(57)【要約】  本開示のいくつかの側面は、細胞または対象のゲノム内、例えばヒトゲノム内、の単一部位を編集することを包含する核酸の標的化された編集に有用である、組成物、ストラテジー、システム、試薬、方法、およびキットを提供する。いくつかの態様において、核酸（例えば、ゲノムのＤＮＡ）におけるシトシン（Ｃ）からグアニン（Ｇ）への変化を誘導する能力のある融合蛋白質が提供される。いくつかの態様において、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９）と核酸編集蛋白質、または例えばデアミナーゼドメイン、ポリメラーゼドメイン、および／または塩基除去酵素などの蛋白質ドメインとの融合蛋白質が、提供される。いくつかの態様において、標的化された核酸編集のための方法が提供される。いくつかの態様において、例えば核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（例えばＣａｓ９）、および核酸編集蛋白質またはドメインの融合蛋白質などの、標的化された核酸編集蛋白質の生成のための試薬およびキットが、提供される。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、および（ｉｉ）シチジンデアミナーゼドメイン、および（ｉｉｉ）ウラシル結合蛋白質（ＵＢＰ）を含む、融合蛋白質。
【請求項２】
ウラシル結合蛋白質が、ウラシル修飾酵素である、請求項１に記載の融合蛋白質。
【請求項３】
ウラシル結合蛋白質が、ウラシル塩基除去酵素である、請求項１または２に記載の融合蛋白質。
【請求項４】
ウラシル結合蛋白質が、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５】
ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素が、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ウシ、アカゲザル、チンパンジー、ゴリラ、ヤツメウナギ、またはウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）活性を有する、それらの任意の変異型からである、請求項４に記載の融合蛋白質。
【請求項６】
ウラシル結合蛋白質が、配列番号４９（ＵｄｇＸ）のアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＵｄｇＸである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項７】
ウラシル結合蛋白質が、配列番号４９（ＵｄｇＸ）のアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の融合蛋白質。
【請求項８】
ウラシル結合蛋白質が、配列番号４８（ＵＤＧ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＵＤＧである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項９】
ウラシル結合蛋白質が、配列番号４８（ＵＤＧ）のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載の融合蛋白質。
【請求項１０】
ウラシル結合蛋白質が、配列番号５０（ＵｄｇＸ＊）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＵｄｇＸ＊である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１１】
ウラシル結合蛋白質が、配列番号５０（ＵｄｇＸ＊）のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の融合蛋白質。
【請求項１２】
ウラシル結合蛋白質が、配列番号５１（ＵｄｇＸ＿Оｎ）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含むＵｄｇＸ＿Оｎである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３】
ウラシル結合蛋白質が、配列番号５１（ＵｄｇＸ＿Оｎ）のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の融合蛋白質。
【請求項１４】
ウラシル結合蛋白質が、配列番号５３（ＳＭＵＧ１）のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、ＳＭＵＧ１である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１５】
ウラシル結合蛋白質が、配列番号５３（ＳＭＵＧ１）のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の融合蛋白質。
【請求項１６】
融合蛋白質が、構造：［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＢＰ］を含み、ここで各々の「  ］−［  」の例が、任意のリンカーを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１７】
シチジンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐが、リンカーを介して融合される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１８】
シチジンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐが、配列番号１０２〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合されている、請求項１７に記載の融合蛋白質。
【請求項１９】
ｎａｐＤＮＡｂｐおよびＵＢＰが、リンカーを介して融合されている、請求項１〜１８いずれか一項のいずれかの融合蛋白質。
【請求項２０】
ｎａｐＤＮＡｂｐおよびＵＢＰが、配列番号１０２〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合されている、請求項１９に記載の融合蛋白質。
【請求項２１】
融合蛋白質が、（ｉｖ）核酸ポリメラーゼドメイン（ＮＡＰ）を、さらに含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項２２】
核酸ポリメラーゼドメインが、真核生物の核酸ポリメラーゼドメインである、請求項２１に記載の融合蛋白質。
【請求項２３】
核酸ポリメラーゼドメインが、ＤＮＡポリメラーゼドメインである、請求項２１または２２に記載の融合蛋白質。
【請求項２４】
核酸ポリメラーゼドメインが、損傷乗り越えポリメラーゼ活性を有する、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項２５】
核酸ポリメラーゼドメインが、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである、請求項２１〜２４いずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項２６】
核酸ポリメラーゼドメインが、Ｒｅｖ７、Ｒｅｖ１複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパ、およびポリメラーゼエタからである、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項２７】
核酸ポリメラーゼドメインが、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、エタ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミューおよびニューからなる真核生物のポリメラーゼの群から選択される、請求項２１〜２５いずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項２８】
核酸ポリメラーゼドメインが、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項２９】
核酸ポリメラーゼドメインが、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３０】
融合蛋白質が、構造：
［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＢＰ］−［ＮＡＰ］；
［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］−［ＵＢＰ］；
［シチジンデアミナーゼ］−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＢＰ］；または、
［ＮＡＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＢＰ］；を含み、ここで、「  ］−［  」のどの場合も、任意のリンカーを含む、請求項２１〜２９のいずれか一項に記載の前記融合蛋白質。
【請求項３１】
ＮＡＰおよびＵＢＰが、リンカーを介して融合されている、請求項２１〜３０いずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３２】
ＮＡＰおよびＵＢＰが、配列番号１０２〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合されている、請求項３１の融合蛋白質。
【請求項３３】
ＮＡＰおよびｎａｐＤＮＡｂｐが、リンカーを介して融合されている、請求項２１〜３２いずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３４】
ＮＡＰおよびｎａｐＤＮＡｂｐが、配列番号１０２〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合される、請求項３３に記載の融合蛋白質。
【請求項３５】
ＮＡＰおよびシチジンデアミナーゼが、リンカーを介して融合されている、請求項２１〜３４いずれか一項に記載のいずれかの融合蛋白質。
【請求項３６】
ＮＡＰおよびシチジンデアミナーゼが、配列番号１０２〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合されている、請求項３５に記載の融合蛋白質。
【請求項３７】
ｎａｐＤＮＡｂｐが、Ｃａｓ９ドメインを含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項３８】
Ｃａｓ９ドメインが、配列番号４〜２６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３７に記載の融合蛋白質。
【請求項３９】
Ｃａｓ９ドメインが、配列番号４〜２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３７または３８に記載の融合蛋白質。
【請求項４０】
Ｃａｓ９ドメインが、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である、請求項３７に記載の融合蛋白質。
【請求項４１】
Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）が、配列番号１０、１３、１６または２１のいずれか１つに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の融合蛋白質。
【請求項４２】
ｎＣａｓ９が、配列番号１０、１３、１６または２１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４０または４１に記載の融合蛋白質。
【請求項４３】
Ｃａｓ９ドメインがヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である、請求項３７に記載の融合蛋白質。
【請求項４４】
ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）が、配列番号７、８、９または２２のいずれか１つに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４３に記載の融合蛋白質。
【請求項４５】
ｄＣａｓ９が、配列番号７、８、９または２２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４３または４４に記載の融合蛋白質。
【請求項４６】
（ｉ）核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、および（ｉｉ）シチジンデアミナーゼドメイン、および（ｉｉｉ）核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）ドメインを含む融合蛋白質。
【請求項４７】
核酸ポリメラーゼドメインが、真核生物の核酸ポリメラーゼドメインである、請求項４６に記載の融合蛋白質。
【請求項４８】
核酸ポリメラーゼドメインが、ＤＮＡポリメラーゼドメインである、請求項４６または４７に記載の融合蛋白質。
【請求項４９】
核酸ポリメラーゼドメインが、損傷乗り越えポリメラーゼ活性を有する、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５０】
核酸ポリメラーゼドメインが、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである、請求項４６〜４９のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５１】
核酸ポリメラーゼドメインが、Ｒｅｖ７、Ｒｅｖ１複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパおよびポリメラーゼエタからである、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５２】
核酸ポリメラーゼドメインが、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、エタ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミューおよびニューからなる真核生物の ポリメラーゼの群から選択される、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５３】
核酸 ポリメラーゼドメインが、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４６〜５２のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５４】
核酸ポリメラーゼドメインが、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５５】
シチジンデアミナーゼドメインが、アポリポ蛋白質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼからのデアミナーゼである、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５６】
ＡＰＯＢＥＣファミリーデアミナーゼが、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、およびＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼからなる群から選択される、請求項５５に記載の融合蛋白質。
【請求項５７】
シチジンデアミナーゼドメインが、配列番号６７〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１〜５６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５８】
シチジンデアミナーゼドメインが、配列番号６７〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項５９】
シチジンデアミナーゼドメインが、配列番号９３のＷ９０Ｙ、Ｒ１２６Ｅ、およびＲ１３２Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナミナーゼにおける１つ以上の対応する変異、を含むラットＡＰＯＢＥＣ１（ｒＡＰＯＢＥＣ１）デアミナーゼである、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項６０】
シチジンデアミナーゼドメインが、配列番号９１のＷ９０Ｙ、Ｑ１２６Ｅ、およびＲ１３２Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナミナーゼにおける１つ以上の対応する変異、を含むヒトＡＰＯＢＥＣ１（ｈＡＰＯＢＥＣ１）デアミナーゼである、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項６１】
シチジンデアミナーゼドメインが、配列番号７７のＷ２８５Ｙ、Ｒ３２０Ｅ、およびＲ３２６Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナミナーゼにおける１つ以上の対応する変異、を含むヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ）デアミナーゼである、請求項１〜５７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項６２】
シチジンデアミナーゼドメインが、活性化誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ）である、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項６３】
シチジンデアミナーゼドメインが、Petromyzon marinusからのシチジンデアミナーゼ１（ｐｍＣＤＡ１）である、請求項１〜５４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項６４】
ｎａｐＤＮＡｂｐが、Ｃａｓ９ドメインである、請求項４６〜６３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項６５】
Ｃａｓ９ドメインが、配列番号４〜２６のいずれか１つに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６４に記載の融合蛋白質。
【請求項６６】
Ｃａｓ９ドメインが、配列番号４〜２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項６４または６５に記載の融合蛋白質。
【請求項６７】
Ｃａｓ９ドメインが、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である、請求項６４に記載の融合蛋白質。
【請求項６８】
Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）が、配列番号１０、１３、１６、または２１に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項６７に記載の融合蛋白質。
【請求項６９】
ｎＣａｓ９が、配列番号１０、１３、１６、または２１のアミノ酸配列を含む、請求項６７または６８に記載の融合蛋白質。
【請求項７０】
Ｃａｓ９ドメインが、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である、請求項６４に記載の融合蛋白質。
【請求項７１】
ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）が、配列番号７、８、９、または２２に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の融合蛋白質。
【請求項７２】
ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）が、配列番号７、８、９、または２２のアミノ酸配列を含む請求項７０または７１に記載の融合蛋白質。
【請求項７３】
融合蛋白質が、構造：［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］を含み、ここで、「  ］−［  」のどの場合も、任意のリンカーを含む、請求項４６〜７２のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項７４】
シチジンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐが、リンカーを介して融合されている、請求項４６〜７３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項７５】
シチジンデアミナーゼおよびｎａｐＤＮＡｂｐが、配列番号１０２〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合されている、請求項７４に記載の融合蛋白質。
【請求項７６】
ｎａｐＤＮＡｂｐおよびＮＡＰが、リンカーを介して融合されている、請求項４６〜７５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項７７】
ｎａｐＤＮＡｂおよびＮＡＰが、配列番号１０２〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合される、請求項７６に記載の融合蛋白質。
【請求項７８】
（ｉ）核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、および（ｉｉ）塩基除去酵素（ＢＥＥ）を含む、融合蛋白質。
【請求項７９】
塩基除去酵素が、シトシン（Ｃ）またはチミン（Ｔ）塩基除去酵素である、請求項７８に記載の融合蛋白質。
【請求項８０】
塩基除去酵素が、シトシン（Ｃ）塩基除去酵素である、請求項７８または７９に記載の融合蛋白質。
【請求項８１】
塩基除去酵素が、配列番号４８に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、および配列番号４８のアミノ酸残基１５６においてＡを含む、請求項７９または８０に記載の融合蛋白質。
【請求項８２】
塩基除去酵素が、配列番号６５のアミノ酸配列を含む、請求項８０または８１に記載の融合蛋白質。
【請求項８３】
塩基除去酵素が、チミン（Ｔ）塩基除去酵素である、請求項７８または７９の融合蛋白質。
【請求項８４】
塩基除去酵素が、配列番号４８に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、および配列番号４８のアミノ酸残基２１３においてＤを含む、請求項８３に記載の融合蛋白質。
【請求項８５】
塩基除去酵素が、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、請求項Ｂ６またはＢ７に記載の融合蛋白質。
【請求項８６】
融合蛋白質が、構造：［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＢＥＥ］、または［ＢＥＥ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］を含み、ここで、「  ］−［  」のどの場合も、任意のリンカーを含む、請求項７８〜８５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項８７】
ＢＥＥおよびｎａｐＤＮＡｂｐが、リンカーを介して融合されている、請求項７８〜８６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項８８】
ＢＥＥおよびｎａｐＤＮＡｂｐが、配列番号１０２〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合されている、請求項８６または８７に記載の融合蛋白質。
【請求項８９】
融合蛋白質が、（ｉｉｉ）核酸ポリメラーゼドメイン（ＮＡＰ）をさらに含む、請求項７８〜８８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項９０】
核酸ポリメラーゼドメインが、真核生物の核酸ポリメラーゼドメインである、請求項８９に記載の融合蛋白質。
【請求項９１】
核酸ポリメラーゼドメインが、ＤＮＡポリメラーゼドメインである、請求項８９または９０に記載の融合蛋白質。
【請求項９２】
核酸ポリメラーゼドメインが、損傷乗り越えポリメラーゼ活性を有する、請求項８９〜９１のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項９３】
核酸ポリメラーゼドメインが、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである、請求項８９〜９２のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項９４】
核酸ポリメラーゼドメインが、Ｒｅｖ７、Ｒｅｖ１複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパ、およびポリメラーゼエタからである、請求項８９〜９３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項９５】
核酸ポリメラーゼドメインが、アルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、エタ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミューおよびニューからなる真核生物の核酸ポリメラーゼの群から選択される、請求項８９〜９４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項９６】
核酸ポリメラーゼドメインが、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列に、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項８９〜９５のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項９７】
核酸ポリメラーゼドメインが、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項８９〜９６に記載の融合蛋白質。
【請求項９８】
融合蛋白質が、構造：
「ｎａｐＤＮＡｂｐ」−［ＢＥＥ］−［ＮＡＰ］；
［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］−［ＢＥＥ］；
［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＢＥＥ］；
［ＮＡＰ］−［ＢＥＥ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］；
［ＢＥＥ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］；または
［ＢＥＥ］−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］を含み、
ここで、「  ］−［  」のどの場合も、任意のリンカーを含む、請求項８９〜９７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項９９】
ＮＡＰとＢＥＥが、リンカーを介して融合されている、請求項８９〜９８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１００】
ＮＡＰとＢＥＥが、配列番号１０２〜１０９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合されている、請求項９９に記載の融合蛋白質。
【請求項１０１】
ＢＥＥとｎａｐＤＮＡｂｐが、リンカーを介して融合されている、請求項８９〜１００のいずれか一項のいずれかに記載の融合蛋白質。
【請求項１０２】
ＢＥＥとｎａｐＤＮＡｂｐが、配列番号１０２〜１０９のいずれか１つのアミノ酸を含むリンカーを介して融合されている、請求項１０１に記載の融合蛋白質。
【請求項１０３】
ＢＥＥとｎａｐＤＮＡｂｐが、リンカーを介して融合されている、請求項８９〜１０２のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１０４】
ＢＥＥとｎａｐＤＮＡｂｐが、配列番号１０２〜１０９のいずれか１つのアミノ酸を含むリンカーを介して融合される、請求項１０３に記載の融合蛋白質。
【請求項１０５】
ｎａｐＤＮＡｂｐが、Ｃａｓ９ドメインを含む、請求項７８〜１０４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１０６】
Ｃａｓ９ドメインが、配列番号４〜２６のいずれか１つに少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０５に記載の融合蛋白質。
【請求項１０７】
Ｃａｓ９ドメインが、配列番号４〜２６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１０５または１０６に記載の融合蛋白質。
【請求項１０８】
Ｃａｓ９ドメインが、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である、請求項１０５に記載の融合蛋白質。
【請求項１０９】
Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）が、配列番号１０、１３、１６、または２１に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１０８に記載の融合蛋白質。
【請求項１１０】
ｎＣａｓ９が、配列番号１０、１３、１６、または２１のアミノ酸配列を含む、請求項１０８または１０９に記載の融合蛋白質。
【請求項１１１】
Ｃａｓ９ドメインが、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である、請求項１０５に記載の融合蛋白質。
【請求項１１２】
ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）が、配列番号７、８、９、または２２に少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１１に記載の融合蛋白質。
【請求項１１３】
ｄＣａｓ９が、配列番号７、８、９、または２２のアミノ酸配列を含む、請求項Ｂ３４またはＢ３５に記載の融合蛋白質。
【請求項１１４】
以下：
（ｉ）配列番号４〜４０のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である第１のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号６７〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である第２のアミノ酸配列；および
（ｉｉｉ）配列番号４８〜５３のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である第３のアミノ酸配列を含む、融合蛋白質。
【請求項１１５】
（ｉｖ）配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である第４のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１１４に記載の前記融合蛋白質。
【請求項１１６】
第１アミノ酸配列が、配列番号４〜４０のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である、請求項１１４または１１５に記載の融合蛋白質。
【請求項１１７】
第２のアミノ酸配列が、配列番号６７〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である、請求項１１４〜１１６のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１１８】
第３のアミノ酸配列が、配列番号４８〜５３のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である、請求項１１４〜１１７のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１１９】
第４のアミノ酸配列が、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である、請求項１１５〜１１８のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１２０】
融合蛋白質が、構造：
ＮＨ２-［第２のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第２のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列]−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第３のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第３のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；を含み、ここで「−」の各々が、任意のリンカーを含む、請求項１１４〜１１９のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１２１】
融合蛋白質が、構造：
ＮＨ２−［第４のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第２のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第２のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第２のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第４のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第２のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第２のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第２のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第４のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第４のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第４のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第３のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第３のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第３のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第４のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第３のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第３のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第３のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第４のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
を含み、ここで、「−」の各々が、任意のリンカーを含む、請求項１１５〜１１９のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１２２】
以下：
（ｉ）配列番号４〜４０のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である第１のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号６７〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である第２のアミノ酸配列；および
（ｉｉｉ）配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である第３のアミノ酸配列、
を含む、融合蛋白質。
【請求項１２３】
第１のアミノ酸配列が、配列番号４〜４０のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である、請求項１２２に記載の融合蛋白質。
【請求項１２４】
第２のアミノ酸配列が、配列番号６７〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である、請求項１２２〜１２３のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１２５】
第３のアミノ酸配列が、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である、請求項１２２〜１２４のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１２６】
融合蛋白質が、構造：
ＮＨ２−［第２のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第２のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第３のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第３のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
を含み、ここで「−」の各々が任意のリンカーを含む、請求項１２２〜１２５のいずれか一項に記載の前記融合蛋白質。
【請求項１２７】
以下：
（ｉ）配列番号４〜４０のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である第１のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号６５または６６のアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である、第２のアミノ酸配列；
を含む融合蛋白質。
【請求項１２８】
（ｉｉｉ）配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８０％同一である第３のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１２７に記載の融合蛋白質。
【請求項１２９】
第１のアミノ酸配列が、配列番号４〜４０のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である、請求項１２７または１２８に記載の融合蛋白質。
【請求項１３０】
第２のアミノ酸配列が、配列番号６５または６６のアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である、請求項１２７〜１２９のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３１】
第３のアミノ酸配列が、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列に少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％同一である、請求項１２８〜１３０のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３２】
融合蛋白質が、構造：
ＮＨ２−［第２のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２−［第１のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
を含み、ここで「−」の各々が、任意のリンカーを含む、請求項１２７〜１３１のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３３】
融合蛋白質が、構造：
ＮＨ２−［第２のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第２のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第１のアミノ酸配列］−［第３のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第３のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［第３のアミノ酸配列］−［第２のアミノ酸配列］−［第１のアミノ酸配列］−ＣＯＯＨ；
を含み、ここで「−」の各々が、任意のリンカーを含む、請求項１２８〜１３１のいずれか一項に記載の融合蛋白質。
【請求項１３４】
核酸分子および請求項１〜１３３のいずれか一項に記載の融合蛋白質を含む、複合体。
【請求項１３５】
核酸分子が、ＲＮＡである、請求項１３４に記載の複合体。
【請求項１３６】
核酸分子が、ｇＲＮＡである、請求項１３４または１３５に記載の複合体。
【請求項１３７】
核酸分子が、ｓｇＲＮＡである、請求項１３４〜１３６のいずれか一項に記載の複合体。
【請求項１３８】
請求項１〜１３３のいずれか一項に記載の融合蛋白質を含む、医薬組成物。
【請求項１３９】
請求項１３４〜１３７のいずれか一項に記載の複合体を含む、医薬組成物。
【請求項１４０】
薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む、請求項１３８または１３９に記載の医薬組成物。
【請求項１４１】
核酸分子を請求項１〜１３３のいずれか一項に記載の融合蛋白質に、または請求項１３４〜１３７のいずれか一項の複合体に接触することを含む、方法。
【請求項１４２】
核酸分子が、ＤＮＡである、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
核酸分子が、ゲノムのＤＮＡである、請求項１４１または１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集する方法であって、方法が：
ａ）二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を、核塩基編集因子およびガイド核酸を含む複合体と接触すること、ここで、標的領域が、標的核酸塩基対を含み；
ｂ）前記標的領域の鎖分離を誘導すること；および
ｃ）標的領域の単一鎖において、シトシンまたはチミンを切除すること、を含む前記方法。
【請求項１４５】
ステップｃが、標的領域の単一鎖においてシトシンを切除することを含む、請求項１４４に記載の方法。
【請求項１４６】
二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集するための方法で、方法が：
ａ）二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質と接触させること、ここで、標的領域は、標的核酸塩基対を含み；
ｂ）標的領域の前記標的核酸塩基対の第１核酸塩基を切除すること；および
ｃ）第１核酸塩基を、第１核酸塩基とは異なる第２核酸塩基と置き換えること；を含む前記方法。
【請求項１４７】
核酸コンストラクトを含むキットであって：
（ａ）請求項１〜１３３のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする核酸配列；および
（ｂ）（ａ）の発現を駆動する、異種プロモーター
を含む、前記キット。
【請求項１４８】
請求項１〜１３３のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４９】
請求項１４８に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１５０】
請求項１〜１３３のいずれか一項に記載の融合蛋白質を含む、細胞。
【請求項１５１】
請求項１３４〜１３７のいずれか一項に記載の複合体を含む、細胞。
【請求項１５２】
請求項１〜１３３のいずれか一項に記載の融合蛋白質をコードする核酸分子を含む、細胞。
【請求項１５３】
細胞が、in vitroに存在する、請求項１５０〜１５２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５４】
細胞が、in vivoに存在する、請求項１５０〜１５２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５５】
疾患または障害を有するまたは有することが疑われる対象を処置する方法で、請求項１〜１３３のいずれか一項に記載の融合蛋白質、１３４〜１３７のいずれか一項に記載の複合体、請求項１４８に記載のポリヌクレオチド、または請求項１４９に記載のベクターを、対象へ投与することを含む、前記方法。
【請求項１５６】
二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集するための方法で、方法が：
ａ．二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を核酸塩基編集因子およびガイド核酸を含む複合体に接触させること、ここで、標的領域が標的核酸塩基対を含む；
ｂ．前記標的領域の鎖分離を誘導すること；
ｃ．標的領域の単一鎖における前記標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基へ変換すること；
ｄ．二本鎖のＤＮＡ配列から前記第２核酸塩基を切除して、脱塩基の部位を産生すること；および
ｅ．前記標的領域の１つの鎖だけを切ること；
ここで、脱塩基の部位に反対の第３の核酸塩基が、第４の核酸塩基によって置き換えられること；を含む、前記方法。
【請求項１５７】
２０％未満から１％未満までのインデル形成を引き起こす、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５８】
第４の核酸塩基に相補的な第５の核酸塩基を、脱塩基の部位の中へ挿入することをさらに含み、それにより意図される編集された塩基対を生成する、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１５９】
意図される編集された塩基対を生成する効率が、少なくとも５％である、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
効率が、少なくとも１０％から少なくとも５０％にわたる、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
意図される編集された塩基対に対する意図されない編集された塩基対の比が２：１から１０：１である、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６２】
意図される編集された塩基対に対するインデル形成の比が、２：１から２００：１にわたる、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６３】
切断される鎖が、ガイド核酸にハイブリダイゼーションされる、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６４】
切断された単一鎖が、第一核酸塩基を含む鎖に反対である、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６５】
第１核酸塩基が、シトシンである、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６６】
第２の核酸塩基が、ウラシルである、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６７】
核酸塩基編集因子が、ウラシル結合蛋白質を含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６８】
核酸塩基編集因子が、ニッカーゼ活性を含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６９】
意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位の上流である、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１７０】
意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である、請求項１６９に記載の方法。
【請求項１７１】
意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位の下流である、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１７２】
意図される編集された塩基対が、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
核酸塩基編集因子が、リンカーを含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１７４】
リンカーが１〜２５アミノ酸長である、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
リンカーが５〜２０アミノ酸長である、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７６】
リンカーが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長である、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７７】
標的領域が標的ウインドウを含み、標的ウインドウが標的核酸塩基対を含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１７８】
標的ウインドウが１〜１０のヌクレオチドを含む、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
標的ウインドウが、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１ヌクレオチド長である、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１８０】
標的ウインドウが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド長である、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１８１】
標的ウインドウが、意図される編集された塩基対を含む、請求項１７７〜１８０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
核酸配列の標的編集（例えば、標的切断またはゲノムＤＮＡ中への特異的改変の標的導入）は、遺伝子機能の研究にとって極めて有望なアプローチであり、またヒト遺伝子疾患のための新しい治療(therapies)を提供する見込みも有している。多くの遺伝子疾患は原理上、ゲノム中の特定の場所での特定のヌクレオチド変化をもたらすこと（例えば、疾患に関連する遺伝子の特定のコドンにおけるＣ→Ｇ変化またはＧ→Ｃ変化）によって処置され得るところ、かかる精密な遺伝子編集を達成するためのプログラム可能なやり方の開発は、強力で新しい研究ツールならびに遺伝子編集ベースの治療法(therapeutics)に対して見込みのある新しいアプローチの両方に代表される。
【発明の概要】
【０００２】
本明細書に提供されるのは、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）を変更する組成物、キット、および方法、例えば、ポリヌクレオチドの中のシトシン→グアニン変異を生成することである。本明細書に極めてより詳細に記載されるように、塩基編集（例えば、Ｃ→Ｇ編集）は、核酸塩基（例えば、シトシン（Ｃ））を除去することによって成し遂げられ、これにより核酸配列内の脱塩基部位を生成する。脱塩基部位と反対の核酸塩基（例えば、グアニン）は、次いで、例えば内因的な損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼによって異なる核酸塩基（例えば、シトシン）と置き換えられる。本明細書に記載される塩基編集融合蛋白質は、核酸内（例えば、ゲノムＤＮＡ）で特異的な変異（例えば、Ｃ→Ｇ変異）を生成する能力があり、それは、例えば、核酸変異（例えばＣ→Ｇ、またはＧ→Ｃ変異）に関連する疾患を処置することに使用し得る。
【０００３】
Ｃ→Ｇ塩基編集因子の１つの例は、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）ドメイン、およびシチジンデアミナーゼを含有する融合蛋白質を包含する。特定の理論に束縛されることを望まないが、かかる塩基編集融合蛋白質は、特異的な核酸配列と結合する（例えば、Ｃａｓ９ドメインを介して）ことが可能であり、核酸配列内のシトシンをウリジンへ脱アミノ化し、それは、次いでＵＤＧによって核酸分子から切除され得る。脱塩基部位と反対の核酸塩基は、次いで、例えば、内因性損傷乗り越えポリメラーゼによって、別の塩基（例えば、シトシン）により、置き換えられ得る。典型的に、塩基修復マシナリー（例えば、細胞において）は、脱塩基部位と反対の核酸塩基をシトシンに置き換えるものの、他の塩基（例えば、アデニン、グアニン、またはチミン）が、脱塩基部位と反対の核酸塩基を置き換えてもよい。さらに、損傷乗り越えポリメラーゼを塩基編集因子の中へ組み込むことは、脱塩基部位と反対のシトシン組み込みを、増加し得ることが見いだされた。よって、塩基編集因子は、種々の損傷乗り越えポリメラーゼを組み込むように操作され、塩基編集効率を改善した。脱塩基部位と反対のＣの組み込みに対する優先性を増加する損傷乗り越えポリメラーゼは、Ｃ→Ｇ核酸塩基編集を改善する。非Ｃ核酸塩基（例えば、アデニン、グアニン、およびチミン）を優先的に組み込む他の損傷乗り越えポリメラーゼが使用されて、代わりの変異（例えば、Ｃ→Ａ変異）を生成してもよいことが理解されるべきである。
【０００４】
別の例として、塩基編集融合蛋白質は、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）、および核酸塩基（例えば、シトシン）を除去する塩基除去酵素を包含してもよい。上に記載されるように、シトシンをウリジンへ脱アミノ化しおよびウリジンをＵＤＧを使用して切除することよりもむしろ、塩基編集因子は、第１の脱アミノ化をすることなしに、シトシンまたはチミンンなどの核酸塩基を認識し及び除去する塩基除去酵素を包含してもよい。よって、塩基編集因子（例えば、Ｃ→Ｇ塩基編集因子）は、核酸分子からシトシンまたはチミンを除去する塩基除去酵素に核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）を融合することによって、操作られた。さらにより、上に記載される塩基編集因子によって、損傷乗り越えポリメラーゼは、この塩基編集因子の中へ組み込まれ、塩基編集因子の塩基除去酵素によって生まれた脱塩基部位と反対のシトシン組み込みを増加させた。例示的な塩基編集蛋白質および塩基編集ストラテジーをアウトラインする模式図表示は、例えば図１〜６、３３〜３６、４０および５２において見られ得る。
【０００５】
いくつかの態様において、本開示は、塩基編集能力のある融合蛋白質を提供する。例示的な塩基編集融合蛋白質は、以下を包含する。いくつかの態様において、融合蛋白質は、（ｉ）核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、（ｉｉ）シチジンデアミナーゼドメイン、および（ｉｉｉ）ウラシル結合蛋白質（ＵＢＰ）を包含する。いくつかの態様において、融合蛋白質は、（ｉｖ）核酸ポリメラーゼドメイン（ＮＡＰ）をさらに含む。別の例として、融合蛋白質は、（ｉ）核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、（ｉｉ）シチジンデアミナーゼドメイン、および（ｉｉｉ）核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）ドメインを含んでもよい。別の例として、融合蛋白質は、（ｉ）核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、および（ｉｉ）塩基除去酵素（ＢＥＥ）を含んでもよい。いくつかの態様において、融合蛋白質は、（ｉｉｉ）核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）ドメインをさらに包含する。塩基編集因子および塩基編集因子を使用する方法は、さらに詳細に以下に記載される。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】図１は、Ｃ→ＴおよびＣ→Ｇ塩基編集を説明する一般的な模式図を示す。特定のＤＮＡポリメラーゼ（例えば、損傷乗り越えポリメラーゼ）は、脱塩基部位と反対の塩基をＧと置き換えることが知られている。Ｃ→Ｇ塩基編集を達成する１つのストラテジーは、脱塩基部位の創造を誘導し、かかるポリメラーゼを次いで補充し、または繋ぎ留めて、脱塩基部位と反対のＧをＣによって、置き換えることである。
【０００７】
【図２】図２は、塩基編集を介する脱塩基部位生成、およびＣ→Ｇ編集のための塩基特異的な修復を説明する一般的な模式図を示す。
【０００８】
【図３】図３は、脱塩基部位がＣ→Ｇ塩基編集のために形成される、図１からのスキーム１を説明する模式図である。脱塩基が、効率的に生成される場合、これは、Ｃ→Ｇ編集経路のフラックスの合計を増加し得る。
【０００９】
【図４】図４は、Ｃ→Ｇ塩基編集についてのアプローチ１を説明する模式図であり、そこで脱塩基部位の形成における増加が、使用される。例えばＵＤＧドメインおよび損傷乗り越えポリメラーゼを使用することによって、脱塩基が効率的に生成される場合、これは、Ｃ→Ｇ編集経路を介するフラックスの合計を増加し得る。
【００１０】
【図５】図５は、塩基編集へのＵｄｇＸの効果を説明する模式図を示す。最小のウラシル切除活性でウラシルに密に結合すると同定されるＵＤＧの相同分子種、ＵｄｇＸは、Ｃ→Ｇ編集の量を増加する。１．）において、ＵｄｇＸ＊は、in vitroアッセイを介して、ウラシルと結合する活性を欠くと決定された、ＵＤＧのバリアントである。２．）において、ＵｄｇＸ＿Ｏｎは、in vitroアッセイを介して、ウラシル切除を増加すると示された、バリアントである。３．）において、ＵＤＧの直接融合は、ウラシルを切除する。
【００１１】
【図６】図６は、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）、Ｃａｓ９ドメイン（例えば、ｎＣａｓ９）、およびシチジンデアミナーゼを含有する、例示的なＣ→Ｔ塩基編集因子（例えば、ＢＥ３）を説明する模式図（左にある）を示す。右にあるのは、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）（またはそのバリアント）、Ｃａｓ９ドメイン（例えば、ｎＣａｓ９）およびシチジンデアミナーゼを含有する、Ｃ→Ｇ塩基編集因子を説明する模式図である。
【００１２】
【図７】図７は、７つの塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ２＿ＵＤＧ；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用して、ＷＴ  Ｈａｐ１細胞におけるＨＥＫ２部位での合計の編集百分率を示す。Ｒａｗ編集値は、左のパネルにおいて示される。右にあるパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこで、シーケンシングが編集されたＣを含有する鎖の反対のＤＮＡ鎖において実施されたとき、Ｃ→Ｇ塩基編集が、図画によってドット棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって図画的に示される。
【００１３】
【図８】図８は、ＷＴ  Ｈａｐ１細胞における、追加のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＲＥＶ７；およびＳＭＵＧ１、そこでＢＥ３およびＢＥ３＿ＵｄｇＸは図４から繰り返される）による、ＨＥＫ２部位での合計の編集百分率を示す。上のパネルは、Ｒａｗ編集値を示す。下のパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこで、編集されたＣを含有する鎖の反対のＤＮＡ鎖においてシーケンシングが実施されたとき、Ｃ→Ｇ塩基編集は、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることにより、図画的に示される。
【００１４】
【図９】図９は、ＷＴ  Ｈａｐ１細胞における種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ３＿ＲＥＶ７；ＢＥ２＿ＵＤＧ；ＢＥ３＿ＵＤＧ  ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１による、ＨＥＫ２部位での編集特異性の比率を示す。上のパネルは、Ｇ→Ａ，ＣまたはＴになっている総編集の百分率、および編集の比率を示す。下のパネルは、特異性の比率値の図画での表示である。
【００１５】
【図１０】図１０は、７つの塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ２＿ＵＤＧ；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用して、ＷＴ  Ｈａｐ１細胞におけるＲＮＦ２部位での合計の編集百分率を示す。Ｒａｗ編集値は、左のパネルにおいて示される。右にあるパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこで、編集されたＣを含有する鎖の反対のＤＮＡ鎖においてシーケンシングが実施されたとき、Ｃ→Ｇ塩基編集は、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることにより、図画的に示される。
【００１６】
【図１１】図１１は、ＷＴ  Ｈａｐ１細胞における追加のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＲＥＶ７；およびＳＭＵＧ１、そこでＢＥ３およびＢＥ３＿ＵｄｇＸは図７から繰り返される）によるＲＮＦ２部位での合計の編集百分率を示す。上のパネルは、Ｒａｗ編集値を示す。下のパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこで、Ｃ→Ｇ塩基編集は、編集されたＣを含有する鎖の反対のＤＮＡ鎖においてシーケンシングが実施されたとき、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって、図画的に示される。
【００１７】
【図１２】図１２は、ＷＴ  Ｈａｐ１細胞における種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ３＿ＲＥＶ７；ＢＥ２＿ＵＤＧ；ＢＥ３＿ＵＤＧ  ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ； ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）による、ＲＮＦ２部位での編集特異性の比率を示す。上のパネルは、Ｇ→Ａ、ＣまたはＴになっている総編集の百分率、および編集の比率を示す。下のパネルは、特異性の比率値の図画での表示である。
【００１８】
【図１３】図１３は、ＷＴ  Ｈａｐ１細胞におけるＦＡＮＣＦ部位での合計の編集百分率百分率を、７つの塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏn；ＢＥ２＿ＵＤＧ；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用して示す。Ｒａｗ編集値は、左のパネルにおいて示される。右にあるパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこで、Ｃ→Ｇ塩基編集は、黒塗りの棒（Ｃ）が、ドット柄の棒（Ｇ）になることにより、図画的に示される。
【００１９】
【図１４】図１４は、ＷＴ  Ｈａｐ１細胞における追加のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＲＥＶ７；およびＳＭＵＧ１；そこでＢＥ３およびＢＥ３ＵｄｇＸが図１０から繰り返される）によるＦＡＮＣＦ部位での合計の編集百分率を示す。上のパネルは、Ｒａｗ編集値を示す。下のパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこでＣ→Ｇ塩基編集は、黒塗りの棒（Ｃ）がドット柄の棒（Ｇ）になることによって、図画的に示される。
【００２０】
【図１５】図１５は、ＷＴ  Ｈａｐ１細胞における種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ３＿ＲＥＶ７；ＢＥ２＿ＵＤＧ；ＢＥ３＿ＵＤＧ  ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）によるＦＡＮＣＦ部位での編集特異性の比率を示す。上のパネルは、Ｃ→Ａ、ＧまたはＴになっている総編集の百分率、および編集の比率を示す。下のパネルは、特異性の比率値の図画での表示である。
【００２１】
【図１６】図１６は、７つの塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏn；ＢＥ２＿ＵＤＧ；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用して、ＵＤＧ−／−Ｈａｐ１細胞におけるＨＥＫ２部位での合計の編集百分率を示す。Ｒａｗ編集値は、左のパネルにおいて示される。右にあるパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこでＣ→Ｇ塩基編集は、編集されたＣを含有する鎖の反対のＤＮＡ鎖においてシーケンシングが実施されたとき、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって、図画的に示される。
【００２２】
【図１７】図１７は、ＵＤＧ−／−Ｈａｐ１細胞における追加のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＲＥＶ７；およびＳＭＵＧ１、そこでＢＥ３およびＢＥ３＿ＵｄｇＸは、図１３から繰り返される）によるＨＥＫ２部位での合計の編集百分率を示す。上のパネルは、Ｒａｗ編集値を示す。下のパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこでＣ→Ｇ塩基編集は、編集されたＣを含有する鎖の反対のＤＮＡ鎖においてシーケンシングが実施されたとき、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって、図画的に示される。
【００２３】
【図１８】図１８は、ＵＤＧ−／−Ｈａｐ１細胞における、種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ３＿ＲＥＶ７；ＢＥ２＿ＵＤＧ；ＢＥ３＿ＵＤＧ  ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ； ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）による、ＨＥＫ２部位での編集特異性比率を示す。上のパネルは、Ｇ→Ａ、ＣまたはＴになっている総編集の百分率、および編集の比率を示す。下のパネルは、特異性の比率値の図画での表示である。
【００２４】
【図１９】図１９は、ＵＤＧ−／−Ｈａｐ１細胞におけるＲＮＦ２部位での７つの塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏn；ＢＥ２＿ＵＤＧ；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用して、合計の編集百分率を示す。Ｒａｗ編集値は、左のパネルにおいて示される。右にあるパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこでＣ→Ｇ塩基編集は、編集されたＣを含有する鎖の反対のＤＮＡ鎖においてシーケンシングが実施されたとき、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって、図画的に示される。
【００２５】
【図２０】図２０は、ＵＤＧ−／−Ｈａｐ１細胞における、追加のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＲＥＶ７；およびＳＭＵＧ１、そこでＢＥ３およびＢＥ＿ＵｄｇＸは、図１６から繰り返される）によるＲＮＦ２部位での合計の編集百分率を示す。上のパネルは、Ｒａｗ編集値を示す。下のパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこでＣ→Ｇ塩基編集は、編集されたＣを含有する鎖の反対のＤＮＡ鎖においてシーケンシングが実施されたとき、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって、図画的に示される。
【００２６】
【図２１】図２１は、ＵＤＧ−／−Ｈａｐ１細胞における、種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ３＿ＲＥＶ７；ＢＥ２＿ＵＤＧ；ＢＥ３＿ＵＤＧ  ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）による、ＲＮＦ２部位での編集特異性比率を示す。上のパネルは、Ｇ→Ａ、ＣまたはＴになっている総編集の百分率、および編集の比率を示す。下のパネルは、特異性の比率値の図画での表示である。
【００２７】
【図２２】図２２は、７つの塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏn；ＢＥ２＿ＵＤＧ；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用して、ＵＤＧ−／−Ｈａｐ１細胞におけるＦＡＮＣＦ部位での合計の編集百分率を示す。Ｒａｗ編集値は、左のパネルにおいて示される。右にあるパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこでＣ→Ｇ塩基編集は、黒塗りの棒（Ｃ）が、ドット柄の棒（Ｇ）になることによって、図画的に示される。
【００２８】
【図２３】図２３は、ＵＤＧ−／−Ｈａｐ１細胞における、追加のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＲＥＶ７；およびＳＭＵＧ１、そこでＢＥ３およびＢＥ３＿ＵｄｇＸは、図１９から繰り返される）によるＦＡＮＣＦ部位での合計の編集百分率を示す。上のパネルは、Ｒａｗ編集値を示す。下のパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し, そこでＣ→Ｇ塩基編集は、黒塗りの棒（Ｃ）が、ドット柄の棒（Ｇ）になることにより、図画的に示される。
【００２９】
【図２４】図２４は、ＵＤＧ−／−Ｈａｐ１細胞における、種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ３＿ＲＥＶ７；ＢＥ２＿ＵＤＧ；ＢＥ３＿ＵＤＧ  ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）による、ＦＡＮＣＦ部位での合計の編集特異性比率を示す。上のパネルは、Ｃ→Ａ、ＧまたはＴになっている総編集の百分率、および編集の比率を示す。下のパネルは、特異性の比率値の図画での表示である。
【００３０】
【図２５】図２５は、Ｒｅｖ１−／−Ｈａｐ１細胞における種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ２＿ＵＮＧ；ＢＥ３＿ＵＮＧ；ＢＥ２ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）によるＨＥＫ２部位での合計の編集百分率を示す。上のパネルは、Ｒａｗ編集値を示す。下のパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこでＣ→Ｇ塩基編集は、編集されたＣを含有する鎖の反対のＤＮＡ鎖においてシーケンシングが実施されたとき、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって、図画的に示される.
