(57)【要約】【課題】新規水溶性一分枝状および二分枝状錯化剤並びに対応するランタニド錯体の提供。【解決手段】本発明は、式（Ｉ）で表される錯化剤に関する。本発明はまた、上記錯化剤から得られるランタニド錯体にも関する。応用：生体分子の標識。［化１］2020523411.tif 000040（式中、Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２およびＣｈｒｏｍ３は、本明細書に定義される通りである。）【選択図】なし
2020523411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式（Ｉ）で表される錯化剤。
【化１】
2020523411.tif 000034
（式中、
Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２およびＣｈｒｏｍ３は、互いに独立して下記式の基を表すが、
【化２】
2020523411.tif 000035
ただし、式（Ｉ）の化合物は、（ｉ）（Ｉａ）基および（Ｉｂ）基から選択される１または２個の基と、（ｉｉ）少なくとも１個のＬ１−ＣＯ−Ｒ基とを含むものとし、
Ｒは、−ＯＲ２または−ＮＨ−Ｅ基であり、
Ｒ１は、−ＣＯ２Ｈまたは−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｒ３基であり、
Ｒ２は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ３は、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、好ましくはメチル；−ＳＯ３−基によって好ましくはメタ位もしくはパラ位が置換されていてもよいフェニル；またはベンジルであり、
Ｌ１は、直接結合；酸素原子、窒素原子および硫黄原子から選択される少なくとも１個の原子で中断されていてもよい−（ＣＨ２）ｒ−基；−ＣＨ＝ＣＨ−基；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−基；−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−基；またはＰＥＧ基であり、
Ｌ２は、二価の連結基であり、
Ｇは、反応性基であり、
Ｅは、−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｓ−ＣＨ２−ＳＯ３−もしくは−（ＣＨ２）ｓ−Ｎ＋Ａｌｋ１Ａｌｋ２Ａｌｋ３基、またはスルホベタインであり、
ｒは、１〜６の整数、好ましくは１〜３の整数であり、
ｓは、０、１または２であり、
Ａｌｋ１、Ａｌｋ２、Ａｌｋ３は同一でも異なってもよく、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを表す。）
【請求項２】
Ｃｈｒｏｍ１が、式（Ｉａ）の基であり、Ｃｈｒｏｍ２およびＣｈｒｏｍ３がそれぞれ、同一または異なる式（Ｉｃ）の基である、請求項１に記載の錯化剤。
【請求項３】
Ｃｈｒｏｍ２およびＣｈｒｏｍ３が同一である、請求項２に記載の錯化剤。
【請求項４】
Ｃｈｒｏｍ１およびＣｈｒｏｍ２がそれぞれ、同一または異なる式（Ｉｂ）の基であり、Ｃｈｒｏｍ３が、式（Ｉｄ）の基である、請求項１に記載の錯化剤。
【請求項５】
Ｃｈｒｏｍ１およびＣｈｒｏｍ２が同一である、請求項４に記載の錯化剤。
【請求項６】
Ｒ１が、−ＣＯ２Ｈまたは−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｒ３基（式中、Ｒ３は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたはフェニル）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の錯化剤。
【請求項７】
Ｌ１が、直接結合；酸素原子および硫黄原子から選択される少なくとも１個の原子で中断されていてもよい−（ＣＨ２）ｒ−基（式中、ｒ＝２または３）；−ＣＨ＝ＣＨ−基；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−基；または−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−基である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の錯化剤。
【請求項８】
Ｅが、−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｓ−ＣＨ２−ＳＯ３−基（式中、ｓ＝０または１）；−（ＣＨ２）ｓ−Ｎ＋Ａｌｋ１Ａｌｋ２Ａｌｋ３（式中、Ａｌｋ１、Ａｌｋ２、Ａｌｋ３は、同一または異なって（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルを表し、ｓ＝０または１）；または下記式の基：
【化３】
2020523411.tif 000036
（式中、Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、ｔは、１または２である。）
である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の錯化剤。
【請求項９】
反応性基Ｇが、アクリルアミド、活性化アミン、活性化エステル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、アニリン、アジド、アジリジン、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、イミドエステル、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ハロゲン化スルホニル、チオール、ケトン、アミン、酸ハロゲン化物、スクシンイミジルエステル、ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、アジドニトロフェニル、アジドフェニル、３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド、グリオキサール、トリアジン、アセチレン基、特に下記式の基から選択される基：
【化４】
2020523411.tif 000037
（式中、ｗは０〜８の範囲であり、ｖは０または１であり、Ａｒは、ハロゲン原子によって置換されていてもよい、１〜３個のヘテロ原子を含む飽和または不飽和５員または６員ヘテロ環である。）
から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の錯化剤。
【請求項１０】
Ｌ２が、
直接結合；
１つまたは複数の二重または三重結合を含んでいてもよい直鎖状または分枝状Ｃ１〜Ｃ２０アルキレン基；
Ｃ５〜Ｃ８シクロアルキレン基；Ｃ６〜Ｃ１４アリーレン基；
下記式の二価の基から選択される基：
【化５】
2020523411.tif 000038
（式中、ｎ、ｍ、ｐ、ｑは、１〜１６の整数、好ましくは１〜５の整数であり、ｅは、１〜６の整数、好ましくは１〜４の整数である。）
から選択されるが、
ただし、上記アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレン基は、酸素、窒素、硫黄、リンなどの１個もしくは複数のヘテロ原子、または１個もしくは複数のカルバモイルもしくはカルボキサミド基を含んでいてもよく、上記アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレン基は、１〜５個のＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、スルホナートまたはオキソ基によって置換されていてもよい、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の錯化剤。
【請求項１１】
−Ｌ２−Ｇ基が、カルボン酸、アミン、スクシンイミジルエステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イソチオシアナート、マレイミド基から選択される反応性基Ｇと、１〜５個の炭素原子を有するアルキレン鎖または下記式の基から選択される基：
【化６】
2020523411.tif 000039
（式中、ｎ、ｍは、１〜１６の整数、好ましくは１〜５の整数であり、ｅは、１〜６の整数、好ましくは１〜４の整数である。）
からなるスペーサーアームＬ２とからなり、Ｇ基が、上記二価の基のどちらか一端に連結されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の錯化剤。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の錯化剤とランタニドとを含むランタニド錯体。
【請求項１３】
上記ランタニドが、Ｅｕ３＋、Ｓｍ３＋、Ｔｂ３＋、Ｇｄ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｅｒ３＋から選択されることを特徴とする、請求項１２に記載のランタニド錯体。
【請求項１４】
上記ランタニドが、Ｅｕ３＋またはＴｂ３＋、好ましくはＥｕ３＋であることを特徴とする、請求項１３に記載のランタニド錯体。
【請求項１５】
（ｉ）Ｇ基を含む請求項１２〜１４のいずれか一項に記載のランタニド錯体と、（ｉｉ）官能基を含む所望の分子とを反応させることによって得られるコンジュゲートであって、上記官能基は、Ｇ基の原子の１個と共有結合を形成するものである、コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、水溶性錯化剤またはリガンド、これらの錯化剤から得られるランタニド錯体、および、分子を標識し、時間分解蛍光法で検出するためのこれらのランタニド錯体の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ランタニド錯体の使用は、この２０年で生命科学の分野において大幅に拡大してきた。この理由は、これらの蛍光性化合物が、それらを生体分子を検出するのに好まれる標識としている有利な分光学的特徴を有するからである。これらの蛍光性化合物は、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）測定を実施するために適合するフルオロフォアと組み合わせた使用に特に適しており、生体分子間の相互作用の研究へのその応用が、Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社およびそのＨＴＲＦ（登録商標）製品群など、いくつかの企業により商業的に利用されている。ランタニド錯体の寿命が比較的長いことにより、時間分解蛍光測定（すなわちフルオロフォア励起後に遅延時間をおく）を行うことも可能になり、そのため測定媒体による蛍光干渉を制限することができる。後者の特徴は、測定媒体が、多数のタンパク質を含むためそれらの蛍光が研究中の化合物の蛍光に干渉するおそれがある生物学的媒体に近づくほどいっそう有用である。
【０００３】
多くのランタニド錯体が記載されている。例えば、Ｌａｔｖａらは、４１個のＥｕ（ＩＩＩ）およびＴｂ（ＩＩＩ）錯体を開示し、それらの発光を研究した（非特許文献１）。化合物３９は特に、１，４，７−トリアザシクロノナン環（以下「ＴＡＣＮ」）からなり、その窒素原子は、フェニルエチニルピリジンに由来する発色団によって置換されている。著者らによれば、この発色団およびＥｕ（ＩＩＩ）からなる錯体の量子収量は良好とされているが、この錯体は、生体分子とカップリングするのに適していない。さらに、この化合物は非常に疎水性であるので、水性媒体中での使用は問題になり得る。最後に、この錯体の吸収は３１５ｎｍにおいて最適であるが、バイオアッセイのプレートリーダーで使用されることが多い励起波長はむしろ３３７ｎｍである。
【０００４】
Ｄ’Ａｌｅｏらは、ジピコリン酸に由来する３つのリガンドから構成されるランタニド錯体の合成を記載した（非特許文献２）。これらのリガンドの１つ（Ｌ１）は、ポリエチレングリコールエーテル−オキシド（以下「ＰＥＧ」）をフェニル基上に有するフェニルエチニル基によって置換されているジピコリン酸分子からなる。著者らによれば、ＰＥＧ基は、この生成物に、水性媒体および有機溶媒に対する良好な溶解性を付与する。しかし、これらの錯体は、水性媒体中で十分に安定ではなく、バイオコンジュゲーション反応において使用できない。
【０００５】
いくつかの他のランタニド錯体が開示されており、一部は商業的に利用されている。特に、大多環状ランタニドクリプタート（特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献３；特許文献４；特許文献５）、ジエチレントリアミン五酸単位に結合したクマリン由来単位を含むランタニド錯体（特許文献６）、およびピリジン誘導体（特許文献７；特許文献８）、ビピリジン誘導体（特許文献９）またはテルピリジン誘導体（特許文献１０；特許文献１１；特許文献１２）を含むランタニド錯体が挙げられる。
【０００６】
特許文献１３には、下記式の錯化剤が記載されている。
