(57)【要約】【課題】ＩＵＩ授精（洗浄された精子を子宮内に導入）は、精子Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）発現が最小値を通過するとき、すなわち約最小値の時間ウィンドウ内にあるときに発生するべきである。【解決手段】ＦｃＲ発現が最小値を通過する時点で授精する準備を整えるために、精子は標準的慣行に従って授精のために調製される。ＩＵＩ手順の時間自体は、好ましい精子状態で発生するように、また洗浄された精子を子宮内に注入することによって医師が患者を治療するための臨床の許可された時間ウィンドウ内に調整される。ＦｃＲ発現のレベルは時間ベースのアッセイによって決定され、授精はアッセイによって決定される精子の受精能状態に基づいて実施される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
授精または保存のために精液サンプルを利用するための最適な時間を決定するための方法であって、この方法は、
ｉ．  試験される男性対象からの精液サンプルを提供し、前記サンプルを制御された条件下でインキュベートする工程と、
ｉｉ．  精子の受精能状態を示すマーカーを選択する工程であって、ここで前記マーカーの発現が前記精子の受精能状態と相関し、ここで前記マーカーがＦｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方である、マーカーを選択する工程と、
ｉｉｉ．  複数の時点で、前記ＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の発現レベルを前記精液サンプル中の精子によって検出する工程と、
ｉｖ．  前記精液サンプル中の前記精子が前記ＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方を、前記精子のＦｃＲ発現が最大値に近づくことと相関する約最大値または所定のレベルで発現する時点を決定する工程と、
ｖ．  前記精子が前記Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の最小値レベルの発現を示す時点を選択し、それによって投与の最適な時間または授精もしくは凍結のための前記精液サンプルを提供し、改善された妊娠結果を提供する工程とを含む、方法。
【請求項２】
前記制御された条件が、前記精液を一定の温度、ｐＨまたはその両方の下でインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記制御された条件が、約０℃〜約３７℃の温度で前記精液をインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記制御された条件が、約１２℃〜約３７℃の温度で前記精液をインキュベートすることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
工程（ｉｉｉ）で、前記複数の時点が少なくとも１０分間隔である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｉｉｉ）で、前記複数の時点が少なくとも１５分間隔である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｉｉｉ）で、前記複数の時点が少なくとも２０分間隔である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｉｉｉ）で、前記複数の時点が少なくとも３０分間隔である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
工程（ｖ）の前記時点が、前記Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の前記最小値レベルの発現の約２０分前から約２０分後にある、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
改善された妊娠結果を得るための方法であって、この方法は、
ｉ．試験される男性対象からの精液サンプルを提供し、前記サンプルを制御された条件下でインキュベートする工程と、
ｉｉ．精子の受精能状態を示すマーカーを選択する工程であって、ここで前記マーカーの発現が、時間と共に変化し、ここで前記マーカーがＦｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方である、マーカーを選択する工程と、
ｉｉｉ．複数の時点で、前記ＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の前記精液サンプル中の精子による発現レベルを検出する工程と、
ｉｖ．前記精液サンプル中の前記精子が前記ＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方を、前記精子のＦｃＲ発現が最大値に近づくことと相関する約最大値または所定のレベルで発現する時点を決定する工程と、
ｖ．前記精子が前記Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の最小値レベルの発現を示す前に起こる時点を選択し、それによって前記精液サンプルを授精または凍結のために投与する最適な時間を提供する工程と、
ｖｉ．ＩＵＩまたは凍結によって前記処理された精子を女性に授精し、それによって改善された妊娠結果が得られる工程とを含む、方法。
【請求項１１】
前記制御された条件が、約２０℃〜約３７℃の温度で前記精液をインキュベートすることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記制御された条件が、約３７℃の温度で前記精液をインキュベートすることを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｉｉｉ）で、前記複数の時点が少なくとも１０分間隔である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｉｉｉ）で、前記複数の時点が少なくとも１５分間隔である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｉｉｉ）で、前記複数の時点が少なくとも２０分間隔である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ｉｉｉ）で、前記複数の時点が少なくとも３０分間隔である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｖ）の前記時点が、前記Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の前記最小値レベルの発現の約２０分前から約２０分後にある、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
女性患者における授精を実施するための方法であって、
ｉ．試験される男性対象からの精液サンプルを採取し、前記サンプルを制御された条件下でインキュベートする工程と、
ｉｉ．前記射精液の精子のアリコートをアッセイするために、前記採取された精液のごく一部を除去する工程と、
ｉｉｉ．複数の時点におけるＦｃ受容体（ＦｃＲ）マーカーの前記発現レベルを検出する工程であって、ここで前記ＦｃＲの前記発現が前記精子の受精能状態を示す、検出する工程と、
ｉｖ．前記精液サンプル中の前記精子が前記ＦｃＲマーカーを最大値で発現し、前記精液サンプル中の前記精子の処理を開始する前記時点を決定する工程と、
ｖ．前記精子が前記Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）の最小値レベルの発現を示す前に起こる時点を選択し、それによって前記精液サンプルを授精のために投与する最適な時間を提供する工程と、
ｖｉ．ＩＵＩまたは凍結によって前記処理された精子を女性に授精し、それによって改善された妊娠結果が得られる工程とを含む、方法。
【請求項１９】
前記制御された条件が、約３７℃の温度で前記精液をインキュベートすることを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｉｉｉ）で、前記複数の時点が少なくとも１０分間隔である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
工程（ｉｉｉ）で、前記複数の時点が少なくとも１５分間隔である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ｉｉｉ）で、前記複数の時点が少なくとも２０分間隔である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｉｉｉ）で、前記複数の時点が少なくとも３０分間隔である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｖ）の前記時点が、前記Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の前記最小値レベルの発現の約２０分前から約２０分後にある、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
ＦｃＲ発現、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の前記レベルが、精子内で検出され、ここで前記精子は、精液、膣液、培地、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つに含まれる、請求項１、１０、または１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１月１５日に出願された、人工授精における受精能を改善する方法と題された、米国仮特許出願第６２／４４６，４５５号に優先権の利益を主張するものであり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、人工授精（ＡＩ）、特に子宮内授精（ＩＵＩ）の精子サンプルの受精能を改善する方法を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
人工授精においてより高い受精率を達成するための哺乳類の精液の処理は、特に自然の手段によって子を得ようと試みたカップルに特に有利でありうる。保険社会福祉省によれば、不妊症は、米国のカップルの１０〜１５％に計り知れない苦しみを与えている。アメリカ生殖医学会の実践委員会（受精能および不妊症ｖｏｌ．１０３）の２０１５年の報告によれば、男性が要因である場合は、カップルにおける不妊症の３０〜４０％を占める。Ａｇａｒｗａｌ（２０１５）によるさらに新しい発行物においては、男性因子不妊症は、不妊症症例の２０〜３０％を占め、症例の５０％に寄与していた。これらの困難をさらに悪化させるのは、人々が子を生もうと選ぶ時期が人生においてますます遅くなることであって、母体の高齢化問題だけでなく、父親の年齢問題も生じる。
