(57)【要約】  質量分析法による分析に適したビーズアレイが開示されている。一実施形態において、ビーズアレイは、複数の反応部位を含み、反応部位の各々は、複数の異なる標的分析物を結合することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１反応部位および第２反応部位を含むビーズアレイであって、前記第１および第２反応部位の各々がビーズおよび捕捉剤を含み、前記各捕捉剤が抗体を含み、前記第１反応部位の前記捕捉剤が前記第２反応部位の前記捕捉剤とは異なるビーズアレイにおいて、
前記第１反応部位の前記捕捉剤が、エピトープを特異的に認識し、第１標的および第２標的を特異的に結合し、
前記第２反応部位の前記捕捉剤が、前記第１反応部位の前記捕捉剤によって認識されないエピトープを特異的に認識し、
前記第１および前記第２標的の各々が、（ｉ）前記第１反応部位の前記捕捉剤によって認識される前記エピトープを含み、（ｉｉ）タンパク質性化合物であり、（ｉｉｉ）分子量が５０００Ｄａ未満であって、前記第１標的の前記分子量が前記第２標的の前記分子量と異なる、ビーズアレイ。
【請求項２】
前記ビーズアレイが、天然のタンパク質の配列中の異なるエピトープを特異的に認識する異なる捕捉剤を含み、前記異なる捕捉剤が異なるビーズに関連付けられている、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項３】
前記ビーズアレイが、天然のタンパク質の異なるタンパク質分解フラグメントを特異的に認識する異なる捕捉剤を含み、前記異なるタンパク質分解フラグメントが、集合的に前記タンパク質の配列長の２０％超を占め、前記異なる捕捉剤が異なるビーズに関連付けられている、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項４】
前記ビーズアレイが、天然のタンパク質のタンパク質分解フラグメント内の異なる非重複エピトープを個別に認識する異なる捕捉剤を含み、前記異なる捕捉剤が異なるビーズに関連付けられている、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項５】
前記第１反応部位の前記捕捉剤によって認識される前記エピトープが、ヒトタンパク質およびマウスタンパク質に天然に存在する、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項６】
前記第１反応部位の前記捕捉剤によって認識される前記エピトープが、第１タンパク質および第２タンパク質に天然に存在し、前記第２反応部位の前記捕捉剤によって認識される前記エピトープが、前記第１タンパク質に天然に存在し、前記第２タンパク質に存在しない、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項７】
前記第１および前記第２反応部位の捕捉剤によって認識される前記エピトープが、トリプシンおよびキモトリプシンによって認識されるタンパク質分解切断部位を欠いている、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項８】
前記第１反応部位の前記捕捉剤によって認識される前記エピトープが、トリプシンによって認識されるタンパク質分解切断部位を欠き、前記第２反応部位の前記捕捉剤によって認識される前記エピトープが、前記タンパク質分解切断部位を含む、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項９】
前記第１反応部位の前記捕捉剤により認識される前記エピトープが、翻訳後修飾（ＰＴＭ）を欠き、前記第１および前記第２標的の１つが前記ＰＴＭを含む、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項１０】
前記第１反応部位の前記捕捉剤によって認識される前記エピトープが、第１ＰＴＭを含み、前記第１および前記第２標的の少なくとも１つが、第２ＰＴＭをさらに含み、前記第２ＰＴＭが前記エピトープ外に位置し、前記第１ＰＴＭがリン酸化であり、前記第２ＰＴＭがアセチル化、メチル化、グリコシル化、ユビキチン化、およびＳＵＭＯ化の１つである、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項１１】
前記第１および前記第２反応部位の前記捕捉剤が、アッセイにおいて対応するエピトープも特異的に認識し、前記アッセイがウェスタンブロット、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫沈降および免疫蛍光の少なくとも１つである、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項１２】
前記第１反応部位の複製をさらに含み、前記複製が前記第１反応部位の前記捕捉剤と同一の捕捉剤を含み、前記ビーズアレイに含まれる前記複製の量が１０未満である、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項１３】
前記第１および前記第２反応部位が位置的および光学的コード化を欠いている、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項１４】
前記第１反応部位のビーズが、６％を超えるアガロース含有量を有し、１５０ミクロンを超える直径を有する、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項１５】
前記第１反応部位が、２つの異なる値を含む組み合わせに関連付けられ、前記２つの異なる値が前記第１標的の分子量および前記第２標的の分子量に由来し、前記組み合わせが前記第１反応部位の前記捕捉剤に特異的に結合する標的を同定するのに必要および十分である、請求項１に記載のビーズアレイ。
【請求項１６】
親和性結合を行う方法であって、
ビーズアレイをサンプルと接触させるステップであって、前記ビーズアレイが第１反応部位および第２反応部位を含み、前記第１および前記第２反応部位の各々がビーズおよび捕捉剤を含み、前記各捕捉剤が抗体を含み、前記第１反応部位の前記捕捉剤が前記第２反応部位の前記捕捉剤とは異なる、ステップと、
前記サンプルからの第１標的および第２標的を前記第１反応部位に結合するステップであって、前記第１および第２標的の各々が、（ｉ）前記第１反応部位の前記捕捉剤によって認識される天然のエピトープを含み、（ｉｉ）タンパク質性化合物であり、（ｉｉｉ）分子量が５０００Ｄａ未満であって、前記第１標的の分子量が前記第２標的の分子量と異なる、ステップと、
前記サンプルからの第３標的を前記第２反応部位に結合するステップであって、前記第３標的が前記第２反応部位の前記捕捉剤によって認識され、前記第１反応部位の前記捕捉剤によって認識されないエピトープを含むステップと
を含む、方法。
【請求項１７】
前記第１、前記第２および前記第３標的が、天然のタンパク質の異なるタンパク質分解フラグメントを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１、前記第２および前記第３標的が天然の同位体量を有する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１および前記第２反応部位の前記捕捉剤によって認識されるエピトープが、少なくとも２つの消化酵素によって認識されるタンパク質分解切断部位を欠き、前記少なくとも２つの消化酵素が、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−ＣおよびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記第１標的が第１タンパク質に由来し、前記第２標的が第２タンパク質に由来し、前記第１および前記第２タンパク質が異なる生物学的経路の構成要素である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記第１標的がヒトタンパク質に由来し、前記第２標的がマウスタンパク質に由来する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１反応部位の前記捕捉剤によって認識される前記エピトープが第１ＰＴＭを含み、前記第１および前記第２標的の少なくとも１つが第２ＰＴＭをさらに含み、前記第１ＰＴＭの部位が前記第２ＰＴＭの部位からアミノ酸１０個未満だけ離れている、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記第１反応部位の前記捕捉剤により認識される前記エピトープがリン酸化部位を含み、前記第１および前記第２標的の少なくとも１つがリン酸化以外のＰＴＭをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１反応部位の前記捕捉剤によって認識される前記エピトープが少なくとも２つのＰＴＭを含み、前記第１および前記第２標的の少なくとも１つが追加のＰＴＭをさらに含み、前記追加のＰＴＭが前記エピトープ外に位置する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
天然のタンパク質の異なるフラグメントを前記ビーズアレイの異なる反応部位に結合するステップをさらに含み、前記異なるフラグメントが集合的に前記タンパク質の配列長の２０％超を占める、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
天然のタンパク質の少なくとも３つの異なるフラグメントを前記ビーズアレイの異なる反応部位に結合するステップをさらに含み、前記少なくとも３つの異なるフラグメントの各々がＰＴＭを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
線形モード飛行時間質量分析法（ＴＯＦ  ＭＳ）を使用して前記第１標的を検出するステップと、反射モードＴＯＦ  ＭＳを使用して前記第２標的を検出するステップとをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１および前記第２標的が、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）ＭＳによる検出のために異なるマトリックスを必要とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ビーズアレイが、前記第１反応部位の複製を５つ未満含む、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６２／５５５，２３５号（発明者Ｖｌａｄｉｓｌａｖ  Ｂ．Ｂｅｒｇｏ、２０１７年９月７日出願）の米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく利益を主張し、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所（ＮＩＨ）により授与された助成金番号ＧＭ１０３３４８および国立科学財団（ＮＳＦ）により授与された助成金番号１４５６２２４の下で政府の支援によりなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年９月７日に作成されたＡＳＣＩＩコピーの名称は８４０２５ＰＣＴ＿ＳＬ．ｔｘｔで、大きさは１４，６３８バイトである。
【０００４】
本明細書に開示される実施形態は、概して、ビーズアレイの分野に関し、より具体的には、ビーズアレイ内のビーズコード化の分野に関する。本明細書に開示される実施形態は、ビーズベースの分析アッセイ、プロテオミクス、タンパク質定量化、親和性分離および質量分析の分野にも関する。
【背景技術】
【０００５】
生物学的アレイは、多重分析プラットフォーム技術であり、ライフサイエンス、特にゲノミクス、メタボロミクス、リピドミクス、グライコミクス、プロテオミクス、組織学、および細胞学の分野に複数の用途を見出してきた。生物学的アレイは、通常、顕微鏡スライドガラスまたはガラスビーズなどの固体支持体に固定された多数の異なる捕捉剤を特徴とする。捕捉剤は、標的分析物を結合することができる。選択した固体支持体の種類に応じて、生物学的アレイは、印刷アレイまたはビーズアレイのいずれかに分類できる。印刷アレイとビーズアレイとの主な違いは、ビーズアレイがしばしば位置コード化を欠いていることである。その結果、特定のビーズに結合されている捕捉剤の同一性は、ビーズの空間的位置から推測できない場合があり、他の手段のビーズコード化を使用する必要がある。
【０００６】
ビーズアレイをコード化する様々な方法が当技術分野で知られている。そのような方法では、光学ラベル、蛍光ラベル、光学バーコード、識別子結合リガンドおよび質量タグが利用される。
【０００７】
特定の種類のビーズアレイは、ビーズのコード化を必要としない。例えば、質量分析法により捕捉剤を直接分析し、測定された分子量、消化プロファイルまたはＭＳ−ＭＳフラグメンテーションプロファイルに基づいてそのような捕捉剤を同定することが可能であり得る。
【０００８】
質量分析法により標的分析物を直接分析し、測定された分子量、消化プロファイル、またはＭＳ−ＭＳフラグメンテーションプロファイルに基づいてそのような標的分析物を同定することも可能であり得る。
【０００９】
「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ」と題された特許文献１は、マトリックス支援レーザ脱離イオン化質量分析法（ＭＡＬＤＩ  ＭＳ）を使用して、単一ビーズに結合した非標識ペプチドと同位体標識ペプチドとの混合物を分析することを開示している。ビーズ結合ペプチドのアミノ酸配列は、タンデムＭＡＬＤＩ質量分析（ＭＡＬＤＩ  ＭＳ−ＭＳ）を使用してペプチドフラグメンテーションプロファイルを測定し、その後にデータベース検索を行うか、ｄｅ  ｎｏｖｏ同定を行うことにより決定できることが開示されている。ペプチド量の定量的測定の可能性も開示されており、それには同位体標識ペプチド、すなわち２Ｈおよび１８Ｏ同位体を含むペプチドを使用する必要がある。
【００１０】
「Ｄｅｃｏｄｉｎｇ  ｏｆ  ａｒｒａｙ  ｓｅｎｓｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ」と題された特許文献２は、質量分析を使用して、生物活性剤を既に含むマイクロスフェアに結合した識別子結合リガンド（ＩＢＬ）を同定することを開示している。開示された手法では、ＩＢＬは、ビーズ質量タグと同様に機能する。生物活性剤の特性決定は、質量分析を使用することにより直接行うことができることも開示されている。
【００１１】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる「Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ」と題された特許文献３は、マイクロアレイが活性剤コード化の従来の手段を持たない可能性があることを開示している。結果として、活性剤はそれ自体のコードとして機能し、マイクロアレイのデコード化手順は、対応するビーズから活性剤を放出し、続いて質量分析を使用して活性剤を同定することを含み得る。
【００１２】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる特許文献４（出願番号１３／３６９，９３９）は、ビーズアレイ内に存在するまたは存在する可能性がある化合物の分子量に関する情報を提供することを開示している。そのような化合物には、捕捉剤、標的、プローブ、二次プローブ、リンカー、およびビーズ質量タグが含まれてもよい。分子量情報は、質量分析データの取得を案内し、個々のビーズに存在する分析物を同定するためにも使用できることが開示されている。
【００１３】
非特許文献１は、免疫親和性濃縮に適した抗ペプチド抗体を開示している。この文献は、タンパク質標的、対応するトリプシンペプチド、それらのアミノ酸配列および予測分子量のリストを含む表も開示している。
【００１４】
非特許文献２は、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓにコンジュゲートした抗ペプチド抗体を用いて、消化されたヒト血漿をインキュベーションした後に記録したＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルを開示している。質量スペクトルの１，０００〜１，５００のｍ／ｚ領域で、複数の（２０を超える）異なるピークが検出された。これらのピークのいくつかは、ビーズコンジュゲート抗体によって特異的に捕捉されたペプチドに割り当てられた。別のピークは、抗体コンジュゲートビーズに非特異的に結合したヒト血清アルブミンに由来するタンパク質分解ペプチドに割り当てられた。ピークの大部分は特定の分析物に割り当てられておらず、その起源は不明のままであった。
【００１５】
先行技術は、反応部位が反応部位の捕捉剤に特異的に結合する標的分析物の分子量によってのみコード化される標的コード化ビーズアレイを教示も示唆もしていない。特に、先行技術は、反応部位の捕捉剤が２、３、４、またはそれ以上の数の異なる標的分析物を結合でき、各値が反応部位の捕捉剤に特異的に結合する標的分析物の分子量に由来する２、３、４、またはそれ以上の数の値の組み合わせによって反応部位がコード化される、標的コード化ビーズアレイを教示も示唆もしていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１６】
【特許文献１】米国特許第７８４６７４８号公報
【特許文献２】米国特許第７０３３７５４号公報
【特許文献３】米国特許第９６１８５２０号公報
【特許文献４】米国特許出願公開第２０１２／０２０２７０９Ａ１号公報
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】“ＭＡＬＤＩ  Ｉｍｍｕｎｏｓｃｒｅｅｎｉｎｇ（ＭｉＳＣＲＥＥＮ）：Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉ−ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ”，Ｒａｚａｗｉ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１１，３６４，５０〜６４
【非特許文献２】“Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｅａｖｙ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒａｔｉｏｓ  Ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ＮＬ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１２，１１，１８６８〜１８７８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、ビーズアレイの分析を可能にする方法および組成物が依然として必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
一態様では、本明細書は、少なくとも第１反応部位と第２反応部位とを含むビーズアレイを説明する。第１反応部位は、第１ビーズと、第１ビーズに関連付けられた第１捕捉剤とを含む。第１捕捉剤は、天然のエピトープを特異的に認識し、そのようなエピトープを含む少なくとも２つの異なる標的を特異的に結合する。異なる標的は、異なる分子量を有するタンパク質性化合物であり得る。異なる標的は、単一の前駆体タンパク質のタンパク質分解フラグメント、または異なる前駆体タンパク質のタンパク質分解フラグメントであり得る。第２反応部位は、第２ビーズと、第１捕捉剤と化学的に異なり、第２ビーズと関連付けられ、第１反応部位の捕捉剤によって認識されないエピトープを特異的に認識する第２捕捉剤とを含む。第１および第２反応部位の各々は、対応する反応部位に特異的に結合する標的の分子量に由来する少なくとも２つの異なる値を含む固有の組み合わせに関連付けられている。第１反応部位に関連付けられた組み合わせは、第２反応部位に関連付けられた組み合わせとは異なる。
【００２０】
別の態様では、本明細書は、ビーズアレイを使用して親和性結合を行う方法を説明し、この方法には、ビーズアレイをサンプルと接触させるステップと、サンプルからの第１標的および第２標的をビーズアレイの第１反応部位に結合するステップと、サンプルからの第３標的をビーズアレイの第２反応部位に結合するステップとが含まれる。第１および第２反応部位は、ビーズと捕捉剤とを含み、第１反応部位の捕捉剤は、第２反応部位の捕捉剤とは異なる。第１標的および第２標的は、分子量が５０００Ｄａ未満の、第１反応部位の捕捉剤により認識される天然のエピトープを含むタンパク質性化合物である。第３標的は、第２反応部位の捕捉剤によって認識され、第１反応部位の捕捉剤によって認識されないエピトープを含む。
【００２１】
さらに別の態様では、本明細書は、ビーズアレイをデコード化する方法を説明し、この方法には、マイクロアレイの反応部位を分析することによって生成された質量スペクトルを受信するステップと、質量スペクトル内の第１信号および第２信号を検出するステップと、第１信号および第２信号のｍ／ｚ値またはそれらの等価物が、マイクロアレイの反応部位の少なくとも１つに関連付けられた組み合わせに存在する値と一致することを検証するステップとが含まれる。
【００２２】
さらに別の態様では、本明細書は、ビーズアレイを作成する方法を説明する。この方法は、ビーズアレイの個々の反応部位を評価して、各反応部位に特異的または非特異的に結合する標的分析物の同一性および分子量を決定するステップを含む。この方法は、標的分析物の同一性および分子量に関する情報を、その後ビーズアレイに含まれるデコードテーブルに入力するステップを任意で含んでもよい。
