(57)【要約】筋損傷、筋傷害、または筋萎縮などの筋肉の状態を予防または治療するための組成物が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、組成物は、プロスタグランジンE2（PGE2）化合物およびミオトキシンを含む。いくつかの態様では、筋損傷、筋傷害、または筋萎縮は、神経傷害、外科的手技、または外傷の結果である。筋肉再生を促進する方法および筋肉量を増大させる方法も、本明細書に提供される。2020523409.tif 000078
2020523409.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロスタグランジンE2（PGE2）化合物およびミオトキシンを含む、筋肉の状態を予防または治療するための組成物。
【請求項２】
PGE2化合物が、PGE2、PGE2のプロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2の異化を弱める化合物、PGE2の阻害を中和する化合物、それらの誘導体、それらの類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
PGE2受容体アゴニストが、式（I）の化合物、その誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、その立体異性体、またはそれらの組み合わせを含み、
2020523409.tif 000067
式中、環Aは、置換C1-C10アルキルおよび置換C2-C10アルケニルからなる群より独立して選択される置換基R1およびR2を含む置換4〜6員シクロアルキル環または置換4〜6員シクロアルケニル環であり、環Aは、1つまたは複数の追加的な置換基をさらに含む、
請求項2記載の組成物。
【請求項４】
環Aが、置換シクロペンチル環または置換シクロペンテニル環である、請求項3記載の組成物。
【請求項５】
環A上の1つまたは複数の追加的な置換基が、重水素、ヒドロキシ、アミノ、オキソ、C1-C6アルキル、およびハロゲンからなる群より選択される、請求項3記載の組成物。
【請求項６】
環A上の1つまたは複数の追加的な置換基が、ヒドロキシまたはオキソである、請求項3記載の組成物。
【請求項７】
環Aが、一緒になって共有結合を形成してヘテロシクロアルキル環を形成する2つの追加的な置換基を有する、請求項3記載の組成物。
【請求項８】
環Aが、
2020523409.tif 000068
からなる群より選択される、請求項3記載の組成物。
【請求項９】
環Aが、
2020523409.tif 000069
からなる群より選択される、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
環Aが、
2020523409.tif 000070
である、請求項9記載の組成物。
【請求項１１】
R1が、置換C1-C10アルキルである、請求項3記載の組成物。
【請求項１２】
R1が、置換C2-C10アルケニルである、請求項3記載の組成物。
【請求項１３】
R1上の置換基が、重水素、ヒドロキシ、オキソ、C1-C6アルキル、-COOR3、およびハロゲンからなる群より選択され、R3が、水素またはC1-C6アルキルである、請求項11記載の組成物。
【請求項１４】
R1が、
2020523409.tif 000071
からなる群より選択される、請求項11記載の組成物。
【請求項１５】
R1が、
2020523409.tif 000072
からなる群より選択される、請求項12記載の組成物。
【請求項１６】
R1が、
2020523409.tif 000073
である、請求項15記載の組成物。
【請求項１７】
R2が、置換C1-C10アルキルである、請求項3記載の組成物。
【請求項１８】
R2が、置換C2-C10アルケニルである、請求項3記載の組成物。
【請求項１９】
R2上の置換基が、重水素、ヒドロキシ、オキソ、C1-C6アルキル、-COOR3、およびハロゲンからなる群より選択され、R3が、水素またはC1-C6アルキルである、請求項17または18記載の組成物。
【請求項２０】
R2が、
2020523409.tif 000074
からなる群より選択される、請求項18または19記載の組成物。
【請求項２１】
R2が、
2020523409.tif 000075
からなる群より選択される、請求項18記載の組成物。
【請求項２２】
R2が、
2020523409.tif 000076
である、請求項21記載の組成物。
【請求項２３】
式（I）の化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、またはその立体異性体が、式（Ia）、式（Ib）、式（Ic）、もしくは式（Id）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である、請求項3記載の組成物：
2020523409.tif 000077
。
【請求項２４】
式（I）の化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、またはその立体異性体が、式（Id）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である、請求項23記載の組成物。
【請求項２５】
PGE2誘導体が、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2を含む、請求項2記載の組成物。
【請求項２６】
PGE2の異化を弱める化合物が、
15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ（15-PGDH）を不活性化もしくは遮断するか、またはプロスタグランジントランスポーター（PGTもしくはSLCO2A1）を不活性化もしくは遮断する、化合物、中和ペプチド、または中和抗体
を含む、請求項2記載の組成物。
【請求項２７】
PGE2化合物が、PGE2である、請求項1記載の組成物。
【請求項２８】
ミオトキシンが、麻酔薬、二価陽イオン、蛇毒、トカゲ毒、ハチ毒、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項1記載の組成物。
【請求項２９】
麻酔薬が、アミノ-アミド型麻酔薬、アミノ-エステル型麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項28記載の組成物。
【請求項３０】
アミノ-アミド型麻酔薬が、ブピバカイン、レボブピバカイン、アルチカイン、ロピバカイン、ブタニリカイン、カルチカイン、ジブカイン、エチドカイン、リドカイン、メピバカイン、プリロカイン、トリメカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項29記載の組成物。
【請求項３１】
アミノ-エステル型麻酔薬が、アミノ安息香酸エステル麻酔薬、安息香酸エステル麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項29記載の組成物。
【請求項３２】
アミノ安息香酸エステル麻酔薬が、ベンゾカイン、ブタカイン、ブタンベン、クロロプロカイン、ジメトカイン、ルカイン、メプリルカイン、メタブテタミン、メタブトキシカイン、ニトラカイン、オルトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、プロキシメタカイン、リソカイン、テトラカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項31記載の組成物。
【請求項３３】
安息香酸エステル麻酔薬が、アミロカイン、コカイン、シクロメチカイン、α-ユーカイン、β-ユーカイン、ヘキシルカイン、イソブカイン、ピペロカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項31記載の組成物。
【請求項３４】
蛇毒またはトカゲ毒が、ノテキシン、カルジオトキシン、ブンガロトキシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項28記載の組成物。
【請求項３５】
二価陽イオンが、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、それらの塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項28記載の組成物。
【請求項３６】
PGE2化合物が、PGE2および／または16,16-ジメチルプロスタグランジンE2であり、ミオトキシンが、ブピバカインである、請求項1記載の組成物。
【請求項３７】
筋肉の状態が、筋損傷、筋傷害、または筋萎縮に関連する、請求項1〜36のいずれか一項記載の組成物。
【請求項３８】
それを必要とする対象において骨盤底障害を処置するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項３９】
投与する工程が、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを前記対象の骨盤底筋に投与することを含む、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
骨盤底筋が、肛門挙筋、尾骨筋、または両方である、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
骨盤底障害が、腹圧性尿失禁、過活動膀胱／切迫性尿失禁、混合性尿失禁、骨盤臓器脱、および大便失禁からなる群より選択される、請求項38記載の方法。
【請求項４２】
それを必要とする対象において眼疾患または眼障害を処置するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４３】
投与する工程が、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを前記対象の眼筋、眼瞼筋、外眼筋、またはそれらの組み合わせに投与することを含む、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
それを必要とする対象の筋骨格障害を処置するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４５】
筋骨格障害が、手の機能障害を含む、請求項44記載の方法。
【請求項４６】
筋骨格障害が、母指機能障害を含む、請求項44記載の方法。
【請求項４７】
筋骨格障害が、廃用誘発性筋萎縮である、請求項231記載の方法。
【請求項４８】
それを必要とする対象において閉塞性睡眠時無呼吸を処置するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項４９】
投与する工程が、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを前記対象の上気道筋に投与することを含む、請求項48記載の方法。
【請求項５０】
上気道筋が、オトガイ舌筋、口蓋帆張筋、オトガイ舌骨筋、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
それを必要とする対象において眼咽頭型筋ジストロフィーを処置するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項５２】
投与する工程が、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを上眼瞼筋または咽頭筋に投与することを含む、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
それを必要とする対象において糖尿病性ニューロパチーを処置するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを該対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項５４】
投与する工程が、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを、足の小さい筋肉、下腿筋、または足の内在筋に投与することを含む、請求項53記載の方法。
【請求項５５】
PGE2化合物が、PGE2、PGE2のプロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2の異化を弱める化合物、PGE2の阻害を中和する化合物、それらの誘導体、それらの類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５６】
PGE2化合物が、PGE2である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
ミオトキシンが、麻酔薬、二価陽イオン、蛇毒、トカゲ毒、ハチ毒、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
PGE2化合物が、PGE2および／または16,16-ジメチルプロスタグランジンE2であり、ミオトキシンが、ブピバカインである、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
PGE2化合物およびミオトキシンが、同時に投与される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項６０】
投与することが、筋肉内投与を含む、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その開示が全ての目的のためにその全体で参照により本明細書に組み入れられる、2017年6月9日に出願された米国仮出願第62/517,758号の優先権を主張する。
【０００２】
連邦政府の支援による研究および開発によってなされた発明に対する権利の記載
本発明は、米国立衛生研究所により付与された助成金番号AG020961による米国政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
筋損傷は、比較的軽症から極めて重症までの範囲にわたる極めてよく見られる現象であり、多数の形態をとる可能性がある。加えて、筋損傷は、いくつもの原因から生じる。例えば、筋肉は、外科的手技（例えば、外科的処置）の間にしばしば付随的に損傷する。これは、帝王切開および人工関節置換術（例えば、人工膝関節置換術および人工股関節置換術）などの外科的手技に関連して特に明白である。さらに、多くの筋損傷は、筋組織の切断、圧迫、および／または圧挫をもたらす外傷および偶発性事象の結果である。加えて、多くの筋損傷は、固定（例えば、肢固定）および／または神経損傷（例えば、末梢神経損傷）の結果である。
【０００４】
末梢神経損傷（PNI）は、病気に起因する外傷または固定のよく見られる結果であって、最終的に罹患者の身体的、心理的、および社会的ウェルビーイングに影響する重度の運動障害を生じる可能性がある。特に末梢神経は、戦争中に一般的に高速の銃創および爆発の破片で傷つく。さらに、防弾チョッキの改良および迅速な撤退により、より多くの兵士が重度の四肢外傷から生き延びることが可能になったので、戦争性PNI（combat PNI）は、ますますよく見られるようになっている。PNIは、イラクおよびアフガニスタン紛争からのUKの戦争負傷者の8％に発生した。戦争性PNIを有する戦争負傷者のうち、完全任務に戻ったのは約9％だけである。
【０００５】
圧迫性のPNI（手根管症候群（CTS）など）は、神経の絞扼により引き起こされる神経損傷の部類である。圧迫性のPNIは、退役軍人集団に特によく見られる。例えば、2007〜2008年に120,000人の退役軍人がCTSの診断を受け、そのうち10,000人が手根管開放手術を受けた。
【０００６】
（戦争または圧迫のいずれかが原因の）PNI後の主な病的状態は、筋肉が除神経された場合に起こる筋萎縮である。除神経された筋肉の回復は、完全には理解されていない複雑な過程である。しかし、筋肉の内因性再生因子が重大であることが知られており、年齢などの要因により影響される可能性がある。重症のCTSを有する患者について、除神経された筋肉は、短母指外転筋（APB）であり、この筋肉は、母指を掌面から出し、多くの細かい運動活動に欠かせない（図1）。今のところ、唯一の医学的介入手段は、正中神経を絞扼している靱帯を開放する手術によるものである。これは、運動神経の再生および筋肉の潜在的回復を可能にする。不幸にも、重症CTSを有する患者の多くは、神経が開放された後であっても機能的回復に乏しい。
【０００７】
筋肉損傷および神経損傷の後の筋肉機能の回復を改善する新しい治療法の必要がある。本発明は、この必要を満たし、関連する利点も同様に提供する。
【発明の概要】
【０００８】
発明の簡単な概要
第1の局面では、筋肉の状態を予防または治療するための組成物が本明細書に提供される。いくつかの態様では、組成物は、プロスタグランジンE2（PGE2）化合物およびミオトキシンを含む。
【０００９】
第2の局面では、薬学的組成物が本明細書に提供される。いくつかの態様では、薬学的組成物は、PGE2化合物およびミオトキシンを含む本明細書記載の組成物を含む。
【００１０】
第3の局面では、それを必要とする対象において筋肉再生を促進するためおよび／または筋肉量を増大させるための方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、この方法は、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象に投与することを含む。
【００１１】
第4の局面では、それを必要とする対象において筋肉の状態を予防または治療するための方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、この方法は、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象に投与することを含む。他の態様では、この方法は、PGE2受容体アゴニストおよびミオトキシンを対象に投与することを含む。
【００１２】
第5の局面では、それを必要とする対象において筋肉再生を促進するため、筋力を増大させるためおよび／もしくは筋肉量を増大させるため、またはそれを必要とする対象において筋肉の状態を予防もしくは治療するためのキットが、本明細書に提供される。いくつかの態様では、キットは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを含む本明細書記載の組成物を含む。他の態様では、キットは、本明細書記載の薬学的組成物を含む。
【００１３】
筋肉の状態を予防または治療するための組成物であって、プロスタグランジンE2（PGE2）化合物およびミオトキシンを含む組成物が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2、PGE2のプロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2の異化を弱める化合物、PGE2の阻害を中和する化合物、それらの誘導体、それらの類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、PGE2受容体アゴニストは、式（I）の化合物、その誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、その立体異性体、またはそれらの組み合わせを含み、
2020523409.tif 000003
式中、環Aは、置換C1-C10アルキルおよび置換C2-C10アルケニルからなる群より独立して選択される置換基R1およびR2を含む置換4〜6員シクロアルキル環または置換4〜6員シクロアルケニル環であり、環Aは、1つまたは複数の追加的な置換基をさらに含む。
【００１４】
いくつかの場合では、環Aは、置換シクロペンチル環または置換シクロペンテニル環である。いくつかの場合では、環A上の1つまたは複数の追加的な置換基は、重水素、ヒドロキシ、アミノ、オキソ、C1-C6アルキル、およびハロゲンからなる群より選択される。いくつかの場合では、環A上の1つまたは複数の追加的な置換基は、ヒドロキシまたはオキソである。いくつかの態様では、環Aは、一緒になって共有結合を形成してヘテロシクロアルキル環を形成する2つの追加的な置換基を有する。いくつかの態様では、環Aは、
2020523409.tif 000004
からなる群より選択される。
【００１５】
いくつかの態様では、環Aは、
2020523409.tif 000005
からなる群より選択される。
【００１６】
いくつかの態様では、環Aは、
2020523409.tif 000006
である。
【００１７】
いくつかの態様では、R1は、置換C1-C10アルキルである。いくつかの態様では、R1は、置換C2-C10アルケニルである。いくつかの態様では、R1上の置換基は、重水素、ヒドロキシ、オキソ、C1-C6アルキル、-COOR3、およびハロゲンからなる群より選択され、その際、R3は、水素またはC1-C6アルキルである。いくつかの態様では、R1は、
2020523409.tif 000007
からなる群より選択される。
【００１８】
いくつかの態様では、R1は、
2020523409.tif 000008
からなる群より選択される。
【００１９】
いくつかの態様では、R1は、
2020523409.tif 000009
である。
【００２０】
いくつかの態様では、R2は、置換C1-C10アルキルである。
【００２１】
いくつかの態様では、R2は、置換C2-C10アルケニルである。いくつかの態様では、R2上の置換基は、重水素、ヒドロキシ、オキソ、C1-C6アルキル、-COOR3、およびハロゲンからなる群より選択され、その際、R3は、水素またはC1-C6アルキルである。いくつかの態様では、R2は、
2020523409.tif 000010
からなる群より選択される。
【００２２】
いくつかの態様では、R2は、
2020523409.tif 000011
からなる群より選択される。
【００２３】
いくつかの態様では、R2は、
2020523409.tif 000012
である。
【００２４】
いくつかの態様では、式（I）の化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、またはその立体異性体は、式（Ia）、式（Ib）、式（Ic）、もしくは式（Id）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。
2020523409.tif 000013
【００２５】
いくつかの態様では、式（I）の化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、またはその立体異性体は、式（Id）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。
【００２６】
いくつかの態様では、PGE2誘導体は、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2を含む。いくつかの態様では、PGE2の異化を弱める化合物は、15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ（15-PGDH）を不活性化もしくは遮断する、またはプロスタグランジントランスポーター（PGTもしくはSLCO2A1）を不活性化もしくは遮断する化合物、中和ペプチド、または中和抗体を含む。いくつかの態様では、PGE2化合物はPGE2である。
【００２７】
いくつかの態様では、ミオトキシンは、麻酔薬、二価陽イオン、蛇毒、トカゲ毒、ハチ毒、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、麻酔薬は、アミノ-アミド型麻酔薬、アミノ-エステル型麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ-アミド型麻酔薬は、ブピバカイン、レボブピバカイン、アルチカイン、ロピバカイン、ブタニリカイン、カルチカイン、ジブカイン、エチドカイン、リドカイン、メピバカイン、プリロカイン、トリメカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ-エステル型麻酔薬は、アミノ安息香酸エステル麻酔薬、安息香酸エステル麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ安息香酸エステル麻酔薬は、ベンゾカイン、ブタカイン、ブタンベン、クロロプロカイン、ジメトカイン、ルカイン（lucaine）、メプリルカイン、メタブテタミン、メタブトキシカイン、ニトラカイン（nitracaine）、オルトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、プロキシメタカイン、リソカイン、テトラカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、安息香酸エステル麻酔薬は、アミロカイン、コカイン、シクロメチカイン、α-ユーカイン、β-ユーカイン、ヘキシルカイン、イソブカイン、ピペロカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、蛇毒またはトカゲ毒は、ノテキシン、カルジオトキシン、ブンガロトキシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、二価陽イオンは、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、それらの塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２８】
いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2および／または16,16-ジメチルプロスタグランジンE2であり、ミオトキシンは、ブピバカインである。
【００２９】
いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2および／または16,16-ジメチルプロスタグランジンE2であり、ミオトキシンは、ブピバカインである。いくつかの態様では、筋肉の状態は、筋損傷、筋傷害、または筋萎縮に関連する。
【００３０】
本明細書記載の組成物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、水性基剤を含む。いくつかの態様では、薬学的に許容される担体は、低粘度化合物を含む。いくつかの態様では、低粘度化合物は、ゼラチンを含む。いくつかの態様では、低粘度化合物は、ヒドロゲルを含む。
【００３１】
それを必要とする対象において筋肉再生を促進するためおよび／または筋肉量を増大させるための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象に投与することを含む方法が、本明細書記載されている。いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2、PGE2のプロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2の異化を弱める化合物、PGE2の阻害を中和する化合物、それらの誘導体、それらの類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、PGE2誘導体は、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2を含む。いくつかの態様では、PGE2の異化を弱める化合物は、15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ（15-PGDH）を不活性化もしくは遮断する、またはプロスタグランジントランスポーター（PGTもしくはSLCO2A1）を不活性化もしくは遮断する化合物、中和ペプチド、または中和抗体を含む。いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2である。
【００３２】
いくつかの態様では、ミオトキシンは、麻酔薬、二価陽イオン、蛇毒、トカゲ毒、ハチ毒、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、麻酔薬は、アミノ-アミド型麻酔薬、アミノ-エステル型麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ-アミド型麻酔薬は、ブピバカイン、レボブピバカイン、アルチカイン、ロピバカイン、ブタニリカイン、カルチカイン、ジブカイン、エチドカイン、リドカイン、メピバカイン、プリロカイン、トリメカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ-エステル型麻酔薬は、アミノ安息香酸エステル麻酔薬、安息香酸エステル麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ安息香酸エステル麻酔薬は、ベンゾカイン、ブタカイン、ブタンベン、クロロプロカイン、ジメトカイン、ルカイン、メプリルカイン、メタブテタミン、メタブトキシカイン、ニトラカイン、オルトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、プロキシメタカイン、リソカイン、テトラカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、安息香酸エステル麻酔薬は、アミロカイン、コカイン、シクロメチカイン、α-ユーカイン、β-ユーカイン、ヘキシルカイン、イソブカイン、ピペロカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、蛇毒またはトカゲ毒は、ノテキシン、カルジオトキシン、ブンガロトキシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、二価陽イオンは、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、それらの塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００３３】
いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2および／または16,16-ジメチルプロスタグランジンE2であり、ミオトキシンは、ブピバカインである。いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンは、同時に投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンは、順次投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物は、ミオトキシンの前に投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物は、ミオトキシンの後に投与される。
【００３４】
いくつかの態様では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方を投与することは、局所、経口、腹腔内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、静脈内、または心臓内投与を含む。いくつかの態様では、投与することは、筋肉内投与を含む。いくつかの態様では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、標的となる筋肉のサイズを基に決定される。いくつかの態様では、標的となる筋肉は、短母指外転筋であり、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、約10μgである。
【００３５】
いくつかの態様では、この方法は、標的となる筋肉を機械的傷害に供することをさらに含む。いくつかの態様では、機械的傷害は、切離、熱傷、凍傷、針穿刺、運動、外科的手技、外傷、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、この方法は、単離された筋細胞の集団を対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、対象に対して自家である。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、対象に対して同種である。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、精製される。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、対象に投与される前にPGE2化合物、ミオトキシン、または両方と共に培養される。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団をPGE2化合物、ミオトキシン、または両方と共に培養することは、単離された筋細胞の集団のPGE2化合物、ミオトキシン、または両方への短期的、間欠的、または連続的曝露を含む。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団を投与することは、細胞を対象内に注射または移植することを含む。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団の投与ならびにPGE2化合物およびミオトキシンの投与は、同時に行われる。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団の投与ならびにPGE2化合物およびミオトキシンの投与は、順次に行われる。いくつかの態様では、対象は、筋肉の状態を有する。
【００３６】
いくつかの態様では、筋肉の状態は、筋損傷、筋傷害、筋萎縮、またはそれらの任意の組み合わせに関連する。いくつかの態様では、筋肉の状態は、外傷、急性筋傷害、急性神経傷害、慢性神経傷害、手の軟部組織傷害、手根管症候群（CTS）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、遠位型筋ジストロフィー（DD）、遺伝性ミオパチー、筋強直性筋ジストロフィー（MDD）、ミトコンドリアミオパチー、筋細管ミオパチー（MM）、重症筋無力症（MG）、うっ血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解、皮膚筋炎、癌悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、サルコペニア、脊髄性筋萎縮、肛門括約筋機能障害、ベル麻痺、腱板損傷、脊髄損傷、人工股関節置換、人工膝開節置換、手首の骨折、および糖尿病性ニューロパチーからなる群より選択される。
【００３７】
いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンは、外傷の直後に投与される。いくつかの態様では、対象は、外科的手技を受ける。いくつかの態様では、外科的手技は、神経損傷の予防、神経損傷の低減、神経損傷の修復、またはそれらの任意の組み合わせのためのものである。いくつかの態様では、外科的手技は、筋肉を切離すること、筋肉を修復すること、または両方を含む。いくつかの態様では、対象は、PGE2化合物およびミオトキシンの投与前に外科的手技を受ける。いくつかの態様では、対象は、PGE2化合物およびミオトキシンの投与と同時に外科的手技を受ける。いくつかの態様では、対象は、PGE2化合物およびミオトキシンの投与後に外科的手技を受ける。いくつかの態様では、神経損傷は、末梢神経損傷である。いくつかの態様では、外科的手技は、手根管開放手技を含む。
【００３８】
それを必要とする対象における筋肉の状態を予防または治療するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象に投与することを含む方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2、PGE2のプロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2の異化を弱める化合物、PGE2の阻害を中和する化合物、それらの誘導体、それらの類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、PGE2誘導体は、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2を含む。いくつかの態様では、PGE2の異化を弱める化合物は、15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ（15-PGDH）を不活性化もしくは遮断する、またはプロスタグランジントランスポーター（PGTもしくはSLCO2A1）を不活性化もしくは遮断する化合物、中和ペプチド、または中和抗体を含む。いくつかの態様では、PGE2化合物はPGE2である。いくつかの態様では、ミオトキシンは、麻酔薬、二価陽イオン、蛇毒、トカゲ毒、ハチ毒、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、麻酔薬は、アミノ-アミド型麻酔薬、アミノ-エステル型麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ-アミド型麻酔薬は、ブピバカイン、レボブピバカイン、アルチカイン、ロピバカイン、ブタニリカイン、カルチカイン、ジブカイン、エチドカイン、リドカイン、メピバカイン、プリロカイン、トリメカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ-エステル型麻酔薬は、アミノ安息香酸エステル麻酔薬、安息香酸エステル麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ安息香酸エステル麻酔薬は、ベンゾカイン、ブタカイン、ブタンベン、クロロプロカイン、ジメトカイン、ルカイン、メプリルカイン、メタブテタミン、メタブトキシカイン、ニトラカイン、オルトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、プロキシメタカイン、リソカイン、テトラカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、安息香酸エステル麻酔薬は、アミロカイン、コカイン、シクロメチカイン、α-ユーカイン、β-ユーカイン、ヘキシルカイン、イソブカイン、ピペロカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、蛇毒またはトカゲ毒は、ノテキシン、カルジオトキシン、ブンガロトキシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、二価陽イオンは、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、それらの塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００３９】
いくつかの態様では、PGE2化合物はPGE2であり、ミオトキシンはブピバカインである。いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンは、同時に投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンは、順次投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物は、ミオトキシンの前に投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物は、ミオトキシンの後に投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方を投与することは、局所、経口、腹腔内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、静脈内、または心臓内投与を含む。いくつかの態様では、投与することは、筋肉内投与を含む。いくつかの態様では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、標的となる筋肉のサイズを基に決定される。いくつかの態様では、標的となる筋肉は、短母指外転筋であり、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、約10μgである。
【００４０】
いくつかの態様では、この方法は、標的となる筋肉を機械的傷害に供することをさらに含む。いくつかの態様では、機械的傷害は、切離、熱傷、凍傷、針穿刺、運動、外科的手技、外傷、またはそれらの組み合わせを含む。
【００４１】
いくつかの態様では、この方法は、単離された筋細胞の集団を対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、対象に対して自家である。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、対象に対して同種である。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、精製される。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、対象に投与される前にPGE2化合物、ミオトキシン、または両方と共に培養される。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団をPGE2化合物、ミオトキシン、または両方と共に培養することは、単離された筋細胞の集団のPGE2化合物、ミオトキシン、または両方への短期的、間欠的、または連続的曝露を含む。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、細胞を対象内に注射または移植することを含む。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団の投与ならびにPGE2化合物およびミオトキシンの投与は、同時に行われる。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団の投与ならびにPGE2化合物およびミオトキシンの投与は、順次に行われる。
【００４２】
いくつかの態様では、筋肉の状態は、筋損傷、筋傷害、筋萎縮、またはそれらの任意の組み合わせに関連する。いくつかの態様では、筋肉の状態は、外傷、急性筋傷害、急性神経傷害、慢性神経傷害、手の軟部組織傷害、手根管症候群（CTS）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、遠位型筋ジストロフィー（DD）、遺伝性ミオパチー、筋強直性筋ジストロフィー（MDD）、ミトコンドリアミオパチー、筋細管ミオパチー（MM）、重症筋無力症（MG）、うっ血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解、皮膚筋炎、癌悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、サルコペニア、脊髄性筋萎縮、肛門括約筋機能障害、ベル麻痺、腱板損傷、脊髄損傷、人工股関節置換、人工膝開節置換、手首の骨折、および糖尿病性ニューロパチーからなる群より選択される。
【００４３】
いくつかの態様では、PGE2受容体アゴニストおよびミオトキシンは、外傷の直後に投与される。いくつかの態様では、対象は、外科的手技を受ける。いくつかの態様では、外科的手技は、神経損傷の予防、神経損傷の低減、神経損傷の修復、またはそれらの任意の組み合わせのためのものである。いくつかの態様では、外科的手技は、筋肉を切離すること、筋肉を修復すること、または両方を含む。いくつかの態様では、対象は、PGE2化合物およびミオトキシンの投与前に外科的手技を受ける。いくつかの態様では、対象は、PGE2化合物およびミオトキシンの投与と同時に外科的手技を受ける。いくつかの態様では、対象は、PGE2化合物およびミオトキシンの投与後に外科的手技を受ける。いくつかの態様では、神経損傷は、末梢神経損傷である。いくつかの態様では、外科的手技は、手根管開放手技を含む。いくつかの態様では、対象を処置することは、対象における筋力、筋肉の協調運動、または両方の改善を生じる。
【００４４】
それを必要とする対象における筋肉の状態を予防または治療するための方法であって、プロスタグランジンE2（PGE2）受容体アゴニストを対象に投与することを含む方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、PGE2受容体アゴニストは、式（I）の化合物、その誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、その立体異性体、またはそれらの組み合わせを含み、
2020523409.tif 000014
式中、環Aは、置換C1-C10アルキルおよび置換C2-C10アルケニルからなる群より独立して選択される置換基R1およびR2を含む置換4〜6員シクロアルキル環または置換4〜6員シクロアルケニル環であり、環Aは、1つまたは複数の追加的な置換基をさらに含む。
【００４５】
いくつかの態様では、Aは、置換シクロペンチル環または置換シクロペンテニル環である。いくつかの場合では、環A上の1つまたは複数の追加的な置換基は、重水素、ヒドロキシ、アミノ、オキソ、C1-C6アルキル、およびハロゲンからなる群より選択される。いくつかの場合では、環A上の1つまたは複数の追加的な置換基は、ヒドロキシまたはオキソである。いくつかの態様では、環Aは、一緒になって共有結合を形成してヘテロシクロアルキル環を形成する2つの追加的な置換基を有する。
【００４６】
いくつかの態様では、環Aは、
2020523409.tif 000015
からなる群より選択される。
【００４７】
いくつかの態様では、環Aは、
2020523409.tif 000016
からなる群より選択される。
【００４８】
いくつかの態様では、環Aは、
2020523409.tif 000017
である。
【００４９】
いくつかの態様では、R1は、置換C1-C10アルキルである。
【００５０】
いくつかの態様では、R1は、置換C2-C10アルケニルである。
【００５１】
いくつかの態様では、R1上の置換基は、重水素、ヒドロキシ、オキソ、C1-C6アルキル、-COOR3、およびハロゲンからなる群より選択され、その際、R3は、水素またはC1-C6アルキルである。
【００５２】
いくつかの態様では、R1は、
2020523409.tif 000018
からなる群より選択される。
【００５３】
いくつかの態様では、R1は、
2020523409.tif 000019
からなる群より選択される。
【００５４】
いくつかの態様では、R1は、
2020523409.tif 000020
である。
【００５５】
いくつかの態様では、R2は、置換C1-C10アルキルである。いくつかの態様では、R2は、置換C2-C10アルケニルである。いくつかの態様では、R2上の置換基は、重水素、ヒドロキシ、オキソ、C1-C6アルキル、-COOR3、およびハロゲンからなる群より選択され、その際、R3は、水素またはC1-C6アルキルである。いくつかの態様では、R2は、
2020523409.tif 000021
からなる群より選択される。
【００５６】
いくつかの態様では、R2は、
2020523409.tif 000022
からなる群より選択される。
【００５７】
いくつかの態様では、R2は、
2020523409.tif 000023
である。
【００５８】
いくつかの態様では、式（I）の化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、またはその立体異性体は、式（Ia）、式（Ib）、式（Ic）、もしくは式（Id）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。
2020523409.tif 000024
【００５９】
いくつかの態様では、式（I）の化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、またはその立体異性体は、式（Id）の化合物、またはその薬学的に許容される塩、溶媒和物、もしくは立体異性体である。
【００６０】
いくつかの態様では、PGE2受容体アゴニストは、PGE2、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2、または両方を含む。
【００６１】
いくつかの態様では、この方法は、ミオトキシンを対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、ミオトキシンは、麻酔薬、二価陽イオン、蛇毒、トカゲ毒、ハチ毒、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、麻酔薬は、アミノ-アミド型麻酔薬、アミノ-エステル型麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ-アミド型麻酔薬は、ブピバカイン、レボブピバカイン、アルチカイン、ロピバカイン、ブタニリカイン、カルチカイン、ジブカイン、エチドカイン、リドカイン、メピバカイン、プリロカイン、トリメカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ-エステル型麻酔薬は、アミノ安息香酸エステル麻酔薬、安息香酸エステル麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ安息香酸エステル麻酔薬は、ベンゾカイン、ブタカイン、ブタンベン、クロロプロカイン、ジメトカイン、ルカイン、メプリルカイン、メタブテタミン、メタブトキシカイン、ニトラカイン、オルトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、プロキシメタカイン、リソカイン、テトラカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、安息香酸エステル麻酔薬は、アミロカイン、コカイン、シクロメチカイン、α-ユーカイン、β-ユーカイン、ヘキシルカイン、イソブカイン、ピペロカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、蛇毒またはトカゲ毒は、ノテキシン、カルジオトキシン、ブンガロトキシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、二価陽イオンは、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、それらの塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、PGE2受容体アゴニストは、PGE2、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2、または両方であり、ミオトキシンはブピバカインである。
【００６２】
いくつかの態様では、この方法は、標的となる筋肉を機械的傷害に供することをさらに含む。いくつかの態様では、機械的傷害は、切離、熱傷、凍傷、針穿刺、運動、外科的手技、外傷、またはそれらの組み合わせを含む。
【００６３】
いくつかの態様では、この方法は、単離された筋細胞の集団を対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、対象に対して自家である。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、対象に対して同種である。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、精製される。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、対象に投与する前にPGE2受容体アゴニストと共に培養される。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団をPGE2化合物と共に培養することは、単離された筋細胞の集団のPGE2化合物への短期的、間欠的、または連続的曝露を含む。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団を投与することは、細胞を対象内に注射または移植することを含む。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団の投与およびPGE2受容体アゴニストの投与は、同時に行われる。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団の投与およびPGE2受容体アゴニストの投与は、順次に行われる。
【００６４】
いくつかの態様では、筋肉の状態は、筋損傷、筋傷害、筋萎縮、またはそれらの任意の組み合わせに関連する。いくつかの態様では、筋肉の状態は、外傷、急性筋傷害、急性神経傷害、慢性神経傷害、手の軟部組織傷害、手根管症候群（CTS）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、遠位型筋ジストロフィー（DD）、遺伝性ミオパチー、筋強直性筋ジストロフィー（MDD）、ミトコンドリアミオパチー、筋細管ミオパチー（MM）、重症筋無力症（MG）、うっ血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解、皮膚筋炎、癌悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、サルコペニア、脊髄性筋萎縮、肛門括約筋機能障害、ベル麻痺、腱板損傷、脊髄損傷、人工股関節置換、人工膝開節置換、手首の骨折、および糖尿病性ニューロパチーからなる群より選択される。
【００６５】
いくつかの態様では、PGE2受容体アゴニストは、外傷の直後に投与される。
【００６６】
いくつかの態様では、対象は、外科的手技を受ける。いくつかの態様では、外科的手技は、神経損傷の予防、神経損傷の低減、神経損傷の修復、またはそれらの任意の組み合わせのためのものである。いくつかの態様では、外科的手技は、筋肉を切離すること、筋肉を修復すること、または両方を含む。いくつかの態様では、対象は、PGE2受容体アゴニストの投与前に外科的手技を受ける。いくつかの態様では、対象は、PGE2受容体アゴニストの投与と同時に外科的手技を受ける。いくつかの態様では、対象は、PGE2受容体アゴニストの投与後に外科的手技を受ける。いくつかの態様では、神経損傷は、末梢神経損傷である。いくつかの態様では、外科的手技は、手根管開放手技を含む。いくつかの態様では、麻酔薬は、対象に投与されない。
【００６７】
それを必要とする対象において筋肉再生を促進するため、それを必要とする対象において筋肉量を増大させるため、もしくはその両方のため、またはそれを必要とする対象における筋肉の状態を治療もしくは予防するためのキットであって、本明細書記載の組成物または本明細書記載の薬学的組成物を含むキットが、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、対象は、筋肉の状態を有する。いくつかの態様では、筋肉の状態は、筋損傷、筋傷害、筋萎縮、またはそれらの任意の組み合わせに関連する。いくつかの態様では、筋肉の状態は、外傷（例えば、急性筋外傷、急性神経外傷）、急性筋傷害、急性神経傷害、慢性神経傷害、手の軟部組織傷害、手根管症候群（CTS）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、遠位型筋ジストロフィー（DD）、遺伝性ミオパチー、筋強直性筋ジストロフィー（MDD）、ミトコンドリアミオパチー、筋細管ミオパチー（MM）、重症筋無力症（MG）、うっ血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解、皮膚筋炎、癌悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、サルコペニア、脊髄性筋萎縮、肛門括約筋機能障害、ベル麻痺、腱板損傷、脊髄損傷、人工股関節置換、人工膝開節置換、手首の骨折、および糖尿病性ニューロパチーからなる群より選択される。
【００６８】
いくつかの態様では、キットは、単離された筋細胞をさらに含む。いくつかの態様では、キットは、使用説明書をさらに含む。いくつかの態様では、キットは、1種または複数種の試薬をさらに含む。いくつかの態様では、キットは、組成物、薬学的組成物、単離された筋細胞、またはそれらの任意の組み合わせを対象に投与するためのデリバリーデバイスをさらに含む。
【００６９】
それを必要とする対象において骨盤底障害を処置するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象に投与することを含む方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の骨盤底筋に投与することを含む。いくつかの態様では、骨盤底筋は、肛門挙筋、尾骨筋、または両方である。いくつかの態様では、肛門挙筋は、恥骨尾骨筋、腸骨尾骨筋、恥骨直腸筋、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、骨盤底障害は、腹圧性尿失禁、過活動膀胱／切迫性尿失禁、混合性尿失禁、骨盤臓器脱、および大便失禁からなる群より選択される。いくつかの態様では、この方法は、骨盤底障害に関連する症状を治療、予防、または改善するために適した治療法を対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、追加的な治療法は、筋肉トレーニング／バイオフィードバック、ニューロモデュレーション、薬物療法、外科手術、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００７０】
