(57)【要約】本明細書で提供されるのは、ポリヌクレオチドを含有するライブラリーであり、ポリヌクレオチドのうちの１つは、特定の超可変領域ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖をコードする。本明細書で更に提供されるのは、複数のユニーク抗体をコードするポリヌクレオチドを含有するライブラリーであり、各抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。また、それに関する抗体、ポリペプチドライブラリー、ベクターライブラリー、細胞、非ヒト動物、抗体軽鎖、抗体ライブラリーの作製方法、キット、及び二重特異性抗体の生成方法も提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリヌクレオチドを含むライブラリーであって、前記ポリヌクレオチドのうちの１つは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードし、前記抗体軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、前記ライブラリー。
【請求項２】
前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも１０が、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域をコードし、前記抗体軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドのそれぞれが、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖をコードし、前記抗体軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項４】
前記ポリヌクレオチドが、約１０００未満のＨＶＲ−Ｌ１配列、ＨＶＲ−Ｌ２配列、及びＨＶＲ−Ｌ３配列のユニークな組み合わせを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項５】
前記ポリヌクレオチドが、約２８０以下のＨＶＲ−Ｌ１配列、ＨＶＲ−Ｌ２配列、及びＨＶＲ−Ｌ３配列のユニークな組み合わせを含む、請求項４に記載のライブラリー。
【請求項６】
前記軽鎖可変領域が、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む前記抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項７】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１を含み、前記抗体のＨＶＲ−Ｌ２が、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項８】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む前記抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項９】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項１０】
前記軽鎖可変領域が、（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１３）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１４）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１６）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１１】
前記軽鎖可変領域が、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１２】
前記軽鎖可変領域が、表２に列挙される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１３】
前記軽鎖可変領域が、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ３と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ４と、を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項１４】
前記軽鎖可変領域が、配列番号２８〜５０からなる群から選択される配列を含む、請求項１に記載のライブラリー。
【請求項１５】
前記ポリヌクレオチドが、全長抗体軽鎖をコードする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項１６】
抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを更に含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項１７】
抗体重鎖可変領域をコードする前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのユニーク配列、少なくとも１００のユニーク配列、少なくとも１０００のユニーク配列、または少なくとも約１０９のユニーク配列を含む、請求項１６に記載のライブラリー。
【請求項１８】
複数のユニーク抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、ライブラリーであって、各抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、前記複数の各抗体の前記軽鎖可変領域は、同一の配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、前記ライブラリー。
【請求項１９】
前記軽鎖可変領域が、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む、請求項１７に記載のライブラリー。
【請求項２０】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１を含み、前記抗体のＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載のライブラリー。
【請求項２１】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む、請求項１７に記載のライブラリー。
【請求項２２】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む、請求項１７に記載のライブラリー。
【請求項２３】
前記軽鎖可変領域が、（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１３）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１４）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１６）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む、請求項１７に記載のライブラリー。
【請求項２４】
前記軽鎖可変領域が、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む、請求項１７に記載のライブラリー。
【請求項２５】
前記軽鎖可変領域が、表２に列挙される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１７に記載のライブラリー。
【請求項２６】
前記軽鎖可変領域が、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ３と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ４と、を含む、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２７】
前記軽鎖可変領域が、配列番号２８〜５０からなる群から選択される配列を含む、請求項１７に記載のライブラリー。
【請求項２８】
前記ライブラリー中の前記抗体の前記重鎖可変領域が、少なくとも１つのユニーク配列、少なくとも１００のユニーク配列、少なくとも１０００のユニーク配列、または少なくとも約１０９のユニーク配列を有する、請求項１７〜２７のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項２９】
前記ライブラリーの前記ポリヌクレオチドが合成ポリヌクレオチドである、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項３０】
前記抗体軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つが、構造決定及び／またはコンピューターモデリングによって評価されたとき、複数の立体構造を取る、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項３１】
前記抗体軽鎖可変領域をコードする前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ベクター中にある、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項３２】
前記ベクターが、発現ベクターである、請求項３１に記載のライブラリー。
【請求項３３】
前記ベクターが、ディスプレイベクターである、請求項３１に記載のライブラリー。
【請求項３４】
前記抗体軽鎖可変領域をコードする前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、細胞中にある、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項３５】
前記細胞が、細菌、酵母、または哺乳類の細胞である、請求項３４に記載のライブラリー。
【請求項３６】
ポリヌクレオチドを含む非ヒト動物であって、前記ポリヌクレオチドのうちの１つは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードし、前記抗体軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、前記非ヒト動物。
【請求項３７】
前記非ヒト動物が、哺乳類である、請求項３６に記載の非ヒト動物。
【請求項３８】
表面上に提示された少なくとも１つのポリペプチドを含むファージであって、前記少なくとも１つのポリペプチドは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含み、前記抗体軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、前記ファージ。
【請求項３９】
ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体軽鎖であって、前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、前記抗体軽鎖。
【請求項４０】
前記軽鎖可変領域が、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む前記抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む、請求項３９に記載の抗体軽鎖。
【請求項４１】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１を含み、前記抗体のＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の抗体軽鎖。
【請求項４２】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む、請求項３９に記載の抗体軽鎖。
【請求項４３】
前記軽鎖可変領域が、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む、請求項３９に記載の抗体軽鎖。
【請求項４４】
前記軽鎖可変領域が、（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１３）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１４）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１６）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む、請求項３９に記載の抗体軽鎖。
【請求項４５】
前記軽鎖可変領域が、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む、請求項３９に記載の抗体軽鎖。
【請求項４６】
前記軽鎖可変領域が、表２に列挙される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む、請求項３９に記載の抗体軽鎖。
【請求項４７】
前記軽鎖可変領域が、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ３と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ４と、を含む、請求項３９〜４６のいずれか１項に記載の抗体軽鎖。
【請求項４８】
前記軽鎖可変領域が、配列番号２８〜５０からなる群から選択される配列を含む、請求項３９に記載の抗体軽鎖。
【請求項４９】
前記抗体軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つが、構造決定及び／またはコンピューターモデリングによって評価されたとき、複数の立体構造を取る、請求項３９〜４８のいずれか１項に記載の抗体軽鎖。
【請求項５０】
重鎖及び軽鎖を含む抗体であって、前記軽鎖が、請求項３９〜４９のいずれか１項に記載の軽鎖である、前記抗体。
【請求項５１】
前記抗体が、約１０−７〜約１０−１１Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）で、少なくとも１つの標的に結合する、請求項５０に記載の抗体。
【請求項５２】
抗原結合ドメインを含むライブラリーであって、前記抗原結合ドメインのうちの１つは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域を含み、前記抗体軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、前記ライブラリー。
【請求項５３】
前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変領域を更に含む、請求項５２に記載のライブラリー。
【請求項５４】
前記ライブラリーがファージを含み、前記抗原結合ドメインが前記ライブラリーの少なくとも１つのファージの表面上に提示される、請求項５２または５３に記載のライブラリー。
【請求項５５】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載のライブラリーのポリヌクレオチド配列を準備し、組み立てることを含む、ライブラリーの調製方法。
【請求項５６】
（ａ）複数の立体構造を有する配列を含む、１つ、２つまたは３つの軽鎖ＨＶＲを選択するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチド配列を組み立てて、複数の抗体軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成するステップと、を含む、抗体ライブラリーの作製方法。
【請求項５７】
前記抗体軽鎖可変領域配列が、ヒト抗体配列である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体軽鎖可変領域が、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、前記軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
２つの抗体重鎖可変領域及び２つの同一の軽鎖可変領域を含む、二重特異性抗体の生成方法であって、
（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインをスクリーニングすることであって、前記第１の抗原結合ドメインは、第１の抗体重鎖可変領域及び第１の抗体軽鎖可変領域を含み、前記第１の抗体軽鎖可変領域は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、前記抗体軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、前記スクリーニングすることと、
（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインをスクリーニングすることであって、前記第２の抗原結合ドメインは、第２の抗体重鎖可変領域及び第２の抗体軽鎖可変領域を含み、前記第２の抗体軽鎖可変領域は、前記第１の抗体軽鎖可変領域と同じ配列を有する、前記スクリーニングをすることと、
（ｃ）前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体を生成することと、を含む、
前記生成方法。
【請求項６０】
二重特異性抗体であって、（ａ）第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域を含む第１の結合ドメインであって、第１の標的に結合する、前記第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域を含む第２の結合ドメインであって、前記第２の結合ドメインは、第２の標的に結合し、前記第２の軽鎖可変領域は、前記第１の軽鎖可変領域配列と同一の配列を有する、前記第２の結合ドメインと、を含み、前記第１及び第２の軽鎖可変領域のそれぞれは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、前記二重特異性抗体。
【請求項６１】
前記第１の重鎖可変領域が、第１の重鎖定常領域に連結され、前記第２の重鎖可変領域が、第２の重鎖定常領域に連結され、前記第１の抗体軽鎖可変領域が、第１の軽鎖定常領域に連結され、前記第２の抗体軽鎖可変領域が、第２の軽鎖定常領域に連結され、前記第１及び前記第２の抗体軽鎖が、同一の配列を有する、請求項６０に記載の二重特異性抗体。
【請求項６２】
請求項１〜３５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドのライブラリーを含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、抗体軽鎖（例えば、ダイナミックヒト抗体の軽鎖）をコードするポリヌクレオチドを含有するライブラリー、ならびにそれに関する抗体軽鎖、抗体、細胞、動物、方法、及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
モノクローナル抗体は、生物学的研究、医学的診断、及び医薬品を含む、様々な分野で非常に有用なものとなった。その潜在的な結合特異性の多様性により、有益な特異性及び能力を持つ抗体ができる。しかしながら、この多様性のために、膨大な数の抗体をスクリーニングして、所望の特性を有する１つ以上の抗体を特定するのは、困難であり手のかかるものである。
【０００３】
目的の抗体を特定する１つの方法は、クローニングしたＢ細胞配列のライブラリー、ファージディスプレイライブラリー、酵母ディスプレイライブラリーなどの抗体ライブラリーをスクリーニングすることである。これらのライブラリーにより、多数のユニーク抗体配列を表す多数の抗体をスクリーニングして、目的の特異的性質、例えば、特定の標的への結合、結合親和性、選択性などを有する抗体を特定することができる。しかしながら、現在のライブラリーには、特定の制限がある。ヒトＢ細胞レパートリーなどの生物源に由来するライブラリーは、その生物源からクローニングすることができる抗体配列に限られる。合成ライブラリーは、生物学的に得られたライブラリーと比較して、非天然配列を含み得るが、これについても、特定の時間枠で合成することができる抗体の量という制限がある。更に、非常に大きなライブラリーには、より多くの時間と、網羅的なスクリーニングアプローチが必要であり、そうでなければ、目的の抗体について、ライブラリーのごく一部しか実際にスクリーニングすることができない。
【０００４】
したがって、潜在的に機能関連性の高いダイナミック抗体を設計及び構築するために、明確に定義された開発可能な配列プロファイルを有する、十二分な一連のダイナミックユニットを含有するダイナミック抗体ライブラリーの開発が必要とされている。そのようなライブラリーは、ライブラリー中の抗体上の抗体結合部位の多様性だけでなく、所与の抗原上の新規エピトープ及び／または立体構造エピトープを備える抗体スクリーニングの効率も大きく改善させるだろう。更に、そのようなライブラリーにより、高い親和性及び開発可能性プロファイルを有する目的の特定の抗体が特定される可能性が高まるだろう。
