(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの圧力室を有し、圧力室に液体を供給するための供給口を有し、圧力室とハウジングの外側との間に多数の導管を有するハウジングを備えた分注装置に関するものであり、各導管内にはチューブが配置されており、その一端は圧力室に突出し、他端はハウジングの外側に突出している。
2020502530.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの圧力室を有し、前記圧力室に液体を供給するための供給口を有し、前記圧力室とハウジングの外側との間に多数の導管を有する前記ハウジングを備えた分注装置であって、
前記各導管内にはチューブが配置されており、その一端は前記圧力室に突出し、他端は前記ハウジングの外側に突出している、分注装置。
【請求項２】
前記圧力室が、１つの空間寸法において他の２つの空間寸法よりも大きい範囲を有し、前記圧力室の長手方向軸線は前記より大きな範囲の方向に延び、前記圧力室の前記長手方向軸線は前記ハウジングの前記外側と平行に延びていることを特徴とする、請求項１に記載の分注装置。
【請求項３】
前記導管が、前記圧力室の前記長手方向軸線と平行に延びる前記圧力室の壁のうちの１つに配置され、前記導管は互いに平行に配置されていることを特徴とする、請求項１または２に記載の分注装置。
【請求項４】
前記圧力室が円筒形または直方体であることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項５】
少なくとも２つの導管が存在することを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項６】
前記導管が、前記圧力室の前記長手方向軸線と平行に１つまたは複数の列に配置されていることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項７】
１列あたり少なくとも８本、好ましくは２４本または４８本の導管があることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項８】
前記チューブが毛細管であることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項９】
前記チューブが金属製であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項１０】
前記チューブが、０．１ｍｍ〜０．８ｍｍ、好ましくは０．２ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲内の内径を有することを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項１１】
前記チューブが、前記ハウジングの前記外側に対して実質的に垂直（９０°）になるように、または前記ハウジングの前記外側に対して４０°から９０°未満の範囲内の角度で傾斜するように配置されることを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項１２】
前記ハウジングの前記外側に位置する前記チューブの部分が、好ましくはプラスチック製のスリーブで覆われていることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項１３】
前記供給口が、前記圧力室の前記長手方向軸線に対して垂直に配置された前記壁のうちの１つに配置されていることを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項１４】
前記ハウジングが通気口を備えることを特徴とする、請求項１から１３のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項１５】
前記通気口が、前記圧力室の前記長手方向軸線に対して垂直に配置された前記壁のうちの１つに配置されていることを特徴とする、請求項１から１４のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項１６】
前記圧力室が、６０ｍｍ２〜３００ｍｍ２の範囲内の断面積、または４ｍｍ〜１０ｍｍの範囲内、好ましくは５．５ｍｍ〜６．５ｍｍの範囲内の直径を有することを特徴とする、請求項１から１５のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項１７】