【００３１】
【図２６】図２６は、Ｒｅｖ１−／−Ｈａｐ１細胞における、種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ２＿ＵＮＧ；ＢＥ３＿ＵＮＧ；ＢＥ２ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）によるＨＥＫ２部位での編集特異性の比率を示す。上のパネルは、Ｇ→Ａ、ＣまたはＴになっている総編集の百分率、および編集の比率を示す。下のパネルは、特異性の比率値の図画での表示である。
【００３２】
【図２７】図２７は、Ｒｅｖ１−／−Ｈａｐ１細胞における種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ２＿ＵＮＧ；ＢＥ３＿ＵＮＧ；ＢＥ２ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）によるＲＮＦ２部位での合計の編集百分率を示す。上のパネルは、Ｒａｗ編集値を示す。下のパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこでＣ→Ｇ塩基編集は、編集されたＣを含有する鎖の反対のＤＮＡ鎖においてシーケンシングが実施されたとき、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって、図画的に示される。
【００３３】
【図２８】図２８は、Ｒｅｖ１−／−Ｈａｐ１細胞における、種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ２＿ＵＮＧ；ＢＥ３＿ＵＮＧ；ＢＥ２ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）によるＲＮＦ２部位での、編集特異性の比率を示す。上のパネルは、Ｇ→Ａ、ＣまたはＴになっている総編集の百分率、および編集の比率を示す。下のパネルは、特異性の比率値の図画での表示である。
【００３４】
【図２９】図２９は、Ｒｅｖ１−／−Ｈａｐ１細胞における、種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ２＿ＵＮＧ；ＢＥ３＿ＵＮＧ；ＢＥ２ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）によるＦＡＮＣＦ部位での、合計の編集百分率を示す。上のパネルは、Ｒａｗ編集値を示す。下のパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこでＣ→Ｇ塩基編集は、黒塗りの棒（Ｃ）が、ドット柄の棒（Ｇ）になることにより、図画的に示される。
【００３５】
【図３０】図３０は、Ｒｅｖ１−／−Ｈａｐ１細胞における、種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ２＿ＵＮＧ；ＢＥ３＿ＵＮＧ；ＢＥ２ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）によるＦＡＮＣＦ部位での、編集特異性の比率を示す。上のパネルは、Ｃ→Ａ、ＧまたはＴになっている総編集の百分率、および編集の比率を示す。下のパネルは、特異性の比率値の図画での表示である。
【００３６】
【図３１】図３１は、示されるＣ→Ｇ塩基編集因子を使用して、ＨＥＫ２、ＲＮＦ２、およびＦＡＮＣＦ部位での合計の編集百分率についてのＲａｗ編集値の図画での表示を示す。
【００３７】
【図３２】図３２は、ＨＥＫ２、ＲＮＦ２、およびＦＡＮＣＦ部位での、合計の編集百分率についての特異性の比の図画での表示を示す。
【００３８】
【図３３】図３３は、Ｃ→Ｇ塩基編集のための、脱塩基部位の反対へのＣの組み込みを増加するアプローチを説明する模式図を示す。例えば、ポリメラーゼ（例えば、損傷乗り越えポリメラーゼ）を使用することによって、脱塩基部位の反対へＣの組み込みへの優先性が増加する場合、合計のＣ→Ｇ塩基編集もまた増加する。
【００３９】
【図３４】図３４は、Ｃ→Ｇ塩基編集のための、脱塩基部位の反対へのＣの組み込みを増加するアプローチを説明する模式図を示す。例えば、損傷乗り越えポリメラーゼを塩基編集因子の中に組み込むことによってなど、脱塩基部位の反対へのＣの組み込みへの優先性が増加する場合、合計のＣ→Ｇ塩基編集もまた増加する。
【００４０】
【図３５】図３５は、図３３および図３４のＣ→Ｇ塩基編集アプローチにおいて使用され得る、異なるポリメラーゼを説明する模式図を示す。
【００４１】
【図３６】図３６は、ウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）、Ｃａｓ９ドメイン（例えば、ｎＣａｓ９）、およびシチジンデアミナーゼを含有する、例示的なＣ→Ｔ塩基編集因子（例えば、ＢＥ３）を説明する模式図（左にある）を示す。右にあるのは、損傷乗り越えポリメラーゼ、Ｃａｓ９ドメイン（例えば、ｎＣａｓ９）、およびシチジンデアミナーゼを含有する、Ｃ→Ｇ塩基編集因子を説明する模式図である。
【００４２】
【図３７】図３７は、ＲＥＶ１、Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌエタ、およびＰｏｌイオタに繋ぎ留められる塩基編集因子を使用する、ＷＴ細胞における、ＨＥＫ２部位での塩基編集を示す。Ｃ→Ｇ編集は、右のパネルにおける図画での表示においてドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって、図画的に示される。Ｐｏｌカッパの繋ぎ留めは、Ｃ→Ｇ編集の効率を劇的に増加する。Ｒａｗ編集値は、左のパネルにおいて示される。
【００４３】
【図３８】図３８は、ＲＥＶ１、Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌエタ、およびＰｏｌイオタにつなぎ留められる塩基編集因子を使用するＷＴ細胞におけるＲＮＦ２部位での塩基編集を示す。Ｃ→Ｇ編集は、右のパネルにおける図画での表示において、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって、図画的に示される。Ｐｏｌカッパの繋ぎ留めは、Ｃ→Ｇ編集の効率を劇的に増加する。Ｒａｗ編集値は、左のパネルにおいて示される。
【００４４】
【図３９】図３９は、ＲＥＶ１、Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌエタ、およびＰｏｌイオタに繋ぎ留められた塩基編集因子を使用する、ＷＴ細胞におけるＦＡＮＣＦ部位での塩基編集を示す。右のパネルにおける図画での表示において黒塗りの棒（Ｃ）がドット柄の棒（Ｇ）になることによって、図画的に示される。繋ぎ留めるＰｏｌカッパは、Ｃ→Ｇ編集の効率を劇的に増加する。Ｒａｗ編集値は、左のパネルにおいて示される。
【００４５】
【図４０】図４０は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）、損傷乗り越えポリメラーゼ、Ｃａｓ９ドメイン（例えば、ｎＣａｓ９）、およびシチジンデアミナーゼを含有する、例示的なＣ→Ｇ塩基編集因子を説明する模式図（左にある）を示す。右にあるのは、損傷乗り越え ポリメラーゼ、Ｃａｓ９ドメイン（例えば、ｎＣａｓ９）、および塩基除去酵素（例えば、ＣまたはＴ残基を切除する能力のあるＵＤＧバリアント）を含有する、Ｃ→Ｇ塩基編集因子を説明する模式図である。
【００４６】
【図４１】図４１は、ＰｏｌカッパまたはＰｏｌイオタいずれかに繋ぎ留められるコンストラクトを使用する、ＨＥＫ２、ＲＮＦ２、およびＦＡＮＣＦ部位において、図４０（ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）、損傷乗り越えポリメラーゼ、Ｃａｓ９ドメイン、およびシチジンデアミナーゼを含有する塩基編集因子）の左のパネルにおいて説明される塩基編集因子を使用するＣ→Ｇ塩基編集を、示す。Ｃ→Ｇ編集は、ＨＥＫ２およびＲＮＦ２について、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって、およびＦＡＮＣＦについて、黒塗りの棒（Ｃ）がドット柄の棒（Ｇ）になることによって図画的に示される。
【００４７】
【図４２】図４２は、図４０の右のパネル（損傷乗り越えポリメラーゼ、Ｃａｓ９ドメイン、およびＴを切除する塩基除去酵素（ＵＤＧ１４７））において示される、Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌイオタ、およびＲＥＶ１のいずれかに繋ぎ留める塩基編集因子を使用する、ＷＴ細胞におけるＨＥＫ２部位での塩基編集を示す。Ｃ→Ｇの量は、ＨＥＫ２部位の中の特定の残基において図画的に説明される。ＵＤＧ１４７は、Ｔを直接的に除去する、ＵＤＧバリアントである。
【００４８】
【図４３】図４３は、図４０の右のパネル（損傷乗り越えポリメラーゼ、Ｃａｓ９ドメイン、およびＴを切除する塩基除去酵素（ＵＤＧ１４７））において示される、Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌイオタ、およびＲＥＶ１のいずれかに繋ぎ留める塩基編集因子を使用する、ＷＴ細胞におけるＲＮＦ２部位での塩基編集を示す。Ｃ→Ｇの量は、ＨＥＫ２部位の中の特定の残基において図画的に説明される。ＵＤＧ１４７は、Ｔを直接的に切除するＵＤＧバリアントである。
【００４９】
【図４４】図４４は、図４０の右のパネル（損傷乗り越えポリメラーゼ、Ｃａｓ９ドメイン、およびＴを切除する塩基除去酵素（ＵＤＧ１４７））において示される、Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌイオタ、およびＲＥＶ１のいずれかに繋ぎ留める塩基編集因子を使用する、ＷＴ細胞におけるＦＡＮＣＦ部位での塩基編集を示す。Ｃ→Ｇの量は、ＨＥＫ２部位の中の特異的な残基において図画的に説明される。ＵＤＧ１４７は、Ｔを直接的に切除するＵＤＧバリアントである。
【００５０】
【図４５】図４５は、図４０の右のパネル（損傷乗り越えポリメラーゼ、Ｃａｓ９ドメイン、およびＣを切除する塩基除去酵素（ＵＤＧ２０４））において示される、Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌイオタ、およびＲＥＶ１のいずれかに繋ぎ留められる塩基編集因子を使用する、ＷＴ細胞におけるＨＥＫ２部位での塩基編集を示す。Ｃ→Ｇの量は、ＨＥＫ２部位の中の特定の残基において図画的に説明される。ＵＤＧ２０４は、Ｃを直接的に切除するＵＤＧバリアントである。
【００５１】
【図４６】図４６は、図４０の右のパネル（損傷乗り越えポリメラーゼ、Ｃａｓ９ドメイン、およびＣを切除する塩基除去酵素（ＵＤＧ２０４）を含有する塩基編集因子）において示される、Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌイオタ、およびＲＥＶ１のいずれかに繋ぎ留められる塩基編集因子を使用する、ＷＴ細胞におけるＲＮＦ２部位での塩基編集を示す。Ｃ→Ｇの量は、ＨＥＫ２部位の中の特定の残基において図画的に説明される。ＵＤＧ２０４は、Ｃを直接的に切除するＵＤＧバリアントである。
【００５２】
【図４７】図４７は、図４０の右のパネル（損傷乗り越えポリメラーゼ、Ｃａｓ９ドメイン、およびＣを切除する塩基除去酵素（ＵＤＧ２０４）を含有する塩基編集因子）において示される、Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌイオタ、およびＲＥＶ１のいずれかに繋ぎ留められる塩基編集因子を使用する、ＷＴ細胞におけるＦＡＮＣＦ部位での塩基編集を示す。Ｃ→Ｇの量は、ＨＥＫ２部位の中の特定の残基において図画的に説明される。ＵＤＧ２０４は、Ｃを直接的に切除するＵＤＧバリアントである。
【００５３】
【図４８】図４８は、塩基修復におけるＭＳＨ２の役割を説明する模式図を示し、そこでＭＳＨ２がＤＮＡの中のウラシル（Ｕ）→シトシン（Ｃ）の変換を促進することがある。
【００５４】
【図４９】図４９は、６つの塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ； ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏn；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用する、ＭＳＨ２−/−細胞におけるＨＥＫ２部位での塩基編集を示す。Ｒａｗ編集値は、左のパネルにおいて示される。右にあるパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこで、Ｃ→Ｇ塩基編集は、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって図画的に示される。
【００５５】
【図５０】図５０は、６つの塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ； ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏn；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用するＭＳＨ２−／−細胞におけるＲＮＦ２部位での塩基編集を示す。Ｒａｗ編集値は、左のパネルにおいて示される。右にあるパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこで、Ｃ→Ｇ塩基編集は、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって図画的に示される。
【００５６】
【図５１】図５１は、６つの塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＢＥ３＿ＵＮＧ）を使用する、ＭＳＨ２−／−細胞におけるＦＡＮＣＦ部位での塩基編集を示す。Ｒａｗ編集値は、左のパネルにおいて示される。右にあるパネルは、Ｒａｗ編集値の図画での表示を示し、そこでＣ→Ｇ塩基編集は、黒塗りの棒（Ｃ）が、ドット柄の棒（Ｇ）になることにより、図画的に示される。
【００５７】
【図５２】図５２は、ＵＤＧ（またはＵＤＧバリアント）、Ｃａｓ９（例えば、ｎＣａｓ９）ドメイン、およびシチジンデアミナーゼを含有するＣ→Ｇ塩基編集因子が、損傷乗り越えポリメラーゼとともに、トランス（in trans）に発現されているところの、塩基編集アプローチを説明する模式図である。
【００５８】
【図５３】図５３は、種々のポリメラーゼ（Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌイオタ、ＲＥＶ１、Ｐｏｌベータ、およびＰｏｌデルタ）とともに、トランス（in trans）に発現される５つの塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用する、ＨＥＫ２９３細胞におけるＨＥＫ２部位での塩基編集を示す。Ｃ→Ｇ塩基編集は、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって図画的に示される。
【００５９】
【図５４】図５４は、種々のポリメラーゼ（Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌイオタ、ＲＥＶ１、Ｐｏｌベータ、およびＰｏｌデルタ）とともに、トランス（in trans）に発現される５つの塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用する、ＨＥＫ２９３細胞におけるＲＮＦ２部位での塩基編集を示す。Ｃ→Ｇ塩基編集は、ドット柄の棒（Ｇ）が黒塗りの棒（Ｃ）になることによって図画的に示される。
【００６０】
【図５５】図５５は、種々のポリメラーゼ（Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌイオタ、ＲＥＶ１、Ｐｏｌベータ、およびＰｏｌデルタ）とともに、トランス（in trans）に発現される５つの塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用する、ＨＥＫ２９３細胞におけるＦＡＮＣＦ部位での塩基編集を示す。Ｃ→Ｇ塩基編集は、黒塗りの棒（Ｃ）がドット柄の棒（Ｇ）になることによって図画的に示される。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
定義
本明細書におよびクレームに使用されるとき、単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈上明白に他に示される場合を除き、単数または複数を含む。よって、例えば、「薬剤(an agent)」への言及は、単数の剤および複数のかかる剤を含む。
【００６２】
本明細書において使用される、用語「デアミナーゼ」または「デアミナーゼドメイン」は、脱アミノ化反応を触媒する蛋白質または酵素を指す。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、シチジンまたはデオキシシチジンの加水分解的脱アミノ化をそれぞれ触媒してウリジンまたはデオキシウリジンにするシチジンデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼドメインであり、シトシンからウラシルへの加水分解的脱アミノ化を触媒する、シチジンデアミナーゼである。いくつかの態様において、用語「デアミナーゼ」または「デアミナーゼドメイン」は、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラットまたはマウスなどの、生体からの天然に生じるデアミナーゼである。いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、生物からの天然のデアミナーゼのバリアントであり、自然界に存在しない。例えば、いくつかの態様において、デアミナーゼまたはデアミナーゼドメインは、生物からの天然のデアミナーゼと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。
【００６３】
用語「塩基編集因子（ＢＥ）」、または「核酸塩基編集因子（ＮＢＥ）」は、核酸配列（例として、ＤＮＡまたはＲＮＡ）内の塩基（例として、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ）を改変させることが可能なポリペプチドを含む薬剤を指す。いくつかの態様において、塩基編集因子は、核酸内の塩基を脱アミノ化することが可能である。いくつかの態様において、塩基編集因子は、ＤＮＡ分子内の塩基を脱アミノ化することが可能である。いくつかの態様において、塩基編集因子は、ＤＮＡ中のシトシン（Ｃ）を脱アミノ化することが可能である。いくつかの態様において、塩基編集因子は、ＤＮＡ分子内の塩基を切除することが可能である。いくつかの態様において、塩基編集因子は、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）分子内のアデニン、グアニン、シトシン、チミンまたはウラシルを切除することが可能である。いくつかの態様において、塩基編集因子は、シチジンデアミナーゼに融合される核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）を含む蛋白質である（例えば、融合蛋白質）。いくつかの態様において、塩基編集因子は、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）などのウラシル結合タンパク質（ＵＢＰ）に融合される。いくつかの態様において、塩基編集因子は、核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）ドメインに融合される。いくつかの態様において、（ＮＡＰ）ドメインは、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、塩基編集因子は、ｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼおよびＵＢＰ（例えば、ＵＤＧ）を含む。いくつかの態様において、塩基編集因子は、ｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼ、および核酸ポリメラーゼ（例えば、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼ）を含む。いくつかの態様において、塩基編集因子は、ｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼ、ＵＢＰ（例えば、ＵＤＧ）、および核酸ポリメラーゼ（例えば、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼ）を含む。
【００６４】
いくつかの態様において、塩基編集因子のｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメインである。いくつかの態様において、塩基編集因子は、シチジンデアミナーゼに融合されるＣａｓ９蛋白質を含む。いくつかの態様において、塩基編集因子は、シチジンデアミナーゼに融合されるＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｄ１０Ａ変異を含み、および、配列番号６の残基８４０においてヒスチジン、またはＣａｓ９を二本鎖核酸のただ１つの鎖を切断する能力を与える、配列番号４〜２６のいずれか１つなどの本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含む。いくつかの態様において、塩基編集因子は、シチジンデアミナーゼに融合されるヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９ドメインは、配列番号６の変異、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ、または、Ｃａｓ９蛋白質のヌクレアーゼ活性を不活性化する、配列番号４〜２６のいずれか１つなどの本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含む。
【００６５】
用語「リンカー」は、本明細書に使用されるとき、２つの分子または部分、例えばヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインおよび核酸編集ドメイン（例として、シチジンデアミナーゼ）などの、例として融合蛋白質の２つのドメインを連結する、結合（例として共有結合）、化学基、または分子を指す。いくつかの態様において、リンカーは、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼのｇＲＮＡ結合ドメイン（Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメインを含む）と、核酸編集蛋白質の触媒ドメインとを結び合わせる。いくつかの態様において、リンカーは、ｄＣａｓ９と核酸編集蛋白質とを結び合わせる。典型的には、リンカーは、２つの基、分子、もしくは他の部分の間に位置しているか、またはそれらによってフランキングされており、および共有結合を介して各々に接続されており、よって２つを接続している。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸または複数のアミノ酸（例として、ペプチドまたは蛋白質）である。いくつかの態様において、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学的部分(chemical moiety)である。いくつかの態様において、リンカーは、５〜１００アミノ酸長、例えば、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、または１５０〜２００アミノ酸長である。より長いかまたはより短いリンカーもまた企図される。いくつかの態様において、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ(配列番号１０２）を含むが、これもまた、ＸＴＥＮリンカーとして言及されてもよい。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳ（配列番号１０３）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１０３）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１０４）、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１０５）、（Ｇ）ｎ（配列番号１２１）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号１０６）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号１２２）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２）、（ＸＰ）ｎモチーフ（配列番号１２３）、ＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳ(配列番号１０７）、ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ(配列番号１０８)、ＧＧＳＧＧＳＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０９）、ＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２０）、または、これらのいずれかの組み合わせも含み、ここでｎは、独立して１と３０との間の整数であり、およびここでXは、任意のアミノ酸でもある。いくつかの態様において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。
【００６６】
用語「変異」は、本明細書に使用されるとき、配列（例として、核酸配列またはアミノ酸配列）内の残基の別の残基との置換、または配列内の１以上の残基の欠失もしくは挿入を指す。変異は、典型的には、配列内の本来の残基の同定、その後に前記残基の位置の同定、および新たに置換された残基のアイデンティティーの同定が続くことによって、本明細書に記載される。本明細書に提供されるアミノ酸置換（変異）を作製するための様々な方法は、当該技術分野において周知であり、例えばGreen and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012))によって提供される。
【００６７】
本明細書において使用される、「ウラシル結合蛋白質」またはＵＢＰは、ウラシルに結合することが可能である、蛋白質を指す。いくつかの態様において、ウラシル結合蛋白質は、ウラシル修飾酵素である。いくつかの態様において、ウラシル結合蛋白質は、ウラシル塩基除去酵素である。いくつかの態様において、ウラシル結合蛋白質は、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）である。いくつかの態様において、ウラシル結合蛋白質は、ウラシルと、野生型ＵＤＧ（例えば、ヒトＵＤＧ）がウラシルに結合する親和性の、少なくとも１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％である親和性で結合する。
【００６８】
本明細書において使用される、用語「塩基除去酵素」または「ＢＥＥ」は、核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）から塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、ＧまたはＵ）を除去することが可能である、蛋白質を指す。いくつかの態様において、ＢＥＥは、ＤＮＡからシトシンを除去することが可能である。いくつかの態様において、ＢＥＥは、ＤＮＡからチミンを除去することが可能である。例示的なＢＥＥは、限定されることなしに、Ｓａｎｇら、“A Unique Uracil-DNA binding protein of the uracil DNA glycosylase superfamily,” Nucleic Acids Research, Vol. 43, No. 17 2015によって記載されるように、ＵＤＧ  Ｔｙｒ１４７Ａｌａ、およびＵＤＧ  Ａｓｎ２０４Ａｓｐを包含し、その全体の内容は、本明細書に参照により組み込まれる。
【００６９】
用語「核酸ポリメラーゼ」または「ＮＡＰ」という用語は、核酸分子（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）をヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）から合成する酵素を指す。いくつかの態様において、ＮＡＰはＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである。例えば、複製フォークをリスタートすること、または、ＤＮＡ損傷の存在によるゲノム中の残存するギャップを満たすことによって、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼは、変異誘発において役割を担う。例示的な損傷乗り越えポリメラーゼは、限定されることなしに、Ｐｏｌベータ、Ｐｏｌラムダ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌミュー、Ｐｏｌイオタ、Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌアルファ、Ｐｏｌデルタ、Ｐｏｌガンマ、およびＰｏｌニューを包含する。
【００７０】
用語「核局在配列」または「ＮＬＳ」は、細胞核中への蛋白質の移入を、例えば核輸送によって促進するアミノ酸配列を指す。核局在配列は、当該技術分野において知られ、および当業者に明らかであるだろう。いくつかの態様において、ＮＬＳは、単節型ＮＬＳ（monopartite NLS）である。いくつかの態様において、ＮＬＳは、双節型ＮＬＳ（bipartite NLS）である。双節型ＮＬＳは、比較的短いスペーサー配列（例えば、２〜２０のアミノ酸、５〜１５までのアミノ酸、または８〜１２のアミノ酸）によって分けられている。例えば、ＮＬＳ配列は、Plankらの、2000年11月23日に出願され、2001年5月31日にWO/2001/038547として公開された、国際ＰＣＴ出願PCT/EP2000/011690、およびKaethar,K.M.Vらによる、“Application of bioinformatics-coupled experimental analysis reveals a new transport-competent nuclear localization signal in the nucleoptotein of Influenza A virus strain” BMC Cell Biol, 2008, 9: 22に記載され、各々の内容は、例示的な核局在配列のそれらの開示について参照することにより本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４１)、ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号４２)、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４３）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号４４）、ＫＫＴＧＧＰＩＹＲＲＶＤＧＫＷＲＲ（配列番号４５）、ＲＲＥＬＩＬＹＤＫＥＥＩＲＲＩＷＲ（配列番号４６）、またはＡＶＳＲＫＲＫＡ（配列番号４７）を含む。
【００７１】
用語「核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質」または「ｎａｐＤＮＡｂｐ」は、ｎａｐＤＮＡｂｐを特異的な核酸配列へ誘導するガイド核酸などの核酸（例として、ＤＮＡまたはＲＮＡ）と結び付く蛋白質を指す。例えば、Ｃａｓ９蛋白質は、Ｃａｓ９蛋白質を、ガイドＲＮＡに相補性を有する特異的なＤＮＡ配列へ誘導するガイドＲＮＡと結び付き得る。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、クラス２微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエフェクターである。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメイン、例えば、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９（nuclease active Ｃａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質の例は、限定せずに、Ｃａｓ９（例として、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２Ｃ３、およびアルゴノートを含む。しかしながら、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質がまた、ＲＮＡに結合する核酸プログラム可能な蛋白質も含むことは、理解されるはずである。例えば、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ｎａｐＤＮＡｂｐをＲＮＡへ誘導する核酸に関連することがある。他の核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質もまた、本開示において具体的に挙げられていないとしても、本開示の範囲内にある。
【００７２】
用語「Ｃａｓ９」または「Ｃａｓ９ドメイン」は、Ｃａｓ９蛋白質、またはそのフラグメント（例として、Ｃａｓ９の活性型、不活性型、または部分的活性型のＤＮＡ切断ドメイン、および／またはＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメインを含む蛋白質）を含むＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを指す。Ｃａｓ９ヌクレアーゼはまた、ときにｃａｓｎ１ヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ（clustered regularly interspaced short palindromic repeat）関連ヌクレアーゼとも言及される。ＣＲＩＳＰＲは、可動性(mobile)遺伝子エレメント（ウイルス、転位性エレメント、および接合型プラスミド）に対する防御を提供する適応免疫システムである。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、スペーサー、前駆(antecedent)可動性エレメントに相補的な配列、および核酸に侵入する標的（target invading nucleic acids)を含有する。ＣＲＩＳＰＲクラスターは、転写されプロセシングされてＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）になる。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムにおいて、プレｃｒＲＮＡ(pre-crRNA)の正しいプロセシングは、トランスにコードされた小型ＲＮＡ(trans-encoded small RNA)（ｔｒａｃｒＲＮＡ）、内在性リボヌクレアーゼ３（ｒｎｃ）、およびＣａｓ９蛋白質を要求する。ｔｒａｃｒＲＮＡは、リボヌクレアーゼ３に補助される(aided)プレｃｒＲＮＡのプロセシングのためのガイドとして働く。その後、Ｃａｓ９／ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡは、スペーサーに相補的な直鎖状または環状のｄｓＤＮＡ標的を、エンドヌクレアーゼ的に(endonucleolytically)切断する。ｃｒＲＮＡに相補的ではない標的鎖は、先ずエンドヌクレアーゼ的に切られ、次いで３’−５’エキソヌクレアーゼ的に(exonucleolytically)トリミングされる。自然界において、ＤＮＡ結合およびＤＮＡ切断は、典型的には、蛋白質および両方のＲＮＡを要求する。しかしながら、単一のガイドＲＮＡ（「ｓｇＲＮＡ」または単に「ｇＮＲＡ」）は、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとの両面を単一のＲＮＡ種に組み込むように操作され得る。例として、Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照（この全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲリピート配列中の短いモチーフ（ＰＡＭまたはプロトスペーサー隣接モチーフ）を認識することで、自己対非自己を区別するのに役立つ。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列および構造は、当業者に周知である（例として、“Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.” Ferretti et al., J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)；“CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.” Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z. A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011)；および“A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.” Jinek M., Chylinski K., Fonfara I, Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)を参照。これらの各々の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。Ｃａｓ９オーソログは、S. pyogenesおよびS. thermophilusを含むがこれらに限定されない様々な種において記載されている。追加の好適な��ａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、本開示に基づき当業者には明らかであろう。かかるＣａｓ９ヌクレアーゼおよび配列は、Chylinski, Rhun, and Charpentier, “The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems” (2013) RNA Biology 10:5, 726-737（この全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示される生物および遺伝子座からのＣａｓ９配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、不活性（例として、不活性化）ＤＮＡ切断ドメインを有する、つまりＣａｓ９は、ニッカーゼである。
【００７３】
ヌクレアーゼ不活性化型Ｃａｓ９蛋白質は、交換可能に「ｄＣａｓ９」蛋白質（ヌクレアーゼ「不活性」なＣａｓ９）と言われ得る。不活性型ＤＮＡ切断ドメインを有するＣａｓ９蛋白質（またはそのフラグメント）を生成するための方法は公知である（例えば、Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., "Repurposing CRISPR as an RNA-Guided Platform for Sequence-Specific Control of Gene Expression" (2013) Cell. 28; 152(5): 1173-83参照。そのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。例えば、Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインは、２つのサブドメイン、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよびＲｕｖＣ１サブドメインを包含することが公知である。ＨＮＨサブドメインはｇＲＮＡに対して相補的な鎖を切断するのに対して、ＲｕｖＣ１サブドメインは非相補鎖を切断する。これらのサブドメイン内の変異は、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を抑制し得る。例えば、変異Ｄ１０ＡおよびＨ８４０ＡはS. pyogenesのＣａｓ９のヌクレアーゼ活性を完全に不活性化する（Jinek et al., Science. 337:816-821(2012); Qi et al., Cell. 28; 152(5): 1173-83 (2013)）。いくつかの態様においては、Ｃａｓ９のフラグメントを含む蛋白質が提供される。例えば、いくつかの態様において、蛋白質は、２つのＣａｓ９ドメイン：（１）Ｃａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン；または（２）Ｃａｓ９のＤＮＡ切断ドメインの１つを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９またはそのフラグメントを含む蛋白質は、「Ｃａｓ９バリアント」と言われる。Ｃａｓ９バリアントはＣａｓ９またはそのフラグメントとの相同性を持ち合う。例えば、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様において、Ｃａｓ９バリアントは、野生型Ｃａｓ９と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはより多くのアミノ酸変化を有し得る。いくつかの態様において、Ｃａｓ９バリアントはＣａｓ９のフラグメント（例えば、ｇＲＮＡ結合ドメインまたはＤＮＡ切断ドメイン）を含み、フラグメントは、野生型Ｃａｓ９の対応するフラグメントと少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９６％同一、少なくとも約９７％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様において、フラグメントは、対応する野生型Ｃａｓ９のアミノ酸長の少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも��０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％である。
【００７４】
いくつかの態様において、フラグメントは少なくとも１００アミノ酸長である。いくつかの態様において、フラグメントは、少なくとも１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１０５０、１１００、１１５０、１２００、１２５０、または１３００アミノ酸長である。いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９は、Streptococcus pyogenes由来のＣａｓ９（ＮＣＢＩ参照配列：NC_017053.1、配列番号１（ヌクレオチド）；配列番号４（アミノ酸））に対応する。
【化１−１】
2020510439.tif 000003
【化１−２】
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【化１−３】
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【化２−１】
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【化２−２】
2020510439.tif 000007
【００７５】
いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９は、配列番号２（ヌクレオチド）および／または配列番号５（アミノ酸）に対応するか、または含む。
【化３−１】
2020510439.tif 000008
【化３−２】
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【化３−３】
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【化４−１】
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【化４−２】
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【００７６】
いくつかの態様において、野生型Ｃａｓ９は、Streptococcus pyogenes由来のＣａｓ９（ＮＣＢＩ参照配列：NC_002737.2、配列番号３（ヌクレオチド）；およびユニポート参照配列：Q99ZW2、配列番号６（アミノ酸））に対応する。
【化５−１】
2020510439.tif 000013
【化５−２】
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【化５−３】
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【化６−１】
2020510439.tif 000016
【化６−２】
2020510439.tif 000017
【００７７】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９は：Corynebacterium ulcerans（NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1）；Corynebacterium diphtheria（NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1）；Spiroplasma syrphidicola（NCBI Ref: NC_021284.1）；Prevotella intermedia（NCBI Ref: NC_017861.1）；Spiroplasma taiwanense（NCBI Ref: NC_021846.1）；Streptococcus iniae（NCBI Ref: NC_021314.1）；Belliella baltica（NCBI Ref: NC_018010.1）；Psychroflexus torquisl（NCBI Ref: NC_018721.1）；Streptococcus thermophilus（NCBI Ref: YP_820832.1）、Listeria innocua（NCBI Ref: NP_472073.1）、Campylobacter jejuni（NCBI Ref: YP_002344900.1）、もしくはNeisseria meningitidis（NCBI Ref: YP_002342100.1）からのＣａｓ９、または任意の他の生物からのＣａｓ９を言う。
【００７８】
いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性を不活性化する１つ以上の変異を有するＣａｓ９アミノ酸配列に対応するか、またはその一部または全部を含む。例えば、いくつかの態様において、ｄＣａｓ９ドメインは、配列番号６のＤ１０およびＨ８４０Ａ変異または別のＣａｓ９における対応する変異を含む。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、配列番号７のアミノ酸を含む（Ｄ１０およびＨ８４０Ａ）。