【０００４】
さらに、人工授精で使用される精子の質を向上させることによって良好な受精能を達成することは、酪農場の成功または失敗の唯一にして最大の決定因子であると考えられる。なぜなら「オープン」または非妊娠の乳牛は乳を分泌せず、したがって生産的ではないため、利益を減少させる。結果として、受精能の向上は価値あることとみなされる。類似の状況は、子孫数が収益性を駆動する、乳製品または食肉用に飼養されるの他のタイプの動物に対しても存在する。家畜には、ヤギ、ヒツジ、ウシ、バッファロー、ラクダ、ブタなど多くの種が含まれる。また、外来種または絶滅危惧種におけるオス側の受精能を改善するために、当技術分野において長期的なニーズがある。
【０００５】
ＵＳ  ９３８３３６９には、ＡＩで使用するための精液を処理するためのプロセス制御方法が記載されており、これは特に、以前は望まれていたがこのプロセス制御なしでは達成しえなかった圃場形質（ｆｉｅｌｄ  ｔｒａｉｔｓ）の選択に関してより一貫した結果を可能にする。本方法は、ＡＩの処理のためにリアルタイムでプロセス内で採取された精液のモニタリングを含む。本方法は、例えば、卵子を受精させる能力などの、所望の形質を有する精液サンプルを得るための時間ベースのアッセイの開発を妨げてきた、精子群が代謝的に活性化するタイミングのばらつきのために、所望の結果に対する障害への解決策を提供する。また、均一な特性を有する精子分量の生産も妨げられてきた。
【０００６】
具体的には、記載された方法は、精液サンプル中の精子の代謝状態の変化を、リアルタイムでモニタリングすることを含む。個々の精液サンプル中の精子の代謝状態のリアルタイムアッセイは、個々の精子サンプルの採取後に、精液サンプル中の精子が所望の形質、例えば受精能を有する時、より良好でより一貫した決定を可能にする。このような方法は、乳牛の群れを授精させるのに入選した雄牛が使用される酪農業では、重要な有用性を見出した。そのような雄牛は受精能が証明されており、遺伝的に比較的均質であり、完全に同一の管理下に置かれた収容および通常の獣医による給餌により精液処理を容易にする。また、アッセイは、授精を実施するのに使用される分量（ストロー）に希釈および処理される、正にその精液に対して行われる。
【０００７】
しかしながら、人間が補助する生殖臨床では、カップルは一般的に、不妊症精密検査に呼ばれる前に、何度も妊娠を得ようと試みている。不妊症は、世界保健機関によって、通常の無保護の性交から１２カ月経っても臨床妊娠を達成できないことと一般的に定義されている。例えば、低質の精子を含む妊娠を防止する生物学的欠乏がある。したがって、このような臨床では、妊娠はｗｗｗ．ｂａｂｙｃｅｎｔｅｒ．ｃｏｍによれば、典型的には、ＩＵＩを使用して約４〜５％のみおよびＩＵＩおよび受精能技術を使用して７〜１６％の割合でが達成される。より高価なインビトロ受精（ＩＶＦ）手順は、年齢に応じて、約５〜４０％の割合で各女性のサイクルについて確実な結果を達成する（３８〜４０歳の女性についてはサイクル当たり２１％の成功）。安価で安全なＩＵＩ手順を使用して、確実な妊娠の割合を増加させることが望ましい。
【０００８】
個体から採取した精液サンプルからの精子行動の時間経過における変動性の程度は、ＩＵＩにおける精子授精のための好ましい時間予測不能にする。さらに、ヒト臨床で精液を処理する方法は、リアルタイムのモニタリングを著しく複雑にする。アッセイは、遠心分離によって授精のために準備されている精子を用いて行うことはできず、有害な工程は家畜では決して使用されない。遠心分離前に取られたアリコートは、実験室分析に使用され、アッセイされる精子は、したがって授精のために使用されるものとは異なって処理される（ウシに対するのとは異なる）。さらに、ヒトの臨床では、ＩＵＩに使用される精子を、子宮内に配置されたときのけいれんを防ぐために合成培地に洗い流し、精子をさらに人工的な条件や射精液には見られない化学物質や環境にさらす。多くの場合、精子数が制限されているか、他の意味で精子に欠陥があり、家畜の精液分量では決して見られない状況である。したがって、ウシとの作業とは全く対照的に、ヒトの臨床での作業のためには非常に異なるサンプルを臨床分析のために使用しなければならず、授精のための精子は非常に異なって処理され、多様な結果のリスクを引き起こす。精子細胞のこの異なるサンプルにもかかわらず、それらは直接アッセイされていない分量（授精）のために意図した細胞における適切な精子状態をそれでもなお予測しなければならない。
【０００９】
人間が補助する生殖臨床における精子分析は、現在、未処理の射精液の単一サンプルを単一の時点で評価することによって実施されていることが理解されている。この時点は一般的に、精子が卵子を受精させることができるようになる前に発生する。というのも、射精されたばかりの哺乳類の精子は不妊だからである。したがって、精子の健康状態およびＩＵＩ分量に適した状態にある精子を正確に判断するために不可欠な二つの重要な情報、すなわち時間とともに変化する精子行動に関するデータ、および誘発されうる精子行動の変化に関するデータが欠けている。これらの変化は、精子の質および精子の状態に応じて、多かれ少なかれ発生する。
【００１０】
この情報の欠落が種を超えてどのように有害であるかについては多くの例がある。例えば、豚肉産業や乳牛界の特定の地域におけるものがほとんどである、冷凍されていない精子分量の貯蔵寿命は測定されたことがない。これは、いくつかの悪い射精液が使用され、受胎に悪影響を及ぼしうることを意味する。前述のように、ヒト臨床では、医療上の決定は、射精液から射精液への変動を表すものではない単一のデータセットに基づいており、単一の射精液における精子の生物学的変化は、経時的にまたはインビトロでの特定の薬剤による誘発により生じる。この単一時点試験法は、精子が経時的にどのように変化するか、または誘発時に正常な精子に典型的な行動の変化を伴って反応するのに十分健康であるかどうかについての理解を曖昧にする。この分野の著名な専門家は、ヒトの臨床における現在の精子評価法の無用さを説明し、また、ＩＵＩよりも技術的に複雑な方法、特にＩＶＦおよび卵細胞質内精子注入法（ＩＣＳＩ）が、生まれた赤ちゃんにＩＶＦとＩＣＳＩから危険をもたらす可能性があるという懸念を表明している（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、２００９年、Ａｌｕｋａｌ、２００８年）。あるケースでは、看護師は、赤ちゃんが新生児のＩＣＵに入ったときに決まって質問されることは、これがＩＶＦの赤ちゃんかどうかということであると出願人に打ち明けた。看護師は、これはＩＶＦの赤ちゃんが弱いため、医療スタッフがより綿密に監視する必要があるためだと述べた。
【００１１】
明らかに、精子分量の受精能を増加させる手段と同様に、精子行動と受精能（状態）との密接な相関関係を提供する方法が必要とされている。医療費の削減と女性とその赤ちゃんへの医療リスクへのプラスの影響は、最終的に本当に欲しかった子どもをもうけることができたカップルによって得られる計り知れない利益に加えることができる。
【００１２】
しかし、子孫を望んでいるカップルのためのそのような射精歴の収集は、入選雄牛ほど簡単には入手できない。さらに、ヒトの生活の通常の変化は、入選雄牛農場の制御された条件では見られないものの、同じ男性からの各射精液をさらに異なるものにすることができる。さらに、人間が補助する生殖臨床におけるＩＵＩのための精液処理には、精子を洗浄して天然精液を除去することが含まれる。したがって、ＩＵＩ分量のためのヒト精子の処理は、授精される正にその精子を試験することを著しく妨げ、代わりにこのプロセスは、アリコートサンプルおよび天然精液培地中の精子の試験から利益を得ることができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、人間が補助する生殖臨床において、確実な妊娠結果を得るために、精子を授精するのに好ましい時間を提供するために、信頼できる時間ベースアッセイを開発することが、当技術分野において依然として必要とされている。理想的には、アッセイは、従前の男性歴（ｐｒｉｏｒ  ｍａｌｅ  ｈｉｓｔｏｒｙ）なしでＩＵＩ手順でオンサイトで実施することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
現在記載しているのは、ＩＵＩにおける受胎とより適合する好ましい精子状態での授精を可能にし、増加した確実な妊娠結果を提供する方法である。このように、本説明は、ＡＩ臨床で使用するために精液をＩＵＩ分量に処理するためのプロセス管理の方法を提供する。本明細書に記載の方法は、特定の精液サンプル中の精子の連続的に活性化された群の代謝状態の変化を、リアルタイムでモニタリングすることを含む。特定の精液サンプル中の活性精子群の代謝状態のリアルタイムアッセイは、個々の精子サンプルの採取後に、精液サンプル中の精子が授精のための所望の受精能状態を有する時、精子またはそのサブセット（コホート、グループまたはバッチ）のより良好でより一貫した決定を可能にする。例えば、集団の精子活性化の総代謝率を経て進行する中で、精液または緩衝液サンプル中の一群の精子の代謝状態をリアルタイでムモニタリングすることは、個々の精液サンプルの受精能状態の発現のリアルタイム発生を決定するのに使用でき、確実な妊娠結果のための授精に好ましい時間を提供する。有利なことに、本明細書に開示される方法は現場で使用することができ、また確実な妊娠結果の増加は、現在の治療よりも低い薬物暴露により、プロセスをより経済的かつより安全にする。これらの方法は、侵襲的卵子回収およびそれに付随する女性に対する外科的危険性の使用なしに授精を可能にする。
【００１５】
したがって、一態様では、インキュベーションおよび／または処理中の精液サンプル中の精子の代謝状態の変化をモニタリングすることによって、女性が授精するための精液サンプルの最適な処理時間を決定する方法があり、この方法は、
ｉ．試験される男性対象からの精液サンプルを提供し、サンプルを制御された条件下でインキュベートする工程と、
ｉｉ．精子の受精能状態を示すマーカーを選択する工程であって、ここでマーカーの発現が、時間と共に変化し、ここでマーカーがＦｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方である、マーカーを選択する工程と、
ｉｉｉ．複数の時点で、ＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の精液サンプル中の精子による発現レベルを決定する工程と、
