(57)【要約】  本発明は、宿主細胞においてCasシステムを脱抑制するための、ベクター及び方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含み、
各cRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する、
ベクター。
【請求項２】
ヌクレオチド配列(a)が、宿主細胞における配列の発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含む、請求項1に記載のベクター。
【請求項３】
ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が、宿主細胞における配列又はアレイの発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含む、請求項1又は2に記載のベクター。
【請求項４】
(a)及び(b)が、同じオペロンによって含まれる又は細胞において作動可能な共通プロモーターの制御下にある、請求項1から3のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項５】
宿主細胞が野生型宿主細胞である、請求項1から4のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項６】
1つ又は複数のCas配列の転写が抑制され、任意選択で、タイプI CRISPR/CasシステムのCasA、B、C、D及びEのうちの1つ又は複数の転写が抑制される、請求項1から5のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項７】
宿主細胞ゲノムのCas改変が、
(a)宿主細胞を死滅させる;
(b)細胞又はエピソームの成長又は増殖を減少させる;
(c)細胞又はエピソームの成長又は増殖を増加させる;
(d)前記プロトスペーサー配列を含む又はそれに隣接する、ヌクレオチド配列の転写を減少させる又は防止する;又は
(e)前記プロトスペーサー配列を含む又はそれに隣接する、ヌクレオチド配列の転写を増加させる、請求項1から6のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項８】
抑制因子がH-NS、StpA、LRP又はCRPである、請求項1から7のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項９】
脱抑制因子が、宿主細胞において、それぞれ、H-NS、StpA、LRP又はCRP抑制因子との複合体を形成可能であり、CRISPR/Casシステムの抑制を防止する又は減少させる、変異体H-NS、StpA、LRP又はCRPである、請求項1から8のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１０】
脱抑制因子がLeuO又はLysR又はその機能的な均等物である、請求項1から9のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１１】
細胞が細菌又は古細菌細胞である、請求項1から10のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１２】
発現可能なhtpG配列を含む、請求項1から11のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１３】
細胞が、Cascade及びCas3を含むCRISPR/Casシステムを含み、Cascadeが、宿主細胞において抑制され、ベクターが、(i)前記Cascade抑制の脱抑制因子をコードする発現可能なヌクレオチド配列;及び
(ii)宿主細胞における脱抑制Cascadeと共に機能できる、Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含み;ヌクレオチド配列が、宿主細胞において発現可能である、請求項1から12のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１４】
(i)及び(ii)のヌクレオチド配列が、細胞において作動可能な1つ又は複数の構成的なプロモーターの制御下にある、請求項13に記載のベクター。
【請求項１５】
細菌又は古細菌宿主細胞への導入のための、(任意選択で、請求項1から14のいずれか一項に記載の)核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって天然で抑制される、内因性CRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含み;
各cRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変し、
ここで、
(c)抑制因子が、細胞ゲノムによってコードされるH-NS、StpA、LRP若しくはCRP又はその機能的な均等物であり;
(d)ヌクレオチド配列(a)が、宿主細胞における配列の発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含み;及び
(e)ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が、宿主細胞における配列の発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含む、ベクター。
【請求項１６】
脱抑制因子が、LeuO又はその機能的な均等物;又は抑制因子の変異体;又は抑制因子をコードする宿主細胞によって含まれるヌクレオチド配列に相補的なsiRNAである、請求項15に記載のベクター。
【請求項１７】
細胞が、大腸菌、ストレプトコッカス又はサルモネラ細胞、任意選択で、EHEC大腸菌又はS.エンテリカ血液型亜型チフィムリウム細胞である、請求項1から16のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１８】
プロトスペーサー配列が、染色体配列、内因性宿主細胞配列、野生型宿主細胞配列、非ウイルス染色体宿主細胞配列であり、外因性配列及び/又は非ファージ配列ではない、請求項1から17のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項１９】
CRISPR/CasシステムがCas3及び抑制Cascadeを含み、脱抑制因子が細胞におけるCascadeを脱抑制可能であり、ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が脱抑制CRISPR/Casシステムと共に作動可能なCRISPR反復配列を含み、反復配列が配列番号49〜52から選択される配列又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列を含む又はそれからなる、請求項1から18のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２０】
Cas3が、配列番号58又は60から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列を含む、請求項19に記載のベクター。
【請求項２１】
Cas3が、ヌクレオチド配列AWGを含む又はそれからなるPAMと共に作動可能である、請求項19又は20に記載のベクター。
【請求項２２】
Cascadeが抑制CasAを含み、脱抑制因子がCasAを脱抑制可能であり、CasAが配列番号66若しくは68から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列を含む、請求項19、20又は21に記載のベクター。
【請求項２３】
細胞がS.エンテリカ細胞であり、CRISPR/Casシステムが抑制されたタイプE(Cse)Casを含み、脱抑制因子がCasを脱抑制可能であり、任意選択で、脱抑制因子がLeuO又はその機能的な均等物である、請求項1から18のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２４】
CRISPR/CasシステムがCas3及び抑制Cascadeを含み、脱抑制因子が細胞におけるCascadeを脱抑制可能であり、ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が脱抑制CRISPR/Casシステムと共に作動可能なCRISPR反復配列を含み、反復配列が配列番号53又はそれと少なくとも70%同一である配列を含む又はそれからなる、請求項1から18及び23のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２５】
Cas3が、配列番号56若しくは64から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列を含む、請求項24に記載のベクター。
【請求項２６】
Cascadeが抑制CasAを含み、脱抑制因子がCasAを脱抑制可能であり、CasAが配列番号70若しくは72から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列を含む、請求項24又は25に記載のベクター。
【請求項２７】
ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が、細胞において脱抑制CRISPR/Casシステムと共に作動可能なCRISPR反復配列を含み、反復配列が細胞のCRISPR/Casシステムによって含まれる宿主アレイにおける反復と少なくとも90%同一であり、ベクター又は配列又はアレイ(b)が、宿主CRISPR/CasシステムのCasヌクレアーゼによって認識されるPAMを含まない、請求項1から26のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２８】
CasA、B、C、D及びEヌクレオチド配列からなる群からの配列を含まない又は、前記群の配列の全てを含まない、請求項1から27のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項２９】
Cas1、Cas2、Cas5及びCas6配列からなる群からの配列を含まない、請求項1から28のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３０】
Cas3ヌクレオチド配列を含まない、請求項1から29のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３１】
ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防する医学的な使用のための、請求項1から30のいずれか一項に記載のベクターであって、宿主細胞が、対象によって含まれるベクター。
【請求項３２】
ヒト又は動物マイクロバイオームにおいて、前記宿主細胞を死滅させるための又はその成長若しくは増殖を減少させるための、医学的使用のための、請求項1から31のいずれか一項に記載のベクター。
【請求項３３】
マイクロバイオームが、複数の前記宿主細胞を含み、宿主細胞の種又は株とは異なる種又は株の更なる細胞を含み、更なる細胞がプロトスペーサー配列を含まない、請求項32に記載のベクター。
【請求項３４】
任意選択で、ベクターが同一である、請求項1から33のいずれか一項に記載の複数のベクターを含む複数のバクテリオファージ又はファージミド。
【請求項３５】
ファージが、宿主細胞に感染可能であるが、更なる細胞に感染可能ではない、又はファージミドが、そのようなファージによって含まれる、請求項33に従属するときの、請求項34に記載の複数のバクテリオファージ又はファージミド。
【請求項３６】
複数の請求項1から35のいずれか一項に記載のベクター、バクテリオファージ又はファージミドを含み、任意選択で、ヒト又は動物における疾患又は状態を治療する又は予防するための、1つ又は複数の医療薬又は抗生物質を更に含む医薬。
【請求項３７】
ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防する方法であって、請求項1から36のいずれか一項に記載のベクター、複数のベクター又は医薬を対象に投与する工程を含み、対象のマイクロバイオームによって含まれる宿主細胞は、細胞の内因性の脱抑制Casによって改変され、治療又は予防が実施される、方法。
【請求項３８】
野生型大腸菌又はサルモネラ宿主細胞を死滅させる、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)
(i)細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のための、CRISPRアレイ又はCRISPRスペーサー配列;
(ii)細胞におけるガイドRNA(gRNA)をコードするヌクレオチド配列の導入のための部位を含み;
前記cRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する、ベクター。
【請求項４０】
(i)又は(ii)の前記部位への挿入が、請求項1から33のいずれか一項に記載のベクターを形成する、請求項39に記載のベクター。
【請求項４１】
細菌又は古細菌宿主細胞への導入のための、複数の核酸ベクターを含み、任意選択で、ヒト又は動物における疾患又は状態を治療する又は予防するための、1つ又は複数の医療薬又は抗生物質を更に含む医薬であって;
(a)各細胞が、細胞におけるH-NS及び/又はStpAから選択される抑制因子によって抑制される、CRISPR/Casシステムを含み、
(b)ベクターが、細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列を含み、配列が、任意選択で、強力な及び/又は構成的なプロモーターの制御下で脱抑制因子を産生するために、細胞において発現可能であり;及び
ベクターが、細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイを欠いており;及び細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を欠いている、医薬。
【請求項４２】
Cascade Cas、Cas3又はCas9が抑制される、請求項1から41のいずれか一項に記載のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
【請求項４３】
システムが、
(a)配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、又は配列番号49〜52から選択される配列を含む反復及びAWGを含む又はそれからなるPAMと共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログである、Cas;又は
(b)配列番号56、64、70及び72から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、又は配列番号53を含む反復と共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログである、Cas;又は
(c)配列番号62から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、又はNNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はそれからなるPAMと共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログである、Casを含む、請求項1から42のいずれか一項に記載のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
【請求項４４】
システムが、
(a)配列番号49〜52から選択される配列(又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列)を含む反復及びAWGを含む又はそれからなるPAM;
(b)配列番号53(又は前記選択される配列と少なくとも70%同一である配列)を含む反復;又は
(c)NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はそれからなるPAMを含む、請求項1から43のいずれか一項に記載のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
【請求項４５】
システムが抑制Casを含み、Casが、
(a)AWGを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、Casヌクレアーゼは、配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む);又は
(b)NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、Casヌクレアーゼは、配列番号62から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む)と共に作動可能である、請求項1から44のいずれか一項に記載のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
【請求項４６】
抑制因子が、
(i)配列番号17、19、21、23、25及び27から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列;又は
(ii)配列番号29、31、33及び35から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1から45のいずれか一項に記載のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
【請求項４７】
脱抑制因子が、
(i)配列番号3、5、7、9、11、13及び15から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列;又は
(ii)配列番号37、39及び41から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列;又は
(iii)配列番号43、45及び47から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項1から46のいずれか一項に記載のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
【請求項４８】
該又は各ベクターが、Casコードヌクレオチド配列又はシステムの抑制Casをコードするヌクレオチド配列を欠く、請求項1から47のいずれか一項に記載のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
【請求項４９】
細菌細胞(任意選択で、大腸菌細胞)において核酸リコンビニアリングを実施するインビトロ方法であって、細胞が、抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、方法が、
(a)所望の核酸(NOI)を細胞に導入する工程;
(b)請求項1から33及び42から48のいずれか一項に記載のベクターを細胞に導入する工程であって、工程(a)及び(b)は、同時に又は任意の順序で実施される;
(c)細胞において、ベクターによってコードされる脱抑制因子及びcrRNA又はgRNAを発現させる工程、ここで、脱抑制因子が、CRISPR/Casシステムを脱抑制し、システムのCasヌクレアーゼがcrRNA又はgRNAによってガイドされて、NOIによって含まれるプロトスペーサー配列を改変(例えば、切断)する;及び
(d)任意選択で、改変されたNOIを単離する工程を含む、方法。
【請求項５０】
単離され改変されたNOIを第二細胞に導入する工程及び任意選択で、そこから子孫細胞を得る工程を含む、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
第二細胞が、非ヒト動物胚性幹細胞(ES細胞)又は人工多能性幹細胞(iPS)である、請求項50に記載の方法。
【請求項５２】
第二細胞又は子孫細胞を非ヒト動物に発生させる工程を含む、請求項51に記載の方法。
【請求項５３】
動物からタンパク質又は核酸(又はそのヌクレオチド配列)を単離する工程を更に含む、請求項51に記載の方法。
【請求項５４】
核酸又はそのヌクレオチド配列を発現ベクター又は宿主細胞に、その核酸又はヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質の発現のために、挿入する工程、タンパク質を発現させる工程、及びタンパク質を単離する工程、及び任意選択で、単離されたタンパク質を、ヒト又は動物における使用のための医薬に製剤化する工程を更に含む、請求項53に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、宿主細胞においてCas又はCascadeを脱抑制するための、ベクター及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大腸菌(Escherichia coli)のタイプI-E CRISPR-Casシステムは、CRISPR RNAプロセシング並びに標的DNAの切断及びデグラデーションに要求される2つのオペロンに6つのCas遺伝子(casABCDE及びcas3)をコードする。casABCDEオペロンは、K-12等の大腸菌株においてH-NSによって抑制される。
【０００３】
Gomaaらは、全て6つの大腸菌Cas遺伝子を誘導的に発現する、2つのプラスミド(pCasA-E及びpCas3)からなるシステムを使用した。加えて、Gomaaらは、操作されたスペーサー配列の挿入を収容する、大腸菌K-12において内因性CRISPR1アレイの変化バージョンをコードする、第三のプラスミドを生成した。操作され、ゲノム-ターゲティングスペーサーをコードする、pCRISPRプラスミドを、T7ポリメラーゼ(BW25113-T7)及び2つのCas-発現プラスミド(pCasA-E及びpCas3)の誘導性発現で前操作された大腸菌K-12亜株BW25113細胞に形質転換した。代替的に、著者らは、hns遺伝子の欠失によって染色体性にコードされたCas遺伝子の発現を強制させた。
【０００４】
Citorikらは、外因性ストレプトコッカス・ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)Cas9及びCRISPR座位をコードするヌクレオチド配列の大腸菌への送達のための接合プラスミド又はファージの使用を開示している。
【０００５】
US20160333348(SNIPR Technologies Limited)は、特に混合細菌集団における種をターゲッティングするための、細菌における活性内因性Casヌクレアーゼの利用を開示している。
【０００６】
Gomaaら等の最先端技術は、外因性CRISPR/Casシステムを導入することによって抑制された内因性Casの問題に対処しているが、これには、CRISPRアレイ、Cas3、CasA、B、C、D及びE等の成分をコードする全ての配列を収容する複数のベクターの構築が要求される。したがって、導入が要求される大量の外因性配列は、標的細菌細胞に入る多くの異なるベクターを要求し、成功の確率が減少し、プロセスの効率が減少する。例えば、天然ヒト、動物、植物又は環境マイクロバイオームのターゲティングは、それらに外因性CRISPR/Casシステムの1つ又は複数の成分をコードする外因性配列を装備させる標的宿主細胞の前操作を許容しない。加えて、宿主細胞におけるCRISPR/Cas活性(例えば、死滅)に作用する、標的細胞に入ることが要求される核酸ベクターの数を(好ましくは、1つに至るまで)減少させることが好ましいであろう。
【０００７】
最も一般的に採用されるCas9は、4.2キロベース(kb)と測定され、S.ピオゲネス(S pyogenes)に由来する。分子の長さは、ベクター(例えば、バクテリオファージ)がどれだけの遺伝物質を収容することができるかという限界を押し上げ、様々な設定において、CRISPRを使用することに対する障壁を作り出す(Ranらを参照されたい)。S.サーモフィルス(S thermophilus)Cas9(UniProtKB-G3ECR1(CAS9_STRTR))ヌクレオチド配列は、1.4kbのサイズを有する。
【０００８】
活性内因性Casヌクレアーゼ(例えば、US20160333348に記載される)を採用する等の解決策は、これが宿主において天然で活性のCasである場合に一般に有用である。これらの解決策により、かさ高い外因性Cas配列を使用するとの必要性が回避されるが、宿主において天然で抑制された内因性Casの利用を可能にし、それによって、他の天然に存在する細菌種に対処することが望ましいであろう。これを、例えば、ヒト、動物又は環境に天然で見出されるマイクロバイオームに対処するために、野生型細胞、例えば、細菌又は古細菌細胞においてなすことができることも望ましいであろう。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】US20160333348
【特許文献２】GB1609811.3
【特許文献３】PCT/EP2017/063593
【特許文献４】WO2017/118598
【特許文献５】USSN15/478,912
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Gomaaら; MBio. 2014 Jan 28;5(1):e00928〜13. doi: 10.1128/mBio.00928〜13、「Programmable removal of bacterial strains by use of genome-targeting CRISPR-Cas systems」.
【非特許文献２】Citorikら、Nat Biotechnol. 2014 Nov;32(11):1141〜5. doi: 10.1038/nbt.3011. Epub 2014 Sep 21、「Sequence-specific antimicrobials using efficiently delivered RNA-guided nucleases」.