前記ハウジングが、前記長手方向軸線が平行に延びる２つ、３つ、または４つの圧力室を備え、液体を供給するための別々の供給口が各圧力室に属することを特徴とする、請求項１から１６のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の分注装置と、ラインを介して前記供給口に接続されている液体リザーバとを備える分注システム。
【請求項１９】
前記液体リザーバと前記供給口との間にバルブが配置されていることを特徴とする、請求項１８に記載の分注システム。
【請求項２０】
前記液体リザーバからの前記液体が、０．５〜２バールの範囲内、好ましくは０．５〜０．８５バールの範囲内の圧力下で前記バルブに当接し、前記バルブの切り替え時間は、５ミリ秒〜２００ミリ秒の範囲内、好ましくは５ミリ秒〜５０ミリ秒の範囲内であることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の分注システムの使用。
【請求項２１】
前記バルブの開放時間中の添加量が、毛細管当たり０．３μｌ〜３００μｌ、好ましくは毛細管当たり１μｌ〜３０μｌの範囲内であることを特徴とする、請求項１８または１９に記載の分注システムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、マイクロタイタープレートのウェル内への液体の並行供給のための分注装置および分注システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
新規な原薬の識別および開発の目的は、リガンド結合、高分子の配座変化または酵素反応などの生化学的過程を調節する化学化合物を識別することである。小型化が迅速で費用効果が高くかつ効率的なアッセイを確実にするので、通常、多数の化学構造をアッセイするためのハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）が使用される。
【０００３】
それらの高い感度および自動化可能性のために、蛍光に基づくアッセイはおそらくＨＴＳにとって最も重要なアプローチである。酵素反応による蛍光の変化を追跡することに加えて、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）、または蛍光偏光（ＦＰ）によるタンパク質間相互作用またはリガンド結合を決定するためのラベリング技術が使用される。
【０００４】
多くの生物学的過程、特に小さなリガンドの結合は、急速混合法を必要とする非常に速い動態によって特徴付けられる。
【０００５】
しかしながら、３８４個または１５３６個のアッセイウェルを有するプレートフォーマットを使用する計測器は、時間分解能に関して制限されることが多く、その結果、迅速な結合動態の決定は低スループットの方法に限定される。時間分解能をかなり向上させるマルチディスペンサを装備した計測器のスクリーニングアプローチでさえ、主に秒の時間範囲に制限されている（参照：Ｇｏｎｚａｌｅｚ，Ｊ．Ｅ．，ａｎｄ  Ｍａｈｅｒ，Ｍ．Ｐ．（２００２）Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｖｏｌｔａｇｅ／Ｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＶＩＰＲ  ＴＭ）：Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｉｏｎ  Ｃｈａｎｎｅｌ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｎｎｅｌｓ  ８，２８３−２９５；Ｍｏｒｉ，Ｔ．，Ｉｔａｍｉ，Ｓ．，Ｙａｎａｇｉ，Ｔ．，Ｔａｔａｒａ，Ｙ．，Ｔａｋａｍｉｙａ，Ｍ．，ａｎｄ  Ｕｃｈｉｄａ，Ｔ．（２００９）Ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｌｙｌ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １４，４１９−４２４；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｋ．Ｓ．，ａｎｄ  Ｎｅａｇｌｅ，Ｂ．Ｄ．（１９９６）ＦＬＩＰＲ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ａｃｃｕｒａｔｅ，Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  １，７５−８０）。
【０００６】
先行技術から知られている急速混合法は連続フローまたはストップトフロー装置である。
【０００７】
