(57)【要約】  本発明は、ＣＤ３およびＥＧＦＲに同時に結合する二重特異性抗体に関する。このクラスの抗体は、Ｔ細胞をリダイレクトし、活性化Ｔ細胞とＥＧＦＲ発現腫瘍細胞との間に免疫シナプスを形成し、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の殺傷レベルを高めることにより、ＥＧＦＲ腫瘍の治療に有用であることが本発明者によって実証されている。特に、本発明は、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ１（配列番号４、５および６）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ３（配列番号７、２および８）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ４（配列番号４、５および９）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＤ１（配列番号１、２および１０）およびＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＤ２（配列番号１１、１０および２）を含む群から選択されるＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ３εおよびＥＧＦＲでエピトープに結合するＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体。
【請求項２】
少なくとも１つのＦＡＢおよび１つのｓｃＦｖ部分を含む、請求項１に記載のＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体。
【請求項３】
前記少なくとも１つのＦＡＢおよび１つのｓｃＦｖ部分が互いに連結されている、請求項２に記載のＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体。
【請求項４】
ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ１（配列番号４、５および６）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ３（配列番号７、２および８）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ４（配列番号４、５および９）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＤ１（配列番号１、２および１０）およびＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＤ２（配列番号１１、１０および２）を含む群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体。
【請求項５】
医薬品として使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体。
【請求項６】
ＥＧＦＲ発現癌の治療として使用するための、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体。
【請求項７】
前記ＥＧＦＲ発現癌が、１つ以上のＫＲＡＳまたはＢ−Ｒａｆ突然変異をさらに含む、請求項６に記載のＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体。
【請求項８】
ヒトＥＧＦＲのドメイン４に結合し、配列番号２３および２４、配列番号２５および２６、配列番号３１および３３、配列番号３２および３４、配列番号３６および３８、配列番号３７および３９の群またはそれらの誘導体から選択される重可変配列および軽可変配列を含む抗体またはその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＤ３およびＥＧＦＲに同時に結合する二重特異性抗体に関する。このクラスの抗体は、Ｔ細胞をリダイレクトし、活性化Ｔ細胞とＥＧＦＲ発現腫瘍細胞との間に免疫シナプスを形成し、ＥＧＦＲ発現腫瘍細胞の殺傷レベルを高めることにより、ＥＧＦＲ腫瘍の治療に有用であることが本発明者によって実証されている。
【背景技術】
【０００２】
多くの上皮由来癌細胞によって過剰発現している上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ）により標的とすることにより、それらの成長が阻害され、肯定的な臨床転帰となることが実証されている。
【０００３】
がん免疫療法または免疫腫瘍学は、第４の抗腫瘍療法として、その臨床的有効性については、いくつかの症例では有望であり、他の症例では注目すべきデータとなり、その後に発展期を経験している。
【０００４】
しかし、抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂにより治療された患者の臨床応答は、変動しやすく、ＥＧＦＲ発現の変動、新生細胞のシグナル伝達、治療を回避するために癌細胞が使用する適応メカニズム、またはこれらすべての要因の同様のいくつかの組み合わせを反映し得る。
【０００５】
癌細胞が抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ療法に対して耐性になり得るメカニズムの１つは、哺乳類のｒａｓ遺伝子ファミリーのＫｉｒｓｔｅｎ  ｒａｓ（ＫＲＡＳ）癌遺伝子相同体の突然変異によるものであることが十分に明らかになっている。体細胞ＫＲＡＳ突然変異は、白血病、結腸直腸癌、膵癌、肺癌において高い割合で発見されている。ＫＲＡＳ突然変異は、結腸直腸癌における承認済み抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ療法パニツムマブ（ベクティビックス（登録商標））およびセツキシマブ（アービタックス（登録商標））に対する反応が非常に低いことが予測される。研究では、腫瘍が突然変異型のＫＲＡＳ遺伝子を発現させる患者は、セツキシマブまたはパニツムマブに応答しないことが示されている。ＫＲＡＳ突然変異の出現は、結腸直腸癌および他の癌における抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂ療法に対する後天的耐性を引き起こす頻度の高い要因である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＥＧＦＲ癌の治療に関連する問題に対処するため、本発明者らは、ＥＧＦＲ過剰発現癌の治療に好適であり、既存の治療法の問題を克服する抗腫瘍薬の新規セットを作成した。
【０００７】
本発明は、ＣＤ３εおよびＥＧＦＲ上のエピトープに結合する二重特異性抗体に関する。
【０００８】
ここでは、ＣＤ３εバインダーは、好ましくはＳＰ３４またはＯＫＴ３であるか、またはそれらから誘導されたものである。
【０００９】
ＥＧＦＲバインダーは、好ましくはパニツムマブおよびセツキシマブである。
【００１０】
本発明によれば、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体は、少なくとも１つのＦＡＢおよび１つのｓｃＦｖ結合部分を含む。
【００１１】
特に、本発明は、これらに限定されないが、抗体、ＤＡＲＰｉｎ、フィノマー（Ｆｙｎｏｍｅｒ）、アフィマー（Ａｆｆｉｍｅｒ）、可変リンパ球受容体、アンチカリン、ｎａｎｏｆｉｔｉｎ、可変新抗原受容体（ＶＮＡＲ）などのタンパク質ベースの標的特異的結合分子の結合部分に関する。
【００１２】
特に、結合部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｃａｂ、二重特異性単鎖Ｆｖ二量体、二特異性抗体、三特異性抗体などの抗体から取得または誘導される。好ましい実施形態では、アゴニストは、Ｆａｂ、ＳｃＦｖおよびｄＡｂから取得されたかまたは誘導された結合部分を含む。
【００１３】
本発明によれば、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体は、互いに連結された少なくとも１つのＦＡＢおよび１つのｓｃＦｖ部分を含む。
【００１４】
特に、結合部分は、同じまたは異なる抗体Ｆｃまたはその一部を含む足場に遺伝的に融合されてもよい。本発明のこの態様によれば、ＩｇＧなどの第１の完全長抗体は、本発明によるＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体の基礎を形成し得、結合部分の第２のセットは、本発明に従って開始抗体に移植され得る。
【００１５】
好ましくは、２つの結合部分は、第２の結合部分が免疫グロブリン重鎖の可変部分の遠位に配置されるように連結される。
【００１６】
あるいは、２つの結合部分は、第２の結合部分が免疫グロブリン重鎖の可変部分の近位に配置されるように連結される。
【００１７】
好ましくは、２つの結合部分は、第２の結合部分が免疫グロブリン軽鎖の可変部分の遠位に配置されるように連結される。
【００１８】
あるいは、２つの結合部分は、第２の結合部分が免疫グロブリン軽鎖の可変部分の近位に配置されるように連結される。
【００１９】
本発明によれば、２つの連結された結合部分は、ペプチドリンカーによって分離され得る。
【００２０】
本発明によれば、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体は、以下を含む群から選択される：ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ１（配列番号４、５および６）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ３（配列番号７、２および８）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ４（配列番号４、５および９）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＤ１（配列番号１、２および１０）およびＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＤ２（配列番号１１、１０および２）。
【００２１】
本発明の別の態様によれば、ヒトＥＧＦＲのドメイン４に結合し、以下の群から選択される重可変配列および軽可変配列を含む抗体またはその断片に関する：配列番号２３および２４、配列番号２５および２６、配列番号３１および３３、配列番号３２および３４、配列番号３６および３８、配列番号３７および３９またはそれらの誘導体。
【００２２】
本発明はまた、医薬品としての本発明によるＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体の使用に関する。
【００２３】
本発明はまた、ＥＧＦＲの過剰発現を特徴とするかまたはＥＧＦＲの過剰発現により悪化する癌または他の疾患の治療のための医薬品としての、本発明によるＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体の使用に関する。
【００２４】
本発明はまた、有効量のＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体を患者に投与することを伴う、癌罹患患者を治療する方法に関する。
【００２５】
本発明はまた、有効量のＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体および患者の免疫系をさらに調節するための小分子またはバイオ医薬品などの１つ以上の他の剤を患者に投与することを伴う、癌罹患患者を治療する方法に関する。こうした剤の例としては、抗ＰＤ−１抗体およびマルチキナーゼ阻害剤などの抗腫瘍性小分子が挙げられる。
【００２６】
さらに、本発明は、本発明によるＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体と別の医薬品との患者への同時投与に関し、他の医薬品は、相乗効果または相加効果を有する。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、必要とする患者に治療量の本発明によるＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体を投与することにより、ＥＧＦＲ発現癌を治療する方法が提供される。
【００２８】
本発明の別の態様によれば、医薬品として使用するための、本発明によるＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体が提供される。
【００２９】
本発明の別の態様によれば、ＥＧＦＲ発現癌の治療として使用するための、本発明によるＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体が提供される。
【００３０】
本発明の別の態様によれば、ＥＧＦＲ発現癌は、１つ以上のＫＲＡＳまたはＢ−Ｒａｆ突然変異をもたらすことをさらに含む。
【００３１】
特に定義されない限り、本発明に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。一般に、本明細書に記載の細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴまたはポリヌクレオチドの化学およびハイブリダイゼーションに関連して利用される命名法、および技術は、当技術分野で周知であり一般的に使用されるものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションなど）には標準的な手法が使用される。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様に従って、または当技術分野で一般的に達成されているように、または本明細書に記載されているように実行される。前述の技術および手順は、一般に、当技術分野で周知の従来の方法に従って実行され、本明細書全体で引用および議論される様々な一般的およびより具体的な参考文献に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年））を参照されたい。本明細書に記載されている分析化学、合成有機化学、および医学および医薬化学に関連して利用される命名法、ならびに実験室手順および技術は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。標準的な手法は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、配合、送達、および患者の治療に使用される。
【００３２】
基本的な抗体構造単位が、四量体を含むことは公知である。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対で構成され、各対は１つの「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１つの「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のアミノ末端部分には、主に抗原認識を担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を含む。各鎖のカルボキシ末端部分は、エフェクター機能を主に担う定常領域を画成する。一般に、ヒトから得られた抗体分子は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、およびＩｇＤのクラスのいずれかに関し、分子内に存在する重鎖の性質が互いに異なる。また、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２など、特定のクラスは、サブクラス（アイソタイプとも称される）を有する。さらに、ヒトでは、軽鎖は、κ鎖またはλ鎖であり得る。
【００３３】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」（ＭＡｂ）または「モノクローナル抗体組成物」という用語は、固有の軽鎖遺伝子産物および固有の重鎖遺伝子産物からなる抗体分子の１つの分子種のみを含む抗体分子の集団を指す。特に、モノクローナル抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）は、その集団の分子のすべてにおいて同一である。ＭＡｂは、それに対する独特の結合親和性を特徴とする抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位を含む。
【００３４】
「抗原結合部位」または「結合部分」という用語は、抗原結合に関与する免疫グロブリン分子の部分を指す。抗原結合部位は、重（「Ｈ」）鎖および軽（「Ｌ」）鎖のＮ末端可変（「Ｖ」）領域のアミノ酸残基によって形成される。「超可変領域」と呼ばれる重鎖および軽鎖のＶ領域内の３つの高度に異なる伸長部は、「フレームワーク領域」または「ＦＲ」として公知であるより保存されたフランキング伸長部の間に置かれる。したがって、「ＦＲ」という用語は、免疫グロブリン内の超可変領域の間、および超可変領域に隣接して自然に見られるアミノ酸配列を指す。抗体分子において、軽鎖の３つの超可変領域および重鎖の３つの超可変領域は、抗原結合表面を形成するために３次元空間で互いに対して配置される。抗原結合表面は、結合された抗原の三次元表面に相補的であり、重鎖および軽鎖のそれぞれの３つの超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」と称する。各ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９８７年および１９９１年））、またはＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７年）、Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３（１９８９年）に従っている。
【００３５】
本開示の融合タンパク質の単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）断片部分は、本明細書においては同義的に、本明細書において標的ポリペプチドと称する。
【００３６】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語には、免疫グロブリンまたはその断片、またはＴ細胞受容体に対して／これらによって特異的に結合できる任意のタンパク質決定基を含む。「エピトープ」という用語には、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体に対して／これらによって特異的に結合できる任意のタンパク質決定基を含む。エピトープ決定基は、通常、アミノ酸または糖側鎖などの、化学的に活性である表面分子基から構成され、通常、特定の三次元構造特性、ならびに特定の電荷特性を有する。抗体は、解離定数が１ｍＭ以下場合、例えば、いくつかの実施形態では、１μＭ以下（例えば、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭまたは≦１ｎＭ）の場合、抗原に特異的に結合すると言われている。
【００３７】
本明細書で使用される「免疫学的結合」および「免疫学的結合特性」という用語は、免疫グロブリン分子と免疫グロブリンが特異的である抗原との間に生じるタイプの非共有相互作用を指す。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（ＫＤ）で表すことができ、ＫＤが小さいほど高い親和性を表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当該分野で周知の方法を使用して定量化され得る。そのような方法の１つは、抗原結合部位／抗原複合体の形成および解離の速度の測定を伴い、これらの速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、および両方向の速度に等しく影響を与える幾何学的パラメータに依存する。したがって、「オン速度定数」（ｋｏｎ）と「オフ速度定数」（ｋｏｆｆ）は両方とも、濃度および実際の会合速度および解離速度を算出することによって求めることができる（Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：１８６−８７（１９９３年）を参照されたい）。Ｋｏｆｆ／ｋｏｎ比により、親和性に関係のないすべてのパラメータを外すことができるようになり、解離定数ＫＤと等しくなる（一般には、Ｄａｖｉｅｓら（１９９０年）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５９：４３９−４７３を参照されたい）。本開示の抗体は、平衡結合定数（ＫＤ）が１ｍＭ以下、いくつかの実施形態では１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、または１００ｐＭ以下から約１ｐＭである場合、放射性リガンド結合アッセイ、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、フローサイトメトリー結合アッセイ、または当業者に公知である同様のアッセイなどのアッセイにより測定された場合、抗原に特異的に結合すると言われている。
【００３８】
本明細書で言及される「単離タンパク質」という用語は、ｃＤＮＡ、組換えＲＮＡ、または合成起源またはそれらのいくつかの組み合わせのタンパク質を意味し、その起源または誘導源により、「単離タンパク質」は、（１）自然界に見られるタンパク質に会合していない、（２）同じ供給源からの他のタンパク質を含まない、例えば、海洋タンパク質が含まれていない、（３）異なる種の細胞によって発現している、または（４）自然界に存在しない。
【００３９】
「ポリペプチド」という用語は、本明細書では、ポリペプチド配列の天然のタンパク質、断片、または類縁体を指す総称として使用される。したがって、天然のタンパク質断片および類縁体は、ポリペプチド属の種である。
【００４０】
本明細書で対象に適用されるとき、「自然発生」という用語は、自然界で対象を見つけることができるという事実を指す。例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、自然界のある供給源から単離することができ、また、実験室においてヒトによって意図的に改変されていないか、またはそうでなければ、自然に発生する生物（ウイルスなど）に存在する。
【００４１】
「配列同一性」という用語は、２つのポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、比較ウィンドウ全体で同一であることを意味する（すなわち、ヌクレオチドごとまたは残基ごとに）。「配列同一性パーセント」という用語は、比較ウィンドウで最適に整列させた２つの配列を比較すること、一致した位置の数を得るために、同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ、もしくはＩ）または残基が両方の配列で生じる位置の数を決定すること、その一致した位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数（つまり、ウィンドウサイズ）で除算すること、その結果に１００を掛けて、配列同一性パーセントを求めることにより、算出する。本明細書で使用される「実質的な同一性」という用語は、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列の特徴を示し、ポリヌクレオチドまたはアミノ酸は、少なくとも１８ヌクレオチド（６アミノ酸）位置の比較ウィンドウ全体、多くの場合、少なくとも２４〜４８ヌクレオチド（８〜１６アミノ酸）位置のウィンドウ全体の参照配列と比較して、少なくとも８５パーセントの配列同一性、例えば、少なくとも９０〜９５パーセントの配列同一性、より通常は少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する配列を含み、配列同一性パーセントは、参照配列を、比較ウィンドウ全体で参照配列の合計２０パーセント以下の欠失または付加を含み得る配列と比較することにより算出される。参照配列は、より大きい配列のサブセットであり得る。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、２０個の従来のアミノ酸およびそれらの略語は従来の用法に従う。Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（第２版、Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ、編、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ７  Ｍａｓｓ．（１９９１）年）を参照されたい。２０種類の従来のアミノ酸、α−、α−二置換アミノ酸などの非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、および他の従来にないアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）も、本開示のポリペプチドに好適な構成成分であり得る。従来ではないアミノ酸の例としては、以下が挙げられる：４ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、σ−Ｎ−メチルアルギニン、および他の類似のアミノ酸およびアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）。本明細書で使用されるポリペプチド表記では、標準的な使用法および慣例に従って、左手方向がアミノ末端方向であり、右手方向がカルボキシ末端方向である。
