(57)【要約】  脱毛に罹患した領域を処置する方法が本明細書中で開示されている。いくつかの実施形態において、脱毛を処置する方法は、老化細胞または老化細胞由来の因子を脱毛が生じた領域にデリバリーすることを含む。老化細胞の組成物を作製する方法および老化細胞の組成物も本明細書中で開示されている。
2020514395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱毛に罹患した領域において対象における発毛を向上させるまたは誘導するための方法であって、
少なくとも１つの細胞老化関連分泌形質（ＳＡＳＰ）因子、または前記少なくとも１つのＳＡＳＰ因子を分泌する少なくとも１つの老化細胞を前記脱毛に罹患した領域において前記対象にデリバリーすること
を含み、
前記少なくとも１つの老化細胞は、非複製的であるか、または非複製的形質を呈する少なくとも１つの細胞を含み、
前記少なくとも１つの老化細胞または前記少なくとも１つのＳＡＳＰ因子のデリバリーは、前記脱毛に罹患した領域において毛包の成長期の延長および休止期の短縮のうちの１つ以上を誘導し、
前記毛包の前記成長期の延長および／または前記休止期の短縮は、前記脱毛に罹患した領域において前記対象における発毛を向上させるまたは誘導する、方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つの老化細胞は、メラノサイトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記メラノサイトは、母斑由来である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記母斑は、有毛母斑である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＡＳＰ因子は、オステオポンチンポリペプチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記オステオポンチンポリペプチドは、骨髄細胞を前記脱毛に罹患した領域に動員する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記骨髄細胞は、さらなるオステオポンチンポリペプチドまたはＳＡＳＰ因子を分泌して、前記脱毛に罹患した領域において前記対象における発毛をさらに向上させるまたは誘導する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記デリバリーすることは、前記少なくとも１つの老化細胞の局所デリバリーを含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記局所デリバリーは、マイクロニードルデバイスの適用に続いて行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記局所デリバリーは、フラクショナルレーザー処置の適用に続いて行われる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記デリバリーすることは、前記少なくともＳＡＳＰ因子の局所デリバリーを含む、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記局所デリバリーは、マイクロニードルデバイスの適用に続いて行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記局所デリバリーは、フラクショナルレーザー処置の適用に続いて行われる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つの老化細胞種を脱毛に罹患した領域にデリバリーすることを含む、方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの老化細胞種は、老化細胞の集団である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記老化細胞の集団は、純粋な老化細胞の集団である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの老化細胞は、ヒト老化細胞である、請求項１４から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの老化細胞は、老化メラノサイト、老化線維芽細胞、老化ケラチノサイト、および老化脂肪細胞からなる群から選択される、請求項１４から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子を脱毛に罹患した領域にデリバリーすることを含む、方法。
【請求項２０】
ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子および免疫細胞種由来の少なくとも１つの因子を脱毛に罹患した領域にデリバリーすることを含む、方法。
【請求項２１】
前記ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子は、ＳＡＳＰ分子のカクテルである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子は、アンジオゲニン（ＡＮＧ）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＣＬ１１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＣＬ１３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＣＬ１６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＣＬ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２０（ＣＣＬ２０）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２５（ＣＣＬ２５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２６（ＣＣＬ２６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＣＬ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド７（ＣＣＬ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＣＬ８）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、コロニー刺激因子３（ＣＳＦ３）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸＣＬ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＸＣＬ１１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＸＣＬ２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＸＣＬ３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＸＣＬ８）、ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ＷＮＴシグナル伝達経路インヒビター１（ＤＫＫ１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、エピレギュリン（ＥＲＥＧ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、インスリン様増殖因子結合タンパク質５（ＩＧＦＢＰ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質６（ＩＧＦＢＰ６）、インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）、インターロイキン１２Ｂ（ＩＬ１２Ｂ）、インターロイキン１３（ＩＬ１３）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、インターロイキン１アルファ（ＩＬ１Ａ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）、インターロイキン２１（ＩＬ２１）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン６シグナル伝達物質（ＩＬ６ＳＴ）、インターロイキン７（ＩＬ７）、ガレクチン９（ＬＧＡＬＳ９）、マクロファージ遊走阻止因子（グリコシル化阻害因子）（ＭＩＦ）、水晶体線維の主要内在性タンパク質（ＭＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦＢ）、ホスファチジルイノシトールグリカン型アンカー生合成クラスＦ（ＰＩＧＦ）、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ受容体（ＰＬＡＵＲ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、セルピンファミリーＢメンバー２（ＳＥＲＰ���ＮＢ２）、セルピンファミリーＥメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＥ１）、オステオポンチン（ＳＰＰ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦＢ２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１０ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１１ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１３（ＴＮＦＳＦ１３）、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、Ｗｎｔファミリーメンバー１６（ＷＮＴ１６）、およびＷｎｔファミリーメンバー５Ａ（ＷＮＴ５Ａ）からなる群から選択される、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記免疫細胞は、マクロファージ、好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好酸球、好塩基球、リンパ球、および単球からなる群から選択される、請求項２０から２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
デリバリーに先立って任意の１つ以上の阻害因子のＳＡＳＰ分子の前記カクテルを欠乏させることをさらに含む、請求項２１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
デリバリーすることは、少なくとも１つの皮内注射を含む、請求項１４から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記少なくとも１つの皮内注射は、複数の繰り返しの皮内注射を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも１つの正常な細胞を少なくとも１つの発がん因子に曝露することを含む、老化細胞を生じさせる方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの正常な細胞を少なくとも１つの老化誘導因子に曝露することを含む、老化細胞を生じさせる方法であって、
前記老化誘導因子は、ＢＲＡＦＶ６００Ｅ、ＮＲＡＳＱ６１Ｒ、ＨＲＡＳＧ１２Ｖ、ｐ２１ＣＩＰ／ＷＡＦ、ｐ１６ＩＮＫ４Ａ、およびｐ１４ＡＲＦからなる群から選択される、方法。
【請求項２９】
ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子を含む、組成物。
【請求項３０】
ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子および少なくとも１つの免疫細胞を含む、組成物。
【請求項３１】
前記ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子は、ＳＡＳＰ分子のカクテルである、請求項２９または３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子は、アンジオゲニン（ＡＮＧ）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＣＬ１１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＣＬ１３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＣＬ１６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＣＬ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２０（ＣＣＬ２０）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２５（ＣＣＬ２５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２６（ＣＣＬ２６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＣＬ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド７（ＣＣＬ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＣＬ８）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、コロニー刺激因子３（ＣＳＦ３）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸＣＬ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＸＣＬ１１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＸＣＬ２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＸＣＬ３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＸＣＬ８）、ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ＷＮＴシグナル伝達経路インヒビター１（ＤＫＫ１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、エピレギュリン（ＥＲＥＧ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、インスリン様増殖因子結合タンパク質５（ＩＧＦＢＰ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質６（ＩＧＦＢＰ６）、インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）、インターロイキン１２Ｂ（ＩＬ１２Ｂ）、インターロイキン１３（ＩＬ１３）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、インターロイキン１アルファ（ＩＬ１Ａ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）、インターロイキン２１（ＩＬ２１）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン６シグナル伝達物質（ＩＬ６ＳＴ）、インターロイキン７（ＩＬ７）、ガレクチン９（ＬＧＡＬＳ９）、マクロファージ遊走阻止因子（グリコシル化阻害因子）（ＭＩＦ）、水晶体線維の主要内在性タンパク質（ＭＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦＢ）、ホスファチジルイノシトールグリカン型アンカー生合成クラスＦ（ＰＩＧＦ）、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ受容体（ＰＬＡＵＲ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、セルピンファミリーＢメンバー２（ＳＥＲＰ���ＮＢ２）、セルピンファミリーＥメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＥ１）、オステオポンチン（ＳＰＰ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦＢ２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１０ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１１ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１３（ＴＮＦＳＦ１３）、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、Ｗｎｔファミリーメンバー１６（ＷＮＴ１６）、およびＷｎｔファミリーメンバー５Ａ（ＷＮＴ５Ａ）からなる群から選択される、請求項２９から３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの免疫細胞は、マクロファージである、請求項３０から３２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３４】
デリバリーすることは、マイクロニードルデバイスまたはフラクショナルレーザー処置の適用に続く局所デリバリーを含む、請求項１４から２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
実質的にＳＡＳＰ由来の因子から構成される組成物をデリバリーすることを含む、方法。
【請求項３６】
