(57)【要約】  組成物、および移植戦略によって細胞を固形臓器に移植する方法が提供される。これらの方法および組成物を使用して、病変器官を修復したり、実験的宿主の疾患状態のモデルを確立したりすることができる。本方法は、組織または器官の表面上への付着、パッチグラフト、早期系統段階間葉細胞を支持する上皮細胞を含む「バンドエイド様」カバーを含む。細胞は、ドナー細胞の幹細胞性を集合的に支持する、無血清の定義された条件下で調製されたゲル形成生体材料に組み込まれる。移植片は、移植片を標的部位に固定するために使用される生分解性、生体適合性、生体吸収性の裏打ちで覆われる。移植片内の細胞は、二週間以内にレシピエント（宿主）組織内に均一に分散されるように、組織全体へと移動する。器官または組織へのドナー細胞の生着および統合のメカニズムには、ＭＭＰの複数の膜結合型および分泌型が関与する。【選択図】図１−１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の混合集団を持続させ維持するためのパッチグラフトであって、
（ａ）二つ以上の細胞型を有する混合集団であって、そのうちの少なくとも一つが膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現する能力のある早期系統段階にあり、ハイドロゲル中の培地で支持される前記混合集団は、前記パッチグラフト内または前記パッチグラフトから離れる前記混合集団の移動を可能にするのに十分な粘弾性を有する、混合集団と、
（ｂ）裏打ちまたはバリアの方向に前記混合集団の移動を阻害するのに十分な粘弾性を有する、生体適合性、生分解性材料を含む前記裏打ちと、を含み、
前記混合集団を持続および維持する一方で、前記少なくとも一つの早期系統段階細胞型が、膜結合型および／または分泌型ＭＭＰをもはや発現できない後期系統段階への分化またはさらなる成熟を阻害するように構成されている、パッチグラフト。
【請求項２】
前記裏打ちがハイドロゲルが注入された多孔性メッシュを含む、請求項１に記載のパッチグラフト。
【請求項３】
（ｃ）前記裏打ちの漿膜表面上に重ねられたハイドロゲルであって、前記漿膜表面が前記混合集団と接触しているものと反対側にある、ハイドロゲルをさらに含む、請求項１に記載のパッチグラフト。
【請求項４】
要素（ａ）の前記ハイドロゲルが一つまたは複数のヒアルロナンを含む、請求項１に記載のパッチグラフト。
【請求項５】
要素（ｂ）の前記ハイドロゲルが一つまたは複数のヒアルロナンを含む、請求項２に記載のパッチグラフト。
【請求項６】
要素（ｃ）の前記ハイドロゲルが一つまたは複数のヒアルロナンを含む、請求項３に記載のパッチグラフト。
【請求項７】
前記培地が、クボタの培地、または「幹細胞性」を支持するその他の培地を含む、請求項１に記載のパッチグラフト。
【請求項８】
前記混合集団が、間葉細胞および上皮細胞を含む、請求項１に記載のパッチグラフト。
【請求項９】
前記間葉細胞が、早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）を含む、請求項８に記載のパッチグラフト。
【請求項１０】
前記ＥＬＳＭＣが、血管芽細胞、血管内皮の前駆体、または星状細胞の前駆体または間葉幹細胞（ＭＳＣ）のうち一つまたは複数を含む、請求項９に記載のパッチグラフト。
【請求項１１】
前記上皮細胞が上皮幹細胞を含む、請求項８に記載のパッチグラフト。
【請求項１２】
前記上皮細胞が胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）を含む、請求項８に記載のパッチグラフト。
【請求項１３】
前記上皮細胞が、コミットしたおよび／または成熟上皮細胞を含む、請求項８に記載のパッチグラフト。
【請求項１４】
前記コミットしたおよび／または成熟上皮細胞が、成熟実質細胞を含む、請求項１３に記載のパッチグラフト。
【請求項１５】
前記成熟実質細胞が、肝細胞、胆管細胞、および膵島細胞のうちの一つまたは複数を含む、請求項１４に記載のパッチグラフト。
【請求項１６】
前記間葉細胞および上皮細胞の両方が、幹細胞を含む、請求項８に記載のパッチグラフト。
【請求項１７】
前記混合集団が、自己および／または同種細胞を含む、請求項１に記載のパッチグラフト。
【請求項１８】
一つまたは複数の細胞型が、遺伝学子組み換えされている、請求項１に記載のパッチグラフト。
【請求項１９】
前記裏打ちが、多孔性メッシュ、スカフォールド、または膜を含む、請求項１に記載のパッチグラフト。
【請求項２０】
前記裏打ちが非多孔性材料を含む、請求項１に記載のパッチグラフト。
【請求項２１】
前記非多孔性材料が、絹、羊膜、胎盤、網、合成繊維、前述の誘導体、またはその組み合わせから選択される、請求項２０に記載のパッチグラフト。
【請求項２２】
前記裏打ちが、機械力に耐えるのに十分な弾性を有し、標的器官または組織につなぐことができ、曲率のある場所につなぐのに十分な可撓性を有する、請求項１に記載のパッチグラフト。
【請求項２３】
生体材料が、前記細胞集団を持続および維持する能力を持ち、前記パッチグラフト内または前記パッチグラフトから離れる前記細胞集団の移動を可能にするのに十分なレオロジー特性（例えば、粘弾性）を有する限り、任意の生体材料（ハイドロゲル以外）を利用することができる、請求項１に記載のパッチグラフト。
【請求項２４】
細胞の集団を持続させ維持するためのパッチグラフトであって、
（ａ）細胞の集団（随意に単一型）であって、ハイドロゲルまたは他の生体材料の培地で支持され、前記パッチグラフト内または前記パッチグラフトから離れる前記細胞の移動を可能にするのに十分なレオロジー特性（例えば、粘弾性）を有する、細胞の集団と、
（ｂ）裏打ちの方向に前記細胞集団の移動を阻害（またはバリアを提供）するのに十分な粘弾性を有する、生体適合性、生分解性材料を含む前記裏打ちと、を含む、パッチグラフト。
【請求項２５】
機械力に耐えるのに十分な粘弾性および弾性を備えたハイドロゲルまたは他の生体材料を含み、そのような力には他の組織および器官からのものを含む、パッチグラフトまたは組織のためのカバーまたはコーティング。
【請求項２６】
ハイドロゲルまたは他の同等の生体材料で表面をカバーまたはコーティングすることを含む、機械力または他の器官および組織からの接触を伴うまたはそれから生じる癒着を防止する方法。
【請求項２７】
標的組織にパッチグラフトを接触させることを含む、前記標的組織に細胞を生着させる方法であって、
（ａ）二つ以上の細胞型を有する混合集団であって、そのうちの少なくとも一つが膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現する能力のある早期系統段階にあり、ハイドロゲル中の培地で支持される前記混合集団は、標的組織に向かっておよび標的組織内への前記混合集団の移動を可能にするのに十分な粘弾性を有する、混合集団と、
（ｂ）標的組織から離れ、裏打ちまたはバリアを通る、前記混合集団の移動を阻害するのに十分な粘弾性を有する、生体適合性、生分解性材料を含む前記裏打ちと、を含む、方法。
【請求項２８】
前記パッチグラフト内に含まれる前記細胞が、前記組織に組み込まれることを可能にすることをさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記標的組織は、肝臓、膵臓、胆管、甲状腺、胸腺、胃腸、肺、前立腺、乳房、脳、膀胱、脊髄、皮膚、子宮、腎臓、筋肉、血管、心臓、軟骨、腱、および骨組織からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記標的組織が肝組織である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記標的組織が膵臓組織である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記標的組織が胆管組織である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記標的組織が胃腸組織である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記標的組織が腎組織である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記標的組織が器官である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記器官が、筋骨格系、消化器系、呼吸器系、泌尿器系、女性生殖器系、男性生殖器系、内分泌系、循環器系、リンパ系、神経系、または外皮系の器官である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記器官が、肝臓、膵臓、胆管、甲状腺、胸腺、腸、肺、前立腺、乳房、脳、膀胱、脊髄、皮膚、子宮、腎臓、筋肉、血管、心臓、軟骨、腱、および骨からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
標的組織にパッチグラフトを接触させることを含む、標的組織に細胞を生着させる方法であって、前記パッチグラフトが、
（ａ）細胞の集団であって、早期系統段階を有する一つの集団を含み、ハイドロゲルまたは他の生体材料の培地で支持される単一型または複数型の細胞を含み、前記パッチグラフト内または前記パッチグラフトから離れる前記集団の細胞の移動を可能にするのに十分なレオロジー特性（例えば、粘弾性）を有する、細胞の集団と、
（ｂ）裏打ちの方向に前記集団の細胞の移動を阻害（またはバリアを提供）するのに十分なレオロジー特性（例えば、粘弾性）を有する、生体適合性、生分解性材料を含む前記裏打ちと、を含み、
前記パッチグラフトが、細胞の前記集団を持続および維持する一方で、早期系統段階を有する前記一つの集団が、後期系統段階への分化またはさらなる成熟を阻害するように構成されている、方法。
【請求項３９】
早期系統段階を有する前記一つの集団が、膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現する能力を持つ、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
肝臓疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、前記方法は前記対象の肝臓にパッチグラフトを接触させることを含み、（ａ）二つ以上の細胞型を有する混合集団であって、そのうちの少なくとも一つが膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現する能力のある早期系統段階にあり、ハイドロゲル中の培地で支持される前記混合集団は、標的組織に向かっておよび標的組織内への前記混合集団の移動を可能にするのに十分な粘弾性を有する、混合集団と、
（ｂ）標的組織から離れる方向に、裏打ちまたはバリアを通る、前記混合集団の移動を阻害するのに十分な粘弾性を有する、生体適合性、生分解性材料を含む前記裏打ちと、を含み、
前記パッチグラフト内に含まれる前記細胞が前記肝臓に組み込まれることを可能にし、それによって肝機能をある程度回復させる、方法。
【請求項４１】
前記肝疾患または障害は、肝線維症、肝硬変、ヘモクロマトーシス、肝臓がん、胆道閉鎖症、非アルコール性脂肪性肝疾患、肝炎、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、肝蛭症、アルコール性肝疾患、α１−アンチトリプシン欠損症、糖原病ＩＩ型、トランスサイレチン関連遺伝性アミロイドーシス（ａｍｙｌｏｉｄｏｉｓｉｓ）、ジルベール症候群、原発性胆汁肝硬変、原発性硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、肝外傷またはウィルソン病である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
膵臓の疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、前記方法は前記対象の膵臓にパッチグラフトを接触させることを含み、（ａ）二つ以上の細胞型を有する混合集団であって、そのうちの少なくとも一つが膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現する能力のある早期系統段階にあり、ハイドロゲル中の培地で支持される前記混合集団は、標的組織に向かっておよび標的組織内への前記混合集団の移動を可能にするのに十分な粘弾性を有する、混合集団と、
（ｂ）標的組織から離れる方向に、裏打ちまたはバリアを通る、前記混合集団の移動を阻害するのに十分な粘弾性を有する、生体適合性、生分解性材料を含む前記裏打ちと、を含み、
前記パッチグラフト内に含まれる前記細胞が前記膵臓に組み込まれることを可能にし、それによって膵機能をある程度回復させる、方法。
【請求項４３】
前記膵臓の前記疾患または障害は、糖尿病、膵外分泌不全、膵炎、膵臓がん、オッディ括約筋機能不全、嚢胞性線維症、膵管癒合不全、輪状膵、膵臓外傷、または膵管出血（ｈｅｍｏｓｕｃｃｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｕｓ）である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
胃腸疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、前記方法は一つまたは複数の前記対象の腸にパッチグラフトを接触させることを含み、（ａ）二つ以上の細胞型を有する混合集団であって、そのうちの少なくとも一つが膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現する能力のある早期系統段階にあり、ハイドロゲル中の培地で支持される前記混合集団は、標的組織に向かっておよび標的組織内への前記混合集団の移動を可能にするのに十分な粘弾性を有する、混合集団と、
（ｂ）標的組織から離れる方向に、裏打ちまたはバリアを通る、前記混合集団の移動を阻害するのに十分な粘弾性を有する、生体適合性、生分解性材料を含む前記裏打ちと、を含み、
前記パッチグラフト内に含まれる前記細胞が前記腸に組み込まれることを可能にし、それによって腸機能をある程度回復させる、方法。
【請求項４５】
前記胃腸疾患または障害は、胃腸炎、胃腸がん、回腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、消化性潰瘍、セリアック病、線維症、血管形成異常、ヒルシュスプルング病、偽膜性大腸炎、または胃腸外傷である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
腎臓疾患または障害を有する対象を治療する方法であって、前記方法は一つまたは複数の前記対象の腎臓にパッチグラフトを接触させることを含み、（ａ）二つ以上の細胞型を有する混合集団であって、そのうちの少なくとも一つが膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現する能力のある早期系統段階にあり、ハイドロゲル中の培地で支持される前記混合集団は、標的組織に向かっておよび標的組織内への前記混合集団の移動を可能にするのに十分な粘弾性を有する、混合集団と、
（ｂ）標的組織から離れる方向に、裏打ちまたはバリアを通る、前記混合集団の移動を阻害するのに十分な粘弾性を有する、生体適合性、生分解性材料を含む前記裏打ちと、を含み、
前記パッチグラフト内に含まれる前記細胞が前記腎臓に組み込まれることを可能にし、それによって腎機能をある程度回復させる、方法。
【請求項４７】
前記腎臓疾患または障害は、腎炎、ネフローゼ、腎炎症候群、ネフローゼ症候群、慢性腎臓疾患、急性腎障害、腎臓外傷、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎疾患、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、ループス腎症、腎臓がん、アルポート症候群、アミロイドーシス、グッドパスチャー症候群、またはウェグナー肉芽腫症である、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願との相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項の下に、２０１７年６月１２日出願の米国出願第６２／５１８，３８０号、および２０１８年４月３０日に出願された米国出願第６２／６６４，６９４号に対する優先権を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本発明は、一般的に、細胞の移植または組織生着の分野に関する。より具体的には、固形臓器または組織から固形臓器または組織へ、特に内臓へである。本発明は、固形臓器または組織の疾患または状態を治療し、または疾患のモデルシステムを確立するために、固形臓器および組織への細胞の迅速な移植、生着および統合のための戦略を提供する組成物および方法に関する。この可能性の代表例は、肝疾患または膵疾患の治療のための細胞療法である。
【背景技術】
【０００３】
固形臓器からの細胞のための移植戦略、造血細胞の移植または間葉幹／前駆体に使用されるものとは異なる戦略が、長い間必要とされてきた。Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ９０，８０７−８１０（２０１０）；Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２３，１８−２７（２０１７）；Ｔｒｏｕｎｓｏｎ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １７，１１−２２（２０１５）；Ｓｕｎ  Ｂ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４６，９４１−９４５（２０１４）；Ｌａｉｎａｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ  ４９，３５４−３６２（２００８）。造血細胞および間葉細胞の移植は、血管チャネルを介した細胞の送達によって常法的に行われ、「ホーミング」と呼ばれるプロセスである微小環境シグナル伝達により、関連する標的部位にあるとき、移植細胞における接着分子の活性化に依存する。皮膚に使用する方法（眼の標的に類似したもの）は、標的部位に直接適用する細胞を用いた移植方法を採用する。Ｓｕｎ  Ｂ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４６，９４１−９４５（２０１４）。皮膚のための多くの移植方法は、固形内臓からの細胞のために利用可能であるが、これらの内臓の微小環境を収容するために実質的な修正を必要とする。移植片は、組織および器官の相互作用によって生じる機械力と拮抗しなければならない。例えば、呼吸中の肺の影響、横隔膜に対する肝臓の圧迫、または食品の処理中に腸管が隣接組織に及ぼす機械力の一時的な影響が挙げられる。移植片、特に内臓の移植片は、ダイナミックな機械力に加えて、器官の構造のサイズ、形状、および複雑さに関する懸念のため、設計が困難である。
【０００４】
数十年にわたり、皮膚以外の固形臓器からの細胞に対する細胞療法は、血管経路を介した移植または組織への直接注射を使用して、試みられた。ほとんどの移植された細胞は、これらの戦略のいずれかによって送達されると、死亡するかまたは異所的部位に輸送され、そこで数ヶ月間生存し、不適切な部位に組織を生成し、臨床的に悪影響を及ぼす可能性がある。Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ９０，８０７−８１０（２０１０）；Ｌａｎｚｏｎｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３１，２０４７−２０６０（２０１３）。肝臓における生着は、細胞をヒアルロナンでコーティングし、肝臓に血管を送達することによって改善することができ、生着の効率の向上は、肝臓のヒアルロナンの除去の自然なプロセスに起因する。Ｎｅｖｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｈｅｒａｐｙ  ８，６８，２０１７。しかしながら、この改善は、移植戦略を用いた場合よりも依然として効率が低く、および重要なことに、異所的部位への細胞の送達を依然として可能にする。
【０００５】
固形臓器への細胞生着の改善された方法の必要性が残っている。本開示は、この必要性を満たし、関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【０００６】
固形臓器からの細胞の移植戦略に対する必要性が長い間あり（Ｔｕｒｎｅｒ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ９０，８０７−８１０（２０１０）、戦略は、造血細胞、間葉幹細胞、または皮膚の移植に使用されるものとは異なる。造血細胞および間葉細胞の移植は、血管チャネルを介して常法的に行われ、「ホーミング」と呼ばれるプロセスである微小環境シグナル伝達により、関連する標的部位にある接着分子の活性化に依存する。皮膚に使用する方法は、標的部位に直接適用する細胞を用いた移植方法を採用する。
【０００７】
皮膚以外の固形臓器からの細胞の移植は、長期間血管送達を使用してきた。これらの細胞上の接着分子は常に活性化され、生命を脅かす塞栓を生成する可能性のある急速な（秒）細胞凝集をもたらすため、これは論理的ではない。健康リスクを最小限にするために塞栓がうまく管理されていても、細胞生着の効率は低く、成人細胞では約２０％、幹／前駆体ではさらに低い（＜５％）。ほとんどの移植された細胞は、死亡するかまたは異所的部位に輸送され、そこで数ヶ月間生存し、不適切な部位に組織を生成し、臨床的に悪影響を及ぼす可能性がある。標的部位に生着する少ない割合の細胞は、組織の重要な部分になるためには数週間から数ヶ月を必要とし、ゆっくりと組み込まれる。細胞がヒアルロナンでコーティングされ、組織のヒアルロナン（例えば、肝臓）の除去のために血管に送達された場合、肝臓における生着が改善される。（Ｎｅｖｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｔｈｅｒａｐｙ  ８，６８，２０１７）。
【０００８】
出願人は、細胞をヒアルロナンでコーティングするよりも成功した、根本的に異なるアプローチを提案する：標的部位の表面上に移植片を直接配置し、移植生体材料の状態にあるときに、移植生体材料および特定の細胞の固有の表現型特性を使用して、移植を促進する。これは、皮膚の細胞療法の戦略の一部の態様に対応するが、機械的な効果、相互に近い器官の摩耗または圧迫、および特定器官の固有の流体微小環境、ならびに器官のサイズ、構造および複雑さを考慮して、内臓のためには大幅な修正を必要とする。
【０００９】
本明細書には、組織および固形臓器への細胞の移植のための新規のパッチグラフト組成物および方法が記載されている。いくつかの実施形態では、これらの方法と移植片は、特に細胞が幹細胞または成熟細胞であるかどうかの細胞の成熟レベルに応じた設計特徴を用いて、内臓に適合させる。いくつかの実施形態では、パッチグラフトのドナー細胞（随意に自己または同種）は、本明細書に開示され、任意選択で細胞の混合物、またはオルガノイドの形態、上皮幹細胞のおよびそれらのネイティブの凝集体、系統段階の適切な間葉細胞パートナー、例えば、早期系統段階の間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）などの間葉幹／前駆細胞として移植片生体材料に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ドナー細胞は、成体上皮の細胞懸濁液として移植片材料に組み込まれ、膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の発現を最適化するように設計された比率で、間葉幹／前駆細胞、任意でＥＬＳＭＣと提携した成体細胞である。いくつかの実施形態では、その他の重要な変数は、移植生体材料および裏打ち材料であり、両方ともドナー細胞の分化に対する影響がニュートラルである必要がある。
【００１０】
本開示の態様は、単一細胞集団または混合細胞集団を持続および維持するためのパッチグラフトに関し、このパッチグラフトは、（ａ）単一細胞型または二つ以上の細胞型を有する混合集団であって、そのうちの少なくとも一つは、膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現できる早期系統段階にあり、または別のソースからＭＭＰが含まれており（例えば、精製または組み換えＭＭＰ）、ハイドロゲルマトリックス中に存在する培地で支持される該細胞集団または混合集団は、任意に該ハイドロゲル内もしくは外および／またはパッチグラフト内もしくは外に、該混合集団の移動を可能にするのに十分な粘弾性を有する、単一細胞型または混合集団と、（ｂ）裏打ちの方向に該混合集団の移動を阻害するのに十分な粘弾性を有する生体適合性、生分解性材料を含む該裏打ちと、任意に（ｃ）該裏打ちの漿膜（すなわち外側）表面に重ねられるハイドロゲルであって、これは該混合集団と接触しているものとは反対であり、パッチグラフトが標的部位につながれている実施形態では、標的部位と接触している側とは反対である（例えば、器官または組織）、ハイドロゲルと、を含む。いくつかの実施形態では、この層は、他の組織もしくは器官によるまたは他の組織もしくは器官からの癒着を防止または阻害する。いくつかの実施形態では、パッチグラフトは、該混合集団を持続および維持する一方で、該少なくとも一つの早期系統段階細胞型が、膜結合型および／または分泌型ＭＭＰをもはや発現できない後期系統段階への分化またはさらなる成熟を阻害するように構成されている。パッチグラフトは、単層に裏打ち層または複数層を加えたものでありうる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、該裏打ちは多孔性または非多孔性である。いくつかの実施形態では、裏打ちは、多孔性メッシュ、スカフォールド、または膜を含む。いくつかの実施形態では、裏打ちは、絹、合成繊維、またはアミニオン（ａｍｉｎｉｏｎ）、胎盤もしくは網などの天然材料、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、該裏打ちは、ハイドロゲルが注入された多孔性メッシュを含む。さらなる実施形態では、こうした注入は、標的器官または組織からの細胞の移動を防止する。いくつかの実施形態では、該裏打ちは固体材料を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、該ハイドロゲルのうちの一つまたは複数は、ヒアルロナンを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、該培地は、クボタの培地、または幹細胞を支持し、幹細胞性を維持することができる別の培地を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、該混合集団は、間葉細胞および上皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、該上皮細胞は、外胚葉性、内胚葉性、または中胚葉性であってもよい。いくつかの実施形態では、該間葉細胞は、早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）を含む。いくつかの実施形態では、該ＥＬＳＭＣは、血管芽細胞、血管内皮の前駆体、星状細胞の前駆体、および間葉幹細胞（ＭＳＣ）のうち一つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、該上皮細胞は、上皮幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、該上皮細胞は、胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、該上皮細胞は、コミットした（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）および／または成熟上皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、該コミットしたおよび／または成熟上皮細胞は、成熟した実質細胞を含む。いくつかの実施形態では、該成熟実質細胞は、肝細胞、胆管細胞、および膵島細胞のうちの一つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、該間葉細胞および上皮細胞はどちらも幹細胞を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、該混合集団は、自己細胞および／または同種細胞を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、一つまたは複数の細胞型は遺伝子組み換えされている。
【００１７】
さらなる態様が、開示されたパッチグラフト組成物を使用する方法に関した。したがって、本明細書に提供されるのは、標的組織を本明細書で上記に開示したパッチグラフトに接触させることを含む、それから成る、または本質的にそれから成る、細胞を標的組織に生着させる方法である。
【００１８】
この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は、肝臓、膵臓、胆管、甲状腺、胸腺、胃腸、肺、前立腺、乳房、脳、膀胱、脊髄、皮膚および皮下組織、子宮、腎臓、筋肉、血管、心臓、軟骨、腱、および骨組織からなる群から選択される。この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は肝臓組織である。この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は膵臓組織である。この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は胆管組織である。この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は胃腸組織である。いくつかの実施形態では、組織は病気であるか、損傷している、または障害を有する。この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は腎臓組織である。
【００１９】
この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は器官である。この方法のいくつかの実施形態では、器官は、筋骨格系、消化器系、呼吸器系、泌尿器系、女性生殖器系、男性生殖器系、内分泌系、循環器系、リンパ系、神経系、または外皮系の器官である。この方法のいくつかの実施形態では、器官は、肝臓、膵臓、胆管、甲状腺、胸腺、胃、腸、肺、前立腺、乳房、脳、膀胱、脊髄、皮膚および皮下組織、子宮、腎臓、筋肉、血管、心臓、軟骨、腱、および骨からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、器官は病気であるか、損傷している、または障害を有する。
【００２０】
また、肝臓疾患または障害を有する対象を治療する方法が本明細書に提供されており、この方法は、対象の肝臓を本明細書の上記に開示されるパッチグラフトに接触させることを含む、それから成る、または本質的にそれから成る。この方法のいくつかの実施形態では、肝疾患または障害は、肝線維症、肝硬変、ヘモクロマトーシス、肝臓ガン、胆道閉鎖症、非アルコール性脂肪性肝疾患、肝炎、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、肝蛭症、アルコール性肝疾患、α１−アンチトリプシン欠損症、糖原病ＩＩ型、トランスサイレチン関連遺伝性アミロイドーシス（ａｍｙｌｏｉｄｏｉｓｉｓ）、ジルベール症候群、原発性胆汁肝硬変、原発性硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、肝外傷またはウィルソン病である。
【００２１】
他の態様では、膵臓の疾患または障害を有する対象を治療する方法が本明細書に提供されており、この方法は、対象の膵臓を本明細書の上記に開示されるパッチグラフトに接触させることを含む、それから成る、または本質的にそれから成る。この方法のいくつかの実施形態では、膵臓の疾患または障害は、糖尿病、膵外分泌不全、膵炎、膵臓がん、オッディ括約筋機能不全、嚢胞性線維症、膵管癒合不全、輪状膵、膵臓外傷、または膵管出血（ｈｅｍｏｓｕｃｃｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｕｓ）である。
【００２２】
他の態様では、胃腸の疾患または障害を有する対象を治療する方法が本明細書に提供されており、この方法は、一つまたは複数の対象の腸を本明細書の上記に開示されるパッチグラフトに接触させることを含む、それから成る、または本質的にそれから成る。いくつかの実施形態では、胃腸疾患または障害は、胃腸炎、胃腸がん、回腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、消化性潰瘍、セリアック病、線維症、血管形成異常、ヒルシュスプルング病、偽膜性大腸炎、または胃腸外傷である。
【００２３】
