(57)【要約】  本発明は、一般に、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）リガンドを結合及び中和することが可能なポリペプチド、及びＴＧＦ−ベータの発現又は活性化に関連する障害（例えば、癌及び線維性疾患）を治療するためのこれらのポリペプチドの使用、及びそのような分子の作成方法に関する。
2020510434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）アイソタイプの効果を阻害するために有用なポリペプチドコンストラクトであって、前記コンストラクトが、以下：
第１のＴＧＦ−β受容体外部ドメイン（ＴβＲ−ＥＣＤ）を含む第１の領域、及び
抗体重鎖の第２の定常ドメイン（ＣＨ２）及び／又は第３の定常ドメイン（ＣＨ３）を含む第２の領域；
ここで、前記第２の領域のＮ末端は、前記第１の領域のＣ末端に結合され； 及び
前記コンストラクトが、前記第１のＴβＲ−ＥＣＤにタンデムに連結された第２のＴβＲ−ＥＣＤをさらに含む、
を含む、ポリペプチドコンストラクト。
【請求項２】
前記ポリペプチドコンストラクトが、単一のＴβＲ−ＥＣＤ有する対応するコンストラクトよりも少なくとも２０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、又は６００倍高い効力でＴＧＦ−β活性を阻害する、請求項１に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項３】
前記ポリペプチドコンストラクトが、非Ｆｃ融合ＴβＲ−ＥＣＤダブレットよりも少なくとも１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍又は９００倍高い効力でＴＧＦ−β活性を阻害する、請求項１に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項４】
前記第２の領域が、抗体重鎖のＦｃ領域を含む、請求項１に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項５】
前記ＴβＲ−ＥＣＤが、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体外部ドメイン（ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ）を含む、請求項１に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項６】
前記第１のＴβＲ−ＥＣＤ及び前記第２のＴβＲ−ＥＣＤが、同一のＴＧＦ−βアイソタイプに結合する、請求項１に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項７】
前記第１のＴβＲ−ＥＣＤ及び前記第２のＴβＲ−ＥＣＤが、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３の両方にそれぞれ結合する、請求項６に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項８】
前記第１のＴβＲ−ＥＣＤ及び前記第２のＴβＲ−ＥＣＤが、同一のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項９】
前記ＴβＲ−ＥＣＤが、配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項１０】
前記第２の領域が、ＩｇＧ抗体の重鎖の前記ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む、請求項１〜９に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項１１】
前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１又はＩｇＧ２抗体である、請求項１０に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項１２】
前記第２の領域が、前記コンストラクトを他のコンストラクトと架橋するためのシステイン残基を含むヒンジ領域を含む、請求項１〜１１の何れか1項に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項１３】
前記第２の領域が、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２４、及びそれらと実質的に同一の配列からなる群から選択される、請求項１〜１２の何れか1項に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項１４】
配列番号１０、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３、及びそれらと実質的に同一の配列からなる群から選択される、請求項１に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項１５】
前記コンストラクトが、少なくとも1つのジスルフィド架橋によってそれぞれの抗体定常ドメイン間に連結された第１及び第２のポリペプチドコンストラクトを含む二量体ポリペプチドである、請求項１〜１４の何れか1項に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項１６】
前記二量体ポリペプチドが、
第１及び第２の領域を含む第１の単鎖ポリペプチド；
ここで、第２の領域が、抗体重鎖の前記第２の定常ドメイン（ＣＨ２）及び第３の定常ドメイン（ＣＨ３）、並びに所定の抗体の重鎖可変領域を含み；
ここで、第１の領域が、2つのＴβＲＩＩ−ＥＣＤを含み；
ここで、前記第２の領域のＮ末端が、前記第１の領域のＣ末端に連結され； 及び
前記第１の単鎖ポリペプチドのポリペプチドを含む第２の単鎖ポリペプチド、
を含む、請求項１３に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項１７】
請求項１〜１６の何れか１項に記載の何れかのポリペプチドコンストラクトをコードする核酸分子。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１９】
選択された発現宿主により分泌可能な形態で、請求項１〜１９の何れか１項に記載の何れかのポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項２０】
前記核酸が、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３及びそれらと実質的に同一の配列を有するタンパク質をコードする、請求項１９に記載の核酸配列。
【請求項２１】
前記核酸が、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２及び配列番号３３からなる群から選択される、請求項２０に記載の核酸配列。
【請求項２２】
請求項１〜１６の何れか１項に記載のポリペプチドコンストラクト及び医薬的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む組成物。
【請求項２３】
請求項１７に記載の核酸分子又は請求項１８に記載のベクターを含むトランスジェニック細胞宿主。
【請求項２４】
前記第１のポリペプチドコンストラクトと同一の第２のポリペプチドコンストラクトをコードする第２の核酸分子又は第２のベクターをさらに含む、請求項２３に記載のトランスジェニック細胞宿主。
【請求項２５】
二量体ポリペプチドを産生する方法であって、前記宿主を培養し、その宿主を増殖させることにより前処理された培地から請求項１３に記載の二量体ポリペプチドコンストラクトを回収することを含む、方法。
【請求項２６】
病状、疾患又は障害の治療のための請求項１〜１６の何れか１項に記載のポリペプチドコンストラクトの使用。
【請求項２７】
前記病状、疾患又は障害が、癌、眼疾患、線維性疾患、又は結合組織の遺伝的障害を含む、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
配列番号１４を含むポリペプチドコンストラクト。
【請求項２９】
ホモ二量体としての、請求項２８に記載のポリペプチドコンストラクト。
【請求項３０】
請求項２８に記載のポリペプチドを含む医薬組成物。
【請求項３１】
癌の治療のための請求項２８に記載のポリペプチドの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＴＧＦ−β受容体外部ドメイン融合分子及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、ＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体外部ドメイン融合分子及びＴＧＦ−βリガンドの中和におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＴＧＦ−βは、細胞の増殖、遊走及び分化を含むいくつかの生理学的プロセスを調節する３０を超えるリガンドのスーパーファミリーの一部である。それらのレベル及び／又はシグナル伝達の摂動は、重大な病理学的な影響を引き起こす。例えば、ＴＧＦ−β及びアクチビンリガンドは、癌を含む多くの疾患で重要な病原性の役割を果たす（(Hawinkels & Ten Dijke, 2011; Massague et al, 2000; Rodgarkia-Dara et al, 2006）。特に、ＴＧＦ−βは、腫瘍進行の重要な調節因子と考えられており、ほとんどの腫瘍タイプで過剰発現される。上皮腫瘍細胞に上皮間葉転換を誘導することにより、腫瘍形成を促進し、積極的な転移をもたらす（Thiery et al, 2009）。ＴＧＦ−βはまた、腫瘍微小環境における免疫応答の強力な抑制因子として作用することにより、腫瘍形成を促進する（Li et al, 2006）。実際に、ＴＧＦ−βは、腫瘍微小環境に存在する最も強力な免疫抑制因子の１つとして認識される。ＴＧＦ−βは、樹状細胞、マクロファージ、ＮＫ細胞、好中球、Ｂ細胞及びＴ細胞等を含む多くの免疫細胞タイプの分化、増殖及び生存を妨げる。従って、自然免疫と適応免疫の両方を調節する（Santarpia et al, 2015; Yang et al, 2010）。腫瘍微小環境におけるＴＧＦ−βの重要性は、いくつかの腫瘍タイプ（黒色腫、肺、膵臓、結腸直腸、肝臓及び乳房を含む）で、ＴＧＦ−βリガンドレベルの上昇が疾患の進行及び再発、転移、並びに死亡と相関していることを示す証拠によって強調される。従って、ＴＧＦ−β阻害を含む抗腫瘍治療アプローチの考案に多大な努力が注がれてきた（Arteaga, 2006; Mourskaia et al, 2007; Wojtowicz-Praga, 2003）。これらのアプローチには、ＴＧＦ−βリガンドに結合又は「トラップ」するＴＧＦ−β受容体外部ドメインに基づくポリペプチドの融合の使用が含まれる（WO01/83525; WO2005/028517; WO2008/113185; WO2008/157367; WO2010/003118; WO2010/099219; WO2012/071649; WO2012/142515; WO2013/000234; US5693607; US2005/0203022; US2007/0244042; US8318135; US8658135; US8815247; US2015/0225483; 及びUS2015/0056199参照）。
【０００３】
ＴＧＦ−β機能を阻害する治療薬を開発する1つのアプローチは、抗体又は可溶性デコイ受容体（受容体外部ドメイン（ＥＣＤ）ベースのリガンドトラップとも称される）を使用してリガンドを結合及び隔離し、これによって、リガンドの細胞表面受容体へのアクセスを遮断することであった（Zwaagstra et al, 2012）。一般に、受容体ＥＣＤベースのトラップは、広範囲のリガンドを隔離することができ、タンパク質工学アプローチを使用して最適化され得る治療薬のクラス（ｃｌａｓｓ）である（Economides et al, 2003; Holash et al, 2002; Jin et al, 2009）。
【０００４】
