(57)【要約】  本発明は、脂質代謝に影響を与え、それにより、肥満、2型糖尿病(T2D)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性膵疾患、及び肪性腎疾患を含むがそれらに限定されない複数のヒト疾患と強い関連性を有し得る化合物を特定する方法に関する。より具体的には、本発明は、ヒトキナーゼ哺乳動物Sterile20様3(MST3=STK24)の発現又は活性の調整剤を特定する方法、及び代謝性疾患の処置に使用するためのそのような調整剤、特にオリゴヌクレオチドに関する。
2020533013.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物MST3、好ましくはヒトMST3の使用を含む、哺乳動物の脂質代謝を調整することができる薬剤を特定する方法。
【請求項２】
MST3活性及び/又はMST3発現の判定を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
MST3活性又はMST発現が、MST3を発現する哺乳動物細胞において判定される、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
(i)候補化合物調整剤を、MST3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現する宿主細胞と接触させる工程と、
(ii)前記候補化合物調整剤のMST3の活性及び/又は発現に対する効果を判定し、それによって、前記化合物をMST3調整剤として特定し、それによって、前記化合物を哺乳動物の脂質代謝の潜在的調整剤として特定する工程と
を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
MST3活性が、脂質沈着、脂質異化、例えば、脂肪酸酸化及び/若しくは脂質分泌、並びに/又は脂質同化、例えば、脂質取り込み及び/若しくは脂質合成、並びに/又はインスリン刺激によるグルコース取り込み(ISGU)の測定によって判定される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
MST3発現が、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)、ウェスタンブロット、又は近接ライゲーションアッセイ(PLA)を使用して判定される、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
(i)候補化合物調整剤をMST3ポリペプチドと接触させる工程と、
(ii)前記候補化合物調整剤のMST3の活性に対する効果を判定し、それによって、前記化合物をMST3調整剤として特定し、それによって、前記化合物を哺乳動物の脂質代謝の潜在的調整剤として特定する工程と
を含む、請求項2に記載の方法。
【請求項８】
MST3活性が、MST3ペプチド基質のリン酸化のレベルの測定によって判定される、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
候補化合物のMST3との結合の判定を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項１０】
(i)候補化合物調整剤をMST3ポリペプチドと接触させる工程と、
(ii)前記候補化合物調整剤のMST3との結合を判定し、それによって、前記化合物をMST3結合剤として特定し、それによって、前記化合物を哺乳動物の脂質代謝の潜在的調整剤として特定する工程と
を含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記MST3ポリペプチドが、組換えにより製造され、精製されたMST3ポリペプチドである、請求項7から10のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
代謝性疾患の処置に使用するための、配列番号1の核酸配列又はその相補配列にハイブリダイズ可能な配列を含む、8〜80塩基長からなるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドからなる化合物。
【請求項１３】
前記代謝性疾患が、肥満、2型糖尿病(T2D)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性膵疾患、及び脂肪性腎疾患から選択される、請求項12に記載の使用のための化合物。
【請求項１４】
代謝性疾患の処置のための方法であって、配列番号1の核酸配列又はその相補配列にハイブリダイズ可能な配列を含む、医薬有効量の8〜80塩基長からなるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを、そのような処置を必要とする対象に投与する工程を含む、方法。
【請求項１５】
