(57)【要約】  本発明は、アルファウイルス起源のレプリカーゼによって複製することができ、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡレプリコンを包含する。そのようなＲＮＡレプリコンは、細胞、特にＴ細胞などの免疫エフェクター細胞においてＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現させるのに有用である。そのようなＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現するように操作された細胞は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体が結合する抗原の発現を特徴とする疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡレプリコン。
【請求項２】
前記Ｔ細胞受容体が、Ｔ細胞受容体α鎖およびＴ細胞受容体β鎖を含む、請求項１に記載のＲＮＡレプリコン。
【請求項３】
Ｔ細胞受容体のＴ細胞受容体鎖をコードするオープンリーディングフレームおよび前記Ｔ細胞受容体の異なるＴ細胞受容体鎖をコードするさらなるオープンリーディングフレームを含む、請求項１または２に記載のＲＮＡレプリコン。
【請求項４】
前記人工Ｔ細胞受容体が一本鎖を含み、前記ＲＮＡレプリコンが前記人工Ｔ細胞受容体の前記一本鎖をコードするオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載のＲＮＡレプリコン。
【請求項５】
前記人工Ｔ細胞受容体が１より多い鎖を含み、ならびに前記ＲＮＡレプリコンが、前記人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームおよび前記人工Ｔ細胞受容体の異なる鎖をコードする１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載のＲＮＡレプリコン。
【請求項６】
前記人工Ｔ細胞受容体が２本の鎖を含み、ならびに前記ＲＮＡレプリコンが、前記人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームおよび前記人工Ｔ細胞受容体の異なる鎖をコードするさらなるオープンリーディングフレームを含む、請求項１または５に記載のＲＮＡレプリコン。
【請求項７】
前記人工Ｔ細胞受容体が、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびＴ細胞シグナル伝達ドメインを含む、請求項１および４から６のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
【請求項８】
前記Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体が疾患特異的抗原、好ましくは腫瘍抗原を標的とする、請求項１から７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
【請求項９】
シスレプリコンまたはトランスレプリコンである、請求項１から８のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
【請求項１０】
機能性アルファウイルス非構造タンパク質またはＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
【請求項１１】
５'複製認識配列を含み、前記５'複製認識配列が、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
【請求項１２】
前記第１のオープンリーディングフレームが前記５'複製認識配列と重複しない、請求項１０または１１に記載のＲＮＡレプリコン。
【請求項１３】
前記第１のオープンリーディングフレームの開始コドンが、前記ＲＮＡレプリコンの５'→３'方向で最初の機能的開始コドンである、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
【請求項１４】
機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物、
前記機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製され得る、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン
を含む系。
【請求項１５】
前記アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンまたは請求項１４に記載の系。
【請求項１６】
請求項１から１３、および１５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンをコードする核酸配列を含むＤＮＡ。
【請求項１７】
免疫反応性細胞を生成する方法であって、Ｔ細胞受容体の鎖または人工Ｔ細胞受容体の鎖（１つまたは複数）をコードする請求項１から１３、および１５のいずれか一項に記載の１つ以上のＲＮＡレプリコン、または前記ＲＮＡレプリコンをコードするＤＮＡをＴ細胞またはその前駆細胞に形質導入する工程を含む方法。
【請求項１８】
Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する細胞を生成する方法であって、
（ａ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製されることができ、およびＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖（１つもしくは複数）をコードするオープンリーディングフレーム（１つもしくは複数）を含む、請求項１から１３、および１５のいずれか一項に記載の１つ以上のＲＮＡレプリコン、または前記ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）をコードする核酸配列を含むＤＮＡを得る工程、ならびに
（ｂ）前記ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）または前記ＤＮＡを細胞に接種する工程
を含む方法。
【請求項１９】
Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する細胞を生成する方法であって、
（ａ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物または前記ＲＮＡ構築物をコードする核酸配列を含むＤＮＡを得る工程、
（ｂ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製されることができ、および前記Ｔ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖（１つもしくは複数）をコードするオープンリーディングフレーム（１つもしくは複数）を含む、請求項１から１３、および１５のいずれか一項に記載の１つ以上のＲＮＡレプリコン、または前記ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）をコードする核酸配列を含むＤＮＡを得る工程、ならびに
（ｃ）前記ＲＮＡ構築物または前記ＤＮＡと、前記ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）または前記ＤＮＡとを細胞に共接種する工程
を含む方法。
【請求項２０】
請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法によって生成される細胞。
【請求項２１】
請求項１から１３、および１５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン、請求項１６に記載のＤＮＡ、または請求項２０に記載の細胞、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２２】
薬剤として使用するための、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体が標的とする抗原の発現を特徴とする細胞が関与する疾患の治療において使用するための、請求項２１または２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体が標的とする抗原の発現を特徴とする細胞が関与する疾患の治療方法であって、請求項２１に記載の医薬組成物の治療有効量を被験体に投与することを含む治療方法。
【請求項２５】
抗原の発現を特徴とする細胞が関与する疾患を有する被験体を治療する方法であって、前記抗原を標的とするＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する請求項１７から１９のいずれか一項に記載の方法によって生成された細胞を前記被験体に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルファウイルス起源のレプリカーゼによって複製することができ、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡレプリコンを包含する。そのようなＲＮＡレプリコンは、細胞、特にＴ細胞などの免疫エフェクター細胞においてＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現させるのに有用である。そのようなＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現するように操作された細胞は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体が結合する抗原の発現を特徴とする疾患の治療に有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞は、ヒトおよび動物の細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たす。特定の抗原の認識および結合は、Ｔ細胞の表面に発現されるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって媒介される。Ｔ細胞のＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合し、標的細胞の表面に提示される免疫原性ペプチド（エピトープ）と相互作用することができる。ＴＣＲの特異的結合は、増殖および成熟エフェクターＴ細胞への分化をもたらすＴ細胞内のシグナルカスケードを開始させる。
【０００３】
ＴＣＲは、ＴＣＲ  α鎖およびβ鎖のヘテロ二量体複合体、共受容体ＣＤ４またはＣＤ８、およびＣＤ３シグナル伝達モジュールを含む複雑なシグナル伝達機構の一部である。ＴＣＲα／βヘテロ二量体は、ＣＤ３と協調して抗原認識および細胞膜を介した活性化シグナルの中継を担い、一方ＣＤ３鎖自体は、細胞内のアダプタータンパク質に着信シグナルを伝達する。したがって、ＴＣＲα／β鎖の移入は、Ｔ細胞を目的の抗原へと再指向させる可能性を提供する。
【０００４】
養子細胞移入（ＡＣＴ）に基づく免疫療法は、低い前駆体頻度から臨床的に適切な細胞数までエクスビボで増殖させた後に非免疫レシピエントまたは自己宿主に移入される、以前に感作されたＴ細胞による受動免疫の形態として広く定義することができる。ＡＣＴ実験に使用されてきた細胞型には、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞（Ｍｕｌｅ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５，１４８７−１４８９；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３，１４８５−１４９２）、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８６，１１５９−１１６６）、造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）後のドナーリンパ球および腫瘍特異的Ｔ細胞株またはクローン（Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２４，３６３−３７３；Ｙｅｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９９，１６１６８−１６１７３）が含まれる。養子Ｔ細胞移入は、ＣＭＶなどのヒトウイルス感染に対して治療活性を有することが示された。黒色腫の養子免疫療法のために、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇと共同研究者たちは、骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法および高用量ＩＬ−２と組み合わせて、切除された腫瘍から単離され、インビトロで拡大された自己腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の持続注入に基づくＡＣＴアプローチを確立した。臨床試験は、転移性黒色腫に罹患している治療患者の〜５０％の客観的奏効率をもたらした（Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：２３４６−２３５７）。
【０００５】
代替的なアプローチは、短時間のエクスビボ培養中に定義された特異性の腫瘍反応性免疫受容体を発現するように再プログラム化された自己Ｔ細胞の養子移入とそれに続く患者への再注入である（Ｋｅｒｓｈａｗ  Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １３（８）：５２５−４１）この戦略は、腫瘍反応性Ｔ細胞が患者に存在しない場合でも、ＡＣＴを様々な一般的悪性疾患に適用可能にする。Ｔ細胞の抗原特異性はＴＣＲ  α鎖およびβ鎖のヘテロ二量体複合体に全面的に依存するので、クローニングされたＴＣＲ遺伝子のＴ細胞への移入は、それらを目的の抗原へと再指向させる可能性を提供する。したがって、ＴＣＲ遺伝子治療は、治療選択肢として自己リンパ球を用いた抗原特異的免疫療法を開発する魅力的な戦略を提供する。ＴＣＲ遺伝子導入の主な利点は、治療量の抗原特異的Ｔ細胞を数日以内に生産できること、および患者の内因性ＴＣＲレパートリには存在しない特異性を導入できることである。いくつかのグループは、ＴＣＲ遺伝子導入が初代Ｔ細胞の抗原特異性を再指向する魅力的な戦略であることを明らかにした（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１，３２８７−３２９５；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，８２０７−８２１２；Ｆｕｊｉｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，５２８−５３２；Ｋｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，９５７−９６１；Ｄｅｍｂｉｃ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２０，２３２−２３８）。ヒトにおけるＴＣＲ遺伝子療法の実現可能性は、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇと彼のグループによる悪性黒色腫の治療のための臨床試験で最初に実証された。黒色腫／メラノサイト抗原特異的ＴＣＲをレトロウイルスで形質導入した自己リンパ球の養子移入は、治療された黒色腫患者の最大３０％で癌の退縮をもたらした（Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４，１２６−１２９；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１４，５３５−５４６）。一方、ＴＣＲ遺伝子療法の臨床試験は、多くの異なる腫瘍抗原を標的とする、黒色腫以外の癌にも拡大された（Ｐａｒｋ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９，５５０−５５７）。
【０００６】
定義された特異性の抗原標的受容体をＴ細胞に挿入するための遺伝子工学的アプローチの使用は、ＡＣＴの潜在的可能性を大きく拡大した。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原結合ドメイン、最も一般的にはモノクローナル抗体からの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）に融合した細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインから構成される抗原標的受容体の一種である。ＣＡＲは、ＭＨＣ媒介提示とは無関係に、細胞表面抗原を直接認識し、すべての患者で所与の抗原に特異的な単一の受容体構築物の使用を可能にする。最初のＣＡＲは、抗原認識ドメインをＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のＣＤ３ζ活性化鎖に融合させた。その後のＣＡＲ反復には、ＣＤ３ζと並行して、ＣＤ２８または４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）などの様々なＴＮＦ受容体ファミリー分子からの細胞内ドメインを含む二次共刺激シグナルが含まれた。さらに、第３世代の受容体には、ＣＤ３ζに加えて、最も一般的にはＣＤ２８および４−１ＢＢからの２つの共刺激シグナルが含まれる。第２および第３世代のＣＡＲは、インビトロおよびインビボで抗腫瘍効果を劇的に改善し（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１８３）５５６３−５５７４）、場合によっては進行した癌の患者において完全な寛解を誘導した（Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，（３６５）７２５−７３３）。
【０００７】
古典的なＣＡＲは、ＣＤ３ζなどの膜貫通およびシグナル伝達ドメインに融合した、抗原特異的一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）断片からなる。Ｔ細胞に導入すると、膜結合タンパク質として発現され、そのコグネイト抗原に結合すると免疫応答を誘導する（Ｅｓｈｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）ＰＮＡＳ，（９０）７２０−７２４）。誘導された抗原特異的免疫応答は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化をもたらし、これが次に、特定の抗原を発現する腫瘍細胞またはウイルス感染細胞などの、特定の抗原を発現する細胞の根絶を導く。これらの古典的ＣＡＲ構築物は、Ｔ細胞の活性化に通常不可欠な内因性ＣＤ３複合体を介してＴ細胞を活性化／刺激するのではない。抗原結合ドメインのＣＤ３ζへの融合により、生化学的な「短絡」を通してＴ細胞の活性化が誘導される（Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９）３６５−３７４）。
【０００８】
より生理学的な機構を介してＴ細胞の活性化が起こる代替的なアプローチは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するＣβ定常ドメインに融合した類似の一本鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ）断片を提供すること、およびＴＣＲ由来のＣα定常ドメインと共発現させることであり（Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｂｌｏｏｄ，（１１５）５１５４−５１６３）、後者は、不可欠な内因性ＣＤ３ζホモ二量体を動員する（Ｃａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｃｅｌｌ，（１１１）９６７−７９）。これらの構築物が免疫系の活性化因子として機能するためには、ｓｃＴＣＲとＣαの間の鎖の対合を達成するために、それらの定常ドメインがマウスＴＣＲを起源とするか、またはマウス化される必要があることが重要であった（Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（６６）８８７８−８６；Ｂｉａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１８４）６２３２−４１）。
【０００９】
受容体が、抗原結合時に、それが発現されているＴ細胞を活性化することができる、代替的な組換え人工Ｔ細胞受容体が記述されている。
【００１０】
一般に、移入されたＴ細胞の数は治療応答と相関すると考えられている。しかしながら、養子Ｔ細胞移入に適したＴ細胞の作製は依然として課題のままである。
【００１１】
予防および治療目的のための１つ以上のポリペプチドをコードする外来遺伝子情報を含む核酸分子が、長年にわたって生物医学研究において検討されてきた。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子の使用に関連する安全性の懸念の影響を受けて、リボ核酸（ＲＮＡ）分子が近年注目を集めている。裸のＲＮＡの形態、または複合体化もしくはパッケージング形態、例えば非ウイルスまたはウイルス送達ビヒクルでの一本鎖または二本鎖ＲＮＡの投与を含む、様々なアプローチが提案されてきた。ウイルスおよびウイルス送達ビヒクルでは、遺伝情報は、典型的にはタンパク質および／または脂質によってカプセル化されている（ウイルス粒子）。例えば、ＲＮＡウイルスに由来する操作されたＲＮＡウイルス粒子が、植物を処理するため（国際公開第２０００／０５３７８０Ａ２号）または哺乳動物のワクチン接種のための（Ｔｕｂｕｌｅｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９０，ｐｐ．１９１−１９５）送達ビヒクルとして提案されている。一般に、ＲＮＡウイルスは、ＲＮＡゲノムを有する感染性粒子の多様な群である。ＲＮＡウイルスは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）ウイルスと二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）ウイルスに細分することができ、ｓｓＲＮＡウイルスは、一般にプラス鎖［（＋）鎖］ウイルスおよび／またはマイナス鎖［（−）鎖］ウイルスにさらに分けることができる。プラス鎖ＲＮＡウイルスは、そのＲＮＡが宿主細胞での翻訳の鋳型として直接機能し得るため、生物医学における送達システムとして明らかに魅力的である。
【００１２】
アルファウイルスは、プラス鎖ＲＮＡウイルスの典型的な代表例である。アルファウイルスの宿主には、昆虫、魚類、ならびに家畜およびヒトなどの哺乳動物を含む広範囲の生物が含まれる。アルファウイルスは、感染細胞の細胞質で複製する（アルファウイルスの生活環の総説については、Ｊｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７−８５６参照）。多くのアルファウイルスの総ゲノム長は、典型的には１１，０００〜１２，０００ヌクレオチドの範囲であり、ゲノムＲＮＡは、典型的には５'キャップおよび３'ポリ（Ａ）尾部を有する。アルファウイルスのゲノムは、非構造タンパク質（ウイルスＲＮＡの転写、修飾および複製、ならびにタンパク質修飾に関与する）および構造タンパク質（ウイルス粒子を形成する）をコードする。ゲノム内に、典型的には２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が存在する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１〜ｎｓＰ４）は、典型的にはゲノムの５'末端の近傍から始まる最初のＯＲＦによって一緒にコードされ、一方アルファウイルスの構造タンパク質は、最初のＯＲＦの下流に見出される２番目のＯＲＦによって一緒にコードされ、ゲノムの３'末端の近傍に伸びている。通常、最初のＯＲＦは２番目のＯＲＦよりも大きく、比率はおよそ２：１である。
【００１３】
アルファウイルスに感染した細胞では、非構造タンパク質をコードする核酸配列だけがゲノムＲＮＡから翻訳され、一方構造タンパク質をコードする遺伝情報は、真核生物のメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ；Ｇｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１１１−１２４）に類似したＲＮＡ分子であるサブゲノム転写物から翻訳可能である。感染後、すなわちウイルス生活環の初期段階に、（＋）鎖ゲノムＲＮＡは、非構造ポリタンパク質（ｎｓＰ１２３４）をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のためにメッセンジャーＲＮＡのように直接作用する。一部のアルファウイルスでは、ｎｓＰ３のコード配列とｎｓＰ４のコード配列との間にオパール終止コドンが存在する：翻訳がオパール終止コドンで終結すると、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３を含むポリタンパク質Ｐ１２３が生成され、さらにｎｓＰ４も含むポリタンパク質Ｐ１２３４がこのオパールコドンの読み取り終了時に生成される（Ｓｔｒａｕｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１−５６２；Ｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．２４８３−２５００）。ｎｓＰ１２３４は、ｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４断片へと自己タンパク質分解的に切断される。ポリペプチドｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４は会合して、（＋）鎖ゲノムＲＮＡを鋳型として使用して、（−）鎖ＲＮＡを転写する（−）鎖レプリカーゼ複合体を形成する。典型的には、後の段階で、ｎｓＰ１２３断片は個別のタンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３に完全に切断される（Ｓｈｉｒａｋｏ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６８，ｐｐ．１８７４−１８８５）。４つのタンパク質すべてが、ゲノムＲＮＡの（−）鎖相補体を鋳型として使用して、新たな（＋）鎖ゲノムを合成する（＋）鎖レプリカーゼ複合体を形成する（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２３，ｐｐ．１５３−１６３、Ｖａｓｉｌｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２７８，ｐｐ．４１６３６−４１６４５）。
【００１４】
感染細胞では、ｎｓＰ１によってサブゲノムＲＮＡおよび新たなゲノムＲＮＡに５'キャップが与えられ（Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，４３５−４４３；Ｒｏｚａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７３，ｐｐ．２１２９−２１３４）、ｎｓＰ４によってポリアデニル酸［ポリ（Ａ）］尾部が与えられる（Ｒｕｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００９，ｖｏｌ．３８４，ｐｐ．２０１−２０８）。したがって、サブゲノムＲＮＡとゲノムＲＮＡの両方がメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に類似する。
【００１５】
アルファウイルス構造タンパク質（すべてウイルス粒子の成分である、コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｅ２およびエンベロープタンパク質Ｅ１）は、典型的にはサブゲノムプロモータの制御下で単一のオープンリーディングフレームによってコードされる（Ｓｔｒａｕｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１−５６２）。サブゲノムプロモータは、シスで作用するアルファウイルス非構造タンパク質によって認識される。特に、アルファウイルスレプリカーゼは、ゲノムＲＮＡの（−）鎖相補体を鋳型として使用して（＋）鎖サブゲノム転写物を合成する。（＋）鎖サブゲノム転写物は、アルファウイルス構造タンパク質をコードする（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２３，ｐｐ．１５３−１６３、Ｖａｓｉｌｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２７８，ｐｐ．４１６３６−４１６４５）。サブゲノムＲＮＡ転写物は、構造タンパク質を１つのポリタンパク質としてコードするオープンリーディングフレームの翻訳のための鋳型として働き、ポリタンパク質は、切断されて構造タンパク質を生成する。宿主細胞でのアルファウイルス感染の後期には、ｎｓＰ２のコード配列内に位置するパッケージングシグナルが、構造タンパク質によってパッケージングされた出芽ビリオンへのゲノムＲＮＡの選択的パッケージングを確実にする（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７２，ｐｐ．４３２０−４３２６）。
【００１６】
感染細胞では、（−）鎖ＲＮＡの合成は、典型的には感染後最初の３〜４時間にのみ観察され、後期段階では検出不能であり、この時点では（＋）鎖ＲＮＡ（ゲノムおよびサブゲノムの両方）の合成のみが観察される。Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８−１６５１によれば、ＲＮＡ合成の調節に関する一般的なモデルは、非構造ポリタンパク質のプロセシングへの依存性を示唆する：非構造ポリタンパク質ｎｓＰ１２３４の最初の切断はｎｓＰ１２３およびｎｓＰ４を生成する；ｎｓＰ４は、（−）鎖合成には活性であるが、（＋）鎖ＲＮＡの生成には非効率的であるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）として作用する。ｎｓＰ２／ｎｓＰ３接合部での切断を含む、ポリタンパク質ｎｓＰ１２３のさらなるプロセシングは、（＋）鎖ＲＮＡの合成を増加させ、（−）鎖ＲＮＡの合成を減少または終結させるようにレプリカーゼの鋳型特異性を変化させる。
【００１７】
アルファウイルスＲＮＡの合成は、４つの保存された配列エレメント（ＣＳＥ；Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１−５６２；およびＦｒｏｌｏｖ，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８−１６５１）を含むシス作用性ＲＮＡエレメントによっても調節される。
【００１８】
一般に、アルファウイルスゲノムの５'複製認識配列は、異なるアルファウイルス間での全体的相同性が低いことを特徴とするが、保存された予測二次構造を有する。アルファウイルスゲノムの５'複製認識配列は、翻訳開始に関与するだけでなく、ウイルスＲＮＡの合成に関与する２つの保存された配列エレメント、ＣＳＥ  １およびＣＳＥ  ２を含む５'複製認識配列も含む。ＣＳＥ  １およびＣＳＥ  ２の機能にとって、二次構造は直鎖状配列よりも重要であると考えられている（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１−５６２）。
【００１９】
対照的に、アルファウイルスゲノムの３'末端配列、すなわちポリ（Ａ）配列のすぐ上流の配列は、保存された一次構造、特に「１９ヌクレオチド保存配列」とも称される保存された配列エレメント４（ＣＳＥ  ４）を特徴とし、これは（−）鎖合成の開始に重要である。
【００２０】
「接合配列」とも称されるＣＳＥ  ３は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの（＋）鎖上の保存された配列エレメントであり、（−）鎖上のＣＳＥ  ３の相補体は、サブゲノムＲＮＡ転写のためのプロモータとして働く（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１−５６２；およびＦｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８−１６５１）。ＣＳＥ  ３は、典型的にはｎｓＰ４のＣ末端断片をコードする領域と重複する。
【００２１】
アルファウイルスタンパク質に加えて、おそらくはタンパク質である宿主細胞因子も、保存された配列エレメントに結合し得る（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ、上記）。
【００２２】
アルファウイルス由来のベクターは、外来遺伝情報を標的細胞または標的生物に送達するために提案されている。単純なアプローチでは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームに置き換える。アルファウイルスに基づくトランス複製系は、２つの別々の核酸分子上のアルファウイルスヌクレオチド配列エレメントに依存する：一方の核酸分子はウイルスレプリカーゼをコードし（典型的にはポリタンパク質ｎｓＰ１２３４として）、他方の核酸分子は前記レプリカーゼによってトランスで複製されることができる（したがってトランス複製系という呼称）。トランス複製には、所与の宿主細胞内にこれらの両方の核酸分子が存在することを必要とする。トランスでレプリカーゼによって複製されることができる核酸分子は、アルファウイルスのレプリカーゼによる認識およびＲＮＡ合成を可能にする特定のアルファウイルス配列エレメントを含まなければならない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２３】
【特許文献１】国際公開第２０００／０５３７８０Ａ２号明細書
【非特許文献】
【００２４】
【非特許文献１】Ｍｕｌｅ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２５，１４８７−１４８９
【非特許文献２】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３１３，１４８５−１４９２）
【非特許文献３】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８６，１１５９−１１６６
【非特許文献４】Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２４，３６３−３７３
【非特許文献５】Ｙｅｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９９，１６１６８−１６１７３
【非特許文献６】Ｄｕｄｌｅｙ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２３：２３４６−２３５７
【非特許文献７】Ｋｅｒｓｈａｗ  Ｍ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １３（８）：５２５−４１
【非特許文献８】Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１，３２８７−３２９５
【非特許文献９】Ｃｏｏｐｅｒ，Ｌ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，８２０７−８２１２
【非特許文献１０】Ｆｕｊｉｏ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６５，５２８−５３２
【非特許文献１１】Ｋｅｓｓｅｌｓ，Ｈ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２，９５７−９６１
【非特許文献１２】Ｄｅｍｂｉｃ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２０，２３２−２３８
【非特許文献１３】Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４，１２６−１２９
【非特許文献１４】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｌ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１４，５３５−５４６
【非特許文献１５】Ｐａｒｋ，Ｔ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２９，５５０−５５７
【非特許文献１６】Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（１８３）５５６３−５５７４
【非特許文献１７】Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，（３６５）７２５−７３３
【非特許文献１８】Ｅｓｈｈａｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）ＰＮＡＳ，（９０）７２０−７２４
【非特許文献１９】Ａｇｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９）３６５−３７４
【非特許文献２０】Ｖｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｂｌｏｏｄ，（１１５）５１５４−５１６３
【非特許文献２１】Ｃａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｃｅｌｌ，（１１１）９６７−７９
【非特許文献２２】Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，（６６）８８７８−８６
【非特許文献２３】Ｂｉａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１８４）６２３２−４１
【非特許文献２４】Ｔｕｂｕｌｅｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１９０，ｐｐ．１９１−１９５
【非特許文献２５】Ｊｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７−８５６
【非特許文献２６】Ｇｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１１１−１２４
【非特許文献２７】Ｓｔｒａｕｓ  ＆  Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１−５６２
【非特許文献２８】Ｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．２４８３−２５００
【非特許文献２９】Ｓｈｉｒａｋｏ  ＆  Ｓｔｒａｕｓｓ，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．ｖｏｌ．６８，ｐｐ．１８７４−１８８５
【非特許文献３０】Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３２３，ｐｐ．１５３−１６３
【非特許文献３１】Ｖａｓｉｌｊｅｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ．２７８，ｐｐ．４１６３６−４１６４５
【非特許文献３２】Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０５，４３５−４４３
【非特許文献３３】Ｒｏｚａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．７３，ｐｐ．２１２９−２１３４
【非特許文献３４】Ｒｕｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００９，ｖｏｌ．３８４，ｐｐ．２０１−２０８
【非特許文献３５】Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７２，ｐｐ．４３２０−４３２６
【非特許文献３６】Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８−１６５１
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現し、養子細胞移入に適したＴ細胞などの免疫エフェクター細胞を安全かつ効率的な方法で提供する必要がある。本明細書で説明するように、本発明の態様および実施形態はこの必要性に対処する。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
免疫療法戦略は、例えば感染症および癌疾患の予防および治療のための有望な選択肢である。ますます多くの病原体関連および腫瘍関連の抗原の同定により、免疫療法のための適切な標的の幅広いコレクションがもたらされた。本発明は、疾患の予防および治療のための免疫療法処置に適した、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞におけるＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の効率的な発現に適する改善された薬剤および方法を包含する。
【００２７】
本発明は、アルファウイルス由来のＲＮＡベクター（ＲＮＡレプリコン）が、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞においてＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現するのに有用であることを実証する。そのような免疫エフェクター細胞は、その受容体を介して抗原に結合し、免疫エフェクター細胞のエフェクター機能を発揮するという点で機能性である。
【００２８】
様々な種類のＲＮＡレプリコンが本発明に従って有用である。１つの種類のＲＮＡレプリコンでは、アルファウイルス構造タンパク質をコードするアルファウイルス由来のＲＮＡベクターのオープンリーディングフレームが、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームで置き換えられている。それぞれのレプリコンを「シスレプリコン；ＷＴ−ＲＲＳ」として図１に示す。本発明による他の種類のＲＮＡレプリコンは、アルファウイルスに基づくトランス複製系に関連する。それぞれのレプリコンを「トランスレプリコン；ＷＴ−ＲＲＳ」として図１に示す。そのようなレプリコンは、サブゲノムプロモータの制御下でＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームの増幅を可能にするという利点に結び付く。
【００２９】
ｎｓＰ１２３４をコードするオープンリーディングフレームは、典型的にはアルファウイルスゲノムの５'複製認識配列（ｎｓＰ１のコード配列）と重複し、また典型的にはＣＳＥ  ３を含むサブゲノムプロモータ（ｎｓＰ４のコード配列）とも重複する。したがって、そのような「トランスレプリコン」では、ＲＮＡ複製に必要な５'複製認識配列はｎｓＰ１のＡＵＧ開始コドンを含み、そのためアルファウイルス非構造タンパク質のＮ末端断片のコード配列と重複し、５'複製認識配列を含むレプリコンは、典型的には（少なくとも）アルファウイルス非構造タンパク質の一部、典型的にはｎｓＰ１のＮ末端断片をコードする。これはいくつかの面で不利である：シスレプリコンの場合、この重複は、例えば異なる哺乳動物標的細胞（ヒト、マウス、家畜）へのレプリカーゼＯＲＦのコドン使用頻度の適合を制限する。ウイルスに見出される５'複製認識配列の二次構造は、あらゆる標的細胞において最適というわけではないと考えられる。しかし、レプリカーゼＯＲＦで生じる可能性のあるアミノ酸変化を考慮し、レプリカーゼ機能への影響を試験しなければならないので、二次構造を自由に改変することはできない。また、完全なレプリカーゼＯＲＦを異種起源からのレプリカーゼに交換することは不可能であり、というのは、これが５'複製認識配列構造の破壊をもたらし得るためである。トランスレプリコンの場合、５'複製認識配列をトランスレプリコン内に保持する必要があるため、この重複はｎｓＰ１タンパク質の断片の合成をもたらす。ｎｓＰ１の断片は、典型的には必要なく、望ましくない：望ましくない翻訳は宿主細胞に不必要な負担を課し、薬学的に活性なタンパク質に加えてｎｓＰ１の断片をコードする治療適用のためのＲＮＡレプリコンは、規制上の懸念に直面する可能性がある。例えば、トランケートされたｎｓＰ１が望ましくない副作用を引き起こさないことを実証する必要がある。さらに、５'複製認識配列内のｎｓＰ１のＡＵＧ開始コドンの存在は、目的の遺伝子の翻訳のための開始コドンがリボソーム翻訳開始にアクセス可能な最も５'側の位置にあるように、目的の異種遺伝子をコードするトランスレプリコンを設計することを妨げてきた。これが次に、ｎｓＰ１の開始コドンとインフレームで融合タンパク質としてクローニングされない限り、先行技術のトランスレプリコンＲＮＡからの導入遺伝子の５'キャップ依存性翻訳を困難にしている（そのような融合構築物は、例えばＭｉｃｈｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３６２，ｐｐ．４７５−４８７によって記載されている）。そのような融合構築物は、上記のｎｓＰ１断片の同じ不必要な翻訳をもたらし、上記と同じ懸念を生じさせる。さらに、融合タンパク質は、目的の融合した導入遺伝子の機能もしくは活性を変化させ得るため、またはワクチンベクターとして使用した場合、融合領域にまたがるペプチドが融合した抗原の免疫原性を改変し得るため、さらなる懸念を引き起こす。
【００３０】
したがって、本発明は、レプリカーゼによる複製に必要な配列エレメントを含むさらなる種類のＲＮＡレプリコンを提供するが、これらの配列エレメントは、アルファウイルス非構造タンパク質またはその断片などのいかなるタンパク質またはその断片もコードしない。したがって、レプリカーゼによる複製に必要な配列エレメントとタンパク質コード領域は結合していない。それぞれのレプリコンを「トランスレプリコン；Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳΔＳＧＰ」として図１に示す。結合解除は、天然のアルファウイルスゲノムＲＮＡと比較して少なくとも１つの開始コドンを除去することによって達成される。レプリカーゼは、ＲＮＡレプリコンによってまたは別個の核酸分子によってコードされ得る。１つの特に好ましい実施形態では、そのようなレプリコンはサブゲノムプロモータを含まず、およびＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームの翻訳のための開始コドンは、リボソーム翻訳開始にアクセス可能な最も５'側の位置にある。
【００３１】
第１の態様では、本発明は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームを含むＲＮＡレプリコンを提供する。
【００３２】
一実施形態では、Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞受容体α鎖およびＴ細胞受容体β鎖を含む。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、Ｔ細胞受容体のＴ細胞受容体鎖をコードするオープンリーディングフレームおよびＴ細胞受容体の異なるＴ細胞受容体鎖をコードするさらなるオープンリーディングフレームを含む。
【００３３】
一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は一本鎖を含み、ＲＮＡレプリコンは、前記人工Ｔ細胞受容体の前記一本鎖をコードするオープンリーディングフレームを含む。
【００３４】
一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は１より多い鎖を含み、ＲＮＡレプリコンは、人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームおよび人工Ｔ細胞受容体の異なる鎖をコードする１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は２本の鎖を含み、ＲＮＡレプリコンは、人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームおよび人工Ｔ細胞受容体の異なる鎖をコードするさらなるオープンリーディングフレームを含む。
【００３５】
一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよびＴ細胞シグナル伝達ドメインを含む。
【００３６】
一実施形態では、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体は、疾患特異的抗原、好ましくは腫瘍抗原を標的とする。
【００３７】
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、シスレプリコンまたはトランスレプリコンである。
【００３８】
一実施形態では、特にＲＮＡレプリコンがシスレプリコンである場合、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む。
【００３９】
一実施形態では、特にＲＮＡレプリコンがトランスレプリコンである場合、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。この実施形態では、レプリコンの複製のための機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、本明細書に記載されるようにトランスで提供され得る。
【００４０】
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、目的のタンパク質、例えば機能性アルファウイルス非構造タンパク質またはＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームは５'複製認識配列と重複しない。
【００４１】
ＲＮＡレプリコンがシスレプリコンである場合、第１のオープンリーディングは一般に、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングである。この実施形態では、ＲＮＡレプリコンは一般に、サブゲノムプロモータの制御下にあるＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードする少なくとも１つのさらなるオープンリーディングフレームを含む。ＲＮＡレプリコンがトランスレプリコンである場合、第１のオープンリーディングは一般に、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングであり、ＲＮＡレプリコンは、好ましくは機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。
【００４２】
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは５'複製認識配列を含み、この５'複製認識配列は、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。
【００４３】
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、（修飾された）５'複製認識配列、および５'複製認識配列の下流に位置する、目的のタンパク質、例えば機能性アルファウイルス非構造タンパク質またはＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードする第１のオープンリーディングフレームを含み、前記５'複製認識配列と目的のタンパク質をコードする第１のオープンリーディングフレームは重複せず、好ましくは５'複製認識配列はＲＮＡレプリコンのいずれのオープンリーディングフレームとも重複せず、例えば５'複製認識配列は機能的開始コドンを含まず、好ましくはいかなる開始コドンも含まない。最も好ましくは、第１のオープンリーディングフレームの開始コドンは、ＲＮＡレプリコンの５'→３'方向で最初の機能的開始コドン、好ましくは最初の開始コドンである。一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームおよび好ましくはＲＮＡレプリコン全体が、アルファウイルス非構造タンパク質の断片、特にｎｓＰ１および／またはｎｓＰ４の断片などの非機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現しない。一実施形態では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は５'複製認識配列に対して異種である。一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームはサブゲノムプロモータの制御下にない。
【００４４】
一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームは機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードし、ＲＮＡレプリコンは、サブゲノムプロモータの制御下にあるＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードする少なくとも１つのさらなるオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、サブゲノムプロモータと第１のオープンリーディングフレームは重複しない。
【００４５】
別の実施形態では、第１のオープンリーディングフレームはＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードし、ＲＮＡレプリコンは、好ましくは機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。ＲＮＡレプリコンは、サブゲノムプロモータの制御下にあるＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖（例えば第１のオープンリーディングフレームによってコードされるＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖と共に、機能的Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を形成するＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖）をコードする少なくとも１つのさらなるオープンリーディングフレームを含み得る。
一実施形態では、サブゲノムプロモータと第１のオープンリーディングフレームは重複しない。
【００４６】