【非特許文献３】Chirwa NT及びHerrington MB、Microbiology. 2003 Feb;149(Pt 2):525〜35
【非特許文献４】Pulら、Mol Microbiol. 2010 Mar;75(6):1495〜512. doi: 10.1111/j.1365〜2958.2010.07073.x. Epub 2010 Feb 1、「Identification and characterization of E. coli CRISPR-cas promoters and their silencing by H-NS」
【非特許文献５】Westraら、Mol Microbiol. 2010 Sep;77(6):1380〜93. doi: 10.1111/j.1365〜2958.2010.07315.x. Epub 2010 Aug 18、「H-NS-mediated repression of CRISPR-based immunity in Escherichia coli K12 can be relieved by the transcription activator LeuO」
【非特許文献６】Liangら、Int J Infect Dis. 2015 Jan;30:1〜6. doi: 10.1016/j.ijid.2014.09.015. Epub 2014 Nov 5、「Inhibiting the growth of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro with antisense peptide nucleic acid conjugates targeting the ftsZ gene」
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この目的で、本発明は、以下を提供する:
【００１２】
第一の態様において、
宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)任意選択で、各crRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する;細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)を各々コードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【００１３】
第二の態様において、
細菌又は古細菌宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって天然で抑制された内因性CRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)任意選択で、各crRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する;細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)を各々コードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含み;
ここで、抑制因子は、細胞ゲノムによってコードされるH-NS、StpA、LRP若しくはCRP又はそのホモログ、若しくはオルソログ又は機能的な均等物である;及び
ここで、脱抑制因子は、それぞれ、H-NSの複合体を形成可能であるLeuO又はそのホモログ、若しくはオルソログ若しくは機能的な均等物;又はH-NS、StpA、LRP若しくはCRP抑制因子との複合体を形成可能であるH-NS、StpA、LRP若しくはCRPの変異体とである、ベクター。
【００１４】
第三の態様において、
いずれかの先行する態様に記載の複数のベクターを含む医薬であって、任意選択で、ヒト又は動物における疾患又は状態を治療する又は予防するための、1つ又は複数の医療薬(例えば、抗がん医薬)又は抗生物質(例えば、プロトスペーサー配列は、宿主細胞抗生物質耐性遺伝子によって含まれる)を更に含む医薬。
【００１５】
第四の態様において、
ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防する方法であって、いずれかの先行する態様のベクター又は医薬を対象に投与する工程を含み、対象のマイクロバイオームによって含まれる宿主細胞は、細胞の内因性の脱抑制Casによって改変され、治療又は予防が実施される、方法。
【００１６】
第五の態様において、
野生型の細菌又は古細菌細胞(例えば、大腸菌又はサルモネラ(Salmonella)細胞)を死滅させる方法であって、細胞が、Cas3及びCascadeタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む内因性CRISPR/Casシステムを含み、Cas3及び/又はCascadeが、細胞において天然で抑制され、方法が、
(a)前記Cas3及び/又はCascadeを脱抑制する工程及び
(b)(i)細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のための、CRISPRアレイ;又は(ii)それぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)を各々コードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を細胞に導入する工程を含み;
各crRNA又はgRNAが、Cas又はCascadeをガイドして、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する、方法。
【００１７】
第六の態様において、
宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)(i)細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のための、CRISPRアレイ又はCRISPRスペーサー配列;又は
(ii)細胞におけるガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列の導入のための部位を含み;
前記crRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する、ベクター。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図1は、spCas9及びリボソームRNAサブユニット16sをターゲティングする自己ターゲティングsgRNAの発現を制御する調節因子を示す。
【図２】図2は、外因性のCRISPR-Casシステムによる大腸菌株の特異的なターゲティングを示す。sgRNAは、大腸菌TOP10のようなK-12由来大腸菌株のゲノムを標的とするが、試験した他の株は影響されなかった。
【図３】図3は、CRISPR-Cas9システムの誘導なしの、TH寒天における、本研究で用いた個々の細菌種及び混合培養の段階希釈でのスポットアッセイを示す。
【図４】図4は、異なる選択培地における103倍希釈のスポットアッセイを示す。2.5gl-1のPEAを有するTHは、枯草菌(B.subtilis)単独のための選択的培地である。マルトースを補充したMacConkeyは、グラム陰性菌と腸内桿菌を選択的に単離し、それらをマルトース発酵に基づいて区別するように設計された、細菌用の選択的且つ鑑別的な培養培地である。したがって、TOP10ΔmalK変異体は、プレート上に白いコロニーを形成し、一方Nissleは、ピンクのコロニーを形成する;Aは大腸菌ΔmalK、Bは大腸菌Nissile、Cは枯草菌、DはL.ラクティス(L lactis)、Eは混合培養である;MacConkeyが-のBとEの画像はピンクに見える;MacConkeyが+のBとEの画像はピンクに見える。
【図５】図5は、異なる培地及び選択プレート上の、本研究で使用される細菌の選択的増殖を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明は、とりわけ、ベクター、複数の前記ベクターを含む組成物、方法及び使用を提供する。本発明は、飲料及び食糧(又はこれらを製造、加工又は保存する装置)によって含まれる環境(例えば、水又は水路、冷却又は加熱装置における、農業用植物中の又は農業用植物上における、土壌における)に天然に見られる野生型細菌集団又はヒト又は動物微生物相(例えば、腸、肺における又は皮膚における)によって含まれる野生型細菌集団のターゲティングに有用である。それ故、本発明は、宿主細胞の前改変により死滅又は成長阻害に、それらを受容性(receptive)とすることが不可能である又は望ましくない状況で有用性が見出される(例えば、対象の腸又は他の位置の微生物相のインサイチュでの治療が望まれるとき)。他の適用において、本発明は、宿主細胞が原因である又は媒介する疾患又は状態の治療又は予防のためにヒト又は動物対象に投与する医薬のエクスビボでの産生(例えば、腸細菌移植)に有用性が見出され、ここで医薬は、改変混合細菌集団(例えば、1つ又は複数のヒトドナーの糞便又は腸内微生物相から得た)を含み、これは本発明の使用又は方法の産物であり、ここで集団は、宿主細胞の種又は株と異なる種又は株の細菌の亜集団を含む。前者の亜集団細胞はプロトスペーサー標的を含まず、故に本使用又は方法により改変されない。それ故、例えば、本方法は、例えば、本明細書に開示される代謝性の、又はGIの状態(例えば、大腸炎)又は疾患の治療又は予防のための医薬の生産のために、混合集団において、バクテロイデス門(Bacteroidetes)の特定の亜集団の割合を減少させ、温存するために使用することができる。この様式で、本発明は、このような使用又はヒト又は動物における前記治療又は予防のための改変細菌移植(例えば、改変糞便移植)医薬を提供することができる。例えば、方法は、医学的使用(例えば、代謝状態(例えば肥満又は糖尿病)又はGI管状態(例えば、大腸炎、IBD、IBS、クローン病又は本明細書に言及される任意のこのような状態)又は癌(例えば、GI管癌又はメラノーマ)の治療又は予防)のための、又は化粧品又は個人衛生使用(例えば、ヒトの腋窩又はヒトの他の関連位置に局所適用することによる腋窩又は他の体臭の軽減のための、例えば、ヒトの局所使用)のための、ヒト又は動物に投与する
ための細菌の改変コレクションを産生するために、インビトロでの1つ又は複数の微生物相の改変に使用することができる。別の例では、本発明のベクターをヒト又は動物に投与し、宿主細胞はヒト又は動物に保持され、例えば、ヒト又は動物の微生物相(例えば、腸内微生物相又は本明細書に開示する任意の他のタイプの微生物相)によって含まれる。この様式で、宿主細胞により媒介される又は引き起こされる疾患又は状態を治療又は予防することができる。一例では、宿主細胞形質転換はインビトロで実施され、任意選択で、ベクターは宿主細胞に電気穿孔されるプラスミド又はファージミドであり;代替的に、ベクターは、宿主細胞に感染し、脱抑制因子及びアレイ又はgRNAコード配列を宿主細胞に導入するウイルス(例えば、バクテリオファージ)によって含まれる。一例では、核酸はRNA(例えば、gRNAのコピー)である。別の例では、ベクターは、DNAベクター又はRNAベクターである。
【００２０】
一例では、生物は、植物若しくは動物、例えば、脊椎動物(例えば、本明細書に開示する任意の哺乳動物若しくはヒト)又は作物若しくは食用植物である。
【００２１】
一例では、方法、使用、ベクター又は組成物は、医科学又は歯科学又は眼科学使用(例えば、生物における感染の治療若しくは予防又は生物における感染拡大制限)のためである。
【００２２】
一例では、方法、使用、ベクター又は組成物は、化粧品使用(例えば、化粧品製品、例えば、メイクアップにおける使用)又は衛生使用(例えば、衛生製品、例えば、石鹸における使用)のためである。
【００２３】
一例では、組成物は、以下の任意のとおりである:一例では、組成物は、医科、眼科、歯科又は医薬組成物(例えば、抗宿主ワクチンによって含まれる)である。一例では、組成物は、抗微生物組成物、例えば、抗生物質又は抗ウイルス、例えば、薬、殺菌剤又は口腔洗浄剤である。一例では、組成物は化粧品組成物(例えば、顔又は体のメイクアップ組成物)である。例えば、組成物は除草剤である。一例では、組成物は殺虫剤(例えば、宿主がバチルス(Bacillus)(例えば、チューリンゲンシス(thuringiensis))宿主であるとき)である。一例では、組成物は飲料(例えば、ビール、ワイン又はアルコール飲料)添加物である。一例では、組成物は食品添加物(例えば、宿主が大腸菌、サルモネラ、リステリア(Listeria)又はクロストリジウム(Clostridium)(例えば、ボツリヌム(botulinum))宿主であるとき)である。一例では、組成物は水添加物である。一例では、組成物は、水生動物環境(例えば、魚用水槽における)のための添加物である。一例では、組成物は石油又は石油化学工業組成物である又はこのような組成物に含まれる(例えば、宿主が硫酸還元細菌、例えば、デスルホビブリオ(Desulfovibrio)宿主であるとき)。一例では、組成物は石油又は石油化学添加物である。一例では、組成物は化学添加物である。一例では、組成物は殺菌剤(例えば、ヒト又は動物使用のための、例えば、外科的又は医学的使用又は新生児の食物摂取のための消毒装置のための)である。一例では、組成物は、ヒト又は動物使用のための個人衛生組成物である。一例では、組成物は環境使用、例えば、土壌処理又は環境除染のための組成物(例えば、汚水又は石油、石油化学又は化学から、例えば、宿主が硫酸還元細菌、例えば、デスルホビブリオ宿主であるとき)である。一例では、組成物は植物成長刺激因子である。一例では、組成物は、石油、石油化学、金属又は鉱物抽出において使用するための組成物である。一例では、組成物は布処理又は添加物である。一例では、組成物は動物皮革、革製品又はスエード処理又は添加物である。一例では、組成物は染料添加物である。一例では、組成物は飲料(例えば、ビール又はワイン)醸造又は発酵添加物(例えば、宿主がラクトバチルス(Lactobacillus)宿主である
とき)である。一例では、組成物は紙添加物である。一例では、組成物はインク添加物である。一例では、組成物は接着剤添加物である。一例では、組成物は抗ヒト又は動物又は植物寄生虫組成物である。一例では、組成物は空気添加物(例えば、エアコンディショニング装置における又はそれにより産生される空気のための、例えば、宿主がレジオネラ(Legionella)宿主である場合)である。一例では、組成物は凍結防止添加物(例えば、宿主がレジオネラ宿主である場合)である。一例では、組成物は洗眼又は眼科組成物(例えば、コンタクトレンズ流体)である。一例では、組成物は乳製品食品(例えば、組成物はミルク又は乳製品である又はこれに含まれる;例えば、宿主はラクトバチルス、ストレプトコッカス、ラクトコッカス(Lactococcus)又はリステリア宿主である)によって含まれる。一例では、組成物は家庭用又は工業用洗浄製品(例えば、宿主が大腸菌、サルモネラ、リステリア又はクロストリジウム(例えば、ボツリヌム)宿主である場合)である又はこれによって含まれる。一例では、組成物は、燃料によって含まれる。一例では、組成物は、溶媒(例えば、水以外)によって含まれる。一例では、組成物は、ベーキング添加物(例えば、食品ベーキング添加物)である。一例では、組成物は研究室試薬(例えば、生命工学又は組換えDNA又はRNA技術における使用のための)である。一例では、組成物は、繊維浸漬剤によって含まれる。一例では、組成物は、ビタミン合成プロセスにおける使用のためである。一例では、組成物は穀類枯死(anti-crop)又は植物腐敗組成物(例えば、宿主が腐生栄養性細菌であるとき)である。一例では、組成物は、例えば、金属腐食を防止又は減少させるための、抗腐食化合物(例えば、宿主が硫酸還元細菌、例えば、デスルホビブリオ宿主であるとき、例えば石油抽出、処理又は封じ込め装置、金属抽出、処理又は封じ込め装置又は鉱物抽出、処理又は封じ込め装置の腐食の減少又は防止に使用するため)である。一例では、組成物は農業又は畜産組成物である又はこのような組成物に含まれる。一例では、組成物はサイレージ添加物である。本発明は、この段落に記載する組成物のいずれかの使用又はこの段落に記載する適用のいずれかにおける使用のための、本明細書に記載するCRISPRアレイ、gRNA
コードヌクレオチド配列、ベクター又は複数のベクターを提供し、例えば、宿主細胞は細菌又は古細菌細胞である。本発明は、この段落に記載した適用のいずれかのための方法を提供し、方法は、CRISPRアレイ、gRNAコードヌクレオチド配列、ベクター又は複数のベクターと宿主細胞(例えば、細菌又は古細菌細胞)を組み合わせる工程を含む。一実施形態では、宿主細胞は、ヒト(又はヒト胚)又は動物中又は動物上に存在しない。
【００２４】
アレイ、ベクター、組成物、使用、又は方法等の本発明の態様のいずれも、産業用又は家庭用使用のためであるか、又はこのような使用のための方法に使用される。例えば、それは、農業、石油又は石油産業、食品又は飲料産業、衣料品産業、包装産業、電子機器産業、コンピューター産業、環境産業、化学産業、航空宇宙産業、自動車産業、生命工学産業、医療産業、健康産業、歯科産業、エネルギー産業、消費財産業、製薬産業、採鉱産業、清掃産業、林業、漁業、娯楽産業、リサイクリング産業、化粧品産業、プラスチック産業、パルプ又は紙産業、繊維産業、衣料品産業、革製品又はスエード又は動物皮革の産業、タバコ産業又は製鋼産業用である又はこれらで使用される。
【００２５】
本発明は、宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)各crRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する;細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)を各々コードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含む、ベクターを提供する。
【００２６】
(a)の配列は、それが、脱抑制因子の発現に関して細胞において作動可能である、プロモーターに作動可能に連結されうるので、発現可能である。
【００２７】
任意選択で、本明細書の任意の宿主細胞は、細菌又は古細菌細胞である。一例では、細胞は、定常期にある。一例では、細胞は、指数期にある。一例では、細胞は、誘導期にある。一例では、細胞は、例えば、ヒト、動物、植物、土壌、水、海、水路又は環境の、天然に存在するマイクロバイオームによって含まれる、野生型細胞又は天然に存在する細胞である。一例では、細胞は、人工的に遺伝的に改変されている。一例では、CRISPR/Casシステムは、人工的に抑制され、脱抑制因子が前記抑制を除去する又は減少させる。
【００２８】
一例では、本発明の複数のベクターは、複数の前記宿主細胞に導入され、宿主細胞は、例えば、エクスビボ、インビボ又はインビトロで細菌集団によって含まれる。一例では、宿主細胞は、生物又は環境(例えば、水路微生物相、水微生物相、ヒト又は動物腸内微生物相、ヒト又は動物口腔微生物相、ヒト又は動物膣微生物相、ヒト又は動物皮膚又は毛微生物相又はヒト又は動物腋窩微生物相)によって含まれる微生物相集団によって含まれ、集団は、生物又は環境と相利共生又は片利共生である第一細菌を含み、第二細菌は前記宿主細胞を含み、宿主細胞は、生物又は環境に有害(例えば、病原性)である。一実施形態では、集団はエクスビボにある。一例では、第一細菌亜集団の第二細菌亜集団に対する比は増加する。一例では、第一細菌は、バクテロイデス(例えば、B.フラジリス(B fragalis)及び/又はB.シータイオタミクロン(B thetaiotamicron))細菌である。任意選択で、バクテロイデスは、カッカエ(caccae)、カピロスス(capillosus)、セルロシリティカス(cellulosilyticus)、コプロコラ(coprocola)、コプロフィルス(coprophilus)、コプロスイス(coprosuis)、ディスタソニス(distasonis)、ドレイ(dorei)、エガーシイ(eggerthii)、ファエシス(faecis)、ファインゴールディー(finegoldii)、フルクサス(fluxus)、フラジリス(fragalis)、インテスティナリス(intestinalis)、メラニノゲニカス(melaninogenicus)、ノルディイ(nordii)、オレイシプレヌス(oleiciplenus)、オラーリス(oralis)、オバータス(ovatus)、ペクチノフィルス(pectinophilus)、プレベイウス(plebeius)、ステルコリス(stercoris)、シータイオタオミクロン(thetaiotaomicron)、ユニフォルミス(uniformis)、ブルガタス(vulgatus)及びキシラニソルベンス(xylanisolvens)から選択される、1、2、3又はそれ以上のバクテロイデス種を含む。例えば、バクテロイデスは、B.シータイオタオミクロンである又はそれを含む。例えば、バクテロイデスは、B.フラジリスである又はそれを含む。
【００２９】
一例では、宿主、第一又は第二細胞は、US20160333348、GB1609811.3、PCT/EP2017/063593及び全ての米国の同等の出願に開示されている任意の細菌種である。これらの種の開示(特に、PCT/EP2017/063593の表1を含む)は、それらの全体において、そこで開示される1つ又は複数の開示の、本願の1つ又は複数の請求項における潜在的な包含のために、本明細書に組み込まれる。
【００３０】
一例では、宿主細胞又は細菌集団は、ヒトが消費する飲料又は水(例えば、水路又は飲料水)に保持される。一例では、宿主細胞又は前記集団は、その腸内又は口内微生物相の定植及びリバランスのためにヒト又は非ヒト動物に投与するための組成物(例えば、医薬(例えば、細菌腸移植)、飲料、口内洗浄剤又は食糧)によって含まれる(例えば、医薬の前記使用は、ヒト又は動物における疾患又は状態を治療する又は予防することである)。一例では、宿主細胞又は前記集団は、固体表面にある又はバイオフィルム(例えば、腸バイオフィルム又は工業用装置におけるバイオフィルム)によって含まれる。一例では、ベクター、方法又は使用は、工業又は医療の流体、固体表面、装置又はコンテナ(例えば、食品、消費財、化粧品、パーソナルヘルスケア製品、石油又は石油製品)のインビトロ処理のためである;又は水路、水、飲料、食糧又は化粧品の処理のためであり、宿主細胞は、流体、表面、装置又はコンテナ、水路、水、飲料、食糧又は化粧品にある又はそれによって含まれる。
【００３１】
一例では、本発明は、使用又は方法の集団又は産物を含む、医学又は栄養学的な使用のためのコンテナを提供する。例えば、コンテナは、例えば、吸入器又はシリンジ若しくはIV針に連結された滅菌容器である。一例では、使用又は方法の産物集団は、疾患又は状態(例えば、本明細書に列挙される疾患又は状態)を治療する又は予防するために、そのマイクロバイオームを生息させるための、ヒト又は動物への投与に有用である。本発明は、本発明の使用又は方法のための集団産物を含む、ヒト又は非ヒト動物消費用の食糧又は飲料を提供する。
【００３２】
一例では、ベクター、組成物は、粘膜、腸、経口、鼻腔内、直腸内、腟内、眼又は頬側投与による、ヒト又は非ヒト動物への投与のためである(又は、投与される)。
【００３３】
任意選択で、ベクターは、Cas(例えば、Cas3及び/又はCas9)ヌクレアーゼコード配列を欠く。一例では、システムは、抑制された宿主細胞Cascade、Cas3、CasCas9又はcpf1活性を含む。
【００３４】
例えば、宿主細胞は、野生型(例えば、操作されていない)細菌細胞である。別の例では、宿主細胞は、(例えば、外来性ヌクレオチド配列を染色体に導入するために又は、例えば、宿主細胞の染色体又はプラスミド上の内在性ヌクレオチド配列を改変するために)操作される。一例では、前記宿主細胞の細菌コロニーの形成は、宿主細胞へのベクターの導入後に阻害される。一例では、宿主細胞の増殖は、前記導入後に阻害される。一例では、宿主細胞は、前記導入後に死滅させられる。
【００３５】
任意選択で、各宿主細胞は、ヒト微生物相に見られる株又は種のものであり、任意選択で、宿主細胞は、異なる株又は種の細胞と混合され、異なる細胞は、ヒト(例えば、ヒト腸における)とプロバイオティク、片利共生又は相利共生にある腸内細菌科(Enterobacteriaceae)又は細菌である。一例では、宿主細胞は、大腸菌又はサルモネラ細胞である。
【００３６】
本発明は、任意選択で、ヒトの微生物相におけるバクテロイデス門細菌(例えば、バクテロイデス、例えば、フラジリス及び/又はシータイオタミクロン)、ファーミキューテス門細菌及び/又はグラム陽性又は陰性細菌の比率の変更のため等の、細菌集団成長阻害又は混合細菌集団中の第一細菌及び第二細菌の亜集団の相対比率の変更、例えば、ヒト又は動物マイクロバイオームの変更のためである。例えば、本発明のある実施形態は、以下を提供する:
ヒト又は動物対象における疾患を治療する又は予防する方法における使用のための抗微生物組成物、ここで、対象の腸が混合細菌集団を含み、方法が、抗微生物を対象に投与して、対象の腸によって含まれる混合細菌集団の宿主細胞を改変し、腸集団の片利共生又は相利共生バクテロイデス門細菌を支持し、それによって、対象の腸におけるバクテロイデス門細菌の比率を増加させる工程を含み、ここで、前記治療又は予防が成立し、ここで、組成物は本発明の1つ又は複数のベクターを含み、宿主細胞は腸集団において天然で抑制されたCRISPR/Casシステムを含む。
【００３７】
対象の片利共生又は相利共生バクテロイデス門細菌を利用することは、既に腸にいる内因性片利共生者及び相利共生者の活性による疾患修飾効果を活用することにとって有利である。これにより、当技術分野において教示されているように潜在的に病原性である外因性バクテロイデス門細菌を投薬するリスクが回避される。更に、患者自身の腸細菌を活用することによって(例えば、他の腸細菌、例えばグラム陽性、例えばクロストリジウム属細菌をターゲティングすることによって、拡大のために患者の腸マイクロバイオームにニッチを生み出すことによって)より持続的な効果を発生させることが可能でありうる。内因性の患者細菌の有用な利用に関する可能性により、細菌調製物又はその抽出物を使用する製剤の投薬の考慮及び維持の必要性も回避される。
【００３８】
加えて、バクテロイデス、例えば、B.フラジリス及びB.シータイオタミクロンは厳密な嫌気性菌であり、嫌気性環境中の組成物の産生、貯蔵及び投与は厳しく制限される。本発明は、それを腸の適合する嫌気性環境中に停留する、患者自身のバクテロイデス門細菌を利用することによって回避する。
【００３９】
更に、腸における患者自身の内因性バクテロイデス門細菌及び患者の免疫システム及び他の相互作用因子は、共に進化し、適合して効果的に働き(例えば、疾患に対処するために有用な免疫応答を刺激する)、本発明は、例えば、対象における免疫応答を刺激するために、内因性腸バクテロイデス門細菌を利用することによって本利点を活用することができる。加えて、それには、外因性に投与されたバクテロイデス門細菌(又はそのペプチド)を必要とせず、これが(投薬問題を)幾分か取り除く可能性があり、有益な使用のために正確に腸陰窩区域に効果的にコロニーを作る、それらの様式が何らかの形で見出される必要がある。代わりに、本発明におけるエフェクター細菌は、患者において既に所定の位置にあり、直ちに有用である。
【００４０】
一例では、本方法は、炎症性陽疾患(IBD)を治療する又は予防するためである。一例では、本方法は、医療目的で肥満を治療する又は予防するためである。一例では、本方法は、糖尿病を治療する又は予防するためである。一例では、本方法は、バクテロイデス門細菌のファーミキューテス門細菌に対する相対比を増加させることを含む。一例では、バクテロイデス門細菌は、B.フラジリス及び/又はB.シータイオタミクロンである。一例では、バクテロイデス門細菌は、B.ユニフォルミスである。
【００４１】
一例では、本発明のベクターは、US20160333348、GB1609811.3、PCT/EP2017/063593及び全ての米国の同等の出願に開示されている任意の方法における使用のためである;一例では、本発明のベクターは、US20160333348、GB1609811.3、PCT/EP2017/063593及び全ての米国の同等の出願に開示されている任意のベクターに従う。US20160333348、GB1609811.3、PCT/EP2017/063593及び全ての米国の同等の出願の開示(これらの特定の開示を含む)は、その全体において、そこで開示される1つ又は複数の開示の、本願の1つ又は複数の請求項における潜在的な包含のために、本明細書に組み込まれる。
【００４２】
一例では、本発明のベクター又は組成物は、宿主細胞溶解のためのエンドリシンを宿主細胞において発現させるためのヌクレオチド配列を含み、任意選択で、エンドリシンは、ファージphi11、ファージTwort、ファージP68、ファージphiWMY又はファージKエンドリシン(例えば、MV-Lエンドリシン又はP-27/HPエンドリシン)である。
【００４３】
脱抑制因子は、細胞におけるCRISPR/Casシステムを活性化可能である、活性化因子として作用し得、活性化因子は、抑制因子の存在下で前記システムを活性化する。例えば、抑制因子は、システムの核酸(例えば、プロモーター)に結合し得、活性化因子が、抑制を無効にし、抑制因子がシステムの要素に結合するときに、システムを活性化する。
【００４４】