ｉｖ．精液サンプル中の精子がＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方を、精子のＦｃＲ発現が最大値に近づくことと相関する約最大値または所定のレベルで発現する時点を決定する工程と、
ｖ．精子がＦｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の最小値レベルの発現を示す前に起こる時点を選択し、それによって改善された妊娠結果を提供するための精液サンプルを授精のために処理する最適な時間を提供する工程とを含む。
【００１６】
特定の実施形態では、方法は、精液サンプル中の精子を授精のために調製する工程をさらに含み、それにより調製が完了し、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の発現が最小値である場合に近い期間中に授精が起こり得、それによって精液サンプルを授精のために使用するための好ましい時間を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本明細書は、卵子を受精させるために同種のメスに精子を授精する前にオスからの精液サンプルをリアル時間ベースでアッセイすることによって改善された妊娠結果を得るための方法を提供し、この時間ベースのアッセイ法は、
ｉ．試験される男性対象からの精液サンプルを提供し、前記サンプルを制御された条件下でインキュベートする工程と、
ｉｉ．精子の受精能状態を示すマーカーを選択する工程であって、ここでマーカーの発現が、時間と共に変化し、ここでマーカーがＦｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方である、マーカーを選択する工程と、
ｉｉｉ．複数の時点で、ＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の精液サンプル中の精子による発現レベルを決定する工程と、
ｉｖ．精液サンプル中の精子がＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方を、精子のＦｃＲ発現が最大値に近づくことと相関する約最大値または所定のレベルで発現する時点を決定する工程と、
ｖ．精子が、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の最小値レベルの発現を示す前に起こる時点を選択し、精液サンプル中の精子を授精のために調製し、それにより調製が完了し、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の発現が最小値である場合に近い期間中に授精が起こり得、それによって精液サンプルを授精のために使用するための好ましい時間を提供する工程と、
ｖｉ．精子のＦｃＲ発現が最小値になる時点付近で、処理された精子をＩＵＩによって女性に授精することにより、改善された妊娠結果を得る工程とを含む、方法。
【００１８】
アッセイは、合成培地中の精液のアリコートまたは洗浄された精子のアリコート上で行うことができ、これが望ましい場合、洗浄培地中の精子のアッセイを可能にし、洗浄培地中の活性化された精子の群に従い、授精の時間を決定することができる。
【００１９】
好ましい実施形態では、改善された確実な妊娠結果を得るために最適な時間に、新たに採取した射精液で女性を妊娠させる方法は、
ｉ．射精液を採取する工程と、
ｉｉ．該精子の受精能状態を示すＦｃ受容体（ＦｃＲ）マーカーの発現について、経時的に該射精液の精子をアッセイするために採取された精液のごく一部またはアリコートを除去する工程と、
ｉｉｉ．複数の時点で、ＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方のアリコート中の精子による発現レベルを決定する工程と、
ｉｖ．精液サンプル中の精子がＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方を、精子のＦｃＲ発現が最大値に近づくことと相関する約最大値または所定のレベルで発現する時点を決定する工程と、
ｖ．精子が、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の最小値レベルの発現を示す前に起こる時点を選択する工程と、
ｖｉ．調製が完了し、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の発現が最小値になるときに近い期間中に授精が起こりうるように、授精のために該射精液の残りの精子を処理する工程であって、ここで該処理後、残りの射精液の精子は所望の受精能状態を有し、それにより精液サンプルを授精のために使用するのに好ましい時間を提供する、処理する工程と、
ｖｉｉ．精子のＦｃＲ発現が最小値になる時点付近で、処理された精子をＩＵＩによって女性に授精することにより、女性の授精のための最適な時間に所望の受精能状態で精子を得、改善された確実な妊娠結果を得る工程とを含む、方法。
【００２０】
マーカーには、好ましくは限定されないが、アクロソームの長さもしくは形態、アクロソーム膜の外観またはその構成要素が含まれ、これは原形質膜内の開窓を通して点状パターンで現れ、かかるパターンはアクロソーム吻から開始してさらに頭の方へと延び、精液サンプルの精子の細胞表面分子の発現、精液サンプルの精子の静電荷、および精液サンプルの精子または精子周囲の培地に脱落する精子由来物質（ＦｃＲなど）の精子またはその断片による染料の浸透性、精液サンプルの精子の細胞表面分子の発現、精液サンプルの精子の静電荷、および精液サンプルの精子の精子またはその断片による染料の浸透性が含まれる。好ましいマーカーは、精子頭部の表面上のＦｃ受容体である。使用したマーカーがＦｃＲ発現に相関する限り、本発明に従って使用することができる。
【００２１】
別の実施形態では、精液サンプルは、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、２５、３０分の範囲の間隔で該マーカーについてアッセイされ、これはマーカーの発現の変化の速度、アッセイを実施するのに必要な時間、またはその両方に依存する。ある好ましい実施形態では、精液サンプルは１５分間または３０分間隔でアッセイされる。さらなる態様では、アッセイは、精液サンプルのアリコート、または精子のアリコートを利用して、分量中の精子に相関する結果を生成することが好ましい。
【００２２】
別の実施形態では、精子サンプルは、代謝状態のマーカーのモニタリングの間、一定の温度でインキュベートされる。
【００２３】
別の実施形態では、マーカーは、好ましくは限定されないが、精子の表面上または内部またはその両方で発現するリガンド、レクチン、酵素、受容体から選択される。一実施形態では、リガンドは、好ましくは限定されないが、流動性または異なる膜領域、例えば脂質ラフトの識別するために、例えば、蛍光偏光測定の緩和時間に反映されるような（適切なラベル脂質プローブによって反射されるような）、脂質分子構造よりもむしろ相対膜流動性によって検出されるものを含む、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物および糖脂質ならびに脂質を含む。別の実施形態では、マーカーは、好ましくは限定されないが、アクロソームの長さ、アクロソームの形態、アクロソームラフリング、ピーナッツアグルチニン陽性標的の発現、細胞表面分子の発現、該精子の静電荷、および精子膜の浸透性、脂質、コレステロール、ホスファチジルセリン、糖およびタンパク質、細胞内イオン、ならびに重炭酸塩から選択される。前述のように、好ましいマーカーは、精子頭部の表面上のＦｃ受容体である。精子の変化状態、および精子上のＦｃ受容体の発現の変化と相関することができる任意のマーカーを使用することができる。
【００２４】
一実施形態では、第一のリガンドの結合または精子と薬剤との相互作用は、二次マーカーの出現を誘発し、それは二次マーカーを補助リガンドと接触させることによって検出される。あるいは、本発明によるアッセイは、結合しないが精子に進入するかまたは他の方法（チャンネル、例えばイオンチャンネルを通じて、精子上の脂質二重層の一つへの脂質挿入または薬剤の移動など）で相互作用する薬剤を用いて行い、好ましくは検出可能な、好ましくは目に見える変化をモニターすることができる経時的な変化を誘発することができる。
【００２５】
別の実施形態では、該精子またはその断片による染料の浸透性は、精子またはその断片の該染料の強度によって該精子サンプルのアリコートでアッセイされる。精子は、精子膜上に精漿剤を結合することが知られている。出願人は、精子が周囲の培地から薬剤を吸収または貪食することができることを示唆するデータを観察した。したがって、精子の断片には、精巣や精巣上体に形成される精子だけでなく、精子が積荷として獲得する薬剤も含まれると解釈されるべきである。
【００２６】
別の実施形態では、細胞表面マーカーの発現をモニターし、精液サンプルを処理するために選択された時点を、該サンプル中の該マーカーの発現がピーク発現に対して減少し、その後発現の最小値から増加し始めた早い時点に関して決定される。
【００２７】
一実施形態では、アッセイは、特定されたマーカーを有する精液サンプル中の精子の割合に基づく。一態様では、特定マーカーは生化学的マーカーであり、これは随意に細胞表面上に存在する。いずれにしても、マーカーは、精子の代謝受精能状態を反映するか、または示す。マーカーは、精子特異的マーカーに限定されない。
【００２８】
一実施形態では、アッセイは、精子の代謝受精能状態を反映するマーカーを有する精液サンプル中の精子の割合を決定することを包含する。アッセイは、ａ）精液サンプルからアリコートを除去する工程と、ｂ）アリコートをマーカーに対する第一のリガンドと接触させる工程と、ｃ）該精子による該リガンドの結合を検出する工程と、ｄ）リガンドに結合する該アリコート中の精子の割合を決定する工程とを含む。この実施形態の代替の態様では、工程ｄ）は、マーカーまたはリガンドに直接または間接的に結合する検出可能なラベルによってマーカーのレベルを評価する工程によって置き換えることができる。
【００２９】
別の実施形態では、アッセイは、該精液サンプルの精子中に検出された該マーカーの濃度を決定することを包含し、ａ）精液サンプルからアリコートを除去する工程と、ｂ）アリコートを該マーカーに対する第一のリガンドと接触させる工程と、ｃ）該精子による該リガンドの結合を検出する工程と、ｄ）リガンドによるマーカーの結合を定量化することによって、該アリコート中の精子によって発現されるマーカーの量を決定する工程と、それによって、該精液サンプルの精子中で検出された該マーカーの濃度を決定する工程とを含む。
【００３０】
特定の実施形態では、リガンドは検出可能なラベル、好ましくは可視ラベルでラベルされる。特定の実施形態では、リガンドはラベル抗体、例えば、抗ＦｃＲ抗体に結合するラベル抗ＦｃＲ抗体またはラベル抗体である。