それを必要とする対象において眼疾患または眼障害を処置するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象に投与することを含む方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、眼疾患または眼障害は、眼瞼機能障害を含む。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の眼瞼筋に投与することを含む。いくつかの態様では、眼瞼筋は、ミュラー筋、後頭前頭筋、側頭頭頂筋、鼻根筋、鼻筋、鼻中隔下制筋、眼輪筋、皺眉筋、眉毛下制筋、前耳介筋、上耳介筋、後耳介筋、口輪筋、口角下制筋、笑筋、大頬骨筋、小頬骨筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、下唇下制筋、口角挙筋、頬筋、オトガイ筋、前頭筋、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、眼瞼機能障害は、眼瞼の垂れ下がり、下垂、皮膚弛緩症、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、この方法は、投与する前、途中、または後に、対象にアイリフト手術を行うことをさらに含む。いくつかの態様では、眼瞼機能障害は、不正乱視に関連する。いくつかの態様では、眼疾患または眼障害は、瞬目障害、ウェットアイ症候群（wet eye syndrome）、ドライアイ症候群、涙腺萎縮、第7顔面神経麻痺、再発性麦粒腫、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の眼筋に投与することを含む。いくつかの態様では、眼筋は、リオラン筋、ホルネル筋、前頭筋、後頭前頭筋、側頭頭頂筋、鼻根筋、鼻筋、鼻中隔下制筋、眼輪筋、皺眉筋、眉毛下制筋、前耳介筋、上耳介筋、後耳介筋、口輪筋、口角下制筋、笑筋、大頬骨筋、小頬骨筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、下唇下制筋、口角挙筋、頬筋、オトガイ筋、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、眼疾患または眼障害は、眼瞼外反または眼瞼内反である。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の眼筋に投与することを含む。いくつかの態様では、眼筋は、前頭筋、後頭前頭筋、側頭頭頂筋、鼻根筋、鼻筋、鼻中隔下制筋、眼輪筋、皺眉筋、眉毛下制筋、前耳介筋、上耳介筋、後耳介筋、口輪筋、口角下制筋、笑筋、大頬骨筋、小頬骨筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、下唇下制筋、口角挙筋、頬筋、オトガイ筋、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、この方法は、投与することの前、途中、または後に、対象に眼瞼手術を行うことをさらに含む。いくつかの態様では、眼瞼手術は、外側腱板柵状法である。いくつかの態様では、眼疾患または眼障害は、斜視または眼振である。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の外眼筋に投与することを含む。いくつかの態様では、外眼筋は、外側直筋、内側直筋、上直筋、下直筋、上斜筋、下斜筋、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、斜視は、以下、すなわちアペール症候群、脳性麻痺、先天性風疹、血管腫、色素失調症、ヌーナン症候群、プラダー-ウィリー症候群、未熟児網膜症、網膜芽細胞腫、外傷性脳損傷、トリソミー18、ボツ��ヌス中毒、糖尿病、グレーブス病、ギラン-バレー症候群、眼外傷、貝中毒、脳卒中、および眼疾患または眼外傷による視力喪失のうち任意の1つに関連する。いくつかの態様では、眼振は、以下、すなわち乳児眼振症候群、薬物または医薬品の摂取、過剰なアルコール消費、迷路機能を障害する鎮静薬、頭部外傷、内耳障害、脳卒中、チアミンまたはビタミンB12欠乏、およびパーキンソン病のうち任意の1つに関連する。いくつかの態様では、この方法は、投与する前、途中、または後に対象に眼の手術を行うことをさらに含む。いくつかの態様では、眼疾患または眼障害は、虹彩機能不全に関連する。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の虹彩括約筋または虹彩散大筋に投与することを含む。いくつかの態様では、眼疾患または眼障害は、老視である。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の毛様体筋に投与することを含む。いくつかの態様では、眼疾患または眼障害は、近視である。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の毛様体筋、強膜中の筋肉、強膜周辺の筋肉、内眼筋、またはそれらの組み合わせに投与することを含む。
【００７１】
それを必要とする対象の筋骨格障害を処置するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象に投与することを含む方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、筋骨格障害は、手の機能障害を含む。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の手筋に投与することを含む。いくつかの態様では、手筋は、短母指外転筋、短母指屈筋、母指対立筋、小指外転筋、短小指屈筋、小指対立筋、背側骨間筋、掌側骨間筋、虫様筋、短掌筋、母指内転筋、長母指外転筋、短母指伸筋、長母指屈筋,橈側手根屈筋、深指屈筋、浅指屈筋、尺側手根屈筋、長橈側手根伸筋、短橈側手根伸筋、示指伸筋、総指伸筋、小指伸筋、尺側手根伸筋、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００７２】
いくつかの態様では、この方法は、投与する前、途中、または後に対象に手の手術を行うことをさらに含む。いくつかの態様では、筋骨格障害は、母指機能障害を含む。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の手筋に投与することを含む。いくつかの態様では、手筋は、短母指外転筋、母指対立筋、短母指屈筋、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、母指機能障害は、母指球萎縮が原因である。
【００７３】
いくつかの態様では、この方法は、投与する前、途中、または後に手の手術を対象に行うことをさらに含む。いくつかの態様では、手の手術は、手根管症候群手術である。いくつかの態様では、母指機能障害は、肘部管症候群または胸郭出口症候群に関連する。
【００７４】
いくつかの態様では、筋骨格障害は、足の機能障害を含む。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の足筋に投与することを含む。いくつかの態様では、足筋は、短趾屈筋、母趾外転筋、小趾外転筋、足底方形筋、虫様筋、長趾屈筋、母趾内転筋、短母趾屈筋、長母趾屈筋、短小趾屈筋、背側骨間筋、底側骨間筋、母趾屈筋内側頭（flexor hallucis medialis）、短母趾屈筋外側頭、母趾内転筋横頭（adductor hallucis transverse）、母趾内転筋斜頭（adductor hallucis oblique）、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、足の機能障害は、足底筋膜炎が原因である。いくつかの態様では、足の機能障害は、下垂足である。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の足筋または下腿筋に投与することを含む。いくつかの態様では、足筋または下腿筋は、前脛骨筋、第三腓骨筋、長趾伸筋、長母趾伸筋、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００７５】
いくつかの態様では、この方法は、投与する前、途中、または後に対象に外科手術を行うことをさらに含む。いくつかの態様では、下垂足は、以下、すなわち腓骨神経の圧迫、神経根傷害、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、または脳卒中のうち任意の1つに関連する。いくつかの態様では、筋骨格障害は、廃用誘発性筋萎縮である。いくつかの態様では、廃用誘発性筋萎縮は、橈骨遠位端骨折によって引き起こされる。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の手筋または前腕筋に投与することを含む。いくつかの態様では、手筋または前腕筋は、橈側手根屈筋、長母指屈筋、浅指屈筋、深指屈筋、尺側手根屈筋、短橈側手根伸筋、長橈側手根伸筋、長母指伸筋、総指伸筋、尺側手根伸筋、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００７６】
いくつかの態様では、この方法は、投与する前、途中、または後に、対象に外科手術を行うことをさらに含む。いくつかの態様では、外科手術は、手首関節鏡手術である。いくつかの態様では、廃用誘発性筋萎縮は、股関節部骨折によって引き起こされる。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の股関節部の筋肉に投与することを含む。いくつかの態様では、股関節部の筋肉は、腸骨筋、大腰筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、大腿筋膜張筋、上双子筋、下双子筋、内閉鎖筋、外閉鎖筋、大腿方形筋、梨状筋、大内転筋、長内転筋、短内転筋、小内転筋、恥骨筋、大腿直筋、外側広筋、内側広筋、中間広筋、大腿四頭筋、縫工筋、大腿二頭筋、半腱様筋、半膜様筋、小腰筋、腸腰筋、薄筋、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００７７】
いくつかの態様では、この方法は、投与する前、途中、または後に、外科手術を対象に行うことをさらに含む。いくつかの態様では、外科手術は、関節形成術である。いくつかの態様では、廃用誘発性筋萎縮は、腱板損傷によって引き起こされる。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の腱板筋に投与することを含む。いくつかの態様では、腱板筋は、棘上筋、棘下筋、肩甲下筋、小円筋、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００７８】
それを必要とする対象において胃食道逆流症（GERD）を処置するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象に投与することを含む方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の横隔膜脚部に投与することを含む。
【００７９】
それを必要とする対象において閉塞性睡眠時無呼吸を処置するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象に投与することを含む方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象の上気道筋に投与することを含む。いくつかの態様では、上気道筋は、オトガイ舌筋、口蓋帆張筋、オトガイ舌骨筋、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００８０】
それを必要とする対象において眼咽頭型筋ジストロフィーを処置するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象に投与することを含む方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを上眼瞼筋または咽頭筋に投与することを含む。
【００８１】
それを必要とする対象において糖尿病性ニューロパチーを処置するための方法であって、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象に投与することを含む方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、投与することは、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを足の小さい筋肉、下腿筋、または足の内在筋に投与することを含む。いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2、PGE2のプロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2の異化を弱める化合物、PGE2の阻害を中和する化合物、それらの誘導体、それらの類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、PGE2誘導体は、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2を含む。いくつかの態様では、PGE2の異化を弱める化合物は、15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ（15-PGDH）を不活性化もしくは遮断する、またはプロスタグランジントランスポーター（PGTもしくはSLCO2A1）を不活性化もしくは遮断する化合物、中和ペプチド、または中和抗体を含む。いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2である。いくつかの態様では、ミオトキシンは、麻酔薬、二価陽イオン、蛇毒、トカゲ毒、ハチ毒、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、麻酔薬は、アミノ-アミド型麻酔薬、アミノ-エステル型麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ-アミド型麻酔薬は、ブピバカイン、レボブピバカイン、アルチカイン、ロピバカイン、ブタニリカイン、カルチカイン、ジブカイン、エチドカイン、リドカイン、メピバカイン、プリロカイン、トリメカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ-エステル型麻酔薬は、アミノ安息香酸エステル麻酔薬、安息香酸エステル麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、アミノ安息香酸エステル麻酔薬は、ベンゾカイン、ブタカイン、ブタンベン、クロロプロカイン、ジメトカイン、ルカイン、メプリルカイン、メタブテタミン、メタブトキシカイン、ニトラカイン、オルトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、プロキシメタカイン、リソカイン、テトラカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、安息香酸エステル麻酔薬は、アミロカイン、コカイン、シクロメチカイン、α-ユーカイン、β-ユーカイン、ヘキシルカイン、イソブカイン、ピペロカイン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、蛇毒またはトカゲ毒は、ノテキシン、カルジオトキシン、ブンガロトキシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、二価陽イオンは、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、それらの塩、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2および／または16,16-ジメチルプロスタグランジンE2であり、ミオトキシンは、ブピバカインである。いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンは、同時に投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンは、順次に投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物は、ミオトキシンの前に投与される。いくつかの態様��は、PGE2化合物は、ミオトキシンの後に投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方を投与することは、局所、経口、腹腔内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、静脈内、または心臓内投与を含む。いくつかの態様では、投与することは、筋肉内投与を含む。いくつかの態様では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、標的となる筋肉のサイズを基に決定される。いくつかの態様では、標的となる筋肉は、短母指外転筋であり、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、約10μgである。
【００８２】
いくつかの態様では、この方法は、標的となる筋肉を機械的傷害に供することをさらに含む。いくつかの態様では、機械的傷害は、切離、熱傷、凍傷、針穿刺、運動、外科的手技、外傷、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、この方法は、単離された筋細胞の集団を対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、対象に対して自家である。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、対象に対して同種である。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、精製される。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団は、対象に投与する前にPGE2化合物、ミオトキシン、または両方と共に培養される。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団をPGE2化合物、ミオトキシン、または両方と共に培養することは、単離された筋細胞の集団のPGE2化合物、ミオトキシン、または両方への短期的、間欠的、または連続的曝露を含む。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団を投与することは、細胞を対象内に注射または移植することを含む。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団の投与ならびにPGE2化合物およびミオトキシンの投与は、同時に行われる。いくつかの態様では、単離された筋細胞の集団の投与ならびにPGE2化合物およびミオトキシンの投与は、順次に行われる。
【００８３】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明および図面から、当業者に
明らかになると考えられる。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図1は、短母指外転筋（APB）の図解を示す（左）。矢印は、APBの萎縮位置を示し、萎縮位置を右の写真にも示す。
【図２】図2A〜2Hは、一過性PGE2処置が、若齢MuSCの増殖をインビトロで促進することを示す。図2A：若齢前脛骨（TA）筋傷害（ノテキシン、NTX）後のPGE2レベル；対照は、ELISAによりアッセイした未損傷の対側TAである；（1時点あたりn＝4匹のマウス）。図2B：ノテキシン傷害後のMuSCによるPGE2合成酵素（Ptges2およびPtges）のRT-qPCRによる発現（1時点あたりn＝3匹のマウス）。図2C：ビヒクル（-）またはPGE2（10ng/ml）で24時間処置し、続いてヒドロゲル上で7日目まで培養した後のMuSC数の増加（短期的処置）；（4つの独立した実験でn＝12匹のマウス）。図2D：EP4アンタゴニスト（ONO-AE3-208、1μM）の非存在下または存在下においてビヒクル（-）またはPGE2（10ng/ml）で24時間一過性処置後のMuSC数の増加（3つの独立した実験でn＝9匹のマウスをアッセイ）。図2E-2G：EP4ヌルMuSCの増殖。EP4f/f（ヌル）MuSCに、GFP／ルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクターを形質導入し、Creをコードするレンチウイルスベクター（+Cre）またはコードしないレンチウイルスベクター（-Cre；空のベクター）で処置して、EP4アレルを欠失させた。続いてMuSCをビヒクル（-）またはPGE2（10ng/ml）で24時間処置し、ヒドロゲル上で3日間培養した。図2E：EP4-ヌルMuSC分析を示す模式図。図2F：EP4ヌルMuSCの数（2つの独立した実験でn＝6匹のマウス）。図2G：代表的な画像。バー＝40μm；GFP、緑；mCherry、赤。図2H：ヒドロゲル上で2日毎に7日間ビヒクル（-）またはPGE2（10ng/ml）で処置した、チャコール処理済み培地中で培養後のMuSC数（n＝3匹のマウスで3回の技術的反復）。*P＜0.05、**P＜0.001、***P＜0.0005 ****P＜0.0001。多重比較のためのボンフェローニ補正を伴うANOVA検定（図2A、2B、2D、および2F）；対応のあるt検定（図2C）；マン-ホイットニー検定（図2H）。平均+s.e.m. n.s.、有意でない。
【図３】図3A〜3Jは、加齢MuSCのPGE2に対する異常応答を示す。図3A：加齢TA傷害（ノテキシン、NTX）後のPGE2レベル；対照は、ELISAによりアッセイした未傷害の対側TAである；（1時点あたりn＝4匹のマウス）。図3B：ELISAによりアッセイした未傷害の若齢（n＝7匹）マウスおよび加齢（n＝5匹）マウスのTA中のPGE2レベル。図3C：PGE2が分解酵素15-PGDHによりその不活性PGE代謝物、13,14-ジヒドロ-15-ケトPGE2（PGEM）に異化することを示す模式図。図3D：質量分析により定量したPGEMレベル；（年齢群あたりn＝4匹のマウス）。図3E：PGE2分解酵素15-PGDH（Hpgd）の発現；（n＝3匹のマウスで2回の技術的反復）。図3F：ビヒクル（-）、PGE2（10ng/ml）または15-PGDH阻害剤、SW033291（1μM；SW）で短期的24時間処置後の7日目にアッセイした加齢MuSC数の増加；（5回の独立した実験でn＝15匹のマウス）。図3G：ヒドロゲル上でビヒクル（-）またはPGE2（10ng/ml）で2日ごとに7日間処置した、チャコール処理済み培地中で培養後の加齢MuSCの数；（n＝3匹のマウスで3回の技術的反復）。図3H：MuSCに対するPGE2の効果を示す模式図。PGE2は、EP4受容体／cAMP（サイクリックAMP）シグナル伝達経路を経由して作用して増殖を促進する。加齢MuSCでは、PGT（プロスタグランジントランスポーター）による細胞内輸送に続き、PGE2から不活性型PGEMへの異化が、15-PGDHによって媒介される。図3I：対照についての（左）、およびPGE2で短期的処置後の（右）、マイクロウェル中で48時間経時的顕微鏡検査により追跡した加齢MuSCのクローンからの軌跡。本来の細胞および新しく生まれたその各後代の軌跡を異なる色で表す。図3J：経時的顕微鏡検査により追跡した、対照についての（左、n＝32個のクローン）、およびPGE2で短期的処置後の（右、n＝45個のクローン）クローンにおける加齢MuSCの生細胞数（個）の変化。全ての時点における各世代（G1〜G6）の生細胞の比率を、100個の単一MuSCからなる出発集団に対して規準化した細胞数として示す。生細胞数の増加パーセントは、4.0％（対照）および5.4％（PGE2処置）であった（上欄）。経時的顕微鏡検査により追跡した、対照についての（左）、およびPGE2で短期的処置後の（右）クローンにおける加齢MuSC死細胞数（個）の変化。全ての時点における各世代（G1〜G6）の死細胞の比率を、100個の単一MuSCからなる出発集団に対して規準化した細胞数として示す。死細胞数の増加パーセントは、1.0％（対照）および0.1％（PGE2処置）であった（下欄）。*P＜0.05、**P＜0.001、***P＜0.0005。多重比較のためのボンフェローニ補正を伴うANOVA検定（図3Aおよび3F）；マン-ホイットニー検定（図3B、3D、3E、および3G）。平均±s.e.m. n.s.、有意でない。
【図４】図4A〜4Dは、短期的PGE2処置がMuSCの生着およびインビボ再生を促進することを示す。図4A：図2Cに記載のように、ビヒクル（-）またはPGE2で短期的処置後のトランスジェニックマウスから単離された培養GFP／luc標識若齢MuSC（細胞250個）の生着。移植の模式図（上）。各TAについてラジアンスとして測定した非侵襲性の生物発光イメージング（BLI）シグナル；（1条件あたりn＝5匹のマウス）（下）。図4B：培養においてCre（+Cre）でまたはCreなしで（-Cre；空のベクター）処置してEP4アレルを欠失させたGFP／luc標識EP4f/f MuSC（細胞1,000個）の生着。BLIのためにGFP／ルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクターをEP4f/f MuSCに形質導入した。移植の模式図（上）。移植後のBLIシグナル（1条件あたりn＝5匹のマウス（下）。図4C：ビヒクル（-）またはdmPGE2を同時注射した新鮮選別GFP／luc標識若齢MuSC（細胞250個）の生着。移植の模式図（上）。移植後のBLIシグナル；（ビヒクル処置およびdmPGE2処置についてそれぞれマウスn＝4およびn＝5）。図4D：ビヒクル（-）またはdmPGE2を同時注射されたGFP／luc標識加齢MuSC（細胞250個）の生着；（1条件あたりn＝3匹のマウス）（下）。BLIのためにGFP／ルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクターを加齢MuSCに形質導入した。移植の模式図（上）。移植後のBLIシグナルを平均ラジアンス（p s-1 cm-2 sr-1）として表現する。各条件についての代表的なBLI画像。バー＝5mm（図4A〜4D）。データは、2回の独立した実験を代表するものである。*P＜0.05、**P＜0.001および***P＜0.0005。群比較のためのANOVA検定、およびフィッシャー検定によるエンドポイントの有意差。平均+s.e.m。
【図５】図5A-5Rは、PGE2単独の筋肉内注射によりMuSCの増大が促進され、再生が改善し、力が増大することを示す。若齢：（図5A〜5D）カルジオトキシン（CTX）傷害の48時間後に若齢マウスのTA筋にビヒクル（-）またはdmPGE2を注射した；（1条件あたりn＝3匹のマウス）。図5A：実験手順の模式図（上）。カルジオトキシン傷害の14日後に、核（DAPI；青）、ラミニン（緑）およびPAX7（赤）染色を行った、代表的なTAの横断面（下）。矢尻先端部は、PAX7+ MuSCを示す。バー＝40μm。図5B：免疫蛍光による若齢マウスのTAの横断面中の線維100本あたりのPAX7発現衛星細胞の内在MuSCの増加。図5C：筋線維解析のためのバクスターアルゴリズム（Baxter Algorithms for Myofiber Analysis）を使用して定量した、ビヒクルで処置した若齢TA（-、色を塗っていない白い棒線）およびdmPGE2で処置した若齢TA（青で塗りつぶした棒線）における筋線維横断面積（CSA）。図5D：小さい（＜1,000μm2 CSA）筋線維および大きな（＞1,000μm2 CSA）筋線維の分布。（図5E〜5G）Pax7-ルシフェラーゼによりアッセイした内在MuSCの増加。Pax7CreERT2;Rosa26-LSL-Lucマウスをタモキシフェン（TAM）で腹腔内処置し、TAをカルジオトキシン（CTX）傷害に供し、3日後にビヒクル（-）またはdmPGE2を注射し、BLIによりモニターした；（1条件あたりn＝3匹のマウス）。図5E：実験手順の模式図。図5F：BLI（1条件あたりn＝3匹のマウス）。図5G：代表的なBLI画像。バー＝5mm。加齢：（図5H〜5K）カルジオトキシン（CTX）傷害の48時間後に加齢マウスのTAをビヒクル（-）またはdmPGE2処置でインビボ処置した；（1条件あたりn＝3匹のマウス）。図5H：実験手順の模式図（上）。カルジオトキシン傷害の14日後に、核（DAPI；青）、ラミニン（緑）およびPAX7（赤）染色を行った代表的なTAの横断面（下）。矢尻先端部は、PAX7+筋肉幹細胞を示す。バー＝40μm。図5I：加齢マウスについての図5Bと同様の内在MuSCの増加。図5J：加齢TAについての図5Cと同様の筋線維横断面積（CSA）。図5K：加齢TAについての図5Dと同様のCSAの分布。（図5L〜5P）下り勾配トレッドミル走行後の筋肉収縮力としてインビボ測定した、加齢マウスにおける筋力の増大。マウスに20°の下り勾配トレッドミル走行を連続2週間受けさせ、5週目に力をアッセイした。最初の1週間の間、加齢マウスの腓腹筋（GA）内側頭および外側頭にビヒクル（-）またはdmPGE2のいずれかを注射した。生物学的反復は、ビヒクル（-）処置またはdmPGE2処置についてそれぞれn＝10または8匹であり、技術的反復は、それぞれ5回であった。図5L：実験の模式図。代表的な単収縮力（図5M）および強縮力（図5N）。生理学的断面積（PCSA）に対して力を規準化することによって比筋肉単収縮力（図5O）および比筋肉強縮力（図5P）を計算した。対応のあるt検定（図5B、5D、5Iおよび5K）；群比較のためのANOVA検定、およびフィッシャー検定によるエンドポイントの有意差（図5F）；マン-ホイットニー検定（図5Oおよび5P）。*P＜0.05、**P＜0.001および****P＜0.0001。平均+s.e.m.。図5Q：PGE2またはビヒクルのみを投与した加齢マウスにおける筋肉単収縮力。図5R：PGE2またはビヒクルのみを投与したマウスにおける筋肉強縮力。
【図６】図6A〜6Kは、PGE2がMuSCの増大を促進することを示す。図6A：ELISAによりアッセイした、若齢マウスの前脛骨筋（TA）後肢筋肉について凍結傷害の3日後の対側の未傷害対照と比較したPGE2レベル；（1時点あたり1条件あたりn＝4匹のマウス）。図6B：PGE2（10ng/ml）で24時間（d0〜d1）またはビヒクル（-）で処置後、EdU（赤）で1時間標識し、ミオゲニン（緑）について染色した、分裂中の筋肉幹細胞（MuSC）の代表的な画像。バーは、40μmを表す。図6C：（b）と同様にEDUで標識した分裂中のMuSCのパーセンテージ；（n＝6匹のマウス、2つの独立した実験で3回の技術的反復を行う）。図6D：ビヒクル（-）または表示用量のPGE2（1〜200ng/ml）で処置後に代謝的生存率アッセイVisionBlueにより測定した増殖の増加；（n＝6匹のマウス、2つの独立した実験で3回の技術的反復を行う）。図6E：ビヒクル（-）またはPGE2で24時間処置後のMuSCによるプロスタグランジン受容体（Ptger 1〜4）の発現；（n＝3匹のマウス、2回の技術的反復）。図6F：未処置対照（-）と比較した、PGE2で1時間処置後のMuSCにおけるcAMPレベルの増加；（n＝6匹のマウス、2つの独立した実験において3回の技術的反復でアッセイ）。図6G-6H：ビヒクル（-）またはPGE2で24時間処置後のMuSCによるPax7（図6G）およびミオゲニン（図6H）の発現；（n＝3匹のマウス、2回の技術的反復）。図6I-6J：GFP／ルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクターをEP4f/f MuSCに形質導入し、Creをコードする（+Cre）またはCreをコードしない（-Cre；空のベクター）レンチウイルスベクターで処置してEP4アレルを欠失させた。棒グラフは、+Cre MuSC（図6I）およびGFP／Luc+MuSC（図6J）のパーセンテージを示す。図6K：2日毎にビヒクル（-）またはPGE2（10ng/ml）を補充したチャコール処理済み胎仔ウシを含有する筋芽細胞培地中で7日後のヒドロゲル培養物中のMuSCの代表的な画像。バーは、40μmを表す。*P＜0.05、**P＜0.001、***P＜0.0005。対応のあるt検定（図6A、6E、6G、および6H）；マン-ホイットニー検定（図6C）。平均+s.e.m. n.s.、有意でない。
【図７】図7A〜7Cは、プロスタグランジンおよびPGE2代謝物を検出するための若齢および加齢筋肉の質量分析を示す。図7A：分析したプロスタグランジン（PGE2、PGF2αおよびPGD2）およびPGE2代謝物（15-ケトPGE2および13,14-ジヒドロ-15-ケトPGE2）の化学構造、化学式、精密質量および分子量。内部標準PGF2α-D9およびPGE2-D9を全ての複合標準に添加した。図7B：原液を最終濃度0.1ng/ml〜500ng/mlに希釈することによって液体クロマトグラフィー-エレクトロスプレーイオン化-タンデム質量分析（LC-ESI-MS/MS）のための検量線を作成した。各標準物質について標準曲線の式及び相関係数を示す。図7C：代表的なクロマトグラム。分かれたピークは、分析したプロスタグランジン及びそれらの代謝物の優れたクロマトグラフィー分解能を示す。cps、カウント毎秒。
【図８】図8A〜8Gは、加齢MuSCがPGE2処置に応答して増殖および細胞生存率を増大させることを示す。図8A〜8C：若齢および加齢MuSCについて、qRT-PCRにより測定したmRNAレベルをGapdhに対して規準化した；（n＝3匹のマウス、2回の技術的反復）。図8A：Slco2a1遺伝子によりコードされるプロスタグランジントランスポーター（PGT）。図8B：PGE2合成酵素、PtgesおよびPtges2。図8C：遺伝子Ptger1〜Ptger4によりコードされるEP1〜EP4受容体。図8D：ビヒクル（-）またはPGE2処置で24時間処置した後のMuSC中のPax7 mRNAレベル；（n＝3匹のマウス、2回の技術的反復）。図8E：ビヒクル（-；上）またはPGE2（下）で短期的処置した後の、経時的顕微鏡検査により追跡した単一加齢MuSCクローン。各クローンについて、48時間の経時的追跡後に結果として得られた生細胞（白棒線）および死細胞（黒棒線）の数を示す。図8F：48時間のビヒクル（-）または一過性PGE2処置について経時的顕微鏡検査により評価した、追跡した生存加齢MuSCの増殖曲線。図8G：ビヒクル（-）またはPGE2で24時間処置した7日後のヒドロゲル上での成長後に分析した加齢MuSC上のアポトーシス性アネキシンV+のフローサイトメトリー分析；（3つの独立した実験でn＝9匹のマウス）。マン-ホイットニー検定（図8A〜8D）およびα＝0.05での対応のあるt検定（図8G）。平均+s.e.m. n.s.、有意でない。
【図９】図9A〜9Bは、筋肉横断面積の筋線維解析のためのバクスターアルゴリズムを示す。図9A：カルジオトキシン（CTX）傷害の48時間後にビヒクル（-）またはPGE2でインビボ処置した若齢マウスの前脛骨筋線維の代表的な横断面画像。画像は、ラミニン（緑）およびDAPI（青）による染色を示す。図9B：傷害の14日目の筋線維の横断面の断面積（CSA）を決定するための、筋線維解析のためのバクスターアルゴリズムにより解析した、図9Aからの対応する切り出し画像（下）。バーは40μmを表す。
【図１０】図10A〜10Gは、MuSC中のPGE2受容体EP4の欠失により、傷害後の骨格筋の再生および力が減少することを示す。タモキシフェンで処置したPax7特異的EP4条件付きノックアウトマウス（Pax7CreERT2;EP4fl/fl）の前脛骨筋（TA）を、ノテキシン傷害の6日後（図10C〜10D）、21日後（図10Bおよび10E）、および14日後（図10Fおよび10G）にアッセイした；（1条件あたりn＝3匹のマウス）。図10A：実験の模式図。図10B：傷害後の対照またはEP4 KOマウスから選別したMuSC（α7+ CD34+ lin-）におけるPtger4（EP4受容体）の発現。図10C：代表的なTA断面。DAPI、青；胚性ミオシン重鎖（eMyHC）、赤。バー＝40μm。図10D：eMyHC+線維のパーセンテージ。図10E：対照およびPax7特異的EP4ノックアウトTAにおける筋線維の横断面積（CSA）。図10F：ノテキシン傷害後14日目の筋肉単収縮力および（図10G）筋肉強縮力。マン-ホイットニー検定（図10B、10C、10F、および10G）；群比較のためのANOVA検定、およびフィッシャー検定による各ビンの有意差（図10E）。*P＜0.05、***P＜0.0005、および****P＜0.0001。平均+s.e.m。
【図１１】図11A〜11Cは、再生の初期時点での筋肉における内因性PGE2シグナル伝達の遮断により再生および力が低減することを示す。前脛骨筋（TA）へのカルジオトキシン傷害後にビヒクル（-）またはNSAID（インドメタシン）を注射した後の非侵襲性の生物発光イメージング（BLI）による、タモキシフェン（TAM）で処置したPax7CreERT2;Rosa26-LSL-Lucマウスにおける内在MuSCをアッセイした；（1条件あたりn＝3匹のマウス）。図11A：実験の模式図。図11B：BLI；（1条件あたりn＝3匹のマウス）。図11C：ノテキシン傷害後14日目の筋肉単収縮力（ビヒクル処置についてn＝8およびNSAID処置についてn＝10）。群比較のためのANOVA検定、およびフィッシャー検定によるエンドポイントの有意差（図11B）。マン-ホイットニー検定（図11C）。*P＜0.05、**P＜0.001、***P＜0.0005、および****P＜0.0001。平均+s.e.m。
【図１２】図12A〜12Kは、損傷した筋組織中のPGE2の一過性増加がMuSCの増殖を加速させることを示す。図12A：未傷害マウス後肢から新鮮単離した筋肉幹細胞（MuSC）（新鮮MuSC）、ヒドロゲル上で2日間培養したMuSC（培養MuSC）、成長培地中で培養した初代筋芽細胞（筋芽細胞GM）および分化培地中で24時間培養した分化中の初代筋芽細胞（筋芽細胞DM）におけるPtger4の発現（1条件あたりn＝3回の生物学的反復）。図12B：ノテキシンによる前脛骨筋（TA）傷害後にELISAによりアッセイしたPGE2レベル；（測定した1条件あたりn＝4匹のマウス）。対照は、対側の未傷害の脚を指す。図12C：ノテキシン傷害の3および6日後の代表的なTA横断面。DAPI、青；ラミニン、白；PGE2、緑。バー＝40μm。図12D：TA筋肉傷害（ノテキシン）後のプロスタグランジン合成酵素、PtgesおよびPtges2の発現（n＝3匹のマウス、2回の技術的反復）。対照は、対側の未傷害の脚を指す。図12E：ELISAによりアッセイした、インドメタシン（Indo）の存在下または非存在下における単離した線維の馴化培地のPGE2レベル；（1条件あたりn＝3匹のマウス）。図12F：ビヒクルまたはPGE2（10ng/ml）で24時間処置し、続いて7日目までヒドロゲル上で培養した後のMuSC数；（4回の独立した実験でn＝12匹のマウス）。図12G：ビヒクル（上）またはPGE2（下）で処置したMuSCクローンの38時間の経時的顕微鏡検査による軌跡。図12H：ビヒクル（左、n＝40個のクローン）およびPGE2処置（右、n＝44個のクローン）後に経時的顕微鏡検査により追跡したクローンにおけるMuSC細胞数（個）の変化。図12I：ビヒクルまたはPGE2で処置した各MuSCクローンについて平板培養後の分裂時間のプロット。分裂時間38時間を示すクローンは、記録した時間経過の間に全く分裂しなかったクローンを指す。線は、ガウスの対数正規型当てはめによる非線形回帰曲線を表し、R2＝0.9（対照）および0.97（PGE2）である。図12J：ビヒクルまたはPGE2で処置したMuSCクローンにおける平板培養後の分裂時間のバイオリン図。図12K：ビヒクルまたはPGE2で処置した、追跡したMuSCの細胞サイズ。*P＜0.05、**P＜0.001、***P＜0.0005 ****P＜0.0001。マン-ホイットニー検定（図12A、12E、12J、12K）；多重比較についてボンフェローニ補正を伴うANOVA検定（図12B、12D）；対応のあるt検定（図12F）。平均+s.e.m.
【図１３】図13A〜13Gは、PGE2処置が筋肉再生を増強することを示す。図13A：ビヒクルまたはPGE2を同時注射した、新鮮選別したGFP／luc標識MuSC（細胞250個）の生着。移植の模式図（上）。平均ラジアンス（p s-1cm-2sr-1）として表現した、移植後の生物発光イメージング（BLI）シグナル；（ビヒクル処置およびPGE2処置についてそれぞれn＝4およびn＝5匹のマウス、下）。移植後4週間目に、レシピエントマウスをノテキシンで再傷害した。図13B〜13E：カルジオトキシン（CTX）傷害後にマウスのTAにビヒクルまたはPGE2を注射した；（1条件あたりn＝3匹のマウス、ビヒクル処置は対側脚）。図13B：実験の模式図（上）。代表的なTA横断面（下）。DAPI、青；ラミニン、緑；PAX7、赤。矢尻先端部は、PAX7+ MuSCを示す。バー＝40μm。図13C：線維100本あたりのPAX7+衛星細胞の定量。図13D：ビヒクルで処置したTA（色を塗っていない白い棒線）およびPGE2で処置したTA（青で塗りつぶした棒線）における代表的な筋線維横断面積（CSA）。図13E 小さい（＜1,000μm2 CSA）筋線維および大きい（＞1,000μm2 CSA）筋線維の分布。図13Fおよび13G：タモキシフェン（TAM）で処置したPax7CreERT2;Rosa26-LSL-LucマウスにおいてBLIによりアッセイした内在MuSC；（1条件あたりn＝3匹のマウス）。図13F：実験の模式図。図13G BLI（左）；（1条件あたりn＝3匹のマウス）。代表的なBLI画像（右）。バー＝5mm。*P＜0.05、**P＜0.001。群比較のためのANOVA検定、およびフィッシャー検定によるエンドポイントの有意差（図13A、13G）；対応のあるt検定（図13C、13E）。平均+s.e.m.
【図１４】図14A〜14Eは、EP4がMuSCにおけるPGE2シグナル伝達を媒介することを示す。図14A：ビヒクルまたはPGE2で24時間処置後のMuSCによるプロスタグランジン受容体（Ptger 1〜Ptger 4）の発現；（n＝3匹のマウス、2回の技術的反復）。図14B：1時間のPGE2処置後のMuSC中のcAMPレベル；（n＝6匹のマウス、2つの独立した実験で3回の技術的反復を行う）。図14C：EP4アンタゴニスト（ONO-AE3-208、1μM）の非存在下または存在下においてビヒクルまたはPGE2で24時間処置後のMuSC数。図14D：ビヒクルまたはPGE2で処置したEP4ヌルMuSCの増殖。Creをコードするレンチウイルスベクター（+Cre、EP4-ヌル）またはCreをコードしないレンチウイルスベクター（-Cre；対照）でEP4f/f MuSCを処置して、EP4アレルを欠失させた。EP4-ヌルMuSCおよび対照MuSCの分析を示す模式図（上）。EP4-ヌルMuSCおよび対照MuSCの数；（n＝6匹のマウス、2つの独立した実験）（下）。図14E：培養物においてCre存在下（+Cre）または非存在下（-Cre；空のベクター）で処置してEP4アレルを欠失させたGFP／luc標識EP4f/f MuSC（細胞1,000個）の生着。BLIのために、GFP／ルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクターをEP4f/f MuSCに形質導入した。移植の模式図（上）。移植後のBLIシグナル（1条件あたりn＝5匹のマウス）（下左）。代表的なBLI画像（下右）。バー＝5mm。*P＜0.05、**P＜0.001、****P＜0.0001。マン-ホイットニー検定（図14A、14B）；多重比較のためのボンフェローニ補正を伴うANOVA検定（図14C、14D）；群比較のためのANOVA検定、およびフィッシャー検定によるエンドポイントの有意差（図14E）。平均+s.e.m. n.s.、有意でない。
【図１５】図15A〜15Gは、Nurr1がMuSCにおけるPGE2／EP4シグナル伝達の下流エフェクターであることを示す。図15A：ビヒクル処置MuSCまたはPGE2処置MuSCにおいて24時間後の発現が異なる転写因子のヒートマップ。図15B：TA筋傷害（ノテキシン）後のNurr1の発現（1時点あたりn＝3匹のマウス）。図15C：ビヒクルまたはPGE2で24時間処置後のMuSCによるNurr1の発現；（n＝3匹のマウス、3つの独立した実験で行う）。図15D：ビヒクルまたはPGE2で24時間処置した筋原性前駆細胞におけるNURR1またはIgG対照のフローサイトメトリー分析。図15E：shSCRまたはshNurr1形質移入細胞のPGE2またはビヒクルの24時間処置に続く7日目までのヒドロゲル上の培養後のMuSC数（n＝6匹のマウス、2つの独立した実験を行う）。図15F：4-ヒドロキシタモキシフェン（4OHT）の存在下または非存在下でインビトロ処置し、続いてビヒクルまたはPGE2に24時間曝露したPax7CreERT2:EP4f/f（EP4 cKO）MuSC中のNurr1の発現；（n＝3匹のマウス）。図15G：MuSC、成長培地中で培養した初代筋芽細胞（Myob. GM）および分化培地中で24時間培養した分化中の初代筋芽細胞（Myob. DM）におけるNurr1の発現（1条件あたりn＝3回の生物学的反復）。*P＜0.05、**P＜0.001、***P＜0.0005。多重比較のためのボンフェローニ補正を伴うANOVA検定（図15B、15E、15F、15G）；マン-ホイットニー検定（図15C）。平均+s.e.m. n.s.、有意でない。
【図１６】図16A〜16Lは、MuSCにおけるPGE2シグナル伝達の機能喪失が筋肉再生および筋力を損なうことを示す。図16A〜16H：タモキシフェン（TAM）で処置したPax7特異的EP4条件付きノックアウトマウス（Pax7CreERT2;EP4f/f、EP4 cKO）の前脛骨筋（TA）をノテキシン傷害の7日後（図16C、16E）、14日後（図16G、16H）および21日後（図16B、16D）にアッセイした；（全ての時点について1条件あたりn＝3匹のマウス）。図16A：実験の模式図。図16B：傷害の21日後に対照マウスまたはEP4 cKOマウスから選別したMuSC（α7+ CD34+ lin-）中のPtger4（EP4受容体）の発現。図16C：傷害の7日後の胚性ミオシン重鎖（eMyHC）陽性線維のパーセンテージ。図16D：傷害の21日後の対照TAおよびEP4 cKO TAにおける筋線維横断面積（CSA）。図16E：傷害の7日後、DAPI、青；eMyHC、赤（左）；および傷害の21日後、DAPI、青、ラミニン、緑（右）の代表的なTA横断面。バー＝40μm。図16F：インビボ筋肉収縮力アッセイの模式図。図16G：ノテキシン傷害後14日目の代表的な単収縮力（左）および強縮力（右）。図16H：筋肉単収縮力（左）および強縮力（右）の定量。（対照についてn＝8およびEP4 cKOについてn＝3）。（図16I、16J）TA中へのカルジオトキシン傷害後にビヒクルまたはNSAID（インドメタシン）を注射した後のタモキシフェン（TAM）処置したPax7CreERT2;Rosa26-LSL-Lucマウスにおける非侵襲性生物発光イメージング（BLI）によりアッセイした内因性筋肉幹細胞（MuSC）。図16I：実験の模式図（上）。代表的なBLI画像（下）。バー＝5mm。図16J：BLI；（1条件あたりn＝3匹のマウス、2つの独立した実験で行う；図は、1つの実験の代表である）。（図16K、16L）C57Bl/6マウス（2〜4月齢）におけるカルジオトキシン後14日目のビヒクルまたはNSAID（インドメタシン）後に筋肉の力を測定した。図16K：代表的な単収縮力。図16L：筋肉単収縮力の定量（ビヒクル処置についてn＝8およびNSAID処置についてn＝10）。*P＜0.05、***P＜0.0005および****P＜0.0001。マン-ホイットニー検定（図16B、16C、16H、16L）；群比較のためのANOVA検定、およびフィッシャー検定により各ビンについて有意差。図16D、群比較のためのANOVA検定、およびフィッシャー検定によるエンドポイントの有意差。図16J.平均+s.e.m.
【図１７】図17は、PGE2シグナル伝達が再生におけるMuSCの機能を拡大するというモデルを示す。MuSCに果たすPGE2の役割の図解を示す。傷害後に、筋肉のニッチ中に放出されたPGE2は、EP4受容体に作用し、それが、cAMP／ホスホ-CREBを経由してシグナル伝達し、Nurr1増殖誘導転写因子の発現をもたらす。これは、効率的な筋肉再生のためのMuSC増大を促進する。NSAID処置によるPGE2／EP4シグナル伝達の欠如またはEP4受容体の特異的欠如は、異常なMuSC機能ならびに筋肉再生および筋力回復の障害をもたらす。
【図１８】図18A〜18Gは、PGE2がMuSCの増殖を促進することを示す。図18A：前脛骨筋（TA）について凍結傷害後にELISAによりアッセイしたPGE2レベル；（1条件あたりn＝3匹のマウス）。対照は、対側の未傷害の脚を指す。図18B：ビヒクルまたは表示用量のPGE2（1〜200ng/ml）で処置後に代謝的生存率アッセイVisionBlueにより測定した増殖；（n＝6匹のマウス、2つの独立した実験で3回の技術的反復を行う）。図18C：PGE2（10ng/ml）で24時間またはビヒクルで処置後にEdU（赤）で1時間標識し、ミオゲニン（緑）で共染色したMuSCの代表的な画像。バーは、40μmを表す。図18D：図18CにおいてEdUで標識した分裂中のMuSCのパーセンテージ；（n＝6匹のマウス、2つの独立した実験で3回の技術的反復を行う）。図18E：通常の血清を有する成長培地（非除去済み血清）またはチャコール処置済み培地（処置済み血清）中でビヒクルまたはPGE2で毎日7日間処置した、培養後のMuSC数；（n＝6匹のマウス、3つの独立した実験）。図18F：ビヒクル（左）またはPGE2（右）処置後に経時的に分析した各個別のMuSCクローンについての平板培養後の最初の分裂までの時間。図18G：経時的分析期間全体（38時間）にわたり追跡した全MuSCクローンの平板培養後の分裂時間の累積度数。*P＜0.05、**P＜0.001。マン-ホイットニー検定（図18A、18D）。多重比較のためのボンフェローニ補正を伴うANOVA検定（図18E）。平均+s.e.m。n.s.、有意でない。
【図１９】図19A〜19Eは、PGE2の直接注射が肥大を促進せずに筋肉再生を増強することを示す。図19A：PGE2を同時注射した新鮮選別GFP/luc標識MuSC（細胞250個）の生着後のGFP+ MuSCを示す、生着の8週間後のTAの代表的な横断面画像。画像は、GFP、緑、ラミニン、赤およびDAPI、青による染色を示す。バーは、40μmを表す。図19B：PGE2を同時注射した新鮮選別GFP/luc標識MuSC（細胞250個）の生着後のGFP+筋線維を示す、生着の8週間後のTAの代表的な横断面画像。画像は、GFP、緑、コムギ胚芽アグルチニン（WGA）またはラミニン、赤およびDAPI、青による染色を示す。バーは、40μmを表す。図19C：傷害の48時間後にビヒクルまたはPGE2でインビボ処置した、カルジオトキシン（CTX）傷害後14日目のC57Bl/6マウスのTA筋線維の代表的な横断面画像。画像は、ラミニン、緑およびDAPI、青による染色を示す。バーは、40μmを表す。図19D：傷害後14日目の筋線維の横断面の横断面積（CSA）を決定するための筋線維解析のためのバクスターアルゴリズムにより解析した、（A）からの対応する切り出し画像（下）。バーは、40μmを表す。図19E：傷害後14日目のビヒクル処置TAまたはPGE2処置TAの質量。マン-ホイットニー検定（図19E）。平均+s.e.m. n.s.、有意でない。
【図２０】図20A〜20Gは、MuSCにおけるEP4の機能喪失が増殖低下をもたらすことを示す。図20A〜20D：mCherry/Creをコードするレンチウイルスベクター（+Cre）またはコードしないレンチウイルスベクター（-Cre；空のベクター）で処置してEP4アレルを欠失させたEP4f/f MuSC。棒グラフは、Cre+ MuSC（図20A）およびGFP/Luc+ MuSC（図20B）のパーセンテージを示す。図20C：代表的な画像。バー＝40μm；GFP、緑；mCherry、赤。図20D：EP4f/f MuSC±CreによるPtger4の発現。図20E〜20G：4-ヒドロキシタモキシフェン（4OHT）でインビトロ処置したPax7CreERT2;EP4f/fマウスまたは対照Pax7+/+;EP4f/+マウス（1条件あたりn＝3匹のマウス）から単離したPax7特異的EP4ノックアウトMuSC。図20E：実験の模式図。図20F：培養7日後のMuSC数。図20G：qRT-PCRによるプロスタグランジン受容体（Ptger1〜Ptger4）の発現。*P＜0.05、**P＜0.001、***P＜0.0005、****P＜0.0001。マン-ホイットニー検定（図20D）；多重比較のためのボンフェローニ補正を伴うANOVA検定（図20F、20G）。平均+s.e.m。n.s.、有意でない。
【図２１】図21A〜21Eは、PGE2処置MuSCのトランスクリプトーム解析を示す。図21A：ビヒクル処置MuSCに対する発現変化倍率として示す、24時間後のビヒクル処置MuSCまたはPGE2処置MuSCのトランスクリプトームのヒートマップ。図21B：Ingenuity Pathway Analysisによって示された、PGE2処置MuSCにおける差次的発現アップレギュレーション遺伝子の濃縮された分子細胞機能経路。図21C：Metacore Analysisによって示された、PGE2処置MuSCにおける差次的発現アップレギュレーション遺伝子の濃縮された経路マップ。図21D：shSCR（対照）またはshNurr1形質移入細胞におけるNURR1のフローサイトメトリー分析。図21E：4-ヒドロキシタモキシフェン（4OHT）でインビトロ処置し、または処置せず、続いてビヒクルまたはPGE2に24時間曝露したPax7CreERT2:EP4f/f MuSCにおけるPtger4（EP4受容体）の発現；（n＝3匹のマウス）。****P＜0.0001。多重比較のためのボンフェローニ補正を伴うANOVA検定（図21E）。平均+s.e.m. n.s.、有意でない.
【図２２】図22Aおよび22Bは、傷害後のPGE2の機能喪失の後に筋肉量が変化しないことを示す。図22A：傷害後14日目の対照またはMuSC特異的EP4条件付きノックアウトマウスのTAの質量。図22B：傷害後14日目のビヒクルまたはNSAID処置TAの質量。マン-ホイットニー検定。平均+s.e.m. n.s.、有意でない。
【図２３】図23A〜23Cは、PGE2誘導体（16,16-ジメチルプロスタグランジンE2；dmPGE2）とブピバカイン（BPV）との組み合わせを含む組成物が、再生の間に筋肉幹細胞の増大を高めることを示す。図23Aは、生物発光イメージング（BLI）によりタモキシフェン（TAM）で処置したPax7CreERT2;Rosa26-LSL-Lucマウスにおける再生中の内因性筋肉幹細胞（MuSC）の増大のインビボ解析のための実験手順を図示する模式図を示す。図23Bは、傷害の2週間後の対照マウス（BPV/ビヒクル）および実験マウス（BPV/dmPGE2）の肢の代表的なBLI画像を示す。バー＝5mm。図23Cは、傷害後2週間目の対照群と実験群との間のBLIシグナルの対数変化倍率を示す。データを平均±s.e.m.として示す（n＝6）。星印（*）は、p＜0.05で統計的有意差があることを示す。
【図２４】図24は、再生中に筋肉幹細胞の増大を誘導することにおける、dmPGE2と組み合わせて投与した場合のブピバカインの用量依存的効果を示す。グラフは、注射の3日後からの生物発光イメージング（BLI）のラジアンスの変化倍率により測定した、Pax7CreERT2;Rosa26-LSL-Lucマウスにおける内在マウス筋肉幹細胞の相対増大を示す。対照群と処置群との間の統計的有意差を、ボンフェローニ多重比較補正を行う一元配置ANOVA検定により決定した。エラーバーは、s.e.m.を表し、1条件あたりn＞3。
【図２５】図25A〜25Dは、本発明の組成物および方法の利点を評価することに使用するための携帯型マイクロ内視鏡を説明する。図25Aは、マイクロ内視鏡および付属のワークステーションの写真を示す。図25Bは、マイクロ内視鏡の概略図を示す。図25Cは、マイクロ内視鏡により生成した例示的な画像を示す。図25Dは、マイクロ内視鏡により生成した例示的なより高倍率の画像を示す。
【図２６】図26は、臨床試験のための例示的な時間配列表を示す。
【図２７】図27A〜27Cは、PGE2化合物とミオトキシンとを組み合わせて筋肉再生を誘導し、筋肉の機能を改善する相乗効果を示す。Pax7プロモーター発現ルシフェラーゼマウスをインビボで得るためにPax7-CreERT2;Rosa-LSL-ルシフェラーゼマウス（2〜4月齢）をタモキシフェンで連続5日間処置した。1週間後に、アブミ骨底力測定装置を使用して前脛骨筋のベースラインの強縮力を測定し、その後薬物を注射した（0日時点）。続いて、マウスに50μlのビヒクル（食塩水）、筋肉幹細胞活性化物質プロスタグランジンE2（PGE2、20μg）、筋肉幹細胞の増大剤ブピバカイン（BPV、0.25％）または組み合わせ薬物（PGE2 20μgと一緒にブピバカイン0.25％）を前脛骨筋（TA）に注射した。図27Aは、筋肉幹細胞の増大を測定するために3日毎に2週間測定した生物発光（BLI、ラジアンスとして測定）を示す。図27Bは、同じマウスから4週間目に測定した、結果として生じた強縮力を示し、その際、ベースラインの力との差のパーセントを計算した。図27C：4週間目（エンドポイント）に、TAを単離し、筋肉の長さ、重量および羽状角により計算した生理的横断面積（PCSA）に基づき特異力（specific force）（mN/mm2）を得た。特異力および強縮力の差のパーセントは、ビヒクルおよび単独で注射した両方の小分子と比較して薬物の組み合わせで有意に増加した。*P＜0.05、**P＜0.001。群比較のためのANOVA検定、およびフィッシャー検定によるエンドポイントの有意差（図27A）。多重比較のためのボンフェローニ補正を伴うANOVA検定（図27B、図27C）。データを平均±SEMとして示す。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
発明の詳細な説明
I. 序論
最近の研究が、除神経筋の神経筋接合部を刺激することへの筋肉幹細胞（MuSC）の重要性を示したとはいえ、最近まで、除神経後の筋肉機能の回復を改善することは、未解決の問題のままであった。この問題の解決策は、筋肉にすでに存在するMuSCを刺激および増強することにより、または筋移植からのMuSCを刺激および増強することにより除神経萎縮を後退または予防する能力にある。
【００８６】
本発明は、一部、プロスタグランジンE2（PGE2）化合物とブピバカインなどのミオトキシンとの組み合わせが、休止状態のMuSCを呼び起こして、筋肉再生に従事させて筋力を回復させるという発見に基づく。いくつかの場合では、ミオトキシンの添加は、筋肉再生を誘導する。それらの場合、PGE2化合物にミオトキシンを添加することにより、PGE2化合物単独で誘導される筋肉再生よりも良好に筋肉再生が改善する。それゆえに、ある局面では、本発明の組成物および方法は、神経開放術後の萎縮した短母指外転筋（APB）の再生を促進して、神経筋接合部の形成ならびに筋収縮機能および体積の回復を促進するために特に有用である。
【００８７】
最近の研究は、除神経筋における神経筋接合部を刺激することに筋肉幹細胞（MuSC）が重要であることを示した（Liu et al., 2015）とはいえ、最近まで、除神経後の筋肉機能の回復を改善することは未解決の問題のままであった。この問題の解決策は、筋肉にすでに存在するMuSCを刺激および増強することにより除神経萎縮を後退または予防する能力にある。
【００８８】
II. 定義
本明細書において使用される以下の用語は、特に明記しない限り、それらのものとされる意味を有する。
【００８９】
本明細書において使用される用語「1つの（a）」、「1つの（an）」、または「その（the）」は、1つのメンバーを含む局面を含むだけでなく、1つを超えるメンバーを含む局面も含む。例えば、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈によって明白に他の意味に定められない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「細胞（a cell）」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「薬剤（the agent）」への言及は、当業者に公知である1つまたは複数の薬剤への言及を含み、以下同様である。
【００９０】
用語「プロスタグランジンE2」または「PGE2」は、シクロオキシゲナーゼ（COX）酵素および末端プロスタグランジンEシンターゼ（PGES）によってアラキドン酸を経由して合成することができるプロスタグランジンを意味する。PGE2は、血管拡張、炎症、および睡眠覚醒サイクルの調節を含むいくつかの生物学的機能において役割を果たしている。
【００９１】
用語「プロスタグランジンE2受容体アゴニスト」または「PGE2受容体アゴニスト」は、任意のPGE2受容体に結合し活性化させ、それによってPGE2シグナル伝達経路を刺激することができる、化学化合物、小分子、ポリペプチド、生物学的産物などを意味する。
【００９２】
用語「PGE2の異化を弱める化合物」は、PGE2の分解を低減または減少させることができる、化学化合物、小分子、ポリペプチド、生物学的産物などを意味する。
【００９３】
用語「PGE2阻害を中和する化合物」は、PGE2の合成、活性、分泌、および機能などの阻害剤を遮断または妨害することができる、化学化合物、小分子、ポリペプチド、生物学的産物などを意味する。
【００９４】
用語「PGE2の異化を弱める化合物」は、PGE2の細胞内分解のためのトランスポーターを介したPGE2の輸送を弱める物理過程を意味する。この過程は、PGE2を15-PGDHによる異化のために細胞内部に輸送するプロスタグランジントランスポーターの物理的遮断であることができる。プロスタグランジントランスポーターは、2310021C19Rik、MATR1、Matrin F/Q、OATP2A1、PGT、PHOAR2、SLC21A2、溶質担体有機陰イオントランスポーターファミリーメンバー2A1、およびSLCO2A1としても公知である。
【００９５】
化合物との関連での用語「誘導体」には、所与の化合物のアミド、エーテル、エステル、アミノ、カルボキシル、アセチル、および／またはアルコール誘導体が含まれるが、それに限定されるわけではない。
【００９６】