前記ＳＡＳＰ由来の因子は、アンジオゲニン（ＡＮＧ）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＣＬ１１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＣＬ１３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＣＬ１６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＣＬ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２０（ＣＣＬ２０）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２５（ＣＣＬ２５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２６（ＣＣＬ２６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＣＬ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド７（ＣＣＬ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＣＬ８）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、コロニー刺激因子３（ＣＳＦ３）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸＣＬ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＸＣＬ１１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＸＣＬ２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＸＣＬ３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＸＣＬ８）、ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ＷＮＴシグナル伝達経路インヒビター１（ＤＫＫ１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、エピレギュリン（ＥＲＥＧ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、インスリン様増殖因子結合タンパク質５（ＩＧＦＢＰ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質６（ＩＧＦＢＰ６）、インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）、インターロイキン１２Ｂ（ＩＬ１２Ｂ）、インターロイキン１３（ＩＬ１３）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、インターロイキン１アルファ（ＩＬ１Ａ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）、インターロイキン２１（ＩＬ２１）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン６シグナル伝達物質（ＩＬ６ＳＴ）、インターロイキン７（ＩＬ７）、ガレクチン９（ＬＧＡＬＳ９）、マクロファージ遊走阻止因子（グリコシル化阻害因子）（ＭＩＦ）、水晶体線維の主要内在性タンパク質（ＭＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦＢ）、ホスファチジルイノシトールグリカン型アンカー生合成クラスＦ（ＰＩＧＦ）、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ受容体（ＰＬＡＵＲ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、セルピンファミリーＢメンバー２（ＳＥＲＰＩＮＢ２）、セル���ンファミリーＥメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＥ１）、オステオポンチン（ＳＰＰ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦＢ２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１０ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１１ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１３（ＴＮＦＳＦ１３）、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、Ｗｎｔファミリーメンバー１６（ＷＮＴ１６）、およびＷｎｔファミリーメンバー５Ａ（ＷＮＴ５Ａ）を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの老化細胞およびＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子を脱毛に罹患した領域にデリバリーすることを含む、方法。
【請求項３８】
前記少なくとも１つの老化細胞は、老化メラノサイト、老化線維芽細胞、老化ケラチノサイト、および老化脂肪細胞からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子は、アンジオゲニン（ＡＮＧ）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＣＬ１１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＣＬ１３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＣＬ１６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＣＬ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２０（ＣＣＬ２０）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２５（ＣＣＬ２５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２６（ＣＣＬ２６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＣＬ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド７（ＣＣＬ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＣＬ８）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、コロニー刺激因子３（ＣＳＦ３）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸＣＬ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＸＣＬ１１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＸＣＬ２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＸＣＬ３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＸＣＬ８）、ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ＷＮＴシグナル伝達経路インヒビター１（ＤＫＫ１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、エピレギュリン（ＥＲＥＧ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、インスリン様増殖因子結合タンパク質５（ＩＧＦＢＰ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質６（ＩＧＦＢＰ６）、インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）、インターロイキン１２Ｂ（ＩＬ１２Ｂ）、インターロイキン１３（ＩＬ１３）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、インターロイキン１アルファ（ＩＬ１Ａ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）、インターロイキン２１（ＩＬ２１）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン６シグナル伝達物質（ＩＬ６ＳＴ）、インターロイキン７（ＩＬ７）、ガレクチン９（ＬＧＡＬＳ９）、マクロファージ遊走阻止因子（グリコシル化阻害因子）（ＭＩＦ）、水晶体線維の主要内在性タンパク質（ＭＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦＢ）、ホスファチジルイノシトールグリカン型アンカー生合成クラスＦ（ＰＩＧＦ）、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ受容体（ＰＬＡＵＲ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、セルピンファミリーＢメンバー２（ＳＥＲＰ���ＮＢ２）、セルピンファミリーＥメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＥ１）、オステオポンチン（ＳＰＰ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦＢ２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１０ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１１ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１３（ＴＮＦＳＦ１３）、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、Ｗｎｔファミリーメンバー１６（ＷＮＴ１６）、およびＷｎｔファミリーメンバー５Ａ（ＷＮＴ５Ａ）からなる群から選択される、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子および少なくとも１つの免疫細胞由来の少なくとも１つの因子をデリバリーすることを含む、方法。
【請求項４１】
前記ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子は、アンジオゲニン（ＡＮＧ）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＣＬ１１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＣＬ１３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＣＬ１６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＣＬ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２０（ＣＣＬ２０）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２５（ＣＣＬ２５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２６（ＣＣＬ２６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＣＬ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド７（ＣＣＬ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＣＬ８）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、コロニー刺激因子３（ＣＳＦ３）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸＣＬ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＸＣＬ１１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＸＣＬ２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＸＣＬ３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＸＣＬ８）、ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ＷＮＴシグナル伝達経路インヒビター１（ＤＫＫ１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、エピレギュリン（ＥＲＥＧ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、インスリン様増殖因子結合タンパク質５（ＩＧＦＢＰ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質６（ＩＧＦＢＰ６）、インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）、インターロイキン１２Ｂ（ＩＬ１２Ｂ）、インターロイキン１３（ＩＬ１３）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、インターロイキン１アルファ（ＩＬ１Ａ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）、インターロイキン２１（ＩＬ２１）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン６シグナル伝達物質（ＩＬ６ＳＴ）、インターロイキン７（ＩＬ７）、ガレクチン９（ＬＧＡＬＳ９）、マクロファージ遊走阻止因子（グリコシル化阻害因子）（ＭＩＦ）、水晶体線維の主要内在性タンパク質（ＭＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦＢ）、ホスファチジルイノシトールグリカン型アンカー生合成クラスＦ（ＰＩＧＦ）、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ受容体（ＰＬＡＵＲ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、セルピンファミリーＢメンバー２（ＳＥＲＰ���ＮＢ２）、セルピンファミリーＥメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＥ１）、オステオポンチン（ＳＰＰ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦＢ２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１０ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１１ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１３（ＴＮＦＳＦ１３）、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、Ｗｎｔファミリーメンバー１６（ＷＮＴ１６）、およびＷｎｔファミリーメンバー５Ａ（ＷＮＴ５Ａ）からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記免疫細胞は、マクロファージ、好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好酸球、好塩基球、リンパ球、および単球からなる群から選択される、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４３】
複製老化を実現するために細胞を繰り返し継代することを含む、老化細胞を生じさせる方法。
【請求項４４】
少なくとも１種類の免疫細胞とともに培養された老化細胞由来の少なくとも１つの因子を含む、組成物。
【請求項４５】
前記老化細胞由来の少なくとも１つの因子は、アンジオゲニン（ＡＮＧ）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＣＬ１１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＣＬ１３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＣＬ１６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＣＬ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２０（ＣＣＬ２０）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２５（ＣＣＬ２５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２６（ＣＣＬ２６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＣＬ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド７（ＣＣＬ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＣＬ８）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、コロニー刺激因子３（ＣＳＦ３）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸＣＬ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＸＣＬ１１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＸＣＬ２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＸＣＬ３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＸＣＬ８）、ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ＷＮＴシグナル伝達経路インヒビター１（ＤＫＫ１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、エピレギュリン（ＥＲＥＧ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、インスリン様増殖因子結合タンパク質５（ＩＧＦＢＰ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質６（ＩＧＦＢＰ６）、インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）、インターロイキン１２Ｂ（ＩＬ１２Ｂ）、インターロイキン１３（ＩＬ１３）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、インターロイキン１アルファ（ＩＬ１Ａ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）、インターロイキン２１（ＩＬ２１）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン６シグナル伝達物質（ＩＬ６ＳＴ）、インターロイキン７（ＩＬ７）、ガレクチン９（ＬＧＡＬＳ９）、マクロファージ遊走阻止因子（グリコシル化阻害因子）（ＭＩＦ）、水晶体線維の主要内在性タンパク質（ＭＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦＢ）、ホスファチジルイノシトールグリカン型アンカー生合成クラスＦ（ＰＩＧＦ）、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ受容体（ＰＬＡＵＲ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、セルピンファミリーＢメンバー２（ＳＥＲＰ���ＮＢ２）、セルピンファミリーＥメンバー１（ＳＥＲＰＩＮＥ１）、オステオポンチン（ＳＰＰ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦＢ２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１０ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１１ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１３（ＴＮＦＳＦ１３）、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、Ｗｎｔファミリーメンバー１６（ＷＮＴ１６）、およびＷｎｔファミリーメンバー５Ａ（ＷＮＴ５Ａ）からなる群から選択される、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