一例では、プロトスペーサー配列は、宿主細胞の染色体によって含まれ、例えば、配列は、宿主細胞の抗生物質耐性遺伝子、ビルレンス遺伝子又は必須遺伝子によって含まれる。一例は、本発明のベクターを抗生物質(例えば、ベータラクタム抗生物質)と組み合わせて提供し、例えば、ベクターは、宿主細胞ゲノム又はエピソーム(例えば、宿主細胞によって含まれるプラスミド)によって含まれる抗生物質耐性遺伝子によって含まれるプロトスペーサー配列を標的とする。一例では、エピソームは、プラスミド、トランスポゾン、可動遺伝要素(mobile genetic element)又はウイルス配列(例えば、ファージ又はプロファージ配列)である。
【００４５】
一例では、標的配列は染色体配列、内在性宿主細胞配列、野生型宿主細胞配列、非ウイルス染色体宿主細胞配列であり、外来性配列及び/又は非ファージ配列ではなく(すなわち、これらの1つ又は複数又は全て)、例えば、配列は宿主細胞染色体によって含まれる抗生物質耐性遺伝子又は必須遺伝子配列等の野生型宿主染色体細胞配列である。一例では、配列は、宿主細胞プラスミド配列であり、例えば、抗生物質耐性遺伝子配列である。
【００４６】
任意選択で、該又は各宿主細胞プロトスペーサー配列は、NGG、NAG、NGA、NGC、NGGNG、NNGRRT又はNNAGAAWプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)、例えば、AAAGAAA又はTAAGAAA PAM(これらの配列は5'から3'記載されている)に隣接する。一実施形態では、PAMは、プロトスペーサー配列の3'端に直接隣接する。一例では、Casは、S.アウレウス(S aureus)、S.サーモフィルス又はS.ピオゲネスCasである。一例では、CasはCpf1である及び/又はPAMはTTN又はCTAである。
【００４７】
任意選択で、システムは、タイプI(例えば、タイプI-A、I-B、I-C、I-D、I-E、又はI-F) CRISPR/Casシステムである。任意選択で、システムは、タイプII CRISPR/Casシステムである。任意選択で、システムは、タイプIIII CRISPR/Casシステムである。任意選択で、システムは、タイプIV CRISPR/Casシステムである。任意選択で、システムは、タイプV CRISPR/Casシステムである。任意選択で、システムは、タイプVI CRISPR/Casシステムである。
【００４８】
任意選択で、CRISPRアレイは、プロトスペーサー配列をターゲティングするための、複数コピーの同じスペーサーを含む。任意選択で、本発明のベクター又は複数のベクターが提供され、ベクターは、宿主細胞プロトスペーサー配列ターゲティングのための、前記gRNAコード配列の複数のCRISPRアレイを含む。任意選択で、該又は各ベクターは、crRNA(例えば、gRNA)をコードする、2、3又はそれ以上のコピーの核酸配列を含み、コピーは、宿主細胞配列(例えば、ビルレンス、耐性又は必須遺伝子配列)のターゲティングのための同じスペーサー配列を含む。
【００４９】
一例では、少なくとも2つの標的配列は、Casによって改変され、例えば、抗生物質耐性遺伝子及び必須遺伝子である。この様式での複数のターゲティングは、エスケープ変異体宿主細胞の進化を減少させるのに有用でありうる。
【００５０】
一例では、Casは、野生型内因性宿主細胞Casヌクレアーゼである。一例では、プロトスペーサー標的改変又は切断は、dsDNA Casヌクレアーゼ(例えば、Cas9、例えば、spCas9又はsaCas9)によって実施され、切断の修復は非相同末端連結(NHEJ)による;代替的に、Casは、エキソヌクレアーゼ又はCas3である。一例では、Casは、切断するためのCasヌクレアーゼ、妨害するためのdeadCas(dCas)又は標的を活性化するための転写活性化因子にコンジュゲートしたdCas(例えば、dCas3又はdCas9)である。
【００５１】
一例では、アレイ、gRNAコード配列又はベクターは、アレイ又は、gRNAコード配列の反復配列と共に細胞において天然で見出されるCasエンドヌクレアーゼコード配列と組み合わされない。
【００５２】
例えば、tracrRNAを使用しないタイプのCasシステムに関して、tracrRNA配列を本発明のアレイ又はベクターから省略してもよい、又は内因性tracrRNAは、ベクターによってコードされたcrRNAと共に使用されてもよい。
【００５３】
一例では、宿主プロトスペーサー配列は、少なくとも5、6、7、8、9、10、20、30又は40連続ヌクレオチドを含む。
【００５４】
一例では、該又は各ベクターは、宿主におけるcrRNA又はgRNAの転写に関して機能的な外来性プロモーターを含む。
【００５５】
一例では、該又は各アレイ反復は、宿主のCRISPR/Casシステムによって含まれる宿主アレイにおける反復と同一(又は少なくとも90、95若しくは98%同一)であり、ベクターアレイは、宿主CRISPR/CasシステムのCasヌクレアーゼによって認識されるPAMを含まない。これは、gRNAの反復配列に準用される。これは、CRISPRアレイが、宿主標的配列を標的とするのに内在性宿主Casを使用することを単純に可能とするため、有利である。次に、これは、アレイが宿主機構による使用のために合わせられ、故に、宿主細胞において機能することを助けるため、能率的である。これは、加えて又は代替的に、ベクターコード化アレイ配列を内因性コード化tracrRNAと組み合わせることを可能とし、その理由は、CRISPRアレイ反復が、プレ-crRNAの産生及び宿主標的配列にハイブリダイズする成熟crRNAへのプロセシングのために、内因性tracrRNAにハイブリダイズするからである。後者の複合体は、次に内因性Casヌクレアーゼ(例えば、Cas3)をガイドすることができる。この実施形態は、それ故に、CRISPRアレイを含有しているが、tracrRNA-及び/又はCasヌクレアーゼ-コード配列を含まないベクター(例えば、パッケージ化ウイルス又はファージ)の単純な構築の柔軟性を提供する。これは、ベクター構築にとってより簡単であり、またベクター、特にウイルスベクター(例えば、ファージ)の容量制限を考慮して有用であり、ベクター(例えば、ウイルス又はファージ)における有用な空間も解放する。更なる空間が、例えば、宿主遺伝子不活性化又は宿主における発現のための所望の非宿主配列における取り込みのために、例えば、改変のために宿主ゲノムを標的とするために、例えば、アレイにおいてより多くのスペーサーの包含を可能にするために、有用でありうる。追加的に又は代替的に、空間を、ベクターにおける複数のCRISPRアレイの包含に使用できる。これらは、例えば、第一アレイが第一CRISPR/Casタイプ(例えば、タイプII又はタイプII-A)のものであり、第二アレイが第二タイプ(例えば、タイプI又はIII又はタイプII-B)のものである場合の配置であり得る。追加的に又は代替的に、アレイは、宿主における異なるCasヌクレアーゼを使用できた(例えば、一方のアレイは宿主Casヌクレアーゼと共に作動可能であり、第二アレイは外来性Casヌクレアーゼ(すなわち、ベクターコード化ヌクレアーゼ)又は異なる宿主Casと共に作動可能である)。これらの態様は、一旦ベクターが導入されたら宿主におけるターゲティングのための機構を提供し、これは、宿主がその後に広範囲の要素を標的とする必要がありうるため、ベクターの宿主耐性減少に有益である。例えば、宿主が第一CRISPRアレイ配列に基づく新しいスペーサーを獲得できたとしても、第二CRISPRアレイはなお宿主において宿主細胞におけるそれぞれの標的配列の標的として機能できる。それ故、この実施形態は、ベクターへの宿主適応の減少に有用である。
【００５６】
任意選択で、本発明のベクターは、宿主標的配列にハイブリダイズするための複数(例えば、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90、100又はそれ以上)のコピーのスペーサーを含む、1、2、3、4、5、6又はそれ以上の本発明のCRISPRアレイ又はgRNAコード配列を含む。これは、全てのこれらのスペーサーが宿主細胞において組換えにより喪失される機会を減少させる。この態様の更なる適用において、CRISPRアレイは、1つ又は複数(例えば、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90又はそれ以上)のスペーサーコピーを含む第一アレイ及び1つ又は複数(例えば、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、70、80、90又はそれ以上)の同一スペーサーコピーを含む第二アレイを含み、第一アレイにおけるスペーサーコピーは、各々第一反復に隣接しており、第二アレイにおける同一スペーサーコピーは、各々第二反復に隣接しており、第一反復は、第二反復と異なる。これは有益であり、第一反復が選択されて第一(例えば、脱抑制された)宿主Casヌクレアーゼによって認識されうる及び第二反復が第二Cas(例えば、ベクターコード化又は宿主Cas)によって認識されて1種を超えるアレイが関与する宿主適応の機会を減少させる。
【００５７】
任意選択で、本発明のベクター又は複数のベクターが提供され、各ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス、ビリオン、ファージ、ファージミド又はプロファージである。例えば、本発明は、本発明の複数のベクターを含む複数のバクテリオファージを提供し、例えば、ベクターは同一である。一例では、ベクターは、ウイルスベクターである。ウイルスベクターは、特に限られた外因性DNA挿入容量を有し、故に、ウイルスパッケージング容量を考慮する必要がある。コートタンパク質及びポリメラーゼを発現させるため等の、必要不可欠なウイルス機能をコードする配列のために余地を残す必要がある。一例では、ベクターは、ファージベクター又はAAV若しくはレンチウイルスベクターである。ファージベクターは、宿主が細菌細胞である場合に有用である。一例では、ベクターは、古細菌宿主細胞に感染可能なウイルスである。
【００５８】
任意選択で、ベクター成分(a)及び(b)は、宿主細胞内及び/又は宿主細胞間を伝達可能なトランスポゾンによって含まれる。トランスポゾンは、US20160333348、GB1609811.3及び全ての米国の同等の出願に記載されるトランスポゾンであってもよく;これらの開示(これらの特定のトランスポゾンの開示を含む)は、その全体において、そこで開示される1つ又は複数の開示の、本願の1つ又は複数の請求項における潜在的な包含のために、本明細書に組み込まれる。
【００５９】
一例では、該又は各ベクターは、ナノ粒子によって又はリポソーム中に提供される。
【００６０】
一例では、CRISPR/Casシステムの1つ又は複数の成分の転写が抑制される。例えば、1つ又は複数のCas配列(例えば、Cas3、Cas9又はCpf1)の転写が抑制される。例えば、タイプI CRISPR/CasシステムのCasA、B、C、D及びEのうちの1つ又は複数の転写が抑制され、例えば、CasA及び/又はCas3が抑制される。
【００６１】
任意選択で、宿主細胞ゲノムのCas改変は、
a. 宿主細胞を死滅させる;
b. 細胞又はエピソームの成長又は増殖を減少させる;
c. 細胞又はエピソームの成長又は増殖を増加させる;
d. 前記プロトスペーサー配列を含む又はそれに隣接する、ヌクレオチド配列の転写を減少させる又は防止する;又は
e. 前記プロトスペーサー配列を含む又はそれに隣接する、ヌクレオチド配列の転写を増加させる。
【００６２】
一例では、宿主細胞集団増殖阻害は、本発明のベクターに曝されていない前記宿主細胞の増殖と比較して、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍又は10倍である。例えば、増殖阻害は、宿主細胞の第二サンプル(単独又は混合細菌集団)のコロニー数と比較して、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍又は10倍宿主細胞の第一サンプル(単独又は混合細菌集団)より低い細菌コロニー数により示され、細胞の第一サンプルは前記ベクターにより形質転換されているが、第二サンプルは前記ベクターに曝されていない。一実施形態では、コロニー数は、第一サンプルが本発明のベクターに曝されてから、12、24、36、又は48時間後に決定される。一実施形態では、コロニーは、インビトロで(例えば、ペトリ皿にて)固体寒天上で増殖する。したがって、増殖阻害が、標的配列を含む細胞又は集団の増殖の減少(非処理、すなわち、対照サンプル増殖と比較して<100%増殖)により示すことができる又はこのような増殖の完全排除であり得ることが理解される。一例では、宿主細胞集団の増殖は、所定期間にわたり(例えば、宿主細胞においてcrRNA又はgRNAを組み合わせた後24時間又は48時間)少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は95%減少され、すなわち、宿主細胞集団の増殖は、前記ベクターに曝されていないが、それ以外は前記所定期間、同じ条件下に維持されている対照宿主細胞集団の増殖より、少なくともこのようなパーセント少ない。一例では、増殖のパーセント低下は、前記期間の終わり(例えば、対照サンプルの指数増殖期中期の時点)に各集団のサンプルのコロニー数を比較することによって決定される。例えば、テスト集団を、0時間にベクターに曝した後、テスト集団及び対照集団のサンプルを採取して、各サンプルを寒天プレートにプレーティングし、前記所定期間、同一条件下でインキュベートする。期間の終わりに、各サンプルのコロニー数をカウントして、パーセンテージ差を計算する(すなわち、テストコロニー数を対照コロニー数で除して、次に100を掛け、次にその結果を100から引いて増殖低下のパーセンテージを得る)。倍数差は、対照コロニー数を、テストコロニー数で除して、計算する。
【００６３】
集団増殖の阻害は、それ故に、集団における宿主細胞数の増殖の減少により示され得る。これは、脱抑制又は活性化CRISPR/Casシステムによる及び/又は宿主細胞における標的プロトスペーサー配列におけるシステムの作用による宿主細胞増殖(例えば、分裂及び/又は細胞増殖)のダウンレギュレーションによる細胞死滅に起因し得る。本明細書中に開示される方法、使用、治療又は予防の一実施形態では、ヒト若しくは動物対象又は環境の宿主細胞負荷が減少され、それによって、疾患又は状態が、治療される(例えば、減少される又は排除される)又は予防される(すなわち、疾患又は状態を発症する対象のリスクが減少される又は排除される)又は環境が処理される。
【００６４】
一例では、成分(a)及び(b)は、代わりに、前記Cas改変が起こる宿主細胞へのベクターの導入のために、異なる第一及び第二ベクターによって含まれる。
【００６５】
一例では、脱抑制因子は、タンパク質又はRNAである。例えば、脱抑制因子は、抑制因子をコードする宿主細胞遺伝子によって含まれるヌクレオチド配列に相補的なサイレンシングRNA(siRNA)であり、例えば、配列は、ORF又は調節エレメント、例えば、遺伝子のプロモーター又はエンハンサーの配列である。
【００６６】
一例では、抑制因子は、抗CRISPR又は抗Cas(例えば、抗Cas3又は抗Cas9)タンパク質、核酸又はRNA(例えば、宿主細胞によって含まれるプロファージによってコードされる)である。例えば、抑制因子は、acr、acrIIA2及びacrIIA4、aca1及びaca2遺伝子又はそのオルソログ、ホモログ若しくはパラログによってコードされる;並びに任意選択で、脱抑制因子は、宿主細胞における脱抑制因子遺伝子配列に相補的であり、それによって、遺伝子の発現をサイレンシングする、siRNAである。一例では、抑制因子は、AcrIIAタンパク質、例えば、AcrIIA2及び/又はAcrIIA4である。
【００６７】
H-NSは、しばしば他の核様体関連タンパク質(NAP)との組合せで作用するので、関連する調節タンパク質、例えば、StpA、LRP及びFISの結合が分析されている(Luijsterburgら、2006;Dorman,2009)。抑制因子は、H-NS(核様体構造化タンパク質)、StpA、FIS、LRP((ロイシン応答性調節タンパク質)又はCRP(cAMP受容体タンパク質);又は宿主細胞において抑制因子として機能する、そのオルソログ、若しくはパラログ、ホモログ若しくは機能的な均等物であってもよい。例えば、抑制因子は、大腸菌H-NS、StpA、FIS、LRP又はCRPタンパク質のオルソログ、又はパラログ、ホモログ又は機能的な均等物であってもよい。一例では、CRISPR/Casシステムは、1種を超える、このような抑制因子、例えば、H-NS及びLRP;又はH-NS及びCRPによって抑制される。
【００６８】
脱抑制因子は、宿主細胞において、それぞれ、H-NS、StpA、LRP又はCRP抑制因子(例えば、野生型宿主又は大腸菌H-NS、StpA、LRP又はCRP)との複合体を形成可能であり、CRISPR/Casシステムの抑制を防止する又は減少させる、変異体H-NS、StpA、LRP又はCRPであってもよい。脱抑制因子は、(例えば、インビトロで又は宿主細胞若しくは大腸菌において)、それぞれ、野生型宿主又は大腸菌H-NS、StpA、LRP又はCRPとの複合体を形成可能である、変異体H-NS、StpA、LRP又はCRPであってもよい。
【００６９】
一例では、抑制因子はH-NS又はStpAであり、脱抑制因子はLeuOである。
【００７０】
一例では、エピソームは、プラスミドである。
【００７１】
以下の定義を適用する:
ホモログ
・  共通の祖先DNA配列から遺伝する第二遺伝子又はタンパク質に関連する、遺伝子又はタンパク質。用語「ホモログ」は、種分化のイベントによって分離された遺伝子又はそれらのタンパク質産物の間の類縁関係(オルソログを参照されたい)又は、遺伝的な複製のイベントによって分離された遺伝子の間の類縁関係(パラログを参照されたい)に適用され得る。
オルソログ
・  オルソログは、種分化によって共通の先祖遺伝子又はタンパク質から進化した異なる種における遺伝子又はタンパク質である。通常、オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持している。
パラログ
・  パラログは、ゲノム内での複製によって血縁関係にある遺伝子又はタンパク質である。オルソログは、進化の過程で同じ機能を保持しているが、一方、パラログは、たとえ、これらが当初のものと血縁関係にあるとしても、新しい機能を進化させる。
【００７２】
抑制因子又は脱抑制因子自身のホモログは、宿主細胞における抑制因子又は脱抑制因子としての活性を有する。抑制因子又は脱抑制因子自身のオルソログは、宿主細胞における抑制因子又は脱抑制因子としての活性を有する。抑制因子又は脱抑制因子自身のパラログは、宿主細胞における抑制因子又は脱抑制因子としての活性を有する。
【００７３】
一例では、細胞は、細菌又は古細菌細胞である。一例では、細胞は、環境、土壌、植物、哺乳動物、ヒト、マウス、ラット、ブタ、イヌ、霊長類、サル、ヒツジ、雌ウシ、ウマ、ネコ、反芻動物、家畜、昆虫又はトリ、例えば、ニワトリ若しくはシチメンチョウによって含まれ、例えば、そのマイクロバイオームによって含まれる。マイクロバイオームは、植物の葉、植物の幹、土壌、腸、皮膚、口、肺、眼球、耳、舌、腋窩、膣、直腸、陰嚢、陰茎又は毛髪マイクロバイオームでありうる。一例では、細胞は、脊椎動物、無脊椎動物、哺乳動物、ヒト、げっ歯類、マウス、ラット、魚類又は昆虫細胞である。
【００７４】
一例では、宿主細胞は、大腸菌細胞であり、例えば、
・  志賀毒素産生大腸菌(STEC)(STECは、ベロ毒素産生大腸菌(VTEC)又は腸管出血性大腸菌(EHEC)とも称されうる。この病原型は、食品媒介の大流行と関係するニュースについて最も一般的に耳にするものである);
・  腸内毒素原性大腸菌(ETEC);
・  腸管病原性大腸菌(EPEC);
・  腸管凝集性大腸菌(EAEC);
・  腸管組織侵入性大腸菌(EIEC);及び
・  散在性付着性大腸菌(DAEC)から選択される。
【００７５】
2011年にヨーロッパにおいて大きい大流行を引き起こした志賀毒素産生大腸菌O104:H4株は、頻繁にEHECと称された。北アメリカにおいて最も一般的に同定されるSTECは、大腸菌O157:H7である。一例では、細胞は、大腸菌O104:H4又は大腸菌O157:H7である。
【００７６】
内因性CRISPR/Casシステムは、細胞が高密度にパックされるときに、例えば、ファージ侵入又はプラスミド水平伝播と戦うために、定常期に宿主細胞において、幾分か脱抑制及び/又はアップレギュレートされ得ることが観察されている。本発明のベクターの一例では、成分(a)及び/又は(b)は、定常増殖期中の宿主細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結される。高密度にパックされた細胞はバイオフィルムに存在しうる、故に、本発明のベクターの一例では、成分(a)及び/又は(b)は、バイオフィルム(例えば、環境における又はヒト若しくは動物体における、例えば、肺又は腸バイオフィルム)によって含まれる宿主細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結される。
【００７７】
またプロトスペーサーターゲティング、又は代替的に、指数増殖期(例えば、内因性CRISPR/Casシステムが抑制されうる)を可能にするために、本発明のベクターの一例では、成分(a)及び/又は(b)は、指数増殖期中の宿主細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結される。本発明のベクターの一例では、成分(a)及び/又は(b)は、誘導期中の宿主細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結される。
【００７８】
転写調節因子CsgDは、バイオフィルム形成に中心的なものであり、curli構造及びエクスポートタンパク質及びジグアニル酸シクラーゼadrA(これは間接的にセルロース産生を活性化する)の発現を制御する。Chirwa NT及びHerrington MB、Microbiology. 2003 Feb;149(Pt 2):525〜35、「CsgD、a regulator of curli及びcellulose synthesis、also regulates serine hydroxymethyltransferase synthesis in Escherichia coli K-12」は、相同的なCsgD及びAgfDタンパク質が、FixJ/UhpA/LuxRファミリーのメンバーであること並びにそれぞれ大腸菌及びサルモネラ・エンテリカ血液型亜型チフィムリウム(Salmonella enterica serovar Typhimurium)によってcurli(薄い凝集性線維)及びセルロース産生が調節されると提唱されることを説明している。CsgDがglyAをアップレギュレートしてcurliの合成を促進することが提唱される。本発明のベクターの一例では、成分(a)及び/又は(b)は、宿主細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは、CsgD又はAgfD、例えば、大腸菌CsgD又はAgfDによって制御される。これは、例えば、バイオフィルム中の宿主細胞における又はバイオフィルムの生物発生に関与するベクター成分の発現を促進させるのに有用でありうる。任意選択で、宿主細胞は、大腸菌及びサルモネラ・エンテリカ血液型亜型チフィムリウム細胞である。
【００７９】
遺伝子rpoS(RNAポリメラーゼ、シグマS)は、大腸菌における37.8kDのタンパク質である、シグマ因子シグマ-38(σ38、又はRpoS)をコードする。シグマ因子は、細菌における転写を調節するタンパク質である。シグマ因子は、異なる環境の状態に応答して活性化することができる。rpoSは指数期後期に転写され、RpoSは定常期遺伝子の一次調節因子である。RpoSは、一般ストレス応答の中心的な調節因子であり、逆行性及び順向性様式の両方で作動し:それは、細胞が、困難な環境(environmental challenges)で生存することを許容するばかりでなく、引き続くストレスに対して細胞に準備もさせる(干渉効果)。本発明のベクターの一例では、成分(a)及び/又は(b)は、宿主細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは、シグマ因子、例えば、RpoS、例えば、大腸菌RpoSによって調節される。これは、例えば、シグマ因子及びRpoS調節がアップレギュレートされる増殖期中の宿主細胞におけるベクター成分の発現を促進させるのに有用でありうる。任意選択で、宿主細胞は、大腸菌及びサルモネラ・エンテリカ血液型亜型チフィムリウム細胞である。大腸菌におけるrpoSの転写は、染色体rpoSpプロモーターによって主に調節される。rpoSpは、rpoS mRNAの転写を促進し、リッチ培地で成長する細胞において定常期に入る際に誘導される。それ故、一例では、ベクターによって含まれる該又は各前記プロモーターが、操作して、定常期中に宿主細胞において、その成分(a)又は(b)の転写をアップレギュレートする、例えば、該又は各プロモーターはrpoSpプロモーターである。
【００８０】
防御機構として、細菌宿主環境は、病原体、例えばファージの侵入に敵対的である。したがって、感染は、病原性細菌にとってストレス性のイベントであり得、ビルレンス遺伝子の制御は病原体による感染のタイミングと時間的に相関し得る。サルモネラにおけるRpoS-依存的なビルレンス遺伝子の発見は、ストレス応答の一般的な調節因子としてのRpoSと一貫性があり:この細菌中のビルレンスプラスミド中に見出されたspv遺伝子はRpoSによって制御される、また興味深いことに、脾臓及び肝臓等の深リンパ組織中での増殖に要求される。それ故、一実施形態では、ベクターは、宿主細胞(例えば、大腸菌又はサルモネラ細胞)に感染可能なバクテリオファージ等のウイルスであり、成分(a)及び/又は(b)は、宿主細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結され、プロモーターは、RpoS、例えば大腸菌RpoSによって調節される。任意選択で、宿主細胞は、ヒト又は動物によって含まれる脾臓又は肝臓細菌集団によって含まれる。任意選択で、ベクターは、状態又は疾患、例えば脾臓、肝臓又は免疫関連疾患又は状態を治療する又は予防するための前記ヒト又は動物に対する投与のためである。一例では、該又は各プロモーターは、ビルレンス遺伝子、例えば、宿主細胞ビルレンス遺伝子、例えば、spv遺伝子のプロモーターである。
【００８１】
任意選択で、ヌクレオチド配列(a)は、宿主細胞における配列の発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含む。
【００８２】
任意選択で、ヌクレオチド配列又はアレイ(b)は、宿主細胞における配列又はアレイの発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含む。
【００８３】
任意選択で、(a)及び(b)は、同じオペロンによって含まれる又は細胞において作動可能な共通の発現制御(例えば、同じプロモーター)の制御下にある。
【００８４】
任意選択で、プロモーターは、宿主細胞における発現のための強力な及び/又は構成的なプロモーターである。
【００８５】
任意選択で、宿主細胞は、野生型宿主細胞であり、例えば、ベクターは、天然環境又はヒト若しくは動物マイクロバイオームにおける使用のためである。
【００８６】
任意選択で、ベクターは、発現可能なhtpG配列を含み、例えば、宿主は、例えば、ヒト又は動物マイクロバイオームによって含まれる大腸菌宿主である。HtpGは、大腸菌における定常状態Cas3タンパク質レベルを37℃で増加させる。したがって、この実施形態は、ヒト又は動物によって含まれる(例えば、その腸マイクロバイオームによって含まれる)大腸菌等の宿主細胞を改変するため特に有用である。一例では、抑制されるCasは、Cas3である。
【００８７】
一実施形態では、以下が提供される
宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、宿主細胞は、Cascade及び  Cas3を含むCRISPR/Casシステムを含み、Cascadeは、宿主細胞において(例えば、H-NSによって)抑制され、ベクターは、
(i)前記Cascade抑制の脱抑制因子(例えば、LeuO)をコードする発現可能なヌクレオチド配列;及び
(ii)宿主細胞における脱抑制Cascadeと共に機能できる、Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含み、;ここで、ヌクレオチド配列は、宿主細胞において発現可能であり、それによって、脱抑制因子は、Cascadeを脱抑制又は活性化し、それによって、Cascadeは、脱抑制因子の存在下で、Cas3と共に機能して、宿主細胞ゲノムのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する、ベクター;
或いは
Cascade及びCas3を含むCRISPR/Casシステムを含む、宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、Cascadeは、宿主細胞において(例えば、H-NSによって)抑制され、ベクターは
(i)前記Cascade抑制の脱抑制因子(例えば、LeuO)をコードする発現可能なヌクレオチド配列;及び
