(57)【要約】  本発明は、肝細胞癌を有する患者を検出、診断、予後診断、監視、および治療するための方法に関する。特に、本発明は、免疫療法の恩恵を受ける患者、 すなわち免疫療法に最も反応する患者の検出および治療のための診断マーカーを提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
肝細胞癌と診断された対象の免疫療法に反応する表現型を検出する方法であって、
ａ．肝細胞癌を有する前記対象からのサンプルにおける表３の１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルをアッセイし、試験発現プロファイルを取得することと、
ｂ．前記遺伝子の前記試験発現プロファイルを参照発現プロファイルと比較することであって、前記参照発現プロファイルは、対照からのサンプル中の同じ遺伝子の参照発現レベルを含む、比較することと、そして
ｃ．当該試験発現プロファイルにおける１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルが、免疫療法応答性表現型を示す参照発現プロファイルにおける同じ遺伝子の発現レベルと比較して同じであることを検出し、および当該対象が免疫療法に反応することをさらに検出する、方法。
【請求項２】
前記対象が最近肝細胞癌（ＨＣＣ）と診断されている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが肝細胞癌腫からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対照が、免疫療法に良好に反応した肝細胞癌を有する対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対照が、免疫療法に良好に反応した別の形態の癌を有する対象である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記癌が肺癌または黒色腫である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
肝細胞癌を有する対象を治療する方法であって、
ａ．肝細胞癌を有する前記対象からのサンプルにおける表３の１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルをアッセイし、試験発現プロファイルを取得することと、
ｂ．前記遺伝子の前記試験発現プロファイルを参照発現プロファイルと比較することであって、前記参照発現プロファイルは、対照からのサンプル中の同じ遺伝子の参照発現レベルを含む、比較することと、
ｃ．前記試験発現プロファイルにおける１つまたは複数の遺伝子の前記遺伝子発現レベルが、免疫療法応答性表現型を示す前記参照発現プロファイルにおける同じ遺伝子の発現レベルと比較して同じであることを検出することと、そして
ｄ．免疫療法で前記対象を治療することと、を含む方法。
【請求項８】
前記対象が最近肝細胞癌（ＨＣＣ）と診断されている、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが肝細胞癌腫からのものである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前期対照が、免疫療法に良好に反応した肝細胞癌を有する対象である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記対照が、免疫療法に良好に反応した別の形態の癌を有する対象である、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌が肺癌または黒色腫である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫療法が、細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質（ＣＴＬＡ−４）（例えば、イピリムマブ）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）（例えば、ニボルマブおよびペムブロリズマブ）およびそのリガンドＰＤ−Ｌ１（例えば、アテゾリズマブ）、ならびにそれらの組み合わせに対するモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
肝細胞癌を有する対象を治療する方法であって、
ａ．肝細胞癌を有する対象からのサンプルにおける表３の１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルをアッセイし、第１の試験発現プロファイルを取得する；
ｂ．表３の前記１つまたは複数の遺伝子の前記第１の試験発現プロファイルを、第１の参照発現プロファイルと比較することであって、前記第１の参照発現プロファイルは、対照からのサンプル中の同じ遺伝子の参照発現レベルを含む、比較することと、
ｃ．前記第１の試験発現プロファイルにおける１つまたは複数の遺伝子の前記遺伝子発現レベルが、免疫療法応答性表現型を示す前記第１の参照発現プロファイルにおける同じ遺伝子の発現レベルと比較して同じであることを検出し、および前記対象が免疫療法に反応することをさらに検出することと、
ｄ．肝細胞癌を有する前記対象からのサンプル中の図１２の１つまたは複数の遺伝子の前記遺伝子発現レベルをアッセイし、第２の試験発現プロファイルを取得することと、
ｅ．図１２の前記１つまたは複数の遺伝子経路の前記第２の発現プロファイルを第２の参照発現プロファイルと比較することであって、前記第２の発現プロファイルは、対照からのサンプル中の同じ遺伝子の参照発現レベルを含む、比較することと、
ｆ．前記第１の試験発現プロファイルにおける１つまたは複数の遺伝子の前記遺伝子発現レベルが、疲弊した免疫応答クラスを示す前記第２の参照発現プロファイルにおける同じ遺伝子の発現レベルと比較して同じであることを検出することと、そして
ｇ．免疫療法と第二の薬剤の組み合わせで前記対象を治療することと、を含む方法。
【請求項１５】
前記対象が最近肝細胞癌（ＨＣＣ）と診断されている、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルが肝細胞癌腫からのものである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記対照が、免疫療法に良好に反応した肝細胞癌を有する対象である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記対照が、免疫療法に良好に反応した別の形態の癌を有する対象である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記癌が肺癌または黒色腫である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫療法が、細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、およびそのリガンドＰＤ−Ｌ１、ならびにそれらの組み合わせに対するモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｆ）で増加する前記遺伝子が、ＴＧＦ-βおよびＣＴＮＮＢ１シグナル伝達経路由来の遺伝子からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記第二の薬剤が、ＴＧＦ-β阻害剤およびＣＴＮＮＢ１シグナル伝達経路阻害剤からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＣＴＮＮＢ１シグナル伝達経路からの前記遺伝子が、ＣＣＬ４、ＰＴＫ２およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記第二の薬剤は、化学療法剤または放射線である、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
肝細胞癌（ＨＣＣ）を有する対象を治療する方法であって、
ａ．肝細胞癌を有する対象からのサンプルにおける表３の１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルをアッセイし、第１の試験発現プロファイルを取得する；
ｂ．表３の１つまたは複数の遺伝子の第１の試験発現プロファイルを第１の参照発現プロファイルと比較する。ここで、第１の参照発現プロファイルは、対照からのサンプル中の同じ遺伝子の参照発現レベルを含む；
ｃ．当該試験発現プロファイルにおける１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルが、免疫療法応答性表現型を示す参照発現プロファイルにおける同じ遺伝子の発現レベルと比較して同じであることを検出し、および当該対象が免疫療法に反応することをさらに検出する；
ｄ．肝細胞癌を有する前記対象のサンプルで、ＰＭＥＰＡ１、ＬＧＡＬＳ１、ＬＧＡＬＳ３、ＴＧＦ−β、ＣＴＮＮＢ１シグナル伝達経路からの遺伝子、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の前記遺伝子発現レベルをアッセイして、第２の試験発現プロファイルを取得することと、
ｅ．ＰＭＥＰＡ１、ＬＧＡＬＳ１、ＬＧＡＬＳ３、ＴＧＦ−β、ＣＴＮＮＢ１シグナル伝達経路からの遺伝子およびそれらの組み合わせからなる群から選択される前記１つまたは複数の遺伝子の前記第２の試験発現プロファイルを、第２の参照発現プロファイルと比較することであって、前記第２の発現プロファイルは、対照からのサンプル中の同じ遺伝子の参照発現レベルを含む、比較することと、
ｆ．前記第２の試験発現プロファイルにおける１つまたは複数の遺伝子の前記遺伝子発現レベルが、疲弊した免疫応答表現型を示す前記第２の参照発現プロファイルにおける同じ遺伝子の発現レベルと比較して同じであることを検出することと、そして
ｇ．免疫療法と第二の薬剤の組み合わせで前記対象を治療することと、を含む方法。
【請求項２６】
前記対象が最近肝細胞癌（ＨＣＣ）と診断されている、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記サンプルが肝細胞癌腫からのものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記対照が、免疫療法に良好に反応した肝細胞癌を有する対象である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記対照が、免疫療法に良好に反応した別の形態の癌を有する対象である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記癌が肺癌または黒色腫である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫療法が、細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、およびそのリガンドＰＤ−Ｌ１、ならびにそれらの組み合わせに対するモノクローナル抗体からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
工程（ｆ）で増加する前記遺伝子が、ＴＧＦ-βおよびＣＴＮＮＢ１シグナル伝達経路由来の遺伝子からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記第二の薬剤が、ＴＧＦ−β阻害剤およびＣＴＮＮＢ１シグナル伝達経路阻害剤からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＣＴＮＮＢ１シグナル伝達経路からの前記遺伝子が、ＣＣＬ４、ＰＴＫ２およびそれらの組み合わせからなる群から選  択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記第二の薬剤は、化学療法剤または放射線である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
肝細胞癌と診断された対象の免疫療法に反応する表現型を検出するためのキットであって、表３にリストされている１つまたは複数の遺伝子のプローブ、生体組織または体液から核酸を単離および精製するための試薬、単離および精製された核酸についてのアッセイを実行するための試薬、使用説明書、参照値、または含まれる遺伝子の対照サンプルの参照値を取得する手段を含む、キット。
【請求項３７】
図１２に列挙された１つまたは複数の遺伝子のためのプローブをさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記プローブがマイクロアレイ形式で固体状態に付帯している、請求項３７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年６月１４日に出願の米国特許出願第６２／５１９７１１号、および２０１８年２月１２日に出願の米国特許出願第６２／６２９２３１号のどちらにも優先権を主張し、参照によって本明細書にその全体が援用される。
【０００２】
本発明は、肝細胞癌を有する患者を検出、診断、予後診断、監視、およびを治療するための方法に関する。特に、本発明は、免疫療法の恩恵を受ける患者、すなわち免疫療法に最も反応する患者の検出および治療のための診断マーカーを提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
肝細胞癌（ＨＣＣ）は、世界中の癌関連死亡の２番目の主要原因である。ＨＣＣの死者数（年間約８００，０００人）は、その高い致死性の証拠である新しい症例の数と重複している（Ｍｕｒｒａｙ，ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｌｌｏｖｅｔ，ｅｔ  ａｌ．２０１６）。この悪性腫瘍は、慢性炎症性肝疾患（例：肝硬変）の状況でしばしば発生し、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、アルコール乱用、メタボリックシンドローム、糖尿病などの明確な危険因子と関連する（Ｌｌｏｖｅｔ，ｅｔ  ａｌ．２０１６）。過去１０年間、主要な進歩によりＨＣＣの分子病因が解明されたが（Ｚｕｃｍａｎ−Ｒｏｓｓｉ，ｅｔ  ａｌ．２０１５）、それでも、現在の治療選択肢は非常に限られている。外科的切除、移植または局所切断などの治癒的アプローチが有効である初期段階では、少数のＨＣＣ患者のみが診断される。進行期の患者では、生存率を高める唯一の全身療法は、マルチチロシンキナーゼ阻害薬ソラフェニブ（第１選択）（Ｌｌｏｖｅｔ，ｅｔ  ａｌ．２００８）およびレゴラフェニブ（第２選択）（Ｂｒｕｉｘ  ｅｔ  ａｌ．２０１７）である。それにもかかわらず、これらの薬剤によって提供される生存上の利点があっても、平均寿命は２年未満である。
【０００４】
ＨＣＣは、細胞外マトリックス内および支持間質に分散した悪性肝細胞、免疫細胞、内皮細胞を含む細胞タイプの混合物で構成される。以前の研究では、これらの別個のコンパートメントに由来する分子シグナルを事実上詳細に分析するための一連の分析アプローチが確立されている（Ｍｏｆｆｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．２０１３）。
【０００５】
近年、Ｔ細胞の調節経路を標的として腫瘍を攻撃するために身体自身の免疫応答を解き放つ免疫チェックポイント阻害剤は、さまざまな固形がんで顕著な効果を示している。これにより、黒色腫や肺癌などの進行期の悪性腫瘍の治療のために細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質（ＣＴＬＡ−４）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）、そのリガンドＰＤ−Ｌ１に対するモノクローナル抗体を含む４種類の免疫ベース剤について食品医薬品局（ＦＤＡ）の承認が得られた。これらの薬剤、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびアテゾリムマブは、これらの患者の生存率を大幅に改善している（Ｌｌｏｖｅｔ、ｅｔ  ａｌ。２０１５）。これらの化合物は、転移性疾患患者の一部で持続的な臨床反応と長期寛解を誘発する（Ｚｏｕ，ｅｔ  ａｌ．２０１６；Ｋｈａｌｉｌ，ｅｔ  ａｌ．２０１６）。これらの治療法は腫瘍細胞ではなく免疫細胞に向けられていることを考えると、膀胱がんと結腸直腸がんを含む固形がんと血液がんの両方で重要な活性が最近報告されており、広範囲のがんタイプで効果的であり得る（Ｔｏｐａｌｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｌｅ，ｅｔ  ａｌ．２０１５）。しかし、興味深いことに、すべての患者がこれらのレジメンに反応する可能性が同じではない（Ｚｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０００６】
これらの治療法の有望性と、どの患者がそれらの治療法から利益を得るかについての相反する証拠を考えると、免疫療法の肯定的な結果を予測するための信頼できるバイオマーカーを見つけることへの強い要求があった。そのようなバイオマーカーの１つは、タンパク質ＰＤ−Ｌ１の発現である。非小細胞肺癌の初期試験では、ＰＤ−Ｌ１発現が陽性の患者は、ＰＤ−Ｌ１が陰性の患者と比較して、全体的な反応が大きいことが示唆されている（Ｈｅｒｂｓｔ，ｅｔ  ａｌ．２０１６；Ｇａｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．２０１５；Ｔｏｐａｌｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
【０００７】
