(57)【要約】  本発明は、（ベクター）ワクチンの分野に関し、とりわけ、目的の外因性遺伝子を含有するパラミクソウイルス科ウイルスを発現させるための、ヌクレオチド配列の配置の増強に関する。本発明は、目的の遺伝子、とりわけ、抗原をコードする配列を発現させるのに適する、関連の発現カセットおよびベクターにさらに関する。本発明のウイルスベクターは、免疫原性組成物またはワクチンを生産するために有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の遺伝子（１）が発現カセットの３’方向に配置され、第２の遺伝子（２）が発現カセットの５’方向に配置されるような、パラミクソウイルス科ウイルスの２つの隣接する必須遺伝子（１；２）の間の挿入のための発現カセットであって、
・目的の異種または外因性のヌクレオチド配列である第１のヌクレオチド配列、および
・第１のヌクレオチド配列の５’末端に隣接する第２のヌクレオチド配列であって、前記第２のヌクレオチド配列が遺伝子の５’非コード領域であり、前記遺伝子が、第１の遺伝子（１）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第２のヌクレオチド配列、および
・第１のヌクレオチド配列の３’末端に隣接する第３のヌクレオチド配列であって、前記第３のヌクレオチド配列が遺伝子の３’非コード領域であり、前記遺伝子が、第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第３のヌクレオチド配列
を含む発現カセット。
【請求項２】
・前記第１のヌクレオチド配列、および
・前記第２のヌクレオチド配列、および
・前記第３のヌクレオチド配列、および
・前記第２のヌクレオチド配列の５’末端に隣接するか、または前記第３のヌクレオチド配列の３’末端に隣接するさらなるヌクレオチド配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列であるさらなるヌクレオチド配列
からなる、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
前記第３のヌクレオチド配列が、
第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’非コード領域、および
前記３’非コード領域の５’末端に隣接する配列であって、前記３’非コード領域の５’末端に隣接する前記配列が、翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列をコードし、前記翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列が、Ｋｏｚａｋ配列であってもよい、配列
からなる、請求項１または２に記載の発現カセット。
【請求項４】
・第１の遺伝子（１）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ遺伝子からなる群から選択されてもよく、
・第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのＭ遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのＨ、Ｐ、Ｆ、ＬおよびＮ遺伝子からなる群から選択されてもよい、
パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子とＭ遺伝子との間の挿入のための、請求項１から３のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列が、ＲＮＡ配列であり、かつ／または
前記第１のヌクレオチド配列が、前記第３のヌクレオチド配列内に組み入れられた遺伝子開始（ＧＳ）配列、および／もしくはパラミクソウイルス科ウイルスのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１から４のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の発現カセットを含むパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【請求項７】
・前記５’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのＮ遺伝子の５’非コード領域であり、かつ／もしくは
・前記３’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのＨ遺伝子の３’非コード領域であり、
かつ／または前記発現カセットが、パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子とＭ遺伝子との間に挿入される、請求項１から５のいずれか１項に記載の発現カセット、または請求項６に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【請求項８】
前記パラミクソウイルス科ウイルスが、ＣＤＶであり、ＣＤＶの遺伝子の５’非コード領域が、
好ましくは、配列番号１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＮ遺伝子の５’非コード領域、
好ましくは、配列番号２の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＰ遺伝子の５’非コード領域、
好ましくは、配列番号３の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＭ遺伝子の５’非コード領域、
好ましくは、配列番号４の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＦ遺伝子の５’非コード領域、
好ましくは、配列番号５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＨ遺伝子の５’非コード領域、および、
好ましくは、配列番号６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＬ遺伝子の５’非コード領域
からなる群から選択される、請求項１から７のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【請求項９】
前記パラミクソウイルス科ウイルスが、ＣＤＶであり、ＣＤＶの遺伝子の３’非コード領域が、
好ましくは、配列番号７の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＨ遺伝子の３’非コード領域、
好ましくは、配列番号８の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＮ遺伝子の３’非コード領域、
好ましくは、配列番号９の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＰ遺伝子の３’非コード領域、
好ましくは、配列番号１０の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＭ遺伝子の３’非コード領域、
好ましくは、配列番号１１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＦ遺伝子の３’非コード領域、および
好ましくは、配列番号１２の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＬ遺伝子の３’非コード領域
からなる群から選択される、請求項１から８のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【請求項１０】
前記第２のヌクレオチド配列が、ＣＤＶのＮ遺伝子の５’非コード領域であり、ＣＤＶのＮ遺伝子の前記５’非コード領域が、好ましくは、配列番号１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【請求項１１】
・前記第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’非コード領域が、ＣＤＶのＨ遺伝子の３’非コード領域であり、ＣＤＶのＨ遺伝子の前記３’非コード領域が、好ましくは、配列番号７の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含み、かつ／または
・前記３’非コード領域配列の５’末端に隣接する前記配列が、５〜８ヌクレオチドの長さであるＫｏｚａｋ配列をコードし、Ｋｏｚａｋ配列が、好ましくは、配列番号１３の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含む、請求項１から１０のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【請求項１２】
パラミクソウイルス科ウイルスの前記遺伝子間配列が、ＣＤＶの遺伝子間配列であり、ＣＤＶの前記遺伝子間配列が、好ましくは、配列番号１４の配列と少なくとも６６％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、請求項２から５および８から１１のいずれか１項に記載の発現カセット、または請求項６および８から１１のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【請求項１３】
・前記第２のヌクレオチド配列の５’末端に隣接する遺伝子間配列の５’末端に隣接するＲＮＡ配列であって、配列番号２３の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含むＲＮＡ配列、および／または
・前記第３のヌクレオチド配列の３’末端に隣接する遺伝子間配列の３’末端に隣接するＲＮＡ配列であって、配列番号２４の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含むＲＮＡ配列
をさらに含む、請求項６から１２のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【請求項１４】
・前記目的のヌクレオチド配列が、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質をコードし、ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする前記配列が、好ましくは、配列番号１５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含むか；または
・前記目的のヌクレオチド配列が、Ｈ３亜型ヘマグルチニン（Ｈ３）、好ましくは、ブタインフルエンザウイルスのＨ３をコードし、Ｈ３をコードする前記配列が、好ましくは、配列番号１６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含むか；または
・前記目的のヌクレオチド配列が、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質をコードし、前記ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質が、好ましくは、配列番号３５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなるか；または
・前記目的のヌクレオチド配列が、Ｈ３亜型ヘマグルチニン（Ｈ３）、特に、ブタインフルエンザウイルスのＨ３をコードし、前記Ｈ３が、好ましくは、配列番号３６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなる、
請求項１から１３のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【請求項１５】
前記発現カセットが、
・配列番号１７もしくは配列番号１８の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列を有するポリヌクレオチド；または
・配列番号１９もしくは配列番号２０の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列を有するポリヌクレオチド
からなるか、あるいは前記パラミクソウイルス科ウイルスベクターがこれを含む、請求項１から１４のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【請求項１６】
・配列番号２１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列；または
・配列番号２２の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列
を含む、請求項６から１５のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクターをコードし、好ましくは、ＤＮＡ分子である核酸分子。
【請求項１８】
請求項６から１７のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクターまたはＤＮＡ分子または核酸分子を含有する哺乳動物宿主細胞。
【請求項１９】
医薬、好ましくは、ワクチンとしての使用のための、請求項１から１８のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクターまたは核酸分子。
【請求項２０】
請求項１７に記載のＤＮＡ分子を含むＤＮＡ構築物。
【請求項２１】
異種遺伝子を含有する感染性パラミクソウイルス科ウイルスベクターを調製するための方法、特に、請求項６から１６のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクターを調製するための方法であって、
ａ．異種ＲＮＡポリメラーゼを発現させる宿主細胞を用意するステップ；
ｂ．宿主細胞に、請求項２０に記載のＤＮＡ構築物をトランスフェクトし、ＤＮＡ分子が、異種ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるステップ、および
ｃ．細胞により産生されるウイルスを単離するステップ
を含む方法。
【請求項２２】
ワクチンまたは医薬組成物であって、
ａ．請求項６から１６のいずれか１項に記載のベクター、ならびに
ｂ．前記ベクターにより発現される組換えタンパク質、および／または前記ベクターにより発現される複数の組換えタンパク質を含むウイルス様粒子、ならびに
ｃ．薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤
を含み、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適し、
ｄ．前記ワクチンが、アジュバントをさらに含んでもよい、
ワクチンまたは医薬組成物。
【請求項２３】
ベクターにより発現される前記組換えタンパク質が、
・ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質など、パルボウイルスＶＰ２抗原であるか、または
・インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質であり、前記エンベロープタンパク質が、Ｈ３などのヘマグルチニンであってもよい、
請求項２２に記載のワクチンまたは医薬組成物。
【請求項２４】
ａ．請求項１４から１６のいずれか１項に記載のＣＤＶベクター、ならびに
ｂ．配列番号３５または配列番号３６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドまたは組換えタンパク質、ならびに
ｃ．薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤であって、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適する、薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤
ｄ．任意にアジュバント
を含む、請求項２２または２３に記載のワクチンまたは医薬組成物。
【請求項２５】
動物における少なくとも１つの病原体の感染により引き起こされる臨床徴候または疾患を軽減または防止する方法であって、
・少なくとも１つの病原体の前記感染が、ＣＤＶおよび／もしくはＣＰＶの感染であってもよいか、または
・少なくとも１つの病原体の前記感染が、ブタインフルエンザウイルスの感染であってもよく、ブタインフルエンザウイルスが、Ｈ３亜型のインフルエンザウイルスであってもよく、前記Ｈ３亜型のインフルエンザウイルスが、好ましくは、Ｈ３Ｎ２亜型またはＨ３Ｎ１亜型のブタインフルエンザウイルスである、
方法における使用のための、請求項２２から２４のいずれか１項に記載のワクチンまたは医薬組成物。
【請求項２６】
動物における少なくとも１つの病原体と関連する疾患に対して、動物、好ましくは、イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および／または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物、あるいはイノシシ科動物またはウシなどの食料生産動物にワクチン接種し、かつ／あるいは前記病原体と関連するか、またはこれらにより引き起こされる、１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を軽減するためのキットであって、
ａ）前記動物にワクチンを投与することが可能なシリンジまたは分注器；および
ｂ）請求項２２から２４のいずれか１項に記載のワクチンまたは医薬組成物、および
ｃ）任意に、指示書の小冊子
を含み、
前記少なくとも１つの病原体が、好ましくは、ＣＤＶおよび／もしくはＣＰＶであるか、
または前記少なくとも１つの病原体が、ＳｗＩＶであってもよい、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
Ａ．発明の分野
本発明は、（ベクター）ワクチンの分野に関し、とりわけ、前記外因性遺伝子を含有するパラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）ウイルスを介して、目的の外因性遺伝子を発現させるための、ヌクレオチド配列の配置の増強に関する。本発明は、目的の遺伝子、とりわけ、抗原をコードする配列を発現させるのに適する、関連の発現カセットおよびベクターにさらに関する。本発明のウイルスベクターは、免疫原性組成物またはワクチンを生産するために有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ．関連技術の背景およびこれについての記載
パラミクソウイルス科のパラミクソウイルスは、多くの蔓延する動物疾患およびヒト疾患の一因となる、マイナスセンスで、一本鎖のＲＮＡウイルスである。パラミクソウイルスの例は、家禽および他の鳥類種に感染するニューカッスル病ウイルス、またはヒトにおいて疾患を引き起こす麻疹ウイルスである。これらのウイルスは、現在、７つの属に分けられる、４９の種を含み、これらの中には、７つの種を伴うモルビリウイルス属がある。
イヌジステンパー（ＣＤ）は、イヌおよび他の動物の、高度に感染性の熱性疾患である。死亡率は、高く、３０〜８０パーセントの間である。ＣＤを生き延びたイヌは、恒久的な中枢神経系の損傷を有することが多い。ＣＤの確立された病因は、ＣＤウイルス（ＣＤＶ）として公知の、パラミクソウイルス科、モルビリウイルス（Ｍｏｒｂｉｌｌｉｖｉｒｕｓ）属のメンバーによる感染である。一般に、パラミクソウイルスは、マイナスの極性を有する、１８〜２０ｋｂの一本鎖ＲＮＡゲノムを含有するエンベロープウイルスである。ゲノムは、融合（Ｆ）糖タンパク質、およびヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）糖タンパク質またはヘマグルチニン（Ｈ）糖タンパク質を含む、５〜７つの構造タンパク質をコードする。膜糖タンパク質であるヘマグルチニン（Ｈ）は、ウイルスの、宿主細胞への接合の一因となり、融合糖タンパク質（Ｆ）は、ウイルスと、感染細胞との間の膜融合、または感染細胞と、隣接する非感染細胞との間の膜融合を引き起こす。
【０００３】
パラミクソウイルス科のメンバーのゲノム末端は、３’リーダーおよび５’トレーラーと呼ばれる遺伝子外領域からなる：３’リーダー領域は、ゲノムプロモーターを含有し、トレーラーは、全長プラスセンスの複製中間体であり、アンチゲノムプロモーターを含有する、アンチゲノムの３’末端をコードする。各遺伝子は、保存的遺伝子開始（ＧＳ）配列で始まり、保存的遺伝子終結（ＧＥ）配列で終わる。転写は、３’リーダー領域で始まり、個々の遺伝子が、個々の別個のｍＲＮＡに転写される、開始−停止機構により、連鎖的な形で進む。遺伝子は、一部の属（レスピロウイルス（Ｒｅｓｐｉｒｏｖｉｒｕｓ）属、モルビリウイルス属、およびヘニパウイルス（Ｈｅｎｉｐａｖｉｒｕｓ）属）については、異なる遺伝子接合部間の長さおよび配列が保存的であるが、他の属（ルブラウイルス（Ｒｕｂｕｌａｖｉｒｕｓ）属、アブラウイルス（Ａｖｕｌａｖｉｒｕｓ）属、ニューモウイルス（Ｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）属、およびメタニューモウイルス（Ｍｅｔａｐｎｅｕｍｏｖｉｒｕｓ）属）については、配列または長さが非保存的である、非コード遺伝子間配列（ＩＧＳ）により隔てられる。
【０００４】
ＣＤＶについては、Ｆ糖タンパク質およびＨ糖タンパク質のいずれも、ウイルスエンベロープ内および感染細胞の表面上に存在することが見出される。他のモルビリウイルス属メンバーについての解析からの推測により、ＣＤＶのＦ糖タンパク質およびＨ糖タンパク質は、ＣＤＶの感染およびその免疫生物学に重要かつ必須であると考えられる。イヌを防御および処置するための、ポックスベースの組換えＣＤＶワクチンが開発されている（ＵＳ５，７５６，１０２）。米国特許出願ＵＳＳＮ０９／５８７，９６４は、ＣＤＶ抗原を発現させる、ＤＮＡプラスミドベースのワクチンについて開示した。
Wang et al.（Vaccine 30: 5067−5072 (2012)）は、逆遺伝学を使用することにより、狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現させる、組換えＣＤＶワクチン株を作出した。しかし、実施において見られる欠点は、このようなウイルス株が、おそらく、時間経過につれて、複製された非コード領域配列の間の相同組換えにより媒介されて、挿入された遺伝子を失うことである。
【０００５】
したがって、パラミクソウイルス科ウイルスゲノムに、外来遺伝子を安定的に挿入することを可能とする発現系が強く必要とされている。
さらに、イヌジステンパーウイルスおよびイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）は、全世界に分布する、イヌ科イヌ属動物および他の肉食動物の、２つの主要な病原体である。肉食動物集団における、これらの２つのウイルスについての疫学、およびそれらのコントロールの成功は、易感染性宿主に対する能動的免疫化に依存する。ワクチン接種スキームは、とりわけ、弱毒化生イヌパルボウイルス成分およびイヌジステンパー成分を含有する多価ワクチンの使用を含むことが極めて多い。しかし、免疫化の成功は、生後齢類型、既往の免疫状態、および母体由来免疫の存在に依存する。イヌジステンパーウイルスおよびイヌパルボウイルスなど、イヌ科イヌ属動物の主要な病原体に対して防御する、改善されたワクチンを見出すことが、強く必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
発明の概要
上記の技術的問題に対する解決策は、特許請求の範囲において特徴づけられる記載および実施形態により達成される。
したがって、その異なる態様における本発明は、特許請求の範囲に従い実施される。
本発明は、ＣＤＶウイルスのヌクレオタンパク質（Ｎ）遺伝子の５’非コード領域が５’末端に隣接する外来遺伝子を含む発現カセットを、ＣＤＶウイルスゲノムのリンタンパク質（Ｐ）遺伝子とマトリックスタンパク質（Ｍ）遺伝子との間に挿入することにより（図１を参照されたい）、ウイルスベクターが、外来遺伝子を長時間にわたってもなお収容し、維持し、発現させることができるという知見に基づく。これは、ＣＤＶベースのベクターなど、遺伝的に安定なトランス遺伝子パラミクソウイルス科ベースのベクターの作出を可能とする。
したがって、第１の態様では、本発明は、第１の遺伝子（１）が発現カセットの３’方向に配置され、第２の遺伝子（２）が発現カセットの５’方向に配置されるような、パラミクソウイルス科ウイルスの２つの隣接する必須遺伝子（１；２）の間の挿入のための発現カセットであって、
・目的のヌクレオチド配列である第１のヌクレオチド配列、および
・第１のヌクレオチド配列の５’末端に隣接する第２のヌクレオチド配列であって、前記第２のヌクレオチド配列が遺伝子の５’非コード領域であり、前記遺伝子が、第１の遺伝子（１）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第２のヌクレオチド配列
を含む発現カセット
を提供する。
【０００７】
本発明の発現カセットは、好ましくは、ＲＮＡ分子である。好ましくは、前記発現カセットは、単離発現カセットである。
本発明に従う発現カセットは、好ましくは、
・第１のヌクレオチド配列の３’末端に隣接する第３のヌクレオチド配列であって、前記第３のヌクレオチド配列が遺伝子の３’非コード領域であり、前記遺伝子が、第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第３のヌクレオチド配列
をさらに含む。
【０００８】
具体的態様では、本発明は、骨格としてのＣＤＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＤＱ９０３８５４．１、ＡＹ２８８３１１、またはＡＹ２８６４８０により表示される遺伝子型）のＬｅｄｅｒｌｅワクチン株（受託番号：ＶＲ−１２８の下に、ＡＴＣＣに寄託された）、またはこのさらなる継代により導出されたウイルスなど、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％同一なこの配列（例えば、イヌジステンパーウイルスである、Ｌｅｄｅｒｌｅ  Ａｖｉｒｕｌｅｎｔ、型番；ＮＲ−３８４５、Ｂｉｏｄｅｆｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ、Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  ４１３７、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ  ２０１０８−４１３７、ＵＳＡ）を使用する。
図２におけるプラスミドマップは、例示的に、本発明に従うベクターを作出するためのＤＮＡ構築物を示す。
本発明に従うベクターは、特に、哺乳動物、特に、イノシシ科動物のワクチン接種に有用である。
本発明は、ＣＤＶおよび別のウイルス、とりわけ、ＣＤＶおよびＣＰＶなど、別のイヌウイルスに対する二重免疫化のためのベクターにさらに関する。この二重免疫化ベクターは、ベクター骨格、およびトランス遺伝子として挿入されるＣＰＶ  ＶＰ２など、他のイヌ抗原に由来するＣＤＶ抗原を発現させる。
したがって、本発明はまた、好ましくは、ＣＤＶのＰ遺伝子とＭ遺伝子との間に配置され、イヌ科動物パルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質をコードする、目的の異種ＲＮＡ配列を含むイヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）ベクターも提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、ブタにおける、ブタインフルエンザウイルスまたはブタ伝染性下痢ウイルスに対する免疫応答を誘導するためのベクターを想定し、したがって、本発明の文脈ではまた、ブタインフルエンザウイルスのＨ３亜型ヘマグルチニン、またはブタ伝染性下痢ウイルスのスパイクタンパク質をコードする、異種ＲＮＡ配列を伴う発現カセットを含む、パラミクソウイルス科ウイルスベクターも提供される。
本発明は、このようなベクターを含む哺乳動物宿主細胞、および、このような宿主細胞を使用して、ベクターワクチンを作出する方法のほか、本発明のＣＤＶベクターを含む、免疫原性組成物およびワクチンにさらに関する。
【００１０】
発明の詳細な説明
本発明は、先行技術に固有の問題を解決し、先端技術において、顕著に異なる進歩をもたらす。
本発明は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるデータにより、本明細書で提示される教示に従い創出されたＣＤＶ組換体（すなわち、ＣＤＶベクター）であって、ＣＰＶの２ｂ遺伝子型または２ｃ遺伝子型に由来するＶＰ２タンパク質をコードするＣＤＶ組換体についての探索を示す。ウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞内の産生時に、良好な増殖動態を示し、ローラーボトル内の感染の６日間後に、ピーク力価に達した。組換体は、免疫蛍光法およびウェスタンブロットにより決定される通り、トランス遺伝子（ＶＰ２）の強い発現特徴を示し、この特徴は、組換体を、ＣＤＶ−ＣＰＶ二重ワクチン候補物質として適格とする。加えて、このようなウイルスを、Ｖｅｒｏ細胞上の、２０代の細胞継代にわたり、遺伝子の安定性についても調べた。いずれのウイルスも、遺伝的安定性を、完全に維持したことから、ワクチンのためのバイオプロセシングに対して受容性であることが指し示される。
本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏ結果により、本発明に従うＣＤＶベクターが、イノシシ科動物宿主、標的リンパ細胞において複製されることをさらに裏付ける。多様な臓器について、サンプリングし、調べることにより、ウイルスは、ワクチン接種された動物の、リンパ節、脾臓、または扁桃腺において検出された。重要なことは、全ての歩哨動物が、研究の終了時まで、血清陰性を維持したことであり、ここから、ワクチン接種時に、組換えＣＤＶウイルスが、動物から動物に伝播しなかったことが指し示される。
【００１１】
有効性に関して、ＣＤＶ−ＶＰ２をワクチン接種された、全ての動物は、イヌパルボウイルス２に対してセロコンバージョンを示した（ＣＰＶウイルス中和試験により測定される）。中和抗体力価の、特定の増大は、２回目のワクチン接種の後で検出された（図６を参照されたい）。２回目の免疫化の２１日後における中和抗体のレベルは、文献に従い、実際の宿主（イヌ科イヌ属動物）における防御的力価範囲を表す、１：４０〜１：４００のレベルに到達した（Glover et al. 2012; Taguchi et al. 2011）。
さらに、ブタインフルエンザウイルスのＨ３亜型ヘマグルチニン（Ｈ３）をコードする、本発明に従うＣＤＶベクターの使用は、このような受動的に存在する母体免疫の存在にもかかわらず、Ｈ３Ｎ２母体由来抗体陽性（Ｈ３Ｎ２−ＭＤＡ陽性）子ブタにおける、能動免疫の発生をもたらす。
さらに、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）のスパイクタンパク質をコードする、本発明に従うＣＤＶベクターを、雌ブタに、鼻腔内投与したところ、次いで、抗体陽性初乳の摂取を介して、ＰＥＤＶによる抗原投与の後における、臨床徴候、致死性、およびウイルス排出の発生率または重症度の低減により見られる、子ブタの受動免疫化が結果としてもたらされた。
【００１２】
一般に、本発明は、第１の遺伝子（１）が発現カセットの３’方向に配置され、第２の遺伝子（２）が発現カセットの５’方向に配置されるような、パラミクソウイルス科ウイルスの２つの隣接する必須遺伝子（１；２）の間の挿入のための、本明細書の後出ではまた、「本発明の発現カセット」とも称される発現カセットであって、
・目的のヌクレオチド配列である第１のヌクレオチド配列、および
・第１のヌクレオチド配列の５’末端に隣接する第２のヌクレオチド配列であって、前記第２のヌクレオチド配列が遺伝子の５’非コード領域であり、前記遺伝子が、第１の遺伝子（１）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第２のヌクレオチド配列、および
・第１のヌクレオチド配列の３’末端に隣接する第３のヌクレオチド配列であって、前記第３のヌクレオチド配列が遺伝子の３’非コード領域であり、前記遺伝子が、第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第３のヌクレオチド配列
を含む発現カセットを提供する。
【００１３】
好ましくは、前記第３のヌクレオチド配列は、
第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’非コード領域、および
