(57)【要約】  同種宿主に移植された場合に移植部位で局所免疫抑制を提供するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された細胞と、この細胞を作製及び使用する方法とが提供される。細胞は、トランスジーンのセットであって、各トランスジーンは、細胞質性、膜結合性又は局所作用性である遺伝子産物であって、その機能は、抗原提示細胞の活性化及び機能を緩和すること、移植片攻撃白血球活性又は細胞溶解機能を緩和すること、同種移植片細胞のマクロファージ細胞溶解機能及び食作用を緩和すること、移植片攻撃白血球においてアポトーシスを誘導すること、局所炎症タンパク質を緩和すること、及び白血球媒介アポトーシスから保護することの１つ又は複数である、遺伝子産物をコードする、トランスジーンのセットを含む。トランスジーンは、以下の遺伝子：ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡＧ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６の２つ以上を含む。【選択図】図１Ａ−Ｄ
2020523037.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
同種宿主に移植された場合に移植部位で局所免疫抑制を提供するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された細胞であって、
−  トランスジーンのセットであって、各トランスジーンは、細胞質性、膜結合性又は局所作用性である遺伝子産物であって、その機能は、
ａ）抗原提示細胞の活性化及び機能を緩和すること、
ｂ）移植片攻撃白血球活性又は細胞溶解機能を緩和すること、
ｃ）同種移植片細胞のマクロファージ細胞溶解機能及び食作用を緩和すること、
ｄ）移植片攻撃白血球においてアポトーシスを誘導すること、
ｅ）局所炎症タンパク質を緩和すること、及び
ｆ）白血球媒介アポトーシスから保護すること
の１つ又は複数である、遺伝子産物をコードする、トランスジーンのセット
を含み、前記トランスジーンのセットは、以下の遺伝子：ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６或いはＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ若しくはＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ若しくはＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１若しくはＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８又はＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９若しくはＳｐｉ６のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子の２つ以上を含む、細胞。
【請求項２】
前記トランスジーンのセットは、以下の遺伝子：ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６或いはＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ若しくはＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ若しくはＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１若しくはＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８又はＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９若しくはＳｐｉ６のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子の３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全てを含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記トランスジーン遺伝子のセットは、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ若しくはＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ若しくはＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１若しくはＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９若しくはＳｐｉ６又はＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ若しくはＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ若しくはＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１若しくはＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９若しくはＳｐｉ６のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項４】
以下のトランスジーン：ＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１及びＩＦＮγＲ１  ｄ３９又はＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１若しくはＩＦＮγＲ１  ｄ３９のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子の１つ又は複数をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項５】
前記ＴＧＦ−β又は生物学的物質は、移植片環境内で局所的に作用する、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
幹細胞、ゲノム編集に従う細胞及び／又は治療細胞型の供給源である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項７】
胚幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞又は前駆細胞、生殖幹細胞、肺幹細胞又は前駆細胞、乳腺幹細胞、嗅覚成体幹細胞、毛包幹細胞、腸管幹細胞又は前駆細胞、複能性幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞、神経幹細胞又は前駆細胞、成体幹細胞、体性幹細胞、組織特異的幹細胞、全能性幹細胞、線維芽細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、肝芽細胞、筋芽細胞、前脂肪細胞、肝細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、Ｋ５６２ヒト赤血球系白血病細胞株、骨細胞、滑膜細胞、腱細胞、靭帯細胞、半月板細胞、脂肪細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、赤血球性−巨核球性細胞、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、島β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、外分泌前駆細胞、管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色又は褐色脂肪細胞、ホルモン分泌細胞、表皮角化細胞、上皮細胞、腎細胞、生殖細胞、骨格関節滑膜細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、軟骨細胞、内皮細胞、心膜細胞、髄膜細胞、ケラチノサイト前駆細胞、ケラチノサイト幹細胞、周皮細胞、グリア細胞、上衣細胞、羊膜又は胎盤膜から単離された細胞、漿膜細胞、体細胞或いは皮膚、心臓、脳若しくは脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、腸又は胃に由来する細胞である、請求項６に記載の細胞。
【請求項８】
細胞増殖を制御するための少なくとも１つの機構をさらに含み、
ａ）１つ又は複数の細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）の遺伝子修飾であって、前記ＣＤＬは、１つ又は複数の内在性又は外性遺伝子座であって、その転写産物は、分裂細胞によって発現される、１つ又は複数の内在性又は外性遺伝子座であり、前記遺伝子修飾は、
ｉ）前記ＣＤＬをコードするＤＮＡ配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含むアブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系、及び
ｉｉ）前記ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系
の１つ又は複数である、遺伝子修飾
を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項９】
前記ＣＤＬの前記遺伝子修飾は、
ａ）前記ＡＬＩＮＫ系を含むＤＮＡベクター、
ｂ）前記ＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター、及び
ｃ）前記ＡＬＩＮＫ系及び前記ＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター
の１つ又は複数を用いて前記ＣＤＬのターゲティングされた置換を行うことを含み、前記ＡＬＩＮＫ及び／又はＥＡＲＣ系は、それぞれ前記ＣＤＬに作動可能に連結されている、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記ＣＤＬの前記遺伝子修飾は、同型接合性、異型接合性、半接合性若しくは複合異型接合性であり、及び／又は前記ＥＡＲＣ系を含む前記ＣＤＬの前記遺伝子修飾は、前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質によってのみ前記ＣＤＬの活性化をもたらす、請求項８又は９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記ＣＤＬは、表５に列挙される遺伝子座の１つ又は複数である、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記ＣＤＬは、細胞周期、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、タンパク質翻訳及び代謝の１つ又は複数において機能する遺伝子産物をコードする、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の１つ又は複数であり、好ましくは、前記ＣＤＬは、Ｃｄｋ１又はＣＤＫ１である、請求項１２に記載の細胞。
【請求項１４】
前記ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系を含み、好ましくは、前記ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系又はリガンド可逆二量体化系であり、好ましくは、前記ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系である、請求項８〜１３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６】
ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６の１つ又は複数は、活性化白血球における対応する内在性遺伝子の発現レベル以上のレベルで発現される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１７】
ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６の８つ全ては、活性化白血球における対応する内在性遺伝子の発現レベル以上のレベルで発現される、請求項１６に記載の細胞。
【請求項１８】
前記ＰＤ−Ｌ１トランスジーンは、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９】
前記ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３トランスジーンは、配列番号１６又は配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２０】
前記Ｃｄ４７トランスジーンは、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２１】
前記ＣＤ２００トランスジーンは、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２２】
前記ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬトランスジーンは、配列番号１０又は配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２３】
前記Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂトランスジーンは、配列番号２又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２４】
前記Ｍｆｇｅ８トランスジーンは、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２５】
前記Ｓｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６トランスジーンは、配列番号８又は配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２６】
前記ＩＦＮγＲ１  ｄ３９トランスジーンは、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項４〜２５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２７】
前記２つ以上のトランスジーンは、構成的プロモータに作動可能に連結されている、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項２８】
前記構成的プロモータは、ＣＡＧプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＥＦ１αプロモータ、ＰＧＫプロモータ、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＨＳＶのｔｋプロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶのＬＴＲプロモータ、モロニーウイルスのプロモータ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータからなる群から選択される、請求項２７に記載の細胞。
【請求項２９】
治療剤をコードするトランスジーンをさらに含む、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３０】
前記治療剤は、タンパク質又は抗体である、請求項２９に記載の細胞。
【請求項３１】
前記抗体は、阻害抗体又はアゴニスト抗体である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
前記治療剤は、表２に列挙される薬剤或いは癌、酵素若しくはホルモン欠損症、代謝疾患又は変性疾患において変異されることが知られている遺伝子の野生型バージョンである、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３３】
前記治療剤は、テトラサイクリン応答エレメント、光誘導系、放射性遺伝子系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、不安定化ドメイン系又はリガンド可逆二量体化系からなる群から選択される誘導性発現系を使用して発現される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３４】
前記治療剤は、ＣＡＧプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＥＦ１αプロモータ、ＰＧＫプロモータ、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＨＳＶのｔｋプロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶのＬＴＲプロモータ、モロニーウイルスのプロモータ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータからなる群から選択される構成的プロモータを使用して発現される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項３５】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の細胞を含む、遺伝子修飾細胞の集団。
【請求項３６】
同種宿主における移植部位での局所免疫抑制を提供するための方法であって、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の細胞又は請求項３５に記載の遺伝子修飾細胞の集団を同種宿主における移植部位に移植することを含む方法。
【請求項３７】
同種宿主における移植部位での局所免疫抑制を提供するための方法であって、
（ｉ）細胞を提供すること、及び
（ｉｉ）前記細胞内でトランスジーンのセットを発現させることであって、各トランスジーンは、細胞質性、膜結合性又は局所作用性の遺伝子産物であって、その機能は、
ａ）抗原提示細胞の活性化及び機能を緩和すること、
ｂ）移植片攻撃白血球活性又は細胞溶解機能を緩和すること、
ｃ）同種移植片細胞のマクロファージ細胞溶解機能及び食作用を緩和すること、
ｄ）移植片攻撃白血球においてアポトーシスを誘導すること、
ｅ）局所炎症タンパク質を緩和すること、及び
ｆ）白血球媒介アポトーシスから保護すること
の１つ又は複数である、遺伝子産物をコードする、発現させること
を含み、前記トランスジーンのセットは、以下の遺伝子：ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡＧ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６或いはＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ若しくはＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ若しくはＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１若しくはＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８又はＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９若しくはＳｐｉ６のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子の２つ以上を含む、方法。
【請求項３８】
前記トランスジーンのセットは、以下の遺伝子：ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６或いはＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ若しくはＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ若しくはＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１若しくはＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８又はＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９若しくはＳｐｉ６のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子の３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全てを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記トランスジーン遺伝子のセットは、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ若しくはＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ若しくはＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１若しくはＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９若しくはＳｐｉ６又はＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ若しくはＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ若しくはＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１若しくはＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９若しくはＳｐｉ６のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
以下のトランスジーン：ＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１及びＩＦＮγＲ１  ｄ３９又はＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１若しくはＩＦＮγＲ１  ｄ３９のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子の１つ又は複数を発現させることをさらに含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＴＧＦ−β又は生物学的物質は、移植片環境内で局所的に作用する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞は、幹細胞、ゲノム編集に従う細胞及び／又は治療細胞型の供給源である、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞は、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞又は前駆細胞、生殖幹細胞、肺幹細胞又は前駆細胞、乳腺幹細胞、嗅覚成体幹細胞、毛包幹細胞、腸管幹細胞又は前駆細胞、複能性幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞、神経幹細胞又は前駆細胞、成体幹細胞、体性幹細胞、組織特異的幹細胞、全能性幹細胞、線維芽細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、肝芽細胞、筋芽細胞、前脂肪細胞、肝細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、Ｋ５６２ヒト赤血球系白血病細胞株、骨細胞、滑膜細胞、腱細胞、靭帯細胞、半月板細胞、脂肪細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、赤血球性−巨核球性細胞、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、島β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、外分泌前駆細胞、管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色又は褐色脂肪細胞、ホルモン分泌細胞、表皮角化細胞、上皮細胞、腎細胞、生殖細胞、骨格関節滑膜細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、軟骨細胞、内皮細胞、心膜細胞、髄膜細胞、ケラチノサイト前駆細胞、ケラチノサイト幹細胞、周皮細胞、グリア細胞、上衣細胞、羊膜又は胎盤膜から単離された細胞、漿膜細胞、体細胞或いは皮膚、心臓、脳若しくは脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、腸又は胃に由来する細胞である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
同種宿主での移植部位において、請求項１〜７のいずれか一項に記載の細胞の増殖を制御する方法であって、
ａ）細胞内で細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）を遺伝子修飾することであって、前記ＣＤＬは、１つ又は複数の内在性又は外性遺伝子座であって、その転写産物は、分裂細胞によって発現される、１つ又は複数の内在性又は外性遺伝子座であり、前記ＣＤＬの前記遺伝子修飾は、
ｉ）前記ＣＤＬをコードするＤＮＡ配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含むアブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系、及び
ｉｉ）前記ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＤＬの調節の誘導性外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系
の１つ又は複数を含む、遺伝子修飾すること、
ｂ）前記細胞又は前記細胞の集団を同種宿主における移植部位に移植すること、及び
ｃ）ｉ）前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記遺伝子修飾細胞を前記陰性選択マーカの誘導物質の非存在下で維持することにより、前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記遺伝子修飾細胞の増殖を可能にし、且つ／又は前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記細胞を前記陰性選択マーカの前記誘導物質に曝露することにより、前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記遺伝子修飾細胞の増殖をアブレート若しくは阻害すること、及び／又は
ｉｉ）前記ＥＡＲＣ系を含む前記遺伝子修飾細胞を前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に暴露することにより、前記ＥＡＲＣ系を含む前記遺伝子修飾細胞の増殖を可能にするか、又は前記ＥＡＲＣ系を含む前記細胞を前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の前記誘導物質の非存在下で維持することにより、前記ＥＡＲＣ系を含む前記遺伝子修飾細胞の増殖を予防若しくは阻害すること
を含む方法。
【請求項４５】
前記同種宿主は、哺乳動物である、請求項３６〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記同種宿主は、マウスである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記同種宿主は、ヒトである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記宿主は、細胞療法を用いて処置され得る変性疾患又は状態を有する、請求項３６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記疾患又は状態は、盲目、関節炎、虚血、糖尿病、多発性硬化症、脊髄損傷、卒中、癌、肺疾患、血液疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、酵素若しくはホルモン欠損症、代謝疾患、自己免疫疾患、加齢黄斑変性症、網膜ジストロフィー、感染症、血友病、心筋梗塞、変性疾患又は加齢関連疾患である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６の１つ又は複数は、活性化白血球における対応する内在性遺伝子の発現レベル以上のレベルで発現される、請求項３７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６の８つ全ては、活性化白血球における対応する内在性遺伝子の発現レベル以上のレベルで発現される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記ＰＤ−Ｌ１トランスジーンは、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３トランスジーンは、配列番号１６又は配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｃｄ４７トランスジーンは、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＣＤ２００トランスジーンは、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬトランスジーンは、配列番号１０又は配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂトランスジーンは、配列番号２又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記Ｍｆｇｅ８トランスジーンは、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記Ｓｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６トランスジーンは、配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＩＦＮγＲ１  ｄ３９トランスジーンは、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項４０〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記１つ又は複数のトランスジーンは、構成的プロモータに作動可能に連結されている、請求項３７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記構成的プロモータは、ＣＡＧプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＥＦ１αプロモータ、ＰＧＫプロモータ、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＨＳＶのｔｋプロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶのＬＴＲプロモータ、モロニーウイルスのプロモータ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータからなる群から選択される、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記細胞は、治療剤をコードするトランスジーンをさらに含む、請求項３７〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記治療剤は、タンパク質又は抗体である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記抗体は、阻害抗体又はアゴニスト抗体である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記治療剤は、表２に列挙される薬剤又は対象において変異されている遺伝子の野生型バージョンである、請求項６３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記治療剤は、テトラサイクリン応答エレメント、光誘導系、放射性遺伝子系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、不安定化ドメイン系又はリガンド可逆二量体化系からなる群から選択される誘導性発現系を使用して発現される、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記治療剤は、ＣＡＧプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＥＦ１αプロモータ、ＰＧＫプロモータ、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＨＳＶのｔｋプロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶのＬＴＲプロモータ、モロニーウイルスのプロモータ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータからなる群から選択される構成的プロモータを使用して発現される、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の細胞を含む組成物。
【請求項７０】
薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
請求項１〜３４のいずれか一項に記載の細胞又は請求項６９若しくは７０に記載の組成物を含むキット。
【請求項７２】
疾患又は状態の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の細胞又は請求項６９若しくは７０に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項７３】
前記疾患又は状態は、盲目、関節炎、虚血、糖尿病、多発性硬化症、脊髄損傷、卒中、癌、肺疾患、血液疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、酵素若しくはホルモン欠損症、代謝疾患、自己免疫疾患、加齢黄斑変性症、網膜ジストロフィー、感染症、血友病、心筋梗塞、変性疾患、加齢関連疾患又は表２に列挙される疾患若しくは状態である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞は、前記対象への投与前に系統制限細胞型に分化される、請求項７２又は７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記疾患又は状態は、心筋梗塞であり、及び前記細胞は、心筋細胞に分化される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記疾患又は状態は、盲目であり、及び前記細胞は、光受容体細胞に分化される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記疾患又は状態は、脊髄損傷、パーキンソン病、ハンチントン病又はアルツハイマー病であり、及び前記細胞は、ニューロンに分化される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７８】
前記疾患又は状態は、多発性硬化症であり、及び前記細胞は、グリア細胞に分化される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞は、細胞又は前記治療剤を必要とする組織又は身体部位に局所投与される、請求項７２〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞は、静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、皮内、非経口的、動脈内、血管内又は潅流によって投与される、請求項７２〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞は、皮下注入によって投与されて、クロークされた皮下組織を産生する、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞は、組織として投与される、請求７２〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記組織は、ゲル、生体適合性マトリックス又は細胞足場と共に投与される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞は、２５，０００〜５，０００，０００，０００個の細胞の量で投与される、請求項７２〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記細胞は、８００，０００，０００〜３，０００，０００，０００個の細胞の量で投与される、請求項８０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項７２〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記追加の治療剤は、前記細胞の投与前に投与される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記追加の治療剤は、前記細胞の投与後に投与される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記追加の治療剤は、前記細胞の投与と同時に投与される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９０】
前記追加の治療剤は、免疫抑制剤、疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、生物学的応答修飾剤（ＤＭＡＲＤの一種）、コルチコステロイド若しくは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、メトトレキサート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、レフルノミド、シクロホスファミド、アザチオプリン、トファシチニブ、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、カイネレット、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ若しくはトシリズマブ、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アバタセプト、アダリムマブ、アレムツズマブ、アミノサリチル酸塩、抗生物質、抗ヒスタミン、抗ＴＮＦα、アザチオプリン、ベリムマブ、βインターフェロン、カルシニューリン阻害剤、セルトリズマブ、コルチコステロイド、クロモリン、シクロスポリンＡ、シクロスポリン、フマル酸ジメチル、エタネルセプト、フィンゴリモド、フマル酸エステル、グラチラマーアセテート、ゴリムマブ、ヒドロキシウレア、ＩＦＮγ、ＩＬ−１１、レフルノミド、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、長時間作用型β２アゴニスト、ミトキサントロン、ミコフェノール酸モフェチル、ナタリズマブ、オクレリズマブ、ピメクロリムス、プロバイオティック、レチノイド、サリチル酸、短時間作用型β２アゴニスト、スルファサラジン、タクロリムス、テリフルノミド、テオフィリン、トシリズマブ、ウステキヌマブ若しくはベドリズマブ、ベバキュジマブ、ラニビズマブ若しくはアフリベルセプト）、光線力学的治療、光凝固、カルビドパ−レボドパ、ドーパミンアゴニスト、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤、抗コリン作動薬、アマンタジン、深部脳刺激薬、抗凝固薬、抗血小板剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体遮断薬、アンギオテンシン受容体ネプリライシン阻害剤、β遮断薬、併用α及びβ遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、コレステロール低下薬、ニコチン酸、コレステロール吸収阻害剤、ジギタリス製剤、利尿薬、血管拡張剤、抗血小板剤二剤併用療法、心臓処置、抗ウイルス化合物、ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤、抗菌化合物、抗真菌化合物、抗寄生虫化合物、インスリン、スルホニルウレア、ビグアニド、メグリチニド、チアゾリジンジオン、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、α−グルコシダーゼ阻害剤、胆汁酸封鎖剤、アスピリン、食事療法、凝固因子、デスモプレシン、血餅保存薬、フィブリンシーラント、理学療法、補酵素、骨髄移植、器官移植、血液透析、血液濾過、交換輸血、腹膜透析、中鎖トリアシルグリセロール、ミグルスタット、酵素補充療法、チェックポイント阻害剤、化学療法薬、生物学的薬剤、放射線療法、凍結療法、温熱療法、外科的切除若しくは腫瘍組織又は抗癌ワクチンである、請求項８６〜８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記細胞の増殖を制御することをさらに含む、請求項７２〜９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記細胞は、ＡＬＩＮＫ系を含み、及び増殖を制御する前記方法は、
ｉ）前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記細胞を前記陰性選択マーカの誘導物質の非存在下で維持することにより、前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記細胞の増殖を可能にすること、又は
ｉｉ）前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記細胞を前記陰性選択マーカの前記誘導物質に暴露することにより、前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記細胞の増殖をアブレート若しくは阻害すること
を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞は、ＥＡＲＣ系を含み、及び増殖を制御する前記方法は、
ｉ）前記ＥＡＲＣ系を含む前記細胞を前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に暴露することにより、前記ＥＡＲＣ系を含む前記細胞の増殖を可能にすること、又は
ｉｉ）前記ＥＡＲＣ系を含む前記細胞を前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の前記誘導物質の非存在下で維持することにより、前記ＥＡＲＣ系を含む前記細胞の増殖を予防若しくは阻害すること
を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記細胞は、前記治療の完了後に除去される、請求項７２〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
疾患又は状態の処置を、それを必要とする対象において行う際に使用するための、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の細胞又は請求項６９若しくは７０に記載の組成物。
【請求項９６】
前記疾患又は状態は、盲目、関節炎、虚血、糖尿病、多発性硬化症、脊髄損傷、卒中、癌、肺疾患、血液疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、酵素若しくはホルモン欠損症、代謝疾患、自己免疫疾患、加齢黄斑変性症、網膜ジストロフィー、感染症、血友病、心筋梗塞、変性疾患、加齢関連疾患又は表２に列挙される疾患若しくは状態である、請求項９５に記載の細胞。
【請求項９７】
同種宿主における移植部位に局所免疫抑制を提供する際に使用するための、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の細胞又は請求項６９若しくは７０に記載の組成物。
【請求項９８】
以下のトランスジーン：ＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１及びＩＦＮγＲ１  ｄ３９又はＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１若しくはＩＦＮγＲ１  ｄ３９のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子の１つ又は複数をさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項９９】
前記ＴＧＦ−β又は生物学的物質は、移植片環境内で局所的に作用する、請求項９８に記載の細胞。
【請求項１００】
幹細胞、ゲノム編集に従う細胞及び／又は治療細胞型の供給源である、請求項１に記載の細胞。
【請求項１０１】
胚幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞又は前駆細胞、生殖幹細胞、肺幹細胞又は前駆細胞、乳腺幹細胞、嗅覚成体幹細胞、毛包幹細胞、腸管幹細胞又は前駆細胞、複能性幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞、神経幹細胞又は前駆細胞、成体幹細胞、体性幹細胞、組織特異的幹細胞、全能性幹細胞、線維芽細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、肝芽細胞、筋芽細胞、前脂肪細胞、肝細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、Ｋ５６２ヒト赤血球系白血病細胞株、骨細胞、滑膜細胞、腱細胞、靭帯細胞、半月板細胞、脂肪細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、赤血球性−巨核球性細胞、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、島β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、外分泌前駆細胞、管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色又は褐色脂肪細胞、ホルモン分泌細胞、表皮角化細胞、上皮細胞、腎細胞、生殖細胞、骨格関節滑膜細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、軟骨細胞、内皮細胞、心膜細胞、髄膜細胞、ケラチノサイト前駆細胞、ケラチノサイト幹細胞、周皮細胞、グリア細胞、上衣細胞、羊膜又は胎盤膜から単離された細胞、漿膜細胞、体細胞或いは皮膚、心臓、脳若しくは脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、腸又は胃に由来する細胞である、請求項１００に記載の細胞。
【請求項１０２】
細胞増殖を制御するための少なくとも１つの機構をさらに含み、
ａ）１つ又は複数の細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）の遺伝子修飾であって、前記ＣＤＬは、１つ又は複数の内在性又は外性遺伝子座であって、その転写産物は、分裂細胞によって発現される、１つ又は複数の内在性又は外性遺伝子座であり、前記遺伝子修飾は、
ｉ）前記ＣＤＬをコードするＤＮＡ配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含むアブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系、及び
ｉｉ）前記ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系
の１つ又は複数である、遺伝子修飾
を含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項１０３】
前記ＣＤＬの前記遺伝子修飾は、
ａ）前記ＡＬＩＮＫ系を含むＤＮＡベクター、
ｂ）前記ＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター、及び
ｃ）前記ＡＬＩＮＫ系及び前記ＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター
の１つ又は複数を用いて前記ＣＤＬのターゲティングされた置換を行うことを含み、前記ＡＬＩＮＫ及び／又はＥＡＲＣ系は、それぞれ前記ＣＤＬに作動可能に連結されている、請求項１０２に記載の細胞。
【請求項１０４】
前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記ＣＤＬの前記遺伝子修飾は、同型接合性、異型接合性、半接合性若しくは複合異型接合性であり、及び／又は前記ＥＡＲＣ系を含む前記ＣＤＬの前記遺伝子修飾は、前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質によってのみ前記ＣＤＬの活性化をもたらす、請求項１０２に記載の細胞。
【請求項１０５】
前記ＣＤＬは、表５に列挙される遺伝子座の１つ又は複数である、請求項１０２に記載の細胞。
【請求項１０６】
前記ＣＤＬは、遺伝子産物であって、細胞周期、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、タンパク質翻訳及び代謝の１つ又は複数において機能する遺伝子産物をコードする、請求項１０５に記載の細胞。
【請求項１０７】
前記ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の１つ又は複数であり、好ましくは、前記ＣＤＬは、Ｃｄｋ１又はＣＤＫ１である、請求項１０６に記載の細胞。
【請求項１０８】
前記ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系を含み、好ましくは、前記ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系である、請求項１０２に記載の細胞。
【請求項１０９】
前記ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系又はリガンド可逆二量体化系であり、好ましくは、前記ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系である、請求項１０２に記載の細胞。
【請求項１１０】
ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６の１つ又は複数は、活性化白血球における対応する内在性遺伝子の発現レベル以上のレベルで発現される、請求項１に記載の細胞。
【請求項１１１】
ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６の８つ全ては、活性化白血球における対応する内在性遺伝子の発現レベル以上のレベルで発現される、請求項１１０に記載の細胞。
【請求項１１２】
前記ＰＤ−Ｌ１トランスジーンは、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項１１３】
前記ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３トランスジーンは、配列番号１６又は配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項１１４】
前記Ｃｄ４７トランスジーンは、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項１１５】
前記ＣＤ２００トランスジーンは、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項１１６】
前記ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬトランスジーンは、配列番号１０又は配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項１１７】
前記Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂトランスジーンは、配列番号２又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項１１８】
前記Ｍｆｇｅ８トランスジーンは、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項１１９】
前記Ｓｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６トランスジーンは、配列番号８又は配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項１に記載の細胞。
【請求項１２０】
前記ＩＦＮγＲ１  ｄ３９トランスジーンは、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項４に記載の細胞。
【請求項１２１】
前記２つ以上のトランスジーンは、構成的プロモータに作動可能に連結されている、請求項１に記載の細胞。
【請求項１２２】
前記構成的プロモータは、ＣＡＧプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＥＦ１αプロモータ、ＰＧＫプロモータ、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＨＳＶのｔｋプロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶのＬＴＲプロモータ、モロニーウイルスのプロモータ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータからなる群から選択される、請求項１２１に記載の細胞。
【請求項１２３】
治療剤をコードするトランスジーンをさらに含む、請求項１に記載の細胞。
【請求項１２４】
前記治療剤は、タンパク質又は抗体である、請求項１２３に記載の細胞。
【請求項１２５】
前記抗体は、阻害抗体又はアゴニスト抗体である、請求項１２４に記載の細胞。
【請求項１２６】
前記治療剤は、表２に列挙される薬剤或いは癌、酵素若しくはホルモン欠損症、代謝疾患又は変性疾患において変異されることが知られている遺伝子の野生型バージョンである、請求項１２３に記載の細胞。
【請求項１２７】
前記治療剤は、テトラサイクリン応答エレメント、光誘導系、放射性遺伝子系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、不安定化ドメイン系又はリガンド可逆二量体化系からなる群から選択される誘導性発現系を使用して発現される、請求項１２３に記載の細胞。
【請求項１２８】
前記治療剤は、ＣＡＧプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＥＦ１αプロモータ、ＰＧＫプロモータ、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＨＳＶのｔｋプロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶのＬＴＲプロモータ、モロニーウイルスのプロモータ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータからなる群から選択される構成的プロモータを使用して発現される、請求項１２３に記載の細胞。
【請求項１２９】
請求項１に記載の細胞を含む、遺伝子修飾細胞の集団。
【請求項１３０】
同種宿主における移植部位での局所免疫抑制を提供するための方法であって、請求項１に記載の細胞又は請求項１２９に記載の遺伝子修飾細胞の集団を同種宿主における移植部位に移植することを含む方法。
【請求項１３１】
以下のトランスジーン：ＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１及びＩＦＮγＲ１  ｄ３９又はＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１若しくはＩＦＮγＲ１  ｄ３９のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子の１つ又は複数を発現させることをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ＴＧＦ−β又は生物学的物質は、移植片環境内で局所的に作用する、請求項１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記細胞は、幹細胞、ゲノム編集に従う細胞及び／又は治療細胞型の供給源である、請求項３７に記載の方法。
【請求項１３４】
前記細胞は、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞又は前駆細胞、生殖幹細胞、肺幹細胞又は前駆細胞、乳腺幹細胞、嗅覚成体幹細胞、毛包幹細胞、腸管幹細胞又は前駆細胞、複能性幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞、神経幹細胞又は前駆細胞、成体幹細胞、体性幹細胞、組織特異的幹細胞、全能性幹細胞、線維芽細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、肝芽細胞、筋芽細胞、前脂肪細胞、肝細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、Ｋ５６２ヒト赤血球系白血病細胞株、骨細胞、滑膜細胞、腱細胞、靭帯細胞、半月板細胞、脂肪細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、赤血球性−巨核球性細胞、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、島β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、外分泌前駆細胞、管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色又は褐色脂肪細胞、ホルモン分泌細胞、表皮角化細胞、上皮細胞、腎細胞、生殖細胞、骨格関節滑膜細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、軟骨細胞、内皮細胞、心膜細胞、髄膜細胞、ケラチノサイト前駆細胞、ケラチノサイト幹細胞、周皮細胞、グリア細胞、上衣細胞、羊膜又は胎盤膜から単離された細胞、漿膜細胞、体細胞或いは皮膚、心臓、脳若しくは脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、腸又は胃に由来する細胞である、請求項１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