【００２３】
さらに別の態様では、本明細書は、ビーズアレイ内の標的分析物を同定するいくつかの方法を説明する。記載の方法のいくつかは、標的分析物の分子量に由来する値を測定し、その後、マイクロアレイに備えられたデコードテーブルを使用して標的分析物の同一性を決定することを含む。記載の方法は、無細胞タンパク質転写−翻訳反応、細菌細胞培養、哺乳類細胞培養、細胞培養上清、動物モデル、異種移植片、組織生検、生体液などを含む、様々な種類の生体サンプルを分析するために利用できる。
【００２４】
本明細書に記載の分析方法および組成物は、基礎研究、医薬品の発見および開発、疾患の診断および予後、バイオマーカの発見および検証、個別化医療、精密医療、システム生物学などを含む幅広い用途に利用できる。
【００２５】
本開示の実施形態は、添付の図面を参照してさらに説明され、いくつかの図を通して同様の構造は同様の数字によって参照される。示した図面は必ずしも縮尺通りではなく、代わりに、本開示の実施形態の原理を例示することに一般的に重点が置かれている。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】いくつかの異なる反応部位を含むビーズアレイを概略的に示す。反応部位の各々は、ビーズと、２つ以上の異なる標的分析物を特異的に結合できる捕捉剤の複数のコピーとを含む。
【図１Ｂ】ビーズアレイの個々の反応部位に特異的に結合する標的分析物に関する情報を含むいくつかのエントリを含むデコードテーブルを概略的に示す。標的分析物に関する情報には、名前、データベースＩＤおよび／または配列などの同一性、ならびに分子量、質量電荷比および／または飛行時間値が含まれる。
【図２Ａ】親和性結合を行う方法を概略的に示しており、前駆体タンパク質の異なるタンパク質分解フラグメントがビーズアレイの異なる反応部位に捕捉される。
【図２Ｂ】親和性結合を行う方法を概略的に示しており、異なる前駆体タンパク質に由来するタンパク質分解フラグメントがビーズアレイの同じ反応部位に捕捉される。
【図３】磁気ビーズ分離ラックに置かれたマイクロ遠心チューブ内の複数の異なる反応部位を含む懸濁ビーズアレイの写真である。
【図４】８ウェルＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）モジュールに取り付けられ、スプリングモジュール用のＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイの中央部に配置されたマイクロウェルスライドの写真である。
【図５】マイクロウェルスライド上の５００μｍのウェル内に４００μｍの磁気アガロースビーズが配列されたビーズアレイの写真である。
【図６Ａ】ＣＨＣＡ  ＭＡＬＤＩマトリックスの結晶を含む直径５００μｍのマイクロスポットのアレイの明視野顕微鏡画像であり、いくつかのマイクロスポットは、乾燥によりサイズが縮小したアガロースビーズも含む。
【図６Ｂ】アガロースビーズの除去後のＣＨＣＡ  ＭＡＬＤＩマトリックスの結晶を含む直径５００μｍのマイクロスポットのアレイの明視野顕微鏡画像である。
【図７】酵素消化されたＭＫＮ−４５細胞溶解液にアレイを曝露した後の４プレックスビーズアレイの個々の反応部位から記録された例示的な質量スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
「マイクロアレイ」および「ビーズアレイ」という用語は、本明細書全体にわたって互換的に使用され、少なくとも２つの反応部位を含む群を指す。
【００２８】
「反応部位」という用語は、ビーズと、ビーズに関連付けられた捕捉剤との組み合わせを指す。
【００２９】
「捕捉剤」という用語は、化合物を特異的に結合できる分子または分子複合体を指す。捕捉剤の非限定的な例は、モノクローナル抗体である。「捕捉剤」という用語の単数形は、複数の分子または複数の分子複合体を指すことができる。例えば、複数の抗体分子を指すことができる。
【００３０】
「標的分析物」および「標的」という用語は、本明細書全体にわたって互換的に使用され、一般に捕捉剤の結合相手を指す。標的分析物の非限定的な例は、ペプチドである。「標的分析物」および「標的」という用語の単数形は、複数の分子、例えば複数のペプチド分子を指すことができる。
【００３１】
「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書全体にわたって互換的に使用され、ペプチド結合としても知られるアミド結合により連結された少なくとも２つのアミノ酸を含む化合物を指す。
【００３２】
「タンパク質」という用語は、生化学、生物物理学、および分子生物学の分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。一般に、少なくとも１つのポリペプチドを含む分子または分子複合体を指す。
【００３３】
「タンパク質性化合物」という用語は、ペプチド、ポリペプチド、およびタンパク質を包含する。
【００３４】
「ウェル」および「マイクロウェル」という用語は、本明細書全体にわたって互換的に使用され、液体培地、粒子、またはその両方を保持できるピットまたはくぼみなどの形態的特徴を指す。
【００３５】
「値」という用語は、一般に、大きさ、量、または数といった代数項で示される数値として定義される。
【００３６】
一実施形態では、図１Ａに概略的に示すように、本明細書は、マイクロアレイ、すなわち、第１反応部位１０２と第２反応部位１０３とを含むビーズアレイを説明する。第１反応部位は、第１ビーズ１１１に結合した第１捕捉剤１１２の複数のコピーを含む。第１捕捉剤１１２は、第１標的１２１および第２標的１２２を特異的に結合するように構成される。第１標的および第２標的の両方は、第１捕捉剤によって特異的に認識されるエピトープ１２８を含むタンパク質性化合物である。第１標的の分子量および第２標的の分子量は、５０００ダルトン（Ｄａ）未満である。第１標的の分子量は、第２標的の分子量とは異なる。第１標的の分子量は、第２標的の分子量と１Ｄａ未満または数千Ｄａほど異なっていてもよい。一実施形態では、第１標的の分子量と第２標的の分子量との差は、５Ｄａより大きい。例えば、第１標的と第２標的との間の分子量の差は、１０Ｄａより大きい、２０Ｄａより大きい、５０Ｄａより大きい、１００Ｄａより大きい、２００Ｄａより大きい、５００Ｄａより大きい、または１，０００Ｄａより大きい可能性がある。第２反応部位は、第２ビーズ１１３に結合した第２捕捉剤１１４の複数のコピーを含む。第２捕捉剤は、第１捕捉剤とは異なり、第１標的１２３、第２標的１２４、および第３標的１２５を特異的に結合するように構成される。第２反応部位の捕捉剤は、第１反応部位の捕捉剤によって認識されないエピトープ１２９を特異的に認識する。３つの標的１２３、１２４、および１２５の各々は、異なる分子量を有する。３つの標的１２３、１２４、および１２５の各々は、エピトープ１２９を含む。第１および第２ビーズは、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、他の種類のポリマー、アガロース、セルロース、他の種類のヒドロゲルまたは複合材料などの生体適合性材料から製造できる。第１および第２捕捉剤の各々は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、単一ドメイン抗体、アプタマー、ＳＯＭＡｍｅｒ（登録商標）試薬、アフィマー、タンパク質、ポリペプチド、受容体、リガンド、酵素、酵素基質、酵素阻害剤、または親和性結合が可能な他の化合物であり得る。例えば、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を選択して、第１ビーズにコンジュゲートした抗体が第２ビーズにコンジュゲートした抗体とは異なるエピトープを認識するように、特定のエピトープを認識してもよい。
【００３７】
一実施形態では、第１および第２ビーズならびに第１および第２捕捉剤は標識されていない、すなわち、検出可能な標識を含まない。例えば、ビーズおよび捕捉剤の両方に、光学ラベルおよび質量タグが欠けている場合がある。さらに、第１および第２ビーズにも位置コード化が欠けている場合がある。反応部位に位置コード化が欠けているマイクロアレイでは、反応部位の位置に基づいた捕捉剤の同定ができない。
【００３８】
第１および第２ビーズに存在する捕捉剤の量は、少なくとも１００アトモルの各標的をそれぞれの反応部位に結合させるのに十分であるのが好ましい。ビーズの特定の特性および捕捉試薬の性質に応じて、反応部位の各々は、それぞれの標的の１ピコモルを超える、さらには１０ピコモルを超える結合する能力を有し得る。
【００３９】
マイクロアレイは、少なくとも１つの反応部位の少なくとも１つの複製をさらに含み得る。例えば、図１Ａに概略的に示す第１反応部位の複製は、ビーズと、第１反応部位の捕捉剤と化学的に区別できないビーズ結合捕捉剤とを含み得る。マイクロアレイは、特定の反応部位の１〜１００個の複製を含み得る。特定の分析用途では、マイクロアレイに含まれる特定の反応部位の複製の数が比較的少ないことが望ましい場合がある。例えば、マイクロアレイは、特定の反応部位の複製を２０個未満、１５個未満、１０個未満、または５個未満含み得る。実際、特定の反応部位の複製を１、２、３、または４個提供すれば十分な場合がよくある。一態様では、特定の反応部位の複製の数が少ないことは、多数の同一反応部位間で低量の分析物が過度に希釈されて、個々の反応部位から取得される信号の強度が低下することが妨げられることを保証するのに役立つ。別の態様では、複製反応部位の数が少ないことは、試薬、例えばそのようなマイクロアレイを作製するために必要な抗体の量を減らすことにより、マイクロアレイ製造のコストを下げるのに役立ち得る。さらに別の態様では、複製反応部位の数が少ないことは、特定のビーズベースのアッセイのマルチプレックス化能力を高めるのに役立ち得る。何故なら、複製されない反応部位の数が多いことは、反応体積が小さく、その後に固体支持体で分析できることと一体であり得るからである。本明細書に開示される方法および組成物は、個々のビーズの非常に効率的な取り扱いおよび分析を可能にし、マイクロアレイ処理ステップ全体でビーズを失う可能性を最小限に抑えることに留意されたい。本明細書に開示される方法および組成物を利用して、マイクロアレイ処理ステップ全体で単一のビーズさえ失うことを防ぎ、エンドユーザがマイクロアレイ内のすべてのビーズを分析することを可能にする。本明細書に記載のマイクロアレイ操作手順により、少なくともいくつかの反応部位が固有である、すなわちマイクロアレイ内に複製を持たないマイクロアレイを組み立てることが可能になる。これにより、多くの低量の分析物の検出感度が向上する可能性がある。
【００４０】
一実施形態では、図１Ｂに概略的に示すように、マイクロアレイはデコードテーブル１３０をさらに含む。デコードテーブルには、マイクロアレイの個々の反応部位に特異的に結合する標的の同一性および分子量に関する情報が含まれる。例えば、第１反応部位に関連付けられ、「反応部位１」として概略的に示されるエントリ１３１は、第１反応部位に特異的に結合する第１標的の同一性および分子量に関する情報を含み、デコードテーブルの列１３２および１３３にそれぞれ「標的１−１」および「値１−１」として概略的に示されている。エントリ１３１は、第１反応部位に特異的に結合する第２標的の同一性および分子量に関する情報をさらに含み、それぞれ「標的１−２」および「値１−２」として概略的に示されている。同様に、「反応部位２」として概略的に示される第２反応部位に関連付けられたエントリには、第２反応部位に特異的に結合する３つの異なる標的の各々の同一性および分子量に関する情報が含まれる。
【００４１】
標的がタンパク質であるか、またはタンパク質の酵素消化などを介してタンパク質に由来している場合、標的の同一性に関する情報には、タンパク質の名前、タンパク質の識別子、データベース内のタンパク質の受入番号、タンパク質のアミノ酸組成、タンパク質内の領域のアミノ酸組成、およびタンパク質内の部位のアミノ酸組成の１つ以上が含まれ得る。より一般的には、標的の同一性に関する情報には、標的の名前、その化学組成、その構造式などの１つ以上が含まれ得る。標的の分子量に関する情報は、標的の分子量に由来する値であり得る。具体的には、標的の分子量、標的の質量電荷比（ｍ／ｚ）、標的の飛行時間（ＴＯＦ）値の１つ以上であり得る。また、（１）単一または多電荷型の標的、（２）水素付加物、アンモニウム付加物、ナトリウム付加物、カリウム付加物、または他の付加物の標的、（３）分子量の減少をもたらす、水、アンモニアの損失、または他の修飾などを受けた標的、（４）分子量の増加をもたらす酸化または他の修飾などを受けた標的のｍ／ｚ比またはＴＯＦ値など、質量分析によって測定できる別の定量値でもあり得る。デコードテーブルは、対応する捕捉剤の同一性に関する情報を任意に含み得る。例えば、捕捉剤が抗体である場合、デコードテーブルは、抗体によって認識されるエピトープの配列、抗体の製造業者、抗体のカタログ番号などに関する情報を含んでもよい。デコードテーブルに含まれるデータは、例えば紙に印刷するなど、印刷媒体で保存されてもよく、あるいは、例えばコンピュータメモリ、ＵＳＢメモリカードなどのリムーバブル・メモリ・デバイス、クラウドベースのストレージなど、電子媒体で保存されてもよい。デコードテーブルに含まれるデータは、他の手段、例えばウェブサイトの投稿、電子通信による送受信、例えば電子メールまたはテキストメッセージを介して利用可能であってもよい。あるいは、デコードテーブルに含まれるデータは、ソフトウェアプログラムまたは別の形態のコンピュータアルゴリズムによりオンデマンドで生成されてもよい。
【００４２】
デコードテーブルを提供することにより、分子量（ＭＷ）、または標的分析物の質量電荷比（ｍ／ｚ）もしくは標的分析物の飛行時間（ＴＯＦ）値などの質量分析で測定できる標的分析物の他の特性に基づいて、標的分析物の同定が可能になる。一実施形態では、標的の分子量に由来する単一の値は、標的の同一性と明確に関連付けられており、したがって、マイクロアレイ内の標的を明確に同定するのに十分である。一実施形態では、標的の分子量に由来する値は、標的のフラグメント化されていない形態の分子量に由来する値である。言い換えれば、タンデム質量分析による標的のフラグメント化は、標的の同一性を決定するために必要ではない。さらに、本開示のマイクロアレイは液体クロマトグラフィー（ＬＣ）分離を使用しないため、分析物保持時間などのＬＣ測定に関連する重要な分析パラメータをデコードテーブルに含める必要はない。
【００４３】
マイクロ・アレイ・デコードテーブルに、特定の反応部位に特異的に結合し得るすべての異なる標的の同一性および分子量に関する情報を含める必要はない。言い換えれば、特定の反応部位に特異的に結合し得る異なる標的の量は、同一性および分子量に関する情報がデコードテーブルで入手可能な異なる標的の量よりも多い場合がある。例えば、図１Ａおよび図１Ｂを参照すると、第１反応部位１０２は２より多い異なる標的を特異的に結合し、第２反応部位１０３は３より多い異なる標的を特異的に結合し得る。同一性および分子量に関する情報がマイクロ・アレイ・デコードテーブルで入手可能な異なる標的の量は、マイクロアレイ内の特定の標的、特定の標的群、または特定の反応部位を明確に同定するのに十分でなければならない。一実施形態において、デコードテーブルは、特定の反応部位に特異的に結合し得る２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の異なる標的の同一性および分子量情報を含む。一実施形態では、特定の反応部位に特異的に結合し得る異なる標的の分子量に関する情報は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２の異なる値を含む。特定の場合、マイクロアレイ内の標的の分子量は、単一の測定ＭＷ、ｍ／ｚまたはＴＯＦ値に基づいて標的を明確に同定できるように十分に固有であり得、各値は、図１Ｂで「反応部位Ｎ」、「標的Ｎ」および「値Ｎ」として概略的に示されている。
【００４４】
特定の場合、マイクロ・アレイ・デコードテーブルには、分子量情報が提供されている標的の量が、同一性情報が提供されている標的の量とは異なる特定の反応部位のエントリが含まれ得る。例えば、分子量情報が提供されている標的の量は、同一性情報が提供されている標的の量よりも多い場合がある。このような場合が、図１Ｂで「反応部位３」とラベル付けされたエントリとして概略的に示されており、「標的３」として示される単一の標的に対して同一性情報が提供されているが、分子量情報は、２つの異なる標的に対して提供されており、「値３−１」および「値３−２」として示されている。これは、例えば、特定の反応部位が、その同一性が知られていない標的を特異的に結合できる場合に起こり得る。あるいは、マイクロアレイ製造業者は、分子量情報がデコードテーブルで提供されるすべての標的の同一性を開示しないことを選択してもよい。
【００４５】
開示された種類のマイクロアレイは、標的の分子量が固有である場合だけでなく、標的の分子量が固有ではない場合、すなわち、マイクロアレイ内の２つ以上の異なる標的の分子量が同一または非常に近似していて、質量分析では分離できない場合でも、標的を明確に同定できる。例えば、図１Ａを参照すると、第１反応部位１０２に特異的に結合する標的１２２の分子量は、第２反応部位１０３に特異的に結合する標的１２５の分子量に非常に近いか同一であり得る。２つの異なる分析物の分子量が同一または非常に近似している場合、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析では区別できないが、タンデム質量分析、例えばＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦ  ＭＳまたは他の種類の質量分析では区別できる場合がある。単一の標的が、マイクロアレイ内の２つ以上の異なる反応部位に特異的に結合できることもあり得る。例えば、第１反応部位１０２に特異的に結合する図１Ａに概略的に示す標的１２１は、第２反応部位１０３にも特異的に結合し得る。そのような場合、マイクロアレイの単一の反応部位によって捕捉され、単一の質量スペクトル、いわゆるスペクトルシグネチャで一緒に検出され得る２、３、４、５またはさらにそれ以上の数の異なる標的の分子量、ｍ／ｚ値、またはＴＯＦ値の組み合わせは、質量分析によって対応する標的を明確に同定できるように十分に固有である。２つ以上の値を使用して特定の標的分析物および／または特定の反応部位の同一性を判断する利点としては、分析物の同定の信頼性の向上と、マイクロアレイベースの分析方法における高度なマルチプレックス化とが挙げられる。
【００４６】
開示された種類のマイクロアレイは、同じ反応部位によって捕捉された異なる標的の数が、異なるサンプル間で相違するような分析用途にも適しており、異なるサンプルとは、例えば異なる細胞株、または異なる化合物で処理された細胞株である。
【００４７】
開示されたマイクロアレイコード化システムは、マイクロアレイ内の標的分析物を同定するために、質量分析による標的分析物のフラグメント化または配列決定を必要としないことが以前に指摘された。それにもかかわらず、質量分析、例えばタンデム質量分析による分析物の配列決定は、マイクロアレイに存在する標的分析物の一部またはすべてに対して、分析物の同定の信頼性を高めるため、または分析物の同定以外の目的のために、任意で行うことができる。例えば、ペプチド配列内の翻訳後修飾の位置を決定するために、タンデム質量分析によりペプチドを分析してもよい。
【００４８】
質量分析による配列決定は、特にマイクロアレイの反応部位によって捕捉された個々の標的分析物を同定する目的でも使用できる。そのような場合、デコードテーブルに含まれる標的分析物の分子量および同一性に関する情報は冗長である可能性があり、したがって、デコードテーブルをマイクロアレイに供給する必要がない場合がある。マイクロアレイは、マイクロアレイによって捕捉された個々の標的分析物のＭＳ−ＭＳ配列決定を使用してデコード化される。そのような手法の潜在的な利点の１つは、マイクロアレイの反応部位に結合する新規分析物を発見および同定する可能性である。しかしながら、これには、ＭＳ−ＭＳ（ＭＳ２）分析を実施できるより高度なＭＳ機器の利用が必要である。
【００４９】
質量分析による配列決定は、タンデム質量タグ（ＴＭＴ）ならびに相対および絶対定量（ｉＴＲＡＱ）の等圧タグなどの化学標識法を使用して、複数のサンプルのタンパク質量変化の定量プロファイリングにも使用できる。本明細書に含まれる実験例では、ＴＭＴおよびｉＴＲＡＱベースのタンパク質定量研究を行うのに適した、大径で結合能の高い磁気アガロースビーズについて説明する。
【００５０】
一実施形態では、本開示のマイクロアレイは、複数の異なる反応部位およびマイクロアレイデコード化手段、例えばマイクロ・アレイ・デコードテーブルを含む。そのようなマイクロアレイの反応部位の各々は、１〜３０個の異なる標的を特異的に結合するように構成されており、各標的は異なる分子量を有する。反応部位の各々には、ビーズと、ビーズに関連付けられた捕捉剤とが含まれる。反応部位の各々は、１〜３０個の異なる値を含む組み合わせに関連付けられており、各値は、対応する反応部位に特異的に結合する標的の分子量に由来する。特定の反応部位に関連付けられた組み合わせは、標的分析物の測定分子量または同等のパラメータ、例えばｍ／ｚもしくはＴＯＦ値を使用して標的分析物の同定を可能にするコードとして機能する。そのような組み合わせは、（１）同一性および（２）各標的の分子量に関する情報を含むマイクロ・アレイ・デコードテーブルの一部であり得る。デコードテーブルは、特定の反応部位に特異的に結合し得る異なる標的の量に関する情報をさらに含み得る。また、生体液または細胞溶解液などの生体サンプル中の個々の異なる標的の存在量に関する情報も含まれ得る。存在量情報は、定量的または定性的な形で提供されてもよい。例えば、デコードテーブルには、特定のペプチド分析物が特定の細胞株から調製されたサンプルに存在しないかまたは検出できないという記述が含まれ得る。