前記３’非コード領域の５’末端に隣接する配列であって、前記３’非コード領域の５’末端に隣接する前記配列が、翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列をコードし、前記翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列が、Ｋｏｚａｋ配列であってもよい、配列
からなる。
別の好ましい態様に従い、本発明の発現カセットは、
・前記第１〜第３のヌクレオチド配列、および
・第２のヌクレオチド配列の５’末端に隣接するか、または前記第３のヌクレオチド配列の３’末端に隣接するさらなるヌクレオチド配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列であるさらなるヌクレオチド配列
からなる。
パラミクソウイルス科ウイルスの、前記２つの隣接する遺伝子（１；２）は、好ましくは、パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択され、かつ／または
前記パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子は、
・パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｇ、およびＬ遺伝子である。
【００１４】
例示的な一実施形態に従い、本発明は、パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子とＭ遺伝子との間の挿入のための発現カセットであって、
・第１の遺伝子（１）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ遺伝子からなる群から選択されてもよく、
・第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのＭ遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのＨ、Ｐ、Ｆ、ＬおよびＮ遺伝子からなる群から選択されてもよい
発現カセットを提供する。
【００１５】
好ましくは、前記第２のヌクレオチド配列は、発現カセットの３’方向に配置され、第１の遺伝子（１）の５’非コード領域を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子から選択される遺伝子の５’非コード領域であり、かつ／または
前記第３のヌクレオチド配列は、発現カセットの５’方向に配置され、第２の遺伝子（２）の３’非コード領域を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子の３’非コード領域を含むか、もしくはこれからなる。
別の好ましい態様に従い、本発明の発現カセットの、前記第１のヌクレオチド配列は、前記第３のヌクレオチド配列内に組み入れられた遺伝子開始（ＧＳ）配列、および／またはパラミクソウイルス科ウイルスのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている。
本発明の発現カセットの、前記第１〜第３のヌクレオチド配列、および前記さらなるヌクレオチド配列は、したがって、前記第１のヌクレオチド配列が、第１のＲＮＡ配列であり、前記第２のヌクレオチド配列が、第２のＲＮＡ配列であり、前記第３のヌクレオチド配列が、第３のＲＮＡ配列であり、前記さらなるヌクレオチド配列が、さらなるＲＮＡ配列であるように、好ましくは、ＲＮＡ配列である。
【００１６】
一例では、本発明の発現カセットは、
・目的のＲＮＡ配列である、第１のＲＮＡ配列、ならびに
・第１のＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第２のＲＮＡ配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスのＮ遺伝子の５’非コード領域である第２のＲＮＡ配列、ならびに
・第１のＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第３のＲＮＡ配列であって、
・パラミクソウイルス科ウイルスのヘマグルチニン（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ）（Ｈ）遺伝子、パラミクソウイルス科ウイルスのリンタンパク質（Ｐ）遺伝子、パラミクソウイルス科ウイルスの融合タンパク質（Ｆ）遺伝子、パラミクソウイルス科ウイルスの大型ポリメラーゼタンパク質（Ｌ）遺伝子、およびパラミクソウイルス科ウイルスのヌクレオタンパク質（Ｎ）遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’非コード領域、ならびに
・Ｋｏｚａｋ配列をコードする、前記３’非コード領域の５’末端に隣接する配列
からなる第３のＲＮＡ配列、ならびに
・任意に、第２のヌクレオチド配列の５’末端に隣接するか、または前記第３のヌクレオチド配列の３’末端に隣接するさらなるＲＮＡ配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列であるさらなるＲＮＡ配列
を含む。
【００１７】
例示の目的で、本明細書の後出で提示される、例示的な特異的配列との関連で、本明細書で記載されるＲＮＡ配列の配置についての概略表示は、図３に示される。
好ましくは、本発明の発現カセットは、非自然発生であり、かつ／または単離パラミクソウイルス科ウイルスベクターのゲノム内に組み入れられる。
本明細書で言及されるパラミクソウイルス科ウイルスは、特に、モルビリウイルス属のウイルスであり、モルビリウイルス属のウイルスは、好ましくは、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、ネコモルビリウイルス（ＦｅＭＶ）、および小反芻獣疫ウイルス（ＰＰＲＶ）からなる群から選択され、モルビリウイルス属のウイルスは、最も好ましくは、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）である。例えば、ＣＤＶが、パラミクソウイルス科ウイルスとして選ばれる場合、本明細書の後出で記載されるパラミクソウイルス科ウイルスベクターは、特に、ＣＤＶベクターである。
【００１８】
別の態様に従い、本発明は、本発明の発現カセットを含み、本明細書ではまた、「本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクター」とも称されるパラミクソウイルス科ウイルスベクターである、パラミクソウイルス科ウイルスベクターにさらに関する。本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターは、好ましくは、単離パラミクソウイルス科ウイルスベクターである。
好ましい一態様では、本発明は、
・前記５’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのＮ遺伝子の５’非コード領域であり、かつ／もしくは
・前記３’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのＨ遺伝子の３’非コード領域であり、
かつ／または前記発現カセットが、パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子とＭ遺伝子との間に挿入される、
前記パラミクソウイルス科ウイルスベクター、または本発明の発現カセットに関する。
【００１９】
したがって、本発明はまた、第１の遺伝子（１）が、挿入されたＲＮＡ配列の３’方向に配置され、第２の遺伝子（２）が５’方向に配置されるような、パラミクソウイルス科ウイルスの２つの隣接する必須遺伝子（１；２）の間に挿入されたＲＮＡ配列を含むパラミクソウイルス科ウイルスベクターであって、
・前記挿入されたＲＮＡ配列が、第１のＲＮＡ配列を含むか、またはこれからなり、前記第１のＲＮＡ配列が、目的のヌクレオチド配列であり、
・前記挿入されたＲＮＡ配列が、第１のＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第２のＲＮＡ配列を含むか、またはこれからなり、前記第２のＲＮＡ配列が、遺伝子の５’非コード領域であり、前記遺伝子が、第１の遺伝子（１）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択され、
・前記挿入されたＲＮＡ配列が、第１のＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第３のＲＮＡ配列を含むか、またはこれからなり、前記第３のＲＮＡ配列が、遺伝子の３’非コード領域を含むか、またはこれからなり、前記遺伝子が、第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、
パラミクソウイルス科ウイルスベクターにも関する。
好ましくは、前記第１のＲＮＡ配列は、前記第３のヌクレオチド配列内に組み入れられた遺伝子開始（ＧＳ）配列、および／またはパラミクソウイルス科ウイルスのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている。
【００２０】
特定の好ましい態様に従い、パラミクソウイルス科ウイルスの、前記２つの隣接する遺伝子（１；２）は、パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択され、
かつ／または前記パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子は、
・パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｇ、およびＬ遺伝子である。
さらに好ましい態様に従い、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターの前記第３のＲＮＡ配列は、
第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’非コード領域、および
前記３’非コード領域の５’末端に隣接する配列であって、前記３’非コード領域の５’末端に隣接する前記配列が、翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列をコードし、前記翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列が、Ｋｏｚａｋ配列であってもよい、配列
からなる。
【００２１】
前記パラミクソウイルス科ウイルスの２つの隣接する必須遺伝子（１；２）が、パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子およびＭ遺伝子である一例では、
・第１の遺伝子（１）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ遺伝子からなる群から選択されてもよく、
・第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのＭ遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのＨ、Ｐ、Ｆ、ＬおよびＮ遺伝子からなる群から選択されてもよい。
【００２２】
パラミクソウイルス科ウイルスベクターについての本発明の文脈では、好ましくは、
・前記第２のヌクレオチド配列は、遺伝子の５’非コード領域であり、遺伝子は、発現カセットの３’方向に配置されたパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子であって、第１の遺伝子（１）を除外する必須遺伝子から選択され、これは、特に、第１の遺伝子（１）の５’非コード領域のそれぞれが選択されないことを意味し、かつ／または
・前記第３のヌクレオチド配列は、遺伝子の３’非コード領域を含むか、またはこれからなり、遺伝子は、発現カセットの５’方向に配置されたパラミクソウイルス科の必須遺伝子であって、第２の遺伝子（２）を除外する必須遺伝子から選択され、これは、特に、第２の遺伝子（２）の３’非コード領域のそれぞれが選択されないことを意味する。
本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターに関して、
・前記５’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのＮ遺伝子の５’非コード領域であり、かつ／または
・前記３’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのＨ遺伝子の３’非コード領域である
ことがさらに好ましい。
【００２３】
好ましくは、発現カセットまたは本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターは、特に、
・目的のＲＮＡ配列である第１のＲＮＡ配列、ならびに
・第１のＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第２のＲＮＡ配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスのヌクレオタンパク質（Ｎ）遺伝子の５’非コード領域である第２のＲＮＡ配列、ならびに
・第１のＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第３のＲＮＡ配列であって、
パラミクソウイルス科ウイルスのＨ、ＨＮ、ＦまたはＬ遺伝子の３’非コード領域、および
Ｋｏｚａｋ配列をコードする、前記３’非コード領域の５’末端に隣接する配列
からなる第３のＲＮＡ配列
を含む。
【００２４】
別の好ましい態様に従い、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターは、
・第２のＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第４のＲＮＡ配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列である第４のＲＮＡ配列、および／または
・第４のＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第５のＲＮＡ配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列である第５のＲＮＡ配列
をさらに含む。
好ましくは、本発明の発現カセット、または本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターの、前記第３のＲＮＡ配列は、パラミクソウイルス科ウイルスのＨ遺伝子の３’非コード領域を含むか、もしくはこれらからなり、かつ／または前記発現カセットは、好ましくは、パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子とＭ遺伝子との間に挿入される。
【００２５】
特に好ましい態様に従い、本発明はまた、
（Ａ）本発明の発現カセットであって、
・目的の異種または外因性のＲＮＡ配列である、第１のＲＮＡ配列、ならびに
・第１のＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第２のＲＮＡ配列であって、ＣＤＶのＮ遺伝子の５’非コード領域である第２のＲＮＡ配列、ならびに
・第１のＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第３のＲＮＡ配列であって、
パラミクソウイルス科ウイルスのＨ、ＨＮ、Ｆ、またはＬ遺伝子の３’非コード領域、および
Ｋｏｚａｋ配列をコードする、前記３’非コード領域の５’末端に隣接する配列
からなる第３のＲＮＡ配列
を含み、
好ましくは、
・第２のＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第４のＲＮＡ配列であって、ＣＤＶの遺伝子間配列である第４のＲＮＡ配列、または
・第３のＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第５のＲＮＡ配列であって、ＣＤＶの遺伝子間配列である第５のＲＮＡ配列
をさらに含む発現カセット
にも関し、
（Ｂ）本発明はまた、それぞれ、（Ａ）の発現カセットを含む、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターにも関し、この場合、このベクターは、本明細書では「本発明のＣＤＶベクター」とも称される。
【００２６】
好ましくは、本発明の発現カセット、または本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターの、前記第１の核酸配列は、前記第３のヌクレオチド配列内に組み入れられた遺伝子開始（ＧＳ）配列、および／またはパラミクソウイルス科ウイルスのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている。
【００２７】
本発明の発現カセット、または本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターの文脈では、前記パラミクソウイルス科ウイルスは、好ましくは、ＣＤＶであり、前記ＣＤＶの遺伝子の５’非コード領域は、
好ましくは、配列番号１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＮ遺伝子の５’非コード領域、
好ましくは、配列番号２の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＰ遺伝子の５’非コード領域、
好ましくは、配列番号３の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＭ遺伝子の５’非コード領域、
好ましくは、配列番号４の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＦ遺伝子の５’非コード領域、
好ましくは、配列番号５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＨ遺伝子の５’非コード領域、および、
好ましくは、配列番号６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＬ遺伝子の５’非コード領域
からなる群から選択される。
【００２８】
本発明の発現カセット、または本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターの文脈の中では、前記パラミクソウイルス科ウイルスは、好ましくは、ＣＤＶであり、前記ＣＤＶの遺伝子の３’非コード領域は、
好ましくは、配列番号７の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＨ遺伝子の３’非コード領域、
好ましくは、配列番号８の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＮ遺伝子の３’非コード領域、
好ましくは、配列番号９の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＰ遺伝子の３’非コード領域、
好ましくは、配列番号１０の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＭ遺伝子の３’非コード領域、
好ましくは、配列番号１１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＦ遺伝子の３’非コード領域、および
好ましくは、配列番号１２の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＬ遺伝子の３’非コード領域
からなる群から選択される。
【００２９】
好ましくは、本発明の発現カセット、または本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターの、前記第２のヌクレオチド配列、または前記第２のＲＮＡ配列は、ＣＤＶのＮ遺伝子の５’非コード領域であり、ＣＤＶのＮ遺伝子の前記５’非コード領域は、好ましくは、配列番号１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む。
本発明の発現カセット、または本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターに関して、好ましくは
・前記第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’非コード領域は、ＣＤＶのＨ遺伝子の３’非コード領域であり、ＣＤＶのＨ遺伝子の前記３’非コード領域が、好ましくは、配列番号７の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含み、かつ／または
・前記３’非コード領域配列の５’末端に隣接する前記配列は、５〜８ヌクレオチドの長さであるＫｏｚａｋ配列をコードし、Ｋｏｚａｋ配列は、好ましくは、配列番号１３の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含む。
【００３０】
好ましくは、本発明の発現カセット、または本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターの前記遺伝子間配列は、ＣＤＶの遺伝子間配列であり、ＣＤＶの前記遺伝子間配列は、好ましくは、配列番号１４の配列と少なくとも６６％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む。
好ましくは、本発明の発現カセット、または本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターの文脈において、本明細書で記載される、前記目的のヌクレオチド配列は、目的の遺伝子もしくは抗原をコードする配列であり、かつ／または前記目的のヌクレオチド配列は、好ましくは、非自然発生のヌクレオチド配列および／もしくは組換えヌクレオチド配列である。
【００３１】
特に、前記目的のヌクレオチド配列は、好ましくは、組換えヌクレオチド配列、および／または異種ヌクレオチド配列、および／または外因性ヌクレオチド配列である。
前記目的のヌクレオチド配列は、好ましくは、疾患原因物質に由来する抗原をコードし、疾患原因物質は、好ましくは、イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および／または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物に感染することが可能であり、あるいはイノシシ科動物またはウシなどの食料生産動物に感染することが可能な疾患原因物質である。
本発明の好ましい一態様に従い、パラミクソウイルス科ウイルスは、第１の生物科の動物に感染することが可能な、パラミクソウイルス科ウイルスであり、目的のヌクレオチド配列は、前記第１の生物科の動物に感染することが可能な、疾患原因物質に由来する抗原をコードし、前記疾患原因物質は、好ましくは、前記パラミクソウイルス科ウイルスと異なる。
【００３２】
前記第１の生物科の前記動物は、好ましくは、イヌ科の動物、ネコ科の動物、およびイノシシ科の動物からなる群から選択され、前記第１の生物科の前記動物は、最も好ましくは、イヌ、ネコ、またはブタなど、イヌ科動物、ネコ科動物、またはイノシシ科動物である。
任意に、第１の生物科の動物に感染することが可能な、前記パラミクソウイルス科ウイルスは、ＣＤＶであり、前記第１の生物科の動物に感染することが可能な、前記疾患原因物質が、イヌ科動物パルボウイルス（ＣＰＶ）であるか、または
任意に、第１の生物科の動物に感染することが可能な、前記パラミクソウイルス科ウイルスは、ＬＰＭＶ（Ｌａ  Ｐｉｅｄａｄ  Ｍｉｃｈｏａｃａｎ  Ｍｅｘｉｃｏ  ｖｉｒｕｓ）ウイルスであり、前記第１の生物科の動物に感染することが可能な、前記疾患原因物質は、ブタインフルエンザウイルス（ＳｗＩＶ）である。
別の好ましい選択肢として、第１の生物科の動物に感染することが可能な、前記パラミクソウイルス科ウイルスは、ＬＰＭＶ（Ｌａ  Ｐｉｅｄａｄ  Ｍｉｃｈｏａｃａｎ  Ｍｅｘｉｃｏ  ｖｉｒｕｓ）ウイルスであり、前記第１の生物科の動物に感染することが可能な、前記疾患原因物質は、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である。
【００３３】
特に好ましい態様に従い、前記目的のヌクレオチド配列は、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、またはブタインフルエンザウイルス（ＳｗＩＶ）に由来する抗原をコードする。
別の好ましい選択肢として、前記目的のヌクレオチド配列は、好ましくは、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）に由来する抗原をコードする。
好ましくは、
・前記目的のヌクレオチド配列は、プロトパルボウイルスカプシドタンパク質をコードし、前記プロトパルボウイルスカプシドタンパク質は、好ましくは、肉食動物プロトパルボウイルス１（ＣＰＶまたはＦＰＶ）カプシドタンパク質、霊長動物プロトパルボウイルス１カプシドタンパク質、齧歯動物プロトパルボウイルス１カプシドタンパク質、齧歯動物プロトパルボウイルス２カプシドタンパク質、有蹄動物パルボウイルス１（ＰＰＶ）カプシドタンパク質からなる群から選択されるか、または
・前記目的のヌクレオチド配列は、インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質をコードし、前記エンベロープタンパク質は、ヘマグルチニンであってもよく、かつ／または前記インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルスからなる群から選択されてもよく、Ａ型インフルエンザウイルスは、好ましくは、インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ３、およびＨ９１１の群から選択される。
【００３４】
別の好ましい選択肢として、前記目的のヌクレオチド配列は、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質をコードし、前記コロナウイルスＳタンパク質は、好ましくは、アルパカコロナウイルスＳタンパク質、アルファコロナウイルス１  Ｓタンパク質、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ  Ｓタンパク質、ヒトコロナウイルスＮＬ６３  Ｓタンパク質、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）Ｓタンパク質、ヒトコロナウイルスＯＣ４３  Ｓタンパク質、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１  Ｓタンパク質、マウスコロナウイルスＳタンパク質、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）Ｓタンパク質、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）Ｓタンパク質、およびトリ感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）Ｓタンパク質からなる群から選択される。
特に、
前記目的のヌクレオチド配列は、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質をコードし、前記ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質が、好ましくは、配列番号３５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなるか；または
前記目的のヌクレオチド配列は、Ｈ３亜型ヘマグルチニン（Ｈ３）、特に、ブタインフルエンザウイルスのＨ３をコードし、前記Ｈ３が、好ましくは、配列番号３６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなる。
【００３５】
別の好ましい選択肢として、前記目的のヌクレオチド配列は、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）スパイク（Ｓ）タンパク質をコードし、前記ＰＥＤＶ  Ｓタンパク質が、好ましくは、配列番号４５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなる。
より好ましくは、
・前記目的のヌクレオチド配列は、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質をコードし、ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする前記配列は、特に、配列番号１５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含むか；または
・前記目的のヌクレオチド配列は、Ｈ３亜型ヘマグルチニン（Ｈ３）、好ましくは、ブタインフルエンザウイルスのＨ３をコードし、Ｈ３をコードする前記配列が、好ましくは、配列番号１６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含む。
【００３６】
別の好ましい選択肢として、前記目的のヌクレオチド配列は、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）スパイク（Ｓ）タンパク質をコードし、ＰＥＤＶ  Ｓタンパク質をコードする前記配列が、好ましくは、配列番号３７または配列番号３８の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含む。
本発明に従う、別の好ましい態様に従い、前記発現カセットは、
・配列番号１７もしくは配列番号１８の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列を有するポリヌクレオチド、または
・配列番号１９もしくは配列番号２０の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列を有するポリヌクレオチド
からなるか、あるいは前記パラミクソウイルス科ウイルスベクターはこれを含む。
【００３７】
別の好ましい選択肢として、前記発現カセットは、配列番号３９もしくは配列番号４０の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列を有するポリヌクレオチドからなるか、あるいは前記パラミクソウイルス科ウイルスベクターはこれを含む。
好ましくは、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターは、
・配列番号２１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列；または
・配列番号２２の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列
を含む。
別の好ましい選択肢として、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターは、配列番号４１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列を含む。
【００３８】
別の好ましい態様に従い、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターは、
・第４のＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第６のＲＮＡ配列であって、配列番号２３の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含む第６のＲＮＡ配列、および／または
・第５のＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第７のＲＮＡ配列であって、配列番号２４の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含む第７のＲＮＡ配列
をさらに含む。
【００３９】
本発明は、本明細書でまた、「ＣＤＶ−ＣＰＶ二重免疫化のためのベクター」とも称される、イヌジステンパーウイルスベクターであって、好ましくは、ＣＤＶのＰ遺伝子とＭ遺伝子との間に配置され、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質をコードし、ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする前記配列が、配列番号１５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含んでもよく、
好ましくは、前記異種ＲＮＡ配列の３’方向に配置された遺伝子開始（ＧＳ）配列であって、最も好ましくは、ＣＤＶのＨ遺伝子の、外因性３’非コード領域内に組み入れられたＧＳ配列、および／またはＣＤＶのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている、
