(57)【要約】  本発明は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを単離する方法であって、血漿またはＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿画分の陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、方法に関する。さらには、本発明は、本発明の方法から得られ得るＧｌｕ−プラスミノーゲンならびに臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つもしくはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害を患っているかまたは発症するリスクがある患者を治療する方法におけるその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを単離する方法であって、以下の工程：
（ｉ）血漿またはＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿画分を提供する工程；
（ｉｉ）血漿または血漿画分を、陽イオン基を含む樹脂に基づく陰イオン交換体と接触させる工程；
（ｉｉｉ）血漿または血漿画分をローディングした工程（ｉｉ）から得られた陰イオン交換体を、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含まない第１の緩衝液Ｂ１を用いて洗浄する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の洗浄された陰イオン交換体から、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含む第２の緩衝液Ｂ２を用いてＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させ、それにより、緩衝液Ｂ２およびＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を得る工程；
（ｖ）場合により、工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを所望の範囲内のｐＨに調整する工程；
（ｖｉ）場合により、工程（ｉｖ）、（ｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られた溶液に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンがプラスミンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲンに成熟することを防止する１つまたはそれ以上の安定化剤を加えることにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを安定化させる工程；
（ｖｉｉ）場合により、工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかからの溶液を１つまたはそれ以上の抗ウイルス処理に供する工程；および
（ｖｉｉｉ）場合により、工程（ｉｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られたＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を乾燥または凍結乾燥させる工程
を含む、前記方法。
【請求項２】
血漿画分は：
（ａ）典型的に、冷凍およびその後に解凍に供された血漿の上清から得られた脱クリオ血漿；
（ｂ）コーン法もしくはキストラー−ニッチマン法のペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩの廃棄物画分またはこれらの画分の２つもしくは３つ全ての組合せ；および
（ｃ）コーン法もしくはキストラー−ニッチマン法のペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩもしくはペーストＩ＋ＩＩＩまたはＧｌｕ−プラスミノーゲンを含有するこれらのいずれかの画分もしくは廃棄物画分
からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
陰イオン交換体の樹脂は、アミノ基またはその塩、好ましくは、第一級アミノ基またはその塩を有し、より好ましくは、構造部分−Ｒ−ＮＨ２または−Ｒ−ＮＨ３＋＋Ａ−（式中、ＲはＣ１〜Ｃ１０−アルキレン残基であり、Ａ−は陰イオン性対イオンである）を有し、特に、陰イオン交換体はリシル部分を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
第１の緩衝液Ｂ１および／または第２の緩衝液Ｂ２は、７．１〜１１．５のｐＨ、好ましくは８．５〜１１のｐＨ、特に１０〜１１のｐＨを有する塩基性緩衝液である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
第２の緩衝液Ｂ２は、陰イオン交換体の陽イオン基と競合する陽イオンとして、可溶性のアミンまたはその塩、好ましくは、第１級Ｃ１〜Ｃ１０−アミンまたはその塩、特に、リシンまたはその塩を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｖｉ）の安定化剤は、アプロチニン、アルファ−２−アンチプラスミン、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−アルギニンクロロメチルケトン、小分子安定化剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかから得られた溶液は、工程（ｖｉｉ）の抗ウイルス処理に供され、抗ウイルス処理は：
（ｖｉｉ−ａ）１つまたはそれ以上の界面活性剤、好ましくは、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００からなる群から選択される１つまたはそれ以上の界面活性剤を加えること；
（ｖｉｉ−ｂ）リン酸エステル、特にトリ−ｎ−ブチル−ホスフェートのような１つまたはそれ以上の他の抗ウイルス剤を加えること；
（ｖｉｉ−ｃ）限外濾過、特にナノ濾過；および
（ｖｉｉ−ｄ）上述のものの２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
以下の工程：
（ｉ）血漿またはＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿画分を提供する工程；
（ｉｉ）血漿または血漿画分を、構造部分−Ｒ−ＮＨ２または−Ｒ−ＮＨ３＋＋Ａ−（式中、ＲはＣ１〜Ｃ１０−アルキレン残基であり、Ａ−は陰イオン性対イオン、特にリシル残基である）を有する樹脂に基づく陰イオン交換体と接触させる工程；
（ｉｉｉ）血漿または血漿画分をローディングした工程（ｉｉ）から得られた陰イオン交換体を、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含まない８．５〜１１のｐＨを有する第１の緩衝液Ｂ１を用いて洗浄する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の洗浄された陰イオン交換体から、陰イオン交換体のアミノ基と競合する、第１級Ｃ１〜Ｃ１０−アミンまたはその塩、特に、リシンまたはその塩を含む８．５〜１１のｐＨの第２の緩衝液Ｂ２を用いてＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させ、それにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を得る工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを７〜８または４．５〜５．５の範囲内、特に７〜８の範囲内のｐＨに調整する工程；
（ｖｉ）工程（ｉｖ）、（ｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られた溶液に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンがプラスミンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲンに成熟することを防止する１つまたはそれ以上の安定化剤を加えることにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを安定化させる工程であって、特に、前記安定化剤は、アプロチニン、アルファ−２−アンチプラスミン、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−アルギニンクロロメチルケトン、小分子安定化剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、工程；ならびに
（ｖｉｉ）工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかからの溶液を抗ウイルス処理に供する工程であって、特に、前記抗ウイルス処理は：
（ｖｉｉ−Ｉ）１つまたはそれ以上の界面活性剤、好ましくは、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００からなる群から選択される１つまたはそれ以上の界面活性剤、ならびにリン酸エステル、特にトリ−ｎ−ブチル−ホスフェートのような１つまたはそれ以上の他の抗ウイルス剤を加えること；
（ｖｉｉ−ＩＩ）工程（ｖｉｉ−Ｉ）の溶液を除去すること；ならびに
（ｖｉｉ−ＩＩＩ）限外濾過、特にナノ濾過
である、工程；ならびに
（ｖｉｉｉ）場合により、工程（ｉｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られたＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を乾燥または凍結乾燥、特に凍結乾燥させる工程
を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
以下の工程：
（ｉ）以下：
（ａ）典型的に、冷凍およびその後に解凍に供された血漿の上清から得られた脱クリオ血漿；および
（ｂ）コーン法もしくはキストラー−ニッチマン法のペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩの廃棄物画分またはこれらの画分の２つもしくは３つ全ての組合せ、
特に、コーン法またはキストラー−ニッチマン法のペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩまたはＩ＋ＩＩＩの廃棄物画分
からなる群から選択されるＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿画分；
（ｉｉ）血漿または血漿画分を、構造部分−Ｒ−ＮＨ２または−Ｒ−ＮＨ３＋＋Ａ−（式中、Ｒは上記に定義される通りであり、特に、ＲはＣ１〜Ｃ１０−アルキレン残基であり、Ａ−は陰イオン性対イオン、特にリシル残基である）を有する樹脂に基づく陰イオン交換体と接触させる工程；
（ｉｉｉ）血漿または血漿画分をローディングした工程（ｉｉ）から得られた陰イオン交換体を、０．０１〜０．１Ｍの濃度の８．５〜１１のｐＨを有する第１の緩衝液Ｂ１を用いて洗浄する工程であって、前記第１の緩衝液Ｂ１は、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含まない、工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の洗浄された陰イオン交換体から、０．０１〜０．１Ｍの濃度の８．５〜１１のｐＨの第２の緩衝液Ｂ２を用いてＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させ、それにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を得る工程であって、前記第２の緩衝液Ｂ２は、陰イオン交換体のアミノ基と競合する、第１級Ｃ１〜Ｃ１０−アミンまたはその塩、特に、リシンまたはその塩を含む、工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを所望の範囲内のｐＨに調整する工程；
（ｖｉ）場合により、工程（ｉｖ）、（ｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られた溶液に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンがプラスミンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲンに成熟することを防止する１つまたはそれ以上の安定化剤を加えることにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを安定化させる工程であって、特に、前記安定化剤は、アプロチニン、アルファ−２−アンチプラスミン、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−アルギニンクロロメチルケトン、小分子安定化剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、工程；および
（ｖｉｉ）場合により、工程（ｖｉ）の溶液を抗ウイルス処理に供する工程
を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法から得られ得るＧｌｕ−プラスミノーゲン。
【請求項１１】
総ポリペプチド質量に基づいて、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）のＧｌｕ−プラスミノーゲンを含み、特に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法から得られ得るものである、タンパク質組成物。
【請求項１２】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、好ましくは、請求項１０に記載のＧｌｕ−プラスミノーゲン、および少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１３】
臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つもしくはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害を患っているかまたは発症するリスクがある患者を治療する方法における使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲンであって、特に、前記障害は臓器不全である、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン。
【請求項１４】
患者は：
（ａ）患者の血液中に見出されるアルファ−２−アンチプラスミン対Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの比が、同じ種の集団全体において見出される平均の比と比較して少なくとも１．１倍高いこと；および／または
（ｂ）患者の血液中のＧｌｕ−プラスミノーゲンのレベルが、同じ種の集団全体において見出される平均のレベルと比較して少なくとも１％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）低いこと
を特徴とする、請求項１３に記載の使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲン。
【請求項１５】
臓器不全は、個々の臓器における病理学的急性腎不全、急性移植拒絶、凝固亢進、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、および血栓事象であるかまたはそれに関連するものであり、特に、臓器は、心臓、肺および静脈からなる群から選択される、請求項１３または１４に記載の使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲン。
【請求項１６】
前記Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは、請求項１０に記載のＧｌｕ−プラスミノーゲンであり、および／または請求項１２に記載の医薬組成物の部分を形成する、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲン。
【請求項１７】
臓器不全または血栓事象を発症するリスクは、後天性プラスミノーゲン欠乏症により引き起こされる、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲン。
【請求項１８】
臓器不全または血栓事象のリスクは、微小凝固障害により引き起こされる、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲン。
【請求項１９】
患者は、深静脈血栓症および／もしくは肺塞栓症を患っているかまたは発症するリスクがある、請求項１３〜１８のいずれか１項に記載の使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲン。
【請求項２０】
臓器不全または血栓事象を発症するリスクは、プラスミン阻害物質の後天性の増加により引き起こされ、特に、プラスミン阻害物質はアルファ−２−アンチプラスミンである、請求項１３〜１９のいずれか１項に記載の使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲン。
【請求項２１】
障害は、個々の臓器における、臓器不全、深静脈血栓症、慢性または急性臓器塞栓症、臓器梗塞、急性移植拒絶のような線維素溶解系の局所的なまたは生成された不均衡を引き起こす急性または慢性炎症、凝固亢進、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、および血栓事象からなる群から選択され、特に、臓器は、心臓、肺および静脈からなる群から選択される、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血漿またはＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿画分の陰イオン交換クロマトグラフィーを含む、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを単離する方法に関する。さらには、本発明は、本発明の方法から得られ得るＧｌｕ−プラスミノーゲンならびに臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つもしくはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害を患っているかまたは発症するリスクがある患者を治療する方法におけるその使用に関する。本発明によるプラスミノーゲンはまた、一般に後天性プラスミノーゲン欠乏症を患っている患者を治療するために使用することができる。したがって、それらの患者は、臓器不全（例えば、患者の腎臓、心臓、脳、肝臓、肺、筋肉、排出腺、内分泌腺、目、骨などにおける臓器不全）を発症するリスクがある患者であり得る。
【背景技術】
【０００２】
臓器不全は、重篤な生命を脅かす病的状態である。多くの場合、多臓器不全は、敗血症、多発性外傷および／またはウイルス疾患により引き起こされ、ショック症状に繋がり、組織因子の放出および凝固プロセスの終了を開始させる。多発外傷性ショックおよび手術は、組織損傷、悪性腫瘍に繋がって転移の解放に繋がることがあり、敗血症の場合、白血球が増加する。各機序は組織因子の増進を開始させることがあり、フィブリンクロットの形成に関連し得る。線維素溶解により凝固亢進の均衡を取ることができなければ、この事象は頻繁に多臓器不全に繋がる。死体腎臓移植後の線維素溶解の障害およびプロテインＣの増加がＳｅｉｔｚらにより教示されている［非特許文献１］。
【０００３】
多臓器不全を有する患者は、可能な限り迅速な好適な治療戦略を発見するために様々な異なる医薬を用いて治療することができる。
【０００４】
敗血症に起因する多臓器不全を有する患者は、通常、抗生物質を用いて血栓症予防と共に治療される。一部の場合には、患者はまた、臓器特異的治療、例えば、腎不全のための透析、多臓器欠陥（例えば、虫垂）の手術、通気療法および異なる細菌のための抗感染療法および全身性血管効果を呈する血管関連薬物（アドレナリン、ノルアドレナリンのようなカテコールアミン）、血行動態安定化、および活性化プロテインＣ（場合により組換え）および免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧおよびＩｇＭ）により治療される。
【０００５】
そのような治療は、重篤な望ましくない副作用を抱えている。したがって、天然プロテアーゼ阻害剤による血栓効果の治療が検討された。血栓効果に対する現行の標準治療は、天然プロテアーゼ阻害剤を使用することにより線維素溶解を改善させない。アンチトロンビン−ＩＩＩ（主にＦ．Ｘａおよびトロンビンを阻害する）のような天然プロテアーゼ阻害剤の追加は、既存のフィブリンクロットはそのような天然プロテアーゼ阻害剤を用いる治療により影響されないという欠陥を有する。線維素溶解を開始させることができず、多臓器不全に繋がる。
【０００６】
血栓症の治療は、通常、薬物により行われる。静脈血栓の外科的除去は特殊な場合のために留保される。血栓の拡大を予防するために、抗凝固阻害が求められる。最初に、ヘパリン調製物または第Ｘａ因子阻害剤が使用される。クロットの成長が停止すると、身体は損傷の浄化を開始することができる。クロットが破壊され、静脈の自由な流れを再び得ようとする。これには数週から数ヶ月かかり、静脈系のより多くの部分が罹患している程、時間は長くなる。クロットの破壊および静脈の再生において、血液の凝固性を増加させる物質が放出される。この期間中、新たな血栓症のリスクが特に高い。したがって、さらなる抗凝固薬は多くの場合に回避される。次いで、フェンプロクモン、ワルファリンまたはエチルビスクマセタット（ｅｔｈｙｌｂｉｓｃｏｕｍａｃｅｔａｔ）のような４−ヒドロキシクマリンを約３〜６ヶ月間使用することができる。クマリンの使用は、血栓症を予防するが出血しやすさも増加させるので、典型的に、定期的な血液検査および特に注意することを必要とする。とりわけ、抗凝固療法に起因する出血のこのリスクは、日常の臨床プラクティスにおいて未だに解決されていない問題である。
【０００７】
一般にプラスミノーゲンの精製方法が文献に記載されている（特許文献１を参照）。
【０００８】
しかしながら、特に、得られるプラスミノーゲンは安定でなく、またＬｙｓ−プラスミノーゲンの画分を含有することから、これらの方法は満足のいくものではない。他の方法は、かなり不良な回収率を示し、Ｇｌｕ−プラスミン、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンおよびＬｙｓ−プラスミノーゲンを明確に識別しない（特許文献２；特許文献３；非特許文献２を参照）。
【０００９】
血液凝固の均衡は、２つの阻害因子、アンチトロンビンＩＩＩおよびヘパリン補因子ＩＩにより取られる。形成されたフィブリンクロットは、線維素溶解系の活性化によってのみ除去される。線維素溶解系の活性化は、プラスミン活性化に依存する。ヒト血漿は、活性化のいくつもの形態でプラスミノーゲンを含有し、それはＧｌｕ−プラスミノーゲン（ネイティブ）から開始し、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン（わずかに活性化）であり、またその活性化形態であるプラスミンを含有する。健常個体におけるｕＰＡ、ｔＰＡを通じたネイティブＧｌｕ−プラスミノーゲンの活性化は鍵となる機序である（非特許文献３）。
【００１０】
ストレプトキナーゼまたはウロキナーゼは、異なる血栓形成事象において血栓溶解を達成するために治療的状況において使用される（非特許文献４；非特許文献５）。線維素溶解は、プラスミノーゲン（ＰＬＧ）の活性化に起因して開始され、ＰＬＧからプラスミンへの切断に繋がる［非特許文献６］。それにより、３つの異なる活性化の機序が公知である［非特許文献７］。プラスミノーゲンは、内皮細胞およびフィブリンクロットに対して高い結合親和性を有する。組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）の追加の結合は、活性化およびプラスミン形成に繋がる。最後の機序は、細胞表面上のプラスミノーゲンの結合により説明され、プラスミノーゲンはｔＰＡによりプラスミンに活性化される［非特許文献３］。
【００１１】
活性化されたプラスミンは、線維素溶解系における鍵となる酵素である。したがって、プラスミンは、フィブリンクロットマトリックスに結合している限り制御阻害因子アルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）により阻害されないが、放出されたプラスミンは即座に阻害される。遊離のプラスミンは０．１秒の非常に短い半減期を有する。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンおよびアルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）の半減期は５０時間である。対照的に、Ｌｙｓ７８−プラスミノーゲンはわずか２０時間の半減期を有する［非特許文献７］。プラスミンは、トリプシンより高い選択性でリシンおよびアルギニン残基のカルボキシル側において優先的な切断を呈する。それは、重合したフィブリンを可溶性生成物に変換させる［非特許文献８］。
【００１２】
中間分子Ｌｙｓ−プラスミノーゲンは、典型的に、ヒト身体中でフィブリンクロットの時点においてのみ存在する。Ｌｙｓ−プラスミノーゲンは、典型的に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンからＬｙｓ−プラスミノーゲンへの変換後にプラスミンに直接的に変換される。それゆえ、プラスミノーゲンの活性化前の形態であるＬｙｓ−プラスミノーゲンは、典型的に、ヒト身体中で循環しない。
【００１３】
ヒト身体において、減少したＡ２ＡＰ（アルファ−２−アンチプラスミン）（７０〜８０％）および１００％増加したＰＬＧの比を測定することができる。ヒト血清中のＰＬＧ濃度は約０．２ｇ／Ｌであり、プラスミノーゲン基準活性は０．７５〜１．６０Ｕ／ｍＬの範囲内である［非特許文献９］。ＰＬＧの分子量は９２ｋＤａである［非特許文献１０］。ある特定の病的状態の下で、Ａ２ＡＰ＞ＰＬＧ（１．２６の平均比）は非可逆的な反発に繋がる。プラスミノーゲンの欠乏は、特に微小血管系において、フィブリンクロットの望ましくない持続の危険に繋がる。
【００１４】
実施例のセクションに示されるように、疾患の異なる状態において、患者は後天性プラスミノーゲン欠乏症を示すことを立証することができた。
【００１５】
一部の場合には、増加した濃度のアルファ−２−アンチプラスミンは、場合による使用可能な量のプラスミノーゲンを阻害する。しかし他の場合には、アルファ−２−アンチプラスミン濃度は、線維素溶解の減少に影響を有しない。これらの患者は既にほとんどの量のプラスミノーゲンを使い果たしている。結果として生じるプラスミノーゲンの欠乏は、再生産の欠如に起因してヒト身体により均衡を取ることができない。凝固および線維素溶解系の理にかなった均衡は凝固亢進へと移行する。これはまた、組織プラスミノーゲン活性化因子の投与が３０％の卒中患者においてのみ改善を示し得る理由である。
【００１６】
要約すると、先行する研究は、一般にプラスミノーゲンを含む組成物の投与は、血液中のプラスミノーゲンの異常に低い（全体）レベルを患っている患者の身体状態を改善できることを示している。プラスミノーゲンレベルの減少は、このタンパク質の消費の増加により引き起こすことができる。例えば、臓器不全を有する患者は、血液中のかなり低いレベルのプラスミノーゲンを示す。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは、活性の特定の領域を知ることなくプラスミノーゲン欠乏症のオーファンドラッグステータスについて試験されている。