用語「処置すること」または「処置」は、次のうちのいずれか1つを意味する：疾患の1つもしくは複数の症状を改善すること；そのような症状の発現をそれらが起こる前に予防すること；疾患の進行を減速することもしくは完全に予防すること（再発エピソード間の期間がより長くなること、症状の悪化を減速することもしくは予防することなどによって明らかになり得る）；寛解期間の発現を促進すること；疾患の進行-慢性期で（第1期および第2期の両方で）引き起こされる不可逆的損傷を減速すること；前記進行期の発現を遅らせること；またはそれらの任意の組み合わせ。
【００９７】
用語「投与する」、「投与すること」、または「投与」は、所望の生物学的作用部位への本明細書記載の化合物および細胞などの薬剤または組成物の送達を可能にするために使用され得る方法を意味する。これらの方法には、非経口投与（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内、動脈内、血管内、心臓内、クモ膜下腔内、鼻腔内、皮内、および硝子体内など）、経粘膜注射、経口投与、坐剤としての投与、および局所投与が含まれるが、それに限定されるわけではない。当業者は、疾患または状態に関連する1つまたは複数の症状を予防または緩和するための、本明細書記載の化合物および／または細胞の治療的有効量を投与するための追加的な方法を知っているであろう。
【００９８】
用語「治療的有効量」または「治療的有効用量」または「有効量」は、有益な、または所望の臨床効果をもたらすのに十分である化合物、治療薬剤（例えば細胞）、および／または医薬の量を意味する。治療的有効量または治療的有効用量は、非限定的に、患者の年齢、大きさ、疾患のタイプまたは程度、疾患のステージ、再生細胞の投与経路、使用される補助療法のタイプまたは程度、進行中の疾患過程、および所望の処置のタイプ（例えば、積極的な処置対従来の処置）を含む、各患者に個別の要因に基づく場合がある。本明細書記載の薬学的化合物または組成物の治療的有効量は、細胞培養および動物モデルから最初に推定することができる。例えば、細胞培養方法で決定されたIC50値は、動物モデルでの開始点の役割を果たすことができ、同時に、動物モデルで測定されたIC50値を使用して、ヒトでの治療的有効用量を見出すことができる。
【００９９】
用語「薬学的に許容される担体」は、生物に顕著な刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物活性および特性を失わせない担体または希釈剤を意味する。
【０１００】
用語「対象」、「個体」、および「患者」は、本明細書において互換可能に使用されて、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを意味する。哺乳動物には、マウス、ラット、サル、ヒト、農用動物、競技動物、およびペットが含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【０１０１】
用語「機械的傷害」は、非限定的な例が切離、熱傷、凍傷、針穿刺、および運動を含む、物理過程により誘導される筋毒性の作用を意味する。場合によっては、機械的傷害は、外科的手技（例えば、切離、切開、縫合、および／もしくは筋肉修復を含む外科的手技もしくは処置）または外傷（例えば、偶発性外傷または傷害）の結果として起こり、非限定的な例は、鈍傷および／または圧挫損傷（例えば、腕、脚、手、足、および指などの四肢または付属器にかかわるもの）である。
【０１０２】
用語「ミオトキシン」は、筋肉細胞に損傷または死滅を誘導する化合物を意味する。いくつかの態様では、ミオトキシンによって筋肉細胞に生じる毒性作用（例えば、筋肉細胞の損傷、筋肉細胞死）は、筋肉幹細胞のその後の活性化、筋肉再生、または両方を直接的または間接的にトリガーする場合がある。ミオトキシンの非限定的な例には、麻酔薬（例えば、ブピバカイン）、二価陽イオン、蛇毒、トカゲ毒、ハチ毒、およびそれらの中に含有される化合物（例えば、ノテキシン、カルジオトキシン、およびブンガロトキシン）が含まれる。
【０１０３】
いくつかの場合では、ミオトキシンは、穏やかなミオトキシンである。本明細書に使用される穏やかなミオトキシンは、筋組織が組織学で評価された小さい損傷に供されることを意味する。本明細書に使用される穏やかなミオトキシンには、一過性であるが可逆的な筋損傷または細胞死を引き起こす任意の化合物が含まれる場合がある。筋肉内に投与される賦形剤の筋毒性は、炎症細胞（白血球、マクロファージおよび他の単球）の動員、一過性サイトカインレベル、成長因子および炎症性代謝物の誘導をモニターすることにより評価することができる。組織学的に、筋毒性は、筋線維の構築および周囲を取り囲むマトリックスの破壊、急性細胞死および壊死の誘導、短期的筋常在細胞（筋肉幹細胞を含む）の増殖の誘導、胚性ミオシン重鎖（eMHC）の発現誘導、および筋線維内の中心核位置の存在によって評価することもできる。全身的には、筋毒性は、筋肉クレアチンキナーゼレベルによって検出することもできる。機能的に、筋毒性は、筋肉の力の低減および神経筋接合部の破壊により検出することができる。
【０１０４】
筋毒性の可逆性は、損傷した筋線維組織構造の短期間（例えば、マウスモデルで約21日）の回復、組織における線維症の欠如（過剰のコラーゲン沈着または他のマトリックス成分の欠如）および脂質沈着の欠如（脂肪細胞の分化転換）により評価することができる。
【０１０５】
穏やかなミオトキシンの非限定的な例には、例えば、ブピバカインまたはリドカインなどの麻酔薬が含まれる場合がある。
【０１０６】
化合物の投与との関連での用語「短期的曝露」は、対象、例えば、ヒト対象または細胞への化合物の一時的または短時間の適用を意味する。いくつかの態様では、短期的曝露は、処置の経過にわたるまたは長期間にわたる化合物の単回投与を含む。
【０１０７】
化合物の投与との関連での用語「間欠的曝露」は、対象、例えば、ヒト対象または細胞への化合物の繰り返し適用を意味し、その際、各適用の間に所望の期間が経過する。
【０１０８】
化合物の投与との関連での用語「短期的レジメン」とは、対象、例えばヒト対象への化合物の一時的もしくは短時間の適用、または対象、例えばヒト対象への化合物の繰り返し適用を意味し、その際、各適用の間に所望の期間（例えば1日）が経過する。いくつかの態様において、短期的レジメンは、処置の経過にわたるまたは長期間にわたる対象への化合物の短期的曝露（例えば単回投与）を含む。他の態様では、短期的レジメンは、各曝露の間に所望の期間が経過する、対象への化合物の間欠的曝露（例えば反復投与）を含む。
【０１０９】
化合物の投与との関連での用語「連続的曝露」は、長期間にわたる、対象、例えば、ヒト対象または細胞への化合物の長期的な繰り返し適用を意味する。
【０１１０】
化合物の投与との関連での用語「長期的レジメン」は、化合物の量またはレベルが、選択された期間にわたって実質的に一定であるような、長期間にわたる、対象、例えばヒト対象への化合物の長期的な繰り返し適用を意味する。いくつかの態様では、長期的レジメンは、長期間にわたる対象への化合物の連続的曝露を含む。
【０１１１】
III. 態様の詳細な説明
A. 組成物および薬学的組成物
本発明の一局面では、筋肉の状態を予防または治療するための組成物が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、組成物は、プロスタグランジンE2（PGE2）化合物およびミオトキシンを含む。いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2、PGE2のプロドラッグ、PGE2受容体アゴニスト、PGE2の異化を弱める化合物、PGE2の阻害を中和する化合物、それらの誘導体、それらの類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。PGE2のプロドラッグは、例えば投与もしくは筋肉再生部位で、またはプロドラッグが筋肉細胞に曝露された場合に、薬理学的に活性なPGE2薬に代謝されることができる。
【０１１２】
特定の態様では、PGE2化合物は、その安定性、活性、分解抵抗性、筋肉細胞への輸送を増大させる（例えば、細胞取り込みを促進する）、および／または筋肉細胞中の保持を増大させる（例えば、取り込み後に筋肉細胞からの分泌を減少させる）、PGE2への1つまたは複数の修飾を含有するPGE2誘導体またはPGE2類似体である。
【０１１３】
非限定的に、PGE2誘導体およびPGE2類似体の例には、2,2-ジフルオロ-16-フェノキシ-PGE2化合物、2-デカルボキシ-2-ヒドロキシメチル-16-フルオロ-PGE2化合物、2-デカルボキシ-2-ヒドロキシメチル-11-デオキシ-PGE2化合物、19(R)-ヒドロキシPGE2、16,16-ジメチルPGE2、16,16-ジメチルPGE2 p-(p-アセトアミドベンズアミド)フェニルエステル、11-デオキシ-16,16-ジメチルPGE2（dmPGE2）、9-デオキシ-9-メチレン-16,16-ジメチルPGE2、9-デオキシ-9-メチレンPGE2、ブタプロスト、スルプロストン、エンプロスチル、PGE2セリノールアミド、PGE2メチルエステル、16-フェニルテトラノルPGE2、5-トランス-PGE2、15(S)-15-メチルPGE2、および15(R)-15-メチルPGE2が含まれる。追加的なPGE2誘導体およびPGE2類似体は、例えば米国特許第5,409,911号に示されている。
【０１１４】
PGE2誘導体およびPGE2類似体の追加的な非限定的な例には、PGE2のヒダントイン誘導体、すなわちヒドロキシシクロペンタノン環が複素環に置き換わっており、不飽和アルファ-アルケニル鎖がフェネチル鎖で置換されている、Zhao et al.（Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17:6572-5 (2007)）に記載されているより安定なPGE2類似体、Ungrin et al.（Mol. Pharmacol., 59: 1446-56 (2001)）に記載されているPGE2類似体、Tanami et al.（Bioorg. Med. Chem. Lett., 8: 1507-10 (1998)）に記載されているPGE2の13-デヒドロ誘導体、ならびに米国特許第8,546,603号および同第8,158,676号に記載されている置換シクロペンタンが含まれる。
【０１１５】
いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2受容体のアゴニスト、例えば、EP1受容体、EP2受容体、EP3受容体、およびEP4受容体である。PGE2受容体アゴニストの非限定的な例には、ONO-DI-004、ONO-AEl-259、ONO-AE-248、ONO-AE1-329、ONO-4819CD（Ono Pharmaceutical Co., Japan）、L-902688（Cayman Chemical）、CAY10598（Cayman Chemical）、およびCP-533536（Pfizer）が含まれる。追加的なPGE2受容体アゴニストは、例えば、米国特許第6,410,591号、同第6,610,719号、同第6,747,037号、同第7,696,235号、同第7,662,839号、同第7,652,063号、同第7622,475号、および同第7,608,637号に記載されている。
【０１１６】
特定の態様では、PGE2受容体アゴニストは、式（I）の化合物、その誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、その立体異性体、またはそれらの組み合わせを含み、
2020523409.tif 000025
式中、環Aは、置換C1-C10アルキルおよび置換C2-C10アルケニルからなる群より独立して選択される置換基R1およびR2を含む置換4〜6員シクロアルキル環または置換4〜6員シクロアルケニル環であり、環Aは、1つまたは複数の追加的な置換基をさらに含む。いくつかの態様では、環Aは、置換シクロペンチル環または置換シクロペンテニル環である。特定の態様では、環A上の1つまたは複数の追加的な置換基は、重水素、ヒドロキシ、アミノ、オキソ、C1-C6アルキル、およびハロゲンからなる群より選択される。場合によっては、環A上の1つまたは複数の追加的な置換基は、ヒドロキシまたはオキソである。いくつかの態様では、環Aは、一緒になって共有結合を形成してヘテロシクロアルキル環を形成する2つの追加的な置換基を有する。
【０１１７】
いくつかの態様では、環Aは、
2020523409.tif 000026
からなる群より選択される。
【０１１８】
特定の態様では、環Aは、
2020523409.tif 000027
からなる群より選択される。
【０１１９】
場合によっては、環Aは、
2020523409.tif 000028
である。
【０１２０】
いくつかの態様では、R1は、置換C1-C10アルキルである。他の態様では、R1は、置換C2-C10アルケニルである。いくつかの態様では、R1は、重水素、ヒドロキシ、オキソ、C1-C6アルキル、-COOR3、およびハロゲンからなる群より選択され、その際、R3は、水素またはC1-C6アルキルである。
【０１２１】
いくつかの態様では、R1は、
2020523409.tif 000029
からなる群より選択される。
【０１２２】
他の態様では、R1は、
2020523409.tif 000030
からなる群より選択される。
【０１２３】
場合によっては、R1は、
2020523409.tif 000031
である。
【０１２４】
いくつかの態様では、R2は、置換C1-C10アルキルである。他の態様では、R2は、置換C2-C10アルケニルである。いくつかの態様では、R2上の置換基は、重水素、ヒドロキシ、オキソ、C1-C6アルキル、-COOR3、およびハロゲンからなる群より選択され、その際、R3は、水素またはC1-C6アルキルである。
【０１２５】
いくつかの態様では、R2は、
2020523409.tif 000032
からなる群より選択される。
【０１２６】
いくつかの態様では、R2は、
2020523409.tif 000033
からなる群より選択される。
【０１２７】
場合によっては、R2は、
2020523409.tif 000034
である。
【０１２８】
いくつかの態様では、式（I）の化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、またはその立体異性体は、式（Ia）、式（Ib）、式（Ic）、もしくは式（Id）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、それらの溶媒和物、またはそれらの立体異性体である。
2020523409.tif 000035
【０１２９】
場合によっては、化合物は、式（Id）の化合物である。
【０１３０】
いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2である。他の態様では、PGE2化合物は、PGE2の誘導体である。場合によっては、誘導体は、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2（dmPGE2）である。特定の態様では、PGE2化合物は、PGE2および／またはdmPGE2である。
【０１３１】
他の態様では、PGE2化合物は、PGE2の誘導体である。場合によっては、誘導体は、一部分にコンジュゲートしたPGE2である。特定の態様では、PGE2化合物は、PGE2-ビオチンまたはPGE2-PEG（ポリエチレングリコール）ヒドロゲルである。例示的な態様を下に示す：
PGE2-ビオチン
2020523409.tif 000036
PGE2-PEG11-ビオチン
2020523409.tif 000037
【０１３２】
いくつかの態様では、PGE2誘導体は、分子プローブにコンジュゲートしたPGE2化合物を含む。いくつかの場合では、分子プローブは、ペプチド配列、抗原結合性フラグメント（Fab）、重鎖のみの抗体（HcAb）、完全長抗体（Ab）、単一ドメイン抗体／ナノボディー（Nb）、もしくはナノ粒子、または組み合わせである。いくつかの場合では、分子プローブは、全身送達を介して筋組織にホーミングおよび筋組織を標的化することが可能である。
【０１３３】
それらの態様では、分子プローブにコンジュゲートしたPGE2化合物を含むPGE2誘導体は、PGE2化合物の半減期を増大させる、PGE化合物の特異性を増大させる、およびPGE2化合物の有害なオフターゲット効果を低減する場合がある。分子プローブにコンジュゲートしたPGE2の非限定的な例には、PGE2-インテグリン-アルファ7抗体またはナノボディー；PGE2-M-カドヘリン抗体またはナノボディー；およびPGE2-抗PGE2抗体が含まれる。いくつかの場合では、分子プローブにコンジュゲートしたPGE2化合物を含むPGE2誘導体は、サルコペニアまたは悪液質を処置するために使用される場合がある。
【０１３４】
いくつかの態様では、PGE2化合物は、PGE2の異化を弱める化合物である。いくつかの場合では、PGE2の異化を弱める化合物は、15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ（15-PGDH）を不活性化もしくは遮断する、または15-PGDHによる異化のためにPGE2を細胞内部に輸送するプロスタグランジントランスポーターを不活性化もしくは遮断する化合物、中和ペプチド、または中和抗体であることができる。プロスタグランジントランスポーターは、2310021C19Rik、MATR1、Matrin F/Q、OATP2A1、PGT、PHOAR2、SLC21A2、溶質担体有機陰イオントランスポーターファミリーメンバー2A1、およびSLCO2A1としても公知である。
【０１３５】
いくつかの態様では、組成物は、幹細胞誘導分子を含む場合がある。いくつかの場合では、幹細胞誘導分子は、本明細書記載のPGE2化合物である。いくつかの場合では、組成物は、ミオトキシンと組み合わせて幹細胞誘導分子を含む。本明細書に使用され得る幹細胞誘導分子の他の非限定的な例には、オキシトシン、ベータインテグリン活性化抗体、ラパマイシン、SetD7阻害剤、p38MAPK阻害剤（SB202190およびSB203580など）、ニューレグリン、神経成長因子（NGF）、Hif2アルファ阻害剤、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、線維芽細胞成長因子4（FGF4）、上皮成長因子（EGF）、インターロイキン-1α、インターロイキン-13、TNFα、LIF、IL6、インターフェロンガンマ、オンコスタチンM（OSM）、グレリン、およびアペリンが含まれる。
【０１３６】
いくつかの態様では、ミオトキシンは、麻酔薬、二価陽イオン、ヘビ毒、トカゲ毒、ハチ毒、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。適切な二価陽イオンには、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、それらの塩、およびそれらの組み合わせが含まれるが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様では、ヘビ毒またはトカゲ毒は、ノテキシン、カルジオトキシン、ブンガロトキシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１３７】
いくつかの態様では、麻酔薬は、アミノ-アミド型麻酔薬、アミノ-エステル型麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合では、麻酔薬は、穏やかなミオトキシンである。アミノ-アミド型麻酔薬の非限定的な例には、ブピバカイン、レボブピバカイン、アルチカイン、ロピバカイン、ブタニリカイン、カルチカイン、ジブカイン、エチドカイン、リドカイン、メピバカイン、プリロカイン、およびトリメカインが含まれる。いくつかの態様では、組成物は、アミノ-アミド型麻酔薬の組み合わせを含む。
【０１３８】
いくつかの態様では、麻酔薬は、アミノ-エステル型麻酔薬である。特定の態様では、アミノ-エステル型麻酔薬は、アミノ安息香酸エステル麻酔薬、安息香酸エステル麻酔薬、またはそれらの組み合わせである。アミノ安息香酸エステル麻酔薬の非限定的な例には、ベンゾカイン、ブタカイン、ブタンベン、クロロプロカイン、ジメトカイン、ルカイン、メプリルカイン、メタブテタミン、メタブトキシカイン、ニトラカイン、オルトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、プロキシメタカイン、リソカイン、およびテトラカインが含まれる。安息香酸麻酔薬の非限定的な例には、アミロカイン、コカイン、シクロメチカイン、α-ユーカイン、β-ユーカイン、ヘキシルカイン、イソブカイン、およびピペロカインが含まれる。特定の態様では、組成物は、1種もしくは複数種のアミノ安息香酸エステル麻酔薬および／または1種もしくは複数種の安息香酸エステル麻酔薬の組み合わせを含む。
【０１３９】
穏やかな筋毒性作用を有し得る麻酔薬の他の非限定的な例には、ベンゾナテート、ジペロドン、ホモカイン、ホトカイン（fotocaine）、ヒドロキシプロカイン、オキセタカイン、オキシブプロカイン、パラエトキシカイン（paraethoxycaine）、フェナカイン、ピリドカイン、プラモカイン、プリマカイン（primacaine）、プロカインアミド、プロパラカイン、ピロカイン、キニソカイン、トリカイン、およびトロパコカインが含まれる。
【０１４０】
いくつかの態様では、組成物は、PGE2および／またはdmPGE2を含むPGE2化合物ならびにブピバカインであるミオトキシンを含む。
【０１４１】
本発明の組成物は、筋損傷、筋傷害、または筋萎縮に関連する筋肉の状態を含むが、それに限定されるわけではない任意の数の筋肉の状態を処置するために適している場合がある。組成物は、また、それを必要とする対象において筋肉再生を促進するため、それを必要とする対象において筋肉量を増大させるため、または両方のために有用である。本発明の組成物による予防または治療のために適した状態の非限定的な例には、外傷（例えば、急性筋外傷、急性神経外傷）、急性筋傷害、急性神経傷害、慢性神経傷害、手の軟部組織傷害、手根管症候群（CTS）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、遠位型筋ジストロフィー（DD）、遺伝性ミオパチー、筋強直性筋ジストロフィー（MDD）、ミトコンドリアミオパチー、筋細管ミオパチー（MM）、重症筋無力症（MG）、うっ血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解、皮膚筋炎、癌悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、サルコペニア、脊髄性筋萎縮、肛門括約筋機能障害、ベル麻痺、腱板損傷、脊髄損傷、人工股関節置換、人工膝開節置換、手首の骨折、糖尿病性ニューロパチー、胃食道逆流症（GERD）、閉塞性睡眠時無呼吸（OSA）、骨盤底障害（例えば、腹圧性尿失禁、過活動膀胱／切迫性尿失禁、混合性尿失禁、骨盤臓器脱、大便失禁）、筋骨格障害（例えば、手の機能障害、母指機能障害、足の機能障害）、足底筋膜炎、下垂足、廃用誘発性筋萎縮、眼瞼機能障害（例えば、眼瞼の垂れ下がり、瞬目障害、眼瞼内反、眼瞼外反）、斜視、眼振、および老視が含まれる。本発明の組成物による予防または治療のために適した状態の追加的な例には、神経再支配後に回復しない神経傷害または直接の外傷後の顔または手の萎縮および筋機能障害；グレーブス病、外傷、および進行性外眼筋麻痺に見られる眼球運動不能および複視（dipoplia）を引き起こす外眼筋傷害；ならびに尿失禁および大便失禁を含む、少数の細胞の局所移植により再生できる、小さい孤立した筋肉に影響する筋肉障害が含まれる場合がある。
【０１４２】
本発明の別の局面では、薬学的組成物が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、薬学的組成物は、PGE2化合物およびミオトキシンを含む薬学的に許容される担体および本明細書記載の組成物を含む。ある局面では、薬学的に許容される担体は、投与されている特定の組成物により、および組成物を投与するために使用される特定の方法により、部分的に決定される。したがって、本発明の薬学的組成物の多種多様な適切な製剤がある（例えばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 18TH ED., Mack Publishing Co., Easton, PA (1990)を参照されたい）。
【０１４３】
本明細書に使用される「薬学的に許容される担体」は、薬学的組成物を製剤化する際に当業者に公知の任意の標準的な薬学的に許容される担体を含む。したがって、薬学的に許容される塩としてもしくはコンジュゲートとして存在するような細胞または化合物自体は、薬学的に許容される希釈剤；例えば、食塩水、リン酸緩衝食塩水（PBS）、水性エタノール、またはグルコース、マンニトール、デキストラン、プロピレングリコール、油（例えば、植物油、動物油、合成油など）、結晶セルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウム、ゼラチン、もしくはポリソルベート80などの溶液中の製剤として、または適切な賦形剤中の固体製剤として調製され得る。
【０１４４】
薬学的組成物は、しばしば、1種または複数種の緩衝液（例えば、中性緩衝食塩水またはリン酸緩衝食塩水）、糖質（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソールなど）、静菌薬、EDTAまたはグルタチオンなどのキレート剤、製剤をレシピエントの血液と等張、低張または弱高張にする溶質、懸濁化剤、増粘剤、保存剤、香味剤、甘味剤、および着色化合物を適宜さらに含むであろう。
【０１４５】
本発明の薬学的組成物は、投薬製剤と適合するように、治療的に有効であろう量で投与される場合がある。投与すべき量は、例えば、個体の年齢、体重、身体活動、および食事、処置すべき状態または疾患、および前記状態または疾患のステージまたは重症度を含む多様な要因に依存する場合がある。ある態様では、用量の大きさは、また、特定の個体における治療剤の投与に伴う任意の有害副作用の存在、性質、および程度により決定される場合がある。
【０１４６】
しかし、任意の特定の患者に対する特定の用量レベルおよび投薬頻度は、様々な場合があり、採用される特定の化合物の活性、その化合物の代謝安定性および作用の長さ、年齢、体重、遺伝特性、全身の健康状態、性別、食事、投与の様式および時間、排泄速度、薬物の組み合わせ、特定の状態の重症度、ならびに治療を受けている宿主を含む、多様な要因に依存する場合があることが、理解されるであろう。
【０１４７】
ある態様では、化合物の用量は、好ましくは、正確な投薬量を簡易に投与するのに適した単位剤形の、固体、半固体、凍結乾燥した粉末、または液体剤形、例えば、錠剤、丸剤、ペレット剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、坐剤、停留浣腸、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、ゲル剤、エアロゾル、またはフォーム剤などの形態をとる場合がある。
【０１４８】
本明細書に使用される用語「単位剤形」は、ヒトおよび他の哺乳動物に対する単位投薬量として適した物理的に別個の単位を意味し、各単位は、適切な薬学的賦形剤に関連して所望の発現、耐容性、および／または治療効果を生成するように計算された所定の量の治療薬剤を含有する（例えばアンプル）。加えて、より高濃度の剤形が調製される場合があり、次いでそれらから、より希薄な単位剤形が生成される場合がある。したがって、より高濃度の剤形は、例えば、少なくとも1倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、またはそれ以上より実質的に多い量の治療的化合物を含有する場合がある。
【０１４９】
このような剤形を調製するための方法は、当業者に公知である（例えばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES、前記を参照されたい）。典型的には、これらの剤形は、従来の薬学的な担体または賦形剤を含み、他の医学的薬剤、担体、補助物質、希釈剤、組織透過促進剤、および可溶化剤などをさらに含む場合がある。適切な賦形剤は、当技術分野において周知の方法によって、特定の剤形および投与経路に調整することができる（例えばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES、前記を参照されたい）。
【０１５０】
適切な賦形剤の例には、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、食塩水、シロップ、メチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、およびポリアクリル酸、例えばカーボポール、例えば、カーボポール941、カーボポール980、カーボポール981などが含まれるが、それに限定されるわけではない。剤形は、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油などの滑沢剤；湿潤剤；乳化剤；懸濁化剤；ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸エチル、およびヒドロキシ安息香酸プロピル（すなわちパラベン）などの保存剤；無機酸および有機酸および塩基などのpH調整剤；甘味剤；ならびに香味剤を追加的に含むことができる。剤形は、また、生分解性ポリマービーズ、デキストラン、ヒドロゲル、およびシクロデキストリン包接錯体を含む場合がある。
【０１５１】
経口投与について、治療的有効用量は、錠剤、カプセル剤、乳剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、スプレー剤、ロゼンジ、散剤、および徐放性製剤の形態であることができる。経口投与のための適切な賦形剤には、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ゼラチン、スクロース、および炭酸マグネシウムなどが含まれる。
【０１５２】
治療的有効用量は、また、凍結乾燥された形態で提供することができる。このような剤形は、投与前に再構成するために、緩衝剤、例えば重炭酸塩を含む場合があり、または緩衝剤は、例えば水を用いて再構成するための凍結乾燥された剤形中に含まれる場合がある。凍結乾燥剤形は、適切な血管収縮薬、例えばエピネフリンをさらに含む場合がある。凍結乾燥剤形は、再構成された剤形を個体に直ちに投与できるように、任意で再構成のための緩衝液と組み合わせてパッケージされたシリンジ中に提供することができる。
【０１５３】
いくつかの態様では、本発明の薬学的組成物は、水性基剤を含む薬学的に許容される担体を含む。他の態様では、薬学的に許容される担体は、低粘度化合物を含む。場合によっては、低粘度化合物は、ゼラチンを含む。他の例では、低粘度化合物は、ヒドロゲルを含む。
【０１５４】
B. 筋肉再生を促進し、筋肉の状態を予防または治療するための方法
本発明の別の局面では、それを必要とする対象において筋肉再生を促進するため、それを必要とする対象において筋肉量を増大させるため、または両方のための方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、この方法は、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象に投与することを含む。いくつかの態様では、薬学的に許容される担体およびPGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを含む薬学的組成物が、対象に投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物の治療的有効量が、対象に投与される。他の態様では、ミオトキシンの治療的有効量が、対象に投与される。特定の態様では、PGE2化合物およびミオトキシンの治療的有効量が、対象に投与される。
【０１５５】
本発明のなお別の局面では、それを必要とする対象における筋肉の状態を予防または治療するための方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、この方法は、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを対象に投与することを含む。いくつかの態様では、薬学的に許容される担体およびPGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを含む薬学的組成物が、対象に投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物の治療的有効量が、対象に投与される。他の態様では、ミオトキシンの治療的有効量が、対象に投与される。特定の態様では、PGE2化合物およびミオトキシンの治療的有効量が、対象に投与される。
【０１５６】
本発明のさらに別の局面では、それを必要とする対象における筋肉の状態を予防または治療するための方法が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、この方法は、PGE2受容体アゴニストを対象に投与することを含む。他の態様では、この方法は、ミオトキシンを対象に投与することをさらに含む。いくつかの態様では、薬学的に許容される担体、PGE2受容体アゴニスト、および任意でミオトキシンを含む薬学的組成物が、対象に投与される。いくつかの態様では、PGE2受容体アゴニストの治療的有効量が、対象に投与される。他の態様では、ミオトキシンの治療的有効量が、対象に投与される。特定の態様では、PGE2受容体アゴニストおよびミオトキシンの治療的有効量が、対象に投与される。
【０１５７】
いくつかの態様では、この方法は、PGE2、PGE2のプロドラッグ（例えばNCAD受容体を標的化する神経カドヘリン（NCAD）と結合したPGE2）、PGE2受容体アゴニスト、PGE2の異化を弱める化合物、PGE2の阻害を中和する化合物、それらの誘導体、それらの類似体、およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるPGE2化合物を投与することを含む。PGE2のプロドラッグは、例えば、投与もしくは筋肉再生の部位で、またはプロドラッグが筋肉細胞に曝露された場合に、薬理学的に活性なPGE2薬に代謝されることができる。いくつかの場合では、PGE2化合物は、PGE2受容体の会合およびシグナル伝達を保持するが、インターナリゼーションを防止し、長期活性をもたらし、分解経路に打ち勝つ、ビオチン化薬または他の修飾である。
【０１５８】
特定の態様では、投与されるPGE2化合物は、その安定性、活性、分解抵抗性、筋肉細胞への輸送を増加させる（例えば、細胞取り込みを促進する）、および／または筋肉細胞中の保持を増加させる（例えば、取り込み後に筋肉細胞からの分泌を低減する）、PGE2への1つまたは複数の修飾を含有するPGE2誘導体またはPGE2類似体である。
【０１５９】
非限定的に、本発明の方法による投与に適したPGE2誘導体およびPGE2類似体の例には、2,2-ジフルオロ-16-フェノキシ-PGE2化合物、2-デカルボキシ-2-ヒドロキシメチル-16-フルオロ-PGE2化合物、2-デカルボキシ-2-ヒドロキシメチル-11-デオキシ-PGE2化合物、19(R)-ヒドロキシPGE2、16,16-ジメチルPGE2、16,16-ジメチルPGE2 p-(p-アセトアミドベンズアミド)フェニルエステル、11-デオキシ-16,16-ジメチルPGE2（dmPGE2）、9-デオキシ-9-メチレン-16,16-ジメチルPGE2、9-デオキシ-9-メチレンPGE2、ブタプロスト、スルプロストン、エンプロスチル、PGE2セリノールアミド、PGE2メチルエステル、16-フェニルテトラノルPGE2、5-トランス-PGE2、15(S)-15-メチルPGE2、15(R)-15-メチルPGE2、およびPGE2-ビオチンまたはPGE2-PEG（ポリエチレングリコール）ヒドロゲルが含まれる。追加的なPGE2誘導体およびPGE2類似体は、例えば米国特許第5,409,911号に示されている。
【０１６０】
投与のためのPGE2誘導体およびPGE2類似体の追加的な非限定的な例には、PGE2のヒダントイン誘導体、すなわちヒドロキシシクロペンタノン環が複素環に置き換わっており、不飽和アルファ-アルケニル鎖がフェネチル鎖で置換されている、Zhao et al. （Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 17:6572-5 (2007)）に記載されているより安定なPGE2類似体、Ungrin et al.（Mol. Pharmacol., 59: 1446-56 (2001)）に記載されているPGE2類似体、Tanami et al.（Bioorg. Med. Chem. Lett., 8： 1507-10 (1998)）に記載されているPGE2の13-デヒドロ誘導体、ならびに米国特許第8,546,603号および同第8,158,676号に記載されている置換シクロペンタンが含まれる。
【０１６１】
いくつかの態様では、PGE2受容体、例えば、EP1受容体、EP2受容体、EP3受容体、およびEP4受容体のアゴニストであるPGE2化合物が、投与される。PGE2受容体アゴニストの非限定的な例には、ONO-DI-004、ONO-AEl-259、ONO-AE-248、ONO-AE1-329、ONO-4819CD（Ono Pharmaceutical Co., Japan）、L-902688（Cayman Chemical）、CAY10598（Cayman Chemical）、およびCP-533536（Pfizer）が含まれる。追加的なPGE2受容体アゴニストは、例えば、米国特許第6,410,591号、同第6,610,719号、同第6,747,037号、同第7,696,235号、同第7,662,839号、同第7,652,063号、同第7622,475号、および同第7,608,637号に記載されている。
【０１６２】
特定の態様では、本発明の方法により投与されるPGE2受容体アゴニストは、式（I）の化合物、その誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、その立体異性体、またはそれらの組み合わせを含み、
2020523409.tif 000038
式中、環Aは、置換C1-C10アルキルおよび置換C2-C10アルケニルからなる群より独立して選択される置換基R1およびR2を含む置換4〜6員シクロアルキル環または置換4〜6員シクロアルケニル環であり、環Aは、1つまたは複数の追加的な置換基をさらに含む。いくつかの態様では、環Aは、置換シクロペンチル環または置換シクロペンテニル環である。特定の態様では、環A上の1つまたは複数の追加的な置換基は、重水素、ヒドロキシ、アミノ、オキソ、C1-C6アルキル、およびハロゲンからなる群より選択される。場合によっては、環A上の1つまたは複数の追加的な置換基は、ヒドロキシまたはオキソである。いくつかの態様では、環Aは、一緒になって共有結合を形成してヘテロシクロアルキル環を形成する2つの追加的な置換基を有する。
【０１６３】
いくつかの態様では、環Aは、
2020523409.tif 000039
からなる群より選択される。
【０１６４】
特定の態様では、環Aは、
2020523409.tif 000040
からなる群より選択される。
【０１６５】
場合によっては、環Aは、
2020523409.tif 000041
である。
【０１６６】
いくつかの態様では、R1は、置換C1-C10アルキルである。他の態様では、R1は、置換C2-C10アルケニルである。いくつかの態様では、R1は、重水素、ヒドロキシ、オキソ、C1-C6アルキル、-COOR3、およびハロゲンからなる群より選択され、その際、R3は、水素またはC1-C6アルキルである。
【０１６７】
いくつかの態様では、R1は、
2020523409.tif 000042
からなる群より選択される。
【０１６８】
他の態様では、R1は、
2020523409.tif 000043
からなる群より選択される。
【０１６９】
場合によっては、R1は、
2020523409.tif 000044
である。
【０１７０】
いくつかの態様では、R2は、置換C1-C10アルキルである。他の態様では、R2は、置換C2-C10アルケニルである。いくつかの態様では、R2上の置換基は、重水素、ヒドロキシ、オキソ、C1-C6アルキル、-COOR3、およびハロゲンからなる群より選択され、その際、R3は、水素またはC1-C6アルキルである。
【０１７１】
いくつかの態様では、R2は、
2020523409.tif 000045
からなる群より選択される。
【０１７２】
いくつかの態様では、R2は、
2020523409.tif 000046
からなる群より選択される。
【０１７３】
場合によっては、R2は、
2020523409.tif 000047
である。
【０１７４】
いくつかの態様では、式（I）の化合物、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物、またはその立体異性体は、式（Ia）、式（Ib）、式（Ic）、もしくは式（Id）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される塩、それらの溶媒和物、またはそれらの立体異性体である。
2020523409.tif 000048
場合によっては、化合物は、式（Id）の化合物である。
【０１７５】
いくつかの態様では、本発明の方法により投与されるPGE2化合物は、PGE2を含む。他の態様では、投与されるPGE2化合物は、PGE2の誘導体を含む。場合によっては、誘導体は、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2（dmPGE2）である。特定の態様では、投与されるPGE2化合物は、PGE2および／またはdmPGE2を含む。
【０１７６】
いくつかの態様では、投与されるPGE2化合物は、PGE2の異化を弱める化合物である。いくつかの場合では、PGE2の異化を弱める化合物は、15-ヒドロキシプロスタグランジンデヒドロゲナーゼ（15-PGDH）を不活性化もしくは遮断する、または15-PGDHによる異化のために細胞内部にPGE2を輸送するプロスタグランジントランスポーターを不活性化もしくは遮断する化合物、中和ペプチド、または中和抗体であることができる。プロスタグランジントランスポーターは、2310021C19Rik、MATR1、Matrin F/Q、OATP2A1、PGT、PHOAR2、SLC21A2、溶質担体有機陰イオントランスポーターファミリーメンバー2A1、およびSLCO2A1としても公知である。
【０１７７】
いくつかの態様では、本発明の方法により投与される組成物は、幹細胞誘導分子を含む場合がある。いくつかの場合では、幹細胞誘導分子は、本明細書記載のPGE2化合物である。本明細書に使用され得る幹細胞誘導分子の他の非限定的な例には、オキシトシン、ベータインテグリン活性化抗体、ラパマイシン、SetD7阻害剤、p38 MAPK阻害剤（SB202190およびSB203580など）、ニューレグリン、神経成長因子（NGF）、Hif2アルファ阻害剤、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、線維芽細胞成長因子4（FGF4）、上皮成長因子（EGF）、インターロイキン-1α、インターロイキン-13、TNFα、LIF、IL6、インターフェロンガンマ、オンコスタチンM（OSM）、グレリン、およびアペリンが含まれる。
【０１７８】
いくつかの態様では、本発明の方法により投与されるミオトキシンは、麻酔薬、二価陽イオン、ヘビ毒、トカゲ毒、ハチ毒、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。適切な二価陽イオンには、Ba2+、Sr2+、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Ni2+、Co2+、それらの塩、およびそれらの組み合わせが含まれるが、それに限定されるわけではない。いくつかの態様では、ヘビ毒またはトカゲ毒は、ノテキシン、カルジオトキシン、ブンガロトキシン、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１７９】
いくつかの態様では、麻酔薬は、アミノ-アミド型麻酔薬、アミノ-エステル型麻酔薬、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの場合では、麻酔薬は、穏やかなミオトキシンである。アミノ-アミド型麻酔薬の非限定的な例には、ブピバカイン、レボブピバカイン、アルチカイン、ロピバカイン、ブタニリカイン、カルチカイン、ジブカイン、エチドカイン、リドカイン、メピバカイン、プリロカイン、およびトリメカインが含まれる。いくつかの態様では、組成物は、アミノ-アミド型麻酔薬の組み合わせを含む。
【０１８０】
いくつかの態様では、麻酔薬は、アミノ-エステル型麻酔薬である。特定の態様では、アミノ-エステル型麻酔薬は、アミノ安息香酸エステル麻酔薬、安息香酸エステル麻酔薬、またはそれらの組み合わせである。アミノ安息香酸エステル麻酔薬の非限定的な例には、ベンゾカイン、ブタカイン、ブタンベン、クロロプロカイン、ジメトカイン、ルカイン、メプリルカイン、メタブテタミン、メタブトキシカイン、ニトラカイン、オルトカイン、プロポキシカイン、プロカイン、プロキシメタカイン、リソカイン、およびテトラカインが含まれる。安息香酸麻酔薬の非限定的な例には、アミロカイン、コカイン、シクロメチカイン、α-ユーカイン、β-ユーカイン、ヘキシルカイン、イソブカイン、およびピペロカインが含まれる。特定の態様では、組成物は、1種もしくは複数種のアミノ安息香酸エステル麻酔薬および／または1種もしくは複数種の安息香酸エステル麻酔薬の組み合わせを含む。
【０１８１】
穏やかな筋毒性作用を有し得る麻酔薬の他の非限定的な例には、ベンゾナテート、ジペロドン、ホモカイン、ホトカイン、ヒドロキシプロカイン、オキセタカイン、オキシブプロカイン、パラエトキシカイン、フェナカイン、ピリドカイン、プラモカイン、プリマカイン、プロカインアミド、プロパラカイン、ピロカイン、キニソカイン、トリカイン、およびトロパコカインが含まれる。
【０１８２】
いくつかの態様では、本発明の方法による投与のための組成物は、PGE2および／またはdmPGE2を含むPGE2化合物ならびに麻酔薬であるミオトキシン（例えば、ブピバカイン）を含む。特定の態様では、麻酔薬は、対象に投与されない。いくつかの態様では、麻酔薬でないミオトキシンが、対象に投与される。
【０１８３】
本明細書に提供される方法は、それを必要とする対象において筋肉の状態または疾患（例えば、筋損傷、筋傷害、または筋萎縮に関連する筋肉の状態または疾患）を予防または治療するために使用することができる。この方法は、筋肉の状態（例えば、筋損傷、筋傷害、または筋萎縮）を経験する可能性が高い対象に予防的処置を提供することができる。いくつかの態様では、対象は、筋肉を冒す二次症状が起こり得る状態または疾患を有することができる。他の態様では、対象は、筋肉の状態または疾患を処置するための外科的または治療的な手技または介入を受けたことがあり、本明細書に開示される方法は、再発または再燃を予防または阻害するために使用される。いくつかの態様では、対象は、筋肉を冒す本明細書記載の状態または疾患のうち任意の1つを有する。
【０１８４】
本明細書に使用される用語「処置」または「処置すること」は、疾患の重症度を低減するため、疾患進行を停止させるため、または疾患を取り除くために、疾患症状の発現前に、および／または状態もしくは疾患の臨床的出現もしくは他の出現後に、適切な形態の化合物および／または細胞を投与することを包含する。疾患「の予防」または疾患「を予防すること」という用語は、好ましくは状態または疾患に対する感受性が増大した対象において、状態または疾患の症状の発現を延長または遅延させることを含む。いくつかの態様では、対象を処置することにより、筋力および／または筋肉の協調運動に改善が生じる。
【０１８５】
本明細書に提供される方法は、それを必要とする対象における筋肉再生を促進するため、それを必要とする対象における筋肉量を増大させるため、または両方のために有用である場合がある。筋肉の再生は、筋肉幹細胞、衛星細胞、筋肉前駆細胞、およびそれらの任意の組み合わせから新しい筋線維を形成することを含む。この方法は、また、筋肉修復、維持、または両方を強化または増強するために有用である。さらに、筋肉再生を促進することにより、本明細書に提供される方法は、また、神経筋接合部の形成ならびに筋収縮機能および体積の回復を促進する。
【０１８６】
いくつかの態様では、本明細書に提供される方法は、PGE2化合物およびミオトキシンを含む組成物を筋肉または筋肉細胞にインビボで投与することを含む。他の態様では、本明細書に提供される方法は、PGE2化合物を含む第1の組成物を筋肉細胞にエクスビボで提供すること、および筋肉細胞を筋肉にインビボで投与することを含む。いくつかの場合では、第1の組成物は、ミオトキシンをさらに含む場合がある。他の場合では、筋肉細胞を筋肉にインビボで投与することは、ミオトキシンを筋肉にインビボで投与することをさらに含む。
【０１８７】
いくつかの態様では、本明細書に提供される方法は、老化細胞除去薬（senolytic drug）を投与することをさらに含む。老化細胞除去薬は、老化関連分泌表現型を生成する老化細胞の除去を誘導する薬物である。いくつかの場合では、老化細胞除去薬は、BCL-2、BCL‐XL、MDM2、p53、p21、セルピン（PAI-1&2）、HSP-90、PI3Kδ、AKT、HIF1アルファ、エフリン、またはそれらの組み合わせを伴う経路を標的化する薬物である。老化細胞除去薬の例には、ダサチニブ、アルベスピマイシン（alvespimycin）、ゲルダナマイシン、タネスピマイシン；フィセチン、ABT-263、ABT-767、A1331852、およびA1155463が含まれる。いくつかの場合では、老化細胞除去薬の投与は、PGE2化合物およびミオトキシンを含む組成物を投与する前、途中、後、またはそれらの組み合わせである。
【０１８８】
本発明の方法にしたがって、本発明の組成物および薬学的組成物（例えば、PGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせを含む、またはPGE2受容体アゴニストおよび任意でミオトキシンを含む）は、筋肉の傷害、筋変性、筋損傷、筋萎縮、またはそれらの任意の組み合わせなどの筋肉の状態を経験している対象に投与することができる。場合によっては、筋肉の状態は、部分的または完全な除神経の結果である。筋萎縮は、筋肉量の減少、筋力低下、または両方を含むことができる。筋萎縮は、対象の任意の筋肉を冒す場合がある。いくつかの場合では、本明細書に提供される組成物、方法、およびキットを必要とする対象は、例えば、年齢、不活動、傷害、疾患、またはそれらの任意の組み合わせによる筋肉減少を示しているまたは経験している場合がある。
【０１８９】
いくつかの態様では、化合物は、筋肉細胞の増殖、筋肉細胞の分化、筋肉細胞の融合、またはそれらの任意の組み合わせを活性化することができる。いくつかの場合では、筋組織は、再生される場合がある。他の場合では、筋肉の機能（例えば、筋肉量、筋力、筋収縮、またはそれらの任意の組み合わせ）は、回復または強化される場合がある。いくつかの場合では、筋力低下および筋萎縮は、改善する場合がある。
【０１９０】
損傷した筋肉は、胸筋複合体（musculi pectoralis complex）、広背筋、大円筋および肩甲下筋、腕橈骨筋、二頭筋、上腕筋、方形回内筋、円回内筋、橈側手根屈筋、尺側手根屈筋、浅指屈筋、深指屈筋、短母指屈筋、母指対立筋、母指内転筋（例えば、短母指外転筋、長母指外転筋）、短母指屈筋、腸腰筋、腰筋、腹直筋、大腿直筋、大殿筋、中殿筋、内側ハムストリングス、腓腹筋、外側ハムストリングス、大腿四頭筋メカニズム、長内転筋、短内転筋、大内転筋、腓腹筋内側頭、腓腹筋外側頭、ヒラメ筋、後脛骨筋、前脛骨筋、長趾屈筋、短趾屈筋、長母趾屈筋、長母趾伸筋、手筋、腕筋、足筋、脚筋、胸部筋肉、腹筋、背筋、臀部筋、肩の筋肉、頭頸部の筋肉、顔面筋、および眼筋咽頭筋などを含むが、それに限定されるわけではない、身体の任意の筋肉であることができる。場合によっては、筋肉は、短母指外転筋であり得る。
【０１９１】
筋肉再生を必要とする対象は、筋骨格傷害（例えば、骨折、ストレイン、捻挫、急性傷害、およびオーバーユース傷害など）、肢または顔への外傷後損傷、スポーツ損傷、高齢者の骨折後、手の軟部組織傷害、筋萎縮（例えば、筋肉量の減少）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）、ベッカー型筋ジストロフィー、福山型先天性筋ジストロフィー（FCMD）、肢帯型筋ジストロフィー（LGMD）、先天性筋ジストロフィー、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（FHMD）、筋強直性筋ジストロフィー、眼咽頭型筋ジストロフィー、遠位型筋ジストロフィー、エメリー-ドレイフス型筋ジストロフィー、先天性筋強直症、筋強直性ジストロフィー、他の筋ジストロフィー、癌、末期腎疾患（ESRD）、後天性免疫不全症候群（AIDS）、または慢性閉塞性肺疾患（COPD）による悪液質などの筋消耗疾患、術後筋力低下、外傷後筋力低下、サルコペニア、不活動（例えば、筋肉廃用または不動）、尿道括約筋不全、尿道括約筋不全、および神経筋疾患などを有する場合がある。
【０１９２】
神経筋疾患の非限定的な例には、酸性マルターゼ欠損症、筋萎縮性側索硬化症、アンダーセン-タウィル症候群、ベッカー型筋ジストロフィー、ベッカー型先天性筋強直症、ベスレムミオパチー、球脊髄性筋萎縮症、カルニチン欠損症、カルニチンパルミチルトランスフェラーゼ欠損症、セントラルコア病、中心核ミオパチー、シャルコー-マリー-トゥス病、先天性筋ジストロフィー、先天性筋無力症候群、先天性筋強直性ジストロフィー、コリ病、脱分枝酵素欠損症、デジェリン-ソッタス病、皮膚筋炎、遠位型筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、筋強直性ジストロフィー、エメリー-ドレイフス型筋ジストロフィー、内分泌性ミオパチー、オイレンベルク病、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー、遠位型脛骨筋ミオパチー、フリードライヒ運動失調症、福山型（Fukuyuma）先天性筋ジストロフィー、糖原病10型、糖原病11型、糖原病2型、糖原病3型、糖原病5型、糖原病7型、糖原病9型、ガワーズ-レイン遠位型ミオパチー、遺伝性封入体筋炎、甲状腺機能亢進性のミオパチー、甲状腺機能低下性のミオパチー、封入体筋炎、遺伝性ミオパチー、インテグリン欠損先天性筋ジストロフィー、脊髄-延髄性筋萎縮、脊髄性筋萎縮、乳酸デヒドロゲナーゼ欠損症、ランバート-イートン筋無力症候群、マッカードル病、メロシン欠損型先天性筋ジストロフィー、筋肉の代謝疾患、ミトコンドリアミオパチー、三好遠位型ミオパチー、運動ニューロン疾患、筋-眼-脳病、重症筋無力症、ミオアデニル酸デアミナーゼ欠損症、筋原線維ミオパチー、筋ホスホリラーゼ欠損症、先天性筋緊張症、筋強直性筋ジストロフィー、筋細管ミオパチー、ネマリンミオパチー、埜中遠位型ミオパチー、眼咽頭型筋ジストロフィー、先天性パラミオトニア、ピアソン症候群、周期性四肢麻痺、ホスホフルクトキナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸キナーゼ欠損症、ホスホグリセリン酸ムターゼ欠損症、ホスホリラーゼ欠損症、多発性筋炎、ポンペ病、進行性外眼筋麻痺、脊髄性筋萎縮、ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー、ウェランダー型遠位型ミオパチー、およびZASP関連ミオパチーなどが含まれるが、それに限定されるわけではない。
【０１９３】
筋萎縮（例えば、筋消耗）は、例えば、通常の加齢（例えば、サルコペニア）、遺伝子異常（例えば、変異または一塩基多型）、栄養不足、血行不良、ホルモン支援の低下、運動不足に起因する筋肉の廃用（例えば、床上安静、ギプス包帯中の肢固定など）、外科的手技（例えば、外科的処置）、外傷（例えば、偶発性外傷）、傷害（例えば、偶発性傷害）、加齢、筋肉を支配する神経の損傷、灰白髄炎、筋萎縮性側索硬化症（ALSまたはルー・ゲーリック病）、心不全、肝疾患、糖尿病、肥満、メタボリックシンドローム、脱髄疾患（例えば、多発性硬化症、シャルコー-マリー-トゥス病、ペリツェウス-メルツバッハ病、脳脊髄炎、視神経脊髄炎、副腎白質ジストロフィー、およびギラン-バレー症候群）、除神経、疲労、運動誘発性の筋肉疲労、フレイル、神経筋疾患、衰弱、ならびに慢性疼痛などが原因で引き起こされる可能性があり、またはそれらに関連していることができる。
【０１９４】
特定の態様では、予防または治療される筋肉の状態または疾患は、外傷（例えば、急性筋外傷、急性神経外傷）、急性筋傷害、急性神経傷害、慢性神経傷害、手の軟部組織傷害、手根管症候群（CTS）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、遠位型筋ジストロフィー（DD）、遺伝性ミオパチー、筋強直性筋ジストロフィー（MDD）、ミトコンドリアミオパチー、筋細管ミオパチー（MM）、重症筋無力症（MG）、うっ血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解、皮膚筋炎、癌悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、サルコペニア、脊髄性筋萎縮、肛門括約筋機能障害、ベル麻痺、腱板損傷、脊髄損傷、人工股関節置換、人工膝開節置換、手首の骨折、糖尿病性ニューロパチー、胃食道逆流症（GERD）、閉塞性睡眠時無呼吸（OSA）、骨盤底障害（例えば、腹圧性尿失禁、過活動膀胱／切迫性尿失禁、混合性尿失禁、骨盤臓器脱、大便失禁）、筋骨格障害（例えば、手の機能障害、母指機能障害、足の機能障害）、足底筋膜炎、下垂足、廃用誘発性筋萎縮、眼瞼機能障害（例えば、眼瞼の垂れ下がり、瞬目障害、眼瞼内反、眼瞼外反）、斜視、眼振、および老視からなる群より選択される。場合によっては、対象は、筋消耗を伴うまたは伴わない尺骨神経絞扼を（例えば、肘部に）有する。適切な状態の追加的な例には、神経再支配後に回復しない神経傷害または直接の外傷後の顔または手の萎縮および筋機能障害；グレーブス病、外傷、および進行性外眼筋麻痺に見られる眼球運動不能および複視を引き起こす外眼筋傷害；ならびに尿失禁および大便失禁を含む、少数の細胞の局所移植により再生できる、小さい孤立した筋肉に影響する筋障害が含まれる場合がある。
【０１９５】
いくつかの態様では、対象は、外傷を受けたことがある。他の態様では、治療されている筋肉の状態は、外傷である。特定の態様では、外傷は、鈍的外傷または挫傷を含む。場合によっては、外傷は、肢（例えば、腕、脚、手、足、指）への鈍的外傷または挫傷を含む。いくつかの態様では、外傷は偶発性である。いくつかの態様では、PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）は、外傷が起こった直後に投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）とミオトキシンとの組み合わせは、外傷が起こった直後に投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）およびミオトキシンは、対象に同時投与される。いくつかの態様では、PGE2化合物またはPGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせは、外傷の発生後、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、または60分以内に投与される。他の態様では、PGE2化合物またはPGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせは、外傷の発生の約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、または24時間以内に投与される。PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）またはPGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせは、外傷の発生に次いで、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の回数投与することができる。
