。各ウイルスについて、三つの異なる用量:5e11vg/kg、2e12vg/kg、4e12vg/kgを投与した。顎下採血によって定期的に血清を採集した。AAV感染の1ヶ月後、マウスを屠殺した。心筋および骨格筋の組織試料を採集し、液体窒素中で急速凍結させ、保管のために-80℃に保った。組織中のグリコーゲンを、蒸留水中でのビーズ衝突により組織をホモジナイズすることによって測定した。試料を煮沸および遠心分離し、上清を市販のグリコーゲンアッセイキットで使用した。前述の例に記載されたように、ヒトGAAに対する抗体を用いたウェスタンブロットを用いて、血清を定量した。各マウスについて、各組織のグリコーゲンレベルを、1ヶ月での構築物の血清レベルに対してプロットした。4パラメーターのカーブフィットを使用して、各組織における二つの処置のEC50を決定した。
【０２３８】
抗hCD63::GAAまたはsp7-Δ8GAAのどちらかをコードする肝特異的プロモーター（LSP）を含有するAAVを感染させると、各感染用量で同等のGAAの血清レベルがもたらされた。図11    しかし、アッセイされたそれぞれの筋組織において、抗hCD63::GAAとsp7-Δ8GAAの使用を比べると、約2.2倍のEC50の低減が観察され、このことは、同等の血清レベルでは、抗hCD63::GAAは、抗体に融合されていない改変GAA発現構築物よりも効率的にグリコーゲンを取り除くことを示す。図12および  表10を参照されたい。
表10：心臓、横隔膜、四頭筋、三頭筋におけるAAV  抗hCD63::GAAおよびAAV  sp7-Δ8GAA  のEC50  （95%信頼区間）
【表９】
2020523321.tif 000011
実施例9：例示的なCD63抗体
【０２３９】
抗ヒトCD63抗体の生成
【０２４０】
抗ヒトCD63抗体は、マウス（例えば、ヒトイムノグロブリン重鎖可変領域およびヒトカッパ軽鎖可変領域をコードするDNAを含む工学的に操作されたマウス）をヒトCD63で免疫することによって得た。
【０２４１】
免疫後、各マウスから脾細胞を採取し、（1）マウス骨髄腫細胞と融合して、それらの生存能を保持しハイブリドーマ細胞を形成し、ヒトCD63特異性についてスクリーニングしたか、または（2）反応性抗体を結合し特定するソーティング反応部としてどちらかのヒトCD63断片を用いて、（米国特許出願公開第2007/0280945号A1に記載されるように）B細胞をソーティングした（抗原陽性B細胞）。
【０２４２】
ヒトCD63に対するキメラ抗体は、例えば、そのそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許第7,105,348号、米国特許第8,642,835号、および米国特許第9,622,459号に記載されるようなVELOCIMMUNE技術を用いて、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有して最初に単離された。
【０２４３】
一部の抗体では、試験の目的のために、マウス定常領域を、所望のヒト定常領域、例えば野生型ヒトCHまたは改変ヒトCH（例えば、  IgG1、IgG2、またはIgG4アイソタイプ）、および軽鎖定常領域（CL）に置換して、完全ヒト抗hCD63を生成するが、そのようなものとしては、抗hCD63抗体またはその抗原結合部分を含む完全ヒト二重特異性抗体が挙げられる。  選択される定常領域は、特定の用途に従い変化し得るが、一方、可変領域には、高親和性の抗原結合性と標的特異性の特徴が存在する。
【０２４４】
この実施例の方法に従って生成された抗ヒトCD63結合アームを含む例示的な二重特異性抗体のある特定の生物学的特性を、下記に記載される実施例に詳細に説明する。
【０２４５】
抗CD63抗体の重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸および核酸の配列
【０２４６】
表11は、本明細書に開示されるマルチドメイン治療用抗CD63::GAAタンパク質を生成するために使用される、選択された抗CD63の重鎖もしくは軽鎖の可変領域（それぞれHCVRもしくはLCVR）、または重鎖もしくは軽鎖のCDR（それぞれHCDRおよびLCDR）をコードする核酸（NA）配列の配列識別子と、丸括弧にはアミノ酸（AA）配列の配列識別子とを記載する。
表11:抗CD63配列識別子  
【表１０】
2020523321.tif 000012
【０２４７】
親抗ヒトCD63抗体による結合  
【０２４８】
ヒトCD63発現細胞に対する抗CD63抗体の相対細胞表面結合を、ヒトCD63を内因的に発現するCD63陽性のHEK293細胞（ATCC、カタログ番号CRL-1573）と、CD63陰性のHEK293/CD63ノックアウト細胞とを使用して、フローサイトメトリーを介してアクセスした。アッセイのため、96ウェルV字底プレート（アキシジェンサイエンティフィック、カタログ番号P-96-450-V-C-S）中、2%FBS（パラダイム、カタログ番号1500-500）を含有するカルシウムおよびマグネシウム不含のPBS（VWR、カタログ番号45000-446）（染色緩衝液）に細胞を播種した。次いで細胞を、100nMから1.7pMに及ぶ濃度で抗CD63抗体またはアイソタイプ対照抗体と共に、氷上で30分間インキュベーションした。抗体を含有しないウェルを対照として使用した。HEK293/CD63KO細胞を、最高濃度（100nM）の抗体のみで染色した。次いで、染色緩衝液を用いて細胞を1回洗浄し、100nMのPEコンジュゲート抗マウスFc二次抗体（ジャクソンイムノリサーチ、カタログ番号115-115-164）と共に4℃で30分間インキュベーションした。次いで細胞を洗浄し、PBS中に希釈されたCytofix（BD  バイオサイエンス、カタログ番号554655）の50%溶液を使用して固定した。試料をIntellicyte  Hypercytフローサイトメーター上でランし、結果をForeCytソフトウェア(Intellicyte)で解析して、平均蛍光強度（MFI）を計算した。GraphPad  Prismを使用して12点応答曲線にわたる4パラメータロジスティック方程式を使用して、測定された値を解析したので、結果として得られたEC50値を報告する（表12）。シグナルとノイズとの比（S/N）は、抗CD63抗体または対照抗体のMFIと抗体を含有しないウェルとの比を計算することによって決定した（表12）。