【化７】
2020510439.tif 000018
【００７９】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、Ｄ１０Ａ変異を含み、一方で、配列番号６によって提供されるアミノ酸配列における位置８４０、または配列番号４〜２６によって提供される任意のアミノ酸配列において記載されるＣａｓ９など対応する位置の残基はヒスチジンのままである。いかなる特定の理論によって拘束されようとすることを望まないが、Ｈ８４０触媒残基の存在は、標的Ａの反対のＴを含有する、編集されない（例えば脱アミノ化されない）鎖を切断するＣａｓ９の活性を維持する。Ｈ８４０の回復（例えば、ｄＣａｓ９のＡ８４０から）は、Ａを含有する標的鎖の切断をもたらさない。かかるＣａｓ９バリアントは、ｇＲＮＡによって定義される標的配列に基づいて特定の場所に単一鎖のＤＮＡ切断（ニック）を生成する能力があり、編集されない鎖の修復に至り、最終的には編集されない鎖のＴからＣへの変化をもたらす。
【００８０】
他の態様においては、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａ以外の変異を有するｄＣａｓ９バリアントが提供され、これは例えばヌクレアーゼ不活性化型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をもたらす。かかる変異は、例として、Ｄ１０およびＨ８４０における他のアミノ酸置換、またはＣａｓ９のヌクレアーゼドメイン内の他の置換（例えば、ＨＮＨヌクレアーゼサブドメインおよび／またはＲｕｖＣ１サブドメインにおける置換）を包含する。いくつかの態様においては、ｄＣａｓ９のバリアントまたはホモログ（例えば、配列番号６、７、８、９、または２２のバリアント）が提供され、これらは、配列番号６、７、８、９、または２２と少なくとも約７０％同一、少なくとも約８０％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、少なくとも約９８％同一、少なくとも約９９％同一、少なくとも約９９．５％同一、または少なくとも約９９．９％同一である。いくつかの態様においては、ｄＣａｓ９のバリアント（例えば、配列番号６、７、８、９、または２２のバリアント）が提供され、配列番号７、８、９、または２２よりも約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約２５アミノ酸、約３０アミノ酸、約４０アミノ酸、約５０アミノ酸、約７５アミノ酸、約１００アミノ酸、またはより多い程度短いか、または長いアミノ酸配列を有する。
【００８１】
いくつかの態様において、本明細書において提供されるＣａｓ９融合蛋白質は、Ｃａｓ９蛋白質の全長アミノ酸配列、例えば本明細書において提供されるＣａｓ９配列の１つを含む。他の態様において、しかしながら、本明細書において提供される融合蛋白質は、全長Ｃａｓ９配列ではなくそのフラグメントのみを含む。例えば、いくつかの態様において、本明細書において提供されるＣａｓ９融合蛋白質はＣａｓ９フラグメントを含み、フラグメントはｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡまたはｓｇＲＮＡに結合するが、例えばそれがヌクレアーゼドメインの短縮版のみを含むか、またはヌクレアーゼドメインを全く含まないという点で、機能的なヌクレアーゼドメインを含まない。
【００８２】
好適なＣａｓ９ドメインおよびＣａｓ９フラグメントの例示的なアミノ酸配列は本明細書において提供されており、Ｃａｓ９ドメインおよびフラグメントの追加の好適な配列は当業者には明らかであろう。
【００８３】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９は：Corynebacterium ulcerans（NCBI Refs: NC_015683.1, NC_017317.1）；Corynebacterium diphtheria（NCBI Refs: NC_016782.1, NC_016786.1）；Spiroplasma syrphidicola（NCBI Ref: NC_021284.1）；Prevotella intermedia（NCBI Ref: NC_017861.1）；Spiroplasma taiwanense（NCBI Ref: NC_021846.1）；Streptococcus iniae（NCBI Ref: NC_021314.1）；Belliella baltica（NCBI Ref: NC_018010.1）；Psychroflexus torquisI（NCBI Ref: NC_018721.1）；Streptococcus thermophilus（NCBI Ref: YP_820832.1）；Listeria innocua（NCBI Ref: NP_472073.1）；Campylobacter jejuni(NCBI Ref: YP_002344900.1）；またはNeisseria meningitidis（NCBI Ref: YP_002342100.1）からのＣａｓ９を指す。
【００８４】
これらのバリアントおよびホモログを包含する、追加のＣａｓ９蛋白質（例えば、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（nuclease dead Ｃａｓ９）（ｄＣａｓ９）、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）、またはヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９）が、この開示の範囲内であることは、理解されるべきである。例示的なＣａｓ９蛋白質は、限定することなく、以下に提供されるものを含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、ヌクレアーゼ不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９は、アミノ酸配列（配列番号７、８、９、または２２）を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、Ｃａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）である。いくつかの態様において、ｎＣａｓ９は、アミノ酸配列（配列番号１０、１３、１６、または２１）を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９蛋白質は、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９である。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９は、アミノ酸配列（配列番号４、５、６、１１、１２、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２３、２４、２５、または２６）を含む。
例示的な触媒不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）：
【化８−１】
2020510439.tif 000019
【化８−２】
2020510439.tif 000020
例示的なＣａｓ９ニッカーゼ（ｎＣａｓ９）:
【化９】
2020510439.tif 000021
例示的な触媒不活性型Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）：
【化１０】
2020510439.tif 000022
【００８５】
本明細書において使用される、用語「Ｃａｓ９ニッカーゼ」は、二本鎖の核酸分子（例えば、二本鎖のＤＮＡ分子）のうちの１つの鎖のみを切断することが可能であるＣａｓ９の蛋白質を指す。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｄ１０Ａ変異を含み、および配列番号６のＨ８４０ヒスチジン、または配列番号４〜２６のいずれか１つなどに提供されるＣａｓ９のいずれにおいても対応する変異を有する。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、配列番号１０、１３、１６、または２１において掲げられるアミノ酸配列を含むことがある。かかるＣａｓ９ニッカーゼは、活性化ＨＮＨヌクレアーゼドメインを有し、およびＤＮＡの非標的鎖、つまりｇＲＮＡによって結合される鎖を切断することが可能である。さらに、かかるＣａｓ９ニッカーゼは、不活性化ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを有し、およびＤＮＡの標的鎖、つまり塩基の編集が所望される鎖を切断することが可能ではない。
【００８６】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、単細胞原核微生物のドメインおよび界を構成する古細菌（例えばナノ古細菌）由来のＣａｓ９を指す。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、例えば、Burstein et al., “New CRISPR-Cas systems from uncultivated microbes.” Cell Res. 2017 Feb 21. doi: 10.1038/cr.2017.21（その内容全体は参照によってここで組み込まれる）において記載される、ＣａｓＸまたはＣａｓＹを指す。ゲノム解析メタゲノミクスを用いて、古細菌ドメインの生命において最初に報告されたＣａｓ９を含む、多数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムが同定されている。この多様なＣａｓ９蛋白質は、活性ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの一部として、ほとんど研究されていないナノ古細菌に見出だされた。細菌において、これまで知られていなかった２つのシステムであるＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＸおよびＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＹが発見され、これらはこれまでに発見されたものの中で最もコンパクトである。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、ＣａｓＸ、またはＣａｓＸのバリアントを言う。いくつかの態様において、Ｃａｓ９は、ＣａｓＹ、またはＣａｓＹのバリアントを言う。他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合蛋白質が、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）として用いられてもよいこと、および本開示の範囲内であることは理解されるべきである。
【００８７】
いくつかの態様において、本明細書において提供される、任意の融合蛋白質の核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、ＣａｓＸまたはＣａｓＹ蛋白質であってもよい。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ＣａｓＸ蛋白質である。いくつかの態様において、ＣａｓＸ蛋白質は、ヌクレアーゼ不活性ＣａｓＸ蛋白質（ｄＣａｓＸ）、ＣａｓＸニッカーゼ（ＣａｘＸｎ）またはヌクレアーゼ活性ＣａｓＸである。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ＣａｓＹ蛋白質である。いくつかの態様において、ＣａｓＹ蛋白質は、ヌクレアーゼ不活性ＣａｓＹ蛋白質（ｄＣａｓＹ）、ＣａｓＹニッカーゼ（ＣａｘＹｎ）またはヌクレアーゼ活性ＣａｓＹである。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓＸまたはＣａｓＹ蛋白質と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に存在するＣａｓＸまたはＣａｓＹ蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、配列番号２７〜２９のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、配列番号２７〜２９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のＣａｓＸおよびＣａｓＹが、本開示に従って、用いられてもよいことは理解されるべきである。
【化１１】
2020510439.tif 000023
【化１２】
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【化１３−１】
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【化１３−２】
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【００８８】
本明細書において用いられる用語「有効量」は、所望の生物学的応答を誘起するために十分である生物活性物質の量を言う。例えば、いくつかの態様において、核酸塩基編集因子の有効量は、核酸塩基編集因子によって特異的に結合される標的部位の変異を誘導するために十分である、核酸塩基編集因子の量を言い得る。いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質、例えば核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質とデアミナーゼドメイン（例えば、アデノシンデアミナーゼドメイン）とを含む融合蛋白質の有効量は、融合蛋白質によって特異的に結合および編集される標的部位の編集を誘導するために十分である融合蛋白質の量を言い得る。当業者によって理解されるであろうが、物質、例えば融合蛋白質、核酸塩基編集因子、デアミナーゼ、ハイブリッド蛋白質、蛋白質二量体、蛋白質（または蛋白質二量体）とポリヌクレオチドとの複合体、またはポリヌクレオチドの有効量は、例えば所望の生物学的応答、例えば、編集されるべき特定のアレル、ゲノム、または標的部位、ターゲティングされようとする細胞または組織、および用いられようとする物質のような種々の因子に依存して変わり得る。
【００８９】
本明細書において用いられる用語「核酸」および「核酸分子」は、核酸塩基と酸部分とを含む化合物、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオチドのポリマーを言う。典型的には、ポリマー核酸、例えば３つ以上のヌクレオチドを含む核酸分子は直鎖状分子であり、その中の隣接するヌクレオチド同士はホスホジエステル結合によって違いにリンクされている。いくつかの態様において、「核酸」は個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチドおよび／またはヌクレオシド）を言う。いくつかの態様において、「核酸」は、３つ以上の個々のヌクレオチド残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を言う。本明細書において用いられる用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドのポリマー（例えば、ひとつながりの少なくとも３ヌクレオチド）を言うために交換可能に用いられ得る。いくつかの態様において、「核酸」は、ＲＮＡならびに一本および／または二本鎖ＤＮＡを包摂する。核酸は、例えばゲノム、転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、プラスミド、コスミド、染色体、染色分体、または他の天然に存在する核酸分子の文脈で天然に存在し得る。他方で、核酸分子は、天然に存在しない分子、例えば、組み換えＤＮＡもしくはＲＮＡ、人工染色体、操作されたゲノム、またはそのフラグメント、あるいは合成ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであり得、あるいは、天然に存在しないヌクレオチドまたはヌクレオシドを包含する。さらにその上に、用語「核酸」、「ＤＮＡ」、「ＲＮＡ」、および／または類似の用語は、核酸アナログ、例えばホスホジエステルバックボーン以外を有するアナログを包含する。核酸は、天然のソースから精製、組み換え発現システムを用いて産生および任意に精製、化学合成などされ得る。適切なところでは、例えば化学合成された分子のケースにおいては、核酸は、ヌクレオシドアナログ、例えば化学修飾された塩基または糖を有するアナログ、およびバックボーン改変を含み得る。核酸配列は、別様に示されない限り５’から３’方向に提示される。いくつかの態様において、核酸は、天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）；ヌクレオシドアナログ（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジン）；化学修飾された塩基；生物学的に改変された塩基（例えば、メチル化塩基）；インターカレーションされた塩基；修飾された糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソース）；および／または修飾されたリン酸基（例えば、ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合）であるか、またはそれを含む。
【００９０】
本明細書において用いられる用語「増殖性疾患」は、細胞または細胞集団が異常に高まった増殖速度を見せるという点で細胞または組織ホメオスタシスが乱れている任意の疾患を言う。増殖性疾患は、過増殖性疾患、例えば前新生物性の過形成状態および新生物疾患を包含する。新生物疾患は細胞の異常な増殖を特徴とし、良性および悪性新生物両方を包含する。悪性新生物はがんともまた言われる。
【００９１】
用語「蛋白質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」は本明細書においては交換可能に用いられ、ペプチド（アミド）結合によって一緒にリンクされたアミノ酸残基のポリマーを言う。用語は、任意のサイズ、構造、または機能の蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドを言う。典型的には、蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは少なくとも３アミノ酸の長さであろう。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、個々の蛋白質または蛋白質のコレクションを言い得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチド中のアミノ酸の１つ以上は、例えば、化学的実体、例えば炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、コンジュゲーション、官能化、または他の改変のためのリンカーなどの追加によって改変され得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、単分子でもまたあり得、または多分子複合体であり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在する蛋白質またはペプチドの単にフラグメントであり得る。蛋白質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然に存在、組み換え体、もしくは合成、またはそれらの組み合わせであり得る。
【００９２】
本明細書において用いられる用語「融合蛋白質」は、少なくとも２つの異なる蛋白質からの蛋白質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを言う。１つの蛋白質は、融合蛋白質のアミノ末端（Ｎ末端）部分またはカルボキシ末端（Ｃ末端）部分に位置し得、それゆえにそれぞれ「アミノ末端融合蛋白質」または「カルボキシ末端融合蛋白質」を形成する。蛋白質は、異なるドメイン、例えば、核酸編集蛋白質の核酸結合ドメイン（例えば、標的部位への蛋白質の結合をもたらすＣａｓ９のｇＲＮＡ結合ドメイン）および核酸切断ドメインまたは触媒ドメインを含み得る。いくつかの態様において、蛋白質は、蛋白質性部分、例えば核酸結合ドメインを構成するアミノ酸配列と、有機化合物、例えば核酸切断物質として働き得る化合物とを含む。いくつかの態様において、蛋白質は、核酸、例えばＲＮＡとの複合体であるか、またはそれと会合している。本明細書において提供される蛋白質のいずれかは、当分野において公知の任意の方法によって産生され得る。例えば、本明細書において提供される蛋白質は、組み換え蛋白質発現および精製によって産生され得、これはペプチドリンカーを含む融合蛋白質に特に適している。組み換え蛋白質発現および精製のための方法は周知であり、Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual （4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012)）に記載されているものを包含し、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９３】
用語「ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ」および「ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」は本明細書においては交換可能に用いられ、切断の標的ではない１つ以上のＲＮＡと複合体を形成する（例えば、それと結合または会合する）ヌクレアーゼを言う。いくつかの態様において、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼは、ＲＮＡとの複合体であるときに、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体と言われ得る。典型的には、結合されたＲＮＡ（単数または複数）はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と言われる。ｇＲＮＡは、２つ以上のＲＮＡの複合体としてまたは単一のＲＮＡ分子として存在し得る。単一のＲＮＡ分子として存在するｇＲＮＡはシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と言われ得るが、「ｇＲＮＡ」は、単分子としてまたは２つ以上の分子の複合体としてのどちらかで存在するガイドＲＮＡを言うために交換可能に用いられる。典型的には、単一のＲＮＡ種として存在するｇＲＮＡは２つのドメイン：（１）標的核酸との相同性を持ち合う（例えば、かつ標的へのＣａｓ９複合体の結合をもたらす）ドメイン；および（２）Ｃａｓ９蛋白質に結合するドメインを含む。いくつかの態様において、ドメイン（２）は、ｔｒａｃｒＲＮＡとして公知の配列に対応し、ステムループ構造を含む。例えば、いくつかの態様において、ドメイン（２）は、Jinek et al., Science 337:816-821(2012)によって提供されているｔｒａｃｒＲＮＡと同一または相同であり、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。ｇＲＮＡの他の例（例えば、ドメイン２を包含するもの）は、「Switchable Cas9 Nucleases And Uses Thereof」と題する２０１３年９月６日出願の米国仮特許出願U.S.S.N.61/874,682および「Delivery System For Functional Nucleases」と題する２０１３年９月６日出願の米国仮特許出願U.S.S.N.61/874,746に見出され得、それぞれの内容全体はそれらの全体が参照によってここで組み込まれる。いくつかの態様において、ｇＲＮＡはドメイン（１）および（２）の２つ以上を含み、「延長型ｇＲＮＡ」と言われ得る。例えば、延長型ｇＲＮＡは、例えば２つ以上のＣａｓ９蛋白質に結合し、本明細書に記載される２つ以上の別々の領域において標的核酸に結合するであろう。ｇＲＮＡは標的を相補するヌクレオチド配列を含み、これが前記標的部位へのヌクレアーゼ／ＲＮＡ複合体の結合を媒介し、ヌクレアーゼ：ＲＮＡ複合体の配列特異性を提供する。いくつかの態様において、ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼは（ＣＲＩＳＰＲ関連システム）Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ、例えばStreptococcus pyogenesからのＣａｓ９（Ｃｓｎ１）である（例えば、“Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes.” Ferretti J. J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C, Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L., White J., Yuan X., Clifton S.W., Roe B.A., McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001)；"CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III." Deltcheva E., Chylinski K., Sharma CM., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471 :602-607(2011)；および"A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfara I, Hauer M., Doudna J. A., Charpentier E. Science 337:816-821(2012)参照。そのそ���ぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９４】
ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９）は標的ＤＮＡ切断部位へのＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションを実践するので、原理的には、これらの蛋白質は、ガイドＲＮＡによって規定される任意の配列にターゲティングされる能力がある。ＲＮＡによってプログラム可能なヌクレアーゼ、例えばＣａｓ９を部位特異的切断に（例えば、ゲノムを改変するために）使用する方法は、当分野において公知である（例えば、Cong, L. et al., Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819-823 (2013)；Mali, P. et al., RNA-guided human genome engineering via Cas 9. Science 339, 823-826 (2013)；Hwang, W.Y. et al., Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013)；Jinek, M. et al., RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013); Dicarlo, J.E. et al., Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013)；Jiang, W. et al., RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)を参照；そのそれぞれの内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【００９５】
本明細書において用いられる用語「対象」は、個体生物、例えば個体哺乳動物を言う。いくつかの態様において、対象はヒトである。いくつかの態様において、対象は非ヒト哺乳動物である。いくつかの態様において、対象は非ヒト霊長動物である。いくつかの態様において、対象はげっ歯動物である。いくつかの態様において、対象はヒツジ、ヤギ、ウシ、ネコ、またはイヌである。いくつかの態様において、対象は脊椎動物、両生類、爬虫類、魚類、昆虫、ハエ、または線虫である。いくつかの態様において、対象は研究動物である。いくつかの態様において、対象は遺伝子操作されており、例えば遺伝子操作された非ヒト対象である。対象は、どちらかの性、および発達の任意のステージであり得る。
【００９６】
用語「標的部位」は、シチジンデアミナーゼを含む融合蛋白質（例えば、本明細書において提供されるｄＣａｓ９−シチジンデアミナーゼ融合蛋白質）などの塩基編集因子によって修飾される核酸分子中の配列を指す。
【００９７】
用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される疾患もしくは異常またはその１つ以上の症状を後戻りさせるか、軽減するか、その始まりを遅らせるか、またはその進行を阻害することを狙った臨床的介入を指す。本明細書において用いられる用語「処置」、「処置する」、および「処置すること」は、本明細書に記載される疾患もしくは異常またはその１つ以上の症状を後戻りさせるか、軽減するか、その始まりを遅らせるか、またはその進行を阻害することを狙った臨床的介入を言う。いくつかの態様において、処置は、１つ以上の症状が発生した後におよび／または疾患が診断された後に投与され得る。他の態様において、処置は、症状の不在下において、例えば、症状を防止するかもしくはその始まりを遅らせるか、または疾患の始まりもしくは進行を阻害するために投与され得る。例えば、処置は、（例えば、症状の既往に照らして、および／または遺伝学的または他の易罹患性因子に照らして）症状の始まりに先立って易罹患性の個体に投与され得る。処置は、症状が解消した後にもまた、例えばそれらの再発を防止するかまたは遅らせるために継続され得る。
【００９８】
蛋白質または核酸の文脈において本明細書において用いられる用語「組み換え体」は、天然に存在せず、ヒトによる操作の産物である蛋白質または核酸を言う。例えば、いくつかの態様において、組み換え蛋白質または核酸分子は、任意の天然に存在する配列と比較して少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つの変異を含むアミノ酸またはヌクレオチド配列を含む。
【００９９】
発明の詳細な説明
核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）
本開示のいくつかの側面は、塩基編集因子などの蛋白質を、特定の核酸（例えばＤＮＡまたはＲＮＡ）配列へとガイドするために用いられ得る、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質を提供する。核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質は、Ｃａｓ９（例えば、ｄＣａｓ９およびｎＣａｓ９）、ＣａｓＸ、ＣａｓＹ、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、Ｃ２Ｃ３、およびアルゴノートを包含するが、これに限定されない。Ｃａｓ９とは異なるＰＡＭ特異性を有する核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質の一例は、プレボテラ属（Prevotella）およびフランシセラ１（Francisella）由来のクラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回分配列リピート（Ｃｐｆ１）である。Ｃａｓ９と同様に、Ｃｐｆ１もまたクラス２ＣＲＩＳＰＲエフェクターである。Ｃｐｆ１が、Ｃａｓ９とは別個の特徴との強固なＤＮＡ干渉を仲介することが示されている。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを欠く単一ＲＮＡ−誘導型エンドヌクレアーゼであり、Ｔ−リッチプロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＴＮ、ＴＴＴＮ、またはＹＴＮ）を利用する。さらに、Ｃｐｆ１はねじれ型ＤＮＡの二本鎖切断を介してＤＮＡを切断する。１６のＣｐｆ１−ファミリー蛋白質の中で、AcidaminococcusおよびLachnospiraceae由来の２つの酵素がヒト細胞において効率的なゲノム編集活性を有することが示されている。Ｃｐｆ１蛋白質は、当分野において公知であり、例えば以前に、Yamano et al., “Crystal stucture of Cpf1 in complex with guide RNA and target DNA.” Cell (165) 2016, p. 949-962に記載されており、その内容全体は参照として本明細書に組み込まれる。
【０１００】
ガイドヌクレオチド配列−プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質ドメインとして使用され得るヌクレアーゼ−不活性Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１）バリアントもまた本組成物および方法において役立つ。Ｃｐｆ１蛋白質は、Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインと同様であるＲｕｖＣ−様エンドヌクレアーゼドメインを有するが、ＨＮＨエンドヌクレアーゼドメインは有しておらず、Ｃｐｆ１のＮ−末端がＣａｓ９のアルファ−ヘリックス認識ローブ（lobe）を有していない。Ｃｐｆ１のＲｕｖＣ様ドメインが両ＤＮＡ鎖の切断を担うことおよびＲｕｖＣ様ドメインの不活性化がＣｐｆ１のヌクレアーゼ活性を不活性にすることが、Zetsche et al., Cell, 163, 759-771, 2015（参照により本明細書に組み込まれている）に示されていた。例えば、Francisella novicida Cpf１（配列番号３０）におけるＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、またはＤ１２５５Ａに対応する変異は、Ｃｐｆ１のヌクレアーゼ活性を不活性にする。いくつかの態様において、本開示のｄＣｐｆ１は、配列番号３０におけるＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異を含む。Ｃｐｆ１のＲｕｖＣドメインを不活性にする任意の変異、例えば、置換変異、欠失、または挿入は、本開示に従って使用され得る。
【０１０１】
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれかの核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、Ｃｐｆ１蛋白質であり得る。いくつかの態様において、Ｃｐｆ１蛋白質は、Ｃｐｆ１ニッカーゼ（ｎＣｐｆ１）である。いくつかの態様において、Ｃｐｆ１蛋白質は、ヌクレアーゼ不活性Ｃｐｆ１（ｄＣｐｆ１）である。いくつかの態様において、Ｃｐｆ１、ｎＣｐｆ１、またはｄＣｐｆ１は、配列番号３０〜３７のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも（at ease）９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｄＣｐｆ１は、配列番号３０〜３７のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも（at ease）９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号３０におけるＤ９１７Ａ、Ｅ１００６Ａ、Ｄ１２５５Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ、Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ、Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ、またはＤ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａに対応する変異または他の(ahother)Ｃｐｆ１における対応する変異を含む。いくつかの態様において、ｄＣｐｆ１は、配列番号３０〜３７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他の細菌種に由来するＣｐｆ１もまた、本開示に従って使用され得ることは理解されるべきである。
【０１０２】
野生型Francisella novicida Ｃｐｆ１（配列番号３０）（Ｄ９１７、Ｅ１００６、およびＤ１２５５は太字および下線付きである）
【０１０３】
【化１４−１】
2020510439.tif 000027
【化１４−２】
2020510439.tif 000028
【０１０４】
Francisella novicida Ｃｐｆ１ Ｄ９１７Ａ（配列番号３１)(Ａ９１７、Ｅ１００６、およびＤ１２５５は、太字および下線付きである)
【０１０５】
【化１５−１】
2020510439.tif 000029
【化１５−２】
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【０１０６】
Francisella Novicida Ｃｐｆ１ Ｅ１００６Ａ（配列番号３２）（Ｄ９１７、Ａ１００６、およびＤ１２５５は、太字および下線付きである）
【０１０７】
【化１６−１】
2020510439.tif 000031
【化１６−２】
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【０１０８】
Francisella Novicida Ｃｐｆ１ Ｄ１２５５Ａ （配列番号３３） （Ｄ９１７、Ｅ１００６、およびＡ１２５５は、太字および下線付きである)
【０１０９】
【化１７】
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【０１１０】
Francisella novicida Ｃｐｆ１ Ｄ９１７Ａ／Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ（配列番号３４）（Ａ９１７、Ａ１００６、およびＡ１２５５は太字および下線付きである）
【０１１１】
【化１８−１】
2020510439.tif 000034
【化１８−２】
2020510439.tif 000035
【０１１２】
Francisella novicida Ｃｐｆ１ Ｄ９１７Ａ／Ｄ１２５５Ａ（配列番号３５）（Ａ９１７、Ａ１００６、およびＡ１２５５は太字および下線付きである）
【０１１３】
【化１９−１】
2020510439.tif 000036
【化１９−２】
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【０１１４】
Francisella novicida Ｃｐｆ１ Ｅ１００６Ａ／Ｄ１２５５Ａ（配列番号３６）（Ｄ９１７、Ａ１００６、およびＡ１２５５は太字および下線付きである）」
【０１１５】
【化２０−１】
2020510439.tif 000038
【化２０−２】
2020510439.tif 000039
【０１１６】
Francisella Novicida Ｃｐｆ１ Ｄ９１７Ａ/Ｅ１００６Ａ/Ｄ１２５５Ａ（配列番号３７）（Ａ９１７、Ａ１００６、およびＡ１２５５は、太字および下線付きである)
【０１１７】
【化２１】
2020510439.tif 000040
【０１１８】
いくつかの態様において、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、古典的な（ＮＧＧ）ＰＡＭ配列を要求しない核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐはアルゴノート蛋白質である。かかる核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質の一例は、Natronobacterium gregoryi由来のアルゴノート蛋白質（ＮｇＡｇｏ）である。ＮｇＡｇｏはｓｓＤＮＡ−誘導型エンドヌクレアーゼである。ＮｇＡｇｏは、約２４ヌクレオチドの５’リン酸化ｓｓＤＮＡ（ｇＤＮＡ）に結合し、それをその標的部位にガイドし、ｇＤＮＡ部位においてＤＮＡ二本鎖切断を生じさせるであろう。Ｃａｓ９とは対照的に、ＮｇＡｇｏ−ｇＤＮＡシステムは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を要求しない。ヌクレアーゼ不活性ＮｇＡｇｏ（ｄＮｇＡｇｏ）を使用することは、標的化され得る塩基を大きく拡張し得る。ＮｇＡｇｏの特徴づけおよび使用は、Gao et al., Nat Biotechnol., 2016 Jul;34(7):768-73.  PubMed PMID: 27136078; Swarts et al., Nature.  507(7491) (2014):258-61；およびSwarts et al., Nucleic Acids Res.  43(10) (2015):5120-9に記載されており、それぞれ参照によって本明細書に組み込まれている。Natronobacterium gregoryiアルゴノートの配列は配列番号３８によって提供されている。
【０１１９】
野生型Natronobacterium gregoryi アルゴノート（配列番号３８）
【０１２０】
【化２２】
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【０１２１】
いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、アルゴノート蛋白質の原核生物ホモログである。アルゴノート蛋白質の原核生物ホモログは公知であり、例えば、Makarova K., et al., “Prolaryotic homologys of Argonaute proteins are predicted to function as key components of a novel system of defense against mobile genetic elements”, Biol Direct. 2009 Aug 25;4:29. doi: 10.1186/1745-6150-4-29において記載されており、その内容全体は参照によって本明細書により組み込まれる。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Marinitoga piezophilaアルゴノート（ＭｐＡｇｏ）蛋白質である。ＣＲＩＳＰＲ−関連Marinitoga piezophilaアルゴノート（ＭｐＡｇｏ）蛋白質は、５’−リン酸化ガイドを使用して、単一鎖標的配列を切断する。５’ガイドは、すべての公知のアルゴノートにより用いられる。ＭｐＡｇｏ−ＲＮＡ複合体の結晶構造は、５’リン酸相互作用を妨げる残基を含むガイド鎖結合部位を示している。このデータは、５’−ヒドロキシル化ガイドについての非古典的な特異性を伴うアルゴノートサブクラスの進化を示唆している。例えば、Kaya et al., “A bacterial argonaute with noncanonical guide RNA specificity”, Proc Natl Acad Sci U S A. 2016 Apr 12;113(15):4057-62を参照し、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。他のアルゴノート蛋白質は、使用され得、本開示の範囲内にあることを理解されるべきである。
【０１２２】
いくつかの態様において、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの単一エフェクターである。微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの単一エフェクターは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、およびＣ２ｃ３を包含するが、これに限定されない。典型的に、微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、クラス１およびクラス２システムに分割される。Ｃｌａｓｓ１システムは、マルチサブユニットエフェクター複合体を有し、一方クラス２システムは、単一蛋白質エフェクターを有する。例えば、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１はクラス２エフェクターである。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１に加えて、３つの別個のクラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、およびＣ２ｃ３）が、Shmakov et al., “Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR Cas Systems”, Mol. Cell, 2015 Nov 5; 60(3): 385-397に記載されており、その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれる。Ｃ２ｃ１およびＣ２ｃ３の２つのシステムのエフェクターは、Ｃｐｆ１に関するＲｕｖＣ−様エンドヌクレアーゼドメインを含有する。第３のシステム、Ｃ２ｃ２は、２つのＨＥＰＮ  ＲＮａｓｅドメインに基づくエフェクターを含有する。成熟したＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡの生産は、Ｃ２ｃ１によるＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡの生産とは異なり、ｔｒａｃｒＲＮＡとは独立である。Ｃ２ｃ１は、ＤＮＡ切断についてＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡの両方に依存している。細菌のＣ２ｃ２は、その活性型ＲＮＡ単一鎖ＲＮＡ分解活性とは別個にＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡの成熟について独特なＲＮａｓｅ活性を所有することを示されている。これらのＲＮａｓｅ機能は、互いにおよび、ＣＰｆ１のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡプロセシング挙動とは異なる。例えば、East-Seletsky, et al., “Two distinct RNase activities of CRISPR-C2c2 enable guide RNA processing and RNA detection”, Nature, 2016 Oct 13;538(7624):270-273を参照し、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。Leptotrichia shahiiにおけるＣ２ｃ２のインビトロ生化学的分析は、Ｃ２ｃ２が単一ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡによる誘導型であり、相補的プロトスペーサーを運搬するｓｓＲＮＡ標的を切断するようプログラムされ得ることを示している。２つの保存されたＨＥＰＮドメインにおける触媒残基は、切断を仲介する。触媒残基における変異は、触媒不活性型ＲＮＡ結合蛋白質を生成する。例えば、Abudayyeh et al., “C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector”, Science, 2016 Aug 5; 353(6299)を参照し、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１２３】