連続フロー実験の場合、反応は、ミキサの下流の経路の関数として平衡流条件下で分析される。ミキサ設計の改善により、１００μｓまたはさらに短い範囲のデッドタイムがもたらされた（参照：Ｒｅｇｅｎｆｕｓｓ，Ｐ．，Ｃｌｅｇｇ，Ｒ．Ｍ．，Ｆｕｌｗｙｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｂａｒｒａｎｔｅｓ，Ｆ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｊｏｖｉｎ，Ｔ．Ｍ．（１９８５）Ｍｉｘｉｎｇ  ｌｉｑｕｉｄｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｓｅｃｏｎｄｓ，Ｒｅｖ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．５６，２９３−２９０；Ｓｈａｓｔｒｙ，Ｍ．Ｃ．Ｒ．，Ｌｕｃｋ，Ｓ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｒｏｄｅｒ，Ｈ．（１９９８）Ａ  Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ−Ｆｌｏｗ  Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  Ｍｉｘｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｍｏｎｉｔｏｒ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｍｉｃｒｏｓｅｃｏｎｄ  Ｔｉｍｅ  Ｓｃａｌｅ，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ７４，２７１４−２７２１；Ｒｏｄｅｒ，Ｈ．，Ｍａｋｉ，Ｋ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａ  Ｓｈａｓｔｒｙ，Ｍ．Ｃ．（２００４）Ｒａｐｉｄ  ｍｉｘｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｌｄｉｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３４，１５−２７）。しかしながら、効率的な混合を達成するためには、高い流速および比較的大きなチャネル寸法が必要であり、これは大量の材料を使い果たす。
【０００８】
市販のストップトフロー計測器の場合、反応物は空気圧アクチュエータを用いて２つのシリンジを介して供給される。観察セルが一杯になった後、停止シリンジが停止ブロックに当たると流れは突然停止する。計測器は、数ミリ秒のデッドタイムを日常的に達成することができる（参照：Ｄｉｃｋｓｏｎ，Ｐ．Ｎ．，ａｎｄ  Ｍａｒｇｅｒｕｍ，Ｄ．Ｗ．（１９８６）Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ  ｆｉｒｓｔ−ｏｒｄｅｒ  ｒａｔｅ  ｃｏｎｓｔａｎｔｓ  ａｎｄ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｄｅａｄ−ｔｉｍｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５８，３１５３−３１５８；Ｎａｋａｔａｎｉ，Ｈ．，ａｎｄ  Ｈｉｒｏｍｉ，Ｋ．（１９８０）Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｔｕｄｅ  ｉｎ  Ｓｔｏｐｐｅｄ−Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ８７，１８０５−１８１０；Ｐｅｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｆ．（１９７９）Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｅａｄ  ｔｉｍｅ  ｏｆ  ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｓｔｏｐｐｅｄ−ｆｌｏｗ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ９３，４４２−４４４）。
【０００９】
連続フローとストップトフローの両方の計測器は、１つのキュベットまたは１つのチャネルに制限される低スループットの方法である。しかしながら、迅速な結合反応または酵素動態の決定が新規な原薬の識別および開発において基本的な役割を果たすので、複数の阻害剤および濃度をアッセイするための迅速な混合方法が必要である。マイクロタイタープレートで迅速な動態を観察することができるようにするために、高い時間分解能と高度に並列化されたシステムのスループットを組み合わせた、迅速な動態を検出するための新しいイメージング計測器が開発された。これにより、初めて、新規な原薬の識別および開発への迅速な動態の効率的な適用が可能になる。