同種宿主での移植部位において、請求項１に記載の細胞の増殖を制御する方法であって、
ａ）細胞内で細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）を遺伝子修飾することであって、前記ＣＤＬは、１つ又は複数の内在性又は外性遺伝子座であって、その転写産物は、分裂細胞によって発現される、１つ又は複数の内在性又は外性遺伝子座であり、前記ＣＤＬの前記遺伝子修飾は、
ｉ）前記ＣＤＬをコードするＤＮＡ配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含むアブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系、及び
ｉｉ）前記ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＤＬの調節の誘導性外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系
の１つ又は複数を含む、遺伝子修飾すること、
ｂ）前記細胞又は前記細胞の集団を同種宿主における移植部位に移植すること、及び
ｃ）ｉ）前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記遺伝子修飾細胞を前記陰性選択マーカの誘導物質の非存在下で維持することにより、前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記遺伝子修飾細胞の増殖を可能にし、且つ／又は前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記細胞を前記陰性選択マーカの前記誘導物質に曝露することにより、前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記遺伝子修飾細胞の増殖をアブレート及び／若しくは阻害すること、及び／又は
ｉｉ）前記ＥＡＲＣ系を含む前記遺伝子修飾細胞を前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に暴露することにより、前記ＥＡＲＣ系を含む前記遺伝子修飾細胞の増殖を可能にするか、又は前記ＥＡＲＣ系を含む前記細胞を前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の前記誘導物質の非存在下で維持することにより、前記ＥＡＲＣ系を含む前記遺伝子修飾細胞の増殖を予防若しくは阻害すること
を含む方法。
【請求項１３６】
前記同種宿主は、哺乳動物である、請求項３７に記載の方法。
【請求項１３７】
前記同種宿主は、マウスである、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記同種宿主は、ヒトである、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３９】
前記宿主は、細胞療法を用いて処置され得る変性疾患又は状態を有する、請求項３７に記載の方法。
【請求項１４０】
前記疾患又は状態は、盲目、関節炎、虚血、糖尿病、多発性硬化症、脊髄損傷、卒中、癌、肺疾患、血液疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、酵素若しくはホルモン欠損症、代謝疾患、自己免疫疾患、加齢黄斑変性症、網膜ジストロフィー、感染症、血友病、心筋梗塞、変性疾患又は加齢関連疾患である、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６の１つ又は複数は、活性化白血球における対応する内在性遺伝子の発現レベル以上のレベルで発現される、請求項３７に記載の方法。
【請求項１４２】
ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６の８つ全ては、活性化白血球における対応する内在性遺伝子の発現レベル以上のレベルで発現される、請求項１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記ＰＤ−Ｌ１トランスジーンは、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項１４４】
前記ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３トランスジーンは、配列番号１６又は配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項１４５】
前記Ｃｄ４７トランスジーンは、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項１４６】
前記ＣＤ２００トランスジーンは、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項１４７】
前記ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬトランスジーンは、配列番号１０又は配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項１４８】
前記Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂトランスジーンは、配列番号２又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記Ｍｆｇｅ８トランスジーンは、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項１５０】
前記Ｓｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６トランスジーンは、配列番号８又は配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項１５１】
前記ＩＦＮγＲ１  ｄ３９トランスジーンは、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性を有するタンパク質をコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項１５２】
前記１つ又は複数のトランスジーンは、構成的プロモータに作動可能に連結されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項１５３】
前記構成的プロモータは、ＣＡＧプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＥＦ１αプロモータ、ＰＧＫプロモータ、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＨＳＶのｔｋプロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶのＬＴＲプロモータ、モロニーウイルスのプロモータ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータからなる群から選択される、請求項１５２に記載の方法。
【請求項１５４】
前記細胞は、治療剤をコードするトランスジーンをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項１５５】
前記治療剤は、タンパク質又は抗体である、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
前記抗体は、阻害抗体又はアゴニスト抗体である、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記治療剤は、表２に列挙される薬剤又は対象において変異されている遺伝子の野生型バージョンである、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５８】
前記治療剤は、テトラサイクリン応答エレメント、光誘導系、放射性遺伝子系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、不安定化ドメイン系又はリガンド可逆二量体化系からなる群から選択される誘導性発現系を使用して発現される、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５９】
前記治療剤は、ＣＡＧプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＥＦ１αプロモータ、ＰＧＫプロモータ、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＨＳＶのｔｋプロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶのＬＴＲプロモータ、モロニーウイルスのプロモータ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータからなる群から選択される構成的プロモータを使用して発現される、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１６０】
請求項１に記載の細胞を含む組成物。
【請求項１６１】
薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む、請求項１６０に記載の組成物。
【請求項１６２】
請求項１に記載の細胞又は請求項１６０に記載の組成物を含むキット。
【請求項１６３】
疾患又は状態の処置を、それを必要とする対象において行う方法であって、請求項１に記載の細胞又は請求項１６０に記載の組成物を前記対象に投与することを含む方法。
【請求項１６４】
前記疾患又は状態は、盲目、関節炎、虚血、糖尿病、多発性硬化症、脊髄損傷、卒中、癌、肺疾患、血液疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、酵素若しくはホルモン欠損症、代謝疾患、自己免疫疾患、加齢黄斑変性症、網膜ジストロフィー、感染症、血友病、心筋梗塞、変性疾患、加齢関連疾患又は表２に列挙される疾患若しくは状態である、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６５】
前記細胞は、前記対象への投与前に系統制限細胞型に分化される、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１６６】
前記疾患又は状態は、心筋梗塞であり、及び前記細胞は、心筋細胞に分化される、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記疾患又は状態は、盲目であり、及び前記細胞は、光受容体細胞に分化される、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６８】
前記疾患又は状態は、脊髄損傷、パーキンソン病、ハンチントン病又はアルツハイマー病であり、及び前記細胞は、ニューロンに分化される、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６９】
前記疾患又は状態は、多発性硬化症であり、及び前記細胞は、グリア細胞に分化される、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１７０】
前記細胞は、細胞又は前記治療剤を必要とする組織又は身体部位に局所投与される、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７１】
前記細胞は、静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、皮内、非経口的、動脈内、血管内又は潅流によって投与される、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７２】
前記細胞は、皮下注入によって投与されて、クロークされた皮下組織を産生する、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７３】
前記細胞は、組織として投与される、請求１６３に記載の方法。
【請求項１７４】
前記組織は、ゲル、生体適合性マトリックス又は細胞足場と共に投与される、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記細胞は、２５，０００〜５，０００，０００，０００個の細胞の量で投与される、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７６】
前記細胞は、８００，０００，０００〜３，０００，０００，０００個の細胞の量で投与される、請求項１７１に記載の方法。
【請求項１７７】
追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１７８】
前記追加の治療剤は、前記細胞の投与前に投与される、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１７９】
前記追加の治療剤は、前記細胞の投与後に投与される、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１８０】
前記追加の治療剤は、前記細胞の投与と同時に投与される、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１８１】
前記追加の治療剤は、免疫抑制剤、疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、生物学的応答修飾剤（ＤＭＡＲＤの一種）、コルチコステロイド若しくは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、メトトレキサート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、レフルノミド、シクロホスファミド、アザチオプリン、トファシチニブ、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、カイネレット、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ若しくはトシリズマブ、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アバタセプト、アダリムマブ、アレムツズマブ、アミノサリチル酸塩、抗生物質、抗ヒスタミン、抗ＴＮＦα、アザチオプリン、ベリムマブ、βインターフェロン、カルシニューリン阻害剤、セルトリズマブ、コルチコステロイド、クロモリン、シクロスポリンＡ、シクロスポリン、フマル酸ジメチル、エタネルセプト、フィンゴリモド、フマル酸エステル、グラチラマーアセテート、ゴリムマブ、ヒドロキシウレア、ＩＦＮγ、ＩＬ−１１、レフルノミド、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、長時間作用型β２アゴニスト、ミトキサントロン、ミコフェノール酸モフェチル、ナタリズマブ、オクレリズマブ、ピメクロリムス、プロバイオティック、レチノイド、サリチル酸、短時間作用型β２アゴニスト、スルファサラジン、タクロリムス、テリフルノミド、テオフィリン、トシリズマブ、ウステキヌマブ若しくはベドリズマブ、ベバキュジマブ、ラニビズマブ若しくはアフリベルセプト）、光線力学的治療、光凝固、カルビドパ−レボドパ、ドーパミンアゴニスト、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤、抗コリン作動薬、アマンタジン、深部脳刺激薬、抗凝固薬、抗血小板剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体遮断薬、アンギオテンシン受容体ネプリライシン阻害剤、β遮断薬、併用α及びβ遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、コレステロール低下薬、ニコチン酸、コレステロール吸収阻害剤、ジギタリス製剤、利尿薬、血管拡張剤、抗血小板剤二剤併用療法、心臓処置、抗ウイルス化合物、ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤、抗菌化合物、抗真菌化合物、抗寄生虫化合物、インスリン、スルホニルウレア、ビグアニド、メグリチニド、チアゾリジンジオン、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、α−グルコシダーゼ阻害剤、胆汁酸封鎖剤、アスピリン、食事療法、凝固因子、デスモプレシン、血餅保存薬、フィブリンシーラント、理学療法、補酵素、骨髄移植、器官移植、血液透析、血液濾過、交換輸血、腹膜透析、中鎖トリアシルグリセロール、ミグルスタット、酵素補充療法、チェックポイント阻害剤、化学療法薬、生物学的薬剤、放射線療法、凍結療法、温熱療法、外科的切除若しくは腫瘍組織又は抗癌ワクチンである、請求項１７７に記載の方法。
【請求項１８２】
前記細胞の増殖を制御することをさらに含む、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１８３】
前記細胞は、ＡＬＩＮＫ系を含み、及び増殖を制御する前記方法は、
ｉ）前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記細胞を前記陰性選択マーカの誘導物質の非存在下で維持することにより、前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記細胞の増殖を可能にすること、又は
ｉｉ）前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記細胞を前記陰性選択マーカの前記誘導物質に暴露することにより、前記ＡＬＩＮＫ系を含む前記細胞の増殖をアブレート若しくは阻害すること
を含む、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８４】
前記細胞は、ＥＡＲＣ系を含み、及び増殖を制御する前記方法は、
ｉ）前記ＥＡＲＣ系を含む前記細胞を前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に暴露することにより、前記ＥＡＲＣ系を含む前記細胞の増殖を可能にすること、又は
ｉｉ）前記ＥＡＲＣ系を含む前記細胞を前記誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の前記誘導物質の非存在下で維持することにより、前記ＥＡＲＣ系を含む前記細胞の増殖を予防若しくは阻害すること
を含む、請求項１８２に記載の方法。
【請求項１８５】
前記細胞は、前記治療の完了後に除去される、請求項１６３に記載の方法。
【請求項１８６】
疾患又は状態の処置を、それを必要とする対象において行う際に使用するための、請求項１に記載の細胞又は請求項１６０に記載の組成物。
【請求項１８７】
前記疾患又は状態は、盲目、関節炎、虚血、糖尿病、多発性硬化症、脊髄損傷、卒中、癌、肺疾患、血液疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、ＡＬＳ、酵素若しくはホルモン欠損症、代謝疾患、自己免疫疾患、加齢黄斑変性症、網膜ジストロフィー、感染症、血友病、心筋梗塞、変性疾患、加齢関連疾患又は表２に列挙される疾患若しくは状態である、請求項１８６に記載の細胞。
【請求項１８８】
同種宿主における移植部位に局所免疫抑制を提供する際に使用するための、請求項１に記載の細胞又は請求項１６０に記載の組成物。
【請求項１８９】
ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６の１つ又は複数は、前記細胞のゲノム中の全ての遺伝子について遺伝子発現の上位５％にあるレベルで発現される、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９０】
ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６の８つ全ては、前記細胞のゲノム中の全ての遺伝子について遺伝子発現の上位５％にあるレベルで発現される、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９１】
ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６の１つ又は複数は、前記細胞のゲノム中の全ての遺伝子について遺伝子発現の上位５％にあるレベルで発現される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１９２】
ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ又はＨ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ又はＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１又はＣｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９又はＳｐｉ６の８つ全ては、前記細胞のゲノム中の全ての遺伝子について遺伝子発現の上位５％にあるレベルで発現される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、移植の分野に関する。本開示は、移植された細胞の環境において局所免疫抑制を生じるための方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト胚幹（ＥＳ）細胞及び誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞の出現は、再生及び翻訳医学に対してパラダイムシフト効果を有している。これらの細胞は、人体内で任意の細胞型に分化する能力を保持しながら、多能性状態で無期限に自己再生することができる。このような特性により、研究者は、ヒトの発達及び発達障害の病因をよりよく理解することができた。研究者は、いくつか例を挙げると、脊髄損傷、糖尿病、盲目、多発性硬化症及び癌を含む、従来の医学で処置することが難しいか又は不可能であった疾患に対する強力な新しいツールも現代医学に与えた。細胞療法に適用可能な疾患の有効性及び範囲は、幹細胞分化を制御する方法及び分化した細胞産物の生物学についての理解が高まるにつれてのみ増加する。
【０００３】
これらの用途では、重要且つ重大な課題が生じる。細胞の安全性に加えて、最も重要な関心事の１つは、異なる遺伝的背景からの細胞の免疫拒絶である。免疫系は、ドナーとレシピエントとの間で異なる、特定のタンパク質フラグメント（特に主要組織適合性複合体（マウスにおけるＭＨＣ、ヒトにおけるＨＬＡ）由来のもの）を発現する「非自己」細胞を認識及び排除するための複雑な一連の機構を進化させたため、免疫拒絶は、依然として重要な障壁である（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ．１８：３０９−２６（２０１７））。この応答は、日和見感染及び悪性腫瘍（多くの場合、「外来性」タンパク質及びエピトープの存在によって定義される）に対して保護するための進化的圧力の副産物であることは、ほぼ確実である。文脈に依存して、移植された細胞又は組織の拒絶は、分／時間（超急性）、日／月（急性）及び月／年（慢性）の時間スケールにわたって生じ得る（ＬａＲｏｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：７５０３−９（２００７））。この拒絶は、先天性（Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２４１：３９−４８（２０１１））及び適応免疫（Ｉｓｓａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１５５−６９（２０１０））の両方に由来する細胞型の複雑で協調した効果に起因する。
【０００４】
拒絶に対する最も重要な経路の１つは、適応免疫系のプライミング及びＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞の活性化である。これは、抗原提示細胞がドナー特異的ペプチドを処理し、次いで二次リンパ器官において同じペプチドに特異的であるレシピエントＴ細胞を活性化した後に起こる（Ｌｅｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１５５：３１−４１（１９８２）；Ｇｕｅｒｍｏｎｐｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：６２１−６７（２００２）；Ｓｔｏｃｋｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７８：９１−１０２（２０００））。次いで、これらのＴ細胞は、移植された細胞又は組織に遊走し、パーフォリン及びグランザイムのような細胞溶解因子の放出を伴って、移植された細胞又は組織を死滅させる。ＮＫ細胞は、外来ＭＨＣ発現又はＭＨＣ発現なしに基づいてドナー細胞においてアポトーシスも誘導し得（Ｋｉｔｃｈｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．８１：８１１−７（２００６）；Ｂｅｎｉｃｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１６：４７−５３（２０１１））、マクロファージのような他の細胞型は、移植部位での炎症誘発性サイトカインの放出を伴う拒絶を支持し得る（Ｍａｎｎｏｎ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｏｒｇａｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１７：２０−５（２０１２））。多くの他の細胞型及び亜型も同種移植片拒絶において役割を有する。これらは、一般的なウイルス性及び細菌性病原体を排除するために使用される同じ免疫経路であるため、同種移植片の拒絶と共に脊椎動物種にわたって高度に保存されている。
【０００５】
同種移植片の拒絶を防ぐための現在の解決策は、以下の２つの選択肢を含む：一致した組織適合性ハプロタイプを有するドナーを見つけること（ほとんどは、遺伝的に関連するファミリーからのものである可能性がある）、及びより一般的には広範に指向される免疫抑制薬を使用すること（Ｗｉｓｅｍａｎ，Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．１１：３３２−４３（２０１６）；Ｍａｌａｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３７：２８４０−２（２００５））。一般的な薬物としては、カルシニューリン阻害剤（Ｆｌｅｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２２：１−１５（２００８）；Ｃａｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２０：６１０−５（２０１１））、抗増殖剤（Ｈａｒｄｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．３：６８−７７（２０１３））、ｍＴＯＲ阻害剤（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３：４２３−３６（２００７）；Ｎｅｕｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｖｅｒ  Ｔｒａｎｓｐｌ．７：４７３−８４（２００１））及びステロイド（Ｓｔｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．３３：１５７−６７（２０１１））のファミリー由来のものが挙げられ、これらの全ては、Ｔ細胞の増殖又は機能を抑制する（特に最初の３つ）。これらの薬物は、生涯にわたって毎日服用する必要があり、１回の服用を忘れても拒絶反応の危険性が増大することがある。しかし、それらは、常に機能するわけではなく、それらが機能する場合、慢性拒絶反応の割合は、依然として経時的に継続的に上昇する（Ｄｅｍｅｔｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２：２７−４４（１９９７）；Ｌｉｂｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．１４：３８７−９７（２００１））。最も重要なことに、それらは、全身作用性であり、最終的に癌及び生命を脅かす感染の増加した割合で患者を免疫不全にする（Ｇａｌｌａｇｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２１：８５２−８（２０１０））。ＥＳ細胞に関連して、これらの薬物は、ＭＨＣバリアを横切る生存を可能にする際にわずかな改善のみを示した（Ｓｗｉｊｎｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０５：１２９９１−６（２００８）；Ｔｏｒｉｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｌ  Ｒｅｓ．３１：２２０−７（２００９））。より新しいよりターゲティングされた免疫抑制剤が利用可能になり、皮膚及び心臓（Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３８１：４３４−８（１９９６））並びにＥＳ細胞同種移植片設定（Ｐｅａｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．８：３０９−１７（２０１１））で試験されるようになってきているが、それらは、依然として全身作用性であり、従って宿主免疫を損なわれたままにする可能性が高い。
【０００６】
ｉＰＳ細胞の発見に対する１つの提案された利点は、それらが各患者から及び各患者のために生成され得ることであった。これらの細胞は、理論的には、対応する患者による免疫拒絶から保護されるはずである（Ｐｅａｒｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．４：１６４ｐｓ２５（２０１２））。しかしながら、ｉＰＳ細胞状態の誘導は、異常及び悪性腫瘍を生じ得るエピジェネティックな変化及びインビトロ培養圧力を含み、従って安全性及び機能を達成するために各細胞株を激しく試験及び／又は遺伝子修飾する必要がある（Ｈｕｓｓｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４７１：５８−６２（２０１１）；Ｌａｕｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．８：１０６−１８（２０１１）；Ｌｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４７１：６８−７３（２０１１））。最終的に、個々の患者ごとにｉＰＳ細胞株を作製し、試験するのに必要なコスト及び時間は、このアプローチを実際的且つ経済的に非現実的にする。たとえコストが劇的に低減されたとしても、（とりわけ）火傷、心臓発作、卒中及び脊髄損傷のような状態のために即座の処置を必要とする患者を助けることはできない。さらに、最近の知見を考慮すると、ｉＰＳ細胞由来の細胞型が、それらが由来する同じ宿主に移植された場合でも、免疫拒絶から真に保護されるかどうかは、議論の余地がある（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４７４：２１２−５（２０１１））。
【０００７】
この点に関して提案された１つの解決策は、治療用細胞又は組織の移植前、その間又はその後に増殖及び／又は移植される、Ｔｒｅｇなどの自然に抑制又は調節する免疫細胞を使用することであった（Ｃｏｂｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｍｅｄ．３（６）（２０１３）；Ｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．１２：４１７−３０（２０１２））。これらの戦略は、抑制性免疫経路の認識、特にＣＤ４＋細胞調節性Ｔ細胞のサブセットをプログラムするマスターレギュレータＦｏｘＰ３の発見（Ｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２９９：１０５７−６１（２００３）；Ｆｏｎｔｅｎｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：３３０−６（２００３））及び同種移植片に対する耐性を促進する際のそれらの決定的な重要性の証明（Ｋｅｎｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０８：２０４３−５３（２０１１））に基づいて示唆されている。この考えは、骨髄移植と結合したモノクローナル抗体によるエフェクタＴ細胞の枯渇及びドナーキメリズムの創出にほとんど排他的に焦点を当てた最初の寛容誘導戦略のいくつかと対照的である（Ｃｏｂｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３２３：１６４−６（１９８６）；Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１６９：７７９−９４（１９８９））。抑制性Ｔ細胞表現型の重要性は、細胞を殺滅しないが、それらを同種移植片に応答しないままにし（Ｃｏｂｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：６００３−１０（２００４））、なお同時に他の特異性のナイーブＴ細胞を抑制することができるような方法において、重要なＴ細胞受容体を遮断した戦略で後に評価された（Ｃｏｂｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１２９：１６５−２０１（１９９２）；Ｑｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：２７３７−４５（１９９０））。Ｔｒｅｇｓとして現在認識されているこれらの細胞は、ＴＧＦβ（Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９４：６２９−４４（２００１）；Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：８３４−４２（２００４））、ＣＴＬＡ４（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８１：１８０６−１３（２００８）；Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：６３−７０（２０１５））、ＩＬ１０（Ｏ’Ｇａｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１１４：１３７２−８（２００４）；Ｃｈａｕｄｈｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．３４：５６６−７８（２０１１））及びＩＬ３５（Ｃｏｌｌｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．４５０：５６６−９（２００７））のような抑制因子の発現並びにＩＬ−２の優先的な消費（Ｓｈｅｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．３０：６３６−４５（２００９）；Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１：７２３−３５（２００５））、抗原提示細胞の操作又は殺滅（Ｍａｈｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５０：１−１３（２００７）；Ｓｈｅｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ���，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２１２：６０−７３（２００６））並びに局所ＡＴＰ（Ｒｅｇａｔｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：２９５５−６５（２０１１）；Ｒｅｇａｔｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１−７（２０１３））又は必須アミノ酸（Ｃｏｂｂｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０６：１２０５５−６０（２００９））の枯渇を含む（しかし、これらに限定されない）多くの機構によって寛容を促進し得る。
【０００８】
Ｔｒｅｇの潜在的な治療的使用のための２つのアプローチは、移植と結合したドナー抗原を使用するインビトロ拡大又は調節性Ｔ細胞とエフェクタＴ細胞との間の差異を活用する選択的インビボ拡大のいずれかを含む。これらの戦略は、興味深いが、今日まで、同種移植片の長期的な受容は、インビトロ又はインビボで拡大されたＴｒｅｇの使用のみによって実証されていない。Ｔｒｅｇ生物学には、インビトロ又はインビボ拡大のための最適な方法論並びに治療に関連する用量及びタイミングを含む多くの合併症及び未知の側面が残っている。また、抗原特異的Ｔｒｅｇ抑制は、炎症状況に応じて「打ち負かす」ことができ（Ｋｏｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．１３：４２３−３１（２００７））、Ｔｒｅｇは、ＮＫ細胞によって殺滅できることが示されている（Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：１７２９−３６（２００８））。
【０００９】
Ｔｒｅｇｓに加えて、樹状細胞（ＤＣ）のような抗原提示細胞などの他の抑制細胞型も同種移植片耐性を誘導するために探索されている（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：６３−７０（２０１５））。ＤＣは、自然免疫と適応免疫との間の関連であり、それらの成熟状態及び局所炎症性キューのような状況に依存してエフェクタ及び抑制免疫応答の両方を誘導し得る。同種移植片拒絶中、ＤＣは、同種移植片特異的Ｔ細胞クローンが認識して活性化される、ＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ４０（とりわけ）のような共刺激分子と共に、ＭＨＣ（マウス）又はＨＬＡ（ヒト）分子の結合溝の内側の同種移植片抗原をそれらの表面上に提示する（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３６：６３−７０（２０１５））。寛容原性ＤＣは、ＭＨＣ及び共刺激分子の発現レベルを低く保ち、次いでＤＣ−Ｔ細胞相互作用時にナイーブＴ細胞をアネルギー性又はさらにＴ調節性サブタイプに促進する抑制キューへの曝露によって未成熟状態から誘導され得る。
【００１０】
治療的に、この生物学の１つの適用は、目的の特異的同種移植片抗原及び免疫抑制因子に同時にインビトロで曝露されるＤＣを拡大することであり、その多くは、試験されており、それらは、ＴＧＦ−β、ＩＬ１０、ｃＡＭＰ、プロスタグランジンＥ２、ヒスタミン、神経ペプチド、ビタミンＤ２、Ｂ２アゴニスト、ＨＬＡ−Ｇ、グルコサミン並びにコルチコステロイド、シクロスポリン、タクロリムス、ラパマイシン、アスピリン、メコフェノール酸モフェチル、サングリフェリン及びデオキシスペルグアリンなどの薬物を含む（Ｈａｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４：２４−３４（２００４））。代わりに、ＤＣは、ＴＧＦ−β、ＩＬ−１０、ＶＥＧＦ、ＦａｓＬ、ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＩＤＯ、ＮＦＫｂデコイ受容体、可溶性ＴＮＦＲ、ＣＣＲ７及びＩＬ−１２のｓｉＲＮＡ誘導サイレンシングのような免疫調節因子を直接発現するように遺伝子操作されている（Ｍｏｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１９６：１２５−４６（２００３））。次いで、これらの培養又は操作されたＤＣを同種移植片と同時にレシピエントに移し、同種移植片特異的Ｔ細胞を抑制するか、又は同種移植片集中型Ｔ調節細胞の数を増加させるという仮定の下で、同種移植片の生存を延長し得るか否かを試験する。
【００１１】
この種の１つの原型的アプローチにおいて、骨髄由来ＤＣをＳＯＣＳ１で形質導入し（共刺激分子及びＭＨＣＩＩのアップレギュレーションを防止する）、これは、マウス心臓同種移植片を延長した（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：８７−９５（２００９））。別の実証において、ＦａｓＬ発現ＤＣは、マウス心臓同種移植片を延長することもできた（Ｍｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：１６１−７（２０００））。一般に、これらの系統に沿って寛容原性ＤＣを使用する多くの特異的及び組み合わせアプローチが存在し（Ｂｊｏｒｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２４：１１１８−２０（２００５）：Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．７：ｅ５２０９６（２０１２）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：５４８０−７（２００７）；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３８：１５６１−３（２００６）；Ｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７７：５８６８−７７（２００６）；Ｌｕｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：１８１３−２２（２０００）；Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：２０−６（２０１１））、結果は、ＤＣへの修飾のタイプ、培養条件、タイミング及び試験される同種移植片のタイプに応じて非常に変動が大きい（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．２０１６：５７３０６７４（２０１６）；Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｖｉｄ  Ｂａｓｅｄ  Ｍｅｄ．７：１３５−４６（２０１４））。これらの研究のほとんど全ては、マウスで行われているが、最近のヒト試験は、健康なボランティアにおける安全性についての試験（Ｄｈｏｄａｐｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１９３：２３３−８（２００１）；Ｄｈｏｄａｐｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１００：１７４−７（２００２））及び糖尿病患者１０例を対象とした第Ｉ相臨床試験（Ｇｉａｎｎｏｕｋａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．３４：２０２６−３２（２０１１））を含めて開始されている。
【００１２】
養子Ｔｒｅｇ及び寛容原性ＤＣ療法の両方には、未知のものが多く残っており、最も重要なものの１つは、それらの有効性の持続時間である。インビボ研究では、これらの２つのアプローチ（追加の免疫抑制薬の有無にかかわらず）を使用して、延長された同種移植片生存が可能であることが示されているが、それは、長期間ではなく、ほとんど全ての場合、同種移植片は、最終的に死亡する。これは、Ｔｒｅｇ及びＤＣの両方が有限の時間スパンを有するという事実に適合している。また、寛容原性表現型、特にＤＣの間で炎症経路を「変換」し、代わりに促進することも可能である（Ｄｅｌａｍａｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：２−１１（２０１１）；Ｓｃｈｒｅｉｂｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５９：１５７３−８２（２０１０）；Ｓａｔｐａｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：９３７−４８（２０１３））。これは、ＤＣの高度に適応的な性質及び広範囲の炎症性キューを感知し、応答するそれらの能力による可能性が高い。これらの細胞は、インビボ養子移入後に非常に迅速に死滅できることも示されている。また、抑制性Ｔｒｅｇ及び寛容原性ＤＣの多くのサブセットが記載されており、いずれのサブタイプが理想的なサブタイプであるか、又はそれが同種移植片移植の状況に完全に依存するかどうかは、依然として不明である。
【００１３】
さらに、これらの種類のアプローチには、臨床医が治療的なものに加えて複雑な免疫細胞型を操作し、それを用いて作業することを必要とするという点で実用的且つ経済的な大きい障壁がある。それらの有限の寿命を考えると、これらの細胞が同種移植片に長期耐性を付与するために連続的に且つ／又は繰り返し送達される必要があるかどうかは、依然として不明である。これは、細胞を重要な免疫調節因子で培養、増殖又は形質導入するための既に高価で時宜を得た方法論を複雑にし、最終的に極めて時間感受性である処置のための使用を妨げる。
【００１４】
寛容を誘導するための別のアプローチは、造血細胞移植（ＨＣＴ）の使用であり、ここで、ＨＬＡミスマッチ器官のレシピエントは、同じドナーからの造血細胞を使用してＨＣＴを受ける（Ｇｏｚｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇ  Ｆｏｒｕｍ．２１：２８１−４（１９７０）；Ｉｌｄｓｔａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３０７：１６８−７０（１９８４）；Ｓａｙｅｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ．１１４：９５４−５（１９９１）；Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１０５：１７３−８１（２０００）；Ｋａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．３５８：３５３−６１（２００８）；Ｓａｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：１６５−７３（２０１１））。これは、レシピエントにおいて新たに発生するＴ細胞及びＢ細胞がレシピエント及びドナー抗原の両方に寛容であることを可能にし得るキメラ現象を生じる（Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５３：１０８７−９８（１９９４）；Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．６１：４６９−７７（１９９６）；Ｔｏｍｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．６１：４７７−８５（１９９６）；Ｋｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．６２：３８０−７（１９９６）；Ｍａｎｉｌａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．６６：９６−１０２（１９９８））。これは、造血細胞が胸腺における陽性及び陰性選択において果たす役割に起因し、ここで、それらは、同種移植片にも存在し得る造血細胞含有抗原に対して親和性を有する細胞を排除し、最終的にそれらの拒絶を導く。（Ｇｒｉｅｓｅｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．９０：４６５−７４（２０１０））。しかしながら、このアプローチの固有且つ危険なリスクは、移植された造血細胞がレシピエント組織を外来として認識し、全身的に攻撃する移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の可能性である（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．７：ｅ５２０９６（２０１２））。その開始以来、非骨髄破壊的戦略の使用を含む、拒絶反応を抑制するためのＨＣＴのいくつかの変異体が開発されてきた。これらの戦略は、ＨＣＴを受けるレシピエントがそれらの造血コンパートメントの完全な除去を受けないように、多くの場合により低い投薬量を伴う変更された化学療法レジメンを使用する。例えば、これらの戦略の最近のものは、ＨＬＡミスマッチの腎臓レシピエントにおける寛容を促進する一方、ＧＨＶＤを大幅に回避するために、寛容促進細胞（ＦＣ）ベースのＨＣＴを使用した（Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．４：１２４ｒａ２８（２０１２））。
【００１５】
ＧＨＶＤのリスク及び二次ＨＣＴ手順のリスクに加えて、これらのキメラ化誘導アプローチに対する一般的な制限は、骨髄の収集のために利用可能なＨＬＡ適合ドナーを有する必要性である。これは、げっ歯類の研究では容易に達成されるが、ヒトでは非常に要求が厳しい。ドナー器官は、理想的には、できるだけ早くドナーから採取されるべきであり、これは、可能であれば、骨髄を収集するための信じられないほど短いウィンドウを残す。それは、非常に患者及び手術特有のアプローチを必要とする、費用がかかり、且つロジスティック的に要求の厳しい手順でもある。また、調節細胞アプローチと同様に、患者が急性の損傷又は疾患の治療から利益を得るか、又は処置を即座に必要とする状況に実際にどのように適用されるかは、明らかでない。
【００１６】
インビボでの同種拒絶を減少させるために試験された別のアプローチは、組織適合性分子の除去であり（Ｔｏｒｉｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１２２：１３４１−９（２０１３））、これは、同種拒絶における「非自己」認識の主要な抗原性供給源である。これは、ＨＬＡ適合ドナー及びレシピエントが移植後の器官生存率を大幅に改善したという経験的データに適合する（Ｏｐｅｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．１：３３４−４２（１９９９））。このアプローチには、いくつかの陽性結果があったが、ＭＨＣクラスＩの除去は、細胞をＮＫ細胞に対して極めて感受性にする（Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．８９：２１６−２４（２０１１）；Ｒａｕｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５２０−３１（２００６）；Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．９２：２０８−９（２０１４））。このアプローチはまた、ＣＤ８＋  Ｔ細胞間のＭＨＣ非依存性殺傷経路を無傷のままにし（Ｈａｓｐｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１４：４９−５８（２０１４））、またＭＨＣ／ＨＬＡ遺伝子ファミリー以外の抗原の違い（マイナー抗原）に対応していない（Ｒｏｏｐｅｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．１９０：８６−９４（２００２））。
【００１７】
このアプローチの使用は、ＮＫ細胞を阻害する最小多型ＨＬＡであるＨＬＡ−Ｅをコードする遺伝子の導入と組み合わせた、多能性幹細胞からの全ての古典的ＨＬＡクラスＩ分子の欠失を含んだ（Ｇｏｒｎａｌｕｓｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１７））。このアプローチは、部分的に免疫不全のヒト化マウスにおいてＮＫ及びＣＤ８  Ｔ細胞攻撃に対する短期耐性を示したが、これらの細胞が完全に免疫能力のある宿主において長期間生存し得ることは、実証されなかった。別のアプローチにおいて、ＥＳ細胞は、ＰＤ−Ｌ１及びＣＴＬＡ４−Ｉｇを発現するように操作され、これは、同種宿主における生存を改善したが（Ｒｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．１４：１２１−３０（２０１４））、ＣＴＬＡ４−Ｉｇが全身性免疫抑制を導き得るという重篤な制限を伴う。ＥＳ細胞又はｉＰＳ細胞に対する一連の修飾が、全身性免疫抑制の可能性なしに且つ免疫抑制薬の必要なしに、それらが同種拒絶を逃れることを可能にすることは依然として実証されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
本開示の目的は、上記の欠点の１つ又は複数を軽減及び／又は除去することである。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
一態様において、同種宿主に移植された場合に移植部位で局所免疫抑制を提供するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された細胞が提供される。遺伝子修飾細胞は、トランスジーンのセットであって、各トランスジーンは、細胞質性、膜結合性又は局所作用性である遺伝子産物であって、以下の機能：ａ）抗原提示細胞の活性化及び機能を緩和すること、ｂ）移植片攻撃白血球活性又は細胞溶解機能を緩和すること、ｃ）同種移植片細胞のマクロファージ細胞溶解機能及び食作用を緩和すること、ｄ）移植片攻撃白血球においてアポトーシスを誘導すること、ｅ）局所炎症タンパク質を緩和すること、及びｆ）白血球媒介アポトーシスから保護することの１つ又は複数を有する遺伝子産物をコードする、トランスジーンのセットを含む。
【００２０】
細胞の実施形態では、トランスジーンのセットは、以下の遺伝子：ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（又はＨＬＡ−Ｇのマウスバージョン、Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（又はＦＡＳＬＧのマウスバージョン、ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（又はＣｃｌ２１のマウスバージョン、Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（又はＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９のマウスバージョン、Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を含む。
【００２１】
細胞の実施形態において、トランスジーンのセットは、以下の遺伝子：ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の２つ以上を含む。
【００２２】
細胞の実施形態において、トランスジーン遺伝子のセットは、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）又はＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子を含む。
【００２３】
細胞の実施形態において、細胞は、以下の遺伝子：ＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１及びＩＦＮγＲ１  ｄ３９又はＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１若しくはＩＦＮγＲ１  ｄ３９のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個又は１１個全て）をさらに含む。
【００２４】
細胞の実施形態において、ＴＧＦ−β又は生物学的物質は、移植片環境内で局所的に作用する。細胞の実施形態において、ＴＧＦ−β又は生物学的物質は、移植片環境内で局所的に作用し、全身作用は、最小限である。
【００２５】
細胞の種々の実施形態において、細胞は、幹細胞、ゲノム編集に従う細胞及び／又は治療細胞型の供給源（例えば、治療細胞型に分化され得る細胞又は所望の標的組織の細胞）である。種々の実施形態において、細胞は、胚幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞又は前駆細胞、生殖幹細胞、肺幹細胞又は前駆細胞、乳腺幹細胞、嗅覚成体幹細胞、毛包幹細胞、腸管幹細胞又は前駆細胞、複能性幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞、神経幹細胞又は前駆細胞、成体幹細胞、体性幹細胞、組織特異的幹細胞、全能性幹細胞、線維芽細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、肝芽細胞、筋芽細胞、前脂肪細胞、肝細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、Ｋ５６２ヒト赤血球系白血病細胞株、骨細胞、滑膜細胞、腱細胞、靭帯細胞、半月板細胞、脂肪細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、赤血球性−巨核球性細胞、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、島β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、外分泌前駆細胞、管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色又は褐色脂肪細胞、ホルモン分泌細胞、表皮角化細胞、上皮細胞、腎細胞、生殖細胞、骨格関節滑膜細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、軟骨細胞、内皮細胞、心膜細胞、髄膜細胞、ケラチノサイト前駆細胞、ケラチノサイト幹細胞、周皮細胞、グリア細胞、上衣細胞、羊膜又は胎盤膜から単離された細胞、漿膜細胞、体細胞或いは皮膚、心臓、脳若しくは脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、腸又は胃に由来する細胞である。