Alicyclobaccillus acidoterrastris Ｃ２ｃ１（ＡａｃＣ２ｃ１）の結晶構造は、キメラ単一−分子ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と複合していると報告されている。例えば、Liu et al., “C2c1-sgRNA Complex Structure Reveals RNA-Guided DNA Cleavage Mechanism”, Mol. Cell, 2017 Jan 19;65(2):310-322を参照し、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。結晶構造はまた、Alicyclobacillus acidoterrestris Ｃ２ｃ１において三重複合体として標的ＤＮＡに結合したものを報告している。例えば、Yang et al., “PAM-dependent Target DNA Recognition and Cleavage by C2C1 CRISPR-Cas endonuclease”, Cell, 2016 Dec 15;167(7):1814-1828を参照し、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれている。標的および非標的ＤＮＡ鎖の両方で、ＡａｃＣ２ｃ１の触媒能力のあるコンホメーションは、捕捉され、標的ＤＮＡのスタガー７ヌクレオチド切断の結果生じるＣ２ｃ１−仲介切断と、単一ＲｕｖＣ触媒ポケット内に独立して位置する。Ｃ２ｃ１三重複合体と前もって同定されたＣａｓ９およびＣｐｆ１の対応物との間の構造の比較は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムにより使用されたメカニズムの多様性を説明している。
【０１２４】
いくつかの態様において、本明細書において提供される、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）の任意の融合蛋白質は、Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３蛋白質であり得る。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣ２ｃ１蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣ２ｃ２蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐはＣ２ｃ３蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に生じるＣ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３蛋白質と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも（at ease）９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、天然に生じるＣ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３蛋白質である。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、配列番号３９または４０のいずれか１つと少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも（at ease）９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。他の細菌種由来のＣ２ｃ１、Ｃ２ｃ２、またはＣ２ｃ３もまた、本開示に従って使用され得ることを理解されるべきである。
【化２３−１】
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【化２３−２】
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【化２４−１】
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【化２４−２】
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【０１２５】
核塩基編集因子のＣａｓ９ドメイン
いくつかの側面において、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、Ｃａｓ９ドメインである。非限定的な、例示的なＣａｓ９ドメインは、本明細書において提供される。Ｃａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性Ｃａｓ９ドメイン、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメイン、またはＣａｓ９ニッカーゼであってもよい。 いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性ドメインである。例えば、Ｃａｓ９ドメインは、二本鎖核酸の両方の鎖を切る（例えば二本鎖ＤＮＡ分子の両方の鎖）、Ｃａｓ９ドメインであってもよい。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、配列番号４〜２９に提示される、いずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に提供されるいずれかのＣａｓ９または配列番号４〜２９において提示される１つのアミノ酸配列に、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％、同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に提供されるいずれかのＣａｓ９または配列番号４〜２９において提示されるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０またはより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に提供される任意のＣａｓ９または配列番号４〜２９において提示されるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも ６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００同一である近接しているアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ不活性ドメイン（ｄＣａｓ）である。例えば、ｄＣａｓ９ドメインは、二本鎖核酸分子のいずれの鎖も切断することなく、二本鎖核酸分子に結合してもよい（例えば、ｇＲＮＡ分子を介して）。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメインは、配列番号６に提示されるアミノ酸配列のＤ１０Ｘ変異およびＨ８４０Ｘ変異、または配列番号４〜２６において提供されるアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列などの、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含み、ここでＸが、アミノ酸の任意の変化である。いくつかの態様において、ヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメインは、配列番号６に提示されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異およびＨ８４０Ａ変異、または、配列番号４〜２６において提供されるアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列などの、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異などを含む。１つの例として、ヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインは、配列番号９において提示されるアミノ酸配列（Cloning vector pPlatTET-gRNA2,Accession No.BAV54124）を含む。
【０１２７】
【化２５−１】
2020510439.tif 000046
【化２５−２】
2020510439.tif 000047
；例えば、Qi et al.,“Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression.”Cell. 2013; 152(5):1173-83を参照、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１２８】
追加の好適なヌクレアーゼ不活性ｄＣａｓ９ドメインは、本開示および当該技術分野における知識に基づき当業者に明らかだろうし、および本開示の範囲内である。かかる追加の例示的な好適なヌクレアーゼ不活性Ｃａｓ９ドメインは、しかし限定されないが、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ、およびＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａ変異型ドメインを包含する（Prashant et al., Cas 9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nature Biotechnology. 2013; 31(9): 833-838を参照、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる）。いくつかの態様において、ｄＣａｓ９ドメインは、本明細書に提供されるいずれかのｄＣａｓ９ドメインと、少なくとも６０％、少なくとも ６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、配列番号７、８、９、または２２に提示されるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはより多くの変異を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、配列番号７、８、９、または２２に提示されるいずれか１つのアミノ酸配列と比較して、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも５００、少なくとも６００、少なくとも７００、少なくとも８００、少なくとも９００、少なくとも１０００、少なくとも１１００、または少なくとも１２００同一である近接しているアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、Ｃａｓ９ニッカーゼである。Ｃａｓ９ニッカーゼは、二本鎖核酸分子（例えば、二本鎖ＤＮＡ分子）のただ１つの鎖を切断することが可能であるＣａｓ９蛋白質であってもよい。いくつかの態様においてＣａｓ９ニッカーゼは、二本鎖核酸分子の標的鎖を切断し、これは、Ｃａｓ９に結合したｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）の塩基対である（相補的な）鎖をＣａｓ９ニッカーゼが切断することを意味する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｄ１０Ａ変異を含み、および配列番号６の８４０位置においてヒスチジンを有し、または配列番号４〜２６のいずれか１つのような本明細書に提供される任意のＣａｓ９における変異を含む。例えば、Ｃａｓ９ニッカーゼは、配列番号１０、１３、１６、または２１において提示されるアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、二本鎖核酸分子の非標的、塩基の編集されていない鎖を切断し、これは、Ｃａｓ９ニッカーゼがＣａｓ９に結合したｇＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）に塩基対ではない鎖を切断することを意味する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、Ｈ８４０Ａ変異を含み、および配列番号６の位置１０に、アスパラギン酸残基、または配列番号４〜２６のいずれか１つなどの、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を有する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、本明細書に提供されるいずれか１つのＣａｓ９ニッカーゼに、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。追加の好適なＣａｓ９ニッカーゼは、本開示および当該技術分野における知識に基づいて明らかだろうし、および本開示の範囲内である。
【０１３０】
減少したＰＡＭ排他性をともなうＣａｓ９ドメイン
開示のいくつかの側面は、異なるＰＡＭ特異性を有するＣａｓ９ドメインを提供する。典型的に、S.pyogenes（ＳｐＣａｓ９）からのＣａｓ９などのＣａｓ９蛋白質は、特定の核酸領域に結合するのに、古典的なＮＧＧＰＡＭ配列を要求し、そこで、「ＮＧＧ」における「Ｎ」は、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）、またはシトシン（Ｃ）、およびＧは、グアニンである。これは、ゲノム内の所望される塩基を編集する能力を限定することがある。いくつかの態様において、本明細書に提供される融合蛋白質を編集する、塩基は、正確な場所に位置することが必要であり、例えば、ＰＡＭの上流のおよそ１５塩基である領域（例えば、「脱アミノ化するウィンドウ」）の４塩基内に標的塩基が存在する。Komor, A.C., et al., “Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage” Nature 533, 420-424 (2016)、を参照、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、脱アミノ化ウィンドウは、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０塩基領域内である。いくつかの態様において、脱アミノ化ウィンドウは、ＰＡＭの５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５塩基上流である。よって、いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、古典的な（例えば、ＮＧＧ）ＰＡＭ配列を含有しないヌクレオチド配列に結合することが可能であるＣａｓ９ドメインを含有することがある。非古典的なＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは、当該技術分野において記載されてきており、および当業者に明らかであるだろう。例えば、非古典的なＰＡＭ配列に結合するＣａｓ９ドメインは、Kleinstiver, B. P., et al., “Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities” Nature 523, 481-485 (2015); and Kleinstiver, B. P., et al., “Broadening the targetting range of Staphylococcus aureus CRISPR-Cas9 by modifying PAM recognition” Nature Biotechnology 33, 1293-1298 (2015)、に記載されており；各々の全体の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、Staphylococcus aureus（ＳａＣａｓ９)からのＣａｓ９ドメインである。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性ＳａＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性ＳａＣａｓ９（ＳａＣａｓ９ｄ）、またはＳａＣａｓ９ニッカーゼ（ＳａＣａｓ９ｎ）である。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９は、アミノ酸配列配列番号１２を含む。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９は、配列番号１２のＮ５７９Ｘ変異を含み、または配列番号１３または１４において提供される任意のアミノ酸配列における対応する変異を含み、ここで、Ｘは、Ｎを除く任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９は、配列番号１２のＮ５７９Ａ変異、または、配列番号１３または１４において提供される任意のアミノ酸配列における対応する変異を含む。
【０１３２】
いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、非古典的なＰＡＭを有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９ドメイン、ＳａＣａｓ９ｄドメイン、またはＳａＣａｓ９ｎドメインは、ＮＮＧＲＲＴ ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合し得、そこでＮ＝Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ、およびＲ＝ＡまたはＧである。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９ドメインは、配列番号１２におけるＥ７８１Ｘ、Ｎ９６７ＸおよびＲ１０１４Ｘ変異の１つ以上、または配列番号１３または１４において提供される任意のアミノ酸における対応する変異を含み、そこで、Ｘは任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９ドメインは、配列番号１２のＥ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、およびＲ１０１４Ｈ変異の１つ以上、または、配列番号１３または１４において提供される任意のアミノ酸における対応する変異の１つ以上を含む。いくつかの態様において、ＳａＣａｓ９ドメインは、配列番号１２のＥ７８１Ｋ、Ｎ９６７Ｋ、またはＲ１０１４Ｈ変異を１つ、または配列番号１３または１４において提供される任意のアミノ酸における対応する変異を含む。
【０１３３】
いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質のＣａｓ９ドメインは、配列番号１２〜１４のいずれか１つに少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である、アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質のＣａｓ９ドメインは、配列番号１２〜１４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質のＣａｓ９ドメインは、配列番号１２〜１４のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【０１３４】
例示的なＳａＣａｓ９配列
【０１３５】
【化２６】
2020510439.tif 000048
【０１３６】
下線付きであり、および太字である配列番号１２の残基Ｎ５７９は、変異されて（例えば、Ａ５７９へ）ＳａＣａｓ９ニッカーゼを生み出すことがある。
【０１３７】
例示的なＳａＣａｓ９ｎ配列
【０１３８】
【化２７】
2020510439.tif 000049
【０１３９】
配列番号１２の残基Ａ５７９から変異されてＳａＣａｓ９ニッカーゼを生み出し得る配列番号１３のＮ５７９は、下線付きであり、および太字である。
【０１４０】
例示的なＳａＫＫＨ  Ｃａｓ９
【０１４１】
【化２８−１】
2020510439.tif 000050
【化２８−２】
2020510439.tif 000051
【０１４２】
配列番号１２の残基Ａ５７９から変異されてＳａＣａｓ９ニッカーゼを生み出し得る、配列番号１４の残基Ａ５７９は、下線付きであり、および太字である。配列番号１２のＥ７８１、Ｎ９６７、およびＲ１０１４から変異され、ＳａＫＫＨ Ｃａｓ９を生み出し得る配列番号１４の残基Ｋ７８１、Ｋ９６７、およびＨ１０１４は、下線付きでありおよび斜体である。
【０１４３】
いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、Streptococcus Pyogenes（ＳｐＣａｓ９）からのＣａｓ９ドメインである。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、ヌクレアーゼ活性化ＳｐＣａｓ９、ヌクレアーゼ不活性ＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９ｄ）、またはＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（ＳｐＣａｓ９ｎ）である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９は、アミノ酸配列配列番号１５を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９は、配列番号１５のＤ９Ｘ変異、または、配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの、任意のＣａｓ９における対応する変異を含み、ここでＸは、Ｄを除く任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９は、配列番号１５のＤ９Ａ変異、または、配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの、本明細書において提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ｄドメイン、またはＳｐＣａｓ９ｎドメインは、非古典的なＰＡＭを有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメイン、ＳｐＣａｓ９ｄドメイン、またはＳｐＣａｓ９ｎドメインは、ＮＧＧ、ＮＧＡ、またはＮＧＣＧ  ＰＡＭ配列を有する核酸配列に結合し得る。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号１５のＤ１１３４Ｘ、Ｒ１３３４Ｘ、およびＴ１３３６Ｘ変異の１つ以上、または配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含み、ここでＸは、任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号１５のＤ１１３４Ｅ、Ｒ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異の１つ以上、または配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号１５のＤ１１３４Ｅの１つ、Ｒ１３３４Ｑの１つ、およびＴ１３３６Ｒの１つの変異、または配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号１５のＤ１１３４Ｘ、Ｒ１３３４Ｘ、およびＴ１３３６Ｘ変異の１つ以上、または配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含み、ここでＸは、任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号１５のＤ１１３４Ｖ、Ｒ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒ変異の１つ以上、または配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号１５のＤ１１３４Ｖの１つ、Ｒ１３３４Ｑの１つ、およびＴ１３３６Ｒ変異の１つ、または配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号１５のＤ１１３４Ｘ、Ｇ１２１７Ｘ、Ｔ１３３４Ｘ、およびＴ１３３６Ｘの変異の１つ以上、または配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含み、ここでＸは、任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号１５のＤ１１３４Ｖ、Ｇ１２１７Ｒ、Ｔ１３３４Ｑ、およびＴ１３３６Ｒの変異の１つ以上、または配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含む。いくつかの態様において、ＳｐＣａｓ９ドメインは、配列番号１５のＤ１１３４Ｖの１つ、Ｇ１２１７Ｒの１つ、Ｔ１３３４Ｑの１つ、およびＴ１３３６Ｒの１つの変異、または配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含む。
【０１４４】
いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質のＣａｓ９ドメインは、配列番号１５〜１９のいずれか１つに少なくとも６０％、少なくとも ６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である、アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質のＣａｓ９ドメインは、配列番号１５〜１９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質のＣａｓ９ドメインは、配列番号１５〜１９のいずれか１つのアミノ酸配列からなる。
【０１４５】
例示的なＳｐＣａｓ９
【０１４６】
【化２９−１】
2020510439.tif 000052
【化２９−２】
2020510439.tif 000053
【０１４７】
例示的なＳｐＣａｓ９ｎ
【０１４８】
【化３０−１】
2020510439.tif 000054
【化３０−２】
2020510439.tif 000055
【０１４９】
例示的なＳｐＥＱＲＣａｓ９
【０１５０】
【化３１−１】
2020510439.tif 000056
【化３１−２】
2020510439.tif 000057
【０１５１】
配列番号１５のＤ１１３４、Ｒ１３３４、およびＴ１３３６から変異され、ＳｐＥＱＲ  Ｃａｓ９を生み出し得る、配列番号１７のＥ１１３４、Ｑ１３３４、およびＲ１３３６は、下線付きでありおよび太字である。
【０１５２】
例示的なＳｐＶＱＲＣａｓ９
【０１５３】
【化３２−１】
2020510439.tif 000058
【化３２−２】
2020510439.tif 000059
【０１５４】
配列番号１５のＤ１１３４、Ｒ１３３４、およびＴ１３３６から変異され、ＳｐＶＱＲ  Ｃａｓ９を生み出し得る、配列番号１８のＶ１１３４、Ｑ１３３４、およびＲ１３３６は、下線付きでありおよび太字である。
【０１５５】
例示的なＳｐＶＲＥＲＣａｓ９
【０１５６】
【化３３】
2020510439.tif 000060
【０１５７】
配列番号１５のＤ１１３４、Ｇ１２１７、Ｒ１３３４、およびＴ１３３６から変異され、ＳｐＶＲＥＲ  Ｃａｓ９を生み出し得る、配列番号１９のＶ１１３４、Ｒ１２１７、Ｑ１３３４、およびＲ１３３６は、下線付きでありおよび太字である。
【０１５８】
高いフィデリティのＣａｓ９ドメイン
本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供される核酸塩基編集因子の高いフィデリティＣａｓ９ドメインを提供する。いくつかの態様において、高いフィデリティのＣａｓ９ドメインは、対応する野生型Ｃａｓ９ドメインと比較して、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖リン酸バックボーンとの間の静電気の相互作用を減少させる１つ以上の変異を含む、操作されたＣａｓ９ドメインである。特定の理論に束縛されることを望まないが、ＤＮＡの糖リン酸バックボーンとの減少した静電気の相互作用を有する高いフィデリティのＣａｓ９ドメインは、より少ないオフターゲット効果を有する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメイン（例えば、野生型Ｃａｓ９ドメイン）は、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖リン酸バックボーンとの間の会合を減少させる１つ以上の変異を有する。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、Ｃａｓ９ドメインとＤＮＡの糖リン酸バックボーンとの間の会合を、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、またはより多くの程度減少させる１つ以上の変異を含む。
【０１５９】
いくつかの態様において、本明細書に提供される任意のＣａｓ９融合蛋白質は、配列番号６に提供されるアミノ酸配列のＮ４９７Ｘ、Ｒ６６１Ｘ、Ｑ６９５Ｘ、および／またはＱ９２６Ｘ変異の１つ以上、または配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの、本明細書において提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含み、ここでＸは、任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意のＣａｓ９融合蛋白質は、配列番号６において提供されるアミノ酸配列のＮ４９７Ａ、Ｒ６６１Ａ、Ｑ６９５Ａ、および／またはＱ９２６Ａ変異の１つ以上、または、配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、配列番号６において提供されるアミノ酸配列のＤ１０Ａ変異、配列番号４〜２６において提供される任意のアミノ酸配列などの、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメイン（例えば、本明細書に提供される任意の融合蛋白質）は、配列番号２０に提示されるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、Ｃａｓ９ドメインは、配列番号２０に、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。高いフィデリティをもつＣａｓ９ドメインは、当該技術分野において知られ、および当業者に明らかであるだろう。例えば、高いフィデリティをもつＣａｓ９ドメインは、Kleinstiver, B.P., et al. “High-fidelity CRISPR-Cas 9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects.” Nature 529, 490-495 (2016); and Slaymaker, I.M., et al. “Rationally engineered Cas nucleases with improved specificity.” Science 351, 84-88 (2015)；において記載され、各々の全体の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
例えば、本明細書に提供される任意のＣ→Ｇ塩基編集因子など、本明細書に提供される任意の塩基編集因子が、本明細書に記載されるようにＣａｓ９ドメイン変更することによって高いフィデリティの塩基編集因子に変換され、例えば、高いフィデリティのＣ→Ｇ塩基編集因子などの高いフィデリティ塩基編集因子を生成してもよいことを理解されるべきである。いくつかの態様において、高いフィデリティのＣａｓ９ドメインは、ｄＣａｓ９ドメインである。いくつかの態様において、高いフィデリティのＣａｓ９ドメインは、ｎＣａｓ９ドメインである。
【０１６１】
配列番号６のＣａｓ９に対する変異が、太字および下線付きで示される、高いフィデリティＣａｓ９ドメイン
【０１６２】
【化３４−１】
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【化３４−２】
2020510439.tif 000062
【０１６３】
本開示は、本明細書に提供される任意のｎａｐＤＮＡｂｐｓの短縮などの、ｎａｐＤＮＡｂｐｓのフラグメントをもまた提供する。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐｓは、Ｎ末端短縮であり、そこで１つ以上のアミノ酸は、ｎａｐＤＮＡｂｐｓのＮ末端から欠ける。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ＮａｐＤＮＡｂｐｓのＮ末端から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０のアミノ酸が欠けている。例えば、ｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端短縮は、配列番号４〜４０のいずれか１つにおいて提供されるｎａｐＤＮＡｂｐのいずれか１つなどの本明細書に提供される任意のｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端短縮であってもよい。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃ末端短縮であり、そこで１つ以上のアミノ酸は、ｎａｐＤＮＡｂｐのＣ末端から欠けている。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、ｎａｐＤＮＡｂｐのＣ末端から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０のアミノ酸が欠けている。例えば、ｎａｐＤＮＡｂｐのＣ末端短縮は、配列番号４〜４０のいずれか１つにおいて提供されるＮＡＰなどの本明細書に提供される任意のｎａｐＤＮＡｂｐのＣ末端短縮であってもよい。
【０１６４】
いくつかの態様において、本明細書に提供される任意のｎａｐＤＮＡｂｐｓは、配列番号４〜４０において提供されるｎａｐＤＮＡｂｐｓのいずれか１つなどの、本明細書に提供される任意のｎａｐＤＮＡｂｐｓと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはより多くのアミノ酸変化を有する。
【０１６５】
ウラシル結合蛋白質（ＵＢＰ）
ウラシル結合蛋白質またはＵＢＰは、ウラシルに結合することが可能である蛋白質を指す。いくつかの態様において、ウラシル結合蛋白質は、ウラシル修飾酵素である。いくつかの態様において、ウラシル結合蛋白質は、ウラシル塩基除去酵素である。いくつかの態様において、ウラシル結合蛋白質は、ウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）である。いくつかの態様において、ウラシル結合蛋白質は、野生型ＵＤＧ（例えば、ヒトＵＤＧ）がウラシルに結合する親和性の、少なくとも１％、２％、３％、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または少なくとも９５％である親和性で、ウラシルに結合する。いくつかの態様において、ウラシル結合蛋白質は、ウラシルに結合する野生型ＵＤＧ（例えば、ヒトＵＤＧ）などの、野生型ウラシル結合蛋白質と比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはより多くのアミノ酸変化を有することがある。
【０１６６】
いくつかの態様において、ＵＢＰは、ウラシル修飾酵素である。いくつかの態様において、ＵＢＰは、ウラシル塩基除去酵素である。いくつかの態様において、ＵＢＰは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼである。いくつかの態様において、ＵＢＰは、本明細書に提供される任意のウラシル結合蛋白質である。例えば、ＵＢＰは、ＵＤＧ、ＵｄｇＸ、ＵｄｇＸ＊、ＵｄｇＸ＿Ｏｎ、またはＳＭＵＧ１であってもよい。いくつかの態様において、ＵＢＰは、ウラシル結合蛋白質、ウラシル塩基除去酵素、またはウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＵＢＰは、本明細書に提供される任意のウラシル結合蛋白質に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、例えば以下に提供されるＵＢＰおよびＵＢＰバリアントのいずれかである。いくつかの態様において、ＵＢＰは、配列番号４８〜５３のいずれか１つに少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＵＢＰは、配列番号４８〜５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ウラシル結合蛋白質は、配列番号４８〜５３のいずれか１つなどの、本明細書に提供される任意のＵＢＰと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはより多くのアミノ酸変化を有する。
【０１６７】
本開示は、本明細書に提供される任意のＵＢＰの短縮などの、ＵＢＰのフラグメントもまた提供する。いくつかの態様において、ＵＢＰは、Ｎ末端短縮であり、そこで１つ以上のアミノ酸は、ＵＢＰのＮ末端から欠けている。いくつかの態様において、ＵＢＰは、ＵＢＰのＮ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０のアミノ酸が欠けている。例えば、ＵＢＰのＮ末端短縮は、配列番号４８〜５３のいずれか１つにおいて提供されるＵＢＰのいずれか１つなどの本明細書に提供される任意のＵＢＰのＮ末端短縮であってもよい。いくつかの態様において、ＵＢＰは、Ｃ末端短縮であり、そこで１つ以上のアミノ酸が、ＵＢＰのＣ末端から欠けている。いくつかの態様において、ＵＢＰは、ＵＢＰのＣ末端から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０のアミノ酸が欠けている。例えば、ＵＢＰのＣ末端短縮は、配列番号４８〜５３のいずれか１つにおいて提供されるいずれか１つのＵＢＰなどの、本明細書に提供される任意のＵＢＰのＣ末端の短縮であってもよい。
【０１６８】
他のＵＢＰは、当業者に明らかであるだろうしおよび本開示の範囲内であることを理解されるべきである。例えば、ＵＢＰは、Sang et al., “A Unique uracil-DNA binding proteinof the uracil DNA glycosylase superfamily,”  Nucleic Acids Research, Vol. 43, No. 17 2015において、前もって記載されており、その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
ＵＤＧ
【化３５】
2020510439.tif 000063
ＵｄｇＸ
【化３６】
2020510439.tif 000064
ＵｄｇＸ＊（Ｒ１０７Ｓ）
【化３７】
2020510439.tif 000065
ＵｄｇＸ＿Ｏｎ（Ｈ１０９Ｓ）
【化３８−１】
2020510439.tif 000066
【化３８−２】
2020510439.tif 000067
Ｒｅｖ７
【化３９】
2020510439.tif 000068
Ｓｍｕｇ１
【化４０】
2020510439.tif 000069
【０１６９】
核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）
核酸ポリメラーゼ、またはＮＡＰは、ヌクレオチド（例えば、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチド）から核酸分子（例えばＤＮＡおよびＲＮＡ）を合成する酵素を指す。いくつかの態様において、ＮＡＰは、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、損傷乗り越えポリメラーゼである。損傷乗り越えポリメラーゼは、例えば、複製フォークをリスタートすること、またはＤＮＡ損傷の存在によるゲノムにおいて残存するギャップを満たすことによって、変異誘発において役割を担う。例示的な損傷乗り越えポリメラーゼは、Ｐｏｌベータ、Ｐｏｌラムダ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌミュ―、Ｐｏｌイオタ、Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌアルファ、Ｐｏｌデルタ、Ｐｏｌガンマ、およびＰｏｌニューを包含する。
【０１７０】
いくつかの態様において、ＮＡＰは、真核生物の核酸ポリメラーゼである。いくつかの態様において、ＮＡＰはＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼ活性を有する。いくつかの態様において、ＮＡＰは、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、Ｒｅｖ７、Ｒｅｖ１複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパ、またはポリメラーゼエタである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、真核生物のポリメラーゼアルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、エタ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミューまたはニューである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、天然に存在する核酸ポリメラーゼ（例えば、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼ）に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＮＡＰは、例えば、下の本明細書に提供される任意の核酸ポリメラーゼに、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、ＮＡＰは、配列番号５４〜６４のいずれか１つに、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸を含んでもよい。いくつかの態様において、ＮＡＰは、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。他のＮＡＰは、当業者に明らかであるだろうし、および本開示の範囲内であることを理解されるべきである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、核酸ポリメラーゼは、配列番号５４〜６４のいずれか１つなどの、本明細書に提供される任意のＮＡＰと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはより多くのアミノ酸変化を有する。
【０１７１】
本開示は、本明細書に提供される任意のＮＡＰの短縮などの、ＮＡＰのフラグメントもまた提供する。いくつかの態様において、ＮＡＰは、Ｎ末端短縮であり、そこで１つ以上のアミノ酸はＮＡＰのＮ末端から欠けている。いくつかの態様において、ＮＡＰは、ＮＡＰのＮ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０のアミノ酸が欠けている。例えば、ＮＡＰのＮ末端短縮は、配列番号５４〜６４のいずれか１つにおいて提供されるＮＡＰのいずれか１つなどの、本明細書に提供される任意のＮＡＰのＮ末端短縮であってもよい。いくつかの態様において、ＮＡＰは、Ｃ末端短縮であり、そこで１つ以上のアミノ酸はＮＡＰのＣ末端から欠けている。いくつかの態様において、ＮＡＰは、ＮＡＰのＣ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０のアミノ酸が欠けている。例えば、ＮＡＰのＣ末端短縮は、配列番号５４〜６４のいずれか１つにおいて提供されるＮＡＰのいずれか１つなどの、本明細書に提供される任意のＮＡＰのＣ末端短縮であってもよい。
Ｐｏｌベータ
【化４１−１】
2020510439.tif 000070
【化４１−２】
2020510439.tif 000071
Ｐｏｌ ラムダ
【化４２】
2020510439.tif 000072
Ｐｏｌエタ
【化４３】
2020510439.tif 000073
Ｐｏｌミュー
【化４４−１】
2020510439.tif 000074
【化４４−２】
2020510439.tif 000075
Ｐｏｌイオタ
【化４５】
2020510439.tif 000076
Ｐｏｌカッパ
【化４６−１】
2020510439.tif 000077
【化４６−２】
2020510439.tif 000078
Ｐｏｌアルファ
【化４７−１】
2020510439.tif 000079
【化４７−２】
2020510439.tif 000080
Ｐｏｌデルタ
【化４８】
2020510439.tif 000081
Ｐｏｌガンマ
【化４９−１】
2020510439.tif 000082
【化４９−２】
2020510439.tif 000083
Ｐｏｌニュー
【化５０】
2020510439.tif 000084
Ｒｅｖ１
【化５１】
2020510439.tif 000085
【０１７２】
塩基除去酵素（ＢＥＥ）
塩基除去酵素、またはＢＥＥは、核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）から塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、またはＵ）を除去することが可能である、蛋白質を指す。いくつかの態様において、ＢＥＥは、ＤＮＡからシトシンを除去することが可能である。いくつかの態様において、ＢＥＥは、ＤＮＡからチミンを除去することが可能である。例示的なＢＥＥは、限定されることなしに、Sang et al., “A Unique uracil-DNA binding protein of the uracil DNA glycosylase superfamily,” Nucleic Acids Research, Vol. 43, No. 17 2015、において記載されるように、ＵＤＧ Ｔｙｒ１４７ＡｌａおよびＵＤＧ Ａｓｎ２０４Ａｓｐを包含し；その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