老化細胞が、老化メラノサイト、老化線維芽細胞、老化ケラチノサイト、および老化脂肪細胞からなるからなる群から選択される、請求項４３または４４に記載の組成物。
【請求項４７】
前記少なくとも１種類の免疫細胞は、マクロファージ、好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好酸球、好塩基球、リンパ球、および単球からなる群から選択される、請求項４３から４５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項４８】
請求項４３から４６のいずれか１項に記載の組成物を使用することを含む方法であって、前記組成物を脱毛に罹患した領域にデリバリーすることを含む、方法。
【請求項４９】
ＳＡＳＰ由来のすべての因子を含む、組成物。
【請求項５０】
アンジオゲニン（ＡＮＧ）、アンフィレギュリン（ＡＲＥＧ）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＣＬ１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＣＬ１１）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＣＬ１３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド１６（ＣＣＬ１６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＣＬ２）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２０（ＣＣＬ２０）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２５（ＣＣＬ２５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２６（ＣＣＬ２６）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＣＬ３）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド７（ＣＣＬ７）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＣＬ８）、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２）、コロニー刺激因子３（ＣＳＦ３）、カテプシンＢ（ＣＴＳＢ）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（ＣＸＣＬ１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１１（ＣＸＣＬ１１）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１３（ＣＸＣＬ１３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド２（ＣＸＣＬ２）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（ＣＸＣＬ３）、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド８（ＣＸＣＬ８）、ｄｉｃｋｋｏｐｆ  ＷＮＴシグナル伝達経路インヒビター１（ＤＫＫ１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、エピレギュリン（ＥＲＥＧ）、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）、線維芽細胞増殖因子７（ＦＧＦ７）、フィブロネクチン１（ＦＮ１）、ヘパリン結合ＥＧＦ様増殖因子（ＨＢＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）、細胞間接着分子３（ＩＣＡＭ３）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮＧ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ１）、インスリン様増殖因子結合タンパク質２（ＩＧＦＢＰ２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質３（ＩＧＦＢＰ３）、インスリン様増殖因子結合タンパク質４（ＩＧＦＢＰ４）、インスリン様増殖因子結合タンパク質５（ＩＧＦＢＰ５）、インスリン様増殖因子結合タンパク質６（ＩＧＦＢＰ６）、インスリン様増殖因子結合タンパク質７（ＩＧＦＢＰ７）、インターロイキン１２Ｂ（ＩＬ１２Ｂ）、インターロイキン１３（ＩＬ１３）、インターロイキン１５（ＩＬ１５）、インターロイキン１アルファ（ＩＬ１Ａ）、インターロイキン１ベータ（ＩＬ１Ｂ）、インターロイキン２１（ＩＬ２１）、インターロイキン４（ＩＬ４）、インターロイキン６（ＩＬ６）、インターロイキン６シグナル伝達物質（ＩＬ６ＳＴ）、インターロイキン７（ＩＬ７）、ガレクチン９（ＬＧＡＬＳ９）、マクロファージ遊走阻止因子（グリコシル化阻害因子）（ＭＩＦ）、水晶体線維の主要内在性タンパク質（ＭＩＰ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子サブユニットＢ（ＰＤＧＦＢ）、ホスファチジルイノシトールグリカン型アンカー生合成クラスＦ（ＰＩＧＦ）、プラスミノーゲン活性化因子、ウロキナーゼ受容体（ＰＬＡＵＲ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、セルピンファミリーＢメンバー２（ＳＥＲＰＩＮＢ２）、セルピンファミリーＥメンバー１���ＳＥＲＰＩＮＥ１）、オステオポンチン（ＳＰＰ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ１（ＴＧＦＢ１）、トランスフォーミング増殖因子ベータ２（ＴＧＦＢ２）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１０ｃ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｃ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１１ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ａ（ＴＮＦＲＳＦ１Ａ）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１Ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１３（ＴＮＦＳＦ１３）、胸腺間質性リンパ球新生因子（ＴＳＬＰ）、Ｗｎｔファミリーメンバー１６（ＷＮＴ１６）、およびＷｎｔファミリーメンバー５Ａ（ＷＮＴ５Ａ）を含む、組成物。
【請求項５１】
少なくとも１つの免疫細胞を少なくとも１つの老化細胞とともに培養することから得られる因子のカクテルをデリバリーすることを含む、方法。
【請求項５２】
前記少なくとも１つの免疫細胞は、マクロファージ、好中球、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好酸球、好塩基球、リンパ球、および単球からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記少なくとも１つの老化細胞は、老化メラノサイト、老化線維芽細胞、老化ケラチノサイト、および老化脂肪細胞からなる群から選択される、請求項１、５０および５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子は、Ａｎｇｐｔｌ４、Ａｘｌ、Ｂｍｐ４、Ｃ１ｑｔｎｆ２、Ｃ１ｑｔｎｆ５、Ｃ１ｑｔｎｆ７、Ｃｃｌ１７、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ６、Ｃｃｌ９、Ｃｔｓｂ、Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｌ９、Ｄｈｈ、Ｄｋｋ３、Ｆｇｆ７、Ｆｒｚｂ、Ｆｓｔｌ１、Ｇｄｆ１０、Ｉｇｆｂｐ２、Ｉｇｆｂｐ４、Ｉｇｆｂｐ７、Ｉｌ１０、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｆ９、Ｉｎｈｂａ、Ｉｎｓｌ６、Ｍｉｆ、Ｍｍｐ１１、Ｍｍｐ１２、Ｍｍｐ１４、Ｍｍｐ２、Ｍｍｐ２３、Ｍｍｐ３、Ｎｒｇ２、Ｏｇｎ、Ｏｍｄ、Ｐｄｇｆａ、Ｐｌａｔ、Ｐｏｓｔｎ、Ｒｅｔｎｌａ、Ｓｃｔ、Ｓｐａｒｃ、Ｓｐｐ１、Ｔｉｍｐ１、Ｔｎｆ、Ｔｎｆａｉｐ６、Ｗｉｆ１、およびＷｉｓｐ１からなる群から選択される、請求項１、１９から２１、３７、３８、および４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子は、ＡＮＧＰＴＬ７、ＢＡＭＢＩ、ＣＣＬ１８、ＤＫＫＬ１、ＦＧＦＢＰ２、ＦＲＺＢ、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＩＬ１７Ｄ、ＭＭＰ１７、ＰＤＧＦＤ、ＳＰＰ１、ＴＮＦＳＦ１２、Ｃ１ＱＴＮＦ５、ＮＲＧ３、ＰＬＡＴ、およびＴＩＭＰ２からなる群から選択されるヒト母斑皮膚に固有の因子である、請求項１、１９から２１、３７、３８、または４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＳＡＳＰ由来の因子は、Ａｎｇｐｔｌ４、Ａｘｌ、Ｂｍｐ４、Ｃ１ｑｔｎｆ２、Ｃ１ｑｔｎｆ５、Ｃ１ｑｔｎｆ７、Ｃｃｌ１７、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ６、Ｃｃｌ９、Ｃｔｓｂ、Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｌ９、Ｄｈｈ、Ｄｋｋ３、Ｆｇｆ７、Ｆｒｚｂ、Ｆｓｔｌ１、Ｇｄｆ１０、Ｉｇｆｂｐ２、Ｉｇｆｂｐ４、Ｉｇｆｂｐ７、Ｉｌ１０、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｆ９、Ｉｎｈｂａ、Ｉｎｓｌ６、Ｍｉｆ、Ｍｍｐ１１、Ｍｍｐ１２、Ｍｍｐ１４、Ｍｍｐ２、Ｍｍｐ２３、Ｍｍｐ３、Ｎｒｇ２、Ｏｇｎ、Ｏｍｄ、Ｐｄｇｆａ、Ｐｌａｔ、Ｐｏｓｔｎ、Ｒｅｔｎｌａ、Ｓｃｔ、Ｓｐａｒｃ、Ｓｐｐ１、Ｔｉｍｐ１、Ｔｎｆ、Ｔｎｆａｉｐ６、Ｗｉｆ１、およびＷｉｓｐ１からなる群から選択される因子を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ＳＡＳＰ由来の因子は、ＡＮＧＰＴＬ７、ＢＡＭＢＩ、ＣＣＬ１８、ＤＫＫＬ１、ＦＧＦＢＰ２、ＦＲＺＢ、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＩＬ１７Ｄ、ＭＭＰ１７、ＰＤＧＦＤ、ＳＰＰ１、ＴＮＦＳＦ１２、Ｃ１ＱＴＮＦ５、ＮＲＧ３、ＰＬＡＴ、およびＴＩＭＰ２からなる群から選択されるヒト母斑皮膚に固有の因子を含む、請求項３５に記載の組成物。
【請求項５８】
前記ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子は、Ａｎｇｐｔｌ４、Ａｘｌ、Ｂｍｐ４、Ｃ１ｑｔｎｆ２、Ｃ１ｑｔｎｆ５、Ｃ１ｑｔｎｆ７、Ｃｃｌ１７、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ６、Ｃｃｌ９、Ｃｔｓｂ、Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｌ９、Ｄｈｈ、Ｄｋｋ３、Ｆｇｆ７、Ｆｒｚｂ、Ｆｓｔｌ１、Ｇｄｆ１０、Ｉｇｆｂｐ２、Ｉｇｆｂｐ４、Ｉｇｆｂｐ７、Ｉｌ１０、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｆ９、Ｉｎｈｂａ、Ｉｎｓｌ６、Ｍｉｆ、Ｍｍｐ１１、Ｍｍｐ１２、Ｍｍｐ１４、Ｍｍｐ２、Ｍｍｐ２３、Ｍｍｐ３、Ｎｒｇ２、Ｏｇｎ、Ｏｍｄ、Ｐｄｇｆａ、Ｐｌａｔ、Ｐｏｓｔｎ、Ｒｅｔｎｌａ、Ｓｃｔ、Ｓｐａｒｃ、Ｓｐｐ１、Ｔｉｍｐ１、Ｔｎｆ、Ｔｎｆａｉｐ６、Ｗｉｆ１、およびＷｉｓｐ１からなる群から選択される、請求項２９から３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子は、ＡＮＧＰＴＬ７、ＢＡＭＢＩ、ＣＣＬ１８、ＤＫＫＬ１、ＦＧＦＢＰ２、ＦＲＺＢ、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＩＬ１７Ｄ、ＭＭＰ１７、ＰＤＧＦＤ、ＳＰＰ１、ＴＮＦＳＦ１２、Ｃ１ＱＴＮＦ５、ＮＲＧ３、ＰＬＡＴ、およびＴＩＭＰ２からなる群から選択されるヒト母斑皮膚に固有の因子である、請求項２９から３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６０】
前記老化細胞由来の少なくとも１つの因子は、Ａｎｇｐｔｌ４、Ａｘｌ、Ｂｍｐ４、Ｃ１ｑｔｎｆ２、Ｃ１ｑｔｎｆ５、Ｃ１ｑｔｎｆ７、Ｃｃｌ１７、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ６、Ｃｃｌ９、Ｃｔｓｂ、Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｌ９、Ｄｈｈ、Ｄｋｋ３、Ｆｇｆ７、Ｆｒｚｂ、Ｆｓｔｌ１、Ｇｄｆ１０、Ｉｇｆｂｐ２、Ｉｇｆｂｐ４、Ｉｇｆｂｐ７、Ｉｌ１０、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｆ９、Ｉｎｈｂａ、Ｉｎｓｌ６、Ｍｉｆ、Ｍｍｐ１１、Ｍｍｐ１２、Ｍｍｐ１４、Ｍｍｐ２、Ｍｍｐ２３、Ｍｍｐ３、Ｎｒｇ２、Ｏｇｎ、Ｏｍｄ、Ｐｄｇｆａ、Ｐｌａｔ、Ｐｏｓｔｎ、Ｒｅｔｎｌａ、Ｓｃｔ、Ｓｐａｒｃ、Ｓｐｐ１、Ｔｉｍｐ１、Ｔｎｆ、Ｔｎｆａｉｐ６、Ｗｉｆ１、およびＷｉｓｐ１からなる群から選択される、請求項４４に記載の組成物。
【請求項６１】
前記老化細胞由来の少なくとも１つの因子は、ＡＮＧＰＴＬ７、ＢＡＭＢＩ、ＣＣＬ１８、ＤＫＫＬ１、ＦＧＦＢＰ２、ＦＲＺＢ、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＩＬ１７Ｄ、ＭＭＰ１７、ＰＤＧＦＤ、ＳＰＰ１、ＴＮＦＳＦ１２、Ｃ１ＱＴＮＦ５、ＮＲＧ３、ＰＬＡＴ、およびＴＩＭＰ２からなる群から選択されるヒト母斑皮膚に固有の因子である、請求項４４に記載の組成物。
【請求項６２】
以下のＳＡＳＰ因子を含む組成物：Ａｎｇｐｔｌ４、Ａｘｌ、Ｂｍｐ４、Ｃ１ｑｔｎｆ２、Ｃ１ｑｔｎｆ５、Ｃ１ｑｔｎｆ７、Ｃｃｌ１７、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ６、Ｃｃｌ９、Ｃｔｓｂ、Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｌ９、Ｄｈｈ、Ｄｋｋ３、Ｆｇｆ７、Ｆｒｚｂ、Ｆｓｔｌ１、Ｇｄｆ１０、Ｉｇｆｂｐ２、Ｉｇｆｂｐ４、Ｉｇｆｂｐ７、Ｉｌ１０、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｆ９、Ｉｎｈｂａ、Ｉｎｓｌ６、Ｍｉｆ、Ｍｍｐ１１、Ｍｍｐ１２、Ｍｍｐ１４、Ｍｍｐ２、Ｍｍｐ２３、Ｍｍｐ３、Ｎｒｇ２、Ｏｇｎ、Ｏｍｄ、Ｐｄｇｆａ、Ｐｌａｔ、Ｐｏｓｔｎ、Ｒｅｔｎｌａ、Ｓｃｔ、Ｓｐａｒｃ、Ｓｐｐ１、Ｔｉｍｐ１、Ｔｎｆ、Ｔｎｆａｉｐ６、Ｗｉｆ１、およびＷｉｓｐ１。
【請求項６３】
以下のヒト母斑皮膚のＳＡＳＰ因子を含む組成物：ＡＮＧＰＴＬ７、ＢＡＭＢＩ、ＣＣＬ１８、ＤＫＫＬ１、ＦＧＦＢＰ２、ＦＲＺＢ、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＩＬ１７Ｄ、ＭＭＰ１７、ＰＤＧＦＤ、ＳＰＰ１、ＴＮＦＳＦ１２、Ｃ１ＱＴＮＦ５、ＮＲＧ３、ＰＬＡＴ、およびＴＩＭＰ２。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年３月２３日に出願された米国特許仮出願第６２／４７５，６８８号の利益を主張するものである。上記の出願の内容は、参照によってその全体が本明細書に明確に組み込まれたものとする。
【０００２】
分野
（ｉ）脱毛を処置する方法、（ｉｉ）老化細胞を得て、それを発毛刺激のために皮膚にデリバリーするための方法、ならびに（ｉｉｉ）老化細胞関連分泌形質(senescent cell associated secretory phenotype)（ＳＡＳＰ）分子およびその組み合わせを生成し、発毛刺激のためにそれを皮膚にデリバリーするための方法の実施形態が本明細書に記載されている。
【背景技術】
【０００３】
背景
脱毛（脱毛症）は、（ｉ）毛髪再生周期の増殖期（ｇｒｏｗｔｈ  ｐｈａｓｅ）（成長期（ａｎａｇｅｎ  ｐｈａｓｅ）とも呼ばれる）の短縮の結果、段々に短い毛髪が産生される、（ｉｉ）周期の静止期（ｒｅｓｔ  ｐｈａｓｅ）（休止期（ｔｅｌｏｇｅｎ  ｐｈａｓｅ）とも呼ばれる）の延長の結果、毛包が新しい毛髪を産生することを止めるか、または（ｉｉｉ）上記２つのメカニズムの組み合わせに起因する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在の利用可能な脱毛に対する処置には、増殖期の継続時間を延長するためのアプローチが含まれる。当該技術分野では、静止期を短縮することを含む脱毛処置および効果的に休止状態の毛包を休止期から成長期へ移行させる処置が不足している。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
いくつかの実施形態において、脱毛に罹患した領域において対象における発毛を向上させるまたは誘導するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、本方法は、少なくとも１つの細胞老化関連分泌形質（ＳＡＳＰ）因子、または前記少なくとも１つのＳＡＳＰ因子を分泌する少なくとも１つの老化細胞もしくは細胞種を脱毛に罹患した領域において対象にデリバリーすることを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの老化細胞または細胞種は、非複製的であるか、または非複製的形質を呈する少なくとも１つの細胞種を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの老化細胞もしくは細胞種または少なくとも１つのＳＡＳＰ因子のデリバリーは、脱毛に罹患した領域において毛包の成長期の延長および休止期の短縮のうちの１つ以上を誘導する。いくつかの実施形態において、毛包の成長期の延長および／または休止期の短縮は、脱毛に罹患した領域において対象における発毛を向上させるまたは誘導する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの老化細胞は、メラノサイトである。いくつかの実施形態において、メラノサイトは、母斑皮膚由来のものである。いくつかの実施形態において、母斑は、有毛母斑である。いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ因子は、オステオポンチンポリペプチドである。いくつかの実施形態において、オステオポンチンポリペプチドは、骨髄細胞を脱毛に罹患した領域に動員する。いくつかの実施形態において、骨髄細胞は、さらなるオステオポンチンポリペプチドまたは他のＳＡＳＰ因子を分泌して、脱毛に罹患した領域において対象における発毛をさらに向上させるまたは誘導する。いくつかの実施形態において、デリバリーすることは、少なくとも１つの老化細胞または細胞種の局所デリバリーを含む。いくつかの実施形態において、局所デリバリーは、マイクロニードルデバイスの適用に続いて行われる。いくつかの実施形態において、局所デリバリーは、フラクショナルレーザー処置の適用に続いて行われる。いくつかの実施形態において、デリバリーすることは、少なくとも１つのＳＡＳＰ因子の局所デリバリーを含む。
【０００７】
いくつかの実施形態において、局所デリバリーは、マイクロニードルデバイスの適用に続いて行われる。いくつかの実施形態において、局所デリバリーは、フラクショナルレーザー処置の適用に続いて行われる。