前記代謝性疾患が、肥満、2型糖尿病(T2D)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性膵疾患、及び脂肪性腎疾患から選択される、請求項14に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質代謝に影響を与え、それにより、肥満、2型糖尿病(T2D)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性膵疾患、及び肪性腎疾患を含むがそれらに限定されない複数のヒト疾患と強い関連性を有し得る化合物を特定する方法に関する。より具体的には、本発明は、ヒトキナーゼ哺乳動物Sterile20様3(MST3)の発現又は活性の調整剤(modulators)を特定する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトキノームは、酵母Sterile20キナーゼに因んで命名された、いわゆる「STE」キナーゼの大きなグループを特徴としている。STEスーパーファミリーには、いくつかのサブファミリーが含まれるが、そのうちの1つは、「哺乳動物Sterile20様」(MST)ファミリーと命名されている(Creasyら、1996)。哺乳動物には、MST1(別名STK4)、MST2(別名STK3)、MST3(別名STK24)、MST4、及びYSK1(別名STK25又はSOK1)の5つのMSTキナーゼが存在する。これら5つの哺乳動物MSTキナーゼは、それらそれぞれの調節、基質、及び機能によって、MST1/2、MST3/4、及びYSK1の3つのサブグループに広く分類することができる(Thompson及びSahai、2015)。
【０００３】
MST1及びMST2は、成長制御、増殖、及び遊走の調節に関与することが明らかにされている。MST3及びMST4は、細胞遊走、細胞極性、及びアポトーシスに影響を与えることが明らかにされている。
【０００４】
YSK1は、最近、脂質及びグルコース代謝の調節因子であることが示されている(Nerstedtら、2012)。
【０００５】
細胞極性及び遊走の調節におけるMST3の役割
MST3は、多くの状況で、アクチンダイナミクスを調節することが示されている。発達中の神経系では、MST3は、樹状突起スパインの維持に必要とされ、また、糸状仮足の形成を制限する(Ultanirら、2014)。また、MST3は、他の細胞型では、アクチン依存性の突起を制限する。このことは、MST3を枯渇させた場合に、2D表面での遊走の増加をもたらすが、3Dマトリックスでは間隙をすり抜けられなくすると示唆されている(Luら、2006、Madsenら、2015)。
【０００６】
哺乳動物細胞培養研究もまた、MST3が細胞極性の調節に関与することを示している。MST3は、おそらくStriatinタンパク質との相互作用により、ゴルジ体に局在し得る(Luら、2006)。CCM3又はMo25との相互作用は、MST3のゴルジ体から原形質膜への移動をトリガーする。
【０００７】
アポトーシスの調節におけるMST3の役割
MST3は、カスパーゼで切断することができる(Leeら、1998、Leeら、2001)。この切断は、アミノ酸313で生じ、N末端キナーゼドメインをC末端調節配列から分離する。これは、活性キナーゼドメインの核内蓄積をもたらすが、これはアポトーシスを促進し得る(Huangら、2002、Leeら、2004)。
【０００８】
疾患におけるMST3の役割
細胞遊走におけるその役割と一致して、MST3は、がんとの関与が示されている。CCM3が細胞皮質においてMST3の活性を促進し、そこでMSTが、ERMタンパク質及びMLCのリン酸化を調整し、がん細胞が小さな間隙をすり抜けられるようにする(Madsenら、2015、Tozluogluら、2015)。
【０００９】
哺乳動物細胞におけるプロテオミクス研究により、STRIPAK複合体と称される巨大なPP2A複合体の成分として、MST3が同定された(Glatterら、2009、Keanら、2011)。最近では、がんゲノムシーケンシングが、STRIPAK複合体のがんとの関与を示している。FAM40Bは、高い頻度で変異し、その変異の数とタイプは、これが発癌機能を有することを示唆している(Davoliら、2013)。腫瘍中に見られるFAM40Bのトランケーション変異体の分析は、それらが、PP2Aの触媒サブユニットに結合できず、MST3を負に調節することができない可能性があることを示している(Madsenら、2015)。
【００１０】
MST3の調節不全はまた、血管内皮形成異常の病理とも関与している(Stocktonら、2010、Zhengら、2010)。
【００１１】
脂質代謝におけるMST3の役割
従来技術は、脂質代謝におけるMST3の役割を明らかにしていない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Creasyら、1996
【非特許文献２】Thompson及びSahai、2015