いくつかの態様において、塩基除去酵素（ＢＥＥ）は、シトシン、チミン、アデニン、グアニン、またはウラシル塩基除去酵素である。いくつかの態様において、塩基除去酵素（ＢＥＥ）は、シトシン塩基除去酵素である。いくつかの態様において、ＢＥＥは、チミン塩基除去酵素である。いくつかの態様において、塩基除去酵素は、天然に生じるＢＥＥに、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、塩基除去酵素は、本明細書に提供される任意のＢＥＥに、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含み、例えば、下のＵＤＧ（Ｔｙｒ１４７Ａｌａ）、またはＵＤＧ（Ａｓｎ２０４Ａｓｐ）である。いくつかの態様において、塩基除去酵素は、配列番号６５〜６６のいずれか１つに少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、塩基除去酵素は、配列番号６５〜６６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、塩基除去酵素は、配列番号６５〜６６のいずれか１つなどの、本明細書に提供される任意のＢＥＥと比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはより多くのアミノ酸変化を有する。
【０１７４】
開示は、本明細書に提供される任意のＢＥＥの短縮などの、ＢＥＥのフラグメントもまた提供する。いくつかの態様において、ＢＥＥは、Ｎ末端短縮であり、そこで１つ以上のアミノ酸は、ＢＥＥのＮ末端から欠けている。いくつかの態様において、ＢＥＥは、ＢＥＥのＮ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０のアミノ酸が欠けている。例えば、ＢＥＥのＮ末端短縮は、配列番号６５〜６６のいずれか１つにおいて提供されるＢＥＥのいずれか１つなどの、本明細書に提供される任意のＢＥＥのＮ末端短縮であってもよい。いくつかの態様において、ＢＥＥは、Ｃ末端短縮であり、そこで１つ以上のアミノ酸は、ＢＥＥのＣ末端から欠けている。いくつかの態様において、ＢＥＥは、ＢＥＥのＣ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０のアミノ酸が欠けている。例えば、ＢＥＥのＣ末端短縮は、本明細書に提供される任意のＢＥＥのＣ末端短縮であってもよく、配列番号６５〜６６のいずれか１つにおいて提供されるＢＥＥのいずれか１つなどである。
【０１７５】
他のＢＥＥは、当業者に明らかであるだろうし、および本開示の範囲内であることを理解されるべきである。例えば、ＢＥＥは、Sang et al., “A Unique uracil-DNA binding protein  of the uracil DNA glycosylase superfamily,”  Nucleic Acids Research, Vol. 43, No. 17 2015において、前もって記載され；その内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
ＵＤＧ（Ｔｙｒ１４７Ａｌａ）−変異された残基は、太字および下線付きによって示される。
【化５２】
2020510439.tif 000086
ＵＤＧ（Ａｓｎ２０４Ａｓｐ）−変異された残基は、太字および下線付きによって示される。
【化５３】
2020510439.tif 000087
【０１７６】
デアミナーゼドメイン
いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質または塩基編集因子は、シチジンデアミナーゼドメインを含む。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ＣからＵへの塩基変化を触媒し得る。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、アポリポ蛋白質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ３デアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅデアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ＡＰＯＢＥＣ４デアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、活性化誘導 デアミナーゼ（ＡＩＤ）である。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、脊椎動物のデアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、非脊椎動物のデアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ヒト、チンパンジー、ゴリラ、サル、ウシ、イヌ、ラット、マウスのデアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ヒトデアミナーゼである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ラットデアミナーゼ、例えばｒＡＰＯＢＥＣ１である。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、Petromyzon marinusシチジンデアミナーゼ１（pmCDA1）である。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）である。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇのフラグメントである（配列番号１００）。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、Ｄ３１６Ｒ＿Ｄ３１７Ｒ変異（配列番号９９）を含むヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇのバリアントである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇのフラグメントであり、および配列番号７７（配列番号１０１）におけるＤ３１６Ｒ＿Ｄ３１７Ｒ変異に対応する変異を含む。
【０１７７】
いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、天然に生じるシチジンデアミナーゼに、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、本明細書に提供される任意のシチジンデアミナーゼに、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、配列番号６７〜１０１のいずれか１つのデアミナーゼドメインに、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％同一である。いくつかの態様において、核酸編集ドメインは、配列番号６７〜１０１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む核酸編集ドメインである。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、配列番号６７〜１０１のいずれか１つなどの、本明細書に提供される任意のシチジンデアミナーゼドメインに比較して、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、またはより多くのアミノ酸変化を有する。
【０１７８】
本開示は、本明細書に提供される任意のシチジンデアミナーゼドメインの短縮など、シチジンデアミナーゼドメインのフラグメントをもまた提供する。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、Ｎ末端短縮、そこで１つ以上のアミノ酸が、シチジンデアミナーゼドメインのＮ末端から欠けている。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼドメインのＮ末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０のアミノ酸が欠けている。例えば、シチジンデアミナーゼドメインのＮ末端短縮は、配列番号６７〜１０１のいずれか１つにおいて提供されるシチジンデアミナーゼドメインのいずれか１つなどの、本明細書に提供される任意のシチジンデアミナーゼドメインのＮ末端短縮であってもよい。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、Ｃ末端短縮であり、そこで１つ以上のアミノ酸は、シチジンデアミナーゼドメインのＣ−末端から欠けている。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼドメインは、シチジンデアミナーゼドメインのＣ末端から、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２１、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０のアミノ酸が欠けている。例えば、シチジンデアミナーゼドメインのＣ末端短縮は、配列番号６７〜１０１のいずれか１つにおいて提供されるシチジンデアミナーゼドメインのいずれか１つなどの、本明細書に提供される任意のシチジンデアミナーゼドメインのＣ末端短縮であってもよい。
【０１７９】
いくつかの例示的なシチジンデアミナーゼドメインは、限定されることなしに、下に提供されるものを包含する。いくつかの態様において、例えば、局在化シグナルなしのドメインなど（核局在配列、核外移行シグナルなし、細胞質の局在化シグナルなし）、それぞれの配列の活性ドメインが使用され得ることが理解されるべきである。
【０１８０】
ヒトＡＩＤ：
【化５４】
2020510439.tif 000088
【０１８１】
マウスＡＩ：
【化５５】
2020510439.tif 000089
【０１８２】
イヌＡＩＤ：
【化５６】
2020510439.tif 000090
【０１８３】
ウシＡＩＤ：
【化５７】
2020510439.tif 000091
【０１８４】
ラットＡＩＤ
【化５８】
2020510439.tif 000092
【０１８５】
マウスＡＰＯＢＥＣ−３：
【化５９】
2020510439.tif 000093
【０１８６】
ラットＡＰＯＢＥＣ−３：
【化６０−１】
2020510439.tif 000094
【化６０−２】
2020510439.tif 000095
【０１８７】
アカゲザルＡＰＯＢＥＣ−３Ｇ：
【化６１】
2020510439.tif 000096
【０１８８】
チンパンジーＡＰＯＢＥＣ−３Ｇ：
【化６２】
2020510439.tif 000097
【０１８９】
ミドリザルＡＰＯＢＥＣ−３Ｇ：
【化６３】
2020510439.tif 000098
【０１９０】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｇ：
【化６４−１】
2020510439.tif 000099
【化６４−２】
2020510439.tif 000100
【０１９１】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｆ：
【化６５】
2020510439.tif 000101
【０１９２】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｂ：
【化６６】
2020510439.tif 000102
【０１９３】
ラットＡＰＯＢＥＣ３：
【化６７】
2020510439.tif 000103
【０１９４】
ウシＡＰＯＢＥＣ−３Ｂ：
【化６８】
2020510439.tif 000104
【０１９５】
チンパンジーＡＰＯＢＥＣ−３Ｂ：
【化６９】
2020510439.tif 000105
【０１９６】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｃ：
【化７０】
2020510439.tif 000106
【０１９７】
ゴリラＡＰＯＢＥＣ３Ｃ
【化７１】
2020510439.tif 000107
【０１９８】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ａ：
【化７２】
2020510439.tif 000108
【０１９９】
アカゲザルＡＰＯＢＥＣ−３Ａ：
【化７３】
2020510439.tif 000109
【０２００】
ウシＡＰＯＢＥＣ−３Ａ：
【化７４】
2020510439.tif 000110
【０２０１】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｈ：
【化７５】
2020510439.tif 000111
【０２０２】
アカゲザルＡＰＯＢＥＣ−３Ｈ：
【化７６】
2020510439.tif 000112
【０２０３】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−３Ｄ：
【化７７】
2020510439.tif 000113
【０２０４】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−１
【化７８】
2020510439.tif 000114
【０２０５】
マウスＡＰＯＢＥＣ−１：
【化７９】
2020510439.tif 000115
【０２０６】
ラットＡＰＯＢＥＣ−１：
【化８０】
2020510439.tif 000116
【０２０７】
ヒトＡＰＯＢＥＣ−２
【化８１】
2020510439.tif 000117
【０２０８】
マウスＡＰＯＢＥＣ−２：
【化８２】
2020510439.tif 000118
【０２０９】
ラットＡＰＯＢＥＣ−２：
【化８３−１】
2020510439.tif 000119
【化８３−２】
2020510439.tif 000120
【０２１０】
ウシＡＰＯＢＥＣ−２：
【化８４】
2020510439.tif 000121
【０２１１】
Petromyzon marinusＣＤＡ１（ｐｍＣＤＡ１）
【化８５】
2020510439.tif 000122
【０２１２】
ヒトＡＰＯＢＥＣ３Ｇ  Ｄ３１６Ｒ＿Ｄ３１７Ｒ
【化８６】
2020510439.tif 000123
【０２１３】
ヒトＡＰＯＢＥＣ３ＧチェーンＡ
【化８７】
2020510439.tif 000124
【０２１４】
ヒトＡＰＯＢＥＣ３ＧチェーンＡ  Ｄ１２０Ｒ＿Ｄ１２１Ｒ
【化８８】
2020510439.tif 000125
【０２１５】
塩基編集因子の編集ウィンドウを調節する、デアミナーゼドメイン
本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供される任意の融合蛋白質のデアミナーゼドメインの触媒活性を調節すること、例えば、デアミナーゼドメインにおいて点変異を作製することによって、融合蛋白質（例えば、塩基編集因子）の加工性に影響を与えるという認識に基づく。例えば、塩基編集融合蛋白質内のデアミナーゼドメインの触媒活性を減らす、しかし除かない変異は、デアミナーゼドメインが標的残基に隣接する残基の脱アミノ化を触媒するだろうことの可能性をより低くし得、これにより脱アミノ化ウィンドウを狭める。脱アミノ化ウィンドウを狭める能力は、特定の標的残基に隣接する残基の望まれない脱アミノ酸を防止してもよく、それは、オフターゲット効果を減少させるか、または防止する。
【０２１６】
いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、触媒デアミナーゼ活性を減らしているデアミナーゼドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼドメイン）を含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、適切な対照と比較すると、減少した触媒デアミナーゼ活性を有するデアミナーゼドメイン（例えば、シチジンデアミナーゼドメイン）を含む。例えば、適切な対照は、デアミナーゼの中に１つ以上の変異を導入することの前のデアミナーゼのデアミナーゼ活性であり得る。他の態様において、適切な対照は、野生型デアミナーゼであり得る。いくつかの態様において、適切な対照は、野生型アポリポ蛋白質Ｂ  ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーデアミナーゼである。いくつかの態様において、適切な対照は、ＡＰＯＢＥＣ１デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ２デアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ａデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｄデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆデアミナーゼ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇデアミナーゼ、またはＡＰＯＢＥＣ３Ｈデアミナーゼである。いくつかの態様において、適切な対照は、活性化誘導のデアミナーゼ（ＡＩＤ）である。いくつかの態様において、適切な対照は、Petromyzon marinus（ｐｍＣＤＡ１）からのシチジンデアミナーゼ１である。いくつかの態様において、デアミナーゼドメインは、適切な対照と比較すると、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％少ない触媒デアミナーゼ活性を有するデアミナーゼドメインであってもよい。
【０２１７】
いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、以下：ｒＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９３）のＨ１２１Ｘ、Ｈ１２２Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｒ１２６Ｘ、Ｒ１１８Ｘ、Ｗ９０Ｘ、Ｗ９０Ｘ、およびＲ１３２Ｘからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、以下：ｒＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９３）のＨ１２１Ｒ、Ｈ１２２Ｒ、Ｒ１２６Ａ、Ｒ１２６Ｅ、Ｒ１１８Ａ、Ｗ９０Ａ、Ｗ９０ＹおよびＲ１３２Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。
【０２１８】
いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、以下：ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）のＤ３１６Ｘ、Ｄ３１７Ｘ、Ｒ３２０Ｘ、Ｒ３２０Ｘ、Ｒ３１３Ｘ、Ｗ２８５Ｘ、Ｗ２８５Ｘ、Ｒ３２６Ｘからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含み、ここでＸは任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、以下：ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）のＤ３１６Ｒ、Ｄ３１７Ｒ、Ｒ３２０Ａ、Ｒ３２０Ｅ、Ｒ３１３Ａ、Ｗ２８５Ａ、Ｗ２８５Ｙ、Ｒ３２６Ｅからなる群から選択される１つ以上の変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。
【０２１９】
いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｒＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９３）のＨ１２１ＲおよびＨ１２２Ｒの変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｒＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９３）のＲ１２６Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｒＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９３）のＲ１２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｒＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９３）のＲ１１８Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける、１つ以上の対応する変異を含むＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｒＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９３）のＷ９０Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｒＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９３）のＷ９０Ｙ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｒＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９３）のＲ１３２Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｒＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９３）のＷ９０ＹおよびＲ１２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｒＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９３）のＲ１２６ＥおよびＲ１３２Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｒＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９３）のＷ９０ＹおよびＲ１３２Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｒＡＰＯＢＥＣ１（配列番号９３）のＷ９０Ｙ、Ｒ１２６ＥおよびＲ１３２Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。
【０２２０】
いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）のＤ３１６ＲおよびＤ３１７Ｒ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）のＲ３２０Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）のＲ３２０Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）のＲ３１３Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）のＷ２８５Ａ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）のＷ２８５Ｙ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）のＲ３２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）のＷ２８５ＹおよびＲ３２０Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）のＲ３２０ＥおよびＲ３２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）のＷ２８５ＹおよびＲ３２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、ｈＡＰＯＢＥＣ３Ｇ（配列番号７７）のＷ２８５Ｙ、Ｒ３２０Ｅ、およびＲ３２６Ｅ変異、または別のＡＰＯＢＥＣデアミナーゼにおける１つ以上の対応する変異を含む、ＡＰＯＢＥＣデアミナーゼを含む。
【０２２１】
ヌクレアーゼプログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、シチジンデアミナーゼ、およびウラシル結合蛋白質（ＵＢＰ）を含む融合蛋白質
本開示のいくつかの側面は、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、シチジンデアミナーゼ、およびウラシル結合蛋白質（ＵＢＰ）を含む融合蛋白質を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、塩基編集因子である。いくつかの態様において、ＵＢＰは、ウラシル修飾酵素である。いくつかの態様において、ＵＢＰは、ウラシル塩基除去酵素である。いくつかの態様において、ＵＢＰは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼである。いくつかの態様において、ＵＢＰは、本明細書に提供される任意のウラシル結合蛋白質である。例えば、ＵＢＰは、ＵＤＧ、ＵｄｇＸ、ＵｄｇＸ＊、ＵｄｇＸ＿Ｏｎ、またはＳＭＵＧ１であってもよい。いくつかの態様において、ＵＢＰは、ウラシル結合蛋白質、ウラシル塩基除去酵素またはウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＵＢＰは、本明細書に提供される任意のウラシル結合蛋白質に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、ＵＢＰは、配列番号４８〜５３のいずれか１つに、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、ＵＢＰは、配列番号４８〜５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０２２２】
いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメイン、Ｃｐｆ１ドメイン、ＣａｓＸドメイン、ＣａｓＹドメイン、Ｃ２ｃｌドメイン、Ｃ２ｃ２ドメイン、Ｃ２ｃ３ドメイン、またはアルゴノートドメインである。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書に提供される任意のｎａｐＤＮＡｂｐである。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質のｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメインである。Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に提供される任意のＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９蛋白質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）であってもよい。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意のＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９蛋白質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）は、本明細書に提供される任意のシチジンデアミナーゼドメインと融合されてもよい。いくつかの態様において、融合蛋白質は、構造：
ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＢＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼ］−［ＵＢＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＵＢＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＵＢＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［シチジンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＢＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ＵＢＰ］−ＣＯＯＨ
を含む。
【０２２３】
いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）、およびＵＢＰを含む融合蛋白質は、リンカー配列を包含しない。いくつかの態様において、リンカーは、シチジンデアミナーゼドメインとｎａｐＤＮＡｂｐとの間に存在する。いくつかの態様において、リンカーは、シチジンデアミナーゼドメインとＵＢＰとの間に存在する。いくつかの態様において、リンカーは、ｎａｐＤＮＡｂｐとＵＢＰとの間に存在する。いくつかの態様において、上の一般構成において使用される「−」は、任意のリンカーの存在を示す。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＵＢＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＵＢＰは、本明細書に提供される任意のリンカーを介して融合される。例えば、いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＵＢＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＵＢＰは、「リンカー」と題する項において下に提供される任意のリンカーを介して融合される。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＵＢＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＵＢＰは、１から２００の間のアミノ酸を含むリンカーを介して融合される。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＵＢＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＵＢＰは、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜８０、１〜１００、１〜１５０、１〜２００、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜６０、５〜８０、５〜１００、５〜１５０、５〜２００、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜８０、１０〜１００、１０〜１５０、１０〜２００、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜８０、２０〜１００、２０〜１５０、２０〜２００、３０〜４０、３０〜５０、３０〜６０、３０〜８０、３０〜１００、３０〜１５０、３０〜２００、４０〜５０、４０〜６０、４０〜８０、４０〜１００、４０〜１５０、４０〜２００、５０〜６０、５０〜８０、５０〜１００、５０〜１５０、５０〜２００、６０〜８０、６０〜１００、６０〜１５０、６０〜２００、８０〜１００、８０〜１５０、８０〜２００、１００〜１５０、１００〜２００、または１５０〜２００のアミノ酸長を含むリンカーを介して融合される。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＵＢＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＵＢＰは、４、１６、２４、３２、９１または１０４アミノ酸長を含むリンカーを介して融合される。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＵＢＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＵＢＰは、
ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２）、
ＳＧＧＳ（配列番号１０３）、
ＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳ（配列番号１０７）、
ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号１０８）、
ＧＧＳＧＧＳＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０９）、または
ＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２０）
のアミノ酸配列を含むリンカーを介して融合される。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＵＢＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＵＢＰは、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２）を含むリンカーを介して融合され、それはまた、ＸＴＥＮリンカーとしても言及される。
【０２２４】
ヌクレアーゼプログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、シチジンデアミナーゼ、および核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）ドメインを含む、融合蛋白質
本開示のいくつかの側面は、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、シチジンデアミナーゼおよび核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）ドメインを含む融合蛋白質を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、塩基編集因子である。いくつかの態様において、ＮＡＰは、真核生物の核酸ポリメラーゼである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、損傷乗り越えポリメラーゼ活性を有する。いくつかの態様において、ＮＡＰは、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、Ｒｅｖ７、Ｒｅｖ１複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパ、またはポリメラーゼエタである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、真核生物のポリメラーゼアルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、エタ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミュー、またはニューである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、核酸ポリメラーゼ（例えば、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼ）に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＮＡＰは、本明細書に提供される任意の核酸ポリメラーゼ配列に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、ＮＡＰは、配列番号５４〜６４のいずれか１つに、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＮＡＰは、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０２２５】
いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメイン、Ｃｐｆ１ドメイン、ＣａｓＸドメイン、ＣａｓＹドメイン、Ｃ２ｌドメイン、Ｃ２ｃ２ドメイン、Ｃ２ｃ３ドメイン、またはアルゴノートドメインである。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書に提供される任意のｎａｐＤＮＡｂｐである。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質のｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメインである。Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に提供される任意のＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９蛋白質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）であり得る。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意のＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９蛋白質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）は、本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼのいずれかに融合されてもよい。いくつかの態様において、融合蛋白質は、構造：
ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼ］−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＡＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［シチジンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ＮＡＰ］−ＣＯＯＨ
を含む。
【０２２６】
いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば, Ｃａｓ９ドメイン）、およびＮＡＰを含む融合蛋白質は、リンカー配列を包含しない。いくつかの態様において、リンカーは、シチジンデアミナーゼドメインとｎａｐＤＮＡｂｐの間に存在する。いくつかの態様において、リンカーは、シチジンデアミナーゼドメインとＮＡＰの間に存在する。いくつかの態様において、リンカーは、ｎａｐＤＮＡｂｐとＮＡＰの間に存在する。いくつかの態様において、上の一般構成において使用される「−」は、任意のリンカーの存在を示す。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＮＡＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＮＡＰは、本明細書に提供される任意のリンカーを介して融合される。例えば、いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＮＡＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＮＡＰは、「リンカー」と題する項において下に提供される、任意のリンカーを介して融合される。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＮＡＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＮＡＰは、１と２００の間のアミノ酸を含むリンカーを介して融合される。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＮＡＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＮＡＰは、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜８０、１〜１００、１〜１５０、１〜２００、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜６０、５〜８０、５〜１００、５〜１５０、５〜２００、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜８０、１０〜１００、１０〜１５０、１０〜２００、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜８０、２０〜１００、２０〜１５０、２０〜２００、３０〜４０、３０〜５０、３０〜６０、３０〜８０、３０〜１００、３０〜１５０、３０〜２００、４０〜５０、４０〜６０、４０〜８０、４０〜１００、４０〜１５０、４０〜２００、５０〜６０、５０〜８０、５０〜１００、５０〜１５０、５０〜２００、６０〜８０、６０〜１００、６０〜１５０、６０〜２００、８０〜１００、８０〜１５０、８０〜２００、１００〜１５０、１００〜２００、または１５０〜２００のアミノ酸長を含むリンカーを介して融合される。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＮＡＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＮＡＰは、４、１６、３２、または１０４アミノ酸長を含むリンカーを介して融合される。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＮＡＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＮＡＰは、
ＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２）、
ＳＧＧＳ（配列番号１０３）、
ＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳ（配列番号１０７）、
ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号１０８）、
ＧＧＳＧＧＳＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０９）、または
ＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２０）のアミノ酸配列を含む、リンカーを介して融合される。いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼとｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼとＮＡＰ、および／またはｎａｐＤＮＡｂｐとＮＡＰは、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２）を含むリンカーを介して融合され、それは、ＸＴＥＮリンカーとしてもまた言及されてもよい。
【０２２７】
ヌクレアーゼプログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、シチジンデアミナーゼ、ウラシル結合蛋白質（ＵＢＰ）、および核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）ドメインを含む融合蛋白質
本開示のいくつかの側面は、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、シチジンデアミナーゼ、ウラシル結合蛋白質（ＵＢＰ）、および核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）ドメインを含む、融合蛋白質を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、塩基編集因子である。いくつかの態様において、ＮＡＰは、真核生物の核酸ポリメラーゼである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、損傷乗り越えポリメラーゼ活性を有する。いくつかの態様において、ＮＡＰは、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、Ｒｅｖ７、Ｒｅｖ１複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパ、またはポリメラーゼエタである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、真核生物のポリメラーゼアルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、エタ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミュー、またはニューである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、核酸ポリメラーゼ（例えば、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼ）に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一である、アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＮＡＰは、本明細書に提供される任意の核酸ポリメラーゼに、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、ＮＡＰは、配列番号５４〜６４のいずれか１つに少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％ 同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、ＮＡＰは、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０２２８】
いくつかの態様において、ＵＢＰは、ウラシル修飾酵素である。いくつかの態様において、ＵＢＰは、ウラシル塩素除去酵素である。いくつかの態様において、ＵＢＰは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼである。いくつかの態様において、ＵＢＰは、本明細書に提供される任意のウラシル結合蛋白質である。例えば、ＵＢＰは、ＵＤＧ、ＵｄｇＸ、ＵｄｇＸ＊、ＵｄｇＸ＿Ｏｎ、またはＳＭＵＧ１であってもよい。いくつかの態様において、ＵＢＰは、ウラシル結合蛋白質、ウラシル塩基除去酵素、またはウラシルＤＮＡグルコシラーゼ（ＵＤＧ）酵素に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＵＢＰは、本明細書に提供される任意のウラシル結合蛋白質に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、ＵＢＰは、配列番号４８〜５３のいずれか１つに、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、ＵＢＰは、配列番号４８〜５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０２２９】
いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメイン、Ｃｐｆ１ドメイン、ＣａｓＸドメイン、ＣａｓＹドメイン、Ｃ２ｌドメイン、Ｃ２ｃ２ドメイン、Ｃ２ｃ３ドメイン、またはアルゴノートドメインである。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書に提供される任意のｎａｐＤＮＡｂｐである。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質のｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメインである。Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に提供される任意のＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９蛋白質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）であり得る。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意のＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９蛋白質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）は、本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼのいずれかに融合されてもよい。いくつかの態様において、融合蛋白質は、構造：
ＮＨ２−［ＮＡＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＢＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼ］−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＢＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］−［ＵＢＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＢＰ］−［ＮＡＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＡＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ＵＢＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼ］−［ＮＡＰ］−［ＵＢＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼ］−［ＵＢＰ］−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［シチジンデアミナーゼ］−［ＵＢＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＡＰ］−［ＵＢＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＵＢＰ］−［ＮＡＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＵＢＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＵＢＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＡＰ］−［ＵＢＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［シチジンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＵＢＰ］−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［シチジンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＵＢＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＵＢＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ＮＡＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＢＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］−［ＵＢＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＢＰ］−［ＮＡＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＵＢＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ＮＡＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ＵＢＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ＵＢＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ＮＡＰ］−［ＵＢＰ］−ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［シチジンデアミナーゼ］−［ＵＢＰ］−［ＮＡＰ］−ＣＯＯＨ
を含む。
【０２３０】
いくつかの態様において、シチジンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）、ＵＢＰ、およびＮＡＰを含む融合蛋白質は、リンカー配列を包含しない。いくつかの態様において、リンカーは、シチジンデアミナーゼドメインと、ｎａｐＤＮＡｂｐ、ＮＡＰ、および／またはＵＢＰの間に存在する。いくつかの態様において、リンカーは、ｎａｐＤＮＡｂｐと、シチジンデアミナーゼドメイン、ＮＡＰ、および／またはＵＢＰの間に存在する。いくつかの態様において、リンカーは、ＮＡＰと、シチジンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、および／またはＵＢＰの間に存在する。いくつかの態様において、リンカーは、ＵＢＰと、シチジンデアミナーゼ、ｎａｐＤＮＡｂｐ、およびＮＡＰの間に存在する。 いくつかの態様において、上の一般構成において使用される「−」は、任意のリンカーの存在を示す。いくつかの態様において、リンカーは、本明細書に、例えば、「リンカー」と題する項において、提供される任意のリンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、１と２００の間のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、リンカーは、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜８０、１〜１００、１〜１５０、１〜２００、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜６０、５〜８０、５〜１００、５〜１５０、５〜２００、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜８０、１０〜１００、１０〜１５０、１０〜２００、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜８０、２０〜１００、２０〜１５０、２０〜２００、３０〜４０、３０〜５０、３０〜６０、３０〜８０、３０〜１００、３０〜１５０、３０〜２００、４０〜５０、４０〜６０、４０〜８０、４０〜１００、４０〜１５０、４０〜２００、５０〜６０、５０〜８０、５０〜１００、５０〜１５０、５０〜２００、６０〜８０、６０〜１００、６０〜１５０、６０〜２００、８０〜１００、８０〜１５０、８０〜２００、１００〜１５０、１００〜２００、または１５０〜２００のアミノ酸長を含む。いくつかの態様において、４、１６、３２、または１０４アミノ酸長を含むリンカー。
いくつかの態様において、
ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２）、ＳＧＧＳ（配列番号１０３）、
ＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳ（配列番号１０７）、
ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号１０８）、
ＧＧＳＧＧＳＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０９）、
またはＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２０）
のアミノ酸配列を含むリンカー。
いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２）を含み、それはＸＴＥＮリンカーとしてもまた言及されることがある。
【０２３１】
ヌクレアーゼプログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質および塩基除去酵素（ＢＥＥ）を含む融合蛋白質
本開示のいくつかの側面は、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、および塩基除去酵素を含む、融合蛋白質を提供する。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質は、塩基編集因子である。いくつかの態様において、塩基除去酵素（ＢＥＥ）は、シトシン、チミン、アデニン、グアニン、またはウラシル塩基除去酵素である。いくつかの態様において、塩基除去酵素（ＢＥＥ）は、シトシン塩基除去酵素である。いくつかの態様において、ＢＥＥはチミン塩基除去酵素である。いくつかの態様において、塩基除去酵素は、天然に生じるＢＥＥに少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、塩基除去酵素は、配列番号６５または６６のいずれか１つに少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、塩基除去酵素は、配列番号６５または６６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０２３２】
いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメイン、Ｃｐｆ１ドメイン、ＣａｓＸドメイン、ＣａｓＹドメイン、Ｃ２１ドメイン、Ｃ２ｃ２ドメイン、Ｃ２ｃ３ドメイン、またはアルゴノートドメインである。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐは、本明細書に提供される任意のｎａｐＤＮＡｂｐである。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意の融合蛋白質のｎａｐＤＮＡｂｐは、Ｃａｓ９ドメインである。Ｃａｓ９ドメインは、本明細書に提供される任意のＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９蛋白質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）であり得る。いくつかの態様において、本明細書に提供される任意のＣａｓ９ドメインまたはＣａｓ９蛋白質（例えば、ｄＣａｓ９またはｎＣａｓ９）は、本明細書に提供されるシチジンデアミナーゼのいずれかに融合されてもよい。いくつかの態様において、融合蛋白質は、構造：
ＮＨ２−［ＢＥＥ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＢＥＥ］−ＣＯＯＨ；
を含む。
【０２３３】
いくつかの態様において、融合蛋白質は、核酸ポリメラーゼ（ＮＡＰ）をさらに含む。いくつかの態様において、ＮＡＰは、真核生物の核酸ポリメラーゼである。
いくつかの態様において、ＮＡＰは、ＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、損傷乗り越えポリメラーゼ活性を有する。いくつかの態様において、ＮＡＰは、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、Ｒｅｖ７、Ｒｅｖ１複合体、ポリメラーゼイオタ、ポリメラーゼカッパ、またはポリメラーゼエタである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、真核生物のポリメラーゼアルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、エタ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミュー、またはニューである。いくつかの態様において、ＮＡＰは、核酸ポリメラーゼ（例えば、損傷乗り越えＤＮＡポリメラーゼ）に、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＮＡＰは、本明細書に提供される任意の核酸ポリメラーゼに少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、ＮＡＰは、配列番号５４〜６４のいずれか１つに少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一であるアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの態様において、ＮＡＰは、配列番号５４〜６４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質は、構造：
ＮＨ２−［ＢＥＥ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＢＥＥ］−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＡＰ］−［ＢＥＥ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ＮＡＰ］−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＢＥＥ］−ＣＯＯＨ；
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＮＡＰ］−［ＢＥＥ］−ＣＯＯＨ；または
ＮＨ２−［ｎａｐＤＮＡｂｐ］−［ＢＥＥ］−［ＮＡＰ］−ＣＯＯＨ
を含む。
【０２３４】
いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）、およびＢＥＥを含む融合蛋白質は、リンカー配列を包含しない。いくつかの態様において、ｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）、ＢＥＥ、およびＮＡＰを含む融合蛋白質は、リンカー配列を包含しない。いくつかの態様において、リンカーは、ｎａｐＤＮＡｂｐとＢＥＥの間に存在する。いくつかの態様において、リンカーは、ＢＥＥとＮＡＰおよび／またはｎａｐＤＮＡｂｐの間に存在する。いくつかの態様において、リンカーは、ＮＡＰとＢＥＥおよび／またはｎａｐＤＮＡｂｐとの間に存在する。いくつかの態様において、リンカーは、ｎａｐＤＮＡｂｐとＢＥＥおよび／またはＮＡＰとの間に存在する。いくつかの態様において、上の一般構成において使用される「−」は、任意のリンカーの存在を示す。いくつかの態様において、リンカーは、例えば、「リンカー」と題する項においてなど、本明細書に提供される任意のリンカーである。いくつかの態様において、リンカーは、１と２００の間のアミノ酸を含む。いくつかの態様において、リンカーは、１〜５、１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、１〜５０、１〜６０、１〜８０、１〜１００、１〜１５０、１〜２００、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜４０、５〜６０、５〜８０、５〜１００、５〜１５０、５〜２００、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜８０、１０〜１００、１０〜１５０、１０〜２００、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜８０、２０〜１００、２０〜１５０、２０〜２００、３０〜４０、３０〜５０、３０〜６０、３０〜８０、３０〜１００、３０〜１５０、３０〜２００、４０〜５０、４０〜６０、４０〜８０、４０〜１００、４０〜１５０、４０〜２００、５０〜６０、５０〜８０、５０〜１００、５０〜１５０、５０〜２００、６０〜８０、６０〜１００、６０〜１５０、６０〜２００、８０〜１００、８０〜１５０、８０〜２００、１００〜１５０、１００〜２００、または１５０〜２００のアミノ酸長を含む。いくつかの態様において、４、１６、３２、または１０４アミノ酸長を含むリンカー。いくつかの態様において、
ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２）、ＳＧＧＳ（配列番号１０３）、
ＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳ（配列番号１０７）、
ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号１０８）、
ＧＧＳＧＧＳＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０９）、または
ＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２０）
のアミノ酸配列を含むリンカー。いくつかの態様において、リンカーは、ＸＴＥＮリンカーとしてもまた言及されてもよい、アミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２）を含む。
【０２３５】
核局在配列（ＮＬＳ）を含む融合蛋白質
いくつかの態様において、本明細書において提供される融合蛋白質は、１つ以上の核標的配列、例えば、核局在配列（ＮＬＳ）をさらに含む。いくつかの態様において、ＮＬＳは、ＮＬＳを含む、細胞核への蛋白質の移入を促進する（例えば、核輸送により）アミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、本明細書において提供される任意の融合蛋白質は、核局在配列（ＮＬＳ）さらに含む。いくつかの態様において、ＮＬＳは融合蛋白質のＮ末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳは融合蛋白質のＣ末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはｎａｐＤＮＡｂｐのＮ末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはｎａｐＤＮＡｂｐのＣ末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはＮＡＰのＮ末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはＮＡＰのＣ末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはシチジンデアミナーゼのＮ末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはシチジンデアミナーゼのＣ末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはＵＢＰのＮ末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはＵＢＰのＣ末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはＢＥＥのＮ末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはＢＥＥのＣ末端に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳは１つ以上のリンカーを介して融合蛋白質に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳはリンカーを用いないで融合蛋白質に融合されている。いくつかの態様において、ＮＬＳは本明細書において提供される、または参照されるＮＬＳ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ＮＬＳは配列番号４１または配列番号４２で示されるアミノ酸配列を含む。追加の核局在配列は当分野において知られており、当業者にとって明らかであるだろう。例えば、ＮＬＳ配列はPlank et al.,PCT/EP2000/011690において記載されており、その内容は例示的な核局在配列の開示についての参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの態様において、ＮＬＳは、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４１）、ＭＤＳＬＬＭＮＲＲＫＦＬＹＱＦＫＮＶＲＷＡＫＧＲＲＥＴＹＬＣ（配列番号４２）、ＫＲＴＡＤＧＳＥＦＥＳＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４３）、ＫＲＧＩＮＤＲＮＦＷＲＧＥＮＧＲＫＴＲ（配列番号４４）、ＫＫＴＧＧＰＩＹＲＲＶＤＧＫＷＲＲ（配列番号４５）、ＲＲＥＬＩＬＹＤＫＥＥＩＲＲＩＷＲ（配列番号４６）、またはＡＶＳＲＫＲＫＡ（配列番号４７）を含む。
【０２３６】
リンカー
ある種の態様においては、リンカーが、本明細書に記載の蛋白質または蛋白質ドメインのいずれかをリンクするために用いられ得る。リンカーは共有結合ほども単純であり得、または、これは長さが多くの原子であるポリマーリンカーであり得る。ある種の態様において、リンカーはポリペプチド（polypeptide）であるか、またはアミノ酸に基づく。他の態様において、リンカーはペプチド様ではない。ある種の態様において、リンカーは共有結合である（例えば、炭素−炭素結合、ジスルフィド結合、炭素−ヘテロ原子結合など）。ある種の態様において、リンカーはアミド結合の炭素−窒素結合である。ある種の態様において、リンカーは、環状または非環状の、置換または無置換の、分岐または非分岐の、脂肪族またはヘテロ脂肪族リンカーである。ある種の態様において、リンカーはポリマー性である（例えば、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリアミド、ポリエステルなど）。ある種の態様において、リンカーはアミノアルカン酸のモノマー、二量体、またはポリマーを含む。ある種の態様において、リンカーはアミノアルカン酸を含む（例えば、グリシン、エタン酸、アラニン、ベータ−アラニン、３−アミノプロパン酸、４−アミノ酪酸、５−ペンタン酸など）。ある種の態様において、リンカーはアミノヘキサン酸（Ａｈｘ）のモノマー、二量体、またはポリマーを含む。ある種の態様において、リンカーは炭素環部分に基づく（例えば、シクロペンタン、シクロヘキサン）。他の態様において、リンカーはポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）を含む。他の態様において、リンカーはアミノ酸を含む。ある種の態様において、リンカーはペプチドを含む。ある種の態様において、リンカーはアリールまたはヘテロアリール部分を含む。ある種の態様において、リンカーはフェニル環に基づく。リンカーは、ペプチドからリンカーへの求核剤の取り付けを促すための官能部分（例えば、チオール、アミノ）を包含し得る。いずれかの求電子剤がリンカーの一部として用いられ得る。例示的な求電子剤は、活性エステル、活性アミド、マイケルアクセプター、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化アリール、ハロゲン化アシルおよびイソチオシアネートを包含し、しかしこれらに限定されない。
【０２３７】
いくつかの態様において、リンカーはアミノ酸（単数）または、複数のアミノ酸（複数）（例えば、ペプチドまたは蛋白質）である。いくつかの態様において、リンカーは結合（例えば、共有結合）、有機分子、基、ポリマー、または化学部位である。いくつかの態様において、リンカーは５〜１００アミノ酸長である。例としては、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０〜３５、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜６０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、または１５０〜２００アミノ酸長である。より長いまたは短いリンカーもまた、企図される。いくつかの態様において、リンカーは、ＸＴＥＮリンカーとも言及されることのあるアミノ酸配列ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、アミノ酸配列ＳＧＧＳ（配列番号１０３）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、（ＳＧＧＳ）ｎ（配列番号１０３）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１０４)、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１０５）、（Ｇ）ｎ（配列番号１２１）、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号１０６）、（ＧＧＳ）ｎ（配列番号１２２）、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２）、ＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２０）、または、（ＸＰ）ｎモチーフ（配列番号１２３）、またはそれらのいずれの組み合わせを含み、ここで、ｎは、独立して１と３０との間の整数であり、およびここでＸは、任意のアミノ酸である。いくつかの態様において、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。いくつかの態様において、リンカーは、ＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳ（配列番号１０２）、およびＳＧＧＳ（配列番号１０３）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、ＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳ（配列番号１０７）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、ＳＧＧＳＳＧＧＳＳＧＳＥＴＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＳＧＧＳＳＧＧＳ（配列番号１０８）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、ＧＧＳＧＧＳＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＳＰＡＧＳＰＴＳＴＥＥＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＴＥＰＳＥＧＳＡＰＧＴＳＥＳＡＴＰＥＳＧＰＧＳＥＰＡＴＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０９）を含む。いくつかの態様において、リンカーは、ＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１２０）を含む。
【０２３８】
核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）は、ガイド核酸と複合する
本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される融合蛋白質のいずれか、および融合蛋白質のｎａｐＤＮＡｂｐに結合したガイド核酸を含む複合体を提供する。本開示のいくつかの側面は、本明細書において提供される、任意の融合蛋白質、および融合蛋白質のＣａｓ９ドメイン（例えば、ｄＣａｓ９、ヌクレアーゼ活性型Ｃａｓ９、またはＣａｓ９ニッカーゼ）に結合したガイドＲＮＡを含む複合体を提供する。
【０２３９】
いくつかの態様において、ガイド核酸（例えば、ガイドRNA）は、１５〜１００ヌクレオチドの長さであり、標的配列に対して相補的である少なくとも１０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、標的配列に対して相補的である１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個の一続きのヌクレオチドの配列を含む。いくつかの態様において、標的配列はＤＮＡ配列である。いくつかの態様において、標的配列は、ＲＮＡ配列である。いくつかの態様において、標的配列は、哺乳動物のゲノムにおける配列である。いくつかの態様において、標的配列は、ヒトのゲノムの中の配列である。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、古典的なＰＡＭ配列（ＮＧＧ）に、直ちに隣接する。いくつかの態様において、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、疾患や異常に関連するガイド核酸に相補的である。いくつかの態様において、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、本明細書に提供される任意の疾患または異常に関する変異を有する疾患または障害に関する配列に相補的である。いくつかの態様において、ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、本明細書に提供される疾患または障害にする任意の遺伝子に相補的である。
【０２４０】
融合蛋白質を使用する方法
本開示の、いくつかの側面は、本明細書に提供される任意の融合蛋白質（例えば塩基編集因子）、またはガイド核酸（例えば、ｇＲＮＡ）および本明細書に提供される融合蛋白質（例えば、塩基編集因子）を含む、複合体を使用する方法を提供する。例えば、本開示のいくつかの側面は、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を、本明細書において提供される融合蛋白質または塩基編集因子のいずれかと、および、少なくとも１つのガイド核酸（ｅ．ｇ．ガイドＲＮＡ）と接触させる方法を提供し、ここにおいて、該ガイド核酸（例えば、ガイドＲＮＡ）は、約１５〜１００ヌクレオチド長であり、標的配列に対して相補的である、少なくとも１０の一続きのヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、古典的なｓｐＣａｓ９ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）に、直ちに隣接する。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、古典的なｓｐＣａｓ９ＰＡＭ配列（ＮＧＧ）に、直ちに隣接しない。いくつかの態様において、標的配列の３’末端は、ＡＧＣ、ＧＡＧ、ＴＴＴ、ＧＴＧ、またはＣＡＡ配列に、直ちに隣接する。
【０２４１】
いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は、疾患または障害に関する配列を含む。いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は、疾患または障害に関連する点変異を含む。いくつかの態様において、融合蛋白質の活性（例えば、ｎａｐＤＮＡｂｐ、シチジンデアミナーゼ、およびウラシル結合蛋白質ＵＢＰ）、または複合体は、点変異の修正という結果になる。いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は、疾患または障害に関連するＧ→Ｃ、またはＣ→Ｇ点変異を含み、およびここで、変異Ｃ塩基の脱アミノ化および／または切除は、疾患または障害に関連しない配列という結果になる。いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は、蛋白質をコードし、および点変異はコドンに存在し、野生型コドンと比較して、変異コドンによってコードされるアミノ酸における変化という結果になる。いくつかの態様において、変異Ｃの脱アミノ化は、変異コドンによってコードされるアミノ酸の変化という結果になる。いくつかの態様において、変異Ｃの脱アミノ化は、野生型アミノ酸をコードするコドンという結果になる。いくつかの態様において、接触は、対象中のin vivoである。いくつかの態様において、対象は、疾患または障害を有するか、あるいは、疾患または障害を有すると診断されている。いくつかの態様において、疾患または障害は、２２ｑ１３．３欠失症候群；２−メチル−３−ヒドロキシ酪酸尿；３メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ１欠損症；３−メチルクロトニルＣｏＡカルボキシラーゼ２欠損症；３−メチルグルタコン酸尿症２型；３−メチルグルタコン酸尿症３型；３−メチルグルタコン酸尿症Ｖ型；３−オキソ−５アルファステロイドデルタ４−デヒドロゲナーゼ欠損症；４６、ＸＹ性転換、タイプ１；４６、ＸＹ真の雌雄同体、ＳＲＹ関連；４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ欠損症；異常な顔の形; 異常なグリコシル化（CDG IIa）；軟骨形成２型；色覚異常２；色覚異常５；色覚異常６；色覚異常７；後天性ヘモグロビンＨ病；先端仙骨指症Ｉ型；ホルモン抵抗性を伴う、または伴わない先端骨形成不全１；ホルモン抵抗性を伴うまたは伴わない、先端骨形成不全症２；先端顔面骨異形成症、シンシナティ型；ＡＣＴＨ抵抗；急性神経障害性ゴーシェ病；アダムス・オリバー症候群；アダムス・オリバー症候群２；アダムス・オリバー症候群４；アダムス・オリバー症候群６；アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症；アデニロコハク酸リアーゼ欠損症；思春期ネフロン癆；副腎白質ジストロフィー；成人性接合部表皮水疱症；成人神経セロイドリポフスチン症；ＡＤＵＬＴ症候群；加齢黄斑変性１４；加齢黄斑変性３；アイカルディ・グティエール症候群５；アイカルディ・グティエール症候群６；アレクサンダー病；アルファサラセミア；アルファＢクリスタリン障害；アルポート症候群、常染色体劣性；アルポート症候群、Ｘ連鎖劣性；小児期の交互の片麻痺２；アルツハイマー病；アルツハイマー病、１型；アルツハイマー病、３型；エナメル質形成不全症、低成熟型、ＩＩＡ３；エナメル質形成不全、１Ｅ型；アーミッシュ致死小頭症；ＡＭＬ−急性骨髄性白血病；アミロイド形成性トランスサイレチンアミロイドーシス；筋萎縮性側索硬化症１６、若年性��筋萎縮性側索硬化症６、常染色体劣性；筋萎縮性側索硬化症１型；筋萎縮性側索硬化症１０型；筋萎縮性側索硬化症２型；筋萎縮性側索硬化症９型；アンデルセンタウィル症候群；貧血、先天性赤血球生成異常、タイプＩＶ；Ｇ６ＰＤ欠乏による貧血、非球状赤血球溶血；貧血、鉄芽球性、ピリドキシン不応性、常染色体劣性；エンジェルマン症候群；腎症、動脈瘤、筋肉のけいれんを伴う遺伝性血管障害；免疫不全を伴う無汗性外胚葉性形成異常；無爪症；生殖器の異常とステロイド合成障害を伴うアントリー・ビクスラー症候群；生殖器の異常またはステロイド合成障害のないアントリー・ビクスラー症候群；再生不良性貧血；アポリポタンパク質ａ−ｉ欠乏症；アルギナーゼ欠損症；不整脈誘発性右室心筋症；不整脈誘発性右室心筋症、１１型； 不整脈誘発性右室心筋症、９型；乳児期の動脈石灰化；動脈蛇行症候群；先天性遠位１型多関節症；関節不整脈腎機能障害胆汁うっ滞症候群；関節不整脈、遠位、５ｄ型；アート症候群（Arts syndrome）；アスパルチルグルコサミン尿症、フィンランド型；窒息性胸部ジストロフィー２；ビタミンＥ欠乏症を伴う運動失調；毛細血管拡張性運動失調症候群；毛細血管拡張性運動失調症様障害；アテオステオジェネシス（Atelosteogenesis）１型；心房細動；心房細動、家族性、１０；心房中隔欠損４；球果萎縮症；ＡＴＲ−Ｘ症候群；非典型溶血性尿毒症症候群１；聴神経障害、常染色体劣性、１；耳介顆症候群１；自己免疫疾患、多系統、乳児発症；自己免疫性リンパ増殖性症候群、１Ａ型；自己免疫性リンパ増殖性症候群、Ｖ型；常染色体優性夜間前頭葉てんかん；ミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性進行性外眼筋麻痺２；ミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性進行性外眼筋麻痺３；ミトコンドリアＤＮＡ欠失を伴う常染色体優性進行性外眼筋麻痺４；常染色体劣性先天性魚鱗癬１；常染色体劣性先天性魚鱗癬５；常染色体劣性低リン血症性ビタミンＤ難治性くる病；アクセンフェルト・リーガー異常；アクセンフェルト・リーガー症候群１型；アクセンフェルト・リーガー症候群タイプ３；バラター・ウィンター症候群１；バーデ・ビードル症候群；バーデ・ビードル症候群１０；バーデ・ビードル症候群１２；バーデ・ビードル症候群２；バーデ・ビードル症候群３；バーデ・ビードル症候群４；バーデ・ビードル症候群９；バーター症候群出生前２型；バーター症候群、４ｂ型；基底核疾患、ビオチン反応性；ベッカー型筋ジストロフィー；良性家族性新生児発作１；良性家族性新生児乳児発作；良性再発性肝内胆汁うっ滞２；バーナード・スーリエ症候群、Ｂ型；ベータサラセミア；ビエッティ結晶性角膜網膜ジストロフィー；胆汁酸合成障害、先天性、２；ビオチニダーゼ欠損症；出血性障害、血小板型、１９；血液型−−ルテラン阻害剤；ブルーム症候群；ボスリー・サリー・アロレイン症候群；ブーシェノイハウザー症候群；短指症Ｂ２型；乳がん；乳−卵巣がん、家族性１；乳−卵巣がん、家族性２；気管支拡張症；ブラウン・ビアレット・ヴァン・レーレ（Brown-Vialetto-Van Laere）症候群；ブラウン・ビアレット・ヴァン・レーレ（Brown-Vialetto-Van Laere）症候群２；水疱性魚鱗癬性紅皮症；バーキットリンパ腫；カンプトメリック異形成；キャップミオ��チー２；炭水化物欠乏性糖タンパク質症候群Ｉ型；炭水化物欠乏糖タンパク質症候群ＩＩ型；結腸癌；膵臓癌；心不整脈；致死性乳児チトクロームＣオキシダーゼ欠損症、心脳筋障害３；心臓顔面皮膚症候群；心臓顔面皮膚症候群２；心筋症；心筋症、制限的；カーニー複合体、１型；カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ欠損症；白内障１；感音難聴、ダウン症候群のような顔の外観、低身長および精神遅滞を伴う白内障、先天性；カテコールアミン作動性多形性心室頻拍；中核疾患；中枢性早熟症；小脳性運動失調および性腺機能低下性性腺機能低下症；進行性外眼筋麻痺を伴う小児小脳性運動失調症；小脳性運動失調、難聴、ナルコレプシー；脳アミロイド血管障害、ＡＰＰ関連；皮質下梗塞および白質脳症を伴う脳常染色体優性動脈障害；脳海綿状奇形１；脳性麻痺、痙性四肢麻痺、１；脳−下顎−下顎症候群；神経セロイドリポフスチン症１；神経セロイドリポフスチン症１０；神経セロイドリポフスチン症ニューロン６；神経セロイドリポフスチン症７；神経セロイドリポフスチン症８；神経セロイドリポフスチン症、１３；神経セロイドリポフスチン症、２；Ch\xc3\xa9diak−ヒガシ症候群；チャー症候群；シャルコー・マリー・トゥース病；シャルコー・マリー・トゥース病１Ｂ型；シャルコー・マリー・トゥース病２Ｂ型；シャルコー・マリー・トゥース病２Ｄ型；シャルコー・マリー・トゥース病２Ｉ型；シャルコー・マリー・トゥース病２Ｋ型；シャルコー・マリー・トゥース病、軸索、声帯麻痺、常染色体劣性；シャルコー・マリー・トゥース病、脱髄、１Ｃ型；シャルコー・マリー・トゥース病、優性中間型（dominant intermediate）Ｅ；シャルコー・マリー・トゥース病、２型；シャルコー・マリー・トゥース病、２Ａ２型；シャルコー・マリー・トゥース病、４Ｃ型；シャルコー・マリー・トゥース病、４Ｇ型；シャルコー・マリー・トゥース病、ＩＡ型；シャルコー・マリー・トゥース病、ＩＥ型；シャルコー・マリー・トゥース病、ＩＦ型；シャルコー・マリー・トゥース病、Ｘ連鎖劣性、５型；ＣＨＡＲＧＥ関連；小児症候群；コレスタノール貯蔵疾患；コレステロールモノオキシゲナーゼ（側鎖切断）欠損症； 軟骨異形成症１、Ｘ連鎖劣性；チョップ症候群；染色体９ｑ欠失症候群；慢性肉芽腫症、Ｘ連鎖；毛様体ジスキネジア、原発、１４；毛様体ジスキネジア、原発、１９；毛様体ジスキネジア、原発性、３；毛様体ジスキネジア、原発性、７；頭蓋骨異形成症；コケイン症候群Ａ型；Coffin-Lowry症候群；コーエン症候群；コール疾患；大腸がん、遺伝性、非ポリポーシス、１型；グラニューロマを伴う複合型細胞性体液性免疫欠損；複合型酸化的リン酸化欠損症２４；複合型酸化的リン酸化欠損症９；分類不能型免疫不全症７；補体成分９欠乏症；錐体杆体ジストロフィー１０；錐体杆体ジストロフィー１１；錐体杆体ジストロフィー３；錐体杆体ジストロフィー５；錐体杆体ジストロフィー６；先天性副腎形成不全、Ｘ連鎖；先天性巨核球性血小板減少症；先天性無虹彩症；先天性輸精管両側欠如；先天性白内障、難聴、および神経退化；先天性拘縮性くも膜症；先天性葉酸吸収欠損；グリコシル化の先天性障害１Ｋ型；グリコシル化の先天性障害１Ｍ型；グリコシル化の先天性障害１��型；グリコシル化の先天性障害１ｕ型；グリコシル化の先天性障害２Ｃ型；先天性全身性リポジストロフィー１型；先天性全身性リポジストロフィー２型；先天性心疾患、複数型、１、Ｘ連鎖；先天性ラクターゼ欠損症；先天性ＱＴ延長症候群；脳および眼の異常を伴う先天性筋ジストロフィー・ジストログリカノパシー、Ａ２型；脳および眼の異常を伴う先天性筋ジストロフィー・ジストログリカノパシー、Ａ７型；精神遅滞を伴う先天性筋ジストロフィー・ジストログリカノパチー、Ｂ１型；精神遅滞を伴う先天性筋ジストロフィー・ジストログリカノパチー、Ｂ２型；繊維型の不均衡を伴う先天性ミオパチー；先天性筋強直症、常染色体優性型；先天性筋強直症、常染色体劣性型；先天性定常夜盲、常染色体優性３；先天性定常夜間失明、１Ａ型；先天性定常夜間失明症、１Ｆ型；コプロポルフィリア；角膜ジストロフィー、フックス内皮、８；角膜上皮ジストロフィー；角膜の脆弱性、ケロト球、青い強膜、および関節の過剰運動；コーネリア・デ・ランゲ症候群１；コーネリア・デ・ランゲ症候群４；他の脳奇形３を伴う、皮質形成異常、複雑型；コルチゾン還元酵素欠損症１；カウデン症候群２；頭蓋外胚葉異形成１；頭蓋顔面難聴手症候群；頭蓋骨関節症；頭蓋癒合症；頭蓋癒合症３；頭蓋骨癒合症および歯の異常；クレアチン欠乏症、Ｘ連鎖；クリグラー・ナジャー症候群、１型；クルーゾン症候群；クリプトフタルモス症候群；停留精巣、片側性または両側性；クッシング指節癒合症；BeareおよびStevensonのCutis Gyrata症候群；シスタチオニン尿症；嚢胞性線維症；シスチン症、眼の非腎障害；チトクロームｃオキシダーゼ欠損症；ダノン疾患；難聴、常染色体優性１２；難聴、常染色体優性２０；難聴、常染色体劣性１Ａ；難聴、常染色体劣性６３；難聴、常染色体劣性８；難聴、常染色体劣性９；アセチルＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ欠損症；アルファ−マンノシダーゼ欠損症；フェロキシダーゼ欠損症；グリセロールキナーゼ欠損症；グアニジノエタテートメチルトランスフェラーゼ欠損症；ヒドロキシメチルグルタリルＣｏＡリアーゼ欠損症；ヨウ化物ペルオキシダーゼ欠損症；マロニルＣｏＡデカルボキシラーゼ欠損症；ＵＤＰグルコース−ヘキソース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ欠損症；音声および言語発達遅延；デルタサラセミア；Dent疾患１；デスブコイ