【０００５】
本明細書で引用される全ての参考文献は、特許出願、特許公報、非特許文献及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔアクセッション番号を含め、それぞれの個々の参考文献が参照により援用されることが具体的かつ個別に示される場合と同様に、その全体が参照により本明細書に援用される。
【発明の概要】
【０００６】
上記及び他の必要性を満たすために、本明細書で開示されるのは、ダイナミックヒト抗体を可能にする、軽鎖超可変領域（ＨＶＲ）及び軽鎖可変領域（例えば、ＶＬ領域）などの抗体配列である。これらの配列は、高い能力で標的に結合し、及び／または複数の有用なエピトープを認識し、及び／または低い配列同一性（およそ６０％以下の配列同一性）で異なる種間で共有されるエピトープと交差反応することができる、柔軟性の高いＨＶＲ配列ループを有する抗体ができるように設計された。有利には、これらの抗体配列により、より小さなライブラリーでありながら、多数の有用な抗体を含有し、及び／または所与のライブラリーサイズで多様性がはるかに大きいライブラリーの作製が可能となる。そのようなライブラリーは、広範囲の標的に特異的である目的の新規抗体、またはいくつかの場合では、目的の複数の標的と交差反応する新規抗体を特定するために使用することができる。
【０００７】
したがって、一態様において、本明細書で提供されるのは、ポリヌクレオチド（例えば、合成ポリヌクレオチド）を含むライブラリーであり、当該ポリヌクレオチドのうちの１つは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードし、当該抗体軽鎖可変領域のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも２５０、または２８０は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域をコードし、当該抗体軽鎖可変領域のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドのそれぞれは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖をコードし、当該ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、約１０００未満のＨＶＲ−Ｌ１配列、ＨＶＲ−Ｌ２配列、及びＨＶＲ−Ｌ３配列のユニークな組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、約２８０以下のＨＶＲ−Ｌ１配列、ＨＶＲ−Ｌ２配列、及びＨＶＲ−Ｌ３配列のユニークな組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１を含み、抗体のＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変領域のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つは、構造決定及び／またはコンピューターモデリングによって評価されたとき、複数の立体構造を取る。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、ベクター中にある。いくつかの実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、ディスプレイベクターである。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、細胞中にある。いくつかの実施形態において、細胞は、細菌、酵母、または哺乳類の細胞（例えば、非ヒト動物細胞または単離ヒト細胞）である。
【０００９】
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１３）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１４）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１６）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、表２に列挙される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ３と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ４と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２８〜５０からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、全長抗体軽鎖をコードする。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを更に含む。いくつかの実施形態において、抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも１つのユニーク配列、少なくとも１００のユニーク配列、少なくとも１０００のユニーク配列、または少なくとも約１０９のユニーク配列を含む。
【００１１】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、複数のユニーク抗体をコードするポリヌクレオチド（例えば、合成ポリヌクレオチド）を含むライブラリーであり、各抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、複数の各抗体の軽鎖可変領域は、同一の配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、当該ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１を含み、抗体のＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１３）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１４）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１６）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、表２に列挙される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ３と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ４と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２８〜５０からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中の抗体の重鎖可変領域は、少なくとも１つのユニーク配列、少なくとも１００のユニーク配列、少なくとも１０００のユニーク配列、または少なくとも約１０９のユニーク配列を有する。いくつかの実施形態において、ライブラリーのポリヌクレオチドは、合成ポリヌクレオチドである。
【００１３】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、先行実施形態のいずれかに記載のライブラリーに由来するポリヌクレオチド（例えば、合成ポリヌクレオチド）によって発現されるポリペプチドを含む抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、約１０−７及び約１０−１１Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）で、少なくとも１つの標的に結合する。
【００１４】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、ポリペプチドを含むライブラリーであって、当該ポリペプチドのうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５など）は、先行実施形態のいずれかに記載のポリヌクレオチド（例えば、合成ポリヌクレオチド）ライブラリーのポリヌクレオチドによってコードされる、当該ライブラリーである。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのうちの少なくとも２つは、ポリヌクレオチドライブラリーのポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのうちの少なくとも１００は、ポリヌクレオチドライブラリーのポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、ポリペプチドのそれぞれは、ポリヌクレオチドライブラリーのポリヌクレオチドによってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのポリペプチドは、軽鎖可変ドメインである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのポリペプチドは、ファージの表面上に提示される。いくつかの実施形態において、ポリペプチドを含むライブラリーは、少なくとも１つの重鎖可変ドメインポリペプチドを更に含む。
【００１５】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、ベクターを含むライブラリーであって、当該ベクターのうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも２５、少なくとも５０、少なくとも７５、少なくとも１００、少なくとも１２５、少なくとも１５０、少なくとも１７５、少なくとも２００、少なくとも２２５、少なくとも２５０、少なくとも２７５など）は、先行実施形態のいずれかに記載のポリヌクレオチドライブラリーのポリヌクレオチドを含む、当該ライブラリーである。いくつかの実施形態において、ベクターのうちの少なくとも２つは、ポリヌクレオチドライブラリーに由来するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ベクターのうちの少なくとも１００は、ポリヌクレオチドライブラリーに由来するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ベクターのそれぞれは、ポリヌクレオチドライブラリーに由来するポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのベクターは、軽鎖可変ドメインポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、ベクターを含むライブラリーは、重鎖可変ドメインポリペプチドをコードするベクターを更に含む。また、本明細書で提供されるのは、細胞の集団を含むライブラリーであって、少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも１００、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９など）の細胞は、先行実施形態のいずれかに記載のライブラリーのベクターを含む、当該ライブラリーである。いくつかの実施形態において、細胞のうちの少なくとも２つは、ライブラリーのベクターを含む。いくつかの実施形態において、細胞のうちの少なくとも１００は、ライブラリーのベクターを含む。いくつかの実施形態において、細胞のそれぞれは、ライブラリーのベクターを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの細胞は、細菌、酵母、または哺乳類の細胞（例えば、非ヒト動物細胞または単離ヒト細胞）である。
【００１６】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、表面上に提示された少なくとも１つのポリペプチドを含むファージであり、当該少なくとも１つのポリペプチドは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域を含む抗原結合ドメインを含み、当該抗体軽鎖可変領域のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域を更に含む。
【００１７】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、先行実施形態のいずれかに記載のポリヌクレオチドライブラリーを含む非ヒト動物である。いくつかの実施形態において、非ヒト動物は、哺乳類（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、または非ヒト霊長類）である。いくつかの実施形態において、非ヒト動物は、ポリヌクレオチドを含み、当該ポリヌクレオチドのうちの１つは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードし、当該抗体軽鎖可変領域のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１８】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体軽鎖であり、当該ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１を含み、抗体のＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１３）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１４）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１６）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、表２に列挙される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ３と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ４と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２８〜５０からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において軽鎖可変領域のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つは、構造決定及び／またはコンピューターモデリングによって評価されたとき、複数の立体構造を取る。
【００１９】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、重鎖及び軽鎖を含む抗体であり、当該軽鎖は、本明細書に記載される軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、当該ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１を含み、抗体のＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１３）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１４）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１６）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、表２に列挙される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ３と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ４と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２８〜５０からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、約１０−７及び約１０−１１Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）で、少なくとも１つの標的に結合する。
【００２０】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、本明細書に記載される抗体軽鎖可変領域のいずれかをコードするポリヌクレオチド（例えば、合成ポリヌクレオチド）である。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体軽鎖可変領域のいずれかを含む全長抗体軽鎖をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載される抗体軽鎖可変領域のいずれかを含む抗体をコードする。
【００２１】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、抗体軽鎖可変領域を含むライブラリーであり、当該抗体軽鎖可変領域のうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００など）は、本明細書に記載される抗体軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中の抗体軽鎖可変領域のそれぞれは、本明細書に記載される抗体軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、１つ以上の抗体重鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、全長抗体軽鎖を含むライブラリーであり、当該抗体軽鎖のうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００など）は、本明細書に記載される抗体軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中の抗体軽鎖のそれぞれは、本明細書に記載される抗体軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、１つ以上の全長抗体重鎖を更に含む。いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、抗体を含むライブラリーであり、当該抗体のうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００など）は、本明細書に記載される抗体軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中の抗体のそれぞれは、本明細書に記載される抗体軽鎖可変領域のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【００２２】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、先行実施形態のいずれかに記載のライブラリーのポリヌクレオチド配列を準備し、組み立てることを含む、ライブラリーの調製方法である。
【００２３】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、（ａ）複数の立体構造を有する配列を含む、１つ、２つまたは３つの軽鎖ＨＶＲを選択するステップと、（ｂ）ポリヌクレオチド配列を組み立てて、複数の抗体軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、合成ポリヌクレオチド）のライブラリーを生成するステップと、を含む、抗体ライブラリーの作製方法である。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変領域配列は、ヒト抗体配列である。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変領域は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、当該軽鎖可変領域のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１を含み、抗体のＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１３）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１４）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１６）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、表２に列挙される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ３と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ４と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２８〜５０からなる群から選択される配列を含む。別の態様において、本明細書で提供されるのは、抗原結合ドメインを含むライブラリーであり、当該抗原結合ドメインのうちの１つは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域を含み、当該抗体軽鎖可変領域のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変領域を更に含む。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変領域は、上記実施形態のいずれかに記載の１つ以上のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、ファージを含む。いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインは、ライブラリーの少なくとも１つのファージの表面上に提示される。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、ファージ表面上に提示される上記実施形態のいずれか１つに記載の抗原結合ドメインを発現する複数のファージを含む。
