(57)【要約】  本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介してイズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）酵素に結合した結合体に関する。非ペプチド性重合体連結部が免疫グロブリンＦｃに特異的に連結された結合体、その製造方法及びそれを含む組成物に関する。
2020528756.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体。
【請求項２】
前記イズロン酸−２−スルファターゼは、ムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）を治療することができるものである、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項３】
前記酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していないイズロン酸−２−スルファターゼよりトランスサイトーシス（transcytosis）及びバイオアベイラビリティ（bioavailability, BA）が増加したものである、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項４】
前記トランスサイトーシスは、免疫グロブリンＦｃ領域とＦｃＲｎ（neonatal Fc receptor）との結合によるものである、請求項３に記載の酵素結合体。
【請求項５】
前記酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していないイズロン酸−２−スルファターゼより組織分布性（tissue distribution）が増加したものである、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項６】
前記酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していないイズロン酸−２−スルファターゼより骨髄標的性が増加したものである、請求項５に記載の酵素結合体。
【請求項７】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、非グリコシル化されたものである、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項８】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１つ〜４つのドメインからなる、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項９】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ領域をさらに含む、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項１０】
前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来する免疫グロブリンＦｃフラグメントである、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項１１】
前記免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項１３】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項１４】
前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項１５】
前記酵素結合体は、イズロン酸−２−スルファターゼのＮ末端に非ペプチド性重合体連結部が結合されたものである、請求項１に記載の酵素結合体。
【請求項１６】
請求項１に記載の酵素結合体を含むムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）予防又は治療用薬学的組成物。
【請求項１７】
前記薬学的組成物は、トランスサイトーシス、バイオアベイラビリティ、組織分布性及び骨髄標的性を増加させるものである、請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
（ａ）両末端に同一又は異なる反応性官能基が位置する非ペプチド性重合体のいずれかの反応性官能基を、遊離したイズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）と反応させ、前記末端を介して非ペプチド性重合体がイズロン酸−２−スルファターゼに共有結合により連結された連結体を得るステップと、
（ｂ）前記連結体の反応していない末端の反応性官能基を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質と反応させ、前記連結体と生体適合性物質を共有結合により連結するステップとを含む、下記化学式（１）で表される酵素結合体を製造する方法。
【化１】
2020528756.tif 000008
（式中、Ｘはイズロン酸−２−スルファターゼであり、
Ｌは非ペプチド性重合体連結部であり、
ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、
ＦはＸの生体内半減期を延長させることのできる物質である。）
【請求項１９】
前記イズロン酸−２−スルファターゼは、ムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）を治療することができるものである、請求項１８に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項２０】
前記Ｆは、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカライド（saccharide）、ヘパリン並びにエラスチンからなる群から選択される、請求項１８に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項２１】
前記ＦｃＲｎ結合物質は免疫グロブリンＦｃ領域である、請求項２０に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項２２】
前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１８に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項２３】
前記非ペプチド性重合体はポリエチレングリコールである、請求項２２に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項２４】
前記反応性官能基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される、請求項１８に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項２５】
前記アルデヒド基は、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基である、請求項２４に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項２６】
前記スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はスクシンイミジルカーボネートである、請求項２４に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項２７】
前記反応性官能基は、両末端がどちらもアルデヒド基である、請求項２４に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項２８】
前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれアルデヒド基及びマレイミド基を反応性官能基として有する、請求項２４に記載の酵素結合体を製造する方法。
【請求項２９】
前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれアルデヒド基及びスクシンイミド基を反応性官能基として有する、請求項２４に記載の酵素結合体を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して治療学的酵素類に結合した治療学的酵素類結合体、前記結合体の製造方法、及びそれを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
治療学的酵素類などのタンパク質は、一般に安定性が低いので変性しやすく、血液中のプロテアーゼにより分解され、血中濃度及び力価を維持するために患者に頻繁に投与する必要がある。しかし、主に注射剤の形態で患者に投与されるタンパク質医薬品において、活性ポリペプチドの血中濃度を維持するために頻繁に注射することは患者に多大な苦痛をもたらす。このような問題を解決するために、治療学的酵素類の血中安定性を向上させ、血中薬物濃度を高い濃度に長期間持続して薬効を最大化するための多くの努力がなされてきた。このような治療学的酵素類の持続性製剤は、治療学的酵素類の安定性を向上させると共に、薬物自体の力価が十分に高く維持されなければならず、患者に免疫反応を誘発しないものでなければならない。
【０００３】
特に、ハンター症候群（Hunter syndrome又はHunter disease）は、ムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）ともいい、リソソーム蓄積症（lysosomal storage disease, LSD）の一種である。前記疾患は、特定酵素の遺伝的欠陥により生じ、死亡に至る致命的な疾患であり、欠陥のある酵素の補充治療が必須である（非特許文献１）。
【０００４】
酵素補充治療はリソソーム蓄積症において標準となる治療であり、不足した酵素を補充することにより既存の症状を緩和したり、疾患の進行を遅らせる効果を発揮する。しかし、継続して１〜２週間ごとに２〜６時間かけて薬物を静脈に投与しなければならず、患者及びその家族の日常生活が制限される。
【０００５】
また、ハンター症候群の治療に用いられる組換え酵素のヒトにおける半減期は、短い場合は１０分、長くとも３時間未満であり、その持続時間が非常に短いので、生涯酵素を投与しなければならない患者に不便をかけており、その半減期の延長が強く求められている。
【０００６】
さらに、ハンター症候群治療に用いられる酵素の生体内蓄積位置が異なるという問題や、治療酵素が骨髄に到達しないなどという問題があるので、ハンター症候群治療剤の開発の必要性が高まっている状況である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第９７／０３４６３１号
【特許文献２】国際公開第９６／０３２４７８号
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｆｒａｎｃｅｓ  Ｍ．  Ｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  ２０１２  Ｎｏｖ  ２６；１９９（５）：７２３−３４