【００５１】
本開示のマイクロアレイは、２〜１００個の異なる反応部位を含み得る。あるいは、本開示のマイクロアレイは、１００を超える異なる反応部位を含み得る。複数の反応部位を特徴とするマイクロアレイの実験例が、本明細書で提供される。
【００５２】
本開示のマイクロアレイは、２〜１００個の異なる標的を特異的に結合するように構成してもよく、異なる標的の各々は異なる分子量を有する。あるいは、本開示のマイクロアレイは、１００〜５００個の異なる標的を特異的に結合するように構成してもよい。あるいは、本開示のマイクロアレイは、５００を超える異なる標的を特異的に結合するように構成してもよい。異なる標的は、単一のタンパク質または複数の異なるタンパク質に由来し得る。例えば、マイクロアレイは、天然の前駆体タンパク質の異なるタンパク質分解フラグメントを特異的に認識して結合する異なる捕捉剤を含み得る。マイクロアレイに含まれる捕捉剤によって認識される、そのような前駆体タンパク質の異なるタンパク質分解フラグメントの数は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０であるかまたは１０を超えてもよい。同じ前駆体タンパク質の様々な領域に由来するタンパク質分解フラグメントの結合により、タンパク質の一次配列のかなりの部分、タンパク質の完全な配列までの分析が可能になる。具体的には、マイクロアレイは、前駆体タンパク質の異なるタンパク質分解フラグメントを結合する異なる捕捉剤を含んでもよく、これらは集合的に、タンパク質の一次配列の長さの５％超、１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、または１００％を占める。そのような異なる捕捉剤は、異なるビーズに関連付けられており、したがって、異なるタンパク質分解フラグメントは、異なる反応部位によって捕捉される。同じタンパク質に由来する異なるペプチドを結合できるマイクロアレイのいくつかの例が、本明細書で提供されている。
【００５３】
本開示のマイクロアレイは、１００個未満の異なる標的、１００〜１，０００個の異なる標的、または１，０００個を超える異なる標的の分析を行うように構成してもよい。本開示のマイクロアレイを使用して分析され得る異なる標的の数は、個々の標的の化学組成、質量分析計のスペクトル分解能、および質量分析計の検出質量範囲を含むいくつかの要因によって決定される。例えば、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによって線形モードで測定されるタンパク質分解ペプチドの場合、検出質量範囲は約８００Ｄａ〜８，０００Ｄａに設定できる。個々のタンパク質分解ペプチドの分子量が約５Ｄａ離れており、現代のＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ機器のスペクトル分解能の範囲内にある場合、そのようなマイクロアレイ内で１，０００を超える異なる標的分析物を測定し、明確に同定することができる。
【００５４】
本開示のマイクロアレイは、複数の異なる標的を結合するように構成してもよく、異なる標的の各々は、７００Ｄａより大きく３０，０００Ｄａより小さい分子量を有する。本開示のマイクロアレイはまた、７００Ｄａより小さいかまたは３０，０００Ｄａより大きい分子量を有する標的を結合するように構成してもよい。本明細書では、１，０００Ｄａ未満、１，０００〜１０，０００Ｄａ、および１０，０００Ｄａ超の分子量を有する標的を結合できるマイクロアレイの実験例が提供されている。
【００５５】
本開示のマイクロアレイは、タンパク質のＣ末端に隣接する領域に由来する複数の標的の結合を行うように構成してもよい。これを達成するために、タンパク質一次配列のＣ末端の十分近くに、例えば、タンパク質Ｃ末端からアミノ酸３個未満、５個未満、７個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、または２５個未満に位置するエピトープを認識するように抗体を選択することができる。そのようなマイクロアレイを使用して、とりわけ、Ｃ末端領域のタンパク質の不均一性、タンパク質分解および／またはタンパク質修飾を検出できる。
【００５６】
本開示のマイクロアレイは、タンパク質のＮ末端に隣接する領域に由来する複数の標的の結合を行うように構成してもよい。これを達成するために、一次配列のタンパク質Ｎ末端の十分近くに、例えば、タンパク質Ｎ末端からアミノ酸３個未満、５個未満、７個未満、１０個未満、１５個未満、２０個未満、または２５個未満に位置するエピトープを認識するように抗体を設計することができる。そのようなマイクロアレイを使用して、とりわけ、開始剤メチオニンの除去および／またはタンパク質Ｎ末端のアセチル化を検出できる。
【００５７】
一実施形態では、本開示のマイクロアレイは、複数の異なる標的を結合するように構成され、異なる標的の少なくとも１つのフラグメント化パターンに関する情報を含むデコードテーブルを含む。特定の標的のフラグメント化パターンに関する情報を使用して、標的の同一性を確認することができる。標的のフラグメント化パターンに関する情報を含むデコードテーブルを含むマイクロアレイの実験例は、本明細書で提供されている。
【００５８】
本開示のマイクロアレイは、位置、光学、および質量タグのコード化を欠く１つまたはいくつかの反応部位を含み得る。一実施形態では、マイクロアレイのすべての反応部位は、位置、光学、および質量タグのコード化を欠いている。さらに、マルチプレックス・サンドイッチ・イムノアッセイとは異なり、本開示のマイクロアレイは、標的分析物ごとに単一の（捕捉）抗体のみを含み、標的分析物ごとに２つの異なる抗体（捕捉および検出）を必要とせず、含まない。
【００５９】
一実施形態では、本明細書は、少なくとも２つの異なる反応部位およびデコードテーブルを含むマイクロアレイを開示する。異なる反応部位の各々は、少なくとも１つの標的を特異的に結合できる。デコードテーブルには、異なる反応部位の各々に特異的に結合する標的の同一性および分子量に関する情報、ならびにサンプル内の標的の少なくとも１つの存在量に関する情報が含まれる。デコードテーブルには、任意で、標的の存在量データが提供されたサンプルの説明を含めることもできる。
【００６０】
サンプル中の標的の存在量に関する情報を提供することにより、マイクロアレイをサンプルと反応させた後の、質量分析による標的の同定の信頼性を高めることができる。
【００６１】
特定の標的の存在量情報は、様々な形式で提供できる。一実施形態において、存在量情報は、サンプル中の標的の存在の可能性に関する情報として提供される、すなわち、特定の標的が、サンプル中に存在するまたは存在しないことを予想することができる。例えば、マウス由来のタンパク質は、ヒト細胞株由来のサンプルには存在しないと予想される。別の例では、特定のタンパク質またはタンパク質アイソフォームが特定の細胞株、特定の臓器または特定の組織種類で発現せず、したがって、そのようなサンプル中のその存在量はゼロになることは既知であり得る。一実施形態では、存在量情報は、サンプル中の２つ以上の標的の相対的な存在量に関する情報として提供される。例えば、特定の前駆体タンパク質の２つのアイソフォームが特定の比率で存在すると予想されるか、アイソフォームの少なくとも一方が他方よりも多く存在すると予想され得る。別の例では、特定の前駆体タンパク質の２つのＰＴＭ部位が特定の比率で存在すると予想される場合があり、その場合、一方の部位が他方よりも大幅に修飾、例えばリン酸化されている。一実施形態では、存在量情報は定量的形態で提供される。例えば、血清または血漿中の特定のタンパク質の存在量に関する情報は、少なくともおおよそ既知であり、濃度範囲、例えば、ｍｇ／ｍｌ、μｇ／ｍｌ、ｎｇ／ｍｌまたはｐｇ／ｍｌとして表すことができる。別の例では、特定の分析物から予想される質量スペクトル信号のおおよその強度が提供され得る。
【００６２】
標的の存在量データが提供されるサンプルの説明には、サンプルの起源、例えば特定の細胞株、組織、生体液など；特定の化合物への細胞株の曝露などのサンプル処理条件；サンプル処理履歴、例えば特定の消化酵素の使用のうちの１つ以上が含まれ得る。
【００６３】
マイクロアレイの異なる反応部位に特異的に結合する異なる標的分析物のいくつかの非限定的な例を以下に提供し、本明細書の実施例の項でさらに説明する。
【００６４】
ペプチドアイソフォームとは、密接に関連しているが同一ではないアミノ酸配列を有するペプチドである。配列の違いには、アミノ酸の追加、アミノ酸の削除、アミノ酸の置換、およびアミノ酸の修飾が含まれ得る。アミノ酸修飾は、リン酸化、アセチル化、メチル化、ユビキチン化、グリコシル化などの翻訳後修飾（ＰＴＭ）であり得る。単一のペプチド配列には、複数のＰＴＭ部位および複数のＰＴＭ種類が含まれ得る。例えば、タンパク質リン酸化は、単一のペプチド配列内の複数の隣接部位で発生し得る。
【００６５】
異なる化学修飾を有するペプチド：ペプチドの化学修飾には、通常、１つ以上の化学基のペプチドへの、つまりアミノ酸の側鎖またはペプチドのＮもしくはＣ末端基への共有結合が含まれる。ペプチドを修飾できる多数の試薬が知られている。例えば、ペプチドは、リジン側鎖の第一級アミンおよびペプチドＮ末端を標的とするＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルまたはイミドエステルを含む化合物で共有結合的に修飾されてもよい。具体的には、シアニン色素ＣＹ（登録商標）３およびＣＹ（登録商標）５、クマリンまたはクマリン誘導体などの蛍光色素でペプチドを示差的に標識することができる。
【００６６】
他の点では同一のアミノ酸配列内に異なる数の化学修飾を含むペプチド：例えば、ペプチドは、Ｎ末端アミンおよびさらにリジン側鎖アミンでも化学修飾される。したがって、２つのリジン残基を有するペプチドには、０、１、２、または３個の化学修飾アミンが含まれ得る。
【００６７】
内因性ペプチドと内部標準：通常、内部標準はスパイクされる、つまり、内因性ペプチドを既に含むサンプルに追加される。内部標準は、内因性ペプチドの配列とは異なる配列を有する合成ペプチドであってもよい。
【００６８】
失敗した切断部位を含むタンパク質分解ペプチド：トリプシン、キモトリプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕＣ、ＬｙｓＣ、ＬｙｓＮ、Ａｒｇ−Ｃ、ペプシン、エラスターゼなどの消化酵素による前駆体タンパク質の消化により、０、１、２、３、４、５、６、またはそれ以上の数の切断の失敗を含む複数のペプチドが生成され得る。そのようなペプチドは、同じエピトープを有するが、長さが異なり、結果として分子量が異なる場合がある。さらに、一部の消化酵素は非特異的活性を示す場合があり、例えば、トリプシンの特定の製剤はキモトリプシン活性をさらに示す場合がある。そのような筋書きでは、タンパク質分解ペプチドは、対応する消化酵素に典型的ではない、または予想されない切断部位を含む場合がある。
【００６９】
ペプチド結合の非酵素的加水分解によって生成されたペプチド：特定の種類のペプチド結合は、本質的に安定性が低く、消化酵素がなくても加水分解を受ける場合がある。これらには、臭化シアンの存在下でのメチオニン含有ペプチド結合の加水分解、ギ酸の存在下でのアスパラギン酸−プロリンペプチド結合の加水分解、ヒドロキシルアミンの存在下でのアスパラギン−グリシンペプチド結合の加水分解が含まれる。ペプチド結合の部分加水分解により、長さが異なる２つ以上の異なるペプチドが出現する。
【００７０】
異なる種に由来するペプチド：タンパク質分解消化と組み合わせた腫瘍異種移植片の生成など、特定の生物学的技法により、異なる種、例えばヒトとマウスに由来するペプチドの混合物が生成される場合がある。そのようなペプチドは同じエピトープを有するが、エピトープ外のアミノ酸組成が異なる場合がある。
【００７１】
反応部位の捕捉剤によって認識されるエピトープ内で同一または類似の配列を共有するタンパク質に由来するペプチド。そのようなタンパク質は、同じ生物学的経路または異なる生物学的経路の構成要素であり得る。後者の場合、単一のマイクロアレイ反応部位は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上の数の異なる生物学的経路の構成要素であるタンパク質に由来するペプチドを特異的に結合するように構成され得る。したがって、単一のマイクロアレイ反応部位は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の数の異なる生物学的経路の変化をプローブするように構成され得る。
【００７２】
図２Ａ〜図２Ｂは、マイクロアレイのいくつかの例、およびマイクロアレイを使用して親和性結合を行う方法を概略的に示す。図２Ａを参照すると、マイクロアレイ、すなわちビーズアレイは、異なるビーズ２０７、２０８、および２０９に関連付けられた異なる捕捉剤を含み得る。異なる捕捉剤は、天然のタンパク質２０１の配列に存在する異なるエピトープを特異的に認識する。エピトープがタンパク質分解消化後に保存される場合、異なる反応部位は、対応するエピトープを含む異なるタンパク質分解フラグメント２０２、２０３、２０４、および２０５も特異的に認識し、特異的に結合する。マイクロアレイは、複数の異なるタンパク質分解フラグメントを特異的に認識する複数の異なる捕捉剤を含んでもよく、これらは集合的に、タンパク質の配列長の１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、または１００％を占める。例えば、タンパク質分解フラグメントが重複していない場合、タンパク質の２つのタンパク質分解フラグメントは集合的にタンパク質の配列長の２０％超を占め、各タンパク質分解フラグメントは１０個を超えるアミノ酸を含み、タンパク質全体は１００個未満のアミノ酸を含む。
【００７３】
重複するタンパク質分解フラグメント２０２および２０３が、例えば不完全な酵素消化により生じる可能性がある同じエピトープを含む場合、図２Ａに概略的に示されるように、同じ捕捉剤によって認識され、同じ反応部位２０７によって捕捉される。
【００７４】
図２Ｂを参照すると、２つの異なるタンパク質２１１および２１２のタンパク質分解消化により、同一のフラグメント２１５が生成され、ビーズアレイの同じ反応部位２１９によって捕捉される可能性がある。フラグメント２１５の存在量の測定により、前駆体タンパク質２１１および２１２の両方の存在量に関する情報が得られるが、個々のタンパク質の存在量に関する情報は得られない。それぞれタンパク質２１１および２１２に由来するタンパク質分解フラグメント２１４および２１６を特異的に捕捉する追加の反応部位２１７および２１８を含めることにより、タンパク質特異的な定量化が可能になる。あるいは、タンパク質２１１および２１２に由来するフラグメント２１５は、共通のエピトープを有するが、エピトープ外のアミノ酸組成の違いにより分子量が異なる可能性がある。このような場合、単一の反応部位で捕捉された場合でも、質量分析によってフラグメントを区別する。
【００７５】
マイクロアレイ内の異なる捕捉剤は、分子量が５０００Ｄａ未満のタンパク質性化合物内の異なるエピトープを個々に認識し得る。
【００７６】
マイクロアレイの捕捉剤によって認識されるエピトープは、ヒトタンパク質およびマウスタンパク質、またはより一般的には異なる種に由来する少なくとも２つのタンパク質に存在する天然の配列であり得る。したがって、マイクロアレイの反応部位は、ヒトおよびマウスの両方のタンパク質に由来するタンパク質分解フラグメントを結合し得る。このようなマイクロアレイの例は、本明細書に記載されている。
【００７７】
マイクロアレイは、第１反応部位の捕捉剤によって認識されるエピトープが、第１タンパク質および第２タンパク質に天然に存在する一方、第２反応部位の捕捉剤によって認識されるエピトープが、第１タンパク質に天然に存在するが、第２タンパク質に存在しないように設計され得る。このようなマイクロアレイの例は、本明細書に記載されている。
【００７８】
マイクロアレイは、第１および第２反応部位の捕捉剤によって認識されるエピトープが、トリプシンおよびキモトリプシンによって認識されるタンパク質分解切断部位を欠くように設計され得る。トリプシンは、通常、リジンまたはアルギニンを含むタンパク質分解切断部位を認識するが、切断部位にプロリンが続く場合、またはホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシンなどのリン酸化アミノ酸に隣接する場合を除く。場合によって、トリプシンは、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ａｒｇ−Ａｒｇ、Ｌｙｓ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ｌｙｓ配列を含む部位を認識しないことがある。キモトリプシンは、通常、チロシン、トリプトファン、フェニルアラニンなどの大きな疎水性アミノ酸を含む部位を認識するが、ロイシン、イソロイシン、メチオニンを含む部位も認識する。このようなマイクロアレイは、トリプシンまたはキモトリプシンのいずれかを使用した酵素消化によって生成されたサンプルのプロファイリングに有用であり得る。このようなマイクロアレイの例は、本明細書に記載されている。
【００７９】
マイクロアレイは、第１反応部位の捕捉剤によって認識されるエピトープが、トリプシンによって認識されるタンパク質分解切断部位を欠く一方、第２反応部位の捕捉剤によって認識されるエピトープが、そのようなタンパク質分解切断部位を含むように設計され得る。このようなマイクロアレイは、トリプシンまたは別のプロテアーゼのいずれかを使用した酵素消化によって生成されたサンプルのプロファイリングに有用であり得る。このようなマイクロアレイの例は、本明細書に記載されている。
【００８０】
マイクロアレイは、第１および第２反応部位の捕捉剤によって認識されるエピトープが、少なくとも２つの消化酵素、例えばトリプシン、キモトリプシン、ペプシン、エラスターゼ、サーモリシン、エンドプロテイナーゼＡｒｇ−Ｃ、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−ＣおよびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎの少なくとも２つによって認識されるタンパク質分解切断部位を欠くように設計され得る。このようなマイクロアレイの例は、本明細書に記載されている。
【００８１】
マイクロアレイは、第１反応部位の捕捉剤が、ＰＴＭを欠くエピトープを特異的に認識し、第１標的および第２標的を特異的に結合するように設計されてもよく、第１標的および第２標的は両方ともエピトープを含むが、２つの標的の一方のみがエピトープ外に位置するＰＴＭを含む。このようなマイクロアレイの例は、本明細書に記載されている。
【００８２】
マイクロアレイは、第１反応部位の捕捉剤が、第１ＰＴＭ、例えばリン酸化を含むエピトープを特異的に認識し、第１標的および第２標的を特異的に結合するように設計されてもよく、第１標的および第２標的は両方ともエピトープを含むが、標的の少なくとも一方は、エピトープ外に位置する第２ＰＴＭ、例えばアセチル化、メチル化、グリコシル化、ユビキチン化またはＳＵＭＯ化も含む。第１ＰＴＭの部位は、第２ＰＴＭの部位からアミノ酸１０個未満だけ離れていてもよい。このようなマイクロアレイの例は、本明細書に記載されている。
【００８３】
マイクロアレイは、第１反応部位の捕捉剤が少なくとも２つのＰＴＭを含むエピトープを特異的に認識し、第１標的および第２標的を特異的に結合するように設計されてもよく、第１標的および第２標的の少なくとも一方は、エピトープ外に位置する追加のＰＴＭをさらに含む。このようなマイクロアレイの例は、本明細書に記載されている。
【００８４】
マイクロアレイは、マイクロアレイの異なる反応部位が、天然のタンパク質の少なくとも３つの異なるタンパク質分解フラグメントを特異的に結合するように設計され得る。一実施形態では、異なる各フラグメントは、少なくとも１つのＰＴＭを含む。このようなマイクロアレイの例は、本明細書に記載されている。
【００８５】
マイクロアレイには、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリー、免疫組織化学、免疫沈降または免疫蛍光アッセイで対応するエピトープを特異的に認識する捕捉剤が含まれ得る。このようなマイクロアレイの例は、本明細書に記載されている。
【００８６】
マイクロアレイには、線形モードＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳで検出可能だが、反射モードＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳでは検出できない第１標的と、反射モードＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳで検出可能な第２標的との２つの異なる標的を特異的に結合する捕捉剤を含めてもよい。線形モードＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳで検出可能な標的には、例えばリン酸化ペプチドのような不安定な化合物、または例えば１０ｋＤａを超える高分子量の化合物が含まれる。実施例１４に詳細に記載されているヤギ抗アコニターゼ２抗体は、無傷のＡＣＯ２タンパク質（ＭＷ８５，４２５Ｄａ、マトリックスとしてシナピン酸を使用する線形モードＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳで検出可能）と、アミノ酸５４１〜５５５を含むそのタンパク質分解フラグメント（ＭＷ４７８１．１Ｄａ、マトリックスとしてα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸を使用する反射モードＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳで検出可能）との両方を認識する。