【０１９６】
いくつかの態様では、本発明の方法により（例えば、筋肉の状態もしくは疾患のために、または予防的に）処置される対象は、外科的手技（例えば、外科的処置）を受ける。いくつかの態様では、外科的手技は、神経傷害の予防、低減、または修復のためである。非限定的な例として、神経傷害（例えば、外科的に処置される）は、末梢神経傷害であることができる。場合によっては、本発明の方法により（例えば、筋肉の状態または疾患について）処置されるまたは予防的処置を与えられる対象は、手根管開放手技を受ける。いくつかの態様では、外科的手技は、筋肉を切離すること、筋肉を修復すること、または両方を含む。非限定的な例として、PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）、またはPGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせは、帝王切開、人工股関節置換、または人工膝開節置換と一緒に投与することができる（例えば、PGE2化合物、またはPGE2化合物とミオトキシンとの組み合わせは、帝王切開、人工股関節置換、または人工膝開節置換が行われるのと同時に投与することができる）。いくつかの態様では、本発明の方法は、術後の回復を強化する。本発明の方法は、また、小さい筋肉の機能、小さい筋肉の筋力、または両方（例えば、手、顔、眼咽頭筋）を強化するために使用することができる。外科的手技と一緒に使用する場合、本発明の方法は、外科手術の前に、外科手術の途中に、外科手術の後に、またはそれらの任意の組み合わせで行うことができる。いくつかの態様では、PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）だけが、投与される（例えば、外科的手技の前に、同時に、または後に）。特定の態様では、麻酔薬は送達されない。非限定的な例として、場合によっては、本発明の方法は、マーカインの投与の必要性を取り除く場合がある。
【０１９７】
組成物および薬学的組成物（例えば、PGE2化合物およびミオトキシンを含む、またはPGE2受容体アゴニストおよび任意でミオトキシンを含む）は、局所、経口、腹腔内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、静脈内、頭蓋内、クモ膜下腔内、脊髄内、病巣内、鼻腔内、脳室内に、吸入によりおよび／または心臓内注射により投与することができる。組成物は、短期的レジメン（例えば、単回もしくは間欠投与）または長期的レジメン（例えば、連続投与）により投与することができる。
【０１９８】
PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）とミオトキシンとの組み合わせが投与される場合、PGE2化合物およびミオトキシンは、同時または順次に投与することができる。PGE2化合物およびミオトキシンが、順次に投与される場合、PGE2化合物を最初に投与し、次いでミオトキシンを投与するか、またはその逆であってよい。いくつかの態様では、順次投与の順序は、交互であるか、またはさもなければ処置の間で変動する（例えば、1つの処置の間に、PGE2化合物が最初に投与され、ミオトキシンの投与が続き、次に後続の処置の間にミオトキシンが最初に投与され、PGE2化合物が続く）。
【０１９９】
PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）およびミオトキシンが順次投与される場合、化合物の投与は、ある長さの時間だけ離れていてもよい。いくつかの場合では、化合物の投与は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60分、またはそれ以上だけ離れている。他の場合では、化合物の投与は、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24時間、またはそれ以上だけ離れている。他の場合では、化合物の投与は、約1、2、3、4、5、6、7日、またはそれ以上だけ離れている。
【０２００】
いくつかの態様では、PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）、ミオトキシン、または両方の用量は、標的となる筋肉のサイズを基に決定される。非限定的な例として、標的となる筋肉が短母指外転筋（例えば、およそ平均的なサイズの短母指外転筋）である場合、用量は、約10μgのPGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）、ミオトキシン、または両方を含むことができる。他の非限定的な例として、用量は、筋組織1kgあたり約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、25、40、45、50mg、またはそれ以上のPGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）、ミオトキシン、または両方を含むことができる。
【０２０１】
他の態様では、PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）、ミオトキシン、または両方の用量は、対象の体重に基づく。特定の態様では、PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）、ミオトキシン、または両方の用量は、対象の体重1kgあたり約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、25、40、45、50mg、またはそれ以上である。
【０２０２】
いくつかの態様では、対象は、また、対象に対して自家または同種のいずれかである、単離された（または単離および精製された）筋肉細胞の集団を投与される。細胞は、当業者に公知の任意の方法により単離、精製、または両方を行うことができる。細胞は、筋肉細胞の同種集団または不均一集団であることができる。
【０２０３】
単離された筋細胞は、注射または移植により投与することができる。いくつかの態様では、本明細書記載の組成物、薬学的組成物、または両方（例えば、PGE2化合物およびミオトキシンを含む、またはPGE2受容体アゴニストおよび任意でミオトキシンを含む）ならびに細胞は、一緒にまたは同時に投与される場合がある。他の態様では、組成物、薬学的組成物、または両方、および細胞は、順次に投与される場合がある。いくつかの場合では、組成物、薬学的組成物、または両方は、細胞の前に投与される場合がある。他の場合では、細胞は、組成物、薬学的組成物、または両方の前に投与される場合がある。さらに、細胞は、外科的手技（例えば、神経傷害または筋肉の状態もしくは疾患の処置のための例えば、外科的処置）の前に、途中に、または後に投与することができる。
【０２０４】
対象に投与される筋肉細胞の集団には、骨格筋細胞、平滑筋細胞、心筋細胞、胚性幹細胞由来筋肉細胞、人工多能性幹細胞由来筋肉細胞、脱分化した筋肉細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含むことができる。追加的に、対象に投与される筋肉細胞は、筋肉幹細胞、衛星細胞、筋細胞、筋芽細胞、筋管、筋線維、またはそれらの任意の組み合わせであることができる。本明細書記載の組成物および／または薬学的組成物（例えば、PGE2化合物およびミオトキシンを含む、またはPGE2受容体アゴニストおよび任意でミオトキシンを含む）は、局所、経口、腹腔内、筋肉内、動脈内、皮内、皮下、静脈内、または心臓内投与により対象に投与することができる。いくつかの場合では、組成物および／または薬学的組成物は、機能障害のある、傷害した、損傷したおよび／または萎縮した筋肉に直接投与される場合がある。組成物および／または薬学的組成物は、短期的レジメン（例えば、単回もしくは間欠投与）または長期的レジメン（例えば、連続投与）により投与することができる。
【０２０５】
衛星細胞は、筋組織内に存在することができる小型の単核前駆細胞である。これらの細胞は、誘導されて増殖し、筋肉細胞に分化することができ、場合によっては、融合して筋線維になることができる。筋損傷または筋傷害時に、休止した衛星細胞（例えば、今現在分化しておらず、細胞分裂も受けていない衛星細胞）および筋肉幹細胞が活性化されて、筋肉幹細胞ニッチから増殖および／または遊走することができる。衛星細胞および筋肉幹細胞は、また、筋細胞、筋芽細胞、または他の筋肉細胞型に分化することができる。
【０２０６】
胚性幹細胞から筋肉細胞を作製するための方法およびプロトコルは、例えば、Hwang et al., PLoS One, 2013, 8(8):e72023、およびDarabi et al., Cell Stem Cell, 2012, 10(5):610-9に記載されている。人工多能性幹細胞から筋肉細胞を作製するための方法およびプロトコルは、例えば、Darabi et al., Cell Stem Cell, 2012, 10(5):610-9； Tan et al., PLoS One, 2011、およびMizuno et al., FASEB J., 2010, 24(7):2245-2253に記載されている。
【０２０７】
いくつかの態様では、筋肉細胞は、成熟筋肉または成体筋肉などの筋肉、例えば、四頭筋、大殿筋、二頭筋、三頭筋、または個体からの任意の筋肉からの生検により得られる。筋肉は、骨格筋、平滑筋、または心筋であることができる。平滑筋幹細胞を単離する方法の詳細な説明は、例えば、米国特許第8,747,838号、および米国特許出願公開第20070224167号に見出すことができる。筋組織からの筋肉幹細胞または衛星細胞などの、関心対象の筋肉細胞を単離する方法は、例えば、Blanco-Bose et al., Exp. Cell Res., 2001, 26592:212-220に詳細に説明されている。
【０２０８】
関心対象の筋肉細胞、例えば、筋肉幹細胞、筋肉衛星細胞、筋細胞、筋芽細胞、筋管、および／または筋線維の集団を精製するための方法は、関心対象の筋肉細胞の細胞表面に発現される特異的細胞表面マーカーまたは特異的ポリペプチドを有する細胞を選択すること、単離することまたは富化することを含む。有用な細胞表面マーカーは、例えば、Fukada et al., Front. Physiol., 2013, 4：317に記載されている。フローサイトメトリー、例えば、蛍光標示式細胞分取（FACS）；磁気ビーズ細胞分離、例えば、磁気活性化細胞分取（MACS）などの細胞分取方法、および他の抗体ベースの細胞分取方法を行って、関心対象の筋肉細胞を他の細胞型から単離または分離することができる。
【０２０９】
関心対象の筋肉細胞の単離された集団は、従来の培養ベースの方法を使用して増大または繁殖させることができる。筋肉細胞を培養するための方法は、例えば、米国特許第5,324,656号に見出される。いくつかの場合では、細胞は、ヒドロゲルなどの足場またはゲル上で培養される場合がある。
【０２１０】
いくつかの態様では、細胞を対象に投与する前に、細胞を刺激して、細胞をPGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）および／またはミオトキシンと共に培養することにより増殖させる場合がある。インビトロ培養の間に細胞を化合物に短期的、間欠的または連続的に曝露することができる。いくつかの場合では、筋肉細胞の集団は、PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）および／またはミオトキシンと共に培養した後、少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約200％、少なくとも約500％、少なくとも約1000％、またはそれ以上増大する場合がある。
【０２１１】
本明細書記載の方法を使用して、筋線維の数を少なくとも約1％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、少なくとも約15％、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約100％、少なくとも約200％、少なくとも約500％、少なくとも約1000％、またはそれ以上増加させることができる。いくつかの態様では、この方法は、損傷した、傷害した、萎縮した、または変性した筋肉の成長を増大させることができる。
【０２１２】
いくつかの態様では、標的となる筋肉は、機械的傷害に供される場合がある。非限定的な例として、機械的傷害は、切離、熱傷、凍傷、針穿刺、運動（例えば、短時間もしくは長期運動）、外科的手技（例えば、外科的処置）、外傷（例えば、偶発性外傷もしくは傷害）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。場合によっては、機械的傷害は、PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）の投与の前、後、またはそれと同時である。いくつかの態様では、PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）の投与と一緒に行われる場合、機械的傷害は、筋肉細胞の増殖、筋肉細胞の成長、筋肉細胞の生存率、筋肉再生、筋肉の成長、および／または筋肉量の増大を刺激する再生誘導因子として作用する。特定の態様では、機械的傷害は、ミオトキシンが対象に投与されない場合、再生誘導因子として作用する。
【０２１３】
場合によっては、機械的傷害は、PGE2受容体アゴニストの投与の前、後、またはそれと同時である。場合によっては、機械的傷害は、ミオトキシンの投与の前、後、またはそれと同時である。いくつかの他の場合に、機械的傷害は、PGE2化合物（例えば、PGE2受容体アゴニスト）とミオトキシンとの組み合わせの投与の前、後、またはそれと同時である。
【０２１４】
C. 眼の障害または疾患を処置する方法
一局面では、この方法は、それを必要とする対象の視覚系への本明細書記載のPGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物の投与を含む場合がある。いくつかの態様では、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物を、それを必要とする対象に投与して、眼の障害または疾患を処置することができる。他の態様では、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物を、それを必要とする対象に投与して、眼の機能を改善することができる。さらなる態様では、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物を、それを必要とする対象に投与して、白内障手術または網膜手術などの、眼の障害または疾患を処置するための既存のアプローチの有効性を強化することができる。
【０２１５】
眼瞼機能
眼瞼は、眼を保護する。眼がまばたきをすると、眼瞼が水分を眼全体に広げる。まばたきは、また、ごみや他の粒子を眼の表面から退けることを助ける。何かが眼に近づいた場合、眼瞼は閉じて眼を傷害から守る。眼瞼機能は、障害を受ける場合があり、眼の障害または疾患を生じる。いくつかの場合では、眼瞼が下がって、下垂などの障害を生じる場合がある。他の場合では、眼瞼は、内側または外側に反って、眼瞼内反または眼瞼外反などの障害を生じる場合がある。他の場合では、眼瞼は、異常なまばたきまたは単収縮を有して、ドライアイ症候群またはウェットアイ症候群（流涙）などの障害を生じる場合がある。ある局面では、眼瞼機能障害による眼疾患または眼障害の処置のための方法が、本明細書に提供される。いくつかの場合では、この方法は、それを必要とする対象にPGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物を投与して、眼瞼機能を改善することを含む。いくつかの場合では、眼瞼機能は、眼筋の筋肉再生を誘発することにより改善される場合がある。眼筋は、眼瞼機能に影響する筋肉であり得る。眼筋の非限定的な例には、挙筋、ミュラー筋または輪筋が含まれる。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシン）を眼筋に投与することを含む場合がある。
【０２１６】
眼瞼の垂れ下がり
眼瞼の垂れ下がりは、上眼瞼の過度のたるみである。いくつかの場合では、下垂としても公知のように、上眼瞼の縁があるべき位置よりも低い場合がある。他の場合では、皮膚弛緩症としても公知のように、上眼瞼にたるんだ皮膚が過剰にある場合がある。他の場合では、下垂と皮膚弛緩症との組み合わせであり得る。眼瞼の垂れ下がりは、眼瞼筋の筋力低下が原因の場合がある。いくつかの場合では、眼瞼筋の筋力低下の原因は、通常の加齢過程、または傷害もしくは疾患の結果が原因であり得る。いくつかの場合では、眼瞼の垂れ下がりは、眼の周囲または後ろの腫瘍、糖尿病、ホルネル症候群、重症筋無力症、脳卒中、眼瞼の腫脹（例えば、麦粒腫）などの別の障害に関連する場合がある。他の場合では、眼瞼の垂れ下がりは、先天性の場合がある。他の場合では、眼瞼の垂れ下がりは、ボトックスの投与／曝露が原因の場合がある。
【０２１７】
いくつかの局面では、本開示の方法は、眼瞼の垂れ下がりを処置することを含み得る。いくつかの場合では、この方法は、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物を、眼瞼の垂れ下がりを有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。いくつかの場合では、眼瞼の垂れ下がりは、下垂、皮膚弛緩症、または両方を含む場合がある。いくつかの態様では、眼瞼の垂れ下がりを処置することは、下垂、皮膚弛緩症、または両方を処置することを含む場合がある。いくつかの態様では、この方法は、加齢過程が原因の筋力低下、または傷害もしくは疾患の結果としての筋力低下などの、眼筋の筋力低下によって引き起こされる眼瞼の垂れ下がりを処置することを含む場合がある。いくつかの態様では、この方法は、眼の周囲もしくは後ろの腫瘍、ホルネル症候群、重症筋無力症、脳卒中、または眼の腫脹（例えば、麦粒腫）によって引き起こされる眼瞼の垂れ下がりを処置することを含む場合がある。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物を、眼瞼の垂れ下がりを有する対象の眼瞼筋に投与することを含む。いくつかの態様では、治療的組成物は、対象の眼瞼筋の筋肉再生を誘発することにより眼瞼の垂れ下がりを処置する場合がある。いくつかの場合では、眼瞼筋は、挙筋、ミュラー筋、輪筋、前頭筋、または顔面筋の任意の1つであり得る。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物を挙筋、ミュラー筋、輪筋、前頭筋、または顔面筋の任意の1つに投与することを含み得る。
【０２１８】
いくつかの態様では、治療的組成物は、眼瞼の垂れ下がりを処置するためにアイリフト手術（例えば、眼瞼形成術）と一緒に投与される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の態様では、治療的組成物は、眼瞼の垂れ下がりを処置するためにアイリフト手術なしで投与される場合がある。
【０２１９】
いくつかの態様では、治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）は、局所投与、皮内投与、筋肉内投与、またはそれらの組み合わせにより投与される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、筋肉内投与により投与される。いくつかの場合では、筋肉内投与は、眼瞼筋の注射を含む。眼瞼筋は、挙筋、ミュラー筋、輪筋、前頭筋、または顔面筋のうち任意の1つを含む場合がある。いくつかの場合では、麻酔薬は、治療的組成物の注射の前に対象の眼に投与される場合がある。いくつかの場合では、眼瞼筋に、外科的露出を行って注射される場合があり、他の場合では、眼瞼筋に、外科的露出なしに注射される場合がある。いくつかの態様では、眼瞼筋に注射するために27ゲージ、28ゲージ、29ゲージまたは30ゲージ針が使用される場合がある。
【０２２０】
いくつかの態様では、本開示の方法は、それを必要とする対象の眼瞼筋に体積約0.01mL〜約0.15mLの本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を注射することを伴う場合がある。いくつかの態様では、眼瞼筋に、少なくとも約0.01mLの治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、眼瞼筋に最大で約0.15mLの本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）が注射される場合がある。いくつかの態様では、眼瞼筋に0.01mLよりも大きい、0.02mLよりも大きい、0.03mLよりも大きい、0.04mLよりも大きい、0.05mLよりも大きい、0.06mLよりも大きい、0.07mLよりも大きい、0.08mLよりも大きい、0.09mLよりも大きい、0.10mLよりも大きい、0.11mLよりも大きい、0.12mLよりも大きい、0.13mLよりも大きい、または0.14mLよりも大きい本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）が注射される場合がある。
【０２２１】
いくつかの局面では、本開示の治療的組成物が眼瞼の垂れ下がりを処置する有効性は、投与前、投与後、または両方に試験を行うことによって決定される場合がある。いくつかの場合では、試験は、投与前、投与後、または両方に眼瞼がどれほど大きく垂れ下がっているかを決定する場合がある。いくつかの場合では、試験は、細隙灯検査、引っ張り試験、視野試験、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後に調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、変化しない場合がある。いくつかの態様では、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方を含む）の投与頻度は、治療的組成物の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、眼瞼の垂れ下がりを処置するために治療的組成物の1回のみの投与が必要な場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物の2、3、4、5、または5回よりも多い投与が、必要な場合がある。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する場合がある。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後に減少する場合がある。
【０２２２】
いくつかの態様では、本開示の治療的組成物を必要とする対象は、治療的組成物の投与前の試験により特定される場合がある。いくつかの場合では、試験は、フェニレフリン化学試験であり得る。このような場合、フェニレフリン化学試験に対して陽性反応であることにより、対象がミュラー筋再生のための候補として特定される場合がある。いくつかの場合では、対象は、ミュラー筋に本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方を含む）を注射することにより眼瞼の垂れ下がりについて処置される場合がある。
【０２２３】
いくつかの局面では、不正乱視を処置するための方法であって、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方を含む）をそれを必要とする対象に投与することを含む方法が、提供される。不正乱視は、眼瞼の垂れ下がりの結果としての角膜の瘢痕化が原因であり得る。いくつかの場合では、不正乱視は、本明細書記載のように眼瞼の垂れ下がりを処置することにより処置される場合がある。
【０２２４】
瞬目障害
まばたきは、有害な物質が眼に入ることを防止し、健康な眼の涙および角膜上皮表面のホメオスタシスに重要であり得る。涙腺は、眼のための潤滑液を生成する。まばたきをすると、眼瞼は、液体を涙腺から眼の全域に移動させる。眼がヒリヒリすると、涙腺は、任意の不純物を洗い流すために過剰な液体を生成する。過剰な液体は、涙管を通過して鼻腔内に流れる。眼のまばたき機能が障害され、眼の健康に影響する場合がある。いくつかの場合では、瞬目障害は、ドライアイ症候群、またはドライアイ症候群に類似した症状を生じる場合がある。他の場合では、瞬目障害は、ウェットアイ症候群、またはウェットアイ症候群に類似した症状を生じる場合がある。瞬目障害は、眼瞼弛緩、眼瞼の制御欠如、および他の眼筋の筋力低下を含む、多数の原因のせいであり得る。瞬目障害は、乾燥により角膜に重度の損傷を引き起こす可能性があり、神経栄養性角膜などの壊滅的な角膜疾患をもたらす可能性がある。
【０２２５】
いくつかの局面では、それを必要とする対象における瞬目障害を処置するための方法が、提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、瞬目障害を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与すること含む場合がある。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物を、ドライアイ症候群を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。いくつかの態様では、治療的組成物は、瞬目障害、涙腺萎縮、第7神経麻痺、または繰り返す麦粒腫に関連するドライアイ症候群を処置するために投与される場合がある。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物を、ウェットアイ症候群（流涙または涙の過剰分泌）を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。
【０２２６】
いくつかの態様では、治療的組成物は、対象の眼筋における筋肉再生を誘発することにより瞬目障害、ドライアイ症候群、ウェットアイ症候群、またはそれらの組み合わせを処置する場合がある。いくつかの場合では、眼筋は、まばたきに影響する筋肉を含む。いくつかの場合では、眼筋は、輪筋、リオラン筋、ホルネル筋、前頭筋、または顔面筋のうち任意の1つを含む場合がある。顔面筋は、後頭前頭筋、側頭頭頂筋、鼻根筋、鼻筋、鼻中隔下制筋、眼輪筋、皺眉筋、眉毛下制筋、耳介筋（前耳介筋、上耳介筋および後耳介筋）、口輪筋、口角下制筋、笑筋、大頬骨筋、小頬骨筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、下唇下制筋、口角挙筋、頬筋、またはオトガイ筋を含み得る。いくつかの場合では、瞬目障害、ドライアイ症候群、またはウェットアイ症候群は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方を含む）を輪筋、リオラン筋、ホルネル筋、前頭筋、顔面筋のうち任意の1つ、またはそれらの組み合わせに投与することにより処置することができる。最近の研究により、除神経筋における神経筋接合部を刺激することに筋肉幹細胞（MuSC）が重要であることが示された（Liu et al., 2015）とはいえ、最近まで、除神経後の筋肉機能の回復を改善することは未解決の問題のままであった。この問題の解決は、筋肉にすでに存在するMuSCを刺激および増強することにより除神経萎縮を後退または予防できることにある。
【０２２７】
いくつかの態様では、瞬目障害、ドライアイ症候群、またはウェットアイ症候群を処置する方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、それを必要とする対象に局所投与、皮内投与、筋肉内投与、またはそれらの組み合わせにより投与することを含む場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、筋肉内投与により投与される場合がある。いくつかの場合では、筋肉内投与は、眼筋の注射を含む場合がある。眼筋は、輪筋、リオラン筋、ホルネル筋、前頭筋、または顔面筋のうち任意の1つを含む場合がある。最近の研究により、除神経筋における神経筋接合部を刺激することに筋肉幹細胞（MuSC）が重要であることが示されたとはいえ、最近まで、除神経後の筋肉機能の回復を改善することは未解決の問題のままであった。この問題の解決は、筋肉にすでに存在するMuSCを刺激および増強することにより除神経萎縮を後退または予防できることにある。
【０２２８】
いくつかの態様では、この方法は、本開示の治療的組成物を涙腺の機能に影響する筋肉に投与して、涙腺萎縮などの涙腺機能不全に関連する瞬目障害を処置することを含む場合がある。いくつかの場合では、麻酔薬は、治療的組成物の注射前に眼に投与される場合がある。いくつかの場合では、眼瞼筋に、外科的露出を行って注射される場合があり、他の場合では、眼瞼筋に、外科的露出なしに注射される場合がある。いくつかの態様では、眼瞼筋に注射するために27ゲージ、28ゲージ、29ゲージまたは30ゲージ針が使用される場合がある。
【０２２９】
いくつかの態様では、瞬目障害、ドライアイ症候群、ウェットアイ症候群、またはそれらの組み合わせを処置する方法は、本開示の治療的組成物を、それを必要とする対象の眼筋に体積約0.01mL〜約0.15mLで投与すること（例えば、筋肉内注射）を含む場合がある。いくつかの態様では、眼筋に少なくとも約0.01mLの本開示の治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、眼筋に最大で約0.15mLの本開示の治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、眼筋に0.01mLよりも大きい、0.02mLよりも大きい、0.03mLよりも大きい、0.04mLよりも大きい、0.05mLよりも大きい、0.06mLよりも大きい、0.07mLよりも大きい、0.08mLよりも大きい、0.09mLよりも大きい、0.10mLよりも大きい、0.11mLよりも大きい、0.12mLよりも大きい、0.13mLよりも大きい、または0.14mLよりも大きい本開示の治療的組成物が注射される場合がある。
【０２３０】
いくつかの局面では、治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、または両方に試験を行うことによって決定される場合がある。ウェットアイ症候群の処置のために、フルオレセインおよびリサミングリーン染色試験、涙液層の光干渉断層撮影（OCT）、または両方が行われる場合がある。ドライアイ症候群の処置のために、視力測定、細隙灯検査、涙液層破壊時間（TBUT）の測定、涙の生成速度の測定（シルマーテスト）、涙の濃度の測定（浸透圧）、またはそれらの組み合わせが行われる場合がある。いくつかの場合では、試験は、MMP-9、ラクトフェリン、およびNGF-1を含むが、それに限定されるわけではない炎症分子または成長因子分子のレベルを測定することを含み得る。
【０２３１】
いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後に調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、変化しない場合がある。いくつかの態様では、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）の投与頻度は、治療的組成物の事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、瞬目障害、ドライアイ症候群、またはウェットアイ症候群を処置するために治療的組成物の1回だけの投与が必要な場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物の2、3、4、5、または5回よりも多い投与が、瞬目障害、ドライアイ症候群、またはウェットアイ症候群を処置するために必要な場合がある。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する場合がある。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後に減少する場合がある。
【０２３２】
眼瞼内反および眼瞼外反
眼瞼は眼を異物から保護している。いくつかの場合では、眼瞼は、眼の上に正しく位置していない。例えば、眼瞼内反は、眼瞼の縁が内側に曲がることである。いくつかの場合では、眼瞼内反によって、睫毛が眼にこすりつけられる。これは、涙の過剰分泌、眼の不快、眼痛、眼刺激、眼の赤み、およびいくつかの極端な場合には、角膜損傷および視力減退を生じる可能性がある。眼瞼内反の原因は、眼筋の筋力低下、特に眼の下部の筋肉の筋力低下を含む場合がある。眼瞼外反は、眼瞼が外側に曲がることにより内面が露出することである。いくつかの場合では、眼瞼外反は、乾燥した痛みのある眼、眼の涙の過剰分泌（流涙）、慢性結膜炎、角膜炎、眼の赤み、またはそれらの組み合わせを引き起こす場合がある。眼瞼外反の原因は、加齢過程、および顔面神経麻痺などによる眼瞼の筋力低下が原因であり得る。
【０２３３】
いくつかの局面では、眼瞼内反、眼瞼外反、または両方の処置のための方法が提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、眼瞼内反または眼瞼外反を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。いくつかの態様では、眼瞼内反または眼瞼外反を処置する方法は、本開示の治療的組成物を、それを必要とする対象の眼筋に投与することを含み得る。いくつかの場合では、眼瞼筋は、輪筋、前頭筋、または顔面筋のいずれかであり得る。顔面筋は、後頭前頭筋、側頭頭頂筋、鼻根筋、鼻筋、鼻中隔下制筋、眼輪筋、皺眉筋、眉毛下制筋、耳介筋（前耳介筋、上耳介筋および後耳介筋）、口輪筋、口角下制筋、笑筋、大頬骨筋、小頬骨筋、上唇挙筋、上唇鼻翼挙筋、下唇下制筋、口角挙筋、頬筋、またはオトガイ筋を含む場合がある。
【０２３４】
いくつかの態様では、治療的組成物は、眼瞼手術（例えば、外側腱板柵状法）と組み合わせて投与される場合がある。それらの態様では、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の態様では、治療的組成物は、眼の手術なしで投与される場合がある。
【０２３５】
いくつかの態様では、本明細書に提供される方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、それを必要とする対象に局所投与、皮内投与、筋肉内投与、またはそれらの組み合わせにより投与することを含む場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、筋肉内投与により投与される場合がある。いくつかの場合では、筋肉内投与は、眼筋の注射を含む。いくつかの場合では、眼筋は、輪筋、前頭筋、または顔面筋のうちいずれかを含む場合がある。いくつかの場合では、麻酔薬は、それを必要とする対象の眼に注射前に投与される場合がある。いくつかの場合では、眼筋に、外科的露出を行って注射される場合があり、他の場合では、眼筋に、外科的露出なしに注射される場合がある。いくつかの態様では、眼筋に注射するために27ゲージ、28ゲージ、29ゲージまたは30ゲージ針が使用される場合がある。
【０２３６】
いくつかの態様では、眼瞼外反、眼瞼内反、または両方を処置する方法は、本開示の治療的組成物を、それを必要とする対象の眼筋に体積約0.01mL〜約0.15mLで投与すること（例えば、筋肉内注射）を含む場合がある。いくつかの態様では、眼筋に少なくとも約0.01mLの本開示の治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、眼筋に最大で約0.15mLの本開示の治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、眼筋に0.01mLよりも大きい、0.02mLよりも大きい、0.03mLよりも大きい、0.04mLよりも大きい、0.05mLよりも大きい、0.06mLよりも大きい、0.07mLよりも大きい、0.08mLよりも大きい、0.09mLよりも大きい、0.10mLよりも大きい、0.11mLよりも大きい、0.12mLよりも大きい、0.13mLよりも大きい、または0.14mLよりも大きい本開示の治療的組成物が注射される。
【０２３７】
いくつかの局面では、（例えば、眼瞼内反、眼瞼外反、または両方を処置するための）本開示の治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、または両方に試験を行うことによって決定される場合がある。いくつかの場合では、試験は、眼、眼瞼、またはそれらの組み合わせの検査を含む場合がある。いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、変化しない場合がある。いくつかの態様では、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）の投与頻度は、（例えば、眼瞼外反、眼瞼内反、または両方を処置するための）治療的組成物の投与の有効性を決定した後に調整される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物の1回だけの投与が、眼瞼内反または眼瞼外反を処置するために必要な場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物の2、3、4、5、または5回よりも多い投与が、眼瞼内反または眼瞼外反を処置するために必要な場合がある。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する場合がある。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後に減少する場合がある。
【０２３８】
外眼筋
外眼筋は、眼の動きを制御する6つの筋肉（外側直筋、内側直筋、上直筋、下直筋、上斜筋、および下斜筋）および眼瞼の挙上を制御する1つの筋肉（眼瞼挙筋）を含む。これらの外眼筋の任意の1つの損傷もしくは傷害、筋力低下、または不適切な神経支配は、眼の障害または疾患および視覚機能の低減を生じる可能性がある。いくつかの局面では、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を投与することにより眼の障害または疾患を処置するための方法が、提供される。いくつかの場合では、治療的組成物は、少なくとも1つの外眼筋、例えば、外側直筋、内側直筋、上直筋、下直筋、上斜筋、下斜筋、または眼瞼挙筋に投与される場合がある。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物を、それを必要とする対象の外眼筋に投与して、筋肉再生を誘発することを含む場合がある。
【０２３９】
斜視
斜視は、両眼が同じ方向を向かない眼障害である。結果として、眼は、同じ物体を同時に見ない。この状態は、より一般的には「内斜視」として公知である。6つの異なる外眼筋（外側直筋、内側直筋、上直筋、下直筋、上斜筋および下斜筋）が、それぞれの眼を取り囲み、一緒に働いて、両眼が同じ物体に焦点を合わせることを可能にしている。斜視を有する患者では、これらの筋肉は、一緒に働かない。結果として、一方の眼が1つの物体を見て、他方の眼が異なる方向を向いて、別の物体に焦点を合わせる。多くの場合に、斜視の原因は未知である。いくつかの場合では、誕生時にまたはそのすぐ後に眼位のずれが観察される（先天性斜視）。いくつかの場合では、小児における斜視に関連する障害には、アペール症候群、脳性麻痺、先天性風疹、血管腫、色素失調症候群、ヌーナン症候群、プラダー-ウィリー症候群、未熟児網膜症、網膜芽細胞腫、外傷性脳損傷およびトリソミー18が含まれる場合があるが、それに限定されるわけではない。斜視は、成人に発生する場合もあり、ボツリヌス中毒、糖尿病、グレーブス病、ギラン-バレー症候群、眼への傷害、貝毒、脳卒中、外傷性脳損傷および疾患または傷害による視力喪失を含むが、それに限定されるわけではない多数の異なる原因によるものであり得る。
【０２４０】
いくつかの局面では、斜視または先天性斜視を処置するための方法が提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシン）を、斜視または先天性斜視を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。いくつかの態様では、治療的組成物は、外眼筋のうち少なくとも1つ、例えば、外側直筋、内側直筋、上直筋、下直筋、上斜筋、および下斜筋に筋肉再生を誘発することにより、斜視または先天性斜視を処置する場合がある。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物を、外側直筋、内側直筋、上直筋、下直筋、上斜筋、および下斜筋のいずれかに投与することを含む場合がある。いくつかの場合では、それぞれの眼筋は、幅約5mm〜約7mm、長さ約10mm、および厚さ1mm以下を有する場合がある。
【０２４１】
いくつかの態様では、本開示の治療的組成物は、斜視または先天性斜視を処置するための眼筋手術と組み合わせて投与される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の場合では、治療的組成物は、斜視または先天性斜視を処置するための眼筋手術なしで投与される場合がある。
【０２４２】
いくつかの態様では、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）は、斜視または先天性斜視の処置のために外眼筋（例えば、外側直筋、内側直筋、上直筋、下直筋、上斜筋、および下斜筋）の注射により投与される場合がある。他の場合では、本開示の治療的組成物は、薬物放出デポーとして薬物徐放により、本開示の組成物（例えば、PGE2化合物、ミオトキシン）を生成する細胞マトリックスデポーまたは筋肉近くもしくは筋肉に隣接して配置されるポリマー埋込み片を含み得る遺伝子療法により投与される場合がある。例示的な態様では、局所麻酔薬、眼球のうっ血除去薬、または両方は、外眼筋の注射前にそれを必要とする対象の眼に投与される場合がある。いくつかの場合では、外眼筋に、外科的露出を行って注射される場合があり、他の場合では、外眼筋に、外科的露出なしに注射される場合がある。いくつかの態様では、外眼筋に筋電図ガイド下で注射される場合があり、他の態様では、外眼筋に筋電図ガイドなしで注射される場合がある。いくつかの態様では、外眼筋に注射するために27ゲージ、28ゲージ、29ゲージまたは30ゲージ針が使用される場合がある。眼位のずれを矯正するために、必要に応じて1つまたは複数の外眼筋に注射することができる。いくつかの態様では、眼位のずれを矯正するために両眼の外眼筋に注射することができる。
【０２４３】
いくつかの態様では、斜視を処置する方法は、本開示の治療的組成物を、それを必要とする対象の外眼筋に約0.05mL〜約0.15mLの体積で投与すること（例えば、筋肉内注射）を含む場合がある。いくつかの態様では、外眼筋に少なくとも約0.05mLの治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、外眼筋に最大で約0.15mLの治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、外眼筋に0.05mLよりも大きい、0.06mLよりも大きい、0.07mLよりも大きい、0.08mLよりも大きい、0.09mLよりも大きい、0.10mLよりも大きい、0.11mLよりも大きい、0.12mLよりも大きい、0.13mLよりも大きい、または0.14mLよりも大きい治療的組成物が注射される場合がある。
【０２４４】
いくつかの局面では、（例えば、斜視を処置するための）本開示の治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、または両方で試験を行うことによって決定される場合がある。いくつかの場合では、試験は、眼位がどれだけ大きくずれているかを決定する場合がある。いくつかの態様では、角膜の光反射試験、遮蔽／非遮蔽試験、網膜検査、眼科検査、視力、またはそれらの組み合わせが行われる場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物の投与の有効性は、投与前および投与後に両眼の眼位の変化により決定することができる。いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後に調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の両方は、変化しない場合がある。
【０２４５】
いくつかの態様では、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）の投与頻度は、（例えば、斜視を処置するための）治療的組成物の投与の有効性を決定した後に調整される場合がある。いくつかの場合では、斜視を処置するために治療的組成物の1回だけの投与が必要な場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物の2、3、4、5、または5回よりも多い投与が、必要な場合がある。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する場合がある。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後に減少する場合がある。
【０２４６】
眼振
眼振、または眼球振盪は、眼の急速な制御不能の運動を説明するために使用される用語である。この運動は、横方向（水平性眼振）；上下方向（垂直性眼振）、または回転性（回転性または回旋性眼振）であり得る。いくつかの場合では、運動は、片眼だけの場合がある。他の場合では、運動は、両眼の場合がある。いくつかの場合では、眼振は、誕生時に存在する場合がある（乳児眼振症候群（INS））。いくつかの場合では、眼振は、眼の先天性疾患によって引き起こされる場合がある。他の場合では、眼振は、特定の薬物または医薬品（例えばフェニトイン）の摂取、過剰なアルコール、迷路機能を障害する鎮静薬、頭部外傷、内耳障害（例えば、内耳炎（labyrinthis）またはメニエール病）、脳卒中、およびチアミンまたはビタミンB12欠乏を含む多様な原因により獲得される場合がある。いくつかの場合では、眼球振盪は、パーキンソン病などの他の障害に二次的であり得る。
【０２４７】
いくつかの局面では、眼振を処置するための方法が、提供される。いくつかの場合では、眼振は、水平性眼振、垂直性眼振、回転性もしくは回旋性眼振、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの場合では、眼振は、乳児眼振症候群である。いくつかの場合では、この方法は、眼振を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象への本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を含む。いくつかの態様では、治療的組成物は、外眼筋、例えば、外側直筋、内側直筋、上直筋、下直筋、上斜筋、および下斜筋のうち少なくとも1つに筋肉再生を誘発することにより眼振を処置する場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、眼振の処置のために外眼筋、例えば、外側直筋、内側直筋、上直筋、下直筋、上斜筋、および下斜筋のうち少なくとも1つに投与される場合がある。
【０２４８】
虹彩
虹彩は、角膜と水晶体との間に位置して、括約筋（瞳孔括約筋）および散大筋（瞳孔散大筋）を含む。虹彩の円い中央開口部は、瞳孔と呼ばれる。虹彩は、瞳孔の大きさを調節して、どれだけ多くの光が眼に入るかを制御する。虹彩の障害は、視覚機能障害を生じる可能性がある。
【０２４９】
いくつかの局面では、視覚機能障害を処置するための方法が提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、視覚機能障害を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。いくつかの態様では、治療的組成物は、虹彩の筋肉の筋肉再生を誘発することにより視覚機能障害を処置する場合がある。虹彩の筋肉は、括約筋、散大筋、または両方であり得る。いくつかの場合では、治療的組成物は、それを必要とする対象に局所、皮内、または眼内投与される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、虹彩の筋肉（例えば、括約筋、散大筋）に筋肉内投与により投与される場合がある。いくつかの局面では、処置の有効性は、投与前、投与後、または両方で光感受性の変化を観察することにより決定される場合がある。
【０２５０】
毛様体筋および他の内眼筋
毛様体は、毛様体筋を含有する輪状構造である。毛様体筋は、調節（accommodation）と呼ばれる過程で眼が近くの物体に焦点を合わせたときに、水晶体の形状を変化させる。老視は、眼の水晶体が焦点を合わせる能力を失って、物体を間近で見ることが難しくなる状態である。老視は、加齢過程に伴う自然なことと考えられている。老視を処置する1つのアプローチは、毛様体筋の筋肉再生を誘発することであり得る。したがって、老視を処置する方法が、本明細書に提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、老視を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。いくつかの態様では、治療的組成物は、毛様体筋の筋肉再生を誘発することにより老視を処置する場合がある。いくつかの局面では、処置の有効性は、投与前、投与後、または両方で読み取り試験を行うことによって決定することができる。
【０２５１】
いくつかの局面では、近視を処置するため、または近視の後退を調節するための方法が、提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／もしくはミオトキシンを含む）を、近視を有する、有する疑いがある、もしくは発生するリスクがある対象に、または近視の後退を調節するために対象に投与することを含む場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、毛様体筋、強膜中の筋肉、強膜周辺の筋肉、または内眼筋などの眼筋に投与される場合がある。
【０２５２】
眼咽頭型筋ジストロフィー
眼咽頭型筋ジストロフィーは、上眼瞼および咽頭の筋肉を冒す緩徐進行性筋疾患（ミオパチー）によって特徴付けられる遺伝障害である。発現は、典型的には成人期であり、最も頻繁には年齢40歳から60歳の間である。症状には、眼瞼の垂れ下がり（下垂）、腕および脚の筋力低下、ならびに飲み込み困難（嚥下困難）が含まれる場合があるが、それに限定されるわけではない。
【０２５３】
いくつかの局面では、眼咽頭型筋ジストロフィーを処置する方法が、提供される。いくつかの場合では、方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、眼咽頭型筋ジストロフィーを有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。いくつかの場合では、眼咽頭型筋ジストロフィーを処置することは、治療的組成物を上眼瞼の筋肉、咽頭の筋肉、または両方に投与することを含む場合がある。
【０２５４】
D. 筋骨格障害を処置する方法
本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）の筋骨格系への適用が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、治療的組成物は、筋骨格障害を処置するためにそれを必要とする対象に投与することができる。いくつかの場合では、筋骨格障害は、筋肉障害である。他の態様では、治療的組成物は、筋骨格系の機能を改善するためにそれを必要とする対象に投与することができる。さらなる態様では、治療的組成物は、それを必要とする対象に、手根中手関節形成術などの筋骨格系の障害または疾患の既存処置の有効性を増強するために投与することができる。
【０２５５】
筋骨格系の機能不全は、異なる要因が原因であり得る。いくつかの場合では、筋肉障害は、加齢が原因であり得る。例えば、サルコペニアは、50歳を過ぎて1年に0.5％〜1％の様々な筋肉減少である骨格筋量の変性的減少であり、加齢に関連する。他の場合では、筋肉障害は、患部筋肉の廃用が原因であり得る。いくつかの場合では、廃用は、固定（例えば、副子、ギプス）が原因であり得る。他の場合では、廃用は、疼痛（例えば、関節炎）が原因であり得る。いくつかの場合では、筋肉障害は、除神経の結果としての筋萎縮であり得る。下位運動ニューロンを冒す疾患は、筋線維の神経支配を損なって筋萎縮を生じる場合がある。他の場合では、筋肉障害は、糖質コルチコイド誘発筋萎縮などの代謝的な理由のせいであり得る。例えば、過剰なアルコール摂取は、アルコール性ミオパチーをもたらす可能性がある。別の例では、慢性糖尿病は、手足を神経支配する神経を損傷する可能性があり、糖尿病性筋萎縮症をもたらす。筋肉機能障害の他の原因には、外傷、および筋肉関連変性疾患が含まれる場合がある。本明細書記載の原因のいずれかによる筋肉障害を処置する方法が、本明細書に提供される。いくつかの場合では、これらの方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を投与することを含む。
【０２５６】
手の老化
身体の老化骨格筋における最もよく見られる変化の1つは、25％〜45％の範囲の筋肉量の大きな減少であり、これは、「高齢者のサルコペニア」と記載されるときがある。手に直接的な機能的役割を果たす11個の内在筋および15個の外来筋がある。外来手筋および内在手筋は、物体をつかむために必要な力（握力）を生成する。60歳を過ぎると、握力が急速に20〜25％低下する。これは、筋線維の実質的な喪失および特に母指球筋群の筋線維長の減少を伴い、活動電位の低減における重要な役割に寄与する。母指の内在筋系は、手の内在筋系全体の約40％を構成する。主な筋肉の3つ、母指内転筋斜頭、母指対立筋、および短母指屈筋は、物体を強くつまむ際に母指を安定化するのに重要な役割を果たし、これらの運動は、一般に加齢性機能障害を示す。高齢者における母指球筋の収縮能は、正中神経の強縮性刺激により評価されている。高齢成人におけるより高い筋肉疲労耐性は、末梢神経系および中枢神経系の両方の差にあるとされている。高齢者では、手筋に関連する生存可能な運動単位の活動電位および数の両方に有意な減少がある。
【０２５７】
いくつかの局面では、手の機能障害を処置するための方法が提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシン）を、それを必要とする対象に投与することを含む場合がある。いくつかの態様では、対象は、50歳よりも高齢、55歳よりも高齢、60歳よりも高齢、65歳よりも高齢、または70歳よりも高齢である。いくつかの態様では、手の機能障害は、加齢の結果であり得る。いくつかの態様では、治療的組成物は、対象の手筋における筋肉再生を誘発することにより手の機能障害を処置する場合がある。いくつかの場合では、手筋は、内在筋であり得る。内在筋には、以下、すなわち3つの母指球筋、3つの小指球筋、骨間筋、虫様筋、短掌筋、および母指内転筋のいずれかが含まれる場合があるが、それに限定されるわけではない。いくつかの場合では、手筋は外来筋である。外来筋には、以下、すなわち長母指外転筋、短母指伸筋、長母指屈筋、橈側手根屈筋、深指屈筋、4つの浅指屈筋、尺側手根屈筋、長橈側手根伸筋、短橈側手根伸筋、示指伸筋、総指伸筋、小指伸筋、および尺側手根伸筋のいずれかが含まれる場合があるが、それに限定されるわけではない。
【０２５８】
いくつかの態様では、治療的組成物は、手の手術（例えば、非観血的整復固定術、腱修復術、神経修復術、手術的ドレナージおよび／もしくはデブリードマン、または人工関節置換術）と組み合わせて投与される場合がある。このような場合、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の態様では、治療的組成物は、手の手術なしで投与される場合がある。
【０２５９】
いくつかの態様では、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）は、局所投与、皮内投与、筋肉内投与、またはそれらの組み合わせにより投与される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、筋肉内投与により投与される場合がある。いくつかの場合では、筋肉内投与は、手筋の注射を含む場合がある。手筋には、以下、すなわち母指球筋、小指球筋、骨間筋、虫様筋、短掌筋、母指内転筋、長母指内転筋、長母指屈筋、橈側手根屈筋、深指屈筋、4つの浅指屈筋、尺側手根屈筋、短母指伸筋、長橈側手根伸筋、短橈側手根伸筋、示指伸筋、総指伸筋、小指伸筋、または尺側手根伸筋のいずれか1つが含まれる場合がある。いくつかの場合では、麻酔薬は、治療的組成物の注射前に対象の手に投与される場合がある。いくつかの場合では、手筋に、外科的露出を行って注射される場合があり、他の場合では、手筋に、外科的露出なしに注射される場合がある。いくつかの態様では、手筋に注射するために20ゲージ、21ゲージ、22ゲージ、23ゲージ、24ゲージまたは25ゲージ針が使用される場合がある。
【０２６０】
いくつかの態様では、手の機能障害を処置する方法は、本開示の治療的組成物を、それを必要とする対象の手筋に体積約0.01mL〜約0.15mLで投与すること（例えば、筋肉内注射）を含む場合がある。いくつかの態様では、手筋に少なくとも約0.01mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、手筋に最大で約0.15mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、手筋に0.01mLよりも大きい、0.02mLよりも大きい、0.03mLよりも大きい、0.04mLよりも大きい、0.05mLよりも大きい、0.06mLよりも大きい、0.07mLよりも大きい、0.08mLよりも大きい、0.09mLよりも大きい、0.10mLよりも大きい、0.11mLよりも大きい、0.12mLよりも大きい、0.13mLよりも大きい、または0.14mLよりも大きい治療的組成物が注射される。
【０２６１】
いくつかの局面では、本開示の治療的組成物の投与の（例えば、手の機能障害を処置するための）有効性は、投与前、投与後、または両方で試験を行うことによって決定される場合がある。いくつかの場合では、試験は、投与前、投与後、または両方で手の機能を測定する場合がある。いくつかの場合では、試験は、最大ピンチ力検査、安定（steadiness）ピンチ力検査、ペグボード検査、2点識別覚検査、精密ピンチ安定検査、ハンドグリップ力検査、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０２６２】
いくつかの態様では、本開示の治療的組成物の用量は、事前の投与（例えば、手の機能障害を処置するため）の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、変化しない場合がある。
【０２６３】
いくつかの態様では、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）の投与頻度は、治療的組成物の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、手の機能障害を処置するために治療的組成物の1回だけの投与が必要な場合がある。いくつかの場合では、手の機能障害を処置するために治療的組成物の2、3、4、5、または5回よりも多い投与が、必要な場合がある。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する場合がある。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で減少する場合がある。