１つの特に好ましい実施形態では、５'複製認識配列の下流に位置する第１のオープンリーディングフレームはＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードし、５'複製認識配列と第１のオープンリーディングフレームは重複せず、５'複製認識配列は機能的開始コドンを含まず、好ましくはいかなる開始コドンも含まず、およびＲＮＡレプリコンは機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。この実施形態では、第１のオープンリーディングフレームの開始コドンは、ＲＮＡレプリコンがアルファウイルス非構造タンパク質の断片、特にｎｓＰ１および／またはｎｓＰ４の断片などの非機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現しないように、ＲＮＡレプリコンの５'→３'方向で最初の機能的開始コドン、好ましくは最初の開始コドンである。ＲＮＡレプリコンは、サブゲノムプロモータの制御下にあるＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖（例えば第１のオープンリーディングフレームによってコードされるＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖と共に、機能的Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を形成するＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖）をコードする少なくとも１つのさらなるオープンリーディングフレームを含み得る。
一実施形態では、サブゲノムプロモータと第１のオープンリーディングフレームは重複しない。
【００４７】
一実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスの５'末端の約２５０ヌクレオチドの相同な配列を含む。好ましい実施形態では、前記５'複製認識配列は、アルファウイルスの５'末端の約３００〜５００ヌクレオチドに相同な配列を含む。好ましい実施形態では、前記５'複製認識配列は、ベクター系にとっての親である特定のアルファウイルス種の効率的な複製に必要な５'末端配列を含む。
【００４８】
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスの保存された配列エレメント１（ＣＳＥ  １）および保存された配列エレメント２（ＣＳＥ  ２）に相同な配列を含む。
【００４９】
好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンはＣＳＥ  ２を含み、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの断片を含むことをさらに特徴とする。より好ましい実施形態では、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの前記断片は、いかなる開始コドンも含まない。
【００５０】
一実施形態では、５'複製認識配列は、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列を含み、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、天然のアルファウイルス配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。
【００５１】
好ましい実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、少なくとも非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然開始コドンの除去を含むことを特徴とする。
【００５２】
好ましい実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然開始コドン以外の１つ以上の開始コドンの除去を含むことを特徴とする。より好ましい実施形態では、前記核酸配列は、非構造タンパク質、好ましくはｎｓＰ１のオープンリーディングフレームの天然開始コドンの除去をさらに特徴とする。
【００５３】
好ましい実施形態では、５'複製認識配列は、ＲＮＡレプリコンに関する５'複製認識配列の機能性を提供する１つ以上のステムループを含む。好ましい実施形態では、５'複製認識配列の１つ以上のステムループは欠失または破壊されない。より好ましくは、ステムループ１、３および４のうちの１つ以上、好ましくはステムループ１、３および４のすべて、またはステムループ３および４は、欠失または破壊されない。より好ましくは、５'複製認識配列のステムループのいずれも欠失または破壊されない。
【００５４】
好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入された１つ以上のステムループ内のヌクレオチド対合破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化を含む。
【００５５】
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、トランケートされたアルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。
【００５６】
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは３'複製認識配列を含む。
【００５７】
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質がＲＮＡレプリコンから鋳型として発現され得ることを特徴とする。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、第１のオープンリーディングフレームを含むサブゲノムＲＮＡの産生を制御するサブゲノムプロモータを含む。
【００５８】
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、サブゲノムプロモータを含むことを特徴とする。典型的には、サブゲノムプロモータは、目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含むサブゲノムＲＮＡの産生を制御する。
【００５９】
一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、ＲＮＡレプリコンから鋳型として発現され得る。より好ましい実施形態では、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、サブゲノムＲＮＡからさらに発現され得る。
【００６０】
好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、目的のタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含むサブゲノムＲＮＡの産生を制御するサブゲノムプロモータを含むことをさらに特徴とする。目的のタンパク質は、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質と同一または異なる第２のタンパク質であり得る。
【００６１】
より好ましい実施形態では、サブゲノムプロモータおよび目的のタンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームは、目的のタンパク質をコードする第１のオープンリーディングフレームの下流に位置する。
【００６２】
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製され得る。
【００６３】
第２の態様では、本発明は、
機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物、
機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製され得る、本発明の第１の態様によるＲＮＡレプリコン
を含む系を提供する。好ましくは、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードしないことをさらに特徴とする。
【００６４】
一実施形態では、第１の態様によるＲＮＡレプリコンまたは第２の態様による系は、アルファウイルスがベネズエラウマ脳炎ウイルスであることを特徴とする。
【００６５】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるＲＮＡレプリコンをコードする核酸配列を含むＤＮＡを提供する。
【００６６】
さらなる態様では、本発明は、免疫反応性細胞を生成する方法であって、Ｔ細胞受容体の鎖もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖（１つまたは複数）をコードする本発明の１つ以上のＲＮＡレプリコン、または前記ＲＮＡレプリコンをコードするＤＮＡをＴ細胞またはその前駆細胞に形質導入する工程を含む方法を提供する。一実施形態では、細胞は、その細胞表面にＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する。
【００６７】
さらなる態様では、本発明は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する細胞を生成する方法であって、
（ａ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製されることができ、およびＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖（１つもしくは複数）をコードするオープンリーディングフレーム（１つもしくは複数）を含む、本発明の１つ以上のＲＮＡレプリコン、または前記ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）をコードする核酸配列を含むＤＮＡを得る工程、ならびに
（ｂ）前記ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）またはＤＮＡを細胞に接種する工程
を含む方法を提供する。
【００６８】
さらなる態様では、本発明は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する細胞を生成する方法であって、
（ａ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物またはこのＲＮＡ構築物をコードする核酸配列を含むＤＮＡを得る工程、
（ｂ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製されることができ、およびＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖（１つもしくは複数）をコードするオープンリーディングフレーム（１つもしくは複数）を含む、本発明の１つ以上のＲＮＡレプリコン、または前記ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）をコードする核酸配列を含むＤＮＡを得る工程、ならびに
（ｃ）前記ＲＮＡ構築物または前記ＤＮＡと、前記ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）または前記ＤＮＡとを細胞に共接種する工程
を含む方法を提供する。
【００６９】
本発明の一実施形態では、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体は、１より多い鎖、例えば２本の鎖を含む。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、前記Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体のすべての鎖をコードする１つ以上のオープンリーディングフレームを含む。一実施形態では、異なるＲＮＡレプリコンは、前記Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の異なる鎖をコードするオープンリーディングフレームを含む。後者の実施形態では、これらの異なるＲＮＡレプリコンを細胞に共接種して（任意で、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物と共に）、機能性Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を提供し得る。
【００７０】
一実施形態では、細胞は、その細胞表面にＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する。
【００７１】
さらなる態様では、本発明は、細胞を生成するための本発明の方法によって生成された細胞を提供する。一実施形態では、細胞は組換え細胞である。
【００７２】
さらなる態様では、本発明は、本発明の１つ以上のＲＮＡレプリコンを含むＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する細胞を提供し、ＲＮＡレプリコン（１つまたは複数）は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖（１つまたは複数）をコードするオープンリーディングフレーム（１つまたは複数）を含む。細胞は、その細胞表面にＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を有し得る。
【００７３】
一実施形態では、上記細胞は、養子細胞移入に有用な細胞である。細胞は、免疫エフェクター細胞または幹細胞、好ましくは免疫反応性細胞であり得る。免疫反応性細胞は、Ｔ細胞またはその前駆細胞、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞またはその前駆細胞であり得る。一実施形態では、細胞はヒト細胞である。一実施形態では、修飾された細胞は、疾患関連抗原と反応する。一実施形態では、前記抗原は、疾患細胞などの細胞の表面に存在する。一実施形態では、前記抗原は、ＭＨＣ分子に関連して疾患細胞などの細胞の表面に提示される。一実施形態では、修飾された細胞は、ＭＨＣに関連して提示された場合、疾患関連抗原と反応する。一実施形態では、前記細胞は内因性ＴＣＲの表面発現を欠く。
【００７４】
本発明は一般に、疾患特異的抗原を発現する疾患細胞、特に腫瘍抗原を発現する癌細胞などの抗原を発現する細胞を標的とすることによる疾患の治療を包含する。細胞は、その表面に抗原を発現し得るおよび／または抗原を提示し得る。前記方法は、抗原を発現する細胞の選択的根絶を提供し、それによって抗原を発現しない正常細胞への有害作用を最小限に抑える。一実施形態では、特に細胞の表面に存在する場合、またはＭＨＣに関連して提示される場合、抗原への結合を介して細胞を標的とするＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現するように本発明に従って遺伝子改変されたＴ細胞を投与する。Ｔ細胞は、抗原を発現している疾患細胞を認識することができ、疾患細胞の根絶をもたらす。一実施形態では、標的細胞集団または標的組織は、腫瘍細胞または腫瘍組織である。
【００７５】
さらなる態様では、本発明は、本発明のＲＮＡレプリコンを含む、例えば、各ＲＮＡレプリコンがＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の異なる鎖の１つをコードする本発明のＲＮＡレプリコンのセット、本発明のＤＮＡ、または本発明の細胞を含む医薬組成物、および薬学的に許容される担体を提供する。
【００７６】
本発明の医薬組成物は、特に腫瘍抗原などのＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体が結合する、すなわち標的とする抗原の発現を特徴とする癌などの疾患の治療において薬剤として使用され得る。
【００７７】
さらなる態様では、本発明は、薬剤として使用するための本発明の医薬組成物を提供する。
【００７８】
さらなる態様では、本発明は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体が標的とする抗原の発現を特徴とする細胞が関与する疾患の治療において使用するための本発明の医薬組成物を提供する。
【００７９】
さらなる態様では、本発明は、被験体に治療有効量の本発明の医薬組成物を投与することを含む疾患の治療方法を提供し、疾患は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体が標的とする抗原の発現を特徴とする細胞を含む。
【００８０】
さらなる態様では、本発明は、抗原の発現を特徴とする細胞が関与する疾患を有する被験体を治療する方法を提供し、この方法は、抗原を標的とするＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する細胞を生成するための本発明の方法によって生成された細胞を被験体に投与することを含む。
【００８１】
本発明の一実施形態では、抗原は腫瘍抗原である。本発明の一実施形態では、疾患は癌である。一実施形態では、Ｔ細胞などの細胞は、被験体に対して自己由来、同種異系または同系であり得る。
【００８２】
本発明のすべての態様の一実施形態では、治療方法は、被験体から細胞の試料、好ましくはＴ細胞またはＴ細胞前駆体を含む試料を得ること、およびＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体をコードする本明細書に記載の１つ以上のレプリコン、またはこれらのレプリコンをコードするＤＮＡを細胞にトランスフェクトして、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞などの細胞を提供することをさらに含む。本発明のすべての態様の一実施形態では、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子改変された細胞は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体をコードする核酸で一過性にトランスフェクトされる。したがって、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体をコードする核酸は、細胞のゲノムに組み込まれない。本発明のすべての態様の一実施形態では、細胞および／または細胞の試料は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子改変された細胞が投与される被験体に由来する。本発明のすべての態様の一実施形態では、細胞および／または細胞の試料は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子改変された細胞が投与される哺乳動物とは異なる哺乳動物に由来する。
【００８３】
本発明のすべての態様の一実施形態では、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子改変されたＴ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体および／または内因性ＨＬＡの発現に関して不活性化される。
【００８４】
本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原は癌細胞などの疾患細胞で発現される。一実施形態では、抗原は、癌細胞などの疾患細胞の表面で発現され、および／またはＭＨＣ分子に関連して癌細胞などの疾患細胞の表面に提示される。
【００８５】
一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は、抗原の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインのエピトープに結合する。一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は、生細胞の表面に存在する抗原の天然のエピトープに結合する。
【００８６】
一実施形態では、Ｔ細胞受容体は、ＭＨＣ分子に関連して提示されるＴ細胞エピトープに結合する。
【００８７】
本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原は腫瘍抗原である。本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原は、クローディン６およびクローディン１８．２などのクローディン、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、メソテリン、ＣＥＡ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、ＧＤ−２、ならびにＮＹ−ＥＳＯ−１からなる群より選択される。本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原は病原体抗原である。病原体は、真菌、ウイルス、または細菌の病原体であり得る。本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原の発現は細胞表面で起こる。一実施形態では、Ｔ細胞によって発現されるおよび／もしくはＴ細胞上に存在する場合の前記人工Ｔ細胞受容体の、細胞上に存在する抗原への結合、またはＴ細胞によって発現されるおよび／もしくはＴ細胞上に存在する場合の前記Ｔ細胞受容体の、ＭＨＣ分子に関連して提示されるＴ細胞エピトープへの結合は、サイトカインの放出などの前記Ｔ細胞の免疫エフェクター機能をもたらす。一実施形態では、Ｔ細胞によって発現されるおよび／もしくはＴ細胞上に存在する場合の前記人工Ｔ細胞受容体の、癌細胞などの疾患細胞上に存在する抗原への結合、またはＴ細胞によって発現されるおよび／もしくはＴ細胞上に存在する場合の前記Ｔ細胞受容体の、癌細胞などの疾患細胞上にＭＨＣ分子に関連して提示されるＴ細胞エピトープへの結合は、疾患細胞の細胞溶解および／またはアポトーシスを引き起こし、前記Ｔ細胞は、好ましくは細胞傷害性因子、例えばパーフォリンおよびグランザイムを放出する。
【００８８】
本発明のすべての態様の一実施形態では、抗原結合部位を形成する人工Ｔ細胞受容体のドメインは、人工Ｔ細胞受容体のエクトドメインに含まれる。本発明のすべての態様の一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、膜貫通ドメインは、膜にまたがる疎水性αヘリックスである。本発明のすべての態様の一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は、新生タンパク質を小胞体に向かわせるシグナルペプチドを含む。一実施形態では、シグナルペプチドは、抗原結合部位を形成するドメインに先行する。
【００８９】
本発明のすべての態様の一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は、特に疾患細胞などの細胞の表面上に存在する場合、好ましくはそれが標的とする抗原に特異的である。
【００９０】
本発明のすべての態様の一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞などの免疫反応性細胞によって発現され得るおよび／または免疫反応性Ｔ細胞の表面上に存在し得る。一実施形態では、免疫反応性細胞は、人工Ｔ細胞受容体が標的とする抗原と反応する。
【００９１】
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載の方法で使用するための本明細書に記載の作用物質および組成物を提供する。
【００９２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】親ウイルスゲノムおよびベクターのシスおよびトランス複製ＲＮＡ  （Ａ）アルファウイルスゲノムの一般的構成。２つの大きなオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、サブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）によって分離されている。５'ＯＲＦはＲＮＡ増幅のための酵素複合体（レプリカーゼ）をコードし、３'ＯＲＦはウイルス構造遺伝子（カプシドおよびエンベロープ糖タンパク質）をコードした。５'末端で、２つの保存された配列エレメント（ＣＳＥ）が、レプリカーゼコード領域と部分的に重複する５'複製認識配列（ＲＲＳ）を構築する。３'ＲＲＳは、ＣＳＥ  ４（３'末端の１９ヌクレオチド）とポリＡ尾部（Ａｎ）の約１５ヌクレオチドによって構築される。  （Ｂ）シス−レプリコンベクターは、ＲＲＳおよびＳＧＰのＷＴ配列を保持し、それらは目的の遺伝子（ここではキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）によって置き換えられる構造遺伝子のＯＲＦを欠く。  （Ｃ）トランスレプリコンベクター系。シスレプリコンは、レプリカーゼをコードするが複製することができないｍＲＮＡと、レプリカーゼによってトランスで増幅される短いＲＮＡに分割される。これらのいわゆるトランスレプリコンには２つの異なる型があり、１つはシスレプリコンと同一のＷＴ配列中にすべてのウイルスＲＲＳを含む。他方の型は、翻訳開始コドンとして機能できるＡＵＧコドンを除去するように変異した短縮５'ＣＳＥを含む。５'ＡＵＧの除去は、目的のＯＲＦの開始コドンのみで翻訳が開始されることを確実にし、目的のＯＲＦは変異した５'ＣＳＥの下流に挿入される。本発明における目的の遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。ＴＣＲのα鎖とβ鎖を別々の複製ＲＮＡベクターに挿入した。
【図２Ａ】ＣＡＲをトランスフェクトした休止ＣＤ４＋細胞からのＩＦＮｇ放出は、複製ＲＮＡを使用して刺激される  ＣＤ４＋Ｔ細胞に、ヒトクローディン６に反応するＣＡＲをコードする、示されているＲＮＡ種をエレクトロポレーションした。ＮＴＲとＴＲを、示されているようにレプリカーゼをコードするｍＲＮＡで同時トランスフェクトし、ＣＡＲをコードするＲＮＡを、１０μｇのＣＡＲコードｍＲＮＡに基づいて等モルに調整した。エレクトロポレーションの２４時間後、細胞を回収し、ＣＡＲ特異的抗体で染色してＣＡＲ発現を観測した。さらに、トランスフェクトしたＴ細胞と、ヒトクローディン６を発現するまたは発現しないＪＹ細胞との共培養を開始した。２４時間後、細胞培養上清を回収し、分泌されたＩＦＮｇの濃度をＥＬＩＳＡによって決定した。  （Ａ）エレクトロポレーションの２４時間後のＣＡＲ発現のフローサイトメトリ分析。
【図２ＢＣＤ】ＣＡＲをトランスフェクトした休止ＣＤ４＋細胞からのＩＦＮｇ放出は、複製ＲＮＡを使用して刺激される  （Ｂ）Ａに示すヒストグラムの棒グラフ。  （Ｃ）ｈ−クローディン６陽性および陰性標的細胞との２４時間の共培養後のＩＦＮｇの濃度。  （Ｄ）ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）スーパー抗原を使用して非特異的に刺激し、ＪＹ−ｈクローディン６細胞に暴露した細胞からのＩＦＮ−ｇ放出。  （ｍＲＮＡ：非複製ｍＲＮＡ；ＴＲ：トランスレプリコン；ＲＲＳ：複製認識配列；ＳＧＰ：サブゲノムプロモータ）
【図３ＡＢ】ＣＡＲをトランスフェクトしたＣＤ８  Ｔ細胞からのＩＦＮ−ｇ放出は、複製ＲＮＡを使用して刺激され、より持続される  ＣＤ８＋Ｔ細胞を、磁気支援細胞選別を使用して健常ドナーの新鮮または凍結末梢血単核細胞から単離した。新鮮細胞から単離した細胞をＯＫＴ３およびＩＬ−２で４８時間前刺激し、ＩＬ−２の存在下で７２時間増殖させ、凍結ＰＢＭＣからのＣＤ８＋細胞はＭＡＣＳの直後に使用した。両方のＴ細胞集団に、ヒトクローディン６に反応するＣＡＲをコードする、示されているＲＮＡ種をエレクトロポレーションした。ＮＴＲとＴＲを、レプリカーゼをコードするｍＲＮＡで同時トランスフェクトし（＋Ｒ）、ＣＡＲコードＲＮＡを１０μｇのＣＡＲコードｍＲＮＡに基づいて等モルに調整した。エレクトロポレーションの２４時間から１２０時間後に、細胞をＣＡＲ特異的抗体で染色してＣＡＲ発現を観測した。さらに、ＣＡＲ発現分析の各時点で、トランスフェクトしたＴ細胞とヒトクローディン６を発現するまたは発現しないＪＹ細胞との共培養を開始した。２４時間後、細胞培養上清を回収し、ＩＦＮ−ｇ分泌をＥＬＩＳＡによって定量化した。  （Ａ）休止ＣＤ８細胞におけるＣＡＲ発現のフローサイトメトリ分析。細胞あたりの平均ＣＡＲ発現レベル（ＣＡＲ特異的染色の平均蛍光強度、ＭＦＩ）。  （Ｂ）休止細胞と標的細胞の２４時間の共培養時のＩＦＮｇの濃度。
【図３ＣＤ】ＣＡＲをトランスフェクトしたＣＤ８  Ｔ細胞からのＩＦＮ−ｇ放出は、複製ＲＮＡを使用して刺激され、より持続される  （Ｃ、Ｄ）ＡおよびＢと同じであるが、ＯＫＴ３／ＩＬ−２で前刺激したＣＤ８細胞を使用した。  （ｍＲＮＡ：非複製ｍＲＮＡ；ＴＲ：トランスレプリコン；ＲＲＳ：複製認識配列；ＳＧＰ：サブゲノムプロモータ；＋Ｒ：レプリカーゼ同時トランスフェクション）。
【図４】複製ＲＮＡ移入後の黒色腫細胞に応答した、改善されたネオ抗原特異的ＴＣＲ媒介認識およびＩＦＮ−ｇ分泌  Ａ）ＣＤ８＋Ｔ細胞に異なるＲＮＡ形態およびモル比のネオ抗原（「Ｍｕｔ１４」）特異的ＴＣＲ  α／β  ＲＮＡ＋／−レプリカーゼＲＮＡをトランスフェクトし、一晩休ませ、３ｘ１０５Ｔ細胞を５ｘ１０４ＭＺ−ＧＡＢＡ−０１８＿ＰＧＫ＿ｈＢ２Ｍ＿ｂｌｎ＿Ｃ５＿Ｐ９黒色腫細胞と共培養した。特異的ＩＦＮγ分泌をＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した。  Ｂ）蛍光色素結合ＣＤ８特異的およびＶβ特異的抗体で染色した後、フローサイトメトリによってＣＤ８＋Ｔ細胞上のＴＣＲ表面発現を分析した。細胞を単一の生細胞でゲートした。
【図５】複製ＲＮＡ移入後の自己ネオ抗原特異的ＴＣＲによって媒介される改善された腫瘍細胞溶解  予備活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞に、６．４ｐｍｏｌのネオ抗原特異的ＴＣＲ  α／β  ＲＮＡ＋／−１２．８ｐｍｏｌレプリカーゼＲＮＡをトランスフェクトし、２０時間後に異なるＥ：Ｔ比でＭＺ−ＧａＢａ−１８−β２ｍ黒色腫細胞細胞株と共培養した。Ｍ０５−ＴＣＲをトランスフェクトしたＴ細胞（Ａ）またはＭ１４−ＴＣＲをトランスフェクトしたＴ細胞（Ｂ）によって媒介される特異的溶解を、４８時間の共培養後にルシフェラーゼに基づく細胞毒性アッセイによって分析した。
【図６】本発明に従って有用な非修飾または修飾５'複製認識配列を含むＲＮＡレプリコンの概略図  略語：ＡＡＡＡ＝ポリ（Ａ）尾部；ＡＴＧ＝出発コドン／開始コドン（ＤＮＡレベルのＡＴＧ；ＲＮＡレベルのＡＵＧ）；５ｘＡＴＧ＝ｎｓＰ１＊をコードする核酸配列内のすべての開始コドンを含む核酸配列（セムリキ森林ウイルス由来のｎｓＰ１＊をコードする核酸配列の場合、５ｘＡＴＧは５つの特定の開始コドンに対応する、実施例１参照）；Δ５ＡＴＧ＝ｎｓＰ１＊をコードする核酸配列に対応する核酸配列；ただし、自然界で見出されるアルファウイルスのｎｓＰ１＊をコードする核酸配列の開始コドンを含まない（セムリキ森林ウイルスに由来するｎｓＰ１＊の場合、「Δ５ＡＴＧ」は、自然界で見出されるセムリキ森林ウイルスと比較して５つの特定の開始コドンの除去に対応する、実施例１参照）；ＥｃｏＲＶ＝ＥｃｏＲＶ制限部位；ｎｓＰ＝アルファウイルス非構造タンパク質（例えばｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）をコードする核酸配列；ｎｓＰ１＊＝ｎｓＰ１の断片をコードする核酸配列、この断片はｎｓＰ１のＣ末端断片を含まない；＊ｎｓＰ４＝ｎｓＰ４の断片をコードする核酸配列、この断片はｎｓＰ４のＮ末端断片を含まない；ＲＲＳ＝５'複製認識配列；ＳａｌＩ＝ＳａｌＩ制限部位；ＳＧＰ＝サブゲノムプロモータ；ＳＬ＝ステムループ（例えばＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４）；ＳＬ１〜４の位置は図で示されている；ＵＴＲ＝非翻訳領域（例えば５'−ＵＴＲ、３'−ＵＴＲ）；ＷＴ＝野生型；導入遺伝子は、好ましくはＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームに関する。  シスレプリコンＷＴ−ＲＲＳ：アルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列が目的の遺伝子（「導入遺伝子」）をコードするオープンリーディングフレームに置き換えられていることを除いて、本質的にアルファウイルスのゲノムに対応するＲＮＡレプリコン。「レプリコンＷＴ−ＲＲＳ」が細胞に導入された場合、レプリカーゼ（ｎｓＰ１２３４またはその断片（１つまたは複数））をコードするオープンリーディングフレームの翻訳産物は、シスでＲＮＡレプリコンの複製を駆動し、サブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）の下流の核酸配列（サブゲノム転写物）の合成を駆動することができる。  トランスレプリコンまたは鋳型ＲＮＡ  ＷＴ−ＲＲＳ：アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１〜４をコードする核酸配列のほとんどが除去されていることを除いて、本質的に「レプリコンＷＴ−ＲＲＳ」に対応するＲＮＡレプリコン。より具体的には、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３をコードする核酸配列は完全に除去されている；「鋳型ＲＮＡ  ＷＴ−ＲＲＳ」が、ｎｓＰ１のＣ末端断片を含まない（ただし、ｎｓＰ１のＮ末端断片を含む；ｎｓＰ１＊）ｎｓＰ１の断片をコードするように、ｎｓＰ１をコードする核酸配列はトランケートされている；「鋳型ＲＮＡ  ＷＴ−ＲＲＳ」が、ｎｓＰ４のＮ末端断片を含まない（ただし、ｎｓＰ４のＣ末端断片を含む；＊ｎｓＰ４）ｎｓＰ４の断片をコードするように、ｎｓＰ４をコードする核酸配列はトランケートされている。このトランケートされたｎｓＰ４配列は、完全に活性なサブゲノムプロモータと���分的に重複する。ｎｓＰ１＊をコードする核酸配列は、自然界で見出されるアルファウイルスのｎｓＰ１＊をコードする核酸配列のすべての開始コドンを含む（セムリキ森林ウイルス由来のｎｓＰ１＊の場合、５つの特定の開始コドン）。  Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳ：自然界で見出されるアルファウイルスのｎｓＰ１＊をコードする核酸配列の開始コドンを含まないことを除いて、本質的に「鋳型ＲＮＡ  ＷＴ−ＲＲＳ」に対応するＲＮＡレプリコン（セムリキ森林ウイルスの場合、「Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」は、自然界で見出されるセムリキ森林ウイルスと比較して５つの特定の開始コドンの除去に対応する）。開始コドンを除去するために導入されたすべてのヌクレオチド変化は、ＲＮＡの予測される二次構造を保存するために追加のヌクレオチド変化によって補償された。  Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳΔＳＧＰ：サブゲノムプロモータ（ＳＧＰ）を含まず、＊ｎｓＰ４をコードする核酸配列を含まないことを除いて、本質的に「Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」に対応するＲＮＡレプリコン。「導入遺伝子１」＝目的の遺伝子。  Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳ−バイシストロニック：サブゲノムプロモータの上流の最初の目的遺伝子（「導入遺伝子１」）をコードする最初のオープンリーディングフレームおよびサブゲノムプロモータの下流の２番目の目的遺伝子（「導入遺伝子２」）をコードする２番目のオープンリーディングフレームを含むことを除いて、本質的に「Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」に対応するＲＮＡレプリコン。２番目のオープンリーディングフレームの局在化は、ＲＮＡレプリコン「Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」における目的の遺伝子（「導入遺伝子」）の局在化に対応する。  シスレプリコンΔ５ＡＴＧ−ＲＲＳ：最初の目的遺伝子をコードするオープンリーディングフレームが機能性アルファウイルス非構造タンパク質（典型的にはポリタンパク質ｎｓＰ１−ｎｓＰ２−ｎｓＰ３−ｎｓＰ４、すなわちｎｓＰ１２３４をコードする１つのオープンリーディングフレーム）をコードすることを除いて、本質的に「Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳ−バイシストロニック」に対応するＲＮＡレプリコン。「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」の「導入遺伝子」は、「Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳ−バイシストロニック」の「導入遺伝子２」に対応する。機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、サブゲノムプロモータを認識し、目的の遺伝子（「導入遺伝子」）をコードする核酸配列を含むサブゲノム転写物を合成することができる。「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」は、「シスレプリコンＷＴ−ＲＲＳ」と同様に、機能性アルファウイルスの非構造タンパク質をシスでコードする；しかし、「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」によってコードされるｎｓＰ１のコード配列は、すべてのステムループを含む「シスレプリコンＷＴ−ＲＲＳ」の正確な核酸配列を含む必要はない。
【図７】キャップジヌクレオチドの構造。上：天然キャップジヌクレオチド、ｍ７ＧｐｐｐＧ。下：ホスホロチオエートキャップ類似体β−Ｓ−ＡＲＣＡジヌクレオチド：ステレオジェニックなＰ中心のため、β−Ｓ−ＡＲＣＡには２つのジアステレオマーが存在し、これらは、逆相ＨＰＬＣでの溶出特性に従ってＤ１およびＤ２と呼称される。
【発明を実施するための形態】
【００９４】
本発明を以下で詳細に説明するが、本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコルおよび試薬に限定されず、これらは異なり得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は付属の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されるべきである。特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００９５】
好ましくは、本明細書で使用される用語は、"Ａ  ｍｕｌｔｉｌｉｎｇｕａｌ  ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｔｅｒｍｓ：（ＩＵＰＡＣ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ）"，Ｈ．Ｇ．Ｗ．Ｌｅｕｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｂ．Ｎａｇｅｌ，ａｎｄ  Ｈ．Ｋｏｌｂｌ，Ｅｄｓ．，Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ，ＣＨ−４０１０  Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，（１９９５）に記載されているように定義される。
【００９６】
本発明の実施は、特に指示されない限り、当技術分野の文献（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  １９８９参照）で説明されている化学、生化学、細胞生物学、免疫学、および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用いる。
【００９７】
以下において、本発明の要素を説明する。これらの要素を具体的な実施形態と共に列挙するが、それらは、追加の実施形態を創製するために任意の方法および任意の数で組み合わせてもよいことが理解されるべきである。様々に説明される例および好ましい実施形態は、本発明を明確に記述される実施形態のみに限定すると解釈されるべきではない。この説明は、明確に記述される実施形態を任意の数の開示される要素および／または好ましい要素と組み合わせた実施形態を開示し、包含すると理解されるべきである。さらに、本出願において記述されるすべての要素の任意の並び替えおよび組合せは、文脈上特に指示されない限り、この説明によって開示されているとみなされるべきである。
【００９８】
「約」という用語は、およそまたはほぼを意味し、本明細書に記載の数値または範囲の文脈では、好ましくは列挙または特許請求される数値または範囲の＋／−１０％を意味する。
【００９９】
本発明を説明する文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用される「１つの」（「ａ」および「ａｎ」）および「その」（「ｔｈｅ」）という用語ならびに同様の言及は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数および複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、その範囲内に属する各々別々の値を個別に言及することの簡略方法として機能することが意図されている。本明細書で特に指示されない限り、各個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのごとくに本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で特に指示されない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書で提供されるありとあらゆる例または例示的言語（例えば「など」）の使用は、単に本発明をより良く説明することを意図し、特許請求される本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言語も、本発明の実施に不可欠な、特許請求されていない要素を指示すると解釈されるべきではない。
【０１００】
特に明記されない限り、「含む」という用語は、「含む」によって導入されたリストのメンバーに加えて、さらなるメンバーが場合により存在し得ることを示すために本文書の文脈で使用される。しかし、「含む」という用語は、さらなるメンバーが存在しない可能性を包含することが本発明の特定の実施形態として考えられ、すなわちこの実施形態の目的のために、「含む」は「からなる」の意味を有すると理解されるべきである。
【０１０１】
総称によって特徴付けられる成分の相対量の表示は、その総称でカバーされるすべての特定の変異体またはメンバーの合計量を指すことを意味する。総称によって定義された特定の成分が特定の相対量で存在すると指定され、この成分が総称でカバーされる特定の変異体またはメンバーであるとさらに特徴付けられる場合、総称でカバーされる他の変異体またはメンバーが、総称でカバーされる成分の合計相対量が指定された相対量を超えるように付加的に存在しないこと、より好ましくは総称でカバーされる他の変異体またはメンバーが全く存在しないことを意味する。
【０１０２】
本明細書の本文全体を通していくつかの資料を引用する。本明細書で引用される資料（すべての特許、特許出願、科学出版物、製造者の仕様書、指示書等を含む）の各々は、上記または下記のいずれでも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明がそのような開示に先行する権利を有さなかったことの承認と解釈されるべきではない。
【０１０３】
本明細書で使用される「低減する」または「阻害する」などの用語は、好ましくは５％以上、１０％以上、２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％以上のレベルの全体的な減少を生じさせる能力を意味する。「阻害する」という用語または同様の語句には、完全なまたは本質的に完全な阻害、すなわちゼロまたは本質的にゼロへの低減が含まれる。
【０１０４】
「増加する」または「増強する」などの用語は、好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも１００％の増加または増強に関する。
【０１０５】
「正味電荷」という用語は、化合物または粒子などの物体全体の電荷を指す。
【０１０６】
全体的な正味の正電荷を有するイオンは陽イオンであり、一方、全体的な正味の負電荷を有するイオンは陰イオンである。したがって、本発明によれば、陰イオンは陽子よりも多くの電子を有するイオンであり、正味の負電荷を与え、陽イオンは陽子よりも少ない電子を有するイオンであり、正味の正電荷を与える。
【０１０７】
所与の化合物または粒子に関して、「帯電した」、「正味電荷」、「負に帯電した」または「正に帯電した」という用語は、ｐＨ７．０の水に溶解または懸濁した場合の所与の化合物または粒子の正味電荷を指す。
【０１０８】
本発明によれば、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である。一般に、核酸分子または核酸配列は、好ましくはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）である核酸を指す。本発明によれば、核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ウイルスＲＮＡ、組換えによって調製された分子および化学合成された分子を含む。本発明によれば、核酸は、一本鎖または二本鎖の線状または共有結合閉環分子として存在し得る。本発明による「核酸」という用語は、ヌクレオチド塩基上、糖上またはリン酸塩上の核酸、ならびに非天然ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含む核酸の化学的誘導体化も含む。
【０１０９】
本発明によれば、「核酸配列」は、核酸、例えばリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）中のヌクレオチドの配列を指す。この用語は、核酸分子全体（核酸分子全体の一本鎖など）またはその一部（例えば断片）を指してもよい。
【０１１０】
本発明によれば、「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」という用語は、リボヌクレオチド残基を含み、好ましくは完全にまたは実質的にリボヌクレオチド残基からなる分子に関する。「リボヌクレオチド」という用語は、β−Ｄ−リボフラノシル基の２'位にヒドロキシル基を有するヌクレオチドに関する。「ＲＮＡ」という用語は、二本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、部分的または完全に精製されたＲＮＡなどの単離されたＲＮＡ、本質的に純粋なＲＮＡ、合成ＲＮＡ、ならびに１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、置換および／または改変によって天然に存在するＲＮＡとは異なる修飾ＲＮＡなどの組換え生産されたＲＮＡを含む。そのような改変は、例えばＲＮＡの末端（一方もしくは両方）へのまたは内部での、例えばＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける、非ヌクレオチド物質の付加を含み得る。ＲＮＡ分子中のヌクレオチドは、非天然のヌクレオチドまたは化学合成されたヌクレオチドもしくはデオキシヌクレオチドなどの非標準のヌクレオチドも含み得る。これらの改変されたＲＮＡは、類似体、特に天然に存在するＲＮＡの類似体と称され得る。
【０１１１】
本発明によれば、ＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。本発明のいくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡが好ましい。「一本鎖ＲＮＡ」という用語は、一般に、相補的な核酸分子（典型的には相補的なＲＮＡ分子）が結合していないＲＮＡ分子を指す。一本鎖ＲＮＡは、ＲＮＡの一部が折り返され、塩基対、ステム、ステムループおよびバルジを含むがこれらに限定されない二次構造モチーフを形成することを可能にする自己相補的配列を含み得る。一本鎖ＲＮＡは、マイナス鎖［（−）鎖］またはプラス鎖［（＋）鎖］として存在することができる。（＋）鎖は、遺伝情報を含むまたはコードする鎖である。遺伝情報は、例えばタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であり得る。（＋）鎖ＲＮＡがタンパク質をコードする場合、（＋）鎖は翻訳（タンパク質合成）の鋳型として直接機能し得る。（−）鎖は（＋）鎖の相補体である。二本鎖ＲＮＡの場合、（＋）鎖と（−）鎖は２つの別個のＲＮＡ分子であり、これら両方のＲＮＡ分子が互いに会合して二本鎖ＲＮＡ（「二重鎖ＲＮＡ」）を形成する。
【０１１２】
ＲＮＡの「安定性」という用語は、ＲＮＡの「半減期」に関する。「半減期」は、分子の活性、量、または数の半分を除去するのに必要な期間に関する。本発明の文脈において、ＲＮＡの半減期は、そのＲＮＡの安定性の指標である。ＲＮＡの半減期は、ＲＮＡの「発現の持続期間」に影響を与え得る。長い半減期を有するＲＮＡは長期間にわたって発現されると予想することができる。
【０１１３】
「翻訳効率」という用語は、特定の期間内にＲＮＡ分子によって提供される翻訳産物の量に関する。
【０１１４】
核酸配列に関する「断片」は、核酸配列の一部、すなわち５'末端および／または３'末端（一方もしくは両方）で短縮された核酸配列を表す配列に関する。好ましくは、核酸配列の断片は、前記核酸配列からのヌクレオチド残基の少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を含む。本発明では、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を保持するＲＮＡ分子の断片が好ましい。
【０１１５】
アミノ酸配列（ペプチドまたはタンパク質）に関する「断片」は、アミノ酸配列の一部、すなわち、Ｎ末端および／またはＣ末端で短縮されたアミノ酸配列を表す配列に関する。Ｃ末端で短縮された断片（Ｎ末端断片）は、例えばオープンリーディングフレームの３'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。Ｎ末端で短縮された断片（Ｃ末端断片）は、例えば、トランケートされたオープンリーディングフレームが翻訳を開始させるように働く開始コドンを含む限り、オープンリーディングフレームの５'末端を欠くトランケートされたオープンリーディングフレームの翻訳によって得ることができる。アミノ酸配列の断片は、例えばアミノ酸配列からのアミノ酸残基の少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％を含む。
【０１１６】
本発明による、例えば核酸およびアミノ酸配列に関する「変異体」という用語は、任意の変異体、特に突然変異体、ウイルス株変異体、スプライス変異体、立体配座、アイソフォーム、対立遺伝子変異体、種変異体および種ホモログ、特に天然に存在するものを含む。対立遺伝子変異体は、遺伝子の通常の配列における改変に関連しており、その重要性はしばしば不明である。完全な遺伝子配列決定によって、所与の遺伝子の多数の対立遺伝子変異体がしばしば同定される。核酸分子に関して、「変異体」という用語は縮重核酸配列を含み、本発明による縮重核酸は、遺伝暗号の縮重のためにコドン配列において参照核酸とは異なる核酸である。種ホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列のものとは異なる種を起源とする核酸またはアミノ酸配列である。ウイルスホモログは、所与の核酸またはアミノ酸配列のものとは異なるウイルスを起源とする核酸またはアミノ酸配列である。
【０１１７】
本発明によれば、核酸変異体は、参照核酸と比較して単一または複数のヌクレオチドの欠失、付加、変異、置換および／または挿入を含む。欠失は、参照核酸からの１つ以上のヌクレオチドの除去を含む。付加変異体は、１、２、３、５、１０、２０、３０、５０、またはそれ以上のヌクレオチドなどの、１つ以上のヌクレオチドの５'末端および／または３'末端融合を含む。置換の場合、配列中の少なくとも１つのヌクレオチドが除去され、少なくとも１つの他のヌクレオチドがその場所に挿入される（トランスバージョンおよびトランジションなど）。変異には、脱塩基部位、架橋部位、および化学的に改変または修飾された塩基が含まれる。挿入には、参照核酸への少なくとも１つのヌクレオチドの付加が含まれる。
【０１１８】
本発明によれば、「ヌクレオチド変化」は、参照核酸と比較した単一または複数のヌクレオチドの欠失、付加、変異、置換および／または挿入を指すことができる。いくつかの実施形態では、「ヌクレオチド変化」は、参照核酸と比較した、単一ヌクレオチドの欠失、単一ヌクレオチドの付加、単一ヌクレオチドの変異、単一ヌクレオチドの置換および／または単一ヌクレオチドの挿入のからなる群より選択される。本発明によれば、核酸変異体は、参照核酸と比較した１つ以上のヌクレオチド変化を含み得る。
【０１１９】
特定の核酸配列の変異体は、好ましくは前記特定の配列の少なくとも１つの機能的特性を有し、好ましくは前記特定の配列と機能的に等価であり、例えば特定の核酸配列の特性と同一または類似の特性を示す核酸配列である。
【０１２０】
以下に記載されるように、本発明のいくつかの実施形態は、とりわけ、自然界で見出されるアルファウイルスなどのアルファウイルスの核酸配列と相同である核酸配列を特徴とする。これらの相同な配列は、自然界で見出されるアルファウイルスなどのアルファウイルスの核酸配列の変異体である。
【０１２１】
好ましくは、所与の核酸配列と前記所与の核酸配列の変異体である核酸配列との間の同一性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。同一性の程度は、好ましくは、少なくとも約３０、少なくとも約５０、少なくとも約７０、少なくとも約９０、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約２５０、少なくとも約３００、または少なくとも約４００ヌクレオチドの領域について与えられる。好ましい実施形態では、同一性の程度は、参照アミノ酸配列の全長について与えられる。
【０１２２】
「配列類似性」は、同一であるかまたは保存的アミノ酸置換を表すアミノ酸の割合を示す。２つのポリペプチドまたは核酸配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸またはヌクレオチドの割合を示す。
【０１２３】
「％同一」という用語は、特に、比較する２つの配列間の最適なアラインメントにおいて同一であるヌクレオチドの割合を指すことが意図されており、前記割合は純粋に統計的であり、２つの配列間の相違は配列の全長にわたってランダムに分布していてもよく、比較する配列は、２つの配列間の最適なアラインメントを得るために、参照配列と比較して付加または欠失を含んでいてもよい。２つの配列の比較は、通常、対応する配列の局所領域を同定するために、最適なアラインメント後に、セグメントまたは「比較ウィンドウ」に関して前記配列を比較することによって実施される。比較のための最適なアラインメントは、手作業によって、またはＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｓ  Ａｐｐ．Ｍａｔｈ．２，４８２による局所相同性アルゴリズムを用いて、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８，４４３による局所相同性アルゴリズムを用いて、およびＰｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５，２４４４の類似性検索アルゴリズムを用いて、または前記アルゴリズムを使用したコンピュータプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ  Ｐ、ＢＬＡＳＴ  ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を援用して実施し得る。
