(57)【要約】  本発明は、多糖及びオリゴ糖、並びにその食用効果の分野に関する。特に、分岐α−グルカンの製造方法に関する。本発明は、（α１→６）グルコシド結合が散在している（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを含みかつ（α１→４，６）分岐点を有する分岐α−グルカンと、食品組成物と、デンプン含有食品材料の可消化炭水化物を低減するためのα−グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用と、を更なる態様とする。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも８％の分岐率を有するα−グルカンの製造方法であって、（α１→４）グルコシド結合を切断し、かつ連続した（α１→６）グルコシド結合は形成せずに新たな（α１→６）グルコシド結合を作成することのできるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素に、（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を非還元末端に少なくとも２つ含む多糖類又はオリゴ糖基質を接触させて、（α１→６）グルコシド結合が散在している（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを有しかつ（α１→４，６）分岐点を有するグルコースポリマーを形成することを含み、前記α−グルカノトランスフェラーゼが、配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記α−グルカノトランスフェラーゼが、ＧｔｆＢタイプの酵素である、α−グルカンの製造方法。
【請求項２】
前記α−グルカノトランスフェラーゼが、Ｇｔｆ１８０ラクトバチルス・ロイテリ１８０の残基番号による１０２９位にヒスチジン残基、及び／又は１１３７位にセリン残基、及び／又は１１４０位にアラニン残基を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記α−グルカノトランスフェラーゼが、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６８、及びＬ．デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６からなる群から選択される細菌由来のＧｔｆＢ酵素である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記基質が、少なくとも４の重合度を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記基質が、デンプン、デンプン誘導体、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、マルトデキストリン、（α１→４）グルカン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記多糖類又はオリゴ糖基質が、３０℃〜７５℃の温度及び４．０〜９．０のｐＨでα−グルカノトランスフェラーゼ酵素と接触する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
（α１→６）グルコシド結合が散在している（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを含みかつ（α１→４，６）分岐点を有するα−グルカンであって、前記α−グルカンが、少なくとも８％の分岐率を有し、１重量％未満の連続した（α１→６）結合を含み、１×１０３Ｄａ〜５×１０４Ｄａの平均分子量を有し、そして少なくとも８５重量％のα−グルカンが、２〜７の重合度を有する（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を含む、α−グルカン。
【請求項８】
請求項７に記載のα−グルカンを含む食品組成物。
【請求項９】
前記食品組成物が、飲料、ジャガイモ製品、朝食用シリアル、ペットフード製品、焼成された生地製品、又は菓子製品である、請求項８に記載の食品組成物。
【請求項１０】
デンプン含有食品材料の可消化炭水化物を低減するためのα−グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用であって、前記α−グルカノトランスフェラーゼ酵素が、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、使用。
【請求項１１】
Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ５１６８、及びＬ．デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６からなる群から選択される細菌。
【請求項１２】
配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むα−グルカノトランスフェラーゼ酵素。
【請求項１３】
配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性を持つポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多糖及びオリゴ糖、並びにその食用効果の分野に関する。特に、分岐α−グルカンの製造方法に関する。本発明の更なる態様は、（α１→６）グルコシド結合が散在している（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを含みかつ（α１→４，６）分岐点を有する分岐α−グルカンと、食品組成物と、デンプン含有食品材料の可消化炭水化物を低減するためのα−グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用と、である。
【背景技術】
【０００２】
肥満及び過体重は、世界中で急激に増加している。満腹感が高く、かつエネルギー密度が低い食品の開発により、体重増加の防止及び体重減少の促進が可能となる。糖の代わりに難消化性又は遅消化性炭水化物を含有する食品及び飲料の摂取は、糖含有食品及び飲料と比較して、食後の血中グルコースの上昇を抑える。
【０００３】
ヒトの食品の中で最も一般的な炭水化物は、デンプンである。この多糖類は、ほとんどの緑色植物により貯蔵エネルギーとして生産される。デンプンは、ジャガイモ、小麦、トウモロコシ、米、キャッサバなどの主食に多く含まれる。デンプン及びマルトオリゴ糖を化学修飾して難消化性炭水化物にするための様々な方法が提案されている。
【０００４】
乳酸菌（ＬＡＢ）は、食品及び健康関連産業の用途で多様な細胞外多糖類（ＥＰＳ）を産生することが知られている。例としては、スクロースから単一のグルカンスクラーゼ（ＧＳ）酵素の作用によって合成されるα−グルカンがある。国際公開第２００１／９０３７２号は、スクロースからラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）１２１ＧｔｆＡグルカンスクラーゼによって合成された、健康増進食品成分とみなされる「ロイテラン」として知られる分岐α−グルカンの形成について記載している。この酵素は、グリコシドヒドロラーゼファミリー７０（ＧＨ７０）のメンバーである。
【０００５】
高度に分岐したα−グルカンは、胃の低ｐＨ条件によってトリガーされる増粘効果と、消化性の低下とを組み合わせることができることが観察されている。この増粘は満腹感をもたらす（欧州特許第１５４５５６２号）。
【０００６】
欧州特許第２４２７５６５号は、デンプンを比較的長いイソマルトオリゴ糖側鎖を含有する直鎖状グルコオリゴ糖に変換するためのＬ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢのＧＨ７０グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用について記載している。Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢは、（α１→４）結合を切断し、新たな連続した（α１→６）グルコシド結合を形成するような４，６−α−グルカノトランスフェラーゼ（４，６−α−ＧＴａｓｅ）活性を示す。かかる材料は、消化に対しある程度耐性を有するため、摂取時にグルコースの生成が少なく、肥満及びＩＩ型糖尿病の予防に役立つ。
【０００７】
同時係属出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７１４７４号は、ＧＨ７０ファミリーのＧｔｆＤ酵素であるアゾトバクター・クロオコッカム（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ  ｃｈｒｏｏｃｏｃｃｕｍ）ＮＣＩＭＢ  ８００３及びパエニバチルス・ベイジンゲンシス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｅｉｊｉｎｇｅｎｓｉｓ）ＤＳＭ  ２４９９７が、アミロース及びデンプンを、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＡ  ＧＳによってスクロースから合成されたロイテランポリマーに類似する交互の（α１→４）／（α１→６）グルコシド結合及び（α１→４，６）分岐点を有するα−グルカンに変換する方法について記載している。デンプンを変換するＧＨ７０ファミリーの酵素としては異例なことに、これら両方のＧｔｆＤ酵素は連続した（α１→６）グルコシド結合を合成することができない。
【０００８】
デンプン、デンプン誘導体、及びマルトオリゴ糖の酵素修飾のための更なる手段を提供して、それらの機能特性を変化させ、それらの栄養価を改善するための更なる手段を提供することが望ましい。特に、食品製造への使用に適し、良好な酵素活性及び耐熱性を示しこのような修飾を行う酵素を提供することは有益である。
【０００９】
本明細書における先行技術文献のいかなる参照も、かかる先行技術が周知であること、又は当分野で共通の一般的な認識の一部を形成していることを認めるものとみなされるべきではない。本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語、及び同様の語は、排他的又は網羅的な意味で解釈されるべきではない。換言すれば、これらは「含むが、これらに限定されない」ことを意味することを目的としている。
【発明の概要】
【００１０】
本発明の課題は、従来技術を改良すること、そして、デンプン及び他の多糖若しくはオリゴ糖を酵素により修飾して消化性の低い材料にするための改良手段を提供すること、又は少なくとも有用な代替物を提供することである。本発明の目的は、独立請求項の主題によって達成される。従属請求項は、本発明の着想を更に展開するものである。
【００１１】
したがって、本発明は、第１の態様では、少なくとも８％の分岐率を有するα−グルカンの製造方法であって、（α１→４）グルコシド結合を切断し、かつ連続した（α１→６）グルコシド結合は形成せずに新たな（α１→６）グルコシド結合を作成することのできるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素に、（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を非還元末端に少なくとも２つ含む多糖類又はオリゴ糖基質を接触させて、（α１→６）グルコシド結合が散在している（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを有しかつ（α１→４，６）分岐点を有するグルコースポリマーを形成することを含む方法を提供し、当該α−グルカノトランスフェラーゼ（例えば、ＧｔｆＢタイプの酵素である）は、配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００１２】
第２の態様では、本発明は、（α１→６）グルコシド結合が散在している（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを含みかつ（α１→４，６）分岐点を有するα−グルカンに関し、当該α−グルカンは、少なくとも８％の分岐率を有し、１重量％未満の連続した（α１→６）結合を含み、１×１０３Ｄａ〜５×１０４Ｄａの平均分子量を有し、そして少なくとも８５重量％のα−グルカンは、２〜７の重合度を有する（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を含む。本発明の第３の態様は、（α１→６）グルコシド結合が散在している（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを含みかつ（α１→４，６）分岐点を有するα−グルカンを含む食品組成物に関し、当該α−グルカンは、少なくとも８％の分岐率を有し、１重量％未満の連続した（α１→６）結合を含み、１×１０３Ｄａ〜５×１０４Ｄａの平均分子量を有し、そして少なくとも８５重量％のα−グルカンは、２〜７の重合度を有する（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を含む。
【００１３】
本発明の更なる態様は、デンプン含有食品材料の可消化炭水化物を低減するための、配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性を有する又は配列番号１のアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を含むα−グルカノトランスフェラーゼ酵素（例えば、ＧｔｆＢ酵素）の使用である。本発明のなお更なる態様は、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性を有する核酸配列を含む細菌、ラクトバチルス・ロイテリ株ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１（ＮＣＣ  ２６０３）及びＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２（ＮＣＣ  ２６１３）からなる群から選択される細菌、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むα−グルカノトランスフェラーゼ酵素、並びに配列番号１に対して少なくとも９０％の配列同一性を持つポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。
【００１４】
本発明者らは、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１（ＮＣＣ  ２６０３）及びＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２（ＮＣＣ  ２６１３）のゲノムにおいて、新規なＧＨ７０ファミリータンパク質を同定した。これらの酵素は、互いに非常に類似しており、ＧｔｆＢと表記される。ＧｔｆＢ  ＧＨ７０サブファミリーは、ほとんどが、連続した（α１→６）結合を合成する４，６−α−グルカノトランスフェラーゼを含むが、驚くべきことに、これらの新規な酵素の活性は、非乳酸菌株で同定されたＧｔｆＤ  ４，６−α−グルカノトランスフェラーゼの活性に類似している。アミロースに作用するＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素の研究では、当該酵素は連続した（α１→６）グルコシド結合を合成することができず、代わりに、交互の直鎖状（α１→４）／（α１→６）結合及び（α１→４，６）分岐点により接続された直鎖状（α１→４）配列からなる低分子量ロイテラン様ポリマーを合成することを示す。