【非特許文献３】Nerstedtら、2012
【非特許文献４】Ultanirら、2014
【非特許文献５】Luら、2006
【非特許文献６】Madsenら、2015
【非特許文献７】Leeら、1998
【非特許文献８】Leeら、2001
【非特許文献９】Huangら、2002
【非特許文献１０】Leeら、2004
【非特許文献１１】Tozluogluら、2015
【非特許文献１２】Glatterら、2009
【非特許文献１３】Keanら、2011
【非特許文献１４】Davoliら、2013
【非特許文献１５】Stocktonら、2010
【非特許文献１６】Zhengら、2010
【発明の概要】
【００１３】
本発明者は、哺乳動物の脂質代謝におけるMST3の役割を特定した。より具体的には、本発明者は、MST3が、哺乳動物細胞系における脂質分配の調節に関与していること、また、MST3が、脂肪毒性が生じやすい末梢組織における脂質利用と脂質貯蔵との間の代謝の動的平衡を制御し、それにより、肥満、2型糖尿病(T2D)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性膵疾患、及び脂肪性腎疾患を含むがそれらに限定されない複数のヒト疾患と強い関連性を有するインスリン感受性を調節すると考えられることに気付いた。
【００１４】
したがって、一態様において、本発明は、哺乳動物の脂質代謝の調整剤を特定する方法を提供する。
【００１５】
本方法は、哺乳動物MST3、好ましくは、ヒトMST3の使用を含む。
【００１６】
本方法は、MST3活性及び/又はMST3発現の判定を含んでもよい。
【００１７】
MST3活性及び/又はMST3発現は、MST3を発現する哺乳動物細胞において判定することができる。哺乳動物細胞は、構成的MST3発現を有する細胞、又は組換えMST3を過剰発現する細胞であってもよい。
【００１８】
哺乳動物細胞は、ヒト細胞又はげっ歯類細胞であってもよい。
【００１９】
一実施形態では、本発明による方法は、MST3の活性及び/又は発現を調整することができる薬剤を特定する方法を含み、この方法は、
(i)候補化合物調整剤を、MST3ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現する宿主細胞と接触させる工程と、
(ii)候補化合物調整剤のMST3の活性及び/又は発現に対する効果を判定し、それによって、その化合物をMST3調整剤として特定し、それによって、その化合物を哺乳動物の脂質代謝の潜在的調整剤として特定する工程と
を含む。
【００２０】
MST3活性は、脂質沈着、脂質異化、例えば、脂肪酸酸化及び/若しくは脂質分泌、並びに/又は脂質同化、例えば、脂質取り込み及び/若しくは脂質合成の測定によって判定することができる。脂質沈着はインスリン感受性を調節することから、インスリン刺激によるグルコース取り込み(ISGU)のようなインスリン感受性パラメータもまた、MST3活性の尺度として使用することができる。
【００２１】
MST3発現は、定量的リアルタイムPCR(qRT-PCR)、ウェスタンブロット、又は近接ライゲーションアッセイ(PLA)のような技法を用いて判定することができる。
【００２２】
別の実施形態では、本発明による方法は、MST3の活性を調整することができる薬剤を特定する方法を含み、この方法は、
(i)候補化合物調整剤をMST3ポリペプチドと接触させる工程と、
(ii)候補化合物調整剤のMST3活性に対する効果を判定し、それによって、その化合物をMST3調整剤として特定し、それによって、その化合物を哺乳動物の脂質代謝の潜在的調整剤として特定する工程と
を含む。
【００２３】
MST3活性は、MST3ポリペプチド、好ましくは、組換えにより製造され、精製されたMST3ポリペプチド、及びMST3ペプチド基質を使用し、MST3活性の尺度として、ペプチド基質のリン酸化レベルを判定することによって、判定することができる。
【００２４】
また別の実施形態では、本発明による方法は、MST3の活性を調整することができる薬剤を特定する方法を含み、この方法は、
(i)候補化合物調整剤をMST3ポリペプチドと接触させる工程と、
(ii)候補化合物調整剤のMST3との結合を判定し、それによって、その化合物をMST3結合剤として特定し、それによって、その化合物を哺乳動物の脂質代謝の潜在的調整剤として特定する工程と
を含む。
【００２５】
MST3結合は、MST3ポリペプチド、好ましくは、組換えにより製造され、精製されたMST3ポリペプチド、及び候補化合物を使用し、Olesenら、2016により記載されているように、MST3の融解温度に対する化合物の影響を判定することによって、判定することができる。
【００２６】
MST3ポリペプチドは、ヒトMST3であってもよい。ヒトMST3のアミノ酸配列は、例えば、UniProtKBデータベース受託番号-Q9Y6E0(STK24_HUMAN)及びNCBI GenBankデータベース受託番号NP_003567に見い出すことができ、本明細書では、配列番号2とする。