(ii)宿主細胞における脱抑制Cascadeと共に機能できる、Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含み;ここで、ヌクレオチド配列は、宿主細胞において発現可能であり、それによって、脱抑制因子は、Cascadeを脱抑制又は活性化し、それによって、Cascadeは、脱抑制因子の存在下で、Cas3と共に機能して、宿主細胞ゲノムのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する、ベクター。
【００８８】
任意選択で、(i)及び(ii)のヌクレオチド配列は、同じオペロンによって含まれる又は細胞において作動可能な共通の発現制御(例えば、同じプロモーター)の制御下にある。
【００８９】
任意選択で、配列(i)及び(ii)並びにCRISPRアレイ又は前記gRNAをコードする配列は、宿主細胞における一緒の脱抑制因子、Cas3及びアレイ又はgRNAの発現のために、宿主細胞への導入のための、2つ以上の異なるベクターによって含まれる。
【００９０】
一態様は、以下を提供する:
細菌又は古細菌宿主細胞への導入のための、(任意選択で、本発明の任意の他の配置、例、実施形態又は態様に従う)核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって天然で抑制された内因性CRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)各crRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する;細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)を各々コードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含み;
ここで、抑制因子は、細胞ゲノムによってコードされるH-NS、StpA、LRP又はCRP又はそのホモログ、又はオルソログ又は機能的な均等物(例えば、大腸菌K12 H-NS、StpA、LRP又はCRPのホモログ、オルソログ又は機能的な均等物)である;及び
ここで、脱抑制因子は、抑制因子又は大腸菌K12 H-NS、StpA、LRP若しくはCRPとの複合体を形成可能である、LeuO又はそのホモログ、若しくはオルソログ若しくは機能的な均等物(例えば、大腸菌K12 LeuOのホモログ、オルソログ若しくは機能的な均等物);或いは、抑制因子との複合体を形成可能である、H-NS、StpA、LRP又はCRPの変異体(例えば、大腸菌K12 H-NS、StpA、LRP又はCRPの変異体)である、ベクター。
【００９１】
一例では、抑制因子は、CRISPR/Casシステムの1つ又は複数の配列(例えば、プロモーター配列、例えば、抑制Casのプロモーター)を阻害、立体的にブロック又は結合して、細胞におけるCasの転写を減少させる又は予防する。例えば、プロモーター配列は、Cas(例えば、CasA又はCas3)遺伝子プロモーターである。一例では、抑制因子は、タイプI CasA(cse1)プロモーターに対する結合に関して前記H-NS、StpA又はCRPと競合可能である。一例では、抑制因子は、タイプI(例えば、タイプI-B又は-F)Cas3プロモーターに対する結合に関して前記H-NS、StpA又はCRPと競合可能であり、例えば、これは、標準的な競合アッセイ、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)又はELISAを使用してインビトロで決定することができる。一例では、抑制因子は、σ70-依存性プロモーター配列、Pcispr1プロモーター配列、Pcasプロモーター配列及び/又は抗Pcasプロモーター配列を阻害、立体的にブロック又は結合し、例えば、宿主細胞は大腸菌細胞である。
【００９２】
一例では、脱抑制因子は、LysR-タイプ調節因子タンパク質である。一例では、脱抑制因子は、タイプI CasA(cse1)又はCas3プロモーター(例えば、大腸菌K12からのプロモーター)に対する結合に関してLeuOと競合可能である。例えば、これは、標準的な競合アッセイ、例えば、SPR又はELISAを使用してインビトロで決定することができる。一例では、抑制因子はH-NSであり、脱抑制因子はH-NSG113Dである。
【００９３】
一例では、抑制因子は、宿主細胞種のCRISPR/CasシステムのCRISPRアレイによって含まれるCasAプロモーターに結合し、casは、前記抑制Cas、例えば、CasA又はCas3である。
【００９４】
σ70-依存性プロモーターは、大腸菌において、タイプIアレイの第一CRISPR反復配列からの第一(最も5')ヌクレオチドの約50bp上流で観察されている。DNaseフットプリントは、-40から-90位の間に位置するσ70-依存性プロモーターの存在を実証しており、これはPcrispr1と呼ばれる。それ故、一例では、抑制因子は、宿主細胞のCRISPR/CasシステムのCRISPRアレイによって含まれるσ70-依存性プロモーターの結合の配列に結合する。一例では、抑制因子は、宿主細胞のCRISPR/CasシステムのCRISPRアレイのσ70 RNAポリメラーゼ転写を阻害する。
【００９５】
一例では、脱抑制因子は、下記で更に論じられているようなもの等の、H-NSパラログである。
【００９６】
58%アミノ酸同一性を有するH-NSのパラログであるStpA(Zhang及びBelfort、1992)は、H-NSと非常に類似するDNA結合特性を示し、その標的結合部位に同じ大きさのDNase I保護の領域を作る。DNAに対する一般的に高い親和性と一致して(Zhangら、1996)、StpAは、H-NSよりも幾分か低い濃度で完全な保護に到達する。LRP及びFISは、DNase I切断からのより弱い保護の原因になる。一例では、抑制因子は、核様体関連タンパク質(NAP)である。一例では、脱抑制因子は、核様体関連タンパク質(NAP)の変異体であり、その変異体は、宿主細胞種のCRISPR/CasシステムのCRISPRアレイによって含まれる結合部位等のNAPの標的結合部位(例えば、IGLB配列)に対する結合についてNAPと競合し、Casは、前記抑制Cas(例えば、Cas3又はCasA)である。一例では、NAPは、StpA、LRP、FIS又はH-NSである。一例では、抑制因子はH-NSであり、脱抑制因子は、例えば、宿主細胞における発現に関して強力な又は構成的なプロモーターの制御下でベクターから発現されるLRP及び/又はFISである。この様式で、脱抑制因子は、過剰に発現され、標的結合部位に対する結合についてH-NSと競合排除(out-competes)しうる、更に脱抑制因子は宿主細胞におけるCas又はCascade活性を抑制しない又はわずかに弱く抑制しうる。プロモーター(又は本明細書中の任意の他のプロモーター)は、例えば、細菌性の構成的なプロモーターOXB17、OXB18、OXB19又はOXB20であってもよく、好ましくは、最も強いので、後者である(http://www.oxfordgenetics.com/Products/Plasmids/Details/Bacterial/pSF-OXB18/OG561を参照されたい)。一例では、宿主細胞における発現のために、プロモーターはT7プロモーターであり、ベクターはT7 RNAポリメラーゼをコードする。
【００９７】
H-NSサイレンシング及びアンチサイレンシングに影響する多数の因子が、過去に記録(Navarreら、2007;Stoebelら、2008)に残されており、一例を挙げるとSlyA(Lithgowら、2007;Perezら、2008)が含まれる。SlyA(いくつかの他の関連タンパク質のように)は、それら自体、DNA標的部位と相互作用する調節因子として作用しないが、むしろH-NSとDNA結合欠陥性ヘテロ二量体を形成し、それによって、H-NS-媒介性サイレンシングに対抗する。したがって、一例では、脱抑制因子は、SlyAを含む。一例では、脱抑制因子は、PhoP、PhoQ、Crp及び/又はFnrを含む。種々の抗サイレンシング機構が観察されており、(i)局所DNA構造のレベルを操作する、タンパク質非依存性プロセス、(ii)DNA結合タンパク質、例えば、Ler、LeuO、RovA、SlyA、VirB、及びAraCに関連するタンパク質、及び(iii)H-NSが、StpA、Sfh、Hha、YdgT、YmoA又はH-NST等の完全長又は部分的パラログとヘテロマーのタンパク質間複合体を形成する調節機構が関与している。RovAタンパク質は、当初、温度に応答して、エルシニア(Yersinia)の増殖期に、インベーシンをコードする遺伝子であるinvの陽性制御因子として同定されたSlyAのホモログである(Cathelynら、2007)。RovAは、invのようにH-NSタンパク質による抑制に対する対象である遺伝子のレギュロンの転写を制御することが現在知られている。エルシニア・エンテロコリチカ(Yersinia enterocolitica)におけるRovAの主要な機能が、H-NS-媒介性転写サイレンシングのアンタゴニストとして作用することが提唱されている(Cathelynら、2007)。したがって、一例では、脱抑制因子は、1、2、3若しくはそれ以上のLer、LeuO、RovA、SlyA、VirB、AraC、StpA、Sfh、Hha、YdgT、YmoA及びH-NST;又はそのホモログ、オルソログ、パラログ若しくは機能的な均等物を含む。
【００９８】
アジア型コレラの病原学的な因子である、V.コレラ(V cholerae)の主要なビルレンス因子は、A+T-リッチな水平に伝達可能な遺伝要素内で遺伝子によってコードされる(Davis及びWaldor、2003;McLeodら、2005;Murphy及びBoyd、2008)。これらの遺伝子がいくつかの環境シグナルによって調節されて、それらの産物が細菌が宿主中の適切な部位に到着するとき、発現されること及びそれらが他で抑制されることが保証される(Leeら、1999;Schildら、2007)。V.コレラによって発現される主要なビルレンス因子は、コレラ毒素、CTX、及び毒素共調節ピリ線毛、Tcpである(Skorupski及びTaylor、1997)。H-NSは、それらのA+T-リッチなプロモーターをターゲティングすることによって、これらの主要なビルレンス因子をコードする遺伝子の転写をサイレンシングする(Nyeら、2000)。このサイレンシングは、ToxT調節タンパク質、AraC-様DNA結合タンパク質と対立し、これはV.コレラにおける幾つかのビルレンス遺伝子プロモーターの転写を脱抑制する(Yu及びDiRita、2002)。その機構は、H-NSの置き換えばかりでなく、ToxTによる転写の活性化も関与すると考えられる(おそらくToxTとRNAポリメラーゼの間の直接的な相互作用に起因する)(Hulbert及びTaylor、2002;Yu及びDiRita、2002)。したがって、一例では、脱抑制因子は、ToxT(例えば、V.コレラ  ToxT)を含む。したがって、一例では、脱抑制因子は、AraC又はそのホモログ、オルソログ、パラログ若しくは機能的な均等物を含む。後者の例は、AppY、CfaD、GadW、GadX、HilC、HilD、PerA、RegA、Rns、UreR及びVirFである。
【００９９】
DNAと核タンパク質フィラメントを形成する能力は、H-NS-媒介性転写サイレンシングにおいて重要な役割を担う。LeuOは、遺伝物質に沿ったH-NSの重合に限界を設定することができるタンパク質として同定されている。サルモネラ・チフィムリウム(Salmonella Typhimurium)中のleuABCDオペロンの発現を支配するプロモーターリレーにおける転写活性化因子として同定されたのがLysR-様DNA結合タンパク質である(Chen及びWu、2005;Chenら、2005;Fang及びWu、1998)。したがって、一例では、脱抑制因子は、LysR又はそのホモログ、オルソログ、パラログ若しくは機能的な均等物を含む。
【０１００】
他の核様体関連タンパク質は、DNAに対するH-NS結合をアンタゴナイズすることができる。磁気ピンセット及び原子間力顕微鏡法での実験により、大量のHUタンパク質が、DNA中の同じ結合部位に対してH-NSと競合し、H-NS-凝縮プロモーター領域を開放できることが示唆されている(van Noortら、2004)。Fisタンパク質は、例えば、rRNA遺伝子プロモーターでのH-NS抑制をアンタゴナイズするとも報告されており、ここでは、その結合部位が、H-NSの結合部位の中に分布する(Schneiderら、2003)。Fisレベルが低いときの増殖の後期に、H-NSが、rRNA遺伝子プロモーターを抑制する(Afflerbachら、1998)。核様体関連タンパク質HU並びにRNAポリメラーゼのRpoSストレス及び定常期シグマ因子は、大腸菌におけるH-NS-抑制proUプロモーターで陽性に調節する役割を有すると記載されており(Manna及びGowrishankar、1994)、H-NSとRpoSレギュロンの間のより広い重複が記載されている(Barthら、1995)。これは、ストレスを受けている細菌においてH-NS-媒介性抑制を克服することにおけるRpoSに関する役割を示しうる。したがって、一例では、脱抑制因子は、HU、RpoS及び/若しくはFis;又はそのホモログ、オルソログ、パラログ若しくは機能的な均等物を含む。
【０１０１】
ある魅力的なタンパク質のグループは、H-NSのオリゴマー化ドメインに対して相同性を有する小さいポリペプチドで構成されている。このドメインに最も近いアミノ酸配列類似性を有するものは、H-NSTファミリーのメンバーであり、そのように呼ばれる理由は、それらが核酸結合及びリンカードメインを欠くH-NS切断型に似ているからである(Williamson及びFree、2005)。これらの切断型をコードする遺伝子は、腸管病原性大腸菌(EPEC)及び尿路疾患性大腸菌を含む様々な病原性腸内細菌の病原性アイランド(pathogenicity islands)中に検出されている。EPEC、H-NST(EPEC)からのタンパク質は、H-NSと同時精製される。このタンパク質がH-NSの能力に干渉して大腸菌におけるproUオペロンを抑制することができる。したがって、一例では、脱抑制因子は、H-NST;又はそのホモログ、オルソログ、パラログ若しくは機能的な均等物を含む;例えば、抑制因子は、H-NS又はStpAである。
【０１０２】
H-NSと直接的に相互作用する小さいタンパク質をコードする遺伝子は、祖先の染色体及び水平方向で獲得されたアイランドに見出される。エルシニアのYmoAタンパク質は、Y.エンテロコリチカにおいてビルレンス遺伝子発現の制御因子として当初認識されていた(Cornelisら、1991)。それは、Hhaタンパク質(大腸菌における溶血素遺伝子発現のモジュレーターとして最初に発見された)に関連し、2つのタンパク質は、互いに機能的に置き換えることができる(Balsalobreら、1996;Mikulskis及びCornelis、1994)。Hhaタンパク質は、その効果を溶血素遺伝子発現に発揮するためにH-NSと相互作用しなければならない;YmoAもH-NSと相互作用し、この関係性は、エルシニアからのH-NSタンパク質の単離に活用された(Nietoら、2000  、2002)。YmoAの溶液構造は、核磁気共鳴分光学を使用して解明された(McFeetersら、2007)。結果は、YmoA(及びHha)が、H-NSの独立オリゴマー化ドメインと認めるべきであるとの観点に重きをおく。潜在的に、そのタンパク質が、オリゴマー化してYmoA-H-NS及びHha-H-NSヘテロマーを産生しうる。YmoA及びHhaパートナーにおける核酸-結合ドメインの非存在は、抑制複合体の構造を損なわせる(又は少なくとも改変する)、DNA-タンパク質-DNA架橋に参加するヘテロマーの不全をもたらしうる。Hha-様タンパク質のパラログの発見により、一層の複雑性が加えられることになった。ydgT遺伝子は、大腸菌及びサルモネラにおいてHha-様タンパク質をコードし、H-NS及びH-NSパラログ、StpAタンパク質と相互作用することができる(Paytubiら、2004)。したがって、一例では、脱抑制因子は、YmoA及び/又はHha及び/又はydgT;或いはそのホモログ、オルソログ、パラログ若しくは機能的な均等物を含む;例えば、抑制因子は、H-NS又はStpAである。
【０１０３】
全てのH-NSパラログが、H-NSとの直接的なタンパク質間相互作用によって作用すると考えられるわけではない。LerDNA結合タンパク質は、腸管出血性大腸菌(EHEC)及びEPECのLEE(腸細胞消滅の座位)病原性アイランドによってコードされる。それが、アイランドにおける主要なビルレンスオペロンの転写を、37℃でH-NSのサイレンシング活性と対立させることによって活性化する(Barbaら、2005;Bustamanteら、2001;Haackら、2003;Umanskiら、2002)。Ler及びH-NSは部分的にパラログであり、そのオリゴマー化ドメインが高度に発散型のコイルドコイル(divergent coiled-coils)であり;Ler及びH-NSがヘテロ二量体を形成するとの証拠は存在しない。代わりに、Lerは、H-NSを置き換えると考えられる(Haackら、2003)。それはまた、LEE外側で遺伝子発現に作用する(Elliottら、2000)。例えば、Lerは、EHECにおけるlpfオペロンでH-NSのサイレンシング活性に対抗し、長い極性の海馬采をコードする(Torresら、2007)。それ故、そのH-NSに対する相同性にもかかわらず、LerはむしろVirB又はSlyAのように作用する。したがって、一例では、脱抑制因子は、Ler;又はそのホモログ、オルソログ、パラログ若しくは機能的な均等物を含む;例えば、抑制因子は、H-NS又はStpAである。
【０１０４】
バクテリオファージT7からのgp5.5タンパク質は、H-NSに結合し、不活性化し、それによって、ファージの繁殖を支持することが知られている(Liu及びRichardson,1993)。したがって、一例では、脱抑制因子は、gp5.5;又はそのホモログ、オルソログ、パラログ若しくは機能的な均等物を含む;例えば、抑制因子は、H-NS又はStpAである。
【０１０５】
誰かが、なぜCRISPR-casシステムは隠れている(cryptic)のか問うかもしれない。その理由は、Casタンパク質が外来のDNAスペーサーの組み込みに関与するので、細胞は、宿主DNAエレメントが誤って組み込まれることを回避しなければならないからである。cas遺伝子の定常発現は、細胞に対して確実に有害でありうる。したがって、cas遺伝子発現を必要とされるまでサイレントに維持する、機構が存在しなければならない。本発明者らのデータは、H-NSが、この種の制御を担う少なくとも1つの重要な成分であることを示唆している。それ故、1つの態様において、本発明は、本明細書に開示される任意のベクター(又はそのようなベクターを使用する使用又は方法、又は組成物)を提供する、但し、ベクターがcrRNA又はgRNAをコードするヌクレオチド配列を含まない或いはCRISPRアレイを含まないが、ベクターが1つ又は複数の前記脱抑制因子をコードする(例えば、抑制因子はH-NSである)ものを除く。この態様において、細胞における脱抑制因子の発現は、宿主細胞における内因性Cas発現(例えば、Cas3及び/又はCascade Cas、例えば、CasA)を脱抑制又は活性化し、そのような発現は、改変(例えば、宿主DNA、例えば、染色体DNAの切断)を引き起こし、これが細胞を死滅させ又は細胞成長又は増殖を減少させる。それは、宿主細胞における発現のための強力な及び/又は構成的なプロモーターからのベクターにおいてコードされる各脱抑制因子にとって有利でありうる。高レベルの脱抑制因子発現は、抑制因子、例えば、H-NSを置き換え、内因性Casに宿主細胞の染色体又は他のDNAの切断を引き起こさせ、それによって、宿主細胞を死滅させ又はその成長若しくは増殖を減少させうる。
【０１０６】
例えば、ベクターは、細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイを含まない;及び細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)を各々コードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含まない。例えば、ベクターは、crRNA又はgRNAをコードしない。これは、脱抑制が、宿主細胞における内因性Casヌクレアーゼ活性を十分に活性化する場合に、有用であり得、それによって、ヌクレアーゼ活性は、宿主細胞を死滅させる或いは宿主細胞成長又は増殖を阻害する。例えば、抑制因子はH-NS又はStpAであり、脱抑制因子はLeuO又は本明細書に開示される任意の他の脱抑制因子である。例えば、脱抑制因子の発現は、宿主細胞における発現のための強力な及び/又は構成的なプロモーターの制御下にある。
【０１０７】
一例では、本発明は、以下を提供する:
ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防する方法であって、ベクターを対象に投与する工程を含み、対象のマイクロバイオームによって含まれる宿主細胞(例えば、大腸菌、サルモネラ、又はS.エンテリカ血液型亜型チフィムリウム)は、細胞の内因性の脱抑制Casによって改変され、治療又は予防が実施され;ここで、
(i)各細胞は、細胞における抑制因子(例えば、H-NS及び/又はStpA)によって抑制される(例えば、Cascade Cas、Cas3又はCas9が抑制される)、CRISPR/Casシステムを含み、
(ii)ベクターは、細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子(例えば、LeuO)をコードするヌクレオチド配列を含み、配列は、(例えば、強力な及び/又は構成的なプロモーターの制御下で)脱抑制因子を産生するために、細胞において発現可能であり;及び
(iii)ベクターは、細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイを欠いており;及び細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を欠いている、方法。
ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防する方法であって、ベクターを対象に投与する工程を含み、対象のマイクロバイオームによって含まれる宿主細胞(例えば、大腸菌、サルモネラ、又はS.エンテリカ血液型亜型チフィムリウム)は、細胞の内因性の脱抑制Casによって改変され、治療又は予防が実施され;ここで、
(i)各細胞は、細胞におけるH-NS及び/又はStpAから選択される抑制因子によって抑制される、CRISPR/Casシステムを含み、Cascade Cas、Cas3又はCas9が抑制され、
(ii)ベクターは、細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列を含み、配列は、強力な及び/又は構成的なプロモーターの制御下で脱抑制因子を産生するために、細胞において発現可能であり;及び
(iii)ベクターは、細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイを欠いており;及び細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を欠いている、方法。
野生型の細菌又は古細菌細胞(例えば、大腸菌又はサルモネラ細胞)を死滅させる方法であって、細胞が、Cas3及びCascadeタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む内因性CRISPR/Casシステムを含み、Cas3及び/又はCascadeが、細胞において天然で抑制され、(i)細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のための、CRISPRアレイ;又は(ii)それぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を細胞に導入することなく、前記Cas3及び/又はCascadeを脱抑制する工程;又は宿主細胞を操作することなく、crRNA又はガイドRNAをコードする工程を含む、方法。一例では、方法は、宿主細胞に核酸ベクターを導入する工程を含み、ここで、
(i)細胞は、細胞におけるH-NS及び/又はStpAから選択される抑制因子によって抑制される、CRISPR/Casシステムを含み、Cascade Cas、Cas3又はCas9が抑制され、
(ii)ベクターは、細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列を含み、配列は、強力な及び/又は構成的なプロモーターの制御下で脱抑制因子を産生するために、細胞において発現可能であり;及び
(iii)ベクターは、細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイを欠いており;及び細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を欠いている。
本明細書に記載の宿主細胞への導入のための複数の核酸ベクターを含む医薬であって、任意選択で、ヒト又は動物における疾患又は状態を治療する又は予防するための、1つ又は複数の医療薬(例えば、抗がん医薬)又は抗生物質(例えば、プロトスペーサー配列が、宿主細胞抗生物質耐性遺伝子によって含まれる)を更に含み;ここで、
(i)各細胞は、細胞におけるH-NS及び/又はStpAから選択される抑制因子によって抑制される、CRISPR/Casシステムを含み、Cascade Cas、Cas3又はCas9が抑制され、
(ii)ベクターは、細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列を含み、配列は、強力な及び/又は構成的なプロモーターの制御下で脱抑制因子を産生するために、細胞において発現可能であり;及び
(iii)ベクターは、細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイを欠いており;及び細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を欠いている、医薬。
【０１０８】
一例では、該又は各宿主細胞(又は第一及び/又は第二細菌)は、グラム陽性細胞である。一例では、該又は各宿主細胞は、腸内細菌科、例えば、サルモネラ、ペスト菌(Yersinia pestis)、クレブシエラ(Klebsiella)、シゲラ(Shigella)、プロテウス(Proteus)、エンテロバクター(Enterobacter)、セラチア(Serratia)、又はシトロバクター(Citrobacter)細胞である。任意選択で、該又は各細胞は、大腸菌(例えば、大腸菌K12)又はサルモネラ(例えば、S.エンテリカ血液型亜型チフィムリウム)細胞である。任意選択で、該又は各宿主細胞(又は第一及び/又は第二細菌)は、グラム陰性細胞である。
【０１０９】