【００１５】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢの活性部位は、構造がよりオープンであることから分岐状生成物の合成能を説明することができるのに対し、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ  ４，６−α−ＧＴａｓｅは、その活性部位を越えてトンネルが延在することから、直鎖状生成物のみを形成する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化試験によると、分岐型のポリマー（特に比較的小さいサイズの分岐を有する高度に分岐したポリマー）は、ヒト消化管酵素による消化がより抑えられ及び／又はより時間がかかり、このことはデンプン質製品の血糖指数を低減させるというこれらの酵素の応用について新たな視野を広げる［ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７１４７４］。Ｌ．ロイテリ菌には、食品に安全に使用されてきた長い歴史があることは、食品産業に利用するにあたって利点となる。Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ、及びＬ．ロイテリ株ＮＣＣ  ２６０３によってコードされるホモログは、ＧＨ１３及びＧＨ７０ファミリー間の新たな進化的中間体を表す。Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素は、食品中に存在するデンプンを、血中グルコース放出の少ない炭水化物へ変換するのに有益なバイオ触媒を提供する。
【００１６】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素により形成された分岐α−グルカンの１Ｄ１Ｈ  ＮＭＲ分析により、（α１→４）及び（α１→６）結合の形成が明らかになった。α−グルカンのメチル化分析により、末端の４−置換、６−置換、及び４，６−二置換のグルコピラノース残基の存在が明らかとなった。６−置換及び４，６−二置換グルコピラノース残基の存在は、ＧｔｆＢ酵素が、それぞれ直鎖及び分岐状の配向で（α１→６）結合を形成することを意味する。２つの連続した（α１→６）結合したグルコピラノース残基に関するエビデンスは２Ｄ  ＮＭＲ分光分析により観察されなかった。また、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素により合成された分岐α−グルカンは、デキストラナーゼのエンド−（α１→６）−ヒドロラーゼ活性に対して耐性であり、この多糖類中に連続した（α１→６）結合が存在しないことを更に裏付けた。したがって、全ての分岐残基は、（α１→４，６）−α−Ｄ−Ｇｌｃｐ−（α１→４）残基である。また、メチル化分析により検出された全ての６−置換グルコピラノース残基は、（α１→４）結合されているはずであり、α−グルカン構造の直鎖部分に交互に（α１→６）／（α１→４）結合を形成する（α１→４）グルカン鎖を接続する。これは、欧州特許第１９４３９０８号に開示されているＥ．Ｃ．２．４．１．１８活性を有する分岐酵素の作用とは対照的である。このような分岐酵素は、（α１→４，６）分岐点のみを生成し、α−グルカン構造の直鎖部分に（α１→６）結合を生成せず、更に（α１→６）グルコシド結合が散在している（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメント（「交互の」（α１→４）及び（α１→６）グルコシド結合と呼ばれることもある）も形成しない。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】ＮＣＣゲノムデータベースで同定された新規なＧｔｆＢ様タンパク質並びに他のＧＨ７０デンプン及びスクロース作用酵素の触媒ドメインにおける保存モチーフＩ〜ＩＶの配列アラインメントを示す表である：（Ａ）基質結合部位を形成するモチーフＩＩ及びＩＶ内の残基の一部に違いを示すＧｔｆＢ様酵素、（Ｂ）特性評価されたＧｔｆＢ様酵素、（Ｃ）ＧｔｆＣ様及びＧｔｆＤ様４，６−α−ＧＴａｓｅ酵素、（Ｄ）スクロース活性ＧＳ酵素。ＧＨ７０酵素中の７つの保存されたアミノ酸残基（配列の上の１〜７の番号によって示される）もまた、ＮＣＣゲノムデータベースにおいて同定されたＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１及びＬ．デルブルエッキ（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）ＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６ＧｔｆＢタンパク質において保存されており、これら７つのアミノ酸残基のうち６つは、Ｓ．サーモフィルス（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＮＣＭ  Ｉ−５１６８及びＳ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７に保存されている。触媒三残基を構成するアミノ酸は太字とし、わずかに影を付けた。「ホットスポット」である１０２９、１０６５、１１３７、及び１１４０（Ｌ．ロイテリＧｔｆ１８０  ＧＳ残基番号）は、四角で囲われている。記号：ＮＵ、求核剤；Ａ／Ｂ、一般的な酸／塩基；ＴＳ、遷移状態安定剤。  図２は、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２（Ｌ．ロイテリＮＣＣ  ２６１３とも呼称される）ＧＨ７０酵素の相同性モデルを示す。三次構造予測は、Ｐｈｙｒｅ２サーバ及びＬ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ−ΔＮΔＶをテンプレートとして使用することによって実現した。
【図２Ａ】Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２  ＧＨ７０酵素の全体的な３Ｄモデル構造である。ドメインＡ、Ｂ、Ｃ、及びＩＶを示し、活性部位において推定される触媒残基は、スティックで描写する。
【図２Ｂ】ループＡ１、Ａ２及びＢを強調したＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素及びＬ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢの活性部位部分のクローズアップであり、２つの酵素におけるこれらのループの配列アラインメントも示す。Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢでは、ループＡ１及びＢがかなり短いことから、Ｌ．ロイテリ１２１酵素で観察されるよりも基質結合溝がかなり開いていることが予測される。
【図２Ｃ】サブサイト−１〜−５でＬ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ（ＰＤＢ：５ＪＢＦ）に結合したマルトペンタオース及びＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢモデルを重ね合わせて示す。結合溝付近の残基を示す。
【図３】２５ｍＭのマルトオリゴ糖（ＤＰ２〜ＤＰ７）、０．６％（ｗ／ｖ）Ｖ型アミロース、０．６％（ｗ／ｖ）アミロペクチン、及び０．６％（ｗ／ｖ）ジャガイモ可溶性デンプンとのインキュベーションから４０μｇ／ｍＬのＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮ（Ａ）及びＬ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ（Ｂ）４，６−α−グルカノトランスフェラーゼ酵素により生成された生成物のＴＬＣ分析を示す。反応混合物を、３７℃及びｐＨ５．５（Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ）又はｐＨ５．０（Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ）で２４時間インキュベートした。Ｓ：標準、Ｇ１：グルコース、Ｇ２：マルトース、Ｇ３：マルトトリオース、Ｇ４：マルトテトラオース、Ｇ５：マルトペンタオース、Ｇ６：マルトヘキサオース、Ｇ７：マルトヘプタオース、ＡＭＶ：Ｖ型アミロース、ＡＭＰ：アミロペクチン、ＳＴＲ：ジャガイモ可溶性デンプン、Ｐｏｌ：ポリマー。  図４は、０．６％（ｗ／ｖ）Ｖ型アミロースを、４０μｇ／ｍＬのＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮ、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ、及びＰ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤと共に、２４時間、３７℃で、かつｐＨ５．５（Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ）、ｐＨ５．０（Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ）、及びｐＨ７．０（Ｐ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤ）でインキュベートすることによって形成された生成物混合物の特性評価を示す。
【図４Ａ】生成された生成物の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ，２９８Ｋ）である。Ｇα／β及びＲα／βとして示すアノマーのシグナルは、それぞれ遊離型グルコース及び還元型−（１→４）−Ｄ−Ｇｌｃｐ単位に対応する。化学シフトは、内部アセトン（δ２．２２５）のシグナルに対して百万分率（ｐｐｍ）で示されている。
【図４Ｂ】形成された反応生成物のＨＰＳＥＣ分子量分布である。
【図５】Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラムでのサイズ排除クロマトグラフィーによって分離されたＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮ酵素によって生成されたα−グルカンの５００ＭＨｚ  １Ｄ１Ｈ  ＮＭＲスペクトル、２Ｄ１Ｈ−１Ｈ  ＴＯＣＳＹスペクトル（混合時間１５０ｍｓ）、及び２Ｄ１３Ｃ−１Ｈ  ＨＳＱＣスペクトル（Ｄ２Ｏ，２９８Ｋ）を示す。反応生成物を、０．６％（ｗ／ｖ）Ｖ型アミロースから得て、４０μｇ／ｍＬのＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮ酵素と共に、２４時間、３７℃でｐＨ５．５でインキュベートした。（α１→４）及び（α１→６）のアノマーのシグナルのピークを示す。構造レポーターのピークは、ａ：６−置換ＧｌｃｐについてはＨ−４、ｂ：末端ＧｌｃｐについてはＨ−４、ｃ：４−置換ＧｌｃｐについてはＨ−４、ｄ：６−置換ＧｌｃｐについてはＨ−６ａ、ｅ：６−置換ＧｌｃｐについてはＨ−６ｂである。
【図６】Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮ（２０μｇ／ｍＬ）をマルトヘプタオースとインキュベートした時に形成されたオリゴ糖混合物の、ｔ＝１時間、３時間、及び２４時間（ｐＨ５．５，３７℃）のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイルを示す。ピークの同一性は、市販のオリゴ糖標準を用いて確認した。Ｇ１：グルコース、Ｇ２〜Ｇ７：マルトースからマルトヘプタオース、イソ−Ｇ２：イソマルトース、イソ−Ｇ３：イソマルトトリオース、Ｐａ：パノース。
【図７】Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮ酵素（４０μｇ／ｍｌ）（Ａ）及びＬ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ酵素（４０μｇ／ｍＬ）（Ｂ）を、０．３５％Ｖ型アミロース（ＡＭＶ）（ドナー基質）又はＶ型アミロースと２５ｍＭマルトース若しくは２５ｍＭイソマルトース（アクセプター基質）と３７℃で２４時間インキュベートすることによって生成されたオリゴ糖混合物のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイルを示す。ピークの同一性は、市販のオリゴ糖標準を用いて確認した。Ｇ１：グルコース、Ｇ２〜Ｇ４：マルトースからマルトテトラオース、イソ−Ｇ２〜イソ−Ｇ５：イソマルトースからイソマルトペンタオース、Ｐａ：パノース。
【図８】３７℃で４８時間、過剰量の（Ａ）アスペルギルス・オリゼα−アミラーゼ、（Ｂ）ケトミウム・エラティカム・デキストラナーゼ、及び（Ｃ）クレブシエラ・プランティコラ・プルラナーゼＭ１で消化した後のＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮ多糖類（５ｍｇ／ｍＬ）の薄層クロマトグラフィー分析を示す。比較のため、Ａ．クロオコッカムＮＣＩＭＢ  ８００３ＧｔｆＤ及びＰ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤによって生産されたロイテラン様ポリマー、並びにＬ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢにより合成されたＩＭＭＰ生成物（（α１→６）結合は約９０％）に、同じ酵素処理を施した。レーン１〜５：それぞれ、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮポリマー、Ａ．クロオコッカムＧｔｆＤポリマー、Ｐ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤ  ＨＭＭポリマー、Ｐ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤ  ＬＭＭポリマー、及びＬ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢポリマーの酵素処理によって生成される反応生成物。レーン６、α−アミラーゼ、デキストラナーゼ及びプルラナーゼ消化の陽性対照：アミロース（Ａ）、デキストラン（Ｂ）、及びプルラン（Ｃ）。レーンＳ、標準：グルコース（Ｇ１）〜マルトヘプタオース（Ｇ７）、Ｐｏｌ：ポリマー。
【図９】プルラナーゼＭ１を使用して、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢポリマー（Ａ）、Ｐ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤ  ＬＭＭポリマー（Ｂ）、Ｐ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤ  ＨＭＭポリマー（Ｃ）、及びＡ．クロオコッカムＧｔｆＤポリマー（Ｄ）を消化することによって形成されるオリゴ糖のＨＰＡＥＣ−ＰＡＤプロファイルを示す。確認されたオリゴ糖構造を含む。市販のオリゴ糖標準を使用して、ロイテランのプルラナーゼ加水分解物のプロファイルと比較することにより、ピーク１〜１６の同一性を確認した［Ｓ．Ｓ．ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４３（２００８）１２５１−１２６５］。