【００１７】
オーファンドラッグステータスは、遺伝性のプラスミノーゲン欠乏症についてのみ到達された。これらの患者は、興味深いことに、健常状態において凝固亢進の増加を有しない。この適応症のために、プラスミノーゲンは主に、身体全体にわたる粘膜上の線維性堆積物の形成に主に関する重篤な臨床症状を予防するために使用されるが、主に血栓事象には使用されない。
【００１８】
原理的に、治療としてＧｌｕ−プラスミノーゲンを使用する、髄膜炎菌に起因する複数の皮膚壊死を含む多臓器不全を有する患者の回復は、バイオ医薬品としての高い潜在能力を説明する。複数の皮膚壊死（ウォーターハウス・フリードリヒセン症候群）からの４歳の少年の回復のデータ［非特許文献１１］。髄膜炎菌患者のデータは、排尿の増加により見ることができるＧｌｕ−プラスミノーゲン治療による回復を説明する。
【００１９】
プラスミノーゲン治療の２３日後に患者は生存し、集中治療から解放されることができた。播種性血管内凝固（ＤＩＣ）もまた非特許文献１２に記載されている。
【００２０】
驚くべきことに、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは成熟形態のＬｙｓ−プラスミノーゲンまたはプラスミンよりも有意に高い望ましい活性を有することが発見された。しかしながら、その乏しい入手可能性により、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの実用可能性は未だに限られている。分別方法など、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを単離するための当該技術分野において公知の満足のいく方法はほとんどない。
【００２１】
したがって、特に、再現性のある処理を用いて大規模かつ大量に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを取得および単離するための効率的な方法が望ましい。
【００２２】
上記に鑑みて、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを取得および単離するための効率的な方法に対する満たされていない必要性が未だに存在する。精製されたＧｌｕ−プラスミノーゲンはまた、臓器不全を患っているかまたは臓器不全を発症するリスクがある患者の治療のような患者の治療においておよび血液画分からそのような化合物を得るためのさらなる展望を可能とする。
【００２３】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは、ヒト血漿中の天然循環アイソフォームである。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは、異なる単離および精製方法に起因してＬｙｓ−プラスミノーゲンに切断されることがある。血栓性疾患である遺伝性のプラスミノーゲン欠乏症は１９８２年に調査検討された［非特許文献１３］。最初に、多くの研究者はＬｙｓ−プラスミノーゲン注射を用いてこれらの患者を治療することを試みたが、それは出血のような非常に大きい副作用を結果としてもたらした。患者は、鼠径部血腫、陥入および肉眼的血尿を発症した［非特許文献１４］。Ｌｙｓ−プラスミノーゲン形態は別のコンホメーションを有し、天然に存在するＧｌｕ−プラスミノーゲンよりも高い親和性を上皮細胞に対して有する。親和性の増加は、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンの非特異的結合に繋がる。結合分子はプラスミンに直接的に変換され、これもまた上皮細胞を切断する。有害効果は、遺伝性のプラスミノーゲン欠乏症の治療のよい影響より大きかった。無作為かつ不明確な治療機会は、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンの産生不良に繋がる。
【００２４】
初期の実験は、プラスミンの静脈注射は出血の形態で高度に有害な効果を結果としてもたらすことを示した。プラスミンは、例えば手術中に局所的に、臨床現場において血栓事象の低減のためにほとんど使用されなかった（非特許文献１５；非特許文献１６）。しかしながら、プラスミンの直接注射を用いて微小血栓事象を溶解させることはできない。枝状の微小凝固は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの静脈注射を用いてのみ達することができる。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンがフィブリンクロットの微小凝固に達する場合、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは臨床現場において活性化され、プラスミンは血栓を消散させる。
【００２５】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの残りをＬｙｓ−プラスミノーゲンに、そして最後にプラスミンに変換させるために最小量のＬｙｓ−プラスミノーゲンで充分である。さらに、数分子がＬｙｓ−プラスミノーゲンに変換された時に、理にかなった自己活性化機序に起因して、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの収率は劇的に低減される。したがって、最良かつ理にかなった精製機構の正しい選択はかなりの影響力を有し得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２６】
【特許文献１】英国特許第１３０５５０４号
【特許文献２】国際公開第２００２／０９５０１９号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５２８８４８９号
【非特許文献】
【００２７】
【非特許文献１】Ｓｅｉｔｚ  Ｒ、Ｍｉｃｈａｌｉｋ  Ｒ、Ｋａｒｇｅｓ  ＨＥ、Ｌａｎｇｅ  Ｈ、Ｅｇｂｒｉｎｇ  Ｒ．、「Ｉｍｐａｉｒｅｄ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｃａｄａｖｅｒ  ｋｉｄｎｅｙ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．」、Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ．、１９８６年５月１日；４２巻（３号）：２７７〜８８頁
【非特許文献２】Ｂｏｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１５年、４７５号：７１〜７９頁
【非特許文献３】Ｓｔｒｉｃｋｅｒ，Ｒ．Ｂ．；Ｗｏｎｇ、「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｂｙ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂａｓｔｈｅｎｉｃ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．」、Ｂｌｏｏｄ、１９８６年、Ｓ．２７５〜２８０頁
【非特許文献４】Ｋｕｎａｍｎｅｎｉ，Ａ．；Ｄｕｒｖａｓｕｌａ，Ｒ．、「Ｓｔｒｅｐｔｏｋｉｎａｓｅ−Ａ  Ｄｒｕｇ  ｆｏｒ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｒｅｖｉｅｗ．」、Ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｒｕｇ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２０１４年、Ｓ．１０６〜１２１頁
【非特許文献５】Ｔａｋａｄａ，Ａｋｉｋａｚｕ；Ｔａｋａｄａ，Ｙｕｍｉｋｏ、「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｔｏ  Ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎ  ｂｙ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ．」、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９８２年、Ｓ．６７１〜６７７頁
【非特許文献６】Ｗｏｈｌ，Ｒ．Ｃ．；「Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｔ  ｐＨ  ７．４  ａｎｄ  ３７  ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｃ」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８０年、Ｓ．２００５〜２０１３頁
【非特許文献７】Ｆｒｅｄｅｎｂｕｒｇｈ，Ｊ．Ｃ．；Ｎｅｓｈｅｉｍ，Ｍ．Ｅ．、「Ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｉｓ  ａ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｄｕｒｉｎｇ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９９２年、Ｓ．２６１５０〜２６１５６頁
【非特許文献８】Ｃａｓｔｅｌｌｉｎｏ，Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｊ．；Ｐｌｏｐｌｉｓ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ  Ａ．、「Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ／ｐｌａｓｍｉｎ  ｓｙｓｔｅｍ．」、Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ、２００５年、Ｓ．６４７〜６５４頁
【非特許文献９】Ｃｅｄｅｒｈｏｌｍ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｓ．、「Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ  ｉｎ  ｐｌａｓｍａ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ．」、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ、１９８１年、Ｓ．９７９〜９８１頁
【非特許文献１０】Ｓｕｍｍａｒｉａ，Ｌ．；Ｓｐｉｔｚ，Ｆ．；Ａｒｚａｄｏｎ，Ｌ．；Ｂｏｒｅｉｓｈａ，Ｉ．Ｇ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｋ．Ｃ．、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｇｌｕ−  ａｎｄ  Ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎｓ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍｉｎｓ．」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７６年、Ｓ．３６９３〜３６９９頁
【非特許文献１１】Ｅｇｂｒｉｎｇ  Ｒ、Ｓｅｉｔｚ  Ｒ、Ｂｌａｎｋｅ  Ｈ、Ｌｅｉｔｉｔｉｓ  Ｊ、Ｋｅｓｐｅｒ  ＨＪ、Ｂｕｒｇｈａｒｄ  Ｒ、Ｆｕｃｈｓ  Ｇ、Ｌｅｒｃｈ  Ｌ．、「Ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  （ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｉｎ  ＩＩＩ−ｔｈｒｏｍｂｉｎ，ａｌｐｈａ−２−ａｎｔｉｐｌａｓｍｉｎ−ｐｌａｓｍｉｎ  ａｎｄ  ａｌｐｈａ−１−ａｎｔｉｔｒｙｐｓｉｎ−ｅｌａｓｔａｓｅ）  ｉｎ  ｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ，ｆｕｌｍｉｎａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｆａｉｌｕｒｅ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉａｃ  ｓｈｏｃｋ：ｖａｌｕｅ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｉｎ  ＤＩＣ／Ｆ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．」、Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ  Ｍｉｔｔ．、１９８６年２月；（７９号）：８７〜１０３頁
【非特許文献１２】Ｗａｄａら（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｒｅ、２０１４年、２巻：１５）
【非特許文献１３】Ｈａｓｅｇａｗａ  Ｄ、Ｔｙｌｅｒ  Ｂ、Ｅｄｓｏｎ  ＪＲ．、「Ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｔｈｒｅｅ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．」、Ｂｌｏｏｄ、１９８２年；６０巻：２１３ａ．
【非特許文献１４】Ｊｅａｎ−Ｎｏｅｌ  Ｆｉｅｓｓｉｎｇｅｒ＿１９８５＿Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａａｒｔｅｒｉａｌ  Ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−Ｌｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ｉｎｆｕｓｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｒｔｅｒｉａｌ  Ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｌｏｗｅｒ  ｌｉｍｂｓ
【非特許文献１５】ＢＩＲＤ  Ｆ、ＣＬＩＦＦＴＯＮ  ＥＥ．：「Ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｃｕｔｅ  ａｂｓｃｅｓｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎ  （ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｎ）．」、Ｓｕｒｇｅｒｙ．、１９５７年７月；４２巻（１号）：２４９〜５５頁；
【非特許文献１６】ＭＯＳＥＲ  ＫＭ．：「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｎ  （ｐｌａｓｍｉｎ）  ｉｎ  ｍａｎ．」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．、１９５９年７月；２０巻（１号）：４２〜５５頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
驚くべきことに、血漿および血漿画分、特に脱クリオ血漿からＧｌｕ−プラスミノーゲンを容易に得ることができること、およびＧｌｕ−プラスミノーゲンは、臓器不全を患っているかまたは臓器不全を発症するリスクがある患者を治療するための効果的な医薬物質として働き得ることが行った実験において発見された。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
したがって、本発明の第１の態様は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを単離する方法であって、以下の工程：
（ｉ）血漿またはＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿画分を提供する工程；
（ｉｉ）血漿または血漿画分を、陽イオン基を含む樹脂に基づく陰イオン交換体と接触させる工程；
（ｉｉｉ）血漿または血漿画分をローディングした工程（ｉｉ）から得られた陰イオン交換体を、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含まない第１の緩衝液Ｂ１を用いて洗浄する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の洗浄された陰イオン交換体から、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含む第２の緩衝液Ｂ２を用いてＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させ、それにより、緩衝液Ｂ２およびＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を得る工程；
（ｖ）場合により、工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを所望の範囲内のｐＨに調整する工程；
（ｖｉ）場合により、工程（ｉｖ）、（ｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られた溶液に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンがプラスミンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲンに成熟することを防止する１つまたはそれ以上の安定化剤を加えることにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを安定化させる工程；
（ｖｉｉ）場合により、工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかからの溶液を１つまたはそれ以上の抗ウイルス処理に供する工程；および
（ｖｉｉｉ）場合により、工程（ｉｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られたＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を乾燥または凍結乾燥させる工程
を含む、方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
この方法は、既存の血漿分別方法とは異なる血漿画分から比較的高収率のかなり純粋なＧｌｕ−プラスミノーゲン（典型的に、全てのポリペプチド成分の９０％（ｗ／ｗ）より高い純度を有する）を得ることを可能とする。当該技術分野において公知の方法と比較して、本発明の方法は、高い全体的なタンパク質純度と共に、増加したタンパク質収率を得ることおよびＧｌｕ−プラスミノーゲン活性化（Ｌｙｓ−プラスミノーゲンまたはプラスミンへの活性化）を最小化することを可能とする。
【００３１】
本発明の方法は、既存の血漿分別方法と一体化させることができる。開始血漿中間物としては、血漿、脱クリオ血漿が挙げられ、捕捉されたＧｌｕ−プラスミノーゲンの後の通過画分を直接的にコーン法に流すことができる。さらには、コーン法の後のペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（すなわち、Ｉ〜ＩＩＩ）またはペーストＩ＋ＩＩＩ（そしてまた、それぞれ、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩまたは画分Ｉ＋ＩＩＩＩ）の結果として生じた廃棄物画分を使用することができる。
【００３２】
例えば、ペーストＩ、ペーストＩ＋ＩＩＩ、ペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩおよびいくつもの中間物のようなＧｌｕ−プラスミノーゲンを含有する任意のおよび各コーン画分を使用することができる。最も好ましくは、既存の生成物（例えば、ＩｇＧ、アルブミン）が方法により影響されない画分が使用される。主生成物の精製後、この廃棄物画分は通常廃棄される。課題となるのは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの形態を保ち、許容されるタンパク質収率を維持することである。これは一般に、高収率、高安定性の生成物を伴い、コーンまたはキストラー−ニッチマンにより定義される典型的な血漿分別方法の標準的な方法への最小の介入を伴う、有益な方法を見出すための主な課題である。
【００３３】
本発明の方法は、当該技術分野における血漿分画手順において廃棄物画分と考えられる画分などの様々なプラスミン画分からＧｌｕ−プラスミノーゲンを単離することを可能とする。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「単離する」は、組成物中の単離されたＧｌｕ−プラスミノーゲンの含有量を増加させることとして最も広い意味で「精製する」と交換可能に理解することができる。それは必ずしも純粋ではない。しかしながら、好ましくは、方法の生成物は、総タンパク質重量に基づいて、少なくとも２５％（ｗ／ｗ）のＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む。より好ましくは、方法の生成物は、総タンパク質重量に基づいて、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、よりいっそう好ましくは少なくとも７０％（ｗ／ｗ）、よりいっそう好ましくは少なくとも８０％（ｗ／ｗ）、特に少なくとも９０％（ｗ／ｗ）のＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む。
【００３５】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲン含有サンプルの純度は、典型的に、本発明の方法を実行すると増加する。純度は、さらなる精製工程を使用することでさらに増加させることができる。生成物の仕様は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンが高純度に精製されることを意味する。不純物（例えば、使用される血漿中、使用される血漿画分中、および生成物中に残存するもの）は、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、アルブミンおよび／または他の血漿タンパク質を含み得る。好ましくは、活性化プロテアーゼは、本発明の方法により（本質的に）除去される。好ましくは、最終生成物中のＬｙｓ−プラスミノーゲンの含有量はかなり低く（例えば、総タンパク質重量に基づいて、０．５％未満、好ましくは０．１％未満、より好ましくは０．０５％未満、特に０．０１％未満）、特に、（本質的に）検出可能でない。
【００３６】
本発明の方法により得られるＧｌｕ−プラスミノーゲンはまた、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン形態において安定化させることができる（すなわち、例えば、（本質的に）Ｌｙｓ−プラスミノーゲン形態に変換しない）。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンからＬｙｓ−プラスミノーゲンへの最小の変換は生成物を不安定化させ得る。最終生成物中の（主な）不純物は最も好ましくはアルブミンであり、これもまたより高い安定性に繋がり得る。
【００３７】
好ましい実施形態では、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは、最終生成物中で少なくとも９５％またはそれより高い純度を有する。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、本発明の方法の工程（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）のいずれかから得られた溶液のダイアフィルトレーションの工程、好ましくは、工程（ｖ）から得られた溶液のダイアフィルトレーションのさらなる工程をさらに含み、特に、前記さらなる工程は、グリシン緩衝液中へのダイアフィルトレーションである。この工程は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物の高い安定性に達するために使用することができる。そのようなさらなる工程の生成物は、工程（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）のいずれか、特に、工程（ｖｉ）〜（ｖｉｉｉ）のいずれかにさらに供される溶液であり得る。
【００３９】
本発明の方法により得られるＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物の純度および安定性は、驚くべきことに、先行技術のそれと比較して有益である。
【００４０】
介入の方法により得られ得る精製されたＧｌｕ−プラスミノーゲンは、好ましくは、（例えば、グリシン緩衝液中に）ダイアフィルトレーションすることができる。この追加の工程は、タンパク質分解活性を有さず、凝集物を有さず、断片を有さず、高いＧｌｕ−プラスミノーゲン回収を有する特に高度に安定なＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物を実証した。
【００４１】
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」という用語は、主にアミノ酸残基から構成され、アミド結合を介して互いに連続的に連結された少なくとも２０アミノ酸残基を含む任意の化学的実体として最も広い意味で本発明の全体を通じて交換可能に理解することができる。本発明の意味においてタンパク質は、１つもしくはそれ以上の翻訳後修飾に供することもできるし、供さないこともでき、かつ／または１つもしくはそれ以上の非アミノ酸部分を共役することもできるし、共役させないこともできることが理解される。タンパク質の末端は、場合により、例えば、アミド化、アセチル化、メチル化、アシル化のような当該技術分野において公知の任意の手段によりキャッピングすることができる。
【００４２】
翻訳後修飾は当該技術分野において周知であり、脂質化、リン酸化、硫酸化、グリコシル化、切断、酸化、還元、脱カルボキシル化、アセチル化、アミド化、脱アミド、ジスルフィド結合形成、アミノ酸付加、補因子付加（例えば、ビオチン化、ヘム付加、エイコサノイド付加、ステロイド付加）および金属イオン、非金属イオン、ペプチドまたは小分子の錯化および鉄−硫化物クラスターの付加であり得るがこれらに限定されない。さらに、場合により、補因子、特に、環状グアニジン一リン酸（ｃＧＭＰ）であるが、場合により、例えば、ＡＴＰ、ＡＤＰ、ＮＡＤ＋、ＮＡＤＨ＋Ｈ＋、ＮＡＤＰ＋、ＮＡＤＰＨ＋Ｈ＋、金属イオン、陰イオン、脂質などでもある補因子を、これらの補因子の生物学的影響にかかわらず、タンパク質に結合させることができる。
【００４３】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの文脈において、特にグリコシル化は役割を果たし得る。本発明の方法の利点は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの２つのグリコシル化パターンが、精製された生成物中に観察可能であり得ることである。
【００４４】
本発明の意味におけるＧｌｕ−プラスミノーゲンは、目的の任意の種のＧｌｕ−プラスミノーゲンであり得る。好ましくは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは、ヒトまたは哺乳動物起源のものであり、特にヒトＧｌｕ−プラスミノーゲンである。Ｇｌｕ−プラスミノーゲン（すなわち、ネイティブのインタクトなヒトプラスミノーゲン）は、２４個ものジスルフィド結合を有する２９１アミノ酸の糖タンパク質である。