【００２６】
細胞の実施形態において、細胞は、細胞増殖を制御する（例えば、修飾細胞の腫瘍形成能を低下させるか、又は腫瘍形成性になった修飾細胞の増殖を低下させる）ための少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ又はそれを超える）の機構を含むようにさらに遺伝子修飾される。遺伝子修飾細胞は、１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ又はそれを超える）の細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）の遺伝子修飾を含み、ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物は、分裂細胞（例えば、免疫抑制トランスジーンの１つ又は複数を含む全ての分裂細胞）によって発現される、１つ又は複数の遺伝子座であり、遺伝子修飾は、ａ）ＣＤＬをコードするＤＮＡ配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含むＡＬＩＮＫ系、及びｂ）ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＤＬの調節の外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系の１つ又は複数である。
【００２７】
細胞の実施形態において、ＣＤＬの遺伝子修飾は、ａ）ＡＬＩＮＫ系を含むＤＮＡベクター、ｂ）ＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター、及びｃ）ＡＬＩＮＫ系及びＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクターの１つ又は複数を用いてＣＤＬのターゲティングされた置換を行うことを含み、ＡＬＩＮＫ及び／又はＥＡＲＣ系は、それぞれＣＤＬに作動可能に連結されている。
【００２８】
細胞の種々の実施形態において、ＣＤＬのＡＬＩＮＫ遺伝子修飾は、同型接合性、異型接合性、半接合性若しくは複合異型接合性であり、及び／又はＥＡＲＣ遺伝子修飾は、機能的ＣＤＬ修飾がＥＡＲＣ修飾対立遺伝子を通してのみ生成され得ることを確実にする。
【００２９】
細胞の種々の実施形態において、ＣＤＬは、表５に列挙される遺伝子座の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ又はそれを超える）である。種々の実施形態では、ＣＤＬは、細胞周期、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、タンパク質翻訳及び代謝の１つ又は複数において機能する遺伝子産物をコードする。種々の実施形態では、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の１つ又は複数であり、好ましくは、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１又はＣＤＫ１である。いくつかの実施形態では、ＣＤＬは、Ｔｏｐ２Ａである。いくつかの実施形態では、ＣＤＬは、Ｅｅｆ２である。種々の実施形態では、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の２つ以上であり、好ましくは、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１及びＴｏｐ２Ａ又はＣｄｋ１及びＥｅｆ２である。
【００３０】
細胞の種々の実施形態では、ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系を含み、好ましくは、ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系である。
【００３１】
細胞の種々の実施形態では、ＥＡＲＣ系は、ドキシサイクリン誘導「ｄｏｘ−架橋」系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系又はリガンド可逆二量体化系であり、好ましくは、ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系である。
【００３２】
一態様では、同種宿主における移植部位での局所免疫抑制を提供するための方法が提供される。この方法は、細胞を提供すること、及び細胞内でトランスジーンのセットを発現させることを含み、各トランスジーンは、細胞質性、膜結合性又は局所作用性である遺伝子産物であって、以下の機能：ａ）抗原提示細胞の活性化及び機能を緩和すること、ｂ）移植片攻撃白血球活性又は細胞溶解機能を緩和すること、ｃ）同種移植片細胞のマクロファージ細胞溶解機能及び食作用を緩和すること、ｄ）移植片攻撃白血球においてアポトーシスを誘導すること、ｅ）局所炎症タンパク質を緩和すること、及びｆ）白血球媒介アポトーシスから保護することの１つ又は複数を有する遺伝子産物をコードする。
【００３３】
本方法の実施形態では、トランスジーンのセットは、以下の遺伝子：ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）又はＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８若しくはＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を含む。
【００３４】
本方法の実施形態において、トランスジーンのセットは、以下の遺伝子：ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の２つ以上を含む。
【００３５】
本方法の実施形態において、トランスジーン遺伝子のセットは、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）又はＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子を含む。
【００３６】
本方法の実施形態において、方法は、以下の遺伝子：ＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１及びＩＦＮγＲ１  ｄ３９又はＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１若しくはＩＦＮγＲ１  ｄ３９のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個又は１１個全て）を発現させることをさらに含む。本方法の実施形態において、ＴＧＦ−β又は生物学的物質は、移植片環境内で局所的に作用する。実施形態において、ＴＧＦ−β又は生物学的物質は、移植片環境内で局所的に作用し、全身作用は、最小限である。
【００３７】
本方法の種々の実施形態において、細胞は、幹細胞、ゲノム編集に従う細胞及び／又は治療細胞型の供給源（例えば、治療細胞型に分化され得る細胞又は所望の標的組織の細胞）である。種々の実施形態において、細胞は、胚幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞又は前駆細胞、生殖幹細胞、肺幹細胞又は前駆細胞、乳腺幹細胞、嗅覚成体幹細胞、毛包幹細胞、腸管幹細胞又は前駆細胞、複能性幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞、神経幹細胞又は前駆細胞、成体幹細胞、体性幹細胞、組織特異的幹細胞、全能性幹細胞、線維芽細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、肝芽細胞、筋芽細胞、前脂肪細胞、肝細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、Ｋ５６２ヒト赤血球系白血病細胞株、骨細胞、滑膜細胞、腱細胞、靭帯細胞、半月板細胞、脂肪細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、赤血球性−巨核球性細胞、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、島β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、外分泌前駆細胞、管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色又は褐色脂肪細胞、ホルモン分泌細胞、表皮角化細胞、上皮細胞、腎細胞、生殖細胞、骨格関節滑膜細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、軟骨細胞、内皮細胞、心膜細胞、髄膜細胞、ケラチノサイト前駆細胞、ケラチノサイト幹細胞、周皮細胞、グリア細胞、上衣細胞、羊膜又は胎盤膜から単離された細胞、漿膜細胞、体細胞或いは皮膚、心臓、脳若しくは脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、腸又は胃に由来する細胞である。
【００３８】
本方法の種々の実施形態において、細胞は、移植部位又はその近くに提供される（例えば、注入される）。本方法の種々の実施形態において、細胞は、移植片内に提供される（例えば、注入又は移植される）（例えば、移植前、その間又はその後に組織又は器官移植片内に注入又は移植される）。いくつかの実施形態において、トランスジーンが発現される細胞は、移植の細胞である（例えば、移植される組織又は器官の細胞は、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するように修飾される）。
【００３９】
一態様では、同種宿主での移植部位において細胞の増殖を制御する方法が提供される（例えば、移植部位での細胞の腫瘍形成能を低下させるか、又は移植部位で腫瘍形成性になった細胞の増殖を低下させるため）。本方法は、ａ）細胞内で１つ又は複数の（例えば、１つ、２つ、３つ又はそれを超える）細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）を遺伝子修飾することであって、ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物は、分裂細胞（例えば、免疫抑制トランスジーンの１つ又は複数を含む全ての分裂細胞）によって発現される、１つ又は複数の遺伝子座であり、ＣＤＬの遺伝子修飾は、ｉ）ＣＤＬをコードするＤＮＡ配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含むアブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系、及びｉ）ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＤＬの調節の誘導性外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系の１つ又は複数を含む、遺伝子修飾すること、ｂ）移植部位での局所免疫抑制を提供するための少なくとも１つの機構を含むように細胞を遺伝子修飾すること、ｃ）同種宿主における移植部位に細胞又は細胞集団を移植すること、及びｄ）ＡＬＩＮＫ系を含む遺伝子修飾細胞を陰性選択マーカの誘導物質の非存在下で維持することにより、ＡＬＩＮＫ系を含む遺伝子修飾細胞の増殖を可能にするか、又はＡＬＩＮＫ系を含む細胞を陰性選択マーカの誘導物質に曝露することにより、ＡＬＩＮＫ系を含む遺伝子修飾細胞の増殖をアブレート及び／若しくは阻害すること、並びに／又はＥＡＲＣ系を含む遺伝子修飾細胞を誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に曝露することにより、ＥＡＲＣ系を含む遺伝子修飾細胞の増殖を可能にするか、又はＥＡＲＣ系を含む細胞を誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質の非存在下で維持することにより、ＥＡＲＣ系を含む遺伝子修飾細胞の増殖を防止若しくは阻害することを含む。
【００４０】
本方法の実施形態において、ＣＤＬの遺伝子修飾は、ａ）ＡＬＩＮＫ系を含むＤＮＡベクター、ｂ）ＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクター、及びｃ）ＡＬＩＮＫ系及びＥＡＲＣ系を含むＤＮＡベクターの１つ又は複数を用いてＣＤＬのターゲティングされた置換を行うことを含み、ＡＬＩＮＫ及び／又はＥＡＲＣ系は、それぞれＣＤＬに作動可能に連結されている。
【００４１】
方法の様々な実施形態では、ＣＤＬのＡＬＩＮＫ遺伝子修飾は、同型接合性、異型接合性、半接合性若しくは複合異型接合性であり、及び／又はＥＡＲＣ遺伝子修飾は、機能性ＣＤＬ修飾がＥＡＲＣ修飾対立遺伝子を通してのみ生成され得ることを確実にする。
【００４２】
方法の様々な実施形態では、ＣＤＬは、表５に列挙される遺伝子座の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ又はそれを超える）である。様々な実施形態では、ＣＤＬは、遺伝子産物であって、その機能は、細胞周期、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ転写、タンパク質翻訳及び代謝の１つ又は複数に関与している、遺伝子産物をコードする。様々な実施形態では、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の１つ又は複数であり、好ましくは、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１又はＣＤＫ１である。いくつかの実施形態では、ＣＤＬは、Ｔｏｐ２Ａである。いくつかの実施形態では、ＣＤＬは、Ｅｅｆ２である。種々の実施形態では、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＮＰＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２の２つ以上であり、好ましくは、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１及びＴｏｐ２Ａ又はＣｄｋ１及びＥｅｆ２である。
【００４３】
方法の様々な実施形態では、ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系を含み、好ましくは、ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系である。
【００４４】
方法の様々な実施形態では、ＥＡＲＣ系は、ドキシサイクリン誘導「ｄｏｘ−架橋」系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系又はリガンド可逆二量体化系であり、好ましくは、ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系である。
【００４５】
本方法の実施形態において、遺伝子修飾細胞は、トランスジーンのセットであって、各トランスジーンは、細胞質性、膜結合性又は局所作用性である遺伝子産物であって、以下の機能：ａ）抗原提示細胞の活性化及び機能を緩和すること、ｂ）移植片攻撃白血球活性又は細胞溶解機能を緩和すること、ｃ）同種移植片細胞のマクロファージ細胞溶解機能及び食作用を緩和すること、ｄ）移植片攻撃白血球においてアポトーシスを誘導すること、ｅ）局所炎症タンパク質を緩和すること、及びｆ）白血球媒介アポトーシスから保護することの１つ又は複数を有する遺伝子産物をコードする、トランスジーンのセットを含む。
【００４６】
本方法の実施形態では、トランスジーンのセットは、以下の遺伝子：ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）又はＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８若しくはＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を含む。
【００４７】
本方法の実施形態において、トランスジーンのセットは、以下の遺伝子：ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の２つ以上を含む。
【００４８】
本方法の実施形態において、トランスジーン遺伝子のセットは、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）又はＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子を含む。
【００４９】
本方法の実施形態において、細胞は、以下の遺伝子：ＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１及びＩＦＮγＲ１  ｄ３９又はＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１若しくはＩＦＮγＲ１  ｄ３９のアゴニストとして作用する生物学的物質をコードする遺伝子の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個又は１１個全て）をさらに含む。
【００５０】
本方法の実施形態において、ＴＧＦ−β又は生物学的物質は、移植片環境内で局所的に作用する。実施形態において、ＴＧＦ−β又は生物学的物質は、移植片環境内で局所的に作用し、全身作用は、最小限である。
【００５１】
本方法の種々の実施形態において、細胞は、幹細胞、ゲノム編集に従う細胞及び／又は治療細胞型の供給源（例えば、治療細胞型に分化され得る細胞又は所望の標的組織の細胞）である。種々の実施形態において、細胞は、胚幹細胞、多能性幹細胞、誘導多能性幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞又は前駆細胞、生殖幹細胞、肺幹細胞又は前駆細胞、乳腺幹細胞、嗅覚成体幹細胞、毛包幹細胞、腸管幹細胞又は前駆細胞、複能性幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞、神経幹細胞又は前駆細胞、成体幹細胞、体性幹細胞、組織特異的幹細胞、全能性幹細胞、線維芽細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、肝芽細胞、筋芽細胞、前脂肪細胞、肝細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、Ｋ５６２ヒト赤血球系白血病細胞株、骨細胞、滑膜細胞、腱細胞、靭帯細胞、半月板細胞、脂肪細胞、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、骨格筋細胞、心筋細胞、赤血球性−巨核球性細胞、好酸球、マクロファージ、Ｔ細胞、島β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、外分泌前駆細胞、管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、胆管細胞、白色又は褐色脂肪細胞、ホルモン分泌細胞、表皮角化細胞、上皮細胞、腎細胞、生殖細胞、骨格関節滑膜細胞、骨膜細胞、軟骨膜細胞、軟骨細胞、内皮細胞、心膜細胞、髄膜細胞、ケラチノサイト前駆細胞、ケラチノサイト幹細胞、周皮細胞、グリア細胞、上衣細胞、羊膜又は胎盤膜から単離された細胞、漿膜細胞、体細胞或いは皮膚、心臓、脳若しくは脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、腸又は胃に由来する細胞である。
【００５２】
本方法の種々の実施形態において、細胞は、移植部位又はその近くに提供される（例えば、注入される）。本方法の種々の実施形態において、細胞は、移植片内に提供される（例えば、注入又は移植される）（例えば、移植前、その間又はその後に組織又は器官移植片内に注入又は移植される）。いくつかの実施形態において、トランスジーンが発現される細胞は、移植の細胞である（例えば、移植される組織又は器官の細胞は、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するように修飾される）。
【００５３】
本方法の種々の実施形態において、同種宿主は、哺乳動物である。本方法の種々の実施形態において、同種宿主は、マウス又はヒトである。
【００５４】
本方法の種々の実施形態において、宿主は、細胞療法を用いて処置され得る変性疾患又は状態を有する。種々の実施形態において、疾患又は状態は、盲目、関節炎（例えば、変形性関節症若しくは関節リウマチ）、虚血、糖尿病（例えば、１型若しくは２型糖尿病）、多発性硬化症、脊髄損傷、卒中、癌、肺疾患、血液疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病及びＡＬＳなどの神経疾患、酵素若しくはホルモン欠乏症、代謝障害（例えば、リソソーム貯蔵障害、ガラクトース血症、メープルシロップ尿症、フェニルケトン尿症、グリコーゲン貯蔵疾患、ミトコンドリア障害、フリードリッヒ運動失調症、ペルオキシソーム障害、金属代謝障害若しくは有機酸血症）、自己免疫疾患（例えば、乾癬、全身性エリテマトーデス、グラーブ病、炎症性腸疾患、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、血管炎、自己免疫性肝炎、円形脱毛症、自己免疫性膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、皮膚筋炎）、加齢黄斑変性症、網膜ジストロフィー、感染症、血友病、変性疾患（例えば、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患、慢性外傷性脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、嚢胞性線維症、チトクロムｃ酸化酵素欠損症、エーラース・ダンロス症候群、本態性振戦、進行性骨化性線維異形成症（Ｆｒｉｂｒｏｄｉｓｐｌａｓｉａ  Ｏｓｓｉｆｉｃａｎｓ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉａｖａ）、乳児神経軸索ジストロフィー、円錐角膜、球状角膜、筋ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症、以前の疾患、進行性核上麻痺、サンドホフ病、脊髄性筋萎縮症、網膜色素変性症）又は加齢関連疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患）、心血管疾患（例、狭心症、心筋梗塞）、白内障、骨粗鬆症若しくは高血圧）である。
【００５５】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）は、活性化白血球における対応する内在性遺伝子の発現レベル以上のレベルで発現される（例えば、Ｔ細胞、例えばクローキングトランスジーンの発現レベルは、活性化白血球における内在性遺伝子の発現レベルに等しいか、又は活性化白血球における内在性遺伝子の発現レベルよりも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上高い）。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の８つ全ては、活性化白血球における対応する内在性遺伝子の発現レベル以上のレベルで発現される。
【００５６】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態において、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）は、野生型幹細胞における対応する内在性遺伝子の発現レベルを超えるレベルで発現される（例えば、同じ種由来の野生型ＥＳ細胞、例えばクローキングトランスジーンの発現レベルは、同じ種由来の非修飾野生型ＥＳ細胞における内在性遺伝子の発現と比較してクローク細胞において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１，０００倍以上高い）。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の８つ全ては、野生型幹細胞（例えば、クローク細胞としての同じ種由来の胚幹細胞）における内在性遺伝子の発現レベルよりも高い（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０又は１００倍以上の）レベルで発現される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）は、ＥＳ細胞ゲノム中の全ての遺伝子について遺伝子発現の上位５％にあるレベルで発現される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）は、ＥＳ細胞ゲノム中の全ての遺伝子について遺伝子発現の上位１％にあるレベルで発現される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の全ては、ＥＳ細胞ゲノム中の全ての遺伝子について遺伝子発現の上位５％にあるレベルで発現される。
【００５７】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１トランスジーンは、配列番号１１又は配列番号１２のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するタンパク質をコードする。
【００５８】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）トランスジーンは、配列番号１６又は配列番号１５のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するタンパク質をコードする。
【００５９】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、Ｃｄ４７トランスジーンは、配列番号３又は配列番号４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するタンパク質をコードする。
【００６０】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＣＤ２００トランスジーンは、配列番号５又は配列番号６のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するタンパク質をコードする。
【００６１】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）トランスジーンは、配列番号１０又は配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するタンパク質をコードする。
【００６２】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）トランスジーンは、配列番号２又は配列番号１のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するタンパク質をコードする。
【００６３】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、Ｍｆｇｅ８トランスジーンは、配列番号１３又は配列番号１４のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するタンパク質をコードする。
【００６４】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、Ｓｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）トランスジーンは、配列番号８又は配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するタンパク質をコードする。
【００６５】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＩＦＮγＲ１  ｄ３９トランスジーンは、配列番号１７のアミノ酸配列に対して少なくとも８５％の同一性（例えば、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列同一性）を有するタンパク質をコードする。
【００６６】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、１つ又は複数のトランスジーンは、構成的プロモータに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、構成的プロモータは、ＣＡＧプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＥＦ１αプロモータ、ＰＧＫプロモータ、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＨＳＶのｔｋプロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶのＬＴＲプロモータ、モロニーウイルスのプロモータ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータからなる群から選択される。
【００６７】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、治療剤をコードするトランスジーンをさらに含む（例えば、細胞は、治療剤をコードするトランスジーンをさらに含むように修飾される）。いくつかの実施形態では、治療剤は、タンパク質又は抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、阻害抗体又はアゴニスト抗体である。いくつかの実施形態では、治療剤は、表２に列挙される薬剤である。いくつかの実施形態では、治療剤は、対象において変異されている遺伝子の野生型バージョン（例えば、対象における疾患又は状態に関連する変異遺伝子の野生型バージョン、例えば癌、酵素若しくはホルモン欠損、代謝障害又は変性疾患に関連する遺伝的変異）である。いくつかの実施形態では、治療剤は、テトラサイクリン応答エレメント、光誘導系、放射性遺伝子系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、不安定化ドメイン系又はリガンド可逆二量体化系からなる群から選択される誘導性発現系を使用して発現される。いくつかの実施形態では、治療剤は、ＣＡＧプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＥＦ１αプロモータ、ＰＧＫプロモータ、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＨＳＶのｔｋプロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶのＬＴＲプロモータ、モロニーウイルスのプロモータ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータからなる群から選択される構成的プロモータを使用して発現される。
【００６８】
別の態様では、上記の細胞のいずれかによる遺伝子修飾細胞の集団が提供される。
【００６９】
一態様では、同種宿主における移植部位での局所免疫抑制を提供するための方法が提供される。本方法は、上記のような遺伝子修飾細胞又は上記のような遺伝子修飾細胞の集団を同種宿主における移植部位に移植することを含む。
【００７０】
別の態様では、本発明は、本発明の細胞を含む組成物を特徴とする。いくつかの実施形態では、組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤をさらに含む。
【００７１】
別の態様では、本発明の細胞又は本発明の医薬組成物を含むキットが特徴とされる。
【００７２】
別の態様では、本発明の細胞又は本発明の組成物を対象に投与することにより、疾患又は状態の処置を、それを必要とする対象において行う方法が特徴とされる。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、盲目、関節炎（例えば、変形性関節症若しくは関節リウマチ）、虚血、糖尿病（例えば、１型若しくは２型糖尿病）、多発性硬化症、脊髄損傷、卒中、癌、肺疾患、血液疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病及びＡＬＳなどの神経疾患、酵素若しくはホルモン欠乏症、代謝障害（例えば、リソソーム貯蔵障害、ガラクトース血症、メープルシロップ尿症、フェニルケトン尿症、グリコーゲン貯蔵疾患、ミトコンドリア障害、フリードリッヒ運動失調症、ペルオキシソーム障害、金属代謝障害若しくは有機酸血症）、自己免疫疾患（例えば、乾癬、全身性エリテマトーデス、グラーブ病、炎症性腸疾患、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、血管炎、自己免疫性肝炎、円形脱毛症、自己免疫性膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、皮膚筋炎）、加齢黄斑変性症、網膜ジストロフィー、感染症、血友病、変性疾患（例えば、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患、慢性外傷性脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、嚢胞性線維症、チトクロムｃ酸化酵素欠損症、エーラース・ダンロス症候群、本態性振戦、進行性骨化性線維異形成症、乳児神経軸索ジストロフィー、円錐角膜、球状角膜、筋ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症、以前の疾患、進行性核上麻痺、サンドホフ病、脊髄性筋萎縮症、網膜色素変性症）若しくは加齢関連疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患（例えば、狭心症、心筋梗塞）、白内障、骨粗鬆症若しくは高血圧）又は表２に列挙される疾患若しくは状態並びに／或いは対象において変異されている遺伝子の野生型バージョン（例えば、対象における疾患又は状態に関連する変異遺伝子の野生型バージョン、例えば癌、酵素若しくはホルモン欠損症、代謝障害又は変性疾患に関連する遺伝子変異）である。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、加齢黄斑変性症（例えば、湿性ＡＭＤ）又は網膜ジストロフィーであり、治療剤は、ＶＥＧＦ阻害剤（例えば、ＶＥＧ受容体の可溶型（例えば、可溶型ＶＥＧＦＲ−１又はＮＲＰ−１）、血小板因子−４、プロラクチン、ＳＰＡＲＣ、ＶＥＧＦ阻害抗体（例えば、ベバシズマブ又はラニビズマブ）又はＨｏｌａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１１３８３−１１３９８，２００２に記載されている可溶性デコイ受容体、例えばＶＥＧＦ−Ｔｒａｐｐａｒｅｎｔａｌ、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐΔＢ１、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐΔＢ２、ＶＥＧＦ−ＴｒａｐＲ１Ｒ２、例えばアフリベレプト）である。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、変形性関節症又は関節リウマチであり、治療剤は、抗炎症性の生物学的物質（例えば、ＴＮＦα阻害剤（例えば、アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、ゴリムマブ又はサートリズマブ）、インターロイキン−６（ＩＬ６）受容体阻害剤（例えば、トシリズマブ）、ＩＬ１受容体阻害剤（例えば、アナキンラ）又は関節リウマチを処置するために使用される別の薬剤（例えば、アバタセプト、リツキシマブ））である。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、糖尿病（例えば、１型糖尿病又は２型糖尿病）であり、治療剤は、インスリンである。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、血友病であり、治療剤は、第ＶＩＩＩ因子である。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、代謝欠損であり、治療剤は、対象において変異されている遺伝子の野生型バージョンの核酸配列を有するトランスジーン又は対象において欠損している酵素をコードするトランスジーンである。
【００７３】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、対象への投与前に系統制限細胞型に分化される。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、心筋梗塞であり、及び細胞は、心筋細胞に分化される。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、盲目であり、及び細胞は、光受容体細胞に分化される。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、脊髄損傷、パーキンソン病、ハンチントン病又はアルツハイマー病であり、及び細胞は、ニューロンに解離される。いくつかの実施形態では、疾患又は状態は、多発性硬化症であり、及び細胞は、グリア細胞に分化される。
【００７４】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、細胞又は治療剤を必要とする組織又は身体部位に局所的に投与される（例えば、注入又は移植される）。
【００７５】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、静脈内、皮下、筋肉内、経皮的、皮内、非経口的、動脈内、血管内又は潅流によって投与される。
【００７６】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、皮下注入によって投与されて、クロークされた皮下組織を産生する。
【００７７】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、組織として投与される。いくつかの実施形態では、組織は、ゲル、生体適合性マトリックス又は細胞足場と共に投与される。
【００７８】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、２５，０００〜５，０００，０００，０００個の細胞（例えば、２．５×１０４、５×１０４、７．５×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、６×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９又は５×１０９個の細胞）の量で投与される。
【００７９】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、８００，０００，０００〜１００，０００，０００，０００個の細胞（例えば、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９又は３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０又は１×１０１１個の細胞）の量で投与される。
【００８０】
前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、追加の治療剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、細胞の投与前に投与される。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、細胞の投与後に投与される。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、細胞の投与と同時に投与される。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、免疫抑制剤、疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、生物学的応答修飾剤（ＤＭＡＲＤの一種）、コルチコステロイド若しくは非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、メトトレキサート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、レフルノミド、シクロホスファミド、アザチオプリン、トファシチニブ、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、カイネレット、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ若しくはトシリズマブ、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アバタセプト、アダリムマブ、アレムツズマブ、アミノサリチル酸塩、抗生物質、抗ヒスタミン、抗ＴＮＦα、アザチオプリン、ベリムマブ、βインターフェロン、カルシニューリン阻害剤、セルトリズマブ、コルチコステロイド、クロモリン、シクロスポリンＡ、シクロスポリン、フマル酸ジメチル、エタネルセプト、フィンゴリモド、フマル酸エステル、グラチラマーアセテート、ゴリムマブ、ヒドロキシウレア、ＩＦＮγ、ＩＬ−１１、レフルノミド、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、長時間作用型β２アゴニスト、ミトキサントロン、ミコフェノール酸モフェチル、ナタリズマブ、オクレリズマブ、ピメクロリムス、プロバイオティック、レチノイド、サリチル酸、短時間作用型β２アゴニスト、スルファサラジン、タクロリムス、テリフルノミド、テオフィリン、トシリズマブ、ウステキヌマブ若しくはベドリズマブ、ベバキュジマブ、ラニビズマブ若しくはアフリベルセプト）、光線力学的治療、光凝固、カルビドパ−レボドパ、ドーパミンアゴニスト、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤、抗コリン作動薬、アマンタジン、深部脳刺激薬、抗凝固薬、抗血小板剤、アンギオテンシン変換酵素阻害剤、アンギオテンシンＩＩ受容体遮断薬、アンギオテンシン受容体ネプリライシン阻害剤、β遮断薬、併用α及びβ遮断薬、カルシウムチャネル遮断薬、コレステロール低下薬、ニコチン酸、コレステロール吸収阻害剤、ジギタリス製剤、利尿薬、血管拡張剤、抗血小板剤二剤併用療法、心臓処置、抗ウイルス化合物、ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤、抗菌化合物、抗真菌化合物、抗寄生虫化合物、インスリン、スルホニルウレア、ビグアニド、メグリチニド、チアゾリジンジオン、ＤＰＰ−４阻害剤、ＳＧＬＴ２阻害剤、α−グルコシダーゼ阻害剤、胆汁酸封鎖剤、アスピリン、食事療法、凝固因子、デスモプレシン、血餅保存薬、フィブリンシーラント、理学療法、補酵素、骨髄移植、器官移植、血液透析、血液濾過、交換輸血、腹膜透析、中鎖トリアシルグリセロール、ミグルスタット、酵素補充療法、チェックポイント阻害剤、化学療法薬、生物学的薬剤、放射線療法、凍結療法、温熱療法、外科的切除若しくは腫瘍組織又は抗癌ワクチンである。
【００８１】
前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、本方法は、細胞の増殖を制御することをさらに含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＡＬＩＮＫ系を含み、及び増殖を制御する方法は、ｉ）ＡＬＩＮＫ系を含む細胞を陰性選択マーカの誘導物質の非存在下で維持することにより、ＡＬＩＮＫ系を含む細胞の増殖を可能にするか、又はｉｉ）ＡＬＩＮＫ系を含む細胞を陰性選択マーカの誘導物質に曝露することにより、ＡＬＩＮＫ系を含む細胞の増殖をアブレート若しくは阻害することを含む。いくつかの実施形態では、細胞は、ＥＡＲＣ系を含み、及び細胞増殖を制御する方法は、ｉ）ＥＡＲＣ系を含む細胞を誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に暴露することにより、ＥＡＲＣ系を含む細胞の増殖を可能にするか、又はｉｉ）ＥＡＲＣ系を含む細胞を誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質の非存在下で維持することにより、ＥＡＲＣ系を含む細胞の増殖を予防若しくは阻害することを含む。
【００８２】
前述の方法のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、治療の完了後に除去される。細胞の除去は、手術（例えば、移植された組織又は器官を除去するため又はクロークされた皮下組織を除去するため）によるか、又はＡＬＩＮＫ及び／若しくはＥＡＲＣ系の使用によることができる。いくつかの実施形態では、１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれを超える）のＡＬＩＮＫ及び／又はＥＡＲＣ系がクローク細胞の全てを排除するために使用される。
【００８３】
別の態様では、本発明は、疾患又は状態の処置を、それを必要とする対象において行う際に使用するための本発明の細胞又は本発明の組成物を提供する。いくつかの実施形態において、疾患又は状態は、盲目、関節炎（例えば、変形性関節症若しくは関節リウマチ）、虚血、糖尿病（例えば、１型若しくは２型糖尿病）、多発性硬化症、脊髄損傷、卒中、癌、肺疾患、血液疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病及びＡＬＳなどの神経疾患、酵素若しくはホルモン欠乏症、代謝障害（例えば、リソソーム貯蔵障害、ガラクトース血症、メープルシロップ尿症、フェニルケトン尿症、グリコーゲン貯蔵疾患、ミトコンドリア障害、フリードリッヒ運動失調症、ペルオキシソーム障害、金属代謝障害若しくは有機酸血症）、自己免疫疾患（例えば、乾癬、全身性エリテマトーデス、グラーブ病、炎症性腸疾患、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、血管炎、自己免疫性肝炎、円形脱毛症、自己免疫性膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、皮膚筋炎）、加齢黄斑変性症、網膜ジストロフィー、感染症、血友病、変性疾患（例えば、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患、慢性外傷性脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、嚢胞性線維症、チトクロムｃ酸化酵素欠損症、エーラース・ダンロス症候群、本態性振戦、進行性骨化性線維異形成症、乳児神経軸索ジストロフィー、円錐角膜、球状角膜、筋ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症、以前の疾患、進行性核上麻痺、サンドホフ病、脊髄性筋萎縮症、網膜色素変性症）若しくは加齢関連疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症）、心血管疾患（例、狭心症、心筋梗塞）、白内障、骨粗鬆症若しくは高血圧）又は表２に列挙される疾患若しくは状態である。
【００８４】
別の態様では、本発明は、同種宿主における移植部位での局所免疫抑制を提供する際に使用するための本発明の細胞又は本発明の組成物を提供する。
【００８５】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、トランスジーンＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のセットの２つ（例えば、ＰＤ−Ｌ１及びＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）；ＰＤ−Ｌ１及びＣｄ４７；ＰＤ−Ｌ１及びＣｄ２００；ＰＤ−Ｌ１及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；ＰＤ−Ｌ１及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）及びＣｄ４７；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）及びＣｄ２００；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７及びＣｄ２００；Ｃｄ４７及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；Ｃｄ４７及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；Ｃｄ４７及びＭｆｇｅ８；Ｃｄ４７及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ２００及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；Ｃｄ２００及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；Ｃｄ２００及びＭｆｇｅ８；Ｃｄ２００及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；又はＭｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６））を含む。
【００８６】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、トランスジーンＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のセットの３つ（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）及びＣｄ４７；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）及びＣｄ２００；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７及びＣｄ２００；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７及びＣｄ２００；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＭｆｇｅ８；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９��Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；Ｃｄ４７、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ２００、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６））を含む。
【００８７】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、トランスジーンＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のセットの４つ（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７及びＣｄ２００；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ��、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉ���  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；又はＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６））を含む。
【００８８】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、トランスジーンＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のセットの５つ（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８、ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−��１、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒ��ｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；又はＣｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６））を含む。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、トランスジーンＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のセットの６つ（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＣｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２���ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；又はＣｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６））を含む。
【００８９】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、トランスジーンＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のセットの７つ（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＭｆｇｅ８；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；ＰＤ−Ｌ１、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）；又はＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６））を含む。
【００９０】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、トランスジーンＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のセットの８つ全てを含む。
【００９１】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、トランスジーンＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のセットの１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つ全て）を含む。
【００９２】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、トランスジーンＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のセットの１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ又は７つ全て）を含む。
【００９３】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、トランスジーンＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）のセットの１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つ全て）を含む。
【００９４】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、ＰＤ−Ｌ１を発現するように修飾されていない。
【００９５】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、ＦａｓＬを発現するように修飾されていない。
【００９６】
前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、ＴＧＦ−βを発現するように修飾されていない。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、ＣＴＬＡ４又はＣＬＴＡ４−Ｉｇを発現するように修飾されていない。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、ＩＤＯを発現するように修飾されていない。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ−３５を発現するように修飾されていない。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ−１０を発現するように修飾されていない。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、ＶＥＧＦを発現するように修飾されていない。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、ＮＦκｂデコイ受容体Ｆを発現するように修飾されていない。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、可溶性ＴＮＦＲを発現するように修飾されていない。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、ＣＣＲ７を発現するように修飾されていない。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、ＳＯＣＳ１を発現するように修飾されていない。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、ＨＬＡ−Ｅを発現するように修飾されていない。前述の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、細胞は、ＩＬ−１２に指向されるｓｉＲＮＡを発現するように修飾されていない。