【図１０】Ｖ型アミロースから形成された、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２（Ｌ．ロイテリＮＣＣ  ２６１３とも呼称される）ＧｔｆＢ−ΔＮ  ＬＭＭポリマー、Ａ．クロオコッカムＮＣＩＭＢ  ８００３ＧｔｆＤ  ＨＭＭポリマー、並びにＨＭＭ及びＬＭＭ  Ｐ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤポリマー［ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７１４７４］の複合構造の視覚的説明である。当該複合構造は、各生成物に対して説明された全ての構造的特徴を含む。各構造成分の量は、１Ｄ１Ｈ  ＮＭＲの積分及びメチル化分析、並びにプルラナーゼによる酵素分解試験を組み合わせたデータと一致する。
【図１１】異なる量のＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素によって修飾された小麦粉のｉｎ−ｖｉｔｒｏでの消化結果のプロットを示す。グルコース放出率（％）を時間（分）に対してプロットする。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
結果として、本発明は、少なくとも８％の分岐率を有するα−グルカンの製造方法であって、（α１→４）グルコシド結合を切断し、かつ連続した（α１→６）グルコシド結合は形成せずに新たな（α１→６）グルコシド結合を作成することのできるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素に、（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を非還元末端に少なくとも２つ含む多糖類又はオリゴ糖基質を接触させて、（α１→６）グルコシド結合が散在している（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを有しかつ（α１→４，６）分岐点を有するグルコースポリマーを形成することを含む方法を提供し、当該α−グルカノトランスフェラーゼは、配列番号１に対して少なくとも７０％の同一性（例えば、配列番号１に対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む（例えば、それからなる）。本発明の方法におけるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素は、（α１→４）グルコシド結合を切断し、マルトオリゴ糖をＤＰ７まで（例えばＤＰ５まで）転移させることが可能であり得る。本発明の方法におけるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素は、ＧｔｆＢ型の酵素であってもよい。本発明の方法におけるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素は、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６８、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６からなる群から選択される細菌由来のＧｔｆＢ酵素であり得る。
【００１９】
配列番号１は、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素の配列である。配列番号４は、ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６８ＧｔｆＢ酵素（ストレプトコッカス・サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７ＧｔｆＢ酵素の配列と同一である）の配列である。配列番号５は、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６酵素の配列である。配列番号１９は、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１ＧｔｆＢ酵素の配列である。
【００２０】
ＮＣＣ  ２６１３とも呼称されるＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２を、２０００年４月１９日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに寄託し、寄託番号Ｉ−２４５２を得た。
【００２１】
ＮＣＣ  ２６０３とも呼称されるＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１を、２０００年４月１９日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに寄託し、寄託番号Ｉ−２４５１を得た。
【００２２】
ＮＣＣ  ８２８とも呼称されるＬ．デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６を、２０１７年２月１４日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに寄託し、寄託番号Ｉ−５１６６を得た。
【００２３】
ＮＣＣ  ９０３とも呼称されるＳ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７を、２０１７年２月１４日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに寄託し、寄託番号Ｉ−５１６７を得た。
【００２４】
ＮＣＣ  ２４０８とも呼称されるＳ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６８を、２０１７年２月１４日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに寄託し、寄託番号Ｉ−５１６８を得た。
【００２５】
ＮＣＣ  ２９７０とも呼称されるラクトバチルス・ファーメンタム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８を、２０１６年３月８日にＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ），Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ，２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ，Ｆ−７５７２４  ＰＡＲＩＳ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに寄託し、寄託番号Ｉ−５０６８を得た。
【００２６】
多糖類は、グリコシド結合により相互に結合される単糖単位の長鎖から構成される高分子炭水化物である。オリゴ糖は、少数の単糖（典型的に３〜９個）を含む糖ポリマーである。アミロースは、（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を非還元末端に少なくとも２つ含む基質の一例である。本明細書において、略記Ｇｔｆは、グルカノトランスフェラーゼを指す。本発明の方法で形成され得る１つ以上の（α１→４）グルコシド結合間の単一の（α１→６）グルコシド結合は、「架橋」（α１→６）結合と呼ばれることがある。（α１→４）と言う表記は、α（１→４）の代わりに、１→４α結合を指すために使用されてもよいが、これらは（α１→６）及びα（１→６）のように同義である。
【００２７】
本発明の前後関係において、分岐率は、分岐アンヒドログルコース単位（ＡＧＵ）、すなわち、他の３つの単位に結合するＡＧＵの、分子内のＡＧＵの総数に対する総数として定義される。分岐率は、ガスクロマトグラフィーによるメチル化など、当該技術分野において既知の方法によって求めることができる。本発明の方法によって生産されるα−グルカンは、少なくとも８％、例えば、少なくとも１０％、例えば、少なくとも１５％の分岐率を有し得る。
【００２８】
本発明の一実施形態は、少なくとも８％の分岐率を有するα−グルカンの製造方法であって、（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を非還元末端に少なくとも２つ含む多糖類又はオリゴ糖基質を、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性（例えば、配列番号１に対して少なくとも９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む（例えば、それからなる）Ｌ．ロイテリＧｔｆＢ酵素と接触させることを含む、方法を提供する。
【００２９】
デンプンに対し活性なＧＨ７０酵素は、ＧＳにおいて十分に保存されたモチーフＩＩＩの１０６５（Ｌ．ロイテリ１８０Ｇｔｆ１８０の残基番号）残基を置換するＴｙｒ残基を持つ。
【００３０】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６８、及びＬ．デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６のＧｔｆＢタンパク質配列は、基質結合部位を形成するモチーフＩＩ及びＩＶにおいて残基の一部に違いを示す。ＧｔｆＣ及びＧｔｆＤ酵素と同様に、サブサイト＋１Ａｓｎ残基（Ｌ．ロイテリＧｔｆ１８０  ＧＳ中のＮ１０２９）は、これら５つのＧｔｆＢタンパク質においてＨｉｓにより置換される。モチーフＩ〜ＩＶの残基に対するＬ．ロイテリＧｔｆ１８０  ＧＳの番号と他の酵素配列における番号との対応関係を図１に示す。例えば、Ｌ．ロイテリＧｔｆ１８０  ＧＳの残基番号による残基１０２９は、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１のＧｔｆＢにおける残基６８３、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２のＧｔｆＢにおける残基６４６、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７のＧｔｆＢにおける残基１０３９、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６８のＧｔｆＢにおける残基１０３９、及びＬ．デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６のＧｔｆＢにおける残基６７８である。Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１及びＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２のＧｔｆＢタンパク質の場合、推定される遷移状態安定領域に続く１１３７位及び１１４０位（Ｇｔｆ１８０  Ｌ．ロイテリ１８０の残基番号）のアミノ酸は、ほとんどのＧｔｆＢ及びＧｔｆＣ様４，６−α−ＧＴａｓｅに典型的に見られるＧｌｎ及びＬｙｓ残基ではなくＳｅｒ及びＡｌａである。Ｌ．デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６のＧｔｆＢタンパク質の場合、推定される遷移状態安定領域に続く１１４０位のアミノ酸（Ｇｔｆ１８０  Ｌ．ロイテリ１８０の残基番号）もまたＡｌａである。
【００３１】
本発明の一実施形態は、少なくとも８％の分岐率を有するα−グルカンの製造方法であって、（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を非還元末端に少なくとも２つ含む多糖類又はオリゴ糖基質を、Ｇｔｆ１８０ラクトバチルス・ロイテリ１８０の残基番号により、残基１０２９にヒスチジン及び／又は残基１１３７にセリン及び／又は残基１１４０にアラニンを有するアミノ酸配列を含むＧｔｆＢ酵素と接触させることを含む、方法を提供する。本発明の方法によるＧｔｆＢ酵素は、１０６５位にチロシン残基、及び１０２９位にヒスチジン残基（Ｇｔｆ１８０  Ｌ．ロイテリ１８０の残基番号）を有するアミノ酸配列を含み得る。本発明の方法によるＧｔｆＢ酵素は、１０６５位にチロシン残基、１０２９位にヒスチジン残基、及び１１４０位にアラニン残基（Ｇｔｆ１８０  Ｌ．ロイテリ１８０の残基番号）を有するアミノ酸配列を含み得る。本発明の方法によるＧｔｆＢ酵素は、Ｇｔｆ１８０ラクトバチルス・ロイテリ１８０の残基番号により、１０６５位にチロシン残基、１０２９位にヒスチジン残基、及び／又は１１３７位にセリン残基、及び／又は１１４０位にアラニン残基を有するアミノ酸配列を含み得る。本発明は、少なくとも８％の分岐率を有するα−グルカンの製造方法であって、（α１→４）グルコシド結合を切断し、かつ連続した（α１→６）グルコシド結合は形成せずに新たな（α１→６）グルコシド結合を作成することのできるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素に、（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を非還元末端に少なくとも２つ含む多糖類又はオリゴ糖基質を接触させて、（α１→６）グルコシド結合が散在している（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを有しかつ（α１→４，６）分岐点を有するグルコースポリマーを形成することを含む方法を提供することができ、当該α−グルカノトランスフェラーゼは、Ｇｔｆ１８０ラクトバチルス・ロイテリ１８０の残基番号により、１０２９位にヒスチジン残基及び／又は１１３７位にセリン残基及び／又は１１４０位にアラニン残基を有するアミノ酸配列を含むＧｔｆＢ型の酵素である。
【００３２】
本発明の方法における基質は、少なくとも４の重合度を有し得、例えば、少なくとも４つのＤ−グルコース単位を含み得る。重合度は、ポリマー又はオリゴマー分子中のモノマー単位の数である。例えば、本発明の方法における基質は、少なくとも５の重合度を有し得、例えば、少なくとも５つのＤ−グルコース単位を含み得る。本発明の方法における基質は、デンプン（例えば、ワキシーデンプン又は高アミロースデンプン）、デンプン誘導体、マルトオリゴ糖、アミロース、アミロペクチン、マルトデキストリン、（α１→４）グルカン、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。デンプン誘導体は、天然のデンプンを物理的、酵素的又は化学的に処理してその特性を変化させることにより調製される。
【００３３】
本発明の方法における基質は、別の材料内に含まれてもよく、該基質は例えば穀粉の形で提供される粉末状デンプンであってもよい。食品成分中に含まれる多糖類又はオリゴ糖を、消化性の低いα−グルカン、例えば分岐α−グルカンに変換可能であることは有利である。このような変換は、成分中の繊維含量を増加させることができ、及び／又は、成分のカロリー含有量の低減に有用であり得る。本発明の方法は、食品加工工程の一部として行ってもよく、例えばα−グルカノトランスフェラーゼ酵素を、工程中に食品成分に適用して食品製品を生産してもよい。基質は、栄養価のあるプロファイルを既に有する材料中に含まれることもあり、例えば、該基質は、全粒小麦粉中に含まれ得る。
【００３４】
多糖又はオリゴ糖基質が本発明の方法におけるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素によって変換され得る程度は、反応時間を制限することによって調整できる。部分的に変換された基質は、物性の変化をもたらす。本発明の方法におけるα−グルカンの生産は、基質とα−グルカノトランスフェラーゼ酵素との間の反応が完了する前に停止してもよく、例えば、変性（例えば加熱による）又は酵素の除去によって停止してもよい。
【００３５】