いくつかの態様では、腎臓疾患または障害を有する対象を治療する方法が本明細書に提供されており、この方法は、一つまたは複数の対象の腎臓を本明細書の上記に開示されるパッチグラフトに接触させることを含む、それから成る、または本質的にそれから成る。この方法のいくつかの実施形態では、腎臓疾患または障害は、腎炎、ネフローゼ、腎炎症候群、ネフローゼ症候群、慢性腎臓疾患、急性腎障害、腎臓外傷、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎疾患、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、ループス腎症、腎臓がん、アルポート症候群、アミロイドーシス、グッドパスチャー症候群、またはウェグナー肉芽腫症である。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１−１】図１Ａ〜１Ｃは、パッチグラフトのためのブタドナー細胞についての情報を提供する。図１Ａは、プロセスの概略図であり、オルガノイドの調製、パッチグラフトの組み立て、および手術を行うために必要な時間を予測する。図１Ｂでは、幹細胞パッチグラフトのためのドナー細胞を、遺伝子導入ブタ由来の胆管組織の細胞懸濁液から単離し、細胞を無血清クボタ培地中および低付着性培養皿上のオルガノイドとして調製した。胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）、ならびにそれらの早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭ）パートナー、血管芽細胞、および血管内皮と星状細胞の前駆体のオルガノイド。それらは、導入遺伝子である緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の発現を示すものと位相顕微鏡写真で示されている。）。導入遺伝子は上皮細胞および間葉細胞の両方にあるため、凝集体の全ての細胞は緑色である。導入遺伝子をヒストン（Ｈ−２Ｂ）座位に結合した。パラフィン包埋、切片化、ヘマトキシリン／エオシンで染色された幹細胞オルガノイドの組織学。（ｄ）ＢＴＳＣおよびＥＬＳＭＣのオルガノイドの拡大画像。図１Ｃは、これらの細胞が、肝臓および膵臓の両方の前駆体であることを示す幹細胞、肝臓および膵臓マーカーの発現を示す免疫組織化学（ＩＨＣ）を示している。ＩＨＣアッセイは、ＥｐＣＡＭなどの中間段階幹細胞マーカーを有する外層を示し、また多能性遺伝子および内胚葉性転写因子（例えば、ＳＯＸ１７、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１）などの非常に原始的遺伝子を発現する内部細胞を示す。
【図１−２】図１Ｄは、パッチグラフトのためのブタドナー細胞についての情報を提供する。図１Ｄは、オルガノイド内の様々な遺伝子の発現を評価し、細胞が幹細胞または早期前駆体であることを示す、代表的なｑＲＴ−ＰＣＲアッセイである。対照は、コブタの肝臓由来の成熟肝細胞であった。
【図２−１】図２Ａ〜２Ｂは、パッチグラフトの主要な成分についての情報を提供する。図２Ａは、ブタの肝臓に貼り付けられたパッチグラフトの概略図であり、右側は移植片の組成である。上皮細胞と間葉細胞の両方の早期系統段階細胞は、生着の主要な調節因子であるマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の産生源である。ドナー細胞が配置される移植片生体材料のマトリックス成分は、ヒアルロナンハイドロゲルなどの硫酸化なしで（または最小限で）軟質である（約１００Ｐａ）。移植片の構造は、標的部位につながれた生体材料および細胞の層から成る。培地成分は、ドナー細胞の分化に影響を与える血清、成長因子およびサイトカインを欠いており、幹細胞／前駆体などの早期系統段階細胞の生存および増殖に合わせたものであるべきである。裏打ちは、外科手術において使用されるのに十分な引張強さを有するが、ドナー細胞の分化においてその影響は中立である（例えば、Ｉ型コラーゲンを有するものは避けるべきである）。裏打ちは、より剛直な１０Ｘハイドロゲル（約７００Ｐａ）で含浸または被覆され、ドナー細胞の移動を標的組織に向けるバリアとして機能し、癒着を最小限にする。標的部位への付着後、漿膜表面上にコーティングまたはペイントするのに十分な流体である２Ｘ  ＨＡハイドロゲルを添加し、癒着をさらに最小限にするために使用する。図２Ｂは、宿主の肝臓または膵臓に貼り付けられた移植片を示す。
【図２−２】図２Ｃ〜２Ｅは、パッチグラフトの主要な成分についての情報を提供する。図２Ｃは、移植片組成を構成する層を示す、移植片の概略図である。図２Ｄは、特定のハイドロゲル層のレオロジー特性または粘弾性特性（せん断および圧縮機械力）を経験的に評価するアッセイの結果を示す。図２Ｅは、ハイドロゲルの３層の粘弾性特性の配合組成を提供する。
【図２−３】図２Ｆは、パッチグラフトの主要な成分についての情報を提供する。図２Ｆは、ブタの肝臓の表面に縫合されたパッチグラフトの近接画像である。
【図３−１】図３Ａ〜３Ｂは、肝臓パッチグラフトの免疫組織化学（ＩＨＣ）および組織学の結果を示す。図３Ａは、一週間後のパッチグラフトのトリクローム染色の結果を示す。トリクロームは、コラーゲン（青色）、細胞質（赤色）および核（黒色）を識別し、グリソン鞘（通常は肝小葉の表面に隣接）と癒着（移植片の漿膜表面上）を識別するために使用された。漿膜表面の層には高レベルの青色の染色があり、移植片への癒着を示唆している。また、移植片は、裏打ちと宿主の間の界面で宿主組織から分離しており、これはこの界面で生成されるＭＭＰが多くなるため、頻繁に見出された。再形成領域は、肝臓の古典的な小葉構造の損失の証拠を提供し、それらはドナー細胞が組織内に移動し、同時に宿主組織構造を変化させる領域をもたらす。低倍率画像（ａ）では、肝臓に配置された移植片のトリクローム染色により、グリソン鞘の広範な再形成が発生し、移植片と宿主の肝臓がしばしば分離されることが確認された。より高倍率の画像（ｂ）では、再形成領域は驚くべき広範囲であり、（ｃ）肝小葉構造が全く欠失している移植片に近い領域、および（ｄ）再形成プロセスで分解が進行している残りの肝小葉内の領域から成る。図３Ｂは、三週間後のパッチグラフトのトリクローム染色の結果を示す。移植片内のヒアルロナンは、裏打ちのみを残して再吸収されている（ａ）。ＨＡを再吸収すると、グリソン鞘が再現し、（ｂ）移植片近くの肝小葉は、肝臓の小葉および腺房などの典型的な組織学的パターンに再び安定化した。（ｂ）の矢印は、グリソン鞘の再形成におけるコラーゲンの再現を示す。
【図３−２】図３Ｃ〜３Ｄは、肝臓パッチグラフトの免疫組織化学（ＩＨＣ）および組織学の結果を示す。図３Ｃおよび図３Ｄは、移植後一週間（Ｃ）および移植後二週間（Ｄ）の移植片からの部分のヘマトキシリン／エオシン染色の結果を示す。上部の図は４０倍である。図（ａ、ｂ、ｃ）の部位は、１００倍に拡大された拡大写真であり、これら各々の下の長方形の画像は、２００倍に拡大されている。移植片の３つの部位（ａ）裏打ちおよび関連する移植片生体材料内の部位、（ｂ）移植片と宿主組織の間の界面の部位、（ｃ）肝小葉内の部位が示されている。ヘマトキシリン／エオシン染色により、炎症性プロセスの特徴を組み込む生着および移動プロセスの評価に寄与する画像が得られる。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、生着、移動、および一週間以内に成体の運命への急速な成熟を示す。図４Ａは、一週間後のブタの肝臓の表面上のパッチグラフトの低倍率画像である。破線は移植片および宿主肝臓の界面を示す。ドナーＧＦＰ＋細胞（ピンク色の核を有する、白の矢印は、多数のドナーＧＦＰ＋幹細胞のある領域を示す）は、ＧＦＰに対する抗体で標識化し、二次的に赤色蛍光プローブであるＮｏｖｏ  Ｒｅｄに連結したもので標識化することで視覚化された。核を４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で青色に染色することで、青色の核のみを有する宿主細胞およびピンク色の核を有するドナー細胞の認識が可能になった（ＤＡＰＩおよびＮｏｖｏ  Ｒｅｄの混合）。宿主組織（ａ）は移植片のヒアルロナン（ＨＡ、黒バックグラウンド）内に延び、裏打ちによる組織には時々はオルガノイド（挿入）が含まれるが、多くのドナー細胞が単一細胞に分散され、多数の分散ドナーＧＦＰ＋幹細胞（ｂ）が宿主組織全体に見られる。再形成の領域を構成するこの領域におけるグリソン鞘の証拠はない。図４Ｂは、ドナー細胞の生着および移動が急速であったことを示し、一週間以内に、すべてのドナー細胞が宿主肝臓内にあり、ドナー細胞は、移植部位の近くおよび肝葉の反対側の両方にあった（推定距離は移植片から少なくとも１．５ｃｍ）。継続的な研究では、コブタの肝臓の領域をより大きな距離（すなわち肝臓の他の葉）で分析し、特定の時間内にドナー細胞がどれほどの距離を移動できるかをより正確に定義している。移植部位の肝葉から遠隔側にある宿主の成熟肝細胞（リポフスチンの自己蛍光からの森林緑色）の小葉近くのドナー細胞（ピンク色の核）が示されている。図４Ｃは、ドナー細胞の成熟が、ＨＡの再吸収と並行して成体運命を引き起こすことを示す。森林緑色（リポフスチンの自己蛍光）の宿主の肝細胞（ａ）近くのドナーＧＦＰ＋細胞（ピンク色の核を有する単一細胞）を含み、ラベンダー色（ピンク色のＧＦＰ、青色−ＤＡＰＩ、および緑色のリポフスチンの混合）の肝細胞（ｂ）由来の成熟ドナーから容易に識別される領域の拡大写真であり、すなわちそれはドナーＧＦＰ＋幹細胞から制限された系統である。他のＩＨＣアッセイ（データ非表示）では、宿主肝細胞およびドナー肝細胞両方のプレート中の明るい新緑色細胞は、血管内皮および星状細胞であることが証明された。
【図５−１】図５Ａ〜図５Ｂは、肝臓パッチグラフト中の細胞の生着および成熟を、移植後一週間後と二週間後で比較する。図５Ａは、パッチグラフト後１週間のブタ肝臓の検査である。シリウスレッド染色、コラーゲンを染色するアゾ染料使用し、パンサイトケラチン（ｐＣＫ）およびＳｏｘ９に対する免疫組織化学および免疫蛍光法（ＩＦ）染色を、連続３−μｍ部分で実施した。パッチグラフト部位では、移植されたドナー細胞は、肝小葉と融合した。上部パネル（元の倍率＝５倍）では、パッチグラフトは、間葉および上皮ｐＣＫ＋細胞（矢印）から成る。中間パネルでは、より高い倍率が提供される（２０倍）。上皮細胞は、胆汁サイトケラチン（ｐＣＫ）および内胚葉性幹細胞マーカーＳｏｘ９を発現する典型的な胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）の免疫表現型を示す。パッチグラフト内のＢＴＳＣは、細胆管を再構築する細胞列に配置され（矢印）、隣接する肝小葉の肝細胞プレートと直接連続している（矢頭）。小葉中の宿主肝細胞は、ｐＣＫおよびＳｏｘ９陰性である。下部パネル（元の倍率＝２０倍）では、ＧＦＰの免疫蛍光法は、個々の移植細胞およびその子孫を識別することを可能にする。パッチグラフトに隣接した小葉中の肝細胞は、ＧＦＰ陽性であり、これらは宿主肝実質組織に融合されたドナー細胞由来であったことを示している。パッチグラフトと肝小葉との間の界面では、ｐＣＫ＋／ＧＦＰ＋小管（ドナー由来胆管細胞）が、小葉（矢頭）内のＧＦＰ＋／ｐＣＫ−細胞（ドナー由来肝細胞）と直接連続しており、肝細胞の運命への移植細胞の成熟を示唆している。図５Ｂは、パッチグラフト後２週間のブタ肝臓の検査である。ＩＦ染色で、ＧＦＰ＋細胞が移植部位の遠隔にある小葉内に存在することが明らかになる。それらは均一に分散するため、宿主細胞（ＤＡＰＩによる青色の核を持つ細胞）およびドナー細胞（ＤＡＰＩによる青色とＧＦＰラベルの赤色の融合によるピンク色／紫色の核）が混在している。肝細胞核因子（ＨＮＦ）４α（緑色およびピンク色／紫色の核の混合物）およびアルブミン（緑色の細胞質とピンク色／紫色の核）などの成熟肝細胞マーカーを共発現する。別個のチャネルまたは融合したチャネルが含まれた。核を青色で表示した（ＤＡＰＩ）。元の倍率：４０倍。
【図５−２】図５Ｃは、肝臓パッチグラフト中の細胞の生着および成熟を、移植後一週間後と二週間後で比較する。図５Ｃは、パッチグラフト一週間後のブタの肝臓の評価であり、パッチグラフトと宿主組織との間の界面で起こる再形成の広範囲な領域を示している。低倍率画像および１の拡大画像の部分は、ヘマトキシリン／エオシン（軽く染色）であり、２はベクター−ＳＧで染色され、青色／灰色を提供し、３はヘマトキシリン／エオシンのバックグラウンドで、アルファ−フェトプロテインを染色している。５Ｃ内の特定の部位は番号付けされ、小葉内で発生する変化を示す拡大写真と相関する。ドナー細胞とともに大量のＭＭＰがこの領域に浸食するため、宿主の肝小葉および腺房は壊れる。ドナー細胞は、小葉の境界領域で観察され、ＨＮＦ４−αおよびα−フェトプロテインなどの肝特異的マーカーを示す部位も、細胞が肝臓の運命に成熟していることを意味する。これらの特性はＢＴＳＣによって発現されなかったため、これらはドナー細胞が肝臓の運命への成熟を遂げていることが示している。
【図６−１】図６Ａ〜６Ｂは、膵臓につながれた幹細胞オルガノイドのパッチグラフトに関する情報を提供する。図６Ａは、膵臓の大部分と、十二指腸（ブルンナー腺を含有する領域）の粘膜下組織に生着した、ＧＦＰ＋ドナー細胞の低倍率（パノラマスキャン）画像である。パッチグラフトの部位におけるブタ膵臓、肝臓、および十二指腸の免疫蛍光染色。ＧＦＰ（緑）、インスリン（赤）、ＤＡＰＩ（青）。ドナー由来ＧＦＰ＋細胞は、パッチグラフトが位置付けられた部位の近くで発生し、膵臓実質組織内に統合されているように見える。ＳＥＲＩ外科用スカフォールドのシルクメッシュは、膵臓、肝臓、および十二指腸の間に挟まれているのが観察される。図６Ｂは、ドナー細胞が機能的な膵島に成熟することを示す。より高い倍率では、ドナー由来のＧＦＰ＋／インスリン＋ベータ細胞（ＧＦＰのマージからの黄色およびインスリンの染色からの赤）は、膵臓実質組織内の宿主ＧＦＰ−／インスリン＋（赤色）ベータ細胞と混合されて観察される。膵島細胞の周囲には、腺房細胞および管細胞を含む、膵外分泌細胞の形態と一致する形態を示す多数のＧＦＰ＋細胞がある。この解釈を支持するのは、実際にはこれらの細胞が、古典的な腺房マーカーであるアミラーゼを産生するというＣおよびＤの所見である。
【図６−２】図６Ｃ〜６Ｄは、膵臓につながれた幹細胞オルガノイドのパッチグラフトに関する情報を提供する。図６Ｃおよび図６Ｄは、ドナー幹細胞に由来する機能的腺房細胞の証拠を示す。生着したＧＦＰ＋ドナー細胞の領域に焦点を当てた、パッチグラフト部位における同一組織ブロックからの連続部分の免疫蛍光染色。アミラーゼ（緑色）、インスリン（赤色）、グルカゴン（白色−Ｃではパノラマスキャンで見えないが、Ｄではより高い倍率で見える）、ＤＡＰＩ（青色）。アミラーゼ＋腺房細胞は、膵臓の外分泌組織の大部分である。低倍率および高倍率で連続部分に示される染色を比較することによって、膵臓のドナー由来ＧＦＰ＋細胞のほとんどがアミラーゼ＋腺房運命を獲得したことが推定される。
【図７−１】図７Ａ〜７Ｄは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の特徴付けを提供する。ＭＭＰは、細胞外マトリックス成分を溶解するカルシウム依存性亜鉛含有酵素の大きな遺伝子ファミリーから成る。サブセットが分泌型因子（例えば、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９）であり、サブセットが膜結合型（例えば、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５）である、ブタで知られている少なくとも２４個のアイソフォームがある。ＭＭＰ１は、特に再形成の領域でＩＨＣによって同定されたが、ＲＮＡ配列分析に利用できるブタＭＭＰ１の注釈付き形態がまだないため、ＲＮＡ配列によっては同定されなかった。図７Ａ，図７Ｂ，図７Ｃ、および図７Ｄは、分泌および膜結合型カテゴリーのアイソフォームが、幹／前駆体および成熟細胞の両方によって発現されたことを示している。発現レベルの定量化は、膜結合型形態が幹／前駆体および成熟細胞の両方に対して類似していたことを示した（図７Ｄの比較を参照）。対照的に、分泌型は、幹／前駆体において非常に高いレベルで発現され、成熟細胞型においては低いまたは無視できるレベルで発現された。分析された成体細胞の細胞集団は、コブタの肝臓および胆管組織の懸濁液から単離され、ＣＤ４５＋細胞（造血細胞）、ＣＤ１４６＋細胞（星状細胞）、ＣＤ３１＋細胞（血管内皮）、ＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４５−細胞（成体二倍性肝細胞および胆管細胞）から成る。これらのＥｐＣＡＭ＋／ＣＤ４５−細胞は、コブタの肝臓に見られる成熟実質細胞である。ＢＴＳＣは、実施例で与えられるプロトコルによって胆管から分離された。
【図７−２】図７Ｅ〜７Ｈは、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の特徴付けを提供する。図７Ｅは、ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣ移植片を用いた再形成の領域における代表的ＭＭＰ発現を示す。ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのパッチグラフトに隣接した部分では、再形成の領域（ブラケット）を示すトリクロームで染色した。領域は、ＭＭＰの「海」に溶解する細胞とマトリックス成分である、赤と青の線形ストライプとして表示される。ストライプは、まだほとんど無傷である小葉の端で終わるが、侵入する細胞に由来するＭＭＰの効果から、それらの境界で「ほつれ」始める。図７Ｆは、ＭＭＰ１（Ｎｏｖｏ−ｒｅｄ＋）に対するＩＨＣアッセイの代表的画像を示す。メチルグリーンはバックグラウンド染色である。肝臓の小葉／腺房構造は、細胞の起伏のある渦巻きに溶解し、ＭＭＰの分泌アイソフォームであるＭＭＰ１の強い発現によって特徴付けられる。図７Ｇは、ＭＭＰ２（Ｎｏｖｏ−ｒｅｄ＋）を染色した部分を示す。ヘマトキシリンはバックグラウンド染色である。肝臓の小葉／腺房構造は消失し、ＭＭＰ２（錆び茶色）が強く染色された細胞の混合物によって置換された。図７Ｈは、肝小葉の中で進行中の再形成プロセスを示す。肝小葉は、侵入細胞が点在する細胞片になっており、ＭＭＰ２＋発現（錆び色）は非常に高く、小葉／腺房構造の消失に寄与する。ヒアルロナンが除去されると（２〜３週間）、小葉構造が再現した。
【図８】図８は、肝臓および膵臓における生着および統合現象の概略的な実証である。
【図９−１】図９Ａ〜９Ｃは、血管内皮または星状細胞などの成熟した間葉細胞（ＭＭＣ）と組み合わされた、成熟（成体）肝細胞のパッチグラフトに関する情報を提供する。これらのパッチグラフトは生着できなかった。肝細胞が、ここではブタ間葉幹細胞（ＭＳＣ）である、早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）と組み合わされた場合、生着は達成可能であった。ＥＬＳＭＣが提示された場合、生着が発生したが、移植片近くの領域に制限された。図９Ａは、正常なブタの肝臓のトリクローム染色を示す。バーは、低倍率画像（ａ）については２００μｍ、高倍率画像（ｂ）については５０μｍである。グリソン鞘のコラーゲンおよび肝腺房間の境界に注意されたい。図９Ｂは、成熟した間葉細胞（ＭＭＣ）、血管内皮、および星状細胞と組み合わせた正常な成体肝細胞のパッチグラフトのトリクローム染色が生着しなかったことを示す。低倍率画像（ａ）では、グリソン鞘が損傷していないこと、および細胞が鞘の上に残っていることに注意されたい。（ｂ）より高い倍率では、移植片の隣にある小葉の細胞（肝細胞内のまだらの赤色）の再形成（可塑性現象）の証拠がある。この可塑性は、幹細胞および成体細胞の両方に存在することが知られている膜結合型ＭＭＰに起因すると仮定される。図９Ｃは、成熟した間葉細胞（ＭＭＣ）と組み合わされた正常な成体肝細胞のパッチグラフトに関するＩＨＣアッセイを示す。切片をＲＢＭＹ−１に対する抗体で染色し、対比染色としてヘマトキシリンで染色した。グリソン鞘は無傷であり、小葉間の境界ゾーンも同様である。より高い倍率（ｂ）では、生着が起こっていないことは明らかである。（ｄ）非特異的染色を示すための陰性対照（一次抗体なしの染色）。
【図９−２】図９Ｄ〜９Ｅは、血管内皮または星状細胞などの成熟した間葉細胞（ＭＭＣ）と組み合わされた、成熟（成体）肝細胞のパッチグラフトに関する情報を提供する。図９Ｄは、ここではブタ間葉幹細胞（ＭＳＣ）が、ＭＭＰの細胞源の役割を果たした、ＥＬＳＭＣと組み合わされた正常な成体肝細胞のパッチグラフトのトリクローム染色を示す。移植片は、移植片と宿主組織との間の界面で分離される。ブラケットは、再形成の領域を示す。肝小葉は、通常はそれらの間の境界ゾーンを構成するマトリックスを失い、端でほつれているように見えることに留意されたい。より高い倍率（ａ）では、画像全体にドナー細胞（小葉の中心にある濃い赤色のものと比較して薄い赤色）が見られ、（ｂ）および（ｃ）では、グリソン鞘がパッチの下でかなり薄くなっていることを示す領域の拡大写真である（ボックスの左の領域と比較して）。移植片（ｃ）に隣接した細胞において、幅広い再形成が明らかであった。図９Ｅは、ＥＬＳＭＣ（ブタＭＳＣ）と組み合わされた肝細胞の一週間後のパッチグラフトを示す。切片（ａ）をＲＢＭＹ−１（茶色）に対する抗体で染色し、対比染色としてメチルグリーンで染色した。ドナー細胞は生着し（錆赤色の領域）、移植片近くの腺房で成体実質細胞に成熟した。切片（ｂ）は、薄くなったグリソン鞘の残りの部分に近い画像の拡大写真を示し、ドナー細胞（暗褐色の核）が宿主細胞（核はメチルグリーンであった）に均一に散在していることを示した。切片（ｃ）は（ｂ）の陰性対照である。切片（ｄ）を、ＧＦＰに対する抗体（ノーバスレッド（Ｎｏｖｕｓ  ｒｅｄ）と結合し、錆茶色になる）と、対比染色としてメチルグリーンで染色した。ほとんどの細胞が生着し、宿主肝腺房内に濃い赤色のドナー（成熟）肝細胞のバンドを形成した。グリソン鞘は残っていたが、厚さが減少した。移植片近くの肝臓の領域をはるかに超える移動は、実験の三週間の時間枠以内に観察されなかった。
【図１０】図１０は、幹細胞と成体細胞との生着を比較する概略図である。
【図１１】図１１は、生着プロセスが、宿主組織内の相当な距離への細胞の移動を伴う証拠を示す。ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣの移植片では、移植後一週間のオルガノイドが示されている。８つの異なるゾーンに分けられた肝臓の概略図は、ドナー細胞の存在について評価された領域を示すために使用される。切片は、領域１〜８から調製され、次いでドナー細胞の識別を可能にするために染色される。表には、移植片と各領域の間の距離、および見つかったＧＦＰ＋細胞の割合を示す結果が要約されている。表の左側の画像は、各ゾーンの代表的な切片のスキャンである。暗褐色の染色は、移植片近くの６で最も強く、移植片からの距離が大きくなるにつれて薄くなり、最も薄いのはゾーン１である。
【図１２−１】図１２Ａは、宿主肝臓全体でのドナー細胞の移動の証拠を提供する。ＧＦＰ＋細胞をＮｏｖｏ−ｒｅｄ（錆茶色）で染色し、宿主細胞をメチルグリーンで染色した。図１２Ａは、移植片と宿主肝臓との界面の低倍率画像である。宿主肝臓からの移植片の分離はしばしば見られ（図３でもこれに注意のこと）、非常に高レベルの分泌型ＭＭＰと相関していることが示された。領域（ａ）および（ｂ）の拡大写真は、以下に示される。染色がまだらであり、組織のヒアルロナンレベルが起因することが証明された色のさめた外観を示す領域を有する、低倍率画像の領域、および（ｂ）の拡大写真の領域に注目されたい。
【図１２−２】図１２Ｂ〜１２Ｅは、宿主肝臓全体でのドナー細胞の移動の証拠を提供する。ＧＦＰ＋細胞をＮｏｖｏ−ｒｅｄ（錆茶色）で染色し、宿主細胞をメチルグリーンで染色した。図１２Ｂは、細胞が移動する中間ゾーンを示す。ドナー細胞は、胆管および腺房の実質組織の両方の組織全体に存在する。図１２Ｃは、細胞が移動する距離ゾーンを示す。胆管のみが染色されていることに注目のこと。図１２Ｄは、胆管中のドナー細胞を示す拡大写真を提供する。図１２Ｅおよび図１２Ｆは、実質組織内の拡大写真を提供し、ドナー細胞が核中にＧＦＰラベリングを有することを示す。
【図１３】図１３は、特定の裏打ちを備えたパッチグラフトで得た有害状態を示す（表１および２も参照のこと）。これらには、壊死、癒着、および膨張が管の閉塞を引き起こすように、移植片がいくつかの管に近すぎるところに置かれた場合に起こることが見出された、胆汁うっ滞の部位が含まれた。
【図１４】図１４は、上皮細胞（図１４Ａ）および間葉細胞（図１４Ｂ）の両方の系統段階と対応するバイオマーカープロファイルのチャートを示す。
【図１５】図１５は、腎臓にパッチグラフトされたＨ２Ｂ−ＧＦＰ＋ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドを示す。評価は移植後１週間で行われた。パネルＡは、移植された腎臓のトリクローム染色を示す。腎臓は、断面で調製され、移植片を用いて「Ｖ」字型になっているより深い層を露出させた。明るい青色で染色されている「Ｖ」の下半分は、腎臓の移植片側であり、図中の「Ｖ」の上側は、移植された層より深い層である。パネルＢは、移植された腎臓の同じ切片のＨ＆Ｅ染色を示す。パネルＣはパッチグラフトされた腎臓の高倍率である。移植片下の腎臓の被嚢は、肝臓と類似した方法で緩められた（ＭＭＰによる溶解から）。パネルＤは、パッチ下の層で腎臓に生着したＧＦＰ＋細胞（濃い赤色）のＩＨＣ染色を示す。パネルＥは、腎臓のより深い層でＧＦＰ＋細胞（濃い赤色）の生着を示す。剖検レポートでは、移植された腎臓内またはパッチグラフトを受けた動物の他の場所では壊死が見られなかったことが示された。
【００２５】
表の簡単な説明
表１は、パッチグラフトのための外科手術またはその他の手法の概要を提供する。
【００２６】
表２は、例示的パッチグラフトに対して試験された裏打ちの比較を提供する。
【００２７】
表３は、実施例において、ＩＨＣおよびＩＦに使用される抗体の概要を提供する。
【００２８】
表４は、ｑＲＴ−ＰＣＲアッセイに使用されるプライマーの概要を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示による実施形態は、以下により完全に説明される。しかしながら、本開示の態様は、異なる形態で具体化されてもよく、本明細書に記載される実施形態に限定されると解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、本開示が徹底的かつ完全であるように提供され、本発明の範囲を当業者に完全に伝達することになる。本明細書の記載で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的のために過ぎず、本発明の限定を意図するものではない。本明細書に記載されるすべての刊行物、特許出願、特許およびその他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。
【００３０】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語（技術用語および科学用語を含む）は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書で定義されたものなどの用語は、本出願および関連する当該技術分野の文脈における意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書に明示的に定義されていない限り、理想化されたまたは過度に形式的な意味で解釈されるべきではないことがさらに理解される。以下に明示的に定義されていないが、そのような用語は、それらの共通の意味にしたがって解釈されるべきである。
【００３１】
本技術の実施は、別段の指示がない限り、当業分野の範囲内にある組織培養、免疫学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、および組み換えＤＮＡの従来技術を採用する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ  ｅｄｓ．（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２０１２）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＣＲ  １：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）；ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ｅｄｓ．（２０１４）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（２０１１）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｇａｉｔ  ｅｄ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，６８３，１９５；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ａｎｄｅｒｓｏｎ（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ；Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８４）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６））；Ｐｅｒｂａｌ（１９８４）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．（１９８７）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍａｋｒｉｄｅｓ  ｅｄ．（２００３）Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ；Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ  ｅｄｓ．（１９８７）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）；ａｎｄ  Ｈｅｒｚｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ（１９９６）Ｗｅｉｒ’ｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙを参照のこと。
【００３２】
文脈が別途示されていない限り、本明細書に記載の本発明の様々な特徴を任意の組み合わせで使用できることが特に意図されている。さらに、本開示は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴または特徴の組み合わせを除外または省略できることも意図する。説明するために、本明細書が、複合体が成分Ａ、ＢおよびＣを含むと述べている場合、Ａ、ＢまたはＣのいずれか、またはそれらの組み合わせを、単独または任意の組み合わせで省略および放棄できることを特に意図している。
【００３３】
例えば、ｐＨ、温度、時間、濃度、および範囲を含む分子量などのすべての数値表示は、必要に応じて１．０または０．１の増分、あるいは＋／−１５％、あるいは１０％、あるいは５％、あるいは２％の変動で（＋）または（−）に変化する近似値である。当然のことながら、必ずしも明示的に述べられていないが、すべての数値表示の前には「約」という用語がつく。また、当然のことながら、必ずしも明示的に述べられていないが、本明細書に記載される試薬は単に例示であり、そのような同等物は当該技術分野で公知である。
【００３４】
定義
本発明の説明および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別途示されていない限り、複数形を含むことが意図されている。
【００３５】
本明細書で使用される「約」という用語は、量または濃度（例えば、バイオマトリックススカフォールド内の総タンパク質中のコラーゲンの割合）などの測定可能な値を指す場合、特定量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％、またはさらに０．１％の変動を包含することを意味する。
【００３６】
本明細書に開示される任意の成分、範囲、剤形などの選択を説明するために使用される用語または「許容可能」、「有効」もしくは「十分」は、該成分、範囲、剤形などが開示された目的に適しているとことを意図する。
【００３７】
また、本明細書で使用される場合、「および／または」は、一つまたは複数の関連する列挙された項目のうちの任意のおよび全ての可能性のある組み合わせ、ならびに二者択一（「または」）で解釈された時の組み合わせの欠如を意味し、包含する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「含む」という用語は、組成物および方法が列挙された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することを意図する。本明細書で使用される場合、「本質的に〜から成る」（および文法的変形）という移行句は、列挙した材料またはステップおよび列挙された実施形態の「基本的および新規な特性に実質的に影響を与えないもの」を包含すると解釈されるべきである。Ｉｎ  ｒｅ  Ｈｅｒｚ，５３７  Ｆ．２ｄ  ５４９，５５１−５２，１９０  Ｕ．Ｓ．Ｐ．Ｑ．４６１，４６３（ＣＣＰＡ  １９７６）（ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｒｉｇｉｎａｌ）；ＭＰＥＰ  §  ２１１１．０３を参照のこと。したがって、本明細書で使用される「本質的に〜から成る」という用語は、「含む」と同等として解釈されるべきではない。「から成る」は、他の成分の微量以上の要素、および本明細書に開示される組成物を投与するための実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される態様は、本開示の範囲内である。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「パッチグラフト」という用語は、ドナー細胞（同種または自己）を宿主に移植することを可能にする適切な生体材料中に埋め込まれた、または含まれた細胞の組成を指す。いくつかの実施形態では、用語は、ドナー細胞を宿主に移植することを可能にする適切な生体材料中に埋め込まれた、または含まれた細胞の組成を指す。生体材料は、定義された条件下で調製され（例えば、任意選択的に補充された基本培地および／または栄養因子、ビタミン、アミノ酸、炭水化物、ミネラル、インスリン、トランスフェリン／Ｆｅ、および／または脂質の培地（精製アルブミンと高密度リポタンパク質などのリポタンパク質担体分子との複合体である精製遊離脂肪酸））、任意選択で凝固し、ソフトゲルに含まれ（２００Ｐａ未満、任意に約１００Ｐａ）、外科的付着を可能にするのに十分な引っ張り強度を有するか、さもなければ宿主の組織または器官につながれ、さらにドナー細胞の分化に最小限の影響を及ぼす化学物質である裏打ちで覆われてもよい。避けたいのは、細胞の分化を促進する可能性のある因子、特に早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）を含むサプリメントであり、これらにはＥＬＳＭＣに影響を及ぼす血清、成長因子およびサイトカイン、ならびに成熟マトリックス成分（例えば、Ｉ型コラーゲン）が含まれる。