ただし、精度が低く結果が混在しているため、免疫組織化学（ＩＨＣ）ベースのＰＤ−Ｌ１の検出は、免疫療法に対する患者の反応を判定および予測する上で信頼できない。まず、手順に技術的な問題がある。ＩＨＣベースの検出は、「陽性」腫瘍ＰＤ−Ｌ１染色の定義および陽性染色のための異なるカットオフ値の使用に関して主観的である。同じアッセイを用いた病理学者所見の変動の証拠もある（Ｂｒｕｎｎｓｔｒｏｍ，ｅｔ  ａｌ．２０１７；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２０１６）。
【０００８】
さらに、さまざまな研究で使用される抗体の感度も異なる。ＩＨＣを使用したＰＤ−Ｌ１のさまざまな研究で、少なくとも７つの異なる抗体が使用されている。異なるＰＤ−Ｌ１抗体の使用は、さまざまな研究にわたって腫瘍のＰＤ−Ｌ１発現にばらつきがあることのさらなる理由である。一般的に、Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２０１６を参照されたい。
【０００９】
ＩＨＣプロトコルの精度は、時間的および空間的などの生物学的要因にも依存する。言い換えれば、腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１の発現は、時間と面積にわたって均一ではない。例えば、腫瘍でＰＤ−Ｌ１の過剰発現がすでに起こっている場合（一時的）、または患者から得られたサンプルが適切な腫瘍と免疫の界面を逃した場合（空間的）に得られた標本は、ＩＨＣによるＰＤ−Ｌ１測定において不正確さをもたらす（Ｌａｔｃｈｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．２００１）。したがって、ＰＤ−Ｌ１検出のＩＨＣの精度は、生検のタイミングに依存し、放射線や化学療法を含む以前の治療にも関連する。研究により、放射線治療後に腫瘍のＰＤ−Ｌ１発現が上方制御されることが示された（Ｄｅｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２０１４）。
【００１０】
空間的因子は、ＰＤ−Ｌ１発現が原発腫瘍対転移性病変で異なり得ると考えておくことも必要である。１つのサンプル内でさえ、ＰＤ−Ｌ１発現、局在および拡散の異なるパターンにより、偏りが生じる可能性がある（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２０１６）。また、同じ腫瘍の異なる場所は不均一であり、ＰＤ−Ｌ１陽性の結果は、陽性の膜染色のみが生物学的意義があることが示されている場合、膜または細胞質染色によって定義される（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２０１６）。
【００１１】
さらに、ＩＨＣによるＰＤ−Ｌ１タンパク質発現の正確なスコアリングは、データが遡及的である、患者の臨床的特徴が異なる、腫瘍タイプが異なるサンプルを比較するなどの他の考慮事項により困難である。
【００１２】
ＨＣＣの治療に免疫療法が使用され始めている。ニボルマブを試験した第ＩＩ相拡張臨床試験の結果は、治療を受けた２１４人の患者の客観的奏効率が１６％であり、生存期間の中央値が１４ヶ月であることが示された（Ｅｌ−Ｋｈｏｕｅｉｒｙ、ｅｔ  ａｌ．２０１５）。ただし、この試験では、客観的反応（２１／１４５症例、１５％）は腫瘍細胞でのＰＤ−Ｌ１発現とは関連しなかった。ＨＣＣ腫瘍の免疫学的プロファイルと、この情報を活用して免疫ベースの治療に対する反応を最大化する方法についてはほとんど知られていない。
【００１３】
これらの理由と、上記に示したように、ＰＤ−Ｌ１発現は免疫療法の理想的な候補を選択するための信頼できるバイオマーカーではないという事実のため、免疫療法の恩恵を受けるＨＣＣ患者を検出するための正確な予測バイオマーカーの同定が必要である。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は、肝細胞癌（ＨＣＣ）患者において免疫療法応答性の表現型を正確に検出する遺伝子発現バイオマーカーのセットを使用することによって、免疫療法応答性を検出するためのバイオマーカーとしてのＰＤ−Ｌ１発現を使用する問題を解決する。
【００１５】
本明細書に記載のバイオマーカーは、免疫療法に対する患者の反応を明確に特定および予測するための新規かつユニークな方法を提供するだけでなく、薬物スクリーニングおよびＨＣＣならびに他の癌に関する基礎研究で使用するための標的も提供する。
【００１６】
非負行列因子分解（ＮＭＦ）を使用して、本明細書で説明する実施形態は、９５６人のヒトＨＣＣサンプルの遺伝子発現データをデコンボリューションし、炎症性浸潤から放出されるシグナルを分離して、ＨＣＣの免疫学的景観を特徴付ける。これにより、「免疫」クラスと呼ばれる特定の生物学的特性を持つＨＣＣの免疫特異的クラスの識別が可能になった。このクラスの主な特徴には、免疫細胞の実際の存在と活性化、細胞溶解活性の強化、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１のタンパク質発現が含まれる。１１２個の遺伝子の発現を使用したこのクラスのさらなる評価（図１０）により、免疫療法に対して反応を示す遺伝子シグネチャープロファイルが見つかった。この免疫クラスの遺伝子発現プロファイルは、免疫療法で治療されているＨＣＣ患者およびＨＣＣに反応した他の癌患者と比較された。これらの場合、免疫クラスの遺伝子発現プロファイルは、免疫療法応答性と相関した。
【００１７】
１１２遺伝子パネルが正常に最も高いスコアとのそれらの遺伝子を選択して５６個の遺伝子まで減少した。以下に示すように、５６遺伝子の免疫分類子の感度は９７％、特異性は９８％、精度は９７％であった（表３）。
【００１８】
したがって、遺伝子発現バイオマーカーの使用は、免疫療法に反応するＨＣＣ患者の正確な検出を提供する。
【００１９】
さらに、免疫クラスで上方制御された１０８個の遺伝子を含む、図１０の１１２個の遺伝子のサブセットを図１１に示す。
【００２０】
免疫クラスの詳細な分析により、活発な免疫活性または疲弊した免疫活性のいずれかを持つ２つの堅牢な微小環境ベースのタイプが明らかになった。これらのさらなる分類は、ＨＣＣ患者の治療法の選択を決定し、ＨＣＣの免疫学的環境を包括的に理解するのに役立つ。疲弊した免疫活性クラスは、図１２の遺伝子経路によって特定できる。これらの遺伝子発現バイオマーカーは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１発現に関して、これら２つのクラスに有意な差がなかったため、これらのサブクラスの特定が特に問題となる（実施例４）。
【００２１】
従って、本発明の一の実施形態は、肝細胞癌と診断された対象で免疫療法に反応する表現型を検出する方法および／またはアッセイであり、以下を含む：
【００２２】
ａ．肝細胞癌を有する対象からのサンプルにおける表３の１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルをアッセイし、試験発現プロファイルを取得する；
【００２３】
ｂ．当該遺伝子の試験発現プロファイルを参照発現プロファイルと比較する。ここで、参照発現プロファイルは、対照からのサンプル中の同じ遺伝子の参照発現レベルを含む；そして
【００２４】
ｃ．当該試験発現プロファイルにおける１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルが、免疫療法応答性表現型を示す参照発現プロファイルにおける同じ遺伝子の発現レベルと比較して同じであることを検出し、および当該対象が免疫療法に反応することをさらに検出する。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態は、ＨＣＣを有する対象を治療する方法であり、以下を含む：
【００２６】
ａ．肝細胞癌を有する対象からのサンプルにおける表３の１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルをアッセイし、試験発現プロファイルを取得する；
ｂ．当該遺伝子の試験発現プロファイルを参照発現プロファイルと比較する。ここで、参照発現プロファイルは、対照からのサンプル中の同じ遺伝子の参照発現レベルを含む；
ｃ．当該試験発現プロファイルにおける１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルが、免疫療法応答性表現型を示す参照発現プロファイルにおける同じ遺伝子の発現レベルと比較して同じであることを検出する；そして
ｄ．免疫療法で当該対象を治療する。
いくつかの実施形態では、免疫療法には、細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質（ＣＴＬＡ−４）（例えば、イピリムマブ）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）（例えば、ニボルマブおよびペムブロリズマブ）およびそのリガンドＰＤ−Ｌ１（例えば、アテゾリズマブ）、ならびにそれらの組み合わせに対するモノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
いくつかの実施形態では、対象は最近、肝細胞癌（ＨＣＣ）と診断されている。いくつかの実施形態において、対象は以前にＨＣＣについて治療されている。
【００２８】
いくつかの実施形態では、サンプルは腫瘍組織である。いくつかの実施形態では、腫瘍からの複数のサンプルが遺伝子発現についてアッセイされる。
【００２９】
任意の遺伝子の発現の決定は、マイクロアレイ；サザンブロット；ノーザンブロット；ドットブロット；プライマー伸長；ヌクレアーゼ保護；サブトラクティブハイブリダイゼーションと、例えばヒドロキシアパタイトを使用した非二重分子の分離；溶液ハイブリダイゼーション；フィルターハイブリダイゼーション；ＲＴ−ＰＣＲなどの増幅技術、融解曲線分析を使用したＰＣＲ、質量分析を使用したＰＣＲなどのその他のＰＣＲ関連技術；制限エンドヌクレアーゼなどのフィンガープリンティング；および構造特異的エンドヌクレアーゼの使用が含まれるが、これに限定されない当該技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。ｍＲＮＡの発現はまた、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩ）、液体クロマトグラフィー、およびキャピラリーゲル電気泳動を用いて分析することができる。当該分野で公知の任意のさらなる方法を使用して、転写産物の存在または不在を検出することができる。
【００３０】
ＨＣＣを有する対象の遺伝子の発現は、対照における同じ遺伝子の発現の参照レベルと比較できる。対照は、免疫療法に反応したＨＣＣを有する対象であり得る。対照は、別の形態の癌を有する免疫療法に反応した対象であり得る。対照は、肺癌または黒色腫を有する免疫療法に反応した対象であり得る。発現遺伝子のレベルは、絶対的または相対的として測定され得る。絶対定量では特定のＲＮＡの濃度を測定し、検量線が必要である。相対定量では、ハウスキーピング遺伝子と比較した特定のＲＮＡの倍数変化を測定する。通常、相対定量は、遺伝子発現レベルの生理学的変化を調査するのに適切である。
【００３１】
これらの方法のいずれかは、図１０および１１にリストされている１つまたは複数の遺伝子を使用して実行できる。
【００３２】
本発明はまた、活性免疫応答クラスまたは疲弊した免疫応答クラスの免疫クラスの下位分類による免疫療法に対する応答性をさらに検出および同定する方法を提供する。これらの下位分類は間質の活性化に基づいている。活性化された間質を欠くものは、活性免疫応答クラスで考慮される。活性化された間質を持つものは、疲弊した免疫応答クラスで考慮される。これらのクラスは、免疫クラスの両方の部分がわずかに異なる治療プロトコルを保証する。
【００３３】
したがって、本発明のさらなる実施形態は、ＨＣＣを有する対象を治療する方法であって、以下を含む：
ａ．肝細胞癌を有する対象からのサンプルにおける表３の１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルをアッセイし、第１の試験発現プロファイルを取得する；
ｂ．表３の１つまたは複数の遺伝子の第１の試験発現プロファイルを第１の参照発現プロファイルと比較する。ここで、第１の参照発現プロファイルは、対照からのサンプル中の同じ遺伝子の参照発現レベルを含む；
ｃ．当該試験発現プロファイルにおける１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルが、免疫療法応答性表現型を示す参照発現プロファイルにおける同じ遺伝子の発現レベルと比較して同じであることを検出し、および当該対象が免疫療法に反応することをさらに検出する；
ｄ．肝細胞癌を有する対象からのサンプル中の図１２の経路における１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルをアッセイし、第２の試験発現プロファイルを取得する；  
ｅ．図１２の経路における１つまたは複数の遺伝子の第２の試験発現プロファイルを第２の参照発現プロファイルと比較する。ここで、第２の発現プロファイルは、対照からのサンプル中の同じ遺伝子の参照発現レベルを含む；
ｆ．当該第２の試験発現プロファイルにおける１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルが、疲弊した免疫応答表現型を示す第２の参照発現プロファイルにおける同じ遺伝子の発現レベルと比較して同じであることを検出する；そして
ｇ．免疫療法と第二の薬剤の組み合わせで当該対象を治療する。
いくつかの実施形態では、対象は最近、肝細胞癌（ＨＣＣ）と診断されている。いくつかの実施形態において、対象は以前にＨＣＣについて治療されている。
【００３４】
いくつかの実施形態では、サンプルは腫瘍組織である。いくつかの実施形態では、腫瘍からの複数のサンプルが遺伝子発現についてアッセイされる。
【００３５】
任意の遺伝子の発現の決定は、マイクロアレイ；サザンブロット；ノーザンブロット；ドットブロット；プライマー伸長；ヌクレアーゼ保護；サブトラクティブハイブリダイゼーションと、例えばヒドロキシアパタイトを使用した非二重分子の分離；溶液ハイブリダイゼーション；フィルターハイブリダイゼーション；ＲＴ−ＰＣＲなどの増幅技術、融解曲線分析を使用したＰＣＲ、質量分析を使用したＰＣＲなどのその他のＰＣＲ関連技術；制限エンドヌクレアーゼなどのフィンガープリンティング；および構造特異的エンドヌクレアーゼの使用が含まれるが、これに限定されない当該技術分野で公知の任意の方法によって行うことができる。ｍＲＮＡの発現はまた、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩ）、液体クロマトグラフィー、およびキャピラリーゲル電気泳動を用いて分析することができる。当該技術分野で公知の任意のさらなる方法を使用して、転写産物の存在または不在を検出することができる。
【００３６】
ＨＣＣを有する対象からの遺伝子の発現は、対照における同じ遺伝子の発現の参照レベルと比較できる。対照は、工程（ｂ）と工程（ｅ）の両方で同じでも、または対照が異なっていてもよい。対照は、免疫療法に反応したＨＣＣを有する対象であり得る。対照は、別の形態の癌を有する免疫療法に反応した対象であり得る。対照は、肺癌または黒色腫を有する免疫療法に反応した対象であり得る。発現遺伝子のレベルは、絶対的または相対的として測定され得る。絶対定量では特定のＲＮＡの濃度を測定し、検量線が必要である。相対定量は、ハウスキーピング遺伝子と比較した特定のＲＮＡの倍数変化を測定する。通常、相対定量は、遺伝子発現レベルの生理学的変化を調査するのに適切である。
【００３７】
工程ａ〜ｃは、図１０および１１にリストされている１つまたは複数の遺伝子を使用して実行できる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、免疫療法には、細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質（ＣＴＬＡ−４）（例えば、イピリムマブ）、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）（例えば、ニボルマブおよびペムブロリズマブ）およびそのリガンドＰＤ−Ｌ１（例えば、アテゾリズマブ）、ならびにそれらの組み合わせに対するモノクローナル抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
いくつかの実施形態では、発現レベルが工程（ｄ）においてアッセイされる遺伝子は、ＰＭＥＰＡ１、ＬＧＡＬＳ１、ＬＧＡＬＳ３、ＴＧＦ−βであり、またはＣＸＣＬ１２およびＣＣＬ２含むＣＴＮＮＢ１シグナル伝達経路に由来する。
【００４０】
いくつかの実施形態では、第二の薬剤には、ＴＧＦ−β阻害剤およびＣＴＮＮＢ１シグナル伝達経路阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、第二の薬剤は化学療法剤または放射線である。
【００４１】
本発明のさらなる実施形態は、ＨＣＣを有する対象を治療する方法であり、以下を含む：
ａ．肝細胞癌を有する対象からのサンプルにおける表３の１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルをアッセイし、第１の試験発現プロファイルを取得する；
ｂ．表３の１つまたは複数の遺伝子の第１の試験発現プロファイルを第１の参照発現プロファイルと比較する。ここで、第１の参照発現プロファイルは、対照からのサンプル中の同じ遺伝子の参照発現レベルを含む；
ｃ．当該試験発現プロファイルにおける１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルが、免疫療法応答性表現型を示す参照発現プロファイルにおける同じ遺伝子の発現レベルと比較して同じであることを検出し、および当該対象が免疫療法に反応することをさらに検出する；