【００３１】
このアッセイの別の実施形態では、精子によるリガンドの結合を検出することは、直接的または間接的に精子または精子の断片に結合したラベルを検出することを含む。一態様では、精子断片は、無傷の精子から関連付けられるか、または分離されているかのどちらかである。
【００３２】
別の実施形態では、精子によるリガンドの結合を検出することは、アリコート中の精子と第一のリガンドに結合する第二のリガンドとを接触させることを包含する。
【００３３】
別の実施形態では、第一のリガンドおよび／または第二のリガンドは抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかであってもよく、一つまたは複数のラベルを含むことができる。
【００３４】
本明細書に記載される方法およびアッセイの別の実施形態では、精子の代謝受精能状態のインジケーターは生化学的マーカーである。生化学的インジケーターは、以下の生化学的インジケーター、細胞表面分子、酵素および受容体のうちの一つまたは複数を含むが、これに限定されない。
【００３５】
本発明によれば、時間ベースのアッセイは、男性不妊症の診断アッセイとしても使用されうる。また、ＩＵＩの妊娠結果をより成功させるため、適切な受精能状態の精子を提供するために、後でＩＵＩで使用するための凍結または凍結融解分量の精子の調製にも使用できる。
【００３６】
この明細書に組み込まれてその一部を形成する添付の図面は、本発明のいくつかの実施形態を図示するものであり、この説明と共に、この発明の原理を説明するのに役立つ。図面は、本発明の実施形態の解説の目的のためのみであり、本発明を限定すると解釈されるものではない。この発明の例示的な実施形態を示す添付の図面とあわせて、以下の発明を実施するための形態から、この発明のさらなる目的、特徴および利点が明らかになることとなる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１Ａおよび図１Ｂは、ドナーからの精液の異なるサンプルにおけるＦｃ受容体陽性精子の割合の時間ベースのグラフを説明する。
【図２】図２Ａおよび図２Ｂは、別のドナーからの精液の異なるサンプルにおけるＦｃ受容体陽性精子の割合の時間ベースのグラフを説明する。
【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄは、第三のドナーからの精液の異なるサンプルにおけるＦｃ受容体陽性精子の割合の時間ベースのグラフを説明する。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂは、第四のドナーからの精液の異なるサンプルにおけるＦｃ受容体陽性精子の割合の時間ベースのグラフを説明する。
【図５】図５は、自然な授精プロセスのために精液中に脱落したＦｃＲの蓄積を示す破線の矢印を伴う精子ＦｃＲ陽性対時間の割合のグラフである。
【図６】図６は、精子がＩＵＩプロセスのために洗浄されるとき、脱落したＦｃＲの蓄積を示す破線の矢印を伴う精子ＦｃＲ陽性対時間の割合のグラフである。
【図７】図７は、自然な授精対ＩＵＩプロセスのために脱落したＦｃＲの蓄積の差を示す破線の矢印を伴う精子ＦｃＲ陽性対時間の割合のグラフである。
【図８】図８Ａ、図８Ｂおよび図８Ｃは、異常な精子のサンプルに対する精子ＦｃＲ陽性対時間の割合を示すグラフである。
【図９Ａ】図９Ａ（１）および図９Ａ（２）は、例示的な時間ベースのアッセイに対する精子ＦｃＲ陽性対時間の割合の対応するプロットとのサイトメーター画像および読取値を説明する。
【図９Ｂ】図９Ｂ（１）および図９Ｂ（２）は、例示的な時間ベースのアッセイに対する精子ＦｃＲ陽性対時間の割合の対応するプロットとのサイトメーター画像および読取値を説明する。
【図９Ｃ】図９Ｃ（１）および図９Ｃ（２）は、例示的な時間ベースのアッセイに対する精子ＦｃＲ陽性対時間の割合の対応するプロットとのサイトメーター画像および読取値を説明する。
【図９Ｄ】図９Ｄ（１）および図９Ｄ（２）は、例示的な時間ベースのアッセイに対する精子ＦｃＲ陽性対時間の割合の対応するプロットとのサイトメーター画像および読取値を説明する。
【図９Ｅ】図９Ｅ（１）および図９Ｅ（２）は、例示的な時間ベースのアッセイに対する精子ＦｃＲ陽性対時間の割合の対応するプロットとのサイトメーター画像および読取値を説明する。
【図９Ｆ】図９Ｆ（１）および図９Ｆ（２）は、例示的な時間ベースのアッセイに対する精子ＦｃＲ陽性対時間の割合の対応するプロットとのサイトメーター画像および読取値を説明する。
【図１０】図１０は、本発明による授精のための期間ＩＵＩを示す精子ＦｃＲ陽性対時間の割合のグラフである。
【図１１】図１１は、洗浄された精子および純粋な精液アッセイの精子ＦｃＲ陽性の割合を比較するグラフである。
【図１２Ａ】図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅおよび図１２Ｆは、ＦｃＲサイクルを通して同調して精子群が成熟することを示しており、これは精子群が連続して進むにつれて、精子群ごとに完了するのに約１時間かかることを示す。図１２Ａ  すべての精子が蓄えられており、ＦｃＲ陽性であるものはほとんどない新鮮な射精液。
【図１２Ｂ】図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅおよび図１２Ｆは、ＦｃＲサイクルを通して同調して精子群が成熟することを示しており、これは精子群が連続して進むにつれて、精子群ごとに完了するのに約１時間かかることを示す。図１２Ｂ  一群の精子が一斉に、アクロソーム表面のＦｃＲに対して陽性になる。
【図１２Ｃ】図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅおよび図１２Ｆは、ＦｃＲサイクルを通して同調して精子群が成熟することを示しており、これは精子群が連続して進むにつれて、精子群ごとに完了するのに約１時間かかることを示す。図１２Ｃ  陽性の精子はＦｃＲを脱落し始め、それゆえ精子はそれらの表面上のＦｃＲに対してより陽性でなくなる。
【図１２Ｄ】図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅおよび図１２Ｆは、ＦｃＲサイクルを通して同調して精子群が成熟することを示しており、これは精子群が連続して進むにつれて、精子群ごとに完了するのに約１時間かかることを示す。図１２Ｄ  ほとんどすべてのＦｃＲを脱落した使用済みの精子は、ここで陰性に見える。
【図１２Ｅ】図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅおよび図１２Ｆは、ＦｃＲサイクルを通して同調して精子群が成熟することを示しており、これは精子群が連続して進むにつれて、精子群ごとに完了するのに約１時間かかることを示す。図１２Ｅ  新たな群の精子は、外来精子の女性の免疫攻撃を回避する既存の保護的な脱落ＦｃＲの存在下で、貯蔵プールからの成熟を開始する。
【図１２Ｆ】図１２Ａ、図１２Ｂ、図１２Ｃ、図１２Ｄ、図１２Ｅおよび図１２Ｆは、ＦｃＲサイクルを通して同調して精子群が成熟することを示しており、これは精子群が連続して進むにつれて、精子群ごとに完了するのに約１時間かかることを示す。図１２Ｆ  精子の第二のコホートが一斉に、アクロソーム表面のＦｃＲに対して陽性になる。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
以下は、本発明の実施において、当分野の当業者を補助するために提供される詳細な説明である。当分野の当業者であれば、本開示の趣旨または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の実施形態の修正および変更を行い得る。本明細書において言及されるすべての公表文献、特許出願、特許、図面およびその他の参考文献は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。
【００３９】
本明細書に記載の方法は、精子がＩＵＩの間に反応する不自然な条件およびプロセスによって妨害される、精子が通常自然授精で入る受精能状態ウィンドウを特定する。本明細書に記載の方法は、臨床で使用するのに必要な自然状態に似せるように精子を補正し、調整するのを可能にし、ＩＵＩにおける医原性の受精能不全を防止し、ＩＵＩのための精子分量を均一で好ましい生物学的状態へ加工することを可能にし、これは本発明なしで達成することは現在不可能である。
【００４０】
したがって、本明細書に記載されるのは、所望の受精能形質が早期の明確な代謝状態と比較して精子と関連するかまたは関連するであろう精液サンプルの採取後の時点をより正確に決定することを可能にする方法である。早期の明確な代謝状態は、精液サンプル中の精子が所望の受精能形質を有する時点の前に、規定の数分または数時間前に起こること以外は、所望の形質とのいかなる関連性も有する必要はない。
【００４１】
別に規定していない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者が通常理解している意味と同じ意味を有する。本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態の解説のみを目的としており、本発明を限定することは意図されていない。
【００４２】
値の範囲が提供される場合、文脈により明白に別段の指定が無い限り（例えばある数の炭素原子を含有する基の場合、当該範囲内におさまる各炭素原子数が提供される）、その範囲および任意の他の指定範囲の上限と下限の間の、下限単位の十分の一までの各介在値、またはその指定範囲の間の値が本発明範囲内に包含されることを理解されたい。これらのより小さな範囲の上限および下限が独立してより小さな範囲に含まれてもよく、これも本発明内に包含され、指定範囲中の任意の具体的に除外される境界値となる。指定範囲が境界値の一つまたは両方を含む場合、それら含まれる境界値のいずれか、両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００４３】
以下の語を、本発明を説明するために用いる。本明細書において用語が具体的に定義されていない場合、その用語は、本発明の説明においてその使用に関連して当該用語を適用する当業者により当分野において認識されている意味が与えられる。
【００４４】
本明細書において使用される場合、「ａ」および「ａｎ」という冠詞は、文脈により明白に別段の示唆が無い限り、当該冠詞の文法的客体のうちの一つまたは複数（すなわち少なくとも一つ）を指すように本明細書において使用される。一例として、「要素」は一つの要素または複数の要素を意味する。
【００４５】