【０００８】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種類の老化細胞または細胞種を皮膚の脱毛に罹患した領域にデリバリーすることを含む方法が提供される。
【０００９】
いくつかの実施形態において、老化細胞によって分泌される少なくとも１つの因子、すなわち、老化細胞関連分泌形質（ＳＡＳＰ）分子を皮膚の脱毛に罹患した領域に注射することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、少なくとも１種類の正常な細胞を少なくとも１つの発がん因子に曝露して、その老化を誘導することを含む方法が提供される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの正常な細胞を少なくとも１種類の老化誘導因子に曝露することを含む方法が提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態において、少なくとも部分的に、実質的に、または完全にＳＡＳＰ由来の因子から構成される組成物をデリバリーすることを含む方法が提供される。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子および少なくとも１つの老化細胞または細胞種を脱毛に罹患した領域にデリバリーすることを含む方法が提供される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子および免疫細胞由来の少なくとも１つの因子を脱毛に罹患した領域にデリバリーすることを含む方法が提供される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの老化細胞を少なくとも１つの免疫細胞または細胞種と共培養することによって産生される因子のカクテルをデリバリーすることを含む方法が提供される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子を含む組成物が提供される。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ因子としては、Ａｎｇｐｔｌ４、Ａｘｌ、Ｂｍｐ４、Ｃ１ｑｔｎｆ２、Ｃ１ｑｔｎｆ５、Ｃ１ｑｔｎｆ７、Ｃｃｌ１７、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ６、Ｃｃｌ９、Ｃｔｓｂ、Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｌ９、Ｄｈｈ、Ｄｋｋ３、Ｆｇｆ７、Ｆｒｚｂ、Ｆｓｔｌ１、Ｇｄｆ１０、Ｉｇｆｂｐ２、Ｉｇｆｂｐ４、Ｉｇｆｂｐ７、Ｉｌ１０、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｆ９、Ｉｎｈｂａ、Ｉｎｓｌ６、Ｍｉｆ、Ｍｍｐ１１、Ｍｍｐ１２、Ｍｍｐ１４、Ｍｍｐ２、Ｍｍｐ２３、Ｍｍｐ３、Ｎｒｇ２、Ｏｇｎ、Ｏｍｄ、Ｐｄｇｆａ、Ｐｌａｔ、Ｐｏｓｔｎ、Ｒｅｔｎｌａ、Ｓｃｔ、Ｓｐａｒｃ、Ｓｐｐ１、Ｔｉｍｐ１、Ｔｎｆ、Ｔｎｆａｉｐ６、Ｗｉｆ１、およびＷｉｓｐ１が挙げられる。いくつかの実施形態において、ヒト母斑皮膚に固有のＳＡＳＰ因子：ＡＮＧＰＴＬ７、ＢＡＭＢＩ、ＣＣＬ１８、ＤＫＫＬ１、ＦＧＦＢＰ２、ＦＲＺＢ、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＩＬ１７Ｄ、ＭＭＰ１７、ＰＤＧＦＤ、ＳＰＰ１、ＴＮＦＳＦ１２、Ｃ１ＱＴＮＦ５、ＮＲＧ３、ＰＬＡＴ、およびＴＩＭＰ２。
【００１７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種類の免疫細胞または細胞種とともに培養された老化細胞由来の少なくとも１つの因子を含む組成物が提供される。
【００１８】
いくつかの実施形態において、一部またはすべてのＳＡＳＰ由来の因子を含む組成物が提供される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、表１．１に列挙されているすべての因子を含む組成物が提供される。
【００２０】
上で概要が示され、下でさらに詳細に記載される組成物および関連する方法は、専門家が行う特定の行為を記載するが、当然のことながら、それらは、別の関係者によるそうした行為の指示も含む場合がある。したがって、「少なくとも１つの老化細胞種を移植すること」などの行為は、「少なくとも１つの老化細胞種の移植を教示すること」を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、がん遺伝子により誘導される細胞老化の段階を示す。
【図２】図２は、有毛母斑の動物モデルであるＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスの皮膚の毛包の周りの多くのＴｒｐ２陽性老化メラノサイトを示す画像を含む（右パネル）。正常な皮膚（左パネル）では、Ｔｒｐ２陽性正常メラノサイトは毛包内にのみ存在する（矢印）。
【図３】図３Ａの上パネルは、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスの皮膚におけるいわゆる毛包バルジ幹細胞の合計パーセンテージが著しくは改変されないことを示す。図３Ｂの下パネルは、静止状態のバルジ幹細胞のパーセンテージが対照マウスと比較してはるかに低い（０．０５％対１４．２％）ことを示しており、これは、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスの母斑皮膚の内部における毛包幹細胞の過剰活性化を示す。図３Ｂは、一部の実施形態によると、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスの皮膚が対照マウスからの皮膚（５．７７％）と比較して、免疫細胞の数（２０．７％）が著しく増加したことを示している。
【図４】図４Ａ〜４Ｂは、幼い小児の先天性の色素性母斑を示す。図４Ｃ〜４Ｄは、向上した再発毛を示すために生後５０日目の剃毛後、および後の生後６２日目の実験マウスおよび対照マウスの画像を含む。図４Ｅ〜Ｆは、生後５６日目の実験マウスおよび対照マウスの組織学的データおよび画像を示す。図４Ｆにおける白くなった皮膚のＬａｃＺ画像中の複数の箇所は、ＷＮＴシグナル伝達および発毛を示す。図４Ｇは、生後のサンプル採取実施およびデータ収集のタイミングのタイムライン概要を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｅは、がん遺伝子により誘導された発毛を示す画像および実験を含む。図５Ｂ〜２Ｃは、実験の描写および得られたデータを含み、ここでは、ＦＡＣＳによって分離された細胞を野生型マウスに注射した。図５Ｃは、注射した老化メラノサイト細胞に反応した発毛を示す。図５Ｄ〜５Ｅは、対照マウスおよび実験マウスにおける発毛または発毛の欠如を示す画像を含む。
【図６】図６Ａ〜６Ｇは、遺伝子発現の生物情報学的解析により生成されたデータおよび情報を示す。図６Ａのプロットは、主成分分析（ＰＣＡ）の結果を示し、これは、遺伝子発現が野生型マウスと実験マウスの間で幹細胞を変化させることを示す。図６Ｂは、野生型マウスと実験マウスの間の差次的に発現した遺伝子のヒートマップを含む。図６Ｂはまた、生後３０日目および５６日目の野生型マウスと比較した実験マウスの有毛母斑幹細胞においてアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子のベン図も含む。図６Ｃは、実験細胞および対照細胞に関するシングルセルＲＮＡ−ｓｅｑデータを示す図６Ｄからのヒートマップデータの遺伝子オントロジー解析を示す。図６Ｅは、シングルセルシーケンシング解析からのバイオリンプロットを示す。図６Ｆは、選択遺伝子に関するＲＮＡシーケンシングデータを確認するｑＲＴ−ＰＣＲデータのプロットを含む。図６Ｇは、野生型と比較して実験マウスにおいてダウンレギュレート（左の長方形）、またはアップレギュレート（右の長方形）されたシグナル伝達・転写関連遺伝子の表である。図６Ｈおよび６Ｈ’は、毛包幹細胞におけるパルスチェイス実験からのデータおよび組織構造画像を示す。図６Ｉは、培養されたＧＦＰ標識バルジ幹細胞および毛芽（ＨＧ）細胞の画像を含む。図６Ｉ’は、付着細胞の平均数またはＧＦＰ標識バルジ幹細胞およびＨＧ細胞の静止状態までの継代数のグラフによる描写を含む。
【図７】図７Ａ〜７Ｎは、メラノサイトの画像および解析のグラフィカルデータを含む。図７Ａ〜７Ｄ、７Ｇおよび７Ｈは、バルクＲＮＡシーケンシングの解析を含む。図７Ｄは、母斑を有するマウスの皮膚から抽出された突然変異体メラノサイトにおいて増加したシグナル伝達因子（上部円）、および培養細胞において特定されたＳＡＳＰ因子（左および右円）を含むベン図を含む。図７Ｅおよび７Ｆは、シングルセルＲＮＡシーケンシングからのデータのプロットを含む。図７Ｉは、皮膚細胞において測定された分泌および表面結合オステオポンチン（Ｓｐｐ１）タンパク質のプロットを示す。図７Ｊは、マウス母斑皮膚におけるオステオポンチンの複数のアイソフォームのウエスタンブロットデータを示す。図７Ｋは、Ｓｐｐ１に関する遺伝子レポーターアッセイの画像を含む。図７Ｌは、データを収集した時点のデータおよび３色のタイムラインを示す。このデータは、Ｓｐｐ１が母斑発毛に関与する唯一の分子ではないことを示す。図７Ｍは、対照マウスおよび実験マウスにおける創傷に誘導された発毛の写真およびグラフィカルデータを示す。図７Ｎは、Ｓｐｐ１注射またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）対照後の発毛の写真およびグラフィカルデータを示す。
【図８】図８Ａ〜８Ｄは、骨髄細胞のＲＮＡシーケンシングデータを含む。図８Ａは、ＰＣＡプロットである。図８Ｂは、ヒートマップである。図８Ｃは、遺伝子オントロジー解析を示す。図８Ｄは、ＲＮＡシーケンシング解析によって特定された突然変異体骨髄細胞において差次的に発現した遺伝子のベン図および概要を含む。ベン図は、培養細胞において特定されたＳＡＳＰ因子（左円）、ならびにメラノサイト（下の円）および骨髄細胞（右円）のＳＡＳＰ因子を含む。図８Ｅは、図８Ａ〜８Ｄに示したＲＮＡシーケンシング解析に関する遺伝子発現データを確認するｑＲＴ−ＰＣＲデータのプロットを含む。図８Ｆおよび８Ｇは、骨髄細胞のシングルセル遺伝子発現解析を含む。図８Ｈおよび８Ｉは、野生型マウスおよび実験マウスの皮膚にある骨髄細胞の画像を含む。図８Ｈ’および８Ｉ’は、野生型マウスおよび実験マウス皮膚にある骨髄細胞の数の簡潔な定量情報を含むプロットである。図８Ｊは、ＢＳＡまたはＳｐｐ１を注射したマウス皮膚の画像を含み、Ｓｐｐ１に応じた免疫細胞の到来を示す。図８Ｋおよび８Ｋ’は、母斑皮膚の発毛の維持における骨髄細胞の関与を確認する画像およびグラフィカルデータを含む。
【図９】図９Ａは、さまざまな細胞種におけるｃｄ４４発現のプロットを示す。図９Ｂは、細胞種ごとに並べたｃｄ４４のアイソフォームを示す。図９Ｃは、ｃｄ４４に関する遺伝子レポーターアッセイの画像を含む。図９Ｄおよび９Ｄ’は、オステオポンチンを含むビーズを注射した皮膚を示す画像およびグラフィカルデータを含む。図９Ｅおよび９Ｅ’は、創傷に誘導された発毛を示す画像およびグラフィカルデータを含む。これらの図のデータは、オステオポンチンがｃｄ４４に作用して、その結果をもたらすことを示す。図９Ｆおよび９Ｆ’は、休止期および成長期における生後５２日目の実験マウスの画像を含む。図９Ｇは、実験マウスのデータを収集した時点の概要を含む。図９Ｇ’は、図９Ｇに示した時点の実験マウスにおける異所性（ｅｃｔｏｐｉｃ）成長期ＨＦを定量するプロットを含む。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｉおよび１０Ｇ’〜１０Ｉ’は、顔面有毛母斑を有する３人のヒト対象からのデータの描写を含む。各患者の有毛母斑皮膚、ならびに各患者からの対照非母斑皮膚に関するＲＮＡシーケンシングデータを得た。図１０Ａは、ＲＮＡシーケンシングデータのＰＣＡ分析である。図１０Ｂは、ＲＮＡシーケンシングデータのヒートマップである。図１０Ｃは、ＲＮＡシーケンシングデータの遺伝子オントロジー解析である。図１０Ｄは、ヒト対照皮膚と比較してヒト母斑皮膚でアップレギュレートまたはダウンレギュレートされた遺伝子を示す。図１０Ｅは、対照皮膚と比較してヒト母斑皮膚においてアップレギュレートされた分子の概要、ならびにヒト母斑皮膚においてアップレギュレートされた遺伝子（左上の円）、実験マウスにおいてアップレギュレートされた遺伝子（下の円）、および培養細胞における遺伝子（右上の円）の間の重なる部分を示すベン図を含む。図１０Ｆは、ｑＲＴ−ＰＣＲによって示されるヒト母斑における遺伝子の発現を示すグラフによる描写を含む。図１０Ｇ〜１０Ｉおよび１０Ｇ’〜１０Ｉ’は、ヒト母斑および対照皮膚の組織構造画像を含む。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｆは、生後１５、２３、４４、６２、６９および１００日目における実験マウスおよび対照マウスの組織学的データおよび画像を示し、それぞれの時点において、実験マウスが発毛していることを示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｂは、アルビノバックグラウンドと交配した後またはそうでないものの生後５６日目および１００日目の対照マウスおよび実験Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスの組織学的データおよび画像を示す。これらのデータは、メラニンが必ずしもＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスに見られる発毛の原因ではないことを示す。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂは、Ｔｙｒ−ＣｒｅＥＲＴ２；ｔｄＴｏｍａｔｏマウスの皮膚から細胞選別によって単離された蛍光老化メラノサイト（図１３Ａのパネル）が免疫不全ＳＣＩＤマウスの皮膚に注射されると、異所性発毛が誘導され得ることを示す（図１３Ａの図、および図１３Ｂのパネルを参照）。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｂは、対照マウスおよび実験マウスにおける発毛または発毛の欠如の画像を含む。
【図１５】図１５は、シングルセルシーケンシングデータにおける細胞周期の状態の解析を示す。
【図１６】図１６は、シングルセルシーケンシング解析からのバイオリンプロットを示す。
【図１７】図１７は、シングルセルシーケンシング解析からのバイオリンプロットを示す。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｄは、ＨＧ細胞のＲＮＡシーケンシング解析を示す。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｅは、ＤＰ線維芽細胞のＲＮＡシーケンシングデータのＲＮＡシーケンシング解析およびｑＲＴ−ＰＣＲ検証を示す。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｄは、ｃｄ４５造血細胞のＲＮＡシーケンシング解析を示す。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｃおよび２１Ｂ’〜２１Ｃ’は、ＲＮＡシーケンシング解析の詳細な解析のグラフィカルデータを含む。
【図２２】図２２は、休止期（停止期）および成長期（増殖期）にある毛包の絵である。図は、バルジ、ＨＧ細胞およびＤＰ細胞が毛包内に互いに関連してどこに存在するかを示す。図は、母斑皮膚における各細胞種のシグナル伝達変化の概要を示す。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｂは、Ｓｐｐ１に関する遺伝子レポーターアッセイの画像を含む。Ｓｐｐ１の発現は、２つの時点で示されている（全組織および詳細な切片）。これらのデータは、Ｓｐｐ１が野生型よりも突然変異体マウスにおいてより産生されることを示す。
【図２４】図２４Ａ〜２４Ｆは、生後のさまざまな時点における実験マウスおよび対照マウス皮膚の画像を含む。
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｂは、発毛におけるｃｄ４４の役割を示す画像を含む。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｄは、生後３０、５６、６９および１００日目における休止期および成長期の実験マウスの画像を含む。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｄは、生後のさまざまな時点における実験マウスおよび対照マウスならびに皮膚の画像を含む。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
ヒトにおける脱毛（脱毛症とも呼ばれる）は、毛包による毛髪合成の生理的な周期的プロセスであるいわゆる毛周期の以下の２つの変化に起因する：（ａ）増殖期（成長期とも呼ばれる）の短縮の結果、段々に短い毛髪が産生されていく；および（ｂ）静止期（休止期とも呼ばれる）の延長の結果、毛包が長期間すべて一緒に新しい毛髪を作ることを止める。
【００２３】
脱毛に対する薬理学的な解決手段は、シグナル伝達経路を調節することを含み、これは、通常、全身、局部または局所デリバリーされる医薬品のいずれかを用いてより長い増殖期およびより短い静止期を誘導する。現在まで、最も顕著な抗脱毛効果は、さまざまなやり方でアンドロゲンシグナル伝達を低減する薬剤に対して記録され、その効果は、主に増殖期を延長することに向けられている。休止期から成長期への移行に対するアンドロゲンシグナル伝達の低減の効果は、大きくない。このため、例えば、フィナステリドの抗脱毛効果は、極めて段階的なものであり、完全に現れるのに数年かかる。特に、休止状態の毛包は、観察可能なフィナステリドの成長期延長効果のためにまず自発的に新しい成長期に入る必要がある。
【００２４】
マウスでは、活性化または抑制が毛包の休止期から新しい成長期への移行を促進することが可能な多くの他のシグナル伝達経路が特定された。しかしながら、大部分はヒトでの増殖期活性化に対して、その効果が研究されていない。さらに、新しい増殖期を刺激することが可能ないくつかの重要なシグナル伝達分子は強力な増殖因子でもあり、これは、望ましくない場合が多い、多くの他のオフターゲット副作用（ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｄｅ  ｅｆｆｅｃｔ）を有する。例えば、マウスにおいて発毛を活性化させる（ａｃｔｉｖｅ）ことが可能なＷＮＴシグナル伝達は、がん細胞の増殖を助長するシグナルも出す可能性がある。したがって、脱毛を処置するためにＷＮＴ分子を使用することは、皮膚腫瘍形成の高いリスクをもたらすかもしれない。
【００２５】
現在まで、（ｉ）新しい毛髪の増殖期を効率的に活性化させるため、および（ｉｉ）同時に増殖期の継続時間、よって毛髪の長さを増加させるためのヒトにおける治療的解決手段は存在しない。
【００２６】
「有毛母斑」
「有毛母斑」は、研究中であり、ほとんど理解されていない現象である。母斑は、良性の皮膚病変の１種であり、これは、色素性で、増加した数の特殊なメラノサイトを含む。正常な皮膚と違って、有毛母斑皮膚病変は、いわゆる老化メラノサイトを多く含み、これは、発がん突然変異を得た結果として老化する。周辺の非母斑皮膚と比較して向上した発毛を伴うヒト毛髪母斑の例を図５Ａに示す。いわゆる細胞老化関連分泌形質（ＳＡＳＰ）の活性化を含むがん遺伝子誘導性老化細胞形成の典型的な段階を図１に示す。
【００２７】
産毛と呼ばれる通常の体毛は、一般に非常に短く、細く、非色素性であることが多いため、ほとんど目に見えない。しかしながら、こうした毛髪は、母斑の境界内側にあると長く、太い有色の目立つ頭皮様の毛髪（硬毛とも呼ばれる）に変わる。臨床的に、多くの硬毛を得ることが最終的な目標である場合、産毛から硬毛への変化は極めて望ましく、脱毛を処置するための基礎をなす。
【００２８】