【００１０】
新しい計測器の重要な構成要素は、マイクロタイタープレートのウェルへの液体の並行供給のための分注装置である。そのような分注装置は先行技術から知られている。
【００１１】
欧州特許出願公開第１０９９４８０号明細書は、各個々の分注毛細管がそれに割り当てられたそれ自身のマイクロバルブを有するマイクロ分注装置を開示している。このマイクロ分注装置は、各個々のバルブがそれ自身の供給ラインを必要とし、そしてそのようなバルブ配置は個々のバルブ直径のためにマイクロタイタープレートの４８個のウェルへの並行分注を可能にしないという欠点を有する。
【００１２】
独国特許出願公開第１９９１１４５６号明細書から知られている分注装置の場合には、液体供給は圧力容器または回転プランジャポンプと共に電磁バルブを備えたディスペンサを介して制御される。液体は、液体リザーバに接続されて所望の数の出口まで複数回分岐する主液体チャネルを介して送達される。
【００１３】
独国特許出願公開第１０２３６０２９号明細書は、分注される液体の量を分注するために制御可能なポンプに接続された樹木状に対称的に構成された線形ディスペンサコームを開示している。
【００１４】
独国特許出願公開第１０２５５５９５号明細書は、複数の分注チャネルを含むマルチチャネル分注装置を開示しており、そこではマイクロバルブが液体用の各出口ノズルに割り当てられている。マイクロバルブは、それぞれマニホールドの出口に接続された少なくとも１つの供給口を含み、その入口は流量センサを介して液体リザーバに接続されている。流量センサは、互いに分注チャネルの許容誤差を補償するために較正に使用される。
【００１５】
これらの既知の分注装置の不利な点は、長い毛細管長さであり、構造によっては、異なる毛細管半径であり、それは、各毛細管に対して高くそしてさらに異なる圧力損失をもたらし、したがって異なる分注容量をもたらす。
【００１６】
特定の問題に対する解決策は、以下に記載される分注装置である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１７】
【特許文献１】欧州特許出願公開第１０９９４８０号明細書
【特許文献２】独国特許出願公開第１９９１１４５６号明細書
【特許文献３】独国特許出願公開第１０２３６０２９号明細書
【特許文献４】独国特許出願公開第１０２５５５９５号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明による分注装置は、少なくとも１つの圧力室を有し、圧力室に液体を供給するための供給口を有し、圧力室とハウジングの外側との間に多数の導管を有するハウジングを備え、各導管内にはチューブが配置されており、その一端は圧力室に突出し、他端はハウジングの外側に突出している。
【００１９】
圧力室は、１つの空間寸法において他の２つの空間寸法よりも大きな範囲を有することが好ましい。圧力室の長手方向軸線はより大きな範囲の方向に延びている。圧力室の長手方向軸線は同時にハウジングの外側と平行に延びている。好ましい実施形態では、圧力室は円筒形または直方体である。
【００２０】
導管は、圧力室の長手方向軸線と平行に延びる圧力室の壁の１つに配置されている。好ましくは、導管は互いに平行に配置されている。少なくとも２つの導管が存在する。導管は、圧力室の長手方向軸線と平行に１つまたは複数の列に配置され得る。これに関連して、１列当たり１２本、特に好ましくは２４本または４８本の導管がある。理想的には、１列あたりの導管の数は、分注装置によって分注が行われるマイクロタイタープレートの列（長辺）内のウェルの数と一致する。
【００２１】
チューブは、金属またはプラスチック製の毛細管、毛細管、すなわち細いチューブであることが好ましく、その中では、使用される液体によって毛細管効果が生じる。それらは０．１ｍｍ〜０．８ｍｍ、好ましくは０．２ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲内の内径を有するべきである。外径は、０．３５ｍｍ〜２ｍｍ、好ましくは０．６ｍｍ〜１．１ｍｍの範囲内であり得る。チューブの長さは、６ｍｍ〜１５ｍｍ、好ましくは８．５ｍｍ〜１３ｍｍ、特に好ましくは１０ｍｍ〜１３ｍｍの範囲内である。
【００２２】
液体がマイクロタイタープレートのウェル内に上から垂直に供給されるべきか、それともある角度でウェルの側壁上に供給または注入されるべきかに依存して、チューブは、それらがハウジングの外側に対して垂直（９０°）になるように配置されるか、またはハウジングの外側に対して４０°から９０°未満の範囲内の角度で傾斜している。