以前は、新規のタンパク質工学デザイン戦略は、アビディティ効果によりリガンドのＴＧＦ−βスーパーファミリーのメンバーを強力に中和することができる単鎖、二価ＴＧＦ−βＩＩ型受容体外部ドメイン（ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ）トラップを生成するために用いられた（Zwaagstra et al, 2012) [WO 2008/113185; WO 2010/031168]）。この場合、二価性は、ＴβＲＩＩ−ＥＣＤの構造化されたリガンド結合ドメインに隣接する天然変性領域（ＩＤＲ）の領域を使用して２つのＴβＲＩＩ外部ドメインの共有結合を介して達成された。これら単鎖二価トラップの例、Ｔ２２ｄ３５は、一価の非改変ＴβＲＩＩ外部ドメインよりも〜１００倍高いＴＧＦ−β中和能を示したが、二価トラップは、ＴＧＦ−β２アイソタイプを中和せず、循環半減期は、比較的短かった。
【０００５】
強化された効力等の向上した特性を持つＴβＲＩＩ−ＥＣＤベースのトラップを提供することは有用であろう。
【０００６】
出願全体を通して参照される全ての特許、特許出願、及び出版物は、以下に示される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】WO/1995/04069
【特許文献２】WO/2004/076670
【特許文献３】WO 2008/113185
【特許文献４】WO 2010/031168
【特許文献５】US8815247
【特許文献６】US62777375
【特許文献７】US2015/0225483
【特許文献８】WO01/83525;
【特許文献９】WO2005/028517;
【特許文献１０】WO2008/113185;
【特許文献１１】WO2008/157367;
【特許文献１２】WO2010/003118;
【特許文献１３】WO2010/099219;
【特許文献１４】WO2012/071649;
【特許文献１５】WO2012/142515;
【特許文献１６】WO2013/000234;
【特許文献１７】US5693607;
【特許文献１８】US2005/0203022;
【特許文献１９】US2007/0244042;
【特許文献２０】US8318135;
【特許文献２１】US8658135;
【特許文献２２】US8815247;
【特許文献２３】US2015/0225483;
【特許文献２４】US2015/0056199
【非特許文献】
【０００８】
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【非特許文献１８】Thiery JP, Acloque H, Huang RY, Nieto MA (2009) Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell 139: 871-890
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【非特許文献２３】Zwaagstra JC, Sulea T, Baardsnes J, Lenferink AE, Collins C, Cantin C, Paul-Roc B, Grothe S, Hossain S, Richer LP, L'Abbe D, Tom R, Cass B, Durocher Y, O'Connor-McCourt MD (2012) Engineering and therapeutic application of single-chain bivalent TGF-beta family traps. Mol Cancer Ther 11: 1477-1487
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１Ａ／Ｂは、ＴＧＦ−βＩＩ型受容体外部ドメイン（ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ； Ｔ２ｍとも略記）及び２つのＴ２ｍドメインの単一鎖融合（Ｔ２２ｄ３５とも略記）（図１Ａ）の略図であり； 図１Ｂは、対応するアミノ酸配列を提供し、ここで、天然リンカー配列（配列番号６、配列番号７、配列番号８）に下線が引かれ、ＴβＲＩＩ構造化ドメインの配列（配列番号４）が太字で示される。
【図２Ａ−Ｃ】図２Ａ／Ｂ／Ｃは、融合タンパク質Ｔ２ｍ−Ｆｃ（２Ｂ）及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ（２Ｃ）を生成するためのＩｇＧ２ Ｆｃ領域（２Ａ）の重鎖のＮ末端へのＴ２ｍ及びＴ２２ｄ３５モジュールの融合の概略図である； 図２Ｄは、Ｔ２ｍ−Ｆｃ及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９、配列番号１０）を提供する。図２Ｅは、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ融合体のＦｃとＥＣＤ領域の間のリンカー領域の追加のバリアントのアライメント配列を提供する。図２Ｆ及び２Ｇは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（図２Ｆ； 配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０）及びヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域（図２Ｇ； 配列番号２３）を使用したＴ２２ｄ３５−Ｆｃリンカーバリアントのアミノ酸配列を提供する。天然のリンカー配列（配列番号６、配列番号７、配列番号８）には下線が引かれ、ＴβＲＩＩ構造化ドメインの配列（配列番号４）は、太字で示され、ヒトＩｇＧ Ｆｃ配列バリアント（配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２４）は、太字斜体で示される。図２Ｆ及び２Ｇは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（図２Ｆ； 配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０）及びヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域（図２Ｇ； 配列番号２３）を使用したＴ２２ｄ３５−Ｆｃリンカーバリアントのアミノ酸配列を提供する。
【図２Ｄ】図２Ａ／Ｂ／Ｃは、融合タンパク質Ｔ２ｍ−Ｆｃ（２Ｂ）及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ（２Ｃ）を生成するためのＩｇＧ２ Ｆｃ領域（２Ａ）の重鎖のＮ末端へのＴ２ｍ及びＴ２２ｄ３５モジュールの融合の概略図である； 図２Ｄは、Ｔ２ｍ−Ｆｃ及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９、配列番号１０）を提供する。図２Ｅは、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ融合体のＦｃとＥＣＤ領域の間のリンカー領域の追加のバリアントのアライメント配列を提供する。図２Ｆ及び２Ｇは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（図２Ｆ； 配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０）及びヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域（図２Ｇ； 配列番号２３）を使用したＴ２２ｄ３５−Ｆｃリンカーバリアントのアミノ酸配列を提供する。天然のリンカー配列（配列番号６、配列番号７、配列番号８）には下線が引かれ、ＴβＲＩＩ構造化ドメインの配列（配列番号４）は、太字で示され、ヒトＩｇＧ Ｆｃ配列バリアント（配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２４）は、太字斜体で示される。図２Ｆ及び２Ｇは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（図２Ｆ； 配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０）及びヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域（図２Ｇ； 配列番号２３）を使用したＴ２２ｄ３５−Ｆｃリンカーバリアントのアミノ酸配列を提供する。
【図２Ｅ】図２Ａ／Ｂ／Ｃは、融合タンパク質Ｔ２ｍ−Ｆｃ（２Ｂ）及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ（２Ｃ）を生成するためのＩｇＧ２ Ｆｃ領域（２Ａ）の重鎖のＮ末端へのＴ２ｍ及びＴ２２ｄ３５モジュールの融合の概略図である； 図２Ｄは、Ｔ２ｍ−Ｆｃ及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９、配列番号１０）を提供する。図２Ｅは、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ融合体のＦｃとＥＣＤ領域の間のリンカー領域の追加のバリアントのアライメント配列を提供する。図２Ｆ及び２Ｇは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（図２Ｆ； 配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０）及びヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域（図２Ｇ； 配列番号２３）を使用したＴ２２ｄ３５−Ｆｃリンカーバリアントのアミノ酸配列を提供する。天然のリンカー配列（配列番号６、配列番号７、配列番号８）には下線が引かれ、ＴβＲＩＩ構造化ドメインの配列（配列番号４）は、太字で示され、ヒトＩｇＧ Ｆｃ配列バリアント（配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２４）は、太字斜体で示される。図２Ｆ及び２Ｇは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（図２Ｆ； 配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０）及びヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域（図２Ｇ； 配列番号２３）を使用したＴ２２ｄ３５−Ｆｃリンカーバリアントのアミノ酸配列を提供する。
【図２Ｆ】図２Ａ／Ｂ／Ｃは、融合タンパク質Ｔ２ｍ−Ｆｃ（２Ｂ）及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ（２Ｃ）を生成するためのＩｇＧ２ Ｆｃ領域（２Ａ）の重鎖のＮ末端へのＴ２ｍ及びＴ２２ｄ３５モジュールの融合の概略図である； 図２Ｄは、Ｔ２ｍ−Ｆｃ及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９、配列番号１０）を提供する。図２Ｅは、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ融合体のＦｃとＥＣＤ領域の間のリンカー領域の追加のバリアントのアライメント配列を提供する。図２Ｆ及び２Ｇは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（図２Ｆ； 配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０）及びヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域（図２Ｇ； 配列番号２３）を使用したＴ２２ｄ３５−Ｆｃリンカーバリアントのアミノ酸配列を提供する。天然のリンカー配列（配列番号６、配列番号７、配列番号８）には下線が引かれ、ＴβＲＩＩ構造化ドメインの配列（配列番号４）は、太字で示され、ヒトＩｇＧ Ｆｃ配列バリアント（配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２４）は、太字斜体で示される。図２Ｆ及び２Ｇは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（図２Ｆ； 配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０）及びヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域（図２Ｇ； 配列番号２３）を使用したＴ２２ｄ３５−Ｆｃリンカーバリアントのアミノ酸配列を提供する。