症候群；デスモステロール症；ＤＦＮＡ２非症候性難聴；糖尿病２型；糖尿病、インスリン依存性、２０；Digitorenocerebral症候群；拡張型心筋症１ＦＦ；拡張型心筋症１Ｇ；拡張型心筋症１Ｓ；拡張型心筋症１Ｘ；拡張型心筋症３Ｂ；シトクロムｐ４５０酸化還元酵素欠損によるステロイド生成障害；遠位遺伝性運動神経障害２Ｂ型；口内炎−リンパ浮腫症候群；ダッシュ症候群；デュシェンヌ型筋ジストロフィー；ディスケラット症先天性常染色体優性；先天性ディスケラット症X連鎖；先天性ディスケラット症、常染色体優性、２；先天性ディスケラット症、常染色体劣性、５；ジストニア１；ジストニア２７；ジストニア５、ドーパ反応型；高フェニルアラニン血症を伴うまたは伴わないジストニア、ドーパ反応性、常染色体劣性；早期乳児てんかん性脳症１３；早期乳児てんかん性脳症２；早期乳児てんかん性脳症８；早期乳児てんかん性脳症９；早期筋クローヌス脳症；外胚葉異形成合指症候群１；欠指症、外胚葉異形成、および口唇／口蓋裂症候群３；エーラース・ダンロス症候群、古典型；エーラース・ダンロス症候群、ヒドロキシリジン欠乏症；エーラース・ダンロス症候群、筋収縮型；エーラース・ダンロス症候群、４型；アイヒスフェルト型先天性筋ジストロフィー；エリプトサイトーシス３；子宮内膜癌；終板アセチルコリンエステラーゼ欠損症；前庭水道肥大症候群；エンテロキナーゼ欠損症；単純性表皮水疱症、ケブナー型；てんかん、夜間前頭葉、３型；てんかん、進行性筋クローヌス１Ａ（UnverrichtおよびLundborg）；てんかん、進行性筋クローヌス２ｂ；てんかん性脳症、早期乳児、１；てんかん性脳症、早期乳児、２４；てんかん性脳症、早期乳児、２８；てんかん性脳症、早期乳児、３１；骨端軟骨異形成、ミウラ型；突発性運動失調１型；突発性運動失調、６型；突発性疼痛症候群、家族性、３；赤血球増加症、家族性、２；赤血球増加症、家族性、３；運動失調を伴うエリスロケラット皮膚炎；滲出性硝子体網膜症１；滲出性硝子体網膜症５；Fabry疾患；Fabry疾患、心臓バリアント；第Ｖ因子および第ＶＩＩＩ因子、複合欠損症、２；蕁麻疹と難聴を伴う家族性アミロイド腎症；家族性乳がん；家族性寒冷蕁麻疹；家族性熱性けいれん８；家族性片麻痺片頭痛３型；家族性肥大型心筋症１；家族性肥大型心筋症１０；家族性肥大型心筋症１１；家族性肥大型心筋症２０；家族性肥大型心筋症２３；家族性肥大型心筋症４；家族性肥大型心筋症６；家族性形成不全、糸球体嚢胞腎；家族性乳児筋無力症；家族性若年性痛風；家族性地中海熱；骨髄性悪性腫瘍を伴う家族性血小板障害；家族性孔脳症；家族性皮膚ポルフィリン症；家族性内臓アミロイドーシス、オスタータグ型；ファンコニ貧血、補完グループＣ；ファンコニ貧血、補完グループＦ；ファンコニ貧血、補完グループＧ；ファンコニ貧血、補完グループＪ；ファンコニ貧血、補完グループＴ；ファーバー脂肪肉芽腫症；胎児ヘモグロビン量的形質遺伝子座１；胎児ヘモグロビン量的形質遺伝子座６；線維軟骨形成；精神遅滞を伴うまたは伴わない言語障害を伴う焦点てんかん；限局性糸球体硬化症６；中心窩形成不全および初老性白内障症候群；前鼻異形成１；前鼻異形成２；前頭側頭型認知症；フルクトースビホスファターゼ欠損症；フ���ラーゼ欠損症；ガラクトシルセラミドベータ−ガラクトシダーゼ欠損症；胆嚢疾患４；Gamstorp-Wohlfart症候群；ガングリオシドシアリダーゼ欠損症；ガングリオシドーシスＧＭ１  ３型；ガードナー症候群；赤血球生成異常を伴うＧＡＴＡ−１関連血小板減少症；Gaucher疾患；Gaucher疾患３Ｃ型；ゴーシェ病、周産期致死；Gaucher疾患、１型；熱性けいれんを伴う全身性てんかん、１型；熱性けいれんを伴う全身性てんかん、２型；熱性けいれんを伴う全身性てんかん、９型；ゲルストマン・シュトラウスラー・シャインカー症候群；グランツマン血栓症；緑内障１、開放隅角、Ｆ；緑内障、先天性；全体（global）発達遅延；グルココルチコイド欠乏症４；グルタル酸尿症、１型；グリコーゲン貯蔵疾患ＩＩＩａ；グリコーゲン貯蔵疾患ＩＶ、先天性神経筋；グリコーゲン貯蔵疾患ＩＸＢ；グリコーゲン貯蔵心臓の疾患、先天致死性；グリコーゲン貯蔵疾患、ＩＩ型；グリコーゲン貯蔵疾患、ＩＶ型；グリコーゲン貯蔵疾患、Ｖ型；グリコーゲン貯蔵疾患、ＶＩ型；グリコシルホスファチジルイノシトール欠乏症；灰色の血小板症候群；グリス細胞Ｉ症候群２型；発育と精神遅滞、下顎顔面骨異形成症、小頭症、口蓋裂；免疫不全を伴う成長ホルモン非感受性；ヘモクロマトーシス１型；ヘモクロマトーシス３型；ヘキソキナーゼ欠損による溶血性貧血；グルコースリン酸イソメラーゼ欠損による溶血性貧血、非球状赤血球症；アセルロプラスミン血症による全身性ヘモジデローシス；ヘンネカムリンパ管拡張症−リンパ浮腫症候群；遺伝性先天性末端皮膚炎；遺伝性血管浮腫１型；遺伝性乳がんおよび卵巣がん症候群；遺伝性がん素因症候群；遺伝性びまん性胃がん；スフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症；遺伝性第ＩＩ因子欠乏症；遺伝性第ＩＸ因子欠乏症；遺伝性第ＶＩＩＩ因子欠乏症；遺伝性第ＸＩ因子欠乏症；遺伝性フルクトスリア；遺伝性平滑筋腫症および腎細胞がん；Ｉ型遺伝性リンパ浮腫；遺伝性神経痛性筋萎縮症；遺伝性非ポリポーシス大腸がん５型；遺伝性非ポリポーシス大腸腫瘍；遺伝性膵炎；遺伝性傍神経節腫−褐色細胞腫症候群；遺伝性パイロポイキロサイトーシス；遺伝性感覚神経障害１Ｄ型；遺伝性鉄芽球性貧血；ヘテロタキシー、内臓、Ｘ連鎖；異所形成；ヒルシュスプルング疾患神経節芽細胞腫；組織球性骨髄性網状赤血球症；全前脳症１１；全前脳症２；全前脳症３；全前脳症４；ＭＴＨＦＲ欠乏によるホモシステイン血症；ＣＢＳ欠乏によるホモシスチン尿症；ハーラー症候群；甲状腺好酸性細胞癌；ハッチンソン・ギルフォード症候群；高カルシウム尿症、小児期、自然治癒；高コレステロール血症；過剰驚愕症３；遺伝性ハイパーエクプレシア；高フェリチン血症白内障症候群；高リポ蛋白質血症、Ｉ型；高リポ蛋白質血症、ＩＤ型；高リジン血症；高オルニチン血症−高アンモニア血症−ホモシトルリン尿症症候群；高プロインスリン血症；顔面中央部の突出、近視、精神遅滞、および骨の脆弱性を伴う重度の両眼隔離症；肥大型心筋症；低カルシウム血症、常染色体優性１；低カルシウム血症、常染色体優性１、バーター症候群；軟骨形成不全；鉄過剰を伴う低色素性小球性貧血；肝臓グリコーゲン合成酵素の欠損を伴う低血糖；嗅覚低下を伴うまたは伴わない性腺機能低下性性腺機能低下症１３；脱汗性Ｘ連鎖外胚葉形成異常；低カリウム血症の定期的な麻痺１；低マグネシウム血症１、腸；眼球の関与を伴う低マグネシウム血症５、腎；低マグネシウム血症、発作、および精神遅滞；低髄鞘形成性白質ジストロフィー７；乏歯症および／または低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を伴うまたは伴わない、低髄鞘形成性白質ジストロフィー８；低蛋白質血症、異化亢進性；甲状腺機能低下症、先天性、非甲状腺腫、１；甲状腺機能低下症、先天性、非甲状腺腫性、５；甲状腺機能低下症、先天性、非甲状腺腫性、６；貧毛症６；貧毛症−リンパ浮腫−毛細血管拡張症症候群；Ｉ細胞疾患； 尋常性魚鱗癬；特発性大脳基底核石灰化５；免疫不全１２；免疫不全２３；免疫不全２４；免疫不全３０；免疫不全３１ａ；免疫不全３１Ｃ；高ＩｇＭ１型の免疫不全；封入体ミオパチー２；乳児小脳網膜の変性；乳児ＧＭ１ガングリオシドーシス；乳児の低ホスファターゼ症；乳児眼振、Ｘ連鎖；インスリン抵抗性糖尿病および黒皮症；知的障害；中間型メープルシロップ尿疾患２型；侵襲性肺炎球菌感染症、再発性孤立、２；虹彩−角膜−線維柱形成不全；脳内の鉄蓄積；ジャクソン・ワイス症候群；ヤコブ・クロイツフェルト病；ジュベール症候群２３；若年性ＧＭ＞１＜ガングリオシドーシス；若年性ポリポーシス症候群；歌舞伎メイクアップ症候群；カルマン症候群３；カルマン症候群４；カルマン症候群５；カルマン症候群６；円錐角膜１；コールシュッター症候群；クーゲルベルク・ヴェランダー病；ラフォラ病；ランガー中等度異形成症候群；ラロン型孤立性ソマトトロピン欠損；ラーセン症候群、優性型；妊娠の母体急性脂肪肝を伴うLchad欠乏症；レーバー先天性黒内障１３；レーバー先天性黒内障４；レーバー先天性黒内障９；リー病；レオパード症候群；レオパード症候群１；レオパード症候群２；レプラショーニズム症候群；レリ・ヴァイル異軟骨症；レッシュ・ナイハン症候群；白質ジストロフィー、低髄鞘形成、６；運動失調を伴う白質脳症；脳幹および脊髄の関与および乳酸上昇を伴う白質脳症；白質消失を伴う白質脳症；ライディッヒ細胞無形成；リー・フラウメニ症候群１；肢帯型筋ジストロフィー；肢帯型筋ジストロフィー、１Ｂ型；肢帯型筋ジストロフィー、１Ｃ型；肢帯型筋ジストロフィー、１Ｅ型；肢帯型筋ジストロフィー、２Ａ型；肢帯型筋ジストロフィー、２Ｂ型；肢帯型筋ジストロフィー、２Ｅ型；肢帯型筋ジストロフィー、２Ｆ型；肢帯型筋ジストロフィー、２Ｌ型；肢帯筋ジストロフィー−ジストログリカノパチー、Ｃ１型；肢帯型筋ジストロフィー−ジストログリカノパチー、Ｃ１４型；肢帯型筋ジストロフィー−ジストログリカノパチー、Ｃ２型；肢帯型筋ジストロフィー−ジストログリカノパチー、Ｃ７型；滑脳症１；ＱＴ延長症候群１；ＱＴ延長症候群１３；ＱＴ延長症候群１５；ＱＴ延長症候群２；ＱＴ延長症候群９；ＱＴ延長症候群、ＬＱＴ１サブタイプ；長鎖３−ヒドロキシアシルＣｏＡ脱水素酵素欠損症；ロウ症候群；黄体形成ホルモン抵抗性、女性；リンパ増殖性症候群１；リンパ増殖性症候群１、Ｘ連鎖；リンチ症候群Ｉ；リンチ症候群ＩＩ；マクロ血小板減少症、家族性、バーナード・スリエ型；中心錐体に関与する黄斑ジストロフィー；マジード症候群；食道の悪性腫瘍；前立腺の悪性腫瘍；下顎骨異形成症；メープルシロップ尿疾患；メープルシロップ尿疾患１Ａ型；メープルシロップ尿疾患２型；マルファン症候群；マリー・ウンナの遺伝性貧毛症１；若年者の成人発症型２型糖尿病；若年者の成人発症型３型糖尿病；中鎖アシルＣｏＡ脱水素酵素；マイヤー・ゴーリン症候群５；メルニック・フレーザー症候群；ＭＥＮ２表現型：未分類；ＭＥＮ２表現型：不明；メンケス癖髪症候群；閉経期、自然、年齢、量的形質遺伝子座３；精神遅滞３０、Ｘ連鎖；橋と小脳の形成不全を伴う精神遅滞と小頭症；精神遅滞、常染色体優性１３；精神遅滞、常染色体優性１６；精神遅滞、常染色体優性２９；精神遅滞、常染色体優性３８；精神遅滞、常染色体優性７；精神遅滞、常染色体劣性３４；精神遅滞、常染色体劣性４９；精神遅滞、ステレオタイプ運動、てんかん、および／または脳奇形；精神遅滞、症候性、Claes-Jensen型、Ｘ連鎖；精神遅滞、Ｘ連鎖、症候群１３；精神遅滞、Ｘ連鎖、症候群３２；精神遅滞、Ｘ連鎖、症候群、レイモンド型；精神遅滞、Ｘ連鎖、症候群、ｗｕタイプ；精神遅滞−低張相症候群Ｘ連鎖、１；メロシン欠損先天性筋ジストロフィー；メタクロマチック白質ジストロフィー；骨幹端軟骨異形成症、シュミット型；メチルコバラミン欠乏症、cblgタイプ；メチルマロン酸尿症、ｍｕｔ（０）タイプ；小頭症および絨毛網膜症、常染色体劣性、２；絨毛網膜症、リンパ浮腫、または精神遅滞を伴うまたは伴わない小頭症；小球性貧血；陰茎；微小眼球症候群３；微小眼球症症候群５；分離した小眼球症３；分離した小眼球症６；孤立性小眼球症、コロボーマ７；糖尿病の微小血管合併症７；軽度の非ＰＫＵ高フェニルアラニン血症；ミトコンドリア複合体Ｉ欠損症；ミトコンドリア複合体ＩＩ欠損症；ミトコンドリア複合体ＩＩＩ欠損症；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群１３（脳筋障害型）；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群２；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群９（メチルマロン酸尿症を伴う脳筋障害）；ミトコンドリア短鎖エノイルＣｏＡヒドラターゼ欠損症；ミトコンドリア三機能性蛋白質欠損症；三好筋ジストロフィー１；三好筋ジストロフィー３；モール・トラネビャエル症候群；多彩異数性モザイク症候群；モワット・ウィルソン症候群；ムコリピドーシスＩＩＩガンマ；ムコ多糖症ＶＩ型；ムコ多糖症、ＭＰＳ−ＩＩ；ムコ多糖症、ＭＰ
Ｓ−ＩＩＩ−Ｂ；ムコ多糖症、ＭＰＳ−Ｉ−Ｓ；ムコ多糖症、ＭＰＳ−ＩＶ−Ａ；ムコ多糖症、ＭＰＳ−ＩＶ−Ｂ；ムンケ症候群；ムリブリーナニズム症候群；複数の先天異常；多発性内分泌腫瘍、１型；多発性内分泌腫瘍、２型；多発性内分泌腫瘍、２ａ型；多発性骨端異形成１；多発性骨端異形成症５；複数の外骨腫２型；多発性翼状片症候群エスコバール型；複数のスルファターゼ欠損症；角膜真皮の切断；筋無力症、肢帯、家族性；アセチルコリン受容体欠損症に関連する先天性筋無力症候群、９；アセチルコリン受容体欠損症に関連する、先天性筋無力症候群、９；シナプス前およびシナプス後欠損を伴う先天性筋無力症候群；先天性筋無力症候群、尿細管凝集２；筋無力症候群、先天性スローチャネル型；筋クローヌスてんかんミオパチー感覚性運動失調；筋クローヌス、家族性皮質；筋原線維性ミオパチー１；ミオキミア１；姿勢筋萎縮を伴う筋障害、Ｘ連鎖；ミオパチー、アクチン、先天性、過剰な細い筋フィラメント；ミオパチー、中心核の；ミオパチー、遠位、１；ミオパチー、分離したミトコンドリアの、常染色体優性；ミオパチー、体重の減少、Ｘ連鎖、早期発症、重度；先天性筋強直症；爪疾患、非症候性先天性、８；小眼球症４；ナルコレプシー７；ネイティブアメリカンミオパチー；ナバホ神経肝障害；ネマリンミオパチー３；新生児低血圧症；新生児のインスリン依存性糖尿病；シトリン欠乏による新生児肝内胆汁うっ滞；卵巣の腫瘍；腎結石／骨粗鬆症、低リン血症、２；ネフロン癆１６；ネフロン癆１８；ネフローゼ症候群、１０型；Neu-Laxova症候群１；脳鉄蓄積を伴う神経変性５；脳下垂体糖尿病尿崩症；ニコライデス・バライサー症候群；ニーマン・ピック病Ｃ１型；ニーマン・ピック病、Ａ型；ニーマン・ピック病、Ｂ型；ニーマン・ピック病、ｃ１型、少年型；埜中ミオパチー；非ケトン性高グリシン血症；ヌーナン症候群１；ヌーナン症候群５；ヌーナン症候群７；ヌーナン症候群８；提供されない；指定されていない；眼皮膚白皮症３型；眼咽頭筋ジストロフィー；眼異形成症；視神経萎縮９；視神経萎縮および白内障、常染色体優性；視神経低形成および中枢神経系の異常；口腔顔面デジタル症候群；オルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症；オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ欠損症；口腔顔面裂溝１１；オロファシオデジタル症候群６；オロト酸尿症；骨形成不全症１２型；骨形成不全症１３型；骨形成不全症ＩＩＩ型；正常な強膜を伴う骨形成不全、優性型；骨形成不全、劣性周産期致死；大理石骨病常染色体優性タイプ１；大理石骨病常染色体劣性７；耳口蓋デジタル症候群、Ｉ型；厚皮骨膜症症候群；パリスター・ホール症候群；パピヨン−レフ\ xc3 \ xa8vre症候群；傍神経節腫１；傍神経節腫４；副甲状腺癌；頭頂孔２；パーキンソン病１；パーキンソン病７；パーキンソン病９；発作性夜間ヘモグロビン尿症１；部分ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損症；剥離性皮膚症候群、先端部タイプ；Pelger-Hu \ xc3 \ xabtの異常；ペリツェウス・メルツバッハ病；ペンドレッド症候群；永久的な新生児糖尿病；ペルオキシソーム生合成障害６Ｂ；ペルオキシソーム生合成障害９Ｂ；ポイツ・ジェガーズ症候群；ファイファー症候群；フ��ニルケトン尿症；褐色細胞腫；ホスホグリセリン酸キナーゼ１欠損症；ホスホリボシルピロリン酸シンテターゼ超活性；感光性トリコチオジストロフィー；ピアソン症候群；色素性淡蒼球変性；ピットホプキンス症候群；ピットホプキンス様症候群２；下垂体依存性副腎皮質機能亢進症；下垂体ホルモン欠乏症、複合型１；下垂体ホルモン欠乏症、複合型４；下垂体ホルモン欠乏症，複合型５；血小板型出血障害１６；凝集性赤血球症候群；結節性多発動脈炎；多発性嚢胞腎疾患、乳児型；ポリグルコサン体ミオパチー２；多小脳回、両側前頭頭頂；多発神経障害、難聴、運動失調、網膜色素変性、白内障；先天性小脳形成不全、１Ｂ型；先天性小脳形成不全、１ｃ型；先天性小脳形成不全、９型；ポレッティボルトシャウザー症候群；軸前多指症２；早期の染色分体分離特性；早発性卵巣障害５；早発性卵巣不全７；早発性卵巣障害９；原発性常染色体劣性小頭症１；原発性常染色体劣性小頭症２；原発性常染色体劣性小頭症５；原発性常染色体劣性小頭症６；原発性毛様体ジスキネジア；原発性拡張型心筋症；原発性家族性肥大型心筋症；原発性高シュウ酸尿症、Ｉ型；原発性高シュウ酸尿症、ＩＩＩ型；原発性限局性皮膚アミロイドーシス１；原発性開放隅角緑内障若年発症１；原発性肺高血圧；原発性肺高血圧４；プリムローズ症候群；進行性骨化性筋炎；進行性硬化性ポリジストロフィー；増殖性血管障害および水頭症−水頭症症候群；Ｘ連鎖のプロペルジン欠乏症；プロピオン酸血症；疑似ハーラー多発性ジストロフィー；偽性低アルドステロン症１型常染色体優性；偽性低アルドステロン症２Ｂ型；偽性低アルドステロン症、２型；偽性副甲状腺機能低下症１Ａ型；弾性線維性仮性黄色腫；多発性凝固因子欠乏症を伴う弾性線維性仮性黄色腫；遺伝性出血性毛細血管拡張症に関する肺動脈高血圧；肺線維症および／または骨髄機能不全、テロメアに関する、２；濃化異骨症；ピリドキシン依存性てんかん；ピルビン酸デヒドロゲナーゼＥ１−アルファ欠損症；橈骨形成不全−血小板減少症候群；レイン症候群；ラソパシー；劣性ジストロフィー表皮水疱症；ライフェンシュタイン症候群；腎カルニチン輸送障害；腎細胞癌、乳頭、１；腎異形成；腎低尿酸血症２；溶血性貧血を伴う腎尿細管性アシドーシス；網膜錐体ジストロフィー３Ａ；色素性網膜炎；網膜色素変性症１０；網膜色素変性症１１；網膜色素変性症１４；色素性網膜炎２；網膜色素変性症２５；網膜色素変性症３３；網膜色素変性症３５；色素性網膜炎４；網膜色素変性症４３；網膜色素変性症５０；網膜色素変性症５６；色素性網膜炎７３；色素性網膜炎７４；網膜芽細胞腫；レット障害；レット症候群、先天性バリアント；レット症候群、zappellaバリアント；ラブドイド腫瘍素因症候群２；根粒性軟骨異形成症１型；リエンホフ症候群；ロバーツ−ＳＣ恐怖症症候群；ロビノー症候群；ＲＲＭ２Ｂ関連ミトコンドリア疾患；ルビンシュタイン・タイビ症候群；セートレ・ヒョツェン症候群；肩甲骨筋障害、Ｘ連鎖優性；シンドラー病、１型；シンドラー病、３型；シュナイダー結晶性角膜ジストロフィー；セッケル症候群１；発作；選択的歯非形成１（selective tooth agenesis 1）；シニア・ローケン症候群８；感覚性運動失調性ニューロパシー、構音障���、および眼不全麻痺；セサミ（SeSAME）症候群；アデノシンデアミナーゼ欠損症による重度の複合型免疫不全；重度の複合型免疫不全と小頭症、発育異常、電離放射線に対する感受性；重度の先天性好中球減少症；重度の先天性好中球減少症４、常染色体劣性；乳児期の重度の筋クローヌスてんかん；重度のＸ連鎖筋管ミオパチー；ＱＴ短縮症候群；ＱＴ短縮症候群２；非特異的骨格異常を伴う低身長；低身長、外耳道閉鎖、下顎形成不全、骨格異常；低身長、特発性、常染色体；低身長、特発性、Ｘ連鎖；多指症を伴う、または伴わない短指胸部形成異常１３；多指症を伴う短胸部形成異常１４；多指症を伴うまたは伴わない仮肋骨胸部形成異常３；シュプリンツェン症候群；シュプリンツェン・ゴールドバーグ症候群；シュワックマン症候群；シアル酸貯蔵疾患、重度の乳児性型；シアリドーシス、ＩＩ型；洞機能不全症候群２、常染色体優性；Ｂ細胞免疫不全、周期性発熱、および発達遅延を伴う鉄芽球性貧血；シトステロール血症；Sj \ xc3 \ xb6gren-Larsson症候群；スミス・レムリ・オピッツ症候群；ソースビー眼底変性症；ソトス症候群１；ソトス症候群２；痙性運動失調Charlevoix-Saguenay型；痙性対麻痺１１、常染色体劣性；痙性対麻痺３０、常染色体劣性；痙性対麻痺４、常染色体優性；痙性対麻痺５４、常染色体劣性；痙性対麻痺６；痙性対麻痺７；痙性対麻痺８；精子形成不全８；球状赤血球症４型；スフィンゴ脂質活性化剤蛋白質１欠乏症；スフィンゴミエリン／コレステロールリピドーシス；脊髄性筋萎縮症、下肢優位２、常染色体優性；脊髄性筋萎縮症、ＩＩ型；脊髄小脳失調症１４；脊髄小脳性運動失調２１；脊髄小脳性運動失調３５；脊髄小脳性運動失調３８；脊髄小脳性運動失調、常染色体劣性１２；脊椎肋骨異骨症２；関節弛緩を伴う骨幹端異形成；脊椎骨幹端骨異形成、パキスタン型；先天性脊椎骨端異形成症；錐体杆体ジストロフィーを伴う脊椎骨幹端骨異形成；頭頸部の扁平上皮癌；シュタルガルト病１；シュタルガルト病３；スチール症候群；スティックラー症候群１型；硬い皮膚症候群（Stiff skin syndrome）；刺痛関連脈管障害、乳児発症；亜急性神経障害性ゴーシェ病；スクシニルＣｏＡアセトアセテートトランスフェラーゼ欠損症；スーパーオキシドジスムターゼ、細胞外の上昇；弁上大動脈狭窄；指節癒合症−短指症症候群；合指症９型；タンジール病；足根手根連合症候群；テイ・サックス疾患；テイ・サックス疾患、Ｂ１バリアント；Ｔ細胞前リンパ球性白血病；テンプル・バライサー症候群；腹部前軸短指症症候群；ファロー四徴；胸部大動脈瘤および大動脈解離；血小板減少症２；血小板減少症、Ｘ連鎖；血小板減少症、Ｘ連鎖、間欠性；活性化された蛋白質Ｃ耐性による血栓症；血栓症、遺伝性、蛋白質Ｃ欠乏、常染色体優性による；血栓症、遺伝性、蛋白質Ｃ欠乏、常染色体劣性による；甲状腺がん、非髄質、４；甲状腺機能障害１；甲状腺毒性の定期的な麻痺；ティーツ症候群；歯の無形成、選択的、３；歯の無形成、選択的、Ｘ連鎖、１；一過性新生児糖尿病１；一過性新生児糖尿病２；トリーチャーコリンズ症候群２；毛状指節異形成症Ｉ型；魚鱗癬を伴うトリグリセリド貯蔵疾患；トリオースリン酸イソメラーゼ欠損症；三指節親指；結節性硬化症１；結節性硬化症２；結節性硬化症候群；チロシナーゼ陰性眼皮膚白皮症；チロシナーゼ陽性の眼皮膚白皮症；チロシン血症２型；ウルリッヒ型先天性筋ジストロフィー；未分類；ウンフェルリヒト・ルントボルク症候群；アップショー・シュルマン症候群；ウリジン−５‘−一リン酸ヒドロラーゼ欠損症による、溶血性貧血；アッシャー症候群、１Ｄ型；アッシャー症候群、１Ｆ型；アッシャー症候群、２Ａ型；ファンデルワーデ症候群；多彩なポルフィリン症；大頭症と脳室肥大を有するベイター症候群(vater association)；心室中隔欠損３；ビタミンD依存性くる病、１型；ビタミンＤ依存性くる病、２型；ビタミンｋ依存性凝固因子、複合欠乏症、１；卵形ジストロフィー；フォン・ヒッペル・リンダウ症候群；フォン・ヴィルブランド病、２ｂ型；ワールデンブルグ症候群１型；ワールデンブルグ症候群２Ｅ型、神経学的関与なし；ワールデンブルグ症候群４Ａ型；ワールデンブルグ症候群４Ｂ型；ワールデンブルグ症候群４Ｃ型；ウォーカー・ワールブルグ先天性筋ジストロフィー；ウォーバーグマイクロ症候群３；いぼ、低ガンマグロブリン血症、感染症、および骨髄性細胞貯留；ウェルドニッヒ・ホフマン病；ウェルナー症候群；ウィアッカー症候群；ヴィーデマン・シュタイナー症候群；ウィンチェスター症候群；ウルフラム症候群２；遺伝性乾燥有口赤血球症(Xerocytosis)；色素性乾皮症、グループＤ；色素性乾皮症、グループＧ；Ｘ連鎖ガンマグロブリン血症；Ｘ連鎖遺伝性運動神経および感覚神経症；ステリルスルファターゼ欠損症を伴うＸ連鎖魚鱗癬；Ｘ連鎖精神遅滞４１；Ｘ連鎖精神遅滞９０；Ｘ連鎖脳室周囲の異所形成；Zimmermann-Laband症候群；またはZimmermann-Laband症候群２である。
【０２４２】
いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は、疾患または障害に関連する配列を含む。いくつかの態様において、標的ＤＮＡ配列は、疾患または障害に関連する点変異を含む。いくつかの態様において、疾患または障害に関連する点変異は、疾患または障害に関連する遺伝子である。いくつかの態様において、 疾患または障害に関連する遺伝子は、ＡＡＲＳ２、ＡＡＳＳ、ＡＢＣＡ１、ＡＢＣＡ４、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ６、ＡＢＣＣ６、ＡＢＣＣ８、ＡＢＣＤ１、ＡＢＣＧ８、ＡＢＨＤ１２、ＡＢＨＤ５、ＡＣＡＤＭ、ＡＣＡＴ１、ＡＣＥ、ＡＣＯ２、ＡＣＴＡ１、ＡＣＴＢ、ＡＣＴＧ１、ＡＣＴＮ２、ＡＣＶＲ１、ＡＣＶＲＬ１、ＡＤＡ、ＡＤＡＭＴＳ１３、ＡＤＡＲ、ＡＤＧＲＧ１、ＡＤＳＬ、ＡＦＦ４、ＡＧＡ、ＡＧＢＬ１、ＡＧＬ、ＡＧＰＡＴ２、ＡＧＲＮ、ＡＧＸＴ、ＡＩＰＬ１、ＡＫＲ１Ｄ１、ＡＬＡＤ、ＡＬＡＳ２、ＡＬＤＨ３Ａ２、ＡＬＤＨ７Ａ１、ＡＬＤＯＢ、ＡＬＧ１、ＡＬＰＬ、ＡＬＳ２、ＡＬＸ３、ＡＬＸ４、ＡＭＰＤ２、ＡＭＴ、ＡＮＫＳ６、ＡＮＯ５、ＡＰＣ、ＡＰＯＡ１、ＡＰＯＥ、ＡＰＰ、ＡＰＲＴ、ＡＱＰ２、ＡＲ、ＡＲＨＧＥＦ９、ＡＲＩＤ２、ＡＲＬ６、ＡＲＳＡ、ＡＲＳＢ、ＡＲＳＥ、ＡＲＸ、ＡＳＡＨ１、ＡＳＢ１０、ＡＳＰＭ、ＡＴＦ６、ＡＴＬ１、ＡＴＭ、ＡＴＰ１３Ａ２、ＡＴＰ１Ａ３、ＡＴＰ６Ｖ１Ｂ２、ＡＴＰ７Ａ、ＡＴＲ、ＡＴＲＸ、ＡＶＰ、Ｂ２Ｍ、Ｂ３ＧＡＬＴ６、ＢＡＡＴ、ＢＡＲＤ１、ＢＢＳ１０、ＢＢＳ１２、ＢＢＳ２、ＢＢＳ４、ＢＢＳ９、ＢＣＫＤＨＡ、ＢＣＫＤＨＢ、ＢＣＳ１Ｌ、ＢＥＳＴ１、ＢＨＬＨＡ９、ＢＩＣＤ２、ＢＬＭ、ＢＭＰ１、ＢＭＰ４、ＢＭＰＲ２、ＢＲＡＦ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ＢＲＩＰ１、ＢＴＤ、ＢＴＫ、Ｃ１０ｏｒｆ２、Ｃ１ＧＡＬＴ１Ｃ１、Ｃ５ｏｒｆ４２、Ｃ９、ＣＡ１、ＣＡＣＮＡ１Ｓ、ＣＡＬＭ２、ＣＡＮＴ１、ＣＡＰＮ３、ＣＡＳＫ、ＣＡＳＱ２、ＣＡＳＲ、ＣＡＶ３、ＣＢＳ、ＣＣＢＥ１、ＣＣＤＣ３９、ＣＤ４０ＬＧ、ＣＤＣ６、ＣＤＣ７３、ＣＤＨ１、ＣＤＨ２３、ＣＤＫＬ５、ＣＤＫＮ２Ａ、ＣＤＯＮ、ＣＥＣＲ１、ＣＥＮＰＪ、ＣＥＰ１２０、ＣＥＰ８３、ＣＦＰ、ＣＦＴＲ、ＣＨＡＴ、ＣＨＣＨＤ１０、ＣＨＤ７、ＣＨＲＮＡ１、ＣＨＲＮＢ２、ＣＨＲＮＧ、ＣＨＳＴ１４、ＣＨＳＹ１、ＣＬＣＮ１、ＣＬＣＮ２、ＣＬＣＮ５、ＣＬＣＮＫＡ、ＣＬＤＮ１６、ＣＬＤＮ１９、ＣＬＩＣ２、ＣＬＮ６、ＣＬＮ８、ＣＮＧＡ３、ＣＮＮＭ２、ＣＮＴＮＡＰ２、ＣＯＡ５、ＣＯＬ１１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ１Ａ２、ＣＯＬ２７Ａ１、ＣＯＬ２Ａ１、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ４Ａ５、ＣＯＬ５Ａ１、ＣＯＬ５Ａ２、ＣＯＬ６Ａ１、ＣＯＬ６Ａ３、ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬＱ、ＣＯＭＰ、ＣＰ、ＣＰＯＸ、ＣＰＴ１Ａ、ＣＰＴ２、ＣＲ２、ＣＲＡＤＤ、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＲＨ、ＣＲＸ、ＣＲＹＡＢ、ＣＳＦ１Ｒ、ＣＳＴＢ、ＣＴＨ、ＣＴＬＡ４、ＣＴＮＳ、ＣＴＰＳ１、ＣＴＳＣ、ＣＴＳＤ、ＣＴＳＦ、ＣＴＳＫ、ＣＵＬ３、ＣＸＣＲ４、ＣＹＢＢ、ＣＹＰ１Ｂ１、ＣＹＰ２７Ａ１、ＣＹＰ２７Ｂ１、ＣＹＰ４Ｆ２２、ＣＹＰ４Ｖ２、ＣＹＰ７Ｂ１、ＤＡＲＳ２、ＤＢＴ、ＤＣＬＲＥ１Ｃ、ＤＣＸ、ＤＤＨＤ２、ＤＥＳ、ＤＧＵＯＫ、ＤＨＣＲ２４、ＤＨＣＲ７、ＤＫＣ１、ＤＬＧ３、��ＬＬ４、ＤＭＤ、ＤＭＰ１、ＤＮＡＨ１１、ＤＮＡＨ５、ＤＮＡＪＢ６、ＤＮＡＪＣ１９、ＤＮＭ１、ＤＮＭ２、ＤＮＭＴ１、ＤＯＣＫ６、ＤＯＫ７、ＤＯＬＫ、ＤＰＡＧＴ１、ＤＰＭ２、ＤＳＣ２、ＤＳＰ、ＤＹＮＣ１Ｈ１、ＤＹＮＣ２Ｈ１、ＤＹＲＫ１Ａ、ＤＹＳＦ、ＥＣＥＬ１、ＥＣＨＳ１、ＥＤＡ、ＥＤＮ３、ＥＥＦ１Ａ２、ＥＦＨＣ１、ＥＦＴＵＤ２、ＥＧＬＮ１、ＥＨＭＴ１、ＥＩＦ２Ｂ５、ＥＬＮ、ＥＬＯＶＬ４、ＥＬＯＶＬ５、ＥＭＰ２、ＥＮＰＰ１、ＥＯＧＴ、ＥＲＣＣ２、ＥＲＣＣ８、ＥＳＣＯ２、ＥＴＦＤＨ、ＥＸＯＳＣ３、ＥＸＯＳＣ８、ＥＸＴ２、ＥＹＡ１、ＥＹＳ、Ｆ１２、Ｆ２、Ｆ５、Ｆ８、Ｆ９、ＦＡＭ２０Ｃ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＦ、ＦＡＮＣＧ、ＦＡＳ、ＦＢＬＮ５、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２、ＦＢＰ１、ＦＢＸＬ４、ＦＣＧＲ３Ｂ、ＦＧＦ８、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＨ、ＦＨＬ１、ＦＫＴＮ、ＦＬＣＮ、ＦＬＧ、ＦＬＮＡ、ＦＬＮＢ、ＦＬＴ４、ＦＬＶＣＲ２、ＦＯＸＣ１、ＦＯＸＥ１、ＦＯＸＧ１、ＦＯＸＬ２、ＦＲＡＳ１、ＦＲＭＤ７、ＦＴＬ、ＦＵＳ、Ｇ６ＰＣ３、Ｇ６ＰＤ、ＧＡＡ、ＧＡＢＲＡ１、ＧＡＢＲＧ２、ＧＡＤ１、ＧＡＬＣ、ＧＡＬＮＳ、ＧＡＬＴ、ＧＡＭＴ、ＧＡＲＳ、ＧＡＴＡ１、ＧＡＴＡ６、ＧＢＡ、ＧＢＡ２、ＧＢＥ１、ＧＣＤＨ、ＧＣＨ１、ＧＣＫ、ＧＤＡＰ１、ＧＤＩ１、ＧＦＡＰ、ＧＧＣＸ、ＧＨＲ、ＧＪＡ８、ＧＪＢ１、ＧＪＢ２、ＧＫ、ＧＬＢ１、ＧＬＩ３、ＧＬＲＡ１、ＧＭＰＰＢ、ＧＮＡＩ３、ＧＮＡＳ、ＧＮＡＴ１、ＧＮＥ、ＧＮＰＴＡＢ、ＧＮＰＴＧ、ＧＰＩ、ＧＰＩＨＢＰ１、ＧＰＴ２、ＧＲＩＡ３、ＧＲＩＮ２Ａ、ＧＲＩＮ２Ｂ、ＧＲＩＰ１、ＧＲＮ、ＧＳＣ、ＧＵＣＹ２Ｄ、ＧＹＧ１、ＧＹＳ２、Ｈ６ＰＤ、ＨＡＤＨＢ、ＨＢＢ、ＨＢＤ、ＨＢＧ１、ＨＢＧ２、ＨＣＮ１、ＨＣＮ４、ＨＥＳＸ１、ＨＥＸＡ、ＨＦＥ、ＨＦＭ１、ＨＧＳＮＡＴ、ＨＩＮＴ１、ＨＫ１、ＨＭＧＣＬ、ＨＮＦ１Ａ、ＨＮＦ１Ｂ、ＨＯＧＡ１、ＨＯＸＡ１、ＨＰＤ、ＨＰＧＤ、ＨＰＲＴ１、ＨＲ、ＨＳＤ１７Ｂ１０、ＨＳＰＢ１、ＩＤＳ、ＩＤＵＡ、ＩＦＴ１２２、ＩＦＴ８０、ＩＧＨＭＢＰ２、ＩＫＢＫＧ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＭＰＤＨ１、ＩＭＰＧ２、ＩＮＦ２、ＩＮＧ１、ＩＮＰＰＬ１、ＩＮＳＬ３、ＩＮＳＲ、ＩＲＦ６、ＩＲＸ５、ＩＳＰＤ、ＩＴＧＡ２Ｂ、ＩＴＧＢ３、ＩＴＫ、ＪＡＧＮ１、ＫＣＮＡ１、ＫＣＮＨ１、ＫＣＮＨ２、ＫＣＮＪ１、ＫＣＮＪ１０、ＫＣＮＪ１１、ＫＣＮＪ１８、ＫＣＮＪ２、ＫＣＮＪ５、ＫＣＮＫ３、ＫＣＮＱ１、ＫＣＮＱ２、ＫＣＮＱ４、ＫＤＭ５Ｃ、ＫＩＡＡ０１９６、ＫＩＡＡ０５８６、ＫＩＦ１１、ＫＩＦ１Ａ、ＫＩＦ２Ａ、ＫＩＳＳ１、ＫＩＳＳ１Ｒ、ＫＬＦ１、ＫＭＴ２Ａ、ＫＭＴ２Ｄ、ＫＲＡＳ、ＫＲＩＴ１、ＫＲＴ１、ＫＲＴ５、ＫＲＴ６Ａ、ＬＡＭＡ１、ＬＡＭＡ２、ＬＡＭＢ２、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＰ２、ＬＢＲ、ＬＣＴ、ＬＤＬＲ、ＬＩＰＡ、ＬＩＴＡＦ、ＬＭＢＲ１、ＬＭＮＡ、ＬＰＩＮ２、ＬＰＬ、ＬＲＩＴ３、ＬＲＰ５、ＬＲＲＣ６、ＬＲＴＯＭＴ、ＬＹＳＴ、ＬＹＺ、ＭＡＤ１Ｌ１、ＭＡＦ、ＭＡＬＴ１、ＭＡＮ２Ｂ１、ＭＡＰＫ１、ＭＡＳＴＬ、ＭＡＴＮ３、ＭＣ２Ｒ、ＭＣＣＣ１、ＭＣＣＣ２、ＭＣＦＤ２、ＭＣＭ８、ＭＣＯＬＮ１、ＭＣＰＨ１��ＭＥＣＰ２、ＭＥＦ２Ｃ、ＭＥＦＶ、ＭＥＮ１、ＭＥＳＰ２、ＭＥＴ、ＭＦＮ２、ＭＦＳＤ８、ＭＧＡＴ２、ＭＩＴＦ、ＭＫＫＳ、ＭＬＨ１、ＭＬＹＣＤ、ＭＭＡＣＨＣ、ＭＭＰ１４、ＭＯＧ、ＭＰＬ、ＭＰＶ１７、ＭＰＺ、ＭＲＥ１１Ａ、ＭＲＰＬ３、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６、ＭＳＲ１、ＭＳＸ１、ＭＴ−ＡＴＰ６、ＭＴＨＦＲ、ＭＴＭ１、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴＲ、ＭＵＳＫ、ＭＵＴ、ＭＹＢＰＣ３、ＭＹＣ、ＭＹＨ７、ＭＹＬ２、ＭＹＬ３、ＭＹＯ１Ｅ、ＭＹＯＣ、ＮＡＧＡ、ＮＡＧＬＵ、ＮＡＲＳ２、ＮＢＥＡＬ２、ＮＢＮ、ＮＤＰ、ＮＤＵＦＡ１、ＮＤＵＦＡ１３、ＮＤＵＦＡＦ３、ＮＤＵＦＳ８、ＮＥＦＬ、ＮＥＵ１、ＮＥＸＮ、ＮＦＩＸ、ＮＨＥＪ１、ＮＨＬＲＣ１、ＮＩＰＡ１、ＮＩＰＢＬ、ＮＫＸ２−５、ＮＬＲＰ３、ＮＭＮＡＴ１、ＮＮＴ、ＮＯＢＯＸ、ＮＯＧ、ＮＯＬ３、ＮＯＴＣＨ３、ＮＰＣ１、ＮＰＲ２、ＮＲ０Ｂ１、ＮＲ３Ｃ２、ＮＲ５Ａ１、ＮＲＸＮ１、ＮＳＤ１、ＮＳＤＨＬ、ＮＴ５Ｃ３Ａ、ＮＹＸ、ＯＡＴ、ＯＣＡ２、ＯＣＲＬ、ＯＦＤ１、ＯＰＡ３、ＯＰＣＭＬ、ＯＳＭＲ、ＯＴＣ、ＯＴＯＦ、ＯＴＸ２、ＯＸＣＴ１、ＰＡＦＡＨ１Ｂ１、ＰＡＨ、ＰＡＫ３、ＰＡＬＢ２、ＰＡＮＫ２、ＰＡＰＳＳ２、ＰＡＲＫ７、ＰＡＸ２、ＰＡＸ３、ＰＡＸ６、ＰＡＸ９、ＰＣＣＡ、ＰＣＣＢ、ＰＣＤＨ１５、ＰＣＤＨ１９、ＰＣＹＴ１Ａ、ＰＤＥ４Ｄ、ＰＤＥ６Ａ、ＰＤＥ６Ｂ、ＰＤＥ６Ｃ、ＰＤＥ６Ｈ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＨＡ１、ＰＥＴ１００、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ７、ＰＧＫ１、ＰＧＭ１、ＰＧＭ３、ＰＨＧＤＨ、ＰＨＫＢ、ＰＨＯＸ２Ｂ、ＰＩＥＺＯ１、ＰＩＧＭ、ＰＩＴＰＮＭ３、ＰＩＴＸ２、ＰＫＨＤ１、ＰＫＰ２、ＰＬＡ２Ｇ６、ＰＬＫ４、ＰＬＯＤ１、ＰＬＰ１、ＰＭＭ２、ＰＭＰ２２、ＰＭＳ２、ＰＮＰＬＡ６、ＰＯＬＧ、ＰＯＬＧ２、ＰＯＬＲ１Ａ、ＰＯＬＲ１Ｄ、ＰＯＬＲ３Ａ、ＰＯＬＲ３Ｂ、ＰＯＭＴ１、ＰＯＭＴ２、ＰＯＲ、ＰＯＵ１Ｆ１、ＰＰＯＸ、ＰＰＴ１、ＰＲＫＡＣＧ、ＰＲＫＡＧ２、ＰＲＫＡＲ１Ａ、ＰＲＫＣＧ、ＰＲＮＰ、ＰＲＯＣ、ＰＲＯＫ２、ＰＲＯＫＲ２、ＰＲＰＦ３１、ＰＲＰＳ１、ＰＲＳＳ５６、ＰＳＡＰ、ＰＳＥＮ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＮ１１、ＰＵＲＡ、ＰＶＲＬ４、ＰＹＧＬ、ＰＹＧＭ、ＲＡＢ１８、ＲＡＢ２７Ａ、ＲＡＢ７Ａ、ＲＡＤ２１、ＲＡＤ５１Ｃ、ＲＡＦ１、ＲＡＧ２、ＲＡＸ、ＲＡＸ２、ＲＢ１、ＲＢＭ８Ａ、ＲＤＨ１２、ＲＥＴ、ＲＨＯ、ＲＩＴ１、ＲＮＦ２１６、ＲＯＧＤＩ、ＲＰ２、ＲＰＧＲ、ＲＰＳ６ＫＡ３、ＲＲＭ２Ｂ、ＲＳＰＯ４、ＲＵＮＸ１、ＲＵＮＸ２、ＲＹＲ１、ＲＹＲ２、ＳＡＣＳ、ＳＡＭＨＤ１、ＳＢＤＳ、ＳＣＮ１１Ａ、ＳＣＮ１Ａ、ＳＣＮ２Ａ、ＳＣＮ５Ａ、ＳＣＮ８Ａ、ＳＣＮＮ１Ｂ、ＳＤＨＡＦ１、ＳＤＨＢ、ＳＤＨＤ、ＳＥＭＡ４Ａ、ＳＥＰＮ１、ＳＥＲＰＩＮＦ１、ＳＥＲＰＩＮＧ１、ＳＥＴＢＰ１、ＳＧＣＢ、ＳＧＣＤ、ＳＨ２Ｄ１Ａ、ＳＨ３ＴＣ２、ＳＨＡＮＫ３、ＳＨＨ、ＳＨＯＸ、ＳＩＧＭＡＲ１、ＳＩＸ３、ＳＫＩ、ＳＬＣ１１Ａ２、ＳＬＣ１７Ａ５、ＳＬＣ１９Ａ３、ＳＬＣ１Ａ３、ＳＬＣ２２Ａ５、ＳＬＣ２５Ａ１３、ＳＬＣ２５Ａ１５、ＳＬＣ２５Ａ１９、ＳＬＣ２５Ａ２２、ＳＬＣ２５Ａ３８、ＳＬＣ２５Ａ４、ＳＬＣ２６Ａ４、ＳＬＣ２Ａ１０、ＳＬＣ２Ａ９、ＳＬＣ３３Ａ１��ＳＬＣ３５Ｃ１、ＳＬＣ３９Ａ４、ＳＬＣ４６Ａ１、ＳＬＣ４Ａ１、ＳＬＣ５２Ａ２、ＳＬＣ５２Ａ３、ＳＬＣ５Ａ５、ＳＬＣ６Ａ５、ＳＬＣ６Ａ８、ＳＬＣ９Ａ３Ｒ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＲＣＡ２、ＳＭＡＲＣＡ４、ＳＭＮ１、ＳＭＰＤ１、ＳＮＣＡ、ＳＮＲＮＰ２００、ＳＮＲＰＢ、ＳＯＤ１、ＳＯＤ３、ＳＯＸ９、ＳＰＡＳＴ、ＳＰＡＴＡ５、ＳＰＧ１１、ＳＰＧ７、ＳＰＴＢ、ＳＲＤ５Ａ２、ＳＲＹ、ＳＴＡＣ３、ＳＴＡＲ、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ５Ｂ、ＳＴＫ１１、ＳＴＳ、ＳＴＸ１Ｂ、ＳＴＸＢＰ１、ＳＵＣＬＧ１、ＳＵＭＦ１、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＡＺ、ＴＢＣ１Ｄ２４、ＴＢＸ１、ＴＢＸ２０、ＴＣＦ１２、ＴＣＦ４、ＴＥＣＴＡ、ＴＥＲＣ、ＴＥＲＴ、ＴＦＡＰ２Ｂ、ＴＦＲ２、ＴＧＦＢ３、ＴＧＦＢＩ、ＴＧＦＢＲ２、ＴＧＩＦ１、ＴＧＭ１、ＴＧＭ５、ＴＧＭ６、ＴＨＲＡ、ＴＨＲＢ、ＴＩＭＭ８Ａ、ＴＫ２、ＴＭＥＭ１７３、ＴＭＥＭ２４０、ＴＭＥＭ９８、ＴＭＰＲＳＳ１５、ＴＭＰＲＳＳ３、ＴＭＰＲＳＳ６、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ、ＴＮＮＩ３、ＴＮＮＴ１、ＴＯＲ１Ａ、ＴＰ５３、ＴＰ６３、ＴＰＩ１、ＴＰＭ１、ＴＰＭ２、ＴＰＭ３、ＴＰＯ、ＴＰＰ１、ＴＲＩＭ３７、ＴＲＮＴ１、ＴＲＰＭ６、ＴＲＰＳ１、ＴＳＣ１、ＴＳＣ２、ＴＳＨＲ、ＴＳＰＡＮ１２、ＴＴＰＡ、ＴＴＲ、ＴＵＢＢ４Ａ、ＴＵＬＰ１、ＴＹＭＰ、ＴＹＲ、ＴＹＲＰ１、ＵＢＥ２Ｔ、ＵＢＥ３Ａ、ＵＢＩＡＤ１、ＵＭＯＤ、ＵＭＰＳ、ＵＲＯＤ、ＵＳＨ２Ａ、ＵＳＰ８、ＶＤＲ、ＶＨＬ、ＶＰＳ１３Ｂ、ＶＰＳ３３Ｂ、ＶＷＦ、ＷＡＳ、ＷＤＲ１９、ＷＤＲ４５、ＷＤＲ６２、ＷＤＲ７２、ＷＦＳ１、ＷＮＫ４、ＷＮＴ５Ａ、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＷＷＯＸ、ＺＢＴＢ２０、ＺＣ４Ｈ２、ＺＤＨＨＣ９、ＺＥＢ２、ＺＦＰ５７、ＺＩＣ３、またはＺＮＦ４６９からなる群から選択される。
【０２４３】
いくつかの態様は、本明細書において提供される、ＤＮＡを編集する融合蛋白質を使用するための方法を、提供する。いくつかの態様において、融合蛋白質は、標的核酸塩基、例えばＣ残基を脱アミノ化することにより、核酸に点変異を導入するために用いられる。いくつかの態様において、融合蛋白質は、標的ＣをＵに脱アミノ化するために使用され、次いで、Ｃ残基によって以前に占有されていた脱塩基部位を作成するために除去される。いくつかの態様において、標的核酸塩基の脱アミノ化は、遺伝子欠損の修正、例えば遺伝子産物の機能喪失に至る点変異の修正をもたらす。いくつかの態様において、本明細書に提供される方法は、疾患または障害に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子またはアレイに不活性化する点変異を導入するために使用される。例としては、いくつかの態様において、がん遺伝子の中に、ＤＮＡ編集する融合蛋白質を用いて不活性化する点変異を導入する方法（例えば、増殖性疾患の処置において）が、本明細書において提供される。不活性化する変異は、いくつかの態様において、コードする配列において、未熟な終止コドンを、生成することがあり、それは、例えば、完全な長さの蛋白質の機能を欠く、正常より短い蛋白質という、正常より短い遺伝子産物の発現をもたらす。
【０２４４】
いくつかの態様において、本明細書において提供される方法の目的は、ゲノム編集をすることを介して、機能不全の遺伝子の機能を、取り戻すことである。本明細書において提供される、核酸塩基編集蛋白質は、例えば、ヒト細胞培養において、疾患に関係する変異を修正することによる遺伝子編集に基づくインビトロにおけるヒトの治療に、有効にされ得る。本明細書において提供される、核酸塩基編集する蛋白質、例えば、核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（例えば、Ｃａｓ９）およびシチジンデアミナーゼ、およびウラシル結合蛋白質を含む融合蛋白質が、Ｃ→ＧまたはＣ→Ｔの変異のいずれの一点を、修正することに使用され得ることは、当業者によって理解されるだろう。第１のケースにおいて、変異Ｃ→Ｕの脱アミノ化、および続くＵの切除は、変異を修正し、および後者のケースにおいて、Ｃ→Ｕの脱アミノ化、および変異Ｇと塩基対とされるＵの続く切除は、一順の複製に続き、変異を修正する。
【０２４５】
疾患関連遺伝子およびアレルの点変異の上首尾な修正は、治療および基礎研究に用途を有する遺伝子修正のための新たな戦略を開く。核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質（ｎａｐＤＮＡｂｐ）、シチジンデアミナーゼ、およびウラシル結合蛋白質を含む、開示される融合蛋白質のような、部位特異的な一塩基改変システムは、「逆」遺伝子治療にもまた用途を有し、ある種の遺伝子機能が故意に抑圧または喪失される。それらのケースにおいて、タンパク質における不活性化変異をもたらす、部位特異的に残基を変異させることは、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで蛋白質機能を喪失または阻害させるために使用され得る。
【０２４６】
本開示は、本明細書において提供されるＤＮＡ編集融合蛋白質によって修正され得る点変異に関連する、またはそれによって引き起こされる疾患と診断された、対象の処置のための方法を提供する。例えば、いくつかの態様においては、かかる疾患、例えば上に記載されているような点変異に関連するがんを有する対象に、点変異（例えば、Ｃ→ＧまたはＧ→Ｃ点変異）を修正する、または疾患関連遺伝子に不活性化変異を導入する塩基編集融合蛋白質の有効量を投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様において、疾患は増殖性疾患である。いくつかの態様において、疾患は遺伝子疾患である。いくつかの態様において、疾患は新生物疾患である。いくつかの態様において、疾患は代謝疾患である。いくつかの態様において、疾患はリソソーム蓄積症である。点変異を修正または疾患関連遺伝子に不活性化変異を導入することによって処置され得る他の疾患は、当業者には公知であろう。本開示はこの点で限定されない
【０２４７】
本開示は、病原性のＧ→ＣまたはＣ→Ｇの変異を含む遺伝子のリストを、提供する。かかる病原性のＧ→ＣまたはＣ→Ｇへの変異は、本明細書において提供される方法および組成物を使用することによって、修正されてもよく、例としては、ＣからＧに変異させること、および／またはＧからＣに変異させること、それによって遺伝子の機能を回復する。
【０２４８】
いくつかの態様において、融合蛋白質は、古典的なＰＡＭを認識し、したがって、隣接配列中の古典的なＰＡＭ、例えばＮＧＧでそれぞれ病原性のＧ→ＣまたはＣ→Ｇへの変異を修正することができる。例えば、古典的なＰＡＭを認識するＣａｓ９蛋白質は、配列番号６によって提供されるStreptococcus pyogenes Ｃａｓ９のアミノ酸配列または配列番号６のＲｕｖＣおよびＨＮＨドメインを含むそのフラグメントと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む。
【０２４９】
本明細書に提供されるｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９ドメイン）を含む融合蛋白質のいずれかを、標的部位、例えば編集される点変異を含む部位に標的化するために、例えばｓｇＲＮＡなどのガイドＲＮＡと共に融合蛋白質を共発現させることが典型的に必要であることは、当業者に明らかだろう。本明細書の他の箇所でより詳細に説明されるように、ガイドＲＮＡは、典型的には、Ｃａｓ９結合を可能にするｔｒａｃｒＲＮＡフレームワーク、およびＣａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合蛋白質に配列特異性を付与するガイド配列を含む。いくつかの態様において、ガイドＲＮＡは、構造５’−［ガイド配列］−ｇｕｕｕｕａｇａｇｃｕａｇａａａｕａｇｃａａｇｕｕａａａａｕａａａｇｇｃｕａｇｕｃｃｇｕｕａｕｃａａｃｕｕｇａａａａａｇｕｇｇｃａｃｃｇａｇｕｃｇｇｕｇｃｕｕｕｕｕ−３’（配列番号１１９）を含み、ここで、ガイド配列は、標的配列に相補的である配列を含む。いくつかの態様において、ガイド配列は、標的核酸に相補的な核酸配列を含む。ガイド配列は典型的には２０ヌクレオチド長である。Ｃａｓ９：核酸編集酵素／ドメイン融合蛋白質を特定のゲノム標的部位に標的化するための好適なガイドＲＮＡの配列は、本開示に基づいて当業者に明らかであろう。かかる好適なガイドＲＮＡ配列は、典型的には、編集される標的ヌクレオチドの上流または下流の５０ヌクレオチド以内の核酸配列に相補的であるガイド配列を含む。
【０２５０】
塩基編集因子効率
本開示のいくつかの側面は、ここで提供される塩基編集因子のいずれかが、インデルの有意な割合を生成することなしに特定のヌクレオチド塩基を改変することができるという認識に基づく。ここで用いられる「インデル」は、核酸へのヌクレオチド塩基の挿入または欠失を言う。かかる挿入または欠失は、遺伝子のコード領域内のフレームシフト変異に至り得る。いくつかの態様においては、核酸中に多数の挿入または欠失（すなわちインデル）を生成することなしに、核酸中の特定のヌクレオチドを効率的に改変する（例えば変異させるかまたは脱アミノ化する）塩基編集因子を創ることが望ましい。ある種の態様において、ここで提供される塩基編集因子のいずれかは、インデルと比べて、意図される改変（例えば、点変異または脱アミノ化）のより高い割合を生成することができる。いくつかの態様において、ここで提供される塩基編集因子は、１：１超である意図される点変異対インデルの比を生成することができる。いくつかの態様において、ここで提供される塩基編集因子は、少なくとも１．５：１、少なくとも２：１、少なくとも２．５：１、少なくとも３：１、少なくとも３．５：１、少なくとも４：１、少なくとも４．５：１、少なくとも５：１、少なくとも５．５：１、少なくとも６：１、少なくとも６．５：１、少なくとも７：１、少なくとも７．５：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも２００：１、少なくとも３００：１、少なくとも４００：１、少なくとも５００：１、少なくとも６００：１、少なくとも７００：１、少なくとも８００：１、少なくとも９００：１、もしくは少なくとも１０００：１、またはより多くである意図される点変異対インデルの比を生成することができる。意図される変異およびインデルの数は、いずれかの好適な方法、例えば下の例に用いられている方法を用いて決定され得る。いくつかの態様において、インデル頻度を計算するために、インデルが生じる可能性があるウインドウの両側に隣接する２つの１０ｂｐ配列に対する正確な一致について、配列決定リードがスキャンされる。正確に一致するものが見つからない場合、リードは分析から除外される。このインデルウインドウの長さが参照配列と正確に一致する場合、リードはインデルを含まないものとして分類される。インデルウインドウが参照配列より２塩基以上長いかまたは短い場合、配列決定のリードはそれぞれ挿入または欠失として分類される。
【０２５１】
いくつかの態様において、ここに提供される塩基編集因子は、核酸のある領域におけるインデルの形成を限定することが可能である。いくつかの態様において、領域は、塩基編集因子によって標的化されるヌクレオチド、または塩基編集因子によって標的化されるヌクレオチドの２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチド以内の領域である。いくつかの態様において、ここに提供される塩基編集因子のいずれかは、核酸のある領域におけるインデルの形成を、１％未満、１．５％未満、２％未満、２．５％未満、３％未満、３．５％未満、４％未満、４．５％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、または２０％未満に限定することが可能である。ある核酸領域において形成されるインデルの数は、核酸（例えば、細胞のゲノム中の核酸）が塩基編集因子に対して暴露される時間の量に依存し得る。いくつかの態様において、インデルの数または割合は、塩基編集因子に対する核酸（例えば、細胞のゲノム中の核酸）の暴露の少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも６時間、少なくとも１２時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、少なくとも４８時間、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも１０日、または少なくとも１４日の後に決定される。
【０２５２】
本開示のいくつかの側面は、ここで提供される塩基編集因子のいずれかが、意図されない点変異などの意図されない変異の有意な数を生成することなしに、核酸（例えば、対象のゲノム中の核酸）中の点変異などの意図される変異を効率的に生成することができるという認識に基づく。いくつかの態様において、意図される変異は、意図される変異を創るように特異的に設計されたｇＲＮＡに結合した特異的な塩基編集因子によって生成する変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、疾患または障害に関連する変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、疾患または障害に関連するシトシン（Ｃ）→グアニン（Ｇ）点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、疾患または異常に関連するグアニン（Ｇ）→シトシン（Ｃ）点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、遺伝子のコード領域内のシトシン（Ｃ）→グアニン（Ｇ）点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、遺伝子のコード領域内のグアニン（Ｇ）→シトシン（Ｃ）点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、ストップコドン、例えば未成熟ストップコドンを遺伝子のコード領域内に創る点変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、ストップコドンを消去する変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、遺伝子のスプライシングを変改する変異である。いくつかの態様において、意図される変異は、遺伝子の制御配列（例えば、遺伝子プロモーターまたは遺伝子リプレッサー）を変改する変異である。いくつかの態様において、ここで提供される塩基編集因子のいずれかは、１：１超である意図される変異対意図されない変異の比（例えば、意図される点変異：意図されない点変異）を生成することができる。いくつかの態様において、ここで提供される塩基編集因子のいずれかは、少なくとも１．５：１、少なくとも２：ｌ、少なくとも２．５：１、少なくとも３：ｌ、少なくとも３．５：１、少なくとも４：ｌ、少なくとも４．５：１、少なくとも５：１、少なくとも５．５：１、少なくとも６：１、少なくとも６．５：１、少なくとも７：１、少なくとも７．５：１、少なくとも８：１、少なくとも１０：１、少なくとも１２：１、少なくとも１５：１、少なくとも２０：１、少なくとも２５：１、少なくとも３０：１、少なくとも４０：１、少なくとも５０：１、少なくとも１００：１、少なくとも１５０：１、少なくとも２００：１、少なくとも２５０：１、少なくとも５００：１、もしくは少なくとも１０００：１、またはより多くである、意図される変異対意図されない変異の比（例えば、意図される点変異：意図されない点変異）を生成することができる。ここで「塩基編集因子効率」の項に記載されている塩基編集因子の特徴が、ここで提供される融合蛋白質、または融合蛋白質を使用する方法のいずれかに適用され得るということは理解されるはずである。
【０２５３】
核酸編集のための方法
本開示のいくつかの側面は、核酸を編集するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、核酸の核酸塩基（例えば、二本鎖ＤＮＡ配列の塩基対）を編集するための方法である。いくつかの態様において、方法は、ａ）核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ配列）の標的領域を、塩基編集因子（例えば、シチジンデアミナーゼおよびウラシル結合蛋白質に融合したＣａｓ９ドメイン）およびガイド核酸（例えばｇＲＮＡ）を含む複合体と接触させ、標的領域が標的の核酸塩基対を含むステップと、ｂ）前記標的領域において鎖分離を誘導するステップと、ｃ）標的領域の単一鎖上の前記標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基に変換するステップと、ｄ）第２の核酸塩基を切除し、それにより脱塩基部位を創り出すステップと、ｅ）第１の核酸塩基に対して相補的な第３の核酸塩基を、シトシン（Ｃ）である第４の核酸塩基によって置き換るステップを含む。いくつかの態様において、方法は、核酸中における２０％未満のインデル形成をもたらす。いくつかの態様においてステップｂが省かれるということは理解されるはずである。いくつかの態様において、第１の核酸塩基はシトシン（Ｃ）である。いくつかの態様において、第２の核酸塩基は脱アミノ化されたシトシンまたはウラシルである。いくつかの態様において、第３の核酸塩基はグアニンである。いくつかの態様において、第４の核酸塩基はシトシン（Ｃ）である。いくつかの態様において、第５の核酸塩基は、ステップ（ｄ）において、生成された脱塩基部位の中へ連結される。いくつかの態様において第５の核酸塩基はグアニン（Ｇ）である。いくつかの態様において、方法は、１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、１％、０．５％、０．２％未満、または０．１％未満のインデル形成をもたらす。いくつかの態様においては、意図される塩基対の少なくとも５％が編集される。いくつかの態様においては、意図される塩基対の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％が編集される。