【００２４】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、２つの抗体重鎖可変領域及び２つの同一の軽鎖可変領域を含む二重特異性抗体の生成方法であって、（ａ）第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインをスクリーニングすることであって、当該第１の抗原結合ドメインは、第１の抗体重鎖可変領域及び第１の抗体軽鎖可変領域を含み、当該第１の抗体軽鎖可変領域は、先行実施形態のいずれかに記載のライブラリーのポリヌクレオチドによってコードされる（例えば、当該第１の抗原結合ドメインは、第１の抗体重鎖可変領域及び第１の抗体軽鎖可変領域を含み、当該第１の抗体軽鎖可変領域は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、当該抗体軽鎖可変領域のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む）、当該スクリーニングすることと、（ｂ）第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインをスクリーニングすることであって、当該第２の抗原結合ドメインは、第２の抗体重鎖可変領域及び第２の抗体軽鎖可変領域を含み、当該第２の抗体軽鎖可変領域は、当該第１の抗体軽鎖可変領域と同じ配列を有する（例えば、当該第２の抗原結合ドメインは、第２の抗体重鎖可変領域及び第２の抗体軽鎖可変領域を含み、当該第２の抗体軽鎖可変領域は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、当該抗体軽鎖可変領域のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む）、当該スクリーニングをすることと、（ｃ）当該第１の抗原結合ドメイン及び当該第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体を生成することと、を含む、当該生成方法である。
【００２５】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、（ａ）第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域を含む第１の結合ドメインであって、第１の標的に結合する、当該第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域を含む第２の結合ドメインであって、当該第２の結合ドメインは、第２の標的に結合し、当該第２の軽鎖可変領域は、当該第１の軽鎖可変領域配列と同一の配列を有する、当該第２の結合ドメインと、を含み、当該第１及び第２の軽鎖可変領域のそれぞれは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、当該ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１を含み、抗体のＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１３）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１４）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１６）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、表２に列挙される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ３と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ４と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２８〜５０からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の重鎖可変領域は、第１の重鎖定常領域に連結され、第２の重鎖可変領域は、第２の重鎖定常領域に連結され、第１の抗体軽鎖可変領域は、第１の軽鎖定常領域に連結され、第２の抗体軽鎖可変領域は、第２の軽鎖定常領域に連結され、第１及び第２の抗体軽鎖は、同一の配列を有する。
【００２６】
別の態様において、本明細書で提供されるのは、先行実施形態のいずれかに記載のポリヌクレオチドのライブラリーまたは当該ポリヌクレオチドを含む細胞の集団を含むキットである。
【００２７】
上記及び本明細書に記載される様々な実施形態の特性の１つ、複数または全てが組み合わされ、本発明の他の実施形態が形成され得ることを理解されたい。本発明のこれらの態様及び他の態様は、当業者に明らかとなるであろう。本発明のこれらの実施形態及び他の実施形態は、以下の詳細な説明によって更に詳述される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａは、ＶＬドメインのアミノ酸のエントロピープロットを残基番号ごとに示す。８１のヒト抗体のＶＬ構造を使用して、エントロピーを計算した。図１Ｂは、例示的な抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列（配列番号６０）について、本明細書で使用される超可変領域（ＨＶＲ）の定義を、同じＶＬ配列の相補性決定領域（ＣＤＲ）のＫａｂａｔ定義と比較して示す。
【図２】図２Ａは、抗原結合が確認された、ＤＰＬ５及びＳＥＬ０２１抗体ライブラリーに由来する抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のセグメント使用を示す。指定の配列番号に対応するアミノ酸配列は、表１に見出すことができる。図２Ｂは、単一及び複数の抗原標的への抗原結合が確認された、ＤＰＬ５、ＳＥＬ０２１、及びＤＰＬ１６〜３４抗体ライブラリーの抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のセグメント使用を示す。指定の配列番号に対応するアミノ酸配列は、表１に見出すことができる。
【図３】抗原ＴＡＧＴ−１、ＴＡＧＴ−２、及びＴＡＧＴ−３への結合が確認されたｆａｂの親和性測定値を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示は、抗体軽鎖（例えば、ダイナミックヒト抗体の軽鎖）をコードする（例えば、非天然または合成）ポリヌクレオチドを含有するライブラリーを提供する。有利には、本明細書で開示される抗体軽鎖は、目的の複数の基質に対するより効果的な基質結合及び／または特異性を得るための柔軟性の高いループを生成するように設計されたＨＶＲ配列を含む。これらのＨＶＲ配列により、既存の技法よりも小さな抗体ライブラリーの作製が可能となると考えられる。
【００３０】
Ｉ．一般的技法
本明細書中に記載されるまたは参照される技法及び手順は、当業者によって一般に十分に理解されており、従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒ��ａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；及びＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）に記載される、広く利用されている方法論などを使用して、一般的に用いられる。
【００３１】
ＩＩ．定義
本発明を詳述する前に、本発明は、特定の組成物または生物系に限定されず、当然のことながら、変わり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を記載する目的でのみ使用され、限定を意図するものではないことを理解されたい。
【００３２】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈により別途明示される場合を除き、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「分子（ａ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」への言及は、任意選択により、２つ以上のかかる分子の組み合わせなどを含む。
【００３３】
本明細書で使用される「約」という用語は、本技術分野の当業者であれば容易に理解する、それぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」を付した値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（及び記載する）。
【００３４】
本明細書に記載される本発明の態様及び実施形態は、態様及び実施形態を「含む」、態様及び実施形態「からなる」、ならびに態様及び実施形態「から本質的になる」ことを含むことを理解されたい。
【００３５】
「抗体」という用語は、本明細書中、その最も広い意味で使用され、所望の生物学的活性を呈する限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメント（例えば、単鎖可変フラグメントまたはｓｃＦｖ）を具体的に含む。
【００３６】
基本的な４本鎖の抗体単位は、２本の同一の軽鎖（Ｌ）と２本の同一の重鎖（Ｈ）とから構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＶＨとＶＬとが一緒に対合することにより、単一の抗原結合部位が形成される。異なる抗体クラスの構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  Ｅｄ．，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ，１９９４，ｐａｇｅ  ７１  ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。
【００３７】
任意の脊椎動物種に由来するＬ鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）と呼ばれる２つの明確に異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、その重鎖の定常ドメイン（ＣＨ）のアミノ酸配列に応じて、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭの５つのクラスがあり、それぞれ、アルファ（「α」）、デルタ（「δ」）、イプシロン（「ε」）、ガンマ（「γ」）及びミュー（「μ」）と表記される重鎖を有する。γ及びαのクラスは、ＣＨ配列及び機能における比較的わずかな相違に基づいて、サブクラス（アイソタイプ）に更に分類され、例えば、ヒトは、次のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２を発現する。種々の免疫グロブリンクラスのサブユニット構造及び三次元構成は既知であり、例えば、Ａｂｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄ．（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，２０００）に概説されている。
【００３８】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と呼ばれることもある。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と呼ばれることもある。これらのドメインは、一般に、可変性が最も高い抗体部分であり、抗原結合部位を含有する。
【００３９】
「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基ナンバリング」または「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置ナンバリング」という用語及びその変形は、Ｋａｂａｔら（上掲）において、抗体の重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインの編成に使用されるナンバリングシステムを指す。このナンバリングシステムを使用する場合、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮に応じてアミノ酸がより少ないこともあれば、ＦＲまたはＨＶＲへの挿入に応じて追加のアミノ酸を含有することもある。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後に１つのアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従うと残基５２ａ）を含み得、重鎖ＦＲ残基８２の後に複数の挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔに従うと残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含み得る。所与の抗体に対する残基のＫａｂａｔナンバリングは、抗体の配列と「標準的な」Ｋａｂａｔナンバリング配列との相同領域でのアラインメントによって決定され得る。
【００４０】
Ｋａｂａｔナンバリングシステムは、一般に、可変ドメイン中の残基（概ね、軽鎖の残基１〜１０７及び重鎖の残基１〜１１３）について言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））。「ＥＵナンバリングシステム」または「ＥＵインデックス」は、一般に、免疫グロブリン重鎖定常領域中の残基について言及する際に使用される（例えば、Ｋａｂａｔら（上掲）で報告されるＥＵインデックス）。「Ｋａｂａｔに従うＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基ナンバリングを指す。
【００４１】
「定常ドメイン」という用語は、免疫グロブリンの他の部分である、抗原結合部位を含有する可変ドメインと比べて、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン（総称して、ＣＨ）及び軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインを含有する。
【００４２】
「全長抗体」という用語（「インタクト」抗体または「全」抗体という用語は、本明細書で区別なく使用され得る）は、抗体フラグメントとは対照的に、実質的にインタクトな形態の抗体を指し得る。同様に「全長抗体軽鎖」という用語（「インタクト」抗体軽鎖または「全」抗体軽鎖という用語は、本明細書で区別なく使用され得る）は、抗体軽鎖フラグメントとは対照的に、実質的にインタクトな形態の抗体軽鎖を指し得る。具体的には、全抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を有するものを含む。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）であってもよいし、そのアミノ酸配列バリアントであってもよい。いくつかの場合において、インタクト抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有し得る。
【００４３】
本明細書に使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体を指す。すなわち、その集団に含まれる個々の抗体は、微量で存在し得る可能性のある自然発生の変異及び／または翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除き、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原部位を対象とする。異なる決定基（エピトープ）を対象とする種々の抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。「モノクローナル」という修飾語句は、実質的に同種の抗体集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、例えば、様々な技法によって作製することができ、これらには、例えば、ハイブリドーマ法（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−９７（１９７５）；Ｈｏｎｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，１４（３）：２５３−２６０（１９９５），Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ：Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８１））、組み換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９２）；Ｓｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３８（２）：２９９−３１０（２００４）；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４０（５）：１０７３−１０９３（２００４）；Ｆｅｌｌｏｕｓｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１（３４）：１２４６７−４７２（２００４）；及びＬｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８４（１−２）：１１９−１３２（２００４）参照、及びヒト免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子座または遺伝子の一部または全てを有する動物におけるヒト抗体またはヒト様抗体の産生技術（例えば、ＷＯ１９９８／２４８９３；ＷＯ１９９６／３４０９６；ＷＯ１９９６／３３７３５；ＷＯ１９９１／１０７４１；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；米国特許第５，５４５，８０７号；同第５，５４５，８０６号；同第５，５６９，８２５号；同第５，６２５，１２６号；同第５，６３３，４２５号及び同第５，６６１，０１６号；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔ���ｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−８１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５−８５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８２６（１９９６）；ならびにＬｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）参照）が含まれる。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「超可変領域（ＨＶＲ）」は、配列が超可変性であり、及び／または構造的に定義されたループを形成する、抗体ドメインの領域を指す。一般に、抗体は、６つのＨＶＲを含み、３つがＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）にあり、３つがＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）にある。例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｗｕ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２４８：１−２５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．，２００３）を参照されたい。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、次の順序：ＦＷ１−ＨＶＲ１−ＦＷ２−ＨＶＲ２−ＦＷ３−ＨＶＲ３−ＦＷ４で配置された、３つのＨＶＲ及び４つのフレームワーク（ＦＷ）領域から構成される。本開示全体を通して、軽鎖の３つのＨＶＲは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３と称される。比較のために、図１Ｂに示される例示的な抗体軽鎖可変ドメインのＨＶＲの定義（本明細書で使用されるもの）は、相補性決定領域（ＣＤＲ）のＫａｂａｔ定義とは異なる（Ｙｖｏｎｎｅ  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ−ｍａｔｕｒｅｄ  Ｆａｂ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  Ａｎｔｉｇｅｎ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９３，８６５−８８１）。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「ライブラリー」は、共通のクラスを有する２つ以上の実体の集まりを指す。例えば、ポリヌクレオチドを含有するライブラリーは、２つ以上のポリヌクレオチドの集まりを指し得る。「ライブラリー」という用語は、本明細書中、その最も広い意味で使用され、合わせても合わせなくてもよいサブライブラリーを具体的に含む。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「ユニーク」は、１つの集まりの１メンバーであって、その集まりの他のメンバーとは異なる１メンバーを指す。例えば、抗体をコードする複数のポリヌクレオチドをコードするライブラリーに由来するユニーク抗体は、当該ライブラリーによってコードされる他の抗体によって共有されない特定の配列を有する抗体を指し得る。実際問題として、ライブラリーが物理的に実現した「ユニーク」メンバーは、２つ以上のコピーで存在し得ることを理解されたい。例えば、ライブラリーは、複数の「ユニーク」抗体を含有し得、「ユニーク」抗体分子のうちの１つ以上は、２つ以上のコピーで生じ得る。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、「多様性」は、可変性及び／または不均一性を指す。例えば、ライブラリー中の抗体の多様性は、ライブラリー中に存在するユニーク配列を含む抗体が様々であることを指し得る。