【００２３】
ハウジングの外側に位置するチューブの疎水性を高めるために、それらを、好ましくはプラスチック、例えばテフロン（登録商標）で被覆することができる。
【００２４】
一実施形態では、液体の供給口は、圧力室の長手方向軸線に対して垂直に配置された壁のうちの１つに配置されている。ハウジングは通気口をさらに含むことができ、圧力室を液体で満たす間にそこから空気が押し出される。この通気口は、圧力室の長手方向軸線に対して垂直に配置された壁のうちの１つに配置され得る。
【００２５】
圧力室は、６０ｍｍ２〜３００ｍｍ２の範囲内の断面積、または４ｍｍ〜１０ｍｍの範囲内、好ましくは５．５ｍｍ〜６．５ｍｍの範囲内の直径を有することができる。
【００２６】
分注装置のハウジングはまた、１つより多い圧力室、例えば２つ、３つ、または４つの圧力室を備えることができ、それらの長手方向軸線は互いに平行に延びる。圧力室への液体の供給のための別々の供給口が各圧力室に属し、各圧力室は、圧力室とハウジングの外側との間の（対応するチューブを有する）多数の導管に接続されている。好ましくは、種々の圧力室の導管およびチューブは互いに平行に配置されている。必要ならば、１つまたは複数の圧力室を有する複数のハウジングを互いに隣接して互いに平行に配置することも可能である。
【００２７】
本発明は、上述の分注装置と、分注装置の供給口にラインを介して接続されている液体リザーバとを含む分注システムをさらに提供する。液体リザーバへの圧力は、液体リザーバから圧力室への液体のポンピングを引き起こす。このために、液体リザーバは周囲の雰囲気から気密に閉鎖され、必要な圧力を作り上げるポンプに接続されている。複数の圧力室の場合には、各圧力室の供給口を、同じ液体のリザーバまたは様々な液体のリザーバに接続することができる。
【００２８】
ポンプの圧力と組み合わされた液体リザーバと供給口との間のバルブの切り替え時間により、各切り替えサイクル（導管の開閉）において圧力室に入り、個々のチューブを介して出力される液体の量を制御することが可能である。
【００２９】
本発明の一実施形態では、液体リザーバからの液体は、０．５〜２バールの範囲内、好ましくは０．５〜０．８５バールの範囲内の圧力下でバルブに当接し、バルブの切り替え時間は５ミリ秒〜２００ミリ秒の範囲内（１５３６個のウェルのマイクロタイタープレートの場合は５〜６０ミリ秒、３８４個のウェルのマイクロタイタープレートの場合は４０〜２００ミリ秒）、好ましくは５ミリ秒〜５０ミリ秒の範囲内である。
【００３０】
バルブの切り替え時間およびポンプによる圧力は、分注装置の供給量が毛細管当たり０．３〜３００μｌの範囲内、好ましくは１〜３０μｌの範囲内になるように調整される。
【００３１】
本発明による分注装置または分注システムの利点は、圧力室内に突出する短いチューブと組み合わされた大容量の圧力室のおかげで、圧力勾配がなく、したがって、液体の非常に迅速かつ定量的で正確な供給が可能であることである。結果として、例えば３８４個のウェルまたは１５３６個のウェルのマイクロタイタープレートへのμｌ範囲の精密かつ迅速な並行分注が可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】２つの圧力室を備えた２つの分注装置の斜視図である。
【図２】２つの圧力室を備えた分注装置の内部構造の斜視図である。
【図３】２つの圧力室を備えた分注装置の背面図である。
【図４】分注装置の側面図である。
【図５】分注装置の側面の部分拡大図である（バルブ側）。
【図６】液体リザーバを備えた分注システムの図である。
【図７】イメージング計測器（１チャネル検出）の図である。
【図８】イメージング計測器（２チャネル検出）の図である。
【図９】１５３６個のアッセイウェルのマイクロタイタープレートの発光の偽色画像である。
【図１０Ａ】イメージング計測器を用いたＡＮＳのＢＳＡへの結合の動態の測定図である。
【図１０Ｂ】イメージング計測器を用いたＡＮＳのＢＳＡへの結合の動態の別の測定図である。
【図１０Ｃ】イメージング計測器を用いたＡＮＳのＢＳＡへの結合の動態のさらに別の測定図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