【非特許文献２】Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ，  Ｒ．Ｌ．Ｈｉｌｌ，  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）を含む酵素結合体を提供することを目的とする。
【００１０】
また、本発明は、前記酵素結合体を含むリソソーム蓄積症の予防又は治療用薬学的組成物を提供することを目的とする。
【００１１】
さらに、本発明は、前記酵素結合体を製造する方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の一態様は、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を提供する。
【００１３】
具体的な一態様として、前記イズロン酸−２−スルファターゼは、ムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）を治療することができるものである酵素結合体を提供する。
【００１４】
具体的な他の態様として、前記酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していないイズロン酸−２−スルファターゼ酵素よりトランスサイトーシス（transcytosis）及びバイオアベイラビリティ（bioavailability, BA）が増加したものである酵素結合体を提供する。
【００１５】
具体的なさらに他の態様として、前記トランスサイトーシスは、免疫グロブリンＦｃ領域とＦｃＲｎ（neonatal Fc receptor）との結合によるものである酵素結合体を提供する。
【００１６】
具体的なさらに他の態様として、前記酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していないイズロン酸−２−スルファターゼ酵素より組織分布性（tissue distribution）が増加したものである酵素結合体を提供する。
【００１７】
具体的なさらに他の態様として、前記酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していないイズロン酸−２−スルファターゼ酵素より骨髄標的性が増加したものである酵素結合体を提供する。
【００１８】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、非グリコシル化されたものである酵素結合体を提供する。
【００１９】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４ドメインからなる群から選択される１つ〜４つのドメインからなる酵素結合体を提供する。
【００２０】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、ヒンジ領域をさらに含む酵素結合体を提供する。
【００２１】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域が、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ又はＩｇＭに由来する免疫グロブリンＦｃフラグメントである酵素結合体を提供する。
【００２２】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域のそれぞれのドメインが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭからなる群から選択される免疫グロブリンに由来する異なる起源を有するドメインのハイブリッドである酵素結合体を提供する。
【００２３】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域は、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体である酵素結合体を提供する。
【００２４】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域はＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである酵素結合体を提供する。
【００２５】
具体的なさらに他の態様として、前記免疫グロブリンＦｃ領域はヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃフラグメントである酵素結合体を提供する。
【００２６】
具体的なさらに他の態様として、前記酵素結合体は、イズロン酸−２−スルファターゼ又はその誘導体のＮ末端に非ペプチド性重合体連結部が結合されたものである酵素結合体を提供する。
【００２７】
本発明の他の態様は、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）酵素結合体を含むムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【００２８】
具体的な一態様として、前記薬学的組成物は、トランスサイトーシス、バイオアベイラビリティ、組織分布性及び骨髄標的性を増加させるものである薬学的組成物を提供する。
【００２９】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）両末端に同一又は異なる反応性官能基が位置する非ペプチド性重合体のいずれかの反応性官能基を、遊離したイズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）と反応させ、前記末端を介して非ペプチド性重合体がイズロン酸−２−スルファターゼに共有結合により連結された連結体を得るステップと、（ｂ）前記連結体の反応していない末端の反応性官能基を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質と反応させ、前記連結体と生体適合性物質を共有結合により連結するステップとを含む、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００３０】
具体的な一態様として、前記方法により製造される酵素結合体は化学式（１）で表される。
【００３１】
【化１】
2020528756.tif 000003
（式中、Ｘはイズロン酸−２−スルファターゼであり、Ｌは非ペプチド性重合体連結部であり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、ＦはＸの生体内半減期を延長させることのできる物質である。）
【００３２】
具体的な他の態様として、前記Ｆは、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカライド（saccharide）、ヘパリン並びにエラスチンからなる群から選択される、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００３３】
より具体的な態様として、前記ＦｃＲｎ結合物質は免疫グロブリンＦｃ領域である、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００３４】
具体的なさらに他の態様として、前記イズロン酸−２−スルファターゼは、ムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）を治療することができるものである、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００３５】
具体的なさらに他の態様として、前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００３６】
具体的なさらに他の態様として、前記非ペプチド性重合体はポリエチレングリコールである、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００３７】
具体的なさらに他の態様として、前記（ａ）ステップの非ペプチド性重合体の反応基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択される、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００３８】
具体的なさらに他の態様として、前記アルデヒド基は、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基である、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００３９】
具体的なさらに他の態様として、前記スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はスクシンイミジルカーボネートである、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【００４０】
具体的なさらに他の態様として、前記反応性官能基は、両末端がどちらもアルデヒド基である、酵素結合体を提供する。
【００４１】
具体的なさらに他の態様として、前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれアルデヒド基及びマレイミド基を反応性官能基として有する酵素結合体を提供する。
【００４２】
具体的なさらに他の態様として、前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれアルデヒド基及びスクシンイミド基を反応性官能基として有する酵素結合体を提供する。
【発明の効果】
【００４３】
本発明の持続型イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）酵素結合体は、前記酵素の生体内持続性が向上するだけでなく、トランスサイトーシス（transcytosis）、バイオアベイラビリティ、組織分布性及び骨髄標的性が向上する酵素結合体であり、製造された酵素結合体は、ムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体のＰＫ実験結果を示す図である。
【図２】イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性を示す図である。
【図３】イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞内吸収活性を示す図である。
【図４】イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体のＩＣＲマウスにおける組織分布（tissue distribution）を、持続型結合体を形成していないイズロン酸−２−スルファターゼと比較して確認した結果を示す図である（＊ｐ＜０．０５，＊＊ｐ＜０．０１，＊＊＊ｐ＜０．０００５ｖｓイズロン酸−２−スルファターゼ，対応のないｔ検定（unpaired t-test））。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
以下、本発明を実施するための形態について説明する。なお、本願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【００４６】
