(57)【要約】  １２個より多い炭素原子のアルキル鎖を有する、疎水性界面活性剤を含む緩衝組成物を用いた、キャピラリー電気泳動によるタンパク質の分離。高分子量人工物の生成が抑制される。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
疎水性界面活性剤ゲル緩衝液を含む、キャピラリー電気泳動によって、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、タンパク質サンプルの解析方法。
【請求項２】
疎水性界面活性剤ゲル緩衝液中のサンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動タンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）を向上させる方法。
【請求項３】
疎水性界面活性剤ゲル緩衝液中のサンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動によって決定されるタンパク質純度を向上させる方法。
【請求項４】
疎水性界面活性剤を含む、タンパク質分離解析のためのキャピラリー電気泳動ゲル緩衝液。
【請求項５】
疎水性界面活性剤が同じ電荷の硫酸ヘッド基、および１４〜１６から選択されるアルキル鎖長のナトリウム対イオンを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
疎水性界面活性剤がテトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）およびヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）から成る群から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
疎水性界面活性剤がヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
硫酸ヘッド基、および１２個より多い炭素原子を有するアルキル鎖を含む疎水性テールを含む疎水性界面活性剤を含む、電気泳動緩衝組成物。
【請求項９】
アルキル鎖が１９または２０より少ない炭素原子を有する、請求項８に記載の緩衝組成物。
【請求項１０】
アルキル鎖が１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の炭素原子を有する、請求項９に記載の緩衝組成物。
【請求項１１】
疎水性界面活性剤がドデシル硫酸ナトリウムよりも疎水性である、請求項８〜１０のいずれか１項に記載の緩衝組成物。
【請求項１２】
疎水性界面活性剤が、ドデシル硫酸ナトリウムと比較して、キャピラリーふるい電気泳動によるタンパク質ピーク分離効率の向上を誘導することができる、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の緩衝組成物。
【請求項１３】
疎水性界面活性剤が、トリデシル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）、ペンタデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）、ヘプタデシル硫酸ナトリウム、およびオクタデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）から成る群から選択される、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の緩衝組成物。
【請求項１４】
疎水性界面活性剤がヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）である、請求項１３に記載の緩衝組成物。
【請求項１５】
疎水性界面活性剤が約０．００１％から約４％ｗ／ｖの濃度である、請求項８〜１４のいずれか１項に記載の緩衝組成物。
【請求項１６】
組成物がさらに、緩衝成分、有機性添加剤、親水性ポリマー、金属キレーター、およびそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、１つ以上のさらなる成分を含む、請求項８〜１５のいずれか１項に記載の緩衝組成物。
【請求項１７】
緩衝成分がトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６に記載の緩衝組成物。
【請求項１８】
有機性添加剤がマンニトール、グリセロール、エチレングリコール、エタノール、メタノール、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６または１７に記載の緩衝組成物。
【請求項１９】
親水性ポリマーがデキストラン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載の緩衝組成物。
【請求項２０】
金属キレーターがエチレンジアミンテトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の緩衝組成物。
【請求項２１】
請求項４に記載の緩衝液、または請求項８〜２０のいずれか１項に記載の組成物を含むサンプル緩衝液中の、対象のタンパク質を変性させることを含む、電気泳動による対象のタンパク質の分離方法。
【請求項２２】
さらに泳動緩衝液中で電気泳動ゲルを泳動させることを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
泳動緩衝液および／または電気泳動ゲルが、請求項４に記載の緩衝液または請求項８〜２０のいずれか１項に記載の組成物を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
請求項４に記載の緩衝液、または請求項８〜２０のいずれか１項に記載の組成物を含むサンプル緩衝液中の、対象のタンパク質を変性させること、および泳動緩衝液中で電気泳動ゲルを泳動させることを含む、電気泳動による対象のタンパク質のピーク分離効率を向上させる方法であって、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて行った分離のタンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）に比べて、タンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）が向上する、方法。
【請求項２５】
電気泳動がキャピラリーゲル電気泳動である、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
電気泳動ゲルの結果が、ドデシル硫酸ナトリウムを用いて行われた電気泳動ゲルに比べて、人工高分子量種が少ないことを示す、請求項１〜３、５〜７、および２１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
変性が、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約７５℃、または少なくとも約８０℃の温度で行われる、請求項１〜３、５〜７、および２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
変性が、約６０℃および約７０℃の間、約６５℃および約７０℃の間、または約６０℃および約６５℃の間の温度で行われる、請求項１〜３、５〜７、および２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
変性が、少なくとも約３分、少なくとも約４分、少なくとも約５分、少なくとも約６分、少なくとも約７分、少なくとも約８分、少なくとも約９分、少なくとも約１０分にわたって行われる、請求項１〜３、５〜７、および２１〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
対象のタンパク質が抗体である、請求項１〜３、５〜７、および２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
抗体がＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびＩｇＧから選択されるアイソタイプである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ＩｇＧ抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
対象のタンパク質が、酵素、ホルモン、サイトカイン、細胞表面受容体、プロテアーゼ、サイトカイン受容体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項１〜３、５〜７、および２１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
対象のタンパク質が融合タンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
融合タンパク質が非相同部位に融合している、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
非相同部位が半減期延長部位である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
半減期延長部位がＦｃを含む、請求項３６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国仮特許出願第６２／５５５３３５号（２０１７年９月７日出願）の優先権を主張し、この開示は引用によってその全体が本明細書に援用される。
キャピラリー電気泳動によってタンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）を向上させることができる方法。当該方法は、界面活性剤のタンパク質への親和性を向上させることによってタンパク質分離効率（ＰＳＥ）を向上させるために、界面活性剤の疎水性を上昇させることを含む。
【背景技術】
【０００２】
本出願にわたって、様々な文献が、括弧内において、著者名および日付によって、または特許番号または特許公開番号によって参照される。これらの文献の開示は、本明細書に記載および請求される開示の日付に当業者に既知の技術水準をさらに完全に記載するために、本明細書において引用によってその全体が本出願に援用される。しかしながら、本明細書における参照文献の引用は、そのような文献が本開示の先行文献であると認識するものとみなされるべきではない。
【０００３】
治療用タンパク質の商業化には、生合成の複雑さから生成物の不均一性を測定することができる分析技術が必要である(Chirino, A. J., et.al.(2004) Characterizing Biological Products and Assessing Comparability Following Manufacturing Changes. Nat Biotechnol. 22, 1383−1391,2; Zhao, S., et.al.(2014) Applications of Capillary Electrophoresis in Characteriziong Recombinant Protein Therapeutics. Electrophoresis 35, 96−108)。この目的のために、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）は、分子量および流体力学半径によってタンパク質を分離し、定量的に検出することによって、タンパク質サイズの不均一性を理解することに寄与する（Rustandi, R.. et.al. (2008) Applications of CE SDS Gel in Development of Biopharmaceutical Antibody−Based Products. Electrophoresis 29, 3612−3620−4; Chen, T., et.al. (2016) Antibody−Drug Conjugate Characterization by Chromatographic and Electrophoretic Techniques. J. Chromatogr. B 1032, 39−50）。この方法において、タンパク質は帯電した界面活性剤によって変性されて、親水性ゲル緩衝溶液にみたされたキャピラリーを通ってふるいにかけられて、分子量に応じて分離される、均一の分子量／電荷比を有する、タンパク質−界面活性剤複合体を生じる。その後、ＵＶ検出は理想的には、ピークの定量化が起こりうるキャピラリーに沿った場所で行われ、これには高い段数および分離によって定義される、適切なタンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）が必要である。この点において、ＣＧＥはほとんどの治療タンパク質、特にＩｇＧについてよく機能し、バイオテクノロジー産業において製品純度の評価の基準として受け入れられてきた (Nunally, B., et.al. (2006) A Series of Collaborations Between Various Pharmaceutical Companies and Regulatory Authorities Concerning the Analysis of Biomolecules Using Capillary Electrophoresis. Chromatographia 64, 359−368)。
【０００４】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、従来のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）において確率されているため、主にＣＧＥ分離のための既定の界面活性剤として使用されてきた（Laemmli, U. K. (1970) Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of Bacteriophage T4. Nature 227, 680−685; Otzen, D. E. (2015) Proteins in a Brave New Surfactant World. Curr. Opin. Colloid Interface Sci. 20, 161−169）。さらに、ＳＤＳは１ｇのタンパク質に対して１．４ｇのＳＤＳの比で、一般的なタンパク質に均一に結合することができ、ほとんどの場合、ＳＤＳ：タンパク質複合体の均一な質量／電荷比を保証する(Reynolds, J. A., et.al.(1970) Binding of Dodecyl Sulfate to Proteins at High Binding Ratios.  Possible Implications for the State of Proteins in Biological Membrane. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 66, 1002−1007)。したがって、ＣＧＥは一般にＳＤＳ−ＣＧＥまたはＣＥ−ＳＤＳと称される。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の実施態様は、疎水性界面活性剤ゲル緩衝液を含む、キャピラリー電気泳動によって、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、タンパク質サンプルの解析方法である。
【０００６】
本発明の実施態様は、疎水性界面活性剤ゲル緩衝液において、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動タンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）を向上させる方法である。
【０００７】
本発明の実施態様は、疎水性界面活性剤ゲル緩衝液において、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動によってタンパク質純度決定を向上させる方法である。
【０００８】
本発明の別の実施態様は、疎水性界面活性剤ゲル緩衝液を含むキャピラリー電気泳動によって、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、タンパク質サンプルを解析する方法であって、ここで、疎水性界面活性剤は同じ電荷の硫酸ヘッド基、および１１、１４、および１６から選択されるアルキル鎖長を有するナトリウム対イオンを有する。
【０００９】