【００４５】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは、単一のＮ−結合型シアル酸付加二分岐グリカンを含有する。２つのＯ−グリカンは、末端のＧａｌにおいてα−２−３シアル酸付加されたＧａｌ  β−１−３ＧａｌＮＡｃコアを有する。追加のジシアル酸付加形態は、ＧａｌＮＡｃへのα−２−６連結を有する第２のシアル酸残基を有する。モノおよびジシアル酸付加形態は、ヒトプラスミノーゲンにおいて８０：２０のモル比で生じる。ヒトプラスミノーゲン活性化因子のための最適な条件は３７℃、ｐＨ７．４である［Ｗｏｈｌ，Ｒ．Ｃ．；Ｓｕｍｍａｒｉａ，Ｌ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｋ．Ｃ．、「Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｂｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｔ  ｐＨ  ７．４  ａｎｄ  ３７  ｄｅｇｒｅｅｓ  Ｃ．」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９８０年、Ｓ．２００５〜２０１３頁］。血漿中のＰＬＧの濃度（２．２μＭ）は、血漿および間質液中の受容体の５０％占有より大きい。ＰＬＧ受容体は細胞表面上に豊富に存在し（３７，０００部位／血小板−＞１０７部位／内皮細胞）、単一のクラスの分子に限定されない。プラスミンは８３ｋＤａの分子量を有する［Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｋ．Ｃ．；Ｂｏｒｅｉｓｈａ，Ｉ．Ｇ．；Ａｒｚａｄｏｎ，Ｌ．；Ｓｕｍｍａｒｉａ，Ｌ．、「Ｐｈｙｓｉｃａｌ  ａｎｄ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＨ２−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ｌｙｓｉｎｅ  ｆｏｒｍｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｌａｓｍｉｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ＮＨ２−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌｙｓｉｎｅ  ｈｅａｖｙ  （Ａ）  ｃｈａｉｎ．」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７５年、Ｓ．４０４４〜４０４７頁；Ｂａｒｌｏｗ，Ｇ．Ｈ．；Ｓｕｍｍａｒｉａ，Ｌ．；Ｒｏｂｂｉｎｓ，Ｋ．Ｃ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍｉｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｍｉｃｒｏｇｒａｍ  ｌｅｖｅｌ．」、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９６９年、Ｓ．１１３８〜１１４１頁］。遊離のプラスミンは０．１秒の半減期を有し、これは、対応する阻害因子アルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）が２．６日の半減期を有することとは対照的である。
【００４６】
周知の通り、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを切断し、それにより、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン（典型的にＧｌｕ−プラスミノーゲンのアミノ酸部分Ｌｙｓ７７のＮ末端での切断）、Ｇｌｕ−プラスミン（典型的にＧｌｕ−プラスミノーゲンのアミノ酸部分Ａｒｇ５６１とＶａｌ５６２との間の切断）および（Ｌｙｓ−）プラスミン（典型的にＧｌｕ−プラスミノーゲンのアミノ酸部分Ｌｙｓ７７のＮ末端、アミノ酸部分Ａｒｇ５６１とＶａｌ５６２との間の切断）に酵素的に成熟させることができる。
【００４７】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンのアミノ酸部分Ｌｙｓ７７のＮ末端での切断は、組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰａ）により促進させることができる。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンのアミノ酸部分Ａｒｇ５６１とＶａｌ５６２との間の切断は、プラスミンにより自己触媒的に促進させることができる。
【００４８】
血漿（ｂｌｏｏｄ  ｐｌａｓｍａ）（「血漿」（ｐｌａｓｍａ）、「血漿」（ｐｌａｓｍ）または「血漿」（ｂｌｏｏｄ  ｐｌａｓｍ）などとしても表される）は、任意の供給源から得ることができる。例えば、それは、細胞が除去された血液保存物から得ることができる。血漿はまた、様々な供給者から市販されている。
【００４９】
本発明、特にその工程（ｉ）および（ｉｉ）の文脈において、「血漿画分」という用語は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿から分離された任意の部分として最も広い意味において理解することができる。血漿から血漿画分を調製するためのいくつもの経路が当業者に公知である。１つの一般的に公知の例は、冷凍解凍サイクルおよび溶液中のエタノールの濃度を徐々に増加させることに基づくコーン法（Ｃｏｈｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ）（コーン法（Ｃｏｈｎ  ｍｅｔｈｏｄ）としても表される）である。
【００５０】
工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを所望の範囲内のｐＨに調整する工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを４．５〜１０．３の範囲内のｐＨに調整するものであり得る。
【００５１】
例えば、工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを所望の範囲内のｐＨに調整する工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを７〜８、４．５〜５．５、５．５〜６．５、６．５〜７．３、７．３〜８．０、または８．０〜１０．３の範囲内のｐＨに調整するものであり得る。
【００５２】
好ましい実施形態では、工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを７〜８または４．５〜５．５の範囲内、特に７〜８の範囲内のｐＨに調整するものである。これは、生理学的範囲内または生理学的範囲の近くの範囲である。
【００５３】
代替的な好ましい実施形態では、工程（ｖ）は、工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを４．５〜５．５、５．５〜６．５、６．５〜７．３、７．３〜８．０、または８．０〜１０．３の範囲内のｐＨに調整するものである。そのようなｐＨ値は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンおよび場合により他の成分を安定化させ得る。
【００５４】
任意の溶液を場合により濾過することができる。
【００５５】
手順の工程（ｉｉ）〜（ｖｉｉｉ）のそれぞれを場合により繰り返すことができることが理解されるであろう。
【００５６】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、以下の工程：
（ｉ）血漿またはＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿画分を提供する工程；
（ｉｉ）血漿または血漿画分を、陽イオン基を含む樹脂に基づく陰イオン交換体と接触させる工程；
（ｉｉｉ）血漿または血漿画分をローディングした工程（ｉｉ）から得られた陰イオン交換体を、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含まない第１の緩衝液Ｂ１を用いて洗浄する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の洗浄された陰イオン交換体から、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含む第２の緩衝液Ｂ２を用いてＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させ、それにより、緩衝液Ｂ２およびＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を得る工程；
（ｖ）場合により、工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを所望の範囲内のｐＨに調整する工程；
（ｖｉ）工程（ｉｖ）、（ｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られた溶液に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンがプラスミンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲンに成熟することを防止する１つまたはそれ以上の安定化剤を加えることにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを安定化させる工程；
（ｖｉｉ）工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかからの溶液を１つまたはそれ以上の抗ウイルス処理に供する工程であって、特に、前記抗ウイルス処理が：
（ｖｉｉ−Ｉ）１つまたはそれ以上の界面活性剤、好ましくは、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００からなる群から選択される１つまたはそれ以上の界面活性剤、ならびにリン酸エステル、特にトリ−ｎ−ブチル−ホスフェートのような１つまたはそれ以上の他の抗ウイルス剤を加えること；および
（ｖｉｉ−ＩＩ）工程（ｖｉｉ−Ｉ）の溶液を除去すること
である、前記工程；
（ｉｉ＊）工程（ｖｉｉ）から得られた溶液を、陽イオン基を含む樹脂に基づく陰イオン交換体と接触させる工程；
（ｉｉｉ＊）血漿または血漿画分をローディングした工程（ｉｉ＊）から得られた陰イオン交換体を、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含まない第１の緩衝液Ｂ１を用いて洗浄する工程；
（ｉｖ＊）工程（ｉｉｉ）の洗浄された陰イオン交換体から、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含む第２の緩衝液Ｂ２を用いてＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させ、それにより、緩衝液Ｂ２およびＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を得る工程；
（ｖｉｉ）工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかからの溶液を１つまたはそれ以上の抗ウイルス処理に供する工程であって、特に、前記抗ウイルス処理が：
（ｖｉｉ−ＩＩＩ＊）限外濾過、特にナノ濾過
である、前記工程；
（ｖ＊）場合により、工程（ｖｉｉ＊）から得られた溶液のｐＨを所望の範囲内のｐＨ（上記の通り、１つの好ましい実施形態では、例えば、７〜８または４．５〜５．５の範囲内、特に、７〜８の範囲内のｐＨ）に調整する工程；
（ｖｉ＊）場合により、工程（ｖ＊）から得られた溶液に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンがプラスミンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲンに成熟することを防止する１つまたはそれ以上の安定化剤を加えることにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを安定化させる工程であって、特に、前記安定化剤が、アプロチニン、アルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−アルギニンクロロメチルケトン、小分子安定化剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、前記工程；および
（ｖｉｉｉ）場合により、特に凍結乾燥により、工程（ｖｉｉ＊）、（ｖ＊）または（ｖｉ＊）のいずれかから得られたＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を乾燥または凍結乾燥させる工程
を含む方法に関する。
【００５７】
工程（ｖｉｉ−Ｉ）の溶液を除去するサブ工程（ｖｉｉ−ＩＩ）は、任意の好適な緩衝液を用いて洗浄することにより行うことができる。例示的には、例えば、ｐＨ５．７５の２５ｍＭの酢酸緩衝液のような、１０〜２５０ｍＭの酢酸塩および５．４〜７．４の範囲内のｐＨの酢酸緩衝液を使用することができる。
【００５８】
好ましい実施形態では、血漿画分は：
（ａ）典型的に、冷凍およびその後に解凍に供された血漿の上清から得られた脱クリオ血漿；
（ｂ）コーン法もしくはキストラー−ニッチマン法のペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩの廃棄物画分またはこれらの画分の２つもしくは３つ全ての組合せ；および
（ｃ）コーン法もしくはキストラー−ニッチマン法のペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩもしくはペーストＩ＋ＩＩＩまたはＧｌｕ−プラスミノーゲンを含有するこれらのいずれかの画分もしくは廃棄物画分
からなる群から選択される。
【００５９】
より好ましい実施形態では、血漿画分は：
（ａ）典型的に、冷凍およびその後に解凍に供された血漿の上清から得られた脱クリオ血漿；および
（ｂ）コーン法もしくはキストラー−ニッチマン法のペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩもしくはＩ＋ＩＩＩの廃棄物画分またはこれらの画分の２つもしくは３つ全ての組合せ
からなる群から選択される。
【００６０】
好ましい実施形態では、血漿画分は：
（ａ）典型的に、冷凍およびその後に解凍に供された血漿の上清から得られた脱クリオ血漿；および
（ｂ）コーン法のペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩもしくはペーストＩ＋ＩＩＩの廃棄物画分またはこれらの画分の２つもしくは３つ全ての組合せ
からなる群から選択される。
【００６１】
コーン法のペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（すなわち、Ｉ〜ＩＩＩ）またはペーストＩ＋ＩＩＩの廃棄物画分は、典型的に、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（すなわち、Ｉ〜ＩＩＩ）またはＩ＋ＩＩＩのペースト相である。
【００６２】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを単離する方法であって、以下の工程：
（ｉ）Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを含む脱クリオ血漿（その亜画分など）を提供する工程；
（ｉｉ）脱クリオ血漿を、陽イオン基を含む樹脂に基づく陰イオン交換体と接触させる工程；
（ｉｉｉ）脱クリオ血漿をローディングした工程（ｉｉ）から得られた陰イオン交換体を、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含まない第１の緩衝液Ｂ１を用いて洗浄する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の洗浄された陰イオン交換体から、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含む第２の緩衝液Ｂ２を用いてＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させ、それにより、緩衝液Ｂ２およびＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を得る工程；
（ｖ）場合により、工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを所望の範囲内のｐＨに調整する工程；
（ｖｉ）場合により、工程（ｉｖ）、（ｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られた溶液に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンがプラスミンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲンに成熟することを防止する１つまたはそれ以上の安定化剤を加えることにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを安定化させる工程；
（ｖｉｉ）場合により、工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかからの溶液を１つまたはそれ以上の抗ウイルス処理に供する工程；および
（ｖｉｉｉ）場合により、工程（ｉｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られたＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を乾燥または凍結乾燥させる工程
を含む、方法である。
【００６３】
脱クリオ血漿（ｃｒｙｏ−ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ）は、当該技術分野において理解されるものとして最も広い意味において理解することができる。「脱クリオ血漿」（ｃｒｙｏ  ｐｏｏｒ  ｐｌａｓｍａ）、「クリオ上清」、「クリオ沈殿枯渇物」という用語をこれと交換可能に使用することができる。それは、典型的に、クリオ沈殿が除去された血漿、したがって冷凍およびその後に解凍に供された血漿の上清として理解される。
【００６４】
好ましい実施形態では、本発明の方法の工程（ｉ）は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿画分を提供することであり、前記血漿画分は、ペーストＩ＋ＩＩＩおよび／もしくはペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩからのものであるか、またはカプリル酸および場合によりカルシウムトリホスフェート処理後のペーストＩ＋ＩＩＩおよび／もしくはペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩからの廃棄物ペーストである。
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明の方法の工程（ｉ）は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿画分を提供することであり、前記血漿画分は、カプリル酸および場合によりカルシウムトリホスフェート処理後のペーストＩ＋ＩＩＩおよび／またはペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩからの沈殿物である。
【００６６】
代替的な好ましい実施形態では、本発明の方法の工程（ｉ）は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿画分を提供することであり、前記血漿画分は、カプリル酸および、場合により、カルシウムトリホスフェート処理後のペーストＩ＋ＩＩＩおよび／またはペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩからの上清である。
【００６７】
ペーストＩ＋ＩＩＩおよびペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩはまた、以前に冷凍解凍サイクルに供されたサンプル（すなわち、脱クリオ血漿）から得ることができることが理解されるであろう。
【００６８】
さらには、ペーストＩ＋ＩＩＩからおよび／またはＩ〜ＩＩＩからも、ならびに、場合により、カプリル酸およびカルシウムトリホスフェート処理後の結果として生じた廃棄物画分からＧｌｕ−プラスミノーゲンを精製することができる。画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩは、主生成物ＩｇＧの精製のための方法から得ることができる。先行する工程において、ペースト懸濁液を酢酸緩衝液（１０ｍＭ〜２５０ｍＭ、ｐＨ５．０〜６．０）中に溶解させることができる。
【００６９】
その後、カプリル酸およびカルシウムトリホスフェートを加えることができ、深層濾過工程において除去することができる。濾液は、ＩｇＧのさらなる精製工程のために使用することができ、濾過ケーク（廃棄物画分）は、場合により、再び洗浄することができる。個々の分別方法に応じた特定の洗浄工程に起因してＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させることができる。ｐＨ値を調整することができる。次いで、上記される本発明の方法を実行することができ、したがって、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを精製することができる。
【００７０】
ペーストＩ＋ＩＩＩおよび／またはペースト懸濁液Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩから、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを直接的に精製することもできる。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの収率は、血漿濃度（例えば、約８０〜１００μｇ／ｍＬ、一例では、９０μｇ／ｍＬなど）と比較して、最小限に減少し得る（例えば、約６０〜８０μｇ／ｍＬ、一例では、７３μｇ／ｍＬなど）。例示的には、減少は、０．５〜０．９倍、好ましくは０．６〜０．８倍、特に０．７０〜０．７５倍の血漿濃度が得られるようなものであり得る。Ｇｌｕ−プラスミノーゲン濃度は、多くの場合に３０μｇ／ｍＬ未満である廃棄物画分における濃度より高いものであり得る。したがって、廃棄物画分と比較して、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン濃度は、少なくとも１．１倍、好ましくは少なくとも１．３倍、より好ましくは少なくとも１．７倍、よりいっそう好ましくは少なくとも２倍、特に少なくとも２．５倍増加し得る。しかしながら、廃棄物画分を使用する大きな利点は、ＩｇＧのようなタンパク質生成物のための現行の製造手順に影響することなく、そうでなければ廃棄されるタンパク質を追加的に使用することであり得る。それと共に、新規の精製手順が新たなタンパク質生成物のために得られる。一般に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは、ペーストＩ＋ＩＩＩ、画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩおよび画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの廃棄物画分から単離することができる。濃度は、各個々のコーン法またはキストラー−ニッチマン法とは異なり得る。
【００７１】
原理的に、陰イオン交換体は、タンパク質、特にＧｌｕ−プラスミノーゲンの精製のために好適な当該技術分野において公知の任意の陰イオン交換体であり得る。
【００７２】
典型的に、それは、カラム、特に、固相として樹脂を有するクロマトグラフィーカラムである。最も典型的には、樹脂はビーズ（主にマイクロメートル範囲内）を形成する。
【００７３】
そのようなビーズは、１〜１０００μｍ、好ましくは１０〜５００μｍ、より好ましくは２０〜２００μｍ、よりいっそう好ましくは５０〜１５０μｍ、よりいっそう好ましくは６０〜１２０μｍ、特に７０〜１００μｍの範囲内の質量平均の粒子の（本質的に）球状のビーズであり得る。
【００７４】
あるいは、静止したフィルターおよび一体構造の担体を使用することもできる。例えば、シリカ、セラミックス、多糖またはこれらの２つもしくはそれ以上の組合せのような任意の固相を使用することができる。陰イオン交換体の樹脂は、典型的に、陰イオン交換を可能とするためにその表面上に陽イオン基またはその塩を有する。本発明の文脈において、そのような陽イオン基は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを回復不能に破壊することなくＧｌｕ−プラスミノーゲンとの陰イオン交換を可能とする任意の陽イオン基であり得る。好ましい樹脂は、高い結合能力、頑強な材料およびより高い流速を使用できる能力を有する。好ましくは、陰イオン交換体は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを（本質的に）修飾せず、特に、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンへの変換に繋がらない。さらには、タンパク質分解活性は、好ましくは、陰イオン交換体の使用に起因して増加しない。
【００７５】
好ましい実施形態では、陰イオン交換体の樹脂は、アミノ基またはその塩、好ましくは、第一級アミノ基またはその塩を有する。
【００７６】
好ましい実施形態では、陰イオン交換体の樹脂は、アミノ基またはその塩、好ましくは、第一級アミノ基またはその塩を有し、より好ましくは、構造部分−Ｒ−ＮＨ２または−Ｒ−ＮＨ３＋＋Ａ−（式中、Ｒは、２０個以下の炭素原子の有機スペーサーであり、好ましくは、分岐または非分岐のＣ１〜Ｃ１０−（ヘテロ）アルキレン残基、分岐または非分岐のＣ１〜Ｃ１０−（ヘテロ）アルケニレン残基、分岐または非分岐のＣ１〜Ｃ１０−（ヘテロ）アルキニレン残基、Ｃ４〜Ｃ１０−（ヘテロ）シクロアルキレン残基、Ｃ４〜Ｃ１０−（ヘテロ）芳香性残基からなる群から選択され、これらの残基のいずれも、場合により、上述の残基の１つまたはそれ以上により置換することができ、Ａ−は陰イオン性対イオンであり、特に、陰イオン交換体はリシル部分を有する）を有する。
【００７７】
より好ましい実施形態では、陰イオン交換体の樹脂は、構造部分−Ｒ−ＮＨ２または−Ｒ−ＮＨ３＋＋Ａ−（式中、ＲはＣ１〜Ｃ１０−アルキレン残基であり、Ａ−は陰イオン性対イオンである）を有する。特に好ましい実施形態では、陰イオン交換体はリシル部分を有する。リシル部分は、Ｌ−リシルまたはＤ−リシル部分、特にＬ−リシル部分であり得る。
【００７８】
好ましくは、本発明の方法はまた、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンのタンパク質分解活性を低減させる方法である。
【００７９】
陰イオン交換体は、任意の結合能力を有し得る。好ましい実施形態では、陰イオン交換体は、樹脂の排液１ｍＬ当たり０．１ｍｇより多くのプラスミノーゲン、好ましくは樹脂の排液１ｍＬ当たり０．２ｍｇより多くのプラスミノーゲン、より好ましくは樹脂の排液１ｍＬ当たり０．５ｍｇより多くのプラスミノーゲン、よりいっそう好ましくは樹脂の排液１ｍＬ当たり１．０ｍｇより多くのプラスミノーゲン、特に樹脂の排液１ｍＬ当たり１．５ｍｇより多くのプラスミノーゲンの結合能力を有する。
【００８０】