【図２Ｇ】図２Ａ／Ｂ／Ｃは、融合タンパク質Ｔ２ｍ−Ｆｃ（２Ｂ）及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ（２Ｃ）を生成するためのＩｇＧ２ Ｆｃ領域（２Ａ）の重鎖のＮ末端へのＴ２ｍ及びＴ２２ｄ３５モジュールの融合の概略図である； 図２Ｄは、Ｔ２ｍ−Ｆｃ及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ融合タンパク質のアミノ酸配列（配列番号９、配列番号１０）を提供する。図２Ｅは、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ融合体のＦｃとＥＣＤ領域の間のリンカー領域の追加のバリアントのアライメント配列を提供する。図２Ｆ及び２Ｇは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（図２Ｆ； 配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０）及びヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域（図２Ｇ； 配列番号２３）を使用したＴ２２ｄ３５−Ｆｃリンカーバリアントのアミノ酸配列を提供する。天然のリンカー配列（配列番号６、配列番号７、配列番号８）には下線が引かれ、ＴβＲＩＩ構造化ドメインの配列（配列番号４）は、太字で示され、ヒトＩｇＧ Ｆｃ配列バリアント（配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２４）は、太字斜体で示される。図２Ｆ及び２Ｇは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ（図２Ｆ； 配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０）及びヒトＩｇＧ２ Ｆｃ領域（図２Ｇ； 配列番号２３）を使用したＴ２２ｄ３５−Ｆｃリンカーバリアントのアミノ酸配列を提供する。
【図３】図３Ａ／Ｂ／Ｃは、Ｔ２ｍ−Ｆｃ融合タンパク質（３Ａ）の分取ＳＥＣ溶出プロファイルを示す； 画分（Ｆｒ．）６−１１は、プールされ濃縮された。次いで、ＳＥＣ精製物のタンパク質の完全性が、ＵＰＬＣ−ＳＥＣプロファイル（３Ｂ）及び非還元（ＮＲ）及び還元（Ｒ）条件下（３Ｃ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価によって評価された。
【図４】図４Ａ／Ｂ／Ｃは、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ融合タンパク質（４Ａ）の分取ＳＥＣ溶出プロファイルを示す； Ｆｒ．７−１０が、プールされ濃縮された。次いで、ＳＥＣ精製物のタンパク質の完全性が、ＵＰＬＣ−ＳＥＣプロファイル（４Ｂ）及び非還元（ＮＲ）及び還元（Ｒ）条件下（４Ｃ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価によって評価された。
【図５】図５Ａ／Ｂは、プロテインＡ精製Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ２−ｖ２（ＣＣ）、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ１−ｖ１（ＣＣ）、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ１−ｖ２（ＳＣＣ）、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ１−ｖ３（ＧＳＬ−ＣＣ）、ｈＩｇＧ１ＦｃΔＫ（Ｃ）−Ｔ２２ｄ３５、ｈＩｇＧ１ＦｃΔＫ（ＣＣ）−Ｔ２２ｄ３５及びｈＩｇＧ２ＦｃΔＫ（ＣＣ）−Ｔ２２ｄ３５バリアントの非還元（Ａ）及び還元（Ｂ）条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を提供する。
【図６】図６Ａ／Ｂ／Ｃは、さまざまな融合タンパク質の完全なモノマー（Ａ）、凝集体（Ｂ）、及びフラグメント（Ｃ）の割合を提供し、これは、ＩｇＧ Ｆｃ部分のＮ末端にＴ２２ｄ３５ダブレットを発現させることに利点があることを示唆する。表には、分析されたパラメーターの数値の違いがリストされる。
【図７】図７Ａ／Ｂ／Ｃは、Ａ５４９ ＩＬ−１１放出アッセイにおける非Ｆｃ融合単一鎖Ｔ２２ｄ３５トラップと比較したＴ２ｍ−Ｆｃ及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ融合タンパク質の機能的評価を提供する。ＴＧＦ−β１（５Ａ）、−β２（５Ｂ）、−β３（５Ｃ）の中和が評価され、ＴＧＦ−βコントロールの％として計算された（３回の実験の平均＋／−ＳＤ）。表には、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（４−ＰＬアルゴリズム（（ｌｏｇ （阻害剤） ｖｓ．レスポンス−可変スロープ（４つのパラメーター））で計算されたＩＣ５０の計算値が記載される。
【図８】図８は、Ａ５４９ ＩＬ−１１放出アッセイにおけるＣ末端Ｆｃ融合Ｔ２２ｄ３５トラップバリアントと比較した、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ２−ｖ２（ＣＣ）、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ１−ｖ１（ＣＣ）、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ１−ｖ２（ＳＣＣ）、及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ１−ｖ３（ＧＳＬ−ＣＣ）の機能的評価を提供する。ＴＧＦ−β１の中和が評価され、ＴＧＦ−β１コントロールの％として計算された（３回の実験の平均＋／−ＳＤ）。
【図９】図９は、Ａ５４９ ＩＬ−１１放出アッセイにおけるＴ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ−ｖ１（ＣＣ）バリアントによる中和ＴＧＦ−β１、−β２、及びβ３の機能的評価を提供する。ＴＧＦ−β中和は、ＴＧＦ−βコントロールの％として評価及び計算された（３回の実験の平均＋／−ＳＤ）。表には、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（４−ＰＬ アルゴリズム（（ｌｏｇ  （阻害剤） ｖｓ．レスポンス−可変スロープ（４つのパラメーター）で計算されたＩＣ５０の計算値が記載される。
【図１０】図１０は、同系ＭＣ−３８マウス大腸癌モデルにおけるＴ２２ｄ３５−Ｆｃ融合タンパク質の機能的ｉｎ ｖｉｖｏ評価である。（Ａ）記載されるように腫瘍体積を計算し、コホート当たりの平均腫瘍値＋／−ＳＤとしてプロットされた。２元配置分散分析が、用いられ、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃの計算された平均腫瘍体積及びＣＴＬ ＩｇＧ治療コホートの経時的な統計的有意差が時間経過とともに生じるか否かが分析された。加えて、ＣＴＬ ＩｇＧ（Ｂ）及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ治療コホート（Ｃ）について、個々のマウスごとにＭＣ−３８腫瘍成長（計算体積）がプロットされた。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、ＴＧＦβを阻害する効力が強化されたポリペプチドコンストラクトを提供する。
【００１１】
本発明のポリペプチドコンストラクトは、第１の領域及び第２の領域を含み、ここで前記第１の領域は、第１及び／又は第２のＴＧＦβ受容体外部ドメイン（ＥＣＤ）を含み； 前記第２の領域は、抗体重鎖の第２定常ドメイン（ＣＨ２）及び／又は第３の定常ドメイン（ＣＨ３）を含む。好ましい非限定的な実施形態において、前記第１の領域のＣ末端は、前記第２の領域のＮ末端に連結される。好ましい非限定的な実施形態において、前記ポリペプチドコンストラクトの前記第１の領域は、第１のＴβＲＩＩ−ＥＣＤ（ＥＣＤ１）及び／又は第２のＴβＲＩＩ−ＥＣＤ（ＥＣＤ２）を含み、ここで、ＥＣＤ１及びＥＣＤ２は、タンデムに連結される。
【００１２】
そのＣ末端で抗体定常ドメインと連結された（ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ）−（ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ）ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）を含む第１の領域が、そのＣ末端で抗体定常ドメインと連結された単一ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ（すなわち、第２のＥＣＤが存在しない場合、ここでは、シングレット（ｓｉｎｇｌｅｔ）とも称される）を有する対応するコンストラクトよりも少なくとも６００倍高い効力でＴＧＦβ活性を阻害する、ポリペプチドコンストラクトを提供した。
【００１３】
提供されたポリペプチドコンストラクトは、第１のＥＣＤにタンデムに連結された第２のＴＧＦβ受容体外部ドメインを含み、ここで、抗体定常ドメインに連結されたポリペプチドコンストラクト（すなわち、ＥＣＤダブレットコンストラクト）は、抗体定常ドメインが存在しない（すなわち、ＥＣＤダブレットコンストラクト、本明細書において非Ｆｃ融合ダブレットとも称される）対応するコンストラクトよりも少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、又は９００倍高いＴＧＦβ中和（阻害）を示す。
【００１４】
ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ及びそれらがＴＧＦ−β活性を阻害する効力に関連して、それらの構成を慎重に選択すると驚くほど強化された効能が得られることが見出されている。これは、特定のＴβＲＩＩ−ＥＣＤが、タンデムに連結され、及びそのＣ末端が、抗体定常ドメイン（Ｆｃ）のＮ末端に連結される場合に起こる。各ポリペプチドの定常ドメイン間のシステイン架橋を介して架橋された２つのそのようなポリペプチドを含む融合及び二量体形態の場合、２つの「アーム（ａｒｍ）」のそれぞれに２つのＴβＲＩＩ−ＥＣＤ（ＥＣＤ「ダブレット（ｄｏｕｂｌｅｔ）」）を有する結果として生じるいわゆる「Ｆｃ融合」は、２つの「アーム」のそれぞれに１つの外部ドメインを有する「Ｆｃ融合」と比較して、とりわけ、ヒト非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）Ａ５４９細胞によるＴＧＦ−β１及び−β３誘導性ＩＬ−１１分泌の阻害によって示されるように、ＴＧＦ−β１で６００倍超、ＴＧＦ−β３で２０倍超の阻害活性を示し得る。Ｆｃ領域を欠くか、第２のＥＣＤを欠く（つまり、ＥＣＤ「シングレット」）何れかの対応するものと比較して、効力の増強は明らかである。効力の増強は、Ｆｃ融合シングレットよりもＦｃ融合ダブレットの方が少なくとも１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、又は６００倍高い。効力の増強は、Ｆｃ融合ダブレットが、非Ｆｃ融合ダブレットよりも少なくとも１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００倍及び約１０００倍高い。Ｆｃ領域を欠く（Ｆｃ融合ダブレットＴ２２ｄ３５は、非Ｆｃ融合ダブレットよりもＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３でそれぞれ９７２倍及び２４３倍優れている）か、第２のＥＣＤを欠く（ＥＣＤ「シングレット」； Ｆｃ融合ダブレットＴ２２ｄ３５−Ｆｃは、非ＦｃダブレットよりもＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３でそれぞれ６１５倍及び２４倍優れている）対応するものと比較して、効力の増強は明らかである。より具体的には、Ｆｃ−ダブレット（Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ）は、非Ｆｃ融合ＥＣＤダブレットと比較して、ＴＧＦ−β１で少なくとも９７０倍、ＴＧＦ−β３で少なくとも２４０倍の効力の増強を示す。さらに、Ｆｃ−ダブレット（Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ）は、Ｆｃ−シングレット（Ｔ２ｍ−Ｆｃ）と比較して、ＴＧＦ−β１で少なくとも６００倍、ＴＧＦ−β３で少なくとも２０倍高い効力の増強を示す。
【００１５】
一般的な側面では、タンデムに連結された少なくとも２つのＴβＲＩＩ−ＥＣＤを含むポリペプチドコンストラクト（すなわち、ＥＣＤダブレット）、及び少なくとも、抗体重鎖の第２の定常ドメイン（ＣＨ２）及び／又は第３の定常ドメイン（ＣＨ３）を含む抗体定常ドメインが提供され、ここで、外部ドメインのＣ末端は、抗体定常ドメインのＮ末端に連結される。この形態では、コンストラクトは、単一鎖ポリペプチドである。従って、抗体定常ドメインは、ＣＨ２ドメインのみを含み得、又はＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み得る。