本明細書および請求の範囲において本明細書に使用される場合、「および／または」という語句は、そのように結合される要素のうちの「いずれか、または両方」を意味すると理解されたい。すなわち、一部の例では要素は結合して存在し、他の例では結合せずに存在する。「および／または」を用いて列記された複数の要素は、同じように解釈されるべきである。すなわち、要素の「一つまたは複数」がそのように結合されている。「および／または」条項により具体的に特定された要素以外の他の要素が、それら具体的に特定された要素との関連性の有無に関係なく、任意に存在し得る。したがって、非限定的な例として、例えば「含む」などの非限定的文言と併せて使用される場合、「Ａおよび／またはＢ」という言及は、一つの実施形態においては、Ａのみを指し（任意でＢ以外の要素を含む）、別の実施形態においてはＢのみを指し（任意でＡ以外の要素を含む）、さらに別の実施形態においてはＡとＢの両方を指す（任意で他の要素を含む）。
【００４６】
本明細書および請求の範囲において本明細書で使用される場合、「または」は、上記に定義される「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離するときに、「または」または「および／または」は包括的なものとして解釈されるものとする。すなわち、多くの要素、または要素のリストのうちの少なくとも一つを含むが、複数も含み、そして任意で列記されていない追加の項目も含む。例えば「〜の内のただ一つ」、または「〜の内の正確に一つ」、または請求項において使用される場合には「〜からなる」など、反対を明確に示唆される用語のみが、多くの要素、または要素のリストのうちの正確に一つの要素の含有を指す。概して本明細書に使用される場合、「または」という用語は、例えば「いずれか」、「〜のうちの一つ」、「〜のうちの一つのみ」、または「〜のうちの正確に一つ」などの排他的な用語が先行する場合にのみ排他的な選択肢（すなわち「一つまたはその他であるが、両方ではない」）を示すものと解釈されるべきである。
【００４７】
請求の範囲、ならびに明細書において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「担持する（ｃａｒｒｙｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、「保持する（ｈｏｌｄｉｎｇ）」、「構成される（ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ）」などのすべての移行句は、非限定であり、すなわちそれらを含むが限定されないことを意味すると理解されたい。「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」および「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という移行句のみ、それぞれ限定的または半限定的な移行句であるものとし、このことは米国特許審査基準のセクション２１１１．０３に記載されている。
【００４８】
本明細書において使用される場合、明細書および請求の範囲において、一つまたは複数の要素のリストに関し、「少なくとも一つ」という語句は、要素リスト中のいずれか一つ、または複数の要素から選択される少なくとも一つの要素を意味すると理解されるべきであるが、要素リスト内に具体的に列記されるすべての要素のうちの少なくとも一つを必ずしも含むものではなく、要素リスト中の要素の任意の組み合わせを除外するものではない。さらにこの定義は、「少なくとも一つ」という語句が指す要素リスト内で具体的に特定された要素以外にも、具体的に特定されたそれら要素の関連性の有無にかかわらず、任意で要素が存在し得ることを許容する。したがって非限定的な例として、「ＡおよびＢのうちの少なくとも一つ」（または同等に「ＡまたはＢのうちの少なくとも一つ」、または同等に「Ａおよび／またはＢのうちの少なくとも一つ）は、一つの実施形態において、任意で複数のＡを含む少なくとも一つのＡを指し、Ｂは存在しない（任意でＢ以外の要素を含む）。別の実施形態においては、任意で複数のＢを含む少なくとも一つのＢを指し、Ａは存在しない（任意でＡ以外の要素を含む）。さらに別の実施形態においては、任意で複数のＡを含む少なくとも一つのＡと、任意で複数のＢを含む少なくとも一つのＢを指す（任意で他の要素を含む）。
【００４９】
本明細書に記載される複数の工程または動作を含む特定の方法において、当該方法の工程まだは動作の順序は、文脈より別段の示唆が無い限り、当該方法の工程まだは動作が列挙される順序に必ずしも限定されない。
【００５０】
「同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」および「同時に投与すること（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」または「併用療法（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ）」という語は、同時投与（二つ以上の治療薬の同時投与）と、治療薬が患者の体内にある程度、好ましくは効果量が同時に存在する間は時間を変えて投与すること（一つまたは複数の治療薬を、追加の治療薬の投与の時間とは異なる時間に投与すること）との両方を指す。特定の好ましい態様において、本明細書に記載の本化合物の一つまたは複数が、特に受精能促進剤または精子支持剤を含む、少なくとも一つの追加生物活性剤と併用して同時投与される。特に好ましい態様において、化合物の同時投与により、受精能促進または精子支持活性を含む相乗作用的な活性および／または治療がもたらされる。
【００５１】
本明細書に使用される場合、別段の示唆が無い限り、「化合物」という用語は、本明細書に開示される任意の具体的な化学化合物を指し、互変異性体、位置異性体、幾何異性体、および適切な場合には光学異性体（鏡像異性体）およびその他の立体異性体（ジアステレオマー）を含む立体異性体、ならびに文脈で適切な場合にはその薬学的に許容可能な塩および誘導体（プロドラッグ型を含む）を含む。
【００５２】
「患者」または「対象」という用語は本明細書全体を通して、本発明による組成物を用いた予防的治療を含む治療が提供される動物、好ましくはヒトまたは家畜を記載するために使用される。例えばヒト患者などの特定の動物に特異的な感染症、状態または疾患の治療に関し、患者という用語は、例えばイヌまたは猫などの家庭内動物、または例えばウマ、ウシ、ヒツジなどの農業用動物を含む特定の動物を指す。概して本発明において患者という用語は、別段の示唆が無い限り、または当該用語を使用している状況から暗示されない限り、ヒト患者を指す。
【００５３】
「有効」という用語は、その意図される用途の文脈の範囲内で使用される場合、意図される結果を生じさせる化合物、組成物、または構成要素の量を記載するために使用される。「有効」という用語は、その他すべての有効量または有効濃度の用語を含み、それらは本出願で別途記載または使用される。
【００５４】
本明細書で使用される場合、精子に関して「受精能形質」または「受精能状態」という用語は、精子の生理学的「スイムアップ」または運動特性を含むが、好ましくはこれに限定されない。所望の形質は、受精前に発現させることができ、例えば、受精可能な生理学的状態にあるという形質である。図１Ａ〜図４Ｂに示すとおり、時間ゼロ（採取の時間）に対する所望の受精能の発現のタイミングは、精液サンプル間で著しく変化することがある。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「精液サンプル」という用語は、ヒト、ウシ、ヤギ、ヒツジ、バッファロー、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット、マウス、ウサギ、ハムスター、および絶滅危惧種の哺乳類を含むが、好ましくはこれらに限定されない、任意の哺乳類の射精液から採取した任意の精液サンプルを含む。好ましくは、サンプルは、採取直後に一定の温度でインキュベートすることを含む制御された条件でインキュベートされ、本発明の時間ベースが実施される。精液サンプルは、射精によるよりもむしろ男性の管からのサンプル回収のために、正常な射精液において見られる要素の一部を含有するそれらのサンプルを含む。これは、針吸引または他の手順によって得られるように、それらの周囲の体液中の精巣上体の精子を含むであろう。
【００５６】
本明細書に記載の態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、一定の温度、ｐＨまたはその両方の下で精液をインキュベートすることを含む。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、約０℃〜約３７℃の温度で精液をインキュベートすることを含む。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、約２０℃〜約３７℃の温度で精液をインキュベートすることを含む。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、約２２℃〜約３７℃の温度で精液をインキュベートすることを含む。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、約３７℃の温度で精液をインキュベートすることを含む。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「代謝状態（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｔａｔｕｓ）」または「代謝状態（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｓｔａｔｅ）」または「代謝段階」という用語は、精子サンプルのインキュベーション期間中の特定の時点で、特定の生化学的特性および生物物理学的特性に関する精子の生理学的状態である。典型的には、精子の生理機能は、精子の受精能の生理学的変化など、経時的に変化する（例えば、図１Ａ〜図４Ｂ参照）。したがって、精液サンプル中の精子の生理機能または代謝状態の変化は、所望の形質、例えば受精能状態の発現を含み得る。さらに、精液サンプル中の精子の生理機能または代謝状態の変化は、一つまたは複数のマーカーの発現によって反映され得る。本明細書に開示される方法の一実施形態では、一つまたは複数のマーカーの発現は、所望の形質の発現よりも早く起こる。さらに、出願人は、精液サンプル中の精子によるかかるマーカーの発現が、所望の形質の発現前に所定の時間間隔で起こることを発見した。
【００５８】