使用される樹脂は、特に、セラミックビーズに基づく場合、高い圧縮性を有し得る。したがって、好ましい実施形態では、陰イオン交換体の固相は、セラミックスに基づく。例えば、セラミックビーズに結合したリシン部分は、陰イオン交換体として使用することができる。高密度のリガンド（例えば、リシン部分に基づく）を使用する場合、カラムの迅速なパッキングを達成することができる。これは、数分以内に達成することができる。
【００８１】
例えば、Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ−Ｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｓｏｒｂｅｎｔ（Ｐａｌｌ、ＵＳＡから市販されている）を陰イオン交換体樹脂として使用することができる。例えばＨｙｐｅｒ−Ｄ樹脂はかなり剛性であり、圧力の増加または樹脂の縮小もしくは膨潤を伴わずに高い流速の使用を可能とする。さらには、そのような樹脂の特徴は、高い結合能力に起因して高い生産性に繋がり得る。好ましくは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを溶出するときの困難を回避するためおよびタンパク質分解活性化機構を回避するために、結合能力は高過ぎないものである。
【００８２】
陰イオン交換体はまた、英国特許第１３０５５０４号、国際公開第２００２／０９５０１９号パンフレットまたはＢｏｉら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０１５年、４７５巻：７１〜７９頁のいずれかにおいて一般にプラスミンおよびプラスミノーゲンの文脈において開示されるようなものであり得る。
【００８３】
代替的な好ましい実施形態では、陰イオン交換体の固相は、多糖または多糖の組合せに基づく。より好ましい実施形態では、陰イオン交換体の固相は、セファロースに基づく。例えば、セファロースビーズに結合したリシン部分を陰イオン交換体として使用することができる。セファロースは、典型的に、部分架橋アガロースに基づく。それは、約１〜１０％の架橋アガロース、好ましくは２〜５％の架橋アガロース、特に約４％の架橋アガロースを含有し得る。例えば、ＥＣＨ−Ｌｙｓｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ＵＫ）を陰イオン交換体樹脂として使用することができる。この樹脂は架橋された４％のアガロースに基づき、したがって、大きいサンプル体積の迅速な処理を可能とする。
【００８４】
任意の流速を使用することができる。例えば、１０〜５０００ｃｍ／ｈ、好ましくは２０〜１０００ｃｍ／ｈ、より好ましくは５０〜５００ｃｍ／ｈ、特に少なくとも２００ｃｍ／ｈの流速を使用することができる。
【００８５】
工程（ｉ）において、フィード体積の血漿または血漿画分がカラムにフィードされる。好ましい実施形態では、工程（ｉ）において、５〜５０カラム体積（ＣＶ）、好ましくは８〜２５ＣＶ、より好ましくは１０〜２２ＣＶ、よりいっそう好ましくは１５〜２１ＣＶ、特に（約）２０ＣＶの血漿または血漿画分がフィード液として使用される。
【００８６】
好ましくは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンと陰イオン交換体との接触時間はかなり短い。１つの好ましい実施形態では、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンと陰イオン交換体との接触時間は、１〜６０分、好ましくは２〜４５分、より好ましくは３〜３０分、よりいっそう好ましくは５〜２０分、よりいっそう好ましくは７〜１５分、特に約１０分である。この接触時間はまた、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの分子がカラムを通過するために必要な時間として定義することができる。
【００８７】
接触時間に基づいて、特に５〜２５ｃｍのカラム高さを使用する場合に、本発明の方法において使用される（線）流速は、好ましくは１０ｃｍ／ｈ〜１００ｃｍ／ｈの範囲内、より好ましくは２０ｃｍ／ｈ〜８０ｃｍ／ｈの範囲内、よりいっそう好ましくは３０ｃｍ／ｈ〜５０ｃｍ／ｈの範囲内、特に４１ｃｍ／ｈ〜４６ｃｍ／ｈの範囲内であり得る。
【００８８】
対イオンＡ−は、この目的のために好適な任意の陰イオンであり得ることが理解されるであろう。典型的に、対イオンは５００Ｄａ未満の分子量を有する。好ましくは、対イオンＡ−は薬学的に許容されるものである。必ずしもそうではないが好ましくは、対イオンＡ−は、塩化物、リン酸、リン酸水素、リン酸二水素、硫酸、ヒドロキシル、炭酸、および炭酸水素からなる群から選択される。対イオンＡ−は、典型的に、カラムがフラッシュされる時に使用される緩衝液中に含まれるようなものである。対イオンＡ−は、例えば、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの陰イオン基との、陰イオンの迅速な交換を可能とするために、−Ｒ−ＮＨ３＋に強固に結合しないようなものであるべきである。
【００８９】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、工程（ｉｉ）の血漿または血漿画分を、陽イオン基を含む樹脂に基づく陰イオン交換体と接触させることの前の追加の工程：
（ｏ）ｐＨ６〜８の範囲内、特にｐＨ６．５〜ｐＨ７．４の範囲内のｐＨを有する緩衝液を用いて陰イオン交換体を平衡化する工程
を含む。
【００９０】
緩衝液Ｂ１および／または緩衝液Ｂ２の緩衝剤は、任意の濃度において使用することができる。好ましくは、緩衝液Ｂ１および／または緩衝液Ｂ２の各々の緩衝剤の濃度は、互いから独立してそれぞれ、０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲内、好ましくは１ｍＭ〜０．５Ｍの範囲内、特に０．０１〜０．１Ｍの範囲内である。緩衝液Ｂ１およびＢ２の両方における緩衝剤は、任意の濃度において使用することができる。好ましくは、緩衝液Ｂ１およびＢ２の両方における緩衝剤の濃度は、互いから独立してそれぞれ、０．１ｍＭ〜１Ｍの範囲内、好ましくは１Ｍ〜０．５Ｍの範囲内、特に０．０１〜０．１Ｍの範囲内である。同等の濃度および／またはｐＨ値をＢ１およびＢ２において使用できる場合であっても、両方の緩衝液は、その同じまたは異なる緩衝剤および場合によるさらなる成分を含むことができることが理解されるであろう。
【００９１】
緩衝液Ｂ１および／または緩衝液Ｂ２の緩衝剤は、任意の電導度を有し得る。好ましくは、緩衝液Ｂ１および／または緩衝液Ｂ２の電導度は、互いから独立してそれぞれ、５００ｍＳ／ｃｍ未満、好ましくは２００ｍＳ／ｃｍ未満、より好ましくは１００ｍＳ／ｃｍ未満、よりいっそう好ましくは０．１〜５０ｍＳ／ｃｍの範囲内、よりいっそう好ましくは０．２〜２０ｍＳ／ｃｍの範囲内、よりいっそう好ましくは０．５〜１５ｍＳ／ｃｍの範囲内、よりいっそう好ましくは１〜１０ｍＳ／ｃｍの範囲内、特に約５ｍＳ／ｃｍである。
【００９２】
例示的には、ｐＨ６．６のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をこの平衡化工程のために使用することができる。特に好ましい実施形態では、ｐＨ６．６の０．０５Ｍのリン酸緩衝液をこの平衡化工程のために使用することができる。
【００９３】
緩衝液Ｂ１およびＢ２のｐＨは、互いから独立してそれぞれ、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンについて許容される範囲内、すなわち、特に、そのアミド結合を破壊しない範囲内において自由に選択することができる。使用される緩衝液のｐＨは、選択されるカラムの樹脂に適合させることができることが理解されるであろう。特に、第一級アミノ基を含む樹脂が使用される場合、ｐＨは、好ましくは、塩基性範囲内である。
【００９４】
好ましい実施形態では、第１の緩衝液Ｂ１は、７．１〜１１．５のｐＨ、好ましくは８．５〜１１のｐＨ、特に１０〜１１のｐＨを有する。別の好ましい実施形態では、第２の緩衝液Ｂ２は、７．１〜１１．５のｐＨ、好ましくは８．５〜１１のｐＨ、特に１０〜１１のｐＨを有する。したがって、好ましい実施形態では、第１の緩衝液Ｂ１および／または第２の緩衝液Ｂ２は、７．１〜１１．５のｐＨ、好ましくは８．５〜１１のｐＨ、特に１０〜１１のｐＨを有する塩基性緩衝液である。緩衝液Ｂ１およびＢ２のｐＨは、同じまたは異なるものであり得る。好ましくは、緩衝液Ｂ１およびＢ２のｐＨの差異は、ΔｐＨ２未満、より好ましくはΔｐＨ１未満、よりいっそう好ましくはΔｐＨ０．５未満、特にΔｐＨ０．３以下またはそれに（本質的に）等しいものであり得る。この工程はまた、好ましくは、（高度に精製された）Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物を溶出させるためおよび８０％より高い収率を達成するために有益である。
【００９５】
したがって、好ましい実施形態では、方法は、血漿または血漿画分中のＧｌｕ−プラスミノーゲンの開始量の８０％より高い、好ましくは８５％より高い、特に９０％より高いＧｌｕ−プラスミノーゲンの収率を達成した。
【００９６】
必ずしもそうではないが好ましくは、緩衝液Ｂ１およびＢ２の組成は、（陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンの存在以外、）両方の緩衝液中で（本質的に）同一である。好ましくは、緩衝液Ｂ１は、０．０１〜０．１Ｍ（好ましくは０．０３〜０．０７Ｍ、特に０．０５Ｍ）の酢酸ナトリウムを含む。例示的には、緩衝液Ｂ１は、０．０１〜０．１Ｍ（好ましくは、０．０３〜０．０７Ｍ、特に０．０５Ｍ）の酢酸ナトリウムおよび０．０１〜０．１Ｍ（好ましくは０．０３〜０．０７Ｍ、特に０．０５Ｍ）のグリシンを含むことができ、８．５〜１１の範囲内のｐＨ（好ましくは１０〜１１の範囲内のｐＨ、特にｐＨ１０．３）に調整することができる。
【００９７】
好ましくは、緩衝液Ｂ２は、０．０１〜０．１Ｍ（好ましくは０．０３〜０．０７Ｍ、特に０．０５Ｍ）の酢酸ナトリウムを含む。例示的には、緩衝液Ｂ２は、０．０１〜０．１Ｍ（好ましくは０．０３〜０．０７Ｍ、特に０．０５Ｍ）の酢酸ナトリウムおよび０．０１〜０．１Ｍ（好ましくは０．０３〜０．０７Ｍ、特に０．０５Ｍ）のグリシンおよび０．０１〜０．０５Ｍ（好ましくは０．０２〜０．０３Ｍ、特に０．０２５Ｍ）のリシンを含むことができ、８．５〜１１の範囲内のｐＨ（好ましくは１０〜１１の範囲内のｐＨ、特にｐＨ１０．５）に調整することができる。
【００９８】
上記の通り、第２の緩衝液Ｂ２は、陰イオン交換体の陽イオン基と競合する陽イオン（競合物陽イオンＣＣ）を含む。これは、原理的に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンとのイオン性相互作用について陰イオン交換体の樹脂の陽イオン部分との競合を可能とする任意の陽イオンであり得る。
【００９９】
好ましい実施形態では、陰イオン交換体の樹脂との特に有益な競合を可能とするために、緩衝液Ｂ２において使用される競合物陽イオンＣＣは、陰イオン交換体の樹脂のような類似の化学的および物理化学的特性を有する。したがって、当業者は、好ましくは、緩衝液Ｂ２において使用される競合物陽イオンＣＣを、使用される樹脂に適合させる。
【０１００】
したがって、上記に鑑みて、好ましい実施形態では、第２の緩衝液Ｂ２は、陰イオン交換体の陽イオン基と競合する陽イオンとして、可溶性のアミンまたはその塩、好ましくは、第１級Ｃ１〜Ｃ１０−アミンまたはその塩、特に、リシンまたはその塩を含む。陽イオン（例えば、リシンまたはその塩のような陽イオン競合物）の濃度は、方法の抽出物に適合させることができる。
【０１０１】
好ましい実施形態では、陽イオン（例えば、リシンまたはその塩のような陽イオン競合物）の濃度は、０．００１ｍｏｌ／Ｌ〜１．０ｍｏｌ／Ｌの範囲内、好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．１ｍｏｌ／Ｌの範囲内、より好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．１５ｍｏｌ／Ｌの範囲内、よりいっそう好ましくは０．０１ｍｏｌ／Ｌ〜０．０５ｍｏｌ／Ｌの範囲内、よりいっそう好ましくは０．０２ｍｏｌ／Ｌ〜０．０４ｍｏｌ／Ｌの範囲内、特に（約）０．０２５ｍｏｌ／Ｌ（すなわち、２５ｍｍｏｌ／Ｌ）である。
【０１０２】
工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを所望の範囲内（例えば、７〜８）のｐＨに調整する工程（工程（ｖ））は、任意の手段により実行することができる。
【０１０３】
場合により、ｐＨは、クエン酸の添加により調整される。例示的には、７．５のｐＨを得ることができる。あるいは、酸性の酸の添加によりｐＨを５．０〜６．０または６．０〜７．５に適合させることができる。
【０１０４】
工程（ｖｉ）の安定化剤は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンがプラスミンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲンに成熟することを防止する任意の化学的実体であり得る。好ましくは、安定化剤は、変換されたプラスミン分子を（直ちに）捕捉して、これらの分子がさらなるプラスミノーゲン分子を活性化させることを回避させる。好ましくは、安定化剤は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物の非経口投与の後にヒト身体中で負の効果を有しない。特に、安定化剤は毒性でなく、特に好ましくは、薬学的に許容されるものである。
【０１０５】
好ましい実施形態では、工程（ｖｉ）の安定化剤は天然の安定化剤である。したがって、安定化剤は、合成起源のものではない。特に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを安定化させることが当該技術分野において公知の全ての安定化剤は、本発明の状況において好適である。
【０１０６】
好ましい実施形態では、工程（ｖｉ）の安定化剤は、アプロチニン、アルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−アルギニンクロロメチルケトン、小分子安定化剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される。より好ましい実施形態では、工程（ｖｉ）の安定化剤は、アプロチニン、アルファ−２−アンチプラスミン、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−アルギニンクロロメチルケトン、およびこれらの組合せからなる群から選択される。あるいはまたはさらに、セルピン、グリセリン、および／もしくは１つもしくはそれ以上の炭水化物またはこれらの誘導体もまた安定化剤として使用することができる。炭水化物は、例えば、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、フコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、ソルボース）、二糖（例えば、スクロース、マルトース、セロビオース、ラクトース、キシロビオース、ツラノース、トレハロース、メリビオース）、三糖（例えば、メレジトース、ラフィノース）、ならびにオリゴ糖および多糖（例えば、デキストラン、デンプン、セルロース、アガロース）からなる群から選択することができる。使用される炭水化物はまた、ＨａｗｋｅおよびＬｅａ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９５３年６月；５４巻（３号）：４７５〜９頁）においてリポビテリンＩＩＩの安定化についておよびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９６２年、８４巻：１２９７〜１３０２頁）において凍結乾燥時の生物の安定化について記載されているように選択および使用することができる。炭水化物誘導体は、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ、ヒプロメロース）、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、またはこれらの２つもしくはそれ以上の組合せのような、例えば、そのアシル化（例えば、アセチル化、メチル化）または硫酸化形態であり得る。
【０１０７】
任意の濃度の安定化剤を使用することができる。この濃度は、プラスミンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲンへの成熟を回避するために好適なものであるべきである。
【０１０８】
例えば、（場合により組換えの）アプロチニンを０．１〜５０μｇ／ｍＬの濃度範囲内、特に０．５〜３５μｇ／ｍＬの濃度範囲内で使用することができる。
【０１０９】
例えば、（場合により組換えの）アプロチニンは、３０μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬまたは０．６μｇ／ｍＬの濃度において使用することができる。好ましくは、（場合により組換えの）アプロチニンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン１μｇ当たり１ｎｇ〜１μｇ、より好ましくはＧｌｕ−プラスミノーゲン１μｇ当たり１０ｎｇ〜０．７５μｇ、特にＧｌｕ−プラスミノーゲン１μｇ当たり０．０１６μｇ〜０．４８μｇの濃度範囲内で使用することができる。
【０１１０】
例えば、ヒトアルブミンは、０．１μｇ／ｍＬ〜１００ｍｇ／ｍＬの濃度範囲内、好ましくは１μｇ／ｍＬ〜５０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲内、より好ましくは５μｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲内、特に０．０１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲内で使用することができる。好ましくは、アルブミンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン１μｇ当たり１ｎｇ〜１μｇの濃度範囲内、より好ましくはＧｌｕ−プラスミノーゲン１μｇ当たり１０ｎｇ〜２５μｇの濃度範囲内、特にＧｌｕ−プラスミノーゲン１μｇ当たり０．２μｇ〜１５μｇの濃度範囲内で使用することができる。
【０１１１】
ｐＨおよび緩衝液の組成は、安定な中間Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物に影響を及ぼし得る。
【０１１２】
好ましい実施形態では、追加の工程において、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物をさらなる緩衝液中にダイアフィルトレーションすることができる。好ましくは、このさらなる緩衝液は、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、グリシン緩衝液、およびこれらの２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択することができる。より好ましくは、このさらなる緩衝液は、ｐＨ６．６〜８．０の０．００５〜０．１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ７．０〜７．４の０．００５〜０．１Ｍのクエン酸緩衝液、およびｐＨ４．５〜５．５の０．０１〜０．１Ｍのグリシン緩衝液、ならびにこれらの２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択することができる。
【０１１３】
本発明の精製方法は、驚くべきことに、他の精製方法と比較してより高い安定性を有するＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物に繋がる。
【０１１４】
上記に説明したように、工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかから得られた溶液を抗ウイルス処理に供することができる。血液から得られた製造物においてウイルス汚染物が懸念されるので、これは医薬の状況において精製されたＧｌｕ−プラスミノーゲンの使用可能性を向上させ得る。これは、当該技術分野において公知の任意の抗ウイルス処理であり得る。
【０１１５】
好ましい実施形態では、工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかから得られた溶液は、工程（ｖｉｉ）の抗ウイルス処理に供され、抗ウイルス処理は：
（ｖｉｉ−ａ）１つまたはそれ以上の界面活性剤、好ましくは、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００からなる群から選択される１つまたはそれ以上の界面活性剤を加えること；
（ｖｉｉ−ｂ）リン酸エステル、特にトリ−ｎ−ブチル−ホスフェート（ＴｎＢＰ）のような１つまたはそれ以上の他の抗ウイルス剤を加えること；
（ｖｉｉ−ｃ）限外濾過、特にナノ濾過；ならびに
（ｖｉｉ−ｄ）上述の２つまたはそれ以上の組合せ
からなる群から選択される。
【０１１６】
１つまたはそれ以上の界面活性剤（そしてまた、溶媒界面活性剤（ＳＤ））を加えた後（工程ｖｉｉ−ａ）、そのような界面活性剤は、好ましくは、例えば、特定のＳＤ除去用樹脂により、および／または陰イオン交換体により除去される。好ましくは、界面活性剤を除去する方法は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンに（本質的に）影響を有さず、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンにいかなる修飾も導入しない。好ましくは、界面活性剤は、ウイルスの除去の第２の工程が行われる前に（本質的に）除去（例えば、捕捉）される。
【０１１７】
例示的には、０．１〜５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．５〜１．５％（ｗ／ｖ）、特に１％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を使用することができる。例示的には、０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．２〜０．４％（ｗ／ｖ）、特に０．３％（ｗ／ｖ）のＴｎＢＰを使用することができる。例示的には、０．１〜５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０と０．１〜０．５％（ｗ／ｖ）のＴｎＢＰとの組合せを使用することができる。特に、１％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０と０．３％（ｗ／ｖ）のＴｎＢＰとの組合せを使用することができる。
【０１１８】
上記の任意の抗ウイルス処理に追加してまたはそれの代替として、工程（ｉｖ）〜（ｖｉｉ）のいずれかから得られた溶液または工程（ｖｉｉｉ）から得られた固体形態は、ＵＶ光により照射し、それにより（本質的に）滅菌することができる。好ましい実施形態では、ナノ濾過法が追加の抗ウイルス除去工程のために使用される。
【０１１９】
非常に好ましい実施形態では、方法は、以下の工程：
（ｉ）血漿またはＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿画分を提供する工程；
（ｉｉ）血漿または血漿画分を、構造部分−Ｒ−ＮＨ２または−Ｒ−ＮＨ３＋＋Ａ−（式中、ＲはＣ１〜Ｃ１０−アルキレン残基であり、Ａ−は陰イオン性対イオン、特にリシル残基である）を有する樹脂に基づく陰イオン交換体と接触させる工程；
（ｉｉｉ）血漿または血漿画分をローディングした工程（ｉｉ）から得られた陰イオン交換体を、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含まない８．５〜１１のｐＨを有する第１の緩衝液Ｂ１を用いて洗浄する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の洗浄された陰イオン交換体から、陰イオン交換体のアミノ基と競合する、第１級Ｃ１〜Ｃ１０−アミンまたはその塩、特に、リシンまたはその塩を含む８．５〜１１のｐＨの第２の緩衝液Ｂ２を用いてＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させ、それにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を得る工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを所望のｐＨ範囲（例えば、７〜８または４．５〜５．５の範囲内、特に、７〜８の範囲内のｐＨ）に調整する工程；
（ｖｉ）工程（ｉｖ）、（ｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られた溶液に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンがプラスミンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲンに成熟することを防止する１つまたはそれ以上の安定化剤を加えることにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを安定化させる工程であって、特に、前記安定化剤が、アプロチニン、アルファ−２−アンチプラスミン、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−アルギニンクロロメチルケトン、小分子安定化剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、工程；ならびに
（ｖｉｉ）工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかからの溶液を抗ウイルス処理に供する工程であって、特に、前記抗ウイルス処理が：
（ｖｉｉ−Ｉ）１つまたはそれ以上の界面活性剤、好ましくは、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００からなる群から選択される１つまたはそれ以上の界面活性剤、ならびにリン酸エステル、特にトリ−ｎ−ブチル−ホスフェートのような１つまたはそれ以上の他の抗ウイルス剤を加えること；
（ｖｉｉ−ＩＩ）工程（ｖｉｉ−Ｉ）の溶液を除去し、それにより、１つまたはそれ以上の界面活性剤（そしてまた、溶媒界面活性剤（ＳＤ））を除去すること；および
（ｖｉｉ−ＩＩＩ）限外濾過、特にナノ濾過を行うこと；ならびに
（ｖｉｉｉ）場合により、工程（ｉｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られたＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を乾燥または凍結乾燥、特に凍結乾燥させる工程
を含む。
【０１２０】
好ましくは、緩衝液Ｂ１およびＢ２は、特に、濃度および／または電導度に関して、上記および実施例のセクションに定義されるものである。
【０１２１】
さらに、１つまたはそれ以上の安定化剤の含有量および緩衝液の濃度は、上記および実施例のセクションにおいて使用されるものであり得る。
【０１２２】
場合により、工程（ｉｉ）〜（ｉｖ）は、工程（ｖ）〜（ｖｉｉ）のいずれかから得られた任意の溶液を用いて繰り返すことができる。本明細書において、上記に説明したものと同じ条件、または他の条件を使用することができる。また、全ての他の工程を繰り返すことができる。これは、例示的に以下の通りに実行することができる：
【０１２３】
特に好ましい実施形態では、方法は、以下の工程：
（ｉ）血漿またはＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿画分を提供する工程；
（ｉｉ）血漿または血漿画分を、構造部分−Ｒ−ＮＨ２または−Ｒ−ＮＨ３＋＋Ａ−（式中、ＲはＣ１〜Ｃ１０−アルキレン残基であり、Ａ−は陰イオン性対イオン、特にリシル残基である）を有する樹脂に基づく陰イオン交換体と接触させる工程；