前記目的を達成するための本発明の一態様は、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）酵素と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体を提供する。
【００４７】
本発明の一具体例においては、前記酵素結合体は、両末端に反応性官能基を有する非ペプチド性重合体を、遊離Ｆｃ領域と遊離イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）酵素に反応させ、共有結合を形成して得たものであり、ここで、前記非ペプチド性重合体は、前記非ペプチド性重合体連結部と繰り返し単位の種類、数、位置の面で同じ物質である。前記遊離Ｆｃ領域及び遊離酵素反応に用いられる非ペプチド性重合体は、その繰り返し単位の両端に前記繰り返し単位とは化学的構造が異なる末端反応性官能基を有する物質であってもよい。このような酵素結合体の製造過程においては、その非ペプチド性重合体の両末端反応性官能基を介して遊離酵素及び遊離免疫グロブリンＦｃ領域とそれぞれ化学反応を起こし、その化学反応により末端反応性官能基が変換されて生じる共有結合により非ペプチド性重合体の繰り返し単位が酵素及びＦｃ領域に連結された酵素結合体が得られる。すなわち、本発明の前記具体例においては、非ペプチド性重合体が製造過程を経て酵素結合体内の非ペプチド性重合体連結部に変換される。
【００４８】
本発明における「治療学的酵素」又は「酵素」とは、酵素の不足、欠乏、機能異常などにより発生する疾患を治療するための酵素であり、酵素補充療法（enzyme replacement therapy）、投与などにより前記疾患を有する個体を治療できる酵素を意味する。具体的には、特定酵素の不足、欠乏などにより発症するムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）の治療のための酵素であり、より具体的には、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）であるが、これらに限定されるものではない。
【００４９】
本発明における「ムコ多糖症（mucopolysaccharidosis, MPS）」とは、粘液性多糖の遺伝性分解酵素欠乏症であり、「ムコ多糖体症」としても知られている。リソソーム酵素の不足によるリソソーム蓄積症の一種である。糖鎖分解酵素、スルファターゼ、アセチルトランスフェラーゼの欠乏などが原因として知られている。ガルゴイリズム（gargoylis）ともいう。主症状は、尿に粘液性多糖が過剰排泄されることである。現在は６つの病型に分類されており、Ｉ型はハーラー症候群（Hurler syndrome）、シャイエ症候群（Scheie syndrome）であり、ＩＩ型はハンター症候群（Hunter syndrome）であり、ＩＩＩ型はサンフィリッポ症候群（Sanfilippo syndrome）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ型であり、ＩＶ型はモルキオ症候群（Morquio syndrome）Ａ、Ｂ型であり、ＶＩ型はマロトー・ラミー症候群（Maroteaux-Lamy syndrome）であり、ＶＩＩ型はスライ症候群（Sly syndrome）である。
【００５０】
本発明における「ハンター症候群（Hunter syndrome, Hunter disease）」とは、性染色体劣性遺伝疾患であり、イズロン酸−２−スルファターゼ（Iduronate 2-sulfatase, IDS）の欠乏により発症し、前記酵素の欠乏によりヘパラン硫酸（heparan sulfate）及びデルマタン硫酸（dermatan sulfate）が蓄積されることが知られている。機能低下、進行性難聴、色素性網膜変性、うっ血乳頭（papilledema）、水頭症などの症状を示す。本発明において、「ムコ多糖症ＩＩ型」と「ハンター症候群」は混用される。
【００５１】
本発明における「イズロン酸−２−スルファターゼ結合体」又は「酵素結合体」とは、前記ハンター症候群の治療効果を有するイズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）が非ペプチド性重合体連結部を介して免疫グロブリンＦｃ領域に連結されたものであり、前記酵素によりハンター症候群の予防又は治療効果が得られる。
【００５２】
本発明の酵素結合体は、イズロン酸−２−スルファターゼの半減期を延長させることのできる物質を前記酵素に連結するので、持続性が増加するという効果を有する。よって、本発明の「酵素結合体」は、「持続型結合体」と混用される。
【００５３】
また、本発明の酵素結合体は、酵素補充療法（enzymatic replacement therapy, ERT）の薬物として用いられてもよい。前記酵素補充療法は、疾患の原因となる欠乏又は不足酵素を補充することにより、低下した酵素機能を回復させて疾患を予防又は治療することができる。
【００５４】
イズロン酸−２−スルファターゼが欠乏したハンター症候群患者に本発明のイズロン酸−２−スルファターゼを含む結合体を投与することにより、ハンター症候群患者の症状を緩和又は治療することができる。また、本発明の結合体は、持続性、トランスサイトーシス及びバイオアベイラビリティを増加させるという効果を有するので、少量の投与であっても効果的にハンター症候群の予防、改善又は治療効果を発揮する。
【００５５】
具体的には、本発明のＦｃ領域に連結された酵素結合体は、前記Ｆｃ領域がＦｃＲｎに結合されるので、Ｆｃ領域が連結されていない酵素よりトランスサイトーシス（transcytosis）が増加するという効果を有する。
【００５６】
ＦｃＲｎを媒介とする増加したトランスサイトーシスは、酵素がＦｃ領域に連結されているため大きな分子を形成するにもかかわらず、細胞内吸収率を維持するように助けるだけでなく、治療酵素が酵素活性を長く維持しつつ体内に吸収され、酵素自体の機能が行えるようにすることにより、ハンター症候群の治療を可能にする。
【００５７】
一方、治療学的酵素類、特にハンター症候群治療に用いられるイズロン酸−２−スルファターゼは、バイオアベイラビリティ（BA, bioavailability）が低いので静脈注射（iv, intravenous）で投与しなければならないという欠点があり、このような静脈注射は毎回患者が病院に行かなければならないという不便さがある。また、このような静脈注射は、アレルギータイプの過敏性反応を誘発し、高頻度により薬物注入に伴う反応（infusion reaction）をもたらす。
【００５８】
本発明の酵素結合体は、ＦｃＲｎ結合部位によるトランスサイトーシス（transcytosis）によりバイオアベイラビリティを高めるので、静脈注射ではなく皮下注射を可能にし、このような投与方法の変化は、自己注射を可能にして患者の利便性を向上させ、薬物注入に伴う反応を減少させて副作用を最小限に抑えることができる。
【００５９】
また、治療学的酵素類、特にハンター症候群に用いられる酵素補充療法（ＥＲＴ）のための酵素は、特定組織に蓄積された老廃物を除去しなければならないので、各組織への均一な分布が非常に重要である。しかし、現在用いられているＥＲＴ酵素類は主に肝臓に多く分布しているので、様々な臓器に分布する薬物の開発が必須である。
【００６０】
本発明のイズロン酸−２−スルファターゼを含む酵素結合体は、延長された血中半減期とＦｃＲｎ結合部位によるトランスサイトーシス（transcytosis）により肝臓以外の様々な組織、特に骨髄、脾臓、腎臓などでも生体内濃度が高い優れた分布を示すので、治療学的効率を最大化させることができる。特に、本発明の酵素結合体は、高い骨髄標的性を示す。骨髄組織は骨の内部に存在する柔軟な構造の組織であるので、骨髄組織への標的性を増大させることにより、酵素補充療法による骨髄での薬理作用によりさらなる効果を期待することができ、ハンター症候群を効果的に治療することができる。
【００６１】
特に、骨髄における疾患は、骨の異常症状又は骨の生成抑制、骨髄で必ず作られなければならない赤血球生成ホルモンと血小板生成ホルモンの生成抑制により貧血など様々な副作用を引き起こすが、現在市販されている酵素治療剤は骨髄の分布が非常に低いので、これらの副作用が頻繁に発生する。このような面から、本発明のイズロン酸−２−スルファターゼを含む酵素結合体は、骨髄標的性が高いので、酵素補充療法の優れた治療剤となる。
【００６２】
よって、本発明の酵素結合体は、免疫グロブリンＦｃ領域とＦｃＲｎとの結合により、免疫グロブリンＦｃ領域が結合していない酵素よりトランスサイトーシス、バイオアベイラビリティ、組織分布性及び骨髄標的性が増加したものであってもよい。
【００６３】
本発明における「イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）」とは、ハンター症候群（Hunter syndrome, MPS-II）に関するスルファターゼ酵素であり、ヘパラン硫酸（heparin sulfate）及びデルマタン硫酸（dermatan sulfate）のリソソーム分解に必要な酵素である。本発明の具体的な一態様においては、「イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）」として、ヒトイズロン酸−２−スルファターゼの１つの精製形態である「イデュルスルファーゼ（idursulfase）」を用いてもよい。前記イデュルスルファーゼは、例えばイデュルスルファーゼアルファ又はイデュルスルファーゼベータであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００６４】
前記イズロン酸−２−スルファターゼ酵素は、当該技術分野において周知の方法で準備又は作製することができ、具体的には動物細胞発現ベクターを挿入した動物細胞を培養し、培養物から精製することもでき、市販されている酵素を購入して用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【００６５】
本発明の一実施例においては、イズロン酸−２−スルファターゼを免疫グロブリンＦｃ領域と非ペプチド性重合体に連結した結合体を製造し（実施例３）、前記酵素結合体のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ活性を確認した（実施例４〜６）。
【００６６】
その結果、酵素結合体のイズロン酸−２−スルファターゼは、Ｆｃ領域との結合にもかかわらず、酵素活性を保持しながらも、半減期、バイオアベイラビリティ及び組織分布性が全て増加することが確認された。
【００６７】
本発明の酵素結合体に含まれるイズロン酸−２−スルファターゼは、天然のものであってもよく、天然の全長であってもよく、その一部で構成されたフラグメントであってもよい。あるいは、イズロン酸−２−スルファターゼは、天然の配列において一部のアミノ酸の置換（substitution）、付加（addition）、欠失（deletion）、修飾（modification）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される改変が行われた酵素の誘導体（analog）であってもよい。このようなイズロン酸−２−スルファターゼの誘導体が天然のものの活性より増加した活性を有するものは言うまでもなく、天然のものと比べて少なくとも有意水準の活性を有するものであれば、いかなるものを本発明に用いてもよい。
【００６８】