いくつかのマウスモデルを使用した研究は、母斑皮膚にある特殊な老化メラノサイトが発毛を活性化させることができるかどうかの仮説を試験した。こうした研究は、老化メラノサイトが実際に顕著に発毛を向上させることを示した。これらの研究は、老化メラノサイトが、それが分泌するＳＡＳＰ因子によりこの効果を実現することも示した。一般に、ＳＡＳＰは、老化メラノサイトを含むすべての種類の老化細胞によって産生される炎症シグナル伝達経路のメンバー中で豊富な一連の分泌シグナル伝達分子である。
【００２９】
「有毛母斑」由来の老化メラノサイトにおけるＳＡＳＰプロフィール
有毛母斑皮膚由来の老化メラノサイトのＳＡＳＰプロフィールは、選別細胞に対するＲＮＡシーケンシングによって評価され、確立された。この分析から、個々の分子としてか、または組み合わせでのいずれかで母斑における発毛の促進に関与しているようである複数の候補分子プレーヤーが特定された。まとめると、このデータに基づいて、老化細胞由来のＳＡＳＰ因子が発毛を向上させる主要なものであることが確認された。これは、本明細書中で開示されているいくつかの実施形態による休止状態（休止期）の毛包を、老化細胞または老化細胞由来のＳＡＳＰまたはＳＡＳＰの成分のいずれかに曝露することが、その活性化を誘導し、発毛を向上させることを示す。
【００３０】
さらに、このデータは、老化メラノサイト産生ＳＡＳＰはまた、免疫細胞、特に、マクロファージの皮膚への動員および活性化も誘導することを示している。選別された母斑皮膚のマクロファージに対するＲＮＡシーケンシング研究は、それらが多くの同じＳＡＳＰ因子およびその他のさらなる炎症性サイトカインも分泌することを示した。したがって、事実上、マクロファージおよびその分泌分子が老化細胞由来のＳＡＳＰ因子の発毛誘導効果を増幅および増強する。したがって、マクロファージ由来のシグナル伝達因子とともにＳＡＳＰまたはＳＡＳＰの成分が発毛誘導効果の増強をもたらすことがある。
【００３１】
発毛を誘導するために老化細胞、ＳＡＳＰおよび免疫細胞由来の因子を利用する実施形態
本明細書に記載されているいくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ因子は、皮膚注射のために、培養された老化メラノサイトまたは任意の他の種類の老化細胞（線維芽細胞、ケラチノサイトなど）から回収され、精製される。有利にも、さまざまな種類の老化細胞がそのＳＡＳＰ分子プロフィールの大部分を共有するため、さまざまな老化細胞が使用可能であることが確認された。本明細書に記載されているいくつかの実施形態において、分泌因子は、マクロファージなどの免疫細胞との老化細胞の共培養物から回収され、精製される。回収されたら、こうした「生理活性因子カクテル」は、以下に限定されないが、直接的な皮内注射、マイクロニードルデバイスまたはフラクショナルレーザー処置の適用を用いた局所デリバリーを含む多くの方法により皮膚にデリバリーすることができる。
【００３２】
本明細書に記載されているいくつかの実施形態において、発毛は、（ｉ）老化細胞もしくは（ｉｉ）老化細胞由来のシグナル伝達分子の生理活性ＳＡＳＰカクテル、または（ｉｉｉ）老化細胞とマクロファージの組み合わせによって産生されるシグナル伝達分子カクテルによって刺激される。
【００３３】
脱毛に罹患した領域の処置の方法の実施形態
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの老化細胞種を脱毛に罹患した領域に移植することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、老化細胞の集団を脱毛に罹患した領域に移植することを含む方法が提供される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、老化細胞の集団は、純粋な老化細胞の集団である。例えば、本方法は、７０％を超えて純粋な、８０％を超えて純粋な、９０％を超えて純粋な、または９５％を超えて純粋な老化細胞の集団を移植することを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの老化細胞およびＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子を脱毛に罹患した領域にデリバリーすることを含む方法が提供される。
【００３６】
本明細書に記載されている老化細胞のいずれも、あらゆる生物由来のものであってもよい。いくつかの実施形態において、老化細胞は、ヒト老化細胞である。いくつかの実施形態において、老化細胞は、老化メラノサイト、老化線維芽細胞、老化ケラチノサイト、または老化脂肪細胞のうちの任意の１つ以上である。いくつかの実施形態において、老化細胞は、老化したか、または老化形質に入った任意の細胞種である。いくつかの実施形態において、老化形質は、非複製的形質を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子を脱毛に罹患した領域に移植することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、免疫細胞によって産生された少なくとも１つの因子を脱毛に罹患した領域に添加することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子および免疫細胞由来の少なくとも１つの因子を脱毛に罹患した領域に添加することを含む方法が提供される。
【００３８】
いくつかの実施形態において、少なくとも部分的、実質的または完全にＳＡＳＰ由来の因子から構成される組成物を、脱毛に罹患した領域にデリバリーすることを含む方法が提供される。いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子および少なくとも１つの免疫細胞由来の少なくとも１つの因子を、脱毛に罹患した領域にデリバリーすることを含む方法が提供される。
【００３９】
いくつかの実施形態において、老化細胞を少なくとも１種類の免疫細胞とともに培養することから得られる少なくとも１つの因子を、脱毛に罹患した領域にデリバリーすることを含む方法が提供される。老化細胞は、皮膚の任意の老化細胞である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの老化細胞は、老化メラノサイト、老化線維芽細胞、老化ケラチノサイト、または老化脂肪細胞のうちの任意の１つ以上を含む。免疫細胞は、任意の免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫は、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球、およびマクロファージのうちの任意の１つ以上を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの老化細胞を少なくとも１つの免疫細胞と共培養することによって産生される因子のカクテルをデリバリーすることを含む方法が提供される。少なくとも１つの老化細胞は、皮膚で見出される任意の老化細胞（ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｎ  ｃｅｌｌ）である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの老化細胞は、老化メラノサイト、老化線維芽細胞、老化ケラチノサイト、または老化脂肪細胞のうちの任意の１つ以上である。少なくとも１つの免疫細胞は、任意の免疫細胞種である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの免疫細胞は、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球および単球のうちの任意の１つ以上である。いくつかの実施形態において、免疫細胞は、マクロファージである。
【００４１】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの老化細胞および老化細胞由来の少なくとも１つの因子を脱毛に罹患した領域にデリバリーすることを含む方法が提供される。少なくとも１つの老化細胞は、任意の老化細胞である。いくつかの実施形態において、老化細胞は、老化メラノサイト、老化線維芽細胞、老化ケラチノサイト、および老化脂肪細胞のうちの任意の１つ以上である。
【００４２】
いくつかの実施形態において、それらに限定されないが、表１に列挙されている任意の１つ以上の因子を含むＳＡＳＰ由来の１つ以上の因子をデリバリーすることを含む本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて。
【００４３】
【表１−１】
2020514395.tif 000003
【表１−２】
2020514395.tif 000004
【表１−３】
2020514395.tif 000005
【００４４】
いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＡＳＰ因子は、１つ以上の細胞によって産生される。いくつかの実施形態において、１つ以上の細胞は、哺乳動物細胞、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、細菌細胞、酵母菌細胞、および／または１つ以上のＳＡＳＰ因子を産生することが可能な細胞のあらゆる他の種類のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＡＳＰ因子は、細胞から分泌される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＡＳＰ因子は、培地へ分泌される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＡＳＰ因子は、分泌後に単離および／または精製される。例えば、１つ以上のＳＡＳＰ因子は、細胞および細胞と関連する培地を遠心分離した後で上清から単離および／または精製されてもよい。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＡＳＰ因子は、細胞から分泌されずに単離および／または精製される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＡＳＰ因子は、標準的な分子生物学技術の使用によるなど細胞において組み換えで産生される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＡＳＰ因子は、合成される。いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＡＳＰ因子は、商業的に購入される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ因子としては、Ａｎｇｐｔｌ４、Ａｘｌ、Ｂｍｐ４、Ｃ１ｑｔｎｆ２、Ｃ１ＱＴＮＦ５、Ｃ１ｑｔｎｆ７、Ｃｃｌ１７、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｃｃｌ６、Ｃｃｌ９、Ｃｔｓｂ、Ｃｘｃｌ１２、Ｃｘｃｌ９、Ｄｈｈ、Ｄｋｋ３、Ｆｇｆ７、Ｆｒｚｂ、Ｆｓｔｌ１、Ｇｄｆ１０、Ｉｇｆｂｐ２、Ｉｇｆｂｐ４、Ｉｇｆｂｐ７、Ｉｌ１０、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｆ９、Ｉｎｈｂａ、Ｉｎｓｌ６、Ｍｉｆ、Ｍｍｐ１１、Ｍｍｐ１２、Ｍｍｐ１４、Ｍｍｐ２、Ｍｍｐ２３、Ｍｍｐ３、Ｎｒｇ２、Ｏｇｎ、Ｏｍｄ、Ｐｄｇｆａ、Ｐｌａｔ、Ｐｏｓｔｎ、Ｒｅｔｎｌａ、Ｓｃｔ、Ｓｐａｒｃ、Ｓｐｐ１、Ｔｉｍｐ１、Ｔｎｆ、Ｔｎｆａｉｐ６、Ｗｉｆ１、および／またはＷｉｓｐ１などのマウスＳＡＳＰ因子が挙げられる。いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ因子としては、ＡＮＧＰＴＬ７、ＢＡＭＢＩ、ＣＣＬ１８、ＤＫＫＬ１、ＦＧＦＢＰ２、ＦＲＺＢ、ＧＤＦ１、ＧＤＦ１０、ＧＤＦ１１、ＧＤＦ１５、ＩＬ１７Ｄ、ＭＭＰ１７、ＰＤＧＦＤ、ＳＰＰ１、ＴＮＦＳＦ１２、Ｃ１ＱＴＮＦ５、ＮＲＧ３、ＰＬＡＴ、および／またはＴＩＭＰ２などのヒト母斑皮膚ＳＡＳＰ因子が挙げられる。いくつかの実施形態は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、その間の任意の数、またはそれ以上の本明細書において記載または特定されているＳＡＳＰ因子を含む。
【００４６】
免疫細胞由来の少なくとも１つ以上の因子をデリバリーすることを含む本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、因子は、任意の白血球種由来である。いくつかの実施形態において、任意の白血球種由来の因子は、造血幹細胞からもたらされる。いくつかの実施形態において、白血球由来の因子は、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球および単球のうちの任意の１つ以上から得られる。いくつかの実施形態において、１つ以上の因子が由来する免疫細胞は、マクロファージである。
【００４７】
いくつかの実施形態において、デリバリーすることは、少なくとも１回の皮内注射を含む。いくつかの実施形態において、デリバリーすることは、複数の繰り返しの皮内注射を含む。いくつかの実施形態において、デリバリーすることは、局所デリバリーを含む。いくつかの実施形態において、局所デリバリーは、マイクロニードルデバイスまたはフラクショナルレーザー処置の適用に続く。
【００４８】
本明細書中で開示されているあらゆる組成物は、本明細書中で開示されている任意の方法により脱毛に罹患した領域にデリバリーすることができる。
【００４９】
老化細胞を生じさせる方法の実施形態
いくつかの実施形態において、１つ以上の正常な細胞を１つ以上の発がん因子に曝露することを含む老化細胞を生じさせる方法が提供される。いくつかの実施形態において、１つ以上の正常な細胞を１つ以上の老化誘導因子（ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ）に曝露することを含む老化細胞を生じさせる方法が提供される。いくつかの実施形態において、複製老化を実現するために細胞の繰り返しの継代を含む老化細胞を生じさせる方法が提供される。
【００５０】
組成物の実施形態
いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子および１つの免疫細胞種由来の少なくとも１つの因子を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ由来の少なくとも１つの因子は、表１に列挙されている任意の１つ以上の因子である。
【００５１】
免疫細胞由来の因子を含む組成物において、この因子は、任意の１つ以上の白血球または白血球の任意の組み合わせ由来である。いくつかの実施形態において、造血幹細胞からもたらされる任意の１つ以上の白血球由来の因子。いくつかの実施形態において、白血球由来の因子は、好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球および単球のうちの任意の１つ以上に由来するものである。いくつかの実施形態において、１つ以上の因子が由来する免疫細胞は、マクロファージである。
【００５２】
いくつかの実施形態において、少なくとも１種類の免疫細胞とともに培養された老化細胞由来の少なくとも１つの因子を含む組成物が提供される。老化細胞は、皮膚で見出される任意の老化細胞を含むことができる。いくつかの実施形態において、老化細胞は、老化メラノサイト、老化線維芽細胞、老化ケラチノサイト、および老化脂肪細胞のうちの任意の１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、老化細胞由来の少なくとも１つの因子としては、表１．１に列挙されている任意の１つ以上の因子が挙げられるがそれらに限定されない。
【００５３】
いくつかの実施形態において、ＳＡＳＰ由来のすべての因子を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、表１．１に列挙されている因子のそれぞれを含む組成物が提供される。
【００５４】
いくつかの実施形態において、１つ以上のＳＡＳＰ因子を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、本組成物は、１つ以上のＳＡＳＰ因子を含有する培地または上清を含む。いくつかの実施形態において、培地または上清に含まれるＳＡＳＰ因子は、細胞によって培地または上清へ分泌される。
【実施例】
【００５５】
上記の実施形態のいくつかの態様を以下の実施例においてさらに詳細に開示するが、これは本開示の範囲を限定することは決して意図されない
【実施例１】
【００５６】
トランスジェニックマウス系統、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１ＫおよびＴｙｒ−ＣｒｅＥＲＴ２；ＢｒａｆＶ６００Ｅを過剰活性発毛（ｏｖｅｒａｃｔｉｖｅ  ｈａｉｒ  ｇｒｏｗｔｈ）のモデルとして使用することができることの検証。
メラノサイト細胞系統におけるがん遺伝子により誘導された老化のモデルとしていくつかのトランスジェニックマウスを使用して、それらがヒト有毛母斑病変を再現する過剰活性発毛を示すことを検証した。そのようなマウスモデルの１つがＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋである。ヒト有毛母斑と同様に、これらのマウスの皮膚は、多くの異所性老化メラノサイトを示した（図２）。Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスの皮膚における発毛は、調べたすべての時点において劇的に向上していた。正常な対照マウスは、一般に活発な発毛を示さないが、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスは図４Ｆ（下パネル）に示されるとおり多くの成長した毛包を示した。Ｔｙｒ−ＣｒｅＥＲＴ２；ＢｒａｆＶ６００Ｅマウスはまた、老化母斑（ｓｅｎｅｓｃｅｎｔ  ｎｅｖｕｓ）のモデルであることを示す発毛の向上（図５Ａ）を示している。
【実施例２】
【００５７】
パルスチェイス技術を使用して、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスの皮膚において毛包幹細胞が活性であることを示す
いわゆるパルスチェイス技術は、毛包幹細胞（バルジ幹細胞とも呼ばれる）が対照マウスと比較してＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスの皮膚では静止状態が減り、より活性であることを示した（図３）。このデータは、老化細胞の存在が、例えば、毛包幹細胞を活性化することによって、発毛の向上をもたらすことを裏付けている。
【実施例３】
【００５８】
皮膚における異所発毛が老化メラノサイトの結果であることの検証
マウスの皮膚への蛍光標識化老化メラノサイトの注射は、発毛の異所的な活性化をもたらした（図５Ｂおよび５Ｃ）。発毛が他の種類のメラノサイトではなく老化メラノサイトの結果であったことを検証するために、増殖させた正常な非老化メラノサイトの２つのマウスモデル、Ｋ１４−Ｅｄｎ３マウスおよびＫ１４−Ｋｉｔｌマウスにおいて発毛を調べた。これらの両マウスでは、増殖させたメラノサイトにもかかわらず、発毛の向上は観察されなかった（図５Ａ）。
【実施例４】
【００５９】
Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスの母斑皮膚において造血細胞の数の増加が観察されている
図３ＢのＦＡＣＳ分析によって示された特定の実施形態において、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスの母斑皮膚では造血細胞の数が増加した。これは、ＳＡＳＰシグナル伝達に関与する免疫細胞の数の増加と一致する可能性もある。
【実施例５】
【００６０】
老化細胞によるシグナル伝達は、皮膚の幹細胞ニッチを過剰に活性化する