本発明の別の実施態様は、疎水性界面活性剤ゲル緩衝液における、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動タンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）を向上させる方法であって、ここで、疎水性界面活性剤は同じ電荷の硫酸ヘッド基、および１１、１４、および１６から選択されるアルキル鎖長を有するナトリウム対イオンを有する。
【００１０】
本発明の別の実施態様は、疎水性界面活性剤ゲル緩衝液における、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動によるタンパク質純度の決定を向上させる方法であって、ここで、疎水性界面活性剤は同じ電荷の硫酸ヘッド基、および１１、１４、および１６から選択されるアルキル鎖長を有するナトリウム対イオンを有する。
【００１１】
本発明の別の実施態様は、ウンデシル硫酸ナトリウム（ＳＵＳ）、テトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）、およびヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）から成る群から選択される、疎水性界面活性剤ゲル緩衝液を含む、キャピラリー電気泳動によるサンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、タンパク質サンプルを解析する方法である。
【００１２】
本発明の別の実施態様は、ウンデシル硫酸ナトリウム（ＳＵＳ）、テトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）、およびヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）から成る群から選択される、疎水性界面活性剤ゲル緩衝液において、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動タンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）を向上させる方法である。
【００１３】
本発明の別の実施態様は、ウンデシル硫酸ナトリウム（ＳＵＳ）、テトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）、およびヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）から成る群から選択される、疎水性界面活性剤ゲル緩衝液における、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動によるタンパク質純度決定を向上させる方法である。
【００１４】
本発明の別の実施態様は、ヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）ゲル緩衝液を含む、キャピラリー電気泳動によるサンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、タンパク質サンプルの解析方法である。
【００１５】
本発明の別の実施態様は、ヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）ゲル緩衝液における、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動タンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）を向上させる方法である。
【００１６】
本発明の別の実施態様は、ヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）ゲル緩衝液において、サンプル中の変性された対象のタンパク質を分離することを含む、キャピラリー電気泳動によって決定されるタンパク質純度決定を向上させる方法である。
【００１７】
本発明の別の実施態様は、疎水性界面活性剤を含む、タンパク質分離解析のためのキャピラリー電気泳動ゲル緩衝液である。
【００１８】
いくつかの実施態様において、本開示に有用な電気泳動緩衝組成物は、硫酸ヘッド基、および１２個より多い炭素原子を有するアルキル鎖を含む疎水性テールを含む、疎水性界面活性剤を含む。
【００１９】
いくつかの実施態様において、疎水性界面活性剤は、１９または２０より少ない炭素原子を有するアルキル鎖を有する。いくつかの実施態様において、疎水性界面活性剤のアルキル鎖は、１３、１４、１５、１６、１７、または１８個の炭素原子を有する。いくつかの実施態様において、緩衝組成物は、ドデシル硫酸ナトリウムよりも疎水性の大きい疎水性界面活性剤を含む。
【００２０】
当該方法は、タンパク質ピーク分離効率を向上させるのに有効でありうる。いくつかの実施態様において、疎水性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウムと比較して、キャピラリーふるい電気泳動によるタンパク質ピーク分離効率の向上を誘導することができる。別の実施態様において、疎水性界面活性剤は、ＨＭＷ種人工物を除去することができる。
【００２１】
いくつかの実施態様において、緩衝組成物は、トリデシル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）、ペンタデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）、ヘプタデシル硫酸ナトリウム、およびオクタデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）から成る群から選択される界面活性剤を含む。いくつかの実施態様において、疎水性界面活性剤はヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）である。いくつかの実施態様において、疎水性界面活性剤は約０．０２％から約４％ｗ／ｖの濃度である。
【００２２】
いくつかの実施態様において、緩衝組成物はさらに追加の成分を含みうる。いくつかの実施態様において、緩衝組成物はさらに、緩衝成分、有機性添加剤、親水性ポリマー、金属キレーター、およびそれらの任意の組み合わせから成る群から選択される、１つ以上の追加の成分を含む。いくつかの実施態様において、緩衝成分はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、有機性添加剤はマンニトール、グリセロール、エチレングリコール、エタノール、メタノール、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施態様において、疎水性ポリマーはデキストラン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施態様において、金属キレーターはエチレンジアミンテトラ酢酸、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００２３】
当該方法は、電気泳動によって対象のタンパク質を分離するために有用であって、ここで、電気泳動緩衝液は、サンプル緩衝液、泳動緩衝液、および／またはゲル自体に加えられる。いくつかの実施態様において、電気泳動によって対象のタンパク質を分離するための方法は、サンプル緩衝液において、対象のタンパク質を変性させることを含む。いくつかの実施態様において、当該方法はさらに、泳動緩衝液において、電気泳動ゲルを泳動することを含む。いくつかの実施態様において、泳動緩衝液および／または電気泳動ゲルは、電気泳動緩衝組成物を含む。
【００２４】
当該方法は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて行った分離のタンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）と比較して、タンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）を向上させるのに有用である。いくつかの実施態様において、電気泳動によって対象のタンパク質のピーク分離効率を向上させる方法は、サンプル緩衝液において対象のタンパク質を変性させること、および／または泳動緩衝液においてサンプルを電気泳動させることを含み、ここで、タンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて行った分離のタンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）と比較して、タンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）が向上する。いくつかの実施態様において、電気泳動はキャピラリーゲル電気泳動である。いくつかの実施態様において、電気泳動ゲルは、ドデシル硫酸ナトリウムを用いて行った電気泳動ゲルと比較して、人工高分子量種が少ないことを示す。
【００２５】
いくつかの実施態様において、変性は少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約７５℃、または少なくとも約８０℃の温度で行われる。いくつかの実施態様において、変性は約６０℃および約７０℃の間、約６５℃および約７０℃の間、または約６０℃および約６５℃の間の温度で行われる。いくつかの実施態様において、変性は少なくとも約３分、少なくとも約４分、少なくとも約５分、少なくとも約６分、少なくとも約７分、少なくとも約８分、少なくとも約９分、少なくとも約１０分にわたって行われる。
【００２６】
いくつかの実施態様において、対象のタンパク質は抗体である。いくつかの実施態様において、抗体はＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびＩｇＧから選択されるアイソタイプである。いくつかの実施態様において、ＩｇＧ抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択される。いくつかの実施態様において、対象のタンパク質は、酵素、ホルモン、サイトカイン、細胞表面受容体、プロテアーゼ、サイトカイン受容体、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、対象のタンパク質は融合タンパク質である。いくつかの実施態様において、融合タンパク質は非相同部位に融合する。いくつかの実施態様において、非相同部位は半減期延長部位である。いくつかの実施態様において、半減期延長部位はＦｃを含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１Ａ−１Ｃは、ゲル緩衝液溶液に加えた０．２％ヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）が存在する、または存在しない結果を比較した、組み換え治療タンパク質−１（ＲＴＰ−１）のキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）の電気泳動図を示す。画像は対象の領域のみを表示するようにトリミングした。図１ＡはＳＤＳおよびＳＨＳゲル緩衝液のピーク分離効率（ＰＳＥ）における相対的な差異を示す、高レベルのオーバーレイを示す。メインＲＴＰ−１ピークからの不純物ピーク１（ＩＰ１）の分離における、効果またはＳＤＳゲル（図１Ｂ）およびＳＨＳゲル（図１Ｃ）を強調するベースライン拡大図。
【００２８】
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ＲＴＰ−１純度方法の範囲における、ＳＨＳの影響を示す（直線性）。図２Ａは、ふるいゲル緩衝液中にＳＤＳ、０．２％ＳＨＳ、または０．４％ＳＨＳと共に存在する、ＩＰ１の見かけの相対的割合を示す。図２Ｂは、ＳＤＳ、０．２％ＳＨＳ、または０．４％ＳＨＳと比較したＩＰ１領域シグナルの直線性を示す。ＳＨＳが存在する場合、試験した濃度範囲全体で一貫性があることに注意されたい。合わせて、データは、ＳＨＳを用いた場合には＞３０ｋであったのに対して、ＳＨＳなしでは、アッセイ範囲はピーク領域シグナル＜１０ｋに限定されたことを示す。
【００２９】
【図３】図３は、ＲＴＰ−１ ＰＳＥにおける様々な界面活性剤の影響を示す電気泳動図を示す（少しのオフセットを含む関連する領域に範囲を狭めた）。挿入図：ゲル緩衝溶液に加えた界面活性剤の構造。注入したＲＴＰ−１サンプルおよびゲル緩衝液は、電気泳動図の上に記載した界面活性剤のみを含む。メインピークおよびＩＰ１の間のメインピーク段数および分離における、ゲル緩衝液界面活性剤組成物の影響を表１に列挙する。
【００３０】
【図４】図４は、ＲＴＰ−１メインピーク段数における、ゲル緩衝液のＳＤＳ（０．２％、１％、２％、または４％）またはＳＨＳ（０．２％または１％）濃度を変化させた影響を示す。段数におけるＳＤＳの影響は、濃度が＞２．０％で飽和に近づいた。
【００３１】
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、ＲＴＰ−１のドメイン２部位の電荷表面プロファイルを示す。赤および青はそれぞれ、負および正の静電荷を示す。図５Ａおよび図５Ｂは、反対表面露出図を示す。図５Ａに示される表面の高い負電荷に注意されたい。これは、タンパク質の疎水性コアとのエネルギー的に有利な相互作用をよりよく確立することによって、アンフォールディングを開始させることができる、ＳＨＳなどのより長い疎水性テールを有するものを除いて、界面活性剤の結合の障壁となりうる。
【００３２】
【図６】図６Ａ〜６Ｄは、ＳＤＳ：ＲＴＰ−１およびＳＨＳ：ＲＴＰ−１示差走査熱量測定（ＤＳＣ）プロファイルの比較を示す。図６Ａは、ＳＤＳ濃度変化のＲＴＰ−１ ＤＳＣプロファイルにおける影響を示し、図６Ｂは、ＳＨＳ濃度変化の影響を示す。それぞれドメイン１および２を表す２つの吸熱プロファイル、Ｅ１およびＥ２を明確に見ることができ、これらを変性温度（Ｔｍ１およびＴｍ２）およびエンタルピー（ΔＨ１およびΔＨ２）について評価した。これらの関数についての値は、表２に列挙する。界面活性剤濃度に対する２つのドメインのエンタルピー変化のプロットは、図６Ｃおよび６Ｄに示す。
【００３３】
【図７】図７Ａおよび７Ｂは、ＳＤＳおよびＳＨＳゲル緩衝溶液：ｍＡｂｓ ＲＴＰ−２（図７Ａ）およびＲＴＰ−３（図７Ｂ）を用いて得た他のタンパク質のＣＧＥプロファイルを示す。ＲＴＰ−２（ＲＴＰ−２と表す）は、ＲＴＰ−３（ＲＴＰ−３と表す）と比較して、比較的高い割合の表面の疎水性を有し、タンパク質ＰＳＥとタンパク質／界面活性剤の疎水性の相関関係が示唆される。黒および赤のトレースは、それぞれＳＤＳおよびＳＨＳゲル緩衝溶液から得た電気泳動図である。
【００３４】
【図８】図８は、評価した界面活性剤（ＳＵＳ、ＳＤＳ、ＳＴＳ、およびＳＨＳ）の化学構造を示す。
【００３５】
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、ＣＥ−ＳＤＳトレースによる還元されたｍＡｂ−１およびｍＡｂ−３の電気泳動図のオーバーレイを示す。（Ｂ）はベースラインの位置で（Ａ）を拡大して、ＮＧＨＣおよびＨＣ後のＨＭＷ種のピーク形状を示す。ＬＣ＝軽鎖；ＨＣ＝重鎖；ＮＧＨＣ＝非グリコシル化重鎖；ＨＭＷ＝高分子量。図９Ａは全体図を示し、図９Ｂは拡大図を示す。図９Ａおよび９Ｂのいずれについても、上線はｍＡｂ−１を示し、下線はｍＡｂ−３を示す。
【００３６】
【図１０】図１０は、非還元（２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）なし）、部分的に還元（０．００５％および０．０２％のＢＭＥ）、および還元（５％ＢＭＥ）条件下でのＣＥ−ＳＤＳによる、ｍＡｂ−１の拡大した電気泳動図のオーバーレイを示す。注：アルキル化試薬ＩＡＭを、ジスルフィド結合交換によって生じるｍＡｂ−１分子の断片を抑制するために、非還元および部分的に還元されたＣＥ−ＳＤＳ条件に加えた。一番上の最初の線は５％ＢＭＥ（完全に還元された）についてであり；二番目の線は０．０２％ＢＭＥについてであり；三番目の線は０．００５％ＢＭＥについてであり；四番目の線はＢＭＥなし（還元されない）についてである。
【００３７】
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、０．２３−１．２３ｍｇ／ｍＬの範囲内のタンパク質濃度の関数としての、純度の相対百分率（ＬＣ＋ＨＣ）（図１１Ａ）および総ＨＣ後ＨＭＷ種（図１１Ｂ）のプロットを示す。
【００３８】