【０００７】
【化１】
2020523411.tif 000003
【０００８】
この特許文献において、発明者らは、輝度を増加させるために３つの発色団を有する錯体を検討している。さらに、これらの錯体を水溶性にするために、発明者らはＰＥＧ基を使用する。これらのＰＥＧ基は、「総合電荷」の観点から中性であるが、プラスチックおよびガラスへの吸着特性を錯体に付与するため、これらの錯体をイムノアッセイにおいて使用することが困難になる。
【０００９】
特許文献１４には、下記式で表される３つの発色団基を含む錯化剤が記載されている。
【００１０】
【化２】
2020523411.tif 000004
【００１１】
この特許文献において、発明者らは、ＰＥＧ基をアニオンまたはカチオン荷電基で置き換えた。これらの錯体は、完全に可溶性であり、プラスチックまたはガラスにはもはや吸着しない。これらの錯体は、かなり大きい星型構造および非常に高い輝度特性を有する。
【００１２】
特許文献１５は、水および生物学的媒体に対する溶解性に関して有利な特性を与える少なくとも２個のベタイン基を有機部分に含むランタニド錯体に関する。これらの可溶化基は、生細胞について非特異的吸着現象を限定するものとして示される。一方、これらの錯体は、特許文献１４と同様に、かなり大きい星型構造および良好な輝度特性をもたらす同一または異なる３つの発色団を有する。
【００１３】
特許文献１６および特許文献１７には、高モル吸光係数を有するＴＡＣＮ錯体が記載されている。これらの錯体は、高輝度を有するが、３つの発色団も有する。発明者らは、最適なエネルギー移動（ＦＲＥＴ）が起こるようにできるだけ高輝度の錯体を求めている。錯体の星型構造は、この場合も大型であり、それらの輝度が高い。
【００１４】
３つの発色団をトリアザシクロナン大環状分子上に導入することは、必ずしも利点とは限らない。その理由は、発色団が、長くて時間のかかる合成によるシントンであるからである。ＴＡＣＮ錯体中に３つの発色団が存在すると、分子のサイズが増加し、それにより、生体分子について立体障害が増加する。それにもかかわらず、発色団の数が多いほど、輝度が高くなる。というのは、このパラメータは、分子の量子収量およびモル吸光係数（ε）に依存するからである。３つの発色団を分子中に導入することによって、輝度は増加する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】欧州特許第０１８０４９２号明細書
【特許文献２】欧州特許第０３２１３５３号明細書
【特許文献３】欧州特許第０６０１１１３号明細書
【特許文献４】国際公開第２００１／９６８７７号
【特許文献５】国際公開第２００８／０６３７２１号
【特許文献６】米国特許第５，６２２，８２１号明細書
【特許文献７】米国特許第４，９２０，１９５号明細書
【特許文献８】米国特許第４，７６１，４８１号明細書
【特許文献９】米国特許第５，２１６，１３４号明細書
【特許文献１０】米国特許第４，８５９，７７７号明細書
【特許文献１１】米国特許第５，２０２，４２３号明細書
【特許文献１２】米国特許第５，３２４，８２５号明細書
【特許文献１３】国際公開第２０１３／０１１２３６号
【特許文献１４】国際公開第２０１４／１１１６６１号
【特許文献１５】国際公開第２０１４／１６２１０５号
【特許文献１６】国際公開第２０１４／１４７２８８号
【特許文献１７】国際公開第２０１６／０６６６４１号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Ｌａｔｖａら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ、１９９７年、７５巻、１４９頁
【非特許文献２】Ｄ’Ａｌｅｏら、Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００８年、４７巻、１０２５８頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明において、錯体の輝度と、錯体がエネルギー供与体として使用される時間分解ＦＲＥＴに基づくイムノアッセイにおいて生物学的標的を検出するその能力との間に相関性がないということが見出された。本発明は、先行技術の欠点を克服すること、すなわち、１つまたは２つの発色団を導入して合成を単純化すること、立体障害を低減すること、最後に、エネルギー移動に関して少なくとも同じ性能を有する蛍光プローブとすることを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
したがって、本発明は、約３３７ｎｍで励起させた場合に先行技術の化合物より低い輝度を有するが、時間分解ＦＲＥＴに基づくイムノアッセイにおいて生物学的標的を検出する能力が３つの発色団を有する類似体の能力と同等またはそれより優れている蛍光性ランタニド錯体を提供することを目的とする。これらの錯体は、水性媒体に対する良好な溶解性、ＦＲＥＴ実験における使用に適した発光スペクトル、さらには、サイズがより小さいことによる生体分子の標識における良好な実用性も有する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】本発明を代表する錯体のＵＶスペクトルを示す図である。
【図２】本発明を代表する錯体のクロマトグラムを示す図である。
【図３】本発明を代表する錯体の質量スペクトルを示す図である。
【図４】本発明を代表する錯体の有効性を試験するのに使用されたイムノアッセイを示す模式図である。
【図５】図４におけるイムノアッセイの実施時に測定されたＦＲＥＴシグナル（ΔＦ）を示す図である。
【図６】本発明を代表する錯体の有効性を試験するのに使用されたイムノアッセイを示す模式図である。
【図７】図６におけるイムノアッセイの実施時に測定されたＦＲＥＴシグナル（ΔＦ）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
錯化剤
本発明に係る錯化剤は、下記式（Ｉ）で表される化合物である。
【００２１】
【化３】
2020523411.tif 000005
【００２２】
（式中、
Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２およびＣｈｒｏｍ３は、互いに独立して下記式の基を表すが、
【００２３】
【化４】
2020523411.tif 000006
【００２４】
ただし、式（Ｉ）の化合物は、（ｉ）（Ｉａ）基および（Ｉｂ）基から選択される１または２個の基と、（ｉｉ）少なくとも１個のＬ１−ＣＯ−Ｒ基とを（必ず）含むものとし、
Ｒは、−ＯＲ２または−ＮＨ−Ｅ基であり、
Ｒ１は、−ＣＯ２Ｈまたは−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｒ３基であり、
Ｒ２は、Ｈまたは（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、
Ｒ３は、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキル、好ましくはメチル；−ＳＯ３−基によって好ましくはメタ位もしくはパラ位が置換されていてもよいフェニル；またはベンジルであり、
Ｌ１は、直接結合；酸素原子、窒素原子および硫黄原子から選択される少なくとも１個の原子で中断されていてもよい−（ＣＨ２）ｒ−基；−ＣＨ＝ＣＨ−基；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−基；−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−基；またはＰＥＧ基であり、
Ｌ２は、二価の連結基であり、
Ｇは、反応性基であり、
Ｅは、−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｓ−ＣＨ２−ＳＯ３−もしくは−（ＣＨ２）ｓ−Ｎ＋Ａｌｋ１Ａｌｋ２Ａｌｋ３基、またはスルホベタインであり、
ｒは、１〜６の整数、好ましくは１〜３の整数であり、
ｓは、０、１または２であり、
Ａｌｋ１、Ａｌｋ２、Ａｌｋ３は同一でも異なってもよく、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキルを表す。）
【００２５】
したがって、本発明に係る錯化剤は、式（Ｉ）の構造が３個の発色団（Ｃｈｒｏｍ１、Ｃｈｒｏｍ２およびＣｈｒｏｍ３）を含むので、（Ｉａ）基および（Ｉｂ）基から選択される１または２個の基と、その結果として（Ｉｃ）基および（Ｉｄ）基から選択される１または２個の基とを含む。式（Ｉ）の化合物に対するさらなる要件は、少なくとも１個のＬ１−ＣＯ−Ｒ基が構造中に存在しなければならないことである。
【００２６】
ＰＥＧ基は、式−ＣＨ２−（ＣＨ２ＯＣＨ２）ｙ−ＣＨ２ＯＣＨ３のポリエチレングリコール基（式中、ｙは１〜５の整数）を指す。
【００２７】
スルホベタインは、下記から選択される基である。
【００２８】
【化５】
2020523411.tif 000007
【００２９】
式中、Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、好ましくはメチルまたはエチルを表し、ｔは、１、２、３、４、５または６であり、好ましくは１または２であるが、式−（ＣＨ２）２Ｎ＋（ＣＨ３）２−（ＣＨ２）３−ＳＯ３−で表されるスルホベタインが好ましい。
【００３０】
ｐＨに応じて、−ＳＯ３Ｈ、−ＣＯ２Ｈおよび−ＰＯ（ＯＨ）２基は、脱プロトン化した形態または脱プロトン化していない形態である。したがって、これらの基は、以下の本明細書において、−ＳＯ３−基、−ＣＯ２−基および−ＰＯ（ＯＨ）Ｏ−基も指し、その逆も指す。
【００３１】
錯化剤の第１の好ましいファミリーは、Ｃｈｒｏｍ１が式（Ｉａ）の基であり、Ｃｈｒｏｍ２およびＣｈｒｏｍ３がそれぞれ、同一または異なる式（Ｉｃ）の基である式（Ｉ）の化合物からなる。一実施形態において、Ｃｈｒｏｍ２およびＣｈｒｏｍ３は同一である。直前の実施形態と組み合わせることができる別の実施形態において、Ｒ１は、−ＣＯ２Ｈまたは−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｒ３基（式中、Ｒ３は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたはフェニル）である。
【００３２】
錯化剤の第２の好ましいファミリーは、Ｃｈｒｏｍ１およびＣｈｒｏｍ２がそれぞれ、同一または異なる式（Ｉｂ）の基であり、Ｃｈｒｏｍ３が式（Ｉｄ）の基である式（Ｉ）の化合物からなる。一実施形態において、Ｃｈｒｏｍ１およびＣｈｒｏｍ２は同一である。直前の実施形態と組み合わせることができる別の実施形態において、Ｒ１は、−ＣＯ２Ｈまたは−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）Ｒ３基（式中、Ｒ３は（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルまたはフェニル）である。
【００３３】
これら２つの好ましいファミリーのうち、好ましいサブファミリーは、錯化剤が以下の特徴の１つまたは複数を含むものである。
・Ｒ２は、Ｈである。
・Ｌ１は、直接結合；酸素原子および硫黄原子から選択される少なくとも１個の原子で中断されていてもよい−（ＣＨ２）ｒ−基（式中、ｒ＝２または３）；−ＣＨ＝ＣＨ−基；−ＣＨ＝ＣＨ−ＣＨ２−基；または−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−基である。
・Ｅは、−ＣＨ２−（ＣＨ２）ｓ−ＣＨ２−ＳＯ３−基（式中、ｓ＝０または１）；−（ＣＨ２）ｓ−Ｎ＋Ａｌｋ１Ａｌｋ２Ａｌｋ３（式中、Ａｌｋ１、Ａｌｋ２、Ａｌｋ３は、同一または異なって（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルを表し、ｓ＝０または１）；または下記式の基：
【００３４】
【化６】
2020523411.tif 000008
【００３５】
（式中、Ｒ４は、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルであり、ｔは、１または２である。）
である。
【００３６】
本発明の一実施形態において、式（Ｉ）の錯化剤がいくつかのＥ基を含む場合、これらの基の多くとも１個はスルホベタインを表す。
【００３７】
スペーサーアームＬ１またはＬ２が有する反応性基Ｇによって、本発明に係る化合物と、蛍光化される種、例えば有機分子、ペプチドまたはタンパク質とのカップリングが可能になる。２つの有機分子をコンジュゲーションする方法は、反応性基の使用に基づいており、当業者の一般知識の一部である。これらの従来方法は、例えばＢｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、第２版、２００８年、１６９〜２１１頁に記載されている。
【００３８】
典型的には、反応性基は、それぞれ適当な求核性または求電子性基の存在下にある場合に共有結合を形成することができる求電子性または求核性基である。反応性基を含む本発明に係る化合物と官能基を有する有機分子、ペプチドまたはタンパク質とのコンジュゲーション反応によって、反応性基の１個または複数の原子を含む共有結合が形成される。