【００１６】
実施形態において、ポリペプチドは、２つの単一鎖ポリペプチド及び鎖を共有結合する架橋手段を含む、二量体融合ポリペプチドとして提供される。
【００１７】
他の実施形態において、２つの外部ドメインは、一般にそれらの結合標的及び／又はそれら標的種に関して同一である。
【００１８】
好ましい実施形態において、第１の領域は、２つのＴＧＦβ受容体外部ドメイン（ＴＧＦβＲ−ＥＣＤ又は「ＴβＲ−ＥＣＤ」）を含む。好ましい実施形態において、ＴβＲ−ＥＣＤは、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ型外部ドメイン（ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ）である。好ましい実施形態において、ＴβＲ−ＥＣＤは、配列番号１、及びそれと実質的に同一の配列を含む。
【００１９】
第２の領域は、配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２４からなる群から選択される配列、及びそれと実質的に同一の配列を含み得る。
【００２０】
好ましい実施形態において、本発明のポリペプチドコンストラクトの第２の領域は、ＣＨ１をさらに含み得る。実施形態において、コンストラクトは、単機能性である。
【００２１】
本発明のポリペプチドコンストラクトは、ヒト起源の抗体重鎖を活用する。好ましい実施形態において、抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１（配列番号１５）及びＩｇＧ２（配列番号２４）からなる群から選択される。
【００２２】
従って、他の態様において、本発明によるポリペプチドコンストラクトが提供され、コンストラクトは、二量体ポリペプチドであり； ここで、二量体ポリペプチドは、以下を含む：
（ｉ）抗体重鎖の第２の定常ドメイン（ＣＨ２）及び第３の定常ドメイン（ＣＨ３）を含む第２の領域を含む第１の単一鎖ポリペプチド、及び２つのＴＧＦ−β受容体外部ドメイン（ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ）を含む第１の領域、ここで、第１の領域のＣ末端が、第２の領域のＮ末端に連結される、及び
（ｉｉ）抗体重鎖の第２の定常ドメイン（ＣＨ２）及び第３の定常ドメイン（ＣＨ３）を含む第２の領域を含む第２の単一鎖ポリペプチド、及びタンデムに連結された２つのＴＧＦ−β受容体外部ドメイン（ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ）を含む第１の領域、ここで、第１の領域のＣ末端は、第２の領域のＮ末端に連結され、第１の単一鎖ポリペプチドは、第２の単一鎖ポリペプチドと架橋される。
【００２３】
本発明の何れかのポリペプチドコンストラクトをコードする核酸分子も提供される。本発明の核酸分子を含むベクターも提供される。
【００２４】
本発明の１つ又は複数の独立に選択されたポリペプチドコンストラクト及び医薬的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む組成物も提供される。
【００２５】
本発明の核酸分子又はベクターを含むトランスジェニック細胞宿主も提供される。トランスジェニック細胞宿主は、第２のポリペプチドコンストラクトが、第１のポリペプチドコンストラクトと同じ又は異なる場合、第２のポリペプチドコンストラクトをコードする第２の核酸分子又は第２のベクターをさらに含み得る。２つのポリペプチドコンストラクトが異なる場合（ヘテロ二量体）、必然的に第２の核酸分子又は第２のベクターが存在するが、コンストラクトが同一の場合（ホモ二量体）、必然的ではない。
【００２６】
医学的病状、疾患又は障害の治療のための本発明によるポリペプチドコンストラクトの使用も提供され； ここで、医学的病状、疾患又は障害は、限定されないが、癌、眼疾患、線維性疾患、又は結合組織の遺伝的障害及び免疫障害を含む。
【００２７】
本発明のペプチドコンストラクトは、ヒト起源の抗体重鎖からのＣＨ２及びＣＨ３又はＣＨ２のみを含み得る。例えば、限定することを望まないが、抗体重鎖は、ヒトＩｇＧ１及びＩｇＧ２からなる群から選択され得る。実施形態において、コンストラクト中の定常ドメインは、それ自体がＣＨ２、又はそれ自体がＣＨ３、又はＣＨ２−ＣＨ３である。適切には、抗体重鎖成分は、同一又は異なる単一鎖ポリペプチドコンストラクト間のジスルフィド結合を提供する。同様に、適切には、抗体重鎖は、宿主細胞により産生される二量体ポリペプチドのプロテインＡベースの単離を提供する。
【００２８】
実施形態において、受容体外部ドメイン領域は、タンデムに、すなわち直線的に連結された、独立して選択された２つの外部ドメインを含む。いくつかの実施形態において、外部ドメインは、それらの標的リガンドに関して配列が同一であるか、又は少なくとも同一である。
【００２９】
本発明はまた、本明細書に記載のポリペプチドコンストラクトをコードする核酸分子を提供する。上記の核酸分子を含むベクターもまた、本発明に含まれる。本発明はまた、本明細書に記載の核酸分子又はベクターを含むトランスジェニック細胞宿主も含み； 当該細胞宿主は、第１のポリペプチドコンストラクトとは異なる第２のポリペプチドコンストラクトをコードする第２の核酸分子又は第２のベクターをさらに含み得る。本発明のポリペプチドを産生するために使用されるシステムは、特に、ジスルフィド架橋を介した二量体化が必要な場合の分泌システムであり得、従って、発現ポリヌクレオチドは、培養培地への分泌時に宿主によって切断される分泌シグナルをコードする。
【００３０】
本明細書に記載の１つ又は複数の独立に選択されたポリペプチドコンストラクト及び医薬的に許容される担体、希釈剤、又は賦形剤を含む組成物も本発明に含まれる。
【００３１】
本発明のこれら及び他の特徴は、添付の図面を参照して、例として以下に説明される。
【００３２】
本発明の追加の態様及び利点は、以下の説明を考慮することで明らかになるであろう。詳細な説明及び実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の範囲内の様々な変更及び修正が当業者に明らかになるため、例示としてのみ与えられる。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
現在、全てのトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β１、β２及びβ３）アイソフォームに結合して中和するポリペプチドコンストラクトが提供されている。これらのポリペプチドは、ＴＧＦ−β受容体外部ドメインを利用して、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３を含む様々なＴＧＦβ種をトラップ又は隔離し、ＴＧＦ−β２をある程度拡張する。本発明のポリペプチドコンストラクトが、ＴＧＦ−β１及び−β３を中和する効力は、本明細書で実証されるように、関連するコンストラクトよりも驚くほどはるかに高い。この理由から、本コンストラクトは、癌、線維性疾患及び特定の免疫障害等の医学的適応症の治療のための医薬品として特に有用であると予想される。
【００３４】
本ポリペプチドコンストラクトは、ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ等の２つのＴβＲ−ＥＣＤを含み、これらはタンデム（Ｃ末端からＮ末端）に連結され、抗体重鎖の少なくとも第２の定常ドメイン（ＣＨ２）及び／又は第３の定常ドメイン（ＣＨ３）を含む抗体定常ドメインをさらに含む。抗体定常ドメイン（Ｆｃ）は、そのＮ末端で外部ドメインのＣ末端に結び付けられる。外部ドメインをダブレットとして使用し、そのダブレットを抗体定常ドメインのＮ末端に結び付けると、抗体定常ドメインのＮ末端に結び付けられた単一ＥＣＤを有するコンストラクトと比較して、ＴＧＦβ１に対して６１５倍、ＴＧＦβ３に対して２４倍増強された中和効力を有する「トラップ」を提供する。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語TβＲＩＩ−ＥＣＤは、ＴＧＦ−βリガンドに結合するＴＧＦ−βＩＩ型受容体の細胞外領域を指す。本コンストラクトの好ましい実施形態において、ＴＧＦβＲＩＩ−外部ドメインは、安定な三次元折り畳み構造を形成する配列を含むＴＧＦβＲ種の外部ドメイン（すなわち、ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ）である：
QLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIF （配列番号４）。
【００３６】
フレキシブル天然フランキング配列を含む関連する形態において、以下に示すように、ＥＣＤには下線付きの構造を含めることができる：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD （配列番号１）。
【００３７】
この配列は、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３と称されるＴＧＦ−βリガンドアイソタイプに結合する。ＴＧＦ−β２の結合親和性は、低い。
【００３８】
本発明のポリペプチドコンストラクトにおいて、２つのＴβＲＩＩ−ＥＣＤは、同じ配列を含み得る。２つの外部ドメインは、タンデムに連結されており、その結果、１つの外部ドメインのＣ末端が、他の外部ドメインのＮ末端に連結されている線形ポリペプチドが得られる。
【００３９】
追加のアミノ酸残基が導入されないように、２つの外部ドメインは直接融合によって連結され得る。あるいは、追加のアミノ酸残基は、２つの受容体外部ドメインをタンデムに結び付けるリンカーを形成することができる。本発明のタンパク質コンストラクトにおいて、本発明のポリペプチドコンストラクトの第１及び第２の領域も連結される。「連結される（ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、２つの領域が共有結合していることを意味する。化学結合は、化学反応によって達成され得、又は単一ポリペプチド鎖の２つの領域の組換え発現産物であり得る。特定の非限定的な例において、第１の領域のＣ末端は、第２の領域のＮ末端に直接連結される、すなわち、２つの領域の間に追加の「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」アミノ酸は、存在しない。リンカーが存在しない場合、つまり、２つの領域の直接的な融合の場合、完全な外部ドメインのC末端と抗体定常領域ＣＨ２−ＣＨ３のN末端の間の直接の連結となる。配列番号８の内因性障害リンカーを介して配列番号１にＦｃバリアント（配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２４）を融合することで、これは、配列番号１を有するＴβＲＩＩ−ＥＣＤの一部であり（すなわち、追加の「リンカー」アミノ酸は加えられていない）、それは、配列番号１の最後の位置にあるアスパラギン酸を、グルタミン酸、スレオニン、バリン又は配列番号１２、配列番号１５、配列番号１８、配列番号２４で見出されるバリンのそれぞれに接続する。
【００４０】
融合コンストラクトを産生する際の一般的な慣行は、ＧＧＧＧＳ又は［Ｇ４Ｓ］ｎ（ｎは、１、２、３、４又は５より多く、例えば１０、２５又は５０）等のグリシン−セリンリンカー（ＧＳＬ）を融合コンポーネント間に導入することである。上記の段落で教示されるように、本発明のポリペプチド融合体は、Ｆｃ領域及び受容体外部ドメイン領域に存在するものを除いて、何れかの追加のアミノ酸配列を使用せずに直接連結により産生され得る。従って、外来配列をリンカーとして利用することを控えることができ、望ましくない免疫原性に対する潜在力（ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）及び分子量の追加による利点を提供する。エントロピー因子はまた、グリシン及びグリシン−セリンリンカーの潜在的な妨げであり、これは、フレキシブルが高く、標的結合時に部分的に制限されるため、結合親和性に好ましくないエントロピーの損失を引き起こす。従って、本発明の実施形態において、ＴＧＦβＲＩＩ−ＥＣＤのフレキシブル、天然変性（ｉｎｔｒｉｎｓｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｏｒｄｅｒｅｄ）N末端領域のみが、天然リンカーとして使用された。しかしながら、これらの天然変性リンカー（例えば、配列番号６、配列番号７、配列番号８）の特定のアミノ酸組成及び長さは、結果として生じる直接融合コンストラクトが、それら意図された二量体リガンドへの正しい結合に必要な形状及び好ましい分子相互作用を持つか否かの正確な予測を妨げた。他の実施形態において、融合ポリペプチドは、配列番号２０のコンストラクトに例示されているようなフレキシブル人工ＧＳＬを含むことができ、ここで、配列番号２１のＧＳリンカーが、配列番号１を有するＴβＲＩＩ−ＥＣＤの最後の位置でのアスパラギン酸（Ｄ）と配列番号１５を有するＦｃ領域バリアントの最初の位置でのスレオニン（Ｔ）の間に導入される。