【０２４９】
表12に示すように、本発明の三つの抗CD63抗体は、21.0から31.6に及ぶS/N値と0.5nMから1.9nMに及ぶEC50  値で、HEK293細胞との結合を示した。非結合対照は、HEK293細胞への結合を示さなかった（S/N≦1.5）。抗CD63抗体およびアイソタイプ対照抗体はどちらも、HEK293/CD63KO細胞との結合が弱いかほぼないことを示した(S/N  ≦4.4)。
表12：フローサイトメトリーによって測定されたHEK293細胞およびHEK293/CD63  KO細胞に対する抗CD63抗体の結合
【表１１】
2020523321.tif 000013
【０２５０】
ヒトCD63発現細胞に結合するための本発明の抗CD63モノクローナル抗体の能力も、電気化学発光法（ECL）ベースの検出アッセイを用いて決定した。
【０２５１】
過剰発現細胞を生成するために、マウス胚性線維芽細胞NIH3T3細胞（ATCC、カタログ番号CRL-1658）をトランスフェクションして、ヒトCD63（hCD63；登録番号NP_001771のアミノ酸M1-M238；配列番号77）を安定的に発現する細胞株「NIH3T3/hCD63」を形成した。内因性発現細胞、すなわちヒトアンドロゲン感受性前立腺腺癌細胞株であるLNCAP（ATCC、カタログ番号CRL-1740）、およびヒト原発性グリア芽腫細胞株であるU87MG（ATCC、カタログ番号HTB-14）におけるヒトCD63の発現レベルを、Quantum（商標）Alexa  Fluor（登録商標）647  MESF（バングス・ラボラトリー（Bangs  Laboratories）、カタログ番号647B）およびSimply  Cellular（登録商標）抗マウスIgG（バングス・ラボラトリー社、カタログ番号815）を用いて、製造業者の指示書に従って分析した。LNCAP細胞を、U87MG細胞よりも低いヒトCD63コピー数を持つものと決定した。蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）によるヒトCD63の検出可能な発現のない非トランスフェクトNIH3T3細胞を、陰性対照として含めた。
【０２５２】
簡潔に述べると、細胞株を、Ca2+/Mg2+不含ＰＢＳ緩衝液中で1回リンスし、酵素不含細胞解離溶液（Enzyme  Free  Cell  Dissociation  Solution）（ミリポア、カタログ番号S-004-C）を用いて37℃で10分間インキュベーションして、細胞を剥離した。次いで、細胞をCa2+/Mg2+含有ＰＢＳで1回洗浄し、  Cellometer（商標）自動T4細胞カウンター（ネクセロムバイオサイエンス社）を用いて計数した。約2.0x104個のNIH3T3/hCD63細胞、LNCAP細胞、U87MG細胞、またはNIH3T3細胞を、96ウェル炭素電極プレート（メソスケールディスカバリー、カタログ番号Ｌ15ＸＢ−6）上に別々に播種し、次いで、37oCで1時間インキュベーションした。非特異的結合部位を、Ca2+/Mg2+含有ＰＢＳ中2%BSA（w/v）を用いて、室温（RT）で1時間ブロッキングした。Ca2+/Mg2+含有ＰＢＳ中0.5%BSA（w/v）に濃度（1.7pMから100nM）の範囲で抗CD63抗体またはアイソタイプ対照抗体を含有する溶液、ならびに対照緩衝液のみを、次いで、プレートに結合したNIH3T3/hCD63細胞、LNCAP細胞、U87MG細胞、またはNIH3T3細胞に2連で添加して、室温で1時間インキュベーションした。続いて、プレートを洗浄して、細胞洗浄ヘッド（MDSアナリティカルテクノロジー）を備えたAquaMax2000プレートワッシャーを使用して、非結合の抗体を除去した。プレートに結合した抗体を、1μg/mLのFcγ  断片に特異的なSULFO-TAG（商標）コンジュゲートヤギポリクローナル抗ヒトIgG抗体（ジャクソンイムノリサーチ、カタログ番号109-005-098）、またはFcγ断片に特異的なSULFO-TAG（商標）コンジュゲートヤギポリクローナル抗マウスIgG抗体（ジャクソンイムノリサーチ、カタログ番号115-005-164）のどちらかで、室温で1時間検出した。プレートを洗浄し、次いで製造業者の指示書に従って読取緩衝液（MSD、カタログ番号R92TD-2）と共にインキュベーションした。発光シグナルを、SECTOR撮像装置（MSD）を使用して測定した。相対光単位（RLU）で測定された発光強度を記録して、供試された濃度の範囲で各抗体の結合強度を標示した。ヒトCD63発現細胞との3.7nMの抗体の結合で検出された信号を、陰性細胞との同濃度の抗体の結合と比較した比率を、CD63との結合の特異性の指標として報告出力した。3を超える結合比を有する抗体を、特異的な結合体として分類し、3以下の結合比を有する抗体を、非結合体として分類して表13にNBとしてマークした。さらに、直接的な結合シグナル（RLU）を、抗体濃度の関数として分析し、そのデータを、GraphPad  Prism（商標）ソフトウェアを使用してシグモイド（4パラメータロジスティック）用量反応モデルにフィッティングさせた。ヒトCD63発現細胞との結合に関するEC50  を、最大結合シグナルの50%が検出された抗体の濃度として定義し、それを決定して、各抗体の強度を標示し、特異的な結合体についてのみ表13に報告した。
【０２５３】
表13に示されるように、四つの抗CD63抗体が、実施例9の記載のように生成され、比較体Ab（比較体1）は、工学的に操作されたNIH3T3/hCD63細胞上で発現されたヒトCD63、ならびにLNCAP細胞株およびU87MG細胞株上で内因的に発現されたヒトCD63に、特異的に結合した。実施例9に記載された四つの抗CD63抗体は、280pMから970pMに及ぶEC50値と、陰性細胞株の91倍から281倍に及ぶ結合比で、NIH3T3/hCD63細胞に結合した。本発明の四つの抗CD63抗体は、500pMから1.4nMに及ぶEC50値と、陰性細胞株の52倍から272倍に及ぶ結合比で、U87MG細胞に結合した。実施例9に記載された生成された四つの抗CD63抗体は、210pMから1.7nMに及ぶEC50値と、陰性細胞株の7倍から20倍に及ぶ結合比で、LNCAP細胞に結合した。LNCAP細胞上の結合比がより低かったことは、これらの細胞上のCD63のコピー数がU87MG細胞に比較してさらに低いことと一致する。アイソタイプ対照抗体は、予想通りに、細胞結合比が3以下であった。