【００３９】
好ましくは、反応性基Ｇは、以下の化合物の１つに由来する基である：アクリルアミド、活性化アミン（例えば、カダベリンまたはエチレンジアミン）、活性化エステル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、アニリン、アジド、アジリジン、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、モノクロロトリアジン、ジクロロトリアジンなどのハロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジドを含む）、イミドエステル、イソシアナート、イソチオシアナート、マレイミド、ハロゲン化スルホニル、チオール、ケトン、アミン、酸ハロゲン化物、スクシンイミジルエステル、ヒドロキシスクシンイミジルエステル、ヒドロキシスルホスクシンイミジルエステル、アジドニトロフェニル、アジドフェニル、３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオンアミド、グリオキサール、トリアジン、アセチレン基、特に下記式の基から選択される基。
【００４０】
【化７】
2020523411.tif 000009
【００４１】
（式中、ｗは０〜８の範囲であり、ｖは０または１であり、Ａｒは、ハロゲン原子によって置換されていてもよい、１〜３個のヘテロ原子を含む飽和または不飽和５員または６員ヘテロ環である。）
【００４２】
好ましくは、反応性基Ｇは、アミン（−ＮＨＢｏｃとして保護されていてもよい）、スクシンイミジルエステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イソチオシアナート、マレイミド基、またはカルボン酸（−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ｔＢｕ基として保護されていてもよい）である。後者の場合、酸は、求核性種と反応するようにエステルとして活性化されなければならない。
【００４３】
反応性基Ｇは、二価の有機基によって構成されることが有利なスペーサーアームＬ１またはＬ２を介して錯化剤に結合している。特に、スペーサーアームＬ２は、下記から選択することができる。
・直接結合；
・１つまたは複数の二重または三重結合を含んでいてもよい直鎖状または分枝状Ｃ１〜Ｃ２０、好ましくはＣ１〜Ｃ８アルキレン基；
・Ｃ５〜Ｃ８シクロアルキレン基；Ｃ６〜Ｃ１４アリーレン基；
・下記式の二価の基から選択される基。
【００４４】
【化８】
2020523411.tif 000010
【００４５】
（式中、ｎ、ｍ、ｐ、ｑは、１〜１６の整数、好ましくは１〜５の整数であり、ｅは、１〜６の整数、好ましくは１〜４の整数である。）
ただし、上記アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレン基は、酸素、窒素、硫黄、リンなどの１個もしくは複数のヘテロ原子、または１個もしくは複数のカルバモイルもしくはカルボキサミド基を含んでいてもよく、上記アルキレン、シクロアルキレンまたはアリーレン基は、１〜５個、好ましくは１〜３個のＣ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ６〜Ｃ１４アリール、スルホナートまたはオキソ基によって置換されていてもよい。
【００４６】
式（Ｉａ）の基において、−Ｌ２−Ｇ基は、好ましくは、カルボン酸（−ＣＯ２Ｍｅ、−ＣＯ２ｔＢｕ基として保護されていてもよい）、アミン（−ＮＨＢｏｃとして保護されていてもよい）、スクシンイミジルエステル、ハロアセトアミド、ヒドラジン、イソチオシアナート、マレイミド基から選択される反応性基Ｇと、１〜５個の炭素原子を有するアルキレン鎖または下記式の基から選択される基：
【００４７】
【化９】
2020523411.tif 000011
【００４８】
（式中、ｎ、ｍは、１〜１６の整数、好ましくは１〜５の整数であり、ｅは、１〜６の整数、好ましくは１〜４の整数である。）
からなるスペーサーアームＬ２とから構成され、Ｇ基が、上記二価の基のどちらか一端に連結されている。
【００４９】
錯体
本発明はまた、上述の錯化剤により錯化したランタニド原子からなるランタニド錯体であって、上記ランタニドがＥｕ３＋、Ｓｍ３＋、Ｔｂ３＋、Ｇｄ３＋、Ｄｙ３＋、Ｎｄ３＋、Ｅｒ３＋から選択されるランタニド錯体にも関する。上記ランタニドは、好ましくはＴｂ３＋またはＥｕ３＋、さらにより好ましくはＥｕ３＋である。
【００５０】
これらの錯体は、本発明に係る錯化剤とランタニド塩とを反応させることによって調製される。したがって、溶媒（上記塩と相溶性があるアセトニトリル、メタノールまたは他の溶媒）または緩衝液中での１当量の錯化剤と１〜５当量のランタニド塩（塩化物、酢酸塩またはトリフル酸塩の形態のユウロピウムまたはテルビウム）との反応によって、数分間の撹拌後、対応する錯体が生じる。
【００５１】
上述したように、得られた蛍光性錯体は、特にそれらの量子収量、それらの発光寿命、およびそれらの励起スペクトル（約３３７ｎｍでのレーザー励起またはフラッシュランプに特に適している）に関して、優れた光物理的特性を有する。さらに、それらの発光スペクトルのバンド分布は約６２０ｎｍを中心としており、そのため、シアニン型またはアロフィコシアニン型アクセプター（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社販売のＸＬ６６５など）と共にＦＲＥＴを使用した場合に並はずれた非常に好ましい特性が錯体に付与される。これらの錯体は、大部分の二価のカチオン（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋など）またはＥＤＴＡを含む生物学的環境において安定性が高いため、それらの発光は、先行技術の３つの発色団を有する錯体と比較して優れたままである。
【００５２】
コンジュゲート
Ｇ基を含む本発明に係る錯化剤およびランタニド錯体は、反応性基と反応して共有結合を形成することができる官能基を含む有機または生体分子を標識するのに特に適している。したがって、本発明はまた、所望の分子（タンパク質、抗体、酵素、ホルモンなど）を標識するためのランタニド錯体の使用にも関する。
【００５３】
本発明はまた、本発明に係る錯体で標識された分子にも関する。反応性基と反応することができる官能基を有するならば、いずれの有機または生体分子も、本発明に係る錯体とコンジュゲーションすることができる。特に、本発明に係るコンジュゲートは、本発明に係る錯体と、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗体、糖、炭水化物鎖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、酵素基質（特に、ベンジルグアニンまたはベンジルシトシンなどの酵素自殺基質（ＳｎａｐｔａｇおよびＣｌｉｐｔａｇとして販売されている酵素基質））、クロロアルカン（Ｈａｌｏｔａｇという名称で販売されている酵素の基質）、補酵素Ａ（ＡＣＰｔａｇまたはＭＣＰｔａｇという名称で販売されている酵素の基質）から選択される分子とを含む。
【００５４】
合成
本発明に係る錯化剤（リガンド）および錯体の調製のための一般戦略を、以下（スキーム１：単一アンテナおよびスキーム２：２個のアンテナ）に概略的に記載し、実験の部にさらに詳述する。
【００５５】
【化１０】
2020523411.tif 000012
【００５６】
Ｂｏｃ−モノ保護トリアザシクロナン大環状分子１を出発物質として、２個の可溶化基を付加させるために使用される２つのピリジニル単位を導入した。保護基Ｂｏｃを除去し、次いでアンテナ（発色団）を大環状分子に付加して、リガンド３を得た。エステル（カルボン酸エステルおよびホスフィン酸エステル）の加水分解を、通常の方法で塩基性条件を使用して実施した。そして、これにより、ユウロピウム原子が組み込まれるため、錯体５が形成された。この錯体を基にして、２個の水可溶化官能基が導入された。最後に、アンテナ（発色団）が有する保護基Ｂｏｃの脱保護後、錯体を生体分子にコンジュゲーションすることができるように官能化した（７）。
【００５７】
【化１１】
2020523411.tif 000013
【００５８】
ツーアンテナ系は、同様の戦略を使用し、ピリジニル単位および発色団の導入の順序を逆にすることによって得られた。今回は、最初にアンテナを導入して、化合物８を得た。Ｂｏｃ基の除去後、最後のピリジニル単位を導入した。シーケンスは同一であった。すなわち、エステル官能基（カルボン酸エステルおよびホスフィン酸エステル）の加水分解、ユウロピウム錯体の形成、２個の水可溶化官能基（今回、これらの官能基は発色団が有する）の導入、次いで官能基の組み込みによって、ツーアンテナファミリー１３を得た。
【００５９】
１）ピリジニルブリックの調製
以下のスキーム（３〜１１）は、以下の三官能性ピリジニル誘導体の様々な合成経路を示す。
・２位に錯化官能基（カルボン酸またはホスフィン酸）；
・４位に、水可溶化基を導入させることができる官能基（メチルエステル官能基）または官能基を組み込むことができる官能基（保護アミン官能基およびｔｅｒｔ−ブチルエステル官能基）；
・最後に、６位に、ＴＡＣＮ環のアミンと反応できるようにするために対応するメシラートに変換されるメチルアルコール官能基。
【００６０】
【化１２】
2020523411.tif 000014
【００６１】
シントン１４ａ〜ｃの合成は上述のものに記載されている（国際公開第２０１３／０１１２３６号および国際公開第２０１４／１１１６６１号を参照のこと）。これらのシントンから、連続した以下の３つの反応によって一連の化合物１７ａ〜ｆが得られた。ピリジン誘導体とアルケンの間に炭素−炭素結合を生じるＨｅｃｋ反応。この手順は、例えば欧州特許出願公開第２００２８３６号明細書に記載されている。二重結合の接触水素化による還元の後、メシル化反応を行うことより、化合物１７ａ〜ｆを得た。あるいは、二重結合を保持して、系を硬直させ、水可溶化基をアピカル配向させた（１８ａ〜ｆ）。
【００６２】
【化１３】
2020523411.tif 000015
【００６３】
同じ戦略に従い、対応するアルケンを使用することによって、ｔｅｒｔ−ブチルエステル形態（１７および１８シリーズの類似体）の化合物２１ａ〜ｆおよび２２ａ〜ｆ（スキーム４）が得られた。
【００６４】
【化１４】
2020523411.tif 000016
【００６５】
同じ戦略に従い、対応するアルケンを使用することによって、ＮＨＢｏｃ形態（１７および１８シリーズの類似体）の化合物２５ａ〜ｆおよび２６ａ〜ｆ（スキーム５）が得られた。
【００６６】
【化１５】
2020523411.tif 000017
【００６７】
同様の戦略に従って、２５シリーズの類似体である（炭素鎖を含まない）化合物２８ａ〜ｃを調製した。ＮＨＢｏｃ基の導入は、例えばＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０１０年、５１巻、４４４５頁の総説に記載された方法を使用して実施した。
【００６８】
【化１６】
2020523411.tif 000018
【００６９】
スキーム７に記載された方法に従って、官能基（ＣＯ２ＲまたはＮＨＢｏｃ）を有する脂肪族リンカーと芳香族環（ピリジン）の間の４位に酸素原子が介在しているピリジニル誘導体を調製した。ケリダム酸２９をメチルジエステルとしてエステル化し、次いで光延反応を使用して、官能基を有するリンカーを導入した（例えば、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１２年、１０巻、９１８３頁に記載された手順）。水素化ホウ素ナトリウムを使用したモノ還元によって、モノアルコール形態の化合物３２ａ〜ｃが得られ、次いで対応するメシル化誘導体３３ａ〜ｃに変換された。
【００７０】
【化１７】
2020523411.tif 000019
【００７１】
４位のメチルエステル官能基を芳香環（ピリジン）に直に固定することができる。この場合、市販の化合物３４を出発物質とし、まずエステル化する必要があった。次いで、ピリジンをｍ−ＣＰＢＡの存在下で酸化し、対応するＮ−オキシド誘導体３６を得た。Ｎ−オキシド官能基は無水トリフルオロ酢酸と容易に反応し、転位することにより、加水分解後に６位のメチルアルコール官能基が得られた。後者を通常の条件下でメシル化して、化合物３８を得た。
【００７２】
【化１８】
2020523411.tif 000020
【００７３】
化合物３９を使用し、それをまずエステル化し、次いでホスフィン酸エステル４１ａ〜ｂに変換して、類似したホスフィナート誘導体４４ａ〜ｂを調製した。反応シーケンスの残りは、化合物３８の合成の場合と同一であった。
【００７４】
【化１９】
2020523411.tif 000021
【００７５】
スキーム１０に記載された反応シーケンスに従って、誘導体５１ａ〜ｂを調製した。この例では、チオグリコール酸エチルまたはｔｅｒｔ−ブチルを使用して、エステル官能基を導入した。