本発明の方法におけるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素を固定してもよく、例えば多糖類又はオリゴ糖基質と接触させる前に固定してもよい。このような固定法は、従来技術において公知である。酵素を固定することにより、（上記の）酵素の除去を容易に行うことができる。固定法は、共有結合、封入、物理吸着、架橋、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。共有結合による固定においては、酵素中の、触媒活性には必須でない官能基を介して、酵素を支持体に共有結合させる。アルミナ、シリカ、及びケイ素化アルミナ等の酸化物材料を用いて酵素を共有結合させることができる。封入による固定においては、酵素をポリマーマトリックス又は膜の格子内に局在させる。封入の方法は、主に５つのタイプ、すなわち格子、マイクロカプセル、リポソーム、膜及び逆ミセル、に分類される。酵素は、様々な合成又は天然ポリマーのマトリックス中に封入される。イオノトロピックなゲル化によりゲルを形成する天然多糖類であるアルギン酸塩は、そのような固定化マトリックスの１つである。物理吸着による固定は、担体への酵素の固定方法のなかでも最も簡単かつ古典的な方法である。吸着による固定は、水素結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス力、及びそれらの組み合わせなどの、酵素と担体との間の物理的相互作用に基づく方法である。吸着は一般に、化学的結合手段よりも酵素への損害が少ない。架橋による固定は、酵素分子間の架橋試薬となる二又は多官能性の化合物を利用するものである。架橋は、吸着又は封入などの他の固定方法と組み合わせて使用することができる。
【００３６】
多糖類又はオリゴ糖基質は、１０℃〜７５℃（例えば、２０℃〜７０℃、例えば３０℃〜６５℃、例えば３５℃〜４５℃）の温度で、及び４．０〜９．０（例えば４．８〜８．０、例えば５．０〜６．０）のｐＨで、本発明の方法におけるα−グルカノトランスフェラーゼ酵素と接触させることができる。Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素は、アルカリ環境における用途に有用である高ｐＨ値で活性である。
【００３７】
更なる実施形態では、本発明は、（α１→６）グルコシド結合が散在している（α１→４）結合したＤ−グルコース単位の直鎖状セグメントを含みかつ（α１→４，６）分岐点を有するα−グルカンに関し、当該α−グルカンは、少なくとも８％（例えば、少なくとも１２％、更なる例としては少なくとも１５％）の分岐率を有し、１重量％未満の連続した（α１→６）結合を含み、１×１０３Ｄａ〜５×１０４Ｄａの平均分子量（例えば、２×１０３Ｄａ〜２×１０４Ｄａの平均分子量、例えば５×１０３Ｄａ〜１×１０４Ｄａの平均分子量）を有し、そして少なくとも８５重量％（例えば、少なくとも９０重量％、更なる例としては少なくとも９５重量％）のα−グルカンは、２〜７の重合度を有する（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を含む。２〜７の重合度を有する（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を含むα−グルカンの割合は、例えば、α−グルカンをプルラナーゼで消化し、得られた混合物をＴＬＣ及び／又はＨＰＡＥＣで評価することによって測定することができる。
【００３８】
本発明によるα−グルカンは、５５〜６５％の連続した（α１→４）グルコシド結合と、直鎖状の（α１→４）結合したＤ−グルコース単位間に散在する８〜１５％の単一（α１→６）グルコシド結合と、１０〜２０％の（α１→４，６）分岐点、例えば１４〜１８％の（α１→４，６）分岐点とを含んでもよい。本発明によるα−グルカンは、１％未満の連続した（α１→６）グルコシド結合を有してもよく、例えば０．５％未満の連続した（α１→６）グルコシド結合を有してもよく、更なる例では、連続した（α１→６）グルコシド結合を有さなくてもよい。本発明のα−グルカンは、デンプンからＰ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤによって合成された低分子量のα−グルカン（同時係属出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７１４７４）に類似しているが、７を超える重合度を有する（α１→４）結合したＤ−グルコース単位をほとんど有していない。このことは、より短い鎖の割合の増加がデンプンの消化率の低下に関連していることから有益である［Ｘｉｎｇｆｅｎｇ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１６４，５０２−５０９（２０１４）］。
【００３９】
更なる態様では、本発明は、（α１→４）結合したＤ−グルコース単位を非還元末端に少なくとも２つ含む多糖類又はオリゴ糖基質が、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むα−グルカノトランスフェラーゼ酵素、例えばＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１ＧｔｆＢ酵素又はＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素と接触することによって得ることができる（例えば、得られた）α−グルカンを提供する。
【００４０】
本発明のα−グルカンは、食物繊維とみなすことができる。α−グルカンは、その高度な分岐構造のため、消化管上部における酵素による分解に耐性を示し、最終的には大腸において、大腸細菌叢による完全な発酵に用いられ得る。また、このような食物繊維は、ヒト又は動物における満腹感を増強する。血糖値は食後に上昇する。本発明のα−グルカンは、デンプン等の材料と比較して消化性が低いため、これらを含む食事は、デンプンを含む同様の食事と比較して血糖値応答が低く、インスリン応答の誘導も緩やかである。本発明のα−グルカンを含む組成物は、対象における食後血中グルコース及びインスリン濃度の制御に用いられ得る。対象は、ヒト又は動物であってもよい。本発明のα−グルカンを含む組成物は、対象における食後血中グルコース及びインスリン濃度の増加に関連する障害の治療又は予防用のものであってもよい。障害は、例えば、妊娠糖尿病などの糖尿病、グルコース代謝異常、高インスリン血症又はインスリン抵抗性からなる群から選択され得る。対象は、糖尿病又は前糖尿病のヒト又はペットであってもよい。
【００４１】
典型的には、食後高インスリン血症は、インスリン抵抗性、メタボリックシンドローム、グルコース不耐性、及び２型糖尿病の発症を促進し得る［Ｋｏｐｐ  Ｗ．，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．２００３，Ｊｕｌ；５２（７）：８４０−８４４］。しかしながら、食後のインスリン要求量を低下させることにより、一方では２型糖尿病における血糖調節の悪化を低減することができ、他方では２型糖尿病に罹患しやすい対象において発症のリスクを低減することができる。
【００４２】
「前糖尿病患者」とはインスリン抵抗性又はグルコース代謝障害を示している対象であり、例えば家族歴、生活様式、又は遺伝的性質によって、後年になって糖尿病を発症しやすい。インスリン分泌の低減は、長期的には膵臓が疲弊するリスクを低下させることから、前糖尿病の患者又は代謝疾患を有する患者における膵臓の管理にとって有益である。したがって、本発明のα−グルカンを含む組成物の使用により、これらの対象における糖尿病、グルコース代謝障害、高インスリン血症、若しくはインスリン抵抗性のリスク及び／又は発症を低減し得る。
【００４３】
糖尿病、インスリン抵抗性、又はグルコース不耐性の罹患は主として成人において認められる。しかしながら、小児の罹患が増加しており、又は罹患しやすくなっており、若しくはこのような障害を後年になって発症するリスクを有するようになっている。したがって、これらの障害の予防及び／又は治療は若年期から開始するのが有利である。あるいは、ヒトにおいて観察されるのと同様に、糖尿病、高インスリン血症、又はインスリン抵抗性は、動物、特にペットとして飼育される動物においても広まっている。したがって、本発明はまた、ネコ及びイヌにも関連する。
【００４４】
本発明のα−グルカンを含む組成物は、血漿中の食後グルコース及びインスリン濃度を減少させるための非治療的用途に用いられてもよい。本発明のα−グルカンを含む組成物を、例えば、２型糖尿病、インスリン抵抗性、又はグルコース不耐性を後のある時点で発症するリスクのある健康な対象等の対象にも投与できることは有益である。本発明のα−グルカンを含む組成物は、本明細書に開示のとおり、摂取後にインスリン濃度を低下させる。多くの健康な人々が体重の減量を望んでいる。食物繊維を含有する食事を消費することは、満腹感を高めることができるため、可消化カロリーの消費を減少させたい人々の助けとなる。本発明のα−グルカンを含む組成物は、体重を減量させる非治療的用途に用いられてもよい。
【００４５】
本発明の別の態様は、本発明のα−グルカンを含む食品組成物に関する。食品組成物は、例えば、本発明のα−グルカンを１〜２０重量％含むことができる。食品組成物は、飲料（例えば粉末状の飲料ミックス又は飲料用クリーマー）、ジャガイモ製品（例えば、インスタントマッシュポテト）、朝食用シリアル（例えば、押出シリアル又はポリッジ）、ペットフード製品、焼成された生地製品（例えばパン、ピザ又は具入りのセイボリーターンオーバー（ｓａｖｏｕｒｙ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ））、又は菓子製品であってよい。菓子製品は、アイスクリーム等の冷凍菓子製品、ビスケット（例えばフィリング入りビスケット又はウエハ）などの焼き菓子製品、チョコレート菓子製品、又はシュガースタイルの菓子製品（例えばガム、ゼリー、ハードキャンディ（ｈａｒｄ−ｂｏｉｌｅｄ  ｓｗｅｅｔ）又はチューイー・スゥイート（ｃｈｅｗｙ  ｓｗｅｅｔ）であってもよい。「シュガースタイルの菓子製品」又は「シュガースタイルのキャンディ」という用語は、伝統的に砂糖を主成分とする菓子製品を意味するが、他の甘味料及び／又は砂糖代用品によって製造されてもよい。
【００４６】
更なる実施形態では、本発明は、食品材料、例えばデンプン系食品材料の可消化炭水化物を低減するためのα−グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用を提供し、該α−グルカノトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１に対して少なくとも８５％の同一性（例えば、配列番号１に対して少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む（例えば、それからなる）、又は配列番号１のアミノ酸配列を有する。本発明の範囲において、可消化炭水化物とは、全炭水化物のうち、消化可能で、体細胞へのエネルギー供給に利用できる部分に該当する。
【００４７】
本発明は更に、食品材料、例えばデンプン系食品材料の可消化炭水化物を低減するためのＧｔｆＢ  α−グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用を提供し、該α−グルカノトランスフェラーゼＧｔｆＢ酵素は、Ｇｔｆ１８０ラクトバチルス・ロイテリ１８０の残基番号により、残基１０２９にヒスチジン及び／又は残基１１３７にセリン及び／又は残基１１４０にアラニンを有するアミノ酸配列を含む。本発明は更に、食品材料、例えばデンプン系食品材料の可消化炭水化物を低減するためのＧｔｆＢ  α−グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用を提供し、該α−グルカノトランスフェラーゼＧｔｆＢ酵素は、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６８、及びＬ．デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６、例えばＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２からなる群から選択される細菌由来である。
【００４８】
一実施形態において、本発明は、食品材料、例えばデンプン系食品材料の血糖指数を低減するためのα−グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用を提供し、該α−グルカノトランスフェラーゼ酵素は、配列番号１に対して少なくとも８５％の同一性（例えば、配列番号１に対して少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、又は９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む（例えば、それからなる）、又は配列番号１のアミノ酸配列を有する。血糖指数は、ヒトの血中グルコース（血糖とも呼ばれる）濃度に対し食品による影響を示す特定の種類の食品に関連する数値である。１００と言う値は、基準（同等量の純粋なグルコース）を表す。
【００４９】
本発明は更に、食品材料、例えばデンプン系食品材料の血糖指数を低減するためのＧｔｆＢ  α−グルカノトランスフェラーゼ酵素の使用を提供し、該α−グルカノトランスフェラーゼＧｔｆＢ酵素は、Ｇｔｆ１８０ラクトバチルス・ロイテリ１８０の残基番号により、残基１０２９にヒスチジン及び／又は残基１１３７にセリン及び／又は残基１１４０にアラニンを有するアミノ酸配列を含む。
【００５０】
本発明の一態様は、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、配列番号１に対して少なくとも９６、９７、９８、又は９９％の同一性）を有する核酸配列を含む細菌、例えば、ラクトバチルス・ロイテリ細菌を提供する。別の態様では、本発明は、配列番号４に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、配列番号４に対して少なくとも９６、９７、９８、又は９９％の同一性）を有する核酸配列を含む細菌、例えば、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７又はＳ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６８細菌を提供する。別の態様では、本発明は、配列番号５に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、配列番号５に対して少なくとも９６、９７、９８、又は９９％の同一性）を有する核酸配列を含む細菌、例えば、ラクトバチルス・デルブルエッキ亜種デルブルエッキ細菌ＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６を提供する。本発明の一態様は、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６８、及びＬ．デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６からなる群から選択される細菌である。例えば、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６８、及びＬ．デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６からなる群から選択される細菌である。
【００５１】