表13.  電気化学発光ベースの検出により測定されたヒトCD63発現細胞への抗CD63抗体の結合
【表１２】
2020523321.tif 000014
【０２５４】
親抗ヒトCD63抗体によって媒介される細胞毒性
【０２５５】
本明細書に記載される抗CD63抗体がCD63発現細胞内で内部移行する能力を評価するために、  in  vitroの間接的な細胞障害活性アッセイを実施した。ヒトCD63陽性のT47D細胞（ATCC、カタログ番号HTB-133）およびヒトCD63陰性のNIH3T3細胞（ATCC、カタログ番号CRL-1658）をそれぞれ、PDL被覆96ウェルプレート（BDバイオコート、カタログ番号356461）中、10%  FBS  (ATCC、カタログ番号30-2020)、ペニシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン  (ギブコ、カタログ番号10378-016)、50uMベータ-メルカプトエタノール(シグマ、カタログ番号M7522)  (成長培地)、ピルビン酸ナトリウム100mM  (ミリポア、カタログ番号TMS-005-C)、HEPES  1M  (アーバインサイエンティフィック、カタログ番号9319)、およびウシインスリン10  ug/mL  (ジェミニバイオプロダクト、カタログ番号700-912P)  を含有するRPMI  (アーバインサイエンティフィック、カタログ番号9160)にウェル当たり6,000細胞個で、またはDME高グルコース(アーバインサイエンティフィック、カタログ番号9033)、10%ウシ胎児血清(ハイクローン、カタログ番号SH30072.03)、およびペンシリン/ストレプトマイシン/L-グルタミン(ギブコ、カタログ番号10378-016)にウェル当たり2,000細胞個で播種し、5％CO2中37℃で一晩成長させた。細胞生存率曲線については、細胞を、3.0pMから2.2nMに及ぶ濃度で順次希釈した抗CD63抗体（H2M12450N）または非結合アイソタイプ対照抗体と共に、37℃で5分間インキュベーションした。次いで、細胞障害性ペイロードMMAFにコンジュゲーションされたFab抗mFc二次抗体（モラデック、カタログ番号AM-201AF-50）を、20nMで各ウェルに添加した。陰性対照として供された培地のみ、および33μＭのジギトニン（プロメガ、カタログ番号G9441）を使用して、最大細胞障害活性を決定した。72時間のインキュベーション後、製造業者のプロトコールに従って細胞計数キット−8（同仁化学研究所、カタログ番号CK04）を用いて、インキュベーション時間の範囲を1〜3時間として、細胞生存率を測定した。450nmでの吸光度（OD450）をEnvisionプレートリーダー（パーキンエルマー）で測定した。ジギトニン処理細胞由来のバックグラウンドのOD450  レベルを全てのウェルから減算し、生存率を未処理対照のパーセンテージ（%生存率）として表した。ＩＣ50  値を、8点応答曲線にわたる4パラメータロジスティック方程式（GraphPad  Prism）から決定した。全てのIC50  値をnM濃度で表し、処理後に残存する最小％生細胞を報告出力した。
【０２５６】
表14に要約されるように、抗CD63抗体であるH2M12450Nは、T47Dの生存率を21%に低減させ、IC50  値が0.24nMであったのに対し、アイソタイプ対照は、生存率を64%に低減させたに過ぎなかった。抗体は、ＮＩＨ3Ｔ3細胞株の生存率にほぼまたは全く影響を与えなかった。
表14.  T47D細胞およびNIH3T3細胞における間接的な細胞障害活性アッセイによって測定された抗CD63抗体の内部移行
【表１３−１】
2020523321.tif 000015
【表１３−２】
2020523321.tif 000016
【０２５７】
25℃および37℃で測定されたCD63（EC2）ループ反応部に結合する抗CD63モノクローナル抗体のBiacore結合カイネティクス
【０２５８】
精製された抗CD63モノクローナル抗体に結合する各種CD63ループ反応部についての平衡解離定数（KD）を、リアルタイム表面プラズモン共鳴ベースのBiacore  T200バイオセンサーまたはBiacore  2000バイオセンサーを使用して決定した。全ての結合試験を、10mM  HEPES、150mM  NaCl、3mM  EDTA、および0.05%  v/v  界面活性剤Tween-20、pH7.4（HBS-ET）のランニング緩衝液中、25℃および37℃で実施した。Biacore  CM5センサーチップの表面を、まずウサギ抗マウスFc特異的ポリクローナル抗体（GEヘルスケア、カタログ番号BR100838）または抗ヒトFabキット（GEヘルスケア、カタログ番号28958325）のどちらかを用いたアミンカップリングによって誘導体化し、抗CD63モノクローナル抗体を捕捉した。C末端Myc-Myc-ヘキサヒスチジンと共に発現された組換えヒトCD63細胞外ループ2（hCD63  ECループ2-MMH；配列番号80）、またはC末端ヒトFcタグと共に発現された組換えヒトCD63細胞外ループ2（hCD63  ECループ2-hFc；配列番号81）のどちらかについて、結合試験を実施した。異なる濃度のhCD63  ECループ2-MMHまたはhCD63  ECループ2-hFc（4倍希釈中50nM  〜12.5nMまたは3倍希釈系列中90nM〜0.37nMのどちらかで供試）を、まずHBS-ETランニング緩衝液中で調製し、抗CD63モノクローナル抗体表面に捕捉された抗マウスFcの上に、流速35  μL/分または50  μL/分で4分間注入し、その間に、CD63反応部に結合したモノクローナル抗体の解離を、HBS-ETランニング緩衝液中で8分間または10分間モニタリングした。Scrubber2.0cカーブフィッティングソフトウェアを使用して、質量輸送限界（mass  transport  limitation）を用いてリアルタイム結合センサーグラムを1:1結合モデルにフィッティングさせることによって、会合速度（ka）および解離速度（kd）を決定した。結合解離平衡定数（KD）および解離半減期（t1/2）を、以下のように運動速度から計算した:    
【数１】
2020523321.tif 000017
【０２５９】