【００４０】
「裏打ち」という用語は、本明細書で使用される場合、移植片を標的部位につなぎ、および／またはその中の細胞の標的部位への移動を促進し、および／または裏打ちに向かって細胞の移動を防止または阻害することができるパッチグラフトの表面上の裏打ちまたはバリアとして機能する材料を指す。裏打ちは、「生分解性、生体適合性材料」、「生体適合性、生分解性材料」、または材料を指すその任意のバリエーションであるか、またはそれらを含み、材料は（ｉ）移植される対象と生体適合性がある、（ｉｉ）器官および組織（特に内部のもの）で発生する圧縮およびせん断力に耐える機械的弾性を示し、これによりこの材料が手術用組織として機能できるようになる、（ｉｉｉ）材料と接触している細胞の分化状態に中立的または最小限の影響を有する。いくつかの実施形態では、パッチグラフトの裏打ちはこうした材料を含む。このような実施形態では、（ｉｉ）の機械的弾性は、裏打ちが移植片を標的部位につなぐことができるようなものであるべきである。さらなるこうした実施形態では、裏打ちは、例えば、標的部位から離れる方向に移動するこれらの細胞の分化に影響を与えることによって、または該移動を物理的に遮断することによって、細胞移動を標的部位に向かって方向付ける。これに関して、適切な材料には、セリシルク（Ｓｅｒｉ−ｓｉｌｋ）、随意に輪郭セリシルク、またはその誘導体、そのアミニオン（ａｍｉｎｉｏｎ）またはその抽出物（例えば、胎児に面する側および／またはＰＧＡおよび／またはＰＬＬＡから成るパッチまたは織物）が含まれるがこれらに限定されない。合成材料の適切なパッチの非限定的な例には、９１％ＰＧＡ−ｃｏ−９％ＰＬＬＡから成る織布パッチ、９１％ＰＧＡ−ｃｏ−９％ＰＬＬＡから成るニットパッチ、または１００％ＰＧＡから成る不織布パッチが含まれる。より一般的に、適切な裏打ちには、ＳｅｒｉＲ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｉｌｋ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ（Ｓｏｆｒｅｇｅｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）などのカイコガシルクの形態、カイコガシルクの他の誘導体、およびポリグリコール酸−ｃｏ−ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＬＡ）の形態などの合成繊維が含まれ得る。
【００４１】
いくつかの実施形態では、裏打ちは生体吸収性でもある。本明細書で使用される場合、「生体吸収性」とは、移植片の宿主またはレシピエントの身体によって破壊することができ、機械的除去を必要としない材料を指す。いくつかの実施形態では、生体吸収性裏打ちは、約２〜約１０週間、約２〜約２０週間、約２〜約５２週間、約４〜約１６週間、約４〜約１２週間、または約４〜約８週間の間隔で生体吸収性である。いくつかの実施形態では、生体吸収性裏打ちは、約４〜約８週間、約４〜約１２週間、約４〜約１６週間、約４〜約２０週間、および約４〜約５２週間の間隔で生体吸収性である。
【００４２】
本明細書で使用される場合、移植片の生体材料には、裏打ちとは無関係に、ハイドロゲルを形成できるものが含まれる。「ゲル」という用語は、軟らかくて弱いものから硬くて丈夫なものまでさまざまな特性を有することができる固体のゼリー様材料を意味する。ゲルは実質的に希薄な架橋システムとして定義され、定常状態にある時には流れを示さない。重量では、ゲルはほとんど液体であるが、それらは液体内の三次元架橋ネットワークにより固体のように動くことになる。ゲルにその構造（硬度、剛性、機械的特性または粘弾性特性）を与え、その接着性に寄与するのは、流体内の架橋である。このように、ゲルは、固体が連続相であり、液体が不連続相である固体内の液体の分子の分散である。「ハイドロゲル」は本明細書では「ハイドロゲルマトリックス」とも呼称されるが、ポリマー鎖のネットワークで構成された高分子ポリマーゲルで構成されるゲルの非限定的な例である。ハイドロゲルは、ネットワーク形成と共に、鎖またはステップ成長のいずれかによって、親水性モノマーまたは親水性二量体（例えば、ヒアルロナンの場合）から合成される。空隙欠陥と共にネット様構造は、水素結合を介して大量の水を吸収するハイドロゲルの能力を高める。結果として、ハイドロゲルは、特徴的でしっかりした、しかし弾性のある機械的特性を発達させる。古い結合が材料内で破壊された場合、新しい結合を自然に形成することができる。静電気吸着力と共にハイドロゲルの構造は、非共有の水素結合を介した新しい結合形成を促進する。
【００４３】
移植片に使用される生体材料は、生体材料の粘弾性としてより厳しく定義されうる機械的特性、剛性を有する。ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｖｉｓｃｏｅｌａｓｔｉｃｉｔｙを参照のこと。生着につながる移植片生体材料は、非常に軟質（例えば、約１００Ｐａ）で、ドナー細胞が未成熟のままであり（Ｌｏｚｏｙａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２０１１；３２（３０）：７３８９−７４０２）、膜結合型および／または分泌型ＭＭＰを生成できる条件でなければならない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「粘弾性」という用語は、変形を受けると粘性および弾性の両方の特性を示す材料の特性を意味する。ハチミツのような粘性材料は、せん断流に抵抗し、応力が加わると、時間と共に直線的に歪む。弾性材料は、引き伸ばされると歪み、応力が取り除かれると、迅速に元の状態に戻る。粘弾性材料は、これらの特性の両方の要素を有し、そのため、時間依存性歪みを呈する。弾性は通常、秩序ある固体における結晶学的平面に沿って延びる結合の結果であるが、粘性は非晶質材料内部の原子または分子の拡散の結果である。材料の機械的および粘弾性応答を試験する数多くの機器があるが、粘弾性の挙動を試験するために、周囲温度より上および下で使用でき、粘弾性を試験するのにより具体的であるため、広帯域粘弾性分光法（ＢＶＳ）および共鳴超音波分光法（ＲＵＳ）は、より一般的に使用される。これらの二つの機器は、時間と温度の重ね合わせに訴えることなく、様々な周波数および時間範囲で減衰機構を採用する。ＢＶＳおよびＲＵＳを使用して材料の機械的特性を研究することは、粘弾性を呈する材料がどのように機能するかを理解するために重要である。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「ヒアルロナン」または「ヒアルロン酸」という用語は、β１−４、β１−３結合およびその塩によって連結されたグルコサミンおよびグルクロン酸［１−３］から成る二糖単位のポリマーを意味する。したがって、ヒアルロナンという用語は、ヒアルロナンの天然形態および合成形態の両方を指す。天然起源のヒアルロナン（ＨＡ）、Ｄ−グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）およびＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の二糖単位を含む水溶性多糖類は、交互に連結されて線状ポリマーを形成する。高分子量ＨＡは、１００〜１０，０００個の二糖単位を含み得る。ＨＡは、多くの場合、ナトリウム塩、ヒアルロン酸ナトリウムとして天然に発生している。ＨＡ；ヒアルロン酸ナトリウムおよびＨＡまたはヒアルロン酸ナトリウムのいずれかの調製物は、「ヒアルロナン」と呼ばれることが多い。許容可能なヒアルロン酸の非限定的な例としては、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、およびヒアルロン酸カルシウムが挙げられる。
【００４６】
その他のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）をハイドロゲルで使用することもできる。これらには、コンドロイチン硫酸（ＣＳ）とデルマタン硫酸（ＤＳ）、グルクロン酸とガラクトサミンのポリマー、ヘパラン硫酸（ＨＳ）とヘパリン（ＨＰ）、グルクロン酸とグルコサミンのポリマーが含まれる。硫酸化パターンは、複数のタンパク質ファミリー（例えば、凝固タンパク質、成長因子、サイトカイン、好中球酵素）との複合体の形成を決定するため、これらのＧＡＧの硫酸化の程度およびパターンは重要である。例えば、Ｐｏｗｅｌｌ  ＡＫ，Ｙａｔｅｓ  ＥＡ，Ｆｅｒｎｉｇ  ＤＧ，Ｔｕｒｎｂｕｌｌ  ＪＥ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｒｉｎ／ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ａｐｐｒａｉｓａｌ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ．Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２００４  Ａｐｒ；１４（４）：１７Ｒ−３０Ｒ］を参照のこと。以下に示されるように、生着を最適化するパッチグラフトに適したものには、ヒアルロナン、非硫酸化ＧＡＧ、肝細胞の壁龕に見られるコンドロイチン硫酸のような硫酸化が最小限のものが含まれる。Ｋａｒｕｍｂａｉａｈ  Ｌ、ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  Ｃｒｅａｔｅ  Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  Ｎｉｃｈｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．２０１５  Ｄｅｃ  １６；２６（１２）：２３３６−４９  ａｎｄ  Ｈａｙｅｓ  ＡＪ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｕｌｆａｔｉｏｎ  ｍｏｔｉｆｓ  ａｓ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ．２００８  Ｆｅｂ；５６（２）：１２５−３８（参照により本明細書に組み込まれる）。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、移植片中の一つまたは複数の細胞を指す。本開示の細胞は真核生物である。いくつかの実施形態では、この細胞は、任意でヒト器官由来の動物由来であり、幹細胞、成熟体細胞、前駆細胞、または幹細胞から成熟細胞までの系統段階の中間体であり得る。「細胞の集団」または「細胞」という用語は、同じまたは異なる起源を持つ同じまたは異なる細胞型の一つまたは複数の細胞の群を指し、この用語は、本明細書では「ドナー細胞」という用語と交換可能に使用され、自己または同種でありうる細胞を意図する。いくつかの実施形態では、この細胞の集団は、新たに単離された細胞からの細胞株に由来してもよく、またはいくつかの実施形態では、この細胞の集団は、任意でドナーまたはレシピエントからの器官または組織の一部に由来してもよい。
【００４８】
「幹細胞」という用語は、自己複製することができ（親細胞と同一の娘細胞を生成）、多能性であり、すなわち、複数のタイプの成体細胞を生じさせることができる細胞集団を指す。本明細書で使用される場合、「前駆細胞」または「前駆体」という用語は、幹細胞の子孫およびその子孫を包含するように広く定義される。前駆体は、多能性、両能性、または単能性であり得るが、自己複製能力が（あるとしても）最小限の細胞集団である。コミットした前駆体は、単能性であり、特定の系統に分化して、一つの成熟細胞型のみにつながる可能性がある。幹細胞の非限定的な例としては、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚葉幹細胞、決定された幹細胞（外胚葉性、中胚葉性、または内胚葉性）、周産期幹細胞、羊水由来幹細胞、間葉幹細胞（ＭＳＣ）、血管芽細胞、および臍帯、ホウォートンゼリー、および／または胎盤由来のものが挙げられるが、これらに限定されない。幹細胞とコミットした前駆体との間の中間体には、肝芽細胞および膵管前駆体などの細胞集団、および多能性であるが、広範な増殖能力があり、自己複製性能が（もしあれば）より限定的である、他の形態のＴＡ細胞が含まれる。
【００４９】
「間葉細胞」という用語は、血管芽細胞、血管内皮前駆体、星状細胞前駆体、血管内皮、星状細胞、間質細胞、成熟および前駆細胞のさまざまな亜集団、ならびに多能性間質細胞および成熟および前駆体間葉細胞のさまざまな亜集団である間葉幹細胞（ＭＳＣ）を含むが、これらに限定されない、間葉由来の細胞を指す。ＭＳＣは、組織から培養選択プロセスにより調製された細胞集団である（Ｃａｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１８；ＰＭＩＤ：２９７３２６５３；Ｇｒａｃｅｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ２０１８：ＰＭＩＤ  ２９６９８６７０；Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔ．２０１５；ＰＭＩＤ：２６２７３３０５。成熟した間葉細胞には少なくとも二つの主なカテゴリーがある。（ａ）線維コラーゲン（例えば、Ｉ、ＩＩＩ、Ｖ型）および関連するマトリックス成分（フィブロネクチン、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン）、および複合体を形成する結合シグナル（例えば、成長因子、サイトカイン）、および通常は線形（紐状）細胞集団である細胞に関連する複合体を形成する結合シグナル（例えば、成長因子、サイトカイン）を含む細胞外マトリックスの形態を生成し、それらに囲まれている成熟した間葉細胞（星状／間質細胞）。こうした細胞の非限定的な例には、星状細胞、腱、間質、および筋線維芽細胞が挙げられる。（ｂ）ネットワークコラーゲン（例えば、ＩＶ型、ＶＩ型、ＶＩＩＩ、Ｘ）および関連するマトリックス分子（ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリンプロテオグリカン）、およびより扁平または立方状または玉石の形態を有する細胞に関連する結合シグナル（例えば、成長因子、サイトカイン）を含む細胞外マトリックスの形態を生成し、それらに囲まれている血管内皮などの成熟した間葉細胞。こうした細胞の非限定的な例としては、血管内皮、および筋上皮が挙げられる。
【００５０】
これらの間葉細胞型の前駆体には、多能性であり、血管内皮（この後期段階は有窓血管内皮）または星状細胞（この後期段階は筋線維芽細胞（間質）の系統に分化することができる血管芽細胞が含まれるが、これらに限定されない。前駆体には、多能性細胞であり、線維芽細胞（間質）、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞（軟骨細胞）、筋細胞（筋肉細胞）、および脂肪細胞（脂肪細胞）にも分化できる間葉幹細胞（ＭＳＣ）も含まれる。ＭＳＣは、培養選択方法によって任意に調製され得る（Ｃａｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１８；ＰＭＩＤ：２９７３２６５３；Ｇｒａｃｅｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ２０１８：ＰＭＩＤ  ２９６９８６７０；Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔ．２０１５；ＰＭＩＤ：２６２７３３０５。
【００５１】
「上皮細胞増殖」という用語は、典型的には立方状または玉石形態を有するコロニーを形成する上皮細胞のコロニーの直径と、コロニーの細胞の直径の複合である成長の推定値と相関する。対照的に、間葉細胞がより遊走性および運動性が高く、コロニー密度はコロニー境界内に残る細胞の正味合計を反映しているので、間葉細胞コロニーの成長の推定値はコロニーの密度と相関する。
【００５２】
「上皮細胞」という用語は、組織および／または宿主の全身ニーズに多様な機能を提供する特殊な細胞である、上皮に由来する細胞を指す。それらは、前駆体または未成熟細胞として移動する能力によって認識される。成熟すると静止状態になり、頂部、基底部、および側面を有する扁平または玉石状または柱状の分極細胞の層を形成し、それらは各種接合部（コネキシン、密着結合、付着）によって相互に結合される。その膨張可能性は、コロニーの（密度によってではなく）直径で示される。成熟した上皮細胞は、特殊な産生物の分泌、または代謝（肝細胞、胆管細胞）、解毒（肝細胞）、酵素の産生（腺房細胞）、内分泌因子の産生（例えば、膵島または他の内分泌細胞）、電気活性度（神経細胞）、および吸収（腸細胞）への寄与などの多様な機能を提供する。
【００５３】
「胆管幹細胞」（ＢＴＳＣ）という用語は、胆管全体に見られ、胆管周囲腺（ＰＢＧ）、ブルンナー腺、壁外および壁内の両方、ならびに胆嚢絨毛の陰窩中に位置する上皮幹細胞を指す。これらは、コミットした肝臓および／または膵臓前駆細胞に移行する能力を有する。肝臓の子孫は、ヘリング管を介して肝臓の類洞に入る。膵臓の前駆体は、膵臓内に位置する胆管の領域である膵管腺（ＰＤＧ）内に見られる。
【００５４】
これまでのところ、幹細胞集団の少なくとも７つの亜集団は、重複した特性で特定され、極めて原始的なＢＴＳＣから肝臓または膵臓幹細胞として定義可能な幹細胞集団にまで渡る。これらについて知られている内容の説明を以下に示す。最も原始的なものは、壁外胆管周囲腺―胆管の表面につながれたものと、壁内胆管周囲腺―胆管壁内に見られるもの、の両方に見られた。胆管壁の中心にある線維筋層の近くの壁内胆管周囲腺（ＰＢＧ）は、最も原始的な幹細胞集団が見られる壁龕である、陰窩とみなすこともできる（腸陰窩と類似）。胆管ネットワーク内のＰＢＧの最大数は、肝膵の共通管内および大きな肝内胆管内で見られる。胆嚢にはＰＢＧは発生しないが、代わりに、胆嚢内の幹細胞壁龕は、肝幹細胞の前駆体である中期から後期段階幹細胞集団を含む胆嚢絨毛の底部である。ＢＴＳＣは、肝臓および膵臓両方の前駆体である。それらは肝臓幹細胞、肝臓の前駆体、および膵臓幹細胞、膵臓の前駆体を生じさせ、これらは胆管全体に見られるが、その数は肝臓に近いか膵臓に近いかによって影響を受ける。したがって、少数の膵臓幹細胞および多数の肝臓幹細胞が大きな肝内胆管のＰＢＧに位置し、一方で少数の肝臓幹細胞および多数の膵臓幹細胞が肝膵の共通管のＰＢＧに位置する。
【００５５】
遺伝子シグネチャの概要を図に示す。一般的に、ＢＴＳＣのすべての亜集団は、肝臓および膵臓の両方の内胚葉性転写因子（例えば、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１７、ＰＤＸ１）、多能性遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＳＡＬＬ４、ＫＬＦ４／ＫＬＦ５、ＢＭＩ−１）；ＣＤ４４の一つまたは複数のヒアルロナン受容体アイソフォーム（標準および／またはバリアントアイソフォーム）；ＣＸＣＲ４；ならびにサイトケラチン８および１８を含む、ジェネリックバイオマーカーを発現する。胆管およびＰＢＧ内の幹細胞亜集団は以下を含む。（１）ＣＫ７、ＴＲＡ−１６０および１８１を発現し、また腸の幹細胞とは異なる特性を有する、十二指腸の粘膜下層にあるブルンナー腺細胞。（２）ヨウ化ナトリウム共輸送体（ＮＩＳ）およびＣＸＣＲ４、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧは発現するが、ＬＧＲ５またはＥｐＣＡＭは発現しない、初期段階壁内胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）。（３）ＮＩＳの発現は少ないが、ＥｐＣＡＭではなくＬＧＲ５の発現を得る中間段階壁内ＢＴＳＣ。（４）大きな肝内胆管および肝膵の共通管でも多数見られる、後期段階壁内ＢＴＳＣ（胆嚢で見られる唯一のＢＴＳＣ）。これらはＬＧＲ５とＥｐＣＡＭの両方を発現する。これらは肝臓幹細胞（肝臓内にあり、ＳＯＸ１７を発現するが、ＰＤＸ１は発現しない）および膵臓幹細胞（肝膵の共通管内にあり、ＰＤＸ１を発現するがＳＯＸ１７は発現しない）の前駆体である。（５）肝臓幹細胞は、へリング管、大きな肝内胆管のＰＢＧ、肝外胆管のＰＢＧ、および肝膵の共通管のＰＢＧに見ることができるが、最も多く見られるのは肝内部位である。肝臓幹細胞は、自己複製の能力および多能性を保持する。これらの細胞のためのバイオマーカーには、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ−４アルファ、ＩＴＧＢ１（ＣＤ２９）、ＯＮＥＣＵＴ２、ＳＡＬＬ４、ＬＧＲ５、ＣＤ４４、細胞質中および細胞膜に見られる上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、ＣＤ１３３（プロミニン）、無視できるレベル（または存在しない）アルブミン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）の完全欠如、Ｐ４５０  Ａ７の欠如、およびセクレチン受容体（ＳＲ）の欠如が挙げられる。肝臓幹細胞および肝芽細胞は、サイトカイン８、１８、および１９を発現する。（６）膵臓幹細胞は、胆管全体にわたって少数見られるが（大きな肝内胆管のＰＢＧでも）、肝膵の共通管のＰＢＧでは多数見られる。これらは、多能性遺伝子と、全ての幹細胞集団に見られる他の遺伝子の発現を有するが、ＳＯＸ１７を有さなくなったという点で異なり、膵島に系統を限定する亜集団は、ＮＧＮ３を発現する。これらは細胞全体および細胞膜でＥｐＣＡＭを発現し、低インスリンを発現する（または発現しない）。それらの成熟は、インスリン発現の増加、ならびに他の膵島ホルモン（例えば、グルカゴン）の発現と相関する。腺房集団に成熟するものは、ＭＵＣ６およびアミラーゼを発現する。
【００５６】
肝臓幹細胞および膵臓幹細胞も、発生の初期にそれぞれのソース器官に見られる場合があり（例えば、ＥＳＣ他）、本明細書に開示されるこれらの細胞のいずれかは、誘導を通して代替的に生成できる（すなわち、「ｉＰＳＣ」）ことに留意されたい。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「支持」という用語は、別の系統段階からの細胞の伝播を支援するか、または生存、膨張、移動、分化、および成熟の観点から隣接細胞に対する影響にアクティブな要因である「パラクリン信号」の生成を通じて隣接細胞に支援を提供できる細胞を説明するために使用される。例えば、支持間葉細胞は、上皮細胞に影響を与える能力、随意にマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）および／または一つまたは複数のパラクリン信号または成長因子の分泌を介して定義され得る。これらの多くは最近のレビューにまとめられている。（Ｃａｔｈｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２０１８；ＰＭＩＤ：２９７３２６５３；Ｇｒａｃｅｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ２０１８：ＰＭＩＤ  ２９６９８６７０；Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎｔ．２０１５；ＰＭＩＤ：２６２７３３０５。
【００５８】
「系統段階パートナー」という用語は、本明細書において、細胞の生着をサポートするのに適切な系統段階である、間葉細胞および／または上皮細胞を指す。肝臓または胆管幹細胞については、血管芽細胞（ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３＋、ＶＥＧＦｒ＋、ＣＤ３１陰性）およびその直接の子孫、血管内皮の前駆体（ＣＤ１３３＋、ＶＥＧＦｒ＋、ＣＤ３１＋、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ＋））ならびに星状細胞の前駆体（ＣＤ１４６＋、ＩＣＡＭ−１＋、平滑筋αアクチン＋（ＡＳＭＡ）、ビタミンＡ陰性）から成る。これらは、限定されないが、骨髄または脂肪組織由来のものなど、間葉幹細胞（ＭＳＣ）を使用することによって、部分的におよび／またはある程度で模倣することができる。理論に束縛されるものではないが、このような細胞は、組織から分離した直後に、または理想的には無血清条件下での最小限の継代後に使用されるべきであると考えられる。これらの細胞は、本明細書において、早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）と総称される。
【００５９】
系統ネットワーク内の中間体は、「ＴＡ細胞」と呼ばれるが、両能性（または多能性）であり得る細胞は、かなりの増殖能力を有するが、真の自己複製は（もしあれば）ほとんど示さず、低から中程度（ない場合も）の多能性遺伝子発現を有し、肝臓（例えば、アルブミン、アルファ−フェトタンパク質）または膵臓（例えば、インスリン、ＭＵＣ６、アミラーゼ）の運命に対するコミットを示す特性を発現する。これらには、肝芽細胞（肝臓を生じさせるネットワーク）および膵管前駆体（膵臓を生じるネットワーク）が含まれる。
【００６０】
本明細書において使用される場合、「膵管前駆体」という用語は、膵臓内の膵管腺（ＰＤＧ）内に見られる両能性細胞を指し、腺房細胞および膵島を生じさせる。研究では、これらが、ＳＯＸ９、ＰＤＸ１、ＰＴＦ１ａ、ＨＮＦ１β、ＥｐＣＡＭ、ＬＧＲ５、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ４４を発現し、亜集団がＮＧＮ３またはＭＵＣ６またはアミラーゼを発現することが見出された。それらは他者によって広範囲に特徴付けられてきた。例えば、Ｒｅｚａｎｅｊａｄ  Ｈ，Ｏｕｚｉｅｌ−Ｙａｈａｌｏｍ  Ｌ，Ｋｅｙｚｅｒ  ＣＡ，Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ＢＡ，Ｈｏｌｌｉｓｔｅｒ−Ｌｏｃｋ  Ｊ，Ｌｉ  ＷＣ，Ｇｕｏ  Ｌ，Ｄｅｎｇ  Ｓ，Ｌｅｉ  Ｊ，Ｍａｒｋｍａｎｎ  Ｊ，Ｂｏｎｎｅｒ−Ｗｅｉｒ  Ｓ．Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ  ｏｆ  ＳＯＸ９  ａｎｄ  ＨＮＦ１β  ｉｓ  ｄｙｎａｍｉｃ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１８  Ｍａｒ  １３；１０（３）：７２５−７３８を参照のこと。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「肝芽細胞」という用語は、肝細胞および胆管細胞系統を生じさせることができ、ヘリング管内もしくはヘリング管に隣接して、または大きな肝内胆管内のＰＢＧ内に見られる、両能性肝臓細胞を指す。これらは、肝臓幹細胞またはＢＴＳＣで観察されたものに比べて、増殖（すなわち、拡大）する並外れた能力を有するが、自己複製する能力（もしあれば）は低い。これらの細胞は、肝臓幹細胞または胆管幹細胞と重複するが、それと異なるバイオマーカープロファイルによって特徴付けられる。これらは、ＳＯＸ９、低（または無視できる）レベルのＳＯＸ１７、高レベルのＬＧＲ５、ＨＮＦ４−α、およびＥｐＣＡＭを発現し、主に細胞膜で見られ、Ｐ４５０Ａ７、サイトケラチン７、セクレチン受容体を発現し、すべての肝芽細胞で一貫してアルブミンを発現し、高レベルのアルファフェトタンパク質（ＡＦＰ）、細胞接着分子（ＩＣＡＭ−１）を発現するが、ＮＣＡＭは発現せず、多能性遺伝子は無視できるレベルか全く発現しない（例えば、ＳＡＬＬ４、ＫＬ４／ＫＬＦ５、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ）。）また、成熟肝臓実質マーカーも発現しない（例えば、Ｐ４５０３ＡなどのＰ４５０）。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「コミットした前駆体」という用語は、単一の細胞型、例えばコミットした肝細胞前駆体細胞を生じさせる、単能性前駆体を指す。いくつかの実施形態では、これらは多能性遺伝子を発現しない。コミットした肝細胞性前駆体は、アルブミン、ＡＦＰ、グリコーゲン、ＩＣＡＭ−１、グリコーゲン合成に関与する様々な酵素、およびギャップ接合遺伝子、コネキシン２８の発現によって認識される。これらは肝細胞を生じさせる。コミットした胆管（または胆管細胞）前駆体は、胆管細胞を生じさせ、ＥｐＣＡＭ、サイトケラチン７および１９、アクアポリン、ＣＦＴＲ（嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子）、および胆汁の産生に関連する膜ポンプの発現によって認識される。いくつかの実施形態では、コミットした膵島前駆体は、インスリン、グルカゴン、およびその他の膵島ホルモンを低レベルではあるが発現し、成熟すると、膵島ホルモンの発現レベルは増加するが、特定の細胞が優先的に特定のホルモンを発現する。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「凝集体」という用語は、一緒に集められた複数の細胞を指す。凝集体は、サイズおよび形状の両方で異なってもよく、または実質的に均一なサイズおよび／または形状であってもよい。本明細書で使用される細胞凝集体は、例えば、球形、円筒（好ましくは等しい高さおよび直径を有する）、またはとりわけ棒状など、様々な形状のものとすることができる。他の形状の凝集体を使用することができるが、本開示の一実施形態では、細胞凝集体は球形または円筒形であることが一般的に好ましい。「非凝集」という用語は、個体、または単細胞、幹および／または前駆細胞または成熟細胞を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物は、実質的に凝集した細胞、実質的に凝集していない細胞、またはそれらの混合物を含むことができる。
【００６４】
本明細書では、「オルガノイド」という用語は、本明細書に記載される単純なパニング法によって自己組織化される間葉細胞を有するドナー上皮細胞の特定の細胞凝集体を意味する。いくつかの実施形態では、間葉細胞は支持的な間葉細胞である。いくつかの実施形態では、オルガノイドは、低付着皿で培養した後に、懸濁液中の凝集細胞の系統段階に合わせた無血清の定義された条件下で形成される。他には、マトリゲルなどの特定のマトリックス抽出物を利用して、オルガノイドが調製される。実際に、この物質は業界標準であることが知られている。Ｈｉｎｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１６；４２０：２５１−２６１．ＰＭＩＤ：２７３６４４６９を参照のこと。これらのオルガノイドが維持される記載の条件は、本発明で説明したパッチグラフトにおけるこれらのオルガノイドの使用にはうまく機能しない。マトリゲルに見られるものなどの因子は、これらのパッチグラフトの成功に必要な細胞によるＭＭＰ産生を停止または実質的に減少させる。さらに、マトリゲルは、細胞を臨床的にヒトで使用したり、獣医目的で使用するための条件の成分にはなり得ない。
【００６５】
「培養」または「細胞培養」という用語は、人工的なインビトロ環境での細胞の維持を意味する。「細胞培養システム」は本明細書で使用される場合、細胞集団がエクスビボ（生体外で）で成長できる培養条件を指す。
【００６６】
本明細書で使用される「培養培地」は、細胞の培養、成長、または増殖のための栄養液を指す。培養培地は、これらに限定されないが、細胞を特定の状態（例えば、多能性状態、増殖状態、静止状態、など）に維持する能力、細胞を成熟させる能力、いくつかの場合では、具体的には、前駆体細胞の特定の系統の細胞への分化を促進する能力などの機能的特性によって特徴付けられてもよい。培養培地の非限定的な例は、典型的には約１０％〜約２０％のレベルで血清を補充した任意の基底培地である、血清補充培地（ＳＳＭ）である。血清は、自己（細胞と同じ種）、またはより一般的には、商業的な目的（例えば、ニワトリ、ウシ、ブタなど）のために日常的に屠殺される動物由来の血清とすることができる。特に、幹細胞が関与する本実施形態は、分化を駆動する血清および／または血清成分の組み込みを回避する培地を使用する。内胚葉性の幹／前駆体用に設計された無血清培地である、クボタの培地は、銅、低カルシウム（＜０．５ｍＭ）を含まず、セレン、亜鉛、インスリン、トランスフェリン、脂質で補充されているが、サイトカインまたは成長因子を含まない培地（栄養素、アミノ酸、ビタミン、塩、炭水化物）である、基底培地から成る。幹細胞を支持するその他の培地も使用できる可能性があるが、成熟プロセスが膜結合型および／または分泌型ＭＭＰの産生を弱めることになるため、細胞を分化させる任意の要因を回避する必要がある。
【００６７】