【０２５４】
いくつかの態様において、標的ヌクレオチド中の意図される産物対意図されない産物の比は、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくは２００：１、またはより多くである。いくつかの態様において、意図される点変異対インデル形成の比は、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、もしくは１０００：１、またはより多くである。いくつかの態様において、切られる単一鎖（ニックが入る鎖）はガイド核酸にハイブリダイゼーションする。いくつかの態様において、切られる単一鎖は、第１の核酸塩基を含む鎖とは反対である。いくつかの態様において、塩基編集因子はＣａｓ９ドメインを含む。いくつかの態様において、塩基編集因子はニッカーゼ活性を含む。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対はＰＡＭ部位の上流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対はＰＡＭ部位の下流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である。いくつかの態様において、方法は古典的な（例えばＮＧＧ）ＰＡＭ部位を要求しない。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子はリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは長さが１〜２５アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは長さが５〜２０アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸である。いくつかの態様において、標的領域は標的ウインドウを含み、標的ウインドウは標的核酸塩基対を含む。いくつかの態様において、標的ウインドウは１〜１０ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的ウインドウは長さが１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１ヌクレオチドである。いくつかの態様において、標的ウインドウは長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドである。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は標的ウインドウ内にある。いくつかの態様において、標的ウインドウは、意図される編集された塩基対を含む。いくつかの態様において、方法は、ここで提供される塩基編集因子のいずれかを用いて行われる。いくつかの態様において、標的ウインドウは脱アミノ化ウインドウである。
【０２５５】
いくつかの態様において、本開示は、ヌクレオチドを編集するための方法を提供する。いくつかの態様において、本開示は、二本鎖ＤＮＡ配列の核酸塩基対を編集するための方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、ａ）二本鎖ＤＮＡ配列の標的領域を、塩基編集因子およびガイド核酸（例えばｇＲＮＡ）を含む複合体と接触させ、標的領域が標的核酸塩基対を含むこと、ｂ）前記標的領域において鎖分離を誘導すること、ｃ）標的領域の単一鎖上の前記標的核酸塩基対の第１の核酸塩基を第２の核酸塩基に変換すること、ｄ）第２の核酸塩基を切除し、それによって、脱塩基部位を創出すること、ｅ）第１の核酸塩基に対して相補的な第３の核酸塩基を、シトシン（Ｃ）である第４の核酸塩基によって置き換えることを含み、意図される編集された塩基対を生成する効率は少なくとも５％である。いくつかの態様においてステップｂが省かれるということは理解されるはずである。いくつかの態様においては、意図される塩基対の少なくとも５％が編集される。いくつかの態様においては、意図される塩基対の少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％が編集される。いくつかの態様において、方法は、１９％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、８％、６％、４％、２％、１％、０．５％、０．２％未満、または０．１％未満のインデル形成を引き起こす。いくつかの態様において、標的ヌクレオチドにおける意図される産物対意図されない産物の比は、少なくとも２：１、５：１、１０：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、もしくは２００：１、またはより多くである。いくつかの態様において、意図される点変異対インデル形成の比は、１：１、１０：１、５０：１、１００：１、５００：１、もしくは１０００：１、またはより多くである。いくつかの態様において、切られる単一鎖はガイド核酸にハイブリダーゼーションする。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子はニッカーゼ活性を含む。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対はＰＡＭ部位の上流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド上流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対はＰＡＭ部位の下流である。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、ＰＡＭ部位の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチド下流である。いくつかの態様において、方法は古典的な（例えばＮＧＧ）ＰＡＭ部位を要求しない。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子はリンカーを含む。いくつかの態様において、リンカーは長さが１〜２５アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは長さが５〜２０アミノ酸である。いくつかの態様において、リンカーは長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸である。いくつかの態様において、標的領域は標的ウインドウを含み、標的ウインドウは標的核酸塩基対を含む。いくつかの態様において、標的ウインドウは１〜１０ヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的ウインドウは長さが１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、または１ヌクレオチドである。いくつかの態様において、標的ウインドウは長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドである。いくつかの態様において、意図される編集された塩基対は、標的ウインドウ内に存在する。いくつかの態様において、標的ウインドウは意図される編集された塩基対を含む。いくつかの態様において、核酸塩基編集因子はここで提供される塩基編集因子のいずれか１つである。
【０２５６】
医薬組成物
本開示の他の側面は、ここに記載の、塩基編集因子、融合蛋白質、または融合蛋白質−ｇＲＮＡ複合体のいずれかを含む医薬組成物に関する。ここで使用される用語「医薬組成物」は、医薬用途のために処方された組成物を指す。いくつかの態様において、医薬組成物は薬学的に許容可能な担体をさらに含む。いくつかの態様において、医薬組成物は追加の薬剤（例えば、特異的送達、半減期の延長、または他の治療用化合物用）を含む。
【０２５７】
ここで使用されるとき、用語「薬学的に許容可能な担体」は、液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、潤滑剤、タルクマグネシウム、カルシウムまたは亜鉛ステアラート、ステアリン酸）などの薬学的に許容可能な材料、組成物またはビヒクル、または、化合物を身体の１つの部位（例えば送達部位）から別の部位（例えば器官、組織または身体の一部）に運搬または輸送することに関与する溶媒封入材料を意味する。薬学的に許容可能な担体は、製剤の他の成分と適合性であり、そして対象の組織に有害ではない（例えば、生理学的適合性、無菌性、生理学的ｐＨなど）という意味で「許容可能」である。薬学的に許容可能な担体として役立ち得る材料のいくつかの例は、以下を含む：（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖；（２）コーンスターチおよびポテトスターチなどのデンプン；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶セルロースおよび酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、およびタルク等の潤滑剤；（８）カカオバター、座剤用ワックス等の賦形剤；（９）ラッカセイ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油および大豆油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンガー溶液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの増量剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなどの血清成分；（２２）エタノールなどのＣ２〜Ｃ１２アルコール；および（２３）医薬製剤に使用される他の非毒性適合性物質。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、香味剤、芳香剤、防腐剤および酸化防止剤もまた製剤中に存在することができる。用語「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容可能な担体」などは、ここでは互換的に使用される。
【０２５８】
いくつかの態様において、医薬組成物は、例えば遺伝子編集のために、対象に送達するために製剤化される。ここに記載の医薬組成物の好適な投与経路は、限定されないが、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、経鼓室、臓器内、硬膜外、クモ膜下腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼周囲、腫瘍内、脳内、および脳室内の投与を含む。
【０２５９】
いくつかの態様において、ここに記載の医薬組成物は罹患部位（例えば腫瘍部位）に局所投与される。いくつかの態様において、ここに記載の医薬組成物は、注射によって、カテーテルによって、座薬によって、またはインプラントによって対象に投与され、インプラントは多孔性、非多孔性、またはゼラチン状材料であり、シアラスティック膜などの膜、または繊維を含む。
【０２６０】
他の態様において、ここに記載の医薬組成物は制御された放出システムで送達される。一態様において、ポンプを使用することができる（例えば、Langer, 1990, Science 249:1527-1533; Sefton, 1989, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574を参照）。別の態様において、ポリマー材料を使用することができる。（例えば、Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., CRC Press, Boca Raton, Fla., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., Wiley, New York, 1984); Ranger and Peppas, 1983, Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照。またLevy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105も参照。）他の制御された放出系は、例えば、上記のLangerに論じられている。
【０２６１】
いくつかの態様において、医薬組成物は、対象、例えばヒトへの静脈内または皮下投与に適した組成物として日常的な手順に従って製剤化される。いくつかの態様において、注射による投与のための医薬組成物は、滅菌等張水性緩衝の溶液である。必要に応じて医薬は、可溶化剤、および、注射部位の痛みを和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬も含み得る。一般に、成分は別々に供給されるか、または例えば活性薬剤の量を示すアンプルまたはサシェなどの密封容器中の乾燥凍結乾燥粉末または無水濃縮物などの単位剤形として一緒に混合されて供給される。医薬を注入により投与する場合、滅菌医薬品グレードの水または生理食塩水を含む注入ボトルを用いて投薬することができる。医薬組成物を注射により投与する場合、成分を投与前に混合することができるように、注射用滅菌水または食塩水のアンプルを提供することができる。
【０２６２】
全身投与用の医薬組成物は、液体、例えば、無菌食塩水、乳酸加リンガー液またはハンクス液であり得る。さらに、医薬組成物は固体形態であり、使用直前に再溶解または懸濁することができる。凍結乾燥形態もまた企図される。
【０２６３】
医薬組成物は、非経口投与にも適している、リポソームまたは微結晶などの脂質粒子またはベシクル内に含有させることができる。粒子は、組成物がその中に含まれている限り、単層または多層などの任意の好適な構造であり得る。化合物は、フソジェニック脂質ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、低レベル（５〜１０モル％）のカチオン性脂質を含有する「安定化プラスミド−脂質粒子」（ＳＰＬＰ）中に捕捉され、そしてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）コーティングによって安定化され得る（Zhang Y. P. et al., Gene Ther. 1999, 6:1438-47）。Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムメチルサルフェート、または「ＤＯＴＡＰ」などの正荷電脂質は、かかる粒子およびベシクルに特に好ましい。かかる脂質粒子の調製はよく知られている。例えば、米国特許第4,880,635号；第4,906,477号；第4,911,928号；第4,917,951号；第4,920,016号；および第4,921,757号を参照。これらのそれぞれは、参照によりここに組み込まれる。
【０２６４】
ここに記載の医薬組成物は、例えば単位用量として投与または包装することができる。本開示の医薬組成物に関して使用される場合の用語「単位用量」は、対象に対する単位投与量として好適な物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要な希釈剤、すなわち、担体またはビヒクルに関連して、所望の治療効果を生じるように計算された既定量の活性材料を含む。
【０２６５】
さらに、医薬組成物は、（ａ）凍結乾燥形態の本発明の化合物（例えば、融合蛋白質または塩基編集因子）を含有する容器、および（ｂ）注射用の薬学的に許容可能な希釈剤（例えば、滅菌水）を含有する第２の容器を含む医薬キットとして提供され得る。薬学的に許容可能な希釈剤は、本発明の凍結乾燥化合物の再構成または希釈に使用することができる。かかる容器（単数または複数）に任意に付随するのは、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の通知であり得、同通知は、人的管理のための製造、使用、または販売の機関による承認を反映する。
【０２６６】
別の側面において、上記の疾患の処置に有用な材料を含む製品が含まれる。いくつかの態様において、製品は容器およびラベルを含む。好適な容器は、例えば、瓶、バイアル、注射器、および試験管を含む。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料から形成することができる。いくつかの態様において、容器は、ここに記載の疾患を処置するのに有効であり、無菌アクセスポートを有してもよい組成物を保持する。例えば、容器は、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る。組成物中の活性剤は本発明の化合物である。いくつかの態様において、容器上のまたは容器に付随するラベルは、組成物が選択した疾患を処置するために使用されることを示す。製品はさらに、リン酸緩衝食塩水、リンガー液、またはデキストロース溶液などの薬学的に許容可能な緩衝液を含む第２の容器を含み得る。それはさらに、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用のための指示とともに添付文書を含む、商業的および使用者の観点から望ましい他の材料を含み得る。
【０２６７】
キット、 ベクター、細胞
この開示のいくつかの側面は、（ａ）本明細書に提供される任意の融合タンパク質をコードする核酸配列、および（ｂ）（ａ）の配列の発現を駆動する異種プロモーターを含む核酸コンストラクトを含むキットを提供する。いくつかの態様において、キットは、ガイドＲＮＡバックボーンをコードする発現コンストラクトをさらに含み、ここでコンストラクトは、標的配列と同一または相補的な核酸配列のガイドＲＮＡバックボーンへのクローニングを可能にするように位置するクローニング部位を含む。
【０２６８】
本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供される融合タンパク質のｎａｐＤＮＡｂｐ（例えば、Ｃａｓ９蛋白質）をコードするポリヌクレオチドを提供する。本開示のいくつかの側面は、かかるポリヌクレオチドを含む、ベクターを提供する。いくつかの態様において、ベクターは、ポリヌクレオチドの発現を駆動する異種プロモータを含む。
【０２６９】
本開示のいくつかの側面は、本明細書に提供される任意の融合蛋白質、本明細書に提供される任意の融合蛋白質をコードする核酸分子、本明細書に提供される任意の融合蛋白質およびｇＲＮＡを含む複合体、および／または本明細書に提供される任意のベクターを提供する。
【０２７０】
上記のレポーターシステムの例示的な態様の説明は、例示目的でのみ提供されており、限定的であることを意味していない。追加のレポーターシステム、例えば、上に詳細に記載されている例示的なシステムの変形形態もまた、本開示に包含される。
【０２７１】
例
脱塩基部位の生成を介するシトシン（Ｃ）→グアニン（Ｇ）塩基編集因子および操作された特異的な修復
ＨＥＫ２、ＲＮＦ２、およびＦＡＮＣＦ部位についてのシーケンシングデータは、下に与えられる。表示されるデータは、ウィンドウにおいて最も編集されたＣについての塩基編集値を表す。これはＨＥＫ２についてのＣ６、ＲＮＦ２についてのＣ６、およびＦＡＮＣＦについてのＣ６である。塩基編集の前および後の３つの異なる部位についての配列は、以下の通りである：
【化８９】
2020510439.tif 000126
；
【化９０】
2020510439.tif 000127
；および
【化９１】
2020510439.tif 000128
ＨＥＫ２およびＲＮＦ２の両方について、非標的鎖は、シーケンシングされた（この鎖は標的Ｃ’に相補的なＧ’を含有する）。ＦＡＮＣＦについて、標的鎖は、シーケンシングされた（この鎖は、標的Ｃ’ｓを含有する）。Ｃ→Ｔ塩基編集についての模式図（例えば、Ｃ→Ｔ塩基編集因子であるＢＥ３を使用する）およびＣ→Ｇ塩基編集は、図１および２において示される。特定のＤＮＡポリメラーゼは、脱塩基部に反対の塩基をＧと置き換えることが知られる。Ｃ→Ｇ塩基編集を達成する１つのストラテジーは、脱塩基部位の創造を誘導し、次いでかかるポリメラーゼを補充するまたは繋ぎとめ、脱塩基部位に反対のＧをＣによって置き換えることである。これは、ポリメラーゼのあらかじめ決定された塩基優先性に基づきＣおよびＴが切除されおよびすべてのポリメラーゼを用いて修復され得る場合、すべての編集因子に対するアクセスを提供し得るだろう。
【０２７２】
異なる融合コンストラクトは、下に要約され、および表１に示される。ＵｄｇＸは、最小のウラシル切除活性でウラシルにきつく結合すると知られるＵＤＧのアイソフォームである。ＵｄｇＸ＊は、Sangらによるin vitroアッセイによって、ウラシル切除活性を欠損すると観察されたＵｄｇＸ（Sang et al. NAR, 2015）の変異されたバージョンである。ＵｄＸ＿Ｏｎは、Sangらにおいて報告された同じin vitroアッセイにおいて増加するウラシル切除活性を有すると観察された別の変異されたバージョンのＵｄｇＸ（Sang et al. NAR, 2015）である。ＵＤＧは、脱塩基部位を創り出すＤＮＡからウラシルの切除を担う酵素である。Ｒｅｖ７は、脱塩基部位の反対にＣを組み込むと知られる、Ｒｅｖ１／Ｒｅｖ３／Ｒｅｖ７複合体の構成要素である。Ｒｅｖ１は、上に記載の複合体の酵素的構成要素である。ポリメラーゼアルファ、ベータ、ガンマ、デルタ、イプシロン、ガンマ、エタ、イオタ、カッパ、ラムダ、ミューおよびニューは、脱塩基部位の反対への塩基の組み込みに対して異なる優先性をもつ真核生物のポリメラーゼである。
【表１−１】
2020510439.tif 000129
【表１−２】
2020510439.tif 000130
例において使用されるコンストラクト：
ＢＥ＿完全長−これは、シチジンデアミナーゼ、ｎＣａｓ９、およびウラシルグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）ドメインを含む、Ｃ→Ｔ塩基編集因子コンストラクトである。
【化９２−１】
2020510439.tif 000131
【化９２−２】
2020510439.tif 000132
ＢＥ３＿ＮｏＵＧＩ−このコンストラクトは、ＵＧＩドメインを欠如する、上に記載のＢＥ３コンストラクトである。
【化９３−１】
2020510439.tif 000133
【化９３−２】
2020510439.tif 000134
Ｃａｓ９ニッカ―ゼ配列−ＢＥ３において使用される。
【化９４−１】
2020510439.tif 000135
【化９４−２】
2020510439.tif 000136
ｄＣａｓ９配列−ＢＥ２において使用される
【化９５】
2020510439.tif 000137
ＢＥ３＿ＵＤＧによってＵＧＩを置き換える、ＵｄｇＸバリアント、ポリメラーゼ  −  下のコンストラクトにおいて、ＮＬＳ配列は、下線付きによって同定されおよびリンカーは斜体によって同定される。下の配列において示される「［ＵＧＩ］」は、ＵＤＧ、ＵＤＧバリアント（例えば、ＵＤＧ、ＵｄｇＸ＊（Ｒ１０７Ｓ）、およびＵｄｇＸ＿Ｏｎ（Ｈ１０９Ｓ））、Ｒｅｖ７、およびＳｍｕｇ１が挿入された場所を同定する（ＢＥ３のＵＧＩよりむしろ）。下の配列において示される「［ポリメラーゼ］」は、ポリメラーゼ（例えば、Ｐｏｌベータ、Ｐｏｌラムダ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌミュー、Ｐｏｌイオタ、Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌアルファ、Ｐｏｌデルタ、Ｐｏｌガンマ、およびＰｏｌニュー）、およびＲｅｖ１が挿入された場所を同定する。
【化９６−１】
2020510439.tif 000138
【化９６−２】
2020510439.tif 000139
【化９７】
2020510439.tif 000140
Ｎ末端ＵＤＧ（ＵＤＧ（Ｔｙｒ１４７Ａｌａ）またはＵＤＧ（Ａｓｎ２０４Ａｓｐ）を挿入する）＋Ｃ末端におけるＣａｓ９ニッカーゼおよびポリメラーゼ  −  下のコンストラクトにおいて、ＮＬＳ配列は、下線付きで同定され、およびリンカーは斜体で同定される。下の配列において示される「［ＵＤＧバリアント］」は、ＵＤＧ  Ｔｙｒ１４７ＡｌａおよびＵＤＧ  Ａｓｎ２０４Ａｓｐ、が挿入された場所を同定する。下の配列において示される「［ポリメラーゼ］」は、ポリメラーゼ（例えば、Ｐｏｌベータ、Ｐｏｌラムダ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌミュー、Ｐｏｌイオタ、Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌアルファ、Ｐｏｌデルタ、Ｐｏｌガンマ、およびＰｏｌニュー）、およびＲｅｖ１が挿入された場所を同定する。
【化９８−１】
2020510439.tif 000141
【化９８−２】
2020510439.tif 000142
【０２７３】
例１：Ｃ→Ｇアプローチ１−脱塩基部位形成を増加する
脱塩基部位が、より効率的に生成される場合、Ｃ→Ｇ塩基編集経路を介するフラックスの合計は、増加するだろう。このアプローチにおいて使用される塩基編集因子の模式図表示が、図３および４に示される。ＵｄｇＸを使用し、最小のウラシル切除活性でウラシルにきつく結合すると同定されるＵＤＧの相同分子種は、Ｃ→Ｇ編集の量を増加する。特定の理論に束縛されることを望まないが、Ｕにほぼ共有結合するＵｄｇＸは、損傷乗り越えポリメラーゼタイプの修復を扇動する傷害を擬態する。さらに、ＵｄｇＸは、低いレベルの触媒活性を有し、それはきつい結合と組み合わせて、Ｕを切除しおよび脱塩基部位形成をもたらす。脱塩基部位形成は、オフターゲット生成物を許容し、およびこの損傷の優先的な生成は、より多くの生成物をもたらす。これは、異なる実験および塩基編集因子を介して指示され、そして図５および６において説明される。
【０２７４】
ＷＴ細胞におけるＨＥＫ２、ＲＮＦ２、およびＦＡＮＣＦ部位でのＣ→Ｇ塩基編集の結果は、７つの塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＊；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏn；ＢＥ２＿ＵＤＧ；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用して、図７〜１５において示される。それらの図は、標準のＣ→Ｔ編集からの配列の動揺(perturbation)に対し、高、中、および低寛容性を有する３つの代表の部位での最も編集された位置（Ｃ６）におけるＣ→Ｇ塩基編集についての結果を示す。
【０２７５】
種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥＵＤＧ＿ＵｄｇＸ；ＢＥ２＿ＵＮＧ；ＢＥ３＿ＵＮＧ；ＢＥ２ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）を使用するＵＤＧ−／−細胞におけるＨＥＫ２、ＲＮＦ２、およびＦＡＮＣＦ部位でのＣ→Ｇ塩基編集の結果が、図１６〜２４において示される。
【０２７６】
種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ２＿ＵＮＧ；ＢＥ３＿ＵＮＧ；ＢＥ２ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）を使用するＲｅｖ１−／−細胞におけるＨＥＫ２、ＲＮＦ２、およびＦＡＮＣＦ部位でのＣ→Ｇ塩基編集の結果が、図２５〜３０において示される。
【０２７７】
種々のＣ→Ｇ塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ２＿ＵＮＧ；ＢＥ３＿ＵＮＧ；ＢＥ２ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；およびＳＭＵＧ１）を使用する３つのそれぞれの細胞タイプ（ＷＴ、ＵＤＧ−/−、およびＲＥＶ１−／−細胞）におけるＨＥＫ２、ＲＮＦ２、およびＦＡＮＣＦ部位でのＣ→Ｇ塩基編集因子の結果は、図３１および３２において要約される。
【０２７８】
例２：Ｃ→Ｇアプローチ２−脱塩基部位の反対へのＣ組み込みを増加する
脱塩基部位の反対へのＣ組み込みについての優先性の増加は、全体のＣ→Ｇ塩基編集の増加をもたらすはずである。このアプローチについての模式図およびこのアプローチに使用される塩基編集因子は、図３３および３４において説明される。Ｃ→Ｇ塩基編集のためのこのアプローチに使用され得る種々のポリメラーゼは、図３５において示される。簡単には、脱塩基部位の生成は、Ｃから非Ｔ生成物の形成をもたらす。Ｒｅｖ１はｄＣトランスフェラーゼ活性を有する。この経路を除くこと、またはどのように脱塩基傷害が修復されるかを変えることは、新しい塩基編集因子をもたらすはずである。この経路がこの生成物の形成を単独で担う場合、Ｒｅｖ１−／−ノックアウト細胞株は、Ｃ→Ｇ編集を欠損するはずである。種々のポリメラーゼの融合は、脱塩基部位へ反対の修復についてのポリメラーゼ優先性に基づき、反対の鎖の修復をもたらし、Ｃ→Ｇ塩基編集を増加することをもたらすはずである。例示的な塩基編集因子は、図３６において説明される。
【０２７９】
種々の塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ２＿ＵＤＧ；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用するＷＴ細胞におけるＨＥＫ２、ＲＮＦ２、およびＦＡＮＣＦ部位でのＣ→Ｇ塩基編集の結果は、図３７〜３９において示される。
【０２８０】
ヒトポリメラーゼη、ι、κ、およびＲＥＶ１による、脱塩基部位およびＧの反対への１塩基組み込みについての安定した状態の運動パラメータは、表２において与えられる。Choi et al. J mol Bio. 2010、を参照）。
【表２】
2020510439.tif 000143
【０２８１】
ヒトポリメラーゼαおよびδ／ＰＣＮＡによる脱塩基部位およびＧの反対への１塩基組み込みについての安定した状態の運動パラメータは、表３において与えられる。
【表３】
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【表４】
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【０２８２】
例３：Ｃ→Ｇアプローチ３−脱塩基形成およびＣ組み込みの両方を増加する
増加されるＣ→Ｇ塩基編集のために脱塩基形成およびＣ組み込みの両方を増加するための塩基編集因子の模式図が、図４０において説明される。コンストラクトに繋ぎ留められるポリメラーゼの追加、特にＰｏｌカッパは、Ｃ→Ｇ塩基編集を増加する。ＰｏｌカッパまたはＰｏｌイオタのいずれかにより繋ぎ留められるコンストラクトを使用する、ＨＥＫ２、ＲＮＦ２およびＦＡＮＣＦ部位での塩基編集の結果は、図４１に示される。ＷＴ細胞におけるシトシン残基での、ＨＥＫ２、ＲＮＦ２、およびＦＡＣＦ部位における、追加のポリメラーゼに繋ぎ留められるコンストラクトを使用する塩基編集の結果が、図４２〜４７において示される。ＵＤＧ１４７は、Ｔを直接的に除去し、およびＣ→Ｇ塩基編集を増加する酵素である（図４２〜４４）、一方で、ＵＤＧ２０４は、Ｃを直接的に除去し、およびＣ→Ｇ塩基編集を増加する酵素（図４５〜４７）である。
【０２８３】
例４：Ｃ→Ｇアプローチ４−代わりの修復経路を除きＣ→Ｇフラックスを増加する
Ｃ→Ｇ編集を改善する１つの方法は、代わりの修復の経路を除くまたは下方調節することである。１つの例として、タンパク質ＭＳＨ２−/−修復経路を除くことは、Ｃ→Ｇ塩基編集の増加をもたらすことがあることが、図４８に示される。種々の塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ２＿ＵＤＧ；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用するＭＳＨ２−/−細胞におけるＨＥＫ２、ＲＮＦ２、およびＦＡＮＣＦ部位でのＣ→Ｇ塩基編集の結果は、図４９〜５１に示される。
【０２８４】
例５：Ｃ→Ｇアプローチ５−トランス（in trans）構成要素の発現
一緒に機能する塩基編集因子構成要素を同定するための１つのアプローチは、それらの構成要素を、細胞において、トランスで一緒に発現することである。Ｃ→Ｇ変異を誘導する塩基編集因子構成要素（例えば、ポリメラーゼ、ウラシル結合蛋白質、塩基除去酵素、シチジンデアミナーゼ、および／または核酸プログラム可能なＤＮＡ結合蛋白質）が同定されれば、それらは、繋ぎ留められ、塩基編集因子を生成し得る。ＡＰＯＢＥＣ−Ｃａｓ９ニッカーゼに融合され発現されるＵＤＧおよびＵｄｇＸバリアントおよびトランスに同時に過剰発現されるＴＬＳポリメラーゼは、ＲＮＦ２部位でのＣ→Ｇ編集をもたらす。構成要素のトランスでの発現を説明する模式図は、図５２において示される。
【０２８５】
種々のポリメラーゼ（Ｐｏｌカッパ、Ｐｏｌエタ、Ｐｏｌイオタ、ＲＥＶ１、Ｐｏｌベータ、およびＰｏｌデルタ）による、トランスで発現される、５つの異なる塩基編集因子（ＢＥ３；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ；ＢＥ２＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ３＿ＵｄｇＸ＿Ｏｎ；ＢＥ２＿ＵＤＧ；およびＢＥ３＿ＵＤＧ）を使用するＨＥＫ２９３細胞におけるＨＥＫ２、ＲＮＦ２、およびＦＡＮＣＦにおける塩基編集の結果が、図５３〜５５に示される。
参考文献
【数１−１】
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【数１−２】
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【０２８６】
例６：−Ｃａｓ９バリアント配列
本開示は、Ｃａｓ９バリアント、例えば１つ以上の生物からのＣａｓ９蛋白質を提供し、これは１つ以上の変異を含み得る（例えば、ｄＣａｓ９またはＣａｓ９ニッカーゼを創るため）。いくつかの態様において、下でアステリスク（ａｓｔｅｒｅｋ）によって同定されているＣａｓ９蛋白質のアミノ酸残基の１つ以上は、変異させられ得る。いくつかの態様において、配列番号６によって提供されるアミノ酸配列のＤ１０および／またはＨ８４０残基、または配列番号４〜２６によって提供されるアミノ酸配列のいずれか１つなどにおける、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異は、変異している。いくつかの態様において、配列番号６によって提供されるアミノ酸配列のＤ１０残基、または配列番号４〜２６によって提供されるアミノ酸配列のいずれか１つなどにおける、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異は、Ｄを除く任意のアミノ酸残基に変異している。いくつかの態様において、配列番号６によって提供されるアミノ酸配列のＤ１０残基、または配列番号４〜２６によって提供されるアミノ酸配列のいずれか１つなどにおける、本明細書に提供される任意のＣａｓ９における対応する変異は、Ａに変異している。いくつかの態様において、配列番号６によって提供されるアミノ酸配列のＨ８４０残基、または配列番号４〜２６によって提供される任意のアミノ酸配列などの任意のＣａｓ９における対応する残基は、Ｈである。いくつかの態様において、配列番号６によって提供されるアミノ酸配列のＨ８４０残基、または配列番号４〜２６によって提供される任意のアミノ酸配列などの任意のＣａｓ９における対応する変異は、Ｈを除くいずれかのアミノ酸残基に変異している。いくつかの態様において、配列番号６によって提供されるアミノ酸配列のＨ８４０残基、または配列番号４〜２６によって提供される任意のアミノ酸配列などの、任意のＣａｓ９における対応する変異は、Ａに変異している。いくつかの態様において、配列番号６によって提供されるアミノ酸配列のＤ１０残基、または配列番号４〜２６によって提供される任意のアミノ酸配列などの、任意のＣａｓ９における対応する残基は、Ｄである。
【０２８７】
種々の種からのＣａｓ９配列をアラインメントして、配列番号６のＤ１０およびＨ８４０の対応する相同なアミノ酸残基が他のＣａｓ９蛋白質中に同定され、相同なアミノ酸残基の対応する変異を有するＣａｓ９バリアントの生成を許し得るかどうかを決定した。アラインメントはNCBI Constraint-based Multiple Alignment Tool（COBALT（st-va.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobaltにおいてアクセス可能）を用いて、次のパラメータによって実施した。アラインメントパラメータ：Gap Penalties -11, -1；End-Gap Penalties -5, -1。ＣＤＤパラメータ：Use RPS BLAST on；Blast E-value 0.003；Find Conserved columns and Recompute on。クエリクラスタリングパラメータ：Use query clusters on；Word Size 4；Max cluster distance 0.8；Alphabet Regular。
【０２８８】
４つのＣａｓ９配列の例示的なアラインメントを下に提供する。アラインメント中のＣａｓ９配列は、配列１（Ｓ１）：配列番号２３|WP_010922251|gi 499224711|ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣａｓ9[Streptococcus pyogenes]；配列２（Ｓ２）：配列番号２４|WP_039695303|gi 746743737|II型CRISPR RNA誘導型エンドヌクレアーゼCas9 [Streptococcus gallolyticus]；配列３（Ｓ３）：配列番号２５|WP_045635197|gi 782887988|ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼＣａｓ9[Streptococcus mitis]; 配列４（Ｓ４）：配列番号２６|5AXW_A|gi 924443546|Staphylococcus Aureus Cas9である。ＨＮＨドメイン（太字かつ下線）およびＲｕｖＣドメイン（枠囲み）が４つの配列のそれぞれについて同定されている。Ｓ１中のアミノ酸残基１０および８４０とアラインメントされた配列中の相同なアミノ酸とは、それぞれのアミノ酸残基の次にアステリスクによって同定されている。
【化９９−１】
2020510439.tif 000148
【化９９−２】
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【化９９−３】
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【０２８９】
アラインメントは、当分野において公知のアラインメントプログラムおよびアルゴリズムを用いて、参照配列または参照残基とアラインメントするアミノ酸配列または残基を同定することによって、参照Ｃａｓ９アミノ酸配列またはアミノ酸残基に対して相同であるアミノ酸配列およびアミノ酸残基が、異なる種からのＣａｓ９配列を包含するがこれに限定されないＣａｓ９配列バリアントから同定され得るということを実証している。本開示は、配列番号２３〜２６中のアステリスクによって同定されているアミノ酸残基の１つ以上（例えば、それぞれＳ１、Ｓ２、Ｓ３、およびＳ４）がここに記載されるように変異した、Ｃａｓ９バリアントを提供する。配列番号２３〜２６においてアステリスクによって同定されている残基に対応する配列番号６のＣａｓ９の残基Ｄ１０およびＨ８４０は、ここにおいて「相同な」または「対応する」残基と言われる。かかる相同な残基は、例えば上に記載されているように配列アラインメントによって、参照配列または残基とアラインメントする配列または残基を同定することによって同定され得る。類似に、ここにおける配列番号６中の同定された変異、例えば配列番号６の残基１０および８４０の変異に対応するＣａｓ９配列の変異は、ここにおいて「相同な」または「対応する」変異と言われる。例えば、上の４つのアラインメントされた配列について、配列番号６またはＳ１（配列番号２３）のＤ１０Ａ変異に対応する変異は、Ｓ２ではＤ１１Ａ、Ｓ３ではＤ１０Ａ、Ｓ４ではＤ１３Ａであり；配列番号６またはＳ１（配列番号２３）のＨ８４０Ａに対応する変異は、Ｓ２ではＨ８５０Ａ、Ｓ３ではＨ８４２Ａ、Ｓ４ではＨ５６０Ａである。
【０２９０】
さらに、異なる種からの数個のＣａｓ９配列が、上に概述される同じアルゴリズムおよびアラインメントパラメータそ使用して、アラインメントされている。異なる種からの数個のＣａｓ９配列（「６３２公開」の配列番号１１〜２６０）を、上で概述されている同じアルゴリズムおよびアラインメントパラメータを用いてアラインメントし、および、例えば、「核酸塩基編集因子およびその使用」と題され、２０１７年４月２７日に公開された特許公開WO2017/070632（「６３２公開」）において示され、本明細書に参照によって組み込まれる。他のＣａｓ９蛋白質の残基に対して相同なアミノ酸残基を、この方法で同定し、これを使用して、他のＣａｓ９蛋白質へ対応する変異を導入してもよい。配列番号６の残基１０および８４０に対して相同なアミノ酸残基を、上で概述されている同じ様式で同定した。アラインメントは本明細書に提供され、参照によって組み込まれる。ＨＮＨドメイン（太字かつ下線）およびＲｕｖＣドメイン（枠囲み）が４つの配列のそれぞれについて同定されている（配列番号２３〜２６）。配列番号６のアミノ酸残基１０および８４０に対応する単一の残基はアラインメント中の配列番号２３において枠囲みされており、アラインメントされた配列中の対応するアミノ酸残基の同定を許す。
【０２９１】
均等物および範囲、参照による組み込み
当業者は、ここに記載されている発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを用いて確かめることができるであろう。本発明の範囲は、上記の説明に限定されることを意図するものではなく、むしろ添付の請求項に記載の通りである。
【０２９２】
請求項において、「a」、「an」、および「the」などの冠詞は、そうでないと示されていない限り、または文脈から明らかでない限り、１以上を意味し得る。グループの１以上のメンバーの間の「or」を含む請求項または説明は、そうでないと示されていない限り、または文脈から明らかでない限り、１、１より多く、またはすべてのグループメンバーが所与の製品またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連がある場合に満足すると考えられる。発明は、そのグループの正確に１のメンバーが所与の製品またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連がある態様を含む。発明はまた、１より多く、またはすべてのグループメンバーが、所与の製品またはプロセスに存在し、用いられ、またはそうでなければ関連する態様も含む。
【０２９３】
さらに、発明は、１以上の請求項からの、または説明の関連する部分からの１以上の制限、要素、条項、説明用語などが別の請求項に導入される、すべての変形、組み合わせ、および並び換えを包含することを理解されたい。例えば、別の請求項に従属する任意の請求項は、同じ基本請求項に従属する任意の別の請求項に見出される１以上の制限を含むように修正することができる。さらに、請求項が組成物を記載している場合、そうでないと示されていない限り、または矛盾または不一致が生じることが当業者に明らかでない限り、ここに開示された目的のいずれかに組成物を使用する方法が含まれ、ここに開示された製造方法または当該技術分野において知られた他の方法のいずれかにしたがって組成物を製造する方法が含まれることを理解されたい。
【０２９４】
要素がリストとして、例えばマーカッシュグループフォーマットで提示されている場合、要素の各サブグループも開示されており、任意の要素（単数または複数）をそのグループから除去することができることを理解されたい。用語「含む(comprising)」は、開かれていることを意図しており、追加の要素またはステップを含めることを可能にすることにも留意されたい。一般に、発明または発明の態様が特定の要素、特徴、ステップなどを含むものとして言及されている場合、発明の所定の態様または発明の側面はかかる要素、特徴、ステップなどからなるかまたは本質的になることも理解されるべきである。簡潔にするために、それらの態様は、ここでこれらの言葉で具体的に説明されていない。したがって、１以上の要素、特徴、ステップなどを含む発明の各態様について、発明はまた、それらの要素、特徴、ステップなどからなるかまたは本質的になる態様を提供する。
【０２９５】
範囲が与えられているところでは、エンドポイントが包含される。さらにその上に、発明の種々の態様において、別様に示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表されている値は、記された範囲内のいずれかの特定の値を、文脈が明瞭に別様に述べていない限り範囲の下限の単位の十分の一までとり得るということは理解されるはずである。別様に示されないかまたは文脈および／もしくは当業者の理解から別様に明白でない限り、範囲として表されている値は所与の範囲内のいずれかの部分範囲をとり得、部分範囲のエンドポイントは範囲の下限の単位の十分の一と同じ程度の正確度で表されるということもまた理解されるはずである。
【０２９６】
加えて、本発明のいずれかの具体的な態様が請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得るということは理解されるであろう。範囲が与えられているところでは、範囲内のいずれかの値が請求項のいずれか１つ以上から明示的に除外され得る。本発明の組成物および／または方法のいずれかの態様、要素、特徴、用途、または側面は、いずれか１つ以上の請求項から除外され得る。簡潔性の目的のために、１つ以上の要素、特徴、目的、または側面が除外された態様の全てがここに明示的に示されているわけではない。
【０２９７】
上記に列挙したものを含む、ここに記載のすべての刊行物、特許および配列データベースの記載は、あたかも各個別の刊行物または特許が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されるように参照によりその全体がここに組み入れられる。矛盾がある場合、本明細書中の任意の定義を含む本出願が支配するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
2020510439.tif 000199
【図５０】
2020510439.tif 000200
【図５１】
2020510439.tif 000201
【図５２】
2020510439.tif 000202
【図５３】
2020510439.tif 000203
【図５４】
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【図５５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020510439.tif 000208
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