【図１２】図１２は、０．５％−４％ＳＤＳを含むサンプル緩衝液を用いて調整し、ＳＤＳに基づくゲルによって分離した、還元されたｍＡｂ−１サンプルの拡大した電気泳動図のオーバーレイを示す。一番上の最初の線は４％ＳＤＳについてであり；二番目の線は３％ＳＤＳについてであり；三番目の線は２％ＳＤＳについてであり；四番目の線は１％ＳＤＳであり、一番下の五番目の線は０．５％ＳＤＳについてである。
【００３９】
【図１３】図１３は、１％ＳＤＳを含むサンプル緩衝液を用いて調製し、０．２％−４％ＳＤＳを含むゲルマトリクスを用いて分離した、還元されたｍＡｂ−１サンプルの拡大した電気泳動図のオーバーレイを示す。一番上の最初の線は０．２％ＳＤＳゲルについてであり；二番目の線は０．５％ＳＤＳゲルについてであり；三番目の線は１％ＳＤＳゲルについてであり；四番目の線は２％ＳＤＳゲルについてであり；一番下の五番目の線は４％ＳＤＳゲルについてである。
【００４０】
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、ＣＥ−ＳＤＳ（１％ＳＤＳサンプル緩衝液＋ＳＤＳに基づくゲル）によって、異なるインキュベーション条件を用いて調製した、還元されたｍＡｂ−１（図１４Ａ）およびｍＡｂ−３（図１４Ｂ）サンプルの拡大した電気泳動図のオーバーレイを示す。図１４Ａおよび１４Ｂの両方について、一番上の最初の線は、５分間６０℃のインキュベーション条件を表し；二番目の線は１０分間６０℃を表し；三番目の線は１０分間７０℃を表し；四番目の線は１０分間８０℃を表し；一番下の五番目の線は１５分間９０℃を表す。
【００４１】
【図１５】図１５は、ＣＥ−ＳＤＳによるサンプルのオンボード安定性試験における、還元されたｍＡｂ−１の拡大した電気泳動図のオーバーレイを示す。一番下の線は、保存の開始時にサンプルを１５℃で保存した結果の電気泳動図を示し；真ん中の線は１０時間後であり；一番上の線は２０時間後である。
【００４２】
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、異なるサンプル緩衝液およびゲルマトリックス条件の組み合わせによって解析した、還元されたｍＡｂ−１サンプルの拡大した電気泳動図のオーバーレイを示す。図１６Ａにおいて、還元されたｍＡｂ−１サンプルは、異なる界面活性剤（２％ＳＣ１０Ｓサンプル緩衝液、１％ＳＤＳサンプル緩衝液、および０．５％ＳＴＳサンプル緩衝液）を含むサンプル緩衝液を用いて、ＳＤＳに基づくゲル（AB Sciex）の泳動によって分離して調製した。一番上の線は、２％ＳＣ１０Ｓサンプル緩衝液の電気泳動の結果を示す。真ん中の線は、１％ＳＤＳサンプル緩衝液の電気泳動の結果を示す。一番下の線は、０．５％ＳＴＳサンプル緩衝液の電気泳動の結果を示す。図１６Ｂにおいて、還元されたｍＡｂ−１サンプルは、異なる界面活性剤（２％ＳＣ１０Ｓサンプル緩衝液、１％ＳＤＳサンプル緩衝液、および０．５％ＳＴＳサンプル緩衝液）を含むサンプル緩衝液を用いて調製し、ＳＨＳに基づくゲルの泳動によって分離した。一番上の線は、２％ＳＣ１０Ｓサンプル緩衝液の電気泳動の結果を示す。真ん中の線は、１％ＳＤＳサンプル緩衝液の電気泳動の結果を示す。一番下の線は、０．５％ＳＴＳサンプル緩衝液の電気泳動の結果を示す。
【００４３】
【図１７】図１７は、界面活性剤、０．２％ＳＨＳ、またはＳＤＳおよびＳＨＳの混合物（１％ＳＤＳ＋０．２％ＳＨＳまたは０．５％ＳＤＳ＋０．２％ＳＨＳ）を含むサンプル緩衝液を用いて調製し、ＳＨＳに基づくゲルの泳動によって分離した、還元されたｍＡｂ−１サンプルの拡大した電気泳動図のオーバーレイを示す。一番上の線は、１％ＳＤＳ＋０．２％ＳＨＳサンプル緩衝液の電気泳動の結果を示す。真ん中の線は、０．５％ＳＤＳ＋０．２％ＳＨＳサンプル緩衝液の電気泳動の結果を示す。一番下の線は、０．２％ＳＨＳサンプル緩衝液の電気泳動の結果を示す。
【００４４】
【図１８】図１８は、ＳＴＳを含むサンプル緩衝液を用いて調製し、ＳＨＳおよびＳＴＳに基づくゲルを泳動させることによって分離した、還元されたｍＡｂ−１サンプルの拡大した電気泳動図のオーバーレイを示す。上線は、ＳＴＳに基づくゲルの結果を示し；下線はＳＨＳに基づくゲルの結果を示す。
【００４５】
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、ＣＥ−ＳＤＳ法（図１９Ａ）およびＣＥ−ＳＣＸＳ法（同じヘッド基を有するがアルキル鎖長がＳＤＳと異なる、疎水性界面活性剤を用いた方法）による、還元されたｍＡｂサンプルの拡大された電気泳動図のオーバーレイを示す。図１９Ａは、ＳＤＳ含有サンプル緩衝液、およびＳＤＳに基づくふるいゲル（AB Sciex）の結果を示し；図１９Ｂは、ＳＴＳ含有サンプル緩衝液およびＳＨＳに基づくふるいゲルの結果を示す。一番上の線はｍＡｂ−２の結果を示し；真ん中の線はｍＡｂ−１の結果を示し；一番下の線はｍＡｂ−３の結果を示す。
【００４６】
【図２０】図２０は、ＳＣ１０Ｓ、ＳＤＳ、およびＳＤＳよりも疎水性である６個の界面活性剤（ＳＣ１３ＳからＳＣ１８Ｓ）の化学構造を示す。
【００４７】
本発明の詳細な説明
Ｉ．用語
本開示をさらに容易に理解することができるように、いくつかの用語を最初に定義する。本開示で用いられる場合、本明細書で別段の定めがない限り、以下のそれぞれの用語は、以下に記載される意味を有するものとする。本開示全体にわたって、追加の定義が記載される。
【００４８】
本明細書で用いられる用語「および／または」は、他の有無を問わず、２つの特定の特徴または構成要素のそれぞれの具体的な開示として解釈されるべきである。したがって、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句において用いられる用語「および／または」は、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、および「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」などの語句において用いられる用語「および／または」は、以下のそれぞれの局面：Ａ、Ｂ、およびＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）を含むことが意図される。
【００４９】
「含む」という用語を用いて本明細書において局面が記載されている場合は常に、「から成る」および／または「本質的に〜から成る」の用語で記載される同様の局面もまた提供されることが理解される。
【００５０】
別段定義されない限り、本明細書において用いられる全ての技術的および科学的用語は、本開示が関連する技術分野における当業者に一般に理解されるものと同様の意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; and the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressは、本開示で用いられる多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。
【００５１】
単位、接頭語、および記号は、国際単位系（ＳＩ）に許容された形式で記載される。数値範囲には、その範囲を定義する数値が含まれる。本明細書で提供される見出しは、本開示の様々な局面を限定するものではなく、それらは明細書全体を参照することによって得られうる。そのため、直後で定義される用語は、明細書全体を参照することによりより完全に定義される。
【００５２】
選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢の１つ、両方、またはその任意の組み合わせのいずれかを意味することが理解されるべきである。本明細書で用いられる不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、「１つ以上」の引用される、または列挙される任意の構成要素をいうことが理解されるべきである。
【００５３】
用語「約」または「本質的に〜を含む」は、当業者によって決定される、特定の値または組成物についての許容可能な誤差範囲内である、値または組成物をいい、これは値または組成物が、測定または決定される方法、すなわち測定系の制限に部分的に依存する。例えば、「約」または「本質的に〜を含む」は、当技術分野の実施ごとに、１以内または１を超える標準偏差内であることを意味しうる。あるいは、「約」または「本質的に〜を含む」は、最大で２０％の範囲を意味しうる。さらに、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、当該用語は最大で１０倍または最大で５倍の値を意味しうる。特定の値または組成物が本出願および特許請求の範囲において提供されている場合、特に断らない限り、「約」または「本質的に〜を含む」の意味は、その特定の値または組成物についての許容可能な誤差範囲の範囲内であると推定されるべきである。
【００５４】
本明細書で記載される、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲、または整数範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、特に言及されない限り、その分数（整数の１／１０、および１／１００など）の値を含むことが理解されるべきである。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「対象のタンパク質」は、その最も広い意味で用いられ、精製が望ましい、混合物中に存在する任意のタンパク質（天然または組み換えのいずれか）を含む。そのような対象のタンパク質としては、限定されないが、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、免疫グロブリン（例えば、抗体）、および／または任意の融合タンパク質が挙げられる。
【００５６】
本明細書で交互に用いられる用語「分離する」または「単離する」は、対象のタンパク質および１つ以上の不純物を含む、組成物またはサンプルから、対象のタンパク質の純度を上昇させることをいう。分離または単離は電気泳動を介して生じ、ここで電場を使用して、物質を介して負電荷に帯電した分子を移動させる。分子が同じ均一な電荷を有している場合、それらは大きさに基づいて電場を介して移動し、移動速度の違いにより、対象のタンパク質などの分子が分離または単離される。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「緩衝液」は、溶液中に存在することにより、ｐＨの単位変化を生じさせるために添加しなければならない酸またはアルカリの量を増加させる物質をいう。緩衝液は、その酸−塩基共役成分の作用によって、ｐＨの変化に抵抗する。生物学的試薬と共に使用するための緩衝液は、一般に、溶液のｐＨが生理学的範囲内になるような一定濃度の水素イオンを維持することができる。従来の緩衝成分としては、限定されないが、有機および無機塩、酸、および塩基が挙げられる。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「電気泳動緩衝組成物」は、タンパク質を変性させることができる、少なくとも１つの界面活性剤を含む物質をいう。電気泳動緩衝組成物は、サンプル緩衝液の一部としてサンプル組成物に、電気泳動緩衝液、電気泳動ゲル自体に、直接添加することができる。電気泳動緩衝組成物の例は、本明細書の他の場所に記載される。
【００５９】
用語「泳動緩衝液」は、電気泳動プロセス中に電流が流れる時に、特定のｐＨ範囲を維持するのを助けるために、電気泳動において用いられる電気泳動緩衝液をいう。それは、溶液中に存在することによって、ｐＨの単位変化を生じさせるために添加しなければならない酸またはアルカリの量を増加させる物質をいう。緩衝液は、その酸−塩基共役成分の作用によって、ｐＨの変化に抵抗する。
【００６０】
用語「サンプル緩衝液」は、電気泳動による解析のためにゲル上で泳動させるために調製される、タンパク質サンプルに添加する緩衝液をいう。これは、溶液中に存在することによって、ｐＨの単位変化を引き起こすために添加しなければならない酸またはアルカリの量を増加させる物質をいう。緩衝液は、酸塩基共役成分の作用によって、ｐＨの変化に抵抗する。サンプル緩衝液は、タンパク質を変性させ、負電荷に帯電させるために用いられる界面活性剤を含みうる。サンプル緩衝液はまた、ジスルフィド結合を破壊するために用いられるβ-メルカプトエタノール、またはゲル中のタンパク質サンプルの泳動後に用いられるブロモフェノールブルーなどの他の成分も含みうる。
【００６１】
用語「ピーク分離効率」または「ＰＳＥ」は、段数（plate count）および／または分離能によって定義される。段数は、カラムの効率を示す指標である、理論段数（Ｎ）をいう。これは段数理論に従って定義された段数を表し、理論上の段数が大きくなるほど、ピークが鋭くなる計算に基づいて、カラム効率を決定するために用いることができる。理論段数は、カラムの取扱説明書や検査報告書に数値として記載される。ガウス分布（正規分布）を想定すると、理論段数は次のように計算できる：
Ｎ＝１６（Ｒｔ／Ｗ）２
［式中、Ｎ＝理論段数（段数）、Ｒｔはピークの保持／移動時間、およびＷはピーク高の６１％に描かれた接線を有するベースラインにおけるピーク幅。］
【００６２】
比較すると、溶出の分解能は、２つの溶出ピークがクロマトグラフィー分離においてどれだけうまく区別することができるかの定量的な尺度である。これは、溶出ピークの合計幅で割った、２つのピーク間の保持時間の違いとして定義され、以下のように表される：
Ｒ＝２（Ｒｔ２−Ｒｔ１）／（Ｗ２＋Ｗ１）
［式中、Ｒ＝２つのピーク間の分離、Ｒｔ１およびＲｔ２はそれぞれ、ピーク１および２の保持／移動時間、およびＷ２＋Ｗ１はピーク高の５０％に描かれた接線を有するベースラインにおけるピーク幅の合計。］
【００６３】
本明細書で用いられる用語「不純物」は、混合物内の任意の望ましくない成分または化合物を含む、最も広い意味で用いられる。細胞培養、細胞溶解液、または浄化バルク（例えば、浄化細胞培養上清）において、不純物としては、例えば、宿主細胞核酸（例えば、ＤＮＡ）、および細胞培地に存在する宿主細胞タンパク質が挙げられる。宿主細胞不純物タンパク質としては、限定されないが、宿主細胞によって生産される天然または組み換えタンパク質、並びに対象のタンパク質に関連する、または由来するタンパク質（例えば、タンパク質分解フラグメント）、および他の工程に関連する不純物が挙げられる。いくつかの実施態様において、不純物沈殿は、遠心分離、滅菌濾過、デプス濾過、タンジェンシャルフロー濾過などの手段を用いて、細胞培養から分離される。
【００６４】
用語「抗体」は、いくつかの実施態様において、ジスルフィド結合によって分子間結合した、少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含むタンパク質をいう。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶＨと省略される）、および重鎖定常領域（本明細書においてＣＨと省略される）から成る。いくつかの抗体、例えば天然に存在するＩｇＧ抗体において、重鎖定常領域はヒンジおよび３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から成る。いくつかの抗体、例えば、天然に存在するＩｇＧ抗体において、それぞれの軽鎖は軽鎖可変領域（本明細書においてＶＬと省略される）、および軽鎖定常領域から成る。軽鎖定常領域は、１つのドメイン（本明細書においてＣＬと省略される）から成る。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存性の高い領域が分散している。それぞれのＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから成り、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順番で配置されている：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。重鎖はＣ末端リシンを含んでも、含まなくてもよい。用語「抗体」としては、二重特異性抗体または多特異性抗体が挙げられる。
【００６５】
本明細書で用いられる「ＩｇＧ抗体」、例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４抗体は、いくつかの実施態様において、天然に存在するＩｇＧ抗体の構造を有する、すなわち、同じサブクラスの天然に存在するＩｇＧ抗体と同じ数の、重鎖および軽鎖、およびジスルフィド結合を有する。例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体は、２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）から成り、ここで、（抗体がジスルフィド架橋を変更するような変異を有さない限り）２つのＨＣおよびＬＣは、それぞれ天然に存在するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４抗体におい存在するジスルフィド結合と、同じ数および部位で結合する。