したがって、「精子の代謝受精能状態を示すマーカー」という語句は、特定の時点で精子の代謝状態を反映する生理学的、構造的、機能的、生化学的および／または電気化学的属性を含むがこれらに限定されない、精子の測定可能な属性を指す。本発明によれば、マーカーという用語は、精子のＦｃＲ発現と相関するあらゆる属性を含む。「マーカー」という用語は、好ましくはこれらに限定されないが、精子および／またはその断片の構造的、物理的、電気物理学的、または生化学的属性を含み、例えば、アクロソームの長さ、精子の精子形態（ラフリング）、精子上の細胞表面分子の発現、精子の静電荷、および精子による分子への浸透性、例えば、これに限定されないが、染料などの非限定的な例を含む。「マーカー」という用語はさらに、限定されないが、精子の表面上または内部またはその両方で発現する、リガンド、レクチン、酵素および受容体を含む。いくつかの実施形態では、マーカーは、例えば、明視野顕微鏡を使用して見ることができるアクロソームの形態的変化である。アクロソーム形態に関して、経時的にアクロソーム膜の表面がますますラッフルに見える。いくつかの実施形態では、マーカーは代謝の一部の段階で潜在的であり得、検出されないことがある。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語には、分析物、抗原または抗体を特異的に結合および認識する、一つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、またはその一部によって実質的にコードされるポリペプチドが含まれるが、これに限定されない。「抗体」はまた、限定されないが、分析物への曝露に応答して宿主によって生産される抗体の抗原特異的結合領域（イディオタイプ）に特異的に結合し、これを認識する一つまたは複数の免疫グロブリン遺伝子によって実質的にコードされるポリペプチドが含まれる。本明細書に記載される方法の一実施形態では、抗体は、そのパラトープ以外の抗体上の部位を通して、精子またはその断片、または一次抗体に結合する。別の実施形態では、抗体は、そのパラトープを介して精子またはその断片、または一次抗体に結合する。本明細書に記載される方法の別の実施形態では、抗体は、そのパラトープおよびそのパラトープ以外の抗体上の部位の両方を介して、精子もしくはその断片、または一次抗体に結合する。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、分析物または抗原に対する特異性を保持する、インビボでまたはバキュロウイルスのようなインビトロ発現系を用いて生産される、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製物、ならびにモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ハイブリッド抗体、改変抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆｖ断片、Ｆｃ断片（断片結晶性断片）単一ドメイン抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二重特異性抗体、二官能性抗体、二重鎖抗体など、ならびに機能的断片およびその多量体を含む調製物を包含する。例えば、抗体は、分析物または抗原に対する特異性を保持する可変領域、または可変領域の断片、およびその多量体を含むことができる。抗体構造および用語については、例えば、Ｐａｕｌ、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、３ｒｄ  Ｅｄ．、１９９３、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  を参照のこと。抗体またはその部分は、任意の哺乳類種、例えば、マウス、ヤギ、ヒツジ、ラット、ヒト、ウサギ、または乳牛抗体由来であってもよい。抗体またはその断片は、ファージディスプレイライブラリを使用することを含む、組み換えＤＮＡ方法論を使用した全抗体または合成の改変を含む、当技術分野で公知の方法によって合成的に生産され得る。好ましい実施形態では、「抗体」は、精子頭部の表面上のＦｃ受容体に結合するか、またはこの結合能力を持つ抗体の断片である。
【００６１】
本明細書において使用される場合、「結合する」という語句は、本明細書に記載のアッセイを実施するのに十分である、結合親和性（Ｋａ）を有するリガンドの抗体、試薬または結合部分の結合を指す。典型的には、必要とされるすべては弱い結合であるが、信号を生成するのに十分である。しかしながら、結合親和性を少なくとも１０３Ｍ−１、１０４Ｍ−１、１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１またはそれ以上、好ましくは１０７Ｍ−１以上、より好ましくは１０８Ｍ−１またはそれ以上、最も好ましくは１０９Ｍ−１またはそれ以上とすることができるように、より強い結合親和性を使用することができる。抗体の結合親和性は、当業者によって容易に決定することができる（例えば、表面プラズモン共鳴またはスキャチャード分析によって）。種々の免疫アッセイ形態を使用して、特定の抗原と特異的に免疫反応性の抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイは、分析物と特異的に免疫反応性のモノクローナル抗体を選択するために日常的に使用される。特異的免疫反応性を決定するために使用できる免疫アッセイ形式および条件の説明については、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８８）を参照されたい。典型的には、結合反応は、ノイズに対するバックグラウンドシグナルの少なくとも２倍であり、より典型的には、バックグラウンドよりも１０〜１００倍大きい。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「ラベル」という用語は、可溶性または粒子、金属、有機、または無機のラベルを含むがこれらに限定されない検出可能なインジケーターを含み、また放射ラベル（例えば、１４Ｃ、３Ｈ、３２Ｐ）、酵素ラベル（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、および他の酵素結合体）、例えば緑色蛍光ラベルなどのスペクトルラベル、蛍光ラベル（例えば、フルオレセインおよびその誘導体、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フルオレセインイソチオシアネートとほぼ同一のスペクトル特性および量子収率を有する緑色蛍光染料複合体であるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８染料、ローダミン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎにより販売されているカルボシアニン核酸染色であり、カタログ製品Ｖ１３２４３、緑色蛍光ＹＯ−ＰＲＯ（登録商標）−１であるＹｏ−Ｐｒｏ）、化学発光化合物（例えば、ルシフェリンおよびルミノール）、コロイド金などの分光測色ラベル、または炭素粒子、または色付きガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズ、ならびに細胞浸透性ｐＨインジケーター、カルボキシＳＮＡＲＦ（登録商標）−１、脱エステル化後に約７．５のｐＫａを有し、カタログ番号ＰＰＬＭ６３−Ｃ１２７０としてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって販売されているアセテートである、アセトキシメチルエステルを含む染料を含み得る。必要に応じて、または所望により、粒子ラベルは、例えば、染料を粒子に塗布することによって色付けすることができる。好ましい実施形態では、「ラベル」は可視ラベルである。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「色付き粒子ラベル」という用語は、カラーラテックス（ポリスチレン）粒子、金属（例えば、金）のゾル、非金属元素（例えば、セレニウム、炭素）ゾルおよび染料ゾルを含むが、これらに限定されない。一実施形態では、色付き粒子ラベルは、コンジュゲートペアのメンバーをさらに含む色付き粒子である。使用されうる色付き粒子の例には、例えばポリスチレンラテックスビーズ、コロイドゴールド粒子、コロイド硫黄粒子、コロイダルセレン粒子、コロイド硫酸バリウム粒子、コロイド硫酸鉄粒子、金属ヨウ素酸粒子、ハロゲン化銀粒子、シリカ粒子、コロイダル金属（含水）酸化物粒子、コロイダル金属硫化物粒子、カーボンブラック粒子、コロイダル鉛セレン化物粒子、コロイダルカドミウムセレン化物粒子、コロイダル金属リン酸粒子、コロイダル金属フェライト粒子などの有機ポリマーラテックス粒子、有機もしくは無機層、タンパク質もしくはペプチド分子、またはリポソームで被覆された上記コロイド粒子のいずれかが含まれるが、これらに限定されない。例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって販売される量子ドットは、本明細書に包含されるラベルである。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、マーカーに関して用語「発現の減少」は、マーカー（到達性の減少または潜在性の増加を含む）または所与の測定可能な活性（例えば、結合活性、膜透過性、静電荷）の基準に対して少なくとも５％の発現の減少を指す。かかる発現または活性の減少は、少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはそれ以上、１００％も含み、すなわち、所与の発現または活性の完全な欠如によって下方制御される。マーカーの発現の減少は、本明細書の作業実施例に記載されるように測定することができる。「発現の増加」という用語は、基準に対して少なくとも５％、例えば、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のマーカーまたは所与の測定可能な活性（例えば、結合活性、膜浸透性、静電荷）の発現の増加を指す。マーカーの発現または活性の増加は、本明細書の作業実施例に記載されるように測定することができる。
【００６５】