（ｉｉｉ）血漿または血漿画分をローディングした工程（ｉｉ）から得られた陰イオン交換体を、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含まない８．５〜１１のｐＨを有する第１の緩衝液Ｂ１を用いて洗浄する工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の洗浄された陰イオン交換体から、陰イオン交換体のアミノ基と競合する、第１級Ｃ１〜Ｃ１０−アミンまたはその塩、特に、リシンまたはその塩を含む８．５〜１１のｐＨの第２の緩衝液Ｂ２を用いてＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させ、それにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を得る工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを所望の範囲内のｐＨに調整する工程；
（ｖｉ）工程（ｉｖ）、（ｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られた溶液に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンがプラスミンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲンに成熟することを防止する１つまたはそれ以上の安定化剤を加えることにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを安定化させる工程であって、特に、前記安定化剤が、アプロチニン、アルファ−２−アンチプラスミン、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−アルギニンクロロメチルケトン、小分子安定化剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、工程；ならびに
（ｖｉｉ）工程（ｖｉ）の溶液を抗ウイルス処理に供する工程であって、特に、前記抗ウイルス処理が：
（ｖｉｉ−Ｉ）１つまたはそれ以上の界面活性剤、好ましくは、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｗｅｅｎ−８０およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００からなる群から選択される１つまたはそれ以上の界面活性剤、ならびにリン酸エステル、特にトリ−ｎ−ブチル−ホスフェートのような１つまたはそれ以上の他の抗ウイルス剤を加えること；および
（ｖｉｉ−ＩＩ）工程（ｖｉｉ−Ｉ）の溶液を除去すること
である、工程；ならびに
（ｉｉ＊）工程（ｖｉｉ）から得られた溶液を、構造部分−Ｒ−ＮＨ２または−Ｒ−ＮＨ３＋＋Ａ−（式中、ＲはＣ１〜Ｃ１０−アルキレン残基であり、Ａ−は陰イオン性対イオン、特にリシル残基である）を有する樹脂に基づく陰イオン交換体と接触させる工程；
（ｉｉｉ＊）血漿または血漿画分をローディングした工程（ｉｉ＊）から得られた陰イオン交換体を、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含まない８．５〜１１のｐＨを有する第１の緩衝液Ｂ１を用いて洗浄する工程；
（ｉｖ＊）工程（ｉｉｉ＊）の洗浄された陰イオン交換体から、陰イオン交換体のアミノ基と競合する、第１級Ｃ１〜Ｃ１０−アミンまたはその塩、特に、リシンまたはその塩を含む８．５〜１１のｐＨの第２の緩衝液Ｂ２を用いてＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させ、それにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を得る工程；
（ｖｉｉ＊）工程（ｉｖ）〜（ｖｉ）のいずれかからの溶液を抗ウイルス処理に供する工程であって、特に、前記抗ウイルス処理が：
（ｖｉｉ−ＩＩＩ＊）限外濾過、特にナノ濾過を行うこと
である、工程；ならびに
（ｖ＊）場合により、工程（ｖｉｉ＊）から得られた溶液のｐＨを所望のｐＨ範囲（例えば、７〜８または４．５〜５．５の範囲内、特に、７〜８の範囲内のｐＨ）に調整する工程；
（ｖｉ＊）場合により、工程（ｖ＊）から得られた溶液に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンがプラスミンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲンに成熟することを防止する１つまたはそれ以上の安定化剤を加えることにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを安定化させる工程であって、特に、前記安定化剤が、アプロチニン、アルファ−２−アンチプラスミン、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−アルギニンクロロメチルケトン、小分子安定化剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、工程；ならびに
（ｖｉｉｉ）場合により、工程（ｖｉｉ＊）、（ｖ＊）または（ｖｉ＊）のいずれかから得られたＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を乾燥または凍結乾燥、特に凍結乾燥させる工程
を含む。
【０１２４】
好ましくは、それぞれ現れる緩衝液Ｂ１およびＢ２は、特に、濃度および／または電導度に関して、上記に定義されるものである。
【０１２５】
特に好ましい実施形態では、本発明の方法は、以下の工程：
（ｉ）以下：
（ａ）典型的に、冷凍およびその後に解凍に供された血漿の上清から得られた脱クリオ血漿；および
（ｂ）コーン法もしくはキストラー−ニッチマン法のペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（そしてまた、Ｉ〜ＩＩＩ）もしくはＩ＋ＩＩＩの廃棄物画分またはこれらの画分の２つまたは３つ全ての組合せ
からなる群から選択されるＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む血漿画分、
特に、コーン法またはキストラー−ニッチマン法のペーストＩ＋ＩＩＩまたはペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩの廃棄物画分；
（ｉｉ）血漿または血漿画分を、構造部分−Ｒ−ＮＨ２または−Ｒ−ＮＨ３＋＋Ａ−（式中、ＲはＣ１〜Ｃ１０−アルキレン残基であり、Ａ−は陰イオン性対イオン、特にリシル残基である）を有する樹脂に基づく陰イオン交換体と接触させる工程；
（ｉｉｉ）血漿または血漿画分をローディングした工程（ｉｉ）から得られた陰イオン交換体を、０．０１〜０．１Ｍの濃度の８．５〜１１のｐＨを有する第１の緩衝液Ｂ１を用いて洗浄する工程であって、前記第１の緩衝液Ｂ１が、陰イオン交換体の樹脂の陽イオン基と競合する陽イオンを含まない、工程；
（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）の洗浄された陰イオン交換体から、０．０１〜０．１Ｍの濃度の８．５〜１１のｐＨの第２の緩衝液Ｂ２を用いてＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させ、それにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを含む溶液を得る工程であって、前記第２の緩衝液Ｂ２が、陰イオン交換体のアミノ基と競合する第１級Ｃ１〜Ｃ１０−アミンまたはその塩、特に、リシンまたはその塩を含む、工程；
（ｖ）工程（ｉｖ）から得られた溶液のｐＨを所望の範囲内のｐＨに調整する工程；
（ｖｉ）工程（ｉｖ）、（ｖ）または（ｖｉｉ）のいずれかから得られた溶液に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンがプラスミンまたはＬｙｓ−プラスミノーゲンに成熟することを防止する１つまたはそれ以上の安定化剤を加えることにより、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを安定化させる工程であって、特に、前記安定化剤が、アプロチニン、アルファ−２−アンチプラスミン、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−アルギニンクロロメチルケトン、小分子安定化剤、およびこれらの組合せからなる群から選択される、工程；および
（ｖｉｉ）場合により、工程（ｖｉ）の溶液を抗ウイルス処理に供する工程
を含む。
【０１２６】
好ましい実施形態では、陰イオン交換体は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させる工程（ｉｖ）を実行した後に再生させることができる。これは、陰イオン交換体をＮａＯＨまたはＫＯＨ含有水溶液と接触させることにより達成することができる。例示的には、０．２〜１．５ＭのＮａＯＨ、より好ましくは０．５〜１ＭのＮａＯＨの範囲内のＮａＯＨをこの目的のために使用することができる。最も好ましくは、０．１ＭのＮａＯＨおよび０．１ＭのＨＣｌを使用することができる。これは例えば、個々の陰イオン交換体の長期寿命をサポートし得る。
【０１２７】
本発明の方法から得られ得る（および得られた）Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは特に純粋であり、特に患者を治療する状況において、いくつもの応用のために良好に使用できることが理解されるであろう。
【０１２８】
したがって、本発明のさらなる態様は、本発明の方法から得られ得る（得られた）Ｇｌｕ−プラスミノーゲンに関する。
【０１２９】
上記の方法の文脈において提供される定義および／または好ましい実施形態は、適宜変更の上で、本発明によるＧｌｕ−プラスミノーゲンに適用されることが理解されるであろう。
【０１３０】
精製された天然に存在するタンパク質Ｇｌｕ−ＰＬＧは、ヒト身体中のプラスミノーゲンと同じ物理化学的および生物学的特性を有する。ｉｎ  ｖｉｖｏでの物理化学的および生物学的特性を本明細書においてより詳細に説明する。
【０１３１】
本発明の方法から得られ得る（得られた）Ｇｌｕ−プラスミノーゲンはまた、製造することができ、そしてまた場合により、冷凍、急速冷凍または凍結乾燥された状態で貯蔵することができ、次いで、例えば、−３５℃、−８０℃または液体窒素中のような凝固点より低い任意の温度で貯蔵することができる。
【０１３２】
好ましい実施形態では、本発明によるＧｌｕ−プラスミノーゲンは凍結乾燥される（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｉｅｄ；ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄとも表される）。凍結乾燥粉末はまた、周囲温度において貯蔵することができる。
【０１３３】
凍結乾燥工程では、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを安定化させ、保護する１つまたはそれ以上の剤が存在し得る。これは、上記される１つもしくはそれ以上の炭水化物またはその誘導体としての安定化剤であり得る。例えば、炭水化物もしくはその誘導体および／またはグリセリンが存在し得る。
【０１３４】
炭水化物は、例えば、単糖（例えば、グルコース、フルクトース、フコース、キシロース、アラビノース、マンノース、ガラクトース、ソルボース）、二糖（例えば、スクロース、マルトース、セロビオース、ラクトース、キシロビオース、ツラノース、トレハロース、メリビオース）、三糖（例えば、メレジトース、ラフィノース）、およびオリゴ−および多糖（例えば、デキストラン、デンプン、セルロース、アガロース）からなる群から選択することができる。使用される炭水化物はまた、ＨａｗｋｅおよびＬｅａ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１９５３年６月；５４巻（３号）：４７５〜９頁）においてリポビテリンＩＩＩの安定化についておよびＺｉｍｍｅｒｍａｎｎ（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１９６２年、８４巻：１２９７〜１３０２頁）において凍結乾燥時の生物の安定化について記載されているように選択および使用することができる。炭水化物誘導体は、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ、ヒプロメロース）、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルデンプン、ヒドロキシエチルデンプン、またはこれらの２つもしくはそれ以上の組合せのような、例えば、そのアシル化（例えば、アセチル化、メチル化）または硫酸化形態であり得る。
【０１３５】
上記に説明したように、本発明の方法は、並外れた高純度においてＧｌｕ−プラスミノーゲンを得ることを可能とした。
【０１３６】
したがって、本発明のさらなる態様は、総タンパク質質量に基づいて、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）のＧｌｕ−プラスミノーゲンを含むタンパク質組成物に関する。
【０１３７】
好ましい実施形態では、タンパク質組成物は、総タンパク質質量に基づいて、少なくとも８５％（ｗ／ｗ）、より好ましくは少なくとも９０％（ｗ／ｗ）またはさらには少なくとも９５％（ｗ／ｗ）のＧｌｕ−プラスミノーゲンを含む。
【０１３８】
典型的に、そのようなタンパク質組成物は、特に高い安定性および有意に低減されたタンパク質分解活性を有し、特に、タンパク質分解活性を（本質的に）有しない。
【０１３９】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの両方のグリコシル化形態をそのような高度に精製されたタンパク質組成物において同定することができる。好ましくは、主な不純物はアルブミンである。より好ましくは、アルブミンは、（本質的に）唯一の不純物である。上述したように、アルブミンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンに対する安定化効果を有し得る。したがって、場合により、微量のアルブミンをタンパク質組成物中に意図的に存在させることができる。これは、その好ましい濃度など、上記により詳細に記載されている。
【０１４０】
好ましい実施形態では、この組成物中に含まれるＧｌｕ−プラスミノーゲンは、本発明の方法から得られる。
【０１４１】
タンパク質組成物は、上記の方法およびＧｌｕ−プラスミノーゲンの文脈において説明したように、溶液、懸濁液、エマルションまたは乾燥形態であり得る。特に、タンパク質組成物は凍結乾燥粉末である。
【０１４２】
上記に説明したように、タンパク質組成物は、特に、凍結乾燥粉末または溶液である場合、場合により、例えば、上記される１つまたはそれ以上の糖および／または安定化剤のような１つまたはそれ以上の安定化剤を含むことができる。含有量範囲は上記に提供される。
【０１４３】
そのようなタンパク質は、典型的に、純粋な乾燥タンパク質としてではなく、医薬組成物中で投与されることが当業者に公知である。
【０１４４】
したがって、さらなる態様では、本発明はまた、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【０１４５】
上記の方法またはＧｌｕ−プラスミノーゲンの文脈において提供される定義および／または好ましい実施形態は、適宜変更の上で、本発明による医薬組成物に適用されることが理解されるであろう。「医薬組成物」および「医薬配合物」という用語は、交換可能に理解することができる。
【０１４６】
好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物中に含まれるＧｌｕ−プラスミノーゲンは、本発明の方法により得られるＧｌｕ−プラスミノーゲンである。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」、「薬学的に許容される賦形剤」、「担体」および「賦形剤」という用語は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの薬理学的許容性をサポートし得る任意の物質として最も広い意味において交換可能に理解することができる。
【０１４８】
好ましい医薬組成物は、初回通過効果を回避する投与経路を可能とする。より好ましくは、医薬組成物は、患者への注射による投与のために好適（例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）、動脈内（ｉ．ａ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、および皮下（ｓ．ｃ．）注射からなる群から選択される投与経路のために好適）であるように調製される。あるいはまたはさらに、医薬組成物はまた、例えば、経鼻または経皮投与のような他の投与経路のために好適なものであり得る。
【０１４９】
すぐ使用できる医薬組成物は、好ましくは、液体配合物、特に注射用ポーションである。貯蔵形態はまた、液体であり得るが、乾燥形態（例えば、乾燥または凍結乾燥Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを含む粉末のような粉末）またはペーストもしくはシロップなどでもあり得る。場合により、乾燥形態、ペーストまたはシロップは、患者への投与の前に溶解または乳化させることができる。
【０１５０】
薬学的に許容される担体は、例示的に、水性緩衝液、生理食塩水、水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エタノール、植物油、パラフィン油またはこれらの２つもしくはそれ以上の組合せからなるリストから選択することができる。さらには、薬学的に許容される担体は、場合により、１つもしくはそれ以上の界面活性剤、１つもしくはそれ以上の気泡剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））、１つもしくはそれ以上の着色剤（例えば、食品着色料）、１つもしくはそれ以上のビタミン、１つもしくはそれ以上の塩（例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛の塩）、１つもしくはそれ以上の保湿剤（例えば、ソルビトール、グリセリン、マンニトール、プロピレングリコール、ポリデキストロース）、１つもしくはそれ以上の酵素、１つもしくはそれ以上の保存剤（例えば、安息香酸、メチルパラベン）、１つもしくはそれ以上の酸化防止剤、１つもしくはそれ以上の薬草および植物抽出物、１つもしくはそれ以上の安定化剤、１つもしくはそれ以上のキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））、ならびに／または１つもしくはそれ以上の取込みメディエーター（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、細胞透過ペプチド（ＣＰＰ）、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）、抗菌性ペプチド、など）を含有することができる。
【０１５１】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の投薬単位に関する。例示的には、本発明は、単回用量容器または複数剤形に関し得る。
【０１５２】
上記に指し示したように、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、特に、医薬組成物中に含まれるＧｌｕ−プラスミノーゲンは、製薬の状況において非常に良好に使用することができる。
【０１５３】
したがって、さらなる態様では、本発明はまた、臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つもしくはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害、特に臓器不全を患っているかまたは発症するリスクがある患者を治療する方法における使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲンに関する。
【０１５４】
好ましい実施形態では、障害は臓器不全または血栓事象である。
【０１５５】
プラスミノーゲンは、直接的な治療機会として使用することができる。現在使用されているｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）またはｕＰＡ（ウロキナーゼ）は、少なくとも正常なプラスミノーゲンレベルを必要とする間接的な療法として使用される。ｔＰＡは、プラスミノーゲンをプラスミンへと活性化させ得る。これは、連続する追加の組織損傷を引き起こし得る既に形成された血栓を溶解させるために使用することができる。それらの場合における低いプラスミノーゲンレベルは、ｉｎ−ｖｉｖｏでのＧｌｕ−プラスミノーゲンタンパク質の消費により引き起こされることがある。患者は、多くの場合、危険な４８時間の間に血漿中に低濃度のプラスミノーゲンを有することが発見された。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの注射後、プラスミノーゲンの総レベルは経時的に増加した。さらに、プラスミノーゲンの測定だけでなく、アルファ−２−アンチプラスミンの量もまた決定的なものであり得る。増加した量のアルファ−２−アンチプラスミンは、利用可能なプラスミノーゲン分子を阻害し得る。また、この場合、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの注射は、高濃度のアルファ−２−アンチプラスミンの均衡を取ることがあり、危険な４８時間の状態内において改善に繋がり得る。
【０１５６】
したがって、より好ましい態様では、本発明はまた、臓器不全を患っているかまたは臓器不全を発症するリスクがある患者を治療する方法における使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲンに関する。
【０１５７】
上記の方法および／または医薬組成物の文脈において提供される定義および好ましい実施形態は、適宜変更の上で、本発明による使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲンに適用されることが理解されるであろう。
【０１５８】
換言すれば、本発明はまた、臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つもしくはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害、特に臓器不全を患っているかまたは発症するリスクがある患者を治療する方法であって、それを必要とする対象へのＧｌｕ−プラスミノーゲンの投与を含む、方法に関する。
【０１５９】
臓器不全、特に多臓器不全は、感染症、敗血症、（微小）循環障害（例えば、鬱血、アテローム性動脈硬化症など）、毒性事象、移植、損傷、およびこれらの２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される状態により引き起こされることがある。血栓事象は、深静脈血栓症および慢性血栓塞栓性肺高血圧症からなる群から選択することができる。動脈閉塞疾患は、心筋梗塞、脳梗塞、腎梗塞、もしくは肝梗塞に関連するかまたはこれらにより引き起こされるものであり得る。
【０１６０】
好ましい実施形態では、臓器不全は、腎臓、心臓、肺、脳および静脈からなる群から選択される臓器の不全である。好ましい実施形態では、臓器不全は、腎不全、好ましくは急性腎不全（ＡＫＩ）であり、これは例示的には急性腎損傷である。
【０１６１】
したがって、さらなる態様では、本発明はまた、臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つもしくはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害、特に臓器不全を患っているかまたは発症するリスクがある患者を治療する方法における使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲンであって、前記方法が、前記患者への使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲンの投与を含む、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンに関する。
【０１６２】
好ましい実施形態では、臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害を発症するリスクは、先天性または好ましくは後天性のプラスミノーゲン欠乏症により引き起こされる。
【０１６３】
したがって、より好ましい実施形態では、臓器不全または血栓事象を発症するリスクは、後天性プラスミノーゲン欠乏症により引き起こされる。代替的な好ましい実施形態では、臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害を発症するリスクは、微小凝固障害（ｍｉｃｒｏ−ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）により引き起こされる。
【０１６４】
したがって、より好ましい実施形態では、臓器不全または血栓事象を発症するリスクは、微小凝固障害により引き起こされる。
【０１６５】
好ましい実施形態では、患者は、深静脈血栓症および／もしくは肺塞栓症を患っているかまたは発症するリスクがある。
【０１６６】
したがって、好ましい実施形態では、本発明はまた、深静脈血栓症を患っているかまたはそのリスクがある患者を治療する方法における使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲンに関する。
【０１６７】
したがって、好ましい実施形態では、本発明はまた、肺塞栓症を患っているかまたはそのリスクがある患者を治療する方法における使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲンに関する。
【０１６８】
好ましい実施形態では、臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害を発症するリスクは、プラスミン阻害物質の後天性の増加により引き起こされ、特に、プラスミン阻害物質はアルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）である。
【０１６９】
したがって、より好ましい実施形態では、臓器不全または血栓事象を発症するリスクは、プラスミン阻害物質の後天性の増加により引き起こされ、特に、プラスミン阻害物質はアルファ−２−アンチプラスミンである。
【０１７０】
好ましい実施形態では、障害は、個々の臓器における、臓器不全、深静脈血栓症、慢性または急性臓器塞栓症、臓器梗塞（特に、心梗塞、腎梗塞、肝梗塞、肺梗塞、または脳梗塞）、急性移植拒絶のような線維素溶解系の局所的なまたは生成された不均衡を引き起こす急性または慢性炎症、凝固亢進、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、および血栓事象からなる群から選択され、特に、臓器は、心臓、肺および静脈からなる群から選択される。
【０１７１】
好ましい実施形態では、患者は、プラスミノーゲンを欠乏している。プラスミノーゲン欠乏症は、先天性または後天性プラスミノーゲン欠乏症であり得る。
【０１７２】