目的の異種ＲＮＡ配列を含むベクターをさらに提供する。
別の好ましい選択肢として、前記目的の異種ＲＮＡ配列は、好ましくは、配列番号３５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする。
【００４０】
特に、ＣＤＶ−ＣＰＶ二重免疫化のためのベクター内の前記目的の異種ＲＮＡ配列は、
・好ましくは、ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする、前記目的の異種ＲＮＡ配列の３’末端に隣接する、ＣＤＶのＨ遺伝子の外因性３’非コード領域、特に、その中に組み入れられたＧＳ配列、および／または
・ＣＤＶのゲノムプロモーター
に作動可能に連結されている。
本発明は、本発明の発現カセット、または本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターをコードする核酸分子であって、好ましくはＤＮＡ分子であり、好ましくは単離核酸分子である核酸分子をさらに提供する。
加えて、本発明は、本明細書の後出ではまた、「本発明のＤＮＡ分子」とも称されるＤＮＡ分子であって、
（ｉ）目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、
（ｉｉ）（ｉ）の配列の３’末端に隣接し、配列番号２５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）の配列の５’末端に隣接し、配列番号２６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列、および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の配列の５’末端に隣接し、配列番号２７の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列
を含む分子を提供する。
【００４１】
本発明のＤＮＡ分子は、好ましくは、
（ｖ）（ｉｉ）の配列の５’末端に隣接し、配列番号２８の配列と少なくとも６６％同一であるＤＮＡ配列、および／または
（ｖｉ）（ｉｖ）の配列の３’末端に隣接し、配列番号２８の配列と少なくとも６６％同一であるＤＮＡ配列
をさらに含む。
好ましくは、本発明のＤＮＡ分子は、単離ＤＮＡ分子である。
別の好ましい態様に従い、本発明のＤＮＡ分子は、
（ｖｉｉ）（ｖ）の配列の３’末端に隣接する配列番号２９の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＤＮＡ配列、および／または
（ｖｉｉｉ）（ｖｉ）の配列の５’末端に隣接する配列番号３０の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列
をさらに含む。
【００４２】
好ましくは、
・（ｉ）の配列は、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、前記配列は、好ましくは、配列番号３１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＤＮＡ配列であるか、または
・（ｉ）の配列は、Ｈ３亜型ヘマグルチニン（Ｈ３）、好ましくは、ブタインフルエンザウイルスのＨ３をコードするＤＮＡ配列であり、前記配列は、好ましくは、配列番号３２の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列である。
別の好ましい選択肢として、（ｉ）の配列は、ＰＥＤＶ  Ｓタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、前記配列は、好ましくは、配列番号４２または配列番号４３の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列である。
【００４３】
別の好ましい態様に従い、本発明のＤＮＡ分子は、
・配列番号３３の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列、または
・配列番号３４の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列
を含む。
別の好ましい選択肢として、本発明のＤＮＡ分子は、配列番号４４の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列を含む。
本発明は、
・本発明の発現カセット、
・本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクター、もしくは本明細書で記載される、ＣＤＶ−ＣＰＶ二重免疫化のためのベクター、または
・本発明のＤＮＡ分子
を含有し、好ましくは、単離哺乳動物宿主細胞である、哺乳動物宿主細胞をさらに提供する。
【００４４】
本発明はまた、医薬、好ましくは、ワクチンとしての使用のための、
・本発明の発現カセット、
・本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクター、または
・本発明のＤＮＡ分子
も提供する。
加えて、本発明の文脈では、本発明のＤＮＡ分子を含み、特に、プラスミドなどのＤＮＡベクターであるＤＮＡ構築物が提供される。本発明のＤＮＡ分子が挿入されうる、ＤＮＡベクターまたはプラスミドは、当業者により認知されているであろう。本明細書で記載されるＤＮＡ構築物は、好ましくは、単離ＤＮＡ構築物である。本明細書で使用される「ＤＮＡ分子を含むこと」という用語は、特に、「ＤＮＡ分子の配列を含むこと」という用語と同義であることが理解される。
さらに、本発明は、本明細書で記載されるＤＮＡ構築物のＲＮＡ転写物であって、好ましくは、単離ＲＮＡ転写物であるＲＮＡ転写物を提供する。
【００４５】
本発明はまた、本明細書で記載されるＤＮＡ構築物をトランスフェクトされた細胞であって、好ましくは、単離細胞である細胞も提供する。
さらに、本発明は、本明細書で言及されるＲＮＡ転写物をトランスフェクトされた細胞であって、好ましくは、単離細胞である細胞を提供する。
好ましくは、細胞または哺乳動物宿主細胞は、それぞれ、Ｖｅｒｏ細胞である。
さらに、本発明の文脈では、異種遺伝子を含有する感染性パラミクソウイルス科ウイルスを調製するための方法、特に、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターを調製するための方法であって、
ａ．異種ＲＮＡポリメラーゼを発現させる宿主細胞を用意するステップ；
ｂ．宿主細胞に、本明細書で記載されるＤＮＡ構築物をトランスフェクトし、ＤＮＡ構築物内に含まれた本発明のＤＮＡ分子が、異種ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるステップ、および
ｃ．細胞により産生されるウイルスを単離するステップ
を含む方法が提供される。
【００４６】
パラミクソウイルス科ウイルスは、マイナス鎖ＲＮＡゲノムを有するので、トランスフェクト細胞内の、ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、またはパラミクソウイルス科ウイルスによりコードされるＲＮＡポリメラーゼの存在が要請される。最も好ましいのは、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼの使用である。トランスフェクト細胞内の、ＲＮＡポリメラーゼの存在は、例えば、ＲＮＡポリメラーゼをコードし、発現させるプラスミドの共トランスフェクションにより、または細胞に、ＲＮＡポリメラーゼタンパク質を浸透させることによりもたらすことができる。本発明に従い、この点で、Ｔ７ポリメラーゼを発現させるＢＨＫ−２１細胞、またはＢＳＲ−Ｔ７／５細胞への、ＤＮＡ構築物のトランスフェクションなど、ＲＮＡポリメラーゼを産生するトランスジェニック細胞の使用が、特に好ましい。代替的に、細胞にはまた、ＲＮＡポリメラーゼをコードし、宿主細胞にトランスフェクトされると、ＲＮＡポリメラーゼに翻訳されるｍＲＮＡもトランスフェクトすることができる。
別の態様に従い、本発明は、免疫原性組成物またはワクチンの製造のための、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクター、または本明細書で記載される細胞の使用をさらに提供する。
【００４７】
さらに別の態様では、本発明はまた、本明細書の後出ではまた、「本発明の免疫原性組成物」とも称される免疫原性組成物であって、
ａ．感染性ウイルスおよび／もしくは弱毒化ウイルスであってもよく、または弱毒化ウイルスおよび／もしくは改変生ウイルスであってもよい、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクター、ならびに
ｂ．前記ベクターにより発現される組換えタンパク質、および／または前記ベクターにより発現される複数の組換えタンパク質を含むウイルス様粒子、ならびに
ｃ．任意に、薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤
を含み、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適する、免疫原性組成物も提供する。
好ましくは、ベクターにより発現される前記組換えタンパク質は、
・ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質など、パルボウイルスＶＰ２抗原であるか、または
・インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質であり、前記エンベロープタンパク質が、Ｈ３などのヘマグルチニンであってもよい。
【００４８】
特に、本明細書で使用される「前記ベクターにより発現される」または「ベクターにより発現される」という語句は、それぞれ、特に、「ベクターを感染させた細胞内で発現される」または「前記ベクターを感染させた細胞内で発現される」のそれぞれと同義であることが理解される。
別の好ましい態様に従い、
ａ．本発明の免疫原性組成物は、ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする、上記で言及されたベクターのうちのいずれかを含むか、またはこれからなり、前記ベクターが、好ましくは、ＣＤＶベクター、特に、本発明のＣＤＶベクター、または本明細書で記載される、ＣＤＶ−ＣＰＶ二重免疫化のためのベクターであり、
ｂ．本発明の免疫原性組成物は、好ましくは、配列番号３５の配列または配列番号３６と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドを含むか、またはこれからなり、前記ポリペプチドが、好ましくは、前記ベクターにより発現される組換えタンパク質であり、
ｃ．本発明の免疫原性組成物は、薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤を含むか、またはこれからなってもよく、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適する。
【００４９】
別の好ましい選択肢として、前記ベクターにより発現される前記組換えタンパク質は、コロナウイルスＳタンパク質であり、前記コロナウイルスＳタンパク質は、特に、好ましくは、配列番号４５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるＰＥＤＶ  Ｓタンパク質であってもよい。
本発明はまた、本明細書の後出ではまた、「本発明のワクチンまたは医薬組成物」とも称される、ワクチンまたは医薬組成物であって、
ａ．本発明の文脈において、本明細書で記載されるベクターのうちのいずれか、ならびに
ｂ．前記ベクターにより発現される組換えタンパク質、および／または前記ベクターにより発現される複数の組換えタンパク質を含むウイルス様粒子、ならびに
ｃ．薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤
を含み、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適し、
ｄ．前記ワクチンが、アジュバントをさらに含んでもよく、
ベクターにより発現される前記組換えタンパク質が、好ましくは、
・ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質など、パルボウイルスＶＰ２抗原であるか、または
・インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質であり、前記エンベロープタンパク質が、Ｈ３などのヘマグルチニンであってもよい、
ワクチンまたは医薬組成物も提供する。
【００５０】
好ましくは、
ａ．本発明のワクチンまたは医薬組成物は、ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする、上記で言及されたベクターのうちのいずれかまたはインフルエンザウイルスのヘマグルチニンを含むか、またはこれからなり、前記ベクターは、好ましくは、ＣＤＶベクター、特に、本発明のＣＤＶベクター、または本明細書で記載される、ＣＤＶ−ＣＰＶ二重免疫化のためのベクターであり、
ｂ．本発明のワクチンまたは医薬組成物は、好ましくは、配列番号３５の配列または配列番号３６と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドを含むか、またはこれからなり、前記ポリペプチドが、好ましくは、前記ベクターにより発現される組換えタンパク質であり、
ｃ．本発明のワクチンまたは医薬組成物は、薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤を含むか、またはこれからなり、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適し、
ｄ．本発明のワクチンまたは医薬組成物は、アジュバントを含むか、またはこれからなってもよい。
【００５１】
別の好ましい選択肢として、本発明のワクチンまたは医薬組成物中に組み入れられた、前記ベクターにより発現される前記組換えタンパク質は、コロナウイルスＳタンパク質であり、前記コロナウイルスＳタンパク質は、特に、好ましくは、配列番号４５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるＰＥＤＶ  Ｓタンパク質であってもよい。
【００５２】
本発明は、感染と関連するか、またはこれにより引き起こされる、１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を軽減するための免疫原性組成物またはワクチンを調製するための方法であって、
ａ．哺乳動物宿主細胞に、本発明の文脈において、本明細書で記載されるベクターのうちのいずれかを感染させるステップ、
ｂ．感染細胞を、適切な条件下で培養するステップ、
ｃ．感染細胞培養物を回収するステップ、
ｄ．任意に、ステップｃ）の、回収された感染細胞培養物を精製するステップ、
ｅ．任意に、前記回収された感染細胞培養物を、薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含み、
免疫原性組成物またはワクチンが、好ましくは、
・ＣＤＶおよびＣＰＶの感染、または
・Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルスからなる群から選択されてもよく、Ａ型インフルエンザウイルスが、好ましくは、インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ３、およびＨ９１１の群から選択されるインフルエンザウイルスの感染
と関連するか、またはこれにより引き起こされる、１つまたは複数の臨床徴候の重症度を軽減する免疫原性組成物またはワクチンである
方法をさらに提供する。
【００５３】
別の好ましい選択肢として、前記免疫原性組成物またはワクチンは、アルパカコロナウイルス、アルファコロナウイルス１、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、マウスコロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）、およびトリ感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）からなる群から選択されてもよいコロナウイルスの感染と関連するか、またはこれにより引き起こされる、１つまたは複数の臨床徴候の重症度を軽減する。
【００５４】
本発明はまた、動物における少なくとも１つの病原体の感染により引き起こされる臨床徴候もしくは疾患を軽減もしくは防止する方法、または動物における少なくとも１つの病原体の感染を処置もしくは防止する方法であって、好ましくは、前記動物が、イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および／または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物、あるいはイノシシ科動物などの食料生産動物であり、
・少なくとも１つの病原体の前記感染が、好ましくは、ＣＤＶおよび／もしくはＣＰＶの感染であり、前記感染が、最も好ましくは、ＣＤＶおよび／もしくはＣＰＶの感染であるか、または
・少なくとも１つの病原体の前記感染が、好ましくは、ブタインフルエンザウイルスの感染であり、ブタインフルエンザウイルスが、Ｈ３亜型のインフルエンザウイルスであってもよく、前記Ｈ３亜型のインフルエンザウイルスが、好ましくは、Ｈ３Ｎ２亜型またはＨ３Ｎ１亜型のブタインフルエンザウイルスである
方法における使用のための、
・本発明の免疫原性組成物、または
・本発明のワクチンまたは医薬組成物
にも関する。
別の好ましい選択肢として、少なくとも１つの病原体の前記感染は、ＰＥＤＶの感染である。
特に、本発明はまた、
動物、好ましくは、イヌ科動物において、ＣＰＶおよびＣＤＶに対する免疫応答を誘導するための方法、または
ブタにおいて、ブタインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための方法であって、ブタインフルエンザウイルスが、Ｈ３亜型のインフルエンザウイルスであってもよく、前記Ｈ３亜型のインフルエンザウイルスが、好ましくは、Ｈ３Ｎ２亜型またはＨ３Ｎ１亜型のブタインフルエンザウイルスである方法
における使用のための、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチン、または本発明の医薬組成物にも関する。
【００５５】
別の好ましい選択肢として、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチン、または本発明の医薬組成物は、ブタ、特に、好ましくは、妊娠した雌ブタにおいて、ＰＥＤＶに対する免疫応答を誘導するための方法における使用のためのものである。
一態様では、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチン、または本発明の医薬組成物は、子ブタが、免疫原性組成物が投与された雌ブタにより授乳され、前記雌ブタが、特に、前記子ブタを妊娠している間に／妊娠したときに、好ましくは、免疫原性組成物が投与された雌ブタである、子ブタにおける、ＰＥＤＶの感染により引き起こされる臨床徴候または疾患を軽減または防止する方法における使用のための、免疫原性組成物もしくはワクチン、または医薬組成物である。
本発明の特定の好ましい態様に従い、このような使用において、本発明の免疫原性組成物もしくはワクチン、または本発明の医薬組成物は、前記雌ブタに投与されるなど、経粘膜投与、好ましくは、鼻腔内投与されるものとする。
【００５６】
加えて、本発明は、イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および／または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物、あるいはイノシシ科動物を含む食料生産動物などの動物を、動物における少なくとも１つの病原体により引き起こされる臨床疾患に対して免疫化する方法であって、動物に、本発明の免疫原性組成物、または本発明のワクチンもしくは医薬組成物を投与するステップを含み、前記免疫原性組成物またはワクチンが、感染の臨床徴候を引き起こさず、動物を、前記少なくとも１つの病原体の病原性形態に対して免疫化する免疫応答を誘導することが可能であり、前記少なくとも１つの病原体が、好ましくは、ＣＤＶもしくはＣＰＶ、またはＳｗＩＶ、あるいは、最も好ましくは、ＣＤＶおよびＣＰＶである方法を提供する。
本発明は、雌ブタにおける、ＰＥＤＶに特異的な抗体の産生を誘導するための方法であって、特に、好ましくは、配列番号４５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるＰＥＤＶ  Ｓタンパク質をコードする、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターを含む、本発明の免疫原性組成物、または本発明のワクチンもしくは医薬組成物を、前記雌ブタに投与するステップを含む方法をさらに提供する。
【００５７】
さらに、本発明は特に、子ブタにおける、ＰＥＤＶの感染により引き起こされる臨床徴候または疾患を軽減または防止する方法であって、
・特に、好ましくは、配列番号４５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるＰＥＤＶ  Ｓタンパク質をコードする、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターを含む、本発明の免疫原性組成物、または本発明のワクチンもしくは医薬組成物を、雌ブタに投与するステップ、および
・前記子ブタが、前記雌ブタにより授乳されることを可能とするステップ
を含む方法を提供する。
好ましくは、前記雌ブタは、特に、前記子ブタを妊娠している雌ブタである。
【００５８】
より好ましくは、このような、子ブタにおける、ＰＥＤＶの感染により引き起こされる臨床徴候または疾患を軽減または防止する方法は、
・特に、好ましくは、配列番号４５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるＰＥＤＶ  Ｓタンパク質をコードする、本発明のパラミクソウイルス科ウイルスベクターを含む、本発明の免疫原性組成物、または本発明のワクチンもしくは医薬組成物を、前記子ブタを妊娠している雌ブタに投与するステップ、
・前記雌ブタが、前記子ブタを出産することを可能とするステップ、および
・前記子ブタが、前記雌ブタにより授乳されることを可能とするステップ
を含む。
好ましくは、本発明の免疫原性組成物、または本発明のワクチンもしくは医薬組成物は、動物に筋内投与されるか、または鼻腔内投与によるなど、経粘膜投与される。
最も好ましくは、このような、子ブタにおける、ＰＥＤＶの感染により引き起こされる臨床徴候または疾患を軽減または防止する方法では、前記免疫原性組成物または前記ワクチンまたは医薬組成物は、前記雌ブタに経粘膜投与され、好ましくは、鼻腔内投与される。
【００５９】
さらに別の好ましい態様に従い、本発明はまた、動物における少なくとも１つの病原体と関連する疾患に対する免疫応答を誘導するか、あるいは動物における少なくとも１つの病原体に対して、動物、好ましくは、イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および／または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物、あるいはイノシシ科動物またはウシなどの食料生産動物にワクチン接種し、かつ／あるいは動物における少なくとも１つの病原体と関連するか、またはこれらにより引き起こされる、１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を軽減するためのキットであって、
ａ）前記動物にワクチンを投与することが可能なシリンジまたは分注器；および
ｂ）本発明の免疫原性組成物、または本発明のワクチンもしくは医薬組成物、および
ｃ）任意に、指示書の小冊子
を含み、
前記少なくとも１つの病原体が、好ましくは、ＣＤＶもしくはＣＰＶ、またはＳｗＩＶもしくはＰＥＤＶであり、前記少なくとも１つの病原体が、最も好ましくは、ＣＤＶおよびＣＰＶである、キットも提供する。
【００６０】
定義
そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。用語の意味および範囲は、明確なはずであるが、万一、なんらかの潜在的な曖昧さが生じた場合、本明細書で提示される定義が、任意の辞書または外部の定義に対して優先される。さらに、文脈により、そうでないことが要請されない限りにおいて、単数形の用語は、複数形を含み、複数形の用語は、単数形を含むものとする。本明細書では、そうでないことが言明されない限りにおいて、「または」の使用は、「および／または」を意味する。さらに、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語のほか、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含まれる」など、他の形態の使用は、限定的ではない。本明細書で参照される、全ての特許および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
本発明の実施は、そうでないことが指し示されない限りにおいて、当技術分野の技術の範囲内にある、ウイルス学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、タンパク質化学、および免疫学の従来の技法を援用するであろう。このような技法は、文献において説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989); DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986); Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)のシリーズ; Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press)；およびHandbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照されたい。
【００６２】
本発明について詳細に記載する前に、そのようなＤＮＡ配列、ポリペプチド配列、または工程パラメータは、当然ながら、変動しうるので、本発明は、特定のＤＮＡ配列、ポリペプチド配列、または工程パラメータに限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語法は、本発明の特定の実施形態について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることが意図されるものではないことも理解されたい。本明細書および付属の特許請求の範囲において使用される通り、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、本明細書で使用される単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」とは、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「ある抗原」に対する言及は、２つまたはこれを超える抗原の混合物を含み、「ある賦形剤」に対する言及は、２つまたはこれを超える賦形剤の混合物を含むなどである。
【００６３】
パラミクソウイルス科についての定義
特に、本明細書で使用される「パラミクソウイルス科ウイルス」という用語は、パラミクソウイルス科のウイルスの文脈で、頻繁に使用される「パラミクソウイルス」という用語と同義であることが理解される。
本明細書で使用される「パラミクソウイルス科ウイルスのＮ遺伝子の５’非コード領域」という用語は、特に、好ましくは、感染性パラミクソウイルス科ウイルスの、発現可能なＮ遺伝子のＲＮＡ配列であって、コード配列の５’末端に隣接し、前記遺伝子の遺伝子（すなわち、終止コドンと相補的なＲＮＡトリプレットの５’末端）配列を含むＲＮＡ配列に関する。したがって、より特定すると、本明細書で言及される「５’非コード領域配列」とは、好ましくは、感染性パラミクソウイルス科ウイルスの発現可能なＮ遺伝子の５’非コード配列の全体と同一なＲＮＡ配列である。さらにより特定すると、本明細書で言及される「５’非コード領域配列」とは、パラミクソウイルス科ウイルスのＮ遺伝子の非コード配列と同一なＲＮＡ配列であり、この場合、前記非コード配列は、（ａ）コード配列と、（ｂ）前記Ｎ遺伝子をＰ遺伝子と接続する遺伝子間配列とにより挟まれる。
【００６４】
本明細書で使用される、パラミクソウイルス科ウイルスの特異的遺伝子（例えば、Ｈ遺伝子）の「３’非コード領域」という用語は、特に、好ましくは、感染性パラミクソウイルス科ウイルスの発現可能な特異的遺伝子（例えば、Ｈ遺伝子）のＲＮＡ配列であって、コード配列の３’末端に隣接し、前記遺伝子の遺伝子（すなわち、開始コドンと相補的なＲＮＡトリプレットの３’末端）配列を含むＲＮＡ配列に関する。したがって、より特定すると、本明細書で言及される「３’非コード領域配列」とは、好ましくは、感染性パラミクソウイルス科ウイルスの発現可能な特異的遺伝子（例えば、Ｈ遺伝子）の３’非コード配列の全体と同一なＲＮＡ配列である。さらにより特定すると、本明細書で言及される「３’非コード領域配列」とは、パラミクソウイルス科ウイルスの特異的遺伝子（例えば、Ｈ遺伝子）の非コード配列と同一なＲＮＡ配列であり、この場合、前記非コード配列は、（ａ）コード配列と、（ｂ）前記遺伝子を３’方向の次の遺伝子と接続する遺伝子間配列とにより挟まれる。
本明細書で使用される「遺伝子間領域」という用語は、特に、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子の５’末端を、パラミクソウイルス科ウイルスの５’方向において、隣接する遺伝子の３’始点と接続するＲＮＡ配列を指す。
【００６５】
本明細書で使用される「遺伝子開始配列」という用語は、特に、「遺伝子開始シグナル」という用語と同義である。
それぞれ、本明細書で使用される「パラミクソウイルス科ウイルスのゲノムプロモーター」という用語は、「パラミクソウイルス科ウイルスのゲノムリーダー配列」という用語と同義であり、「ＣＤＶのゲノムプロモーター」という用語は、「ＣＤＶのゲノムリーダー配列」という用語と同義であることが理解される。
分子生物学についての定義
本明細書で記載される「〜の５’末端に隣接する配列」という語句は、特に、「〜の５’末端と共有結合によって連結された配列」という語句、または「その３’末端ヌクレオチドが、〜の５’末端ヌクレオチドと共有結合によって連結された配列」という語句のそれぞれと同義であり、この場合、特に、前記２つの末端ヌクレオチドが、ペントースの５’炭素に接合させたリン酸基と、隣接するペントースの３’炭素原子との間で、共有結合によって連結されることが理解される。
【００６６】
本明細書で記載される「〜の３’末端に隣接する配列」という語句は、特に、「〜の３’末端と共有結合によって連結された配列」という語句、または「その５’末端ヌクレオチドが、〜の３’末端ヌクレオチドと共有結合によって連結された配列」という語句のそれぞれと同義であり、この場合、特に、前記２つの末端ヌクレオチドが、ペントースの３’炭素原子と、隣接するペントースの５’炭素に接合させたリン酸基との間で、共有結合によって連結されることが理解される。
本発明の文脈で使用される「Ｋｏｚａｋ配列」という用語は、特に、リボソームによる翻訳開始部位の認識に参与する、ｍＲＮＡ配列をコードするヌクレオチド配列に関することが理解される。好ましくは、本発明の文脈における、Ｋｏｚａｋ配列をコードするＲＮＡ配列とは、開始コドン（ＡＵＧ）の５’末端に隣接するＲＮＡ分子の配列に転写される可能性があり、翻訳過程の開始において役割を果たすＲＮＡ配列である。
【００６７】
当技術分野で公知の「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチド構築物、典型的に、宿主細胞に遺伝物質を伝達するのに使用される、プラスミドまたは細菌人工染色体を指す。ベクターは、例えば、細菌、ウイルス、ファージ、細菌人工染色体、コスミド、またはプラスミドでありうる。本明細書で使用されるベクターは、ＤＮＡから構成される場合もあり、ＲＮＡから構成される場合もある。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡから構成される。一部の実施形態では、ベクターは、感染性ウイルスである。このようなウイルスベクターは、それが、細胞培養物中でも、宿主動物においても、ウイルスベクターの複製において機能を果たさない外来遺伝子を有する形で操作されたウイルスゲノムを含有する。本開示の具体的態様に従い、ベクターは、遺伝子素材の単なる伝染、宿主細胞または生物へのトランスフェクション、ワクチン、例えば、ＤＮＡワクチンとしての使用、または遺伝子発現の目的など、多様な態様に使用されうる。遺伝子発現とは、遺伝子と呼ばれる特異的ポリヌクレオチド配列により方向付けられる、細胞内のタンパク質の生合成について記載する用語である。具体的態様では、ベクターは、それが、適切な環境内に存在する場合に、ベクターにより保有される、１つまたは複数の遺伝子によりコードされるタンパク質の発現を方向付けることが可能なベクターである、「発現ベクター」でありうる。