【００４１】
実施形態において、ポリペプチドコンストラクトの第１及び第２の領域は、配列番号８、１３、１６、１９、２５、及びそれらと実質的に同一の配列からなる群から選択される天然の天然変性ポリペプチドリンカーにより接続される。他の実施形態において、ポリペプチドコンストラクトの領域は、配列番号２１及び配列番号２２、及びそれらと実質的に同一の配列からなる群から選択されるフレキシブルリンカーによって接続される。
【００４２】
この実施形態において、本ポリペプチドコンストラクトの１つの領域は、配列番号６の天然の天然変性ポリペプチドリンカーによってタンデムに連結された第１及び第２の受容体外部ドメインを含み、以下のアミノ酸配列を有するＴβＲＩＩ−ＥＣＤダブレットを含む：
PPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD (配列番号５)。
【００４３】
本コンストラクトはまた、少なくとも抗体重鎖の第２の定常ドメイン（ＣＨ２）及び／又は第３の定常ドメイン（ＣＨ３）を含む抗体定常ドメインを含む領域を含む。抗体の定常ドメインは、そのＮ末端で外部ドメインダブレットのＣ末端に結合しているため、コンストラクトの方向は、ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ（連結）ＴβＲＩＩ−ＥＣＤ（連結）ＣＨ２−ＣＨ３の単一鎖となる。
【００４４】
抗体定常ドメインは、２つの本ポリペプチドコンストラクト間の架橋を付与する。これは、発現されたポリペプチドコンストラクトが、それら発現宿主から分泌される際に達成される。従って、単一鎖ポリペプチドの産生は、２つのコンストラクトが、各コンストラクトに存在する各抗体定常ドメイン内の１つ以上のシステイン残基を含むジスルフィド結合を介して架橋される二量体形態のコンストラクトを提供する。
【００４５】
コンストラクト中に存在する抗体定常ドメインは、ＩｇＧ定常領域、特にＩｇＧ１又はＩｇＧ２の何れかの定常ドメインに由来することが好ましい。
【００４６】
提供されるコンストラクトは、ポリペプチドコンストラクトの二量体が形成できる構造として作用する以外に、定常領域自体が特定の活性を有しないという意味で単機能性である。これらの最小定常領域は、対応するヒンジ領域を組み込み、必要に応じてシステイン残基組成を変更することにより、いくつかの利点を提供するために改変され得る。従って、２つのＦｃフラグメントの架橋に関与するシステイン残基の一部又は全部、又は完全長抗体の重鎖と軽鎖の間を架橋するために自然に使用されるシステイン残基は、置換又は削除され得る。システイン残基の数を最小限に抑えることの１つの利点は、凝集を促進する可能性のあるジスルフィド結合スクランブルの経口を減らすことである。例えば、これらのシステイン残基及びその改変物は、ポリペプチドコンストラクトの第１及び第２の領域の連結部の周りに位置する天然又は非天然のリンカー配列に見られ、以下に表される：
SEEYNTSNPDTHTCPPCPAPE (配列番号１６)、SEEYNTSNPDVEPKSSDKTHTCPPCPAPE (配列番号１９)、SEEYNTSNPDGGGSGGGSGGGTHTCPPCPAPE (配列番号２２)ヒトＩｇＧ１ヒンジ配列のバリエーションを組み込む； 及びSEEYNTSNPDERKCCVECPPCPAPP (配列番号１３) 及びSEEYNTSNPDVECPPCPAPP (配列番号２５) ヒトＩｇＧ２ヒンジ配列のバリエーションを組み込む； 及びそれらと実質的に同一の配列。
【００４７】
Ｆｃホモ二量体の安定性は、分子間ジスルフィド結合の数に依存し得ることに注意する一方で、Ｆｃホモ二量体化が起こるために、自然に発生するヒンジ間ジスルフィド結合の全てが形成される必要はない。
【００４８】
本開示において、当該技術分野で「免疫グロブリン」（Ｉｇ）とも呼ばれる「抗体」とは、重及び軽ポリペプチド鎖対から構成されたタンパク質を指す。本明細書に要約されているが、抗体及び各ドメインの構造は、十分に確立されており、当業者によく知られている。抗体が正しく折り畳まれると、各鎖は、折り畳まれて、より線形のポリペプチド配列によって連結された多数の異なる球状ドメインンになる； 免疫グロブリン軽鎖は、可変（ＶＬ）及び定常（ＣＬ）ドメインに折り畳まれ、重鎖は、可変（ＶＨ）及び３つの定常（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）ドメインに折り畳まれる。ペアになると、重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）と最初の定常ドメイン（ＣＬ及びＣＨ１）の相互作用により、結合領域（Ｆｖ）を含むＦａｂ（フラグメント、抗原結合）が形成される； ２つの重鎖の相互作用により、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインが対になり、Ｆｃ（フラグメント、結晶化能）が形成される。ＣＨ２及びＣＨ３ドメインについて本明細書に記載される特徴は、Ｆｃにも該当する。
【００４９】
本発明及びその特定の実施形態において、有意に増強された効力を示すポリペプチドコンストラクトは、以下を含む：
Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (配列番号１０)
Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ２−ｖ２（ＣＣ）：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDISVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (配列番号２３)
Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ１−ｖ１（ＣＣ）：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (配列番号１４)
Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ１−ｖ２（ＳＣＣ）：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDVEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (配列番号１７)； 及び
Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ１−ｖ３（ＧＳＬ−ＣＣ）：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDIPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPDGGGSGGGSGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (配列番号２０)。
【００５０】
特定の実施形態において、ポリペプチドコンストラクトは、有意に増強された効力を示す本発明のポリペプチドを含む。例えば、有意に増強された効力を示すポリペプチドは、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０又は配列番号２３を含み得る。他の特定の実施形態において、ポリペプチドコンストラクトは、有意に増強された効力を示すポリペプチドを含むホモ二量体であり得る； 例えば、有意に増強された効力を示すポリペプチドコンストラクトが、配列番号１４である場合、ポリペプチドコンストラクトは、各ポリペプチドコンストラクトが配列番号１４を含む２つのポリペプチドコンストラクトを含むホモ二量体である。同様に、増強された効力を示すポリペプチドコンストラクトが配列番号１０、１４、１７、２０、又は２３である場合、本発明のホモ二量体は同様に、ホモ二量体の各ポリペプチドが、配列番号１０、１４、１７、２０又は２３である２つのポリペプチドコンストラクトを含む。
【００５１】
前述のように、これらの単一鎖ポリペプチドコンストラクトは、生産宿主から分泌されると二量体化し、２つの単一鎖ポリペプチドの定常ドメインの間に形成されるジスルフィド結合により連結された２つの単一鎖ポリペプチドを含む二量体ポリペプチドコンストラクトが生じる。
【００５２】
「著しく増強された効力」とは、ＴＧＦ−βの生物学的活性の評価に関連するアッセイで測定した際、この二量体形態の本ポリペプチドコンストラクトの効果又は活性が、対応するコンストラクトよりも大きいことを意味する。この決定を行うための適切な手段が本明細書に例示される。例えば、Ａ５４９細胞によるＴＧＦ−β誘導ＩＬ−１１放出によって示されるように、Ｎ末端Ｆｃ融合Ｔ２２ｄ３５ダブレットはＴＧＦ−βを中和し、Ｎ末端Ｆｃ融合Ｔ２ｍシングレットよりもはるかによく拡張する（図７）。
【００５３】
このタイプの融合コンストラクトは、ＴβＲＩＩ受容体外部ドメインに基づく分子の他のいくつかのバージョンに比べて利点を有することが観察されており、これは、非Ｆｃ融合二価ＴＧＦ−β受容体外部ドメインコンストラクト（Ｔ２２ｄ３５ダブレット等）及び単一受容体外部ドメインがＦｃ領域のＮ末端に融合したコンストラクトを含む。特に、現在提供されているＦｃ融合コンストラクトは、Ｆｃ領域の存在により製造性が改善されている（例えば、産生がプロテインＡクロマトグラフィーを使用して達成され得る）。Ｆｃ領域は、循環半減期の改善も可能にする。重要なことに、本コンストラクトは、シングレット融合（Ｔ２ｍ−Ｆｃ）及び非Ｆｃ融合ダブレット外部ドメイン（Ｔ２２ｄ３５）と比較して、実質的に高いＴＧＦ−β中和能を有する。提供されたＮ末端融合ＴＧＦ−βＥＣＤダブレットＦｃコンストラクト（Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ）は、ＴＧＦ−βリガンド中和能の有意な改善に関して利点を示す（図７に示すように、例えば、非Ｆｃ融合ダブレット比較してＴＧＦ−β１中和の９７０倍超の改善が示される）。さらに、９９％を超えるモノマー含有量を示す生物物理学的分析で実証されているように、それらは改善された製造可能性を示す（すなわち、凝集体の最小存在及び精製されたＮ末端融合Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃコンストラクトの断片の非存在）（図６に示すように）。従って、本発明の利点は、ＴＧＦ−β２のある程度の中和を含むＴＧＦ−βリガンド中和の予想外に高い効力であり、これは、Ｔ２ｍ−Ｆｃ（Ｆｃシングレット）又はＴ２２ｄ３５（非Ｆｃ融合）コンストラクトでは観察されない。
【００５４】
特定の実施形態において、本発明のポリペプチドコンストラクトの第２の領域は、配列番号１２、１５、１８、２４によって例示されるようなN末端配列のバリエーションを示す群から選択される。これらは、Ｆｃ領域の二量体化の程度を調節する手段としてヒンジ領域から保持されるシステイン残基の長さ及び数が異なり得、従って、有効性と製造性の両方に影響を与える。従って、実施形態において、ポリペプチドコンストラクトは、定常ドメインのバリエーションを含み、ここで、架橋に関与する少なくとも1つのシステイン残基が削除又は置換される。適切な置換は、セリン又はアラニンを含み、及び好ましくはセリンによる置換を含む。
【００５５】
実質的に同一の配列は、培養培地への分泌時に適切な折り畳みをさらに提供する1つ以上の保存的アミノ酸突然変異を含み得る。参考配列に対する1つ以上の保存的アミノ酸突然変異が、参照配列と比較して生理学的、化学的、物理化学的又は機能的特性に実質的な変化のない突然変異ペプチドを生じ得ることは、当該技術分野で周知である； そのような場合、参照配列と突然変異配列は、「実質的に同一」のポリペプチドと見なされるだろう。保存的アミノ酸置換は、本明細書では、類似の化学的性質（例えば、サイズ、電荷、又は極性）を有する他のアミノ酸残基へのアミノ酸残基の置換として定義される。これらの保存的アミノ酸突然変異は、定常ドメインの全体構造を維持しながら、フレームワーク領域に対して作成され得る； 従って、Ｆｃの機能は維持される。
【００５６】
特定の非限定的な例において、本発明のポリペプチドコンストラクトの第１の領域は、ＴＧＦ−β受容体ＩＩ型、例えば以下：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD (配列番号１、本明細書ではＴ２ｍとも称される).