【００２７】
本発明によるMST3ポリペプチドは、配列番号2によるアミノ酸配列、又は配列番号2によるアミノ酸配列との配列同一性が少なくとも80%のその変異体、又はその機能的に活性な断片を含んでもよい。
【００２８】
MST3の機能的に活性な断片は、配列番号2によるアミノ酸配列を有するMST3ポリペプチドのMST3キナーゼ活性と比較して、少なくとも90%のMST3キナーゼ活性、例えば、少なくとも80%、少なくとも70%、少なくとも60%、又は少なくとも50%のMST3キナーゼ活性を保持するMST3ポリペプチドとして定義される。
【００２９】
MST3の調整剤をスクリーニングする方法は、組換えにより製造され、精製されたMST3ポリペプチド、及びMST3ペプチド基質の使用に基づいてもよい。酵素アッセイ、例えば、TR-FRET又はADP hunterアッセイをMST3アッセイ用に適合させて、ペプチド基質のリン酸化レベルを判定するために使用することができる。
【００３０】
特定された調整剤の選択性は、標準的なラジオメトリックフィルタープレートアッセイを用いて、キナーゼパネルに対して評価することができる。表面プラズモン共鳴法(SPR)を使用して、候補化合物のMST3との結合を評価することもできる。
【００３１】
本発明による方法でテストすることができる候補化合物には、「小分子」として一般に知られている、単純な有機分子、例えば、分子量が2000ダルトン未満のものが含まれる。本方法はまた、化合物ライブラリー、例えば、合成ペプチドライブラリー及びペプチドファージライブラリーを含むペプチドライブラリーをスクリーニングするためにも使用することができる。
【００３２】
MST3活性の調整剤、すなわち、阻害因子又は刺激因子が特定されると、次いで、医薬品化学技術を使用して、その特性を更に改良してもよく、例えば、有効性を向上させ、及び/又は副作用を減少させることができる。
【００３３】
その他の適切な候補分子としては、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチド、例えば、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及びアンチセンスRNA又はDNA、並びにMST3の活性及び/又は発現を調整することができる可能性があるその他任意の分子が挙げられる。
【００３４】
ヒトMSTをコードするcDNA配列は、例えば、NCBI GenBankデータベース受託番号NM_003576に見い出すことができ、本明細書では、配列番号1とする。
【００３５】
好適なオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、8〜80塩基長からなり、配列番号1の核酸配列にハイブリダイズ可能な配列を含む。
【００３６】
本発明を実施するために使用することができる当該技術分野で公知の方法は、多数存在することが理解されるであろう。MST3調整剤を特定するために使用することができる適切な方法の例としては、平衡結合混合物の急速濾過、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)及び蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ(FRET)、シンチレーション近接アッセイ(SPA)、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)、クロマチン免疫沈降分析(ChIP)、表面プラズモン共鳴法(SPR)、qRT-PCR、ウェスタンブロット、及びPLAアッセイが挙げられる。
【００３７】
第2の態様では、本発明は、代謝性疾患を処置するための化合物、医薬組成物、及び方法を提供する。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、代謝性疾患の処置に使用するための、配列番号1の核酸配列又はその相補配列にハイブリダイズ可能な配列を含む、8〜80塩基長からなるオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを提供する。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、代謝性疾患の処置に使用するための、配列番号1の核酸配列又はその相補配列にハイブリダイズ可能な配列を含む、8〜80塩基長からなるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドを含む、医薬組成物を提供する。
【００４０】
別の実施形態では、本発明は、代謝性疾患の処置用の医薬の製造に使用するための、配列番号1の核酸配列又はその相補配列にハイブリダイズ可能な配列を含む、8〜80塩基長からなるオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドを提供する。