基底培地は、細胞培養に使用される緩衝液であり、アミノ酸、糖、脂質、ビタミン、ミネラル、塩、微量元素、および細胞周囲の間質液の化学成分を模倣する組成物中の様々な栄養素から成る。さらに、細胞培養培地は通常、少ない割合（典型的に２〜１０％）の血清で補充された基底培地から成る。本明細書に記載する移植技術では、条件を使用して細胞を幹細胞または早期前駆体細胞として維持するため、細胞を成熟細胞の運命に向かわせる可能性のある血清または任意の典型的なサプリメントを回避する。通常の基底培地に加えて、様々な栄養補助剤、脂質（アルブミンと高密度リポタンパク質などの担体分子と複合した遊離脂肪酸の混合物）。二つのホルモン／成長因子のみが追加される：炭水化物代謝に必要なインスリン、およびポリメラーゼのためのＦｅ担体として必要なトランスフェリン。内胚葉性の幹／前駆体用に設計された無血清培地である、クボタの培地は、銅、低カルシウム（＜０．５ｍＭ）を含まず、亜鉛、セレン、インスリン、トランスフェリン、脂質で補充されているが、サイトカインまたは成長因子を含まない基底培地から成る。その他の成長因子およびサイトカインおよび特に血清は、ドナー細胞の分化を誘発し、それによって生着および移動プロセスに必要なＭＭＰの産生を最小化するために避けるべきである。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「クボタの培地」とは、銅、カルシウム（＜０．５ｍＭ）、セレン、亜鉛、インスリン、トランスフェリン／Ｆｅ、精製アルブミンに結合した遊離脂肪酸の混合物、および任意に高密度のリポタンパク質（ＨＤＬ）を含有しない任意の培地を指す。いくつかの実施形態では、クボタの培地は、銅、低カルシウム（例えば、０．３ｍＭ）、約１０〜９Ｍのセレン、約０．１％ウシ血清アルブミンまたはヒト血清アルブミン（高精製および脂肪酸なし）、約４．５ｍＭのニコチンアミド、約０．１ｎＭの硫酸亜鉛七水和物、約１０〜８Ｍのヒドロコルチゾン（肝臓前駆体には使用されるが膵臓前駆体には使用されない任意の成分）、約５μｇ／ｍｌのトランスフェリン／Ｆｅ、約５μｇ／ｍｌのインスリン、約１０μｇ／ｍｌの高密度リポタンパク質、および精製血清アルブミンに結合した後に加えられた精製遊離脂肪酸の混合物を含まない、任意の培地（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０またはＤＭＥＭ−Ｆ１２）を含む。遊離脂肪酸混合物は、それぞれ約１００ｍＭのパルミチン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、およびステアリン酸から成る。この培地の調製のための非限定的な例示的方法は、他の場所で公開されている。例えば、Ｋｕｂｏｔａ  Ｈ，Ｒｅｉｄ  ＬＭ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎ．（米国）２０００；９７：１２１３２−１２１３７、その開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、したがって、これらのパッチグラフトの条件は、少ない割合（一般的に２〜１０％）の血清で補充した培地の日常的な使用に反している。血清は、生物学的プロセス（例えば、増殖、分化）を促進するために必要な必須シグナル伝達分子（ホルモン、成長因子、サイトカイン）を提供するために、長期間追加されてきた。いくつかの実施形態では、細胞の分化を避けるため、および／または特に分泌型ＭＭＰの産生の不活性化もしくは抑制を避けるために、血清は含まれていない。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「有効な量」または「有効量」という用語は、疾患状態または症状（例えば、肝臓または膵臓疾患）を治療するのに十分な量を指す。有効量は、一回または複数回の投与、塗布または用量で投与することができる。このような送達は、個別の投与単位が使用される期間、組成物の生物学的利用性、投与経路などを含む多くの変数に依存する。しかしながら、任意の特定の患者に対する組成物の特定の量は、使用される特定の薬剤の活性、患者の年齢、体重、健康状態、性別、および食事、投与の時間、排泄量、組成物の組み合わせ、治療している特定の疾患（例えば、肝臓または膵臓疾患）の重症度、および投与の形態を含む種々の要因に依存することが理解される。
【００７１】
「同等」または「生物学的同等物」という用語は、特定の分子、生物学的、または細胞材料を指すときに互換的に使用され、所望の構造または機能を維持しながら、最小限の相同性を有するものを意図する。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセスおよび／または転写されたｍＲＮＡがその後ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳されるプロセスを意味する。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。遺伝子の発現レベルは、細胞または組織試料中のｍＲＮＡまたはタンパク質の量を測定することによって決定されてもよく、さらに、複数の遺伝子の発現レベルは、特定の試料の発現プロファイルを確立するために決定されてもよい。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「機能的」という用語は、特別な特定の効果を達成することを意図するために、任意の分子、生物学的、または細胞材料を修飾するために使用され得る。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、ＲＮＡがコード（例えば、ｍＲＮＡ）または非コード（例えば、ｎｃＲＮＡ）であるかどうかにかかわらず、ＲＮＡ分子に転写された任意の核酸配列を広く含むことを意味する。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「生成する」という用語とその同義語（例えば、生成している、生成した、など）は、本開示のオルガノイドを存在させる方法ステップを指すとき、「産生する」およびその同義語と互換的に使用される。
【００７６】
「単離された」という用語は、本明細書で使用される場合、その他の材料を実質的に含まない分子または生物学的もしくは細胞材料を指す。
【００７７】
「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」という用語は、互換的に使用され、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドまたはその類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドの高分子形態を指す。ポリヌクレオチドは、任意の三次元（３Ｄ）構造を有することができ、公知または未知の任意の機能を実施し得る。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子または遺伝子フラグメント（例えば、プローブ、プライマー、ＥＳＴまたはＳＡＧＥタグ）、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、ＲＮＡｉ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組み換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブおよびプライマー。
【００７８】
ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。存在する場合、ポリヌクレオチドのアセンブリの前または後に、ヌクレオチド構造に対する修飾を付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断される可能性がある。ポリヌクレオチドは、標識成分との結合などにより、重合後にさらに修飾することができる。この用語はまた、二本鎖分子および一本鎖分子の両方を指す。別途指定または必要な場合を除き、ポリヌクレオチドであるこの技術の任意の態様は、二本鎖型と、二本鎖型を構成することが公知のまたは予測される、それぞれの二つの相補的な一本鎖型との両方を包含する。
【００７９】
「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」という用語は、二つ以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチド模倣体の化合物を意味するために、互換的に最も広い意味で使用される。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されてもよい。別の態様では、サブユニットは、他の結合、例えば、エステル、エーテルなどによって連結されてもよい。タンパク質またはペプチドは、少なくとも二つのアミノ酸を含む必要があり、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得る、アミノ酸の最大数に制限はない。本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、グリシンおよびＤおよびＬ両方の光学異性体、アミノ酸類似体、およびペプチド模倣体を含む、天然および／または非天然または合成アミノ酸のいずれかを指す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、互換的に使用され、任意の動物を意味することが意図されている。いくつかの実施形態では、対象は哺乳類であってもよい。いくつかの実施形態では、哺乳類は、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、サル、マウス、ヒト、またはラットである。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「組織」という用語は、生きているもしくは死亡した生物体の組織、または生きているもしくは死亡した生物体由来のまたはそれを模倣するように設計された任意の組織を指す。組織は、健康、病気、外傷によって負傷、損傷および／または遺伝的変異を有する場合がある。「自然組織」または「生体組織」という用語および変形は、本明細書で使用される場合、その自然状態、または生物体に由来するときから未修飾の状態で存在する生体組織を指す。「微小器官」は、「自然組織」を模倣する「生物工学的組織」のセグメントを指す。
【００８２】
生体組織は、任意の単一組織（例えば、相互接続され得る細胞の集合）または生物体の体の器官もしくは部分もしくは領域を構成する組織の群を含み得る。組織は、均質な細胞材料を含んでもよく、または例えば、肺組織、骨格組織、および／または筋組織を含むことができる胸部を含む体の領域で見られるような複合構造であってもよい。例示的組織としては、肝臓、膵臓、胆管、肺、腸、甲状腺、胸腺胸腺、膀胱、腎臓、前立腺、子宮、乳房、皮膚および皮下組織、脳、脊髄、血管（例えば、大動脈、腸骨静脈）、心臓、筋肉、およびそれらの任意の組み合わせに由来するものを含むが、これらに限定されない。
【００８３】
本明細書で使用される場合、対象の疾患を「治療する」または疾患の「治療」は、（１）疾患の素因がある、または疾患の症状がまだ表れていない対象に、症状または疾患が発生するのを防ぐこと、（２）疾患を抑制すること、または発症を阻止すること、（３）疾患または疾患の症状を改善すること、または退行させることを指す。当技術分野で理解されているように、「治療」は、臨床結果を含む、有益または望ましい結果を得るための手法である。本技術の目的のための有益または望ましい結果は、検出可能または検出不能にかかわらず、一つまたは複数の症状の緩和または改善、状態の程度の減弱（疾患を含む）、状態の状況（疾患を含む）の安定化（すなわち、悪化しない）、状態の遅延または減速（疾患を含む）、状態の進行、改善、または緩和（疾患を含む）、状況および寛解（部分的か全身的か）のうちの一つまたは複数を含むことができるが、これらに限定されない。
【００８４】
略語
ＡＦＰ、α−フェトタンパク質；ＡＬＢ、アルブミン；ＢＴＳＣ、胆管幹細胞；ＣＤ、共通決定；ＣＤ４４、ヒアルロナン受容体；ＣＤ１３３、プロミニン；ＣＦＴＲ、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子；ＣＫ、サイトケラチンタンパク質；ＣＸＣＲ４、ＣＸＣ−ケモカイン受容体４（フーシンまたはＣＤ１８４とも呼ばれる；血小板因子４とも呼ばれる；ＥＧＦ、上皮成長因子；ＥＬＳＭＣ、血管芽細胞およびそれらの子孫、血管内皮細胞および星状細胞の前駆体から成る早期系統段階間葉細胞；ＥｐＣＡＭ、上皮細胞接着分子；ＦＧＦ、線維芽細胞成長因子；ＨＢ、肝芽細胞；ＨＧＦ、肝細胞成長因子；ＨｐＳＣ、肝臓幹細胞；ＫＭ、内胚葉性幹細胞用に設計された無血清培地であるクボタの培地；ＫＲＴ、サイトケラチン遺伝子；ＬＧＲ５、Ｒ−スポンジンに結合するロイシンリッチリピート含有Ｇ−タンパク質共役型受容体５；ＭＭＰ、細胞外マトリックスの溶解、細胞移動および再生反応に関連するプロテイナーゼの大きなファミリーである、マトリックスメタロプロテイナーゼ；ＮＡＮＯＧ、自己複製に決定的に関与する転写因子；ＮＣＡＭ、神経細胞接着分子；ＮＩＳ、ナトリウム／ヨウ化物共輸送体；ＯＣＴ４、（オクタマー結合転写因子４）幹細胞によって発現される遺伝子である、ＰＯＵ５Ｆ１とも呼ばれる（ＰＯＵドメイン、クラス５、転写因子１）；ＰＤＸ１、膵臓の発達に重要な転写因子である、膵臓および十二指腸のホメオボックス１；ＰＢＧ、胆管幹細胞の幹細胞壁龕である、胆管周囲腺；ＳＡＬＬ４、幹細胞の自己複製に重要であることが見出された、Ｓａｌ様タンパク質４；ＳＯＸ、Ｓｒｙ−関連ＨＭＧボックス；ＳＯＸ２、胚性幹細胞および決定された幹細胞の自己再生または多能性の維持に必須である転写因子。ＳＯＸ９、内胚葉性組織（肝臓、腸および膵臓）と関連する転写因子；ＳＯＸ１７、肝臓の分化に必須である転写因子；ＶＥＧＦ、血管内皮細胞成長因子；ｖＷＦ、フォン・ヴィルブランド因子。
【００８５】
本開示を実施する方法
本明細書に提供される実施例では、出願人は、細胞が幹細胞または成熟細胞であるかどうかによって設計特徴を有する内臓に細胞を移植するための新規の方法である、パッチグラフティングを確立する。出願人は、肝臓および膵臓の両方の前駆体である、胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）の移植片を用いて肝臓または膵臓に移植し、本明細書でこれらの方法を実証する。これらの方法を開発するために使用される宿主は、ブタの種、Ｓｕｓ  ｓｃｒｏｆａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃｓである。これらは、探索医療、外科手術モデル、および手順訓練で使用される主な動物種であり、前臨床研究のサルの代替としてますます使用されている。
【００８６】
例示的な成功は、肝臓および膵臓の前駆体である胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）のオルガノイドが、早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）と組み合わされ、軟質（約１００Ｐａ）のヒアルロナン（ＨＡ）ハイドロゲルに含まれることで達成された。オルガノイドを含有するＨＡハイドロゲルを、より剛直なＨＡハイドロゲル（約７００Ｐａ）を漿膜側に含浸させたセリシルクの裏打ち（メッシュ材料）上に配置し、肝臓または膵臓の表面に外科手術的にまたはその他の方法でつないだ。一週間以内に、移植片は、器官被嚢および隣接組織、および随意に遠位実質組織の再形成を引き起こし、その後ドナー細胞および宿主細胞の合併が生じた。二週間後までに、ドナー細胞は、肝細胞（アルブミン）または膵島（β−細胞−インスリン）などの機能的成体運命に成熟した。三週間後までに、ＨＡが除去され、器官被嚢および正常な組織の組織学が回復した。生着／移動／統合プロセスは、細胞によって発現された複数の細胞膜結合型および分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼに依存していることが判明した。
【００８７】
これらの実施例の結果は、固形臓器から内臓へ細胞を移植する過去の努力の結果とは対照的であり、移植は直接注入または血管経路を介した細胞の送達のいずれかによって達成された（Ｂｈａｔｉａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｌａｎｚｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、Ｗｅｂｅｒおよびその他によるレビューを参照）。過去の移植方法では、生命を脅かす可能性のある塞栓のリスクがあり、有意なレベルの異所細胞分布がある中で、少数の細胞が生着した。これらの問題により、内部固形臓器の細胞療法が最小限に使用されるか、または全く使用されない。
【００８８】
パッチグラフト戦略は、細胞療法の代替方法を提供し、適切な細胞数の送達および組織へのそれらの統合を可能にし、機能の著しい回復を提供することができる。実施例は、使用する生体材料および裏打ちが、ドナー細胞の一部またはすべてを未成熟として維持することを支持し、ＭＭＰの関連するレパートリーを生成できる限り、安全性を実証する。一般的な失敗の原因は、ドナー細胞の分化をもたらす任意の因子であった。理論に束縛されるものではないが、本明細書では、必要なＭＭＰを自然に産生する細胞を移植片に提供する代わりに、組み換え型発現系またはその他の遺伝子改変技術を使用して、精製ＭＭＰを移植片生体材料に組み込むことができ、および／または細胞を形質転換させて、ＭＭＰを分泌させることができると考えられる。このような実施形態では、構築体を介して組み込まれたまたは形質導入されたＭＭＰの組み合わせには、以下の実施例で提供される発現プロファイルで特定されるものが含まれるべきである。
【００８９】
パッチグラフトの組成
本明細書に開示される態様は、細胞の単一の集団または二つ以上の集団（例えば、自己もしくは同種でありうるドナー細胞）およびＭＭＰ供給源を含む層と、移植片を標的部位につなぐために使用されうる、生体適合性、生分解性材料を含む裏打ちとを含むパッチグラフトに関する。いくつかの実施形態では、集団または細胞の集団は、上皮細胞の集団および間葉細胞の集団を含む。いくつかの実施形態では、細胞の集団は、移植片の一部として特定の状態または「系統段階」で維持される必要があり、これらは器官に組み込まれるまで、さらに分化または成熟しないことを意味する。これは、細胞源、ＭＭＰ含量、使用される培地、および裏打ち品質に関連する変数のバランスをとることによって達成できる。これらの態様の各々は、以下でより詳細に説明される。
【００９０】
理論に束縛されるものではないが、パッチグラフトは、（１）支持間葉幹／前駆体細胞集団の分化につながらない、または適切なＭＭＰを含有する培地およびハイドロゲル中の最適な細胞集団または細胞の混合物−例えば、膜結合型および／または分泌型ＭＭＰを生成する、ドナー上皮細胞および支持間葉幹／前駆体細胞集団−と、（２）標的部位に移植片をつなぎ、移植片内の細胞が標的部位から離れて裏打ちに移動するのを防ぐのに適した裏打ちと、を用いて成功できると考えられる。
【００９１】
例示的な細胞
理論に束縛されるものではないが、細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、決定された幹細胞、コミットした前駆体、ＴＡ細胞、または成熟細胞を含む任意の成熟系統段階にありうる。しかしながら、特定の実施形態では、ＭＭＰ供給源はパッチグラフト内に存在しなければならない。したがって、本明細書で意図されるのは、パッチグラフトで使用するためのＭＭＰの細胞源である。こうした細胞源は、膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼを発現することができる早期系統段階にある必要がある。このような早期系統段階の非限定的な例は、早期系統段階の間葉幹細胞（ＥＳＭＬＣ）である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、移植される細胞は、間葉細胞と組み合わせた上皮細胞である。いくつかの実施形態では、上皮細胞は、上皮幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、上皮細胞は、コミットしたおよび／または成熟上皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、コミットしたおよび／または成熟した上皮細胞は、成熟した実質細胞を含む。いくつかの実施形態では、成熟実質細胞は、肝細胞、胆管細胞、または膵島細胞のうちの一つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、間葉細胞はＥＬＳＭＣを含む。いくつかの実施形態では、ＥＬＳＭＣは、血管芽細胞、血管内皮の前駆体、星状細胞の前駆体、およびＭＳＣのうち一つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、上皮細胞および間葉細胞は、互いの系統段階パートナーである。いくつかの実施形態では、上皮細胞および間葉細胞は、互いの系統段階パートナーではない。例えば、それぞれほぼ同じ系統段階または成熟段階にはない。いくつかの実施形態では、上皮細胞は成熟細胞である。いくつかの実施形態では、間葉細胞はＥＬＳＭＣである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、上皮細胞および間葉細胞のうちの少なくとも一つは、ドナーに由来する。いくつかの実施形態では、ドナーは、組織移植を必要とする対象である。いくつかの実施形態では、ドナーは組織移植のための健康な細胞源である。いくつかの実施形態では、上皮細胞および間葉細胞のうちの少なくとも一つは、パッチグラフトの意図されたレシピエントに対して自己である。いくつかの実施形態では、全ての細胞（すなわち、上皮および間葉）は、移植片の意図されたレシピエントに対して自己である。いくつかの実施形態では、細胞のドナーは、レシピエント（同種移植）以外のものであってもよく、または病気または機能不全の状態の内臓を有する対象（自己）であってもよく、随意に、細胞は病気または機能不全ではない内臓の一部から、および／または機能を復元するように遺伝子組み換えされている細胞から取得される。
【００９４】
別の態様では、間葉細胞は、ドナー細胞の系統段階パートナーであり、例えば、同等または対応する系統段階にある。別の態様では、間葉細胞は、ドナー細胞の系統段階の適切なパートナーではない。間葉系統段階細胞は、血管芽細胞、血管内皮および／または星状細胞の早期系統段階前駆体、間葉幹細胞、血管内皮または星状細胞、またはこれらの細胞集団の誘導体であってもよい。
【００９５】
幹細胞移植については、上皮細胞を、本来の系統段階パートナー間葉細胞（血管芽細胞および／または血管内皮または星状細胞の前駆体）と組み合わせるべきである。成体の上皮細胞については、適切なパートナーは、血管芽細胞および／または星状細胞および血管内皮細胞の前駆体から成る早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）を含む。出願人は、間葉幹細胞（ＭＳＣ）の調製物を成体細胞と組み合わせて使用して、生着を達成できることを示した。いくつかの実施形態では、特定のＭＳＣは他のＭＳＣより好ましい場合がある。理論に束縛されるものではないが、細胞の培養を最小限に抑え、細胞の分化を促進する可能性のある血清およびマトリックス成分を回避する細胞の組み合わせを選択することによって、移植片は最適化できると考えられる。理論に束縛されるものではないが、パラクリンシグナル伝達はＭＭＰの産生をサポートするため、上皮‐間葉関係が重要であることがさらに理解される。しかしながら、成熟血管内皮と組み合わせた成熟上皮細胞は、移植片内で生存し、機能的細胞になるが、生着しない。したがって、成熟上皮細胞が成熟間質と組み合わされて移植片を形成する場合、結果として生じる移植片は線維症になる可能性が高い。
【００９６】
病気または機能不全の器官の治療については、細胞はレシピエント以外のドナー（同種移植）由来のものであるか、または自己移植であってもよく、したがって、病気または機能不全の状態の内臓を有する対象由来の細胞は、随意に病気または機能不全ではない内臓の一部から、および／または機能を復元するように遺伝子組み換えされている細胞から取得される。
【００９７】
疾患を研究するモデルシステムを確立するために、細胞は、疾患を有し、実験的宿主の正常な組織の上／中へと移植されるものとすることができる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、上皮細胞は、支持間葉細胞、任意でＥＬＳＭＣと組み合わされた幹細胞であり、任意で自己組織化するオルガノイドを形成してもよい。これらのオルガノイドは、ヒアルロナンハイドロゲル中に埋め込まれてもよく、これに含まれてもよい。本開示の幹および／または前駆細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、胚性生殖細胞（ＥＧＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、膵臓幹細胞（ＰＳＣ）、肝臓幹細胞（ＨｐＳＣ）、胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）、肝芽細胞、膵管前駆体、コミットした膵臓前駆細胞、またはコミットした肝臓前駆細胞を含む、当技術分野で公知の任意の幹および／または前駆細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞集団は、膵臓幹細胞、肝臓幹細胞、胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）またはブルンナー腺幹細胞などの幹細胞のみを含む。他の実施形態では、細胞は、肝芽細胞または膵管前駆細胞などの多能性前駆体亜集団のみを含むか、または移植片は、コミットした、単能性前駆体（例えば、肝細胞性または胆管もしくは膵島もしくは腺房コミットした前駆細胞）を含むことができる。他の実施形態では、細胞は幹細胞と前駆体との混合物を含む。
【００９９】
成体の上皮細胞を使用する場合、それらは適切な比でＥＬＳＭＣと混合され、生体材料の中に移植されうる。細胞混合物の比は、標的組織を模倣するように決定されてもよい。別の方法として、または追加的に、比はオルガノイドの自己組織化を通して決定されうる。オルガノイドまたは細胞混合物は、軟質のヒアルロナンハイドロゲルなどの軟質移植生体材料内に埋め込まれる。幹細胞移植片の場合、本開示の幹および／または前駆細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、胚性生殖細胞（ＥＧＣ）、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ブルンナー腺幹細胞（ＢＧＳＣ）、胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）、膵臓幹細胞（ＰＳＣ）、肝臓幹細胞（ＨｐＳＣ）、ＴＡ細胞（例えば、肝芽細胞または膵管前駆体）、およびコミットした、単能性前駆体（例えば、コミットした膵臓前駆体または肝細胞もしくは胆管細胞前駆体）を含む、当技術分野で公知の任意の幹および／または前駆細胞を含むことができる。いくつかの実施形態では、細胞集団は幹細胞のみを含む。他の実施形態では、細胞は前駆体亜集団のみを含む。他の実施形態では、細胞は、幹細胞と前駆体の混合物、または幹／前駆細胞とより成熟した細胞の混合物を含む。さらに他の方法として、成体細胞（例えば、肝細胞、胆管細胞、腸細胞、膵島）とＥＬＳＭＣのキメラ混合物がある。
【０１００】
幹細胞および／または前駆細胞は、当業者に公知の任意の方法によって特定することができる。非限定的な例としては、自己複製能力を定義するアッセイと、形態学的解析、遺伝子および／またはタンパク質発現、細胞表面マーカーなどによる多能性を示すアッセイの組み合わせの使用が挙げられる。いくつかの実施形態では、幹および／または前駆細胞は、早期段階の肝細胞系統細胞（例えば、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ−４アルファ、ＨＮＦ６、ＨＥＳ１、ＣＫ１９））を示す少なくとも一つのマーカーと、早期段階の膵細胞系統（例えば、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＮＧＮ３、ＨＮＦβ１）を示す少なくとも一つのマーカーを示す。例えば、幹および／または前駆細胞、特にＢＴＳＣは、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１７、ＰＤＸ１、ＣＤ１３３、ＮＣＡＭ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ナトリウム・ヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ４４のさまざまなアイソフォーム、ＣＸＣＲ４、およびさまざまな多能性遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＳＡＬＬ４、ＢＭｉ−１）、またはそれらの任意の組み合わせの発現によって特定されうる。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、幹および／または前駆細胞は、肝臓および膵臓の親系統などの早期親段階細胞系統を示す、少なくとも一つのマーカーを発現する。したがって、肝臓系統と膵臓系統の両方の系統（例えば、ＳＯＸ９、ＬＧＲ５／ＬＧＲ６、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ１３３、ＣＫ１９）によって共有されるもの、および肝臓系統（例えば、ＳＯＸ１７、ＨＮＦ−４−アルファ、ＨＮＦ６、ＨＥＳ１）について一つ、および早期段階膵臓細胞系統（例えば、ＰＤＸ１、ＰＲＯＸ１、ＮＧＮ３、ＨＮＦβ１）について一つを発現する。例えば、幹および／または前駆細胞、特にＢＴＳＣは、ＳＯＸ９、ＳＯＸ１７、ＰＤＸ１、ＣＤ１３３、ＮＣＡＭ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、ナトリウム・ヨウ素共輸送体（ＮＩＳ）、ＬＧＲ５、ＬＧＲ６、ＥｐＣＡＭ、およびさまざまな多能性遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５、ＳＡＬＬ４、ＢＭｉ−１）、またはそれらの任意の組み合わせの発現によって特定されうる。
【０１０２】
成熟細胞型の生成
幹および／または前駆細胞も、希望する場合、より成熟細胞型に分化することができる。自然分化および／または方向付けられた分化によって、インビトロでこれを実行できる。方向付けられた分化は、限定培地の使用、幹および／または前駆細胞を遺伝的に改変して目的の遺伝子、またはその組み合わせ発現させることを含み得る。
【０１０３】
細胞を分化するための限定培地の非限定的な例としては、内胚葉性幹細胞の成体運命への分化に使用されるホルモン限定培地（ＨＤＭ）が挙げられる。クボタの培地にサプリメントを追加して、正常な肝臓または胆管幹細胞の特定の成体運命への分化を促進する、無血清のホルモン限定培地（ＨＤＭ）を生成することができる。これらには、０．６ｍＭ以上の濃度、１ｎＭトリヨードチロニン（Ｔ３）、１０−１２Ｍの銅、１０ｎＭのヒドロコルチゾン、および２０ｎｇ／ｍｌの塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を達成するためのカルシウムの補充が含まれる。肝細胞（ＨＤＭ−Ｈ）対胆管細胞（ＨＤＭ−Ｃ）対膵島（ＨＤＭ−Ｐ）を選択的に産生するために必要なこれらに加えての培地条件は以下のとおりである：
１）ＨＤＭ−Ｈ：７μｇ／Ｌのグルカゴン、２ｇ／Ｌガラクトース、１０ｎｇ／ｍｌの上皮成長因子（ＥＧＦ）および２０ｎｇ／ｍｌ肝細胞成長因子（ＨＧＦ）で補充；
２）ＨＤＭ−Ｃ：２０ｎｇ／ｍｌの血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）および１０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦでさらに補充；および
３）ＨＤＭ−Ｐ：グルココルチコイドなしで調製し、１％のＢ２７、０．１ｍＭのアスコルビン酸、０．２５μＭのシクロパミン、１μＭのレチノイン酸、２０ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ−７を４日間さらに補充し、次いで５０ｎｇ／ｍｌのエキセンディン−４、および２０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦを補充したものに変更し、さらに６日間誘導した。
【０１０４】
本明細書に提供されるＨＤＭには、Ｗｎｔ信号、上皮成長因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦｓ）、神経栄養因子、さまざまなインターロイキン、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、血管内皮細胞成長因子（ＶＥＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＧＭ−ＣＳＦ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ヘパリン結合成長因子、ＩＧＦ結合タンパク質、および／または胎盤成長因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０５】
本明細書に提供されるＨＤＭは、インターロイキン、リンホカイン、モノカイン、コロニー刺激因子、ケモカイン、インターフェロン、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含むがこれに限定されないサイトカインで補充することができる。
【０１０６】
出願人は、ヒアルロナンが幹および／または前駆細胞に影響を与え、細胞の付着および細胞間相互作用に必要な重要な細胞接着分子を調節する因子を発現し、幹および／または前駆細胞が、細胞懸濁液の調製、凍結保存、または移植後のこれらの付着因子の内部移行を防止することができる。こうした付着因子の非限定的な例には、インテグリンが含まれる。インテグリンは、細胞を基底膜の細胞外マトリックスタンパク質、その他の細胞上のリガンド、および可溶性リガンドに付着させるように機能するヘテロ二量体膜貫通糖タンパク質の大きなファミリーである。インテグリンは、それぞれαおよびβと呼ばれる大小のサブユニットを含む。このサブユニットは、αβヘテロ二量体を形成し、ヒトでは少なくとも１８個のαおよび８個のβサブユニットが公知であり、２４個のヘテロ二量体を生成する。いくつかの実施形態では、幹および／または前駆細胞は、より高いレベルのインテグリンサブユニット、例えばＩＴＧα１、ＩＴＧα２、ＩＴＧα２Ｂ、ＩＴＧα３、ＩＴＧα４、ＩＴＧα５、ＩＴＧα６、ＩＴＧα７、ＩＴＧα８、ＩＴＧα９、ＩＴＧα１０、ＩＴＧα１１、ＩＴＧαＤ、ＩＴＧαＥ、ＩＴＧαＬ、ＩＴＧαＭ、ＩＴＧαＶ、ＩＴＧαＸ、ＩＴＧβ１、ＩＴＧβ２、ＩＴＧβ３、ＩＴＧβ４、ＩＴＧβ５、ＩＴＧβ６、ＩＴＧβ７、およびＩＴＧβ８を発現する。一つの好ましい実施形態では、幹および／または前駆細胞は、より高いレベルのインテグリンサブユニットベータ１（ＩＴＧβ１）および／またはインテグリンサブユニットベータ４（ＩＴＧβ４）を発現する。Ｔａｋａｄａ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．８（５）：２１５。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本開示の幹および／または前駆細胞は、天然起源の幹および／または前駆細胞とは、未修飾の幹および／または前駆細胞のインテグリンサブユニットの量よりも少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、２００％を超える量でインテグリンサブユニットを発現するという点で異なっている。インテグリンサブユニットの増加は、これが望ましい場合、幹および／または前駆細胞を付着させ、細胞間相互作用を形成させ、および幹および／または前駆細胞の内部移行の防止を助けられることが意図されている。