を含み得る。
【００５７】
好ましい実施形態において、ポリペプチドコンストラクトは、ＴβＲＩＩ−ＥＣＤが他のＴβＲＩＩ−ＥＣＤとタンデムに連結されているＴβＲＩＩ−ＥＣＤ「ダブレット」を含み、これは、外部ドメインが、例えば以下：
IPPHVQKSVNNDMIVTDNNGAVKFPQLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIF
-リンカー-
QLCKFCDVRFSTCDNQKSCMSNCSITSICEKPQEVCVAVWRKNDENITLETVCHDPKLPYHDFILEDAASPKCIMKEKKKPGETFFMCSCSSDECNDNIIFSEEYNTSNPD
(配列番号５、本明細書ではＴ２２ｄ３５とも称される)ここで、非限定的な一実施形態において、リンカーは、配列番号６に対応する； 及びそれと実質的に同一の配列、
等の同一又は異なるＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体外部ドメインであり得る。「実質的に同一」は、上記定義の通りである。
【００５８】
外部ドメインダブレットは、同一又は異なる外部ドメインを組み込むことができ、両方ともＴＧＦβスーパーファミリー受容体ファミリーに属する。実施形態において、外部ドメインは、同一の標的に結合する。他の実施形態において、外部ドメインは、同じ受容体種のものである。他の実施形態において、外部ドメインは、同一であり、従って、ホモマーである。
【００５９】
例えば、本発明のポリペプチドコンストラクトは、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３それぞれについてＴ２２ｄ３５ダブレット単独よりも強力な、少なくとも９００倍及び２００倍からなる群から選択されるＴＧＦ−β中和効力を有し得る。例えば、ＩＬ−１１放出アッセイにおいて、Ｔ２２ｄ３５ダブレットコンストラクトは、非Ｆｃ融合Ｔ２２ｄ３５ダブレット単独と比較して、ＴＧＦ−β１の中和が約９７２倍、ＴＧＦ−β３の中和が約２４３倍強力である。
【００６０】
他の実施形態において、コンストラクトの効力は、抗体定常ドメインが、ダブレット以外の単一外部ドメインに結びつけられるコンストラクトより、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３それぞれの中和のために少なくとも６００倍及び少なくとも２０倍高い。本発明のポリペプチドコンストラクトは、抗体定常ドメインがダブレット以外の単一外部ドメインに結び付けられるコンストラクトの効力と比較した場合、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３それぞれに対して少なくとも６１５倍及び２４倍良好な中和効力を有し得る。
【００６１】
中和効力は、次のように要約できる： Ｆｃ融合ダブレット（ＥＣＤ−ＥＣＤ−Ｆｃ）の中和効力は、Ｆｃ融合ＥＣＤモノマー（ＥＣＤ−Ｆｃ）よりも高い； すなわち、ＥＣＤ−ＥＣＤ−Ｆｃ、ＥＣＤ−Ｆｃは、非Ｆｃ融合ダブレット（ＥＣＤ−ＥＣＤ）よりも強力であり、非Ｆｃ融合ダブレットＥＣＤは、非Ｆｃ融合シングレットＥＣＤよりも強力であり； すなわち、ＥＣＤ−ＥＣＤ−Ｆｃ＞＞ＥＣＤ−Ｆｃ＞ＥＣＤ−ＥＣＤ＞＞ＥＣＤ。製剤性に関して、Ｆｃタンパク質の存在により、プロテインＡの精製が可能になり、切断可能なタグを使用する必要がなくなる。加えて、Ｆｃ部分のＮ末端にシングレット又はダブレットＥＣＤを配置すると、Ｆｃ部分のヒンジ領域のシステイン残基の不適切なペアリングによる凝集の問題が防止される。従って、ＥＣＤシングレット又はダブレットのＦｃ部分のＮ末端への融合により、Ｃ末端融合よりも製造性が向上する（Ｎ末端融合は、モノマー種の割合が高く、凝集体が少なく、断片が少ない）。加えて、Ｎ末端Ｆｃ融合Ｔ２ｍシングレットＥＣＤと比較して、Ｎ末端Ｆｃ融合ダブレットＥＣＤの全てのＴＧＦ−βアイソタイプのＴＧＦ−β中和能に予想外の有意な増加が観察される。
【００６２】
加えて、本発明のポリペプチドコンストラクトが、ＴＧＦ−βに結合するＴβＲＩＩ−ＥＣＤを含む場合、ポリペプチドコンストラクトは、ＴＧＦ−βの３つのアイソタイプ全て（すなわち、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、及びＴＧＦ−β３）を様々な程度で中和し得る。
【００６３】
本発明のポリペプチドコンストラクトは、細胞ベースアッセイで評価されるように、二価のコンパレータポリペプチド、すなわち、非Ｆｃ融合Ｔ２２ｄ３５（ダブレットのみ）及びＴ２ｍ−Ｆｃ（Ｆｃ融合シングレット）よりも有意に高い（２０倍以上）ＴＧＦ−β中和能を有する。本発明の一連のポリペプチドコンストラクト内で、Ｆｃ定常領域のＮ末端に融合したＴβＲＩＩ−ＥＣＤの２つ以上のコピーを含むものは、細胞ベースアッセイで評価されるように、１つのコピーのみを含むコンストラクトよりも高い効力を有する。
【００６４】
本発明のポリペプチドコンストラクトは、単一のポリペプチド鎖として発現される。一旦発現されると、本発明のポリペプチドコンストラクトは、二量体を形成し、ここで、それぞれのポリペプチドコンストラクトのＣＨ２及びＣＨ３ドメインが相互作用し、発現産物が培養培地に分泌されるときに生じるような適切に組み立てられたＦｃ領域を形成する。
【００６５】
本発明のポリペプチドコンストラクトはまた、組換え抗体又はその断片の発現、検出又は精製を補助する追加の配列を含み得る。当業者に知られているそのような配列又はタグの何れかが用いられ得る。例えば、限定することを望まないが、抗体又はその断片は、標的又はシグナル配列（例えば、限定されないがｏｍｐＡ）、検出／精製タグ（例えば、限定されないが、ｃ−Ｍｙｃ、Ｈｉｓ５、Ｈｉｓ６、又はＨｉｓ８Ｇ）、又はそれらの組み合わせを含み得る。他の実施例において、シグナルペプチドは、MDWTWRILFLVAAATGTHA（配列番号１１）であり得る。さらなる実施例において、追加の配列は、［ＷＯ／１９９５／０４０６９］又は［ＷＯ／２００４／０７６６７０］に記載されているようなビオチン認識部位であり得る。同様に当業者に知られているように、リンカー配列は、追加の配列又はタグと組み合わせて使用され得、又は検出／精製タグとして機能し得る。適切には、定常領域は、プロテインＡ親和性アプローチを使用して単鎖ポリペプチドを抽出／単離することを可能にするプロテインＡ結合部位（典型的にＣＨ２とＣＨ３の間近くに存在する）を含む。
【００６６】
本発明は、上記の分子をコードする核酸配列も包含する。遺伝子コードの縮重を考慮すると、多くのヌクレオチド配列は、当業者によって容易に理解されるように、所望のポリペプチドをコードする効果を有するだろう。核酸配列は、様々な微生物での発現のためにコドン最適化され得る。本発明は、上記の核酸を含むベクターも包含し得、ここで、ベクターは、典型的に、選択された細胞生産宿主においてその発現を促進するためのコンストラクトをコードするポリヌクレオチドに動作可能に連結されたプロモーター及びシグナル配列を含む。両方が二量体ポリペプチドコンストラクトの分泌をもたらすという条件で、ベクターは同一又は異なり得る。
【００６７】
さらに、本発明は、本明細書に記載の核酸及び／又はベクターを含む、トランスジェニック細胞宿主とも称される細胞を包含する。宿主細胞は、第１のポリペプチドコンストラクトとは異なる第２のポリペプチドコンストラクトをコードする第２の核酸及び／又はベクターを含み得る。第１及び第２のポリペプチドコンストラクトの共発現は、ヘテロ二量体の形成をもたらし得る。
【００６８】
本発明はまた、本明細書に記載の１つ又は複数のポリペプチドコンストラクトを含む組成物を包含する。組成物は、上記のような単一のポリペプチドコンストラクトを含んでもよく、又はポリペプチドコンストラクトの混合物であってもよい。組成物はまた、１つ又は複数のカーゴ分子に連結された１つ又は複数の本発明のポリペプチドコンストラクトを含み得る。例えば、何れかの方法で限定されることを望まないが、組成物は、本発明による抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を生成するために、細胞傷害性薬物に連結された本発明の１つ又は複数のポリペプチドコンストラクトを含み得る。
【００６９】
組成物はまた、医薬的に許容される希釈剤、賦形剤、又は担体を含み得る。希釈剤、賦形剤、又は担体は、当該技術分野で周知の何れかの適切な希釈剤、賦形剤又は担体であり得、組成物の他の成分、組成物の送達方法と適合性がなければならず、組成物の受領者に有害なものではない必要がある。組成物は、何れかの適切な形態であり得る； 例えば、組成物は、懸濁液形態、粉末形態（例えば、凍結乾燥又はカプセル化に限定される）、カプセル又は錠剤形態で提供され得る。例えば、限定することを望まないが、組成物が、懸濁形態で提供される場合、担体は、水、生理食塩水、適切な緩衝液、又は溶解性及び／又は安定性を改善するための添加物を含み得る； 懸濁液を産生するための再構成は、抗体又はその断片の生存率を確保するために、適切なｐＨ緩衝液で行われる。乾燥粉末は、安全性を改善するための添加剤、及び／又はバルク／容量を増加させるための担体も含み得る； 例えば、限定されることを望まないが、乾燥粉末組成物は、スクロール又はトレハロースを含み得る。特定の非限定的な例において、組成物は、対象の胃腸管に抗体又はその断片を送達するように製剤化され得る。従って、組成物は、カプセル化、徐放、又は抗体又はその断片の送達のための他の適切な技術を含み得る。本化合物を含む適切な組成物を調製することは、当業者の能力の範囲内であろう。
【００７０】
本発明のコンストラクトは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーのリガンドの過剰発現又は過剰活性化に関連する疾患又は障害を治療するために使用され得る。疾患又は障害は、限定されないが、癌、眼疾患、線維性疾患、又は結合曽々木の遺伝的障害から選択され得る。
【００７１】
癌治療の分野において、ＴＧＦ−βが、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ’ｓ）等の免疫療法によって誘発される抗腫瘍応答を阻害する重要な因子であることが最近実証された（Hahn & Akporiaye, 2006）。具体的には、ＩＣＩ抗体に対する治療反応は、主に腫瘍に局在するＴ細胞の再活性化に起因する。ＩＣＩ抗体に対する耐性は、腫瘍の微小環境にＴ細胞が不足する免疫抑制機構の存在に依存する。従って、耐性患者の反応を誘発するために、ＩＣＩ抗体は、Ｔ細胞を活性化し、腫瘍への補充、すなわち、「非Ｔ細胞炎症」腫瘍表現型の逆転を誘導できる薬剤と組み合わせる必要があるこことが現在、認識される。ある文献は、非Ｔ細胞炎症腫瘍の微小環境を克服することが、免疫腫瘍学の最も重要な次のハードルであることを指摘した（Gajewski, 2015）。
【００７２】
原理証明ＴＧＦ−βトラップ、Ｔ２２ｄ３５を使用して、ＴＧＦ−βをブロックすると「非Ｔ細胞炎症」腫瘍表現型が効果的に逆転することが示された（Zwaagstra et al, 2012）。これにより、抗ＴＧＦ−β分子は、ＩＣＩ及び他の免疫療法薬との相乗効果の可能性がある組み合わせとして位置づけられる。これを支持して、２０１４年の研究（Holtzhausen et al., ASCO poster presentation）では、生理学的に関連するトランスジェニックメラノーマモデルで抗ＣＴＬＡ−４抗体を組み合わせた場合のＴＧＦ−βブロッカーの効果を調べた。この研究は、抗ＣＴＬＡ−４抗体単剤療法は、メラノーマの進行を抑制することができなかったが、ＴＧＦ−βアンタゴニストとＣＴＬＡ−４抗体の組み合わせは、原初性メラノーマ腫瘍の増殖並びにメラノーマ転移の両方を有意かつ、相乗的に抑制したことを実証した。これらの観察結果は、メラノーマ組織のエフェクターＴ細胞の有意な増加と相関する。
【００７３】
本明細書において、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃである基本構造を有する本ポリペプチドが、同系マウスＭＣ−３８結腸癌モデルにおいて腫瘍の増殖を有意に低減することを示す。従って、これは、他の免疫療法剤との潜在的な相乗的組み合わせで使用されると抗ＴＧＦ−β分子を位置付ける。