本実施例は、毛包幹細胞が静止状態で存在し、そのトランスクリプトームおよび組成が変化する可能性があること、および老化メラノサイトの存在下において毛髪再生が劇的に向上することを示す。ここでは、後者が炎症促進性因子を含有する細胞老化関連分泌形質（ＳＡＳＰ）を活性化することが示された。オステオポンチンは、毛髪再生に関与する新規のＳＡＳＰ因子である。オステオポンチン注射は、新たな発毛を誘導するのに、およびオステオポンチンレベルを増幅し、毛髪再生に対するＳＡＳＰ効果を向上させる骨髄細胞を動員するのに十分であることが示された。オステオポンチン、その受容体、Ｃｄ４４の欠失、または骨髄細胞の欠乏のすべてが、老化メラノサイトによって向上した毛髪再生を著しく逆行させた。従来、老化細胞は、組織再生潜在能力に対して有害であると考えられているが、ここでは、それがＳＡＳＰシグナル伝達および免疫細胞調節のために幹細胞ニッチを豊富にすることによって再生を向上させることが可能であることが示されている。
【００６１】
ここでは、老化細胞が、組織幹細胞（ＳＣ）によって静止状態の劇的な減少を誘導することが可能で、それがその固有のセクレトーム、ＳＡＳＰによって可能にされることが示された。ここでは、色素母斑皮膚（ほくろとも呼ばれる）の老化メラノサイトが、ＳＡＳＰによりシグナルを出して、毛髪ＳＣを過剰に活性化し、これが、顕著に向上した毛髪再生につながることが示されている。ＳＡＳＰは、骨髄細胞を動員し、それが、結果として、新規の再生促進性シグナル伝達因子に関するそれを増幅し、豊富にする。オステオポンチンは、本明細書において向上した毛髪再生に関与する新規のＳＡＳＰ因子と特定されている。老化した組織細胞による組織前駆細胞の活性化によりＳＣ生物学における新たなパラダイムがもたらされる。
【００６２】
老化メラノサイト（ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ）を含む母斑皮膚では毛髪再生が過剰に活性化されている
周期的な毛髪再生は、幹細胞静止状態のレベルで厳重に制御されており（Yi, 2017）、過剰発毛の自然発生的な状態はまれである。有毛色素母斑は、ヒトでは顕著に向上した発毛を伴う良性の皮膚病変の１種である（図４Ａおよび４Ｂ）。母斑における過剰発毛のメカニズムはわかっていない。母斑は、皮膚メラノサイトの一般的にＮｒａｓまたはＢｒａｆにおけるがん遺伝子突然変異の結果として生じる（Roh et al., 2015）。これは、影響を受ける細胞においてがん遺伝子誘導性老化（ＯＩＳ）を活性化する（Dhomen et al., 2009）。しかしながら、突然変異をもつ細胞は、永続的な細胞周期停止に入る前に、一時的に増殖し、老化細胞が豊富な空間的に制限された病変を生じる。完全な老化状態になると、細胞は、特殊なＳＡＳＰセクレトームを活性化する（Coppe et al., 2008）。
【００６３】
いくつかの炎症性サイトカインおよび増殖因子は、ＳＡＳＰの一部であり、そのシグナル伝達の役目は、生物学的なプロセスを調節する際に速やかに認識されることであり、この生物学的なプロセスは、通常の胚発生（Storer et al., 2013）、細胞可塑性およびリプログラミング（Mosteiro et al., 2016； Ritschka et al., 2017）、損傷修復（Chiche et al., 2017； Demaria et al., 2014）、ならびにがんの進行（Capell et al., 2016； Herranz et al., 2015； Laberge et al., 2015； Ruhland et al., 2016； Yoshimoto et al., 2013）を含む。
【００６４】
老化メラノサイトは、毛包幹細胞静止状態を妨害する
老化メラノサイトが毛髪再生に活性の役割をもつＨＦ細胞集団、バルジＳＣ、毛芽（ＨＧ）前駆細胞およびＤＰ線維芽細胞にどのように影響を及ぼすのかを考察した。これらのトランスクリプトームを細胞選別後のＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）によってプロフィールを調べた。Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｋ１４−Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ突然変異体およびＫ１４−Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ対照マウスから、それぞれＧＦＰ＋／ＣＤ３４＋／ＰｃａｄｌｏおよびＧＦＰ＋／ＣＤ３４ｎｅｇ／Ｐｃａｄｈｉ集団としてバルジおよびＨＧ細胞を単離した（Greco et al., 2009）。Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｓｏｘ２−ＧＦＰ突然変異体およびＳｏｘ２−ＧＦＰ対照マウスからＧＦＰ＋；ＣＤ１３３＋集団としてＤＰ線維芽細胞の分画を単離した（Driskell et al., 2009）。対照の野生型（ＷＴ）マウスの背面のＨＦがそれぞれ第２の成長期および休止期にあるときのＰ３０およびＰ５６にバルジおよびＤＰ細胞のプロフィールを調べた。ＨＧ前駆細胞は、休止期中にのみ存在するため、そのプロフィールをＰ５６に調べた。
【００６５】
バルジＳＣに対するＲＮＡ−ｓｅｑ解析は、両時点におけるＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１ＫマウスとＷＴマウスの間の顕著な差を明らかにした（図６Ａ）。複数の差次的に発現した遺伝子を特定した（図６Ｂ）。最大の差が、Ｐ５６のＷＴサンプルと突然変異体サンプルの間で観察された。Ｐ５６のＷＴ細胞は、９７３の遺伝子をアップレギュレートする一方で、Ｐ５６の突然変異体細胞は、１１５９の遺伝子をアップレギュレートする。遺伝子オントロジー（ＧＯ）解析は、細胞周期ブロック、サーカディアンリズム、ＷＮＴおよびＪＡＫ−ＳＴＡＴ抑制を含む遺伝子カテゴリーに関するＷＴ細胞が豊富になることを示した（図６Ｃ）。反対に、突然変異体細胞に対する解析は、細胞周期、細胞遊走、ＷＮＴシグナル伝達および皮膚発生遺伝子カテゴリーに関して豊富になることを示した（図６Ｃ）。これらのＧＯシグネチャーは、ＷＴ  バルジＳＣがＰ５６に静止しており、休止期にあるＨＦと一致したことを示す。これも、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１ＫバルジＳＣが静止状態から外れることを示唆する。しかしながら、この代案は、Ｐ５６の突然変異体の皮膚は多数の異所性成長期ＨＦを含むため、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１ＫサンプルのＲＮＡ−ｓｅｑシグネチャーが休止期および成長期バルジＳＣの複合物であることである。
【００６６】
こうした可能性に対処するために、Ｐ５６のＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１ＫマウスとＷＴマウスの間のバルジＳＣを、シングルセルＲＮＡ−ｓｅｑに関して比較した。解析は、ＷＴバルジＳＣが２つの異なる種類からなることを示している（図６Ｄの右上および右下のクラスター）。遺伝子プロファイリングは、両ＳＣ種が静止状態であり、高レベルの細胞周期インヒビターＣｄｋｎ１ａ、静止期マーカー（ｑｕｉｅｓｃｅｎｃｅ  ｍａｒｋｅｒ）Ｎｆａｔｃ１（Horsley et al., 2008）、Ｈｏｐｘ（Takeda et al., 2013）およびシグナル伝達インヒビターＢｍｐ２を発現することを示す（図６Ｅ）。興味深いことに、突然変異体バルジＳＣは、その組成が劇的に変わる。多くのＳＣは、完全に新しい種類になる（図６Ｄの左下のクラスター）一方で、静止状態のＳＣ種は、完全に消滅する（右下のクラスター）か、またはほとんど無くなる（右上のクラスター）。静止状態の減少は、細胞周期解析（図１５）および遺伝子発現により明らかである。突然変異体固有のＳＣは、Ｃｄｋｎ１ａ、Ｎｆａｔｃ１、Ｈｏｐｘ、Ｂｍｐ２／４をダウンレギュレートし、細胞周期アクチベーターＣｄｋ１およびＨｅｄｇｅｈｏｇ経路標的Ｆｏｘｅ１をアップレギュレートする（Eichberger et al., 2004）。同時に、それらは、右下のクラスターからのＷＴ  ＳＣと多くのマーカー：転写因子Ｌｈｘ２（Folgueras et al., 2013）、Ｓｏｘ９（Vidal et al., 2005）、Ｔｂｘ１（Chen et al., 2012）、Ｇタンパク質共役受容体Ｌｇｒ５（Jaks et al., 2008）およびＨｅｄｇｅｈｏｇ経路成分Ｇｌｉ１／２、Ｐｔｃｈ１／２を共有するが、大部分は図６Ｄの右上のクラスターのＳＣとは異なる（図６Ｅ、１６および１７を参照）。後者（ｌａｔｅｒ）は、いくつかの固有の転写因子、Ｆｏｘｎ２、Ｏｖｏｌ１／２、Ｓｏｘ６および古典的ＷＮＴリガンドＷｎｔ３／７ｂ／１０ａを発現する。Ｐ５６のＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ皮膚が多くの休止期ＨＦを含むことを考えれば、右下のクラスターＳＣの消失は、突然変異体マウスの休止期バルジＳＣによる静止状態の劇的な減少と一致する。ＷＴの右下のクラスターＳＣとＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスの左下のクラスターＳＣとの間のマーカーの類似点は、前者の静止状態のＳＣが老化メラノサイトの存在下において活性化状態に移行することを示唆している。
【００６７】
次に、静止状態の減少が機能的アッセイにおいて確認された。バルジＳＣに対してパルスチェイス実験を行った。ＷＴ  ＨＦが早期の成長期にあり、そのＳＣが増殖性であるときのＰ２７〜Ｐ３４日の間にマウスをＥｄＵでパルスし（Hsu et al., 2011）、その後、Ｐ９２日目まで追跡した。サイトメトリ解析により、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１ＫマウスのバルジＳＣの総数は、ＷＴと大幅には異ならなかったが、ＥｄＵ保持ＳＣが顕著に減少した（ｎ＝４）（図６Ｈ）。突然変異体における標識保持ＳＣの欠乏は、Ｓｏｘ９による共染色により確認された（図６Ｈ’）。選別されたバルジＳＣに対して長期クローン形成アッセイ（ｃｌｏｎｏｇｅｎｉｃ  ａｓｓａｙ）を行った。Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１ＫバルジＳＣの付着能力はＷＴ  ＳＣの能力と同様であったが、その連続継代潜在能力は大幅に損なわれ、突然変異体ＳＣは、ＷＴ  ＳＣに関する１３．７回の継代数（ｎ＝３）と比較して、平均して６回の継代数（ｎ＝３）を維持した（図６Ｉおよび６Ｉ’）。同時に、付着率および継代潜在能力は、突然変異体（ｎ＝３）とＷＴ  短期ＨＧ前駆細胞（ｎ＝３）の間では変わらなかった。
【００６８】
その後、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１ＫマウスのバルジＳＣによる静止状態の減少と同時にどのようなシグナル伝達変化が起こるかを求めた。これに対処するために、シングルセルデータと比較してさらに大きな深度の範囲を有するバルクＲＮＡ−ｓｅｑデータを解析した。まず、シングルセル解析からの静止期マーカー、Ｎｆａｔｃ１およびＨｏｐｘも、バルク解析によりＷＴ  ＳＣに対してＰ５６のＮｒａｓＱ６１Ｋにおいてダウンレギュレートされたことが確認された。ＮｒａｓＱ６１Ｋ  ＳＣにおいてその他の静止期マーカー：Ａｘｉｎ２（Lim et al., 2016）、Ｃｏｌ１７ａ１（Matsumura et al., 2016）、Ｆｇｆ１８（Kimura-Ueki et al., 2012）およびＦｏｘｃ１（Lay et al., 2016； Wang et al., 2016）もダウンレギュレートされた（図６Ｆおよび６Ｇ）。さらに、ＮｒａｓＱ６１Ｋ  ＳＣは、ＢＭＰ経路に関する以下の複数のシグナル伝達調節因子：Ｂｍｐ２、Ｆｓｔ、Ｇｒｅｍ１、Ｄａｎｄ５、Ｎｂｌ１、Ｎｏｇ、Ｓｍａｄ９、Ｓｏｓｔｄｃ１、ＷＮＴ経路：Ｄｋｋ３、Ｄｋｋｌ１、Ｆｚｄ２／３／７／９、Ｗｎｔ１０ａ／３／７ｂ、Ｗｉｆ１、ならびにＣｔｇｆ、Ｆｇｆ１、およびＨｈｉｐをダウンレギュレートする。反対に、それらは、ＴＧＦβ経路メンバー：Ｂｍｐ１、Ｇｄｆ１０、Ｉｎｈｂａ、Ｉｎｈｂｂ、Ｔｇｆｂ１、ＷＮＴ経路因子：Ｆｚｄ４／５、Ｒｓｐｏ１、Ｗｎｔ９ａ、ならびにＦｇｆ５、Ｆｇｆ２１、Ｃｃｌ２１ａ、Ｃｘｃｌ９／１０／１２、Ｉｌ１ｆ５およびＳｐｐ１をアップレギュレートする（図６Ｇ）。上の因子のうち、Ｓｐｐ１（オステオポンチンとも呼ばれる）は、ＷＴ  ＳＣと比較してＰ５６のＮｒａｓＱ６１Ｋにおいて最大の倍率変化（７３．９×）および高い発現値を示した。実際、これも、Ｐ３０のＮｒａｓＱ６１Ｋ  ＳＣが高度に発現し、Ｐ３０のＷＴ  ＳＣは実質的に発現しなかった。これは、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１ＫマウスのＨＦ  ＳＣにおいてＳｐｐ１が特にアップレギュレートされることを示唆する。
【００６９】
ＷＴ対照と比較して、Ｐ５６のＮｒａｓＱ６１ＫのＨＧ前駆細胞は、Ｇｒｈｌ３、Ｍｅｉｓ２、Ｏｖｏｌ１、Ｓｏｘ６／１５、古典的（Ｗｎｔ３／３ａ／７ｂ／１０ａ）および非古典的ＷＮＴリガンド（Ｗｎｔ５ａ／５ｂ／１１／１６）、複数のサイトカイン、Ｃｃｌ１／２／７／２０／２７ａ／２７ｂ、インターロイキン、Ｉｌ１ａ／１ｂ／１ｆ５／１ｆ９／６／２４／３４およびケモカイン、Ｃｘｃｌ９／１６、ならびにＦｓｔおよびＮｇｆを含むいくつかの転写因子をアップレギュレートする。これらは、転写因子、Ｉｄ１／２／４、Ｌｈｘ２、Ｓｏｘ５／１３、Ｔｂｘ１、複数のＷＮＴ経路成分：Ｄｋｋ３、Ｆｚｄ２／３／７／８、Ｌｇｒ４／５、Ｌｅｆ１、Ｌｒｐ６、Ｔｃｆ７ｌ１／１２、Ｗｎｔ７ａ／１０ｂ、Ｗｉｆ１、およびＨｅｄｇｅｈｏｇ経路メンバー、Ｇｌｉ１／２、Ｐｔｃｈ１／２をダウンレギュレートする（図１８Ａ〜１８Ｄ）。このＲＮＡ−ｓｅｑシグネチャーは、ＷＮＴ経路の複雑な変化、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ経路の抑制的変化、および炎症シグナル伝達の顕著な活性化と一致した。Ｐ５６のＮｒａｓＱ６１Ｋ  ＤＰ線維芽細胞は、転写因子、Ａｌｘ４、Ｈｅｙ１／２、Ｍｓｘ１／２、Ｐａｘ１、Ｐｉｔｘ２、Ｓｏｘ１８、Ｔｂｘ５／１８、ＢＭＰ経路成分：Ｂｍｐ４、Ｂａｍｂｉ、Ｉｄ１、Ｓｏｓｔｄｃ１、ＷＮＴ経路成分：Ｆｚｄ４／１０、Ｒｓｐｏ１／３／４、Ｓｆｒｐ１／４、Ｗｎｔ５ｂ、ならびにＦｇｆ７／１０、Ｓｐｐ１およびサイトカイン、Ｃｘｃｌ１／５／９／１２／１４をアップレギュレートする。それらは、転写因子およびエピジェネティック因子、Ｅｚｈ２、Ｈｄａｃ５／９、Ｓｔａｔ２／３／５ａ、Ｚｅｂ１、ＢＭＰ成分：Ｃｈｒｄｌ１、Ｇｒｅｍ１、ＷＮＴ成分、Ｄｋｋ３、Ｆｚｄ９、Ｗｎｔ６／１０ａ／１６ならびにＤｈｈおよびＰｄｇｆａをダウンレギュレートする（図１９Ａ〜１９Ｅ）。このＲＮＡ−ｓｅｑシグネチャーは、ＷＮＴおよびＢＭＰリガンドおよびアンタゴニスト産生、発毛促進ＦＧＦリガンドの活性化、ならびにオステオポンチンを含むサイトカイン産生の複雑な変化を強調する。
【００７０】
免疫細胞は母斑メラノサイトのセクレトームを増大する
Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｔｙｒ−ＣｒｅＥＲＴ２；ｔｄＴｏｍａｔｏ突然変異体およびＴｙｒ−ＣｒｅＥＲＴ２；ｔｄＴｏｍａｔｏ対照マウス皮膚からｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞としてメラノサイト系統を単離した。Ｐ５６の突然変異体サンプルのトランスクリプトームを、その後、Ｐ３０の成長期およびＰ５６の休止期ＷＴの両サンプルと比較した（図７Ａおよび７Ｂ）。この方法は、５９８の突然変異体固有のアップレギュレートされた遺伝子を特定し、通常の毛周期に応じてメラノサイト系統において調節される遺伝子を除外した。突然変異体固有の遺伝子は、エイジング、ＷＮＴ抑制、細胞周期ブロックおよび有糸分裂を含むＧＯ  ｔｅｒｍに関して豊富であった（図７Ｃ）。ＯＩＳを経た突然変異体メラノサイトと一致して、それらは、腫瘍抑制因子、Ｃｄｋｎ２ｂ（ｐ１５とも呼ばれる）、Ｌｚｔｓ１、ならびにＣｄｋｎ３、Ｈ２ａｆｘおよびＡｕｒｋａ／ｂ、Ｃｄｃａ３／８、Ｃｄｃ２０／２５ｃ、Ｃｅｎｐａ、Ｍａｄ２ｌ１、Ｎｃａｐｈ、Ｋｎｓｔｒｎ、Ｐｌｋ１、Ｐｓｒｃ１、Ｒｅｅｐ４を含む多くの有糸分裂関連遺伝子を強くアップレギュレートする。後者の遺伝子セットの奇異なアップレギュレーションは、ＯＩＳメラノサイトによる延長された有糸分裂停止、早期のＭ期脱出（ｍｉｔｏｔｉｃ  ｓｌｉｐｐａｇｅ）および多核化（ｍｕｌｔｉｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ）と一致する（Dikovskaya et al., 2015）。母斑メラノサイトにおいて独特にアップレギュレートされる２７の分泌性シグナル伝達因子を特定した（図７Ｄ）。これは、ＢＭＰ経路メンバー：Ｂｍｐ４、Ｆｓｔｌ１、ＷＮＴ経路メンバー：Ｆｒｚｂ、Ｗｉｆ１、Ｗｉｓｐ１、ＩＧＦ調節因子、Ｉｇｆｂｐ２／４／７、ならびにＤｈｈ、Ｆｇｆ７、Ｓｐｐ１およびＴｎｆを含む。興味深いことに、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）におけるＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウス母斑メラノサイトのセクレトームとインビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）におけるＢＲＡＦＶ６００Ｅ誘導ヒト老化メラノサイトのセクレトームの間に重なる部分（Pawlikowski et al., 2013）、またはコアＳＡＳＰ因子がほとんどなかった（Andriani et al., 2016； Coppe et al., 2010； Coppe et al., 2008； Freund et al., 2010）。Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ母斑メラノサイトは、インビトロＳＡＳＰの特性とは異なって、複数のＣＣおよびＣＸＣケモカインまたはインターロイキンをはっきりとはアップレギュレートしなかった（図７Ｄ）。Ｐ５６のＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ母斑メラノサイトにおける選択された細胞周期インヒビターおよびセクレトーム遺伝子のアップレギュレーションは、シングルセルＲＮＡ−ｓｅｑによっても確認された（図７Ｅおよび７Ｆ）。総合して、このデータは、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ皮膚の老化メラノサイトがインビトロ老化細胞セクレトームとは大きく異なる固有のセクレトームをアップレギュレートすることを示す。
【００７１】
毛周期活性化における免疫細胞シグナル伝達に対して急速に生じた役割を考慮して（Ali et al., 2017； Amberg et al., 2016； Castellana et al., 2014； Chen et al., 2015； Gay et al., 2013； Lee et al., 2017； Wang et al., 2017b）、母斑皮膚の免疫細胞セクレトームが変化するか、さらにどのように変化するかを見るための実験を行った。すべての皮膚内在性ＣＤ４５発現（ｅｘｐｒｅｓｉｎｇ）造血細胞（図２０Ａ〜２０Ｄ）およびＬｙｓＭ−Ｃｒｅ；ｔｄＴｏｍａｔｏ標識化に基づいて単離したｔｄＴｏｍａｔｏ＋骨髄細胞（図８Ａおよび８Ｂ）のトランスクリプトームのプロフィールを調べた。突然変異体固有の遺伝子を特定するために、メラノサイトと同様に同じＲＮＡ−ｓｅｑ解析方法を使用し、Ｐ５６の突然変異体細胞をＰ３０およびＰ５６のＷＴ細胞の両方と比較した。突然変異体固有の骨髄細胞のトランスクリプトームは、走化性、タンパク質分解およびケモカインシグナル伝達を含むＧＯ  ｔｅｒｍに関して豊富であった（図８Ｃ）。母斑皮膚の骨髄細胞は、ＳＡＳＰに属する分泌因子を顕著にアップレギュレートし、これは、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図８Ｅ）およびシングルセルＲＮＡ−ｓｅｑ（図８Ｆおよび８Ｇ）によって確認された特長である。特に、それらは、母斑メラノサイトのセクレトームにおける欠乏とは異なり、ＣＣケモカイン、Ｃｃｌ４／５／６／９／１７、ＣＸＣケモカイン、Ｃｘｃｌ１９／１２、インターロイキン、Ｉｌ１ａ／１ｆ９／１０およびマトリックスメタロプロテイナーゼ、Ｍｍｐ２／３／１２／１４をアップレギュレートする（図８Ｄ）。さらに、母斑メラノサイトと同様に、それらは、ＩＧＦ調節因子、Ｉｇｆｂｐ２／７ならびにＰｏｓｔｎ、Ｓｐｐ１およびＴｉｍｐ１をアップレギュレートする（図８Ｄおよび２１）。