【００９７】
定義
別に定義しない限り、本明細書で使用する技術及び科学用語の全ては、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【００９８】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、記載されている値の１０％以下だけ上回る又は下回る値を指す。例えば、用語「約５ｎＭ」は、４．５ｎＭ〜５．５ｎＭの範囲を示す。
【００９９】
本明細書で使用する場合、用語「活性化された白血球」は、知覚された侵襲に対する反応により引き起こされる白血球（例えば、好中球、好酸球又は好塩基球などの顆粒球、単球又はＢ又はＴ細胞などのリンパ球）の状態を指す。白血球が活性化されると、それらは、増殖し、サイトカインを分泌し、分化し、抗原を提示し、より極性化し、より貪食性となり、且つ／又はより細胞傷害性となる。免疫細胞の活性化を刺激する因子には、炎症誘発性サイトカイン、病原体及び非自己抗原提示が含まれる。活性化白血球は、リンパ器官から単離することができる。Ｔ細胞などの白血球は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ又は当業者によって使用される他の方法を用いてインビトロでも活性化され得る（例えば、Ｆｒａｕｗｉｔｈ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０９：２９５−２９９（２００２）；及びＴｒｉｃｋｅｔｔ  ａｎｄ  Ｋｗａｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７５：２５１−２５５（２００３）を参照されたい）。
【０１００】
本明細書で使用する場合、「同種」は、同じ種の異なる対象から採取されたか又は対象に由来する細胞、組織、ＤＮＡ又は因子を意味する。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、用語「幹細胞」は、１つ又は複数の特殊化した細胞に分化し得、自己再生のための能力を有する細胞を指す。幹細胞には、胚幹細胞（ＥＳＣ）及び誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）などの多能性幹細胞（ＰＳＣ）並びに種々の組織に見られる臍帯血幹細胞、間葉間質細胞及び成体幹細胞などの複能性幹細胞が含まれる。用語「幹細胞」は、ゲノム編集に従う細胞、治療細胞型の供給源としての役割を果たし得る細胞（例えば、細胞療法に使用される系統制限細胞若しくは最終分化細胞又は所望の標的組織の細胞）及び「人工」細胞獲得幹細胞特性（例えば、多能性又は複能性又は自己再生）を有する細胞も含む。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、用語「胚幹細胞」及び「ＥＳ細胞」は、適切な条件下でインビトロ培養において維持され得る胚盤胞の内部細胞塊に由来する、胚由来の全能性幹細胞又は多能性幹細胞を指す。ＥＳ細胞は、３つの脊椎動物胚葉、例えば内胚葉、外胚葉又は中胚葉のいずれかの細胞に分化することができる。ＥＳ細胞は、適当なインビトロ培養条件下で無限に増殖する能力によっても特徴付けられる。例えば、Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５（１９９８）を参照されたい。
【０１０３】
本明細書で使用する場合、用語「誘導多能性幹細胞」、「ｉＰＳ細胞」及び「ｉＰＳＣ」は、分化した体細胞に直接由来し得る多能性幹細胞を指す。例えば、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘファミリー転写因子（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘｌ５）、Ｍｙｃファミリー転写因子（例えば、ｃ−Ｍｙｃ、１−Ｍｙｃ、ｎ−Ｍｙｃ）、クルッペル様ファミリー（ＫＬＦ）転写因子（例えば、ＫＬＦ１、ＫＬＦ２、ＫＬＦ４、ＫＬＦ５）並びに／又は関連する転写因子、例えばＮＡＮＯＧ、ＬＩＮ２８及び／若しくはＧｌｉｓ１を含む、再プログラミング因子の特定のセットを非多能性細胞に導入することにより、ヒトｉＰＳ細胞を生成することができる。ヒトｉＰＳ細胞は、例えば、転写因子の作用を模倣する小分子であるｍｉＲＮＡ又は系譜決定因子の使用によっても生成することができる。ヒトｉＰＳ細胞は、脊椎動物の３つの胚葉、例えば内胚葉、外胚葉又は中胚葉の任意の細胞に分化する能力によって特徴付けられる。ヒトｉＰＳ細胞は、適当なインビトロ培養条件下で無限に増殖する能力によっても特徴付けられる。例えば、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｃｅｌｌ  １２６：６６３（２００６）を参照されたい。
【０１０４】
本明細書で使用する場合、用語「抗原提示細胞の活性化及び機能を緩和する」は、遺伝子産物であって、その機能は、抗原提示細胞の活性化又は白血球攻撃移植片の活性化を促進する抗原提示細胞の能力を阻害することである、遺伝子産物をコードするトランスジーンを指す（Ｆｉｏｒｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４６：３４４４−５１（１９９１）；Ｓａｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：３２４５−５３（１９９９））。実施形態において、抗原提示細胞の活性化及び機能の緩和は、対照に対するＡＰＣ活性化及び機能の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の低下を指す（例えば、抗原提示細胞活性化に関するアッセイを用いて決定して、例えば低下した増殖、低下した炎症促進性サイトカイン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１、例えばＩＬ−１β）、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、例えばＴＮＦα）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）の分泌（これは、培養培地又は血液などの患者サンプルのＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロット分析を用いて測定することができる））又は細胞表面マーカ（例えば、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１１ｂ、ＨＬＡ分子（例えば、ＭＨＣ−ＩＩ）、ＣＤ４０、Ｂ７、ＩＬ−２、ＣＤ８０又はＣＤ８６の低下したレベル（これは、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査、インサイチューハイブリダイゼーション及び細胞表面マーカの測定を可能にする他のアッセイを用いて評価することができる）など）。抗原提示細胞は、樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファージを含む。肥満細胞及び好中球も抗原を提示するように誘導され得る。抗原提示細胞の活性化及び機能の緩和の決定方法は、当該技術分野で公知である。抗原提示細胞の活性化及び機能を緩和する遺伝子産物の例としては、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）及びＰＤ−Ｌ１が挙げられるが、これらに限定されない。このようなトランスジーンは、本明細書では「クローキング」又は「クロークされた」遺伝子と称され得る。
【０１０５】
本明細書で使用する場合、用語「移植片攻撃白血球の活性又は細胞溶解機能を緩和する」は、遺伝子産物であって、その機能は、同種移植片細胞の付近での移植片攻撃白血球の活性又は細胞溶解機能を阻害又は防止することである、遺伝子産物をコードするトランスジーンを指す（ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６：１６７１−５（１９８１）；Ｂｏｎｇｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：４２４−９（１９８３）；ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４６６−７０（１９７９））。一実施形態において、移植片攻撃白血球の活性化又は細胞溶解機能の緩和は、対照に対する白血球の活性化又は細胞溶解機能の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の低下を指す（例えば、白血球活性化に関するアッセイを用いて測定して、例えば低下した増殖、低下した炎症誘発性サイトカイン（例えば、インターロイキン−１（ＩＬ−１、例えばＩＬ−１β）、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ、例えばＴＮＦα）、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）及び顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）の分泌、これは、培養培地又は血液などの患者サンプルのＥＬＩＳＡ又はウェスタンブロット分析を用いて測定することができる）又は低下した極性化（例えば、マクロファージ又は単球におけるＩＬ−１２、ＴＮＦ、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−２３、ＭＡＲＣＯ、ＭＨＣ−ＩＩ、ＣＤ８６、ｉＮＯＳ、ＣＸＣＬ９及びＣＸＣＬ１０のレベルの低下又はＴｈ１特異的マーカ（例えば、Ｔ−ｂｅｔ、ＩＬ−１２Ｒ、ＳＴＡＴ４）、ケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ６又はＣＸＣＲ３）；又はＴ細胞におけるＴｈ２−特異的マーカ（例えば、ＣＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＳＴＡＴ６、ＧＡＴＡ３又はＩＬ−４Ｒα）のレベルの低下、これは、フローサイトメトリー、免疫組織化学的検査、インサイチューハイブリダイゼーション、ｑＰＣＲ又は「細胞表面マーカ若しくは細胞内タンパク質の」ウェスタンブロット分析及び分泌タンパク質に関するＥＬＩＳＡ若しくはウェスタンブロット分析を用いて評価することができる）又は細胞溶解機能に関するアッセイを用いて（例えば、標的細胞株により発現される表面抗体に対する抗体で予め被覆した標的細胞株と共に白血球をインキュベートし、蛍光生存能染色を有する生存標的細胞の数を測定することにより、又は白血球からの細胞溶解性顆粒（例えば、パーフォリン、グランザイム又は免疫細胞から放出される他の細胞溶解性タンパク質）の分泌を測定することにより）決定して）。移植片攻撃白血球の活性化又は細胞溶解機能の緩和の決定方法は、当該技術分野で公知である。移植片攻撃白血球の活性化又は細胞溶解機能を緩和する遺伝子産物の例としては、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ３９、Ｃｄ７３及びＬａｇ３が挙げられるが、これらに限定されない。このようなトランスジーンは、本明細書では「クローキング」又は「クロークされた」遺伝子と称され得る。
【０１０６】
本明細書で使用する場合、用語「同種移植片細胞のマクロファージ細胞溶解機能及び食作用を緩和する」は、遺伝子産物であって、その機能は、同種移植片細胞のマクロファージ細胞溶解機能及び／又は食作用を阻害又は防止することである、遺伝子産物をコードするトランスジーンを指す（Ｆｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．１９：１２７−３８．（１９８１）；Ｓｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６０：５４６−５４（１９８５）；Ａｍａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９６：３３３１−４０（２０１６））。実施形態において、同種移植片細胞のマクロファージ細胞溶解機能及び食作用の緩和は、対照に対する同種移植片細胞のマクロファージ細胞溶解機能及び／又は食作用の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の低下を指す（例えば、マクロファージ細胞溶解機能に関するアッセイを用いて決定して（例えば、標的細胞株によって発現される表面抗原に対する抗体で予め被覆した標的細胞株と共にマクロファージをインキュベートし、蛍光生存能染色を有する生存標的細胞の数を測定することにより、又はマクロファージから放出される細胞溶解（性）顆粒（例えば、パーフォリン、グランザイム又は免疫細胞から放出される他の細胞溶解（性）タンパク質）の分泌を測定することにより、又はマクロファージ食作用に関するアッセイを用いて決定して（例えば、蛍光ビーズ又は標的細胞株により発現される表面抗原に対する抗体で予め被覆した標的細胞株と共にマクロファージを培養し、免疫細胞の内部の蛍光を測定するか、又はビーズ若しくは貪食された細胞の数を定量化する））。同種移植片細胞のマクロファージ細胞溶解機能及び食作用の緩和を決定するための方法は、当該技術分野で公知である。マクロファージ細胞溶解機能を緩和する遺伝子産物の例としては、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、Ｍｆｇｅ８及びＩｌ１ｒ２が挙げられるが、これらに限定されない。このようなトランスジーンは、本明細書では「クローキング」又は「クロークされた」遺伝子と称され得る。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、用語「移植片攻撃白血球におけるアポトーシスを誘導する」は、遺伝子産物であって、その機能は、移植片細胞の付近で移植片攻撃白血球を殺滅することである、遺伝子産物をコードするトランスジーンを指す（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９６：１４８７１−６（１９９９）；Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９７：１７０７−１２（２０００）；Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．９８：５１５８−６３（２００１））。実施形態において、移植片攻撃白血球におけるアポトーシスの誘導は、対照に対する移植片攻撃白血球におけるアポトーシスの誘導の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の増大を指す（例えば、ＴＵＮＥＬ染色、カスパーゼ染色若しくはアネキシンＶ染色又は蛍光生存能染色の使用などのアポトーシスに関するアッセイを用いて決定して）。移植片攻撃白血球におけるアポトーシスの誘導を決定するための方法は、当該技術分野で公知である。移植片攻撃白血球におけるアポトーシスを誘導できる遺伝子産物の例としては、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）及びＴｎｆｓｆ１０が挙げられるが、これらに限定されない。このようなトランスジーンは、本明細書では「クローキング」又は「クロークされた」遺伝子と称され得る。
【０１０８】
本明細書で使用する場合、用語「局所免疫性タンパク質を緩和する」は、遺伝子産物であって、その機能は、局所タンパク質の活性を阻害することであり、前記タンパク質の機能は、移植片攻撃白血球蓄積及び／又はそれらの細胞溶解機能を促進することである、遺伝子産物をコードするトランスジーンを指す（Ｆｅｌｉｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１１２−２９（２０１７））。実施形態において、局所免疫性タンパク質の緩和は、対照に対する局所炎症性タンパク質の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の低下を指す（例えば、白血球活性化又は炎症部位への遊走を促進する炎症性タンパク質（例えば、ケモカイン、例えばＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２及びＣＸＣＬ８又は炎症誘発性サイトカイン、例えばＩＬ−１β、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１８、ＴＮＦα、ＩＦＮγ若しくはＧＭＣＳＦ、これらは、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット分析又は分泌タンパク質の測定に関して当該技術分野で公知である他の技術を用いて測定することができる）に関するアッセイを用いて決定して）。局所炎症性タンパク質の緩和を決定する方法は、当該技術分野で公知である。局所炎症性タンパク質を緩和する遺伝子産物の例としては、ＰＤ−Ｌ１、Ｉｌ１ｒ２及びＡｃｋｒ２が挙げられるが、これらに限定されない。このようなトランスジーンは、本明細書では「クローキング」又は「クロークされた」遺伝子と称され得る。
【０１０９】
本明細書で使用する場合、用語「白血球媒介アポトーシスから保護する」は、遺伝子産物であって、その機能は、同種移植片細胞のアポトーシス又は細胞溶解を誘導し得る任意の細胞成分を阻害することである、遺伝子産物をコードするトランスジーンを指す（Ａｂｄｕｌｌａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：３３９０−９（２００７））。実施形態において、白血球媒介アポトーシスに対する保護は、対照に対する白血球媒介アポトーシスの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％又は１００％の低下を指す（例えば、白血球媒介アポトーシスに関するアッセイを用いて決定して（例えば、標的細胞株により発現される表面抗原に対する抗体で予め被覆した標的細胞株と共に白血球をインキュベートし、蛍光生存能染色を有する生存標的細胞の数を測定することにより、又は白血球から放出される細胞溶解（性）顆粒（例えば、パーフォリン、グランザイム又は免疫細胞から放出される他の細胞溶解（性）タンパク質）の数を測定することにより）。白血球媒介アポトーシスに対する保護の決定方法は、当該技術分野で公知である。白血球媒介アポトーシスから保護する遺伝子産物の例としては、Ｓｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）及びＤａｄ１が挙げられるが、これらに限定されない。このようなトランスジーンは、本明細書では「クローキング」又は「クロークされた」遺伝子と称され得る。
【０１１０】
本明細書で使用する場合、用語「生物学的物質」は、設計されたポリペプチド及びトランスジーンとして発現し得る対応するコードＤＮＡを指す。このポリペプチドは、内在性遺伝子の機能を作動若しくは阻害するか、又は生物学的プロセスを阻害若しくは活性化することができる。ポリペプチドがアゴニスト又はアンタゴニスト活性又は機能を有するか否かの決定方法は、当該技術分野で一般に公知である。実施形態において、アゴニスト機能は、対照の機能に対して機能の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０、９５％又は１００％である。実施形態において、アンタゴニスト機能は、対照の機能に対して機能の少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０、９５％又は１００％である。
【０１１１】
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結される」は、第２の分子に連結された第１の分子を指し、第１の分子が第２の分子の機能又は発現に影響を与えるように分子が配列されている。２つの分子は、単一連続分子の一部であり得るか又はあり得ず、隣接し得るか又はし得ない。例えば、プロモータが細胞内で目的の転写可能なポリヌクレオチド分子の転写を調節する場合、プロモータは、転写可能なポリヌクレオチド分子に作動可能に連結している。さらに、転写調節エレメントの２つの部分は、一方の部分の転写活性化機能が他方の部分の存在により悪影響を受けないように連結されている場合、互いに作動可能に連結されている。２つの転写調節エレメントは、リンカー核酸（例えば、介在する非コード化核酸）によって互いに作動可能に連結され得るか、又は介在ヌクレオチドが存在することなく互いに作動可能に連結され得る。
【０１１２】
本明細書で使用する場合、用語「プロモータ」は、ＲＮＡポリメラーゼにより結合されるＤＮＡ上の認識部位を指す。ポリメラーゼは、同種移植片の転写を駆動する。
【０１１３】
参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列に関連する「パーセント（％）配列同一性」は、最大の配列同一性パーセントを達成するために、必要に応じて配列を整列させてギャップを導入した後、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列中の核酸又はアミノ酸と同一である候補配列中の核酸又はアミノ酸の割合として定義される。パーセント核酸又はアミノ酸配列同一性の決定を目的とした整列は、当業者の能力の範囲内である種々の方法、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２又はＭｅｇａｌｉｇｎソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたる最大整列の達成に必要である、配列を整列させるための任意のアルゴリズムを含む適切なパラメーターを決定することができる。例えば、パーセント配列同一性の値は、配列比較コンピュータープログラムＢＬＡＳＴを使用して生成することができる。例として、所定の核酸又はアミノ酸配列Ａの、所定の核酸又はアミノ酸配列Ｂへの、Ｂとの又はＢに対するパーセント配列同一性（これは、代替的に、所定の核酸又はアミノ酸配列Ｂへの、Ｂとの又はＢに対する特定のパーセント配列同一性を有する所定の核酸又はアミノ酸配列Ａと表現することができる）は、以下のように計算される。
１００×（比Ｘ／Ｙ）
式中、Ｘは、配列アラインメントプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ）により、プログラムのＡ及びＢのアラインメントにおいて同一マッチとしてスコアされたヌクレオチド又はアミノ酸の数であり、Ｙは、Ｂにおける核酸の総数である。核酸又はアミノ酸配列Ａの長さが核酸又はアミノ酸配列Ｂと等しくない場合、Ｂに対するＡのパーセント配列同一性は、Ａに対するＢのパーセント配列同一性と等しくないことが理解される。
【０１１４】
本明細書で使用する場合、用語「医薬組成物」は、対象が発症している又は発症し得る特定の疾患又は状態を予防、処置又は制御するために、対象、例えば哺乳動物、例えばヒトに投与される治療剤を任意選択的に１つ又は複数の薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤及び／又は担体と組み合わせて含む混合物を指す。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容され得る」は、理想的な利益／リスク比に見合う、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応及び／又は他の問題の合併症を有さない、対象、例えば哺乳動物（例えば、ヒト）の組織との接触に好適な化合物、材料、組成物及び／又は剤形を指す。
【０１１６】
本明細書で使用する場合、用語「野生型」は、所定の生物における特定の遺伝子に関して最高頻度を有する遺伝子型を指す。
【０１１７】
本明細書で使用する用語「１つの細胞分裂遺伝子座」、「複数の細胞分裂遺伝子座」及び「ＣＤＬ」は、ゲノム遺伝子座であって、その転写産物は、分裂細胞によって発現される、ゲノム遺伝子座を指す。ＣＤＬが単一遺伝子座を含むとき、細胞（又はその誘導体）におけるＣＤＬ発現の非存在は、細胞がＣＤＬ発現の非存在下でアブレートされるか、又は細胞の増殖がＣＤＬ発現の非存在下で阻止若しくは障害されるかのいずれかであるため、腫瘍開始及び／又は形成が妨げられることを意味する。ＣＤＬが複数の遺伝子座を含む場合、細胞（又はその誘導体）における遺伝子座の全部又はサブセットによる発現の非存在は、細胞がＣＤＬ発現の非存在下でアブレートされるか、又は細胞の増殖がＣＤＬ発現の非存在下で阻止若しくは障害されるかのいずれかであるため、腫瘍開始及び／又は形成が妨げられることを意味する。ＣＤＬは、非分裂及び／又は非増殖細胞において発現されても発現されなくてもよい。ＣＤＬは、宿主細胞に対して内在性であるか、又はトランスジーンであり得る。ＣＤＬがトランスジーンである場合、これは、宿主細胞と同じ若しくは異なる種に由来するものであるか、又は合成起源のものであり得る。一実施形態では、ＣＤＬは、細胞分裂中に転写される単一遺伝子座である。例えば、一実施形態では、単一遺伝子座ＣＤＬは、ＣＤＫ１である。一実施形態では、ＣＤＬは、細胞分裂中に転写される２つ以上の遺伝子座を含む。例えば、一実施形態では、多遺伝子座ＣＤＬは、２つのＭＹＣ遺伝子（ｃ−Ｍｙｃ及びＮ−ｍｙｃ）を含む（Ｓｃｏｇｎａｍｉｇｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。一実施形態では、多遺伝子座ＣＤＬは、ＡＵＲＯＲＡ  Ｂ及びＣキナーゼを含み、これらは重複する機能を有し得る（Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｍｉｒａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。細胞分裂及び細胞増殖は、本明細書では置き換え可能に使用され得る用語である。
【０１１８】
本明細書で使用する用語「細胞分裂の正常速度」、「正常な細胞分裂速度」、「細胞増殖の正常速度」及び「正常な細胞増殖速度」は、非癌性の健全な細胞に典型的な細胞分裂及び／又は増殖の速度を指す。細胞分裂及び／又は増殖の正常速度は、細胞型に特有であり得る。例えば、表皮、腸、肺、血液、骨髄、胸腺、精巣、子宮及び乳腺の細胞数は、高速度の細胞分裂及び高速度の細胞死によって維持されることが広く認められている。対照的に、膵臓、腎臓、角膜、前立腺、骨、心臓及び脳の細胞数は、低速度の細胞分裂及び低速度の細胞死によって維持される（Ｐｅｌｌｅｔｔｉｅｒｉ  ａｎｄ  Ｓａｎｃｈｅｚ  Ａｌｖａｒａｄｏ，２００７）。
【０１１９】
本明細書で使用する用語「誘導性陰性増殖エフェクタ」及び「ｉＮＥＰ」は、ｉ）ＣＤＬ発現を誘導により停止又は阻止し、これによって細胞分裂及び増殖を妨げるか、ｉｉ）ＣＤＬ発現細胞を誘導によりアブレートする（すなわち増殖細胞の少なくとも一部を殺傷する）か、又はｉｉｉ）細胞分裂の速度が腫瘍形成に寄与する上で十分速くならないように、細胞の正常細胞分裂速度に対して細胞分裂の速度を遅くすることにより、細胞分裂及び／又は増殖を制御する目的で、ＣＤＬ発現の使用を促進する遺伝子修飾を指す。
【０１２０】
本明細書で使用する用語「アブレーションリンク」及び「ＡＬＩＮＫ」は、ＣＤＬと、陰性選択マーカをコードする配列との間に転写リンクを含むｉＮＥＰの一例を指す。ＡＬＩＮＫ修飾により、ユーザは、ＡＬＩＮＫ修飾細胞を陰性選択マーカの誘導物質に曝露することにより、ＡＬＩＮＫを含む増殖宿主細胞を誘導的に殺傷するか、又は増殖細胞の少なくとも一部を殺傷することにより、宿主細胞の増殖を阻害することが可能になる。例えば、増殖細胞の少なくとも一部を殺傷することによって増殖細胞をアブレートするか又は細胞増殖を阻害するために、ＣＤＬにＡＬＩＮＫを含むように修飾された細胞を陰性選択マーカの誘導物質（例えば、プロドラッグ）で処理し得る。
【０１２１】
本明細書で使用する用語「ＣＤＬの調節の外性活性化因子」及び「ＥＡＲＣ」は、活性化因子を介した非コード若しくはコードＤＮＡ転写又は対応する翻訳の外因性改変を促進する機構又は体系を含むｉＮＥＰの一例を指す。ＥＡＲＣ修飾により、ユーザは、ＥＡＲＣ修飾細胞から、ＥＡＲＣ修飾ＣＤＬの転写及び／又は翻訳を可能にする誘導物質を除去することにより、ＥＡＲＣを含む細胞の分裂を停止又は阻害することが可能になる。例えば、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系をＣＤＬに作動可能に連結させて、ＣＤＬの発現又はＣＤＬ翻訳を外因的に制御するために使用することができ、これによりＣＤＬ転写及び／又は翻訳に薬物誘導性活性化因子及び対応する誘導薬の存在が必要となる。誘導薬の非存在下では、細胞分裂及び／又は増殖は、停止又は阻害される（例えば、正常細胞分裂速度まで減速される）であろう。例えば、ＣＤＬ  Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１の発現並びに細胞分裂及び増殖が誘導物質（例えば、ドキシサイクリン）の存在下でのみ可能となるように、ＣＤＬ  Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１を修飾してｄｏｘ−架橋を含有させ得る。
【０１２２】
本明細書で使用する用語「増殖アンタゴニスト系」は、その存在が細胞の増殖を（完全又は部分的に）阻害する天然又は操作された化合物を指す。
【０１２３】
本明細書で使用する用語「ｄｏｘ−架橋」は、内在性又は外性プロモータによってｒｔＴＡを発現し（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、標的領域の転写をＴＲＥの制御下とすることにより、プロモータの活性を標的転写領域から分離する機構を指す。本明細書で使用する場合、「ｒｔＴＡ」は、テトラサイクリン誘導システムの逆テトラサイクリントランス活性化因子を指し（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、「ＴＲＥ」は、最小プロモータの上流のＴｅｔＯオペレーター配列からなるプロモータを指す。ドキシサイクリンの存在下でｒｔＴＡがＴＲＥプロモータに結合すると、ＴＲＥプロモータの下流の遺伝子座の転写が増加する。標的領域の転写発現の許容状態又は非許容状態がドキシサイクリンによって制御されている限り、ｒｔＴＡ配列は、ＣＤＬと同じ転写ユニット又はゲノムの異なる場所に挿入され得る。ｄｏｘ−架橋は、ＥＡＲＣの一例である。
【０１２４】
本明細書で使用する場合、用語「フェイルセーフ細胞」は、１つ以上のＣＤＬ（例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ又は５つ）に１つ以上の同型接合性、異型接合性、半接合性又は複合異型接合性ＡＬＩＮＫ又はＥＡＲＣを含む細胞を指す。フェイルセーフ細胞は、ＡＬＩＮＫ若しくはＥＡＲＣのいずれか又はＡＬＩＮＫ及びＥＡＲＣの両方の修飾（例えば、異なるＣＤＬ又は単一ＣＤＬにおけるＡＬＩＮＫ及びＥＡＲＣ修飾）を含み得る。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、用語「フェイルセーフ」は、制御されない（例えば、腫瘍形成性）増殖を示す可能性が低い細胞の特性を指す。細胞増殖が負のレギュレータ又は誘導物質の制御下にあり、遺伝子変異により増殖を制御するシステムの活性を失う可能性が低い場合、細胞は、「フェイルセーフ」と見なされ得る。フェイルセーフ体積は、ＡＬＩＮＫの数と、ＡＬＩＮＫを標的とするＣＤＬの数とに依存する（例えば、２つの異なるＣＤＬの同型接合性修飾を有する細胞は、単一ＣＤＬの異型接合性修飾を有する細胞よりも大きいフェイルセーフ体積を有する（例えば、遺伝子変異を介して増殖を制御するシステムの全てを失う可能性は、より低い）。フェイルセーフ特性は、表３にさらに記載される。
【０１２６】
本特許又は特許出願ファイルは、少なくとも１つの有色の図面を含む。有色図面を有する本特許又は特許出願公開の複製は、請求及び必要な料金の支払い後に事務所により提供される。
【０１２７】
本開示のこれら及び他の特徴は、添付の図面が参照される以下の詳細な説明においてより明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１Ａ−Ｄ】免疫組織化学的検査を用いた、Ｃ５７ＢＬ／６マウス胚幹細胞株Ｃ２におけるクローキングタンパク質（Ｃｄ２００（図１Ａ）、ＦａｓＬ（図１Ｂ）、Ｈ２−Ｍ３（図１Ｃ）及びＣｄ４７（図１Ｄ））の発現を示す代表図を示す。
【図２Ａ−Ｅ】混合リンパ球反応における、脾細胞（図２Ａ）、ｗｔ  Ｂ１６黒色腫細胞（図２Ｂ）、クロークされたＢ１６黒色腫細胞（図２Ｃ）、ｗｔ  ＥＳ細胞（図２Ｄ）及びクロークされたＥＳ細胞（図２Ｅ）を使用したＴ細胞活性化を示すフローサイトメトリープロットである。
【図３Ａ−Ｂ】同種モデルにおけるクロークされた（図３Ｂ）Ｂ１６Ｆ１０癌細胞がそれらのＷＴ対応物（図３Ａ）と比較して拒絶から保護されることを示す概略図及び画像である。Ｃ５７ＢＬ／６（ｎ＝５）における非クローク細胞及びＦＶＢ／Ｎ（ｎ＝４）における非クローク細胞（図３Ａ）；Ｃ５７ＢＬ／６（ｎ＝５）におけるクローク細胞並びにＦＶＢ／Ｎ（ｎ＝６）におけるクローク細胞（図３Ｂ）の代表的な画像。
【図４】クロークされた胚幹細胞が同系Ｂ６マウスレシピエント（上部パネル）及びＦＶＢ同種レシピエント（下部パネル）において腫瘍を形成することを示す概略図である。
【図５Ａ−Ｃ】クロークＣ５７ＢＬ／６  ＥＳ細胞の皮下注入により形成された奇形腫を有する同種マウスを示す一連の写真である。赤色矢印は、奇形腫を示す。図５Ａは、Ｃ３Ｈマウスにおける奇形腫を示し、図５Ｂは、ＦＶＢ／Ｎマウスにおける奇形腫を示し、図５Ｃは、ＣＤ１マウスにおける奇形腫を示す。
【図６】クローク組織を有する動物が免疫を損なわれていないことを示す概略的な一連の画像である。
【図７】クローク細胞を有する動物が免疫を損なわれていないことを示す、さらなる結果を示すＦＶＢ／Ｎマウスの一連の画像である。
【図８Ａ−Ｃ】Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の胚幹細胞を含有するクローンフェイルセーフにおけるトランスジーン発現を示す。図８Ａは、ＦａｓＬ発現を示し、図８Ｂは、Ｃｃｌ２１ｂ発現を示し、図８Ｃは、Ｃｄ２００発現を示す。
【図８Ｄ−Ｆ】Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の胚幹細胞を含有するクローンフェイルセーフにおけるトランスジーン発現を示す。図８Ｄは、Ｃｄ４７発現を示し、図８Ｅは、Ｍｆｇｅ８発現を示し、図８Ｆは、Ｓｐｉ６発現を示す。
【図８Ｇ−Ｈ】Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の胚幹細胞を含有するクローンフェイルセーフにおけるトランスジーン発現を示す。図８Ｇは、Ｈ２−Ｍ３発現を示し、図８Ｈは、ＰＤ−Ｌ１発現を示す。
【図９】ＥＳ細胞クローンにおけるクローキングトランスジーン発現を示す一連のグラフである。各クローキングトランスジーンは、異なる色で示される。同心円は、ｌｏｇ１０スケールでの発現レベルを表す。太い黒丸は、陽性対照（マウスリンパ器官から単離された活性化白血球）に正規化された１×発現を表し、次の外側リングは、それぞれ陽性対照と比較した１０×及び１００×発現を表す。最も内側のリングは、陽性対照と比較した０．１×発現である。クローンＮＴ２及び１５（赤の四角形で示す）は、クローキング遺伝子の最も高い発現を有した。これらのクローンは、同種宿主中で生存した。
【図１０】ＥＳ細胞の全ゲノムに関する全ゲノム遺伝子発現レベル分布間でのクローキングトランスジーンの発現を示すグラフである。ＮＴ２細胞株及びＮＴ２由来奇形腫における８個のクローキングトランスジーンの全ては、ＥＳ細胞ゲノムにおける全ての遺伝子の上位５％にある発現レベルを有し、クローキングトランスジーンの５個は、ＥＳ細胞ゲノムにおける全ての遺伝子の上位１％の発現レベルを有する。ＮＴ２細胞株及びＮＴ２由来奇形腫におけるトランスジーンの発現レベルは、同種移植片耐性の達成に成功した。
【図１１Ａ−Ｂ】ＦＶＢ／ＮマウスにおけるＣ５７ＢＬ／６由来奇形腫を示す写真である。遺伝子導入系、ＮＴ２は、１０個の注入部位のうちの９個の奇形腫をもたらした。画像は、注入から３か月後に撮影した。図１１Ｂは、図１１Ａにおいて矢印で示される奇形腫の拡大図である。
【図１２Ａ−Ｂ】ガンシクロビルで処置された、同系（図１２Ａ）及び同種（図１２Ｂ）マウスにおける奇形腫腫瘍のサイズを示すグラフである。
【図１３Ａ−Ｂ】同系（図１３Ａ）及び同種（図１３Ｂ）宿主の両方に注入されたクローク胚幹細胞が３つ全ての細胞系統に分化できることを示す一連の顕微鏡写真である。
【図１４Ａ−Ｄ】クロークＥＳ細胞のマウスへの皮下注入により形成された奇形腫における３つ全ての胚葉の形成を示す顕微鏡写真である。図１４Ａ、図１４Ｂ及び図１４Ｃは、３つの胚葉を示す（ｅｃ＝外胚葉、図１４Ａに示す；ｅｎ＝内胚葉、図１４Ｃに示す；ｍｅ＝中胚葉、図１４Ｂに示す）。図１４Ｄは、赤色矢印により示される血管を示し、組織がよく血管形成されていることを確認する。
【図１５】アロ耐性に不可欠な標的遺伝子を発現するベクターの構築を示す概略図である。
【図１６Ａ−Ｈ】ＥＳ細胞における、クローキングトランスジーンでコードされたタンパク質の発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図１６Ａは、ＰＤ−Ｌ１の発現を示し、図１６Ｂは、ＣＤ２００の発現を示し、図１６Ｃは、ＣＤ４７の発現を示し、図１６Ｄは、ＦａｓＬの発現を示し、図１６Ｅは、Ｈ２−Ｍ３の発現を示し、図１６Ｆは、Ｃｃｌ２１の発現を示し、図１６Ｇは、Ｍｆｇｅ８の発現を示し、図１６Ｈは、Ｓｐｉ６の発現を示す。
【図１７Ａ−Ｂ】クロークＥＳ細胞が典型的なＥＳ細胞形態を有し（図１７Ａ）、ＥＳ細胞マーカアルカリホスファターゼを発現する（図１７Ｂ）ことを示す顕微鏡写真である。
【図１８Ａ−Ｂ】クロークＥＳ細胞における多能性ＥＳ細胞（Ｏｃｔ４（図１８Ａ）及びＳＳＥＡ１（図１８Ｂ））のマーカの発現を示す蛍光顕微鏡写真である。図１８Ａ〜１８Ｂの挿入画像は、ＥＳ細胞マーカ（Ｏｃｔ４及びＳＳＥＡ）及びＤＡＰＩに関する蛍光顕微鏡写真の単一チャネル画像を示し、ＤＡＰＩは、核を標識して、ＥＳ細胞マーカに関する染色がクローク細胞と共局在することを示す。
【図１９】クローキングトランスジーンによって阻害される免疫プロセス（上）及びＥＳ細胞内でクローキングトランスジーンの発現に用いられる発現カセット（下）を示す概略図である。
【図２０】ＥＳ細胞におけるＭＨＣレベルに対するインターフェロンγ（ＩＦＮγ）の効果を示す一連のグラフである。ＩＦＮγは、野生型ＥＳ細胞及び野生型ＩＦＮγ受容体ＩＦＮγＲ１を過剰発現しているＥＳ細胞におけるＭＨＣレベルを増大させたが、ＩＦＮγ受容体のドミナントネガティブ型（ＩＦＮγＲ１  ｄ３９）を過剰発現しているＥＳ細胞におけるＭＨＣレベルを増大させず、ＩＦＮγＲ１  ｄ３９がＥＳ細胞におけるＭＨＣのＩＦＮγ媒介アップレギュレーションを完全に阻害したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１２９】
細胞及び方法の説明
例えば、細胞が同種宿主に移植される場合に遺伝子修飾細胞などのツール及び細胞を使用して移植部位で局所免疫抑制を提供するための方法が特徴とされる。遺伝子修飾細胞は、トランスジーンの１つ又はセットを含み、各トランスジーンは、細胞質性、膜結合性又は局所作用性である遺伝子産物であって、その機能は、宿主免疫系の機能（例えば、移植片攻撃白血球及びＮＫ細胞活性化）を緩和すること、又は白血球攻撃に対する防御機構として作用することである、遺伝子産物をコードする。
【０１３０】
種々の細胞質性、膜結合性又は局所作用性免疫因子は、局所免疫区画及び局所免疫集団を調節することが見出されている。ＰＤ−Ｌ１（Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−６６（２００３：Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．９：５６２−７（２００３）；Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ．８：７９３−８００（２００２））、ＣＤ４７（（Ｗｉｌｌｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１０９：６６６２−７（２０１２）；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．１０：ｅ０１３７３４５（２０１５）；Ｄｅｍｅｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２１９３−９（２０００））、ＣＤ２００（Ｊｅｎｍａｌｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７６：１９１−９（２００６）；Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７４：１３４８−５６（２００５）；Ｋｒｅｔｚ−Ｒｏｍｍｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８：５５９５−６０５（２００７））、ＦａｓＬ（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１８４：１０７５−８２（１９９６）；Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．３７３：４４４−８（１９９５）；Ｍａｚａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８４：２２０２２−８（２００９））及びＳｐｉ６（Ｍｅｄｅｍａ  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ．９８：１１５１５−２０（２００１）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２４：４５１−６１（２００６）；Ｓｏｒｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ．７７：３８−４５（２０１２））のような免疫因子は、免疫調節におけるそれらの役割を含めて、記載されている非常に多くのものの中にある。本発明者らは、同種細胞におけるこれらの免疫調節因子の１つ又は複数の発現を使用して、細胞が投与される宿主において局所免疫抑制を提供し、且つ／又は同種拒絶を減少させ得ることを発見した。
【０１３１】
本発明者らは、細胞又は細胞集団に導入された特異的免疫調節因子の使用によって同種細胞を修飾した。修飾された細胞は、多くの異なる局所免疫経路の同時調節を介して免疫拒絶を回避する。このような遺伝子操作された細胞は、遺伝的バックグラウンドにかかわらず、レシピエントの免疫系による拒絶なしに多くのレシピエントに「既製」で移植され得る。この免疫調節アプローチは、レシピエントにとって危険であり得る移植レシピエントの全身的免疫抑制の必要性を克服する。従って、免疫抑制剤は、本明細書に記載される修飾細胞を受容する患者に投与され得るが、この治療は、免疫抑制剤の投与を含む必要はない。この免疫調節アプローチは、患者特異的なｉＰＳ細胞を誘導するか、調節細胞を操作するか、又は造血細胞移植（ＨＣＴ）を介してキメラを誘導する費用がかかり、非実用的な方法論も克服する。
【０１３２】
細胞は、トランスジーンのセットを発現するように遺伝子修飾され得、このトランスジーンは、細胞質性、膜結合性又は局所的に作用する遺伝子産物であって、、その機能は、宿主免疫系の機能（例えば、移植片攻撃白血球及びＮＫ細胞活性化）を緩和すること、又は免疫応答（例えば、白血球攻撃）に対する防御機構として作用することである、遺伝子産物をコードする。トランスジーンのセットは、上述した遺伝子調節経路において役割を有する遺伝子から選択され得る。このような遺伝子は、表１に提供されるものを含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
【表１】
2020523037.tif 000003
【０１３４】
Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド２１（Ｃｃｌ２１）は、局所リンパ節によって発現され、ここで、Ｃｃ１２１は、活性化された抗原提示細胞（ＡＰＣ）を誘引するように作用する。この重要な機能は、移植細胞上でこの遺伝子を過剰発現することによってＡＰＣの移動を「逆転」させる機会を提供する。実際、いくつかの黒色腫は、Ｃｃｌ２１を発現し、ＣＣＲ７＋細胞を動員し、次いでそれらの腫瘍間質の部分を「自己」として再編成することができる。これは、Ｃｄ４＋  Ｔｒｅｇの動員及び維持を指示する間質再構築を導く（Ｚｉｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２８：６９７−８（２０１０））。実際、腫瘍上のＣｃｌ２１の発現は、同系同種移植片設定における拒絶から、同時移植されたＣｃｌ２１欠損腫瘍細胞を保護し得る（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３２８：７４９−５２（２０１０））。Ｃｃｌ２１ｂは、ヒトＣｃｌ２１のマウスのオルソログである。
【０１３５】
マウス及びヒトＣｃｌ２１のアミノ酸配列は、以下の通りである。
マウスＣｃｌ２１
【化１】
2020523037.tif 000004
ヒトＣｃｌ２１
【化２】
2020523037.tif 000005
【０１３６】
臍帯におけるＣｄ４７の発現は、反応性低下Ｔ細胞の発達を促進し得る（Ａｖｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２４５９−６８（２００１））。赤血球もＣｄ４７をアップレギュレートして、それらの「自己」提示の欠如に起因して樹状細胞の活性化を回避する（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．４３：６２２−４（２０１５））。より最近になって、ヒトＣｄ４７の発現の増大は、マウスモデルにおいて、豚からヒトへの造血細胞移植における生着を増加させることが示された（Ｔｅｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１４：２７１３−２２（２０１４））。
【０１３７】
マウス及びヒトＣｄ４７のアミノ酸配列は、以下の通りである。
マウスＣｄ４７
【化３】
2020523037.tif 000006
ヒトＣｄ４７
【化４】
2020523037.tif 000007
【０１３８】
Ｃｄ２００も重要な免疫調節（性）分子であり、その発現の増大は、同種移植片拒絶、自己免疫及びアレルギー性疾患の重篤性を低減することができる（Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７２：７７４４−９（２００４））。インビトロで、Ｃｄ２００のＡＰＣ発現は、活性化Ｃｄ８＋  Ｔ細胞によるインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）及び細胞溶解顆粒の産生を抑制することが示されている（Ｍｉｓｓｔｅａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．８６：６２４６−５７（２０１２））。最も興味深いことに、Ｃｄ２００の過剰発現は、Ｆｏｘｐ３＋  Ｔｒｅｇ細胞の促進により、マウスにおいて皮膚及び心臓同種移植片の生存を増大させる（Ｇｏｒｃｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．９８：１２７１−８（２０１４））。
【０１３９】
マウス及びヒトＣｄ２００のアミノ酸配列は、以下の通りである。
マウスＣｄ２００
【化５】
2020523037.tif 000008
ヒトＣｄ２００
【化６】
2020523037.tif 000009
【０１４０】
Ｓｐｉ６は、活性化Ｃｄ８＋  Ｔ細胞によって放出される細胞傷害性エフェクタ分子グランザイムＢの内在性阻害剤である（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７２：１５４３４−４１（１９９７））。いくつかのデータは、間葉（系）幹細胞（ＭＳＣ）がこの分子をアップレギュレートすることによって免疫拒絶から逃れることを示している（Ｅｌ  Ｈａｄｄａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．１１７：１１７６−８３（２０１１））。樹状細胞が、それら自体が接触媒介による細胞傷害性を介して殺滅されずに細胞傷害性Ｔ細胞に抗原を提示する能力は、Ｓｐｉ６により媒介されることが最近証明されている（Ｌｏｖｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８８：１０５７−６３（２０１２））。Ｓｐｉ６は、Ｓｅｒｐｉｎ  Ｂ９としても知られている。
【０１４１】
マウスＳｐｉ６及びヒト対応物Ｓｅｒｐｉｎ  Ｂ９のアミノ酸配列は、以下の通りである。
マウスＳｐｉ６
【化７】
2020523037.tif 000010
ヒトＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９
【化８】
2020523037.tif 000011
【０１４２】
活性化された細胞障害性Ｃｄ８＋は、ＦａｓＬの発現によって標的細胞を殺滅することができ、ＦａｓＬは、ＦＡＳ受容体に結合し、標的細胞においてカスパーゼ媒介アポトーシスを活性化する。しかしながら、多くの腫瘍は、それらの表面上にＦａｓＬをアップレギュレートすることにより、「反撃」を発達させた（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：１１８３−９１（２００３））。ヒト及びマウス固形癌の脈管構造におけるＦａｓＬの選択的発現は、稀なＣｄ８＋  Ｔ細胞浸潤及びＦｏｘＰ３＋  Ｔｒｅｇ細胞の優勢に関連している（Ｍｏｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ．２０：６０７−１５（２０１４））。ごく最近になって、Ｂリンパ球も、免疫応答のエフェクタ段階において、ＦａｓＬの発現を用いてＴヘルパー細胞を殺滅することが示された（Ｌｕｎｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：１２２（２０１５））。ＦａｓＬは、ヒトＦＡＳＬＧのマウスのオルソログである。
【０１４３】
マウスＦａｓＬ及びヒト対応物ＦＡＳＬＧのアミノ酸配列は、以下の通りである。
マウスＦａｓＬ
【化９】
2020523037.tif 000012
ヒトＦＡＳＬＧ
【化１０】
2020523037.tif 000013
【０１４４】
ＰＤ−Ｌ１は、プログラム細胞死（ＰＤ−１）に結合する重要な免疫調節分子である。ＰＤ−１は、Ｔ細胞上に発現し、ＰＤ−Ｌ１に結合してＴ細胞アネルギーをもたらす（ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２６：１６７１−５（１９８１））。
【０１４５】
マウス及びヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列は、以下の通りである。
マウスＰＤ−Ｌ１
【化１１】
2020523037.tif 000014
ヒトＰＤＬ１（ＣＤ２７４）
【化１２】
2020523037.tif 000015
【０１４６】
同種移植片により誘導されるもののような炎症性環境は、多数の他の自然免疫細胞の中でも、マクロファージ及び炎症性単球を誘引する。乳脂肪球上皮増殖因子８（Ｍｆｇｅ−８）は、多数のマウス腫瘍により発現され（Ｎｅｕｔｚｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６７：６７７７−８５（２００７））、単球を抑制性のＭ２様マクロファージに極性化することにより、局所免疫抑制に寄与することが示されている（Ｓｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２８９：２４５６０−７２（２０１４））。
【０１４７】
マウス及びヒトＭＦＧＥ−８のアミノ酸配列は、以下の通りである。
マウスＭＦＧＥ８
【化１３】
2020523037.tif 000016
ヒトＭＦＧＥ８
【化１４】
2020523037.tif 000017
【０１４８】
ＮＫ細胞の強力な殺滅の潜在性も移植片拒絶において非常に重要である。ＮＫ細胞は、ＭＨＣクラスＩ分子を欠いた標的細胞及び炎症性設定における他の細胞を殺滅し得る。ヒトＨＬＡ−ＧのマウスホモログであるＨ２−Ｍ３は、ＮＫ細胞に対する調節効果を有することが最近示されており、「自己分子」を欠く細胞を無視することが許諾されている（Ａｎｄｒｅｗｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：１１７１−７（２０１２））。これは、ＮＫ及びＴ細胞の両方上の免疫抑制性受容体、ＨＬＡ−Ｇの結合により達成されると考えられる（Ｃａｒｏｓｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７：３３−１４４（２０１５））。Ｈ２−Ｍ３は、ヒトＨＬＡ−Ｇのマウスのオルソログである。
【０１４９】
マウスＨ２−Ｍ３及びヒト対応物ＨＬＡ−Ｇのアミノ酸配列は、以下の通りである。
マウスＨ２−Ｍ３
【化１５】
2020523037.tif 000018
ヒトＨＬＡ−Ｇ
【化１６】
2020523037.tif 000019
【０１５０】
ＰＤ−Ｌ１、Ｈ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｐｉ６Ａの１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を含むトランスジーンのセットが細胞内で発現され得る。細胞は、例えば、幹細胞又は治療法に使用でき、且つ／又は治療細胞型に分化できる細胞など、ゲノム編集に従う細胞であり得る。幹細胞は、例えば、胚幹（ＥＳ）細胞又は誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞であり得る。トランスジーンのセットは、これらの遺伝子の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ若しくは８つ全てを含み得るか、又はこれらの遺伝子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つを含み得る。細胞は、ＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１及び／又はＩＦＮγＲ１  ｄ３９の１つ又は複数を発現するようにさらに遺伝子修飾され得る。ＴＧＦ−βトランスジーンは、当業者に公知の方法を用いて、遺伝子産物を膜結合形態で発現するように（即ち遺伝子産物が同種移植片の細胞表面上に発現されるように）修飾され得る。例えば、ＴＧＦ−βを膜に局在化させる方法は、ＬＲＲＣ３２タンパク質又は細胞膜へのＴＧＦ−βの局在化をもたらす任意の他のポリペプチドをコードする追加のトランスジーンと共にＴＧＦ−βを同時発現させることである。このタンパク質は、ＴＧＦ−βを膜に固定する。（Ｔｒａｎ  ＤＱ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１０６：１３４４５−５０（２００９））。
【０１５１】
ＩＦＮγＲ１  ｄ３９のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【化１７】
2020523037.tif 000020
【０１５２】
遺伝子は、ヒト遺伝子又はマウス遺伝子であり得る。実施形態では、遺伝子は、細胞が移植される同種移植片レシピエントのレシピエントと同じ種のものである。実施形態では、遺伝子は、遺伝子の機能が保存されているか、又は設計された生物学的物質が内在性対応物のアゴニスト機能を有する任意の種のものである。これらのトランスジーンを細胞に導入し、発現させるための方法は、本明細書に記載されており、当業者にも知られている。これらのトランスジーンを発現する細胞は、全身的な免疫抑制なしに及び免疫抑制薬の必要なしに同種拒絶を回避する能力のため、「クロークされた」と称され得る。
【０１５３】
上記のクローク細胞に由来する細胞の集団は、同種レシピエントの移植部位に移植された場合、局所免疫抑制を生成するためにも使用され得ることが本明細書で意図される。
【０１５４】
本開示のクローク細胞を生成する前又は後、細胞は、最初に、フェイルセーフ細胞であるように修飾され得る。フェイルセーフ細胞は、動物細胞における細胞増殖を制御するために細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）を使用する。ＣＤＬは、本明細書に提供されるように、遺伝子座であって、その転写産物は、細胞分裂中に発現される、遺伝子座である。ＣＤＬは、本明細書に記載されるように、陰性選択マーカ及び／又は誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含むように遺伝子修飾され得、これは、ユーザが適切な誘導物質を添加又は除去することにより、遺伝子修飾細胞の増殖を可能にし、アブレートし、且つ／又は阻害することを可能にする。フェイルセーフ細胞を作製及び使用するための方法は、例えば、国際公開第２０１６／１４１４８０号パンフレットに記載されており、その全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。細胞は、最初にフェイルセーフにされ、その後、クロークされ得る。代わりに、細胞は、最初にクロークされ、その後、フェイルセーフにされ得る。
【０１５５】