任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、マイコプラズマ(mycoplasma)、クラミジア(chlamydiae)、スピロヘータ(spirochete)又はマイコバクテリウム(mycobacterium)である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、ストレプトコッカス(例えば、ピオゲネス又はサーモフィルス)宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、スタフィロコッカス(Staphylococcus)(例えば、アウレウス、例えば、MRSA)宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、大腸菌(例えば、O157:H7)宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、シュードモナス(Pseudomonas)(例えば、エルジノーサ(aeruginosa))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、ビブリオ(Vibrio)(例えば、コレラ(cholerae)(例えば、O139)又はバルニフィカス(vulnificus))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、ナイセリア(Neisseria)(例えば、ゴノレー(gonnorrhoeae)又はメニンギティディス(meningitidis))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、ボルデテラ(Bordetella)(例えば、パータシス(pertussis))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、ヘモフィルス(Haemophilus)(例えば、インフルエンザ(influenzae))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、シゲラ(Shigella)(例えば、ディセンテリアエ(dysenteriae))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、ブルセラ(Brucella)(例えば、アボルタス(abortus))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、フランシセラ(Francisella)宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、キサントモナス(Xanthomonas)宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、アグロバクテリウム(Agrobacterium)宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、エルウィニア(Erwinia)宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、レジオネラ(例えば、ニューモフィラ(pneumophila))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、リステリア(例えば、モノサイトゲネス(monocytogenes))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、カンピロバクター(Campylobacter)(例えば、ジェジュニ(jejuni))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、エルシニア(例えば、ペスティス(pestis))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、ボレリア(Borelia)(例えば、ブルグドルフェリ(burgdorferi))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、ヘリコバクター(Helicobacter)(例えば、ピロリ(pylori))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、クロストリジウム(例えば、ディフィシル(dificile)又はボツリヌム)宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、エーリキア(Erlichia)(例えば、シャフェンシス(chaffeensis))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、サルモネラ(例えば、チフィ(typhi)又はエンテリカ、例えば、血清型チフィムリウム、例えば、DT104)宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、クラミジア(例えば、ニューモニエ(pneumoniae))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、パラクラミジア(Parachlamydia)宿主である���任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、コリネバクテリウム(Corynebacterium)(例えば、アミコラツム(amycolatum))宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、クレブシエラ(例えば、ニューモニエ)宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、エンテロコッカス(Enterococcus)(例えば、フェカーリス(faecalis)又はフェシウム(faecim)、例えば、リネゾリド耐性)宿主である。任意選択で、宿主(又は第一及び/又は第二細菌)は、アシネトバクター(Acinetobacter)(例えば、バウマンニ(baumannii)、例えば、多剤耐性)宿主である。
【０１１０】
任意選択で、脱抑制Casは、Cas3である。任意選択で、脱抑制Casは、Cas9である。任意選択で、脱抑制Casは、例えば、宿主細胞が大腸菌細胞であるときに、Cascade Casである。Cascadeは、抗ウイルス防御のためのCRISPR関連複合体としても知られる。
【０１１１】
任意選択で、CRISPR/Casシステムは、タイプI(例えば、タイプI-B、タイプI-E又はタイプI-F)システムである。
【０１１２】
任意選択で、プロトスペーサー配列は、細胞によって含まれる必須遺伝子、ビルレンス遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子によって含まれる。
【０１１３】
任意選択で、ベクターは、CasA、B、C、D及びE(例えば、細胞が大腸菌細胞であるとき)又はCasABCDE12(例えば、宿主細胞がS.エンテリカ血液型亜型チフィムリウム細胞であるとき)ヌクレオチド配列からなる群からの配列を含まない又はベクターは前記群の全ての配列を含まない。
【０１１４】
任意選択で、ベクターは、Cas1、Cas2、Cas5及びCas6配列からなる群からの配列を含まない。
【０１１５】
任意選択で、ベクターは、Cas3ヌクレオチド配列を含まないベクターからなる群からの配列を含まない。
【０１１６】
任意選択で、ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防する医学的な使用のための、本発明のベクター又は任意の他の態様、ここで、宿主細胞は、対象によって含まれる。一例では、宿主細胞は、疾患(すなわち、宿主細胞による対象の感染)である或いは疾患若しくは状態(例えば、IBD、大腸炎、クローン病、がん、自己免疫疾患若しくは状態、肥満、糖尿病又はCNS疾患若しくは状態(例えば、アルツハイマー病若しくはパーキンソン病))と関連する又は媒介する。任意選択で、ヒト又は動物体の治療、予防、診断の医学的な方法における使用のための、本発明のベクター又は任意の他の態様。
【０１１７】
任意選択で、環境(例えば、土壌、前記宿主細胞及び酵母細胞を含む組成物)、ヒト、動物又は植物マイクロバイオームにおける宿主細胞の成長又は増殖を減少させるための、本発明のベクター又は任意の他の態様。これは、例えば、マイクロバイオームが天然に存在するとき、有用である。
【０１１８】
任意選択で、複数の宿主細胞を死滅させるための又はその成長若しくは増殖を減少させるための、本発明のベクター又は任意の他の態様。
【０１１９】
該又は各宿主細胞は、複数の前記宿主細胞を含む及び宿主細胞(例えば、細菌又は古細菌宿主細胞)の種又は株とは異なる種又は株(例えば、細菌種又は株、又は古細菌種又は株)の1つ又は複数の細胞を含むマイクロバイオーム(例えば、腸マイクロバイオーム又は環境マイクロバイオーム)によって含まれ得る。
【０１２０】
一態様は、本発明による複数のベクターを含む医薬であって、任意選択で、ヒト又は動物における疾患又は状態を治療する又は予防するための、1つ又は複数の医療薬(例えば、抗がん医薬)又は抗生物質(例えば、プロトスペーサー配列が、宿主細胞抗生物質耐性遺伝子によって含まれる)を更に含む医薬を提供する。
【０１２１】
一態様は、ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防する方法であって、本発明のベクター又は医薬を対象に投与する工程を含み、対象のマイクロバイオームによって含まれる宿主細胞は、細胞の内因性の脱抑制Casによって改変され、治療又は予防が実施される、方法。
【０１２２】
一態様は、野生型の細菌又は古細菌細胞(例えば、大腸菌又はサルモネラ細胞)を死滅させる方法を提供し、ここで、細胞が、Cas3及びCascadeタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む内因性CRISPR/Casシステムを含み、Cas3及び/又はCascadeが、細胞において天然で抑制されており、
(a)前記Cas3及び/又はCascadeを脱抑制する工程及び
(b)(i)細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のための、CRISPRアレイ;又は(ii)それぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)を各々コードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を細胞に導入する工程を含み;各crRNA又はgRNAが、Cas又はCascadeをガイドして、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する。
【０１２３】
任意選択で、工程(b)において、本発明によるベクターが、細胞に導入され、それによって、(i)又は(ii)が細胞に導入される。
【０１２４】
任意選択で、Cas3転写、発現又は活性は、脱抑制される。
【０１２５】
任意選択で、Cas転写、発現又は活性は脱抑制され、CasはCascade Cas(例えば、CasA、B、C、D又はE)である。
【０１２６】
任意選択で、発現可能な脱抑制因子配列が、前記アレイ又はgRNAコード配列と一緒に、同時に又は連続して、細胞に導入される。
【０１２７】
任意選択で、脱抑制因子配列及びアレイ又はgRNAコード配列は、同じ核酸ベクター(例えば、ファージミド、ファージ又はプラスミド)によって含まれる。
【０１２８】
任意選択で、脱抑制因子配列及びアレイ又はgRNAコード配列は、同じオペロンによって含まれる又は細胞において作動可能な共通の発現制御(例えば、同じプロモーター)の制御下にある。これは、宿主細胞におけるこれらの要素の協調的な発現に有利である。
【０１２９】
任意選択で、工程(a)は、(i)H-NSとの複合体を形成可能である、LeuO又は、そのホモログ、オルソログ又は機能的な均等物;又は(ii)それぞれH-NS、StpA、LRP又はCRP抑制因子との複合体を形成可能である、H-NS、StpA、LRP又はCRPの変異体を細胞において発現させることを含む。
【０１３０】
本発明によるベクター又はベクターを含む医薬組成物、食糧、飲料、環境の処理用の組成物、殺虫薬、除草剤、又は化粧品も提供される。
【０１３１】
一態様は、宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)(i)細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のための、CRISPRアレイ又はCRISPRスペーサー配列;又は
(ii)細胞におけるガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列の導入のための部位を含み;
ここで、前記crRNA(例えば、ガイドRNAによって含まれるとき)又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する(例えば、切断又は変異を引き起こす)、ベクターを提供する。
【０１３２】
任意選択で、部位(b)は、CRISPRアレイによって含まれ、アレイは、宿主細胞のそれぞれのプロトスペーサー配列をターゲティングするための、1つ又は複数の前記スペーサー配列を収容可能である。これは、ベクターに対する宿主細胞の耐性の発生に先手を打つために有用である。
【０１３３】
任意選択で、(i)のアレイ又は(ii)の配列は、宿主細胞における発現のための強力な及び/又は構成的なプロモーターであるプロモーターの制御下にある。強力なプロモーターは、宿主細胞集団の成長又は存在の任意の又は異なる期の期間の発現の機会を最大化するために有用である。
【０１３４】
任意選択で、(a)の配列は、宿主細胞における脱抑制因子の発現のための強力な及び/又は構成的なプロモーターであるプロモーターの制御下にある。
【０１３５】
任意選択で、宿主細胞における発現のための、発現可能なCas3配列及び/又は発現可能なhtpG配列。htpGによるCas3のアップレギュレートは、標的配列の改変を促進させるのに有利でありうる。
【０１３６】
任意選択で、各前記crRNAは、宿主細胞におけるCas(例えば、Casヌクレアーゼ、例えば、Cas9又はCas3)と共に作動可能である。
【０１３７】
任意選択で、脱抑制Casがヌクレアーゼ活性を有するとき、Casは、宿主細胞ゲノムの内因性ヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１３８】
任意選択で、Casは、宿主細胞にそこでの前記Casの発現のために導入されうるベクターによって又は異なるベクターによって含まれるヌクレオチド配列によりコードされる。
【０１３９】
任意選択で、(i)のスペーサー又は(ii)の配列が、そこに挿入されているとき、ベクターは、宿主細胞に導入されうる本発明のベクターに従う。
【０１４０】
BglJ-RcsBヘテロマーは、HNS抑制leuO及びbgl座位を活性化することが知られており、故に、一例では、ベクターは、宿主細胞におけるBglJ-RcsBヘテロマーの形成のために、BglJ及び/又はRcsBをコードする。
【０１４１】
一例では、プロトスペーサーは、宿主細胞集団クオラムセンシングを媒介するタンパク質をコードする遺伝子、例えば、BglJ又はLuxIファミリー遺伝子によって含まれる。LuxIファミリータンパク質は、N-アシルホモセリンラクトン(AHL)クオラムセンシングシグナルを生成し、それは有益であり得るので、これらを標的として、宿主細胞集団の成長、生存度又は増殖を減少させる。
【０１４２】
本明細書のプロモーターの一例では、プロモーターは、H-NS又はH-NSファミリーメンバーの結合部位を欠いている構成的なプロモーターである。構成的なプロモーターの重大な特徴は、標準的なTTGACA(-35)-17bp-TATAAT(-10)配列の高レベルの保存性であり、故に、一例では、プロモーターは、TTGACA及び/又はTATAAT配列を含む。
【０１４３】
本明細書のプロモーターの一例では、プロモーターは、H-NSプロモーターであり、例えば、宿主細胞種のH-NSプロモーターの配列を含む。これは、細胞におけるH-NS抑制因子として同じ比率及び/又は回数でのベクター配列発現を提供するのに有用でありうる。
【０１４４】
H-NSを伴うHhaは、H-NSの抑制能力を増加させる。一例では、ベクターは、宿主細胞における阻害剤の発現のための、阻害剤Hha/H-NS多量体化又はYdgT/H-NS多量体化をコードする。
【０１４５】
一例では、宿主細胞は、S.エンテリカ血液型亜型チフィムリウム株LT2細胞である。S.エンテリカからのタイプE(Cse)cas遺伝子の発現が、H-NS及びLeuOによって調節される可能性が高いことが提唱されている。例えば、S.エンテリカ血液型亜型チフィでは、casA(STY3070)の転写は、H-NS及びLeuOによって影響されるように見えるにもかかわらず(Hernandez-Lucasら、2008)、この株における多岐に方向づけられたcas3とcasA遺伝子の間の遺伝子間領域の保存性は乏しい。
【０１４６】
一例では、宿主細胞は、大腸菌EPEC、EHEC、K12又は株MG1655細胞である。
【０１４７】
H-NSは、直接的に、入ってくるファージ又はプラスミドのDNAに結合することが知られているので(Navarreら、2006;Navarreら、2007)、これが、H-NSの再分布をもたらす可能性があり(Doyleら、2007;Dillonら、2010)、抑制因子の局所濃度の減少に起因するCascade遺伝子の発現を許容する。一例では、ベクターは、H-NS又はStpA結合部位を含む。一例では、ベクターは、H-NS又はStpA結合部位を含まない。
【０１４８】
leuO発現は、H-NSによって負に調節され、LeuO自身によって正に調節されるので(Hommaisら、2001;Chenら、2005)、これがcas遺伝子転写に関する活性化シグナルを更に増幅するであろう。一例では、ベクターは、複数のLeuOコード配列を含む。これが、LeuOタンパク質の存在下で、正のフィードバックを効果的に増幅しうる。
【０１４９】
宿主細胞のCascade領域、casA遺伝子(ygcL)及びcas3遺伝子(ygcB)の間の遺伝子間領域(遺伝子間領域ygcL-ygcBに関してIGLB)は、H-NS(例えば、大腸菌における)に対する結合部位を含んでもよい。それ故、一例では、ベクターは、宿主細胞ゲノムの1つ又は複数のIGLB領域に対する抑制因子の結合を阻害する阻害剤をコードする。例えば、大腸菌では、以下のプライマーを使用して、IGLB配列を増幅することができる、
UP-IGLB(IGLB領域のクローニングのための上流プライマーとして使用される)
5'-TTGTTCTCCTTCATATGCTCCGACATTTCT-3'(配列番号1)
DOWN-IGLB(IGLB領域のクローニングのための下流プライマーとして使用される)
5'-CTTCGGGAATGATTGTTATCAATGACGATA-3'(配列番号2)
【０１５０】
casA-cas3遺伝子間領域(ここではIGLBと表示される)はPcasを含有しており、これに対して、H-NSは強い結合親和性を有し、また多岐に方向づけられた抗cas3(抗Pcasとして知られる)プロモーターはPcasの80bp上流に位置し、未知の機能のアンチセンス転写物を生じさせる(Pulら、Mol Microbiol. 2010 Mar;75(6):1495〜512. doi: 10.1111/j.1365〜2958.2010.07073.x. Epub 2010 Feb 1、「Identification and characterization of E. coli CRISPR-cas promoters and their silencing by H-NS」)。LeuO及びH-NSの両方ともが、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によって決定されるように、IGLB断片に結合する。本発明の一例では、脱抑制因子及び/又は抑制因子は、宿主細胞ゲノムによって含まれるCRISPR/CasシステムIGLBに結合する。本発明の一例では、脱抑制因子及び/又は抑制因子は、宿主細胞ゲノムによって含まれるCRISPR/CasシステムPcas(又はオルソログ若しくはホモログ)に結合する。本発明の一例では、脱抑制因子及び/又は抑制因子は、宿主細胞ゲノムによって含まれるCRISPR/Casシステム抗Pcas(又はオルソログ若しくはホモログ)に結合する。結合部位は、例えば、宿主細胞のタイプI CRISPRアレイによって含まれる。
【０１５１】
脱抑制因子の一試験(example test)として、脱抑制因子は、例えば、Westraら2010(Westraら、Mol Microbiol. 2010 Sep;77(6):1380〜93. doi: 10.1111/j.1365〜2958.2010.07315.x. Epub 2010 Aug 18、「H-NS-mediated repression of CRISPR-based immunity in Escherichia coli K12 can be relieved by the transcription activator LeuO」)によって記載され、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)によって決定されるように、IGLB配列(この配列は宿主種ゲノムによって含まれる)に結合する。前結合(Pre-bound)LeuOは、インビトロ結合アッセイにおいてIGLB断片に対するH-NSの協同的結合を妨害する。これと一致して、前結合H-NSは、脱抑制因子がH-NS/LeuO複合体に加えられたとき、IGLBから部分的に放出させる。IGLB配列内のLeuO又は他の脱抑制因子の結合領域をマップするために、DNase Iフットプリント分析を行うことができる。IGLB DNAの限定的なDNase I加水分解に際して、前に示されたように、H-NSは、フットプリントの拡大を引き起こす(Pulら、2010)。
【０１５２】
脱抑制因子は、宿主細胞ゲノムによって含まれる抑制因子(例えば、H-NS)に関する結合部位に相補的であり、例えば、宿主細胞のCRISPR/CasシステムのPcasプロモーター又は抗casプロモーターのいずれかに相補的であるオリゴヌクレオチドを含んでいてもよく、ここで、転写物は、脱抑制因子の存在下で、Pcasプロモーター又は抗casプロモーターから開始することができる。別の例では、脱抑制因子は、宿主ゲノムによって含まれるLGLB DNAを結合可能ではない。
【０１５３】
任意選択で、脱抑制因子は、ドミナントネガティブなH-NS変異体タンパク質G113Dである(Ueguchiら、1996;Pulら、2007)。このH-NS変異体タンパク質はDNA結合活性を喪失しているが、野生型H-NSとヘテロマーを形成できる。生じるヘテロマーも、それらのDNA結合特性を喪失している(Pulら、2005)。例えば、脱抑制因子はG113D又はその機能的な均等物であり、例えば、宿主細胞におけるG113D又は均等物の発現に関して強力な及び/又は構成的なプロモーターの制御下にあるヌクレオチド配列によって、ベクター中にコードされる。
【０１５４】
一例では、宿主細胞における脱抑制因子の発現は誘導性であり、例えば、脱抑制因子は誘導性プロモーターの制御下にあるベクターヌクレオチド配列によりコードされる。例えば、誘導は、光による又は化学的な手段による物理的なもの(例えば、熱誘導)であってもよい。
【０１５５】
一例では、方法は、宿主細胞のCRISPR/CasアレイにおけるRNAポリメラーゼプロモーター相互作用のH-NS抑制の脱抑制を含み又はベクターはその脱抑制のためであり、Casは前記抑制Casである。
【０１５６】
一例では、抑制因子は、宿主細胞のCRISPR/CasシステムのIGLB領域に結合する。一例では、抑制因子は、宿主細胞のCRISPR/Casシステムのプロモーターに結合する。一例では、抑制因子は、宿主細胞のCRISPR/CasシステムのRNAポリメラーゼ結合部位の阻害剤である。一例では、抑制因子は、宿主細胞のCRISPR/CasシステムからのRNA転写の阻害剤である。一例では、抑制因子は、宿主細胞のCRISPR/Casシステムによって含まれる転写開始部位からのRNA転写の阻害剤であり、転写開始部位はシステムのCRISPRアレイの第一CRISPR反復の第一(最も5')ヌクレオチドの100、50又は30ヌクレオチド上流内にある、或いは開始部位はシステムのCRISPRアレイのリーダー領域内にある。例えば、抑制因子はH-NH又はStpAであり、これが、そのような領域に結合する。
【０１５７】
大腸菌タイプI-Eシステムでは、PAMは、プロト-スペーサーの(5'の)直ぐ上流に位置する5'-AWG-3'配列に対応する。それ故、宿主細胞が大腸菌細胞であるとき、プロトスペーサーはPAMの直ぐ3'にあり、PAMは5'-AWG-3'、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGである。
【０１５８】
宿主細胞がS.サーモフィルス細胞であるとき、プロトスペーサーはPAMの直ぐ3'又は直ぐ5'にあり、PAMはNNAGAAW又はNGGNGである。一例では、PAMは、5'-AW-3'、例えば、AA又はAT、又はAGである。任意選択で、PAMは、S.サーモフィルスのCRISPR4システムのPAMである。例えば、本発明のCRISPRアレイ又はガイドRNAコードヌクレオチド配列は反復配列を含み、反復配列は5'-GTTTTTCCCGCACACGCGGGGGTGATCC-3'(配列番号74)である。
【０１５９】
任意選択で、システムは、抑制Casを含み、
(a)Casは、配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含む、又は配列番号49〜52から選択される配列を含む反復及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含む又はそれからなるPAMと共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログであり、任意選択で、宿主細胞は大腸菌細胞であり;又は
(b)Casは、配列番号56、64、70及び72から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含む、又は配列番号53を含む反復と共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログであり任意選択で、宿主細胞はS.エンテリカであり;又は
(c)Casは、配列番号62から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含む、又はNNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含む又はそれからなるPAMと共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログであり、任意選択で、宿主細胞はS.サーモフィルス細胞である。
【０１６０】
任意選択で、システムは抑制Casを含み、Casは、
(a)配列番号49〜52から選択される配列を含む反復及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、宿主細胞は大腸菌細胞である);
(b)配列番号53を含む反復(宿主細胞はS.エンテリカである);又は
(c)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、宿主細胞はS.サーモフィルス細胞である)と共に作動可能である。
【０１６１】
任意選択で、システムは抑制Casを含み、Casは、
(a)AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、Casヌクレアーゼは、配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、80、90、95又は98%同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞は大腸菌細胞である);又は
(b)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、Casヌクレアーゼは、配列番号62から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、80、90、95又は98%同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞はS.サーモフィルス細胞である)と共に作動可能である。
【０１６２】
任意選択で、標的ヌクレオチド配列又はプロトスペーサーは、宿主細胞のゲノム中の前記PAMの直ぐ3'に少なくとも5、6、7、8、9又は10連続ヌクレオチドの配列を含む。任意選択で、標的ヌクレオチド配列又はプロトスペーサーは、宿主細胞のゲノム中の前記PAMの直ぐ5'に少なくとも5、6、7、8、9又は10連続ヌクレオチドの配列を含む。一例では、PAMは、宿主細胞の染色体又はエピソームによって含まれる。
【０１６３】
任意選択で、抑制因子は、
(i)配列番号17、19、21、23、25及び27から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、80、90、95又は98%同一であるアミノ酸配列を含むH-NS;又は
(ii)配列番号29、31、33及び35から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、80、90、95又は98%同一であるアミノ酸配列を含むStpAである。
任意選択で、脱抑制因子は、
(iii)配列番号3、5、7、9、11、13及び15から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、80、90、95又は98%同一であるアミノ酸配列を含むLeuO;又は
(iv)配列番号37、39及び41から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、80、90、95又は98%同一であるアミノ酸配列を含むLRP;又は
(v)配列番号43、45及び47から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、80、90、95又は98%同一であるアミノ酸配列を含むCRPである。
【０１６４】
一例では、宿主細胞(例えば、哺乳動物、ヒト、マウス、細菌又は古細菌細胞)によって含まれるCRISPR/Casシステムは、抑制Cas、例えば、Cas1、2、3、9、A、B、C、D又はEを含む。例えば、Casは宿主細胞の内因性ヌクレオチド配列によりコードされ、宿主細胞は細菌又は古細菌細胞である。別の例では、Casは細胞によって含まれる外因性ヌクレオチド配列によりコードされ、例えば、それは、ベクター(例えば、本発明のベクター)によって導入されている。
【０１６５】