【００４３】
同様に、特に明記しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は、５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加方向は、ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の５’から５’末端であるＤＮＡ鎖上の転写方向配列領域と称し、これは、「上流配列」と称し、ＲＮＡと同じ配列を有し、ＲＮＡ転写物の３’から３’末端にあるＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称する。
【００４４】
ポリペプチドに適用される場合、「実質的に同一」という用語は、デフォルトのギャップ重みを使用するプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列させた場合、２つのペプチド配列が、少なくとも８０パーセントの配列同一性、例えば少なくとも９０パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性、または少なくとも９９パーセントの配列同一性を共有することを意味する。
【００４５】
いくつかの実施形態では、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００４６】
保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システインおよびメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニンバリン、グルタミン酸−アスパラギン酸、およびアスパラギン−グルタミンである。
【００４７】
本明細書に論じられるように、抗体分子または免疫グロブリン分子のアミノ酸配列のわずかな変化は、本開示に包含されることが企図され、アミノ酸配列の変化が、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、９０％、９５％、または９９％を維持するものとする。特に、保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換は、その側鎖に関連するアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。遺伝的にコードされたアミノ酸は、一般的に以下のファミリーに分類される：（１）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸である、（２）塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジンである、（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンである、および（４）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸としては、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸塩、グルタミン、グルタミン酸塩、ヒスチジン、リジン、セリン、およびトレオニンが挙げられる。疎水性アミノ酸としては、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが挙げられる。アミノ酸の他のファミリーとしては、（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびスレオニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが挙げられる。例えば、イソロイシンまたはバリンによるロイシン、グルタミン酸によるアスパラギン酸、セリンによるスレオニンの個々の置換、または構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の同様の置換は、特に置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を含まない場合、結果として得られる分子の結合または特性に対する主要な効果を有さないと予測することが合理的である。アミノ酸が変化することにより機能性ペプチドがもたらされるか否かは、ポリペプチド誘導体の比活性をアッセイすることにより容易に決定できる。アッセイについては、本明細書に詳細に記載する。抗体分子または免疫グロブリン分子の断片または類縁体は、当業者によって容易に調製することができる。断片または類縁体の好適なアミノ末端およびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界付近で生じる。構造的および機能的ドメインは、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列データを公開配列データベースまたは独自の配列データベースと比較することにより特定され得る。いくつかの実施形態では、コンピューター化された比較方法を使用して、既知の構造および／または機能の他のタンパク質内に生じる配列モチーフまたは予測されるタンパク質立体構造ドメインを特定する。既知の三次元構造に折り畳まれるタンパク質配列を同定する方法は公知である。Ｂｏｗｉｅら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４（１９９１年）。したがって、前述の例は、当業者が、本発明により構造的および機能的ドメインを定義するために使用され得る配列モチーフおよび���造的立体構造を認識できることを実証している。
【００４８】
好適なアミノ酸置換は、以下のものである：（１）タンパク質分解に対する感受性を低下させる、（２）酸化に対する感受性を低下させる、（３）タンパク質複合体を形成するための結合親和性を変化させる、（４）結合親和性を変化させる、および（４）こうした類縁体の他の物理化学的または機能的特性を付与するか、または改変する。類縁体は、天然に存在するペプチド配列以外の配列の様々な突然変異タンパク質を含み得る。例えば、天然に存在する配列内（例えば、分子間接触を形成するドメイン（複数可）外のポリペプチドの一部分内）では、単一または複数のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）を行い得る。保存的アミノ酸置換では、親配列の構造的特徴を実質的に変化させないものとする（例えば、置換アミノ酸は、親配列内で生じるらせんを破壊する傾向、または親配列の特徴である他のタイプの二次構造を破壊する傾向がないものとする）。技術的に認識されているポリペプチドの二次構造および三次構造の例は、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、編、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８４年））；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｃ．Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｊ．Ｔｏｏｚｅ、編、Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９１年））；およびＴｈｏｒｎｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ３５４：１０５（１９９１年）に記載されている。
【００４９】
本明細書で使用される「ポリペプチド断片」という用語は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、例えば、完全長ｃＤＮＡ配列から推定される天然に存在する配列内の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、典型的には、少なくとも５、６、８または１０アミノ酸長、例えば、少なくとも１４アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長、または少なくとも７０アミノ酸長である。本明細書で使用される「類縁体」という用語は、推定アミノ酸配列の一部と実質的な同一性を有し、好適な結合条件下でＣＤ４７に特異的な結合を有する少なくとも２５のアミノ酸のセグメントからなるポリペプチドを指す。典型的には、ポリペプチド類縁体は、天然に存在する配列に対する保存的アミノ酸置換（または付加または欠失）を含む。類縁体は、典型的には、少なくとも２０アミノ酸長、例えば、少なくとも５０アミノ酸長以上であり、多くの場合、完全長の天然に存在するポリペプチドと同じ長さであり得る。
【００５０】
ペプチド類縁体は、一般的に、製薬業界で、鋳型ペプチドの特性に類似した特性を有する非ペプチド薬として使用されている。これらのタイプの非ペプチド化合物は、「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ）」または「ペプチド模倣物（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ）」と称する。Ｆａｕｃｈｅｒｅ、Ｊ．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１５：２９（１９８６年）、Ｖｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｅｉｄｉｎｇｅｒ  ＴＩＮＳｐ．３９２（１９８５年）；およびＥｖａｎｓら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３０：１２２９（１９８７年）。このような化合物は、多くの場合、コンピューター化された分子モデリングの補助により開発される。治療上有用なペプチドと構造的に類似しているペプチド模倣物を使用して、同等の治療効果または予防効果を生み出してもよい。一般的に、ペプチド模倣体は、ヒト抗体などのパラダイムポリペプチド（すなわち、生化学的特性または薬理活性を有するポリペプチド）と構造的に類似してるが、当該分野で周知の方法により、以下からなる群から選択される連結により、任意により置換される１つ以上のペプチド連結を有する：−−ＣＨ２ＮＨ−−、−−ＣＨ２Ｓ−、−−ＣＨ２−ＣＨ２−−、−−ＣＨ＝ＣＨ−−（シスおよびトランス）、−−ＣＯＣＨ２−−、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−−、および−ＣＨ２ＳＯ−−。同じタイプのＤ−アミノ酸でのコンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の体系的な置換（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）を使用することにより、より安定したペプチドを生成し得る。さらに、コンセンサス配列または実質的に同一のコンセンサス配列多様体を含む拘束されたペプチドは、当技術分野で公知である方法によって、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋を形成できる内部システイン残基を付加することにより、生成され得る（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ  Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７（１９９２）年）。
【００５１】
「剤」という用語は、本明細書では、化学化合物、化学化合物の混合物、生体高分子、および／または生体材料から作製された抽出物を示すために使用される。
【００５２】
本明細書で使用される「標識」または「標識された」という用語は、例えば、放射線標識されたアミノ酸の取り込みまたはマークされたアビジン（例えば、光学的または熱量測定法によって検出できる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出できるビオチニル部分のポリペプチドへの付着による、検出可能なマーカーの取り込みを指す。特定の状況では、標識またはマーカーも治療用となり得る。ポリペプチドおよび糖タンパク質を標識する様々な方法が、当技術分野で公知であり、使用され得る。ポリペプチドの標識の例としては、放射性同位元素または放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン蛍光体、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、潜在的立体障害を減少させるために、標識は、様々な長さのスペーサーアームによって付着されている。本明細書で使用される「薬剤または薬物」という用語は、患者に適切に投与されたときに所望の治療効果を誘発することができる化学化合物または組成物を指す。
【００５３】
「抗新生物薬」という用語は、本明細書において、ヒトの新生物、特に癌腫、肉腫、リンパ腫、または白血病などの悪性（癌性）病変の発生または進行を阻害する機能特性を有する剤を指すために使用される。転移の阻害は、多くの場合、抗新生物薬の特性である。
【００５４】
本明細書で使用される「治療する（ｔｒｅａｔ）」、「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」などの用語は、障害および／またはそれに関連する症状を軽減するかつ／または回復させることを指す。「軽減する（ａｌｌｅｖｉａｔｅ）」および／または「軽減すること（ａｌｌｅｖｉａｔｉｎｇ）」とは、例えば癌などの疾患の発症または進行を低下、抑制、減弱、減少、停止、および／または安定化することを意味する。除外するものではないが、障害または状態を治療することは、それに関連する障害、状態または症状が完全に消失することを必要とするものではないことが理解されるであろう。
【００５５】
本明細書の他の化学用語は、Ｔｈｅ  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｅｒｍｓ（Ｐａｒｋｅｒ，Ｓ．、編、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ（１９８５年））に例示されているように、当技術分野の従来の用法に従って使用される。
【００５６】
本明細書で使用される「実質的に純粋である」とは、対象種が存在する優勢種であることを意味し（すなわち、モル基準で、組成物中のあらゆる他の個々の種よりも豊富である）、いくつかの実施形態では、実質的に精製された画分は、対象種が、存在するすべての巨大分子種の少なくとも約５０パーセント（モル基準）である組成物である。
【００５７】
一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物中に存在するすべての巨大分子種の約８０パーセント以上、例えば約８５％、９０％、９５％、および９９％以上である。いくつかの実施形態では、対象種は、本質的に均一になるまで精製される（従来の検出方法では、組成物中において汚染種は検出できない）。この場合、この純粋な組成物は、本質的に、単一の巨大分子種からなる。
【００５８】
本開示では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国および／または欧州特許法でそれらに帰属する意味を有し得、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、などを意味し得る。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」という用語は、同様に米国特許法に帰する意味を有する。これらの用語はオープンエンド型であり、これにより、先行技術の実施形態は除いて、引用されているものの基本的または新規の特徴が、記載されているものよりも多く存在することによって変わらない限り、記載されているものよりも多く存在し得る。
【００５９】
「有効量」とは、未治療の患者に対して、疾患の症状を回復させるのに必要な量を意味する。ある疾患の治療的処置のために本発明を実施するために使用される活性化合物（複数可）の有効量は、対象の投与様式、年齢、体重、および全身の健康状態によって異なる。最終的には、主治医または獣医が、適切な量および投与レジメンを決定する。こうした量は、「有効」量と称する。
【００６０】
「対象」とは、これらに限定されないが、ヒト、またはウシ、ウマ、イヌ、げっ歯類、ヒツジ、霊長類、ラクダ、ネコなどの非ヒト哺乳類などの哺乳類を意味する。
【００６１】
本明細書で使用される「投与する」という用語は、こうした剤による治療を必要とする対象に治療薬を移送する、送達する、導入する、または輸送する任意の様式を指す。こうした様式としては、これらに限定されないが、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮内、鼻腔内、および皮下投与が挙げられる。
【００６２】
以下に、図の簡単な要約を示す。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】様々な異なるＢＥＡＴアーキテクチャで組み立てられているパニツムマブ抗ＥＧＦＲバインダー（黒）およびヒト化ＳＰ３４抗ＣＤ３バインダー（灰色）を示す図である。
【図２】膜結合ＥＧＦＲを発現するＢＡＦ細胞上の３Ａ６および１０Ｅ６ハイブリドーマ候補のフローサイトメトリー解析を示す図である。この図は、ＢＡＦ細胞で発現した膜結合ＥＧＦＲに対する親３Ａ６および１０Ｅ６ハイブリドーマ上清のＦＡＣＳプロファイルを示している。両方のハイブリドーマクローンから採取した１００μｌを、１０６細胞／ｍｌに希釈した１００μｌのＥＧＦＲトランスフェクトＢＡＦ細胞とインキュベートした。陰性対照として、１０μｇ／ｍｌに希釈した精製マウスＩｇＧアイソタイプを使用した。抗体結合は、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＰＥにより検出された。
【図３】３Ａ６Ａ１２Ｂ５および１０Ｅ６Ｆ５が、ＥＧＦＲ受容体の細胞外ドメインＩＶに特異的に結合することを示す図である。この図は、いくつかの濃度（１０〜０．０１μｇ／ｍｌの範囲）の精製３Ａ６Ａ１２Ｆ５および１０Ｅ６Ｆ５ハイブリドーマサブクローンを、固定化組換え可溶性ＥＧＦＲ（Ａ）またはＥＧＦＲ−Ｈｅｒ３キメラ分子（ＢおよびＣ）または単一のＥＧＦＲのドメインＩＶ（Ｄ）に対して試験を行った、ＥＬＩＳＡによる結果を示す。ベクティビックス（登録商標）もアッセイで試験を行った。
【図４】ＣＤ３−ＥＧＦＲ＿５およびＣＤ３−ＥＧＦＲ＿８が、ＥＧＦＲ＋Ａ５４９標的細胞の殺傷活性を示すことを示す図である。ＥＧＦＲ＋Ａ５４９細胞（標的細胞、Ｔ）に対するＣＤ３リダイレクト殺傷アッセイを、エフェクター細胞（Ｅ）として３名の健康なドナーからのＰＢＭＣを使用して、４８時間、Ｅ：Ｔ比１０：１で実施した。ヒストグラムは、３名の個々のドナーから算出した平均特異的殺傷率を示す。本アッセイでは、２つのＢＥＡＴ分子を１０ｎＭで使用した。
【図５】（Ａ）キメラ３Ａ６抗体のＫＤ測定値を示す図である。（Ｂ）キメラ１０Ｅ６抗体のＫＤ測定値を示す図である。
【図６】（Ａ）１０Ｅ６−最適適合抗体のＫＤ測定値を示す図である。（Ｂ）１０Ｅ６−安定抗体のＫＤ測定値を示す図である。
【図７】（Ａ）３Ａ６キメラ抗体を用いた結合試験のセンサーグラム、（Ｂ）１０Ｅ６キメラ抗体を用いた結合試験のセンサーグラムを示す図である。（Ｃ）ポリクローナルヤギ抗ＥＧＦＲ抗体を使用した対照実験のセンサーグラムを示す図である。
【図８】（Ａ）１０Ｅ６−最適適合抗体のサーモグラムを示す図である。最初のピークは、ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３ドメインに対応しており、７１．７℃のＴｍを示し、２番目のピークはＦａｂに対応している。（Ｂ）１０Ｅ６−安定抗体のサーモグラムを示す図である。最初のピークは、ＩｇＧ１  ＣＨ２−ＣＨ３ドメインに対応しており、７１．８℃のＴｍを示し、２番目のピークはＦａｂに対応している。
【図９】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿１は、Ａ５４９腫瘍では有効性を有さないことを示す図である。
【図１０】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ１およびＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、Ａ５４９腫瘍では、同じ有効性を有することを示す図である。
【図１１】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、ＳＮＵ−２１６腫瘍では、ベクティビックスよりも優れた有効性を示すことを示す図である。
【図１２】異種移植モデルにおけるＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３抗腫瘍活性に対するデキサメタゾンの影響を示す図である。（Ａ）グラフは、平均腫瘍サイズ（ｍｍ３）±ＳＥＭを示す。（Ｂ）グラフは、３７日目のマウスあたりの腫瘍成長を示している。
【図１３】ＥＧＦＲ（Ａ）およびＣＤ３（Ｂ）の単純結合ＥＬＩＳＡフォーマットの概略を示す図である。
【図１４】二重結合ＥＬＩＳＡフォーマットの概略を示す図である。
【図１５】ＥＧＦＲ単純結合ＥＬＩＳＡによるマウス血清中のＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の検出を示す図である。
【図１６】ＣＤ３単純結合ＥＬＩＳＡによるマウス血清中のＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の検出を示す図である。
【図１７】ＣＤ３およびＥＧＦＲ二重結合ＥＬＩＳＡによるマウス血清中のＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の検出を示す図である。
【図１８】Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット血清中のＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の薬物動態プロファイルを示す図である。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の薬物動態は、１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で単回静脈内注入を行った後、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝４）で評価した。薬物動態（ＰＫ）査定用の血液サンプルは、４２日間（６週間）にわたって、事前に指定された投与後の時点、０．２５時間、１時間、６時間、２４時間、４８時間、９６時間、１６８時間、３３６時間、５３０時間、６７２時間、８４０時間および１００８時間に収集した。これらの血清サンプル中のＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の濃度は、好適なＥＬＩＳＡ法を使用して定量化した。試験を行った４匹の動物を表すデータ（Ｎ＝１）。
【図１９】ＥＬＩＳＡによるＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３結合の検出を示す図である。コーティングされたヒトＣＤ３−Ｆｃ（ｈｕＣＤ３−Ｆｃ、Ａ）、ヒトＥＧＦＲドメインＩ−ＩＶ  ｈｉｓ−タグ（ｈｕＥＧＦＲ−Ｈｉｓ；Ｂ）またはｈｕＥＧＦＲ−Ｈｉｓ（Ｃ）でインキュベートし、次に、ＨＲＰと結合した抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ（ＡおよびＢ）またはｈｕＣＤ３−ビオチンの後にＨＲＰ結合ストレプトアビジン（Ｃ）のいずれかで検出されたＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３および対照抗体の用量反応である。グラフは、各治療のシグモイド用量反応結合曲線（４５０ｎＭでの吸光度）を示している。各データ点は、３つの独立した複製からの重複値の平均値±ＳＥＭである。
【図２０】フローサイトメトリーによるＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３結合の検出を示す図である。ＰＢＭＣＳ（Ａ〜Ｃ）または扁平上皮癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１７０３（Ｄ）のいずれかでインキュベートし、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ−γ）で検出されたＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３および対照抗体の用量反応である。ＰＢＭＣの場合、細胞は抗ＣＤ４または抗ＣＤ８抗体でも標識された。グラフは、各治療の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の非線形シグモイド回帰結合曲線を示している。各データ点は、３つの独立した複製からの重複値の平均値±ＳＥＭである。