ｄ．肝細胞癌を有する対象からのサンプル中のＰＭＥＰＡ１、ＬＧＡＬＳ１、ＬＧＡＬＳ３、ＴＧＦ−β、ＣＴＮＮＢ１シグナル伝達経路からの遺伝子およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルをアッセイし、第２の試験発現プロファイルを取得する；
ｅ．ＰＭＥＰＡ１、ＬＧＡＬＳ１、ＬＧＡＬＳ３、ＴＧＦ−β、ＣＴＮＮＢ１、シグナル伝達経路からの遺伝子およびそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子の第２の試験発現プロファイルを、第２の参照発現プロファイルと比較する。ここで、第２の発現プロファイルは、対照からのサンプル中の同じ遺伝子の参照発現レベルを含む；
ｆ．当該第２の試験発現プロファイルにおける１つまたは複数の遺伝子の遺伝子発現レベルは、疲弊した免疫応答表現型を示す第２の参照発現プロファイルにおける同じ遺伝子の発現レベルと比較して同じであることを検出する；そして
ｇ．免疫療法と第二の薬剤の組み合わせで当該対象を治療する。
いくつかの実施形態では、ＣＴＮＮＢ１シグナル伝達経路からの遺伝子は、ＣＸＣＬ１２およびＣＣＬ２である。
【００４２】
本発明はキットも提供する。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
本発明を例示する目的で、本発明の特定の実施形態を図面に示す。しかし、本発明は、図面に示された実施形態の正確な配置および手段に限定されない。
【００４４】
【図１】図１は、調査のフローチャートを示す。この研究では、合計９５６個のＨＣＣサンプルが使用された。２２８個のＨＣＣを含むトレーニングコホート（Ｈｅｐｔｒｏｍｉｃ）は、免疫クラスを識別するために実質的に顕微解剖された。その後、７つの独立したデータセットで検証が行われた。
【図２】図２は、研究で使用されている公的に入手可能な遺伝子シグネチャーの表を、本文中の出現順に示す。
【図３−１】図３は、ＨＣＣの免疫クラスの識別を示す。図３Ａは、免疫発現パターンの模範的な遺伝子を使用し、ランダムフォレストによって改良されたＨＣＣサンプル（トレーニングデータセット、ｎ＝２２８）のコンセンサスクラスター化ヒートマップを示す。ヒートマップでは、遺伝子セットの濃縮度の高いスコアと低いスコアがそれぞれ赤と青で表されている。シグネチャーの肯定的な予測は赤で示され、不在は灰色で示される。両方のシグネチャーで同様の結果が得られた。図３Ｂは、免疫クラスの患者（Ｍ３２１）および免疫クラス外の患者（Ｍ７４３）における免疫細胞浸潤、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１染色の代表的な画像を示す。画像は２０Ｘで取得された。図３Ｃは、コホートの残りと比較した免疫クラスの患者の三次リンパ構造（ＴＬＳ）数を示すグラフである。縦軸はＴＬＳカウントであり、連続変数で示され、水平軸は免疫クラス内（右）対免疫クラス外（左）の患者で示される。
【図３−２】同上。
【図３−３】同上。
【図４−１】図４は、免疫クラスに２つの異なる微小環境ベースのサブタイプが含まれていることを示す。図４Ａは、免疫クラスの２つの異なるサブタイプである活性（青色のバー）と疲弊した（緑色のバー）免疫応答サブタイプを識別した活性化炎症性間質応答を捕捉できる分子シグネチャーを使用する全腫瘍遺伝子発現データのＮＴＰ分析である。ヒートマップでは、遺伝子セットの濃縮度の高いスコアと低いスコアがそれぞれ赤と青で表されており、同じ表現が高および低遺伝子発現に使用される。ＮＴＰによって計算されたシグネチャーの肯定的な予測は赤で示され、不在は灰色で示される。図４Ｂは、免疫クラス対コホートの残り、および２つの免疫サブタイプ間における免疫細胞浸潤（高対低）、ＴＬＳ［陽性（≧５フォーカス）対陰性（＜５フォーカス）］、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１陽性染色の分布のヒートマップ表示である。免疫浸潤（１０／３５対１／１４、ｐ＝０．１４）、ＴＬＳカウント（≧５フォーカス、１５／３４対４／１７、ｐ＝０．２２）、ＰＤ−Ｌ１（９／３４対３／１４、ｐ＝１．００）およびＰＤ−１発現（８／３４対０／１４、ｐ＝０．０８）に関して活性免疫と疲弊した免疫サブタイプの間に有意差は観察されなかった。図４Ｃは、活性免疫サブタイプの患者（Ｍ４９９）および疲弊した免疫サブタイプの患者（Ｂ２０９）における免疫細胞浸潤、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１染色の代表的な画像である。画像は４０Ｘで取得された。
【図４−２】同上。
【図４−３】同上。
【図５−１】図５は、免疫応答タイプの状態と免疫クラスの堅牢性に応じた、全体的な生存率と再発率のカプラン・マイヤー推定値を示す。図５Ａは、Ｈｅｐｔｒｏｍｉｃコホートの活性免疫応答状態（活性免疫応答対残り＋疲弊した免疫応答）に応じた全体的な生存率のカプランマイヤー推定値を示す。図５Ｂは、ＴＣＧＡコホートの活性免疫応答状態１に応じた全体的な生存率のカプラン・マイヤー推定値を示す。図５Ｃは、公開されている利用可能なＴＣＧＡデータセットで行われた免疫クラスの外部検証を示す。５図５Ｄは、トレーニングコホートの微小環境ベースの免疫サブタイプによる、全体的な再発のカプラン・マイヤー推定値を示す。トレーニングセット（Ｈｅｐｔｒｏｍｉｃ）では、活性免疫応答クラスター内の患者は、疲弊したクラスター（ｐ＝０．０４）と比較して低い腫瘍再発率を示した。活性免疫応答クラスターとコホートの残りの部分（ｐ＝０．３２）、および疲弊した免疫応答クラスターと残りの部分（ｐ＝０．１５）の間に有意差は見られなかった。図５Ｅは、検証データセット内の微小環境ベースの免疫サブタイプに基づく全体的な再発のカプラン・マイヤー推定値を示す。検証セットでは、活性免疫応答サブタイプの中央値７９か月対疲弊した免疫応答サブタイプの中央値２７か月（ｐ＝０．１４）、残りのコホートの中央値３１か月（ｐ＝０．０８）では非有意な傾向しか観察されなかった。
【図５−２】同上。
【図５−３】同上。
【図６−１】図６は、免疫クラスとコピー数の異常、新抗原の存在、ドライバー遺伝子の変異、メチル化の変化との関連を示す。図６Ａは、免疫クラスの患者とコホートの残りの患者の利益負担を示している。図６Ｂは、免疫クラスの患者とコホート残りの患者の損失の負担を示す。両方の図に、幅広い（左パネル）と局所（右パネル）の両方が示されている。図６Ｃは、免疫クラスとコホート残りで新抗原を生じると予測される突然変異の割合が類似していたことを示すグラフである。図６Ｄは、２つの微小環境ベースのサブタイプとコホートの残りとの間で新抗原を生じると予測される突然変異の割合を示すグラフである。図６Ｅは、免疫クラスとコホートの残りの部分との間の突然変異率の比較のグラフである。図６Ｆは、異なる免疫サブタイプとコホートの残りの部分との間の突然変異率のグラフである。図６ＧはＴＧＣＡコホートの免疫クラス、残りの患者との間の公知のドライバー遺伝子における突然変異の分布のヒートマップ表示である。図６Ｈはボックスプロットとして表される３グループのうち１９２個の免疫関連プロモーター遺伝子における３６３個のＣｐＧ部位のメチル化レベルの差のグラフである。テューキー検定による正確なｐ値は次のとおりである：活性対残りの間：ｐ＝３．５７Ｅ−１３；疲弊対残り：ｐ＝１．９３Ｅ−１３；疲弊対活性：ｐ＝３．４２Ｅ−７。図６Ｉは、免疫応答サブタイプおよびコホートの残りにおけるＬＧＡＬＳ３発現（左）とＰＭＥＰＡ１発現（右）のグラフである。図６Ｊは、免疫クラスおよびコホートの残りと比較したＣＴＮＮＢ１クラスの患者におけるＣＣＬ４発現のボックスプロット表示である。図６Ｋは、免疫クラスおよびコホートの残りの患者と比較したＣＴＮＮＢ１クラスの患者における正規化されたＰＴＫ２発現（マイクロアレイデータ）のボックスプロット表示である。ＰＴＫ２式はｌｏｇ２で表される。図６Ｌは、ＨｅｐｔｒｏｍｉｃコホートのＨＣＣ試料におけるマイクロアレイと定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）により検出された正規化ＰＴＫ２遺伝子発現レベルの相関グラフを示す。図６Ｍは、ＨｅｐｔｒｏｍｉｃコホートのＨＣＣサンプルでマイクロアレイとコピー数によって検出された正規化遺伝子発現レベル（スピアマンの順位相関係数）の相関グラフである。
【図６−２】同上。
【図６−３】同上。
【図６−４】同上。
【図６−５】同上。
【図６−６】同上。
【図６−７】同上。
【図６−８】同上。
【図７−１】図７は、腫瘍内の免疫プロファイルは、周囲の非腫瘍肝臓の免疫浸潤に対応していないことを示す。図７Ａは、腫瘍（上部パネル）および一致した周囲の非腫瘍肝臓（下部パネル）の遺伝子発現がＨｅｐｔｒｏｍｉｃコホートの１６７人の患者（トレーニングデータセット）について利用可能であることを示す。ヒートマップは、腫瘍（上部パネル）および対応する周囲組織（下部パネル）の免疫特性の濃縮スコアを表す。多結節性は、免疫分類子に陽性の患者でより頻繁［２５／５５（４５％）対  ２４／１１０（２２％）、ｐ＝０．０１］であった。図７Ｂは、周囲の肝臓に免疫分類子が存在することによる、全体的な生存率のカプラン・マイヤー推定値を示す。
【図７−２】同上。
【図８】図８は、免疫分類子によって陽性と予測された患者＃１におけるニボルマブの抗腫瘍活性を示す。最初に、患者＃１は、肝内再発と単一３ｃｍ  ＨＣＣの切除後１６ｃｍの転移性骨盤腫瘤を呈した。図８Ａは、ニボルマブによる治療開始前の患者＃１のＣＴ画像を示す。図８Ｂは、患者＃１のＣＴ画像を示しており、ニボルマブによる治療の２ヶ月後の腫瘍質量の７５％減少を示す。白い矢印は、各画像の腫瘍を指す。
【図９−１】図９は、免疫クラスの患者とＰＤ−１療法に反応する黒色腫患者との遺伝的類似性を示す。図９Ａは、ＨＣＣコホートの２つのグループ（免疫クラス対残り）とＣｈｅｎらのデータセットの４つのグループ［ＰＤ１事前応答者（プレＰＤ１  Ｒ）および非応答者（プレＰＤ１  ＮＲ）；ＣＴＬＡ４事前応答者（プレＣＴＬＡ４  Ｒ）および非応答者（プレＣＴＬＡ−４  ＮＲ）］を考慮して適用したＨｅｐｔｒｏｍｉｃのサブマップ分析である。図９Ｂは、ＨＣＣコホートの３つのグループ（活性免疫、疲弊した免疫、残り）とＣｈｅｎ  らのデータセットの４つのグループ［ＰＤ１事前応答者（プレＰＤ１  Ｒ）および非応答者（プレＰＤ１  ＮＲ）；ＣＴＬＡ４事前応答者（プレＣＴＬＡ４  Ｒ）および非応答者（プレＣＴＬＡ−４  ＮＲ）］を考慮して適用したＨｅｐｔｒｏｍｉｃのサブマップ分析である。図９Ｃは、ＨＣＣコホートの２つのグループ（免疫クラスと残り）とＣｈｅｎらのデータセットの４つのグループ［ＰＤ１事前応答者（プレＰＤ１  Ｒ）および非応答者（プレＰＤ１  ＮＲ）；ＣＴＬＡ４事前応答者（プレＣＴＬＡ４  Ｒ）および非応答者（プレＣＴＬＡ−４  ＮＲ）］を考慮して適用したＴＣＧＡのサブマップ分析である。図９Ｄは、ＨＣＣコホートの３つのグループ（活動性免疫、疲弊した免疫、および残り）とＣｈｅｎらのデータセットの４つのグループ［ＰＤ１事前応答者（プレＰＤ１  Ｒ）および非応答者（プレＰＤ１  ＮＲ）；ＣＴＬＡ４事前応答者（プレＣＴＬＡ４  Ｒ）および非応答者（プレＣＴＬＡ−４  ＮＲ）］を考慮して適用したＴＣＧＡのサブマップ分析である。類似性は、免疫クラスと抗ＰＤ１応答者の間（Ｈｅｐｔｒｏｍｉｃでｐ＝０．０１およびＴＣＧＡで非有意な傾向）と、両方のコホートにおける活性免疫サブタイプと抗ＰＤＩ応答者の間（ボンフェローニ補正ｐ値＝０．０１）で観察された。
【図９−２】同上。
【図１０−１】図１０は、免疫サブクラス遺伝子分類子の遺伝子の表である。
【図１０−２】同上。
【図１０−３】同上。
【図１０−４】同上。
【図１１−１】図１１は、免疫クラスで有意に過剰発現している遺伝子の表である。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【図１１−４】同上。
【図１２−１】図１２は、疲弊した免疫応答サブタイプの濃縮された遺伝子経路の表である。
【図１２−２】同上。
【図１２−３】同上。
【図１２−４】同上。
【図１２−５】同上。
【図１２−６】同上。
【図１２−７】同上。
【図１３】図１３は、免疫クラスと残りの患者との間のドライバー遺伝子における局所的高レベル増幅（ＨＬＡ）およびホモ接合性欠失の分布の表である。
【図１４】図１４は、元の１１２遺伝子の免疫分類子と比較した５６遺伝子の免疫分類子の予測能力のヒートマップ可視化を示す。ヒートマップでは、各列がサンプルを表し、各行が１１２遺伝子分類子または５６遺伝子免疫分類子（下の行）を表す。免疫クラスに属すると肯定的に予測されたサンプルは左側の暗いボックスとして表され、免疫分類子に対して否定的であると予測された患者は右側の明るいボックスとして表される。図１４Ａは、ＴＧＣＡデータセットの結果を示す（ｎ＝１９０のサンプル）。図１４Ｂは、検証コホート（ｎ＝１３２）の結果を示す。図１４Ｃは、ＨＣＣ−Ｉデータセットの結果を示す（ｎ＝９０）。
【図１５】図１５は、分析した全ての患者における計算受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析（Ｎ＝４４１）である。標準誤差＝０．０１１、信頼区間（０．９４９−０．９９３）、漸近的有意性＝０．０１１。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
定義
本明細書で使用される用語は一般に、本発明の文脈および各用語が使用される特定の文脈内で、当技術分野での通常の意味を有する。本発明の方法およびそれらの使用方法を説明する際の追加の指針を実施者に提供するために、特定の用語を以下または本明細書の他の場所で説明する。さらに、同じことを複数の方法で言うことができることが理解されよう。したがって、本明細書で説明する用語のいずれか１つまたは複数に対して代替の言語および同義語を使用することも、用語を本明細書で詳述または説明するかどうかに特別な意義を置くこともできない。特定の用語の同義語が提供されている。１つまたは複数の同義語の記載は、他の同義語の使用を除外しない。本明細書で議論される用語の例を含む、本明細書のどこかの例の使用は、例示のみであり、本発明または例示される用語の範囲および意味を決して限定しない。同様に、本発明はその好ましい実施形態に限定されない。
【００４６】
本明細書で使用する「肝細胞癌（ＨＣＣ）」という用語は、肝臓の原発性悪性腫瘍を意味し、主に基礎となる慢性肝疾患および肝硬変の患者に発生する。起源の細胞は肝幹細胞であると考えられているが、これは依然として調査対象である。腫瘍は、局所的な拡大、肝内への拡がり、および遠隔転移とともに進行する。
【００４７】
本明細書で使用される、用語「対象」または本明細書で使用される「患者」は、治療を提供することができる哺乳動物、好ましくはヒトを指す。
【００４８】
本明細書で使用される「治療」または「治療する」という用語は、予防投与（発症予防）のため、または対象もしくは患者が罹っている場合にその虚弱または疾患または状態または事象の発症もしくは再発の程度もしくは可能性を治癒または抑制させるための対象に対する薬の投与または医療処置の実施を指す。本開示に関連して、この用語は、薬理学的物質もしくは製剤の投与、または放射線療法および手術を含むがこれらに限定されない非薬理学的方法の実施も意味し得る。本明細書で使用される薬理学的物質には、これらに限定されないが、例えばゲムシタビン（（ＧＥＭＺＡＲ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ）、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ）、アルブミン結合パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ）、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）、シスプラチン、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）、およびイリノテカンリポソーム（ＯＮＩＶＹＤＥ）のような当該技術分野で確立されている化学療法剤が含まれ得る。薬理学的物質には、チェックポイント阻害剤などの免疫療法で使用される物質が含まれ得、イピリムマブ、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、およびアテゾリムマブが含まれ得るが、これらに限定されない。治療には、放射線療法と手術だけでなく、多数の薬理物質が含まれる場合がある。
【００４９】
本明細書で使用する「薬剤」という用語は、効果を生み出すまたは生み出すことが可能な物質を意味し、化学物質、医薬品、生物製剤、有機小分子、抗体、核酸、ペプチド、タンパク質などが含まれるが、これらに限定されない。
【００５０】
語句「治療有効量」は、対象における臨床的に重大な状態の改善、または疾患に関連する１つまたは複数の症状の遅延もしくは最小化もしくは緩和、または対象に所望の有益な生理変化をもたらすのに十分な量を意味する。
【００５１】
用語「発現プロファイル」または「遺伝子発現プロファイル」は、特定の条件下またはそれに応答して細胞、組織、または生物によって発現される１つまたは複数の遺伝子の任意の説明または測定を指す。発現プロファイルは、特定の条件下で上方制御、下方制御、または影響を受けない遺伝子を特定できる。遺伝子発現は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで検出できる。核酸レベルでの発現プロファイリングは、遺伝子転写産物レベルを測定するための任意の利用可能な技術を使用して達成できる。例えば、この方法は、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンハイブリダイゼーション、またはオリゴヌクレオチドマイクロアレイもしくはｃＤＮＡマイクロアレイなどの核酸マイクロアレイへのハイブリダイゼーションを採用することができよう。あるいは、この方法では、蛍光色素ベースの定量リアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ（登録商標）ＰＣＲ）などの逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用できよう。タンパク質レベルでの発現プロファイリングは、タンパク質レベルを測定するための任意の利用可能な技術、例えばペプチド特異的捕捉剤アレイを使用して達成できる。