【０２６４】
いくつかの態様では、それを必要とする対象は、治療的組成物の投与の前に試験により特定される場合がある。いくつかの場合では、試験は、最大ピンチ力検査、安定ピンチ力検査、ペグボード検査、2点識別覚検査、精密ピンチ安定検査、ハンドグリップ力検査、またはそれらの組み合わせであり得る。
【０２６５】
母指球の萎縮
圧迫性の末梢神経傷害（PNI）は、神経の絞扼によって引き起こされる神経傷害の部類である。手根管症候群（CTS）は、手首の正中神経が圧迫されることに起因する、最もよく見られる圧迫性の末梢神経障害である。手根管症候群の症状には、内在正中神経支配母指球筋である短母指外転筋（APB）、母指対立筋、および短母指屈筋の浅層筋腹における感覚障害（例えば、しびれ感および感覚異常）ならびに運動障害が含まれる場合がある。正中神経の長期圧迫は、潜在的に母指球筋の、および重症手根管症候群の患者における運動機能を障害し、母指球筋の萎縮が生じる場合がある。例えば、重症CTSの結果として、APB筋の除神経および萎縮が生じる。APB筋は、母指を掌面から出し、多くの細かい運動活動に欠かせない。CTSの外科的処置は、正中神経を絞扼している靱帯を開放することである。これにより、運動神経の再生および筋肉の潜在的回復が可能になる。不幸にも、重症CTSを有する患者の多くは、神経が開放された後であっても機能的回復に乏しい。握りを制御しているこれらの特異的筋群への機能を回復することにより、自立および全体的な生活の質を増進することができる。
【０２６６】
いくつかの局面では、母指機能障害の処置のための方法が提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、母指機能障害を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む。いくつかの態様では、母指機能障害は、母指球萎縮が原因である。いくつかの態様では、治療的組成物は、対象の手筋における筋肉再生を誘発することにより母指機能障害を処置する場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、母指機能障害の処置のために対象の手筋に投与される。いくつかの場合では、手筋は、短母指外転筋（APB）、母指対立筋、または短母指屈筋である。いくつかの場合では、手筋は、短母指外転筋である。
【０２６７】
いくつかの態様では、本開示の治療的組成物は、母指機能障害を処置するための手の手術と組み合わせて投与される場合がある。いくつかの場合では、手の手術は、手根管症候群手術であり得る。いくつかの場合では、治療的組成物は、外科手術前、外科手術の途中、外科手術後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の態様では、治療的組成物は、手の手術なしで投与される場合がある。
【０２６８】
いくつかの態様では、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）は、母指機能障害の処置のために局所投与、皮内投与、筋肉内投与、またはそれらの組み合わせにより投与される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、筋肉内投与により投与される場合がある。いくつかの場合では、筋肉内投与は、手筋の注射を含む。いくつかの場合では、手筋は、母指球筋を含む場合がある。いくつかの場合では、手筋は、短母指外転筋（APB）、母指対立筋、または短母指屈筋を含む場合がある。いくつかの場合では、手筋は、短母指外転筋であり得る。いくつかの場合では、麻酔薬は、本開示の治療的組成物の注射前にそれを必要とする対象の手に投与される場合がある。いくつかの場合では、手筋に外科的露出を行って注射される場合があり、他の場合では、手筋に、外科的露出なしに注射される場合がある。いくつかの態様では、手筋に注射するために20ゲージ、21ゲージ、22ゲージ、23ゲージ、24ゲージまたは25ゲージ針が使用される場合がある。
【０２６９】
いくつかの局面では、母指機能障害を処置する方法は、本開示の治療的組成物を、それを必要とする対象の手筋に約0.01mL〜約0.15mLの体積で投与すること（例えば、筋肉内注射）を含み得る。いくつかの態様では、手筋に、少なくとも約0.01mLの治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、手筋に、最大で約0.15mLの治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、手筋に、0.01mLよりも大きい、0.02mLよりも大きい、0.03mLよりも大きい、0.04mLよりも大きい、0.05mLよりも大きい、0.06mLよりも大きい、0.07mLよりも大きい、0.08mLよりも大きい、0.09mLよりも大きい、0.10mLよりも大きい、0.11mLよりも大きい、0.12mLよりも大きい、0.13mLよりも大きい、または0.14mLよりも大きい治療的組成物が注射される場合がある。
【０２７０】
いくつかの局面では、本開示の治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、または両方で試験を行うことによって決定される場合がある。いくつかの場合では、試験は、投与前、投与後、または両方で手の機能を測定する場合がある。いくつかの場合では、試験は、指尖つまみ力試験、モバーグピックアップ検査、または両方であり得る。いくつかの場合では、試験は、カナダ作業遂行測定（COPM）などの患者中心の総合的な生活の質尺度であり得る。
【０２７１】
いくつかの局面では、本開示の治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、変化しない場合がある。
【０２７２】
いくつかの態様では、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）の投与頻度は、治療的組成物の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、母指機能障害を処置するために治療的組成物の1回だけの投与が必要な場合がある。いくつかの場合では、母指機能障害を処置するために治療的組成物の2、3、4、5、または5回よりも多い投与が、必要な場合がある。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する場合がある。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で減少する場合がある。
【０２７３】
いくつかの態様では、母指機能障害を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象は、本開示の治療的組成物の投与の前に試験により特定される場合がある。いくつかの場合では、試験は、指尖つまみ力検査、モバーグピックアップ検査、または両方であり得る。
【０２７４】
いくつかの局面では、圧迫性末梢神経傷害によって引き起こされる筋障害の処置のための方法が、提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、圧迫性末梢神経傷害を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む。例えば、肘での尺骨神経絞扼に起因する肘部管症候群は、2番目に多く見られる上肢絞扼である。尺骨神経の圧迫の結果として、第4指および第5指に疼痛または知覚異常が生じる。手指のしびれ感および刺痛に加えて、筋萎縮は、尺骨神経圧迫のよく見られる結果である。別の例では、胸郭出口症候群は、腕神経叢として公知の、肩と頸部との間の神経の圧迫に起因する。これは、片方または両方の上肢に疼痛、筋力低下、しびれ感、刺痛、冷覚、またはときにより全般的な種類の不快を引き起こす可能性がある。よく見られる症状は、肩の下から手の方へ下がって通常は小指および薬指に放散する疼痛、しびれ感、および刺痛である。この状態は、また、手の内在筋の筋萎縮をもたらす可能性がある。
【０２７５】
足底筋膜炎
足底筋膜は、足底上の厚みのある組織である。足底筋膜は、踵骨を足指と接続し、足底弓を生み出す。この組織が腫脹したまたは炎症を起こした場合、足底筋膜炎と呼ばれる。足底筋膜炎は、踵痛の最もよく見られる原因の1つであり、米国内で約200万人が罹患し、かかりつけ医および足専門医の両方への100万を超える来診を招いていると推定されている。足底筋膜炎は、座りがちな人および運動家の両方を冒し、生活習慣または運動のいずれかの慢性的な過負荷に起因すると考えられている。最新文献により、足底筋膜炎は、疾患の慢性度および炎症ではなく変性の証拠から、筋膜症（fasciosis）と名付けるのがより正確であると示唆されている。
【０２７６】
筋力低下は、慢性足底筋膜炎の潜在的原因であり得る。研究により、過重負荷されている肢において、内側縦足弓を支持する受動メカニズムと能動メカニズムとの両方があることが示された。支持は、張力が働いた足底筋膜により受動的に達成され、足底に内在する足筋（PIFM）および後脛骨（TP）筋の関与により能動的に達成される。足底筋膜炎は、足の前部のPIFM萎縮に関連している。慢性足底筋膜炎を有する足の前部の体積は、平均で対側の健康な足の5.2％未満であった。足の前部の筋肉には、短母趾屈筋内側頭、短母趾屈筋外側頭、母趾内転筋横頭、母趾内転筋斜頭および底側骨間筋が含まれる。小趾外転筋萎縮を有する患者は、また、有しない患者よりも有意に高い頻度のアキレス腱炎、踵骨浮腫、踵骨棘、足底筋膜炎、および後脛骨筋腱機能障害を有する。追加的に、筋力が低下したまたは萎縮した短趾屈筋を強化することにより、内側縦足弓の安定化を助けることもできる。
【０２７７】
いくつかの局面では、足の機能障害の処置のための方法が、提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、足の機能障害を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む。いくつかの態様では、足の機能障害は、足底筋膜炎が原因である。したがって、いくつかの実施形態では、治療的組成物は、足底筋膜炎を処置するために適している場合がある。いくつかの態様では、治療的組成物は、それを必要とする対象の足筋における筋肉発生を誘発することにより足の機能障害を処置する場合がある。いくつかの場合では、足筋は、足底に内在する足筋、母趾屈筋内側頭、短母趾屈筋外側頭、母趾内転筋横頭、母趾内転筋斜頭、背側および底側骨間筋、小趾外転筋、ならびに短趾屈筋である。
【０２７８】
いくつかの態様では、本開示の治療的組成物は、外科手術と組み合わせて投与される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の場合では、治療的組成物は、足の外科手術なしで投与される場合がある。
【０２７９】
いくつかの態様では、治療的組成物は、別の処置と組み合わせて投与される場合がある。いくつかの場合では、別の処置は、非ステロイド系抗炎症薬、ストレッチング、夜間副子、カスタムメイドの装具、コルチコステロイド注射、多血小板血漿注射、体外衝撃波療法、筋膜切開術、またはそれらの組み合わせを含む。
【０２８０】
いくつかの態様では、本開示の治療的組成物は、局所投与、皮内投与、筋肉内投与、または組み合わせにより投与される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、筋肉内投与により投与される場合がある。いくつかの場合では、筋肉内投与は、足筋の注射を含む場合がある。いくつかの場合では、足筋は、足底に内在する足筋、母趾屈筋内側頭、短母趾屈筋外側頭、母趾内転筋横頭、母趾内転筋斜頭、背側および底側骨間筋、小趾外転筋、および短趾屈筋を含む場合がある。
【０２８１】
いくつかの場合では、麻酔薬は、本開示の治療的組成物の注射前にそれを必要とする対象の足に投与される場合がある。いくつかの場合では、足筋に、外科的露出を行って注射される場合があり、他の場合では、足筋に、外科的露出なしに注射される場合がある。いくつかの態様では、足筋に注射するために20ゲージ、21ゲージ、22ゲージ、23ゲージ、24ゲージまたは25ゲージ針が使用される場合がある。
【０２８２】
いくつかの態様では、足の機能障害を処置する方法は、それを必要とする対象の足筋に本開示の治療的組成物を約0.01mL〜約0.15mLの体積で投与すること（例えば、筋肉内注射）を含む場合がある。いくつかの態様では、足筋に少なくとも約0.01mLの治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、足筋に、最大で約0.15mLの治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、足筋に、0.01mLよりも大きい、0.02mLよりも大きい、0.03mLよりも大きい、0.04mLよりも大きい、0.05mLよりも大きい、0.06mLよりも大きい、0.07mLよりも大きい、0.08mLよりも大きい、0.09mLよりも大きい、0.10mLよりも大きい、0.11mLよりも大きい、0.12mLよりも大きい、0.13mLよりも大きい、または0.14mLよりも大きい治療的組成物が注射される場合がある。
【０２８３】
いくつかの局面では、本開示の治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、または両方で試験を行うことによって決定される場合がある。いくつかの場合では、試験は、投与前、投与後、または両方で足の機能を測定する場合がある。いくつかの場合では、試験は、足底の疼痛、足裏に沿った疼痛、扁平足、高アーチ、足腫脹、足の発赤、足底アーチのこわばりもしくは緊張、またはそれらの組み合わせを決定するための理学的検査であり得る。
【０２８４】
いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、変化しない場合がある。
【０２８５】
いくつかの態様では、足の障害を処置するための本開示の治療的組成物の投与頻度は、治療的組成物の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、足の機能障害を処置するために治療的組成物の1回だけの投与が必要な場合がある。いくつかの場合では、足の機能障害を処置するために治療的組成物の2、3、4、5、または5回よりも多い投与が、必要な場合がある。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する場合がある。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後に減少する場合がある。
【０２８６】
いくつかの態様では、足の機能障害の処置を必要とする対象は、治療的組成物の投与の前の試験により特定される場合がある。いくつかの場合では、試験は、足底の疼痛、足裏に沿った疼痛、扁平足、高アーチ、足腫脹、足の発赤、足底アーチのこわばりもしくは緊張、またはそれらの組み合わせを決定するための理学的検査であり得る。
【０２８７】
下垂足
尖足としても公知の下垂足は、足の前部を上に挙げることが困難なことに関する用語である。ある場合では、歩行の間に地面につま先を擦る場合がある。下垂足は、歩行を障害し、転倒を招く可能性がある。下垂足は、足の前部の挙上に関与する筋肉のうち1つまたは複数の筋力低下または麻痺によって引き起こされる。下垂足の原因にはいくつかある。例えば、足の挙上に関与する筋肉を制御する脚神経である腓骨神経の圧迫は、下垂足のよく見られる原因である。この神経は、また、人工股関節置換または人工膝開節置換の際に傷害される場合がある。脊柱における神経根傷害、「挟まれた神経」も、下垂足を引き起こす可能性がある。糖尿病は、また、対象を下垂足に関連する神経障害により影響を受けやすくする場合がある。様々な形態の筋ジストロフィーが、進行性の筋力低下を引き起こす。加えて、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、多発性硬化症または脳卒中などの、脊髄または脳を冒す障害が、下垂足を引き起こす場合がある。
【０２８８】
PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、下垂足を処置する方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、治療的組成物は、それを必要とする対象の足筋または下腿筋に筋発生を誘発することにより足の機能障害を処置する。いくつかの場合では、足筋または下腿筋は、前脛骨筋、第三腓骨筋、長趾伸筋、長母趾伸筋、またはそれらの組み合わせである。
【０２８９】
いくつかの態様では、治療的組成物は、外科手術（例えば、神経手術）と組み合わせて投与される。それらの態様では、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の態様では、治療的組成物は、足手術または下腿手術なしで投与される。
【０２９０】
いくつかの態様では、治療的組成物は、別の処置と組み合わせて投与される。いくつかの場合では、別の処置は、装具または副子、理学療法、神経刺激、神経手術、またはそれらの組み合わせを含む。
【０２９１】
いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物は、局所投与、皮内投与、筋肉内投与、または組み合わせにより投与される。いくつかの場合では、治療的組成物は、筋肉内投与により投与される。いくつかの場合では、筋肉内投与は、足筋または下腿筋の注射を含む。足筋または下腿筋は、前脛骨筋、第三腓骨筋、長趾伸筋、長母趾伸筋を含む場合がある。いくつかの場合では、麻酔薬は、注射の前に必要とする対象の足または下腿に投与される場合がある。いくつかの場合では、足筋または下腿筋に、外科的露出を行って注射され、他の場合では、足筋または下腿筋に、外科的露出なしに注射される。いくつかの態様では、足筋または下腿筋に注射するために20ゲージ、21ゲージ、22ゲージ、23ゲージ、24ゲージまたは25ゲージ針が使用される。
【０２９２】
いくつかの態様では、必要としている対象の足筋または下腿筋に、体積約0.01mL〜約0.15mLのPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、足筋または下腿筋に少なくとも約0.01mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、足筋または下腿筋に最大で約0.15mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、足筋または下腿筋に0.01mLよりも大きい、0.02mLよりも大きい、0.03mLよりも大きい、0.04mLよりも大きい、0.05mLよりも大きい、0.06mLよりも大きい、0.07mLよりも大きい、0.08mLよりも大きい、0.09mLよりも大きい、0.10mLよりも大きい、0.11mLよりも大きい、0.12mLよりも大きい、0.13mLよりも大きい、または0.14mLよりも大きい、PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。
【０２９３】
治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、またはそれらの組み合わせで試験を行うことによって決定される場合がある。試験は、投与前および／または投与後に足または下腿の機能を測定する場合がある。試験は、歩行を観察するため、脚筋の筋力低下を決定するため、脛、足、および／もしくは足指のしびれ感を決定するため、またはそれらの組み合わせの理学的検査であり得る。
【０２９４】
いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、同じままである場合がある。
【０２９５】
いくつかの態様では、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物の投与頻度は、治療的組成物の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、足または下腿機能の障害を処置するために治療的組成物の単回投与が必要である。いくつかの場合では、治療的組成物の2回以上、3回以上、4回以上、5回以上の投与が、必要である。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で減少する。
【０２９６】
糖尿病性ニューロパチー
糖尿病は、米国におけるニューロパチーの最もよく見られる原因であり、ニューロパチーは、糖尿病の最もよく見られる合併症である。足の小さい筋肉の萎縮は、糖尿病でよく見られ、末梢運動性ニューロパチーと関係する。長期にわたる糖尿病患者では、足筋を含む下腿筋の筋力低下および萎縮は、非ニューロパチー患者と比較してニューロパチー患者でよく見られる。内在足筋の体積は、非ニューロパチーの糖尿病患者および非糖尿病対照と比較してニューロパチーの糖尿病患者で低いことが示されている。足の内在筋の萎縮は、ニューロパチーの糖尿病患者によく見られる固定されたワシ爪趾変形および槌趾変形をもたらす可能性がある。追加的に、足の内在筋は、足底弓を安定化する。高アーチは、母趾外転筋、短母趾屈筋および母趾内転筋のような足底内在筋の萎縮でよく見られる。
【０２９７】
いくつかの局面では、糖尿病性ニューロパチーまたは関連障害の処置のための方法が、提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、糖尿病性ニューロパチーまたは関連障害を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。いくつかの場合では、糖尿病性ニューロパチーに関連する障害には、足の小さい筋肉の萎縮、下腿筋の筋力低下および萎縮、ならびに足の内在筋の萎縮が含まれる場合があるが、それに限定されるわけではない。いくつかの場合では、この方法は、足の小さい筋肉、下腿筋、または足の内在筋に治療的組成物を投与することを含む。
【０２９８】
廃用誘発性筋萎縮
骨格筋の筋肉量減少は、肢固定、床上安静、脊髄損傷および部分／完全末梢神経損傷後の臨床背景で頻繁に起こり、筋肉量および力生成の顕著な減少を生じる。廃用条件下の筋萎縮の程度は様々であり、年齢、生理機能および筋肉の線維型の組成、ならびに荷重除去および不活動の程度を含む多様な要因に依存することができる。廃用誘発性萎縮は、各人をその生涯で冒す可能性があり、特に高齢者おいて消耗性である可能性がある。現在のところ、廃用誘発性筋萎縮を処置する良い薬理学的戦略はない。
【０２９９】
PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、廃用誘発性筋萎縮を処置する方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、冒された筋肉は、荷重除去、不活動、または組み合わせを1日よりも長く、5日よりも長く、10日よりも長く、50日よりも長く、または100日よりも長く経験している。いくつかの態様では、治療的組成物は、それを必要とする対象の筋肉において筋肉発生を誘発することにより、廃用誘発性萎縮を処置し、その際、前記筋肉は、長期間の荷重除去および／または不活動を経験している。いくつかの場合では、筋肉は、骨格筋である。いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物は、筋肉内投与により投与される。いくつかの場合では、筋肉内投与は、患部筋肉の注射を含む。
【０３００】
いくつかの態様では、廃用誘発性筋萎縮は、コーレス骨折としても公知の橈骨遠位端骨折が原因である。コーレス骨折は、手首に関して手の後側および外側に生じる。これは、高齢者によく見られる。筋肉量の減少は、固定が原因で起こる可能性がある。PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、橈骨遠位端骨折が原因の筋萎縮を処置する方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、治療的組成物は、それを必要とする対象の筋肉に筋発生を誘発することにより筋萎縮を処置する。いくつかの場合では、筋肉は、橈側手根屈筋、長母指屈筋、浅指屈筋、深指屈筋、尺側手根屈筋、短／長橈側手根伸筋、長母指伸筋、総指伸筋、尺側手根伸筋またはそれらの組み合わせである。いくつかの態様では、治療的組成物は、外科手術（例えば、手首関節鏡手術）と組み合わせて投与される。それらの態様では、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の態様では、治療的組成物は、外科手術なしで投与される。
【０３０１】
いくつかの態様では、治療的組成物は、別の処置と組み合わせて投与される。いくつかの場合では、別の処置は、装具または副子、理学療法、神経刺激、神経手術、またはそれらの組み合わせを含む。
【０３０２】
いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物は、局所投与、皮内投与、筋肉内投与、または組み合わせで投与される。いくつかの場合では、治療的組成物は、筋肉内投与により投与される。いくつかの場合では、筋肉内投与は、手筋または前腕筋の注射を含む。手筋または前腕筋は、橈側手根屈筋、長母指屈筋、浅指屈筋、深指屈筋、尺側手根屈筋、短／長橈側手根伸筋、長母指伸筋、総指伸筋、尺側手根伸筋、またはそれらの組み合わせを含む場合がある。
【０３０３】
いくつかの場合では、麻酔薬は、必要としている対象の手または前腕に注射前に投与される場合がある。いくつかの場合では、手筋または前腕筋に、外科的露出を行って注射され、他の場合では、手筋または前腕筋に、外科的露出なしに注射される。いくつかの態様では、手筋または前腕脚筋に注射するために20ゲージ、21ゲージ、22ゲージ、23ゲージ、24ゲージまたは25ゲージ針が使用される。
【０３０４】
いくつかの態様では、必要としている対象の手筋または前腕筋に、体積約0.01mL〜約0.15mLのPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、手筋または前腕筋に少なくとも約0.01mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、手筋または前腕筋に最大で約0.15mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、手筋または前腕筋に0.01mLよりも大きい、0.02mLよりも大きい、0.03mLよりも大きい、0.04mLよりも大きい、0.05mLよりも大きい、0.06mLよりも大きい、0.07mLよりも大きい、0.08mLよりも大きい、0.09mLよりも大きい、0.10mLよりも大きい、0.11mLよりも大きい、0.12mLよりも大きい、0.13mLよりも大きい、または0.14mLよりも大きいPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。
【０３０５】
治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、またはそれらの組み合わせで試験を行うことによって決定される場合がある。試験は、投与前および／または後に手または前腕の機能を測定する場合がある。試験には、手関節可動域、握力、上肢障害評価表（Disability of Arm Shoulder and Hand）などの患者報告型アウトカムまたはそれらの組み合わせが含まれる場合がある。
【０３０６】
いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、同じままである場合がある。
【０３０７】
いくつかの態様では、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物の投与頻度は、治療的組成物の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、手または前腕機能障害を処置するために治療的組成物の単回投与が必要である。いくつかの場合では、治療的組成物の2回以上、3回以上、4回以上、5回以上の投与が、必要である。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で減少する。
【０３０８】
いくつかの態様では、廃用誘発性筋萎縮は、股関節部骨折が原因である。股関節部骨折は、大外傷または小外傷が原因であり得る。骨粗鬆症により骨が弱くなった高齢者では、比較的わずかな外傷、例えばウォーキングでさえも、股関節部骨折を招く場合がある。筋肉量の減少は、関節固定、および床上安静が原因で起こる可能性がある。筋肉減少が、荷重除去および不活動の組み合わせにより誘発される可能性がある。股関節部の筋肉の筋力低下は、高齢患者の大腿骨近位部骨折の置換後に頻発する状態である。PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、股関節部骨折が原因の筋萎縮を処置する方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、治療的組成物は、それを必要とする対象の股関節部の筋肉に筋肉発生を誘発することにより筋萎縮を処置する。いくつかの場合では、股関節部の筋肉は、腸骨筋、大腰筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、大腿筋膜張筋、上双子筋、下双子筋、内閉鎖筋、外閉鎖筋、大腿方形筋、梨状筋、大内転筋、長内転筋、短内転筋、小内転筋、恥骨筋、大腿直筋、外側広筋、内側広筋、中間広筋、大腿四頭筋、縫工筋、大腿二頭筋、半腱様筋、半膜様筋、小腰筋、腸腰筋、薄筋、またはそれらの組み合わせである。
【０３０９】
いくつかの態様では、治療的組成物は、外科手術（例えば、関節形成術）と組み合わせて投与される。それらの態様では、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の態様では、治療的組成物は、外科手術なしで投与される。
【０３１０】
いくつかの態様では、治療的組成物は、別の処置レジメンと組み合わせて投与される。いくつかの場合では、別の処置レジメンは、装具もしくは副子、理学療法、神経刺激、神経手術、またはそれらの組み合わせを含む。
【０３１１】
いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物は、局所投与、皮内投与、筋肉内投与、または組み合わせにより投与される。いくつかの場合では、治療的組成物は、筋肉内投与により投与される。いくつかの場合では、筋肉内投与は、股関節部の筋肉の注射を含む。いくつかの場合では、股関節部の筋肉は、腸骨筋、大腰筋、大殿筋、中殿筋、小殿筋、大腿筋膜張筋、上双子筋、下双子筋、内閉鎖筋、外閉鎖筋、大腿方形筋、梨状筋、大内転筋、長内転筋、短内転筋、小内転筋、恥骨筋、大腿直筋、外側広筋、内側広筋、中間広筋、大腿四頭筋、縫工筋、大腿二頭筋、半腱様筋、半膜様筋、小腰筋、腸腰筋、薄筋、またはそれらの組み合わせである。
【０３１２】
いくつかの場合では、麻酔薬は、必要としている対象の股関節に注射前に投与される場合がある。いくつかの場合では、股関節部の筋肉に、外科的露出を行って注射され、他の場合では、股関節部の筋肉に、外科的露出なしに注射される。いくつかの態様では、股関節部の筋肉に注射するために20ゲージ、21ゲージ、22ゲージ、23ゲージ、24ゲージまたは25ゲージ針が使用される。
【０３１３】
いくつかの態様では、必要としている対象の股関節部の筋肉に体積約0.5mL〜約5mLのPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、股関節部の筋肉に少なくとも約0.5mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、股関節部の筋肉に最大で約4mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、股関節部の筋肉に0.5mLよりも大きい、1.0mLよりも大きい、1.5mLよりも大きい、2.0mLよりも大きい、2.5mLよりも大きい、3.0mLよりも大きい、3.5mLよりも大きいPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。
【０３１４】
治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、またはそれらの組み合わせで試験を行うことによって決定される場合がある。試験は、投与前および／または後に股関節関連機能を測定する場合がある。試験は、股関節筋および膝筋の筋力試験ならびにゲットアップアンドゴーテスト（get up and go test）などの機能試験またはそれらの組み合わせであり得る。
【０３１５】
いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、同じままである場合がある。
【０３１６】
いくつかの態様では、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物の投与頻度は、治療的組成物の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、手または前腕の機能障害を処置するために治療的組成物の単回投与が必要である。いくつかの場合では、治療的組成物の2回以上、3回以上、4回以上、5回以上の投与が、必要である。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で減少する。
【０３１７】
いくつかの態様では、廃用誘発性筋萎縮は、腱板損傷が原因である。いくつかの場合では、腱板損傷は、急性腱板断裂が原因であり得る。いくつかの場合では、腱板損傷は、変性および／または慢性腱板断裂が原因であり得る。変性および／または慢性腱板断裂は、反復性ストレス、血液の供給不足、骨棘、またはそれらの組み合わせが原因であり得る。40歳を超える人々は、腱板断裂のリスクがより大きい。筋肉量の減少は、筋肉の緊張欠如および関節のこわばりが原因で起こる可能性がある。筋肉減少は、荷重除去と不活動との組み合わせによって誘発される可能性がある。PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、腱板損傷が原因の筋萎縮を処置する方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、治療的組成物は、それを必要とする対象の腱板筋における筋肉発生を誘発することにより筋萎縮を処置する。いくつかの場合では、腱板筋は、棘上筋、棘下筋、肩甲下筋、小円筋、またはそれらの組み合わせである。
【０３１８】
いくつかの態様では、治療的組成物は、外科手術（例えば、腱板関節鏡手術）と組み合わせて投与される。それらの態様では、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の態様では、治療的組成物は、外科手術なしで投与される。
【０３１９】
いくつかの態様では、治療的組成物は、別の処置レジメンと組み合わせて投与される。いくつかの場合では、別の処置レジメンは、装具もしくは副子、理学療法、神経刺激、神経手術、またはそれらの組み合わせを含む。
【０３２０】
いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物は、局所投与、皮内投与、筋肉内投与、または組み合わせにより投与される。いくつかの場合では、治療的組成物は、筋肉内投与により投与される。いくつかの場合では、筋肉内投与は、腱板筋の注射を含む。いくつかの場合では、腱板筋は、棘上筋、棘下筋、肩甲下筋、小円筋、またはそれらの組み合わせである。
【０３２１】
いくつかの場合では、麻酔薬は、必要としている対象の腱板筋に注射前に投与される場合がある。いくつかの場合では、腱板筋に、外科的露出を行って注射され、他の場合では、腱板筋に、外科的露出なしに注射される。いくつかの態様では、腱板筋に注射するために20ゲージ、21ゲージ、22ゲージ、23ゲージ、24ゲージまたは25ゲージ針が使用される。
【０３２２】
いくつかの態様では、必要としている対象の腱板筋に体積約0.5mL〜約5mLのPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、腱板筋に少なくとも約0.5mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、腱板筋に最大で約4mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、腱板筋に0.5mLよりも大きい、1.0mLよりも大きい、1.5mLよりも大きい、2.0mLよりも大きい、2.5mLよりも大きい、3.0mLよりも大きい、3.5mLよりも大きいPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。
【０３２３】
治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、またはそれらの組み合わせで試験を行うことによって決定される場合がある。試験は、投与前および／または後に腱板関連機能を測定する場合がある。試験は、肩外転、外旋および前屈、フルカンテストおよびエンプティーカンテスト（full and empty can test）、ドロップアームテスト、および回旋筋腱板のための生活の質アウトカム尺度（Quality of Life Outcome Measure for Rotator Cuff）またはそれらの組み合わせの筋力検査であり得る。
【０３２４】
いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、同じままである場合がある。
【０３２５】
いくつかの態様では、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物の投与頻度は、治療的組成物の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、手または前腕機能の障害を処置するために治療的組成物の単回投与が必要である。いくつかの場合では、治療的組成物の2回以上、3回以上、4回以上、5回以上の投与が、必要である。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で減少する。
【０３２６】
E. 骨盤底障害を処置する方法
骨盤底障害（PFD）は、骨盤底筋の機能障害に起因する。骨盤底筋は、しばしば出産および骨盤手術により損傷する。骨盤底障害は、また、他の外傷、加齢、肥満、神経疾患、および他の傷害に起因する。最もよく見られる骨盤底障害は、少なくとも部分的に、骨盤底筋の機能低下が原因である。これらの障害には、腹圧性尿失禁、過活動膀胱／切迫性尿失禁、混合性尿失禁、骨盤臓器脱、および大便失禁が含まれる。
【０３２７】
骨盤底障害は、女性の方がよく罹患するものの、男女両方における多種多様な状態を含む。骨盤底は、骨盤臓器（膀胱、前立腺、直腸、子宮膣）に対する解剖学的支持を提供し、泌尿器系の適正な機能、性生殖機能、および結腸直腸機能に欠かせない。骨盤底は、骨盤底筋ならびに関連結合組織（靱帯、腱、およびそれを覆う筋膜）から構成される。骨盤底筋には、肛門挙筋および尾骨筋が含まれる。肛門挙筋は、3つの部分、恥骨尾骨筋、腸骨尾骨筋および恥骨直腸筋を有する。
【０３２８】
骨盤底筋の機能を強化または改善することにより、これらの種類の骨盤底障害が処置される場合がある。加えて、骨盤底筋の機能を強化または改善することにより、高リスク（例えば、合併症のある出産（complicated delivery）の後、ある種の骨盤外科手術の後）として特定された患者に骨盤底障害が発生することが予防される場合がある。本出願は、また、処置のアウトカムを改善するために骨盤底障害のための既存の処置（例えば、筋肉トレーニング／バイオフィードバック、ニューロモデュレーション、薬物療法、外科手術）と組み合わせて使用される場合がある。
【０３２９】
骨盤底障害を治療または予防する方法が、本明細書に提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、骨盤底障害を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。いくつかの場合では、骨盤底障害は、腹圧性尿失禁、過活動膀胱／切迫性尿失禁、混合性尿失禁、骨盤臓器脱、および大便失禁からなる群より選択される。いくつかの局面では、この方法は、本開示の治療的組成物を、それを必要とする対象の骨盤底筋に投与することを含む場合がある。いくつかの場合では、骨盤底筋は、肛門挙筋、尾骨筋、または両方を含む。いくつかの場合では、肛門挙筋は、恥骨尾骨筋、腸骨尾骨筋、および恥骨直腸筋を含む。
【０３３０】
一局面では、本明細書の他の箇所に記載するプロスタグランジンE2（PGE2）化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物の泌尿生殖器系への適用が、本明細書に提供される。いくつかの態様では、治療的組成物は、泌尿生殖器系の機能を改善するために投与することができる。さらなる態様では、治療的組成物は、泌尿生殖器系の疾患または障害を処置するための既存のアプローチの有効性の強化するために投与することができる。泌尿生殖器系の疾患または障害は、泌尿器系障害、婦人科障害、結腸直腸障害、またはそれらの組み合わせであることができる。
【０３３１】
骨盤底筋は、膀胱および尿道を支持する。大部分の成人は、400mLを超える尿を膀胱内に収容することができる。尿は、膀胱から尿道を通過して外部に流れる。膀胱の開口部周囲に括約筋がある。括約筋は、尿が尿道を通過して漏れるのを防止するように締め付けている。これらの筋肉のいずれかの障害は、腹圧性尿失禁などの泌尿器系障害を生じる可能性がある。その上、これらの筋肉のいずれかの強化は、過活動膀胱障害および低活動膀胱障害などの泌尿器系障害を処置することを目標とすることができる。
【０３３２】
腹圧性尿失禁
腹圧性尿失禁は、咳嗽、重い物の持ち上げ、運動、または姿勢の変化などの身体活動または労作の間に尿が膀胱から漏れたときに起こる。これは、膀胱中に尿を収容する能力を制御する筋肉のいずれかが弱いまたは機能不全の場合に起こる。骨格外尿道筋、恥骨尿道筋（pubic urethral muscle）などの筋肉のうち任意の1つが、弱くなった場合、膀胱に圧がかかると尿が出る可能性がある。筋肉の弱化は、分娩、尿道領域への傷害、医薬品、前立腺手術などの骨盤領域の外科手術、骨格筋の進行性の萎縮および収縮性減少、神経損傷によって引き起こされ得る。現行の処置には、外科的介入および「膨張性薬剤（bulking agent）」の注射が含まれる。
【０３３３】
PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、腹圧性尿失禁（SUI）を処置する方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、治療的組成物は、それを必要とする対象の筋肉再生を誘発することによってSUIを処置する。いくつかの場合では、筋肉は、骨格外尿道筋、恥骨尿道筋、または外尿道括約筋である。
【０３３４】
いくつかの態様では、治療的組成物は、外科手術（例えば、前立腺手術）と組み合わせて投与される。それらの態様では、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の態様では、治療的組成物は、外科手術なしで投与される。
【０３３５】
いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物は、筋肉内投与により投与される。いくつかの場合では、筋肉内投与は、骨格外尿道筋、恥骨尿道筋、および外尿道括約筋の注射を含む。いくつかの場合では、注射の前に麻酔薬が投与される場合がある。いくつかの場合では、筋肉に、外科的露出を行って注射され、他の場合では、筋肉に、外科的露出なしに注射される。いくつかの態様では、筋肉に注射するために18ゲージ、19ゲージ、20ゲージ、21ゲージ、22ゲージ、または23ゲージ針が使用される。
【０３３６】
いくつかの態様では、必要としている対象の筋肉に体積約2mL以下のPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、筋肉に少なくとも約2mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、筋肉に2mL未満、1.8mL未満、1.6mL未満、1.4mL未満、1.2mL未満、1mL未満、0.8mL未満、0.6mL未満、0.4mL未満または0.2mL未満のPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。
【０３３７】
治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、またはそれらの組み合わせで試験を行うことによって決定される場合がある。試験は、膀胱鏡検査、パッドウェイトテスト（pad weight test）、排尿日誌、骨盤または腹部超音波検査、残尿（PVR）検査、尿検査、尿ストレステスト、尿漏出圧などの尿流動態検査、造影剤を用いるx線検査、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、同じままである場合がある。いくつかの態様では、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物の投与頻度は、治療的組成物の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物の単回投与が必要である。いくつかの場合では、治療的組成物の2回以上、3回以上、4回以上、5回以上の投与が、必要である。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で減少する。
【０３３８】
混合型尿失禁または過活動膀胱
過活動膀胱（OAB）は、膀胱が不適切なタイミングで尿を絞り出す状態である。例えば、過活動膀胱の患者は、1日に8回以上、夜間に2回以上排尿する場合があり、切迫した尿意が急に強く生じる場合があり、または排尿の衝動が突然強く起きた後に尿漏れする。神経障害（例えば、脳卒中、多発性硬化症）、糖尿病、利尿薬、尿路感染症、腫瘍、膀胱結石、前立腺肥大症、便秘症、カフェインまたはアルコールの過剰消費、加齢による認知機能低下、および排尿不全を含むいくつかの状態が、過活動膀胱の徴候および症状の原因となり得る。外尿道括約筋の機能を強化および改善することにより、膀胱と尿道との間の陽性反射作用および陰性反射作用に影響することができる。例えば、尿道括約筋の収縮作用の改善は、膀胱に尿の流れを阻害するようシグナルを送ることができる。
【０３３９】
PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、過活動膀胱（OAB）を処置する方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、治療的組成物は、それを必要とする対象の筋肉の筋肉再生を誘発することによりOABを処置する。いくつかの場合では、筋肉は、骨格外尿道筋である。
【０３４０】
いくつかの態様では、治療的組成物は、外科手術（例えば、前立腺手術）と組み合わせて投与される。それらの態様では、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の態様では、治療的組成物は、外科手術なしで投与される。
【０３４１】
いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が、筋肉内投与により投与される。いくつかの場合では、筋肉内投与は、骨格外尿道筋の注射を含む。いくつかの場合では、注射の前に麻酔薬が投与される場合がある。いくつかの場合では、筋肉に、外科的露出を行って注射され、他の場合では、筋肉に、外科的露出なしに注射される。いくつかの態様では、筋肉に注射するために18ゲージ、19ゲージ、20ゲージ、21ゲージ、22ゲージ、または23ゲージ針が使用される。
【０３４２】
いくつかの態様では、必要としている対象の筋肉に、体積約2mL以下のPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、筋肉に少なくとも約2mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、筋肉に2mL未満、1.8mL未満、1.6mL未満、1.4mL未満、1.2mL未満、1mL未満、0.8mL未満、0.6mL未満、0.4mL未満または0.2mL未満のPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。
【０３４３】
治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、またはそれらの組み合わせで試験を行うことによって決定される場合がある。試験は、残尿（PVR）検査、尿流速試験、膀胱圧試験、またはそれらの組み合わせであり得る。いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、同じままである場合がある。いくつかの態様では、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物の投与頻度は、治療的組成物の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物の単回投与が必要である。いくつかの場合では、治療的組成物の2回以上、3回以上、4回以上、5回以上の投与が、必要である。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で減少する。
【０３４４】
産科的肛門括約筋損傷（OASIS）
産科的肛門括約筋損傷（OASIS）は、出産時の肛門括約筋への損傷であり、肛門失禁、直腸腟瘻および疼痛を含む重大な併存症をもたらす可能性がある。それらは、吸引経腟分娩よりも鉗子分娩（force delivery）に関連する場合の方が多く見られる。それらは、また、産後尿閉のリスク増大と関連する。肛門括約筋の外科的修復により、筋肉の機能が完全には回復しない場合がある。
【０３４５】
PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、産科肛門括約筋傷害を処置する方法が、本明細書に記載されている。いくつかの態様では、治療的組成物は、それを必要とする対象の肛門筋の筋肉再生を誘発することによりOABを処置する。いくつかの場合では、肛門筋は、外肛門括約筋、または内肛門括約筋である。
【０３４６】
いくつかの態様では、治療的組成物は、外科手術（例えば、外肛門括約筋修復術、内肛門括約筋修復術）と組み合わせて投与される。それらの態様では、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の態様では、治療的組成物は、外科手術なしで投与される。
【０３４７】
いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物は、筋肉内投与により投与される。いくつかの場合では、筋肉内投与は、骨格外肛門括約筋の注射を含む。いくつかの場合では、麻酔薬は、注射前に投与される場合がある。いくつかの場合では、筋肉に外科的露出を行って注射され、他の場合では、筋肉に、外科的露出なしに注射される。いくつかの態様では、筋肉に注射するために18ゲージ、19ゲージ、20ゲージ、21ゲージ、22ゲージ、または23ゲージ針が使用される。
【０３４８】
いくつかの態様では、必要としている対象の肛門括約筋に、体積約2mL以下のPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、前記筋肉に少なくとも約2mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、前記筋肉に2mL未満、1.8mL未満、1.6mL未満、1.4mL未満、1.2mL未満、1mL未満、0.8mL未満、0.6mL未満、0.4mL未満または0.2mL未満のPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。
【０３４９】
治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、またはそれらの組み合わせで試験を行うことによって決定される場合がある。いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、同じままである場合がある。いくつかの態様では、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物の投与頻度は、治療的組成物の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物の単回投与が必要である。いくつかの場合では、治療的組成物の2回以上、3回以上、4回以上、5回以上の投与が、必要である。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で減少する。
【０３５０】
大便失禁
腸失禁または遺糞としても公知の大便失禁は、排便を制御できずに、予期せずに糞便を直腸から漏らすことである。これは、放屁する間に時たま便を漏らすものから、排便管理の完全欠如までの幅がある。原因には、下痢、便秘症、筋損傷または損傷なしが含まれる。いくつかの場合では、筋損傷は、出産が原因である、または加齢に関連する。
【０３５１】
PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、大便失禁を処置する方法が、本明細書に記載される。いくつかの態様では、治療的組成物は、それを必要とする対象の肛門筋の筋肉再生を誘発することにより大便失禁を処置する。いくつかの場合では、肛門筋は外肛門括約筋、または内肛門括約筋である。
【０３５２】
いくつかの態様では、治療的組成物は、外科手術（例えば、外肛門括約筋修復術、内肛門括約筋修復術）と組み合わせて投与される。それらの態様では、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。他の態様では、治療的組成物は、外科手術なしで投与される。
【０３５３】
いくつかの態様では、PGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物は、筋肉内投与により投与される。いくつかの場合では、筋肉内投与は、骨格外肛門括約筋の注射を含む。いくつかの場合では、麻酔薬は、注射前に投与される場合がある。いくつかの場合では、筋肉に外科的露出を行って注射され、他の場合では、筋肉に、外科的露出なしに注射される。いくつかの態様では、筋肉に注射するために18ゲージ、19ゲージ、20ゲージ、21ゲージ、22ゲージ、または23ゲージ針が使用される。
【０３５４】
いくつかの態様では、必要としている対象の肛門括約筋に、体積約2mL以下のPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、前記筋肉に少なくとも約2mLの治療的組成物が注射される。いくつかの態様では、前記筋肉に2mL未満、1.8mL未満、1.6mL未満、1.4mL未満、1.2mL未満、1mL未満、0.8mL未満、0.6mL未満、0.4mL未満または0.2mL未満のPGE2化合物およびミオトキシンを含む治療的組成物が注射される。
【０３５５】
治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、またはそれらの組み合わせで試験を行うことによって決定される場合がある。いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物および／またはミオトキシンの用量は、同じままである場合がある。いくつかの態様では、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む治療的組成物の投与頻度は、治療的組成物の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物の単回投与が必要である。いくつかの場合では、治療的組成物の2回以上、3回以上、4回以上、5回以上の投与が、必要である。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で減少する。
【０３５６】
F. 胃食道逆流性疾患を処置する方法
胃食道逆流症（GERD）は、成人集団に10〜20％の有病率で、上部消化管の最もよく見られる疾患の1つである。GERDは、食道最下部の輪状筋が脆弱化または損傷し、胃酸が遠位食道に侵入可能になった場合に起こる。酸は、化学受容体を刺激して、刺激を引き起こし、症状の発現につながる。GERDの食道症状（例えば、胸やけ）および食道外症状（例えば、口腔、咽頭、喉頭、および肺障害）は、胃酸への粘膜曝露により誘起され、逆流事象の頻度および粘膜酸性化の持続時間と関係する。他のGERD症状には、上腹部の膨満感、圧迫感（pressure）または痛み、消化不良、悪心、鼓腸、おくび、慢性咳嗽、気管支痙攣、喘鳴、嗄声、および喘息が含まれる場合がある。
【０３５７】
逆流防止機構（antireflux barrier）は、2つの括約筋、食道胃接合部にある下部食道括約筋（LES）および横隔膜の括約筋である。これらの2つの括約筋は、緊張性閉鎖および括約筋機構の逆流閉鎖の増強を維持する。LESは平滑筋から構成され、筋原性要因および神経原性要因のおかげで緊張性収縮を維持する。横隔膜の括約筋は、興奮性神経による緊張および収縮も示す横紋筋から構成されている。哺乳動物の横隔膜は、主として呼吸筋である。しかし、横隔膜は、2つの別々の筋肉、横隔膜脚部および肋骨部からなる。横隔膜肋骨部は、呼吸筋であるのに対し、横隔膜脚部は、呼吸および消化の2つの機能を有する。横隔膜脚部は、骨格筋から構成される。横隔膜の括約筋の収縮は、食道の下端で強力な括約筋機構を提供し、LESのレベルで緊張性（持続性）圧増加および相性圧増加の両方に寄与する。脚部筋肉の解剖研究により、自然に発生する酸逆流に有意な増加があったことが実証されている。横隔膜脚部の除去後、内在食道筋は脚部筋肉の欠如を完全には代償することができない。ヒトにおいて横隔膜裂孔は最小のGEJ開口部であり、裂孔ヘルニアが過度の逆流を示したことは、横隔膜脚部が重大な関門の役割を果たしていることを指し示している。研究により、食道炎を有する患者は、横隔膜脚部がより薄い場合があり、強制吸入時にGEJ活動が欠損する場合があることも示されている。食道炎患者における横隔膜脚部の解剖学的変化および機能不全は、GERDにおける骨格筋欠損の可能性を裏付けている。
【０３５８】
GERDの一次処置は、制酸薬、ヒスタミン受容体アンタゴニストまたはプロトンポンプ阻害剤を含むいくつかのクラスのメカニズムにより達成することができる酸抑制である。外科療法には、腹腔鏡下噴門形成術または減量手術が含まれる場合がある。抗逆流手術の合併症には、噴門形成術で処置された患者の約6％における食道拡張を要するに足る重症度の嚥下困難ならびに鼓腸の顕著な増加およびおくびを出せないこと（ガスブロート症候群）が含まれる場合がある。
【０３５９】
いくつかの局面では、胃食道逆流症（GERD）を処置するための方法が提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシン）を、GERDを有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。いくつかの態様では、治療的組成物は、横隔膜脚部における筋肉再生を誘発することによりGERDを処置する場合がある。
【０３６０】