【図２１】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、ＥＧＦＲ発現ヒト癌細胞株のリダイレクトされた溶解を誘導する。標的癌細胞（Ｔ）およびエフェクター細胞（Ｅ；ＰＢＭＣ）を、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照抗体の用量反応の存在下でＥ：Ｔ比１：１０でインキュベートし、細胞毒性アッセイ（ＭＴＳ）によって、癌細胞のリダイレクト溶解を決定した。ＥＣ５０値は、特異的殺傷のシグモイド用量反応曲線から求めた。エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す。細胞株のリダイレクトされた溶解は、統計的には異なっていた（一元配置分散分析；Ｆ＝５，６；ｐ＜０．０００１）。
【図２２】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３が、抗体依存性の低い細胞媒介性細胞傷害を有することを示す図である。ＣＤ３ｘＥＧＦＲの抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、ＥＧＦＲ＋癌細胞株Ａ−４３１およびＡ５４９（Ａ）、ならびにＣＤ３＋ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（Ｂ）において評価し、特異的殺傷のシグモイド用量反応曲線から求めたＥＣ５０値によって表す。エラーバーは、２つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。治療の効果は、ＥＧＦＲ＋癌細胞（最小二乗モデル、Ｆ＝２９、ｐ＜０．０００１）およびＣＤ３＋ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（Ｔ検定、ｔ＝３、ｐ＜０．０５）で統計的に有意であった。統計的有意差（ｐ＜０．０５）は、アスタリスク（＊）で表す。
【図２３】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３が、補体依存性細胞傷害を有さないことを示す図である。特異的補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）は、ＥＧＦＲ＋癌細胞Ａ５４９（Ａ）およびＣＤ３＋ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（Ｂ）において評価し、特異的ＣＤＣのシグモイド用量反応曲線が表されている。
【図２４】ＰＢＭＣの増殖に対するＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の効果を示す図である。ＰＢＭＣは、ＣＤ３ｘＥＧＦＲまたは対照の用量を増大させて、４８時間インキュベートした。グラフは、６つの独立した実験からの３Ｈ−チミジン取り込みの結果を示している。ＡＥ０４２、Ｐ１０６９、およびＴＲＳはＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の異なるバッチを表し、濃度は、０．０００５μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌである。様々な処置について、「ｃ」はコーティングを表し、「ｓ」は可溶性を表す。エラーバーは、平均±ＳＥＭを表す。
【図２５】ＰＢＭＣの増殖に対するＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の効果の統計分析を示す図である。図２４のデータは、ｍＡｂ非含有対照（Ａ）に対する平均およびアイソタイプ対照（Ｂ）に対する平均と比較するために最小二乗モデルにフィッティングさせた後、ダネットの比較（α＝０，０５）によって分析した。平均の有意差は、判定限界外に針棒として示す（各治療の９５％ＣＩ区間；灰色の領域）。
【図２６】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３に応答する非特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。ＰＢＭＣは、ＣＤ３ｘＥＧＦＲまたは対照の用量を増大させて、２４時間または４８時間インキュベートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、フローサイトメトリーにより活性化マーカーＣＤ６９の発現として測定した。ＡＥ０４２、Ｐ１０６９、およびＴＲＳはＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の異なるバッチを表し、濃度は、０．０００５μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌである。様々な処置について、「ｃ」はコーティングを表し、「ｓ」は可溶性を表す。エラーバーは、６つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。
【図２７】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３とｍＡｂ非含有状態と間の非特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化の統計的比較を示す図である。図２６のデータは、２４時間（Ａ）および４８時間（Ｂ）の時点で、ｍＡｂ非含有対照に対する平均を比較するために、最小二乗フィットモデル後、ダネットの比較（α＝０，０５）によって分析した。平均の有意差は、判定限界外に針棒として示す（各治療の９５％ＣＩ区間；灰色の領域）。
【図２８】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３とアイソタイプ対照との間の非特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化の統計的比較を示す図である。図２６のデータは、２４時間（Ａ）および４８時間（Ｂ）の時点で、アイソタイプ対照に対する平均を比較するために、最小二乗フィットモデル後、ダネットの比較（α＝０，０５）によって分析した。平均の有意差は、判定限界外に針棒として示す（各治療の９５％ＣＩ区間；灰色の領域）。
【図２９】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３に応答する非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を示す図である。ＰＢＭＣは、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照の用量を増大させて、２４時間または４８時間インキュベートした。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、フローサイトメトリーにより活性化マーカーＣＤ６９の発現として測定した。ＡＥ０４２、Ｐ１０６９、およびＴＲＳはＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の異なるバッチを表し、濃度は、０．０００５μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌである。様々な処置について、「ｃ」はコーティングを表し、「ｓ」は可溶性を表す。エラーバーは、６つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。
【図３０】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３とｍＡｂ非含有状態と間の非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の統計的比較を示す図である。図２９のデータは、２４時間（Ａ）および４８時間（Ｂ）の時点で、ｍＡｂ非含有対照に対する平均を比較するために、最小二乗フィットモデル後、ダネットの比較（α＝０，０５）によって分析した。平均の有意差は、判定限界外に針棒として示す（各治療の９５％ＣＩ区間；灰色の領域）。
【図３１】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３とアイソタイプ対照との間の非特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の統計的比較を示す図である。図２９のデータは、２４時間（Ａ）および４８時間（Ｂ）の時点で、アイソタイプ対照に対する平均を比較するために、最小二乗フィットモデル後、ダネットの比較（α＝０，０５）によって分析した。平均の有意差は、判定限界外に針棒として示す（各治療の９５％ＣＩ区間；灰色の領域）。
【図３２】２４時間の時点でのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３に対する非特異的Ｔ細胞サイトカイン応答を示す図である。ＰＢＭＣをＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照の用量を増大させて、２４時間インキュベートし、上清中のＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γの放出レベルをＬｕｍｉｎｅｘで測定した。ＡＥ０４２およびＰ１０６９は、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の異なるバッチであり、０．０００５μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌおよび５μｇ／ｍｌの濃度を表す。様々な処置について、「ｃ」はコーティングを表し、「ｓ」は可溶性を表す。エラーバーは、６つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。
【図３３】２４時間の時点でのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３とｍＡｂ非含有状態との間の非特異的Ｔ細胞サイトカイン応答の統計的比較を示す図である。図３２のデータは、ＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）、およびＴＮＦ−α（Ｄ）のｍＡｂ非含有対照に対する平均を比較するために、最小二乗フィットモデル後、ダネットの比較（α＝０，０５）によって分析した。平均の有意差は、判定限界外に針棒として示す（各治療の９５％ＣＩ区間；灰色の領域）。
【図３４】２４時間の時点でのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３とアイソタイプ対照との間の非特異的Ｔ細胞サイトカイン応答の統計的比較を示す図である。図３２のデータは、ＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）、およびＴＮＦ−α（Ｄ）のアイソタイプ対照に対する平均を比較するために、最小二乗フィットモデル後、ダネットの比較（α＝０，０５）によって分析した。平均の有意差は、判定限界外に針棒として示す（各治療の９５％ＣＩ区間；灰色の領域）。
【図３５】４８時間の時点でのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３に対する非特異的Ｔ細胞サイトカイン応答を示す図である。ＰＢＭＣをＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照の用量を増大させ４８時間インキュベートし、上清中のＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γの放出レベルをＬｕｍｉｎｅｘで測定した。ＡＥ０４２、Ｐ１０６９、およびＴＲＳは、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の異なるバッチであり、０．０００１μｇ／ｍｌ、０．０００５μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ、０．００５μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．０５μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、１、５μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌの濃度を表す。様々な処置について、「ｃ」はコーティングを表し、「ｓ」は可溶性を表す。エラーバーは、６つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。
【図３６】４８時間の時点でのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３とｍＡｂ非含有状態との間の非特異的Ｔ細胞サイトカイン応答の統計的比較を示す図である。図３５のデータは、ＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）、およびＴＮＦ−α（Ｄ）のｍＡｂ非含有対照に対する平均を比較するために、最小二乗フィットモデル後、ダネットの比較（α＝０，０５）によって分析した。平均の有意差は、判定限界外に針棒として示す（各治療の９５％ＣＩ区間；灰色の領域）。
【図３７】４８時間の時点でのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３とアイソタイプ対照との間の非特異的Ｔ細胞サイトカイン応答の統計的比較を示す図である。図３５のデータは、ＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）、およびＴＮＦ−α（Ｄ）のアイソタイプ対照に対する平均を比較するために、最小二乗フィットモデル後、ダネットの比較（α＝０，０５）によって分析した。平均の有意差は、判定限界外に針棒として示す（各治療の９５％ＣＩ区間；灰色の領域）。
【図３８】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３が、高密度ＰＢＭＣアッセイにおいて非特異的Ｔ細胞サイトカイン応答を誘発しないことを示す図である。ＰＢＭＣを高密度（１０７細胞／ｍｌ）で４８時間インキュベートした。次に、細胞を通常の密度（１０６細胞／ｍｌ）で播種し、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照の用量を増大させて２４時間培養し、上清中のＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γの放出レベルをＬｕｍｉｎｅｘで測定した。ＡＥ０４２およびＴＲＳは、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の異なるバッチであり、濃度は、０．０００１μｇ／ｍｌ、０．００１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１μｇ／ｍｌ、および１０μｇ／ｍｌである。エラーバーは、４つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。
【図３９】高密度ＰＢＭＣアッセイにおけるＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３とｍＡｂ非含有状態との非特異的Ｔ細胞サイトカイン応答の統計的比較を示す図である。図３８のデータは、ＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）、およびＴＮＦ−α（Ｄ）のｍＡｂ非含有対照に対する平均を比較するために、最小二乗フィットモデル後、ダネットの比較（α＝０，０５）によって分析した。平均の有意差は、判定限界外に針棒として示す（各治療の９５％ＣＩ区間；灰色の領域）。
【図４０】高密度ＰＢＭＣアッセイにおけるＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３とアイソタイプ対照間の非特異的Ｔ細胞サイトカイン応答の統計的比較を示す図である。図３８のデータは、ＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）、およびＴＮＦ−α（Ｄ）のアイソタイプ対照に対する平均を比較するために、最小二乗フィットモデル後、ダネットの比較（α＝０，０５）によって分析した。平均の有意差は、判定限界外に針棒として示す（各治療の９５％ＣＩ区間；灰色の領域）。
【図４１】ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、全血アッセイにおいてサイトカイン応答を誘発しないことを示す図である。健康なボランティアからの全血を、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照の用量を増大させて２４時間培養し、血清中のＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γのレベルをＬｕｍｉｎｅｘで測定した。ＡＥ０４２およびＴＲＳは、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の異なるバッチであり、濃度は、０．００１μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、および１μｇ／ｍｌである。エラーバーは、４つの独立した実験の平均値±ＳＥＭを表す。
【図４２】全血アッセイにおける、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３とｍＡｂ非含有状態間のサイトカイン応答の統計的比較を示す図である。図４１のデータは、ＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）、およびＴＮＦ−α（Ｄ）のｍＡｂ非含有対照に対する平均を比較するために、最小二乗フィットモデル後、ダネットの比較（α＝０，０５）によって分析した。平均の有意差は、判定限界外に針棒として示す（各治療の９５％ＣＩ区間；灰色の領域）。
【図４３】全血アッセイにおける、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３とアイソタイプ対照間のサイトカイン応答の統計的比較を示す図である。図４１のデータは、ＩＬ−２（Ａ）、ＩＬ−６（Ｂ）、ＩＦＮ−γ（Ｃ）、およびＴＮＦ−α（Ｄ）のアイソタイプ対照に対する平均を比較するために、最小二乗フィットモデル後、ダネットの比較（α＝０，０５）によって分析した。平均の有意差は、判定限界外に針棒として示す（各治療の９５％ＣＩ区間；灰色の領域）。
【図４４】ＮＯＤ  ＳＣＩＤ異種移植マウスモデルにおけるＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３治療的処置の有効性を示す図である。Ａ５４９細胞上でのＥＧＦＲの発現レベルは、グラフの前にｓＡＢＣによって決定した。腫瘍細胞（標的細胞、Ｔ）およびＰＢＭＣ（エフェクター細胞、Ｅ）の混合物を、ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの右側腹部に、Ｅ：Ｔ比２：１で（ｎ＝４〜５匹／群／ＰＢＭＣドナー）皮下注入した。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、２ｍｇ／ｋｇで、２日目から開始して、週１回、３週間、ｉ．ｖ投与した。腫瘍の成長は、外部キャリパー測定により決定した。グラフは、平均腫瘍サイズ（ｍｍ３）±ＳＥＭを示す。２つのＰＢＭＣドナーを含めた。試験名：Ａ５４９＿１５
【図４５】４１日目での治療処置および対照群におけるＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３間のＡ５４９腫瘍体積の比較を示す図である。データは、群ごとに４１日目での各動物の腫瘍体積を示した。データは、図４４から求めたものである。試験名：Ａ５４９＿１５
【発明を実施するための形態】
【００６４】
以下は、本発明に関連する非網羅的な例のセットである。
実施例１：様々なフォーマットでのＣＤ３ｘＥＧＦＲ二重特異性抗体の工学設計
【００６５】
Ｈｏｍｂａｃｈら（２００７年）は、標的分子内の標的エピトープの位置が、Ｔ細胞活性化の有効性に大きい影響を有すること、およびＴ細胞と標的細胞膜との間の距離を短くすることで、二重特異性抗体の細胞毒性の可能性が高まり得ることであることを実証した。発明者らの仮説は、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ  ＢＥＡＴ二重特異性抗体内において、結合ドメインを再配置することで、リダイレクトされたＴ細胞とＥＧＦＲ発現癌細胞との間の距離を変化させ、そのため、発明者らの分子の細胞毒性の可能性を調節できるというものであった。
【００６６】
パニツムマブ抗ＥＧＦＲバインダーおよびヒト化ＳＰ３４抗ＣＤ３バインダーは、以下に記載されるように、複数の異なるＢＥＡＴフォーマットに改変させた。
【００６７】
代替的ＢＥＡＴアーキテクチャの構築
代替的ＢＥＡＴアーキテクチャは、パニツムマブ抗ＥＧＦＲバインダーとヒト化ＳＰ３４抗ＣＤ３バインダーの位置を変えることにより設計された（図１）。アーキテクチャに応じて、バインダーは、単鎖断片（ｓｃＦｖ）またはＦａｂとしてフォーマットされた。ｓｃＦｖフォーマット内のバインダーは、Ｇｌｙ４ＳｅｒまたはＧｌｙ４Ｔｈｒリンカー（配列番号１３および１４）と融合し、柔軟性が得られた。ＦａｂがｓｃＦｖに融合するとき、それらの間にＧｌｙ４Ｓｅｒリンカーが付加された。部分的にまたは完全に異なるポリペプチド鎖をコードするコーディングＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、最初に、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって遺伝子合成され、標準的な分子生物学技術を使用して改変された。ＰＣＲ産物は、適切なＤＮＡ制限酵素で切断し、ＣＭＶプロモーターおよび同じＤＮＡ制限酵素で予め切断されたウシホルモンポリアデニル化（ｐｏｌｙ（Ａ））を担持する修飾ｐｃＤＮＡ３．１プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＡＧ、Ｚｕｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）において精製およびライゲート連結した。すべてのポリペプチド鎖は、分泌がマウスＶＪ２Ｃリーダーペプチドによって駆動されるこの発現ベクターにおいて、独立してライゲート連結された。ポリペプチド鎖Ａ（図１を参照）は一般に、可変ドメインに加えて、ＩｇＧ１ヒンジに続いて、Ｌ２３４Ａ置換基およびＬ２３５Ａ置換基を両方とも（ＥＵ番号付け）有するＩｇＧ３  ＣＨ２ドメインと、ＢＥＡＴ（Ａ）置換を含むＩｇＧ３  ＣＨ３ドメインとを含む。ヒト化ＳＰ３４抗ＣＤ３バインダーのＶＨ３型フレームワークによるプロテインＡの結合を防ぐため、ＳＰ３４が鎖Ａに置かれたときにプロテインＡ結合の無効化突然変異Ｎ８２ａＳおよび／またはＧ６５Ｓが付加された。ポリペプチド鎖Ｂは、一般にＩｇＧ１ヒンジに続いて、Ｌ２３４Ａ置換およびＬ２３５Ａ置換を両方ともを有するＩｇＧ１  ＣＨ２ドメイン、およびＢＥＡＴ（Ｂ）置換を含むＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを含んでいた。バインダーがＦａｂフォーマットで存在する場合には、ＩｇＧ１  ＣＨ１ドメインもポリペプチド鎖の一部であった。以下の分子が構築された：ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿１（配列番号１、２および３）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ１（配列番号４、５および６）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ３（配列番号７、２および８）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ４（配列番号４、５および９）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＤ１（配列番号１、２および１０）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＤ２（配列番号１１、１０および２）およびＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿９（配列番号１、２および１２）。
【００６８】
代替的ＢＥＡＴアーキテクチャでのＣＤ３ｘＥＧＦＲの産生