【００５２】
「遺伝子」、「遺伝子転写産物」、および「転写産物」という用語は、アプリケーションで多少交換可能に使用される。「構造遺伝子」とも呼ばれる「遺伝子」という用語は、１つまたは複数のタンパク質または酵素のすべてまたは一部を含む特定のアミノ酸配列をコード化または対応するＤＮＡ配列を意味し、例えば、遺伝子が発現される条件を決定するプロモーター配列などの調節ＤＮＡ配位列を含む場合と含まない場合がある。構造遺伝子ではない一部の遺伝子は、ＤＮＡからＲＮＡに転写されるが、アミノ酸配列に翻訳されない場合がある。他の遺伝子は、構造遺伝子の調節因子またはＤＮＡ転写の調節因子として機能し得る。「転写産物」または「遺伝子転写産物」は、特定の遺伝子の転写によって生成されるＲＮＡの配列である。したがって、転写産物を介して遺伝子の発現を測定できる。
【００５３】
本明細書で使用する「免疫クラス」という用語は、免疫細胞を特定するシグネチャー、すなわち、Ｔ細胞、細胞毒三次リンパ構造（ＴＬＳ）、およびマクロファージ、免疫メタ遺伝子、黒色腫および頭頸部扁平上皮癌におけるペムブロリズマブに対する反応を予測するＩＦＮ遺伝子シグネチャーおよびＰＤ−１シグナル伝達の有意な濃縮を示す肝細胞癌を有する患者を指す。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「ＩＦＮ」という用語はインターフェロンを指す。
【００５５】
本明細書で使用される「ＣＴＮＮＢ１」という用語は、カテニンベータ１を指す。
【００５６】
本明細書で使用される「ＮＭＦ」という用語は、非負行列因数分解を指す。
【００５７】
本明細書で使用される「ＴＬＳ」という用語は、三次リンパ構造を指す。
【００５８】
本明細書で使用される「ＦＤＲ」という用語は、誤発見率を指す。
【００５９】
本明細書で使用される「ＣＣＬ」という用語は、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンドを指す。
【００６０】
本明細書で使用される「ＣＸＣＬ」という用語は、ケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）リガンドを指す。
【００６１】
本明細書で使用される「ＪＡＫ／ＳＴＡＴ」という用語は、ヤヌスキナーゼ／シグナルトランスデューサーおよび転写活性化因子を指す。
【００６２】
本明細書で使用される「ＧＳＥＡ」という用語は、遺伝子セット濃縮分析を指す。
【００６３】
本明細書で使用される「ＥＭＴ」という用語は、上皮間葉移行を指す。
【００６４】
本明細書で使用される「ＮＴＰ」という用語は、最も近いテンプレート予測を指す。
【００６５】
本明細書で使用される「ＴＢＲＳ」という用語は、ＴＧＦ−ベータ応答シグネチャーを指す。
【００６６】
本明細書で使用される「Ｆ−ＴＢＲＳ」という用語は、線維芽細胞由来のＴＧＦ−β応答シグネチャーを指す。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「Ｔ−ＴＢＲＳ」という用語は、Ｔ細胞由来のＴＧＦ−β応答シグネチャーを指す。
【００６８】
本明細書で使用される「ＬＧＡＬＳ」という用語は、レクチン、ガラクトース結合、可溶性１を指す。
【００６９】
本明細書で使用される「ＮＫＧ２Ｄ」という用語は、ナチュラルキラーグループ２Ｄを指す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「ＴＢＸ」という用語は、１つのＴボックス転写因子を指す。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「ＦＦＰＥ」という用語は、埋め込まれたホルマリン固定パラフィンを指す。
【００７２】
本明細書で使用される「ＰＭＥＰＡ１」という用語は、前立腺膜貫通タンパク質、アンドロゲン誘導性１を指す。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「ＰＴＫ２」という用語は、プロテインチロシンキナーゼ２を指す。
【００７４】
本明細書で使用される「ＡＦＰ」という用語は、アルファフェトプロテインを指す。
【００７５】
本明細書で使用される「ＲＦ」という用語は、ランダムフォレストを指す。
【００７６】
本明細書で使用する「ＳＣＮＡ」という用語は、体細胞コピー数異常を指す。
【００７７】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容誤差範囲内であることを意味し、これは値の測定または決定方法、つまり、測定システムの制限、すなわち、医薬品製剤などの特定の目的に必要な精度に一部依存する。例えば、「約」は、当該技術分野の慣行により、１標準偏差内または１標準偏差を超えることを意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の２０％まで、好ましくは１０％まで、より好ましくは５％まで、さらにより好ましくは１％までの範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。本出願および特許請求の範囲に特定の値が記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値の許容誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定する必要がある。
【００７８】
分子生物学
本発明によれば、分子免疫学、細胞免疫学、薬理学、および微生物学で通常使用されるものなど、当該技術分野内の多数のツールおよび技法があり得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照されたい。３ｒｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｃｏｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．およびＥｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．（２００５）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．：Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎ．Ｊ．を参照されたい。
【００７９】
ＨＣＣの免疫クラスおよびサブクラス、活動性免疫応答および疲弊した免疫応答の同定
本発明は、ＨＣＣ患者において免疫応答性の表現型を正確に検出する遺伝子発現バイオマーカーのセットを使用して免疫応答性を検出するためのバイオマーカーとしてのＰＤ−Ｌ１発現を使用して問題を解決する。本明細書に記載のバイオマーカーは、免疫療法に対する患者の反応を明確に識別、検出、予測するための新規かつユニークな方法を提供するだけでなく、薬物スクリーニングやＨＣＣやその他のがんに関する基礎研究で使用するための多くのマーカーも提供する。
【００８０】
非負行列因子分解（ＮＭＦ）を使用して、実施形態が本明細書に記載され、９５６個のヒトＨＣＣサンプルの遺伝子発現データをデコンボリューションし、ＨＣＣの免疫学的景観を特徴づけるために炎症性浸潤からの放出信号を単離した。これにより、「免疫」クラスと呼ばれる特定の生物学的特性を持つＨＣＣの以前は気付かれていなかった堅牢な免疫特異的クラスの識別が可能になった。ＨＣＣの２５％近くは免疫クラスに属し、免疫細胞の高い浸潤、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の発現、および活性なＩＦＮ−γシグナル伝達を含むその分子特性は、免疫療法に最も反応する癌のものに非常に似ている（Ｊｉ，ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｌｅ，ｅｔ  ａｌ．２０１５；Ｂａｌｄ，ｅｔ  ａｌ．２０１４）。１１２個の遺伝子の発現を用いたこのクラスのさらなる評価（図１０）により、免疫療法に対する応答を示す遺伝子シグネチャープロファイルが見出された（実施例２および５）。この免疫クラスの遺伝子発現プロファイルは、免疫療法で治療されているＨＣＣ患者およびＨＣＣに反応した他の癌患者と比較された。これらの場合、免疫クラスの遺伝子発現プロファイルは、免疫療法応答性と相関した（実施例５；図８および９）。
【００８１】
元の１１２遺伝子の免疫分類子は、最高スコアの遺伝子を選択する５６遺伝子に成功裏に削減された（表３）。５６遺伝子の免疫分類子の予測能力がテストされ、３つのデータセット（ＴＧＣＡ、検証コホート、ＨＣＣ−Ｉデータセット）において１１２遺伝子の元の免疫分類子と比較された。５６遺伝子の免疫分類子の感度は９７％、特異度は９８％、精度は９７％であった（実施例１０、図１４および１５）。したがって、遺伝子発現バイオマーカーの使用は、免疫療法に反応するＨＣＣ患者の正確な検出を提供する。
【００８２】
ＰＤ−Ｌ１染色は免疫クラスで濃縮されたが、ほとんどの症例を捕捉できなかったため、次善のマーカーになる（実施例３）。上記のように、この知見は、ＨＣＣ患者を対象としたニボルマブを用いた大規模第ＩＩ相試験（Ｅｌ−Ｋｈｏｕｅｉｒｙ，ｅｔ  ａｌ．２０１７）で腫瘍細胞のＰＤ−Ｌ１発現について観察された予測能力の欠如と一致しており、免疫療法の恩恵を受けるＨＣＣ患者を検出するための他のバイオマーカーの必要性を示す。
【００８３】
この免疫クラスの免疫表現型は免疫療法への反応を予測できるが、チェックポイント阻害剤への好ましい反応は、腫瘍細胞、免疫細胞、および免疫応答を弱めるか強化する場合がある微小環境に存在する他の免疫調節剤間の複雑で動的な相互作用に依存するため、さらに分析が行われた。これに関して、免疫クラスの遺伝子発現プロファイルの仮想解剖により、そのような相互作用の解明が可能になり、サンプルの以下の２つの明確な微小環境ベースのクラスターが特定された：１）活性免疫応答、２）疲弊した免疫応答。これらのサブタイプの頑健性は、ＲＮＡ配列決定からマイクロアレイに及ぶサンプルの別個のタイプ（すなわち、新鮮凍結およびパラフィン包埋組織）を使用して、異なるプラットフォーム間での７つの独立したデータセットでそれらの正常な複製によって支持された。活性免疫応答クラスターは、ＩＦＮシグネチャーの濃縮、適応免疫応答遺伝子の過剰発現と良好な生存率などの抗腫瘍免疫特性を示した一方、疲弊した免疫応答は、腫瘍促進性シグナル（例えば、活性化された間質、Ｔ細胞枯渇および免疫抑制成分）によって特徴づけられた（図１２）。特に、攻撃的な癌で頻繁に過剰発現される強力な免疫調節サイトカインであるＴＧＦ−βの活性化は、疲弊したサブタイプで有意に濃縮された。ＴＧＦ−βは、腫瘍間質相互作用、血管新生、転移を調節し、Ｔ細胞枯渇の誘導（Ｐａｒｋ、ｅｔ  ａｌ．２０１６  ；Ｓｔｅｐｈｅｎ、ｅｔ  ａ．２０１４）およびＭ２型マクロファージの促進（Ｆｌａｖｅｌｌ、ｅｔ  ａｌ。２０１０）介して宿主免疫応答を抑制する（実施例４）。
【００８４】
免疫応答、発癌性シグナル伝達、および腫瘍微小環境間の相互作用を理解することは、現在の免疫療法の有効性を改善するために重要である。例えば、疲弊した免疫応答サブタイプ内の患者は、ＴＧＦ−β阻害と免疫チェックポイント遮断の組み合わせの恩恵を受けることができる。これに関して、ＨＣＣを含む進行固形腫瘍におけるニボルマブと組み合わせた新規ＴＧＦ−β阻害剤であるガルニセルチブを試験するフェーズ１ｂ／２臨床試験が現在進行中であり（ＮＣＴ０２４２３３４３）、患者の濃縮戦略はない。同様に、Ｔ細胞排除の原因となる発癌メカニズムの分析は、そうでなければ応答しない可能性が高い患者に追加の併用戦略をもたらす可能性がある。最近の分子解析により、ＣＴＮＮＢ１シグナル伝達経路の活性化と黒色腫およびその他の腫瘍におけるＴ細胞浸潤の低下との相関関係が明らかになった（Ｐｏｒｔａ−Ｐａｒｄｏ  ａｎｄ  Ｇｏｄｚｉｋ  ２０１６）。これらの発見と一致して、ＣＴＮＮＢ１クラス内のＨＣＣサンプルは、より低い免疫細胞シグネチャースコアを示した。興味深いことに、ＣＴＮＮＢ１クラスはＰＴＫ２の過剰発現も示した。これは、免疫排除を促進することが最近報告された別の発癌性シグナルである（Ｊｉａｎｇ、ｅｔ  ａｌ．２０１６）。
【００８５】
免疫療法に対する反応を予測する免疫クラスに関連する遺伝子
十分に議論されたように、免疫療法に対する反応の現在のバイオマーカーであるＰＤ−Ｌ１の発現は信頼性が低く、信頼性の高いバイオマーカーが当技術分野で必要とされている。本明細書のデータは、免疫療法に対する陽性反応と相関する遺伝子セットの形のバイオマーカーを初めて示す。
【００８６】
これらのバイオマーカーには、免疫クラスで差次的に発現する１１２個の遺伝子が含まれる。これらの遺伝子は図１０にリストされている。
【００８７】
５６個の遺伝子のセットは、免疫療法に対する陽性応答の関連付けにおいてより高感度かつ正確であることが示されている。これらの遺伝子は表３にリストされている。
【００８８】
さらに、図１１にリストされている１０８個の遺伝子は、免疫クラスで上方制御される。
【００８９】
これらのバイオマーカーを使用することにより、免疫療法に対するＨＣＣ患者の反応に関して重要な予測と決定を行うことができる。これらのバイオマーカーのテストは、ＨＣＣの診断後いつでも実行できるが、臨床医がＨＣＣの陽性診断を下した後、できるだけ早くそのようなテストを実行することが好ましいであろう。そのようにして、病気の貴重な洞察を治療の選択に利用することができる。
【００９０】
したがって、本発明の一の実施形態では、図１０の１つまたは複数の遺伝子の発現試験を行うことができ、陽性の結果は、対象が免疫療法の候補であることを示すであろう。
【００９１】
本発明のさらなる実施形態では、図１１の１つまたは複数の遺伝子の発現のための試験を行うことができ、陽性の結果は、対象が免疫療法の候補であることを示すであろう。
【００９２】
本発明のさらなる実施形態では、表３の１つまたは複数の遺伝子の発現のための試験を行うことができ、陽性の結果は、対象が免疫療法の候補であることを示すであろう。
【００９３】
これも十分に議論したように、本明細書のデータは、ＨＣＣ患者による治療に対する反応も予測する２つの異なるサブクラスも示す。活性免疫応答および疲弊した免疫応答と呼ばれるこれらのサブクラスは、図１２に見られる一連の遺伝子経路の発現によっても特定できる。
【００９４】
したがって、本発明のさらなる実施形態では、図１２にリストされた経路における１つまたは複数の遺伝子の発現の試験を行うことができ、陽性結果は、患者が免疫療法の候補である間、免疫療法はＴＧＦ−β阻害剤などの別の薬剤と組み合わせる必要があることを示すであろう。
【００９５】
これらの転写産物または遺伝子のいずれかを検出するために、ＨＣＣに関して陽性と診断された対象の腫瘍のサンプルを取得して調製し、バイオマーカーの存在、すなわち表３、図１０、１１、および／または１２の遺伝子発現について分析する。これは、診断検査室および／または医療提供者によって、さまざまな方法で実現できる。  あるいは、核酸は、肝臓、全血、および血漿を含むがこれらに限定されない任意の生体組織から、および血漿を含むがこれに限定されない任意の生体液から得ることができる。
【００９６】
核酸は、当該技術分野で公知の方法により、腫瘍、組織または体液の細胞から抽出、単離および精製される。
【００９７】
必要に応じて、公知の手法を使用して、遺伝子配列を含む核酸サンプルを調製する。例えば、当業者には理解されるように、公知の溶解緩衝液、超音波処理、エレクトロポレーションを使用して、必要に応じて精製および増幅を行って、サンプルを処理して細胞を溶解することができる。さらに、反応はさまざまな方法で達成できる。反応の成分は、同時に、または任意の順序で連続的に加えることができる。さらに、反応には、方法およびアッセイに有用なさまざまな他の試薬を含めることができ、最適なハイブリダイゼーションを促進するため、および／または非特異的またはバックグラウンドの相互作用を低減するために使用できる塩、緩衝液、アルブミンなどの中性タンパク質、および界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。また、それ以外では、サンプルの調製方法と純度に応じて、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤など、アッセイの効率を改善する試薬を使用することもできる。
【００９８】
調製後、ｍＲＮＡまたは他の核酸は、当業者に公知の方法で分析される。さらに、核酸が検出される場合、好ましい方法は、切断またはせん断技術を利用して、標的配列を含む核酸サンプルを、標的への取り扱いおよびハイブリダイゼーションを促進するサイズに切断する。これは、超音波処理などの機械的力により核酸をせん断することにより、または制限エンドヌクレアーゼを使用して核酸を切断することにより、または当該技術分野で既知の他の方法により達成することができる。ただし、ほとんどの場合、アーカイブ中に発生する自然分解により、「短い」オリゴヌクレオチドが生成される。一般に、本発明の方法およびアッセイは、２０〜１００塩基対の短いオリゴヌクレオチドで行うことができ、２０〜５０が好ましく、最も好ましいのは４４、４５、４６、４７、４８、および４９を含む４０〜５０である。
【００９９】