【００６８】
ベクター、ならびに発現のためにベクター（または組換え体）を作る方法および／またはこれらを使用する方法は、とりわけ、米国特許第４，６０３，１１２号、同第４，７６９，３３０号、同第５，１７４，９９３号、同第５，５０５，９４１号、同第５，３３８，６８３号、同第５，４９４，８０７号、同第４，７２２，８４８号、同第５，９４２，２３５号、同第５，３６４，７７３号、同第５，７６２，９３８号、同第５，７７０，２１２号、同第５，９４２，２３５号、米国出願第３８２，４２５号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１６７１６号、同第ＷＯ９６／３９４９１号、同第ＷＯ９５／３００１８号；Paoletti, “Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, “PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996;  Moss, “Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety,” PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Ｓｍｉｔｈら、米国特許第４，７４５，０５１号（組換えバキュロウイルス）；Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, “Baculovirus Expression Protocols” (1995 Humana Press Inc.); Smith et al., “Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector”, Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165; Pennock et al., “Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, “Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406;欧州特許出願第３７０５７３号；１９８６年１０月１６日に出願された、米国出願第９２０，１９７号；欧州特許出願第２６５７８５号；米国特許第４，７６９，３３１号（組換えヘルペスウイルス）；Roizman, “The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors,” PNAS USA 93:11307-11312, October 1996; Andreansky et al., “The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors,” PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996; Robertson et al., “Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes”, PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996; Frolov et al., “Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications,” PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996; Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991;米国特許第５，５９１，４３９号、同第５，５５２，１４３号；ＷＯ９８／００１６６；いずれも、１９９６年７月３日に出願され、許可された、米国出願第０８／６７５，５５６号および同第０８／６７５，５６６号（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992, “Adenovirus as cloning vectors,” Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993; Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990; Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434；ＰＣＴ  ＷＯ９１／１１５２５；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；およびMcClements et al., “Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease”, PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996；ならびに米国特許第５，５９１，６３９号、同第５，５８９，４６６号、および同第５，５８０，８５９号のほか、ＷＯ９０／１１０９２、ＷＯ９３／１９１８３、ＷＯ９４／２１７９７、ＷＯ９５／１１３０７、ＷＯ９５／２０６６０；Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectorsに開示されている方法によりなされる場合もあり、これらと類似の方法によりなされる場合もある。また、ＷＯ９８／３３５１０；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998（レンチウイルス発現系）；Ｓａｎｆｏｒｄら、米国特許第４，９４５，０５０号；Ｆｉｓｃｈｂａｃｈら（Ｉｎｔｒａｃｅｌ）；ＷＯ９０／０１５４３；Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997)（ＤＮＡベクター系）；Ｓｚｏｋａら、米国特許第４，３９４，４４８号（ＤＮＡを生細胞に導入する方法）；ＭｃＣｏｒｍｉｃｋら、米国特許第５，６７７，１７８号（細胞変性ウイルスの使用）；および米国特許第５，９２８，９１３号（遺伝子送達のためのベクター）のほか、本明細書で引用される他の文献も参照されたい。
【００６９】
「ウイルスベクター」という用語は、宿主細胞へのその侵入が、特異的生物学的活性、例えば、ベクターにより保有されるトランス遺伝子の発現を結果としてもたらすように、組換えＤＮＡ法により操作された遺伝子改変ウイルスについて記載する。具体的態様では、トランス遺伝子は、抗原である。ウイルスベクターは、標的の細胞、組織、または生物において、複製コンピテントの場合もあり、そうでない場合もある。特に、本明細書で使用される「ウイルスベクター」という用語は、「ウイルスベクター」という用語と同義であることが理解される。
【００７０】
ウイルスベクターの作出は、当技術分野で周知である、任意の適切な遺伝子操作法であって、限定せずに述べると、例えば、Sambrook et al.（Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)）またはK. Maramorosch and H. Koprowski（Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014)）において記載されている、制限エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＤＮＡシーケンシング、細胞培養物中のトランスフェクションの標準的技法を含む遺伝子操作法を使用して達することができる。
ウイルスベクターは、任意の公知の生物のゲノムに由来する配列を組み込みうる。配列は、それらの天然形態で組み込むこともでき、所望の活性を得るように、任意の形で修飾することもできる。例えば、配列は、挿入、欠失、または置換を含みうる。
【００７１】
ウイルスベクターは、２つまたはこれを超える、目的のタンパク質のコード領域を含みうる。例えば、ウイルスベクターは、第１の目的のタンパク質のコード領域、および第２の目的のタンパク質のコード領域を含みうる。第１の目的のタンパク質と、第２の目的のタンパク質とは、同じ場合もあり、異なる場合もある。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、第３の目的のタンパク質のコード領域、および第４の目的のタンパク質のコード領域を含みうる。第３の目的のタンパク質と、第４の目的のタンパク質とは、同じ場合もあり、異なる場合もある。１つのウイルスベクターによりコードされる、２つまたはこれを超える、目的のタンパク質の全長は変動しうる。例えば、２つまたはこれを超えるタンパク質の全長は、少なくとも約２００アミノ酸．少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、またはこれより長い長さでありうる。
【００７２】
「ウイルスベクター」および「ウイルス構築物」という用語は、互換的に使用されうる。
本明細書で使用される「構築物」という用語は、プラスミド、ＢＡＣ、または組換えウイルスなど、人工的に作出された組換え核酸を指す。
「プラスミド」という用語は、細菌宿主細胞内の細菌染色体と独立に複製される、細胞質ＤＮＡを指す。本発明の具体的態様では、「プラスミド」および／または「導入プラスミド」という用語は、例えば、ウイルスベクターへの挿入のための発現カセットの構築に有用な、組換えＤＮＡ技術の要素を指す。別の具体的態様では、「プラスミド」という用語は、ＤＮＡワクチン接種の目的に有用なプラスミドを指定するのに使用されうる。
本明細書で使用される「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、互換的であり、任意の核酸を指す。「核酸配列」という用語は、「ヌクレオチド配列」という用語と同義であることが理解される。「ヌクレオチド配列」という用語は、「ポリヌクレオチド配列」という用語と同義であることが理解される。
本明細書で使用される「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「ＲＮＡ配列」、または「ＤＮＡ配列」という用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、ならびにこれらの断片および部分を指し、一本鎖の場合もあり、二本鎖の場合もあり、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す、ゲノムまたは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡを指す。配列は、非コード配列の場合もあり、コード配列の場合もあり、両方の混合物の場合もある。本発明の核酸配列は、当業者に周知の標準的技法を使用して調製することができる。
【００７３】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語はまた具体的に、５つの生物学的に発生する塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシン、およびウラシル）以外の塩基から構成される核酸も含む。
本明細書で使用される「プロモーター」または「プロモーター配列」という用語は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を可能とし、遺伝子の転写を方向付けるヌクレオチド配列を意味する。典型的に、プロモーターは、遺伝子の転写開始部位に対して近位である、遺伝子の５’非コード領域内に配置される。転写の開始において機能する、プロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列により特徴づけられることが多い。プロモーターの例は、細菌、酵母、植物、ウイルス、および哺乳動物（ウマ、ブタ、ウシ、およびヒトを含む）、鳥類、または昆虫などの動物に由来するプロモーターを含むがこれらに限定されない。プロモーターは、誘導的プロモーターの場合もあり、抑制的プロモーターの場合もあり、かつ／または構成的プロモーターの場合もある。誘導的プロモーターは、温度の変化など、培養条件の何らかの変化に応答して、それらの制御下における、ＤＮＡからの転写レベルの上昇を誘発する（Ptashne, 2014）。当業者に周知のプロモーターの例は、例えば、ＳＶ４０大型Ｔプロモーター、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶの即初期遺伝子１プロモーター、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイルス多角体プロモーターである。
【００７４】
「相補的なヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡなど、ポリヌクレオチドの２つの対合鎖のうちの一方の鎖について記載する。各アデノシンに対して、相補鎖のヌクレオチド配列は、チミン（または、ＲＮＡの場合は、ウラシル）を含有し、各グアニンに対して、シトシンを含有し、この逆も成り立つように、相補鎖のヌクレオチド配列は、その対合鎖のヌクレオチド配列の鏡像をなす。例えば、５’−ＧＣＡＴＡＣ−３’の、相補的なヌクレオチド配列は、３’−ＣＧＴＡＴＧ−５’であるか、または、ＲＮＡの場合は、３’−ＣＧＵＡＵＧ−５’である。
【００７５】
本明細書で使用される「遺伝子」、「目的の遺伝子」という用語は、同じ意味を有し、目的の産物をコードする、任意の長さのポリヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、コード配列に先行する調節的配列（５’非コード配列または非翻訳配列）、およびコード配列に後続する調節的配列（３’非コード配列または非翻訳配列）をさらに含みうる。選択される配列は、全長遺伝子の場合もあり、切断型遺伝子の場合もあり、融合遺伝子の場合もあり、タグ付け遺伝子遺伝子の場合もあり、ｃＤＮＡ遺伝子の場合もあり、ゲノムＤＮＡ遺伝子の場合もあり、ＤＮＡ断片遺伝子の場合もある。ポリペプチドまたはＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡは、成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からスプライシングされ、したがって同じポリペプチドまたはＲＮＡをコードするｃＤＮＡ内には存在しない非コード領域（すなわち、イントロン）を含みうることが、一般に理解される。遺伝子は、天然配列、すなわち、自然発生形態の場合もあり、突然変異形態の場合もあり、異なる供給源に由来するか、または他の形で、所望の通りに修飾された配列を含む場合もある。これらの改変は、選択された宿主細胞内のコドン使用を最適化するコドン最適化、またはタグ付けを含む。さらに、遺伝子は、少数を挙げれば、（クリプティック）スプライスドナー、アクセプター部位、および分岐点、ポリアデニル化シグナル、ＴＡＴＡボックス、カイ部位、リボソーム侵入部位、リピート配列、二次構造（例えば、ステムループ）、転写因子または他の調節因子に対する結合部位、制限酵素部位などであるがこれらに限定されない例などの、シス作用型部位の除去または付加を含みうる。選択される配列は、分泌型ポリペプチド、細胞質内ポリペプチド、核内ポリペプチド、膜結合型ポリペプチド、または細胞表面ポリペプチドをコードしうる。
【００７６】
本明細書で使用される、１つまたは複数の「必須遺伝子」は、それぞれ、特に、宿主細胞内の複製に不可欠である遺伝子を包摂することが意図される。
本明細書で使用される「目的のヌクレオチド配列」という用語は、必ずしも、遺伝子を含まず、遺伝子または他の遺伝情報のエレメントまたは一部、例えば、ｏｒｉ（複製起点）を含みうるので、目的の遺伝子より一般的な用語である。目的のヌクレオチド配列は、コード配列を含むのかどうかに依存しない、任意のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列でありうる。
「転写」という用語は、細胞内の、ｍＲＮＡの生合成について記載する。
本明細書で使用される「発現」という用語は、宿主細胞内の核酸配列の転写および／または翻訳を指す。本発明の具体的態様に従い、「発現」という用語は、宿主細胞内の異種核酸配列および／または外因性核酸配列の転写および／または翻訳を指す。宿主細胞内の所望の産物の発現のレベルは、細胞内に存在する、対応するＲＮＡまたはｍＲＮＡの量、または選択された配列によりコードされる所望のポリペプチドの量に基づき決定されうる。例えば、選択された配列から転写されるｍＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼに対するＲＮＡ保護、細胞内ＲＮＡに対するｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、またはＲＴ  ｑＰＣＲ（逆転写に続く、定量的ＰＣＲ）により定量されうる。選択された配列から発現されるタンパク質は、多様な方法により、例えば、ＥＬＩＳＡにより、ウェスタンブロット法により、ラジオイムノアッセイにより、免疫沈降により、タンパク質の生物学的活性についてアッセイすることにより、またはタンパク質の免疫染色に続くＦＡＣＳ解析により定量されうる。
【００７７】
「発現カセット」または「転写単位」または「発現単位」という用語は、転写される、１つまたは複数の遺伝子を含有する、ベクター内、構築物内、またはポリヌクレオチド配列内の領域を規定し、この場合、転写される遺伝子をコードするヌクレオチド配列のほか、発現カセット内に含有される調節エレメントを含有するポリヌクレオチド配列は、互いに、作動可能に連結されている。「発現カセット」または「転写単位」または「発現単位」は、プロモーターから転写され、転写は、少なくとも１つのポリアデニル化シグナルにより終結させられる。具体的一態様では、「発現カセット」または「転写単位」または「発現単位」は、単一のプロモーターから転写される。結果として、異なる遺伝子が、少なくとも転写において連結される。１つを超えるタンパク質または産物が、各転写単位から、転写および発現されうる（マルチシストロニックの転写単位）。各転写単位は、単位内に含有される、選択される配列のうちのいずれかの転写および翻訳に必要な調節エレメントを含むであろう。さらに、各転写単位は、同じ調節エレメントを含有する場合もあり、異なる調節エレメントを含有する場合もある。例えば、各転写単位は、転写単位内の遺伝子の機能的な連結に使用されうる、同じターミネーター、ＩＲＥＳエレメント、またはイントロンを含有しうる。ベクターまたはポリヌクレオチド配列は、１つを超える転写単位を含有しうる。
【００７８】
「ウイルス力価」という用語は、ウイルス調製物の容量当たりの感染単位の尺度である。ウイルス力価は、生物学的手順におけるエンドポイントであり、並行的に実行される、ある特定の比率の試験が作用を示す場合の希釈率として規定される（Reed and Muench, 1938）。具体的に、１ミリリットル当たりの組織培養物感染５０％用量（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）は、この希釈率と並行して接種される細胞培養物の数の５０％が感染するときの、ウイルス調製物の希釈率を与える。
「転写調節エレメント」は、通常、発現される遺伝子配列、転写開始部位および転写終結部位、ならびにポリアデニル化シグナルの上流におけるプロモーターを含む。
「転写開始部位」という用語は、一次転写物、すなわち、ｍＲＮＡ前駆体に組み込まれる第１の核酸に対応する、構築物中の核酸を指す。転写開始部位は、プロモーター配列と重複しうる。
【００７９】
「終結シグナル」または「ターミネーター」または「ポリアデニル化シグナル」または「ポリＡ」または「転写終結部位」または「転写終結エレメント」とは、真核ｍＲＮＡ  ３’末端の特異的部位における切断、および切断された３’末端における、約１００〜２００アデニンヌクレオチド配列（ポリＡｔａｉｌ）の、転写後組込みを引き起こし、したがって、ＲＮＡポリメラーゼに、転写を終結させるシグナル配列である。ポリアデニル化シグナルは、切断部位の約１０〜３０ヌクレオチド上流における、配列ＡＡＴＡＡＡと、下流に配置される配列とを含む。ｔｋポリＡ、ＳＶ４０後期ポリＡおよびＳＶ４０早期ポリＡ、ＢＧＨポリＡ（例えば、米国特許第５，１２２，４５８号において記載されている）、またはハムスター成長ホルモンポリＡ（ＷＯ２０１００１０１０７）など、多様なポリアデニル化エレメントが公知である。
「翻訳調節エレメント」は、発現される各個別のポリペプチドのための、翻訳開始部位（ＡＵＧ）、終止コドン、およびポリＡシグナルを含む。一部の構築物には、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）が含まれうる。発現を最適化するために、発現される核酸配列の５’非翻訳領域および／または３’非翻訳領域を除去、添加、または変更して、転写または翻訳のレベルで、発現に干渉する場合もあり、これを低減する場合もある、任意の、潜在的に余剰で不適切な、代替的翻訳開始コドンまたは他の配列を消失させることが推奨されうる。コンセンサスのリボソーム結合部位（Ｋｏｚａｋ配列）を、開始コドンのすぐ上流に挿入して、翻訳を増強し、したがって、発現を増強することができる。このリボソーム結合部位近傍のＡ／Ｕ含量の増大は、より効率的なリボソーム結合を推し進める。
【００８０】
定義により、宿主細胞内に挿入される、あらゆるポリヌクレオチド配列、またはあらゆる遺伝子、およびこれによりコードされる、それぞれのタンパク質またはＲＮＡは、それが、異なる（ウイルス）種に由来する場合、宿主細胞に関して、「外因性」、「外因性配列」、「外因性遺伝子」、「外因性コード配列」と称される。本明細書で、抗原など、目的の配列または遺伝子との関連で使用される「外因性」という用語は、前記目的の配列または遺伝子、具体的に、前記抗原が、その天然の種文脈の外部で発現されることを意味する。したがって、ＣＰＶ  ＶＰ２抗原は、パラミクソウイルス科ウイルスベクターとの関連における、外因性抗原の１例（実施例２を参照されたい）である。本明細書で使用される「外因性ＲＮＡ」または「外因性核酸配列」という用語は、特に、組換え配列に由来するなど、外部の供給源に由来するパラミクソウイルス科ウイルスのゲノムに導入された核酸配列を指す。このような外部の供給源の例は、パラミクソウイルス科ウイルス配列のほか、パラミクソウイルス科ウイルスに由来しない配列を含む。より特定すると、外因性核酸配列の導入は、それぞれ、非自然発生部分を有する、ゲノムまたは遺伝子を結果としてもたらす。したがって、本明細書で使用される「外因性ＲＮＡ」という用語は、特に、パラミクソウイルス科ウイルスゲノム内では、天然で見出されないヌクレオチド配列を指す。このような非自然発生部分、または天然で見出されない配列のそれぞれはまた、１つの自然発生のヌクレオチド配列の、別の自然発生のヌクレオチド配列への挿入の結果でもありうる。
【００８１】
定義により、宿主細胞内に挿入される、あらゆるポリヌクレオチド配列、またはあらゆる遺伝子、およびこれによりコードされる、それぞれのタンパク質またはＲＮＡは、宿主細胞に関して、「異種」、「異種配列」、「異種遺伝子」、「異種コード配列」、「トランス遺伝子」、または「異種タンパク質」と称される。これは、導入される配列または導入される遺伝子が、宿主細胞の内因性配列または内因性遺伝子と同一であってもなおあてはまる。例えば、パラミクソウイルス科ウイルスベクターに、パラミクソウイルス科野生型ウイルスとは異なる部位または修飾された形態で導入された、パラミクソウイルス科ウイルスのＮ遺伝子の５’非コード領域は、定義により、異種配列である。本明細書で、抗原など、目的の配列または遺伝子との関連で使用される「異種」という用語は、前記目的の配列または遺伝子、具体的に、前記抗原が、その天然の亜種文脈の外部で発現されることを意味する。
【００８２】
「非自然発生の」という用語は、ハイブリッド配列など、この文脈では、自然発生しない抗原など、任意の目的の配列または遺伝子、または異なる種に由来する抗原など、目的の配列もしくは遺伝子、または人工の突然変異、挿入、欠失などに起因して、天然の産物でない抗原など、目的の配列または遺伝子を意味する。
「組換え」という用語は、本発明についての本明細書を通して、「非自然発生の」、「異種」、および「外因性」という用語と互換的に使用される。したがって、「組換え」タンパク質は、異種ポリヌクレオチド配列または外因性ポリヌクレオチド配列から発現されるタンパク質である。ウイルスに関して使用される組換えという用語は、ウイルスゲノムの人工操作により作製されるウイルスを意味する。外因性抗原をコードする配列など、異種配列または外因性配列を含むウイルスは、組換えウイルスである。組換えウイルスという用語と、非自然発生のウイルスという用語とは、互換的に使用される。
したがって、「異種ベクター」という用語は、異種ポリヌクレオチド配列または外因性ポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。「組換えベクター」という用語は、異種ポリヌクレオチド配列または組換えポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。
【００８３】
本明細書で使用される「作動可能に連結されている」という用語は、調節エレメントと、遺伝子またはそのコード領域との接続について記載するように使用される。典型的に、遺伝子の発現は、１または複数の調節エレメント、例えば、限定せずに述べると、構成的プロモーターまたは誘導的プロモーター、組織特異的調節エレメント、およびエンハンサーの制御下に置かれる。遺伝子またはコード領域は、調節エレメント「に作動可能に連結されている」か、またはこれ「に作動的に連結されている」か、またはこれ「と作動可能に会合している」といい、遺伝子またはコード領域が、調節エレメントに制御されるか、またはこの影響を受けることを意味する。例えば、プロモーターが、コード配列の転写または発現をもたらす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。
特に、本発明の文脈では、「配列と、・・・同一であること」という用語は、「配列と、・・・の配列同一性を有すること」という用語と同義であることが理解される。
【００８４】
本明細書で使用される通り、特に、「配列番号Ｙの配列と少なくともＸ％同一であること」という用語は、「配列番号Ｙの配列と少なくともＸ％同一であること配列番号Ｙの長さにわたり」という用語、または「配列番号Ｙの配列と少なくともＸ％同一であること配列番号Ｙの全長にわたり」という用語のそれぞれと同義であることが理解される。この文脈で、「Ｘ」とは、「Ｘ％配列同一性」が、本明細書で言及される配列同一性パーセントのうちのいずれかを表すように、６６〜１００の任意の数、特に、６６〜１００から選択される、任意の整数である。それぞれ、この文脈における「Ｙ」とは、「配列番号Ｙ」が、本明細書で言及される配列番号のうちのいずれかを表すように、１〜４５から選択される、任意の整数である。
本明細書で記載される「少なくとも９９％同一であること」という用語はまた（範囲の１つの端点において）、「１００％同一であること」または「配列と同一であること」という用語のそれぞれも含み、これらにも関することがさらに理解される。
【００８５】
当技術分野で公知の「配列同一性」とは、２つもしくはこれを超えるポリペプチド配列、または２つもしくはこれを超えるポリヌクレオチド配列の間の関係、すなわち、基準配列と、基準配列と比較される所与の配列との関係を指す。配列同一性は、このような配列の連なりの間のマッチにより決定される、最高度の配列類似性をもたらすように、配列を、最適な形でアライメントした後で、所与の配列を、基準配列と比較することにより決定される。このようなアライメントがなされたら、配列同一性は、位置対位置ベースで確認される、例えば、配列は、特定の位置において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であれば、その位置において「同一」である。次いで、このような位置同一性の総数を、基準配列内のヌクレオチドまたは残基の総数で除して、配列同一性％をもたらす。配列同一性は、それらの教示が参照により本明細書に組み込まれる、Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987); Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)；およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載されている方法を含むがこれらに限定されない公知の方法により、たやすく計算されうる。配列同一性を決定するのに好ましい方法は、被験配列の間で、最大のマッチをもたらすようにデザインされる。配列同一性を決定する方法は、所与の配列の間の配列同一性を決定する、公開のコンピュータプログラムにコード化されている。このようなプログラムの例は、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)）を含むがこれらに限定されない。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他の供給元から公開されている（それらの教示が参照により本明細書に組み込まれる、BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894、Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)）。これらのプログラムは、所与の配列と、基準配列との、最高のレベルの配列同一性をもたらすために、デフォルトのギャップ重みを使用して、配列を、最適な形でアライメントする。例示として述べると、基準ヌクレオチド配列に対する、少なくとも、例えば、８５％、好ましくは、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、なおより好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにより、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、所与のポリヌクレオチド配列が、基準ヌクレオチド配列の、各１００ヌクレオチド当たり、最大で１５、好ましくは、最大で１０、なおより好ましくは、最大で５カ所の点突然変異を含みうることを除き、基準配列と同一であることが意図される。言い換えれば、基準ヌクレオチド配列と比べて、少なくとも８５％、好ましくは、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、なおより好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド内では、基準配列内のヌクレオチドのうちの、最大で１５％、好ましくは、１０％、９％、８％、７％、６％、なおより好ましくは、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％を、欠失させるか、または別のヌクレオチドで置換することもでき、基準配列内の全ヌクレオチドのうちの、最大で１５％、好ましくは、１０％、９％、８％、７％、６％、なおより好ましくは、５％、４％、３％、２％、１％、０．１％の数のヌクレオチドを、基準配列に挿入することもできる。基準配列のこれらの突然変異は、基準ヌクレオチド配列の、５’末端位または３’末端位に生じる場合もあり、これらの末端位の間の、ある位置であって、基準配列内のヌクレオチド間で、個別に散在するか、または基準配列内の、１つもしくは複数の連続群内に散在する、ある位置に生じる場合もある。同様に、基準アミノ酸配列に対する、少なくとも、例えば、８５％、好ましくは、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、なおより好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の「配列同一性」を有する、所与のアミノ酸配列を有するポリペプチドにより、ポリペプチドの所与のアミノ酸配列は、所与のポリペプチド配列が、基準アミノ酸配列の、各１００アミノ酸当たり、最大で１５、好ましくは、最大で１０、９、８、７、６、なおより好ましくは、最大で５、４、３、２、１カ所のアミノ酸の変更を含みうることを除き、基準配列と同一であることが意図される。言い換えれば、基準アミノ酸配列との、少なくとも８５％、好ましくは、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、なおより好ましくは、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を有する、所与のポリペプチド配列を得るために、基準配列内のアミノ酸残基のうちの、最大で１５％、好ましくは、１０％、９％、８％、７％、６％、なおより好ましくは、５％、４％、３％、２％、１％を、欠失させるか、または別のアミノ酸で置換することもでき、基準配列内のアミノ酸残基の総数のうちの、最大で１５％、好ましくは、１０％、９％、８％、７％、６％、なおより好ましくは、５％、４％、３％、２％、１％の数のアミノ酸を、基準配列に挿入することもできる。基準配列のこれらの変更は、基準アミノ酸配列の、アミノ末端位またはカルボキシ末端位に生じる場合もあり、これらの末端位の間の、ある位置であって、基準配列内の残基間で、個別に散在するか、または基準配列内の、１もしくは複数の連続群内に散在する、ある位置に生じる場合もある。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。しかし、保存的置換は、配列同一性を決定する場合のマッチとしては組み入れられない。