一過性発現のために、等量の各改変鎖ベクターを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ；Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、浮遊適応ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ細胞に同時トランスフェクトした（ＡＴＣＣ−ＬＧＬ標準、Ｔｅｄｄｉｎｇｔｏｎ、ＵＫ；カタログ番号：ＣＲＬ−１０８５２）。典型的には、０．８〜１２０万個細胞／ｍｌの密度で、懸濁液中の１００ｍｌの細胞にＤＮＡ−ＰＥＩ混合物をトランスフェクトする。それぞれの鎖をコードする組換え発現ベクターが宿主細胞に導入されると、免疫グロブリン構築物は、培養培地への分泌を可能にするために４〜５日間細胞をさらに培養することにより産生される（ＥＸ−ＣＥＬＬ  ２９３、ＨＥＫ２９３無血清培地（Ｓｉｇｍａ）、０．１％プルロン酸および４ｍＭグルタミンを補充）。分泌タンパク質を含む無細胞培養上清は、遠心分離、およびその後の滅菌ろ過によって調製された。その後、プロテインＡアフィニティー樹脂（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）を使用して、無細胞上清からＢＥＡＴを精製した。清澄化した上清を０．２ＭのＮａＨ２ＰＯ４でｐＨ６．０に調整し、重力流によりプロテインＡに添加した。カラムは、２０ＣＶの０．２Ｍクエン酸リン酸緩衝液ｐＨ６．０で洗浄した。タンパク質は、ｐＨ４．１の１６ＣＶの２０ｍＭ酢酸ナトリウムで溶出し、０．１容量の１ＭトリスｐＨ８．０（Ｓｉｇｍａ）で中和した。サンプルは、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、緩衝液交換して、ＰＢＳｐＨ７．４とした。例外的に、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ３無細胞上清を、０．２Ｍクエン酸リン酸緩衝液ｐＨ６．０で事前に平衡化した１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラムに添加し、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（商標）クロマトグラフィーシステムで流量１ｍｌ／分で操作した（いずれもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ製。カラムカタログ番号：１１−００３４−９３）。実行緩衝液は、０．２Ｍクエン酸リン酸緩衝液ｐＨ６．０であった。洗浄緩衝液は、０．２Ｍクエン酸リン酸緩衝液ｐＨ５．０であった。溶出は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．１を使用して行った。溶出後、２８０ｎｍでＯＤを読み取った。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ抗体を含む画分を貯留し、０．１％容量の１ＭトリスｐＨ８．０で中和した。サンプルは、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、緩衝液交換して、ＰＢＳｐＨ７．４とした。
【００６９】
実施例２：ＥＧＦＲのドメインＩＶに特異的な抗ＥＧＦＲ抗体の生成および特性評価。
免疫
７週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈａｒｌａｎ）を使用して、ＥＧＦＲの細胞外ドメイン４に対する抗体を作製した。マウスは、５０μｇヒトＥＧＦＲ  Ｈｉｓタグ付きタンパク質（配列番号１５）または５０μｇ細胞外ドメインＩＶ  ＥＧＦＲ  Ｈｉｓタグ付きタンパク質（配列番号１６）のいずれかの混合物を１００μｌのアジュバントと組み合わせて、腹腔内（ｉ．ｐ）経路および皮下（ｓ．ｃ．）経路で３回免疫した。免疫したマウス血清中のドメインＩＶに特異的な循環抗ＥＧＦＲ抗体の存在を、組換えヒトＥＧＦＲ  ｈｉｓまたはドメインＩＶ  Ｈｉｓタンパク質でコーティングしたプレートを用いた直接ＥＬＩＳＡにより評価した。マウス血清を連続希釈し（１：１００〜１：１０９）、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに添加し、ヤギ抗マウス分子ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して結合された抗体を検出した。アジュバントなしの１０μｇの抗原による最終的な静脈内追加免疫を、屠殺の３日前に、最良の抗ＥＧＦＲドメインＩＶ  ＩｇＧ血清力価を示す動物において実施した。動物を安楽死させ、融合のために脾臓を採取した。
【００７０】
融合プロトコル
１ｍｌの温式ＰＥＧ１５００を回旋させながら１分間かけて細胞スラリーにゆっくり加えた。細胞は、さらに２分間、穏やかに混合した。次に、４ｍｌの温式ＳＦＭを４分間かけて加えた。温式ＳＦＭ１０ｍｌをゆっくりと加え、細胞を水浴、３７℃で５分間インキュベートした。細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、２００ｍｌの完全培地に再懸濁した。融合のために、細胞を１０枚の９６平底ウェルプレートに２００μｌ／ウェルで播種した。
【００７１】
フローサイトメトリーによる膜結合ＥＧＦＲ上のハイブリドーマ上清のスクリーニング
組換えヒトＥＧＦＲに特異的なマウスＩｇＧの含有量について、２つの融合の約１９００のウェルをＥＬＩＳＡにより分析した。陽性ハイブリドーマ上清を、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに固定されたヒトＥＧＦＲの組換えドメインＩＶに対して、さらにスクリーニングした。試験を行ったすべてのクローンの中で、２つの親候補である３Ａ６および１０Ｅ６が同定され、膜結合ＥＧＦＲをトランスフェクトしたＢＡＦ細胞において、フローサイトメトリーによる試験を行った。このアッセイでは、１０５細胞／ウェルを１００μｌの上清と共に４℃で１時間インキュベートした。この一次インキュベーションの後、細胞を１３００ｒｐｍで２分間遠心分離し、ペレットをＦＡＣＳ緩衝液で１／１００に希釈したＰＥ標識ヤギ抗マウス二次抗体１００μｌで再懸濁した。次いで、細胞を４℃で３０分間インキュベートし、２回洗浄し、上清を除去し、細胞を１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。サンプルは、フローサイトメトリーで解析した。図２に示すとおり、フローサイトメトリー実験の結果は、３Ａ６および１０Ｅ６ハイブリドーマ候補は両方とも、１０μｇ／ｍｌで使用したアイソタイプ対照と比較して、ＢＡＦ細胞で発現した膜結合ヒトＥＧＦＲ受容体を認識することを示している。これらの２つのハイブリドーマ候補が拡張され、サブクローン化された。
【００７２】
ＥＬＩＳＡによる可溶性ＥＧＦＲ上のハイブリドーマ上清のスクリーニング
サブクローン３Ａ６Ａ１２Ｂ５および１０Ｅ６Ｆ５は、それぞれ３Ａ６および１０Ｅ６の親クローンから誘導された。両方のサブクローンの上清を採取し、製造業者の説明書に従ってＬＣ−κマウスアフィニティマトリックス（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製した。これらの精製抗体は、可溶性ヒトＥＧＦＲまたは組換えＥＧＦＲ−Ｈｅｒ３キメラ構築物のいずれかでコーティングされた９６ウェルプレートでＥＬＩＳＡにより試験された。これらの分子をＰＢＳ中で２μｇ／ｍｌに希釈し、高結合９６ウェルプレートに４℃で一晩固定した。プレートをＰＢＳ２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）によりブロックし、３Ａ６Ａ１２Ｂ５または１０Ｅ６Ｆ５のいずれかの段階希釈液で１時間インキュベートした。対照として、パニツムマブ（ベクティビックス（登録商標））を同じ濃度で使用した。次に、プレートをＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧ（３Ａ６Ａ１２Ｂ５および１０Ｅ６Ｆ５を検出するため）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ、Ｎｅｗｍａｒｋｅｔ、ＵＫ）またはヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ‘）２断片特異的ＨＲＰ（パニツムマブを検出するため）のいずれか１００μｌと共に１時間インキュベートした。このインキュベーション後、プレートを洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質と共にインキュベートした。Ｈ２ＳＯ４  ２Ｎ  １００μｌを加えて反応を停止し、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ２分光光度計（Ｂｉｏｔｅｋ、ＵＳＡ；ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｏｒ：ＷＩＴＴＥＣ  ＡＧ、Ｌｉｔｔａｕ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により４５０ｎｍでの吸光度を読み取った。図３の結果は、精製３Ａ６Ａ１２Ｂ５抗体および１０Ｅ６Ｆ５抗体が、用量依存様式で可溶性ＥＧＦＲ分子（Ａ）を認識し、キメラＨｅｒ３Ｉ−ＩＩＩ−ＥＧＦＲ  ＩＶ（Ｃ）分子およびＥＧＦＲ  ＩＶ（Ｄ）分子にも結合することを示している。逆に、これら２つの候補はいずれも、キメラＥＧＦＲ  Ｉ−ＩＩＩ  Ｈｅｒ３  ＩＶ分子を認識することはない（Ｂ）。これらの結果は、３Ａ６Ａ１２Ｂ５抗体および１０Ｅ６Ｆ５抗体が両方とも、ＥＧＦＲ、特にドメインＩＶに結合することを示している。
【００７３】
リダイレクト溶解アッセイ（ＲＤＬ）
このアッセイは、実施例に記載されている手順に従って行った。図４は、ＢＥＡＴ  ＣＤ３−ＥＧＦＲ＿５分子およびＣＤ３−ＥＧＦＲ＿８分子が両方とも、ＥＧＦＲ＋Ａ５４９標的細胞に対する殺傷能力を呈することを示している。
【００７４】
実施例３：抗ＥＧＦＲドメインＩＶ抗体３Ａ６および１０Ｅ６のヒト化
３．１マウスの免疫および抗体の特性評価に使用されるヒトＥＧＦＲおよびキメラヒトＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ３タンパク質
Ｃ末端ポリヒスチジンタグを有するヒトＥＧＦＲ可溶性細胞外領域のポリペプチド鎖（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ００５３３残基２５〜６３８、本明細書ではｈＥＧＦＲと称する、配列番号１５）をコードするコーディングＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、ＧＥＮＥＡＲＴ  ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成され、標準的な分子生物学技術を使用して改変した。ＰＣＲ産物は、適切なＤＮＡ制限酵素で切断し、精製し、ＣＭＶプロモーターおよび同じＤＮＡ制限酵素で以前に切断したウシホルモンポリアデニル化（ポリ（Ａ））シグナルを担持する修飾ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにライゲート連結した。
【００７５】
以下のＥＧＦＲドメインＩＶのみの構築物を上記のｈＥＧＦＲ構築物からＰＣＲ増幅し、上記の発現プラスミドに制限ライゲート連結した：ｈＥＧＦＲ−ＩＶ＿５０５〜６３８（５０５〜６３８は、残基の範囲を示し、この構築物は、溶解度を高めるために突然変異Ｗ５１６Ａを追加で担持し、適切な突然変異を含むプライマーを使用して、標準的なオーバーラップＰＣＲにより突然変異を付加した）、ｈＥＧＦＲ−ＩＶ＿５５６〜６３８およびｈＥＧＦＲ−ＩＶ＿５８０〜６３８（配列番号１６、１７および１８）。カニクイザルＥＧＦＲ−ＩＶ＿５５６〜６３８および５８０〜６３８（本明細書では、ｃＥＧＦＲ−ＩＶ＿５５６〜６３８および５８０〜６３８と称する）は、ＰＣＲをオーバーラップさせることにより、突然変異Ａ５６６Ｖ（残基５５６〜６３８を含む構築物についてのみ）、Ｐ６３７Ａ、およびＴ６３８Ｒをヒト構築物に付加することによって作製された（配列番号１９および２０）。
【００７６】
以下のキメラヒトＥＧＦＲ−ＥｒｂＢ３構築物（ヒトＥｒｂＢ３、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号：Ｐ２１８６０）が設計され、それらのポリペプチド鎖をコードするｃＤＮＡは、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって合成された：ｈＥＧＦＲ−Ｉ−ＩＩ−ＩＩＩ＿ｈＥｒｂＢ３−ＩＶおよびｈＥｒｂＢ３−Ｉ−ＩＩ−ＩＩＩ＿ｈＥＧＦＲ−ＩＶ（配列番号２１および２２）。
【００７７】
上記のＥＧＦＲ構築物の一過性発現のために、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を使用して、適切な発現ベクターを浮遊適応ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞（ＡＴＣＣ−ＣＲＬ−１０８５２）にトランスフェクトした。典型的には、０．８〜１２０万個の細胞／ｍｌの密度で懸濁液中の１００ｍｌの細胞に、１００μｇの発現ベクターを含むＤＮＡ−ＰＥＩ混合物をトランスフェクトする。組換え発現ベクターが宿主細胞に導入されると、細胞をさらに４日〜５日間さらに培養することによりタンパク質が産生され、０．１％プルロン酸、４ｍＭグルタミンを補充した培地（ＥＸ−ＣＥＬＬ  ２９３、ＨＥＫ２９３−無血清培地；Ｓｉｇｍａ、Ｂｕｃｈｓ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）への分泌が可能になる。次いで、ＥＧＦＲを、Ｎｉセファロースエクセル（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して無細胞上清から精製し、さらなる分析に使用した。
【００７８】
３．２キメラ３Ａ６および１０Ｅ６
標準的な分子生物学技術を使用して、ハイブリドーマ細胞からの抗体から抽出されたＶＨ配列およびＶＬ配列は、マウス−ヒトキメラＩｇＧ１抗体に再フォーマットさせた。マウス３Ａ６および１０Ｅ６ＶＨドメインをヒトＩｇＧ１  Ｆｃ（ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３）に融合し、対応するＶＬドメインをＩｇＧ１定常κに融合した。得られた構築物を上記の改変ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドにライゲート連結した（３Ａ６キメラ抗体配列番号２３および２４、１０Ｅ６キメラ抗体配列番号２５および２６）。
【００７９】
キメラ抗体の一過性発現のために、重鎖および軽鎖の組換えベクターを、ＰＥＩを使用して、１：１のモル比で浮遊適応ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした。プロテインＡアフィニティー樹脂を使用して、無細胞上清から抗体を精製した（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ、Ｗａｌｔｈａｍ  ＭＡ、ＵＳＡ）。清澄化された上清を重力流によりプロテインＡに添加した。タンパク質は、０．１ＭグリシンｐＨ３．０で溶出した。サンプルは、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＮＡＰ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ、Ｇｌａｔｔｂｒｕｇｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用して、緩衝液交換して、ＰＢＳｐＨ７．４とした。
【００８０】
３．３マウスモノクローナル３Ａ６のヒト化
ヒトＣＤＲ移植アクセプターフレームワークの結合特性を実質的に保持するヒトアクセプターフレームワークを選択することなど、抗ヒトＥＧＦＲマウス抗体３Ａ６のヒト化が本明細書に記載されている。２つの移植片、最適適合フレームワークを使用するものと、安定したフレームワークを使用するものとを調製した。
【００８１】
相同性一致を使用して、３Ａ６  ＣＤＲを移植するヒトの最適適合アクセプターフレームワークを選択した。データベース（例：ヒトおよびマウスの免疫グロブリン遺伝子座の生殖細胞系可変遺伝子のデータベース（上記のＩＭＧＴデータベース）またはＶＢＡＳＥ２（Ｒｅｔｔｅｒ  Ｉら（２００５年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３、Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ  Ｄ６７１−Ｄ６７４）またはＫａｂａｔデータベース（Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｇら（２０００年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２１４−２１８）または出版物（例：Ｋａｂａｔ  ＥＡら、上記）を使用して、マウスの重鎖および軽鎖Ｖ領域が属するヒトのサブファミリーを特定し、アクセプター分子として使用する最適適合ヒト生殖細胞系フレームワークを決定し得る。アクセプターとして使用されるこれらのサブファミリー内の重鎖および軽鎖可変配列（ＶＨおよびＶＬ）の選択は、移植後の６つのＣＤＲの適切な相対的提示を保持するのを助けるために、ＣＤＲ１領域およびＣＤＲ２領域の配列相同性および／または構造の一致に基づいて行われ得る。
【００８２】
例えば、ＩＭＧＴデータベースを使用すると、３Ａ６重鎖可変ドメインフレームワークとヒト重鎖可変ドメインサブファミリー４のメンバーとの良好な相同性が示される。ＣＤＲおよびフレームワーク配列の両方の最良の相同性および同一性は、ＣＤＲ３までの全配列について５９．４％の配列同一性を有する生殖系列配列ＩＧＨＶ４−４＊０８（配列番号２７）で観察された。
【００８３】
同じアプローチを使用すると、３Ａ６軽鎖可変ドメイン配列は、ヒト軽鎖可変ドメインκサブファミリー６のメンバーと良好な相同性を示した。ＣＤＲおよびフレームワーク配列の両方の最良の相同性および同一性は、６９．５％の配列同一性を有する生殖系列配列ＩＧＫＶ６−２１＊０２（配列番号２８）で観察された。
【００８４】
アクセプターとして使用されるヒト重鎖および軽鎖可変配列（ＶＨおよびＶＬ）の選択は、天然の抗体レパートリーに見られるように、良好な生物物理学的特性（Ｅｗｅｒｔ  Ｓら（２００３年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、３２５、５３１−５５３に記載のとおり）および／またはペアリング（Ｇｌａｎｖｉｌｌｅ  Ｊら（１９９９年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、１０６（４８）：２０２１６−２１；ＤｅＫｏｓｋｙ  ＢＪら（２０１５年）Ｎａｔ  Ｍｅｄ、２１（１）：８６−９１に記載のとおり）を有する生殖細胞系に基づき得る。良好なペアリングおよび／または安定性について、当該分野で公知であるフレームワーク配列は、ヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２９）フレームワークおよびＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号３０）フレームワークであり、これらは、３Ａ６安定移植ヒト化のアクセプターフレームワークとして使用した。
【００８５】
ヒトガンマ１アイソタイプの２つのヒト化抗体を調製した。これらの抗体は、ヒト−マウスハイブリッド重鎖可変ドメインおよびヒト−マウスハイブリッド軽鎖可変ドメインを含んだ。最初のハイブリッド重鎖可変ドメインは、ヒト重鎖可変ドメインＩＧＨＶ４−４＊０８をベースとしており、これは生殖細胞系ＣＤＲＨ１およびＨ２を、それぞれ３Ａ６  ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２に置き換えたものである。ヒトアクセプターフレームワークに対する最良一致ＪＨセグメント配列は、相同性検索を用いてＩＭＧＴデータベースから特定した。ヒトアクセプターフレームワーク上にＣＤＲを収容するために、ヒト残基をマウス残基に置き換えることにより主要位置を改変した。このプロセスは逆突然変異と呼ばれ、モノクローナル抗体のヒト化における最も予測不可能な手順である。これには、ヒト化抗体での潜在的な免疫原性を最小限に抑えると同時に親和性を保存するために、保持する必要のある、マウス抗体の重要なフレームワーク残基の同定および選択を必要とする。ヒトＩＧＨＶ４−４＊０８フレームワーク領域、３Ａ６マウスＣＤＲ、ヒトからマウスフレームワークへの主要な逆突然変異、およびＪＨとヒトアクセプターとの最良な一致を有する、得られたヒト−マウスハイブリッド重鎖可変配列は、本明細書では、配列番号３１を有する重鎖可変ドメイン３Ａ６最適適合ＶＨと称する。２番目のハイブリッド重鎖可変ドメインは、ヒト重鎖可変ドメインＩＧＨＶ３−２３＊０４をベースとしており、生殖細胞系ＣＤＲＨ１およびＨ２を、それぞれ３Ａ６  ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２に置き換えたものである。ヒトアクセプターフレームワークに対する最良一致ＪＨセグメント配列は、相同性検索を用いてＩＭＧＴデータベースから特定した。ヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４フレームワーク領域、３Ａ６マウスＣＤＲ、ヒトからマウスフレームワークへの主要な逆突然変異、およびＪＨとヒトアクセプターとの最良な一致を有する、得られたヒト−マウスハイブリッド重鎖可変配列は、本明細書では、配列番号３２を有する重鎖可変ドメイン３Ａ６安定ＶＨと称する。
【００８６】
同様に、この最初のヒト化抗体候補に使用される最初のヒト−マウスハイブリッド軽鎖可変ドメインは、ヒトＩＧＫＶ６−２１＊０２フレームワーク領域、３Ａ６マウスＣＤＲ、およびヒトアクセプターに最良に一致するＪＫを有し、かつ本明細書では、配列番号３３を有する軽鎖可変ドメイン３Ａ６最適適合ＶＬと称する（この場合、マウスおよびヒトのフレームワーク内で、すべての主要な位置が同じであったため、フレームワーク内での逆突然変異は必要なかった）。３Ａ６−最適適合−ＶＨおよび３Ａ６−最適適合−ＶＬを包含する最初のヒト化抗体は、本明細書では３Ａ６−最適適合抗体と略す。２番目のヒト化抗体候補に使用される２番目のヒト−マウスハイブリッド軽鎖可変ドメインは、ヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１フレームワーク領域、３Ａ６マウスＣＤＲ、ヒトからマウスフレームワークへの主要な逆突然変異、およびＪＫからヒトアクセプターへの最良の一致を有し、本明細書では、配列番号３４を有する軽鎖可変ドメイン３Ａ６−安定−ＶＬと称する。３Ａ６−安定−ＶＨおよび３Ａ６−安定−ＶＬを包含する第２のヒト化抗体は、本明細書では３Ａ６−安定抗体と略す。
【００８７】
３．４マウスモノクローナル１０Ｅ６のヒト化
ヒトＣＤＲ移植アクセプターフレームワークの結合特性を実質的に保持するヒトアクセプターフレームワークを選択することなど、抗ヒトＥＧＦＲマウス抗体１０Ｅ６のヒト化が本明細書に記載されている。２つの移植片として、最適適合フレームワークを使用するものと、最も安定したフレームワークを使用するものとを調製した。
【００８８】
相同性一致は、上記のように使用して、１０Ｅ６  ＣＤＲを移植するヒトの最適適合のアクセプターフレームワークを選択した。ＩＭＧＴデータベースは、１０Ｅ６重鎖可変ドメインフレームワークとヒト重鎖可変ドメインサブファミリー４のメンバーとの良好な相同性を示している。ＣＤＲおよびフレームワーク配列の両方の最良の相同性および同一性は、ＣＤＲ３までの全配列について７３．２％の配列同一性を有する生殖系列配列ＩＧＨＶ４−３０−４＊０１（配列番号３５）で観察された。
【００８９】
同じアプローチを使用すると、１０Ｅ６軽鎖可変ドメイン配列は、ヒト軽鎖可変ドメインκサブファミリー６のメンバーと良好な相同性を示した。ＣＤＲおよびフレームワーク配列の両方の最良の相同性および同一性は、６９．５％の配列同一性を有する生殖系列配列ＩＧＫＶ６−２１＊０２（配列番号１４）で観察された。
【００９０】
上記のように、安定したフレームワークが選択された。ヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４（配列番号２９）フレームワークおよびＩＧＫＶ１−３９＊０１（配列番号３０）は、安定した移植片ヒト化のアクセプターフレームワークとして使用した。
【００９１】