【００４８】
「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」という用語は、本明細書で区別なく使用され、２つ以上のアミノ酸の重合体を指し得る。
【００４９】
本明細書で区別なく使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの重合体を指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりまたは合成反応により重合体中に組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びその類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、重合体の組み立て前または後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、標識へのコンジュゲーションなど、合成後になされた修飾（複数可）を含み得る。他の修飾タイプには、例えば、「キャップ」、類似体による天然ヌクレオチドのうちの１つ以上の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）による修飾、及び荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）による修飾、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）を含有する修飾、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）による修飾、キレート化剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有する修飾、アルキル化剤を含有する修飾、修飾結合による修飾（例えば、αアノマー核酸など）、ならびにポリヌクレオチド（複数可）の未修飾形態が含まれる。更に、糖内に通常存在するヒドロキシル基のうちのいずれかを、例えば、ホスホン酸基、リン酸基によって置き換えてもよいし、標準的な保護基によって保護してもよいし、活性化させて追加のヌクレオチドへの更なる結合を生成してもよいし、固体または半固体の支持体にコンジュゲートしてもよい。５’末端及び３’末端のＯＨを、リン酸化してもよいし、アミンまたは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換してもよい。他のヒドロキシルも、標準的な保護基に誘導体化してもよい。ポリヌクレオチドはまた、当該技術分野において一般的に知られているリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態も含み得、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル−、２’−フルオロ−または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及びメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシド類似体を含む。１つ以上のホスホジエステル結合は、代替連結基に置き換えられてもよい。これらの代替連結基には、限定されないが、リン酸が、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯまたはＣＨ２（「ホルムアセタール」）に置き換えられる実施形態が含まれ、式中、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈ、置換もしくは無置換アルキル（１〜２０Ｃ）（任意にエーテル（−Ｏ−）結合を含有する）、アリール、��ルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニルまたはアラルジルである。ポリヌクレオチド内の全ての結合が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、本明細書において言及される全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００５０】
「単離された」（単離されたポリペプチド、核酸、または細胞など）は、その天然環境の構成成分から分離された分子を指す。
【００５１】
細胞（例えば、合成ポリヌクレオチドまたは合成ポリヌクレオチドのライブラリーを含む細胞または細胞の集団）または単離された細胞は、ポリヌクレオチド挿入物を組み込むためのベクター（複数可）のレシピエントになり得るか、レシピエントになっている個々の細胞または細胞培養物を含む。宿主細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含み、その子孫は、自然発生的、偶発的または意図的な変異により、元の親細胞とは必ずしも完全に同一でない場合がある（形態学的またはゲノムＤＮＡ相補体において）。宿主細胞は、ポリヌクレオチド（複数可）（例えば、本開示の抗体軽鎖可変領域をコードする合成ポリヌクレオチド）をｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトした細胞を含む。
【００５２】
「非ヒト動物」は、家畜、農場または動物園の動物、競技用動物、ペット動物（イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）及び研究に使用される動物などのヒトに分類されない任意の動物を指す。研究動物は、限定するものではないが、線虫類、節足動物、脊椎動物、哺乳類、カエル、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュまたはフグ）、鳥類（例えば、ニワトリ）、イヌ、ネコ、及び非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル、カニクイザル、チンパンジーなど）を指し得る。好ましい実施形態において、動物は、抗体を産生する動物である。
【００５３】
ＩＩＩ．抗体ライブラリー及びライブラリーの作製
本開示のある特定の態様は、ポリヌクレオチド、例えば、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）または軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードするポリヌクレオチドのライブラリーに関する。本開示のライブラリーは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを１つ以上含有し得、本明細書に記載されるＨＶＲ配列（例えば、表１に示されるＨＶＲ配列）をそれぞれ独立して含む。
【００５４】
いくつかの実施形態において、本開示のライブラリーは、典型的な抗体ライブラリーよりも少ない数のユニーク軽鎖ＨＶＲ配列及び／またはユニークＶＬ配列を含有する。有利には、そのようなライブラリーは、目的の多数の抗原のうちの１つ以上に結合する抗体の特定に十分な多様性をもたらすことができるとともに、ライブラリーサイズが小さくなったことにより効率的なスクリーニングも可能となる。いくつかの実施形態において、本開示のライブラリーは、約１０００未満、約９００未満、約８００未満、約７００未満、約６００未満、約５００未満、約４００未満、または約３００未満のＨＶＲ−Ｌ１配列、ＨＶＲ−Ｌ２配列、及びＨＶＲ−Ｌ３配列のユニークな組み合わせを含むポリヌクレオチドを含むか、それらからなる。ある特定の実施形態において、本開示のライブラリーは、約２８０以下のＨＶＲ−Ｌ１配列、ＨＶＲ−Ｌ２配列、及びＨＶＲ−Ｌ３配列のユニークな組み合わせを含むポリヌクレオチドを含むか、それらからなる。
【００５５】
いくつかの実施形態において、ライブラリーは、複数のポリヌクレオチドを含有し、当該ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、本開示の抗体軽鎖可変領域（例えば、本開示のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む）をコードする。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードし、当該ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の少なくとも１つまたは少なくとも２つは、本開示のＨＶＲ−Ｌ１配列（例えば、配列番号１〜４）、本開示のＨＶＲ−Ｌ２配列（例えば、配列番号５〜９）、及び本開示のＨＶＲ−Ｌ３配列（例えば、配列番号１０〜２３）から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ポリヌクレオチドのうちの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、少なくとも５５、少なくとも６０、少なくとも６５、少なくとも７０、少なくとも７５、少なくとも８０、少なくとも８５、少なくとも９０、少なくとも９５、少なくとも１００、少なくとも１１０、少なくとも１２０、少なくとも１３０、少なくとも１４０、少なくとも１５０、少なくとも１６０、少なくとも１７０、少なくとも１８０、少なくとも１９０、少なくとも２００、少なくとも２２５、または少なくとも２５０は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードし、当該ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の少なくとも１つまたは少なくとも２つは、本開示のＨＶＲ−Ｌ１配列（例えば、配列番号１〜４）、本開示のＨＶＲ−Ｌ２配列（例えば、配列番号５〜９）、及び本開示のＨＶＲ−Ｌ３配列（例えば、配列番号１０〜２３）から選択されるアミノ酸配列を含み、及び／またはポリヌクレオチドの３００未満、または２８０以下は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードし、当該ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の少なくとも１つまたは少なくとも２つは、本開示のＨＶＲ−Ｌ１配列（例えば、配列番号１〜４）、本開示のＨＶＲ−Ｌ２配列（例えば、配列番号５〜９）、及び本開示のＨＶＲ−Ｌ３配列（例えば、配列番号１０〜２３）から選択されるアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態において、ライブラリーのポリヌクレオチドのそれぞれは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードし、当該ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の少なくとも１つまたは少なくとも２つは、本開示のＨＶＲ−Ｌ１配列（例えば、配列番号１〜４）、本開示のＨＶＲ−Ｌ２配列（例えば、配列番号５〜９）、及び本開示のＨＶＲ−Ｌ３配列（例えば、配列番号１０〜２３）から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリーの１つ以上のポリヌクレオチドは、ベクター（例えば、発現ベクターまたはディスプレイベクター）中にある。
【００５６】
いくつかの実施形態において、ライブラリー中のポリヌクレオチドは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードし、ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１〜４）からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中のポリヌクレオチドは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードし、ＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５〜９）からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、ライブラリー中のポリヌクレオチドは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体軽鎖可変領域をコードし、ＨＶＲ−Ｌ１は、配列番号１０〜２３）からなる群から選択される配列を含む。
【００５７】
本明細書に記載される軽鎖ＨＶＲ配列は、本開示のライブラリー中に、任意の組み合わせで含まれ得る。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１を含み、抗体のＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。
【００５８】
ある特定の実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３配列；配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。ある特定の実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、表２に列挙される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、表１に列挙されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２８〜５０から選択される配列、または配列番号２８〜５０から選択される配列に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【００５９】
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、次式：（ＦＷ−Ｌ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＦＷ−Ｌ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＦＷ−Ｌ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＦＷ−Ｌ４）に従うとおり、ＨＶＲの間に近接して配置される可変領域軽鎖フレームワーク配列を更に含む。いくつかの実施形態において、フレームワーク配列のうちの１つ、２つ、３つ、または４つは、以下である。
ＦＷ−Ｌ１は、ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号２４）であり、
ＦＷ−Ｌ２は、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２５）であり、
ＦＷ−Ｌ３は、ＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹ（配列番号２６）であり、
ＦＷ−Ｌ４は、ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２７）である。
【００６０】
いくつかの実施形態において、ライブラリーは、複数のポリヌクレオチドを含有し、当該ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、抗体重鎖可変領域（例えば、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含む）をコードする。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、少なくとも１０３、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、または少なくとも１０１２の抗体重鎖可変領域のユニーク配列をコードする、複数のポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、少なくとも１０３の抗体重鎖可変領域のユニーク配列をコードする、複数のポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、少なくとも１０９の抗体重鎖可変領域のユニーク配列をコードする、複数のポリヌクレオチドを含有する。他の実施形態において、ライブラリーは、１つの抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態において、ライブラリーは、１〜約１０３の抗体重鎖可変領域のユニーク配列をコードする、複数のポリヌクレオチドを含有する。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ライブラリーのポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、全長抗体軽鎖（複数可）をコードする。他の実施形態において、ライブラリーのポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、軽鎖Ｆａｂフラグメント（複数可）をコードする。いくつかの実施形態において、ライブラリーのポリヌクレオチドのうちの１つ以上は、単鎖可変フラグメント（複数可）をコードする。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ライブラリーは、複数のユニーク抗体をコードする複数のポリヌクレオチドを含有する。いくつかの実施形態において、各抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、複数の各抗体の軽鎖可変領域は、同一の配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の少なくとも１つまたは少なくとも２つは、本開示のＨＶＲ−Ｌ１配列（例えば、配列番号１〜４）、本開示のＨＶＲ−Ｌ２配列（例えば、配列番号５〜９）、及び本開示のＨＶＲ−Ｌ３配列（例えば、配列番号１０〜２３）から選択されるアミノ酸配列を含む。本明細書に記載される軽鎖ＨＶＲ配列は、１つ以上の重鎖可変領域（複数可）をコードするポリヌクレオチドも含む本開示のライブラリー中に、任意の組み合わせで含まれ得る。
【００６３】
いくつかの実施形態において、本開示のライブラリーは、本開示の１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、合成ポリヌクレオチド）をコードする１つ以上のベクターを含む。例えば、いくつかの実施形態において、ライブラリーは、抗体軽鎖可変領域をコードする１つ以上のポリヌクレオチド（例えば、合成ポリヌクレオチド）をコードする１つ以上のベクターを含み、当該抗体軽鎖可変領域は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、当該抗体軽鎖可変領域のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む）。
【００６４】