【００７６】
【化２０】
2020523411.tif 000022
【００７７】
スキーム１１に記載された合成経路に従って、ホスフィナート類似体５６ａ〜ｄを調製した。
【００７８】
２）発色団の調製
【００７９】
【化２１】
2020523411.tif 000023
【００８０】
国際公開第２０１３／０１１２３６号および国際公開第２０１４／１１１６６１号に詳述されているプロトコルに従って、発色団５８ａ〜ｃ（スキーム１２）および６０ａ〜ｃ（スキーム１３）を調製した。
【００８１】
【化２２】
2020523411.tif 000024
【００８２】
３）単一アンテナ錯体の合成
【００８３】
【化２３】
2020523411.tif 000025
【００８４】
Ｂｏｃ−モノ保護ＴＡＣＮ大環状分子を出発物質として、ピリジニル誘導体（Ｐｙ）を縮合させて、化合物６１ａ〜ｓを得た。大環状分子を脱保護し、対応する発色団（Ｐｙが有するものと同一であるＺ）をリガンドに導入した。エステル官能基を加水分解し（６３シリーズ）、ユウロピウムを様々なリガンドにおいて錯化して、一連の錯体６４ａ〜ｓを得た。
【００８５】
【化２４】
2020523411.tif 000026
【００８６】
６４ａ〜ｓシリーズについては、２個の水可溶化基の導入によって、化合物を水性媒体に対して可溶化した。これらの基は、アニオン性（スルホナート）または中性（双性イオン：スルホベタイン）またはカチオン性（第四級アンモニウム）である。
【００８７】
【化２５】
2020523411.tif 000027
【００８８】
最後に、Ｂｏｃ基をトリフルオロ酢酸の存在下で取り除き、それにより、ＮＨ２で官能化された本発明の錯体（６６）を得た。
【００８９】
４）ツーアンテナ錯体の合成
ツーアンテナ錯体の合成をスキーム１７〜２０に記載する。
【００９０】
【化２６】
2020523411.tif 000028
【００９１】
合成は、３種類の発色団：カルボキシラート、ホスフィン酸メチルおよびホスフィン酸フェニルを用いたモノ保護ＴＡＣＮのアルキル化反応から始めた。保護基Ｂｏｃを除去し、発色団と同一であるＺを有する対応するピリジンを最後のＴＡＣＮアルキル化部位に導入して、化合物６７ａ〜ａｆを得た。
【００９２】
【化２７】
2020523411.tif 000029
【００９３】
リガンドを加水分解し、ユウロピウム原子を大環状分子に導入して、６８シリーズを得た。
【００９４】
【化２８】
2020523411.tif 000030
【００９５】
次いで、水可溶化基（Ｅ１〜Ｅ５）を両方の発色団に導入した（スキーム１９）。それらは、アニオン性、中性またはカチオン性である。
【００９６】
【化２９】
2020523411.tif 000031
【００９７】
最後に、その後、Ｂｏｃまたはｔｅｒｔ−ブチルエステル基をトリフルオロ酢酸の存在下で除去して、化合物７０ａ〜ａｆを得た（スキーム２０）。
【００９８】
実験の部
使用した略語：
ＡｃＯＥｔ：酢酸エチル
ＡｃＯＨ：酢酸
Ｂｏｃ：ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー
ＣＤＣｌ３：重水素化クロロホルム
ＣＨＣｌ３：クロロホルム
ＣｓＣＯ３：炭酸セシウム
ＣｕＩ：ヨウ化銅（Ｉ）
ＣＨ２Ｃｌ２／ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＩＡＤ：アゾジカルボン酸ジイソプロピル
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド
Ｅｔ：エチル
Ｅｔ３Ｎ／ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＥＳＩ＋：ポジティブモードのエレクトロスプレーイオン化
ＥｔＯＨ：エタノール
Ｄ：日
ＨＡＴＵ：（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート）
Ｈ２Ｏ：水
Ｈ２ＳＯ４：硫酸
ＨＮＯ３：硝酸
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＬＣ−ＭＳ：質量分析に連結した高速液体クロマトグラフィー
ＬｉＯＨ／Ｌｉｔｈｉｎｅ：水酸化リチウム
ＬｎＣｌ３：塩化ランタニド
ｍ−ＣＰＢＡ：メタクロロ過安息香酸
Ｍｅ：メチル
ＭｅＣＮ：アセトニトリル
ＭｅＯＨ：メタノール
ＭｇＳＯ４：硫酸マグネシウム
Ｍｓ：メシル
ＭｓＣｌ：塩化メシル
ＮａＣｌ：塩化ナトリウム
ＮａＨ：水素化ナトリウム
Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２：ビス（ジフェニルホスフィノ）フェロセン］ジクロロパラジウム（ＩＩ）
Ｐｄ（ＰＰｈ３）４：テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）
Ｐｄ／Ｃ：チャコール担持パラジウム
Ｐｄ（ＯＡｃ）２：酢酸パラジウム（ＩＩ）
Ｐｈ：フェニル
ＰＰｈ３：トリフェニルホスフィン
ＰｔＦ：融点
Ｐｙ：ピリジン
Ｒｆ：溶媒先端
Ｒｔ：保持時間
ＲＴ：室温
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチル
ＴＥＡ：トリエチルアミン
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＴＭＳ：トリメチルシリル
Ｔｓ：トシル
ＴＳＴＵ：Ｏ−（Ｎ−スクシンイミジル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボラート
ＵＰＬＣ−ＭＳ：質量分析に連結した超高速液体クロマトグラフィー
Ｘｐｈｏｓ：２−ジシクロヘキシルホスフィノ−２’，４’，６’−トリイソプロピルビフェニル
【００９９】
クロマトグラフィー
アルミニウム箔上のＭｅｒｃｋ製６０Ｆ２５４シリカゲルプレートまたはアルミニウム箔上のＭｅｒｃｋ製６０Ｆ２５４中性酸化アルミニウムプレート（タイプＥ）で薄層クロマトグラフィーを行った。
【０１００】
分析および分取高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を以下の２台の装置で行った。
・分析ＨＰＬＣ：ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、クォータナリーポンプＰ４０００、重水素ランプ（１９０〜３５０ｎｍ）を備えたＵＶ１０００検出器、Ｗａｔｅｒｓ製ＸＢｒｉｄｇｅＣ１８分析カラム（３．５μｍ、４．６×１００ｍｍ）
・分取ＨＰＬＣ：Ｓｈｉｍａｄｚｕ社、２台のＬＣ−８Ａポンプ、Ｖａｒｉａｎ製ＰｒｏＳｔａｒＵＶダイオードアレイ検出器、Ｗａｔｅｒｓ製ＸＢｒｉｄｇｅＣ１８分取カラム（５μｍ：１９×１００ｍｍまたは５０×１５０ｍｍ）
【０１０１】
検出器としてＰＤＡ型のＵＶダイオードストリップ検出器またはＳＱＤ２型のシンプル四重極質量検出器を備えたＷａｔｅｒｓ製Ａｃｑｕｉｔｙ  ＨＣｌａｓｓ装置で分析超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）を行った。使用されたプローブは、ポジティブモードのエレクトロスプレー（キャピラリー電圧３．２ｋＶ、コーン電圧３０Ｖ）である。
【０１０２】
Ｍｅｒｃｋ製６０シリカゲル（０．０４０〜０．０６３ｍｍ）でシリカカラムクロマトグラフィーを行った。Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ製中性活性型酸化アルミニウムＢｒｏｃｈｍａｎｎＩでアルミナカラムクロマトグラフィーを行った。
【０１０３】
グラジエントＡ
Ｗａｔｅｒｓ製ＡｃｑｕｉｔｙＣ１８カラム、３００Å、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ−Ａ／水０．１％ギ酸Ｂ／アセトニトリル０．１％ギ酸ｔ＝０分５％Ｂ−ｔ＝０．２分５％Ｂ−ｔ＝５分１００％Ｂ−０．６ｍＬ／分
グラジエントＢ
Ｗａｔｅｒｓ製ＸｂｒｉｄｇｅＣ１８カラム、５μｍ、５０×１５０ｍｍ−Ａ／水２５ｍＭ  ＴＥＡＡｃ  ｐＨ７Ｂ／アセトニトリルｔ＝０分１０％Ｂ−ｔ＝１９分６０％Ｂ−１００ｍＬ／分
グラジエントＣ
Ｗａｔｅｒｓ製ＡｃｑｕｉｔｙＣ１８カラム、３００Å、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ−Ａ／水５ｍＭ酢酸アンモニウムＢ／アセトニトリルｔ＝０分５％Ｂ−ｔ＝０．２分５％Ｂ−ｔ＝５分１００％Ｂ−０．６ｍＬ／分
グラジエントＤ
Ｗａｔｅｒｓ製ＸｂｒｉｄｇｅＣ１８、５μｍ、２０×１００ｍｍ−Ａ／水２５ｍＭ  ＴＥＡＡｃ  ｐＨ７Ｂ／アセトニトリルｔ＝０分５％Ｂ−ｔ＝１９分６０％Ｂ−２０ｍＬ／分
グラジエントＥ
Ｗａｔｅｒｓ製ＸｂｒｉｄｇｅＣ１８、５μｍ、２０×１００ｍｍ−Ａ／水２５ｍＭ  ＴＥＡＡｃ  ｐＨ７Ｂ／アセトニトリルｔ＝０分２％Ｂ−ｔ＝１９分４０％Ｂ−２０ｍＬ／分
グラジエントＦ
Ｗａｔｅｒｓ製ＸｂｒｉｄｇｅＣ１８、５μｍ、２０×１００ｍｍ−Ａ／水２５ｍＭ  ＴＥＡＡｃ  ｐＨ６Ｂ／アセトニトリルｔ＝０分２％Ｂ−ｔ＝１９分４０％Ｂ−２０ｍＬ／分
【０１０４】
分光測定
・核磁気共鳴
ＮＭＲスペクトル（１Ｈ、１３Ｃおよび３１Ｐ）は、直径５ｍｍの多核種ＢＢＦＯ測定プローブ（Ｚグラジエントおよび２Ｈロック）を備えたＢｒｕｋｅｒ製Ａｖａｎｃｅ４００ＭＨｚＮａｎｏＢａｙ分光計（９．４テスラ磁石）を使用して行われた。化学シフト（δ）は百万分率（ｐｐｍ）で表す。以下の略語を使用する。
ｓ：一重線、ｂｓ：ブロードな一重線、ｄ：二重線、ｔ：三重線、ｑ：四重線、ｍ：多重線、ｄｄ：二重線の二重線、ｔｄ：二重線の三重線、ｑｄ：二重線の四重線、ｄｄｄ：二重線の二重線の二重線。
・質量分析（ＬＲＭＳ）
質量スペクトル（ＬＣ−ＭＳ）は、Ｗａｔｅｒｓ製ＸＢｒｉｄｇｅＣ１８３．５μｍ４．６×１００ｍｍカラムを備えたマルチモードＥＳＩ／ＡＰＣＩソースを有するシングル四重極型Ｗａｔｅｒｓ製ＺＱ２０００分光計またはＳＱＤ２型のシングル四重極質量分析計を使用して行った。
・高分解能質量分析（ＨＲＭＳ）
気流支援大気圧イオン化（ＡＰＩ）源を備えたＱＳｔａｒ  Ｅｌｉｔｅ質量分析計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＣＩＥＸ）を用いて分析を行った。試料をポジティブエレクトロスプレーモードにて以下の条件下でイオン化した：エレクトロスプレー電圧（ＩＳＶ）：５５００Ｖ；オリフィス電圧（ＯＲ）：２０Ｖ；ネブライザーガス圧（空気）：２０ｐｓｉ。飛行時間分析機器（ＴＯＦ）を用いて高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を得た。正確な質量測定は、二重内部較正を用いて３連で行った。
【実施例】
【０１０５】
化合物１：国際公開第２０１３／０１１２３６号および国際公開第２０１４／１１１６６１号に記載された手順に従って、化合物１を調製した。
【０１０６】
化合物１４ａ〜１４ｃ：国際公開第２０１３／０１１２３６号および国際公開第２０１４／１１１６６１号に記載された手順に従って、化合物１４ａ〜１４ｃを調製した。
【０１０７】
化合物１５ａ：１００ｍＬのシュレンクフラスコ中で、化合物１４ａ（４４０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）に可溶化して、無色溶液を得た。反応混合物に、トリ（ｏ−トリル）ホスフィン（９１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）、Ｐｄ（ＯＡｃ）２（３３．７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）、ＴＥＡ（０．３１４ｍｌ、２．２５２ｍｍｏｌ）およびアクリル酸メチル（０．２０３ｍＬ、２．２５２ｍｍｏｌ）を一度に添加した。反応液を７０℃で５時間撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ−ＭＳ（グラジエントＡ）でモニターした。この後、反応は完了した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＡｃＯＥｔ（５０ｍＬ）中に希釈し、水（２×５０ｍＬ）、次いで飽和ＮａＣｌ水溶液（５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。１００／０から９９／１へのＤＣＭ／ＭｅＯＨ溶媒グラジエントを使用したシリカカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製して、白色粉末の形態で化合物１５ａ（２３３ｍｇ、６２％）を得た。