ヒトガンマ１アイソタイプの２つのヒト化抗体を調製した。これらの抗体は、ヒト−マウスハイブリッド重鎖可変ドメインおよびヒト−マウスハイブリッド軽鎖可変ドメインを含んだ。最初のハイブリッド重鎖可変ドメインは、ヒト重鎖可変ドメインＩＧＨＶ４−３０−４＊０１をベースとしており、これは生殖細胞系ＣＤＲＨ１およびＨ２を、それぞれ１０Ｅ６  ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２に置き換えたものである。ヒトアクセプターフレームワークに対する最良一致ＪＨセグメント配列は、相同性検索を用いてＩＭＧＴデータベースから特定した。ヒトＩＧＨＶ４−３０−４＊０１フレームワーク領域、１０Ｅ６マウスＣＤＲ、ヒトからマウスフレームワークへの主要な逆突然変異、およびＪＨとヒトアクセプターとの最良な一致を有する、得られたヒト−マウスハイブリッド重鎖可変配列は、本明細書では、配列番号３６を有する重鎖可変ドメイン１０Ｅ６最適適合ＶＨと称する。２番目のハイブリッド重鎖可変ドメインは、ヒト重鎖可変ドメインＩＧＨＶ３−２３＊０４をベースとしており、これは生殖細胞系ＣＤＲＨ１およびＨ２を、それぞれ１０Ｅ６  ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２に置き換えたものである。ヒトアクセプターフレームワークに対する最良一致ＪＨセグメント配列は、相同性検索を用いてＩＭＧＴデータベースから特定した。ヒトＩＧＨＶ３−２３＊０４フレームワーク領域、１０Ｅ６マウスＣＤＲ、ヒトからマウスフレームワークへの主要な逆突然変異、およびＪＨとヒトアクセプターとの最良な一致を有する、得られたヒト−マウスハイブリッド重鎖可変配列は、本明細書では、配列番号３７を有する重鎖可変ドメイン１０Ｅ６安定ＶＨと称する。
【００９２】
同様に、この最初のヒト化抗体候補に使用される最初のヒト−マウスハイブリッド軽鎖可変ドメインは、ヒトＩＧＫＶ６−２１＊０２フレームワーク領域、１０Ｅ６マウスＣＤＲ、ヒトからマウスフレームワークへの主要な逆突然変異、およびＪＫからヒトアクセプターへの最良な一致を有し、本明細書では、配列番号３８を有する軽鎖可変ドメイン１０Ｅ６最適適合ＶＬと称する。１０Ｅ６最適適合ＶＨおよび１０Ｅ６最適適合ＶＬを包含する最初のヒト化抗体は、本明細書では１０Ｅ６最適適合抗体と略す。２番目のヒト化抗体候補に使用される２番目のヒト−マウスハイブリッド軽鎖可変ドメインは、ヒトＩＧＫＶ１−３９＊０１フレームワーク領域、１０Ｅ６マウスＣＤＲ、ヒトからマウスフレームワークへの主要な逆突然変異、およびＪＫからヒトアクセプターへの最良の一致を有し、本明細書では、配列番号３９を有する軽鎖可変ドメイン１０Ｅ６安定ＶＬと称する。１０Ｅ６安定ＶＨおよび１０Ｅ６安定ＶＬを包含する第２のヒト化抗体は、本明細書では１０Ｅ６安定抗体と略す。
【００９３】
３．５ヒト化３Ａ６抗体および１０Ｅ６抗体の産生
最適適合ＶＨおよびＶＬならびに安定ＶＨおよびＶＬのコーディングＤＮＡ配列（ｃＤＮＡ）は、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）によって合成され、標準的な分子生物学技術を使用して改変させた。ＶＨドメインは、ヒトＩｇＧ１  ＣＨ１−ヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分に融合し、上記の発現ベクターに制限ライゲート連結した。同様に、ＶＬドメインの遺伝子をヒト定常κドメインに融合し、別の発現ベクターにライゲート連結した。得られた抗体は、３Ａ６最適適合（配列番号４０および４１）、３Ａ６安定（配列番号４２および４３）、１０Ｅ６最適適合（配列番号４４および４５）ならびに１０Ｅ６安定（配列番号４６および４７）であった。
【００９４】
抗体の一過性発現のために、重鎖および軽鎖の組換えベクターを、ＰＥＩを使用して、１：１のモル比で浮遊適応ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした。次に、プロテインＡアフィニティー樹脂を使用して、無細胞上清から抗体を精製した。清澄化された上清を重力流によりプロテインＡに添加した。タンパク質は、０．１ＭグリシンｐＨ３．０で溶出した。サンプルは、Ｉｌｌｕｓｔｒａ  ＮＡＰ−１０カラムを使用して、緩衝液交換して、ＰＢＳｐＨ７．４とした。
【００９５】
３．６表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるヒトＥＧＦＲに対するキメラおよびヒト化抗体の速度論的結合親和性定数
動的結合親和性定数（ＫＤ）を測定した。ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ−ＢＩＡｃｏｒｅ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）で、室温において測定を行い、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアで解析した。Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、１００ＲＵの目的の抗体を捕捉した。ｈＥＧＦＲは、ＨＢＳ−ＥＰ＋緩衝液中、３０μｌ／分の流量で、３Ａ６については１９．５３〜２５００ｎＭ、１０Ｅ６ベースの抗体では２．４〜３１２．５ｎＭまたは１〜２５０ｎＭの範囲の濃度で注入した（図５および図６、データは、応答単位の数（略記ＲＵ；Ｙ軸）対時間（Ｘ軸）として表す）。各結合事象の後、ｐＨ１．５のグリシン緩衝液１０μｌで表面を再生した。解離時間は４分であった。実験データは、１：１ラングミュアモデルを使用して、グローバルＲｍａｘで処理した。
【００９６】
３．７ＳＰ３４と組み合わせた３Ａ６および１０Ｅ６二重特異性抗体の産生
３Ａ６バインダーおよび１０Ｅ６バインダーとヒト化ＳＰ３４とを組み合わせた二重特異性ＢＥＡＴ抗体を生成するために、上記のＶＨ断片をヒトＩｇＧ１  ＣＨ１ヒンジに融合し、その後ＢＥＡＴ（Ａ）置換を含むＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインを融合した。ＣＨ２ドメインには、Ｌ２３４Ａ置換およびＬ２３５Ａ置換の両方の（ＥＵ番号）を含めた。ｓｃＦｖフォーマットの実験室内ヒト化ＳＰ３４の後に、５つの短いアミノ酸リンカー（Ｇｌｙ４Ｔｈｒ）を、ヒトＩｇＧ３  ＣＨ２ドメイン、その後ＢＥＡＴ（Ｂ）置換を含むＩｇＧ３  ＣＨ３ドメインに融合した。ＣＨ２ドメインには、Ｌ２３４Ａ置換およびＬ２３５Ａ置換を両方とも含んでいた。構築物は、上記のように、発現ベクターにライゲート連結した。得られた分子は、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿５（配列番号４８、２４および４９）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿６（配列番号５０、２６および４９）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿７（配列番号４８、３５および４９）およびＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿８（配列番号５２、３６および４７）であった。
【００９７】
ＢＥＡＴ抗体の一過性発現のために、重鎖および軽鎖およびｓｃＦｖ−Ｆｃ鎖の組換えベクターを、上記のようにＰＥＩを使用して１：１：１のモル比で浮遊適応ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトした。無細胞上清を、０．２Ｍクエン酸リン酸緩衝液ｐＨ６．０で事前に平衡化した１ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ（商標）ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（商標）プロテインＡカラムに添加し、ＡＫＴＡｐｕｒｉｆｉｅｒ（商標）クロマトグラフィーシステムで流量１ｍｌ／分で操作した（いずれもＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ製。カラムカタログ番号：１１−００３４−９３）。実行緩衝液は、０．２Ｍクエン酸リン酸緩衝液ｐＨ６．０であった。洗浄緩衝液は、０．２Ｍクエン酸リン酸緩衝液ｐＨ５．０であった。溶出は、２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ４．１を使用して行った。溶出後、２８０ｎｍでＯＤを読み取った。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ抗体を含む画分を貯留し、０．１％容量の１ＭトリスｐＨ８．０で中和した。
【００９８】
３．８カニクイザルとのエピトープマッピングおよび交差反応性
ＥＧＦＲドメインＩＶ内のエピトープを絞り込み、カニクイザルＥＧＦＲとの交差反応性を実証するために、表面プラズモン共鳴を使用して、様々なヒトおよびカニクイザルのＥＧＦＲドメインＩＶ構築物に対する３Ａ６抗体および１０Ｅ６抗体の結合を評価した。
【００９９】
測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ２０００機器（ＧＥ）で行った。ＣＭ５センサーチップをプロテインＧと共有結合させ、１００  ＲＵの３Ａ６または１０Ｅ６キメラ抗体を捕捉した。様々なヒトおよびカニクイザルのＥＧＦＲ構築物を、アナライトとして、２００ｎＭの濃度、３０μｌ／分の流量で、ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液に注入した。解離時間は４分であった。各結合事象の後、ｐＨ１．５のグリシン緩衝液１０μｌで表面を再生した。ＥＧＦＲドメインＩＶ構築物の完全性を検証するために、少なくとも１つの抗ＥＧＦＲドメインＩＶバインダー（ＡＦ２３１、Ｂｉｏ−Ｔｅｃｈｎｅ  ＡＧ、Ｚｕｇ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を含むことが公知であるポリクローナルヤギ抗ＥＧＦＲを上記のように固定し、上記のとおり、ヒトおよびカニクイザルＥＧＦＲ構築物を注入した。結果を図７に示す。３Ａ６抗体および１０Ｅ６抗体は両方とも、ヒトおよびカニクイザルのＥＧＦＲ−ＩＶ＿５５６〜６３８に結合することができた。ＥＧＦＲ−ＩＶ＿５８０〜６３８は、抗体のいずれにも結合していなかった。したがって、本発明者らは、３Ａ６および１０Ｅ６抗体の結合エピトープは、ＥＧＦＲドメインＩＶ内にあり、より正確には残基５５６〜６３８内にあると結論付けている。さらに、残基５５６〜５８０には、エピトープの必要とされる部分が含まれている。さらに、３Ａ６抗体および１０Ｅ６抗体が両方とも、カニクイザルＥＧＦＲに対して交差反応することを示す。
【０１００】
３．９１０Ｅ６最適適合および１０Ｅ６安定抗体の熱安定性
ＰＢＳ緩衝液中の１０Ｅ６最適適合抗体および１０Ｅ６安定抗体の熱安定性は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって調査した。熱量測定は、ＶＰ−ＤＳＣキャピラリー差動走査マイクロ熱量計で実施した（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ、Ｍａｌｖｅｒｎ、ＵＫ）。細胞体積は、０．１２８ｍｌ、加熱速度は１℃／分、過剰圧力は６４ｐ．ｓ．ｉに維持した。いずれのサンプルも、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、１ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した。各タンパク質のモル熱容量は、タンパク質が省略された同一の緩衝液を含む重複サンプルと比較することにより推定した。部分モル熱容量および融解曲線は、標準的な手順を使用して分析した。サーモグラムをベースライン補正し、濃度を正規化し、Ｏｒｉｇｉｎ  ｖ７．０ソフトウェア（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｔｄ提供）により、非２状態モデルを使用してさらに解析した。結果を図８に示す。１０Ｅ６最適適合Ｆａｂおよび１０Ｅ６安定Ｆａｂの融解温度（Ｔｍ）が決定され、それぞれ８２．８℃および８４．９℃であった。
【０１０１】
実施例４：皮下に異種移植されたＡ５４９腫瘍におけるＣＤ３−ＥＧＦＲ＿１の有効性
材料および方法
４．１．細胞株の培養条件
細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気の標準培地で培養した。細胞は、最適なコンフルエントで維持するために、週に２〜３回継代し、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ検出キット（ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）を用いて、細胞のマイコプラズマ汚染に関する試験を定期的に行った。細胞は、一貫してマイコプラズマ汚染を含まないことを試験した。
【０１０２】
４．２エフェクター細胞：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｌａ  Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した血液フィルタから採取した。血液フィルタ処理のために、１％Ｌｉｑｕｅｍｉｎｅ（登録商標）（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ）を補充した４０ｍｌのＰＢＳを血液フィルタに注入し、あらかじめフィコールを添加した５０ｍｌ血液分離管（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、ＰＡＡ５３５７１０）にＰＢＭＣを含む溶液を収集した（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１４４０−０３）。フィコール管を、８００ｇで、ブレーキなく、室温（ＲＴ）で２０分間遠心分離し、ＰＢＭＣ「バフィーコート」リングを採取し、３０ｍｌのＰＢＳを含む５０ｍｌファルコン管に移した。ＰＢＭＣは、処理する前にＰＢＳで３回洗浄した。
【０１０３】
４．３．動物の飼育
Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞の欠損を特徴とする７週齢の免疫不全雌ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスで、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った（Ｈａｒｌａｎ、Ｇｕａｎａ、Ｆｒａｎｃｅ）。マウスは、げっ歯類マイクロアイソレーターケージ内の標準化環境条件下で維持させた（２０±１℃室温、５０±１０％相対湿度、１２時間の明暗サイクル）。マウスには、照射した食物および寝床、ならびに０．２２μｍのろ過された飲料水を与えた。実験はいずれも、スイス連邦の獣医局（ｃａｎｔｏｎａｌ  ａｎｄ  ｆｅｄｅｒａｌ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）から事前の許可を得て、スイス連邦動物保護法（Ｓｗｉｓｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｌａｗ）に従って実施した。動物保護法に従って、皮下（ｓ．ｃ．）異種移植によって誘発させた腫瘍が２０００ｍｍ３に達したときに、マウスを安楽死させた。
【０１０４】
４．４．異種移植実験
腫瘍細胞（標的細胞、Ｔ）およびＰＢＭＣ（エフェクター細胞、Ｅ）の混合物を、ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの右側腹部に、Ｅ：Ｔ比２：１で（ｎ＝５匹／群／ＰＢＭＣドナー）ｓ．ｃ．注入した。
【０１０５】
プロトコルは予防用であり、治療は細胞移植３時間後に静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。
【０１０６】
ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿１は、週に１回、３週間ｉ．ｖ投与した。
【０１０７】
腫瘍の大きさの定量化は、キャリパー測定によって行った。腫瘍体積は、次式を使用して算出した：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５ｘ長さｘ幅２
【０１０８】
概要および結果
図９を参照すると、Ａ５４９細胞でのＥＧＦＲの発現レベルは、ｓＡＢＣによって決定した。雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右脇腹に、健康なヒトドナーから得たＡ５４９腫瘍細胞およびＰＢＭＣをｓ．ｃ．注入した。各ＰＢＭＣドナーについて、合計５匹のマウスを移植した。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿１は、０日目から開始して、週１回、３週間、ｉ．ｖ投与した。腫瘍の成長は、第４．４節で説明した外部キャリパー測定によって決定した。対照マウスは、ＰＢＳで処置した。実行した統計分析：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、その後、多重比較のためのダネットの事後分析。各条件（対照またはＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿１）について、２つのＰＢＭＣドナーを含めた（各条件にｎ＝１０匹／動物）。
【０１０９】
結論として、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿１は、Ａ５４９腫瘍では有効性を示さなかった。
【０１１０】
実施例５皮下異種移植されたＡ５４９腫瘍におけるＣＤ３−ＥＧＦＲ−ＳＦ１とＣＤ３−ＥＧＦＲ−ＳＦ３との有効性の比較
材料および方法
５．１．細胞株の培養条件
細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気の標準培地で培養した。細胞は、最適なコンフルエントで維持するために、週に２〜３回継代し、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ検出キットを用いて、細胞のマイコプラズマ汚染に関する試験を定期的に行った（ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）。細胞は、一貫して、マイコプラズマ汚染なく、試験が行われた。
【０１１１】
５．２．エフェクター細胞：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｌａ  Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した血液フィルタから採取した。血液フィルタ処理のために、１％Ｌｉｑｕｅｍｉｎｅ（登録商標）（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ）を補充した４０ｍｌのＰＢＳを血液フィルタに注入し、ＰＢＭＣを含む溶液を、あらかじめフィコールを添加した５０ｍｌ血液分離管（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、ＰＡＡ５３５７１０）に収集した（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１４４０−０３）。フィコール管を、８００ｇで、ブレーキなく、室温（ＲＴ）で２０分間遠心分離し、ＰＢＭＣ「バフィーコート」リングを採取し、３０ｍｌのＰＢＳを含む５０ｍｌファルコン管に移した。ＰＢＭＣは、処理する前にＰＢＳで３回洗浄した。
【０１１２】
５．３動物の飼育
Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞の欠損を特徴とする７週齢の免疫不全雌ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスで、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った（Ｈａｒｌａｎ、Ｇｕａｎａ、Ｆｒａｎｃｅ）。マウスは、げっ歯類マイクロアイソレーターケージ内の標準化環境条件下で維持させた（２０±１℃室温、５０±１０％相対湿度、１２時間の明暗サイクル）。マウスには、照射した食物および寝床、ならびに０．２２μｍのろ過した飲料水を与えた。実験はいずれも、スイス連邦の獣医局（ｃａｎｔｏｎａｌ  ａｎｄ  ｆｅｄｅｒａｌ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）から事前の許可を得て、スイス連邦動物保護法（Ｓｗｉｓｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｌａｗ）に従って実施した。動物保護法に従って、皮下（ｓ．ｃ．）異種移植によって誘発させた腫瘍が２０００ｍｍ３に達したときに、マウスを安楽死させた。
【０１１３】
５．４  異種移植実験
腫瘍細胞（標的細胞、Ｔ）およびＰＢＭＣ（エフェクター細胞、Ｅ）の混合物を、ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの右側腹部に、Ｅ：Ｔ比１：１で（ｎ＝５匹／群／ＰＢＭＣドナー）ｓ．ｃ．注入した。
【０１１４】
プロトコルは予防用であり、治療は細胞移植３時間後に静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。
・ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ１は、週１回、３週間、ｉ．ｖ投与した。
・ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、週１回、３週間、ｉ．ｖ投与した。
【０１１５】
腫瘍の大きさの定量化は、キャリパー測定によって行った。腫瘍体積は、次式を使用して算出した：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５ｘ長さｘ幅２
【０１１６】
５．５．統計処理
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用してデータを分析した。データは平均±ＳＥＭとして表示されている。統計分析は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、その後、多重比較のためのダネットの事後分析によって実施した。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると見なした。
【０１１７】
概要および結果
図１０を参照すると、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ１およびＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、Ａ５４９腫瘍において同じ有効性を有している。Ａ５４９細胞でのＥＧＦＲの発現レベルは、ｓＡＢＣによって決定した。等しい数（１０ｘ１０６）の健康なヒトドナーから得たＡ５４９腫瘍細胞およびＰＢＭＣを雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右脇腹にｓ．ｃ．注入した。各ＰＢＭＣドナーについて、合計５匹のマウスを移植した。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ１およびＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、０日目から開始して、週１回、３週間、ｉ．ｖ投与した。腫瘍の成長は、第５．４節で説明した外部キャリパー測定によって決定した。対照マウスは、ＰＢＳで処置した。実行した統計分析：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、その後、多重比較のためのダネットの事後分析。各条件（対照、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ１またはＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３）について、３つのＰＢＭＣドナーを含めた（各条件にｎ＝１５匹／動物）。
【０１１８】
結論として、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ１およびＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、異種移植されたＡ５４９腫瘍において同じ有効性を有する。
【表１】
2020517659.tif 000003
【０１１９】
実施例６：ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、他のＥＧＦＲ標的療法よりも優れたｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌効力を示す（ｉ）。
材料および方法
６．１．細胞株の培養条件
細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気の標準培地で培養した。細胞は、最適なコンフルエントで維持するために、週に２〜３回継代し、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ検出キットを用いて、細胞のマイコプラズマ汚染に関する試験を定期的に行った（ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）。マイコプラズマ汚染については、試験した細胞は、一貫して、陰性であった。
【０１２０】