【０１０８】
ＭＭＰ
ＭＭＰは、生着および統合を促進する主要な要因の一つである。ＭＭＰは、多くのアイソフォーム（少なくとも２８個、ピグ中で２４個のアイソフォームが知られている）から成り、その一部は分泌され（例えば、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９）、一部は細胞膜に関連する（例えば、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５）。理論に束縛されるものではないが、生着、特に分泌型の混合には、これらの混合が必要であると考えられる。検査されたすべての細胞は、分泌型および膜結合型の両方をさまざまな量で生成するが、幹／前駆体は非常に高いレベルの分泌型を生成する。生着は、これらの分泌型ＭＭＰ（および膜結合型との一部の既知の相乗効果）に依存する。これらの細胞源は、生着を達成するために必要なＭＭＰを提供する実用的な方法である。代替的手法として、出願人は、ＭＭＰの精製／組み換え型を移植片生体材料および／または移植片内の細胞の遺伝子操作に組み込み、必要なＭＭＰを生成することを企図している。
【０１０９】
細胞は、複数のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の供給源、理想的には細胞源、任意選択的に分泌型および膜結合型の一方または両方がある限り、成功裏に生着できる。ＭＭＰは、未成熟細胞および成熟細胞の両方のすべての細胞型によって生成されるが、それらはどのアイソフォームが生成されるか、特定のＭＭＰのどのレベルにおいて発現するかは異なる。代表的な分泌型には、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７およびＭＭＰ９が含まれる。代表的な膜結合型には、ＭＭＰ１４およびＭＭＰ１５が含まれる。経験的に、分泌型ＭＭＰの最も高い産生は、早期系統段階細胞、幹細胞および早期前駆体によるものであることが分かっている。移植片の生体材料は、上皮細胞および間葉細胞の両方の能力をサポートして、器官または組織周辺の被嚢を溶解し、細胞外マトリックス成分の複数形態の溶解手段によって細胞の移動を可能にする、これらの複数形態のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を生成する。
【０１１０】
より一般的には、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰＳ）は、細胞外マトリックス成分の分解および調節に関与し、ならびに正常または病原性プロセスでの移植、浸潤、血管新生、血管形成、および移動に関与する亜鉛依存性プロテイナーゼの大きなファミリーである。マトリクシン（ｍａｔｒｉｘｉｎ）、アダマライシン、アスタシン、セラリシンなどを含む少なくとも２８個のアイソフォームがある。それらの役割は、胎盤の移植などの通常のプロセス、ならびに癌の浸潤および転移などの病原性のもので特徴付けられてきた。
【０１１１】
本明細書に記載される研究は、移植された細胞の生着、移動および統合に寄与するＭＭＰの完全に新しい役割のための証拠を提供する。上皮および間葉の両方の幹／前駆体は、これらの役割に特に強力な複数のＭＭＰアイソフォームを発現する。細胞の成熟により、一つまたは複数の強力な幹／前駆細胞関連ＭＭＰの発現が弱まり、浸潤および移動プロセスが減少する。成体細胞はまた、主に膜結合型（ＭＴ−ＭＭＰ）であるＭＭＰも発現し、該ＭＭＰは可塑性プロセスに関与しているが、細胞の組織への大規模な生着および統合には関与していない。ただし、ＭＴ−ＭＭＰと分泌型の間にはいくらかの相乗作用がある。この実現の正味合計は、移植片生体材料、裏打ちおよびその他の条件が、他の特性の中でもとりわけ、分泌型ＭＭＰなどの様々なＭＭＰの発現を最適化し、移植および移動プロセスが発生するのを可能にするものでなければならないということである。したがって、移植された細胞の分化を促進する要因は、並行して、複雑なＭＭＰ応答を弱める。この実現は、回避するべき要因には、血清（分化を促進する）、分化を促進する可溶性信号（例えば、特定の成長因子、サイトカインおよびホルモン）；分化を促進する細胞外マトリックス成分（例えば、コラーゲン、接着分子、高度に硫酸化されたグリコサミノグリカン／プロテオグリカン）；および移植片の剛性（分化を促進する粘弾性特性）に寄与する機械力を含まれることを意味する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、混合物中の一つまたは複数の細胞は、分泌型および／または膜結合型ＭＭＰの供給源である。分泌型ＭＭＰは、随意に、一つまたは複数の上皮細胞または間葉細胞によって自然に生成されるか、または随意に、ＭＭＰ産生のための組み換え発現ベクターまたは遺伝子編集による一つまたは複数の上皮細胞または間葉細胞の形質転換により生成されてもよい。いくつかの実施形態では、ＭＭＰを自然に分泌する幹／前駆細胞集団などを含むが、これらに限定されず、ＭＭＰ発現を弱める変数−随意に膜結合型および／または分泌型ＭＭＰ発現がパッチグラフト内で制御される。こうした変数の非限定的な例には、培地または移植片生体材料への血清補充、上皮細胞および／または間葉細胞の分化に影響を与えるホルモンまたは他の可溶性信号、酸素レベル（嫌気性条件が細胞を未成熟に保つ一方で、より高い酸素レベルが分化を促進するため）、および移植片材料の剛性（剛性、またはせん断力および圧縮などの機械力が分化を促進し得るため）などが挙げられるが、これらに限定されない、幹／前駆細胞の成熟をもたらす変数が含まれる。
【０１１３】
幹細胞移植片については、上皮細胞およびその間葉細胞パートナーの両方が、最適な幹細胞または前駆体であり、両方とも複数のタイプのＭＭＰの寄与を提供するためである。成体細胞を生着させるために、上皮細胞または間葉細胞の一つは、膜結合型および／または分泌型ＭＭＰの細胞源を最適に提供するべきである。例えば、必要に応じて、膜結合型および／または分泌型ＭＭＰの細胞源としてＥＬＳＭＣを使用する。したがって、上皮および間葉細胞の両方が成熟細胞型である移植片は、生着に成功していない。成熟血管内皮の場合、上皮細胞は生存する可能性が高く、増殖および機能するが、生着しない。成熟間質の場合、移植片は線維症になる可能性が高い。
【０１１４】
まとめると、上皮‐間葉細胞パートナーの両方が幹／前駆体であるか、または上皮細胞または間葉細胞のうち少なくとも一つが幹細胞である場合、生着は生じることになる。例えば、随意にマトリックス結合型および／またはマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の分泌型アイソフォームの供給源としてのＥＬＳＭＣを使用するか、またはそれらのＭＭＰの精製／組み換え型が移植片生体材料に供給される場合。パッチグラフトに適した早期系統段階の間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）は、血管芽細胞、血管内皮の前駆体、早期系統段階の血管内皮、星状細胞の前駆体、早期段階の星状細胞、または間葉幹細胞（ＭＳＣ）、またはこれらの混合物になり得る。
【０１１５】
したがって、本明細書で意図されているのは、少なくとも一つの細胞集団（例えば、上皮細胞および間葉細胞）およびＭＭＰの供給源を含むパッチグラフトとして使用するための組成物である（すなわち、随意に培地および／またはハイドロゲルの条件によって支持される、膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現する能力を有する早期系統段階の細胞集団）。
【０１１６】
培地成分
本明細書に開示される細胞およびＭＭＰの供給源と組み合わせて使用するために、任意の培地（栄養素、ビタミン、塩などを含む）に加えて、幹／前駆体の増殖および／または生存に有用であることがわかっている、インスリン、トランスフェリン／Ｆｅおよび脂質などの重要な可溶性因子を使用することができる。成熟はＭＭＰの発現の低下または減弱をもたらすので、細胞を成熟させるすべての要因を回避する必要がある。回避するべき要因には、血清、分化を促進する可溶性信号、分化を促進する細胞外マトリックス成分、および剛性または機械力（圧縮、摩耗）が含まれる。こうした培地の非限定的な例は、クボタの培地である。
【０１１７】
したがって、本明細書で意図されているのは、少なくとも一つの細胞集団およびＭＭＰの供給源を含むパッチグラフトとして使用するための組成物である（例えば、適切な培地で支持された、膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）、または精製されたＭＭＰを発現する能力を有する早期系統段階の細胞集団）。適切な培地の非限定的な例は、クボタの培地である。胚幹（ＥＳ）細胞または誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞に使用されるものなど、その他の幹細胞培地は、ＭＭＰの供給源である細胞の分化を促進する可溶性信号もしくはマトリックス信号を含まない限り、またはＭＭＰが存在するかもしくは他のソースから含まれる限り、同様に適切でありうる。
【０１１８】
ハイドロゲル
パッチグラフトは、一つまたは複数のハイドロゲル成分を含む。いくつかの態様では、ハイドロゲルを形成することができる生体材料、または類似の不溶性複合体（例えば、非コラーゲン性ゼラチン）は、ヒアルロナン、チオール修飾ヒアルロナン、その他のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）、またはその組み合わせを含む。凝固のトリガーは、マトリックス成分の架橋またはゲル化できるそれらの成分のゲル化を誘発する任意の要因とすることができる。架橋剤は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはＰＥＧ−ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）ハイドロゲル、またはそのジスルフィド含有誘導体を含んでもよい。特に、ハイドロゲル中に含まれる生体材料は、例えば、ＥＬＳＭＣなどのパッチグラフトで使用するために開示された一つまたは複数の細胞集団の幹細胞性を支持する能力について選択されるべきである。
【０１１９】
幹細胞性の維持を支持するマトリックス成分は、使用できるが、分化を促進する成分は使用できない。支持成分の非限定的な例には、ヒアルロナンたは非硫酸化（または最小硫酸化）グリコサミノグリカンが含まれる。これらは、さまざまなレベルの剛性（随意に粘弾性として測定）を有するように修飾されて「調整」できるため、特に有用である。したがって、いくつかの態様では、随意に内臓の単離された細胞である細胞集団は、細胞を宿主に導入する前に、生体材料内でエクスビボで凝固させるか、または別の方法として、流体物質として注入し、インビボで凝固させることができる。
【０１２０】
ハイドロゲルの非常に軟質のバージョン（例えば約１００Ｐａ）は、ドナー細胞を未成熟状態で維持するのに理想的である。より剛直なバージョン（例えば＞５００Ｐａ）を使用して、ＭＭＰの生産を遮断して移動をブロックするのに十分なほど細胞を成熟させることができる。さらに剛直なバージョンは、隣接組織からの癒着を最小化することもできる。特定の実施形態では、細胞の集団およびＭＭＰの供給源、随意に別の細胞集団（すなわち、膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現する能力を有する早期系統段階での細胞集団）。
【０１２１】
理論に束縛されるものではないが、羊膜中に見られる細胞外マトリックスの形態は、ドナー細胞を未成熟に保つことができると考えられる。したがって、羊膜は、ハイドロゲルでの使用、および随意に、代替的な生体適合性、生分解性材料としての使用の両方が意図されている。
【０１２２】
特に、成熟を引き起こすことが知られている材料には、これに限定されないが、Ｉ型コラーゲンなどの成熟細胞外マトリックスに由来する特定の成分が含まれる。これらの材料は、細胞、ハイドロゲル、培地、裏打ち、および／または任意のさらなる成分を含むが、これらに限定されない、パッチグラフトのすべての要素から除外されるべきである。
【０１２３】
したがって、本明細書で意図されているのは、少なくとも一つの細胞集団およびＭＭＰの供給源を含むパッチグラフトで使用するための組成物である（すなわち、適切な培地で支持され、およびハイドロゲルに含まれた、膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現する能力を有する早期系統段階の細胞集団）。
【０１２４】
上述のように、剛性は細胞を分化させる能力を駆動することができる。さらなる剛直なハイドロゲルは、移動する細胞の能力に対して効果を有しうる。細胞が器官内へ移動する必要があるとき、細胞が含まれるハイドロゲルは、任意で、ハイドロゲルおよび／またはパッチグラフト内にまたはそれから離れるように、該細胞の移動を可能にするのに十分な粘弾性を有するべきである。こうした粘弾性の非限定的な例には、限定されないが、約５０〜約１００Ｐａまたは約２５０Ｐａの範囲の粘弾性、例えば少なくとも約５０Ｐａ、少なくとも約１００Ｐａ、少なくとも約１５０Ｐａ、少なくとも約２００Ｐａ、最大で約２５０Ｐａ、最大で約２００Ｐａ、最大で約１５０Ｐａ、最大で約１００Ｐａ、および／または限定されないが、これらの間の任意の個々の値である、約５０Ｐａ、約１００Ｐａ、約１５０Ｐａ、約２００Ｐａ、および約２５０Ｐａなどが挙げられる。
【０１２５】
理論に束縛されるものではないが、細胞がパッチグラフトから標的器官または組織へと移動すると、それらが関連付けられたまたはそれらをコーティングするハイドロゲルの一部と共に移動すると考えられる。ハイドロゲルは、細胞が分化または成熟するのに影響を与える組織微小環境内の信号から細胞をシールドし、細胞を未成熟のままでいるのを可能にする。これにより、実質組織を通って移動する細胞が促進される。ハイドロゲル中のヒアルロナンが徐々に分解され、除去されると、細胞は分化または成熟し始め、成体細胞の機能を開始する。
【０１２６】
オルガノイドの生成方法
理論に束縛されるものではないが、早期段階の系統細胞は、オルガノイドまたは凝集体に組み込まれた場合、移植片の成功率が高い可能性があることが判明している。こうした組織化は、任意選択的に、上皮細胞および間葉細胞の両方の早期系統段階を含みうる。
【０１２７】
したがって、本明細書に提供されるのは、オルガノイドの形成方法であり、この方法は、組織培養に適した容器で培養培地の存在下で、上皮細胞と間葉細胞の混合物を培養すること、容器の表面に付着した成熟細胞をパニングによって除去すること、および培養培地の細胞懸濁液から自己組織化したオルガノイドを回収することを、含むか、それらから成るか、または本質的にそれらから成る。また、このように生成したオルガノイドを含む組成物が本明細書に開示される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、手順には、無血清状態下および３７ｏＣで、通常の培養皿に選択的、かつ迅速（１５〜３０分）に付着させることによって成熟細胞を除去するためのパニングが関与する。これらの条件下でも、成熟細胞は細胞付着を可能にする様々なマトリックス成分を発現するためである。このようなパニングプロセスを複数回（例えば、４〜５回）行うと、早期系統段階細胞の細胞懸濁液が濃縮される。次いで、細胞懸濁液を低付着皿に移し、早期系統段階細胞用に設計された無血清培地中に再び移し、３７０Ｃのインキュベーター中に一晩置く。この条件は、系統段階が一致する上皮細胞および間葉細胞のオルガノイドへの自己組織化を促進する。オルガノイドは、早期段階の上皮細胞（ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、決定された幹細胞、ＴＡ細胞、前駆体）と早期段階の間葉細胞（血管芽細胞、血管内皮の前駆体、星状細胞の前駆体）を混ぜ合わせることで得ることができる。
【０１２９】
生体上皮細胞と成熟間葉細胞との混合物、および成熟上皮細胞と早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）のキメラ混合物は、通常オルガノイドを生成しないが、移植片生体材料の懸濁液中の細胞の混合物として使用できる。成熟上皮細胞（例えば、肝細胞、胆管細胞、膵島、腺房細胞、腸細胞など）が成熟間葉細胞（例えば、血管内皮、星状細胞、間質細胞、筋線維芽細胞）と組み合わされている場合、混合物は移植片の標的部位または器官への統合を成功させないが、器官または組織の表面に持続するものをもたらす。成体および幹／前駆体（例えば、血管芽細胞を有する成熟肝細胞）を含むキメラ混合物が使用される場合、細胞の生着および移動を可能にするＭＭＰ供給源があるため、生着が発生する。
【０１３０】
別の態様では、内臓の単離された細胞は、細胞を宿主に導入する前に、生体材料内でエクスビボで凝固させるか、または別の方法として、流体物質として注入し、インビボで移植片に凝固させることができる。好ましくは、細胞は、病気または機能不全の組織またはその近くに導入され、注入または組織上／組織中への移植を介して、または適切な外科手術方法を使用して導入され得る。
【０１３１】
別の態様では、ハイドロゲルを形成することができる生体材料、または類似の不溶性複合体は、ヒアルロナン、チオール修飾ヒアルロナン、またはその他のグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）を含むことができる。凝固のトリガーは、マトリックス成分の架橋またはゲル化できるそれらの成分のゲル化を誘発する任意の要因とすることができる。架橋剤は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）またはＰＥＧ−ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）ハイドロゲル、またはそのジスルフィド含有誘導体を含んでもよい。
【０１３２】
別の態様では、本開示は、第一のタイプの細胞（上皮）を一つまたは複数の第二のタイプの細胞（間葉細胞）と培養することによってオルガノイドの形成方法を提供し、第二のタイプの細胞は、第一のタイプの細胞の適切な系統パートナーとなるための成熟段階にある。いくつかの実施形態では、パニングによって培養皿に付着した成熟細胞を除去すること、低付着培養皿に付着しなかった細胞を適切な培地に移すこと、およびこれらの条件下で自己組織化するオルガノイドを回収することによって、達成することができる。第一のタイプの細胞は、上皮幹細胞、上皮細胞のコミットした前駆体、または成熟細胞（例えば、肝細胞）であってもよい。第二のタイプの細胞は、間葉系統（例えば、血管芽細胞、間葉幹細胞）の幹細胞、これらの系統の前駆体（例えば、血管内皮または星状細胞前駆体）、または早期系統段階間葉細胞の混合物であってもよい。結果的に、こうした形成はすべての条件下で発生することはできない。例えば、マトリゲルでの培養は、パッチグラフトの成功に適切なオルガノイドを生成しない。マトリゲル調製されたオルガノイドは生着する可能性があるが、生着の程度は、定義された条件で調製されたオルガノイドの生着と比較して弱まる。さらに、マトリゲルは、臨床製品に使用される条件の成分であることはできない。
【０１３３】
別の態様では、本開示は、ドナー細胞の分化対する効果が中立である生体適合性、生分解性の裏打ちを含む複数の層、ハイドロゲルなどに凝固されうるヒアルロナンなどの一つまたは複数の生体材料を含む第二の層、凝固した生体材料に組み込まれる上皮細胞および支持間葉細胞の混合物、縫合または外科手術用接着剤で標的部位に付着させたバンドエイド様構造を含むパッチグラフトを接触させることを含む、器官内への細胞の生着方法を提供する。裏打ちの漿膜表面には、ドナー細胞が組み込まれる軟質生体材料中に見られる少なくとも二倍のレベルである、４００Ｐａ以上を達成するように調製された凝固した生体材料の層が追加される。パッチグラフト内の細胞は、生着し、組織／器官を通って組織／器官内へと移動し、その後、それらが位置する微小環境によって指定される、関連する成体運命に成熟することができる。多孔性裏打ちに埋め込まれた、または含まれる生体材料のより高いパスカルレベルは、細胞が間違った方向に移動するのを妨ぎ、移植片の漿膜表面に追加されて、他の器官および組織からの細胞の癒着を最小限にする。
【０１３４】
オルガノイド
本明細書に開示される一実施形態によると、胆管幹細胞（以下、「ＢＴＳＣ」）の浮遊凝集体であるオルガノイド、および早期系統段階間葉細胞（以下「ＥＬＭＣ」）は、移植片に細胞を組み込む最も成功した方法であることが証明された。本明細書に開示されるのは、ＢＴＳＣおよびＥＬＭＣが、成熟した星状／間質細胞を除去するためにパニングによってオルガノイドに自己選択でき、またこれにより、移植片の系統段階の適切な上皮‐間葉パートナーの確立において、より効率的かつ効果的であることが証明された。別の態様では、本開示は、第一のタイプの細胞を第二のタイプの細胞で培養することによってオルガノイドの形成方法を提供し、第二のタイプの細胞は、第一のタイプの細胞の段階に適切な系統パートナーであり、培養皿に付着した成熟細胞をパニングで除去し、培養物の懸濁液から自己組織化したオルガノイドを回収する。第一のタイプの細胞は、上皮幹細胞、またはコミットした上皮細胞であってもよい。第二のタイプの細胞は、間葉系統、間葉幹細胞、または早期系統段階間葉細胞の細胞であってもよい。さらなる態様は、自己組織化したオルガノイドおよびその使用に関する。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ドナー細胞および／または支持間葉細胞のいずれかで、マトリックスメタロプロテイナーゼ（以下、ＭＭＰ）を発現する。理論に束縛されるものではないが、ＭＭＰは、ドナーおよび宿主細胞の合併、およびグリソン鞘（または組織もしくは器官の周りの同等の被嚢）の溶解を可能にすると考えられる。本明細書の開示は、いくつかの実施形態では、早期段階幹細胞またはＥＬＭＣが高レベルのＭＭＰを発現する一方で、成熟肝細胞は低レベルのＭＭＰを発現する。いくつかの実施形態では、成熟肝細胞と成熟類洞血管内皮（ＣＤ３１＋＋＋、ＶＥＧＦ−受容体＋、タイプＩＶコラーゲン＋およびＣＤ１１７に対して陰性の場合）および成体胆管細胞との組み合わせは、成熟星状細胞および間質細胞（ＩＣＡＭ−１＋、ＡＳＭＡ＋、ビタミンＡ＋＋、タイプＩコラーゲン＋）と関連しており、結果として細胞凝集体が器官の表面に残り、効果的に生着することができない。いくつかの実施形態では、成熟上皮細胞の生着は、生着および移動に必要なＭＭＰを産生する未成熟な間葉細胞と組み合わせることが必要である。
【０１３６】
本明細書に開示される一実施形態によると、ＢＴＳＣおよびＥＬＳＭＣなどの幹／前駆細胞の浮遊凝集体であるオルガノイドは、パッチグラフトで成功するための細胞の最も成功した提示を証明した。本明細書に開示されるのは、ＢＴＳＣおよびＥＬＳＭＣは、無血清の条件下で通常の皿に付着した細胞の標準的なパニング手順によって、成熟間葉細胞の除去によりオルガノイドに自己選択でき、その後、残りの細胞（付着しなかった）を低付着皿および無血清の規定された培地中で培養する。オルガノイドは、これらの条件下で自己組織化する。
【０１３７】
別の態様では、本開示は、第一のタイプの細胞、上皮細胞を第二のタイプの細胞、間葉細胞で培養することによってオルガノイドの形成方法を提供し、第二のタイプの細胞は、第一のタイプの細胞の段階に適切な系統パートナーであり、通常の培養皿に付着した成熟細胞をパニング手順で除去し、低付着の培養皿上の培養物の懸濁液から自己組織化のオルガノイドを回収する。第一のタイプの細胞は、上皮幹細胞、ＴＡ細胞、コミットした上皮前駆体であってもよい。第二のタイプの細胞は、間葉細胞系統の幹細胞、ＴＡ細胞、またはコミットした間葉前駆体であってもよい。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ドナー細胞および／または支持間葉細胞のいずれかで、マトリックスメタロプロテイナーゼ（以下、ＭＭＰ）を発現する。理論に束縛されるものではないが、ＭＭＰは、組織もしくは器官の周りの被嚢の溶解をもたらし、ドナー細胞と宿主細胞の合併を可能にすると考えられる。本明細書の開示は、いくつかの実施形態では、早期段階幹細胞またはＥＬＭＣが高レベルのＭＭＰを発現する一方で、成熟肝細胞は低レベルのＭＭＰを発現する。いくつかの実施形態では、成熟肝細胞と成熟類洞血管内皮（ＣＤ３１＋＋＋、ＶＥＧＦ−受容体＋、タイプＩＶコラーゲン＋およびＣＤ１１７に対して陰性の場合）および成体胆管細胞との組み合わせは、成熟星状細胞および間質細胞（ＩＣＡＭ−１＋、ＡＳＭＡ＋、ビタミンＡ＋＋、タイプＩコラーゲン＋）と関連しており、結果として細胞凝集体が器官の表面に残り、効果的に生着することができない。いくつかの実施形態では、成熟上皮細胞の生着は、生着および移動に必要なＭＭＰを産生する未成熟な間葉細胞と組み合わせることが必要である。
【０１３９】
本明細書に開示される一実施形態によると、ＢＴＳＣおよびＥＬＳＭＣなどの幹／前駆細胞の浮遊凝集体であるオルガノイドは、パッチグラフトで成功するための細胞の最も成功した提示を証明した。本明細書に開示されるのは、ＢＴＳＣおよびＥＬＳＭＣは、無血清の条件下で通常の皿に付着した細胞の標準的なパニング手順によって、成熟間葉細胞の除去によりオルガノイドに自己選択でき、その後、残りの細胞（付着しなかった）を低付着皿および無血清の規定された培地中で培養する。オルガノイドは、これらの条件下で自己組織化する。
【０１４０】
別の態様では、本開示は、第一のタイプの細胞、上皮細胞を第二のタイプの細胞、間葉細胞で培養することによってオルガノイドの形成方法を提供し、第二のタイプの細胞は、第一のタイプの細胞の段階に適切な系統パートナーであり、通常の培養皿に付着した成熟細胞をパニング手順で除去し、低付着の培養皿上の培養物の懸濁液から自己組織化のオルガノイドを回収する。第一のタイプの細胞は、上皮幹細胞、ＴＡ細胞、コミットした上皮前駆体であってもよい。第二のタイプの細胞は、間葉細胞系統の幹細胞、ＴＡ細胞、またはコミットした間葉前駆体であってもよい。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、パッチグラフト戦略で成功するためには、ドナー細胞および／または支持間葉細胞のいずれかが、複数のマトリックスメタロプロテイナーゼ（以下、ＭＭＰ）および特に分泌型ＭＭＰを発現する必要がある。理論に束縛されるものではないが、ＭＭＰの複数のアイソフォームは、器官または組織の周りの被嚢の溶解を可能にし、それに続いてドナー細胞の宿主組織への急速な移動が可能となると考えられる。本明細書の開示は、早期段階上皮幹細胞および／またはＥＬＳＭＣが高レベルの膜結合型および／または分泌型ＭＭＰを発現するが、成熟細胞（例えば、肝細胞）は細胞膜結合型ＭＭＰを発現する場合であっても、低いレベルの分泌型ＭＭＰを発現することを提供する。かかる成体細胞（例えば、肝細胞、胆管細胞、膵島、腸細胞など）の生着は、間葉パートナーはＭＭＰ、生着が起こる場合には、特に分泌型ＭＭＰの細胞供給源であることが必要である。別の方法として、移植片の生体材料に、ＭＭＰの関連アイソフォーム、つまり精製された形態のＭＭＰを提供することである。
【０１４２】
本開示によると、パッチグラフトを使用して生着できる細胞の数はかなり多く（＞１０８）、移植片の寸法、オルガノイドの数およびサイズ（または細胞数―オルガノイドの一部でない場合）、ドナー細胞が幹細胞かまたは成熟細胞か、および分泌型および膜結合型ＭＭＰの発現（上皮および／または間葉細胞由来かどうか）によって指定される。これらの所見は、血管送達または注入移植によって実現可能な、限られた数の細胞（例えば、１０５−１０６）とはかなり異なる。
【０１４３】
本明細書に開示されているのは、移植片を作製することが、細胞と、不溶性になり、標的部位に細胞を局在化させたままにできる適切な生体材料との混合を含むことである。別の態様では、内臓の単離された細胞は、細胞を宿主に導入する前に、生体材料内でエクスビボで凝固させるか、または別の方法として、流体物質として注入し、インビボで凝固させることができる。別の態様では、ハイドロゲルを形成することができる生体材料、または類似の不溶性複合体は、ヒアルロナンまたは他の非硫酸化または最小硫酸化グリコサミノグリカン、チオール修飾ヒアルロン酸ナトリウム、または植物由来材料（例えばアルギン酸）を含むことができる。凝固のトリガーは、マトリックス成分の架橋またはゲル化できるそれらのゲル化を誘発する任意の要因とすることができる。架橋剤は、ポリエチレングリコールジアクリレート、またはそのジスルフィド含有誘導体を含んでもよい。細胞および生体材料の不溶性複合体は、約０．１〜２００Ｐａ、好ましくは約０．１〜約１Ｐａ、約１〜約１０Ｐａ、約１０〜１００Ｐａ、または約１００〜約２００の範囲の粘弾性を持つことが好ましい。
【０１４４】
好ましくは、細胞は、病気または機能不全の組織またはその近くに導入され、注入または外科手術送達を介して導入され得る。理論に束縛されるものではないが、本明細書の仮説では、より剛直なＨＡハイドロゲル（例えば＞５００Ｐａ）が細胞の分化を誘発し、部分的に成熟を伴うＭＭＰの発現の減少、および同時に移行能力の低下により、生着を減少させる。
【０１４５】
裏打ち
ドナー細胞の成熟状態に対する中立性を備えた、生体適合性、生分解性裏打ちには、複数のオプションがある。これらには、ＳｅｒｉＲ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｓｉｌｋ  ＳｃａｆｆｏｌｄｓまたはＣｏｎｔｏｕｒ  Ｓｅｒｉ−Ｓｉｌｋ（Ｓｏｆｒｅｇｅｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ）などのカイコガシルクの形態、カイコガシルクの他の誘導体、羊膜誘導体、網、胎盤、およびポリグリコール酸−ｃｏ−ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＬＡ）の形態などの合成繊維または材料が含まれる。裏打ちの有効性に重要なことは、ドナー細胞の分化に影響が最小限であることである。したがって、臨床的に使用される多くの形態の裏打ちは、ドナー細胞の分化を誘発する成分（例えば、成熟型の細胞外マトリックスの形態）から成るため、パッチグラフトには有用ではない。
【０１４６】
裏打ちは、縫合または外科手術用接着剤によって移植片を標的部位に取り付けるのに十分な引張強さを有する必要がある。数か月以内に分解できるが、ドナー細胞の成熟状態を変化させない分解生成物を含む、生体適合性、生分解性材料から成るべきである。したがって、生成物は、ｐＨまたは環境の他の側面に対する影響を最小限に抑えるべきである。裏打ちはまた、標的部位の表面に適合することができる必要があり、そのため可撓性の裏打ちは、曲率が大きい部位での移植片の使用を容易にする。セリシルク（Ｓｅｒｉ−Ｓｉｌｋ）は、裏打ちに適した材料の非限定的な例である。羊膜由来代替物はまた、これに限らないが、Ｏｓｉｒｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｉｎｃ（米国メリーランド州コロンビア）によって生産された羊膜由来材料など、裏打ちに適した材料として企図されている。
【０１４７】
裏打ちは、セリシルクなどの多孔性スカフォールド、または羊膜もしくは胎盤の膜もしくは網などの非多孔性膜、または多孔性もしくは非多孔性の合成繊維、またはそれらの組み合わせから供給されうる。裏打ちが多孔性である場合、それを密封するために生体材料を注入／含浸し、裏打ちの方向、すなわち標的部位から離れるか、または裏打ちを介して細胞の該集団の移動を阻害する必要がある。裏打ち材料の重要な特性として、上記で定義されたように生体適合性、生分解性、中性であり、上記のように十分な引張強さを有するということがある。さらに、材料は随意に生体吸収性であってもよい。
【０１４８】
裏打ちは、使用に応じてさらに最適化されうる。例えば、いくつかの実施形態では、パッチグラフトは、空気の乾燥効果を耐えるように設計された裏打ちを含む場合、皮膚および皮下組織に有用である。
【０１４９】
本明細書で上記に開示したハイドロゲルマトリックスは、パッチグラフトの他の部分でも有用でありうる。例えば、生体適合性、生分解性の裏打ちは多孔性であるべきであり、ハイドロゲルを使用して、裏打ちの方向への細胞の該集団の移動を阻害してもよい。こうしたハイドロゲルは、ハイドロゲルと比較して、より高い粘弾性を必要とすることになる。例えば、１．５〜１５倍、例えば２倍以上。適切な粘弾性の非限定的な例には、限定されないが、約２５０〜約６００Ｐａの範囲の粘弾性特性、例えば、少なくとも約２５０Ｐａ、少なくとも約３００Ｐａ、少なくとも約３５０Ｐａ、少なくとも約４００Ｐａ、少なくとも約４５０Ｐａ、少なくとも約５００Ｐａ、少なくとも約５５０Ｐａ、最大で約６００Ｐａ、最大で約５５０Ｐａ、最大で約５００Ｐａ、最大で約４５０Ｐａ、最大で約４００Ｐａ、最大で約３５０Ｐａ、最大で約２００Ｐａおよび／または限定されないが、これらの間の任意の個々の値である、約２５０Ｐａ、約３００Ｐａ、約３５０Ｐａ、約４００Ｐａ、約４５０Ｐａ、約５００Ｐａ、約５５０Ｐａ、および約６００Ｐａなどが挙げられる。さらに適切な粘弾性の非限定的な例には、限定されないが、約６００〜約８００Ｐａの範囲の粘弾性、例えば少なくとも約６００Ｐａ、少なくとも約６５０Ｐａ、少なくとも約７００Ｐａ、少なくとも約７５０Ｐａ、最大で約８００Ｐａ、最大で約７５０Ｐａ、最大で約７００Ｐａ、最大で約６５０Ｐａ、最大で約６００Ｐａ、および／または限定されないが、これらの間の任意の個々の値である、約６００Ｐａ、約６５０Ｐａ、約７００Ｐａ、約７５０Ｐａ、および約８００Ｐａなどが挙げられる。なおさらなる非限定的例は、約２５０Ｐａ〜約８００Ｐａの範囲を含む。