本発明の更なる態様は、配列番号１に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、配列番号１に対して少なくとも９６、９７、９８、又は９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む（例えば、含む）α−グルカノトランスフェラーゼ酵素である。本発明の更なる態様は、配列番号４に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、配列番号４に対して少なくとも９６、９７、９８、又は９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む（例えば、含む）α−グルカノトランスフェラーゼ酵素である。本発明の更なる態様は、配列番号５に対して少なくとも９５％の同一性（例えば、配列番号５に対して少なくとも９６、９７、９８、又は９９％の同一性）を有するアミノ酸配列を含む（例えば、含む）α−グルカノトランスフェラーゼ酵素である。α−グルカノトランスフェラーゼ酵素は、例えば、ＧｔｆＢ酵素であってよい。本発明のなお更なる態様は、配列番号１に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号１に対して少なくとも９６、９７、９８、又は９９％の同一性）を持つポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターである。本発明の別の態様は、配列番号４に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号４に対して少なくとも９６、９７、９８、又は９９％の同一性）を持つポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターである。本発明の別の態様は、配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性（例えば、配列番号５に対して少なくとも９６、９７、９８、又は９９％の同一性）を持つポリペプチドをコードする核酸配列を含む発現ベクターである。
【００５２】
実験
材料及び方法
炭水化物に対し活性のある酵素の自動アノテーション用のｄｂＣＡＮデータベースを使用して、ＮＣＣゲノムデータベースに存在するＧＨ７０ファミリー酵素のアノテーションを実施した［Ｙ．Ｙｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｄｂＣＡＮ：ａ  ｗｅｂ  ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．４０（２０１２）Ｗ４４５−５１］。１Ｅ−５未満のＥ値及び３５０を超えるビットスコアを有するヒットを検討した。結果として、７８８のタンパク質配列が回収された。ＭＵＳＣＬＥアルゴリズムを使用するＪａｌｖｉｅｗ  ２デスクトップアプリケーションとの多重配列アラインメントの構築のため、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ（アクセッション番号：ＡＡＵ０８０１４．２）、ロイコノストック・シトレウムＮＲＲＬ  Ｂ−１２９９分岐スクラーゼ（アクセッション番号：ＣＤＸ６６８２０．１）、及びＬ．ロイテリ１８０Ｇｔｆ１８０  ＧＳ（アクセッション番号：ＡＡＵ０８００１．１）タンパク質配列と共に使用した［Ａ．Ｍ．Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊａｌｖｉｅｗ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ２−−ａ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｅｄｉｔｏｒ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２５（２００９）１１８９−１１９１］。配列は、典型的にはＧＳ中に存在する保存されたＴｒｐを置換する芳香族Ｔｙｒ（Ｙ１０５５  Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢの残基番号）を持つ場合にのみデンプンに作用すると推定されるＧＨ７０酵素であるとみなされ、その結果、１０６のＧｔｆＢ様遺伝子産物のセットが得られた。分岐スクラーゼは、アラインメント中のこの位置におけるＧｌｙ残基の存在によって区別された。更なる分析のために、ＮＣＣゲノムデータベース内で同定されたＧｔｆＢタンパク質のセットを、ＣＡＺｙ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｚｙ．ｏｒｇ／）にインデックスされており、デフォルトパラメータを使用してＭＵＳＣＬＥによって整列された、特性評価されたＧＨ７０タンパク質によって拡大した。ＭＥＧＡ６を使用して、ＪＴＴマトリックスモデルに基づく最尤法によって系統発生の関係を決定した［Ｋ．Ｔａｍｕｒａ，Ｇ．Ｓｔｅｃｈｅｒ，Ｄ．Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ａ．Ｆｉｌｉｐｓｋｉ，Ｓ．Ｋｕｍａｒ，ＭＥＧＡ６：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．３０（２０１３）２７２５−２７２９］。分析には、１６７個のアミノ酸配列が含まれた。アラインメントのギャップ及び欠損データを含む位置の部分的な削除を行った。推定された系統発生の関係の統計的信頼性は、１，０００回のブートストラップ反復試験を実施することにより評価した。
【００５３】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢタンパク質配列の分析
多重アミノ酸配列アラインメントを、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｏｍｅｇａ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｏ／）により作成し、Ｊａｌｖｉｅｗ  ２デスクトップアプリケーションを使用して視覚化する。Ｌ．ロイテリＧｔｆＢタンパク質の細胞内局在を、ＣＥＬＬＯ  ｖ．２．５：細胞内局在予測システム（ｈｔｔｐ：／／ｃｅｌｌｏ．ｌｉｆｅ．ｎｃｔｕ．ｅｄｕ．ｔｗ／）を使用して予測し、その理論ＭＷ（分子量）をＥｘＰＡＳｙ  Ｃｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ／ＭＷ（ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｃｏｍｐｕｔｅ＿ｐｉ／）によって予測した。
【００５４】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢタンパク質の構造モデリング
Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ  ４，６−α−ＧＴａｓｅ（ＰＤＢ登録：５ＪＢＤ）の最近決定された三次元構造［Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２５（２０１６）２３１−２４２］を、デフォルト設定で完全長配列の１対１スレッディングのテンプレートとして用い、Ｐｈｙｒｅによって［Ｋｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１０（２０１５）８４５−８５８］Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢの三次元モデルを構築した。結合部位の比較のために、マルトペンタオース又はイソマルト−マルトペンタサッカライド（ＰＤＢ登録：５ＪＢＥ、５ＪＢＦ）と複合させたＬ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ４，６−α−ＧＴａｓｅの結晶構造もまた使用した。
【００５５】
Ｌ．ロイテリＧｔｆＢ遺伝子のクローニング
Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅ，Ｈｅｌｓｉｎｋｉ，Ｆｉｎｌａｎｄ）により、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ゲノムＤＮＡからＧｔｆＢタンパク質のＮ末端切断変異体（ＧｔｆＢ−ΔＮ）をコードしているｇｔｆＢ遺伝子フラグメントを増幅させ、改変ｐＥＴ１５ｂベクターにライゲーション非依存性クローニング（ＬＩＣ）によりクローニングした［Ｄ．Ｂｏｎｓｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．４（２００６）１２５２−１２６０］。使用したプライマーは、ＬＩＣ適合性延長部（下線部）を含有し、フォワードＣＡＧＧＧＡＣＣＣＧＧＴＧＧＧＣＡＴＴＴＡＣＴＴＧＧＡＡＡＴＣ及びリバースＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＧＧＴＴＡＡＴＣＧＴＣＴＴＣＡＡＴＡＴＴＡＧＣとした。ＫｐｎＩ消化ベクター及び生成されたＰＣＲ産物をゲルから精製し、続いてｄＡＴＰ及びｄＴＴＰそれぞれの存在下でＴ４  ＤＮＡポリメラーゼで処理した。２つの反応生成物を１：４のモル比で共に混合し、該混合物を用いてケミカルコンピテントな大腸菌ＤＨ５α細胞（Ｐｈａｂａｇｅｎ）を形質転換し、ｐＥＴ１５ｂ／ｇｔｆＢ−ΔＮを得た。このベクターは、３Ｃプロテアーゼにより切断可能なＮ末端Ｈｉｓ６−タグと融合したＧｔｆＢ−ΔＮ（アミノ酸４１７〜１２８１）をコードする。構築された発現ベクターｐＥＴ１５ｂ／ｇｔｆＢ−ΔＮをヌクレオチドシーケンシング（ＧＡＴＣ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により検証し、大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）に形質転換した。
【００５６】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢタンパク質の発現及び精製
アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を添加した新鮮なＬｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ培地に、ｐＥＴ１５ｂ／ｇｔｆＢ−ΔＮプラスミドを有する大腸菌ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（ＤＥ３）の一晩培養物の１％（ｖ／ｖ−１）を接種し、３７℃及び１６０ｒｐｍで培養した。イソプロピル−β−ｄ−１−チオガラクトピラノシドを０．１ｍＭまで添加し、０．７のＯＤ６００でタンパク質発現を誘導し、１６℃で２０時間培養を続けた。遠心分離により細胞を回収した（１０，０００×ｇ、２０分）。ＧｔｆＢ−ΔＮ酵素を、既報のように［Ｇａｎｇｏｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １８６０（２０１６）１２２４−１２３６］、Ｎｉ２＋−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）アフィニティークロマトグラフィー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）により精製した。純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって評価し、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００分光光度計（Ｉｓｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｄｅ  Ｍｅｅｒｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによりタンパク質濃度を測定した。
【００５７】
酵素活性のアッセイ
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮ酵素の初期の総活性を、先に記載のとおり［１９，２９］、０．１２５％（ｗ／ｖ）Ｖ型アミロース（ＡＶＥＢＥ，Ｆｏｘｈｏｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用したアミロース−ヨウ素染色法により測定した。酵素アッセイは、２５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）及び１ｍＭのＣａＣｌ２中２μｇ／ｍＬの酵素で慣習的に実施した。トランスグリコシル化及び／又は加水分解活性によるα−グルカン−ヨウ素複合体の吸光度の減少を、４０℃で８分間、６６０ｎｍでモニターした。活性は、１分当たり１ｍｇの基質を変換する酵素の量を１単位として定義した。ｐＨプロファイル及び最適ｐＨは、ｐＨを３．０〜１０．０に変化させて４０℃で測定した。ナトリウムシトレート緩衝液（２５ｍＭ）はｐＨ３．０〜７．０で、ナトリウムホスフェート緩衝液（２５ｍＭ）はｐＨ７．０〜８．０で、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（２５ｍＭ）はｐＨ８．０〜９．０で、及びナトリウムバイカーボネート（２５ｍＭ）はｐＨ９．０〜１０．０で使用した。
【００５８】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素の基質特異性
４０μｇ／ｍＬの精製酵素を２５ｍＭのスクロース（Ａｃｒｏｓ）、ニゲロース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、パノース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、イソマルトース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、イソマルトトリオース（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、イソマルトペンタオース（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ）、２〜７の重合度（ＤＰ）を有するマルトオリゴ糖（ＭＯＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、又は０．６％（ｗ／ｖ）Ｖ型アミロース（ＡＶＥＢＥ，Ｆｏｘｈｏｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、ジャガイモデンプン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）若しくはアミロペクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）のいずれかとインキュベートして、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素の基質特異性を調べた。ジャガイモデンプンをオートクレーブでα化した（１５分，１２０℃）。Ｖ型アミロース（１％、ｗ／ｖ）を水酸化ナトリウム（１Ｍ）で原液として調製した。使用前に、原液を７ＭのＨＣｌで中和し、０．８５％（ｗ／ｖ）の濃度に希釈した。１ｍＭのＣａＣｌ２を含む２５ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．５）で３７℃で２４時間インキュベートを行った。試料を１００℃まで８分間加熱することにより反応を停止させた。反応の進行を、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）及び／又は高性能アニオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）によって分析した。
【００５９】
パルス電流測定検出分析と組み合わせた、薄層クロマトグラフィー及び高性能アニオン交換クロマトグラフィー