遺伝子発現を調べるための方法には、多くの場合、ハイブリダイゼーションベースであり、サザンブロット；ノーザンブロット；ドットブロット；プライマー伸長；ヌクレアーゼ保護；サブトラクティブハイブリダイゼーションと、例えばヒドロキシアパタイトを使用した非二重分子の分離；溶液ハイブリダイゼーション；フィルターハイブリダイゼーション；ＲＴ−ＰＣＲなどの増幅技術、融解曲線分析を使用したＰＣＲ、質量分析を使用したＰＣＲなどのその他のＰＣＲ関連技術；制限エンドヌクレアーゼなどのフィンガープリンティング；および構造特異的エンドヌクレアーゼの使用が含まれる。ｍＲＮＡの発現はまた、質量分析法（例えば、ＭＡＬＤＩまたはＳＥＬＤＩ）、液体クロマトグラフィー、およびキャピラリーゲル電気泳動を用いて分析することができる。当該技術分野で公知の任意のさらなる方法を使用して、転写産物の存在または不在を検出することができる。
【０１００】
これらの手法の一般的な説明については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．１９８９；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ  １９９０；およびＡｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０を参照されたい。
【０１０１】
遺伝子発現の検出のための好ましい方法は、アレイまたはマイクロアレイの使用である。これらの用語は交換可能に使用され、本明細書では「プローブ」と呼ばれる、異なる分子の表面または基板上の任意の秩序ある配列を指す。任意のアレイの各異なるプローブは、本明細書では、アレイの文脈においてその「標的」と呼ばれる特定分子を特異的に認識し、および／またはそれに結合することができる。マイクロアレイを使用して検出できる典型的な標的分子の例には、ｍＲＮＡ転写産物、ｃＲＮＡ分子、ｃＤＮＡ、ＰＣＲ産物、タンパク質が含まれる。
【０１０２】
マイクロアレイは、サンプル中の複数の異なる標的分子の有無、量を同時に検出するのに役立つ。サンプル中のプローブの標的分子の存在と量、または不在は、表面または基板上の特定の位置でプローブに結合した標的の有無と量を分析することで容易に決定できる。
【０１０３】
好ましい実施形態では、本発明で使用されるアレイは「アドレス可能なアレイ」であり、異なるプローブのそれぞれが特定の「アドレス」に関連付けられている。
【０１０４】
本発明において使用されるアレイは、表面または基板上に固定化された複数の核酸プローブを含む好適な核酸配列である。異なる核酸プローブは、サンプル中の異なる標的核酸分子に相補的であり、したがってハイブリダイズすることができる。したがって、各プローブを使用して、複数の異なる遺伝子の存在と量、例えば、異なるｍＲＮＡ分子またはそれから誘導される核酸分子（例えば、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡ）の存在と存在量を同時に検出することができる。
【０１０５】
アレイは再現性があり、特定のアレイの複数のコピーを作成し、それぞれの結果を簡単に比較できることが望ましい。好ましくは、マイクロアレイは小さく、結合条件下で安定な材料から作られる。マイクロアレイ内の特定の結合部位または結合部位の一意のセットは、標的に特異的に結合する。細胞のＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが作成され、適切な条件下でマイクロアレイにハイブリダイズされる場合、任意の特定の遺伝子に対応するアレイの部位へのハイブリダイゼーションのレベルまたは程度は、その遺伝子から転写されたｍＲＮＡの細胞の有病率を反映することが理解されよう。例えば、全細胞ｍＲＮＡに相補的な検出可能に標識された（例えば、フルオロフォアで）ｃＤＮＡがマイクロアレイにハイブリダイズする場合、細胞内で転写されない遺伝子に相当するアレイ上のる部位（すなわち、遺伝子の核酸産物に特異的に結合できる）はシグナルがほとんどないか、まったくないが、ｍＲＮＡが多く見られる遺伝子は比較的強いシグナルを持っている。
【０１０６】
例として、ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）は、遺伝子発現プロファイルおよびその他の生物学的アッセイの評価のためのデータを生成する。オリゴヌクレオチド発現アレイは、数千のｍＲＮＡ転写産物を同時に、定量的に「調査」する。各転写産物は、プローブアレイ上で複数のプローブペアによって表され、遺伝子ファミリーの密接に関連するメンバーを区別できる。各プローブには、特定のオリゴヌクレオチドプローブの何百万ものコピーが含まれており、低強度のｍＲＮＡハイブリダイゼーションパターンでも正確かつ高感度に検出できる。スキャナーまたは光学検出システムを使用してハイブリダイゼーションデータをキャプチャした後、ソフトウェアを使用して各プローブセルの強度値を自動的に計算できる。プローブ細胞の強度を使用して、ｍＲＮＡの存在量レベルと相関する各遺伝子の平均強度を計算できる。発現データは、任意の分析パラメーターに基づいて迅速にソートし、任意に選択した遺伝子のサブセットに対してさまざまなグラフィック形式で表示できる。
【０１０７】
本発明のアッセイおよび方法で使用できるマイクロアレイのさらなる例は、例えば米国特許第５，３２４，６３３号；５，７４４，３０５号；５，４５１，６８３号；５，４８２，８６７号；５，４９１，０７４号；５，６２４，７１１号；５，７９５，７１６号；５，８３１，０７０号；５，８５６，１０１号；５，８５８，６５９号；５，８７４，２１９号；５，９６８，７４０号；５，９７４，１６４号；５，９８１，１８５号；５，９８１，９５６号；６，０２５，６０１号；６，０３３，８６０号；６，０９０，５５５号；６，１３６，２６９号；６，０２２，９６３号；６，０８３，６９７号；６，２９１，１８３号；６，３０９，８３１号；６，４１６，９４９号；６，４２８，７５２号および６，４８２，５９１号に記載されているＶＬＳＩＰＳ（商標）（Ｖｅｒｙ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）技術と呼ばれることもある技術に従って合成されたマイクロアレイである。
【０１０８】
本発明における使用に有用な他の例示的なアレイには、これらに限定されないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）、Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サンディエゴ）から利用可能なＳｅｎｔｒｉｘ（登録商標）アレイもしくはＳｅｎｔｒｉｘ（登録商標）ＢｅａｄＣｈｉｐアレイまたは米国特許第６，２６６，４５９号、６，３５５，４３１号；６，７７０，４４１号；および６，８５９，５７０号に記載されているようなウェル内にビーズを含む他のもが含まれる。表面に粒子を有するアレイも使用することができ、それらには米国特許第６，４８９，６０６号；７，１０６，５１３号；７，１２６，７５５号；および７，１６４，５３３号に記載されているものが含まれる。
【０１０９】
フローサイトメーターまたは類似の装置の流体流などの流体形式のビーズの配列もまた、本発明方法で使用することができまる。マイクロ流体デバイスを使用して流体サンプル中のビーズを区別するために本発明で使用できる例示的なフォーマットは、例えば、米国特許第６，５２４，７９３号に記載されている。ビーズを区別するための市販の流体フォーマットには、例えば、ＬｕｍｉｎｅｘのＸＭＡＰ（商標）テクノロジーまたはＬｙｎｘ  ＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓのＭＰＳＳ（商標）メソッドで使用されるものが含まれる。
【０１１０】
スポットマイクロアレイも本発明の方法で使用できる。例示的なスポットマイクロアレイは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手可能なＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）アレイである。
【０１１１】
発明に有用な他のマイクロアレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社から入手可能なＳｕｒｅＰｒｉｎｔ（商標）技術として、インクジェット印刷法を用いて製造されたものである。本発明で使用することができる他のマイクロアレイには、米国特許第５，４２９，８０７号、５，４３６，３２７号；５，５６１，０７１号；５，５８３，２１１号；５，６５８，７３４号；５，８３７，８５８号；５，９１９，５２３号；６，２８７，７６８号；６，２８７，７７６号；６，２８８，２２０号；６，２９７，００６号；６，２９１，１９３号；および６，５１４，７５１号に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１２】
本発明のスクリーニングおよび診断方法は、標的遺伝子座の増幅を含み得る。核酸配列の標的増幅のための好ましい方法は、ポリメラーゼ、特にポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用することである。ＰＣＲまたは他のポリメラーゼ駆動増幅法は、関連する核酸配列の数百万のコピーを取得し、次いでプローブの基質として使用したり、配列決定したり、または他のアッセイで使用することができる。
【０１１３】
ポリメラーゼ連鎖反応を使用する増幅は、本発明の実施形態において特に有用である。ＰＣＲは、ＤＮＡのソース内に存在する定義済みのターゲットＤＮＡ配列を増幅するための迅速で多用途のｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。通常、この方法は、ＤＮＡ配列の異種コレクション（例：総ゲノムＤＮＡまたは複雑なｃＤＮＡ集団）内の特定の標的ＤＮＡ配列の選択的増幅を可能にするように設計されている。そのような選択的増幅を可能にするために、標的配列からのいくつかの事前のＤＮＡ配列情報が必要である。この情報を使用して、標的配列に特異的で、多くの場合約１５〜２５ヌクレオチド長の２つのオリゴヌクレオチドプライマー（アンプリマー）を設計する。
【０１１４】
免疫チェックポイント阻害剤による治療
免疫チェックポイントは、免疫系のＴ細胞機能を調節する。Ｔ細胞は、細胞性免疫において中心的な役割を果たす。チェックポイントタンパク質は、Ｔ細胞にシグナルを送り、Ｔ細胞機能を本質的に停止または阻害する特定のリガンドと相互作用する。がん細胞は、その表面に高レベルのチェックポイントタンパク質発現を駆動させて腫瘍微小環境に進入するＴ細胞の表面でのチェックポイントタンパク質発現  を制御し、抗がん免疫応答を抑制するシステムを利用する。従って、チェックポイントタンパク質の阻害は、Ｔ細胞機能の完全または部分的な回復と癌細胞に対する免疫応答をもたらす。チェックポイントタンパク質の例には、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（分子のＣＤ２ファミリーに属し、すべてのＮＫ、γδ、およびメモリーＣＤ８  ＋（αβ）Ｔ細胞に発現）、ＣＤ  １６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ  １およびＣＨＫ２キナーゼ、Ａ２ａＲ、およびさまざまなＢ−７ファミリーリガンドが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１５】
チェックポイント阻害剤には、統計的に有意な方法で免疫系の阻害経路を遮断または阻害する薬剤が含まれる。そのような阻害剤は、小分子阻害剤を含んでもよく、または免疫チェックポイント受容体に結合して遮断もしくは阻害する抗体またはその抗原結合断片、または免疫チェックポイント受容体リガンドに結合して遮断もしくは阻害する抗体を含んでもよい。遮断または阻害の標的となり得る例示的なチェックポイント分子には、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４（ＣＤ２ファミリー分子に属し、すべてのＮＫ、γδ、およびメモリーＣＤ８＋（αβ）Ｔ細胞で発現）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５とも呼ばれる）、ＣＧＥＮ−１５０４９、ＣＨＫ  １およびＣＨＫ２キナーゼ、Ａ２ａＲおよびさまざまなＢ−７ファミリーリガンドが含まれるが、これらに限定されない。Ｂ７ファミリーリガンドには、Ｂ７−１、Ｂ７−２、Ｂ７−ＤＣ、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６およびＢ７−Ｈ７が含まれるが、これらに限定されない。チェックポイント阻害剤には、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＰＤ−１、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ  １６０およびＣＧＥＮ−１５０４９の１つまたは複数に結合し、その活性を遮断もしくは阻害する抗体またはその抗原結合断片、他の結合タンパク質、生物学的治療薬または小分子が含まれる。例示的な免疫チェックポイント阻害剤には、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ−４遮断抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体（抗Ｂ７−Ｈ１；ＭＥＤＩ４７３６）、ＭＫ−３４７５（ＰＤ−１遮断薬）、ニボルマブ（抗ＰＤ１抗体）、ＣＴ−０１１（抗ＰＤ１抗体）、ＢＹ５５モノクローナル抗体、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤＬ１抗体）、ＢＭＳ−９３６５５９（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤＬ１抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤＬ１抗体）およびヤーボイ／イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４チェックポイント阻害剤）が含まれる。チェックポイントタンパク質リガンドには、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ２８、ＣＤ８６およびＴＩＭ−３が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞およびプロＢ細胞で発現する２８８アミノ酸の細胞表面タンパク質分子であり、それらの運命／分化に役割を果たす。ＰＤ−１には、Ｂ７ファミリーのメンバーであるＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２の２つのリガンドがある。ＰＤ−１は、免疫監視からの腫瘍特異的逃避において役割を果たす。ＰＤ−１は、Ｔリンパ球（ＴＩＬ）に浸潤している黒色腫で上方制御されている（Ｄｏｔｔｉ（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１４（８）：１４５７−５８）。腫瘍はＰＤ−１リガンド（ＰＤＬ−１およびＰＤＬ−２）を発現することが判明しており、ＣＴＬにおけるＰＤ−１のアップレギュレーションと組み合わせると、Ｔ細胞機能の喪失およびＣＴＬの効果的な抗腫瘍応答仲介能力の低下の有力な因子となり得る。
【０１１７】
黒色腫の臨床試験では、抗ＰＤ−１遮断による強力な抗腫瘍反応が示されている。進行黒色腫、卵巣がん、非小細胞肺がん、前立腺がん、腎細胞がん、および結腸直腸がんの場合のＰＤ−１阻害による有意な利益も報告されている。マウスモデルの研究は、この証拠を神経膠腫治療に適用している。放射線に対する抗ＰＤ−１遮断アジュバントは、細胞傷害性Ｔ細胞集団を促進し、神経膠腫腫瘍のマウスでの長期生存の利点をもたらした。
【０１１８】
本開示の一の態様は、ＰＤ−１の阻害剤として作用することができる抗体であるチェックポイント阻害剤を提供することで、ＰＤ−１によって制御される免疫応答を調節する。一実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は抗原結合フラグメントであり得る。本明細書に開示される抗ＰＤ−１抗体は、ヒトＰＤ−１に結合し、ＰＤ−１の活性を刺激し、それによりＰＤ−１を発現する免疫細胞の機能を阻害することができる。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１ブロッカーの例は、米国特許第７，４８８，８０２号；７，９４３，７４３号；８，００８，４４９号；８，１６８，７５７号；８，２１７，１４９号、ならびにＰＣＴ公開特許出願ＷＯ０３０４２４０２、ＷＯ２００８１５６７１２、ＷＯ２０１００８９４１１、ＷＯ２０１００３６９５９、ＷＯ２０１１０６６３４２、ＷＯ２０１１１５９８７７、ＷＯ２０１１０８２４００、およびＷＯ２０１１１６１６９９に記載されている。
【０１１９】
現在、臨床試験でテストされているＰＤ−１阻害剤がいくつかある。ＣＴ−０１１は、ＰＤ−１に対するヒト化ＩｇＧ１モノクローナル抗体である。自家幹細胞移植を受けたびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）を有する対象における第ＩＩ相臨床試験が最近完了した。予備的結果は、対照群の４７％と比較して、対象の７０％が追跡期間終了時に無増悪であり、対照群の６２％と比較して対象の８２％が生存していたことを示した。この試験では、ＣＴ−０１１がＰＤ−１の機能を遮断するだけでなく、ナチュラルキラー細胞の活性も増強するため、抗腫瘍免疫応答が強化されることが判明した。
【０１２０】
ＢＭＳ  ９３６５５８は、ＰＤ−１を標的とする完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。フェーズＩの試験では、治療抵抗性の進行した悪性腫瘍を有する対象へのＢＭＳ−９３６５５８の隔週投与により、永続的な部分的または完全な退縮が示された。最も有意な反応率は、黒色腫（２８％）および腎細胞癌（２７％）の対象で観察されたが、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の対象でも実質的な臨床活性が観察され、一部の反応は１年以上さらに持続した。