前記酵素誘導体には当該酵素のバイオシミラーやバイオベターの形態が含まれるが、バイオシミラーの例として、公知酵素と発現宿主の差異、グリコシル化の様相と程度の差異、特定位置の残基が当該酵素の基準配列に対して１００％の置換でない場合はその置換の程度の差異も、本発明の酵素結合体に用いることができるバイオシミラー酵素に該当する。前記酵素は、遺伝子組換えにより動物細胞、大腸菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、生きている動物などから生産することができ、生産方法はこれらに限定されるものではなく、市販されている酵素であってもよい。
【００６９】
また、前記酵素又はその誘導体と８０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、前記酵素は組換え技術により微生物から得たものであってもよく、市販されているものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７０】
本発明における「相同性（homology）」とは、野生型（wild type）タンパク質のアミノ酸配列又はそれをコードする塩基配列と類似する程度を示すものであり、本発明のアミノ酸配列又は塩基配列と前記パーセント以上同一である配列を有する配列を含む。このような相同性は、２つの配列を肉眼で比較して決定することもできるが、比較対象となる配列を並べて相同性の程度を分析するバイオインフォマティクスアルゴリズム（bioinformatic algorithm）を用いて決定することもできる。前記２つのアミノ酸配列間の相同性は百分率で表される。有用な自動化されたアルゴリズムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Genetics Computer Group, Madison, W, USA）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡコンピュータソフトウェアモジュールで用いることができる。前記モジュールで自動化された配列アルゴリズムには、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ Ｗｕｎｓｃｈ、Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ及びＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ配列アルゴリズムが含まれる。他の有用な配列に対するアルゴリズムと相同性の決定は、ＦＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＰＳＩＢＬＡＳＴ及びＣＬＵＳＴＡＬ Ｗが含まれるソフトウェアで自動化されている。
【００７１】
前記酵素又はその誘導体の配列及びそれをコードする塩基配列の情報は、ＮＣＢＩなどの公知のデータベースから得られる。
【００７２】
本発明における「免疫グロブリンＦｃ領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域１（ＣＬ１）を除いた残りの部分を意味し、重鎖定常領域にヒンジ（hinge）領域をさらに含むこともある。特に、免疫グロブリンＦｃ領域全体及びその一部を含むフラグメントであってもよく、本発明における免疫グロブリンＦｃ領域は、免疫グロブリンフラグメントと混用されてもよい。
【００７３】
天然Ｆｃは重鎖定常領域１においてＡｓｎ２９７部位に糖鎖が存在するが、大腸菌由来の組換えＦｃは糖鎖が存在しない形態で発現する。Ｆｃから糖鎖が除去されると、重鎖定常領域１に結合するＦｃγ受容体１、２、３と補体（ｃ１ｑ）の結合力が低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が低減又は除去される。
【００７４】
本発明における「免疫グロブリン定常領域」とは、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域、重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）を除いたものであり、重鎖定常領域２（ＣＨ２）及び重鎖定常領域３（ＣＨ３）（又は重鎖定常領域４（ＣＨ４）を含む）部分を含むＦｃフラグメントを意味するものであり、重鎖定常領域にヒンジ（hinge）部分を含むこともある。また、本発明の免疫グロブリン定常領域は、天然のものと実質的に同等又は向上した効果を有するものであれば、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖の可変領域を除き、一部又は全部の重鎖定常領域１（ＣＨ１）及び／又は軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む拡張された免疫グロブリン定常領域であってもよい。さらに、ＣＨ２及び／又はＣＨ３に相当する非常に長い一部のアミノ酸配列が除去された領域であってもよい。すなわち、本発明の免疫グロブリン定常領域は、（１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメイン、（２）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメイン、（３）ＣＨ１ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（４）ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメイン、（５）少なくとも１つの定常領域ドメインと免疫グロブリンヒンジ領域（又はヒンジ領域の一部）との組み合わせ、（６）重鎖定常領域各ドメインと軽鎖定常領域の二量体であってもよい。免疫グロブリンＦｃフラグメントをはじめとする定常領域は、生体内で代謝される生分解性のポリペプチドであるので、薬物のキャリアとして安全に用いることができる。また、免疫グロブリンＦｃフラグメントは、免疫グロブリン分子全体に比べて相対的に分子量が少ないので、結合体の作製、精製及び収率面で有利なだけでなく、アミノ酸配列が抗体毎に異なるため、高い非均質性を示すＦａｂ部分を除去することにより、物質の同質性が非常に高くなり、血中抗原性を誘発する可能性が低くなるという効果も期待することができる。
【００７５】
一方、免疫グロブリン定常領域は、ヒト起源、又はウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物起源であってもよく、ヒト起源であることが好ましい。また、免疫グロブリン定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ由来、又はそれらの組み合わせ（combination）もしくはそれらのハイブリッド（hybrid）による定常領域からなる群から選択されてもよい。ヒト血液に最も豊富なＩｇＧ又はＩｇＭ由来であることが好ましく、リガンド結合タンパク質の半減期を延長させることが知られているＩｇＧ由来であることが最も好ましい。本発明における免疫グロブリンＦｃ領域は、同一起源のドメインからなる単鎖免疫グロブリンで構成された二量体又は多量体であってもよい。
【００７６】
本発明における「組み合わせ（combination）」とは、二量体又は多量体を形成する際に、同一起源の単鎖免疫グロブリン定常領域（好ましくはＦｃ領域）をコードするポリペプチドが異なる起源の単鎖ポリペプチドに結合することを意味する。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＤ Ｆｃ及びＩｇＥ Ｆｃフラグメントからなる群から選択される少なくとも２つのフラグメントから二量体又は多量体を作製することができる。
【００７７】
本発明における「ハイブリッド（hybrid）」とは、単鎖免疫グロブリン定常領域（好ましくはＦｃ領域）内に、少なくとも２つの異なる起源の免疫グロブリン定常領域に相当する配列が存在することを意味する。本発明においては、様々な形態のハイブリッドが可能である。すなわち、ＩｇＧ Ｆｃ、ＩｇＭ Ｆｃ、ＩｇＡ Ｆｃ、ＩｇＥ Ｆｃ及びＩｇＤ ＦｃのＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及びＣＨ４からなる群から選択される１つ〜４つのドメインのハイブリッドが可能であり、ヒンジ領域をさらに含んでもよい。
【００７８】
ＩｇＧもＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のサブクラスに分けられ、本発明においては、それらの組み合わせ又はそれらのハイブリダイゼーションも可能である。具体的には、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４サブクラスであり、より具体的には、補体依存性傷害（CDC, Complementdependent cytotoxicity）などのエフェクター機能（effector function）のほとんどないＩｇＧ４のＦｃ領域であってもよい。
【００７９】
また、免疫グロブリン定常領域は、天然糖鎖、天然のものに比べて増加した糖鎖、天然のものに比べて減少した糖鎖、又は糖鎖が除去された形態であってもよい。このような免疫グロブリン定常領域糖鎖の増減又は除去には、化学的方法、酵素学的方法、微生物を用いた遺伝工学的方法などの通常の方法が用いられる。ここで、免疫グロブリン定常領域から糖鎖が除去された免疫グロブリン定常領域は、補体（ｃ１ｑ）の結合力が著しく低下し、抗体依存性細胞傷害又は補体依存性細胞傷害が低減又は除去されるので、生体内で不要な免疫反応を誘発しない。このようなことから、糖鎖が除去されるか、非グリコシル化された免疫グロブリン定常領域は、薬物のキャリアとしての本来の目的に適する。よって、より具体的には、ヒトＩｇＧ４由来の非グリコシル化されたＦｃ領域、すなわちヒト非グリコシル化ＩｇＧ４ Ｆｃ領域を用いることができる。ヒト由来のＦｃ領域は、ヒト生体において抗原として作用し、それに対する新規な抗体を生成するなどの好ましくない免疫反応を起こす非ヒト由来のＦｃ領域に比べて好ましい。
【００８０】
また、本発明の免疫グロブリン定常領域には、天然アミノ酸配列だけでなく、その配列誘導体（mutant）も含まれる。アミノ酸配列誘導体とは、天然アミノ酸配列中の少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより異なる配列を有するものを意味する。例えば、ＩｇＧ Ｆｃの場合、結合に重要であることが知られている２１４〜２３８、２９７〜２９９、３１８〜３２２又は３２７〜３３１番目のアミノ酸残基が修飾に適した部位として用いられてもよい。また、ジスルフィド結合を形成する部位が除去された誘導体、天然ＦｃからＮ末端のいくつかのアミノ酸が除去された誘導体、天然ＦｃのＮ末端にメチオニン残基が付加された誘導体など、様々な種類の誘導体が用いられる。さらに、エフェクター機能をなくすために、補体結合部位、例えばＣ１ｑ結合部位が除去されてもよく、ＡＤＣＣ部位が除去されてもよい。このような免疫グロブリン定常領域の配列誘導体を作製する技術は、特許文献１、２などに開示されている。
【００８１】