本発明の特定の実施形態では、宿主細胞は、内因性CRISPR/Casシステムを含む細菌又は古細菌細胞であり、システムは、宿主ゲノムの1つ又は複数の内因性ヌクレオチド配列によってコードされる抑制Cascade又はCas(例えば、Cas1、2、3、9、A、B、C、D又はE)を含む。有利には、本発明は、Cascade又はCasを脱抑制するために使用でき、それによって、Cascade又はCasを利用して、宿主ゲノム(例えば、染色体又はエピソームのプロトスペーサー配列)によって含まれる標的プロトスペーサー配列を改変(例えば、切断)し、例えば、細胞を死滅させることができる。この態様は、1つ又は複数のベクターを宿主細胞に導入することが関与し、ここで、crRNA又はガイドRNA(例えば、単一ガイドRNA)がコードされ、脱抑制されると、Cascade又はCasと共に作動可能である。脱抑制は、1つ又は複数の前記ベクターによって保持される本発明の脱抑制因子の手段によって実施され、脱抑制因子は、抑制Cascade又はCasを脱抑制するために、宿主細胞の内側で発現される。通例、脱抑制された内因性Casを利用する能力により、本発明のベクターにおける対応するCasコード配列の省略が可能となる。これにより、ベクター中の有用な空間が開放される(特に、いくつかのCasコード配列は大きい、例えば、S.ピオゲネスCas9配列は4.2kbであり、これは、例えば、ファージベクターのパッケージング容量に近いことが考慮される)。自由な空間により、更なるスペーサー及び/又はCRISPRアレイ又はgRNAコード配列を含むことを可能とし、宿主配列の切断のマルチプレックス化を可能とする。これは、宿主に本発明のベクターに対する耐性を進化させる機会を最小化するために有用である。ベクターによってコードされる外因性Casに依存するよりむしろ、内因性Casを利用する別の利点は、内因性Casが、宿主細胞機構にとってネイティブであり、故に、一旦脱抑制されると効率的に働く可能性が高いことである。大腸菌細胞において発現される外因性Cas、例えば、S.ピオゲネスCasは、それが外来のタンパク質であるので下位(inferior)であってもよく、また大腸菌機構と共に非常に効率的に働かなくてもよい。それ故、任意選択で、本発明のベクターは、抑制Cas又はCascadeをコードするヌクレオチド配列を欠いており;又はベクターはCasをコードする任意のヌクレオチド配列を欠く。任意選択で、本発明の方法は、宿主細胞への抑制Casをコードするヌクレオチド配列の導入を含まない又は宿主細胞へのCasをコードする任意のヌクレオチド配列の導入を含まない。
【０１６６】
本発明のこの態様の適用例(example application)は、本発明の1つ又は複数のベクターの、大腸菌細胞(例えば、大腸菌O157 H7 EDL933(EHEC)細胞)への導入であり、これは抑制Cas3及び/又はCascade(又はそのCasA)(ここで、H-NSが、Cas及び/又はCascadeを抑制する)を含む。ベクターは、(a)細胞におけるCascade又はCasを脱抑制可能である脱抑制因子(例えば、LeuO)をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び(b)各crRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Cas又はCascadeのCasをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する;細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含む。成分(b)は、脱抑制Cas又はCascadeと共に作動可能であるCRISPR反復配列を含み、例えば、反復配列は、配列番号49〜52から選択される配列を含む又はそれからなる。一例では、脱抑制Casは、配列番号58又は60のアミノ酸配列を含むCas3である。一例では、脱抑制Casは、配列番号66又は68のアミノ酸配列を含むCasAである。任意選択で、標的ヌクレオチド配列又はプロトスペーサーは、宿主細胞のゲノム中のPAMの直ぐ3'に少なくとも5、6、7、8、9又は10連続ヌクレオチドの配列を含み、PAMはAWG、AAG、AGG、GAG及びATGから選択される。
【０１６７】
本発明のこの態様の適用例は、本発明の1つ又は複数のベクターの、S.エンテリカ細胞(例えば、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィムリウム細胞、例えば、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィムリウムLT2細胞又はサルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィムリウムパラチフィA細胞)への導入であり、これは抑制Cas3及び/又はCascade (又はそのCasA)(ここで、H-NSが、Cas及び/又はCascadeを抑制する)を含む。ベクターは、(a)細胞におけるCascade又はCasを脱抑制可能である脱抑制因子(例えば、LeuO)をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び(b)各crRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Cas又はCascadeのCasをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する;細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含む。成分(b)は、脱抑制Cas又はCascadeと共に作動可能であるCRISPR反復配列を含み、例えば、反復配列は、配列番号53を含む又はそれからなる。一例では、脱抑制Casは、配列番号56又は64のアミノ酸配列を含むCas3である。一例では、脱抑制Casは、配列番号70又は72のアミノ酸配列を含むCasAである。任意選択で、標的ヌクレオチド配列又はプロトスペーサーは、宿主細胞のゲノム中のPAMの直ぐ3'に少なくとも5、6、7、8、9又は10連続ヌクレオチドの配列を含み、PAMはCas3と共に作動可能である。
【０１６８】
任意選択で、ベクターは、Casコードヌクレオチド配列又はシステムの抑制Casをコードするヌクレオチド配列を欠く。
【０１６９】
任意選択で、代替法においては、ベクターは、成分(a)を含むが、成分(b)を含まなく、成分(b)(及び、任意選択で、成分(b)も)は、第一ベクターと組み合わされる第二ベクターによって含まれ;任意選択で、ベクターは、Casコードヌクレオチド配列又はシステムの抑制Casをコードするヌクレオチド配列を欠く。
【０１７０】
任意選択で、システムは抑制Cascade(例えば、CasA、B、C、D及びE)を含み、脱抑制因子は宿主細胞(例えば、大腸菌又はサルモネラ細胞)におけるCascadeを脱抑制可能であり、任意選択で、各ベクターは、前記抑制Cascadeの1つ又は複数のCasをコードするヌクレオチド配列を欠く。
【０１７１】
任意選択で、システムは抑制CasA、Cas3又はCas9を含み、脱抑制因子は宿主細胞(例えば、大腸菌又はサルモネラ細胞)におけるCasを脱抑制可能であり、任意選択で、各ベクターは、Casをコードするヌクレオチド配列を欠く。
態様:
【０１７２】
本発明の特定の態様は、以下のとおりである:
1.宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)各crRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する;細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含む、ベクター。
2.CRISPR/Casシステムの1つ又は複数の成分の転写が抑制される、態様1のベクター。
3.1つ又は複数のCas配列の転写が抑制される、態様1又は2のベクター。
4.タイプI CRISPR/CasシステムのCasA、B、C、D及びEのうちの1つ又は複数の転写が抑制される、いずれかの先行する態様のベクター。
5.Cas3の転写が抑制される、いずれかの先行する態様のベクター。
6.宿主細胞ゲノムのCas改変が
(a)宿主細胞を死滅させる;
(b)細胞又はエピソームの成長又は増殖を減少させる;
(c)細胞又はエピソームの成長又は増殖を増加させる;
(d)前記プロトスペーサー配列を含む又はそれに隣接する、ヌクレオチド配列の転写を減少させる又は防止する;又は
(e)前記プロトスペーサー配列を含む又はそれに隣接する、ヌクレオチド配列の転写を増加させる、いずれかの先行する態様のベクター。
7.成分(a)及び(b)が、代わりに、前記Cas改変が起こる宿主細胞へのベクターの導入のために、異なる第一及び第二ベクターによって含まれる、いずれかの先行する態様のベクター。
8.脱抑制因子がタンパク質又はRNAである、いずれかの先行する態様のベクター。
9.抑制因子がH-NS、StpA、LRP又はCRPである、いずれかの先行する態様のベクター。
10.脱抑制因子が、宿主細胞において、それぞれ、H-NS、StpA、LRP又はCRP抑制因子との複合体を形成可能であり、CRISPR/Casシステムの抑制を防止する又は減少させる、変異体H-NS、StpA、LRP又はCRPである、いずれかの先行する態様のベクター。
11.抑制因子がH-NS又はStpAであり、脱抑制因子がLeuOである、いずれかの先行する態様のベクター。
12.エピソームがプラスミドである、いずれかの先行する態様のベクター。
13.細胞が細菌又は古細菌細胞である、いずれかの先行する態様のベクター。
14.ヌクレオチド配列(a)が、宿主細胞における配列の発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含む、いずれかの先行する態様のベクター。
15.ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が、宿主細胞における配列又はアレイの発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含む、いずれかの先行する態様のベクター。
16.(a)及び(b)が、同じオペロンによって含まれる又は細胞において作動可能な共通の発現制御(例えば、同じプロモーター)の制御下にある、いずれかの先行する態様のベクター。
17.プロモーターが、宿主細胞における発現のための強力な及び/又は構成的なプロモーターである、態様16のベクター。
18.宿主細胞が野生型宿主細胞である、いずれかの先行する態様のベクター。
19.発現可能なhtpG配列を含む、いずれかの先行する態様のベクター。
20.いずれかの先行する態様のベクターであって、細胞が、Cascade及び  Cas3を含むCRISPR/Casシステムを含み、Cascadeが、宿主細胞において(例えば、H-NSによって)抑制され、(i)前記Cascade抑制の脱抑制因子(例えば、LeuO)をコードする発現可能なヌクレオチド配列;及び(ii)Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含み、Cas3が、宿主細胞における脱抑制Cascadeと共に機能でき;ヌクレオチド配列が、宿主細胞において発現可能である、ベクター。
21.(i)及び(ii)のヌクレオチド配列が、同じオペロンによって含まれる又は細胞において作動可能な共通の発現制御(例えば、同じプロモーター)の制御下にある、態様20のベクター。
22.配列(i)及び(ii)並びにCRISPRアレイ又は前記gRNAをコードする配列が、宿主細胞における一緒の脱抑制因子、Cas3及びアレイ又はgRNAの発現のために、宿主細胞への導入のための、2つ以上の異なるベクターによって含まれる、態様20又は21のベクター。
23.細菌又は古細菌宿主細胞への導入のための(任意選択で、いずれかの先行する態様に記載の)核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって天然で抑制された内因性CRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)各crRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する;細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含み;
ここで、抑制因子が、細胞ゲノムによってコードされるH-NS、StpA、LRP若しくはCRP又はその機能的な均等物である;及び
ここで、脱抑制因子が、それぞれ、H-NSとの複合体を形成可能であるLeuO又はその機能的な均等物;又はH-NS、StpA、LRP若しくはCRP抑制因子との複合体を形成可能であるH-NS、StpA、LRP若しくはCRPの変異体である、ベクター。
24.細胞が、大腸菌(例えば、大腸菌K12)又はサルモネラ(例えば、S.エンテリカ血液型亜型チフィムリウム)細胞である、態様23のベクター。
25.Casが、Cas3である、態様23又は24のベクター。
26.CRISPR/Casシステムが、タイプI(例えば、タイプI-E又はタイプI-F)システムである、態様23から25のいずれか1つのベクター。
27.プロトスペーサー配列が、細胞によって含まれる必須遺伝子、ビルレンス遺伝子又は抗生物質耐性遺伝子によって含まれる、態様23から26のいずれか1つのベクター。
28.CasA、B、C、D及びEヌクレオチド配列からなる群からの配列を含まない又は、前記群の配列の全てを含まない、態様23から27のいずれか1つのベクター。
29.Cas1、Cas2、Cas5及びCas6配列からなる群からの配列を含まない、態様23から28のいずれか1つのベクター。
30.Cas3ヌクレオチド配列を含まない、態様23から29のいずれか1つのベクター。
31.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防する医学的な使用のための、いずれかの先行する態様のベクターであって、宿主細胞が、対象によって含まれるベクター。
32.ヒト、動物又は植物マイクロバイオームにおいて、前記宿主細胞を死滅させるための又はその成長若しくは増殖を減少させるための、いずれかの先行する態様のベクター。
33.複数の宿主細胞を死滅させるための又はその成長若しくは増殖を減少させるための、複数のいずれかの先行する態様のベクター。
34.該又は各宿主細胞が、複数の前記宿主細胞を含む及び宿主細胞の種又は株とは異なる種又は株の1つ又は複数の細胞を含むマイクロバイオーム(例えば、腸マイクロバイオーム又は環境マイクロバイオーム)によって含まれる、いずれかの先行する態様のベクター。
35.先行する態様のいずれかに記載の複数のベクターを含む医薬であって、任意選択で、ヒト又は動物における疾患又は状態を治療する又は予防するための、1つ又は複数の医療薬(例えば、抗がん医薬)又は抗生物質(例えば、プロトスペーサー配列が、宿主細胞抗生物質耐性遺伝子によって含まれる)を更に含む医薬。
36.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防する方法であって、いずれかの先行する態様のベクター又は医薬を対象に投与する工程を含み、対象のマイクロバイオームによって含まれる宿主細胞は、細胞の内因性の脱抑制Casによって改変され、治療又は予防が実施される、方法。
37.野生型の細菌又は古細菌細胞(例えば、大腸菌又はサルモネラ細胞)を死滅させる方法であって、細胞が、Cas3及びCascadeタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む内因性CRISPR/Casシステムを含み、Cas3及び/又はCascadeが、細胞において天然で抑制され、方法が、
(a)前記Cas3及び/又はCascadeを脱抑制する工程及び
(b)(i)細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のための、CRISPRアレイ;又は(ii)それぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を細胞に導入する工程を含み;各crRNA又はgRNAが、Cas又はCascadeをガイドして、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する、方法。
38.工程(b)において、態様1から33のいずれか1つに記載のベクターが、細胞に導入される、態様37の方法。
39.Cas3転写、発現又は活性が脱抑制される、態様37又は38の方法。
40.Cas転写、発現又は活性が脱抑制され、CasがCascade Cas(例えば、CasA、B、C、D又はE)である、態様37、38又は39の方法。
41.発現可能な脱抑制因子配列が、前記アレイ又はgRNAコード配列と一緒に、同時に又は連続して、細胞に導入される、態様37から40のいずれか1つの方法。
42.脱抑制因子配列及びアレイ又はgRNAコード配列が、同じ核酸ベクター(例えば、ファージミド、ファージ又はプラスミド)によって含まれる、態様37から41のいずれか1つの方法。
43.脱抑制因子配列及びアレイ又はgRNAコード配列が、同じオペロンによって含まれる又は細胞において作動可能な共通の発現制御(例えば、同じプロモーター)の制御下にある、態様37から42のいずれか1つの方法。
44.工程(a)が、(i)H-NSとの複合体を形成可能である、LeuO又は、その機能的な均等物;又は(ii)それぞれH-NS、StpA、LRP又はCRP抑制因子との複合体を形成可能である、H-NS、StpA、LRP又はCRPの変異体を細胞中に発現させることを含む、態様37から43のいずれか1つの方法。
45.態様1から34のいずれか1つに記載のベクター又はベクターを含む医薬組成物、食糧、飲料、環境の処理用の組成物、殺虫薬、除草剤、又は化粧品。
46.宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)
(i)細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のための、CRISPRアレイ又はCRISPRスペーサー配列;
(ii)細胞におけるガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードするヌクレオチド配列の導入のための部位を含み;前記crRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する、ベクター。
47.部位(b)が、CRISPRアレイによって含まれ、アレイは、宿主細胞のそれぞれのプロトスペーサー配列をターゲティングするための、1つ又は複数の前記スペーサー配列を収容可能である、態様46のベクター。
48.(i)のアレイ又は(ii)の配列が、宿主細胞における発現のための強力な及び/又は構成的なプロモーターであるプロモーターの制御下にある、態様46又は47のベクター。
49.(a)の配列が、宿主細胞における脱抑制因子の発現のための強力な及び/又は構成的なプロモーターであるプロモーターの制御下にある、態様46又は47のベクター。
50.宿主細胞における発現のための、発現可能なCas3配列及び/又は発現可能なhtpG配列を含む、態様46から49のいずれか1つのベクター。
51.各前記crRNAが、宿主細胞におけるCas(例えば、Casヌクレアーゼ)と共に作動可能である、態様46から50のいずれか1つのベクター。
52.Casが、宿主細胞ゲノムの内因性ヌクレオチド配列によってコードされる、態様51のベクター。
53.Casが、宿主細胞にそこでの前記Casの発現のために導入されうるベクターによって又は異なるベクターによって含まれるヌクレオチド配列によりコードされる、態様51のベクター。
54.(i)のスペーサー又は(ii)の配列が、そこに挿入されているとき、ベクターが、態様1から34のいずれか1つのベクターに従う、態様46から53のいずれか1つのベクター。
55.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防する方法であって、ベクターを対象に投与する工程を含み、対象のマイクロバイオームによって含まれる細菌又は古細菌宿主細胞(例えば、大腸菌、サルモネラ、又はS.エンテリカ血液型亜型チフィムリウム)が、細胞の内因性の脱抑制Casによって改変され、治療又は予防が実施され;ここで、
(i)各細胞が、細胞における抑制因子によって抑制される、CRISPR/Casシステムを含み、(ii)ベクターが、細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列を含み、配列が、脱抑制因子を産生するために、細胞において発現可能であり;及び
(iii)ベクターが、細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイを欠いており;及び細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を欠いている、方法。
56.細菌又は古細菌宿主細胞への導入のための複数の核酸ベクターを含む医薬であって、任意選択で、ヒト又は動物における疾患又は状態を治療する又は予防するための、1つ又は複数の医療薬(例えば、抗がん医薬)又は抗生物質(例えば、プロトスペーサー配列が、宿主細胞抗生物質耐性遺伝子によって含まれる)を更に含み;ここで、
(i)各細胞が、細胞におけるH-NS及び/又はStpAから選択される抑制因子によって抑制される、CRISPR/Casシステムを含み、(ii)ベクターが、細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列を含み、配列が、任意選択で、強力な及び/又は構成的なプロモーターの制御下で脱抑制因子を産生するために、細胞において発現可能であり;及び
ベクターが、細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイを欠いており;及び細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を欠いている、医薬。
57.Cascade Cas、Cas3又はCas9が抑制される、態様55の方法又は態様56の医薬。
58.システムが抑制Casを含み、  (a)Casが、配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含む、又は配列番号49〜52から選択される配列を含む反復及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含む又はそれからなるPAMと共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログであり、任意選択で、宿主細胞は大腸菌細胞であり;又は
(b)Casが、配列番号56、64、70及び72から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含む、又は配列番号53を含む反復と共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログであり、任意選択で、宿主細胞はS.エンテリカであり;又は
(c)Casが、配列番号62から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含む、又はNNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含む又はそれからなるPAMと共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログであり、任意選択で、宿主細胞はS.サーモフィルス細胞である、いずれかの先行する態様のベクター、医薬、方法又は組成物。
59.システムが抑制Casを含み、Casが、  (a)配列番号49〜52から選択される配列を含む反復及びAWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、宿主細胞は大腸菌細胞である);
(b)配列番号53を含む反復(宿主細胞はS.エンテリカである);又は
(c)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、宿主細胞はS.サーモフィルス細胞である)と共に作動可能である、いずれかの先行する態様のベクター、医薬、方法又は組成物。
60.システムが抑制Casを含み、Casが、  (a)AWG、例えば、AAG、AGG、GAG又はATGを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、Casヌクレアーゼは、配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞は大腸菌細胞である);又は
(b)NNAGAAW、NGGNG又はAW、例えば、AA、AT又はAGを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、Casヌクレアーゼは、配列番号62から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、宿主細胞はS.サーモフィルス細胞である)と共に作動可能である、いずれかの先行する態様のベクター、医薬、方法又は組成物。
61.プロトスペーサーが、宿主細胞のゲノム中の前記PAMの直ぐ3'に少なくとも5、6、7、8、9又は10連続ヌクレオチドの配列を含む、態様58から60のいずれか1つのベクター、医薬、方法又は組成物。
62.プロトスペーサーが、宿主細胞のゲノム中の前記PAMの直ぐ5'に少なくとも5、6、7、8、9又は10連続ヌクレオチドの配列を含む、態様58から60のいずれか1つのベクター、医薬、方法又は組成物。
63.抑制因子が、
(i)配列番号17、19、21、23、25及び27から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含むH-NS;又は
(ii)配列番号29、31、33及び35から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含むStpAである、いずれかの先行する態様のベクター、医薬、方法又は組成物。
64.脱抑制因子が、
(iii)配列番号3、5、7、9、11、13及び15から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含むLeuO;又は
(iv)配列番号37、39及び41から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含むLRP;又は
(v)配列番号43、45及び47から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含むCRPである、いずれかの先行する態様のベクター、医薬、方法又は組成物。
65.ベクターが、Casコードヌクレオチド配列又はシステムの抑制Casをコードするヌクレオチド配列を欠く、いずれかの先行する態様のベクター、医薬、方法又は組成物。
66.代替的に、ベクターが成分(a)を含むが、成分(b)を含まない、いずれかの先行する態様のベクター、医薬、方法又は組成物であって、成分(b)が、第一ベクターと組み合わされる第二ベクターによって含まれ;任意選択で、ベクターが、Casコードヌクレオチド配列又はシステムの抑制Casをコードするヌクレオチド配列を欠く、ベクター、医薬、方法又は組成物。
67.システムが抑制Cascade(例えば、CasA、B、C、D及びE)を含み、脱抑制因子が宿主細胞(例えば、大腸菌又はサルモネラ細胞)におけるCascadeを脱抑制可能であり、任意選択で、各ベクターが、前記抑制Cascadeの1つ又は複数のCasをコードするヌクレオチド配列を欠く、いずれかの先行する態様のベクター、医薬、方法又は組成物。
68.システムが抑制CasA、Cas3又はCas9を含み、脱抑制因子は宿主細胞(例えば、大腸菌又はサルモネラ細胞)におけるCasを脱抑制可能であり、任意選択で、各ベクターが、Casをコードするヌクレオチド配列を欠く、いずれかの先行する態様のベクター、医薬、方法又は組成物。
リコンビニアリング
本発明は、以下のとおり核酸リコンビニアリング法も提供する:
69.細胞(例えば、細菌細胞、例えば、大腸菌細胞)において核酸(例えば、DNA)リコンビニアリングを実施するインビトロ方法であって、細胞が、抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、方法が、
(a)所望の核酸(NOI)を細胞に(例えば、エレクトロポレーションによって)導入する工程;
(b)(例えば、上記態様又は下記条項のいずれか1つに記載の)本発明のベクターを細胞に(例えば、エレクトロポレーションによって)導入する工程、ここで、工程(a)及び(b)は、同時に又は任意の順序で実施される;
(c)細胞において、ベクターによってコードされる脱抑制因子及びcrRNA又はgRNAを発現させる工程、ここで、脱抑制因子が、CRISPR/Casシステムを脱抑制し、システムのCasヌクレアーゼがcrRNA又はgRNAによってガイドされて、NOIによって含まれるプロトスペーサー配列を改変(例えば、切断)する;及び
(d)任意選択で、改変されたNOIを単離する工程を含む、方法。
細胞は、例えば、racプロファージRecE/RecT又はラムダレッドαβδを含む、リコンビニアリング-コンピテント細胞である。例えば、細胞は、ラムダレッド組換えシステムを含む、リコンビニアリング-コンピテント細胞である。一例では、NOIはDNA(例えば、dsDNA又はssDNA)である。別の例では、NOIはRNAである。単離された改変されたNOIは、Casによって産生された改変に加え、改変を含んでいてもよく、例えば、改変は、Casによって作られた改変の前後に作られる。