本明細書で更に提供されるのは、例えば、本開示のライブラリーのポリヌクレオチド配列（例えば、合成ポリヌクレオチド（複数可））を準備し、組み立てることによる、ライブラリーの調製方法である。本明細書で更に提供されるのは、例えば、複数の立体構造を有する配列を含む、１つ、２つ、または３つの軽鎖ＨＶＲ（例えば、本開示の１つ、２つまたは３つの軽鎖ＨＶＲ）を選択することと、ポリヌクレオチド配列を組み立てて、複数の抗体軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチド（例えば、合成ポリヌクレオチド）のライブラリーを生成することと、を含む、ライブラリーの作製方法である。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変領域配列は、ヒト抗体配列である。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変領域は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、当該ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、本開示のＨＶＲ−Ｌ１配列（例えば、配列番号１〜４）、本開示のＨＶＲ−Ｌ２配列（例えば、配列番号５〜９）、及び本開示のＨＶＲ−Ｌ３配列（例えば、配列番号１０〜２３）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態において、抗体軽鎖可変領域のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つは、複数の立体構造を取る。いくつかの実施形態において、複数の立体構造は、限定するものではないが、構造決定（例えば、Ｘ線結晶学またはＮＭＲ）及び／またはコンピューターモデリングを含む、当該技術分野において既知の技術を使用して、評価または検出することができる。
【００６６】
一連の抗体軽鎖及び／または重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドは、軽鎖配列または重鎖配列の一部または全体の発現に適した任意のベクターにクローニングすることができる。いくつかの実施形態において、ベクターにクローニングされた当該ポリヌクレオチドにより、ウイルスコートタンパク質の全てまたは一部に融合され（すなわち、融合タンパク質の生成）、粒子または細胞の表面上に提示された軽鎖配列または重鎖配列の一部または全体の生成が可能となる。例えば、ファージミドベクターなどのいくつかの種類のベクターが利用可能であり、本発明の実施に使用することができる。ファージミドベクターは、一般に、プロモーター、シグナル配列、表現型選択遺伝子、複製起点部位、及び当業者に知られている他の必要な構成要素を含む、様々な構成要素を含有している。いくつかの実施形態において、抗体軽鎖及び／または重鎖可変領域のセットをコードするポリヌクレオチドは、細菌ディスプレイ用の細菌細胞または酵母ディスプレイ用の酵母細胞において発現させるためのベクターにクローニングすることができる。例示的なベクターは、米国特許出願公開第ＵＳ２０１６０１４５６０４号に記載されている。いくつかの実施形態において、ベクターは、５’から３’へ、表面（例えば、ファージ、細菌、酵母、または哺乳類の細胞の表面）上に提示されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、制限部位、表面上への提示能力を有する表面ペプチドをコードする第２のポリヌクレオチド、及び第２の制限部位を含む、ディスプレイベクターである。いくつかの実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、ファージコートタンパク質、酵母外壁タンパク質、細菌外膜タンパク質、細胞表面テザードメイン、もしくはアダプター、またはその短縮型もしくは誘導体をコードする。ある特定の実施形態において、第２のポリヌクレオチドは、繊維状ファージＭ１３の遺伝子ＩＩＩ、またはその短縮型もしくは誘導体である。いくつかの実施形態において、表面ペプチドは、ファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌ディスプレイもしくは哺乳類ディスプレイ、またはこれらを横断するシャトリングディスプレイ用のものである。いくつかの実施形態において、アミノ酸配列及び表面ペプチドは、発現されると、表面上に融合タンパク質として提示される。いくつかの実施形態において、ベクターは、第１の制限部位の５’側または第２の制限部位の３’側に融合タグを更に含む。
【００６７】
本開示のある特定の態様は、本明細書に記載されるベクター（複数可）を含有する細胞の集団に関する。本明細書に記載される技法、または他の好適な技法のいずれかによって生成されたポリヌクレオチドによってコードされる抗体の軽鎖及び／または重鎖を発現させ、スクリーニングして、所望の構造及び／または活性を有する抗体を特定することができる。抗体の発現は、例えば、無細胞抽出物（例えば、リボソームディスプレイ）、ファージディスプレイ、原核細胞（例えば、細菌ディスプレイ）、または真核細胞（例えば、酵母ディスプレイ）を使用して、実施することができる。いくつかの実施形態において、細胞は、細菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞である。細菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞にトランスフェクトするための方法は、当該技術分野において知られており、本明細書に引用される参考文献に記載されている。これらの細胞種におけるポリペプチド（例えば、抗体鎖）の発現（例えば、本開示のライブラリーからの発現）及び目的の抗体のスクリーニングは、以下に詳述される。
【００６８】
あるいは、ポリヌクレオチドは、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ及びＳｋｅｒｒａ（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８９，１７８：４７６；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９１，９：２７３）に記載されているものなどのＥ．ｃｏｌｉ発現系で発現させることができる。変異タンパク質は、Ｂｅｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８９，１７８：４７６によって記載されているように、培地中及び／または細菌の細胞質中における分泌により発現させることができる。いくつかの実施形態において、ＶＨ及びＶＬをコードする単一ドメインは、ｏｍｐＡ、ｐｈｏＡまたはｐｅｌＢシグナル配列などのシグナル配列をコードする配列の３’末端にそれぞれ結合される（Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１９８７，１６９：４３７９）。これらの遺伝子の融合体は、ジシストロンコンストラクトに組み立てられ、それにより、これらの融合体は、単一のベクターから発現され、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム中に分泌され、そこで再度フォールディングし、活性型で回収することができる（Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９１，９：２７３）。例えば、抗体重鎖遺伝子は、抗体軽鎖遺伝子とともに発現させて、抗体または抗体フラグメントを生成することができる。
【００６９】
他の実施形態において、抗体配列は、例えば、ＵＳ２００４００７２７４０；ＵＳ２００３０１０００２３；及びＵＳ２００３００３６０９２に記載されているように、分泌シグナル及び脂質化部分を使用して、原核生物、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの膜表面上に発現される。
【００７０】
あるいは、抗体は、例えば、Ｊｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００７，１０４：８２４７に記載されているようなアンカーペリプラズム発現（ＡＰＥｘ２−ハイブリッド表面ディスプレイ）によって、または、例えば、Ｍａｚｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２５：５６３に記載されるような他のアンカリング法によって、発現及びスクリーニングすることができる。
【００７１】
哺乳類細胞、例えば、骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ／０細胞）、ハイブリドーマ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、及びヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞などの高等真核細胞もまた、本開示の抗体の発現に使用することができる。典型的に、哺乳類細胞で発現される抗体は、培地中に分泌されるか、細胞の表面上に発現されるように設計される。抗体または抗体フラグメントは、例えば、インタクト抗体分子として、または個々のＶＨ及びＶＬフラグメント、Ｆａｂフラグメント、単一ドメインとして、または一本鎖（ｓｃＦｖ）として、生成され得る。
【００７２】
他の実施形態において、抗体は、哺乳類細胞ディスプレイを使用して選択することができる（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，２００６，１０３：９６３７）。上記及び以下に例示されるいくつかの実施形態において、抗体は、例えば、ファージディスプレイを使用して、ウイルスコードタンパク質の全てまたは一部に融合され（すなわち、融合タンパク質の生成）、粒子または細胞の表面上に、提示された軽鎖配列または重鎖配列の一部または全体が生成された後に選択することができる。
【００７３】
本開示のある特定の態様は、本開示のポリヌクレオチドライブラリーを含む非ヒト動物に関する。例えば、本開示の非ヒト動物は、そのゲノムが、本開示の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含むように改変され得る。非限定的な例において、本開示の軽鎖可変領域のうちの１つ以上を発現するように改変された軽鎖免疫グロブリン遺伝子座（例えば、ＶＬ遺伝子座）を含む、トランスジェニックマウスが作製される。いくつかの実施形態において、トランスジェニック動物（例えば、マウス）は、ポリヌクレオチドによってコードされる抗体または軽鎖を発現する。非ヒト動物の１つ以上の免疫グロブリン遺伝子座を改変する技法は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）を作製するために使用される方法）。
【００７４】
本開示のライブラリーに由来する抗体のスクリーニングは、当該技術分野において知られている任意の適切な手段によって実施することができる。例えば、結合活性は、標準的なイムノアッセイ及び／またはアフィニティークロマトグラフィーによって評価することができる。触媒機能（例えば、タンパク質分解機能）についての本発明の抗体のスクリーニングは、標準的なアッセイ、例えば、ヘモグロビンプラークアッセイを使用して達成することができる。標的に対する抗体の結合親和性の決定は、様々な既知の技法、例えば、所与の標的または抗原に対する抗体の結合速度を表面プラズモン共鳴に基づいて測定するＢＩＡＣＯＲＥ（商標）機器、またはＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＲＥＤ９６プラットフォーム（Ｐａｌｌ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用した、以下に例示するようなＢｉｏ−Ｌａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ（ＢＬＩ）を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイすることができる。ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイは、多数の動物モデルのいずれかの使用によって実施した後、必要に応じて、ヒトで試験することができる。細胞ベースの生物学的アッセイもまた企図される。抗体または抗原結合フラグメントは、機能活性、例えば、アンタゴニスト活性またはアゴニスト活性について更に選択することができる。例示的なスクリーニング方法が本明細書に記載される。例えば、いくつかの実施形態において、ｆａｂフラグメント（複数可）と１つ以上の標的（複数可）との間の結合親和性は、抗原にヒトＩｇＧ１−Ｆｃタグをタグ付けし、それをＡｎｔｉ−ｈＩｇＧ−Ｆｃ  Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒによって捕捉することにより、ＢＬＩを使用して測定される。Ｆａｂは、ＣＨ１ドメインのＣ末端にＨｉｓ６タグがタグ付けされ、Ｅ．ｃｏｌｉなどの宿主細胞中で過剰発現され、例えば、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して精製され得る。次いで、カイネティクスバッファーで、例えば、５〜１０μｇ／ｍＬまで希釈した精製ｆａｂを含有するウェル中に浸漬させたＡＨＣセンサー（抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ捕捉ディップ及び読み取りバイオセンサー）を使用して、親和性が測定され得る。
【００７５】
標的もしくは抗原への結合、及び／または機能アッセイによってバインダーを特定した後に、核酸が抽出され得る。次いで、抽出したＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞の形質転換に直接使用してもよいし、あるいは、コード配列を、例えば、好適なプライマーとのＰＣＲを使用して増幅し、任意の典型的なシーケンシング法によって配列決定してもよい。バインダーの可変ドメインＤＮＡを制限酵素で消化し、次いで、タンパク質発現用ベクターに挿入することができる。
【００７６】
ＩＶ．抗体及び抗体産生
本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されるライブラリーから定義及び選択される抗体である。本開示のある特定の態様は、抗体の軽鎖もしくは重鎖のＨＶＲ、ＨＶＲを含む可変領域及び／またはそれをコードするポリヌクレオチド（複数可）に関する。いくつかの実施形態において、ＨＶＲ及び／または可変領域は、抗体フラグメント、全長抗体、または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の一部である。
【００７７】
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、以下の表１に列挙されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の各配列のうちの１つ、２つ、または３つを含む。
2020537633.tif 000003
【００７８】
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、以下の表２に列挙される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。
2020537633.tif 000004
2020537633.tif 000005
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【００７９】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供されるのは、本開示のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を有する抗体軽鎖である。いくつかの実施形態において、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、本開示のＨＶＲ−Ｌ１配列（例えば、配列番号１〜４）、本開示のＨＶＲ−Ｌ２配列（例えば、配列番号５〜９）、及び本開示のＨＶＲ−Ｌ３配列（例えば、配列番号１０〜２３）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００８０】
本明細書に記載される軽鎖ＨＶＲ配列は、本開示の抗体軽鎖または軽鎖可変領域に、任意の組み合わせで含まれ得る。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１を含み、抗体のＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む。ある特定の実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３配列；配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。ある特定の実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、表２に列挙される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、表１に列挙されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む。いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、配列番号２８〜５０から選択される配列を含む。
【００８１】
いくつかの実施形態において、軽鎖可変領域は、次式：（ＦＷ−Ｌ１）−（ＨＶＲ−Ｌ１）−（ＦＷ−Ｌ２）−（ＨＶＲ−Ｌ２）−（ＦＷ−Ｌ３）−（ＨＶＲ−Ｌ３）−（ＦＷ−Ｌ４）に従うとおり、ＨＶＲの間に近接して配置される可変領域軽鎖フレームワーク配列を更に含む。いくつかの実施形態において、フレームワーク配列のうちの１つ、２つ、３つ、または４つは、以下である。
ＦＷ−Ｌ１は、ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣ（配列番号２４）であり、
ＦＷ−Ｌ２は、ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹ（配列番号２５）であり、
ＦＷ−Ｌ３は、ＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹ（配列番号２６）であり、
ＦＷ−Ｌ４は、ＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号２７）である。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本明細書で更に提供されるのは、重鎖及び軽鎖を含む抗体であり、当該軽鎖は、本開示の軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で更に提供されるのは、本開示の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む、抗体フラグメントまたはｓｃＦｖである。
【００８３】
いくつかの実施形態において、本開示の抗体または抗体フラグメントは、特定の結合親和性で、少なくとも１つの標的（例えば、標的タンパク質または標的エピトープ）または少なくとも２つの標的に結合する。例えば、いくつかの実施形態において、本開示の抗体または抗体フラグメントは、約１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、または１０−１１Ｍ以下の平衡解離定数（Ｋｄ）で、少なくとも１つの標的または少なくとも２つの標的に結合する。いくつかの実施形態において、本開示の抗体または抗体フラグメントは、約１０−７〜約１０−１１Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）で、少なくとも１つの標的または少なくとも２つの標的に結合する。結合親和性を決定するための例示的なアッセイは、以下に記載され、例示される。
【００８４】
本開示の抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載の組み換え方法及び組成物を使用して産生され得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される任意の抗体をコードする、単離された核酸が提供される。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／またはＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／または重鎖）をコードし得る。いくつかの実施形態において、そのような核酸を含む１つ以上のベクター（例えば、発現ベクターまたはディスプレイベクター）が本明細書で提供される。いくつかの実施形態において、そのような核酸を含む宿主細胞が提供される。そのような一実施形態において、宿主細胞は、（１）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含むベクター、または（２）抗体のＶＬを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第１のベクター及び抗体のＶＨを含むアミノ酸配列をコードする核酸を含む第２のベクターを含む（例えば、当該ベクターで形質転換されている）。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞またはリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。いくつかの実施形態において、抗体の作製方法が提供され、当該方法は、上記抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現に好適な条件下で培養することと、任意選択により、抗体を宿主細胞（または宿主細胞培地）から回収することと、を含む。