【０１２４】
同一性パーセントは、比較する配列が一致する同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の数で除して、この結果に１００を乗じることによって得られる。
【０１２５】
例えば、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｂｌａｓｔ／ｂｌ２ｓｅｑ／ｗｂｌａｓｔ２．ｃｇｉで入手可能なＢＬＡＳＴプログラム「ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」を使用し得る。
【０１２６】
２つの配列が互いに相補的である場合、核酸は別の核酸に「ハイブリダイズできる」または「ハイブリダイズする」。２つの配列が互いに安定な二重鎖を形成できる場合、核酸は別の核酸と「相補的」である。本発明によれば、ハイブリダイゼーションは、好ましくは、ポリヌクレオチド間の特異的なハイブリダイゼーションを可能にする条件（ストリンジェントな条件）下で実施される。ストリンジェントな条件は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されており、例えばハイブリダイゼーション緩衝液（３．５ｘＳＳＣ、０．０２％Ｆｉｃｏｌｌ、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミン、２．５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７）、０．５％ＳＤＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中の６５℃でのハイブリダイゼーションを参照されたい。ＳＳＣは、０．１５Ｍ塩化ナトリウム／０．１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７である。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡが転写された膜を、例えば室温で２×ＳＳＣ中で洗浄し、次に６８℃までの温度で０．１〜０．５×ＳＳＣ／０．１×ＳＤＳ中で洗浄する。
【０１２７】
相補性パーセントは、第２の核酸配列と水素結合（例えばワトソン−クリック塩基対合）を形成することができる核酸分子中の連続する残基の割合を示す（例えば１０個のうちの５、６、７、８、９、１０個が５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および１００％相補的である）。「完全に相補的」または「全面的に相補的」とは、核酸配列のすべての連続する残基が、第２の核酸配列の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。好ましくは、本発明による相補性の程度は、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、または最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。最も好ましくは、本発明による相補性の程度は１００％である。
【０１２８】
「誘導体」という用語は、ヌクレオチド塩基、糖またはリン酸塩上の核酸の化学的誘導体化を含む。「誘導体」という用語は、天然には存在しないヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体を含む核酸も含む。好ましくは、核酸の誘導体化はその安定性を高める。
【０１２９】
本発明によれば、「核酸配列に由来する核酸配列」とは、それが由来する核酸の変異体である核酸を指す。好ましくは、ＲＮＡ分子中の特定の配列を置換する場合、特定の配列に関して変異体である配列は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を保持する。
【０１３０】
「ｎｔ」は、１つのヌクレオチドの略語であるか、または複数のヌクレオチド、好ましくは核酸分子中の連続するヌクレオチドの略語である。
【０１３１】
本発明によれば、「コドン」という用語は、リボソームでのタンパク質合成中に次にどのアミノ酸が付加されるかを特定する、コード核酸中の塩基トリプレットを指す。
【０１３２】
「転写」および「転写する」という用語は、特定の核酸配列を有する核酸分子（「核酸鋳型」）がＲＮＡポリメラーゼによって読み取られ、その結果ＲＮＡポリメラーゼが一本鎖ＲＮＡ分子を生成する過程に関する。転写中に、核酸鋳型の遺伝情報が転写される。核酸鋳型はＤＮＡであってもよい；しかし、例えばアルファウイルス核酸鋳型からの転写の場合、鋳型は、典型的にはＲＮＡである。その後、転写されたＲＮＡはタンパク質に翻訳され得る。本発明によれば、「転写」という用語は「インビトロ転写」を含み、「インビトロ転写」という用語は、ＲＮＡ、特にｍＲＮＡが無細胞系においてインビトロで合成される過程に関する。好ましくは、クローニングベクターを転写物の生成に適用する。これらのクローニングベクターは、一般に転写ベクターと称され、本発明によれば「ベクター」という用語に包含される。クローニングベクターは、好ましくはプラスミドである。本発明によれば、ＲＮＡは、好ましくはインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）であり、適切なＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって得られ得る。転写を制御するためのプロモータは、任意のＲＮＡポリメラーゼについての任意のプロモータであり得る。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型は、核酸、特にｃＤＮＡをクローニングし、それをインビトロ転写のための適切なベクターに導入することによって得られ得る。ｃＤＮＡは、ＲＮＡの逆転写によって得られ得る。
【０１３３】
転写中に生成される一本鎖核酸分子は、典型的には鋳型の相補的配列である核酸配列を有する。
【０１３４】
本発明によれば、「鋳型」または「核酸鋳型」または「鋳型核酸」という用語は、一般に、複製または転写され得る核酸配列を指す。
【０１３５】
「核酸配列から転写された核酸配列」および同様の用語は、適切な場合、鋳型核酸配列の転写産物である完全なＲＮＡ分子の一部としての核酸配列を指す。典型的には、転写された核酸配列は一本鎖ＲＮＡ分子である。
【０１３６】
「核酸の３'末端」とは、本発明によれば、遊離ヒドロキシ基を有するその末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの図式的表示では、３'末端は常に右側にある。「核酸の５'末端」は、本発明によれば、遊離リン酸基を有するその末端を指す。二本鎖核酸、特にＤＮＡの図式的表示では、５'末端は常に左側にある。
５'末端  ５'−−Ｐ−ＮＮＮＮＮＮＮ−ＯＨ−３'  ３'末端
３'−ＨＯ−ＮＮＮＮＮＮＮ−Ｐ−−５'
【０１３７】
「上流」とは、核酸分子の第１のエレメントと第２のエレメントの両方が同じ核酸分子中に含まれ、核酸分子の第１のエレメントが第２のエレメントよりもその核酸分子の５'末端のより近くに位置する、核酸分子の第１のエレメントの、その核酸分子の第２のエレメントに対する相対的位置を表す。その場合、第２のエレメントは、その核酸分子の第１のエレメントの「下流」であると言われる。第２のエレメントの「上流」に位置するエレメントは、同義的に、その第２のエレメントの「５'」側に位置すると称され得る。二本鎖核酸分子の場合、「上流」および「下流」のような指示は、「＋」鎖に関して与えられる。
【０１３８】
本発明によれば、「機能的連結」または「機能的に連結された」は、機能的関係内での接続に関する。核酸は、別の核酸配列と機能的に関連している場合、「機能的に連結され」ている。例えば、プロモータは、コード配列の転写に影響を及ぼす場合、前記コード配列に機能的に連結されている。機能的に連結された核酸は、典型的には互いに隣接しているが、適切な場合はさらなる核酸配列によって分離されており、特定の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼによって転写されて単一のＲＮＡ分子（共通転写物）を生じる。
【０１３９】
特定の実施形態では、核酸は、本発明に従って、核酸に関して同種または異種であり得る発現制御配列に機能的に連結される。
【０１４０】
「発現制御配列」という用語は、本発明によれば、プロモータ、リボソーム結合配列、および遺伝子の転写または誘導されたＲＮＡの翻訳を制御する他の制御エレメントを含む。本発明の特定の実施形態では、発現制御配列は調節することができる。発現制御配列の正確な構造は、種または細胞型に応じて異なり得るが、通常、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５'非転写配列ならびに５'および３'非翻訳配列を含む。より具体的には、５'非転写発現制御配列は、機能的に連結された遺伝子の転写制御のためのプロモータ配列を包含するプロモータ領域を含む。発現制御配列は、エンハンサー配列または上流活性化配列も含み得る。ＤＮＡ分子の発現制御配列は、通常、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列などの５'非転写配列ならびに５'および３'非翻訳配列を含む。アルファウイルスＲＮＡの発現制御配列は、サブゲノムプロモータおよび／または１つ以上の保存された配列エレメントを含み得る。本発明による特定の発現制御配列は、本明細書に記載されるように、アルファウイルスのサブゲノムプロモータである。
【０１４１】
本明細書で特定される核酸配列、特に転写可能なコード核酸配列は、任意の発現制御配列、特に前記核酸配列と同種または異種であり得るプロモータと組み合わせてもよく、「同種」という用語は、核酸配列が天然でも発現制御配列に機能的に連結されているという事実を指し、「異種」という用語は、核酸配列が天然では発現制御配列に機能的に連結されていないという事実を指す。
【０１４２】
転写可能な核酸配列、特にペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列と発現制御配列とは、それらが、転写可能な、特にコード核酸配列の転写または発現が発現制御配列の制御下または影響下にあるように互いに共有結合されている場合、互いに「機能的に」連結されている。核酸配列が機能的なペプチドまたはタンパク質に翻訳される場合、コード配列に機能的に連結された発現制御配列の誘導は、コード配列のフレームシフトを引き起こすことなく、またはコード配列が所望のペプチドまたはタンパク質に翻訳されるのを不可能にすることなく、前記コード配列の転写をもたらす。
【０１４３】
「プロモータ」または「プロモータ領域」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの認識および結合部位を提供することによって、転写物、例えばコード配列を含む転写物の合成を制御する核酸配列を指す。プロモータ領域は、前記遺伝子の転写の調節に関与するさらなる因子のさらなる認識または結合部位を含み得る。プロモータは、原核生物または真核生物遺伝子の転写を制御し得る。プロモータは「誘導性」であり得、誘導因子に応答して転写を開始し得るか、または転写が誘導因子によって制御されない場合は「構成的」であり得る。誘導因子が存在しない場合、誘導性プロモータはごくわずかしか発現されないかまたは全く発現されない。誘導因子の存在下では、遺伝子の「スイッチが入る」か、または転写のレベルが増加する。これは通常、特定の転写因子の結合によって媒介される。本発明による特定のプロモータは、本明細書に記載されるように、アルファウイルスのサブゲノムプロモータである。他の特定のプロモータは、アルファウイルスのゲノムプラス鎖またはマイナス鎖プロモータである。
【０１４４】
「コアプロモータ」という用語は、プロモータに含まれる核酸配列を指す。コアプロモータは、典型的には転写を適切に開始するために必要なプロモータの最小部分である。コアプロモータは、典型的には転写開始部位とＲＮＡポリメラーゼの結合部位とを含む。
【０１４５】
「ポリメラーゼ」は、一般に、モノマー構築ブロックからのポリマー分子の合成を触媒することができる分子実体を指す。「ＲＮＡポリメラーゼ」は、リボヌクレオチド構築ブロックからのＲＮＡ分子の合成を触媒することができる分子実体である。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシリボヌクレオチド構築ブロックからのＤＮＡ分子の合成を触媒することができる分子実体である。ＤＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼの場合、分子実体は、典型的にはタンパク質または複数のタンパク質の集合体もしくは複合体である。典型的には、ＤＮＡポリメラーゼは、典型的にはＤＮＡ分子である鋳型核酸に基づいてＤＮＡ分子を合成する。典型的には、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ分子である（その場合、ＲＮＡポリメラーゼはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＤｄＲＰである）か、またはＲＮＡ分子である（その場合、ＲＮＡポリメラーゼはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、ＲｄＲＰである）、鋳型核酸に基づいてＲＮＡ分子を合成する。
【０１４６】
「ＲＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ」または「ＲｄＲＰ」は、ＲＮＡ鋳型からのＲＮＡの転写を触媒する酵素である。アルファウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの場合、ゲノムＲＮＡの（−）鎖相補体と（＋）鎖のゲノムＲＮＡの連続合成によってＲＮＡ複製がもたらされる。したがって、アルファウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、同義的に「ＲＮＡレプリカーゼ」と称される。自然界では、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、典型的にはレトロウイルスを除くすべてのＲＮＡウイルスによってコードされている。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードするウイルスの典型的な代表例はアルファウイルスである。
【０１４７】
本発明によれば、「ＲＮＡ複製」は、一般に、所与のＲＮＡ分子（鋳型ＲＮＡ分子）のヌクレオチド配列に基づいて合成されたＲＮＡ分子を指す。合成されるＲＮＡ分子は、例えば鋳型ＲＮＡ分子と同一または相補的であり得る。一般に、ＲＮＡ複製は、ＤＮＡ中間体の合成を介して起こり得るか、またはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって媒介されるＲＮＡ依存性ＲＮＡ複製によって直接起こり得る。アルファウイルスの場合、ＲＮＡ複製はＤＮＡ中間体を介して起こるのではなく、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）によって媒介される：鋳型ＲＮＡ鎖（第１のＲＮＡ鎖）−またはその一部−が、第１のＲＮＡ鎖またはその一部に相補的な第２のＲＮＡ鎖を合成するための鋳型として働く。第２のＲＮＡ鎖−またはその一部−は、今度は、場合により第２のＲＮＡ鎖またはその一部に相補的な第３のＲＮＡ鎖を合成するための鋳型として働く。それにより、第３のＲＮＡ鎖は、第１のＲＮＡ鎖またはその一部と同一である。したがって、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型の相補的ＲＮＡ鎖を直接合成することができ、（相補的中間体鎖を介して）同一のＲＮＡ鎖を間接的に合成することができる。
【０１４８】
本発明によれば、「鋳型ＲＮＡ」という用語は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって転写または複製され得るＲＮＡを指す。
【０１４９】
本発明によれば、「遺伝子」という用語は、１つ以上の細胞産物の産生および／または１つ以上の細胞間もしくは細胞内機能の達成に関与する特定の核酸配列を指す。より具体的には、前記用語は、特定のタンパク質または機能的もしくは構造的ＲＮＡ分子をコードする核酸を含む核酸セクション（典型的にはＤＮＡ；ただしＲＮＡウイルスの場合はＲＮＡ）に関する。
【０１５０】
本明細書で使用される「単離された分子」は、他の細胞物質などの他の分子を実質的に含まない分子を指すことが意図されている。「単離された核酸」という用語は、本発明によれば、核酸が、（ｉ）例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によってインビトロで増幅された、（ｉｉ）クローニングによって組換え生産された、（ｉｉｉ）例えば切断およびゲル電気泳動分画によって精製された、または（ｉｖ）例えば化学合成によって合成されたことを意味する。単離された核酸は、組換え技術による操作に利用可能な核酸である。
【０１５１】
「ベクター」という用語は、本明細書ではその最も一般的な意味で使用され、例えば核酸を原核生物および／または真核生物宿主細胞に導入し、適切な場合にはゲノムに組み込むことを可能にする、前記核酸のための任意の中間ビヒクルを含む。そのようなベクターは、好ましくは細胞内で複製および／または発現される。ベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルスゲノム、およびそれらの画分を含む。
【０１５２】
本発明の文脈における「組換え」という用語は、「遺伝子操作を介して作製された」ことを意味する。好ましくは、本発明の文脈における組換え細胞などの「組換え物体」は、天然には存在しない。
【０１５３】
本明細書で使用される「天然に存在する」という用語は、物体が自然界で見出され得るという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）中に存在し、自然界の供給源から単離することができ、実験室で人によって意図的に改変されていないペプチドまたは核酸は、天然に存在する。「自然界で見出される」という用語は、「自然界に存在する」ことを意味し、公知の物体ならびに自然からまだ発見および／または単離されていないが、天然源から将来発見および／または単離される可能性がある物体を含む。
【０１５４】
本発明によれば、「発現」という用語は、その最も一般的な意味で使用され、ＲＮＡの産生、またはＲＮＡおよびタンパク質の産生を含む。また、核酸の部分的発現も含む。さらに、発現は一過性または安定であり得る。ＲＮＡに関して、「発現」または「翻訳」という用語は、コードＲＮＡ（例えばメッセンジャーＲＮＡ）の鎖が、ペプチドまたはタンパク質を生成するようにアミノ酸の配列の集合体に指令する、細胞のリボソームにおける過程に関する。
【０１５５】
本発明によれば、「ｍＲＮＡ」という用語は「メッセンジャーＲＮＡ」を意味し、典型的にはＤＮＡ鋳型を使用することによって生成され、ペプチドまたはタンパク質をコードする転写物に関する。典型的には、ｍＲＮＡは、５'−ＵＴＲ、タンパク質コード領域、３'−ＵＴＲ、およびポリ（Ａ）配列を含む。ｍＲＮＡは、ＤＮＡ鋳型からのインビトロ転写によって生成され得る。インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、様々なインビトロ転写キットが市販されている。本発明によれば、ｍＲＮＡは、安定化修飾およびキャッピングによって改変し得る。
【０１５６】
本発明によれば、「ポリ（Ａ）配列」または「ポリ（Ａ）尾部」という用語は、典型的にはＲＮＡ分子の３'末端に位置するアデニル酸残基の連続的または断続的な配列を指す。連続的な配列は、連続するアデニル酸残基を特徴とする。自然界では、連続的なポリ（Ａ）配列が典型的である。ポリ（Ａ）配列は通常真核生物のＤＮＡにはコードされていないが、細胞核での真核生物の転写中に、転写後の鋳型非依存性ＲＮＡポリメラーゼによってＲＮＡの遊離３'末端に結合し、本発明はＤＮＡによってコードされるポリ（Ａ）配列を包括する。
【０１５７】
本発明によれば、核酸分子に関して「一次構造」という用語は、ヌクレオチドモノマーの直鎖状配列を指す。
【０１５８】
本発明によれば、核酸分子に関して「二次構造」という用語は、塩基対合、例えば一本鎖ＲＮＡ分子の場合、特に分子内塩基対合を反映する核酸分子の二次元表示を指す。各ＲＮＡ分子は単一のポリヌクレオチド鎖のみを有するが、分子は、典型的には（分子内）塩基対の領域を特徴とする。本発明によれば、「二次構造」という用語は、塩基対、ステム、ステムループ、バルジ、内部ループおよび多分岐ループなどのループを含むがこれらに限定されない構造モチーフを含む。核酸分子の二次構造は、塩基対合を示す二次元図面（平面グラフ）によって表すことができる（ＲＮＡ分子の二次構造の詳細については、Ａｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｒａｐｈ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍｓ  Ａｐｐｌ．，２００６，ｖｏｌ．１０，ｐｐ．３２９−３５１参照）。本明細書に記載されるように、特定のＲＮＡ分子の二次構造は本発明の文脈に関連する。
【０１５９】
本発明によれば、核酸分子、特に一本鎖ＲＮＡ分子の二次構造は、ＲＮＡ二次構造予測のためのウェブサーバ（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂ／Ｓｅｒｖｅｒｓ／Ｐｒｅｄｉｃｔ１／Ｐｒｅｄｉｃｔ１．ｈｔｍｌ）を使用した予測によって決定される。
【０１６０】
好ましくは、本発明によれば、核酸分子に関して「二次構造」は、具体的には前記予測によって決定された二次構造を指す。予測は、ＭＦＯＬＤ構造予測（ｈｔｔｐ：／／ｕｎａｆｏｌｄ．ｒｎａ．ａｌｂａｎｙ．ｅｄｕ／？ｑ＝ｍｆｏｌｄ）を使用して実行または確認してもよい。
【０１６１】
本発明によれば、「塩基対」は、２つのヌクレオチド塩基が塩基上のドナー部位とアクセプタ部位との水素結合を介して互いに会合する二次構造の構造モチーフである。相補的な塩基であるＡ：ＵおよびＧ：Ｃは、塩基上のドナー部位とアクセプタ部位との水素結合を介して安定な塩基対を形成する；Ａ：ＵおよびＧ：Ｃ塩基対はワトソン−クリック塩基対と呼ばれる。より弱い塩基対（ウォブル塩基対と呼ばれる）は、塩基ＧとＵ（Ｇ：Ｕ）によって形成される。塩基対Ａ：ＵおよびＧ：Ｃは、正準塩基対と呼ばれる。Ｇ：Ｕ（ＲＮＡではかなり頻繁に生じる）および他のまれな塩基対（例えばＡ：Ｃ；Ｕ：Ｕ）のような他の塩基対は、非正準塩基対と呼ばれる。
【０１６２】
本発明によれば、「ヌクレオチド対合」とは、２つのヌクレオチドの塩基が塩基対（正準または非正準塩基対、好ましくは正準塩基対、最も好ましくはワトソン−クリック塩基対）を形成するように互いに会合する、２つのヌクレオチドを指す。
【０１６３】
本発明によれば、核酸分子に関して「ステムループ」または「ヘアピン」または「ヘアピンループ」という用語は、すべて互換的に、核酸分子、典型的には一本鎖ＲＮＡなどの一本鎖核酸分子の特定の二次構造を指す。ステムループで表される特定の二次構造は、ステムおよびヘアピンループとも呼ばれる（末端）ループを含む連続する核酸配列からなり、ステムは、ステム−ループ構造のループを形成する短い配列（例えば３〜１０ヌクレオチド）によって分離された２つの隣接する完全にまたは部分的に相補的な配列エレメントによって形成される。２つの隣接する完全にまたは部分的に相補的な配列は、例えばステムループエレメント、ステム１およびステム２として定義され得る。ステムループは、これらの２つの隣接する完全にまたは部分的に逆相補的な配列、例えばステムループエレメント、ステム１とステム２が互いに塩基対を形成する場合に形成され、ステムループエレメント、ステム１とステム２の間に位置する短い配列によって形成されるその末端に不対ループを含む二本鎖核酸配列をもたらす。したがって、ステムループは２つのステム（ステム１およびステム２）を含み、これらは−核酸分子の二次構造のレベルでは−互いに塩基対を形成し、および−核酸分子の一次構造のレベルでは−ステム１またはステム２の一部ではない短い配列によって分離されている。説明すると、ステムループの二次元表示はロリポップ形構造に類似する。ステムループ構造の形成には、それ自体が折りたたまれて対合した二本鎖を形成することができる配列の存在が必要である；対合した二本鎖はステム１とステム２によって形成される。対合したステムループエレメントの安定性は、典型的には、長さ、ステム２のヌクレオチドと塩基対（好ましくは正準塩基対、より好ましくはワトソン−クリック塩基対）を形成することができるステム１のヌクレオチドの数と、ステム２のヌクレオチドとそのような塩基対を形成することができない（ミスマッチまたはバルジ）ステム１のヌクレオチドの数とによって決定される。本発明によれば、最適なループ長は３〜１０ヌクレオチド、より好ましくは４〜７ヌクレオチド、例えば４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチドまたは７ヌクレオチドである。所与の核酸配列がステムループを特徴とする場合、それぞれの相補的な核酸配列も、典型的にはステムループを特徴とする。ステムループは、典型的には一本鎖ＲＮＡ分子によって形成される。例えば、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５'複製認識配列には、いくつかのステムループが存在する（図６に示されている）。
【０１６４】
本発明によれば、核酸分子の特定の二次構造（例えばステムループ）に関して「破壊」または「破壊する」とは、特定の二次構造が存在しないかまたは改変されていることを意味する。典型的には、二次構造は、二次構造の一部である少なくとも１つのヌクレオチドの変化の結果として破壊され得る。例えば、ステムループは、ステムを形成する１つ以上のヌクレオチドの変化によって破壊され得るため、ヌクレオチドの対合は不可能である。
【０１６５】
本発明によれば、「二次構造破壊を補償する」または「二次構造破壊の補償」とは、核酸配列の１つ以上のヌクレオチド変化を指す；より典型的には、以下を特徴とする、１つ以上の第１のヌクレオチド変化も含む核酸配列における１つ以上の第２のヌクレオチド変化を指す：１つ以上の第１のヌクレオチド変化は、１つ以上の第２のヌクレオチド変化が存在しない場合、核酸配列の二次構造の破壊を引き起こすが、１つ以上の第１のヌクレオチド変化と１つ以上の第２のヌクレオチド変化の共起は、核酸の二次構造の破壊を引き起こさない。共起とは、１つ以上の第１のヌクレオチド変化と１つ以上の第２のヌクレオチド変化の両方の存在を意味する。典型的には、１つ以上の第１のヌクレオチド変化と１つ以上の第２のヌクレオチド変化は、同じ核酸分子内に一緒に存在する。特定の実施形態では、二次構造破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化は、１つ以上のヌクレオチド対合破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化である。したがって、一実施形態では、「二次構造破壊の補償」とは、「ヌクレオチド対合破壊の補償」、すなわち１つ以上のヌクレオチド対合破壊、例えば１つ以上のステムループ内の１つ以上のヌクレオチド対合破壊の補償を意味する。１つ以上１つ以上のヌクレオチド対合破壊は、少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入された可能性がある。二次構造破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化の各々は、１つ以上のヌクレオチドの欠失、付加、置換および／または挿入からそれぞれ独立して選択され得るヌクレオチド変化である。説明のための例では、ヌクレオチド対合Ａ：ＵがＡからＣへの置換によって破壊された場合（ＣおよびＵは、典型的にはヌクレオチド対を形成するのに適さない）、ヌクレオチド対合破壊を補償するヌクレオチド変化は、ＧによるＵの置換であり得、それによってＣ：Ｇヌクレオチド対合の形成が可能になる。したがって、ＧによるＵの置換は、ヌクレオチド対合破壊を補償する。代替的な例では、ヌクレオチド対合Ａ：ＵがＡからＣへの置換によって破壊された場合、ヌクレオチド対合破壊を補償するヌクレオチド変化は、ＡによるＣの置換であり得、それによって元のＡ：Ｕヌクレオチド対合の形成が回復する。一般に、本発明では、元の核酸配列を回復せず、新規のＡＵＧトリプレットも生成しない、二次構造破壊を補償するヌクレオチド変化が好ましい。上記の一連の例では、ＵからＧへの置換がＣからＡへの置換よりも好ましい。
【０１６６】
本発明によれば、核酸分子に関して「三次構造」という用語は、原子座標によって定義される核酸分子の三次元構造を指す。
【０１６７】
本発明によれば、ＲＮＡ、例えばｍＲＮＡなどの核酸は、ペプチドまたはタンパク質をコードし得る。したがって、転写可能な核酸配列またはその転写物は、ペプチドまたはタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含み得る。
【０１６８】
本発明によれば、「ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸」という用語は、核酸が、適切な環境、好ましくは細胞内に存在する場合、翻訳過程中にペプチドまたはタンパク質を産生するようにアミノ酸の集合体に指令できることを意味する。好ましくは、本発明によるコードＲＮＡは、コードＲＮＡの翻訳を可能にする細胞翻訳機構と相互作用して、ペプチドまたはタンパク質を生成することができる。
【０１６９】
本発明によれば、「ペプチド」という用語は、オリゴペプチドおよびポリペプチドを含み、ペプチド結合を介して互いに連結された２個以上、好ましくは３個以上、好ましくは４個以上、好ましくは６個以上、好ましくは８個以上、好ましくは１０個以上、好ましくは１３個以上、好ましくは１６個以上、好ましくは２０個以上、および最大で好ましくは５０個、好ましくは１００個または好ましくは１５０個までの連続するアミノ酸を含む物質を指す。「タンパク質」という用語は、大きなペプチド、好ましくは少なくとも１５１個のアミノ酸を有するペプチドを指すが、「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では通常同義語として使用される。
【０１７０】
「ペプチド」および「タンパク質」という用語は、本発明によれば、アミノ酸成分だけでなく、糖およびリン酸構造体などの非アミノ酸成分も含む物質を含み、エステル、チオエーテルまたはジスルフィド結合などの結合を含む物質も含む。
【０１７１】
本発明によれば、「開始コドン」および「出発コドン」という用語は、同義的に、リボソームによって翻訳される最初のコドンである可能性のあるＲＮＡ分子のコドン（塩基トリプレット）を指す。そのようなコドンは、典型的には真核生物のアミノ酸メチオニンおよび原核生物の修飾メチオニンをコードする。真核生物および原核生物における最も一般的な開始コドンはＡＵＧである。本明細書でＡＵＧ以外の開始コドンを意味すると特に明記されない限り、ＲＮＡ分子に関して「開始コドン」および「出発コドン」という用語は、コドンＡＵＧを指す。本発明によれば、「開始コドン」および「出発コドン」という用語はまた、デオキシリボ核酸の対応する塩基トリプレット、すなわちＲＮＡの開始コドンをコードする塩基トリプレットを指すためにも使用される。メッセンジャーＲＮＡの開始コドンがＡＵＧである場合、ＡＵＧをコードする塩基トリプレットはＡＴＧである。本発明によれば、「開始コドン」および「出発コドン」という用語は、好ましくは機能的な開始コドンまたは出発コドン、すなわち翻訳を開始するためにリボソームによってコドンとして使用されるまたは使用されることになる開始コドンまたは出発コドンを指す。ＲＮＡ分子には、例えばコドンからキャップまでの距離が短いために、翻訳を開始するためにリボソームによってコドンとして使用されないＡＵＧコドンが存在し得る。これらのコドンは、機能的な開始コドンまたは出発コドンという用語には包含されない。
【０１７２】
本発明によれば、「オープンリーディングフレームの出発コドン」または「オープンリーディングフレームの開始コドン」という用語は、コード配列、例えば自然界で見出される核酸分子のコード配列におけるタンパク質合成の開始コドンとして働く塩基トリプレットを指す。ＲＮＡ分子では、オープンリーディングフレームの開始コドンの前に５'非翻訳領域（５'−ＵＴＲ）がしばしば存在するが、これは厳密には必要ではない。
【０１７３】
本発明によれば、「オープンリーディングフレームの天然の出発コドン」または「オープンリーディングフレームの天然の開始コドン」という用語は、天然のコード配列におけるタンパク質合成の開始コドンとして働く塩基トリプレットを指す。天然のコード配列は、例えば自然界で見出される核酸分子のコード配列であり得る。いくつかの実施形態では、本発明は、自然界で見出される核酸分子の変異体を提供し、これは、天然の開始コドン（天然のコード配列中に存在する）が除去されている（そのため変異体核酸分子には存在しない）ことを特徴とする。
【０１７４】
本発明によれば、「最初のＡＵＧ」は、メッセンジャーＲＮＡ分子の最も上流のＡＵＧ塩基トリプレット、好ましくは翻訳を開始するためにリボソームによってコドンとして使用されるまたは使用されることになるメッセンジャーＲＮＡ分子の最も上流のＡＵＧ塩基トリプレットを意味する。したがって、「最初のＡＴＧ」とは、最初のＡＵＧをコードするコードＤＮＡ配列のＡＴＧ塩基トリプレットを指す。いくつかの場合には、ｍＲＮＡ分子の最初のＡＵＧは、オープンリーディングフレームの開始コドン、すなわちリボソームタンパク質合成中に開始コドンとして使用されるコドンである。
【０１７５】
本発明によれば、核酸変異体の特定のエレメントに関して「除去を含む」または「除去を特徴とする」という用語および同様の用語は、参照核酸分子と比較して、前記特定のエレメントが核酸変異体において機能しないかまたは存在しないことを意味する。限定されることなく、除去は、特定のエレメントのすべてもしくは一部の欠失、特定のエレメントのすべてもしくは一部の置換、または特定のエレメントの機能的もしくは構造的特性の改変で構成され得る。核酸配列の機能的エレメントの除去は、機能が、除去を含む核酸変異体の位置で示されないことを必要とする。例えば、特定の開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡ変異体は、リボソームタンパク質合成が除去を特徴とするＲＮＡ変異体の位置で開始されないことを必要とする。核酸配列の構造エレメントの除去は、構造エレメントが除去を含む核酸変異体の位置に存在しないことを必要とする。例えば、特定のＡＵＧ塩基トリプレット、すなわち特定の位置のＡＵＧ塩基トリプレットの除去を特徴とするＲＮＡ変異体は、例えば、特定のＡＵＧ塩基トリプレット（例えばΔＡＵＧ）の一部もしくはすべての欠失、または特定のＡＵＧ塩基トリプレットの１つ以上のヌクレオチド（Ａ、Ｕ、Ｇ）の、１つ以上の異なるヌクレオチドによる置換を特徴とし得るため、生じる変異体のヌクレオチド配列は前記ＡＵＧ塩基トリプレットを含まない。１個のヌクレオチドの適切な置換は、ＡＵＧ塩基トリプレットをＧＵＧ、ＣＵＧもしくはＵＵＧ塩基トリプレットに、またはＡＡＧ、ＡＣＧもしくはＡＧＧ塩基トリプレットに、またはＡＵＡ、ＡＵＣもしくはＡＵＵ塩基トリプレットに変換するものである。より多くのヌクレオチドの適切な置換を、それに応じて選択することができる。
【０１７６】
本発明によれば、「アルファウイルス」という用語は広く理解されるべきであり、アルファウイルスの特徴を有する任意のウイルス粒子を含む。アルファウイルスの特徴には、ＲＮＡポリメラーゼ活性を含む、宿主細胞での複製に適した遺伝情報をコードする（＋）鎖ＲＮＡの存在が含まれる。多くのアルファウイルスのさらなる特徴は、例えばＳｔｒａｕｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１−５６２に記載されている。「アルファウイルス」という用語は、自然界で見出されるアルファウイルス、およびそのあらゆる変異体または誘導体を含む。いくつかの実施形態では、変異体または誘導体は自然界では見出されない。
【０１７７】
一実施形態では、アルファウイルスは、自然界で見出されるアルファウイルスである。典型的には、自然界で見出されるアルファウイルスは、動物（ヒトなどの脊椎動物、および昆虫などの節足動物を含む）などの１つ以上の真核生物に対して感染性である。
【０１７８】
自然界で見出されるアルファウイルスは、好ましくは以下からなる群より選択される：バーマフォレストウイルス複合体（バーマフォレストウイルスを含む）；東部ウマ脳炎複合体（７つの抗原型の東部ウマ脳炎ウイルスを含む）；ミデルブルグウイルス複合体（ミデルブルグウイルスを含む）；ヌドゥムウイルス複合体（ヌドゥムウイルスを含む）；セムリキ森林ウイルス複合体（ベバルウイルス、チクングニアウイルス、マヤロウイルスおよびそのサブタイプであるウナウイルス、オニョンニョンウイルスおよびそのサブタイプであるイグボオラウイルス、ロスリバーウイルスおよびそのサブタイプであるベバルウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、セムリキ森林ウイルスおよびそのサブタイプであるメトリウイルスを含む）；ベネズエラウマ脳炎複合体（カバソウウイルス、エバーグレーズウイルス、モッソダスペドラスウイルス、ムカンボウイルス、パラマナウイルス、ピクスナウイルス、リオネグロウイルス、トロカラウイルスおよびそのサブタイプであるビジューブリッジウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含む）；西部ウマ脳炎複合体（アウラウイルス、ババンキーウイルス、キジラガッチェウイルス、シンドビスウイルス、オケルボウイルス、ワタロアウイルス、バギークリークウイルス、フォートモーガンウイルス、ハイランドＪウイルス、西部ウマ脳炎ウイルスを含む）；ならびにサケ膵臓病ウイルスを含むいくつかの未分類ウイルス；睡眠病ウイルス；ミナミゾウアザラシウイルス、トナテウイルス。より好ましくは、アルファウイルスは、セムリキ森林ウイルス複合体（セムリキ森林ウイルスを含む、上記に示したようなウイルス型を含む）、西部ウマ脳炎複合体（シンドビスウイルスを含む、上記に示したようなウイルス型を含む）、東部ウマ脳炎ウイルス（上記に示したようなウイルス型を含む）、ベネズエラウマ脳炎複合体（ベネズエラウマ脳炎ウイルスを含む、上記に示したようなウイルス型を含む）からなる群より選択される。
【０１７９】
さらなる好ましい実施形態では、アルファウイルスはセムリキ森林ウイルスである。代替的なさらなる好ましい実施形態では、アルファウイルスはシンドビスウイルスである。代替的なさらなる好ましい実施形態では、アルファウイルスはベネズエラウマ脳炎ウイルスである。
【０１８０】
本発明のいくつかの実施形態では、アルファウイルスは、自然界で見出されるアルファウイルスではない。典型的には、自然界では見出されないアルファウイルスは、ヌクレオチド配列、すなわちゲノムＲＮＡの少なくとも１つの変異によって自然界で見出されるアルファウイルスとは区別される、自然界で見出されるアルファウイルスの変異体または誘導体である。ヌクレオチド配列の変異は、自然界で見出されるアルファウイルスと比較して、１つ以上のヌクレオチドの挿入、置換または欠失から選択され得る。ヌクレオチド配列の変異は、ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドまたはタンパク質における変異と関連していてもよく、または関連していなくてもよい。例えば、自然界では見出されないアルファウイルスは、弱毒化アルファウイルスであり得る。自界では見出されない弱毒化アルファウイルスは、典型的にはそのヌクレオチド配列中に少なくとも１つの変異を有し、この変異によって自然界で見出されるアルファウイルスとは区別され、および全く感染性ではないか、または感染性ではあるが疾患を引き起こす能力がより低いもしくは疾患を引き起こす能力を全く有さないアルファウイルスである。説明のための例として、ＴＣ８３は、自然界で見出されるベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）とは区別される弱毒化アルファウイルスである（ＭｃＫｉｎｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９６３，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒｏｐ．Ｍｅｄ．Ｈｙｇ．，１９６３，ｖｏｌ．１２；ｐｐ．５９７−６０３）。
【０１８１】
アルファウイルス属のメンバーはまた、ヒトにおけるそれらの相対的な臨床的特徴に基づいて、すなわち主に脳炎に関連するアルファウイルスと、主に発熱、発疹、および多発性関節炎に関連するアルファウイルスとに分類され得る。
【０１８２】
「アルファウイルス性」という用語は、アルファウイルスにおいて見出される、またはアルファウイルスを起源とする、または、例えば遺伝子工学によってアルファウイルスから誘導されることを意味する。
【０１８３】
本発明によれば、「ＳＦＶ」はセムリキ森林ウイルスを表す。本発明によれば、「ＳＩＮ」または「ＳＩＮＶ」はシンドビスウイルスを表す。本発明によれば、「ＶＥＥ」または「ＶＥＥＶ」はベネズエラウマ脳炎ウイルスを表す。
【０１８４】
本発明によれば、「アルファウイルスの」という用語は、アルファウイルスを起源とする実体を指す。説明すると、アルファウイルスのタンパク質は、アルファウイルスに見出されるタンパク質および／またはアルファウイルスによってコードされるタンパク質を指し得、アルファウイルスの核酸配列は、アルファウイルスに見出される核酸配列および／またはアルファウイルスによってコードされる核酸配列を指し得る。好ましくは、「アルファウイルスの」核酸配列は、「アルファウイルスのゲノムの」および／または「アルファウイルスのゲノムＲＮＡの」核酸配列を指す。
【０１８５】
本発明によれば、「アルファウイルスＲＮＡ」という用語は、アルファウイルスゲノムＲＮＡ（すなわち（＋）鎖）、アルファウイルスゲノムＲＮＡの相補体（すなわち（−）鎖）、およびサブゲノム転写物（すなわち（＋）鎖）、またはそのいずれかの断片のうちの任意の１つ以上を指す。
【０１８６】
本発明によれば、「アルファウイルスゲノム」は、アルファウイルスのゲノム（＋）鎖ＲＮＡを指す。
【０１８７】
本発明によれば、「天然のアルファウイルス配列」という用語および同様の用語は、典型的には、天然に存在するアルファウイルス（自然界で見出されるアルファウイルス）の（例えば核酸）配列を指す。いくつかの実施形態では、「天然のアルファウイルス配列」という用語には、弱毒化アルファウイルスの配列も含まれる。
【０１８８】
本発明によれば、「５'複製認識配列」という用語は、好ましくはアルファウイルスゲノムの５'断片と同一または相同である連続する核酸配列、好ましくはリボ核酸配列を指す。「５'複製認識配列」は、アルファウイルスのレプリカーゼによって認識され得る核酸配列である。５'複製認識配列という用語には、天然の５'複製認識配列およびその機能的等価物、例えば自然界で見出されるアルファウイルスの５'複製認識配列の機能的変異体が含まれる。本発明によれば、機能的等価物には、本明細書に記載の少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とする５'複製認識配列の誘導体が含まれる。５'複製認識配列は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの（−）鎖相補体の合成に必要であり、（−）鎖鋳型に基づく（＋）鎖ウイルスゲノムＲＮＡの合成に必要である。天然の５'複製認識配列は、典型的には少なくともｎｓＰ１のＮ末端断片をコードするが、ｎｓＰ１２３４をコードするオープンリーディングフレーム全体は含まない。天然の５'複製認識配列が、典型的には少なくともｎｓＰ１のＮ末端断片をコードするという事実を考慮すると、天然の５'複製認識配列は、典型的には少なくとも１つの開始コドン、典型的にはＡＵＧを含む。一実施形態では、５'複製認識配列は、アルファウイルスゲノムの保存された配列エレメント１（ＣＳＥ  １）またはその変異体およびアルファウイルスゲノムの保存された配列エレメント２（ＣＳＥ  ２）またはその変異体を含む。５'複製認識配列は、典型的には４つのステムループ（ＳＬ）、すなわちＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４を形成することができる。これらのステムループの番号付けは、５'複製認識配列の５'末端から始まる。
【０１８９】
本発明によれば、「アルファウイルスの５'末端に」という用語は、アルファウイルスのゲノムの５'末端を指す。アルファウイルスの５'末端の核酸配列は、アルファウイルスのゲノムＲＮＡの５'末端に位置するヌクレオチドに加えて、場合によりさらなるヌクレオチドの連続する配列を含む。一実施形態では、アルファウイルスの５'末端の核酸配列は、アルファウイルスゲノムの５'複製認識配列と同一である。
【０１９０】
「保存された配列エレメント」または「ＣＳＥ」という用語は、アルファウイルスＲＮＡに見出されるヌクレオチド配列を指す。これらの配列エレメントは、オルソログが異なるアルファウイルスのゲノムに存在し、異なるアルファウイルスのオルソログＣＳＥが、好ましくは高い割合の配列同一性および／または類似の二次もしくは三次構造を共有するため、「保存された」と称される。ＣＳＥという用語には、ＣＳＥ  １、ＣＳＥ  ２、ＣＳＥ  ３およびＣＳＥ  ４が含まれる。
【０１９１】
本発明によれば、「ＣＳＥ  １」または「４４−ｎｔ  ＣＳＥ」という用語は、同義的に、（−）鎖鋳型からの（＋）鎖合成に必要なヌクレオチド配列を指す。「ＣＳＥ  １」という用語は、（＋）鎖上の配列を指し、（（−）鎖上の）ＣＳＥ  １の相補的配列は（＋）鎖合成のプロモータとして機能する。好ましくは、ＣＳＥ  １という用語は、アルファウイルスゲノムの最も５'側のヌクレオチドを含む。ＣＳＥ  １は、典型的には保存されたステムループ構造を形成する。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＳＥ  １の場合、二次構造は、一次構造、すなわち直鎖状配列よりも重要であると考えられている。モデルアルファウイルスであるシンドビスウイルスのゲノムＲＮＡでは、ＣＳＥ  １は、ゲノムＲＮＡの最も５'側の４４個のヌクレオチドによって形成される、４４個のヌクレオチドの連続する配列からなる（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１−５６２）。
【０１９２】
本発明によれば、「ＣＳＥ  ２」または「５１−ｎｔ  ＣＳＥ」という用語は、同義的に、（＋）鎖鋳型からの（−）鎖合成に必要なヌクレオチド配列を指す。（＋）鎖鋳型は、典型的にはアルファウイルスゲノムＲＮＡまたはＲＮＡレプリコンである（ＣＳＥ  ２を含まないサブゲノムＲＮＡ転写物は（−）鎖合成のための鋳型として機能しないことに留意されたい）。アルファウイルスのゲノムＲＮＡでは、ＣＳＥ  ２は、典型的にはｎｓＰ１のコード配列内に局在する。モデルアルファウイルスであるシンドビスウイルスのゲノムＲＮＡでは、５１−ｎｔ  ＣＳＥはゲノムＲＮＡのヌクレオチド位置１５５〜２０５に位置する（Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８−１６５１）。ＣＳＥ  ２は、典型的には２つの保存されたステムループ構造を形成する。これらのステムループ構造は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５'末端から数えて、それぞれアルファウイルスゲノムＲＮＡの３番目と４番目の保存されたステムループであるため、ステムループ３（ＳＬ３）およびステムループ４（ＳＬ４）と呼称される。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＳＥ  ２の場合、二次構造は、一次構造、すなわち直鎖状配列よりも重要であると考えられている。
【０１９３】
本発明によれば、「ＣＳＥ  ３」または「接合配列」という用語は、同義的に、アルファウイルスゲノムＲＮＡに由来し、サブゲノムＲＮＡの開始部位を含むヌクレオチド配列を指す。（−）鎖におけるこの配列の相補体は、サブゲノムＲＮＡ転写を促進するように作用する。アルファウイルスゲノムＲＮＡでは、ＣＳＥ  ３は、典型的にはｎｓＰ４のＣ末端断片をコードする領域と重複し、構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの上流に位置する短い非コード領域にまで及ぶ。
【０１９４】
本発明によれば、「ＣＳＥ  ４」または「１９−ｎｔの保存された配列」または「１９−ｎｔ  ＣＳＥ」という用語は、同義的に、アルファウイルスゲノムの３'非翻訳領域のポリ（Ａ）配列のすぐ上流の、アルファウイルスゲノムＲＮＡからのヌクレオチド配列を指す。ＣＳＥ  ４は、典型的には１９個の連続するヌクレオチドからなる。特定の理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＳＥ  ４は、（−）鎖合成の開始のためのコアプロモータとして機能すると理解されており（Ｊｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７−８５６）、および／またはアルファウイルスゲノムＲＮＡのＣＳＥ  ４およびポリ（Ａ）尾部は、効率的な（−）鎖合成のために一緒に機能すると理解されている（Ｈａｒｄｙ＆Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００５，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．４６３０−４６３９）。
【０１９５】
本発明によれば、「サブゲノムプロモータ」または「ＳＧＰ」という用語は、核酸配列（例えばコード配列）の上流（５'側）の核酸配列であって、ＲＮＡポリメラーゼ、典型的にはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、特に機能性アルファウイルス非構造タンパク質の認識および結合部位を提供することによって前記核酸配列の転写を制御する核酸配列を指す。ＳＧＰは、さらなる因子のためのさらなる認識または結合部位を含み得る。サブゲノムプロモータは、典型的にはアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルスの遺伝要素である。アルファウイルスのサブゲノムプロモータは、ウイルスゲノムＲＮＡに含まれる核酸配列である。サブゲノムプロモータは、一般に、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えば機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で転写の開始（ＲＮＡ合成）を可能にすることを特徴とする。ＲＮＡ（−）鎖、すなわちアルファウイルスゲノムＲＮＡの相補体は、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成のための鋳型として働き、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成は、典型的にはサブゲノムプロモータにおいてまたはその近くで開始される。本明細書で使用される「サブゲノムプロモータ」という用語は、そのようなサブゲノムプロモータを含む核酸内の特定の局在化に限定されない。一部の実施形態では、ＳＧＰは、ＣＳＥ  ３と同一であるか、ＣＳＥ  ３と重複するか、またはＣＳＥ  ３を含む。
【０１９６】
「サブゲノム転写物」または「サブゲノムＲＮＡ」という用語は、同義的に、ＲＮＡ分子を鋳型（「鋳型ＲＮＡ」）として使用した転写の結果として得られるＲＮＡ分子を指し、鋳型ＲＮＡは、サブゲノム転写物の転写を制御するサブゲノムプロモータを含む。サブゲノム転写物は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、特に機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で得られる。例えば、「サブゲノム転写物」という用語は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの（−）鎖相補体を鋳型として使用して、アルファウイルスに感染した細胞で調製されるＲＮＡ転写物を指し得る。しかし、本明細書で使用される「サブゲノム転写物」という用語はそれに限定されず、異種ＲＮＡを鋳型として使用することによって得られる転写物も含む。例えば、サブゲノム転写物はまた、本発明によるＳＧＰ含有レプリコンの（−）鎖相補体を鋳型として使用することによっても入手され得る。したがって、「サブゲノム転写物」という用語は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの断片を転写することによって得られるＲＮＡ分子、ならびに本発明によるレプリコンの断片を転写することにより得られるＲＮＡ分子を指し得る。
【０１９７】
「自己」という用語は、同じ被験体に由来するものを表すために使用される。例えば、「自己細胞」とは、同じ被験体に由来する細胞を指す。自己細胞の被験体への導入は、これらの細胞が、さもなければ拒絶反応をもたらす免疫学的障壁を克服するため、有利である。
【０１９８】
「同種異系」という用語は、同じ種の異なる個体に由来するものを表すために使用される。１つ以上の遺伝子座の遺伝子が同一でない場合、２つ以上の個体は互いに同種異系であると言われる。
【０１９９】
「同系」という用語は、同一の遺伝子型を有する個体または組織、すなわち一卵性双生児もしくは同じ近交系の動物、またはそれらの組織もしくは細胞に由来するものを表すために使用される。
【０２００】
「異種」という用語は、複数の異なる要素からなるものを表すために使用される。一例として、ある個体の細胞を異なる個体に導入することは、異種移植を構成する。異種遺伝子とは、被験体以外の供給源に由来する遺伝子である。
【０２０１】
以下は、本発明の個々の特徴の特定のおよび／または好ましい変形を提供する。本発明はまた、本発明の２つ以上の特徴について記載される特定のおよび／または好ましい変形の２つ以上を組み合わせることによって生成される実施形態を、特に好ましい実施形態として企図する。
【０２０２】
ＲＮＡレプリコン
レプリカーゼ、好ましくはアルファウイルスレプリカーゼによって複製されることができる核酸構築物は、レプリコンと称される。本発明によれば、「レプリコン」という用語は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製され、ＤＮＡ中間体なしで、ＲＮＡレプリコンの１つまたは複数の同一または本質的に同一のコピーを生成することができるＲＮＡ分子を定義する。「ＤＮＡ中間体なしで」とは、ＲＮＡレプリコンのコピーを形成する過程で、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のコピーもしくはレプリコンの相補体が形成されないこと、および／またはＲＮＡレプリコンのコピーもしくはその相補体を形成する過程でデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子が鋳型として使用されないことを意味する。レプリカーゼの機能は、典型的には機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって提供される。
【０２０３】