【００６６】
免疫グロブリンは、限定されないが、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭなどの周知の任意のアイソタイプから選択されうる。ＩｇＧアイソタイプは、いくつかの種類においてサブクラスに分類される：ヒトにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、並びにマウスにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３。免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１は、いくつかのアロタイプで存在し、それらは最大で数個のアミノ酸が互いに異なる。「抗体」としては、例えば、天然および非天然のいずれの抗体；モノクローナルおよびポリクローナル抗体；キメラおよびヒト化抗体；ヒトおよび非ヒト抗体および全合成抗体が挙げられる。
【００６７】
本明細書で用いられる用語、抗体の「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合することができる能力を有する抗体の１つ以上のフラグメントをいう。抗体の抗原結合能は、完全長抗体のフラグメントによって発揮できることが示されている。用語、抗体の「抗原結合部位」に含まれる結合フラグメントの例としては、（ｉ）Ｆａｂフラグメント（パパイン切断からのフラグメント）、またはＶＬ、ＶＨ、ＬＣおよびＣＨ１領域から成る、同様の一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ペプシン切断からのフラグメント）、またはヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって結合される２つのＦａｂフラグメントを含む、同様の二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１領域から成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨ領域から成る、ｄＡｂフラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544−546）；（ｖｉ）単離した相補性決定領域（ＣＤＲ）；および（ｖｉｉ）適宜合成リンカーと組み合わせられうる、２つ以上の単離したＣＤＲの組み合わせが挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの２つの領域、ＶＬ、およびＶＨは、別の遺伝子にコードされているが、それらは組み換え法を用いて、ＶＬおよびＶＨ領域が対になって単一の分子（単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、 Bird et al. (1988) Science 242:423−426; および Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879−5883を参照されたい）を形成しているような単一のタンパク質鎖を作成することが可能な、合成リンカーによって組み合わせることができる。そのような単一鎖抗体はまた、用語、抗体の「抗原結合部位」に含まれることが意図される。これらの抗体フラグメントは、当業者に既知の従来の技術を用いて得られ、フラグメントは無傷の抗体と同様の方法で、有用性についてスクリーニングされる。抗原結合部位は、組み換えＤＮＡ技術によって、または無傷の免疫グロブリンの酵素的または化学的切断によって製造することができる。
【００６８】
「Ｆｃ領域」(フラグメント結晶化可能領域）、「Ｆｃドメイン」、または「Ｆｃ」は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）に存在するＦｃ受容体に対する結合、または古典補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）に対する結合などの、宿主組織または因子に対する免疫グロブリンの結合を介在する、抗体の重鎖のＣ末端領域をいう。そのため、Ｆｃ領域は第一定常領域免疫グロブリンドメイン（例えば、ＣＨ１またはＣＬ）を除く、抗体の定常領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＤ抗体アイソタイプにおいて、Ｆｃ領域は、抗体の２つの重鎖の第二（ＣＨ２）および第三（ＣＨ３）定常領域に由来する、２つの同一のタンパク質フラグメントを含み；ＩｇＭおよびＩｇＥのＦｃ領域は、それぞれのポリペプチド鎖における３つの重鎖定常領域（ＣＨ領域２〜４）を含む。ＩｇＧアイソタイプは、いくつかの種においてサブクラスに分類される：ヒトにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４、並びにマウスにおけるＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、およびＩｇＧ３。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は免疫グロブリンドメインＣＨ２およびＣＨ３、並びにＣＨ１およびＣＨ２ドメインのヒンジを含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界の定義は様々でありうるが、本明細書で定義されるヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１のＤ２２１、ＩｇＧ２のＶ２２２、ＩｇＧ３のＬ２２１、およびＩｇＧ４のＰ２２４のアミノ酸残基から、重鎖のカルボキシ末端に広がると定義され、ここで、番号付けはＫａｂａｔにおけるＥＵ指標に従う。ヒトＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインは、２３７番目のアミノ酸から３４０番目のアミノ酸から広がり、ＣＨ３ドメインはＦｃ領域におけるＣＨ２ドメインのＣ末端側に位置する、すなわち、ＩｇＧの３４１番目のアミノ酸から４４７または（Ｃ末端リシン残基が存在しない場合は）４４６番目、または（Ｃ末端のグリシンおよびリシン残基が存在しない場合は）４４５番目のアミノ酸から広がる。本明細書で用いられるＦｃ領域は、任意のアロタイプ変異体、変異型Ｆｃ（例えば、非天然で生じるＦｃ）を含む、天然のＦｃ配列でありうる。
【００６９】
「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する受容体である。ＩｇＧ抗体に結合するＦｃＲは、これらの受容体の対立遺伝子変異体、および選択的スプライシングされた形態などの、ＦｃγＲファミリーの受容体を含む。ＦｃγＲファミリーは、３つの活性型受容体（マウスにおけるＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶ；ヒトにおけるＦｃγＲＩＡ、ＦｃγＲＩＩＡ、およびＦｃγＲＩＩＩＡ）、および１つの阻害型受容体（ＦｃγＲＩＩＢ）から成る。ヒトＦｃγＲの様々な性質が、当技術分野において既知である。先天性のエフェクター細胞型の大部分は、１つ以上の活性型ＦｃγＲおよび阻害型ＦｃγＲＩＩＢを共発現するが、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は１つの活性型Ｆｃ受容体（マウスにおけるＦｃγＲＩＩＩ、およびヒトにおけるＦｃγＲＩＩＩＡ）を選択的に発現するが、マウスおよびヒトにおける阻害型ＦｃγＲＩＩＢは発現しない。ヒトＩｇＧ１はほとんどのヒトＦｃ受容体に結合し、結合する活性型Ｆｃ受容体の種類に関してはマウスＩｇＧ２ａと同じであると考えられる。
【００７０】
本明細書で用いられる用語「組み換えヒト抗体」は、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子の遺伝子組み換え、または染色体導入された動物（例えば、マウス）、またはそれらから調製されたハイブリドーマから単離した抗体、（ｂ）抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマから単離した抗体、（ｃ）組み換え、組み合わせヒト抗体ライブラリー（recombinant, combinatorial human antibody library）から単離した抗体；および（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを含む他の任意の手段によって製造、発現、作成、または単離された抗体などの、組み換え法によって製造、発現、作成、または単離された全てのヒト抗体を含む。
【００７１】
本明細書で用いられる「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされた、抗体のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、およびＩｇＥ抗体）をいう。
【００７２】
アミノ酸は一般に知られている３文字の記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会によって推奨される１文字の記号によって、本明細書において言及される。同様に、ヌクレオチドは一般に受け入れられている１文字の記号によって言及される。
【００７３】
本明細書で用いられる用語「ポリペプチド」は、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって直線的に結合されたモノマー（アミノ酸）から構成される分子をいう。用語「ポリペプチド」は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖をいい、生成物の特定の長さをいうものではない。本明細書で用いられる用語「タンパク質」は、１つ以上のポリペプチドから構成される分子を含むことが意図され、これはいくつかの場合において、アミド結合以外の結合によって結合しうる。一方で、タンパク質はまた、単一のポリペプチド鎖でありうる。後者の例において、単一のポリペプチド鎖は、いくつかの例において、互いに融合してタンパク質を形成する、２つ以上のポリペプチドサブユニットを含みうる。用語「ポリペプチド」および「タンパク質」はまた、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解切断、または非天然アミノ酸による修飾などの、発現後の修飾の生成物をいう。ポリペプチドまたはタンパク質は、天然に由来しうる。用語「ＨＭＷ種」は、対象の無傷のタンパク質、例えばｍＡｂ−１に対する相対的な見かけの分子量が高い、任意の１つ以上のタンパク質をいう。ＨＭＷ種は、目的のタンパク質と無関係でありうるか、あるいは、凝集体、例えば、二量体または多量体、無傷のタンパク質およびその任意のフラグメントの任意の組み合わせである。分子量の異なる２つのタンパク質またはそのタンパク質フラグメントは、タンパク質の界面活性剤コーティングが不均一であるために、電荷密度が不均一であることによって、電気泳動中に共に移動する可能性がある。
【００７４】
生物源または組み換え技術によって生成されるが、設計した核酸配列から必ずしも翻訳される訳ではない。それは、化学合成などの任意の方法によって生成されうる。
【００７５】
本明細書に記載される任意の濃度範囲、パーセント範囲、比率範囲、または整数範囲は、特に言及されない限り、列挙された範囲内の任意の整数値、および適切な場合は、その分数（整数の１０分の１、および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。
【００７６】
本明細書で用いられる、用語「ＨＭＷ種人工物」または「ＨＭＷ人工物」は、還元および／または非還元条件下での不十分な電気泳動の結果として表れうるピークまたはバンドをいう。ＨＭＷ人工物はそのため、純度の結果が過小評価され、アッセイの頑強性が不十分になることにつながる可能性がある。非還元条件下において、２つのｍＡｂのプロファイルにおいて示されるＨＭＷ人工物は、完全に変性しておらず、そのため、界面活性剤に均一にコーティングされていないタンパク質種であり、これは固有のタンパク質凝集種と共に移動する。非還元ＣＥ−ＳＤＳ法によって測定される、ＨＭＷ種人工物の凝集量は、ネイティブサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および分析超遠心分離（ＡＵＣ）などの、他の直交的な方法によって報告された値よりも有意に高くなり得る。
【００７７】
本明細書で用いられる用語「ｍＡｂ−１」は、抗ＩＬ８抗体（ＨｕＭａｘ−ＩＬ８）をいう。任意の抗ＩＬ−８抗体が本開示に用いられうるが、本明細書で実施例として用いられる抗ＩＬ８抗体は、２００４年７月１５日に公開されたＷＯ２００４／０５８７９７のＰＣＴ公報ににおいて記載される。
【００７８】
本明細書で用いられる用語「ｍＡｂ−２」または「ＲＴＰ−２」は、抗ＴＩＧＩＴ抗体をいう。任意の抗ＴＩＧＩＴ抗体が本開示に用いられうるが、本開示で用いられる抗ＴＩＧＩＴ抗体は、２０１６年６月３０日に公開されたＷＯ２０１６／１０６３０２のＰＣＴ公報において記載される。
【００７９】
本明細書で用いられる用語「ｍＡｂ−３」は、抗ＩＰ−１０抗体をいう。任意の抗ＩＬ−１０抗体が本開示に用いられうるが、本開示で用いられる抗ＩＰ−１０抗体は、２００５年６月３０日に公開されたＷＯ２００５／０５８８１５、２０１７年６月８日に公開されたＷＯ２０１７／０９５８７５、および２０１６年８月３０日に公開されたＵＳ特許第９，４２９，５８１号において記載される。
【００８０】
本開示の様々な局面が、以下のサブセクションにおいてさらに詳細に記載される。
【００８１】
ＩＩ．電気泳動緩衝組成物
組み換えタンパク質発現、例えば、組み換えモノクローナル抗体の発現は複雑であり、化学的および物理的分解と共に多数の翻訳後修飾を必要とする。そのため、治療タンパク質の発現には、開発と生産の各段階において定期的な観察が必要である。タンパク質の純度、不均一性、および安定性の、信頼できる頑強な評価を提供することができる分析方法が、治療タンパク質のプロセス開発および品質管理における製品の特性評価を助けるために必要である。
【００８２】
一般にＣＥ−ＳＤＳと称されるドデシル硫酸ナトリウムを用いた、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）のキャピラリー形式であり、ここで、ポリアクリルアミドスラブゲルは、交換可能なポリマーふるいマトリクスで充填された細径ガラスキャピラリーで置き換えられている。従来の労働不感受性（labor−insensitive）ＳＤＳ−ＰＡＧＥに対して、ＣＥ−ＳＤＳは全体的な断片化パターンを測定することができ、直接的なオンカラムＵＶまたは蛍光検出、自動化、並びに向上した分離および再現性などの利点を有する、正確なタンパク質の定量化を行うことができる。
【００８３】
ＳＤＳは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＣＥ−ＳＤＳ技術の両方において、タンパク質変性のためのデフォルトの界面活性剤として広く用いられており、これはタンパク質が重量ベースで比較的一定量のＳＤＳに結合し（〜１．４ｇのＳＤＳ／１ｇのタンパク質）、ほとんどの場合においてＳＤＳ−タンパク質複合体の均一な分子量／電荷比を生じるという、広く受け入れられている事実に起因しうる。その結果、タンパク質分子の内因性ポリペプチドの電荷は無視できるほどになり、最終的な分離は変性したポリペプチドの相対的な分子量の違いに完全に依存する。
【００８４】