分子の活性を全体的に変化させないタンパク質及びペプチドにおけるアミノ酸交換は当該分野において公知である（非特許文献２）。最も一般的な交換は、アミノ酸残基Ａｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｈｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、Ａｓｐ／Ｇｌｙ間の交換である。場合によっては、リン酸化（phosphorylation）、硫酸化（sulfation）、アクリル化（acrylation）、グリコシル化（glycosylation）、メチル化（methylation）、ファネシル化（farnesylation）、アセチル化（acetylation）、アミル化（amidation）などにより修飾（modification）されてもよい。
【００８２】
前述した免疫グロブリン定常領域誘導体は、本発明の免疫グロブリン定常領域と同じ生物学的活性を示すが、免疫グロブリン定常領域の熱、ｐＨなどに対する構造的安定性を向上させた誘導体であってもよい。また、このような免疫グロブリン定常領域は、ヒト、及びウシ、ヤギ、ブタ、マウス、ウサギ、ハムスター、ラット、モルモットなどの動物の生体内から分離した天然のものから得てもよく、形質転換された動物細胞もしくは微生物から得られた組換えたもの又はその誘導体であってもよい。ここで、天然のものから取得する方法においては、全免疫グロブリンをヒト又は動物の生体から分離し、その後タンパク質分解酵素で処理することにより得ることができる。パパインで処理するとＦａｂ及びＦｃに切断され、ペプシンで処理するとｐＦ’ｃ及びＦ（ａｂ）２に切断される。これらは、サイズ排除クロマトグラフィー（size-exclusion chromatography）などを用いてＦｃ又はｐＦ’ｃを分離することができる。
【００８３】
ヒト由来の免疫グロブリン定常領域、微生物から得られた組換え免疫グロブリン定常領域であることが好ましい。
【００８４】
本発明における「非ペプチド性重合体」とは、繰り返し単位が少なくとも２つ結合された生体適合性重合体を意味し、「非ペプチド性リンカー」と混用される。前記繰り返し単位は、ペプチド結合を除く任意の共有結合により互いに連結される。本発明における非ペプチド性重合体は、末端に反応基を含み、結合体を構成する他の構成要素との反応により結合体を形成することができる。
【００８５】
本発明における「非ペプチド性重合体連結部（linker moiety）」とは、両末端に反応性官能基を有する非ペプチド性重合体が各反応基を介して免疫グロブリンＦｃ領域及びイズロン酸−２−スルファターゼ酵素に結合して形成した結合体内の一構成要素を意味する。
【００８６】
具体的な一実施形態において、前記酵素結合体は、両末端に免疫グロブリンＦｃ領域及びイズロン酸−２−スルファターゼ酵素に結合される反応性官能基を含む非ペプチド性重合体を介して免疫グロブリンＦｃ領域及びイズロン酸−２−スルファターゼ酵素が互いに共有結合的に連結されたものであってもよい。
【００８７】
具体的には、特にこれらに限定されるものではないが、前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、ＰＬＡ（polylactic acid）やＰＬＧＡ（polylactic-glycolic acid）などの生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、オリゴヌクレオチド及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよい。より具体的な実施形態において、前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコールであってもよいが、これに限定されるものではない。また、当該分野で公知のそれらの誘導体や当該分野の技術水準で容易に作製できる誘導体も本発明に含まれる。
【００８８】
本発明に用いられる非ペプチド性重合体の分子量は、０超〜２００ｋＤａの範囲、具体的には１〜１００ｋＤａの範囲、より具体的には１〜５０ｋＤａの範囲、さらに具体的には１〜２０ｋＤａの範囲、一層具体的には３．４ｋＤａ〜１０ｋＤａの範囲、より一層具体的には約３．４ｋＤａであるが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
本発明における「約」とは、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などが全て含まれる範囲であり、約という用語の後に続く数値又はその範囲と同等であるものが全て含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
本発明の具体的な一実施形態において、前記非ペプチド性重合体の両末端は、それぞれ反応性官能基を有してもよい。免疫グロブリンＦｃ領域の官能基、例えばアミノ基又はチオール基、及びイズロン酸−２−スルファターゼ酵素の官能基、例えばアミノ基又はチオール基と反応して共有結合を形成する反応性官能基を有してもよい。このような反応性官能基は、両末端において同じものであってもよく、異なるものであってもよい。
【００９１】
より具体的には、前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれ免疫グロブリンＦｃ及びイズロン酸−２−スルファターゼ酵素に結合される反応基、例えばイズロン酸−２−スルファターゼ酵素又は免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端もしくはリシンに位置するアミノ基、又はシステインのチオール基に結合される反応基を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
さらに具体的には、前記非ペプチド性重合体の反応性官能基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択されてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００９３】
前記アルデヒド基の例として、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
一例として、本発明の一実施例に用いられる非ペプチド性重合体は、両末端にどちらもアルデヒド（aldehyde, -CHO）基を有する線状（linear）重合体であり、ポリエチレングリコール骨格（backbone）を有する。骨格を形成する繰り返し単位の数によって非ペプチド性重合体の大きさが決定され、非ペプチド性重合体の反応基であるアルデヒドは、酵素のアミノ基、具体的にはリシン残基の−ＮＨ2又はＮ末端の−ＮＨ2と共有結合する。前記非ペプチド性重合体のアルデヒド基は特定反応条件下で酵素のＮ末端の−ＮＨ2と特異的に反応し、反応後の精製過程により酵素に共有結合した非ペプチド性重合体連結体が得られる。
【００９５】
前記スクシンイミド誘導体としては、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はスクシンイミジルカーボネートが用いられてもよいが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
前記非ペプチド性重合体は、前記反応基を介して免疫グロブリンＦｃ及びイズロン酸−２−スルファターゼ酵素に連結され、非ペプチド性重合体連結部に変換されてもよい。
【００９７】
また、アルデヒド結合による還元性アミン化で生成された最終産物は、アミド結合で連結されたものよりはるかに安定している。アルデヒド反応基は、低いｐＨではＮ末端に選択的に反応し、高いｐＨ、例えばｐＨ９．０の条件ではリシン残基と共有結合を形成することができる。
【００９８】
本発明の非ペプチド性重合体の末端反応性官能基は、同じものであってもよく、異なるものであってもよい。前記非ペプチド性重合体は、両末端にアルデヒド基を反応性官能基として有するものであってもよく、また前記非ペプチド性重合体は、両末端にそれぞれアルデヒド基及びマレイミド基を反応性官能基として有するものであってもよく、両末端にそれぞれアルデヒド基及びスクシンイミド基を反応性官能基として有するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００９９】
一例として、一末端にはマレイミド基、他の末端にはアルデヒド基、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を反応性官能基として有してもよい。他の例として、一末端にはスクシンイミジル基、他の末端にはプロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基を有してもよい。
【０１００】
プロピオン側の末端にヒドロキシ反応基を有するポリ（エチレングリコール）を非ペプチド性重合体として用いる場合、公知の化学反応により前記ヒドロキシ基を前述した様々な反応性官能基として活性化するか、市販されている修飾された反応性官能基を有するポリ（エチレングリコール）を用いることにより、本発明の酵素結合体を製造することができる。
【０１０１】
具体的な一実施形態において、前記非ペプチド性重合体の反応性官能基がイズロン酸−２−スルファターゼのシステイン残基、より具体的にはシステインの−ＳＨ基に連結されてもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
マレイミド−ＰＥＧ−アルデヒドを用いる場合、マレイミド基はイズロン酸−２−スルファターゼ酵素の−ＳＨ基にチオエーテル（thioether）結合で連結することができ、アルデヒド基は免疫グロブリンＦｃの−ＮＨ2基に還元的アミン化反応により連結することができるが、これに限定されるものではなく、これは一例にすぎない。
【０１０３】
一末端にアルデヒド反応性官能基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる本発明の具体的な一実施形態においては、このような還元的アミン化により、前記ＰＥＧの前記末端の最後に位置する酸素原子に−ＣＨ2ＣＨ2−の構造を有するリンカー官能基が非ペプチド性重合体連結部を形成する。すなわち、この具体的な実施形態の酵素結合体においては、−ＰＥＧ−ＣＨ2ＮＨ−やＮＨＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−ＰＥＧ−などの化学的構造の非ペプチド性重合体連結部を介してイズロン酸−２−スルファターゼが免疫グロブリンＦｃに連結される。
【０１０４】
一末端にマレイミド反応性官能基を有するポリエチレングリコールを非ペプチド性重合体として用いる本発明の他の具体的な実施形態においては、チオエーテル結合により前記マレイミド側の末端がシステイン（例えば、イズロン酸−２−スルファターゼのシステイン）の硫黄原子に連結された構造の非ペプチド性重合体連結部を形成することができる。前記チオエーテル結合は、化学式（２）の構造を有するものであってもよい。
【０１０５】
【化２】
2020528756.tif 000004
・・・・（２）
【０１０６】
しかし、前記例に特に限定されるものではなく、これは一例にすぎない。
【０１０７】
また、前記結合体において、非ペプチド性重合体の反応性官能基が免疫グロブリンＦｃ領域又はイズロン酸−２−スルファターゼのＮ末端に位置する−ＮＨ2に連結されたものであってもよいが、これは一例にすぎない。具体的には、本発明のイズロン酸−２−スルファターゼは、反応性官能基を有する非ペプチド性重合体にＮ末端を介して連結されてもよいが、これに限定されるものではない。
【０１０８】