25℃および37℃での本発明の各種抗CD63モノクローナル抗体に結合するヒトCD63  ECループ2タンパク質についての結合カイネティクスパラメータを、表15から表18に示す。
【０２６０】
25℃では、表15に示すように、全ての本発明の抗CD63モノクローナル抗体が、530pMから11.0nMに及ぶKD値で、hCD63  ECループ2-MMHに結合した。37℃では、表16に示すように、全ての本発明の抗CD63モノクローナル抗体が、1.15nMから56.4nMに及ぶKD値で、hCD63  ECループ2-MMHに結合した。
【０２６１】
25℃では、表17に示すように、全ての本発明の抗CD63モノクローナル抗体が、150pMから753pMに及ぶKD値で、hCD63  ECループ2-hFcに結合した。37°Cでは、表18に示すように、全ての本発明の抗CD63モノクローナル抗体が、119pMから3.38nMに及ぶKD値で、hCD63  ECループ2-hFcに結合した。
表15  ：25℃での抗CD63モノクローナル抗体とのヒトCD63  ECループ2-MMHの結合の結合動態パラメータ
【表１４】
2020523321.tif 000018
表16：37℃での抗CD63モノクローナル抗体とのヒトCD63  ECループ2-MMHの結合の結合動態パラメータ
【表１５】
2020523321.tif 000019
表17：25℃での抗CD63モノクローナル抗体とのヒトCD63  ECループ2-hFCの結合の結合動態パラメータ
【表１６】
2020523321.tif 000020
表18  ：37℃での抗CD63モノクローナル抗体とのヒトCD63  ECループ2-hFCの結合の結合動態パラメータ
【表１７】
2020523321.tif 000021
【０２６２】
抗CD63結合アームを有する二重特異性複合体の内部移行を決定するための二重特異性抗体の生成
【０２６３】
二重特異性抗原結合分子の一部として内部移行するようにこの実施例に記載されるように生成された抗CD63抗体の能力を評価するために、抗体を二重特異性型へと再構成したが、その型では、一方の結合アームを抗CD63抗体VH/VLペア（表11の親抗体を参照）とし、他方を無関係な結合アームとした。二重特異性抗体を作製する標準的な方法を使用したが、例示的方法は、例えば、  それぞれが参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2010/0331527号および米国特許第5731168号に記載されている。二重特異性抗体を、ヒトCD63発現細胞を使用して、内部移行する能力について試験した。アッセイのため、ヒトCD63を内因的に発現するHEK293細胞を、透明底黒色ポリD-リジン被覆96ウェルプレート（グライナー、カタログ番号655946）中、10%FBSおよびペニシリン−ストレプトマイシン／L-グルタミン（ギブコ、カタログ番号10378016）を含有するDMEMに10,000細胞個／ウェルの密度で播種した。2日後、10μg/ｍLから始まり0.157μg/ｍLまでの2倍希釈系列の抗CD63二重特異性抗体および陰性対照抗体を含有する新鮮な培地に培地を置換し、併せて培地のみの対照に置換した。次いで、細胞を37℃で3時間インキュベーションし、抗体の内部移行をさせた。インキュベーション後、細胞をPBSで洗浄し、4%パラホルムアルデヒド（サーモサイエンティフィック、カタログ番号28908）中、室温で20分間固定し、続いて、5%正常ヤギ血清（NGS）（ギブコ、カタログ番号PCN5000）中0.2%  Triton  X-100（スペクトラムケミカル、カタログ番号  TR135）中、室温で20分間透過化した。次いで、2ug/mLのロバ抗マウスIgG  Alexa  Fluor-647  Fab（マニュファクチャ、カタログ番号115-606-006）または2μg/ｍLのヤギ抗ヒトIgG  Alexa  Fluor-647  Fab（ジャクソンイムノリサーチ、カタログ番号115-606-006）のどちらかと共に、細胞を5%のNGS中、室温で1時間インキュベーションした。二次抗体溶液を除去し、次いで細胞をＰＢＳで洗浄し、続いて2滴／mLのNucBlue  (インビトロジェン、カタログ番号R37605)  を含有する新鮮なＰＢＳを添加して、生細胞の核を染色した。抗体の内部移行および核を、ImageXpress  High-Content  Imaging  System（モレキュラーデバイス）にて40×でイメージングし、抗体の内部移行を、MetaXpress  Software  Transfluor  Application  Module  (モレキュラーデバイス)を使用して定量した。抗体の内部移行を、細胞当たりのピット積算強度  ±  標準偏差（SD）として報告する。
【０２６４】
表15に示されるように、ヒトCD63に対する単一アームの結合を組み込んだ全ての二重特異性抗体（H1M12451、H2M12450、またはH2M12395のいずれかに由来する）は、HEK293細胞内への効率の良い内部移行を示した。mAb12450の一方の結合アームを組み込んだ二重特異性抗体は、供試した他方の二重特異性抗体よりも高い量の内部移行を示した。
表15：HEK293細胞による抗CD63二重特異性抗体の内部移行
【表１８−１】
2020523321.tif 000022
【表１８−２】
2020523321.tif 000023
【０２６５】
（項目１）
送達ドメインと酵素ドメインとを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（項目２）
前記送達ドメインが抗原結合タンパク質である、項目1に記載のポリヌクレオチド。
（項目３）
前記送達ドメインが単鎖可変断片（scFv）である、項目1または項目2に記載のポリヌクレオチド。
（項目４）
前記送達ドメインが内部移行エフェクターに結合する、項目1〜3のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目５）