いくつかの態様では、本開示の治療的組成物は、GERDを処置するための外科的手技と組み合わせて投与される場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、外科手術の前、外科手術の途中、外科手術の後、またはそれらの任意の組み合わせで投与することができる。いくつかの場合では、横隔膜脚部に腹腔鏡下でアクセスし、本開示の治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの場合では、横隔膜脚部の位置は、食道および横隔膜裂孔の位置を突き止め、次に食道に隣接する横隔膜に、本明細書に提供される治療的組成物を注射することによって特定される場合がある。いくつかの場合では、注射は、食道周囲に行われる場合がある。いくつかの場合では、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または10回よりも多い食道周囲の注射が行われる場合がある。いくつかの態様では、横隔膜脚部に注射するために27ゲージ、28ゲージ、29ゲージまたは30ゲージ針が使用される場合がある。
【０３６１】
いくつかの態様では、GERDを処置する方法は、本開示の治療的組成物を、それを必要とする対象の横隔膜脚部に体積約0.05mL〜約0.15mLで投与すること（例えば、筋肉内注射）を含む場合がある。いくつかの態様では、横隔膜脚部に少なくとも約0.05mLの治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、横隔膜脚部に最大で約0.15mLの治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、横隔膜脚部に0.05mLよりも大きい、0.06mLよりも大きい、0.07mLよりも大きい、0.08mLよりも大きい、0.09mLよりも大きい、0.10mLよりも大きい、0.11mLよりも大きい、0.12mLよりも大きい、0.13mLよりも大きい、または0.14mLよりも大きい治療的組成物が注射される場合がある。
【０３６２】
いくつかの局面では、本開示の治療的組成物（例えば、GERDを処置するため）の投与の有効性は、投与前、投与後、または両方で試験を行うことによって決定される場合がある。いくつかの場合では、試験は、胸やけ特異的な生活の質（Heartburn Specific Quality of Life）（HBQQL）質問票、GERD健康関連生活の質（GERD-HRQL）質問票、または両方を含む場合がある。いくつかの場合では、試験は、超音波内視鏡検査を使用して横隔膜脚部の厚さの増加をモニタリングすることを含む場合がある。
【０３６３】
G. 閉塞性睡眠時無呼吸を処置する方法
閉塞性睡眠時無呼吸（OSA）、無呼吸、または低呼吸は、睡眠中の上気道の完全閉塞または部分閉塞の繰り返しエピソードにより特徴付けられる。上気道は、3つの領域、すなわち鼻咽頭、中咽頭、および下咽頭に分けられる。中咽頭は、口蓋後方領域（後口蓋後縁から軟口蓋尾側縁）および舌根部（軟口蓋尾側縁から喉頭蓋基部）に細分される。OSAを有する患者の大部分は、口蓋後方領域、舌根部、または両方に上気道の狭窄を有する。
【０３６４】
咽頭気道を囲む骨格筋は、吸気時に一過性に活性化され、これは、気道を拡張し、気道壁を硬化させるのを助ける場合がある。咽頭筋は、軟口蓋、舌、舌骨装置、および咽頭壁の外側後方の位置を調節するのを助ける。口蓋筋内の特定の筋肉の収縮は、口蓋後方領域で気道を開く。咽頭筋は、個別に活性化された場合とは対照的に、協調して活性化された場合に異なる効果を有することができる。オトガイ舌骨筋および胸骨舌骨筋などの咽頭前壁内の筋肉の同時活性化は、舌骨を前方に動かすように作用する。口蓋帆張筋は、軟口蓋を前方に動かす。オトガイ舌筋は、舌を前方に動かすように作用する。舌の外来筋は、オトガイ舌筋、舌骨舌筋、および茎突舌筋からなり、舌の前方突出および後退に重要である。オトガイ舌筋は、舌の主な前方突出筋であり、その収縮は、主として中咽頭を前後方向に広げることにより、咽頭気道の開放を保つのに重要な役割を果たす。呼吸の間に、咽頭筋の主な目標は、気道の開放を保って、空気の流れを肺に出入り可能にすることである。
【０３６５】
健康な個体では、咽頭筋は、気道抵抗の増加を十分に補って開放気道を維持することが可能である。しかし、気道に外圧をかける（crowd）肥満または骨性構造が原因で上気道が狭くなっている個体は、睡眠中に咽頭虚脱のリスクが増加している。OSAは、気流減少（低呼吸）または気流停止（無呼吸）を招き、間欠的低酸素を生じる、睡眠中の上気道の虚脱性の増加により特徴付けられる。拡張筋が呼吸周期の部分の間に開存性を持続することは不可能であり得るので、上気道は虚脱する場合がある。オトガイ舌筋は、主な上気道拡張筋である。OSAの患者では、オトガイ舌筋が、構造的および機能的に異常であることが示されている。これらの上気道拡張筋が不全になる1つの潜在的メカニズムは、疲労による。疲労は、負荷下で筋肉活動に起因する力を発生する筋肉の能力が欠損することであり、安静により元に戻り得る。OSAでは、各閉塞性無呼吸の終わりに上気道拡張筋が強い収縮の反復するバーストに供され、それは、毎晩数百回起こる場合がある。OSAにおいては、閉塞性無呼吸の頻度および持続時間は、夜間の後半の方が大きく、潜在的にオトガイ舌筋の疲労を寄与因子として意味づけている。
【０３６６】
開存性の維持における上気道筋の重要性を考えれば、筋肉機能の低下が、咽頭閉鎖の一因となる可能性がある。収縮需要の増大に適応するために、骨格筋線維の表現型は、酸化的遅筋、疲労抵抗性のI型線維から、増大した力を発生するが、より易疲労性である高解糖能速筋II型線維に移行する可能性がある。速筋線維は、遅筋線維よりも疲労するのが速い。速筋線維の増加は、上気道筋の疲労能を増大させ、気道を虚脱しやすいまま放置し、夜間の反復性賦活化後に疲労レベルが増大するにつれ、エピソードのサイクルがますます重度になることにつながると予想される。オトガイ舌筋は、咽頭の流れ制限を防止するために協調して作用する多くの筋肉のうちの1つにすぎないものの、舌の最適な前方変位を得るために適切に賦活化されると、咽頭の開存性を実質的に改善する場合がある。
【０３６７】
上気道筋の張力および筋力における低減は、OSAの病因の主要因の1つであり得る。これらの筋肉は、オトガイ舌筋および口蓋帆張筋を含む場合がある。いくつかの場合では、これらの筋肉の筋力を改善することにより、上気道の開存性が改善されOSAの症状が軽減する場合がある。加えて、上気道の開存性に寄与し得る他の上気道筋には、オトガイ舌骨筋が含まれる場合がある。これらの筋肉を個別にまたは組み合わせて標的化することにより、上気道の開存性が改善されてOSAが処置される場合がある。いくつかの要因がOSAの原因となり得るものの、上気道の虚脱能および解剖学的構造が、OSAの発病に基本的に重要である。したがって、上気道咽頭筋の筋力低下を有するOSA患者は、この治療法についての潜在的な標的であり得る。
【０３６８】
持続陽圧呼吸（CPAP）は、中等度〜重度OSAのための標準的な処置である。しかし、睡眠中にCPAPのために必要な鼻マスクが、低い容認率およびコンプライアンス率につながっている。口腔内装具（OA）療法も、中等度および重度OSAの処置のために広く使用されている。これらは、睡眠中に下顎を前方に保持する上顎および下顎用の副子からなる。しかし、OAの効力は、CPAPに劣る。上気道の刺激は、舌下神経を一側性に刺激することにより咽頭筋の神経駆動を増強する。このアプローチの主な限界は、デバイスを埋め込むためのリスクのある外科的手技、高い前払い費用および多様な応答である。舌根のRFアブレーション、オトガイ舌筋前方移動術、舌骨吊上げ術、上下顎骨前方移動術、および舌根吊上げ術のような多くの外科的アプローチが、提唱されている。任意の外科的介入と同様に、これらのアプローチは、外科合併症および高い前払い費用というリスクを有する。さらに、いくつかのメカニズムに基づく薬物療法が提唱されているが、大した成果はない。これらには、上気道拡張筋の緊張増大、換気駆動の増大、急速眼球運動（REM）睡眠の比率の低減、睡眠中のコリン作動性緊張の増加、覚醒閾値の増加、気道抵抗の低減、および上気道の表面張力の低減が含まれる。
【０３６９】
OSAは、解剖学的に損なわれたまたは虚脱可能な上気道、睡眠中に上気道拡張筋の不適切な応答性（咽頭陰圧に対するEMG活動の最小増加）、気道狭窄に対する早すぎる目覚め（低い呼吸覚醒閾値）、または過敏な換気制御系を有することを含む、様々な病態生理学的原因を有する。したがって、効果的な処置は、OSAの主原因を処置することまたは原因の組み合わせを処置することを必要とする場合がある。
【０３７０】
いくつかの局面では、閉塞性睡眠時無呼吸（OSA）を処置するための方法が、提供される。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、OSAを有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物を、低呼吸を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物を、無呼吸を有する、有する疑いがある、または発生するリスクがある対象に投与することを含む場合がある。いくつかの場合では、この方法は、本開示の治療的組成物を対象に投与して、OSAを処置するための追加的な治療法または介入の効力を捕捉または強化することを含む場合がある。
【０３７１】
いくつかの態様では、治療的組成物は、対象の上気道の筋肉における筋肉再生を誘発することにより閉塞性睡眠時無呼吸、低呼吸、無呼吸、またはそれらの組み合わせを処置する場合がある。いくつかの場合では、上気道筋は、オトガイ舌筋を含む。いくつかの場合では、上気道筋は、口蓋帆張筋を含む。いくつかの場合では、上気道筋は、オトガイ舌骨筋を含む。いくつかの場合では、OSA、低呼吸、または無呼吸は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、上気道筋（例えば、オトガイ舌筋、口蓋帆張筋、オトガイ舌骨筋、またはそれらの任意の組み合わせ）に投与することにより処置することができる。
【０３７２】
いくつかの態様では、OSA、低呼吸、または無呼吸を処置する方法は、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）を、それを必要とする対象に局所投与、皮内投与、筋肉内投与、またはそれらの組み合わせにより投与することを含む場合がある。いくつかの場合では、治療的組成物は、筋肉内投与により投与される場合がある。いくつかの場合では、筋肉内投与は、上気道筋の注射を含む場合がある。上気道筋は、オトガイ舌筋、口蓋帆張筋、オトガイ舌骨筋、またはそれらの組み合わせを含む場合がある。いくつかの場合では、麻酔薬は、治療的組成物の注射前に上気道に投与される場合がある。いくつかの場合では、上気道筋に外科的露出を行って注射される場合があり、他の場合では、上気道筋に、外科的露出なしに注射される場合がある。いくつかの場合では、上気道の解剖学的構造を変えるための外科的手技は、上気道筋の筋力を増大させることにより（例えば、本開示の治療的組成物を上気道筋に投与することにより）強化される場合がある。いくつかの態様では、上気道筋に注射するために27ゲージ、28ゲージ、29ゲージまたは30ゲージ針が使用される場合がある。
【０３７３】
いくつかの態様では、OSA、低呼吸、無呼吸、またはそれらの組み合わせを処置する方法は、本開示の治療的組成物を、それを必要とする対象の上気道筋に約0.01mL〜約0.15mLの体積で投与すること（例えば、筋肉内注射）を含む場合がある。いくつかの態様では、上気道筋に少なくとも約0.01mLの本開示の治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、上気道筋に最大で約0.15mLの本開示の治療的組成物が注射される場合がある。いくつかの態様では、上気道筋に0.01mLよりも大きい、0.02mLよりも大きい、0.03mLよりも大きい、0.04mLよりも大きい、0.05mLよりも大きい、0.06mLよりも大きい、0.07mLよりも大きい、0.08mLよりも大きい、0.09mLよりも大きい、0.10mLよりも大きい、0.11mLよりも大きい、0.12mLよりも大きい、0.13mLよりも大きい、または0.14mLよりも大きい本開示の治療的組成物が注射される場合がある。
【０３７４】
いくつかの局面では、治療的組成物の投与の有効性は、投与前、投与後、または両方で試験を行うことによって決定される場合がある。いくつかの場合では、試験は、無呼吸／低呼吸指数（AHI）およびエプワース眠気尺度（ESS）により推定されるOSAに関連する日中の眠気レベルを使用してOSA患者に対する臨床的利益を評価する場合がある。いくつかの場合では、試験は、睡眠ポリグラフのパラメーター（例えば、AI、HI、RERArl、Arl、LSat）、睡眠関連生活の質（FOSQ）、および反応時間検査（PVT）を含む場合がある。
【０３７５】
いくつかの態様では、治療的組成物の用量は、事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、増大する場合がある。他の場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、減少する場合がある。いくつかの場合では、PGE2化合物、ミオトキシン、または両方の用量は、変化しない場合がある。いくつかの態様では、本開示の治療的組成物（例えば、PGE2化合物および／またはミオトキシンを含む）の投与頻度は、治療的組成物の事前の投与の有効性を決定した後で調整される場合がある。いくつかの場合では、OSA、低呼吸、または無呼吸を処置するために治療的組成物の1回だけの投与が必要な場合がある。いくつかの場合では、OSA、低呼吸、または無呼吸を処置するために治療的組成物の2、3、4、5、または5回よりも多い投与が、必要な場合がある。いくつかの場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後で増大する場合がある。他の場合では、投与頻度は、事前の投与の有効性を決定した後に減少する場合がある。
【０３７６】
H. キット
本発明のなお別の局面では、それを必要とする対象における筋肉再生を促進するためおよび／もしくは筋肉量を増大させるため、またはそれを必要とする対象における筋肉の状態を予防もしくは治療するためのキットが、本明細書に提供される。いくつかの態様では、キットは、PGE2化合物の組み合わせ（例えば、PGE2受容体アゴニスト）およびミオトキシンを含む本明細書記載の組成物を含む。他の態様では、キットは、本明細書記載の薬学的組成物を含む。キットは、典型的には、ガラスまたはプラスチックなどの多様な材料から形成され得る容器を含有し、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含むことができる。典型的にはラベルがキットに付属し、電子可読形態またはコンピュータ可読形態であり得る任意の書き込みまたは記録材料を含み、キットの内容物を使用するための説明または他の情報を提供する。
【０３７７】
本発明のキットは、筋損傷、筋傷害、または筋萎縮に関連する筋肉の状態を含むが、それに限定されるわけではない任意の数の筋肉の状態を処置するために適している場合がある。キットは、また、それを必要とする対象における筋肉再生を促進するためおよび／または筋肉量を増大させるために有用であり得る。本発明のキットによる予防または治療に適した状態の非限定的な例には、外傷（例えば、急性筋外傷、急性神経外傷）、急性筋傷害、急性神経傷害、慢性神経傷害、手の軟部組織傷害、手根管症候群（CTS）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）、ベッカー型筋ジストロフィー、肢帯型筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ALS）、遠位型筋ジストロフィー（DD）、遺伝性ミオパチー、筋強直性筋ジストロフィー（MDD）、ミトコンドリアミオパチー、筋細管ミオパチー（MM）、重症筋無力症（MG）、うっ血性心不全、周期性四肢麻痺、多発性筋炎、横紋筋融解、皮膚筋炎、癌悪液質、AIDS悪液質、心臓悪液質、ストレス誘発性尿失禁、サルコペニア、脊髄性筋萎縮、肛門括約筋機能障害、ベル麻痺、腱板損傷、脊髄損傷、人工股関節置換、人工膝開節置換、手首の骨折、糖尿病性ニューロパチー、胃食道逆流症（GERD）、閉塞性睡眠時無呼吸（OSA）、骨盤底障害（例えば、腹圧性尿失禁、過活動膀胱／切迫性尿失禁、混合性尿失禁、骨盤臓器脱、大便失禁）、筋骨格障害（例えば、手の機能障害、母指機能障害、足の機能障害）、足底筋膜炎、下垂足、廃用誘発性筋萎縮、眼瞼機能障害（例えば、眼瞼の垂れ下がり、瞬目障害、眼瞼内反、眼瞼外反）、斜視、眼振、老視が含まれる。本発明のキットによる予防または治療のために適した状態の追加的な例には、神経再支配後に回復しない神経傷害または直接の外傷後の顔または手における萎縮および筋機能障害；グレーブス病、外傷、および進行性外眼筋麻痺に見られる眼球運動不能および複視を引き起こす外眼筋傷害；外傷；進行性外眼筋麻痺；ならびに尿失禁および大便失禁を含む、少数の細胞の局所移植により再生することができる小さい単離された筋肉を冒す筋肉障害が含まれる場合がある。
【０３７８】
いくつかの態様では、キットは、単離された筋細胞をさらに含む。他の態様では、キットは、使用説明書（例えば、キットの使用者に対する）をさらに含む。いくつかの態様では、キットは、例えば、本発明の組成物および／または薬学的組成物を投与するため、単離された筋細胞を（例えば、それを必要とする対象に）投与するため、またはそれらの組み合わせのために使用される1つまたは複数の試薬および／または1つまたは複数のデバイス（例えば、デリバリーデバイス）をさらに含む。
【実施例】
【０３７９】
IV. 実施例
本発明は、具体例によってより詳細に説明される。以下の例は、単に例証のために提供されるものであって、決して本発明を限定することを意図するものではない。
【０３８０】
実施例1：短期的なプロスタグランジンE2送達は、老齢マウスにおける骨格筋の再生および強度を増強する
本実施例は、PGE2シグナル伝達が、再生過程の筋幹細胞機能にとって必要であることを例証する。
【０３８１】
高齢者は、運動性および生活の質を低下させる、進行性の骨格筋衰弱および再生不全に苦しむ。一生を通じて骨格筋の損傷および修復に対応する態勢ができている、筋組織中のニッチに存在する成熟筋幹細胞（MuSC）が、筋再生には極めて重要である。老化過程で、機能的なMuSCの割合は、顕著に減少し、筋再生を遅らせる。これまでのところ、この再生の減退に対抗するMuSCを標的とした治療用物質は、臨床的に使用されていない。ここで、本発明者らは、天然の免疫調節因子であるプロスタグランジンE2（PGE2）を、筋再生に不可欠なMuSC機能の強力な調節因子として特定する。本発明者らは、PGE2受容体であるEP4が、マウスでのMuSCのインビトロ増殖およびインビボ生着に不可欠であることを見いだした。老齢マウスのMuSCでは、細胞内在分子の欠陥、すなわち、PGE2を不活化させるプロスタグランジン分解酵素（15-PGDH）の上昇が原因で、PGE2経路は異常調節される。この欠陥は、傷害を受けた筋肉へのMuSC移植と同時に、安定な分解抵抗性PGE2である16,16-ジメチルPGE2（dmPGE2）にMuSCを一時的に短期的曝露させることによって、克服される。注目すべきことに、dmPGE2の単回筋肉内注射だけで、再生を加速させるのに十分であり、これは、傷害後の内因性MuSC数および筋線維サイズの早期増加によって明白である。その上、老齢マウスの筋力生成能力は、運動誘発性の再生および短期的なdmPGE2処理レジメンに応答して増加した。本発明者らの知見は、筋再生および強度の強力な誘導因子としてのPGE2の新規の治療的適応を明らかにする。
【０３８２】
筋再生能の減退に対抗するために、本発明者らは、筋再生に専念する幹細胞集団であるMuSC（衛星細胞としても知られている）を標的とした治療用物質を探し求めた。一時的な炎症性かつ線維脂肪生成性の応答が筋再生において重要な役割を果たしているので、本発明者らは、加齢に関連したMuSC機能の減退を克服し得る、傷害によって誘導される炎症調節因子を特定しようと努めた。本発明者らのトランスクリプトームデータベースの解析により、急性炎症過程の天然の強力な脂質メディエーターであるPGE2に対するPtger4受容体が、新しく単離されたMuSC上で高レベルに発現されていることを明らかにした。筋組織溶解物において、本発明者らは、ノテキシン注射または寒冷傷害を伴う標準的な傷害パラダイムによって若齢（2〜4ヶ月）マウスの筋肉を傷害した3日後にPGE2レベルの急増（図2Aおよび6A）と、その合成酵素であるPtgesおよびPtges2の同時アップレギュレーション（図2B）を検出した。この早期で一時的な時間域は、詳細に記録が残された傷害後のMuSC増大および炎症性サイトカイン蓄積の動態と一致する。PGE2処理がMuSC挙動を増強したかを判定するために、本発明者らは、若齢マウス（2〜4ヶ月）由来の後肢筋肉からMuSCをFACS精製し、それらを堅さ12kpaのヒドロゲル上に播いて、幹細胞機能を維持した。本発明者らは、PGE2（10ng/ml）が、EDU取り込みによってアッセイされる細胞分裂を増加させたこと（図2B〜2D）、そして、PGE2への短期的1日曝露が、1週間後、対照と比べて6倍のMuSC数の増加を誘導したこと（図2C）を見いだした。
【０３８３】
PGE2は、4種のGタンパク質共役型受容体（Ptger1〜4；EP1〜4）を通じてシグナル伝達することが知られているが、MuSCにおけるこれらの受容体の発現は、これまで説明されていない。異なる受容体（Ptger1〜4）の転写物レベルの解析は、MuSCのPGE2処理後にアップレギュレーションされる受容体がPtger1およびPtger4のみであることを明らかにした（図6E）。PGE2で刺激されたMuSCは、細胞内cAMPが上昇していたが、このことは、PGE2が、EP4を通じてシグナル伝達して、増殖および幹細胞転写状態を促進することを裏付けている（図6F〜6H）。EP4アンタゴニストであるONO-AE3-208の存在下では、PGE2によって誘導される増殖は鈍化した（図2D）。しかし、EP4に対するPGE2の特異性は、cre媒介性の条件的切断後の該受容体を欠いているMuSCにおいて最も明らかに示された（図2E〜2Gおよび図6I〜6J）。実際、増殖因子の豊富な培地の存在下であっても、これらのEP4欠損MuSCは増殖することができなかった。最後に、本発明者らは、チャコール処理済み血清を含む培地への曝露によって成長停止させたMuSCが、PGE2の添加によって分裂することを見いだした（図2Hおよび6K）。したがって、PGE2/EP4は、MuSC増殖にとって必要かつ十分なものとして注目される。
【０３８４】
本発明者らは、老化MuSCについて過去に報告されている筋再生の欠陥をPGE2が改善し得るかを判定しようと努めた。若齢マウスの筋肉（2〜4ヶ月）とは対照的に、老化した筋肉（18〜20ヶ月）へのノテキシン損傷は、PGE2合成の増加をもたらすことはなかった。それどころか、老化した筋肉における定常状態のPGE2レベルは、傷害後も依然として変わらず（図3A）、若い肢前脛骨筋（TA）筋肉中よりも有意に高かった（図3B）。本発明者らは、老化した筋肉中のPGE2が、異化作用の欠陥が原因で機能不全である可能性があるという仮説を立てた。実際、若いTA筋組織および老化TA筋組織中に存在するPGE2を本発明者らが質量分析法によって解析したところ、本発明者らは、不活性型である13,14-ジヒドロ-15-ケトPGE2（PGEM）の相対量が、老化した筋組織において有意に増加していることを見いだした（図3C〜3Dおよび図7A〜7C）。これは、PGE2からその不活性型への変換の初期段階である、PGE2分解酵素（15-PGDH）をコードするmRNAのレベルの同時の7倍増加が原因であると証明された（図3E）。対照的に、プロスタグランジントランスポーター（PGT）、PGE2合成酵素およびEP4受容体の相対レベルは、若齢MuSCと老化MuSCとの間で差がなかった（図8A〜8C）。加えて、老化MuSCを、PGE2の1日パルスまたは15-PGDHの阻害剤（SW033291）に曝露すると、15-PGDHの効果は抑えられ、特徴的な増殖の増加およびPax7発現の維持が観察された（図3Fおよび図8D）。若齢MuSCと同様に、老化MuSCも、チャコール処理済み血清から構成された培地中で増殖することができなかったが、PGE2の添加だけでレスキューされた（図3G）。老化MuSCでは、PGE2経路が、細胞内在分子の欠陥、すなわち、15-PGDHの上昇が原因で異常調節され、この上昇を、PGE2またはSWへの短期的曝露によって培養時に克服することができると、本発明者らは推察した（図3H）。
【０３８５】
老化MuSCは異種混合であるので、本発明者らは、PGE2の効果を単一細胞レベルで判定しようと努めた。クローン解析は、全体としての集団の解析では隠れている違いを明らかにすることができる。したがって、本発明者らは、PGE2に1日一時的曝露させた単一の老化MuSCおよび未処理の対照MuSCのヒドロゲル「マイクロウェル」にて長期の低速度撮影顕微鏡検査を実施した。48時間の期間にわたってデータを集め、次いで、本発明者らが過去に記載した細胞トラッキングおよび系統復元用のバクスターアルゴリズムを使用して解析した。本発明者らは、最も頑強なクローンの場合に6世代にわたる、PGE2に応答した累積細胞数の顕著な増加を観察した（図3I〜3J）。PGE2処理後の1クローン当たりの細胞数は、細胞死の大幅な減少（図3Jおよび図8E〜8G）を伴った顕著な増殖の増加（図3I〜3Jおよび図8E〜8F）が原因で、有意に増強された。これらの相乗効果によって、PGE2に応答した老化MuSC数の増加が観察されることになった。
【０３８６】
若齢MuSCのPGE2による一時的処理が再生を増強するかどうかを調査するために、本発明者らは、培養したPGE2処理MuSCを、マウスの傷害を受けた後肢筋肉に移植した。再生の経時的な動力学を定量的にインビボモニタリングするために、本発明者らは、移植後のMuSC機能をモニタリングするため本発明者らが過去に開発した高感度で定量的な生物発光イメージング（BLI）アッセイを利用した。GFPおよびルシフェラーゼを発現する若齢トランスジェニックマウス（2〜4ヶ月）（GFP/Lucマウス）からMuSCを単離し、短期的1日PGE2処理に曝露させ、回収し、7日目に移植した。等しい数のdmPGE2処理MuSCおよび対照MuSC（250個の細胞）を、若齢（2〜4ヶ月）NOD-SCIDマウスの傷害を受けた後肢に移植した。PGE2による短期的処理の後、若齢MuSCの再生能力は、BLIによって評価したところ、1桁増強された（図4A）。対照的に、条件的切断が原因でEP4受容体を欠いている培養MuSCを4倍多い数移植した後（図4B）、最初に検出されたBLIシグナルは、有意性の閾値を下回るレベルまで徐々に減退した（図4B）。
【０３８７】
その上、マウスの筋幹細胞特異的EP4欠失モデル（Pax7CreERT2；EP4fl/fl）においてノテキシン傷害を実施したとき（図10A〜10B）、胚性ミオシン重鎖（eMHC）陽性線維の数の上昇によって観察されるように、筋再生が害された（図10C〜10D）。これは、再生時点の最後（21日目）に評価された、Pax7CreERT2；EP4fl/f群におけるマウス線維の断面積の減少を伴っていた（図10E）。また、傷害後14日目に、力の出力（強縮）の有意な減少も検出された（図10F〜10G）。したがって、EP4受容体を介したPGE2シグナル伝達がインビボでのMuSC再生に必要である。
【０３８８】
培養なしのPGE2の直接的注射が、インビボでの再生を促進する上で有効であり得るかを調査するために、本発明者らは、PGE2を、新しく単離したMuSCと一緒に同時注射した。後続の全てのインビボ注射実験について、本発明者らは、修飾されたより安定な形態のPGE2である16,16-ジメチルPGE2（dmPGE2）を使用した。本発明者らは、老化MuSCでは15-PGDHが有意に上昇しているため（図3E）、老化MuSC実験の場合、修飾された15-PGDH抵抗性dmPGE2の送達が特に重要であるという仮説を立てた。dmPGE2を使用して、本発明者らは、対照と比べて有意に増強された若齢MuSCおよび老化MuSCの生着を観察し、この生着は、十分に認められている幹細胞機能の厳格な試験であるノテキシン傷害に応答してさらに増加した（図4C〜4D）。したがって、dmPGE2をMuSC細胞集団と一緒に送達することが、再生を増強するのに十分である。
【０３８９】
本発明者らは、PGE2の送達だけで筋再生を刺激できると想定した。これを調査するために、若齢マウスの筋肉を心臓毒で傷つけ、3日後、大量のdmPGE2を若齢マウスの後肢筋肉に注射した。本発明者らは、傷害の14日後に、基底膜の下および筋線維の上の典型的な衛星細胞ニッチ中に内因性PAX7発現MuSCの増加（60±15％）を観察した（図5A〜5B）が、傷害がない場合、dmPGE2は効果がなかった。さらに、この早期の時点に、筋線維の分布は、筋線維解析用のバクスターアルゴリズムを使用して断面積として評価したところ、より大きなサイズへとシフトしていたが、このことは、PGE2によって再生が加速されることを示唆している（図5C〜5Dおよび9A〜9B）。加えて、本発明者らは、トランスジェニックマウスモデルPax7creERT2；Rosa26-LSL-Lucを使用して、傷害およびdmPGE2に対する内因性MuSCの応答をルシフェラーゼ発現によって追跡した（図5E）。BLIデータは、組織学的データと合致していた（図5F〜5G）。
【０３９０】
本発明者らは、非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）であるインドメタシンおよびPGE2合成を減少させるCOX2阻害剤の注射が筋再生に与える影響を調査した。心臓毒による傷害の3日後に、同じPax7creERT2；Rosa26-LSL-Lucマウスモデルの後肢筋肉にインドメタシンを注射したところ、本発明者らは、筋幹細胞の活性化および再生の障害の指標である、ルシフェラーゼ活性の有意な低下を観察した（図11A〜11B）。心臓毒によって傷害を受けた筋肉へのインドメタシンの注射もまた、傷害後14日目に評価したところ、対照群と比較して、単収縮力の有意な喪失をもたらした（図11C）。高齢マウスにおいて、本発明者らはまた、dmPGE2の単回注射後、傷害後14日目に内因性MuSC数の大幅な増加（24±2％）（図5H〜5I）と筋線維サイズの同時増加（図5J〜5K）を検出した。したがって、dmPGE2への曝露だけで、内因性修復の規模および経時変化に影響を与える。
【０３９１】
最終的な試験として、本発明者らは、dmPGE2によって増強された再生が、下り坂トレッドミルランニングによって誘導される自然な傷害の後に、筋力の増加を導き得るかを判定した。このシナリオでは、下り勾配20°の下り坂トレッドミルを毎日10分間走ることによって、損傷を引き起こした。1週目の間、処理群の高齢マウスは、連続して5日間走り、運動後にdmPGE2を毎日注射した。2週目の間、処理群の高齢マウスは、5日間連続走ったが、追加の処理は受けなかった（図5L）。dmPGE2処理したマウスの腓腹肉（GA）および未処理のマウスの腓腹肉（GA）について、比単収縮力および比強縮力を比較したところ、両方とも有意に増加していた（図5M〜5P）。したがって、運動誘発性の傷害と同時にdmPGE2に短期的曝露させることは、老化した筋力の有意な増加を付与することができる。
【０３９２】
本発明者らは、骨格筋再生におけるPGE2の新しい適応を発見した。骨格筋に対するPGE2の効果についての先行研究は、PGE2が、組織培養中の筋芽細胞の増殖、融合、タンパク質分解および分化を変化させることを示していた。したがって、これらの研究は、筋芽細胞が幹細胞機能を失った前駆細胞であるので、本発明者らの研究とは異なる。衛星細胞（MuSC）は、発達および再生にとって極めて重要であり、そして、それらの数は、若齢および高齢のマウスおよびヒトにおいてランニングまたは他の非常に激しい運動によって増加する。非ステロイド系抗炎症物質が、運動誘発性のMuSC増加を減弱することが報告されている。本発明者らのデータは、効果的な筋再生を特徴付ける初期の一時的な炎症の高まりという有益な効果が、MuSCの増殖および生着に不可欠かつ十分であるPGE2およびその受容体EP4に部分的に起因するという新規の証拠を提供する。造血組織、肝臓組織および結腸組織について、15-PGDH阻害剤であるSW033291の送達が再生を増強することが最近示された。注目すべきことに、PGE2およびその類似体は、例えば、分娩を誘発するためかつ造血幹細胞移植を促進するために、何十年もヒト患者で安全に使用されており、このことは、傷害後の筋肉を修復する際のその臨床的使用への道を開くものである。まとめると、本発明者らの知見は、短期的PGE2レジメンが、運動誘発性の損傷の再生を迅速かつ頑強に増強し、加齢に伴う制約を克服して、強度の増加をもたらすのに十分であることを示す。
【０３９３】
マウス：本発明者らは、全ての実験およびプロトコルを、スタンフォード大学の実験動物管理委員会（Stanford University and Administrative Panel on Laboratory Animal Care）（APLAC）の施設内ガイドラインを順守して実施した。本発明者らは、老化した筋肉の研究のために米国立老化研究所（NIA）から野生型の老齢C57BL/6（18〜20ヶ月）マウスを入手し、Jackson Laboratoryから野生型の若齢C57BL/6マウスを入手した。二重トランスジェニックGFP/lucマウスを過去に記載の通りに作製した1。簡潔に述べると、遍在性Actbプロモーターの調節下にあるホタルルシフェラーゼ（luc）導入遺伝子を発現するマウスを、FVB系統で維持した。遍在性UBCプロモーターの調節下にある緑色蛍光タンパク質（GFP）導入遺伝子を発現するマウスを、C57BL/6系統で維持した。本発明者らは、NOD-SCID（Jackson Laboratory）レシピエントマウスへの同種異系移植実験にGFP/luc由来の細胞を使用した。EP4flox/flox（EP4f/f）マウスは、K. Andreasson（スタンフォード大学）から贈与された2。Jackson Laboratoryから入手したPax7CreERT2マウス（Stock # 017763）3とJackson Laboratoryから入手したRosa26-LSL-Luc（Stock # 005125）4を交雑することによって、二重トランスジェニックPax7CreERT2；Rosa26-LSL-Lucを作製した。本発明者らは、適切なPCRに基づく戦略によって、これらの遺伝子型を検証した。トランスジェニック系統に由来するマウスは全て、若齢であった。全ての系統について、若齢マウスは2〜4ヶ月齢であり、高齢マウスは18〜20ヶ月齢であった。これらの研究で使用したマウスは全て、雌であった。
【０３９４】
筋幹細胞単離：本発明者らは、過去に記載の通りに筋幹細胞を単離および濃縮した1,5,6。簡潔に述べると、穏やかなコラゲナーゼ消化およびMACs Dissociatorによる切り刻みによって、多数の単一線維が解離するのを可能にし、続いて、ディスパーゼ消化によって、それらのニッチから単核細胞を遊離させた。その後、磁気ビーズカラム（Miltenyi）を使用して、細胞混合物から造血系統発現細胞および非筋細胞を枯渇させた（CD45-/CD11b-/CD31-）。次いで、残存する細胞混合物をFACS解析に供して、CD34マーカーおよびα7-インテグリンマーカーを同時発現しているMuSCを選別した。本発明者らは、FlowJo v10.0を使用してフローサイトメトリー散布図を作成し解析した。選別毎に、本発明者らは、少なくとも3匹の無関係な雌のドナーマウスに由来するMuSC（それぞれ約5,000個）を一緒にプールした。
【０３９５】
筋幹細胞移植：本発明者らは、過去に記載の通りに1,5,6、FACS単離の直後または細胞培養から採取後の250個のMuSC（図4A、4Cおよび4D）または1,000個のMuSC（図4B）を、レシピエントマウスの前脛骨筋（TA）筋肉に直接移植した。若齢MuSCの研究の場合、本発明者らは、GFP/lucマウス（2〜4ヶ月齢）に由来する細胞を、後肢に放射線照射したNOD-SCIDマウスに移植した。老化MuSCの研究の場合、本発明者らは、過去に記載の通りに5、移植前の24時間、培養2日目のluc-IRES-GFPレンチウイルス（GFP/lucウイルス）が形質導入された老齢C57BL/6マウス（18〜20ヶ月、NIH）に由来する細胞を移植した（詳細については、下記の「筋幹細胞の培養、処理およびレンチウイルス感染」のセクションを参照のこと）。筋幹細胞の移植前に、本発明者らは、ケタミン（マウス1匹当たり2.4mg）の腹腔内注射によって、NOD-SCIDレシピエントマウスに麻酔をかけた。次いで、本発明者らは、後肢に線量18Gyを1回放射線照射し、体の残り部分は鉛のジグで遮蔽した。本発明者らは、放射線照射から2日以内に移植を実施した。
【０３９６】
培養細胞を示したように処理し（ビヒクルまたはPGE2処理10ng/ml）、PBS中0.5％トリプシンと37℃で2分間インキュベーションすることによってヒドロゲル培養物から採取し、血球計数器を使用して計数した。本発明者らは、細胞を所望の細胞濃度で0.1％ゼラチン/PBS中に再懸濁し、次いで、それら（1つのTA当たり250個のMuSC）を10μl容量で筋肉内注射することによってTA筋肉に移植した。新しいMuSC移植のために、本発明者らは、選別した細胞を、13nmolの16,16-ジメチルプロスタグランジンE2（dmPGE2）（Tocris、カタログ番号4027）またはビヒクル対照（PBS）と共に同時注射した。本発明者らは、同じマウスの反対側の脚のTA筋肉に移植することによって、異なる条件に由来する細胞を比較した。移植の1ヶ月後に、本発明者らは、10μlのノテキシン（10μg ml-1；Latoxan, France）を注射して、レシピエント筋肉を傷つけ、MuSCをインビボで活性化させた。移植の8週間後に、マウスを安楽死させ、解析のためにTAを採取した。
【０３９７】
生物発光イメージング：本発明者らは、過去に記載の通りに1,5,6、Xenogen-100システムを使用した生物発光イメージング（BLI）を実施した。簡潔に述べると、本発明者らは、イソフルオラン（isofluorane）吸入を使用してマウスに麻酔をかけ、120μLのD-ルシフェリン（0.1mmol kg-1、PBS中で再構成；Caliper LifeSciences）を腹腔内注射によって投与した。本発明者らは、ルシフェリン注射の5分後に、Fストップ=1.0で60秒の露光を使用して、BLIを取得した。デジタル画像を記録し、Living Imageソフトウェア（Caliper LifeSciences）を使用して解析した。本発明者らは、各後肢の全体にわたって設定された一貫した関心領域（ROI）を用いて画像を解析して、生物発光シグナルを算出した。本発明者らは、輝度（ps-1cm-2sr-1）値104の生物発光シグナルを算出して、生着閾値を定めた。この輝度閾値104は、過去に報告されている総フラックス閾値（p/s単位）にほぼ等しい。このBLI閾値は、1以上のGFP+筋線維の組織学的検出に対応している1,5,6。本発明者らは、移植後毎週、BLIイメージングを実施した。
【０３９８】
筋肉傷害：本発明者らは、TA筋肉への10μlのノテキシン（10μg ml-1；Latoxan）または心臓毒（10μM；Latoxan）の筋肉内注射を伴う傷害モデルを使用した。寒冷傷害のために、TA筋肉を覆っている皮膚に切開部を作り、液体窒素中で冷却した銅製プローブをTA筋肉に10秒間隔で3回当てて、クリオプローブの各適用間に筋肉が融解するようにした。必要であれば、傷害の48時間後、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2（dmPGE2）（13nmol、Tocris、カタログ番号4027）またはビヒクル対照（PBS）のいずれかをTA筋肉に注射した。反対側のTAを内部標準として使用した。本発明者らは、傷害の14日後に、解析のために組織を採取した。
【０３９９】
Pax7CreERT2；Rosa26-LSL-Lucマウス実験の場合、本発明者らは、タモキシフェンを5回連続して毎日腹腔内注射することによってマウスを処理して、Pax7プロモーターの制御下のルシフェラーゼ発現を活性化させた。最後のタモキシフェン注射の1週間後に、マウスを10μlの心臓毒（10μM；Latoxan）の筋肉内注射に供し、本発明者らはこれをアッセイの0日目とした。3日後に、13nmolのdmPGE2（13nmol）またはビヒクル対照（PBS）のいずれかをTA筋肉に注射した。反対側のTAを内部標準として使用した。傷害後3日目、7日目、10日目および14日目に生物発光をアッセイした。
【０４００】
組織の組織学的検査：本発明者らは、過去に記載の通りに5,6、組織学的検査のためにレシピエントTA筋組織を採取および調製した。本発明者らは、横断切片を、抗ラミニン一次抗体（Millipore、clone A5、カタログ番号05-206、1：200）および抗PAX7一次抗体（Santa Cruz Biotechnology、カタログ番号sc-81648、1：50）と、次いで、AlexaFluor二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories、1：200）とインキュベーションした。本発明者らは、DAPI（Invitrogen）を用いて核を対比染色した。本発明者らは、Plan NeoFluar 10×/0.30NAまたは20×/0.75NA対物レンズ（Carl Zeiss）を備えたAxioPlan2落射蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Microimaging）およびSlideBook（3i）ソフトウェアによって管理されるORCA-ERデジタルカメラ（Hamamatsu Photonics）を用いて、画像を取得した。この画像を、Adobe Photoshopを使用して、同じ実験からの全画像に対して一貫したコントラスト調整を行って切り取った。Adobe Illustratorを使用して複合画像を作成した。本発明者らは、PAX7陽性細胞の数を、MetaMorph画像解析ソフトウェア（Molecular Devices）を使用して、そして、線維面積を、線維を特定し画像中の線維を区分して各線維の面積を解析する筋線維解析用のバクスターアルゴリズムを使用して、解析した。PAX7の定量のために、本発明者らは、TAの少なくとも2mmの深さに及ぶ連続切片を調べた。線維面積について、上記のマウス毎に、400個超の筋線維を含むラミニン染色した筋線維断面の少なくとも10個の視野を取り込んだ。データ解析は盲検化された。画像取得およびスコア付けを実施する調査員は、解析される試料群に与えられた処理条件を知らなかった。
【０４０１】
ヒドロゲル作製：本発明者らは、過去に記載の通りに6合成されたPEG前駆体からポリエチレングリコール（PEG）ヒドロゲルを作製した。簡潔に述べると、本発明者らは、MuSCを培養し培養中の幹細胞の運命を維持するための最適条件である厚さ1mmの堅さ12kPa（ヤング率）のヒドロゲルを実現するための公開されている配合を使用することによって6、ヒドロゲルを製造した。本発明者らは、過去に記載の通りに6、クローン増殖実験のために12kPaのヒドロゲルマイクロウェルアレイを作製した。本発明者らは、12ウェルまたは24ウェルの培養プレートの表面領域を覆うように、全てのヒドロゲルを切り、付着させた。
【０４０２】
筋幹細胞の培養、処理およびレンチウイルス感染：単離後、本発明者らは、MuSCを、DMEM/F10（50：50）、15％ FBS、2.5ng ml-1線維芽細胞増殖因子-2（FGF-2、bFGFとしても公知）および1％ペニシリン-ストレプトマイシを含有する筋原細胞培養培地中に再懸濁した。本発明者らは、MuSC懸濁液を表面積1cm2当たり細胞500個の密度で播種した。本発明者らは、細胞培養物を5％ CO2中37℃で維持し、培地を毎日交換した。PGE2処理、15-PGDH阻害剤処理およびEP4受容体アンタゴニスト処理の研究のために、本発明者らは、1〜200ng/mlのプロスタグランジンE2（Cayman Chemical）（図面の凡例において特に指定のない限り、使用した標準濃度は10ng/mlであった）、および/または1μMのEP4アンタゴニスト（ONO-AE3-208, Cayman Chemical）、または1μMの15-PGDH阻害剤（SW033291, Cayman Chemical）を、コラーゲンコーティングシャーレで培養したMuSCに最初の24時間、添加した。次いで、細胞をトリプシン処理し、さらに6日間の培養のためにヒドロゲル上に細胞を再度播種した。全ての処理を、溶媒（DMSO）ビヒクル対照と比較した。除去済み血清アッセイのために、本発明者らは、単離MuSCを、DMEM/F10（50：50）、15％チャコール処理済みFBS（Gibco、カタログ番号12676011）、2.5ng ml-1 bFGFおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含有する培地に再懸濁した。図面に注釈がある場合、本発明者らは、除去済み血清細胞培地に1.5μg/mlのインスリン（Sigma, I0516）および0.25μMのデキサメタゾン（Sigma, D8893）を追加で加えた。これらの実験のために、MuSCをヒドロゲル上で培養し、培地交換毎（2日毎）に、ビヒクル（DMSO）または10ng/ml PGE2（Cayman Chemical）を培養物に添加した。7日後に、増殖（下記を参照のこと）をアッセイした。
【０４０３】
特に記載のない限り、本発明者らは、1週間の培養後に全てのMuSC培養アッセイおよび移植を実施した。老化MuSCの移植研究のために、本発明者らは、過去に記載の通りに3、MuSCに、伸長因子1aプロモーター駆動性luc-IRES-GFPをコードするレンチウイルス（GFP/lucウイルス）を培養下で24時間感染させた。EP4f/f MuSC研究のために、本発明者らは、上記（筋幹細胞単離）のようにMuSCを単離し、全ての細胞にGFP/lucウイルスを感染させ、それらの細胞の一部にpLM-CMV-R-Creをコードするレンチウイルス（mCherry/Creウイルス）を培養下で24時間同時感染させた。pLM-CMV-R-Creは、Michel Sadelainから贈与された（Addgeneプラスミド27546番）7。本発明者らは、老化MuSC（250個の細胞）またはEP4f/f MuSC（1,000個の細胞）を、NOD-SCIDレシピエントマウスの若い（2〜4ヶ月）18gy放射線照射TAに移植した。インビトロ増殖アッセイのために、感染後にEP4f/f MuSCをヒドロゲル上に播き、ビヒクル（DMSO）または10ng/ml PGE2で24時間処理し、3日後に増殖をアッセイした。感染の48時間後に、倒立型蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Microimaging）を使用して、細胞のGFPおよび/またはmCherryの発現をアッセイした。MuSCを、FACSによってマウスから新たに単離し、最長で1週間の期間にわたって培養下に置き、したがってマイコプラズマ汚染は評価しない。
【０４０４】
増殖アッセイ：増殖をアッセイするために、本発明者らは、3つの異なるアッセイ（血球計数器、VisionBlueおよびEdU）を使用した。それぞれについて、本発明者らは、平坦なヒドロゲル（血球計数器およびVisionBlue）またはコラーゲンコーティングプレート（EdUアッセイ）上に、MuSCを表面積1cm2当たり細胞500個の密度で播種した。血球計数器で細胞数を計数するために、本発明者らは、PBS中0.5％トリプシンと37℃で5分間インキュベーションすることによって指定の時点に細胞を採取し、血球計数器を使用して少なくとも3回それらを定量した。加えて、本発明者らは、培養時の細胞成長の読み出しとして、VisionBlue迅速細胞生存度蛍光アッセイキット（BioVision、カタログ番号K303）を使用した。簡潔に述べると、本発明者らは、MuSCを培養培地中10％ VisionBlueと3時間インキュベーションし、蛍光プレートリーダー（Infinite M1000 PRO, Tecan）上にてEx=530〜570nm、Em=590〜620nmで蛍光強度を測定した。本発明者らは、Click-iT EdU Alexa Fluor 555画像化キット（Life Technologies）を使用して増殖をアッセイした。簡潔に述べると、本発明者らは、固定前に、生細胞をEdU（20μM）と1時間インキュベーションし、抗ミオゲニン（Santa Cruz、カタログ番号sc576、1：250）と一緒に製造業者のガイドラインに従って核を染色して、分化をアッセイした。本発明者らは、DAPI（Invitrogen）を用いて核を対比染色した。本発明者らは、Plan NeoFluar 10×/0.30NAまたは20×/0.75NA対物レンズ（Carl Zeiss）を備えたAxioPlan2落射蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Microimaging）およびSlideBook（3i）ソフトウェアによって管理されるORCA-ERデジタルカメラ（Hamamatsu Photonics）を用いて、画像を取得した。本発明者らは、MetaMorph画像解析ソフトウェア（Molecular Devices）を使用してEdU陽性細胞を定量した。データ解析は盲検化され、この場合、細胞のスコア付けを実施する調査員は、解析される試料群に与えられた処理条件を知らなかった。
【０４０５】
クローン筋幹細胞増殖および運命解析：本発明者らは、過去に記載の通りに5,6、低速度撮影顕微鏡検査によってクローン筋幹細胞増殖をアッセイした。簡潔に述べると、本発明者らは、単離した老化MuSCをPGE2（Cayman Chemical）またはビヒクル（DMSO）で24時間処理した。ヒドロゲル上で5日間成長させた後、細胞を、直径600μmのヒドロゲルマイクロウェル中に表面積1cm2当たり細胞500個の密度で再度播種した。低速度撮影顕微鏡検査のために、本発明者らは、単一細胞を含むウェルについて播種後12時間（0日）から始めて2日目まで細胞増殖をモニタリングし、個別仕様の環境制御チャンバーおよび電動式載物台を備えたPALM/AxioObserver Z1システム（Carl Zeiss MicroImaging）を使用して倍率10倍で3分毎に画像を記録した。本発明者らは、取得時間間隔の間に1日おきに培地を交換した。本発明者らは、細胞トラッキングおよび系統復元用のバクスターアルゴリズムを使用して一連の低速度撮影画像を解析して、単一細胞を特定および追跡し、系統樹を作成した5,6,8-10。
【０４０６】
生存細胞および死細胞を、それぞれ位相差の境界および運動性の維持または喪失に基づいて、一連の低速度撮影で区別した。本発明者らは、2つの条件における増殖（分裂）および死滅の速度が、時間と共に変動することを見いだした。それ故、本発明者らは、1回目の24時間間隔の速度と2回目の24時間間隔の速度を別々に推定した。この値は、6に記載されている式を使用して推定し、表1に示した。本発明者らは、2つの間隔における増殖速度p24およびp48ならびに対応する死滅速度d24およびd48を示す。例として、2回目の24時間間隔の間の処理条件における増殖速度は、5.38％/時間である。表1（下記）は、2つの条件における増殖および死滅の速度が、1回目の時間間隔では類似していること、そして、実験終了時の細胞数の差が、2回目の時間間隔の間の分裂速度と死滅速度の両方の差に起因することを示している。2つの時間間隔でのモデル化された細胞数は、以下の式によって与えられる。
2020523409.tif 000049
式中、c0は、開始時の細胞数である。実際の細胞カウントと併せてモデル化曲線を図8Fにプロットする。
【０４０７】
（表１）時間当たりの推定の増殖速度および死滅速度
2020523409.tif 000050
【０４０８】
データ解析は盲検化された。画像取得およびスコア付けを実施する調査員は、解析される試料群に与えられた処理条件を知らなかった。
【０４０９】
定量的RT-PCR：本発明者らは、RNeasy Micro Kit（Qiagen）を使用してMuSCからRNAを単離した。筋肉試料について、本発明者らは、組織を液体窒素中で急速凍結し、乳鉢および乳棒を使用して組織をホモジナイズし、続いてシリンジおよび針で粉砕し、次いでトリゾール（Invitrogen）を使用してRNAを単離した。本発明者らは、SensiFAST（商標）cDNA合成キット（Bioline）を使用して、各試料に由来する全mRNAからcDNAを逆転写した。本発明者らは、cDNAを、ABI 7900HTリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）によるSYBR Green PCRマスターミックス（Applied Biosystems）またはTaqMan Assays（Applied Biosystems）を使用したRT-PCRに供した。本発明者らは、95℃で10分間、次いで95℃で15秒および60℃で1分のサイクルを40回、試料をサイクルさせた。相対転写物レベルを定量するために、本発明者らは、2-ΔΔCtを使用して処理試料と未処理試料を比較し、その結果をGapdhと比べて表した。SYBR Green qRT-PCRのために、本発明者らは、以下のプライマー配列を使用した：
2020523409.tif 000051
TaqMan Assays（Applied Biosystems）を、TaqManユニバーサルPCRマスターミックス試薬キット（Applied Biosystems）と共に使用して、製造業者の取扱い説明書に従って、試料中のPax7、ミオゲニン、Slco2a1（PGT）、Ptger3およびPtger4を定量した。転写物レベルは、Gapdhレベルと比べて表した。SYBR Green qPCRの場合、Gapdh qPCRを使用して、インプットcDNA試料を正規化した。Taqman qPCRの場合、マルチプレックスqPCRによって、標的シグナル（FAM）を内部Gapdhシグナル（VIC）によって個別に正規化することができた。
【０４１０】
PGE2 ELISA：筋肉を採取し、インドメタシン（5.6μg/ml）を含有する氷冷PBS中ですすぎ、液体窒素中で急速凍結した。凍結した試料を液体窒素中で微粉砕した。この粉末を、500μlの溶解緩衝液（50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、4mM CaCl、1.5％ Triton X-100、プロテアーゼインヒビターおよび小球菌ヌクレアーゼ）を含むエッペンドルフチューブに移し、次いで、組織ホモジナイザーを使用してホモジナイズした。上清のPGE2レベルをPGE2 ELISAキット（R&D Systems、カタログ番号KGE004B）を使用して測定し、BCAアッセイ（BioRad）によって測定したタンパク質総量と比べて表し、PGE2のngとして表した。各試料を、2連で、2回の独立した実験のそれぞれでアッセイした。
【０４１１】
cAMP活性アッセイ：MuSCを、DMSO（ビヒクル）またはPGE2（10ng/ml）で1時間処理し、製造業者（Promega）によって最適化されたcAMP-Gloアッセイプロトコルに従って環状AMPレベルを測定した。各試料を、3連で、2回の独立した実験でアッセイした。
【０４１２】
フローサイトメトリー：本発明者らは、ヒドロゲル上で7日間培養した後のMuSCについて、ビヒクル（DMSO）またはPGE2（10ng/ml）による最初の短期的（24時間）処理後に、アポトーシスの読み出しとしてアネキシンVをアッセイした。本発明者らは、FITCアネキシンVアポトーシス検出キット（Biolegend、カタログ番号640914）を製造業者のプロトコルに従って使用した。本発明者らは、NIH S10共用機器助成金（S10RR027431-01）を使用して購入した共用FACS施設内のFACSDivaソフトウェア（BD Biosciences）を使用したFACS LSR IIサイトメーターで、細胞のアネキシンVを解析した。
【０４１３】
質量分析法-分析物：全てのプロスタグランジン標準物質（PGF2α；PGE2；PGD2；15-ケトPGE2；13,14-ジヒドロ15-ケトPGE2；PGE2-D4；およびPGF2α-D9）をCayman Chemicalから購入した。PGE2-D4内部標準の場合、3位および4位を合計4個の重水素原子で標識した。PGF2α-D9の場合、17位、18位、19位および20位を合計9個の重水素原子で標識した。
【０４１４】
較正曲線の作成：分析物原液（5mg/mL）をDMSO中で調製した。これらの原液をアセトニトリル/水（1：1 v/v）で段階希釈し、一連の標準使用液を得て、これらを使用して較正曲線を作った。10uLの各標準使用液を200μLのホモジナイゼーション緩衝液（アセトン/水 1：1 v/v；酸化防止のための0.005％ BHT）に添加し、続いて10uLの内部標準溶液（3000ng/mL、それぞれPGF2α-D9およびPGE2-D4）を加えることによって、較正曲線を作成した。較正曲線は、各試料セットを用いて新しく作成した。較正曲線の範囲：PGE2および13,14-ジヒドロ15-ケトPGE2の場合、0.05ng/mL〜500ng/mL；PGD2およびPGF2αの場合、0.1ng/mL〜500ng/mL；ならびに15-ケトPGE2の場合、0.025ng/mL〜500ng/mL。
【０４１５】
抽出手順：抽出手順は、Prasainら11の手順から改変され、アセトンタンパク質沈殿とそれに続く2段階液液抽出を含めた；後者の段階は、LC-MS/MSの感度を高める。ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）および窒素（N2）ガス下での蒸発を使用して、酸化を防止した。
【０４１６】
固形組織を採取し、計量し、液体窒素を用いて急速凍結した。筋組織を、ポリプロピレンチューブ中でホモジナイゼーションビーズおよび200μLのホモジナイゼーション緩衝液と混合し、FastPrep 24ホモジナイザー（MP Biomedicals）内で速度6m/sで40秒間処理した。ホモジナイゼーション後、10μlの内部標準溶液（3000ng/mL）を組織ホモジネートに加え、続いて、超音波処理し、10分間振盪した。試料を遠心分離し、上清を清潔なエッペンドルフチューブに移した。200μLのヘキサンを試料に加え、続いて15分間振盪し、次いで遠心分離した。試料を-80℃で40分間凍結した。凍結した下側の水層からヘキサン層を流し出し、廃棄した。融解後、25μLの1Nギ酸を下側の水層に加え、試料をボルテックスした。2回目の抽出のために、200μLのクロロホルムを水相に加えた。試料を15分間振盪して、完全に抽出されるようにした。遠心分離を実施して、これらの層を分離させた。下側のクロロホルム層を新しいエッペンドルフチューブに移し、窒素下40℃で蒸発乾固させた。乾燥残留物を100μLのアセトニトリル/10mM酢酸アンモニウム（2：8 v/v）中で再構成し、LC-MS/MSによって解析した。
【０４１７】
LC-MS/MS：多くのプロスタグランジンは、同一の質量を有する位置異性体であり、類似の断片化パターンを有するため、クロマトグラフィー分離が極めて重要である。2つのSRMトランジション（1つはクオンティフィア、1つはクオリフィア）を分析物毎に慎重に選択した。標的分析物の認証には、特有のクオリフィアイオン強度比および保持時間が不可欠であった。解析は全て、LC-20ADXRプロミネンス液体クロマトグラフおよび8030三連四重極型質量分析計（Shimadzu）を使用したネガティブエレクトロスプレーLC-MS/MSによって行った。HPLC条件：Acquity UPLC BEH C18 2.1×100mm、粒径1.7umのカラムを、50℃にて、流速0.25mL/分で作動させた。移動相は、A：0.1％酢酸水溶液およびB：アセトニトリル中0.1％酢酸から構成した。溶離プロファイル：最初に、35％ Bで5分間保持し、続いて、3分間で35％〜40％まで、次いで3分間で40％〜95％までの勾配；合計実行時間は14分であった。注入容量は20uLであった。これらのHPLC条件を使用して、本発明者らは、関心対象の分析物のベースライン分離を実現した。
【０４１８】
選択的反応モニタリング（SRM）を定量に使用した。質量トランジションは次の通りであった：PGD2：m/z351.10→m/z315.15（クオンティフィア）およびm/z351.10→m/z233.05（クオリフィア）；PGE2：m/z351.10→m/z271.25（クオンティフィア）およびm/z351.10→m/z315.20（クオリフィア）；PGF2α：m/z353.10→m/z309.20（クオンティフィア）およびm/z353.10→m/z193.20（クオリフィア）；15ケト-PGE2：m/z349.30→m/z331.20（クオンティフィア）およびm/z349.30→m/z113.00（クオリフィア）；13,14-ジヒドロ15-ケトPGE2：m/z351.20→m/z333.30（クオンティフィア）およびm/z351.20→m/z113.05（クオリフィア）；PGE2-D4：m/z355.40→m/z275.20；ならびにPGF2α-D9：m/z362.20→m/z318.30。滞留時間は、20〜30ミリ秒であった。