【００８７】
マイクロアレイには、ＭＡＬＤＩ  ＭＳによる検出に異なるマトリックスを必要とする２つの異なる標的を特異的に結合する捕捉剤が含まれ得る。このような異なるマトリックスの例には、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）と２，５−ジヒドロキシ安息香酸（ＤＨＢ）、ＣＨＣＡとシナピン酸（ＳＡ）、ＣＨＣＡと２´，６´−ジヒドロキシアセトフェノン（ＤＨＡＰ）、および他の組み合わせが含まれる。このような捕捉剤の例は、前の段落で説明したヤギ抗アコニターゼ２抗体である。
【００８８】
一実施形態では、２つの異なる標的は、同位体標識を含まない、すなわち、第１標的および第２標的は同様の同位体量を有する。例えば、第１および第２標的の両方が、その構造に存在するすべての化学元素に関して天然の同位体量を有する場合がある。炭素および窒素の場合、天然の同位体量は、それぞれ１２Ｃが約９８．９％、１４Ｎが約９９．６％であることが知られている。
【００８９】
一実施形態では、２つの異なる標的は、異なる同位体量を有し、例えば第１標的、第２標的、または第１標的および第２標的の両方は同位体標識されている。ペプチドの同位体標識は、２Ｈ、１３Ｃ、１５Ｎ、１８Ｏなどの１つまたはいくつかの安定同位体を組み込むことで実現できる。ペプチドの同位体標識は、放射性同位体を使用することでも実現できる。単一アミノ酸中の同位体標識の存在は、通常、同じアミノ酸の非標識バージョンと比較して４〜１０Ｄａの質量シフトをもたらす。
【００９０】
典型的なボトムアッププロテオミクスアッセイにおけるタンパク質分解ペプチドの非標識形態と同位体標識形態との質量差は、通常１０Ｄａを超えないことに留意されたい。これは、部分的には、最も一般的な消化酵素であるトリプシンが、一般に単一のリジンまたはアルギニン残基を含むペプチドを生成するためである。リジンおよびアルギニンの１３Ｃ、１５Ｎ同位体標識バージョンは、それぞれ８および１０Ｄａだけそれらの非標識の対応物と異なる。キモトリプシンなどの他の消化酵素を使用することにより、いくつかのリジンおよび／またはアルギニン残基を含むタンパク質分解ペプチドが生成され得るが、これらのアミノ酸を含まないペプチドも生成され得る。
【００９１】
一実施形態では、反応部位は、質量分析法による第１および第２標的の分析に適合する形態のビーズから第１および第２標的を放出できるように構成されている。本明細書を通して、質量分析の使用は、主にマトリックス支援レーザ脱離イオン化飛行時間質量分析法（ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳ）の例を使用して説明されている。しかしながら、分析物イオン化および分析物検出の両方に関して、質量分析的分析の多くの他の方法を代わりに使用できることに留意されたい。特に、レーザ・アブレーション・エレクトロスプレー・イオン化（ＬＡＥＳＩ）および脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）ＭＳとして知られる方法を含む、エレクトロスプレーイオン化ＭＳ（ＥＳＩ  ＭＳ）分析の様々な方法を使用できる。
【００９２】
一実施形態では、第１および第２標的はペプチドであり、質量分析による分析は、線形モードのＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによって行われる。反射モードと比較して線形モードでペプチドを測定する利点としては、検出感度の向上と、インソース分解（ＩＳＤ）およびポストソース分解（ＰＳＤ）などの分析物のフラグメント化によるスペクトルの影響の最小化が挙げられる。例えば、多くのリン酸化ペプチドは、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳで測定する場合、質量分析計内で広範囲にフラグメント化することが知られている。しかしながら、それらのフラグメントのスペクトル効果は、反射モードで取得した質量スペクトルと比較して、線形モードで取得した質量スペクトルではそれほど顕著ではない。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによって行われるペプチド分析では、ポジティブ検出モードがより頻繁に使用されるが、ネガティブ検出モードも利用できる。分子量が約１０，０００Ｄａ未満の分析物の場合、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによる測定は反射モードで実施され得る。さらに、ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによる特定の分析物の測定は、タンデム（ＭＳ−ＭＳ）モードで実行され得る。
【００９３】
質量電荷比（ｍ／ｚ）は、質量分析で一般的に測定される分析物の特性の１つである。通常、測定されたｍ／ｚ比を分析物の分子量（ＭＷ）に変換することは簡単である。例えば、ポジティブモードでＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによって測定されるペプチド分析物は、多くの場合、電荷（ｚ）が＋１で、質量（ｍ）がペプチド分析物の分子量にプロトンの質量を加えたものに等しい、単一電荷のプロトン化イオンとして検出される。したがって、質量分析を使用して、測定された分析物の分子量を決定できる。分子質量とも呼ばれる分子量は、通常、原子質量単位（ａｍｕ）またはダルトン（Ｄａ）で報告される。分析物構造に１３Ｃや１５Ｎなどの安定同位体が存在すると、分析物の質量スペクトルに、約１ｍ／ｚ単位だけ離れた複数のピークが出現する。このような複数のピークは、同位体エンベロープとして知られている。同位体エンベロープの存在により、質量分析で測定された分析物の分子質量は、モノアイソトピック質量または平均質量として報告され得る。
【００９４】
本明細書で開示されるマイクロアレイは、特定のビーズに結合した標的分析物の同一性がその標的分析物の直接の質量分析測定により決定され得る標的コード化ビーズアレイとして説明され得る。標的コード化ビーズアレイは、個々のビーズの位置、光学、または質量タグのコード化を必要としない。さらに、標的コード化ビーズアレイは、捕捉剤の質量分析法的な分析を必要としない。その結果、対応する標的分析物がビーズから放出された後でも、捕捉剤をビーズに結合したままにできる。ビーズから標的分析物が放出された後もビーズに捕捉剤を保持することは、より良い品質の質量スペクトル、例えば背景が弱く分析物の信号が強い質量スペクトルを得るのに役立ち得る。あるいは、捕捉剤は、質量分析法による分析に必ずしも適合しない形態の、例えば捕捉剤の分子量が質量分析計の質量検出範囲外であるような形態のビーズから放出されてもよい。
【００９５】
標的コード化ビーズアレイは、標的分析物がそれぞれの捕捉剤に結合した後に、例えばビーズアレイがサンプルに曝露された後、好ましくはサンプルの未反応部分が除去された後にデコード化される。質量分析法による分析には、複数のｍ／ｚ位置（複数の質量チャネル）における信号強度の測定が含まれ、したがって、１回の質量分析測定で、サンプル中の特定の標的分析物の同一性およびその存在量の両方を決定するのに十分なデータが得ることができることに留意されたい。
【００９６】
標的コード化ビーズアレイ内の標的分析物の同定の成功は、サンプル内の標的分析物の十分な存在量に依存することに留意されたい。サンプル中の標的分析物の量が検出限界を下回る場合、標的分析物は検出も同定もされない。それでも、このような否定的な結果は、特定の標的分析物がサンプル中に存在しないか、サンプル中のその存在量が特定の閾値を下回っていることを明らかにするため、貴重な情報を提供する。
【００９７】
標的コード化ビーズアレイを作製する例示的な方法を以下に開示し、本明細書の実施例の項でより詳細に説明する。一実施形態では、本方法は、（１）ビーズに結合でき、ビーズに結合すると、分子量が異なる少なくとも第１標的および第２標的を結合できる捕捉剤を選択するステップと、（２）第１標的の同一性、第１標的の分子量に由来する値、および第２標的の分子量に由来する値に関する情報を含む、デコードテーブルを記録するステップとを含む。
【００９８】
ステップ１：捕捉剤の選択。このステップには、ビーズアレイで使用する抗体の選択および取得が含まれる。特定のバイオマーカのプロファイリング、特定の種類のタンパク質修飾のプロファイリング、特定の生物学的または細胞経路のプロファイリング、複数の細胞経路のプロファイリング、特定の疾患または特定の細胞状態に関連する分子変化のプロファイリングなどを目的として抗体を選択できる。総タンパク質量をプロファイルするために抗体を選択でき、あるいは特定のタンパク質部位でのタンパク質の翻訳後修飾（ＰＴＭ）の程度など、部位特異的タンパク質量をプロファイルするために抗体を選択できる。抗体は、商業ベンダーから購入するか、カスタム生産できる。抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよい。抗体は、様々な宿主種、例えば、ウサギ、マウス、ヤギ、ウマ、ニワトリで成育するか、または合成的に生産できる。異なる宿主種に由来する抗体を同じビーズアレイ内で利用できる。一実施形態では、免疫原はペプチドである。一実施形態では、免疫原は完全長タンパク質または生体細胞である。特定の抗体のエピトープ配列または免疫化ペプチドの配列が既知であることが好ましい。しかしながら、エピトープ配列または免疫化ペプチドの配列が既知でない抗体を利用することも可能である。後者の例は、本明細書の実施例の項に示されている。
【００９９】
多くの市販の抗体には、これらの抗体が検証されている手法、例えば、ウェスタンブロット（ＷＢ）、免疫沈降（ＩＰ）、免疫蛍光（ＩＦ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、フローサイトメトリー（ＦＣ）、クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチイムノアッセイなどのリストがすでに提供されているため、商業ベンダーから抗体を入手することには利点がある。このような情報は、細胞培養、組織、生体液、動物モデルで上記の手法を使用して実施される同じタンパク質標的の追跡調査と、質量分析による特定のタンパク質標的の定量分析との統合を可能にするため、貴重であり得る。
【０１００】
既知のエピトープを有する抗体を選択する際の考慮事項の１つは、エピトープが標的分析物に保存されていなければならないことである。特に、分析されるサンプルがタンパク質の消化酵素とのインキュベーションによって生成される場合、エピトープは消化酵素の切断部位を含まないことが好ましい。例えば、トリプシンとのインキュベーションによって生成されるサンプルの場合、エピトープは内部アルギニンまたはリジンを含まないことが好ましい。同様に、Ｌｙｓ−ＣまたはＬｙｓ−Ｎとのインキュベーションによって生成されるサンプルの場合、エピトープは内部リジンを含まないことが好ましい。しかしながら、切断部位がエピトープ内に存在する可能性がある場合でも、消化酵素による不完全な消化によってエピトープが保存されている可能性があるため、上記の要件は絶対的ではない。さらに、特定のタンパク質修飾は、消化酵素によって通常認識される切断部位のパターンを変更する場合がある。例えば、リジンに隣接するチロシンのリン酸化は、しばしばトリプシンによる切断の失敗をもたらす。既知のエピトープを有する抗体を選択するための別の考慮事項は、ペプチド免疫親和性濃縮を行うために一般に線形または連続エピトープが好ましいことである。
【０１０１】
全体として、異なる捕捉剤の総数、例えば特定のビーズアレイ用に選択される異なる抗体は、１０未満、１０〜３０、３０〜１００、１００〜５００、５００〜１，０００、１，０００〜１０，０００、または１０，０００超であり得る。複数の複製ビーズ、例えば２個のビーズ、３個のビーズ、５個のビーズ、１０個のビーズ、またはそれ以上の数のビーズを各捕捉剤に提供してもよい。直径約３００μｍの球形ビーズの場合、約２５個のビーズを１μＬの体積に、約２，５００個のビーズを１００μＬの体積に、約２５，０００個のビーズを１ｍｌの体積に詰めることができる。標準顕微鏡スライドの寸法のマイクロウェルプレート、２５×７５ｍｍを使用して、直径３００μｍのビーズを５，０００個を超えて配列できる。標準マイクロタイタープレートの寸法のマイクロウェルプレート、８６×１２８ｍｍを使用して、直径３００μｍのビーズを２５，０００個を超えて配列できる。
【０１０２】
ステップ２：デコードテーブルの記録。このステップには、ステップ１で事前に選択した個々の抗体に結合し得るペプチドの同一性を明らかにすることが含まれる。具体的には、特定の抗体に結合すると予想されるペプチドについて、可能な翻訳後修飾（ＰＴＭ）を含むペプチドのアミノ酸配列およびペプチド分子量を明らかにすることが好ましい。そのようなデータは、特定の抗体の既知のエピトープ配列を分析し、その後、特定の分析ワークフローに関連する異なるサンプル調製条件を説明するために、エピトープ外のペプチドアミノ酸組成を決定することにより生成される。例えば、ペプチドの長さおよび分子量は、サンプルの調製に使用される消化酵素の選択によって影響を受ける場合がある。システインの還元やアルキル化などの一般的なプロテオミクス技術の使用も、得られるペプチドのアミノ酸配列および分子量に影響を与える。さらに、分析されるサンプルの性質は、異なる標的分析物の存在にも寄与している可能性があり、例えば、タンパク質リン酸化のレベルを上昇させる条件下で培養された哺乳類細胞は、より多くのリン酸化部位を有するペプチドを生成すると予想される。
【０１０３】
本明細書にも開示されている代替の方法は、後に文書化され得る定義された条件下で実施される個々の抗体の実験的試験および検証を含む。そのような条件には、特定の消化酵素の使用、特定のサンプルの種類、例えば細胞培養の使用、特定の細胞株の使用、特定の質量分析法の使用、および特定の分析手法、例えばタンパク質リン酸化のプロファイリングの使用が含まれ得る。開示された方法では、好ましくは、例えばビーズなどの固体支持体に結合された個々の抗体が、標的分析物を含むサンプルに曝露され、免疫親和性捕捉反応が起こる。抗体に結合する標的分析物は、その後固体支持体から放出され、質量分析により分析される。質量分析による分析には、個々の標的分析物の分子量の決定、ならびに衝突誘起解離（ＣＩＤ）、電子移動解離（ＥＴＤ）、インソース分解（ＩＳＤ）、ポストソース分解（ＰＳＤ）などの既知のフラグメント化技術を使用して実施される個々の標的分析物のアミノ酸配列の決定が含まれ得る。次に、ビーズアレイ内の他の抗体について、上記の手順を繰り返す。
【０１０４】
標的コード化ビーズアレイを使用して生体サンプルを分析する例示的な方法を以下に開示し、本明細書の実施例の項でより詳細に説明する。一実施形態では、標的コード化ビーズアレイは、少なくとも１つの反応部位およびデコードテーブルを含む。反応部位の例は、ビーズに結合された抗体である。ビーズ結合抗体は、異なるＭＷを有する少なくとも２つの異なる標的分析物、すなわち第１標的分析物および第２標的分析物を結合できる。デコードテーブルには、第１標的分析物の同一性に関する情報、第１標的分析物のＭＷ、ｍ／ｚ比および／またはＴＯＦ値に関する情報、第２標的分析物の同一性に関する任意の情報、ならびに第２標的分析物のＭＷ、ｍ／ｚ比および／またはＴＯＦ値に関する情報が含まれる。したがって、デコードテーブルには、第１標的分析物のＭＷおよび第２標的分析物のＭＷに由来する値に関連する、質量スペクトルの２つの信号の検出に基づいてビーズアレイ内の第１標的分析物の同定を可能にするのに十分な情報が含まれる。場合によっては、質量スペクトル内の単一の信号の検出でさえ、第１標的分析物を明確に同定するのに十分である場合がある。これは、第１標的分析物の分子量が十分に固有である場合、つまりビーズアレイによって捕捉された他の標的分析物が同じまたは非常に近似した分子量を有さない場合に起こり得る。
【０１０５】
一実施形態では、標的コード化ビーズアレイを使用して生体サンプルを分析する方法は、（１）ビーズアレイの反応部位を、第１標的および第２標的の反応部位への結合を可能にする条件下で、第１標的および第２標的を含むまたは含むことができるサンプルと接触させるステップと、（２）接触させるステップの後、反応部位から質量スペクトルを取得して、第１標的からの信号と第２標的からの信号とが質量スペクトルで検出可能かまたは実際に検出されるようにするステップと、（３）ビーズアレイとともに備えられたデコードテーブルを使用して、質量スペクトルの第１標的からの信号と第２標的からの信号とを同定するステップと、（４）第１標的からの信号の強度と第２標的からの信号の強度とを測定するステップとを含む。
【０１０６】
ステップ１：反応部位のサンプルとの接触。このステップには、免疫親和性精製（ＩＡＰ）反応を実施し、その後、反応部位からサンプルの未反応部分を除去することが含まれ得る。ビーズベースのＩＡＰ反応を実施する様々な方法が当技術分野で知られている。例えば、ビーズの懸濁液を、サンプルを含む水溶液と単純に混合し、特定の時間インキュベートしてもよい。
【０１０７】
ステップ２：質量スペクトルの取得。このステップには、ビーズからＭＡＬＤＩ標的プレートなどの固体支持体上のスポットに結合された標的分析物を溶出し、質量分析を使用してそのようなスポット内に位置する溶出分析物を分析することが含まれ得る。ビーズは固体支持体上に残っていてもよく、あるいは、質量分析による測定の前に、ビーズを固体支持体から除去してもよい。質量分析による分析にＭＡＬＤＩ  ＭＳの使用が含まれる場合、溶出された分析物をＭＡＬＤＩマトリックスと混合する必要がある。ＭＡＬＤＩ質量分析計のイオン化レーザビームの強度は、溶出された分析物からの十分に強い信号が記録できるように選択する必要があり、例えば、信号対雑音比が少なくとも３：１、好ましくは少なくとも１０：１、より好ましくは少なくとも３０：１、最も好ましくは少なくとも１００：１である場合、信号は十分に強いとみなされる。本明細書に開示の方法により、信号対雑音比が１０００：１を超えるＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳによる単一のビーズから溶出された分析物の検出が可能になる。異なる分析物を含む複数のスポットを測定する場合、イオン化レーザビームの強度を調整する必要があることに留意されたい。
【０１０８】
ステップ３：第１標的からの信号および第２標的からの信号の同定。一実施形態では、このステップには、取得された質量スペクトルから信号、例えば、背景レベルを超える強度のピークを検索することと、特定のｍ／ｚ値でそのようなピークが検出されると、デコードテーブルを検索して、質量スペクトルで検出されたｍ／ｚ値と一致するか、十分に近いｍ／ｚ値に関連する標的分析物を見つけることとを含む。質量スペクトルに他のピークが存在する場合、この工程が繰り返される。場合によって、質量スペクトルの単一ピークを検出することにより、標的分析物の同定を行うことができる。あるいは、質量スペクトルの２つ以上のピークを検出することにより、標的分析物の同定を行うことができる。
【０１０９】
ステップ４：第１標的からの信号強度および第２標的からの信号強度の測定。このステップは、分析ソフトウェアを使用して、質量スペクトルで検出されたピークの強度を決定することで実現できる。信号強度は、ピークの高さ、ピーク下の面積、または他の既知の形式を使用して報告できる。
【０１１０】
サンプルをマイクロアレイの個々の反応部位とインキュベートすると、１つ以上の化合物が反応部位に非特異的に結合する可能性がある。そのような化合物はビーズに結合されてもよく、あるいは捕捉剤に結合されても、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡまたはＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇなどのリンカーに結合されてもよい。非特異的結合の問題を軽減するために、デコードテーブルに、そのような非特異的結合化合物に関連するｍ／ｚ値に関する情報を含んでもよい。
【０１１１】
一実施形態では、第１標的分析物および第２標的分析物は、示差的に修飾されたペプチドである。例えば、２つのペプチドは、それらのＮ末端、Ｃ末端、またはその両方で示差的に修飾され得る。２つのペプチドは、特定のアミノ酸、例えばリジン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アルギニン、ヒスチジンなどにおいて示差的に修飾され得る。本明細書に開示される方法について、適切なペプチド修飾には、異なる同位体量を有する化合物による修飾、ならびに同じ、例えば天然の同位体量を有する化合物による修飾が含まれる。
【０１１２】
一実施形態では、第１標的分析物および第２標的分析物は、示差的に修飾されていないペプチドである。例えば、第１標的分析物は、生体試料の酵素消化によって生成される内因性ペプチドであり、第２標的分析物は、第１標的分析物を含む酵素消化生体試料に添加される内部標準ペプチドであり得る。この例では、第１および第２標的分析物は同じ、例えば天然の同位体量を有するが、アミノ酸組成が異なる可能性があり、アミノ酸組成の違いとは、少なくとも１つのアミノ酸の置換、修飾、追加、または削除である。
【０１１３】
一実施形態では、本開示のマイクロアレイによる分析に適したサンプルは、培養生体細胞の懸濁液またはペレット、生体組織、生体液または異種移植片などの消化された生体試料である。消化は、酵素化合物または非酵素化合物を使用して行うことができる。さらに、生体試料は、消化反応を行う前に細胞溶解に供してもよい。
【０１１４】
しかしながら、特定の用途では、親和性濃縮ステップを行う前に、生体サンプルを溶解および／または消化する必要はない。例えば、未分画の血清には、大量の循環ペプチドが含まれることが知られている。別の例は、培養細胞から細胞培養培地に放出される分泌ペプチドの分析である。