【００７２】
まとめると、老化メラノサイトおよび骨髄細胞の組み合わされたセクレトームは、はっきりと複数の炎症経路リガンドに関して母斑皮膚のシグナル伝達環境を強化する（図２２）。老化メラノサイトおよび骨髄細胞は一緒にＳｐｐ１を発現する一方で、骨髄細胞は、複数のＣＣおよびＣＸＣケモカインおよびインターロイキンを発現する。さらに、老化メラノサイトは、いくつかのＢＭＰおよびＷＮＴ経路モジュレーター、ならびにＤｈｈ、Ｆｇｆ７およびＴｎｆを発現する。その結果として、こうした余分な毛包のシグナル伝達活性は、ＤＰ、ＨＧおよびバルジＳＣを含む休止期ＨＦ区画を変化させる。３つすべての区画は、一緒にいくつかのＣＣおよびＣＸＣサイトカインおよびインターロイキンをアップレギュレートする。ＤＰおよびバルジ細胞はまた、Ｓｐｐ１も顕著にアップレギュレートする。さらにＤＰ細胞は、Ｆｇｆ７／１０、Ｂｍｐ４ならびに選択された分泌ＢＭＰおよびＷＮＴアンタゴニストをアップレギュレートする一方で、ＨＧ細胞は、いくつかの古典的および非古典的ＷＮＴリガンドをアップレギュレートする。こうした老化メラノサイトが起こしたシグナル伝達の変化の結果として、バルジＳＣが静止状態から外れ、休止期ＨＦが毛周期に入るのが顕著に過剰活性化される。
【００７３】
マウス皮膚における毛周期活性化に関係するオステオポンチンシグナル伝達
オステオポンチンに対する転写物は、複数の母斑皮膚細胞種において最も顕著にアップレギュレートされるシグナル伝達因子の１つであった（図７Ｈおよび２２）。オステオポンチンがＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ皮膚においてタンパク質レベルで増加することが確認された。全体の皮膚に対するサイトメトリ解析は、ＷＴマウス（ｎ＝４）に対してＰ５６のＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ（ｎ＝４）ではオステオポンチン分泌細胞の著しい増加を示した（図７Ｉ）。一貫して、ＨＦ上皮細胞、免疫細胞および陽性である皮膚メラノサイトを含む複数の細胞種を伴うＰ５６の突然変異体の皮膚においてより高いオステオポンチンレベル（初期の約３５ｋＤａ形態および修飾された約６５ｋＤａ形態の両方）が、ウエスタンブロットによって（図７Ｊ）および免疫染色により検出された。対照Ｓｐｐ１＋／−レポーターマウスに対してＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｓｐｐ１＋／−レポーターマウスでオステオポンチン発現皮膚細胞の分布の幅広い増加もｌａｃＺ染色により確認された（図７Ｋおよび２３）。
【００７４】
次に、オステオポンチンがＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスの発毛形質において機能的役割を果たすかどうか、さらにそれがＷＴマウスにおいて新しい毛周期を誘導するのに十分であるかどうかを考察した。オステオポンチンの欠失が母斑皮膚において毛周期静止状態を取り戻すかどうかを試験するためにＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｓｐｐ１−／−マウスを形成した。実際に、ＨＦがＰ２３に既に異所性周期を開始する（図４Ｇおよび１１）Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスと比較して、まず、第２休止期の中間にあるＰ５２のＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｓｐｐ１−／−マウスにおいてのみ異所性成長期がはっきりとわかる（図７Ｌおよび１５Ｄ）。Ｐ１８〜６９日の間のＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｓｐｐ１−／−マウスおよび対照Ｓｐｐ１−／−マウスにおける毛周期を調べることによって（各遺伝子型あたりｎ≧２時点）、それが、Ｓｐｐ１が存在しない対照マウスではおおむね正常に進行することが確かめられた。これらの結果は、オステオポンチンは、通常の毛周期進行に必須ではないが、母斑皮膚の毛周期過剰活性化において重要な役割を果たしている可能性があることを示している。また、Ｐ５２後のＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｓｐｐ１−／−皮膚における異所性成長期ＨＦの出現（図１５）は、ＳＡＳＰの一部である他のシグナル伝達因子（図１２Ａ〜１２Ｂ）がオステオポンチンの減少を補うことができることを示している。
【００７５】
オステオポンチンが治癒している皮膚創傷の縁の免疫細胞および線維芽細胞において顕著にアップレギュレートされることを考慮して（Liaw et al., 1998； Mori et al., 2008）、ＷＴマウスのＨＦが創傷周辺において異所性成長期に入る場合、オステオポンチンが創傷誘導性毛周期活性化現象に関係している可能性があるかどうかが問われた。以前の研究は、この現象のシグナル伝達メディエーターの１つとしてＴｎｆを関係づけた（Wang et al., 2017b）。ここでは、ＷＴマウスと比較して、Ｓｐｐ１−／−マウスが創傷を負った１１日後の７ｍｍの全厚の創傷の周辺部において著しく少ない異所性成長期ＨＦを示すことが示されている（図７Ｍ）。また、対照のＢＳＡを吸収させたビーズと比較して、ＷＴマウスにおいて、オステオポンチンを吸収させたビーズの皮内注射の１２日後に、異所性成長期が顕著に誘導された（図７Ｎ）。まとめて、これらの結果は、オステオポンチンがＷＴマウスにおいて新しい毛周期を誘導するのに十分であること、ならびにそれが、炎症性成分、色素性母斑および創傷治癒を伴う少なくとも２つの皮膚状態では異所性毛周期をもたらすことを裏付ける。
【００７６】
オステオポンチン効果は、免疫細胞によってもたらされ、ある場合には、Ｃｄ４４を必要とする
骨髄細胞は、皮膚における炎症状態を含むさまざまな炎症状態と関連したオステオポンチンシグナル伝達に関するソースおよび標的である（Buback et al., 2009； Giachelli et al., 1998； Liaw et al., 1998； Mori et al., 2008）。このことならびにバルク（図８Ｄおよび８Ｅ）およびシングルセルＲＮＡ−ｓｅｑ（図８Ｇおよび２１）におけるＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ骨髄細胞のＳｐｐ１レベルの顕著な増加を考慮して、骨髄細胞が母斑皮膚形質をもたらすかどうかを考察した。まず、Ｐ５６のＬｙｓＭ−Ｃｒｅ；ｔｄＴｏｍａｔｏ対照骨髄細胞特異的レポーターマウスに対してＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ；ｔｄＴｏｍａｔｏ突然変異体の皮膚において著しく多いｔｄＴｏｍａｔｏ＋細胞が観察された（図８Ｈおよび８Ｈ’）。Ｓｐｐ１欠失は、Ｓｐｐ１−／−；ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ；ｔｄＴｏｍａｔｏ対照マウスと比較して、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｓｐｐ１−／−；ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ；ｔｄＴｏｍａｔｏマウスにおけるＰ５６の皮膚の骨髄細胞浸潤（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を低減した（図８Ｉおよび８Ｉ’）。Ｐ４７のＬｙｓＭ−Ｃｒｅ；ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスへのオステオポンチンの皮内注射は、ＢＳＡ対照と比較して、２４時間後に骨髄細胞浸潤（ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）の有意な増加をもたらした（図８Ｊおよび８Ｊ’）。Ｐ５４のＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ；Ｒｏｓａ−ｒｔＴＡ；ｔｅｔＯ−ＤＴＡマウスは、ＤＴＡが関係する骨髄細胞欠乏を誘導するためにドキシサイクリンでも処置した。Ｒｏｓａ−ｒｔＴＡまたはｔｅｔＯ−ＤＴＡコンストラクトのいずれかを欠くドキシサイクリン処置した同腹仔の対照動物と比較して、ドキシサイクリン処置の６日後に有意に少ない異所性成長期ＨＦが観察された（図８Ｋおよび８Ｋ’）。
【００７７】
次に、オステオポンチンに対する受容体であるＣｄ４４（Weber et al., 1996）が母斑皮膚においてその効果をもたらすかどうかを調べた。ＲＮＡ−ｓｅｑにより、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスおよび対照マウスの両方のバルジおよびＨＧ前駆細胞を含む複数の皮膚細胞種においてＣｄ４４が高発現していた（図９Ａ）。Ｃｄ４４は、選択的スプライシングアイソフォームを生じ、標準的なＣｄ４４およびいくつかの変異型Ｃｄ４４ｖアイソフォームを含む。転写物アイソフォームに関するＲＮＡ−ｓｅｑデータのプロフィールを調べ、細胞種特異的Ｃｄ４４アイソフォームエンリッチメントパターンを特定した（図９Ｂ）。バルジおよびＨＧ前駆細胞は、特に、エクソンｖ６およびｖ７を含むＣｄ４４ｖアイソフォームが豊富であり、これは、以前にオステオポンチンシグナル伝達に関係することが関連付けられた（Ponta et al., 2003において概説されている）。Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｃｄ４４＋／−レポーターマウスおよび対照Ｃｄ４４＋／−レポーターマウスにおけるｌａｃＺ染色により、バルジＳＣを含む皮膚におけるＣｄ４４の広範な発現が確認された（図９Ｃ、２５Ａおよび２５Ｂ）。機能的に、オステオポンチンを吸収させたビーズに応じた異所性成長期の誘導は、ＷＴ対照マウスに対してＣｄ４４−／−突然変異体で著しく抑制された（図９Ｄおよび９Ｄ’）。同様に、ＷＴ対照マウスに対してＣｄ４４−／−突然変異体の創傷周辺で有意に少ない異所性成長期ＨＦが誘導された（図９Ｅおよび９Ｅ’）。Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｃｄ４４−／−マウスのＣｄ４４欠失が、異所性毛周期を部分的に取り戻し（図９Ｆ、９Ｆ’、９Ｇ、および９Ｇ’）、これは、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１ＫバックグラウンドにおけるＳｐｐ１欠失の影響の表現型模写である。Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｃｄ４４−／−マウスのすべてのＨＦは、Ｐ４４に休止期であり（図９Ｆ）、異所性成長期ＨＦはまずＰ５２に現れ、その後、段々に増加した（各遺伝子型あたりｎ≧２時点）（図９Ｇ’および２６Ａ〜２６Ｄ）。Ｃｄ４４欠失単独では、最初の２回の毛周期の通常の進行を著しく変化させることはなかったことも確かめられた（図９Ｆ、９Ｆ’および２６Ａ〜２６Ｄ）。これらの結果は、母斑皮膚におけるオステオポンチンの発毛活性化効果がＣｄ４４シグナル伝達を必要とすることを示す。
【００７８】
ＷＮＴシグナル伝達は母斑皮膚の毛周期過剰活性化に必須ではない
母斑皮膚における過剰活性化毛周期は、古典的ＷＮＴリガンドを過剰発現するＫ１４−Ｗｎｔ７ａマウスの形質と類似している（Plikus et al., 2011）。ＷＮＴシグナル伝達は、生理的な毛周期活性化に関与し（Choi et al., 2013； Greco et al., 2009； Kandyba et al., 2013； Lien et al., 2014； Lowry et al., 2005）、それは、高められ、色素性母斑形成の初期段階に至らせる（Pawlikowski et al., 2013）。ＷＮＴレポーター活性細胞の中心は、一貫してＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；ＴＯＰＧＡＬマウスの真皮に見出された（図４Ｆおよび２８Ａ）。同時に、本発明者らのＲＮＡ−ｓｅｑ解析は、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ皮膚のメラノサイトおよび骨髄細胞のいずれも古典的ＷＮＴリガンドを過剰発現していないことを示唆している（図７Ｄおよび８Ｄ）。母斑毛周期形質におけるＷＮＴシグナル伝達の機能的関連性を確認するために、その活性を、いくつかのマウスモデルを使用してブロッキングした。メラノサイトからのＷＮＴシグナル伝達は、可溶性ＷＮＴアンタゴニストＤｋｋ１を過剰発現することまたはＷＮＴリガンド分泌に必須のＷｌｓを切断することのいずれかによって標的化された。Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｔｙｒ−ｒｔＴＡ；ｔｅｔＯ−Ｄｋｋ１マウス（Ｐ０からのドキシサイクリンにより誘導される）およびＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｔｙｒ−ＣｒｅＥＲＴ２；Ｗｌｓｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウス（Ｐ０〜Ｐ５の間のタモキシフェンにより誘導される）はともに、Ｐ２１およびＰ５６において顕著な異所性成長期を示し続ける（図２７Ｂおよび２７Ｃ）。さらに、広範なＤｋｋ１過剰発現は、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ；Ｋｒｔ５−ｒｔＴＡ；ｔｅｔＯ−Ｄｋｋ１マウス（Ｐ０からのドキシサイクリンにより誘導される）において上皮特異的なプロモーターを使用して誘導された。しかしながら、これも、異所性毛周期を抑制する（ｓｕｐｒｅｓｓ）ことができなかった（図２７Ｄ）。同時に、通常の毛周期活性化は、Choi et al． (2013)による報告と一致してドキシサイクリン誘導性Ｋｒｔ５−ｒｔＴＡ；ｔｅｔＯ−Ｄｋｋ１対照マウスでは妨げられた。総合して、このデータは、母斑皮膚の毛周期過剰活性化が決定的にはＷＮＴシグナル伝達によるものではないことを示す。
【００７９】
ヒト有毛色素母斑はオステオポンチン発現をアップレギュレートする
ヒトにおける有毛色素母斑のシグナル伝達の特徴も調べた。全組織ＲＮＡ−ｓｅｑは、有毛母斑と近傍の正常な顔皮膚との間の顕著なトランスクリプトームの差、ならびに患者間のばらつきを明らかにした（図８Ａ〜８Ｃ）。予想どおり、ヒト母斑皮膚は、メラニン形成遺伝子：ＢＣＡＮ、ＤＣＴ、ＧＰＲ１４３、ＭＩＴＦ、ＭＬＡＮＡ、ＭＬＰＨ、ＰＭＥＬ、ＴＹＲおよびＴＹＲＰ１が豊富であることを示した。また、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスメラノサイトのデータと一致して、ヒト母斑は、腫瘍抑制因子ＣＤＫＮ２Ａ、ＧＡＳ５、ＬＺＴＳ１、ＭＩＡおよび有糸分裂マーカー、ＡＮＫＲＤ５３、ＭＡＤ１Ｌ１、ＮＥＫ６、ＰＳＲＣ１をアップレギュレートした（図８Ｄ）。ヒト母斑は、分泌因子のうち、いくつかのＴＧＦβ／ＢＭＰ経路メンバー、ＧＤＦ１／１０／１１／１５、ＢＡＭＢＩ、ＷＮＴモジュレーター、ＤＫＫＬ１、ＦＲＺＢ、ならびにＣＣＬ１８、ＩＬ１７Ｄ、ＰＤＧＦＤおよびＳＰＰ１をアップレギュレートした（図８Ｄ）。比較して、ほんの小数のセクレトーム因子（ｓｅｃｒｅｔｏｍｅ  ｆａｃｔｏｒ）が、ヒト有毛母斑ならびにＴｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋマウスメラノサイトおよび骨髄細胞の間で共有されており、これは、種特異的なシグナル伝達の差を示唆する（図８Ｅ）。興味深いことに、ＳＰＰ１は、そのような共有因子の１つであり、これは、ｑＲＴ−ＰＣＲ（図８Ｆ）によっておよび免疫染色（図８Ｇ〜８Ｉおよび８Ｇ’〜８Ｉ’）によって確認された。ＳＰＰ１発現の増加は、毛包間真皮において、顕著であり、ここでは（ｗｅｒｅ）、多くのＳＰＰ１陽性細胞は、マクロファージマーカーＣＤ１１Ｂも共発現する（図８Ｉ’）。また、成長期ＨＦのバルジおよび毛球領域周辺の母斑皮膚において、多くのＳＰＰ１／ＴＲＰ２二重陽性メラノサイトが見られた（図８Ｈ’）。総合して、このデータは、ＳＰＰ１過剰発現がヒト母斑における発毛過剰活性化と相互に関係することを示唆する。
【００８０】
実施例５の所見の考察
ＦＡＣＳ選別により精製したメラノサイト、バルジ、ＤＰ、ｓＨＧ、および骨髄細胞のゲノム全域にわたる相互比較を使用して、老化した色素性母斑皮膚における毛包幹細胞（ｈａｉｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）活性化のための新規のＳＡＳＰ分子としてオステオポンチンを特定した。オステオポンチンは、マウスの子宮で発現する（Qi et al., 2014）が、オステオポンチンノックアウト（Ｓｐｐ１−／−）マウスが生存可能で全体的に正常であるため（Liaw et al., 1998）、その機能は余分なようである。成体では、オステオポンチン発現のレベルは、損傷後または細胞形質転換などのその他の病理学的な状況下においてアップレギュレートされる（Mori et al., 2008； Zhou et al., 2005）。オステオポンチンの発現パターンは、種々の刺激に応じてその多機能の特長を反映する（Cooper et al., 2005； Liu et al., 2004）。正常な皮膚では、それは、バルジおよびｓＨＧには存在せず、このことは、ＳＣ区画におけるオステオポンチンの複製を阻害する役割を示唆する。オステオポンチンは、メラノサイト、ＤＰ、および皮膚の骨髄細胞において毛周期依存的様式で発現するが、Ｓｐｐ１−／−マウスで通常の周期的な発毛が観察されたため、オステオポンチンは通常のＨＦ  ＳＣ再生に必須でない。しかしながら、これは、母斑皮膚における早発の発毛に関与しており、このことは、Ｓｐｐ１−／−マウスにおいてオステオポンチンが欠失した場合のＨＦ  ＳＣを再生する能力の低下によって立証されている。この所見は、Ｓｐｐ１−／−マウスにおいて変化した創傷治癒に関連して以前に証明された（Liaw et al., 1998）ストレスセンサーとしての全般的な役割を強調するものである。
【００８１】
皮膚は、複数の細胞種を有するさまざまな構造からなる複雑な器官として働く。特定の機能を与える、それらのそれぞれとの相互作用がＳＣ再生に関与する。オステオポンチンは、母斑皮膚のメラノサイト、バルジ、ＤＰ、および骨髄性集団においてアップレギュレートされていた。通常のＨＦ  ＳＣ再生は、近隣のニッチ細胞ＤＰ（Rendl et al., 2008）および脂肪細胞などの皮膚の他の細胞種の両方によって制御される（Festa et al., 2011； Plikus et al., 2008）。一方で、ＨＦニッチ細胞ＤＰ（９．８倍）およびバルジＳＣ（７３．９倍）におけるオステオポンチンのアップレギュレーションは、ＨＦ  ＳＣ再生に対するオステオポンチンの作用様式がニッチおよびＳＣ自体の調節による直接的なものである可能性があることを示唆する。他方では、オステオポンチン高発現老化メラノサイト（１１．８倍）は、骨髄細胞を動員し、それらの細胞におけるオステオポンチン発現を増加させる（３０．２倍）ことが可能であり、これは、他の細胞種を敏感にし、母斑皮膚にオステオポンチンをもたらす陽性フィードバックループを示唆する。しかしながら、この早発成長期毛髪形質（ａｎａｇｅｎ  ｈａｉｒ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）は、骨髄細胞が欠乏すると失われ、このことは、母斑皮膚において発毛を促進する際の骨髄細胞の重要な役割を示唆する。ＳＣは、通常近くにあり、迅速応答性パラクライン因子を産生することができるそのニッチによって調節されるが、異なる機能を有するさまざまな細胞種を含む皮膚の余分なニッチも通常のＳＣ再生に関与する。この関連で、本発明者らの所見は、老化細胞の存在下において毛周期を調節するＳＣとの余分なニッチ細胞の相互作用の概念を裏付ける。