【０４１９】
定量解析は、LabSolutions LCMS（Shimadzu）を使用して行った。内部標準法を定量に使用した：PGE2、15-ケトPGE2および13,14-ジヒドロ15-ケトPGE2の定量のための内部標準としてPGE2-D4を使用した。PGF2α-D9は、PGD2およびPGF2αの定量のための内部標準であった。1/X2（式中、Xは、濃度である）の加重係数を使用した濃度範囲にわたって、較正曲線は直線的（R>0.99）であった。逆算した標準濃度は、名目上の値から±15％であり、定量下限（LLOQ）では±20％であった。
【０４２０】
インビボ筋力測定：老齢マウス（18ヶ月）を、下り坂トレッドミルランに連続して2週間供した。1週目の間、マウスは、毎日5日間走り、6日目および7日目に休息した。1週目の間の各トレッドミルランの2時間後、各マウスの両脚由来の各（外側および内側）腓腹筋（GA）筋肉に、PBS（ビヒクル対照）または13nM dmPGE2（実験群）のいずれかを一用量注射した。2週目の間、マウスを5日間のトレッドミルランにのみ供した。Exer3/6（Columbus Instruments）を使用して、トレッドミルランを実施した。マウスは、下り勾配20°のトレッドミルを7メートル/分の速度で開始して10分間走った。3分後、速度を1メートル/分ずつ最終速度14メートル/分まで上げた。独立した対照老齢マウス群では、疲労状態（電気で刺激しても動物がトレッドミル上に留まることができない状態として定義される）が中央値12分で観察されたので、10分間の走行時間を選択した。力測定は、GA筋肉上、5週目に、過去に公開されたプロトコルに基づいたものであった5。簡潔に述べると、マウス毎に、切開部を作り、GAを露出させた。本発明者らは、無傷のアキレス腱を有する踵骨を切断し、腱-骨複合物を薄い金属フックを備えた300C-LR力変換器（Aurora Scientific）に取り付けた。食塩水（0.9％塩化ナトリウム）溶液で周期的に湿らすことによって、筋肉および腱を保湿した。脚への血流を損なわないようにしながら、下肢の膝から下を金属クランプによって固定した。力測定の手順全体を通してマウスを吸入麻酔（2％イソフルオラン）下に置き、加熱ランプによって体温を維持した。全ての測定において、本発明者らは、所定の最大上刺激電圧の0.1ミリ秒パルスを使用した。2mAの定電流（方形波幅0.1ミリ秒）を送る双極電気刺激カフを使用して、近位坐骨神経を介してGA筋肉を刺激した。単収縮力測定には単回0.1ミリ秒パルスで、強縮力測定には一連の150Hzの0.3秒パルスで、GA筋肉を刺激した。本発明者らは、5回の単収縮測定、次いで5回の強縮測定を筋肉毎に実施し、各測定間の回復を2〜3分とし、1群当たりマウスをn=5匹とした。PCI-6251取得カード（National Instruments）を用いてデータを収集し、Matlabで解析した。本発明者らは、生理学的筋横断面積（PCSA）によって力測定を正規化することによって、比力価を算出し、これは、対照群と実験PGE2処理群との間で類似していた（表2）。PCSA（mm2単位で測定）を以下の式12に従って算出した：
PCSA（mm2）=[質量（g）×Cos θ]÷[ρ（g/mm3）×線維長（mm）]
式中、θは線維の羽状角であり、ρは筋肉密度（0.001056g/mm3）である。
【０４２１】
統計解析：本発明者らは、各々に3つの生物学的レプリケートをプールした少なくとも3回の独立した実験で細胞培養実験を実施した。一般に、本発明者らは、MuSC移植実験を少なくとも2回の独立した実験で実施し、ここで、移植片は、1条件当たり少なくとも合計3〜5個とした。本発明者らは、対応のあるt検定を実験に対して使用し、ここで、対照試料は、インビトロの同じ実験由来とするかまたはインビボの反対側の肢筋由来とした。ノンパラメトリックなマンホイットニー検定を使用して、未処理群（-）と処理群（PGEまたはdmPGE2）と間の有意差をα=0.05を使用して判定した。多重比較にANOVAまたは多重t検定を実施し、図面の凡例に示す通りボンフェローニ補正を使用してまたはフィッシャーの検定で有意レベルを決定した。特に記載のない限り、データを平均±s.e.m.として示す。
【０４２２】
方法の参考文献：
2020523409.tif 000052
【０４２３】
（表２）運動後5週目の老化腓腹筋の生理学的横断面積（PCSA）
2020523409.tif 000053
【０４２４】
実施例2：プロスタグランジンE2（PGE2）注射後の筋力の増加
本実施例は、PGE2を注射した老齢マウスにおける腓腹筋の比単収縮力の増加を示す。老齢マウス（18ヶ月齢）をトレッドミルランに疲労状態まで毎日10日間供した。Exer3/6（Columbus Instruments）を使用して、トレッドミルランを実施した。マウスは、下り勾配20°のトレッドミルを10メートル/分の速度で開始して走った。3分後、速度を1メートル/分ずつ最終速度20メートル/分まで上げた。疲労状態を、電気で刺激しても動物がトレッドミル上に留まることができない状態として定義した。各トレッドミルランの2時間後、各マウスの両方の腓腹筋に、PBS（対照群）または3nM PGE2（実験群）のいずれかを注射した。最後のトレッドミルランの4週間後に、300C-LR力変換器（Aurora Scientific）を使用して、所定の最大上刺激強度の単回0.1ミリ秒パルスで力測定を実施した。
【０４２５】
単一腓腹筋の代表的な未加工の筋力トレースを図5M〜5Nに提供する。筋力および同期パルスをPCI-6251取得カード（National Instruments）を介して記録し、Matlabを使用して解析した。図5O〜5Pは、生理学的筋横断面積で力測定を正規化することによって算出した比筋力価を示す。比単収縮力価（kN/m2）を、最小値、最大値および中央値を示す箱ひげ図によって表す。各筋肉から5回の反復測定を行った。対照群の場合N=4およびPGE2注射群の場合n=5。**は、両側マンホイットニー検定による統計的に有意な値p<0.005を表す。
【０４２６】
図5Qおよび5Rは、それぞれ、マウスをPGE2またはビヒクルのみで処理した別個の実験からの単収縮力および強縮力データを示す。重要なことに、本発明者らは、PGE2を注射して下り坂トレッドミル運動に供した老齢（18〜22ヶ月）マウスにおいて等尺性筋力の増加を観察した。簡潔に述べると、老齢マウスは、毎日（20°の下り勾配で、14メートル/分の最大速度で10分間）5日間走り、6日目および7日目に休息した。この偏心運動レジームは、筋肉の変性および再生のサイクルに起因してMuSC増大をもたらす。1週目の間の各トレッドミルランの2時間後、各マウスの両脚のTA筋肉に、PBS（ビヒクル対照群）または10μgのPGE2（実験群）のいずれかを注射した。2週目の間、マウスを5日間のトレッドミルランにのみ供した。本発明者らの過去に公開したプロトコルを使用して、5週目にTA筋肉上で力測定（単収縮および強縮）を実施した。PGE2処理群は、対照群と比較して有意な力の増加を示した。
【０４２７】
実施例3：プロスタグランジンE2は、効果的な骨格筋幹細胞機能に不可欠であり、再生および強度を増強する
骨格筋は、一生を通じて組織再生可能な静止筋特異的幹細胞（MuSC）を保有する。筋肉傷害は、プロスタグランジンを含めた、多様な細胞タイプ、サイトカインおよび成長因子が関与する複雑な炎症応答を引き起こす。ここで、本発明者らは、プロスタグランジンE2（PGE2）がEP4受容体を介してMuSCを直接標的化し、MuSC増大をもたらすことを示す。PGE2による短期的処理は、内因性MuSCによる筋再生も移植MuSCによる筋再生も頑強に増強するのに十分である。MuSCにおけるEP4受容体の特異的遺伝的除去によるPGE2シグナル伝達の喪失は、再生を害し、筋力低下をもたらす。傷害直後のNSAID投与を通じたPGE2産生の阻害も、同様に再生を遅らせ、筋力を損なう。機構的には、PGE2 EP4相互作用は、増殖誘導性転写因子Nurr1を活性化する環状AMP/ホスホCREB経路を誘発することによって、MuSC増大を引き起こす。本発明者らの知見は、傷害からの回復過程でのMuSCへのPGE2シグナル伝達の喪失が、筋肉の修復および強度を妨げることを明らかにする。そのような機能獲得型または機能喪失型の実験を通じて、本発明者らは、PGE2シグナル伝達が、筋幹細胞機能のレオスタットとして作用することを見いだした。NSAIDに起因するPGE2シグナル伝達の減少または外因性送達に起因するPGE2の増加は、再生の結果を左右するMuSC機能に影響する。PGE2の筋肉内送達後の損傷を受けた筋肉の顕著に増強および加速された修復は、この治療用物質の新しい適応を示唆している。
【０４２８】
傷害後の筋肉修復は、効果的な再生を統合する免疫応答を伴う。ここで、本発明者らは、プロスタグランジンE2（PGE2）を、筋再生の構成要素である筋幹細胞（MuSC）の重要な炎症性メディエーターとして特定する。PGE2は、傷害に応答して、合成され、幹細胞ニッチ内に分泌されて、筋線維修復の鍵である頑強なMuSC増殖をもたらす。EP4は、MuSCにおいてPGE2シグナル伝達を媒介する受容体であり、そして、MuSCにおいてEP4を欠く遺伝子操作されたマウスは、再生不全を有する。筋肉傷害後の疼痛を処置するために通常使用される非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）は、PGE2合成を阻害し、筋再生を遅らせ、筋肉を衰弱させる。重要なことに、傷害を受けた筋肉のPGE2による単回処理は、筋肉修復および強度の回復を劇的に加速させる。
【０４２９】
筋幹細胞（MuSC）としても知られている衛星細胞は、筋再生に極めて重要である。これらは、筋組織中の筋線維に並置されたニッチに静止状態で存在し、一生を通じて骨格筋の損傷および修復に対応する態勢ができている（1〜4）。筋肉傷害は、好中球、単球、マクロファージ、T細胞および線維脂肪細胞を含めた複数の細胞タイプの連続炎症を特徴とした、筋幹細胞活性化を伴う、炎症応答を引き起こす。この炎症期の間、CC-ケモカインリガンド2（CCL2）、IL-10、IL-1β、腫瘍壊死因子-α（TNFα）、形質転換成長因子-β1（TGFβ1）を含めたサイトカインおよび成長因子の放出が同時に起こる（3、5〜10）。加えて、炎症の強力な脂質メディエーターであるプロスタグランジンは、免疫細胞および筋原細胞によって合成および分泌される（6、11）。プロスタグランジンは、アラキドン酸に由来し、これは、ホスホリパーゼA2によって膜リン脂質から放出され、シクロオキシゲナーゼ酵素（COX-1およびCOX-2）によってプロスタグランジンH2（PGH2）へ、その後、異なるプロスタグランジンサブタイプPGD2、PGE2、PGF2α、PGI2またはトロンボキサン（TXA2）へと変換される。プロスタグランジン合成酵素（PGES：mPGES-1、mPGES-2およびcPGES）がPGE2の生成に特異的である（11〜13）。
【０４３０】
PGE2は、筋再生と関連しているが、筋再生および強度に対して直接的な有益効果を有するとは、本発明の発明者らによってこの有益性が発見されるまで知られていなかった。相反する報告が、PGE2は、培養下で筋芽細胞の増殖も分化も促進できることを示唆している（14〜18）。PGE2を欠いているCOX2ノックアウトマウスモデルでは、再生は遅延される。しかしながら、これらの研究では、COX2の全身の構成的喪失と結果として起こる多くの細胞タイプに対する非特異的効果が原因で、PGE2が作用する機構は確立され得なかった（15、19）。同様に、傷害後の筋肉回復は、COX-2阻害剤が与えられたマウスにおいて害された（15）。加えて、COX1およびCOX2の阻害を通じてプロスタグランジンの産生を遮断する非ステロイド系抗炎症薬（NSAID）で処理したマウスは、再生欠如を示した（20、21）。さらに、NSAIDSは、生検においてヒト衛星細胞の運動誘発性の増大を減弱させる（20）。同じように、ホスホリパーゼA2、COX-2およびmPGES-1の発現を抑制することによってプロスタグランジン合成を低下させる糖質コルチコイドは、多発性筋炎患者において筋力の回復に悪影響を及ぼす（22）。しかしながら、NSAIDおよび糖質コルチコイドの標的はCOX酵素であるので、この効果は、PGE2に加えて多数のプロスタグランジンサブタイプを伴い、それ故、多面的な効果を有し得る。したがって、これまで、PGE2の筋再生における時空間的な効果は未解決のままである。さらに、PGE2の合成および活性の阻害は、筋機能の回復にとって有害であることが示されたが、ここで言及される研究は、PGE2の投与が筋再生および筋機能の回復に直接有益であるとのいかなる示唆も提供していない。
【０４３１】
本発明者らは、傷害に応答して、PGE2が筋組織において一時的に誘導されることを発見した。PGE2が、筋再生の構成要素であるMuSCに直接作用するかどうかを立証するために、、本発明者らは、PGE2受容体EP4がMuSCにおいて条件的に切断され得るマウスを生成した。加えて、本発明者らは、再生に対するMuSCの寄与を、PGE2送達後に生物発光イメージングによって経時的に動的かつ高感度に特異的に追跡できる、トランスジェニックレポーターマウスを確立した。本発明者らは、これらのモデルを筋力のアッセイと組み合わせたところ、力の回復をもたらす、PGE2に応答するMuSCの能力と再生との間の直接的関連を見いだした。機能獲得型および機能喪失型の実験は、PGE2シグナル伝達が筋幹細胞機能のレオスタットとして作用することを明らかにした。本発明者らは、PGE2は傷害後に通常合成されるが、PGE2レベルが正常な内因性レベルを超えて一時的に増加することによって再生が増強されるとの証拠を提供する。本発明者らのデータは、PGE2が再生に影響を及ぼし、治療用途を有することを示す。
【０４３２】
損傷を受けた筋組織におけるPGE2の急増は、MuSC増殖を加速させる：本発明者らは、筋再生を媒介する炎症応答を利用することによって、MuSC機能の活性化因子を特定しようと努めた。筋肉傷害は、即時炎症応答を誘発するので（5、7、8、23）、本発明者らは、一時的に誘導された炎症調節因子が、MuSC機能を調節し、かつ、再生において重要な役割を果たし得るという仮説を立てた。本発明者らは、筋組織を解離させた後に蛍光活性化細胞選別（FACS）することによって得られた単離MuSCに対して、qRT-PCRを実施し、急性炎症中の強力な脂質メディエーター（11）であるPGE2に対するPtger4受容体（EP4）のレベルの増加を検出した（図12A）。受容体発現に従って、本発明者らは、ノテキシン注射または寒冷傷害を伴う標準パラダイムによる傷害の3日後に、マウスの筋肉溶解物においてPGE2レベルの急増を検出した（図12B、12Cおよび18A）。その合成酵素PtgesおよびPtges2の同時に起こる一時的なアップレギュレーションも検出された（図12D）。内皮細胞、炎症性細胞およびFAPなどの筋肉内の他の細胞タイプも傷害に応答してPGE2を産生し得るが、MuSCを囲む筋線維が、解離させた筋線維由来の条件培地において観察されたように、PGE2の供給源である（図12E）。さらに、COX2を阻害するNSAIDであるインドメタシンで筋線維を処理すると、PGE2合成は顕著に減少する（図12E）。PGE2レベルのピークが、MuSCの増大ならびに詳細に記録が残された傷害後のTGFβ1、CCL2、IL-10、IL-1βおよびTNFαなどの炎症性サイトカインの蓄積と時間的に同時に起こり、そこで、MuSCの活性化および増大が起こる（3、5、7、8）。PGE2は、これまで炎症性の損傷応答に関与しているとされてきたが、PGE2が筋再生において作用する細胞分子機構はまだ解明されていない。
【０４３３】
PGE2がMuSC増大に対して直接的な効果を有するかどうかを判定するために、本発明者らは、培養中PGE2（10ng/ml）で処理したFACS単離MuSC（24）の増殖能を評価した。PGE2のこの濃度は、頑強なMuSC増殖応答を促進する最低薬物濃度を解明する用量応答アッセイに基づいて決定された（図18B）。本発明者らは、培養中のPGE2への1日曝露が、1週間後、対照と比べてMuSC数の6倍増加を誘導したことを見いだした（図12F）。PGE2処理後のこの細胞分裂の増加はまた、EdU取り込みによっても明白であった（図18Cおよび18D）。プロスタグランジンを含む脂質成分が枯渇されたチャコール処理済み血清を含む培地中でのMuSCの培養（25）は、細胞増殖を顕著に妨げた。PGE2の添加は、この増殖の遮断をレスキューした（図18E）。注目すべきことに、新たに単離されたMuSCは、比較的高いレベルのEP4受容体mRNAを発現したが、細胞が培養中にさらに分化を増した筋細胞を生じるにつれて、発現は無視できるほどのレベルまで徐々に減退した。この結果は、MuSCが、PGE2に最も応答性の筋原細胞タイプであることを示唆している（図12A）。本発明者らは、過去に記載の通りに（26、27）、ヒドロゲル「マイクロウェル」プラットフォームでの低速度撮影顕微鏡分析によって個々のMuSCを追跡することによって、PGE2の効果を単一細胞レベルでさらに分析した（図12G〜Kおよび18F〜H）。クローンアッセイは、全体としての集団の解析では隠れている違いを明らかにすることができる。38時間の期間にわたってデータを集め、次いで、細胞トラッキングおよび系統復元用のバクスターアルゴリズムを使用して解析した（26〜28）。本発明者らは、最も頑強なクローンの場合に6世代にわたる、PGE2に応答した累積細胞分裂および細胞数の顕著な増加を観察した（図12Gおよび12H）。PGE2処理細胞とビヒクル処理対照との間の差の根拠は、播いた後のPGE2添加直後に、その後の増大増加の原因である有糸分裂の開始が加速されるかにある（図12I、12J、18Gおよび18H）。両条件におけるその後の細胞の指数関数的増加は、発生時の差を激化させ、38時間の期間の最後に総細胞数がほぼ2倍に達する（図18Gおよび18H）。PGE2処理後に観察されたより大きな細胞サイズの出現の増加が同時に起こることは（図12K）、有糸分裂事象におけるその役割を支持している（29）。
【０４３４】
PGE2処理は、筋再生を増強する：PGE2が再生においてMuSCの機能に影響を及ぼしたかどうかを判定するために、本発明者らは、インビボ実験を実施した。再生の経時的な動力学を定量的にモニタリングするために、本発明者らは、移植後のMuSC機能をモニタリングするため本発明者らが過去に開発した高感度で定量的な生物発光イメージング（BLI）アッセイを利用した（24、26、27、30）。GFPとルシフェラーゼの両方を発現するトランスジェニックマウス（GFP/Lucマウス）からMuSCを単離し、等しい数のMuSC（250個の細胞）をPGE2またはビヒクルのみのいずれかと、NOD-SCIDガンマ（NSG）マウスの傷害を受けたTAに同時注射した。PGE2同時注射は、BLIによって評価したところ、MuSCの再生能を対照と比較して2桁近く増強させた。組織学的解析は、ニッチ中へのGFP+ MuSCの生着と、時間の経過と共に融合から生じるGFP+線維を明らかにする（図13A、19Aおよび19B）。さらに、生着後に、二次傷害が、対照と比べたPGE2処理MuSCのBLIシグナルの急上昇を引き起こしたが、このことは、増強された幹細胞再増殖を示唆している（図13A）。注目すべきことに、PGE2は、比較的短いインビボ半減期を有することが知られている（31）。したがって、これらの実験は、傷害を受けた筋肉への同時送達時にMuSCをPGE2に一時的に曝露させることが、筋再生を有意に増強するのに十分であることを実証している。
【０４３５】
本発明者らは、PGE2の送達だけで、内因性MuSC数を増加させて再生を増強し、それによって細胞治療薬の必要性を回避できると想定した。本発明者らは、傷害直後の早期時間域の間に送達されるPGE2が、本来備わった炎症応答およびPGE2急増の有益な効果を増強できると判断した。この可能性を調査するために、若齢マウスの筋肉を傷つけ、3日後、本発明者らは大量のPGE2を注射した（図13B）。本発明者らは、傷害の14日後に、基底膜の下および筋線維の上の典型的な衛星細胞ニッチ中に内因性PAX7発現MuSCの著しい増加（65±7％）を観察した（図13Bおよび13C）。組織損傷のない場合にはビヒクル注射対照と違いがないことが観察されたので、PGE2は、傷害後にのみ効果的である（データ示さず）。断面積として評価された筋線維の分布のより小さなサイズからより大きなサイズへの著しいシフトが、再生の時間の経過と共に明らかとなった（図13D、13E、19Aおよび19B）。筋肉質量がこの期間中に増加しなかったので、この変化は、観察された再生の加速に伴って起こる筋線維構造のリモデリングを反映している（図19C）。加えて、本発明者らは、トランスジェニックマウスモデルPax7CreERT2；Rosa26-LSL-Lucを使用して、傷害およびPGE2に対する内因性MuSCの応答をルシフェラーゼ発現によって追跡した（図13Fおよび13G）。BLIデータは、組織学的データと合致していた（図13Bおよび13C）。傷害後のPGE2の単回注射が、内因性MuSC数および再生機能を強化して、この加速された再生度をもたらすのに十分であったことは、全く予想外なことであった。
【０４３６】
EP4受容体は、PGE2シグナル伝達を媒介して、MuSCの増殖および生着を促進する：PGE2は、4種のGタンパク質共役型受容体（Ptger1〜4；EP1〜4）を通じてシグナル伝達することが知られているが（6、11）、MuSCにおけるこれらの受容体の発現は、これまで報告されていない。異なる受容体（Ptger1〜4）の転写物レベルの解析は、PGE2処理の24時間後、MuSCにおいて最も高度に発現される受容体がPtger4であることを明らかにした（図14A）。PGE2で処理されたMuSCは、EP4シグナル伝達に関連する応答である（11）、下流の細胞内環状AMP（cAMP）レベルの上昇を示し（図14B）、EP4アンタゴニストであるONO-AE3-208の存在下では、PGE2によって誘導される増殖応答の増加が鈍化した（図14C）。このデータは、PGE2がEP4を通じてシグナル伝達して増殖を促進することを裏付けている。EP4に対するPGE2の特異性は、EP4f/fマウスから単離されたMuSCにおけるEP4のcre媒介性の条件的切断後の該受容体を欠いているMuSCの増殖の顕著な低下によって最も明らかに示された（図14Dおよび20A〜D）。PGE2に対する増殖応答に必要なEP4の要件は、Cre媒介性EP4切断がMuSC特異的Pax7プロモーターの制御下にあるPax7CreERT2：EP4f/fマウスから単離されたMuSCを、タモキシフェンで処理することによって確認された（図20Eおよび20F）。注目すべきことに、EP1受容体、EP2受容体およびEP3受容体（Ptger1〜3）の発現がMuSCにおいて低いままであるので、他のPGE2受容体による補償は、EP4を欠いているMuSCにおいて起こらない（図20G）。まとめると、これらのデータは、PGE2およびその受容体EP4がMuSC増殖にとって極めて重要であることを示す。EP4がインビボでMuSC機能において役割を果たしているかどうかを判定するために、本発明者らは、培養下の条件的切断後のEP4受容体を欠いているルシフェラーゼ発現MuSCを、NSGマウスの傷害を受けたTAに移植した。最初に検出されたBLIシグナルは、有意性の閾値を下回るレベルまで徐々に減退した（図14Eおよび20A〜D）。したがって、EP4受容体を介したPGE2シグナル伝達がなければ、再生は害される。
【０４３７】
転写因子Nurr1は、MuSCにおけるPGE2/EP4シグナル伝達の下流メディエーターである：増強されたMuSC機能の効果を媒介するPGE2のシグナル伝達下流のメディエーターについて公正な研究を実施するために、本発明者らは、RNAシーケンス解析を実施して、ビヒクル（対照）またはPGE2で24時間処理した単離MuSCを比較した（図21A）。Ingenuity Pathway Analysis（IPA）およびMetacoreソフトウェアパッケージを使用したバイオインフォマティクス解析は、PGE2代謝の調節因子に加えて、MuSCのPGE2処理が、cAMPシグナル伝達および細胞周期調節を含めた幹細胞増大と一致する分子および細胞機能の増加をもたらしたことを明らかにした（図21Bおよび21C）。調整されていないp値<0.05を有する上位200個の発現変動遺伝子の中で、わずか11個の転写因子が特定された（図15A）。Nurr1は、発現変動された少数のうちの1つであった。Nurr1はまた、過去に、cAMPおよびホスホ-CREBを通じてPGE2シグナル伝達を媒介して、結直腸がんおよび神経細胞において細胞増殖を誘導すると示された（32、33）。MuSCにおけるEP4シグナル伝達の下流エフェクターとしてのその推定の役割を調査するために、本発明者らは、そのインビボ発現を調べた。注目すべきことに、Nurr1発現の時間域は、筋組織におけるPGE2のものとよく似ており、傷害後3日目にピークに達した（図15Bおよび12B）。培養中、PGE2処理は、Nurr1 mRNAおよびタンパク質の発現を増加させ（図15Cおよび15D）、そして、Nurr1ノックダウンは、MuSC増殖を誘導する際のPGE2の効果を鈍化させた（図4Eおよび21D）。PGE2媒介性のEP4受容体シグナル伝達に対するNurr1転写調節の特異性を判定するために、本発明者らは、Pax7CreERT2：EP4f/f MuSCにおいてタモキシフェン処理によってEP4受容体を切断した（図21E）。Nurr1は、EP4ノックアウトMuSCにおいてPGE2処理後にアップレギュレーションされなかった（図15F）。Nurr1の発現は、MuSCにおいて最も高く、EP4の発現パターンに従って筋原細胞の分化の発生時に減退した（図15G）。まとめると、これらのデータは、Nurr1転写因子を、MuSC増大を引き起こすPGE2/EP4シグナル伝達のメディエーターとして暗示する。
【０４３８】
PGE2シグナル伝達の喪失は、筋再生および強度を損なう：EP4がインビボでの再生に必要であるかどうかを判定するために、本発明者らは、マウスへの連続腹腔内タモキシフェン注射によってMuSCにおいてEP4が特異的かつ条件的に切断される、Pax7CreERT2：EP4f/fマウスモデルを使用した（図16A）。EP4切断の誘導は、タモキシフェン処理および傷害後のインビボのPax7+細胞において非常に有効であった。選別されたMuSCにおいて検出されたPtger4 mRNAレベルは、対照よりも96％低かった（図16Aおよび16B）。MuSCにおいてEP4シグナル伝達がない場合、本発明者らは、傷害後7日目に、胚性ミオシン重鎖（eMyHC）を発現する未熟な中央に核を有する再生筋線維の異常な持続性を観察した（図16Cおよび16E）。この再生不全の証拠は、傷害後21日目に筋線維断面積が対照と比べて減少した筋線維へのシフトによって確認された（図16Dおよび16E）。これらの実験では、PGE2は、成熟筋線維、線維脂肪生成前駆細胞（FAP）および免疫細胞などの再生過程にある筋組織中の他の細胞タイプに対して作用することができる；しかしながら、これらの細胞は、EP4が欠損したMuSC機能を回復させるのに十分ではなかった。これらの特徴は、EP4シグナル伝達がなければ効果的な筋再生が妨げられるという有力な証拠を提供する。
【０４３９】
本発明者らは、MuSCにおけるEP4の特異的な喪失から生じる筋肉修復の欠陥が、筋力に影響を及ぼしたかどうかをさらに調査した。驚くことに、MuSC上のEP4を通じたシグナル伝達を排除するだけで、筋肉質量の明らかな喪失なしに（図22A）、単収縮力および強縮力をそれぞれ35±6％および31±4％減少させた（図16F〜H）。PGE2の不在が傷害後の筋再生および強度を変化させたかどうかを判定するために、本発明者らは、マウスを非ステロイド系抗炎症薬（NSAID、インドメタシン）による処理に供した。傷害の3日後のPax7CreERT2；Rosa26-LSL-LucマウスモデルのTA筋肉への単回インドメタシン注射は、筋幹細胞の増大および再生の障害の指標となる、対照と比べたBLIの減退をもたらした（図16Iおよび16J）。NSAID処理後のこの再生能の喪失は、対照と比較して、単収縮力の33±7％の大幅な低下を伴った（図16K、16Lおよび22B）。筋肉全体のPGE2合成の阻害時に見られる強度の減少は、EP4特異的ノックアウトMuSCを有する筋肉の再生において観察されるものとよく似ていたが、このことは、PGE2が筋再生に及ぼす効果の大部分をMuSC増大が占めることを示唆している。
【０４４０】
本発明者らは、筋再生中のPGE2の主な作用は、MuSCを直接標的化することであることを発見した。PGE2は、傷害後の早期炎症応答に極めて重要である好中球、マスト細胞およびマクロファージに対して作用する免疫調節因子として暗示されてきた。続いて起こるサイトカインストームは、再生において筋幹細胞機能を誘導すると考えられている（3、6、7、11）。全てのプロスタグランジン合成が除去された全身COX2 KOマウスにおける研究は、この結論を支持した（15、19）。筋芽細胞は、培養時にPGE2に応答性である細胞タイプであると提唱されているが（14、16〜18、34、35）、これらの細胞は、再生において機能することが少なく（24）、観察される効果を説明することができない。さらに、PGE2が関わる他の再生研究は全て、多様な細胞タイプに対する多面的な影響の欠点を抱えている。
【０４４１】
MuSCは、発達および再生にとって極めて重要であり（1〜3、24、36〜38）、その数は、マウスおよびヒトにおいて筋肉を損傷する傷害に応答して劇的に増加する（5、20、39〜42）。傷害を受けた筋肉へのMuSCの注射は、その指数関数的増加をもたらす一方で、その筋芽細胞誘導体の注射は、結果として数を減少させることになり、これらの2種の細胞タイプの再生能に顕著な差異があることが明白である（24）。ここで、本発明者らは、筋再生中のPGE2の主な作用がMuSCに対するものであること、そして、この効果が直接的でありかつEP4受容体によって媒介されることを示す。注目すべきことに、EP4は、MuSC上に頑強に発現され、分化している筋芽細胞上では無視できるほどのレベルまで徐々に減少するが、このことは、PGE2に対して最も応答性の筋原細胞タイプがMuSCであることを示唆している。機構的には、一旦PGE2がEP4受容体と結合すると、それは、cAMPおよび下流の増殖誘導性転写因子Nurr1を活性化し、MuSC増殖の加速をもたらす（図17）。Nurr1は、腸管上皮細胞中の細胞周期阻害因子p21（Waf1/Cip1）を直接遮断することによって、腸管上皮細胞において増殖および再生の誘導と関連しているが（43）、幹細胞、特に筋幹細胞の増大におけるその役割は、これまで説明されていない。Nurr1がインビボのMuSC増殖の開始を媒介することをさらに立証する知見は、そのレベルが、PGE2の急増が観察とされると同時に、傷害の3日後に筋組織において一時的にピークに達するというものである。
【０４４２】
本発明者らは、2つのアプローチを使用したEP4の条件的かつ特異的な切断によって、MuSCの機能および生着が、その受容体を通じたPGE2シグナル伝達に厳密に依存していることを示す。MuSC上のEP4のインビトロ切断とそれに続くインビボ移植は、BLIによって明白である生着の減少をもたらす。EP4の重要な役割の最も特筆すべき証拠は、対照に比べてより小さくかつより未熟な筋線維へのシフトを伴って傷害後の筋力の顕著な低下を引き起こす、EP4の具体的には内因性MuSC上でのそのインビボ切断に由来する（図17）。したがって、EP4受容体がなければ、移植MuSCによる再生も内因性MuSCによる再生も重度に害される。
【０４４３】
傷害後のPGE2の急増は、一時的である。同様に、短期的なPGE2処理は、筋再生を長期に増強および加速させる。新たに単離されたMuSCとPGE2とを傷害を受けた筋肉に同時注射すると、筋肉修復が強化されたことがBLIによって明らかになった。PGE2への造血幹細胞の単回エクスビボ曝露は、その後の幹細胞の増大および移植後の血液の再構成に対して同様に顕著な効果を有した（44）。実際に、傷害を受けた筋肉へのPGE2単独（MuSCなし）の直接単回注射は、2週間以内に明らかとなった内因性MuSC数および筋線維サイズの著しい増加をもたらした。造血再生、肝臓再生および結腸再生に対するPGE2分解酵素（15-PGDH）の阻害剤SW033291の送達の有益な効果は、内因性PGE2レベルの類似の増強に起因する可能性が高い（45）。注目すべきことに、PGE2およびその類似体は、例えば、分娩を誘発するため（46）および造血幹細胞移植を促進するため（44）に、十年以上患者で安全に使用されている。本発明者らの知見と一緒に、これらの研究は、傷害後の筋肉修復を強化する際のその臨床的使用への道を開く。
【０４４４】
本発明者らは、PGE2レベルが再生の有効性を制御するレオスタットとして作用することを示す。傷害に対する本来備わった炎症促進性PGE2応答の増強は、MuSC増大および筋再生の加速をもたらす。対照的に、一般的な方法である傷害時の疼痛を制御するためのNSAID投与は、その効果を無効にし、このことは、この早期の時間域の間のPGE2シグナル伝達が、その有益な効果に極めて重要であることを示唆している。最も注目すべきことは、単回PGE2処理が、筋幹細胞応答を急速かつ頑強に惹起して、損傷を受けた筋肉の再生を増強し、強度を回復させるのに十分であるという本発明者らの知見である。
【０４４５】
本発明者らは、全ての実験およびプロトコルを、スタンフォード大学の実験動物管理委員会（APLAC）の施設内ガイドラインを順守して実施した。本発明者らは、Jackson Laboratoryから野生型の若齢C57BL/6マウスを入手した。二重トランスジェニックGFP/lucマウスを過去に記載の通りに得た（Jackson Laboratory、Stock #008450）（24）。NOD-scidガンマ（NSG）をJackson Laboratoryから入手した（Stock #0055570）。EP4flox/flox（EP4f/f）マウスは、K. Andreasson（スタンフォード大学）から贈与された（Jackson Laboratories、Stock #028102）（47）。Jackson Laboratoryから入手したPax7CreERT2マウス（Stock # 017763）とEP4f/fマウスを交雑することによって、二重トランスジェニックPax7CreERT2；EP4f/fを作製した（48）。Jackson Laboratoryから入手したPax7CreERT2マウスとRosa26-LSL-Luc（Stock # 005125）を交雑することによって、二重トランスジェニックPax7CreERT2；Rosa26-LSL-Lucを作製した（49）。本発明者らは、適切なPCRに基づく戦略によって、これらの遺伝子型を検証した。トランスジェニック系統および野生型系統に由来するマウスは全て、若齢（2〜4ヶ月）であった。全ての実験は、年齢および性別が一致した対照と実験群に無作為に割り付けた同腹仔を使用して実行した。
【０４４６】
本発明者らは、前脛骨筋（TA）筋肉への10μlのノテキシン（10μg ml-1；Latoxan、カタログ番号L8104）または心臓毒（10μM；Latoxan、カタログ番号L8102）の筋肉内注射を伴う傷害モデルを使用した。寒冷傷害のために、TA筋肉を覆っている皮膚に切開部を作り、液体窒素中で冷却した銅製プローブをTA筋肉に10秒間隔で3回当てて、クリオプローブの各適用間に筋肉が融解するようにした。必要であれば、傷害の48時間後、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2（dmPGE2）（13nmol、Tocris、カタログ番号4027）、インドメタシン（35μg、Sigma、カタログ番号I7378）またはビヒクル対照（PBS）のいずれかをTA筋肉に注射した。反対側のTAを内部標準として使用したが、但し、力測定実験で、各マウスの両脚を同じ条件で傷つけ、無関係のマウスを条件毎に使用した。
【０４４７】
Pax7CreERT2；Rosa26-LSL-Lucマウス実験の場合、本発明者らは、タモキシフェンを5回連続して毎日腹腔内注射することによってマウスを処理して、Pax7プロモーターの制御下のルシフェラーゼ発現を活性化させた。最後のタモキシフェン注射の1週間後に、マウスを10μlの心臓毒（10μM；Latoxan）の筋肉内注射に供し、本発明者らはこれをアッセイの0日目とした。3日後に、13nmolのdmPGE2またはビヒクル対照（PBS）のいずれかをTA筋肉に注射した。反対側のTAを内部標準として使用した。傷害後3日目、7日目、10日目および14日目に生物発光をアッセイした。
【０４４８】
Pax7CreERT2；EP4flox/floxマウス実験の場合、本発明者らは、タモキシフェンを5回連続して毎日腹腔内注射することによってマウスを処理して、Pax7発現細胞においてEP4対立遺伝子を切除した。最後のタモキシフェン注射の1週間後に、マウスを10μlのノテキシン（10μg ml-1；Latoxan）の筋肉内注射に供し、本発明者らはこれをアッセイの0日目とした。対照マウスとして、同じ性のPax7+/+；EP4flox/+同腹仔を使用した。
【０４４９】
本発明者らは、過去に記載の通りに筋幹細胞を単離および濃縮した（24、26、27）。簡潔に述べると、gentleMACS Octo Dissociatorを使用し、改変した製造業者のプロトコル（Miltenyi Biotech）を用いて、マウスの後肢筋肉を単離および解離させた。解離させた筋肉を、0.2％コラゲナーゼ（Roche）で60分間消化し、続いて、コラゲナーゼ/ディスパーゼ（0.04U ml-1；Roche）消化を30分間行った。単核細胞を、18G針を用いたシリンジ解離によって遊離させた。マウス筋幹細胞について、単一細胞懸濁液を、CD11b（1：800）、CD45（1：500）、Sca1（1：200）およびCD31（1：200）に対するビオチン化抗体とインキュベートし、続いて、ストレプトアビジン磁気ビーズ（Miltenyi Biotech）、ストレプトアビジン-APC-Cy7、インテグリン-α7-PE（1：500）およびCD34-eFluor660（1：67）とのインキュベーションを行った。ビオチン陽性細胞用の磁気ビーズ選択カラム（Miltenyi）上で、細胞混合物から造血系統発現細胞および非筋細胞を枯渇させた。次いで、残存する細胞混合物をFACS解析に供して、CD45-CD11b-CD31-Sca1-CD34+インテグリン-α7+MuSCを>95％の純度で選別した（DIVA-Van, Becton-Dickinson）。本発明者らは、FlowJo v10.0を使用してフローサイトメトリー散布図を作成し解析した。野生型MuSC選別について、本発明者らは、少なくとも3種の無関係な年齢および性別が一致したドナーマウスに由来するMuSC（それぞれ約5,000個）を一緒にプールした。
【０４５０】
本発明者らは、shSCRまたはshNurr1をトランスフェクトしたMuSCをビヒクル（DMSO）またはPGE2（10ng/ml）で24時間処理した後に、筋原性前駆細胞を使用したフローサイトメトリーによってNURR1レベルを解析した（ノックダウンアッセイのセクションを参照のこと）。本発明者らは、PBS中0.5％トリプシンと37℃で2分間インキュベーションすることによって、細胞を採取した。本発明者らは、PBS中1.6％パラホルムアルデヒドを使用して細胞を固定し、次いで、それらを氷冷メタノール中で透過処理した。次いで、本発明者らは、それらを染色緩衝液（PBS中0.5％BSA）中にて室温で30分間ブロッキングし、マウスモノクローナル抗Nurr1（Abcam、カタログ番号ab41917、1：75）一次抗体または抗マウスIgG対照（Jackson ImmunoResearch Laboratories）で染色した。次いで、本発明者らは、細胞をパシフィックブルーコンジュゲートヤギ抗マウス二次抗体（Thermo Fisher Scientific、カタログ番号P-10994、1：500）で染色した。本発明者らは、NIH S10共用機器助成金（S10RR027431-01）を使用して購入したスタンフォード大学共用FACS施設内のFACSDivaソフトウェア（BD Biosciences）を使用したFACS LSR IIサイトメーターで細胞を解析した。
【０４５１】
本発明者らは、過去に記載の通りに（24、26、27）、細胞培養からの250個のMuSC（図13A）または1,000個のMuSC（図14E）をレシピエントマウスのTA筋肉に直接移植した。野生型MuSC研究のために、本発明者らは、GFP/lucマウス（2〜4ヶ月齢）に由来する細胞を、後肢に放射線照射したNSGマウスに移植した。EP4flox/flox MuSC研究のために、本発明者らは、過去に記載の通りに（26）、移植前の24時間、培養2日目のluc-IRES-GFPレンチウイルス（GFP/lucウイルス）が形質導入されたEP4flox/floxマウス（2〜4ヶ月）に由来する細胞およびmCherry/Creレンチウイルスまたは模擬感染のいずれかを受けた部分群を移植した（詳細については、下記の「筋幹細胞の培養、処理およびレンチウイルス感染」のセクションを参照のこと）。筋幹細胞の移植前に、本発明者らは、ケタミン（マウス1匹当たり2.4mg）の腹腔内注射によって、NSGレシピエントマウスに麻酔をかけた。次いで、本発明者らは、後肢に線量18Gyを1回放射線照射し、体の残り部分は鉛のジグで遮蔽した。本発明者らは、放射線照射から2日以内に移植を実施した。本発明者らは、MuSCを所望の細胞濃度で0.1％ゼラチン/PBS中に再懸濁し、次いで、それら（1つのTA当たり250個または100個のマウスMuSC）を15μl容量で筋肉内注射することによってTA筋肉に移植した。新しいMuSC移植のために、本発明者らは、選別した細胞を、13nmolの16,16-ジメチルプロスタグランジンE2（dmPGE2）（Tocris、カタログ番号4027）またはビヒクル対照（PBS）と共に同時注射した。移植の1ヶ月後、本発明者らは、10μlのノテキシン（10μg ml-1；Latoxan, France）を注射してレシピエント筋肉を傷つけ、MuSCをインビボで再活性化させた。本発明者らは、同じマウスの反対側の脚のTA筋肉に移植することによって、異なる条件に由来する細胞を比較した。図面の凡例で指定されている通り移植の3週後または8週後に、マウスを安楽死させ、解析のためにTAを採取した。
【０４５２】
本発明者らは、過去に記載の通りに（24、26、27、30）、Xenogen-100システムを使用した生物発光イメージング（BLI）を実施した。簡潔に述べると、本発明者らは、イソフルオラン吸入を使用してマウスに麻酔をかけ、120μLのD-ルシフェリン（0.1mmol kg-1、PBS中で再構成；Caliper LifeSciences）を腹腔内注射によって投与した。本発明者らは、ルシフェリン注射の5分後に、Fストップ=1.0で60秒の露光を使用して、BLIを取得した。デジタル画像を記録し、Living Imageソフトウェア（Caliper LifeSciences）を使用して解析した。本発明者らは、各後肢の全体にわたって設定された一貫した関心領域（ROI）を用いて画像を解析して、生物発光シグナルを算出した。本発明者らは、輝度（ps-1cm-2sr-1）値104の生物発光シグナルを算出して、生着閾値を定めた。この輝度閾値104は、過去に報告されているより小さなサイズの関心領域によって規定された105p/sの総フラックス閾値にほぼ等しい。このBLI閾値は、1以上のGFP+筋線維の組織学的検出に対応している（24、26、27）。本発明者らは、移植後毎週、BLIイメージングを実施した。
【０４５３】
本発明者らは、過去に記載の通りに（27）合成されたPEG前駆体からポリエチレングリコール（PEG）ヒドロゲルを作製した。簡潔に述べると、本発明者らは、MuSCを培養し培養中の幹細胞の運命を維持するための最適条件である厚さ1mmの堅さ12kPa（ヤング率）のヒドロゲルを実現するための公開されている配合を使用することによって（27）、ヒドロゲルを製造した。本発明者らは、過去に記載の通りに（27）、クローン増殖実験のために12kPaのヒドロゲルマイクロウェルアレイを作製した。本発明者らは、12ウェルまたは24ウェルの培養プレートの表面領域を覆うように、全てのヒドロゲルを切り、付着させた。
【０４５４】
単離後、本発明者らは、MuSCを、DMEM/F10（50：50）、20％ FBS、2.5ng ml-1線維芽細胞増殖因子-2（FGF-2、bFGFとしても公知）および1％ペニシリン-ストレプトマイシを含有する筋原細胞培養培地中に再懸濁した。本発明者らは、MuSC懸濁液を表面積1cm2当たり細胞500個の密度で播種した。本発明者らは、細胞培養物を5％ CO2中37℃で維持し、培地を1日おきに交換した。PGE2処理、EP4受容体アンタゴニスト処理の研究のために、本発明者らは、1〜200ng/mlのプロスタグランジンE2（Cayman Chemical）（図面の凡例において特に指定のない限り、10ng/mlが、使用した標準濃度であった）および/または1μMのEP4アンタゴニスト（ONO-AE3-208, Cayman Chemical）を、コラーゲンコーティングシャーレで培養したMuSCに最初の24時間、添加した。次いで、細胞をトリプシン処理し、さらに6日間の培養のためにヒドロゲル上に細胞を再度播種した。全ての処理を、溶媒（DMSO）ビヒクル対照と比較した。除去済み血清アッセイのために、本発明者らは、単離MuSCを、DMEM/F10（50：50）、20％チャコール処理済みFBS（Gibco、カタログ番号12676011）、2.5ng ml-1 bFGFおよび1％ペニシリン-ストレプトマイシンを含有する除去済み血清培地に再懸濁した。これらの実験のために、MuSCをヒドロゲル上で培養し、培地交換毎（2日毎）に、ビヒクル（DMSO）または10ng/ml PGE2（Cayman Chemical）を培養物に添加した。7日後に、増殖（下記を参照のこと）をアッセイした。特に記載のない限り、本発明者らは、1週間の培養後に全てのMuSC培養アッセイおよび移植を実施した。
【０４５５】
EP4f/f MuSC研究のために、本発明者らは、上記（筋幹細胞単離）のようにしてMuSCを単離し、過去に記載の通りに（26）、全ての細胞にEF1α-luc-IRES-GFPをコードするレンチウイルス（GFP/lucウイルス）を培養下で24時間感染させ、それらの細胞の一部にpLM-CMV-R-Creをコードするレンチウイルス（mCherry/Creウイルス）を培養下で24時間同時感染させた。pLM-CMV-R-Creは、Michel Sadelainから贈与された（Addgene plasmid # 27546）（50）。本発明者らは、EP4f/f MuSC（1,000個の細胞）を、NSGレシピエントマウスの若い（2〜4ヶ月）18gy放射線照射TAに移植した。インビトロ増殖アッセイのために、感染後にEP4f/f MuSCをヒドロゲル上に播き、ビヒクル（DMSO）または10ng/ml PGE2で24時間処理し、3日後に増殖をアッセイした。感染の48時間後に、倒立型蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Microimaging）を使用して、細胞のGFPおよび/またはmCherryの発現をアッセイした。加えて、本発明者らはまた、Pax7CreERT2；EP4flox/floxまたは対照Pax7+/+；EP4flox/+同腹仔から単離されたMuSCを用いて実験を実施した。MuSCを、コラーゲンコーティングプレートに播き、1μMの4-ヒドロキシタモキシフェンまたはビヒクル（95％エタノール）で48時間処理し、次いで、ヒドロゲル上で継代して7日後に増殖を評価するか、または、PGE2もしくはビヒクルで処理して解析用に採取した。MuSCを、FACSによってマウスから新たに単離し、最長で1週間の期間にわたって培養下に置き、それ故、マイコプラズマ汚染は評価されない。
【０４５６】
本発明者らは、過去に記載の通りに（26、27）、低速度撮影顕微鏡検査によってクローン筋幹細胞増殖をアッセイした。簡潔に述べると、本発明者らは、C57Bl/6マウス（2〜4ヶ月）からMuSCを選別し、それらをコラーゲンコーティングプレートに播き、PGE2（Cayman Chemical）またはビヒクル（DMSO）で24時間処理した。次いで、細胞をトリプシン処理し、直径600μmのヒドロゲルマイクロウェル中に表面積1cm2当たり細胞500個の密度で再度播種した。低速度撮影顕微鏡検査のために、本発明者らは、単一細胞を含むウェルについて播種後38日間にわたって細胞増殖をモニタリングし、個別仕様の環境制御チャンバーおよび電動式載物台を備えたPALM/AxioObserver Z1システム（Carl Zeiss MicroImaging）を使用して倍率10倍で3分毎に画像を記録した。本発明者らは、細胞トラッキングおよび系統復元用のバクスターアルゴリズムを使用して一連の低速度撮影画像を解析して、単一細胞を特定および追跡し、系統樹を作成した（26〜28、51、52）。
【０４５７】
生存細胞および死細胞を、それぞれ位相差の境界および運動性の維持または喪失に基づいて、一連の低速度撮影で区別した。全ての時点における各世代（G1〜G6）の生細胞の割合を、100個の単一MuSCの出発集団に対して正規化された細胞数として示す。データ解析は盲検化された。画像取得およびスコア付けを実施する調査員は、解析される試料群に与えられた処理条件を知らなかった。
【０４５８】
増殖をアッセイするために、本発明者らは、3つの異なるアッセイ（血球計数器、VisionBlueおよびEdU）を使用した。それぞれについて、本発明者らは、平坦なヒドロゲル（血球計数器およびVisionBlue）またはコラーゲンコーティングプレート（EdUアッセイ）上に、MuSCを表面積1cm2当たり細胞500個の密度で播種した。血球計数器で細胞数を計数するために、本発明者らは、PBS中0.5％トリプシンと37℃で5分間インキュベーションすることによって指定の時点に細胞を採取し、血球計数器を使用して少なくとも3回それらを定量した。加えて、本発明者らは、培養時の細胞成長の読み出しとして、VisionBlue迅速細胞生存度蛍光アッセイキット（BioVision、カタログ番号K303）を使用した。簡潔に述べると、本発明者らは、MuSCを培養培地中10％ VisionBlueと3時間インキュベーションし、蛍光プレートリーダー（Infinite M1000 PRO, Tecan）上にてEx=530〜570nm、Em=590〜620nmで蛍光強度を測定した。本発明者らは、Click-iT EdU Alexa Fluor 555画像化キット（Life Technologies）を使用して増殖をアッセイした。簡潔に述べると、本発明者らは、固定前に、生細胞をEdU（20μM）と1時間インキュベーションし、抗ミオゲニン（Santa Cruz、カタログ番号sc576、1：250）と一緒に製造業者のガイドラインに従って核を染色して、分化をアッセイした。本発明者らは、DAPI（Invitrogen）を用いて核を対比染色した。本発明者らは、Plan NeoFluar 10×/0.30NAまたは20×/0.75NA対物レンズ（Carl Zeiss）を備えたAxioPlan2落射蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Microimaging）およびSlideBook（3i）ソフトウェアによって管理されるORCA-ERデジタルカメラ（Hamamatsu Photonics）を用いて、画像を取得した。本発明者らは、MetaMorph画像解析ソフトウェア（Molecular Devices）を使用してEdU陽性細胞を定量した。データ解析は盲検化され、この場合、細胞のスコア付けを実施する調査員は、解析される試料群に与えられた処理条件を知らなかった。
【０４５９】
MuSCにおけるNurr1サイレンシングのために、293T細胞において、パッケージングプラスミドpLP1、pLP2およびpLP/VSVG（Invitrogen）を使用し、FuGENE-6（Promega）を使用して製造業者のプロトコルに従って全てのプラスミドを同時トランスフェクトすることによって、pLKO.1スクランブルshRNA（shSCR）およびpLKO.1-Nurr1 shRNA（Mission shRNA, TRCN0000026029, Sigma）を含有するレンチウイルスを生産した。感染の前日に細胞を播き、293T細胞から12時間毎に2日間上清を採取した。新たに選別したMuSCをコラーゲンコーティングプレートに24時間播種し、次いで、レンチウイルスを感染させた。48時間後、細胞をヒドロゲル上で継代して、PGE2またはビヒクル（DMSO）で24時間処理した。7日後に、増殖をアッセイした。
【０４６０】
本発明者らは、RNeasy Micro Kit（Qiagen）を使用してMuSCからRNAを単離した。筋肉試料について、本発明者らは、組織を液体窒素中で急速凍結し、乳鉢および乳棒を使用して組織をホモジナイズし、続いてシリンジおよび針で粉砕し、次いでトリゾール（Invitrogen）を使用してRNAを単離した。本発明者らは、SensiFAST（商標）cDNA合成キット（Bioline）を使用して、各試料に由来する全mRNAからcDNAを逆転写した。本発明者らは、cDNAを、ABI 7900HTリアルタイムPCRシステム（Applied Biosystems）によるSYBR Green PCRマスターミックス（Applied Biosystems）またはTaqMan Assays（Applied Biosystems）を使用したRT-PCRに供した。本発明者らは、95℃で10分間、次いで95℃で15秒および60℃で1分のサイクルを40回、試料を増幅させた。相対転写物レベルを定量するために、本発明者らは、2-ΔΔCtを使用して処理試料と未処理試料を比較し、その結果をGapdhと比べて表した。SYBR Green qRT-PCRのために、本発明者らは、以下のプライマー配列を使用した：
2020523409.tif 000054
TaqMan Assays（Applied Biosystems）を、TaqManユニバーサルPCRマスターミックス試薬キット（Applied Biosystems）と共に使用して、製造業者の取扱い説明書に従って、試料中のPax7、ミオゲニン、Nurr1、Ptger3およびPtger4を定量した。転写物レベルは、Gapdhレベルと比べて表した。SYBR Green qPCRの場合、Gapdh qPCRを使用して、インプットcDNA試料を正規化した。Taqman qPCRの場合、マルチプレックスqPCRによって、標的シグナル（FAM）を内部Gapdhシグナル（VIC）によって個別に正規化することができた。
【０４６１】
筋肉を採取し、インドメタシン（5.6μg/ml）を含有する氷冷PBS中ですすぎ、液体窒素中で急速凍結した。凍結した試料を液体窒素中で微粉砕した。この粉末を、500μlの溶解緩衝液（50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、4mM CaCl、1.5％ Triton X-100、プロテアーゼインヒビターおよび小球菌ヌクレアーゼ）を含むエッペンドルフチューブに移し、次いで、組織ホモジナイザーを使用してホモジナイズした。上清のPGE2レベルをPGE2 ELISAキット（R&D Systems、カタログ番号KGE004B）を使用して測定し、BCAアッセイ（BioRad）によって測定したタンパク質総量と比べて表し、PGE2のngとして表した。各試料を、2連で、2回の独立した実験のそれぞれでアッセイした。
【０４６２】
条件培地アッセイのために、過去に記載の通りに（53）、長指伸筋（EDL）に由来する筋肉線維を単離した。線維を、除去済み血清培地中、インドメタシン（1μM、Sigma）の存在下または非存在下で24時間培養した。条件培地を採取して、PGE2 ELISAキット（R&D Systems、カタログ番号KGE004B）を使用して測定し、採取した容量（ml）と比べて表した。各試料を、3連で、2回の独立した実験でアッセイした。
【０４６３】
MuSCを、DMSO（ビヒクル）またはPGE2（10ng/ml）で1時間処理し、製造業者（Promega）によって最適化されたcAMP-Gloアッセイプロトコルに従って環状AMPレベルを測定した。各試料を、3連で、2回の独立した実験でアッセイした。
【０４６４】
筋肉傷害のセクションに記載の通りマウスを傷つけた。力測定は、TA筋肉上、傷害後14日目に、過去に公開されたプロトコルに基づいたものであった（26、54）。簡潔に述べると、O2と混合した2〜5％の気化イソフルラン（Isoflurane）でマウスに麻酔をかけた。30℃で体温および筋肉温度を維持するために、マウスを加熱ランプ下に配置した。TA筋肉の遠位腱を切開し、外科縫合糸によって300C-LR力変換器（Aurora Scientific）に結び付けた。固定した鋼製支柱に動物の膝を緊締し、それらの脚をプラットフォームにテープで貼り付け、他の筋肉群が収縮運動しないようにした。皮膚を通して膝の真上およびTA筋肉の真下に設置された2本の針電極間に電気刺激を加え、脛骨神経を刺激した。全ての測定において、本発明者らは、所定の最大上刺激電圧の0.1ミリ秒パルスを使用した。単収縮力測定に単回0.1ミリ秒パルスで、強縮力測定に一連の150Hzの0.3秒パルスで、TA筋肉を刺激した。本発明者らは、5回の単収縮測定、次いで5回の強縮測定を各筋肉で実施し、各測定間の回復を2〜3分とした。PCI-6251取得カード（National Instruments）を用いてデータを収集し、Matlabで解析した。本発明者らは、生理学的筋横断面積（PCSA）によって力測定を正規化することによって、比力価を算出し、これは、群間で類似していた。PCSA（mm2単位で測定）を以下の式（55）に従って算出した：
PCSA（mm2）=[質量（g）×Cos θ]÷[ρ（g/mm3）×線維長（mm）]
式中、θは線維の羽状角であり、ρは筋肉密度（0.001056g/mm3）である。
【０４６５】
RNAシーケンシングのために、α7-インテグリン+CD34+筋幹細胞を上記のように単離し、コラーゲンコーティングプレートに播種し、1日後PGE2またはビヒクル（DMSO）で処理し、処理の24時間後に加工処理した。5,000〜10,000個の細胞からQiagen RNAEasy Micro kitを使用してRNAを単離し、NuGEN Ovation RNA-Seq System v2 kitを使用してcDNAを生成および増幅させた。TruSEQ RNA Library Preparation Kit v2（Illumina）でcDNAからライブラリーを構築し、NIH S10共用機器助成金（S10OD018220）を使用して購入したスタンフォード大学機能ゲノミクス施設が提供するHiSEQ 2500で1試料当たり30〜40×106の1×75bpリードをシーケンシングした。
【０４６６】
RNAシーケンス解析のために、STAR（56）を使用して、RNA配列をハツカネズミ（Mus musculus）ゲノムに対してアラインした。RSEM（57）を、総カウントに加えてさらに、転写物のコールおよび転写物百万分率（TPM）値の算出にも使用した。各遺伝子および各試料のカウント数を含有するカウントマトリックスを得た。このマトリックスをDESeqによって解析して、試料間で遺伝子の解析の統計的有意性（58）を算出した。
【０４６７】
本発明者らは、過去に記載の通りに（26、27）、組織学的検査のためにレシピエントTA筋組織を採取および調製した。マウス傷害アッセイのために、本発明者らは、横断切片を、ウサギポリクローナル抗PGE2（abcam、カタログ番号ab2318、1：100）、ラットポリクローナル抗ラミニン（Clone A5）（EMD Millipore、カタログ番号05-206、1：200）、マウスモノクローナル抗Pax7（Santa Cruz、カタログ番号sc-81648、1：50）、AlexaFluor 647コンジュゲートコムギ胚芽凝集素（WGA）抗体（W32466、Thermo Fisher Scientific）、ウサギポリクローナル抗GFP（A11122、Thermo Fisher Scientific、1：500）およびマウスモノクローナル抗胚性ミオシン重鎖（DSHB、カタログ番号F1.652、1：10）一次抗体と、次いで、AlexaFluor二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories、1：500）とインキュベーションした。本発明者らは、DAPI（Invitrogen）を用いて核を対比染色した。