本発明のこの態様は、リコンビニアリング方法を制御するため有用である。例えば、Cas改変(例えば、Cas切断)の開始、タイミング及び/又は持続時間は、脱抑制因子の発現によって制御することができる。例えば、NOI及び鋳型核酸又は挿入核酸又はリコンビニアリング方法の他の成分は、最初に細胞に導入され、脱抑制因子の発現が続いてもよく、それによって、改変が、Casによって実施され、また鋳型/挿入核酸を使用して、Casによって改変されたNOIが改変又はコピーされる。例えば、方法は、第二NOIを第一NOIの導入と同時に又は連続して細胞に導入する工程;脱抑制因子が発現され;Casがプロトスペーサーを切断し、それによって、第一NOIにおける組換え誘導性末端(recombinogenic ends)を産生する工程;第二NOIによって含まれるヌクレオチド配列は、第一NOIにおける切断部に又はそれに隣接して挿入され;及び任意選択で、第二NOIの配列と連続する第一NOIの配列を含む、連続する改変されたNOIが、産生される工程を含む。別の実施形態では、方法は、第二NOIを使用して、切断部にある又はそれに隣接する第一NOIの配列を取り出す(retrieve)工程を含む。例えば、本発明の方法に使用することができる配列を挿入する又は取り出す適切な技術に関し、故に、本明細書中に参照によって組み込まれるWO2017/118598を参照されたい。
70.ヌクレアーゼがdsDNAヌクレアーゼである、態様69の方法。
71.ヌクレアーゼがssDNAヌクレアーゼである、態様69の方法。
72.ヌクレアーゼがニッカーゼである、態様69の方法。
73.ヌクレアーゼがCas9である、態様69から72のいずれか1つの方法。
74.ヌクレアーゼがCas3であり、任意選択で、抑制因子がCascade(例えば、CasA)を抑制する、態様69から72のいずれか1つの方法。
75.単離され改変されたNOIを、第二細胞(例えば、非ヒト脊椎動物、哺乳動物、ヒト、動物(例えば、雌ウシ、ブタ  ヒツジ、ヤギ、家畜、魚類、サケ又はウマ)、げっ歯類、マウス、ラット又はゼブラフィッシュ又はアフリカツメガエル細胞)に導入する工程及び、任意選択で、そこから子孫細胞を得る工程を含む、態様69から74のいずれか1つの方法。
76.第二細胞が、胚性幹細胞(ES細胞)又は人工多能性幹細胞(iPS)である、態様75の方法。
例えば、第二細胞は、非ヒト動物(例えば、哺乳動物又は非ヒト脊椎動物)細胞、例えば、げっ歯類、マウス又はラット細胞である。
77.第二細胞又は子孫細胞を、非ヒト動物(例えば、雌ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、家畜、魚類、サケ、ウマ、げっ歯類、マウス、ラット、ゼブラフィッシュ又はアフリカツメガエル)に発生させる工程を含む、態様76の方法。
78.動物からタンパク質又は核酸(又はそのヌクレオチド配列)を単離する工程、例えば、抗体、抗体鎖、抗体可変領域又はその核酸を単離する工程を更に含む、態様77の方法。
79.核酸(又はそのヌクレオチド配列)を発現ベクター又は宿主細胞に、その核酸又はヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列(例えば、抗体可変ドメイン)を含むタンパク質の発現のために、挿入する工程、タンパク質を発現させる工程、及びタンパク質を単離する工程、及び任意選択で、単離されたタンパク質を、ヒト又は動物における使用のための医薬に製剤化する工程を更に含む、態様78の方法。
任意選択で、核酸又は配列は、発現ベクターへの挿入の前、途中又は後に、変異される又は別の核酸又はヌクレオチド配列と融合される。例えば、抗体可変ドメイン配列は、ベクター中で、ベクターから抗体鎖を発現させるために、抗体定常領域をコードするヌクレオチド配列に対して作動可能に連結することができる。
条項:
本発明の特定の条項は、以下のとおりである:
1.宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b);細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含み、
各cRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する、ベクター。
2.ヌクレオチド配列(a)が、宿主細胞における配列の発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含む、条項1のベクター。
3.ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が、宿主細胞における配列又はアレイの発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含む、条項1又は2のベクター。
4.(a)及び(b)が、同じオペロンによって含まれる又は細胞において作動可能な共通プロモーターの制御下にある、いずれかの先行する条項のベクター。
5.宿主細胞が野生型宿主細胞である、いずれかの先行する条項のベクター。
6.1つ又は複数のCas配列の転写が抑制され、任意選択で、タイプI CRISPR/CasシステムのCasA、B、C、D及びEのうちの1つ又は複数の転写が抑制される、いずれかの先行する条項のベクター。
7.宿主細胞ゲノムのCas改変が、
(a)宿主細胞を死滅させる;
(b)細胞又はエピソームの成長又は増殖を減少させる;
(c)細胞又はエピソームの成長又は増殖を増加させる;
(d)前記プロトスペーサー配列を含む又はそれに隣接する、ヌクレオチド配列の転写を減少させる又は防止する;又は
(e)前記プロトスペーサー配列を含む又はそれに隣接する、ヌクレオチド配列の転写を増加させる、いずれかの先行する条項のベクター。
8.抑制因子がH-NS、StpA、LRP又はCRPである、いずれかの先行する条項のベクター。
9.脱抑制因子が、宿主細胞において、それぞれ、H-NS、StpA、LRP又はCRP抑制因子との複合体を形成可能であり、CRISPR/Casシステムの抑制を防止する又は減少させる、変異体H-NS、StpA、LRP又はCRPである、いずれかの先行する条項のベクター。
10.脱抑制因子がLeuO又はLysR又はその機能的な均等物である、いずれかの先行する条項のベクター。
11.細胞が細菌又は古細菌細胞である、いずれかの先行する条項のベクター。
12.発現可能なhtpG配列を含む、いずれかの先行する条項のベクター。
13.細胞が、Cascade及びCas3を含むCRISPR/Casシステムを含む、いずれかの先行する条項のベクターであって、Cascadeが、宿主細胞において抑制され、
(i)前記Cascade抑制の脱抑制因子をコードする発現可能なヌクレオチド配列;及び
(ii)宿主細胞における脱抑制Cascadeと共に機能できる、Cas3をコードする発現可能なヌクレオチド配列を含み;ヌクレオチド配列が、宿主細胞において発現可能である、ベクター。
14.(i)及び(ii)のヌクレオチド配列が、細胞において作動可能な1つ又は複数の構成的なプロモーターの制御下にある、条項13のベクター。
15.細菌又は古細菌宿主細胞への導入のための、(任意選択で、いずれかの先行する条項に記載の)核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって天然で抑制される、内因性CRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b);細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含み;
各cRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変し、
ここで、
(c)抑制因子が、細胞ゲノムによってコードされるH-NS、StpA、LRP若しくはCRP又はその機能的な均等物であり;
(d)ヌクレオチド配列(a)が、宿主細胞における配列の発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含み;及び
(e)ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が、宿主細胞における配列の発現のための構成的なプロモーター又は強力なプロモーターを含む、ベクター。
16.脱抑制因子が、LeuO又はその機能的な均等物;又は抑制因子の変異体;又は抑制因子をコードする宿主細胞によって含まれるヌクレオチド配列に相補的なsiRNAである、条項15のベクター。
17.細胞が、大腸菌、ストレプトコッカス又はサルモネラ細胞、任意選択で、EHEC大腸菌又はS.エンテリカ血液型亜型チフィムリウム細胞である、いずれかの先行する条項のベクター。
18.プロトスペーサー配列が、染色体配列、内因性宿主細胞配列、野生型宿主細胞配列、非ウイルス染色体宿主細胞配列であり、外因性配列及び/又は非ファージ配列ではない、いずれかの先行する条項のベクター。
19.CRISPR/CasシステムがCas3及び抑制Cascadeを含み、脱抑制因子が細胞におけるCascadeを脱抑制可能であり、ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が脱抑制CRISPR/Casシステムと共に作動可能なCRISPR反復配列を含み、反復配列が配列番号49〜52から選択される配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一である配列を含む又はそれからなる、いずれかの先行する条項のベクター。
20.Cas3が、配列番号58又は60から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一である配列を含む、条項19のベクター。
21.Cas3が、ヌクレオチド配列AWGを含む又はそれからなるPAMと共に作動可能である、条項19又は20のベクター。
22.Cascadeが抑制CasAを含み、脱抑制因子がCasAを脱抑制可能であり、CasAが配列番号66若しくは68から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98若しくは99%同一である配列を含む、条項19、20又は21のベクター。
23.細胞がS.エンテリカ細胞であり、CRISPR/Casシステムが抑制されたタイプE(Cse) Casを含み、脱抑制因子がCasを脱抑制可能であり、任意選択で、脱抑制因子がLeuO又はその機能的な均等物である、条項1から18のいずれか1つのベクター。
24.CRIPSR/CasシステムがCas3及び抑制Cascadeを含み、脱抑制因子が細胞におけるCascadeを脱抑制可能であり、ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が脱抑制CRISPR/Casシステムと共に作動可能なCRISPR反復配列を含み、反復配列が配列番号53又はそれと少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一である配列を含む又はそれからなる、条項1から18及び23のいずれか1つのベクター。
25.Cas3が、配列番号56若しくは64から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98若しくは99%同一である配列を含む、条項24のベクター。
26.Cascadeが抑制CasAを含み、脱抑制因子がCasAを脱抑制可能であり、CasAが配列番号70若しくは72から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98若しくは99%同一である配列を含む、条項24又は25のベクター。
27.ヌクレオチド配列又はアレイ(b)が、細胞において脱抑制CRISPR/Casシステムと共に作動可能なCRISPR反復配列を含み、反復配列が細胞のCRISPR/Casシステムによって含まれる宿主アレイにおける反復と少なくとも90%同一であり、ベクター又は配列又はアレイ(b)が、宿主CRISPR/CasシステムのCasヌクレアーゼによって認識されるPAMを含まない、いずれかの先行する条項のベクター。
28.CasA、B、C、D及びEヌクレオチド配列からなる群からの配列を含まない又は、前記群の配列の全てを含まない、いずれかの先行する条項のベクター。
29.Cas1、Cas2、Cas5及びCas6配列からなる群からの配列を含まない、条項1から28のいずれか1つのベクター。
30.Cas3ヌクレオチド配列を含まない、いずれかの先行する条項のベクター。
31.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防する医学的な使用のための、いずれかの先行する条項のベクターであって、宿主細胞が、対象によって含まれるベクター。
32.ヒト又は動物マイクロバイオームにおいて、前記宿主細胞を死滅させるための又はその成長若しくは増殖を減少させるための、医学的使用のための、いずれかの先行する条項のベクター。
33.マイクロバイオームが、複数の前記宿主細胞を含み、宿主細胞の種又は株とは異なる種又は株の更なる細胞を含み、更なる細胞が、プロトスペーサー配列を含まない、条項32のベクター。
34.任意選択で、ベクターが同一である、いずれかの先行する条項の複数のベクターを含む複数のバクテリオファージ又はファージミド。
35.ファージが、宿主細胞に感染可能であるが、更なる細胞に感染可能ではない、又はファージミドが、そのようなファージによって含まれる、条項33に従属するときの、条項34の複数のバクテリオファージ又はファージミド。
36.いずれかの先行する条項に記載の複数のベクター、バクテリオファージ又はファージミドを含み、任意選択で、ヒト又は動物における疾患又は状態を治療する又は予防するための、1つ又は複数の医療薬又は抗生物質を更に含む医薬。
37.ヒト又は動物対象における疾患又は状態を治療する又は予防する方法であって、いずれかの先行する条項のベクター、複数のベクター又は医薬を対象に投与する工程を含み、対象のマイクロバイオームによって含まれる宿主細胞は、細胞の内因性の脱抑制Casによって改変され、治療又は予防が実施される、方法。
38.野生型大腸菌又はサルモネラ宿主細胞を死滅させる、条項37の方法。
39.宿主細胞への導入のための核酸ベクターであって、細胞が、細胞における抑制因子によって抑制されたCRISPR/Casシステムを含み、ベクターが、
(a)細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び
(b)(i)細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のための、CRISPRアレイ又はCRISPRスペーサー配列;
(ii)細胞におけるガイドRNA(gRNA)をコードするヌクレオチド配列の導入のための部位を含み;前記cRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Casをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する、ベクター。
40.(i)又は(ii)の前記部位への挿入が、条項1から33のいずれか1つに記載のベクターを形成させる、条項39のベクター。
41.細菌又は古細菌宿主細胞への導入のための、複数の核酸ベクターを含み、任意選択で、ヒト又は動物における疾患又は状態を治療する又は予防するための、1つ又は複数の医療薬又は抗生物質を更に含む医薬であって;
(i)各細胞が、細胞におけるH-NS及び/又はStpAから選択される抑制因子によって抑制される、CRISPR/Casシステムを含み、
(ii)ベクターが、細胞におけるCRISPR/Casシステムを脱抑制可能である脱抑制因子をコードするヌクレオチド配列を含み、配列が、任意選択で、強力な及び/又は構成的なプロモーターの制御下で脱抑制因子を産生するために、細胞において発現可能であり;及び
ベクターが、細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイを欠いており;及び細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を欠いている、医薬。
42.Cascade Cas、Cas3又はCas9が抑制される、いずれかの先行する条項のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
43.システムが
(a)配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含む、又は配列番号49〜52から選択される配列を含む反復及びAWGを含む又はそれからなるPAMと共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログである、Cas;又は
(b)配列番号56、64、70及び72から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含む、又は配列番号53を含む反復と共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログである、Cas;又は
(c)配列番号62から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含む、又はNNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はそれからなるPAMと共に作動可能な、そのオルソログ又はホモログである、Casを含む、いずれかの先行する条項のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
44.システムが、
(a)配列番号49〜52から選択される配列(又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一である配列)を含む反復及びAWGを含む又はそれからなるPAM;
(b)配列番号53(又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%同一である配列)を含む反復;又は
(c)NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はそれからなるPAMを含む、いずれかの先行する条項のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
45.システムが抑制Casを含み、Casが、
(a)AWGを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、Casヌクレアーゼは、配列番号58、60、66及び68から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含む);又は
(b)NNAGAAW、NGGNG又はAWを含む又はそれからなるPAM(任意選択で、Casヌクレアーゼは、配列番号62から選択されるアミノ酸配列又は選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含む)と共に作動可能である、いずれかの先行する条項のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
46.抑制因子が、
(i)配列番号17、19、21、23、25及び27から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列;又は
(ii)配列番号29、31、33及び35から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する条項のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
47.脱抑制因子が、
(i)配列番号3、5、7、9、11、13及び15から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列;又は
(ii)配列番号37、39及び41から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列;又は
(iii)配列番号43、45及び47から選択されるアミノ酸配列又は前記選択される配列と少なくとも70、75、80、85、90、95、96、97、98又は99%(例えば、少なくとも80%)同一であるアミノ酸配列を含む、いずれかの先行する条項のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
48.各ベクターが、Casコードヌクレオチド配列又はシステムの抑制Casをコードするヌクレオチド配列を欠く、いずれかの先行する条項のベクター、バクテリオファージ、ファージミド、医薬又は方法。
【０１７３】
同じベクターに脱抑制因子コード配列及びcrRNA又はgRNAコード配列を提供することは、宿主細胞ゲノムのCas媒介性改変を生じさせるこれらの手段が、同時に細胞に導入されるのを保証するために有用である。それ故、これにより、脱抑制が作用する全ての細胞も、Cas媒介性改変の手段と共に供給されることが保証される。別々のベクターが様々な成分の代わりに使用される場合に、これが保証及び制御するのはより困難であろう;いくつかの細胞は脱抑制因子を受け取るが、crRNA/gRNAを受け取らない可能性があり、逆もまた同様である。本発明は、成分が一緒に送達されるのを保証することによって、ゲノムでコードされるcrRNA/gRNAコード配列前改変が可能ではない野生型宿主細胞を扱うのに有用である;そのような細胞は、例えば、ヒト、動物又は天然環境(例えば、土壌又は水路又は水源)のマイクロバイオームによって含まれうる。脱抑制因子コード配列及びcrRNA又はgRNAコード配列が同じベクターによって含まれる本発明の態様は、それ故に、ヒト又は動物で実践される医療の有用な方法である。更に、これらの態様は、標的宿主細胞への配列の同時伝播(co-transfer)に関する潜在性が、各配列のより予想可能な投薬を可能とするので、故に、例えば、マイクロバイオームによって含まれる、レシピエント宿主細胞に対する組成物の医学的な又は他の使用にとって信頼性が高い投薬を許容する。更に、脱抑制因子コード配列及びcrRNA又はgRNAコード配列が同じベクターによって含まれる態様は、例えば、共通プロモーターによって又はベクターを設計することによって配列の発現の同時制御を許容し、これらの配列を同じオペロンによって含ませる。例えば、誘導性プロモーターは、本発明のベクターが宿主細胞に導入されており、誘発剤の供給(例えば、ベクターが投与されている又は投与されるヒト又は動物に対する投与)が脱抑制因子及びcrRNA/gRNAの同時発現に関するプロモーターのスイッチを入れる際に使用されるであろう。
【０１７４】
他の実施形態では、構成的なプロモーターの使用は、これが宿主細胞における脱抑制因子及びcrRNA/gRNAの発現を保証するので、有利であり、これが次に、内因性に産生されるcrRNA又はgRNAによってガイドされるというよりむしろ、脱抑制Casが本発明のcrRNA又はgRNAによってガイドされる(標的プロトスペーサーを切断する又はその他の点で改変する)機会を増加させる。医学的な使用に関して、例えば、ベクターがヒト又は動物対象(例えば、その腸マイクロバイオーム)に投与される場合、それが構成的な発現を保証し、投薬を制御し、誘導因子が標的細胞に到達するとの見込みのもとに、マイクロバイオームにおける脱抑制因子及びcrRNA/gRNAの有効なレベルの有効な誘導及び産生のために有効な用量で、誘導因子(代わりに誘導性プロモーターが使用される)を投与することによって活性のスイッチを入れることに頼ることを試すよりむしろ、体内のそれらの標的にベクターが到達する機会を最大化するのに有用でありうる。同様に、強力なプロモーターは、脱抑制の機会を増加させることに及び本発明のcrRNA/gRNAの望ましい発現が高い(及びおそらく内因性にコードされるcrRNA又はgRNAのバックグラウンドレベルを生産量で凌ぐ)状態にある機会も増加させることに有用である。それ故、強力なプロモーターの使用は、標的プロトスペーサーの切断(又は他の改変)が宿主細胞において起こる機会を増加させる。
【０１７５】
本明細書に記載された特定の実施形態は例示として示されており、本発明の限定として示されていないことが理解される。本発明の主たる特徴は、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な実施形態に採用することができる。当業者は、ルーチンの研究だけを使用して、本明細書において記載される特定の手順に対する多数の均等物を認識する又は確認することが可能である。そのような均等物は、本発明の範囲内であると考えられ、特許請求の範囲によって網羅される。本明細書中で言及されている全ての刊行物及び特許出願は、本発明が関係する当業者の技術レベルを示している。全ての刊行物及び特許出願並びに全ての同等の米国特許出願及び特許は、あたかも各々個々の刊行物又は特許出願が参照により組み込まれることが、具体的且つ個別に示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。特許請求の範囲及び/又は本明細書において、「を含むこと」という用語と共に使用されるときの、「ある(a)」又は「ある(an)」という語の使用は、「1つの」を意味しうるが、また、「1つ又は複数の」、「少なくとも1つの」、及び「1つ又は1つを超える」という意味とも合致する。特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は、代替物だけ、又は代替物が相互に排他的であることを指すことが明示的に指し示されない限りにおいて、「及び/又は」を意味するように使用されるが、本開示は、代替物だけ、及び「及び/又は」を指す定義を支持する。本出願を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するのに採用されるデバイス、方法についての誤差の固有の変動、又は研究対象間に存在する変動を含むことを指し示すように使用される。
【０１７６】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される「含むこと(comprising)」(並びに、「含む(comprise)」及び「含む(comprises)」等、「含むこと(comprising)」の任意の形態)、「有すること(having)」(並びに、「有する(have)」及び「有する(has)」等、「有すること(having)」の任意の形態)、「含むこと(including)」(並びに、「含む(includes)」及び「含む(include)」等、「含むこと(including)」の任意の形態)、又は「含有すること(containing)」(並びに、「含有する(contains)」及び「含有する(contain)」等、「含有すること(containing)」の任意の形態)という語は、包含的又はオープンエンドなものであり、列挙されていない、更なる要素又は方法の工程を除外するものではない。
【０１７７】
本明細書において使用される「又はその組合せ」という用語又は同様の用語は、用語に先行して列挙された項目についての、全ての順列及び組合せを指す。例えば、「A、B、C、又はその組合せ」は、A、B、C、AB、AC、BC、又はABCのうちの少なくとも1つを含むことを意図し、特定の文脈において、順序が重要である場合は、BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC、又はCABのうちの少なくとも1つを含むことも意図する。この例を続けると、BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等、1つ又は複数の項目又は用語の繰り返しを含む組合せが明示的に含まれる。当業者は、文脈から他に明らかでない限り、典型的には任意の組合せにおける項目又は用語の数に制限がないことを理解する。
【０１７８】
文脈から他に明らかでない限り、本開示の任意の部分は、本開示の任意の他の部分と組み合わせて読むことができる。
【０１７９】
本明細書において開示され、特許請求される組成物及び/又は方法の全ては、本開示に照らして、不要な実験を伴わずに作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法を、好ましい実施形態の観点から記載してきたが、当業者には、本発明の概念、精神、及び範囲から逸脱しない限りにおいて、本明細書において記載される組成物及び/若しくは方法、並びに方法の工程又は工程の順番に、変動を適用しうることが明らかである。当業者に明らかなこれらの類似の代用及び改変は全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲及び概念の範囲内にあるとみなされる。
【０１８０】
本発明は、以下の非限定的な実施例において、より詳細に記載される。
【実施例】
【０１８１】
(実施例1):医学的使用
本発明の適用により、ヒト又は動物における宿主細胞細菌感染を治療する、予防する又は減少させる(例えば、その拡散又は拡大を減少させる)ための、本明細書に記載される複数のベクター、医薬及び方法が提供される。
【０１８２】