【０１２１】
ＢＭＳ  ９３６５５９は、ＰＤ−１リガンドＰＤ−Ｌ１を標的とする完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。フェーズＩの結果は、この薬剤の隔週投与が、特に黒色腫の対象で持続的な反応をもたらすことを示した。客観的反応率は、進行期ＮＳＣＬＣ、黒色腫、ＲＣＣ、または卵巣がんの対象のがんの種類に応じて６％〜１７％の範囲で、一部の対象は１年以上継続して反応を経験した。
【０１２２】
ＭＫ  ３４７５は、進行性胃または胃食道接合部（ＧＥＪ）腺癌の一次治療として、第ＩＩＩ相試験単独または化学療法の併用対化学療法単独におけるヒト化ＩｇＧ４抗ＰＤ−１モノクローナル抗体である。ＭＫ  ３４７５は現在、数多くの世界的な第ＩＩＩ相臨床試験を実施している。
【０１２３】
ＭＰＤＬ  ３２８０Ａ（アテゾリズマブ）はモノクローナル抗体であり、ＰＤ−Ｌ１も標的にする。ＭＰＤＬ  ３２８０Ａは、ＮＳＣＬＣがＰＤ−Ｌ１を発現し、標準治療中または治療後に進行した人々の治療のために、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）から画期的な治療指定を受けた。
【０１２４】
ＡＭＰ  ２２４は、第２  ＰＤ−１リガンド、ＰＤ−Ｌ２の細胞外ドメインとＩｇＧ１の融合タンパク質であり、ＰＤ−Ｌ２／ＰＤ−１相互作用を遮断する可能性がある。ＡＭＰ−２２４は現在、進行がんを有する対象の単剤療法として第Ｉ相試験を受けている。
【０１２５】
Ｍｅｄｉ  ４７３６は抗ＰＤ−Ｌ１抗体であり、この用量漸増試験で許容できる安全性プロファイルと永続的な臨床活性を実証している。複数のがんの拡大と、単独療法および併用療法としてのＭＥＤＩ４７３６の開発が進行中である。
【０１２６】
したがって、特定の実施形態では、ＰＤ−１ブロッカーには、抗ＰＤ−１抗体、およびＰＤ−Ｌ１に結合してリガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２によるＰＤ−１の活性を遮断するＩｇＧ４抗体であるニボルマブ（ＭＤＸ  １１０６、ＢＭＳ  ９３６５５８、ＯＮＯ  ４５３８）などの類似の結合タンパク質；ペムブロリズマブ／ランブロリズマブ（ＭＫ−３４７５またはＳＣＨ  ９００４７５）、抗ＰＤ−１ヒト化モノクローナルＩｇＧ４抗体；ＰＤ−１に結合するＣＴ−０１１ヒト化抗体；Ｂ７−ＤＣの融合タンパク質であるＡＭＰ−２２４；抗体Ｆｃ部分；ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）遮断のためのＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５−０１）が含まれる。他の免疫チェックポイント阻害剤には、可溶性Ｉｇ融合タンパク質であるＩＭＰ３２１などのリンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）阻害剤が含まれる（Ｂｒｉｇｎｏｎｅ、ｅｔ  ａｌ．、２００７、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７９：４２０２−４２１１）。他の免疫チェックポイント阻害剤には、Ｂ７−Ｈ３およびＢ７−Ｈ４阻害剤などのＢ７阻害剤が含まれる。特に、抗Ｂ７−Ｈ３抗体ＭＧＡ２７１（Ｌｏｏ、ｅｔ  ａｌ．、２０１２、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｊｕｌｙ  １５（１８）３８３４）。ＴＩＭ３（Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３）阻害剤も含まれる（Ｆｏｕｒｃａｄｅ、ｅｔ  ａｌ  ．、２０１０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０７：２１７５−８６およびＳａｋｕｉｓｈｉ、ｅｔ  ａｌ．、２０１０、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０７：２１８７−９４）。
【０１２７】
対象に投与される任意の特定の医薬品の正確な有効量は、サイズと健康、状態の性質と程度、および投与のために選択された治療薬または治療薬の組み合わせに依存する。所定の患者の有効量は、日常的な実験により決定され、臨床医の判断の範囲内である。本抗体化合物の治療有効量は、採取された臓器または患者に投与される単回投与あたり約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０  ｍｇ／ｋｇ、または約０．０５  ｍｇ／ｋｇ〜約１０  ｍｇ／ｋｇの範囲の量を含み得る。公知の抗体ベースの医薬品は、この点で指針を提供する。例えば、ハーセプチン（商標）は、２１  ｍｇ／ｍｌ溶液の静脈内注入によって投与され、初期負荷用量は４  ｍｇ／ｋｇ体重で、毎週の維持用量は２  ｍｇ／ｋｇ体重であり、例えばリツキサン（商標）は、３７５  ｍｇ／ｍ  ２で毎週投与される。
【０１２８】
任意の個々の患者の治療有効量は、腫瘍退縮、循環腫瘍細胞、腫瘍幹細胞または抗腫瘍反応に対する抗体化合物の効果を監視することにより、医療提供者が決定できる。これらの方法によって得られたデータの分析により、治療中の治療計画の変更が可能になり、本開示の抗体化合物の最適量は、単独もしくは互いに組み合わせて、または別の治療薬と組み合わせて、またはその両方で使用されるかどうかにかかわらず、投与され、治療の期間も同様に決定できる。このようにして、単独または組み合わせで使用される、満足のいく効力を示す抗体化合物の最低量が投与されるように、およびそのような化合物の投与が患者をうまく治療するのに必要な間だけ継続される治療の過程にわたって投与／治療計画を変更することができる。公知の抗体ベースの医薬品は、投与の頻度に関する指針、例えば、医薬品を毎日、毎週、毎月送達するかどうかなどを提供する。頻度と投与量は症状の重症度にも依存し得る。
いくつかの実施形態では、本開示の抗体化合物は、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、腹腔内、髄腔内、脳室内、経皮（ｔｒａｎｓｄｅｒｍａｌ）、経皮（ｔｒａｎｓｃｕｔａｎｅｏｕｓ）、局所、皮下、腫瘍内、鼻腔内、腸内、舌下、膣内、膀胱内または直腸経路を含むこれらに限定されない様々な経路によって投与され、ヒトの医薬として使用することができる。組成物は、腫瘍などの病変に直接投与することもできる。投薬治療は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールであってもよい。典型的には、治療用組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射剤として調製することができる。注射前の液体ビヒクル中の溶液または懸濁液に適した固体形態も調製することができる。
【０１２９】
ＨＣＣの現在の治療法は、遺伝子発現プロファイルを使用して、対象が免疫療法に反応することを決定するという点で独特である。今日まで、免疫療法を用いた対象の腫瘍の遺伝的プロファイルの取得のこの組み合わせは、ＨＣＣ治療や免疫療法を用いた他の癌の治療には使用されていない。ＨＣＣを治療するこの従来とは異なる方法は、患者の転帰を改善する。
【０１３０】
キット
本明細書に開示されている方法およびアッセイはすべて、医療提供者および／または診断検査室で使用するためのキットの形にすることができると考えられる。
【０１３１】
１つまたは複数の遺伝子バイオマーカーの検出と定量のためのアッセイをキットに組み込むことができる。このようなキットには、表３、図１０、１１、および／または１２にリストされている１つまたは複数の遺伝子のプローブ、生体組織または体液から核酸を分離および精製するための試薬、分離および精製された核酸について分析を実行するための試薬、使用説明書、および参照値または含まれる遺伝子の対照サンプルの参照値を取得する手段が含まれるであろう。
【０１３２】
これらのキットの好ましい実施形態では、プローブが固体状態に取り付けられている。最も好ましい実施形態は、表３、図１０、１１、および／または１２からの１つまたは複数の遺伝子の核酸プローブが表面または基板上に規則正しく配置されたマイクロアレイ形式のプローブを有する。
【０１３３】
実施例
以下の実施例は、本開示の実施形態を実証するために含まれている。以下の実施例は、例示のみを目的として提示されており、本開示を使用する際に当業者を支援するものである。これらの実施例は、本開示の範囲を制限することを意図するものではない。当業者は、本開示に照らして、開示された特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、本開示の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果を得ることができることを理解すべきである。
【０１３４】
実施例１−実施例２〜１０の材料と方法
患者とサンプル
この研究のために、合計９５６個のＨＣＣヒトサンプルの遺伝子発現プロファイルを分析（図１）し、これには、２２８の外科的に切除された新鮮凍結（ＦＦ）サンプルのトレーニングコホート（Ｈｅｐｔｒｏｍｉｃデータセット、ＧＳＥ６３８９８）が含まれる。トレーニングセットのすべてのサンプルは、ＩＲＢ承認時にＨＣＣゲノムコンソーシアムの２つの機関：ＩＲＣＣＳ  Ｉｓｔｉｔｕｔｏ  Ｎａｚｉｏｎａｌｅ  Ｔｕｍｏｒｉ（ミラノ、イタリア）およびＨｏｓｐｉｔａｌＣｌｉｎｉｃ（バルセロナ、スペイン）から以前に取得した。ＲＮＡプロファイリングおよびメチル化データは、２２８個のＨＣＣサンプルすべておよび１６８個の非腫瘍肝隣接肝硬変組織について入手可能であり、他の場所で公開されている（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ、ｅｔ  ａｌ．２０１５）。７つの独立したデータセットからの混合病因患者の追加７２８個のＨＣＣサンプルを外部検証に使用した（図１）。７つの独立したデータセットからの混合病因患者の追加７２８  個のＨＣＣサンプルを外部検証に使用した（図１）。
【０１３５】
これらのデータセットの１つである検証セットには、発明者によって以前に収集され、ＤＡＳＬ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｉｎｃ．、サンディエゴ、ＣＡ）テクノロジー（ＧＳＥ２０１４０、トレーニングセットと重複しないサンプル）（Ｃｈｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｖｉｌｌａｎｅｕｖａ，ｅｔ  ａｌ．２０１１）でプロファイルされた１３１個のＦＦＰＥ組織サンプルが含まれていた。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ  ２０００プラットフォームでのＲＮＡ配列決定によってプロファイルされたＴＣＧＡコホート（ｎ＝１９０）および５つの追加のマイクロアレイプロファイルセット（Ｌｅｅ，ｅｔ  ａｌ．２００４；Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．２００２；Ｉｉｚｕｋａ，ｅｔ  ａｌ．２００３；Ｂｏｙａｕｌｔ，ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｈｏｓｈｉｄａ，ｅｔ  ａｌ．２００９）を含む、６つの追加の公開されている入手可能なデータセットは、さらなる検証のために使用された。トレーニングおよび検証データセット（検証およびＴＣＧＡセット）に含まれる患者の臨床病理データとフォローアップを表１に要約する。
【０１３６】
追加のデータセットの臨床病理学的パラメーターは他で報告されている（Ｌａｃｈｅｎｍａｙｅｒ、ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
【０１３７】
【表１】
2020523022.tif 000003
【０１３８】
ＡＦＰ−アルファフェトプロテイン；ＢＣＬＣ−バルセロナクリニック肝癌；ＩＱＲ−四分位範囲；Ｎ／Ａ−利用不可。
ａ−欠損値トレーニングセット：病因（ｎ＝２）；
チャイルド・ピュースコア（ｎ＝２）；
複数の結節（ｎ＝１）；
血管浸潤（ｎ＝３）
ＢＣＬＣ  ０−Ａ（ｎ＝２）；
腫瘍の分化（ｎ＝４２）；
ビリルビン（ｎ＝３２）；
ＡＦＰ（ｎ＝１１）；
アルブミンとビリルビン（ｎ＝４）；
血小板（ｎ＝２）；
再発（ｎ＝７）。
欠損値検証セット：病因（Ｎ＝３）。
チャイルド・ピュースコア（ｎ＝６）；
腫瘍サイズ（ｎ＝２）；
複数の結節（ｎ＝２）；
血管浸潤（ｎ＝６）
サテライト（ｎ＝６）；
ＢＣＬＣ  ０−Ａ（ｎ＝４）；
腫瘍の分化（ｎ＝４）；
ビリルビン（ｎ＝６）；
ＡＦＰ（ｎ＝１０）；
アルブミン（ｎ＝９）；
血小板（ｎ＝５）；
再発（ｎ＝１）。
欠損値ＴＣＧＡセット：チャイルド・ピュースコア（Ｎ＝８７）。
血管浸潤（ｎ＝３２）
腫瘍の分化（ｎ＝５）；
ビリルビン（ｎ＝５０）；
ＡＦＰ（ｎ＝５８）；
アルブミン（ｎ＝５５）；
不正確な血小板数；
再発（ｎ＝４０）；
病因、腫瘍のサイズと数、サテライト、および更新されたフォローアップ情報は利用不可。
【０１３９】
免疫発現パターンと教師なしクラスタリングの特定
遺伝子発現データの仮想の顕微解剖は、前述（Ｍｏｆｆｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．２０１５）のように、要因の数としてｋ＝１０で、教師なし非負行列因子分解（ＮＭＦ、遺伝子パターンモジュール）を使用してトレーニングセットで行った（Ｂｒｕｎｅｔ，ｅｔ  ａｌ．２００４）。単一サンプルの遺伝子セット濃縮解析（ｓｓＧＳＥＡ、遺伝子パターンモジュール）によって計算された免疫濃縮スコア（Ｙｏｓｈｉｈａｒａ、ｅｔ  ａｌ．２０１３）にＮＭＦ識別因子を統合することにより、免疫関連の発現パターンが明らかになった。免疫発現パターンがＮＭＦによってデコンボリューションされ、ｓｓＧＳＥＡスコアとの統合によって特徴付けられると、上位の遺伝子（または模範的な遺伝子）がその負荷に従ってリストされた。免疫発現パターンの典型的な遺伝子は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）によってさらに特徴付けられた。次に、ＮＭＦコンセンサス（遺伝子パターンモジュール）を使用して、これらの模範遺伝子の教師なしクラスタリングを実行した。得られたクラスの堅牢性は、従来のランダムフォレスト手順を使用して評価された（Ｂｒｅｉｍａｎ  ２００１）。
【０１４０】
免疫クラスの分子特性
分子経路および遺伝子発現シグネチャーの濃縮は、ＧＳＥＡ、ｓｓＧＳＥＡ、および最近傍テンプレート予測（ＮＴＰ）分析（遺伝子パターンモジュール）を使用して評価され（Ｒｅｉｃｈ、ｅｔ  ａｌ．２００６）。この目的のために、分子シグネチャーデータベースの遺伝子セットおよび炎症の異なる状態または個別の免疫細胞を表す以前に報告された遺伝子発現シグネチャーを試験した（Ｍｏｆｆｉｔｔ，ｅｔ  ａｌ．２０１５；Ｙｏｓｈｉｈａｒａ，ｅｔ  ａｌ．２０１３；Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  ２０１５；Ｆｉｎｋｉｎ，ｅｔ  ａｌ．２０１５；Ｍｅｓｓｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｑｕｉｇｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．２０１０；Ｓｐｒａｎｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．２０１５；Ｃｏａｔｅｓ，ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｂｉｎｄｅａ，ｅｔ  ａｌ．２０１３；Ａｌｉｓｔａｒ，ｅｔ  ａｌ．２０１４；Ｒｉｂａｓ，ｅｔ  ａｌ．２０１５；Ｃｈｏｗ，ｅｔ  ａｌ．２０１６；Ｃａｌｏｎ，ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｒｏｏｎｅｙ，ｅｔ  ａｌ．２０１５）（図２）。以前に公開されたＨＣＣの分子分類についても分析した（Ｃｈｉａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｈｏｓｈｉｄａ，ｅｔ  ａｌ．２００９；Ｃｏｕｌｏｕａｒｎ，ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｈｏｓｈｉｄａ，ｅｔ  ａｌ．２００８）（図２）。以前に公開されたＨＣＣ分子分類の予測は、ＮＴＰ分析（遺伝子パターン）を使用して実行した。免疫クラス対残り、および疲弊した免疫応答タイプ対活性免疫応答タイプで過剰発現した遺伝子は、ＦＤＲ  ＜０．０５および倍数変化（ＦＣ）が３以上の比較マーカー選択（ＣＭＳ、遺伝子パターン）によって識別された。次に、模範的な遺伝子をＤａｖｉｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎによって特徴付けた。ＧＳＥＡは、各サブグループで強化された経路を識別するために適用した。
【０１４１】
免疫組織化学と免疫浸潤の評価および三次リンパ構造の存在
免疫浸潤およびＴＬＳの存在は、専門病理学者（ＳＴ）によって分析された。ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色スライドは、免疫浸潤量に従って評価され、０＝免疫細胞浸潤なし、１＝最小、２＝軽度の浸潤、３＝中程度、４＝重度の浸潤としてスコア化された。染色が０〜２のサンプルは免疫浸潤が低いとみなされ、３〜４スコアは免疫浸潤が高いと分類された。ＴＬＳの存在もＨ＆Ｅスライドで定量化された。ＴＬＳは、連続変数として評価され、陰性（＜５フォーカス、１０倍）または陽性（５フォーカス、１０倍以上）として分類された。