【０１５０】
さらに、本明細書に開示されたハイドロゲルは、細胞に隣接した裏打ちの側とは反対の裏打ちの漿膜表面への癒着を防止するためのコーティングとして有用であり得る。こうしたハイドロゲルは、細胞が含まれるハイドロゲルに適した粘弾性と、裏打ちを封止するのに適切な粘弾性との間の粘弾性を有するべきである。適切な粘弾性の非限定的な例には、限定されないが、約２５０〜約４００Ｐａまたは約５００Ｐａの範囲の粘弾性、例えば少なくとも約２５０Ｐａ、少なくとも約３００Ｐａ、少なくとも約３５０Ｐａ、少なくとも約４００Ｐａ、少なくとも約４５０Ｐａ、最大で約５００Ｐａ、最大で約４５０Ｐａ、最大で約４００Ｐａ、最大で約３５０Ｐａ、最大で約２００Ｐａ、および／または限定されないが、これらの間の任意の個々の値である、約２５０Ｐａ、約３００Ｐａ、約３５０Ｐａ、約４００Ｐａ、約４５０Ｐａ、および約５００Ｐａなどが挙げられる。
【０１５１】
一般的な移植片
一般に、パッチグラフトは、前述の方法および成分を使用して、ドナー（同種または自己の）細胞を固形臓器または組織に移植し、ドナー細胞を早期成熟系統段階で持続させ維持する条件で設計され得る。より具体的には、一部または全てのドナー細胞を早期成熟系統段階で持続させ維持する条件で、固形臓器または組織へのドナー細胞（同種または自己の）の移植に有用なパッチグラフトが企図されている。いくつかの実施形態では、ドナー細胞は、上皮および間葉細胞の混合物である。いくつかの実施形態では、両方のドナー細胞集団は、幹／前駆細胞である。いくつかの実施形態では、上皮細胞は成熟細胞であり（例えば、肝細胞、膵島など）、間葉細胞は幹／前駆孫細胞である。いくつかの実施形態では、移植片生体材料の条件、例えば、培地およびマトリックス成分が、ドナー細胞集団または少なくとも間葉細胞集団の両方を幹／前駆細胞として残すことを可能にする。いくつかの実施形態では、培地は、基底培地および可溶性信号を含む。さらなる実施形態では、この基底培地および可溶性信号は、ドナー集団または少なくとも間葉細胞集団の両方における幹細胞性の維持を支持する。いくつかの実施形態では、任意選択で細胞外マトリックス成分を含むマトリックス、およびその剛性レベルは、ドナー集団または少なくとも間葉細胞集団の両方の幹細胞性の維持を支持する。いくつかの実施形態では、マトリックスは、約５０Ｐａ〜約１５０Ｐａの粘弾性を有する軟質ハイドロゲルとして任意で調製されたヒアルロナンを含む。いくつかの実施形態では、パッチグラフトは、移植片を標的部位につなげられる十分な機械的強度を有し、ドナー細胞の成熟系統段階を著しく変化させない生体適合性、生分解性材料から成る裏打ちを含む。随意に、さらなる修正なしに、ドナー細胞の成熟系統段階に有意に影響を与えることなく、ドナー細胞を含有する層を保護するために、裏打ちはそれ自体で適切であるべきである。いくつかの実施形態では、裏打ちはメッシュまたはスカフォールドであり、さらにヒアルロナンなどの生体材料で含浸され、粘弾性はその中に移動する任意の細胞を十分に成熟させて、標的部位に向かう以外の方向にドナー細胞の移動を阻止するのに十分に高い。いくつかの実施形態では、この粘弾性は、約５００Ｐａ以上である。いくつかの実施形態では、移植片の血清学的表面は、隣接する組織または器官からの癒着を最小限に抑えるために生体材料で被覆される。いくつかの実施形態では、これらの生体材料は、約２００Ｐａ〜約３００Ｐａの粘弾性を有する。
【０１５２】
提案された裏打ちは、機械力に耐えるのに十分な弾性を有することが企図され、標的器官または組織につなぐことができ、曲率のある場所につなぐのに十分な可撓性を有する。また、生体材料が、細胞集団を持続および維持する能力を持ち、パッチグラフト内またはパッチグラフトから離れる細胞集団の移動を可能にするのに十分な粘弾性特性を有する限り、任意の生体材料（ハイドロゲル以外）も利用することができる。
【０１５３】
別の実施形態では、パッチグラフトは、細胞集団を持続および維持するのに有用であり、（ａ）パッチグラフト内またはパッチグラフトから離れる細胞の移動を可能にするのに十分な粘弾性を有する、ハイドロゲルまたはその他の生体材料内の培地で支持された細胞集団（任意選択で単一型）と、（ｂ）裏打ちの方向に細胞集団が移動するのを阻害（またはバリアを提供）するために十分な粘弾性を有する生体適合性、生分解性材料を含む裏打ち、とを含む。
【０１５４】
ＭＭＰは膜結合型および／または分泌型ＭＭＰでありうることに注意することが重要であり、それらは、そのような細胞に由来するＭＭＰ産生細胞によって提供されてもよく、または目的の組成物に添加されてもよい（例えば、精製または組み換えで生成）。
【０１５５】
別の実施形態では、カバーまたはコーティングに印加される機械力に耐えるのに十分な粘弾性および弾性を備えたハイドロゲルまたは他の生体材料を含み、そのような力が他の組織および器官からまたはそれらによって印加されることを含む、パッチグラフトまたは組織のカバーまたはコーティングが提供される。カバーまたはコーティングを使用することにより、癒着の形成を阻害または防止するための方法が提供されており（これは、他の器官および組織からの機械力または接触の関与または結果）、この方法は、ハイドロゲルまたは他の同等の生体材料を用いた表面のカバーまたはコーティングを含む。
【０１５６】
さらに別の実施形態では、細胞を標的組織内に生着させる方法が提供され、これは標的細胞とパッチグラフトとを接触させることを含み、パッチグラフトは、（ａ）細胞の集団であって、早期系統段階を有する少なくとも一つの集団を含み、パッチグラフト内またはパッチグラフトから離れる細胞集団の移動を可能にするのに十分なレオロジー特性（例えば、粘弾性）を有するハイドロゲルまたは他の生体材料中の培地に支持された単一型または複数型の細胞を含む、細胞の集団と、（ｂ）裏打ちの方向に細胞集団の移動を阻止（またはバリアを提供）するのに十分なレオロジー特性（例えば、粘弾性）を有する生体適合性、生分解性材料を含む、該裏打ちであって、パッチグラフトが、該細胞集団を持続および維持しながら、早期系統段階を有する該少なくとも一つの集団が後期系統段階に分化またはさらに成熟することを阻害するように構成される、裏打ちと、を含む。さらなる実施形態では、早期系統段階を有する一つの集団が、膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現する能力を持つ、方法が提供される。別の実施形態では、細胞はこの能力を持たないが、ＭＭＰが存在するか、または他のソース（例えば、組み換え）から含まれる。
【０１５７】
ＭＭＰの細胞源を用いた移植片
本開示の態様は、細胞の混合集団を持続および維持するためのパッチグラフトに関し、（ａ）二つ以上の細胞型を有する混合集団であって、そのうちの少なくとも一つは、分泌型および／または膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現できる早期系統段階にあり、ハイドロゲルマトリックス中に存在する培地で支持される該混合集団は、任意に該ハイドロゲル内もしくは外および／またはパッチグラフト内もしくは外に、該混合集団の移動を可能にするのに十分な粘弾性を有する、二つ以上の細胞方を有する混合集団と、（ｂ）裏打ちであって、該裏打ちの方向に該混合集団の移動を阻害するのに十分な粘弾性を有する生体適合性、生分解性材料を含む、裏打ちと、任意に（（ｃ）該裏打ちの漿膜（すなわち外側）表面に重ねられたハイドロゲルであって、これは該混合集団と接触しているものとは反対であり、パッチグラフトが標的部位につながれている実施形態では、標的部位と接触している側とは反対である（例えば、器官または組織）、ハイドロゲルと、を含む。いくつかの実施形態では、この層は、他の組織もしくは器官によるまたは他の組織もしくは器官からの癒着を防止または阻害する。いくつかの実施形態では、パッチグラフトは、該混合集団を持続および維持する一方で、該少なくとも一つの早期系統段階細胞型が、膜結合型および／または分泌型ＭＭＰをもはや発現できない後期系統段階への分化またはさらなる成熟を阻害するように構成されている。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、移植片は、胚性幹（ＥＳ）細胞または誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞などの一つの細胞型のみを含みうる。これは、この細胞がＭＭＰの細胞源であるか、または別の方法として、ＭＭＰの精製された（例えば、組み換え）形態などの他のソースが移植片に添加される限り、成功する可能性がある。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、該裏打ちは多孔性または非多孔性である。いくつかの実施形態では、裏打ちは、多孔性および／もしくは非多孔性メッシュ、スカフォールド、または膜を含む。いくつかの実施形態では、裏打ちは、絹、合成繊維、または羊膜、胎盤もしくは網もしくはそれらの誘導体などの天然材料、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、該裏打ちは、それをバリアに変換するために使用されるハイドロゲルまたは他の生体材料を注入された多孔性メッシュを含む。さらなる実施形態では、こうした注入は、標的器官または組織からの細胞の移動を防止する。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、該裏打ちは固体材料を含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、該ハイドロゲルのうちの一つまたは複数は、ヒアルロナンを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、該培地は、クボタの培地、または幹細胞を支持し、幹細胞性を維持することができる別の培地を含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、該混合集団は、間葉細胞および上皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、該上皮細胞は、外胚葉性、内胚葉性、または中胚葉性であってもよい。いくつかの実施形態では、該間葉細胞は、早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）を含む。いくつかの実施形態では、該ＥＬＳＭＣは、血管芽細胞、血管内皮の前駆体、星状細胞の前駆体、および間葉幹細胞（ＭＳＣ）のうち一つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、該上皮細胞は、上皮幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、該上皮細胞は、胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、該上皮細胞は、コミットした（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）および／または成熟上皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、該コミットしたおよび／または成熟上皮細胞は、成熟した実質細胞を含む。いくつかの実施形態では、該成熟実質細胞は、肝細胞、胆管細胞、および膵島細胞のうちの一つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、該間葉細胞および上皮細胞はどちらも幹細胞を含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、該混合集団は、自己細胞および／または同種細胞を含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、一つまたは複数の細胞型は遺伝子組み換えされている。
【０１６５】
「層状」移植片
いくつかの実施形態では、パッチグラフトは多層移植片として理解されている。例えば、本明細書に提供されているのは、少なくとも（ａ）ドナー細胞、随意に上皮細胞および／または間葉細胞を含むハイドロゲルの軟質の第一層、（ｂ）ハイドロゲルの硬質の第二層、および（ｃ）生体適合性、生分解性裏打ちを含む第三層、を含む複数層を、含む、それらから成る、または本質的にそれらから成るパッチグラフトである。いくつかの実施形態では、特に第三層が多孔性である場合、第二層が第三層に組み込まれ、含浸され、および／または注入される。いくつかの実施形態では、パッチグラフトはハイドロゲルの第四層をさらに含む。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、第四層は移植片の漿膜表面上にコーティングまたはペイントされる。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、第一層は、標的組織または器官に直接接触するように適合されている。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、「軟質」という用語は、パスカル（Ｐａ）アッセイによって定量的に決定される低いレベルの内部圧力を示すハイドロゲル層を指す。パスカルは、１平方メートル当たり１ニュートンとして定義される。いくつかの実施形態では、軟質層は、約１０Ｐａ〜約３００Ｐａ、約５０Ｐａ〜約２５０Ｐａ、約１００Ｐａ〜約２５０Ｐａ、約５０Ｐａ〜約２００Ｐａ、約１５０Ｐａ〜約２００Ｐａ、または約１００Ｐａ〜約２００Ｐａの粘度を有する。特定の実施形態では、軟質ハイドロゲル層は、約２００Ｐａまたはそれ未満の粘度を有する。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、「硬質」という用語は、パスカル（Ｐａ）アッセイによって定量的に決定される高いレベルの内部圧力を示すハイドロゲル層を指す。いくつかの実施形態では、硬質層は、約３００Ｐａ〜約３０００Ｐａ、約３００Ｐａ〜約１０００Ｐａ、約４００Ｐａ〜約７５０Ｐａ、約４００Ｐａ〜約５５０Ｐａ、約４５０Ｐａ〜約６００Ｐａ、または約５００Ｐａ〜約６００Ｐａの粘度を有する。特定の実施形態では、硬質ハイドロゲル層は、約５００Ｐａまたはそれを超える粘度を有する。
【０１６８】
層状移植片の第一層については、細胞および生体材料の不溶性複合体は、約０．１〜２００Ｐａ、好ましくは約０．１〜約１Ｐａ、約１〜約１０Ｐａ、約１０〜１００Ｐａ、または約１００〜約２００、または約５０〜約２５０Ｐａの範囲、または約２００Ｐａの粘度または粘弾性を持つことが好ましい。層状移植片の第一層については、細胞および生体材料の不溶性複合体は、約０．１〜２００Ｐａ、好ましくは約０．１〜約１Ｐａ、約１〜約１０Ｐａ、約１０〜１００Ｐａ、または約１００〜約２００の範囲の粘弾性を持つことが好ましい。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、混合物中の一つまたは複数の細胞は、分泌型および／または膜結合型ＭＭＰの供給源である。いくつかの実施形態では、ＭＭＰを自然に分泌する幹／前駆細胞集団などを含むが、これらに限定されず、ＭＭＰ発現を弱める変数−随意に分泌型ＭＭＰ発現がパッチグラフト内で制御される。こうした変数の非限定的な例には、培地または移植片生体材料への血清補充、上皮細胞および／または間葉細胞の分化に影響を与えるホルモンまたは他の可溶性信号、酸素レベル（嫌気性条件が細胞を未成熟に保つ一方で、より高い酸素レベルが分化を促進するため）、および移植片材料の剛性（せん断力および圧縮などの機械力が分化を促進し得るため）などが挙げられるが、これらに限定されない、幹／前駆細胞の成熟をもたらす変数が含まれる。
【０１７０】
パッチグラフトのいくつかの実施形態では、第一層の粘度は、約５０〜約２５０Ｐａである。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、第一層の粘度は、約２００Ｐａである。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、第二層の粘度は、約２５０〜約６００Ｐａである。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、第二層の粘度は、約５００Ｐａである。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、第四層の粘度は、約２５０〜約５００Ｐａである。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、第四層の粘度は、約４００Ｐａである。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、第二層の粘度は、層１の粘度よりも大きい。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、第二層の粘度は、第一層の粘度よりも約１．５〜約１５倍大きい。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、第二層は、第一層の粘度よりも約２倍大きい。
【０１７１】
一実施形態では、パッチグラフトは、標的部位と接触する層から始まり、無血清の規定された培地中で調製された軟質（＜２００Ｐａ）ハイドロゲルに埋め込まれたドナー細胞からなる層；同じ培地で調製され、より高い剛性（例えば、約５００Ｐａ以上）を有するようにトリガーされ、標的組織に向かう以外の任意の方向に移動するドナー細胞にバリアを提供するハイドロゲルの第二層；ドナー細胞の成熟状態への影響が中立で、外科手術的または他の手段を使用して標的部位に移植片をつなぐことができる、生体適合性、生分解性、生体吸収性の裏打ちである第三層；および軟質ハイドロゲルと非常に剛直なものとの間の中間の剛性であり、近位の組織による癒着を最小限に抑えるために表面にペイントまたはコーティングするのに十分な流体であるハイドロゲルの最終層を含む、これらから成る、または本質的にこれらから成る。
【０１７２】
パッチグラフトのいくつかの実施形態では、第一および第二層が、それぞれ一つまたは複数のヒアルロナンを含む。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、第四層が一つまたは複数のヒアルロナンを含む。
【０１７３】
パッチグラフトのいくつかの実施形態では、上皮細胞および間葉細胞は、一つまたは複数の凝集体を形成する。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、一つまたは複数の凝集体は、オルガノイドである。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、上皮細胞は、上皮幹細胞を含む。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、上皮細胞は、胆汁上皮細胞を含む。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、上皮細胞は、コミットしたおよび／または成熟上皮細胞を含む。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、コミットしたおよび／または成熟した上皮細胞は、成熟した実質細胞を含む。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、成熟実質細胞は、肝細胞、胆管細胞、および膵島細胞のうちの一つまたは複数を含む。
【０１７４】
パッチグラフトのいくつかの実施形態では、間葉細胞は支持的な間葉細胞である。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、間葉細胞は、早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）を含む。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、ＥＬＳＭＣは、血管芽細胞、血管内皮の前駆体、星状細胞の前駆体、および間葉幹細胞（ＭＳＣ）からなる群の一つまたは複数を含む。
【０１７５】
パッチグラフトのいくつかの実施形態では、上皮細胞および間葉細胞は、互いの系統段階パートナーではない。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、上皮細胞は成熟細胞である。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、間葉細胞はＥＬＳＭＣである。
【０１７６】
パッチグラフトのいくつかの実施形態では、上皮細胞および間葉細胞のうちの少なくとも一つは、ドナーに由来する。いくつかの実施形態では、ドナーは、組織移植を必要とする対象である。いくつかの実施形態では、ドナーは組織移植のための健康な細胞源である。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、上皮細胞および間葉細胞のうちの少なくとも一つは、パッチグラフトの意図されたレシピエントに対して自己である。いくつかの実施形態では、全ての細胞（すなわち、上皮および間葉）は、移植片の意図されたレシピエントに対して自己である。いくつかの実施形態では、細胞のドナーは、レシピエント（同種移植）以外のものであってもよく、または病気または機能不全の状態の内臓を有する対象（自己）であってもよく、随意に、細胞は病気または機能不全ではない内臓の一部から、および／または機能を復元するように遺伝子組み換えされている細胞から取得される。疾患を研究するモデルシステムを確立するために、ドナー細胞は、疾患を有し、実験的宿主の正常な組織の上／中へと移植されるものとすることができる。
【０１７７】
パッチグラフトのいくつかの実施形態では、上皮細胞または間葉細胞のうちの少なくとも一つは修飾されている。いくつかの実施形態では、すべての細胞が修飾される。いくつかの実施形態では、修飾は遺伝的な修飾である。いくつかの実施形態では、一つまたは複数の細胞が修飾され、治療用核酸またはポリペプチドを発現する。いくつかの実施形態では、一つまたは複数の細胞が修飾され、核酸またはポリペプチドの野生型アレルを発現する。
【０１７８】
パッチグラフトのいくつかの実施形態では、生体適合性、生分解性の裏打ちは、生体吸収性である。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、生体適合性、生分解性の裏打ちは、多孔性材料を含む。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、生体適合性、生分解性の裏打ちは、スカフォールドまたは膜を含む。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、スカフォールドまたは膜は、絹、羊膜、合成繊維、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、生体適合性、生分解性の裏打ちは、細胞の分化を誘導または防止する任意の因子を含まない。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、生体適合性、生分解性の裏打ちは、成熟細胞外マトリックスに由来する一つまたは複数の成分を含まない。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、成熟細胞外マトリックスに由来する成分は、Ｉ型コラーゲンである。
【０１７９】
パッチグラフトのいくつかの実施形態では、パッチグラフトは、一つまたは複数のマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）をさらに含む。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、ＭＭＰは、膜結合型ＭＭＰである。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、膜結合型ＭＭＰは、上皮細胞または間葉細胞のうちの一つまたは複数によって提供される。パッチグラフトのいくつかの実施形態では、ＭＭＰは、分泌型ＭＭＰである。分泌型ＭＭＰは、随意に、一つまたは複数の上皮細胞または間葉細胞によって自然に生成されるか、または随意に、ＭＭＰ産生のための組み換え発現ベクターによる一つまたは複数の上皮細胞または間葉細胞の形質転換により生成されてもよい。
【０１８０】
いくつかの態様では、本明細書に提供されているのは、少なくとも胆管幹細胞を含むハイドロゲルの軟質の第一層、ハイドロゲルの硬質の第二層、および生体適合性、生分解性裏打ちを含む第三層、を含む複数層を、含む、それらから成る、または本質的にそれらから成るパッチグラフトである。
【０１８１】
一実施形態では、パッチグラフトは、外科手術的にまたはその他の方法で標的部位につなぐことができる「バンドエイド様移植片」を集合的に形成する材料および細胞の層から成る。標的部位に対向する第一層は、細胞の増殖および／または生存のために設計された規定された、無血清の、栄養豊富な培地に懸濁した上皮細胞および支持間葉細胞の混合物を播種した軟質のハイドロゲル（２００Ｐａ未満）を含み、第二層は、同じ培地で調製したハイドロゲルを含有するが、より剛直なレベル（すなわち、パスカルレベル以上）にゲル化され、標的部位以外の方向に細胞が移動するのをブロックするバリアを形成し、第三レベルは、ドナー細胞の分化レベルに影響しないかまたは影響を最小限に抑えるが、パッチの機械的支持構造として機能する、生体適合性、生分解性の裏打ちを含み、第四層は、軟質対硬質のハイドロゲルの中間の剛性レベルであり、近接組織の細胞から移植片への癒着を最小限に抑える役割を果たすペイント可能なハイドロゲル（再びヒアルロナンなど）から成る。ハイドロゲルは、生体適合性、生分解性、および剛性に関して調節可能であるという意味の「調整可能」である材料からなる必要がある。ハイドロゲルの一つの成功した材料は、酸素および／またはポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）に曝露された時、ハイドロゲルを形成しするためにトリガーされてもよく、ヒアルロナンおよびＰＥＧＤＡ濃度（および／または酸素レベル）の正確な比率によって容易に「調整可能」である、チオール修飾ヒアルロナンである。
【０１８２】
別の実施形態では、パッチグラフトは複数の層を含む。標的部位に対向する第一層は、ゲル化または固化させることができ、ドナー細胞に配置される、最小化硫酸化もしくは非硫酸化ＧＡＧまたは他の非硫酸化もしくは中性生体材料である軟質ハイドロゲルである。より剛直で、裏打ち中／上または内に組み込まれた、ハイドロゲルまたは生体材料の第二層であり、裏打ちは、生体適合性、生分解性、生体吸収性の裏打ちで、外科手術または他の目的でパッチを取り扱うことができ、細胞を標的組織に向かって移動させるバリアとしての役割を果たす。裏打ちの漿膜側は、手術の時点でヒアルロナン（または他の最小硫酸化または非硫酸化ＧＡＧまたはゲル化もしくは固化可能な他の材料）などの生体材料でコーティングされ、パスカルレベルは軟質生体材料の層に見られるパスカルレベルの少なくとも二倍であり、隣接組織からの癒着を最小化するという目的に役立つ。パッチグラフトは標的器官または組織につながれ、細胞は組織または器官に移動し、完全に組み込まれ得る。
【０１８３】
特定の実施形態では、パッチグラフトは、軟質のヒアルロナンハイドロゲルなどの軟質の生体材料（＜２００Ｐａ）の第一層を含み、その中に配置されるのは、細胞の系統段階に合わせた無血清、規定された培地に移植されるドナー細胞である。この層は、ドナー細胞を標的組織への移動に向けるように仕向けるバリアとして機能する、より剛直な層（例えば、より剛直なハイドロゲル）の上に配置される。より剛直な層は、外科手術または他の処置のためにパッチを処理して、パッチを標的部位に貼り付けることを可能にする、生体適合性、生分解性の裏打ちである、裏打ちに事前に準備される。最終層は、標的組織側のドナー細胞の剛性と、バリアの剛性の中間の生体材料である。この層は、外科手術時に移植片の漿膜側に追加され、隣接組織からの癒着を最小限に抑える役割を果たす。生体適合性、生分解性の裏打ちは、セリシルクまたはその誘導体であってもよい。
【０１８４】
パッチグラフトの使用および送達方法
本開示の態様は、器官内に細胞を生着させるための組成物および方法に関する。固形臓器から内臓への細胞移植に対する努力は典型的に、血管経路を介した細胞の直接注射または送達のいずれかを使用した。Ｌａｎｚｏｎｉ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ３１，２０４７−２０６０（２０１３）。これらの移植方法は、少数の細胞が標的部位に移植され、生命を脅かす可能性のある塞栓のリスクが生じる。細胞が、「注入移植」によって送達された場合、細胞をヒアルロナンに懸濁、またはヒアルロン酸でコーティングした後に、トリガー（ＰＥＧＤＡ）を同時注入し、以下に記載されているように、ヒアルロナンが生体内原位置でゲル化する。Ｔｕｒｎｅｒ  Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５７，７７５−７８４（２０１３）。注入移植法により、少数にもかかわらず、通常は注入部位あたり１０５−１０７、１０６−１０７、または１０５−１０６の細胞を特定の部位に局在化するための戦略が提供される。この戦略は、異所的な細胞分布を排除または最小化し、部位内の細胞の統合を最適化する。しかしながら、成熟した機能的細胞が使用される場合、それらは免疫原性が高く、長期免疫抑制を必要とする場合がある。また、注入できる細胞の量は、必要な臨床結果を達成するために不十分でありうる。
【０１８５】
これらの障害および懸念は、本明細書に記載される「パッチグラフト」戦略によって克服される。いくつかの実施形態では、「バンドエイド様の」移植片は、外科手術的にまたは他の方法で、器官または組織の表面につながれ、移植片の条件は、細胞が完全に部位内に生着し、器官／組織全体に移動し、その後、関連する成体細胞型に成熟するようなものである。多数の細胞を移植する可能性（＞１０８細胞）は、パッチのサイズ、移植片内の細胞の数または混合物、およびＭＭＰの複数の形態の供給源、理想的にはＭＭＰの細胞源によって形成または決定される。さらに、いくつかの実施形態では、オルガノイドの使用は、規定の無血清条件下でオルガノイドを凍結保存できる容易さを考えると、ドナー細胞を備蓄する能力を促進する。
【０１８６】
本明細書に提供されるパッチグラフト組成物は、組織または固形臓器上への細胞の直接移植を目的とする。方法は安全であり、塞栓および異所性細胞分布を回避し、組織全体への細胞数生着および分布を最適化する。
【０１８７】
したがって、本明細書に提供されるのは、標的組織を本明細書で上記に開示したパッチグラフトに接触させることを含む、それから成る、または本質的にそれから成る、細胞を標的組織に生着させる方法である。
【０１８８】
この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は、肝臓、膵臓、胆管、甲状腺、胸腺、胃腸、肺、前立腺、乳房、脳、膀胱、脊髄、皮膚および皮下組織、子宮、腎臓、筋肉、血管、心臓、軟骨、腱、および骨組織からなる群から選択される。この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は肝臓組織である。この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は膵臓組織である。この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は胆管組織である。この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は胃腸組織である。いくつかの実施形態では、組織は病気であるか、損傷している、または障害を有する。この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は腎臓組織である。
【０１８９】
この方法のいくつかの実施形態では、標的組織は器官である。この方法のいくつかの実施形態では、器官は、筋骨格系、消化器系、呼吸器系、泌尿器系、女性生殖器系、男性生殖器系、内分泌系、循環器系、リンパ系、神経系、または外皮系の器官である。この方法のいくつかの実施形態では、器官は、肝臓、膵臓、胆管、甲状腺、胸腺、胃腸、肺、前立腺、乳房、脳、膀胱、脊髄、皮膚および皮下組織、子宮、腎臓、筋肉、血管、心臓、軟骨、腱、および骨からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、器官は病気であるか、損傷している、または障害を有する。
【０１９０】
また、肝臓疾患または障害を有する対象を治療する方法が本明細書に提供されており、この方法は、対象の肝臓を本明細書の上記に開示されるパッチグラフトに接触させることを含む、それから成る、または本質的にそれから成る。この方法のいくつかの実施形態では、肝疾患または障害は、肝線維症、肝硬変、ヘモクロマトーシス、肝臓ガン、胆道閉鎖症、非アルコール性脂肪性肝疾患、肝炎、ウイルス性肝炎、自己免疫性肝炎、肝蛭症、アルコール性肝疾患、α１−アンチトリプシン欠損症、糖原病ＩＩ型、トランスサイレチン関連遺伝性アミロイドーシス（ａｍｙｌｏｉｄｏｉｓｉｓ）、ジルベール症候群、原発性胆汁肝硬変、原発性硬化性胆管炎、バッド・キアリ症候群、肝外傷またはウィルソン病である。
【０１９１】
他の態様では、膵臓の疾患または障害を有する対象を治療する方法が本明細書に提供されており、この方法は、対象の膵臓を本明細書の上記に開示されるパッチグラフトに接触させることを含む、それから成る、または本質的にそれから成る。この方法のいくつかの実施形態では、膵臓の疾患または障害は、糖尿病、膵外分泌不全、膵炎、膵臓がん、オッディ括約筋機能不全、嚢胞性線維症、膵管癒合不全、輪状膵、膵臓外傷、または膵管出血（ｈｅｍｏｓｕｃｃｕｓ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｕｓ）である。
【０１９２】