【００８５】
本開示の抗体を組み換え産生するには、例えば、上述の抗体をコードする核酸を単離し、それを、宿主細胞における更なるクローニング及び／または発現のために、１つ以上のベクター中に挿入する。かかる核酸は、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合する能力を有するオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され、配列決定することができる。
【００８６】
抗体コーディングベクターのクローニングまたは発現に好適な宿主細胞には、原核細胞または真核細胞が含まれる。例えば、抗体は、特にグリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合には、細菌において産生され得る。細菌での抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号、同第５，７８９，１９９号及び同第５，８４０，５２３号を参照されたい（Ｃｈａｒｌｔｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００３），ｐｐ．２４５−２５４（Ｅ．ｃｏｌｉ．での抗体フラグメントの発現に関する記載）も参照されたい）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離され得、更に精製され得る。
【００８７】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核微生物も、抗体コーディングベクターに好適なクローニング宿主または発現宿主であり、これらには、グリコシル化経路が「ヒト化」されており、部分的または完全なヒトグリコシル化パターンを有する抗体の産生をもたらす、真菌株及び酵母株が含まれる。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２：１４０９−１４１４（２００４），ａｎｄ  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２４：２１０−２１５（２００６）を参照されたい。
【００８８】
グリコシル化抗体の発現に好適な宿主細胞は、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から得ることもできる。無脊椎動物細胞の例には、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞とともに、特に、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞のトランスフェクションに使用することができる、多数のバキュロウイルス株が同定されている。
【００８９】
植物細胞培養物もまた、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物中で抗体を産生するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ（商標）技術を記載）を参照されたい。
【００９０】
脊椎動物細胞もまた、宿主として使用され得る。例えば、懸濁液中で成長するように適合された哺乳類の細胞株が、有用であり得る。有用な哺乳類宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚性腎臓株（２９３細胞または例えばＧｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７）に記載されているような２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０）に記載されているようなＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ科腎臓細胞（ＭＤＣＫ；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２）；例えば、Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２）に記載されているようなＴＲＩ細胞；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳類宿主細胞株には、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞；ならびにＹ０、ＮＳ０及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株が含まれる。抗体産生に適したある特定の哺乳類宿主細胞株の総説については、例えば、Ｙａｚａｋｉ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐｐ．２５５−２６８（２００３）を参照されたい。
【００９１】
同一／共通／単一の軽鎖を有する二重特異性抗体
本明細書で更に提供されるのは、本開示の同一の軽鎖可変領域を有する二重特異性抗体である（例えば、異なる結合特異性を有する２つの重鎖可変領域と、２つの同一の軽鎖可変領域とを有する）。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、２つの抗体重鎖可変領域及び２つの同一の軽鎖可変領域を含み、当該二重特異性抗体は、第１の標的または抗原に結合し、第１の抗体重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域を含む、第１の結合ドメインと、第２の標的または抗原に結合し、第２の抗体重鎖可変領域及び第２の抗体軽鎖可変領域を含む、第２の結合ドメインと、を含み、当該第２の抗体軽鎖可変領域は、当該第１の抗体軽鎖可変領域配列と同一の配列を有する。いくつかの実施形態において、第１及び第２の結合ドメインは、異なる標的生体分子に結合する。いくつかの実施形態において、第１及び第２の結合ドメインは、同じ生体分子上の異なるエピトープに結合する。いくつかの実施形態において、第１の抗体重鎖可変領域は、第１の重鎖可変領域及び第１の重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３を含む）を含む第１の抗体重鎖の一部である。いくつかの実施形態において、第２の抗体重鎖可変領域は、第２の重鎖可変領域及び第２の重鎖定常領域（例えば、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３を含む）を含む第２の抗体重鎖の一部である。いくつかの実施形態において、第１の抗体軽鎖可変領域は、第１の軽鎖可変領域及び第１の軽鎖定常領域を含む第１の抗体軽鎖の一部である。いくつかの実施形態において、第２の抗体軽鎖可変領域は、第２の軽鎖可変領域及び第２の軽鎖定常領域を含む第２の抗体軽鎖の一部である。いくつかの実施形態において、第１及び第２の抗体軽鎖は、本開示の軽鎖と同一の配列を有する。
【００９２】
本明細書で更に提供されるのは、本開示の同一の軽鎖可変領域を有する二重特異性抗体（例えば、異なる結合特異性を有する２つの重鎖可変領域と、２つの同一の軽鎖可変領域とを有する）の生成方法である。いくつかの実施形態において、方法は、第１の抗原に結合し、本開示の第１の抗体重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域を含む、第１の抗原結合ドメインを選択することと、（ｂ）第２の抗原に結合し、本開示の第２の抗体重鎖可変領域を含む、第２の抗原結合ドメインを選択することであって、当該第２の抗体軽鎖可変領域は、第１の抗体軽鎖可変領域配列と同一の配列を有する、当該選択することと、（ｃ）第１の抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、第２の抗体重鎖可変領域のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、第１の抗体軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び第２の抗体軽鎖可変領域配列のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、二重特異性抗体を生成することと、を含む。いくつかの実施形態において、第１の軽鎖可変領域は、本開示のライブラリーに由来するポリヌクレオチドによってコードされる。
【００９３】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される二重特異性抗体は、更なる特異性を有してもよい。例えば、二重特異性抗体の抗原結合部位または標的結合部位のうちの１つは、２つ以上の標的に特異的に結合し得る。
【００９４】
二重特異性抗体を作製／生成する方法は、当該技術分野において知られている。全長二重特異性抗体の産生は、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの共発現に基づくことができ、これらの２つの鎖は、異なる特異性を有する（Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３））。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖は、ランダムな組み合わせであるため、これらのハイブリドーマ（クアドローマ）は、１０種の異なる抗体分子の混合物を産生する可能性があり、正しい二重特異性構造を有するのは、これらのうちの１つのみである。正しい分子の精製は、通常、アフィニティークロマトグラフィーステップにより行われるが、かなり煩雑であり、生成物の収率は低い。同様の手法がＷＯ９３／０８８２９及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０：３６５５−３６５９（１９９１）に開示されている。
【００９５】
当該技術分野において知られている、二重特異性抗体を作製するためのアプローチの１つは、「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）」または「空隙への突起（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ）」法である（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号参照）。このアプローチにおいて、２つの免疫グロブリンポリペプチド（例えば、重鎖ポリペプチド）は、それぞれ界面を含む。一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面は、もう一方の免疫グロブリンポリペプチド上の対応する界面と相互作用し、それにより、２つの免疫グロブリンポリペプチドの会合が可能となる。これらの界面は、一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面に位置する「ノブ」または「突起」（これらの用語は本明細書で区別なく使用され得る）が、もう一方の免疫グロブリンポリペプチドの界面に位置する「ホール」または「空隙」（これらの用語は本明細書で区別なく使用され得る）に対応するように操作され得る。いくつかの実施形態において、ホールは、ノブと同一または類似のサイズであり、２つの界面が相互作用するときに、一方の界面のノブがもう一方の界面の対応するホールに配置可能なように好適に配置される。理論に束縛されることを望むものではないが、これは、ヘテロ多量体を安定させ、他の種、例えば、ホモ多量体よりもヘテロ多量体の形成が優先されると考えられる。いくつかの実施形態において、このアプローチは、２つの異なる免疫グロブリンポリペプチドのヘテロ多量体化を促進し、異なるエピトープに対する結合特異性を有する２つの免疫グロブリンポリペプチドを含む二重特異性抗体を作製するために使用することができる。
【００９６】
いくつかの実施形態において、ノブは、小さなアミノ酸側鎖を大きな側鎖で置き換えることによって、構築され得る。いくつかの実施形態において、ホールは、大きなアミノ酸側鎖を小さな側鎖で置き換えることによって、構築され得る。ノブまたはホールは、元々の界面に存在してもよいし、合成的に導入されてもよい。例えば、ノブまたはホールは、少なくとも１つの「元の」アミノ酸残基を少なくとも１つの「移入」アミノ酸残基に置き換えるように、界面をコードする核酸配列を変更することによって、合成的に導入され得る。核酸配列の変更方法には、当該技術分野においてよく知られている標準的な分子生物学技法を挙げることができる。いくつかの実施形態において、元の残基は、小さな側鎖体積（例えば、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グリシン、セリン、スレオニン、またはバリン）を有し、ノブ形成のための移入残基は、天然アミノ酸であり、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンを含み得る。いくつかの実施形態において、元の残基は、大きな側鎖体積（例えば、アルギニン、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン）を有し、ホール形成のための移入残基は、天然アミノ酸であり、アラニン、セリン、スレオニン、及びバリンを含み得る。
【００９７】
いくつかの実施形態において、ノブまたはホール形成のための元の残基は、ヘテロ多量体またはホモ多量体（例えば、ホモ二量体）の三次元構造体に基づいて特定される。当該技術分野において知られている、三次元構造を取得する技術には、Ｘ線結晶学及びＮＭＲを挙げることができる。いくつかの実施形態において、界面は、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）定常ドメインのＣＨ３ドメインである。これらの実施形態において、ヒトＩｇＧ１のＣＨ３／ＣＨ３界面は、４つの逆平行βストランド上に位置する各ドメイン上の１６の残基を伴う。理論に束縛されることを望むものではないが、ノブがパートナーのＣＨ３ドメインの相補的ホールではなく周囲溶媒に受け入れられるリスクを最小限に抑えるために、変異残基は、好ましくは、中央の２つの逆平行βストランド上に位置する。いくつかの実施形態において、対応するノブとホールを形成する２つの免疫グロブリンポリペプチドの変異は、次の表に記載される１つ以上のペアに対応する。
2020537633.tif 000011
変異は、元の残基、次いでＫａｂａｔナンバリングシステムを使用した位置、続いて移入残基によって示される（残基は全て一文字のアミノ酸コードで示す）。複数の変異は、コロンで分けられている。
【００９８】
いくつかの実施形態において、免疫グロブリンポリペプチドは、上の表３に列挙される１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む。いくつかの実施形態において、二重特異性抗体は、表３の左カラムに列挙される１つ以上のアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む第１の免疫グロブリンポリペプチドと、表３の右カラムに列挙される１つ以上の対応するアミノ酸置換を含むＣＨ３ドメインを含む第２の免疫グロブリンポリペプチドと、を含む。
【００９９】
上で考察したＤＮＡの変異に続いて、対応するノブまたはホール形成変異を１つ以上有する改変された免疫グロブリンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、当該技術分野において知られている標準的な組み換え技法及び細胞系を使用して発現及び精製することができる。例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、同第５，８０７，７０６号、同第５，８２１，３３３号、同第７，６４２，２２８号、同第７，６９５，９３６号、同第８，２１６，８０５号、米国特許出願公開第２０１３／００８９５５３号、及びＳｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：７５３−７５８，２０１３を参照されたい。改変された免疫グロブリンポリペプチドは、Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核生物の宿主細胞、またはＣＨＯ細胞などの真核生物宿主細胞を使用して産生され得る。対応するノブ及びホールを有する免疫グロブリンポリペプチドは、宿主細胞中で共培養で発現させ、ヘテロ多量体として一緒に精製されてもよいし、単一培養で発現させ、別個に精製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立ててもよい。いくつかの実施形態において、２つの細菌宿主細胞株（一方はノブを有する免疫グロブリンポリペプチドを発現し、他方はホールを有する免疫グロブリンポリペプチドを発現する）が、当該技術分野において知られている標準的な細菌培養技法を使用して、共培養される。いくつかの実施形態において、２つの株は、例えば、培養における発現レベルが等しくなるように、特定の比率で混合され得る。いくつかの実施形態において、２つの株は、５０：５０、６０：４０、または７０：３０の比率で混合され得る。ポリペプチドの発現後、細胞は、共に溶解され得、タンパク質が抽出され得る。ホモ多量体種：ヘテロ多量体種の存在量の測定を可能にする、当該技術分野において既知の標準的な技法には、サイズ排除クロマトグラフィーを挙げることができる。いくつかの実施形態において、改変された免疫グロブリンポリペプチドのそれぞれは、標準的な組み換え技法を使用して別個に発現され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てられ得る。組み立ては、例えば、改変された免疫グロブリンポリペプチドをそれぞれ精製し、それらを同量で一緒に混合及びインキュベートし、ジスルフィドを還元し（例えば、ジチオスレイトールによる処理）、濃縮し、ポリペプチドを再酸化することによって、達成され得る。形成された二重特異性抗体は、カチオン交換クロマトグラフィーを含む標準的な技法を使用して精製され、サイズ排除クロマトグラフィーを含む標準的な技法を使用して測定され得る。これらの方法のより詳細な説明については、Ｓｐｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３１：７５３−８，２０１３を参照されたい。いくつかの実施形態において、改変された免疫グロブリンポリペプチドは、上記の方法を使用して、ＣＨＯ細胞で別個に発現され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで組み立てられ得る。
【０１００】
Ｖ．キット
別の態様において、本明細書で提供されるのは、本開示のポリヌクレオチドのライブラリーを含むキットである。いくつかの実施形態において、キットは、例えば、目的の抗体ＨＶＲまたは可変領域を特定するために、ライブラリーを発現、修飾、スクリーニング、または別の方法で使用するための説明を含む、添付文書を更に含む。いくつかの実施形態において、キットは、例えば、ポリヌクレオチド（例えば、合成ポリヌクレオチド）のうちの１つ以上を保存、移動、トランスフェクト、または別の方法で使用するための１つ以上のバッファーを更に含む。いくつかの実施形態において、キットは、ポリヌクレオチドのうちの１つ以上を保存するための１つ以上の容器を更に含む。いくつかの実施形態において、キットは、例えば、ポリヌクレオチドのうちの１つ以上を宿主細胞にトランスフェクションするための１つ以上のベクターを更に含む。
【実施例】
【０１０１】
本発明は、以下の実施例を参照することによって、より十分に理解されるであろう。しかしながら、実施例は、本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。本明細書に記載される実施例及び実施形態は、例示のみを目的にするものであり、それらを考慮した様々な変形または変更が当業者に想起され、本出願の趣旨及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれることを理解されたい。
【０１０２】
実施例１：超可変領域のダイナミックモチーフ最小セットの特定