Ｐｆ＝１５６．４〜１５６．９℃−ＨＰＬＣグラジエントＡ−Ｒｔ＝２．０３分−［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ２５１．９−Ｒｆ＝０．４１（シリカ、ジクロロメタン−メタノール９６：４−ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１２Ｈ１４ＮＯ５＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値、ｍ／ｚ２５２．０８６６、実測値：２５２．０８６８−１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．１３（ｓ，１Ｈ，Ｐｙ  Ｈ５）、７．６７（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ）、７．６５（ｓ，１Ｈ，Ｐｙ  Ｈ３）、７．１９（ｄｄ，Ｊ＝；１６．２Ｈｚ，２Ｈ，ＨＣ＝ＣＨ）、６．７１（ｄ，Ｊ＝１６．２Ｈｚ，１Ｈ）、４．９１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２−ＯＨ）、４．０４（ｓ，３Ｈ，Ｐｙ−ＣＯＯＭｅ）、３．８５（ｓ，３Ｈ，ＣＯＯＭｅ）、３．４９（ｓ  ｌ，１Ｈ，ＯＨ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１６６．２０（ＣＯＯＭｅ）、１６５．２４（Ｐｙ−ＣＯＯＭｅ）、１６１．５９（Ｐｙ  Ｃ２）、１４７．９７（Ｐｙ−Ｃ＝Ｃ）、１４３．７４（Ｐｙ  Ｃ６）、１４０．９２（Ｐｙ  Ｃ４）、１２３．７７（Ｐｙ  Ｃ３）、１２２．０８（Ｐｙ  Ｃ５）、１２１．８６（Ｐｙ−Ｃ＝Ｃ）、６４．６８（ＣＨ２−ＯＨ）、５３．１０（Ｐｙ−ＣＯ２ＣＨ３）、５２．１９（ＣＯ２ＣＨ３）。
【０１０８】
化合物１５ｂ〜１５ｆ：１５ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って対応するアルケンを使用して、これらの化合物を調製した。
【０１０９】
化合物１６ａ：５０ｍＬのフラスコ中で、化合物１５ａ（２３３ｍｇ、０．９２７ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（１０ｍＬ）に可溶化して、無色溶液を得た。反応混合物に１０％Ｐｄ／Ｃ（２３．６９ｍｇ、０．０２２ｍｍｏｌ）を一度に添加した。二水素をバブリングしながら、反応液を室温で２時間撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ−ＭＳ（グラジエントＡ）でモニターした。この後、反応は完了した。反応混合物を２２μｍのナイロンフィルターに通して濾過し、蒸発乾固して、白色粉末の形態で化合物１６ａ（２３１ｍｇ、９８％）を得た。Ｐｆ＝１３３．２〜１３６．４℃−ＨＰＬＣグラジエントＡ−Ｒｔ＝１．８６分−［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ２５３．２−ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１２Ｈ１６ＮＯ５＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値、ｍ／ｚ２５４．１０２３、実測値：２５４．１０２４−１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．９（ｓ，１Ｈ，Ｐｙ  Ｈ５）、７．４１（ｓ，１Ｈ，Ｐｙ  Ｈ３）、４．８５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２−ＯＨ）、４．０１（ｓ，３Ｈ，Ｐｙ−ＣＯＯＭｅ）、３．６９（ｓ，３Ｈ，ＣＯＯＭｅ）、３．０５（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ，Ｐｙ−ＣＨ２−ＣＨ２）、２．７１（ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ，２Ｈ，Ｐｙ−ＣＨ２−ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１７２．４１（ＣＯＯＭｅ）、１６５．６５（Ｐｙ−ＣＯＯＭｅ）、１６０．４９（Ｐｙ  Ｃ２）、１５１．６７（Ｐｙ  Ｃ４）、１４７．２２（Ｐｙ  Ｃ６）、１４０．９２（Ｐｙ  Ｃ３）、１２３．９６（Ｐｙ  Ｃ３）、１２３．９（Ｐｙ  Ｃ５）、６４．６２（ＣＨ２−ＯＨ）、５２．９１（Ｐｙ−ＣＯ２ＣＨ３）、５１．９１（ＣＯ２ＣＨ３）、３３．９７（Ｐｙ−ＣＨ２−ＣＨ２）、３０．０７（Ｐｙ−ＣＨ２−ＣＨ２）。
【０１１０】
化合物１６ｂ〜１６ｆ：１６ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、これらの化合物を調製した。
【０１１１】
化合物１７ａ：１００ｍＬのフラスコ中で、化合物１６ａ（２３１ｍｇ、０．９１２ｍｍｏｌ）を無水ＴＨＦ（３０ｍＬ）に可溶化して、無色溶液を得た。反応混合物を氷浴に入れ、ＴＥＡ（０．１２７ｍＬ、０．９１２ｍｍｏｌ）およびＭｓＣｌ（７２μＬ、０．９１２ｍｍｏｌ）を一度に添加した。混合物を室温に温め、１５分間撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ−ＭＳ（グラジエントＡ）でモニターした。この後、反応は完了した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）中に希釈し、水（２×２５ｍＬ）、次いで飽和ＮａＣｌ水溶液（２０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、白色粉末の形態で化合物１７ａ（２４９ｍｇ、８２％）を得た。ＨＰＬＣグラジエントＡ−Ｒｔ＝３．２分−［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ３３２．３−Ｒｆ＝０．２３（シリカ、ジクロロメタン−メタノール９８：２−ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ１３Ｈ１８ＮＯ７Ｓ＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値、ｍ／ｚ３３２．０７９９、実測値：３３２．０７９９−１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．９８（ｓ，１Ｈ，Ｐｙ  Ｈ５）、７．５４（ｓ，１Ｈ，Ｐｙ  Ｈ３）、５．４１（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２−ＯＭｓ）、４．００（ｓ，３Ｈ，Ｐｙ−ＣＯＯＭｅ）、３．６９（ｓ，３Ｈ，ＣＯＯＭｅ）、３．１６（ｓ，３Ｈ，ＯＭｓ）、３．０７（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｐｙ−ＣＨ２−ＣＨ２）、２．７２（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ，Ｐｙ−ＣＨ２−ＣＨ２）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１７２．２３（ＣＯＯＭｅ）、１６５．２７（Ｐｙ−ＣＯＯＭｅ）、１５４．５６（Ｐｙ  Ｃ２）、１５２．４６（Ｐｙ  Ｃ４）、１４７．９３（Ｐｙ  Ｃ６）、１２５．１９（Ｐｙ  Ｃ３）、１２５．０３（Ｐｙ  Ｃ５）、７０．９７（ＣＨ２−ＯＭｓ）、５３．０８（Ｐｙ−ＣＯ２ＣＨ３）、５１．９４（ＣＯ２ＣＨ３）、３８．０５（ＣＨ２−ＯＳＯ２ＣＨ３）、３３．８７（Ｐｙ−ＣＨ２−ＣＨ２）、３０．０７（Ｐｙ−ＣＨ２−ＣＨ２）。
【０１１２】
化合物１７ｂ〜１７ｆ：１６ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、これらの化合物を調製した。
【０１１３】
化合物１８ａ〜１８ｆ：１７ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、これらの化合物を調製した。
【０１１４】
化合物１９ａ〜１９ｆ：１５ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、これらの化合物を調製した。
【０１１５】
化合物２０ａ〜２０ｆ：１６ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、これらの化合物を調製した。
【０１１６】
化合物２１ａ〜２１ｆ：１７ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、これらの化合物を調製した。
【０１１７】
化合物２２ａ〜２２ｆ：１７ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、これらの化合物を調製した。
【０１１８】
化合物２３ａ〜２３ｆ：１５ａの合成の合成に使用された手順と同じ手順に従って対応するアルケンを使用して、これらの化合物を調製した。
【０１１９】
化合物２４ａ〜２４ｆ：１６ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、これらの化合物を調製した。
【０１２０】
化合物２５ａ〜２５ｆ：１７ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、これらの化合物を調製した。
【０１２１】
化合物２６ａ〜２６ｆ：１７ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、これらの化合物を調製した。
【０１２２】
化合物２７ａ〜ｃ：Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２０１０年、５１巻、４４４５頁の論文に記載された手順に従って、化合物２７ａ〜ｃを調製した。
【０１２３】
化合物２８ａ〜２８ｃ：１７ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、これらの化合物を調製した。
【０１２４】
化合物２９：この化合物は市販品である。
【０１２５】
化合物３０：Ｄａｌｔｏｎ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ、２０１０年、３９巻、７０７頁の論文に記載された手順に従って、化合物３０を調製した。
【０１２６】
化合物３１ａ〜３１ｃ：Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１２年、１０巻、９１８３頁の論文に記載された手順に従って、化合物３１ａ〜３１ｃを調製した。
【０１２７】
化合物３２ａ〜３２ｃ：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１０年、７５巻、７１７５頁の論文に記載された手順に従って、化合物３２ａ〜３２ｃを調製した。
【０１２８】
化合物３３ａ〜３３ｃ：Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１０年、７５巻、７１７５頁の論文に記載された手順に従って、化合物３３ａ〜３３ｃを調製した。
【０１２９】
化合物３４：この化合物は市販品である。
【０１３０】
化合物３５：Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１４年、５７巻、１４８頁の論文に記載された手順に従って、化合物３５を調製した。
【０１３１】
化合物３６：Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１３年、３７２巻、３５頁の論文に記載された手順に従って、化合物３６を調製した。
【０１３２】
化合物３７：国際公開第２０１４／１１１６６１号に記載された手順に従って、化合物３７を調製した。
【０１３３】
化合物３８：１７ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、この化合物を調製した。
【０１３４】
化合物３９：この化合物は市販品である。
【０１３５】
化合物４０：Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２０１４年、５７巻、１４８頁の論文に記載された手順に従って、化合物４０を調製した。
【０１３６】
化合物４１ａ〜ｂ：国際公開第２０１４／１１１６６１号に記載された手順に従って対応する触媒を使用して、化合物４１ａ〜ｂを調製した。
【０１３７】
化合物４２ａ〜ｂ：３６の合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物４２ａ〜ｂを調製した。
【０１３８】
化合物４３ａ〜ｂ：３７の合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物４３ａ〜ｂを調製した。
【０１３９】
化合物４４ａ〜ｂ：１７ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物４４ａ〜ｂを調製した。
【０１４０】
化合物４５：市販品。
【０１４１】
化合物４６：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ−Ａ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２０１４年、２０巻、３６１０頁の論文に記載された手順に従って、化合物４６を調製した。
【０１４２】