しかしながら、電荷およびグリコシル化特性によって、ＳＤＳがいくつかのタンパク質に均一に結合できず、そのため低いタンパク質ピーク分離効率が生じるというシナリオが存在し、このことから比較的低いＳＤＳ結合親和性および／または不完全な変性が示唆される。この最近特定された、分析における問題は、高分子量（ＨＭＷ）人工物は、非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳ条件の両方で、タンパク質分子の純度解析において生じ、これによって過小評価された純度結果および不十分なアッセイの頑強性を生じるという事実に部分的に起因する。非還元条件下において、２つのｍＡｂの特性において示されるＨＭＷ人工物は、完全に変性しておらず、そのため界面活性剤ＳＤＳで均一にコーティングされておらず、内因性のタンパク質凝集体種と共に移動したタンパク質種であった可能性がある。非還元ＣＥ−ＳＤＳ法によって測定された、これらの凝集体量は、ネイティブサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）および分析超遠心分離（ＡＵＣ）などの、他の直交的方法によって報告された値よりも、有意に高かった。ＳＨＳ含有ふるいゲルを用いること、および通常のＳＤＳに基づくサンプル緩衝液を用いてサンプル変性を維持することによって、ＨＭＷ種の生成はうまく抑えられ、そのため合理的な凝集体量を伴う、さらに信頼性のある純度結果が、これらの２つのｍＡｂについて報告された。これらの人工物の量は、タンパク質濃度、サンプル緩衝液、泳動緩衝液、またはゲルマトリックス中のＳＤＳ量などの、サンプル生成パラメーターによって、有意に影響を受けた。サンプルにゲル緩衝液だけでなく、比較的疎水性の界面活性剤を加えることによって、モノクローナル抗体１（ｍＡｂ−１）およびモノクローナル抗体２（ｍＡｂ−２）のＨＣを十分に変性させる、改良された能力が発揮され、そのためＨＣ後のＨＭＷ人工物の生成が抑制されることが発見された。
【００８５】
本開示において評価された、および有用な界面活性剤は、アルキル鎖長のみが異なる、同様に荷電した硫酸ヘッド基およびナトリウム対イオンを含むことができる。界面活性剤は、緩衝液および／またはゲル中に、電気泳動緩衝組成物として含まれうる。いくつかの実施態様において、本開示の電気泳動緩衝組成物は、硫酸ヘッド基、および１１個の炭素原子を有するアルキル鎖、または１２個より多い炭素原子を有するアルキル鎖を含む疎水性テールを含む、疎水性界面活性剤を含む。いくつかの実施態様において、電気泳動緩衝組成物は、１９または２０個未満の炭素原子を有するアルキル鎖を含む、疎水性界面活性剤を含む。いくつかの実施態様において、疎水性界面活性剤は、１３から２０個の炭素原子、１３から１９個の炭素原子、１３から１８個の炭素原子、１４から１８個の炭素原子、１４から１９個の炭素原子、１４から２０個の炭素原子、１５から２０個の炭素原子、１５から１９個の炭素原子、１５から１８個の炭素原子、１６から２０個の炭素原子、１６から１９個の炭素原子、１６から１８個の炭素原子、１７から２０個の炭素原子、１７から１９個の炭素原子、または１７から１８個の炭素原子を有する、硫酸ヘッド基およびアルキル鎖を有する。別の実施態様において、疎水性界面活性剤は、硫酸ヘッド基、および１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個の炭素原子を有するアルキル鎖を有する。別の実施態様において、疎水性界面活性剤は、硫酸ヘッド基、および１８個の原子を有するアルキル鎖を有する。いくつかの実施態様において、疎水性界面活性剤は、硫酸ヘッド基、および１６個の原子を有するアルキル鎖を有する。本開示の目的のために、疎水性界面活性剤における硫酸ヘッド基は、ドデシル硫酸ナトリウムにおける硫酸ヘッド基と少なくとも同じ程度に高い、正味の負の点電荷を有する。いくつかの実施態様において、疎水性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウムよりもさらに疎水性である。別の実施態様において、疎水性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウムに比べて、キャピラリーふるい電気泳動によって、向上したタンパク質ピーク分離効率を生じることができる。
【００８６】
いくつかの実施態様において、疎水性界面活性剤は、トリデシル硫酸ナトリウム、テトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ）、ペンタデシル硫酸ナトリウム、ヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）、ヘプタデシル硫酸ナトリウム、およびオクタデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）から成る群から選択される。いくつかの実施態様において、疎水性界面活性剤はヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）である。これらの実施態様は、図２０に示される。
【００８７】
いくつかの実施態様において、疎水性界面活性剤は、サンプル緩衝液、泳動緩衝液、および／またはゲル中に約０．００１％から約４％ｗ／ｖの濃度で存在する。いくつかの実施態様において、本開示の電気泳動緩衝液またはゲルの調製のために用いることができる、疎水性界面活性剤の濃度の範囲は、例えば、約５％以下、約４．５％以下、約４％以下、約３．５％以下、約３％以下、約２．５％以下、約２％以下、約１．５％以下、約１％以下、約０．９％以下、約０．８％以下、約０．７％以下、約０．６％以下、約０．５％以下、約０．４％以下、約０．３％以下、約０．２％以下、約０．１％以下、約０．０９％以下、約０．０８％以下、約０．０７％以下、約０．０６％以下、約０．０５％以下、約０．０４％以下、約０．０３％以下、約０．０２％以下、約０．０１％以下、または約０．００１％以下である。疎水性界面活性剤の範囲は、約０．００１％から約０．５％、０．０１％から約０．５％、約０．０２％から約０．５％、０．０３％から約０．５％、０．０４％から約０．５％、０．０５％から約０．５％、０．０６％から約０．５％、０．０７％から約０．５％、０．０８％から約０．５％、０．０９％から約０．５％、約０．１％から約０．５％、約０．２％から約０．５％、約０．３％から約０．５％、約０．４％から約０．５％、約０．０２％から約０．４％、０．０３％から約０．４％、０．０４％から約０．４％、０．０５％から約０．４％、０．０６％から約０．４％、０．０７％から約０．４％、０．０８％から約０．４％、０．０９％から約０．４％、約０．１％から約０．４％、約０．２％から約０．４％、約０．３％から約０．４％、約０．０２％から約０．３％、０．０３％から約０．３％、０．０４％から約０．３％、０．０５％から約０．３％、０．０６％から約０．３％、０．０７％から約０．３％、０．０８％から約０．３％、０．０９％から約０．３％、約０．１％から約０．３％、約０．２％から約０．３％、約０．０２％から約０．２％、０．０３％から約０．２％、０．０４％から約０．２％、０．０５％から約０．２％、０．０６％から約０．２％、０．０７％から約０．２％、０．０８％から約０．２％、０．０９％から約０．２％、約０．１％から約０．２％、約０．０２％から約０．１％、０．０３％から約０．１％、０．０４％から約０．１％、０．０５％から約０．１％、０．０６％から約０．１％、０．０７％から約０．１％、０．０８％から約０．１％、または約０．０９％から約０．１％でありうる。別の実施態様において、疎水性界面活性剤の濃度範囲は、約０．００１％から約４％、約０．０１％から約４％、約０．０２％から約４％、約０．０３％から約４％、約０．０４％から約４％、約０．０５％から約４％、約０．０６％から約４％、約０．０７％から約４％、約０．０８％から約４％、約０．０９％から約４％、約０．１％から約４％、約０．２％から約４％、約０．３％から約４％、約０．４％から約４％、約０．５％から約４％、約０．６％から約４％、約０．７％から約４％、約０．８％から約４％、約０．９％から約４％、約１％から約４％、約０．１％から約３％、約０．２％から約３％、約０．３％から約３％、約０．４％から約３％、約０．５％から約３％、約０．６％から約３％、約０．７％から約３％、約０．８％から約３％、約０．９％から約３％、約１％から約３％、約０．１％から約２％、約０．２％から約２％、約０．３％から約２％、約０．４％から約２％、約０．５％から約２％、約０．６％から約２％、約０．７％から約２％、約０．８％から約２％、約０．９％から約２％、約１％から約２％、約０．１％から約１％、約０．２％から約１％、約０．３％から約１％、約０．４％から約１％、約０．５％から約１％、約０．６％から約１％、約０．７％から約１％、約０．８％から約１％、約０．９％から約１％、または約１％から約２％である。いくつかの実施態様において、疎水性界面活性剤の濃度は、約０．００１％、約０．０１％、約０．０２％、約０．０３％、約０．０４％、約０．０５％、約０．０６％、約０．０７％、約０．０８％、約０．０９％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、約２．０％、約２．１％、約２．２％、約２．３％、約２．４％、約２．５％、約２．６％、約２．７％、約２．８％、約２．９％、または約３．０％でありうる。
【００８８】
いくつかの実施態様において、電気泳動緩衝組成物は２つ以上の界面活性剤を含み、ここれ、少なくとも１つの界面活性剤は疎水性界面活性剤である、すなわち、少なくとも１３個の炭素原子を有するアルキル鎖を有する、例えば、ＳＣ１３Ｓ、ＳＣ１４Ｓ、ＳＣ１５Ｓ、ＳＣ１６Ｓ、ＳＣ１７Ｓ、またはＳＣ１８Ｓである。いくつかの実施態様において、電気泳動緩衝組成物は、ＳＤＳと、疎水性界面活性剤、すなわち、少なくとも１３個の炭素原子を有する、例えば、ＳＣ１３Ｓ、ＳＣ１４Ｓ、ＳＣ１５Ｓ、ＳＣ１６Ｓ、ＳＣ１７Ｓ、またはＳＣ１８Ｓとの混合物を含む。別の実施態様において、電気泳動緩衝組成物は、２つの疎水性界面活性剤の混合物、例えば、ＳＣ１３ＳおよびＳＣ１４Ｓ、ＳＣ１３ＳおよびＳＣ１５Ｓ、ＳＣ１３ＳおよびＳＣ１６Ｓ、ＳＣ１３ＳおよびＳＣ１７Ｓ、ＳＣ１３ＳおよびＳＣ１８Ｓ、ＳＣ１４ＳおよびＳＣ１５Ｓ、ＳＣ１４ＳおよびＳＣ１６Ｓ、ＳＣ１４ＳおよびＳＣ１７Ｓ、ＳＣ１４ＳおよびＳＣ１８Ｓ、ＳＣ１５ＳおよびＳＣ１６Ｓ、ＳＣ１５ＳおよびＳＣ１７Ｓ、ＳＣ１５ＳおよびＳＣ１８Ｓ、ＳＣ１６ＳおよびＳＣ１７Ｓ、ＳＣ１６ＳおよびＳＣ１８Ｓ、またはＳＣ１７ＳおよびＳＣ１８Ｓを含む。
【００８９】
いくつかの実施態様において、電気泳動に有用な界面活性剤の種類の決定は、対象のタンパク質の分子量に基づきうる。いくつかの実施態様において、ＳＤＳと、疎水性界面活性剤、すなわち、少なくとも１３個の炭素原子を有するアルキル鎖を有するもの、例えば、ＳＣ１３Ｓ、ＳＣ１４Ｓ、ＳＣ１５Ｓ、ＳＣ１６Ｓ、ＳＣ１７Ｓ、またはＳＣ１８Ｓとの混合物によって分離することができる、対象のタンパク質は、約２０ｋＤａ未満、約１９ｋＤａ未満、約１８ｋＤａ未満、約１７ｋＤａ未満、約１６ｋＤａ未満、約１５ｋＤａ未満、約１４ｋＤａ未満、約１３ｋＤａ未満、約１２ｋＤａ未満、約１１ｋＤａ未満、または約１０ｋＤａ未満、例えば、５ｋＤから１５ｋＤの分子量を有する。
【００９０】
他の実施態様において、疎水性界面活性剤、すなわち、少なくとも１３個の炭素原子を有するアルキル鎖を有するもの、例えば、ＳＣ１３Ｓ、ＳＣ１４Ｓ、ＳＣ１５Ｓ、ＳＣ１６Ｓ、ＳＣ１７Ｓ、またはＳＣ１８Ｓによって分離することができる、対象のタンパク質は、約２０ｋＤａより大きい、約３０ｋＤａより大きい、約４０ｋＤａより大きい、約５０ｋＤａより大きい、約６０ｋＤａより大きい、約７０ｋＤａより大きい、約８０ｋＤａより大きい、約９０ｋＤａより大きい、約１００ｋＤａより大きい、約１１０ｋＤａより大きい、約１２０ｋＤａより大きい、約１３０ｋＤａより大きい、約１４０ｋＤａより大きい、約１５０ｋＤａより大きい、約１６０ｋＤａより大きい、約１７０ｋＤａより大きい、約１８０ｋＤａより大きい、１９０ｋＤより大きい、または約２００ｋＤａより大きい分子量を有する。
【００９１】
いくつかの実施態様において、組成物はさらに、緩衝成分、有機性添加剤、親水性ポリマー、金属キレーター、およびおそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【００９２】
有用でありうる生物学的緩衝液の例としては、限定はされないが、ビストリス（２−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール）、ＡＤＡ（Ｎ−［２−アセトアミド］−２−イミノ二酢酸）、ＡＣＥＳ（２−［２−アセトアミノ［−２−アミノエタンスルホン酸）、ＰＩＰＥＳ（１，４−ピペラジンジエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳＯ（３−［Ｎ−モルホリノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ビストリスプロパン（１，３−ビス［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパン］）、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］−２−アミノエタンスルホン酸）、ＭＯＰＳ（３−［Ｎ−モルホリノ］プロパンスルホン酸）、ＴＥＳ（２−［２−ヒドロキシ−１，１−ビス（ヒドロキシメチル）エチルアミノ］エタンスルホン酸）、ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン）酸）、ＤＩＰＳＯ（３−Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＭＯＢＳ（４−Ｎ−モルホリノブタン硫酸）、ＴＡＰＳＯ（３［Ｎ−トリス−ヒドロキシメチル−メチルアミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、トリス（２−アミノ−２−［ヒドロキシメチル］−１，３−プロパンジオール）、ＨＥＰＰＳＯ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［２−ヒドロキシプロパンスルホン］酸）、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス［２−ヒドロキシプロパンスルホン］酸）、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、ＥＰＰＳ（またはＨＥＰＰＳ）（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］−ピペラジン−Ｎ’−［３−プロパンスルホン］酸）、Ｔリシン（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチルグリシン）、ＧＬＹ−ＧＬＹ（ジグリシン）、ＢＩＣＩＮＥ（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］グリシン）、ＨＥＰＢＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル］ピペラジン−Ｎ’−［４−ブタンスルホン］酸）、ＴＡＰＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−３−アミノプロパンスルホン酸）、ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）、ＴＡＢＳ（Ｎ−トリス［ヒドロキシメチル］メチル−４−アミノブタンスルホン酸）、ＡＭＰＳＯ（３−［（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）アミノ］−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、ＣＨＥＳ（２−（Ｎ−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸）、ＣＡＰＳＯ（３−［シクロヘキシルアミノ］−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホン酸）、ＡＭＰ（２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール）、ＣＡＰＳ（３−シクロヘキシルアミノ−１−プロパンスルホン酸）、ＣＡＢＳ（４−［シクロヘキシルアミノ］−１−ブタンスルホン酸）、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。別の実施態様において、緩衝成分は、トリス緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００９３】
別の実施態様において、電気泳動緩衝組成物は、１つ以上の有機性添加剤を含む。いくつかの実施態様において、有機性添加剤は、マンニトール、グリセロール、エチレングリコール、エタノール、メタノール、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、１つ以上の有機性添加剤としては、限定されない例として、エチレングリコール、プロピレングリコール、ジエチレングリコールのモノメチルエーテル、ジエチレングリコールのジメチルエーテル、メチルカルビトール、テトラヒドロフラン、ジブチルエーテル、ジメチルホルムアミド、スルホラン、または１〜４個の炭素原子を有するアルコールなどの代替溶媒が挙げられる。
【００９４】