プラスミノーゲン欠乏症は、後天性プラスミノーゲン欠乏症、および／または、好ましくは、微小血栓性、血栓性および深静脈の血栓事象における、逸脱した凝固／線維素溶解の均衡であり得る。しかし、外傷、大規模な上皮の破壊または急性もしくは慢性炎症もまた、後天性プラスミノーゲン欠乏症および／または逸脱した凝固／線維素溶解の均衡を結果としてもたらし得る。したがって、患者におけるプラスミノーゲンおよびアルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）レベルは、好ましくは、臓器不全の適応と共に提出された時に、初期の血液検査において測定することができる。プラスミノーゲンレベルの低減またはアルファ−２−アンチプラスミン阻害物質の比の増加は、凝固および線維素溶解系の不均衡の指標として使用することができる。系は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの投与に起因して非常に感受性であり、系の均衡を取ることができ、凝固亢進を回避することができる。
【０１７３】
本発明の文脈において使用される場合、「患者」という用語は、任意の生物、好ましくは任意の動物、より好ましくは、ヒト、特に人間などの哺乳動物として最も広い意味において理解することができる。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは、望ましくない免疫原性の副反応を回避するために、典型的に、治療される患者と同じ種のものであることが理解されるであろう。
【０１７４】
本明細書で使用される「患っている」という用語は、臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害、特に臓器不全に関連する病的状態を患者が発症したこと、すなわち、そのような障害が患者において存在することとして最も広い意味において理解することができる。好ましい実施形態では、本明細書で使用される「患っている」という用語は、臓器不全に関連する病的状態を患者が発症したこと、すなわち、臓器不全が患者において存在することとして最も広い意味において理解することができる。
【０１７５】
障害を患っている患者は、必ずしもそうではないが場合により、例えば、酸塩基平衡異常（例えば、呼吸性アルカローシスまたは乳酸アシドーシス）、乏尿（さらには無尿）、高血糖症、インスリン要求性の増加、頻呼吸、低炭酸ガス血症、低酸素血症、肝臓機能障害、血液学的異常、窒素血症、凝固異常、および虚血性大腸炎からなる群から選択される症状のうちの１つまたはそれ以上のような医学的症状を有する。
【０１７６】
「発症するリスクがある」という用語は、臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害、特に臓器不全に関連する障害を有するある特定のリスクを患者が有することを意味する。この文脈において、好ましくは、患者は、翌週（すなわち、７日）以内の集団全体において存在する、臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害、特に臓器不全を発症する平均リスクと比較してより高いリスクを有する。より好ましくは、リスクは、少なくとも５倍増加しており、よりいっそう好ましくは、リスクは少なくとも１０倍増加しており、よりいっそう好ましくは、リスクは少なくとも１００倍増加しており、よりいっそう好ましくは、リスクは少なくとも１０００倍増加している。
【０１７７】
好ましい実施形態では、本発明は、臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害、特に臓器不全を患っている患者を治療する方法における使用のためのＧｌｕ−プラスミノーゲンに関する。
【０１７８】
好ましくは、投与は、全身投与（例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）、動脈内（ｉ．ａ．）、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、皮下（ｓ．ｃ．）、経皮、経鼻）である。あるいは、投与はまた、局所投与（例えば、髄腔内または硝子体内）であり得る。好ましくは、投与は、全身投与、特に静脈注射である。
【０１７９】
非常に好ましい実施形態では、障害は、臓器不全、深静脈血栓症（ＤＶＴ）、および塞栓症（例えば、慢性または急性臓器塞栓症）からなる群から選択される。ＤＶＴは、最も一般的には脚における、深静脈における血餅の形成である。合併症としては、肺に移動するクロットの剥離の結果としての肺塞栓症、および血栓後症候群を挙げることができる。リスク因子としては、最近の手術、がん、外傷、運動不足、肥満症、喫煙、ホルモン産児制限、妊娠および出産後の期間、抗リン脂質症候群、ならびにある特定の遺伝学的条件が挙げられる［Ｅ．Ｐｒｅｖｉｔａｌｉ、Ｐ．Ｂｕｃｃｉａｒｅｌｌｉ、Ｓ．Ｍ．Ｐａｓｓａｍｏｎｔｉ、Ｉ．Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ、「Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｖｅｎｏｕｓ  ａｎｄ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ」、Ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ＝  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｅ  ｄｅｌ  ｓａｎｇｕｅ、９巻（２０１１年）１２０〜１３８頁；Ｊ．Ｓｔｏｎｅ、Ｐ．Ｈａｎｇｇｅ、「Ｄｅｅｐ  ｖｅｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ、７巻（２０１７年）Ｓ２７６−２８４頁］。遺伝学的因子としては、アンチトロンビン、プロテインＣ、およびプロテインＳの欠乏、ならびに第Ｖ因子ライデン突然変異が挙げられる［Ｊ．Ｓｔｏｎｅ、Ｐ．Ｈａｎｇｇｅ、「Ｄｅｅｐ  ｖｅｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ａｎｄ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ」、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ、７巻（２０１７年）Ｓ２７６−ｓ２８４頁］。基礎となる機序は、典型的に、血流速度の減少、クロットの傾向の増加、および血管壁への損傷の何らかの組合せを伴う。
【０１８０】
凝固亢進（播種性血管内凝固：ＤＩＣまで）または血栓もしくは微小血栓の形成もしくはクロット溶解の遅延を伴う低線維素溶解の状況を臨床的に結果としてもたらす任意の他の状態［ＡＡ  Ｓｈａｒｐ  Ｔｈｒｏｍｂｕｓ  Ｄｉｓｓｏｌｕｔｉｏｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．、２２巻（１９６９年）３６９頁］は、プラスミン置換を指し示し得る。また、線維素溶解系の不均衡（（促進性）酵素プラスミノーゲンに対する阻害因子の過剰：１．２５より大きいアルファ−２−アンチプラスミン［ｍｇ／ｍＬ］／プラスミノーゲン［ｍｇ／ｍＬ］の比）を指し示すものとしてとることができる。したがって、検出された先天性もしくは後天性プラスミノーゲン欠乏症、または、腎臓、肺、心臓、脳の差し迫った臓器不全を示唆するかもしくは塞栓事象もしくは静脈血栓症のリスクを示唆する臨床症状と組み合わさった過剰な阻害因子の検出のいずれかは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン投与を結果として指し示し得る。
【０１８１】
通常、組み合わさって血栓症を引き起こすいくつもの要因が存在する。これらは、遺伝性要因および外的要因の両方であり得る［Ｅ．Ｐｒｅｖｉｔａｌｉ、Ｐ．Ｂｕｃｃｉａｒｅｌｌｉ、Ｓ．Ｍ．Ｐａｓｓａｍｏｎｔｉ、Ｉ．Ｍａｒｔｉｎｅｌｌｉ、「Ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｖｅｎｏｕｓ  ａｎｄ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ」、Ｂｌｏｏｄ  ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  ＝  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎｅ  ｄｅｌ  ｓａｎｇｕｅ、９巻（２０１１年）１２０〜１３８頁；Ｍ．Ａ．Ｉｓｌａｍ、Ｓ．Ｓ．Ｋｈａｎｄｋｅｒ、Ｆ．Ａｌａｍ、Ｍ．Ａ．Ｋａｍａｌ、Ｓ．Ｈ．Ｇａｎ、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｐｒｉｍａｒｙ  ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：Ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｒｅｖｉｅｗ  ｗｉｔｈ  ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｅｓ」、Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｒｅｖｉｅｗｓ（２０１８年）］。
【０１８２】
静脈血栓の発症の原因は、未だに妥当なフィルヒョーの三因子に従う：
１．血液組成の変化
２．血流速度の低減（鬱血）
３．内部血管壁（内皮）への損傷
【０１８３】
血栓症のリスク因子は、特に喫煙と組み合わさった経口避妊薬（「ピル」）、身体不活動、病気における特に長期の寝たきり、肥満症、脱水（脱水症）、がん、過去の血栓症、妊娠である。深静脈血栓症により最も一般的に影響されるのは脚である。次いで言われるのは、大腿または下腿の静脈血栓症である。両方の腓腹、膝窩および大腿が罹患している場合、マルチレベル血栓症（ｍｕｌｔｉ−ｌｅｖｅｌ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ）と呼ばれる。骨盤静脈血栓症の頻度はより低いが、血管のサイズおよび肺塞栓症のより高いリスクから、より危険である。骨盤静脈血栓症の恐れは妊婦にあり、子宮の圧迫の欠如に起因して出産後にクロットが溶解して肺塞栓症に繋がることがあり、これは致死性のことがある。血栓症自体およびＤＶＴの別の合併症は、特に、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）である。
【０１８４】
それは、例えば、感染性傷害（敗血症など）および非感染性傷害（外傷など）に起因する凝固の血管内活性化の特徴を有する後天性症候群の古典的な例である。ＤＩＣの基礎となる機序は、組織因子依存性の凝固の炎症性サイトカインにより開始される活性化、抗凝固経路の不充分な制御および線維素溶解のプラスミノーゲン活性化因子阻害因子１媒介性の抑制により媒介される。少数を挙げれば、外傷、肝臓疾患、臓器破壊（重症膵炎）および悪性腫瘍のようないくつもの臨床的合併症が、ＤＩＣに関連する［Ｓ．Ｇａｎｄｏ、Ｍ．Ｌｅｖｉ、Ｃ．Ｈ．Ｔｏｈ、「Ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ、２巻（２０１６年）１６０３７頁］。
【０１８５】
投与頻度は、個々の患者に適合させることができる。先ず、プラスミノーゲンおよびアルファ−２−アンチプラスミンの量が好ましくは測定される。これは、常用の分析により行うことができる。投与は、１回、２回、もしくはより多くまたは連続的に（例えば、点滴を介して）行うことができる。例示的には、投与は、１日３回、１日２回、もしくは２日毎またはより少ない頻度で行うことができる。
【０１８６】
好ましい実施形態では、患者は：
（ａ）患者の血液中に見出されるアルファ−２−アンチプラスミン対プラスミノーゲン（好ましくはＧｌｕ−プラスミノーゲン）の比が、同じ種の集団全体において見出される平均の比と比較して少なくとも１．１倍高いこと；および／または
（ｂ）患者の血液中のプラスミノーゲン（好ましくはＧｌｕ−プラスミノーゲン）のレベルが、同じ種の集団全体において見出される平均のレベルと比較して少なくとも１％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）低いこと
を特徴とする。
【０１８７】
好ましくは、患者の血液中に見出されるアルファ−２−アンチプラスミン対プラスミノーゲン（好ましくはＧｌｕ−プラスミノーゲン）の比は、同じ種の集団全体において見出される平均の比と比較して、少なくとも１．１５倍高い、より好ましくは少なくとも１．２倍高い、特に少なくとも１．２５倍高い。該比は、臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される重篤な障害、特に臓器不全を有する患者において平均で１．２６倍高いことが実験的に見出されている。
【０１８８】
好ましくは、患者の血液中のプラスミノーゲン（好ましくはＧｌｕ−プラスミノーゲン）のレベルは、同じ種の集団全体において見出される平均のレベルと比較して、少なくとも２％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）低い、より好ましくは少なくとも５％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）低い、特に少なくとも１０％（ｍｏｌ／ｍｏｌ）低い。
【０１８９】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンのレベルの減少は、凝固および線維素溶解の不均衡に繋がり得る。大きい量のＡ２ＡＰおよびＰＬＧの不均衡は、線維素溶解活性を遮断し、凝固の均衡が取れなくなる。特に、臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つまたはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害、特に臓器不全を有する患者は、血液中のアルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）対Ｇｌｕ−プラスミノーゲン（ＰＬＧ）の高い比を示すことが見出された。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの適用は、したがって、現行の「標準治療」処置と組み合わせて患者にとって「時間を買う」（すなわち、患者を安定化させる）ために使用することができる。（時間を買うことの）１つの典型的な例は、場合により、有望な「標準治療」処置を同定しながら、患者の生存および最も重要な臓器機能を少なくとも４８時間維持することである。
【０１９０】
場合により、特に、患者が上記臨床症状の１つまたはそれ以上を示す場合、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの投与に加えて患者を治療することができる。
【０１９１】
例示的には、患者を血行動態の予防措置および／または人工呼吸に供することができる。本治療は、患者の死亡を有意に低減させることができ、標準治療の改善を可能とする。
【０１９２】
急性腎不全の場合の現行の治療選択肢は、ヘパリンのような抗凝固剤を用いる追加の治療である。ヘパリンの追加は、さらなる凝固の阻害に繋がり得る。ヒト化プラスミノーゲンは、典型的に、凝固に対して（本質的に）影響を有しないが、既に構築されたクロットの開始において影響を有する。ヘパリンの結合はプラスミン活性を増加させ得ることが公知である。しかしながら、（有意な）薬物動態薬物相互作用は抗凝固剤を用いる治療と本発明の（ヒト／ヒト化）Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを用いる治療との間で起こらないことが想定される。
【０１９３】
好ましい実施形態では、敗血症に起因する多臓器不全を有する患者はまた、抗生物質、血栓症予防、腎不全のための透析のような臓器特異的治療、多臓器欠陥の手術、通気療法およびあらゆる細菌のための抗感染療法、全身性血管効果を呈する血管関連薬物（アドレナリンまたはノルアドレナリンのようなカテコールアミン）、血行動態安定化、活性化プロテインＣ（場合により組換え）および免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧおよびＩｇＭ）、ならびにアンチトロンビン−ＩＩＩ（主にＦ．Ｘａおよびトロンビンを阻害し得る）のような天然プロテアーゼ阻害剤の追加からなる群から選択される手段を用いて（追加的に）治療することができる。
【０１９４】
臓器不全は、臓器の任意の重篤な機能障害として最も広い意味において理解することができる。好ましくは、本発明の意味では、臓器不全は、臓器の機能障害を補う外的な臨床的介入なしでは正常なホメオスタシスを維持できないような程度まで臓器がその期待される機能を行わなくなった状態である。
【０１９５】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲン（Ｇｌｕ−ＰＬＧ）の投与によりＡ２ＡＰの量の増加の均衡を取ることができることが驚くべきことに発見された［Ｓｅｉｔｚ，Ｒ．；Ｋａｒｇｅｓ，Ｈ．Ｅ．；Ｗｏｌｆ，Ｍ．；Ｅｇｂｒｉｎｇ，Ｒ．、「Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ  ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｒｅｎａｌ  ｆａｉｌｕｒｅ．」、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ、１９８９年、Ｓ．３９〜４６頁］。これは、臓器不全の後退を可能とし、これらの患者の死亡を低減させることが発見された。さらに、異なる疾患が複数の皮膚壊死（ウォーターハウス・フリードリヒセン症候群）として非可逆的な血液凝固に関与し、敗血症および肝炎ならびに死体腎臓移植を有するさらなる患者はまた、ＰＬＧおよびＡ２ＡＰの相対的な濃度が移植片の生存のために有益であることを示した。
【０１９６】
好ましい実施形態では、臓器不全は、個々の臓器における病理学的急性腎不全、急性移植拒絶、凝固亢進、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、および血栓事象であるかまたはこれらに関連するものであり、特に、臓器は、心臓、肺および静脈からなる群から選択される。
【０１９７】
好ましい実施形態では、臓器不全を患っているかもしくは臓器不全を発症するリスクがある患者を治療する方法において使用されるＧｌｕ−プラスミノーゲンは、本明細書に説明される本発明の方法から得られるか、または本発明の医薬組成物の部分を形成する。
【０１９８】
好ましい実施形態では、臓器不全を患っているかまたは臓器不全を発症するリスクがある患者を治療する方法において使用されるＧｌｕ−プラスミノーゲンは、本発明の意味における医薬組成物の形態で投与される。したがって、換言すれば、本発明はまた、臓器不全、血栓事象、動脈閉塞疾患、微小循環、播種性血管内凝固（ＤＩＣ）、およびこれらの２つもしくはそれ以上の組合せからなる群から選択される障害、特に臓器不全を患っているかまたは発症するリスクがある患者を治療する方法における使用のための本発明の医薬組成物（Ｇｌｕ−プラスミノーゲンおよび少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む）に関する。
【０１９９】
さらなる治療工程を実行することができる。凝固亢進状態における現行の治療選択肢は、ビタミンＫアンタゴニスト、ヘパリン、またはＦ．Ｘａ阻害剤の投与である。これは、新たなクロットの形成および既存のクロットの長期残存を予防する予防的処置としてとられる必要がある。血栓の溶解は、ｔＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）またはｕＰＡ（ウロキナーゼ）のいずれかにより誘導することができる。両方の療法は、限られた数の患者においてのみ効果的である。後天性プラスミノーゲン欠乏症を患っている患者は効能を示さないようである。
【０２００】
この欠乏が検出されたら、プラスミノーゲン置換が指し示される［Ｓｔｏｌｌ  Ｇ．：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｕｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ：ｎｏｖｅｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ」、Ｂｌｏｏｄ、２００８年、１１２巻：３５５５〜３５６２頁；ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２００８−０４−１４４７５８］。同著者は、急性血栓塞栓性卒中における主要な治療目標は、閉塞した脳内血管の再疎通を迅速に達成することであることを発見した。永久的な血管閉塞の場合、完全な梗塞が不可避的に発症する。現在、早期の静脈内または動脈内血栓溶解が唯一の確立された治療選択肢である［Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ  ｒｔ−ＰＡ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．、「Ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ．」、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、１９９５年；３３３巻：１５８１〜１５８８頁、Ｃｈｏｉ  ＪＨ、Ｂａｔｅｍａｎ  ＢＴ、Ｍａｎｇｌａ  Ｓら、「Ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｃａｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ．」、Ｓｔｒｏｋｅ、２００６年；３７巻：４１９〜４２４頁］。後の適用による重篤な脳内出血のリスクのため症状発症の３〜６時間後までという限られた時間ウインドウに起因して、この治療に適している患者は１０％未満である［Ａｄａｍｓ  Ｈ，Ａｄａｍｓ  Ｒ、ｄｅｌ  Ｚｏｐｐｏ  Ｇ、Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＬＢ．、「Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅａｒｌｙ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｓｔｒｏｋｅ．、Ｓｔｒｏｋｅ、２００５年；３６巻：９１６〜９２１頁］。新規のプラスミノーゲン活性化因子である組換えデスモテプラーゼの使用により９時間まで治療ウインドウを延長させる試みは失敗した［「Ｄｅｓｍｏｔｅｐｌａｓｅ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ｓｔｒｏｋｅ−２．」、［アクセス日：２０１８年２月２３日］ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｔｒｏｋｅｃｅｎｔｅｒ．ｏｒｇ／ｔｒｉａｌｓ／ＴｒｉａｌＤｅｔａｉｌ．ａｓｐｘ？ｔｉｄ＝５１５．］。分かっていない理由により、血栓溶解治療は、一部の症例では血管閉塞性クロットの溶解に繋がるが、他の症例ではそうではない。
【０２０１】
以下の実施例および特許請求の範囲は、本明細書に記載され、権利を主張される本発明の説明のための実施形態を提供することを意図したものである。これらの実施例は、本発明の主題の範囲に対する限定を提供することを何ら意図するものではない。
【実施例】
【０２０２】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲン調製物の製造方法
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの精製方法
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの単離のために、血漿、脱クリオ血漿、コーン／キストラー−ニッチマン（ＫＮ）法からの画分または場合により４−ＰＣＣ（プロトロンビン複合体濃縮物）法からの通過画分溶出液を使用することができる。使用可能な方法は以下の通りに要約することができる：
１．血漿または脱クリオ血漿
２．場合により：４−ＰＣＣ複合体の捕捉
３．Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの単離および安定化
４．１回目のウイルス不活性化（溶媒／界面活性剤（ＳＤ）処理）
５．ＳＤの除去
６．Ｇｌｕ−プラスミノーゲン複合体の最終の精製
７．２回目のウイルス不活性化（限外／ナノ濾過）
８．配合（限外濾過（ナノ濾過）、安定化、冷凍、乾燥）
９．Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物の取得
【０２０３】
この方法では、工程２は、次世代４−ＰＣＣ生成物に繋がり得る。工程３の画分をコーン／ＫＮ（キストラー−ニッチマン）法に導入することができる。
【０２０４】
工程１〜３は、プラスミノーゲン捕捉工程と表すことができる。工程４および５は、ＳＤ処理／ウイルス除去と表すことができる。工程６および７は、最終のプラスミノーゲン精製と表すことができる。
【０２０５】
本明細書に記載される方法は以下を提供する（一般のコメント）：
現代のクロマトグラフィー技術（認可された製造方法において既に使用されている新たな樹脂およびビーズ構造物）の使用により、最大の再使用可能性と共に消毒標準物質（１ＭのＮａＯＨ）を扱うことができる。
【０２０６】
リシン修飾ゲルをＧｌｕ−プラスミノーゲンの単離方法のために使用した。しかし、他の天然または合成アミノ酸、異なるスペーサーを有する遊離アミノ基を含有する天然および合成化合物のような、遊離アミノ基を含有する他のゲルも使用可能である。
【０２０７】
方法は、最小の調節上の努力および脱クリオ血漿ストリームの変更を用いて、確立された分別方法に一体化させることができる。コーン／ＫＮ（キストラー−ニッチマン）法におけるいかなる変更もなく、ＩｇＧ、アルブミンおよび他のタンパク質の単離のために脱クリオ血漿ストリームを直接的に使用した。
【０２０８】
現代のクロマトグラフィー工程および樹脂に起因するプラスミノーゲンの最小化された活性化のため、捕捉工程によりＧｌｕ−プラスミノーゲンのより高い収率が達成される。
【０２０９】
以下のＧｌｕ−プラスミノーゲンの収率（工程の収率／全体の収率）が得られた［％（ｗ／ｗ）］：
１．血漿（１００／１００）
２．脱クリオ血漿（９０／９０）
３．Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの単離および安定化（８０／７２）
４．１回目のウイルス不活性化（溶媒／界面活性剤（ＳＤ）処理）（９８／７１）
５．ＳＤの除去（９５／６７）
６．Ｇｌｕ−プラスミノーゲン複合体の最終の精製（９５／６４）
７．２回目のウイルス不活性化（限外／ナノ濾過）（９８／６２）
８．配合（限外濾過、安定化、冷凍、乾燥）（９０／５６）
９．Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物の取得、全体的な収率：５６％（ｗ／ｗ）
【０２１０】
単離の直後に、クエン酸を用いてＧｌｕ−プラスミノーゲンのｐＨをｐＨ７．５に変化させ、アプロチニンまたはアルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）のような安定化剤を加えた。
【０２１１】
脱クリオ血漿／血漿画分からのＧｌｕ−プラスミノーゲンの単離方法−方法の工程
捕捉工程：ヒト血漿または脱クリオ血漿をリシンゲル（９ＣＶのローディング量を使用）に直接的に捕捉した。未加工のＧｌｕ−プラスミノーゲンを単離し、安定化させた（実施例１．１を参照）。
【０２１２】
ＳＤ処理／１回目のウイルス除去：未加工のＧｌｕ−プラスミノーゲンに１％のＴｗｅｅｎ−２０および０．３％のＴｎＢＰを加えた。使用した条件：２２℃、２時間および穏やかな振とうを伴う処理。
【０２１３】
ＳＤの除去：陰イオン交換体、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  Ｍ  ＴＭＥＡ、ＭｅｒｃｋにＳＤ溶液（１：１０（クエン酸緩衝液１０ｍＭ、ｐＨ７．６）に希釈）を注入し（ゲル：ｐＨ５．７５の酢酸緩衝液２５ｍＭを含むＥＱ）、全てのＳＤ試薬をそれらの仕様の下で洗浄した。０．５ＭのＮａＣｌを含むｐＨ５．７５の酢酸緩衝液２５ｍＭを用いてＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させた。