第一の例では、本発明の(HM)-アレイ及びLeuO-コードヌクレオチド配列を改変する宿主細胞は、クラスI、II又はIIIスタフィロコッカスパッケージ化ファージ(カウドウイルス目(Caudovirales)又はミオウイルス科(Myoviridae)ファージ)の集団に含まれる。ファージ集団は、メチシリン又はバンコマイシンと併用して又は併用せずにMRSA感染患者に投与される。1つの試験では、ファージHM-アレイは、(i)内在性スタフィロコッカス・アウレウスCRISPRアレイのリーダープロモーターの3'の20ヌクレオチドの領域及び(ii)宿主細胞におけるメチシリン耐性遺伝子を標的とする。バンコマイシンが投与されるとき、常用量より低用量が患者に投与される。宿主細胞感染がノックダウンされ、ファージ医療に対する耐性が確立されない又は通常より低い割合又は重度で確立されると予想される。他の試験では、これらの試験におけるファージも必須スタフィロコッカス・アウレウス遺伝子ftsZを標的とする以外、設計は同一である(Liangら、Int J Infect Dis. 2015 Jan;30:1〜6. doi: 10.1016/j.ijid.2014.09.015. Epub 2014 Nov 5、「Inhibiting the growth of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in vitro with antisense peptide nucleic acid conjugates targeting the ftsZ gene」)。LeuOは、宿主ブドウ球菌細胞において発現され、宿主細胞においてH-NS抑制Casを脱抑制する。ファージベクターは任意のCasコード配列を欠いているが、代わりにHM-アレイから発現されるcrRNAが宿主ゲノムによってコードされる内因性Casと共に操作する。
【０１８３】
更なる試験は、ファージKエンドリシンをメチシリンに加えて又はその代わりに投与した以外、上記の試験を反復する。
【０１８４】
(実施例2):異なる微生物相種の混合共同体における選択的細菌集団増殖阻害
本発明者らは、三種の混合集団における特定の細菌種の選択的増殖阻害を実証した。本発明者らは、ヒト及び動物の腸内微生物相に見出される種を選択した(S.サーモフィルスDSM20617(T)、ラクトバチルス・ラクティス及び大腸菌)。本発明者らは、2つのグラム陽性種(S.サーモフィルス及びL.ラクティス)を含めて、これが前者の種の選択的に死滅させる能力に影響するかどうかを確認し;更に困難性を増加させるために(及び微生物相における状況をより綿密にシミュレートするために)、L.ラクティスを選択した、その理由は、これが、(二種の間の高い16sリボソームRNA配列同一性によって示されるとおり)S.サーモフィルスに系統学的に関連する種であるからである。S.サーモフィルス及びL.ラクティスは、両方ともファーミキューテス門細菌である。更に、微生物相をシミュレートするために、ヒト片利共生腸内種(大腸菌)を含めた。
【０１８５】
1.材料及び方法
US20160333348の実施例6に示す方法を株に使用した(選択培地が2.5gl-1の2-フェニルエタノール(PEA)を補充したTH培地であった以外)。
【０１８６】
1.1  エレクトロコンピテントL.ラクティス細胞の調製
0.5Mショ糖及び1%グリシンを補充したTH培地中のL.ラクティスの一晩培養した培養物を、5mlの同じ培地中で100倍希釈し、0.2〜0.7の間のOD600まで30℃で増殖させた(播種後約2時間)。細胞を、7000×g、4℃、5分間で回収し、5mlの氷冷洗浄バッファー(0.5Mショ糖+10%グリセロール)で三回洗浄した。細胞を洗浄後、それらをエレクトロポレーションバッファー(0.5Mショ糖、10%グリセロール及び1mM MgCl2)にOD600が15〜30になるように懸濁した。エレクトロポレーションバッファー中の細胞は、使用するまで、4℃で保存された(1時間以内)、又は、エッペンドルフチューブに50μlずつ分注し、それらを液体窒素中で凍結し、後で使用するために-80℃で保管した。
【０１８７】
全種のエレクトロポレーション条件は、US20160333348の実施例6に記載のとおりであった。
【０１８８】
1.2 CRISPRアレイの活性化:共同体実験
S.サーモフィルスDSM20617、L.ラクティスMG1363及び大腸菌TOP10を、S.サーモフィルスのDNAポリメラーゼIII及びtetAをターゲッティングするCRISPRアレイを含有するプラスミドで遺伝的に形質転換した。形質転換後、全ての細胞を単独で、及び、共培養で、37℃で3時間増殖させ、プラスミド中にコードされた抗生物質耐性を発生させるための回復を許容した。本発明者らは、CRISPRでコードされた増殖阻害のリードアウトとして形質転換効率を使用すると決定した。したがって、細胞を回復させた後に、培養物をTH培地にプレーティングし、TH培地にPEAを補充し、MacConkey寒天には全てカナマイシンを補充し、1%キシロースで誘導した。
【０１８９】
2.結果
2.0 L.ラクティス、大腸菌及びS.サーモフィルスの間の系統発生的距離
S.サーモフィルス及びL.ラクティスの16S rrNAコード化DNA配列における計算された配列類似性を、83.3%と決定した。次の16S配列を使用した:大腸菌:AB030918.1、S.サーモフィルス:AY188354.1、L.ラクティス:AB030918。配列を次のパラメータを用いてneedle(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)でアラインした:-gapopen 10.0 -gapextend 0.5  -endopen 10.0 -endextend 0.5 -aformat3 pair -snucleotide1 -snucleotide2。US20160333348の図11は、S.サーモフィルス、L.ラクティス及び大腸菌からの16S配列の最尤推定系統樹(maximum-likelihood phylogenetic tree)を示す。
【０１９０】
2.1  増殖条件及び選択培地
S.サーモフィルス及びL.ラクティスは、一般的に多くの発酵食品やヨーグルトに一緒に使用されている。これらが宿主と密接な関係を形成する腸内微生物であることが一般的に知られていること並びにS.サーモフィルス及びL.ラクティスの16SリボソームRNA領域の以前の特徴付けで、これらの生物が系統学的に密接に関連していることを示したこと(Ludwigら、1995)から、本発明者らは、これらの株を選択した。並行して、本発明者らはまた、大腸菌が腸微生物共同体で一般に見られるため、本発明者らの混合集団共培養実験においてこの生物の増殖も評価した。最初に、本発明者らは、本発明者らが共培養実験に使用することを計画した全ての株の増殖を支持する、細菌株及び培養プロトコールを確立することに着手した。本発明者らは、全ての株が37℃でのTHブロス中での増殖を支持することができることを見出した(US20160333348の図3)。
【０１９１】
混合培養から異なる細菌を識別することは、異なる種の細胞数を決定するために重要である。MacConkey寒天で大腸菌を選択的に増殖させることが可能であるが、S.サーモフィルスの選択的増殖のための特定の培地は存在しない。PEA寒天は、グラム陰性菌(大腸菌)からグラム陽性菌(S.サーモフィルス)を単離するために使用される選択培地である。更に、異なる濃度のPEAが異なるグラム陽性菌種及び株の増殖を部分的に阻害し、これにより本研究で使用した他のグラム陽性細菌の間の選択が許容される。2.5gl-1のPEAの使用は、L.ラクティス及び大腸菌の増殖を制限しながら、S.サーモフィルスを選択的に増殖させることが証明された。
【０１９２】
全ての株を、カナマイシン選択マーカーを有するpBAV1KT5のベクター主鎖を使用したプラスミドで形質転換した;本発明者らは、プラスミドを維持しながら細胞を増殖させるのに、30μg ml-1のカナマイシンを補充した培地を用いることが十分であることを見出した。
【０１９３】
2.3  混合集団における形質転換及び選択的増殖阻害
本発明者らは、S.サーモフィルス、L.ラクティス及び大腸菌をCRISPRアレイを含むプラスミドで形質転換し、当量部で合わせた全細菌種の共同体でこれらを培養し、これは本発明者らがS.サーモフィルスに特異的に細胞死を引き起こすことができたかを決定することを許容した。本発明者らは、全種をpBAV1KT5-XylR-CRISPR-PXylA又はpBAV1KT5-XylR-CRISPR-Pldha+XylAプラスミドのいずれかで形質転換した。
【０１９４】
US20160333348の図12は、pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA又はpBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylAプラスミドのいずれかを担持する大腸菌、L.ラクティス及びS.サーモフィルスの共培養における選択的ストレプトコッカス・サーモフィルス増殖阻害を示す。pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA又はpBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylAプラスミドを担持する大腸菌の間に増殖の差は観察されなかった(中央カラム)。しかしながら、S.サーモフィルス(2.5gl-1 PEAを補充したTH寒天上で選択的に増殖、最後のカラム)は、本発明者らの予想どおり、pBAV1KT5-XylR-CRISPR-PxylA(強)又はpBAV1KT5-XylR-CRISPR-PldhA+XylA(弱)プラスミドの間の形質転換効率の減少を示す。したがって、本発明者らは、細胞の混合集団における標的とするS.サーモフィルス亜集団の選択的な増殖阻害を実証した。
【０１９５】
脱抑制された内因性Casを利用することによる混合共同体における大腸菌のターゲティング
本発明のこの例の例示的な適用は、少なくとも3つの異なる細菌種を含む混合細菌集団によって含まれる大腸菌細胞のターゲティングであり、これは本発明の1つ又は複数のベクターの、大腸菌細胞(例えば、大腸菌O157 H7 EDL933(EHEC)細胞)への導入によるものであり、これは、抑制Cas3及び/又はCascade(又はそのCasA)(ここで、H-NSが、Cas及び/又はCascadeを抑制する)を含む。ベクターは、(a)細胞におけるCascade又はCasを脱抑制可能である脱抑制因子(例えば、LeuO)をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び(b)各crRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Cas又はCascadeのCasをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する;細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含む。成分(b)は、脱抑制Cas又はCascadeと共に作動可能であるCRISPR反復配列を含み、例えば、反復配列は、配列番号49〜52から選択される配列を含む又はそれからなる。一例では、脱抑制Casは、配列番号58又は60のアミノ酸配列を含むCas3である。一例では、脱抑制Casは、配列番号66又は68のアミノ酸配列を含むCasAである。任意選択で、標的ヌクレオチド配列又はプロトスペーサーは、宿主細胞のゲノム中のPAMの直ぐ3'に少なくとも5、6、7、8、9又は10連続ヌクレオチドの配列を含み、PAMはAWG、AAG、AGG、GAG及びATGから選択される。
【０１９６】
脱抑制された内因性Casを利用することによる混合共同体におけるS.エンテリカのターゲティング
本発明のこの例の例示的な適用は、少なくとも3つの異なる細菌種を含む混合細菌集団によって含まれるS.エンテリカ細胞のターゲティングであり、これは本発明の1つ又は複数のベクターの、S.エンテリカ細胞(例えば、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィムリウム細胞、例えば、サルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィムリウムLT2細胞又はサルモネラ・エンテリカ亜種エンテリカ血液型亜型チフィムリウムパラチフィA細胞)への導入によるものであり、これは、抑制Cas3及び/又はCascade (又はそのCasA)(ここで、H-NSが、Cas及び/又はCascadeを抑制する)を含む。ベクターは、(a)細胞におけるCascade又はCasを脱抑制可能である脱抑制因子(例えば、LeuO)をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び(b)各crRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Cas又はCascadeのCasをガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する;細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含む。成分(b)は、脱抑制Cas又はCascadeと共に作動可能であるCRISPR反復配列を含み、例えば、反復配列は、配列番号53を含む又はそれからなる。一例では、脱抑制Casは、配列番号56又は64のアミノ酸配列を含むCas3である。一例では、脱抑制Casは、配列番号70又は72のアミノ酸配列を含むCasAである。任意選択で、標的ヌクレオチド配列又はプロトスペーサーは、宿主細胞のゲノム中のPAMの直ぐ3'に少なくとも5、6、7、8、9又は10連続ヌクレオチドの配列を含み、PAMはCas3と共に作動可能である。
【０１９７】
(実施例3):混合細菌共同体における種及び株の選択的増殖阻害のためのベクターコードシステム
本発明者らは、実施例2において、驚くべきことに、異なる種の混合共同体における選択的集団増殖阻害のために宿主細菌における内因性Casヌクレアーゼ活性を利用する可能性を確立した。本発明者らは、次に、異なる種の混合共同体における選択的集団増殖阻害のために、代わりにベクターにコードされたCas活性を使用する可能性を探った。本発明者らは、3つの異なる種の混合集団における特定の細菌種及び、更に標的細菌に対して代替的な株を含んだ選択的増殖阻害を実証した。本発明者らは、驚くべきことに、所定の標的種のうちの標的株のみの選択的増殖阻害を示すことができた。更に、代替的な株は、ベクターにコードされたCRISPR/Casシステムによって標的とされず、ヒト又は動物の腸内微生物相要素を模倣した混合細菌共同体における、このようなベクター媒介性システムの細かな特異性を確立するのに望ましかった。
【０１９８】
本発明者らは、ヒト及び動物の腸内微生物相で見出された種を選択した(枯草菌、ラクトバチルス・ラクティス及び大腸菌)。本発明者らは、ヒト片利共生腸内種である大腸菌の2つの株を含めた。本発明者らは、密接に関連した株ではあるが、一方の株では標的の死滅に使用できるが、他方の株では標的の死滅に使用できない配列の差異を有する株を、区別できるかどうかを確認することは興味深いと考えた。これは、微生物相中の大腸菌のいくつかの株が望ましく、一方で他の株は望ましくない(例えば、ヒト又は動物に対して病原性である)、故に、その株をノックダウンするCas改変の標的となり得るため、興味深かった。
【０１９９】
1. 材料及び方法
1.1. プラスミド及び株
全ての株を、他に示されない限り、好気的条件下でTodd-Hewittブロス(TH)(T1438 Sigma-Aldrich社)中、37℃で培養した。株を、25%グリセロール中、-80℃で保管した。
自己標的化sgRNA-Cas9複合体は、それぞれテオフィリンリボスイッチ及びAraC/PBAD発現システムによって厳密に調節された。大腸菌内で安定に保持されるために、Cas9の厳密な調節が望ましい。プラスミドは、大腸菌のK-12株をターゲッティングするシングルガイドRNA(sgRNA)と共に、ストレプトコッカス・ピオゲネスからの外因性Cas9を含有していた。したがって、K-12由来株TOP10は、システムが活性化されたときに二本鎖自己切断及びその結果としての死を受けやすかった。Nissle等の大腸菌株は、同じ標的配列を有していない、それ故に、それらはsgRNA-Cas9活性の影響を受けなかった。使用された配列を示す、USSN15/478,912(2017年4月4日出願、本明細書中に参照によって組み込まれる)中の表9〜11を参照されたい。本発明者らは、標的細胞に保存され、複数コピー(7コピー)で存在する標的配列(リボソームRNAコード配列)を選択し、これにより、宿主細胞ゲノムを複数の場所で切断する機会が増加し、シングルgRNAデザインを用いた死滅が促進された。
図1は、spCas9の発現及びリボソームRNAサブユニット16sをターゲッティングする自己ターゲッティングsgRNAを制御する調節因子を示す。
【０２００】
1.2. 鑑別増殖培地
全ての株を、37℃で20時間、TH培地で増殖させた。枯草菌のための選択培地は、2.5gl-1の2-フェニルエタノール(PEA)を補充したTH培地であった。PEAを培地に添加し、121℃で15分間、15psiでオートクレーブ処理した。寒天プレートを、1.5%(wt/vol)寒天を対応する培地に添加することにより調製した。
【０２０１】
1.3. クローニング
大腸菌(One Shot(登録商標)ThermoFisher社 TOP10 Chemically Competent細胞)を、全サブクローニング手順に使用した。PCRを、Phusion(商標)ポリメラーゼを使用して実施した。製造元のプロトコールに従って、全てのPCR産物を、Macherey-Nagel(商標)のNucleospin(商標)Gel及びPCR Clean-upで精製した。精製した断片を、総量34μl中に1μlの酵素を有する1×FD緩衝液において、制限酵素DpnIで分解した。製造元のプロトコールに従って、分解反応物を、再び、Macherey-NagelのNucleospin Gel及びPCR Clean-upで精製した。製造元(New England Biolab)のプロトコールに従って、10μlの反応液中で、Gibsonアセンブリを行った。
製造元の説明書に従い、Qiagenキットを使用してプラスミドDNAを調製した。グラム陽性株に対する改変は、細胞溶解を促進するために0.5%グリシン及びリゾチームを補充した培地中で細菌を増殖させることを含んだ。
【０２０２】
1.4. 形質転換
1.4.1 エレクトロコンピテント大腸菌細胞及び形質転換
市販のエレクトロコンピテント細胞を、クローニング及び実験に使用した(One Shot(登録商標)Thermo Fisher社 TOP10エレクトロコンピテント大腸菌)。エレクトロポレーションを、標準設定を使用して実施した: Electro Cell Manipulator(BTX社 Harvard Apparatus ECM630)を使用する1800V、25μF及び200Ω。パルスの後、1mlのLB-SOC培地を添加し、細胞を37℃で1時間インキュベートした。形質転換細胞を、対応する抗生物質を含有する、LB寒天にプレーティングした。
【０２０３】
1.5. 大腸菌及び共同体実験におけるsgRNA-Cas9の活性化
K-12由来株及び他の細菌のリボソームRNAコード配列をターゲッティングするsgRNAを含有するプラスミドを有する大腸菌TOP10及びNissleを、3mlのTHブロス中で一晩増殖させた。翌日、細胞をOD約0.5まで希釈し、次にTH培地中で10倍段階希釈し、96ウェルレプリケーター(Mettler Toledo Liquidator(商標)96)を使用して4μLの体積の液滴を、TH寒天、誘導因子(1%アラビノース及び2mMテオフィリン)を補充したTH寒天、2.5gl-1のPEAを補充したTH寒天、及び1%マルトースを補充したMacConkey寒天にスポットした。プレートを、37℃で20時間インキュベートして、コロニー形成率(CFU)を3回測定から計算した。
【０２０４】
2. 結果
2.1 外因性のCRISPR-Cas9システムを用いた大腸菌株の特異的ターゲッティング
本発明者らは、大腸菌TOP10及びNissleの両方に死滅システムを導入することにより、該システムが2つの大腸菌株を区別できるかどうかを最初に試験した。
【０２０５】
2.1 混合培養における外因性CRISPR-Cas9システムを用いた大腸菌のターゲティング
一晩培養した培養物の段階希釈を、両方の大腸菌株、枯草菌、L.ラクティスについて二回、混合培養について三回行った。全ての株を、誘導因子の有無で、選択プレートにおいて、37℃で20時間増殖させた。システムの誘導は、他の細菌は無傷のまま、sgRNA-Cas9のK-12由来株のターゲッティングを活性化する。
混合培養から異なる細菌を区別することは、異なる種の細胞数を決定し、種の特異的除去を決定するために重要である。MacConkey寒天は大腸菌を選択的に増殖させ、PEA寒天はグラム陰性菌(大腸菌)からグラム陽性菌(枯草菌)を単離するために使用される選択培地である。更に、本発明者らは、異なる濃度のPEAが他のグラム陽性菌の増殖を部分的に阻害することを見出した。2.5gl-1のPEAは、大腸菌及びL.ラクティスの増殖を制限しながら、枯草菌を選択的に増殖させることが証明された。
図2は、誘導性の、外因性の、ベクター媒介性のCRISPR-Casシステムによる大腸菌株の特異的ターゲッティングを示す。sgRNAはK-12由来の大腸菌株、大腸菌TOP10のゲノムを標的とし、一方試験した他の大腸菌株は影響を受けなかった。
図3は、CRISPR-Cas9システムの誘導なしのTH寒天中の本研究で用いた個々の細菌種及び混合培養の段階希釈でのスポットアッセイを示す。
図4は、異なる選択培地における103倍希釈のスポットアッセイを示す。2.5gl-1のPEAを有するTHは、枯草菌単独のための選択的培地である。マルトースを補充したMacConkeyは、グラム陰性菌と腸内桿菌を選択的に単離し、それらをマルトース発酵に基づいて区別するように設計された、細菌用の選択的且つ鑑別的な培養培地である。したがって、TOP10ΔmalK変異体は、プレート上に白いコロニーを形成し、一方Nissleは、ピンクのコロニーを形成する;Aは大腸菌ΔmalK、Bは大腸菌Nissile、Cは枯草菌、DはL.ラクティス、Eは混合培養である;MacConkeyが-のBとEの画像はピンクに見える;MacConkeyが+のBとEの画像はピンクに見える。図5は、異なる培地及び選択プレート上の、本研究で使用される細菌の選択的成長を示す。本発明者らには、明らかに、混合集団において標的大腸菌株(図5のx軸上の「大腸菌」)を選択的に死滅させ、一方、他の関連株(「大腸菌-Nissle」)は同様には死滅しないことがわかった。混合集団における標的株の死滅は、本実験において1000倍であった。
【０２０６】
脱抑制された外因性Casを利用することによる混合共同体における大腸菌のターゲティング
本発明のこの例の例示的な適用は、少なくとも3つの異なる細菌種を含む混合細菌集団によって含まれる大腸菌細胞のターゲティングであり、これは本発明の1つ又は複数のベクターの、大腸菌細胞(例えば、大腸菌O157 H7 EDL933(EHEC)細胞)への導入によるものであり、これは、抑制Cas9、例えば、spCas9又はstCas9(ここで、H-NSが、Casを抑制する)を含む。Cas9は、宿主細胞に(例えば、抑制因子コード配列として同じ又は異なるベクターにおいて)導入される、ベクターによって含まれるヌクレオチド配列によりコードされる。ベクターは、(a)細胞におけるCas9を脱抑制可能である脱抑制因子(例えば、LeuO)をコードするヌクレオチド配列であって、細胞において発現可能であり、脱抑制因子を産生するヌクレオチド配列;及び(b)各crRNA又はgRNAが、脱抑制因子の存在下で、Cas9をガイド可能であり、宿主細胞ゲノムのそれぞれのプロトスペーサー配列を改変する又は宿主によって含まれるエピソームのプロトスペーサー配列を改変する;細胞における1つ又は複数のcrRNAの産生のためのCRISPRアレイ;及び/又は細胞におけるそれぞれのガイドRNA(gRNA、例えば、単一ガイドRNA)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を含む宿主細胞に導入される。成分(b)は、脱抑制Cas9(例えば、Cas9はS.ピオゲネスCas9である)と共に作動可能であるCRISPR反復配列を含む。任意選択で、標的ヌクレオチド配列又はプロトスペーサーは、宿主細胞のゲノム中のPAMの直ぐ5'に少なくとも5、6、7、8、9又は10連続ヌクレオチドの配列を含み、PAMはNGGである。
【０２０７】
[参照文献]
[1] Zhang、X. Z.、及びZhang、Y. H. P. (2011). Simple、fast and high-efficiency transformation system for directed evolution of cellulase in Bacillus subtilis. Microbial Biotechnology、4(1)、98〜105. http://doi.org/10.1111/j.1751-7915.2010.00230.x
[2] Wegmann、U.、O'Connell-Motherway、M.、Zomer、A.、Buist、G.、Shearman、C.、Canchaya、C.、... Kok、J. (2007). Complete genome sequence of the prototype lactic acid bacterium Lactococcus lactis subsp. cremoris MG1363. Journal of Bacteriology、189(8)、3256〜70. http://doi.org/10.1128/JB.01768-06.
【０２０８】
配列表
【０２０９】
【表１Ａ】
2020528762.tif 000002
【０２１０】
【表１Ｂ】
2020528762.tif 000003
【０２１１】
【表１Ｃ】
2020528762.tif 000004
【０２１２】
【表１Ｄ】
2020528762.tif 000005
【０２１３】
【表１Ｅ】
2020528762.tif 000006
【０２１４】
【表１Ｆ】
2020528762.tif 000007
【０２１５】
【表１Ｇ】
2020528762.tif 000008
【０２１６】
【表１Ｈ】
2020528762.tif 000009
【０２１７】
【表１Ｉ】
2020528762.tif 000010
【０２１８】
【表１Ｊ】
2020528762.tif 000011
【０２１９】
【表１Ｋ】
2020528762.tif 000012
【０２２０】
【表１Ｌ】
2020528762.tif 000013
【０２２１】
【表１Ｍ】
2020528762.tif 000014
【０２２２】
【表１Ｎ】
2020528762.tif 000015
【０２２３】
【表１Ｏ】
2020528762.tif 000016
【０２２４】
【表１Ｐ】
2020528762.tif 000017
【０２２５】
【表１Ｑ】
2020528762.tif 000018
【０２２６】
【表１Ｒ】
2020528762.tif 000019
【０２２７】
【表２】
2020528762.tif 000020
【０２２８】
【表３】
2020528762.tif 000021
【０２２９】
【表４Ａ】
2020528762.tif 000022
【０２３０】
【表４Ｂ】
2020528762.tif 000023
【０２３１】
【表４Ｃ】
2020528762.tif 000024
【０２３２】
【表４Ｄ】
2020528762.tif 000025
【０２３３】
【表４Ｅ】
2020528762.tif 000026
【０２３４】
【表４Ｆ】
2020528762.tif 000027
【０２３５】
【表４Ｇ】
2020528762.tif 000028
【０２３６】
【表４Ｈ】
2020528762.tif 000029
【０２３７】
【表４Ｉ】
2020528762.tif 000030
【０２３８】
【表４Ｊ】
2020528762.tif 000031
【０２３９】
【表４Ｋ】
2020528762.tif 000032
【０２４０】
【表４Ｌ】
2020528762.tif 000033
【０２４１】
【表４Ｍ】
2020528762.tif 000034
【０２４２】
【表４Ｎ】
2020528762.tif 000035
【０２４３】
【表４Ｏ】
2020528762.tif 000036
【０２４４】
【表４Ｐ】
2020528762.tif 000037
【０２４５】
【表４Ｑ】
2020528762.tif 000038
【０２４６】
【表４Ｒ】
2020528762.tif 000039
【０２４７】
【表４Ｓ】
2020528762.tif 000040
【０２４８】
【表４Ｔ】
2020528762.tif 000041
【０２４９】
【表４Ｕ】
2020528762.tif 000042
【０２５０】
【表４Ｖ】
2020528762.tif 000043
【０２５１】
【表４Ｗ】
2020528762.tif 000044
【図１】
2020528762.tif 000045
【図２】
2020528762.tif 000046
【図３】
2020528762.tif 000047
【図４】
2020528762.tif 000048
【図５】
2020528762.tif 000049
【配列表】
2020528762000001.app
【国際調査報告】
2020528762.tif 000050
2020528762.tif 000051
2020528762.tif 000052
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