本発明によれば、「複製することができる」および「複製可能である」という用語は一般に、核酸の１つ以上の同一または本質的に同一のコピーが調製できることを表す。「レプリカーゼ」という用語と共に使用される場合、例えば「レプリカーゼによって複製可能である」などにおいて、「複製することができる」および「複製可能である」という用語は、レプリカーゼに関する、核酸分子、例えばＲＮＡレプリコンの機能的特徴を表す。これらの機能的特徴は、（ｉ）レプリカーゼがレプリコンを認識できること、および（ｉｉ）レプリカーゼがＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）として作用できることの少なくとも１つを含む。好ましくは、レプリカーゼは、（ｉ）レプリコンを認識すること、および（ｉｉ）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとして作用することの両方が可能である。
【０２０４】
「認識できる」という表現は、レプリカーゼがレプリコンと物理的に結合できること、および好ましくは、レプリカーゼが、典型的には非共有結合的に、レプリコンに結合できることを表す。「結合」という用語は、レプリカーゼが保存された配列エレメント１（ＣＳＥ  １）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）、保存された配列エレメント２（ＣＳＥ  ２）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）、保存された配列エレメント３（ＣＳＥ  ３）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）、保存された配列エレメント４（ＣＳＥ  ４）またはその相補的配列（レプリコンに含まれる場合）のいずれか１つ以上に結合する能力を有することを意味し得る。好ましくは、レプリカーゼは、ＣＳＥ  ２［すなわち（＋）鎖］および／もしくはＣＳＥ  ４［すなわち（＋）鎖］に結合することができるか、またはＣＳＥ  １の相補体［すなわち（−）鎖］および／もしくはＣＳＥ  ３の相補体［すなわち（−）鎖］に結合することができる。
【０２０５】
「ＲｄＲＰとして作用できる」という表現は、レプリカーゼが、（＋）鎖ＲＮＡが鋳型機能を有する場合、アルファウイルスゲノム（＋）鎖ＲＮＡの（−）鎖相補体の合成を触媒できること、および／またはレプリカーゼが、（−）鎖ＲＮＡが鋳型機能を有する場合、（＋）鎖アルファウイルスゲノムＲＮＡの合成を触媒できることを意味する。一般に、「ＲｄＲＰとして作用できる」という表現には、レプリカーゼが、（−）鎖ＲＮＡが鋳型機能を有し、および（＋）鎖サブゲノム転写物の合成が、典型的にはアルファウイルスサブゲノムプロモータで開始される場合、（＋）鎖サブゲノム転写物の合成を触媒できることも含まれ得る。
【０２０６】
「結合できる」および「ＲｄＲＰとして作用できる」という表現は、通常の生理学的条件での能力を指す。特に、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するか、または機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされた細胞内の状態を指す。細胞は、好ましくは真核細胞である。結合の能力および／またはＲｄＲＰとして作用する能力は、例えば無細胞インビトロ系または真核細胞において、実験的に試験することができる。場合により、前記真核細胞は、レプリカーゼの起源である特定のアルファウイルスが感染性である種に由来する細胞である。例えば、ヒトに対して感染性である特定のアルファウイルス由来のアルファウイルスレプリカーゼが使用される場合、通常の生理学的条件はヒト細胞における条件である。より好ましくは、真核細胞（一例ではヒト細胞）は、レプリカーゼの起源である特定のアルファウイルスが感染性である同じ組織または器官に由来する。
【０２０７】
本発明によれば、「天然のアルファウイルス配列と比較して」および同様の用語は、天然のアルファウイルス配列の変異体である配列を指す。変異体は、典型的にはそれ自体が天然のアルファウイルス配列ではない。
【０２０８】
本発明のＲＮＡレプリコンは、５'複製認識配列を含む。５'複製認識配列は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって認識され得る核酸配列である。言い換えれば、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、５'複製認識配列を認識することができる。
【０２０９】
一実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは５'複製認識配列を含み、５'複製認識配列は、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。
【０２１０】
本発明による、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする５'複製認識配列は、本明細書では「修飾５'複製認識配列」または「本発明による５'複製認識配列」と称され得る。本明細書で以下に記載されるように、本発明による５'複製認識配列は、場合により１つ以上の追加のヌクレオチド変化の存在を特徴とし得る。
【０２１１】
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは３'複製認識配列を含む。３'複製認識配列は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって認識され得る核酸配列である。言い換えれば、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、３'複製認識配列を認識することができる。好ましくは、３'複製認識配列は、レプリコンの３'末端（レプリコンがポリ（Ａ）尾部を含まない場合）、またはポリ（Ａ）尾部のすぐ上流（レプリコンがポリ（Ａ）尾部を含む場合）に位置する。一実施形態では、３'複製認識配列は、ＣＳＥ  ４からなるかまたはＣＳＥ  ４を含む。
【０２１２】
一実施形態では、５'複製認識配列および３'複製認識配列は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で本発明によるＲＮＡレプリコンの複製を指令することができる。したがって、単独または好ましくは一緒に存在する場合、これらの認識配列は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下でＲＮＡレプリコンの複製を指令する。
【０２１３】
機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、シス（レプリコンのオープンリーディングフレームによって目的のタンパク質としてコードされる）またはトランス（第２の態様に記載されるように別のレプリカーゼ構築物のオープンリーディングフレームによって目的のタンパク質としてコードされる）で提供されることが好ましく、これは、レプリコンの場合により修飾された５'複製認識配列と３'複製認識配列の両方を認識することができる。一実施形態では、これは、５'複製認識配列および３'複製認識配列が機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然である場合、または３'複製認識配列が機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然であり、および修飾５'複製認識配列が機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然である５'複製認識配列の変異体である場合に達成される。天然とは、これらの配列の天然の起源が同じアルファウイルスであることを意味する。別の実施形態では、（修飾）５'複製認識配列および／または３'複製認識配列は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質がレプリコンの（修飾）５'複製認識配列と３'複製認識配列の両方を認識できることを条件として、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに天然ではない。言い換えれば、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、（修飾）５'複製認識配列および３'複製認識配列に適合性である。非天然の機能性アルファウイルス非構造タンパク質がそれぞれの配列または配列エレメントを認識できる場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は適合性であると言われる（交差ウイルス適合性）。機能性アルファウイルス非構造タンパク質と（３'／５'）複製認識配列およびＣＳＥとの任意の組合せは、それぞれ、交差ウイルス適合性が存在する限り可能である。交差ウイルス適合性は、ＲＮＡ複製に適した条件で、例えば適切な宿主細胞で、試験する機能性アルファウイルス非構造タンパク質を、試験する３'および（場合により修飾された）５'複製認識配列を有するＲＮＡと共にインキュベートすることにより、本発明に携わる当業者によって容易に試験することができる。複製が起こる場合、（３'／５'）複製認識配列と機能性アルファウイルス非構造タンパク質は適合性であると決定される。
【０２１４】
少なくとも１つの開始コドンの除去はいくつかの利点を有する。ｎｓＰ１＊をコードする核酸配列に開始コドンが存在しないことは、典型的にはｎｓＰ１＊（ｎｓＰ１のＮ末端断片）が翻訳されないことを引き起こす。さらに、ｎｓＰ１＊は翻訳されないため、目的のタンパク質（「導入遺伝子」）をコードするオープンリーディングフレームは、リボソームがアクセスできる最も上流のオープンリーディングフレームである；したがって、レプリコンが細胞に存在する場合、翻訳は、目的の遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＲＮＡ）の最初のＡＵＧで開始される。これは、Ｓｐｕｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２０１１，ｖｏｌ．８５，ｐｐ．４７３９−４７５１）によって記載されているような先行技術のトランスレプリコンを超える利点を示す：Ｓｐｕｕｌ  ｅｔ  ａｌ．によるレプリコンは、７４アミノ酸のペプチドであるｎｓＰ１のＮ末端部分の発現を指令する。また、特定の変異はＲＮＡを複製できなくすることがあり（国際公開第２０００／０５３７８０  Ａ２号）、アルファウイルスの複製に重要な５'構造の一部の除去は複製の効率に影響を及ぼす（Ｋａｍｒｕｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．９１，ｐｐ．１７２３−１７２７）ため、完全長ウイルスゲノムからのＲＮＡレプリコンの構築が些細な問題ではないことも先行技術から公知である。
【０２１５】
従来のシスレプリコンを超える利点は、少なくとも１つの開始コドンの除去が、５'複製認識配列からアルファウイルス非構造タンパク質のコード領域を切り離すことである。これは、例えば天然の５'複製認識配列を人工配列、変異配列、または別のＲＮＡウイルスから取得した異種配列に交換することによって、シスレプリコンのさらなる操作を可能にする。従来のシスレプリコンにおけるそのような配列操作は、ｎｓＰ１のアミノ酸配列によって制限されている。任意の点突然変異、または点突然変異のクラスタは、複製が影響を受けるかどうか、およびタンパク質への有害な作用のためにフレームシフト突然変異につながる小さな挿入または欠失が不可能であるかどうかを実験的に評価する必要がある。
【０２１６】
本発明による少なくとも１つの開始コドンの除去は、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって達成され得る。例えば、本発明によるレプリコンをコードする、すなわち開始コドンの除去を特徴とする適切なＤＮＡ分子をインシリコで設計し、その後インビトロで合成することができる（遺伝子合成）；あるいは、レプリコンをコードするＤＮＡ配列の部位特異的突然変異誘発によって適切なＤＮＡ分子を入手し得る。いずれの場合も、それぞれのＤＮＡ分子はインビトロ転写のための鋳型として働くことができ、それによって本発明によるレプリコンを提供する。
【０２１７】
天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較した少なくとも１つの開始コドンの除去は、特に限定されず、１つ以上のヌクレオチドの置換（ＤＮＡレベルでの開始コドンのＡおよび／またはＴおよび／またはＧの置換を含む）、１つ以上のヌクレオチドの欠失（ＤＮＡレベルでの開始コドンのＡおよび／またはＴおよび／またはＧの欠失を含む）、ならびに１つ以上のヌクレオチドの挿入（ＤＮＡレベルでの開始コドンのＡとＴの間および／またはＴとＧの間の１つ以上のヌクレオチドの挿入を含む）を含む任意のヌクレオチド修飾から選択され得る。ヌクレオチド修飾が置換、挿入または欠失であるかどうかにかかわらず、ヌクレオチド修飾は新しい開始コドンの形成をもたらしてはならない（説明のための例として：ＤＮＡレベルでの挿入はＡＴＧの挿入であってはならない）。
【０２１８】
少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列（すなわち本発明による修飾５'複製認識配列）は、好ましくは自然界で見出されるアルファウイルスのゲノムの５'複製認識配列の変異体である。一実施形態では、本発明による修飾５'複製認識配列は、好ましくは、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスのゲノムの５'複製認識配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする。
【０２１９】
一実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスの５'末端、すなわちアルファウイルスゲノムの５'末端の約２５０個のヌクレオチドに相同な配列を含む。好ましい実施形態では、前記５'複製認識配列は、アルファウイルスの５'末端、すなわちアルファウイルスゲノムの５'末端の約２５０〜５００個、好ましくは約３００〜５００個のヌクレオチドに相同な配列を含む。「アルファウイルスゲノムの５'末端」とは、アルファウイルスゲノムの最も上流のヌクレオチドから始まり、それを含む核酸配列を意味する。言い換えれば、アルファウイルスゲノムの最も上流のヌクレオチドはヌクレオチド番号１と呼称され、および例えば「アルファウイルスゲノムの５'末端の２５０個のヌクレオチド」とは、アルファウイルスゲノムのヌクレオチド１〜２５０を意味する。一実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスのゲノムの５'末端の少なくとも２５０個のヌクレオチドと８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする。少なくとも２５０個のヌクレオチドには、例えば２５０個のヌクレオチド、３００個のヌクレオチド、４００個のヌクレオチド、５００個のヌクレオチドが含まれる。
【０２２０】
自然界で見出されるアルファウイルスの５'複製認識配列は、典型的には少なくとも１つの開始コドンおよび／または保存された二次構造モチーフを特徴とする。例えば、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）の天然の５'複製認識配列は、５つの特定のＡＵＧ塩基トリプレットを含む。Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，ＲＮＡ，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１６３８−１６５１）によれば、ＭＦＯＬＤによる分析は、セムリキ森林ウイルスの天然の５'複製認識配列が、ステムループ１〜４（ＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４）と称される４つのステムループ（ＳＬ）を形成すると予測されることを明らかにした。Ｆｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．によれば、ＭＦＯＬＤによる分析は、異なるアルファウイルスであるシンドビスウイルスの天然の５'複製認識配列も、４つのステムループ：ＳＬ１、ＳＬ２、ＳＬ３、ＳＬ４を形成すると予測されることを明らかにした。
【０２２１】
アルファウイルスゲノムの５'末端には、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によるアルファウイルスゲノムの複製を可能にする配列エレメントが含まれることは公知である。本発明の一実施形態では、ＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスの保存された配列エレメント１（ＣＳＥ  １）に相同な配列および／または保存された配列エレメント２（ＣＳＥ  ２）に相同な配列を含む。
【０２２２】
アルファウイルスゲノムＲＮＡの保存された配列エレメント２（ＣＳＥ  ２）は、典型的には、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１の最初のアミノ酸残基をコードする天然の開始コドンを少なくとも含むＳＬ２が先行するＳＬ３およびＳＬ４で表される。しかし、この説明において、いくつかの実施形態では、アルファウイルスゲノムＲＮＡの保存された配列エレメント２（ＣＳＥ  ２）は、ＳＬ２からＳＬ４にまたがり、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓＰ１の最初のアミノ酸残基をコードする天然の開始コドンを含む領域を指す。好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、ＣＳＥ  ２またはＣＳＥ  ２に相同な配列を含む。一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、好ましくは、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスのＣＳＥ  ２の配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする、ＣＳＥ  ２に相同な配列を含む。
【０２２３】
好ましい実施形態では、５'複製認識配列は、アルファウイルスのＣＳＥ  ２に相同な配列を含む。アルファウイルスのＣＳＥ  ２は、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの断片を含み得る。
【０２２４】
したがって、好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列を含むことを特徴とする。非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、典型的には自然界で見出されるアルファウイルスの非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片の変異体である。一実施形態では、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、好ましくは、自然界で見出される少なくとも１つのアルファウイルスの非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の配列同一性の程度を特徴とする。
【０２２５】
より好ましい実施形態では、本発明のレプリコンに含まれる非構造タンパク質のオープンリーディングフレームに相同な配列は、非構造タンパク質の天然の開始コドンを含まず、より好ましくは非構造タンパク質のいかなる開始コドンも含まない。好ましい実施形態では、ＣＳＥ  ２に相同な配列は、天然のアルファウイルスＣＳＥ  ２配列と比較して、すべての開始コドンが除去されていることを特徴とする。したがって、ＣＳＥ  ２に相同な配列は、好ましくはいかなる開始コドンも含まない。
【０２２６】
オープンリーディングフレームに相同な配列がいかなる開始コドンも含まない場合、オープンリーディングフレームに相同な配列は、翻訳の鋳型として機能しないため、それ自体オープンリーディングフレームではない。
【０２２７】
一実施形態では、５'複製認識配列は、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列を含み、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、天然のアルファウイルス配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を含むことを特徴とする。
【０２２８】
好ましい実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、少なくとも非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然開始コドンの除去を含むことを特徴とする。好ましくは、前記配列は、少なくともｎｓＰ１をコードするオープンリーディングフレームの天然開始コドンの除去を含むことを特徴とする。
【０２２９】
天然の開始コドンは、宿主細胞にＲＮＡが存在する場合に宿主細胞のリボソームでの翻訳が始まるＡＵＧ塩基トリプレットである。言い換えれば、天然の開始コドンは、例えば天然の開始コドンを含むＲＮＡが接種された宿主細胞において、リボソームタンパク質合成中に翻訳される最初の塩基トリプレットである。一実施形態では、宿主細胞は、天然のアルファウイルス５'複製認識配列を含む特定のアルファウイルスの天然宿主である真核生物種由来の細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手可能な細胞株「ＢＨＫ２１［Ｃ１３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ１０（商標））」由来のＢＨＫ２１細胞である。
【０２３０】
多くのアルファウイルスのゲノムは完全に配列決定されて、公開されており、また、これらのゲノムによってコードされる非構造タンパク質の配列も公開されている。そのような配列情報により、天然の開始コドンをインシリコで決定することができる。
【０２３１】
一実施形態では、天然の開始コドンは、コザック配列または機能的に等価な配列に含まれる。コザック配列は、Ｋｏｚａｋ（１９８７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．１５，ｐｐ．８１２５−８１４８）によって最初に記述された配列である。ｍＲＮＡ分子上のコザック配列は、翻訳開始部位としてリボソームによって認識される。この参考文献によれば、コザック配列はＡＵＧ開始コドンを含み、すぐ後に高度に保存されたＧヌクレオチドが続く：ＡＵＧＧ。本発明の一実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、コザック配列の一部である開始コドンの除去を含むことを特徴とする。
【０２３２】
本発明の一実施形態では、レプリコンの５'複製認識配列は、ＲＮＡレベルでＡＵＧＧ配列の一部である少なくともすべての開始コドンの除去を特徴とする。
【０２３３】
好ましい実施形態では、アルファウイルス由来の非構造タンパク質のオープンリーディングフレームまたはその断片に相同な配列は、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然開始コドン以外の１つ以上の開始コドンの除去を含むことを特徴とする。より好ましい実施形態では、前記核酸配列は、天然開始コドンの除去をさらに特徴とする。例えば、天然開始コドンの除去に加えて、任意の１つまたは２つまたは３つまたは４つまたは４つより多い（例えば５つ）開始コドンが除去されていてもよい。
【０２３４】
レプリコンが、非構造タンパク質のオープンリーディングフレームの天然開始コドンの除去、および場合により天然開始コドン以外の１つ以上の開始コドンの除去を特徴とする場合、オープンリーディングフレームに相同な配列は、翻訳のための鋳型として働かないため、それ自体はオープンリーディングフレームではない。
【０２３５】
好ましくは天然開始コドンの除去に加えて、除去される天然開始コドン以外の１つ以上の開始コドンは、好ましくは翻訳を開始する可能性を有するＡＵＧ塩基トリプレットから選択される。翻訳を開始する可能性を有するＡＵＧ塩基トリプレットは、「潜在的な開始コドン」と称され得る。所与のＡＵＧ塩基トリプレットが翻訳を開始する可能性を有するかどうかは、インシリコまたは細胞ベースのインビトロアッセイで決定することができる。
【０２３６】
一実施形態では、所与のＡＵＧ塩基トリプレットが翻訳を開始する可能性を有するかどうかはインシリコで決定される：その実施形態では、ヌクレオチド配列を調べて、ＡＵＧ塩基トリプレットがＡＵＧＧ配列、好ましくはコザック配列の一部である場合、翻訳を開始する可能性を有すると決定される。
【０２３７】
一実施形態では、細胞ベースのインビトロアッセイにおいて、所与のＡＵＧ塩基トリプレットが翻訳を開始する可能性を有するかどうかが決定される：天然開始コドンの除去を特徴とし、天然開始コドンの除去位置の下流に所与のＡＵＧ塩基トリプレットを含むＲＮＡレプリコンが宿主細胞に導入される。一実施形態では、宿主細胞は、天然のアルファウイルス５'複製認識配列を含む特定のアルファウイルスの天然宿主である真核生物種由来の細胞である。好ましい実施形態では、宿主細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ，ＵＳＡから入手可能な細胞株「ＢＨＫ２１［Ｃ１３］（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ１０（商標））」由来のＢＨＫ２１細胞である。天然開始コドンの除去位置と所与のＡＵＧ塩基トリプレットとの間にさらなるＡＵＧ塩基トリプレットが存在しないことが好ましい。天然開始コドンの除去を特徴とし、所与のＡＵＧ塩基トリプレットを含むＲＮＡレプリコンの宿主細胞への移入後に、所与のＡＵＧ塩基トリプレットで翻訳が開始される場合、所与のＡＵＧ塩基トリプレットは翻訳を開始する可能性を有すると決定される。翻訳が開始されるかどうかは、当技術分野で公知の任意の適切な方法によって決定され得る。例えば、レプリコンは、所与のＡＵＧ塩基トリプレットの下流におよび所与のＡＵＧ塩基トリプレットとインフレームで、翻訳産物（存在する場合）の検出を容易にするタグ、例えばｍｙｃタグまたはＨＡタグをコードし得る；コードされたタグを有する発現産物が存在するかどうかは、例えばウェスタンブロットによって決定され得る。この実施形態では、所与のＡＵＧ塩基トリプレットとタグをコードする核酸配列との間にさらなるＡＵＧ塩基トリプレットが存在しないことが好ましい。細胞ベースのインビトロアッセイは、複数の所与のＡＵＧ塩基トリプレットについて個別に実施することができる：各々の場合に、天然開始コドンの除去位置と所与のＡＵＧ塩基トリプレットとの間にさらなるＡＵＧ塩基トリプレットが存在しないことが好ましい。これは、天然開始コドンの除去位置と所与のＡＵＧ塩基トリプレットとの間にあるすべてのＡＵＧ塩基トリプレット（存在する場合）を除去することによって達成され得る。それによって、所与のＡＵＧ塩基トリプレットは、天然開始コドンの除去位置の下流の最初のＡＵＧ塩基トリプレットになる。
【０２３８】
好ましくは、本発明によるレプリコンは、天然開始コドンの除去位置の下流にあり、アルファウイルス非構造タンパク質またはその断片のオープンリーディングフレーム内に位置するすべての潜在的な開始コドンの除去を特徴とする。したがって、本発明によれば、５'複製認識配列は、好ましくはタンパク質に翻訳され得るオープンリーディングフレームを含まない。
【０２３９】
好ましい実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５'複製認識配列の二次構造に等しい二次構造を特徴とする。好ましい実施形態では、本発明によるＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルスゲノムＲＮＡの５'複製認識配列の予測二次構造に等しい予測二次構造を特徴とする。本発明によれば、ＲＮＡ分子の二次構造は、好ましくはＲＮＡ二次構造予測のためのウェブサーバ、ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅＷｅｂ／Ｓｅｒｖｅｒｓ／Ｐｒｅｄｉｃｔ１／Ｐｒｅｄｉｃｔ１．ｈｔｍｌによって予測される。
【０２４０】
天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの５'複製認識配列の二次構造または予測二次構造を比較することによって、ヌクレオチド対合破壊の有無を同定することができる。例えば、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して、少なくとも１つの塩基対、例えばステムループ内、特にステムループのステム内の塩基対が所与の位置に存在しない場合がある。
【０２４１】
好ましい実施形態では、５'複製認識配列の１つ以上のステムループは欠失または破壊されない。より好ましくは、ステムループ３および４は欠失または破壊されない。より好ましくは、５'複製認識配列のステムループのいずれも欠失または破壊されない。
【０２４２】
一実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去は、５'複製認識配列の二次構造を破壊しない。代替的な実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去は、５'複製認識配列の二次構造を破壊する。この実施形態では、少なくとも１つの開始コドンの除去は、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して、所与の位置の少なくとも１つの塩基対、例えばステムループ内の塩基対の不在の原因となり得る。天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して、ステムループ内に塩基対が存在しない場合、少なくとも１つの開始コドンの除去は、ステムループ内にヌクレオチド対合破壊を導入すると決定される。ステムループ内の塩基対は、典型的にはステムループのステム内の塩基対である。
【０２４３】
好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１つの開始コドンの除去によって導入された１つ以上のステムループ内のヌクレオチド対合破壊を補償する１つ以上のヌクレオチド変化を含む。
【０２４４】
少なくとも１つの開始コドンの除去が、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して、ステムループ内にヌクレオチド対合破壊を導入する場合、ヌクレオチド対合破壊を補償すると予想される１つ以上のヌクレオチド変化を導入してもよく、それによって得られる二次構造または予測二次構造を天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較し得る。
【０２４５】
共通の一般的知識および本明細書の開示に基づいて、特定のヌクレオチド変化は、当業者によって、ヌクレオチド対合破壊を補償すると予想され得る。例えば、天然のアルファウイルス５'複製認識配列と比較して、少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするＲＮＡレプリコンの所与の５'複製認識配列の二次構造または予測二次構造の所与の位置で塩基対が破壊された場合、好ましくは開始コドンを再導入することなく、その位置で塩基対を復元するヌクレオチド変化は、ヌクレオチド対合破壊を補償すると予想される。
【０２４６】
好ましい実施形態では、レプリコンの５'複製認識配列は、翻訳可能な核酸配列、すなわちペプチドまたはタンパク質、特にｎｓＰ、特にｎｓＰ１、またはそのいずれかの断片に翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。ヌクレオチド配列が「翻訳可能」であるためには、開始コドンの存在を必要とする；開始コドンは、ペプチドまたはタンパク質の最もＮ末端側のアミノ酸残基をコードする。一実施形態では、レプリコンの５'複製認識配列は、ｎｓＰ１のＮ末端断片をコードする翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。
【０２４７】
以下で詳細に説明するいくつかの状況では、ＲＮＡレプリコンは少なくとも１つのサブゲノムプロモータを含む。好ましい実施形態では、レプリコンのサブゲノムプロモータは、翻訳可能な核酸配列、すなわちペプチドまたはタンパク質、特にｎｓＰ、特にｎｓＰ４、またはそのいずれかの断片に翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。一実施形態では、レプリコンのサブゲノムプロモータは、ｎｓＰ４のＣ末端断片をコードする翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まない。翻訳可能な核酸配列、例えばｎｓＰ４のＣ末端断片に翻訳可能な核酸配列と重複しないか、またはそれを含まないサブゲノムプロモータを有するＲＮＡレプリコンは、ｎｓＰ４のコード配列の一部分（典型的にはｎｓＰ４のＮ末端部分をコードする部分）を欠失させることによって、および／または欠失されていないｎｓＰ４のコード配列の一部分のＡＵＧ塩基トリプレットを除去することによって生成され得る。ｎｓＰ４のコード配列またはその一部分のＡＵＧ塩基トリプレットが除去される場合、除去されるＡＵＧ塩基トリプレットは、好ましくは潜在的な開始コドンである。あるいは、サブゲノムプロモータがｎｓＰ４をコードする核酸配列と重複しない場合、ｎｓＰ４をコードする核酸配列全体を欠失させてもよい。
【０２４８】
一実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、トランケートされたアルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まない。この実施形態の文脈において、ＲＮＡレプリコンがｎｓＰ１のＮ末端断片をコードするオープンリーディングフレームを含まないこと、および場合によりｎｓＰ４のＣ末端断片をコードするオープンリーディングフレームを含まないことが特に好ましい。ｎｓＰ１のＮ末端断片は、トランケートされたアルファウイルスタンパク質である；ｎｓＰ４のＣ末端断片も、トランケートされたアルファウイルスタンパク質である。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは、アルファウイルスのゲノムの５'末端のステムループ２（ＳＬ２）を含まない。上記のＦｒｏｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．によれば、ステムループ２は、ＣＳＥ  ２の上流の、アルファウイルスのゲノムの５'末端に見出される保存された二次構造であるが、複製には不要である。
【０２５０】
一実施形態では、レプリコンの５'複製認識配列は、アルファウイルス非構造タンパク質またはその断片をコードする核酸配列と重複しない。したがって、本発明は、場合により１つ以上のアルファウイルス非構造タンパク質またはその一部のコード領域の欠失と組み合わせて、ゲノムアルファウイルスＲＮＡと比較して本明細書に記載の少なくとも１つの開始コドンの除去を特徴とするレプリコンを包含する。例えば、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３のコード領域を欠失させてもよく、またはｎｓＰ２およびｎｓＰ３のコード領域を、ｎｓＰ１のＣ末端断片のコード領域および／もしくはｎｓＰ４のＮ末端断片のコード領域と共に欠失させてもよく、ならびに１つ以上の残存する、すなわち前記除去後に残存する開始コドンを、本明細書に記載のように除去してもよい。
【０２５１】
１つ以上のアルファウイルス非構造タンパク質のコード領域の欠失は、標準的な方法、例えばＤＮＡレベルで、制限酵素、好ましくはオープンリーディングフレーム内の固有の制限部位を認識する制限酵素を使用した除去によって達成され得る。場合により、固有の制限部位を、突然変異誘発、例えば部位特異的突然変異誘発によってオープンリーディングフレームに導入してもよい。それぞれのＤＮＡは、インビトロ転写のための鋳型として使用し得る。
【０２５２】
制限部位は、特定の制限酵素による、制限部位が含まれる核酸分子、例えばＤＮＡ分子の制限（切断）を指令するのに必要かつ十分な核酸配列、例えばＤＮＡ配列である。制限部位の１コピーが核酸分子内に存在する場合、制限部位は所与の核酸分子に固有である。
【０２５３】
制限酵素は、核酸分子、例えばＤＮＡ分子を制限部位でまたはその近くで切断するエンドヌクレアーゼである。
【０２５４】
あるいは、オープンリーディングフレームの一部または全部の欠失を特徴とする核酸配列は、合成法によって入手し得る。
【０２５５】
本発明によるＲＮＡレプリコンは、好ましくは一本鎖ＲＮＡ分子である。本発明によるＲＮＡレプリコンは、典型的には（＋）鎖ＲＮＡ分子である。一実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、単離された核酸分子である。
【０２５６】
Ｔ細胞受容体および人工Ｔ細胞受容体
Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームを含む本明細書に記載のＲＮＡレプリコンは、細胞、特にＴ細胞などの免疫エフェクター細胞においてＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現させるのに有用である。そのようなＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現するように操作された細胞は、被験体において免疫応答を提供するのに有用であり、特に、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体が標的とする抗原の発現を特徴とする疾患の治療に有用である。
【０２５７】
「免疫応答」という用語は、抗原に対する統合された身体的応答を指し、細胞性免疫応答を含む。免疫応答は、保護的／防御的／予防的および／または治療的であり得る。
【０２５８】
「細胞性免疫応答」または同様の用語は、抗原の発現を特徴とする、特にクラスＩまたはクラスＩＩ  ＭＨＣによる抗原の提示を特徴とする細胞に対する細胞性応答を含むことが意図されている。細胞性応答は、「ヘルパー」または「キラー」のいずれかとして働くＴ細胞またはＴリンパ球と呼ばれる細胞に関連する。ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞とも称される）は、免疫応答を調節することによって中心的な役割を果たし、キラー細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＴＬとも称される）は、癌細胞などの疾患細胞を死滅させ、さらなる疾患細胞の産生を防止する。
【０２５９】
「抗原」という用語は、免疫応答が生成されるおよび／または向けられるエピトープを含む作用物質に関する。好ましくは、本発明の文脈における抗原は、場合によりプロセシング後に、好ましくは抗原または、好ましくは細胞表面に、抗原を発現する細胞に特異的な免疫反応の標的である分子である。「抗原」という用語には、特にタンパク質およびペプチドが含まれる。抗原は、好ましくは、天然に存在する抗原に対応するまたは由来する生成物である。そのような天然に存在する抗原は、ウイルス、細菌、真菌、寄生生物ならびに他の感染性因子および病原体を含んでもよくもしくはそれらに由来してもよく、または抗原は腫瘍抗原であってもよい。本発明によれば、抗原は、天然に存在する生成物、例えばウイルスタンパク質、またはその一部に対応し得る。
【０２６０】
「細胞表面」は、当技術分野におけるその通常の意味に従って使用され、したがってタンパク質および他の分子による結合にアクセス可能な細胞の外側を含む。抗原は、それが細胞の表面に位置し、細胞に加えられた抗原特異的抗体などの抗原結合分子による結合にアクセス可能である場合、前記細胞の表面に発現される。一実施形態では、細胞の表面に発現される抗原は、細胞外部分を有する内在性膜タンパク質である。抗原受容体（Ｔ細胞受容体および人工Ｔ細胞受容体を含む）は、細胞の表面に位置し、細胞に加えられたその標的への結合に利用可能である場合、前記細胞の表面に発現される。一実施形態では、細胞の表面に発現される抗原受容体は、標的を認識する細胞外部分を有する内在性膜タンパク質である。
【０２６１】
本発明の文脈における「細胞外部分」または「エクトドメイン」という用語は、細胞の細胞外空間に面しており、好ましくは、例えば細胞の外側に位置する抗体などの分子に結合することによって前記細胞の外側からアクセス可能であるタンパク質などの分子の一部を指す。好ましくは、この用語は、１つ以上の細胞外ループもしくはドメインまたはその断片を指す。
【０２６２】
「標的」とは、細胞性免疫応答などの免疫応答の標的である細胞などの作用物質を意味する。標的細胞には、癌細胞または感染細胞などの望ましくない細胞が含まれる。好ましい実施形態では、標的細胞は、好ましくは細胞表面に存在するかまたはＭＨＣ分子に関連して提示される標的抗原、特に疾患特異的抗原を発現する細胞である。
【０２６３】
「エピトープ」という用語は、抗原などの分子中の抗原決定基、すなわち免疫系によって認識される、すなわち結合される、例えば抗体または抗原受容体によって認識される分子の一部または断片を指す。例えば、エピトープは、免疫系によって認識される、抗原上の別個の三次元部位である。エピトープは通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、通常は特定の三次元構造特性および特定の電荷特性を有する。立体配座エピトープと非立体配座エピトープは、変性溶媒の存在下では前者への結合が失われ、後者への結合は失われないという点で区別される。腫瘍抗原などのタンパク質のエピトープは、好ましくは前記タンパク質の連続または不連続部分を含み、好ましくは５〜１００、好ましくは５〜５０、より好ましくは８〜３０、最も好ましくは１０〜２５アミノ酸長であり、例えばエピトープは、好ましくは９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５アミノ酸長であり得る。
【０２６４】
本発明の一実施形態では、エピトープはＴ細胞エピトープである。Ｔ細胞エピトープは、特にＭＨＣ分子（ＭＨＣクラスＩまたはクラスＩＩ分子）に関連して提示される場合、Ｔ細胞受容体によって認識される（すなわち特異的に結合する）、抗原プロセシングによって生成される抗原の一部であり、したがってＭＨＣ結合ペプチドである。
【０２６５】
「抗原プロセシング」とは、抗原の断片であるプロセシング産物への前記抗原の分解（例えばタンパク質のペプチドへの分解）、ならびに細胞による、好ましくは抗原提示細胞による特定のＴ細胞への提示のためのＭＨＣ分子とこれらの断片の１つ以上との会合（例えば結合による）を指す。
【０２６６】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、その表面に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に関連して抗原を表示する細胞である。Ｔ細胞は、そのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用してこの複合体を認識し得る。抗原提示細胞は抗原をプロセシングし、Ｔ細胞に提示する。本発明によれば、「抗原提示細胞」という用語は、プロフェッショナル抗原提示細胞およびノンプロフェッショナル抗原提示細胞を含む。
【０２６７】
プロフェッショナル抗原提示細胞は、食作用または受容体媒介エンドサイトーシスのいずれかによって抗原をインターナライズし、次いでクラスＩＩ  ＭＨＣ分子に結合した抗原の断片をその膜上に表示するのに非常に効率的である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上の抗原−クラスＩＩ  ＭＨＣ分子複合体を認識し、それと相互作用する。次に、追加の共刺激シグナルが抗原提示細胞によって生成され、Ｔ細胞の活性化をもたらす。共刺激分子の発現は、プロフェッショナル抗原提示細胞の決定的な特徴である。プロフェッショナル抗原提示細胞の主な種類は、最も広範囲の抗原提示を有し、おそらく最も重要な抗原提示細胞である樹状細胞、マクロファージ、Ｂ細胞、および特定の活性化上皮細胞である。
【０２６８】
ノンプロフェッショナル抗原提示細胞は、ナイーブＴ細胞との相互作用に必要なＭＨＣクラスＩＩタンパク質を構成的には発現しない；これらは、ＩＦＮγなどの特定のサイトカインによってノンプロフェッショナル抗原提示細胞が刺激されたときにのみ発現される。
【０２６９】
樹状細胞（ＤＣ）は、末梢組織中で捕捉された抗原を、ＭＨＣクラスＩＩおよびＩの両方の抗原提示経路によってＴ細胞に提示する白血球集団である。樹状細胞は免疫応答の強力な誘導因子であり、これらの細胞の活性化が抗腫瘍免疫の誘導の重要な工程であることは周知である。樹状細胞および前駆細胞は、末梢血、骨髄、腫瘍浸潤細胞、腫瘍周囲組織浸潤細胞、リンパ節、脾臓、皮膚、臍帯血、または他の任意の適切な組織もしくは体液から入手し得る。例えば、樹状細胞は、末梢血から採取した単球の培養物にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１３および／またはＴＮＦａなどのサイトカインの組合せを添加することによってエクスビボで分化させ得る。あるいは、末梢血、臍帯血または骨髄から採取したＣＤ３４陽性細胞を、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３、ＴＮＦα、ＣＤ４０リガンド、ＬＰＳ、ｆｌｔ３リガンドならびに／または樹状細胞の分化、成熟および増殖を誘導する他の化合物（１つもしくは複数）の組合せを培地に添加することによって、樹状細胞に分化させ得る。樹状細胞は、好都合には「未成熟」細胞および「成熟」細胞として分類され、これらは、よく特徴付けられた２つの表現型を区別する簡単な方法として使用することができる。しかし、この命名法は、分化のすべての可能な中間段階を排除すると解釈されるべきではない。未成熟樹状細胞は、Ｆｃγ受容体およびマンノース受容体の高発現と相関する、抗原取り込みおよびプロセシングの高い能力を有する抗原提示細胞として特徴付けられる。成熟表現型は、典型的には、これらのマーカーの発現はより低いが、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えばＣＤ５４およびＣＤ１１）ならびに共刺激分子（例えばＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６および４−１  ＢＢ）などのＴ細胞活性化に関与する細胞表面分子の発現が高いことを特徴とする。樹状細胞の成熟は、そのような抗原提示樹状細胞がＴ細胞プライミングを引き起こす樹状細胞活性化の状態と称され、一方未成熟樹状細胞による提示は寛容をもたらす。樹状細胞の成熟は、主に、生得的受容体によって検出される微生物特徴を有する生体分子（細菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、エンドトキシン等）、炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＦＮ）、ＣＤ４０Ｌによる樹状細胞表面のＣＤ４０の連結、およびストレスによる細胞死を受けている細胞から放出される物質によって引き起こされる。樹状細胞は、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および腫瘍壊死因子αなどのサイトカインと共にインビトロで骨髄細胞を培養することによって得ることができる。
【０２７０】
Ｔ細胞は、リンパ球として公知の白血球の群に属し、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たす。これらは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）と呼ばれるこれらの細胞表面上の特別な受容体の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞などの他の種類のリンパ球と区別することができる。胸腺は、Ｔ細胞の成熟に関与する主要な器官である。それぞれ別個の機能を有する、Ｔ細胞のいくつかの異なるサブセットが発見されている。
【０２７１】
Ｔヘルパー細胞は、数ある機能の中でも特に、Ｂ細胞の形質細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的過程で他の白血球を補助する。これらの細胞は、その表面にＣＤ４タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても公知である。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原と共に提示された場合に活性化される。ひとたび活性化されると、これらは速やかに分裂し、能動免疫応答を調節または補助するサイトカインと呼ばれる小さなタンパク質を分泌する。
【０２７２】
細胞傷害性Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶反応にも関与する。これらの細胞は、その表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても公知である。これらの細胞は、身体のほぼあらゆる細胞の表面上に存在する、ＭＨＣクラスＩに関連する抗原に結合することによってその標的を認識する。
【０２７３】
Ｔ細胞の大部分は、いくつかのタンパク質の複合体として存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。実際のＴ細胞受容体は、独立したＴ細胞受容体アルファおよびベータ（ＴＣＲαおよびＴＣＲβ）遺伝子から生成され、α−ＴＣＲ鎖およびβ−ＴＣＲ鎖と呼ばれる２本の別個のペプチド鎖からなる。γδ  Ｔ細胞（ガンマデルタＴ細胞）は、その表面に異なるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するＴ細胞の小さなサブセットである。しかし、γδ  Ｔ細胞では、ＴＣＲは１本のγ鎖と１本のδ鎖で構成される。このＴ細胞の群は、αβ  Ｔ細胞よりもはるかにまれである（全Ｔ細胞の２％）。
【０２７４】
Ｔ細胞受容体の各々の鎖は、２つの細胞外ドメイン：可変（Ｖ）領域および定常（Ｃ）領域からなる。定常領域は細胞膜に近接しており、その後に膜貫通領域および短い細胞質尾部が続くが、可変領域はペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する。本発明の目的のために、「Ｔ細胞受容体鎖の定常領域またはその一部」という用語は、Ｔ細胞受容体鎖の定常領域（Ｎ末端からＣ末端まで）の後に、Ｔ細胞受容体鎖の定常領域に天然に連結されている膜貫通領域および細胞質尾部などの膜貫通領域および細胞質尾部が続く実施形態も含む。
【０２７５】
すべてのＴ細胞は、骨髄の造血幹細胞に由来する。造血幹細胞に由来する造血前駆細胞は胸腺に存在し、細胞分裂によって拡大して未成熟な胸腺細胞の大きな集団を生じる。最初期の胸腺細胞はＣＤ４もＣＤ８も発現しないため、二重陰性（ＣＤ４−ＣＤ８−）細胞として分類される。発達が進むにつれて、それらは二重陽性胸腺細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）になり、最終的に胸腺から末梢組織に放出される単一陽性（ＣＤ４＋ＣＤ８−またはＣＤ４−ＣＤ８＋）胸腺細胞に成熟する。
【０２７６】
Ｔ細胞の活性化における最初のシグナルは、Ｔ細胞受容体が別の細胞上の主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）によって提示される短いペプチドに結合することによって提供される。これは、そのペプチドに特異的なＴＣＲを有するＴ細胞のみが活性化されることを確実にする。パートナー細胞は通常、プロフェッショナル抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり、ナイーブ応答の場合は通常樹状細胞であるが、Ｂ細胞およびマクロファージは重要なＡＰＣであり得る。ＭＨＣクラスＩ分子によってＣＤ８＋Ｔ細胞に提示されるペプチドは８〜１０アミノ酸長である；ＭＨＣクラスＩＩ分子の結合溝の末端は開いているため、ＭＨＣクラスＩＩ分子によってＣＤ４＋Ｔ細胞に提示されるペプチドはより長い。
【０２７７】
ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の特異的活性化は、様々な方法で検出し得る。特異的Ｔ細胞活性化を検出する方法には、Ｔ細胞の増殖、サイトカイン（例えばリンホカイン）の産生、または細胞溶解活性の生成を検出することが含まれる。ＣＤ４＋Ｔ細胞の場合、特異的Ｔ細胞活性化を検出する好ましい方法は、Ｔ細胞の増殖の検出である。ＣＤ８＋Ｔ細胞の場合、特異的Ｔ細胞活性化を検出する好ましい方法は、細胞溶解活性の生成の検出である。
【０２７８】
Ｔ細胞は一般に、標準的な手順を使用して、インビトロまたはエクスビボで調製し得る。例えば、Ｔ細胞は、市販の細胞分離システムを使用して、患者などの哺乳動物の骨髄、末梢血または骨髄もしくは末梢血の画分から単離し得る。あるいは、Ｔ細胞は、血縁関係にあるヒトもしくは血縁関係のないヒト、非ヒト動物、細胞株または培養物に由来してもよい。Ｔ細胞を含む試料は、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であり得る。
【０２７９】
Ｔ細胞受容体のα鎖およびβ鎖をコードする核酸は、別々の核酸分子、すなわちＲＮＡレプリコンに含まれ得るか、または単一の核酸分子に含まれ得る。したがって、細胞におけるＴ細胞受容体の発現には、異なるＴ細胞受容体鎖をコードする別々の核酸分子の同時トランスフェクション、または異なるＴ細胞受容体鎖をコードする１種類のみの核酸分子のトランスフェクションが必要である。
【０２８０】
「主要組織適合遺伝子複合体」という用語および「ＭＨＣ」という略語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ分子を含み、すべての脊椎動物で生じる遺伝子の複合体に関する。ＭＨＣタンパク質または分子は、免疫反応におけるリンパ球と抗原提示細胞または疾患細胞との間のシグナル伝達に重要であり、ＭＨＣタンパク質または分子はペプチドに結合し、Ｔ細胞受容体による認識のためにそれらを提示する。ＭＨＣによってコードされるタンパク質は、細胞の表面に発現され、Ｔ細胞に対して自己抗原（細胞自体からのペプチド断片）と非自己抗原（例えば侵入微生物の断片）の両方を表示する。
【０２８１】
ＭＨＣ領域は、クラスＩ、クラスＩＩおよびクラスＩＩＩの３つのサブグループに分けられる。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、α鎖およびβ２ミクログロブリン（１５番染色体によってコードされるＭＨＣの一部ではない）を含む。それらは、抗原断片を細胞傷害性Ｔ細胞に提示する。ほとんどの免疫系細胞、特に抗原提示細胞では、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質はα鎖とβ鎖を含み、抗原断片をＴヘルパー細胞に提示する。ＭＨＣクラスＩＩＩ領域は、補体成分およびサイトカインをコードするものなどの他の免疫成分をコードする。
【０２８２】
ヒトでは、細胞表面の抗原提示タンパク質をコードするＭＨＣ領域の遺伝子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）遺伝子と称される。しかし、ＭＨＣという略語は、しばしばＨＬＡ遺伝子産物を指すために使用される。本発明のすべての態様の好ましい一実施形態では、ＭＨＣ分子はＨＬＡ分子である。
【０２８３】
Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞にモノクローナル抗体の特異性などの任意の特異性を付与する操作された受容体が生産されている。このようにして、養子細胞移入のために多数の抗原特異的Ｔ細胞を生成することができる。本発明によるそのような操作された抗原受容体は、例えばＴ細胞自身のＴ細胞受容体の代わりにまたはそれに加えて、Ｔ細胞上に存在することができ、そのようなＴ細胞は、標的細胞の認識のために抗原のプロセシングおよび提示を必ずしも必要とせず、むしろ、標的細胞上に存在する任意の抗原を好ましくは特異的に認識し得る。本発明によれば、「抗原受容体」という用語は、癌細胞などの標的細胞上の標的構造体（例えば抗原）を認識し、すなわち結合し（例えば標的細胞の表面に発現される抗原への抗原結合部位または抗原結合ドメインの結合によって）、細胞表面に前記抗原受容体を発現するＴ細胞などの免疫エフェクター細胞に特異性を付与し得る、単一分子または分子の複合体を含む人工受容体を含む。好ましくは、抗原受容体による標的構造体の認識は、前記抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞の活性化をもたらす。抗原受容体は、本明細書に記載の１つ以上のドメインを含む１つ以上のタンパク質ユニットを含み得る。一実施形態では、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、ＣＤ３−ζ膜貫通およびエンドドメインに融合される。そのような分子は、標的細胞上のその抗原標的のｓｃＦｖによる認識に応答してζシグナルの伝達および標的抗原を発現する標的細胞の死滅をもたらす。
【０２８４】
本発明によれば、「人工受容体」または「人工Ｔ細胞受容体」という用語は、好ましくは「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」および「キメラＴ細胞受容体」という用語と同義である。
【０２８５】
本発明によれば、人工Ｔ細胞受容体は、一般に抗原結合ドメインおよびＴ細胞シグナル伝達ドメインを含み得る。
【０２８６】
結合ドメインまたは抗原結合ドメインは、抗原を認識して結合する。一実施形態では、抗原結合ドメインは、人工Ｔ細胞受容体のエキソドメインに含まれる。本発明によれば、抗原は、異なるペプチド鎖上に存在し得る抗体およびＴ細胞受容体の抗原結合部分を介してなどの、抗原結合部位を形成することができる任意の抗原結合ドメインを介して抗原受容体によって認識され得る。一実施形態では、抗原結合部位を形成する２つのドメインは免疫グロブリンに由来する。別の実施形態では、抗原結合部位を形成する２つのドメインはＴ細胞受容体に由来する。モノクローナル抗体およびＴ細胞受容体可変ドメイン、特にＴＣＲαおよびβ一本鎖に由来する一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などの抗体可変ドメインが特に好ましい。実際に、高い親和性で所与の標的に結合するほとんどあらゆるものが抗原結合ドメインとして使用できる。一実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原に対する抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。一実施形態では、抗原結合ドメインは、抗原（ＶＨ（抗原））に対する特異性を有する免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）および抗原（ＶＬ（抗原））に対する特異性を有する免疫グロブリンの軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一実施形態では、前記重鎖可変領域（ＶＨ）および対応する軽鎖可変領域（ＶＬ）は、ペプチドリンカー、好ましくはアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）３を含むペプチドリンカーによって連結されている。
【０２８７】
活性化シグナル伝達ドメイン（またはＴ細胞シグナル伝達ドメイン）は、人工Ｔ細胞受容体が抗原に結合すると、細胞傷害性リンパ球を活性化する働きをする。活性化シグナル伝達ドメインの同一性は、人工Ｔ細胞受容体による抗原の結合時に選択された細胞傷害性リンパ球の活性化を誘導する能力を有するという点のみに限定される。適切な活性化シグナル伝達ドメインには、Ｔ細胞ＣＤ３ζ鎖およびＦｃ受容体γが含まれる。当業者は、これらの記載された活性化シグナル伝達ドメインの配列変異体が、本発明に悪影響を及ぼすことなく使用でき、変異体がモデルとするドメインと同じまたは類似の活性を有することを理解する。そのような変異体は、それらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有する。一実施形態では、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは細胞内に位置する。一実施形態では、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、場合によりＣＤ２８と組み合わせて、ＣＤ３−ζ、好ましくはＣＤ３−ζのエンドドメインを含む。
【０２８８】
人工Ｔ細胞受容体は、共刺激ドメインをさらに含み得る。共刺激ドメインは、人工Ｔ細胞受容体が標的部分に結合すると、細胞傷害性リンパ球の増殖および生存を増強する働きをする。共刺激ドメインの同一性は、人工Ｔ細胞受容体による標的部分の結合時に細胞増殖および生存を増強する能力を有するという点のみに限定される。適切な共刺激ドメインには、ＣＤ２８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーであるＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＴＮＦＲスーパーファミリーの受容体のメンバーであるＣＤ１３４（ＯＸ４０）、および活性化Ｔ細胞上に発現されるＣＤ２８スーパーファミリーの共刺激分子であるＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）が含まれる。当業者は、これらの記載された共刺激ドメインの配列変異体が、本発明に悪影響を及ぼすことなく使用でき、変異体がモデルとされるドメインと同じまたは類似の活性を有することを理解する。そのような変異体は、それらが由来するドメインのアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を有する。本発明のいくつかの実施形態では、人工Ｔ細胞受容体構築物は２つの共刺激ドメインを含む。特定の組合せには４つの記載されたドメインのすべての可能な変形が含まれるが、具体例にはＣＤ２８＋ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）およびＣＤ２８＋ＣＤ１３４（ＯＸ４０）が含まれる。
【０２８９】
抗原認識に続いて、受容体がクラスタ化し、シグナルが細胞に伝達される。この点で、「Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン」は、抗原が結合した後にＴ細胞に活性化シグナルを伝達するドメイン、好ましくはエンドドメインである。最も一般的に使用されるエンドドメイン成分はＣＤ３−ζである。
【０２９０】
本発明の人工Ｔ細胞受容体は、融合タンパク質の形態でドメインを一緒に含んでもよい。そのような融合タンパク質は一般に、Ｎ末端からＣ末端の方向に連結された、結合ドメイン、１つ以上の共刺激ドメイン、および活性化シグナル伝達ドメインを含む。しかし、本発明の人工Ｔ細胞受容体はこの配置に限定されず、他の配置も許容され、結合ドメイン、活性化シグナル伝達ドメイン、および１つ以上の共刺激ドメインが含まれる。結合ドメインは抗原に自由に結合できなければならないため、融合タンパク質内の結合ドメインの配置は一般に、細胞の外側で領域の表示が達成される配置であることが理解される。同様に、共刺激および活性化シグナル伝達ドメインは細胞傷害性リンパ球の活性および増殖を誘導する働きをするため、融合タンパク質は一般に、細胞の内部でこれら２つのドメインを表示する。人工Ｔ細胞受容体には、追加要素、例えば融合タンパク質の細胞表面への適切な輸送を確実にするシグナルペプチド、融合タンパク質が内在性膜タンパク質として維持されるのを確実にする膜貫通ドメイン、および結合ドメインに柔軟性を与え、抗原への強力な結合を可能にするヒンジドメイン（またはスペーサ領域）などが含まれ得る。好ましくは、シグナル配列またはシグナルペプチドは、例えば抗原受容体が細胞外環境に存在する抗原に結合し得るように、分泌経路の十分な通過と細胞表面での発現を可能にする配列またはペプチドである。好ましくは、シグナル配列またはシグナルペプチドは切断可能であり、成熟ペプチド鎖から除去される。シグナル配列またはシグナルペプチドは、好ましくは、ペプチド鎖が産生される細胞または生物に関して選択される。一実施形態では、シグナルペプチドは抗原結合ドメインに先行する。一実施形態では、膜貫通ドメインは、膜にまたがる疎水性αヘリックスである。一実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはその断片を含む。本発明のすべての態様の一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサ領域を含む。一実施形態では、スペーサ領域は、抗原認識を容易にするために抗原結合ドメインが異なる方向に配向することを可能にする。一実施形態では、スペーサ領域は、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域を含む。
【０２９１】
本発明のすべての態様の一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は以下の構造を含む：
ＮＨ２−シグナルペプチド−抗原結合ドメイン−スペーサ領域−膜貫通ドメイン−Ｔ細胞シグナル伝達ドメイン−ＣＯＯＨ。
【０２９２】
本発明のすべての態様の一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は、好ましくは標的とされる抗原に特異的である。
【０２９３】
本発明のすべての態様の一実施形態では、人工Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞によって発現され得るおよび／またはその表面に存在し得る。一実施形態では、抗原に結合した場合のＴ細胞は反応性である。
【０２９４】
人工Ｔ細胞受容体−修飾Ｔ細胞は、事実上あらゆる抗原を標的とするように操作できるため、人工Ｔ細胞受容体を発現する操作されたＴ細胞による養子細胞移入療法は有望な治療法である。例えば、患者のＴ細胞を、患者の疾患細胞上の抗原に特異的に向けられる人工Ｔ細胞受容体を発現するように遺伝子操作（遺伝子修飾）し、その後患者に注入して戻し得る。
【０２９５】
本発明によれば、人工Ｔ細胞受容体は、Ｔ細胞受容体の機能を置き換えることができ、特に、Ｔ細胞などの細胞に細胞溶解活性などの反応性を付与し得る。しかし、抗原ペプチド−ＭＨＣ複合体へのＴ細胞受容体の結合とは対照的に、人工Ｔ細胞受容体は、特に細胞表面に発現される場合、抗原に結合し得る。
【０２９６】
Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３−ζ鎖は、ヒトではＣＤ２４７遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＣＤ３−ζは、Ｔ細胞受容体α／βおよびγ／δヘテロ二量体とＣＤ３−γ、−δおよび−εと一緒になって、Ｔ細胞受容体−ＣＤ３複合体を形成する。ζ鎖は、抗原認識をいくつかの細胞内シグナル伝達経路に結び付けるのに重要な役割を果たす。「ＣＤ３−ζ」という用語は、好ましくはヒトＣＤ３−ζに関する。
【０２９７】
ＣＤ２８（分化クラスタ２８）は、Ｔ細胞の活性化に必要な共刺激シグナルを提供する、Ｔ細胞で発現される分子の１つである。ＣＤ２８は、ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）の受容体である。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に加えてＣＤ２８を介した刺激は、様々なインターロイキン（特にＩＬ−６）の産生のための強力な共刺激シグナルをＴ細胞に提供することができる。「ＣＤ２８」という用語は、好ましくはヒトＣＤ２８に関する。
【０２９８】
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質、好ましくは抗体またはＢ細胞受容体（ＢＣＲ）などの抗原受容体に関する。免疫グロブリンは、特徴的な免疫グロブリン（Ｉｇ）フォールドを有する構造ドメイン、すなわち免疫グロブリンドメインを特徴とする。この用語は、膜結合免疫グロブリンおよび可溶性免疫グロブリンを包含する。膜結合免疫グロブリンは、表面免疫グロブリンまたは膜免疫グロブリンとも称され、一般にＢＣＲの一部である。可溶性免疫グロブリンは一般に抗体と称される。免疫グロブリンは一般に、いくつかの鎖、典型的にはジスルフィド結合を介して連結された２本の同一の重鎖と２本の同一の軽鎖を含む。これらの鎖は、主に、ＶＬ（可変軽鎖）ドメイン、ＣＬ（定常軽鎖）ドメイン、ならびにＣＨ（定常重鎖）ドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４などの免疫グロブリンドメインで構成される。哺乳動物免疫グロブリン重鎖には５つの種類、すなわちα、δ、ε、γおよびμがあり、これらは抗体の異なるクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを構成する。可溶性免疫グロブリンの重鎖とは対照的に、膜または表面免疫グロブリンの重鎖は、膜貫通ドメインおよびそのカルボキシ末端に短い細胞質ドメインを含む。哺乳動物には、２種類の軽鎖、すなわちλとκがある。免疫グロブリン鎖は可変領域と定常領域を含む。定常領域は、免疫グロブリンの異なるアイソタイプ内で本質的に保存されており、可変部分は高度に多様であり、抗原認識を構成する。
【０２９９】
「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互に連結された少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質を指す。「抗体」という用語には、モノクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体が含まれる。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域からなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域からなる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称される、より保存された領域が間に組み入れられた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、次の順序でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲから構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【０３００】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、単一の結合特異性および親和性を示す。一実施形態では、モノクローナル抗体は、不死化細胞に融合した非ヒト動物、例えばマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【０３０１】
抗体は、マウス、ラット、ウサギ、モルモットおよびヒトを含むがこれらに限定されない様々な種に由来し得る。
【０３０２】
本明細書に記載の抗体には、ＩｇＡ１またはＩｇＡ２などのＩｇＡ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＤ抗体が含まれる。様々な実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗体、より特定するとＩｇＧ１、カッパまたはＩｇＧ１、ラムダアイソタイプ（すなわちＩｇＧ１、κ、λ）、ＩｇＧ２ａ抗体（例えばＩｇＧ２ａ、κ、λ）、ＩｇＧ２ｂ抗体（例えばＩｇＧ２ｂ、κ、λ）、ＩｇＧ３抗体（例えばＩｇＧ３、κ、λ）またはＩｇＧ４抗体（例えばＩｇＧ４、κ、λ）である。
【０３０３】
本明細書に記載の人工Ｔ細胞受容体は、１つ以上の抗体の抗原結合部分を含み得る。抗体の「抗原結合部分」（もしくは単に「結合部分」）もしくは抗体の「抗原結合断片」（もしくは単に「結合断片」）という用語または同様の用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって実行され得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨドメインから成る一価断片である、Ｆａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ'）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨドメインとＣＨドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬドメインとＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）場合により合成リンカーによって連結されていてもよい２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せが含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬとＶＨは別々の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶＬ領域とＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照）としてそれらを作製することを可能にする合成リンカーによって、組換え法を用いて連結することができる。そのような一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合断片」という用語に包含されることが意図されている。さらなる例は、（ｉ）免疫グロブリンヒンジ領域ポリペプチドに融合した結合ドメインポリペプチド、（ｉｉ）ヒンジ領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常領域、および（ｉｉｉ）ＣＨ２定常領域に融合した免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常領域を含む、結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質である。結合ドメインポリペプチドは、重鎖可変領域または軽鎖可変領域であり得る。結合ドメイン免疫グロブリン融合タンパク質は、米国特許出願第２００３／０１１８５９２号および同第２００３／０１３３９３９号にさらに開示されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【０３０４】
一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）は、リンカーペプチドで連結された免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）可変領域と軽鎖（ＶＬ）可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端を連結することができ、逆もまた同様である。二価の一本鎖可変断片（ジｓｃＦｖ、バイｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖを連結することによって構築できる。これは、２つのＶＨ領域と２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を生成し、タンデムｓｃＦｖを生成することによって実施できる。
【０３０５】
「結合ドメイン」という用語は、本発明に関連して、場合により別のドメインと相互作用する場合、所与の標的構造体／抗原／エピトープと結合する／相互作用する構造、例えば抗体の構造を特徴付ける。したがって、本発明によるこれらのドメインは、「抗原結合部位」を表す。
【０３０６】
抗体および抗体の誘導体は、抗体断片などの結合ドメインを提供するため、特にＶＬおよびＶＨ領域を提供するために有用である。
【０３０７】
抗原受容体内に存在し得る抗原の結合ドメインは、抗原に結合する（それを標的とする）能力、すなわち抗原に存在するエピトープ、好ましくは抗原の細胞外ドメイン内に位置するエピトープに結合する（それを標的とする）能力を有する。好ましくは、抗原の結合ドメインは抗原に特異的である。好ましくは、抗原の結合ドメインは、細胞表面に発現された抗原に結合する。特に好ましい実施形態では、抗原の結合ドメインは、生細胞の表面に存在する抗原の天然のエピトープに結合する。
【０３０８】
抗体は、従来のモノクローナル抗体法、例えばＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）の標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術を含む、様々な技術によって作製することができる。体細胞ハイブリダイゼーション手順が好ましいが、原則として、モノクローナル抗体を作製するための他の技術、例えばＢリンパ球のウイルス形質転換もしくは発癌性形質転換、または抗体遺伝子のライブラリを使用するファージディスプレイ技術も使用できる。
【０３０９】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための好ましい動物系は、マウスの系である。マウスにおけるハイブリドーマ作製は十分に確立された手順である。免疫プロトコルおよび融合のための免疫脾細胞の単離のための技術は、当技術分野で公知である。融合パートナー（例えばマウス骨髄腫細胞）および融合手順も公知である。
【０３１０】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための他の好ましい動物系は、ラットおよびウサギの系である（例えばＳｐｉｅｋｅｒ−Ｐｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９３４８（１９９５）に記載されており、またＲｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．１２４：２９５（２００５）も参照のこと）。
【０３１１】
抗体を作製するために、上述したように、抗原配列、すなわちそれに対して抗体が向けられるべき配列に由来する担体結合ペプチド、組換え発現された抗原もしくはその断片の濃縮調製物、および／または抗原を発現する細胞でマウスを免疫することができる。あるいは、抗原またはその断片をコードするＤＮＡでマウスを免疫することができる。抗原の精製または濃縮調製物を使用した免疫が抗体をもたらさない場合、免疫応答を促進するために抗原を発現する細胞、例えば細胞株でマウスを免疫することもできる。
【０３１２】
免疫プロトコルの過程で、尾静脈または眼窩後採血によって得られる血漿および血清試料を用いて免疫応答を観測することができる。免疫グロブリンの十分な力価を有するマウスを融合に使用することができる。犠死および脾臓の切除の３日前に抗原発現細胞を用いてマウスを腹腔内または静脈内経路で追加免疫して、特異的抗体を分泌するハイブリドーマの割合を増加させることができる。
【０３１３】
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製するために、免疫マウスの脾細胞およびリンパ節細胞を単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適切な不死化細胞株に融合することができる。次に、得られたハイブリドーマを抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングすることができる。個々のウェルを、抗体を分泌するハイブリドーマについてＥＬＩＳＡによってスクリーニングすることができる。抗原発現細胞を使用した免疫蛍光法およびＦＡＣＳ分析により、抗原に対して特異性を有する抗体を同定することができる。抗体を分泌するハイブリドーマを再播種し、再度スクリーニングすることができ、モノクローナル抗体がまだ陽性である場合は、限界希釈によってサブクローニングすることができる。その後、安定なサブクローンをインビトロで培養して、特性付けのために組織培養培地で抗体を生成することができる。
【０３１４】
抗原に結合する抗体および他の結合物質の能力は、標準的な結合アッセイ（例えばＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット法、免疫蛍光法、フローサイトメトリ分析）を使用して決定することができる。
【０３１５】
本発明による「結合」という用語は、好ましくは特異的結合に関する。
【０３１６】
本発明によれば、抗原受容体などの作用物質は、標準的なアッセイにおいて所定の標的に有意な親和性を有し、所定の標的に結合する場合、前記所定の標的に結合する（それを標的とする）ことができる。「親和性」または「結合親和性」は、しばしば平衡解離定数（ＫＤ）によって測定される。好ましくは、「有意な親和性」という用語は、１０−５Ｍ以下、１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、または１０−１２Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）で所定の標的に結合することを指す。
【０３１７】
作用物質は、標準的なアッセイにおいて標的に有意な親和性を有さず、標的に有意に結合しない、特に検出可能に結合しない場合、前記標的に（実質的に）結合する（それを標的とする）ことができない。好ましくは、作用物質は、２まで、好ましくは１０、より好ましくは２０、特に５０または１００μｇ／ｍｌ以上の濃度で存在する場合、前記標的に検出可能に結合しない。好ましくは、作用物質は、それが結合できる所定の標的への結合のＫＤよりも少なくとも１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、または１０６倍高いＫＤで１つの標的に結合する場合、その標的に有意な親和性を有さない。例えば、作用物質が結合できる標的へのその作用物質の結合のＫＤが１０−７Ｍである場合、作用物質が有意な親和性を有さない標的への結合のＫＤは、少なくとも１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍ、１０−３Ｍ、１０−２Ｍ、または１０−１Ｍである。
【０３１８】
作用物質が、所定の標的には結合できるが、他の標的には（実質的に）結合できない、すなわち標準的なアッセイにおいて他の標的に有意な親和性を有さず、他の標的に有意に結合しない場合、作用物質は前記所定の標的に特異的である。好ましくは、そのような他の標的に対する親和性および結合が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの所定の標的に無関係なタンパク質に対する親和性または結合を有意に上回らない場合、作用物質は所定の標的に特異的である。好ましくは、作用物質は、それが特異的でない標的への結合のＫＤよりも少なくとも１０倍、１００倍、１０３倍、１０４倍、１０５倍、または１０６倍低いＫＤで所定の標的に結合する場合、前記所定の標的に特異的である。例えば、作用物質が特異的である標的へのその作用物質の結合のＫＤが１０−７Ｍである場合、作用物質が特異的ではない標的への結合のＫＤは少なくとも１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍ、１０−３Ｍ、１０−２Ｍ、または１０−１Ｍである。
【０３１９】
標的への作用物質の結合は、任意の適切な方法を使用して実験的に決定することができる；例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，"Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ"Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（１９９２）、および本明細書に記載の方法参照。親和性は、従来の技術を使用して、例えば平衡透析によって；製造者が概説する一般的手順を用いて、ＢＩＡｃｏｒｅ  ２０００装置を使用することによって；放射性標識した標的抗原を用いる放射性免疫検定法によって；または当業者に公知の別の方法によって、容易に決定し得る。親和性データは、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ，５１：６６０（１９４９）の方法によって分析し得る。特定の抗体−抗原相互作用の測定される親和性は、異なる条件下で、例えば異なる塩濃度、ｐＨの下で測定された場合、異なり得る。したがって、親和性および他の抗原結合パラメータ、例えばＫＤ、ＩＣ５０の測定は、好ましくは抗体および抗原の標準溶液、ならびに標準緩衝液を使用して行われる。
【０３２０】
レプリコンに含まれる少なくとも１つのオープンリーディングフレーム
本発明によるＲＮＡレプリコンは、目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームとして、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームを含み、およびＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の第１の鎖と一緒になって機能性Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を形成するＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体のさらなる鎖などの、目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームを含み得る。好ましくは、目的のタンパク質は異種核酸配列によってコードされる。目的のペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子は、同義的に「目的の遺伝子」または「導入遺伝子」と称される。様々な実施形態では、目的のペプチドまたはタンパク質は異種核酸配列によってコードされる。本発明によれば、「異種」という用語は、核酸配列が天然ではアルファウイルス核酸配列に機能的または構造的に連結されていないという事実を指す。本発明によるレプリコンは、単一のポリペプチド、すなわちＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖、またはＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の複数の鎖またはＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖と別のポリペプチドの鎖などの複数のポリペプチドをコードし得る。複数のポリペプチドは、単一のポリペプチド（融合ポリペプチド）として、または別々のポリペプチドとしてコードされ得る。いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは、サブゲノムプロモータの制御下にあるかどうかにかかわらずそれぞれ独立して選択され得る、複数のオープンリーディングフレームを含み得る。あるいは、ポリタンパク質または融合ポリペプチドは、場合により自己触媒性プロテアーゼ切断部位（例えば口蹄疫ウイルス２Ａタンパク質）またはインテインによって分離された個々のポリペプチドを含む。
【０３２１】
目的のタンパク質は、例えばレポータタンパク質、薬学的に活性なペプチドまたはタンパク質、細胞内インターフェロン（ＩＦＮ）シグナル伝達の阻害剤、および機能性アルファウイルス非構造タンパク質からなる群より選択され得る。
【０３２２】
機能性アルファウイルス非構造タンパク質
オープンリーディングフレームによってコードされるさらなる適切な目的のタンパク質は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質である。「アルファウイルス非構造タンパク質」という用語には、糖鎖修飾（グリコシル化など）および脂質修飾形態のアルファウイルス非構造タンパク質を含む、ありとあらゆる同時翻訳または翻訳後修飾形態が含まれる。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」という用語は、アルファウイルス起源の個々の非構造タンパク質（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）のいずれか１つ以上、またはアルファウイルス起源の複数の非構造タンパク質のポリペプチド配列を含むポリタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１２３および／またはｎｓＰ４を指す。他の実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１２３４を指す。一実施形態では、オープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、単一の、場合により切断可能なポリタンパク質：ｎｓＰ１２３４としてのｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４のすべてからなる。一実施形態では、オープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、単一の、場合により切断可能なポリタンパク質：ｎｓＰ１２３としてのｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ３からなる。その実施形態では、ｎｓＰ４はさらなる目的のタンパク質であり得、さらなるオープンリーディングフレームによってコードされ得る。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、アルファウイルス非構造タンパク質は、例えば宿主細胞において、複合体または会合体を形成することができる。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１２３（同義語としてＰ１２３）とｎｓＰ４の複合体または会合体を指す。一部の実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ３の複合体または会合体を指す。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４の複合体または会合体を指す。いくつかの実施形態では、「アルファウイルス非構造タンパク質」は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４からなる群より選択されるいずれか１つ以上の複合体または会合体を指す。いくつかの実施形態では、アルファウイルス非構造タンパク質は少なくともｎｓＰ４を含む。
【０３２５】
「複合体」または「会合体」という用語は、空間的に近接している２つ以上の同じまたは異なるタンパク質分子を指す。複合体のタンパク質は、好ましくは互いに直接または間接的に物理的または物理化学的に接触している。複合体または会合体は、複数の異なるタンパク質（ヘテロ多量体）および／または１つの特定のタンパク質の複数のコピー（ホモ多量体）で構成され得る。アルファウイルス非構造タンパク質の文脈において、「複合体または会合体」という用語は、多数の、そのうちの少なくとも１つがアルファウイルス非構造タンパク質である少なくとも２つのタンパク質分子を表す。複合体または会合体は、１つの特定のタンパク質（ホモ多量体）および／または複数の異なるタンパク質（ヘテロ多量体）の複数のコピーで構成され得る。多量体の文脈において、「多」とは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０を超えるなどの、１より多いことを意味する。
【０３２６】
「機能性アルファウイルス非構造タンパク質」という用語は、レプリカーゼ機能を有するアルファウイルス非構造タンパク質を含む。したがって、「機能性アルファウイルス非構造タンパク質」は、アルファウイルスレプリカーゼを含む。「レプリカーゼ機能」は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）、すなわち（＋）鎖ＲＮＡ鋳型に基づいて（−）鎖ＲＮＡの合成を触媒することができる、および／または（−）鎖ＲＮＡ鋳型に基づいて（＋）鎖ＲＮＡの合成を触媒することができる酵素の機能を含む。したがって、「機能性アルファウイルス非構造タンパク質」という用語は、（＋）鎖（例えばゲノム）ＲＮＡを鋳型として使用して（−）鎖ＲＮＡを合成するタンパク質もしくは複合体、ゲノムＲＮＡの（−）鎖相補体を鋳型として使用して新しい（＋）鎖ＲＮＡを合成するタンパク質もしくは複合体、および／またはゲノムＲＮＡの（−）鎖相補体の断片を鋳型として使用してサブゲノム転写物を合成するタンパク質もしくは複合体を指すことができる。機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、例えばプロテアーゼ（自己切断のため）、ヘリカーゼ、末端アデニリルトランスフェラーゼ（ポリ（Ａ）尾部の付加のため）、メチルトランスフェラーゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ（核酸に５'キャップを提供するため）、核局在化部位、トリホスファターゼなどの１つ以上の追加の機能をさらに有し得る（Ｇｏｕｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．８７  ｐｐ．１１１−１２４；Ｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．９６，ｐｐ．２４８３−５００）。
【０３２７】
本発明によれば、「アルファウイルスレプリカーゼ」という用語は、天然に存在するアルファウイルス（自然界で見出されるアルファウイルス）由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、および弱毒化アルファウイルス由来などのアルファウイルスの変異体または誘導体由来のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む、アルファウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを指す。本発明の文脈において、文脈上特定のレプリカーゼがアルファウイルスレプリカーゼではないことが指示されない限り、「レプリカーゼ」および「アルファウイルスレプリカーゼ」という用語は互換的に使用される。
【０３２８】
「レプリカーゼ」という用語は、アルファウイルス感染細胞によって発現されるか、またはアルファウイルスレプリカーゼをコードする核酸でトランスフェクトされた細胞によって発現される、アルファウイルスレプリカーゼのすべての変異体、特に翻訳後修飾変異体、立体配座、アイソフォームおよびホモログを含む。さらに、「レプリカーゼ」という用語は、組換え法によって生成されたおよび生成され得るすべての形態のレプリカーゼを含む。例えば、実験室でのレプリカーゼの検出および／または精製を容易にするタグ、例えばｍｙｃタグ、ＨＡタグまたはオリゴヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）を含むレプリカーゼは、組換え法によって生成され得る。
【０３２９】
場合により、アルファウイルスレプリカーゼは、アルファウイルスの保存された配列エレメント１（ＣＳＥ  １）またはその相補的な配列、保存された配列エレメント２（ＣＳＥ  ２）またはその相補的な配列、保存された配列エレメント３（ＣＳＥ  ３）またはその相補的な配列、保存された配列エレメント４（ＣＳＥ  ４）またはその相補的な配列のいずれか１つ以上に結合する能力によってさらに機能的に定義される。好ましくは、レプリカーゼは、ＣＳＥ  ２［すなわち（＋）鎖］および／もしくはＣＳＥ  ４［すなわち（＋）鎖］に結合することができるか、またはＣＳＥ  １の相補体［すなわち（−）鎖］および／もしくはＣＳＥ  ３の相補体［すなわち（−）鎖］に結合することができる。
【０３３０】
レプリカーゼの起源は特定のアルファウイルスに限定されない。好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するセムリキ森林ウイルスおよび弱毒化セムリキ森林ウイルスなどのセムリキ森林ウイルスの変異体または誘導体を含む、セムリキ森林ウイルス由来の非構造タンパク質を含む。代替的な好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するシンドビスウイルスおよび弱毒化シンドビスウイルスなどのシンドビスウイルスの変異体または誘導体を含む、シンドビスウイルス由来の非構造タンパク質を含む。代替的な好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）および弱毒化ＶＥＥＶなどのＶＥＥＶの変異体または誘導体を含む、ＶＥＥＶ由来の非構造タンパク質を含む。代替的な好ましい実施形態では、アルファウイルスレプリカーゼは、天然に存在するチクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）および弱毒化ＣＨＩＫＶなどのＣＨＩＫＶの変異体または誘導体を含む、ＣＨＩＫＶ由来の非構造タンパク質を含む。
【０３３１】
レプリカーゼは、複数のアルファウイルス由来の非構造タンパク質を含むこともできる。したがって、アルファウイルス非構造タンパク質を含み、レプリカーゼ機能を有する異種複合体または会合体も、同様に本発明に含まれる。単に例示目的のために、レプリカーゼは、第１のアルファウイルス由来の１つ以上の非構造タンパク質（例えばｎｓＰ１、ｎｓＰ２）、および第２のアルファウイルス由来の１つ以上の非構造タンパク質（ｎｓＰ３、ｎｓＰ４）を含み得る。複数の異なるアルファウイルス由来の非構造タンパク質は、別々のオープンリーディングフレームによってコードされ得るか、またはポリタンパク質、例えばｎｓＰ１２３４として単一のオープンリーディングフレームによってコードされ得る。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が発現される細胞において膜複製複合体および／または液胞を形成することができる。
【０３３３】
機能性アルファウイルス非構造タンパク質、すなわちレプリカーゼ機能を有するアルファウイルス非構造タンパク質が本発明による核酸分子によってコードされる場合、レプリコンのサブゲノムプロモータは、存在する場合、前記レプリカーゼと適合性であることが好ましい。この文脈において適合性であるとは、アルファウイルスレプリカーゼが、サブゲノムプロモータが存在する場合、サブゲノムプロモータを認識できることを意味する。一実施形態では、これは、サブゲノムプロモータが、レプリカーゼが由来するアルファウイルスに天然である、すなわちこれらの配列の天然起源が同じアルファウイルスである場合に達成される。代替的な実施形態では、サブゲノムプロモータは、アルファウイルスレプリカーゼがサブゲノムプロモータを認識できることを条件として、アルファウイルスレプリカーゼが由来するアルファウイルスに天然ではない。言い換えれば、レプリカーゼはサブゲノムプロモータと適合性である（交差ウイルス適合性）。異なるアルファウイルスに由来するサブゲノムプロモータおよびレプリカーゼに関する交差ウイルス適合性の例は、当技術分野で公知である。交差ウイルス適合性が存在する限り、サブゲノムプロモータとレプリカーゼの任意の組合せが可能である。交差ウイルス適合性は、サブゲノムプロモータからのＲＮＡ合成に適した条件で、試験するレプリカーゼを、試験するサブゲノムプロモータを有するＲＮＡと共にインキュベートすることにより、本発明を実施する当業者によって容易に試験され得る。サブゲノム転写物が生成された場合、サブゲノムプロモータとレプリカーゼは適合性であると決定される。交差ウイルス適合性の様々な例が公知である（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１−５６２によって総説されている）。
【０３３４】
一実施形態では、アルファウイルス非構造タンパク質は、異種タンパク質、例えばユビキチンとの融合タンパク質としてコードされない。
【０３３５】
本発明では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、ＲＮＡレプリコン上に提供され得るか、あるいは、別個の核酸分子、例えばｍＲＮＡ分子として提供され得る。別個のｍＲＮＡ分子は、場合により、例えばキャップ、５'−ＵＴＲ、３'−ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列、および／またはコドン使用頻度の適合を含み得る。本発明の系について本明細書に記載されるように、別個のｍＲＮＡ分子はトランスで提供され得る。
【０３３６】
機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームがＲＮＡレプリコン上に提供される場合、レプリコンは、好ましくは機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製され得る。特に、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするＲＮＡレプリコンは、レプリコンによってコードされる機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製され得る。この実施形態は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸分子がトランスで提供されない場合に非常に好ましい。この実施形態では、レプリコンのシス複製が目的とされる。好ましい実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび目的のタンパク質をコードするさらなるオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製され得る。この実施形態は、本発明に従って目的のタンパク質を生産するためのいくつかの方法に特に適する。それぞれのレプリコンの例を図６に示す（「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」）。
【０３３７】
レプリコンが機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは５'複製認識配列と重複しないことが好ましい。一実施形態では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータが存在する場合、サブゲノムプロモータと重複しない。それぞれのレプリコンの例を図６に示す（「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」）。
【０３３８】
複数のオープンリーディングフレームがレプリコン上に存在する場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、場合によりサブゲノムプロモータの制御下にあるまたは制御下にない、好ましくはサブゲノムプロモータの制御下にない、それらのいずれかによってコードされ得る。好ましい実施形態では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、ＲＮＡレプリコンの最も上流のオープンリーディングフレームによってコードされる。機能性アルファウイルス非構造タンパク質がＲＮＡレプリコンの最も上流のオープンリーディングフレームによってコードされる場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする遺伝情報は、宿主細胞へのＲＮＡレプリコンの導入後早期に翻訳され、結果として生じたタンパク質は、その後、宿主細胞内で複製、および場合によりサブゲノム転写物の産生を駆動することができる。それぞれのレプリコンの例を図６に示す（「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」）。
【０３３９】
レプリコンに含まれるかまたはトランスで提供される別の核酸分子に含まれる、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの存在は、レプリコンが複製され、その結果として、レプリコンによってコードされる目的の遺伝子が、場合によりサブゲノムプロモータの制御下で、高レベルで発現されることを可能にする。これは、他の導入遺伝子発現系と比較してコスト面の利点に結び付く。本発明のレプリコンは機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で複製され得るため、比較的少量のレプリコンＲＮＡが投与された場合でも、目的の遺伝子の高レベルの発現が達成され得る。レプリコンＲＮＡの量が少ないことは、コストにプラスの影響を与える。
【０３４０】
ＲＮＡレプリコンにおける少なくとも１つのオープンリーディングフレームの位置
ＲＮＡレプリコンは、場合によりサブゲノムプロモータの制御下で、目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現に適する。様々な実施形態が可能である。それぞれが目的のペプチドまたは目的のタンパク質をコードする１つ以上のオープンリーディングフレームがＲＮＡレプリコン上に存在し得る。ＲＮＡレプリコンの最も上流のオープンリーディングフレームは、「第１のオープンリーディングフレーム」と称される。いくつかの実施形態では、「第１のオープンリーディングフレーム」は、ＲＮＡレプリコンの唯一のオープンリーディングフレームである。場合により、１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームが第１のオープンリーディングフレームの下流に存在し得る。第１のオープンリーディングフレームの下流の１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、それらが第１のオープンリーディングフレームの下流に存在する順序で（５'から３'へ）、「第２のオープンリーディングフレーム」、「第３のオープンリーディングフレーム」などと称され得る。好ましくは、各オープンリーディングフレームは、開始コドン（塩基トリプレット）、典型的にはＡＴＧ（それぞれのＤＮＡ分子中）に対応するＡＵＧ（ＲＮＡ分子中）を含む。
【０３４１】
レプリコンが３'複製認識配列を含む場合、すべてのオープンリーディングフレームが３'複製認識配列の上流に局在することが好ましい。
【０３４２】
１つ以上のオープンリーディングフレームを含むＲＮＡレプリコンが宿主細胞に導入される場合、５'複製認識配列から少なくとも１つの開始コドンが除去されているため、翻訳は、好ましくは第１のオープンリーディングフレームの上流位置では開始されない。したがって、レプリコンは、直接第１のオープンリーディングフレームの翻訳のための鋳型として働き得る。好ましくは、レプリコンは５'キャップを含む。これは、レプリコンから直接第１のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子の発現に役立つ。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、レプリコンの少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータ、好ましくはアルファウイルスサブゲノムプロモータの制御下にある。アルファウイルスサブゲノムプロモータは非常に効率的であり、したがって高レベルでの異種遺伝子発現に適する。好ましくは、サブゲノムプロモータは、アルファウイルスのサブゲノム転写物のプロモータである。これは、サブゲノムプロモータがアルファウイルスに天然であり、好ましくは前記アルファウイルス中の１つ以上の構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの転写を制御するものであることを意味する。あるいは、サブゲノムプロモータは、アルファウイルスのサブゲノムプロモータの変異体であり、宿主細胞においてサブゲノムＲＮＡ転写のプロモータとして機能する任意の変異体が適切である。レプリコンがサブゲノムプロモータを含む場合、レプリコンは、保存された配列エレメント３（ＣＳＥ  ３）またはその変異体を含むことが好ましい。
【０３４４】
好ましくは、サブゲノムプロモータの制御下にある少なくとも１つのオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータの下流に局在する。好ましくは、サブゲノムプロモータは、オープンリーディングフレームの転写物を含むサブゲノムＲＮＡの産生を制御する。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、第１のオープンリーディングフレームはサブゲノムプロモータの制御下にある。第１のオープンリーディングフレームがサブゲノムプロモータの制御下にある場合、その局在化は、アルファウイルスのゲノム内の構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームの局在化に類似する。第１のオープンリーディングフレームがサブゲノムプロモータの制御下にある場合、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子は、レプリコンとそのサブゲノム転写物の両方から発現され得る（後者は機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在下で）。それぞれの実施形態を、図６のレプリコン「Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」によって例示する。好ましくは、「Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」は、ｎｓＰ４のＣ末端断片（＊ｎｓＰ４）をコードする核酸配列中に開始コドンを含まない。それぞれがサブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、サブゲノムプロモータの制御下にある第１のオープンリーディングフレームの下流に存在し得る（図６には示していない）。１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームによって、例えば第２のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子は、それぞれサブゲノムプロモータの制御下で、１つ以上のサブゲノム転写物から翻訳され得る。例えば、ＲＮＡレプリコンは、目的の第２のタンパク質をコードする転写物の産生を制御するサブゲノムプロモータを含み得る。
【０３４６】
他の実施形態では、第１のオープンリーディングフレームはサブゲノムプロモータの制御下にない。第１のオープンリーディングフレームがサブゲノムプロモータの制御下にない場合、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子はレプリコンから発現され得る。それぞれの実施形態を、図６のレプリコン「Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳΔＳＧＰ」によって例示する。それぞれがサブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームは、第１のオープンリーディングフレームの下流に存在し得る（２つの例示的な実施形態の説明については、図６の「Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳ−バイシストロニック」および「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」参照）。１つ以上のさらなるオープンリーディングフレームによってコードされる遺伝子は、サブゲノム転写物から発現され得る。