【０２１４】
最終の精製：捕捉工程と同じ工程。
【０２１５】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの単離方法−コーン／ＫＮ法から得られたペーストＩ〜ＩＩＩ廃棄物画分から
コーン／ＫＮ法から得られた廃棄物画分ペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（すなわち、Ｉ〜ＩＩＩ）またはペーストＩ＋ＩＩＩをＧｌｕ−プラスミノーゲンの単離のために使用することができる。
【０２１６】
１．コーン／ＫＮ（キストラー−ニッチマン）法からのペーストＩ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（すなわち、Ｉ〜ＩＩＩ）またはペーストＩ＋ＩＩＩの取得
２．解凍、希釈、ｐＨ調整、濾過
３．Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの単離
４．安定化
５．Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物の取得
【０２１７】
本明細書において、工程２〜４はまた、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン捕捉工程を指すものとして考えることができる。
【０２１８】
実験データ
アッセイ方法
Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物の検出
検出は以下の通りに行った（データ示さず）：プラスミノーゲンの色素産生アッセイ検出  Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｃ．Ｎｅｗａｒｋ、ＤＥ  １９７１４  Ｕ．Ｓ．Ａ、Ｂｅｒｉｃｈｒｏｍ  Ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ。
【０２１９】
ＴＥＣＨＮＯＺＹＭＧｌｕ  Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ  ９６Ｔ（参照：ＴＣ１２０４０  Ｔｅｃｈｎｏｃｌｏｎｅ  ＧｍｂＨ、オーストリア）ＴｅｃｈｎｏｚｙｍによるＧｌｕ−プラスミノーゲンの検出：ＴＣ  Ｇｌｕ−プラスミノーゲン試験は、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンではなくＧｌｕ−プラスミノーゲンの量を決定するための固相酵素イムノアッセイである。アッセイでは、０．０６〜０．５μｇ／ｍＬの範囲内のＧｌｕ−プラスミノーゲンを測定した。正常血漿レベルは６０〜２５０μｇ／ｍＬであった。アッセイ間およびアッセイ内のばらつきはそれぞれ１０％未満および５％未満であった。
【０２２０】
９６ウェルプレートをモノクローナル抗プラスミノーゲン抗体を用いて予めコーティングし、１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を用いて遮断し、凍結乾燥した。（ＴＣ−Ｃｏｄｅ  ＧＸ））。サンプルおよび標準物（凍結乾燥した正常血漿（ＴＣ−Ｃｏｄｅ  ＢＪ））を、安定化タンパク質；０．０５％のプロクリン；および青色色素を含有するインキュベーション緩衝液（ＰＢＳ；ｐＨ７．３）を用いて希釈した。標準曲線は、０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．１２５μｇ／ｍＬ、０．０６３μｇ／ｍＬおよび０．０μｇ／ｍＬのＧｌｕ−プラスミノーゲン濃度を含有した。
【０２２１】
０．１ｍＬの希釈サンプル／標準物を別々のウェル中にピペッティングした。標準物／サンプルを２連で実行することが推奨される。プラスチック箔を用いてプレートに蓋をし、４℃で終夜インキュベートした。３．ウェルに洗浄緩衝液０．２５ｍＬ（界面活性剤；０．０１％のメルチオレートを含有する濃縮液（予備希釈１＋１１．５）（ＰＢＳ；ｐＨ７．３））を加えることにより（必要とされる）ストリップを再構成し、内容物を外に出した。洗浄緩衝液を用いてストリップをさらに４回洗浄した。吸収紙上にストリップを出し、ウェルが完全に乾燥するのを確実にした。好ましくはマルチチャンネルピペットを用いて、希釈ＰＯＸ抗プラスミノーゲン抗体０．１ｍＬを全てのウェルに加えた。プレートに蓋をし、３７℃で１時間インキュベートした。前述の通りに５回洗浄した。ＴＭＢ基質０．１ｍＬを全てのウェルにピペッティングした。室温で１５分間インキュベートした。停止溶液０．１ｍＬを全てのウェルにピペッティングした。４５０ｎｍでの吸光度を測定した（利用可能であれば６２０ｎｍの参照フィルターを用いる）。停止溶液の添加後１時間以内に吸光度を読み取った。標準曲線のグラフを構築した。曲線上の各サンプルの吸光度を突き止め、水平軸から対応する値を読み取った。サンプルの希釈係数を掛けることを忘れないようにした。
【０２２２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの純度を決定するために、追加のＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色と共にＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した。ＢｉｏＲａｄ  Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  ＴＧＸ  Ｓｔａｉｎ  ｆｒｅｅ  ｇｅｌ  ４〜２０％（商品番号：４５６−９０９３）をＰｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｌｌ  ｂｌｕｅ（ＢｉｏＲａｄ  商品番号：１６１−０３７３）、Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｃｏａｃｈｒｏｍ  商品記号：ＨＰＧＧ）およびＬｙｓ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｃｏａｃｈｒｏｍ  商品記号：ＨＰＧＬ）と組み合わせて使用した。Ｂｉｏ  Ｓａｆｅ  ＴＭ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｇ−２５０  Ｓｔａｉｎ（ＢｉｏＲａｄ  商品番号：１６１−０７８６）を用いてタンパク質を染色した。蒸留Ｈ２Ｏを用いてバックグラウンドを脱染色した。
【０２２３】
Ｂｒａｄｆｏｒｄ法−総タンパク質の決定
Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイは、溶液中のタンパク質の濃度を決定するための簡便かつ的確な手順である。アッセイは、すぐに使用できる１×濃度の色素試薬を供給する（ＢｉｏＲａｄ：商品番号５００−０２０５）。タンパク質濃度は１工程で決定される。Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ  Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイキットは、ウシ血清アルブミン標準セットを与える（ＢｉｏＲａｄ：商品番号５００−０２０６）。サンプルおよび予め希釈した標準濃度（０．１２５、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．５、および２．０ｍｇ／ｍｌ）から５μＬをＦ底ポリプロピレン９６ウェルプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ：ロット：Ｇ１７１２９７Ｇ）に加えた。最後に、Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ２５０μＬを各ウェルに加えた。ウェルを混合し、９６ウェルプレートを３７℃で５分間（最大６０分）インキュベートした。分光光度計を使用して３７℃で５９５ｎｍでの吸収キネティクスを測定し；曲線上の各サンプルの吸光度を突き止め、水平軸から対応する値を読み取った。
【０２２４】
分子サイズの分布をＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物のＨＰＬＣサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により分析した。
【０２２５】
（実施例１．４、１．６において使用したように）Ｇｌｕ−プラスミノーゲン調製物中の凝集物のパーセンテージを決定するために以下の方法を利用することができる。
【０２２６】
試験溶液：１００μＬの注入容量を用いて約１ｇ／Ｌで非希釈のサンプルを注入した。参照溶液としてＧｌｕ−プラスミノーゲン（例えば、Ｃｏａｃｈｒｏｍ  ＨＰＰＧ）を使用した。標準溶液はＢｉｏ−Ｒａｄ（ゲル濾過標準物、商品番号１５１−１９０１）のものであった。
【０２２７】
Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ４０００  ＳＷＸＬの固定相と共にカラム（サイズ：長さ＝３０ｍｍ、直径＝７．８ｍｍ）を使用した。移動相として、１リットルの水中に溶解したリン酸水素二ナトリウム二水和物４．８７３ｇ、リン酸二水素ナトリウム一水和物１．７４１ｇ、塩化ナトリウム１１．６８８ｇおよびアジ化ナトリウム５０ｍｇを含有する緩衝液を生成させた。流速は０．５ｍｌ／分であった。
【０２２８】
検出は２８０ｎｍにおいて分光光度的に実行した。得られたクロマトグラムを参照溶液と比較した。以下のスキームにしたがってクロマトグラムを統合し、ピークを同定した：
・ポリマー（＞１２００ｋＤ）、１０〜１３分
・タンパク質  高分子量（１５０〜９００ｋＤ）、１３〜２２分
・Ｇｌｕ−プラスミノーゲン（９２ｋＤａ）：２２〜２４分
・アルブミン（６６ｋＤ）、２５〜２７分
・断片（＜１００ｋＤ）、２６〜４０分
【０２２９】
タンパク質分解活性の決定
発色基質（特に、少なくとも１つのセリンプロテアーゼに対して感受性のもの）およびＧｌｕ−プラスミノーゲン調製物のサンプル（通常、アッセイの線形範囲を満たすように緩衝液中に希釈した）を３７℃で混合し、分光光度計を使用して吸収キネティクスをモニターすることによりタンパク質分解活性を評価した。サンプルのタンパク質分解活性は、式Ｃ（Ｕ／Ｌ）＝Ｓ×ΔＥ／分×Ｆ（Ｃ＝タンパク質分解活性；Ｓ＝発色基質の特定の吸着変化に関する変換係数；およびＦ＝希釈係数）を使用することにより初期吸収（減光Ｅ）の差異（ΔＥ／分）から算出した。基質の使用は製造者の説明書に従った。タンパク質分解活性は、特に、以下の工程を介して評価することができた：
（ａ）基質Ｓ−２２８８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）２５ｍｇを注射用水７．２ｍＬ中に溶解させた；
（ｂ）アッセイの線形範囲を満たすようにＧｌｕ−プラスミノーゲン調製物のサンプルを緩衝液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．４、１０６ｍＭのＮａＣｌ）中に希釈し、温度を３７℃に調整した；
（ｃ）等量（例えば、１００μｌ）の希釈したＧｌｕ−プラスミノーゲン調製物および溶解させた基質を混合した；
（ｄ）分光光度計を使用して３７℃で１〜３分間４０５ｎｍにおいて吸収キネティクスを測定した；
（ｅ）式Ｃ（Ｕ／Ｌ）＝３１３×ΔＥ／分×Ｆ（Ｃ＝タンパク質分解活性、Ｆ＝希釈係数）を使用することにより初期吸収の差異（ΔＥ／分）からサンプルのタンパク質分解活性を算出した。
【０２３０】
この方法の定量限界は８Ｕ／Ｌであり、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン調製物のサンプルを使用するとタンパク質分解活性は検出不可能であった。そのため、最終生成物中のタンパク質分解活性のレベルは８Ｕ／Ｌ未満であることが分かった。
【実施例１】
【０２３１】
実験的実施例１−Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの単離方法
材料および方法
クロマトグラフィー実験は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＮＧＣ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙシステムと共に１ｃｍの内径、５ｃｍのベッド高さのクロマトグラフィーカラム（Ｇｏｔｅｃ  Ｌａｂｏｒｔｅｃｈｎｉｃ）を使用して行った。５分の接触時間でｐＨ６．６のＰＢＳ緩衝液（５×）を用いてカラム（Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ  Ｒｅｓｉｎ）を平衡化した。次いで、脱クリオ血漿／通過画分ＰＣＣを５分の接触時間でローディングした。
【０２３２】
ローディング後の洗浄は、ｐＨ１０．３の０．０５Ｍの酢酸Ｎａ／０．０５Ｍのグリシン緩衝液を用いて行い、ベースライン吸光度とした。
【０２３３】
次いで、５分の接触時間でｐＨ１０．３の０．０５Ｍの酢酸Ｎａ／０．０５Ｍのグリシン緩衝液／０．０２５Ｍのリシンを用いてカラムを溶出し、０．５Ｍの水酸化ナトリウムを用いて再生させた。比濁分析によりローディング、非結合、および溶出画分を分析してＩｇＧおよびアルブミン含有量を決定した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥを実行して純度を決定した。ＥＬＩＳＡを実行してプラスミノーゲン含有量を決定した。
【０２３４】
結果
プラスミノーゲンは、４−ＰＣＣ生成物の通過画分から８４％の収率（回収８４％）で単離された。
【０２３５】
【表１】
2020510445.tif 000002
【０２３６】
総タンパク質
通過画分の総タンパク質（ＴＰ）収率は誤差範囲内で定量的であった。プラスミノーゲン捕捉画分は１．０ｇ／ＬのＴＰ含有量を示し、非常に純粋な生成物を実証した。アルブミン、ＩｇＧのカラムとの相互作用がないことにより、１００％の通過画分が結果としてもたらされた。溶出されたＧｌｕ−プラスミノーゲンは非常に低い総タンパク質濃度を有し、最小化された不純物を結果としてもたらした。
【０２３７】
【表２】
2020510445.tif 000003
【０２３８】
アルブミン
通過画分中のアルブミン含有量は１０４％であった（誤差範囲内で定量的）。
【０２３９】
【表３】
2020510445.tif 000004
【０２４０】
ＩｇＧ
通過画分中のＩｇＧ含有量は９９．５％であった（誤差範囲内で定量的）。
【０２４１】
【表４】
2020510445.tif 000005
【０２４２】
実験的実施例１．１−脱クリオ血漿からのＧｌｕ−プラスミノーゲンの単離方法
実施例１に記載の方法を用いて脱クリオ血漿からＧｌｕ−プラスミノーゲンを精製することができた。接触時間として１０分を使用した。脱クリオ血漿のローディング量は８ＣＶであった（脱クリオ血漿４０ｍＬ）。溶出されたＧｌｕ−プラスミノーゲンでは実施例１と同等の収率が得られた。収率は７６％であり、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの回収は８５％であった。
【０２４３】
生成物の仕様およびＧｌｕ−プラスミノーゲンの投与
精製された天然に存在するタンパク質Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは、いくつもの日において複数の機会のために使用される。
【０２４４】
プラスミノーゲン調製物の標的純度は９０％以上であり、最良にはＬｙｓ−プラスミノーゲンを含有せずにＧｌｕ−プラスミノーゲンを排他的に含有する。不活性化Ｇｌｕ−プラスミノーゲン分子の活性化は、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンにより開始させることができる。Ｌｙｓ−プラスミノーゲンは既に酵素切断されており、プラスミンへのより迅速な活性化プロセスのために開いたコンホメーションを有する。したがって、Ｌｙｓ−プラスミノーゲンは、非特異的活性化およびその後の強い有害効果のため、ヒト身体への応用のために使用できない。クロマトグラフィー樹脂およびＳＤ処理の最新技術の使用は、全体的な方法の間のプラスミノーゲンの最小の損失および不活性化Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの高い収率を結果としてもたらした。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンからＬｙｓ−プラスミノーゲンへの潜在的な活性化の均衡は、活性化プロセス（Ｌｙｓ−プラスミノーゲンおよびプラスミン）を捕捉するアプロチニンにより取られた。さらに、天然の阻害因子Ａ２ＡＰおよびｐＰａｃｋのようないくつもの阻害剤を、不活性化Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物の安定化について試験した。
【実施例２】
【０２４５】
実験的実施例２−ＰＣＣ通過画分からのＧｌｕ−プラスミノーゲンの捕捉工程についての緩衝液および樹脂の比較
１回目のＧｌｕ−プラスミノーゲン捕捉工程についての２つの異なる樹脂の有効性を決定するための試験を行った。Ｒｅｓｉｎ  Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ（Ｐａｌｌ）およびＥＣＨ  −  Ｌｙｓｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＴＭ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を分析した。フィードストリーム通過画分Ｐｒｏ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ（ＰＣＣ）からＧｌｕ−プラスミノーゲンを精製した。このフィード液は、ＩｇＭ  ０．８ｇ／Ｌ、ＩｇＧ  ８．８３ｇ／Ｌ、アルブミン３２．４９ｇ／Ｌ、総タンパク質（ＴＰ）５７ｇ／ＬおよびＧｌｕ−プラスミノーゲン７４μｇ／ｍＬを含有した。カラムクロマトグラフィーは、Ｂｉｏｒａｄ  ＮＧＣクロマトグラフィーシステムを使用してｏｅＧｏｔｅｃカラム（直径１ｃｍ、高さ：２０ｃｍ）を用いて行った。
【０２４６】
４〜５ｍＬのカラム体積（ＣＶ）を有するカラムを使用した。７分または８分の一定の接触時間を各実験アプローチに適用した。フィード液は０．５〜０．６ｍｌ／分の流速でカラムを通過した。フィード液のローディング量は１０ＣＶで一定であった。
【０２４７】
０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）（方法１）または０．０１Ｍのクエン酸三Ｎａ／１ｍＭのＣａＣｌ２／０．１２ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）（方法２）または０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（方法３）を用いてカラムを平衡化した（４ＣＶ）。純粋な通過画分ＰＣＣ（ｐＨ７．３、１３．５ｍＳ／ｃｍ）はカラムを通過した。洗浄緩衝液として、０．０５Ｍの酢酸／０．０５Ｍのグリシン（ｐＨ１０．３）（方法１）または０．０１Ｍのクエン酸三Ｎａ／１ｍＭのＣａＣｌ２／０．１２ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）（方法２）または０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）（方法３）を使用した。通過画分を瓶に回収し、−３５℃で冷凍した。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの溶出のために、０．０５Ｍの酢酸／０．０５Ｍのグリシン／０．０２５Ｍのリシン（ｐＨ１０．３）（方法１）、０．０５Ｍのトリス／０．０２５Ｍのリシン／１ＭのＮａＣｌ（ｐＨ９．０）（方法２）または０．１Ｍのリン酸緩衝液／０．２Ｍのε−アミノカプロン酸（ｐＨ７．４）（方法３）のいずれかを使用した。ＣＩＰ洗浄プログラムとして、０．１ＭのＮａＯＨ（４ＣＶ）、０．１ＭのＨＣｌ（４ＣＶ）を使用し、カラムを２０％のエタノールで貯蔵した。最終のＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物を−３５℃で冷凍した。Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｃｈｎｏｚｙｍを使用してＧｌｕ−プラスミノーゲン濃度を決定した。免疫グロブリン濃度を比濁分析により分析した。アルブミン濃度を多色エンドポイント決定により決定し、ＴＰをブラッドフォード法により決定した。
【０２４８】
結果は、異なる樹脂および異なる緩衝液条件の使用は結果の変動に繋がることを指し示した。目的は、最初にＧｌｕ−プラスミノーゲンを結合させ、次いでＧｌｕ−プラスミノーゲンを高い収率で溶出させることである。他のタンパク質は１００％通過するべきである。この通過画分は大抵、他の方法におけるさらなる精製のために使用される。結果は、両方の樹脂の使用によりＩｇＧおよびアルブミンは１００％通過することを指し示した。ＩｇＭ分子は、異なる緩衝液条件に応じてカラムと相互作用した。最良の通過画分の結果は、両方の樹脂と共に方法１の使用により達成することができた（表１）。
【０２４９】
【表５】
2020510445.tif 000006
【０２５０】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの収率は、３つの方法と組み合わせた樹脂Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄの使用により変動した。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの最も高い収率は方法１により達成することができた。プラスミノーゲンの収率は９０％であり、回収（Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの収率＋通過画分中のＧｌｕ−プラスミノーゲン）はそれぞれ約９５％であった。樹脂ＥＣＨ−Ｌｙｓｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの意図した適用は、３つの方法のそれぞれについて同等のＧｌｕ−プラスミノーゲンの収率を結果としてもたらした。
【０２５１】
Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ  ＲｅｓｉｎおよびＬｙｓｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｒｅｓｉｎを用いる方法１の使用は、他の方法２および３と比較してＧｌｕ−プラスミノーゲン調製物のより高い純度を結果としてもたらした。
【０２５２】
【表６】
2020510445.tif 000007
【実施例３】
【０２５３】
実験的実施例３−１０ｍＭの酢酸緩衝液および２５ＣＶまでのローディング量を用いるＧｌｕ−プラスミノーゲンの精製
この実施例は、１回目のＧｌｕ−プラスミノーゲン捕捉工程における樹脂ＥＣＨ  −  Ｌｙｓｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＴＭ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の結合能力を決定するために行った。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンをフィードストリーム通過画分プロトロンビン複合体（ＰＣＣ）から精製した。このフィード液は、ＩｇＭ  ０．８ｇ／Ｌ、ＩｇＧ  ８．８３ｇ／Ｌ、アルブミン３２．４９ｇ／Ｌ、総タンパク質（ＴＰ）５７ｇ／ＬおよびＧｌｕ−プラスミノーゲン７４μｇ／ｍＬを含有した。カラムクロマトグラフィーは、Ｂｉｏｒａｄ  ＮＧＣクロマトグラフィーシステムを使用してｏｅＧｏｔｅｃカラム（直径１ｃｍ、高さ：２０ｃｍ）を用いて行った。
【０２５４】
５．０２ｍＬのカラム体積（ＣＶ）を有するカラムを使用し、７．８分の一定の接触時間を用いてクロマトグラフィー精製を行った。フィード液は、０．６４ｍｌ／分の流速でカラムを通過した。フィード液のローディング量は最大２５ＣＶであった。
【０２５５】
０．０５Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ６．６）（方法１）を用いてカラムを平衡化した（４ＣＶ）。純粋な通過画分ＰＣＣ（ｐＨ７．３、１３．５ｍＳ／ｃｍ）はカラムを通過した。０．０１Ｍの酢酸／０．０５Ｍのグリシン（ｐＨ１０）を洗浄緩衝液として使用した。通過画分および洗浄画分を瓶に回収し、−３５℃で冷凍した。緩衝液０．０１Ｍの酢酸／０．０５Ｍのグリシン／０．０２５Ｍのリシン（ｐＨ１０．３）を使用してＧｌｕ−プラスミノーゲンを溶出させた。より酸性または中性のｐＨ値は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの収率の低減を結果としてもたらした。ＣＩＰプログラムのために０．１ＭのＮａＯＨ（４ＣＶ）、０．１ＭのＨＣｌ（４ＣＶ）を使用し、カラムを２０％のエタノール中に貯蔵した。
【０２５６】
溶出したＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物のｐＨ値を１Ｍの酢酸を用いてｐＨ５．０に調整した。添加物なしで安定なＧｌｕ−プラスミノーゲンを製造するため、生成物を０．３２Ｍのグリシン緩衝液中にダイアフィルトレーションし（Ｐａｌｌの１０ｋＤａ遠心分離デバイス番号ＭＣＰ０１０Ｃ４１）、−３５℃で冷凍した。Ｇｌｕ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ＥＬＩＳＡ  Ｔｅｃｈｎｏｚｙｍを使用してＧｌｕ−プラスミノーゲン濃度を決定した。免疫グロブリン濃度を比濁分析により分析した。アルブミン濃度を多色エンドポイント決定により決定し、ＴＰをブラッドフォード法により決定した。
【０２５７】
この実施例は、洗浄およびＧｌｕ−プラスミノーゲンの溶出のために０．０１Ｍの酢酸緩衝液と共にＥＣＨ−Ｌｙｓｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを使用する利点を実証した。樹脂は、記載した条件下でフィード液の２５ＣＶを超える高いローディング量および９３％の高いＧｌｕ−プラスミノーゲンの収率を与えた。ＥＣＨ−Ｌｙｓｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは、樹脂１ｍＬ当たり最低１．８５ｍｇのプラスミノーゲンの高い結合能力と共に使用することができた。特に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物の純度は極めて高く、９０％より高かった。Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより不純物としてアルブミンのみが１０％未満で検出された。しかしながら、アルブミンの存在は追加の安定化効果を与えた（表３）。
【０２５８】
【表７】
2020510445.tif 000008
【実施例４】
【０２５９】
実験的実施例４  画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩおよび結果として得られる廃棄物画分からのＧｌｕ−プラスミノーゲンの捕捉
ヒト血漿の冷エタノール分別を起源とする画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ（１４０ｇ）を７６０ｍＬの緩衝液（０．１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ５．０５））中に懸濁した。懸濁液の温度が２２℃に達した後、懸濁液を１５〜３０分間混合した。懸濁液中、７３μｇ／ｍＬのＧｌｕ−プラスミノーゲン濃度が測定された。深層濾過または遠心分離による濾過後、実施例３にしたがって結果として得られる濾液／上清からＧｌｕ−プラスミノーゲンを精製することができた。
【０２６０】