図１は、それぞれ２つの圧力室を有する、本発明による２つの平行に配置された分注装置１０を斜視図で示している。分注装置のさらなる図が図２〜図５に示されている。各分注装置１０は、直径４〜１０ｍｍ、長さ１２０〜１４０ｍｍの２つの管状孔を有する直方体状のハウジング２を有する。前記孔は２つの平行な圧力室５を形成する。各孔は円形の供給口６を形成する開口端を有する。反対側の端部は、システムの充填および排出のために開放されており、分注動作中は密閉されている。そこにあるのは、漏れ口または通気口３である。供給口６が配置されているハウジング２の側面は、前記ハウジングが水平方向にマウント７から突出するようにマウント７に取り付けられている。マウント７は各供給口６のための凹部を有する。外側に突出しているハウジング２の下側には、各圧力室５とハウジング２の下側との間に最大４８本の導管の列があり、各導管には好ましくはステンレス鋼製の毛細管チューブ４が配置され、その一端は圧力室５内に突出し、他端はハウジング２の下面から突出している。毛細管チューブは、０．１〜０．８ｍｍの内径を有し、垂直に配置されている。ハウジング２の下面から突出しているチューブのセグメントは、疎水的に（好ましくはテフロン（登録商標）で）被覆されている。
【００３４】
図３は、２つの供給口６を備えた分注装置１０を背面図で示している。
【００３５】
図４は、分注装置１０を側面図で示している。円形部分Ａは、図５に拡大して示されている。図４において、毛細管チューブ４は圧力室の高さの半分まで突出していることが分かる。これは、４８本すべての毛細管について均一に分注するのに特に有利であることが分かった。
【００３６】
図６は、本発明による分注システムを示している。分注装置１０の圧力室５（ハウジング２内には見えない）は、ライン７１、バルブ７２、および別のライン７０を介して、リザーバ容器内に位置する液体に接続されている。膜ポンプ６６および圧力ライン６８を介して、室内空気が０．８バールの圧力下でリザーバ容器に導入される。室内空気の代わりにＮ２のような異なるガスを使用することも可能である。膜ポンプの代わりに異なる圧力供給システムを使用することも可能である。例えば、米国オハイオ州４４１２４、クリーブランドのパーカー・ハネフィン社（Ｐａｒｋｅｒ  Ｈａｎｎｉｆｉｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって販売されているような、デッドスペース容量が少なく、切り替え時間が短いソレノイドバルブが適切なバルブであることが分かっている。
【００３７】
以下、本発明による分注装置を有するイメージング計測器の動作について説明する。
【００３８】
分析されるべき反応物質を含む液体６５は、リザーバ容器６４（図６）からバルブ７２を介して分注装置の圧力室５（見えない）に汲み上げられる。毛細管チューブ４は、２ｍｍ未満の外径（シースを含む）を有し、これにより、マイクロタイタープレートの４８個のアッセイウェルへの並行分注が可能になる（図６）。高乱流の混合条件を達成するために、チューブ４の分注出口の向きは、３８４個および１５３６個のアッセイウェルを有するマイクロタイタープレートに特に適合されている。３８４個のアッセイウェルを有するマイクロタイタープレートについての最良の混合結果は、マイクロタイタープレート壁上に斜めに反応物を分注することによって達成された。対照的に、１５３６個のアッセイウェルを有するマイクロタイタープレート６０に必要なより低い分注容量は、図６に示されるように垂直に分注される。必要とされる反応物容量についての典型的な分注時間は、０．８バールの圧力でバルブ７２を切り替える既知の時間で分注された液体を秤量することによって決定された。
【００３９】
正確なマイクロタイタープレートマウント６２は、マイクロタイタープレート６０のウェルに対する分注装置１０の正確な向きを確実にした。
【００４０】
反応の進行は、マイクロタイタープレートの一列にある４８個すべてのアッセイウェルまたはすべてのアッセイウェルの蛍光強度を同時に記録することによって追跡される。マイクロタイタープレートマウント６２上に配置されたマイクロタイタープレート６０の上側からの分注は、下面からの照明および検出と組み合わされる。これにより、分注時間および混合時間中の動的過程の観察が可能になる。
【００４１】
マイクロタイタープレート６０の基部の均一な照明は、それぞれ列状に配置されかつプレートに対して斜めに向けられた３６個までのＵＶまたはＶＩＳ高出力ＬＥＤ８０を有する２つのＬＥＤ照明ユニットによって達成される（図７および図８）。利用可能なＬＥＤ８０は３４０〜８００ｎｍの波長範囲内の光９２を供給し、吸光フィルタは選択された波長範囲を透過することによって蛍光励起を改善する。放出された蛍光９４は、迅速かつ高感度の裏面照射型ＥＭＣＣＤ（電子増倍電荷結合素子）またはＩＣＣＤ（強化型電荷結合素子）カメラ８２によって垂直におよび／または９０°の角度で検出される。カメラ８２は干渉フィルタ８４を備えており、さらに偏光フィルタ８５を備えることができる。
【００４２】
調節可能なカメラ構造を二重蛍光検出（図８）に拡張することにより、必要に応じて、例えば、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）に関する測定、または蛍光偏光（ＦＰ）に関連して、２つの発光シグナルを同時に検出することができる。