【０１１５】
本明細書に開示のマイクロアレイは、リン酸化、アセチル化、メチル化、グリコシル化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化などの多様な種類のタンパク質ＰＴＭのプロファイリングに適している。一実施形態では、マイクロアレイ反応部位は、エピトープに特異的に結合する抗体またはアプタマーを含み、マイクロアレイ反応部位によって特異的に捕捉されるすべての標的はエピトープを含む。一実施形態では、エピトープは、６個未満の連続アミノ酸、５個未満の連続アミノ酸、または４個未満の連続アミノ酸を含む。一実施形態では、エピトープは不連続であり、すなわち、対応する抗体によって認識される少なくともいくつかのアミノ酸は互いに隣接していない。一実施形態では、エピトープは第１ＰＴＭを含み、標的の少なくとも１つは、エピトープ外に位置する第２ＰＴＭを含む。一実施形態では、エピトープはＰＴＭを含まず、標的の少なくとも１つはＰＴＭを含む。一実施形態では、マイクロアレイ反応部位に結合する各標的は、少なくとも１つの標的で翻訳後修飾され、少なくとも１つの標的でＰＴＭを欠くタンパク質部位を含む。一実施形態では、マイクロアレイ反応部位により捕捉される個々の標的は、異なる生物学的経路の構成要素である異なるタンパク質に由来する。
【０１１６】
本開示は、本開示の理解を助けるために記載される以下の実施例で説明され、その後に続く特許請求の範囲で定義される本開示の範囲を決して限定するものと解釈されるべきではない。以下の実施例は、当業者に本開示を作成および使用する方法の完全な開示および説明を提供するために提示されるものであり、本開示の範囲を限定することも意図するものでも、以下の実験が実施された実験のすべてまたは唯一の実験であることを表すものでもない。使用された数値（例えば、量、温度、体積、時間など）に関して正確性を確保するための努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差を考慮すべきである。
【実施例】
【０１１７】
材料および機器
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性化磁気６％アガロースビーズは、Ｃｕｂｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（プリマスミーティング、ペンシルバニア州）のカスタム製造品であった。個々のビーズの直径は、光学顕微鏡で測定して、約２５０μｍ〜５００μｍであった。これらの多分散ビーズを、直径範囲が２８０μｍ未満、２８０〜３５５μｍ、３５５〜３７５μｍ、３５５〜４００μｍ、３７５〜４００μｍ、３７５〜４２０μｍ、４００〜４２０μｍ、４００〜４５０μｍおよび４５０μｍ超のビーズを含有する画分を含む、より狭いサイズ分布の画分にさらに分離した。ビーズ分画は、ビーズ懸濁液を一連のポリエステルメッシュフィルター（ＥＬＫＯ  Ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ  Ｃｏ、ＬＬＣ社）に手動で通して、所望のサイズの画分が生成されるまで行った。サイズ分画ビーズは、さらなる使用まで純粋なイソプロパノール（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ社、カタログ番号Ａ４１６−４）に保存した。
【０１１８】
特定の用途では、様々な程度のアガロース架橋を有する磁気アガロースビーズを使用した。水性培地で満たされた９６ウェルマルチウェルプレートのウェルに配置した場合、アガロース架橋度の高いビーズは、プレートの厳しい振とう、例えば８００ＲＰＭ以上の速度で１２時間超の振とうに個々のビーズを分離させずに耐えることができることが実験的に決定された。
【０１１９】
特定の用途では、例えば７．５％または９％のアガロースを含むビーズなど、アガロース含有量が６％を超える磁気ビーズを使用した。アガロース含有量が６％を超えるビーズは、様々なペプチド分析物の結合およびその後の溶出後に、より強いＭＳ信号を生成することが実験的に決定された。
【０１２０】
特定の用途では、例えば直径範囲が７００〜７９０μｍ、７９０〜９１０μｍ、９１０μｍ超のビーズなど、より大きい磁気アガロースビーズを使用した。
【０１２１】
特定の用途では、例えば直径範囲が１６０〜２００μｍのビーズなど、より小さいサイズの磁気アガロースビーズを使用した。
【０１２２】
インジウムスズ酸化物（ＩＴＯ）表面被覆ガラス顕微鏡スライド、カタログ番号２３７００１は、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社（ビレリカ、マサチューセッツ州）製であった。個々のスライドの寸法は、２５ｍｍ×７５ｍｍ×０．９ｍｍであり、ＭＡＬＤＩ撮像用のＭＴＰ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｄａｐｔｅｒ  ＩＩとともに使用するように設計されており、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社（カタログ番号２３５３８０）から入手できる。
【０１２３】
金表面被覆顕微鏡スライドガラスは、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（カタログ番号１２−５５０−５９）製であった。
【０１２４】
シリコーンマイクロウェルガスケットは、ＳＩＬＩＣＯＮＥ  ＩＳＯＬＡＴＯＲＳ（商標）としても知られ、標準グレードのポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を使用するＧｒａｃｅ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ社（ベンド、オレゴン州）のカスタム製造品であった。シリコーンガスケットの全体寸法は、２５ｍｍ×７５ｍｍ×０．５ｍｍであった。各ガスケットは、２６×８８マイクロウェルの正方形グリッドアレイを含んでいた。各マイクロウェルの内径は０．５ｍｍで、隣接するマイクロウェルは０．３ｍｍの距離だけ（中心間で測定して０．８ｍｍの距離）離れていた。周辺のウェルとガスケットの縁との間の約２．５ｍｍの領域にはウェルが含まれていなかった。
【０１２５】
特定の用途では、２５ｍｍ×７３ｍｍ×０．５ｍｍ、２３ｍｍ×７５ｍｍ×０．５ｍｍ、２３ｍｍ×７３ｍｍ×０．５ｍｍなど、長さがより短いおよび／または幅がより狭いシリコーンガスケットを使用した。２５ｍｍ×７５ｍｍのＩＴＯスライドガラスに固定されたときに長さがより短いおよび／または幅がより狭いシリコーンガスケットは、スライドが縁から固定されているときに指が不注意にスライドからガスケットを引っ張る可能性が低いため、手動操作中に破損するリスクが低い水密のシールを形成する。
【０１２６】
１、２、３、４、８、１６、２４および６４個のチャンバを含むいくつかの構成のＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）マルチウェルチャンバは、Ｇｒａｃｅ  Ｂｉｏ−Ｌａｂｓ社から購入した。
【０１２７】
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ＋Ｇは、Ａｂｃａｍ社から購入した（カタログＮｏ．ａｂ５２２１３）。製造業者のウェブサイトに掲載の製品説明では、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ＋Ｇを「…Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＡおよびＰｒｏｔｅｉｎ  Ｇ両方のＩｇＧ結合プロファイルを組み合わせた遺伝子組み換え融合タンパク質」と記載している。
【０１２８】
特に明記しない限り、マイクロ遠心チューブ、ピペットチップ、計量ボートなどの消耗品は、標準研究グレードであった。特に明記しない限り、有機溶媒、酸、塩、緩衝液、洗剤、ＭＡＬＤＩマトリックスなどの試薬は、純度が９９％以上の標準研究グレードであり、製造業者から入手したままさらに精製することなく使用した。標準的なラボ機器には、マイクロ遠心機、マイクロプレート遠心分離機、磁気チューブラック、マイクロタイタープレートシェーカ、ボルテクサなどが含まれる。
【０１２９】
ＭＡＬＤＩマトリックス溶液を堆積させるロボット液体噴霧器ｉＭａｔｒｉｘＳｐｒａｙは、Ｔａｒｄｏ  ＧｍｂＨ社（ズビンゲン、スイス）から購入した。ｉＭａｔｒｉｘＳｐｒａｙの設計および操作は、最近の出版物、ＣＨＩＭＩＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０１４），Ｖｏｌｕｍｅ６８（３），ｐ．１４６〜１４９に記載されている。
【０１３０】
実験結果
本出願に開示の組成物および方法を使用して実施された実験のいくつか、および得られた実験データを以下で説明する。
【０１３１】
実施例１
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ＋Ｇコンジュゲート磁気アガロースビーズの調製
磁気ＱｕｉｃＰｉｃｋデバイス（Ｂｉｏ−Ｎｏｂｉｌｅ社、カタログ番号２４００１）を使用して、イソプロパノール中の１００〜１２５にサイズ分画されたＣｕｂｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製ＰｕｒｅＣｕｂｅ  ＭａｇＢｅａｄｓ  ＸＸＬ  ＮＨＳ活性化ビーズを、イソプロパノール約３００μＬを含む０．６５ｍＬプラスチックマイクロ遠心チューブ（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３２０８）に移した。その後、イソプロパノールを除去した。１ｘ  ＰＢＳ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号ＢＰ２４３８４）約６４０μＬをチューブに添加し、チューブを室温で５分間回転させた。１Ｘ  ＰＢＳ中の組み換えＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ＋Ｇ８０μｇをチューブに添加した。チューブが満たされるまで、追加量の１Ｘ  ＰＢＳを添加した。チューブをチューブ回転機（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製、Ｓｉｌｅｎｔ  Ｓｈａｋｅ  Ｒｅｖｏｌｖｅｒ、カタログ番号ＨＹＱ−１１３０Ａ）で低速、４℃で最低３時間、通常一晩インキュベートした。チューブを回転機から取り外し、２秒未満の短時間、遠心分離した。上清を除去した。１０Ｘトリス−グリシン緩衝液２０μＬを加えて、残りの反応性ＮＨＳ基をクエンチした。チューブをチューブ回転機で低速、室温で３０分間インキュベートした。トリス−グリシン緩衝液を除去し、１Ｘ  ＰＢＳ３００μＬで置き換えた。磁気分離スタンド（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｚ５３３２）を使用して、ビーズを溶液に通して洗浄した。ＰＢＳを除去し、洗浄工程をさらに１回繰り返した。１Ｘ  ＰＢＳ４００μＬを保存のために添加し、ビーズを４℃で保存した。記載の手順全体を通して、ピペットチップでビーズに直接触れたり、強力なピペット混合または過剰なボルテックスを行わないように注意した。
【０１３２】
実施例２
抗体コンジュゲート磁気アガロースビーズの調製
前の実施例に記載のように調製した約２０個のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ＋Ｇコンジュゲートビーズを、きれいな０．６５ｍＬマイクロ遠心チューブに移した。保存液を除去し、１Ｘ  ＰＢＳ３００μＬをビーズに添加した。磁気分離スタンドを使用して、ビーズをＰＢＳ溶液に通して洗浄した。ＰＢＳ溶液を除去し、リン酸化Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２３５／２３６）（Ｄ５７．２．２Ｅ）ＸＰ（登録商標）ウサギモノクローナル抗体、カタログ番号４８５８（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ダンバース、マサチューセッツ州）５μｇをビーズに添加した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはグリセロールを含まない培地に抗体を提供した場合、最適な結果が得られることが実験的に決定された。抗体−ビーズ混合物を、チューブ回転機で低速、４℃で最低３時間、通常一晩インキュベートした。チューブを回転機から取り外し、２秒未満の短時間、遠心分離した。非結合抗体をビーズから除去し、１Ｘ  ＰＢＳ  ３００μＬを添加した。磁気分離スタンドを使用して、ビーズを溶液に通して洗浄した。ＰＢＳ溶液を除去し、洗浄工程をさらに１回繰り返した。保存のために１Ｘ  ＰＢＳ４００μＬを添加し、ビーズを４℃で保存した。
【０１３３】
実施例３
抗体のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ＋Ｇ磁気アガロースビーズへの架橋
前の実施例に記載のように調製した抗体コンジュゲートＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ＋Ｇビーズを、広口ピペットチップを使用して手動でピペッティングすることにより、きれいなマイクロ遠心チューブに移した。マイクロ遠心チューブを磁気スタンドに置き、ビーズとともに移したＰＢＳ溶液を除去した。新しく調製したｐＨ８．２のトリエタノールアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号９０２７９）０．２Ｍ溶液３００μＬをビーズに加え、ビーズ懸濁液を短時間ボルテックスし、遠心分離して上清を除去した。トリエタノールアミンによる洗浄をもう一度繰り返した。ｐＨ８．２の０．２Ｍトリエタノールアミン中の新しく調製したジメチルピメリミデートジヒドロクロライド（ＤＭＰ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号Ｄ８３８８）２５ｍＭ溶液３００μＬをビーズに添加した。ビーズ懸濁液を短時間ボルテックスし、その後遠心分離した。ビーズ懸濁液を含むマイクロ遠心チューブを実験用回転機に置き、ビーズを室温で４５分間回転させながらインキュベートした。その後、ビーズを遠心分離し、上清を除去した。新たに調製したｐＨ８．２のエタノールアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、カタログ番号３９８１３６）０．１Ｍ溶液３００μＬを添加した。ビーズ懸濁液をボルテックスし、その後遠心分離し、上清を除去した。エタノールアミン洗浄工程をもう一度繰り返した。ビーズ懸濁液を含むマイクロ遠心チューブを実験用回転機に置き、ビーズをエタノールアミン溶液中、室温で１時間回転させながらインキュベートした。その後、上清を除去し、ビーズを１Ｘ  ＰＢＳ緩衝液（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号ＢＰ２４３８４３００）３００μＬで２回洗浄し、４℃で１Ｘ  ＰＢＳ緩衝液に保存した。
【０１３４】
実施例４
マルチプレックス標的コード化ビーズアレイの組み立て
ラパマイシンの機械的標的（ｍＴＯＲ）および他の経路に関与するタンパク質標的に特異的なモノクローナル抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（ダンバース、マサチューセッツ州）、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、ミネソタ州）およびＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社（ウォルサム、マサチューセッツ州）から購入した。Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入した抗体としては、リン酸化ｐ７０Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ３８９）（１０８Ｄ２）ウサギｍＡｂ（カタログ番号９２３４）、リン酸化ｐ７０  Ｓ６キナーゼ（Ｔｈｒ３８９）（１Ａ５）マウスｍＡｂ（カタログ番号９２０６）、ｐ７０  Ｓ６キナーゼ（４９Ｄ７）ウサギｍＡｂ（カタログ番号２７０８）、リン酸化Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２３５／２３６）（Ｄ５７．２．２Ｅ）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ（カタログ番号４８５８）、リン酸化Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２４０／２４４）（Ｄ６８Ｆ８）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ（カタログ番号５３６４）、Ｓ６リボソームタンパク質（５４Ｄ２）マウスｍＡｂ（カタログ番号２３１７）、４Ｅ−ＢＰ１（５３Ｈ１１）ウサギｍＡｂ（カタログ番号９６４４）、リン酸化４Ｅ−ＢＰ１（Ｔｈｒ３７／４６）（２３６Ｂ４）ウサギｍＡｂ（カタログ番号２８５５）、リン酸化４Ｅ−ＢＰ１（Ｓｅｒ６５）（Ｄ９Ｇ１Ｑ）ウサギｍＡｂ（カタログ番号１３４４３）、リン酸化４Ｅ−ＢＰ１（Ｔｈｒ７０）（Ｄ７Ｆ６Ｉ）ウサギｍＡｂ（カタログ番号１３３９６）、リン酸化Ａｋｔ（Ｐａｎ）（Ｓｅｒ４７３）（Ｄ９Ｅ）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ（カタログＮｏ．４０６０）、リン酸化Ａｋｔ１（Ｓｅｒ４７３）（Ｄ７Ｆ１０）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ（カタログＮｏ．９０１８）、リン酸化Ａｋｔ（Ｐａｎ）（Ｔｈｒ３０８）（Ｄ２５Ｅ６）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ（カタログ番号１３０３８）、Ａｋｔ（ｐａｎ）（Ｃ６７Ｅ７）ウサギｍＡｂ（カタログ番号４６９１）、Ａｋｔ１（Ｃ７３Ｈ１０）ウサギｍＡｂ（カタログ番号２９３８）、リン酸化ＴＳＣ２（Ｔｈｒ１４６２）（５Ｂ１２）ウサギｍＡｂ（カタログ番号３６１７）、ＴＳＣ２（Ｄ９３Ｆ１２）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ（カタログ番号４３０８）、リン酸化Ｇｓｋ３ｂ（Ｓｅｒ９）（Ｄ８５Ｅ１２）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ（カタログ番号５５５８）およびＧＳＫ３ｂ（Ｄ５Ｃ５Ｚ）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ（カタログ番号１２４５６）が挙げられる。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入した抗体としては、ヒトリン酸化ヒストンＨ２ＡＸ（Ｓｅｒ１３９）（カタログ番号ＡＦ２２８８）、ヒト／マウス／ラットリン酸化ＡＴＭ（Ｓｅｒ１９８１）（カタログ番号ＡＦ１６５５）、ヒトリン酸化ＢＲＣＡ１（Ｓｅｒ１４２３）（カタログ番号ＡＦ１３８６）、ヒトリン酸化Ｃｈｋ２（Ｔｈｒ６８）（カタログ番号ＡＦ１６２６）、ヒトリン酸化Ｃｈｋ１（Ｓｅｒ３４５）（カタログ番号ＡＦ２４７５）が挙げられる。固有の捕捉試薬、すなわちビーズアレイに含まれる抗体の総数は５０を超えていた。
【０１３５】
前の実施例で説明した手順を使用して、個々の抗体を磁気アガロースビーズにコンジュゲートさせた。ｍＴＯＲ経路で複数の標的をプロファイリングするための一連のマルチプレックスビーズアレイは、上に挙げた抗体の１つにコンジュゲートされた１〜３個のビーズを選択し、続いて単一の１．７ｍＬマイクロ遠心チューブで異なる抗体にコンジュゲートされたビーズを組み合わせて組み立てた。例えば、図３は、２つのタンパク質、４Ｅ−ＢＰ１およびｐ７０  Ｓ６キナーゼの総タンパク質量と部位特異的リン酸化とを測定するためのマルチプレックス懸濁ビーズアレイを示す。図３に示すビーズアレイは、直径７００〜７９０μｍの磁気アガロースビーズに個別にコンジュゲートされたＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の抗体＃２８５５、＃９６４４、＃２７０８および＃９２３４を含んでいた。この４プレックスビーズアレイの個々の反応部位は、識別可能な光学特性または質量タグを有さず、位置コード化もなかった。しかしながら、ビーズアレイによって捕捉された標的分析物は、標的分析物の同一性および分子量に関する情報がマイクロ・アレイ・デコードテーブルで提供されているため、質量分析によって容易に同定可能であった。デコードテーブルのデータは、ビーズアレイに含まれる抗体の各々を個別に検証することで生成した。抗体検証工程には、（１）特定の抗体にコンジュゲートされた単一ビーズを使用して消化細胞溶解液からペプチド分析物の免疫親和性濃縮を実施するステップと、（２）質量分析を使用してビーズコンジュゲート抗体によって捕捉された分析物を測定するステップと、（３）検出された分析物信号、すなわち質量スペクトルのピークを特定のペプチド配列に割り当てるステップとが含まれる。ピークの割り当ては、前駆体タンパク質配列、抗体特異性、例えば推定されるエピトープ、および消化酵素特異性に関する利用可能な情報を使用して行った。具体的には、この実施例では、すべての前駆体タンパク質はヒト起源であり、消化酵素は質量分析配列決定グレードのトリプシンであった。このビーズアレイの個々の反応部位によって捕捉されたペプチド標的は、標的の分子量から導出された単一の値に基づいて特定の標的を明確に同定できるほど十分に固有の分子量を有することが実験的に決定された。具体的には、４Ｅ−ＢＰ１の総タンパク質量を測定するための抗体＃９６４４を含む反応部位は、４Ｅ−ＢＰ１のＣ末端に由来するタンパク質分解フラグメントＲＡＧＧＥＥＳＱＦＥＭＤＩ（配列番号１）を捕捉し、これには、失敗した切断部位が１個含まれ、平均計算した［ＭＨ］＋ｍ／ｚは１４６９．５８であった。同じ反応部位は、タンパク質分解フラグメントＡＧＧＥＥＳＱＦＥＭＤＩ（配列番号２）も捕捉し、これには、失敗した切断部位は含まれず、平均計算した［ＭＨ］＋ｍ／ｚは１３１３．３９であった。Ｔｈｒ３７およびＴｈｒ４６で４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化を測定するための抗体＃２８５５を含む反応部位は、タンパク質分解フラグメントＶＶＬＧＤＧＶＱＬＰＰＧＤＹＳＴＴＰＧＧＴＬＦＳＴＴＰＧＧＴＲ（配列番号３）を捕捉し、これは、２つのリン酸基を含み、平均［ＭＨ］＋ｍ／ｚは３２０９．３２であった。抗体＃２８５５���含む反応部位は、同じ配列であるが単一のリン酸基を有するタンパク質分解フラグメントも捕捉し、平均計算した［ＭＨ］＋ｍ／ｚは３１２９．３５であった。