本発明における「Ｎ末端」とは、ペプチドのアミノ末端を意味し、本発明の目的上、非ペプチド性重合体に結合する位置を意味する。例えば、これらに限定されるものではないが、Ｎ末端の最末端のアミノ酸残基だけでなく、Ｎ末端周辺のアミノ酸残基が全て含まれてもよく、具体的には最末端から１〜２０番目のアミノ酸残基が含まれてもよい。
【０１０９】
また、前記結合体において、非ペプチド性重合体の反応性官能基は、イズロン酸−２−スルファターゼ又は免疫グロブリンＦｃ領域のＮ末端でない他の残基のアミノ基に連結したものであってもよいが、これは一例にすぎない。具体的には、前記残基は、イズロン酸−２−スルファターゼ又は免疫グロブリンＦｃ領域のリシン残基であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１１０】
すなわち、本発明の酵素結合体は、非ペプチド性重合体の反応性官能基がイズロン酸−２−スルファターゼ又は免疫グロブリンＦｃ領域のアミノ基に共有結合により連結されたものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１１１】
本発明の酵素結合体は、非ペプチド性重合体の結合位置によって活性が異なりうる。すなわち、非ペプチド性重合体と酵素の位置特異的結合により体内半減期又は活性が向上されうる。
【０１１２】
本発明の他の態様は、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）結合体を含むムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）予防又は治療用薬学的組成物を提供する。
【０１１３】
前記イズロン酸−２−スルファターゼ結合体は、イズロン酸−２−スルファターゼと免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結されたものであってもよい。
【０１１４】
本発明における「免疫グロブリンＦｃ領域」、「非ペプチド性重合体連結部」、「酵素結合体」及び「ムコ多糖症ＩＩ型」については前述した通りである。
【０１１５】
本発明における「予防」とは、前記ムコ多糖症ＩＩ型又はハンター症候群治療のためのイズロン酸−２−スルファターゼ酵素又はそれを含む組成物の投与により前記疾患の発症を抑制又は遅延させるあらゆる行為を意味し、「治療」とは、前記酵素又はそれを含む組成物の投与によりムコ多糖症ＩＩ型又はハンター症候群の症状を好転又は有利に変化させるあらゆる行為を意味する。
【０１１６】
本発明における「投与」とは、任意の適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、前記組成物の投与経路は、特にこれらに限定されるものではないが、前記組成物を生体内標的に到達できるものであれば、一般的なあらゆる経路で投与することができ、例えば腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与などが挙げられる。
【０１１７】
本発明のムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）予防又は治療用薬学的組成物は、前記ムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）の原因となる欠乏又は不足酵素を前記疾患を有する固体に投与することにより、欠乏又は不足した酵素の機能を回復させてムコ多糖症ＩＩ型を治療する効果を有する。
【０１１８】
本発明の具体的な一態様は、トランスサイトーシス（transcytosis）、バイオアベイラビリティ、組織分布性及び骨髄標的性を増加させる薬学的組成物を提供する。
【０１１９】
本発明の薬学的組成物は、イズロン酸−２−スルファターゼがＦｃ領域に連結された酵素結合体とＦｃＲｎ受容体の固有結合により前記酵素結合体が細胞膜を容易に通過できるようにすると共に、血管から組織へより効果的に到達されるようにする。
【０１２０】
よって、トランスサイトーシス（transcytosis）、バイオアベイラビリティ、組織分布性及び骨髄標的性が増加するという効果を有し、優れたムコ多糖症ＩＩ型治療効果を発揮する。
【０１２１】
本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤をさらに含んでもよい。このような薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤は、非自然的に発生したものであってもよい。前記担体は、特にこれらに限定されるものではないが、経口投与の場合は、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを用いることができ、注射剤の場合は、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張化剤、安定化剤などを混合して用いることができ、局所投与用の場合は、基剤、賦形剤、滑沢剤、保存剤などを用いることができる。
【０１２２】
本発明における「薬学的に許容」とは、治療効果を示す程度の十分な量と副作用を起こさないことを意味し、疾患の種類、患者の年齢、体重、健康状態、性別、薬物に対する感受性、投与経路、投与方法、投与回数、治療期間、配合、同時に用いられる薬物などの医学分野における公知の要素により当業者が容易に決定することができる。
【０１２３】
本発明の組成物の剤形は、前述したような薬学的に許容される担体と混合して様々な形態に製造することができる。例えば、経口投与の場合は、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハー剤などの形態に製造することができ、注射剤の場合は、使い捨てアンプル又は複数回投薬形態に製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、丸薬、カプセル剤、徐放性製剤などに剤形化することができる。
【０１２４】
一方、製剤化に適した担体、賦形剤及び希釈剤の例としては、ラクトース、グルコース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、デンプン、アカシア、アルギン酸塩、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱物油などが挙げられる。また、充填剤、抗凝集剤、滑沢剤、湿潤剤、香料、防腐剤などをさらに含んでもよい。
【０１２５】
さらに、本発明の薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌水溶液剤、非水性溶剤、凍結乾燥製剤及び坐剤からなる群から選択されるいずれかの剤形を有してもよい。
【０１２６】
また、前記組成物は、薬学的分野における通常の方法による患者の体内投与に適した単回投与型の製剤、具体的にはタンパク質医薬品の投与に有用な製剤形態に剤形化し、当該技術分野で通常用いる投与方法を用いて経口、又は皮膚、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、髄膜腔内、心室内、肺、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、消化管内、局所、舌下、膣内もしくは直腸経路が含まれる非経口投与経路で投与することができるが、これらに限定されるものではない。
【０１２７】
さらに、前記結合体は、生理食塩水や有機溶媒のように薬剤に許容された様々な担体（carrier）と混合して用いることができ、安定性や吸収性を向上させるために、グルコース、スクロース、デキストランなどの炭水化物、アスコルビン酸（ascorbic acid）、グルタチオンなどの抗酸化剤（antioxidants）、キレート剤、低分子タンパク質、他の安定化剤（stabilizers）などを薬剤として用いることができる。
【０１２８】
本発明の薬学的組成物の投与量と回数は、治療する疾患、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、疾患の重症度などの様々な関連因子と共に、活性成分である薬物の種類により決定される。
【０１２９】
本発明の組成物の総有効量は、単回投与量（single dose）で患者に投与してもよく、複数回投与量（multiple dose）で長期間投与される分割治療方法（fractionated treatment protocol）により投与してもよい。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度に応じて有効成分の含有量を変えてもよい。具体的には、本発明の結合体の総用量は、１日体重１ｋｇ当たり約０．０００１ｍｇ〜５００ｍｇであることが好ましい。しかし、前記結合体の用量は、薬学的組成物の投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌、排泄率などの様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるので、これらを考慮すると、当該分野における通常の知識を有する者であれば、前記本発明の組成物の特定の用途に応じた適切な有効投与量を決定することができるであろう。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を奏するものであれば、その剤形、投与経路及び投与方法が特に限定されるものではない。
【０１３０】
本発明のさらに他の態様は、前記イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）酵素結合体を含む薬学的組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、ムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）の予防又は治療方法を提供する。
【０１３１】
前記酵素結合体、それを含む組成物、ムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）、予防及び治療については前述した通りである。
【０１３２】
本発明における「個体」とは、ムコ多糖症ＩＩ型の疑いのある個体であり、前記個体とは、当該疾患が発症したか、発症するリスクのある、ヒトをはじめとしてマウス、家畜などが含まれる哺乳動物を意味するが、本発明の酵素結合体又はそれを含む前記組成物で治療可能な個体であればいかなるものでもよい。
【０１３３】
本発明の方法は、前記酵素結合体を含む薬学的組成物を薬学的有効量で投与することを含んでもよい。好適な総１日使用量は正しい医学的判断の範囲内で担当医により決定され、１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によっては他の製剤が用いられるか否か、具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路、組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と共に又は同時に投与される薬物をはじめとする様々な因子や、医薬分野で周知の類似の因子に応じて異なる量であることが好ましい。
【０１３４】
本発明のさらに他の態様は、前記酵素結合体を含む、酵素のトランスサイトーシス、バイオアベイラビリティ、組織分布性及び骨髄標的性の増加用組成物を提供する。
【０１３５】