【００４３】
変更された照明角度で示されているＬＥＤユニットの下に配置されている別のＬＥＤ照明ユニットによって、図７および図８に示されている測定システムを拡張することが可能である。これらの追加のＬＥＤユニットが元のＬＥＤユニットと比較して異なる波長を有する場合、複数の波長で蛍光励起をもたらすことが可能である。
【００４４】
蛍光溶液を含有する１５３６個のアッセイウェルを有するマイクロタイタープレートの発光の偽色描写は、例として図９に示されている。アッセイウェルについてのデータは、アッセイウェルあたり毎秒１０００ポイントまでをキャプチャして視覚化し、そしてカスタマイズされたデータ処理ソフトウェアによってそれらを処理することによって収集される。
【００４５】
性能試験
急速混合装置の性能を試験するために日常的に使用されている方法は、急速試験反応の観察である。蛍光研究の場合、適切に追跡されるのは、蛍光収率の大幅な増加と関連する、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）への疎水性染料１−アニリノ−８−ナフタレンスルホン酸（ＡＮＳ）の結合である。様々なＢＳＡ濃度についての蛍光動態は指数関数に適合され、そして共通の出発蛍光に外挿される。この共通点は、反応の開始時点（ｔ０）でＢＳＡの非存在下でＡＮＳの蛍光を提供する。この点から適合された指数関数曲線上にある最初のデータ点までの時間間隔は、測定のデッドタイムの推定値を提供する。図１０Ａ〜図１０Ｃは、様々なＢＳＡ濃度での補正された蛍光動態を示しており、これは迅速な動態のための本発明の分注装置を備えたイメージング計測器において測定されたものである。
【００４６】
５５ミリ秒後、１．６μｌのＡＮＳ溶液を、９ミリ秒の毛細管バルブ切換えによりＢＳＡ含有マイクロタイタープレートの４８個のアッセイウェルに添加した（図１０Ａ）。毛細管バルブの切り替えは灰色のバーで示されている。ＢＳＡへのＡＮＳの結合は、ＡＮＳ蛍光の増加をもたらし、それは３７０ｎｍ（バンドパス３６ｎｍ）での励起後に４６０ｎｍ（バンドパス６０ｎｍ）で記録される。ＡＮＳおよびＢＳＡ溶液を１００ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．５）中で調製した。最終濃度：５μＭのＡＮＳおよび１．９（白丸）、２．５（黒丸）、３．４（逆三角）、７．９（四角）、および１０．６μＭ（三角）のＢＳＡ（図１０Ａ）。
【００４７】
結合反応の開始時点は、二重指数関数的適合および蛍光動態の共通の開始時間ｔ０への外挿によって確認された。蛍光動態（図１０Ａから集めた）を前記開始時間ｔ０に補正した（図１０Ｂ）。実線は、共通の時点ｔ０に外挿された二重指数関数を示している。
【００４８】
反応のｔ０は、バルブ切り替えの時点と等価ではないが、代わりに、アッセイウェルへの反応物の流入および混合に対応する時間遅延を有することに留意されたい。ｔ０から適合された指数関数曲線上の最初に正しく決定された点までの期間によって実行される計測器のデッドタイムは、分注時間および混合アーチファクトに基づいている。マイクロタイタープレートのアッセイウェル中に３μｌの液体が存在し、前記マイクロタイタープレートの１５３６個のアッセイウェル中に１．６μｌの小容量を分注する場合、約１０ミリ秒のデッドタイムを達成することが可能であり、これは、数ミリ秒の市販のストップトフロー計測器の時間分解能にほぼ対応している。
【００４９】
検出された蛍光トレース（図１０Ｂ）は非常に低いノイズレベルを示し、これは高品質の動態データを示す。図１０Ｃは、ＢＳＡ濃度の関数として、動態トレースから確認された、見かけの結合速度定数のグラフを示している。遅い（黒丸）結合相および速い結合相（白丸）を検出することができた。ＢＳＡ濃度に対する遅い動態を有する結合相の線形依存性は、決定されたトレースの正確さおよび信頼性を裏付ける。観察された速度定数（黒）を従来のストップトフロー装置（赤）によって得られたデータと比較した。遅い結合相の濃度依存性に基づいて決定された見かけの速度定数および二次速度定数は、個々のキュベット内のストップトフロー装置に追加することによって得られたデータと非常に一致している。
【符号の説明】
【００５０】
１０  分注装置
１  バルブ
２  ハウジング
３  漏れ／通気口
４  チューブ
５  圧力室
６  供給口
６ａ  シール
７  マウント
８  シース
６０  マイクロタイタープレート
６２  プレートホルダ
６４  リザーバ容器
６５  液体
６６  ポンプ
６８  圧力ライン
７０  ライン
７１  ライン
７２  バルブ