本明細書で使用される場合、精液サンプル中の精子に関する「受精能」という用語は、その活性化ライフサイクルのある点での卵子を受精させ、生存可能な胎児および／または出生動物を作り出す精子の能力を指す。この能力は条件と精子の年齢とともに変化する。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「点状染色」という用語は、精子またはその断片の表面にわたる均一な染色とは対照的に、別個の点または点の形態の検出可能なラベルの分布を意味する。点状染色の定量的解析は、例えば、Ｍａｘｉｍ  Ｍｏｋｉｎ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ  Ｋｅｉｆｅｒによって、“Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｕｎｃｔａｔｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃａｌｌｙ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｕｓｉｎｇ  ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｅｏｌｏｇｙ”、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、  Ｖｏｌｕｍｅ  １５７、  Ｉｓｓｕｅ  ２、２００６年１０月３０日、ページ２１８〜２２４に記述されるように当技術分野で公知である。一群の精子が活性化サイクルを経て進むにつれて、ラベリングはより連続的になり、アクロソームが波打つまたはしわが寄ると、山脈の頂上の雪に似てくる。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「妊娠」という用語は、主に臨床妊娠結果を意味し、６週間で胎児の心拍動を検出することを意味する。この用語はまた、生物学的妊娠を指し、血液中に存在するヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）の量の増加を妊娠マーカーとして意味する。家庭用妊娠検査では、尿はｈＣＧ検出用に採用されたサンプルである。どちらの妊娠の形態においても、精子は卵子を受精させることに成功した。本発明の方法によって選択される精子は、より健康であり、より良好な胚を生産する可能性が高く、これは自然流産に対して妊娠の維持を促進する。
【００６８】
本明細書において使用される場合、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、抗体のＦｃ部分に結合する精子によって脱落、または分泌された生体分子を含む。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、ＦｃＲは、レクチンタンパク質を含む、またはレクチンタンパク質である。態様または実施形態のいずれかにおいて、ＦｃＲは、フコース結合型レクチンタンパク質を含むか、またはフコース結合型レクチンタンパク質である。
【００６９】
確実な妊娠結果の増加は、生殖補助臨床にとって望ましい目標であり、生殖補助を求めるカップルにとっても経済的に望ましい。カリフォルニア州の精子バンクによると、ＩＵＩ手順における確実な妊娠結果は通常手順の約４〜１６％であり、子孫を望んでいるカップルは、それぞれが経済的ならびに精神的な犠牲を払って、通常７ＩＵＩサイクル以内に妊娠することを意味する。ＩＵＩが失敗した場合、カップルはかなり多くの費用でＩＶＦ手順を検討しなければならず、これは多くの場合保険でカバーされない。改善された確実な妊娠結果は、本明細書に記載される方法を使用して得られることができ、これは適切な精子成熟／受精能状態で女性が授精するよう設計され、それによって改善された妊娠結果を提供する。記載された方法は、精子ＦｃＲサイクルの振動的性質の驚くべきかつ予想外の発見および適用に基づいている。アッセイは、ＩＵＩに使用されていない精子のサンプルに対して実施することができ、一方、ＩＵＩで使用されている精子は授精に使用するために洗浄され（アッセイにアクセスできない）、または洗浄された精子は再懸濁培地中でアッセイされ得る。
【００７０】
精子は、受精を達成するために効果的に克服しなければならない敵対的な環境に直面しているという点で非常に珍しい細胞である。理論に束縛されるものではないが、敵対的な環境が自然界で意図的であると考えられるのは、それが卵子を受精させるプールの中への最良の精子の選択を可能にするからである。これにより、射精液と比較して、より高質（より良い形態を持つ）の精子が卵管に見られる理由を説明しうる（Ａｈｌｇｒｅｎ、１９７５）。
【００７１】
本明細書に記載されるように、精子群またはコホートは、成熟およびライフサイクルの間、特定受精能状態を介して協同的または同調的に移動すると仮説されている。これは、射精液全体の中から精子の小グループが同調して受ける細胞行動の変化を通して起こると考えられている。これを受けるための精子の各連続した群は出発プールから引き出され、よって使用済み精子のプールのサイズが増大するにつれて縮小する。
【００７２】
すべての状態が常に射精液に存在するわけではない。連続した精子群のこの循環は、潜在的な卵子受精精子のための安全な避難所である卵管貯蔵庫への精子のサブセットの移動を可能にする。プロセス全体は、精子受精能を評価する際に従来的に測定されていない二つのパラメータに依存すると考えられる。（１）精子が受精能を獲得するプロセスの開始。これは射精後の様々なタイミングで起こる射精されたばかりの哺乳類の精子は不妊である）。（２）外因性物質に反応した精子の受精能状態の改善（これは精子の健康指標として使用できる）。これらのパラメータについて精子をアッセイする能力は歴史的に困難または不可能であった。そのようなアッセイは、妊娠を成功させるために受精能に必要な属性の精子による増加を測定するべきである。
【００７３】
自然の授精プロセスと人間が補助するＩＵＩ臨床プロセスの間には大きな違いがある。自然のプロセスでは、男性は精液を直接膣内に射精する。ＩＵＩプロセスでは、合成培地で洗浄された精子を子宮内に注入する。自然のプロセスでは、精子が膣内に沈着し、子宮内にスイムアップする間に成熟し、精液および粘液が保護剤として作用する。ＩＵＩプロセスでは、精子の成熟状態は知られておらず、精子の成熟と女性の管位置との協調は洗浄手順によって妨げられるため、精子は妊娠と適合しない状態を含む様々な受精能状態で子宮に導入される。自然のプロセスでは精液は膣内にまかれ、精子の温度は体温（約３７℃）で比較的制御されるが、ＩＵＩプロセスでは、子宮内へ注入される前に精子が維持される温度は、複数回下降および上昇し得る。通常のプロセスでは、精子は光に暴露されることはないが、ＩＵＩプロセスは、精子にダメージを与えることが知られている紫外線を含む光に精子をさらす（Ｔｏｒｒｅｓ、Ｅ．Ｒ．；Ａｂａｄ、Ｃ．、Ｐｉｎｅｒｏ、Ｓ．、Ｐｒｏｖｅｒｂｉｏ、Ｔ．、Ｍａｒｉｎ、Ｒ．、Ｐｒｏｖｅｒｂｉｏ、Ｆ．、ａｎｄ  Ｃａｍｅｊｏ、Ｍ．Ｉ．（２０１０）．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｕｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ  Ｃ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｅｒｍ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｐｅｒｏｘｉｄａｔｉｏｎ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔ．Ｂｉｏｌ．８６（３）：１８７−１９３）。通常のプロセスでは、精子は女性の管のより低い量の酸素および精液の存在のために減少した酸素分圧にさらされるが（Ｆｉｓｃｈｅｒ、１９９３）、ＩＵＩプロセスでは、子宮に注入する前に比較的長期間にわたって精子を周囲の酸素にさらすため、精子に対する酸化的損傷のリスクが高まる可能性がある（Ｇｕｔｈｒｉｅ、２０１２）。ＩＵＩのいくつかのケースでは、容量制限があるため、射精液の一部だけ−そしてそれ故に自然授精と比較して減少した精子数−が使用されるのに対して、自然授精では射精液全体が沈着する。自然のプロセスでは、精子上のＦｃ受容体は脱落して女性の生殖管内に存在するが、ＩＵＩプロセスでは、子宮内へまくための処理中に精液中のＦｃ受容体が精液で洗い流される。
【００７４】
自然の授精プロセスでは、精子が成熟するにつれて、ＦｃＲは精子頭部から脱落し、精液内またはＦｃＲが展開されたときに精子が女性の管の体液中で経験するあらゆる環境に存在すると考えられている。図５を参照のこと。破線の矢印は精子のコホートが成熟するにつれての精液中のＦｃＲの増加を示し、曲線はＦｃＲ陽性精子対時間の割合を示す。しかしながら、ＩＵＩプロセスでは、洗浄された精子は精液中のＦｃＲを排除し、洗浄後に脱落したＦｃＲのみが合成培地中に蓄積し始める（図６参照、破線の矢印は経時的な培地中のＦｃＲのレベルを示す）。図７は、自然のプロセスで授精した精液中に脱落したＦｃＲと、ＩＵＩプロセス中に授精した培地中で脱落したＦｃＲとの間に生じ得る有意な差を示す。この違いは、洗浄と精子状態の関係に基づいてさまざまな程度で発生すると予想される。精子が授精培地に再懸濁される前に展開すると、次の精子コホートが開始するまでＦｃＲは低くなる（図７）。精子が授精培地に広がると、単一の群（全ての群ではない）からのＦｃＲが存在するようになる。これは、自然授精において見られる、逐次的に活性化する精子の複数の群から存在する通常より大量のＦｃＲとは対照的である。
【００７５】
自然の授精プロセスでは、精子が成熟するにつれて、ＦｃＲは精子頭部から脱落し、精液内または女性の管の体液中に存在すると考えられている。例えば図５は、精子のコホートが成熟するにつれての精液中のＦｃＲの増加を示し（破線の矢印）は、曲線はＦｃＲ陽性精子対時間の割合を示す。しかしながら、ＩＵＩプロセスでは、洗浄された精子は精液中のＦｃＲを排除し、洗浄後に脱落したＦｃＲのみが合成培地中に蓄積し始める（図６参照、破線の矢印は経時的な培地中のＦｃＲのレベルを示す）。図７は、自然のプロセスで授精した精液中に脱落したＦｃＲと、ＩＵＩプロセス中に授精した培地中で脱落したＦｃＲとの間に生じ得る有意な差を示す。この違いは、洗浄と精子状態の関係に基づいてさまざまな程度で発生すると予想される。精子が授精培地に再懸濁される前に展開すると、次の精子コホートが開始するまでＦｃＲは低くなる（図７）。精子が授精培地に広がると、単一の群（全ての群ではない）からのＦｃＲが存在するようになる。これは、自然授精において見られる、逐次的に活性化する精子の複数の群から存在する通常より大量のＦｃＲとは対照的である。
【００７６】
採取時に、精子の質および成熟は大きく変化する可能性がある。一般に、多くの場合、健康な精子は休眠状態にあり、精子群は経時的に次々に活性化することを可能にする代謝変化を経ると考えられている。最大の活性化に達した後、精子はその老化プロセスを継続し、受精能が低下し、最終的に劣化する。しかしながら、当該分野における研究の結果として、健康な精液サンプルは活性化することができる精子の複数の群（亜集団）を有し、その精子群は異なる期間中に活性化し、一つの群の活性化および老化は、典型的に第二の群の精子の活性化および老化へと続き、多くの場合は第三の群、そしておそらくはさらに多くの群へと続くことが仮定される（図１２Ａ〜１２Ｆを参照）。本明細書に記載される方法では、時間ベースのアッセイは、ＦｃＲ（またはマーカー）展開のサイクルによって精子群を連続的に検出して、ＩＵＩ生殖結果に有意な改善をもたらす。