【０１４２】
ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の免疫組織化学は、トレーニングコホート（免疫クラス内外）に属する１００人の患者のサブセットで実施された。免疫組織化学染色は、１０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＥＤＴＡ（ｐＨ＝９）を用いたマイクロ波での熱誘導抗原回復後に、厚さ３μｍのＦＦＰＥ組織切片で実施した。使用した一次抗体は、抗ＰＤ１（Ａｂｃａｍ、クローンＮＡＴ１０５）、および抗ＰＤ−Ｌ１（Ａｂｃａｍ、クローン２８−８）であった。ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１の免疫染色陽性は、発現プロファイリング結果を知らない２人の専門病理学者（ＪＰおよびＳＴ）によって評価された。前述のように、ＰＤ１の陽性染色を半定量的に測定した（ＰＤ−１／高対ＰＤ−１／低）（Ｃａｌｄｅｒａｒｏ、ｅｔ  ａｌ．２０１６）。簡単に言えば、ＰＤ−１は、腫瘍全体に分布する炎症細胞クラスターの腫瘍内病巣でのみ観察された。腫瘍内のクラスターの数がクラスターの中央値以上である場合、クラスターの数を数え（２０Ｘ）、サンプルをＰＤ−１／高に分類した。一方、腫瘍内炎症細胞はほとんど陰性であったため、ＰＤ−Ｌ１発現は腫瘍性ＨＣＣ細胞でのみ評価された。
【０１４３】
ＨＣＣおよび他のがんで以前に説明したように、膜染色を示す腫瘍細胞の割合を記録し、陽性細胞の少なくとも１％を含む腫瘍を陽性と分類した（Ｃａｌｄｅｒａｒｏ、ｅｔ  ａｌ。２０１６；Ｒｏｂｅｒｔ、ｅｔ  ａｌ．２０１５；Ｇａｒｏｎ、ｅｔ  ａｌ．２０１５；Ｂｏｒｇｈａｅｉ、ｅｔ  ａｌ．２０１５）。
【０１４４】
免疫クラスのメチル化プロファイルの分析
トレーニングコホートに含まれるすべての患者のメチル化データはすでに入手可能であり、他の場所で公開されている。簡単に説明すると、バイサルファイト変換ＤＮＡ（ｂｓ−ＤＮＡ）をＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＦＦＰＥ修復プロセスで処理し、次に、製造元（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）の指示に従ってＩｎｆｉｎｉｕｍ  ＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０  ＢｅａｄＣｈｉｐアレイでハイブリダイズした。結果の生強度データ（ＩＤＡＴ）は、ｍｉｎｆｉ  Ｒパッケージ（ｖ１．１２．０）で開発されたイルミナ正規化方法を使用して正規化された。正規化工程の後、Ｙ染色体に関連するプローブ、および製品記述ファイルに注釈が付けられているように、ＳＮＰが含まれる調査対象部位に近い１０塩基のプローブが削除された。さらに、関連するｐ値が０．０１を超えるＣｐＧ部位は分析のために破棄された。最後に、プロモーター領域に存在するＣｐＧ部位のみが選択された。分析された３つの異なるグループ（疲弊した免疫応答、活性免疫応答、残り）の教師付きヒートマップ表示では、ＡＮＯＶＡ分析を適用してＣｐＧ部位を選択し、グループ間で差次的にメチル化された統計的に有意なＣｐＧ部位（ＦＤＲ調整ｐ値＜０．０５）を特定した（Δβ＞  ０．２）。選択されたＣｐＧ部位は、後にワードのリンケージによって集約されたマンハッタン距離に基づいてクラスター化された。
【０１４５】
独立したデータセットでの免疫分類子の生成と性能検証
免疫遺伝子シグネチャー分類子は、トレーニングセット（Ｈｅｐｔｒｏｍｉｃ  コホート、ｎ＝２２８）で免疫クラス（ＦＤＲ  ＜０．０５、ＦＣ≧３）に属するかどうかに応じて、ＨＣＣサンプル間で差次的に発現される遺伝子を使用して生成された。免疫クラスを捕捉するシグネチャーの性能は、検証セット（ＧＳＥ２０１４０）およびＮＴＰ分析（遺伝子パターン）を使用して公開されている６つの入手可能なデータセットで検証された。ニボルマブの適応外投与を受けた２人の患者を研究に含めて、免疫療法に対する反応を予測する免疫分類子の能力を評価した。患者の同意を得て、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘヒトゲノム  Ｕ２１９  アレイプレート（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用して、治療前の任意の時点で収集された利用可能なアーカイブ組織（ＧＳＥ９３６４７）に由来する腫瘍切片に対してＲＮＡ抽出およびＲＮＡプロファイリングを実施した。発現プロファイル（Ｃｈｅｎ、ｅｔ  ａｌ．２０１６）に基づいて独立した患者コホート間の分子クラスの類似性を定量的に評価するバイオインフォマティクス手法であるクラスマッピング（ＳｕｂＭａｐ）分析（Ｇｅｎｅ  Ｐａｔｔｅｒｎ）を使用し、免疫療法で治療された免疫サブタイプと黒色腫患者の遺伝子発現プロファイル間の類似性を測定した（Ｃｈｅｎ、ｅｔ  ａｌ。２０１６  ；Ｒｏｈ、ｅｔ  ａｌ．２０１７）。研究および追跡調査の論文では、ＣＴＬＡ−４遮断の開始前および治療中、ＣＴＬＡ−４遮断に反応しなかった人に対してはＰＤ−１治療前および治療中、ＰＤ−１療法に反応しなかった人に対してはＰＤ−１治療後に生体組織が得られた。レスポンダーは、６カ月以上にわたって疾患なし／安定疾患または腫瘍体積の減少のＸ線写真の証拠によって定義されたのに対し、非レスポンダーは治療開始後の連続ＣＴスキャンでの腫瘍成長によって定義された。この研究に含まれる５６人の患者のうち、３２人が遺伝子発現を利用でき（カスタムナノストリング免疫パネル）、データセットに含まれるＨＣＣ患者と比較された。
【０１４６】
ＴＣＧＡデータセット内の免疫クラスとコピー数異常、突然変異、および新抗原との相関
ＴＣＧＡ−ＬＩＨＣサンプルについてＧＩＳＴＩＣ２（Ｍｅｒｍｅｌ、ｅｔ  ａｌ．２０１１）によって生成されたコピー数データには、Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＧＤＡＣ  ＦｉｒｅＢｒｏｗｓｅｒからアクセスした。独立して分析された各染色体アームによって定義された幅広い値。最初に、１９０の腫瘍サンプルのそれぞれを、各アームまたは局所領域が削除または増幅されたかどうかについて調べた。次に、マン・ホイットニー検定とクラスカル・ウォリス検定を使用して、免疫クラスと残りの間、および残りと「活性免疫応答」および「疲弊した免疫応答」サブタイプの間で値の分布を比較した。その後、ドライバー遺伝子で発生する局所的な高レベル増幅（ＨＬＡ）またはホモ接合性欠失（ＨＤ）の違いを、ＨＣＣで以前に報告されたように評価した（Ｓｃｈｕｌｚｅ、ｅｔ  ａｌ．２０１５）。この分析の信頼性を高めるために、ＨＬＡおよびＨＤのしきい値を以前に説明したように再定義した（Ｗｅｉｒ、ｅｔ  ａｌ．２００７）。簡単に言えば、遺伝子境界（＋／−２０ｋｂ）内にあるコピー数セグメントのｌｏｇ２比が０．８５を超える場合にＨＬＡが呼ばれるのに対し、コピー数セグメントのｌｏｇ２比が＜−０．７４の場合はＨＤが呼ばれ、これはそれぞれ３．６および１．２コピーに相当する。ＧＩＳＴＩＣ２によって検出され、報告されたドライバー遺伝子に関連する重要なＨＬＡとＨＤを図１３に示す。有意差は、両側フィッシャーの正確検定によって評価された。ｐ＜０．０５の値は有意とみなされた。統計分析は、Ｒ統計ソフトウェアを使用して実行された。
【０１４７】
突然変異と新抗原の分析では、Ｒｏｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ２０１５の表Ｓ４Ａで提供されたサンプルあたりの事象のリストが使用された。このデータは、ＧＤＡＣ  Ｆｉｒｅｈｏｓｅ標準分析パイプラインから取得された。簡単に言うと、ＨＬＡ対立遺伝子の特徴を調べ、ＨＬＡ変異を識別するためのＰＯＬＹＳＯＬＶＥＲベースの変異検出パイプラインが最初に適用された。次に、以前に報告された新抗原予測パイプラインにより、個人特異的ＨＬＡ結合ペプチドが同定された。対応するＰＯＬＹＳＯＬＶＥＲ推定ＨＬＡ対立遺伝子に対するすべての可能な９および１０ｍｅｒ変異ペプチドの結合親和性は、ＮｅｔＭＨＣｐａｎ（ｖ２．４）を使用して予測された（Ｎｉｅｌｓｅｎ、ｅｔ  ａｌ．２００７）。
【０１４８】
統計分析
すべての分析は、ＳＰＳＳソフトウェアバージョン２２を使用して実行された。分子クラス、組織学的マーカーおよび臨床病理学的変数間の相関関係は、それぞれカテゴリーおよび連続データについてフィッシャーの正確検定およびウィルコクソン順位和検定によって分析された。この研究で使用されたすべてのシグネチャーは以前に報告されていた（図２）。
【０１４９】
カプラン・マイヤー推定、ログランク検定、およびＣｏｘ回帰モデリングを実行して、分子的および臨床的変数と全体的な生存率および腫瘍再発との関連を分析した。ＴＣＧＡセット内の多変量解析は、転帰と関連することが知られている主要な変数（すなわち、腫瘍サイズおよび数、サテライト、等）が存在しないため実行されなかった。
【０１５０】
実施例２−ＨＣＣの免疫クラスの識別
ＨＣＣ腫瘍の大量遺伝子発現データから免疫関連ゲノムシグナルを分離するために、２２８個の切除されたＨＣＣサンプルのＮＭＦ分析を実施した（トレーニングコホート、図１）。トレーニングコホートの臨床的特徴を表１に要約する。ＮＭＦによって識別された明確な発現パターンの中で、１つは、以前に報告された免疫強化スコアとの統合による炎症反応と免疫細胞の存在が原因であった。この発現パターンを定義したトップランクの遺伝子（模範遺伝子と呼ばれる）の分析により、免疫関連機能とシグナル伝達がさらに確認された。模範的な遺伝子のコンセンサスクラスタリングにより、本明細書では免疫クラスと呼ばれる、コホートの２４％を占める新しい分子サブグループ（５５／２２８）が免疫細胞として特定された（図３）。
【０１５１】
免疫クラスに属する患者は、免疫細胞を特定するシグネチャー（すなわち、Ｔ細胞、細胞毒、三次リンパ構造（ＴＬＳ）、マクロファージ（Ｐ＜０．００１））、免疫メタ遺伝子、黒色腫（２８遺伝子、ｐ＜０．００１）および頭頸部扁平上皮癌（６−遺伝子、ｐ＜０．００１）のペムブロリズマブに対する反応を予測するＩＦＮ遺伝子シグネチャー、およびＰＤ−１シグナル伝達の有意な濃縮（３６／５５  対１９／１７３、ｐ＜０．００１）を示した（図３Ａ）。
【０１５２】
免疫クラスと残りのサンプル間のクラスの比較によって、ナチュラルキラー（ＮＫ）およびＴ細胞のためのＴ細胞受容体の成分と化学誘引物質（ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９およびＣＸＣＬ１０、ｐ＜０．００１）等の１０８個の過剰発現した免疫関連遺伝子を含む、有意に脱制御された１１２個の遺伝子（免疫分類子、図１０）が同定された（図１１）。同様に、ＧＳＥＡは、ＩＦＮアルファおよびガンマシグナル伝達、炎症反応（すなわち、リンパ球活性化、Ｔヘルパー１細胞傷害性モジュール、ＮＫ媒介毒性など）、ＴＧＦ−βおよびＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達（ＦＤＲ＜０．００１）の濃縮を特定した（結果表示されていない）。
【０１５３】
次に、免疫クラスを以前に報告されたＨＣＣ分子分類と統合することが求められた。これにより、ＩＦＮ関連（１８／５５対１２／１７３、ｐ＝０．０００１）およびＳ１クラス（ＴＧＦ−β／ＷＮＴ活性化）（３２／５５対１５／１７３、ｐ＝０．０００１）の濃縮、ならびにＳ２（２／５５対４６／１７３、ｐ＝０．０００１）およびＣＴＮＮＢ１クラス（８／５５対５９／１７３、ｐ＜０．００１、図３Ａ）の大幅な除外が明らかになった。
【０１５４】
総合すると、これらのデータは、免疫細胞の存在を捕捉するシグネチャー、免疫チェックポイント療法への応答のシグネチャー、およびＩＦＮシグナルが豊富なＨＣＣの免疫関連クラスの識別を示した。
【０１５５】
実施例３−免疫クラスの免疫表現型はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達の濃縮を示す
免疫クラスの免疫学的性質に関するさらなる生物学的洞察を得るために、免疫表現型検査を実施した。予測されたように、このクラスに属する患者は、免疫細胞浸潤率（１１／４９対１４／１６７、ｐ＝０．０１、図３Ａおよび３Ｂ）およびＴＬＳ密度（≧５フォーカス、１９／５１対３４／１７０、ｐ＝０．０１、図３Ａおよび３Ｃ）をより顕著に保持することがヘマトキシリンおよびエオシン染色切片の検査により明らかにされた。
【０１５６】
次に、免疫組織化学によるＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１タンパク質の発現を、トレーニングコホートのサンプルのサブセットで評価した（免疫クラス内および外、図３Ｂ）。全体として、最近の報告によれば、ＰＤ−Ｌ１腫瘍発現はＨＣＣの１６％（１６／９９）で観察された。コホートの１０％（１０／９９）でＰＤ−１タンパク質の発現が観察されたが、サンプルサイズが小さいため、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の高発現の間に有意な相関は見られなかった。それにもかかわらず、ＰＤ−１（免疫クラス内で８／４８対残りで２／５１、ｐ＝０．４）およびＰＤ−Ｌ１（免疫クラス内では１２／４８対残りは４／５１、ｐ＝０．０３）タンパク質発現の高い腫瘍が免疫クラスで有意に濃縮された。他の臨床病理学的変数に関して、免疫クラスとコホートの残りの間に違いは観察されなかった（データは示していない、ｐ＞０．０５）。
【０１５７】
要約すると、病理検査により、免疫クラスに属する患者は高度の免疫浸潤、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１のより高い免疫組織化学的発現、およびＴＬＳの存在を示したことが明らかになった。これらのデータは、ＨＣＣにおける浸潤する免疫細胞に由来する分子シグナルを捕捉する免疫分類子の性能を強調している。
【０１５８】
実施例４−免疫クラスは腫瘍微小環境の二つの異なる成分を捕捉する：活性および疲弊したサブタイプ
免疫系は、抗腫瘍活性と腫瘍促進活性の両方を発揮できる。実際、がん細胞と腫瘍微小環境の間のクロストークは、増殖を維持し、上皮間葉移行（ＥＭＴ）、浸潤、および転移を促進する成長因子を供給することにより、がんの進行を促進する免疫応答を引き起こす。ＨＣＣでこの概念をさらに調査するために、免疫クラス内の患者の腫瘍微小環境に応じて生じる免疫調節を分析した。図４Ａに示すように、免疫クラス（１８／５５）の３３％が「活性化間質」を特徴としていたのに対し、残りの患者（３７／５５、６７％）は、以前に公開された、活性化された炎症性間質性応答を捕捉する分子シグネチャーを用いた最近傍テンプレート予測（ＮＴＰ）分析によって予測したときに、そのような活性の欠如を示した。興味深いことに、正常または非活性間質（３７／５５、６７％）の患者は、適応免疫応答遺伝子（すなわち、Ｔ細胞受容体Ｇ、ＣＤ８Ａ、ＩＦＮ−γ、ＧＺＭＢなど）の過剰発現およびペムブロリズマブへの反応を予測するＩＦＮシグネチャーを含むＴ細胞およびＩＦＮシグネチャーの有意な濃縮を示した（ｐ＜０．００１）。したがって、このクラスターは活性免疫応答と名付けられた。
【０１５９】
逆に、活性化間質の存在は、Ｔ細胞枯渇の特徴（１０／１８対４／３７、ｐ＜０．００１）、およびＴＧＦ−βシグナル伝達やＭ２マクロファージなどの免疫抑制成分（８／１８対１  ／３７、ｐ＝０．０００３）と有意に関連した。特に、ＴＧＦ−β−１および−３の過剰発現は、ＴＧＦ−β経路の活性化を反映するいくつかのシグニチャー、例えば後期ＴＧＦ−βシグネチャー（９／１８対６／３７、ｐ＝０．０２）、Ｓ１／ＴＧＦ−βシグネチャー（１６／１８対１６／３７、ｐ＝０．００１）、ＷＮＴ／ＴＧＦ−βシグナル伝達（１５／１８対１２／３７、ｐ＜０．００１）、線維芽細胞（Ｆ−ＴＢＲＳ）（９／１８対６／３７、ｐ＝０．０２）およびＴ細胞（Ｔ２３ＴＢＲＳ）のＴＧＦ−β応答シグネチャー（ＴＢＲＳ）（１０／１８対９／３７、ｐ＝０．０３）の濃縮とともに、このサブグループで観察された（図４Ａ）。このクラスターにおけるＴ細胞の枯渇と細胞傷害活性の障害は、免疫抑制因子（すなわちＬＧＡＬＳ１、ＣＸＣＬ１２）および骨髄性化学誘引物質（ＣＣＬ２）のアップレギュレーションによって支持された。グランザイムＢ（ＧＺＭＢ）ＩＦＮ−γ、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＢＸ２１受容体などの他の必須ＮＫ細胞活性化因子（Ｈａｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ２０１１；Ｓｌａｖｕｌｉｊｉｃａ、ｅｔ  ａｌ．２０１１）は強くダウンレギュレートされた（図４Ａ）。これらの機能に基づいて、このクラスターは疲弊した免疫応答と名付けられた。両方のクラスターを比較した遺伝子セット濃縮分析は、疲弊した免疫応答におけるＴＧＦ−βのドライバー役割、およびより積極的な表現型を示唆する転移、ＥＭＴ、血管新生、肝臓癌再発に関連した経路の濃縮を確認した（図１２）。興味深いことに、免疫浸潤、ＴＬＳカウント、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１発現の点で、活性免疫サブタイプと疲弊した免疫サブタイプの間に有意差は認められなかった（図３Ｃ、４Ｂおよび４Ｃ）。これらのクラスターを臨床病理学的パラメーターと相関させることにより、免疫応答のタイプの潜在的な予後の影響をさらに調査した。
【０１６０】