炭水化物試料を、ＴＬＣシリカゲル６０Ｆ２５４シート（Ｍｅｒｃｋ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上の１ｃｍ線にスポットした。ＴＬＣプレートを、ブタノール：酢酸：水（２：１：１、ｖ／ｖ）中で６時間展開し、生成物をオルシノール／硫酸染色で可視化した。グルコース及びマルトオリゴ糖（ＤＰ２〜ＤＰ７）の混合物を標準として使用した。
【００６０】
ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤ分析は、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ−１カラム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；２５０×２ｍｍ）及びＩＣＳ３０００電気化学的検出モジュールを備えたＩＣＳ３０００ワークステーション（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を使用して実施した。分析前に、炭水化物試料をＤＭＳＯで１：３００に希釈し、１００ｍＭのＮａＯＨ中の酢酸ナトリウム勾配（１０〜２４０ｍＭ）を５７分にわたって使用することにより０．２５ｍＬ／分の流速でオリゴ糖を分離した。各試料の注入量は５μＬであった。ピークは、市販のオリゴ糖標準及び２〜３０ＤＰのＭＯＳの混合物を使用して同定した。
【００６１】
ＨＰＳＥＣ解析
生成物混合物の分子量分布は、先に記載のとおり［２０，２９］、多角度レーザー光散乱検出器（ＳＬＤ  ７０００  ＰＳＳ，Ｍａｉｎｚ）、粘度計（ＥＴＡ−２０１０  ＰＳＳ，Ｍａｉｎｚ）、及び示差屈折率検出器（Ｇ１３６２Ａ  １２６０  ＲＩＤ  Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を備えたサイズ排除クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  １２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ）を使用して決定した。簡潔に述べると、試料をＤＭＳＯ−ＬｉＢｒ（０．０５Ｍ）中４ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解し、ＰＦＧガードカラムに結合した１００、３００及び４０００Åの多孔性を有する３つのＰＦＧ−ＳＥＣカラムを使用して分離を実施した。ＤＭＳＯ−ＬｉＢｒ（０．０５Ｍ）を溶離液とし、流速は０．５ｍＬ／分とした。３４２〜８０５，０００ＤａまでのＭｗの標準プルランキット（ＰＳＳ、マインツ、ドイツ）を用い、システムの較正及びバリデーションを行った。特定のＲＩ増分値（ｄｎ／ｄｃ）もＰＳＳによって測定したところ、０．０７２ｍＬ／ｇであった（ＰＳＳによる個別連絡（ｐｒｉｖａｔｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ））。多角度レーザー光散乱シグナルを使用して、Ｖ型アミロース、並びにＡ．クロオコッカム及びＰ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤ酵素により生成される高分子量（ＨＭＭ）多糖類の分子量を求めた。これらの多糖類のｄｎ／ｄｃ値は、プルランと同じであると考えられた。Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ、及びＰ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤ低分子量（ＬＭＭ）ポリマーの分子量を、ユニバーサルキャリブレーション法によって求めた。測定は二度行った。
【００６２】
Ｖ型アミロースとＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢとのインキュベートによる生成物の生成、単離、及び構造分析
Ｖ型アミロース（０．６％ｗ／ｖ）及びＧｔｆＢ−ΔＮ（０．２ｍｇ）のインキュベートを、「Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ  ＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ」に記載の条件下で実施した。３７℃で２４時間インキュベート後、１０分間１００℃まで移すことによって反応を停止させた。多糖類は、Ｂｉｏｇｅｌ  Ｐ２カラム（２．５×５０ｃｍ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）でのサイズ排除クロマトグラフィーで、１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３を溶離液とし、４８ｍＬ／ｈの流速で使用して、生成物混合物に一緒に存在する微量の小さなオリゴ糖（ＤＰ＜５）から単離した。
【００６３】
ＮＭＲ分光法
分解能向上１Ｄ／２Ｄ１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは、プローブ温度２９８Ｋで、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ−５００分光計（ＮＭＲ  ｃｅｎｔｅｒ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）でＤ２Ｏ中で記録された。試料をＤ２Ｏ中で２回交換し（９９．９  ａｔ％  Ｄ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＭＡ）途中で凍結乾燥させて、次いで０．６ｍＬのＤ２Ｏ中で溶解した。ＨＯＤシグナルを抑制するためにＷＥＴ１Ｄパルスを用いて、４０００Ｈｚのスペクトル幅及び１６ｋの複素数ポイントで、一次元５００ＭＨｚ１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを記録した。二次元１Ｈ−１Ｈスペクトル（ＣＯＳＹ、ＴＯＣＳＹ  ＭＬＥＶ１７  ３０、５０、及び１５０ｍｓ、及びＲＯＥＳＹ  ３００ｍｓ）を４０００Ｈｚのスペクトル幅で記録し、２００の増分を収集した。ＴＯＣＳＹスペクトルの場合、２０００の複素数データポイントが収集され、ＣＯＳＹ及びＲＯＥＳＹスペクトルについては４０００の複素数データポイントが使用された。２Ｄ１３Ｃ−１Ｈ  ＮＭＲスペクトルを、ｔ２で４０００Ｈｚ、及びｔ１で１００００Ｈｚのスペクトル幅を有する２０００の複素数ポイントの１２８増分で記録した。データは、ＭｅｓｔＲｅＮｏｖａ  ５．３（Ｍｅｓｔｒｅｌａｂｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＳＬ，Ｓａｎｔｉａｇｏ  ｄｅ  Ｃｏｍｐｏｓｔｅｌｌａ，Ｓｐａｉｎ）を使用して処理した。手動位相補正及びＷｈｉｔｔａｃｋｅｒのより滑らかなベースライン補正を全てのスペクトルに適用した。化学シフト（δ）は、内部アセトンを基準としてｐｐｍで表される（１Ｈの場合δ２．２２５、１３Ｃの場合δ３１．０８）。
【００６４】
メチル化分析
先に記載のとおり、多糖試料（約５ｍｇ）をＤＭＳＯ中ＣＨ３Ｉ及び固体ＮａＯＨを用いて完全メチル化した［Ｓ．Ｓ．ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３４３（２００８）１２３７−１２５０］。２Ｍのトリフルオロ酢酸（２時間、１２０℃）で加水分解後、生成した部分メチル化単糖類をＮａＢＤ４で還元し（２時間、室温、水溶液）、該溶液を酢酸で中和した。続いて、メタノールと一緒に蒸発にさせてホウ酸を除去した。得られた部分メチル化アルジトールを、１２０℃でピリジン：無水酢酸（１：１  ｖ／ｖ）を用いて完全アセチル化し、部分メチル化アルジトールアセテートの混合物を得、これを記載のＧＬＣ−ＥＩ−ＭＳにより分析した。
【００６５】
α−アミラーゼ、デキストラナーゼ、及びプルラナーゼによる酵素処理
α−グルカン試料（５ｍｇ）を５００μＬの酢酸ナトリウム緩衝液（５０ｍＭ  ｐＨ５．０）に溶解し、過剰量のα−アミラーゼ（アスペルギルス・オリゼ；Ｍｅｇａｚｙｍｅ）、デキストラナーゼ（ケトミウム・エラティカム；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びプルラナーゼＭ１（クレブシエラ・プランティコラ；Ｍｅｇａｚｙｍｅ）と３７℃で別々にインキュベートした。４８時間後、加水分解度を、ＴＬＣ及び／又はＨＰＡＥＣによって評価した。デンプン、デキストラン、及びプルランを、それぞれα−アミラーゼ、デキストラナーゼ、及びプルラナーゼ処理の陽性対照として使用し、これらの条件下で完全に加水分解された生成物を得た。
【００６６】
ＧｔｆＢ処理小麦粉の特性評価：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化
精製した小麦粉の試料を異なる量のＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素で処理し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を使用して消化率を評価した。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
１４３ｍｇのα化精製小麦粉を５０ｍＬのファルコンチューブに入れ、所要量のミリＱ水を添加することによって試料を調製した（表を参照されたい）。均質化するまでボルテックス混合し、磁石で撹拌した（ほぼ３０分）。３３３μＬの５０ｍＭのＣａＣｌ２溶液を添加した。チューブを、６０ｒｐｍのローラーミキサーで４５ｒｐｍのオーブン中３７℃で平衡化した。所要量の酵素を添加し、２４時間インキュベートした。チューブを沸騰水に６分間入れて酵素を不活性化した。該溶液を凍結乾燥した。１０００ｍＬのメスフラスコ内で、０．２６ｇのＫＨ２ＰＯ４、１．４４ｇのＮａ２ＨＰＯ４＊２Ｈ２Ｏ、及び８．７１ｇのＮａＣｌを８００ｍＬのｍＱ  Ｈ２Ｏで溶解することにより、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（１０ｍＭ）を調製した。ｐＨをＨＣｌ（１Ｍ）で６．９に調整し、ｍＱ  Ｈ２Ｏで標線に合わせた。
【００６９】
１００ｍｇ／ｍＬの酵素の調製のために、１．５ｇのパンクレアチン（Ｐ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）又はラット腸パウダー（ＲＩＰ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を、遠心分離チューブ内で１５ｍＬのＰＢＳ（１０ｍＭ）と混合した。溶液をボルテックスし、氷上で７分間超音波処理した。チューブを、４℃で３０分間１０’０００×ｇで遠心分離した。上清をプラスチックボトルに移した。
【００７０】
試料及び参照は、ＰＢＳ緩衝液中の全グルコースの１％（ｗ／Ｖ）を含有した。消化開始前に２時間、磁気撹拌した。各時間（０、１５、３０、６０、１２０、及び１８０分）について、１組の５ｍＬのエッペンドルフを、ブランク用に１つ、参照用に１つ、そして各試料について１つ準備した。ブランクはＰＢＳ緩衝液のみを含有した。参照は精製小麦粉をα化し、試料と同じ方法で処理した。各時間セットについて、所要の溶液３００μＬ（Ｖ試料）を５ｍＬのエッペンドルフチューブ（ＰＢＳ、参照又は試料）に添加した。パンクレアチン及びＲＩＰ溶液を、水浴中３７℃で５分間平衡化し、その時間セットの５ｍＬのエッペンドルフを、熱ミキサーにおいて３７℃で平衡化した。２００Ｕ／ｍｇのパンクレアチン（Ｖｐ）（Ｕ所要量＝６００Ｕ）及び１００Ｕ／ｍｇ（Ｕ所要量＝３００Ｕ）のＲＩＰを各チューブに加えた。１Ｕは、１分当たりに１μｍｏｌのグルコースを放出するタンパク質量に相当する。チューブを混合し（１０００ｒｐｍ）、対応する時間（１５、３０、６０、１２０、及び１８０分間）にわたって３７℃、４５０ｒｐｍでインキュベートした。インキュベーション後、試料の５００μＬアリコートを、２ｍＬのエッペンドルフチューブ中、１．５ｍＬのエタノール（ＥｔＯＨ）に添加したものを事前に準備し、４℃で保存した。チューブを１０’０００×ｇで１０分間遠心分離した。時間０では、酵素を１０ｍＭのＰＢＳで置き換え、５００μＬアリコートを１．５ｍＬのＥｔＯＨに移して、他の点に関しては同じ条件下で遠心分離した。
【００７１】
０、０．１２５、０．２５、０．５、０．７５、１．０、１．５及び２．０ｍｇ／ｍＬのグルコース標準を使用して、Ｗａｋｏグルコースキットで遊離型グルコースを測定した。グルコース放出の合計（合計［Ｇ１］）は、式１のように決定され、式中、ａ及びｂは標準曲線の勾配及び切片であり、［Ｇ１］ブランクは、ＰＢＳ緩衝液のみを有するブランク試料であり、Ｆ希釈は希釈係数である。グルコース放出率は、グルコース放出の合計を試料中のグルコースの質量（ｍＧ１合計）で除算し、１００を乗じたもの（式２）に相当する。
【００７２】
【数１】
2020510441.tif 000003
【００７３】
結果及び考察
ＮＣＣゲノムデータベース内の新規デンプン活性ＧＨ７０酵素の同定
ＮＣＣゲノムデータベースを新規なＧｔｆＢ様酵素についてスクリーニングした。ＧｔｆＢ酵素のうち同定されたのはＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６８、Ｌ．デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６、及びＬ．ファーメンタムＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８（同時係属出願欧州特許出願公開第１６１７２６０６．２号に記載されている４，３−α−ＧＴａｓｅ）であった。これらのＧｔｆＢタンパク質の保存モチーフＩ〜ＩＶを詳細に分析した（図１）。ＮＣＣで同定されたＧｔｆＢ酵素のモチーフＩ〜ＩＶは、以前に特性評価された４，６−α−ＧＴａｓｅに対応するものと明らかな類似性を示し、容易に同定された。ＧｔｆＢ配列中のこれらの保存領域Ｉ〜ＩＶの順序は、ＩＩ−ＩＩＩ−ＩＶ−Ｉであり、それらの循環式に順序の変えられたドメイン構成を反映する。これらのＧＨ７０モチーフ間で保存された、触媒残基（Ｄ１０１５、Ｅ１０５３、Ｄ１１２５；Ｌ．ロイテリ１２１  ＧｔｆＢの残基番号）及びサブサイト−１の形成に関与する残基（Ｒ１０１３、Ｈ１１２４、Ｄ１４７９）を含む、６つの残基は、全て同定されたＧｔｆＢタンパク質配列に見出された。
【００７４】
モチーフＩＩＩ及びＩＶにおける他の機能上重要な位置に関して、配列に特有の特徴は、グルカンスクラーゼにおいてアクセプター基質とのスタッキング相互作用を形成するモチーフＩＩＩのＷ１０６５（Ｌ．ロイテリ１８０Ｇｔｆ１８０の残基番号）残基の、ＧｔｆＢ型酵素中のチロシンによる置換である。興味深いことに、Ｔｙｒ残基はまたＬ．ファーメンタムＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８ＧｔｆＢ  ４，３−α−ＧＴａｓｅ中にも存在し、ＧｔｆＣ及びＧｔｆＤサブファミリー全体にわたっても厳密に保存される。したがって、この研究では、この「配列フィンガープリント」は、デンプンに対し活性なこれらのＧＨ７０酵素のみを選択する基準として使用された。第２に、モチーフＩＶでは、以前に特性評価されたＧｔｆＢ  ４，６−α−ＧＴａｓｅは、遷移状態安定領域の下流に不変モチーフＱＲＫを有する（図１に示されるアラインメントは、１つのアミノ酸ギャップを予測することに留意されたい）一方で、ＧＳ及び前述のＧＴＦＢ  ３，４  α−ＧＴａｓｅは、この領域における変異を示す。構造データと組み合わせた以前の変異研究により、この領域、より具体的には、残基１１３７及び１１４０（Ｌ．ロイテリ１８０Ｇｔｆ１８０  ＧＳにおける遷移状態安定領域の下流の第１及び第４の残基）が、ＧＳにおけるグリコシド結合特異性に寄与することが明らかになった。ロイテラン様ポリマーを合成するＧｔｆＤ  ４，６−α−ＧＴａｓｅ酵素の場合、１１３７位のＧｌｎ残基も保存される一方、１１４０位のＬｙｓ残基はＨｉｓにより置換され、この新規な生成物特異性の定義が提供される。これらの違いとは対照的に、ＧｔｆＢ  ４，６−α−ＧＴａｓｅ及びＧＳは、この位置にＨｉｓ残基を含有するＧｔｆＣ及びＧｔｆＤ酵素とは異なる、モチーフＩＩのサブサイト＋１  Ａｓｎ残基（Ｌ．ロイテリ  ＧｆＢのＮ１０１９）において高い保存性を共有する。このサブサイト＋１  Ａｓｎ残基は、Ｇｔｆ１８０  ＧＳの活性及び結合特異性にとって重要である。