前記送達ドメインが、CD63、インテグリンアルファ-7（ITGA7）、MHC-1、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、トランスフェリン受容体、LDL受容体、LDL関連タンパク質1受容体、ASGR1、ASGR2、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質2（APLP2）、アペリン受容体（APLNR）、MAL（Myelin  And  Lymphocyteタンパク質（MAL））、IGF2R、液胞型H+ATPアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3、およびCD36からなる群から選択される内部移行エフェクターに結合する、項目1〜4のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目６）
前記送達ドメインが内部移行エフェクターCD63に結合する、項目1〜5のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目７）
前記送達ドメインが、配列番号2のアミノ酸配列、または表11に記載されるHCVRのアミノ酸配列、表11に記載されるLCVRのアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR1のアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR2のアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR3のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR1のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR2のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR3のアミノ酸配列、配列番号  14/22、配列番号  30/38、配列番号46/54、もしくは配列番号62/70に記載されるHCVR/LCVR  アミノ酸ペア、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、任意選択的に、前記HCVR/LCVRアミノ酸ペアが、N末端からC末端まで、HCVR、任意選択的なリンカー、およびLCVRを含み、ならびに／または任意選択的に、酵素ドメインが、LCVRのC末端に（例えばリンカーを介して）付加している、項目1〜6のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目８）
前記酵素ドメインがヒドロラーゼを含む、項目1〜7のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目９）
前記酵素ドメインがグリコシラーゼを含む、項目1〜8のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１０）
前記酵素ドメインがグリコシダーゼを含む、項目1〜9のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１１）
前記酵素ドメインがアルファ-グルコシダーゼを含む、項目1〜10のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１２）
前記酵素ドメインが、配列番号1、配列番号13、配列番号78のアミノ酸配列またはその断片を含む、項目1〜11のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１３）
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含む、項目1〜12のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１４）
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、前記ウイルス核酸配列が、アデノ関連ウイルス（AAV）核酸配列である、項目1〜13のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１５）
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、前記ウイルス核酸配列が、アデノ関連ウイルス（AAV）核酸配列であり、前記AAV  核酸配列が、内部末端反復配列を含み、任意選択的に、肝特異的プロモーターなどの組織特異的調節因子を含む、項目1〜14のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１６）
ウイルス核酸配列および遺伝子座ターゲティング核酸配列をさらに含み、前記ウイルス核酸配列が、配列番号6、配列番号7、または両方と、任意選択的に、肝特異的プロモーターなどの組織特異的調節因子とを含む内部末端反復配列を含むアデノ関連ウイルス（AAV）核酸配列である、項目1〜15のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１７）
配列番号8、配列番号9、またはその両方として記載される配列を含む組織特異的調節因子をさらに含む、項目1〜16のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１８）
配列番号11の核酸配列を含み、および／または配列番号10または配列番号78として記載されるアミノ酸配列をコードする、項目1〜17のいずれか1項に記載のポリヌクレオチド。
（項目１９）
項目1〜18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクター。
（項目２０）
任意選択的に天然ウイルス、工学的に操作されたウイルス、またはキメラウイルスである、ウイルスベクター、
項目1〜18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドを含む裸のポリヌクレオチド、
任意選択的に項目1〜18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドおよび脂質を含む脂質ナノ粒子である、ポリヌクレオチド複合体、ならびに  
それらの任意の組み合わせ、からなる群から選択される、項目19に記載の遺伝子療法ベクター。
（項目２１）