【００７４】
本発明のコンストラクトは、限定されないが、腎臓、肺、肝臓、心臓、皮膚及び眼を含む体の何れかの器官に影響を及ぼすものを含む線維性疾患の治療に有用であり得る。これらの疾患は、限定されないが、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、糸球体腎炎、肝線維症、梗塞後心繊維症、再狭窄、全身性強皮症、眼科手術による繊維症、及び瘢痕を含む。
【００７５】
結合組織の遺伝的障害も治療され得、これは限定されないが、マルファン症候群（ＭＦＳ）及び骨形成不全症（ＯＩ）を含む。
【００７６】
本発明は以下の実施例でさらに説明される。しかしながら、これらの実施例は例示のみを目的とするものであり、何れの方法でも本発明の範囲を限定するために使用されるべきではないことを理解されたい。
【実施例】
【００７７】
材料及び方法
産生及び精製
一過性ＣＨＯ発現
様々なTβＲＩＩ−ＥＣＤ融合変異体（Ｔ２ｍ−Ｆｃ及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ等）は、それぞれ、重鎖Ｆｃ領域で構成され、それらのＮ末端にシグナル配列MDWTWRILFLVAAATGTHA（配列番号１１）を含む。コンストラクトのＤＮＡコード領域は、合成で調製され（Ｂｉｏｂａｓｉｃ Ｉｎｃ．又はＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ ＵＳＡ Ｉｎｃ．）、ｐＴＴ５哺乳類発現プラスミドベクターのＨｉｎｄＩＩＩ（５’末端）及びＢａｍＨ１（３’末端）部位にクローニングされた（Durocher et al, 2002）。融合タンパク質は、ＩｇＧ重鎖（それぞれ、Ｔ２ｍ−ＨＣ及びＴ２２ｄ３５−ＨＣ）コンストラクトに融合した重鎖Ｔ２ｍ又はＴ２２ｄ３５を使用したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の一過性トランスフェクションによって産生された。簡単に説明すると、Ｔ２ｍ−ＨＣ又はＴ２２ｄ３５−ＨＣプラスミドＤＮＡは、４ｍＭグルタミン及び０．１％Ｋｏｌｌｉｐｈｏｒ ｐ−１８８（Ｓｉｇｍａ）を含むＦｒｅｅＳｔｙｌｅ Ｆ１７培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＣＨＯ−３Ｅ７細胞の２．５Ｌ及び４．６Ｌ培養にそれぞれトランスフェクトし、３７℃で維持された。トランスフェクション条件： ＤＮＡ（８０％プラスミドコンストラクト、１５％ＡＫＴプラスミド、５％ＧＦＰプラスミド）： ＰＥＩプロ（比率＝１：２．５）：ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）プロ（ポリプラス）（比率＝１：２．５）。トランスフェクションの２４時間後で、１０％トリプトンＮ１フィード（ＴｅｋｎｉＳｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）及び０．５ｍＭバルプロ酸（ＶＰＡ、Ｓｉｇｍａ）を加え、温度を３２℃にシフトして融合タンパク質の産生及び分泌を促進し、トランスフェクション後１５日間維持した後、細胞が回収された。最終回収時の細胞生存率は、８９．６％であった。
【００７８】
安定プールＣＨＯ発現
様々なＦｃ−融合ＴβＲＩＩ−ＥＣＤタンパク質をコードする標的遺伝子を発現するベクターで細胞にトランスフェクトすることによってＣＨＯＢＲＩ／ｒｃＴＡ細胞プールが生成された。トランスフェクションの翌日、細胞は、２５０ｒｐｍで５分間遠心分離され、選択培地（５０μＭのメチオニンスルホキシミンを加えたＰｏｗｅｒＣＨＯ２培地）に０．５×１０６細胞／ｍＬの密度で播種された。１４〜１８日間、２〜３日ごとに選択培地が交換され、０．５×１０６細胞／ｍＬで接種された。細胞数及び生存率は、上記Ｃｅｄｅｘ Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ自動細胞カウンターＣｅｄｅｘアナライザーで測定された。細胞数及び生存率は、上記Ｃｅｄｅｘ Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ製自動細胞カウンターＣｅｄｅｘアナライザーで測定された。細胞の生存率が９５％を超えると、１２５又は２５０ｍＬ三角フラスコに０．２×１０６細胞／ｍＬでプールが接種された。流加培養では、ＣＨＯＢＲＩ／ｒｃＴＡ細胞プールが上記のように接種された。接種後３日目に、細胞密度が３．５〜４．５×１０６細胞／ｍＬに達した際に、２μｇ／ｍＬのクメイト（ｃｕｍａｔｅ）を加えることにより、組換えタンパク質の発現が誘導された。ＭＳＸ濃度は、１２５μＭに調整され、Ｆ１２．７フィード（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が加えられた後、温度が３２℃にシフトされた。２〜３日ごとに、培養物に５％（ｖ：ｖ）Ｆ１２．７が供給され、組換えタンパク質（ｐＡ−ＨＰＬＣ）及びグルコース（ＶＩＴＲＯＳ ３５０、Ｏｒｔｈｏｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、ＵＳＡ）の濃度測定のためにサンプルが回収された。１７ｍＭの最小濃度を維持するために、グルコースが加えられた。
【００７９】
精製
ＣＨＯ細胞から回収した上清は、濾過され（０．２μｍ）、プロテインＡ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅカラム（ＧＥヘルスケア）にロードされた。２カラム容量のＰＢＳでカラムが洗浄され、３カラム容量の０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ３．６でタンパク質が溶出された。収量を最大にするために、フロースルーが、プロテインＡカラムにリロードされ、上記のように溶出された。溶出画分は、１Ｍ Ｔｒｉｓで中和され、融合タンパク質を含む画分がプールされ、その後、製剤バッファー（Ｃａ２＋を含まない、Ｍｇ２＋を含まないＤＰＢＳ）で平衡化されたＨｉ−ｌｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ２００ ２６／８０サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラム（ＧＥヘルスケア）にロードされた。タンパク質は、１カラム容量の製剤バッファーを使用して溶出され、連続する画分に収集され、２８０ｎｍのＵＶ吸光度で検出された。次いで、融合タンパク質を含むメインピークＳＥＣ画分がプールされ、濃縮された。プールされた画分のＰｒｏｔ−Ａ及びＳＥＣ精製融合タンパク質の完全性は、還元及び非還元条件下（ＳＹＰＲＯ Ｒｕｂｙ染色）でＵＰＬＣ−ＳＥＣ及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ（４〜１５％ポリアクリルアミド）によってさらに分析された。ＵＰＬＣ−ＳＥＣの場合、ＤＰＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ、マイナスＣａ２＋、マイナスＭｇ２＋）中の２〜１０μｇのタンパク質が、Ｗａｔｅｒｓ ＢＥＨ２００ ＳＥＣカラムに注入され、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ−Ｃｌａｓｓ Ｂｉｏ−Ｓｙｓｔｅｍを使用して、室温で８．５分間、０．４ｍＬ／分の流量で分離された。２８０ｎｍでタンパク質のピークが検出された（Ａｃｑｕｉｔｙ ＰＤＡ検出器）。
【００８０】
細胞系統
ヒトＡ５４９非小細胞肺癌細胞を、ＡＴＣＣ（Ｃａｔ＃ ＣＣＬ−１８５、Ｃｅｄａｒｌａｎｅ、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、ＯＮ）から購入した。細胞は、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＭＥＭ）で培養された。ＭＣ−３８マウス大腸腺癌細胞を、Ｋｅｒａｆａｓｔ（Ｃａｔ＃ ＥＮＨ２０４、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）から購入し、２ｍＭ Ｌ−グルタミン及び１０％ウシ胎児血清を加えたダルベッコ改変ＭＥＭで培養した。両方の細胞株は、５％ＣＯ２を加えた加湿雰囲気で３７℃に維持された。
【００８１】
ＴＧＦ−β誘導性Ａ５４９細胞ＩＬ−１１放出アッセイ
ヒトＡ５４９肺癌細胞は、９６ウェルプレートに播種された（５×１０３細胞／ウェル）。翌日、ＴＧＦ−βトラップ融合タンパク質の一連の希釈液の非存在下又は存在下で、完全培地中の１０ｐＭ ＴＧＦ−βが、ＲＴで３０分インキュベートされた後、細胞に加えられた。２１時間のインキュベーションの後、条件培地が採取され、２μｇ／ｍＬビオチン化マウス抗ヒトＩＬ−１１抗体（ＭＡＢ６１８、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）でコーティングされたＭＳＤストレプトアビジンゴールドプレートに加えられた。１８時間後（４℃）、プレートは、０．０２Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄され、２μｇ／ｍＬ ＳＵＬＦＯタグ付きヤギ抗ヒトＩＬ−１１抗体（ＡＦ−２１８−ＮＡ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）が加えられ、プレートが室温で１時間インキュベートされた。最終洗浄の後、プレートは、ＭＥＳＯ ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ ＳＱ１２０マシン（Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）で読み取られた。ＩＬ−１１読み出しは、ＴＧＦ−βのみで処理したコントロール細胞と比較したＩＬ−１１放出パーセントとして表された。Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（４−ＰＬアルゴリズム（（ｌｏｇ（阻害剤）ＶＳ．レスポンス−可変スロープ（４つのパラメーター））が使用され、ＩＣ５０が計算された（必要に応じて自動外れ値オプションが使用された）。
【００８２】
同系マウス結腸癌ＭＣ−３８皮下マウスモデルのインビトロ評価
雌のＣ５７ＢＬ／６−Ｅｌｉｔｅマウス（５〜７週齢）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から購入した。１３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスに０日目に３×１０５のＭＣ−３８細胞を右側腹部に皮下注射した。腫瘍が、５０〜１００ｍｍ３の容量に達した際（５日目）、動物は、２つのコホートに分けられ、治療が開始された：
・コホート１（動物７匹）： アイソタイプコントロール（ＣＴＬ ＩｇＧ； ＢｉｏｘＣｅｌｌ ＩｎＶｉｖｏ ＭＡｂ Ｒａｔ ＩｇＧ２ｂ、抗−ＫＬＨ； クローン ＬＴＦ−２、Ｃａｔ＃ ＢＥ００９０）； １００μＬリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中２００μｇ、腹腔内（ｉ．ｐ．）、５、７、９及び１１日目。
・コホート２（動物６匹）： Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ、１００μＬ ＰＢＳ中５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、５、９、１２及び１６日目。
腫瘍は、治療を開始してから最大１５日間、デジタルキャリパーを使用して週に２回測定された。腫瘍体積は、前述の改変楕円式（Ｔｖｏｌ＝π／６×（長さ×幅×幅））を使用してこれらの測定値から計算された（Tomayko et al., 1986）。
【００８３】
結果及び考察
融合コンストラクト設計