【００８６】
本明細書では、「配列同一性」および「同一性パーセント」という用語は、互換的に使用される。本明細書では、本発明の目的で、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性パーセントを決定するには、最適の比較を目的として、配列をアライメントする（例えば、第２のアミノ酸配列または核酸配列との最適のアライメントのために、第１のアミノ酸または核酸の配列内に、ギャップを導入することができる）ことが規定される。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列内の位置が、第２の配列内の対応する位置と、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占有される場合、分子は、この位置において同一である。２つの配列の間の同一性パーセントとは、配列により共有される同一な位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一な位置の数／位置の総数（すなわち、重複する位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は、同じ長さである。
【００８７】
配列の比較は、比較される２つの配列の全長にわたり実行することもでき、２つの配列の断片にわたり実行することもできる。比較は、比較される２つの配列の全長にわたり実行することが典型的である。しかし、配列同一性は、例えば、２０、５０、１００、またはこれを超える連続アミノ酸残基の領域にわたり実行することもできる。
当業者は、２つの配列の間の相同性を決定するのに、いくつかの、異なるコンピュータプログラムが利用可能である事実を承知しているであろう。例えば、数学的アルゴリズムを使用して、２つの配列の間の、配列の比較および同一性パーセントの決定を達することができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列または核酸配列の間の同一性パーセントは、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、および１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用する、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.accelrys.com/products/gcg/において入手可能である）内のＧＡＰプログラムに組み込まれた、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）によるアルゴリズムを使用して決定される。当業者は、全てのこれらの異なるパラメータは、異なる結果をもたらすが、異なるアルゴリズムを使用しても、２つの配列の、全体的な同一性百分率は、著明に変更されないことを察知するであろう。
【００８８】
本発明のタンパク質配列または核酸配列は、公開されているデータベースに対する検索を実施して、例えば、他のファミリーメンバーまたは類縁の配列を同定するための、「クエリー配列」としても、さらに使用することができる。Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10による、ＢＬＡＳＴＮプログラムおよびＢＬＡＳＴＰプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）を使用して、このような検索を実施することができる。スコア＝５０、ワード長＝３とするＢＬＡＳＴＰプログラムにより、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較を目的として、ギャップ処理されたアライメントを得るためには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402において記載されている、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを活用することができる。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを活用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトのパラメータを使用することができる。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/における、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページを参照されたい。
【００８９】
ワクチンの定義
「免疫原性組成物または免疫学的組成物」とは、少なくとも１つの抗原またはこの免疫原性部分を含み、宿主において、組成物に対する、細胞性免疫応答または抗体媒介性免疫応答である、免疫応答を誘発する組成物を指す。
当技術分野では、本明細書で使用される「抗原」という用語が十分に理解されており、免疫原性である物質、すなわち、免疫原のほか、免疫学的非応答性、またはアネルギー、すなわち、外来物質に対する生体の防御機構による反応の欠如を誘導する物質を含む。本明細書で使用される「抗原」という用語は、全長タンパク質のほか、エピトープを含有するか、またはこれを含む、そのペプチド断片を意味することが意図される。
【００９０】
「食料生産動物」という用語は、イノシシ科動物、ウシ、家禽、魚類など、ヒトによる摂取に使用される動物を意味し、好ましくは、食料生産動物は、イノシシ科動物およびウシを意味し、最も好ましくは、イノシシ科動物を意味する。
【００９１】
本明細書で使用される「免疫原性組成物」とは、例えば、本明細書で記載される免疫応答を誘発するウイルス表面タンパク質など、ポリペプチドまたはタンパク質を指す場合がある。「免疫原性断片」または「免疫原性部分」という用語は、１つまたは複数のエピトープを含み、したがって、本明細書で記載される免疫応答を誘発する、タンパク質またはポリペプチドの断片または切断形態および／もしくは置換形態を指す。一般に、このような切断形態および／もしくは置換形態または断片は、全長タンパク質に由来する、少なくとも６つの連続アミノ酸を含むであろう。このような断片は、当技術分野で周知の、任意の数のエピトープマッピング法を使用して同定することができる。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jerseyを参照されたい。例えば、直鎖状エピトープは、例えば、固体支持体上の、多数のペプチドであって、タンパク質分子の部分に対応するペプチドを、共時的に合成し、ペプチドを支持体に接合させたままで、ペプチドを、抗体と反応させることにより決定することができる。当技術分野では、このような技法が公知であり、例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Geysen et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8:3998-4002; Geysen et al., (1986) Mol. Immunol. 23:709-715において記載されている。同様に、コンフォメーショナルエピトープは、例えば、ｘ腺結晶構造解析および二次元核磁気共鳴など、アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定することにより、たやすく同定される。例えば、Epitope Mapping Protocols, supraを参照されたい。合成抗原、例えば、ポリエピトープ、フランキングエピトープ、および他の組換え由来の抗原または合成由来の抗原もまた、定義内に含まれる。例えば、Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781; Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408; and Gardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998（その教示および内容の全てが、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００９２】
本明細書で使用される「ワクチン」という用語は、動物において、免疫応答を誘導する、少なくとも１つの、免疫学的に活性の成分を含むが、おそらく、活性成分免疫学的活性を増強する、１つまたは複数のさらなる成分を、必ずしも含むわけではない医薬組成物を指す。ワクチンは、加えて、医薬組成物に典型的なさらなる成分を含みうる。区別のために述べると、ワクチンの免疫学的に活性の成分は、それらの元の形態における完全ウイルス粒子、またはいわゆる改変生ワクチン（ＭＬＶ）における弱毒化粒子、もしくはいわゆる死滅ワクチン（ＫＶ）における、適切な方法により不活化させた粒子としての完全ウイルス粒子を含みうる。別の形態では、ワクチンの、免疫学的に活性の成分は、生物の適切なエレメントを含むことが可能であり（サブユニットワクチン）、この場合、これらのエレメントは、全粒子もしくはこのような粒子を含有する増殖培養物を破壊すること、および、任意に、所望の構造をもたらす後続の精製ステップにより、または例えば、細菌、昆虫、哺乳動物、または他の種に基づく、適切な系の使用を介する、適切な操作を含む合成工程に加え、任意に、後続の単離手順および精製手順により、または適切な医薬組成物を使用する、遺伝子素材の直接的組込み（ポリヌクレオチドワクチン接種）を介する、ワクチンを必要とする動物における合成工程の誘導により作出される。ワクチンは、上記で記載したエレメントのうちの、１つ、または、同時に、１つを超えるエレメントを含みうる。本発明の具体的な態様内で使用される「ワクチン」とは、組換えワクチンともまた呼ばれる、生ワクチンまたは生ウイルスを指す。別の具体的態様では、本発明の「ワクチン」は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む、不活化ウイルスまたは死滅ウイルスを指す。したがって、ワクチンは、サブユニットワクチンの場合もあり、死滅（ＫＶ）ワクチンの場合もあり、不活化ワクチンの場合もある。
【００９３】
「感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）」という用語は、培養細胞に感染させるのに、細胞１個当たりどのくらいの数の感染単位、例えば、ＴＣＩＤ５０のウイルス調製物が使用されるのかについて記載する。例えば、０．０１のＭ．Ｏ．Ｉ．は、培養槽の細胞１００個当たり１感染単位が接種されることを意味する。
「ＤＮＡワクチン接種」または「ポリヌクレオチドワクチン接種」という用語は、適切な医薬組成物を使用する、遺伝子素材の直接的接種を意味する。
当技術分野では、多様な物理的不活化法および化学的不活化法が公知である。「不活化させた」という用語は、その免疫原性を保持しながら、このようなウイルスまたは細菌を不活化さまたは死滅させるように、照射される（紫外線（ＵＶ）、Ｘ線、電子ビーム、またはガンマ放射線）か、加熱されるか、または化学的に処理された、かつて毒性または非毒性であった、ウイルスまたは細菌を指す。適切な不活化剤は、ベータ−プロピオラクトン、二元エチレンイミンまたはベータ−エチレンイミンまたはアセチルエチレンイミン、グルタルアルデヒド、オゾン、およびホルマリン（ホルムアルデヒド）を含む。
【００９４】
ホルマリンまたはホルムアルデヒドによる不活化のために、ホルムアルデヒドを、水およびメチルアルコールと混合して、ホルマリンを創出することが典型的である。メチルアルコールの添加は、不活化工程における分解または交差反応を防止する。一実施形態は、約０．１〜１％の３７％ホルムアルデヒド溶液を使用して、ウイルスまたは細菌を不活化させる。素材を不活化させるが、高投与量に由来する副作用が生じないことを確保するように、ホルマリンの量を調整することが、極めて重要である。
より特定すると、ウイルスの文脈における、「不活化させた」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏのそれぞれにおいて、ウイルスが、複製が不可能であることを意味し、細菌の文脈における、「不活化させた」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、細菌が、生殖が不可能であることを意味する。例えば、「不活化させた」という用語は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて繁殖させ、次いで、複製することがもはや可能とならないように、化学的手段または物理的手段を使用して不活化させたウイルスを指す場合がある。別の例では、「不活化させた」という用語は、繁殖させ、次いで、化学的手段または物理的手段を使用して不活化させる結果として、細菌の懸濁液、細菌の断片、またはワクチンの成分として使用されうる、バクテリンなど、細菌の成分をもたらす細菌を指す場合がある。
【００９５】
本明細書で使用される「不活化させた」、「死滅させた」、または「ＫＶ」という用語は、互換的に使用される。
「生ワクチン」という用語は、生存する生物または複製コンピテントウイルスまたはウイルスベクターを含むワクチンを指す。
「医薬組成物」は、それが投与される生物、または生物内もしくは生物表面に生存する生物の生理的機能、例えば、免疫機能を改変することが可能な、１つまたは複数の成分から本質的になる。用語は、抗生剤または駆虫剤のほか、プロセシング特徴、滅菌性、安定性、経口経路、鼻腔内経路、静脈内経路、筋内経路、皮下経路、皮内経路、もしくは他の適切な経路など、腸内経路もしくは非経口経路を介して組成物を投与する実現可能性、投与後の忍容性、または制御放出特性などであるがこれらに限定されない、ある特定の他の目的を達成するのに一般に使用される、他の構成要素を含むがこれらに限定されない。実演だけを目的として示される、このような医薬組成物の非限定的な一例は、以下の通りに調製されうるであろう：感染細胞培養物の細胞培養物上清を、安定化剤（例えば、スペルミジンおよび／またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））と混合し、その後、混合物を、他の方法により凍結乾燥または脱水させる。次いで、ワクチン接種の前に、混合物を、水溶液（例えば、生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ））中で再水和させるか、または非水溶液（例えば、油エマルジョン、アルミニウムベースのアジュバント）中で再溶媒和させた。
【００９６】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な担体または獣医学的に許容可能な担体」とは、任意の溶媒および全ての溶媒、任意の分散媒および全ての分散媒、任意のコーティングおよび全てのコーティング、任意のアジュバントおよび全てのアジュバント、任意の安定化剤および全ての安定化剤、任意の希釈剤および全ての希釈剤、任意の保存剤および全ての保存剤、任意の抗菌剤および全ての抗菌剤ならびに任意の抗真菌剤および全ての抗真菌剤、任意の等張剤および全ての等張剤、任意の吸着遅延剤および全ての吸着遅延剤などを含む。一部の好ましい実施形態では、かつ、とりわけ、凍結乾燥免疫原性組成物を含む実施形態では、本発明における使用のための安定化剤は、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎまたはｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）のための安定化剤を含む。
【００９７】
一部の態様では、本発明の免疫原性組成物は、アジュバントを含有する。本明細書で使用される「アジュバント」とは、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えば、Ｑｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、水中油中水エマルジョンを含みうる。エマルジョンは、特に、ライト液体パラフィン油（欧州薬局方型）；スクアランまたはスクアレンなどのイソプレノイド油；アルケン、特に、イソブテンまたはデケンのオリゴマー化から得られる油；直鎖状アルキル基を含有する酸またはアルコールのエステル、より特定すると、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ（カプリル酸／カプリン酸）エステル、グリセリルトリ（カプリル酸／カプリン酸）エステル、またはプロピレングリコールジオレイン酸エステル；分枝状脂肪酸またはアルコールのエステル、特に、イソステアリン酸エステルに基づく。油を、乳化剤と組み合わせて使用して、エマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは、非イオン性界面活性剤、特に、ソルビタン、マンニド（例えば、無水マンニトールオレイン酸エステル）、グリコール、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびオレイン酸、イソステアリン酸、リノレン酸、またはヒドロキシステアリン酸のエステルであって、エトキシル化されていてもよいエステル、ならびにポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特に、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ製品、とりわけ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｌ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D.  E.  S.). JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995)；およびTodd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)を参照されたい。例示的なアジュバントは、“Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach” edited by M.  Powell and M.  Newman, Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョン、およびこの同じ書物の１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９である。
【００９８】
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、および無水マレイン酸と、アルケニル誘導体とのコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、とりわけ、糖またはポリアルコールのポリアルケニルエーテルで架橋された、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は、カルボマーという用語で公知である（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者はまた、ポリヒドロキシル化化合物で架橋された、このようなアクリルポリマーであって、好ましくは、少なくとも３つのヒドロキシルの、８つ以下の水素原子が、少なくとも２つの炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置きかえられた、少なくとも３つのヒドロキシル基を有するアクリルポリマーについて記載する、米国特許第２，９０９，４６２号も参照することができる。好ましいラジカルは、２〜４個の炭素原子、例えば、ビニル、アリル、および他のエチレン系不飽和基を含有するラジカルである。不飽和ラジカルは、それら自体、メチルなど、他の置換基を含有しうる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）の商標名で販売されている製品が、特に、適切である。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）は、アリルスクロースまたはアリルペンタエリトリトールで架橋されている。これらの中で、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７４Ｐ、ＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９３４Ｐ、およびＣＡＲＢＯＰＯＬ  ９７１Ｐが挙げられうる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１Ｐの使用が、最も好ましい。無水マレイン酸と、アルケニル誘導体とのコポリマーの中には、無水マレイン酸と、エチレンとのコポリマーである、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）がある。これらのポリマーの、水中の溶解は、酸溶液をもたらすが、免疫原性組成物、免疫学的組成物、またはワクチン組成物自体が組み込まれるアジュバント溶液をもたらすために、これは、好ましくは、生理学的ｐＨに中和される。
【００９９】
さらなる、適切なアジュバントは、とりわけ、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ  ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  ＣＡ）、モノホスホリスリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、Ｅ．ｃｏｌｉに由来する易熱性エンテロトキシン（組換えまたは他の形の）、コレラ毒素、ＩＭＳ  １３１４、もしくはムラミルジペプチド、あるいは自然発生のサイトカインもしくは組換えサイトカインまたはこれらの類似体もしくは内因性サイトカイン放出の刺激因子を含むがこれらに限定されない。
アジュバントは、投与１回当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量、好ましくは、投与１回当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量、より好ましくは、投与１回当たり約５００μｇ〜約５ｍｇの量、なおより好ましくは、投与１回当たり約７５０μｇ〜約２．５ｍｇの量で添加することができ、最も好ましくは、投与１回当たり約１ｍｇの量で添加しうることが予測される。代替的に、アジュバントは、最終生成物の容量で、約０．０１％〜５０％の濃度、好ましくは、約２％〜３０％の濃度、より好ましくは、約５％〜２５％の濃度、さらにより好ましくは、約７％〜２２％の濃度であることが可能であり、最も好ましくは、１０％〜２０％の濃度でありうる。
【０１００】
「希釈剤」とは、水、生理食塩液、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを含みうる。等張剤は、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含みうる。安定化剤は、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩を含む。
「単離された」とは、「人為により」、その天然の状態から変更されたことを意味する、すなわち、「単離される」ことが、天然において生じる場合、「単離された」ものは、その元の環境から変化しているか、もしくは取り出されているか、またはこれらの両方である。例えば、この用語が、本明細書で援用される通り、生存する生物において、天然で存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、その天然状態の共存材料から分離された、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いる。
【０１０１】
「弱毒化」とは、病原体の毒力を低減することを意味する。本発明では、「弱毒化」とは、「非毒性」と同義である。本発明では、弱毒化ウイルスとは、標的動物において、感染の臨床徴候を引き起こさず、免疫応答を誘導することが可能であるように、毒力が低減されたウイルスであるが、また、臨床徴候の発生率または重症度が、弱毒化ウイルス、とりわけ、特許請求されるパラミクソウイルス科ウイルスベクターを感染させた動物において、非弱毒化ウイルスまたは病原体を感染させられ、弱毒化ウイルスを施されない、「対照群」の動物と比較して低減されることも意味する。この文脈で、「〜を低減する／低減された」という用語は、上記で規定された対照群と比較して、少なくとも１０％、好ましくは、２５％、なおより好ましくは、５０％、さらにより好ましくは、６０％、なおより好ましくは、７０％、さらにより好ましくは、８０％、なおより好ましくは、９０％の低減を意味し、最も好ましくは、１００％の低減を意味する。したがって、例えば、特許請求される弱毒化ウイルスベクター、とりわけ、特許請求されるパラミクソウイルス科ウイルスベクター（好ましくは、ＣＤＶベクター）などの弱毒化病原体、非毒性病原体は、改変生ワクチン（ＭＬＶ）または改変生免疫原性組成物の作出に適する。
【０１０２】
本明細書における「有効用量」とは、抗原が投与される動物において、臨床症状の軽減をもたらす免疫応答を誘発するか、またはこれを誘発することが可能な抗原の量を意味するがこれらに限定されない。
本明細書で使用される「有効量」という用語は、組成物の文脈では、動物における感染または疾患の事象の発生率を低減するか、または重症度を軽減する、免疫応答を誘導することが可能な、免疫原性組成物の量を意味する。特に、有効量は、投与１回当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を指す。代替的に、治療の文脈では、「有効量」という用語は、疾患もしくは障害、またはこれらの１つもしくは複数の症状の重症度または持続時間を軽減または短縮するか、疾患または障害の進行を防止するか、疾患または障害の退縮を引き起こすか、疾患または障害と関連する、１つまたは複数の症状の再発、発生、発症、または進行を防止するか、あるいは別の治療または治療剤による予防または処置を増強または改善するのに十分な治療の量を指す。
【０１０３】
「免疫応答」または「免疫応答」とは、目的の組成物またはワクチンに対する細胞性免疫応答および／または抗体媒介性免疫応答の発生を意味するがこれらに限定されない。通例、免疫応答または免疫応答は、以下の効果：目的の組成物またはワクチンに含まれる、１つまたは複数の抗原を特異的に方向付けられる、抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生または活性化のうちの１または複数を含むがこれらに限定されない。宿主は、新たな感染への抵抗性が増強され、かつ／または疾患の臨床重症度が軽減されるように、治療的免疫学的（記憶）応答または防御的免疫学的（記憶）応答を提示することが好ましいであろう。このような防御は、症状の数の低減、症状の重症度の軽減、または病原体の感染と関連する症状のうちの１もしくは複数の欠如、ウイルス血の発症の遅延、ウイルス存続の低減、全体的なウイルス負荷の低減、および／またはウイルス排出の低減により裏付けられるであろう。
「疾患に対する防御」、「防御性免疫」、「機能的免疫」、「臨床症状の軽減」、「中和抗体および／またはセロコンバージョンの誘導／産生」、および同様の語句は、疾患または感染に曝露された、非免疫化対象において予測されるより、わずかな有害作用を結果としてもたらす、１つまたは複数の、本発明の治療用組成物またはこの組合せの投与により作り出される、疾患または状態に対する部分的または完全な応答を意味する。すなわち、ワクチン接種された対象では、感染の有害作用の重症度が低下する。ワクチン接種された対象では、感染は、軽減される場合もあり、緩徐化される場合もあり、おそらくは、完全に防止される場合もある。本明細書では、感染の完全な防止が意図される場合、それが具体的に言明される。完全な防止が言明されない場合、用語は、部分的防止を含む。
【０１０４】
「中和抗体」という用語は、その生物学的作用を中和または阻害することにより、感染作用物質、通例、ウイルス、例えば、ＣＤＶまたはＣＰＶが、細胞に感染しないように保つことが可能な抗体に関する。中和は、抗体が、特異的なウイルス抗原に結合する場合に生じ、病原体が、それらの宿主細胞に侵入することを阻止する。一例では、中和抗体は、ウイルスが、その受容体に結合し、その遺伝子素材を、細胞内部に入り込ませることを防止する。
本明細書で互換的に使用される、「抗体」または「免疫グロブリン」という用語は、全抗体、およびこの任意の抗原結合性断片（抗原結合性部分）または単鎖コグネートを含む。「抗体」は、少なくとも１つの重（Ｈ）鎖および１つの軽（Ｌ）鎖を含む。例えば、自然発生のＩｇＧでは、これらの重鎖および軽鎖は、ジスルフィド結合により相互接続され、これらの２つもまた、ジスルフィド結合により相互接続された、２つの対合した重鎖および軽鎖が存在する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書では、ＶHと略記される）と、重鎖定常領域とから構成される。重鎖定常領域は、３つのドメインである、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書では、ＶLと略記される）と、軽鎖定常領域とから構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインである、ＣＬを含む。ＶH領域およびＶL領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）または接合（Ｊ）領域（重鎖内および軽鎖内の、それぞれ、ＪＨまたはＪＬ）と称する、より保存的な領域を散在させた、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称する、超可変性の領域にさらに細分されうる。各ＶHおよびＶLは、アミノ末端から、カルボキシ末端に、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、Ｊで配置された、３つのＣＤＲ、３つのＦＲ、およびＪドメインから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と結合する。抗体の定常領域は、免疫グロブリンの、免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）または古典的補体系の第１成分（Ｃｌｑ）などの体液因子を含む、宿主組織または因子への結合を媒介しうる。
【０１０５】
本明細書における「臨床徴候の発生率および／または重症度の軽減」または「臨床症状の軽減」とは、野生型感染と比較して、群内の感染した対象の数を低減すること、感染の臨床徴候を呈示する対象の数を低減もしくは無化すること、または１つもしくは複数の対象において存在する、任意の臨床徴候の重症度を軽減することを意味するがこれらに限定されない。例えば、本明細書における「臨床徴候の発生率および／または重症度の軽減」または「臨床症状の軽減」とは、病原体の負荷、病原体の排出の任意の低減、病原体の伝染の低減、またはマラリアに症候的な、任意の臨床徴候の軽減を指すものとする。これらの臨床徴候は、本発明の治療用組成物を施される、１つまたは複数の対象において、組成物を施されず、かつ、感染した対象と比較して、少なくとも１０％軽減されることが好ましい。より好ましくは、臨床徴候は、本発明の組成物を施される対象において、少なくとも２０％、好ましくは、少なくとも３０％、より好ましくは、少なくとも４０％軽減され、なおより好ましくは、少なくとも５０％軽減される。
【０１０６】
本明細書における「防御の増大」という用語は、ワクチン接種対象群における、感染作用物質による感染と関連する、１つまたは複数の臨床症状の、ワクチン接種されていない対照の対象群と対比した、統計学的に有意な軽減を意味するがこれらに限定されない。「臨床症状の統計学的に有意な軽減」という用語は、感染作用物質による抗原投与の後の、ワクチン接種対象群における、少なくとも１つの臨床症状の発生頻度が、ワクチン接種されていない対照群より、少なくとも１０％、好ましくは、２０％、より好ましくは、３０％、なおより好ましくは、５０％低下し、なおより好ましくは、７０％低下することを意味するがこれらに限定されない。