【００７５】
興味深いことに、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６７、Ｓ．サーモフィルスＣＮＣＭ  Ｉ−５１６８、及びＬ．デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６のＧｔｆＢタンパク質配列は、基質結合部位を形成するモチーフＩＩ及びＩＶの残基の一部に違いを示す。ＧｔｆＣ及びＧｔｆＤ酵素と同様に、サブサイト＋１  Ａｓｎ残基（Ｌ．ロイテリＧｔｆ１８０  ＧＳ中のＮ１０２９）は、これら５つのＧｔｆＢタンパク質においてＨｉｓにより置換される。Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５１及びＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２のＧｔｆＢタンパク質の場合、推定遷移状態安定領域に続く１１３７位及び１１４０位（Ｇｔｆ１８０  Ｌ．ロイテリ１８０の残基番号）のアミノ酸は、ほとんどのＧｔｆＢ及びＧｔｆＣ様４，６−α−ＧＴａｓｅに典型的に見られるＧｌｎ及びＬｙｓ残基ではなくＳｅｒ及びＡｌａである。Ｌ．デルブルエッキ亜種デルブルエッキＣＮＣＭ  Ｉ−５１６６のＧｔｆＢタンパク質の場合、推定遷移状態安定領域（Ｇｔｆ１８０  Ｌ．ロイテリ１８０の残基番号）に続く１１４０位のアミノ酸もまたＡｌａである。Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢと高い同一性を共有するが、４，３−α−ＧＴａｓｅ活性を示すＬ．ファーメンタムＣＮＣＭ  Ｉ−５０６８ＧｔｆＢもまた、残基１０２９、１１３７、及び１１４０に独特の変異を含み、このことは、これらがＧｔｆＢ酵素における生成物特異性のための「ホットスポット」であることを裏付けていることは注目に値する。
【００７６】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２のＧｔｆＢ酵素のアミノ酸配列分析及び構造モデリング
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ゲノムは、１４５ｋＤａの理論分子量を有するＧＨ７０酵素をコードする単一遺伝子を含有する。他のＧＨ７０ファミリータンパク質について報告されているように、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２  ＧＨ７０酵素は、細胞外タンパク質として機能すると予測される。アミノ酸配列の、生化学的に特性評価されたＧＨ７０酵素とのアラインメントは、Ｌ．ファーメンタムＧｔｆＢ  ４，３−α−ＧＴａｓｅと最も高い配列同一性を示す（８３％同一性）。Ｌ．ロイテリ１２１、ラクトバチルス・ロイテリＭＬ１、及びラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ  ２００１６の特性評価されたＧｔｆＢ  ４，６−α−ＧＴａｓｅ酵素はまた、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２  ＧＨ７０酵素と著しいアミノ酸同一性を共有し（７６％、７５％、及び６６％の同一性）、このことは、このタンパク質がＧＨ７０酵素のＧｔｆＢサブファミリーに属することを更に示す。
【００７７】
得られたＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２  ＧＨ７０酵素の３Ｄモデル（図２）は、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ−ΔＮΔＶ  ４，６−α−ＧＴａｓｅ結晶構造に基づいて［Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１６）］、ドメインＡ、Ｂ、Ｃ、及びＩＶを含み、これは、２つの酵素間の高い配列類似性（これらのドメインに対して７９％の同一性）を反映する。同一の「Ｕ倍」ドメイン組織が、ドメインＡ中の循環置換された触媒（β／α）８バレル（ＧＳ及びＧｔｆＢ型の酵素の特徴）と共に観察される。配列比較により、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ酵素のようなＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２  ＧＨ７０酵素もまた、Ｎ末端可変ドメイン（残基１〜４４６）を有し、Ｃ末端可変ドメインを欠いていることが明らかになった。触媒ドメイン（Ａ）において、活性中心における触媒残基の空間的配置は、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ−ΔＮΔＶの空間配列と類似している。一方、２つの酵素の基質結合部位間で顕著な構造的差異が観察された。最も重要なことに、Ｌ．ロイテリ１２１酵素は、１３残基のループＡ１及び２０残基のループＢによって形成された活性部位を越えて延在するトンネルを特徴とするが、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２  ＧＨ７０酵素中の対応するループは、たったの６及び４残基長である（それぞれ、８０２〜８０７及び５９０〜５９３、図２）。結果として、これらのループは、トンネルを覆うドナー基質結合部位を形成せず、α−アミラーゼのように結合溝を完全にアクセス可能なものにする。マルトペンタオース結合Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ−ΔＮΔＶ構造との位置の重なりは、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２  ＧＨ７０酵素の非常に類似したループＡ２内の残基が結合基質と相互作用する可能性があり、ループＢの残基Ｙ５９２も同様であり得ることを示す（図２）。また、サブサイト−６のチロシン残基（Ｙ１１７７，Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ酵素のＹ１５２１に対応する）は、芳香族スタッキング相互作用をもたらすために保存される（図示せず）。他の顕著な違いは、４，６−α−ＧＴａｓｅ中に存在するアスパラギン（Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢのＮ１０１９）を置換するモチーフＩＩ中のヒスチジン残基（Ｈ６８３）、及びモチーフＩＶの遷移状態安定領域に続く３つの残基（ＱＲＫを置換するＳＲＡ）の存在である。一方、サブサイト＋１付近のチロシン残基（Ｙ７１９，モチーフＩＩＩ）は、４，６−α−ＧＴａｓｅで保存されている。これらのモチーフの残基は、ＧＨ７０酵素の生成物特異性に寄与することが知られている。Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２  ＧＨ７０酵素の３Ｄモデルの活性部位の構造においてこれらの構造的差異が観察されたことから、本発明者らはこの酵素の反応及び生成物特異性の研究を進めた。
【００７８】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２  ＧＨ７０酵素の精製及び生化学的特性。
これまでの研究では、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢのＮ末端可変領域の切断は、酵素触媒特性に影響を与えなかったものの、タンパク質発現を促進したことを示した［Ｙ．Ｂａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．８１（２０１５）７２２３−７２３２］。したがって、ＧｔｆＢ酵素をコードするＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２遺伝子をクローン化し、Ｎ末端可変領域を持たない大腸菌（ＤＥ３）ＢＬ２１  Ｓｔａｒで発現させた（アミノ酸４１７〜１２８１）。使用条件下で、可溶性画分において高レベルのタンパク質発現を観察し、Ｈｉｓタグ親和性精製後、培養液１リットル当たり合計約５０ｍｇの純粋タンパク質を得た。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、約１００ｋＤａの見かけの分子量（これは、アミノ酸配列から推定される予想分子量（９８ｋＤａ）に合致する）を有する単一のタンパク質バンドが示される。
【００７９】
精製したＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２  ＧＨ７０酵素は、スクロースには不活性であったが、マルトデキストリン／デンプンには活性であり、ＧｔｆＢ−ΔＮ酵素として同一性が確認された。以降の反応について最良の条件を決定するために、Ｖ型アミロースを基質として使用して、酵素活性に対するｐＨの影響を決定した。このＧｔｆＢ−ΔＮ酵素は、ｐＨ５．５で最大活性を示したが、広いｐＨ耐性を示し、ｐＨ４〜９にわたって、この活性の８０％超を保持した。このｐＨプロファイルは、他のＧｔｆＢ酵素についての、塩基性ｐＨ値で著しく低い活性を示したという報告と著しく異なる。４０℃で１ｍＭのＣａＣｌ２を含有する２５ｍＭのシトレートホスフェート緩衝液（ｐＨ５．５）中の０．１２５％（ｗ／ｖ）アミロースに対する精製Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮの比活性値の合計は、２４±０．６Ｕ／ｍｇであった。この値は、Ｌ．ファーメンタムＧｔｆＢ−ΔＮ  ４，３−α−ＧＴａｓｅ（２２Ｕ／ｍｇ）について報告されているものと同様であるが、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ  ４，６−α−ＧＴａｓｅについて測定したもの、すなわち２．８Ｕ／ｍｇ（４０℃並びにそれぞれｐＨ５．５及び５．０）よりも著しく高い。
【００８０】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素の基質及び生成物特異性
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮを、異なる炭水化物基質と３７℃で２４時間インキュベートし、その活性をＬ．ロイテリ１２１  ４，６−α−ＧＴａｓｅＧｔｆＢの活性と比較した。ＴＬＣによって示されるように（図３）、ＧｔｆＢ酵素は両方とも、より短鎖及びより長鎖のオリゴ糖生成物の形成から明らかであるように、ＤＰ４〜ＤＰ７を有するＭＯＳに対する加水分解及びトランスグリコシラーゼ（不均化）活性を示した。両方の酵素はまた、ＭＯＳからポリマー材料も蓄積した。Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮの場合、マルトペンタオース（ＤＰ５）及びより長いＭＯＳ基質を使用したときにポリマーの蓄積が検出されたが、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢは、マルトテトラオース（ＤＰ４）からでもポリマーを形成した。Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢの場合、異なるＭＯＳ基質からグルコースが明らかに蓄積されることに留意されたい。代わりに、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮは、マルトース及びいくつかの低分子量オリゴ糖を蓄積するが、そのヒドロラーゼ／トランスグリコシダーゼ活性の副生成物としてのグルコースは生成しない。この観察は、これらの２つのＧｔｆＢ酵素が、それらの作用様式において異なることを示唆している。Ｖ型アミロース、ジャガイモデンプン、及びアミロペクチンをＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮ酵素とインキュベートすると、ＴＬＣでは明瞭に検出することはできなかったものの、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢと同様に、この酵素がこれらのポリマー基質に対しても活性であることを示すいくつかの低分子量生成物が出現した。Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素は、ＤＰ２、ＤＰ３、及びＤＰ５を有するスクロース、パノース、ニゲロース、プルラン、デキストラン、及びイソマルトオリゴ糖に対して不活性であった（データ非掲載）。
【００８１】
より詳細にＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮの生成物特異性を研究するために、Ｖ型アミロースから合成された生成物を一次元１Ｈ  ＮＭＲ分光法により分析した。図４Ａに示すように、この１Ｈ  ＮＭＲ分析により、（α１→４）結合（δ約５．４０〜５．３５）及び（α１→６）結合（δ約４．９７）を示す２つの幅広いアノマーシグナルの存在が明らかとなり、したがって、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮが４，６−α−ＧＴａｓｅとしても作用することが明らかとなった。遊離型グルコース単位（ＧαＨ−１，δ５．２２５；ＧβＨ−１，δ４．６３７）及び４−置換還元末端グルコース残基（ＲαＨ−１，δ５．２２５；ＲβＨ−１，δ４．６５２）に対応する小さなシグナルも同様に検出され、微量のグルコース、マルトース、及び他の小オリゴ糖もまたこの生成物混合物中に存在していたことを示した。この１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは、（α１→４）アノマー領域に強く重なる余分なシグナルの存在によって示されるようにＡ．クロオコッカムＧｔｆＤ及びＰ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤによって合成されたロイテラン様ポリマーのものと非常に類似していた（図４Ａ）。これらのシグナルは、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢによって生成されるＩＭＭＰのＮＭＲスペクトルには存在しないことに留意されたい（図４Ａ）。
【００８２】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮのアミロース由来生成物を、多重検出を用いてＨＰＳＥＣにより分析した。元のＶ型アミロース基質のＨＰＳＥＣプロファイルは、２００×１０３Ｄａの平均Ｍｗで約２１ｍＬで溶出する単一ピークからなる。図４Ｂに示すように、Ｖ型アミロースに対するＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮの作用により、マルトースに対応する小さなショルダーピークと共に、７×１０３Ｄａの平均Ｍｗを有する低分子量のα−グルカンに対応する、より高い溶出体積（約２９ｍＬ）でのピークの形成が得られた。このＨＰＳＥＣプロファイルは、Ｖ型アミロースからより高分子量のポリマーを生成する他の４，６−α−ＧＴａｓｅについて報告されたもの［欧州特許第２４２７５６５号、ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７１４７４］とは著しく異なる。例えば、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮによって生成されるα−グルカンのＭｗ値は、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢのＩＭＭＰ生成物の半分である（１５×１０３Ｄａ）。一方、１３×１０６Ｄａの平均Ｍｗを有するＡ．クロオコッカムＧｔｆＤによって合成されるＨＭＭ多糖類よりもはるかに小さい。Ｌ．ロイテリＮＣＣ２６１３ＧｔｆＢ−ΔＮ生成物プロファイルはまた、ＨＭＭ（２７×１０６Ｄａ）及びＬＭＭ（１９×１０３Ｄａ）ポリマーの両方を含有する二峰性ポリマー分布を示したＰ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤのものとも異なる（図４Ｂ）。