具体的には、前記酵素結合体は、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体であってもよいが、これに限定されるものではない。
【０１３６】
本発明のさらに他の態様は、前記酵素結合体又はそれを含む組成物を、それを必要とする個体に投与するステップを含む、酵素のトランスサイトーシス、バイオアベイラビリティ、組織分布性及び骨髄標的性の増加方法を提供する。
【０１３７】
具体的には、前記酵素結合体は、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体であるが、これに限定されるものではない。
【０１３８】
本発明のさらに他の態様は、前記酵素結合体の、ムコ多糖症ＩＩ型（mucopolysaccharidosis II, MPS II）予防又は治療用途を提供する。
【０１３９】
具体的には、前記酵素結合体は、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体であるが、これに限定されるものではない。
【０１４０】
本発明のさらに他の態様は、前記酵素結合体又はそれを含む組成物の酵素の、トランスサイトーシス、バイオアベイラビリティ、組織分布性及び骨髄標的性の増加用途を提供する。
【０１４１】
前記酵素結合体は、イズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）と免疫グロブリンＦｃ領域が非ペプチド性重合体連結部を介して連結された酵素結合体であってもよい。
【０１４２】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）両末端に同一又は異なる反応性官能基が位置する非ペプチド性重合体のいずれかの反応性官能基を、遊離したイズロン酸−２−スルファターゼ（iduronate-2-sulfatase）と反応させ、前記末端を介して非ペプチド性重合体がイズロン酸−２−スルファターゼに共有結合により連結された連結体を得るステップと、（ｂ）前記連結体の反応していない末端の反応性官能基を、生体内半減期を延長させることのできる生体適合性物質と反応させ、前記連結体と生体適合性物質を共有結合により連結するステップとを含む、化学式（１）で表される酵素結合体を製造する方法を提供する。
【０１４３】
【化３】
2020528756.tif 000005
（式中、Ｘはイズロン酸−２−スルファターゼであり、Ｌは非ペプチド性重合体連結部であり、ａは０又は自然数であるが、ａが２以上であればそれぞれのＬは互いに独立しており、ＦはＸの生体内半減期を延長させることのできる物質である。）
【０１４４】
本発明において、前記Ｆは、高分子重合体、脂肪酸、コレステロール、アルブミン及びそのフラグメント、アルブミン結合物質、特定アミノ酸配列の繰り返し単位の重合体、抗体、抗体フラグメント、ＦｃＲｎ結合物質、生体内結合組織、ヌクレオチド、フィブロネクチン、トランスフェリン（Transferrin）、サッカライド（saccharide）、ヘパリン並びにエラスチンからなる群から選択されるものであってもよく、より具体的には、前記ＦｃＲｎ結合物質は免疫グロブリンＦｃ領域であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１４５】
前記Ｆは、Ｘに共有化学結合又は非共有化学結合により互いに結合されたものであってもよく、Ｌを介して、Ｘに共有化学結合、非共有化学結合又はそれらの組み合わせにより互いに結合されたものであってもよい。
【０１４６】
また、前記Ｌは、ペプチド性重合体又は非ペプチド性重合体であってもよい。
【０１４７】
前記Ｌがペプチド性重合体である場合、１つ以上のアミノ酸を含んでもよく、例えば１個〜１０００個のアミノ酸を含んでもよいが、特にこれに限定されるものではない。本発明において、ＦとＸを連結するために、公知の様々なペプチドリンカーが用いられ、例えば［ＧＳ］ｘリンカー、［ＧＧＧＳ］ｘリンカー、［ＧＧＧＧＳ］ｘリンカーなどが挙げられ、ここで、ｘは１以上の自然数であってもよい。しかし、前記例に限定されるものではない。
【０１４８】
前記Ｌが非ペプチド性重合体である場合、前記非ペプチド性重合体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニルエチルエーテル、生分解性高分子、脂質重合体、キチン、ヒアルロン酸及びそれらの組み合わせからなる群から選択されるものであってもよく、より具体的には、ポリエチレングリコールであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１４９】
本発明において、前記ａは０又は自然数であってもよく、ａが０であれば、本発明の酵素結合体は、非ペプチド性重合体を含まず、ペプチド連結により（fusion）イズロン酸−２−スルファターゼが免疫グロブリンＦｃ領域に結合した連結体であってもよい。
【０１５０】
また、前記反応性官能基は、アルデヒド基、マレイミド基及びスクシンイミド誘導体からなる群から選択されるものであってもよく、より具体的には、前記アルデヒド基は、プロピオンアルデヒド基又はブチルアルデヒド基であってもよく、前記スクシンイミド誘導体は、スクシンイミジルカルボキシメチル、スクシンイミジルバレレート、スクシンイミジルメチルブタノエート、スクシンイミジルメチルプロピオネート、スクシンイミジルブタノエート、スクシンイミジルプロピオネート、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド又はスクシンイミジルカーボネートであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１５１】
また、前記非ペプチド性重合体は、両末端にどちらもアルデヒド基を反応性官能基として有するものであってもよく、両末端にそれぞれアルデヒド基及びマレイミド基を反応性官能基として有するものであってもよく、両末端にそれぞれアルデヒド基及びスクシンイミド基を反応性官能基として有するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１５２】
本発明の酵素結合体を製造する方法は、イズロン酸−２−スルファターゼと非ペプチド性重合体が共有結合された連結体を作製するステップと、前記連結体を免疫グロブリンＦｃ領域に連結して結合体を製造するステップとを含んでもよいが、これに限定されるものではない。
【０１５３】
本発明における「連結体」とは、酵素結合体の製造過程において、非ペプチド性重合体をイズロン酸−２−スルファターゼに共有結合させた中間体であり、後に前記連結体中の非ペプチド性重合体の反応していない末端の反応性官能基を免疫グロブリンＦｃ領域に結合させて結合体を製造することができるものであるが、これに限定されるものではない。
【０１５４】
また、本発明の具体的な態様は、前記イズロン酸−２−スルファターゼ酵素のＮ末端に非ペプチド性重合体連結部が結合された結合体を分離するステップをさらに含む、酵素結合体を製造する方法を提供する。
【０１５５】
本発明の製造方法により製造された酵素結合体は、イズロン酸−２−スルファターゼをＦｃ領域に連結させることにより、前記Ｆｃ領域とＦｃＲｎ受容体の固有結合により酵素結合体が細胞膜を容易に通過できるようにすると共に、血管から組織へより効果的に到達されるようにする。
【０１５６】
このようなイズロン酸−２−スルファターゼ酵素の増加したトランスサイトーシス、バイオアベイラビリティ及び組織分布性は、全て酵素結合体に含まれるイズロン酸−２−スルファターゼが体内で酵素活性を保持しつつ効果的なハンター症候群の治療効果を発揮できるように作用する。
【０１５７】
また、本発明の酵素結合体は、酵素又はその誘導体（analog）の半減期を延長させるものであってもよい。
【０１５８】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例はあくまで本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【実施例１】
【０１５９】
イズロン酸−２−スルファターゼ酵素の準備
本発明のイズロン酸−２−スルファターゼ酵素結合体を製造するために、次の過程を行った。まず、前記イズロン酸−２−スルファターゼとして、Ｓｈｉｒｅ社製のＥｌａｐｒａｓｅを用いた。
【実施例２】
【０１６０】
酵素結合体の製造−１
実施例１のイズロン酸−２−スルファターゼ酵素のアミノ基に非ペプチド性重合体を共有結合により連結させたイズロン酸−２−スルファターゼ連結体を作製して精製した。
【０１６１】
１０ｋＤａのアルデヒド−ポリエチレングリコール−アルデヒド（NOF (Japan), M12N535, 10 kDa, ALD-PEG-ALD）リンカーをイズロン酸−２−スルファターゼのアミノ基に結合させるために、イズロン酸−２−スルファターゼと１０ｋＤａのＡＬＤ−ＰＥＧ−ＡＬＤのモル比を１：２０とし、イズロン酸−２−スルファターゼの濃度を１０ｍｇ／ｍＬとして、４〜８℃で約２時間反応させた。ここで、反応は１００ｍＭリン酸カリウム（Potassium phosphate）、ｐＨ６．０で行い、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Sodium cyanoborohydride）を添加した。反応液は、１０ｍＭリン酸ナトリウム（Sodium phosphate）（ｐＨ６．０）を含むバッファーと塩化ナトリウムの濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ（米国GE社）カラムを用いて、未反応のイズロン酸−２−スルファターゼをモノ結合したイズロン酸−２−スルファターゼ連結体から精製して取り出した。
【実施例３】
【０１６２】
酵素結合体の製造−２
実施例２で精製した非ペプチド性重合体とイズロン酸−２−スルファターゼの連結体に免疫グロブリンＦｃ領域を結合させる。
【０１６３】
前述したように精製したイズロン酸−２−スルファターゼ連結体と免疫グロブリンＦｃフラグメントのモル比を１：１０とし、総タンパク質濃度を７０〜７５ｍｇ／ｍＬとして、４〜８で約１６時間反応させた。ここで、反応液は１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ６．０）であり、還元剤として２０ｍＭシアノ水素化ホウ素ナトリウムを添加した。反応終了後に、前記反応液を１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）バッファーと塩化ナトリウムの濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５Ｑ（GE, 米国）カラムと、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）バッファーと硫酸アンモニウムの濃度勾配を用いたＳｏｕｒｃｅ １５Ｉｓｏ（米国GE社）カラムに適用し、最後に２０ｍＭトリス（Tris）（ｐＨ７．５）、５％（ｖ／ｖ）グリセリンと１００ｍＭクエン酸１水和物（ｐＨ３．７）、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１０％グリセリンバッファーの濃度勾配を用いたＰｒｏｔｅｉｎ Ａ（米国GE社）に適用し、イズロン酸−２−スルファターゼに免疫グロブリンＦｃがポリエチレングリコールリンカーにより共有結合で連結された結合体を精製した。
【０１６４】