６．２．エフェクター細胞：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｌａ  Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した血液フィルタから採取した。血液フィルタ処理のために、１％Ｌｉｑｕｅｍｉｎｅ（登録商標）（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ）を補充した４０ｍｌのＰＢＳを血液フィルタに注入し、ＰＢＭＣを含む溶液を、あらかじめフィコールを添加した５０ｍｌ血液分離管（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、ＰＡＡ５３５７１０）に収集した（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１４４０−０３）。フィコール管を、８００ｇで、ブレーキなく、室温（ＲＴ）で２０分間遠心分離し、ＰＢＭＣ「バフィーコート」リングを採取し、３０ｍｌのＰＢＳを含む５０ｍｌファルコン管に移した。ＰＢＭＣは、処理する前にＰＢＳで３回洗浄した。
【０１２１】
６．３．動物の飼育
Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞の欠損を特徴とする７週齢の免疫不全雌ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスで、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った（Ｈａｒｌａｎ、Ｇｕａｎａ、Ｆｒａｎｃｅ）。マウスは、げっ歯類マイクロアイソレーターケージ内の標準化環境条件下で維持させた（２０±１℃室温、５０±１０％相対湿度、１２時間の明暗サイクル）。マウスには、照射した食物および寝床、ならびに０．２２μｍのろ過した飲料水を与えた。実験はいずれも、スイス連邦の獣医局（ｃａｎｔｏｎａｌ  ａｎｄ  ｆｅｄｅｒａｌ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）から事前の許可を得て、スイス連邦動物保護法（Ｓｗｉｓｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｌａｗ）に従って実施した。動物保護法に従って、皮下（ｓ．ｃ．）異種移植によって誘発させた腫瘍が２０００ｍｍ３に達したときに、マウスを安楽死させた。
【０１２２】
６．４．異種移植実験
腫瘍細胞（標的細胞、Ｔ）およびＰＢＭＣ（エフェクター細胞、Ｅ）の混合物を、ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの右側腹部に、Ｅ：Ｔ比１：１で（ｎ＝５匹／群／ＰＢＭＣドナー）ｓ．ｃ．注入した。
【０１２３】
・ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、週１回、３週間、ｉ．ｖ投与した。
・ベクティビックスは、週２回、６週間、ｉ．ｖ投与した。
【０１２４】
腫瘍の大きさの定量化は、キャリパー測定によって行った。腫瘍体積は、次式を使用して算出した：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５ｘ長さｘ幅２
【０１２５】
６．５統計処理
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用してデータを分析した。データは平均±ＳＥＭとして表示されている。統計分析は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、その後、多重比較のためのダネットの事後分析によって実施した。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると見なした。
【０１２６】
概要および結果
図１１を参照すると、ＳＮＵ−２１６細胞でのＥＧＦＲの発現レベルは、ｓＡＢＣによって決定した。等しい数（１０ｘ１０６）の健康なヒトドナーから得たＳＮＵ−２１６腫瘍細胞およびＰＢＭＣを雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右脇腹にｓ．ｃ．注入した。各ＰＢＭＣドナーについて、合計５匹のマウスを移植した。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、０日目から開始して、週１回、３週間、ｉ．ｖ投与した。ベクティビックスは、０日目から開始して、週２回、６週間、ｉ．ｖ投与した。腫瘍の成長は、第１．４節で説明した外部キャリパー測定によって決定した。グラフは、平均腫瘍サイズ（ｍｍ３）±ＳＥＭを示している。対照マウスは、ＰＢＳで処置した。１つのＰＢＭＣドナーを含めた（各条件にｎ＝５匹／動物）。試験名：ＳＮＵ＿２
【０１２７】
結論として、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、ＳＮＵ−２１６腫瘍においてベクティビックスよりも優れた効力を示す。
【０１２８】
実施例７
ＣＤ３ＸＥＧＦＲ−ＳＦ３は、他のＥＧＦＲ標的療法よりも優れたｉｎ  ｖｉｖｏ抗癌効力を示す（ｉｉ）。
材料および方法
７．１．細胞株の培養条件
細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気の培地で培養した。細胞は、最適なコンフルエントで維持するために、週に２〜３回継代し、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ検出キットを用いて、マイコプラズマ汚染に関する試験を定期的に行った（ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）。試験した細胞は、一貫して、マイコプラズマを含まず陰性であった。
【０１２９】
７．２．エフェクター細胞：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｌａ  Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した血液フィルタから採取した。血液フィルタ処理のために、１％Ｌｉｑｕｅｍｉｎｅ（登録商標）（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ）を補充した４０ｍｌのＰＢＳを血液フィルタに注入し、ＰＢＭＣを含む溶液を、あらかじめフィコールを添加した５０ｍｌ血液分離管（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、ＰＡＡ５３５７１０）に収集した（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１４４０−０３）。フィコール管を、８００ｇで、ブレーキなく、室温（ＲＴ）で２０分間遠心分離し、ＰＢＭＣ「バフィーコート」リングを採取し、３０ｍｌのＰＢＳを含む５０ｍｌファルコン管に移した。ＰＢＭＣは、処理する前にＰＢＳで３回洗浄した。
【０１３０】
７．３．動物の飼育
Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞の欠損を特徴とする７週齢の免疫不全雌ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスで、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った（Ｈａｒｌａｎ、Ｇｕａｎａ、Ｆｒａｎｃｅ）。マウスは、げっ歯類マイクロアイソレーターケージ内の標準化環境条件下で維持させた（２０±１℃室温、５０±１０％相対湿度、１２時間の明暗サイクル）。マウスには、照射した食物および寝床、ならびに０．２２μｍのろ過した飲料水を与えた。実験はいずれも、スイス連邦の獣医局（ｃａｎｔｏｎａｌ  ａｎｄ  ｆｅｄｅｒａｌ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）から事前の許可を得て、スイス連邦動物保護法（Ｓｗｉｓｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｌａｗ）に従って実施した。動物保護法に従って、皮下（ｓ．ｃ．）異種移植によって誘発させた腫瘍が２０００ｍｍ３に達したときに、マウスを安楽死させた。
【０１３１】
７．４．異種移植実験
腫瘍細胞（標的細胞、Ｔ）およびＰＢＭＣ（エフェクター細胞、Ｅ）の混合物を、ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの右側腹部に、Ｅ：Ｔ比１：１で（ｎ＝５匹／群／ＰＢＭＣドナー）ｓ．ｃ．注入した。
【０１３２】
プロトコルは予防用であり、治療は細胞移植３時間後に静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。
・ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、週１回、３週間、ｉ．ｖ投与した。
・デキサメタゾンは、３週間、週３回ｉ．ｐ投与した。
【０１３３】
腫瘍の大きさの定量化は、キャリパー測定によって行った。腫瘍体積は、次式を使用して算出した：
腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５ｘ長さｘ幅２
７．５．統計処理
【０１３４】
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用してデータを分析した。データは平均±ＳＥＭとして表示されている。統計分析は、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、その後、多重比較のためのダネットの事後分析によって実施した。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると見なした。
【０１３５】
概要および結果
図１２を参照する。異種移植モデルにおける、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３抗腫瘍活性に対するデキサメタゾンの影響。Ａ５４９細胞でのＥＧＦＲの発現レベルは、ｓＡＢＣによって決定した。等しい数（１０ｘ１０６）の健康なヒトドナーから得たＡ５４９腫瘍細胞およびＰＢＭＣを雌ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの右脇腹にｓ．ｃ．注入した。各ＰＢＭＣドナーについて、合計５匹のマウスを移植した。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、０日目から開始して、週１回、３週間、ｉ．ｖ投与した。デキサメタゾンは、０日目から開始して、週３回、３週間、ｉ．ｐ．投与した。腫瘍の成長は、第７．４節で説明した外部キャリパー測定によって決定した。対照マウスは、ＰＢＳで処置した。実行した統計分析：一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）、その後、多重比較のためのダネットの事後分析。各条件（対照、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３、デキサメタゾンまたは組み合わせ）に対して、１つのＰＢＭＣドナーを含めた（各条件にｎ＝５匹／動物）。（Ａ）グラフは、平均腫瘍サイズ（ｍｍ３）±ＳＥＭを示している。（Ｂ）グラフは、３７日目のマウスあたりの腫瘍成長を示している。試験名：Ａ５４９＿１０
【表２】
2020517659.tif 000004
【０１３６】
結論として、Ａ５４９細胞の異種移植モデルでは、デキサメタゾンを投与することにより、ＣＤ３ＸＥＧＦＲ−ＳＦ３抗腫瘍活性が低下した。
【０１３７】
実施例８：マウス血清中のＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のｉｎ  ｖｉｖｏ安定性
材料および方法
８．１．細胞株の培養条件
細胞は、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気の培地で培養した。細胞は、最適なコンフルエントで維持するために、週に２〜３回継代し、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ検出キットを用いて、細胞のマイコプラズマ汚染に関する試験を定期的に行った（ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）。マイコプラズマ汚染については、試験した細胞は、一貫して、陰性であった。
【０１３８】
８．２．エフェクター細胞：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｌａ  Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した血液フィルタから採取した。血液フィルタ処理のために、１％Ｌｉｑｕｅｍｉｎｅ（登録商標）（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ）を補充した４０ｍｌのＰＢＳを血液フィルタに注入し、ＰＢＭＣを含む溶液を、あらかじめフィコールを添加した５０ｍｌ血液分離管（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ、ＰＡＡ５３５７１０）に収集した（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１４４０−０３）。フィコール管を、８００ｇで、ブレーキなく、室温（ＲＴ）で２０分間遠心分離し、ＰＢＭＣ「バフィーコート」リングを採取し、３０ｍｌのＰＢＳを含む５０ｍｌファルコン管に移した。ＰＢＭＣは、処理する前にＰＢＳで３回洗浄した。
【０１３９】
８．３．動物の飼育
Ｔ細胞、Ｂ細胞、およびナチュラルキラー細胞の欠損を特徴とする７週齢の免疫不全雌ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスで、ｉｎ  ｖｉｖｏ実験を行った（Ｈａｒｌａｎ、Ｇｕａｎａ、Ｆｒａｎｃｅ）。マウスは、げっ歯類マイクロアイソレーターケージ内の標準化環境条件下で維持させた（２０±１℃室温、５０±１０％相対湿度、１２時間の明暗サイクル）。マウスには、照射した食物および寝床、ならびに０．２２μｍのろ過した飲料水を与えた。実験はいずれも、スイス連邦の獣医局（ｃａｎｔｏｎａｌ  ａｎｄ  ｆｅｄｅｒａｌ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）から事前の許可を得て、スイス連邦動物保護法（Ｓｗｉｓｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｌａｗ）に従って実施した。動物保護法に従って、皮下（ｓ．ｃ．）異種移植によって誘発させた腫瘍が２０００ｍｍ３に達したときに、マウスを安楽死させた。
【０１４０】
８．４異種移植実験
−実験名：ＩＶＳ＿３（ＥＬＩＳＡ単純結合−ＥＧＦＲアーム）バッチＰ１０２７を注入
腫瘍の異種移植を受けていない１５匹のＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスに、２ｍｇ／ｋｇのＣＤ３ＸＥＧＦＲ−ＳＦ３分子を１回ｉ．ｖ注入した。
【０１４１】
ＣＤ３ＸＥＧＦＲ−ＳＦ３注入後、いくつかの時点の血液サンプルで実施した：ｔ＝０ｈ（注入前の１週間）、ｔ＝６ｈ、ｔ＝２４ｈ、ｔ＝４８ｈ、ｔ＝９６ｈ、ｔ＝１４８ｈ。各時点で、３匹のマウスから採血した。
【０１４２】
血液サンプルを１４’０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、マウスの血清を収集して−２０℃で凍結した。
−実験名：ＩＶＳ＿３  ｂｉｓ（ＥＬＩＳＡ単純結合−ＣＤ３アーム＆ＥＬＩＳＡ二重結合−ＣＤ３およびＥＧＦＲアーム）バッチＰ１０６９を注入
【０１４３】
ＩＶＳ＿３試験に使用したマウスは、ＩＶＳ＿３試験の３週間後に再使用した。注入前にＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の検出を実施して、動物の血液中にＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３が残存していないことを確認した。腫瘍の異種移植を受けていないＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスに、２ｍｇ／ｋｇのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３分子を１回ｉ．ｖ．注入した。
【０１４４】
ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３注入後、いくつかの時点の血液サンプルで実施した：ｔ＝０ｈ（注入前の１週間）、ｔ＝６ｈ、ｔ＝２４ｈ、ｔ＝４８ｈ、ｔ＝９６ｈ、ｔ＝１４８ｈ。各時点で、３匹のマウスから採血した。
【０１４５】
血液サンプルを１４’０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、マウスの血清を収集して−２０℃で凍結した。
−実験名：ＩＶＳ＿４（ＥＬＩＳＡ単純結合−ＥＧＦＲアーム）バッチＰ１０２７を注入
【０１４６】
腫瘍細胞ＨＴ２９（標的細胞、Ｔ）およびＰＢＭＣ（エフェクター細胞、Ｅ）の混合物を、２０  ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの右側腹部に、Ｅ：Ｔ比２：１で（ｎ＝１０匹／群／ＰＢＭＣドナー）ｓ．ｃ．注入した。
【０１４７】
腫瘍の大きさの定量化は、キャリパー測定によって行った。腫瘍体積は、次式を使用して算出した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５ｘ長さｘ幅２
【０１４８】
腫瘍が１５０〜２００ｍｍ３に達したとき、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３を２ｍｇ／ｋｇで１回ｉ．ｖ．投与した。
【０１４９】
ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３注入後、いくつかの時点の血液サンプルで実施した：ｔ＝６ｈ、ｔ＝２４ｈ、ｔ＝４８ｈ、ｔ＝９６ｈ、ｔ＝１４８ｈ。各時点で、４匹のマウスから採血した（対照群、マウス２匹、およびＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３処置群、マウス２匹）。
【０１５０】
血液サンプルを１４，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、マウス血清を収集して、−２０℃で凍結した。
【０１５１】
８．５．ＥＬＩＳＡ単純結合
図１３に、アッセイフォーマットを示す。
【０１５２】
ヒトＥＧＦＲ−Ｉ−ＩＶ−Ｃ−Ｈｉｓタグ付きまたはＨｓ  ＣＤ３  １−２６Ｎ末端ペプチド−Ｆｃタグ付きタンパク質を１ｘＰＢＳで２μｇ／ｍｌに希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μｌを加え、４℃で一晩インキュベートした。
【０１５３】
次の日に、上清を除去し、プレートを、室温（ＲＴ）で１時間、２００μｌ  ＰＢＳ２％ＢＳＡ／ウェルによりブロックした。上清は、除去した。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、ＰＢＳ２％ＢＳＡまたは１／１００＋１／２００＋１／４００＋１／８００＋１／１６００＋１／３２００のマウス血清を含むＰＢＳ２％ＢＳＡスパイクの濃度範囲に希釈し、プレートのレイアウトに従って、抗体希釈液１００μｌを各ウェルに加えた。サンプル（血清−ＩＶＳ３−ＩＶＳ４で処置したマウス）については、１／１００＋１／２００＋１／４００＋１／８００＋１／１６００＋１／３２００で希釈し、プレートのレイアウトに従って、血清希釈液１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。１００μｌのヤギ抗ヒトＦｃ  ＨＲＰ（１／１０００、ＰＢＳ  ２％ＢＳＡ）または１００μｌのヤギ抗ヒトＦａｂ  ＨＲＰ（１／１０００、ＰＢＳ  ２％ＢＳＡ）を各ウェルに加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎで５回洗浄し、１００μｌの３，３‘、５，５‘−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を各ウェルに加えた。１００μｌのＨ２ＳＯ４  ２Ｎ／ウェルを加えることにより、５分後に反応を停止させた。吸光度を４５０ｎｍで読み取った。
【０１５４】
次に、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）ソフトウェアを使用して、データをプロットし、分析した。ＳＴＤ曲線を取得するには：ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５を使用して、Ｘ＝Ｌｏｇ（Ｘ）を用いて、Ｘ値を変換、解析非線形回帰、方程式：シグモイド用量反応。サンプル中の抗体濃度（μｇ／ｍｌ）で濃度を取得するために：Ｘ＝Ｌｏｇ（Ｘ）を使用して変換Ｘ値から、次の方法を使用する。ここでも、非線形回帰分析、方程式：シグモイド用量反応を使用。また、未知の値をＳＴＤ曲線で補間した。
【０１５５】
８．６ＣＤ３およびＥＧＦＲでの二重結合ＥＬＩＳＡ
ＣＤ３ＸＥＧＦＲ−ＳＦ３の生物学的活性を確認するために、ＣＤ３ＸＥＧＦＲ−ＳＦ３の標的ＣＤ３およびＥＧＦＲへの結合を定量化する二重結合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイを開発した。図１４に、アッセイフォーマットを示す。
【０１５６】
高結合９６ウェル平底プレートに２μｇ／ｍｌの抗パニツムマブをコーティングし、プレートを４℃で一晩インキュベートした。次に、プレートを室温で１時間、ＰＢＳ−２％ＢＳＡによりブロックした。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、ＰＢＳ２％ＢＳＡまたは１／１００＋１／２００＋１／４００＋１／８００＋１／１６００＋１／３２００のマウス血清を含むＰＢＳ２％ＢＳＡスパイクの濃度範囲に希釈し、プレートのレイアウトに従って、抗体希釈液１００μｌを各ウェルに加えた。サンプル（血清−ＩＶＳ３−ＩＶＳ４で処置したマウス）については、１／１００＋１／２００＋１／４００＋１／８００＋１／１６００＋１／３２００で希釈し、プレートのレイアウトに従って、血清希釈液１００μｌを各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。１００μｌのビオチン化された抗Ｉｄ  ＳＰ３４を０．１μｇ／ｍｌで加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。
【０１５７】
ＰＢＳ−２％ＢＳＡ中で１／４０００希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰ溶液を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ０．０１％Ｔｗｅｅｎで５回洗浄した。最後に、１００μｌのＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｆｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ溶液を各ウェルに加えた。Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ２−分光光度計を使用して、発光を測定した（ゲイン１００、光学位置トップ、発光ホール、積分時間１秒、読み取り高さ１．００ｍｍ）。
【０１５８】
次に、Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）ソフトウェアを使用して、データをプロットし、分析した。ＳＴＤ曲線を取得するには：ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５を使用して、Ｘ＝Ｌｏｇ（Ｘ）を用いて、Ｘ値を変換、解析非線形回帰、方程式：シグモイド用量反応。サンプル中の抗体濃度（μｇ／ｍｌ）で濃度を取得するために：Ｘ＝Ｌｏｇ（Ｘ）を使用して変換Ｘ値から次の方法を使用する。ここでも、非線形回帰分析、方程式：シグモイド用量反応を使用。また、未知の値をＳＴＤ曲線で補間した。
【０１５９】
概要および結果
図１５、図１６および図１７を参照すると、単純結合および二重結合ＥＬＩＳＡによるマウス血清中のＣＤ３ＸＥＧＦＲ−ＳＦ３の検出が行われ、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は注入後１週間まで検出されている。
【０１６０】
実施例９Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット血清中のＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の薬物動態プロファイル。
ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の薬物動態は、１ｍｇ／ｋｇ体重の用量で単回静脈内注入を行った後、雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝４）で評価した。薬物動態（ＰＫ）査定用の血液サンプルは、４２日間（６週間）にわたって、事前に指定された投与後の時点、０．２５時間、１時間、６時間、２４時間、４８時間、９６時間、１６８時間、３３６時間、５３０時間、６７２時間、８４０時間および１００８時間に収集した。