【０１３６】
実施例５
細胞溶解、タンパク質消化およびペプチド抽出
ＭＫＮ４５ヒト胃癌細胞は、２０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地を使用して培養した。プレート上で約８０％コンフルエンスまで増殖した細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、尿素溶解緩衝液１ｍＬをプレートに添加し、細胞をプレートから掻き取り、５０ｍＬＦＡＬＣＯＮ（商標）遠心チューブに回収した。細胞懸濁液を、１５Ｗ出力で毎回２０秒間、３〜５回のバーストでマイクロチップを使用して超音波処理した。細胞懸濁液をバースト間の１分間氷上で冷却した。溶解液を、５，０００ｇで１５分間、室温で遠心分離することにより透明にし、酵素消化のために上清をきれいなチューブに移した。
【０１３７】
透明な細胞上清を還元、アルキル化および酵素消化に供した。１／２７８容量の１．２５Ｍ  ＤＴＴを上清と混合し、４０℃で３０分間インキュベートした。溶液が室温に達するまで氷上で短時間冷却した。続いて、１／１０容量の新たに調製した１００ｍＭヨードアセトアミド溶液を添加し、暗所において室温で１５分間インキュベートした。溶液を０．２Ｍ重炭酸アンモニウム消化緩衝液で５倍に希釈した。１／１００容量の１ｍｇ／ｍＬ配列決定グレードトリプシンストックを添加し、混合しながら３７℃で一晩消化反応を進行させた。キモトリプシンによる消化のために、トリプシンの代わりに１／６０容量の１ｍｇ／ｍＬキモトリプシンストックを添加し、混合しながら３７℃で一晩消化反応を進行させた。
【０１３８】
消化反応の直後に、消化された細胞溶解液を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社のカタログ番号ＷＡＴ０５１９１０の０．７ｍＬ  ＳＥＰ−ＰＡＫ（登録商標）Ｃ１８カラムで精製した。タンパク質消化物に由来するペプチドをカラムに充填する前に、１／２０容量の１０％ＴＦＡを０．５％ＴＦＡの最終濃度まで添加することにより、消化された溶解液を酸性化した。溶液を氷上で１５分間放置し、沈殿物を形成した。酸性化したペプチド溶液を室温において１，７８０ｇで１５分間遠心分離し、沈殿物質を取り除くことなく、ペプチド含有上清をきれいな５０ｍＬコニカルチューブに移した。
【０１３９】
プランジャを取り外した１０ｃｃシリンジのリザーバをＳＥＰ−ＰＡＫ（登録商標）カラムの短端に接続した。１００％ＭｅＣＮ５ｍＬを適用して、カラムをプレウェットした。カラムを０．１％ＴＦＡ溶液１ｍＬ、３ｍＬ、および６ｍＬで順次洗浄した。酸性化および透明化された消化物をカラムに充填し、０．１％ＴＦＡ溶液１ｍＬ、３ｍＬ、および６ｍＬで順次洗浄した後、５％ＭｅＣＮ、０．１％ＴＦＡ溶液２ｍＬで洗浄した。ペプチドは、いずれも０．１％ＴＦＡ、５０％アセトニトリル溶液２ｍＬで３回連続して洗浄して溶出した。溶出されたペプチドを含む溶液を、−８０℃の冷凍庫に少なくとも２時間から一晩置いた。凍結ペプチド溶液を、標準凍結乾燥機を使用して最低２日間凍結乾燥し、ＴＦＡがサンプルから確実に除去されるようにした。凍結乾燥させた消化ペプチドは、数ヶ月間、−８０℃で密封されたマイクロ遠心チューブ内に保管できる。
【０１４０】
実施例６
抗体コンジュゲート磁気ビーズを使用した酵素消化細胞溶解液からのペプチドの多重免疫親和性濃縮の実施
前の実施例に記載のように調製した凍結乾燥細胞溶解液を、結合緩衝液（２５ｍＭトリス中の２．５Ｍ  ＮａＣｌ、１９２ｍＭグリシン、ｐＨ約８．３）に懸濁し、約２ｍｇ／ｍＬの最終濃度にした。溶解物懸濁液は、溶液中に気泡が形成されるのを避けながら、手動で繰り返しピペッティングすることにより均質化した。細胞溶解液を４℃、１４，０００  ＲＰＭで５分間遠心分離した。透明な上清を新しい１．７ｍＬマイクロ遠心チューブに移した。広口ピペットチップを使用して、実施例４に記載のように調製された２０個の抗体コンジュゲート磁気ビーズを含む懸濁ビーズアレイを、きれいな０．６５ｍＬマイクロ遠心チューブに移した。溶解液中に気泡が形成されるのを避けながら、透明な細胞溶解液上清をビーズに添加した。その後、例えば１秒未満の短時間チューブを遠心分離することにより、チューブ壁から液滴を回収した。細胞溶解液上清と混合したビーズの懸濁液を、少なくとも３時間、場合によっては一晩または２４時間より長く、４℃で低速で回転機でインキュベートした。チューブを短時間遠心分離し、磁気ＱｕｉｃＰｉｃｋデバイスを使用してビーズを取り除き、脱イオン水中の２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液３００μＬを含むきれいな０．６５ｍＬチューブに移した。さらに２．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液３４０μＬをチューブに添加した。ビーズを回転機で低速、室温で１０分間インキュベートした。チューブを短時間遠心分離し、約３００μＬの溶液をピペッティングで除去した。磁気ＱｕｉｃＰｉｃｋデバイスを使用して、脱イオン水３００μＬを含むきれいな０．６５ｍＬチューブにビーズを移した。磁気分離スタンド上でチューブを繰り返し移動させることによりビーズを洗浄し、室温で約２分間さらにインキュベートした。広口ピペットチップによるピペッティングを使用して、脱イオン水約２００μＬを含むきれいな０．６５ｍＬチューブにビーズを移し、４℃で保存した。
【０１４１】
実施例７
マイクロウェルスライドの組み立て
マイクロウェルスライドは、シリコーンガスケットをＩＴＯ被覆顕微鏡スライドガラスの導電性側に固定して準備した。具体的には、最初に粘着テープのストリップを使用して、シリコーンガスケットの表面から残留ダスト粒子を除去した。次に、ガスケットを、実験台の平らな表面に配置されたＫＩＭＷＩＰＥＳ（登録商標）などの低リントティッシュ１または２枚の上に置いた。スライドガラスの乾燥したＩＴＯ被覆面をシリコーンガスケットと接触させて配置し、スライドを手動でガスケットに押し込んで水密のシールを形成した。シールの品質を目視検査し、スライドを局所的に押すことにより、残っているエアポケットを除去した。作製したマイクロウェルスライドの全体寸法は、２５ｍｍ×７５ｍｍ×１．４ｍｍであった。
【０１４２】
実施例８
マイクロウェルスライド上のビーズアレイの形成
マイクロウェルスライドは、前の実施例に記載のように準備し、各チャンバの内部寸法が７ｍｍ×１６ｍｍの、８つの長方形チャンバを含むＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）８ウェルスライドモジュールに取り付けた。特定の用途では、標準のＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）スライドモジュールに含まれる厚さ１．６ｍｍのクリアシリコーンガスケットは、厚さ１．４ｍｍのマイクロウェルスライドをよりよく収めるために、より薄い１．３ｍｍのクリアシリコーンガスケットと置き換えた。マイクロウェルスライドは、ＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）ステンレススチールスプリングクリップによってＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）モジュールに固定した。
【０１４３】
その後、ＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）モジュールに取り付けられたマイクロウェルスライドを含むアセンブリを、図４に示すように、スプリングクリップモジュール用の３区画ＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイの中央部に配置した。脱イオン水約３００μＬを８つの各チャンバに分注し、ＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイを室温で５分間２７００  ＲＰＭで遠心分離して、マイクロウェルスライドの直径０．５ｍｍのウェルへの水の浸入を促進させた。
【０１４４】
直径が０．３７５〜０．４２０ｍｍの範囲にある４２個の磁気アガロースビーズを含む水性懸濁液を、ピペッティングにより広口ピペットチップに引き込み、次いでＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）モジュールの８つのチャンバのうち２つにランダムに分注した。ＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイを標準的な実験用マイクロタイタープレートシェーカに置き、１〜２分間機械的に攪拌して、ビーズがマイクロウェルに分配されやすくした。その後、ＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイを室温で１分間２７００  ＲＰＭで遠心分離して、それぞれのマイクロウェルの底にビーズを下降させた。したがって、すべてのビーズは、マイクロウェルスライドの表面より約８０〜１２０ミクロン下に位置した。
【０１４５】
ＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）モジュールに取り付けられたマイクロウェルスライドをＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）トレイから取り外し、厚さ３”×１”×１／８”のニッケルめっき厚さ方向着磁ネオジム磁石（Ｋ＆Ｊ  Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ社、カタログ番号ＢＺ０Ｘ０２）を、ビーズをその位置に保持するのを助けるために、モジュールの下、ステンレススチールクリップの間に配置した。ビーズアレイを乱さないように、ピペットチップをチャンバの側壁に向けて、ピペットで各チャンバからバルク水を抜き取り、磁石およびステンレススチールクリップを取り外し、マイクロウェルスライドをＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）モジュールから取り外した。マイクロウェルスライドを磁石の上面に置き、ＫＩＭＷＩＰＥＳ（登録商標）または代わりにペーパータオルなどの低リント吸収ティッシュ１枚をスライド表面にそっと押し付けることにより、表面に残っている水滴を除去した。図５に見られるように、スライド表面から約８０〜１２０ミクロン下に位置したままのビーズは、この手順によって移動しなかった。バルク水がマイクロウェルスライドの表面から完全に除去されても、個々の直径０．５ｍｍのマイクロウェルは十分な量の液体を保持し、この液体は標準条件下、例えば相対湿度１０％〜９０％、温度１８〜３２℃で約５〜１０分間マイクロウェル内に残ることが観察された。マイクロウェルにある程度の液体が残っている限り、アガロースビーズは完全に水和したサイズを保持した。残留液体がマイクロウェルから蒸発した後にはじめて、乾燥の結果、ビーズは元のサイズの画分に収縮した。
【０１４６】
実施例９
ビーズアレイからの分析物の溶出
前の実施例に記載の手順を使用して、１３個のビーズを含むビーズアレイをマイクロウェルスライド上に作製した。ビーズアレイ内の個々のビーズはすべて、前述のリン酸化Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２３５／２３６）モノクローナル抗体＃４８５８にコンジュゲートし、Ｓｅｒ２３５およびＳｅｒ２３６で二重にリン酸化されたＳ６リボソームタンパク質のタンパク質分解フラグメントを捕捉した。
【０１４７】
ＰＲＯＰＬＡＴＥ（登録商標）モジュールからの分離後にマイクロウェルスライドの表面に存在する水滴は、スライド表面を吸収ティッシュでそっと触れることにより除去した。マイクロウェルスライドを直ちにｉＭａｔｒｉｘＳｐｒａｙのマトリックス堆積領域の中心に置き、１０サイクルのマトリックス堆積をビーズアレイに適用した。ＭＡＬＤＩマトリックス溶液とマイクロウェル内に残っている残留液との最適な混合を達成するために、スライド表面から水滴を除去した後、第１マトリックス堆積サイクルは５分以内、好ましくは３分以内に開始する必要があることに留意されたい。ｉＭａｔｒｉｘＳｐｒａｙのマトリックス堆積パラメータは、高さ：６０ｍｍ；直線距離：０．５ｍｍ；速度：６０ｍｍ／ｓ；密度：５μＬ／ｃｍ２；サイクル数：１０；遅延：０秒；噴霧領域幅：８０ｍｍ；噴霧領域深度：３０ｍｍに設定した。マトリックス溶液には、５ｍｇ／ｍＬのα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（ＣＨＣＡ）、５０％アセトニトリル（ｖ／ｖ）、０．４％トリフルオロ酢酸、および４ｍＭクエン酸二アンモニウムが含まれていた。
【０１４８】
最後のマトリックス堆積サイクルが完了すると、ビーズアレイは風乾させ、これには約２５〜３０分かかった。マイクロウェルスライドを目視検査して、マイクロウェルに残留液体が含まれていないこと、および乾燥によりすべてのビーズのサイズが小さくなっていることを確認した。シリコーンガスケットを顕微鏡スライドから分離した。乾燥したアガロースビーズの一部はシリコーンにくっついており、ガスケットと一緒にスライドから除去した。残りのビーズは、スライド表面に向けられたエアダスターからの圧縮空気の流れを使用して除去した。乾燥したアガロースビーズは圧縮ガスによってその位置から容易に移動されたが、ＭＡＬＤＩマトリックスの結晶はスライド表面にしっかりと付着したままで、それぞれのマイクロスポット内に局在化することが観察された。
【０１４９】
図６Ａは、圧縮空気によってスライドからビーズを除去する前に記録された、ＣＨＣＡ  ＭＡＬＤＩマトリックスを含むスポットのアレイの明視野顕微鏡画像である。乾燥によりサイズが小さくなったアガロースビーズが、９つのスポットで見られる。さらなる４つのスポットには、ビーズは存在しなかったが、スポットの形状、例えばＣＨＣＡマトリックスの不均一な分布は、ビーズが以前に存在しており、シリコーンガスケットとともにスライドから除去された可能性があることを示している。残りのスポットはビーズを含まず、スポット全体でマトリックスのより均一な分布を示した。図６Ｂは、ＣＨＣＡ  ＭＡＬＤＩマトリックスを含むスポットの無関係なアレイの明視野顕微鏡画像であり、圧縮空気を使用してすべてのビーズがスライドから除去されている。最初にビーズが含まれていた場所に形成されたスポットは、ＣＨＣＡマトリックスをほとんどまたはまったく含まない領域を有する特徴的な「三日月」または「ドーナツ」形状を示したことに留意されたい。対照的に、ビーズが最初に存在しなかった場所に形成されたスポットは、一般に、より均一なマトリックス被覆を示した。図６Ａおよび図６Ｂに示す画像は、ＢｉｏＴｅｋ社（ウィヌースキ、バーモント州）のＣＹＴＡＴＩＯＮ（商標）３マルチモードリーダで取得した。
【０１５０】
実施例１０
マイクロスポットのアレイからの質量分析データの取得
顕微鏡スライドのＩＴＯ被覆表面上のマイクロスポットのアレイは、前の実施例に記載の手順を使用して調製した。スライドをＭＡＬＤＩ撮像用のＭＴＰ  Ｓｌｉｄｅ  Ａｄａｐｔｅｒ  ＩＩに入れた。Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社（ビレリカ、マサチューセッツ州）が提供するカスタムジオメトリファイルにより、２２８８スポットの正方形グリッドアレイから質量分析データを連続的に取得でき、各スポットは最大６００μｍの可変の直径を有していた。場合によっては、５０〜５００個のスポットを含むアレイ内のより小さい区画からデータを取得した。
【０１５１】
ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳデータは、機器に付属のｆｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌソフトウェアを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社のＢｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ  Ｓｐｅｅｄ  ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ−ＴＯＦ質量分析計で取得した。データは、２ｋＨｚのレーザ繰り返し率を使用して、１，０００〜７，０００ｍ／ｚの質量範囲で、線形ポジティブモードで取得した。典型的には、単一のマイクロアレイスポットから合計２０，０００のシングルショットスペクトルが収集、蓄積されたが、場合によってはわずか１００ショットから高品質のスペクトルが得られた。場合によっては、スポットに存在する分析物を完全に枯渇させることなく、単一のマイクロアレイスポットから１００，０００を超えるシングルショットスペクトルが収集された。スペクトルは、ｆｌｅｘＣｏｎｔｒｏｌソフトウェアで提供されるランダムウォークまたは逆スパイラル法のいずれか、または両方を使用して、各スポット内の複数箇所から取得した。
【０１５２】
実施例１１
質量分析データの分析
Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社のｆｌｅｘＡｎａｌｙｓｉｓおよびＢＩＯＴＯＯＬＳ（商標）ソフトウェアを使用して、ＭＳデータセットを分析した。場合によって、ＭＳデータを含むファイルを．ｔｘｔ形式に変換し、パブリックドメインソフトウェアｍＭａｓｓを使用して分析した。質量スペクトルを分析して、質量精度、スペクトル分解能、ならびに特定の質量スペクトルに存在する個々のピークの信号対雑音比、相対強度およびピーク面積などの主要なパラメータを決定した。
【０１５３】
実施例１２
複数の標的分析物を捕捉するために構成されたマイクロアレイ反応部位
この実施例では、捕捉剤は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社（ダンバース、マサチューセッツ州）から取得したモノクローナル抗体リン酸化Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）（Ｄ２６）ＸＰ（登録商標）ウサギｍＡｂ、カタログ番号３０７７である。肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）としても知られるＭｅｔは、ＭＷが１４５ｋＤａのチロシンキナーゼである。ＵｎｉＰｒｏｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ）データベース内のこのタンパク質のエントリ番号およびエントリ名は、それぞれＰ０８５８１およびＭＥＴ＿ＨＵＭＡＮである。２０１７年２月２０日にアクセスした製造業者のウェブサイトで提供される製品説明によると、＃３０７７抗体は「…Ｔｙｒ１２３４／１２３５でリン酸化された場合にのみ、内因性レベルのＭｅｔを検出する」。＃３０７７抗体は、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、免疫組織化学（パラフィン）、免疫組織化学（凍結）、免疫蛍光（免疫細胞化学）およびフローサイトメトリーを含む用途で検証されている。前の実施例に記載の手順を使用して、＃３０７７抗体をＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ＋Ｇアガロースビーズにコンジュゲートさせ、溶解したＭＫＮ−４５細胞のトリプシン消化物１ｍｇとインキュベートした。免疫親和性精製（ＩＡＰ）反応を実施し、結合した分析物を単一のビーズから溶出した後、質量スペクトルを線形ポジティブモードで記録した。ＭＳ測定は反射ポジティブモードでも実施した（データは図示せず）。ｍ／ｚ値が１８５３．０６、２２１０．２７、および２６４７．５４で、質量スペクトルに３つの強いピークが検出された。特定のペプチド分析物へのこれらのピークの割り当ては、前駆体タンパク質、すなわちＭｅｔキナーゼの既知のアミノ酸配列、消化酵素、すなわちトリプシンの既知の特異性、および推定されるエピトープに基づいて行った。後者に関して、正確なエピトープ配列は開示されていないが、製造業者のウェブサイトには「モノクローナル抗体は、ヒトＭｅｔのＴｙｒ１２３４／１２３５を取り囲む残基に対応する合成リン酸化ペプチドで動物を免疫することにより生成される」と述べられている。上記の情報に基づいて、ピークの割り当ては以下のように行った。１８５３．０６ピークは、計算されたＭＨ＋値が１８５２．８２のペプチドＤＭＹＤＫＥ［ｐＹ］［ｐＹ］ＳＶＨＮＫ（配列番号４）に割り当て、２２１０．２７ピークは、計算されたＭＨ＋値が２２１０．２３のペプチドＤＭＹＤＫＥ［ｐＹ］［ｐＹ］ＳＶＨＮＫＴＧＡＫ（配列番号５）に割り当て、２６４７．５４ピークは、計算されたＭＨ＋値が２６４７．８１のペプチドＤＭＹＤＫＥ［ｐＹ］［ｐＹ］ＳＶＨＮＫＴＧＡＫＬＰＶＫ（配列番号６）に割り当てた。上記のアミノ酸配列において、［ｐＹ］はリン酸化チロシンを示す。ピークの割り当てには、質量分析によるペプチドのフラグメント化またはタンデム質量分析（ＭＳ−ＭＳ）の使用は不要であることに留意されたい。この実施例において、複数の標的分析物は、異なる数の失敗した切断部位を含む前駆体タンパク質のタンパク質分解フラグメントである。