【０１０７】
「長期持続性防御」とは、少なくとも３週間であるが、より好ましくは、少なくとも３カ月間、さらにより好ましくは、少なくとも６カ月間にわたり存続する「有効性の改善」を指すものとする。家畜の場合、長期持続性防御は、動物が食肉用に市販される、平均年齢まで存続することが最も好ましい。
ウイルスにより誘導される「ウイルス血の低減」という用語は、動物の血流に侵入するウイルスの低減であって、ウイルス血レベル、すなわち、血清１ｍＬ当たりのウイルスＤＮＡコピーもしくはＲＮＡコピーの数、または血清１デシリットル当たりのプラーク形成コロニーの数が、本発明の組成物を施される動物の血清中で、組成物を施されず、感染しうる動物と比較して、少なくとも５０％低減される低減を意味するがこれらに限定されない。より好ましくは、ウイルス血レベルは、本発明の組成物を施される動物において、少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９９．９％、より好ましくは、少なくとも９９．９９％低減され、なおより好ましくは、少なくとも９９．９９９％低減される。
本明細書で使用される「ウイルス血」という用語は、特に、動物、特に、哺乳動物、鳥類、または昆虫の血流中で、ウイルス粒子が、再生され、かつ／または循環する状態として理解される。
【０１０８】
「安全性」とは、ワクチン接種後の、ワクチン接種された動物における有害な帰結であって、ウイルスベースのワクチンの、毒性への、潜在的な復帰、遷延性で全身性の疾病、またはワクチン投与部位における、許容不可能な炎症など、臨床的に重大な副作用を含むがこれらに限定されない帰結の非存在を指す。
本明細書で使用される「ワクチン接種」または「ワクチン接種すること」という用語、またはこれらの変化形は、動物に投与されると、前記動物において、免疫応答を誘発する（直接的に、または間接的に）か、またはこれを誘発することが可能な、本発明の免疫原性組成物の投与を含む工程を意味するがこれらに限定されない。
本発明の文脈における「死亡率」とは、感染により引き起こされる死亡を指し、感染が、極めて重度であるため、動物を安楽死させて、苦痛を防止し、その生涯に人道的な終わりをもたらす状況を含む。
【０１０９】
製剤
組成物が投与される対象は、好ましくは、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えば、ニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウス、およびラットを含むがこれらに限定されない動物であり、最も好ましくは、哺乳動物は、イノシシ科動物である。
本発明の製剤は、有効免疫化量の、１つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容される媒体を含む。媒体は、有効免疫化量の、１つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容される媒体を含む。製剤は、投与方式に適するものとする。
免疫原性組成物は、所望の場合、少量の保湿剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤もまた含有する。免疫原性組成物は、溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸剤、カプセル、持続放出製剤、または粉剤でありうる。経口製剤は、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的担体を含みうる。
【０１１０】
処置法
好ましい投与経路は、鼻腔内経路、経口経路、皮内経路、および筋内経路を含むがこれらに限定されない。最も好ましくは、単回投与の飲用水中の投与が、所望である。当業者は、本発明の組成物はまた、１、２回、またはこれを超える投与によっても投与されうるほか、他の投与経路によっても投与されうることを認識するであろう。例えば、このような他の経路は、皮下経路、皮内経路、腹腔内経路、皮内経路を含み、所望される処置の持続時間および有効性に応じて、本発明に従う組成物は、１回または数回にわたり投与される場合もあり、また、間欠的に、例えば、数日間、数週間、または数カ月間にわたり、毎日のベースで投与される場合もあり、約１０3〜１０ＴＣＩＤ５０（上記のウイルス力価を参照されたい）など、異なる投与量で投与される場合もある。本発明の具体的態様では、投与量は、とりわけ、生ウイルス／生ワクチンについて、約１０3〜１０8ＴＣＩＤ５０である。
組成物は、所望の場合、有効成分を含有する、１つまたは複数の単位剤形を含有しうる、パックまたは分注器により提示されうる。パックは、例えば、金属ホイルまたはブリスターパックなど、プラスチックホイルを含みうる。パックまたは分注器は、投与、好ましくは、哺乳動物、とりわけ、ブタへの投与のための指示書を伴いうる。このような容器には、医薬または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する政府機関により規定された形態における注意書きであって、ヒト投与のための製造、使用、または販売についての機関による承認を反映する注意書きが付随しうる。
【０１１１】
配列の概観
以下の配列は、本明細書で詳述および開示される、本発明における配列であり、配列表内の配列は、左から右に、５’末端から３’末端の方向で提示される：
配列番号１（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＮ遺伝子の５’非コード領域に対応し、
配列番号２（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＰ遺伝子の５’非コード領域に対応し、
配列番号３（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＭ遺伝子の５’非コード領域に対応し、
配列番号４（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＦ遺伝子の５’非コード領域に対応し、
配列番号５（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＨ遺伝子の５’非コード領域に対応し、
配列番号６（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＬ遺伝子の５’非コード領域に対応し、
配列番号７（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＨ遺伝子の３’非コード領域に対応し、
配列番号８（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＮ遺伝子の３’非コード領域に対応し、
配列番号９（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＰ遺伝子の３’非コード領域に対応し、
配列番号１０（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＭ遺伝子の３’非コード領域に対応し、
配列番号１１（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＦ遺伝子の３’非コード領域に対応し、
【０１１２】
配列番号１２（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＬ遺伝子の３’非コード領域に対応し、
配列番号１３（ＲＮＡ）は、Ｋｏｚａｋ配列をコードする配列に対応し、
配列番号１４（ＲＮＡ）は、ＣＤＶの遺伝子間配列に対応し、
配列番号１５（ＲＮＡ）は、ＣＰＶのＶＰ２タンパク質をコードする配列に対応し、
配列番号１６（ＲＮＡ）は、Ｈ３亜型ヘマグルチニンをコードする配列に対応し、
配列番号１７（ＲＮＡ）は、配列番号１４、１、１５、１３、および７の組合せに対応し、
配列番号１８（ＲＮＡ）は、配列番号１、１５、１３、７、および１４の組合せに対応し、
配列番号１９（ＲＮＡ）は、配列番号１４、１、１６、１３、および７の組合せに対応し、
配列番号２０（ＲＮＡ）は、配列番号１、１６、１３、７、および１４の組合せに対応し、
配列番号２１（ＲＮＡ）は、配列番号１４、１、１５、１３、７、および１４の組合せに対応し、
配列番号２２（ＲＮＡ）は、配列番号１４、１、１６、１３、７、および１４の組合せに対応し、
【０１１３】
配列番号２３（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＭ、Ｆ、ＨおよびＬ遺伝子を含む配列に対応し、
配列番号２４（ＲＮＡ）は、ＣＤＶのＮおよびＰ遺伝子を含む配列に対応し、
配列番号２５は、配列番号１のＤＮＡ逆相補体に対応し、
配列番号２６は、配列番号１３のＤＮＡ逆相補体に対応し、
配列番号２７は、配列番号７のＤＮＡ逆相補体に対応し、
配列番号２８は、配列番号１４のＤＮＡ逆相補体に対応し、
配列番号２９は、配列番号２３のＤＮＡ逆相補体に対応し、
配列番号３０は、配列番号２４のＤＮＡ逆相補体に対応し、
配列番号３１は、配列番号１５のＤＮＡ逆相補体に対応し、
配列番号３２は、配列番号１６のＤＮＡ逆相補体に対応し、
配列番号３３は、配列番号２１のＤＮＡ逆相補体に対応し、
配列番号３４は、配列番号２２のＤＮＡ逆相補体に対応し、
配列番号３５は、ＣＰＶ  ＶＰ２のアミノ酸配列に対応し、
配列番号３６は、Ｈ３亜型ヘマグルチニンのアミノ酸配列に対応し、
配列番号３７（ＲＮＡ）は、ＰＥＤＶ  Ｓタンパク質をコードする配列に対応し、
配列番号３８（ＲＮＡ）は、ＰＥＤＶ  Ｓタンパク質をコードする配列に対応し、
配列番号３９（ＲＮＡ）は、配列番号１４、１、３８、１３、および７の組合せに対応し、
配列番号４０（ＲＮＡ）は、配列番号１、３８、１３、７、および１４の組合せに対応し、
配列番号４１（ＲＮＡ）は、配列番号１４、１、３８、１３、７、および１４の組合せに対応し、
配列番号４２は、配列番号３７のＤＮＡ逆相補体に対応し、
配列番号４３は、配列番号３８のＤＮＡ逆相補体に対応し、
配列番号４４は、配列番号４１のＤＮＡ逆相補体に対応し、
配列番号４５は、ＰＥＤＶ  Ｓタンパク質のアミノ酸配列に対応する。
【０１１４】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明のある特定の態様をさらに裏付けるために組み入れられる。これらの図面のうちの１つまたは複数を、本明細書に提示される具体的な実施形態についての詳細な記載と組み合わせて参照することにより、本発明をよりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】イヌパルボウイルスＶＰ２トランス遺伝子を保有する、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）ベクターゲノムの構成についての概略的例示を示す図である。
【図２】外因性ＲＮＡ配列の配置を伴う、ＣＤＶ組換えベクターの作出（レスキュー）のための、ＤＮＡ構築物（プラスミド）のマップを示す図であり、図中、それぞれのプラスミドＤＮＡ配列は、「Ｈ遺伝子開始ＵＴＲ」、「Ｋｏｚａｋ配列」、「ＣＰＶ−ＶＰ２」、および「Ｎ遺伝子ＵＴＲ」と名指される。
【図３Ａ−Ｅ】５’末端〜３’末端方向に、左から右に、ＲＮＡ配列の例示的な配置についての概略表示：（Ａ）主要基礎スキーム、（Ｂ）パラミクソウイルス科ウイルスベクター内の配置、（Ｃ）イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２をコードするＣＤＶベクター内の配置を示す図であり、図中、（Ｄ）および（Ｅ）は、配列表の配列番号に表示される配列の、それぞれの配置を例示する。
【図４】上清画分内で測定されるウイルス力価（ＴＣＩＤ50）を示す図である。力価は、感染後１日間〜感染後６日間において、２４時間ごとにサンプリングされる上清中のウイルス増殖を表し、「ＳＤ」＝「研究日」である。
【図５】ＣＤＶ−ＶＰ２組換え体をワクチン接種された動物についての、研究コース中におけるＣＤＶ中和力価を示す図である。ｙ軸は、アッセイにおいてウイルス（Ｌｅｄｅｒｌｅ株に由来するＣＤＶ株）を中和した血清の最大希釈率を指し示す。中和力価（ＶＮＴ［ウイルス中和試験］力価）を、研究０日目（ＳＤ０）における初回のワクチン接種の前、研究２１日目（ＳＤ２１）における、２回目のワクチン接種の前、および研究４２日目（ＳＤ４２）における、２回目のワクチン接種の３週間後に測定した。個々の動物は、キャプション中で指定される。
【図６】ＣＤＶ−ＶＰ２組換え体をワクチン接種された動物による、研究コース中におけるイヌパルボウイルス中和力価を示す図である。ｙ軸は、アッセイにおいてウイルス（ＣＰＶ）を中和した血清の最大希釈率を指し示す。中和力価（ＶＮＴ［ウイルス中和試験］力価）を、研究０日目（ＳＤ０）における初回のワクチン接種の前、研究２１日目（ＳＤ２１）における、２回目のワクチン接種の前、および研究４２日目（ＳＤ４２）における、２回目のワクチン接種の３週間後に測定した。個々の動物は、キャプション中で指定される。
【図７】ＣＤＶ−Ｈ３組換え体をワクチン接種された動物に由来する試料についての、Ｈ３亜型ヘマグルチニン（Ｈ３）特異的ＥＬＩＳＡ試験により決定される抗体レベルを示す図である。ｙ軸は、２つの時点についての、１：５００の試料希釈液、すなわち、研究０日目（ＳＤ０）における、初回のワクチン接種の前、および研究４５日目（ＳＤ４５）における、２回目のワクチン接種の後において、動物から採取された試料についてのＯＤ値に表示されたリードアウトを指し示す。
【図８】Ｈ３Ｎ２−ＭＤＡ陽性子ブタへの、ＣＤＶ−Ｈ３組換え体のワクチン接種の後における、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す図である。ｙ軸は、ワクチン接種動物（左バーは、６匹の動物についての平均値を表す）、および非ワクチン接種動物（右バーは、３匹の動物についての平均値を表す）における、ＰＢＭＣ  １００万個当たりのＩＦＮガンマ産生細胞の数を指し示す。
【発明を実施するための形態】
【０１１６】
以下の例は、本発明の好ましい実施形態を裏付けるために組み入れられる。当業者は、後続の例で開示される技法が、本発明の実施において、十分に機能することが、本発明者により発見された技法を表し、したがって、その好ましい実施方式を構成すると考えうることを察知されたい。しかし、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱しない限りにおいて、開示される具体的な実施形態において、多くの変化を施し、なおも、同様の結果または類似する結果を得うることも察知されたい。
【０１１７】
（実施例１）
Ａ）ＣＤＶベクターによる、ＣＰＶ−ＶＰ２の発現
Ｐ遺伝子とＭ遺伝子との間（したがって、配列番号２１の配列を含むベクター）に、配列番号１７の配列を挿入した、Ｌｅｄｅｒｌｅワクチン株に由来するＣＤＶ骨格を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究において、イヌパルボウイルス（２ｂ型）ＶＰ２タンパク質の細胞内発現を、ＣＤＶと関連する蛍光焦点において示すことが可能であった。それぞれの結果はまた、２ｃ型イヌパルボウイルス（ＣＰＶ−２ｃ）ＶＰ２タンパク質をコードする、対応するＣＤＶベクター（すなわち、ＣＰＶ  ＶＰ２をコードする配列だけが異なる）についても達成された。免疫蛍光法により、両方のベクターについて得られた結果は、全てのＣＤＶを感染させた合胞体内の、ＣＰＶのＶＰ２タンパク質の強い発現を指し示す。ＶＰ２は、ＣＤＶ抗原とは対照的に、感染細胞の核内に蓄積し、部分的に、感染細胞の細胞質内に蓄積し、これは、合胞体発生の経過中に変動したが、推定核局在化配列は、ＶＰ２遺伝子内の規定の探索によって検出されてもおらず、学術文献により公表されてもいないが、ＣＰＶ−ＶＰ２が、一過性の核トラフィッキングを示すことを指し示しうるであろう。
【０１１８】
Ｂ）遺伝子安定性
実施例１Ａ）の、両方のＣＤＶベクターを、Ｖｅｒｏ細胞系（すなわち、ＣＤＶ産生細胞系）内の、各継代の終了時において、凍結融解サイクルを伴う、連続継代により査定した。組換体の遺伝子の安定性を評価するために、Ｖｅｒｏ細胞上における、連続２０代の細胞継代を実施した。組換えクローンのシーケンシングは、挿入されるＣＰＶ  ＶＰ２配列およびフランキング領域の遺伝子安定性を明らかにした。両方のタンパク質をコードする配列（突然変異を含む）（アミノ酸レベルにおける）は、不変を維持した。加えて、免疫蛍光法（ＩＦ）およびウェスタンブロット法（ＷＢ）を使用して、全ての継代レベルにおいて、ＣＤＶ−ＶＰ２組換体を感染させた細胞内に、強いＶＰ２発現が存在することを裏付けることが可能であった。
【０１１９】
Ｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける増殖
実施例１Ａ）およびＢ）において記載した、両方のＣＤＶベクターを、Ｖｅｒｏ細胞内で増殖させた。ローラーボトルシステムにおける、両方の組換体のピーク力価は、感染の１４４時間後において達成され、力価は、凍結／融解サイクルの後で、劇的に上昇したことから、細胞内のウイルスの会合（親ＣＤＶウイルスと同様の）が指し示される。古典的な親ＣＤＶ−ＭＬＶと比較して、作出されたＣＤＶ組換えワクチン候補物質は、バイオプロセシングに許容可能な、極めて近似する終点力価を有する。
結論として述べると、いずれのＣＤＶベクターも、Ｖｅｒｏ細胞内で産生させたところ、良好な増殖動態を示し、ローラーボトル内の感染の６日後において、ピーク力価に達した。いずれのベクターも、ＩＦおよびＷＢにより決定される通り、それらを二重ＣＤＶ−ＣＰＶワクチン候補物質として適格とする、トランス遺伝子（ＶＰ２）の強い発現特徴を示した。加えて、いずれのウイルスも、Ｖｅｒｏ細胞上の、２０代の細胞継代にわたり、遺伝子の安定性について調べた。いずれのウイルスも、遺伝的安定性を維持したことから、ワクチンのためのバイオプロセシングに対して受容性であることが指し示される。
【０１２０】
（実施例２）
イノシシ科動物のｉｎ  ｖｉｖｏにおける有効性研究：
この実験の目的で、研究０日目（ＳＤ）において、６匹の子ブタの群に、実施例１のＣＰＶ−２ｂ  ＶＰ２（ＣＤＶ−ＶＰ２−２ｂ）をコードする、１×１０5  ＴＣＩＤ50の組換えＣＤＶベクターをワクチン接種し、ＳＤ２１において、２×１０4  ＴＣＩＤ50を追加投与した。両方の適用は、頸部の筋内（ＩＭ）において実施した（投与１回当たり２ｍＬの容量）。
４匹の動物は、陰性対照として用いられ、Ｖｅｒｏ細胞のホモジネート（２ｍＬ）を、頸部に接種された。３匹の動物は、歩哨動物として用いられ、処置を施されなかった。
組入れ基準：
・臨床的に健康であり、生後齢に応じて正常に発育したブタ
除外基準：
・試験責任医師または指定代行者により、研究に干渉すると評価された、損傷、先天性異常、または疾患の臨床徴候を伴うブタ
・身体状態が弱った（体重が＜５ｋｇの）ブタ
【０１２１】
全ての研究動物は、それらの生後齢に適切な施設内で飼育され、同じ管理条件下に保たれた。飼育室は、約２０ｍ2ずつの、４つの囲いを伴う、動物の生後齢に適する、平坦な床板、または、代替的に、部分的に穴あきの床板を有した。ワクチン接種の前に、歩哨動物を、群から隔離し、別個の囲いの中に保ち、ワクチン接種の１２時間後に、再度群分けした。
飼育室は、生物安全性の理由で、陰圧（−７５Ｐａ）下に置いた。飼育室温度は、動物の生後齢の要請に従った。換気回数は、１時間あたり約９回であった。動物は、１２時間にわたる、＞８０ルクスの明期と、１２時間にわたる暗期とを過ごした。動物のための環境強化が施された。適切な品質の不断給水および不断給餌が可能であり、それらの生後齢におけるブタの要請、および標準的手順に従い管理した。
【０１２２】
検査結果は、ＣＤＶベクターが、イノシシ科動物宿主、標的リンパ細胞において、限定的な形で複製されることを示した。ウイルスは、大半が、リンパ節、脾臓、または扁桃腺において検出された。
さらに、血清ウイルス中和試験を実施して、被験動物におけるＣＤＶおよびＣＰＶのそれぞれに対する中和抗体を測定した。
以下に、ＣＤＶについての血清中和試験のプロトコールを示す：
中和試験の１日前における細胞の調製
・コンフルエンシーの大きなＶｅｒｏ細胞をトリプシン化し、それらを、５％ＦＣＳを含有する、適切な容量のＭＥＭアール培地中に再懸濁させる
・懸濁液中の細胞をカウントし、９６ウェルプレート１枚１０ｍＬ当たりの細胞７×１０5個に調整する
・１枚のプレートは、試料４例に十分である。
・ウェル１つ当たりの細胞懸濁液１００μＬを、９６ウェルプレートの全てのウェルに播種する
・プレートを、３７℃のＣＯ2インキュベーター内で、１６〜２４時間にわたりインキュベートする
【０１２３】
血清試料の限界希釈率
・試料を、滅菌ＰＢＳで、１：４に前希釈する
・前希釈された血清を、５６℃で、３０分間にわたり不活化する
・１％の１００倍濃度Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＭＥＭアール培地６０μＬを、空の９６ウェルプレートの、１〜１１列目の各ウェルに添加する
・１％の１００倍濃度Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充した、さらなるＭＥＭアール培地３６μＬを、１列目（Ａ１〜Ｈ１）に添加する
・熱不活化させた血清試料２４μＬを、１列目に添加する（１：５の希釈率に対応する）（各血清試料について、２４μＬずつを、１列目の３つのウェルに添加して、血清について、三連で調べる）
・６０μＬを、列から列に移すことにより、血清の、２倍の系列希釈を実施する
・１１列目まで繰り返す（１：５１２０の希釈率に対応する）
・最後の列から、６０μＬを廃棄する
ＣＤＶウイルスの希釈
・ＣＤＶウイルスを、１％の１００倍濃度Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充した、ＭＥＭアール培地中、１００μＬ当たり２００  ＴＣＩＤ50に希釈し、９６ウェルプレート１枚当たり６ｍＬを計算する。
血清試料の、ＣＤＶウイルスを伴うインキュベーション
・希釈されたウイルス６０μＬを、血清希釈液を含有する９６ウェルプレートの１〜１１列目の全てのウェルに添加する。１１列目におけるウイルスの添加を開始する。
・プレートを静かに攪拌し、３７℃、５％ＣＯ2で、２時間にわたりインキュベートする
血清試料±ＣＤＶウイルスの、ｖ．ｄ．ｓ細胞上のインキュベーション
・培地６０μＬを、９６ウェルプレート内の、１日齢のｖ．ｄ．ｓ細胞から除去する
・２時間にわたるインキュベーション時間が完了した後で、各ウェル１００μＬずつを、血清ウイルス混合物から、１〜１１列目のｖ．ｄ．ｓ細胞プレートの対応するウェルに移す
・１％の１００倍濃度Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＭＥＭアール培地１００μＬを、１２列目の全てのウェル（＝細胞だけの対照）に添加する
・プレートを、３７℃、５％ＣＯ2で、３日間にわたりインキュベートする
・光学顕微鏡により、ウイルス誘導性の細胞変性作用を観察しながら、結果を読み取る
【０１２４】
ＣＤＶの血清中和試験についての結果を、図５に提示する。全ての動物は、研究の開始時（ＳＤ０）に、ＣＤＶ中和抗体を有さなかった。初回の免疫化の３週間後（ＳＤ２１；２回目の免疫化時）、１匹の動物が、中和抗体に対するＣＤＶを有した。２回目の免疫化の２１日後（ＳＤ４２）、ＣＤＶ−ＶＰ２をワクチン接種された、１匹を除く全ての動物は、イヌジステンパーウイルスに対する、著明レベルの中和抗体をもたらした。ＣＰＶについての血清中和試験の結果（ＳＤ４２では、ＣＤＶ中和抗体を有さなかった動物を含む、全ての動物が、ワクチン接種に対して強く反応した）と、別の直交的な一連の試験（実施例３を参照されたい）とを併せて、この１匹の動物は、ワクチン接種に成功したが、ＣＤＶに関する免疫応答は、細胞性応答にシフトすることが結論づけられた。
【０１２５】
ＣＰＶに関する血清中和試験のそれぞれを実施し、これらの結果を、図６に提示する。有効性に関して、ＣＤＶ−ＶＰ２をワクチン接種された、全ての動物は、イヌパルボウイルス２に対してセロコンバージョンを示した。中和Ａｂ力価の、特定の増大は、２回目のワクチン接種の後で検出された（図６を参照されたい）。２回目の免疫化の２１日後（ＳＤ４２）における中和抗体のレベルは、文献に従い、実際の宿主（イヌ科イヌ属動物）における防御的力価範囲を表す、１：４０〜１：４００のレベルに到達した（Glover et al. 2012; Taguchi et al. 2011）。
重要なことは、全ての歩哨動物が、研究の終了時まで、ＣＤＶおよびＣＰＶについて、血清陰性を維持したことであり、ここから、ワクチン接種時に、組換えＣＤＶウイルスが、ワクチン接種された動物から、ワクチン接種されなかった動物に伝播しなかったことが指し示される。
【０１２６】
（実施例３）
Ｈ３Ｎ２−ＭＤＡ陽性子ブタにおける免疫原性：
本研究では、ＳｗＩＶのＨ３をコードするＣＤＶベクターをワクチン接種された、ブタインフルエンザ母体由来抗体（ＭＤＡ）陽性動物の体液性免疫応答および細胞性免疫応答について探索するために、ヘマグルチニン（ＨＡ）特異的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡアッセイおよびＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔアッセイを援用した。
動物へのワクチン接種は、実施例２に従い実施したが、ＣＤＶ骨格内に組み入れられたインサートが、配列番号１９の配列を有し（したがって、ベクターは、ＳｗＩＶのＨ３をコードする、配列番号２２の配列を含み）、ベクター（以下では、ＣＤＶ−Ｈ３と名指される）を、Ｈ３Ｎ２−ＭＤＡ陽性（ＭＤＡ＋動物）である、５匹の子ブタに投与したところ、１匹の子ブタが、（ほぼ）Ｈ３Ｎ２血清陰性である（または、それぞれ、低ＭＤＡを有する）と考えられ、３匹の子ブタが、陰性対照として用いられた点で異なった。
【０１２７】
Ａ）ＨＡ特異的ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ
以下に、使用されるＥＬＩＳＡのプロトコールを提示する：
平底９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐ；型番：４４−２４０４−２１）を、炭酸緩衝液、ｐＨ９．６中に、１μｇ／ｍＬの組換えインフルエンザヘマグルチニンタンパク質（Ｔｒ酵素）により、４℃で、一晩にわたりコーティングする。翌日、コーティング抗原を廃棄し、プレートを、洗浄緩衝液で、５回にわたり洗浄し（５０ｍＭのトリス／０．１４ＭのＮａＣｌ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ８．０）、その後、ウェル１つ当たりのブロッキング緩衝液（５０ｍＭのトリス／０．１４ＭのＮａＣｌ／１％のＢＳＡ、ｐＨ８．０）２００μＬと共に、飼育室温度で、１時間にわたりインキュベートする。試料希釈液は、試料／コンジュゲート希釈液（５０ｍＭのトリス／０．１４ＭのＮａＣｌ／０．０５％のＴｗｅｅｎ２０／１％のＢＳＡ）中で調製する。次いで、ウェル１つ当たり１００μｌの試料および対照（二連の）を、指定のウェルに分注し、カバーを掛けたプレートを、ＲＴで、１時間にわたりインキュベートする。プレートを、洗浄緩衝液で、５回にわたり洗浄する。その後、１：１００．００に希釈されたＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ブタＩｇＧ−Ｈ＋Ｌ検出抗体（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、型番：６０５０−０５）１００μｌを、各ウェルに添加し、カバーを掛けたプレートを、暗所、ＲＴで、１時間にわたりインキュベートする。洗浄ステップ（洗浄緩衝液により、５回にわたる）の後、ウェル１つ当たり１００μｌのＴＭＢ基質溶液（ＰＯＤ；使用準備ができた；Ｓｉｇｍａ；型番：Ｔ４４４４）を、添加し、プレートを、暗所、ＲＴで、５〜１５分間にわたりインキュベートする。反応は、ウェル１つ当たり５０μｌの停止溶液（２Ｎの硫酸）を添加することにより停止させ、４５０ｎｍのＥＬＩＳＡリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  ２、Ｂｉｏｔｅｋ）で、吸光度を測定する。
【０１２８】
このＥＬＩＳＡを使用して、研究４５日目（ＳＤ４５）において、動物から採取された試料を介して、ＭＤＡのベースラインレベルが、中程度（＜ＯＤ  １．０および＞ＯＤ  ０．２）であった場合、主に、細胞媒介性免疫応答を介して応答した動物２（下記を参照されたい）を例外として、動物は、ワクチン接種に対して、中程度に応答性である（動物１および５；図７を参照されたい）ことが分かった。低ＭＤＡ（＜ＯＤ  ０．２）を有する動物４は、高抗体応答を示さなかった。これに対し、ＯＤ  １．０を上回る、高ＭＤＡレベルを伴う２例の動物（動物３および６）は、ワクチン接種時に、特異的Ｈ３抗体の増大を示さなかった。
【０１２９】
Ｂ）ＩＦＮγ−ＥＬＩＳｐｏｔ
加えて、ＥＬＩＳＰＯＴを使用して、ＣＤＶ−Ｈ３ワクチン接種動物による細胞性免疫応答を測定した。
以下に、使用されたＥＬＩＳｐｏｔアッセイのプロトコールを提示する：
ＥＬＩＳｐｏｔプレート（９６ウェル）を、精製抗ＩＦＮ−γ抗体で、少なくとも１２時間にわたりコーティングする。ＰＢＭＣを融解させ、ＰＢＳ（カルシウムなし、マグネシウムなし）中で、２回にわたり洗浄し、トリパンブルーを使用してカウントし、ウェル１つ当たりの細胞３×１０5個に分注するように、ＲＰＭＩ培地中で調整した。コーティング抗体を含有するプレートの、ＰＢＳによる十分な洗浄の後、プレートを、少なくとも、３７℃および５％ＣＯ２で、１時間にわたりブロッキングする。３μｇ／ｍｌのポリクローナル活性化因子であるＣｏｎＡ（ＩＦＮγ放出の陽性対照）を含有するか、または異なる濃度の抗原を伴う細胞培養物培地を添加するのに続き、ＰＢＭＣを播種する。培地だけまたは非刺激細胞を含有するウェルは、陰性対照として用いられる。４８時間にわたる刺激の後、プレートを、最初の２時間にわたり、水で、次いで、ＰＢＳ／０．０１％のＴｗｅｅｎ２０で洗浄する。検出用ビオチニル化抗ＩＦＮγ抗体を使用して、プレートを、室温で、１．５時間にわたりインキュベートし、ＰＢＳ／０．０１％のＴｗｅｅｎ２０／０．１％のＢＳＡ中で希釈する。その後、ＰＢＳ／０．０１％のＴｗｅｅｎ２０／０．１％のＢＳＡ中で希釈された、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼ酵素を、プレート（暗所で、４５分間にわたりインキュベーション）に添加する。最後に、ＮＢＴおよび５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイルホスフェートを、アルカリホスファターゼの基質として使用する（現像相もまた、暗所で行う）。これらの基質系は、色が青〜紫であり、プレートリーダーで測定されうる、不溶性のＮＢＴジホルマザン終末産物をもたらす。流水の水道水による十分な洗浄の後、プレートを、一晩にわたり放置して、完全な乾燥を確保する。Ｃ．Ｔ．Ｌ．ＥＬＩＳｐｏｔリーダーを使用して、スポットカウンティングを実施する。
【０１３０】
アッセイでは、組換えＨ３タンパク質を使用して、ＣＤＶ−Ｈ３組換え体をワクチン接種された動物から単離されたＰＢＭＣを刺激した。図８に示される通り、２ショットをワクチン接種された動物の試料（研究２８日目（ＳＤ２８）において採取された試料）中では、非ワクチン接種動物のＰＢＭＣ中より、著明に多くのＩＦＮガンマ産生細胞が検出された。細胞性免疫のこのような誘導は、感染時における、ワクチンの有効性および病原体の迅速なクリアランスを改善することが公知である。さらに、ワクチン接種された動物における強い（ブタインフルエンザ）母体免疫の存在にもかかわらず、イノシシ科動物のインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（Ｈ３）を発現させるＣＤＶ組換え体をワクチン接種された動物の、著明なＴ細胞応答も発生させた。若齢動物における既存の母体免疫の存在は、能動免疫への干渉を引き起こすことが多く、幼若動物におけるワクチン不奏効の主要な原因である。これらの知見は、ワクチン接種生物におけるＣＤＶ生物学の特徴を示唆し、受動的に存在する母体免疫の存在にもかかわらず、能動免疫の開発をもたらすので重要である。
【０１３１】
（実施例４）
ワクチン有効性研究