前記遺伝子療法ベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルス、またはアデノ関連ウイルスからなる群から選択されるウイルスベクターである、項目19または項目20に記載の遺伝子療法ベクター。
（項目２２）
前記遺伝子療法ベクターが、AAV2/8キメラおよび／または特定の組織、例えば肝臓に対してAAVシュードタイプである、項目19〜21のいずれか1項に記載の遺伝子療法ベクター。
（項目２３）
送達ドメインおよび酵素ドメインを含む組み換えマルチドメイン治療用タンパク質であって、項目1〜18のいずれか1項に記載のポリヌクレオチドによってコードされる、組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２４）
前記送達ドメインが抗原結合タンパク質である、項目23に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２５）
前記送達ドメインが単鎖可変断片（scFv）である、項目23または項目24に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２６）
前記送達ドメインが内部移行エフェクターに結合する、項目23〜25のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２７）
前記送達ドメインが、CD63、インテグリンアルファ-7（ITGA7）、MHC-1、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、トランスフェリン受容体、LDL受容体、LDL関連タンパク質1受容体、ASGR1、ASGR2、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質2（APLP2）、アペリン受容体（APLNR）、MAL（Myelin  And  Lymphocyteタンパク質（MAL））、IGF2R、液胞型H+ATPアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3、およびCD36からなる群から選択される内部移行エフェクターに結合する、項目23〜26のいずれか1項に記載の組換えマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２８）
前記送達ドメインが前記内部移行エフェクターCD63に結合する、項目23〜27のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目２９）
前記送達ドメインが、配列番号2のアミノ酸配列、または表11に記載されるHCVRのアミノ酸配列、表11に記載されるLCVRのアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR1のアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR2のアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR3のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR1のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR2のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR3のアミノ酸配列、配列番号  14/22、配列番号  30/38、配列番号46/54、もしくは配列番号62/70に記載されるHCVR/LCVR  アミノ酸ペア、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、任意選択的に、前記HCVR/LCVRアミノ酸ペアが、N末端からC末端まで、HCVR、任意選択的なリンカー、およびLCVRを含み、ならびに／または任意選択的に、酵素ドメインが、LCVRのC末端に（例えばリンカーを介して）付加している、項目23〜28のいずれか1項に記載の組換えマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３０）
前記酵素ドメインがヒドロラーゼを含む、項目23〜29のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３１）
前記酵素ドメインがグリコシラーゼを含む、項目23〜30のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３２）
前記酵素ドメインがグリコシダーゼを含む、項目23〜31のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３３）
前記酵素ドメインがアルファ-グルコシダーゼ（GAA）またはその一部分を含む、項目23〜32のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３４）
前記酵素ドメインが、配列番号1、配列番号13、配列番号78のアミノ酸配列またはその断片を含み、任意選択的に、前記マルチドメイン治療用タンパク質が、配列番号79として記載されるアミノ酸配列を含む、項目23〜33のいずれか1項に記載の組み換えマルチドメイン治療用タンパク質。
（項目３５）
送達ドメインおよび酵素ドメインを含む組み換えマルチドメイン治療用タンパク質を細胞で発現する方法であって、
a.  前記組換えマルチドメイン治療用タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する遺伝子療法ベクターに前記細胞を接触させること、
ｂ.  前記ポリヌクレオチドを前記細胞のゲノム遺伝子座に組み込ませること、および
ｃ.  前記細胞に前記組み換えマルチドメイン治療用タンパク質を産生させること、を含み、
前記遺伝子療法ベクターが、項目19〜22のいずれか1項による、方法。
（項目３６）
前記遺伝子療法ベクターが、アデノ関連ウイルス（AAV）ベクターである、項目35に記載の方法。
（項目３７）
前記細胞のゲノム遺伝子座が、セーフハーバー遺伝子座である、項目35または項目36に記載の方法。
（項目３８）