【０１５４】
実施例１３
可変数の標的分析物を捕捉するために構成されたマイクロアレイ反応部位
この実施例では、捕捉剤は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入したリン酸化Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２３５／２３６）（Ｄ５７．２．２Ｅ）ＸＰ（登録商標）ウサギモノクローナル抗体、カタログ番号４８５８である。２０１７年２月２０日にアクセスした製造業者のウェブサイトで提供される説明によれば、＃４８５８抗体は「…Ｓｅｒ２３５および２３６でリン酸化された場合にのみ、内因性レベルのリボソームタンパク質Ｓ６を検出する」。ＵｎｉＰｒｏｔデータベースのヒトＳ６リボソームタンパク質のエントリ番号およびエントリ名は、それぞれＰ６２７５３およびＲＳ６＿ＨＵＭＡＮである。磁気アガロースビーズへの抗体のコンジュゲーションおよび免疫親和性濃縮反応は、前の実施例に記載の手順を使用して実施した。免疫親和性濃縮は、過酸化水素の非存在下および存在下で培養されたＭＫＮ−４５細胞のトリプシン消化溶解物から調製した２つのサンプルとは独立して行った。哺乳類細胞を過酸化水素に曝露することにより、タンパク質リン酸化レベルが上昇することが知られている。
【０１５５】
過酸化水素の非存在下で成長したＭＫＮ−４５細胞の消化溶解物から捕捉されたタンパク質分解ペプチドの質量スペクトルは、約８０ｍ／ｚ単位で離間した合計４つの異なるピークを示した。過酸化水素の存在下で成長したＭＫＮ−４５細胞の消化溶解物から捕捉されたタンパク質分解ペプチドの質量スペクトルは、合計６つの明確なピークを示した。４つのピークは、２つのスペクトルの同一のｍ／ｚ位置に存在する一方、過酸化水素処理細胞に固有の２つの追加のピークは、より高いｍ／ｚで現れ、約８０ｍ／ｚ離間もしていた。タンパク質配列、抗体特異性、および消化酵素特異性に関する利用可能な情報を使用して、検出されたすべてのピークは、ヒトＳ６リボソームタンパク質のアミノ酸２３３〜２４９で構成され、３個の失敗した切断部位および可変数のリン酸化部位を含むタンパク質分解ペプチドＲＬＳＳＬＲＡＳＴＳＫＳＥＳＳＱＫ（配列番号７）に割り当てた。示差的にリン酸化されたペプチドの予測平均ｍ／ｚ値は、２０１３．１（２つのリン酸化部位）、２０９３．０（３つのリン酸化部位）、２１７３．０（４つのリン酸化部位）、２２５２．９（５つのリン酸化部位）、２３３２．９（６つのリン酸化部位）および２４１２．９（７つのリン酸化部位）であった。リン酸化部位を含まない、または単一のリン酸化部位を含むペプチドは、Ｓｅｒ２３５およびＳｅｒ２３６の両方がリン酸化されている場合にのみペプチド配列を認識する抗体の特異性のために検出されなかったことに留意されたい。さらに、検出されたペプチド内の複数の失敗した切断部位の存在は、トリプシンがリン酸化残基に近接したＬｙｓまたはＡｒｇ残基を切断しないことが知られているため、この消化酵素の特異性と一致した。この実施例では、マイクロアレイ反応部位は、翻訳後修飾部位の量が異なる少なくとも６つの異なるペプチド分析物を結合できる。
【０１５６】
実施例１４
ヒトおよびマウス起源のタンパク質分解ペプチドを捕捉するために構成されたマイクロアレイ反応部位
この実施例では、捕捉剤は、Ｅｖｅｒｅｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（アッパーヘイフォード、オックスフォードシャー州、イギリス）から供給されているヤギ抗アコニターゼ２（ａａ５４１−５５５）ポリクローナル抗体、カタログ番号ＥＢ０９８５８である。捕捉剤は、ミトコンドリアアコニット酸ヒドラターゼとしても知られるタンパク質ＡＣＯ２の内部配列を認識する。ＵｎｉＰｒｏｔデータベースのヒトＡＣＯ２のエントリ番号およびエントリ名は、それぞれＱ９９７９８およびＡＣＯＮ＿ＨＵＭＡＮである。ＵｎｉＰｒｏｔデータベースのマウスＡＣＯ２のエントリ番号およびエントリ名は、それぞれＱ９９ＫＩ０およびＡＣＯＮ＿ＭＯＵＳＥである。抗体の生成に使用した免疫化ペプチドの配列はＱＤＴＹＱＨＰＰＫＤＳＳＧＱＨ（配列番号８）である。磁気アガロースビーズへの抗体のコンジュゲーションおよび免疫親和性濃縮反応は、前の実施例に記載の手順を使用して実施した。免疫親和性濃縮は、２つのサンプル、すなわち培養ＭＫＮ−４５細胞のトリプシン消化溶解物、およびマウス脳組織のトリプシン消化溶解物とは独立して行った。サンプル調製に使用した消化酵素は、Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ社（レイクウッド、ニュージャージー州）のカタログ番号ＬＳ０２１１９のウシトリプシンであった。
【０１５７】
消化されたＭＫＮ−４５溶解物から捕捉されたタンパク質分解ペプチドの質量スペクトルは、４，４００〜４，８００ｍ／ｚの顕著なピークのペアと、２，２００〜２，４００ｍ／ｚの別のピークのペアを示した。タンパク質配列、抗体特異性および消化酵素特異性に関する利用可能な情報を使用して、より高いｍ／ｚ範囲で観察されたピークのペアを、それぞれ予測平均ｍ／ｚ値が４４７７．７および４７８１．１であるタンパク質分解ペプチドＬＥＡＰＤＡＤＥＬＰＫＧＥＦＤＰＧＱＤＴＹＱＨＰＰＫＤＳＳＧＱＨＶＤＶＳＰＴＳＱＲ（配列番号９）およびＦＲＬＥＡＰＤＡＤＥＬＰＫＧＥＦＤＰＧＱＤＴＹＱＨＰＰＫＤＳＳＧＱＨＶＤＶＳＰＴＳＱＲ（配列番号１０）に割り当てた。より低いｍ／ｚ範囲で観察されたピークのペアは、二重荷電型の同じペプチドに割り当てた。
【０１５８】
消化されたマウス脳組織から捕捉されたタンパク質分解ペプチドの質量スペクトルは、３，８００〜４，０００ｍ／ｚの間の顕著なピークのペアと２，５００ｍ／ｚ未満の一連のより小さいピークとを示した。タンパク質配列、抗体特異性および消化酵素特異性に関する利用可能な情報を使用して、３，８００〜４，０００ｍ／ｚの間に観察されたピークのペアを、それぞれ平均予測ｍ／ｚ値が３８４６．１および３９７４．３であるタンパク質分解ペプチドＦＫＬＥＡＰＤＡＤＥＬＰＲＳＤＦＤＰＧＱＤＴＹＱＨＰＰＫＤＳＳＧＱＲ（配列番号１１）およびＫＦＫＬＥＡＰＤＡＤＥＬＰＲＳＤＦＤＰＧＱＤＴＹＱＨＰＰＫＤＳＳＧＱＲ（配列番号１２）に割り当てた。より低いｍ／ｚ範囲で観察された２つのピークは、二重荷電型の同じペプチドに割り当てた。
【０１５９】
この実施例では、エピトープ配列がこれらのタンパク質に保存されているため、ＡＣＯ２のヒトおよびマウスの両方の形態に由来するタンパク質分解ペプチドを抗体が認識し、特異的に結合する。ヒトおよびマウス起源のタンパク質分解ペプチド間で検出されたｍ／ｚ値の違いは、（１）異なる長さのタンパク質分解ペプチドをもたらす、消化酵素、例えば対応する前駆体タンパク質のトリプシンの異なる認識部位と、（２）消化酵素の認識部位は変化させないものの質量差を引き起こす、対応する前駆体タンパク質のアミノ酸置換との２つの要因の組み合わせに起因する。
【０１６０】
この実施例は、２つの異なる種、すなわち、ヒト（ホモサピエンス）およびマウス（ハツカネズミ）に由来するタンパク質の検出および定量化の方法を実証する。この技術の用途の１つは、細胞、組織および臓器移植物、例えば腫瘍異種移植片におけるタンパク質発現および／またはタンパク質修飾のシングルプレックスまたはマルチプレックス分析である。
【０１６１】
実施例１５
異なる消化酵素によって生成されたタンパク質分解ペプチドを捕捉するために構成されたマイクロアレイ反応部位
この実施例では、捕捉剤は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入したリン酸化４Ｅ−ＢＰ１（Ｔｈｒ３７／４６）（２３６Ｂ４）ウサギモノクローナル抗体、カタログ番号２８５５である。２０１７年２月２０日にアクセスした製造業者のウェブサイトで提供される説明によると、＃２８５５抗体は「…Ｔｈｒ３７および／またはＴｈｒ４６でリン酸化された場合にのみ内因性レベルの４Ｅ−ＢＰ１を検出する。この抗体は、同等の部位でリン酸化されると、４Ｅ−ＢＰ２および４Ｅ−ＢＰ３と交差反応する場合がある」。ＵｎｉＰｒｏｔデータベースのヒト真核生物翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質１のエントリ番号およびエントリ名は、それぞれＱ１３５４１および４ＥＢＰ１＿ＨＵＭＡＮである。磁気アガロースビーズへの抗体のコンジュゲーションおよび免疫親和性濃縮反応は、前の実施例に記載の手順を使用して実施した。抗体認識部位を含むタンパク質分解ペプチドの免疫親和性濃縮は、以下の消化酵素：配列決定グレードの修飾トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社カタログ番号Ｖ５１１７）、配列決定グレードのキモトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社カタログ番号Ｖ１０６１）、ペプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社カタログ番号Ｖ１９５９）、ＭＳグレードＬｙｓ−Ｃプロテアーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社カタログ番号９００５１）、ＭＳグレードＬｙｓ−Ｎプロテアーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社カタログ番号９０３００）、ＭＳグレードＧｌｕ−Ｃプロテアーゼ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社カタログ番号９００５４）、配列決定グレードＡｒｇ−Ｃプロテアーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社カタログ番号Ｖ１８８１）、サーモリシン（Ｐｒｏｍｅｇａ社カタログ番号Ｖ４００１）、エラスターゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ社カタログ番号Ｖ１８９１）を使用したＭＫＮ−４５細胞溶解液の酵素消化によって調製されたいくつかのサンプルから行った。
【０１６２】
前の実施例に記載のように、免疫親和性濃縮後にビーズから溶出したタンパク質分解ペプチドの質量分析を線形ポジティブモードで行った。質量スペクトルで観察されたピークの位置は、特定の酵素による消化後の４Ｅ−ＢＰ１のエピトープ含有フラグメントの予測ｍ／ｚ値と一致した。例えば、トリプシン消化４Ｅ−ＢＰ１の質量スペクトルの２つの強いピークは、それぞれヒト４Ｅ−ＢＰ１のアミノ酸２１〜５１を含むペプチドＶＶＬＧＤＧＶＱＬＰＰＧＤＹＳＴＴＰＧＧＴＬＦＳＴＴＰＧＧＴＲ（配列番号３）の単一および二重リン酸化型の計算平均ｍ／ｚ値に対応する、ｍ／ｚが３１２９．４および３２０９．３付近で観察された。同様に、ペプシン消化４Ｅ−ＢＰ１の質量スペクトルは、ヒト４Ｅ−ＢＰ１のアミノ酸４３〜５４を含むペプチドＦＳＴＴＰＧＧＴＲＩＩＹ（配列番号１３）の単一リン酸化型に対応するｍ／ｚ１３９３．５付近に強いピークを示した。キモトリプシン消化４Ｅ−ＢＰ１の質量スペクトルは、ｍ／ｚ１２４６．３および２０５３．３付近で強いピークのペアを示した。前者のピークは、ヒト４Ｅ−ＢＰ１のアミノ酸４４〜５４を含む、キモトリプシンによる切断の失敗がゼロ個のペプチドＳＴＴＰＧＧＴＲＩＩＹ（配列番号１４）の単一リン酸化型に割り当てられ、後者のピークは、ヒト４Ｅ−ＢＰ１のアミノ酸４３〜５９を含む、キモトリプシンによる切断の失敗が３個のペプチドＦＳＴＴＰＧＧＴＲＩＩＹＤＲＫＦＬ（配列番号１５）の単一リン酸化型に割り当てられた。
【０１６３】
ペプシン消化サンプルには、＃２８５５抗体によって認識されるペプチドＳＴ［ｐＴ］ＰＧＧＴＬ（配列番号１６）（切断の失敗０個、ＭＷ８１３．７８）も含まれる。このペプチドは、４Ｅ−ＢＰ１および４Ｅ−ＢＰ３（ＵｎｉＰｒｏｔエントリ番号Ｏ６０５１６）の２個のタンパク質に由来する。対照的に、ペプシン消化ペプチドＧＧＥＥＳＱＦＥＭＤＩ（配列番号１７）（切断の失敗１個、ＭＷ１２４２．３１）は、前述の＃９６４４抗体によって認識され、４Ｅ−ＢＰ３ではなく４Ｅ−ＢＰ１に由来する。したがって、＃２８５５抗体および＃９６４４抗体の両方を含めることにより、一方の捕捉剤が２つの異なるタンパク質にあるエピトープを認識し、他方の捕捉剤がこれらのタンパク質の一方のみにあるエピトープを認識するマイクロアレイが作成される。
【０１６４】
別の実験では、前述の抗体＃４８５８を含む反応部位をマイクロアレイに追加した。＃２８５５および＃４８５８抗体は両方とも、以下の消化酵素：トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−ＣおよびエンドプロテイナーゼＡｓｐ−Ｎの少なくとも２つによって認識されるタンパク質分解切断部位を欠くエピトープを認識する。
【０１６５】
実施例１６
マイクロアレイの異なる反応部位への標的分析物の非特異的結合
異なる反応部位を特徴とするいくつかの同一のマイクロアレイは、前の実施例に記載の３つのリン酸化特異抗体＃２８５５、＃３０７７および＃４８５８を使用して生成した。同じ種類の抗体を含む１０個未満（３〜５個）の複製ビーズを各マイクロアレイに含ませた。したがって、各マイクロアレイには、リン酸化４Ｅ−ＢＰ１（Ｔｈｒ３７／４６）、リン酸化Ｍｅｔ（Ｔｙｒ１２３４／１２３５）、およびリン酸化Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２３５／２３６）に由来するタンパク質分解ペプチドを結合できる反応部位が合計９個含まれていた。作製したマイクロアレイを、前の実施例に挙げた酵素、すなわちトリプシン、キモトリプシン、Ｇｌｕ−Ｃプロテアーゼ、Ｌｙｓ−ＣプロテアーゼおよびＬｙｓ−Ｎプロテアーゼを使用して調製した一連の消化ＭＫＮ−４５細胞溶解液とともにインキュベートした。消化細胞溶解液の各々の免疫親和性濃縮は、結合反応中の結合緩衝液から２．５Ｍ  ＮａＣｌを省き、ビーズをＮａＣｌの２．５Ｍ溶液の代わりに１ｘＰＢＳ緩衝液で洗浄したことを除いて、実施例６に記載のように行った。各マイクロアレイの個々の反応部位によって捕捉された分析物は、前述のように質量分析によって分析した。結合および洗浄緩衝液に２．５Ｍ  ＮａＣｌが含まれていなくても、トリプシン消化細胞溶解液から捕捉された分析物の質量スペクトルに大きな影響はなかった。対照的に、キモトリプシン消化細胞溶解液の免疫親和性濃縮中の結合および洗浄緩衝液に高濃度の塩を使用しない場合、質量スペクトルに大きな影響を与え、コンジュゲート抗体に関係なくすべての反応部位から記録されたスペクトルでｍ／ｚが２２２２．５付近に強いピークが観察された。この非特異的な２２２２．５のピークは、分析物固有のピークに加えて質量スペクトルに存在し、キモトリプシン消化後の対応する前駆体タンパク質のタンパク質分解フラグメントの予想ｍ／ｚ値と一致した。例えば、リン酸化４Ｅ−ＢＰ１反応部位から記録された質量スペクトルは、前の実施例で同定された１２４６．３および２０５３．３ピークに加えて２２２２．５ピークを示した。２２２２．５ピークの原因となる非特異的結合化合物を同定するために、キモトリプシン消化ＭＫＮ−４５細胞溶解液に曝露したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）コンジュゲートアガロースビーズから溶出液を回収した。溶出液をエドマン分解により分析し、予測平均［Ｍ＋Ｈ］＋値が２２２２．６で、ヒトヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｉのアミノ酸２１〜３８に暫定的に割り当てられるペプチド配列ＫＡＱＫＫＤＧＫＫＲＫＲＳＲＫＥＳＹ（配列番号１８）を得た。ＵｎｉＰｒｏｔデータベースのヒトヒストンＨ２Ｂタイプ１−Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ／Ｉのエントリ番号およびエントリ名は、それぞれＰ６２８０７およびＨ２Ｂ１Ｃ＿ＨＵＭＡＮである。続いて、このデータを使用して、この非特異的結合化合物の分子量と、この化合物がキモトリプシンによる消化を受けたヒト細胞培養物などのヒト起源サンプルの質量スペクトルに現れる可能性があるという事実とに関する情報を含むエントリをマイクロ・アレイ・デコードテーブルに作成した。
【０１６６】
実施例１７
マイクロアレイの異なる反応部位への標的分析物の特異的結合
捕捉剤として使用されるポリクローナル抗体は、Ｅｖｅｒｅｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製であった。これらには、（１）ヤギ抗アコニターゼ２抗体（カタログ番号ＥＢ０９８５７、免疫原性ペプチド配列Ｃ−ＱＨＶＤＶＳＰＴＳＱＲＬＱ（配列番号１９））、（２）ヤギ抗アコニターゼ２（ａａ５４１−５５５）抗体（カタログ番号ＥＢ０９８５８、免疫原性ペプチド配列Ｃ−ＱＤＴＹＱＨＰＰＫＤＳＳＧＱＨ（配列番号２０））、（３）ヤギ抗ＧＰＩ／ニューロロイキン抗体（カタログ番号ＥＢ０９７３９、免疫原性ペプチド配列Ｃ−ＹＲＥＨＲＳＥＬＮＬＲＲ（配列番号２１））および（４）ヤギ抗ＩＤＨ３Ｂ（ａａ３６９−３８３）抗体（カタログ番号ＥＢ１０９９７、免疫原性ペプチド配列Ｃ−ＴＴＤＦＩＫＳＶＩＧＨＬＱＴＫ（配列番号２２））が含まれる。
【０１６７】
前の実施例で説明した手順を使用して、個々の抗体を磁気アガロースビーズにコンジュゲートさせた。上記の４つの抗体の１つにコンジュゲートした２つのビーズを選択し、単一の１．７ｍＬマイクロ遠心チューブで異なる抗体にコンジュゲートしたビーズを組み合わせて、８つの反応部位を含む４プレックスビーズアレイを組み立てた。続いて、組み立てたマイクロアレイを、前の実施例に記載のように調製した２ｍｇのキモトリプシン消化ＭＫＮ−４５細胞溶解液と反応させた。反応させたビーズアレイをマイクロウェルスライドに移し、分析物をビーズから溶出し、前の実施例に記載のようにＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳで分析した。
【０１６８】
マイクロアレイに存在する反応部位の数に一致する、１，０００〜５，０００ｍ／ｚの質量範囲で信号対雑音比が３：１を超える１つまたは複数のピークを有する合計８つの質量スペクトルを同定した。マイクロアレイの４つの異なる反応部位に対応する４つの異なるペアの質量スペクトルを同定した。複製反応部位から記録された質量スペクトルは、非常に類似しており、例えば、異なるスペクトル間で変動するｍ／ｚ値が０．１未満である同数のピークを有していた。図７は、個々の反応部位から取得された例示的な質量スペクトルを示す。表１は、このマイクロアレイのデコードテーブルを示す。この実施例では、配列がＱＨＰＰＫＤＳＳＧＱＨＶＤＶＳＰＴＳＱＲＬ（配列番号２３）およびｍ／ｚが２３０１．４９の同じペプチド標的を、マイクロアレイの２つの異なる反応部位、すなわち抗体ＥＢ０９８５７およびＥＢ０９８５８を含む反応部位によって捕捉した。これらの抗体は、ヒトアコニターゼ２内の隣接配列を認識し、同じタンパク質分解ペプチドに特異的に結合できるようにする。しかしながら、抗体ＥＢ０９８５７は、抗体ＥＢ０９８５８によって捕捉されなかった、配列がＱＨＶＤＶＳＰＴＳＱＲＬＱＬＬＥＰＦＤＫＷＤＧＫＤＬＥＤ（配列番号２４）およびｍ／ｚが３２９７．６０のペプチドをさらに捕捉した。したがって、表１に示すように、２つの反応部位（ＡＣＯ２およびＡＣＯ２（５４１−５５５））は、両方ともｍ／ｚ２３０１．４９で標的を結合するが、前者のみがｍ／ｚ３２９７．６０で標的を結合するので、マイクロアレイ内で容易に区別できる。実際に、表１の＊信号なし＊の注釈で示されるように、反応部位ＡＣＯ２（５４１−５５５）に関連付けられたデコードテーブルのエントリには、ｍ／ｚ３２９７．６０で信号がないことを示す特定の参照を任意で含んでもよい。さらに、図７を参照すると、ＡＣＯ２およびＡＣＯ２（５４１−５５５）スペクトルの両方がいくつかの追加のより低い強度ピークも含むことがわかる。これらのピークはそれぞれの抗体に固有であるため、それらのＭＷ、ｍ／ｚ、またはＴＯＦ値に関する情報をデコードテーブルに含めて、標的同定の信頼性をさらに高めることができる。
【０１６９】
【表１】
2020533612.tif 000003
【０１７０】
前述のマイクロアレイのデコードテーブルの簡略版を表２に示す。この実施例では、反応部位によって捕捉された標的のアミノ酸配列は提供せず、質量スペクトルで検出された１つ以上の信号のみに基づいて反応部位を同定する。さらに、表２の反応部位ＡＣＯ２（５４１−５５５）に示すように、質量スペクトルの特定のｍ／ｚで検出されない信号に基づいて、反応部位を同定できる。
【０１７１】
この実施例では、ＡＣＯ２反応部位は、２３０１．４９および３２９７．６０の２つの異なる値を含む組み合わせに関連付けられている。この組み合わせは、その反応部位の捕捉剤に特異的に結合する標的を同定するために必要かつ十分である。
【０１７２】
【表２】
2020533612.tif 000004
【０１７３】
一部の実験では、Ｅｖｅｒｅｓｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社製の２つのヤギ抗ＧＡＰＤＨ（内因性）抗体：カタログ番号ＥＢ０７０６９、免疫原性ペプチド配列Ｃ−ＧＶＮＨＥＫＹＤＮＳＬＫ（配列番号２７）およびカタログ番号ＥＢ０６３７７、免疫原性ペプチド配列Ｃ−ＨＱＶＶＳＳＤＦＮＳＤＴ（配列番号２８）をマイクロアレイに追加した。後者の抗体によって認識されるエピトープは、トリプシンによって認識されるタンパク質分解切断部位を欠くが、前者の抗体によって認識されるエピトープは、そのような部位、すなわち内部リジンを含む。