８０  ＬＥＤモジュール
８２  カメラ
８４  エミッションフィルタ
８５  偏光フィルタ
８６  励起フィルタ
９０  ビームスプリッタ
９２  励起光
９４  蛍光
【図１】
2020502530.tif 000003
【図２】
2020502530.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
2020502530.tif 000012
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年6月24日(2019.6.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの圧力室を有し、前記圧力室に液体を供給するための供給口を有し、前記圧力室とハウジングの外側との間に多数の導管を有する前記ハウジングを備えた分注装置であって、
前記各導管内にはチューブが配置されており、その一端は前記圧力室に突出し、他端は前記ハウジングの外側に突出している、分注装置。
【請求項２】
前記圧力室が円筒形または直方体であることを特徴とする、請求項１に記載の分注装置。
【請求項３】
少なくとも２つの導管が存在し、前記導管は互いに対して平行に配置されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の分注装置。
【請求項４】
前記導管が、１つまたは複数の列に配置されており、１列あたり少なくとも８本、好ましくは２４本または４８本の導管があることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項５】
前記チューブが毛細管であり、好ましくは前記チューブが金属製であることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項６】
前記チューブが、０．１ｍｍ〜０．８ｍｍ、好ましくは０．２ｍｍ〜０．６ｍｍの範囲内の内径を有することを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項７】
前記チューブが、前記ハウジングの前記外側に対して実質的に垂直（９０°）になるように、または前記ハウジングの前記外側に対して４０°から９０°未満の範囲内の角度で傾斜するように配置されることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項８】
前記ハウジングの前記外側に位置する前記チューブの部分が、好ましくはプラスチック製のスリーブで覆われていることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項９】
前記ハウジングが通気口を備えることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項１０】
前記圧力室が、６０ｍｍ２〜３００ｍｍ２の範囲内の断面積、または４ｍｍ〜１０ｍｍの範囲内、好ましくは５．５ｍｍ〜６．５ｍｍの範囲内の直径を有することを特徴とする、請求項１から９のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項１１】
前記ハウジングが、長手方向軸線が平行に延びる２つ、３つ、または４つの圧力室を備え、液体を供給するための別々の供給口が各圧力室に属することを特徴とする、請求項１から１０のいずれか一項に記載の分注装置。
【請求項１２】
請求項１から１０のいずれか一項に記載の分注装置と、ラインを介して前記供給口に接続されている液体リザーバとを備える分注システム。
【請求項１３】
前記液体リザーバと前記供給口との間にバルブが配置されていることを特徴とする、請求項１２に記載の分注システム。
【請求項１４】
前記液体リザーバからの前記液体が、０．５〜２バールの範囲内、好ましくは０．５〜０．８５バールの範囲内の圧力下で前記バルブに当接し、前記バルブの切り替え時間は、５ミリ秒〜２００ミリ秒の範囲内、好ましくは５ミリ秒〜５０ミリ秒の範囲内であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の分注システムの使用。
【請求項１５】
前記バルブの開放時間中の添加量が、毛細管当たり０．３μｌ〜３００μｌ、好ましくは毛細管当たり１μｌ〜３０μｌの範囲内であることを特徴とする、請求項１２または１３に記載の分注システムの使用。
【国際調査報告】
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2020502530.tif 000018
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