ゲノム遺伝子座が、EESYR  遺伝子座、SARS遺伝子座、ヒト第1番染色体の188,083,272  位もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、ヒト第10番染色体の3,046,320位もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、ヒト第17番染色体の67,  328,980もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、染色体上のアデノ関連ウイルス部位1  (AAVS1)  、ヒト第19番染色体上のAAV  ウイルスの天然発生の組込みの部位もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、ケモカイン受容体5  (CCR5)遺伝子、HIV-1共受容体をコードするケモカイン受容体遺伝子、またはマウスRosa26遺伝子座もしくはその非ヒト哺乳動物のオルソログ、およびヒトアルブミン  (alb)遺伝子座からなる群から選択される、遺伝子座にあるかまたは近い、項目35〜37のいずれか1項に記載の方法。
（項目３９）
前記送達ドメインが抗原結合タンパク質である、項目35〜38のいずれか1項に記載の方法。
（項目４０）
前記送達ドメインが単鎖可変断片（scFv）である、項目35〜39のいずれか1項に記載の方法。
（項目４１）
前記送達ドメインが前記内部移行エフェクターに結合する、項目35〜40のうちいずれか1項に記載の方法。
（項目４２）
前記送達ドメインが、CD63、インテグリンアルファ-7（ITGA7）、MHC-1、Kremen-1、Kremen-2、LRP5、LRP6、LRP8、トランスフェリン受容体、LDL受容体、LDL関連タンパク質1受容体、ASGR1、ASGR2、アミロイド前駆体タンパク質様タンパク質2（APLP2）、アペリン受容体（APLNR）、MAL（Myelin  And  Lymphocyteタンパク質（MAL））、IGF2R、液胞型H+ATPアーゼ、ジフテリア毒素受容体、葉酸受容体、グルタミン酸受容体、グルタチオン受容体、レプチン受容体、スカベンジャー受容体A1-5(SCARA1-5)、SCARB1-3、およびCD36からなる群から選択される内部移行エフェクターに結合する、項目35〜41のいずれか1項に記載の方法。
（項目４３）
前記送達ドメインが内部移行エフェクターCD63に結合する、項目35〜42のいずれか1項に記載の方法。
（項目４４）
前記送達ドメインが、配列番号2のアミノ酸配列、または表11に記載されるHCVRのアミノ酸配列、表11に記載されるLCVRのアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR1のアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR2のアミノ酸配列、表11に記載されるHCDR3のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR1のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR2のアミノ酸配列、表11に記載されるLCDR3のアミノ酸配列、配列番号  14/22、配列番号  30/38、配列番号46/54、もしくは配列番号62/70に記載されるHCVR/LCVR  アミノ酸ペア、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、任意選択的に、前記HCVR/LCVRアミノ酸ペアが、N末端からC末端まで、HCVR、任意選択的なリンカー、およびLCVRを含み、ならびに／または任意選択的に、酵素ドメインが、LCVRのC末端に（例えばリンカーを介して）付加している、項目35〜43のいずれか1項に記載の方法。
（項目４５）
前記酵素ドメインがヒドロラーゼを含む、項目35〜44のいずれか1項に記載の方法。
（項目４６）
前記酵素ドメインがグリコシラーゼを含む、項目35〜45のいずれか1項に記載の方法。
（項目４７）
前記酵素ドメインがグリコシダーゼを含む、項目35〜46のいずれか1項に記載の方法。
（項目４８）
前記酵素ドメインがアルファ-グルコシダーゼを含む、項目35〜47のいずれか1項に記載の方法。
（項目４９）
前記酵素ドメインが、配列番号1、配列番号13、配列番号78のアミノ酸配列またはその任意の断片を含む、項目35〜48のいずれか1項に記載の方法。
（項目５０）
前記ポリヌクレオチドが、配列番号11の核酸配列を含む、項目35〜49のいずれか1項に記載の方法。
（項目５１）
前記細胞がex  vivoである、項目35〜50のいずれか1項に記載の方法。
（項目５２）
前記細胞がin  vivoである、項目35〜50のいずれか1項に記載の方法。
（項目５３）
前記細胞がヒト細胞である、項目35〜52のいずれか1項に記載の方法。
（項目５４）
前記細胞がマウス細胞である、項目35〜52のいずれか1項に記載の方法。
（項目５５）
前記細胞が肝臓細胞である、項目35〜54のいずれか1項に記載の方法。
（項目５６）
項目18〜21のいずれか1項に記載の遺伝子療法ベクターを患者に投与することを含む、それを必要とする患者の組織中のグリコーゲン蓄積を減少させる方法。
（項目５７）
前記組織が、心臓、肝臓、および骨格筋からなる群から選択される、項目56に記載の方法。
（項目５８）
前記マルチドメイン治療用タンパク質が、抗CD63  scFv-GAAを含み、任意選択的に、前記抗CD63scFvが、配列番号  14/22、配列番号  30/38、配列番号46/54、もしくは配列番号62/70に記載されるHCVR/LCVR  アミノ酸ペアを含み、任意選択的に、前記HCVR/LCVRアミノ酸ペアが、N末端からC末端まで、HCVR、任意選択的なリンカー、およびLCVRを含み、任意選択的に、酵素ドメインが、LCVRのC末端に、例えばリンカーを介して付加しており、任意選択的に、前記GAAが、配列番号1または配列番号78のアミノ酸配列を含み、および／または任意選択的に、抗CD63scFv-GAAが、配列番号10もしくは配列番号79として記載される配列を含む、項目56または項目57に記載の方法。
（項目５９）
高いGAAの血清レベルが少なくとも12週間維持される、項目56〜58のいずれか1項に記載の方法。
（項目６０）