【００８２】
オステオポンチンの由来は複雑である（それは、老化メラノサイトまたは骨髄細胞由来であろう）が、それは、老化皮膚におけるＨＦ  ＳＣの再生に活性な役割を有するようである。ＳＡＳＰの特長は、免疫細胞を引き寄せることである。腫瘍における老化細胞は、ＳＡＳＰにより免疫細胞を動員することができ、腫瘍の消去を可能にする（Xue et al., 2007）一方で、長期のＳＡＳＰは、腫瘍増殖、移動、および浸潤を亢進する可能性があり（Bavik et al., 2006）、このことは、老化環境における免疫細胞の異なる機能を示している。ＳＡＳＰ因子は、主に培養物中で特徴づけられ、老化細胞において見出され（Capell et al., 2016； Coppe et al., 2008； Pawlikowski et al., 2013）、それらは、増殖因子、ケモカイン、およびＥＣＭリモデリング酵素が豊富な改変された発現プロフィールを有する。母斑由来の因子の一覧は、広範囲にわたる。ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ３、およびＩＬ１Ｂなどの一連のＳＡＳＰ因子（サイトカインおよびケモカイン）が、骨髄細胞において見出されるが、老化メラノサイトでは見出されなかった一方で、マトリックスメタロプロテイナーゼ（それぞれ骨髄細胞においてＭＭＰ３、１２、および１４および老化メラノサイトにおいてＭＭＰ１１および２３）は、両細胞種において改変されていた。オステオポンチンの発現は、パラクライン／オートクリンシグナルを伝達する際に隣接細胞の挙動に影響がある。
【００８３】
実施例５で使用した実験手順
マウスモデル
すべての実験は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｉｒｖｉｎｅ’ｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅガイドラインに従って行った。Ｂ６．１２９Ｓ６（Ｃｇ）−Ｓｐｐ１ｔｍ１Ｂｌｈ／Ｊ（Liaw et al., 1998）、Ｂ６．１２９（Ｃｇ）−Ｃｄ４４ｔｍ１Ｈｂｇ／Ｊ（Protin et al., 1999）、Ｂ６（Ｃｇ）−Ｔｙｒｃ−２Ｊ／Ｊ（Townsend et al., 1981）、Ｂ６．ＣＢ１７−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／ＳｚＪ（Blunt et al., 1995）、Ｂ６；１２９Ｓ−Ｓｏｘ２ｔｍ２Ｈｏｃｈ／Ｊ（Arnold et al., 2011）、Ｔｙｒ−ＮｒａｓＱ６１Ｋ（Ackermann et al., 2005）をＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入した。骨髄細胞系統特異的欠乏のテトラサイクリン制御性三重変異体マウスを、ＬｙｓＭ−Ｃｒｅ、Ｒｏｓａ−ｒｅＴＡおよびＴｅｔＯＤＴＡを交配することによって作り出した（Chen et al., 2015）。
【００８４】
ＥｄＵパルスチェイス
１か月齢のマウスに連続する７日間毎日ｉ．ｐ．によりＥｄＵ（５μｇ／ｇ体重）を注射し、その後、８週間の追跡期間を続けた。マウスの背側の皮膚を採取し、半分を４％ＰＦＡ中で固定し、パラフィンに包埋し、ＥｄＵイメージングキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を使用して免疫組織化学（ＩＨＣ）によって調べた。残りの半分を、ＥｄＵフローキット（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ）を使用したフローサイトメトリー定量化に使用した。毛胞の総数のうちのＥｄＵ陽性細胞を示すＩＨＣおよび三重陽性ＣＤ３４＋ＣＤ４９ｆ＋ＥｄＵ＋細胞を分析するＦＡＣＳの両方を使用して、ＥｄＵ陽性細胞を定量した。各動物あたり少なくとも２つの切片および群あたり３から５匹の動物を解析に使用した。
【００８５】
皮内タンパク質注射
タンパク質を吸収させたアガロースビーズの皮内デリバリーをPlikus 2008に従って行った。簡単にいえば、組み換えマウスＳＰＰ１タンパク質（Ｒ＆Ｄ）を０．１％ＢＳＡ中で１．３ｍｇ／ｍｌの最終濃度で再構成した。アフィゲルブルーゲルビーズ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を滅菌ＰＢＳ中で３回洗浄した後、注射前の１時間、氷上で０．１％ＢＳＡ中の組み換えタンパク質（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を用いて再懸濁させた。組み換えＳＰＰ１タンパク質およびＢＳＡ対照の両方に関して、最初のビーズ植込みの２４、４８、および７２時間後を含む連続した４日間毎日の注射を、２６Ｇ針を使用して同じ皮膚領域に行ってパウチを作り出し、その後、ガラスマイクロピペットによってデリバリーして、ｐ５１からｐ５３に背中の皮膚の下において微量注入器を使用して約１００ビーズ／２０μｌビーズ溶液を導入した。
【００８６】
組織学および免疫組織化学
パラフィン包埋した切片に関して、背中の皮膚を４℃で一晩４％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）により固定した後、２０％、５０％、および７０％のエタノールにより脱水した。切片をＰＢＳ＋０．１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（ＰＢＳＴ）中で１５分間透過処理し、ＰＢＳＴ＋３％ＢＳＡを使用して室温で少なくとも１時間ブロッキングした。マウスＡｂを製造業者の説明書に従ってＭ．Ｏ．Ｍ．ブロックキットを用いてブロッキングした。一次抗体（Ａｂ）を４℃で一晩インキュベーションし、二次Ａｂを室温で１時間インキュベーションした。凍結切片をＯｐｔｉｍａｌ  Ｃｕｔｔｉｎｇ  Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅコンパウンド（ＯＣＴ）中で凍結保存した。以下の抗体および希釈を使用した。Ｓｐｐ１（１：２０、ヤギ、Ｒ＆Ｄ）、ＣＤ４５（１：１００、ウサギ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｆ４／８０（１：１００、ウサギ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。核を４０６０−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で染色した。β−ｇａｌ染色に関して、薄い切片（２０μｍ）を１．３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  Ｋ３Ｆｅ（ＣＮ）６、および３ｍＭ  Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６を含むＰＢＳ中の１ｍｇ／ｍｌのＸ−ｇａｌ基質において３７℃で一晩インキュベーションした。標準的な方法を用いてヘマトキシリンおよびエオシン染色を行った。ＩｍａｇｅＪを使用して陽性面積パーセントを算出した。すべての画像は、Ｎｉｋｏｎ解剖顕微鏡またはＮｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅ正立顕微鏡を用いて取り込んだ。
【００８７】
ウエスタンブロット
マウスの背中全体の皮膚から単一の細胞をプロテアーゼインヒビターのカクテルを含むＲＩＰＡバッファー（Ｒｏｃｈｅ）中に溶解させた。２５μｇの各細胞溶解物（群あたりｎ＝３サンプル）を１２％分離Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルに載せた。そのタンパク質をニトロセルロース膜に転写した。その膜を２．５μｇ  ｍｌ−１の濃度のＳｐｐ１一次抗体または抗ＧＡＰＤＨとともにインキュベーションした。そのブロットをＥｎｈａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｐｌｕｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐｅｒにより現像した。
【００８８】
リアルタイムＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）をそのオンカラムデオキシリボヌクレアーゼ消化手順と一緒に使用してＦＡＣＳ選別細胞から全ＲＮＡを抽出した。この全ＲＮＡを、その後、Ｏｌｉｇｏ−ｄＴの存在下においてＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって逆転写した。完全長ｃＤＮＡをハウスキーピング遺伝子（ｈｏｕｓｅ  ｋｅｅｐ  ｇｅｎｅ）ＧＡＰＤＨまたは１８ｓを使用して等しい量に正規化した。
【００８９】
細胞単離および選別
単一細胞懸濁液に関して、真皮から表皮を分離するためにＤｉｓｐａｓｅ  ＩＩ溶液（Ｒｏｃｈｅ）中で背中の皮膚をインキュベーションした。真皮および／または表皮をコラゲナーゼＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により３７℃で消化して単一の細胞にした。これらの皮膚の単一細胞をストレーナ（７０μＭに続いて４０μＭ）を用いてろ過した。細胞生死判別色素（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ）を使用して、死んだ細胞を排除した。ゲートされた生細胞をＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において選別した。ＦＡＣＳ取得は、ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）において行い、その後、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＦｌｏｗＪｏ）を用いて解析した。
【００９０】
バルクおよびシングルセルＲＮＡシーケンシング
Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ  Ｐｉｃｏチップによって求めたＲＩＮ値（ＲＩＮ：ＲＮＡ  ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ  ｎｕｍｂｅｒ）＞９．１を有する３つの生物学的トリプリケートを含むＦＡＣＳ選別細胞からの全ＲＮＡをｃＤＮＡ合成および増幅のために選択した。完全長ｃＤＮＡ合成のために１ｎｇのｍＲＮＡを使用した後、Ｓｍａｒｔ−ｓｅｑ２標準手順に従ったＰＣＲ増幅を続けた。Ｎｅｘｔｅｒａ  ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してｃＤＮＡライブラリーを構築した。ライブラリーは、４３ｂｐペアリードを使用してライブラリーあたり１０〜３０百万リードの平均深度までＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔ−Ｓｅｑ５００システムにおいて配列を決定した。
【００９１】
Ｃ１プラットフォームにおけるシングルセルＲＮＡ−ｓｅｑ（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ）サンプル調製に関して、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１手順に従ってＦｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１チップを使用してマウスの背中の皮膚からの選別細胞を捕捉した。チップ充填のために１ｍｌあたり２００，０００〜３５０，０００細胞の濃度を使用した。細胞捕捉後、チップを顕微鏡下において視覚的に調べて、捕捉率を特定し、空のチャンバーまたは複数の細胞を含むチャンバーを後の解析から除外した。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｃｅｌｌ  Ａｕｔｏ  Ｐｒｅｐ  ＳｙｓｔｅｍにおいてＣｌｏｎｔｅｃｈ  ＳＭＡＲＴｅｒ  Ｕｌｔｒａ  Ｌｏｗ  ＲＮＡキットおよびＡＤＶＡＮＴＡＧＥ−２  ＰＣＲキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いてｃＤＮＡを合成および増幅した。ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを９６−ウェルプレートにＦｌｕｉｄｉｇｍ  Ｃ１マニュアルに従ってＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  ＤＮＡ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキットを使用して構築した。複合ライブラリーをフラグメント分布に関してＡｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより解析し、Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍのユニバーサルライブラリー定量キットを使用して定量した。ライブラリーを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔ−Ｓｅｑ５００プラットフォームにおいて７５ｂｐペアエンドリードとして配列を決定した。ＲＮＡ−ｓｅｑリードを、まずパラメータ‘−−ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｍａｘ  １０  −−ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｉｓｍａｔｃｈＮｏｖｅｒＲｅａｄＬｍａｘ  ０．０７  −−  ｏｕｔＦｉｌｔｅｒＭｕｌｔｉｍａｐＮｍａｘ  １０’を用いてＳＴＡＲ  ｖ．２．４．２ａ（Dobin et al., 2013）を使用してリファレンスマウスゲノム（ｍｍ１０／ｇｅｎｏｃｏｄｅ、ｖＭ８）に対してアライメントした。遺伝子発現レベルを、Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ（ＦＰＫＭ）に正規化した発現値を用いてＲＳＥＭ  ｖ．１．２．２５（Li and Dewey, 2011）を使用して定量した。＞９，０００，０００の１箇所にマッピングされたリード（ｕｎｉｑｕｅｌｙ  ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄ）および＞６０％の１箇所へのマッピング効率（ｕｎｉｑｕｅｌｙ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）を示すサンプルを下流分析のために考慮した。差次的発現分析は、タンパク質コード遺伝子およびｌｎｃＲＮＡに対してｅｄｇｅＲ  ｖ．３．２．２（Robinson et al., 2010）を使用して行った。差次的に発現した遺伝子を、倍率変化（ＦＣ）≧２、偽発見率（ＦＤＲ）＜０．０５および百万リードあたりの数（ＣＰＭ）≧２を使用することによって選択した。
【００９２】
実施例５の参照文献
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【００９３】
上で開示されている実施形態の特定の特長および態様のさまざまな組み合わせまたは部分的な組み合わせを行うことができ、それらもやはり１つ以上の本発明の範囲内にあることが意図される。さらに、ある実施形態に関連する任意の個々の特長、態様、方法、性質、特徴、品質、特性、要素、または同種のものの本明細書における開示は、本明細書中に記載されているすべての他の実施形態に使用することができる。したがって、当然のことながら、開示された実施形態のさまざまな特長および態様は、本開示の発明の異なる様式を形成するために互いに組み合わされてもよく、または置き換えられてもよい。したがって、本明細書において開示されている本発明の範囲は、上記の個々の開示された実施形態によって限定されるべきではないことが意図される。さらに、本発明は、さまざまな改変物および代替的形態が可能であるが、その特定の例が図において示され、詳細に本明細書に記載されている。ただし、本発明は開示されている特定の形態または方法に限定されないが、反対に、本発明は、記載されている各種実施形態および添付の特許請求の範囲の趣旨および範囲内にあるすべての改変物、等価物、および代替物を含むことになることが理解されるべきである。本明細書中で開示されている任意の方法は、列挙された順序で行われる必要はない。本明細書中で開示されている方法は、専門家が行う特定の行為を含むが、明示的にまたは黙示によってのいずれかでそれらの行為のあらゆる第三者への指示も含むことができる。例えば、「少なくとも１つの老化細胞種を移植すること」などの行為は、「少なくとも１つの老化細胞種の移植を教示すること」を含む。さらに、本開示の特長または態様がマーカッシュ群として記載されている場合、当業者は、本開示も、それによりマーカッシュ群の複数のメンバーの任意の個々のメンバーまたはサブグループとして記載されていることを認識するであろう。
【００９４】
本明細書中で開示されている範囲はまた、任意およびすべての重なる部分、部分範囲、およびそれらの組み合わせも包含する。「最大」、「少なくとも」、「〜を超える」、「未満」、「〜の間」および同種のものは、挙げられた数を含む。「約」または「およそ」などの用語が前につく数は、挙げられた数を含む。例えば、「少なくとも１つの因子〜」は、「１つの因子」を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図６−９】
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【図６−１０】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図８−４】
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【図８−５】
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【図８−６】
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【図８−７】
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【図８−８】
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【図８−９】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図９−５】
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【図９−６】
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【図９−７】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１０−７】
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【図１０−８】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２７−１】
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【図２７−２】
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【図２７−３】
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【図２７−４】
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【国際調査報告】
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