いくつかの実施態様において、電気泳動緩衝組成物は、１つ以上のポリマーを含む。いくつかの実施態様において、ポリマーは親水性ポリマーである。別の実施態様において、ポリマーは疎水性ポリマーである。いくつかの実施態様において、親水性ポリマーは、デキストラン、ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００９５】
別の実施態様において、電気泳動緩衝組成物はさらに、金属キレーター、すなわち、Ｃａ２＋およびＦｅ３＋などの金属イオンを捕捉することができる分子を含む。いくつかの実施態様において、金属キレーターは、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む。金属キレーター、例えば、ＥＤＴＡによって結合された後は、金属イオンは溶液中に残るが、低下した反応性を示す。他のキレート剤としては、エチレングリコールテトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、ニトリロ三酢酸三ナトリウム、ヒドロキシエチルエチレンジアミン酢酸三ナトリウム（ＨＥＤＴＡ三ナトリウム）、ジエチレントリアミノ酢酸五ナトリウムまたはウラミル酢酸二ナトリウムが挙げられる。
【００９６】
本開示の電気泳動緩衝組成物の調製に用いることができる金属キレーター、例えば、ＥＤＴＡの濃度範囲は、約０．５％以下、または約０．４％以下、または約０．３％以下、または約０．２％以下、または約０．１％以下、または約０．０５％以下、または約０．０３％から約０．５％、または約０．０５％から約０．５％、または約０．１％から約０．５％、または約０．２％から約０．５％、または約０．３％から約０．５％、または約０．４％から約０．５％、または約０．０３％から約０．４％、または約０．０５％から約０．４％、または約０．１％から約０．４％、または約０．２％から約０．４％、または約０．３％から約０．４％、または約０．０３％から約０．３％、または約０．０５％から約０．３％、または約０．１％から約０．３％、または約０．２％から約０．３％、または約０．０３％から約０．５％、または約０．０５％から約０．２％、または約０．１％から約０．２％、または約０．０３％から約０．１％、または約０．０５％から約０．１％、または約０．０３％から約０．０５％である。好ましくは、約０．０５％以下、最も好ましくは０．０３％である。
【００９７】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される電気泳動緩衝組成物は、サンプル緩衝液、泳動緩衝液、および／またはキャピラリーゲル電気泳動のためのゲルに添加することができる。
【００９８】
いくつかの実施態様において、電気泳動緩衝組成物は、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、または約１０．０より高いｐＨを有する。別の実施態様において、電気泳動緩衝組成物は、約６．０から約１１．０の間、約６．５から約１１．０の間、約７．０から約１０．５の間、約７．０から約１０．０の間、約７．０から約９．５の間、約７．０から約９．０の間、約７．０から約８．５の間、約７．０から約８．０の間、または約７．０から約７．５の間のｐＨを有する。別の実施態様において、電気泳動緩衝組成物は、約６．５、約７．０、約７．２、約７．４、約７．６、約７．８、約８．０、約８．２、約８．４、約８．６、約８．８、約９．０、約９．２、約９．４、約９．６、約９．８、約１０．０、約１０．５、約１１．０、または約１１．５のｐＨを有する。
【００９９】
いくつかの実施態様において、電気泳動緩衝組成物は、約５．０、約５．５、約６．０、約６．５、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約９．５、または約１０．０より高いｐＨを有する。いくつかの実施態様において、電気泳動緩衝組成物は、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、または約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、または約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９．０、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、または約９．８、約９．９、または約１０．０より高いｐＨを有する。いくつかの実施態様において、電気泳動緩衝組成物は、約５．０、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、または約５．８、約５．９、約６．０、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、または約６．８、約６．９、約７．０、約７．１、約７．２、約７．３、約７．４、約７．５、約７．６、約７．７、約７．８、約７．９、約８．０、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９．０、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．８。約９．９、または約１０．０のｐＨを有する。
【０１００】
ＩＩＩ．タンパク質分離の方法
本開示は、本開示の電気泳動緩衝組成物を含むサンプル緩衝液中で、対象のタンパク質を変性させることを含む、電気泳動によって対象のタンパク質を分離する方法に関する。いくつかの実施態様において、電気泳動はキャピラリーゲル電気泳動である。
【０１０１】
キャピラリー電気泳動（ＣＥ）は、ｍｍ未満の直径のキャピラリー、並びにマイクロおよびナノ流体チャネルにおいて行われる、界面動電分離法のファミリーである。ＣＥはキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）を含みうるが、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、キャピラリー等電点電気泳動（ＣＩＥＦ）、キャピラリー等電点電気泳動、およびミセル動電クロマトグラフィー（ＭＥＫＣ）などの他の電気泳動技術を含みうる。ＣＥ法において、対象のタンパク質などの分析物は、電界の影響下で、電解質溶液を介して移動する。分析物は、イオン移動度および／または非共有結合性相互作用を介した他の相への分配によって、分離することができる。さらに、分析物は、伝導度およびｐＨの勾配によって、濃縮または「着目」されうる。
【０１０２】
いくつかの実施態様において、当該方法はさらに、泳動緩衝液中における電気泳動ゲルの泳動を含む。いくつかの実施態様において、泳動緩衝液および／またはゲルは、本明細書に記載される電気泳動緩衝組成物を含む。
【０１０３】
本開示はまた、本明細書に記載される電気泳動緩衝組成物を含むサンプル緩衝液中で、対象のタンパク質を変性させること、および泳動緩衝液中で電気泳動ゲルを泳動させることを含む電気泳動によって、対象のタンパク質のピーク分離効率を向上させるための方法を含む。いくつかの実施態様において、タンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を用いて行った分離の、タンパク質ピーク分離効率（ＰＳＥ）と比較して、向上している。いくつかの実施態様において、電気泳動ゲルの結果から、、ＳＤＳを用いて行った電気泳動ゲルに比べて、人工的な高分子量種が少ないことが示される。
【０１０４】
いくつかの実施態様において、変性は少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約７５℃、または少なくとも約８０℃の温度、例えば、約６０℃と約７０℃の間、約６５℃と約７０℃の間、または約６０℃と約６５℃の間の温度で行われうる。別の実施態様において、変性は少なくとも約３分、少なくとも約４分、少なくとも約５分、少なくとも約６分、少なくとも約７分、少なくとも約８分、少なくとも約９分、または少なくとも約１０分にわたって行われる。
【０１０５】
本開示の方法はさらに、分離の後に対象のタンパク質を検出することを含みうる。検出のためのシステムは、ＵＶまたはＵＶ−Ｖｉｓ吸光度を主な検出モードとして用いうる。これらの系において、キャピラリー自体の一部を、検出セルとして用いることができる。チューブ上での検出を用いることによって、分解能を失わずに、分離した分析物を検出することが可能になる。
【０１０６】
蛍光検出もまた、自然に蛍光性であるか、あるいは蛍光タグを含むように化学的に修飾されているサンプルのキャピラリー電気泳動において用いることができる。この検出モードは、これらのサンプルについて高い感度、および向上した選択性を提供するが、蛍光性でないサンプルに用いることはできない。蛍光誘導体、またはタンパク質およびＤＮＡなどの非蛍光分子の結合体を製造するために、多数の標識技術が用いられる。
【０１０７】
サンプル成分の同一性を獲得するために、キャピラリー電気泳動は直接、質量分析器または表面増強ラマン分光計（ＳＥＲＳ）と組み合わせることができる。ほとんどの系において、キャピラリー出口は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を用いたイオン源に導入される。得られたイオンを次いで、質量分析器によって分析する。この装置には揮発性緩衝溶液が必要であり、これが使用できる分離モードの範囲、および達成できる分離度に影響する。測定および分析は、ほとんどの場合、専用のゲル解析ソフトによって行われる。
【０１０８】
ＣＥ−ＳＥＲＳの場合、キャピラリー電気泳動溶出剤は、ＳＥＲＳ活性基板上に堆積しうる。キャピラリー電気泳動の間、一定速度でＳＥＲＳ活性基板を移動させることによって、分析物の保持時間は空間距離に変換することができる。これにより、次の分光技術に特定の溶出剤を適用して、高感受性の同定を行うことができる。ＳＥＲＳ活性基板は、分析物のスペクトルに干渉しないものが選択されうる。
【０１０９】
いくつかの実施態様において、分析物またはサンプル緩衝液における対象のタンパク質は、単離された天然に存在するタンパク質、または組み換えによって調製したタンパク質である。別の実施態様において、対象のタンパク質は、酵素、ホルモン、サイトカイン、細胞表面受容体、プロテアーゼ、サイトカイン受容体、またはそれらの任意の組み合わせでありうる。別の実施態様において、対象のタンパク質は抗体である。
【０１１０】
いくつかの実施態様において、抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびＩｇＧから選択されるアイソタイプである。別の実施態様において、ＩｇＧ抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４から選択される。
【０１１１】
別の実施態様において、対象のタンパク質は融合タンパク質である。いくつかの実施態様において、融合タンパク質は酵素、ホルモン、サイトカイン、細胞表面受容体、プロテアーゼ、サイトカイン受容体、またはそれらの任意の組み合わせである。別の実施態様において、融合タンパク質は非相同部位に融合している。いくつかの実施態様において、非相同部位は半減期延長部位である。別の実施態様において、半減期延長部位はＦｃを含む。
【０１１２】
いくつかの実施態様において、本開示の方法によって解析される、対象のタンパク質は、約５ｋＤ、約１０ｋＤ、約１５ｋＤ、約２０ｋＤ、約２５ｋＤ、約３０ｋＤ、約３５ｋＤ、約４０ｋＤ、約５０ｋＤ、約６０ｋＤ、約７０ｋＤ、約８０ｋＤ、約９０ｋＤ、約１００ｋＤ、約１１０ｋＤ、約１２０ｋＤ、約１３０ｋＤ、約１４０ｋＤ、約１５０ｋＤ、約１６０ｋＤ、約１７０ｋＤ、約１８０ｋＤ、約１９０ｋＤ、または約２００ｋＤより大きい分子量を有する。いくつかの実施態様において、対象のタンパク質は、約１５ｋＤより大きい分子量を有する。別の実施態様において、対象のタンパク質は、約１５ｋＤと約２００ｋＤ、約２０ｋＤと約２００ｋＤ、約３０ｋＤと約２００ｋＤ、約４０ｋＤと約２００ｋＤ、約５０ｋＤと約２００ｋＤ、約３０ｋＤと約１５０ｋＤ、約４０ｋＤと約１５０ｋＤ、約５０ｋＤと約１５０ｋＤの間の分子量を有する。
【０１１３】
本開示はさらに、以下の実施例によって説明されるが、これらはさらなる限定として解釈されるべきではない。本出願にわたって引用される全ての引用文献の内容は、引用によって本明細書に明示的に援用される。
【実施例】
【０１１４】
以下の実施例は、本発明を説明するために、本発明の特定の局面を記載し、当業者に本発明の方法の説明を提供する。実施例は単に、本発明およびその様々な局面の理解および実施において有用である、特定の方法および例示を提供するだけであるから、実施例は本発明を限定すると解釈されるべきではない。
【０１１５】
実施例１
発明者らは、ＣＥ−ＳＤＳによるＰＳＥが不十分なタンパク質について、界面活性剤の疎水性を増加させることによって、界面活性剤のタンパク質に対する親和性が向上し、ＰＳＥを向上させることができることを発見した。図１は、典型的なＣＥ−ＳＤＳ条件下で、ヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ）を含むゲルマトリクスを用いた、組み換え治療タンパク質−１（ＲＴＰ−１）の泳動の、電気泳動図のオーバーレイを示す。ＳＨＳの存在によって、ＰＳＥにおいて認識できる向上が生じ、顕著な不純物ピーク（不純物ピーク１、またはＩＰ１、図１）から主要なタンパク質ピークをベースライン分離することができた。ピーク形状と分離能の向上によって、検出および定量化限界などのアッセイの測定範囲が拡大した。特に、サンプルの添加量は、直線性を失うことなく向上させることができるため、アッセイ感度は３〜４倍増加した（図２）。
【０１１６】
評価した界面活性剤は、アルキル鎖長のみが異なる、同じ電荷の硫酸ヘッド基およびナトリウム対イオンを含む。アルキル鎖長をＲＴＰ−１ ＰＳＥにおける潜在的な向上に直接帰属させるため、最初の実験は、泳動ゲル緩衝液とサンプル溶液の両方において、対象の界面活性剤のみを含んでいた。図３に示すように、ＰＳＥはより長いアルキル鎖で有意に向上し、ＳＨＳはＳＤＳに対して段数を８倍向上させ（１１８２０／１４５０、図４）、主要ピークと不純物ＩＰ１との分離を約２．３倍向上させた（１．８／０．８、図４）。ＳＵＳは、ＳＤＳと比べて僅かにＰＳＥを向上させ、この現象は以前僅かに小さいデシル硫酸ナトリウム（１７）で観測され、より小さいアルキル鎖を有する界面活性剤が、（親和性は低いが）細長いタンパク質をより均一にコーティングすることができる能力に起因していた。興味深いことに、これらの著者はまた、ＳＴＳおよびＳＨＳが、ＰＡＧＥによるこれらのモデルタンパク質のＰＳＥを減少させることを発見した（１７）。この説明の１つは、ＲＴＰ−１は、（以下で議論されるように）その特性を考えると、場合によっては、これらのモデルタンパク質によっては代表されないことである。
【０１１７】
濃度に関係なく、ＳＤＳはＳＨＳと同じ程度のＰＳＥを達成することはできないため、長鎖の界面活性剤によるＣＧＥ分離能は、単に濃度に依存するわけではなかった（図４）。
【０１１８】
より長い炭化水素鎖の界面活性剤とＲＴＰ−１の分離能の向上との相関。仮説として、さらに安定な界面活性剤：タンパク質複合体は、構造がより均一になるため、より高い分離効率をもたらすはずである（１７）。ＲＴＰ−１の特定の物理的性質に基づいて、ＳＤＳは均一に変性したＲＴＰ−１複合体を安定化するには不十分である可能性があり、その代わりに、さらに疎水性の界面活性剤が必要である可能性がある。「ドメイン２」と呼ばれる、ＲＴＰ−１の２つのドメインのうちの１つは、好熱性、すなわち、全体的な構造が剛直であることが示唆される性質であり（１８）、比較的疎水性のコアを含む（１９）。未変性または変性条件下で（ＳＤＳを含む、または含まずに）、好熱性のタンパク質はしばしば、典型的なタンパク質と比較して、変性に対してより高い遷移状態エネルギー障壁を越える必要がある（１８、２０）。モデリング研究によって、ドメイン２の１つの面が、負に帯電した電位を高い割合で有し、これが界面活性剤の硫酸基の静電的反発を引き起こしうることが示される。この反発にはＳＨＳのより疎水性のテールが必要であり、タンパク質の疎水性コアとの、全体的にエネルギー的に有利な相互作用が確立され、アンフォールディングが開始しうる（図５）。
【０１１９】
示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を用いて、ＳＨＳおよびＳＤＳがＲＴＰ−１を完全に変性させるのに必要なエネルギーを定量化した（２１）。界面活性剤：ＲＴＰ−１複合体のの吸熱プロファイルは二相性であり、図６Ａおよび６ＢにおいてピークＥ１およびＥ２として表される。Ｅ１およびＥ２は、それぞれＲＴＰ−１ドメイン１および２に帰属する（データは示されていない）。熱力学データは表１にまとめる。