【０３４７】
本発明によるレプリコンを含む細胞では、レプリコンは機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって増幅され得る。さらに、レプリコンがサブゲノムプロモータの制御下にある１つ以上のオープンリーディングフレームを含む場合、１つ以上のサブゲノム転写物が機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって生成されると予想される。機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、トランスで提供され得るか、またはレプリコンのオープンリーディングフレームによってコードされ得る。
【０３４８】
レプリコンが目的のタンパク質をコードする複数のオープンリーディングフレームを含む場合、各オープンリーディングフレームは異なるタンパク質をコードすることが好ましい。例えば、第２のオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質は、第１のオープンリーディングフレームによってコードされるタンパク質とは異なる。
【０３４９】
いくつかの実施形態では、第１のオープンリーディングフレームおよび／またはさらなるオープンリーディングフレームによって、好ましくは第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質である。いくつかの実施形態では、第１のオープンリーディングフレームおよび／またはさらなるオープンリーディングフレームによって、例えば第２のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖である。
【０３５０】
一実施形態では、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質である。その実施形態では、レプリコンは、好ましくは５'キャップを含む。特に、第１のオープンリーディングフレームによってコードされる目的のタンパク質が機能性アルファウイルス非構造タンパク質である場合、および好ましくはレプリコンが５'キャップを含む場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする核酸配列は、レプリコンから効率的に翻訳されることができ、および結果として生じるタンパク質は、その後、レプリコンの複製を駆動し、サブゲノム転写物（１つまたは複数）の合成を駆動することができる。この実施形態は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするさらなる核酸分子がレプリコンと共に使用されないまたは存在しない場合に好ましい可能性がある。この実施形態では、レプリコンのシス複製が目的とされる。
【０３５１】
第１のオープンリーディングフレームが機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする一実施形態を、図６の「シスレプリコンΔ５ＡＴＧ−ＲＲＳ」によって示す。ｎｓＰ１２３４をコードする核酸配列の翻訳後、翻訳産物（ｎｓＰ１２３４またはその断片（１つまたは複数））はレプリカーゼとして働くことができ、ＲＮＡ合成、すなわちレプリコンの複製および第２のオープンリーディングフレームを含むサブゲノム転写物の合成を駆動することができる（図６の「導入遺伝子」）。
【０３５２】
トランス複製系
第２の態様では、本発明は、
機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物、
機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製され得る、本発明の第１の態様によるＲＮＡレプリコン
を含む系を提供する。
【０３５３】
第２の態様では、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含まないことが好ましい。
【０３５４】
したがって、本発明は、２つの核酸分子：機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するための第１のＲＮＡ構築物（すなわち機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする）および第２のＲＮＡ分子であるＲＮＡレプリコンを含む系を提供する。機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物は、本明細書では同義的に「機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物」または「レプリカーゼ構築物」と称される。
【０３５５】
機能性アルファウイルス非構造タンパク質は上記で定義されたとおりであり、典型的にはレプリカーゼ構築物に含まれるオープンリーディングフレームによってコードされる。レプリカーゼ構築物によってコードされる機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、レプリコンを複製することができる任意の機能性アルファウイルス非構造タンパク質であり得る。
【０３５６】
本発明の系が細胞、好ましくは真核細胞に導入された場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームが翻訳され得る。翻訳後、機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、トランスで別のＲＮＡ分子（ＲＮＡレプリコン）を複製することができる。したがって、本発明は、ＲＮＡをトランスで複製するための系を提供する。その結果として、本発明の系はトランス複製系である。第２の態様によれば、レプリコンはトランスレプリコンである。
【０３５７】
本明細書では、トランス（例えばトランス作用性、トランス調節性の文脈において）は、一般に、「異なる分子から作用する」（すなわち分子間）を意味する。これは、一般に、「同じ分子から作用する」（すなわち分子内）を意味するシス（例えばシス作用性、シス調節性の文脈において）の反対である。ＲＮＡ合成（転写およびＲＮＡ複製を含む）の文脈において、トランス作用性要素には、ＲＮＡ合成が可能な酵素（ＲＮＡポリメラーゼ）をコードする遺伝子を含む核酸配列が含まれる。ＲＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡの合成のための鋳型として、第２の核酸分子、すなわちそれがコードされるもの以外の核酸分子を使用する。ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含む核酸配列の両方が、第２の核酸分子に対して「トランスで作用する」と言われる。本発明の文脈において、トランス作用性ＲＮＡによってコードされるＲＮＡポリメラーゼは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質である。機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、ＲＮＡレプリコンの複製を含むＲＮＡ合成のための鋳型として、ＲＮＡレプリコンである第２の核酸分子を使用することができる。本発明によるトランスでレプリカーゼによって複製され得るＲＮＡレプリコンは、本明細書では同義的に「トランスレプリコン」と称される。
【０３５８】
本発明の系において、機能性アルファウイルス非構造タンパク質の役割は、レプリコンを増幅すること、およびサブゲノムプロモータがレプリコン上に存在する場合、サブゲノム転写物を生成することである。レプリコンが発現のための目的の遺伝子をコードする場合、目的の遺伝子の発現レベルおよび／または発現の持続時間は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質のレベルを変更することによってトランスで調節され得る。
【０３５９】
アルファウイルスレプリカーゼが一般にトランスで鋳型ＲＮＡを認識し、複製することができるという事実は、１９８０年代に最初に発見されたが、とりわけ、トランス複製されたＲＮＡは効率的な複製を妨げると考えられていた（これは、感染細胞のアルファウイルスゲノムと共複製する欠陥干渉（ＤＩ）ＲＮＡの場合に発見された）ため、生物医学的適用についてのトランス複製の潜在的可能性は認識されなかった（Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．６５（Ｐｔ  ８），ｐｐ．１２７３−１２８３；Ｌｅｈｔｏｖａａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，ｖｏｌ．７８，ｐｐ．５３５３−５３５７；Ｐｅｔｔｅｒｓｓｏｎ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，ｖｏｌ．７８，ｐｐ．１１５−１１９）。ＤＩ  ＲＮＡは、高いウイルス量での細胞株の感染中に準天然に発生し得るトランスレプリコンである。ＤＩエレメントは非常に効率的に共複製するため、親ウイルスの毒性を低下させ、それによって阻害性寄生ＲＮＡとして作用する（Ｂａｒｒｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．６５（Ｐｔ  １１），ｐｐ．１９０９−１９２０）。生物医学的適用の潜在的可能性は認識されていなかったが、トランス複製の現象は、シスで同じ分子からレプリカーゼを発現することを必要とせずに、複製の機構を解明することを目的としたいくつかの基礎研究で用いられた；さらに、レプリカーゼとレプリコンの分離はまた、それぞれの変異体が機能喪失変異体である場合でも、ウイルスタンパク質の変異体を含む機能試験を可能にする（Ｌｅｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ  Ｊ．，ｖｏｌ．１３，ｐｐ．２９２５−２９３４）。これらの機能喪失試験およびＤＩ  ＲＮＡは、アルファウイルスエレメントに基づくトランス活性化系が最終的に治療目的に適うように利用可能になり得ることを示唆しなかった。
【０３６０】
本発明の系は、少なくとも２つの核酸分子を含む。したがって、それは、好ましくはＲＮＡ分子である、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、または１０個以上の核酸分子を含み得る。好ましい実施形態では、系は、正確に２つのＲＮＡ分子、レプリコンおよびレプリカーゼ構築物からなる。代替的な好ましい実施形態では、系は、それぞれが好ましくは少なくとも１つの目的のタンパク質をコードする複数のレプリコンを含み、レプリカーゼ構築物も含む。これらの実施形態では、レプリカーゼ構築物によってコードされる機能性アルファウイルス非構造タンパク質は、複製およびサブゲノム転写物の産生をそれぞれ駆動するように各レプリコンに作用することができる。例えば、各レプリコンは、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードし得る。これは、例えば、複数の鎖からなる機能性Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を形成するために、細胞内のＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の複数の鎖の発現が望ましい場合に有利である。
【０３６１】
好ましくは、レプリカーゼ構築物は、（＋）鎖鋳型に基づく（−）鎖合成、および／または（−）鎖鋳型に基づく（＋）鎖合成に必要な少なくとも１つの保存された配列エレメント（ＣＳＥ）を欠く。より好ましくは、レプリカーゼ構築物は、アルファウイルスの保存された配列エレメント（ＣＳＥ）を含まない。特に、アルファウイルスの４つのＣＳＥの中で（Ｓｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１−５６２；Ｊｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｔｕｒｅ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２００９，ｖｏｌ．４，ｐｐ．８３７−８５６）、次のＣＳＥのいずれか１つ以上が、好ましくはレプリカーゼ構築物上に存在しない：ＣＳＥ  １；ＣＳＥ  ２；ＣＳＥ  ３；ＣＳＥ  ４。特に、１つ以上のアルファウイルスＣＳＥの非存在下では、本発明のレプリカーゼ構築物は、アルファウイルスゲノムＲＮＡに類似するよりも典型的な真核生物ｍＲＮＡにはるかに類似する。
【０３６２】
本発明のレプリカーゼ構築物は、好ましくは、少なくとも自己複製することができない、および／またはサブゲノムプロモータの制御下にあるオープンリーディングフレームを含まないという点でアルファウイルスゲノムＲＮＡと区別される。自己複製することができない場合、レプリカーゼ構築物は「自殺構築物」とも称され得る。
【０３６３】
トランス複製系は以下の利点に結び付く：
何よりもまず、トランス複製系の多用途性は、レプリコンおよびレプリカーゼ構築物を様々な時点および／または様々な部位で設計および／または調製できることを可能にする。一実施形態では、レプリカーゼ構築物を最初の時点で調製し、レプリコンをより後の時点で調製する。例えば、その調製後、後の時点での使用のためにレプリカーゼ構築物を保存し得る。本発明は、シスレプリコンと比較して高い柔軟性を提供する：本発明の系は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の新しい鎖をコードする核酸をレプリコンにクローニングすることによって、治療用に設計され得る。事前に調製したレプリカーゼ構築物を保存から復元し得る。言い換えれば、特定のレプリコンとは独立してレプリカーゼ構築物を設計および調製することができる。
【０３６４】
第二に、本発明によるトランスレプリコンは、典型的には、典型的なシスレプリコンよりも短い核酸分子である。これは、目的のタンパク質をコードするレプリコンのより迅速なクローニングを可能にし、目的のタンパク質の高い収率を提供する。
【０３６５】
本発明の系のさらなる利点には、核転写からの独立性および２つの別個のＲＮＡ分子上の重要な遺伝情報の存在が含まれ、これはかつてない設計の自由度を提供する。互いに組み合わせることができるその多様な要素を考慮して、本発明は、所望のレベルのＲＮＡ増幅、所望の標的生物、目的のタンパク質の所望のレベルの生産などのためにレプリカーゼ発現を最適化することを可能にする。本発明による系は、インビトロまたはインビボで、所与の細胞型−休止または周期中−について様々な量または比率のレプリコンとレプリカーゼ構築物を同時トランスフェクトすることを可能にする。
【０３６６】
本発明によるレプリカーゼ構築物は、好ましくは一本鎖ＲＮＡ分子である。本発明によるレプリカーゼ構築物は、典型的には（＋）鎖ＲＮＡ分子である。一実施形態では、本発明のレプリカーゼ構築物は、単離された核酸分子である。
【０３６７】
本発明によるＲＮＡ分子の好ましい特徴
本発明によるＲＮＡ分子は、場合により、さらなる特徴、例えば５'キャップ、５'−ＵＴＲ、３'−ＵＴＲ、ポリ（Ａ）配列、および／またはコドン使用頻度の適合によって特徴付けられ得る。詳細を以下で説明する。
【０３６８】
キャップ
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは５'キャップを含む。
【０３６９】
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は５'キャップを含む。
【０３７０】
「５'キャップ」、「キャップ」、「５'キャップ構造」、「キャップ構造」という用語は、前駆体メッセンジャーＲＮＡなどの一部の真核生物一次転写物の５'末端に見出されるジヌクレオチドを指すために同義的に使用される。５'キャップは、（場合により修飾された）グアノシンが５'−５'三リン酸結合（または特定のキャップ類似体の場合は修飾三リン酸結合）を介してｍＲＮＡ分子の最初のヌクレオチドに結合している構造である。これらの用語は、従来のキャップまたはキャップ類似体を指す場合がある。説明のために、いくつかの特定のキャップジヌクレオチド（キャップ類似体ジヌクレオチドを含む）を図７に示す。
【０３７１】
「５'キャップを含むＲＮＡ」または「５'キャップを備えたＲＮＡ」または「５'キャップで修飾されたＲＮＡ」または「キャップされたＲＮＡ」は、５'キャップを含むＲＮＡを指す。例えば、ＲＮＡに５'キャップを提供することは、前記５'キャップの存在下でのＤＮＡ鋳型のインビトロ転写によって達成され得、前記５'キャップは、生成されたＲＮＡ鎖に共転写によって組み込むか、または、例えばインビトロ転写によってＲＮＡを生成し、転写後にキャッピング酵素、例えばワクシニアウイルスのキャッピング酵素を使用して５'キャップをＲＮＡに付着させ得る。キャップされたＲＮＡでは、（キャップされた）ＲＮＡ分子の最初の塩基の３'位置は、ホスホジエステル結合を介してＲＮＡ分子の次の塩基（「２番目の塩基」）の５'位置に連結される。
【０３７２】
宿主細胞または宿主生物へのそれぞれのＲＮＡの導入後の初期段階でタンパク質をコードする核酸配列の翻訳が望ましい場合、ＲＮＡ分子上のキャップの存在が非常に好ましい。例えば、キャップの存在は、ＲＮＡレプリコンによってコードされる目的の遺伝子が、それぞれのＲＮＡの宿主細胞への導入後の初期段階で効率的に翻訳されることを可能にする。「初期段階」とは、典型的には、ＲＮＡの導入後最初の１時間以内、または最初の２時間以内、または最初の３時間以内を意味する。
【０３７３】
機能的なレプリカーゼの非存在下で翻訳が行われることが望ましい場合、または宿主細胞にわずかなレベルのレプリカーゼしか存在しない場合も、ＲＮＡ分子上のキャップの存在が好ましい。例えば、レプリカーゼをコードする核酸分子が宿主細胞に導入された場合でも、導入後の初期段階では、典型的にはレプリカーゼのレベルはわずかである。
【０３７４】
本発明による系では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物は５'キャップを含むことが好ましい。
【０３７５】
特に、本発明によるＲＮＡレプリコンが機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする第２の核酸分子（例えばｍＲＮＡ）と共に使用または提供されない場合、ＲＮＡレプリコンは５'キャップを含むことが好ましい。独立して、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードする第２の核酸分子と共に使用または提供される場合でも、５'キャップを含み得る。
【０３７６】
「従来の５'キャップ」という用語は、天然に存在する５'キャップ、好ましくは７−メチルグアノシンキャップを指す。７−メチルグアノシンキャップでは、キャップのグアノシンは修飾されたグアノシンであり、修飾は７位のメチル化からなる（図７の上部）。
【０３７７】
本発明の文脈において、「５'キャップ類似体」という用語は、従来の５'キャップに類似するが、好ましくはインビボおよび／または細胞内で、ＲＮＡに付着した場合にそのＲＮＡを安定化する能力を有するように修飾された分子構造を指す。キャップ類似体は従来の５'キャップではない。
【０３７８】
真核生物のｍＲＮＡの場合、５'キャップは一般にｍＲＮＡの効率的な翻訳に関与すると記述されている：一般に、真核生物では、翻訳は、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）が存在しない限り、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子の５'末端でのみ開始される。真核細胞は、核内での転写中にＲＮＡに５'キャップを提供することができる：新しく合成されたｍＲＮＡは通常、例えば転写物が２０〜３０ヌクレオチドの長さに到達すると、５'キャップ構造で修飾される。まず、５'末端ヌクレオチドｐｐｐＮ（ｐｐｐは三リン酸を表す；Ｎは任意のヌクレオシドを表す）は、ＲＮＡ  ５'−トリホスファターゼおよびグアニリルトランスフェラーゼ活性を有するキャッピング酵素によって細胞内で５'ＧｐｐｐＮに変換される。ＧｐｐｐＮは、その後、（グアニン−７）−メチルトランスフェラーゼ活性を有する第２の酵素によって細胞内でメチル化されて、モノメチル化ｍ７ＧｐｐｐＮキャップを形成し得る。一実施形態では、本発明で使用される５'キャップは、天然の５'キャップである。
【０３７９】
本発明では、天然の５'キャップジヌクレオチドは、典型的には、非メチル化キャップジヌクレオチド（Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｎ；ＧｐｐｐＮとも称される）およびメチル化キャップジヌクレオチド（（ｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｎ；ｍ７ＧｐｐｐＮとも称される）からなる群より選択される。ｍ７ＧｐｐｐＮ（ＮはＧである）は、次の式で表される：
【化１】
2020537502.tif 000002
【０３８０】
本発明のキャップされたＲＮＡはインビトロで調製することができ、したがって、宿主細胞のキャッピング機構に依存しない。キャップされたＲＮＡをインビトロで作製するために最も頻繁に使用される方法は、４つのリボヌクレオシド三リン酸すべておよびｍ７Ｇ（５'）ｐｐｐ（５'）Ｇ（ｍ７ＧｐｐｐＧとも呼ばれる）などのキャップジヌクレオチドの存在下で細菌またはバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼでＤＮＡ鋳型を転写することである。ＲＮＡポリメラーゼは、次の鋳型ヌクレオシド三リン酸（ｐｐｐＮ）のα−リン酸上のｍ７ＧｐｐｐＧのグアノシン部分の３'−ＯＨによる求核攻撃で転写を開始し、中間体ｍ７ＧｐｐｐＧｐＮ（ＮはＲＮＡ分子の２番目の塩基である）をもたらす。競合するＧＴＰ開始産物ｐｐｐＧｐＮの形成は、インビトロ転写中のキャップ対ＧＴＰのモル比を５〜１０に設定することによって抑制される。
【０３８１】
本発明の好ましい実施形態では、５'キャップ（存在する場合）は５'キャップ類似体である。これらの実施形態は、ＲＮＡがインビトロ転写によって得られる、例えばインビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）である場合に特に適する。キャップ類似体は、最初に、インビトロ転写によるＲＮＡ転写物の大規模合成を促進すると記述された。
【０３８２】
メッセンジャーＲＮＡについて、いくつかのキャップ類似体（合成キャップ）がこれまでに一般的に記述されており、それらはすべて本発明の文脈で使用することができる。理想的には、より高い翻訳効率および／またはインビボ分解に対する耐性の増加および／またはインビトロ分解に対する耐性の増加に関連するキャップ類似体が選択される。
【０３８３】
好ましくは、一方向でのみＲＮＡ鎖に組み込むことができるキャップ類似体が使用される。Ｐａｓｑｕｉｎｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５，ＲＮＡ  Ｊ．，ｖｏｌ．，１，ｐｐ．９５７−９６７）は、インビトロ転写中に、バクテリオファージＲＮＡポリメラーゼが転写の開始のために７−メチルグアノシン単位を使用し、それによりキャップを有する転写物の約４０〜５０％がキャップジヌクレオチドを逆方向に有する（すなわち最初の反応産物はＧｐｐｐｍ７ＧｐＮである）ことを明らかにした。正しいキャップを有するＲＮＡと比較して、逆キャップを有するＲＮＡは、核酸配列のタンパク質への翻訳に関して機能的ではない。したがって、キャップを正しい方向に組み込むこと、すなわちｍ７ＧｐｐｐＧｐＮなどに本質的に対応する構造を有するＲＮＡが得られることが望ましい。キャップジヌクレオチドの逆組み込みは、メチル化グアノシン単位の２'−または３'−ＯＨ基の置換によって阻害されることが示されている（Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；ＲＮＡ  Ｊ．，ｖｏｌ．７，ｐｐ．１４８６−１４９５；Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．１６１−１６４）。そのような「抗逆キャップ類似体」の存在下で合成されるＲＮＡは、従来の５'キャップｍ７ＧｐｐｐＧの存在下でインビトロ転写されるＲＮＡよりも効率的に翻訳される。そのために、メチル化グアノシン単位の３'ＯＨ基がＯＣＨ３で置き換えられた１つのキャップ類似体が、例えばＨｏｌｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９−４０１７（７−メチル（３'−Ｏ−メチル）ＧｐｐｐＧ；抗逆キャップ類似体（ＡＲＣＡ））によって記述されている。ＡＲＣＡは、本発明による適切なキャップジヌクレオチドである。
【化２】
2020537502.tif 000003
【０３８４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、本質的にキャップ除去を受けにくい。一般に、培養哺乳動物細胞に導入された合成ｍＲＮＡから産生されるタンパク質の量は、ｍＲＮＡの自然分解によって制限されるため、これは重要である。ｍＲＮＡ分解の１つのインビボ経路は、ｍＲＮＡキャップの除去から始まる。この除去は、調節サブユニット（Ｄｃｐ１）と触媒サブユニット（Ｄｃｐ２）を含むヘテロ二量体ピロホスファターゼによって触媒される。触媒サブユニットは、三リン酸架橋のαリン酸基とβリン酸基の間を切断する。本発明では、この種の切断を受けないか、または受けにくいキャップ類似体を選択し得るかまたは存在させ得る。この目的に適したキャップ類似体は、式（Ｉ）：
【化３】
2020537502.tif 000004
式（Ｉ）
［式中、Ｒ１は、置換されていてもよいアルキル、置換されていてもよいアルケニル、置換されていてもよいアルキニル、置換されていてもよいシクロアルキル、置換されていてもよいヘテロシクリル、置換されていてもよいアリール、および置換されていてもよいヘテロアリールからなる群より選択され、
Ｒ２およびＲ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、および置換されていてもよいアルコキシからなる群より独立して選択されるか、またはＲ２とＲ３は一緒になってＯ−Ｘ−Ｏ［Ｘは、置換されていてもよいＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２、ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）、およびＣ（ＣＨ３）２からなる群より選択される］を形成するか、またはＲ２は、Ｒ２が結合している環の４'位の水素原子と結合して−Ｏ−ＣＨ２−もしくは−ＣＨ２−Ｏ−を形成し、
Ｒ５は、Ｓ、Ｓｅ、およびＢＨ３からなる群より選択され、
Ｒ４およびＲ６は、Ｏ、Ｓ、Ｓｅ、およびＢＨ３からなる群より独立して選択され、
ｎは１、２、または３である］
に従うキャップジヌクレオチドから選択され得る。
【０３８５】
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６の好ましい実施形態は、国際公開第２０１１／０１５３４７Ａ１号に開示されており、本発明において適宜に選択され得る。
【０３８６】
例えば、本発明の好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡはホスホロチオエートキャップ類似体を含む。ホスホロチオエートキャップ類似体は、三リン酸鎖の３つの非架橋Ｏ原子の１つがＳ原子で置換された、すなわち式（Ｉ）のＲ４、Ｒ５またはＲ６の１つがＳである特定のキャップ類似体である。ホスホロチオエートキャップ類似体は、Ｊ．Ｋｏｗａｌｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，ＲＮＡ，ｖｏｌ．１４，ｐｐ．１１１９−１１３１によって、望ましくないキャップ除去過程に対する解決策、したがってインビボでのＲＮＡの安定性を高めるための解決策として記載されている。特に、５'キャップのβリン酸基で硫黄原子を酸素原子に置換すると、Ｄｃｐ２に対する安定化をもたらす。本発明において好ましいその実施形態では、式（Ｉ）のＲ５はＳであり、Ｒ４およびＲ６はＯである。
【０３８７】
本発明のさらなる好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、ＲＮＡ  ５'キャップのホスホロチオエート修飾が「抗逆キャップ類似体」（ＡＲＣＡ）修飾と組み合わされたホスホロチオエートキャップ類似体を含む。それぞれのＡＲＣＡ−ホスホロチオエートキャップ類似体は、国際公開第２００８／１５７６８８  Ａ２号に記載されており、それらはすべて本発明のＲＮＡに使用することができる。その実施形態では、式（Ｉ）のＲ２またはＲ３の少なくとも一方はＯＨではなく、好ましくはＲ２およびＲ３の一方はメトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ２およびＲ３の他方は、好ましくはＯＨである。好ましい実施形態では、酸素原子は、βリン酸基で硫黄原子に置換される（したがって、式（Ｉ）のＲ５はＳであり、Ｒ４およびＲ６はＯである）。ＡＲＣＡのホスホロチオエート修飾は、α、β、およびγホスホロチオエート基が翻訳およびキャップ除去機構の両方でキャップ結合タンパク質の活性部位内に正確に配置されることを確実にすると考えられている。これらの類似体の少なくとも一部は、本質的にピロホスファターゼＤｃｐ１／Ｄｃｐ２に耐性である。ホスホロチオエート修飾ＡＲＣＡは、ホスホロチオエート基を欠く対応するＡＲＣＡよりも、ｅＩＦ４Ｅに対してはるかに高い親和性を有すると記載された。
【０３８８】
本発明において特に好ましいそれぞれのキャップ類似体、すなわちｍ２'７，２'−ＯＧｐｐｓｐＧは、β−Ｓ−ＡＲＣＡと称される（国際公開第２００８／１５７６８８  Ａ２号；Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，２０１０，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．９６１−９７１）。したがって、本発明の一実施形態では、本発明のＲＮＡはβ−Ｓ−ＡＲＣＡで修飾される。β−Ｓ−ＡＲＣＡは次の構造で表される：
【化４】
2020537502.tif 000005
【０３８９】
一般に、架橋リン酸塩の酸素原子を硫黄原子に置き換えると、ＨＰＬＣでの溶出パターンに基づき、Ｄ１およびＤ２と称されるホスホロチオエートジアステレオマーをもたらす。簡単に言えば、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマー」または「β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）」は、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマー（β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２））と比較して、ＨＰＬＣカラムで最初に溶出し、したがってより短い保持時間を示すβ−Ｓ−ＡＲＣＡのジアステレオマーである。ＨＰＬＣによる立体化学的配置の決定は、国際公開第２０１１／０１５３４７  Ａ１号に記載されている。
【０３９０】
本発明の第１の特に好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）ジアステレオマーで修飾される。β−Ｓ−ＡＲＣＡの２つのジアステレオマーは、ヌクレアーゼに対する感受性が異なる。β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーを担持するＲＮＡは、Ｄｃｐ２切断に対してほぼ完全に耐性である（非修飾ＡＲＣＡ  ５'キャップの存在下で合成されたＲＮＡと比較して、わずか６％の切断）が、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）５'キャップを有するＲＮＡは、Ｄｃｐ２切断に対して中程度の感受性を示す（７１％の切断）ことが示されている。さらに、Ｄｃｐ２切断に対する安定性の増加は、哺乳動物細胞におけるタンパク質発現の増加と相関することも示されている。特に、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）キャップを担持するＲＮＡは、哺乳動物細胞においてβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）キャップを担持するＲＮＡよりも効率的に翻訳されることが示されている。したがって、本発明の一実施形態では、本発明のＲＮＡは、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ２ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する式（Ｉ）の置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置を特徴とする、式（Ｉ）に従うキャップ類似体で修飾される。その実施形態では、式（Ｉ）のＲ５はＳであり、Ｒ４およびＲ６はＯである。さらに、式（Ｉ）のＲ２またはＲ３の少なくとも一方は、好ましくはＯＨではなく、好ましくはＲ２およびＲ３の一方はメトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ２およびＲ３の他方は、好ましくはＯＨである。
【０３９１】
第２の特に好ましい実施形態では、本発明のＲＮＡは、β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）ジアステレオマーで修飾される。β−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ１）ジアステレオマーは、それぞれキャップされたＲＮＡを未成熟抗原提示細胞に移入すると、ＲＮＡの安定性を高め、ＲＮＡの翻訳効率を高め、ＲＮＡの翻訳を延長し、ＲＮＡの総タンパク質発現を増加させ、および／または前記ＲＮＡによってコードされる抗原または抗原ペプチドに対する免疫応答を増加させるのに特に適することが実証されている（Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．９６１−９７１）。したがって、本発明の代替的な実施形態では、本発明のＲＮＡは、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する式（Ｉ）の置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置を特徴とする、式（Ｉ）に従うキャップ類似体で修飾される。それぞれのキャップ類似体およびその実施形態は、国際公開第２０１１／０１５３４７  Ａ１号およびＫｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．９６１−９７１に記載されている。置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置がβ−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する、国際公開第２０１１／０１５３４７  Ａ１号に記載されている任意のキャップ類似体を本発明で使用し得る。好ましくは、式（Ｉ）のＲ５はＳであり、Ｒ４およびＲ６はＯである。さらに、式（Ｉ）のＲ２またはＲ３の少なくとも一方は、好ましくはＯＨではなく、好ましくはＲ２およびＲ３の一方はメトキシ（ＯＣＨ３）であり、Ｒ２およびＲ３の他方は、好ましくはＯＨである。
【０３９２】
一実施形態では、本発明のＲＮＡは、いずれか１つのリン酸基がボラノリン酸基またはホスホセレノエート基によって置換されている、式（Ｉ）に従う５'キャップ構造で修飾される。そのようなキャップは、インビトロおよびインビボの両方で安定性が増加している。場合により、それぞれの化合物は２'−Ｏ−または３'−Ｏ−アルキル基を有する（アルキルは、好ましくはメチルである）；それぞれのキャップ類似体は、ＢＨ３−ＡＲＣＡまたはＳｅ−ＡＲＣＡと称される。ｍＲＮＡのキャッピングに特に適する化合物には、国際公開第２００９／１４９２５３  Ａ２号に記載されている、β−ＢＨ３−ＡＲＣＡおよびβ−Ｓｅ−ＡＲＣＡが含まれる。これらの化合物については、β−Ｓ−ＡＲＣＡのＤ１ジアステレオマーのＰβ原子における立体化学的配置に対応する、式（Ｉ）の置換基Ｒ５を含むＰ原子における立体化学的配置が好ましい。
【０３９３】
ＵＴＲ
「非翻訳領域」または「ＵＴＲ」という用語は、転写されるがアミノ酸配列に翻訳されないＤＮＡ分子の領域、またはｍＲＮＡ分子などのＲＮＡ分子の対応する領域に関する。非翻訳領域（ＵＴＲ）は、オープンリーディングフレームの５'側（上流）（５'−ＵＴＲ）および／またはオープンリーディングフレームの３'側（下流）（３'−ＵＴＲ）に存在し得る。
【０３９４】
３'−ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の終結コドンの下流で、遺伝子の３'末端に位置するが、「３'−ＵＴＲ」という用語は、好ましくはポリ（Ａ）尾部を含まない。したがって、３'−ＵＴＲはポリ（Ａ）尾部（存在する場合）の上流にあり、例えばポリ（Ａ）尾部に直接隣接している。
【０３９５】
５'−ＵＴＲは、存在する場合、タンパク質コード領域の開始コドンの上流で、遺伝子の５'末端に位置する。５'−ＵＴＲは５'キャップ（存在する場合）の下流にあり、例えば５'キャップに直接隣接している。
【０３９６】
５'および／または３'非翻訳領域は、本発明によれば、これらの領域が、オープンリーディングフレームを含むＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を高めるような方法でオープンリーディングフレームと結合されるように、前記オープンリーディングフレームに機能的に連結され得る。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は、５'−ＵＴＲおよび／または３'−ＵＴＲを含む。
【０３９８】
好ましい実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は、
（１）５'−ＵＴＲ、
（２）オープンリーディングフレーム、および
（３）３'−ＵＴＲ
を含む。
【０３９９】
ＵＴＲは、ＲＮＡの安定性および翻訳効率に関与する。特定の５'および／または３'非翻訳領域（ＵＴＲ）を選択することによって、本明細書に記載の５'キャップおよび／または３'ポリ（Ａ）尾部に関する構造修飾に加えて、両方を改善することができる。ＵＴＲ内の配列エレメントは一般に、翻訳効率（主に５'−ＵＴＲ）およびＲＮＡ安定性（主に３'−ＵＴＲ）に影響を及ぼすと理解されている。レプリカーゼ構築物の翻訳効率および／または安定性を高めるために、活性な５'−ＵＴＲが存在することが好ましい。独立してまたはさらに、レプリカーゼ構築物の翻訳効率および／または安定性を高めるために、活性な３'−ＵＴＲが存在することが好ましい。
【０４００】
第１の核酸配列（例えばＵＴＲ）に関して、「翻訳効率を高めるために活性な」および／または「安定性を高めるために活性な」という用語は、第１の核酸配列が、第２の核酸配列を有する一般的な転写物において、前記第１の核酸配列の非存在下での前記第２の核酸配列の翻訳効率および／または安定性と比較して翻訳効率および／または安定性が増加するような方法で、前記第２の核酸配列の翻訳効率および／または安定性を改変できることを意味する。
【０４０１】
一実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質が由来するアルファウイルスに対して異種または非天然である５'−ＵＴＲおよび／または３'−ＵＴＲを含む。これは、非翻訳領域を所望の翻訳効率およびＲＮＡ安定性に従って設計することを可能にする。したがって、異種または非天然ＵＴＲは高度の柔軟性を可能にし、この柔軟性は、天然のアルファウイルスＵＴＲと比較して有利である。特に、アルファウイルス（天然）ＲＮＡは５'−ＵＴＲおよび／または３'−ＵＴＲも含むことが公知であるが、アルファウイルスＵＴＲは二重の機能を果たす、すなわち（ｉ）ＲＮＡ複製を駆動し、（ｉｉ）翻訳を駆動する。アルファウイルスＵＴＲは翻訳に非効率的であると報告されたが（Ｂｅｒｂｅｎ−Ｂｌｏｅｍｈｅｕｖｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２０８，ｐｐ．５８１−５８７）、典型的には、その二重機能のために、より効率的なＵＴＲに容易に置き換えることはできない。しかし、本発明では、トランスでの複製のためのレプリカーゼ構築物に含まれる５'−ＵＴＲおよび／または３'−ＵＴＲは、ＲＮＡ複製に対するそれらの潜在的な影響とは独立して選択することができる。
【０４０２】
好ましくは、本発明によるレプリカーゼ構築物は、ウイルス起源ではない、特にアルファウイルス起源ではない５'−ＵＴＲおよび／または３'−ＵＴＲを含む。一実施形態では、レプリカーゼ構築物は、真核生物５'−ＵＴＲに由来する５'−ＵＴＲおよび／または真核生物３'−ＵＴＲに由来する３'−ＵＴＲを含む。
【０４０３】
本発明による５'−ＵＴＲは、場合によりリンカーによって分離された、複数の核酸配列の任意の組合せを含み得る。本発明による３'−ＵＴＲは、場合によりリンカーによって分離された、複数の核酸配列の任意の組合せを含み得る。
【０４０４】
本発明による「リンカー」という用語は、２つの核酸配列を連結するために前記２つの核酸配列の間に付加される核酸配列に関する。リンカー配列に関する特定の制限はない。
【０４０５】
３'−ＵＴＲは、典型的には２００〜２０００ヌクレオチド、例えば５００〜１５００ヌクレオチドの長さである。免疫グロブリンｍＲＮＡの３'非翻訳領域は比較的短い（約３００ヌクレオチド未満）が、他の遺伝子の３'非翻訳領域は比較的長い。例えば、ｔＰＡの３'非翻訳領域は約８００ヌクレオチド長であり、第ＶＩＩＩ因子の３'非翻訳領域は約１８００ヌクレオチド長であり、エリスロポエチンの３'非翻訳領域は約５６０ヌクレオチド長である。哺乳動物ｍＲＮＡの３'非翻訳領域は、典型的にはＡＡＵＡＡＡヘキサヌクレオチド配列として公知の相同領域を有する。この配列はおそらくポリ（Ａ）付着シグナルであり、ポリ（Ａ）付着部位の１０〜３０塩基上流に位置することが多い。３'−非翻訳領域は、エキソリボヌクレアーゼに対するバリアとして働く、またはＲＮＡ安定性を高めることが公知のタンパク質（例えばＲＮＡ結合タンパク質）と相互作用するステムループ構造を与えるように折りたたむことができる、１つ以上の逆方向反復配列を含み得る。
【０４０６】
ヒトβグロビン３'−ＵＴＲ、特にヒトβグロビン３'−ＵＴＲの２つの連続する同一のコピーは、高い転写物安定性と翻訳効率に寄与する（Ｈｏｌｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９−４０１７）。したがって、一実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は、ヒトβグロビン３'−ＵＴＲの２つの連続する同一のコピーを含む。したがって、本発明によるレプリカーゼ構築物には、５'→３'方向に：（ａ）場合により５'−ＵＴＲ；（ｂ）オープンリーディングフレーム；（ｃ）ヒトβ−グロビン３'−ＵＴＲの２つの連続する同一のコピー、その断片、またはヒトβ−グロビン３'−ＵＴＲの変異体もしくはその断片を含む３'−ＵＴＲが含まれる。
【０４０７】
一実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は、翻訳効率および／または安定性を高めるために活性であるが、ヒトβ−グロビン３'−ＵＴＲ、その断片、またはヒトβ−グロビン３'−ＵＴＲの変異体もしくはその断片ではない３'−ＵＴＲを含む。
【０４０８】
一実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は、翻訳効率および／または安定性を高めるために活性である５'−ＵＴＲを含む。
【０４０９】
本発明によるＵＴＲ含有レプリカーゼ構築物は、例えばインビトロ転写によって調製することができる。これは、５'−ＵＴＲおよび／または３'−ＵＴＲを有するＲＮＡの転写を可能にするような方法で、鋳型核酸分子（例えばＤＮＡ）を遺伝子改変することによって達成され得る。
【０４１０】
図６に示すように、レプリコンはまた、５'−ＵＴＲおよび／または３'−ＵＴＲによって特徴付けることもできる。レプリコンのＵＴＲは、典型的にはアルファウイルスＵＴＲまたはその変異体である。
【０４１１】
ポリ（Ａ）配列
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリコンは３'−ポリ（Ａ）配列を含む。レプリコンが保存された配列エレメント４（ＣＳＥ  ４）を含む場合、レプリコンの３'−ポリ（Ａ）配列は、好ましくはＣＳＥ  ４の下流に存在し、最も好ましくはＣＳＥ  ４に直接隣接する。
【０４１２】
いくつかの実施形態では、本発明によるレプリカーゼ構築物は３'−ポリ（Ａ）配列を含む。
【０４１３】
本発明によれば、一実施形態では、ポリ（Ａ）配列は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも２６、好ましくは少なくとも４０、好ましくは少なくとも８０、好ましくは少なくとも１００、好ましくは最大５００、好ましくは最大４００、好ましくは最大３００、好ましくは最大２００、特に最大１５０個のＡヌクレオチド、特に約１２０個のＡヌクレオチドを含む、または本質的にこれらからなる、またはこれらからなる。この文脈において、「本質的に〜からなる」とは、ポリ（Ａ）配列のほとんどのヌクレオチド、典型的には「ポリ（Ａ）配列」のヌクレオチド数で少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％がＡヌクレオチド（アデニル酸）であるが、残りのヌクレオチドが、Ｕヌクレオチド（ウリジル酸）、Ｇヌクレオチド（グアニル酸）、Ｃヌクレオチド（シチジル酸）などのＡヌクレオチド以外のヌクレオチドであることを許容することを意味する。この文脈において、「からなる」とは、ポリ（Ａ）配列内のすべてのヌクレオチド、すなわちポリ（Ａ）配列内のヌクレオチド数の１００％がＡヌクレオチドであることを意味する。「Ａヌクレオチド」または「Ａ」という用語は、アデニル酸を指す。
【０４１４】
実際に、約１２０個のＡヌクレオチドの３'ポリ（Ａ）配列は、トランスフェクトされた真核細胞中のＲＮＡのレベル、および３'ポリ（Ａ）配列の上流（５'側）に存在するオープンリーディングフレームから翻訳されるタンパク質のレベルに有益な影響を及ぼすことが実証されている（Ｈｏｌｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９−４０１７）。
【０４１５】
アルファウイルスでは、少なくとも１１個の連続するアデニル酸残基、または少なくとも２５個の連続するアデニル酸残基の３'ポリ（Ａ）配列が、マイナス鎖の効率的な合成に重要であると考えられている。特に、アルファウイルスでは、少なくとも２５個の連続するアデニル酸残基の３'ポリ（Ａ）配列は、保存された配列エレメント４（ＣＳＥ  ４）と共に機能して（−）鎖の合成を促進すると理解されている（Ｈａｒｄｙ＆Ｒｉｃｅ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００５，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．４６３０−４６３９）。
【０４１６】
本発明は、コード鎖に相補的な鎖内に反復ｄＴヌクレオチド（デオキシチミジル酸）を含むＤＮＡ鋳型に基づいて、ＲＮＡの転写中、すなわちインビトロ転写ＲＮＡの生成中に付着される３'ポリ（Ａ）配列を提供する。ポリ（Ａ）配列（コード鎖）をコードするＤＮＡ配列は、ポリ（Ａ）カセットと称される。
【０４１７】
本発明の好ましい実施形態では、ＤＮＡのコード鎖に存在する３'ポリ（Ａ）カセットは、本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が均等に分布するランダム配列によって中断されている。そのようなランダム配列は、５〜５０、好ましくは１０〜３０、より好ましくは１０〜２０ヌクレオチドの長さであり得る。そのようなカセットは、国際公開第２０１６／００５００４  Ａ１号に開示されている。国際公開第２０１６／００５００４  Ａ１号に開示されている任意のポリ（Ａ）カセットを本発明で使用し得る。本質的にｄＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（ｄＡ、ｄＣ、ｄＧ、ｄＴ）が均等に分布し、例えば５から５０ヌクレオチドの長さを有するランダム配列によって中断されているポリ（Ａ）カセットは、ＤＮＡレベルでは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でプラスミドＤＮＡの一定な増殖を示し、ＲＮＡレベルでは、ＲＮＡの安定性と翻訳効率の支持に関する有益な特性とまだ関連する。
【０４１８】
結果として、本発明の好ましい実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ分子に含まれる３'ポリ（Ａ）配列は、本質的にＡヌクレオチドからなるが、４つのヌクレオチド（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）が均等に分布するランダム配列によって中断されている。そのようなランダム配列は、５〜５０、好ましくは１０〜３０、より好ましくは１０〜２０ヌクレオチドの長さであり得る。
【０４１９】
コドン使用頻度
一般に、遺伝暗号の縮重は、同じコード能力を維持しながら、ＲＮＡ配列に存在する特定のコドン（アミノ酸をコードする塩基トリプレット）を他のコドン（塩基トリプレット）で置換することを可能にする（置換するコドンは、置換されるコドンと同じアミノ酸をコードする）。本発明のいくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子に含まれるオープンリーディングフレームの少なくとも１つのコドンは、オープンリーディングフレームが由来する種のそれぞれのオープンリーディングフレーム内のそれぞれのコドンとは異なる。その実施形態では、オープンリーディングフレームのコード配列は「適合」または「改変」されていると言われる。レプリコンに含まれるオープンリーディングフレームのコード配列を適合させ得る。代替的または追加的に、レプリカーゼ構築物に含まれる機能性アルファウイルス非構造タンパク質のコード配列を適合させ得る。
【０４２０】
例えば、オープンリーディングフレームのコード配列を適合させる場合、高頻度で使用されるコドンを選択し得る：国際公開第２００９／０２４５６７  Ａ１号は、より高頻度で使用されるコドンによる希少なコドンの置換を含む、核酸分子のコード配列の適合を記載している。コドン使用頻度は宿主細胞または宿主生物に依存するため、この種の適合は、核酸配列を特定の宿主細胞または宿主生物での発現に適応させるのに適する。一般的に言えば、より高頻度で使用されるコドンは、典型的には宿主細胞または宿主生物においてより効率的に翻訳されるが、オープンリーディングフレームのすべてのコドンの適合が必ずしも必要とされるわけではない。
【０４２１】
例えば、オープンリーディングフレームのコード配列を適合させる場合、Ｇ（グアニル酸）残基とＣ（シチジル酸）残基の含有量は、各アミノ酸のＧＣリッチ含有量が最も高いコドンを選択することによって変更し得る。ＧＣリッチなオープンリーディングフレームを備えるＲＮＡ分子は、免疫活性化を低下させ、ＲＮＡの翻訳と半減期を改善する潜在的可能性を有することが報告されている（Ｔｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２３，１４５７−１４６５）。
【０４２２】
本発明によるレプリコンがアルファウイルス非構造タンパク質をコードする場合、アルファウイルス非構造タンパク質のコード配列は、所望に応じて適合させることができる。アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームはレプリコンの５'複製認識配列と重複しないため、この自由さが可能である。
【０４２３】
本発明の実施形態の安全性特徴
以下の特徴は、単独でまたは任意の適切な組合せで、本発明において好ましい：
好ましくは、本発明のレプリコンまたは系は、粒子形成性ではない。これは、本発明のレプリコンまたは系による宿主細胞の接種後、宿主細胞が、次世代ウイルス粒子などのウイルス粒子を産生しないことを意味する。一実施形態では、本発明によるすべてのＲＮＡ分子は、コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｐ６２、および／またはエンベロープタンパク質Ｅ１などのアルファウイルス構造タンパク質をコードする遺伝情報を全く含まない。本発明のこの態様は、構造タンパク質がトランス複製ヘルパーＲＮＡ上にコードされる先行技術の系よりも安全性に関して付加価値を提供する（例えばＢｒｅｄｅｎｂｅｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，１９９３，ｖｏｌ．６７，ｐｐ．６４３９−６４４６）。
【０４２４】
好ましくは、本発明の系は、コアヌクレオカプシドタンパク質Ｃ、エンベロープタンパク質Ｐ６２、および／またはエンベロープタンパク質Ｅ１などのアルファウイルス構造タンパク質を含まない。
【０４２５】
好ましくは、本発明の系のレプリコンとレプリカーゼ構築物は、互いに同一ではない。一実施形態では、レプリコンは機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードしない。一実施形態では、レプリカーゼ構築物は、（＋）鎖鋳型に基づく（−）鎖合成、および／または（−）鎖鋳型に基づく（＋）鎖合成に必要な少なくとも１つの配列エレメント（好ましくは少なくとも１つのＣＳＥ）を欠く。一実施形態では、レプリカーゼ構築物は、ＣＳＥ  １および／またはＣＳＥ  ４を含まない。
【０４２６】
好ましくは、本発明によるレプリコンも本発明によるレプリカーゼ構築物も、アルファウイルスパッケージングシグナルを含まない。例えば、ＳＦＶのｎｓＰ２のコード領域に含まれるアルファウイルスパッケージングシグナル（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７２，ｐｐ．４３２０−４３２６）は、例えば欠失または突然変異によって除去し得る。アルファウイルスパッケージングシグナルを除去する適切な方法には、ｎｓＰ２のコード領域のコドン使用頻度の適合が含まれる。遺伝暗号の縮重は、コードされるｎｓＰ２のアミノ酸配列に影響を及ぼすことなく、パッケージングシグナルの機能を欠失させることを可能にし得る。
【０４２７】
一実施形態では、本発明の系は単離された系である。その実施形態では、系は、哺乳動物細胞の内部などの細胞の内部に存在しないか、またはアルファウイルス構造タンパク質を含むコートの内部などのウイルスカプシドの内部に存在しない。一実施形態では、本発明の系はインビトロで存在する。
【０４２８】
ＤＮＡ
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるＲＮＡレプリコンをコードする核酸配列を含むＤＮＡを提供する。
【０４２９】
好ましくは、ＤＮＡは二本鎖である。
【０４３０】
好ましい実施形態では、本発明の第３の態様によるＤＮＡはプラスミドである。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は、一般に、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる染色体外遺伝物質の構築物、通常は環状ＤＮＡ二重鎖に関する。