他の態様では、胃腸の疾患または障害を有する対象を治療する方法が本明細書に提供されており、この方法は、一つまたは複数の対象の腸を本明細書の上記に開示されるパッチグラフトに接触させることを含む、それから成る、または本質的にそれから成る。いくつかの実施形態では、胃腸疾患または障害は、胃腸炎、胃腸がん、回腸炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、過敏性腸症候群、消化性潰瘍、セリアック病、線維症、血管形成異常、ヒルシュスプルング病、偽膜性大腸炎、または胃腸外傷である。
【０１９３】
いくつかの態様では、腎臓疾患または障害を有する対象を治療する方法が本明細書に提供されており、この方法は、一つまたは複数の対象の腎臓を本明細書の上記に開示されるパッチグラフトに接触させることを含む、それから成る、または本質的にそれから成る。この方法のいくつかの実施形態では、腎臓疾患または障害は、腎炎、ネフローゼ、腎炎症候群、ネフローゼ症候群、慢性腎臓疾患、急性腎障害、腎臓外傷、嚢胞性腎疾患、多発性嚢胞腎疾患、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、ループス腎症、腎臓がん、アルポート症候群、アミロイドーシス、グッドパスチャー症候群、またはウェグナー肉芽腫症である。
【０１９４】
治療法のいくつかの実施形態では、上皮細胞および間葉細胞のうちの少なくとも一つは、ドナーに由来する。いくつかの実施形態では、ドナーは、組織移植を必要とする対象である。いくつかの実施形態では、ドナーは組織移植のための健康な細胞源である。いくつかの実施形態では、上皮細胞および間葉細胞のうちの少なくとも一つは、パッチグラフトの意図されたレシピエントに対して自己である。いくつかの実施形態では、全ての細胞（すなわち、上皮および間葉）は、移植片の意図されたレシピエントに対して自己である。いくつかの実施形態では、細胞のドナーは、レシピエント（同種移植）以外のものであってもよく、または病気または機能不全の状態の内臓を有する対象（自己）であってもよく、随意に、細胞は病気または機能不全ではない内臓の一部から、および／または機能を復元するように遺伝子組み換えされている細胞から取得される。
【０１９５】
いくつかの実施形態では、本明細書の上記に開示される方法で使用されるパッチグラフトは、少なくとも上皮細胞および間葉細胞を含むハイドロゲルの第一層、ハイドロゲルの第二層、生体適合性、生分解性裏打ちを含む第三層、および随意にハイドロゲルの第四層を含む、複数の層を含むパッチグラフトである。いくつかの実施形態では、方法は、パッチグラフト内に含まれる細胞が、組織に組み込まれることを可能にすることをさらに含む。方法のいくつかの実施形態では、ハイドロゲルの第一層は軟質である。方法のいくつかの実施形態では、ハイドロゲルの第二層は硬質である。方法のいくつかの実施形態では、間葉細胞は支持的な間葉細胞である。
【０１９６】
別の態様では、本開示は、外科手術的にまたは他の方法で、標的部位に集合的につながることのできる、複数層の材料および細胞で構成されるバンドエイド様の複合体である、パッチグラフトの使用を含む、器官への細胞の生着方法を提供する。標的部位に対向する第一層は、細胞の増殖および／または生存のために設計された規定された、無血清の、栄養豊富な培地に懸濁した上皮細胞および支持間葉細胞の混合物を播種した軟質のハイドロゲル（２００Ｐａ未満）を含み、第二層は、同じ培地で調製したハイドロゲルを含有するが、より剛直なレベル（すなわち、パスカルレベル以上）にゲル化され、標的部位以外の方向に細胞が移動するのをブロックするバリアを形成し、第三レベルは、ドナー細胞の分化レベルに影響しないかまたは影響を最小限に抑え、したがって「中立」である、生体適合性、生分解性の裏打ちを含み、第四層は、軟質対硬質のハイドロゲルの中間の剛性レベルであり、近接組織の細胞から移植片への癒着を最小限に抑える役割を果たすペイント可能なハイドロゲル（再びヒアルロナンなど）から成る。ハイドロゲルは、生体適合性、生分解性、および剛性に関して調節可能であるという意味の「調整可能」である材料からなる必要がある。ハイドロゲルの一つの成功した材料は、酸素および／またはポリ（エチレングリコール）ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）に曝露された時、ハイドロゲルを形成しするためにトリガーされてもよく、ヒアルロナンおよびＰＥＧＤＡ濃度（および／または酸素レベル）の正確な比率によって容易に「調整可能」である、チオール修飾ヒアルロナンである。移植片の生体材料の条件下の細胞は、ドナー細胞のレシピエントの組織への生着、移動、および統合を促進する、複数のマトリックメタロスプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を産生する。レシピエント組織の微小環境は、移植された細胞の成体運命を指定する。
【０１９７】
別の態様では、本開示は、少なくとも、生体適合性、生分解性の裏打ちを含む第一層、上皮細胞および支持間葉細胞の混合物を含む一つまたは複数のヒアルロナンを含む第二層、一つまたは複数のヒアルロナンを含む第三層を含む、複数の層を含む、パッチグラフトとの接触を含む器官の中への細胞の生着方法を提供するものであり、細胞が埋め込まれている層は非常に軟質（２００Ｐａ未満）で、裏打ちに関連する層はより剛直（約５００Ｐａ以上）であり、第三層はパスカルのレベルの中間であり、近くの組織または器官からの癒着を最小限に抑えるのに役立つ。さらに別の態様では、細胞は、肝臓、膵臓、胆管、甲状腺、胸腺腸、肺、前立腺、乳房、脳、脊髄、神経節、皮膚および皮下組織、子宮、骨、胸腺、腸、子宮、骨、腎臓、筋肉、血管、または心臓からなる群から選択される器官に生着してもよい。
【０１９８】
さらに別の態様では、細胞は、肝臓、膵臓、胆管、甲状腺、胸腺胸腺、腸、肺、前立腺、乳房、脳、脊髄、神経節、皮膚および皮下組織、子宮、骨、腱、軟骨、腎臓、筋肉、血管、または心臓からなる群から選択される器官に生着してもよい。
【０１９９】
本明細書に開示される方法に適切なパッチグラフトの非限定的な例は、以下を含むパッチグラフトである。（ａ）二つ以上の細胞型を有する混合集団であって、そのうちの少なくとも一つは、分泌型および／または膜結合型および／または分泌型マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を発現できる早期系統段階にあり、ハイドロゲルマトリックス中に存在する培地で支持される該混合集団は、任意に該ハイドロゲル内もしくは外および／またはパッチグラフト内もしくは外に、該混合集団の移動を可能にするのに十分な粘弾性を有する、二つ以上の細胞型を有する混合集団、（ｂ）裏打ちであって、該裏打ちの方向に該混合集団の移動を阻害またはこれにバリアを提供するのに十分な粘弾性を有する生体適合性、生分解性材料を含む、裏打ち、任意に（（ｃ）ハイドロゲルであって、該裏打ちの漿膜（すなわち外側）表面に重ねられ、これは該混合集団と接触しているものとは反対であり、パッチグラフトが標的部位につながれている実施形態では、標的部位と接触している側とは反対である（例えば、器官または組織）、ハイドロゲル。いくつかの実施形態では、この層は、他の組織もしくは器官によるまたは他の組織もしくは器官からの癒着を防止または阻害する。いくつかの実施形態では、パッチグラフトは、該混合集団を持続および維持する一方で、該少なくとも一つの早期系統段階細胞型が、膜結合型および／または分泌型ＭＭＰをもはや発現できない後期系統段階への分化またはさらなる成熟を阻害するように構成されている。
【０２００】
いくつかの実施形態では、該裏打ちは多孔性または非多孔性である。いくつかの実施形態では、裏打ちは、多孔性メッシュ、スカフォールド、または膜を含む。いくつかの実施形態では、裏打ちは、絹、合成繊維、またはアミニオン（ａｍｉｎｉｏｎ）、胎盤もしくは網などの天然材料、またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、該裏打ちは、ハイドロゲルが注入された多孔性メッシュを含む。さらなる実施形態では、こうした注入は、標的器官または組織からの細胞の移動を防止する。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、該裏打ちは固体材料を含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、パッチグラフトは、該裏打ちの漿膜表面上に重ねられたハイドロゲルをさらに含み、これは該単一細胞または混合細胞集団と接触するものとは相反する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、該ハイドロゲルのうちの一つまたは複数は、ヒアルロナンを含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、該培地は、クボタの培地、または幹細胞を支持し、幹細胞性を維持することができる別の培地を含む。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、該混合集団は、間葉細胞および上皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、該上皮細胞は、外胚葉性、内胚葉性、または中胚葉性であってもよい。いくつかの実施形態では、該間葉細胞は、早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）を含む。いくつかの実施形態では、該ＥＬＳＭＣは、血管芽細胞、血管内皮の前駆体、星状細胞の前駆体、および間葉幹細胞（ＭＳＣ）のうち一つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、該上皮細胞は、上皮幹／前駆細胞を含む。いくつかの実施形態では、該上皮細胞は、胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）を含む。いくつかの実施形態では、該上皮細胞は、コミットした（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）および／または成熟上皮細胞を含む。いくつかの実施形態では、該コミットしたおよび／または成熟上皮細胞は、成熟した実質細胞を含む。いくつかの実施形態では、該成熟実質細胞は、肝細胞、胆管細胞、および膵島細胞のうちの一つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、該間葉細胞および上皮細胞はどちらも幹細胞を含む。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、該混合集団は、自己細胞および／または同種細胞を含む。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、一つまたは複数の細胞型は遺伝子組み換えされている。
【実施例】
【０２０７】
以下の実施例は、本開示を実施する際に様々な場合で使用できる手順の非限定的および例示的なものである。さらに、本明細書の以下に開示される全ての参照は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０２０８】
実施例１：パッチグラフト検証用のブタモデル
動物
宿主としてまたは細胞のドナーとして使用された動物は、ＮＣＳＵ（ノースカロライナ州ローリー市）のＣｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの施設で維持された。これらの施設では、手術、剖検、および全生物学的液体および組織の収集が実施された。すべての手順は、ＮＣＳＵのＩＡＣＵＣ委員会によって承認された。レシピエントとして使用されるブタは、ヨークシャー、ラージホワイト、ランドレース（雌ブタから）、デュロック、スポット、およびピエトラン（雄ブタから）から成る六方向交配の、六品種の混合物であった。この非常に異種の遺伝的背景は、ヒト集団の異種の遺伝的構成に相似するという点で望ましい。宿主動物はすべて雌であり、生後約六週間および約１５ｋｇであった。
【０２０９】
二つの分類があった。ａ）生後約六週間および約１５ｋｇの雄ブタは、雌に細胞移植するためのドナーとして使用された。ｂ）ＧＦＰ導入遺伝子を担持する遺伝子導入ドナー動物。ＧＦＰ＋ドナー動物は、標準的な人工受精により、野生型未経産ブタと遺伝子導入Ｈ２Ｂ−ＧＦＰ雄ブタを、繁殖させることにより得られた。このモデルは、内因性β−アクチン（ＡＣＴＢ）座位へのＩＲＥＳ−ｐＨ２Ｂ−ｅＧＦＰのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９介在性相同組み換え修復（ＨＤＲ）を介して開発された。遺伝子導入動物は、すべての組織におけるｐＨ２Ｂ−ｅＧＦＰのユビキチン発現を示す。ＧＦＰのＨ２Ｂへの融合により、ＧＦＰマーカーがヌクレオソームに局在化し、核の明らかな視覚化と染色体ダイナミクスの研究が可能となる。樹立系統は広範囲に分析され、遍在性および核局在化発現が確認されている。さらに、繁殖は、Ｈ２Ｂ−ＧＦＰの次世代への伝播を示している。全ての動物は健康であり、子孫はｐＨ２Ｂ−ｅＧＦＰの伝播について予想されるメンデル比を示す、複数の妊娠が確立された。雄の子孫は誕生時に遺伝子型が同定され、導入遺伝子に対して陽性であったものは組織収集およびドナー細胞の単離のために人道的に安楽死された。
【０２１０】
各ドナーおよびレシピエント動物については、ブタ白血球抗原クラスＩ（ＳＬＡ−Ｉ）およびクラスＩＩ（ＳＬＡ−ＩＩ）遺伝子座は、ＰＣＲ配列特異的プライマー戦略に基づいて、これらの領域において公知のアレルを増幅するよう設計されたプライマーを使用してＰＣＲ増幅されている。システムは、ＳＬＡ−１、ＳＬＡ−２、およびＳＬＡ−３の遺伝子座５３を増幅する４７個の識別用ＳＬＡ−Ｉプライマーセットと、ＤＲＢ１、ＤＱＢ１、およびＤＱＡ遺伝子座を増幅する４７個の識別用ＳＬＡ−ＩＩプライマーセットで構成される。これらのプライマーセットは、類似した配列モチーフを共有する群によってアレルを区別するように開発され、公知のＳＬＡ−ＩおよびＳＬＡ−ＩＩアレルを検出するために簡単かつ明確に示されている。一緒に使用された場合、これらのプライマーは、試験された各動物のハプロタイプを効果的に提供し、ドナーおよびレシピエント動物で一致または不一致のハプロタイプを簡単に確認するためのアッセイを提供する。
【０２１１】
培地および溶液
すべての培地は滅菌ろ過し（０．２２μｍフィルター）、使用前に暗所で４℃に保った。基底培地および胎児ウシ血清（ＦＢＳ）をＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入した。すべての成長因子はＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。その他のすべての試薬は、記載されたものを除き、Ｓｉｇｍａから得た。
【０２１２】
細胞洗浄液は、０．５グラムの血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、＃Ａ８８９６−５Ｇ、脂肪酸無し）、１０−９Ｍセレンおよび５ｍｌの抗生物質（Ｇｉｂｃｏ  ＃３５２４０−０６２、ＡＡＳ）で補充された、５９９ｍｌの基底培地（例えば、ＲＰＭＩ  １６４０；Ｇｉｂｃｏ  ＃１１８７５−０９３）を用いて調製した。処理中の組織および細胞の洗浄に使用した。
【０２１３】
コラゲナーゼ緩衝液が作成され、胆管（管）組織の場合は６００Ｕ／ｍｌ（Ｒ１４５１  ２５ｍｇ）の最終濃度、器官実質組織（肝臓、膵臓）の場合は３００Ｕ／ｍｌ（１２．５ｍｇ）の最終濃度で、コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  ＃Ｃ５１３８）で補充した１００ｍｌの細胞洗浄液で構成されている。
【０２１４】
内胚葉性幹／前駆体用に設計された、指定された無血清培地であるクボタの培地を使用して、細胞懸濁液、オルガノイド、およびＨＡハイドロゲルを調製した。この培地は、銅を含まず、低カルシウム（０．３ｍＭ）、１ｎＭのセレン、０．１％のウシ血清アルブミン（精製済、脂肪酸無し、画分Ｖ）、４．５ｍＭのニコチンアミド、０．１ｎＭの硫酸亜鉛七水和物、５μｇ／ｍｌのトランスフェリン／Ｆｅ、５μｇ／ｍｌのインスリン、１０μｇ／ｍｌの高密度リポタンパク質、および脂肪酸を含まない高度に精製されたアルブミンと複合体を形成した、精製された遊離脂肪酸の混合物を含む、任意の基底培地（ここではＲＰＭＩ１６４０）で構成される。その準備は、方法のレビュー５７に詳細に記載されている。また、これはＰｈｏｅｎｉｘＳｏｎｇｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（米国コネチカット州ブランフォード）から市販されている。
【０２１５】
ＨＡの可溶性の長鎖型（Ｓｉｇｍａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＃５２７４７）は、オルガノイド培養の安定化および凍結保存に使用した。ハイドロゲルの生成に使用したチオール修飾ＨＡは、Ｂｉｏｔｉｍｅの子会社であるＧｌｙｃｏｓａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。これらのチオール修飾ＨＡの成分は、ＩＳＯ９００１：２０００プロセスの宿主としてのバチルス・スブチリスを使用した専有の細菌発酵プロセスにより生成された（ｗｗｗ．ｂｉｏｐｐｏｌｙｍｅｒｓ．ｎｏｖｏｚｙｍｅ．ｃｏｍ／）。この成分は、ＨｙａＣａｒｅ（登録商標）の商標に基づいてＮｏｖｏｚｙｍｅｓによって生成され、動物由来原材料および有機溶剤の残留物を１００％含有していない。動物由来成分は生産で使用されておらず、タンパク質レベルは非常に低く、エンドトキシンはない。生産は、欧州薬局方によって設定された標準に従っている。ＨＡハイドロゲルは、チオール修飾ＨＡであるＧｌｙｃｏｓｉｌ（ＨｙＳｔｅｍ（登録商標）ＨＡ、ＥＳＩ  ＢＩＯ−ＣＧ３１３）を用いて調製され、ポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）を使用してジスルフィド架橋を形成するようにトリガーすることができる。Ｇｌｙｃｏｓｉｌ（登録商標）は、脱気水を用いて１％のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で、またはこの場合ではクボタの培地で、チオール化ＨＡの１％の溶液として再構成される。再構成すると、数時間液体のままであるが、酸素に曝露された場合にはいくらかゲル化する可能性がある。ＧｌｙｃｏｓｉｌをＰＥＧＤＡなどの架橋剤で処理した場合、数分以内にゲル化が発生し、温度またはｐＨ変化なしでより正確なゲル化が発生する。
【０２１６】
架橋のレベルは、剛性のレベルを指定し、チオール修飾ＨＡのＰＥＧＤＡに対する比によって正確に定義されうる。従来の研究では、幹細胞集団は、さまざまな剛性レベルのＨＡハイドロゲルで試験され、剛性レベルが２００Ｐａ２３未満である場合にのみ、抗原的にも機能的にも（例えば、移動能力に関して）幹細胞として維持されることが見出された。この所見を使用して、漿膜側に非常に軟質の層と、ヒアルロナンハイドロゲルのより剛直な層を有する移植片を設計し、標的組織以外の方向への移動に対するバリアを形成し、近辺組織からの細胞からの癒着を最小限に抑える。異なるレベルの剛性を有するハイドロゲルの３つのバージョンは、図２に特徴付けられており、特徴はレオロジー特性の直接測定値を含む。最も剛直なバリアである１０Ｘ  ＨＡハイドロゲル（剛性＝７６０Ｐａ）のバリアは、事前に裏打ち上に調製され、所望により凍結保存されうる。手術の時点で、ドナー細胞は、軟質の１Ｘ  ＨＡハイドロゲル（剛性＝６０Ｐａ）で調製され、より剛直な１０Ｘハイドロゲル（既に裏打ち上にある）上に置かれ、パッチは標的部位につながれた。つなげた後、移植片の漿膜側に、ＢＤ  Ｍｉｃｒｏ−Ｆｉｎｅ（商標）ＩＶの永久針を備えた、ＮＯＲＭ−ＪＥＣＴ  ４０１０．２００Ｖ０プラスチックシリンジを使用して、２Ｘ  ＨＡハイドロゲル（剛性＝１０６Ｐａ）でコーティングまたはペイントした。
【０２１７】
ハイドロゲルのマクロスケールのレオロジー特性は、応力制御された円錐平板レオメーター（ＴＡ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＡＲ−Ｇ２、４０ｍｍ円錐直径、１°角度）を使用して決定された。ゲルは、１ｒａｄ／ｓの周波数および０．６Ｐａ応力振幅で振動しながらレオメーター上で積極的に重合し、架橋反応の十分な完了を照会するために、係数を継続的に監視した。一旦平衡化すると、ハイドロゲルは振動周波数掃引を受けた（応力振幅：０．６Ｐａ、周波数範囲：０．０１〜１００Ｈｚ）。使用された３バージョンのヒアルロナンハイドロゲルの粘弾性（レオロジー）特性を図２にまとめる。
【０２１８】
最も一般的に使用されるドナー細胞は、上述のように遺伝子導入Ｈ２Ｂ−ＧＦＰブタから誘導された。これらは、すべての細胞がＧＦＰでタグ付けされる点において、細胞移植研究に有意な利点を提供する。分子タグとしての蛍光タンパク質の使用は、移植後のドナー細胞の移動および生着を追跡することを可能にした。この融合タンパク質は、核／クロマチンＧＦＰ信号をもたらすヌクレオソームを標的とする。説明した移植片では、幹細胞は完全に核内でＧＦＰを発現するが、成体細胞型に制限される系統は、細胞質または核内でそれを有することができる。細胞質ＧＦＰのレベルは、一週目で特に高く、時間と共に減少することに留意されたい。これは、生着／浸潤／統合プロセスが、Ｈ２Ｂ結合型ＧＦＰが細胞質で見出される細胞に影響を及ぼすためである。これは、細胞が死にかけていることを意味するのではなく、再構築ゾーンの一部である高レベルのＭＭＰおよび関連するシグナル伝達に応答していることを意味する。実際、検出されたＧＦＰ＋細胞は明確に生存可能で増殖し、すべてがさまざまな成体機能を発現する（例えば、アルブミン、ＨＮＦ４α、ＡＦＰ、インスリン、グルカゴン、またはアミラーゼ）。
【０２１９】
移植片の特徴付けでより詳細に説明されるように、成熟肝細胞における裏打ち（新緑色）およびリポフスチン（ダークフォレスト緑色）の両方の自己蛍光は、波長がＧＦＰの波長と重複しているという課題を示した。したがって、出願人は、ＧＦＰに対する抗体を使用して、ＧＦＰ＋信号をピンク色またはローズ色にシフトし、二次的に赤色蛍光プローブを有する抗体にシフトした。これにより、幹細胞は、ピンク核（核青色ＤＡＰＩ染色と抗体タグ付きローズ色ＧＦＰ＋ラベルとの融合）を有する小細胞として認識された。肝細胞に成熟した任意のドナー細胞は、緑色の自己蛍光（リポフスチン）、青色（ＤＡＰＩ）、およびローズ色（ＧＦＰ）の融合によりラベンダー色を有すると認識された（図４）。
【０２２０】
ブタ肝外胆管組織（胆嚢、共通管、肝管）を遺伝子導入ブタから取得した。組織は、滅菌されたステンレス鋼マレットで叩かれ、肝内胆管および肝外胆管の連結を注意深く維持しながら、実質細胞を除去した。続いて、胆管を、０．１％の血清アルブミンおよび１ｎＭのセレン（１０−９Ｍ）の抗生物質で補充した、滅菌無血清の基底培地から成る「細胞洗浄」緩衝液で洗浄した。次いで、交差した外科用メスで機械的に分離し、０．１％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１ｎＭのセレン、３００Ｕ／ｍｌのＩＶ型コラゲナーゼ、０．３ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡｓｅ）および抗生物質で補充されたＲＰＭＩ−１６４０中の細胞懸濁液中に凝集体を酵素的に分散させた。消化は３２°Ｃで３０〜６０分間、頻繁に撹拌しながら行った。ほとんどの組織は、２ラウンドの消化を必要とし、続いて４℃で１１００ｒｐｍで遠心分離した。細胞ペレットは組み合わされ、細胞洗浄液中に再懸濁した。細胞懸濁液を、４℃で５分間３０Ｇで遠心分離し、赤血球を除去した。細胞ペレットを再び細胞洗浄液中に再懸濁し、４０μｍナイロン細胞ストレーナーで濾過し（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  Ｆａｌｃｏｎ  ＃３５２３４０）、新鮮な細胞洗浄液を加えた。細胞数を測定し、トリパンブルーを使用して生存率を評価した。９０〜９５％を超える細胞生存率が日常的に観察された。
【０２２１】
以前の研究では、出願人は、肝細胞および胆管幹細胞に必要とされる重要なパラクリン信号と、成熟実質細胞に必要とされる他の信号とを提供する、間葉細胞集団の抗原性プロファイルを定義した。ＢＴＳＣとパートナーとなる間葉細胞は、ＭＨＣ抗原を含まず、側方散乱が低く、血管芽細胞（ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３＋、ＶＥＧＦ受容体＋およびＣＤ３１陰性）、血管内皮の前駆体（ＣＤ１３３＋、ＶＥＧＦ受容体＋、およびＣＤ３１＋）、および星状細胞の前駆体（ＣＤ１４６＋、ＩＣＡＭ１＋、ＶＣＡＭ＋、α−平滑筋アクチン（ＡＳＭＡ）＋、およびビタミンＡ陰性）として識別可能な亜集団である。これら３つの亜集団は、まとめて早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）と称される。対照的に、成体肝細胞は、成熟類洞血管内皮（ＣＤ３１＋＋＋、ＩＶ型コラーゲン＋、ＶＥＧＦ受容体＋、およびＣＤ１１７陰性）および成熟した星状細胞および間質細胞（ＩＣＡＭ−１＋、ＡＳＭＡ＋、ビタミンＡ＋＋、Ｉ型コラーゲン＋）に関連する成体胆管細胞に関連付けられる。
【０２２２】
細胞懸濁液を、無血清のクボタの培地中のＭｕｌｔｉｗｅｌｌ  Ｆｌａｔ  Ｂｏｔｔｏｍ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｐｌａｔｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃３５３０４３）に加え、３７℃で約一時間インキュベートし、成熟間葉細胞の付着を促進した。培地が無血清であっても、成熟間葉細胞は１０〜１５分以内に皿に付着した。懸濁液中に残留する細胞を別の皿に移し、再び最大一時間インキュベートした。この繰り返しにより、成熟間葉細胞のかなりの部分の枯渇が生じた。成熟間葉細胞の枯渇後、残りの浮遊細胞が、Ｃｏｒｎｉｎｇの超低付着皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＃３４７１）の無血清クボタの培地にウェル当たり約２×１０５の細胞で播種し、ＣＯ２インキュベーターで３７℃で一晩インキュベートした。胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）および一晩で形成されるＥＬＭＳＣから成るオルガノイド（図１）。これらのオルガノイド培養物は、特に培地が可溶性形態のＨＡ（Ｓｉｇｍａ）で補充された（０．１％）場合には、クボタの培地で数週間生存し、以下に記載されるように凍結保存される場合もある。新生仔ブタ胆管組織の各グラムから、約１．５Ｘ１０７細胞を得た。６ウェルで超低付着プレートのウェル当たり約３〜６Ｘ１０５の細胞を使用し、無血清のクボタ培地でインキュベートした。細胞は、平均６０００〜２０，０００個の小さなオルガノイド（約５０〜１００細胞／オルガノイド／ウェル）を生成する。移植片に対して、少なくとも１００，０００個のオルガノイド（＞１０７細胞）を使用した。裏打ちのサイズに応じて、出願人は、移植片内のオルガノイドの数を、３ｃｍＸ４．５ｃｍの裏打ち上の約１ｍｌの軟性ヒアルロナンハイドロゲルに埋め込まれた１０８オルガノイド（すなわち、約１０９細胞）以上まで増加させることができた。
【０２２３】
単離された幹細胞オルガノイドは、不凍因子、デキストラン、およびＤＭＳＯ（ワシントン州、シアトル、Ｂｉｏｌｉｉｆｅ；ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｔｅｍｃｅｌｌ．ｃｏｍ／ｐｒｏｄｕｃｔｓ／ｃｒｙｏｓｔｏｒ−ｃｓ１０．ｈｔｍｌ）を含有する等張性凍結保存緩衝液であるＣＳ１０で凍結保存された。細胞の生存率は、０．１％のＨＡ（Ｓｉｇｍａ  ＃５２７４７）を補充することで、さらに改善した。ＣｒｙｏＭｅｄ（商標）Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−Ｒａｔｅ  Ｆｒｅｅｚｅｒを使用して凍結保存を行った。解凍上の生存率は９０％を超え、解凍後の細胞は付着し、エクスビボおよびインビボで増殖し、インビトロおよびインビボで予想される成熟細胞を生じさせることができた。
【０２２４】
細胞を単離し、移植片を組み立てることは、図１の概略図で特徴付けられ、図２に詳細が要約されている。移植片は裏打ちを使用して形成され（表１）、その上に軟質ヒアルロナンハイドロゲル中に埋め込まれた幹細胞オルガノイドを配置した。これらは事前に容易に調製され、インキュベーター内の培養皿で一晩維持された。移植片は、実験期間の間、標的部位で安定していた。オルガノイドの凍結保存は容易に達成されたが、軟質ハイドロゲル内のオルガノイドの場合はそうではなかった。これは、オルガノイドの軟質ハイドロゲルへの埋め込みを、手術の直前に行う必要があることを意味した。
【０２２５】
手術
麻酔は、静脈内に注射されたケタミン／キシラジンの組み合わせ（各々２〜３ｍｇ／ｋｇ体重）または筋肉内に注射された２０ｍｇ／ｋｇのケタミンと２ｍｇ／ｋｇのキシラジンを投与することにより誘導され、閉回路ガス麻酔薬ユニットを介して投与される酸素中のイソフルランによって維持された。
【０２２６】
動物を背臥位に位置付け、腹部を剣状突起（ｘｙｐｈｏｉｄ）から恥骨まで切開した。皮膚は、ヨウ素化スクラブおよびアルコール溶液を交互に用いて無菌的に準備した。手術室へ入った後、滅菌技術を用いて皮膚の準備を繰り返し、滅菌外科用ドレープの適用前に、その領域を局所ヨウ素溶液で覆った。外科医は適切な無菌技術を使用した。剣状突起から始まり、尾側に８〜１２ｃｍ延びる、皮膚、皮下組織および白線を介して、腹部中央の切開が行われた。左肝部分を露出させ、３ｘ４．５ｃｍのパッチグラフトを肝臓の腹側表面に適用し、これは１０Ｘ  ＨＡ（約７６０Ｐａ）を含む裏打ちに配置されたオルガノイドが埋め込まれた１Ｘ  ＨＡ（約６０Ｐａ）を含み、パッチは肝臓被嚢の表面に直接接触させて配置した。パッチグラフトは、４−０ポリプロピレンの４〜６の単純な断続縫合を用いて、肝臓に縫合した。次いで、移植片の露出した表面を、２ｍｌの２Ｘ  ＨＡハイドロゲル（約１０６Ｐａ）で処理し、その剛性レベルは移植片の漿膜側にペイントまたはコーティングするのに十分な流体であり、隣接組織からの癒着をさらに最小限に抑えるよう機能した。外科手術移植片の配置後、白線は０−ＰＤＳを使用した単純な連続縫合で閉鎖された。白線は、２ｍｇ／ｋｇ０．５％のブピバカインを筋肉内注射してブロックした。皮下組織および皮膚は、それぞれ２−０のＰＤＳ、および３−０のＭｏｎｏｃｒｙｌで連続縫合で閉じられた。組織接着剤を皮膚表面上に置いた。
【０２２７】
遺伝子導入ブタからレシピエントへの移植片の移植は、同種異系であり、そのため免疫抑制が必要であった。使用された免疫抑制プロトコルは、他によって確立されたものであった。すべてのブタに、手術の２４時間前から、免疫抑制薬剤タクロリムス（０．５ｍｇ／ｋｇ）およびミコフェノール酸（５００ｍｇ）を一日二回経口投与した。薬物は実験期間全体にわたって連続的に与えられた。これらはお気に入りの食品と混合すると、動物に容易に与えることができる。
【０２２８】
すべての動物を、ケタミン／キシラジンにより、およびイソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）麻酔により鎮静させ、続いて致死量のペントバルビタールナトリウムの静脈内注射によって、指定時点で人道的に安楽死させた。死亡の確認に伴い、死体を慎重に解剖し、標的臓器を取り出し、実験室への輸送のために冷却済みのクボタの培地に置いた。肝臓に加えて、肺、心臓、腎臓、および脾臓が回収され、１０％の中性ホルマリン中に固定された。
【０２２９】
移植片の特徴付け
固定後４８時間以上で、組織試料を７０％のエタノールの標識カセットに配置し、Ｌｅｉｃａ  ＡＳＰ３００Ｓ組織プロセッサー内でおよそ１０時間、６０度で長いサイクルで処理した。一晩の処理完了後、試料はＬｅｉｃａ  ＥＧ１１６０エンベデッドステーションを使用して埋め込まれた。型をろうで充填し、試料を正しい配向に配置して、所望の切片を収集できるようにした。カセットは、ブロックおよび組織試料が型から一つの単位として取り除かれるまで、冷却された。このブロックをＬｅｉｃａ  ＲＭ２２３５マイクロトームを使用して５ミクロンで切断し、切片を水槽内で浮遊させ、スライド上に配置した。スライドを染色前に一晩空気乾燥させた。切片は、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ；試薬＃７２１１  および＃７１１１）またはマッソンのトリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ  Ｓｔａｉｎ：Ｂｌｕｅ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  Ｋｉｔ＃  ８７０１９）で、Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａｌｌａｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓを使用し、メーカー推奨プロトコルに従って染色した。このプロトコルはＬｅｉｃａ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ  ＸＬにプログラムされている。
【０２３０】
組織を埋め込み、ＯＣＴ  で凍結させ、凍結切片のために−２０℃で瞬間凍結させた。凍結切片を、上述のプロトコルに従ってＩＨＣで染色した。免疫蛍光法では、凍結切片を室温で１時間解凍し、その後、抗体仕様にしたがって１０％の緩衝ホルムアルデヒド、アセトン、またはメタノールで固定した。固定後、切片を１％のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、続いて、ＰＢＳ中２．５％のウマ血清で室温で１時間、ブロッキングした。ＰＢＳ中１０％のヤギ血清で希釈した一次抗体を加え、４℃で一晩インキュベートした。次の朝、切片をＰＢＳで３回すすぎ、ＰＢＳ中２．５％のウマ血清で希釈した二次抗体で室温で２時間インキュベートした。Ｚｅｉｓｓ  ＣＬＳＭ  ７１０  スペクトル共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  顕微法）を使用して画像を撮影した。抗体は  表３に列挙している。
【０２３１】