【０１２０】
表１．様々なゲル緩衝液界面活性剤を用いて得た、ＲＴＰ−１ピーク分離効率（ＰＳＥ）の値
【表１】
2020533582.tif 000003
ａ ＲＴＰ−１サンプル溶液は対応する界面活性剤を含んでいた。
【０１２１】
Ｅ１ピークによって表される、ドメイン１の熱変性の間に観察された、エンタルピー変化は、いずれの界面活性剤についても同等である（図６Ｃ）。
【０１２２】
表２．様々な濃度のＳＤＳまたはＳＨＳのいずれかをＲＴＰ−１に添加して得られたＤＳＣの機能
【表２】
2020533582.tif 000004
ａ、ｂ 界面活性剤の種類に関係なく、［界面活性剤］と同等のＴｍの減少
ｃ 界面活性剤の種類に関係なく、［界面活性剤］と同等のΔＨ１の減少（図６Ｃ）
ｄ ΔＨ２は、特定の濃度（０．１ｍＭ ＳＤＳおよび０．０１３ｍＭ ＳＨＳ）に達した後、ＳＨＳによってさらに著しく減少した（図６Ｄ）。
【０１２３】
しかしながら、図６Ｄに示されるように、好熱性ドメイン２、またはＥ２の熱変性プロファイルは、界面活性剤によって異なっていた。ＳＨＳがこのドメインを変性させるのに必要なエネルギーは、特に予想される臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）の範囲内で、より少なく、これはＳＤＳで８ｍＭ未満、ＳＨＳで２ｍＭ未満（２２）であり、このことは、ＳＨＳ：ＲＴＰ−１複合体は、ＳＨＳの結合によってより安定であることを示唆する。
【０１２４】
ＳＨＳを用いてより分離される他のタンパク質。ＳＨＳを用いたＣＧＥ分離力の向上と、タンパク質の疎水性との間の相関は、他のいくつかのタンパク質についても保持された。図７Ａは、ＳＤＳと比較して、ＳＨＳゲル緩衝液を用いた、第二のタンパク質、ＲＴＰ−２の実質的に向上したＣＧＥプロファイルを示す。ＲＴＰ−２は、空間的凝集傾向（ＳＡＰ）指標によって決定される、表面の疎水性パッチの割合の高いｍＡｂである（２６）。対象的に、ＲＴＰ−３（図７Ｂ）は、ＲＴＰ−２よりもはるかに低いＳＡＰ指標を有する、比較的親水性のｍＡｂであり、ゲル緩衝液中の界面活性剤（ＳＤＳまたはＳＨＳ）の存在に関わらず、高いＰＳＥを示した。
【０１２５】
ＳＨＳ含有ゲル緩衝液の開発および生成物放出についてのＣＥ−ＳＨＳ純度法の定量化。ＳＨＳゲル緩衝組成物は、頑強で再現性があり、＞１５ヶ月の有効期限を有する安定性があるように、開発した。最終的なＲＴＰ−１純度法は、完全に最適化されたＣＥ−ＳＤＳ条件下で得られた場合よりも、３〜４倍高いみかけのタンパク質充填によって、うまく適用した（図２）。
【０１２６】
材料および方法
試薬。グリセロール（＞９９％）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ、＞９９％）、デキストラン（ＭＷ〜２０００ｋＤａ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリズマ、＞９９．９％）、ホウ酸（＞９９．５％）、およびβ−メルカプトエタノール（＞９９％）は、Sigma (St. Louis, MO)から購入した。ウンデシル硫酸ナトリウム（ＳＵＳ、＞９９％）、テトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ、＞９５％）、およびヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ、＞９８％）の粉末は、Alfa Aesar (Wood Hill、MA)から購入した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、＞９９％）の粉末は、Avantor (Center Valley、PA)から購入した。ＣＧＥアッセイ応用においては、１０ｋＤａ 内部標準（Ｉ．Ｓ．）、０．１Ｎ 酸／塩基洗浄溶液、ＳＤＳ−ＭＷゲルおよびＳＤＳ−サンプル緩衝液、組立済みのベアフューズドシリカキャピラリーカートリッジ、および２ｍＬ ユニバーサルバイアルおよびキャップは、AB Sciex (Framingham、MA)から購入した。
【０１２７】
サンプル調製。特に言及されない限り、ＲＴＰ−１は０．９ｍｇ／ｍＬで、０．７６％ ＳＤＳ、５％ β−メルカプトエタノールおよび７６ｍＭ トリス−ＨＣｌと共に調製した。ＳＩ分析プローブを備えたＳｃｈｏｔｔ ｐＨメーターを用いて、５００ｍＭ トリス−ＨＣｌ ｐＨ９．０を調製し、次いで脱イオン水および界面活性剤の粉末を加えて目的の濃度にした。比較的疎水性の界面活性剤については、粉末をトリス−ＨＣｌ緩衝液に溶解させるのに、超音波処理および７０℃の水浴における加熱の組み合わせが必要であった。
【０１２８】
ゲル緩衝溶液の調製。ゲル緩衝溶液は以下のように調製した：トリズマ塩基、ホウ酸、ＥＤＴＡ、およびグリセロールを共に混合し、０．２ミクロンフィルターを介して濾過した。界面活性剤およびデキストランを続いて加えた。全ての成分が溶解した後、Thermo Scientific (Waltham、MA)から購入した、適切な大きさのＰＴＦＥボトルにゆっくりと液体を注ぎ、室温で保管した。
【０１２９】
キャピラリー電気泳動。ＣＧＥ実験は、フォトダイオードアレイ検出器および３２Ｋａｒａｔ取得ソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ９）を備えた、ＰＡ８００＋機器(AB Sciex、Framingham、MA)において行った。電気泳動分離は、サンプル注入点から２０ｃｍの位置におけて検出を行い、１５ｋＶの定電圧で、内径５０μｍのプレカットキャピラリーにおいて生じた。３２ｋａｒａｔからのデータは、データ処理のためにＥｍｐｏｗｅｒ３(Build 3471、Waters、Milford、MA)に転送した。Ｅｍｐｏｗｅｒはクロマトグラフィーに基づくソフトウェアであり、そのためＰＳＥを評価する時のように、移動時間が保持時間に変換され、計算されることに注意されたく、以下の式（１）および（２）を参照されたい。
【０１３０】
ピーク分離効率（ＰＳＥ）の評価。ＰＳＥは、段数（式（１））および分離（式（２））についての以下の式を用いて評価した(United States Pharmacopeia, Chapter 621)。Ｅｍｐｏｗｅｒは、これらの値を自動的にフィールドオプションとして計算する。
【化１】
2020533582.tif 000005
【０１３１】
式中、Ｎ＝理論段数（段数）、Ｒｔはピークの保持／移動時間であり、Ｗは、ピーク高の６１％において描かれた接線を有するベースラインにおけるピーク幅である。
【化２】
2020533582.tif 000006
【０１３２】
式中、Ｒ＝２つのピーク、それぞれピーク１および２の保持／移動時間である、Ｒｔ１およびＲｔ２の分離、Ｗ２＋Ｗ１は、ピーク高の５０％において描かれた接線を有するベースラインにおけるピーク幅の合計である。
【０１３３】
示差走査熱量測定。ＲＴＰ−１を、１ｘＰＢＳ（１５０ｍＭ ＮａＣｌおよび２０ｍＭ ホスフェート ｐＨ７．２）で、様々な分量のＳＤＳまたはＳＨＳを含む０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。測定は、約０．５ｍＬの細胞体積で、Malvern MicroCal VP-DSC システム (Malvern Instruments、Northampton、MA)において行った。温度スキャンは、１℃／分のスキャン速度において、２０〜９５℃で行った。濃度の標準化の前に、それぞれのサンプルスキャンから緩衝液参照スキャンを差し引いた。移動前および移動後のベースラインの立方体補間によって、Origin 7.0 (Origin Lab、Northampton、MA)においてベースラインを作成した。
【０１３４】
タンパク質モデリング。ＲＴＰ−１の２つのドメイン（ドメイン２）のうちの１つのアミノ酸配列は、テンプレートとして既知の構造を有する類似のドメインにアライメントした。ドメインの３Ｄ構造は、相同性モデリングツールＭＯＤＥＬＬＥＲを用いて構築した（１５）。相同性モデルは、側鎖の最適化および最小化のステップを経て、次いでモデルの検証が行われた。ドメインの表面電荷は、Adaptive Poisson−Boltzmann Solverを用いたPropka output fileにおいて、残基の電荷および残基の接近可能性に基づいて計算した（１６）。最後に、PyMOLプログラムによって、静電マップを可視化した(Schrodinger, LLC)。
【０１３５】
実施例２
チャイニーズハムスター卵巣細胞を用いて、組み換えＩｇＧ１タンパク質ｍＡｂ−１、ｍＡｂ−２およびｍＡｂ−３を製造した。タンパク質を使用前に−８０℃から解凍した。グリセロール（＞９９％）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ、＞９９％）、デキストラン（ＭＷ〜２０００ｋＤａ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリズマ、＞９９．９％）、１Ｍ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンヒドロクロライド溶液（バイオパフォーマンス認定)、ホウ酸（＞９９．５％）、β−メルカプトエタノール（ＢＭＥ、＞９９％）、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ、＞９９％）および粉末デシル硫酸ナトリウム（ＳＣ１０Ｓ、＞９９％）を、Sigma−Aldrich (St. Louis、MO)から購入した。粉末ヘキサデシル硫酸ナトリウム（ＳＨＳ、＞９８％）および１−テトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＴＳ、＞９５％）は、Alfa Aesar (Wood Hill、MA)から購入し、粉末ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ、＞９９％）は、Avantor (Center Valley、PA)から購入した。ＣＧＥ応用については、１０ｋＤａ 内部標準（Ｉ．Ｓ．）、０．１Ｎ 酸／塩基洗浄溶液、組立済みのベアフューズドシリカキャピラリーカートリッジ、および２ｍＬ ユニバーサルバイアルおよびキャップは、AB Sciex (Framingham、MA)から購入した。
【０１３６】
サンプル緩衝液およびゲル緩衝液の調製
ＣＥ−ＳＤＳ応用について、ＳＤＳ−ＭＷゲル緩衝液およびＳＤＳ−ＭＷサンプル緩衝液（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１％ｗ／ｖ ＳＤＳ、ｐＨ９．０）は、AB Sciex (Framingham、MA)から購入した。トリズマ塩基、ホウ酸、ＥＤＴＡ、およびグリセロールを合わせて、０．２μｍフィルターを介して濾過した。界面活性剤およびデキストランを次に加えた。全ての成分が溶解した後、Thermo Scientific (Waltham、MA)から購入した、適切な大きさのＰＴＥＥボトルに液体をゆっくりと注いだ。別の界面活性剤を含むサンプル緩衝液は、以下のように調製した：特定のｐＨ値において、１Ｍ トリス−ＨＣｌ溶液を適切な濃度に希釈し、さらに界面活性剤を混合して、均一な溶液を作成した。
【０１３７】
以下の成分を含むサンプル緩衝液を調製した：ＳＣ１６Ｓ（ＳＨＳ）含有サンプル緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．２％ｗ／ｖ ＳＨＳ、ｐＨ８．０）；ＳＣ１４Ｓ（ＳＴＳ）含有サンプル緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、０．５％ｗ／ｖ ＳＴＳ、ｐＨ８．０）；およびＳＣ１０Ｓ含有サンプル緩衝液（５０ｍＭ トリス−ＨＣｌ、２％ｗ／ｖ ＳＣ１０Ｓ、ｐＨ９．０）。
【０１３８】
非還元および還元条件下におけるサンプル調製
非還元条件下におけるＣＧＥ応用については、ＳＤＳサンプル緩衝液（１００ｍＭ トリス−ＨＣｌ、１％ｗ／ｖ ＳＤＳ、ｐＨ９．０、AB Sciex）を用いて、０．９ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度および３０ｍＭ ＩＡＭで、ｍＡｂサンプルを調製した。還元条件下におけるＣＧＥ応用については、ＳＤＳ−ＭＷサンプル緩衝液、ＳＨＳ含有サンプル緩衝液（０．２％ｗ／ｖ ＳＨＳ）、ＳＴＳ含有サンプル緩衝液（０．５％ｗ／ｖ ＳＨＳ）、およびＳＣ１０Ｓ含有サンプル緩衝液（２％ｗ／ｖ、ＳＣ１０Ｓ）などの、異なるサンプル緩衝液条件を用いて、０．９ｍｇ／ｍＬの最終タンパク質濃度および５％ｖ／ｖ ＢＭＥで、ｍＡｂサンプルを調製した。他に言及されない限り、非還元条件下および還元条件下におけるサンプル変性は、それぞれ７０℃で５分間、および７０℃で１０分間行った。
【０１３９】
キャピラリー電気泳動法
ＣＧＥ実験は、ＵＶ検出器および３２Ｋａｒａｔ取得ソフトウェア（Ｖｅｒｓｉｏｎ９）を備えた、ＰＡ８００＋機器(AB Sciex、Framingham、MA)において行った。電気泳動分離は、サンプル注入点から２０ｃｍの位置におけて検出を行い、１５ｋＶの定電圧で、内径５０μｍのプレカットキャピラリーにおいて生じた。３２ｋａｒａｔからのデータは、データ処理のためにＥｍｐｏｗｅｒ３(Build 3471、Waters、Milford、MA)に転送した。
【０１４０】
ｍＡｂの主なクラスである、ＩｇＧ分子の構造およびサイズの類似性により、いずれのサンプル緩衝液およびふるいゲル緩衝液においてもＳＤＳが用いられる、一般的なＣＥ−ＳＤＳ法は通常、幅広い範囲のＩｇＧ分子の分析に適切である。還元条件下において、ＩｇＧ分子はβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）などの還元剤によって処理され、ジスルフィド結合が切断される。軽鎖（ＬＣ）、重鎖（ＨＣ）、および非グリコシル化重鎖（ＮＧＨＣ）などのタンパク質フラグメントが、大きさおよび電気泳動移動度によって分離される。
【０１４１】
実施例３（ＨＣ後のＨＭＷ種および人工物の確認）
図９は、一般的なＣＥ−ＳＤＳ還元条件下における、ｍＡｂ−１およびｍＡｂ−３の泳動の電気泳動図のオーバーレイを示す。これらの２つの還元されたｍＡｂ分子は、主な成分に関しては同等の分離プロファイルを示すが、ＨＣ後の高分子量領域において、マイナー種の異なるパターン（図９ＢにおいてＡ〜Ｄと表示）を示す。これらのマイナー種のうち、種Ａ（赤い長方形で強調される）がｍＡｂ−１およびｍＡｂ−３のサンプルトレースにおいて見られる。ピークＡの移動時間は、１つの重鎖および１つの軽鎖（Ｈ：Ｌ）から成る半抗体フラグメントに対応する。種Ｄ（矢印で示される）はまた、有意なレベルにおいて両方のサンプルトレースにおいて見られ、これは非還元ＣＥ−ＳＤＳ条件下で観察された、抗体の重鎖−重鎖フラグメントに非常に近い分子量を有する（図９）。２つの共通のマイナー種に加えて、ｍＡｂ−１サンプルトレースのＨＣ後領域に存在する、さらなるグループＢ（破線の長方形で囲まれる）およびピークＣ（一部ピークＤと共に移動する）が存在し、これはＡおよびＤ種に対する移動位置から、７５〜１００ｋＤａの範囲内の分子量（ＭＷ）を有すると推定される。ＣＥ−ＳＤＳ還元条件を用いて、ｍＡｂ−１の純度は、ＬＣ（３１．２％）およびＨＣ（６４．０％）の相対率の合計を含めて、９５．３％と測定された。ＮＧＨＣ種は０．６％であり、これは純度の計算から除外された。ｍＡｂ−１の全てのＨＣ後のＨＭＷ種の合計パーセントは、３．０％と決定され、グループＢ種は約２．０％であった。
【０１４２】
ｍＡｂ−１電気泳動図のＨＣ後領域において観察される、いくつかのＨＭＷ種は、ＣＥ−ＳＤＳ還元条件下において誘発された人工物であるように見えた。第一に、非還元条件下におけるｍＡｂ−１のＣＥ−ＳＤＳ分析において、当該方法は、非変性および変性ＳＥＣ測定のそれぞれ０．８％および０．４％よりも、はるかに高い凝集量（〜２．５％）を報告した。このｍＡｂ分子のＡＵＣ評価はさらに、ＳＥＣが凝集の結果を過小評価しておらず、ＣＥ−ＳＤＳ分析において観察された、高いＨＭＷ量が実際に、ＳＤＳが完全なｍＡｂ−１分子を均一にコーティングすることができなかった可能性によって、不完全なタンパク質の変性の結果であったことを確認した。同じＳＤＳサンプル緩衝液、およびＳＤＳに基づくゲルマトリックスが、非還元および還元ＣＥ−ＳＤＳ分析の両方において用いられ、そのため、還元されたｍＡｂ−１分子フラグメントに対して不完全な変性もまた生じうる。第二に、全てのＨＣ後ＨＭＷ種が固有の製品関連不純物であるかどうかを調べるために、ＣＥ−ＳＤＳ非還元、部分的還元、および完全還元の条件下において、ｍＡｂ−１分子の泳動によって研究を行った。
【０１４３】