【００４１】
また別の実施形態では、本発明は、代謝性疾患の処置のための方法であって、配列番号1の核酸配列又はその相補配列にハイブリダイズ可能な配列を含む、8〜80塩基長からなるオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドの医薬有効量を、そのような処置を必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【００４２】
代謝性疾患は、限定するものではないが、肥満、2型糖尿病(T2D)、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、脂肪性膵疾患、及び脂肪性腎疾患から選択することができる。
【００４３】
好適なオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、dsRNA、siRNA、shRNA、miRNA、及びアンチセンスRNA又はDNAである。
【００４４】
オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、8〜80塩基長、好ましくは、8〜70、8〜60、8〜50、8〜40、又は8〜30塩基長であってもよい。
【００４５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド中のヌクレオチドは、RNA残基、DNA残基、又はヌクレオチドアナログであってもよい。
【００４６】
アンチセンスオリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、ペプチド核酸(PNA)、ホスホロジミデートモルホリノオリゴマー(PMO)、及びホスホロチオエートオリゴヌクレオチド(PS-ODN)からなる群から選択することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１−１】［図１−１］は、４つの画像で構成される図１の１枚目の画像を表す。図１は、ヒト肝細胞中のMST3を枯渇させると、β酸化及びトリアシルグリセロール(TAG)分泌が増加し、併せて脂質の取り込み及び合成が抑制されることにより、脂質蓄積が抑制されることを示す図である。不死化ヒト肝細胞(IHH)にMST3又は非標的化コントロール(NTC)低分子干渉RNA(siRNA)をトランスフェクトし、オレイン酸(OA)の存在下及び基本条件下の48時間のインキュベーション後に評価を実施した。(A)抗MST3抗体による代表的なウェスタンブロット。ローディングコントロールとしてアクチンを使用した。(B)中性脂質のオイルレッドO染色。代表的な細胞画像が示されている(スケールバーは100μm)。(C)リピドミクス分析。
【数１】
2020533013.tif 000003
NTC siRNA基本、
【数２】
2020533013.tif 000004
MST3 siRNA基本、□NTC siRNA+OA、
■MST3 siRNA+OA
(D)放射標識パルミテートの酸化。
(E)培地中への[3H]TAGの分泌。-□-NTC siRNA、-■-MST3 siRNA
(F)OAの取り込み。-△-NTC siRNA基本、-▲-MST3 siRNA基本、-□-NTC siRNA+OA、-■-MST3 siRNA+OA。
(G)[14C]標識OAからのTAG合成。
(H)[14C]標識グルコースからのTAG合成。
(C〜E)及び(G〜H)については、結果は、8〜10細胞培養物皿ウェルの平均±SEMである。(D〜E)及び(G〜H)については、OAとのインキュベーション48時間後にのみ評価を行なった。
CE、コレステリルエステル;Cer、セラミド;LPC、リゾホスファチジルコリン;NEFA、非エステル化脂肪酸;NTC、非標的化コントロール;OA、オレイン酸;PC、ホスファチジルコリン;PE、ホスファチジル-エタノールアミン;RFU、相対蛍光単位;SM、スフィンゴミエリン;TAG、トリアシルグリセロール。*p<0.05;**p<0.01((C)では、各試験条件でMST3 siRNAとNTC siRNAを比較した統計的有意差のみを示す)
【図１−２】［図１−２］は、４つの画像で構成される図１の２枚目の画像を表す。
【図１−３】［図１−３］は、４つの画像で構成される図１の３枚目の画像を表す。
【図１−４】［図１−４］は、４つの画像で構成される図１の４枚目の画像を表す。
【図２】ヒト肝細胞における脂肪蓄積を調節するMST3の機能の概略図である。siRNAによりMST3を枯渇させると、NTC siRNAをトランスフェクトした細胞と比較して、β酸化及びVLDL-TAG分泌が増加することにより脂肪滴の異化が亢進され、遊離脂肪酸(FFA)取り込み及びTAG合成が抑制されることにより、脂肪滴の同化が抑えられる。その結果、MST3欠失は、細胞内TAG含有量の低下及び脂肪滴サイズの減少につながる。ER、小胞体;FFA、遊離脂肪酸;LD、脂肪滴、NTC、非標的化コントロール;TAG、トリアシルグリセロール;VLDL、超低密度リポタンパク質。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００４８】