ブタ伝染性下痢（ＰＥＤ）は、おびただしい経済的影響を及ぼしうる、高度に接触伝染性のイノシシ科動物疾患である。全ての生後齢クラスのブタが、易感染性であるが、重度の臨床徴候および死亡率は、主に、哺乳期子ブタにおいて見られる。原因物質は、コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）内のアルファコロナウイルス（Ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）属の、エンベロープのある、一本鎖でプラス鎖のＲＮＡウイルスである、ＰＥＤウイルス（ＰＥＤＶ）である。欧州では、ＰＥＤＶは、１９７０年代後半に、英国で、最初に発生した。その後、ＰＥＤＶは、全欧州中に広がり、散発的な流行を引き起こしている。１９９０年代後半に、ＰＥＤＶは、極めて低度の血清有病率および疾患報告の非存在により証拠立てられている通り、欧州の養豚場から消滅した。疾患が、産業化された養豚場の生産性に対して、大きな影響を及ぼすアジアからは、流行および地域感染が、依然として報告された。２００５年以後、欧州、すなわち、イタリアから、再びＰＥＤ症例が報告された。２０１３年における、見かけ上高毒性のＰＥＤＶの、米国への導入の後、ドイツおよび近隣諸国を含む、中欧からもまた、症例が報告された。後者の症例は、類縁であるが、顕著に異なるＰＥＤＶ株（いわゆる、Ｓ−ＩＮＤＥＬ株）により引き起こされた。ドイツでは、２０１４年５月から、哺乳期ブタにおいて、高罹患率および可変的な死亡率を伴う症例が報告された。
【０１３２】
Ｌｅｄｅｒｌｅワクチンに由来するＣＤＶ骨格であって、Ｐ遺伝子と、Ｍ遺伝子との間に、配列番号３８の配列（ＰＥＤＶスパイクタンパク質をコードする）のインサートを伴う骨格（したがって、ベクターは、配列番号４１の配列を含む）を、ベクターワクチン（本明細書の後出では、それぞれ、「ＣＤＶ＿ＰＥＤＶ−スパイクワクチン」または「ＣＤＶＰＥＤＶ−スパイクベクターワクチン」と名指される）として調べる、本研究は、６匹の雌ブタ、およびそれらの子ブタを組み入れた。
全ての動物を、Ｓ遺伝子をターゲティングするＲＴ−ｑＰＣＲにより、ＰＥＤＶについて点検し、ＰＥＤＶ特異的抗体についても点検した。陰性動物だけを、研究に登録した。
３つの処置群（下記を参照されたい）は、無作為に割り付けられた動物を受け入れた：
・群１（陰性対照）：２匹の雌ブタ（雌ブタ１および雌ブタ２と称する）、非ワクチン接種
・群２（陽性対照）：２匹の雌ブタ（雌ブタ３および雌ブタ４と称する）、非ワクチン接種
・群３（ＣＤＶ＿ＰＥＤＶ−スパイク）：２匹の雌ブタ（雌ブタ５および雌ブタ６と称する）、ＣＤＶ＿ＰＥＤＶ−スパイクベクターワクチンをワクチン接種された
【０１３３】
群３の２匹の雌ブタへのワクチン接種は、終点滴定により規定されるＣＤＶ＿ＰＥＤＶ−スパイクワクチンの原液力価を、７．９４×１０4ＴＣＩＤ５０／ｍｌとする、以下のスキームに従い行った：
分娩予定日の９週間前：２匹の雌ブタの各々は、４ｍｌのワクチンを鼻腔内に施される（各鼻腔内に２ｍｌずつ）；
分娩予定日の６週間前：２匹の雌ブタの各々は、４ｍｌのワクチンを鼻腔内に施される（各鼻腔内に２ｍｌずつ）；
分娩予定日の３週間前：２匹の雌ブタの各々は、４ｍｌのそれぞれのワクチンを鼻腔内に施され（各鼻腔内に２ｍｌずつ）、加えて、２ｍｌを、筋内に施される。
群１の雌ブタに生まれた子ブタ（雌ブタ１の１３匹の子ブタおよび雌ブタ２の１２匹の子ブタ）に、経口モック接種した。生後４日齢において、群２（雌ブタ３の１２匹の子ブタおよび雌ブタ４の１４匹の子ブタ）、および群３（雌ブタ５の５匹の子ブタおよび雌ブタ６の１５匹の子ブタ）の雌ブタに生まれた子ブタに、ＰＥＤＶ野外株（本明細書の後出では、「ＰＥＤＶ  ＥＵ」と名指される）を、経口抗原投与した。
【０１３４】
群２および３の子ブタに接種するために、細胞培養物に適応させたＰＥＤＶ  ＥＵを使用した。力価は、２．１５×１０5ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。群２および３の子ブタに経口接種した。この場合、２ｍｌのシリンジを使用して、各子ブタに、１：１０に希釈されたウイルス原液１ｍｌ（力価：２．１５×１０4ＴＣＩＤ５０）を施した。
２ｍｌのシリンジ内の細胞培養物培地１ｍｌを使用して、群１の子ブタに、経口モック接種した。
ＲＴ−ｑＰＣＲ解析のために、全試験期間中に、全ての動物の、接種日、および接種後（ｐｉ）１〜１０日目のほか、接種後１４、１７、および２０／２１日目に、直腸内スワブ（ＣＯＰＡＮ製の、培地を伴わない単純スワブ）を採取した。細菌学的検討のために、さらなる直腸内スワブを、各雌ブタの、４匹ずつの子ブタから、接種前、抗原投与の２日後に採取した。さらに、確立された、標準化されたスコアシステム（下記を参照されたい）を使用して、ＰＥＤを示す臨床徴候を、毎日記録した。血液試料は、接種日、ならびに接種後１４および２０／２１日目（試験の終了時）、またはそれぞれの動物の安楽死もしくは死の日に採取した。
【０１３５】
臨床モニタリング
ＰＥＤを示す臨床徴候（下記の表を参照されたい）について毎日モニタリングするために、確立された累計臨床スコアを使用した。
【表１】
2020537507.tif 000002
【０１３６】
試料の調製および核酸の抽出
直腸内スワブを、１ｍｌのダルベッコ改変イーグル培地中に浸漬し、室温で、１時間にわたりインキュベートした。ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ抽出プラットフォームと組み合わせた、ＱＩＡｍｐ  ＶｉｒａｌＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）またはＮｕｃｌｅｏＭａｇＶｅｔ−Ｋｉｔを使用して、ウイルスＲＮＡを抽出した。ＲＮＡは、さらなる使用まで、−２０℃で保管した。
血液試料を、室温、２０３１×ｇで、２０分間にわたり遠心分離して、血清を得た。結果として得られる血清をアリコート分割し、−２０℃で保管した。
【０１３７】
ウイルスの検出
ＰＥＤＶの排出を検出するために、既に記載されている（Stadler et al., BMC Vet Res. 11:142 (2015)）、ＰＥＤＶのＳ遺伝子をターゲティングするＲＴ−ｑＰＣＲシステムを使用した。接種後０〜７日目、および接種後１０および２０／２１日目において採取された試料を、ＰＥＤＶ−ゲノムについて調べた。社内標準物質を使用して、１μｌ当たりのゲノムコピー量を計算した。
抗体の検出
製造元のマニュアルに従い、全ての血清により、市販の間接的ＥＬＩＳＡ（ＩＮｇｅｚｉｍ  ＰＥＤＶ、ＩＮＧＥＮＡＳＡ、Ｍａｄｒｉｄ、Ｓｐａｉｎ）を実施した。
細菌学
示差的細菌学のために、同腹仔当たり、４匹ずつの子ブタの糞便スワブを、接種後０および２日目において採取した。
統計学
正規性検定のために、シャピロ−ウィルク検定を使用し、ソフトウェアパッケージ内で実行される通りにマン−ホイットニー順位和検定を行った。ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェアを使用して、統計学的有意性を調べた。
【０１３８】
結果
血清中の抗体の検出：
ＣＤＶ群の全ての子ブタが、抗体陽性の初乳摂取に起因して、抗原投与による接種の前のＥＬＩＳＡ（抗体に対するＰＥＤＶスパイクタンパク質を検出する）において、陽性結果を示したのに対し、陽性対照群および陰性対照群の全ての動物は、明らかに、陰性の結果を示した。
接種後１４日目に、陽性対照群内の、３匹を除く全ての子ブタが、セロコンバージョンを示したのに対し、ワクチン群内の全ての動物は、血清試料中に、依然として高量のＰＥＤＶ特異的ＩｇＧを示した。
研究の終了時に、ＣＤＶ群および陽性対照群の全ての子ブタは、ＥＬＩＳＡにおいて、強い陽性結果を示した。陰性対照の動物はいずれも、全試験期間中に、セロコンバージョンを示さなかった。
さらなる研究において、母雌ブタだけが、鼻腔内経路を介して、２回にわたりワクチン接種される場合も同様にまた、それぞれの抗体結果が達成されることが見られた。
【０１３９】
細菌学：
接種後０および２日目に採取された糞便スワブは、病原性細菌を示さなかった。細菌フローラは、感染時に、著明な変化を受けなかった。
臨床徴候：
陽性対照群（群２）の子ブタは明らかに、ＰＥＤＶを示す臨床徴候であって、接種の２４時間後における嘔吐に続く下痢の臨床徴候を、７日間にわたり示した。２６匹中８匹の子ブタは、重度の脱水および６を超える臨床スコア値（人道的エンドポイント）に起因して、安楽死させなければならなかった。ＰＥＤＶを示す、最初の臨床徴候は、接種の３６時間後において、検出可能であった。
総じて、ＣＤＶベクターをワクチン接種され、ＰＥＤＶを抗原投与された子ブタ（群３）の臨床徴候は、一般的な挙動に関して良好であり、群３のブタで、重度の脱水および６を超える臨床スコア値に起因して安楽死させなければならなかったのは、２０匹中２匹（１０％）だけであった（群２の子ブタのうちの３１％と比較して）。
陰性対照の動物は、全試験期間中において、健康を維持した。
【０１４０】
ウイルスの排出
抗原投与群の間では、ウイルス排出の明らかな差違を検出することができた。接種後１日目において、全ての抗原投与子ブタは、直腸内スワブにおけるウイルスゲノムについて陽性であったが、ＣＤＶ−ＰＥＤＶワクチン接種群内の動物は、抗原投与群内の動物（平均値ＣＴ値：２６．６５）より、著明に少数のＰＥＤＶゲノムコピー数（平均値ＣＴ値：３２．７９）を示した。
また、接種後次の５日間にわたり、ＣＤＶ群の直腸内スワブ内のゲノム負荷は、陽性対照と、極めて同様であったが、接種後７日目以後、ワクチン接種された雌ブタにより保護された子ブタでは、検出可能なウイルスゲノムの量が、カットオフレベルを下回って低下したのに対し、陽性対照群内の全ての動物は、依然としてＰＥＤＶを排出した。
陰性対照群のスワブでは、ＰＥＤＶゲノムを検出することができなかった。
結論として述べると、研究の転帰は、ＣＤＶ  ＰＥＤＶ−スパイク組換えワクチンをワクチン接種された雌ブタに生まれた子ブタが、陽性対照と比較して、臨床徴候の軽減を示したことであり、特に、子ブタの死亡率（ｍｏｒｔａｌｉｔｙ／ｌｅｔｈａｌｉｔｙ）に関して、大きな改善が見られた。さらに、ＰＥＤＶの抗原投与後におけるウイルス排出も、著明に低減された。
【０１４１】
本明細書で開示され、特許請求される組成物および方法の全ては、本開示に照らして、不要な実験を伴わずに作製し、実行することができる。本発明の組成物および方法について、好ましい実施形態との関係で記載してきたが、当業者には、本発明の概念、精神、および範囲から逸脱しない限りにおいて、本明細書において記載される組成物および方法、ならびに方法のステップまたはステップの連鎖に、変動を適用しうることが明らかであろう。より具体的には、同じ結果または同様の結果を達成しながら、化学的かつ生理学的に類縁である、ある特定の薬剤を、本明細書で記載される薬剤で代用しうることが明らかであろう。当業者に明らかな、全てのこのような同様の代用および改変は、以下の特許請求の範囲により規定される、本発明の精神、範囲、および概念の中にあるものとみなされる。
【０１４２】
本明細書ではまた、以下の項（ｃｌａｕｓｅ）も開示される：
１．第１の遺伝子（１）が発現カセットの３’方向に配置され、第２の遺伝子（２）が発現カセットの５’方向に配置されるような、パラミクソウイルス科ウイルスの２つの隣接する必須遺伝子（１；２）の間の挿入のための発現カセットであって、
・目的のヌクレオチド配列である第１のヌクレオチド配列、および
・第１のヌクレオチド配列の５’末端に隣接する第２のヌクレオチド配列であって、前記第２のヌクレオチド配列が遺伝子の５’非コード領域であり、前記遺伝子が、第１の遺伝子（１）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第２のヌクレオチド配列、および
・第１のヌクレオチド配列の３’末端に隣接する第３のヌクレオチド配列であって、前記第３のヌクレオチド配列が遺伝子の３’非コード領域であり、前記遺伝子が、第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、第３のヌクレオチド配列
を含む発現カセット。
２．・前記第１のヌクレオチド配列、および
・前記第２のヌクレオチド配列、および
・前記第３のヌクレオチド配列、および
・前記第２のヌクレオチド配列の５’末端に隣接するか、または前記第３のヌクレオチド配列の３’末端に隣接するさらなるヌクレオチド配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列であるさらなるヌクレオチド配列
からなる、項１に記載の発現カセット。
【０１４３】
３．前記第３のヌクレオチド配列が、
第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’非コード領域、および
前記３’非コード領域の５’末端に隣接する配列であって、前記３’非コード領域の５’末端に隣接する前記配列が、翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列をコードし、前記翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列が、Ｋｏｚａｋ配列であってもよい、配列
からなる、項１または２に記載の発現カセット。
４．パラミクソウイルス科ウイルスの前記２つの隣接する遺伝子（１；２）が、パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択され、かつ／または
前記パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子が、
・パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｇ、およびＬ遺伝子
である、項１から３のいずれか１項に記載の発現カセット。
【０１４４】
５．・第１の遺伝子（１）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ遺伝子からなる群から選択されてもよく、
・第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのＭ遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのＨ、Ｐ、Ｆ、ＬおよびＮ遺伝子からなる群から選択されてもよい、
パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子とＭ遺伝子との間の挿入のための、項１から４のいずれか１項に記載の発現カセット。
【０１４５】
６．・前記第２のヌクレオチド配列が、発現カセットの３’方向に配置され、第１の遺伝子（１）の５’非コード領域を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子から選択される遺伝子の５’非コード領域であり、かつ／または
・前記第３のヌクレオチド配列が、発現カセットの５’方向に配置され、第２の遺伝子（２）の３’非コード領域を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子の３’非コード領域を含むか、もしくはこれからなる、
項１から５のいずれか１項に記載の発現カセット。
７．前記第１のヌクレオチド配列が、前記第３のヌクレオチド配列内に組み入れられた遺伝子開始（ＧＳ）配列、および／またはパラミクソウイルス科ウイルスのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている、項１から６のいずれか１項に記載の発現カセット。
８．前記ヌクレオチド配列が、ＲＮＡ配列である、項１から７のいずれか１項に記載の発現カセット。
９．項１から８のいずれか１項に記載の発現カセットを含む、パラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１４６】
１０．・前記５’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのＮ遺伝子の５’非コード領域であり、かつ／もしくは
・前記３’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのＨ遺伝子の３’非コード領域であり、
かつ／または前記発現カセットが、パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子とＭ遺伝子との間に挿入される、
項１から８のいずれか１項に記載の発現カセット、または項９に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
１１．第１の遺伝子（１）が３’方向に配置され、第２の遺伝子（２）が５’方向に配置されるような、パラミクソウイルス科ウイルスの２つの隣接する必須遺伝子（１；２）の間に挿入されるＲＮＡ配列を含み、
・前記挿入されたＲＮＡ配列が、第１のＲＮＡ配列を含むか、またはこれからなり、前記第１のＲＮＡ配列が、目的のヌクレオチド配列であり、
・前記挿入されたＲＮＡ配列が、第１のＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第２のＲＮＡ配列を含むか、またはこれからなり、前記第２のＲＮＡ配列が遺伝子の５’非コード領域であり、前記遺伝子が、第１の遺伝子（１）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択され、
・前記挿入されたＲＮＡ配列が、第１のＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第３のＲＮＡ配列を含むか、またはこれからなり、前記第３のＲＮＡ配列が遺伝子の３’非コード領域を含むか、またはこれからなり、前記遺伝子が、第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される、パラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１４７】
１２．前記第３のＲＮＡ配列が、
第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’非コード領域、および
前記３’非コード領域の５’末端に隣接する配列であって、前記３’非コード領域の５’末端に隣接する前記配列が、翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列をコードし、前記翻訳の開始または増強のためのコンセンサス配列が、Ｋｏｚａｋ配列であってもよい、配列
からなる、項１１に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
１３．・第２のＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第４のＲＮＡ配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列である第４のＲＮＡ配列、および／または
・第４のＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第５のＲＮＡ配列であって、パラミクソウイルス科ウイルスの遺伝子間配列である第５のＲＮＡ配列
をさらに含む、項１１または１２に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１４８】
１４．パラミクソウイルス科ウイルスの、前記２つの隣接する遺伝子（１；２）が、パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択され、かつ／または
前記パラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子が、
・パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、ＨＮおよびＬ遺伝子、もしくは
・パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｐ、Ｍ、Ｆ、Ｇ、およびＬ遺伝子
である、項１１から１３のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１４９】
１５．前記パラミクソウイルス科ウイルスの２つの隣接する必須遺伝子（１；２）が、パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子およびＭ遺伝子であり、
・第１の遺伝子（１）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのＰ遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのＮ、Ｍ、Ｆ、ＨおよびＬ遺伝子からなる群から選択されてもよく、
・第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる前記群が、パラミクソウイルス科ウイルスのＭ遺伝子を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群であり、前記遺伝子が、パラミクソウイルス科ウイルスのＨ、Ｐ、Ｆ、ＬおよびＮ遺伝子からなる群から選択されてもよい、
項１１から１４のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１５０】
１６．・前記第２のヌクレオチド配列が、発現カセットの３’方向に配置され、第１の遺伝子（１）の５’非コード領域を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子から選択される遺伝子の５’非コード領域であり、かつ／または
・前記第３のヌクレオチド配列が、発現カセットの５’方向に配置され、第２の遺伝子（２）の３’非コード領域を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子の３’非コード領域を含むか、もしくはこれからなる、
項１１から１５のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
１７．・前記５’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのＮ遺伝子の５’非コード領域であり、かつ／または
・前記３’非コード領域が、パラミクソウイルス科ウイルスのＨ遺伝子の３’非コード領域である、
項１１から１６のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１５１】
１８．前記第１のＲＮＡ配列が、前記第３のヌクレオチド配列内に組み入れられた遺伝子開始（ＧＳ）配列、および／またはパラミクソウイルス科ウイルスのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている、
項１１から１７のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
１９．前記パラミクソウイルス科ウイルスが、モルビリウイルス属のウイルスであり、モルビリウイルス属のウイルスが、好ましくは、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）、ネコモルビリウイルス（ＦｅＭＶ）、および小反芻獣疫ウイルス（ＰＰＲＶ）からなる群から選択され、モルビリウイルス属のウイルスが、最も好ましくは、イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）である、項１から１８のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１５２】
２０．前記パラミクソウイルス科ウイルスが、ＣＤＶであり、ＣＤＶの遺伝子の前記５’非コード領域が、
好ましくは、配列番号１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＮ遺伝子の５’非コード領域、
好ましくは、配列番号２の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＰ遺伝子の５’非コード領域、
好ましくは、配列番号３の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＭ遺伝子の５’非コード領域、
好ましくは、配列番号４の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＦ遺伝子の５’非コード領域、
好ましくは、配列番号５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＨ遺伝子の５’非コード領域、および、
好ましくは、配列番号６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＬ遺伝子の５’非コード領域
からなる群から選択される、項１から１９のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１５３】
２１．前記パラミクソウイルス科ウイルスが、ＣＤＶであり、ＣＤＶの遺伝子の３’非コード領域が、
好ましくは、配列番号７の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＨ遺伝子の３’非コード領域、
好ましくは、配列番号８の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＮ遺伝子の３’非コード領域、
好ましくは、配列番号９の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＰ遺伝子の３’非コード領域、
好ましくは、配列番号１０の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＭ遺伝子の３’非コード領域、
好ましくは、配列番号１１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＦ遺伝子の３’非コード領域、および
好ましくは、配列番号１２の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、ＣＤＶのＬ遺伝子の３’非コード領域
からなる群から選択される、項１から２０のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１５４】
２２．前記第２のヌクレオチド配列または前記第２のＲＮＡ配列が、ＣＤＶのＮ遺伝子の５’非コード領域であり、ＣＤＶのＮ遺伝子の前記５’非コード領域が、好ましくは、配列番号１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、項１から２１のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１５５】
２３．・前記第２の遺伝子（２）を除外するパラミクソウイルス科ウイルスの必須遺伝子からなる群から選択される遺伝子の３’非コード領域が、ＣＤＶのＨ遺伝子の３’非コード領域であり、ＣＤＶのＨ遺伝子の前記３’非コード領域が、好ましくは、配列番号７の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含み、かつ／または
・前記３’非コード領域配列の５’末端に隣接する前記配列が、５〜８ヌクレオチドの長さであるＫｏｚａｋ配列をコードし、Ｋｏｚａｋ配列が、好ましくは、配列番号１３の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、項１から２２のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
２４．パラミクソウイルス科ウイルスの前記遺伝子間配列が、ＣＤＶの遺伝子間配列であり、ＣＤＶの前記遺伝子間配列が、好ましくは、配列番号１４の配列と少なくとも６６％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、項２から８および１９から２３のいずれか１項に記載の発現カセット、または項９および１３から２３のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
２５．前記目的のヌクレオチド配列が、目的の遺伝子もしくは抗原をコードする配列であり、かつ／または前記目的のヌクレオチド配列が、非自然発生のヌクレオチド配列および／もしくは組換えヌクレオチド配列である、項１から２４のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１５６】
２６．前記目的のヌクレオチド配列が、組換えヌクレオチド配列、および／または異種ヌクレオチド配列、および／または外因性ヌクレオチド配列である、項１から２５のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
２７．前記目的のヌクレオチド配列が、疾患原因物質に由来する抗原をコードし、疾患原因物質が、好ましくは、イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および／または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物に感染することが可能であり、あるいはイノシシ科動物またはウシなどの食料生産動物に感染することが可能な疾患原因物質である、項１から２６のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１５７】
２８．・パラミクソウイルス科ウイルスが、第１の生物科の動物に感染することが可能な、パラミクソウイルス科ウイルスであり、
・目的のヌクレオチド配列が、前記第１の生物科の動物に感染することが可能な、疾患原因物質に由来する抗原をコードし、前記疾患原因物質が、好ましくは、前記パラミクソウイルス科ウイルスと異なり、
前記第１の生物科の前記動物が、好ましくは、イヌ科の動物、ネコ科の動物、およびイノシシ科の動物からなる群から選択され、前記第１の生物科の前記動物が、最も好ましくは、イヌ、ネコ、またはブタなど、イヌ科動物、ネコ科動物、またはイノシシ科動物である、
項１から２７のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
２９．・第１の生物科の動物に感染することが可能な、前記パラミクソウイルス科ウイルスが、ＣＤＶであり、
・前記第１の生物科の動物に感染することが可能な、前記疾患原因物質が、イヌ科動物パルボウイルス（ＣＰＶ）であるか、
または
・第１の生物科の動物に感染することが可能な、前記パラミクソウイルス科ウイルスが、ＬＰＭＶ（Ｌａ  Ｐｉｅｄａｄ  Ｍｉｃｈｏａｃａｎ  Ｍｅｘｉｃｏ  ｖｉｒｕｓ）ウイルスであり、
・前記第１の生物科の動物に感染することが可能な、前記疾患原因物質が、ブタインフルエンザウイルス（ＳｗＩＶ）またはブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）である、
項２８に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１５８】
３０．前記目的のヌクレオチド配列が、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）、ネコパルボウイルス（ＦＰＶ）、ブタインフルエンザウイルス（ＳｗＩＶ）またはブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）に由来する抗原をコードする、項１から２９のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
３１．・前記目的のヌクレオチド配列が、プロトパルボウイルスカプシドタンパク質をコードし、前記プロトパルボウイルスカプシドタンパク質が、好ましくは、肉食動物プロトパルボウイルス１（ＣＰＶまたはＦＰＶ）カプシドタンパク質、霊長動物プロトパルボウイルス１カプシドタンパク質、齧歯動物プロトパルボウイルス１カプシドタンパク質、齧歯動物プロトパルボウイルス２カプシドタンパク質、有蹄動物パルボウイルス１（ＰＰＶ）カプシドタンパク質からなる群から選択されるか；または
・前記目的のヌクレオチド配列が、インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質をコードし、前記エンベロープタンパク質が、ヘマグルチニンであってもよく、かつ／または前記インフルエンザウイルスが、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルスからなる群から選択されてもよく、Ａ型インフルエンザウイルスが、好ましくは、インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ３、およびＨ９１１の群から選択されるか；または
・前記目的のヌクレオチド配列が、コロナウイルススパイク（Ｓ）タンパク質をコードし、前記コロナウイルスＳタンパク質が、好ましくは、アルパカコロナウイルスＳタンパク質、アルファコロナウイルス１  Ｓタンパク質、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ  Ｓタンパク質、ヒトコロナウイルスＮＬ６３  Ｓタンパク質、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）Ｓタンパク質、ヒトコロナウイルスＯＣ４３  Ｓタンパク質、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１  Ｓタンパク質、マウスコロナウイルスＳタンパク質、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）Ｓタンパク質、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）Ｓタンパク質、およびトリ感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）Ｓタンパク質からなる群から選択される、