化合物４７：化合物４６（０．３１３ｇ、２．０４ｍｍｏｌ）をＨ２ＳＯ４（１１ｍＬ）に室温で溶解し、次いで溶液を氷浴中で冷却した。この混合物にＨＮＯ３（９．７ｍＬ）を滴下し、溶液を１００℃に２日間加熱した。混合物を室温に冷却し、次いで砕氷（１００ｇ）に注ぎ込んだ。１時間後、水相をＣＨ２Ｃｌ２（３×５０ｍＬ）で抽出し、有機相を１つにまとめ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、溶媒混合物（ＣＨ２Ｃｌ２−ＡｃＯＨ、９８／２）を使用したシリカカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製して、白色固体（２２４ｍｇ、５６％）を得た。Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＡｃＯＨ，９８／２）＝０．３８；ＰｔＦ：１４７℃；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６．４９（ｓ，１Ｈ，ＣＯＯＨ）、９．０８（ｓ，１Ｈ，Ｈ３）、８．３６（ｓ，１Ｈ，Ｈ５）、２．７５（ｓ，３Ｈ，ｐｙ−ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１５９．４（ＣＯＯＨ）、１５２．４（Ｃ６）、１４４．４（Ｃ４）、１３８．７（Ｃ２）、１２３．１（Ｃ５）、１２１．７（Ｃ３）、１８．４（ｐｙ−ＣＨ３）；ＭＳ  Ｃ７Ｈ７Ｎ２Ｏ５の計算値１９９．０３６。実測値１９９．０３５［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１４３】
化合物４８：化合物４７（２．９、１４．７ｍｍｏｌ）を無水ＭｅＯＨ（３ｍＬ）に室温で溶解した。この溶液にＨ２ＳＯ４（２００μＬ）を滴下し、溶液を６５℃に３日間加熱した。溶液を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）を残渣に添加し、溶液をＡｃＯＥｔ（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機相を１つにまとめ、５％炭酸水素ナトリウム溶液（２×２０ｍＬ）、次いで飽和食塩水溶液（２０ｍＬ）で洗浄した。ＭｇＳＯ４で乾燥させた後、溶媒を濾過し、減圧下で除去して、化合物４８を得た。その化合物をさらに精製することなくその後の合成に使用した（５７ｍｇ、７６％）。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：８．３３（ｄ，１Ｈ，４Ｊ  ３．１，Ｈ５）、８．１９（ｄ，１Ｈ，４Ｊ  ３．１，Ｈ３）、４．０２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３ＣＯ）、２．５７（ｓ，３Ｈ，ｐｙ−ＣＨ３）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６０．８（ＣＯＯＭｅ）、１５２．７（Ｃ６）、１４２．１（Ｃ４）、１４０．５（Ｃ２）、１２１．４（Ｃ５）、１１９．３（Ｃ３）、５３．８（ＯＣＨ３）、１８．３（ｐｙ−ＣＨ３）；ＭＳ  Ｃ８Ｈ９Ｎ２Ｏ５計算値２１３．０５１。実測値２１３．０５０［Ｍ＋Ｈ］＋。
【０１４４】
化合物４９：無水トリフルオロ酢酸（１．４８ｍＬ、１０ｍＬ）を室温で化合物４８（１１４ｍｇ、０．５４ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３（１０ｍＬ）溶液に添加した。混合物を不活性雰囲気中で６０℃に５時間加熱した。この後、反応液を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。この黄色油状物に、ＥｔＯＨ（３ｍＬ）およびＨ２Ｏ（３ｍＬ）を添加し、溶液を室温で２時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、水相をＣＨ２Ｃｌ２（３×３０ｍＬ）で抽出した。有機相を１つにまとめ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、減圧下で蒸発させた。７０／３０から５０／５０へのヘキサン／ＡｃＯＥｔ溶媒のグラジエントを使用したシリカカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製して、化合物４９（７４ｍｇ、６５％）を得た。Ｒｆ（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ，９５／５）＝０．６７；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：８．６８（ｄ，１Ｈ，４Ｊ  ２．１，Ｈ３）、８．３７（ｄ，１Ｈ，４Ｊ  ２．１，Ｈ５）、５．０６（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２ＯＨ）、４．０６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３ＣＯ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１６４．３（ＣＯＯＭｅ）、１６３．６（Ｃ６）、１５５．３（Ｃ４）、１４９．７（Ｃ２）、１１６．４（Ｃ５）、１１６．３（Ｃ３）、６４．５（ＣＨ２ＯＨ）、２９．５（ＣＯ２ＣＨ３）。
【０１４５】
化合物５０ａ：ＮａＨ（１７ｍｇ、０．７０８ｍｍｏｌ）およびチオグリコール酸エチル（３５μＬ、０．３２０ｍｍｏｌ）を不活性雰囲気下、室温で化合物４９（２１．６ｍｇ、０．１０２ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１ｍＬ）溶液に添加した。混合物を不活性雰囲気中、室温で２時間撹拌した。次いで、溶媒を減圧下で除去し、この黄色油状物にＭｅＯＨ（５ｍＬ）およびＨ２ＳＯ４（２００μＬ）を添加した。溶液をアルゴン下で６５℃に７２時間加熱した。溶媒を減圧下で除去し、残渣にＨ２Ｏ（１０ｍＬ）を添加し、水溶液をＡｃＯＥｔ（３×２０ｍＬ）で抽出した。有機相を１つにまとめ、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。溶離液としてＣＨ２Ｃｌ２−ＭｅＯＨ（９８／２）を使用したシリカカラムクロマトグラフィーにより残渣を精製して、化合物５０ａ（８．２ｍｇ、２５％）を得た。Ｒｆ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，９５／５）＝０．３５；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．８８（ｄ，１Ｈ，４Ｊ  １．９，Ｈ５）、７．６３（ｄ，１Ｈ，４Ｊ  １．９，Ｈ３）、４．６９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２ＯＨ）、４．０２（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｓ）、３．９６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３ＣＯ）、３．７６（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３ＣＯ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：１７０．７（ＣＯＯＭｅ）、１６６．４（ＣＯＯＭｅ）、１６３．３（Ｃ２）、１５２．３（Ｃ４）、１４７．８（Ｃ６）、１２１．２（Ｃ５）、１２１．１（Ｃ３）、６５．１（ＣＨ２ＯＨ）、５３．３（ＣＯ２ＣＨ３）、４８．５（ＣＯ２ＣＨ３）、３３．６（ＳＣＨ２）。
【０１４６】
化合物５０ｂ：５０ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物５０ｂを調製した。
【０１４７】
化合物５１ａ：トリエチルアミン（１２．５μＬ、０．０９ｍｍｏｌ）およびＭｓＣｌ（３．５μＬ、０．０４５ｍｍｏｌ）を化合物５０ａ（８．２ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（２ｍＬ）溶液に添加した。この溶液を室温で３．５時間撹拌した。この後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解した。有機相をＨ２Ｏ（３×１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去して、化合物５１ａを定量的に得た。Ｒｆ（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ，９５／５）＝０．８；１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３，δ）：７．９５（ｄ，１Ｈ，４Ｊ  １．５，Ｈ５）、７．５２（ｄ，１Ｈ，４Ｊ  １．５，Ｈ３）、５．３５（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２ＯＭｓ）、３．９８（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２Ｓ）、３．８２（ｓ，２Ｈ，ＣＯＣＨ３）、３．７７（ｓ，２Ｈ，ＣＯＣＨ３）、３．１４（ｓ，３Ｈ，ＳＣＨ３）。
【０１４８】
化合物５１ｂ：５１ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物５１ｂを調製した。
【０１４９】
化合物５２ａ〜ｂ：それぞれ１４ｂおよび１４ｃの合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物５２ａ〜ｂを調製した。
【０１５０】
化合物５３ａ〜ｂ：４６の合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物５３ａ〜ｂを調製した。
【０１５１】
化合物５４ａ〜ｂ：４９の合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物５４ａ〜ｂを調製した。
【０１５２】
化合物５５ａ〜ｄ：５０ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物５５ａ〜ｄを調製した。
【０１５３】
化合物５６ａ〜ｄ：５１ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物５６ａ〜ｄを調製した。
【０１５４】
化合物５７ａ：５７ｂの合成に使用された手順と同じ手順に従ってピリジン１４ａを使用して、化合物５７ａを調製した。
【０１５５】
化合物５７ｂ：無水ＴＨＦ（１ｍＬ）を臭素化誘導体１４ｂ（１０３ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ）に添加し、溶液を３回の凍結融解サイクルにより脱気した。この溶液に、アセチレン誘導体（８０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（０．２４ｍＬ、１．７５ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を再度脱気した。この溶液に、Ｐｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ２（３０ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）およびＣｕＩ（７ｍｇ、０．０３５ｍｍｏｌ）を添加した。この新しい溶液を再度３回脱気し、次いで不活性雰囲気中、６５℃で撹拌した。反応の進行をＴＬＣでモニターした。１８時間後、反応は完了した。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。シリカカラムクロマトグラフィー（０．１％ずつ増加させて０から３％ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により粗生成物を精製して、化合物５７ｂに対応する黄色油状物（１２２ｍｇ、８７％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．９８（ｓ  ｌ，１Ｈ）、７．５０（ｓ  ｌ，１Ｈ）、７．４５（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ）、６．８８（ｄ，Ｊ＝８．９Ｈｚ，２Ｈ）、４．８０（ｓ，２Ｈ）、４．６５（ｓ，２Ｈ）、４．０９（ｍ，１Ｈ）、３．９９（ｓ  ｌ，１Ｈ）、３．８６（ｍ，１Ｈ）、３．７９（ｓ，３Ｈ）、１．７６（ｄ，Ｊ＝１４．９Ｈｚ，３Ｈ）、１．２６（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１６８．９；１６１．０（ｄ，Ｊ＝１９Ｈｚ）、１５８．８；１５３．３（ｄ，Ｊ＝１５５Ｈｚ）、１３３．８；１３２．９（ｄ，Ｊ＝１２Ｈｚ）、１２８．１（ｄ，Ｊ＝２２Ｈｚ）、１２４．２；１１５．１；１１５．０；９５．７；８５．６；６５．２；６４．３；６１．３（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ）、５２．５；１６．５（ｄ，Ｊ＝４Ｈｚ）、１３．５（ｄ，Ｊ＝１０４Ｈｚ）；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：＋３９．５．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２０Ｈ２２ＮＮａＯ６Ｐ［Ｍ＋Ｎａ］＋の計算値、ｍ／ｚ４２６．１０８２  実測値：４２６．１０６３。Ｒｆ＝０．４４（シリカ；ＤＣＭ−ＭｅＯＨ９０：１０）。