図５の画像については、標準的なプロトコルに従い、切片（３μｍ）をヘマトキシリン−エオシンとシリウスレッドとで染色した。免疫組織化学のために、内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノール過酸化水素（２．５％）で３０分間のインキュベーションによりブロックした。ベンダーによって示されるように、プロテイナーゼＫ（コードＳ３０２０、Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を室温で１０分間適用することにより、抗原を取り出した。次いで、切片を、一次抗体（ｐａｎ−Ｃｙｔｏｋｅｒａｔｉｎ、Ｄａｋｏ、コード：Ｚ０６２２、希釈：１：１００；Ｓｏｘ９、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、コード：ＡＢ５５３５、希釈：１：２００）を用いて４°Ｃで一晩インキュベートした。試料をＰＢＳで５分間２回すすぎ、二次ビオチン化抗体（ＬＳＡＢ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ、コードＫ０６９０、Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を用いて、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（ＬＳＡＢ＋  Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ、コードＫ０６９０、Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を用いて、室温で２０分間インキュベートした。ジアミノベンジジン（Ｄａｋｏ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を基材として使用し、切片を  ヘマトキシリン（ＰＭＩＤ：２９２４８４５８）で対比染色した。免疫蛍光法では、非特異的な  タンパク質結合は、５％の正常なヤギ血清によってブロックされた。標本を、一次抗体で４℃で一晩インキュベートした（ニワトリ  抗ＧＦＰ、Ａｂｃａｍ、コード：ａｂ１３９７０、希釈＝１：２００；ウサギ抗ＨＮＦ４α、Ａｂｃａｍ、コード：９２３７８、希釈：１：５０、ウサギ抗アルブミン、ａｂ２４０６、希釈＝  １：５００）。標本を洗浄し、標識されたアイソタイプ特異的二次抗体（抗−ニワトリＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−５４６、抗マウスＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８、抗ウサギＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ−４８８、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｌｔｄ、Ｐａｉｓｌｅｙ、英国）で１時間インキュベートし、４，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で  細胞核（ＰＭＩＤ：２６６１０３７０）の視覚化のために対比染色した。すべての免疫反応については、陰性対照（一次抗体を免疫前血清で置換した）も含まれた。切片を、Ｊｅｎｏｐｔｉｋ  Ｐｒｏｇ  Ｒｅｓ  Ｃ１０  Ｐｌｕｓ  Ｖｉｄｅｏｃａｍ（Ｊｅｎａ、ドイツ）を装備した、Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＤＭ  ４５００  Ｂ  光学および蛍光顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｌｔｚｌａｒ、ドイツ）によってコード化された方法で調べた。免疫蛍光染色も共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  ＴＣＳ−ＳＰ２）によって解析した。スライドは、画像解析システム（ＩＡＳ−Ｄｅｌｔａ  Ｓｉｓｔｅｍｉ、ローマ、イタリア）でさらに処理され、盲検法で二人の研究者によって独立して評価された。免疫蛍光染色は、デジタルスキャナ（Ａｐｅｒｉｏ  Ｓｃａｎｓｃｏｐｅ  ＦＬ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ、オックスフォード、英国）によって走査され、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅによって処理された。
【０２３２】
肝細胞（リポフスチン）の高い自己蛍光およびセリシルク裏打ちの蛍光を考慮すると、凍結切片は問題であった。出願人は、パラフィン切片の調製、およびＧＦＰ（Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｃｏｉｌｓ、ＮＥ６００−３０８）に対するウサギポリクローナル抗体を用いたＧＦＰの染色により、大きな成功を収めた。ウサギ抗ＧＦＰ抗体は、ロバ抗ウサギＩｇＧ  Ｈ＆Ｌ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８；ａｂ１７５４７０、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の二次抗体と組み合わせて使用される一方で、ロバ抗ヤギＩｇＧ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８抗体は、肝臓の自己蛍光の非特異的染色を除外するために使用された。トリパンブルーを含む染料を使用したクエンチングにより、自己蛍光を減少させた。トリパンブルーは、ＰＢＳの０．４％で組織／細胞に使用された。これにより、バックグラウンドが著しく低減される。
【０２３３】
トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、総ＲＮＡをオルガノイドまたは移植片から抽出した。Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ  １ｓｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｔａｋａｒａ）を使用して合成された第一鎖ｃＤＮＡを、ＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を備えたＦａｓｔｓｔａｒｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、ｍＲＮＡレベルの定量的解析を行った。プライマーは、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｐｒｏｂｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）で設計された。プライマー配列は、表４に列挙している。プライマーを５０℃で２分間、９５℃で１０分間アニールし、次いで９５℃（１５  秒）と６０℃（１分）で４０サイクル行った。グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）の発現は、一般的に対照および標準として使用された。
【０２３４】
Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙ  Ｋｉｔを使用して細胞からＲＮＡを精製し、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２０００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを使用してＲＮＡ完全性（ＲＩＮ）解析を行った。ｃＤＮＡライブラリは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍＲＮＡ調製キットを用いて生成し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２５００プラットフォーム上で配列決定した。１レーン当たり二つの試料を配列決定し、全ての試料（１つのフローセル）で合計８レーンを占めた。ＦａｓｔＱを使用して品質管理分析を完了した。配列読み取りのヒトゲノム（ｈｇ１９）へのマッピングを、デフォルトパラメータを使用してＭａｐＳｐｌｉｃｅ２で実施した。転写物定量化をＲＳＥＭ分析により実施し、ＤＥＳｅｑを使用して遺伝子発現を正規化し、差次的に発現する遺伝子を特定した。ＭａｐＳｐｌｉｃｅ２も使用して、候補融合転写物を検出した。融合コール（Ｆｕｓｉｏｎ  Ｃａｌｌｓ）は、候補融合接合部にわたる読み取りの深さおよび複雑さに基づいていた。ピアソンの相関分析を使用して遺伝子発現プロファイルを比較し、階層的クラスタリングをＲで実施した。階層的クラスタリングは、ＤＥＳｅｑパッケージで提供される分散安定化変換に従って実施した。経路濃縮分析を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）ソフトウェアで行った。差次的遺伝子発現解析は、少なくとも一つのカテゴリーで、最小平均正規化数が５０を超える遺伝子に対してのみ実施された。
【０２３５】
試料間の統計的有意差は、スチューデントの両側ｔ検定を使用して計算され、結果は平均±標準偏差（ＳＤ）として表示される。０．０５未満のＰ値は、統計的に有意とみなされた。
【０２３６】
結果
注入移植に関する以前の研究では、生着には上皮細胞とその系統段階に適切な間葉細胞パートナーの共移植が必要であることが見出された。肝臓および胆管幹細胞については、これらの間葉細胞は、血管芽細胞（ＣＤ１１７＋、ＣＤ１３３＋、ＶＥＧＦｒ＋、ＣＤ３１陰性）およびその直接の子孫、血管内皮の前駆体（ＣＤ１３３＋、ＶＥＧＦｒ＋、ＣＤ３１＋、フォン・ヴィレブランド因子）ならびに星状細胞の前駆体（ＣＤ１４６＋、ＩＣＡＭ−１＋、平滑筋αアクチン＋（ＡＳＭＡ）、ビタミンＡ陰性）から成る。出願人は、これらをまとめて早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣと呼ぶ。出願人はまた、他の方法によって調製され、新生ブタ肝臓から細胞を分離した分離ブタ間葉幹細胞（ＭＳＣ）でも部分的に成功した。
【０２３７】
以前の研究では、出願人は、マルチパラメトリックフローサイトメトリーを使用して、細胞懸濁液の上皮および間葉細胞の系統段階パートナーの比率を決定することにより、一致する上皮および間葉細胞段階の分離を達成し、次いで免疫選択細胞を使用した移植片内でそれらの比率を使用した。これらの研究で、出願人は、パニング手順を繰り返し、その後、残りの細胞懸濁液を低付着皿および無血清クボタの培地で６〜８時間培養することにより、成熟間葉細胞の細胞懸濁液を枯渇させることがより効率的であることを見出した。約５０〜１００個の細胞を含有する各凝集体で自己組織化されたオルガノイド。マーカー分析は、ＢＴＳＣのＥＬＳＭＣとの組み合わせを示した（図１）。図１Ａの概略図にまとめられている通り、それらは直ちに使用されたか、または事前に決定された定義された条件下で凍結保存され、移植片の必要に応じて解凍された。ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドは、免疫蛍光法（ＩＦ）、ｑＲＴ−ＰＣＲおよびＲＮＡ配列を使用して特徴付けられ、ＢＴＳＣ（図１）およびＥＬＳＭＣ（データ非表示）の古典的形質を発現するために示されている。オルガノイドにおけるＢＴＳＣは、成熟肝臓または膵臓遺伝子を発現しないが、低レベルの多能性遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２）および内胚葉性幹細胞遺伝子（例えば、ＥｐＣＡＭ、ＳＯＸ  ９、ＳＯＸ１７、ＰＤＸ１、ＬＧＲ５、ＣＸＣＲ４、ＭＡＦＡ、ＮＧＮ３、およびＮＩＳなど）を発現した。代表的なｑＲＴ−ＰＣＲアッセイは、移植前の細胞のＩＦおよびＩＨＣからの所見を確認した（図１Ｄ）。ＩＨＣアッセイは、より原始的な細胞（例えば、多能性遺伝子を発現するもの）が、オルガノイドの内部および周辺部の後期成熟系統段階に分布した（例えば、ＥｐＣＡＭまたはアルブミンを発現する細胞）ことを示した（図１Ｃ）。
【０２３８】
パッチグラフトからの結果を、以前に確立された、細胞の注入から成る方法で、および数分以内にポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）でヒアルロナンをゲル化することによる、部位への局在化で、注入移植片の結果と比較した。ブタ肝実質組織への注入移植片は、本質的に１００％の生着をもたらしたが、最小限の（ある場合）移動があり、および宿主組織への統合（データ非表示）は数週間にわたってゆっくり発生した。所見は、肝臓幹細胞の注入移植片で以前に観察されたものと類似していた１７。肝葉のすぐ後側の肝臓の管／門脈枝に隣接する腸間膜への注入移植片は、大きな管で実現可能であったが、より小さなものがＨＡハイドロゲルの腫脹効果から閉塞し、また胆汁うっ滞をもたらした（図１３）。パッチグラフトを用いた成功によって、注入移植片戦略のさらなる努力を放棄することになった。
【０２３９】
幹細胞の移植片の組成は、レオロジーアッセイによって評価された剛性のレベルを達成するために、ＰＥＧＤＡに対するＨＡの正確な濃度を有する、ヒアルロナン（ＨＡ）ハイドロゲルの３つの別個の層の条件の使用を伴った（図２Ｃ）。  ドナー細胞は軟質ＨＡ層（約１００Ｐａ）に埋め込まれ、肝臓／膵臓表面に対して配置された。軟質ハイドロゲルは幹細胞性形質２３を維持し、これらの研究では、生着に必須であることが証明された。この層は、裏打ち上で事前に調製され、移動するバリアとしての役割を果たす、剛直な（１０Ｘ；約７００Ｐａ）ＨＡ層の上に配置された。パッチは、縫合または外科手術用接着剤で標的部位に取り付けられた。外科手術時に移植片の漿膜表面をペイントまたはコーティングし、近辺組織からの癒着をさらに最小化するのに十分軟質（剛性  ＝  約２００Ｐａ）の２Ｘ  ＨＡハイドロゲル。
【０２４０】
パッチグラフトは、肝臓表面、すなわちグリソン鞘または膵臓被嚢の表面に置かれ、縫合または外科手術用接着剤によって角に取り付けられた（図２Ｆ）。セリシルクの剛性により、移植片は、最小限の曲率を有する部位に、有意な機械力（例えば、横隔膜近傍）を有する部位から離れて、配置された。膵臓への移植片では、移植片を十二指腸と膵臓の間にくさび留めした。
【０２４１】
試されて放棄されたパッチグラフトの唯一のバリアントは、被嚢の鋭利な外科手術除去の後のものであった。出血は、肝不全に関連する止血が変化した宿主、またはドナー細胞に対する血清の悪影響を与えられた正常な宿主でさえ、将来の使用を過剰に妨げるものであった。器官被嚢を変更するこうした努力がなければ、パッチグラフトは外科手術処置に容易であると証明された。
【０２４２】
多くの裏打ちが、腹部外科手術において臨床的に使用されるものに焦点を当てて試された（表１  および  表２）。セリシルクを除くすべてが問題を引き起こし、さらなる検討のためにそれらの排除につながった。この問題には、脆弱性（例えば、Ｓｅｐｒａｆｉｌｍ、Ｒｅｔｒｏｇｌｙｄｅ）、壊死または線維症の誘発および有意なレベルの癒着（例えば、Ｓｕｒｇｉｓｉｓ、Ｖｅｔｒｉｘ）、ならびにセリシルクの線維状スポンジバージョンまたは腹部にカルボキシメチルセルロース（「ベリーゼリー」）を補充した裏打ちのいずれかとの重度の癒着形成が含まれる。試験されたもののうち、ＳＥＲＩ外科手術用シルク２４−２６（Ａｌｌｅｒｇａｎ、Ｉｎｃ．アーヴィン、カリフォルニア州）は、機械的支持と最小癒着との最良の組み合わせを提供し、この効果は、標的部位への付着後にＳｅｒｉＳｉｌｋの漿膜表面に２Ｘ  ＨＡを適用することによってさらに強化された。この製品は、Ｂｏｍｂｙｘモスシルクの精製フィブロインであり、Ｄａｖｉｄ  Ｋａｐｌａｎ（Ｔｕｆｔ’ｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、ボストン、マサチューセッツ州）によって開発された。出願人はこれを硬いと思ったが、この特性は、外科手術操作および肝臓のような平面／剛直な器官への配置に有用であることを見出した。硬さは、有意な曲率を有する部位または可撓性の必要な部位への適用を困難にした。それでも、その硬さは、ドナー細胞に対する成熟効果に関して中立であることを証明し、この裏打ちがパッチグラフトに許容可能になった所見である。３週間の移植片では、セリシルクはコラーゲンの帯によって包まれ、軽度の異物反応を示唆していた。合成線維などのその他の候補の裏打ちの評価は進行中である。
【０２４３】
手術後１週目での再形成の証拠は、コラーゲンおよびその他の細胞外マトリックス成分を染色する色素を含む、トリクローム染色（図３、７）またはサフラニンＯで検証された。トリクロームで染色された移植片の画像（図３Ａ〜Ｂ）は、同じ部位のものと比較され、ヘマトキシリン／エオシンで染色された（図３Ｃ〜Ｄ）。グリソン鞘および小葉の再構成は、ＨＡが吸収されるのと並行して３週間までに発生した。再形成領域を含む帯域は、驚くべき大きさであった（図３〜５、７）。
【０２４４】
遺伝子導入ＧＦＰ＋ブタから得られたドナー細胞は、ＩＨＣアッセイを通してＧＦＰ発現によって容易に特定された。膵臓では、ドナー細胞は緑色蛍光によって識別された。しかし、肝臓では、肝細胞のリポフスチンの自己蛍光は、ＧＦＰの波長と重複する波長でピークとなる。したがって、ＧＦＰに対する抗体で肝臓のドナー細胞を特定し（ウサギ抗ＧＦＰ抗体；Ｎｏｖｕｓ、ＮＢ６００−３０８）し、赤色蛍光プローブ（ロバ抗ウサギ５５５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で二次抗体に結合し、ドナー細胞にピンク色の核（赤色蛍光プローブ＋青色ＤＡＰＩ）を持たせた。宿主細胞は、それらの青色核（ＤＡＰＩ  染色）が認められたが、ＧＦＰ発現は認められなかった（図４）。
【０２４５】
成熟肝細胞の肝小葉は、自己蛍光（リポフスチン）からの森林緑色であった（図４Ｂ）。肝細胞の凝集体に成熟したドナーＧＦＰ＋細胞は、ＧＦＰからの赤色蛍光プローブ、ＤＡＰＩからの青色、およびリポフスチンからの自己蛍光暗緑色の融合により、ピンク色の核を有するラベンダー色である（図４Ｃ）。肝細胞は、宿主由来であろうとドナー由来であろうと、成熟した星状細胞中のビタミンＡによるもの（図４Ｃ）と推測される、明るい黄色／緑色の自己蛍光を伴う宿主間葉細胞（血管内皮、星状細胞）によってクラスター化された。血管内皮および星状細胞のＩＨＣデータは示されていない。
【０２４６】
１週間以内に、ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣオルガノイドのパッチグラフトは、器官被嚢および隣接した小葉の再形成をもたらし、その後に宿主およびドナー細胞の合併をもたらした（図３〜５、７）。ドナー細胞の指のような拡張部分は、宿主組織の肝小葉へと拡大し、並行して、宿主細胞は移植片のＨＡへと拡大した（図４）。膵臓の場合、移植片は膵臓と十二指腸の間にくさび留めされ、手術後１週間までに、膵臓内と十二指腸の粘膜下のブルンナー腺の両方にドナー細胞の生着が発生した（図６）。肝臓（または膵臓）の大きな領域内の細胞の統合は、ＨＡ層がほとんど吸収された２週間までに完了した。ドナー細胞は、胆管細胞および肝細胞の両方の成体肝実質運命（図５）または膵臓運命に制限された系統を有していた（図６）。
【０２４７】
３週間までに、ＨＡ層を完全に吸収し、裏打ちのみを残した。これは、器官被嚢および被嚢近くの組織の組織学的構造（図３、５、６）、または膵臓被嚢および膵臓組織学的構造（図６）の再出現と相関した。膵臓において、成熟細胞は、膵島細胞（ベータ細胞）用のインスリンおよび腺房細胞用アミラーゼを含む、機能マーカーによって特定された。
【０２４８】
肝臓および膵臓の両方に対する生着効率は、１週間までに１００％に近づいた。これは特定されたすべてのドナー細胞が、器官被嚢の上の移植片の残骸内ではなく、肝臓もしくは膵臓内で生育可能であり、他の器官（例えば、肺）の異所的な細胞分布の証拠は無視できるか、まったくないことが見出されたからである。
【０２４９】
肝臓および膵臓を通るＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣ移植片中のドナー細胞の移動速度は、一週間の終わりまでに器官（肝臓または膵臓）のほとんどの領域にドナー細胞をもたらす顕著な結果を示し、２〜３週間までには組織（肝臓／膵臓）全体に均一に分散された細胞が明らかになった。（図３〜６）。
【０２５０】
グリソン鞘（または膵臓被嚢）および隣接する肝小葉（または膵臓組織）の溶解および再形成と相関し、有意な生着と相関するのは、細胞外マトリックス成分を溶解し、細胞移動に関連することが知られている、複数のＭＭＰの発現の上昇であった。図７は、幹／前駆体対成体細胞により発現したＭＭＰのＲＮＡ配列研究およびＩＨＣアッセイのデータをまとめたものである。ＢＴＳＣは、分泌型（例えば、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７）および膜結合型形態（例えば、ＭＭＰ１４およびＭＭＰ１５）の両方から成る高レベルの複数ＭＭＰを発現した。血管内皮および星状細胞の前駆体であるＥＬＳＭＣも、複数のＭＭＰに寄与した。
【０２５１】
ＲＮＡ配列データからの所見は、ＭＭＰ遺伝子によってコードされるタンパク質に対するＩＨＣアッセイによって確認された（図７）。ＩＨＣアッセイは、特に再形成領域において、分泌型のＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７、ＭＭＰ９）の存在を確認した。ＭＭＰ１のタンパク質発現は、ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣオルガノイドおよび移植片の再形成領域でも見られたが、ＲＮＡ配列所見の既存データバンクには、分析に使用するブタＭＭＰ１の注釈付き種が欠如しているため、ＭＭＰ１は含まれない。したがって、その発現の認識は、ＩＨＣアッセイに基づいている。
【０２５２】
ドナー細胞の分化を引き起こす変数によって、ＭＭＰ、特に分泌型の発現が抑制され、並行して、生着および移動の可能性が失われた（データ非表示）。これらの要因には、血清、ドナー細胞の分化に影響を与えることが知られている様々な可溶性調節信号（成長因子、サイトカイン、ホルモン）、ハイドロゲル中または裏打ち中（特にＩ型コラーゲン含有裏打ち）の細胞外マトリックス成分、およびＨＡハイドロゲル（すなわち、Ｐａレベル）の剛性がが含まれる。ＥＬＳＭＣの分化が間質に対して優先的に進行した場合、移植片は線維化し、血管内皮に対する場合、移植片は生存可能な細胞および組織を保持したが、器官被嚢に対しては表層のままであった（データ非表示）。
【０２５３】
ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣのオルガノイドは、移植のための細胞に対する最も成功した配置を証明した。過去には、特徴的な表面抗原を使用したフローサイトメトリーによって細胞懸濁液からそれらを免疫選択し、次いで新鮮な分離組織からの細胞懸濁液中に見つかった比率にしたがってそれらを混合することにより、上皮間葉パートナーを共移植した１７。ここで、成熟間葉細胞のパニングによる除去後に、それらをオルガノイドに自己選択させることが、移植片に関連するパラクリンシグナル伝達を伴う系統段階の適切な上皮間葉パートナーを確立し、定義された（無血清）条件下でオルガノイドを生成するのにより効率的かつ効果的であり、それらが簡単かつ安全に凍結保存されることが判明した。
【０２５４】
移植片の一次設計は、細胞と、不溶性になり、標的部位に細胞を局在化させたままにできる適切な生体材料との混合から成る。移植片について、理想的な生体材料は、全ての幹細胞の壁龕に見られるヒアルロナン（ＨＡ）などの非硫酸化または最小硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であって、ＨＡの受容体は古典的な幹細胞形質であることが証明された。幹／前駆体としての細胞の維持は、生着に有効な分泌型および膜結合型ＭＭＰの発現を最適化した。
【０２５５】
生着プロセスの証拠は、移植片および宿主組織の界面で発生した再形成の領域内で特に劇的であった。再形成の所見を検証するために、細胞外マトリックス成分を染色する染料を含む、トリクローム染色およびサフラニンＯ用いて、ヘマトキシリン／エオシンで染色された隣接する切片と並行して分析した（図３、７）。外科手術後一週間以内に、器官被嚢および隣接組織の再形成を確認した。手術後３週間までに、これらのアッセイは、ＨＡ除去後の器官被嚢および正常な組織の組織学の再構成を示した。再形成ゾーンは、特に手術後一週間で驚くべき大きさであり（図３、７）、複数の形態のＭＭＰが関与することが示された（図７）。
【０２５６】
ＨＡには数多くのソースおよび型があるが、中でも最も有用なものは、Ｇｌｅｎｎ  Ｐｒｅｓｔｗｉｃｈ（ユタ大学、ソルトレークシティ、ユタ州）によって確立されたチオール修飾物であり、これはＰＥＧＤＡでトリガーされ、正確な生化学的および機械的特性を有するハイドロゲルを形成できる。ＨＡのこれらの特性は、完全な弾性を与え、血液、リンパまたは間質液の全ての可溶性信号の移植片へのアクセスを可能にし、生着および移動が起こるまでドナー細胞の成熟を最小限に抑える。ＨＡおよびＰＥＧＤＡ濃度の単純な変化でレオロジー因子を変化させる能力は、細胞の移動方向を導き、癒着を最小限に抑えるために追加的利点を提供した。幹細胞の壁龕における特性を模倣するソフトＨＡハイドロゲルは、ＭＭＰの幹／前駆体細胞関連レパートリーの発現に許容的であった。したがって、骨格組織の機能で長年研究されたＨＡの機械的特性は、移植戦略の管理においても重要である２３。
【０２５７】
幹／前駆体を含むパッチグラフトは、数日以内に移植片が組織内に「融解」し、その後ドナーおよび宿主細胞が合併し、器官のほとんどの領域全体に一、二週間で細胞が分布するという著しい現象が生じた。その後、ドナー細胞の成熟および器官被嚢の回復が、ＨＡの組織除去と並行して発生した。
【０２５８】
生着および統合プロセスは、細胞外マトリックス成分を分解する、カルシウム依存性、亜鉛含有エンドペプチダーゼのファミリーである、複数のＭＭＰの発現と相関していた。ＲＮＡ配列研究を使用して、高レベルの分泌型（例えば、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７）ならびに膜結合型（例えば、ＭＭＰ１４、ＭＭＰ１５）で構成される、幹／前駆体関連ＭＭＰのパターンを見出した。ＩＨＣアッセイは、分泌型ＭＭＰ（例えば、ＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ７）のタンパク質レベルが、再形成の領域で豊富に発現したことを示した（図７）。ドナー細胞を分化させる条件（可溶性成長因子、サイトカイン、血清、マトリックス成分、機械力）は、特に分泌型ＭＭＰの減少、また並行して、生着プロセスの抑止をもたらした。
【０２５９】
移植片、特にＨＡの生体材料は、エクスビボおよびインビボで示され、細胞内で幹細胞性形質を維持する。移植片は運命決定をトリガーしうる公知の信号を欠いているため、移植片が肝臓または膵臓のどちらに配置されたかによって、異なる成体運命に成熟したドナー細胞の所見は、宿主組織の局所的微小環境を、成熟プロセスの関連因子の論理的なソースとして示唆する。
【０２６０】
生着可能な細胞の数は、相当数（＞１０８）あり、移植片の寸法、細胞数、ならびに分泌型および細胞膜結合型ＭＭＰのレパートリーによって指定される。これらの所見は、血管送達または注入移植によって実現可能な、限られた数の細胞（例えば、１０５−１０６）とは対照的である。
【０２６１】
パッチグラフトは、内臓器官を含む固形臓器に多数の細胞を移植するための安全な戦略であり、特に疾患状態で生着が十分に発生する場合には、患者の治療に有用でありうる。しかしながら、組織が線維症であるか、または肝硬変による影響を受けている場合、異常生着が起こりうる懸念がある。したがって、本明細書では、方法の態様に対するパッチグラフトの有効性を決定するための実施例が提供されている。
【０２６２】
実施例２：肝疾患の治療。
本実施例は、パッチグラフトを使用して肝疾患または障害を有する対象を治療する例示的方法を説明する。ドナー細胞は、本明細書に記載されるように、肝臓および膵臓の前駆体である、胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）のオルガノイドとして調製され、オルガノイドは、血管内皮前駆体および星状細胞前駆体である、血管芽細胞およびそれらの早期系統段階子孫から成る、早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）と凝集したものである。ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣオルガノイドは、対象の肝臓の標的部位につながれた裏打ち上に置かれた軟質ヒアルロナンハイドロゲル（＜２００Ｐａ）に埋め込まれている。
【０２６３】
パッチグラフトの適用後、対象は肝機能の改善を監視される。肝機能をチェックするために一般的に使用される試験には、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、アルブミン、およびビリルビン試験が含まれるが、これらに限定されない。ＡＬＴおよびＡＳＴ試験は、損傷または疾患に応答して肝臓によって放出される酵素を測定する。アルブミンおよびビリルビン試験では、肝臓がタンパク質であるアルブミンをどれだけうまく生成するか、血液の廃棄物であるビリルビンをどれだけうまく処分するかを測定する。約２週間〜約３６週間後に、肝機能の改善が検出されることが期待される。改善は、移植片の適用前の値と比較した一つまたは複数の肝機能試験の改善された値、および／または肝疾患または障害の一つまたは複数の症状の改善または寛解を検出することによって決定される。
【０２６４】
実施例３：膵臓疾患の治療。
本実施例は、パッチグラフトを使用して膵臓の疾患または障害を有する対象を治療する例示的方法を説明する。ドナー細胞は、本明細書に記載されるように、胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）のオルガノイドとして調製され、オルガノイドは、血管内皮前駆体および星状細胞前駆体である、血管芽細胞およびそれらの早期系統段階子孫から成る、早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）と凝集したものである。ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣオルガノイドは、対象の膵臓の標的部位につながれた裏打ち上に置かれた軟質ヒアルロナンハイドロゲル（＜  ２００Ｐａ）に埋め込まれている。
【０２６５】
パッチグラフトの適用後、対象は膵臓機能の改善を監視される。膵機能のチェックに一般的に使用される検査には、膵臓酵素アミラーゼおよびリパーゼのレベルの血液検査、セレクチンまたはコレシストキニンの投与後の直接的な膵臓機能検査、糞便エラスターゼ試験、造影剤を用いたＣＴスキャン、腹部超音波、内視鏡逆行性胆道膵管造影（ＥＲＣＰ）、超音波内視鏡、および磁気共鳴胆道膵管造影が挙げられるが、これらに限定されない。約２週間〜約３６週間後に、膵臓機能の改善が検出されることが期待される。改善は、移植片の適用前の値と比較した一つまたは複数の膵臓機能試験の改善された値、および／または膵臓の疾患または障害の一つまたは複数の症状の改善または寛解を検出することによって決定される。
【０２６６】
実施例４：腎臓疾患の治療。
本実施例は、パッチグラフトを使用して腎臓の疾患または障害を有する対象を治療する例示的方法を説明する。ドナー細胞は、本明細書に記載されるように、胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）のオルガノイドとして調製され、オルガノイドは、血管内皮前駆体および星状細胞前駆体である、血管芽細胞およびそれらの早期系統段階子孫から成る、早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）と凝集したものである。ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣオルガノイドは、対象の腎臓の標的部位につながれた裏打ち上に置かれた軟質ヒアルロナンハイドロゲル（＜２００Ｐａ）に埋め込まれている。
【０２６７】
パッチグラフトの適用後、対象は腎臓機能の改善を監視される。膵臓機能をチェックするために一般的に使用される検査には、当該技術分野で知られている腎臓機能の臨床的に関連する終点が含まれるがこれらに限定されない。約２週間〜約３６週間後に、腎臓機能の改善が検出されることが期待される。改善は、移植片の適用前の値と比較した一つまたは複数の腎臓機能試験の改善された値、および／または腎臓の疾患または障害の一つまたは複数の症状の改善または寛解を検出することによって決定される。
【０２６８】
実施例５：胃腸疾患の治療。
本実施例は、パッチグラフトを使用して胃腸の疾患または障害を有する対象を治療する例示的方法を説明する。ドナー細胞は、本明細書に記載されるように、胆管幹細胞（ＢＴＳＣ）のオルガノイドとして調製され、オルガノイドは、血管内皮前駆体および星状細胞前駆体である、血管芽細胞およびそれらの早期系統段階子孫から成る、早期系統段階間葉細胞（ＥＬＳＭＣ）と凝集したものである。ＢＴＳＣ／ＥＬＳＭＣオルガノイドは、対象の腸の標的部位につながれた裏打ち上に置かれた軟質ヒアルロナンハイドロゲル（＜２００Ｐａ）に埋め込まれている。
【０２６９】
パッチグラフトの適用後、対象は腸機能の改善を監視される。腸機能をチェックするために一般的に使用される検査には、当該技術分野で知られている腸機能の臨床的に関連する終点が含まれるがこれらに限定されない。約２週間〜約３６週間後に、腸機能の改善が検出されることが期待される。改善は、移植片の適用前の値と比較した一つまたは複数の腸機能試験の改善された値、および／または胃腸の疾患または障害の一つまたは複数の症状の改善または寛解を検出することによって決定される。
明細書の添付書類
表１〜４  パッチグラフト２０１８
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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