材料及び方法
不死化ヒト肝細胞(IHH、ヒト由来の肝細胞株)を、ウシインスリン(20U/l、Sigma-Aldrich社、ミズーリ州セントルイス、米国)及びデキサメタゾン(50nmol/1、Sigma-Aldrich社)を添加した完全ウィリアムE培地(Gibco社、ペーズリー、英国)に維持した。培地には、10%(vol./vol.)ウシ胎児血清(FBS)、L-グルタミン(2mmol/l)、及び1%(vol./vol.)ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco社)も添加した。トランスフェクション後、細胞をオレイン酸(OA)と共に48時間インキュベートしたが、これは、インビトロで脂肪症を効果的に誘発することが知られている(Amrutkarら、2016)。
【００４９】
MST3枯渇
製造業者の説明書に従って、Lipofectamine RNAiMax(Invitrogen社、カリフォルニア州サンディエゴ、米国)を使用して、低分子干渉RNA(siRNA)法によりMST3を枯渇させた。抗MST3抗体を用いたウェスタンブロットにより、有効な標的枯渇が確認された。
【００５０】
脂質貯蔵の測定
脂質貯蔵を測定するために、以前に記載されているように(Amrutkarら、2016)、トランスフェクト細胞の中性脂質をオイルレッドOで染色した。更に、リピドミクス分析のために、Folch法(Folchら、1957)を用いて脂質を抽出し、超高速液体クロマトグラフィー/質量分析法及び直接注入質量分析法(Stahlmanら、2013)を用いて定量化した。
【００５１】
脂肪酸酸化の測定
β酸化を測定するために、以前に記載されているように(Nerstedtら、2012)、トランスフェクト細胞を[9,10-3H(N)]-パルミチン酸の存在下でインキュベートし、遊離脂肪酸酸化の生成物として[3H]標識水を測定した。
【００５２】
トリアシルグリセロール分泌の測定
トリアシルグリセロール(TAG)分泌を測定するために、トランスフェクト細胞をパルス培地[18,500Bq/mlの[3H]OA (PerkinElmer社、マサチューセッツ州ウォルサム、米国)、360μmol/lのOA(Sigma-Aldrich社)、及び1%vol./vol.の脂肪酸非含有BSAを含む完全ウィリアムE]と共に8時間インキュベートした後、チェイス培地(30%vol./vol.の脂肪酸非含有BSAを添加した完全ウィリアムE)と共に最大8時間インキュベートした。脂質抽出のために培地を回収してから、シリカゲルプレートでの薄層クロマトグラフィーにより脂質を分離した。放射標識TAGをヨウ素蒸気によって検出し、シンチレーションカウンターにより定量化した。
【００５３】
オレイン酸取り込みの測定
製造業者の説明書に従って、Quencher-Based Technology(QBT) Fatty Acid Uptake Assay Kit(Molecular Devices社、カリフォルニア州サンノゼ、米国)を使用して、オレイン酸(OA)取り込みを測定した。
【００５４】
オレイン酸及びグルコースのトリアシルグリセロールへの取り込み
[14C]OA及び[14C]グルコースのTAGへの取り込みは、以前に記載されているように(Amrutkarら、2016)測定した。
【００５５】
マウス肝臓の脂肪滴における液体クロマトグラフィー質量分析法(LC-MS)による分析
C57BL6/Jの遺伝子背景を有する雄マウスに、16〜18週間にわたり、ペレット状高脂肪飼料(キロカロリーの45%が脂肪由来、D12451、Research Diets社、ニュージャージー州ニューブランズウィック、米国)を与えた。マウスを屠殺し、Zhangらの方法(Zhangら、2011)を使用して、摘出したばかりの肝臓から脂肪滴(LD)を単離した。LC-MS分析は、以前に記載されているように(Chursaら、2017)実施したが、以下の変更を加えた。ProteoExtract Kit(Millipore社、マサチューセッツ州バーリントン、米国)を使用して、LD抽出物からタンパク質を沈殿させ、バッファー[50mmol/lの重炭酸トリエチルアンモニウム(TEAB)、4%SDS]に溶解してから、タンパク質濃度判定を実施した。Pierce High pH Reversed-Phase Peptide Fractionation Kitを使用して、総タンパク質TMT10-plexセットを8画分に分画してから、LC-MS分析を実施した。
【００５６】
結果
MST3は、マウス肝臓の脂肪滴と関連する。