【０１６１】
これらの血清サンプル中でのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の濃度は、ＥＬＩＳＡ法を使用して定量化した。この方法では、ヒトα−パニツムマブ抗体を捕捉抗体として使用し、ビオチン化抗ｉｄビオチンＳＰ３４を検出抗体として使用した。アッセイのＬＬＯＱは、希釈していないＳＤラット血清で６．２５ｎｇ／ｍｌであった。血清濃度対時間プロファイルは、ＰＫパラメータを推定するために、ＰｈｏｅｎｉｘＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）バージョン７．０を使用して、非コンパートメント分析（ＮＣＡ）を行った。
【０１６２】
静脈内ボーラス注入後、最大濃度（Ｃｍａｘ）は、１時間の時点での動物＃Ｍ２を除き、投与後０．２５時間の初期時点で観察された。＃Ｍ３を除くすべての動物において、注入後３５日間、血清濃度はＬＬＯＱ（６．２５ｎｇ／ｍＬ）を超えていた。動物＃Ｍ３では、血清濃度が定量化できたのは、わずかに６７２時間まであった。血清濃度は、１００８時間（４２日目）の時点で、すべての動物においてＬＬＯＱを下回った。
【０１６３】
静脈内薬物動態プロファイルは、４匹すべてのラットで同等であった（図１８）。血清濃度プロファイルは、初期分布期と、その後のより長い最終排出期を伴う双指数関数的配置に従っていると考えられる。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、クリアランスが遅く、分布量が制限されていることを示した。Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおいて、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の最終排出半減期（ｔ１／２）は約４日と推定された。
【表３】
2020517659.tif 000005
Ｃｍａｘ：  投与後の薬物のピーク血漿濃度。ＡＵＣ：曲線下面積、濃度−時間曲線の積分Ｔｍａｘ：  Ｃｍａｘに達するまでの時間。Ｔ１／２、薬物の濃度が元の値の半分に達するのに要する時間。Ｖｚ：静脈内投与後の最終期の分布量。Ｖｓｓ：静脈内投与後に決定される平衡状態での見かけの分布容積。ＣＬ：クリアランス、単位時間あたりの薬物が除去された血漿の量。ＭＲＴＩＮＦ：無限大時間までの平均滞留時間。
【０１６４】
実施例１０：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ薬理学のさらなる調査
材料および方法
１０．１ＥＬＩＳＡ単純結合
高結合９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を４℃で一晩、ヒトＥＧＦＲ−Ｉ−ＩＶ−ｈｉｓまたはヒトＣＤ３  １−２６  Ｎ末端ペプチド（０．０１Ｍ  ＰＢＳ中２μｇ／ｍｌ）でコーティングした。プレートを室温（ＲＴ）で１時間、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡによりブロックした。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３（１０μｇ／ｍｌから開始、１／３希釈）（１０μｇ／ｍｌ）および対照抗体の段階希釈液をＰＢＳ＋２％ＢＳＡで調製し、１００μｌをアッセイプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ  ２０で５回洗浄し、抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ）ＨＲＰ（１／２０００）を室温で１時間加えた。プレートをＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質溶液（３，３‘、５，５‘−テトラメチルベンジジン）を各ウェルに加え、１００μｌのＨ２ＳＯ４（２Ｎ）を加えることにより、反応を１〜１０分間停止した。Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ２−分光光度計を使用して、４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【０１６５】
１０．２ＣＤ３およびＥＧＦＲの二重結合ＥＬＩＳＡ
ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の生物学的活性を確認するために、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の標的ＣＤ３およびＥＧＦＲへの結合を定量化する二重結合酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）アッセイを開発した。このため、高結合９６ウェル平底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を４℃で一晩、ヒト組換えＥＧＦＲ−Ｆｃ（２μｇ／ｍｌ、０．０１Ｍ  ＰＢＳ）でコーティングした。プレートをＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、室温（ＲＴ）で１時間、ＰＢＳ＋２％ＢＳＡによりブロックした。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３（４μｇ／ｍｌから開始、１／４希釈）および対照抗体の段階希釈をＰＢＳ＋２％ＢＳＡ中で行い、１００μｌをアッセイプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、ビオチン化抗ヒトＣＤ３ε（０．５μｇ／ｍｌ）をＲＴで１時間加えた後、ストレプトアビジン−ＨＲＰ（１／１０００）と共に、ＲＴで１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、１００μｌのＴＭＢ基質溶液（３，３‘、５，５‘−テトラメチルベンジジン）を各ウェルに加え、１００μｌのＨ２ＳＯ４（２Ｎ）を加えることにより、反応を１〜１０分間停止した。Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ２−分光光度計を使用して、４５０ｎｍで光学密度を測定した。
【０１６６】
１０．３ＦＡＣＳ単純結合
ＰＢＭＣ（ＣＤ３への結合を判定する）またはＮＣＩ−Ｈ１７０３扁平上皮癌細胞（ＥＧＦＲへの結合を判定する）を用いて、ＦＡＣＳ単純結合を実施した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１ｘＰＢＳ＋１０％Ｖｅｒｓｅｎｅ＋２％ＦＢＳ）に１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、１００μｌをＵ底９６ウェルプレートに加え、次いで３５０ｇで３分間遠心分離した。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３（１０μｇ／ｍｌ、１／３希釈）および対照抗体の段階希釈液を細胞に添加し、４℃で３０分間インキュベートした。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、以下の抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で、４℃で２０分間染色した：抗ヒトＣＤ４  ＰＥ−ｅＦ６１０（１／１００）、抗ヒトＣＤ８ａ  ＡＰＣ（１／１００）および抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ−γ特異）ＰＥ（１／２００）。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、Ｓｙｔｏｘ  ｇｒｅｅｎ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ（１／２００）を含むＦＡＣＳ緩衝液に、４℃で２０分間再懸濁し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で得た。
【０１６７】
１０．４抗体依存性細胞性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ
エフェクター細胞については、フィコール勾配精製を使用して、全血フィルタからＰＢＭＣを採取した。簡潔には、リケミン（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ）を含むＰＢＳをフィルタに注入し、フィコールを添加した５０ｍｌの血液分離管（ＳｅｐＭａｔｅ−５０；Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）に収集し、１２００ｇで１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣＳを採取し、ＰＢＳで３回洗浄し、その後、ＮＫ細胞分離キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、ＮＫ細胞を単離した。単離させたＮＫは、１０６細胞／ｍＬで再懸濁させ、ＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ  Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）と共に３７℃で一晩インキュベートした。標的細胞については、ＨＰＢ−ＡＬＬ、Ａ−４３１、およびＡ５４９をＡＤＤＣ培地（ＲＰＭＩ＋２％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔ＋１％ＮＥＡＡ＋１％ＮａＰｙｒ＋１％Ｐ／Ｓ）で洗浄し、ＣＤＣ培地中、０．２ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３（８０ｎＭ、１／１０希釈）および対照抗体の段階希釈液を標的細胞に加え（１：１の比率）、３７℃で１５〜２０分間インキュベートした。未処置の標的細胞を用いて、自発的殺傷（ベースライン下部）を得た。熱ショック細胞を用いて、最大殺傷（ベースライン上部）を得た（細胞は−８０℃で凍結し、３回解凍した）。次に、ＮＫ細胞（５０，０００細胞）を加え（Ｅ：Ｔ比５：１）、サンプルを３７℃で４．５時間インキュベートした。Ａ５４９およびＡ−４１３については、サンプルを３５０ｇで３分間遠心分離し、上清を採取し、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、細胞毒性（ＬＤＨ放出）を分析した。簡潔に言えば、上清をＬＤＨ基質溶液と共に２０〜６０分間インキュベートした後、５０μｌの停止溶液で停止させ、そのプレートをＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ２−分光光度計により、４９０ｎＭで読み取った。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞については、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で分析するために、７−ＡＡＤ（１／１００）を含む１Ｘ  ＰＢＳ＋１０％Ｖｅｒｓｅｎｅ＋２％ＦＢＳに細胞を再懸濁した。
【０１６８】
１０．５補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）アッセイ
標的細胞（Ａ５４９またはＨＰＢ−ＡＬＬ）をＣＤＣ培地（ＲＰＭＩ＋２％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔ＋１％ＮＥＡＡ＋１％ＮａＰｙｒ＋１％Ｐ／Ｓ）で洗浄し、ＣＤＣ培地に１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３（１００ｎＭ、１／５希釈）および対照抗体の段階希釈液を標的細胞（比率１：１）に加え、３７℃で１５分間インキュベートした後、幼若ウサギ補体１５％を加えた。未処置の標的細胞を使用して、自発的殺傷（ベースラインの下部）を得た。熱ショック細胞により、最大殺傷（ベースライン上部）を得た（細胞は−８０℃で凍結し、３回解凍した）。サンプルを３７℃で４．５時間インキュベートし、３５０ｇで３分間遠心分離した。Ａ５４９細胞について、上清を採取し、ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、細胞毒性（ＬＤＨ放出）について分析した。簡潔に言えば、上清をＬＤＨ基質溶液と共に２０〜６０分間インキュベートした後、５０μｌの停止溶液で停止させ、そのプレートをＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ２−分光光度計により、４９０ｎＭで読み取った。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞については、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で得るために、７−ＡＡＤ（１／１００）を含む１Ｘ  ＰＢＳ＋１０％Ｖｅｒｓｅｎｅ＋２％ＦＢＳに細胞を再懸濁した。データは、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ）を使用して分析した。
【０１６９】
１０．６正常密度ＰＢＭＣアッセイ
ＰＢＭＣは、フィコール勾配精製を使用して全血フィルタから採取した。簡潔には、リケミン（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ）を含むＰＢＳをフィルタに注入し、フィコールを添加した５０ｍｌの血液分離管（ＳｅｐＭａｔｅ−５０；Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）に収集し、１２００ｇで１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣＳを採取し、ＰＢＳで３回洗浄し、１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、９６ウェルプレートに播種し、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３（１０μｇ／ｍｌ、１／３希釈）および対照抗体の段階希釈液の存在下で、３７℃で２４時間または４８時間インキュベートした。
【０１７０】
活性化マーカーは、フローサイトメトリーにより２４時間および４８時間の時点で判定した。細胞を４℃で２０分間、抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）：抗ヒトＣＤ４  ＰＥ−ｅＦ６１０、ＣＤ８  ＡＦ７００、ＣＤ２５  ＰＥおよびＣＤ６９  ＰｅＣｙ７で染色し、次いで、１Ｘ  ＰＢＳ＋１０％Ｖｅｒｓｅｎｅ＋２％ＦＢＳで洗浄し、３５０ｇで３分間遠心分離し、１Ｘ  ＰＢＳ＋１０％Ｖｅｒｓｅｎｅ＋Ｓｙｔｏｘ  ｇｒｅｅｎ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  ｄｙｅ（１／２０００）を含む２％ＦＢＳに４℃で２０分間再懸濁し、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）で得た。データは、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ）を使用して分析した。
【０１７１】
２４時間および４８時間の時点でのサイトカイン放出のために、プレートを３５０ｇで５分間遠心分離し、上清を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘにより、製造業者のプロトコルに従って、サイトカインを定量化した。
【０１７２】
増殖を判定するために、３Ｈ−チミジン（０．５μＣｕ／ウェル）を３０時間インキュベーションした後に加え、４８時間の時点で採取し、ユーザーフィルタメイトフィルタにシンチレーション液を加えた後、ベータシンチレーションカウンターを使用してｃｐｍ（ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｌｌｉｏｎ）を読み取った。
【０１７３】
１０．７高密度ＰＢＭＣアッセイでの非特異的Ｔ細胞活性化
ＰＢＭＣは、フィコール勾配精製を使用して全血フィルタから採取した。簡潔には、リケミン（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ）を含むＰＢＳをフィルタに注入し、フィコールを添加した５０ｍｌの血液分離管（ＳｅｐＭａｔｅ−５０；Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）に収集し、１２００ｇで１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣＳを採取し、ＰＢＳで３回洗浄し、２４ウェルプレートに１０７細胞／ｍｌで播種し、３７℃で４８時間インキュベートした。次に、細胞を３５０ｇで５分間遠心分離し、９６ウェルプレートに通常密度１０６細胞／ｍｌで再懸濁し、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３（１０μｇ／ｍｌ、１／３希釈）および対照抗体の段階希釈液の存在下で、３７℃で２４時間インキュベートした。放出されたサイトカインを測定するために、プレートを３５０ｇで５分間遠心分離し、上清を採取し、Ｌｕｍｉｎｅｘにより、製造業者のプロトコルに従って、サイトカインを定量化した。
【０１７４】
１０．８全血アッセイ（ＷＢＡ）
健康なボランティアから新鮮な全血を採取し、０．５ｍｌ／ウェルを４８ウェルプレートに播種した。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３（１０μｇ／ｍｌ、１／１０希釈）および対照抗体の段階希釈の存在下で、血液を３７℃で２４時間インキュベートした。サンプルを３０００ｇで５分間遠心分離し、上清を採取し、１／２に希釈し、Ｌｕｍｉｎｅｘにより、製造業者のプロトコルに従って、放出されたサイトカインを定量化した。
【０１７５】
１０．９リダイレクト溶解アッセイ（ＲＤＬ）
標的細胞として使用するためにある範囲の細胞株をＡＴＣＣから入手し、トリプシンで週２〜３回継代して、供給業者が推奨する培地で最適なコンフルエントでそれらを維持した。細胞は、Ｍｙｃｏａｌｅｒｔ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して、マイコプラズマ汚染に関する試験を定期的に行い（ＬＴ０７−３１８、Ｌｏｎｚａ）、一貫して、陰性であった。各アッセイの前に、表面のＥＧＦＲ発現を検証するために、特異的抗体結合能（ｓＡＢＣ；ＱＩＦＩＫＩＴ（登録商標））について、細胞を判定した。
【０１７６】
ＰＢＭＣ（エフェクター細胞）は、フィコール勾配精製を使用して全血フィルタから採取した。簡潔には、リケミン（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ）を含むＰＢＳをフィルタに注入し、フィコールを添加した５０ｍｌの血液分離管（ＳｅｐＭａｔｅ−５０；Ｓｔｅｍｃｅｌｌ）に収集し、１２００ｇで１０分間遠心分離した。ＰＢＭＣＳを採取し、ＰＢＳで３回洗浄し、２ｘ１０６細胞／ｍｌで再懸濁した。
【０１７７】
リダイレクトされた溶解のために、標的細胞（Ｔ；１ｘ１０４細胞／ウェル）およびエフェクター細胞（Ｅ；１ｘ１０５細胞／ウェル）（Ｅ：Ｔ比１０：１）は、９６ウェル平底プレートに播種され、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３（１０ｎＭ、１／１０希釈）および対照抗体の段階希釈液の存在下で、３７℃で４８時間インキュベートした。標的細胞の生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＭＴＳアッセイによって、製造業者のプロトコルに従って４８時間の時点で判定した。簡単に言えば、プレートを３回洗浄し、ＭＴＳ溶液をウェルに加えた。プレートは、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ２−分光光度計により４９０ｎｍで読み取った。プレートは、最大殺傷（溶解液を使用して殺傷させた標的のみ）と自発的殺傷（標的のみを有するウェル）との間に十分な差が観察されたときに有効とみなされた。
【０１７８】
１０．１０データおよび統計分析
用量反応分析：Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用してデータをプロットし、分析した。データは、Ｘ＝Ｌｏｇ（Ｘ）を使用して最初に変換した。変換されたデータを使用して、４パラメーターロジスティック回帰（４ＰＬ）フィッティングが適用され、シグモイド用量反応曲線を得た（ヒルスロープは１に固定）。試験されたサンプルの最大有効性のパーセントＦに相当するＥＣＦ値（Ｆ＝２０、５０および８０）は、曲線フィッティングに従って得られた。
【０１７９】
フローサイトメトリーデータ：データは、ＦｌｏｗＪｏ（ＢＤ）を使用して分析し、平均蛍光強度（ＭＦＩ）、特定の細胞集団の割合、または事象（μｌによる）のいずれかを求めた。その後、実験ごとにデータを処理した。
【０１８０】
Ｌｕｍｉｎｅｘデータ：Ｌｕｍｉｎｅｘデータは、ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ  Ａｎａｌｙｓｔ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して分析した。サイトカイン濃度は、定量の上限および下限に正規化させた。
特異的ＡＤＣＣ殺傷率の式：
【数１】
2020517659.tif 000006
【０１８１】
サンプルが、サンプル中で測定された殺傷に相当する場合、ＲＳは自発的殺傷に相当し、ＲＭは、最大殺害に相当する。次に、用量反応分析法を用いて、特異的殺傷率を分析した。
特異的ＣＤＣ殺傷率の式：
【数２】
2020517659.tif 000007
【０１８２】
特異的殺傷率％サンプルが、あるサンプルについて測定された特異的殺傷に相当する場合、特異的殺傷％抗体非含有は、未処置の標的の特異的殺傷に相当する。次に、用量反応分析法を用いて、特異的殺傷率を分析した。
ＲＤＬでの特異的殺傷率の式
【数３】
2020517659.tif 000008
【０１８３】
Ａｂｓ４９０ｎｍ（サンプル）が、あるサンプルについて得られるＯＤに相当する場合、Ａｂｓ４９０ｎｍ（自発的殺傷）は、標的のみのウェルでの平均で得られるＯＤに相当し、Ａｂｓ４９０ｎｍ（最大殺傷）は、溶解した標的細胞のみについて得られる平均ＯＤに相当する。この方法で得られた比率は、上記の用量反応分析法を用いてさらに分析された。
【０１８４】
ドナー除外：ドナー除外は、ＪＭＰソフトウェアを使用して実行した。
【０１８５】
ＲＤＬドナーの除外：用量反応曲線のフィッティングが、Ｒ２＜０．７である場合、またはｍＡｂ非含有サンプルが、４０％を超える特異的殺傷を有している場合には、ドナーは除外された。
【０１８６】
安全実験ドナーの除外：読み出しデータ（活性化率、増殖またはサイトカイン濃度）は、各ドナーの治療に対して個別にフィッティングを行った。対照としてｍＡｂ非含有状態を使用して、ダネットの比較試験を実施した。ｍＡｂ非含有状態とそのドナーの陽性対照の少なくとも１つとの間に統計的差異がない場合に、ドナーは除外された。
【０１８７】
統計分析：ＪＭＰを使用して統計比較を実施した。最小二乗フィット入れ子モデルを実施して、治療の効果、治療の濃度、および治療のバッチを比較した。モデルのフィッティング後、ｍＡｂ非含有状態とＩｇＧアイソタイプ状態を対照として使用して、ダネットの比較を実施した。これらの比較は、ドナーを除外した後、各時点（該当する場合）で個別に実施した。
【０１８８】
概要および結果
ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の生物学的活性を確認し、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の標的ＣＤ３およびＥＧＦＲへの結合を定量化するために、ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。
【０１８９】
特に、コーティングされたヒトＣＤ３−ＦｃまたはヒトＥＧＦＲ  ｈｉｓタグでインキュベートし、ＨＲＰと結合した抗ヒトＩｇＧ  Ｆａｂ（単純ＥＧＦＲまたはＣＤ３、それぞれ図１９ＡおよびＢ）、またはｈｕＣＤ３−ビオチン後、ＨＲＰ結合ストレプトアビジン（二重結合；図１９Ｃ）のいずれかにより検出されたＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３および対照抗体の用量反応である。表４には、３つの独立した複製のシグモイド用量反応結合曲線から求めたＥＣ２０、５０、および８０の値を表す（図１９）。
【表４】
2020517659.tif 000009
【０１９０】