細胞は、脊椎動物細胞、例えばヒト細胞又はマウス細胞などの哺乳動物細胞であり得る。細胞は、脊椎動物幹細胞、例えばヒト幹細胞又はマウス幹細胞のような哺乳動物幹細胞でもあり得る。好ましくは、細胞又は幹細胞が遺伝的修飾を受けやすい。好ましくは、細胞又は幹細胞は、遺伝子修飾を受けやすい。好ましくは、細胞又は幹細胞は、ユーザによって治療的価値を有すると見なされ、これは、細胞又は幹細胞が、疾患、障害、欠損又は損傷の処置を、それを必要とする対象において行うために使用され得ることを意味する。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、細胞は、幹細胞又は前駆細胞（例えば、ｉＰＳＣ、胚幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞若しくは前駆細胞、生殖幹細胞、肺幹細胞若しくは前駆細胞、乳房幹細胞、嗅覚成体幹細胞、毛包幹細胞、複多能性幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞又は神経幹細胞若しくは前駆細胞）である。いくつかの実施形態では、幹細胞は、成体幹細胞（例えば、体性幹細胞又は組織特異的幹細胞）である。いくつかの実施形態では、幹細胞又は前駆細胞は、分化することができる（例えば、幹細胞は、全能性、多能性又は複能性である）。いくつかの実施形態では、細胞は、胚又は新生児組織から単離される。いくつかの実施形態では、細胞は、線維芽細胞、単球前駆細胞、Ｂ細胞、外分泌細胞、膵臓前駆細胞、内分泌前駆細胞、肝芽細胞、筋芽細胞、前脂肪細胞、前駆細胞、肝細胞、軟骨細胞、平滑筋細胞、Ｋ５６２ヒト赤血球系白血病細胞株、骨細胞、滑膜細胞、腱細胞、靭帯細胞、半月板細胞、脂肪細胞、樹状細胞又はナチュラルキラー細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、筋細胞、赤血球巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、島β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞又は褐色脂肪細胞に操作される（例えば、変換又は分化される）。いくつかの実施形態では、細胞は、筋細胞（例えば、骨格、平滑又は心筋細胞）、赤血球巨核球細胞、好酸球、ｉＰＳ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞、島β細胞、ニューロン、心筋細胞、血液細胞（例えば、赤血球、白血球又は血小板）、内分泌前駆細胞、外分泌前駆細胞、管細胞、腺房細胞、α細胞、β細胞、δ細胞、ＰＰ細胞、肝細胞、胆管細胞又は白色若しくは褐色脂肪細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ホルモン分泌細胞（例えば、インスリン、オキシトシン、エンドルフィン、バソプレシン、セロトニン、ソマトスタチン、ガストリン、セクレチン、グルカゴン、甲状腺ホルモン、ボンベシン、コレシストキニン、テストステロン、エストロゲン又はプロゲステロン、レニン、グレリン、アミリン又は膵臓ポリペプチドを分泌する細胞）、表皮角化細胞、上皮細胞（例えば、外分泌上皮細胞、甲状腺上皮細胞、角化上皮細胞、胆嚢上皮細胞又は角膜、舌、口腔、食道、肛門管、遠位尿道若しくは膣の表面上皮細胞）、腎細胞、生殖細胞、骨格関節滑膜細胞、骨膜細胞、骨細胞（例えば、破骨細胞又は骨芽細胞）、軟骨膜細胞（例えば、軟骨芽細胞又は軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ））、軟骨（ｃａｒｔｉｌａｇｅ）細胞（例えば、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ））、線維芽細胞、内皮細胞、心膜細胞、髄膜細胞、ケラチノサイト前駆細胞、ケラチノサイト幹細胞、周皮細胞、グリア細胞、上衣細胞、羊膜若しくは胎盤膜から単離された細胞又は漿膜細胞（例えば、体腔を裏打ちする漿膜細胞）である。いくつかの実施形態では、細胞は、体細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、皮膚又は他の器官、例えば、心臓、脳又は脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、腸又は胃に由来する。細胞は、ヒト又は他の哺乳動物（例えば、げっ歯類、非��ト霊長類、ウシ又はブタ細胞）に由来し得る。本明細書では、クローク細胞は、局所的な移植部位での同種拒絶を回避することが望ましい場合がある、細胞に基づく治療において有用であり得ることが企図される。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のクローク細胞は、宿主免疫応答を１週間以上（例えば、１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年、４年、５年以上、例えば細胞及び／又はその子孫の寿命にわたって）刺激することなく宿主中で生存する。細胞は、宿主中で生存する限りクローキングトランスジーンの発現を維持する（例えば、クローキングトランスジーンがもはや発現されない場合、クローク細胞は、宿主の免疫系によって除去され得る）。いくつかの実施形態では、クローク細胞は、クローク細胞がインビボで検出されることを可能にするタンパク質（例えば、ＧＦＰ又は他の検出可能なマーカのような蛍光タンパク質）をコードするトランスジーンをさらに発現する。
【０１５８】
クローク細胞とフェイルセーフ細胞との組み合わせは、細胞を宿主に移植する前又は後にそのような細胞が生成されるかどうかにかかわらず、望ましくない増殖速度を示す細胞を排除することができる一方、局所移植部位での同種拒絶を回避することが望ましい場合がある、細胞に基づく治療において有用であり得ることが本明細書で企図される。クローキング技術とフェイルセーフ技術の組み合わせは、細胞が局所免疫抑制を提供しているため、レシピエントが悪性腫瘍を発症する危険性に対処しながら、局所免疫防御を可能にする。
【０１５９】
クローク細胞の製造方法
本明細書に記載される組成物及び方法は、クローキングトランスジーンの発現を介して同種細胞の拒絶を減少させるために使用され得る。哺乳動物細胞へのタンパク質の送達のため及び哺乳動物細胞におけるタンパク質をコードする遺伝子の安定な発現のために広範な方法が確立されており、これは、本明細書に記載されるクローク細胞を産生するために使用され得る。
【０１６０】
クローキングタンパク質又は治療剤をコードするポリヌクレオチド
哺乳動物細胞におけるクローキングタンパク質又は治療剤の治療的に有効な発現を達成するために使用され得る１つのプラットフォームは、クローキングタンパク質又は治療剤をコードする遺伝子の安定な発現を介する（例えば、哺乳動物細胞の核又はミトコンドリアゲノムへの組み込みにより又は哺乳動物細胞の核におけるエピソームコンカテマー形成により）。遺伝子は、対応するタンパク質の一次アミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである。哺乳動物細胞に外性遺伝子を導入するために、遺伝子をベクターに組み込むことができる。ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、直接取り込み、発射体衝撃を含む種々の方法により及びリポソーム中のベクターの封入により、細胞に導入され得る。細胞をトランスフェクト又は形質転換する適切な方法の例は、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、感染、リポフェクション及び直接取り込みを含む。このような方法は、例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２０１４）；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ２０１５）により詳細に記載されており、これらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６１】
クローキングタンパク質又は治療剤は、クローキングタンパク質又は治療剤をコードする遺伝子の部分を含有するベクターを細胞膜リン脂質に標的化することによっても哺乳動物細胞に導入され得る。例えば、ベクターは、ベクター分子をＶＳＶ−Ｇタンパク質（全ての細胞膜リン脂質に対して親和性を有するウイルスタンパク質）に連結することにより、細胞膜の細胞外表面上のリン脂質に標的化され得る。このような構築物は、当業者に周知の方法を用いて産生され得る。
【０１６２】
哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼによるクローキングタンパク質又は治療剤をコードするポリヌクレオチドの認識及び結合は、遺伝子発現に重要である。そのようなものとして、ＲＮＡポリメラーゼを補充し、転写開始部位での転写複合体のアセンブリを促進する転写因子に対して高い親和性を示すポリヌクレオチド内の配列エレメントを含み得る。このような配列エレメントとしては、例えば、哺乳動物プロモータが挙げられ、その配列は、特異的転写開始因子及び最終的にＲＮＡポリメラーゼによって認識され、結合され得る。
【０１６３】
本明細書に記載される組成物及び方法における使用に適切なポリヌクレオチドは、哺乳動物プロモータの下流のクローキングタンパク質又は治療剤をコードするポリヌクレオチドも含む。哺乳動物細胞におけるクローキングタンパク質又は治療剤の発現に有用なプロモータは、構成的プロモータを含む。構成的プロモータには、ＣＡＧプロモータ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ＥＦ１αプロモータ及びＰＧＫプロモータが含まれる。代わりに、ウイルスゲノムに由来するプロモータは、哺乳動物細胞におけるこれらの薬剤の安定な発現のためにも使用され得る。これらの薬剤の哺乳動物発現を促進するために使用することができる機能的ウイルスプロモータの例には、アデノウイルス後期プロモータ、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ、ＳＶ４０プロモータ、ＨＳＶのｔｋプロモータ、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモータ、ＨＩＶのＬＴＲプロモータ、モロニーウイルスのプロモータ、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモータ及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモータが含まれる。
【０１６４】
本明細書に以下に記載されるクローキングタンパク質又は治療剤をコードするポリヌクレオチドが哺乳動物細胞の核ＤＮＡに組み込まれると、このポリヌクレオチドの転写は、当該技術分野で公知の方法によって誘導され得る。例えば、発現は、哺乳動物細胞を、転写因子及び／又はＲＮＡポリメラーゼの哺乳動物プロモータへの結合を調節し、従って遺伝子発現を調節する薬剤などの外部化学試薬に曝露することによって誘導することができる。化学試薬は、例えば、プロモータに結合したリプレッサタンパク質を除去することにより、哺乳動物プロモータへのＲＮＡポリメラーゼ及び／又は転写因子の結合を容易にするのに役立ち得る。代わりに、化学試薬は、プロモータの下流に位置する遺伝子の転写速度が化学試薬の存在下で増加するように、ＲＮＡポリメラーゼ及び／又は転写因子に対する哺乳動物プロモータの親和性を増強する役割を果たし得る。上記機構によってポリヌクレオチド転写を増強する化学試薬の例には、テトラサイクリン及びドキシサイクリンが含まれる。これらの試薬は、市販されており（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、確立されたプロトコルに従って遺伝子発現を促進するために哺乳動物細胞に投与することができる。
【０１６５】
本明細書に記載される組成物及び方法において使用するための核酸ベクター中に含まれ得る他のＤＮＡ配列エレメントは、エンハンサー配列を含む。エンハンサーは、ＤＮＡが転写開始部位での転写因子及びＲＮＡポリメラーゼの結合に好ましい三次元配向をとるように、目的の遺伝子を含むポリヌクレオチドにコンホメーション変化を誘導する別のクラスの調節エレメントを表す。従って、本明細書に記載される組成物及び方法において使用するためのポリヌクレオチドは、クローキングタンパク質又は治療剤をコードするポリヌクレオチドを含み、哺乳動物エンハンサー配列をさらに含む。多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子から現在知られており、例としては、哺乳動物グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン及びインスリンをコードする遺伝子からのエンハンサーが挙げられる。本明細書に記載される組成物及び方法における使用のためのエンハンサーは、真核細胞に感染し得るウイルスの遺伝物質に由来するものも含む。例としては、複製起点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）、サイトメガロウイルス初期プロモータエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。真核生物遺伝子転写の活性化を誘導するさらなるエンハンサー配列は、Ｙａｎｉｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：１７（１９８２）に開示されている。エンハンサーは、例えば、この遺伝子の５’又は３’の位置において、クローキングタンパク質又は治療剤をコードするポリヌクレオチドを含むベクターにスプライシングされ得る。好ましい配向において、エンハンサーは、プロモータの５’側に位置し、これは、次に、クローキングタンパク質又は治療剤をコードするポリヌクレオチドに対して５’側に位置する。
【０１６６】
本明細書に記載の核酸ベクターは、Ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含むことができる。ＷＰＲＥは、転写産物の核外移行を促進することにより及び／又は新生転写産物のポリアデニル化の効率を増大させることにより、転写レベルで作用し、従って細胞中のｍＲＮＡの総量を増大させる。ベクターへのＷＰＲＥの添加は、インビトロ及びインビボの両方でいくつかの異なるプロモータからのトランスジーン発現のレベルの実質的な改善を生じ得る。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物及び方法で使用するための核酸ベクターは、例えば、特定の細胞及び組織における遺伝子発現を検証する際に有用であり得るレポータ配列を含む。トランスジーンにおいて提供され得るレポータ配列は、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ及び当該技術分野において周知の他のものをコードするＤＮＡ配列を含む。それらの発現を駆動する調節エレメントと関連する場合、レポータ配列は、酵素、ラジオグラフィー、比色、蛍光又は他の分光アッセイ、蛍光活性化細胞選別アッセイ並びに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び免疫組織化学的検査を含む免疫学的アッセイを含む従来の手段によって検出可能なシグナルを提供する。例えば、マーカ配列がＬａｃＺ遺伝子である場合、シグナルを保有するベクターの存在は、β−ガラクトシダーゼ活性についてのアッセイによって検出される。トランスジーンが緑色蛍光タンパク質又はルシフェラーゼである場合、シグナルを担持するベクターは、ルミノメーターにおける色又は光産生によって視覚的に測定され得る。
【０１６８】
細胞内にトランスジーンを導入するための技術
トランスフェクション
本明細書に記載のクローキングトランスジーン又は治療トランスジーンのようなトランスジーンを標的細胞（例えば、哺乳動物細胞）に導入するために使用され得る技術は、当該技術分野で周知である。例えば、エレクトロポレーションは、目的の細胞に静電電位を印加することによって哺乳動物細胞（例えば、ヒト標的細胞）を透過性にするために使用され得る。このようにして外部電場にさらされたヒト細胞のような哺乳動物細胞は、その後、外性核酸の取り込みに素因がある。哺乳動物細胞のエレクトロポレーションは、例えば、Ｃｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：１３１１（１９８７）に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。同様の技術、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）は、真核細胞の核への外性ポリヌクレオチドの取り込みを刺激するために、印加された電場を利用する。この技術を実施するために有益なＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｉｏｎ（商標）及びプロトコルは、例えば、Ｄｉｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ  １４：３１５（２００５）及び米国特許出願公開第２０１０／０３１７１１４号明細書に詳細に記載されており、これらの各々の開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１６９】
標的細胞のトランスフェクションに有用なさらなる技術は、スクイーズポレーション法を含む。この技術は、適用された応力に応答して形成される膜性細孔を介して外性ＤＮＡの取り込みを刺激するために、細胞の迅速な機械的変形を誘導する。この技術は、ベクターがヒト標的細胞のような細胞への核酸の送達に必要とされない点で有利である。スクイーズポレーションは、例えば、Ｓｈａｒｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ８１：ｅ５０９８０（２０１３）に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７０】
リポフェクションは、標的細胞のトランスフェクションのために有用な別の技術を表す。この方法は、リポソームの外部に向かって、多くの場合にカチオン性官能基（例えば、第四級又はプロトン化アミン）を提示する、リポソームへの核酸のローディングを含む。これは、細胞膜のアニオン性の性質のためにリポソームと細胞との間の静電相互作用を促進し、これは、最終的に、例えばリポソームと細胞膜との直接融合により又は複合体のエンドサイトーシスにより、外性核酸の取り込みを導く。リポフェクションは、例えば、米国特許第７，４４２，３８６号明細書に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。外来核酸の取り込みを誘発するために細胞膜とのイオン相互作用を利用する同様の技術は、細胞をカチオン性ポリマー−核酸複合体と接触させることを含む。細胞膜との相互作用に好ましい正電荷を付与するようにポリヌクレオチドと会合する例示的なカチオン性分子には、活性化デンドリマー（例えば、Ｄｅｎｎｉｇ，Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２８：２２７（２００３）（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載）、ポリエチレンイミン及びジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）−デキストランが挙げられ、そのトランスフェクション剤としての使用は、例えば、Ｇｕｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４０：Ｉ：９．２：９．２．１（１９９７）（その開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。磁性ビーズは、本方法が核酸の取り込みを案内するために印加磁場を利用するため、穏やかで効率的な様式で標的細胞をトランスフェクトするために使用され得る別のツールである。この技術は、例えば、米国特許出願公開第２０１０／０２２７４０６号明細書に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
標的細胞による外性核酸の取り込みを誘導するための別の有用なツールは、細胞を穏やかに透過性にし、ポリヌクレオチドが細胞膜に浸透することを可能にするために、細胞を特定の波長の電磁放射線に曝露することを含む技術である、光学トランスフェクションとも呼ばれるレーザーフェクションである。この技術の生物活性は、エレクトロポレーションに類似しており、場合により、エレクトロポレーションよりも優れていることが見出される。
【０１７２】
インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）は、標的細胞に遺伝物質を送達するために使用され得る別の技術である。インペールフェクションは、カーボンナノファイバー、カーボンナノチューブ及びナノワイヤーのようなナノ材料の使用に依存する。針状ナノ構造は、基材の表面に対して垂直に合成される。細胞内送達を目的とした遺伝子を含有するＤＮＡは、ナノ構造表面に付着される。次いで、これらの針のアレイを有するチップを細胞又は組織に対して押し付ける。ナノ構造によって妨害される細胞は、送達された遺伝子を発現し得る。この技術の一例は、Ｓｈａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０７：１８７０（２０１０）に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
マグネトフェクションも核酸を標的細胞に送達するために使用され得る。マグネトフェクションの原理は、核酸をカチオン性磁性ナノ粒子と会合させることである。磁性ナノ粒子は、完全に生分解性である酸化鉄から作られ、用途に応じて変化する特定のカチオン性の独自の分子でコーティングされる。遺伝子ベクター（ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ウイルスベクターなど）とのそれらの会合は、塩誘導コロイド凝集及び静電相互作用によって達成される。次いで、磁性粒子は、磁石によって生成された外部磁場の影響によって標的細胞上に集中される。この技術は、Ｓｃｈｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１０２（２００２）に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７４】
標的細胞による外性核酸の取り込みを誘導するための別の有用なツールは、ソノポレーションであり、この技術は、細胞原形質膜の透過性を修飾するための音（典型的には、超音波周波数）の使用を含み、細胞を透過性にし、ポリヌクレオチドが細胞膜を透過することを可能にする。この技術は、例えば、Ｒｈｏｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８２：３０９（２００７）に詳細に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７５】
微小胞は、本明細書に記載される方法に従って標的細胞のゲノムを修飾するために使用され得る別の潜在的なビヒクルを表す。例えば、糖タンパク質ＶＳＶ−Ｇと、例えばヌクレアーゼのようなゲノム修飾タンパク質との共過剰発現によって誘導された微小胞を使用して、タンパク質を細胞内に効率的に送達し、次いで内在性ポリヌクレオチド配列の部位特異的切断を触媒して、遺伝子又は調節配列のような目的のポリヌクレオチドの共有結合組み込みのための細胞のゲノムを調製することができる。真核細胞の遺伝子修飾のための、ゲシクルとも呼ばれるこのような小胞の使用は、例えば、Ｑｕｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ［要約］：Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｅａｒｌｙ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ［要約］：Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １８ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ；２０１５  Ｍａｙ  １３，Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．１２２に詳細に記載されている。
【０１７６】
ウイルス感染
高率の転写及び翻訳を達成することに加えて、哺乳動物細胞における外性遺伝子の安定な発現は、哺乳動物細胞の核ゲノムへの遺伝子を含むポリヌクレオチドの組み込みによって達成され得る。外性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを哺乳動物細胞の核ＤＮＡに送達及び組み込むための種々のベクターが開発されている。発現ベクターの例は、例えば、国際公開第１９９４／０１１０２６号パンフレットに開示されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載される組成物及び方法において使用するための発現ベクターは、クローキングトランスジーン又は治療トランスジーン並びに例えばこれらの薬剤の発現及び／又はこれらのポリヌクレオチド配列の哺乳動物細胞のゲノムへの組み込みのために使用されるさらなる配列エレメントを含む。クローキングトランスジーン又は治療トランスジーンの発現のために使用され得る特定のベクターは、遺伝子転写を指令するプロモータ領域及びエンハンサー領域のような調節配列を含むプラスミドを含む。クローキングトランスジーン又は治療トランスジーンの発現のための他の有用なベクターは、これらの遺伝子の翻訳速度を増強するか、又は遺伝子転写から生じるｍＲＮＡの安定性若しくは核外への輸送を改善するポリヌクレオチド配列を含有する。これらの配列エレメントは、例えば、発現ベクター上に保持される遺伝子の効率的な転写を指示するために５’及び３’非翻訳領域及びポリアデニル化シグナル部位を含む。本明細書に記載される組成物及び方法と共に使用するのに適切な発現ベクターは、このようなベクターを含む細胞の選択のためのマーカをコードするポリヌクレオチドも含み得る。適切なマーカの例としては、アンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又はノウルセオスリシンのような抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子が挙げられる。
【０１７７】
核酸送達のためのウイルスベクター
ウイルスゲノムは、標的細胞（例えば、ヒト細胞のような哺乳動物細胞）のゲノム中への目的の遺伝子の効率的な送達のために使用され得るベクターの豊富な供給源を提供する。ウイルスゲノムは、遺伝子送達に特に有用なベクターであり、なぜなら、このようなゲノム内に含まれるポリヌクレオチドは、一般化された形質導入又は特殊化された形質導入によって哺乳動物細胞の核ゲノム中に典型的に組み込まれるからである。これらのプロセスは、天然のウイルス複製サイクルの一部として生じ、遺伝子組み込みを誘導するために、添加されたタンパク質又は試薬を必要としない。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス（例えば、レトロウイルス科ウイルスベクター）、アデノウイルス（例えば、Ａｄ５、Ａｄ２６、Ａｄ３４、Ａｄ３５及びＡｄ４８）、パルボウイルス（例えば、アデノ随伴ウイルス）、コロナウイルス、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、ラブドウイルス（例えば、狂犬病及び水疱性口内炎ウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、麻疹及びセンダイ）などのマイナス鎖ＲＮＡウイルス、ピコルナウイルス及びアルファウイルスなどのプラス鎖ＲＮＡウイルス並びにアデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型及び２型、エプスタイン−バーウイルス、サイトメガロウイルス）及びポックスウイルス（例えば、ワクシニア、修飾ワクシニアアンカラ（ＭＶＡ）、鶏痘及びカナリポックス）を含む二本鎖ＤＮＡウイルスが挙げられる。他のウイルスとしては、例えば、ノーウォークウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、レオウイルス、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト泡沫ウイルス及び肝炎ウイルスが挙げられる。レトロウイルスの例としては、鳥類白血病肉腫、鳥類Ｃ型ウイルス、哺乳類Ｃ型ウイルス、Ｂ型ウイルス、Ｄ型ウイルス、オンコレトロウイルス、ＨＴＬＶ−ＢＬＶ群、レンチウイルス、アルファレトロウイルス、ガンマレトロウイルス、スプーマウイルス（Ｃｏｆｆｉｎ，Ｊ．Ｍ．，Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，１９９６））が挙げられる。他の例としては、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルス、マウス乳房腫瘍ウイルス、ウシ白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルス、鳥類白血病ウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、ヒヒ内在性ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、マソン・ファイザー・サルウイルス、サル免疫不全ウイルス、サル肉腫ウイルス、ラウス肉腫ウイルス及びレンチウイルスが挙げられる。ベクターの他の例は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号明細書に記載されており、その開示は、遺伝子治療における使用のためのウイルスベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７８】
核酸送達のためのＡＡＶベクター
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるクローキングトランスジーン又は治療トランスジーンは、細胞へのそれらの導入を容易にするためにｒＡＡＶベクター及び／又はビリオン中に組み込まれる。本明細書に記載される組成物及び方法において有用なｒＡＡＶベクターは、（１）プロモータ、（２）発現されるべき異種配列（例えば、本明細書に記載されるクローキングトランスジーン又は治療トランスジーン）、及び（３）異種遺伝子の組み込み及び発現を容易にするウイルス配列を含む組換え核酸構築物である。ウイルス配列は、ＤＮＡのビリオンへの複製及びパッケージング（例えば、機能的ＩＴＲ）のためにシスにおいて必要とされるＡＡＶの配列を含み得る。このようなｒＡＡＶベクターは、マーカ又はレポータ遺伝子も含み得る。有用なｒＡＡＶベクターは、全体又は部分的に欠失された１つ又は複数のＡＡＶ  ＷＴ遺伝子を有するが、機能的隣接ＩＴＲ配列を保持する。ＡＡＶ  ＩＴＲは、特定の用途に適した任意の血清型のものであり得る。ｒＡＡＶベクターを使用するための本方法は、例えば、Ｔａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．７：２７９（２０００）及びＭｏｎａｈａｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｇｅｎｅ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ７：２４（２０００）（これらの各々の開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
【０１７９】
本明細書に記載されるトランスジーン及びベクター（例えば、クローキングトランスジーン又は治療トランスジーンに作動可能に連結されるプロモータ）は、細胞へのポリヌクレオチド又はベクターの導入を容易にするためにｒＡＡＶビリオンに組み込まれ得る。ＡＡＶのカプシドタンパク質は、ビリオンの外側の非核酸部分を構成し、ＡＡＶキャップ遺伝子によってコードされる。キャップ遺伝子は、ビリオンアセンブリに必要な３つのウイルスコートタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３をコードする。ｒＡＡＶビリオンの構築は、例えば、米国特許第５，１７３，４１４号明細書；米国特許第５，１３９，９４１号明細書；米国特許第５，８６３，５４１号明細書；米国特許第５，８６９，３０５号明細書；米国特許第６，０５７，１５２号明細書；及び米国特許第６，３７６，２３７号明細書；並びにＲａｂｉｎｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６：７９１（２００２）及びＢｏｗｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４２３（２００３）に記載されており、これらの各々の開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８０】
本明細書に記載の組成物及び方法と併せて有用なｒＡＡＶビリオンには、ＡＡＶ  １、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、ｒｈ１０、ｒｈ３９、ｒｈ４３及びｒｈ７４を含む種々のＡＡＶ血清型に由来するものが含まれる。異なる血清型のＡＡＶベクター及びＡＡＶタンパク質の構築及び使用は、例えば、Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２：６１９（２０００）；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：３４２８（２０００）；Ｘｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２２２４（１９９８）；Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４（２０００）；Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：６６１５（２００１）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５（２００１）に記載されており、これらの各々の開示は、遺伝子送達のためのＡＡＶベクターに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８１】
本明細書に記載される組成物及び方法と関連して、偽型ｒＡＡＶベクターも有用である。偽型ベクターは、所定の血清型（例えば、ＡＡＶ９）のＡＡＶベクターを含み、これは、所定の血清型以外の血清型（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８など）に由来するカプシド遺伝子を用いて偽型化される。偽型ｒＡＡＶビリオンの構築及び使用を含む技術は、当該技術分野で公知であり、例えばＤｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：７６６２（２００１）；Ｈａｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：１５２４（２０００）；Ｚｏｌｏｔｕｋｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２８：１５８（２００２）；及びＡｕｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１０：３０７５（２００１）に記載されている。
【０１８２】
ビリオンカプシド内に変異を有するＡＡＶビリオンは、非変異カプシドビリオンよりも効果的に特定の細胞型を感染させるために使用することができる。例えば、適切なＡＡＶ変異体は、ＡＡＶを特定の細胞型にターゲティングすることを容易にするためのリガンド挿入変異を有し得る。挿入変異体、アラニンスクリーニング変異体及びエピトープタグ変異体を含むＡＡＶカプシド変異体の構築及び特徴付けは、Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４：８６３５（２０００）に記載されている。本明細書に記載される方法において使用され得る他のｒＡＡＶビリオンは、ウイルスの分子増殖により及びエキソンシャフリングにより生成されるカプシドハイブリッドを含む。例えば、Ｓｏｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２５：４３６（２０００）及びＫｏｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４２３（２００１）を参照されたい。
【０１８３】
ゲノム編集
上記に加えて、哺乳動物細胞のような標的細胞への目的の遺伝子の組み込みのために使用され得る種々のツールが開発されてきた。標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを標的細胞に組み込むために使用され得る１つのこのような本方法は、トランスポゾンの使用を包含する。トランスポゾンは、トランスポザーゼ酵素をコードし、５’及び３’切除部位に隣接する目的のポリヌクレオチド配列又は遺伝子を含むポリヌクレオチドである。トランスポゾンが細胞内に送達されると、トランスポザーゼ遺伝子の発現が開始し、その結果、目的の遺伝子をトランスポゾンから切断する活性酵素が得られる。この活性は、トランスポザーゼによるトランスポゾン切除部位の部位特異的認識によって媒介される。いくつかの例において、これらの切除部位は、末端反復又は逆方向末端反復であり得る。トランスポゾンから切り出されると、目的の遺伝子は、細胞の核ゲノム内に存在する類似の切り出し部位のトランスポザーゼ触媒切断により、哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれ得る。これにより、目的の遺伝子を、相補的切除部位で切断された核ＤＮＡに挿入することが可能になり、続いて目的の遺伝子を哺乳動物細胞ゲノムのＤＮＡに結合させるホスホジエステル結合の共有結合ライゲーションが取り込みプロセスを完了する。特定の場合において、トランスポゾンは、標的遺伝子をコードする遺伝子が最初にＲＮＡ産物に転写され、次いで哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれる前にＤＮＡに逆転写されるようなレトロトランスポゾンであり得る。例示的なトランスポゾン系は、ピギーバックトランスポゾン（例えば、国際公開第２０１０／０８５６９９号パンフレットに詳細に記載される）及び睡眠中の美容トランスポゾン（例えば、米国特許第２００５／０１１２７６４号明細書に詳細に記載される）であり、これらの各々の開示は、目的の細胞への遺伝子送達における使用のためのトランスポゾンに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
標的細胞のゲノムへの標的遺伝子の組み込みのための別のツールは、クラスター化された規則的に間隔を置いた短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ系であり、これは、ウイルス感染に対する細菌及び古細菌における適応防御機構として最初に進化した系である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、プラスミドＤＮＡ及び関連するＣａｓ９ヌクレアーゼ内にパリンドローム反復配列を含む。ＤＮＡ及びタンパク質のこのアンサンブルは、最初に外来ＤＮＡをＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込むことにより、標的配列の部位特異的ＤＮＡ切断を指令する。これらの外来配列及びＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の反復スペーサーエレメントを含むポリヌクレオチドは、次に、宿主細胞において転写されてガイドＲＮＡを生成し、これは、その後、標的配列にアニールし、Ｃａｓ９ヌクレアーゼをこの部位に局在化し得る。このようにして、高度に部位特異的なｃａｓ９媒介ＤＮＡ切断が外来ポリヌクレオチドにおいて引き起こされ得、これは、ｃａｓ９を標的ＤＮＡ分子のごく近傍にもたらす相互作用がＲＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションによって支配されるためである。結果として、目的の任意の標的ＤＮＡ分子を切断するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を設計し得る。この技術は、真核生物ゲノムを編集するために利用されており（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：２２７（２０１３））、標的遺伝子をコードする遺伝子を組み込む前にＤＮＡを切断するために、標的細胞ゲノムを部位特異的に編集する効率的な手段として使用することができる。遺伝子発現を調節するためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの使用は、例えば、米国特許第８，６９７，３５９号明細書に記載されており、その開示は、ゲノム編集のためのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの使用に関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。標的細胞に目的の遺伝子を組み込む前にゲノムＤＮＡを部位特異的に切断するための代替的な方法は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）及び転写活性化因子様エフェクタヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の使用を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系と異なり、これらの酵素は、特定の標的配列に局在するための誘導ポリヌクレオチドを含まない。代わりに、標的特異性は、これらの酵素内のＤＮＡ結合ドメインによって制御される。ゲノム編集用途におけるＺＦＮ及びＴＡＬＥＮの使用は、例えば、Ｕｒｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１：６３６（２０１０）；及びＪｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １４：４９（２０１３）に記載されており、これらの各々の開示は、それらがゲノム編集のための組成物及び方法に関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８５】
標的遺伝子をコードするポリヌクレオチドを標的細胞のゲノムに組み込むために使用され得るさらなるゲノム編集技術は、ゲノムＤＮＡを部位特異的に切断するように合理的に設計され得るＡＲＣＵＳ（商標）メガヌクレアーゼの使用を含む。標的遺伝子をコードする遺伝子を哺乳動物細胞のゲノムに組み込むためのこれらの酵素の使用は、このような酵素について確立されている定義された構造−活性関係の観点から有利である。一本鎖メガヌクレアーゼは、所望の位置でＤＮＡを選択的に切断し、標的細胞の核ＤＮＡへの標的遺伝子の部位特異的組み込みを可能にするヌクレアーゼを作製するために特定のアミノ酸位置で修飾され得る。これらの一本鎖ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，０２１，８６７号明細書及び米国特許第８，４４５，２５１号明細書に広く記載されており、これらの各々の開示は、ゲノム編集のための組成物及び方法に関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８６】
クローキングトランスジーンの発現
本明細書に記載されるクローキングトランスジーン（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は任意の組み合わせ）は、クローキング効果を生じるのに十分な量で（例えば、対象（例えば、マウス、ラット又はヒトのような哺乳動物対象）に注入される場合、拒絶を予防するのに十分な量で）発現される。クローク細胞の皮下注入が対象の免疫系によって除去されない奇形腫を生成する場合、トランスジーン発現は、クローキング効果を生じると考えられ得る。クローキングトランスジーンは、前記トランスジーンによってコードされるタンパク質の産生を促進するのに十分なレベルでも発現される。タンパク質産生は、当業者に公知の日常的な方法（例えば、免疫組織化学的検査、ウェスタンブロット分析又は可視化若しくはタンパク質を可能にする他の方法）を使用して検出され得る。好ましくは、クローキングトランスジーンの発現は、クローキングトランスジーン（ＰＤ−Ｌ１、Ｈ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｐｉ６）によってコードされる８つのタンパク質の全てがクローク細胞において検出され得るようなものである（例えば、クローキングトランスジーンによってコードされるタンパク質に対する抗体を使用する免疫組織化学的検査によって検出される）。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、クローキングトランスジーンは、クローク細胞において、Ｔ細胞のような活性化された白血球における内在性遺伝子発現のレベルと同様のレベルで発現される（例えば、リンパ器官から単離された活性化された白血球のような同じ種からの活性化された白血球、例えばクロークされたマウス細胞における発現は、マウスリンパ器官から単離された活性化された白血球における発現に類似する）。１つ又は複数のクローキングトランスジーン（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ）の発現は、同じ種由来の活性化白血球（例えば、Ｔ細胞）における内在性遺伝子の発現以上である（例えば、クローキングトランスジーンの発現レベルは、活性化白血球における内在性遺伝子の発現レベルに等しいか、又は活性化白血球における内在性遺伝子の発現レベルよりも１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上高い）。いくつかの実施形態では、８つのクローキングトランスジーン全てが同じ種由来の活性化白血球における内在性遺伝子の発現レベル以上のレベルで発現される。活性化された白血球は、リンパ器官から単離され得るか、又はＴ細胞のような白血球は、抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ若しくは当業者によって使用される他の方法を用いてインビトロで活性化され得る（例えば、Ｆｒａｕｗｉｔｈ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０９：２９５−２９９（２００２）；及びＴｒｉｃｋｅｔｔ  ａｎｄ  Ｋｗａｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７５：２５１−２５５（２００３）を参照されたい）。クローク細胞におけるトランスジーン発現は、活性化Ｔ細胞のプロファイリング研究において報告された遺伝子発現レベルとも比較され得る（例えば、Ｐａｌａｃｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬＯＳｏｎｅ  ２：ｅ１２２２（２００７）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、クローキングトランスジーン発現は、細胞の野生型バージョン（例えば、幹細胞、例えばクローク細胞と同じ種由来の胚幹細胞）における内在性遺伝子の発現と比較される。１つ又は複数のクローキングトランスジーン（例えば、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ）の発現は、クローク細胞と同じ細胞型の非修飾野生型細胞（例えば、幹細胞、例えば同じ種由来の胚幹細胞）における内在性遺伝子の発現と比較してクローク細胞において少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、５００、１，０００倍以上高い。いくつかの実施形態では、８つのクローキングトランスジーン全てが細胞の野生型バージョン（例えば、幹細胞、例えばクローク細胞と同じ種由来の胚幹細胞）における内在性遺伝子の発現レベルよりも高いレベル（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０又は１００倍以上高い）で発現される��遺伝子発現は、単離されたＥＳ細胞との直接比較により、又はＰｒｏｊｅｃｔ  Ｇｒａｎｄｉｏｓｅデータセット（ｗｗｗ．ｓｔｅｍｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｐｒｏｊｅｃｔ＿ｇｒａｎｄｉｏｓｅ）における幹細胞発現（例えば、ＥＳ細胞発現）と比較して評価することができる。遺伝子発現は、当該技術分野で公知の技術（例えば、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ））を使用して測定され得る。
【０１８８】
移植部位での局所免疫抑制を提供する方法
また、移植部位で局所免疫抑制を提供する方法も特徴とされる。
【０１８９】
本方法は、細胞を提供すること、及びトランスジーンのセットを細胞中で発現させることを含み、各トランスジーンは、細胞質性、膜結合性又は局所作用性である遺伝子産物であって、その機能は、移植片攻撃白血球及びＮＫ細胞活性化の機能を緩和すること、又は白血球攻撃に対する防御機構として作用することである、遺伝子産物をコードする。
【０１９０】
トランスジーンのセットは、以下の遺伝子：ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を含む。実施形態において、トランスジーン遺伝子のセットは、Ｐｄ−Ｌ１、Ｈ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｐｉ６を含む。
【０１９１】
任意選択的に、本方法は、以下のトランスジーン：ＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１及びＩＦＮγＲ１  ｄ３９の１つ又は複数を細胞中で発現させることをさらに含む。実施形態では、ＴＧＦ−β又は生物学的物質は、局所作用性である。
【０１９２】
トランスジーンのような種々の遺伝子修飾を動物細胞に導入するための技術は、本明細書に記載され、当該技術分野で一般的に公知である。
【０１９３】
本方法の実施形態において、細胞は、幹細胞、ゲノム編集に従う細胞及び／又は治療細胞型の供給源（例えば、細胞療法のために系統制限細胞に分化され得る細胞又は所望の標的組織の細胞）である。実施形態では、細胞は、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、組織特異的幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞若しくは前駆細胞、生殖幹細胞、肺幹細胞若しくは前駆細胞、乳房幹細胞、嗅覚成体幹細胞、毛包幹細胞、複能性幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞又は神経幹細胞若しくは前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、標的組織、例えば皮膚、心臓、脳又は脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、腸又は胃に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、線維芽細胞、上皮細胞又は内皮細胞である。細胞は、脊椎動物細胞、例えばヒト又はマウス細胞などの哺乳動物細胞であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するように修飾された細胞は、移植されるべき組織又は器官内の細胞である。いくつかの実施形態では、クローク細胞（例えば、クローク幹細胞）は、当業者が既知の方法を用いてインビトロで、移植のための組織又は器官に分化される。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、１００万〜１０００億個のクローク細胞（例えば、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０又は１×１０１１個のクローク細胞）は、対象内の移植部位の若しくはその近く又は移植するべき器官若しくは組織内に投与される。
【０１９５】
遺伝子修飾細胞を同種宿主の移植部位に移植するための技術は、本明細書に記載され、当該技術分野で公知である。
【０１９６】
クローク細胞による治療剤の発現
本明細書に記載されるクローク細胞は、治療剤を発現するようにさらに修飾され得る。いくつかの実施形態では、治療剤は、タンパク質である。治療タンパク質は、対象の細胞によって変異されているか、又は不十分な量で産生される（例えば、低レベルで産生されるか又は産生されない）タンパク質など、対象において欠損しているタンパク質の野生型形態であり得る。いくつかの実施形態では、治療タンパク質は、阻害性抗体（例えば、タンパク質機能を遮断又は中和する抗体）である。クローク細胞は、タンパク質の過剰産生又は異常産生（例えば、通常、タンパク質を産生しない細胞による産生、タンパク質が通常産生されない時点若しくは位置でのタンパク質の産生又は過剰量のタンパク質の産生）に関連する疾患又は状態を有するか、又は発症する危険性がある対象を処置するための阻害抗体を産生するように修飾され得る。いくつかの実施形態では、治療用抗体は、アゴニスト抗体（例えば、活性化抗体）である。アゴニスト抗体は、内在性受容体に結合し、それを活性化する（例えば、受容体活性化の下流のシグナル伝達を誘導若しくは増加させるか、又は内在性受容体のコンホメーションを開いた状態若しくは活性状態に変化させる）ことによって作用することができる。クローク細胞は、受容体又はシグナル伝達経路の活性化不足に関連する疾患又は状態を有するか、又は発症する危険性がある対象を処置するためにアゴニスト抗体を産生するように修飾され得る。クローク細胞は、本明細書に記載の方法を用いて又は当業者に公知の他の方法を用いて、治療タンパク質又は抗体を産生するように修飾され得る。分泌タンパク質又は抗体を産生するクローク細胞は、循環細胞として送達され得、治療タンパク質若しくは抗体を必要とする組織、器官若しくは身体部位に注入され得るか、又はクロークされた皮下組織を産生するために皮下注入され得る。膜貫通タンパク質又は膜結合タンパク質を産生するクローク細胞は、治療タンパク質に応答する内在性細胞の部位又はその近くに注入され得る。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるクローク細胞は、対象において変異されている遺伝子の野生型コピーを提供する（例えば、クローク細胞は、疾患の遺伝的原因を有さず、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全てを発現する「野生型細胞」である）。このような細胞は、内在性遺伝子における変異によって引き起こされる疾患又は状態を有する対象（例えば、本明細書に以下に記載される１つ又は複数の変異に関連する代謝障害を有する対象）を処置するために使用され得る。
【０１９８】
クローク細胞と共に投与され得るか、又はクローク細胞によって産生され得る例示的な治療剤のリスト及びこれらの治療剤を使用して処置され得る関連する疾患又は状態が以下の表２に提供される。
【０１９９】
【表２】
2020523037.tif 000021
【０２００】
【表３】
2020523037.tif 000022
【０２０１】
【表４】
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【０２０２】
【表５】
2020523037.tif 000024
【０２０３】
【表６】
2020523037.tif 000025
【０２０４】
【表７】
2020523037.tif 000026
【０２０５】
【表８】
2020523037.tif 000027
【０２０６】
治療剤の発現のための誘導系
クローク細胞によって発現される治療剤の連続投与が疾患又は状態を処置するために必要とされる場合、治療剤は、本明細書に記載されるか、又は当業者に公知の構成的プロモータ（例えば、ＣＡＧ、ＣＭＶ又は別の構成的プロモータ）を使用して発現され得る。治療剤が断続的に必要とされる場合（例えば、疾患又は状態中に生じる再発又は再燃の期間中に必要とされるが、対象が無症候性である場合に必要とされない）、治療剤は、必要とされる場合にのみ治療剤を発現する能力を提供する誘導性プロモータによって発現され得る。誘導性プロモータを使用して送達され得る治療剤の１つの例示的なクラスは、ＴＮＦα阻害剤である。ＴＮＦα阻害剤は、現在、関節リウマチを処置するために使用されているが、ＴＮＦαの構成的投与は、全身性免疫抑制をもたらすことができるため、関節炎症の再燃中に断続的に投与されるに過ぎない。クローク細胞が誘導性プロモータの制御下でＴＮＦα阻害剤を発現するように修飾される場合、クローク細胞は、ＴＮＦαを間欠的に送達するために使用され得、従って反復注入の必要性を排除する。連続的に投与された場合に潜在的に有害な効果を有する他の治療剤も、本明細書に記載されるような誘導性プロモータを使用して間欠的に発現され得る。例示的な誘導性発現系を以下に記載する。
【０２０７】
テトラサイクリン反応エレメント
１つの広く使用されている誘導性発現系は、テトラサイクリン制御転写活性化に基づく。この系において、抗生物質テトラサイクリン又はその誘導体の１つ（例えば、ドキシサイクリン）は、遺伝子発現を可逆的に活性化又は阻害するために使用される。この系を使用するために、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）は、目的の遺伝子（例えば、クローク細胞によって発現されるべき治療トランスジーン）の上流に、典型的には非常に低い基礎発現を有する最小プロモータと共に配置される。同様にクローク細胞によって発現される必要があるｒｔＴＡと呼ばれるタンパク質は、ＴＲＥに結合し、テトラサイクリン又はドキシサイクリンの存在下で転写を活性化する。テトラサイクリン又はドキシサイクリンが除去されると、ｒｔＴＡは、もはやＴＲＥに結合せず、目的の遺伝子は、もはや発現されない。この系の進歩バージョンであるＴｅｔ−Ｏｎアドバンストトランス活性化因子（ｒｔＴＡ２ｓ−Ｍ２）及びＴｅｔ−Ｏｎ  ３Ｇは、ヒトコドン最適化され、低濃度のドキシサイクリンに応答するため、ヒト治療に特に有用であり得る。
【０２０８】
光誘導系
遺伝子発現の誘導活性化のための別の方法は、光感受性タンパク質を用いて遺伝子発現を操作する光遺伝学の使用を含む。クローク細胞において治療剤を誘導的に発現するのに使用できる光遺伝学の最近の発展には、青色光に応答して立体構造変化及び二量体化を受けるタンパク質のクラスを含む。これらのタンパク質は、特定のプロモータ配列に結合し、青色光への暴露によって一緒にされた場合に転写を活性化することが示されているＤＮＡ結合及び転写成分に融合されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，９：２６６−２６９，２０１２）。青色光は、クロークされた皮下組織の近くの皮膚に照射されて、クローク細胞による治療剤の産生を誘導し得るため、遺伝子発現を誘導的に活性化する方法は、皮下投与されるクローク細胞における治療剤の産生を制御するために使用され得る。
【０２０９】
放射性遺伝学