図１０において重ねられる電気泳動図は、還元されたｍＡｂ−１サンプルトレースにおいて示されるＨＣ後のグループＢ種が、非還元サンプルおよび２つの部分的に還元されたサンプルのプロファイルにおいて確認されなかったこと明確に示した。対照的に、ピークＡ種は４つのトレース全てにおいて見られた。この観察によって、グループＢ種は、完全に還元されたｍＡｂ−１フラグメントの不完全な変性によって生じる人工物である可能性が非常に高いことが示唆される。最後に、ｍＡｂ−１のＨＣ後の全てのＨＭＷ種の合計比率は、タンパク質濃度と強い関係を示した。図１１は、みかけのタンパク質濃度（０．９ｍｇ／ｍＬ）の２５％−１３５％の範囲において測定された％純度および％総ＨＭＷのプロットを示す。これらの２つの応答の傾向線は、用いたＣＥ−ＳＤＳ法は、異なるタンパク質濃度において、十分で一貫したサンプル変性に達しておらず、それによって、低濃度の場合（０．２３ｍｇ／ｍＬ）と比較して、高タンパク質濃度（１．２３ｍｇ／ｍＬ）条件下において、％総ＨＭＷの２．５％より大きい増加が観測され、純度測定においても減少の結果を伴うことを示す。グループＢおよびピークＣ種のバリエーションが％総ＨＭＷの変化に主に寄与し、一方でＡおよびＤ種の相対率は一定に維持された（データは示されていない）ことがさらに発見された。これらの研究の結論として、ＨＣ後のグループＢおよびＣ種は、実際の製品関連の不純物というよりは、方法に起因する人工物であるため、還元ＣＥ−ＳＤＳ法は、ｍＡｂ−１分子の純度を完全に反映させることはできない。そのため、用いたＣＥ−ＳＤＳ法は、バイアスのない純度測定を達成することができるように最適化される必要がある。
【０１４４】
ＨＭＷ種の形成を排除することができる最終的な溶液を特定する前に、サンプル緩衝液およびゲルマトリックスにおいて用いられるＳＤＳの量、並びにインキュベート時間などの、通常タンパク質変性において大きな影響を与えるいくつかのパラメーターを最初に評価した。
【０１４５】
実施例４（ＳＤＳマトリックス研究）
サンプル緩衝液／ゲルマトリックス調製
多くの場合、タンパク質サンプルに作用するサンプル緩衝液のＳＤＳ量を増加させることが、タンパク質変性の完了を促進させるための最初の試みである。開始時のＣＥ−ＳＤＳサンプル緩衝液のＳＤＳ％を０．５％から４％で変化させることによって、１成分ずつ（ＯＦＡＴ）の研究を行い、還元ｍＡｂ−１サンプルの得られた電気泳動図を、図１２において重ねた。ＳＤＳ％はサンプルロード効率に影響するため、サンプル泳動の注入時間は、標準化したピーク面積に到達するように適宜調節した。より高いＳＤＳ％を含むサンプル緩衝液によって調製した還元ｍＡｂ−１サンプルにおいて、より多くのグループＢのＨＭＷ人工物がさらに観察され、一方で試験範囲においてＡ種の量は一定に保たれた。サンプル緩衝液のＳＤＳ％が０．５％から４％で変化するとき、％総ＨＭＷの全体的な増加は、約１．５％（絶対値）であった。一方で、ふるいゲルマトリックスに存在するＳＤＳ％の影響もまた調査した。図１３は、１％ＳＤＳサンプル緩衝液を用いて生成し、０．２％〜４％ＳＤＳを含むゲルマトリックスによって分離した、還元ｍＡｂ−１サンプルの電気泳動図を比較する。サンプル緩衝液のＳＤＳ％のＯＦＡＴ研究において観測された傾向と同様に、グループＢのＨＭＷ種における有意な上昇もまた、ゲルマトリックスにおいて存在するＳＤＳ％の上昇と共に認められた。上記の２つの実験のセットから得られた結果によって、サンプルおよびゲル緩衝液の両方におけるＳＤＳの濃度の単純な調整では、ＨＭＷ人工物の問題を軽減することはできないことが確認された。
【０１４６】
変性／還元のインキュベート条件
温度および時間などの、サンプルインキュベート条件が、タンパク質の変性に大きな影響を与えることは周知である。タンパク質の変性が不十分であるため、穏やかなインキュベート条件下で変性させたｍＡｂサンプルのＣＥ−ＳＤＳプロファイルにおいては、通常明らかにＨＭＷ種が存在する。インキュベート条件の変更が、人工ＨＭＷ種の生成を抑制するのに有効であるかとうかを調査するために。６０℃、５分から９０℃、１５分にわたる、異なるインキュベート条件セットにおいて、ｍＡｂ−１サンプルを変性および還元させた。その後、販売会社によって供給されたＳＤＳに基づくゲルを用いて、還元ｍＡｂ−１サンプルを分離し、得られた電気泳動図を図１４Ａに示す。６０℃、５分の最も穏やかなインキュベート条件において、１１％より多いグループＢ種が生じた。インキュベート時間を１０分に延長することによって、グループＢ種の量は３．５％に劇的に減少したが、さらに厳しいインキュベート条件を適用しても、その生成は有意に減少しなかった。比較のために、典型的なＣＥ−ＳＤＳ条件下で良好な挙動を示すｍＡｂ−３分子もまた、同様のインキュベート条件を用いて評価し、得られた分離プロファイルを図１４Ｂに列挙する。ｍＡｂ−１サンプルにおいて見られるグループＢ種と同等のＭＷを有するＨＭＷ種はまた、６０℃、３分の穏やかなインキュベート条件下で、ｍＡｂ−３サンプルにおいても生じたことが分かった。
【０１４７】
しかしながら、これらのＨＭＷ種はインキュベート条件が７０℃、１０分に達すると、徐々に目立たない量に減少し、さらに厳しい条件下においても再生成されず、サンプルの変性／還元が完了したことが証明された。このインキュベート条件試験における２つのｍＡｂ分子間のプロファイルの比較によって、グループＢのＨＭＷ種が、事実上方法に誘発された人工物であるということの、より高いレベルの１つの確証が示された。通常の場合と異なり、還元ｍＡｂ−１分子において観察された、グループＢのＨＭＷ人工物は、９０℃、１５分の最も厳しいインキュベート条件においても、ＳＤＳ変性に対して耐性があり、これはこのタンパク質の特定のアミノ酸残基に対するＳＤＳの親和性が低いことに関連しうる。しかしながら、さらなる研究によって、サンプル緩衝液およびゲルマトリックスの両方において、ＳＨＳまたはＳＴＳなどの比較的疎水性の界面活性剤を用いることにより、全てのグループＢのＨＭＷ人工物は、ｍＡｂ分子の大部分に適切な典型的なインキュベート条件（例えば、７０℃、１０分）において完全に除去され、ｍＡｂ−１分子もまた、還元条件下で完全に変性することができることが示された。
【０１４８】
ＣＥ−ＳＤＳ法を用いた泳動によって、１５℃のオートサンプラーに保管された還元ｍＡｂ−１サンプルのオンボード安定性もまた調査した。図１５は、２４の注入シーケンスの開始（Ｔ０）、中間（Ｔ１０時間）および終了（Ｔ２０時間）において実行される、還元ｍＡｂ−１サンプルの分離プロファイルを図示する。最初のサンプル注入（Ｔ０）から最後の注入（Ｔ２０時間）まで、グループＢ種のプロファイルに識別可能な違いが認められた。これらのプロファイルの変化に伴って、グループＢ種の割合が０．６％増加（絶対値）し、それに対応する％純度が０．６％減少し、これは還元ＣＥ−ＳＤＳ法によって解析されたｍＡｂ−１分子のオンボード不安定性が上昇したことを示す。
【０１４９】
サンプル緩衝液およびゲルマトリックスの両方において界面活性剤を変化させることによる、ＨＣ後ＨＭＷ人工物の最小化
通常のＣＥ−ＳＤＳ法の最適化戦略は、還元条件下におけるｍＡｂ−１分子の十分な変性を助けることができなかった。非還元条件下におけるＨＭＷ人工物の抑制に関して、ｍＡｂ−１分子の純度解析にＳＨＳゲルを用いることによってもたらされる利益を考慮すると、サンプル緩衝液および／またはふるいゲルマトリックスにおいて用いられる、標準的な界面活性剤ＳＤＳを、さらに疎水性の界面活性剤に置き換えることによって、還元ｍＡｂ−１分子のＨＣ後ＨＭＷ人工物に対処する可能性があるという仮説を立てた。
【０１５０】
ｍＡｂ−１分子の変性および還元における、界面活性剤の疎水性の影響をさらに理解するために、別の界面活性剤、デシル硫酸ナトリウム（ＳＣ１０Ｓ）およびテトラデシル硫酸ナトリウム（ＳＣ１４ＳまたはＳＴＳ）を、さらなる最適化方法についての代表的な界面活性剤として選択した。界面活性剤ＳＣ１０ＳおよびＳＣ１４Ｓ（ＳＴＳ）は、同じ硫酸ヘッド基を有するが、標準的な界面活性剤ＳＤＳ（ＳＣ１２Ｓとも称される）と比較して、それぞれ２つ少ない、または２つ多いアルキル炭素鎖を有し、そのためＳＤＳよりも小さい、または大きい疎水性を示す。２％（ｗ／ｖ）ＳＣ１０Ｓ、１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、または０．５％（ｗ／ｖ）ＳＴＳを含むサンプル緩衝液を用いて、いくつかの還元ｍＡｂ−１サンプルを調製し、次いでＳＤＳに基づくゲル（ＡＢ Ｓｃｉｅｘから供給される）および我々の手製のＳＨＳに基づくゲルなどの２つの種類のふるいゲルを用いて、それぞれ分離した。本研究のサンプル緩衝液およびゲルマトリックス条件の異なる組み合わせにおいて生じた、還元ｍＡｂ−１サンプルの電気泳動図を、図１６において比較する。生じた方法応答は、純度、主な成分のピーク、およびＨＣ後ＨＭＷの正しいピーク面積の相対割合に関して、表２にまとめる。
表２．還元ｍＡＢ−１サンプル解析におけるピーク率
【表３】
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【０１５１】
ＳＤＳに基づくゲルによる、還元ｍＡｂ−１サンプルの泳動によって、１倍を超える減少を有する、測定された％ＨＭＷ人工物は、サンプル緩衝液の界面活性剤のアルキル炭素鎖長が１０から１４に増加するにつれ、４．４％から１．８％まで変化した。この観察は我々の予想に一致し、これは、グループＢ種の還元された量およびさらに中心によったピーク形状によって証明されるように、より疎水性の界面活性剤の、還元ｍＡｂ−１フラグメントに対する親和性が向上したことに起因しうる。さらに、サンプル緩衝液の界面活性剤のアルキル鎖長が１６に伸びても、さらなる向上は示されず、当該方法はグループＢのＨＭＷ種が存在するため、過小評価された純度結果および不十分な頑強性によっても依然として妥協されていた。さらに長い鎖長を有する界面活性剤は、水溶液における溶解度の限界のために、評価されなかった。一方で、％ＨＭＷ人工物とサンプル緩衝液の界面活性剤のアルキル鎖長との同様の関係はまた、ＳＨＳに基づくゲルに変更したときにも見られた。さらに重要なこととして、ＨＣ後ＨＭＷ人工物の抑制における劇的な改善は、サンプル緩衝液およびゲルマトリックスの両方において、比較的疎水性の界面活性剤、この場合ではそれぞれ、ＳＴＳおよびＳＨＳである、の適用によって、還元ｍＡｂ−１サンプルのトレースから、グループＢ種が完全に除去されることに気付くことによって達成された。その結果、この共同適用を用いて測定した純度結果は９６．５％であり、これは通常のＣＥ−ＳＤＳ法によって得られた値よりも約２．４％（絶対値）低かった。さらに、表１に示す主なピーク成分の量をモニターすることによって、％ＬＣおよび％ＮＧＨＣが異なる界面活性剤の条件下で明らかに変化していないことを見つけるのは難しくない。そのため、％ＨＣおよび％純度における変動は、％ＨＭＷ人工物の変化と主に相関する可能性があり、これらのＨＣ後ＨＭＷ人工物は、完全に変性されていないｍＡｂ−１ ＨＣ種である可能性が非常に高いという結論に至った。
【０１５２】
ここで、ＨＭＷ人工物の部分的な軽減が、サンプル緩衝液またはゲルマトリックスのいずれかに、比較的疎水性の界面活性剤ＳＨＳまたはＳＴＳのみが存在するシナリオにおいて観測された。これらの現象は、タンパク質／フラグメントに結合した界面活性剤ミセルと、ゲルマトリックス中に存在するものとの間の動的平衡に関連しうる。存在する界面活性剤−分析物複合体に対して異なる親和性を有する、界面活性剤ミセルの競合的な解離および再結合は、これらの種が通常の分離温度（例えば２５℃）において、特定の時間枠内（例えば３０分）で、キャピラリーを移動する時に生じうる。ＳＤＳサンプル緩衝液およびＳＨＳゲルを適用した場合、ＳＤＳの低い親和性のために、還元ｍＡｂ−１分子は最初、完全に変性しなかった。そして、さらにキャピラリー内でサンプル変性が生じうるが、ゲルマトリックスに存在するさらに相対的に疎水性のＳＨＳミセルによって、相対的に低い親和性のＳＤＳミセルが徐々に部分的に置き換えられることによって、分離の間完全には完了しない。したがって、ＨＭＷ人工物は、０．９％の量でも未だ検出可能であった。逆の界面活性剤応用（ＳＴＳサンプル緩衝液およびＳＤＳゲル）の状況においては、さらに十分に変性されたｍＡｂ−１フラグメントは、元々結合していたＳＴＳミセルがさらに、ゲル中に存在している疎水性の低いＳＤＳミセルと部分的に交換される影響を受ける可能性があるが、このプロセスはタンパク質親和性の点ではあまり好ましくなく、ＨＭＷ人工物が約１．８％の量で再生成される。
【０１５３】
この応用に用いることができる比較的疎水性の界面活性剤の範囲を拡大するために、０．２％（ｗ／ｖ）ＳＨＳ、または異なる量の組み合わせのＳＨＳおよびＳＤＳの混合物を含むサンプル緩衝液を評価した。図１７に示すように、この界面活性剤はＳＴＳよりも、さらに疎水性であるため、ＳＨＳに基づくゲルとの組み合わせにおいて、ＳＨＳを含むサンプル緩衝液は、ＨＣ後のＨＭＷ人工物の除去において、予想された効果を発揮した。さらに、ＨＭＷ人工物は、ＳＨＳサンプル緩衝液に０．５％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを加えることによって再生成が始まり、ＳＤＳの量を上昇させるにつれてさらに増加した。ＳＤＳがＳＨＳよりも低い親和性を有しているとしても、この発見は、ＳＨＳおよびＳＤＳミセルのｍＡｂ−１フラグメントへの競合的な結合に起因する可能性がある。この評価に加えて、元の界面活性剤ＳＨＳを、ＳＤＳよりも低い疎水性を有するが、ｍＡｂ−１に対して高い親和性を有するＳＴＳに置き換えることによって、他のゲルもまた作成した。図１８は、ＳＨＳおよびＳＴＳに基づくふるいゲルによって泳動した、同様に還元されたｍＡｂ−１サンプルの比較分離プロファイルを示す。両方の場合において、ＨＣ後ＨＭＷ人工物は観測されなかった。
【０１５４】
他のｍＡｂ分子のＣＧＥ分析における、比較的疎水性の界面活性剤の応用
還元条件下におけるｍＡｂ−２分子の純度測定はまた、偏りのない純度結果および向上した分離効果を得ることができるように、、サンプル緩衝液およびふるいゲルマトリックスの両方において、比較的疎水性の界面活性剤が存在する必要がある。対照的に、ｍＡｂ−３分子は、相対的な疎水性界面活性剤、または通常のＣＥ−ＳＤＳ法において用いられる標準的な界面活性剤ＳＤＳを用いて、同等のＣＧＥ効果を得た。
【０１５５】
図１９Ａにおいて示されるように、通常のＣＥ−ＳＤＳ還元条件下におけるｍＡｂ−２分子のプロファイルにおいて、多くの変則的なＨＣ後ＨＭＷ種（グループＢおよびＥ）だけでなく、異常な幅広いＨＣピークもまた観測され、これは比較的疎水性の界面活性剤が、さらに適切なサンプル変性に必要であることを強く示唆する。サンプル緩衝液およびふるいゲル中にそれぞれ、比較的疎水性の界面活性剤ＳＴＳおよびＳＨＳを有する、最適化された方法を用いて、図１９Ｂに示す方法の効果において、全ての変則的なＨＭＷ種の除去、およびピーク高のおよびＨＣ種の段数の、それぞれ３．５倍および６倍の上昇など、顕著な向上が達成された。
＊＊＊
【０１５６】
概要および要約のセクションではなく、詳細な説明のセクションは、特許請求の範囲の解釈として用いられることが意図されることが理解されるべきである。概要および要約のセクションは、発明者によって解釈される本発明の１つ以上、しかし全てではない例示的な局面を記載する可能性があり、そのため、本発明および付属の特許請求の範囲を限定することは決して意図されていない。
【０１５７】
本発明は、特定の機能およびそれらの関係の実現を示す、機能的な構成要素を用いて、前記に記載されている。これらの機能的な構成要素の境界は、説明の便宜上、本明細書において任意に定義されている。特定の機能およびそれらの関係が適切に実行される限り、別の境界が定義されうる。
【０１５８】
特定の局面の前記の記載は、他者が、当技術分野の範囲内の知識を用いて、過度な実験を行わず、本発明の一般的な概念から逸脱することなく、そのような特定の局面の様々な応用のために、容易に変更および／または適応させることができるように、本発明の全体的な本質を完全に明らかにする。そのため、そのような応用および変更は、本明細書に提示される教示および指示に基づいて、開示される局面と均等な意味および範囲内であることが意図される。本明細書における用語または専門用語は、限定ではなく、説明のためのものであり、本明細書の用語または専門用語は、教示および指示に照らして、当業者によって解釈されるべきであることが理解されるべきである。
【０１５９】
本発明の広さおよび範囲は、前記の任意の例示的な局面のいずれによっても限定されるべきではないが、以下の特許請求の範囲およびそれらの均等物に従ってのみ定義されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【国際調査報告】
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