第２の選択肢として、室温でオクタン酸（使用した画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ  １ｋｇ当たり０．１１０ｋｇ）を加えることにより懸濁液をさらに処理し、振動ミキサー（Ｖｉｂｒｏｍｉｘｅｒ（登録商標）、サイズ４）を使用してタンパク質溶液を８０分間さらに混合した。３０分にわたってオクタン酸をゆっくり加えた。画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩの約０．０１５倍量のリン酸三カルシウム（Ｃａ３ＰＯ４）２）を加え、タンパク質溶液を１５〜３０分間さらに混合した。濾過助剤Ｃｅｌｐｕｒｅ（登録商標）Ｐ１００（タンパク質溶液１ｋｇ当たり４．３〜５．７ｇ）を懸濁液に加え、１５分間インキュベートした。さらに、濾過助剤Ｈａｒｂｏｌｉｔｅ（登録商標）９００（タンパク質溶液１ｋｇ当たり１０ｇ）を懸濁液に加え、１５分間インキュベートした。
【０２６１】
深層濾過により沈殿物を濾液から分離させた。濾液は、出発懸濁液の８０％のＩｇＧ、ＩｇＭおよびアルブミンを含有し、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは検出できなかった。しかしながら、タンパク質が濾過ケーク（廃棄物画分）中に残存し、これは通常除去および廃棄されるが、新たなタンパク質（Ｇｌｕ−プラスミノーゲン）を再生させる高い潜在能力を有しているように思われた。いくつもの洗浄工程による沈殿物（濾過ケーク）からのＧｌｕ−プラスミノーゲンの単離に約２８μｇ／ｍＬの濃度で成功し、出発材料から３８％の収率を結果として得た。廃棄物画分である濾過ケークは通常廃棄されるので、収率は、廃棄物画分のリサイクリングにより実際に天然Ｇｌｕ−プラスミノーゲンを得ることができるという事実に従属する。したがって、コーン／ＫＮ法の他の廃棄物画分もまた、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの単離およびさらなる精製のために使用することができる。
【０２６２】
濾過ケークから単離されたＧｌｕ−プラスミノーゲンをさらに精製することができた：Ｇｌｕ−プラスミノーゲン溶液をｐＨ６．６の０．０５Ｍのリン酸緩衝液中に希釈した。最終のＧｌｕ−プラスミノーゲン捕捉工程を実施例３にしたがって行った。
【０２６３】
一般に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは、各画分Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩおよび結果として生じた廃棄物画分から単離することができた。Ｇｌｕ−プラスミノーゲン濃度は、各個々のコーン法またはキストラー−ニッチマン法とは異なった。
【実施例５】
【０２６４】
実験的実施例５  Ｇｌｕ−プラスミノーゲン調製物の純度
Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物を選択的なアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。リシン残基は高親和性を有するが、不純物もまた捕捉することができた。さらには、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの精製方法は凝集物または断片を生成することができた。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは、凝集物または断片の存在なしに高純度を有するべきである。実施例２により精製されたＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物のＳＥＣ分析を表４に示す。異なる方法は類似の結果を示した。Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄを用いて方法２により精製されたＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物のみが高分子量の分子を示した。他のＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物は断片および凝集物を含有しなかった。Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物中のアルブミン含有量の変動は１０〜２０％で最小であった。
【０２６５】
【表８】
2020510445.tif 000009
【実施例６】
【０２６６】
実験的実施例６−精製されたＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物の残存タンパク質分解活性の決定
実施例２にしたがってＧｌｕ−プラスミノーゲンの精製を行った。前述の精製方法により精製したＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物（例えば、ｃ：２５０μｇ／ｍＬ）のサンプル中のタンパク質分解活性を製造者の説明書にしたがって発色基質Ｓ−２２８８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を使用して決定した。基質Ｓ−２２８８（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）２５ｍｇを注射用水７．２ｍＬ中に溶解させた。アッセイの線形範囲を満たすようにサンプルを緩衝液（１００ｍＭのトリス／ＨＣｌ  ｐＨ８．４、１０６ｍＭのＮａＣｌ）中に希釈し、緩衝液１００μＬをサンプル１００μＬと混合した（混合および３７℃への温度調整）。予備希釈したサンプル１００μＬを９６ウェルプレート中で発色基質溶液１００μＬと混合した。分光光度計を使用して３７℃で４０５ｎｍ（１〜３分）において吸収キネティクスを測定した。式Ｃ（Ｕ／Ｌ）＝３１３×ΔＥ／分×Ｆ（Ｃ＝タンパク質分解活性、Ｆ＝希釈係数）を使用することにより初期吸収の差異（ΔＥ／分）からサンプルのタンパク質分解活性を算出した。
【０２６７】
【表９】
2020510445.tif 000010
【０２６８】
精製したＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物は、精製方法に応じて異なるタンパク質分解活性レベルを示した。一部のサンプルでは、緩衝液条件または樹脂の特徴に起因してタンパク質分解活性の増加を決定することができた。異なる精製方法を比較するために、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン濃度は各サンプル中で類似であった。ＥＣＨ−Ｌｙｓｉｎｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅの使用により精製されたＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物はタンパク質分解活性を有しなかった。
【０２６９】
この結果は、精製方法はＧｌｕ−プラスミノーゲンを活性化させず、また他の汚染性プロテアーゼを精製しないことを指し示す。
【０２７０】
Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄ樹脂を用いる生成後、より高いタンパク質分解活性が測定され、これは異なる緩衝液条件の使用と共に変化した。Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄカラムをアプロチニンで飽和させることにより、生成されるＧｌｕ−プラスミノーゲン調製物のタンパク質分解活性は最小化された。さらには、０．３２Ｍのグリシン緩衝液中へのダイアフィルトレーション後にタンパク質分解活性は劇的に低減された。
【実施例７】
【０２７１】
実験的実施例７−液体Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物を用いる貯蔵安定性試験
実施例２および３にしたがって調製したＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物を４８時間にわたって３７℃でインキュベートし、その後にＳＤＳ−ＰＡＧＥにしたがって分解生成物（例えば、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン）の存在について分析した。さらには、４８時間のインキュベーション後のＧｌｕ−プラスミノーゲンの残存含有量をＧｌｕ−プラスミノーゲンＥＬＩＳＡにより決定した。
【０２７２】
Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば、調製物中のＧｌｕ−プラスミノーゲンの安定性は、精製のために使用されるクロマトグラフィー樹脂の他に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの溶出および貯蔵のために使用される緩衝液に依存した。方法１を使用してリシン−セファロースで生成され、０．３２Ｍのグリシン緩衝液（ｐＨ４．３）中にダイアフィルトレーションされた調製物のＧｌｕ−プラスミノーゲン含有量は、３７℃で４８時間にわたって一定のままであった。Ｌｙｓ−プラスミノーゲンへの分解はサンプル中に検出できなかった。実施例２にしたがって調製された他のＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物の一部では、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの分解プロセスが見られた。
【０２７３】
この傾向はまた、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンＥＬＩＳＡを使用して異なるＧｌｕ−プラスミノーゲン調製物の３７℃での４８時間後の残存Ｇｌｕ−プラスミノーゲン含有量を測定することにより観察することができた（表６）。時点ｔ＝０での各サンプルのＧｌｕ−プラスミノーゲン濃度を１００％と定義した。
【０２７４】
【表１０】
2020510445.tif 000011
【０２７５】
一般に、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物は、Ｌｙｓｉｎｅ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄとは対照的にＥＣＨ−Ｌｙｓｉｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅにより精製された場合により高い安定性を示すことを観察することができた。しかしながら、精製のために使用した樹脂と独立して、酢酸緩衝液を用いて溶出されたＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物は、グリシン緩衝液中へのダイアフィルトレーションによりさらに安定化させることができ、その後に類似の高い安定性を示した。安定性解析は、方法１の緩衝液条件の使用は高度に安定な精製されたＧｌｕ−プラスミノーゲン生成物を結果としてもたらすことを指し示した。
【０２７６】
３７℃で４８時間のこの調製物のインキュベーション後に、生成物は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン調製物の安定性を示す仕様の範囲内のままであった：ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分解生成物（例えば、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン）の存在、高速サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＳＥＣ）を用いて測定される凝集物および断片含有量、タンパク質分解活性（ＰＡ）ならびにＧｌｕ−プラスミノーゲンＥＬＩＳＡによる４８時間のインキュベーション後のＧｌｕ−プラスミノーゲンの残存含有量の決定（表７を参照）。
【０２７７】
呈色、乳光、ｐＨ値のような他のパラメーターもまた決定され、試験期間全体にわたって変化しないままであった。
【０２７８】
続けた安定性研究において、９６時間後にも調製物は同じ安定性プロファイルを示し、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物の安定性は、緩衝液組成、使用されるクロマトグラフィー樹脂、ｐＨ値および電導度に依存するという仮説が裏付けられた。
【０２７９】
さらに、３７℃での４８時間にわたる第２の安定性研究において、組換えアプロチニン（Ｇｌｕ−プラスミノーゲン１μｇ当たり組換えアプロチニン０．０１９μｇ）の追加は、使用した貯蔵緩衝液と独立して、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン生成物の安定性をさらに増加させることが実証された。
【０２８０】
【表１１】
2020510445.tif 000012
【実施例８】
【０２８１】
実験的実施例８−作用様式の研究
急性腎不全患者の新たな診断研究は、Ａ２ＡＰとＰＬＧとの比の有意な増加がＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｍａｎｎｈｅｉｍにおける対照集団（５５人の患者）および患者（２５人の患者）において検出されたことを実証する。
【０２８２】
敗血症患者の死後の研究により、腎臓、肝臓、肺、腸、副腎および脳などの多くの臓器における微小血管血栓、ならびに臓器損傷の程度は血栓の量に関係することが実証された。臓器不全の解析のために、敗血症の動物モデルを使用して、凝固を阻害しまたは線維素溶解を促進する療法が臓器不全および死亡を低減させることが実証された。
【０２８３】
しかしながら、これらの敗血症モデルの使用は、線維素溶解の明確な開始の明確でない解析に繋がる。プラスミノーゲンの機構を複雑な疾患モデルにおいて定義することができない。
【０２８４】
前臨床実験における４つの可能性がある作用様式（ＭｏＡ）モデルによりＧｌｕ−プラスミノーゲンの治療可能性を定義することができる。
【０２８５】
疑問であったのは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンが線維素溶解を開始させることができるのかどうか、およびタンパク質と阻害因子との均衡を安定化させるのかどうかということであった。いずれのＭｏＡが好適であるのかが証明された。
【０２８６】
２．１．マウスモデルにおける大静脈の完全閉塞（ミュンヘン大学Ａｎｄｅｒｓ教授）
仮説（先行する実験により発見された）
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの静脈注射は、線維素溶解へと均衡をシフトさせて既存の静脈血栓を解消させる可能性を有する。
【０２８７】
概要
方法：３日間、深静脈血栓を構築した。
解析：研究のエンドポイント→クロットサイズの測定
【０２８８】
【表１２】
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【０２８９】
材料および方法
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験
７〜８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６ＮマウスをＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、スルツフェルト、ドイツから入手した。それらを、食料および水に自由にアクセスできる標準的な住居条件下で維持した。全ての動物にＩＶＣ結紮手術を行い、手術後７２時間にわたりモニターした。試験の最後に頸部脱臼により全てのマウスを屠殺した。全ての動物実験は、欧州動物福祉保護法にしたがって、地方自治体（Ｒｅｇｉｅｒｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｏｂｅｒｂａｙｅｒｎ）による承認（登録番号：５５．２−１−５４−２５３２−５４−２０１７）の下で行った。
【０２９０】
【表１３】
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【０２９１】
【表１４】
2020510445.tif 000015
【０２９２】
動物の受入れ、順応およびモニタリング
有資格者が受入れ時に各動物を検査した。良好な健康状態であり試験動物として好適であると判断された動物を少なくとも１週間隔離した。
【０２９３】
順応および試験の生物学的段階の間、全般的外見および挙動の変化について動物を１日１回観察した。
【０２９４】
群化および処置
マウスを無作為化し、２つの群に割り当てた。ビヒクル／ＰＢＳ群（ｎ＝１２）およびＧｌｕ−プラスミノーゲン群（群当たりｎ＝９）。
【０２９５】
手術
全ての外科的処置は無菌の指定された区画内で実行した。手術の前に各動物に麻酔１００μｌを注射し、動物を５〜１０分間３７℃の飼育室に入れて熟睡させた。１０分後に動物を取り出し、予熱（４０℃）した加熱プレートに置いて、手術中の動物の体温を維持させた。１〜２ｃｍの腹部切開を開き、下大静脈（ＩＶＣ）の位置を確かめた。７−０（８．０ｍｍ０ｍｍ  ３／８  ｃ８ｃ）ポリプロピレン単繊維非吸収性縫合糸（Ｐｒｏｌｅｎｅ＃８７３５Ｈ、Ｅｔｈｉｃｏｎ、ノルダーシュテット、ドイツ）を使用してＩＶＣを結紮した（１００％の狭窄）。結紮の成功後、腹部切開を閉じ、２００μＬのアンタゴニストおよびブプレノルフィンを注射し、再び３７℃の飼育室に戻し、任意の手術合併症についてさらに１時間モニターした。
【０２９６】
治療スケジュール
【表１５】
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【０２９７】
屠殺
全ての動物を動物施設に戻し、モニターし、ブプレノルフィン２００μｌを１２時間毎に注射した。全ての動物のストレス状態を規定のスコアシートに記録した（表２）。手術の７２時間後に全ての動物を頸部脱臼法を用いて屠殺した。ＩＶＣを切除し、血栓クロットの重量を測定して記録した。
【０２９８】
所見
死亡および臨床徴候
任意の異常な臨床徴候および死亡のような重篤な有害事象について動物を１日２回観察した。
【０２９９】
血栓形成および解消
屠殺時に血栓形成（対照動物）および解消（処置動物）について個々の動物を評価した。各個々の動物の血栓重量を記録し、薬物の効能について評価した。
【０３００】
結果
死亡
対照群において２匹の動物およびＧｌｕ−プラスミノーゲン群において１匹の動物が手術合併症に起因して死亡した。
【０３０１】
血栓形成および解消
全てのビヒクル／ＰＢＳ処置群の動物は有意な量の血栓クロットを発生させたが、ほぼ全てのＧｌｕ−プラスミノーゲン処置群の動物はクロットを示さなかったか、またはクロットの最大の解消を示した（表１および図１〜５）。
【０３０２】
考察および結論
本発明にしたがって生成されたＧｌｕ−プラスミノーゲンは、驚くべきことに、高く優れた線維素溶解活性を有する。したがって、本発明による生成物は、既存の血栓を解消させるという仮説を立てた。
【０３０３】
仮説を試験するために、マウスモデルの静脈血栓症におけるＩＶＣの１００％の狭窄を使用した。ビヒクルを注射した対照マウスは、狭窄の７２時間後に血栓クロット形成の発生を示した。ビヒクルマウスの血栓重量と比較して、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン群の動物は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン抽出物の投与後に血栓を有しないか、または血栓重量が有意に低減された。したがって、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの注射は、負の効果に繋がらず、凝固と線維素溶解との不均衡を線維素溶解活性の増加へとシフトさせた。両方の群において、手術合併症に起因する死亡が観察された。
【０３０４】
したがって、開発したＧｌｕ−プラスミノーゲンは、この実験の静脈血栓症モデルにおいて線維素溶解活性を開始させる能力を有すると我々は結論付けた。
【０３０５】
【表１６】
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【０３０６】
両方の群における血栓重量の代表的なグラフ。血栓重量をグラム単位で測定した。データは平均±ＳＥＭを表す。ｐ＜０．０００１（ｎ＝１０のビヒクル群；ｎ＝８の処置群）。これらのデータは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの注射後の既に構築された血栓の高度に有意（＊＊＊＊）な低減を表す。
【０３０７】
実験的実施例８．１．マウスモデルにおける腎臓の一時的な単一の虚血−再潅流
方法：腎臓管の虚血−壊死
解析：糸球体濾過量（１日目および３０日目）、デルタ腎臓重量（３０日目）、腎線維症の寸法（３０日目）。ミュンヘン大学Ａｎｄｅｒｓ教授
【０３０８】
【表１７】
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【０３０９】
実験的実施例８．２．マウスモデルにおける腎臓移植
方法：腎臓組織の壊死および毛細血管における微小クロット形成に起因する腎臓拒絶の解析
解析：糸球体濾過量（１日目および３０日目）、デルタ腎臓重量（３０日目）、腎線維症の寸法（３０日目）およびクロット形成。コンタクト中。
【０３１０】
【表１８】
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【０３１１】
実験的実施例８．３．マウスモデルにおける移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）
方法：フォンウィルブランド因子活性化および多量体栓球凝集に起因してＧｖＨＤに繋がる骨髄移植
解析：研究のエンドポイント→寿命がより長いが否か。
【０３１２】
【表１９】
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【実施例９】
【０３１３】
実験的実施例９．Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの適応機会
３０年前の刊行物において、アルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）とプラスミノーゲン（ＰＬＧ）との比の増加が死体腎臓移植された患者において検出されたことが報告されている。
【０３１４】
さらには、プラスミノーゲンの投与は、敗血症患者の身体状態を改善させることが示された。
【０３１５】
大きい量のアルファ−２−アンチプラスミンおよびプラスミノーゲンの不均衡は線維素溶解活性を停止させ、凝固の均衡が取られない。急性腎不全患者の新たな診断研究において、対照集団（５５人の患者）と患者（２５人の患者）との間で有意な比が検出されることが示された。
【０３１６】
未加工のデータ：急性腎不全患者におけるＰＬＧおよびＡ２ＡＰの測定値
対照集団（５５人の健常血液ドナー）における正常範囲：
ＰＬＧ：８２．７％〜１４４．５％
Ａ２ＡＰ：９６．９％〜１１８．９％
比：０．８０〜１．２６
２５人の急性腎不全患者の非統計正規分布の結果
１．２５人の患者のうち１２人（４８％）が８２．６７％未満のＰＬＧ
２．２５人の患者のうち１４人（５６％）が９６％未満のＡ２ＡＰ
３．２５人の患者のうち６人（２４％）が１．２６より高い比（Ａ２ＡＰ／ＰＬＧ）
４．２５人の患者のうち４人（１６％）が１．２６より高い比および８２％未満のＰＬＧ
【０３１７】
【表２０】
2020510445.tif 000021
【０３１８】
急性腎不全の研究は、異なるパラメーター（丸めた値）において患者（急性腎不全を患っている患者）と対照群（ＮＰ、健常個体）との間の有意差を結果としてもたらした：
【０３１９】
【表２１】
2020510445.tif 000022
【０３２０】
急性腎不全（ＡＫＩ）患者の続けた解析は、有意な後天性プラスミノーゲン欠乏症を結果としてもたらした。
【０３２１】
研究の概要−急性腎不全（ＡＫＩ）
アルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）およびＧｌｕ−プラスミノーゲン（ＰＬＧ）の測定
７７人の急性腎不全患者（ＡＫＩ）
５３人の対照集団（ＣＰ）
【０３２２】
ｔ検定−マン・ホイットニー解析の結果：
ＡＫＩ患者における有意（＊＊）な後天性プラスミノーゲン欠乏症
ＡＫＩ患者における有意（＊＊）な後天性アルファ−２−アンチプラスミン欠乏症
比（Ａ２ＡＰ／ＰＬＧ）の有意差なし
【０３２３】
結論：
急性腎不全（ＡＫＩ）患者は、高いパーセンテージで後天性プラスミノーゲン欠乏症、すなわち、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン置換療法の適応症を有した。
【０３２４】
【表２２】
2020510445.tif 000023
【０３２５】
【表２３】
2020510445.tif 000024
【０３２６】
【表２４】
2020510445.tif 000025
【０３２７】
実験的実施例９．１  適応症  播種性血管内凝固（ＤＩＣ）
試験の概要−ＤＩＣ：
アルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン（ＰＬＧ）、Ｄ−ダイマーの測定
２１人のＤＩＣ患者
５３人の対照集団
【０３２８】
マン・ホイットニー解析の結果：
ＤＩＣ患者における有意（＊＊）な後天性プラスミノーゲン欠乏症
ＤＩＣ患者において後天性アルファ−２−アンチプラスミン欠乏症なし
比（Ａ２ＡＰ／ＰＬＧ）の有意（＊＊＊）な差
【０３２９】
結論：
ＤＩＣ患者は、高いパーセンテージで後天性プラスミノーゲン欠乏症、すなわち、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン置換療法の適応症を有した。
【０３３０】
【表２５】
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【０３３１】
【表２６】
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【０３３２】
【表２７】
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【０３３３】
実験的実施例９．２  適応症  敗血症
試験の概要−敗血症：
アルファ−２−アンチプラスミン（Ａ２ＡＰ）、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン（ＰＬＧ）、ＰＣＴＰの測定
９人の患者
５３人の対照集団
【０３３４】
ｔ検定−マン・ホイットニー解析の結果：
敗血症患者における有意（＊）な後天性プラスミノーゲン欠乏症
敗血症患者において後天性アルファ−２−アンチプラスミン欠乏症なし
比（Ａ２ＡＰ／ＰＬＧ）の有意差なし
【０３３５】
結論：
敗血症患者は、高いパーセンテージで後天性プラスミノーゲン欠乏症、すなわち、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン置換療法の適応症を有した。
【０３３６】
【表２８】
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【０３３７】
【表２９】
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【０３３８】
【表３０】
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【０３３９】
全体的な結論：
後天性プラスミノーゲン欠乏症は高度に複雑な疾患であり、リスクのある患者がプラスミノーゲンおよび／またはアルファ−２−アンチプラスミンについて試験されていないという事実に起因して現在診断が不充分である。リスクのあるこれらの患者の試験は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン置換療法の適応症を結果としてもたらし得る。また、疾患の経過内の両方のパラメーターの試験は、Ｇｌｕ−プラスミノーゲンの適応症を結果としてもたらすはずである。
【国際調査報告】
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