遺伝子発現（例えば、クローク細胞による治療剤の発現）を誘導的に活性化する第３の方法は、電波の使用を含む。電波誘導性発現系の１つのバージョンにおいて、ＴＲＰＶ１受容体は、ＧＦＰ結合ドメインに融合され、ＧＦＰに連結されるフェリチンの形態と同時発現される（Ｓｔａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２１：９２−９８，２０１５）。ＧＦＰ−フェリチンは、ＴＲＰＶ１受容体のＧＦＰ結合ドメインに結合する。特定の周波数の電波が細胞に印加されると、フェリチンは、ＴＲＰＶ１と相互作用し、カルシウムの流入を可能にし、これは、転写因子ＮＦＡＴを活性化する。治療剤は、ＮＦＡＴ感受性プロモータエレメント（例えば、ＳＲＥ−ＣＲＥ−ＮＦＡＴＲＥ）に作動可能に連結され、ＴＲＰＶ１−ＧＦＰ及びＧＦＰ−フェリチンと同時発現される場合、この系を使用して誘導的に発現され得る。電波誘導発現は、電波が組織を通過することができるため、身体の外側からさらに遠い細胞において発現を誘導することができるという利点を提供する。例えば、放射性遺伝学は、網膜における遺伝子発現を調節するために使用され得る。従って、本方法は、非侵襲性及び非有害な電波を用いて、クローク細胞において治療トランスジーンを誘導的に発現させるために使用され得る。
【０２１０】
不安定化ドメイン系
遺伝子発現は、不安定化ドメイン系を使用しても調節され得る。目的のタンパク質（例えば、本明細書に記載される治療剤）をコードするトランスジーンは、不安定化ドメインも含み得、その結果、得られるタンパク質産物は、不安定化ドメインに融合された目的のタンパク質を含む。例示的な不安定化ドメインには、ヒトＦＫ５０６及びラパマイシン結合タンパク質（ＦＫＢＰ１２）の変異体が含まれ、これらは、これらが融合されるタンパク質に不安定性を付与する。ＦＫＢＰ１２変異体には、Ｎ末端変異体Ｆ１５Ｓ、Ｖ２４Ａ、Ｈ２５Ｒ、Ｅ６０Ｇ及びＬ１０６Ｐ並びにＣ末端変異体Ｍ６６Ｔ、Ｒ７１Ｇ、Ｄ１００Ｇ、Ｄ１００Ｎ、Ｅ１０２Ｇ及びＫ１０５Ｉが含まれ、これは、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １２６：９９５（２００６）において特徴付けられ、その開示は、ＦＫＢＰ１２不安定化ドメインに関連するため、参照により本明細書に組み込まれる。不安定化ドメインは、タンパク質分解を促進する。目的のタンパク質（例えば、治療剤）の発現が所望される場合、小分子合成リガンドを使用して、不安定化ドメイン含有タンパク質を安定化させることができる。小分子リガンドＳｈｉｅｌｄ−１（Ｓｈｌｄ１）は、ＦＫＢＰ１２変異体含有タンパク質を分解から保護することにより、それらを安定化するために使用することができる。目的の発現タンパク質を調節するために使用され得る他の不安定化ドメインは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｅｃＤＨＦＲ）の変異体及びヒトエストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ＥＲＬＢＤ）の変異体を含み、これらは、目的のタンパク質に融合される場合に分解を生じる不安定性を付与し、Ｉｗａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．１７：９８１（２０１０）及びＭｉｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．，１３４：３９４２（２０１２）（これらの各々の開示は、不安定化ドメイン系に関連するため、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、それぞれ小分子リガンドトリメトプリム（ＴＭＰ）により又はＣＭＰ８若しくは４−ヒドロキシタモキシフェン（４ＯＨＴ）により安定化され得る。
【０２１１】
クメートスイッチ誘導系
遺伝子発現の誘導的活性化のための別の方法は、クメート遺伝子スイッチ系の使用を含む。この系のリプレッサ配置では、調節は、強力な構成的プロモータの下流に配置されたオペレーター部位（ＣｕＯ）へのリプレッサ（ＣｙｍＲ）の結合によって媒介される。小分子であるクメートの添加は、抑制を軽減し、トランスジーンの発現を可能にする。代わりに、治療剤をコードするトランスジーンに作動可能に連結される最小ＣＭＶプロモータの上流に逆クメートトランス活性化因子（ｒｃＴＡ）を挿入し得る。治療トランスジーンの翻訳開始（ＡＴＧ）の直前にクメートオペレーター（６×ＣｕＯ）の６回反復を挿入することができる。クメートの非存在下では、ｒｃＴＡは、６×ＣｕＯに結合することができないため、治療剤をコードするトランスジーンは、６×ＣｕＯが活性でないために転写されない。クメートが添加される場合、それは、ｒｃＴＡと複合体を形成し、これは、６×ＣｕＯへの結合及び治療剤をコードするトランスジーンの転写を可能にする（Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０２１２】
エクジソン誘導系
誘導的遺伝子発現系の別の例は、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）及びＶｐ１６（ＶｐＥｃＲ）の活性化ドメインに融合されたエクジソン受容体（ＥｃＲ）のＮ末端切断が内在性プロモータによって同時発現されるように、クローク細胞によって発現される遺伝子の５’非翻訳領域に挿入されるエクジソン誘導系である。下流最小プロモータを有するエクジソン応答エレメント（ＥｃＲＥ）は、治療剤をコードするトランスジーンの開始コドンの直接上流に挿入され得る。同時発現されるＲＸＲ及びＶｐＥｃＲは、互いにヘテロ二量体化することがある。エクジソン又は合成薬物類似体ムリステロンＡの非存在下では、二量体化ＲＸＲ／ＶｐＥｃＲは、ＥｃＲＥに結合することができないため、治療剤をコードするトランスジーンは、転写されない。エクジソン又はムリステロンＡの存在下では、二量体化ＲＸＲ／ＶｐＥｃＲは、ＥｃＲＥに結合することができるため、治療剤をコードするトランスジーンが転写される（Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。エクジソン投与は、哺乳動物に対して明らかな効果を有さないため、遺伝子を調節するためのその使用は、任意の遺伝子の一過性誘導性発現に優れているはずである。
【０２１３】
リガンド可逆二量体化系
別の例では、治療剤をコードするトランスジーンは、５’部分及び３’部分などの部分／ドメインに機能的に分割されるように修飾することができ、ＦＫＢＰペプチド配列を各ドメインに挿入することができる。ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）配列は、２つのドメイン間に配置され得、これは、２つの異なるドメインが同時転写されて２つの別個のタンパク質を生成することを可能にする。二量体化剤が存在しない場合、治療剤の２つの別々のドメインは、機能的に不活性である。ラパマイシン又はＡＰ２０１８７などの二量体化剤を導入すると、ＦＫＢＰペプチドは、二量体化し、治療剤の５’及び３’ドメインを一緒にし、活性タンパク質を再構成する（Ｒｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０２１４】
治療剤の細胞に基づく送達
加齢黄斑変性又は網膜ジストロフィーの処置
一例では、クローク細胞は、加齢黄斑変性（ＡＭＤ）又は網膜ジストロフィーを処置するために、ＶＥＧＦトラップ（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＨｏｌａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１１３８３−１１３９８，２００２に記載される可溶性デコイ受容体、例えばアフリベルセプト）などのＶＥＧＦ阻害剤を産生するように修飾され得る。ＶＥＧＦトラップは、異常な血管の形成を促進することができる血管新生タンパク質であるＶＥＧＦに結合し、これを阻害する生物学的物質である。ＶＥＧＦトラップは、網膜剥離及び進行性視力喪失につながり得る網膜下の血管の異常な成長を特徴とする湿性ＡＭＤを処置するために使用される。ＡＭＤを処置するために、ＶＥＧＦトラップは、典型的には、眼内への定期的な注入によって送達される。クローク細胞は、構成的又は誘導性プロモータに作動可能に連結されるＶＥＧＦトラップ又は別のＶＥＧＦ阻害剤をコードするトランスジーンの発現により、ＶＥＧＦトラップ又は別のＶＥＧＦ阻害剤を産生するように修飾され得る。ＶＥＧＦ阻害剤（例えば、ＶＥＧＦトラップ）を発現するクローク細胞（例えば、幹細胞）は、当業者に公知の方法を用いて眼に投与する前に網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞に分化され得るか、又は単離されたＲＰＥ細胞は、クローキングトランスジーン及びＶＥＧＦ阻害剤を発現するように修飾され得る。湿性ＡＭＤ又は網膜ジストロフィーを処置するために、ＶＥＧＦ阻害剤（例えば、ＶＥＧＦトラップ）を発現する２５，０００〜１０万個のクロークされたＲＰＥ細胞（例えば、２５，０００、５０，０００、７５，０００又は１００，０００個のクロークされたＲＰＥ細胞）を各眼の網膜下空間に注入することができる。本明細書に記載される組成物及び方法における使用に適切な他のＶＥＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦ受容体の可溶型（例えば、可溶性ＶＥＧＦＲ−１又はＮＲＰ−１）、血小板因子−４、プロラクチン、ＳＰＡＲＣ及びＶＥＧＦ阻害抗体（例えば、ベバシズマブ及びラニビズマブ）を含む。
【０２１５】
パーキンソン病の処置
別の例では、ドーパミン作動性ニューロン又は当業者に公知の方法を用いてインビトロで分化させてドーパミン作動性ニューロンを産生することができる細胞（例えば、幹細胞）のようなクローク細胞を、ドーパミン作動性ニューロンの喪失を特徴とするパーキンソン病に罹患している対象に投与することができる。２５，０００〜１０万個のクロークされたドーパミン作動性ニューロン（例えば、２５，０００、５０，０００、７５，０００又は１００，０００個のクロークされたドーパミン作動性ニューロン）を、パーキンソン病に罹患している対象の脳に投与することができる（例えば、黒質に定位的に注入し得る）。
【０２１６】
心筋梗塞の処置
本明細書に記載されるクローク細胞は、心筋梗塞（例えば、心臓発作として一般に知られる心筋梗塞）を処置するためにも使用され得る。心筋梗塞は、心臓の一部への血流が減少又は停止し、心筋への損傷を引き起こす場合に生じる。心筋梗塞に罹患した対象を処置するために、クローク細胞（例えば、幹細胞）は、当業者によって公知の方法を用いて心筋細胞に分化され得るか、又は単離された心筋細胞は、クローキングトランスジーンを発現するように修飾され得る。５億〜５０億個のクロークされた心筋細胞（例えば、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９又は５×１０９個のクロークされた心筋細胞）を、心筋梗塞に罹患した対象を処置するために（例えば、死んだ又は損傷した心筋細胞を置換するために）心筋への注入によって対象に投与することができる。
【０２１７】
変形性関節症及び関節リウマチの処置
別の例では、本明細書に記載されるクローク細胞は、変形性関節症又は関節リウマチを処置するために使用することができる。変形性関節症及び慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、関節炎症を特徴とし、一般に抗炎症治療剤で処置される。変形性関節症又はＲＡに罹患している対象を処置するために、クローク細胞は、抗炎症性の生物学的物質（例えば、ＴＮＦαの阻害剤（例えば、ＴＮＦα阻害抗体））を発現するように修飾され得、これは、ＲＡの処置のために既に臨床的に使用されている。クローク細胞は、構成的又は誘導性プロモータに作動可能に連結される抗炎症性の生物学的物質をコードするトランスジーンの発現により、ＴＮＦα阻害剤のような抗炎症性の生物学的物質を産生するように修飾され得る。抗炎症性の生物学的物質（例えば、ＴＮＦα阻害剤）を発現するクローク細胞（例えば、幹細胞）は、当業者に公知の方法を用いて関節に投与する前に関節線維芽細胞に分化され得るか、又は単離された関節線維芽細胞は、クローキングトランスジーン及び抗炎症性の生物学的物質を発現するように修飾され得る。抗炎症性の生物学的物質を発現している１００万〜１億個のクローク関節線維芽細胞（例えば、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７又は１×１０８個のクローク関節線維芽細胞）を、変形性関節症又はＲＡを処置するために関節炎又は炎症性関節（関節の大きさに依存する）に注入することができる。変形性関節症又はＲＡを処置するためにクローク細胞によって発現させることができる抗炎症性の生物学的物質には、ＴＮＦα阻害剤（アダリムマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、ゴリムマブ、セルトロリズマブ）、インターロイキン−６（ＩＬ６）受容体阻害剤（例えば、トシリズマブ）、ＩＬ１受容体阻害剤（例えば、アナキンラ）又はＲＡを処置するために使用される他の薬剤（例えば、アバタセプト、リツキシマブ）が含まれる。
【０２１８】
糖尿病の処置
クローク細胞は、糖尿病（例えば、１型又は２型糖尿病）を処置するために使用され得る。１型糖尿病は、膵臓が十分なインスリンを産生することができないことに起因する。２型糖尿病は、インスリン抵抗性で始まるが、疾患が進行するにつれてインスリンの欠乏が発症することがある。糖尿病に罹患している対象を処置するために、クローク細胞は、インスリンを発現するように修飾され得るか、又は健康な対象由来のインスリン発現細胞（例えば、糖尿病を有さない対象由来の膵臓β細胞）は、クローキングトランスジーンＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するように修飾され得、糖尿病を有する対象に投与される。クローク細胞は、構成的又は誘導性プロモータに作動可能に連結されるインスリンをコードするトランスジーンの発現により、インスリンを産生するように修飾され得る。インスリンを発現するクローク細胞（例えば、幹細胞）は、当業者に公知の方法を用いて投与する前にインスリン産生細胞（例えば、膵臓β細胞）に分化され得るか若しくは分化することなく投与され得るか、又は単離された膵臓β細胞は、クローキングトランスジーンを発現するように、また任意選択的にインスリンをコードするトランスジーンを発現するように修飾され得る。インスリンを発現する（例えば、インスリンを内因的に発現するか、又はインスリンをコードするトランスジーンの発現に起因してインスリンを発現する）８億〜３０億個のクロークされた膵臓β細胞（例えば、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９又は３×１０９個のクロークされた膵臓β細胞）を、糖尿病を処置するためのインスリンを産生するクロークされた皮下組織を作製するために対象に皮下注入することができる。
【０２１９】
血友病の処置
別の例では、本明細書に記載されるクローク細胞は、血友病を処置するために使用することができる。血友病の患者は、血液凝固に必要とされる重要な血液成分である機能的第ＶＩＩＩ因子タンパク質を産生しない。これらの患者は、重篤な出血を有し得、標準的なケアは、精製された第ＶＩＩＩ因子タンパク質の１週間あたり複数回の注入を包含した。血友病に罹患している対象を処置するために、第ＶＩＩＩ因子をコードするさらなるトランスジーンを発現するようにクローク細胞を修飾することができる。第ＶＩＩＩ因子は、ＣＭＶ又はＣＡＧのような構成的プロモータに作動可能に連結されることにより、クローク細胞において構成的に発現される。第ＶＩＩＩ因子を発現するクローク細胞（例えば、幹細胞）は、当業者に公知の方法を用いて投与する前に血液凝固因子（例えば、肝類洞細胞若しくは内皮細胞）を産生する細胞に分化させるか若しくは分化なしに投与することができるか、又は健康な対象（例えば、血友病を有さない対象）からの単離された第ＶＩＩＩ因子発現肝類洞細胞又は内皮細胞を、クローキングトランスジーンＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するように修飾することができ、血友病を有する対象に投与される。１つ又は複数のクローキングトランスジーンを発現するように修飾された、健康な対象からの単離された第ＶＩＩＩ因子発現肝類洞細胞又は内皮細胞は、第ＶＩＩＩ因子が高レベルで発現されることを確実にするために、必要に応じて第ＶＩＩＩ因子をコードするトランスジーンを発現するようにさらに修飾され得る。第ＶＩＩＩ因子を発現する（例えば、第ＶＩＩＩ因子を内因的に発現するか、又は第ＶＩＩＩ因子をコードするトランスジーンの発現に起因して第ＶＩＩＩ因子を発現する）８億〜３０億個のクローク細胞（例えば、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９又は３×１０９個のクローク細胞）を、血友病を処置するための第ＶＩＩＩ因子を産生するクロークされた皮下組織を作製するために対象に皮下注入することができる。
【０２２０】
代謝障害の処置
本発明のクローク細胞は、遺伝性代謝障害を処置するためにも使用され得る。ほとんどの遺伝性代謝障害では、単一の酵素が体内で産生されないか、又は欠陥のある形態で産生される。遺伝性代謝障害には、リソソーム貯蔵障害、例えばハーラー症候群（α−Ｌイズロニダーゼ欠損）、ニーマン・ピック病（ＳＭＰＤ１、ＮＰＣ１又はＮＰＣ２変異）、テイ・サックス病（ＨＥＸＡ変異）、ゴーシェ病（ＧＢＡ遺伝子変異）、ファブリー病（ＧＬＡ変異によるαガラクトシダーゼ欠損）及びクラッベ病（ＧＡＬＣ変異によるガラクトシルセラミダーゼ欠損）；ガラクトース血症（ガラクトシナーゼ又はガラクトース−１−リン酸尿素転移酵素欠損）、メープルシロップ尿症（酵素ＢＣＫＤ欠損）；フェニルケトン尿症（酵素ＰＡＨ欠損）；糖原病（ＧＳＤ）、例えばＧＳＤ０（グリコーゲンシンターゼ（ＧＹＳ２）欠損）、ＧＳＤ１／フォン・ギールケ病（グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６ＰＣ）欠損）、ＧＳＤ  ２／ポンペ病（酸性αグルコシダーゼ（ＧＡＡ）欠損）、ＧＳＤ  ３／コリ病又はフォーブス病（グリコーゲン脱分枝酵素ＡＧＬ欠損）、ＧＳＤ  ４／アンダーソン病（グリコーゲン分岐酵素（ＧＢＥ１）欠損）、ＧＳＤ  ５／マッカードル病（筋肉グリコーゲンホスホリラーゼ（ＰＹＧＭ）欠損）、ＧＳＤ  ６／ハース病（肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ（ＰＹＧＬ）又は筋肉ホスホグリセリン酸ムターゼ（ＰＧＡＭ２）の欠損）、ＧＳＤ  ７／垂井病（筋肉ホスホフルクトキナーゼ（ＰＫＦＭ）の欠損）、ＧＳＤ  ９（ホスホリラーゼキナーゼ（ＰＨＫＡ２、ＰＨＫＢ、ＰＨＫＧ２又はＰＨＫＡ１）の欠損）、ＧＳＤ  １０（エノラーゼ３（ＥＮＯ３）の欠損）、ＧＳＤ  １１（筋肉乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨＡ）の欠損）、ファンコニ・ビッケル症候群（グルコース輸送体２（ＧＬＵＴ２）の欠損）、ＧＳＤ  １２（アルドラーゼＡ（ＡＬＤＯＡ）の欠損）、ＧＳＤ  １３（β−エノラーゼ（ＥＮＯ３）の欠損）又はＧＳＤ  １５（グリコゲニン−１（ＧＹＧ１）の欠損）；ミトコンドリア病、例えばミトコンドリアミオパシー（カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ、ミトコンドリアＤＮＡ欠損による）及び慢性進行性外眼麻痺（ＣＰＥＯ、ミトコンドリアＤＮＡ欠損若しくは複製又はＡＮＴ１、ＰＯＬＧ、ＰＯＬＧ２若しくはＰＥＯ１変異による）、糖尿病及び聴覚消失（ＤＡＤ、ｔＲＮＡＬｅｕ（ＵＵＲ）をコードする位置３２４３におけるミトコンドリアＤＮＡの変異による）、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ４、ＭＴ−ＮＤ４Ｌ及びＭＴ−ＮＤ６における変異により）、リー症候群（ＳＵＲＦ１、ＭＴ−ＡＴＰ６、ＭＴ−ＮＤ２、ＭＴ−ＮＤ３、ＭＴ−ＮＤ５、ＭＴ−ＮＤ６、ＢＣＳ１Ｌ、ＮＤＵＦＡ１０、ＳＤＨＡ、ＮＤＵＦＳ４、ＮＤＵＦＡＦ２、ＮＤＵＦＡ２、ＮＤＵＦＡＦ６、ＣＯＸ１５、ＮＤＵＦＳ３、ＮＤＵＦＳ８、ＦＯＸＲＥＤ１、ＮＤＵＦＡ９、ＮＤＵＦＡ１２、ＮＤＵＦＳ７における変異に関連する）、神経障害、運動失調、網膜色素変性症及び下垂（ＮＡＲＰ、ＭＴ−ＡＴＰ６における変異により）、筋神経胃腸脳症（ｍｙｏｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）（ＭＮＧＩＥ、ＴＹＭＰにおける変異により）、赤色ぼろ線維・ミオクローヌスてんかん症候群（ｍｙｏｃｌｏｎｉｃ  ｅｐｉｌｅｐｓｙ  ｗｉｔｈ  ｒａｇｇｅｄ  ｒｅｄ  ｆｉｂｅｒｓ）（ＭＥＲＲＦ、ｓｉｎ  ＭＴ−ＴＫ、ＭＴ−ＴＬ１、ＭＴ−ＴＨ、ＭＴ−ＴＳ１、ＭＴ−ＴＳ２又はＭＴ−ＴＦにおける変異による）又はミトコンドリア筋症、脳筋症、乳酸アシドーシス、脳卒中様症状（ＭＥＬＡＳ、ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ５、ＭＴ−ＴＨ、ＭＴ−ＴＬ１又はＭＴ−ＴＶにおける変異により）；フリードリッヒ失調症（ＦＸＮにおける変異）；ペルオキシソーム病、例えばツェルウェーガー症候群（ＰＥＸ１、ＰＥＸ２、ＰＥＸ３、ＰＥＸ５、ＰＥＸ６、ＰＥＸ１０、ＰＥＸ１２、ＰＥＸ１３、ＰＥＸ１４、ＰＥＸ１６、ＰＥＸ１９又はＰＥＸ２６における変異）及び副腎白質ジストロフィー（ＡＢＣＤ１における変異）；金属代謝障害、例えばウィルソン病（ウィルソン病タンパク質ＡＴＰ７Ｂにおける変異）及びヘモクロマトーシス（ヒトヘモクロマトーシスタンパク質ＨＦＥにおける変異）；有機酸代謝異常症、例えばメチルマロン酸血症（ＭＵＴ、ＭＭＡＡ、ＭＭＡＢ、ＭＭＡＤＨＣ又はＭＣＥＥにおける変異）及びプロピオン酸血症（ｐｒｏｐｉｏｎｉｃ  ａｃａｄｅｍｉａ）（ＰＣＣＡ又はＰＣＣＢにおける変異）；尿素サイクル異常症、例えばオルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、アルギナーゼ（ＡＲＧ１）欠損症、アルギニノコハク酸リアーゼ（ＡＳＬ）欠損症、アルギニノコハク酸シンターゼ１（ＡＳＳ１）欠損症、シトリン欠損症、カルバモイルリン酸シンターゼ１（ＣＰＳＩ）欠損症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ（ＮＡＧＳ）欠損症及びオルニチントランスロカーゼ（ＯＲＮＴ１）欠損症が含まれる。
【０２２１】
代謝障害に罹患している対象を処置するために、クローク細胞は、対象において変異されている遺伝子の野生型形態若しくは対象において欠失若しくは欠損している酵素をコードするトランスジーン（表２を参照されたい）を発現するように修飾され得るか、又は対象において変異されている遺伝子の野生型形態若しくは対象において欠損している酵素を発現する健康な対象（例えば、代謝障害を有さない対象）由来の細胞は、クローキングトランスジーンＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するように修飾され得、代謝障害を有する対象に投与される。対象において変異されている遺伝子の野生型形態又は対象において欠失若しくは欠損している酵素をコードするトランスジーンは、ＣＭＶ若しくはＣＡＧのような構成的プロモータに作動可能に連結されることによってクローク細胞において構成的に発現され得るか、又は本明細書に記載される誘導性発現系の１つを使用して誘導的に発現され得る。対象において変異されている遺伝子の野生型形態又は対象において欠失若しくは欠損している酵素を発現するように修飾されたクローク細胞（例えば、幹細胞）は、当業者に公知の方法を用いて投与する前に、遺伝子若しくは酵素を正常に発現する細胞に分化させることができるか若しくは分化することなく投与することができ、又は対象において変異若しくは欠損している遺伝子の野生型形態若しくは酵素を発現する健康な対象から単離した細胞を、クローキングトランスジーンＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するように修飾し、代謝障害を有する対象に投与することができる。対象が処置前に特定の変異を有すると依然として診断されていない場合、対象は、標準的な方法を用いて評価され得、代謝障害に関連する変異遺伝子を同定し、クローク細胞が対応する野生型遺伝子を発現することを確実にする。対象において変異されている遺伝子の野生型形態を発現する８億〜３０億個のクローク細胞（例えば、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９又は３×１０９個のクローク細胞）は、皮下注入されて、対応する野生型タンパク質を産生するクロークされた皮下組織を作製し得る。
【０２２２】
クローク細胞の分裂を制御する方法
一態様では、同種宿主における移植部位での細胞の増殖を制御する方法が提供される（例えば、移植部位での細胞の腫瘍形成能を低減するため又は移植部位で腫瘍形成性になった細胞の増殖を低減するため）。
【０２２３】
本方法は、同種宿主に細胞又はそのような細胞の集団が移植された場合に移植部位に局所免疫抑制を提供するための少なくとも１つの機構を含むように遺伝子修飾された細胞を提供すること、細胞内において細胞分裂遺伝子座（ＣＤＬ）を遺伝子修飾することであって、ＣＤＬは、１つ又は複数の遺伝子座であって、その転写産物は、分裂細胞（例えば、１つ又は複数の免疫抑制トランスジーンを含む全ての分裂細胞）によって発現される、１つ又は複数の遺伝子座であり、ＣＤＬの遺伝的修飾は、ａ）ＣＤＬをコードするＤＮＡ配列に転写によって連結される陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列を含むアブレーションリンク（ＡＬＩＮＫ）系、及びｂ）ＣＤＬに作動可能に連結される誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を含む、ＣＤＬの調節の誘導性外性活性化因子（ＥＡＲＣ）系の１つ又は複数を含む、遺伝子修飾すること、ＡＬＩＮＫ系を含む遺伝子修飾細胞を陰性選択マーカの誘導物質の非存在下で維持することにより、ＡＬＩＮＫ系を含む遺伝子修飾細胞を増殖させるか、又はＡＬＩＮＫ系を含む細胞を陰性選択マーカの誘導物質に曝露することにより、ＡＬＩＮＫ系を含む遺伝子修飾細胞の増殖をアブレーション及び／若しくは阻害すること、及び／又はＥＡＲＣ系を含む遺伝子修飾細胞を誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質に曝露することにより、ＥＡＲＣ系を含む遺伝子修飾細胞を増殖させるか、又はＥＡＲＣ系を含む細胞を誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質の非存在下で維持することにより、ＥＡＲＣ系を含む遺伝子修飾細胞の増殖を予防若しくは阻害すること、並びに細胞又は細胞の集団を同種宿主中の移植部位に移植することを含む。１つ又は複数のＣＤＬ（例えば、２つ、３つ、４つ又はそれを超えるＣＤＬ）において１つ又は複数のＡＬＩＮＫ及び／又はＥＡＲＣ系を使用して細胞分裂を制御するように修飾された細胞は、「フェイルセーフ細胞」と呼ばれ得る。遺伝的変異によって細胞分裂を制御する全ての系（例えば、ＡＬＩＮＫ又はＥＡＲＣ）の活性を細胞が失う前に単一のフェイルセーフ細胞から増殖させることができる細胞の数（例えば、細胞が制御から「逃れる」のに要し、数学的モデリングに基づいて制御不能な細胞増殖を示す細胞分裂の数）（クローン体積）がフェイルセーフ体積を決定する。フェイルセーフ量は、ＡＬＩＮＫの数及びＡＬＩＮＫ標的ＣＤＬの数に左右される。フェイルセーフ特性は、表３にさらに詳しく記載する。
【０２２４】
【表９】
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【０２２５】
様々な実施形態では、ＣＤＬは、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５（明示されているのと同様に、参照によりその全体を本明細書に組み込む）に記載されている「必須遺伝子」として同定される遺伝子座である。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５に記載の必須遺伝子は、各々の遺伝子についてスコア（すなわちＣＲＩＳＰＲスコア）を計算することによって同定され、このスコアは、遺伝子の不活性化により課される適応コストを表す。一実施形態では、ＣＤＬは、約−１．０未満のＣＲＩＳＰＲスコア（ＣＳ）を有する（表５、第５列）。
【０２２６】
様々な実施形態では、ＣＤＬは、細胞分裂及び／又は複製に関連する遺伝子産物をコードする１つ又は複数の遺伝子座である（表５、第６列）。例えば、様々な実施形態では、ＣＤＬは、ｉ）細胞周期、ｉｉ）ＤＮＡ複製、ｉｉｉ）ＲＮＡ転写及び／又はタンパク質翻訳、並びにｉｖ）代謝の１つ又は複数に関連する遺伝子産物をコードする遺伝子座である（表５、第７列）。
【０２２７】
一実施形態では、ＣＤＬは、細胞周期の進行の調節（例えば、Ｇ１／Ｓ  Ｇ２／Ｍ及び中期から後期への移行の制御）に関与する１つ又は複数のサイクリン依存性キナーゼ、例えばＣＤＫ１、ＣＤＫ２、ＣＤＫ３、ＣＤＫ４、ＣＤＫ５、ＣＤＫ６、ＣＤＫ７、ＣＤＫ８、ＣＤＫ９及び／又はＣＤＫ１１などである（Ｍｏｒｇａｎ，２００７）。一実施形態では、ＣＤＬは、１つ又は複数のＣＤＫを活性化することによって細胞周期の進行の制御に関与する１つ又は複数のサイクリン、例えばサイクリンＢ、サイクリンＥ、サイクリンＡ、サイクリンＣ、サイクリンＤ、サイクリンＨ、サイクリンＣ、サイクリンＴ、サイクリンＬ及び／又はサイクリンＦなどである（ＦＵＮＧ  ａｎｄ  ＰＯＯＮ，２００５）。一実施形態では、ＣＤＬは、細胞周期のＭ期における中期から後期への移行の進行を制御する後期促進複合体に関与する１つ又は複数の遺伝子座である（Ｐｅｔｅｒｓ，２００２）。一実施形態では、ＣＤＬは、細胞周期のＭ期における中期から後期への移行の進行を制御する動原体成分に関与する１つ又は複数の遺伝子座である。一実施形態では、ＣＤＬは、細胞周期に必要な微小管運動を制御する微小管成分に関与する１つ又は複数の遺伝子座である（Ｃａｓｓｉｍｅｒｉｓ，１９９９）。
【０２２８】
様々な実施形態では、ＣＤＬは、ハウスキーピングに関与する１つ又は複数の遺伝子座である。本明細書で使用する場合、用語「ハウスキーピング遺伝子」又は「ハウスキーピング遺伝子座」は、基本的な細胞機能の維持に必要な１つ又は複数の遺伝子を指す。ハウスキーピング遺伝子は、正常な状態及び病態生理学的状態にある生物の全ての細胞で発現される。
【０２２９】
様々な実施形態では、ＣＤＬは、細胞分裂及び／又は増殖に関連する遺伝子産物をコードする１つ又は複数の遺伝子座であり、約−１．０未満のＣＲＩＳＰＲスコアを有する。例えば、一実施形態では、ＣＤＬは、ｉ）細胞周期、ｉｉ）ＤＮＡ複製、ｉｉｉ）ＲＮＡ転写及び／又はタンパク質翻訳、並びにｉｖ）代謝の１つ又は複数に関連する遺伝子産物をコードする１つ又は複数の遺伝子座であり、約−１．０未満のＣＲＩＳＰＲスコアを有する。一実施形態では、ＣＤＬは、ハウスキーピング遺伝子でもある。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ、Ｃｅｎｐａ／ＣＥＰＮＡ、Ｂｉｒｃ５／ＢＩＲＣ５又はＥｅｆ２／ＥＥＦ２である。いくつかの実施形態では、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１である。いくつかの実施形態では、ＣＤＬは、Ｔｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａである。いくつかの実施形態では、ＣＤＬは、Ｅｅｆ２／ＥＥＦ２である。いくつかの実施形態では、ＣＤＬは、Ｃｄｋ１／ＣＤＫ１及びＴｏｐ２Ａ／ＴＯＰ２Ａ又はＣｄｋ１／ＣＤＫ１及びＥｅｆ２／ＥＥＦ２である。
【０２３１】
細胞は、ＣＤＬの発現を、陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列の発現と連結し、それによってＣＤＬ及び陰性選択マーカの両方を発現する有糸分裂活性細胞の薬物誘導アブレーションを可能にすることにより、「フェイルセーフ」細胞であるように修飾され得る。増殖細胞のアブレーションは、例えば、細胞増殖が細胞の正常な分裂速度と比較して制御されていない及び／又は加速されている場合（例えば、癌性細胞によって示される制御されていない細胞分裂）又は細胞に対する治療上の必要性が過ぎた場合に所望され得る。増幅細胞のアブレーションは、陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列の発現をＣＤＬの発現と連結することにより、結果としてＣＤＬ遺伝子座を発現するＡＬＩＮＫ修飾増幅細胞の排除又は十分な阻害（腫瘍形成に寄与するには低過ぎる速度までの細胞増殖速度の阻害である十分な阻害）を可能にする、本明細書で「アブレーションリンク」（ＡＬＩＮＫ）と呼ばれる細胞に対する遺伝子修飾により達成することができる。陰性選択系のプロドラッグ又は他の誘導物質の存在下で陰性選択マーカを発現する細胞は、選択マーカの作用機構に応じて増殖を停止するか、又は死滅するであろう。細胞は、同型接合性、異型接合性、半接合性又は複合異型接合性ＡＬＩＮＫを含むように修飾し得る。一実施形態では、アブレーションの忠実性を向上させるために、ＣＤＬの全ての機能性対立遺伝子に陰性選択マーカを導入し得る。１つの好ましい実施形態では、ＣＤＬの全ての機能性対立遺伝子に陰性選択マーカを導入し得る。フェイルセーフ系は、必要に応じて、クローク細胞の全てを排除するために使用され得る。
【０２３２】
ＡＬＩＮＫは、ＣＤＬの任意の位置に導入し得、これによりＣＤＬ及び陰性選択マーカの同時発現が可能になる。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、ＡＬＩＮＫ系は、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ／ガンシクロビル系、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン系、カルボキシルエステラーゼ／イリノテカン系又はｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３系を含む。
【０２３４】
陰性選択マーカ（例えば、ＨＳＶ−ＴＫ）をコードするＤＮＡは、陰性選択マーカの発現が陰性選択マーカを発現する宿主細胞及び必然的にＣＤＬを陰性選択マーカ（例えば、ガンシクロビル（ＧＣＶ））の誘導物質（例えば、プロドラッグ）の存在下で死滅させるように宿主細胞中のＣＤＬ（例えば、ＣＤＫ１）中に挿入され得る。この例では、ＡＬＩＮＫで修飾された宿主細胞は、チミジンキナーゼ（ＴＫ）を産生し、及びＴＫタンパク質は、ＧＣＶをＧＣＶ一リン酸に変換し、次にこれが細胞キナーゼによりＧＣＶ三リン酸に変換される。ＧＣＶ三リン酸は、Ｓ期中に複製ＤＮＡに組み込まれ、これは、ＤＮＡ伸長及び細胞アポトーシスの終結を招く（Ｈａｌｌｏｒａｎ  ａｎｄ  Ｆｅｎｔｏｎ、１９９８）。
【０２３５】
修飾ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子（Ｐｒｅｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）は、本明細書において、望ましくない細胞分裂速度を含む細胞を選択的にアブレートするためのＡＬＩＮＫ遺伝子修飾に使用され得る陰性選択マーカをコードするＤＮＡの一例として開示される。
【０２３６】
本明細書では、代替及び／又は追加の陰性選択系を本明細書に記載するツール及び／又は方法で使用することができると考えられる。様々な陰性選択マーカ系が当該技術分野で知られている（例えば、ｄＣＫ．ＤＭ（Ｎｅｓｃｈａｄｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２））。
【０２３７】
例えば、臨床との関連を有する様々な陰性選択系は、副作用が全くないか、又は最小限の副作用で従来の癌療法の治療効果を改善することを目標とする「遺伝子指向性酵素／プロドラッグ療法」（ＧＥＰＴ）の分野で開発進行中である（Ｈｅｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｎａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。多くの場合、ＧＥＰＴは、ウイルスベクターを使用して、癌細胞又は癌細胞の領域内で癌細胞の近傍に、哺乳動物細胞に存在せず、酵素を産生する遺伝子を送達することを含み、この酵素は、比較的非毒性のプロドラッグを毒性物質に変換することができる。
【０２３８】
ＨＳＶ−ＴＫ／ＧＣＶ、シトシンデアミナーゼ／５−フルオロシトシン（ＣＤ／５−ＦＣ）及びカルボキシルエステラーゼ／イリノテカン（ＣＥ／ＣＰＴ−１１）は、ＧＥＰＴ前臨床試験及び臨床試験で評価されている陰性選択マーカ系の例である（Ｄａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｓｈａｈ，２０１２）。
【０２３９】
１型単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ／ガンシクロビル（ＴＫ／ＧＣＶ）系の潜在的な免疫原性を解決するために、ヒトデオキシシチジンキナーゼ酵素がチミジン活性となり、非毒性プロドラッグ：ブロモビニル−デオキシウリジン（ＢＶｄＵ）、Ｌ−デオキシチミジン（ＬｄＴ）又はＬ−デオキシウリジン（ＬｄＵ）と共に陰性選択（自殺）系として作用するように、この酵素を操作することによって「ヒト化」自殺系が開発されている（Ｎｅｓｃｈａｄｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【０２４０】
ＣＤ／５−ＦＣ陰性選択マーカ系は、広く使用されている「自殺遺伝子」系である。シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）は、細菌又は酵母（例えば、それぞれ大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又はサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来）から得ることができる非哺乳動物酵素である（Ｒａｍｎａｒａｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。ＣＤは、シトシンのウラシルへの変換を触媒し、原生動物及び真菌におけるピリミジンサルベージ経路の重要なメンバーであるが、哺乳動物細胞に存在しない。５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）は、ヒトにおける低レベルの細胞傷害性を引き起こす抗真菌プロドラッグである（Ｄｅｎｎｙ，２００３）。ＣＤは、５−ＦＣの遺伝毒性物質５−ＦＵへの変換を触媒し、ヒトにおいて高レベルの毒性を有する（Ｉｒｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０２４１】
ＣＥ／ＣＰＴ−１１系は、哺乳動物種の様々な組織に見出されるセリンエステラーゼであるカルボキシルエステラーゼ酵素を基材とする（Ｈｕｍｅｒｉｃｋｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。抗がん剤ＣＰＴ−１１は、ＣＥにより活性化されて、強力な哺乳動物トポイソメラーゼＩ阻害物質である、７−エチル−１０−ヒドロキシカンプトテシン（ＳＮ−３８）と呼ばれる活性を産生する（Ｗｉｅｒｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。ＳＮ−３８は、分裂細胞に二本鎖ＤＮＡ切断の蓄積を誘導する（Ｋｏｊｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【０２４２】
陰性選択マーカ系の別の例は、ｉＣａｓｐ９／ＡＰ１９０３自殺系であり、これは、ヒトＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に融合した修飾ヒトカスパーゼ９を基材とし、小分子ＡＰ１９０３を用いて化学的二量体化を可能にするものであり、これは、ヒトで安全に試験されている。二量体化薬を投与すると、操作カスパーゼ９成分を発現する細胞のアポトーシスが誘導される。この系は、例えば、低い潜在的免疫原性をはじめとするいくつかの利点を有し、これは、ヒト遺伝子産物から構成されるため、二量体化薬は、操作カスパーゼ９成分を発現する細胞のみに作用する（Ｓｔｒａａｔｈｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。ｉＣａｓｐ／ＡＰ１９０３自殺系は、臨床現場で試験中である（Ｄｉ  Ｓｔａｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０２４３】
本明細書において、ＡＬＩＮＫ系の陰性選択マーカ系は、増殖アンタゴニスト系で置換することができると考えられる。本明細書で使用する用語「増殖アンタゴニスト」は、その存在が細胞の分裂を（完全若しくは部分的に）阻害する天然又は操作化合物を指す。例えば、ＯｍｏｍｙｃＥＲは、突然変異マウスエストロゲン受容体（ＥＲ）ドメインとＭＹＣドミネントネガティブＯｍｏｍｙｃとの融合タンパク質である。タモキシフェン（ＴＡＭ）で誘導されると、融合タンパク質ＯｍｏｍｙｃＥＲは、核に局在化し、ここで、ドミネントネガティブＯｍｏｍｙｃは、Ｃ−Ｍｙｃ、Ｌ−Ｍｙｃ及びＮ−Ｍｙｃと二量体化して、これらを、Ｍｙｃ  ＤＮＡ結合共通配列と結合することができない複合体中に隔離する（Ｓｏｕｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。Ｍｙｃ活性が欠失しているために細胞は、分裂することができない（Ｏｒｉｃｃｈｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。増殖アンタゴニストの別の例は、Ａ−Ｆｏｓ、すなわち等モル競合でのＤＮＡ結合を阻害する、活性化タンパク質１（ＡＰ１）に対するドミネントネガティブ（癌遺伝子Ｆｏｓ及びＪｕｎのヘテロ二量体）である（Ｏｌｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。Ａ−Ｆｏｓはまた、ＥＲドメインと融合して、ＴＡＭにより誘導されるその核局在化をもたらす。ＯｍｏｍｙｃＥＲ／タモキシフェン又はＡ−ＦｏｓＥＲ／タモキシフェンは、ＴＫ／ＧＣＶの代わりに用いてＡＬＩＮＫにすることができる。
【０２４４】
細胞は、ＣＤＬをＥＡＲＣ（例えば、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系）と作動可能に連結することにより、「フェイルセーフ」であるようにも修飾され得る。これらの条件下では、ＣＤＬは、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の誘導物質の存在下でのみ発現され、その存在下でのみ細胞が分裂することができる。これらの条件下において、ＥＡＲＣ修飾細胞は、誘導物質が存在しなければ、誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系の作用機構及びＣＤＬ機能に応じて分裂を停止するか、大幅に減速するか、又は死滅する。細胞は、同型接合性若しくは複合異型接合性ＥＡＲＣを含むように修飾し得るか、又はＥＡＲＣ修飾対立遺伝子のみが機能性ＣＤＬを産生することができるように改変し得る。一実施形態では、例えば、細胞分裂制御のための機構を提供するために、ＥＡＲＣ修飾をＣＤＬの全ての対立遺伝子に導入し得る。
【０２４５】
ＥＡＲＣは、誘導物質の存在下において、ＣＤＬ及び誘導系の活性化因子成分の同時発現を可能にするＣＤＬの任意の位置に挿入し得る。
【０２４６】
一実施形態では、「活性化因子」に基づく遺伝子発現系は、「抑制因子」に基づく遺伝子発現系より好ましい。例えば、抑制因子を用いてＣＤＬを抑制する場合、抑制因子の機能突然変異の喪失によってＣＤＬ発現が解除され、これにより細胞増殖が可能になる。細胞分裂の活性化に基づく抑制の場合、活性化因子機能の喪失（突然変異）によってＣＤＬ発現が停止され、これにより細胞増殖が不可能となる。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、ＥＡＲＣ系は、ｄｏｘ−架橋系、クメートスイッチ誘導系、エクジソン誘導系、電波誘導系又はリガンド可逆二量体化系である。
【０２４８】
ｄｏｘ−架橋は、誘導物質（例えば、ドキシサイクリン又は「ＤＯＸ」）の存在下でｄｏｘ−架橋がＣＤＬ発現を可能にし、それによって細胞分裂及び増殖を可能にするように宿主細胞中のＣＤＬ（例えば、ＣＤＫ１）中に挿入され得る。ｄｏｘ−架橋ＥＡＲＣで修飾された宿主細胞は、分裂細胞中（例えば、ＣＤＬ中）で活性のプロモータの転写制御下において逆テトラサイクリントランス−アクチベータ（ｒｔＴＡ）遺伝子を含み得る（Ｕｒｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。この標的挿入により、ＣＤＬプロモータは、ＣＤＬ転写のためにもはや利用可能ではなくなる。ＣＤＬ転写を回復するために、テトラサイクリン応答エレメント促進剤（例えば、ＴＲＥ（Ａｇｈａ−Ｍｏｈａｍｍａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４））をＣＤＬ転写物の前に挿入すれば、これは、ｒｔＴＡが発現され、ドキシサイクリンが存在する状況でのみＣＤＬ遺伝子を発現するであろう。ＣＤＬ発現の唯一の供給源がｄｏｘ−架橋対立遺伝子であるとき、ドキシサイクリンの非存在下でＣＤＬ遺伝子発現は起こらない。ＣＤＬ発現がなければ、ＥＡＲＣ修飾細胞は、細胞死、細胞分裂の停止によるか、又はＥＡＲＣ修飾細胞が腫瘍形成に寄与できないほど細胞有糸分裂速度を遅くすることによるかのいずれかでその増幅が障害される。
【０２４９】
本明細書で使用する用語「ｄｏｘ−架橋」は、内在性若しくは外性プロモータによりｒｔＴＡを発現させ（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、標的領域の転写をＴＲＥの制御下に置くことにより、標的転写領域からプロモータの活性を分離する機構を指す。本明細書で使用する場合、「ｒｔＴＡ」は、テトラサイクリン誘導系の逆テトラサイクリントランスアクチベータエレメントを指し（Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）、「ＴＲＥ」は、最小プロモータ上流のＴｅｔＯオペレーター配列から構成されるプロモータを指す。ドキシサイクリンの存在下でＴＲＥプロモータにｒｔＴＡを結合した後、ＴＲＥプロモータ下流の遺伝子座の転写が増大する。標的領域の転写発現の許可又は不許可ステータスがドキシサイクリンにより制御される限り、ｒｔＴＡ配列は、ＣＤＬと同じ転写ユニット又はゲノムの異なる位置に挿入し得る。ｄｏｘ−架橋は、ＥＡＲＣの一例である。
【０２５０】
本明細書では、ＣＤＬの５’調節領域へのＥＡＲＣ系の導入も考慮される。
【０２５１】
本明細書では、ＥＡＲＣ修飾を生成するために、本明細書に記載するツール又は方法に、別の及び／又は追加の誘導性活性化因子に基づく遺伝子発現系を使用できることが考慮される。
【０２５２】
例えば、細胞分裂及び／又は増殖が望ましいとき、コードＣＤＬの作用タンパク質産物と融合した不安定化タンパク質ドメイン（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）を小分子合成リガンドと一緒に使用して、ＣＤＬ融合タンパク質を安定化することができる。安定化物質が存在しない場合、不安定化ＣＤＬタンパク質は、細胞により分解され、次にこの細胞が増殖を停止することになる。安定化化合物が添加されると、これは、不安定化ＣＤＬタンパク質と結合し、不安定化ＣＤＬタンパク質は分解されないため、細胞は増殖することが可能になる。
【０２５３】
例えば、転写活性化因子様エフェクタ（ＴＡＬＥ）技術（Ｍａｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を二量体化物質調節発現誘導（Ｐｏｌｌｏｃｋ  ａｎｄ  Ｃｌａｃｋｓｏｎ，２００２）と組み合わせることができる。ＴＡＬＥ技術を用いて、ＣＤＬのプロモータに代わる最小プロモータと一緒に配置される配列に特異的であるように設計されたＤＮＡ結合ドメインを作製することができる。ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインも薬剤二量体化ドメインによって伸長した。後者は、対応する二量体化ドメイン及び転写活性化ドメインを有する別の操作タンパク質に結合することができる。
【０２５４】
例えば、逆クメートトランス活性化因子（ｒｃＴＡ）をＣＤＬの５’非翻訳領域に挿入し、これが内在性ＣＤＬプロモータにより発現されるようにし得る。クメートオペレーター（Ｃｕｍａｔｅ  Ｏｐｅｒａｔｏｒ）の６回反復（６×ＣｕＯ）をＣＤＬの転写開始（ＡＴＧ）の直前に挿入し得る。その系にクメートがない場合、ｒｃＴＡは、６×ＣｕＯに結合することができず、６×ＣｕＯが活性でないため、ＣＤＬは、転写されない。クメートが添加されると、これは、ｒｃＴＡと複合体を形成し、６×ＣｕＯとの結合が可能になるため、ＣＤＬの転写が可能になる（Ｍｕｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。
【０２５５】
例えば、レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と、Ｖｐ１６の活性化ドメインに融合したエクジソン受容体（ＥｃＲ）（ＶｐＥｃＲ）のＮ−末端切断型とをＣＤＬの５’非翻訳領域に挿入して、これらが内在性ＣＤＬプロモータにより同時発現されるようにし得る。エクジソン応答性エレメント（ＥｃＲＥ）は、下流の最小プロモータと一緒に出発コドンの直接上流でＣＤＬに挿入し得る。同時発現されたＲＸＲとＶｐＥｃＲとは、互いにヘテロ二量体化することができる。エクジソン又は合成薬類似体ムリステロンＡがない場合、二量体化ＲＸＲ／ＶｐＥｃＲは、ＥｃＲＥと結合することができないため、ＣＤＬは、転写されない。エクジソン又はムリステロンＡの存在下では、二量体化ＲＸＲ／ＶｐＥｃＲは、ＥｃＲＥと結合し、これによりＣＤＬが転写される（Ｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６）。
【０２５６】
例えば、一過性受容体ポテンシャルバニロイド１（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｖａｎｉｌｌｏｉｄ−１）（ＴＲＰＶ１）をフェリチンと一緒にＣＤＬの５’非翻訳領域に挿入して、内在性ＣＤＬプロモータにより同時発現させ得る。また、ＮＦＡＴ（ＮＦＡＴｒｅ）により誘導可能なプロモータを出発コドンの直接上流でＣＤＬに挿入し得る。通常の環境では、ＮＦＡＴプロモータは、活性ではない。しかし、低周波電波に曝露すると、ＴＲＰＶ１及びフェリチンは、細胞に進入するＣａ＋＋の波を形成し、次にこれが細胞質−ＮＦＡＴ（ＮＦＡＴｃ）を核−ＮＦＡＴ（ＮＦＡＴｎ）に変換し、これは、最終的にＮＦＡＴｒｅを活性化してＣＤＬを転写することになる（Ｓｔａｎｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０２５７】
例えば、ＣＤＬは、部分／ドメイン：５’−ＣＤＬ及び３’ＣＤＬに機能的に区分してＦＫＢＰペプチド配列を各ドメインに挿入することができる。ＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）配列は、２つのドメイン間に配置し得、これらは、ＣＤＬプロモータによって同時に転写されるが、２つの個別のタンパク質を産生する。誘導物質がなければ、２つの個別のＣＤＬドメインは、機能的に不活性となる。ラパマイシン又はＡＰ２０１８７などの二量体化物質を導入すると、ＦＫＢＰペプチドは、二量体化し、５’及び３’ＣＤＬ部分をもたらし、活性タンパク質を再構成する（Ｒｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。
【０２５８】
本方法の実施形態では、遺伝子修飾細胞は、トランスジーンのセットであって、各トランスジーンは、細胞質性、膜結合性又は局所的に作用する遺伝子産物であって、その機能は、移植片攻撃白血球及びＮＫ細胞活性化の機能を軽減すること、又は白血球攻撃に対する防御機構として作用することである、遺伝子産物をコードする、トランスジーンのセットを含む。
【０２５９】
同種宿主に細胞又はそのような細胞の集団が移植された場合に移植部位に局所免疫抑制を提供するための少なくとも１つの機構を含むように細胞を遺伝子修飾するための方法は、例えば、国際公開第２０１６／１４１４８０号パンフレットに記載されており、その全教示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６０】
トランスジーンのセットは、以下の遺伝子：ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数を含む。実施形態において、トランスジーン遺伝子のセットは、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）を含む。
【０２６１】
任意選択的に、本方法は、以下のトランスジーン：ＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１及びＩＦＮγＲ１  ｄ３９の１つ又は複数を細胞中で発現させることをさらに含む。実施形態では、ＴＧＦ−β又は生物学的物質は、移植片環境内で局所的に作用する。
【０２６２】
トランスジーンのような種々の遺伝子修飾を動物細胞に導入するための技術は、本明細書に記載され、当該技術分野で一般的に公知である。
【０２６３】
本方法の実施形態において、細胞は、幹細胞、ゲノム編集に従う細胞又は治療細胞型の供給源として機能し得る細胞（例えば、細胞療法に使用され得る系統制限若しくは最終分化細胞への分化に指向され得る細胞又は所望の標的組織の細胞）である。実施形態では、細胞は、胚幹細胞、誘導多能性幹細胞、成体幹細胞、組織特異的幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、内皮幹細胞、上皮幹細胞、脂肪幹細胞若しくは前駆細胞、生殖系列幹細胞、肺幹細胞若しくは前駆細胞、乳房幹細胞、嗅覚成体幹細胞、毛包幹細胞、複能性幹細胞、羊膜幹細胞、臍帯血幹細胞又は神経幹細胞若しくは前駆細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、標的組織、例えば皮膚、心臓、脳又は脊髄、肝臓、肺、腎臓、膵臓、膀胱、骨髄、脾臓、腸又は胃に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、線維芽細胞、上皮細胞又は内皮細胞である。細胞は、脊椎動物細胞、例えばヒト又はマウス細胞などの哺乳動物細胞であり得る。
【０２６４】
遺伝子修飾細胞を同種宿主の移植部位に移植するための技術は、本明細書に記載され、当該技術分野で公知である。
【０２６５】
本開示の方法のいずれかの種々の実施形態において、宿主は、細胞療法を用いて処置され得る変性疾患又は状態を有する。そのような疾患又は状態の例としては、種々の実施形態において、盲目、関節炎（例えば、変形性関節症若しくは関節リウマチ）、虚血、糖尿病（例えば、１型若しくは２型糖尿病）、多発性硬化症、脊髄損傷、卒中、癌、肺疾患、血液疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病及びＡＬＳなどの神経疾患、酵素若しくはホルモン欠乏症、代謝障害（例えば、リソソーム貯蔵障害、ガラクトース血症、メープルシロップ尿症、フェニルケトン尿症、グリコーゲン貯蔵疾患、ミトコンドリア障害、フリードリッヒ運動失調症、ペルオキシソーム障害、金属代謝障害若しくは有機酸血症）、自己免疫疾患（例えば、乾癬、全身性エリテマトーデス、グラーブ病、炎症性腸疾患、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、血管炎、自己免疫性肝炎、円形脱毛症、自己免疫性膵炎、クローン病、潰瘍性大腸炎、皮膚筋炎）、加齢黄斑変性症、網膜ジストロフィー、感染症、血友病、変性疾患（例えば、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性閉塞性肺疾患、慢性外傷性脳症、クロイツフェルト・ヤコブ病、嚢胞性線維症、チトクロムＣ酸化酵素欠損症、エーラース・ダンロス症候群、本態性振戦、進行性骨化性線維異形成症、乳児神経軸索ジストロフィー、円錐角膜、球状角膜、筋ジストロフィー、神経セロイドリポフスチン症、以前の疾患、進行性核上麻痺、サンドホフ病、脊髄性筋萎縮症、網膜色素変性症）若しくは加齢関連疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患（例、狭心症、心筋梗塞）、白内障、骨粗鬆症若しくは高血圧）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６６】
医薬組成物
本明細書に記載されるクローク細胞は、患者、例えば移植を受けているか、又は本明細書に記載される疾患若しくは状態に罹患しているヒト患者への投与のためにビヒクルに組み込まれ得る。クローク細胞を含有する医薬組成物は、当該技術分野で公知の方法を用いて調製することができる。例えば、このような組成物は、例えば、生理学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌｌｅｎ，Ｌ．Ｅｄ．（２０１３）；参照により本明細書に組み込まれる）を使用して、所望の形態（例えば、水溶液の形態）で調製され得る。
【０２６７】
本明細書に記載されるクローク細胞は、任意の生理学的に適合する担体（例えば、緩衝化生理食塩水溶液）中で投与され得る。薬学的に許容され得る担体及び希釈剤は、生理食塩水、水性緩衝溶液、溶媒及び／又は分散媒体を含む。このような担体及び希釈剤の使用は、当該技術分野において周知である。他の例としては、液体培地、例えばダルベッコス修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）、無菌生理食塩水、無菌リン酸緩衝生理食塩水、ライボビッツ培地（Ｌ１５，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）、無菌水中のデキストロース及び任意の他の生理学的に許容される液体が挙げられる。グリセロール、液状ポリエチレングリコール及びその混合物中並びに油中で分散液を調製することもできる。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液状ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物及び／又は植物油を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることにより、分散液の場合、必要な粒子サイズを維持することにより及び界面活性剤を用いることにより維持することができる。多くの場合、等張化剤、例えば糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましい。この溶液は、好ましくは、容易な注射可能性が存在する程度まで滅菌され、流体である。好ましくは、溶液は、製造及び貯蔵の条件下で安定であり、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロソールなどの使用を介して細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保存される。本発明の溶液は、薬学的に許容され得る担体又は希釈剤及び必要に応じて、上記に列挙される他の成分を使用し、続いて濾過滅菌し、次いで本明細書に記載されるクローク細胞を組み込むことによって調製され得る。