【０１５６】
化合物５７ｃ：５７ｂの合成に使用された手順と同じ手順に従ってピリジン１４ｃを使用して、化合物５７ｃを調製した。
【０１５７】
化合物５９ａ：無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）とＴＥＡ（２０ｍＬ）の混合物中にアセチレン誘導体（０．８６４ｇ、３．１ｍｍｏｌ）およびヨウ素誘導体１４ａ（０．７３５ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を加えた溶液を撹拌下、２０分間脱気した。この溶液に、パラジウム（ＩＩ）ビスクロリドビストリフェニルホスフィン（２２ｍｇ、０．０３１ｍｍｏｌ）およびＣｕＩ（１２ｍｇ、０．０６３ｍｍｏｌ）を添加した。反応液を室温で１２時間撹拌した。反応の進行をＴＬＣでモニターした。この後、反応は完了した。溶媒を減圧下で除去した。残渣に飽和塩化アンモニウム溶液（５０ｍＬ）を添加し、混合物をＤＣＭ（２×２５ｍＬ）で抽出した。有機相を１つにまとめ、飽和塩化アンモニウム溶液（５０ｍＬ）、次いで飽和ＮａＣｌ溶液（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いでＭｇＳＯ４で乾燥させた。濾過後、溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカカラムクロマトグラフィー（９８／２のＤＣＭ／ＭｅＯＨ）により精製して、白色固体として化合物５９ａ（０．９１ｇ、８２％）を得た。ＰｔＦ：１４３〜１４４℃。１Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．０４（ｓ，１Ｈ）、７．５８（ｓ，１Ｈ）、７．４５（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ）、６．８６（ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ，２Ｈ）、４．８３（ｄ，Ｊ＝５．４Ｈｚ，２Ｈ）、４．７５（ｓ，１Ｈ）、４．０１（ｔ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ）、３．９７（ｓ，３Ｈ）、３．３１（ｔｄ，Ｊ＝６．１；６．１Ｈｚ，２Ｈ）、１．９６（ｍ，Ｊ＝６．１Ｈｚ，２Ｈ）、１．４１（ｓ，９Ｈ）。１３Ｃ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１６５．４；１６０．８；１６０．１；１５６．２；１４７．３；１３４．１；１３３．８；１２５．８；１２５．４；１１４．９；１１３．９；９５．９；８５．４；６６．１；６４．８；５３．２；３８．１；２９．７；２８．６．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２４Ｈ２８Ｎ２Ｏ６［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値、ｍ／ｚ４４１．２０２０、実測値：４４１．２０２１。Ｒｆ＝０．３２（シリカ，ＤＣＭ−ＭｅＯＨ９６：４）。
【０１５８】
化合物５９ｂ：無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）を臭素化誘導体１４ｂ（２００ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）に添加し、溶液を３回の凍結融解サイクルにより脱気した。この溶液に、アセチレン誘導体（２６０ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（５ｍＬ）を添加し、溶液を再度脱気した。この溶液に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（７９ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）およびＣｕＩ（１３ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を添加した。この新しい溶液を再度３回脱気し、次いで不活性雰囲気中、６５℃で撹拌した。反応の進行をＴＬＣでモニターした。１時間後、反応は完了した。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＤＣＭ（２５ｍＬ）中に希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液（２５ｍＬ）、次いで水（２５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得た。シリカカラムクロマトグラフィー（１％ずつ増加させて０から５％ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）によりその残渣を精製して、化合物５９ｂに対応する黄色油状物（２２０ｍｇ、６６％）を得た。ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ２５Ｈ３４Ｎ２Ｏ６Ｐ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値、ｍ／ｚ４８９．２１４９、実測値：４８９．２１５２。Ｒｆ＝０．３５（シリカ、ＤＣＭ−ＭｅＯＨ、９５：５）。
【０１５９】
化合物５９ｃ：無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）を臭素化誘導体１４ｃ（１４２ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）に添加し、溶液を３回の凍結融解サイクルにより脱気した。この溶液に、アセチレン誘導体（１４７ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）およびＴＥＡ（５ｍＬ）を添加し、溶液を再度脱気した。この溶液に、Ｐｄ（ＰＰｈ３）４（４６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）およびＣｕＩ（７．６ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加した。この新しい溶液を再度３回脱気し、次いで不活性雰囲気中、６５℃で撹拌した。反応の進行をＴＬＣでモニターした。１時間後、反応は完了した。反応混合物を室温に冷却し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をＤＣＭ（２５ｍＬ）中に希釈し、飽和塩化アンモニウム水溶液（２５ｍＬ）、次いで水（２５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、残渣を得た。シリカカラムクロマトグラフィー（０．５％ずつ増加させて０から３％ＤＣＭ／ＭｅＯＨ）によりその残渣を精製して、化合物５９ｃに対応する黄色油状物（１５４ｍｇ、７０％）を得た。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：８．０１（ｄｄ，Ｊ＝６．４；２．０Ｈｚ，１Ｈ）、７．８９（ｄｄ，Ｊ＝８．４；１２．４Ｈｚ，２Ｈ）、７．４８（ｔ，Ｊ＝８．４Ｈｚ，１Ｈ）、７．４０（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、７．３９（ｔｄ，Ｊ＝８．４；４．２Ｈｚ，２Ｈ）、７．３３（ｄ，Ｊ＝２．０Ｈｚ，１Ｈ）、６．８１（ｄ，Ｊ＝８．８Ｈｚ，２Ｈ）、４．７３（ｓ，１Ｈ）、４．６９（ｓ，２Ｈ）、４．０８（ｑｄ，Ｊ＝５．６；４．８Ｈｚ，２Ｈ）、３．９７（ｔ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ）、３．２６（ｍ，２Ｈ）、１．９２（ｑ，Ｊ＝６Ｈｚ，２Ｈ）、１．３７（ｓ，９Ｈ，１．３１（ｔ，Ｊ＝５．６Ｈｚ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１６０．３（ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ）、１５９．８；１５６．０；１５３．２（ｄ，Ｊ＝１６４Ｈｚ）；１３３．７；１３３．０（ｄ，Ｊ＝１１Ｈｚ）；１３２．６（ｄ，Ｊ＝５Ｈｚ）；１３２．３（ｄ，Ｊ＝１０Ｈｚ）；１２９．６（ｄ，Ｊ＝１３８Ｈｚ）；１２８．６（ｄ，Ｊ＝１８Ｈｚ）；１２８．５（ｄ，Ｊ＝９Ｈｚ）；１２３．８（ｄ，Ｊ＝３Ｈｚ）；１１４．７；１１３．８；９６．０；８５．３（ｄ，Ｊ＝２Ｈｚ）；７９．３；６５．９；６３．８；６１．９（ｄ，Ｊ＝６Ｈｚ）；３７．９；２９．５；２８．４；１６．６；３１Ｐ  ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：＋２５．６．ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ３０Ｈ３６Ｎ２Ｏ６Ｐ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値、ｍ／ｚ５５１．２３０６  実測値：５５１．２３０５。Ｒｆ＝０．２４（シリカ，ＤＣＭ−ＭｅＯＨ，９５：５）。
【０１６０】
化合物６０ａ：アルコール５９ａ（１９５ｍｇ、０．４４ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（７ｍＬ）溶液にＴＥＡ（０．２ｍＬ、１４８μｍｏｌ）を不活性雰囲気下で滴下した。４℃に冷却したこの混合物にＭｓＣｌ（６７μＬ、０．８４ｍｍｏｌ）を滴下した。反応の進行をＴＬＣでモニターした。５分後、反応は完了した。溶媒を減圧下で除去した。残渣をＤＣＭ（１０ｍＬ）に溶解し、この溶液を水（２×１０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、黄緑色油状物（２４０ｍｇ、定量的）を得た。生成物６０ａは、さらに精製することなくその後の合成に使用するのに十分な程度に純粋であった。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ＋）：Ｃ２５Ｈ３１Ｎ２Ｏ８Ｓ［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値、ｍ／ｚ５１９．１８０１、実測値：５１９．１３。Ｒｆ＝０．６（シリカ、ＤＣＭ−ＭｅＯＨ  ９６：４）。
【０１６１】
化合物６０ｂ〜ｃ：６０ａの合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物６０ｂ〜ｃを調製した。
【０１６２】
化合物６１ａ〜ｃ：６１ｄの合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物６１ａ〜ｃを調製した。
【０１６３】
化合物６１ｄ：化合物１（８１ｍｇ、０．３５３ｍｍｏｌ）の無水ＴＨＦ（１０ｍＬ）溶液に、無水ＭｅＣＮ（１０ｍＬ）中に溶解した化合物１７ａ（２３４ｍｇ、０．７０６ｍｍｏｌ）と炭酸カリウム（１９５ｍｇ、１．４１３ｍｍｏｌ）とを一度に添加した。反応液を６０℃で終夜撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ−ＭＳ（グラジエントＡ）でモニターした。この後、反応は完了した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）中に希釈し、水（２５ｍＬ×２）、次いで飽和ＮａＣｌ水溶液（２５ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮した。９６／４から９０／１０へのＤＣＭ／ＭｅＯＨ溶媒グラジエントを使用したシリカカラムクロマトグラフィーにより粗生成物を精製して、白色粉末の形態で化合物６１ｄ（６７ｍｇ、２７％）を得た。
ＨＰＬＣグラジエントＡ−Ｒｔ＝２．９１分−［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ７００．５４−ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ３５Ｈ５０Ｎ５Ｏ１０＋［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値、ｍ／ｚ７００．３５５２、実測値：７００．３５６０−１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．８５（ｓ，２Ｈ）、７．６９（ｓ，１Ｈ）、７．５７（ｓ，１Ｈ）、４．００（ｓ，３Ｈ，Ｐｙ−ＣＯＯＭｅ）、３．９７（ｓ，１０Ｈ）、３，（ｓ，３Ｈ，ＯＭｓ）、３．６６（ｓ，６Ｈ）、３（ｍ，２０Ｈ）、１．４５（ｓ，９Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１７２．４８；１７２．３９；１６５．９０；１６１．４８；１５５．６８；１５１．１３；１４７．５５；１４７．４３；１２６．２７；１２３．７０；７９．２９；６３．５６；６３．４０；５７．１５；５４．８４；５４．６６；５４．３５；５２．８８；５１．８４；５１．８０；５０．０９；４９．５０；３４．０７；３３．９３；３０．１１；３０．０６；２９．６８；２８．５６。