抗体可変ドメインの可変性を構造レベルで理解するために、抗体可変ドメインの幾何学的アラインメントをマッピングし、更に、その幾何学的アラインメントに基づいて、構造エントロピー及び配列エントロピーを計算するアルゴリズムを開発した。そのようなアプローチを取ることは、よく確立されたＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子再構成プロセスによって決定される抗体多様性の古典的理論を、ダイナミックユニットによる立体構造多様性（Ｌｉｎｕｓ  Ｐａｕｌｉｎｇによる鋳型指向立体構造選択；例えば、Ｊａｍｅｓ，Ｌ．ａｎｄ  Ｔａｗｆｉｋ，Ｄ．“Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ−ａ  ６０−ｙｅａｒ−ｏｌｄ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｒｅｖｉｓｉｔｅｄ”，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ．２００３  Ｊｕｌ；２８（７）：３６１−８参照）と組み合わせて併用し、抗体結合部位の選択及び適合によって、ほぼ無限のエピトープ空間のサンプリングを可能にするものである。一例として、本アルゴリズムを使用して、８１のヒト抗体可変軽鎖ドメインの高解像度結晶構造に関する構造及び配列の可変性を解析した。可変軽鎖ドメインの全ての位置について、エントロピーを計算し、それをプロットした（図１Ａ；構造エントロピーは太線、配列エントロピーは点線）。幾何学的アラインメントに基づいた構造エントロピー及び配列エントロピーの計算によって得られた結果を使用して、超可変（ＨＶＲ）領域を特定し、これらの可変領域上の重要な位置を特定した。比較のために、例示的な抗体軽鎖可変ドメイン配列のＨＶＲ（上記の方法によって定義）及びＣＤＲ（Ｋａｂａｔによって定義）を特定した（図１Ｂ）。
【０１０３】
興味深いことに、構造アラインメントによって評価された可変性は、配列アラインメントで観察された可変性よりも概して低かった。構造アラインメントによって評価した場合、可変性は概して低かったが、劇的な構造変化を伴う部位／領域は多数あり、これらの可変部位が抗体機能に重要な役割を果たす可能性が示唆される。更に、これらの超可変領域のいくつかは、複数の立体構造を持ち、高い柔軟性を示す。可変性の高い残基領域の特定により、新しい抗体設計に活用できる、抗体可変ドメインの保存及び可変性に関するより包括的な全体像が得られた。このダイナミックモチーフの特定により、少ないアミノ酸配列数で広範囲な構造多様性をカバーすることが可能になった。抗体設計に対するこのアプローチの驚くべき利点は、より限定された数のダイナミックモチーフを可変領域に利用して広範囲の抗体構造多様性をカバーし、目的の複数の抗原への結合を可能にし得る幅広い柔軟性をこれらの抗体に提供できることであった。したがって、共通軽鎖ライブラリー（ＤＬ２８０と呼ばれる）は、不変残基には単一のヒト生殖細胞系列配列またはヒト生殖細胞系列由来配列を使用して構築したが、超可変領域には限定された数のダイナミックモチーフを使用することで、可変領域ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３で特定された広範囲の構造可変性を把握した。
【０１０４】
実施例２：共通軽鎖ライブラリーの構築
軽鎖ライブラリーＤＬ２８０の構築
ＤＬ２８０軽鎖ライブラリーの構築を開始するために、２０のＨＶＲ−Ｌ１配列とＨＶＲ−Ｌ２配列（表１）の組み合わせをコードする２０のミニ遺伝子を合成した。次いで、合成したミニ遺伝子をＰｖｕＩ及びＢａｍＨＩで消化し、同じ２つの制限酵素で消化した標的ベクターＦａｄ２２にライゲートした。このライゲーション混合物を用いてＤＨ１０Ｂ細胞の形質転換を行い、２０のコンストラクトを精製し、次の構築段階のために配列を検証した。
【０１０５】
１４のＨＶＲ−Ｌ３配列（表１）をコードする合計１４のオリゴペアを設計及び合成した。オリゴのアニーリングは、次の設定のＰＣＲ装置で実施した：９５℃で３分間、次いで、３５サイクル（各サイクル１５秒）９５℃から開始し、１サイクルごとに１℃減温。アニーリング後、各ペアをＰｓｔＩ及びＡｃｃ６５Ｉで別個に消化し、同じ２つの制限酵素で消化した上述の２０のコンストラクトに個別にライゲートした。このライゲーション混合物を用いて、ＤＨ１０Ｂ細胞の形質転換を個々に行い、得られた２８０のコンストラクトを精製し、定量し、配列を検証した。これらの２８０のコンストラクトに対応するＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３領域の配列を表２に列挙する。更に、これらの２８０のコンストラクトは、それぞれ、同じフレームワーク領域、すなわち、ＦＷ−Ｌ１（配列番号２４）、ＦＷ−Ｌ２（配列番号２５）、ＦＷ−Ｌ３（配列番号２６）、及びＦＷ−Ｌ４（配列番号２７）を有する。ライブラリー構築のために、２８０のコンストラクトのそれぞれを同量で混合した。
【０１０６】
上記の２８０のプラスミド混合物をＰｖｕＩ及びＡｃｃ６５Ｉで消化し、同じ２つの制限酵素で同じく消化したファージミドベクターＦａｄ４０にライゲートした。このライゲーション混合物を用いて、ＤＨ１０Ｂ細胞の形質転換を行い、得られたライブラリー（ＤＬ２８０）を精製し、定量し、完全なファージミドライブラリーの組み立てのために保存した。
【０１０７】
ＶＨライブラリーの構築
次のプロトコルにより、ＶＨ＿ｖｒ１及びＶＨ＿ｖｒ２をコードする複数の縮重オリゴを設計し、合成し、二本鎖ＤＮＡに変換した。０．７５μＬの０．２μＭ鋳型オリゴを、１０μＬの５ｘ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲバッファー、４μＬのｄＮＴＰ混合物、１μＬの１００μＭフォワードプライマー、１μＬの１００μＭリバースプライマー、０．５μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μＬ）、及び３３μＬの水と混合した。ＰＣＲ溶液を９６℃で５分間予熱し、次いで、１４サイクル（９６℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で６秒）を実施し、続いて、７２℃で３分間伸長した。ＶＨ＿ｖｒ１は、プライマーペアＦ＿１９９９（ＣＧＴＴＴＧＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧ）（配列番号６１）及びＲ＿１９９９（ＣＧＡＧＧＣＣＣＴＴＡＣＣＣＧＧＧＧＣＣＴＧＡＣＧ）（配列番号６２）を使用して増幅し、一方、ＶＨ＿ｖｒ２は、プライマーペアＦ＿２００３（ＣＣＧＧＧＴＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＡＧＴＧＧ）（配列番号６３）及びＲ＿２００３（ＧＡＧＣＡＣＧＴＣＣＧＴＴＣＧＡＡＴＴＧＴＣＧＣＧＡＣＴＴＡＴＡＧ）（配列番号６４）を使用して増幅した（表４）。
【０１０８】
二本鎖のＶＨ＿ｖｒ１及びＶＨ＿ｖｒ２を、その５’末端または３’末端にある重複配列を介して結合させた。使用したプロトコルは、次のとおりであった。２０ｎｇのＶＨ＿ｖｒ１及び２０ｎｇのＶＨ＿ｖｒ２鋳型を、１０μＬの５ｘ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲバッファー、４μＬのｄＮＴＰ混合物、１μＬの１００μＭ  Ｆ＿１９９９プライマー、１μＬの１００μＭ  Ｒ＿２００３プライマー、０．５μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μＬ）、及び水（最大５０μＬ）と混合した。混合物を９６℃で５分間予熱し、次いで、１４サイクル（９６℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で１０秒）を実施し、続いて、７２℃で３分間伸長した。次いで、これらのＰＣＲフラグメントをゲル電気泳動（ＧＥＮＥｒａｙ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット）により精製し、ＢｓｐＥＩ及びＢｓｔＢＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で消化し、その後、同じ２つの酵素で消化したＦＴＶ０１４にクローニングした。このライゲーション混合物を用いて、エレクトロポレーションによるＤＨ１０Ｂ細胞の形質転換を行い、計算した多様性の１０倍を超える数のコロニーをプラスミド調製物のために回収した。精製したプラスミドは、ライブラリーＶＨ−ＶＲ１２を構成した。
【０１０９】
次のプロトコルにより、ＶＨ＿ｖｒ３をコードする数百の縮重オリゴを設計し、合成し、二本鎖ＤＮＡに変換した。０．７５μＬの０．２μＭ鋳型オリゴを、１０μＬの５ｘ  ＰｒｉｍｅＳＴＡＲバッファー、４μＬのｄＮＴＰ混合物、１μＬの１００μＭフォワードプライマー、１μＬの１００μＭリバースプライマー、０．５μＬのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（２．５Ｕ／μＬ）、及び３３μＬの水と混合した。ＰＣＲ溶液を９６℃で５分間予熱し、次いで、１４サイクル（９６℃で１５秒、６０℃で１５秒、７２℃で６秒）を実施し、続いて、７２℃で３分間伸長した。フォワードプライマーは、Ｓ１０８９（ＡＣＡＡＣＴＧＡＡＣＡＧＣＴＴＡＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＧＴＣＴＡＴＴＡＴＴＧ）（配列番号６５）であり、リバースプライマーは、Ｓ１０９０（ＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＴＡＧＴＧＴＴＣＣＴＴＧＡＣＣＣＣＡ）（配列番号６６）であった（表４）。次いで、ＶＨ＿ｖｒ３をコードする二本鎖ＤＮＡをゲル電気泳動（ＧＥＮＥｒａｙ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット）により精製し、ＡｆｌＩＩ及びＳｐｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で消化し、その後、同じ２つの制限酵素で消化したＦＴＶ０１２にクローニングした。このライゲーション混合物を用いて、エレクトロポレーションによるＤＨ１０Ｂ細胞の形質転換を行い、計算した多様性の１０倍を超える数のコロニーをプラスミド調製物のために回収した。精製したプラスミドは、ライブラリーＶＨ−ＶＲ３を構成した。
【０１１０】
全長ＶＨライブラリーを組み立てるために、精製したＶＨ−ＶＲ３ライブラリープラスミド混合物をＡｆｌＩＩ及びＳｐｅＩ（ＮＥＢ）で消化し、ＶＲ３コードフラグメントをゲル電気泳動（ＧＥＮＥｒａｙ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット）により精製し、その後、同じ２つの制限酵素で消化したＶＨ−ＶＲ１２ライブラリープラスミド混合物にクローニングした。ライゲーション産物を脱塩した後（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ））、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を実施した。ＲＣＡは、以下のように実施した。４０ｎｇのライゲーション産物を、１０μＬの１０ｘ  ＮＥＢｕｆｆｅｒ４、５０μＬの１００μＭ  ｐｄ（Ｎ）８、及び水（最大８８．５μＬ）と混合し、９５℃で３分間加熱し、１サイクルずつ１℃下がる６５サイクル（各サイクル３０秒）でアニーリングした。１０μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、１μＬの１００×ＢＳＡ、及び０．５μＬのＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを添加した後、アニーリングした反応物を３０℃で一晩インキュベートした。ＲＣＡ産物を最初にＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡフラグメントを精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）、ＸｈｏＩで更に消化した。次いで、消化した産物をＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でライゲートした。エタノール沈殿による精製後、このライゲーション産物を用いて、エレクトロポレーションによるＤＨ１０Ｂ細胞の形質転換を行い、計算した多様性の１０倍を超える数のコロニーをプラスミド調製物のために回収した。精製したプラスミドは、ライブラリーＶＨ−ＶＲ１２３を構成した。
2020537633.tif 000012
【０１１１】
共通軽鎖ライブラリーの構築
共通軽鎖ライブラリーは、ＶＨ−ＶＲ１２３ライブラリーに由来する重鎖ライブラリーと、ＤＬ２８０ライブラリーに由来する軽鎖ライブラリーとから構成された。ＶＨ−ＶＲ１２３ライブラリープラスミドとＤＬ２８０ライブラリープラスミドの両方をＢｓｐＥＩ及びＳｐｅＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で消化した。ＶＨ−ＶＲ１２３ライブラリーに由来する重鎖をコードするＤＮＡフラグメントを、ＤＬ２８０ライブラリーに由来するベクター骨格にクローニングした。ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）前に、ライゲーション産物を脱塩した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ））。ＲＣＡは、以下のように実施した。４０ｎｇのライゲーション産物を、１０μＬの１０ｘ  ＮＥＢｕｆｆｅｒ４、５０μＬの１００μＭ  ｐｄ（Ｎ）８、及び水（最大８８．５μＬ）と混合し、９５℃で３分間加熱し、１サイクルずつ１℃下がる６５サイクル（各サイクル３０秒）でアニーリングした。１０μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミックス、１μＬの１００×ＢＳＡ、及び０．５μＬのＰｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを添加した後、アニーリングした反応物を３０℃で一晩インキュベートした。ＲＣＡ産物を最初にＮｏｔＩで消化し、ＤＮＡフラグメントを精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）、Ａｃｃ６５Ｉで更に消化した。次いで、消化した産物をＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でライゲートした。エタノール沈殿による精製後、ライゲーション産物でＥＲ２７３８細胞をエレクトロポレーションによって形質転換した。プレートから合計３．５＊１０９のコロニーを回収した（２ｘＹＴ、１％グルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン）。
【０１１２】
実施例３：目的の抗体を単離するための共通軽鎖ライブラリーのスクリーニング
共通軽鎖ライブラリーファージミド粒子の調製
抗原パンニングのための共通軽鎖ライブラリーファージミド粒子を調製するために、共通軽鎖ライブラリーを含むＥＲ２７３８細胞（上の実施例２に記載）１．６リットルを、０．１の開始ＯＤ６００で、２ｘＹＴ、２％グルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含む培地中に播種した。培養液を、２５０ｒｐｍで振盪しながら、０．６〜０．８のＯＤ６００に達するまで、３７℃で成長させた。次いで、多重感染度（ＭＯＩ）１０で、３７℃で３０分間、細胞にＭ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させた。感染したＥＲ２７３８細胞を、２ｘＹＴ、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む３．２リットルの培地中、２２℃で一晩、成長させた。次いで、培養上清を１０，０００ｒｐｍで１５分間、遠心分離によって回収し、０．４５μｍの低結合メンブレンフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に通して濾過した。次いで、ＰＥＧ／ＮａＣｌを使用して、濾過した上清からファージミド粒子を沈殿させ、ＰＢＳ中に再懸濁した。ＰＥＧ／ＮａＣｌによる沈殿と、それに続くＰＢＳ中への再懸濁のラウンドを追加で実施した。ファージ濃度をＯＤ２６８の測定（ＯＤ２６８の１単位を約１＊１０１３ファージ粒子／ｍＬと仮定）によって決定し、プラークアッセイによって確認した。ライブラリーファージミド粒子を、２０％グリセロール中、−８０℃で保存した。
【０１１３】
ファージライブラリーパンニング
１〜３０μｇ／ｍｌの濃度の抗原タンパク質をＭａｘｉｓｏｒｐストリップ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号４４６４６９）上に４℃で一晩コーティングした。各ライブラリーに対して、複数の抗原ウェルを準備した。コーティングしたウェルを、まず、５％ミルク含有ＰＢＳを用いて、室温で１〜２時間ブロッキングし、ＰＢＳで洗浄した。次いで、１，１００μＬ／ウェルのファージミド粒子溶液（典型的に、２％ミルク含有ＰＢＳ中、１〜５＊１０１２個のファージ）を４つの平行ウェルに添加し、１〜２時間インキュベートした。次いで、Ｔｗｅｅｎ  ２０の濃度を上げながら（０．１％から０．３％）、ＰＢＳでウェルを数回洗浄し、最後にＰＢＳだけで洗浄した。結合したファージミド粒子を、１００μＬの０．２Ｍグリシン−ＨＣｌを用いて、室温で１０分間、ウェルから溶出した。溶出したファージを、直ちに、１８μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和した（ｐＨ９．１）。
【０１１４】
あるいは、ＫｉｎｇＦｉｓｈｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｍ２８０、ストレプトアビジン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６０２１０）を製造元の説明書に従って使用して、ファージミドライブラリーパンニングを実施した。３００μＬのＤｙｎａｂｅａｄｓをＰＢＳで洗浄し、ビオチン化した抗ヒトＦｃとともに、室温で２０分間、インキュベートした。次いで、ビーズを５％ＢＳＡのＰＢＳで、室温で１時間、ブロッキングした。Ｆｃ融合抗原（７０〜１００ｐｍｏｌ）を１時間の室温でのインキュベーションによって捕捉した。次いで、ビーズをＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＬのファージライブラリー溶液（典型的に、５％ＢＳＡ−ＰＢＳ中５＊１０１２〜１＊１０１３個のファージ粒子）とともに１〜２時間インキュベートした。次いで、ビーズをＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（０．１％〜０．３％）及びＰＢＳで数回洗浄し、結合したファージを、１００μＬの０．２Ｍグリシン−ＨＣｌを用いて、室温で１０分間、ビーズから溶出した。溶出したファージを、直ちに、１８μＬの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌで中和した（ｐＨ９．１）。抗原のそれぞれに対して、合計３ラウンドまたは４ラウンドのパンニングを実施し、１０〜１００倍の過剰量の精製ヒトＦｃを含めて、バックグラウンド結合を減らした。
【０１１５】
試験した抗原のいくつかについては、２ｍＬの抗原（１０〜３０μｇ／ｍＬ）を使用して、イムノチューブを４℃で一晩コーティングした。ブロッキング、洗浄、及び溶出の各溶液の量は、必要に応じて増やした。
【０１１６】
濃縮したファージの増幅
溶出した濃縮ファージプールを次のように更に増幅した。溶出したファージミド粒子をＥＲ２７３８細胞に３７℃で３０分間、感染させた。次いで、感染細胞を、２％グルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリンを含む２ｘＹＴ寒天プレート上に播種した。プレートからコロニーを回収し、１００ｍｌの２％グルコース、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び１２．５μｇ／ｍＬのテトラサイクリン中で成長させ、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージを感染させた。増幅したファージを上記プロセスによって精製及び定量した。通常、パンニングの最終ラウンド後に溶出したファージを使用してＥＲ２７３８細胞の感染を行い、得られたＥＲ２７３８コロニーを上清ＥＬＩＳＡスクリーニングアッセイのために採取した。
【０１１７】
上清サンドイッチＥｌｉｓａアッセイ
細菌上清中に存在するＦａｂを測定するために、高感度サンドイッチＥｌｉｓａアッセイを構築した。マイクロプレートをポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）（Ｓｉｇｍａ  Ｉ５２６０）でコーティングして、細菌上清中に存在するＦａｂを捕捉し、次いで、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦｃを使用して、Ｆａｂの捕捉量を検出した。各ウェルのＡ４５０を測定して、Ｆａｂ結合活性を決定した。一次ヒットは、ＥＬＩＳＡシグナルがバックグラウンドの少なくとも２倍であるものと定義し、以下の実施例（実施例４）で更に特徴付けた。
【０１１８】
実施例４：ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗体の特徴付け