【００８３】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮ  ＬＭＭ多糖類の構造特性
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮ  ＬＭＭ多糖類の構造特性を更に調査するために、アミロース由来の反応混合物をＢｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２サイズ排除クロマトグラフィーにかけた。この多糖類の１Ｄ  ＮＭＲ分析は、結合比（α１→４）：（α１→６）＝７５：２５を示した。連続した（α１→６）結合に対応する典型的な化学シフト値は、このＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮポリマーの２Ｄ  ＮＭＲスペクトルにおいて同定されなかった（図５）。メチル化分析により、モル百分率１５、５９、１０、及び１６％での末端、４−置換、６−置換、及び４，６−二置換のグルコピラノース残基の存在が明らかとなった。これは、１Ｈ  ＮＭＲによって求められる結合比と一致している。総合すると、これらのデータは、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮが、ＧｔｆＤ型の酵素と同様にロイテラン様α−グルカンを合成することを裏付け、ＧｔｆＢ様ＧＨ７０サブファミリー内のこの生成物特異性についての第１の証拠となる。異なるアミロース由来のロイテラン型のポリマーの構造特性については表１に要約する。サイズ及び（α１→４）：（α１→６）結合比に関しては、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮによって合成されたα−グルカンは、ほとんどがＬＭＭ  Ｐ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤポリマーに似ているが、６−置換グルコピラノシル単位の量の増加によって示されるように（すなわち、５％ではなく１０％）、交互の（α１→４）／（α１→６）グリコシド結合がより多量に含まれる。
【００８４】
【表２】
2020510441.tif 000004
【００８５】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮにより時間内にマルトヘプタオースから形成されるオリゴ糖
Ｌ．ロイテリＮＣＣ  ２６２３ＧｔｆＢ−ΔＮロイテラン様生成物の形成について理解を深めるために、時間内にマルトヘプタオースから形成されたオリゴ糖をＨＰＡＥＣにより分析した（図６）。Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮは、反応の初期段階で、マルトヘプタオース（マルトヘキサオース及びマルトペンタオースがわずかに混入した）から主な加水分解生成物としてマルトース、マルトトリオース及びマルトペンタオースを放出した。これらの第１の明らかな加水分解生成物と共に、マルトオクタオース標準（溶出時間＝４５．７分）よりも速い溶出時間にて、トランスグリコシル化活性により生じる生成物と共に多くのピークが溶出した。２４時間の反応後、マルトヘプタオース基質は完全に枯渇した一方、低ＤＰのいくつかのＭＯＳ及び未知の構造のオリゴ糖は反応混合物中に残った。注目すべきことに、２４時間の反応中に検出されたグルコースは微量であった。主な加水分解生成物としてのマルトース及びマルトトリオースの形成は、８より高いＤＰを有するオリゴ糖に対応するピークの出現と合わせて、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素が、異なるＤＰのＭＯＳを別のグルカン鎖に優先的に転移させて（グルコースの代わりに）、ロイテラン様ポリマーを形成することを示唆する。この重合機序は、反応サイクル毎に単一のグルコシル単位のみを転移させるＧＳについて観察されたものとは異なる。むしろ、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮの作用様式は、同様にロイテラン型ポリマーを生成するＧｔｆＤ  ４，６−α−ＧＴａｓｅに類似している［ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７１４７４］。同様に、Ｌ．ファーメンタムＧｔｆＢ  ４，３−α−ＧＴａｓｅは、異なるＤＰのＭＯＳを転移させることにより、アミロースを交互の（α１→３）／（α１→４）結合及び（α１→３，４）分岐点を含有するポリマーに変換する［同時係属出願欧州特許出願公開第１６１７２６０６．２号］。ＧＳでは活性部位がサブサイト−１を超えて遮断されるのに対し、デンプンに活性をもつＧＨ７０酵素は、２つ以上のドナー基質結合部位を有し、デンプンから生じるＭＯＳ単位の連続的な転移による伸長プロセスの開始を可能にするものと考えられる。
【００８６】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮアクセプター基質反応の研究
マルトース及びイソマルトースをアクセプター基質と、これらの存在下又は非存在下で酵素を２４時間インキュベートし、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮ酵素及びＬ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢのアクセプター基質特異性を比較した。図７Ａに示すように、マルトースは、ドナー基質としてのＶ型アミロースの存在下でＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮのアクセプター基質としての機能を果たすことができ、その結果、パノース、マルトトリオース、マルトテトラオース、及びマルトペンタオース、並びに相当量の他の未確認のオリゴ糖を形成する。Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢは、異なる生成物分布を示したが、この酵素は、マルトースをアクセプター基質として使用することも可能であり、連続した（α１→６）結合及び増加した重合度を有する一連の伸長生成物と共に、パノース、マルトトリオース、及びマルトテトラオースを生じる（図７Ｂ）。これらの結果は、ＧｔｆＢ酵素の両方が、マルトースを伸長させて新たな（α１→４）又は（α１→６）結合のいずれかを形成することができることを示唆する。イソマルトースとのアクセプター反応は、これらのＧｔｆＢ酵素の異なる作用様式をより明確に反映した。Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ酵素は、相当量のイソマルトトリオース、イソマルトテトラオース、及びイソマルトペンタオース（連続した（α１→６）結合によるイソマルトースの伸長から得られる）の検出によって示されるように、アクセプター基質としてはマルトースよりもイソマルトースの方が明らかに好ましい。対照的に、Ｖ型アミロースを、イソマルトースの存在下又は非存在下でＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮとインキュベートしたときには、オリゴ糖形成において有意な変化は観察されなかった。したがって、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢは、α１→６結合した非還元末端を有するオリゴ糖を優先的に伸長するが、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮは、Ａ．クロオコッカムＧｔｆＤと同様に、アクセプター基質としてイソマルトースを認識することができない［ＰＣＴ／ＥＰ２０１６／０７１４７４］。これらの観察と一致して、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮ及びＬ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ生成物は、それぞれ、それらの構造における連続した（α１→６）結合の非存在又は存在によって異なる。
【００８７】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮロイテラン様多糖類の酵素的加水分解
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮにより生成されたα−グルカンのロイテラン様構造を、このα−グルカンを過剰量の異なる加水分解酵素、α−アミラーゼ、デキストラナーゼ、及びプルラナーゼで処理することによって更に確認した。比較のため、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢ  ４，６−α−ＧＴａｓｅにより合成されたＩＭＭＰ、並びにＡ．クロオコッカム及びＰ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤ  ４，６−α−ＧＴａｓｅにより生産されたロイテラン様ポリマーを、同じ酵素処理に並行して供した。図８に示すように、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮポリマーは、α−アミラーゼのエンド−（１→４）ヒドロラーゼ活性に対して非常に耐性があった。アミロース対照は完全に分解されたのに対し、このポリマーをα−アミラーゼとインキュベートしたときには極微量のＨＭＭオリゴ糖及びマルトースが形成された。同様の加水分解パターンは、Ａ．クロオコッカム及びＰ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤ  ４，６−α−ＧＴａｓｅによって合成されたロイテラン様ポリマーでも得られたが、ＩＭＭＰ消化の場合にはこれらの少量のマルトース又は他のオリゴ糖は検出されなかった。同様に、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮポリマーを、（１→６）グリコシド結合の加水分解を触媒するデキストラナーゼ及びプルラナーゼＭ１による酵素加水分解にかけた。デキストラナーゼが（α１→６）結合したＤ−グルコピラノシル繰り返し単位の直鎖状配列を特異的に攻撃するのに対し、プルラナーゼはプルランの主鎖、及びデンプン分子の分岐点にあるα１→６結合に特異的である。デキストラナーゼ及びプルラナーゼ酵素処理については、それぞれ、デキストラン及びプルランを陽性対照として使用した。予想されるように、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮポリマー並びにＡ．クロオコッカム及びＰ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤポリマーは、デキストラナーゼの作用によって分解されず、代わりにこれらのポリマーはプルラナーゼにより加水分解された。対照的に、ＩＭＭＰ生成物はプルラナーゼ処理に対して耐性であったが、デキストラナーゼのエンド−（α１→６）−ヒドロラーゼ活性により消化された。これらの結果は、Ｌ．ロイテリ１２１ＧｔｆＢポリマーに連続した（α１→６）結合のみが存在すること、及びＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮポリマー中にはそれらが存在しないことと一致している。ＧｔｆＡ  ＧＳ及びＧｔｆＤ  ４，６−α−ＧＴａｓｅによって合成されたロイテラン型のポリマーと同様に、そしてＩＭＭＰとは異なり、このＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮポリマーは、交互の（α１→６）／（α１→４）結合及び（α１→４，６）分岐点を含有するものと考えられる。
【００８８】
Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮポリマーの構造に関する更なる情報は、ＨＰＡＥＣによるプルラナーゼ処理から得られた反応生成物の同定によって得た。図９Ａに示すように、プルラナーゼは、Ｌ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ−ΔＮポリマーを消化し、主にグルコース、及びＤＰ２〜７からのＭＯＳの混合物を生成した。この発見は、このポリマーが、単一の（α１→６）結合によって結合されたマルトース、マルトトリオース、マルトテトラオース、マルトペンタオース、マルトヘキサオース、及びマルトヘプタオースによって形成されることを示す。これらの構成要素はまた、ＬＭＭ  Ｐ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤポリマー中にも存在するが、より長い直鎖状（α１→４）配列（ＤＰ８〜ＤＰ１３）でもまた検出される（図９Ｂ）。プルラナーゼは、Ｐ．ベイジンゲンシスＧｔｆＤ及びＡ．クロオコッカムＧｔｆＤ酵素によって合成されたＨＭＭロイテランポリマーを、それぞれＤＰ６及びＤＰ５までのＭＯＳ単位に分解した（図９Ｃ及び９Ｄ）。全体として、これらのＨＰＡＥＣプロファイルは、これまでに特性評価した４，６−α−ＧＴａｓｅには異なる長さの（α１→４）グルカン鎖を転移させる優先傾向がある結果として、独特な構造を有するロイテランポリマーが得られることを示唆している。図１０は、Ｌ．ロイテリＮＣＣ２６１３ＧｔｆＢ−ΔＮ及び以前に特性評価されたＧｔｆＤ型の酵素によって生産されたロイテラン様ポリマーの複合モデルを示す。Ｌ．ロイテリＮＣＣ２６１３ＧｔｆＢ−ΔＮは、アミロースからＧＨ７０酵素を使用して容易に合成することができるロイテラン様α−グルカンの種類を拡大する。
【００８９】
ＧｔｆＢ処理した小麦粉の特性評価：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化
小麦粉試料を、上記のように異なる濃度のＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢ酵素で処理した。最初に、試料によるグルコース放出率をｉｎ  ｖｉｔｒｏ消化により分析した。この測定は、ヒトの消化を模倣するように設定し、参照と比較して試料によるグルコース放出率を得た。
【００９０】
異なる濃度（３３３．５（ＬｒＧｔｆＢ（−））、６６７（ＬｒＧｔｆＢ）、及び１３３４（ＬｒＧｔｆＢ（＋））μｇ／１００ｍｇデンプン）のＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢによって修飾したα化精製小麦粉から放出されたグルコースを参照と比較した（図１１）。参照α化精製小麦粉は、１５分後に７０％超が急速に消化され、１８０分後、プラトーに到達した（約８５％）。異なる濃度のＬ．ロイテリＣＮＣＭ  Ｉ−２４５２ＧｔｆＢで処理した小麦粉の場合、酵素濃度が高くなるほど消化性が低下する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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