高脂肪飼料を与えたマウスの肝臓から単離した脂肪滴(LD)において、LC-MS法による包括的なホスホプロテオミクスを実施して、肝LDプロテオームの有効な構成要素を特定した。この単離手順によって調製されたLD画分は、LD常在タンパク質が相対的に豊富であり、他の細胞内区画に対応するマーカーが存在しないことにより評価した際におおむね不純物を含まないことが、以前に示されている(Zhangら、2011)。注目すべきことに、Zhangは、LD画分の成分としてMST3を同定していない。
【００５７】
驚くべきことに、本研究は、MST3並びにホスホ-MST3(Thr172)が、LD画分に存在することを証明したが、このことは、このキナーゼがマウス肝臓のLDと関連することのはじめての証拠となる。
【００５８】
ヒト肝細胞中のMST3を枯渇させると、β酸化及びTAG分泌が増加し、併せて遊離脂肪酸の取り込み及び脂質の合成が抑制されることにより、脂質蓄積が抑制される。
MST3は、その肝LDへの細胞内局在性から、肝脂質代謝を調節するものと判断される。肝臓における脂質異化及び同化に対するMST3の影響の可能性を調べるために、ヒトIHHにMST3特異的siRNA又はNTC siRNAをトランスフェクトした。MST3 siRNAをトランスフェクトした細胞では、ウェスタンブロットにより評価されるMST3のタンパク質レベルは、著しく低下していた(図1A)。
【００５９】
代謝評価の前に、トランスフェクト細胞をOAと共に48時間インキュベートしたが、これは、インビトロで脂肪症を効果的に誘発することが知られている。とりわけ、細胞脂質貯蔵及びFFA取り込みを、OAインキュベーションを実施した場合と実施していない場合の双方について検討した。
【００６０】
MST3のノックダウンにより、中性脂質のオイルレッドO染色により評価される肝細胞内の脂質蓄積は、著しく低下した(図1B)。また、リピドミクス分析でも、NTC siRNAと比較して、MST3 siRNAをトランスフェクトした細胞では、いくつかの脂質種のレベルが著しく低いことが確認されたが、これは、基本条件下及びOA負荷後の双方において明白であった(図1C)。siRNAが媒介するMST3のサイレンシングは、β酸化の顕著な増加をもたらした(図1D)。更に、培地へのTAGの分泌は、MST3 siRNAをトランスフェクトした細胞で著しく高かった(図1E)。また、MST3欠損細胞では、FFA流入の顕著な減少も認められ(図1F)、培地由来の[14C]標識OA及び[14C]標識グルコースの細胞内TAGへの取り込みは、MST3を枯渇させた肝細胞において低下した(図1G〜H)。
【００６１】
考察
本研究において、本発明者は、MST3が肝臓の細胞内脂肪滴と関連することのはじめての証拠を提供する。かつては不活性なエネルギー貯蔵庫に過ぎないと考えられていた肝脂肪滴は、ミトコンドリアβ酸化及び超低密度リポタンパク質(VLDL)-トリアシルグリセロール(TAG)分泌の基質を提供し、肝臓の脂質分配の調節において重要な役割を担う細胞小器官としてますます認識されるようになってきた(Mashekら、2015)。
その肝脂肪滴への局在性から、本発明者らは、MST3が肝脂質貯蔵を調節すると仮定した。実際、ヒト培養肝細胞におけるMST3のsiRNAノックダウンは、細胞内脂質蓄積を著しく減少させることが示されている。MST3を欠失させた肝細胞での脂質貯蔵の抑制の根拠をなし得る機序は、いくつか考えられるが、これには、(i)脂質の取り込み率及び合成率の減少、(ii)TAGを多く含むVLDLとしての脂質分泌の増加、(iii)脂肪酸酸化レベルの亢進、又はこれらの機序の任意の組み合わせがある。実際、MST3の枯渇がβ酸化及びTAG分泌を刺激し、FFA流入及びTAG合成を阻害することが示されているように(図2)、MST3が、肝細胞における脂質異化と脂質同化との間の代謝平衡を調節することが示されている。
【００６２】
要約すると、本開示は、脂肪滴関連タンパク質MST3が担う、肝臓脂質貯蔵の調節における細胞特異的な役割の一貫した証拠を提供する。重要なことに、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)としても知られる肝臓における異所性脂肪蓄積は、肝臓及び全身のインスリン抵抗性を悪化させ、2型糖尿病及びメタボリックシンドロームの発症機序に積極的に関与することが、最近の多くの証拠により示唆されている(Ansteeら、2013)。
【００６３】
更に、肝脂質貯蔵は、侵襲性肝疾患である非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)の発症のおもなリスクファクターである(Ansteeら、2013)。
【００６４】
したがって、本開示は、NAFLD/NASH及び関連する複合代謝性疾患を予防及び処置するための潜在的薬物候補としてMST3調整剤を強調する。
(参考文献)
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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