12週間でのGAAの血清レベルが、抗CD63  scFv送達ドメインを含まずGAAをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターを投与された対象中のGAAの血清レベルよりも約2.5〜3倍高い、項目56〜58のいずれか1項に記載の方法。
（項目６１）
心臓、骨格筋、および肝臓の組織のグリコーゲンレベルが、野生型レベルまで低減される、項目56〜60のいずれか1項に記載の方法。
（項目６２）
前記組織中のグリコーゲンレベルが、前記遺伝子療法ベクターの投与の3か月後に野生型レベルで維持される、項目56〜61のいずれか1項に記載の方法。
（項目６３）
項目19〜22のいずれか1項に記載の遺伝子療法ベクターを患者に投与することを含む、それを必要とする患者で酵素欠損症を治療するおよび／または欠損した前記酵素に対して患者を寛容にする方法であって、前記遺伝子療法ベクターが、酵素ドメインおよび送達ドメインを含むマルチドメイン治療用タンパク質をコードする、方法。
（項目６４）
前記酵素欠損症がグリコシダーゼ酵素の欠損である、項目63に記載の方法。
（項目６５）
前記酵素欠損症がアルファ-グルコシダーゼの欠損である、項目63または項目64に記載の方法。
（項目６６）
前記マルチドメイン治療用タンパク質が、抗CD63  scFv-GAAであり、任意選択的に、前記抗CD63  scFv-GAAが、配列番号10または配列番号79として記載されるアミノ酸配列を含む、項目63〜65のいずれか1項に記載の方法。
（項目６７）
高いGAAの血清レベルが、前記遺伝子療法ベクターの投与後少なくとも12週間、患者で維持される、項目63〜66のいずれか1項に記載の方法。
（項目６８）
前記遺伝子療法ベクターの投与の12週間後のGAAの血清レベルが、抗CD63  scFv送達ドメインを含まずGAAをコードするポリヌクレオチドを含む遺伝子療法ベクターを投与された対象中のGAAの血清レベルよりも約2.5〜3倍高い、項目63〜67のいずれか1項に記載の方法。
（項目６９）
前記患者の心臓、骨格筋、および肝臓の組織における前記グリコーゲンレベルが、野生型レベルまで低減される、項目63〜68のいずれか1項に記載の方法。
（項目７０）
前記患者の心臓、骨格筋、および肝臓の組織におけるグリコーゲンレベルが、前記遺伝子療法ベクターの投与の3ヵ月後に野生型レベルで維持される、項目63〜69のいずれか1項に記載の方法。
（項目７１）
治療後の前記患者の筋強度が、野生型レベルまで復元される、項目63〜70のいずれか1項に記載の方法。
（項目７２）
前記患者がポンペ病である、項目63〜71のいずれか1項に記載の方法。
（項目７３）
前記患者は、前記送達ドメインの非存在下で前記酵素ドメインを受けた対照患者と比較して、前記酵素に対する抗体が減少し低減されている、項目63〜72のいずれか1項に記載の方法。
（項目７４）
一つまたは複数の免疫抑制剤を用いて前記患者を免疫抑制することをさらに含む、項目63〜72のいずれか1項に記載の方法。
（項目７５）
前記欠損している酵素を前記患者に投与することを最後のステップとしてさらに含む、項目63〜74のいずれか1項に記載の方法。
（項目７６）
前記患者が、マルチドメイン治療用タンパク質を介して、欠損している酵素を投与され、任意選択的に、前記マルチドメイン治療剤が、抗CD63抗体またはその抗原結合部分を含む、項目75に記載の方法。
（項目７７）
前記患者が、治療有効量のポリヌクレオチドを投与され、その治療有効量のポリヌクレオチドは、GAA、その一部、またはGAAを含むマルチドメイン治療用ポリペプチドもしくはその一部を、前記患者へさらに投与することを不要とする、項目35〜76のいずれか1項に記載の方法。
（項目７８）
前記抗体またはその抗原結合性断片が、表11に記載されるようなHCVR/LCVRアミノ酸配列ペアを含む参照抗体と、ヒトCD63との結合について競合する、単離された抗CD63抗体またはその抗原結合断片。
（項目７９）
前記参照抗体が、配列番号  14/22、配列番号  30／38、配列番号46／54、または配列番号  62／70からなる群から選択されるHCVR/LCVRアミノ酸配列ペアを含む、項目78に記載の抗CD63抗体または抗原結合断片。
（項目８０）
前記抗体またはその抗原結合性断片が、表11に記載されるようなHCVR/LCVRアミノ酸配列ペアを含む参照抗体としてヒトCD63上の同じエピトープに結合する、項目78または項目79に記載の抗CD63抗体または抗原結合断片。
（項目８１）
項目19〜22のいずれか1項に記載の遺伝子療法ベクターおよび医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物。
【図１Ａ】
2020523321.tif 000024
【図１Ｂ】
2020523321.tif 000025
【図２】
2020523321.tif 000026
【図３】
2020523321.tif 000027
【図４】
2020523321.tif 000028
【図５】
2020523321.tif 000029
【図６】
2020523321.tif 000030
【図７Ａ】
2020523321.tif 000031
【図７Ｂ】
2020523321.tif 000032
【図７Ｃ】
2020523321.tif 000033
【図７Ｄ】
2020523321.tif 000034
【図８−１】
2020523321.tif 000035
【図８−２】
2020523321.tif 000036
【図９】
2020523321.tif 000037
【図１０Ａ】
2020523321.tif 000038
【図１０Ｂ】
2020523321.tif 000039
【図１１】
2020523321.tif 000040
【図１２】
2020523321.tif 000041
【配列表】
2020523321000001.app
【国際調査報告】
2020523321.tif 000042
2020523321.tif 000043
2020523321.tif 000044
2020523321.tif 000045
2020523321.tif 000046
2020523321.tif 000047
2020523321.tif 000048
2020523321.tif 000049
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