ＣＤ３およびＥＧＦＲへのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の結合をさらに判定するために、ＰＢＭＣまたはＮＣＩ−Ｈ１７０３扁平上皮癌細胞をそれぞれ使用してＦＡＣＳ単純結合を実施した。特に、ＰＢＭＣＳ（図２０Ａ〜Ｃ）または扁平上皮癌細胞株ＮＣＩ−Ｈ１７０３（図２０Ｄ）のいずれかでインキュベートされ、ＰＥ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ−γ）で検出されたＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３および対照抗体の用量反応である。ＰＢＭＣの場合、細胞は抗ＣＤ４または抗ＣＤ８抗体でも標識された。表５は、３つの独立した複製の非線形シグモイド回帰結合曲線から求めたＥＣ２０、５０、および８０の値を表す（図２０）。
【表５】
2020517659.tif 000010
【０１９１】
様々なＥＧＦＲ発現ヒト癌細胞株のリダイレクトされた溶解を誘導するＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の能力を判定するため、標的癌細胞（Ｔ）およびエフェクター細胞（Ｅ；ＰＢＭＣ）を、Ｅ：Ｔ比１：１０で、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照抗体の用量反応の存在下で、インキュベートした。癌細胞のリダイレクトされた溶解は、細胞毒性アッセイ（ＭＴＳ）によって決定した。ＥＣ５０値は、特異的殺傷のシグモイド用量反応曲線から求めた（図２１）。細胞株のリダイレクトされた溶解は、統計的には異なっていた（一元配置分散分析；Ｆ＝５、６；ｐ＜０．０００１）。結論として、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、試験したＥＧＦＲ発現ヒト癌細胞株のすべてにおいて、リダイレクトされた溶解を誘導する。
【０１９２】
ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、ＥＧＦＲ＋癌細胞株Ａ−４３１およびＡ５４９（図２２Ａ）およびＣＤ３＋ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（図２２Ｂ）において評価し、特異的殺傷のシグモイド用量反応曲線から求めたＥＣ５０値によって表す。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３による処置により、Ａ−４３１およびＡ５４９の両方においてアービタックスと比較して（図２２Ａ；最小二乗モデル、Ｆ＝２９、ｐ＜０．０００１）、およびＨＰＢ−ＡＬＬ細胞のヒト抗ＳＰ３４抗体（図２２Ｂ；Ｔ検定、ｔ＝３、ｐ＜０．０５）と比較して、ＡＤＣＣが低下した。結論として、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、試験したＥＧＦＲまたはＣＤ３発現細胞株ではＡＤＣＣを誘発しない。
【０１９３】
特異的補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）は、ＥＧＦＲ＋癌細胞Ａ５４９（図２３Ａ）およびＣＤ３＋ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞（図２３Ｂ）において評価し、ＥＣ５０値は、特異的ＣＤＣのシグモイド用量反応曲線から求めた。Ａ５４９およびＨＰＢ−ＡＬＬ細胞では両方とも、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３が、特異的補体依存性細胞毒性を誘発することはない。
【０１９４】
非特異的細胞増殖に対するＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の効果を評価するために、健康なドナー（ｎ＝１９）のＰＢＭＣを、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照の用量を増大させて４８時間インキュベートした。４８時間の時点で３Ｈ−チミジンの取り込みを測定することにより、増殖を判定した（図２４）。最小二乗フィットモデルを使用して増殖の統計分析を行った後、ダネットの比較を行って、ｍＡｂ非含有対照（図２５Ａ）またはアイソタイプ対照（図２５Ｂ）のいずれかに対する平均と比較した。
【０１９５】
ｍＡｂ非含有状態と比較して、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、高濃度のＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３  ＡＥ０４２およびＰ１０６９のバッチにおいて、わずかな増殖を誘発したが、この誘発は、最新のバルク原薬ＴＲＳバッチでは観察されていない。アイソタイプ対照と比較した場合、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、最高濃度（５μｇ／ｍｌ）でのＡＥ０４２バッチにおいて、統計的に有意な増殖のみを誘発した。水性または湿潤コーティング形態のいずれかであるＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の他のバッチは、アイソタイプ対照と比較して、増殖のいかなる有意な増加も誘発しなかった。結論として、ＰＢＭＣアッセイでは、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のＴＲＳバッチは、いかなる増殖も誘発しない。
【０１９６】
ＣＤ３ｘＥＧＦＲがＣＤ４＋Ｔ細胞の非特異的活性化を誘発し得るかを評価するために、健康なドナー（ｎ＝２３）のＰＢＭＣを、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照の用量を増大させて、２４時間または４８時間インキュベートした。ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、フローサイトメトリーによりＴ細胞活性化マーカーＣＤ６９の発現として測定した（図２６）。ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化の統計分析は、最小二乗フィットモデルを使用して各時点で実施し、その後ダネットの比較を行って、ｍＡｂ非含有対照（図２７ＡおよびＢ）またはアイソタイプ対照（図２８ＡおよびＢ）に対するいずれかの平均に対して比較した。
【０１９７】
ｍＡｂ非含有状態と比較した場合（すなわち、最も厳密な比較）、高濃度（１〜１０μｇ／ｍｌ）でのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のコーティングされた水性ＴＲＳバッチ、および５μｇ／ｍでのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の水性のみのＡＥ０４２バッチは、２４時間および４８時間の時点で、ＣＤ４＋Ｔ細胞の非特異的活性化を誘発し、水性であるが、コーティングされていないＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３バッチＰ１０６９（０．００５μｇ／ｍｌで開始した濃度において）は、４８時間の時点で、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘発した。アイソタイプ対照と比較したとき、試験したＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のバッチはいずれも、２４時間の時点で非特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を誘発せず、４８時間の時点では、ＡＥ０４２およびＰ１０６９の最高濃度（５μｇ／ｍｌ）のバッチのみ誘発したが、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のＴＲＳバッチでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘発しなかった。結論として、アイソタイプ抗体と比較して、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のＴＲＳバッチは、非特異的ＰＢＭＣにおいて統計的に有意なＣＤ４＋Ｔ細胞活性化を誘発することはない。
【０１９８】
ＣＤ３ｘＥＧＦＲがＣＤ８＋Ｔ細胞の非特異的活性化を誘発し得るかを評価するために、健康なドナー（ｎ＝２３）のＰＢＭＣを、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照の用量を増大させて、２４時間または４８時間インキュベートした。ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化は、フローサイトメトリーにより活性化マーカーＣＤ６９の発現として測定した（図２９）。ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化の統計分析は、最小二乗フィットモデルを使用して各時点で実施し、その後ダネットの比較を行って、ｍＡｂ非含有対照（図３０ＡおよびＢ）またはアイソタイプ対照（図３１ＡおよびＢ）に対するいずれかの平均に対して比較した。
【０１９９】
ＰＢＭＣアッセイでは、ｍＡｂ非含有状態と比較すると（すなわち、最も厳密な比較）、水性であるか、または高濃度（１〜１０μｇ／ｍｌ）でコーティングされた異なるバッチのＣＤｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、２４時間および４８時間の時点で、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘発した。アイソタイプ対照と比較すると、２４時間の時点では、１μｇ／ｍＬのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のコーティングされたＴＲＳバッチのみが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘発するが、１０μｇ／ｍｌでは誘発されず、４８時間の時点では、異なるバッチの最高濃度のみがＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化を誘発した。結論として、非特異的ＰＢＭＣアッセイでは、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、アイソタイプ抗体と比較して、低用量において統計的に有意なＣＤ８＋Ｔ細胞活性化を誘発することはない。
【０２００】
臨床環境でのサイトカインが放出するあらゆる可能性を予測するために、ＰＢＭＣは、サイトカイン放出アッセイの前臨床試験では、日常的に使用されている（Ｓｔｅｂｂｉｎｇｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９：３３２５−３３３１（２００７年））。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３が非特異的Ｔ細胞サイトカイン応答を誘発し得るかを評価するには、健康なドナー（ｎ＝２３）のＰＢＭＣを、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照の用量を増大させて２４時間インキュベートし、上清中のＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γの放出レベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘで測定した（図３２）。放出されたサイトカインの統計分析は、最小二乗フィットモデルを使用して各時点で実行した後、ダネットの比較を行って、ｍＡｂ非含有対照（図３３Ａ〜Ｄ）またはアイソタイプ対照（図３４Ａ〜Ｄ）のいずれかに対する平均と比較した。
【０２０１】
ｍＡｂ非含有状態と比較した場合（すなわち、最も厳密な比較）、非特異的Ｔ細胞アッセイでは、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のバッチはいずれもＩＬ−２の放出を誘発することはなく、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の水性ＡＥ０４２バッチのみがＩＬ−６の放出を誘発し、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のコーティングされた高用量（０．５および５μｇ／ｍｌ）のＡＥ０４２およびＰ１０６９バッチのみが、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの放出を誘発した。アイソタイプ対照と比較した場合、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は２４時間の時点で、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γのいずれの放出も誘発することはなく、ＩＬ−６は、最高濃度でのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３の水性ＡＥ０４２バッチの存在下でのみ誘発され、ＴＮＦ−αは、最高濃度でＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のコーティングされたＰ１０６９バッチのみで誘発された。要約すると、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、ＰＢＭＣとの２４時間のインキュベーション後のバッチ依存方式では、試験を行った最高濃度において、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αの放出のみを誘発し、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γの放出を誘発することはない。
【０２０２】
健康なドナー（ｎ＝２３）のＰＢＭＣを、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照の用量を増大させて４８時間インキュベートし、上清中のＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γのレベルをＬｕｍｉｎｅｘで測定した（図３５）。放出されたサイトカインの統計分析は、最小二乗フィットモデルを使用して各時点で実行した後、ダネットの比較を行って、ｍＡｂ非含有対照（図３６Ａ〜Ｄ）またはアイソタイプ対照（図３７Ａ〜Ｄ）のいずれかに対する平均と比較した。
【０２０３】
ｍＡｂ非含有状態と比較した場合（すなわち、最も厳密な比較）、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のバッチはいずれもＩＬ−２またはＩＦＮ−γの放出を誘発することはなく、コーティングされた高濃度でのＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のみがＴＮＦ−αの放出を誘発し、ＩＬ−６の放出は、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のバッチおよび濃度に応じて大きく変動した。アイソタイプ対照と比較した場合、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、ＩＬ−２またはＩＦＮ−γのいずれのいかなる放出も誘発せず、コーティングされたＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、高濃度でのみＴＮＦ−αの放出を誘発し、ＩＬ−６の放出は、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３のコーティングされていない水性ＡＥ０４２バッチ（０．０５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌ、および５μｇ／ｍｌ）、ならびに０．０１μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌのコーティングされているＴＲＳにおいて誘発されたが、それ以上の濃度ではいずれも誘発されなかった。要約すると、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、ＰＢＭＣと共に４８時間インキュベーションした後、バッチ依存方式で、高濃度では、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αのみの放出を誘発するが、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γを誘発することはない。
【０２０４】
ＰＢＭＣの高密度前培養後、可溶性ｍＡｂとのインキュベーションは、ｍＡｂの前臨床安全性を評価するためのサイトカイン放出アッセイ法として使用する（Ｒｏｍｅｒら、Ｂｌｏｏｄ  １１８：６７７２−６７８２（２０１１年））。健康なドナー（ｎ＝１６）のＰＢＭＣを高密度（１０７細胞／ｍｌ）で４８時間プレインキュベートした。次いで、細胞を通常の密度（１０６細胞／ｍｌ）で播種し、水性のＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照の用量を増大させて２４時間培養し、上清中のＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γの放出レベルをＬｕｍｉｎｅｘで測定した（図３８）。放出されたサイトカインの統計分析は、最小二乗フィットモデルを使用して実施した後、ダネットの比較を行って、ｍＡｂ非含有対照（図３９Ａ〜Ｄ）またはアイソタイプ対照（図４０Ａ〜Ｄ）のいずれかに対する平均を比較した。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、高密度ＰＢＭＣアッセイにおける、未処置（ｍＡｂ非含有）状態またはアイソタイプ対照のいずれかと比較して、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、またはＩＦＮ−γのレベルの有意な増加はいずれも誘発しなかった。
【０２０５】
全血アッセイは、モノクローナル抗体療法の注入後の臨床環境でサイトカインの放出の可能性を識別するためのリスク判定方法として広く使用されている（Ｖｅｓｓｉｌｌｉｅｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ４２４：４３−５２（２０１５年））。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３がサイトカイン産生を誘発し得るかを判定するには、健康なボランティア（ｎ＝１６）の全血を、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３または対照の用量を増大させて、２４時間培養し、上清中のＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γの血漿レベルをＬｕｍｉｎｅｘで測定した（図４１）。放出されたサイトカインの統計分析は、最小二乗フィットモデルを使用して行った後、ダネットの比較を行って、ｍＡｂ非含有対照（図４２Ａ〜Ｄ）またはアイソタイプ対照（図４３Ａ〜Ｄ）のいずれかに対する平均を比較した。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、全血アッセイでは、未処置（ｍＡｂ非含有）状態またはアイソタイプ対照のいずれかと比較して、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＴＮＦ−α、またはＩＦＮ−γのレベルの有意な増加はいずれも誘発しなかった。
【０２０６】
実施例１１ＮＯＤ  ＳＣＩＤ異種移植マウスモデルにおけるＣＤ３ｘＥＧＦＲ＿ＳＦ３のｉｎ  ｖｉｖｏ特性評価
材料および方法
１１．１細胞株の培養条件
Ａ５４９細胞は、５％ＣＯ２の加湿雰囲気で３７℃の培地で培養した。細胞は、最適なコンフルエントで維持するために、週に２〜３回継代し、ＭｙｃｏＡｌｅｒｔ検出キットを使用して、マイコプラズマ汚染に関する試験を定期的に行った。試験を行った細胞は、一貫して陰性であった。
【０２０７】
１１．２エフェクター細胞：ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｌａ  Ｃｈａｕｘ−ｄｅ−Ｆｏｎｄｓ  Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒから入手した血液フィルタから採取した。血液フィルタ処理のために、１％Ｌｉｑｕｅｍｉｎｅ（登録商標）（Ｄｒｏｓｓａｐｈａｒｍ）を補充した４０ｍｌのＰＢＳを血液フィルタに注入し、ＰＢＭＣを含む溶液を、フィコール（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）をあらかじめ添加した５０ｍｌ血液分離管（Ｃｈｅｍｉｅ  Ｂｒｕｎｓｃｈｗｉｇ）に収集した。フィコール管を、８００ｇで、ブレーキなく、室温（ＲＴ）で２０分間遠心分離し、ＰＢＭＣ「バフィーコート」リングを採取し、３０ｍｌのＰＢＳを含む５０ｍｌファルコン管に移した。ＰＢＭＣは、処理する前にＰＢＳで３回洗浄した。
【０２０８】
１１．３動物の飼育
Ｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー細胞欠損（Ｅｎｖｉｇｏ）を特徴とする６〜７週齢の免疫不全ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）雌マウスにおいて行った。マウスは、げっ歯類マイクロアイソレーターケージ内の標準化環境条件下で維持させた（２０±１℃室温、５０±１０％相対湿度、１２時間の明暗サイクル）。マウスには、照射した食物および寝床、ならびに０．２２μｍのろ過した飲料水を与えた。実験はいずれも、スイス連邦の獣医局（ｃａｎｔｏｎａｌ  ａｎｄ  ｆｅｄｅｒａｌ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ａｕｔｈｏｒｉｔｉｅｓ）から事前の許可を得て、スイス連邦動物保護法（Ｓｗｉｓｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  Ｌａｗ）に従って実施した。
【０２０９】
１１．４異種移植実験
腫瘍細胞（標的細胞、Ｔ）およびＰＢＭＣ（エフェクター細胞、Ｅ）の混合物を、ＮＯＤ．ＣＢ１７／ＡｌｈｎＲｊ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ／Ｒｊ（ＮＯＤ／ＳＣＩＤ）マウスの右側腹部に、Ｅ：Ｔ比２：１で（ｎ＝４〜５匹／群／ＰＢＭＣドナー）ｓ．ｃ．注入した。プロトコルは治療用であり、細胞移植後２日目に治療を静脈内（ｉ．ｖ．）投与した。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３（Ｐ１０６９）は、２ｍｇ／ｋｇで３週間、週に１回静脈内投与した。腫瘍の大きさの定量化は、キャリパー測定によって行った。腫瘍体積は、次式を使用して算出した：腫瘍体積（ｍｍ３）＝０．５ｘ長さｘ幅２。
【０２１０】
１１．５統計分析
Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアを使用してデータを分析した。データは平均±ＳＥＭとして表示されている。統計分析は、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙテストによって実行した。Ｐ＜０．０５は、統計的に有意であると見なした。
概要および結果
【表６】
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【０２１１】
４１日目に、ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３処置群では、腫瘍体積の平均は、４８８ｍｍ３であったのに対し、対照群では１０５９ｍｍ３であった（図４４および４５を参照されたい）。ＣＤ３ｘＥＧＦＲ−ＳＦ３は、Ａ５４９腫瘍成長の有意な減少を誘発した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３６Ｃ】
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【図３６Ｄ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３７Ｄ】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４１】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【図４４】
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【図４５】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月14日(2020.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020517659000001.app
【国際調査報告】
2020517659.tif 000087
2020517659.tif 000088
2020517659.tif 000089
2020517659.tif 000090
2020517659.tif 000091