【０１６４】
化合物６１ｅ〜ｓ：６１ｄの合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物６１ｅ〜ｓを調製した。
【０１６５】
化合物６２ａ〜ｃ：６２ｄの合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物６２ａ〜ｃを調製した。
【０１６６】
化合物６２ｄ：２５ｍＬのフラスコ中で、化合物６１ｄ（６７ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５００μＬ）に可溶化して、無色溶液を得た。反応混合物にＴＦＡ（５００μＬ、６．５３ｍｍｏｌ）を一度に添加した。反応液を室温で３０分間撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ−ＭＳ（グラジエントＡ）でモニターした。この後、反応は完了した。反応混合物を減圧下で濃縮して、白色粉末（５７ｍｇ）を得た。その白色粉末をその後の手順において使用した。１００ｍＬのフラスコ中で、化合物６０ａ（７６ｍｇ、０．１４７ｍｍｏｌ）と、２バッチをまとめたものから事前に得られた白色粉末（８７．４ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ）とを無水ＭｅＣＮ（３０ｍＬ）に可溶化して、無色溶液を得た。反応混合物に炭酸カリウム（１６．９２ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ）を一度に添加した。反応液を６５℃で終夜撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ−ＭＳ（グラジエントＡ）でモニターし、この後、反応は完了した。反応混合物を減圧下で濃縮し、ＤＣＭ（５０ｍＬ）中に希釈し、水（２×４０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＭｇＳＯ４で乾燥させ、濾過し、減圧下で濃縮して、白色粉末の形態で化合物６２ｄ（１０．８ｍｇ、１０．６μｍｏｌ、９％）を得た。ＨＰＬＣグラジエントＡ−Ｒｔ＝２．９１分−［Ｍ＋Ｈ］＋、ｍ／ｚ１０２２．６５−ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５４Ｈ６７Ｎ７Ｏ１３Ａｇ＋［Ｍ＋Ａｇ］＋の計算値、ｍ／ｚ１１２８．３８４２、実測値：１１２８．３８４３。
【０１６７】
化合物６２ｅ〜ｓ：６２ｄの合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物６２ｅ〜ｓを調製した。
【０１６８】
化合物６４ａ〜ｃ：６４ｄの合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物６４ａ〜ｃを調製した。
【０１６９】
化合物６４ｄ：５０ｍＬのフラスコ中で、化合物６２ｄ（１０．８ｍｇ、１０．５７μｍｏｌ）を水（４ｍＬ）に可溶化して、無色懸濁液を得た。反応混合物にＬｉＯＨ（１．２９１ｍｇ、０．０５３ｍｍｏｌ）を一度に添加した。反応液を室温で１時間撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ−ＭＳ（グラジエントＡ）でモニターした。この後、脱保護は完了した。反応混合物のｐＨを１Ｍ  ＨＣｌで７に調整した。反応混合物（化合物６３ｄ）に塩化ユウロピウム６水和物（５．８１ｍｇ、１５．８５μｍｏｌ）を一度に添加した。反応液を室温で１時間撹拌し、この後、反応は完了した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（グラジエントＢ）により直接精製し、白色粉末の形態で化合物６４ｄ（６．３２ｍｇ、５．７４μｍｏｌ、５４％）を得た。ＨＰＬＣグラジエントＡ−Ｒｔ＝２．６２分−［Ｍ−２Ｈ］＋、ｍ／ｚ１１０２．６２−ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ４９Ｈ５５ＥｕＮＯ１３＋［Ｍ−２Ｈ］＋の計算値、ｍ／ｚ１１００．３０５１、実測値：１１００．３０６４。
【０１７０】
化合物６４ｅ〜ｓ：６４ｄの合成に使用された手順と同じ手順に従って、化合物６４ｅ〜ｓを調製した。
【０１７１】
錯体６５ｄ−Ｅ２：２５ｍＬのフラスコ中で、化合物６４ｄ（６．３２ｍｇ、５．７４μｍｏｌ）を無水ＤＭＳＯ（１ｍＬ）に可溶化して、無色溶液を得た。反応混合物に、３−アミノ−１−プロパンスルホン酸（３．２９ｍｇ、２２．９６μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４μＬ、２３μｍｏｌ）およびＨＡＴＵ（６．７５ｍｇ、１７．２μｍｏｌ）を一度に添加した。反応液を室温で１５分間撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ−ＭＳ（グラジエントＣ）でモニターし、この後、反応は完了した。反応混合物を分取ＨＰＬＣ（グラジエントＤ）により直接精製し、白色粉末の形態で可溶性錯体６５ｄ−Ｅ２（５．８７ｍｇ、４．３７μｍｏｌ、７６％）を得た。ＨＰＬＣグラジエントＣ−Ｒｔ＝２．１９分−［Ｍ−２Ｈ］＋、ｍ／ｚ１３４５．２６−ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５５Ｈ７０ＥｕＮ９Ｏ１７Ｓ２２＋［Ｍ−Ｈ］２＋の計算値、ｍ／ｚ６７２．６７６８、実測値：６７２．６７６９。
【０１７２】
錯体６６ｄ−Ｅ２：２５ｍＬのフラスコ中で、錯体６５ｄ−Ｅ２（５．６４ｍｇ、４．２μｍｏｌ）をＴＦＡ（２００μＬ）に可溶化して、黄色溶液を得た。反応液を室温で３０分間撹拌した。反応の進行をＵＰＬＣ−ＭＳ（グラジエントＣ）でモニターした。この後、脱保護は完了した。反応混合物を減圧下で濃縮し、分取ＨＰＬＣ（グラジエントＥ）により精製し、白色粉末の形態で錯体６６ｄ−Ｅ２（２．１６μｍｏｌ、５１％）を得た。ＨＰＬＣグラジエントＣ−Ｒｔ＝１．３６分−［Ｍ−２Ｈ］＋、ｍ／ｚ１２４３．４５−ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋）Ｃ５０Ｈ６２ＥｕＮ９Ｏ１５Ｓ２２＋［Ｍ−Ｈ］２＋の計算値、ｍ／ｚ６２２．６５０６、実測値：６２２．６５０３。
【０１７３】
錯体６６ｄ−Ｅ２のＵＶスペクトル、クロマトグラムおよび質量スペクトルをそれぞれ図１〜３に示す。
【０１７４】
錯体６６ｄ−Ｅ２と、国際公開第２０１４／１１１６６１号の記載に従って合成され、その構造が以下に示されたスリーアンテナ錯体（ＴＡＣＮ−Ｐｈｏｓ−トリアンテナおよびＴＡＣＮ−Ｃａｒｂｏ−トリアンテナ）の光物理的特性を決定した。
【０１７５】
【化３０】
2020523411.tif 000032
【０１７６】
下記表からわかるように、錯体６６ｄ−Ｅ２の輝度は、３個のアンテナを有するＴＡＣＮ−Ｐｈｏｓ−トリアンテナおよびＴＡＣＮ−Ｃａｒｂｏ−トリアンテナ錯体の輝度より低い。
【０１７７】
【表１】
2020523411.tif 000033
【０１７８】
以下のプロトコルに従って、６６ｄ−Ｅ２およびＴＡＣＮ−Ｐｈｏｓ−トリアンテナ錯体の効率も試験した。当業者に公知の通常の方法を使用して、各錯体をＮＨＳエステル（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）として官能化した。６６ｄ−Ｅ２−ＮＨＳ錯体またはＴＡＣＮ−Ｐｈｏｓトリアンテナ−ＮＨＳ錯体を使用して、１バッチの抗グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（抗ＧＳＴ）抗体を標識した。ＴＡＣＮ−Ｐｈｏｓトリアンテナ錯体（抗ＧＳＴ−ＴＡＣＮ−Ｐｈｏｓ−トリアンテナ）および錯体６６ｄ−Ｅ２（抗ＧＳＴ−６６ｄ−Ｅ２）の両方とも、平均の抗体結合錯体数は７である。
【０１７９】
ユウロピウム錯体６６ｄ−Ｅ２で標識された抗ＧＳＴ抗体（抗ＧＳＴ−６６ｄ−Ｅ２）またはユウロピウムＴＡＣＮ−Ｐｈｏｓ−トリアンテナ錯体で標識された抗ＧＳＴ抗体（抗ＧＳＴ−ＴＡＣＮ  Ｐｈｏｓ−トリアンテナ）を時間分解蛍光に基づくイムノアッセイ（図４に示す）において使用して、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−ビオチン（ＧＳＴ−ビオチン）タンパク質を検出した。３８４ウェルプレート中で所定濃度の抗ＧＳＴ−６６ｄ−Ｅ２または抗ＧＳＴ−ＴＡＣＮ  Ｐｈｏｓ−トリアンテナおよび５ｎｍのストレプトアビジン−ｄ２（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社製品番号６１０ＳＡＤＬＢ）の存在下、ＢＳＡを含むリン酸緩衝液中に希釈した様々な濃度のＧＳＴ−ビオチンを３連で測定し、インキュベーション２時間後にＰｈｅｒａｓｔａｒ  ＦＳ蛍光リーダー（ＢＭＧ−ｌａｂｔｅｃｈ社）でＨＴＲＦモードにて読み取った。結果を図５に示す。２つの標識抗体について、ＧＳＴ−ビオチンを検出する。驚いたことに、また予想外なことに、抗ＧＳＴ−６６ｄ−Ｅ２抗体を使用したイムノアッセイの性能は、抗ＧＳＴ−ＴＡＣＮ  ｐｈｏｓ−トリアンテナの性能よりも優れている。すなわち、単一アンテナ蛍光プローブは、３個のアンテナを有するプローブに比べて、輝度が３分の１であるにもかかわらず、高いＦＲＥＴ能を有する。
【０１８０】
この結果を確認するために、環状アデノシン一リン酸（ｃＡＭＰ）を認識する抗体を使用して、別のイムノアッセイを行った。このために、抗ｃＡＭＰ抗体を６６ｄ−Ｅ２−ＮＨＳ錯体で標識して、平均して６．５個の錯体／抗体を有する抗ｃＡＭＰ−６６ｄ−Ｅ２コンジュゲートを得た。同じバッチの抗体をＴＡＣＮ−Ｃａｒｂｏ−トリアンテナＮＨＳ錯体で標識し、平均して６．６個の錯体／抗体を有する抗ｃＡＭＰ−ＴＡＣＮ−Ｃａｒｂｏ−トリアンテナコンジュゲートを得た。
【０１８１】
試験の原理を図６に示す。時間分解蛍光を検出法として使用した競合試験において、両方のコンジュゲートを使用した。ユウロピウム錯体で標識された抗ｃＡＭＰは、時間分解蛍光シグナルを生じることによって、フルオロフォアｄ２とコンジュゲーションしたｃＡＭＰ（ｃＡＭＰ、Ｇｓ−ダイナミックキット、Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社（ｒｅｆ  ６２１Ｍ４ＰＥＣ））を認識する。様々なｃＡＭＰ濃度において、ｃＡＭＰ−ｄ２の置換が可能であり、それによりシグナルが緩やかに低下する。
【０１８２】
３８４ウェルプレート中でウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下のリン酸緩衝液中のｃＡＭＰ−ｄ２の存在下、様々なｃＡＭＰ濃度とし、明確に定めた濃度の抗ｃＡＭＰ−６６ｄ−Ｅ２および抗ｃＡＭＰ−ＴＡＣＮ−Ｃａｒｂｏ−トリアンテナコンジュゲートの両方を３連で使用し、インキュベーション１時間後にＰｈｅｒａｓｔａｒ  ＦＳプレートリーダー（ＢＭＧ−ｌａｂｔｅｃｈ社）でＨＴＲＦモードにて読み取った。ＦＲＥＴシグナル阻害応答を図７に示す。この第２の例において、またもや驚いたことに、抗ｃＡＭＰ−６６ｄ−Ｅ２コンジュゲートの性能は、抗ｃＡＭＰ−ＴＡＣＮ−Ｃａｒｂｏ−トリアンテナコンジュゲートの性能よりも優れている。すなわち、単一アンテナ蛍光プローブは、３個のアンテナを有するプローブに比べて、輝度が半分であるにもかかわらず、高いＦＲＥＴ能を有する。
【０１８３】
１または２個のフェニルエチニルピリジン発色団を有するＴＡＣＮ大環状分子からなる錯化剤は、ランタニドと安定な錯体を形成するものであり、所望の分子の蛍光性コンジュゲートを作製するために使用することができる。本発明に係るランタニド錯体は、特にそれらの量子収量、それらの発光寿命、およびそれらの励起スペクトル（約３３７ｎｍでのレーザー励起に非常によく適している）に関して、優れた光物理的特性を有する。さらに、それらの発光スペクトルのバンド分布は約６２０ｎｍを中心としており、それにより、シアニン型またはアロフィコシアニン型アクセプター（Ｃｉｓｂｉｏ  Ｂｉｏａｓｓａｙｓ社販売のＸＬ６６５など）と共にＦＲＥＴを使用した場合に並はずれた非常に好ましい特性が錯体に付与される。これらの錯体は、大部分の二価のカチオン（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋など）またはＥＤＴＡを含む生物学的媒体において安定性が高いため、それらの発光は優れたままである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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