上の実施例３で特定された一次ヒットに対応するＦａｂに、Ｈｉｓ６タグをＣＨ１ドメインのＣ末端にタグ付けし、Ｅ．ｃｏｌｉで過剰発現させ、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、製造元の説明書に従って精製した。親和性をＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６  Ｓｙｓｔｅｍによって測定した。簡潔に述べれば、抗原を捕捉するために、ＡＨＣセンサー（抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃ捕捉ディップ及び読み取りバイオセンサー）を使用し、カイネティクスバッファーで５〜１０μｇ／ｍＬまで希釈した精製Ｆａｂを含有するウェル中に浸漬させた（更なる説明については、例えば、ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｃａｐｔｕｒｅ（ＡＨＣ）Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｓｅｒｔ  ４１−００７２−ＰＤ（２００８）を参照されたい）。取得したＦｏｒｔｅＢｉｏデータをＤａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウェア７．１で処理し、カイネティクスデータを１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィッティングさせた。標的ＴＡＧＴ−１、ＴＡＧＴ−２、及びＴＡＧＴ−３について、２５℃で測定したＦａｂの親和性を表５及び図３に示す。これらの３つの標的抗原（ＴＡＧＴ−１、ＴＡＧＴ−２、及びＴＡＧＴ−３）は、１７％未満の配列同一性を有する無関係のタンパク質であった。
表５：ＴＡＧＴ−１、ＴＡＧＴ−２、及びＴＡＧＴ−３への結合が確認されたＦａｂの、２５℃における親和性測定値
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【０１１９】
上の表５に示されるように、３つの異なる抗原を標的とする親和性の高い複数の抗体が、調製したライブラリーから問題なく特定され、選択された。
【０１２０】
実施例５：ＤＬ２８０ライブラリーのアプリケーション
実施例２で組み立てたＤＬ２８０軽鎖ライブラリーのアプリケーションを異なるシナリオで実証するために、ＤＬ２８０軽鎖ライブラリーを使用して、３つの抗体ライブラリーを構築した：
ＤＰＬ５：大規模ＶＨライブラリーとペアリングされたＤＬ２８０軽鎖のセット全体
ＶＨ：多様性は、＞１０９  ＶＨ
ＶＬ：ＤＬ２８０のセット全体
ＳＥＬ０２１：小規模ＶＨライブラリーとペアリングされたＤＬ２８０軽鎖のセット全体
ＶＨ：２０のＶＨ
ＶＬ：ＤＬ２８０のセット全体
ＤＰＬ１６〜ＤＰＬ３４：大規模ＶＨライブラリーとペアリングされたＤＬ２８０軽鎖のサブセット
ＶＨ：多様性は、＞１０１０  ＶＨ
ＶＬ：ＤＬ２８０の単一種
【０１２１】
ＤＬ２８０軽鎖ライブラリーのロバスト性及び柔軟性を調べるために、ＤＰＬ５、ＳＥＬ０２１、及びＤＰＬ１６〜ＤＰＬ３４ライブラリーを３つの標的：ＴＡＧＴ−１、ＴＡＧＴ−２、及びＴＡＧＴ−３に対してスクリーニングした（実施例３に記載のとおり）。試験した３つのライブラリーのそれぞれからポジティブヒットを特定し、２４のユニークＶＬを含む合計１６５のポジティブヒットを測定し、親和性データにより確認した（表６）。
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【０１２２】
２４のユニークＶＬのうち、９つは、異なるＶＨとペアリングさせると、複数の標的に結合した。例えば、ヒットＩＤ３７５７は、ＤＬ２８０−１３５（配列番号２８）及びＶＨ（配列番号５１）を含有し、ＴＡＧＴ−１に結合するが、ヒットＩＤ５９０５は、同じくＤＬ２８０−１３５を含有するが、異なるＶＨ（配列番号５２）を有し、異なる標的であるＴＡＧＴ−３に結合した。同様に、ＤＬ２８０−６７（配列番号３４）は、１つのＶＨ（配列番号５６）とペアリングさせてヒットＩＤ５１４５にすると、ＴＡＧＴ−２に結合したが、異なるＶＨ（配列番号５７）とペアリングさせてヒットＩＤ７０７７にすると、ＴＡＧＴ−１に結合した。
【０１２３】
ＤＬ２８０に由来するＶＬはまた、異なるＶＨ配列とペアリングさせると、３つの標的抗原全てに結合することができることが発見された。例えば、ＤＬ２８０−７０（配列番号３２）は、１つのＶＨ（配列番号５３）とペアリングさせてヒットＩＤ７０３５にすると、ＴＡＧＴ−２に結合し、２つ目のＶＨ（配列番号５４）とペアリングさせてヒットＩＤ４２１８にすると、ＴＡＧＴ−１と結合し、３つ目のＶＨ（配列番号５５）とペアリングさせてヒットＩＤ５１１４にすると、ＴＡＧＴ−３と結合した。更なる２つのＤＬ２８０は、複数の異なるＶＨを使用すると、同じ標的に結合した。例えば、ＤＬ２８０−２７１（配列番号３６）は、２つの異なるＶＨ（配列番号５８及び５９）とペアリングさせて、それぞれヒットＩＤ５９３０及び６００８にすると、ＴＡＧＴ−３に結合した。以下の表７は、ライブラリー解析中に特定された２４のユニークＶＬの配列使用率と、標的結合数を示す。
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【０１２４】
ＤＰＬ５及びＳＥＬ０２１ライブラリーの抗体ヒットについて、ＤＬ２８０のセグメント使用を解析した（図２Ａ）。
【０１２５】
上位ＶＬのうち１９（表７に示されるとおり）は、単一のＶＬライブラリー（ＤＰＬ１６〜３４）として、ＶＬを、１０１０を超えるＶＨ配列を有するＶＨライブラリーとペアリングすることによって構築したものであり、ＴＡＧＴ−３、ＴＡＧＴ−２、及びＴＡＧＴ−１への結合を再度解析することによって、これらの抗体を再スクリーニングした。３つのライブラリーの全て（ＤＰＬ５、ＳＥＬ０２１、及びＤＰＬ１６〜３４）のヒットを確認した後、ＤＬ２８０のセグメント使用（図２Ｂ）を再評価した（表８）。理論に束縛されることを望むものではないが、所与の超可変領域を含む抗体が結合する抗原の数が多いことは、その特定の超可変領域の柔軟性の程度が高いことを示し得、一方、所与の超可変領域のセグメント使用率が高いことは、超可変領域（及び周辺のポリペプチド配列）のフォールディングがロバストであることを示し得ると考えられる。
表８：ＤＰＬ５、ＳＥＬ０２１、及びＤＰＬ１６〜３４から確認されたヒットにおけるＤＬ２８０のセグメント使用率
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【０１２６】
セグメントの組み合わせ分布についても、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の全ての組み合わせについて計算した（表９及び１０）。
表９：ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の２つのセグメントの組み合わせ使用率
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表１０：ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つのセグメントの組み合わせ使用率
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【０１２７】
構造及び配列可変性に基づいて再定義された抗体の超可変領域をダイナミックモチーフの特定に採用した新規方法により、ＶＬ構成要素がペアリングされるＶＨセグメントに応じて同一または複数の異なる標的に結合することができる、限定された数のＶＬ構成要素の設計が可能になった。本明細書に記載されるデータ及び抗体は、ＤＬ２８０軽鎖ライブラリーが、セット全体またはサブセットのいずれで使用される場合でも、抗体発見に関し、ＶＬ構成要素として機能するのに十分ロバストであることを明らかにしている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年8月21日(2020.8.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む抗体軽鎖であって、前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、抗体軽鎖。
【請求項２】
ａ．前記軽鎖可変領域が、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む前記抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む；
ｂ．前記軽鎖可変領域が、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１を含み、前記抗体のＨＶＲ−Ｌ２は、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む；
ｃ．前記軽鎖可変領域が、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む抗体のＨＶＲ−Ｌ３と、を含む；
ｄ．前記軽鎖可変領域が、配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３と、を含む；
ｅ．前記軽鎖可変領域が、（１）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１１ｂ）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１０〜２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１２）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１３）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１４）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５〜９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１６）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１７）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１８）配列番号１〜４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む；
ｆ．前記軽鎖可変領域が、（１）配列番号２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（２）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（３）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（４）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（５）配列番号３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（６）配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（７）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（８）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（９）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；（１０）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３；及び（１１）配列番号４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１と、配列番号８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２と、配列番号１１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む；または
ｇ．前記軽鎖可変領域が、表２に列挙される抗体のＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３の３つを含む
請求項１に記載の抗体軽鎖。
【請求項３】
ａ．前記軽鎖可変領域が、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ１と、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ２と、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ３と、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＦＷ−Ｌ４と、を含む；
ｂ．前記軽鎖可変領域が、配列番号２８〜５０からなる群から選択される配列を含む；及び／または
ｃ．前記軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つが、構造決定及び／またはコンピューターモデリングによって評価されたとき、複数の立体構造を取る、請求項１または２に記載の抗体軽鎖。
【請求項４】
ポリヌクレオチドを含むライブラリーであって、前記ポリヌクレオチドが請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体軽鎖可変領域をコードする、ライブラリー。
【請求項５】
ａ．前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも１０が、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域をコードし、前記抗体軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む；または
ｂ．前記ポリヌクレオチドのそれぞれが、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及びＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖をコードし、前記抗体軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも２つは、配列番号１〜４からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ１配列、配列番号５〜９からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ２配列、及び配列番号１０〜２３からなる群から選択されるＨＶＲ−Ｌ３配列から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のライブラリー。
【請求項６】
ａ．前記ポリヌクレオチドが、約１０００未満のＨＶＲ−Ｌ１配列、ＨＶＲ−Ｌ２配列、及びＨＶＲ−Ｌ３配列のユニークな組み合わせを含む；及び／または
ｂ．前記ポリヌクレオチドが、約２８０以下のＨＶＲ−Ｌ１配列、ＨＶＲ−Ｌ２配列、及びＨＶＲ−Ｌ３配列のユニークな組み合わせを含む、請求項４または５に記載のライブラリー。
【請求項７】
前記ポリヌクレオチドが完全長抗体軽鎖をコードする、請求項４〜６のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項８】
抗体重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを更に含み、任意選択的に、抗体重鎖可変領域をコードする前記ポリヌクレオチドが、少なくとも１つのユニーク配列、少なくとも１００のユニーク配列、少なくとも１０００のユニーク配列、または少なくとも約１０９のユニーク配列を含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチドが複数のユニーク抗体をコードし、前記複数の各抗体の前記軽鎖可変領域は、同一の配列を含み、任意選択的に、ライブラリー中の前記抗体の前記重鎖可変領域が、少なくとも１つのユニーク配列、少なくとも１００のユニーク配列、少なくとも１０００のユニーク配列、または少なくとも約１０９のユニーク配列を有する、請求項８に記載のライブラリー。
【請求項１０】
ａ．前記ライブラリーの前記ポリヌクレオチドが合成ポリヌクレオチドである；
ｂ．前記抗体軽鎖可変領域の前記ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３のうちの少なくとも１つが、構造決定及び／またはコンピューターモデリングによって評価されたとき、複数の立体構造を取る；
ｃ．前記抗体軽鎖可変領域をコードする前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、ベクター中にあり、任意選択的に、前記ベクターが、発現ベクターまたはディスプレイベクターである；及び／または
ｄ．前記抗体軽鎖可変領域をコードする前記ポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つが、細胞中にあり、任意選択的に、前記細胞が、細菌、酵母、または哺乳類の細胞である
請求項４〜９のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項１１】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のライブラリーを含む非ヒト動物であって、任意選択的に、前記非ヒト動物が哺乳類である、非ヒト動物。
【請求項１２】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のライブラリーを含む、ファージ。
【請求項１３】
重鎖及び軽鎖を含む抗体であって、前記軽鎖が、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体軽鎖であり、任意選択的に、前記抗体が、約１０−７〜約１０−１１Ｍの平衡解離定数（Ｋｄ）で、少なくとも１つの標的に結合する、抗体。
【請求項１４】
抗原結合ドメインを含むライブラリーであって、前記抗原結合ドメインのうちの１つは、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体軽鎖可変領域を含み、任意選択的に、
ａ．前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変領域を更に含む；及び／または
ｂ．前記ライブラリーがファージを含み、前記抗原結合ドメインが前記ライブラリーの少なくとも１つのファージの表面上に提示される、ライブラリー。
【請求項１５】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のライブラリーのポリヌクレオチド配列を準備し、組み立てることを含む、ライブラリーの調製方法。
【請求項１６】
抗体ライブラリーの作製方法であって、
ａ．複数の立体構造を有する配列を有する、１つ、２つまたは３つの軽鎖ＨＶＲを選択するステップと、
ｂ．ポリヌクレオチド配列を組み立てて、複数の抗体軽鎖可変領域配列をコードするポリヌクレオチドのライブラリーを生成するステップと、を含み、
ポリヌクレオチドの１つが、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体軽鎖可変領域をコードし、任意選択的に、
抗体軽鎖可変領域配列が、ヒト抗体配列である、方法。
【請求項１７】
２つの抗体重鎖可変領域及び２つの同一の軽鎖可変領域を含む、二重特異性抗体の生成方法であって、
ａ．第１の抗原に結合する第１の抗原結合ドメインをスクリーニングすることであって、前記第１の抗原結合ドメインは、第１の抗体重鎖可変領域及び第１の抗体軽鎖可変領域を含み、前記第１の抗体軽鎖可変領域は、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体軽鎖可変領域である、前記スクリーニングすることと、
ｂ．第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインをスクリーニングすることであって、前記第２の抗原結合ドメインは、第２の抗体重鎖可変領域及び第２の抗体軽鎖可変領域を含み、前記第２の抗体軽鎖可変領域は、前記第１の抗体軽鎖可変領域と同じ配列を有する、前記スクリーニングをすることと、
ｃ．前記第１の抗原結合ドメイン及び前記第２の抗原結合ドメインを含む二重特異性抗体を生成することと、を含む、生成方法。
【請求項１８】
二重特異性抗体であって、
ａ．第１の重鎖可変領域及び第１の軽鎖可変領域を含む第１の結合ドメインであって、第１の標的に結合する、前記第１の結合ドメインと、
ｂ．第２の重鎖可変領域及び第２の軽鎖可変領域を含む第２の結合ドメインであって、前記第２の結合ドメインは、第２の標的に結合し、前記第２の軽鎖可変領域は、前記第１の軽鎖可変領域配列と同一の配列を有する、前記第２の結合ドメインと、を含み、前記第１及び第２の軽鎖可変領域のそれぞれは、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体軽鎖可変領域であり、
任意選択的に、前記第１の重鎖可変領域が、第１の重鎖定常領域に連結され、前記第２の重鎖可変領域が、第２の重鎖定常領域に連結され、前記第１の抗体軽鎖可変領域が、第１の軽鎖定常領域に連結され、前記第２の抗体軽鎖可変領域が、第２の軽鎖定常領域に連結され、前記第１及び前記第２の抗体軽鎖が、同一の配列を有する、二重特異性抗体。
【請求項１９】
請求項４〜１０のいずれか１項に記載のライブラリーを含む、キット。
【国際調査報告】
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