【０１７４】
実施例１８
サンプル中の標的分析物の相対存在量の推定値の提供
前述の抗体＃４８５８および＃９６４４、ならびにリン酸化ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）（Ｄ１３．１４．４Ｅ）ＸＰ（登録商標）ウサギモノクローナル抗体、カタログ番号４３７０、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製を使用して、前の実施例に記載のようにマイクロアレイを作製した。２０１７年３月２５日にアクセスした製造業者のウェブサイトで提供された説明によると、＃４３７０抗体は「…Ｅｒｋ１のＴｈｒ２０２およびＴｙｒ２０４（Ｅｒｋ２のＴｈｒ１８５およびＴｙｒ１８７）で二重リン酸化され、Ｔｈｒ２０２で単一リン酸化された場合、内因性レベルのｐ４４およびｐ４２ＭＡＰキナーゼ（Ｅｒｋ１およびＥｒｋ２）を検出する」。
【０１７５】
上記の３つの抗体の各々が、トリプシン消化ＭＫＮ−４５細胞溶解液のいくつかの標的を特異的に結合できることが実験的に決定された。同じ抗体によって捕捉された複数の標的からの信号の相対強度は、細胞培養およびサンプル調製条件が同様に保たれている限り、例えば同じ細胞培養培地および同じ消化酵素を使用する限り、異なるサンプル調製間でそれほど変化しないことも実験的に決定された。例えば、それぞれｍ／ｚが１４６９．６および１３１３．４の、４Ｅ−ＢＰ１のタンパク質分解フラグメントＲＡＧＧＥＥＳＱＦＥＭＤＩ（配列番号１）およびＡＧＧＥＥＳＱＦＥＭＤＩ（配列番号２）から記録されたピークの強度比は、一貫して１０：１より大きかった。ペプチドＲＬＳＳＬＲＡＳＴＳＫＳＥＳＳＱＫ（配列番号７）の二重および三重リン酸化型のピークは、４または５つのホスフェートを含むペプチドＲＬＳＳＬＲＡＳＴＳＫＳＥＳＳＱＫ（配列番号７）のピークよりも約２倍強く、それは次に、６または７つのホスフェートを含む同じペプチドからのピークよりも約３倍強かった。ｍ／ｚが２３０５．３付近のＶＡＤＰＤＨＤＨＴＧＦＬ［ｐＴ］Ｅ［ｐＹ］ＶＡＴＲ（配列番号２９）（Ｅｒｋ２）からの信号は、ｍ／ｚが２３３３．３付近のＩＡＤＰＥＨＤＨＴＧＦＬ［ｐＴ］Ｅ［ｐＹ］ＶＡＴＲ（配列番号３０）（Ｅｒｋ１）からの信号と比較して５〜２０倍強かった。
【０１７６】
したがって、表３に示すように、マイクロ・アレイ・デコードテーブルに相対ピーク強度データを含めることが可能であり、ここでは、特定の細胞株（例：ＭＫＮ−４５）、特定の治療条件（例えばＤＭＳＯ治療またはキナーゼ阻害剤治療）、および特定の消化条件（例えば質量分析配列決定グレードのトリプシン）に対して提供する。質量スペクトルのピークの相対強度は、サンプル内の対応する分析物の相対量に直接関係することが多く、そのような情報をデコードテーブルに提供することは、標的分析物の同定に役立ち得る。具体的には、表３のデータは、Ｔｈｒ１８５およびＴｙｒ１８７で二重にリン酸化されたＥｒｋ２のタンパク質分解フラグメントが、Ｔｈｒ２０２およびＴｙｒ２０４で二重にリン酸化されたＥｒｋ１のタンパク質分解フラグメントよりも、トリプシン消化ＭＫＮ−４５細胞溶解液中に多く存在することを示している。場合によっては、質量スペクトル内の信号強度とサンプル内の分析物量との関係は、例えば可変数のＰＴＭ部位を有するペプチドの場合、より複雑である。それにもかかわらず、マイクロアレイのデコードテーブルに存在量データを含むスペクトルパターンを提供することは、標的の同定に有用な方法である。例えば、リン酸化Ｓ６リボソームタンパク質（Ｓｅｒ２３５／２３６）およびリン酸化ｐ４４／４２ＭＡＰＫ（Ｅｒｋ１／２）（Ｔｈｒ２０２／Ｔｙｒ２０４）の両方の反応部位は、２３３３Ｄａに近い分子量の標的を特異的に結合できるが、存在量情報を含むマイクロ・アレイ・デコードテーブルは、検出された標的分析物の明確な割り当てを提供するのに役立ち得る。この実施例では、マイクロアレイの異なる捕捉剤によって認識される２つの標的の分子量（２３３２．９および２３３３．３）の違いは１Ｄａ未満であるが、捕捉剤によって認識される他の標的の分子量は少なくとも５Ｄａ離れており、明確に割り当てることができる。
【０１７７】
【表３】
2020533612.tif 000005
【０１７８】
実施例１９
タンパク質内の複数の部位のＰＴＭ状態を測定するために構成されたマイクロアレイ
標的分析物は、前の実施例に記載のリボソームタンパク質Ｓ６（ｒｐＳ６、ＵｎｉＰｒｏｔエントリ番号Ｐ６２７５３）としても知られるヒトＳ６リボソームタンパク質である。タンパク質の翻訳後修飾のオンラインデータベース（ＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅＰｌｕｓ（登録商標））によると、ｒｐＳ６は、タンパク質Ｃ末端に位置する残基：Ｓｅｒ２３５、Ｓｅｒ２３６、Ｓｅｒ２４０、Ｓｅｒ２４２、Ｓｅｒ２４４、Ｓｅｒ２４６、Ｓｅｒ２４７のクラスターを含む複数の部位でリン酸化され得る。
【０１７９】
ｒｐＳ６内の個々の部位のリン酸化状態を測定するためのマイクロアレイは、前述の方法を使用して作製した。マイクロアレイには、それぞれのビーズに個別にコンジュゲートした３つの異なる抗体：（１）前述のモノクローナルウサギ抗体、カタログ番号４８５８、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製、（２）ポリクローナルウサギ抗体、カタログ番号Ｅ−ＡＢ−３２８１２、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ社製（ヒューストン、テキサス州）、（３）ポリクローナルウサギ抗体、カタログ番号Ｅ−ＡＢ−３２８１３、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ社製が含まれていた。Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ社のウェブサイトで閲覧可能な製品説明によると、Ｅ−ＡＢ−３２８１２の免疫原は「Ｓｅｒ２３５の非リン酸化部位周辺」のヒトｒｐＳ６に由来する合成ペプチドである一方、Ｅ−ＡＢ−３２８１３の免疫原は「Ｓｅｒ２４０の非リン酸化部位周辺」のヒトｒｐＳ６由来の合成ペプチドである。抗体＃４８５８を含む反応部位は、Ｓｅｒ２３５／Ｓｅｒ２３６で二重にリン酸化されたｒｐＳ６のタンパク質分解フラグメント、ならびにＳｅｒ２３５／Ｓｅｒ２３６に加えてＳｅｒ２４０、Ｓｅｒ２４２、Ｓｅｒ２４４、Ｓｅｒ２４６および／またはＳｅｒ２４７でリン酸化されたタンパク質分解フラグメントを結合すると予想される。したがって、この反応部位の捕捉試薬によって認識されるエピトープには２つのＰＴＭが含まれる一方、反応部位に結合する標的の一部には、エピトープ外に位置する１つ以上の追加のＰＴＭが含まれる。抗体＃Ｅ−ＡＢ−３２８１２を含む反応部位は、非リン酸化Ｓｅｒ２３５を含むｒｐＳ６のタンパク質分解フラグメントに結合すると予想される。抗体＃Ｅ−ＡＢ−３２８１３を含む反応部位は、非リン酸化Ｓｅｒ２４０を含むｒｐＳ６のタンパク質分解フラグメントに結合すると予想される。ｒｐＳ６はいくつかの異なる部位でリン酸化され得るため、各マイクロアレイ反応部位は、異なる分子量のタンパク質分解ペプチドを結合すると予想される。
【０１８０】
作製されたマイクロアレイの反応部位は、それぞれ、前述のように調製されたＭＫＮ−４５細胞のトリプシン消化溶解液２００μｇと反応させた。この実施例では、各マイクロアレイ反応部位を消化溶解液とともに個々にインキュベートし、その後ＭＳ分析用に調製した。したがって、特定の反応部位にコンジュゲートした抗体の同一性は、ＭＳ分析の前および最中に既知であった。ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量スペクトルは、前述のように個々の反応部位から取得した。抗体＃４８５８によって捕捉されたタンパク質分解ペプチドの質量スペクトルは、平均ｍ／ｚが２０１３．１、２０９３．０、２１７３．０、２２５２．９、２３３２．９および２４１２．９の付近にいくつかの顕著なピークを示し、それぞれ、２、３、４、５、６および７つのリン酸化部位を含むｒｐＳ６（アミノ酸２３３〜２４９）のＣ末端フラグメントに割り当てた。抗体Ｅ−ＡＢ−３２８１３によって捕捉されたタンパク質分解ペプチドの質量スペクトルは、ｍ／ｚが１８５３．１および１９３３．０の付近に追加のピークを示し、それぞれ、０および１つのリン酸化部位を含むｒｐＳ６（アミノ酸２３３〜２４９）のＣ末端フラグメントに割り当てた。１８５３．１および１９３３．０のピークは、少なくとも２つのリン酸化部位の存在を必要とする抗体＃４８５８を使用して得られた質量スペクトルでは検出されなかった。同様に、２２５２．９、２３３２．９および２４１２．９のピークは、少なくとも１つ、あるいはそれ以上の非リン酸化部位の存在を必要とする抗体Ｅ−ＡＢ−３２８１３を使用して得られた質量スペクトルでは検出されなかった。抗体Ｅ−ＡＢ−３２８１２を使用して得られた質量スペクトルは、ｒｐＳ６の非リン酸化Ｃ末端フラグメントに対応するｍ／ｚが１８５３．１の付近に弱いピークを示し、より高いｍ／ｚでは検出可能なピークはなかった。この信号の強度が低いのは、リン酸化対応物と比較して、いくつかの内部ＡｒｇおよびＬｙｓ残基を含む非リン酸化ｒｐＳ６のトリプシン消化がより効率的であることに起因し得る。この実施例は、天然のタンパク質の配列中の異なるエピトープを特異的に認識する異なる捕捉剤を含み、異なる捕捉剤は異なるビーズに関連付けられている、マイクロアレイを示す。また、ＰＴＭ（この場合はリン酸化）の非存在下および存在下でタンパク質部位（ｒｐＳ６のＳｅｒ２３５）を特異的に認識する異なる捕捉剤を含むマイクロアレイも示す。
【０１８１】
実施例２０
タンパク質の複数のタンパク質分解フラグメントを測定するためのマイクロアレイ
このタンパク質は、前述のヒト真核生物翻訳開始因子４Ｅ結合タンパク質１（４Ｅ−ＢＰ１、ＵｎｉＰｒｏｔエントリ番号Ｑ１３５４１）である。ＰｈｏｓｐｈｏＳｉｔｅＰｌｕｓ（登録商標）データベースによると、４Ｅ−ＢＰ１は、Ｔｈｒ３７、Ｔｈｒ４６、Ｓｅｒ６５、Ｔｈｒ７０、Ｓｅｒ１０１およびＳｅｒ１１２を含む複数の部位でリン酸化され得る。
【０１８２】
４Ｅ−ＢＰ１内の個々の部位のリン酸化状態を測定するためのマイクロアレイは、前述の方法を使用して作製した。マイクロアレイには４つの抗体：（１）リン酸化４Ｅ−ＢＰ１（Ｔｈｒ３７／４６）（２３６Ｂ４）ウサギｍＡｂ（カタログ番号２８５５）、（２）リン酸化４Ｅ−ＢＰ１（Ｓｅｒ６５）（Ｄ９Ｇ１Ｑ）ウサギｍＡｂ（カタログ番号１３４４３）、（３）リン酸化４Ｅ−ＢＰ１（Ｔｈｒ７０）（Ｄ７Ｆ６Ｉ）ウサギｍＡｂ（カタログ番号１３３９６）および（４）４Ｅ−ＢＰ１（５３Ｈ１１）ウサギｍＡｂ（カタログ番号９６４４）が含まれ、すべてＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入し、それぞれのビーズに個別にコンジュゲートした。上記の最初の３つの抗体は、ヒト４Ｅ−ＢＰ１の対応するリン酸化部位を認識するように設計されている一方、＃９６４４抗体は４Ｅ−ＢＰ１の総量をプローブするように設計されている。したがって、マイクロアレイには、４Ｅ−ＢＰ１内の異なる部位をプローブできる４つの異なる反応部位が含まれていた。マイクロアレイには、４つの異なる反応部位の各々の複製が５つ未満含まれていた。
【０１８３】
製造業者のウェブサイトの製品説明によると、＃９６４４抗体は「ヒト４Ｅ−ＢＰ１のＳｅｒ１１２を取り囲む残基に対応する合成ペプチドでウサギを免疫することにより生成される」。この抗体を含む反応部位は、配列ＲＡＧＧＥＥＳＱＦＥＭＤＩ（配列番号１）を含む合成ペプチドを効率的に捕捉したが、配列ＲＡＧＧＥＥ［ｐＳ］ＱＦＥＭＤＩ（配列番号３１）を含む、４Ｅ−ＢＰ１のＳｅｒ１１２に対応する残基がリン酸化されたペプチドを結合しなかった。したがって、＃９６４４抗体は、同じアミノ酸配列を含むリン酸化ペプチドの存在下で非リン酸化ペプチドを特異的に認識した。
【０１８４】
作製したマイクロアレイを、前述のように調製されたＭＫＮ−４５細胞のトリプシン消化溶解液２００μｇとインキュベートした。個々の反応部位で捕捉されたペプチドは、線形および反射ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳで測定し、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡｕｔｏｆｌｅｘのＬＩＦＴモードを使用してＭＳ−ＭＳ配列決定にも供した。個々の反応部位で捕捉されたペプチドの配列をＬＩＦＴによって決定した後、抗体特異性に基づいて、アレイに含まれる４つの抗体の各々にそれらを割り当てることができた。＃９６４４抗体を含む反応部位は、ペプチドＲＡＧＧＥＥＳＱＦＥＭＤＩ（配列番号１）（切断の失敗１個、ＭＷ１４６９．５７）およびＡＧＧＥＥＳＱＦＥＭＤＩ（配列番号２）（切断の失敗０個、ＭＷ１３１３．３９）を捕捉した。＃２８５５抗体を含む反応部位は、ペプチドＶＶＬＧＤＧＶＱＬＰＰＧＤＹＳＴ［ｐＴ］ＰＧＧＴＬＦＳＴＴＰＧＧＴＲ（配列番号３２）（切断の失敗０個、ＭＷ３１２９．３６）、ＶＶＬＧＤＧＶＱＬＰＰＧＤＹＳＴＴＰＧＧＴＬＦＳＴ［ｐＴ］ＰＧＧＴＲ（配列番号３３）（切断の失敗０個、ＭＷ３１２９．３６）およびＶＶＬＧＤＧＶＱＬＰＰＧＤＹＳＴ［ｐＴ］ＰＧＧＴＬＦＳＴ［ｐＴ］ＰＧＧＴＲ（配列番号３４）（切断の失敗０個、ＭＷ３２０９．３４４９）を補足した。さらに、ＶＶＬＧＤＧＶＱＬＰＰＧＤＹＳＴ［ｐＴ］ＰＧＧＴＬＦＳＴＴＰＧＧＴＲＩＩＹＤＲＫ（配列番号３５）などの１および２個の失敗した切断部位を含むペプチドも捕捉した。＃１３４４３抗体を含む反応部位は、ペプチドＦＬＭＥ［ｃａｍＣ］ＲＮ［ｐＳ］ＰＶＴＫＴＰＰＲ（配列番号３６）（失敗した切断部位２個、ＭＷ２０１４．２８）およびＦＬＭＥ［ｃａｍＣ］ＲＮ［ｐＳ］ＰＶＴＫＴＰＰＲＤＬＰＴＩＰＧＶＴＳＰＳＳＤＥＰＰＭＥＡＳＱＳＨＬＲ（配列番号３７））（失敗した切断部位３個、ＭＷ４７４５．２９）を補足した。＃１３３９６抗体を含む反応部位は、ペプチドＦＬＭＥ［ｃａｍＣ］ＲＮＳＰＶＴＫ［ｐＴ］ＰＰＲ（配列番号３８）（失敗した切断部位２個、ＭＷ２０１４．２８）およびＦＬＭＥ［ｃａｍＣ］ＲＮＳＰＶＴＫ［ｐＴ］ＰＰＲＤＬＰＴＩＰＧＶＴＳＰＳＳＤＥＰＰＭＥＡＳＱＳＨＬＲ（配列番号３９）（失敗した切断部位３個、ＭＷ４７４５．２９）を補足した。［ｃａｍＣ］とは、カルバミドメチルシステインを示す。すべてのペプチドは天然の同位体量を有していた。
【０１８５】
この実施例では、マイクロアレイは、異なる捕捉剤、すなわち抗体＃１３４４３および＃１３３９６を含んでおり、これらの抗体は、異なるビーズに関連付けられ、分子量が５０００Ｄａ未満のヒト４Ｅ−ＢＰ１のフラグメント内のリン酸化Ｓｅｒ６５およびリン酸化Ｔｈｒ７０をそれぞれ含む異なるエピトープを個々に認識した。第１ＰＴＭ（リン酸化Ｓｅｒ６５）の部位は、第２ＰＴＭ（リン酸化Ｔｈｒ７０）の部位からアミノ酸１０個未満だけ離れている。
【０１８６】
この実施例では、抗体＃２８５５、すなわちＳＴ［ｐＴ］Ｐ配列（配列番号４０）によって認識されるエピトープは、ヒトおよびマウス
４Ｅ−ＢＰ１の両方に天然に生じる。
【０１８７】
この実施例では、抗体＃２８５５および＃９６４４によって認識されるエピトープは、トリプシンおよびキモトリプシンによって認識されるタンパク質分解切断部位を欠く。
【０１８８】
この実施例では、タンパク質の３つの異なるＰＴＭ含有フラグメントを、マイクロアレイの異なる反応部位で捕捉した。
【０１８９】
この実施例では、タンパク質分解ペプチドの捕捉に使用される抗体は、ウェスタンブロット、免疫沈降、免疫蛍光、免疫組織化学、フローサイトメトリーおよびＥＬＩＳＡを含むアッセイについて製造業者によって検証されている。
【０１９０】
４Ｅ−ＢＰ１の配列長は１１８アミノ酸である。マイクロアレイの個々の反応部位によって捕捉された４Ｅ−ＢＰ１のタンパク質分解フラグメントの長さは、１３アミノ酸〜４２アミノ酸の範囲であった。マイクロアレイによって捕捉されたすべての非重複タンパク質分解フラグメントの合計の配列長は８６アミノ酸であり、タンパク質の配列長の７０％超であった。この実施例では、タンパク質のかなりの部分、例えばタンパク質の配列長の５０％超を、１０個未満の異なる捕捉剤を含むマイクロアレイを使用してプローブすることができた。
【０１９１】
別の実験では、同じマイクロアレイを、キモトリプシンで消化したＭＫＮ−４５細胞溶解液と反応させた。抗体＃９６４４を含む反応部位は、ペプチドＲＮＳＰＥＤＫＲＡＧＧＥＥＳＱＦＥＭＤＩ（配列番号４１）（失敗した切断部位１個、ＭＷ２２９６．４４）およびＲＮ［ｐＳ］ＰＥＤＫＲＡＧＧＥＥＳＱＦＥＭＤＩ（配列番号４２）（失敗した切断部位１個、ＭＷ２３７６．４２）を捕捉した。この反応部位の捕捉剤によって認識されるエピトープはＰＴＭを含まなかったが、捕捉されたペプチド標的の１つは、ヒト４Ｅ−ＢＰ１のＳｅｒ１０１に対応する位置にＰＴＭ、すなわちリン酸化を含んでいた。
【０１９２】
実施例２１
異なるＰＴＭ種類を含む標的を結合するために構成されたマイクロアレイ反応部位
Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社（ミネアポリス、ミネソタ州）ヒト／マウス／ラットリン酸化ＣＤＣ２／ＣＤＫ１（Ｙ１５）抗体、カタログ番号ＡＦ８８８は、ヒトサイクリン依存性キナーゼ２（ＵｎｉＰｒｏｔエントリ番号Ｐ２４９４１）［Ａｃ］ＭＥＮＦＱＫＶＥＫＩＧＥＧＴ［ｐＹ］ＧＶＶＹ（配列番号４３）（切断の失敗２個、ＭＷ２３１４．５２）のキモトリプシン消化フラグメントを認識し、これには、Ｎ末端のアセチル化およびヒトＣＤＣ２のＴｙｒ１５に対応するアミノ酸のリン酸化の両方が含まれる。第１ＰＴＭ（リン酸化）はエピトープ内に位置し、第２ＰＴＭ（アセチル化）はエピトープ外に位置する。この実施例では、第１ＰＴＭの部位は、分子量４０００Ｄａ未満のペプチド内で１０個を超えるアミノ酸だけ第２ＰＴＭの部位から離れている。
【０１９３】
実施例２２
異なる生物学的経路の構成要素である異なるタンパク質に由来する標的を結合するために構成された捕捉剤
ヒトＳＴＡＴ１（ＵｎｉＰｒｏｔエントリ番号Ｐ４２２２４）にあるアミノ酸配列ＰＫＥＡＰ（配列番号４４）を認識する抗体は、転写因子ｐ６５（ＵｎｉＰｒｏｔエントリ番号Ｑ０４２０６）にあるアミノ酸配列ＰＫＰＡＰ（配列番号４５）も認識する。前者のタンパク質は信号変換因子および転写活性化因子であり、後者は転写因子である。これらの配列を含むＳＴＡＴ１およびｐ６５のＭＡＬＤＩ  ＭＳ検出可能なフラグメントは、前述の方法を使用して、ＭＫＮ−４５細胞の溶解液中のそれぞれの前駆体タンパク質のキモトリプシン消化により生成できる。そのような抗体は、Ｓｔａｔ１（Ｄ１Ｋ９Ｙ）ウサギｍＡｂ、カタログ番号＃１４９９４としてＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から入手できる。
【０１９４】
実施例２３
無傷のタンパク質と低分子標的分析物とを結合するために構成されたマイクロアレイ
マイクロアレイには、無傷の、すなわち消化されていないタンパク質および低分子標的を認識するためにそれぞれの製造業者によって検証された抗体が含まれていた。ヒトインスリン（ＭＷ５８０７．６Ｄａ）を認識するマウスモノクローナル抗体は、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、カタログ番号ＮＢＰ２−３２９７５であった。完全長ヒトＣ反応性タンパク質（ＭＷ２５０３９Ｄａ）を認識するウサギポリクローナル抗体は、Ａｂｃａｍ社製、製品コードａｂ３１１５６であった。コルチゾール（ＭＷ３６２．４６）を認識するマウスモノクローナル抗体は、Ａｂｃａｍ社製、製品コードａｂ１１６６００であった。テストステロン（ＭＷ２８８．４３）を認識するマウスモノクローナル抗体は、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社製、カタログ番号ＮＢＰ１−７８５６２であった。
【０１９５】
マイクロアレイには、分子量が７００Ｄａ未満の低分子を認識する抗体と、分子量が５０００Ｄａおよび１００００Ｄａを超える（それぞれインスリンおよびＣＲＰ）無傷のタンパク質を認識する抗体とが含まれていた。
【０１９６】
マイクロアレイには、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ＋Ｇにコンジュゲートしたビーズも含まれていた。架橋が存在しない場合、この実施例に挙げた抗体はＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ＋Ｇコンジュゲートビーズから溶出し、マトリックスとしてシナピン酸を使用するＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳで検出された。特定の抗体配列に応じて、抗体は約１３０ｋＤａ〜１７０ｋＤａの分子量範囲で検出された。この実施例は、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ＋Ｇが結合タンパク質の捕捉試薬、例えば分子量が１００ｋＤａを超える抗体として機能し得ることを示している。
【０１９７】
本明細書で引用されたすべての特許、特許出願、および公開された参考文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本開示は、その特定の実施形態に関連して説明してきたが、さらなる修正が可能であることが理解されよう。さらに、本出願は、本開示が関係する当技術分野で既知のまたは慣習的な慣行の範囲内にあり、添付の請求項の範囲内にある本開示からの逸脱を含む、本開示のあらゆる変形、使用、または適応を網羅することを意図している。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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