【０２６８】
例えば、本明細書に記載される医薬組成物を含有する溶液は、必要に応じて適切に緩衝化され得、液体希釈剤は、最初に、十分な生理食塩水又はグルコースで等張にされる。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与に特に適している。これに関連して、使用することができる無菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知である。いずれにしても、投与責任者が個々の対象に適した用量を決定する。さらに、ヒト投与のために、調製物は、ＦＤＡ生物学局標準によって要求されるように、無菌性、発熱性、一般的安全性及び純度標準を満たし得る。
【０２６９】
半固体又は固体担体中にクローク細胞を含む医薬組成物は、典型的には、移植部位又は対象における疾患又は状態の罹患部位での外科的移植のために処方される。液体組成物は、外科的手順によっても投与され得ることが理解される。特定の実施形態では、半固体又は固体医薬組成物は、半透過性ゲル、マトリックス、細胞足場などを含み得、これらは、非生分解性又は生分解性であり得る。例えば、特定の実施形態では、クローク細胞をそれらの周囲から隔離し、さらに細胞が生物学的分子（例えば、表２に列挙される治療剤）を分泌し、周囲の細胞に送達することを可能にすることが望ましいか又は適切であり得る。
【０２７０】
他の実施形態では、異なる種類の分解性ゲル及びネットワークが本発明の医薬組成物のために利用される。例えば、分解性材料は、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどの生体適合性ポリマーを含む。
【０２７１】
別の実施形態では、１つ又は複数のヒドロゲルが医薬組成物に使用される。１つ又は複数のヒドロゲルは、コラーゲン、アテロコラーゲン、フィブリン構築物、親水性ビニル及びアクリルポリマー、アルギン酸カルシウムのような多糖類及びポリ（エチレンオキシド）を含み得る。さらに、ヒドロゲルは、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、自己集合ペプチド（例えば、ＲＡＤ１６）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリジノン）、ポリ（ビニルアルコール）及びそれらの互いのコポリマー並びにメチルメタクリレート、ビニルアセテートなどの疎水性モノマーとのコポリマーから形成され得る。また、大きいポリ（エチレンオキシド）ブロックを含有する親水性ポリウレタンも好ましい。他の好ましい材料には、ポリマーの相互貫入ネットワークを含むヒドロゲルが含まれ、これは、付加重合又は縮合重合によって形成され得、その成分は、上に列挙されたものなどの親水性及び疎水性モノマーを含み得る。インサイチュー形成分解性ネットワークも本発明における使用に適している（例えば、Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００２；７８：１９９−２０９；Ｗａｎｇ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２００３；２４：３９６９−３９８０；米国特許出願公開第２００２／００２２６７６号明細書を参照されたい）。これらのインサイチュー形成材料は、注入に適した流体として処方され、次いで温度、ｐＨの変化及びインサイチュー又はインビボでの光への暴露などの様々な手段により、ヒドロゲルを形成するように誘導され得る。一実施形態では、構築物は、フィブリン糊含有ゲルを含有する。別の実施形態では、構築物は、アテロコラーゲン含有ゲルを含有する。
【０２７２】
マトリックスを形成するために使用されるポリマーは、ヒドロゲルの形態であり得る。一般に、ヒドロゲルは、明確な三次元構造を維持しながら、水中でそれらの重量の２０％超を吸収することができる架橋ポリマー材料である。この定義は、水性環境中で膨潤する乾燥架橋ポリマー及び水膨潤材料を含む。親水性ポリマーのホストは、ポリマーが生物学的起源であろうと、半合成であろうと又は完全に合成であろうと、ヒドロゲルを生成するために架橋され得る。ヒドロゲルは、合成ポリマー材料から製造することができる。このような合成ポリマーは、ある範囲の特性及び予測可能なロット間の均一性に合わせることができ、一般に免疫原性の懸念がない信頼できる材料源を表す。マトリックスは、自己集合ペプチドから形成されるヒドロゲル（例えば、米国特許第５，６７０，４８３号明細書及び同第５，９５５，３４３号明細書、米国特許出願第２００２／０１６０４７１号明細書並びにＰＣＴ出願国際公開第０２／０６２９６９号パンフレットにおいて議論されるもの）を含み得る。
【０２７３】
ヒドロゲルを薬物送達用途において価値あるものにする特性には、平衡膨潤度、収着動力学、溶質透過性及びそれらのインビボ性能特性が含まれる。化合物への浸透性は、膨潤度又は含水量及び生分解速度に部分的に依存する。ゲルの機械的強度は、膨潤度に比例して低下し得るため、複合系が機械的強度を増強するようにヒドロゲルを基材に付着させ得ることも十分に本発明の意図の範囲内である。いくつかの実施形態では、ヒドロゲルは、ヒドロゲルの有用な送達特性と共に基材の機械的強度を得るために多孔質基材内に含浸され得る。
【０２７４】
別の実施形態では、医薬組成物は、ホモポリマー、コポリマー及びブロックポリマー並びにそれらの組み合わせを含む、天然の、修飾された天然の又は合成の生分解性ポリマーから作製された生体適合性マトリックスを含む。
【０２７５】
適切な生分解性ポリマー又はポリマークラスの例としては、フィブリン、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型及びＶ型コラーゲン、エラスチン、ゼラチン、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、トロンビン、ポリ（アミノ酸）、酸化セルロース、トロポエラスチン、絹、リボ核酸、デオキシリボ核酸；タンパク質、ポリヌクレオチド、アラビアゴム、再構成基底膜マトリックス、デンプン、デキストラン、アルギン酸塩、ヒアルロン、キチン、キトサン、アガロース、多糖類、ヒアルロン酸、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリエチレングリコール、脱細胞化組織、自己集合ペプチド、ポリペプチド、グリコサミノグリカン、それらの誘導体及び混合物が挙げられるが、これらに限定されない、本開示内で考察される任意の生分解性ポリマーが挙げられる。適切なポリマーは、Ｌ（＋）及びＤ（−）ポリマーから形成され得るポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリヒドロキシブチレート、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリ（エチレングリコール）−ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、分解性ポリシアノアクリレート及び分解性ポリウレタンも含む。グリコール酸及び乳酸の両方について、中間環状二量体を調製し、重合前に精製し得る。これらの中間体二量体は、それぞれグリコリド及びラクチドと呼ばれる。
【０２７６】
他の有用な生分解性ポリマー又はポリマークラスには、脂肪族ポリエステル、ポリ（アルキレンオキサレート）、チロシン誘導ポリカーボネート、ポリイミノカーボネート、ポリオルトエステル、ポリオキサエステル、ポリアミドエステル、アミン基を含むポリオキサエステル、ポリ（プロピレンフマレート）、ポリフマレート、ポリジオキサノン、ポリカーボネート、ポリオキサレート、ポリ（α−ヒドロキシ酸）、ポリ（エステル）、ポリウレタン、ポリ（エステルウレタン）、ポリ（エーテルウレタン）、ポリ無水物、ポリアセテート、ポリカプロラクトン、ポリ（オルトエステル）、ポリアミノ酸、ポリアミド並びにそれらのブレンド及びコポリマーが含まれるが、これらに限定されない。追加の有用な生分解性ポリマーには、Ｌ−及びＤ−乳酸のステレオポリマー、ビス（パラ−カルボキシフェノキシ）プロパン及びセバシン酸のコポリマー、セバシン酸コポリマー、カプロラクトンのコポリマー、ポリ（乳酸）／ポリ（グリコール酸）／ポリエチレングリコールコポリマー、ポリウレタン及びポリ（乳酸）のコポリマー、α−アミノ酸のコポリマー、α−アミノ酸及びカプロン酸のコポリマー、α−ベンジルグルタメート及びポリエチレングリコールのコポリマー、スクシネート及びポリ（グリコール）のコポリマー、ポリホスファゼン、ポリ（ヒドロキシアルカノエート）並びにそれらの混合物が含まれるが、これらに限定されない。二元系及び三元系も考えられる。
【０２７７】
一般に、マトリックスを形成するために使用される材料は、望ましくは、（１）意図される用途に適した機械的特性を有し、（２）組織が内部成長して治癒するまで十分に無傷のままであり、（３）炎症又は毒性応答を引き起こさず、（４）その目的を達成した後に体内で代謝され、（５）形成される所望の最終産物に容易に加工され、（６）許容される貯蔵寿命を示し、及び（７）容易に滅菌されるように構成される。
【０２７８】
別の実施形態では、クローク細胞の集団は、足場の使用によって投与され得る。足場の組成、形状及び多孔性は、上記のいずれでもあり得る。典型的には、これらの三次元生体材料は、足場に付着した、足場内に分散した又は足場に捕捉された細胞外マトリックスに組み込まれた生細胞を含有する。身体の標的領域に移植されると、これらの移植片は、宿主組織と一体化され、移植された細胞は、徐々に確立される。
【０２７９】
使用され得る足場の非限定的な例としては、織物、ニット、編組、メッシュ、不織布及びワープニットなどの織物構造；多孔質発泡体、半多孔質発泡体、有孔フィルム又はシート、微粒子、ビーズ及び球体並びに上記構造の組み合わせである複合構造が挙げられる。不織布マットは、例えば、ＶＩＣＲＹＬ縫合糸（Ｅｔｈｉｃｏｎ、Ｉｎｃ．、Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、Ｎ．Ｊ．）の商品名で販売されている、グリコール酸と乳酸との合成吸収性コポリマー（ＰＧＡ／ＰＬＡ）からなる繊維を使用して形成され得る。例えば、ポリ（ε−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーから構成される、米国特許第６，３５５，６９９号明細書で議論されるような、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ）又は凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）などのプロセスによって形成される発泡体を利用することもできる。
【０２８０】
別の実施形態では、フレームワークは、フェルトであり、これは、生体吸収性材料から作製されたマルチフィラメントヤーンから構成することができる。ヤーンは、クリンピング、カッティング、カーディング及びニードリングからなる標準的な織物加工技術を用いてフェルトにすることができる。別の実施形態では、細胞は、複合構造体として使用され得る発泡体足場上に播種される。
【０２８１】
フレームワークは、例えば、組織空隙を充填するために有用な形状に成形され得る。従って、フレームワークは、神経成長のためのチャネルを提供するだけでなく、血管組織、筋肉組織などの支持及び周囲組織のための足場も提供するように成形され得る。さらに、細胞の集団は、予め形成された非分解性の外科用又は移植可能なデバイス上で培養され得ることが理解される。
【０２８２】
医薬組成物は、薬学的にされ得る担体又は媒体と共に処方されるクローク細胞から作製される調製物を含み得る。適切な薬学的に許容され得る担体には、水、塩溶液（リンガー液など）、アルコール、油、ゼラチン、ポリビニルピロリジン、ラクトース、アミロース又はデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル及びヒドロキシメチルセルロースを含むが、これらに限定されない、本開示内で論じられる任意のものが含まれる。このような調製物は、滅菌され得、必要に応じて補助剤（例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤及び着色剤）と混合される。本発明での使用に適した医薬担体は、当該技術分野で公知であり、例えばＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１７ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ）及び国際公開第９６／０５３０９号パンフレットに記載されている。
【０２８３】
処置の方法
本明細書に記載のクローク細胞及び組成物は、それを必要とする対象（例えば、移植を受けているか若しくは受けた対象又は本明細書に記載の疾患若しくは状態を有する対象）に、移植部位又はその近傍への局所投与、疾患又は状態に罹患した部位への局所投与（例えば、ＲＡを処置するための関節への注入、湿性ＡＭＤを処置するための関節への注入、中枢神経系（ＣＮＳ）への直接投与（例えば、パーキンソン病などの神経疾患を処置するための脳内、脳室内、髄腔内、大槽内又は定位投与）、心筋梗塞を処置するための心筋への直接注入、心筋梗塞を処置するための心筋への直接注入）、静脈内、非経口、皮内、経皮、筋肉内、鼻腔内、皮下、経皮、気管内、腹腔内、動脈内、血管内、吸入、潅流、洗浄及び経口投与などの様々な経路によって投与することができる。任意の所定の場合における投与のための最も適切な経路は、投与される特定の細胞又は組成物、患者、医薬製剤方法、投与方法（例えば、投与時間及び投与経路）、患者の年齢、体重、性別、処置される疾患の重篤度、患者の食事及び患者の排泄速度に依存する。組成物は、１回又は２回以上（例えば、年１回、年２回、年３回、月２回又は月１回）投与され得る。局所投与のために、クローク細胞は、カテーテル、注射器、シャント、ステント、マイクロカテーテル、ポンプ、デバイスを用いた移植又は足場を用いた移植を含む、所望の位置に細胞集団を配置する任意の手段によって投与され得る。
【０２８４】
本明細書に記載されるように、投与前に、細胞集団は、所望の細胞型（例えば、ニューロン、心筋細胞、ＲＰＥ細胞、インスリン産生細胞、血液凝固因子産生細胞、関節線維芽細胞又は本明細書に記載される他の細胞型）への幹細胞分化を刺激する１つ又は複数の因子の存在下又は条件下でインキュベートされ得る。このような因子は、当業者に公知であり、当業者は、分化のための適切な条件の決定が日常的な実験を用いて達成され得ることを理解する。このような因子には、成長因子又は栄養因子、ケモカイン、サイトカイン、細胞産物、脱メチル化剤及び例えば血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）、血管新生（ｈｅｍａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ）、血管原生、骨格筋、血管平滑筋、周皮細胞、ニューロン又は血管内皮経路又は系統に沿った幹細胞の分化を刺激することが知られている他の刺激が含まれる。代わりに、患者に投与される組成物は、所望の細胞型への細胞分化を刺激する１つ又は複数の因子を有するクローク細胞の集団を含み、ここで、細胞分化は、組織部位においてインビボで生じる。いくつかの実施形態では、クローク細胞は、当業者に公知の方法を用いてインビトロで器官又は組織に分化され得、器官又は組織移植を必要とする対象に投与される。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、特定の細胞型の細胞は、患者又はドナーから（例えば、例えば疾患又は状態を有さないＨＬＡマッチドナー又はミスマッチドナーから）収集され、１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ）のクローキングトランスジーンを発現するように修飾され、その後、対象に投与される。このようなアプローチは、クロークされたドナー細胞が野生型バージョンの遺伝子を内因的に発現し得るため、特定の遺伝子に変異を保有する対象を処置するために又は特定の分泌タンパク質又は酵素を欠損する対象について有用である（例えば、対象において欠損しているタンパク質又は酵素を内因的に発現するクロークされたドナー細胞を使用して）。このアプローチは、器官又は組織移植における細胞を、移植が実施される前に、クローキングトランスジーンの１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ）を発現するように修飾することができるため、器官又は組織移植を受けている対象の処置にも使用することができる。
【０２８６】
本明細書に記載されるように処置され得る対象は、移植を受けた対象又は本明細書に記載される疾患若しくは状態（例えば、湿性ＡＭＤ若しくは網膜ジストロフィー、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病）、心筋梗塞、骨関節炎若しくはＲＡ、糖尿病、血友病、代謝障害又は表２に列挙される疾患若しくは状態）を有する対象である。本明細書に記載される細胞、組成物及び方法は、細胞の喪失、タンパク質の変異若しくは欠損又はタンパク質の異常な産生によって引き起こされるか又はそれに関連する疾患又は状態を処置するために使用され得、これらは、細胞置換タンパク質若しくは細胞療法、治療タンパク質の産生、アゴニスト抗体の産生又は阻害抗体の産生を用いて処置され得る。本明細書に記載される方法は、本明細書に記載される組成物を用いた処置又は投与前に欠損タンパク質産生に関連する遺伝子における変異について対象をスクリーニングすることを含み得る。対象は、当業者に公知の標準的な方法（例えば、遺伝子試験）を使用して遺伝子変異についてスクリーニングされ得る。本明細書に記載される方法は、本明細書に記載されるクローク細胞又は組成物を用いた処置又は投与前に対象における疾患又は状態の症状を評価することも含み得る。次いで、対象は、対象の状態が改善したかどうかを決定するために、クローク細胞又は組成物の投与後に同じ診断試験を使用して評価され得る。本明細書に記載の組成物及び方法は、患者が組織又は器官拒絶の徴候を示す前に、組織又は器官移植を受けた患者に予防的処置として投与され得る。
【０２８７】
本明細書に記載されるクローク細胞、組成物及び方法は、対象中の死んだ細胞又は死につつある細胞を置換するために（例えば、神経変性疾患に罹患している対象中のニューロンを置換するために、又は心筋梗塞を有した対象中の心筋細胞を置換するために）使用され得る。本明細書に記載されるクローク細胞、組成物及び方法は、組織若しくは器官移植の領域における免疫抑制を提供するため又は組織若しくは器官移植の拒絶の危険性を低減するためにも使用され得る。タンパク質又はアゴニスト抗体などの治療剤を発現するクローク細胞、そのような細胞を含む組成物又はそのような細胞を投与する方法を用いて、対象において変異又は欠損している野生型バージョンのタンパク質（例えば、産生されるが、遺伝子変異のために正しく機能しないタンパク質、例えば切断タンパク質又は変化した電荷、極性若しくは結合特性を有するタンパク質；又は産生されないか若しくは不十分な量で産生されるタンパク質、例えば表２の疾患又は状態に関連する欠損タンパク質産生）を置換又は供給することができる。治療剤（例えば、阻害性又は中和抗体）を発現するクローク細胞、このような細胞を含む組成物又はこのような細胞を投与する方法は、対象において過剰発現されるタンパク質又は異常に産生されるタンパク質（例えば、健康な対象におけるそのタンパク質の産生と異なる時点又は位置において産生されるタンパク質（例えば、表２に列挙される疾患又は状態に関連する異常なタンパク質産生））を遮断又は中和するために使用され得る。
【０２８８】
処置には、クローク細胞又はクローク細胞を含む組成物の種々の単位用量の投与が含まれ得る。各単位用量は、通常、本明細書に記載される所定の量のクローク細胞を含む。投与される量並びに特定の投与経路及び処方は、臨床分野の当業者の技術範囲内である。単位用量は、単回注入として投与される必要はないが、設定された時間にわたる持続点滴を含むことができる。投与は、カテーテル、注射器、シャント、ステント、マイクロカテーテル、ポンプ、デバイスを用いた移植又は足場を用いた移植を使用して実施され得る。投与される細胞の数は、細胞が疾患若しくは損傷に関連する組織、器官若しくは身体部位に投与されるか、又はクロークされた皮下組織を産生するために皮下に投与されるかに依存して変化し得る。組織、器官又は身体部位への投与のために、クローク細胞は、例えば、１×１０４個の細胞〜１×１０１０個の細胞（例えば、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０個の細胞）の用量で患者に投与され得る。投与される細胞の数は、レシピエント組織、器官又は身体部位の大きさに依存する。例えば、２．５×１０４〜１×１０５個の細胞（例えば、２．５×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４又は１×１０５個の細胞）を眼の網膜下腔又は特異的脳領域に投与（例えば、注入）することができ；１×１０６〜１×１０８個の細胞（例えば、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７又は１×１０８個の細胞）を関節に投与（例えば、注入）することができ、細胞の量は間接の大きさに依存し；及び５×１０８〜５×１０９個の細胞（例えば、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９又は５×１０９個の細胞）を心筋に投与することができる。クロークされた皮下組織を作製するために、８×１０８個の細胞〜３×１０９個の細胞（例えば、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９個の細胞）を皮下投与（例えば、注入）することができる。クローク細胞は、２回以上の用量（例えば、２、３、４、５又はそれを超える異なる用量、例えばＲＡを有する患者の異なるサイズの関節に）で又は同じ用量で２回以上（例えば、１時間、１日、１週間、１ヶ月又は１年にわたって２、３、４、５、６回又はそれを超えて）投与され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるクローク細胞は、組織（例えば、クローク細胞からインビトロで増殖及び／又は分化された組織）として投与される。いくつかの実施形態では、クローク組織は、ゲル、生体適合性マトリックス又は足場と共に投与される（例えば、移植される）。
【０２８９】
本明細書に記載される組成物は、移植拒絶を予防若しくは低減するため、又は表２に列挙される疾患若しくは状態の症状を改善するため（例えば、変形性関節症又はＲＡの症状を低減するため（例えば、炎症、関節痛、硬直、関節痛、硬直又は不動を低減するため）；網膜ジストロフィー又は湿性ＡＭＤの症状を低減するため（例えば、視力を改善するため、眼の血管新生を遅らせるため又は低減するため）；パーキンソン病の症状を低減するため（例えば、振戦、硬直、運動緩慢を低減するため又は姿勢若しくは歩行運動を改善するため）；糖尿病の症状を低減するため（例えば、インスリンレベルを改善するため、定期的なインスリン注入の必要性を低減するため）；心筋梗塞の症状を低減するため（例えば、心機能を改善するため、梗塞サイズを低減するため）；血友病の症状を低減するため（例えば、第ＶＩＩＩ因子のような血液凝固因子のレベルを増大させるため、過剰出血を低減するため、打撲傷を低減するため、鼻血を低減するため、関節痛又は腫脹を低減するため）；又は代謝障害の症状を低減するため（例えば、食欲、成長若しくは体重増加を増加させるため又は嗜眠、体重減少、黄疸、発作、腹痛若しくは嘔吐を減少させるため））に十分な量を投与される。移植拒絶は、当業者に公知の標準的な方法を用いて評価され得、処置なしで典型的に観察される移植拒絶率と比較して５％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上）減少し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるクローク細胞又は組成物の投与は、免疫抑制剤を投与された対象において観察されるものと同等の移植拒絶の結果をもたらす。本明細書に記載される疾患及び状態の症状は、当業者に公知の標準的な方法を用いて評価され得、本明細書に記載されるクローク細胞又は組成物の投与前の症状と比較して５％以上（例えば、５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％以上）減少し得る（例えば、対象の状態が改善し得る）。これらの効果は、例えば、本明細書に記載の組成物の投与後、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１５週間、２０週間、２５週間以上以内に生じ得る。患者は、処置のために使用される投与の用量及び経路に依存して、クローク細胞又は組成物の投与の１ヶ月後、２ヶ月後、３ヶ月後、４ヶ月後、５ヶ月後、６ヶ月以上後に評価され得る。評価の結果に応じて、患者は、追加の処置を受けることができる。
【０２９０】
併用療法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるクローク細胞は、１つ又は複数の追加の治療剤と組み合わせて投与される。追加の治療剤は、クローク細胞の投与前、クローク細胞の投与後又はクローク細胞の投与と同時に投与することができる。クローク細胞及び追加の治療剤は、共製剤を介しても同時に投与され得る。クローク細胞及び治療剤は、クローク細胞及び治療剤の作用が重なり合い、それらの組み合わされた効果が障害に関連する症状又は他のパラメーターの減少が単独で送達されたクローク細胞又は治療剤で観察されるものよりも大きいように、又は他のものが存在しない場合に観察されるものよりも大きいように連続的にも投与され得る。クローク細胞及び治療剤の効果は、部分的に相加的であるか、完全に相加的であるか、又は相加的よりも多い（例えば、相乗的）ものであり得る。クローク細胞及び治療剤の連続的又は実質的に同時の投与は、経口経路、静脈内経路、筋肉内経路、局所経路又は皮下経路を含むが、これらに限定されない任意の適切な経路によって達成され得る。クローク細胞及び治療剤は、同じ経路又は異なる経路によって投与することができる。例えば、クローク細胞は、皮下注入によって投与され得る一方、追加の治療剤は、経口的に投与される。クローク細胞は、追加の治療剤の直前若しくは直後、１時間まで、２時間まで、３時間まで、４時間まで、５時間まで、６時間まで、７時間まで、８時間まで、９時間まで、１０時間まで、１１時間まで、１２時間まで、１３時間まで、１４時間まで、１６時間まで、１７時間まで、１８時間まで、１９時間まで、２０時間まで、２１時間まで、２２時間まで、２３時間まで、２４時間まで又は１〜７、１〜１４、１〜２１若しくは１〜３０日前若しくは後に投与され得る。
【０２９１】
一例では、追加の治療剤は、器官又は組織移植に一般的に与えられる免疫抑制剤である。免疫抑制剤は、急性拒絶を予防するために移植直後に与えられる薬剤（例えば、メチルプレドニゾロン、アトガム、チモグロブリン、ＯＫＴ３、バシリキシマブ又はダクリズマブ）又は維持に使用される免疫抑制剤（例えば、プレドニゾン、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス）、マイコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン又はラパマイシン）であり得る。器官移植後に与えられる他の免疫抑制剤には、コルチコステロイド（例えば、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾロン）、細胞毒性免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルカプトプリン、メトトレキサート）、免疫抑制抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリン、バシリキシマブ、インフリキシマブ）、シロリムス誘導体（例えば、エベロリムス、シロリムス）及び抗増殖剤（例えば、ミコフェノール酸モフェチル、ミコフェノール酸ナトリウム及びアザチオプリン）が含まれる。この場合、クローク細胞は、移植部位又はその近くに投与されるか、又は移植される組織は、１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ）のクローキングトランスジーンを発現するように修飾され、免疫抑制剤は、必要に応じて免疫抑制のさらなる供給源として投与される。
【０２９２】
炎症性及び自己免疫関連疾患又は状態を処置する際に使用するために、追加の薬剤は、疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）、生物学的応答修飾剤（ＤＭＡＲＤの一種）、コルチコステロイド又は非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）であり得る。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、メトトレキサート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、レフルノミド、シクロホスファミド、アザチオプリン又はトファシチニブ、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、キネレット、セトロリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ又はトシリズマブなどの生物学的物質である。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、アバタセプト、アダリムマブ、アレムツズマブ（Ｌｅｍｔｒａｄａ）、アミノサリチル酸（５−アミノアリチル（ａｍｉｎｏａｌｉｃｙｌｉｃ）酸、スルファサラジン、メサラミン、バルサラジド、オルサラジン）、抗生物質、抗ヒスタミン、抗ＴＮＦα（インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、ナタリズマブ）、アザチオプリン、ベリムマブ、βインターフェロン、カルシニューリン阻害剤、セトロリズマブ、コルチコステロイド、クロモリン、シクロスポリンＡ、シクロスポリン、ジメチルフマレート（テクフィデラ）、エタネルセプト、フィンゴリモド（ジレニア）、フマル酸エステル、グラチラマーアセテート（コパキソン）、ゴリムマブ、ヒドロキシウレア、ＩＦＮγ、ＩＬ−１１、インフリキシマブ、レフルノミド、ロイコトリエン受容体アンタゴニスト、長時間作用型β２アゴニスト、ミトキサントロン、ミコフェノール酸モフェチル、ナタリズマブ（タイサブリ）、オクレリズマブ、ピメクロリムス、プロバイオティクス（ＶＳＬ＃３）、レチノイド、リツキシマブ、サリチル酸、短時間作用型β２アゴニスト、スルファサラジン、タクロリムス、テリフルノミド（Ａｕｂａｇｉｏ）、テオフィリン、トシリズマブ、ウステキヌマブ（抗ＩＬ−１２／ＩＬ−２３）又はベドリズマブ（抗α３β７インテグリン）である。この場合、クローク細胞は、炎症性又は自己免疫関連の疾患又は状態によって損傷された組織又は器官を置換するために投与され得る。別の例では、投与されるクローク細胞は、特定の炎症性又は自己免疫関連の疾患又は状態の処置に向けられた生物学的治療剤（例えば、抗体）を発現するように修飾され得、追加の薬剤は、化合物又は一般的な抗炎症剤（例えば、ＮＳＡＩＤ又はコルチコステロイド）であり得る。
【０２９３】
例えば、疾患が関節リウマチである場合、追加の薬剤は、プレドニゾン、プレドニゾロン及びメチルプレドニゾロン、メトトレキサート、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン、レフルノミド、シクロホスファミド及びアザチオプリン、トファシチニブ、アダリムマブ、アバタセプト、アナキンラ、キネレット、セルトリズマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ又はトシリズマブの１つ又は複数であり得る。投与されるクローク細胞は、関節の軟骨又は骨産生細胞であり得る。いくつかの実施形態では、クローク細胞は、抗ＴＮＦα抗体を産生するように修飾され得、抗炎症剤（例えば、コルチコステロイド）と組み合わせて投与され得る。
【０２９４】
別の例では、ＡＭＤ又は網膜ジストロフィーの処置に使用するために、追加の治療剤は、追加の生物学的薬剤（例えば、ベバクジマブ、ラニビズマブ若しくはアフリベルセプト）、光線力学療法又は光凝固であり得る。投与されるクローク細胞は、網膜細胞（例えば、ＲＰＥ細胞）であり得る。いくつかの実施形態では、クローク細胞は、ＶＥＧＦ阻害剤を産生するように修飾され得、光線力学療法又は光凝固と組み合わせて投与され得る。
【０２９５】
パーキンソン病の処置における使用のために、本明細書に記載されるクローク細胞は、カルビドパ−レボドパ、ドーパミンアゴニスト（例えば、プラミペキソール、ロピニロール、ロチゴチン若しくはアポモルフィン）、ＭＡＯ−Ｂ阻害剤（例えば、セレギリン若しくはラサギリン）、カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、エンタカポン若しくはトルカポン）、抗コリン作動性（例えば、ベンズトロピン若しくはトリヘキシフェニジル）、アマンタジン又は脳深部刺激と共に投与され得る。投与されるクローク細胞は、ドーパミン作動性ニューロンであり得る。
【０２９６】
心筋梗塞を処置するためのさらなる薬剤には、抗凝固剤（例えば、リバロキサバン、ダビガトラン、アピキサバン、ヘパリン、ワルファリン）、抗血小板剤（例えば、アスピリン、クロピドグレル、ジピラミドール（ｄｉｐｙｒａｍｉｄｏｌｅ）、プラスグレル、チカグレロール）、アンギオテンシン変換酵素阻害剤（例えば、ベナゼプリル、カプトプリル、エナラプリル、フォシノプリル、リシノプリル、モエキシプリル、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル）、アンギオテンシンＩＩ受容体遮断薬（例えば、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン）、アンギオテンシン受容体ネプリライシン阻害剤（例えば、サキュビトリル／バルサルタン）、β遮断薬（例えば、アセブテロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、ソタロール）、α及びβ遮断薬の併用（例えば、カルベジロール、ラベタロール塩酸塩）、カルシウムチャネル遮断薬（例、アムロジピン、ジルチアゼム、フェロジピン、ニフェジピン、ニモジピン、ニソルジピン、ベラパミル）、コレステロール低下薬（例えば、スタチン（例えば、アトルバスタチン、ロスバスタチン）、ニコチン酸（例えば、ロバスタチン）、コレステロール吸収阻害剤（例えば、エゼチミブ／シンバスタチン）、ジギタリス製剤（例えば、ラノキシン）、利尿薬（例えば、アミロライド、ブメンタニド、クロロチアジド、クロルタリドン、フロセミド、ハイドロクロロチアジド、インジパミド、スピロノラクトン）、血管拡張剤（例えば、イソソルビドジニトラート、ネシリチド、ヒドララジン、硝酸塩、ミノキシジル）、二重抗血小板療法（例えば、アスピリン及びＰ２Ｙ１２阻害剤）又は心臓処置（例えば、血管形成術、人工心臓弁手術、アテローム切除術、バイパス手術、心筋形成術、心臓移植、低侵襲心臓手術、ラジオ波焼灼術、ステント処置又は経心筋血行再建）が含まれる。投与されるクローク細胞は、心筋細胞であり得る。
【０２９７】
感染症の処置に使用するために、追加の薬剤は、抗ウイルス化合物（例えば、ビダラビン、アシクロビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ヌクレオシドアナログ逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）（例えば、ＡＺＴ（ジドブジン）、ｄｄＩ（ジダノシン）、ｄｄＣ（ザルシタビン）、ｄ４Ｔ（スタブジン）若しくは３ＴＣ（ラミブジン））、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）（例えば、（ネビラピン若しくはデラビルジン）、プロテアーゼ阻害剤（サキナビル、リトナビル、インジナビル若しくはネルフィナビル）、リバビリン又はインターフェロン）；抗菌化合物；抗真菌化合物；抗寄生虫化合物であり得る。投与されるクローク細胞は、免疫細胞（例えば、感染症への対処を促進し得る細胞（例えば、クロークＴ細胞又はＢ細胞））であり得る。
【０２９８】
糖尿病の処置における使用のために、追加の薬剤は、インスリン、スルホニルウレア（例えば、クロルプロパミド、グリピジド、グリブリド、グリメピリド）、ビグアニド（例えば、メトホルミン）、メグリチニド（例えば、レパグリニド、ナテグリニド）、チアゾリジンジオン（例えば、ロシグリタゾン、ピオグリタゾン）、ＤＰＰ−４阻害剤（シタグリプチン、サキサグリプチン、リナグリプチン、アログリプチン）、ＳＧＬＴ２阻害剤（例えば、カナグリフロジン、ダパグリフロジン）、α−グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ミグリトール）、胆汁酸隔離剤（例えば、コレセベラム）、アスピリン又は食事療法であり得る。投与されるクローク細胞は、インスリンをコードするトランスジーンを発現するように任意選択的に修飾され得る膵臓β細胞であり得る。
【０２９９】
血友病の処置における使用のために、追加の治療剤は、凝固因子、デスモプレシン、血餅保存薬（例えば、抗線維素溶解薬、例えばアプロチニン、アミノカプロン酸、フィブリゴンゲン若しくはトラネキサム酸）、フィブリンシーラント又は理学療法であり得る。投与されるクローク細胞は、第ＶＩＩＩ因子をコードするトランスジーンを発現するように任意選択的に修飾され得る肝臓洞様細胞又は内皮細胞であり得る。
【０３００】
代謝障害又は疾患の処置のために、追加の治療剤は、補酵素（例えば、ビオチン、ヒドロキシコバラミン、リボフラビン、ピリドキシン、葉酸、チアミン、ユビキノン、テトラヒドロビオプテリン）、骨髄移植、器官移植（例えば、肝臓、腎臓若しくは心臓移植）、血液透析、血液濾過、交換輸血、腹膜透析、中鎖トリアシルグリセロール、ミグルスタット、酵素補給療法又は食事制限（例えば、フェニルケトン尿症の対象のための低タンパク質若しくはフェニルアラニン制限食）であり得る。クローク細胞は、代謝障害を有する対象において変異されている遺伝子の野生型コピーを保有する細胞又は代謝障害を有する対象において欠乏した酵素を内因的に産生する細胞（例えば、肝細胞、腎臓細胞、心臓細胞又は代謝障害を有する対象において変異されている遺伝子の野生型コピーを保有するか、若しくは代謝障害を有する対象において欠乏した酵素を産生する任意の他の細胞）であり得る。
【０３０１】
癌の処置における使用のために、追加の薬剤は、チェックポイント阻害剤、化学療法薬、生物学的薬物、非薬物療法（例えば、放射線療法、凍結療法、温熱療法又は外科的切除若しくは腫瘍組織）又は抗癌ワクチンであり得る。クローク細胞は、癌への対処を促進することができる免疫細胞（例えば、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞又はＴ細胞）であり得る。
【０３０２】
チェックポイント阻害剤は、少なくとも４つの主要なカテゴリーに分類することができる：ｉ）Ｔ細胞又はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞上で直接阻害経路を遮断する抗体のような薬剤（例えば、ニボルマブ、ピジリズマブ／ＣＴ−０１１及びペンブロリズマブなどのＰＤ−１ターゲティング抗体、ＴＩＭ−３を標的とする抗体並びにＬＡＧ−３、２Ｂ４、ＣＤ１６０、Ａ２ａＲ、ＢＴＬＡ、ＣＧＥＮ−１５０４９又はＫＩＲを標的とする抗体）、ｉｉ）Ｔ細胞又はＮＫ細胞上で直接刺激経路を活性化する抗体のような薬剤（例えば、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ又は４−１ＢＢを標的とする抗体）、ｉｉｉ）免疫細胞上で抑制経路を遮断するか、又は免疫細胞の抑制集団を枯渇させる抗体のような薬剤（例えば、イピリムマブ又はトレメリムマブなどのＣＴＬＡ−４ターゲティング抗体、ＶＩＳＴＡを標的とする抗体及びＰＤ−Ｌ２（例えば、ＡＭＰ  ２２４などのＰＤＬ２／Ｉｇ融合タンパク質）、Ｇｒ１又はＬｙ６Ｇを標的とする抗体）、ｉｖ）癌細胞上で抑制経路を直接遮断するか、又は癌細胞に対する細胞毒性を増強するために抗体依存性細胞障害作用に依存する抗体又は小分子のような薬剤（例えば、リツキシマブ、ＰＤ−Ｌ１を標的とする抗体又は小分子（例えば、ＭＰＤＬ３２８０Ａ／ＲＧ７４４６；ＭＥＤＩ４７３６；ＭＳＢ００１０７１８Ｃ；ＢＭＳ  ９３６５５９）及びＢ７−Ｈ３（例えば、ＭＧＡ２７１）、Ｂ７−Ｈ４、Ｇａｌ−９又はＭＵＣ１を標的とする抗体又は小分子阻害剤）。１つの実施形態において、チェックポイントの阻害剤は、ＨＶＥＭ、ＣＤ１６０、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ｂ−７ファミリーリガンド又はそれらの組み合わせの阻害剤（例えば、阻害抗体又は小分子阻害剤）である。本明細書に記載されるこのような薬剤は、例えば、当該技術分野で公知の従来の方法（例えば、Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ，Ｇｅｎｅ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ，２０１５；Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２０１２）によって設計及び産生され得る。一実施形態では、チェックポイントの阻害剤は、阻害抗体（例えば、モノクローナル抗体などの単一特異性抗体）である。抗体は、例えば、ヒト化され得るか、又は完全にヒトであり得る。別の実施形態では、チェックポイントの阻害剤は、融合タンパク質、例えばＦｃ受容体融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、チェックポイントの阻害剤は、チェックポイントタンパク質と相互作用する抗体などの薬剤である。別の実施形態では、チェックポイントの阻害剤は、チェックポイントタンパク質のリガンドと相互作用する抗体などの薬剤である。
【０３０３】
化学療法剤には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、葉酸類似体、ピリミジン類似体、プリン類似体及び関連阻害剤、ビンカアルカロイド、エピポドピロトキシン（ｅｐｉｐｏｄｏｐｙｙｌｌｏｔｏｘｉｎ）、抗生物質、Ｌ−アスパラギナーゼ、トポイソメラーゼ阻害剤、インターフェロン、白金配位錯体、アントラセンジオン置換尿素、メチルヒドラジン誘導体、副腎皮質抑制剤、副腎皮質ステロイド、プロゲスチン、エストロゲン、抗エストロゲン、アンドロゲン、抗アンドロゲン及びゴナドトロピン放出ホルモン類似体が含まれる。５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ロイコボリン（ＬＶ）、イレノテカン、オキサリプラチン、カペシタビン、パクリタキセル及びドキセタキセルも含まれる。化学療法剤の非限定的な例としては、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）及びウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチロロメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含むエチレンアミン及びメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリューテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン（ｓａｒｃｏｄｉｃｔｙｉｎ）；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン（ｎｏｖｅｍｂｉｃｈｉｎ）、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン及びラニムスチンなどのニトロソウレア；例えばエンジイン抗生物質（例えば、カリチアマイシン、特にカリケアマイシンガンマル及びカリケアマイシンオメガルなどの抗生物質；ダイネマイシンＡを含むダイネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラミシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウソラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、ケラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン（ｒｏｄｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ユベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝アンタゴニスト；ドネプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロックスウリジンなどのピリジミン類似体；カルステロン、ドロモスタノロン、プロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎；フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）などの葉酸補充薬；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルホミチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモル；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；並びに上記のいずれかの薬学的に許容され得る塩、酸又は誘導体が挙げられる。２つ以上の化学療法剤を、本明細書に記載されるクローク細胞と組み合わせて投与されるカクテル中で使用す��ことができる。組み合わせ化学療法の適切な投薬レジメンは、当該技術分野で公知である。
【０３０４】
抗癌生物学的物質には、癌処置に用いられるサイトカイン（例えば、インターフェロン又はインターロイキン（例えば、ＩＬ−２））が含まれる。別の実施形態では、生物学的物質は、抗血管新生剤、例えば抗ＶＥＧＦ剤、例えばベバシズマブである。いくつかの実施形態では、生物学的物質は、標的に作用して抗癌応答を刺激するか、又は癌にとって重要な抗原に拮抗する免疫グロブリンに基づく生物学的物質、例えばモノクローナル抗体（例えば、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、Ｆｃ融合タンパク質又はその機能的断片）である。そのような薬剤には、リツキシマブ；ダクリズマブ；バシリキシマブ；パリビズマブ；インフリキシマブ；トラスツズマブ；ゲムツズマブオゾガマイシン；アレムツズマブ；イブリツモマブチウキセタン；アダリムマブ；オマリズマブ；トシツモマブ−Ｉ−１３１；エファリズマブ；セツキシマブ；ベバシズマブ；ナタリズマブ；トシリズマブ；パニツマブ；ラニビズマブ；エクリズマブ；セルトリズマブペゴール；ゴリムマブ；カナキヌマブ；ウステキヌマブ；オファツムマブ；デノスマブ；モタビズマブ；ラキシバクマブ；ベリムマブ；イピリムマブ；ブレンツキシマブ；ベドチン；ペルツズマブ；アド−トラスツズマブエムタンシン；及びオビヌツズマブが含まれる。抗体−薬物コンジュゲートも含まれる。
【０３０５】
キット
本発明は、任意選択的に以下のトランスジーン：ＴＧＦ−β、Ｃｄ７３、Ｃｄ３９、Ｌａｇ３、Ｉｌ１ｒ２、Ａｃｋｒ２、Ｔｎｆｒｓｆ２２、Ｔｎｆｒｓ２３、Ｔｎｆｒｓｆ１０、Ｄａｄ１及びＩＦＮγＲ１  ｄ３９の１つ又は複数をさらに発現する、本明細書に記載されるクローク細胞（例えば、本明細書に記載されるクローキングトランスジーンのセット（例えば、ＰＤ−Ｌ１、Ｈ２−Ｍ３、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦａｓＬ、Ｃｃｌ２１ｂ、Ｍｆｇｅ８及びＳｐｉ６の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ）を発現するクローク細胞）を含むキットも特徴とする。いくつかの実施形態において、クローク細胞は、細胞分裂を調節するための１つ又は複数の系（例えば、ＡＬＩＮＫ又はＥＡＲＣ系）及び／又は治療剤（例えば、タンパク質又は抗体をコードするトランスジーン）を含むようにさらに修飾される。クローク細胞は、医薬組成物中に提供され得る。キットは、クローク細胞又は医薬組成物の投与のための注射器及び本明細書に記載される疾患又は状態を処置するためのクローク細胞又は医薬組成物を投与するための使用説明書をさらに含み得る。
【実施例】
【０３０６】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をさらに例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図されず、当業者に公知の他の手順、方法論又は技術が代替的に使用され得ることがそれらの例示的な性質によって理解される。
【０３０７】
実施例１：材料及び方法
アロ耐性に不可欠な標的遺伝子を発現するベクターの構築
アロ耐性に関与する遺伝子のｃＤＮＡ配列を含むプラスミドを以下のように得た。
ＰＤ−Ｌ１：Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、クローン＃Ｖ１０２００１
ＦａｓＬ：Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、＃７５７１９
Ｃｄ４７：Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、＃Ｖ７５５３５
Ｃｄ２００：ＧＥ  Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＩＤ＃  １７４７０
Ｈ２−Ｍ３：Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、クローン＃８１８８
Ｃｃｌ２１：Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、クローン＃Ｖ７７１２０
Ｍｆｇｅ８：Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、クローン＃Ｖ７２６１４
Ｓｐｉ６：Ｍｏｕｎｔ  Ｓｉｎａｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、クローン＃Ｖ８９０７
【０３０８】
これらの関心遺伝子（ＧＯＩ）又はルシフェラーゼ酵素を含む発現ベクターを、Ｇａｔｅｗａｙクローニングシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して作製した。Ｃｄ４７、Ｃｃｌ２１、Ｍｆｇｅ８及びＳｐｉ６  ｃＤＮＡを、ｃＤＮＡ隣接ａｔｔＢ部位を含む形態で獲得した。Ｈ２−Ｍ３、Ｃｄ２００、ＦａｓＬ及びＰＤ−Ｌ１について、プライマーを設計してｃＤＮＡ配列を増幅し、ａｔｔＢ部位を付加した（図１５（ａ））。ＰＣＲ増幅後、ａｔｔＢ含有ｃＤＮＡをＢＰ（ａｔｔＢ部位とａｔｔＰ部位との間の組換え）反応によってｐＤＯＮＲ２２１ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、＃１２５６０１７）に組換えて、エントリー（ｐＥＮＴＲＹ）クローンを作製した（図１５（ｂ））。ＢＰ反応は、１ｍＬチューブ中において、緩衝液及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供されるＢＰ酵素と共にａｔｔＢ隣接トランスジーンｃＤＮＡをｐＤＯＮＲ２２１プラスミドと混合することを伴い、ここで、ＢＰ酵素は、ＧＯＩをｐＤＯＮＲ２２１プラスミドのドッキング部位に組換える。トランスジーンのｐＤＯＮＲ２２１プラスミドへの挿入をＤＮＡ配列決定（ＴＣＡＧ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ  ａｔ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、Ｔｏｒｏｎｔｏ）によって確認した。次に、ＧＯＩを含有するｐＥＮＴＲＹクローンを、ゲートウェイＬＲ（ａｔｔＬ部位とａｔｔＲ部位との間の組換え）反応を介して目的ベクターに組換えた（図１５（ｃ））。ＬＲ反応は、１ｍＬチューブ中において、緩衝液及びＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって提供されるＬＲ酵素と共にＧＯＩ含有ｐＤＯＮＲ２２１プラスミドを目的ベクターと混合することを伴い、ここで、ＬＲ酵素は、ｐＤＯＮＲ２２１から目的プラスミドのドッキング部位にＧＯＩカセットを組換える。全てのトランスジーン構築に使用された目的ベクターは、ＣＡＧＧプロモータ、続いてゲートウェイ進入部位、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）及びプピューロマイシン耐性選択マーカ又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポータのいずれかを含む。カセット全体には、転移可能なＰＢ部位が隣接する。ＬＲ組換え後、ＧＯＩを含有する最終目的ベクター（図１５（ｄ））を制限酵素消化によって確認した。
【０３０９】
ＥＳ細胞培養、トランスフェクション、選択及びクローニング
近交系Ｃ５７ＢＬ／６Ｎマウス株（Ｇｅｒｔｓｅｎｓｔｅｉｎ  ２０１０）に由来するマウスＥＳ細胞を、１５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、ＥＳ細胞培養物との適合性について試験）及び標準量のピルビン酸ナトリウム、非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、グルタマックス、ペニシリン／ストレプトマイシン、β−メルカプト−エタノール及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を補充したＤＭＥＭ高グルコース中で培養した（Ｂｅｈｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４）。細胞をマイトマイシンＣ不活化マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）のフィーダー層上で培養した。培養物を標準的な細胞培養インキュベーター中において３７℃及び５％ＣＯ２で維持した。
【０３１０】
トランスフェクションは、ＪｅｔＰＲＩＭＥ試薬（Ｐｏｌｙｐｌｕｓ、カタログ＃１４−０７）を製造業者プロトコルに従って使用して実施し、３つの工程で行った：１）ＰＤ−Ｌ１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ目的ベクターのみを用いたトランスフェクション、２）ピューロマイシン選択マーカを保有する他の全てのトランスジーンを用いたトランスフェクション、及び３）ｅＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰトランスジーンを用いたトランスフェクション。
【０３１１】
工程１：ＰＤ−Ｌ１−ＩＲＥＳ−ＧＦＰでのトランスフェクションに続いて、細胞を低密度でプレーティングし、それにより５〜６日後に複数回の増殖後、細胞凝集体（コロニー）として存在する個々の細胞クローンをＧＦＰ発現の強度に基づいて選択し、次いでクローン細胞培養物として拡大した。最も高く最も一貫したＧＦＰ発現を有するクローンを次の工程のために選択した。
【０３１２】
工程２：ピューロマイシン選択マーカを含有するトランスジーンでのトランスフェクションの２４時間後、ピューロマイシンを培養培地に添加した。３日目に細胞をクローン密度でプレーティングし、個々のコロニーを採取し、クローンとして拡大させるまでピューロマイシン選択を続けた。多数のこれらのクローンをインビボでスクリーニングし、同種設定において奇形腫を形成することができるクローンを「ＮＴ２」と命名した。
【０３１３】
工程３：ＮＴ２を上記のようにＰＢ−ＣＡＧ−ｅＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰでトランスフェクトし、クローン密度でプレーティングした。ＧＦＰ＋クローンを採取し、拡大した。高レベルのＧＦＰ発現を有する１０個のクローンをさらなる研究のために選択した。
【０３１４】
トランスジーン発現レベルの評価
ＲＮＡを、３０ｍｍ培養プレート上で増殖させた培養物及びインビボで増殖させた腫瘍から単離した。細胞をトリプシンで解離させ、遠心分離し、上清を除去した。細胞ペレットを直ちにドライアイス上で凍結し、−８０℃で保存した。腫瘍組織を切開し、直ちにドライアイス上で凍結し、−８０℃で保存した。Ｓｉｇｍａ  ＧｅｎｅＥｌｕｔｅ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット＃ＲＴＮ３５０を使用して、標準的なプロトコルに従ってＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｕａｎｔｉｆａｓｔ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅキット＃２０５３１３を用いた逆転写酵素反応によって得た。定量的ＰＣＲを、ＢｉｏｌｉｎｅからのＳｅｎｓｉｆａｓｔマスターミックス、＃Ｂｉｏ−９８０２０、遺伝子特異的プライマー及びＲＮＡを１：５０希釈で使用して実施した。サンプルを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  ｅｐＭｏｔｉｏｎ  ５０７０ロボットを使用して３８４ウェルプレートにプレーティングし、定量的ＰＣＲを標準的なプロトコルに従ってＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ３８４  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｃ１０００サーマルサイクラー上で行った。ｑＰＣＲデータをＢｉｏＲａｄ  ＣＦＸ  Ｍａｎａｇｅｒ  ３．１ソフトウェアによって捕捉し、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて発現レベルを計算した。
【０３１５】
奇形腫アッセイ
Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｈｉｇｈ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃａｔ＃  ３５４２４８）を氷上において冷ＤＭＥＭ培地で１：１に希釈した。５×１０７細胞をＤＭＥＭ５００ｕＬ及び同量のＭａｔｒｉｇｅｌに懸濁した。懸濁物の１００ｕｌ  ５×１０個の細胞をＢ６Ｎ（同系）又はＦＶＢ／Ｎ（同種）の各背側側腹部に皮下注入した。得られた奇形腫は、注入後２〜４週間で形成された。奇形腫の大きさは、ノギスを用いて測定し、容積は、式Ｖ＝（Ｌ×Ｗ×Ｈ）／２で計算した。腫瘍を約５００ｍｍ２まで増殖させ、これは、十分に耐性であり、またダウンストリーム実験に十分に適した大きさである。トランスジーンの全ては、「フェイルセーフシステム」を含む細胞に送達された（例えば、国際公開第２０１６／１４１４８０号パンフレット（その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように）。この遺伝子システムは、ガンシクロビル（ＧＣＶ）の投与を伴う細胞分裂の完全な阻害を可能にする。以前に記載された実験からの奇形腫が５００ｍｍ２に到達したら、マウスに５０ｍｇ／ｋｇのＧＣＶを２〜３日毎に２〜３週間腹腔内注入した。この処置計画は、腫瘍の最初の短時間の収縮をもたらし、続いて処置の２〜３週間後に４００〜５００ｍｍ２で腫瘍の大きさを安定化させた。実験の終点でマウスを犠牲にし、腫瘍を切開した。少量の組織をＲＮＡ抽出のためにスナップ凍結すると共に、残りを４％パラホルムアルデヒド中で固定した。
【０３１６】
生物発光イメージング
ｅＬｕｃｉｆｅｒａｓｅトランスジーンでトランスフェクトされた細胞に由来する奇形腫を発症したマウスに３０ｍｇ／ｍＬのＶｉｖｏＧｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒｉｎを１００ｕＬ／２５ｇ体重（Ｐｒｏｍｅｇａ  ＃Ｐ１０４Ｃ）で１０分注入した後、画像化した。動物をイソフルランで麻酔し、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅソフトウェアによって駆動されるＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩイメージャー（Ｃａｌｉｐｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に入れた。露光時間は、シグナル強度に応じて５秒〜５分に設定した。
【０３１７】
組織学
固定された腫瘍をパラフィンに包埋し、切片化し、ＣＭＨＤ病理学コアでの組織学的分析のためにヘマトキシリン／エオシンで染色した。組織学的画像をＮＤＰｖｉｅｗ２ソフトウェアで処理した。
【０３１８】
実施例２：クローク細胞の生成
表１の遺伝子をコードするトランスジーンを発現ベクターにクローニングし、配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限酵素消化及び配列決定の両方により、全て当該技術分野で公知の標準的な方法を用いて検証した。
【０３１９】
トランスジーンＣｄ４７、Ｃｄ２００、ＦａｓＬ及びＨ２−Ｍ３を含有する構築物のセット（セット１）を、本発明者らのＣ５７ＢＬ／６マウスＥＳ株（Ｃ２）に由来するマウス胚幹細胞にトランスフェクトした。トランスジーンの存在をＰＣＲにより確認し、発現したタンパク質の発現を免疫組織化学的検査により記録した（図１Ａ〜Ｄ）。トランスジーンＣｃｌ２１、Ｍｆｇｅ８、ＴＧＦ−β及びＳｐｉ６を含有する構築物の第２のセット（セット２）をＦＶＢ／Ｎ由来のＥＳ細胞（ＥＳ系Ｃ２）にトランスフェクトした。
【０３２０】
培地が１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭを使用したことを除いて、類似の方法を用いてクロークＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞を生成した。
【０３２１】
実施例３：Ｔ細胞活性化の阻害のためのスクリーニングプロセス
修飾されたインビトロ混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを用いて、Ｔ細胞活性化の最も効率的な阻害を生じるトランスジーンの組み合わせについてスクリーニングした。実施例１からのセット１及びセット２のクローキングトランスジーンでトランスフェクトされた細胞株を使用した。ドナーＯＴ−Ｉ脾細胞をカルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルＣＦＳＥで標識し、９６ウェルプレートの各ウェルに６０，０００個の細胞を添加した。ＥＳ又は黒色腫細胞を卵子発現細胞と１０：１で混合した。これらの１０，０００個を脾細胞の各ウェルに添加した。ＩＬ−２を一般的な活性化因子として添加し、３日後にフローサイトメトリーによりＴ細胞増殖を測定した（図２Ａ〜２Ｅ）。最初に、細胞を、ＣＤ８＋細胞のみを含むようにゲートし、全ての条件を４回反復で設定した。
【０３２２】
陰性対照（脾細胞のみ）は、ベースライン６．１２％増殖速度をもたらした（図２Ａ）。野生型Ｂ１６黒色腫（＋１０％卵子発現）細胞は、１７．１％への増殖の明確な加速をもたらす（図２Ｂ）一方、クローク細胞は、この増殖を９．５１％に減少させた（図２Ｃ）。野生型（図２Ｄ）対クロークされたＥＳ細胞（図２Ｅ）について同様の結果が得られた。
【０３２３】
実施例４：同系及び同種移植Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞におけるＷＴ及びクローク癌細胞を用いた研究
候補クローキングトランスジーンのいくつかは、免疫認識カスケードの開始期を阻害又は調節することが意図されるため、これらのトランスジーンの効果は、これらの事象が宿主ＡＰＣの成熟及び局所リンパ節への物理的移動に作用し、そこでそれらが続いてナイーブＴ細胞及びＢ細胞を活性化するため、ＭＬＲ単独によって評価され得る。
【０３２４】
これは、インビボ同種設定において多数のトランスジーン組み合わせをスクリーニングし得る代替アッセイを必要とした。種々のトランスジーンの組み合わせを有する腹腔内及び静脈内注入ＥＳ細胞を選択肢として試みた。しかし、奇形腫の発生は、最小数のＥＳ細胞の凝集に依存し（注入部位に応じて１×１０５〜５×１０６）、この選択肢をこのようなスクリーニングに適合しないものにする。しかしながら、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するマウス黒色腫癌細胞株Ｂ１６Ｆ１０は、このように限定されない。５×１０３未満の静脈内注入は、肺の多種多様な癌小結節を効率的に導入する結果をもたらす。注入される細胞の数を制限することにより、癌細胞が肺胞に捕捉されて、単一の細胞又はごく少数の細胞に由来する小結節を形成することが予想され得る。これらの小結節を単離及び遺伝子型決定することにより、トランスジーンを同定することができる。
【０３２５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（同系移植片対照）の血流中へのＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞の注入は、肺における癌小結節の形成をもたらした（図３Ａ、左パネル）。しかしながら、注入後１４日目に観察した場合、陰性対照（野生型Ｂ１６Ｆ１０黒色腫を同種対照ＦＶＢマウスに移植した）の肺にも小さい黒色腫結節が形成された。しかしながら、黒色腫を２４日間増殖させた場合、結節は、ほぼ完全に退縮した（図３Ａ、右パネル）。
【０３２６】
ＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン系を用いて作製した、候補クローキング遺伝子のランダムな組み合わせを発現する癌細胞の混合物を注入することにより、上記実験を繰り返した。同種設定で発生した肺結節は、同種移植片を認識及び拒絶から保護するのに必要な成功した組み合わせを含んでいた（図３Ｂ、右パネル）。同じ免疫クローク細胞は、同系宿主において加速された発生も生じた（図３Ｂ、左パネル）。
【０３２７】
実施例５：非クローク胚幹細胞は、同種設定において奇形腫を形成しない
表４に示されるように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来する野生型ＥＳＣは、ＦＶＢ／Ｎマウスにおいて奇形腫を形成することができないことが確認された。同様に、本発明者らは、ＦＶＢ／Ｎバックグラウンドに由来する野生型ＥＳＣがＣ５７ＢＬ／６宿主において奇形腫を形成できないことも示した。ＥＳ細胞コロニーをトリプシンで解離させ、添加剤を含まないＤＭＥＭで１回洗浄し、１ミリリットル当たり約５０００万細胞の濃度でＭａｔｒｉｇｅｌ  ＨＣに再懸濁した。レシピエントマウスを麻酔し、１００マイクロリットルを各側腹部領域に皮下注入した。発生中の奇形腫を１２週間追跡し、触診及びノギスによる体積測定によって確認した。
【０３２８】
【表１０】
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【０３２９】
実施例６：クロークＥＳ細胞は、同系宿主及び同種宿主において増殖することができる
候補トランスジーンのクローキング能力を検証するために、ＥＳＣを同じトランスジーンでトランスフェクトし、同時に、画像化によって検出することができるルシフェラーゼトランスジーンを添加した。簡単に述べると、ＥＳ細胞を上述のように調製した。生存細胞の存在を画像化によって繰り返し測定した。図４の画像は、注入後１７日目に撮った。
【０３３０】
図４において、上のパネルは、同系宿主における免疫クローク細胞の増殖を示す一方、下のパネルは、同種宿主における免疫クローク細胞の増殖を示す。
【０３３１】
別の実験では、８つの免疫調節トランスジーン（クローンＮＴ２）の高発現を有するＣ５７ＢＬ／６マウス由来のクロークされたＥＳ細胞を、ミスマッチＭＨＣ対立遺伝子を有する異なる同種マウス株（Ｃ３Ｈ、ＦＶＢ／Ｎ及びＣＤ１）に皮下注入した。赤い矢印は、形成された奇形腫を示す（図５Ａ〜５Ｃ）。
【０３３２】
実施例７：クローク組織を有するマウスは、免疫を損なわない
非免疫クローク（野生型）ＥＳＣを、既存の免疫クローク組織を有するマウスに移植し、マウスを評価して、非免疫クローク移植片を効果的に拒絶することができるかどうかを決定した（図６）。同じマウスを１５日間にわたり数回画像化した。図６の左パネルに示されるように、同系マウス対照において、移植片は、経時的に拒絶されなかった。同種ＦＶＢマウスでは、図６の右パネルの左マウスが既存の免疫クローク移植片（矢印）を有していた。図６の右パネルの中央のマウスは、以前にＣ５７ＢＬ／６同種ＥＳＣで移植されたが、移植を拒絶した（理論に拘束されないが、拒絶は、Ｃ５７ＢＬ／６細胞に対する予め形成された抗体に起因した可能性がある）。図６の右パネルの右側にあるマウスは、以前に移植されていなかった。３匹全てのマウスは、非免疫クローク移植片を問題なく拒絶した。右側のマウスは、移植片をより遅く拒絶したが、これは、Ｃ５７ＢＬ／６細胞に対する予め形成された抗体がなかったためであった可能性がある。
【０３３３】
野生型胚幹細胞が、クロークされた奇形腫を有するＦＶＢ／Ｎマウスへの注入後９日まで検出された場合、同様の実験が行われた（図７）。しかしながら、１２日目には、残存する細胞の証拠が検出できなかった。対照動物は、クロークされた腫瘍も担持するＣ５７ＢＬ／６マウスであった。これらのマウスにおけるシグナルは、実験の時間経過に伴って増加した。
【０３３４】
実施例８：クローキング及びフェイルセーフ胚幹細胞株
フェイルセーフＣ５７ＢＬ／６ＥＳ細胞株（例えば、国際公開第／２０１６／１４１４８０号パンフレットに記載されるような）を５つの候補クローキングトランスジーン（ＰＤ−Ｌ１、ＦａｓＬ、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００及びＨ２−Ｍ３）で同時トランスフェクトした場合、これらのトランスジーン株のいずれも、同種移植片設定において奇形腫を生じなかった。同時トランスフェクトされた遺伝子のセットは、３つのさらなる候補クローキング遺伝子：Ｓｐｉ６、Ｃｃｌ２１ｂ及びＭｆｇｅ８によって拡大された場合、３８のクローン系統が生成された。これらの系統の１つ、ＮＴ２は、同種レシピエント（ＦＶＢ）において奇形腫を作製した。ＮＴ２系統を含む３８個のクローン系統におけるクローキング遺伝子の発現レベル（図８Ａ〜Ｈの矢印参照）を、定量的ＰＣＲを用いて測定した（図８Ａ〜Ｈ）。３８クローンのうち、ＮＴ２は、ＷＴ  ＥＳ細胞と比較してＣｃｌ２１ｂ（１６，０００×）、ＦａｓＬ（２５，０００×）、Ｃｄ２００（１７００×）、Ｃｄ４７（１６×）、Ｍｆｇｅ８（３４×）、Ｓｐｉ６（６００×）及びＨ２−Ｍ３（７５０×）の最も高い過剰発現であった。ＰＤ−Ｌ１は、クローンの中で最高レベルの発現体ではないが、ＥＳ細胞上の３５０×発現も有意な増加であった。これらの遺伝子の発現は、Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｇｒａｎｄｉｏｓｅデータセット（ｗｗｗ．ｓｔｅｍｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ｐｒｏｊｅｃｔ＿ｇｒａｎｄｉｏｓｅ）においてチェックされ、Ｃｃｌ２１ｂ、ＦａｓＬ、Ｃｄ２００、ＰＤ−Ｌ１及びＳｐｉ６発現が検出閾値未満であり、従ってそれらのＥＳ細胞に対する相対的発現が非常に高いことも見出される。このデータに基づいて、これらの８つの高度に活性化された遺伝子は、同種移植片の免疫寛容の誘導において主要な役割を有し得る。
【０３３５】
ＮＴ２細胞をＣ５７ＢＬ／６の両方に注入して、ＦＶＢ同種設定（図１１Ａ〜１１Ｂ）及びＦＶＢ同系Ｃ５７Ｂｌ／６同系設定において奇形腫を作製した。同種奇形腫（ｎ＝６）は、１２日目から３８日目まで着実に増殖していた。５００ｍｍ２の大きさで、ガンシクロビル（ＧＣＶ）処置を開始して、腫瘍の増殖性構成要素を除去した（図１２Ａ〜１２Ｂ、上部パネル（図１２Ａ）同系奇形腫；底部パネル（図１２Ｂ）同種奇形腫）。２０日間の処置により同種移植片の成長が停止した。この実験は、１）フェイルセーフ及びクローク（ＮＴ２）細胞由来の奇形腫がＧＣＶ処置と同様に応答し、それらは、短時間のＧＣＶ曝露後に休眠状態に入ること、２）ＧＣＶ後、奇形腫は、安定したままであることを示す。休眠組織の拒絶の兆候はなく、及び３）ＦＶＢ動物における奇形腫増殖の動態は、Ｃ５７ＢＬ／６と異なる。
【０３３６】
高レベルで発現されたクローキングトランスジーンは、同種マウスにおいて奇形腫を形成するために生存する。本発明者らの系において、クローキングトランスジーンは、非常に強力な合成プロモータＣＡＧ下で発現される（図１９の概略図に示される）。ＣＡＧプロモータは、サイトメガロウイルス初期エンハンサーエレメント、ウサギβ−グロビン遺伝子のスプライサーアクセプター並びにプロモータ、ニワトリβ−アクチン遺伝子の第１エキソン及び第１イントロンの組み合わせである。本発明者らは、各々がトランスジーンの異なる発現レベルを有する多くの異なるＥＳ細胞クローンにおけるトランスジーン転写産物のレベルについて広範なｑＰＣＲ分析を行った。クローキングトランスジーンの最も高い発現を有するＥＳクローンのみが同種宿主において生存する。
【０３３７】
図９に示すように、クローキング技術に関連する免疫調節遺伝子の転写産物発現レベルは、ＥＳ細胞クローン間で変化した。同心円は、ｌｏｇ１０スケールで描かれている。太い黒線は、１×であり、次の外側リングは、１０×であり、次に１００×である。最も内側のリングは、０．１×である。全ての値は、免疫調節トランスジーンを天然に発現するマウスリンパ器官から単離された活性化白血球である陽性対照に対して標準化される。左上のパネルは、参考のためのトランスジェニック修飾を有さない野生型ＥＳ細胞を示し、それらは、関連する免疫調節トランスジーンをほとんど又は全く発現しない。対照的に、クローンＮＴ２及びクローン１５（赤い四角で示される）は、両方とも遺伝子の高発現を有し、同種宿主において生存した。図９に示す他の全てのクローンは、同種宿主中で生存しなかった。
【０３３８】
クローキングトランスジーンの高発現は、図１０にも示されている。図１０に示すように、ＮＴ２細胞株及びＮＴ２由来奇形腫における８個のクローキングトランスジーンの全ては、ＥＳ細胞ゲノムにおける全ての遺伝子の上位５％にある発現レベルを有し、クローキングトランスジーンの５個は、ＥＳ細胞ゲノムにおける全ての遺伝子の上位１％に発現レベルを有する。これらの遺伝子の１つのみがゲノム中の全遺伝子の上位５％の発現レベルを有するため、これらの遺伝子の発現は、ＷＴ  ＥＳ細胞においてはるかに低い。
【０３３９】
実施例９：クロークされたＥＳＣは、同種奇形腫における３つ全ての胚層に寄与する
次に、免疫クローキングが奇形腫においてＥＳＣの完全な多能性発達能力を広げることを可能にするかどうかを尋ねた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスに由来するクロークされたＥＳＣ及びクロークされていないＥＳＣの同系及び同種宿主への注入から生じる奇形腫を組織病理学（ヘマトキシリン及びエオシン染色）によって分析した。図１３Ａ〜１３Ｂ（上部パネルにおける同系宿主ニューロン、骨及び円柱上皮（図１３Ａ）；並びに下部パネルにおける同種宿主ニューロン、骨、円柱上皮及び血管（図１３Ｂ））は、両方の背景から得られた代表的な画像を示し、クローキングトランスジーンの発現がこれらのＥＳ細胞の正常な発生能力を妨害せず、腫瘍が十分に血管新生されていることを証明する。同系組織及び同種組織の両方は、免疫細胞浸潤を示さなかった。
【０３４０】
別の実験において、本発明者らは、クロークされたＥＳ細胞が３つの胚葉（内胚葉、外胚葉及び中胚葉）の全てから細胞を形成し得るかどうかを試験することにより、真に多能性であるかどうかを試験した（図１４Ａ〜１４Ｄ）。これは、１０６〜１０７のクロークされたＥＳ細胞をマウスの皮下に注入し、それらを増殖させ、奇形腫と呼ばれる組織塊に分化させることによってアッセイした。次いで、奇形腫をＥＳ細胞注入の３〜４週間後に除去し、組織切片を切断し、Ｈ＆Ｅで染色した。これらの切片を細胞形態について顕微鏡下で分析して、３つの胚葉全てが存在するかどうかを決定した。
【０３４１】
ＥＳ細胞に挿入され、高レベルで発現された８個のクローキングトランスジーンが、３つ全ての胚葉を形成するそれらの能力を破壊するかどうかを尋ねた。それらは、そうしなかった。図１４Ａ〜１４Ｃは、３つの胚葉を示す（ｅｃ＝外胚葉、図１４Ａに示す；ｅｎ＝内胚葉、図１４Ｃに示す；ｍｅ＝中胚葉、図１４Ｂに示す）。図１４Ｄは、これらの組織が十分に血管化されていることを検証する血管を示す。
【０３４２】
実施例１０：クローキングトランスジーンを発現するＥＳ細胞は、トランスジーンによりコードされるタンパク質を産生する
本発明者らは、蛍光抗体に基づく顕微鏡法を用いて、ＮＴ２  ＥＳ細胞（最も高い発現を有するクローンの１つ）におけるクローキングトランスジーンによってコードされるタンパク質の存在を直接確認した（図１６Ａ〜１６Ｈ）。これらのデータは、トランスジーンによってコードされるタンパク質が、高レベルのｍＲＮＡ発現に基づいて予想される容易に検出可能なレベルでＥＳ細胞において発現されることを確認する。
【０３４３】
実施例１１：高レベルのクローキングトランスジーンを発現するＥＳ細胞は、典型的な形態を有し、共通のＥＳ細胞マーカを発現する
本発明者らは、クロークされたＥＳ細胞を分析し、それらがＥＳ細胞のマーカを発現し、正常なＥＳ細胞形態を保持しているかどうかを決定した。クロークされたＥＳ細胞は、健康な多能性ＥＳ細胞で観察される典型的な形態を有し（図１７Ａ）、また健康な多能性ＥＳ細胞の特徴であるアルカリホスファターゼについて陽性に染色される（図１７Ｂ）。さらに、本発明者らのクロークされたＥＳ細胞は、蛍光抗体を使用して、転写因子Ｏｃｔ４（図１８Ａ）及びＳＳＥＡ（図１８Ｂ）（両方とも正常多能性ＥＳ細胞の共通マーカ）について陽性に染色された。これらのデータは、高レベルの８つの免疫調節性クローキングトランスジーンを発現するＥＳ細胞がそれらの形態及び共通のＥＳ細胞マーカの発現に関して正常なＥＳ細胞として現れることを示す。挿入図は、Ｏｃｔ４及びＳＳＥＡ１についての染色（左下挿入図）がＥＳ細胞と共局在することを示す（右上挿入図においてＤＡＰＩを使用して可視化される）。
【０３４４】
実施例１２：ＩＦＮγＲ１  ｄ３９は、ＥＳ細胞におけるＭＨＣのアップレギュレーションを防止する
活性化されたＴ細胞はＩＦＮγを分泌し、これは、ＥＳ細胞に由来する組織及び細胞を含む多くの細胞型上で発現されるＩＦＮγＲ１／Ｒ２複合体に結合する。ＩＦＮγ受容体へのＩＦＮγ結合は、細胞表面上のＨＬＡ（マウスにおけるＭＨＣ）及びＨＬＡ関連分子のアップレギュレーションを誘導し、これは、同種移植片の同種性及び免疫拒絶の可能性を増加させる。ドナーとレシピエントとの間のＨＬＡタンパク質（主要抗原とも呼ばれる）の差異は、全ての同種移植における拒絶の主要な原因である。
【０３４５】
ＩＦＮγシグナル伝達の破壊がＨＬＡアップレギュレーションを阻害するか、又は減少させるかを評価するために、本発明者らは、野生型ＩＦＮγＲ１又はドミナントネガティブＩＦＮγＲ１（細胞質尾部に３９アミノ酸を欠くＩＦＮγＲ１  ｄ３９）トランスジーンを含むピギーバック組み込み可能ベクターを用いてＣ５７ＢＬ／６ＥＳ細胞をトランスフェクトした。これらのトランスジーンは、同じピギーバック組み込みカセット上に含まれるトランスジーンの上流の構成的ＣＡＧプロモータの制御下で発現された。
【０３４６】
次いで、野生型及びトランスフェクトされたＥＳ細胞を培養物中で増殖させ、１００ｎｇ／ｍＬのＩＦＮγリガンドに２４時間曝露した。野生型ＥＳ及びＩＦＮγＲ１トランスフェクト細胞（それぞれ図２０の左側及び中央パネル）において、ＩＦＮγ曝露は、Ｈ−２ｋｂ及びＨ−２Ｄｂ主要組織適合性表面分子（ＭＨＣクラスＩ）の増大した発現をもたらしたが、ＩＦＮγＲ１  ｄ３９細胞（図２０の右側パネル）ではそうではなかった。ＰＢＳ単独への暴露は、効果がなかった。ＭＨＣクラスＩレベルを蛍光抗体染色により検出し、フローサイトメトリーにより平均蛍光強度（ＭＦＩ）を測定することにより発現レベルを定量した。これらのデータは、ＩＦＮγＲ１  ｄ３９の過剰発現がＥＳ細胞におけるＩＦＮγ媒介性ＭＨＣのアップレギュレーションを完全に阻害することを示し、これは、ＥＳ細胞におけるＩＦＮγＲ１  ｄ３９の発現が免疫系の活性化を予防し、免疫拒絶の可能性を減少させるために使用され得ることを示す。従って、ＩＦＮγＲ１  ｄ３９は、免疫活性化及び移植拒絶を減少させるために、本明細書に記載されるクローク細胞によって発現され得る有用な免疫抑制トランスジーンである。
【０３４７】
実施例１３：湿性ＡＭＤを有する対象へのＶＥＧＦ阻害剤を発現するクローク細胞の投与
本明細書に開示される方法によれば、当業者の医師は、湿性ＡＭＤを用いて、ヒト患者などの患者を処置して、眼の血管新生を低減するか、又は疾患の進行を予防又は低減することができる。この目的のために、当業者の医師は、構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）の制御下のＶＥＧＦ阻害剤（例えば、ＶＥＧＦ−Ｔｒａｐ、例えばアフリベルセプト）の制御下において、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するクローク細胞（例えば、クロークＲＰＥ細胞又はＲＰＥ細胞に分化したクローク幹細胞）をヒト患者に投与することができる。クローク細胞は、湿性ＡＭＤを処置するために、例えば眼への局所投与（例えば、網膜下腔への注入）によって患者に投与され得る。２５，０００〜１０万個のクローク細胞（例えば、２５，０００、５０，０００、７５，０００又は１００，０００個のクローク細胞）を、罹患した各眼に投与することができる。
【０３４８】
患者へのクローク細胞の投与後、当業者の医師は、種々の方法により、ＶＥＧＦ阻害剤の発現及び治療に応答した患者の改善を監視し得る。例えば、医師は、標準的なアプローチを使用して、患者の視力及び眼の血管新生を監視し得る。患者の視力が改善するか、又は悪化しないか、又は眼の血管新生がクローク細胞の投与前に採取された測定と比較して減少するか若しくは悪化しないという知見は、患者が処置に良好に応答していることを示す。その後の用量を決定し、必要に応じて投与することができる。
【０３４９】
実施例１４：パーキンソン病（ＰＤ）の対象へのクロークされたドーパミン作動性ニューロンの投与
本明細書に開示される方法によれば、当業者の医師は、ＰＤの運動症状（例えば、運動緩慢、振戦又は硬直）を軽減するために、又は疾患進行を予防若しくは軽減するために、ＰＤを有するヒト患者などの患者を処置することができる。この目的のために、当業者の医師は、構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）の制御下において、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するクローク細胞（例えば、クローキングトランスジーンを発現するように修飾されたドーパミン作動性ニューロン又はドーパミン作動性ニューロンに分化されたクローク幹細胞）をヒト患者に投与することができる。クローク細胞は、ＰＤを処置するために、例えば中枢神経系への局所投与（例えば、黒質への定位注入）により患者に投与することができる。２５，０００〜１０万個のクローク細胞（例えば、２５，０００、５０，０００、７５，０００又は１００，０００個のクローク細胞）を投与することができる。患者は、任意選択的に、ドーパミンアゴニストのようなＰＤのための追加の治療を投与され得る。
【０３５０】
患者へのクローク細胞の投与後、当業者の医師は、種々の方法により、治療に応答した患者の改善を監視し得る。例えば、医師は、標準的な神経学的試験を用いて患者の運動を監視することができる。患者の運動症状がクローク細胞の投与前に採取された測定と比較して改善するか、又は悪化しないという知見は、患者が処置に良好に応答していることを示す。その後の用量を決定し、必要に応じて投与することができる。
【０３５１】
実施例１５：心筋梗塞に罹患した対象へのクロークされた心筋細胞の投与
本明細書に開示される方法によれば、当業者の医師は、最近心筋梗塞に罹患したヒト患者などの患者を処置して、心機能を改善する（例えば、死んだ又は損傷した心筋細胞を置き換える）ことができる。この目的のために、当業者の医師は、構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）の制御下において、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するクローク細胞（例えば、クロークされた心筋細胞又は心筋細胞に分化されたクロークされた幹細胞）をヒト患者に投与することができる。クローク細胞は、心筋梗塞後の回復を促進するために、例えば心臓への局所投与（例えば、心筋への注入）によって患者に投与され得る。細胞は、単独療法として心筋に注入することができるか、又は細胞は、バイパス手術若しくは別の心臓切開手術手順の実施中に送達することができる。１００万〜５０億個のクロークされた心筋細胞（例えば、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７又は１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９又は５×１０９個のクローク細胞）を投与することができる。
【０３５２】
患者へのクローク細胞の投与後、当業者の医師は、種々の方法により、治療に応答した患者の改善を監視し得る。例えば、医師は、標準的なアプローチ（例えば、ＥＫＧ、心エコー図、血管造影図、ストレス試験又は核イメージング）を使用して、患者の心機能を監視し得る。患者の心機能がクローク細胞の投与前に採取された測定と比較して改善又は安定化するという知見は、患者が処置に良好に応答していることを示す。その後の用量を決定し、必要に応じて投与することができる。
【０３５３】
実施例１６：ＴＮＦα阻害剤を発現しているクローク細胞のＲＡ患者への投与
本明細書に開示される方法によれば、当業者の医師は、関節硬直、腫脹又は疼痛を軽減するために、関節リウマチを有する患者（例えば、ヒト患者）を処置し得る。この目的のために、当業者の医師は、構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）の制御下において、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）及び誘導性プロモータ（例えば、テトラサイクリン応答エレメント）の制御下でＴＮＦα阻害剤（例えば、アダリムマブなどのＴＮＦα阻害抗体）を発現するクローク細胞（例えば、クロークされた関節線維芽細胞又は関節線維芽細胞に分化されたクロークされた関節線維芽細胞）をヒト患者に投与することができる。クローク細胞は、ＲＡを処置するために、例えば関節への局所投与（例えば、手の関節のような関節炎関節への注入）により、患者に投与され得る。抗炎症性の生物学的物質を発現している１００万〜１億個のクローク関節線維芽細胞（例えば、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７又は１×１０８個のクローク間接線維芽細胞）を各罹患関節に投与することができる。患者がＲＡ症状の再発を経験する場合、患者は、ＴＮＦα阻害剤の発現を駆動するためにテトラサイクリン又はドキシサイクリンで処置され得る。テトラサイクリン又はドキシサイクリンは、患者の再発が解消したときに中止することができる。
【０３５４】
患者へのクローク細胞及びテトラサイクリン又はドキシサイクリンの投与後、当業者の医師は、種々の方法により、ＴＮＦα阻害剤の発現及び治療に応答する患者の改善を監視することができる。例えば、医師は、標準的なアプローチを使用して、患者の関節の疼痛、腫脹及び硬直を監視し得る。患者の関節の疼痛、腫脹又は硬直がクローク細胞の投与前に得られた測定値と比較して減少しているという知見は、患者が処置に良好に応答していることを示す。その後の用量を決定し、必要に応じて投与することができる。
【０３５５】
実施例１７：１型糖尿病の対象へのインスリンを発現するクローク細胞の投与
本明細書に開示される方法によれば、当業者の医師は、１型糖尿病を有する患者（例えば、ヒト患者）を処置して、インスリンレベルを増加させることができる。この目的のために、当業者の医師は、構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）及び構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）の制御下のインスリンの制御下において、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するクローク細胞（例えば、クロークされた幹細胞、クロークされた膵臓β細胞又は膵臓β細胞に分化されたクロークされた幹細胞）をヒト患者に投与することができる。クローク細胞は、１型糖尿病を処置するために、例えば皮下注入によって（例えば、クロークされた皮下組織を作製するために）患者に投与され得る。インスリンを発現する１００万〜３０億個のクローク細胞（例えば、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７又は１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９又は３×１０９個のクローク細胞）を皮下投与することができる。
【０３５６】
患者へのクローク細胞の投与後、当業者の医師は、種々の方法により、治療に応答した患者の改善の発現を監視し得る。例えば、医師は、標準的なアプローチを用いて、１型糖尿病のインスリンレベル又は症状（例えば、意図しない体重減少、疲労又はぼやけた視力）を監視することができる。患者のインスリンレベルが増加するか、又は１型糖尿病の症状がクローク細胞の投与前に採取された測定値と比較して減少しているという知見は、患者が処置に良好に応答していることを示す。その後の用量を決定し、必要に応じて投与することができる。
【０３５７】
実施例１８：第ＶＩＩＩ因子を発現しているクローク細胞の血友病患者への投与
本明細書に開示される方法によれば、当業者の医師は、血友病を有する患者（例えば、ヒト患者）を処置して、血液凝固因子のレベルを増加させるか、又は過剰な出血若しくは打撲傷を減少させ得る。この目的のために、当業者の医師は、構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）及び構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）の制御下にある第ＶＩＩＩ因子の制御下でＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するクローク化細胞（例えば、クローク幹細胞、クローク内皮細胞又は内皮細胞に分化されたクローク幹細胞）をヒト患者に投与することができる。クローク細胞は、血友病を処置するために、例えば皮下注入によって（例えば、クロークされた皮下組織を作製するために）患者に投与され得る。第ＶＩＩＩ因子を発現している１００万〜３０億個のクローク細胞（例えば、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７又は１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９又は３×１０９個のクローク細胞）を皮下投与することができる。
【０３５８】
患者へのクローク細胞の投与後、当業者の医師は、種々の方法により、治療に応答した患者の改善の発現を監視し得る。例えば、医師は、標準的なアプローチを使用して、血友病の第ＶＩＩＩ因子レベル又は症状（例えば、過剰な出血又は頻繁な打撲傷）を監視し得る。患者の第ＶＩＩＩ因子レベルが増加するか、又は血友病の症状がクローク細胞の投与前に採取された測定値と比較して減少するという知見は、患者が処置に良好に応答していることを示す。その後の用量を決定し、必要に応じて投与することができる。
【０３５９】
実施例１９：グルコセレブロシダーゼを発現するクローク細胞のゴーシェ病対象への投与
本明細書に開示される方法によれば、当業者の医師は、グルコセレブロシドの蓄積を減少させるために、又はゴーシェ病の症状（例えば、疲労、貧血、低血小板数、肝臓又は脾臓の肥大）を減少させるために、ゴーシェ病を有するヒト患者などの患者を処置し得る。この目的のために、当業者の医師は、構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）及び構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）の制御下のグルコセレブロシダーゼの制御下において、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するクローク細胞（例えば、クローク幹細胞）をヒト患者に投与することができる。クローク細胞は、例えば、皮下注入（例えば、クロークされた皮下組織を作製するために）によって患者に投与されて、ゴーシェ病を処置し得る。グルコセレブロシダーゼを発現する１００万〜３０億個のクローク細胞（例えば、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７又は１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９又は３×１０９個のクローク細胞）を皮下投与することができる。
【０３６０】
患者へのクローク細胞の投与後、当業者の医師は、種々の方法により、治療に応答した患者の改善の発現を監視し得る。例えば、医師は、標準的なアプローチを用いて、グルコセレブロシドの蓄積又はゴーシェ病の症状（例えば、疲労、貧血、低血小板数、肝臓又は脾臓の肥大）を監視することができる。クローク細胞の投与前に採取された測定と比較して患者のグルコセレブロシドの蓄積又はゴーシェ病の症状が減少しているという知見は、患者が処置に良好に応答していることを示す。その後の用量を決定し、必要に応じて投与することができる。
【０３６１】
実施例２０：肝移植を受けている対象へのクローク細胞の投与
本明細書に開示される方法によれば、当業者の医師は、移植拒絶のリスクを低減するために、肝移植を受けている患者（例えば、ヒト患者）を処置し得る。この目的のために、当業者の医師は、構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）の制御下において、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するクローク細胞（例えば、クローク幹細胞、クローク肝細胞又は肝細胞に分化されたクローク幹細胞）をヒト患者に投与することができる。クローク細胞は、移植拒絶の危険性を減少させるために、例えば肝臓又は移植された肝臓の部位の近くへの注入によって患者に投与され得る。１００万〜１０００億個のクローク細胞（例えば、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０又は１×１０１１個のクローク細胞）を肝臓又はその近くに投与することができる。
【０３６２】
患者へのクローク細胞の投与後、当業者の医師は、種々の方法により、治療に応答した患者の改善の発現を監視し得る。例えば、医師は、標準的なアプローチを使用して、移植拒絶を予測する症状について患者を監視し得る。免疫抑制剤を投与された対象で観察されたのと同等の移植拒絶の結果の知見は、患者が処置に良好に応答していることを示す。その後の用量を決定し、必要に応じて投与することができる。
【０３６３】
実施例２１：インスリンを発現しているクローク及びフェイルセーフ細胞の１型糖尿病対象への投与
本明細書に開示される方法によれば、当業者の医師は、１型糖尿病を有する患者（例えば、ヒト患者）を処置して、インスリンレベルを増加させることができる。この目的のために、当業者の医師は、構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）及び構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）の制御下のインスリンの制御下において、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するクローク細胞（例えば、クロークされた幹細胞、クロークされた膵臓β細胞又は膵臓β細胞に分化されたクロークされた幹細胞）をヒト患者に投与することができる。クローク細胞は、ＣＤＬの発現を、陰性選択マーカをコードするＤＮＡ配列の発現と連結することにより、それらの増殖の制御を可能にするようにも修飾され得る。例えば、クローク細胞は、２つのＣＤＬ遺伝子座（例えば、Ｃｄｋ１及びＴｏｐ２Ａ）に同型接合性ＡＬＩＮＫＳ（例えば、ＨＳＶ−ＴＫ系）を含むように修飾され得る。クローク細胞は、１型糖尿病を処置するために、例えば皮下注入によって（例えば、クロークされた皮下組織を作製するために）患者に投与され得る。インスリンを発現する１００万〜３０億個のクローク細胞（例えば、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７又は１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９又は３×１０９個のクローク細胞）を皮下投与することができる。
【０３６４】
患者へのクローク細胞の投与後、当業者の医師は、種々の方法により、治療に応答した患者の改善の発現を監視し得る。例えば、医師は、標準的なアプローチを用いて、１型糖尿病のインスリンレベル又は症状（例えば、意図しない体重減少、疲労又はぼやけた視力）を監視することができる。患者のインスリンレベルが増加するか、又は１型糖尿病の症状がクローク細胞の投与前に採取された測定値と比較して減少しているという知見は、患者が処置に良好に応答していることを示す。その後の用量を決定し、必要に応じて投与することができる。
【０３６５】
当業者の医師は、クロークされた皮下組織の大きさも監視し得る。クロークされた皮下組織が腫瘍形成性になりつつあると思われる場合、医師は、増殖しているクローク細胞を除去するためにガンシクロビルを対象に投与し得る。非増殖性クローク細胞は、ＣＤＬを発現せず、従ってガンシクロビル処置によって除去されない。
【０３６６】
実施例２２：インスリンを発現しているクローク及びフェイルセーフ細胞の１型糖尿病対象への投与
本明細書に開示される方法によれば、当業者の医師は、１型糖尿病を有する患者（例えば、ヒト患者）を処置して、インスリンレベルを増加させることができる。この目的のために、当業者の医師は、構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）及び構成的プロモータ（例えば、ＣＭＶ又はＣＡＧ）の制御下のインスリンの制御下において、ＰＤ−Ｌ１、ＨＬＡ−Ｇ（Ｈ２−Ｍ３）、Ｃｄ４７、Ｃｄ２００、ＦＡＳＬＧ（ＦａｓＬ）、Ｃｃｌ２１（Ｃｃｌ２１ｂ）、Ｍｆｇｅ８及びＳｅｒｐｉｎ  Ｂ９（Ｓｐｉ６）の１つ又は複数（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ又は８つ全て）を発現するクローク細胞（例えば、クロークされた幹細胞、クロークされた膵臓β細胞又は膵臓β細胞に分化されたクロークされた幹細胞）をヒト患者に投与することができる。クローク細胞は、ＣＤＬの発現を、誘導性活性化因子系をコードするＤＮＡ配列の発現と連結することにより、それらの増殖の制御を可能にするようにも修飾され得る。例えば、ｄｏｘ−架橋は、２つのＣＤＬ（例えば、Ｃｄｋ１及びＴｏｐ２Ａ）に挿入されて、誘導物質（例えば、ドキシサイクリン）の存在下でｄｏｘ−架橋がＣＤＬ発現を可能にし、それによって細胞分裂及び増殖を可能にするように、クローク細胞中の両方のＣＤＬにおいて同型接合性修飾を生成し得る。クローク細胞は、１型糖尿病を処置するために、例えば皮下注入によって（例えば、クロークされた皮下組織を作製するために）患者に投与され得る。インスリンを発現する１００万〜３０億個のクローク細胞（例えば、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７又は１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９又は３×１０９個のクローク細胞）を皮下投与することができる。
【０３６７】
患者へのクローク細胞の投与後、当業者の医師は、種々の方法により、治療に応答した患者の改善の発現を監視し得る。例えば、医師は、標準的なアプローチを用いて、１型糖尿病のインスリンレベル又は症状（例えば、意図しない体重減少、疲労又はぼやけた視力）を監視することができる。患者のインスリンレベルが増加するか、又は１型糖尿病の症状がクローク細胞の投与前に採取された測定値と比較して減少しているという知見は、患者が処置に良好に応答していることを示す。その後の用量を決定し、必要に応じて投与することができる。医師が、対象がより高いレベルのインスリンを必要とすると決定した場合、医師は、ドキシサイクリンで対象を処置することにより、クローク細胞を増殖させることができる。所望のレベルのインスリンに到達したら、ドキシサイクリンでの処置を停止することができ、クローク細胞の増殖が停止する。
【０３６８】
【表１１】
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【０３６９】
【表１２】
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【０３７０】
【表１３】
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【０３７１】
【表１４】
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【０３７２】
【表１５】
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【０３７３】
【表１６】
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【０３７４】
【表１７】
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【０３７５】
【表１８】
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【０３７６】
【表１９】
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【０３７７】
【表２０】
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【０３７８】
【表２１】
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【０３７９】
【表２２】
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【０３８０】
【表２３】
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【０３８１】
【表２４】
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【０３８２】
【表２５】
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【０３８３】
【表２６】
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【０３８４】
【表２７】
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【０３８５】
【表２８】
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【０３８６】
【表２９】
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【０３８７】
【表３０】
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【０３８８】
【表３１】
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【０３８９】
【表３２】
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【０３９０】
【表３３】
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【０３９１】
【表３４】
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【０３９２】
【表３５】
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【０３９３】
【表３６】
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【０３９４】
【表３７】
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【０３９５】
【表３８】
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【０３９６】
【表３９】
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【０３９７】
【表４０】
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【０３９８】
【表４１】
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【０３９９】
【表４２】
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【０４００】
【表４３】
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【０４０１】
【表４４】
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【０４０２】
【表４５】
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【０４０３】
【表４６】
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【０４０４】
【表４７】
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【０４０５】
【表４８】
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【０４０６】
【表４９】
2020523037.tif 000068
【０４０７】
【表５０】
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【０４０８】
【表５１】
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【０４０９】
【表５２】
2020523037.tif 000071
【０４１０】
【表５３】
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【０４１１】
【表５４】
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【０４１２】
【表５５】
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【０４１３】
【表５６】
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【０４１４】
【表５７】
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【０４１５】
【表５８】
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【０４１６】
【表５９】
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【０４１７】
【表６０】
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【０４１８】
【表６１】
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【０４１９】
【表６２】
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【０４２０】
【表６３】
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【０４２１】
【表６４】
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【０４２２】
【表６５】
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【０４２３】
【表６６】
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【０４２４】
【表６７】
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【０４２５】
【表６８】
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【０４２６】
【表６９】
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【０４２７】
【表７０】
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【０４２８】
【表７１】
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【０４２９】
【表７２】
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【０４３０】
【表７３】
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【０４３１】
【表７４】
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【０４３２】
【表７５】
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【０４３３】
【表７６】
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【０４３４】
【表７７】
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【０４３５】
【表７８】
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【０４３６】
【表７９】
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【０４３７】
【表８０】
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【０４３８】
【表８１】
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【０４３９】
【表８２】
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【０４４０】
【表８３】
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【０４４１】
【表８４】
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【０４４２】
【表８５】
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【０４４３】
【表８６】
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【０４４４】
【表８７】
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【０４４５】
【表８８】
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【０４４６】
【表８９】
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【０４４７】
【表９０】
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【０４４８】
【表９１】
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【０４４９】
【表９２】
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【０４５０】
【表９３】
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【０４５１】
【表９４】
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【０４５２】
【表９５】
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【０４５３】
【表９６】
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【０４５４】
【表９７】
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【０４５５】
【表９８】
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【０４５６】
【表９９】
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【０４５７】
【表１００】
2020523037.tif 000119
【０４５８】
【表１０１】
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【０４５９】
【表１０２】
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【０４６０】
【表１０３】
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【０４６１】
【表１０４】
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【０４６２】
【表１０５】
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【０４６３】
特定の具体的な実施形態を参照して本開示を説明したが、その様々な修正形態が当業者に明らかであろう。本明細書で提供される全ての例は、本開示を例示する目的のためにのみ含まれ、本開示を限定することを意図するものでは決してない。本明細書で提供される任意の図面は、本開示の様々な態様を例示することのみを目的とするものであり、本開示を縮尺したり限定したりすることを意図するものでは決してない。本明細書に添付される特許請求の範囲は、上記の説明に記載された好ましい実施形態によって限定されるべきではなく、全体として本明細書と一致する最も広い解釈が与えられるべきである。本明細書に列挙される全ての先行技術の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ−Ｄ】
2020523037.tif 000125
【図２Ａ−Ｅ】
2020523037.tif 000126
【図３Ａ−Ｂ】
2020523037.tif 000127
【図４】
2020523037.tif 000128
【図５Ａ−Ｃ】
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【図６】
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【図７】
2020523037.tif 000131
【図８Ａ−Ｃ】
2020523037.tif 000132
【図８Ｄ−Ｆ】
2020523037.tif 000133
【図８Ｇ−Ｈ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ−Ｂ】
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【図１２Ａ−Ｂ】
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【図１３Ａ−Ｂ】
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【図１４Ａ−Ｄ】
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【図１５】
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【図１６Ａ−Ｈ】
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【図１７Ａ−Ｂ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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