項１から３０のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１５９】
３２．・前記目的のヌクレオチド配列が、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質をコードし、前記ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質が、好ましくは、配列番号３５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなるか；または
・前記目的のヌクレオチド配列が、Ｈ３亜型ヘマグルチニン（Ｈ３）、特に、ブタインフルエンザウイルスのＨ３をコードし、前記Ｈ３が、好ましくは、配列番号３６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなるか；または
・前記目的のヌクレオチド配列が、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）スパイク（Ｓ）タンパク質をコードし、前記ＰＥＤＶ  Ｓタンパク質が、好ましくは、配列番号４５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、もしくはこれからなる、
項１から３１のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１６０】
３３．・前記目的のヌクレオチド配列が、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質をコードし、ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする前記配列が、好ましくは、配列番号１５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含むか；または
・前記目的のヌクレオチド配列が、Ｈ３亜型ヘマグルチニン（Ｈ３）、好ましくは、ブタインフルエンザウイルスのＨ３をコードし、Ｈ３をコードする前記配列が、好ましくは、配列番号１６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含むか；または
・前記目的のヌクレオチド配列が、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）スパイク（Ｓ）タンパク質をコードし、ＰＥＤＶ  Ｓタンパク質をコードする前記配列が、好ましくは、配列番号３７または配列番号３８の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含む
項１から３２のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１６１】
３４．前記発現カセットが、
・配列番号１７もしくは配列番号１８の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列を有するポリヌクレオチド；または
・配列番号１９もしくは配列番号２０の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列を有するポリヌクレオチド；または
・配列番号３９もしくは配列番号４０の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列を有するポリヌクレオチド
からなるか、あるいは前記パラミクソウイルス科ウイルスベクターがこれを含む、項１から３３のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１６２】
３５．・配列番号２１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列；または
・配列番号２２の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列；または
・配列番号４１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列
を含む、項１１から３４のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
３６．・第４のＲＮＡ配列の５’末端に隣接する第６のＲＮＡ配列であって、配列番号２３の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含む、第６のＲＮＡ配列、および／または
・第５のＲＮＡ配列の３’末端に隣接する第７のＲＮＡ配列であって、配列番号２４の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、もしくはこれを含む、第７のＲＮＡ配列
をさらに含む、項１３から３５のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクター。
【０１６３】
３７．目的の異種ヌクレオチド配列を含み、前記目的の異種ヌクレオチド配列が、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質をコードするＣＤＶベクター。
３８．ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質をコードする、前記目的の異種ヌクレオチド配列が、配列番号１５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＲＮＡ配列からなるか、またはこれを含む、項３７に記載のＣＤＶベクター。
３９．前記ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質が、好ましくは、配列番号３５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなる、項３７または３８に記載のＣＤＶベクター。
【０１６４】
４０．・前記目的の異種ヌクレオチド配列が、ＣＤＶのＰ遺伝子とＭ遺伝子との間に配置され；かつ／または
・前記目的の異種ヌクレオチド配列が、前記異種ＲＮＡ配列の３’方向に配置された遺伝子開始（ＧＳ）配列、および／またはＣＤＶのゲノムプロモーターに作動可能に連結されている、
項３７または３９に記載のＣＤＶベクター。
４１．前記ＧＳ配列が、ＣＤＶの遺伝子の、外因性３’非コード領域に組み入れられ、ＣＤＶの遺伝子の、前記外因性３’非コード領域は、好ましくは、目的の異種ヌクレオチド配列の３’末端に隣接し、かつ／または
前記目的の異種ヌクレオチド配列が、目的のＲＮＡ配列である、項４０に記載のＣＤＶベクター。
４２．項１から４１のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクターをコードし、好ましくは、ＤＮＡ分子である核酸分子。
【０１６５】
４３．（ｉ）目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、
（ｉｉ）（ｉ）の配列の３’末端に隣接し、配列番号２５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列、
（ｉｉｉ）（ｉ）の配列の５’末端に隣接し、配列番号２６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列、および
（ｉｖ）（ｉｉｉ）の配列の５’末端に隣接し、配列番号２７の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列
を含むＤＮＡ分子、特に、項４２に記載のＤＮＡ分子。
４４．（ｖ）（ｉｉ）の配列の５’末端に隣接し、配列番号２８の配列と少なくとも６６％同一であるＤＮＡ配列、および／または
（ｖｉ）（ｉｖ）の配列の３’末端に隣接し、配列番号２８の配列と少なくとも６６％同一であるＤＮＡ配列
をさらに含む、項４３に記載のＤＮＡ分子。
【０１６６】
４５．（ｖｉｉ）（ｖ）の配列の３’末端に隣接し、配列番号２９の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＤＮＡ配列、および／または
（ｖｉｉｉ）（ｖｉ）の配列の５’末端に隣接し、配列番号３０の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列
をさらに含む、項４４に記載のＤＮＡ分子。
４６．・（ｉ）の配列が、イヌパルボウイルス（ＣＰＶ）ＶＰ２タンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、前記配列が、好ましくは、配列番号３１の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＤＮＡ配列であるか、または
・（ｉ）の配列が、Ｈ３亜型ヘマグルチニン（Ｈ３）、好ましくは、ブタインフルエンザウイルスのＨ３をコードするＤＮＡ配列であり、前記配列が、好ましくは、配列番号３２の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＤＮＡ配列であるか；または
・（ｉ）の配列が、ＰＥＤＶ  Ｓタンパク質をコードするＤＮＡ配列であり、前記配列が、好ましくは、配列番号４２または配列番号４３の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＤＮＡ配列である、
項４２から４５のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
【０１６７】
４７．・配列番号３３の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＤＮＡ配列；または
・配列番号３４の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であるＤＮＡ配列；または
・配列番号４４の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるＤＮＡ配列
を含む、項４２から４６のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子。
４８．項１から４７のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクターまたはＤＮＡ分子を含有する哺乳動物宿主細胞。
【０１６８】
４９．医薬、好ましくは、ワクチンとしての使用のための、項１から４８のいずれか１項に記載の発現カセットまたはパラミクソウイルス科ウイルスベクターまたは核酸分子。
５０．項４２から４７のいずれか１項に記載のＤＮＡ分子を含むＤＮＡ構築物。
５１．項５０に記載のＤＮＡ構築物のＲＮＡ転写物。
５２．項５０に記載のＤＮＡ構築物をトランスフェクトされた細胞。
５３．項５１に記載のＲＮＡ転写物をトランスフェクトされた細胞。
５４．異種遺伝子を含有する感染性パラミクソウイルス科ウイルスを調製するための方法、特に、項９から４１のいずれか１項に記載のパラミクソウイルス科ウイルスベクターを調製するための方法であって、
ａ．異種ＲＮＡポリメラーゼを発現させる宿主細胞を用意するステップ；
ｂ．宿主細胞に、項５０に記載のＤＮＡ構築物をトランスフェクトし、ＤＮＡ分子が、異種ＲＮＡポリメラーゼにより転写されるステップ、および
ｃ．細胞により産生されるウイルスを単離するステップ
を含む方法。
５５．免疫原性組成物またはワクチンの製造のための、項９から４１のいずれか１項に記載のベクター、または項４８、５２、および５３のいずれか１項に記載の細胞の使用。
【０１６９】
５６．免疫原性組成物であって、
感染性ウイルスおよび／または弱毒化ウイルスであってもよく、または弱毒化ウイルスおよび／または改変生ウイルスであってもよい、項９から４１のいずれか１項に記載のベクター、ならびに任意に
前記ベクターにより発現される組換えタンパク質、および／または前記ベクターにより発現される複数の組換えタンパク質を含むウイルス様粒子、ならびに任意に
薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤
を含み、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適する、免疫原性組成物。
５７．ベクターにより発現される前記組換えタンパク質が、
・ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質など、パルボウイルスＶＰ２抗原であるか、または
・インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質であり、前記エンベロープタンパク質が、Ｈ３などのヘマグルチニンであってもよい、
項５６に記載の免疫原性組成物。
５８．項３７または４１に記載のＣＤＶベクターを含むか、またはこれからなり、前記ベクターが、好ましくは、項１９から３６のいずれか１項に記載のベクターであり、
配列番号３５または配列番号３６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるポリペプチドまたは組換えタンパク質を含むか、またはこれからなってもよく、
薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤を含むか、またはこれからなってもよく、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適する、
項５６または５７に記載の免疫原性組成物。
【０１７０】
５９．項１９から３６のいずれか１項に記載のベクターを含むか、またはこれからなり、前記ベクターが、好ましくは、項３７から４１のいずれか１項に記載のベクターであり、
前記ベクターにより発現される組換えタンパク質を含むか、またはこれからなってもよく、前記組換えタンパク質が、配列番号３５または配列番号３６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなり、
薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤を含むか、またはこれからなってもよく、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適する、
項５６または５７に記載の免疫原性組成物。
【０１７１】
６０．前記ベクターにより発現される前記組換えタンパク質が、コロナウイルスＳタンパク質であり、前記コロナウイルスＳタンパク質が、ＰＥＤＶ  Ｓタンパク質であってもよい、項５６に記載の免疫原性組成物。
６１．前記ベクターにより発現される前記組換えタンパク質が、好ましくは、配列番号４５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるＰＥＤＶ  Ｓタンパク質である、項５６または６０に記載の免疫原性組成物。
６２．ワクチンまたは医薬組成物であって、
ａ．項９から４１のいずれか１項に記載のベクター、
ｂ．前記ベクターにより発現される組換えタンパク質、および／または前記ベクターにより発現される複数の組換えタンパク質を含むウイルス様粒子、
ｃ．薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤
を含み、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適し、
ｄ．前記ワクチンが、アジュバントをさらに含んでもよい、
ワクチンまたは医薬組成物。
【０１７２】
６３．ベクターにより発現される前記組換えタンパク質が、
・ＣＰＶ  ＶＰ２タンパク質など、パルボウイルスＶＰ２抗原であるか、または
・インフルエンザウイルスエンベロープタンパク質であり、前記エンベロープタンパク質が、Ｈ３などのヘマグルチニンであってもよい、
項６２に記載のワクチンまたは医薬組成物。
６４．ａ．項３７または４１に記載のＣＤＶベクターを含むか、またはこれからなり、前記ベクターが、好ましくは、項１９から３６のいずれか１項に記載のベクターであり、
ｂ．配列番号３５または配列番号３６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなポリペプチドまたは組換えタンパク質を含むか、またはこれからなり、
ｃ．薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤を含むか、またはこれからなり、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適し、
ｄ．アジュバントを含むか、またはこれからなってもよい、
項６２または６３に記載のワクチンまたは医薬組成物。
【０１７３】
６５．ａ．項１９または３６に記載のＣＤＶベクターを含むか、またはこれからなり、前記ベクターが、好ましくは、項３７から４１のいずれか１項に記載のベクターであり、
ｂ．前記ベクターにより発現される組換えタンパク質を含むか、またはこれからなり、前記組換えタンパク質が、配列番号３５または配列番号３６の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなり、
ｃ．薬学的または獣医学的に許容可能な担体または賦形剤を含むか、またはこれからなり、前記担体が、好ましくは、経口適用、皮内適用、筋内適用、または鼻腔内適用に適し、
ｄ．アジュバントを含むか、またはこれからなってもよい、
項６２または６３に記載のワクチンまたは医薬組成物。
【０１７４】
６６．前記ベクターにより発現される前記組換えタンパク質が、コロナウイルスＳタンパク質であり、前記コロナウイルスＳタンパク質が、ＰＥＤＶ  Ｓタンパク質であってもよい、項６２に記載のワクチンまたは医薬組成物。
６７．前記ベクターにより発現される前記組換えタンパク質が、好ましくは、配列番号４５の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、またはこれからなるＰＥＤＶ  Ｓタンパク質である、項６２または６６に記載のワクチンまたは医薬組成物。
６８．前記ベクターが、項２７に記載のベクターである、項５６から６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２から６７のいずれか１項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
６９．前記ベクターが、項２８に記載のベクターである、項５６から６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２から６７のいずれか１項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
【０１７５】
７０．前記ベクターが、項２９に記載のベクターである、項５６から６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２から６７のいずれか１項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
７１．感染と関連するか、またはこれにより引き起こされる、１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を軽減するための免疫原性組成物またはワクチンを調製するための方法であって、
ａ．哺乳動物宿主細胞に、項９から４１のいずれか１項に記載のベクターを感染させるステップ、
ｂ．感染細胞を、適切な条件下で培養するステップ、
ｃ．感染細胞培養物を回収するステップ、
ｄ．任意に、ステップｃ）の、回収された感染細胞培養物を精製するステップ、
ｅ．任意に、前記回収された感染細胞培養物を、薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含む方法。
【０１７６】
７２．前記免疫原性組成物または前記ワクチンが、特に、動物において、
・イヌジステンパーウイルス（ＣＤＶ）および／もしくはイヌパルボウイルス（ＣＰＶ）の感染、または
・Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、およびＣ型インフルエンザウイルスからなる群から選択されてもよく、Ａ型インフルエンザウイルスが、好ましくは、インフルエンザウイルスＨ３Ｎ２、Ｈ３Ｎ１、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ３、およびＨ９１１の群から選択されるインフルエンザウイルスの感染、または
・アルパカコロナウイルス、アルファコロナウイルス１、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ブタ伝染性下痢ウイルス（ＰＥＤＶ）、ヒトコロナウイルスＯＣ４３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、マウスコロナウイルス、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＳＡＲＳ−ＣｏＶ）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ−ＣｏＶ）、およびトリ感染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）からなる群から選択されてもよいコロナウイルスの感染
と関連するか、またはこれにより引き起こされる、１つまたは複数の臨床徴候の重症度を軽減する、項７１に記載の方法。
【０１７７】
７３．動物における少なくとも１つの病原体の感染により引き起こされる、臨床徴候もしくは疾患を軽減もしくは防止する方法、または動物における少なくとも１つの病原体の感染を処置もしくは防止する方法であって、好ましくは、前記動物が、イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および／または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物、あるいはイノシシ科動物などの食料生産動物である方法における使用のための、項５６から６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２から６７のいずれか１項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
７４．・少なくとも１つの病原体の前記感染が、ＣＤＶおよび／もしくはＣＰＶの感染であってもよいか、
・少なくとも１つの病原体の前記感染が、ブタインフルエンザウイルスの感染であってもよく、ブタインフルエンザウイルスが、Ｈ３亜型のインフルエンザウイルスであってもよく、前記Ｈ３亜型のインフルエンザウイルスが、好ましくは、Ｈ３Ｎ２亜型もしくはＨ３Ｎ１亜型のブタインフルエンザウイルスであるか、または
・少なくとも１つの病原体の前記感染がＰＥＤＶの感染であってもよい、
項７３に記載の使用のための、項５６から６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２から６７のいずれか１項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
【０１７８】
７５．動物、好ましくは、イヌ科動物において、ＣＰＶおよびＣＤＶに対する免疫応答を誘導するための方法、または
ブタにおいて、ブタインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導するための方法であって、ブタインフルエンザウイルスが、Ｈ３亜型のインフルエンザウイルスであってもよく、前記Ｈ３亜型のインフルエンザウイルスが、好ましくは、Ｈ３Ｎ２亜型またはＨ３Ｎ１亜型のブタインフルエンザウイルスである方法、または
ブタ、特に、好ましくは、妊娠した雌ブタにおいて、ＰＥＤＶに対する免疫応答を誘導するための方法
における使用のための、項５６から６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２から６７のいずれか１項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
７６．免疫原性組成物が投与された雌ブタにより授乳される子ブタにおける、ＰＥＤＶの感染により引き起こされる臨床徴候または疾患を軽減または防止する方法における使用のための、項５６、６０、および６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２、６６、および６７のいずれか１項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
７７．項７６に記載の使用のための免疫原性組成物であって、前記雌ブタが、特に、前記子ブタを妊娠している間に、免疫原性組成物が投与された雌ブタである免疫原性組成物。
７８．前記免疫原性組成物または前記ワクチンまたは医薬組成物が、経粘膜投与、好ましくは、鼻腔内投与される、項７３から７７のいずれか１項に記載の使用のための、項５６から６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２から６７のいずれか１項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
【０１７９】
７９．前記免疫原性組成物または前記ワクチンまたは医薬組成物が、前記雌ブタに、経粘膜投与、好ましくは、鼻腔内投与される、項７５から７７のいずれか１項に記載の使用のための、項５６から６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２から６７のいずれか１項に記載のワクチンもしくは医薬組成物。
８０．イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および／または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物、あるいはイノシシ科動物を含む食料生産動物などの動物を、動物における少なくとも１つの病原体により引き起こされる臨床疾患に対して免疫化する方法であって、動物に、項５６から６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２から６７のいずれか１項に記載のワクチンもしくは医薬組成物を投与するステップを含み、前記免疫原性組成物またはワクチンが、感染の臨床徴候を引き起こさず、動物を、前記少なくとも１つの病原体の病原性形態に対して免疫化する免疫応答を誘導することが可能である方法。
８１．前記少なくとも１つの病原体が、ＣＤＶもしくはＣＰＶ、またはＳｗＩＶもしくはＰＥＤＶであるか、あるいは
前記少なくとも１つの病原体が、ＣＤＶおよびＣＰＶである、
項８０に記載の方法。
【０１８０】
８２．雌ブタにおける、ＰＥＤＶに特異的な抗体の産生を誘導するための方法であって、項５６、６０、および６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２、６６、および６７のいずれか１項に記載のワクチンもしくは医薬組成物を、前記雌ブタに投与するステップを含む方法。
８３．子ブタにおける、ＰＥＤＶの感染により引き起こされる臨床徴候または疾患を軽減または防止する方法であって、
・項５６、６０、および６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２、６６、および６７のいずれか１項に記載のワクチンもしくは医薬組成物を、雌ブタに投与するステップ、および
・前記子ブタが、前記雌ブタにより授乳されることを可能とするステップ
を含む方法。
８４．前記雌ブタが、特に、前記ブタを妊娠している雌ブタである、項８３に記載の方法。
【０１８１】
８５．・項５６、６０、および６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２、６６、および６７のいずれか１項に記載のワクチンもしくは医薬組成物を、前記子ブタを妊娠している雌ブタに投与するステップ、
・前記雌ブタが、前記子ブタを出産することを可能とするステップ、および
・前記子ブタが、前記雌ブタにより授乳されることを可能とするステップ
を含む、
項８３または８４に記載の方法。
８６．前記免疫原性組成物または前記ワクチンまたは医薬組成物が、前記雌ブタに、経粘膜投与、好ましくは、鼻腔内投与される、項８２から８５のいずれか１項に記載の方法。
８７．動物における少なくとも１つの病原体と関連する疾患に対する免疫応答を誘導するか、あるいは動物における少なくとも１つの病原体と関連する疾患に対して、動物、好ましくは、イヌ科動物もしくはネコ科動物などの愛玩動物、および／または他の任意の肉食家畜もしくは野生の肉食動物、あるいはイノシシ科動物またはウシなどの食料生産動物にワクチン接種し、かつ／あるいは前記病原体と関連するか、またはこれらにより引き起こされる、１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を軽減するためのキットであって、
ａ）前記動物にワクチンを投与することが可能なシリンジまたは分注器；および
ｂ）項５６から６１のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、または項６２から６７のいずれか１項に記載のワクチン、および
ｃ）任意に、指示書の小冊子
を含み、
前記少なくとも１つの病原体が、好ましくは、ＣＤＶおよび／もしくはＣＰＶであるか、
または前記少なくとも１つの病原体が、ＳｗＩＶもしくはＰＥＤＶであってもよい、キット。
【０１８２】
８８．前記免疫原性組成物が、項６８に記載の免疫原性組成物であり、前記少なくとも１つの病原体が、目的のヌクレオチド配列によりコードされるその抗原が由来する、前記疾患原因物質である、項７１または７２に記載の方法、項７３から７９のいずれか１項に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチンもしくは医薬組成物、項８０から８６のいずれか１項に記載の方法、あるいは項８７に記載のキット。
８９．前記免疫原性組成物が、項６９に記載の免疫原性組成物であり、前記少なくとも１つの病原体が、前記パラミクソウイルス科ウイルス、および目的のヌクレオチド配列によりコードされるその抗原が由来する、前記疾患原因物質である、項７１または７２に記載の方法、項７３から７９のいずれか１項に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチンもしくは医薬組成物、項８０から８６のいずれか１項に記載の方法、あるいは項８７に記載のキット。
【０１８３】
９０．前記免疫原性組成物が、項７０に記載の免疫原性組成物であり、前記少なくとも１つの病原体が、前記パラミクソウイルス科ウイルス、および目的のヌクレオチド配列によりコードされるその抗原が由来する、前記疾患原因物質である、項７１または７２に記載の方法、項７３から７９のいずれか１項に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチンもしくは医薬組成物、項８０から８６のいずれか１項に記載の方法、あるいは項８７に記載のキット。
９１．前記免疫原性組成物が、項７０に記載の免疫原性組成物であり、前記少なくとも１つの病原体が、ＣＤＶおよびＣＰＶである、項７１または７２に記載の方法、項７３から７９のいずれか１項に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチンもしくは医薬組成物、項８０から８６のいずれか１項に記載の方法、あるいは項８７に記載のキット。
９２．前記動物が、イヌ科動物であり、前記イヌ科動物が、好ましくは、イヌである、項７２、８０、８１、および８８から９１のいずれか１項に記載の方法。
９３．前記動物が、ネコ科動物であり、前記ネコ科動物が、好ましくは、ネコである、項７２、８０、８１、および８８から９１のいずれか１項に記載の方法。
【０１８４】
９４．前記動物が、イヌ科動物であり、前記イヌ科動物が、好ましくは、イヌである、項７３から７５および８８から９１のいずれか１項に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチンもしくは医薬組成物。
９５．前記動物が、ネコ科動物であり、前記ネコ科動物が、好ましくは、ネコである、項７３から７５および８８から９１のいずれか１項に記載の使用のための免疫原性組成物またはワクチンもしくは医薬組成物。
９６．前記動物が、イヌ科動物であり、前記イヌ科動物が、好ましくは、イヌである、項８７および８８から９１のいずれか１項に記載のキット。
９７．前記動物が、ネコ科動物であり、前記ネコ科動物が、好ましくは、ネコである、項８７および８８から９１のいずれか１項に記載のキット。
【０１８５】
参考文献
以下の参考文献は、それらが、本明細書で明示される詳細に対して補完的な、例示的な、手順上または他の詳細を提示する程度において、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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