目的のＴＧＦ−βトラップを生成するために、ＴβＲＩＩ−ＥＣＤシングレット（Ｔ２ｍと名付けた）を別のそのようなシングレットに融合し、それにより、ヒト（ｈ）ＩｇＧ２ Ｆｃ領域とヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の重鎖のＮ末端に結び付けられた外部ドメインダブレット（Ｔ２２ｄ３５と名付けた）を形成する。図１は、Ｔ２ｍ及びＴ２２ｄ３５の模式図（図１Ａ）及びアミノ酸配列（図１Ｂ）を示す。これらのモジュールは、Ｔ２ｍ−Ｆｃ（図２Ｂ）及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃバリアント（図２Ｃ）融合を生成するために、いくつかのリンカーバリエーション（図２Ｅ）を使用してＩｇＧ Ｆｃ領域の重鎖のＮ末端に融合された（図２Ａ）。これらの融合体の配列は、図２Ｄに示される。また、Ｆｃドメインのヒンジ領域のシステイン残基の数、異なるＩｇＧアイソタイプ（ヒトＩｇＧ１対ＩｇＧ２）、及びＴ２２ｄ３５とＦｃドメインのＮ末端のリンカーとして様々な長さと性質を探索するＴ２２ｄ３５−Ｆｃのバリアントを設計した（図２Ｅ、２Ｆ及び２Ｇ）。これらのバリエーションは、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ設計の機能性及び製造性の特性を調査し、最終的に最適化することを目的とする。
【００８４】
発現及び精製
一過性ＣＨＯ材料の精製
それぞれの融合タンパク質コンストラクトは、ＣＨＯ−３Ｅ７細胞で一時的に発現され（表１参照）、その後、プロテインＡアフィニティーカラムを使用して条件培地が回収され、及び精製され、続いて分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を行った。Ｔ２ｍ−Ｆｃ（図３Ａ）及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ（図４Ａ）のＳＥＣ溶出プロファイルは、これらの融合タンパク質が、比較的純粋で凝集体が無いことを示した。画分６〜１１（Ｔ２ｍ−Ｆｃ）及び７〜１０（Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ）がプールされ、５．６ｍｇ／ｍｌ（Ｔ２ｍ−Ｆｃ）及び６．０３ｍｇ／ｍｌ（Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ）に濃縮された。Ｔ２ｍ−Ｆｃ及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃの最終収量は、それぞれ２６７ｍｇ及び１６８であった。最終産物（ＳＥＣプールされた画分で示される）は、ＵＰＬＣ−ＳＥＣで純度＞９９％であることが示された（図３Ｂ及び４Ｂ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ評価（図３Ｃ及び４Ｃ、Ｓｙｐｒｏ ＲＵＢＹ染色）は、還元条件下で〜６０ｋＤａ及び〜９０ｋＤａのＴ２ｍ−Ｆｃ及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃのバンドを示しているが、約９０ｋＤａ及び１５０ｋＤａのバンドは検出可能であり、非還元条件下で、それぞれ完全に構築された高純度のＴ２ｍ−Ｆｃ及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ融合タンパク質を示す。産生及び精製の詳細の概要は、表１に記載される。合わせて、これらの結果は、Ｔ２ｍ−Ｆｃ及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ融合タンパク質の良好な製造可能性を示す。
【００８５】
【表１】
2020510434.tif 000003
【００８６】
安定ＣＨＯプール材料の精製
Ｎ末端及びＣ末端のＦｃ融合Ｔ２２ｄ３５バリアントは、その発現レベル及び生物学的特性のいくつかを比較するために、ＣＨＯＢＲＩ／ｒｃＴＡ細胞で安定して発現された。各バリアントのコード領域を哺乳動物細胞発現プラスミドに連結し、トランスフェクション後、各バリアントを安定して発現する細胞の富化プールが選択された。バリアント間の主な違いは、Ｔ２２ｄ３５ダブレットをＦｃドメインから分離するリンカー領域を含むアミノ酸配列に見出され得る（Ｎ末端融合の場合）が、Ｃ末端Ｆｃ融合の場合、各バリアント間の違いは、タンパク質の先端のアミノ末端にある（表２）。
【００８７】
【表２】
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【００８８】
融合タンパク質は、プロテインＡアフィニティーにより、及び溶出バッファーとして１００ｍＭクエン酸（ｐＨ３．６）を使用して精製された。溶出した融合タンパク質のサンプルは、１Ｍ ＨＥＰＥＳで中和され、次いでＺｅｂａスピンカラムを使用してＤＰＢＳへのバッファー交換が行われ（表３）、精製した融合タンパク質のいくつかの完全性が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価された。各バリアントの精製は、同様に行われた。特性の多くは、バリアント間で非常に類似していたが、不適切な折り畳みを示す凝集の可能性により、いくつかの違いが明らかになった。タンパク質の凝集は、立体構造の安定性の低下を示している可能性があり、その結果、活性、効力、又は潜在力が低下する可能性がある。サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）を使用して、Ｎ及びＣ末端のＦｃ融合バリアントの純度を決定した。この方法により、完全なモノマー種の割合並びに凝集体及び／又は分解産物等の不純物の存在が正確に測定できる。図６に示すように、Ｎ末端Ｆｃ融合体として発現されるＴ２２ｄ３５バリアントとＣ末端融合体として発現されるＴ２２ｄ３５バリアントの間に顕著な違いが観察され得る。特に、完全なモノマーの割合（図６Ａ）は、５つ全てのＮ末端融合変異体（配列番号１０、配列番号１４、配列番号１７、配列番号２０、配列番号２３）で約９９％であったが、３つのＣ末端融合体（配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８）では、著しく低かった。完全なモノマーの割合のこの有意な減少は、全てのＣ末端Ｆｃ融合体で観察された高分子量凝集体の増加の蓄積（図６Ｂ）、並びに３つのうちの２つのＣ末端Ｆｃ融合体の低分子量断片の増加の蓄積に起因する。加えて、個々の５００ｍＬの産物の力価及びＮ末端Ｆｃ融合Ｔ２２ｄ３５産物及びＣ末端Ｆｃ融合Ｔ２２ｄ３５産物の平均力価の評価は、Ｃ末端融合体と比較して、Ｎ末端Ｆｃ融合Ｔ２２ｄ３５バリアントをより高い収率で産生できることを示す（表４）。まとめると、これらの結果は、免疫グロブリンのＦｃ部分等の部分のＮ末端でＴ２２ｄ３５ダブレットを発現させることに、有意かつ、予想外の利点があることを示す。これらのデータをまとめると、Ｎ末端Ｆｃ融合Ｔ２２ｄ３５タンパク質の製造性が向上していることがわかる。
【００８９】
【表３】
2020510434.tif 000005
【００９０】
【表４】
2020510434.tif 000006
【００９１】
機能的なインビトロ評価
図７Ａ／Ｂ／Ｃに示すように、Ａ５４９細胞ＩＬ−１１放出アッセイを使用して、Ｔ２ｍ−Ｆｃ及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ融合タンパク質のＴＧＦ−β中和能を非Ｆｃ融合Ｔ２２ｄ３５単一鎖ダブレットトラップと比較した。このデータは、全てのＴＧＦ−βアイソタイプについて、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃの効力が、Ｔ２ｍ−Ｆｃ及び非Ｆｃ融合Ｔ２２ｄ３５単一鎖トラップの効力よりも優れていることを示し、ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３の計算されたＩＣ５０は、それぞれ、０．００３３４８及び０．００３９０８ｎＭである（表５）。これらの値は、Ｔ２２ｄ３５よりも少なくとも９７０倍、少なくとも２４０倍優れた効力（ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３のＩＣ５０は、それぞれ、３．２５３及び０．９４９１ｎＭ）、及びＴ２ｍ−Ｆｃよりも６１５倍及び２４倍高い（ＴＧＦ−β１及びＴＧＦ−β３のＩＣ５０は、それぞれ、２．０５９及び０．０９４３ｎＭ）。加えて、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃは、ＴＧＦ−β１及び−β３よりもはるかに少ない範囲であるが、ＴＧＦ−β２を中和する。対照的に、Ｔ２ｍ−Ｆｃ又はＴ２２ｄ３５単一鎖トラップの何れについても、ＴＧＦ−β２の中和は観察されない。Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃトラップの中和効力は、ＴＧＦ−１βと−β３で類似するが、Ｔ２ｍ−Ｆｃバリアントは、ＴＧＦ−β１と比較してＴＧＦ−β３に対して〜２２倍高い中和効力（それぞれ、２．０５９ｎＭ及び０．０９４３ｎＭ）を示したことに注意すべきである。追加のＮ末端Ｆｃ融合Ｔ２２ｄ３５融合体の評価［Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ２−ｖ２（ＣＣ）、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ１−ｖ１（ＣＣ）、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ１−ｖ２（ＳＣＣ）、及びＴ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ１−ｖ３（ＧＳＬ−ＣＣ）］（図８、表６）は、これら融合体の全てが、匹敵するＴＧＦ−β１中和効力を示すことを表し、これは、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃの効力に非常に類似する。Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ−ＩｇＧ１−ｖ１（ＣＣ）バリアントの追加評価（図９）は、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃバリアントと一致して、ＴＧＦ−β１及び−β３の中和効力が非常に類似する（ＩＣ５０＝それぞれ、０．００３３２７ｎＭ及び０．００３２５１ｎＭ）ことを確認したが、この効力は、ＴＧＦ−β２の方がはるかに低い（ＩＣ５０＝１７．３３ｎＭ）。
【００９２】
【表５】
2020510434.tif 000007
【００９３】
【表６】
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【００９４】
機能性インビボ評価
Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ融合タンパク質（配列番号１０）は、同系ＭＣ−３８マウス結腸癌モデルを使用してインビボで評価された（図９）。Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃ融合体で処置した動物の腫瘍の増殖を、コントロールＩｇＧ（ＣＴＬ ＩｇＧ）で処置した動物の腫瘍の増殖と比較した。図９に示すように、治療後１１日目までの腫瘍増殖の有意な差は観察されなかったが、ＣＴＬ ＩｇＧ（２元配置分散分析）と比較した場合、１５日目にＴ２２ｄ３５−Ｆｃで処置した動物の腫瘍体積で腫瘍増殖の有意な減少が確認され得る。このデータは、Ｔ２２ｄ３５−Ｆｃの投与により、ＣＴＬ ＩｇＧで処理した群と比較して、ＭＣ−３８の増殖の抑制が有意に引き起こされていることを示し、これは、インビボでのＴＧＦ−β１の遮断は、この結腸直腸癌の同系モデルにおける腫瘍の増殖を抑止できることを示唆する。
【００９５】
【表７−１】
2020510434.tif 000009
【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【図１】
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【図２Ａ−Ｂ−Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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