【０４３１】
本発明のＤＮＡは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得るプロモータを含み得る。これは、コードされるＲＮＡ、例えば本発明のＲＮＡのインビボまたはインビトロでの転写を可能にする。ＩＶＴベクターは、インビトロ転写の鋳型として標準化された方法で使用し得る。本発明による好ましいプロモータの例は、ＳＰ６、Ｔ３またはＴ７ポリメラーゼのプロモータである。
【０４３２】
一実施形態では、本発明のＤＮＡは単離された核酸分子である。
【０４３３】
ＲＮＡを調製する方法
本発明による任意のＲＮＡ分子は、それが本発明の系の一部であってもなくても、インビトロ転写によって入手可能であり得る。インビトロ転写ＲＮＡ（ＩＶＴ−ＲＮＡ）は、本発明において特に興味深い。ＩＶＴ−ＲＮＡは、核酸分子（特にＤＮＡ分子）からの転写によって入手できる。本発明の第３の態様のＤＮＡ分子（１つまたは複数）は、特にＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって認識され得るプロモータを含む場合、そのような目的に適する。
【０４３４】
本発明によるＲＮＡは、インビトロで合成することができる。これは、インビトロ転写反応にキャップ類似体を添加することを可能にする。典型的には、ポリ（Ａ）尾部は、ＤＮＡ鋳型上のポリ（ｄＴ）配列によってコードされる。あるいは、キャッピングおよびポリ（Ａ）尾部の付加は、転写後に酵素的に達成することができる。
【０４３５】
インビトロ転写の方法は当業者に公知である。例えば、国際公開第２０１１／０１５３４７  Ａ１号に記載されているように、様々なインビトロ転写キットが市販されている。
【０４３６】
細胞を生成する方法およびそれによって生成される細胞
さらなる態様では、本発明は、Ｔ細胞またはその前駆細胞などの細胞に、本発明の１つ以上のＲＮＡレプリコンおよび場合により機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物、または前記ＲＮＡをコードするＤＮＡを形質導入することを含む、免疫反応性細胞などの細胞を生成する方法を提供する。
【０４３７】
一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する細胞を生成する方法であって、
（ａ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製されることができ、およびＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖（１つもしくは複数）をコードするオープンリーディングフレーム（１つもしくは複数）を含む、本発明による１つ以上のＲＮＡレプリコン、または前記ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）をコードする核酸配列を含むＤＮＡを得る工程、ならびに
（ｂ）前記ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）またはＤＮＡを細胞に接種する工程
を含む方法を提供する。
【０４３８】
さらなる実施形態では、本発明は、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する細胞を生成する方法であって、
（ａ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物またはこのＲＮＡ構築物をコードする核酸配列を含むＤＮＡを得る工程、
（ｂ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製されることができ、およびＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖（１つもしくは複数）をコードするオープンリーディングフレーム（１つもしくは複数）を含む、請求項１から１３、および１５のいずれか一項に記載の１つ以上のＲＮＡレプリコン、または前記ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）をコードする核酸配列を含むＤＮＡを得る工程、ならびに
（ｃ）ＲＮＡ構築物またはＤＮＡと、ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）またはＤＮＡとを細胞に共接種する工程
を含む方法を提供する。
【０４３９】
一実施形態では、トランスフェクトされた細胞は、１つ以上のトランスフェクトされたレプリコンおよび／もしくはトランスフェクトされたレプリカーゼ構築物によってコードされる機能性アルファウイルス非構造タンパク質、ならびに／または１つ以上のトランスフェクトされたレプリコンによってコードされるＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖（１つもしくは複数）を発現する。一実施形態では、細胞は、好ましくはその細胞表面に、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する。Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の異なる鎖は、同じレプリコンまたは異なるＲＮＡレプリコン上に存在する異なるオープンリーディングフレームによってコードされ得る。後者の実施形態では、異なるレプリコンは、好ましくは細胞に同時トランスフェクトされる。
【０４４０】
本方法の様々な実施形態では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物および／またはＲＮＡレプリコンは、ＲＮＡレプリコンが機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製されることができ、およびＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームを含む限り、本発明の系について上記で定義したとおりである。機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物およびＲＮＡレプリコンは、同じ時点で接種されてもよく、あるいは異なる時点で接種されてもよい。２番目の場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物は、典型的には最初の時点で接種され、レプリコンは、典型的にはより後の２番目の時点で接種される。その場合、レプリカーゼは細胞内で既に合成されているため、レプリコンは直ちに複製されると想定される。２番目の時点は、典型的には最初の時点のすぐ後、例えば最初の時点の１分後から２４時間後である。
【０４４１】
１つ以上の核酸分子を接種またはトランスフェクトできる細胞は、「宿主細胞」と称され得る。本発明によれば、「宿主細胞」という用語は、外因性核酸分子で形質転換またはトランスフェクトできる任意の細胞を指す。「細胞」という用語は、好ましくは無傷の細胞、すなわち酵素、細胞小器官、または遺伝物質などのその通常の細胞内成分を放出していない無傷の膜を有する細胞である。無傷の細胞は、好ましくは生存可能な細胞、すなわちその通常の代謝機能を実施することができる生細胞である。「宿主細胞」という用語は、本発明によれば、原核細胞（例えば大腸菌）または真核細胞（例えばヒトおよび動物細胞、植物細胞、酵母細胞および昆虫細胞）を含む。ヒト、マウス、ハムスター、ブタ、ウマ、ウシ、ヒツジおよびヤギを含む家畜、ならびに霊長動物由来の細胞などの哺乳動物細胞が特に好ましい。細胞は、多数の組織型に由来してもよく、初代細胞および細胞株を含み得る。具体的な例には、ケラチノサイト、末梢血白血球、骨髄幹細胞、および胚性幹細胞が含まれる。他の実施形態では、宿主細胞は、抗原提示細胞、特に樹状細胞、単球またはマクロファージである。核酸は、単一またはいくつかのコピーで宿主細胞に存在してもよく、一実施形態では、宿主細胞で発現される。
【０４４２】
細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。原核細胞は、本明細書では、例えば本発明によるＤＮＡの増殖に適し、真核細胞は、本明細書では、例えばレプリコンのオープンリーディングフレームの発現に適する。
【０４４３】
本発明の目的のために、「形質導入」または「トランスフェクション」などの用語は、インビトロまたはインビボでの細胞への核酸の導入または細胞による核酸の取り込みを指す。本発明によれば、本明細書に記載の核酸のトランスフェクションのための細胞は、インビトロまたはインビボで存在することができ、例えば細胞は、患者の器官、組織および／または生物の一部を形成することができる。本発明によれば、トランスフェクションは一過性または安定であり得る。トランスフェクションのいくつかの適用では、トランスフェクトされた遺伝物質が一過性に発現されるだけで十分である。トランスフェクションの過程で導入された核酸は、通常、核ゲノムに組み込まれないため、外来核酸は有糸分裂によって希釈されるかまたは分解される。核酸のエピソーム増幅を可能にする細胞は、希釈率を大幅に低下させる。トランスフェクトされた核酸が実際に細胞およびその娘細胞のゲノムに残ることが望ましい場合は、安定なトランスフェクションが起こらなければならない。ＲＮＡを細胞にトランスフェクトして、そのコードされたタンパク質を一過性に発現させることができる。
【０４４４】
本発明によれば、核酸を細胞に導入する、すなわち移入またはトランスフェクトするのに有用な任意の技術を使用し得る。好ましくは、ＲＮＡなどの核酸は、標準的な技術によって細胞にトランスフェクトされる。そのような技術には、エレクトロポレーション、リポフェクションおよびマイクロインジェクションが含まれる。本発明の１つの特に好ましい実施形態では、ＲＮＡはエレクトロポレーションによって細胞に導入される。エレクトロポレーションまたはエレクトロパーミアビリゼーションは、外部から印加された電場によって引き起こされる細胞形質膜の電気伝導率と透過性の有意な増加に関連する。通常、分子生物学では、細胞にある種の物質を導入する方法として使用される。本発明によれば、タンパク質またはペプチドをコードする核酸の細胞への導入は、前記タンパク質またはペプチドの発現をもたらすことが好ましい。
【０４４５】
インビボでの細胞のトランスフェクションのために、核酸を含む医薬組成物を使用し得る。核酸をＴ細胞などの特定の細胞に指向させる送達ビヒクルを患者に投与して、インビボでトランスフェクションを生じさせ得る。
【０４４６】
一実施形態では、細胞を生成する方法はインビトロ法である。一実施形態では、細胞を生成する方法は、手術または治療法によるヒトまたは動物被験体からの細胞の除去を含むかまたは含まない。
【０４４７】
この実施形態では、本発明に従って生成された細胞を被験体に投与し得る。細胞は、被験体に関して自己、同系、同種異系または異種であり得る。トランスフェクトされた細胞は、当技術分野で公知の任意の手段を使用して被験体に（再）導入し得る。
【０４４８】
他の実施形態では、細胞は、患者などの被験体に存在し得る。これらの実施形態では、細胞を生成する方法は、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ分子を被験体に投与することを含むインビボ法である。
【０４４９】
これに関して、本発明は、被験体においてＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する細胞を生成する方法であって、
（ａ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含み、機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製されることができ、およびＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖（１つもしくは複数）をコードするオープンリーディングフレーム（１つもしくは複数）を含む、本発明の１つ以上のＲＮＡレプリコン、または前記ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）をコードする核酸配列を含むＤＮＡを得る工程、ならびに
（ｂ）ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）またはＤＮＡを被験体に投与する工程
を含む方法も提供する。
【０４５０】
本方法の様々な実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、機能性アルファウイルス非構造タンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよびＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームを含み、ならびに機能性アルファウイルス非構造タンパク質によって複製されることができる限り、本発明のＲＮＡレプリコンについて上記で定義したとおりである。
【０４５１】
本発明は、被験体においてＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現する細胞を生成する方法であって、
（ａ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物またはこのＲＮＡ構築物をコードする核酸配列を含むＤＮＡを得る工程、
（ｂ）機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製されることができ、およびＴ細胞受容体もしくは人工Ｔ細胞受容体の鎖（１つもしくは複数）をコードするオープンリーディングフレーム（１つもしくは複数）を含む、本発明の１つ以上のＲＮＡレプリコン、または前記ＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）をコードする核酸配列を含むＤＮＡを得る工程、ならびに
（ｃ）ＲＮＡ構築物またはＤＮＡとＲＮＡレプリコン（１つもしくは複数）またはＤＮＡを被験体に投与する工程
を含む方法を提供する。
【０４５２】
本方法の様々な実施形態では、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物および／またはＲＮＡレプリコンは、ＲＮＡレプリコンが機能性アルファウイルス非構造タンパク質によってトランスで複製されることができ、およびＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の鎖をコードするオープンリーディングフレームを含む限り、本発明の系について上記で定義したとおりである。機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物およびＲＮＡレプリコンは、同じ時点で投与されてもよく、あるいは異なる時点で投与されてもよい。２番目の場合、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物は、典型的には最初の時点で投与され、ＲＮＡレプリコンは、典型的にはより後の２番目の時点で投与される。その場合、レプリカーゼは細胞内で既に合成されているため、レプリコンは直ちに複製されると想定される。２番目の時点は、典型的には最初の時点のすぐ後、例えば最初の時点の１分後から２４時間後である。好ましくは、ＲＮＡレプリコンおよび機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物が同じ標的組織または細胞に到達する可能性を高めるために、ＲＮＡレプリコンの投与は、機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物の投与と同じ部位で同じ投与経路を介して実施される。「部位」とは、被験体の身体の位置を指す。適切な部位は、例えば左腕、右腕などである。
【０４５３】
一実施形態では、さらなるＲＮＡ分子、好ましくはｍＲＮＡ分子を被験体に投与し得る。場合により、さらなるＲＮＡ分子は、Ｅ３などのＩＦＮを阻害するのに適したタンパク質をコードする。場合により、本発明によるレプリコンまたはレプリカーゼ構築物または系の投与の前に、さらなるＲＮＡ分子を投与し得る。
【０４５４】
本発明によるＲＮＡレプリコン、本発明による系、または本発明によるキット、または本発明による医薬組成物のいずれも、本発明に従って被験体において細胞を生成する方法で使用することができる。例えば、本発明の方法では、ＲＮＡは、例えば本発明に記載されるように、薬学的組成物の形態で、または裸のＲＮＡとして使用することができる。
【０４５５】
本発明の一実施形態では、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体は、機能性Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を生成するために細胞内で複合体を形成しなければならない２本のポリペプチド鎖などの、複数のポリペプチド鎖を含み得る。したがって、本発明は、ＲＮＡレプリコンのセットがＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の異なる鎖をコードする実施形態を含む。例えば、異なるＲＮＡレプリコンは、前記Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の異なる鎖をコードする異なるオープンリーディングフレームを含み得る。これらの異なるＲＮＡレプリコン、すなわちＲＮＡレプリコンのセットは、機能性Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を提供するために細胞に共接種され得る（場合により機能性アルファウイルス非構造タンパク質を発現するためのＲＮＡ構築物と共に）。
【０４５６】
細胞
本発明によれば、抗原受容体をコードする核酸を、Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞または溶解能を有する他の細胞、特にリンパ系細胞に導入することが特に好ましい。
【０４５７】
本発明の文脈において「免疫反応性細胞」または「免疫エフェクター細胞」という用語は、免疫反応中にエフェクター機能を発揮する細胞に関する。「免疫反応性細胞」は、好ましくは、細胞の表面に発現される抗原などの抗原に結合し、免疫応答を媒介することができる。例えば、そのような細胞は、サイトカインおよび／またはケモカインを分泌し、微生物を死滅させ、抗体を分泌し、感染細胞または癌性細胞を認識し、場合によりそのような細胞を排除する。例えば、免疫反応性細胞には、Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、腫瘍浸潤Ｔ細胞）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞、好中球、マクロファージ、および樹状細胞が含まれる。好ましくは、本発明の文脈において、「免疫反応性細胞」はＴ細胞、好ましくはＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。本発明によれば、「免疫反応性細胞」という用語は、適切な刺激で免疫細胞（Ｔ細胞、特にＴヘルパー細胞、または細胞溶解性Ｔ細胞など）に成熟できる細胞も含む。免疫反応性細胞には、ＣＤ３４＋造血幹細胞、未成熟および成熟Ｔ細胞ならびに未成熟および成熟Ｂ細胞が含まれる。Ｔ細胞前駆体の細胞溶解性Ｔ細胞への分化は、抗原に暴露された場合、免疫系のクローン選択に類似する。
【０４５８】
好ましくは、「免疫反応性細胞」または「免疫エフェクター細胞」は、特に抗原提示細胞または癌細胞などの疾患細胞の表面に存在する場合、ある程度の特異性で抗原を認識する。好ましくは、前記認識は、抗原を認識する細胞が応答性または反応性になることを可能にする。細胞がヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）である場合、そのような応答性または反応性は、サイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み得る。細胞がＣＴＬである場合、そのような応答性または反応性は、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介した、細胞、すなわち抗原の発現を特徴とする細胞の除去を含み得る。本発明によれば、ＣＴＬ応答性は、持続的なカルシウム流動、細胞分裂、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生、ＣＤ４４およびＣＤ６９などの活性化マーカーの上方調節、ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解死滅を含み得る。ＣＴＬ応答性はまた、ＣＴＬ応答性を正確に示す人工レポータを使用して判定し得る。抗原を認識し、応答性または反応性であるそのようなＣＴＬは、本明細書では「抗原応答性ＣＴＬ」とも称される。
【０４５９】
本発明の文脈において「免疫エフェクター機能」または「エフェクター機能」という用語は、例えば腫瘍細胞などの疾患細胞の死滅、または腫瘍の播種および転移の抑制を含む腫瘍成長の阻害および／もしくは腫瘍発生の阻害をもたらす免疫系の成分によって媒介される任意の機能を含む。好ましくは、本発明の文脈における免疫エフェクター機能は、Ｔ細胞媒介エフェクター機能である。そのような機能は、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）の場合、インターロイキン２などのサイトカインの放出ならびに／またはＣＤ８＋リンパ球（ＣＴＬ）および／もしくはＢ細胞の活性化を含み、ＣＴＬの場合、例えばアポトーシスまたはパーフォリン媒介細胞溶解を介した、細胞、すなわち抗原の発現を特徴とする細胞の除去、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αなどのサイトカインの産生、ならびに抗原を発現する標的細胞の特異的細胞溶解死滅を含む。
【０４６０】
本発明に関連して使用される細胞は、好ましくは免疫エフェクター細胞であり、免疫エフェクター細胞は、好ましくはＴ細胞である。特に、本明細書で使用される細胞は、好ましくは細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞から選択される細胞傷害性リンパ球である。活性化／刺激すると、これらの細胞傷害性リンパ球はそれぞれ標的細胞の破壊を引き起こす。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、以下の手段のいずれかまたは両方によって標的細胞の破壊を引き起こす。まず、活性化すると、Ｔ細胞は、パーフォリン、グランザイム、およびグラニュライシンなどの細胞毒を放出する。パーフォリンおよびグラニュライシンは標的細胞に孔を作り、グランザイムは細胞に進入して、細胞のアポトーシス（プログラム細胞死）を誘発する細胞質のカスパーゼカスケードを引き起こす。第二に、アポトーシスは、Ｔ細胞と標的細胞との間のＦａｓ−Ｆａｓリガンド相互作用を介して誘導され得る。Ｔ細胞および他の細胞傷害性リンパ球は、好ましくは自己細胞であるが、異種細胞または同種異系細胞を使用することができる。
【０４６１】
「Ｔ細胞」および「Ｔリンパ球」という用語は、本明細書では互換的に使用され、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）および細胞溶解性Ｔ細胞を含む細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、ＣＤ８＋Ｔ細胞）を含む。
【０４６２】
本発明に従って使用されるＴ細胞は、内因性Ｔ細胞受容体を発現してもよく、または内因性Ｔ細胞受容体の発現を欠いてもよい。
【０４６３】
キット
本発明はまた、本発明の第１の態様によるＲＮＡレプリコンまたは本発明の第２の態様による系を含むキットを提供する。
【０４６４】
一実施形態では、キットの構成要素は別個の実体として存在する。例えば、キットの１つの核酸分子が１つの実体に存在し、キットの別の核酸が別の実体に存在してもよい。例えば、開放容器または閉鎖容器は適切な実体である。閉鎖容器が好ましい。使用される容器は、好ましくはＲＮアーゼ不含であるかまたは本質的にＲＮアーゼ不含であるべきである。
【０４６５】
一実施形態では、本発明のキットは、細胞への接種および／またはヒトもしくは動物被験体への投与のためのＲＮＡを含む。
【０４６６】
本発明によるキットは、場合によりラベルまたは他の形態の情報要素、例えば電子データキャリアを含む。ラベルまたは情報要素は、好ましくは指示書、例えば印刷された書面による指示書、または場合により印刷可能な電子形式の指示書を含む。説明書には、キットの少なくとも１つの適切で可能な使用に言及し得る。
【０４６７】
医薬組成物
本明細書に記載の核酸および細胞などの作用物質および組成物は、任意の適切な医薬組成物の形態で投与され得る。
【０４６８】
本発明の医薬組成物は、好ましくは無菌であり、所望の反応または所望の効果を生じさせるために、本明細書に記載の作用物質および場合により本明細書で論じるさらなる作用物質の有効量を含む。
【０４６９】
医薬組成物は通常、均一な剤形で提供され、それ自体公知の方法で調製され得る。医薬組成物は、例えば溶液または懸濁液の形態であり得る。
【０４７０】
医薬組成物は、塩、緩衝物質、防腐剤、担体、希釈剤および／または賦形剤を含んでもよく、そのすべてが、好ましくは薬学的に許容される。「薬学的に許容される」という用語は、医薬組成物の活性成分の作用と相互作用しない物質の非毒性を指す。
【０４７１】
薬学的に許容されない塩は、薬学的に許容される塩を調製するために使用されてもよく、本発明に含まれる。この種の薬学的に許容される塩は、非限定的に、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製される塩を含む。薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカリ土類金属塩としても調製され得る。
【０４７２】
医薬組成物での使用に適する緩衝物質には、塩中の酢酸、塩中のクエン酸、塩中のホウ酸、および塩中のリン酸が含まれる。
【０４７３】
医薬組成物での使用に適する防腐剤には、塩化ベンザルコニウム、クロロブタノール、パラベンおよびチメロサールが含まれる。
【０４７４】
注射製剤は、乳酸リンゲルなどの薬学的に許容される賦形剤を含み得る。
【０４７５】
「担体」という用語は、適用を容易にする、増強するまたは可能にするために活性成分が組み合わされる、天然または合成の有機または無機成分を指す。本発明によれば、「担体」という用語は、患者への投与に適する１つ以上の適合性の固体もしくは液体充填剤、希釈剤または封入物質も含む。
【０４７６】
非経口投与のための可能な担体物質は、例えば滅菌水、リンゲル液、乳酸リンゲル液、滅菌塩化ナトリウム溶液、ポリアルキレングリコール、水素化ナフタレンおよび、特に生体適合性ラクチドポリマー、ラクチド／グリコリドコポリマーまたはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレンコポリマーである。
【０４７７】
本明細書で使用される場合「賦形剤」という用語は、例えば担体、結合剤、潤滑剤、増粘剤、界面活性剤、防腐剤、乳化剤、緩衝剤、香味剤、または着色剤などの、活性成分ではない医薬組成物中に存在し得るすべての物質を示すことが意図されている。
【０４７８】
一実施形態では、医薬組成物が核酸を含む場合、少なくとも１つのカチオン性実体を含む。一般に、カチオン性脂質、カチオン性ポリマーおよび正電荷を有する他の物質は、負に帯電した核酸と複合体を形成し得る。カチオン性化合物、好ましくは、例えばカチオン性またはポリカチオン性ペプチドまたはタンパク質などのポリカチオン性化合物との複合体化によって、本発明によるＲＮＡを安定化することが可能である。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、プロタミン、ポリエチレンイミン、ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｌ−アルギニン、ヒストンまたはカチオン性脂質からなる群より選択される少なくとも１つのカチオン性分子を含む。
【０４７９】
本発明によれば、カチオン性脂質は、カチオン性両親媒性分子、例えば少なくとも１つの親水性および親油性部分を含む分子である。カチオン性脂質は、モノカチオン性またはポリカチオン性であり得る。カチオン性脂質は、典型的にはステロール鎖、アシル鎖またはジアシル鎖などの親油性部分を有し、全体として正味の正電荷を有する。脂質の頭部基は、典型的には正電荷を担持する。カチオン性脂質は、好ましくは１〜１０価の正電荷、より好ましくは１〜３価の正電荷、より好ましくは１価の正電荷を有する。カチオン性脂質の例には、１，２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＴＡＰ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、１，２−ジアシルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン、１，２−ジアルキルオキシ−３−ジメチルアンモニウムプロパン、ジオクタデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、１，２−ジミリストイルオキシプロピル−１，３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＭＲＩＥ）、および２，３−ジオレオイルオキシ−Ｎ−［２（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミウムトリフルオロアセテート（ＤＯＳＰＡ）が含まれるが、これらに限定されない。カチオン性脂質には、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含む第三級アミン基を有する脂質も含まれる。カチオン性脂質は、リポソーム、エマルジョンおよびリポプレックスなどの本明細書に記載の脂質製剤にＲＮＡを配合するのに適する。典型的には、正電荷には少なくとも１つのカチオン性脂質が寄与し、負電荷にはＲＮＡが寄与する。一実施形態では、医薬組成物は、カチオン性脂質に加えて、少なくとも１つのヘルパー脂質を含む。ヘルパー脂質は中性またはアニオン性脂質であり得る。ヘルパー脂質は、リン脂質などの天然脂質、または天然脂質の類似体、または完全合成脂質、または天然脂質と類似性のない脂質様分子であり得る。医薬組成物がカチオン性脂質とヘルパー脂質の両方を含む場合、カチオン性脂質対中性脂質のモル比は、製剤の安定性などを考慮して適切に決定することができる。
【０４８０】
一実施形態では、本発明による医薬組成物はプロタミンを含む。本発明によれば、プロタミンはカチオン性担体剤として有用である。「プロタミン」という用語は、アルギニンに富み、魚類などの動物の精子細胞中で体細胞ヒストンの代わりに特にＤＮＡと会合して見出される、比較的低分子量の様々な強塩基性タンパク質のいずれかを指す。特に、「プロタミン」という用語は、強塩基性で、水に可溶性であり、熱によって凝固せず、複数のアルギニンモノマーを含む、魚類の精子中で見出されるタンパク質を指す。本発明によれば、本明細書で使用される「プロタミン」という用語は、その断片を含む、天然源または生物源から得られるまたはそれに由来する任意のプロタミンアミノ酸配列、および前記アミノ酸配列またはその断片の多量体形態を含むことが意図されている。さらに、この用語は、人工的であり、特定の目的のために特別に設計され、天然源または生物源から単離することができない（合成された）ポリペプチドを包含する。
【０４８１】
本発明による医薬組成物は、緩衝することができる（例えば酢酸緩衝液、クエン酸緩衝液、コハク酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝液を用いて）。
【０４８２】
ＲＮＡ含有粒子
いくつかの実施形態では、保護されていないＲＮＡの不安定性のため、本発明のＲＮＡ分子を複合体化形態または封入形態で提供することが有利である。それぞれの医薬組成物が本発明で提供される。特に、いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、核酸含有粒子、好ましくはＲＮＡ含有粒子を含む。それぞれの医薬組成物は、粒子製剤と称される。本発明による粒子製剤では、粒子は、本発明による核酸と、核酸の送達に適した薬学的に許容される担体または薬学的に許容されるビヒクルとを含む。核酸含有粒子は、例えばタンパク質性粒子の形態または脂質含有粒子の形態であり得る。適切なタンパク質または脂質は、粒子形成剤と称される。タンパク質性粒子および脂質含有粒子は、粒子形態のアルファウイルスＲＮＡの送達に適することが以前に記載されている（例えばＳｔｒａｕｓｓ＆Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，１９９４，ｖｏｌ．５８，ｐｐ．４９１−５６２）。特に、アルファウイルス構造タンパク質（例えばヘルパーウイルスによって提供される）は、タンパク質性粒子の形態でＲＮＡを送達するための適切な担体である。
【０４８３】
本発明による系が粒子製剤として製剤化される場合、各ＲＮＡ種（例えばレプリコン、レプリカーゼ構築物、および場合によりＩＦＮを阻害するのに適したタンパク質をコードするＲＮＡなどのさらなるＲＮＡ種）を個々の粒子製剤として別々に製剤化することが可能である。その場合、個々の粒子製剤はそれぞれ１つのＲＮＡ種を含む。個々の粒子製剤は、例えば別々の容器中に、別々の実体として存在し得る。そのような製剤は、粒子形成剤と共に各ＲＮＡ種を別々に（典型的にはそれぞれＲＮＡ含有溶液の形態で）提供し、それにより粒子の形成を可能にすることによって得られる。それぞれの粒子は、粒子が形成されるときに提供される特定のＲＮＡ種のみを含む（個々の粒子製剤）。
【０４８４】
一実施形態では、本発明による医薬組成物は、複数の個別粒子製剤を含む。それぞれの医薬組成物は、混合粒子製剤と称される。本発明による混合粒子製剤は、上記のように、個々の粒子製剤を別々に形成し、その後個々の粒子製剤を混合する工程によって得られる。混合の工程によって、ＲＮＡ含有粒子の混合集団を含む１つの製剤が得られる（説明のために、例えば粒子の第１の集団は本発明によるレプリコンを含み、粒子の第２の集団は本発明によるレプリカーゼ構築物を含み得る）。個々の粒子集団は、個々の粒子製剤の混合集団を含む１つの容器に一緒に存在し得る。
【０４８５】
あるいは、医薬組成物のすべてのＲＮＡ種（例えばレプリコン、レプリカーゼ構築物、および場合によりＩＦＮを阻害するのに適したタンパク質をコードするＲＮＡなどのさらなる種）を組合せ粒子製剤として一緒に製剤化することが可能である。そのような製剤は、粒子形成剤と共にすべてのＲＮＡ種の組合せ製剤（典型的には組合せ溶液）を提供し、それにより粒子の形成を可能にすることによって得られる。混合粒子製剤とは対照的に、組合せ粒子製剤は、典型的には複数のＲＮＡ種を含む粒子を含む。組合せ粒子組成物では、異なるＲＮＡ種が、典型的には単一の粒子中に一緒に存在する。
【０４８６】
一実施形態では、本発明の粒子製剤は、ナノ粒子製剤である。その実施形態では、本発明による組成物は、ナノ粒子の形態の本発明による核酸を含む。ナノ粒子製剤は、様々なプロトコルにより、様々な複合体化合物を用いて入手できる。脂質、ポリマー、オリゴマー、または両親媒性物質は、ナノ粒子製剤の典型的な構成要素である。
【０４８７】
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、粒子を、特に核酸の全身投与、特に非経口投与に適したものにする直径、典型的には１０００ナノメートル（ｎｍ）以下の直径を有する任意の粒子を指す。一実施形態では、ナノ粒子は、約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍ、好ましくは約５０ｎｍ〜約４００ｎｍ、好ましくは約１００ｎｍ〜約３００ｎｍ、例えば約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲の平均直径を有する。一実施形態では、ナノ粒子は、約２００〜約７００ｎｍ、約２００〜約６００ｎｍ、好ましくは約２５０〜約５５０ｎｍ、特に約３００〜約５００ｎｍまたは約２００〜約４００ｎｍの範囲の直径を有する。
【０４８８】
一実施形態では、動的光散乱によって測定される、本明細書に記載のナノ粒子の多分散指数（ＰＩ）は、０．５以下、好ましくは０．４以下、さらにより好ましくは０．３以下である。「多分散指数」（ＰＩ）は、粒子混合物中の個々の粒子（リポソームなど）の均一または不均一なサイズ分布の測定値であり、混合物中の粒子分布の幅を示す。ＰＩは、例えば、国際公開第２０１３／１４３５５５  Ａ１号に記載されているように決定することができる。
【０４８９】
本明細書で使用される場合、「ナノ粒子製剤」という用語または同様の用語は、少なくとも１つのナノ粒子を含む任意の粒子製剤を指す。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、ナノ粒子の均一な集合体である。いくつかの実施形態では、ナノ粒子組成物は、リポソーム製剤またはエマルジョンなどの脂質含有医薬製剤である。
【０４９０】
脂質含有医薬組成物
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの脂質を含む。好ましくは、少なくとも１つの脂質はカチオン性脂質である。前記脂質含有医薬組成物は、本発明による核酸を含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、小胞、例えばリポソーム中に封入されたＲＮＡを含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、エマルジョンの形態のＲＮＡを含む。一実施形態では、本発明による医薬組成物は、カチオン性化合物との複合体中にＲＮＡを含み、それにより、例えばいわゆるリポプレックスまたはポリプレックスを形成する。リポソームなどの小胞内へのＲＮＡの封入は、例えば脂質／ＲＮＡ複合体とは異なる。脂質／ＲＮＡ複合体は、例えば、ＲＮＡを、例えばあらかじめ形成されたリポソームと混合する場合に得られる。
【０４９１】
一実施形態では、本発明による医薬組成物は、小胞に封入されたＲＮＡを含む。そのような製剤は、本発明による特定の粒子製剤である。小胞は、小さな空間を囲み、その空間を小胞の外側の空間から分離する、球状の殻に取り巻かれた脂質二重層である。典型的には、小胞内部の空間は水性空間であり、すなわち水を含む。典型的には、小胞の外側の空間は水性空間であり、すなわち水を含む。脂質二重層は、１つ以上の脂質（小胞形成脂質）によって形成される。小胞を取り囲む膜は、細胞膜のものと類似のラメラ相である。本発明による小胞は、多層小胞、単層小胞、またはそれらの混合物であり得る。小胞に封入されると、ＲＮＡは、典型的には外部媒体から分離される。したがって、ＲＮＡは、機能的に天然アルファウイルスの保護された形態と同等の、保護された形態で存在する。適切な小胞は、本明細書に記載の粒子、特にナノ粒子である。
【０４９２】
例えば、ＲＮＡはリポソームに封入され得る。その実施形態では、医薬組成物はリポソーム製剤であるかまたはそれを含む。リポソーム内への封入は、典型的にはＲＮＡをＲＮアーゼ消化から保護する。リポソームは一部の外部ＲＮＡを含む（例えばその表面に）が、ＲＮＡの少なくとも半分（理想的にはそのすべて）をリポソームのコア内に封入することが可能である。
【０４９３】
リポソームは、リン脂質などの小胞形成脂質の１つ以上の二重層を有することが多い顕微鏡的脂質小胞であり、薬物、例えばＲＮＡを封入することができる。多重層小胞（ＭＬＶ）、小型単層小胞（ＳＵＶ）、大型単層小胞（ＬＵＶ）、立体的に安定化されたリポソーム（ＳＳＬ）、多小胞性小胞（ＭＶ）および大型多小胞性小胞（ＬＭＶ）、ならびに当技術分野で公知の他の二重層形態を含むがこれらに限定されない、様々な種類のリポソームを本発明の文脈において使用し得る。リポソームのサイズとラメラ性は、調製方法に依存する。単層からなるラメラ相、六方相および逆六方相、立方相、ミセル、逆ミセルを含む脂質が水性媒体中に存在し得る、超分子構造のいくつかの他の形態が存在する。これらの相は、ＤＮＡまたはＲＮＡと組み合わせて得ることもでき、ＲＮＡおよびＤＮＡとの相互作用は、相状態に実質的に影響を及ぼし得る。そのような相は、本発明のナノ粒子ＲＮＡ製剤中に存在し得る。
【０４９４】
リポソームは、当業者に公知の標準的な方法を使用して形成され得る。それぞれの方法には、逆蒸発法、エタノール注入法、脱水−再水和法、超音波処理または他の適切な方法が含まれる。リポソームの形成後に、リポソームをサイズ分類して、実質的に均一なサイズ範囲を有するリポソームの集団を得ることができる。
【０４９５】
本発明の好ましい実施形態では、ＲＮＡは、少なくとも１つのカチオン性脂質を含むリポソーム中に存在する。それぞれのリポソームは、少なくとも１つのカチオン性脂質が使用されることを条件として、単一の脂質からまたは脂質の混合物から形成され得る。好ましいカチオン性脂質は、プロトン化され得る窒素原子を有し、好ましくは、そのようなカチオン性脂質は、第三級アミン基を有する脂質である。第三級アミン基を有する特に適切な脂質は、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）である。一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１２／００６３７８  Ａ１号に記載されているリポソーム製剤中に存在し、リポソームは、ＲＮＡを含む水性コアを封入する脂質二重層を有し、脂質二重層は、好ましくは第三級アミン基を有する、５．０〜７．６の範囲のｐＫａを有する脂質を含む。第三級アミン基を有する好ましいカチオン性脂質には、ＤＬｉｎＤＭＡ（ｐＫａ  ５．８）が含まれ、国際公開第２０１２／０３１０４６  Ａ２号に一般的に記載されている。国際公開第２０１２／０３１０４６  Ａ２号によれば、それぞれの化合物を含むリポソームは、ＲＮＡの封入、したがってＲＮＡのリポソーム送達に特に適する。一実施形態では、本発明によるＲＮＡはリポソーム製剤中に存在し、リポソームは、その頭部基が、プロトン化され得る少なくとも１つの窒素原子（Ｎ）を含む少なくとも１つのカチオン性脂質を含み、リポソームおよびＲＮＡは、１：１〜２０：１のＮ：Ｐ比を有する。本発明によれば、「Ｎ：Ｐ比」は、国際公開第２０１３／００６８２５  Ａ１号に記載されているように、カチオン性脂質中の窒素原子（Ｎ）対脂質含有粒子（例えばリポソーム）に含まれるＲＮＡ中のリン酸原子（Ｐ）のモル比を指す。１：１〜２０：１のＮ：Ｐ比は、リポソームの正味電荷および脊椎動物細胞へのＲＮＡの送達効率に関与する。
【０４９６】
一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む少なくとも１つの脂質を含むリポソーム製剤中に存在し、ＲＮＡは、国際公開第２０１２／０３１０４３  Ａ１号および国際公開第２０１３／０３３５６３  Ａ１号に記載されているように、ＰＥＧ部分がリポソームの外側に存在するようにＰＥＧ化リポソーム内に封入される。
【０４９７】
一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１２／０３０９０１  Ａ１号に記載されているように、リポソームが６０〜１８０ｎｍの範囲の直径を有するリポソーム製剤中に存在する。
【０４９８】
一実施形態では、本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１３／１４３５５５  Ａ１号に開示されているように、ＲＮＡ含有リポソームがゼロに近いまたは負の正味電荷を有するリポソーム製剤中に存在する。
【０４９９】
他の実施形態では、本発明によるＲＮＡはエマルジョンの形態で存在する。エマルジョンは、ＲＮＡ分子などの核酸分子を細胞に送達するために使用されることが以前に記載されている。本明細書では、水中油型エマルジョンが好ましい。それぞれのエマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。本発明によるＲＮＡがエマルジョン粒子に複合体化されているカチオン性水中油型エマルジョンがより好ましい。エマルジョン粒子は、油コアおよびカチオン性脂質を含む。カチオン性脂質は負に帯電したＲＮＡと相互作用することができ、それによってＲＮＡをエマルジョン粒子に固定する。水中油型エマルジョンでは、エマルジョン粒子は水性連続相に分散している。例えば、エマルジョン粒子の平均直径は、典型的には約８０ｎｍ〜１８０ｎｍであり得る。一実施形態では、本発明の医薬組成物はカチオン性水中油型エマルジョンであり、エマルジョン粒子は、国際公開第２０１２／００６３８０  Ａ２号に記載されているように、油コアおよびカチオン性脂質を含む。本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１３／００６８３４  Ａ１号に記載されているように、Ｎ：Ｐ比が少なくとも４：１である、カチオン性脂質を含むエマルジョンの形態で存在し得る。本発明によるＲＮＡは、国際公開第２０１３／００６８３７  Ａ１号に記載されているように、カチオン性脂質エマルジョンの形態で存在し得る。特に、組成物は、カチオン性水中油型エマルジョンの粒子と複合体化したＲＮＡを含んでもよく、油／脂質の比は少なくとも約８：１（モル：モル）である。
【０５００】
他の実施形態では、本発明による医薬組成物は、リポプレックスの形式のＲＮＡを含む。「リポプレックス」または「ＲＮＡリポプレックス」という用語は、脂質と、ＲＮＡなどの核酸との複合体を指す。リポプレックスは、カチオン性（正に帯電した）リポソームとアニオン性（負に帯電した）核酸で形成され得る。カチオン性リポソームは、中性の「ヘルパー」脂質も含み得る。最も単純な場合には、特定の混合プロトコルで核酸とリポソームを混合することによってリポプレックスが自発的に形成されるが、他の様々なプロトコルも適用し得る。正に帯電したリポソームと負に帯電した核酸との間の静電的相互作用が、リポプレックス形成の駆動力であることが理解されている（国際公開第２０１３／１４３５５５  Ａ１号）。本発明の一実施形態では、ＲＮＡリポプレックス粒子の正味電荷はゼロに近いかまたは負である。ＲＮＡおよびリポソームの電気的に中性または負に帯電したリポプレックスは、全身投与後に脾臓樹状細胞（ＤＣ）における実質的なＲＮＡ発現をもたらし、正に帯電したリポソームおよびリポプレックスについて報告されている毒性の増加には関連しないことが公知である（国際公開第２０１３／１４３５５５  Ａ１号参照）。したがって、本発明の一実施形態では、本発明による医薬組成物は、（ｉ）ナノ粒子中の正電荷の数がナノ粒子中の負電荷の数を超えず、および／または（ｉｉ）ナノ粒子が中性もしくは正味の負電荷を有し、および／または（ｉｉｉ）ナノ粒子の正電荷対負電荷の電荷比が１．４：１以下であり、および／または（ｉｖ）ナノ粒子のゼータ電位が０以下である、ナノ粒子、好ましくはリポプレックスナノ粒子の形式のＲＮＡを含む。国際公開第２０１３／１４３５５５  Ａ１号に記載されているように、ゼータ電位は、コロイド系の界面動電位の科学用語である。本発明では、（ａ）ゼータ電位および（ｂ）ナノ粒子中のＲＮＡに対するカチオン性脂質の電荷比は、両方とも、国際公開第２０１３／１４３５５５  Ａ１号に開示されているように計算することができる。要約すると、国際公開第２０１３／１４３５５５  Ａ１号に開示されているように、粒子の正味電荷がゼロに近いかまたは負である、規定の粒径を有するナノ粒子リポプレックス製剤である医薬組成物が、本発明の文脈において好ましい医薬組成物である。
【０５０１】
治療的処置
被験体に投与される能力を考慮して、本発明によるＲＮＡレプリコン、本発明による系、本発明によるＤＮＡ、本発明による細胞、本発明によるキット、または本発明による医薬組成物の各々は、「薬剤」などと称され得る。本発明は、本発明のＲＮＡレプリコン、系、ＤＮＡ、細胞、キット、または医薬組成物が薬剤として使用するために提供されることを予測する。
【０５０２】
薬剤は、被験体を治療するために使用することができる。「治療する」とは、本明細書に記載の化合物または組成物または他の実体を被験体に投与することを意味する。この用語には、療法によってヒトまたは動物の身体を治療する方法が含まれる。
【０５０３】
「治療」または「治療的処置」という用語は、好ましくは個体の健康状態を改善する、および／または寿命を延長させる（増加させる）任意の治療に関する。前記治療は、個体の疾患を除去し、個体の疾患の発症を停止もしくは遅延させ、個体の疾患の発症を阻害もしくは遅延させ、個体の症状の頻度もしくは重症度を減少させ、および／または現在疾患を有しているかもしくは以前に有していたことがある個体の再発を減少させ得る。
【０５０４】
「予防的治療」または「予防的処置」という用語は、個体において疾患が発生するのを防ぐことを意図した任意の治療に関する。「予防的治療」または「予防的処置」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【０５０５】
特に、細胞、特に本明細書に記載のＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を発現するように操作されたＴ細胞などの免疫エフェクター細胞は、被験体において免疫応答を提供するのに有用であり、特にＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体が標的とする抗原の発現を特徴とする疾患の治療に有用である。
【０５０６】
「免疫応答を提供する」とは、免疫応答を提供する前には特定の標的抗原、標的細胞および／または標的組織に対する免疫応答がなかったことを意味し得るが、また、免疫応答を提供する前に特定の標的抗原、標的細胞および／または標的組織に対する一定のレベルの免疫応答があり、免疫応答を提供した後、前記免疫応答が増強されることも意味し得る。したがって、「免疫応答を提供する」には、「免疫応答を誘導する」および「免疫応答を増強する」が含まれる。好ましくは、被験体において免疫応答を提供した後、前記被験体は癌疾患などの疾患を発症することから保護されるか、または免疫応答を提供することによって疾患状態が改善される。例えば、腫瘍抗原に対する免疫応答は、癌疾患を有する患者、または癌疾患を発症する危険性がある被験体において提供され得る。この場合の免疫応答の提供は、被験体の疾患状態が改善されること、被験体が転移を発症しないこと、または癌疾患を発症する危険性がある被験体が癌疾患を発症しないことを意味し得る。
【０５０７】
本発明の様々な態様によれば、目的は、好ましくは、腫瘍抗原を発現する癌細胞などの抗原を発現する疾患細胞に対する免疫応答を提供し、腫瘍抗原などの抗原を発現する細胞が関与する癌疾患などの疾患を治療することである。
【０５０８】
本明細書に記載の抗原特異的免疫細胞は、免疫細胞で発現される抗原受容体によって結合され得る抗原の発現を特徴とする疾患を予防または治療するために患者に投与することができる。そのような免疫細胞は、抗原を発現する細胞の選択的根絶、ならびに免疫細胞で発現される抗原受容体によって結合され得る抗原が発現される疾患に対する免疫またはワクチン接種に使用することができる。
【０５０９】
一実施形態では、疾患を治療または予防する方法は、本発明の抗原受容体をコードする核酸の有効量を患者に投与することを含み、抗原受容体は、治療または予防する疾患に関連する抗原（例えばウイルス抗原または腫瘍抗原）に結合することができる。別の実施形態では、疾患を治療または予防する方法は、有効量の組換え免疫エフェクター細胞または前記免疫エフェクター細胞の増殖した集団を患者に投与することを含み、免疫エフェクター細胞または細胞の集団は、抗原受容体を組換え的に発現し、抗原受容体は、治療または予防する疾患に関連する抗原に結合することができる。好ましい実施形態では、疾患は癌であり、抗原は腫瘍関連抗原である。
【０５１０】
別の実施形態では、本発明は、特定の抗原に関連する疾患または特定の抗原を発現する疾患原因生物に対して免疫化またはワクチン接種する方法を提供し、この方法は、本発明の抗原受容体をコードする核酸の有効量を患者に投与することを含み、抗原受容体は特定の抗原に結合することができる。別の実施形態では、本発明は、特定の抗原に関連する疾患または特定の抗原を発現する疾患原因生物に対して免疫化またはワクチン接種する方法を提供し、この方法は、有効量の組換え免疫エフェクター細胞または前記免疫エフェクター細胞の増殖した集団を患者に投与することを含み、免疫エフェクター細胞または細胞の集団は抗原受容体を組換え的に発現し、抗原受容体は特定の抗原に結合することができる。
【０５１１】
特定の実施形態では、免疫エフェクター細胞の集団は、クローン増殖した集団であり得る。組換え免疫エフェクター細胞またはその集団は、抗原特異的な方法で治療的または予防的免疫エフェクター機能を提供する。好ましくは、抗原受容体は免疫エフェクター細胞の細胞表面に発現される。
【０５１２】
したがって、本明細書に記載の作用物質、組成物および方法は、疾患、例えば抗原を発現する疾患細胞の存在を特徴とする疾患を有する被験体を治療するために使用できる。特に好ましい疾患は癌疾患である。本明細書に記載の作用物質、組成物および方法は、本明細書に記載の疾患を予防するための免疫化またはワクチン接種にも使用し得る。
【０５１３】
「疾患」という用語は、個体の身体に影響を及ぼす異常な状態を指す。疾患はしばしば、特定の症状および徴候に関連する医学的状態として解釈される。疾患は、感染症などの元々外部からの要因によって引き起こされ得るか、または自己免疫疾患などの内部機能障害によって引き起こされ得る。ヒトでは、「疾患」はしばしば、罹患した個体に疼痛、機能障害、困難、社会的問題、もしくは死を引き起こす、または個体と接触するものに対して同様の問題を引き起こす状態を指すためにより広く使用される。このより広い意味では、疾患は時に、損傷、無力、障害、症候群、感染、孤立した症状、逸脱した挙動、および構造と機能の非定型の変化を含むが、他の状況および他の目的では、これらは区別可能なカテゴリーとみなされ得る。多くの疾患を患い、それと共に生活することは人生観および人格を変える可能性があるため、疾患は通常、身体的にだけでなく感情的にも個体に影響を及ぼす。本発明によれば、「疾患」という用語は、感染症および癌疾患、特に本明細書に記載の癌の形態を含む。本明細書における癌または癌の特定の形態への言及には、その癌転移も含まれる。
【０５１４】
本発明に従って治療される疾患は、好ましくは、抗原の発現を特徴とする細胞が関与する疾患である。「抗原の発現を特徴とする細胞が関与する疾患」または同様の表現は、本発明によれば、抗原が疾患組織または器官の細胞において発現されることを意味する。疾患組織または器官の細胞における発現は、健常組織または器官の状態と比較して増加し得る。一実施形態では、発現は疾患組織でのみ認められ、健常組織での発現は認められず、例えば発現は抑制される。本発明によれば、抗原の発現を特徴とする細胞が関与する疾患には、感染症および癌疾患が含まれ、疾患関連抗原は、好ましくはそれぞれ感染因子の抗原および腫瘍抗原である。
【０５１５】
「健常」または「正常」という用語は、非病的状態を指し、好ましくは非感染または非癌性を意味する。
【０５１６】
本発明の実施形態では、「抗原を標的とするＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体」または同様の用語は、プロセシングされた抗原、すなわちＭＨＣに関連して提示されるＴ細胞エピトープに結合するＴ細胞受容体、細胞表面に発現された抗原に結合する人工Ｔ細胞受容体、およびプロセシングされた抗原、すなわちＨＭＣに関連して提示されるＴ細胞エピトープに結合する人工Ｔ細胞受容体を含む。Ｔ細胞などの免疫エフェクター細胞上に存在する場合、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体の結合は、好ましくは、免疫エフェクター細胞の刺激、プライミングおよび／または増殖、ならびに本明細書に記載のエフェクター機能を発揮する免疫エフェクター細胞をもたらす。