【０４６８】
本発明者らは、Plan NeoFluar 10×/0.30NAもしくは20×/0.75NA対物レンズ（Carl Zeiss）を備えたAxioPlan2落射蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Microimaging）およびSlideBook（3i）ソフトウェアによって管理されるORCA-ERデジタルカメラ（Hamamatsu Photonics）を用いて、または20×/0.75NA対物レンズを備えたKEYENCE BZ-X700オールインワン蛍光顕微鏡（Keyence, Osaka, Japan）を用いて画像を取得した。この画像を、Adobe Photoshopを使用して、同じ実験からの全画像に対して一貫したコントラスト調整を行って切り取った。Adobe Illustratorを使用して複合画像を作成した。本発明者らは、PAX7陽性細胞の数を、MetaMorph画像解析ソフトウェア（Molecular Devices）を使用して、そして、線維面積を、線維を特定し画像中の線維を区分して各線維の面積を解析する筋線維解析用のバクスターアルゴリズムを使用して、解析した。PAX7の定量のために、本発明者らは、TAの少なくとも2mmの深さに及ぶ連続切片を調べた。線維面積について、Keyence解析ソフトウェアを使用して傷害を受けた最も大きな面積を有するTAの断片全体を取り込み、ステッチした。データの取り込みおよび解析は盲検化された。画像取得およびスコア付けを実施する調査員は、解析される試料群に与えられた処理条件を知らなかった。
【０４６９】
本発明者らは、各々に3つの生物学的レプリケートをプールした少なくとも3回の独立した実験で細胞培養実験を実施した。一般に、本発明者らは、MuSC移植実験を少なくとも2回の独立した実験で実施し、ここで、移植片は、1条件当たり少なくとも合計3〜5個とした。本発明者らは、対応のあるt検定を実験に対して使用し、ここで、対照試料は、インビトロの同じ実験由来とするかまたはインビボの反対側の肢筋由来とした。ノンパラメトリックなマンホイットニー検定を使用して、ビヒクル処理群とPGE2処理群と間の有意差をα=0.05を使用して判定した。多重比較にANOVAまたは多重t検定を実施し、図面の凡例に示す通りボンフェローニ補正またはフィッシャーの検定を使用して有意レベルを決定した。特に記載のない限り、データを平均±s.e.m.として示す。p値<0.05を有する差を有意とみなした（*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、****p<0.0001）。
【０４７０】
RNASeqデータをMIME準拠フォーマットでGEOに提出した（アクセッション番号GSE97375）。
【０４７１】
参考文献：
2020523409.tif 000055
2020523409.tif 000056
2020523409.tif 000057
2020523409.tif 000058
【０４７２】
筋肉傷害：本発明者らは、前脛骨筋（TA）筋肉への10μlのノテキシン（10μg ml-1；Latoxan、カタログ番号L8104）または心臓毒（10μM；Latoxan、カタログ番号L8102）の筋肉内注射を伴う傷害モデルを使用した。寒冷傷害のために、TA筋肉を覆っている皮膚に切開部を作り、液体窒素中で冷却した銅製プローブをTA筋肉に10秒間隔で3回当てて、クリオプローブの各適用間に筋肉が融解するようにした。必要であれば、傷害の48時間後、16,16-ジメチルプロスタグランジンE2（dmPGE2）（13nmol、Tocris、カタログ番号4027）、インドメタシン（35μg、Sigma、カタログ番号I7378）またはビヒクル対照（PBS）のいずれかをTA筋肉に注射した。反対側のTAを内部標準として使用したが、但し、力測定実験で、各マウスの両脚を同じ条件で傷つけ、無関係のマウスを条件毎に使用した。
【０４７３】
Pax7CreERT2；Rosa26-LSL-Lucマウス実験の場合、本発明者らは、タモキシフェンを5回連続して毎日腹腔内注射することによってマウスを処理して、Pax7プロモーターの制御下のルシフェラーゼ発現を活性化させた。最後のタモキシフェン注射の1週間後に、マウスを10μlの心臓毒（10μM；Latoxan）の筋肉内注射に供し、本発明者らはこれをアッセイの0日目とした。3日後、13nmolのdmPGE2またはビヒクル対照（PBS）のいずれかをTA筋肉に注射した。反対側のTAを内部標準として使用した。傷害後3日目、7日目、10日目および14日目に生物発光をアッセイした。
【０４７４】
Pax7CreERT2；EP4flox/floxマウス実験の場合、本発明者らは、タモキシフェンを5回連続して毎日腹腔内注射することによってマウスを処理して、Pax7発現細胞においてEP4対立遺伝子を切除した。最後のタモキシフェン注射の1週間後に、マウスを10μlのノテキシン（10μg ml-1；Latoxan）の筋肉内注射に供し、本発明者らはこれをアッセイの0日目とした。対照マウスとして、同じ性のPax7+/+；EP4flox/+同腹仔を使用した。
【０４７５】
マウス筋幹細胞に対する蛍光活性化細胞選別：筋幹細胞単離のために、gentleMACS Octo Dissociatorを使用し、改変した製造業者のプロトコル（Miltenyi Biotech）を用いて、マウスの後肢筋肉を解離させた。解離させた筋肉を、0.2％コラゲナーゼ（Roche）で60分間消化し、続いて、コラゲナーゼ/ディスパーゼ（0.04U ml-1；Roche）消化を30分間行った。単核細胞を、18G針を用いたシリンジ解離によって遊離させた。マウス筋幹細胞について、単一細胞懸濁液を、CD11b（1：800）、CD45（1：500）、Sca1（1：200）およびCD31（1：200）に対するビオチン化抗体とインキュベートし、続いて、ストレプトアビジン磁気ビーズ（Miltenyi Biotech）、ストレプトアビジン-APC-Cy7、インテグリン-α7-PE（1：500）およびCD34-eFluor660（1：67）とのインキュベーションを行った。ビオチン陽性細胞用の磁気ビーズ選択カラム（Miltenyi）上で、細胞混合物から造血系統発現細胞および非筋細胞を枯渇させた。次いで、残存する細胞混合物をFACS解析に供して、CD45-CD11b-CD31-Sca1-CD34+インテグリン-α7+MuSCを>95％の純度で選別した（DIVA-Van、Becton-Dickinson）。本発明者らは、FlowJo v10.0を使用してフローサイトメトリー散布図を作成し解析した。野生型MuSC選別について、本発明者らは、少なくとも3種の無関係な年齢および性別が一致したドナーマウスに由来するMuSC（それぞれ約5,000個）を一緒にプールした。
【０４７６】
筋幹細胞移植：野生型MuSC研究のために、本発明者らは、GFP/lucマウス（2〜4ヶ月齢）に由来する細胞を、後肢に放射線照射したNSGマウスに移植した。EP4flox/flox MuSC研究のために、本発明者らは、過去に記載の通りに（26）、移植前の24時間、培養2日目のluc-IRES-GFPレンチウイルス（GFP/lucウイルス）が形質導入されたEP4flox/floxマウス（2〜4ヶ月）に由来する細胞およびmCherry/Creレンチウイルスまたは模擬感染のいずれかを受けた部分群を移植した（詳細については、「筋幹細胞の培養、処理およびレンチウイルス感染」のセクションを参照のこと）。筋幹細胞の移植前に、本発明者らは、ケタミン（マウス1匹当たり2.4mg）の腹腔内注射によって、NSGレシピエントマウスに麻酔をかけた。次いで、本発明者らは、後肢に線量18Gyを1回放射線照射し、体の残り部分は鉛のジグで遮蔽した。本発明者らは、放射線照射から2日以内に移植を実施した。本発明者らは、MuSCを所望の細胞濃度で0.1％ゼラチン/PBS中に再懸濁し、次いで、それら（1つのTA当たり250個または100個のマウスMuSC）を15μl容量で筋肉内注射することによってTA筋肉に移植した。新しいMuSC移植のために、本発明者らは、選別した細胞を、13nmolの16,16-ジメチルプロスタグランジンE2（dmPGE2）（Tocris、カタログ番号4027）またはビヒクル対照（PBS）と共に同時注射した。移植の1ヶ月後、本発明者らは、10μlのノテキシン（10μg ml-1；Latoxan, France）を注射してレシピエント筋肉を傷つけ、MuSCをインビボで再活性化させた。本発明者らは、同じマウスの反対側の脚のTA筋肉に移植することによって、異なる条件に由来する細胞を比較した。図面の凡例で指定されている通り移植の3週後または8週後に、マウスを安楽死させ、解析のためにTAを採取した。
【０４７７】
生物発光イメージング：生物発光イメージング（BLI）のために、本発明者らは、イソフルオラン吸入を使用してマウスに麻酔をかけ、120μLのD-ルシフェリン（0.1mmol kg-1、PBS中で再構成；Caliper LifeSciences）を腹腔内注射によって投与した。本発明者らは、ルシフェリン注射の5分後に、Fストップ=1.0で60秒の露光を使用して、BLIを取得した。デジタル画像を記録し、Living Imageソフトウェア（Caliper LifeSciences）を使用して解析した。本発明者らは、各後肢の全体にわたって設定された一貫した関心領域（ROI）を用いて画像を解析して、生物発光シグナルを算出した。本発明者らは、輝度（ps-1cm-2sr-1）値104の生物発光シグナルを算出して、生着閾値を定めた。この輝度閾値104は、過去に報告されているより小さなサイズの関心領域によって規定された105p/sの総フラックス閾値にほぼ等しい。このBLI閾値は、1以上のGFP+筋線維の組織学的検出に対応している（24、26、27）。本発明者らは、移植後毎週、BLIイメージングを実施した。
【０４７８】
ヒドロゲル作製：本発明者らは、MuSCを培養し培養中の幹細胞の運命を維持するための最適条件である厚さ1mmの堅さ12kPa（ヤング率）のヒドロゲルを実現するための公開されている配合を使用することによって（27）、ヒドロゲルを製造した。本発明者らは、過去に記載の通りに（27）、クローン増殖実験のために12kPaのヒドロゲルマイクロウェルアレイを作製した。本発明者らは、12ウェルまたは24ウェルの培養プレートの表面領域を覆うように、全てのヒドロゲルを切り、付着させた。
【０４７９】
クローン筋幹細胞増殖および運命解析：低速度撮影解析を実施するために、本発明者らは、C57Bl/6マウス（2〜4ヶ月）からMuSCを選別し、それらをコラーゲンコーティングプレートに播き、PGE2（Cayman Chemical）またはビヒクル（DMSO）で24時間処理した。次いで、細胞をトリプシン処理し、直径600μmのヒドロゲルマイクロウェル中に表面積1cm2当たり細胞500個の密度で再度播種した。低速度撮影顕微鏡検査のために、本発明者らは、単一細胞を含むウェルについて播種後38日間にわたって細胞増殖をモニタリングし、個別仕様の環境制御チャンバーおよび電動式載物台を備えたPALM/AxioObserver Z1システム（Carl Zeiss MicroImaging）を使用して倍率10倍で3分毎に画像を記録した。本発明者らは、細胞トラッキングおよび系統復元用のバクスターアルゴリズムを使用して一連の低速度撮影画像を解析して、単一細胞を特定および追跡し、系統樹を作成した（26〜28、51、52）。
【０４８０】
生存細胞および死細胞を、それぞれ位相差の境界および運動性の維持または喪失に基づいて、一連の低速度撮影で区別した。全ての時点における各世代（G1〜G6）の生細胞の割合を、100個の単一MuSCの出発集団に対して正規化された細胞数として示す。データ解析は盲検化された。画像取得およびスコア付けを実施する調査員は、解析される試料群に与えられた処理条件を知らなかった。
【０４８１】
増殖アッセイ：増殖をアッセイするために、本発明者らは、3つの異なるアッセイ（血球計数器、VisionBlueおよびEdU）を使用した。それぞれについて、本発明者らは、平坦なヒドロゲル（血球計数器およびVisionBlue）またはコラーゲンコーティングプレート（EdUアッセイ）上に、MuSCを表面積1cm2当たり細胞500個の密度で播種した。血球計数器で細胞数を計数するために、本発明者らは、PBS中0.5％トリプシンと37℃で5分間インキュベーションすることによって指定の時点に細胞を採取し、血球計数器を使用して少なくとも3回それらを定量した。加えて、本発明者らは、培養時の細胞成長の読み出しとして、VisionBlue迅速細胞生存度蛍光アッセイキット（BioVision、カタログ番号K303）を使用した。簡潔に述べると、本発明者らは、MuSCを培養培地中10％ VisionBlueと3時間インキュベーションし、蛍光プレートリーダー（Infinite M1000 PRO, Tecan）上にてEx=530〜570nm、Em=590〜620nmで蛍光強度を測定した。本発明者らは、Click-iT EdU Alexa Fluor 555画像化キット（Life Technologies）を使用して増殖をアッセイした。簡潔に述べると、本発明者らは、固定前に、生細胞をEdU（20μM）と1時間インキュベーションし、抗ミオゲニン（Santa Cruz、カタログ番号sc576、1：250）と一緒に製造業者のガイドラインに従って核を染色して、分化をアッセイした。本発明者らは、DAPI（Invitrogen）を用いて核を対比染色した。本発明者らは、Plan NeoFluar 10×/0.30NAまたは20×/0.75NA対物レンズ（Carl Zeiss）を備えたAxioPlan2落射蛍光顕微鏡（Carl Zeiss Microimaging）およびSlideBook（3i）ソフトウェアによって管理されるORCA-ERデジタルカメラ（Hamamatsu Photonics）を用いて、画像を取得した。本発明者らは、MetaMorph画像解析ソフトウェア（Molecular Devices）を使用してEdU陽性細胞を定量した。データ解析は盲検化され、この場合、細胞のスコア付けを実施する調査員は、解析される試料群に与えられた処理条件を知らなかった。
【０４８２】
PGE2 ELISA：筋肉を採取し、インドメタシン（5.6μg/ml）を含有する氷冷PBS中ですすぎ、液体窒素中で急速凍結した。凍結した試料を液体窒素中で微粉砕した。この粉末を、500μlの溶解緩衝液（50mM Tris-HCl pH 7.5、150mM NaCl、4mM CaCl、1.5％ Triton X-100、プロテアーゼインヒビターおよび小球菌ヌクレアーゼ）を含むエッペンドルフチューブに移し、次いで、組織ホモジナイザーを使用してホモジナイズした。上清のPGE2レベルをPGE2 ELISAキット（R&D Systems、カタログ番号KGE004B）を使用して測定し、BCAアッセイ（BioRad）によって測定したタンパク質総量と比べて表し、PGE2のngとして表した。各試料を、2連で、2回の独立した実験のそれぞれでアッセイした。
【０４８３】
条件培地アッセイのために、過去に記載の通りに（53）、長指伸筋（EDL）に由来する筋肉線維を単離した。線維を、除去済み血清培地中、インドメタシン（1μM、Sigma）の存在下または非存在下で24時間培養した。条件培地を採取して、PGE2 ELISAキット（R&D Systems、カタログ番号KGE004B）を使用して測定し、採取した容量（ml）と比べて表した。各試料を、3連で、2回の独立した実験でアッセイした。
【０４８４】
インビボ筋力測定：力測定を実施するために、まず、O2と混合した2〜5％の気化イソフルランでマウスに麻酔をかけた。30℃で体温および筋肉温度を維持するために、マウスを加熱ランプ下に配置した。TA筋肉の遠位腱を切開し、外科縫合糸によって300C-LR力変換器（Aurora Scientific）に結び付けた。固定した鋼製支柱に動物の膝を緊締し、それらの脚をプラットフォームにテープで貼り付け、他の筋肉群が収縮運動しないようにした。皮膚を通して膝の真上およびTA筋肉の真下に設置された2本の針電極間に電気刺激を加え、脛骨神経を刺激した。全ての測定において、本発明者らは、所定の最大上刺激電圧の0.1ミリ秒パルスを使用した。単収縮力測定に単回0.1ミリ秒パルスで、強縮力測定に一連の150Hzの0.3秒パルスで、TA筋肉を刺激した。本発明者らは、5回の単収縮測定、次いで5回の強縮測定を各筋肉で実施し、各測定間の回復を2〜3分とした。PCI-6251取得カード（National Instruments）を用いてデータを収集し、Matlabで解析した。本発明者らは、生理学的筋横断面積（PCSA）によって力測定を正規化することによって、比力価を算出し、これは、群間で類似していた。PCSA（mm2単位で測定）を以下の式（55）に従って算出した：
PCSA（mm2）=[質量（g）×Cos θ]÷[ρ（g/mm3）×線維長（mm）]
式中、θは線維の羽状角であり、ρは筋肉密度（0.001056g/mm3）である。
【０４８５】
実施例4：ブピバカインと併用するための最適なPGE2投与量を確立するため、ならびに、マウスにおけるMuSC数および筋再生をモニタリングするための研究
本実施例は、本発明の組成物の筋再生に対する効果を調べるため、ならびに、ブピバカインと併用するためのPGE2またはPGE2誘導体（16,16-ジメチルプロスタグランジンE2）の最適用量を確立するための、二重トランスジェニックマウスモデルおよび生物発光イメージングの使用を説明する。
【０４８６】
Jackson Laboratoryから入手したPax7CreERT2マウスとRosa26-LSL-Lucマウス（Stock # 005125）を交雑することによって、二重トランスジェニックPax7CreERT2；Rosa26-LSL-Lucマウスを作製した。適切なPCRに基づく戦略によって、これらの遺伝子型を検証した。トランスジェニック系統および野生型系統に由来するマウスは全て、若齢（2〜4ヶ月）であった。全ての実験は、年齢および性別が一致した対照を使用して実行した。図23Aに示す実験スキームに描写した通り、タモキシフェンを5回連続して毎日腹腔内注射することによってマウスを処理して、Pax7プロモーターの制御下のルシフェラーゼ発現を活性化させた。最後のタモキシフェン注射の1週間後に、前脛骨筋（TA）筋肉に、0.125％、0.25％または0.5％のブピバカイン（BPV）（Cayman Chemical、カタログ番号16618）および10μgの16,16-ジメチルプロスタグランジンE2（dmPGE2；Tocris、カタログ番号4027）を含有する薬物混合物50μLを、ハミルトンシリンジの30ゲージ針を使用して筋肉内注射した。反対側のTAには、ベースラインの偽薬対照として、0.5％ブピバカイン（BPV）およびDMSOビヒクルを含有する混合物50μLを与えた。傷害後3日目、7日目、10日目および14日目に生物発光をアッセイした。
【０４８７】
過去に記載の通りに、Xenogen-100システムを使用した生物発光イメージング（BLI）を実施した。簡潔に述べると、イソフルオラン吸入を使用してマウスに麻酔をかけ、120μLのD-ルシフェリン（0.1mmol/kg、PBS中で再構成；Caliper LifeSciences）を腹腔内注射によって投与した。ルシフェリン注射の5分後に、Fストップ=1.0で5〜60秒の露光を使用して、BLIを取得した。デジタル画像を記録し、Living Imageソフトウェア（Caliper LifeSciences）を使用して解析した。各後肢の全体にわたって設定された一貫した関心領域（ROI）を用いて画像を解析して、生物発光シグナルを算出した。輝度（ps-1cm-2sr-1）値104の生物発光シグナルを算出して、バックグラウンドに対する正の閾値シグナルを定めた。BPVとdmPGE2またはビヒクルの同時注射後に週2回で2週間、BLIイメージングを実施した。
【０４８８】
図23A〜Cおよび24のデータをn=6匹のマウスの平均±s.e.m.として示す。各時点の多重t検定または一元配置ANOVAを実施して、処理群（BPV/dmPGE2）と対照群（BPV/ビヒクル）とを比較した。*（アスタリスク）として示されるp値<0.05を有する差を有意とみなした。
【０４８９】
図23Bは、BPV単独で処理した筋肉よりも、BPVとdmPGE2の組み合わせで処理した筋肉においてより高かったBLIシグナルの例を示す。注射の2週間後にBLI画像を得た。図23Cに示すように、注射の2週間後のBLIのlog倍率変化は、BPV/ビヒクル群と比較して、BPV/dmPGE2群において有意により高く（p<0.05）、このことは、BPVとdmPGE2を併用したときに筋再生がより顕著であったことを示している。陰性対照群（DMSOビヒクルのみ）およびdmPGE2のみの群では、検出可能な変化は認められなかった。
【０４９０】
図24に示すように、dmPGE2と組み合わせて与えたときに、BPVは、筋再生の用量依存的増加（より大きなBLIシグナルの倍率変化によって明らかな通り）をもたらし、統計的に有意な変化が注射の2週間後に明らかとなった。
【０４９１】
まとめると、これらのデータは、dmPGE2とBPVの組み合わせが、dmPGE2またはBPVのいずれか単独の場合よりも、筋再生を促進する際により効果的であること、そして、dmPGE2のより高い用量がより顕著な筋再生をもたらすことを示す。
【０４９２】
参考文献
2020523409.tif 000059
【０４９３】
実施例5：ブピバカインと併用するための最適なPGE2投与量を確立するため、ならびに、マウスにおけるMuSC数および筋再生をモニタリングするための研究
本実施例は、ブピバカインと併せたPGE2の有効用量を最適化するために実施することができる研究を例証する。ブピバカイン成分は、2つの目的を果たす：注射のための麻酔を提供すること、および、また再生における筋幹細胞機能を刺激すること。調査すべき投与量は、それぞれの薬物単独について患者に過去に使用された範囲を含む。それぞれの場合に、針および軽度に筋毒性の麻酔薬のため、筋幹細胞活性化を最大化するために、4回の注射でPGE2-ブピバカイン総投与量が送達される。BLIによって筋再生能を非侵襲的に調査するために、増加した内因性幹細胞機能の生物発光読み出しを非侵襲的かつ経時的に提供するPax7-ルシフェラーゼトランスジェニックマウスモデルを使用する。忍容性が良好で有効かつ再現性のある除神経誘導性骨格筋萎縮の齧歯動物モデルである、坐骨神経切断モデルを用いる。この技法は、CTS患者で見られる萎縮性の短母指外転筋（APB）筋肉とよく似た筋肉質量の喪失をもたらす。次いで、大量のPGE2-ブピバカインを、4種のマウス無作為群に送達して、3つのPGE2投与量の範囲を調査し、これを対照未処理群と比較する。これらの実験を使用して、臨床試験で使用するためのPGE2とブピバカインの組み合わせの注射最適投与量を規定することができる。
【０４９４】
PGE2およびブピバカインは共に、過去にヒト臨床試験において他の適応症に使用されているが（NCT01861665を参照のこと）、筋肉においては共に使用されていない。この実施例に記載の研究について、0.5％ブピバカインのNOAELである公開されている有効かつFDAによって承認されている用量範囲を使用することができる。この目的は、萎縮した後肢筋肉においてマウスの内因性MuSC機能を最大限に増強する最適PGE2用量を調査することである。これらの実験では、内因性MuSC増大の評価は、時間経過にわたる一連の迅速な高感度かつ非侵襲的なBLI測定を伴う。最後に、組織学的検査は、萎縮した筋肉コホートの分析において、PGET2とブピバカインの組み合わせ注射によって誘導される除神経および早期筋肉損傷応答とその後の筋再生および再神経支配の程度を判定するのに特に有用であり、これは、処置エンドポイント時の筋機能の回復に起因し得る。
【０４９５】
内因性MuSC数をインビボ刺激する際のPGE2の有効用量の確立
生物発光イメージング（BLI）アッセイを簡便な非侵襲的方法として用いて、神経切断誘導萎縮を誘導した後の筋幹細胞レポーターマウスモデル（すなわち、Pax7CreERT2；Rosa26-LSL-Luc）およびPGE2とブピバカインの組み合わせのGA注射を使用することによって、インビボでのMuSC増大を迅速に評価し、再生能の感度尺度を提供する。針および軽度に筋毒性の麻酔薬のため、筋肉全体の曝露を最大にし、かつ、筋幹細胞活性化および再生を増強するために、それぞれの場合のPGE-ブピバカイン総投与量は、4回の注射で送達される。
【０４９６】
BLIは、蛍光イメージングに使用される励起光（バックグラウンドノイズを生成する）を必要としないので、その高いシグナル対ノイズ比に起因して並外れた感度を与える。増大した内因性筋幹細胞において発現されるルシフェラーゼによってルシフェリン触媒反応から放出されるBLIシグナルは、冷却電荷結合素子（CCD）カメラによって直接記録される。この動的読み出しは、MuSC機能のインビボ縦断研究を同じマウスで経時的に実行することを可能にし、それ故、再生した筋肉の最終段階の連続切片化および免疫蛍光解析を有効に補助するものとなる。
【０４９７】
筋再生は、ブピバカインを筋毒素として使用することによって誘導される。ブピバカインは、筋幹細胞の先行研究において筋肉傷害/再生モデルで効果的であることが分かっている。マウスの筋肉において頑強な再生を誘導すると詳細に記録が残された0.5％ブピバカインの投与量が使用される。この用量は、局所麻酔および末梢神経ブロック用に患者に臨床的に使用される用量と同等である。
【０４９８】
固定用量のブピバカインの組み合わせ製剤を、FDAによって承認されているPGE2の最大用量（NCT00602095を参照のこと）よりも少ない範囲のPGE2濃度を用いて調査する。例えば、Pfizer Pharmaceuticals, UKから得ることができる、FDAによって承認されているGMP等級のPGE2を使用する。
【０４９９】
速線維および緩徐線維混合型の組成およびサイズのGAマウス筋肉（135±22.6mg）は、過去に研究された前脛骨筋筋肉よりもヒトABP筋肉（261±119mg）により厳密に近似するので、PGE2およびブピバカインを含む製剤を、両脚の誘導した萎縮腓腹筋（GA）筋肉に送達する。マウスGA筋肉はまた、ヒトAPB筋肉（69％±9％）と類似の線維長/筋肉長比（45.5％±4.5％）を有する。過去の研究は、移植したMuSCが、ジストロフィーマウスの傷害を受けたGA筋肉の強度を回復させることができることを示している。
【０５００】
マウス後肢筋肉萎縮は、確立された坐骨神経切断モデルを使用して誘導され、CTS患者で見られる萎縮性のAPB筋肉とよく似ている。このモデルは、萎縮をもたらす一定期間の後部の後肢筋肉の除神経を引き起こし（すなわち、神経切断後）、続いて、筋肉の再神経支配が起こる（神経軸索が再生されてその運動終板に戻った後）。
【０５０１】
MuSCレポーターマウスモデルおよびBLI技法を使用して、BLIによってアッセイされる内因性MuSCの再生機能を増強する際に最も有効な用量が決定される。具体的には、タモキシフェンを5回連続して毎日腹腔内注射することによってマウスを処理して、ルシフェラーゼ発現を活性化する。最後のタモキシフェン注射の1週間後に、マウスを坐骨神経切断に供する。2週間後、筋肉萎縮が明らかとなた時点で、PGE2-ブピバカイン混合物50μLの筋肉内注射を実施する。過去の報告は、PGE2の提案された最大用量20μg（または4mg/kg）を齧歯動物に有害効果なしに投与することができることを示している。それ故、5、10および20μgの範囲のPGE2用量がGAに送達される。送達は、脚1本当たりそれぞれのGA筋肉に2回の、4回の12.5μL注射（合計0.5cc）を伴う。対照として、GA筋肉に、ビヒクル単独（すなわち、PBS）、0.5％ブピバカイン単独、またはPGE2単独（5、10または20μg）を注射する。傷害後2日毎に2週間、その後週2回で3ヶ月間、生物発光イメージング（BLI）によってインビボMuSC活性を評価する。最適なPGE2-ブピバカイン用量は、BLIによって評価される、筋再生に対して飽和効果を有する最低有効用量である。内因性MuSC集団は、最初に活性化され、次いで急速に増殖して、BLIシグナルの指数関数的増加をもたらし、ピークに達した後、再生がホメオスタシスに達したらプラトーになると考えられる。1条件当たり6匹のマウス（合計48匹のマウス）を分析し、両側アルファ0.05およびBLI強度の標準偏差6.24×105p/s/cm2/sr（先行データに基づく）に基づき、95％の統計的検出力を得る。
【０５０２】
まとめると、このセクションに記載の実験は、再生における内因性MuSC数の増大を増強するPGE2の製剤または最適用量を決定する。次いで、最適用量を、この実施例の以下のセクションに記載の実験に使用する。
【０５０３】
免疫組織学的検査による筋再生に対するPGE2-ブピバカイン製剤の長期効果の評価：MuSC数およびBLIによって測定される筋再生の改善が、独立したトランスジェニックマウス系統Pax7CreERT2 Rosa26-LSL-dtTOMATOにおける筋線維のサイズ、構造、および幹細胞数の組織学的解析を用いて確証される。この系統を使用して、MuSC活性を評価し、傷害後のdtTOMATO+筋線維の系統追跡およびその数の評価に基づいて再生も同じく評価する。上記の通り確立されたPGE2の最適用量を、萎縮性のPax7CreERT2；Rosa26-LSL-dtTOMATOマウスの筋肉において使用する。TOMATOシグナルを使用して、筋肉線維組織切片において活性化された幹細胞およびそれらの分化した子孫を組織学的に解明する。
【０５０４】
生物発光およびTOMATOアッセイは、内因性幹細胞の増大を追跡するが、これらは、幹細胞、前駆細胞を含むサブセット、および分化している筋芽細胞を識別しない。この必要性に取り組むために、幹細胞（例えば、Pax7）、前駆細胞（例えば、Myf5）および分化細胞（例えば、MyoD）をマークする筋原性転写因子に対する抗体を用いて、各実験の終了時に組織学的解析および免疫染色を実施する。また、筋線維に対するMuSCの寄与、および筋線維に沿った衛星細胞位置でニッチに幹細胞をもたらす自己複製も定量する。ラミニンおよびミオシン重鎖（MHC）に対する抗体を用いた免疫染色によって、筋線維を特定する。先行研究に基づき、PGE2処理後すぐに、GA筋肉において分化の進んだ細胞に比べて幹細胞の割合が強化されると予想される。
【０５０５】
筋肉再神経支配を分析するために、再神経支配された神経筋接合部（NMJ）の頻度として「再神経支配比」をスコア付けする。この比は、ニューロフィラメントおよびシナプスベッセルタンパク質（SV2）免疫反応性によって標識される総NMJ（新しいNMJ）をα-ブンガロトキシンおよびシュワン細胞GAP-43免疫反応性によって標識される神経筋接合部（総NMJ）の頻度の関数で表して導出される。
【０５０６】
全GA筋肉のより定量的な評価のために、解離した野生型筋組織のFACS解析を実施して、活性化された筋原細胞（Pax7+/Myf5+）およびコミット筋原細胞（MyoD+/ミオゲニン+）に対する筋幹細胞（Pax7+）の比を決定する。これは、PGE2が幹細胞活性を増強しているかを立証するために重要である。
【０５０７】
これらの実験のために、1群当たり6匹のマウスを使用する：ビヒクル単独、ブピバカイン単独、最適なPGE2用量単独、およびブピバカインと最適なPGE2用量を一緒に、組織学的解析（n=24匹のマウス）およびFACs解析（n=24匹のマウス）に用いて、95％の統計的検出力を達成する。ノンパラメトリックなt検定（例えば、マンホイットニー検定）を使用して、全ての提案された動物実験の統計的有意性を評価する。
【０５０８】
実施例6：強度、構造、および筋体積を評価することによるPGE2に応答するマウスの筋肉の評価
本実施例は、複数の技術を使用してマウスにおける筋機能改善を評価するために使用することができる研究を例証する。マウスまたはヒトにおいて単一運動単位から収縮動態の測定を可能にする、スタンフォードのDelp研究所によって組み立てられた新規のハンドヘルドマイクロ内視鏡（図25）を用いる。力発生動態を筋節変位の経時変化に基づいて算出する。並行して、スタンフォードのBlau研究所およびDelp研究所によって開発された独立した技法を使用してインビボ力測定行って、強度を評価し、単収縮筋力および強縮筋力を評価する。加えて、筋体積の増加を超音波検査によって測定して、傷害を受けた筋肉の筋肉質量の回復の範囲を決定する。これらの測定は、萎縮性GAマウスモデルにおいて筋再生を促進する際のPGE2-ブピバカイン製剤の有効性を評価する。内視鏡検査および超音波検査研究に基づいて、再神経支配の線維サイズおよび範囲の組織学的評価を実施して、アウトカムを交差検証する。重要なことに、マイクロ内視鏡検査および超音波検査の評価方法論を、患者のヒトの手の筋肉を評価するために直接変換および適用して、ベースライン機能および介入後の回復を評価する。
【０５０９】
上の実施例5に記載の実験に続いて、本明細書に記載のように、超音波検査、マイクロ内視鏡検査および力アッセイを使用してマウスを評価し、筋体積の増加、構造、および強度を評価する。新規のハンドヘルドマイクロ内視鏡を使用して、単一運動単位の非侵襲的な収縮動態測定を実施する。力発生を筋節変位の経時変化に基づいて算出する。いくつかの場合に、このアッセイを8週間の時間経過にわたって毎週実行する。この目的は、対照群と比較した、PGE2とブピバカインの組み合わせ処理を受けた筋肉の機能的改善を評価することである。また、超音波分析によって、処理した筋肉の体積も評価する。
【０５１０】
マイクロ内視鏡検査を使用した強度の測定による筋機能の評価：筋再生に対するPGE2とブピバカインの組み合わせの効果の最終試験は、筋力増加に対して機能的アッセイを実施することである。350マイクロメーターくらいの小ささのマイクロ内視鏡を使用して、個々の筋節を受動筋肉および能動筋肉において画像診断し、個々の筋節および長さの変化を動的に直接可視化することができる（Delp研究所で開発された技術）。本明細書に記載のように、測定は、上の実施例5で決定された最適なPGE2-ブピバカイン用量の注射後、内因性MuSCによって産生される筋組織の収縮動態および力生成能力から構成される。また、処理後のマウスの筋肉線維において生成された光の二次高調波周波数を観察するために、低侵襲性の光学マイクロ内視鏡検査を使用して筋節の長さも評価する。横紋骨格筋は、基礎収縮単位である筋節からなる。これらの測定を実施するための有用な装置は、深部組織画像検査用のマイクロ内視鏡の追加を可能にするように適合された走査型レーザー顕微鏡、および二次高調波シグナルを発生させる超短パルスチタンサファイアレーザーを含む。この低侵襲技術を、筋機能のパラメーターを評価するために臨床へ容易に変換することができ、PGE2-ブピバカインで処理した患者の短母指外転筋（APB）の有効性を評価するために使用することができる（以下の実施例7を参照のこと）。上の実施例5に記載の通り処理したマウスにおいてPGE2-ブピバカイン処理の6週間後に力を評価する。したがって、最適なPGE2-ブピバカイン用量は、PBS対照と比較して、最高のBLIシグナルをもたらすだけでなく、最強の力出力ももたらす。マイクロ内視鏡の代用として、Blau研究所によって過去に確立された力変換器技法によってインビボで強度を評価することができる。1条件当たり6匹の独立したマウスを分析して、95％の統計的検出力を得る。
【０５１１】
超音波画像検査による筋体積の評価。超音波画像検査は、筋再生を筋体積に基づいて評価するために使用することができる非侵襲的方法である。その上、超音波検査は、反復測定を経時的に行って筋肉質量に対する本発明の組成物および方法の効果を評価することができる、速くかつ非侵襲的な方法でもある。筋肉の超音波画像検査は、超音波ビームが組織に衝突したときに生成される異なる音響インピーダンスに基づく。筋肉の超音波像は、周囲の脂肪、線維組織、神経、血管および骨とは明白に異なるので、筋肉の厚さを測定することによって、萎縮および再生に起因した筋肉質量の増加を容易に定量することができる。
【０５１２】
CTSに起因する神経筋萎縮は、超音波検査で可視化できる構造的な筋肉変化を引き起こす。筋肉の厚さを測定することによって萎縮を対象化することができる（すなわち、筋肉は、超音波画像上でより白くなる）。超音波検査は、大きな筋肉領域およびより深部の筋肉を特に手において可視化することができるので、超音波検査は、線維束形成を検出する際に、筋電図検査（EMG）および臨床観察と比較してより高感度である。解像度およびフレームを改善すれば、超音波検査によって細動などのより小さな規模の自発的な筋肉活性を検出することができる。
【０５１３】
実施例7：手根管症候群の処置のための臨床試験
本実施例は、重度手根管症候群（CTS）の患者の処置のための本発明の組成物および方法の有益性を判定するように設計された臨床試験を例証する。この試験への介入は、手根管開放術の2ヶ月後にPGE2-ブピバカイン製剤を除神経された短母指外転筋（APB）筋肉に注射することによる治療戦略を調査する。以下のアウトカムを評価する：1）上肢PROMIS評価を使用した両手機能；2）カナダ式作業遂行によって標準化された自己評価質問表によって評価される場合の患者アウトカム；3）モバーグピックアップ試験；4）超音波体積測定；5）「デジタルピンチ動力計」装置を使用し、ピンチ力を使用した、機能的強度；ならびに6）超音波検査による筋肉質量およびマイクロ内視鏡検査による筋肉構造の決定。介入の1、3および6ヶ月後に評価を実施する。本実施例に記載の研究は、CTS筋肉萎縮の処置のためのII相臨床試験として役立つことができ、戦闘死傷者と高齢集団の両方にとって主要問題である他の神経関連筋肉萎縮の処置のためのプラットフォームを提供することができる。
【０５１４】
設計：本研究は、筋肉内PGE2投与が除神経後の筋肉回復を改善するか否かを評価するための無作為化プラセボ対照試験である。この臨床試験は、2つの成果をもたらす：（1）PGE2が、除神経された筋再生能を改善するかどうかを明らかにする；（2）PGE2が、除神経/再神経支配後の筋機能を改善するかどうかも試験する。
【０５１５】
研究集団
組み入れ基準：以下の基準を満たした対象を試験に組み入れる：
・患者は、Palo Alto VAで直視下手根管開放術が予定されている
・神経伝導研究が、APBの遠位運動潜時が<6.5ミリ秒であるAPB筋肉の運動効果を示す
・指尖ピンチ測定によって試験した場合の手根管開放術の2ヶ月後の持続的なAPB筋肉の衰弱。
【０５１６】
除外基準：以下の1以上を有する対象を試験への参加から除外する：
・緑内障の診断
・研究フォーム（教育、認知能力、精神状態、医学的状態）に記入不可能
・プロスタグランジンへの過去の有害反応
・喘息
・介入の投与時に収縮期血圧が170mm/hgを超える
・妊娠
・介入の前後2日間、NSAIDを停止し続けることができない
・0〜10の疼痛スケールで3を超える持続的な手術部痛
【０５１７】
脱退：スクリーニングに申し込んだ全ての患者、参加に合意した数、インフォームドコンセントを提出した数、ベースライン評価基準を埋めた数、無作為化を受ける数、およびそれらの割り付けられた群における試験を完遂する数を記録する。無作為化を受けないことを選択した患者に、提案された臨床試験と同一であるが積極的介入のない観察研究に参加するかを尋ねる。このように試しに、参加しない患者からも無作為化を受ける患者からも経過観察データを集めて、試験集団が、参加しない患者と有意に異なるかどうかを特定する。患者は任意の時点で脱退してよい。
【０５１８】
外科手術：外科手術は、直視下手根管開放術である。これらの手術は、エピネフリン添加1％リドカインの局所麻酔下で実施される。この手術は、手の掌側上で縦切開を使用する。患者を、副木固定なしに薄いガーゼで覆い、12日後に抜糸のために来院させる。12日目の外来時に、患者に傷跡マッサージを指導し、困難を感じているかどうか再度経過観察だけ行う。
【０５１９】
医薬適用/無作為化：0.5mlアンプルに入った10mg/ml希釈の溶液であるPGE2（ジノプロストン）（Pfizer, UK）を介入群に使用する。ジノプロストンは、分娩誘導用の薬物として妊婦に長年使用されてきた。本研究は、この臨床的に利用可能な医薬を別の目的で使用する。ヒトにおける最も一般的な副作用は、大いに妊娠に関係する：子宮破裂および羊水塞栓。報告されている他の副作用は、アナフィラキシー、発熱、胸部痛、不整脈、吐き気、その他を含む。この薬物の半減期は、5分未満である。
【０５２０】
この医薬を、ブピバカインで、最適投与量について1以上の先行の動物試験によって示された最適用量に希釈する。見かけ上同一である対応するプラセボ注射を薬局内で混合する。スタンフォード生物統計学部によって書かれたRプログラムを使用して、無作為化（すなわち、処置群または対照群への対象の割り付け）を作成した。このプログラムは、無作為化割り付けの確率を徐々に変化させて過去に無作為化された対象の群のあらゆる不均衡を補正する「バイアスコイン」方法論を利用する。この「バイアスコイン」アプローチは、処置割り付け毎に予測不可能性を維持しながら、全ての階級において処置群間の有意な不均衡の可能性を減少させる。無作為化は、処置対プラセボ比1：1で行われる。
【０５２１】
募集：身体検査でAPB衰弱を有する対象が募集に申し込み、登録し、術前評価項目を埋める。動力測定法を使用した指尖ピンチ力を使用して、APB力を評価する。指尖ピンチは、CTSにおいてAPB力を評価するための推奨尺度である。指尖ピンチはまた、手根管開放術後の改善を示す最初のピンチ/握力試験である。試験への組み入れのために、APB力は、基準データよりもまたは女性で3.84kgおよび男性で5.78kgよりも15％少ない必要がある。
【０５２２】
外科手術の2ヶ月後、対象を再評価する。次いで、持続的な衰弱を有する対象に介入を進める。これは、神経開放術だけでは回復しなかった対象の処置を可能にする。持続的な衰弱は、対側部位よりも15％少ない力を有する患者のAPBの力尺度を使用することによって規定される。次いで、手術部位に3を超える持続した疼痛を有する患者を除外する。3を超える疼痛は、中等度の疼痛であり、力発生を妨げ得る。過去の研究（ミノサイクリン試験）は、6％が、3ヶ月目にも中等度の疼痛を有していることを示唆している。
【０５２３】
対象の約50％は、APB除神経を有する。そのうち、50％が、2ヶ月目に持続的な衰弱を有すると予想される。
【０５２４】
術前データの取得：募集後、参加者はベースライン評価項目を埋める。これは、手根管開放術前に遂行される。この評価項目は、以下に列記される尺度を含む：
【０５２５】
人口統計データ：民族起源、人種、年齢、性別および医学的合併症。
【０５２６】
（表３）神経伝導重症度得点
2020523409.tif 000060
【０５２７】
これは、神経伝導研究を使用して手根管の重症度を分類するスコアである。神経伝導研究は作業者依存的であり、値は部位間で変動し得る。この評価は、その試験部位に関してその試験にとって異常である値を正確な値の代わりに使用することによって、この問題を取り除く。
【０５２８】
両手PROMIS計測：PROMIS両手計測は、特定の症状または機能的な問題を規定および定量する較正質問を集めたPROMIS項目バンク（v1.0：PF）から項目を選び出す、コンピュータ適応型試験である。この試験は、項目選択アルゴリズム（その評価プログラムが、応答者の現在の項目に与えられた応答に基づいて、応答者の次の項目を選択し、それによって、冗長な項目、無関係な項目、またはそれ以外の目的とされにくい項目の提示を回避することができる）を使用する。PROMISスコアは、Tスコアとして報告され、ここで、平均が50、SDが10である；より高いスコアは、より高いPFレベルを表す。この試験は、代表的なUS試料に対して信頼性>0.95を有すると評価および説明されている。
【０５２９】
カナダ式作業遂行測定（COPM）：この患者中心の試験は、セルフケア、レジャーおよび生産活動の領域における患者の自覚的作業遂行を測定する。この試験は、典型的には施行するのに10〜20分要する医療提供者によって実行される半構造化面接でネストされた、5段階プロセスで行われる。患者は、困難を感じる領域を特定し、それらに優先順位を付ける。患者の遂行度および満足度が、患者にとって重要な領域で格付けされる。遂行度および満足度スコアの変化が経時的に測定される。COPMは、変化に応答性であると示され、遂行度スコアに関する2ポイントの改善が臨床的に有意であると認識される。
【０５３０】
モバーグピックアップ試験：この試験では、母指、示指および中指を使用して、12個の異なる対象物を一度に一つずつ無作為に持ち上げる。患者は、それらを開放箱にできるだけ素早く入れる。その課題を完遂するのに要した時間（秒単位）を測定し、エンドポイントとして記録する。これは、全ての対象物が持ち上げられるまで、または特定の対象物を持ち上げようとする試みが失敗に終わり30秒経過するまで、2回実施する。この試験を目隠しありと目隠しなしで繰り返す。同じ手順を、傷害を受けていない手に対して行う。これは、傷害を受けた手と他の手との間の指標としてスコア化される。この試験は、手の微細運動および感覚機能に関する情報を提供する。
【０５３１】
指尖ピンチ力：指尖ピンチ力は、患者の握力を測定して患者のAPB筋肉の機能不全度を評価するために使用される、デジタルピンチ動力計を使用して測定される。この指尖ピンチは、母指腹の力が示指腹に加わる。試験する腕を彼/彼女の脇に沿わせ、肘を90°に曲げた状態で、患者を座らせる。掌を下に向けて、母指球と示指球との間でピンチ力を測定する。患者は、つかみ、保持し、そして、放す。この試験は、測定間の間隔を2分以内にして3回連続の測定で実施される。
【０５３２】
APBの超音波体積測定：手のAPBおよび他の小筋肉の体積を評価するために超音波検査が使用されてきた。超音波検査は、筋肉のいくつかの側面を検出することができる。まず、超音波検査は、筋肉のサイズを特定することができる。これは、断面積（CSA）を測定することによって日常的に行われる。APBのCSAは、筋力と強く相関する。APB筋肉は、第一中手骨の上部3分の1に探触子を設置することによって測定する。CSAの画像をビットマップ画像ファイルとして保存し、パーソナルコンピュータに転送する。Adobe Photoshop CS6 Extendedを使用して、画像の解析を実施する。投げ縄ツールを使用して、問題となっている筋肉を特定する。解析オプションを使用してCSAを計算する。筋膜は、APB筋の境界を明確にし、APBと母指対立筋（隣接する母指球筋）との区別を可能にする。
【０５３３】
また、筋肉のエコー強度も測定し、これは除神経の兆候である。実際に、筋肉のエコー強度および均質度は、CTSの重症度と相関する。APB筋肉は、5〜10MHz変換器と以下の装置設定を用い、Bモードを使用した超音波検査によって測定される：ゲイン50dB、ダイナミックレンジ56dBおよび深度3cm。手を完全に回外させた状態で対象を座らせる。CSAを測定する。全ての測定を3回繰り返し、その平均を最終測定値として採用する。
【０５３４】
ten試験：ten試験は、感覚を評価するための効率的な方法であり、手根管症候群の重症度のマーカーである。この試験は、患者を座らせ、掌を上に向けて実施される。患者に0〜10個の試験スコアを知らせる。試験者は、示指の指先の指腹部を使用して、正常な感覚の領域（反対側の指が多い）を軽くなでる。これがスケールでスコア10を表すと、参加者に知らせる。その後、同一の圧力を使用して異常な領域および正常な領域を同時に刺激し、参加者は、その患肢上の刺激を、正常なアンカ領域と比較してスコア化する（0〜10）。これらの測定から、感覚比が導出される。
【０５３５】
介入：外科的開放術の2ヶ月後、APBの持続的な衰弱に関して、指尖ピンチ力で患者を再評価する。継続した衰弱を有する患者を試験に参加させ、プラセボ対PGE2とブピバカインの組み合わせに無作為化する。上の実施例5および6に記載の通りマウスにおいて決定された最適用量から、用量を推定する。前臨床予備研究では、平均GA筋肉質量（135mg）当たり10μgのPGE2を投与した。この薬物は全身に送達されないので、マウスにおいて使用された投与量からヒトにおける用量を推定することができる。APB筋肉において使用するための用量は、妊婦の分娩を誘導する薬物として臨床的に使用されている用量（すなわち、1回の処置当たり1〜5mg）をはるかに下回っている。
【０５３６】
介入のために、消毒法を使用し、十分な（a weal of）1％リドカインで皮膚に麻酔をかける。次いで、PGE2とブピバカインの組み合わせまたは食塩水とブピバカインの組み合わせのいずれか0.5ccを、30ゲージ針を使用して、4分割でAPB筋肉に注射する。患者を注射後30分間モニタリングする。PGE2の半減期は5分であり、したがって、30分は、医薬に対するあらゆる急性反応をモニタリングするのに十分である。
【０５３７】
運動は、筋再生に重要な要素である。全ての患者に、そのAPB筋肉を強化する運動プログラムを与え、運動を少なくとも10分/日実施するように指示する。セラパティ（Theraputty）を各患者に提供して、在宅療法プログラムを支援する。患者は、週1回交流し、毎日活動を行うように互いに促す。
【０５３８】
外科手術後のデータ取得：外科手術の4ヶ月後および6ヶ月後（介入の2ヶ月後および4ヶ月後）に患者を評価する。手術後の評価は、以下を含む：
1. 両手PROMIS
2. COPM
3. モバーグピックアップ試験
4. 超音波体積測定
5. 指尖ピンチ力
6. 正式な理学療法への参加：理学療法士による手の施術を受けているかを各患者に尋ねる。正式な理学療法は、その結果に潜在的に影響を及ぼす可能性がある。したがって、理学療法を受けた患者を除外する。
7. 運動順守：運動をどのくらいの頻度で行ったかを各参加者に尋ねる：毎日、週に数回、週1回または全くなし。
8. 有害事象：最終来院以降どんな健康問題を有しているかを対象に尋ねる。
【０５３９】
例示的な対象スケジュールを図26に示す。
【０５４０】
マイクロ内視鏡検査：2つの群を選択して、マイクロ内視鏡検査を受けさせる。これは、試験の開始時に健康な筋肉構造と認められた5人の健康志願者に対して実施する。また、20人の対象に対して介入前および介入の4ヶ月後にマイクロ内視鏡検査を実施して、改善を評価する。これは、二重盲検試験であるので、無作為選択によって両方の群から対象が含まれる。したがって、各群（PGE2対プラセボ）のうち少なくとも5人が務めると予想される。過去の研究では、この数は、有意な知見を得るのに十分であった。この手法は、全員に対して同じである。対象を楽に座らせ、手を回外の状態で安静に保つ。消毒法を使用し、超音波検査ガイダンスを使用して、APB筋肉内にマイクロ内視鏡を挿入する。超音波検査は、筋肉位置および線維配向の決定を助ける。マイクロ内視鏡を1mmずつゆっくり引き抜く。少なくとも3つの異なる線維を画像検査する。
【０５４１】
解析
エンドポイントおよび測定：試験は、3種類のエンドポイントを有する：実現可能性エンドポイント、安全性エンドポイントおよび有効性エンドポイント。
【０５４２】
主要実現可能性エンドポイント：研究プロセスの完遂時に信頼できる有効性尺度を提供するように、実現可能性エンドポイントが設計される。主要実現可能性エンドポイントは、無作為化された群における研究を完遂したスクリーニング受診者の割合である。
【０５４３】
安全性および有害事象エンドポイント：副作用の積極的聞き取り（active capture）は、医薬の投与の間に、かつ、具体的には浮腫、打撲傷または疼痛の増加を尋ねる介入後2日目の追跡調査の電話によって遂行される。有害事象を記録し、試験中に月2回再調査する。
【０５４４】
有効性エンドポイント：主要有効性エンドポイントは、動力測定法によって測定される指尖ピンチ力（kg単位）を使用したAPBの力尺度である。副次エンドポイントは、APB筋肉断面積の変化を含む。これは、超音波検査を使用して記録され、cm2単位で測定される。
【０５４５】
解析集団：全ての無作為化患者を治療企図解析に含める。100％順守の患者を、プロトコルに適合した解析に含める。
【０５４６】
バックグラウンドおよび人口統計特性：人口統計およびバックグラウンド情報を、記述統計（例えば、平均、標準偏差、百分率など）を用いてまとめる。
【０５４７】
実現可能性の解析：研究プロトコルの完遂失敗をもたらす因子の形式的解析は、承諾時に得られるベースライン変動に基づいて理解される。主要実現可能性エンドポイント（すなわち、無作為化された群において研究を完遂したか）に従って患者を二分する。ロジスティック回帰を使用して、研究の完遂失敗に関連する因子を特定する。
【０５４８】
有効性の解析：線形回帰モデルを使用して主要および副次有効性エンドポイントを解析する。年齢、糖尿病状態およびNCSスコアなどの患者因子を管理する。研究試料のサイズおよびパワーは、この比較から導出される（以下を参照のこと）。主要エンドポイントの二次解析は、多重比較に対して補正される。予備サブグループ解析は、多重比較に対して補正されない。
【０５４９】
安全性の解析：介入に関連した有害事象の記述統計および計数を実施する。プラセボ群と介入群との間の比率を比較する。
【０５５０】
欠測データおよびプロトコル非遵守の取扱い法：一次解析は、治療企図解析である。また、徹底的にプロトコルを遵守した患者に対する別個の有効性解析も実施する。
【０５５１】
試験の実施の評価（集積率、データ品質を含む）：試験の実施は、20個の主要エンドポイント事象毎に再調査される。実現可能性エンドポイントは、試験完遂の可能性を確保するために再調査される。これらの再調査のために、プロトコル違反に対する集積率および累積統計が作成される。
【０５５２】
サブグループ解析：サブグループ解析は、70歳を超える年齢および神経伝導研究の重度絞扼スコアによって定義される定義済み高リスクサブグループにおいて、処置有効性を調べる。
【０５５３】
試料サイズ
集積推定量：30ヶ月の期間で60人の対象を登録する。これは、1ヶ月当たりおよそ2人の患者に等しい。
【０５５４】
試料サイズの正当化：研究のために60人の患者を募集する。試料サイズの根拠は、以下の通りである。帰無仮説では、処置群間でAPBの力測定に変化はない。対立仮説では、PGE2とブピバカインの組み合わせがAPBの力測定を有意に変化させる。
【０５５５】
等分散である2標本t検定を使用して、プラセボ群とPGE2-ブピバカイン群との間のAPBの力測定の差を試験する。強縮力測定で10.0 Nの差があったマウスにおける過去の研究のデータに基づいて、80％のパワーの一次アウトカムについて総効果量の差が求められる。それ故、統計解析ソフトウェア（SASバージョン9.4）を以下のパラメーターで使用したProc Power算出を使用して、仮説を試験するためにそのパワーが算出される：群割り付け=1：1、プールされた標準偏差=7.62N、および片側アルファ0.05。片側アルファ0.05で80％のパワーを有する1群当たり必要な対象数は、1群当たり患者25人であると判断される。15％の低下が計画される場合、1群当たり29人の患者、または合計58人の患者が必要である。前臨床データに基づいて、処置群における力の増加の規模は、CTS患者について報告される側面ピンチ力に変換したときに、対象に有意差をもたらすことが予想される。公開される結果によって、予想される力の増加は、対象が、フォークをつかむ能力またはジッパーを引き上げる能力などの過去に可能ではなかった特定の日々の基本作業を実施するのを可能にする（Smaby et al, 2004）。
【０５５６】
追加の解析：COPMスコアの変化およびモバーグピックアップ検査の時間を含めたいくつかの他のアウトカムを評価することができる。これらは共に、連続変数であり、マンホイットニーのU検定を使用して比較される。また、マイクロ内視鏡測定に基づくAPB機能の統計解析を実施することもできる。
【０５５７】
潜在的ピットフォール
不適切な募集：適切な数の対象を募集する際に問題があれば、募集プールを拡張して、内在筋衰弱を伴う肘部の尺骨神経絞扼を有するものを含めることができる。この疾患過程は、手の複数の小筋肉に衰弱がある手根管症候群と類似している。募集をこのように変更する場合、以下の通りプロトコルに対して変更を加える。
（1）神経再生により多くの時間をとるために、注射のタイミングは開放術の4ヶ月後である。
（2）評価を受ける筋肉は、第一背側骨間筋である。第一背側骨間筋も超音波検査で測定し、サイズは強度と相関している。
（3）解析計画は、上記の評価項目を依然として含む。実施される尺骨神経開放術のうち、約50％が萎縮を有する。
【０５５８】
退役軍人集団：いくつかの場合に、研究集団は、一般集団の代表でない場合もある。例えば、退役軍人は、高齢であり、男性人口がより高い。一方で、PGE2による介入は、高齢マウスにおける再生の欠如に特に有効であると思われる。したがって、集団が高齢であることは、この介入の有益性を確認するのに最も適し得る。
【０５５９】
軍人への有益性および影響
PNIは、多くの兵士の現役復帰を妨げる一般的な戦闘傷害である。加えて、多くの高齢退役軍人は、日常生活での活動を行う能力を喪失させる、圧迫損傷に由来するPNIを有する。PNI後の筋機能の喪失は、引き続き難しく未解決な問題となっている。神経再生を改善するための研究は、継続しているが、再神経支配を伴う筋再生を改善するために行われていることは少ない。神経の傷害および修復の後の筋肉回復量を改善するための医薬処置が必要とされている。この重視されているCTS試験を超える潜在用途は、広く、神経と筋肉の両方の処置を可能にするだろう。
【０５６０】
前述の発明を、理解の明瞭化のために例証および例によっていくらか詳細に記載してきたが、添付の特許請求の範囲内で特定の変更および改変を実施してよいことが、当業者は認識するだろう。加えて、本明細書に提供される各参考文献は、各参考文献が参照によって個々に組み入れられるのと同程度に、参照によってその全体が組み入れられる。
【０５６１】
参考文献
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【０５６２】
実施例8. 筋再生におけるPGE2化合物と筋毒素の組み合わせの相乗効果
Pax7プロモーターを発現するルシフェラーゼマウスをインビボで得るために、Pax7-CreERT2；Rosa-LSL-ルシフェラーゼマウス（2〜4ヶ月齢）をタモキシフェンで5日連続して処置した。1週間後、踏み板力測定装置を使用して、薬物の注射前に前脛骨筋のベースライン強縮力を測定した（0日目の時点）。その後、マウスの前脛骨筋（TA）筋肉に、50μlのビヒクル（食塩水）、筋幹細胞活性化因子プロスタグランジンE2（PGE2、20μg）、筋幹細胞増大剤ブピバカイン（BPV、0.25％）または組み合わせ薬（ブピバカイン0.25％をPGE2 20μgと一緒に）を注射した。図27Aは、筋幹細胞増大を測定するために3日毎に2週間測定された生物発光（BLI、輝度として測定）を示す。図27Bは、同じマウスから4週目に測定された生じた強縮力を示し、ここでは、ベースライン力に対するパーセント差を算出した。図27C：4週目（エンドポイント）に、TAを単離し、そして、筋肉長、重量および羽状角によって算出された生理学的横断面積（PCSA）に基づいて比力（mN/mm2）を得た。強縮力の比力およびパーセント差は、ビヒクルおよび単独で注射された低分子の両方と比較して、組み合わせ薬について有意に増加した。*P<0.05、**P<0.001。群比較にANOVA検定、そして、エンドポイントの有意差はフィッシャーの検定による（図27A）。多重比較にボンフェローニ補正を用いたANOVA検定（図27B、図27C）。データを平均±SEMとして示す。
【０５６３】
この結果は、PGE2化合物とブピバカインなどの筋毒素の組み合わせが、筋再生に対して相乗効果を有することを明らかにする。図27Aに示すように、PGE2とブピバカインの組み合わせは、PGE2単独またはブピバカイン単独の場合よりも大きい筋幹細胞増大を誘導する。重要なことに、観察された筋幹細胞増大は、PGE2単独およびブピバカイン単独についての筋幹細胞増大の合計よりも大きい。筋再生に対する相乗効果はまた、別のアッセイでも確認される。図27Bに示すように、組み合わされたPGE2とブピバカインで処置された筋肉の強縮力の増加は、PGE2で処置された筋肉の強縮力の増加の合計よりも大きい。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月10日(2020.2.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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