本実施例で最終的に製造されたイズロン酸−２−スルファターゼ結合体は、イズロン酸−２−スルファターゼ単量体のＮ末端が２本の鎖からなる免疫グロブリンＦｃの一方の鎖に（Ｎ末端プロリン）ポリエチレングリコールリンカーで連結された形態である。
【実施例４】
【０１６５】
イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体の薬物動力学実験
本発明者らは、前記実施例で製造したイズロン酸−２−スルファターゼ酵素結合体の薬物動力学を調査することにより結合体の効果を確認した。
【０１６６】
このために、各群において採血時点当たり３匹のＩＣＲマウス（mouse）でイズロン酸−２−スルファターゼ（Idursulfase, 対照群）と前記実施例で製造したイズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体の血中安定性及び薬物動力学係数を比較した。
【０１６７】
具体的には、対照群はイズロン酸−２−スルファターゼを各１ｍｇ／ｋｇずつ静脈内注射し、０、０．２５、０．５、１、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０及び１４４時間後に採血し、実験群はイズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体をイズロン酸−２−スルファターゼの量で各１ｍｇ／ｋｇずつ皮下注射し、０、１、２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０及び１４４時間後に採血した。イズロン酸−２−スルファターゼに対する抗体を用いて血清中のタンパク質量をＥＬＩＳＡ方法で測定した。
【０１６８】
薬物動力学分析の結果を図１に示す。
【０１６９】
具体的には、イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体の場合、対照群に比べて血中半減期、及び薬物分子の体内暴露の程度（area under curve, AUC）がどちらも増加することが確認された。特に、イズロン酸−２−スルファターゼの血中半減期が４．５時間であったのに対して、イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体は３０．６時間と約７倍以上のはるかに優れた血中半減期を示すことが確認され、体内暴露の程度も約９倍以上増大することが確認された。
【０１７０】
本発明者らは、製造された各酵素結合体のＩｎ ｖｉｔｒｏ活性を次のように確認した。
【実施例５】
【０１７１】
イズロン酸−２−スルファターゼ酵素結合体の活性確認
実施例５−１：イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体のＩｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性
本発明者らは、イズロン酸−２−スルファターゼの持続型結合体の製造による酵素活性の変化を測定すべくｉｎ ｖｉｔｒｏ試験管内酵素活性測定を行った。
【０１７２】
具体的には、酵素基質として知られる４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ａ−Ｌ−Ｉｄｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｕｒｏｎｉｃ Ａｃｉｄ−２−ｓｕｌｆａｔｅ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓａｌｔ（４ＭＵ−α−ＩｄｏｐｙｒａＡ−２）をイズロン酸−２−スルファターゼ及びイズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体と３７℃で４時間反応させ、その後二次反応酵素であるα−イズロニダーゼ（Iduronidase）と３７℃でさらに２４時間反応させた。最終的に生成された４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒｏｎｅ（４ＭＵ）の蛍光を測定することにより、当該物質の酵素活性を測定した。
【０１７３】
その結果、イズロン酸−２−スルファターゼとイズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体の酵素活性（specific activity）がそれぞれ２１．６±３．６３ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇ、１８．５±３．１２ｎｍｏｌ／ｍｉｎ／μｇであることが確認された。結論として、イズロン酸−２−スルファターゼに比べて、イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体の酵素活性は８５．７％であり、このような酵素活性の減少は、持続型結合体の結合（conjugation）で改善されたＰＫにより補償される（図２）。
【０１７４】
実施例５−２：イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体の細胞内吸収活性
イズロン酸−２−スルファターゼはＭ６ＰＲ（mannose phosphate 6 receptor）により細胞に吸収されて作用するので、イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体の製造が前記酵素の細胞吸収活性に影響を及ぼすか否かを次のように確認した。
【０１７５】
まず、Ｍ６ＰＲが発現することが知られているＨｅｐＧ２ ｃｅｌｌ（human hepatocarcinoma）をイズロン酸−２−スルファターゼ及びイズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体でそれぞれ処理し、その後３７℃で細胞内吸収を誘導した。２４時間後に、細胞内に存在するイズロン酸−２−スルファターゼ及びイズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体をＥＬＩＳＡにより分析した。
【０１７６】
その結果、イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体の細胞内吸収活性（Ｖmax＝１０．８３ｎｇ／ｍＬ）は、イズロン酸−２−スルファターゼの細胞内吸収活性（Ｖmax＝９．５０ｎＭ）の約８１．４％であることが確認された。このようなＭ６ＰＲの結合及び細胞内吸収活性の減少（ｖｓ．イズロン酸−２−スルファターゼ）は持続型結合体の立体障害（steric hindrance）の影響であり、持続型結合体の結合（conjugation）で改善されたＰＫにより補償される（図３）。
【０１７７】
実施例５−３：イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体のＭ６ＰＲ結合力の確認
イズロン酸−２−スルファターゼとイズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体のｍａｎｎｏｓｅ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ６受容体（Ｍ６ＰＲ）結合力の確認のために、ｓｕｒｆａｃｅ ｐｌａｓｍｏｎ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ（BIACORE T200, GE healthcare）を用いて次のように分析した。
【０１７８】
具体的には、Ｍ６ＰＲをＣＭ５ ｃｈｉｐにアミンカップリングで固定化した。その後、イズロン酸−２−スルファターゼをＨＢＳ−ＥＰバッファーで２００ｎＭ〜１２．５ｎＭになるように希釈し、Ｍ６ＰＲを固定化したチップに１０分間結合させてから６分間解離させ、その結合力をＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅで計算した。イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体の相対的な結合力をイズロン酸−２−スルファターゼと比較して数値化した。
【０１７９】
その結果、イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体はイズロン酸−２−スルファターゼの約８８％の受容体結合力を有することが確認された（表１）。イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体のＭ６ＰＲに対する結合力が相対的に低いのは、生理活性ポリペプチドがＦｃ領域と融合タンパク質を形成すると一般的に自己受容体に対する結合力が低下する傾向を示すのと同じ原因であると考えられる。本発明の作用原理についての特定の理論に束縛されるものではなく、単に発明の理解を助けるために説明すると、免疫グロブリンＦｃとイズロン酸−２−スルファターゼが共有結合されることにより、イズロン酸−２−スルファターゼ部位が立体障害（steric hindrance）を受けて受容体に対する結合力が減少したからであると考えられる。
【０１８０】
【表１】
2020528756.tif 000006
【０１８１】
前記実施例のイズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体の活性を確認した結果をまとめて表２に示す。
【０１８２】
【表２】
2020528756.tif 000007
【実施例６】
【０１８３】
イズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体の組織分布の確認
各群において採血時点当たり３匹のＩＣＲマウス（mouse）にイズロン酸−２−スルファターゼ（対照群）と前述したように製造したイズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体の組織及び臓器内の分布を比較した。
【０１８４】
具体的には、対照群はイズロン酸−２−スルファターゼを各１．０ｍｇ／ｋｇずつ静脈内注射し、１、８、４８、１４４時間後に臓器を摘出した。実験群はイズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体をイズロン酸−２−スルファターゼの量で各１．０ｍｇ／ｋｇずつ皮下注射し、１、８、４８、１４４時間後に臓器を摘出し、その後ＥＬＩＳＡ方法で組織（血清、腎臓、肝臓、脾臓、心臓、骨髄及び肺）における各物質濃度を測定及び比較した。
【０１８５】
その結果、対照群として用いたイズロン酸−２−スルファターゼと比較して、同一時間帯においてイズロン酸−２−スルファターゼ持続型結合体は全ての組織で高い組織分布結果が認められた（図４）。
【０１８６】
これらの結果は、本発明の酵素結合体が従来の他の治療的酵素に比べて体内暴露の程度及び組織分布性に優れ、リソソーム蓄積症の画期的な治療剤として用いられることを示唆するものである。
【０１８７】
以上の説明から、本発明の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【図１】
2020528756.tif 000009
【図２】
2020528756.tif 000010
【図３】
2020528756.tif 000011
【図４】
2020528756.tif 000012
【国際調査報告】
2020528756.tif 000013
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