【０５１７】
Ｔ細胞受容体の使用を含む本発明の実施形態は、一般に、ＭＨＣ分子に関連して細胞表面に提示される抗原プロセシング産物、すなわち抗原エピトープまたはＴ細胞エピトープの認識を通じて抗原発現細胞を標的とすることを目指す。人工Ｔ細胞受容体の使用を含む本発明の実施形態は、一般に、細胞表面に発現される抗原（例えば人工Ｔ細胞受容体が抗体由来の抗原結合ドメインを含む場合）またはＭＨＣ分子に関連して細胞表面に提示される抗原プロセシング産物、すなわち抗原エピトープもしくはＴ細胞エピトープ（例えば人工Ｔ細胞受容体がＴ細胞受容体由来の結合ドメインを含む場合）の認識を通じて抗原発現細胞を標的とすることを目指す。好ましくは、抗原またはエピトープは、Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体によって認識される場合、適切な共刺激シグナルの存在下で、抗原またはエピトープを認識するＴ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体を担持するＴ細胞のクローン増殖を誘導することができる。
【０５１８】
本発明に従って標的とされる抗原は、病原体または腫瘍抗原に由来する抗原であり得る。したがって、本発明に従って治療され得る疾患は、病原体または癌によって引き起こされるものである。
【０５１９】
好ましい実施形態では、抗原は、疾患特異的抗原または疾患関連抗原である。「疾患特異的抗原」または「疾患関連抗原」という用語は、病理学的に重要なすべての抗原を指す。１つの特に好ましい実施形態では、抗原は、疾患細胞、組織および／または器官に存在するが、健常細胞、組織および／または器官には存在しないかまたは減少した量で存在し、したがって、例えば抗原を標的とする抗原受容体（Ｔ細胞受容体または人工Ｔ細胞受容体）を担持するＴ細胞によって、疾患細胞、組織および／または器官を標的とするために使用できる。一実施形態では、疾患特異的抗原または疾患関連抗原は、疾患細胞の表面に存在する。
【０５２０】
「病原体」という用語は、生物、好ましくは脊椎動物において疾患を引き起こすことができる病原性の生物学的物質を指す。病原体には、細菌、単細胞真核生物（原生動物）、真菌、およびウイルスなどの微生物が含まれる。
【０５２１】
病原性ウイルスの例は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、Ａ型肝炎ウイルス（ＨＡＶ）、ＨＢＶ、ＨＣＶ、パピローマウイルス、およびヒトＴリンパ球向性ウイルス（ＨＴＬＶ）である。単細胞生物には、プラスモジウム、トリパノソーマ、アメーバなどが含まれる。
【０５２２】
病原性単細胞真核生物寄生虫は、例えば、プラスモジウム属（ｇｅｎｕｓ  Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、例えば熱帯熱マラリア原虫（Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、三日熱マラリア原虫（Ｐ．ｖｉｖａｘ）、四日熱マラリア原虫（Ｐ．ｍａｌａｒｉａｅ）もしくは卵形マラリア原虫（Ｐ．ｏｖａｌｅ）、リーシュマニア属（ｇｅｎｕｓ  Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、またはトリパノソーマ属（ｇｅｎｕｓ  Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、例えばクルーズトリパノソーマ（Ｔ．ｃｒｕｚｉ）もしくはブルーストリパノソーマ（Ｔ．ｂｒｕｃｅｉ）に由来し得る。
【０５２３】
好ましい実施形態では、抗原は、腫瘍抗原または腫瘍関連抗原、すなわち細胞質、細胞表面および細胞核に由来し得る癌細胞の構成要素、特に癌細胞の表面抗原として、好ましくは大量に産生される抗原である。
【０５２４】
本発明の文脈において、「腫瘍抗原」または「腫瘍関連抗原」という用語は、正常条件下では限られた数の組織および／もしくは器官で、または特定の発生段階で特異的に発現されるタンパク質に関し、例えば腫瘍抗原は、正常条件下では胃組織、好ましくは胃粘膜、生殖器官、例えば精巣、栄養膜組織、例えば胎盤、または生殖系列細胞で特異的に発現され得、および１つ以上の腫瘍または癌組織で発現または異常発現される。この文脈において、「限られた数」は、好ましくは３以下、より好ましくは２以下を意味する。本発明の文脈における腫瘍抗原には、例えば分化抗原、好ましくは細胞型特異的分化抗原、すなわち正常条件下では特定の分化段階で特定の細胞型において特異的に発現されるタンパク質、癌／精巣抗原、すなわち正常条件下では精巣および時には胎盤で特異的に発現されるタンパク質、ならびに生殖系列特異的抗原が含まれる。本発明の文脈において、腫瘍抗原は、好ましくは癌細胞の細胞表面と関連し、好ましくは正常組織では発現されないかまたはまれにしか発現されない。好ましくは、腫瘍抗原または腫瘍抗原の異常な発現は、癌細胞を同定する。本発明の文脈において、被験体、例えば癌疾患に罹患している患者の癌細胞によって発現される腫瘍抗原は、好ましくは前記被験体の自己タンパク質である。好ましい実施形態では、本発明の文脈における腫瘍抗原は、正常条件下では非必須の組織もしくは器官、すなわち免疫系によって損傷された場合に被験体の死をもたらさない組織もしくは器官において、または免疫系がアクセスできないもしくはほとんどアクセスできない身体の器官または構造において特異的に発現される。好ましくは、腫瘍抗原のアミノ酸配列は、正常組織で発現される腫瘍抗原と癌組織で発現される腫瘍抗原との間で同一である。
【０５２５】
本発明において有用であり得る腫瘍抗原の例は、ｐ５３、ＡＲＴ−４、ＢＡＧＥ、β−カテニン／ｍ、Ｂｃｒ−ａｂＬ  ＣＡＭＥＬ、ＣＡＰ−１、ＣＡＳＰ−８、ＣＤＣ２７／ｍ、ＣＤＫ４／ｍ、ＣＥＡ、クローディン−６、クローディン−１８．２およびクローディン−１２などのクローディンファミリーの細胞表面タンパク質、ｃ−ＭＹＣ、ＣＴ、Ｃｙｐ−Ｂ、ＤＡＭ、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ１、Ｇ２５０、ＧＡＧＥ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇａｐ１００、ＨＡＧＥ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＨＰＶ−Ｅ７、ＨＰＶ−Ｅ６、ＨＡＳＴ−２、ｈＴＥＲＴ（またはｈＴＲＴ）、ＬＡＧＥ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、ＭＡＧＥ−Ａ、好ましくはＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、またはＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｂ、ＭＡＧＥ−Ｃ、ＭＡＲＴ−１／メランＡ、ＭＣ１Ｒ、ミオシン／ｍ、ＭＵＣ１、ＭＵＭ−１、−２、−３、ＮＡ８８−Ａ、ＮＦ１、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＮＹ−ＢＲ−１、ｐ１９０マイナーＢＣＲ−ａｂＬ、Ｐｍ１／ＲＡＲａ、ＰＲＡＭＥ、プロテイナーゼ３、ＰＳＡ、ＰＳＭ、ＲＡＧＥ、ＲＵ１またはＲＵ２、ＳＡＧＥ、ＳＡＲＴ−１またはＳＡＲＴ−３、ＳＣＧＢ３Ａ２、ＳＣＰ１、ＳＣＰ２、ＳＣＰ３、ＳＳＸ、サバイビン、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＴＰＩ／ｍ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、ＴＰＴＥおよびＷＴである。特に好ましい腫瘍抗原には、クローディン−１８．２（ＣＬＤＮ１８．２）およびクローディン−６（ＣＬＤＮ６）が含まれる。
【０５２６】
本明細書で使用される「ＣＬＤＮ」または単に「Ｃｌ」という用語は、クローディンを意味し、ＣＬＤＮ６およびＣＬＤＮ１８．２を含む。好ましくは、クローディンはヒトクローディンである。クローディンは、密着結合の最も重要な成分であるタンパク質のファミリーであり、密着結合において上皮の細胞の間の細胞間隙中の分子の流れを制御する傍細胞バリアを確立する。クローディンは、Ｎ末端およびＣ末端の両方が細胞質に位置し、膜を４回横切る膜貫通タンパク質である。ＥＣ１またはＥＣＬ１と称される最初の細胞外ループは平均５３個のアミノ酸からなり、ＥＣ２またはＥＣＬ２と称される２番目の細胞外ループは約２４個のアミノ酸からなる。クローディンファミリーの細胞表面タンパク質は、様々な起源の腫瘍で発現され、それらの選択的発現（毒性関連の正常組織では発現されない）および形質膜への局在化により、標的癌免疫療法に関連する標的構造体として特に適する。
【０５２７】
ＣＬＤＮ６とＣＬＤＮ１８．２は腫瘍組織で差別的に発現されることが同定されており、ＣＬＤＮ１８．２を発現する唯一の正常組織は胃（胃粘膜の分化上皮細胞）であり、ＣＬＤＮ６を発現する唯一の正常組織は胎盤である。
【０５２８】
ＣＬＤＮ１８．２は、膵臓癌、食道癌、胃癌、気管支癌、乳癌、ＥＮＴ腫瘍などの様々な起源の癌で発現される。ＣＬＤＮ１８．２は、胃癌、食道癌、膵臓癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）などの肺癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、頭頸部癌、および胆嚢の癌、ならびにそれらの転移、特にクルーケンベルグ腫瘍などの胃癌転移、腹膜転移、およびリンパ節転移などの、原発腫瘍の予防および／または治療の貴重な標的である。少なくともＣＬＤＮ１８．２を標的とする抗原受容体は、そのような癌疾患を治療するのに有用である。
【０５２９】
ＣＬＤＮ６は、例えば卵巣癌、肺癌、胃癌、乳癌、肝癌、膵臓癌、皮膚癌、黒色腫、頭頸部癌、肉腫、胆管癌、腎細胞癌、および膀胱癌において発現されることが認められている。ＣＬＤＮ６は、卵巣癌、特に卵巣腺癌および卵巣奇形癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む肺癌、特に扁平上皮肺癌および腺癌、胃癌、乳癌、肝癌、膵臓癌、皮膚癌、特に基底細胞癌および扁平上皮癌、悪性黒色腫、頭頸部癌、特に悪性多形腺腫、肉腫、特に滑膜肉腫および癌肉腫、胆管癌、膀胱の癌、特に移行上皮癌および乳頭状癌、腎癌、特に腎明細胞癌および乳頭状腎細胞癌を含む腎細胞癌、結腸癌、回腸の癌を含む小腸癌、特に小腸腺癌および回腸の腺癌、精巣胎児性癌、胎盤絨毛癌、子宮頸癌、精巣癌、特に精巣セミノーマ、精巣奇形腫および精巣胎児性癌、子宮癌、奇形癌または胎生期癌などの生殖細胞腫瘍、特に精巣の生殖細胞腫瘍、ならびにそれらの転移形態の予防および／または治療のための特に好ましい標的である。少なくともＣＬＤＮ６を標的とする抗原受容体は、そのような癌疾患を治療するのに有用である。
【０５３０】
「癌疾患」または「癌」という用語は、典型的には無秩序な細胞成長を特徴とする個体の生理学的状態を指すかまたは表す。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれるが、これらに限定されない。より具体的には、そのような癌の例には、骨癌、血液癌、肺癌、肝臓癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、結腸癌、乳癌、前立腺癌、子宮癌、性器および生殖器の癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟部組織肉腫、膀胱癌、腎臓癌、腎細胞癌、腎盂癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、神経外胚葉癌、脊髄軸腫瘍、神経膠腫、髄膜腫、および下垂体腺腫が含まれるが、これらに限定されない。本発明による「癌」という用語は、癌転移も含む。好ましくは、「癌疾患」は、腫瘍抗原を発現する細胞を特徴とし、癌細胞は腫瘍抗原を発現する。
【０５３１】
一実施形態では、癌疾患は、退形成、侵襲性、および転移の性質を特徴とする悪性疾患である。悪性腫瘍は、悪性疾患がその成長において自己限定性でなく、隣接組織に浸潤することができ、および遠位の組織に広がる（転移する）能力を有し得るという点で非癌性の良性腫瘍と対比され得、良性腫瘍はこれらの性質を有さない。
【０５３２】
本発明によれば、「腫瘍」または「腫瘍疾患」という用語は、細胞（新生細胞または腫瘍細胞と呼ばれる）の異常な増殖によって形成される腫脹または病変を指す。「腫瘍細胞」とは、急速で制御されない細胞増殖によって成長し、新たな成長を開始させた刺激が停止した後も成長し続ける異常細胞を意味する。腫瘍は、構造機構および正常組織との機能的協調の部分的または完全な欠如を示し、通常、良性、前悪性または悪性のいずれかであり得る明確な組織塊を形成する。
【０５３３】
「転移」とは、癌細胞がその元の部位から身体の別の部位に広がることを意味する。転移の形成は非常に複雑な過程であり、原発性腫瘍からの悪性細胞の分離、細胞外マトリックスの侵襲、内皮基底膜の貫通による体腔および血管への進入、次いで血液によって輸送された後、標的器官の浸潤に依存する。最後に、標的部位における新たな腫瘍の成長は血管新生に依存する。腫瘍転移は、腫瘍細胞または成分が残存し、転移能を発現し得るため、しばしば原発性腫瘍の除去後にも起こる。一実施形態では、本発明による「転移」という用語は、原発性腫瘍および所属リンパ節系から離れた転移に関する「遠隔転移」に関する。一実施形態では、本発明による「転移」という用語は、リンパ節転移に関する。
【０５３４】
再発または回帰は、人が過去に罹患した状態に再び侵される場合に起こる。例えば、患者が腫瘍疾患に罹患したことがあり、前記疾患の治療を受けて成功したが、前記疾患を再び発症した場合、前記の新たに発症した疾患は再発または回帰とみなされ得る。しかし、本発明によれば、腫瘍疾患の再発または回帰は、元の腫瘍疾患の部位でも起こり得るが、必ずしもそうとは限らない。したがって、例えば、患者が卵巣腫瘍を患い、治療を受けて成功したことがある場合、再発または回帰は、卵巣腫瘍の発生または卵巣とは異なる部位での腫瘍の発生であり得る。腫瘍の再発または回帰には、腫瘍が元の腫瘍の部位とは異なる部位で発生する状況および元の腫瘍の部位で発生する状況も含まれる。好ましくは、患者が治療を受けた元の腫瘍は原発性腫瘍であり、元の腫瘍の部位とは異なる部位の腫瘍は二次性腫瘍または転移性腫瘍である。
【０５３５】
本発明によって治療または予防することができる感染症は、ウイルス、細菌、真菌、原生動物、蠕虫、および寄生生物を含むがこれらに限定されない感染因子によって引き起こされる。
【０５３６】
ヒトおよび非ヒト脊椎動物の感染性ウイルスには、レトロウイルス、ＲＮＡウイルスおよびＤＮＡウイルスが含まれる。ヒトにおいて見出されたウイルスの例には：レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ、ＬＡＶまたはＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、またはＨＩＶ−ＩＩＩとも称される）などのヒト免疫不全ウイルスおよびＨＩＶ−ＬＰなどの他の分離株；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばポリオウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、エンテロウイルス、ヒトコクサッキーウイルス、ライノウイルス、エコーウイルス）；カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば胃腸炎を引き起こす株）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばウマ脳炎ウイルス、風疹ウイルス）；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばデングウイルス、脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばコロナウイルス）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば水疱性口内炎ウイルス、狂犬病ウイルス）；フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばエボラウイルス）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばパラインフルエンザウイルス、おたふく風邪ウイルス、麻疹ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス）；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばインフルエンザウイルス）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばハンタウイルス、ブンガウイルス、フレボウイルスおよびナイロウイルス）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ）（出血熱ウイルス）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばレオウイルス、オルビウイルスおよびロタウイルス）；ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス）；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａ）（パルボウイルス）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（乳頭腫ウイルス、ポリオーマウイルス）；アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（ほとんどのアデノウイルス）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）１および２、帯状疱疹ウイルス、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルス）；ポキシウイルス科（Ｐｏｘｙｉｒｉｄａｅ）（痘瘡ウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス）；およびイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばアフリカ豚コレラウイルス）；ならびに未分類ウイルス（例えば海綿状脳症の病原体、デルタ型肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの欠陥サテライトであると考えられている）、非Ａ、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝内部伝播；クラス２＝非経口伝播）（すなわちＣ型肝炎）、ノーウォークおよび関連ウイルス、ならびにアストロウイルス）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５３７】
企図されるレトロウイルスには、単純レトロウイルスと複合レトロウイルスの両方が含まれる。複合レトロウイルスには、レンチウイルス、Ｔ細胞白血病ウイルス、泡沫状ウイルスのサブグループが含まれる。レンチウイルスにはＨＩＶ−１が含まれるが、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ビスナウイルス、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、およびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）も含まれる。Ｔ細胞白血病ウイルスには、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−ＩＩ、サルＴ細胞白血病ウイルス（ＳＴＬＶ）、およびウシ白血病ウイルス（ＢＬＶ）が含まれる。泡沫状ウイルスには、ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）、サル泡沫状ウイルス（ＳＦＶ）、およびウシ泡沫状ウイルス（ＢＦＶ）が含まれる。
【０５３８】
本発明によって治療または予防することができる細菌感染または疾患は、マイコバクテリア（例えばヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ウシ型結核菌（Ｍ．ｂｏｖｉｓ）、トリ型結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、らい菌（Ｍ．ｌｅｐｒａｅ）もしくはマイコバクテリア・アフリカヌム（Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ））、リケッチア、マイコプラスマ、クラミジアおよびレジオネラなどの、その生活環に細胞内段階を有する細菌を含むがこれらに限定されない細菌によって引き起こされる。企図される細菌感染の他の例には、グラム陽性杆菌（例えばリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）などのバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エリジペロズリックス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）種）、グラム陰性杆菌（例えばバルトネラ属（Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、フランシセラ属（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）およびエルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）種）、スピロヘータ菌（例えばライム病を引き起こすボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）を含むボレリア属（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）種）、嫌気性細菌（例えばアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）およびクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）種）、グラム陽性および陰性球菌、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、肺炎球菌属（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）種、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）種、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）種によって引き起こされる感染が含まれるが、これらに限定されない。感染性細菌の具体例には、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ヒト型結核菌、トリ型結核菌、マイコバクテリア・イントラセルラーレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、マイコバクテリア・カンサイ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、マイコバクテリア・ゴルドナエ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレ��トコッカス・アガラクチアエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、ビリダンス型連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコッカス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、豚丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎杆菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトシダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバシラス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｉｕｍ）、フランベジアトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）およびイスラエル放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅ  ｉｓｒａｅｌｌｉ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５３９】
本発明によって治療または予防することができる真菌性疾患には、アスペルギルス症、クリプトコッカス症、スポロトリクス症、コクシジオイデス真菌症、パラコクシジオイデス真菌症、ヒストプラスマ症、ブラストミセス症、接合真菌症、およびカンジダ症が含まれるが、これらに限定されない。
【０５４０】
本発明によって治療または予防することができる寄生虫疾患には、アメーバ症、マラリア、リーシュマニア、コクシジウム、ジアルジア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、およびトリパノソーマ症が含まれるが、これらに限定されない。また、回虫症、鉤虫症、鞭虫症、糞線虫症、トキソカラ症、旋毛虫病、オンコセルカ症、フィラリア、およびディロフィラリア症などの、しかしこれらに限定されない様々な蠕虫による感染も包含される。また、住血吸虫症、肺吸虫症、および肝吸虫症などの、しかしこれらに限定されない様々な吸虫による感染も包含される。
【０５４１】
「個体」および「被験体」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらは、疾患または障害（例えば癌）に罹患し得るかまたは罹患しやすいが、疾患または障害を有していてもよくまたは有していなくてもよいヒト、非ヒト霊長動物または他の哺乳動物（例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウマまたは霊長動物）を指す。多くの実施形態では、個体はヒトである。特に明記されない限り、「個体」および「被験体」という用語は特定の年齢を示すものではなく、したがって成人、高齢者、子供、および新生児を包含する。本発明の好ましい実施形態では、「個体」または「被験体」は「患者」である。「患者」という用語は、本発明によれば、治療のための被験体、特に疾患被験体を意味する。
【０５４２】
「危険性がある」とは、一般集団と比較して疾患、特に癌を発症する可能性が通常よりも高いと特定された被験体、すなわち患者を意味する。さらに、疾患、特に癌を有していたか、または現在有している被験体は、引き続き疾患を発症する可能性があるため、疾患を発症する危険性が高い被験体である。現在癌に罹患しているか、または罹患していたことがある被験体は、癌転移の危険性も高い。
【０５４３】
本発明の作用物質または組成物の予防的投与は、好ましくはレシピエントを疾患の発症から保護する。本発明の作用物質または組成物の治療的投与は、疾患の進行の阻害をもたらし得る。これは、好ましくは疾患の排除につながる、疾患の進行の減速、特に疾患の進行の中断を含む。
【０５４４】
本明細書に記載の作用物質および組成物は、注射または注入を含む非経口投与などによる、任意の従来の経路を介して投与し得る。投与は、好ましくは非経口的であり、例えば静脈内、動脈内、皮下、皮内または筋肉内経路である。
【０５４５】
非経口投与に適する組成物は、通常、活性化合物の滅菌水性または非水性調製物を含み、これは、好ましくはレシピエントの血液と等張である。適合性の担体および溶媒の例は、リンゲル液および等張塩化ナトリウム溶液である。さらに、通常滅菌の固定油が溶液または懸濁液として使用される。
【０５４６】
本明細書に記載の作用物質および組成物は、有効量で投与される。「有効量」は、単独でまたはさらなる用量と共に、所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患または特定の状態の治療の場合、所望の反応は、好ましくは疾患の経過の阻止に関する。これは、疾患の進行を遅くすること、特に疾患の進行を妨げるまたは逆転させることを含む。疾患または状態の治療における所望の反応はまた、前記疾患または前記状態の発症の遅延または発症の防止であり得る。
【０５４７】
本明細書に記載の作用物質または組成物の有効量は、治療される状態、疾患の重症度、年齢、生理学的状態、サイズおよび体重を含む患者の個々のパラメータ、治療の期間、付随する治療の種類（存在する場合）、特定の投与経路ならびに同様の因子に依存する。したがって、本明細書に記載の作用物質の投与量は、様々なそのようなパラメータに依存し得る。患者の反応が初期用量では不十分である場合、より高い用量（または異なる、より局所的な投与経路によって達成される実質的により高い用量）を使用し得る。
【０５４８】
本明細書に記載の作用物質および組成物は、本明細書に記載のもののような様々な障害を治療または予防するために、例えばインビボで患者に投与することができる。好ましい患者には、本明細書に記載の作用物質および組成物を投与することによって治すまたは改善することができる障害を有するヒト患者が含まれる。これには、抗原の発現を特徴とする細胞が関与する障害が含まれる。
【０５４９】
例えば、一実施形態では、本明細書に記載の作用物質は、癌疾患、例えば抗原を発現する癌細胞の存在を特徴とする本明細書に記載のような癌疾患を有する患者を治療するために使用できる。
【０５５０】
本発明に従って記載される医薬組成物および治療方法は、本明細書に記載される疾患を予防するための免疫化またはワクチン接種にも使用され得る。
【０５５１】
医薬組成物は、局所的または全身的に、好ましくは全身的に投与することができる。
【０５５２】
「全身投与」という用語は、作用物質が個体の体内に有意な量で広く分布するようになり、所望の効果を発現するような作用物質の投与を指す。例えば、作用物質は、血液中でその所望の効果を発現し得る、および／または血管系を介してその所望の作用部位に達する。典型的な全身投与経路には、作用物質を血管系に直接導入することによる投与、または経口、肺もしくは筋肉内投与が含まれ、この場合作用物質は吸着され、血管系に入り、血液を介して１つ以上の所望の作用部位に運ばれる。
【０５５３】
本発明によれば、全身投与は非経口投与によることが好ましい。「非経口投与」という用語は、作用物質が腸管を通過しないような作用物質の投与を指す。「非経口投与」という用語には、静脈内投与、皮下投与、皮内投与または動脈内投与が含まれるが、これらに限定されない。
【０５５４】
投与は、例えば経口的、腹腔内または筋肉内経路でも実施し得る。
【０５５５】
本明細書で提供される作用物質および組成物は、単独で、または外科手術、放射線照射、化学療法および／もしくは骨髄移植（自己、同系、同種異系もしくは無関係）などの従来の治療レジメンと組み合わせて使用し得る。
【実施例】
【０５５６】
（実施例）
材料および方法：
以下の材料および方法を以下に説明する実施例で使用した。
【０５５７】
レプリコンおよびトランスレプリコン構築物をコードするＤＮＡ
本明細書で使用するベクター系は、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ；アクセッション番号Ｌ０１４４２）から設計されており、全体的なベクターのデザインは、以前に生成されたセムリキ森林ウイルスベクター系に類似する（図１）。最初の工程では、ＶＥＥＶに基づく自己複製ＲＮＡ（シスレプリコン）をコードするプラスミドを、商業的供給者からの遺伝子合成によって入手した。この構築物は、ＶＥＥＶ構造遺伝子を欠くが、複製認識配列（ＲＲＳ）として働き、Ｔ７ファージＲＮＡポリメラーゼプロモータの転写制御下でｐＳＴ１プラスミド骨格へのウイルス複製を制御する（Ｈｏｌｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９−４０１７）ＶＥＥＶのすべての保存された配列エレメント（ＣＳＥ）を含む。ＶＥＥＶ  ３'ＣＳＥの一番最後のヌクレオチドのすぐ下流に、１０個のヌクレオチドのランダム配列（国際公開第２０１６／００５００４  Ａ１号）で分離された３０および７０個のアデニル酸残基（ポリＡ３０−７０）からなる、プラスミドにコードされたポリ（Ａ）カセットを付加した。プラスミドの線形化のためのＳａｐＩ制限部位をポリ（Ａ）カセットのすぐ下流に配置した。シスレプリコンへの目的の遺伝子の挿入は、サブゲノムプロモータの下流で行われる（図１Ａ）。さらなる遺伝子合成およびＰＣＲベースのシームレスクローニング／組換え技術を使用して、ＶＥＥＶレプリカーゼの完全なオープンリーディングフレームをコードするｍＲＮＡをｐＳＴ１プラスミド骨格にインビトロ転写するための鋳型として働くプラスミドを作製した（Ｈｏｌｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１０８，ｐｐ．４００９−４０１７）。このベクターは、上流にヒトアルファグロビン５'ＵＴＲ、およびレプリカーゼＯＲＦの下流にプラスミドにコードされたポリ（Ａ３０−７０）カセットを含む。再び、プラスミドの線形化のためにＳａｐＩ制限部位をポリ（Ａ）カセットのすぐ下流に配置した。インビトロ転写では、得られるｍＲＮＡはＶＥＥＶの機能的ＲＲＳを欠き、複製することができない。トランスで複製するＲＮＡ（トランスレプリコン）のインビトロ転写のために、鋳型プラスミドの２つの異なる変異体を生成した。最初の変異体では、ＷＴ−ＲＲＳ（非修飾５'ＣＳＥ、サブゲノムプロモータ、３'ＣＳＥ）を有するトランスレプリコンをコードするプラスミドを、シスレプリコンからＶＥＥＶ−レプリカーゼコード配列の大部分を除去し、機能的ＲＲＳ（５'−ＣＳＥおよびサブゲノムプロモータ）を含むものだけを保持することによって得た。レプリカーゼＯＲＦの大部分の除去により、それぞれのプラスミドによってコードされたＲＮＡは、宿主細胞中に存在する場合、シスで複製を駆動することができないが、複製のためにトランスで機能性アルファウイルス非構造タンパク質の存在を必要とする。目的の遺伝子はサブゲノムプロモータの下流に挿入する。
【０５５８】
２番目のトランスレプリコン型では、サブゲノムプロモータを含む配列を除去し、５'ＲＲＳをＶＥＥＶゲノムの最初の〜２７０ヌクレオチドに短縮した。さらに、５'ＲＲＳを変異させて、翻訳開始コドンとして働き得るＡＵＧコドンを除去した。５'ＲＲＳの正しい折りたたみと機能を確保するために、補償ヌクレオチド変化を導入し、このトランスレプリコンはΔ５ＡＴＧ−ＲＲＳΔＳＧＰであった。５'ＡＵＧの除去は、目的のＯＲＦの開始コドンのみで翻訳が開始されることを確実にし、目的のＯＲＦは変異した５'ＣＳＥの下流に挿入される。
【０５５９】
トランス複製ＲＮＡの両方の変異体間の主な生物学的相違は、ＷＴ−ＲＲＳとサブゲノムプロモータを備えたトランスレプリコンが、複製時にのみ生成されるサブゲノム転写物上に導入遺伝子をコードすることである。これは、トランスで発現されるレプリカーゼが存在しない場合、目的のタンパク質が翻訳されないことを意味する。対照的に、Δ５ＡＴＧ−ＲＲＳΔＳＧＰトランスレプリコンは、合成キャップ類似体でインビトロ転写が行われることを条件として、レプリカーゼなしでもタンパク質に翻訳され得る。
【０５６０】
本明細書における目的の遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。ＴＣＲのα鎖とβ鎖を別々の複製ＲＮＡベクターに挿入し、Ｔ細胞に同時移入した。
【０５６１】
インビトロ転写
上記のプラスミドからのインビトロ転写およびＲＮＡの精製は、ＡＲＣＡの代わりにβ−Ｓ−ＡＲＣＡ（Ｄ２）キャップ類似体を使用したことを除いて、以前に記載されているように実施した（Ｈｏｌｔｋａｍｐ  ｅｔ  ａｌ．，前出；Ｋｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．１７，ｐｐ．９６１−９７１）。精製ＲＮＡの品質は、分光測光法およびキャピラリー電気泳動（２１００  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ、Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＵＳＡ）によって評価した。実施例で使用されるＲＮＡは精製ＩＶＴ−ＲＮＡである。
【０５６２】
細胞へのＲＮＡ移入
エレクトロポレーションのために、ＲＮＡを最終容量６２．５μｌ／ｍｍキュベットギャップサイズのＸ−ｖｉｖｏ無血清培地に再懸濁した。方形波エレクトロポレーション装置（ＢＴＸ  ＥＣＭ  ８３０、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ，Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して、以下のエレクトロポレーション設定を適用した：Ｔ細胞：１２５０Ｖ／ｃｍ、３ミリ秒（ｍｓ）の１パルス、ＭＺ−ＧａＢａ−１８−β２ｍ：５６２．５、３ミリ秒、２パルス）。
【０５６３】
細胞株および試薬
ヒト黒色腫細胞株ＭＺ−ＧａＢａ−０１８は、黒色腫患者のワクチン接種後の黒色腫病変から樹立されていた（Ｓａｈｉｎ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７）。ＭＺ−ＧａＢａ−０１８細胞は、β２ミクログロブリン（β２ｍ）遺伝子の欠失によりＨＬＡクラスＩ表面発現を完全に欠いていたため、サブクローンＭＺ−ＧＡＢＡ−０１８＿ＰＧＫ＿ｈＢ２Ｍ＿ｂｌｎ＿Ｃ５＿Ｐ９（ＭＺ−ＧａＢａ−１８−β２ｍ）を、Ｔ細胞アッセイのためのツールとしてβ２ｍでの形質導入によって樹立し、１５％ＦＣＳ（Ｂｉｏｃｈｒｏｍｅ  ＡＧ）および７μｇ／ｍｌブラスチシジンを添加したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養した。ヒトエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）不死化Ｂ細胞リンパ芽球株ＪＹを、１０％ＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６４０＋Ｇｌｕｔａｍａｘ培地で培養した。Ｔ細胞を、５％ヒトＡＢ血清（Ｏｎｅ  Ｌａｍｄａ  Ｉｎｃ．，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、１％非必須アミノ酸および１％ピルビン酸ナトリウム（両方ともＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したＲＰＭＩ培地で増殖させた。細胞は、５％ＣＯ２に平衡化した加湿雰囲気中、３７℃で増殖させた。
【０５６４】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびＴ細胞
ＰＢＭＣを、バフィーコートまたは血液試料からＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）密度勾配遠心分離によって単離した。ＨＬＡアレロタイプは、ＰＣＲ標準法によって決定した。抗ＣＤ４および抗ＣＤ８マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｅｒｇｉｓｃｈ−Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＢＭＣから濃縮した。
【０５６５】
フローサイトメトリ：トランスフェクトしたＴＣＲ遺伝子の細胞表面発現を、ＴＣＲ  β鎖の適切な可変領域ファミリーに対するＰＥ結合抗ＴＣＲ抗体（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＵＳＡ）およびＡＰＣ標識抗ＣＤ８／ＣＤ４抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用したフローサイトメトリによって分析した。トランスフェクトしたＣＡＲの細胞表面発現を、すべてのＣＡＲ構築物に含まれるｓｃＦｖ断片を認識するＡｌｅｘａ−６４７結合イディオタイプ特異的抗体（Ｇａｎｙｍｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を使用して分析した。ＨＬＡ抗原は、ＰＥ標識ＨＬＡクラスＩ特異的抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色することによって検出した。標的細胞上のＣＬＤＮ６およびＣＬＤＮ１８．２表面発現を、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ６４７結合ＣＬＤＮ６またはＣＬＤＮ１８．２特異的抗体（Ｇａｎｙｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）で染色することによって分析した。ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（商標）ＩＩ分析用フローサイトメータ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリ分析を実施した。取得したデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアのバージョン１０（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して分析した。
【０５６６】
ルシフェラーゼ細胞毒性アッセイ：ルシフェラーゼに基づく細胞毒性アッセイを以前に記載されているように実施した（Ｏｍｏｋｏｋｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．，２０１６）。１ｘ１０４個の標的細胞にルシフェラーゼＲＮＡをトランスフェクトし、ＯＫＴ３で事前に活性化したＴＣＲトランスフェクトＣＤ８＋Ｔ細胞と共に４７時間共培養した。Ｄ−ルシフェリン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；最終濃度１．２ｍｇ／ｍＬ）を含む反応混合物を添加した。１時間後、Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００リーダ（Ｔｅｃａｎ）を使用して発光を測定した。総ルシフェラーゼ活性の減少を測定することによって細胞死滅を計算した。生細胞は、ルシフェリンのルシフェラーゼ媒介酸化によって測定した。特異的死滅を次の式に従って計算した：（１−（ＣＰＳｅｘｐ−ＣＰＳｍｉｎ）／（ＣＰＳｍａｘ−ＣＰＳｍｉｎ）））＊１００。
【０５６７】
最大発光（１秒あたりの最大カウント、ＣＰＳｍａｘ）は、標的細胞をモックトランスフェクトしたエフェクターＴ細胞と共にインキュベートした後に評価し、最小発光（ＣＰＳｍｉｎ）は、完全な溶解のために標的を界面活性剤Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で処理した後に評価した。
【０５６８】
ＥＬＩＳＰＯＴ（酵素結合免疫スポットアッセイ）：マイクロタイタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を室温で一晩、抗ＩＦＮγ抗体１−Ｄ１ｋ（Ｍａｂｔｅｃｈ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）で被覆し、２％ヒトアルブミン（ＣＳＬ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｍａｒｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）でブロックした。エレクトロポレーションの２０〜２４時間後に、５ｘ１０４／ウェルの抗原提示刺激細胞を３ｘ１０５／ウェルのＴＣＲトランスフェクトＣＤ８＋エフェクター細胞と共に２組重複して播種した。プレートを一晩インキュベートし（３７℃、５％ＣＯ２）、ＰＢＳ  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、最終濃度１μｇ／ｍｌの抗ＩＦＮγビオチン化ｍＡＢ  ７−Ｂ６−１（Ｍａｂｔｅｃｈ）と共に３７℃で２時間インキュベートした。アビジン結合ホースラディッシュペルオキシダーゼＨ（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ  Ｅｌｉｔｅ  Ｋｉｔ；Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＵＳＡ）をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートし、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で発色させた。
【０５６９】
ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）：ヒトＩＦＮγＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ！キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、製造者の指示に従って標的反応性Ｔ細胞によって分泌されたＩＦＮγの量を培養上清中で定量化した。
【０５７０】
目的
遺伝子導入によるＴリンパ球抗原特異性の再指向は、養子免疫療法のための多数の腫瘍反応性Ｔリンパ球を提供することができる。しかし、ウイルスベクターの生産に関連する安全性の懸念は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞の臨床適用を制限してきた。Ｔリンパ球は、組み込みに関連する安全性の懸念を伴わずに、ＲＮＡエレクトロポレーションによって遺伝子改変することができる。養子免疫療法のための安全なプラットフォームを確立するために、本発明者らは、治療用受容体の高レベルで長期的な発現を達成する新規の複製ＲＮＡ形式を開発した。ＣＡＲおよびＴＣＲに対する本発明者らの系の適用性を試験し、ＲＮＡをトランスフェクトしたＴ細胞のエフェクター機能を分析した。
【０５７１】
（実施例１）
ＣＡＲをトランスフェクトした休止ＣＤ４＋細胞からのＩＦＮγ放出は、複製ＲＮＡを使用して刺激される。
複製ＲＮＡを使用してＴ細胞でのＣＡＲ発現の効率を評価するために、異なるＣＡＲをコードする複製ＲＮＡ種をトランスフェクトし、標的細胞に応答したＣＡＲの表面発現およびＴ細胞のＩＦＮγ分泌を比較した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、磁気支援細胞選別（ＭＡＣＳ）を使用して健常ドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。ＭＡＣＳの直後に、ヒトクローディン−６（ＣＬＤＮ６）反応性ＣＡＲをコードする等モル量の複製および非複製ＲＮＡをＣＤ４＋Ｔ細胞にエレクトロポレーションした。トランス複製ＲＮＡを、示されているようにレプリカーゼをコードするｍＲＮＡと同時トランスフェクトした。エレクトロポレーションした細胞をＣＡＲ特異的抗体で染色すると、エレクトロポレーションの２４時間後に細胞の４０％以上が高レベルのＣＡＲを発現したことが明らかになった（図２Ａ、Ｂ）。ＣＡＲ特異的染色のより高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）に反映されるように、複製ＲＮＡは細胞あたりのより高いＣＡＲ発現レベルをもたらしたが、必ずしもより大きなＣＡＲ陽性集団をもたらしたわけではなかった。ＣＡＲ染色を実施するのと同時に、トランスフェクトしたＴ細胞と、ヒトＣＬＤＮ６を欠くＪＹ細胞、またはヒトＣＬＤＮ６を安定にトランスフェクトしたＪＹ細胞との共培養を開始した。翌日、ＥＬＩＳＡによって培養上清へのＩＦＮγの放出を定量化し、複製ＲＮＡを使用するとＩＦＮγの放出が約１桁増加することを見出した（図２Ｃ）。
【０５７２】
複製ＲＮＡは、ｍＲＮＡと比較してより高いＣＡＲ発現レベルをもたらし、ＩＦＮγ放出を刺激すると結論付けた。
【０５７３】
（実施例２）
ＣＡＲをトランスフェクトしたＣＤ８  Ｔ細胞からのＩＦＮγ放出は、複製ＲＮＡを使用して刺激され、より持続される。
次に、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞を使用してＣＡＲ発現およびＩＦＮγ放出の持続時間を評価した。この目的のために、ＣＤ８＋Ｔ細胞は異なるドナーからの新鮮または凍結ＰＢＭＣから単離した。新鮮ＰＢＭＣから単離したものは、ＯＫＴ３およびＩＬ２で４８時間前刺激し、ＩＬ−２の存在下で７２時間増殖させた。凍結ＰＢＭＣからのＣＤ８細胞は、前刺激した細胞と同時に、ＭＡＣＳの直後にエレクトロポレーションした。両方のＣＤ８分離株に、ヒトクローディン−６反応性ＣＡＲをコードする等モル量の複製および非複製ＲＮＡをエレクトロポレーションした。トランス複製ＲＮＡを、レプリカーゼをコードするｍＲＮＡと同時トランスフェクトした。
【０５７４】
ＣＡＲ表面発現の持続時間を評価するために、エレクトロポレーション後２４時間の間隔で、ＣＡＲ特異的抗体で細胞を染色した。ＣＡＲ発現はすべての試料で急速に低下することが観察された（図３Ａ、Ｃ）。ｍＲＮＡと比較して、休止細胞でのＣＡＲ発現は複製ＲＮＡを使用するとはるかに高くなり（図３Ａ）、ｍＲＮＡは刺激細胞で同等のＣＡＲレベルをもたらした（図３Ｃ）。また、エレクトロポレーション後のＣＡＲ発現の低下が、ＩＦＮγを放出する細胞の能力とどのように相関するかという疑問も検討した。そこで、ＣＡＲ発現を分析したのと同じ時点で、トランスフェクトしたＴ細胞とクローディン６陽性および陰性ＪＹ細胞との共培養を開始し、培養上清を２４時間収集した。ＥＬＩＳＡを用いて、休止細胞からのＩＦＮγ放出が複製ＲＮＡを使用して刺激され、ｍＲＮＡと比較してより持続されることを見出した（図３Ｂ）。前刺激した細胞からのＩＦＮγ放出は全体的にはるかに高く、初期時点ではすべてのＲＮＡ種で同様に強力であった。後の時点では、トランス複製ＲＮＡはより持続的なＩＦＮγ放出をもたらした（図３Ｄ）。
【０５７５】
（実施例３）
複製ＲＮＡ移入後の自己黒色腫細胞のネオ抗原特異的ＴＣＲ媒介認識および機能の改善
複数の公表文献が、チェックポイント遮断（Ｒｉｚｖｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１５；Ｓｎｙｄｅｒ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１４；Ｍｃｇｒａｎａｈａｎ，Ｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１６）および養子Ｔ細胞療法（Ｔｒａｎ，Ｅ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１４；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｐ．Ｆ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，２０１３；Ｔｒａｎ，Ｅ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．２０１６）などの臨床免疫療法の良好な臨床転帰がネオエピトープ免疫認識に関連することを示した。これらのデータは、新規の個別化ワクチン接種戦略（Ｓａｈｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７）だけでなく、進行した上皮癌を有する患者を治療するためのネオ抗原を標的とする自己ＴＣＲ遺伝子療法の開発（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ  Ａ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１６）も支持する。体細胞変異は癌形成の中心であり、腫瘍細胞に独占的で（オンターゲットオフ腫瘍毒性の危険性を最小限に抑える）、陰性選択の間に高親和性ＴＣＲが欠失されないため、ネオ抗原はＴ細胞ベースの免疫療法の理想的な標的である。しかし、この概念を実現するには、固形癌の患者の大多数を治療するための重要な技術、製造および規制の革新が必要である。ネオ抗原特異的ＴＣＲをコードする最適化されたＲＮＡを用いたＴ細胞のエレクトロポレーションは、コスト効率の高い柔軟なプラットフォームを提供する。したがって、複製ＲＮＡ移入の概念をネオ抗原特異的ＴＣＲの発現に適用し、その後、自己黒色腫細胞の機能的認識を分析した。
【０５７６】
黒色腫患者の腫瘍によって発現された２つの個々のネオ抗原（Ｍ０５およびＭ１４）を認識するこの患者の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）からクローニングした２つのＴＣＲを使用した。ヒト黒色腫細胞株ＭＺ−ＧａＢａ−０１８は、黒色腫患者の同じ病変から樹立され、Ｍ０５およびＭ１４を発現することが確認されている（Ｓａｈｉｎ  Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２０１７）。健常ドナーからＣＤ８＋Ｔ細胞を単離し、Ｍ１４−ＴＣＲをコードする等モル量の複製および非複製ＲＮＡでトランスフェクトした。トランス複製ＲＮＡに、レプリカーゼをコードする滴定量のｍＲＮＡを同時トランスフェクトした。トランスフェクトしたＴ細胞を、ＭＺ−ＧａＢａ−１８−β２ｍ細胞と共培養する前に一晩休ませ、黒色腫細胞の特異的認識をＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって分析した（図４Ａ）。黒色腫細胞は、Ｍ０１４−ＴＣＲをコードする標準的なｍＲＮＡまたはＮＴＲ  ＲＮＡ（レプリカーゼＲＮＡなし）をトランスフェクトしたＴ細胞によって認識されなかったが、レプリカーゼＲＮＡと組み合わせたＮＴＲの移入によって認識を誘導することができた。特に、より高い量のレプリカーゼＲＮＡを同時トランスフェクトした場合、認識が用量依存的に増加した。ＴＣＲ表面発現を、Ｍ１４−ＴＣＲのＶβサブファミリーを検出するＶβ特異的抗体を使用したフローサイトメトリ染色によって検証した（図４Ｂ）。ＴＣＲ表面発現も、ＮＴＲ  ＲＮＡと組み合わせた滴定量のレプリカーゼＲＮＡの同時トランスフェクション後に用量依存的に増加した。
【０５７７】
次に、ネオ抗原特異的ＴＣＲの複製ＲＮＡ移入が黒色腫細胞の溶解の改善ももたらし得るかどうかを知りたいと考えた。ＯＫＴ３で事前に活性化したＣＤ８＋Ｔ細胞に、Ｍ０５−ＴＣＲとＭ１４−ＴＣＲの両方をコードする等モル量の複製および非複製ＲＮＡをトランスフェクトした。ＴＣＲをトランスフェクトしたＴ細胞を一晩休ませ、異なるエフェクター対ターゲット（Ｅ：Ｔ）比を使用して、ルシフェラーゼをトランスフェクトしたＭＺ−ＧａＢａ−１８−β２ｍ細胞と共培養した。黒色腫細胞の特異的溶解を、ルシフェラーゼに基づく死滅アッセイを使用して、４８時間の共培養後に分析した（図５）。両方のＴＣＲについて、それぞれの変異エピトープを内因的に発現する黒色腫細胞の溶解の有意な改善が、試験したすべてのＥ：Ｔ比で、複製ＲＮＡを使用したＴＣＲトランスフェクション後にＴ細胞によって媒介され、複製ＲＮＡが、実際に、治療用ＴＣＲをトランスフェクトしたＴ細胞の治療ウィンドウを増加させる潜在的可能性を有し得ることを示した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２ＢＣＤ】
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【図３ＡＢ】
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【図３ＣＤ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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