興味深いことに、活性免疫応答クラスター内の患者は、疲弊した免疫応答クラスターと比較して、切除後の腫瘍再発率が低かった（再発までの期間の中央値３２対２１か月、ｐ＝０．０、図５Ｄおよび５Ｅ）。より良い生存への傾向も観察された（生存期間の中央値は、活性免疫で８８ヶ月、残りの患者で６３ヶ月、ｐ＝０．０７）（図５Ａ）。異なる免疫サブタイプ間で、ＨＢＶおよびＨＣＶ感染を含む他の臨床病理学的変数に違いは見られなかった（結果は示していない）。注目すべきことに、活性免疫サブタイプは、血管浸潤、多結節性、血小板数、およびＨＣＶ感染とともに、全体的生存の独立した予後因子として保持されていた（ＨＲ＝０．５８、ＣＩ  ０．３４−０．９８、ｐ＝０．０４）。
【０１６１】
全体として、これらのデータは免疫クラスを以下の２つの異なる微小環境ベースの要素に分割した：ａ）適応免疫応答遺伝子の過剰発現を特徴とする活性免疫応答サブタイプ（〜６５％）（図４）、およびｂ）免疫抑制シグナル（すなわち、ＴＧＦ−β、Ｍ２マクロファージ）の存在を特徴とする疲弊した免疫応答サブタイプ（〜３５％）。
【０１６２】
実施例５−データセット全体で免疫クラスが検証される
１１２遺伝子発現ベースの免疫分類子（図１０）を使用して、７つの追加データセット（ｎ＝７２８ＨＣＣ、図１）で免疫クラスの存在をさらに評価した。まず、免疫分類子がＴＣＧＡデータセットに適用された。ＴＣＧＡデータセットは、ＲＮＡシークエンシングによってプロファイルされた、公開されている入手可能な最大のデータセット［ｎ＝１９０新鮮凍結（ＦＦ）サンプル］である。トレーニングコホートと同様に、免疫クラス内で４２／１９０（２２％）のＨＣＣサンプルが正常に予測された。免疫クラスの分子特性解析により、免疫細胞を特定するシグネチャー（すなわち、Ｔ細胞、細胞毒、ＴＬＳおよびマクロファージ、ｐ＜０．００１）、免疫チェックポイント療法への応答を予測するシグネチャー（ｐ＜０．００１）およびＰＤ−１シグナル伝達の有意な濃縮が確認された（２４／４２対３１／１４８、ｐ＜０．００１）（図５Ｃ）。公知のＨＣＣ分子クラスと比較して、ＩＦＮ関連（１３／４２対残りで１１／１４８、ｐ＜０．００１）およびＳ１クラス（２８／４２対コホートの残りで２０／１４８、ｐ＜０．００１）の濃縮が確認された。また、トレーニングコホートで以前に観察されたように、ＣＴＮＮＢ１クラスの有意な除外（２／４２対コホートの残りで３０／１４８、ｐ＜０．００１）が確認された。さらに、ＴＣＧＡ免疫クラスの半分は、活性化免疫応答サブタイプを再現する、適応免疫応答遺伝子の過剰発現とともに、活性化間質シグネチャーの欠如を示した（図５Ｃ）。
【０１６３】
一方、残りの半分の患者は、ＴＧＦ−βシグナル伝達に関連する活性化間質（１１／２１対免疫クラスの残りの部分で１／２１、ｐ＝０．０１）、ＮＫＧ２ＤおよびＴＢＸ２１受容体のダウンレギュレーション（ｐ＜０．０１）、疲弊した免疫応答サブタイプの主な特徴を示した。臨床転帰との相関により、活性免疫応答サブタイプ内の患者の方が生存期間（生存期間中央値は活性免疫クラスターで１０７か月対残りの患者で３３か月、ｐ＝０．０３）が良好であることが確認された（図５Ｂ）。
【０１６４】
次に、以前に我々のグループによって収集された検証コホート［ｎ＝１３１ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）ＨＣＣ］および４つのテストＦＦ組織（ｎ＝２８９）と１つのＦＦＰＥサンプル（ｎ＝１１８）を含む５つの追加データセットが調査された（図１）。免疫クラスに割り当てられた患者の割合は、すべてのＦＦデータセットで一貫しており、このクラスに予測されるサンプルの平均２７％（範囲２２〜２８）であった。２つのＦＦＰＥデータセット（検証とＨＣＣ−Ｖ）では、患者の３７％（４８／１３１）と３０％（３５／１１８）がそれぞれ免疫クラスに割り当てられた（結果は表示されていない）。高いパーセンテージは、使用されている異なるゲノムプラットフォーム［ＤＡＳＬ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）対Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ］または異なるタイプの組織材料（ＦＦＰＥ対ＦＦサンプル）による可能性がある。それにもかかわらず、免疫クラスの分子特性と２つの微小環境ベースのサブタイプの存在は、使用するプラットフォームとサンプルのタイプに関係なく、テストしたすべてのデータセットで正常に再現された。
【０１６５】
最後に、免疫療法に対する反応を予測する免疫クラスの能力がテストされた。ニボルマブで治療された２人のＨＣＣ患者に由来する腫瘍遺伝子発現は、部分的な反応を示した患者＃１（ＦＤＲ＝０．００１）に対して肯定的な結果をもたらすが、安定した疾患を提示した患者＃２（ＦＤＲ＝０．２３）ではこの結果は見られないない免疫分類子の存在について分析された。図８。
【０１６６】
チェックポイント阻害剤が規制当局によるＨＣＣ管理にまだ承認されていないことを考慮して、免疫クラスの遺伝子発現プロファイルを、最近公開された３２人の患者のデータセットを使用して免疫療法に応答する黒色腫患者の発現プロファイルと比較した。サブクラスマッピング分析により、免疫クラス、特に活性免疫サブタイプは、ＰＤ−１チェックポイント阻害剤に反応する黒色腫患者のグループとの類似性を示すことが明らかになった。図９。
【０１６７】
実施例６−免疫クラス腫瘍は、染色体異常の負担は低いが、新抗原の発現または腫瘍突然変異の負担には差がない
最近の分析により、腫瘍のゲノム環境と抗腫瘍免疫が関連付けられている（Ｌｅ、ｅｔ  ａｌ．２０１５；Ｒｏｏｎｅｙ、ｅｔ  ａｌ．２０１５；ＭｃＧｒａｎａｈａｎ、ｅｔ  ａｌ．２０１６）。特に、腫瘍の異数性は免疫回避のマーカーと相関し、免疫療法に対する反応の低下と相関するのに対し、新抗原の存在と全体的な変異負荷がＴ細胞応答を促進する可能性があることが提案されている（Ｒｏｈ、ｅｔ  ａｌ．２０１７；Ｄａｖｏｌｉ、ｅｔ  ａｌ．２０１７）。体細胞コピー数異常（ＳＣＮＡ）と変異した新抗原の負担がＨＣＣの局所免疫浸潤に影響するかどうかを検証するために、ＴＣＧＡデータセットが使用された。最近の分析では、いくつかの腫瘍の局所免疫細胞溶解活性は、細胞傷害性Ｔ細胞およびＴ細胞を引き付けるインターフェロン刺激ケモカインと強い相関関係を示した（Ｒｏｏｎｅｙ、ｅｔ  ａｌ．２０１５）。興味深いことに、ＨＣＣ患者では、細胞溶解活性スコアと免疫クラスとの間に強い相関関係が観察された（ｐ＜０．０００１、図５Ｃ）。ＳＣＮＡに関しては、免疫クラス内の患者は、幅広い領域と局所的領域の両方（図６Ａと６Ｂ）で、利得と損失の負担がより低いことを示し、免疫クラスは幅広い領域の利得（範囲０−１６）と３．５幅広い領域の損失（範囲０−２０）の中央値を示したのに対し、コホートの残りの部分では幅広い領域の利得（範囲０〜２２）と９幅広い領域の損失（範囲０〜２６）を示した（それぞれｐ＝０．０４６とｐ＝０．０１）。同様に、免疫クラスでは、５局所的領域の利得（範囲０−１８）と９局所的領域の損失（範囲０−２５）の中央値が特定されたのに対し、コホートの残りの部分では、８．５局所的領域の利得（範囲０−２０）と１３局所的領域の損失（範囲０−２７）であった（両方の比較でｐ＝０．０３）。免疫クラス以外の患者の再発ＳＣＮＡに関連する領域を分析すると（免疫シグネチャーに基づく低免疫浸潤）、染色体１ｑの再発コピー数の増加と染色体３ｐ、１７ｐ、１８ｐの再発損失がアームレベルで観察された。局所的な高レベルの増幅とホモ接合性の欠失に関しては、ＨＣＣで以前に報告されたドライバー遺伝子が関与する局所的な構造異常に分析が限定された（Ｓｃｈｕｌｚｅ、ｅｔ  ａｌ．２０１５）。遺伝子座１１ｑ１３（ＣＣＮＤ１、ＦＧＦ１９など）の高レベルの増幅には有意な差が見られ、これは免疫クラス、特に活性免疫サブタイプで大幅に濃縮された。ＭＹＣ、ＴＥＲＴ、およびＰＴＥＮを含む遺伝子座に関して、有意な差は見られなかった。
【０１６８】
その後、免疫クラスは、ＴＣＧＡデータセットの以前の分析（Ｒｏｏｎｅｙ、ｅｔ  ａｌ．２０１５）に従って、突然変異の全体的な割合と予測される新抗原の割合と相関した。免疫クラスと両方の特徴の間に関連はなかった（図６Ｃおよび６Ｅ）。特に、残りの患者と比較した免疫クラスの突然変異の中央値は、それぞれ１７５対２１２であった（ｐ＝０．１、図６Ｅ）。同様に、新抗原の割合は、２つのグループ間で統計的に異ならなかった（それぞれ２１対２３、ｐ＝０．２８、図６Ｃ）。それにもかかわらず、両方のパラメーターが微小環境ベースのサブタイプに従って分析された場合、活性免疫サブタイプは、ネオエピトープ率（中央値は１８対疲弊したサブタイプで３３対コホートの残りで２３、ｐ＝０．２０、図６Ｄ）および突然変異（中央値は１４０対疲弊したサブタイプで２６９対コホートの残りで２１２、ｐ＝０．０６、図６Ｆ）が低下する傾向を示した。
【０１６９】
最後に、免疫クラスは、公知のドライバー遺伝子の変異と相関した。ＣＴＮＮＢ１経路の突然変異（１２／４２対８１／１４８、ｐ＝０．００３）を除いて、他の突然変異は差次的分布を示さなかった（図６Ｇ）。
【０１７０】
これらのすべてのデータは、新抗原負荷とＴ細胞応答との間に相関関係を示さなかった。これは、異数性や特定の発癌経路の突然変異などの追加メカニズムが、高免疫原性腫瘍の免疫細胞動員を損なう可能性があることを示す。
【０１７１】
実施例７−免疫クラスには固有のＤＮＡメチル化シグネチャーがある
免疫クラスにおける免疫関連遺伝子の大幅なアップレギュレーションを考慮して、そのような脱制御がこれらの腫瘍のエピジェネティックな変化を反映できるかどうかを検討した。全ゲノムメチル化データの教師付き分析により、１９２個の免疫応答遺伝子プロモーターの３６３個のＣｐＧ部位が、コホートの残りと比較して免疫クラスで差次的にメチル化されていることが明らかになった（ＦＤＲ＜０．０５、図６Ｈ）。さらに、差次的にメチル化されたＣｐＧ部位を示す１９２個の遺伝子のうち、１１５個は遺伝子発現と有意な相関を示した。
【０１７２】
特に、癌浸潤性Ｔ細胞のアポトーシスの誘導を介した腫瘍進行中の免疫回避に役割を果たす可能性のある免疫抑制分子ＬＧＡＬＳ３（Ｆｕｋｉｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３）およびＴＧＦ−βシグナル伝達の調節因子ＰＭＥＰＡ１は、２つの免疫サブタイプで有意に過剰発現した（ｐ＜０．００１、図６Ｉ）。
【０１７３】
全体として、これらのデータは、免疫クラスがユニークなメチル化プロファイルによって特徴付けられることを示した。特に、１９２個の免疫関連遺伝子で差次的メチル化が観察され、ほとんどの場合、遺伝子発現の変化と関連していた。
【０１７４】
実施例８−特定の発癌性シグナル伝達経路は協力してＨＣＮのＣＴＮＮＢ１クラスにおけるＴ細胞浸潤を減少させることができる
免疫クラスと以前に報告された分子分類との統合により、テストしたすべてのデータセットでＣＴＮＮＢ１クラスが大幅に除外されていることが明らかになった（図３Ａおよび５Ｃ）。ＨＣＣのＣＴＮＮＢ１クラスは、肝臓関連Ｗｎｔ標的遺伝子の過剰発現、核β−カテニン染色の濃縮、およびＣＴＮＮＢ１変異によって特徴付けられた（Ｃｈｉａｎｇ、ｅｔ  ａｌ．２００８）。ＣＴＮＮＢ１クラスの除外は、ＣＣＬ４の抑制とそれに続くＴ細胞プライミングの失敗を通じて、経路の活性化がＴ細胞排除に関連する黒色腫の最近の報告を支持する（Ｓｐｒａｎｇｅｒ、ｅｔ  ａｌ．２０１５）。コホートでは、ＣＴＮＮＢ１クラス内のＨＣＣサンプルは、免疫クラス内の患者または残りの患者と比較して、いくつかの免疫シグネチャー、特にＴ細胞の濃縮スコアが有意に低かった（ｐ＜０．００１、図６Ｊおよび６Ｋ）。さらに、黒色腫のデータによると、ＣＴＮＮＢ１クラス内の患者はＣＣＬ４のダウンレギュレーションを示した（ｐ＜０．００１）。ＰＴＥＮ（Ｐｅｎｇ、ｅｔ  ａｌ．２０１６）およびＰＴＫ２（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）を含む、さらなる腫瘍形成経路がＴ細胞排除に関連している。興味深いことに、ＰＴＫ２はＣＴＮＮＢ１クラスで有意に過剰発現しており、このサブグループでＰＴＫ２とＣＴＮＮＢ１経路が協調して免疫細胞排除を誘導する可能性が示唆された。さらに、ＰＴＫ２の  ＤＮＡコピー数と発現は高度に相関していた（ｐ＜０．０００１）（図６Ｌおよび６Ｍ）。
【０１７５】
これらのデータは、ＣＴＮＮＢ１クラス内のＨＣＣサンプルが、免疫クラスの患者および残りの患者の腫瘍と比較して、免疫シグネチャーの低い発現を示したことを示唆する。ＣＴＮＮＢ１およびＰＴＫ２シグナル伝達などの特定の発癌シグナル伝達の活性化は、変異または追加のメカニズムの活性化を通じて、このサブグループの免疫学的プロファイルに影響を与える重要な役割を果たす可能性がある。
【０１７６】
実施例９−免疫シグナルの区画化：周囲の組織への免疫浸潤は、その腫瘍対応物を反映しない
最後に、腫瘍内免疫細胞の浸潤のタイプが腫瘍周囲の対応物を反映しているかどうかを評価するために、腫瘍内免疫浸潤と周囲の肝臓組織を相関付けた。これを行うために、患者の遺伝子発現データが腫瘍と一致する周囲の非腫瘍組織の両方で利用可能な１６７人の患者のトレーニングコホートについてサブ分析が行われた。１６７の事例のうち２５％（４２／１６７）が腫瘍の発現プロファイルに基づいて、免疫クラス内で陽性に分類された（図７Ａ）。興味深いことに、これらの患者の少数（１３／４２、３１％）のみが腫瘍と一致する周囲の肝臓の両方で肯定的な予測を組み合わせて示し、腫瘍内免疫浸潤が周囲の組織のプロファイルを反映していないことを示唆する。これらの観察から、非腫瘍性肝臓で発生する免疫浸潤のタイプがさらに調査された。興味深いことに、周囲の組織のプロファイルに基づいて免疫分類子によって積極的に予測された患者は、免疫細胞（ＣＤ８、マクロファージ、ｐ＜０．００１）の存在を捕捉するシグネチャーである、活性化間質［３１／５７（５４％）対７／１１０、（６％）、ｐ＝０．０００１］、ＴＧＦ−βシグナル伝達［３８／５７、（６７％）対２／１１０、（２％）、ｐ＝ｐ＝０．０００１］の強い濃縮と追加の免疫抑制成分（ＬＧＡＬＳ１、ＣＸＣＬ１２、ｐ＜０．００１）を示した、。さらに、疲弊したＴ細胞［１９／５７、（３３％）対７／１１０（６％）、ｐ＝０．０００１］、および周囲の肝臓に由来する予後１８６遺伝子シグネチャー［４３／５７（７５％）対７／１１０（６％）、ｐ＝０．０００１］もこのサブグループで濃縮された。さらに、ＭＥＴＡＶＩＲＦ３−Ｆ４ステージ［４２／４５（９３％）対コホートの残りで６６／８７（７６％）、ｐ＝０．０２］およびＨＣＶ感染［３６／５４（６７％）対残りで３９／１０８（３６％）、ｐ＜０．００１］は、周囲の肝臓の陽性免疫分類子と有意に関連していた。一方、ＨＢＶ感染［７／５４（１３％）対３４／１０８（３１％）、ｐ＝０．０１］およびアルコール乱用［２／５４（４％）対２０／１０８（１９％）、ｐ＝０．００８］は、免疫分類子に対して陰性の患者でより頻繁に見られた（図７Ａ）。最後に、免疫分類子に陽性の患者は、生存期間の中央値が３７ヶ月対コホートの残りで７６ヶ月の有意に悪い予後を示した（ｐ＜０．００１、図７Ｂ）。
【０１７７】
本質的に、これらのデータは、周囲の肝腫瘍の免疫プロファイルが腫瘍内プロファイルを反映せず、ＨＣＣ患者の生存に関連する免疫抑制成分によって主に特徴付けられることを示唆した。
【０１７８】
実施例１０−免疫クラスの５６−遺伝子分類子の識別
元の１１２遺伝子の免疫分類子（図１０）は、最高スコアの遺伝子を選択する５６遺伝子に成功裏に削減された（表３）。５６遺伝子の免疫分類子の予測能力がテストされ、以下の３つのデータセットの１１２遺伝子の元の免疫分類と比較された：ＴＧＣＡ（ｎ＝１９０サンプル、図１４Ａ）、検証コホート（ｎ＝１３２、図１４Ｂ）およびＨＣＣ−Ｉデータセット（ｎ＝９０、図１４Ｃ）。
【０１７９】
以下に示すように、５６遺伝子の免疫分類子の感度は９７％（３つのコホートで個別に分析した場合の範囲９５−１００％）、９８％の特異性（３つのコホートで個別に分析した場合の範囲９６−９９％）および９７％の精度（３つのコホートで個別に分析した場合の範囲は９６〜９８％）であった（表２）。
【０１８０】
さらに、３つのコホートからのすべての患者の５６遺伝子免疫分類子について、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が計算された（ｎ＝４１１、図１５）。ＲＯＣ曲線は、感度と特異性のレベルを解釈する便利な方法である。ＲＯＣ曲線は、予測因子に対して可能な感度と特異性の潜在的な組み合わせのセットの一般化であり、異なる予測因子、この場合は元の１１２遺伝子の免疫分類子と縮小した５６遺伝子の免疫分類子を比較するための自然な共通スケールを提供する。１に近いＡＵＣ値は、スクリーニング測定が満足のいくパフォーマンスの患者を確実に区別することを示す。５６遺伝子の免疫分類子の場合、すべての患者でテストした場合、曲線下面積は０．９７１であった（図１５）。
【０１８１】
【表２】
2020523022.tif 000004
【０１８２】
【表３−１】
2020523022.tif 000005
【表４−２】
2020523022.tif 000006
【０１８３】
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【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図６−６】
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【図６−７】
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【図６−８】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１２−５】
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【図１２−６】
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【図１２−７】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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