【００７７】
採取時の休眠状態からの精子の活性化の時間的経過は、同一種の個体間だけでなく、同じ個体から得られた射精液間でも異なる。図１Ａ〜図４Ｂを参照のこと。当技術分野における従来の知恵は、精子活性化の時間経過におけるこの大きな程度の変動性が、精子のプロセスを信頼性をもって評価すること、または精液サンプルの採取後の時間間隔のみに基づくその受精能などの特定の発育期間の生理的特徴を有する精液サンプルを得ることを困難または不可能にしたということである。
【００７８】
従来的な精液処理では、子宮内授精（ＩＵＩ）のために、精液が採取され、二つのうちの一つの方法で処理される。直ちに使用するために、精漿は精子から洗浄され、精子は採取後数時間以内にＩＵＩ用に調製される。後で使用するために、精液を採取し、人工培地で希釈し、凍結分量に加工する。これらの手順の困難なことは、射精液中の精子の変化する受精能状態と授精を調整しないことによって、医原性ＩＵＩ不妊症の導入の危険を冒すということである。精子は、特定の生物学的受精能状態（以前は測定不能）でＩＵＩ中に授精されなければならず、さもなければ妊娠は起こらない。本発明は、採取後の変化する精子状態を測定する方法を提供する。これにより、妊娠に許容的な精子の状態でＩＵＩを発生させることができ、妊娠に失敗する状態を回避することができる。
【００７９】
本記述の方法に従って処理する際、精液は、ＩＵＩに使用されないアリコート（例えば、約５０μｌ）をアッセイのために除いて、臨床手順に従って採取され、処理される（好ましくは臨床でのサンプル生産で、自宅で生産し輸送されるサンプルは使用しない）。アッセイデータは二通りに解釈することができる。その精子がＩＵＩ妊娠に必要な正常な精子状態変化を生成できない男性を特定するために診断的に使用できる。そのデータはまた、正しい精子受精能状態になる精子分量を、ＩＵＩで妊娠する可能性が高くなるようにするための製造プロセス管理にも使用することができる。これには、次のＩＵＩ適合状態に対する受精能状態の調整が含まれる。（１）液体精液分量に使用される精子、（２）最初は凍結状態にあったＩＵＩ前の解凍された精液中の精子状態、および（３）後の解凍およびＩＵＩを待つための凍結用精子分量の調製。
【００８０】
図８Ａ〜図８Ｃは、精子が妊娠を引き起こす可能性が非常に低いという特徴を示す、ドナーの精子を示す時間ベースのアッセイのグラフを示す。射精液の質は同じ男性からの射精液の間で異なる可能性があるので、射精液の質のこの理解は、例えば、初日の射精液が疑わしいと見なされる場合、連続した日に生成される射精液で二つのＩＵＩを行うことによって、ＩＵＩ妊娠達成の可能性を高めるために使用できる。したがって、時間ベースのアッセイの使用は、ＩＶＦおよびＩＣＳＩなどの手術を必要とするリスクの高い技術とは対照的に、より多くの精子能力を要求するＩＵＩ治療における妊娠を引き起こすための質の精子能力を診断できる。ＩＶＦおよびＩＣＳＩについては、時間ベースのアッセイの使用は依然として精子の受精能状態を診断することができるが、適切な状態を提供するためには異なる診断基準が必要であろう。有意には、記述された方法は、単一群の精子のみが成熟した単一コホート射精液の同定を可能にし（これらは図８Ａ〜図８Ｃの主題である）、本明細書に記載されるように、同一の男性が単一コホートおよびマルチコホートを生産することができる（図１Ａ〜図４Ｂ）。したがって、記載された方法は、妊娠の可能性の低い射精液を排除することによって、およびこれが示されている場合、サイクルごとの射精液品質を向上させるために、サイクルごとに複数のＩＵＩのオプションを提供することによって（すなわち、ＩＵＩにつき単一コホート射精液の生産によって）、受精の確率を改善することができる。
【００８１】
発明によるアッセイは、自然の授精とは異なる、ＩＵＩによって導入された変化に対する補償を可能にする。精子受精能の調整がない場合、これらの変化は、そうでなければ、妊娠を引き起こす適合性がない状態で、高度に選択的な子宮環境へと精子を導入する場合がある。
【００８２】
精子受精能調整により、精子は輸卵管の貯蔵庫に到達するのに正しい状態になるので、十分な細胞数と正常性で射精液を希釈して直接ＩＵＩを行うことが可能である。しかしながら、許容可能な精子受精能状態ウィンドウは狭く、そして一般的に、正しい状態を検出し、次いで精液を処理しそしてそのような狭い時間ウィンドウ内にＩＵＩを完了することは不可能である。それゆえ、精子の受精能ウィンドウを予測し、適切な準備時間を可能にすることにおける本発明によるアッセイの予測値は非常に有用である。妊娠を引き起こすのに必要な精子の数について語る出版物では、ＩＵＩ適合状態は交絡変数として認識されたことがない。このため、出願人は、ＩＵＩサイクルの失敗（多くは医原性または医学的に起因する）または乏精子症（低精子数）のために以前にＩＶＦによって治療された多くのカップルが、本発明の使用を通して妊娠を達成することができると信じている。
【００８３】
特定の実施形態では、射精液はアリコートに分離され、アッセイされ得る。各アリコートが異なる時点でほぼ適切な適合する受精能状態（アッセイによって妊娠を引き起こすのに適していることが明らかにされた好ましい精子受精能状態）に達すると、これらのアリコートは、乏精子にもかかわらず精子数のさらなる濃縮のために正しい時期に順次授精することができる。このプロセスは、本発明を用いてインビトロアッセイによって活性化することが知られていることが知られているため、ＩＵＩが活性化精子の連続的な群を有することを可能にする。本明細書で明示的に企図されている様々な受精様式について、様々な適切な適合可能な受精能状態（「最適」）が存在し得ると仮定される。したがって、文脈が別途示さない限り、本明細書で使用される場合、「好ましい」または「好ましい代謝状態」または「好ましい適合性」という用語は、特定の受精法による妊娠に適した適合性のある受精能状態を指す。
【００８４】
精子は、射精時に成熟プロセスを受ける。本明細書に記載されるように、ＦｃＲ生化学によって決定されるように、精子は連続した群（コホート）において成熟する。これは、卵子を受精させることができるか、または死ぬ、短い寿命を有する完全に成熟した活性化された精子と一致する（Ｃｏｈｅｎ−Ｄａｙａｇ、１９９５）。したがって、本明細書に記載されるアッセイは、精子の成熟の間に精子の頭部上に出現し、次いで各射精液に特有の成熟および受精能状態のタイミングで精子から脱落する精子ＦｃＲ発現の存在を検出または相関させる。
【００８５】
例えば、精子の初期コホートは陽性になり、その後、保護的ＦｃＲマーカーを脱落する。その後、典型的には１〜２時間の間隔で、別の精子群が成熟する。したがって、ＦｃＲマーカーは、成熟度、したがって一群の精子の受精能状態を決定するために使用することができ、治療的に使用されている。マーカーはまた、診断設定において、非限定的な例では、正常な数の群、正常なアッセイ曲線の形状、正常なＦｃＲ初期発現の動態および発現する集団の割合に関して、正確な時期で成熟する射精液中の精子の能力を決定することができる。この知識を用いて、精子分量処理の時間を計り、受精能状態の精液サンプルを生物学的に調整し、または精子の受精能状態に基づいて患者をプレＡＲＴ（ＩＵＩ）またはＡＲＴ（Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）手順に階層化することが今では可能である。
【００８６】
精子群の成熟は個体ごとに、そして同じ個体からの異なる射精液についてさえも著しく異なり得るとしても、驚くべきことに、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）マーカーの最大値発現によって反映される初期の代謝状態と、後に望まれる受精能状態形質との間の時間間隔は、個体から採取され、同じ条件下でインキュベートされた精液サンプルに関して比較的一貫している。一群の精子による受精能状態を通る移動の間のこの一貫した時間間隔は、本明細書に記載のリアルタイム方法において使用されて、各個体の精液サンプルの精子がいつ一つまたは複数のマーカーの発現をモニターすることによって所望の受精能状態を発現するかを決定する。精液サンプルが所望の受精能状態を有し、人工授精のために処理することができる時間は、例えば、ＩＵＩは、マーカー発現をモニターすること、および精液サンプル中の精子が特定のレベルでマーカーを発現する時間に処理することによって決定することができる。
【００８７】
代謝状態は受精能状態を予測する。このコンセプトは特にバイオマーカーの検出を、フィールドパフォーマンスに影響を与える方法で休眠から活動へ、そして老化へと移行する細胞群のプロセス制御に拡張し、精子使用前にリアルタイムで測定できるようになった。好ましくは、規定の代謝状態は、特定のマーカーの同時発現について、または特定のマーカーの特定の発現レベルについてモニタリングすることによって容易に同定される。一旦精子サンプル内の精子群が望ましい代謝状態を達成した時間を決定すると、ラベルの発現と所望の受精能形質との間の所定の規定された時間間隔を適用することによって、精液サンプル中の精子が所望の受精能状態を有するであろう後の時点を決定することができる。したがって、マーカーの発現をモニターすることによって示されるように、精液サンプル中の精子群がいつ所望の代謝状態を達成するかを知ることは、より高い妊娠達成をもたらす人工授精（ＡＩ）のために精液を処理することを可能にする。
【００８８】
特定の代謝状態に到達するには時間の経過が必要であり、射精液ごとに異なる時間の長さは、精子の最初の成熟グループについては特に変わりやすい。しかしながら、出願者は、特定の受精能状態に達するまでの時間は、精子の成熟に関連する精子頭部のＦｃ受容体の発現と相関することができ、そして成熟が始まった後、精子群の成熟は射精液にわたって比較的一貫したタイミングで進行することを見出した。したがって、出願人の作業モデルによれば、アッセイによる代謝状態のタイミングを評価し、このタイミングを精子行動に相関させることで、望ましい受精能状態を予測および獲得することが可能である。これは、精子処理のタイミング、すなわち精子が人工授精のために準備されるときを決定するために時間ベースのアッセイを使用することによって達成される。
【００８９】
本明細書によれば、採取された射精液のアリコートが精液の採取後に予め選択された時間間隔でアッセイされるので、精子によるＦｃ受容体マーカーの発現は最大値に続いて最小値まで変動し、次いで発現が増加し、最大値と最小値を繰り返すことができる。Ｆｃ受容体マーカーの生物学的発現は、精子の受精能状態に相関する。Ｆｃ受容体マーカーの発現がほぼ最大値になるまで精子を処理することにより、ＦｃＲ発現が最小値から最大値に近づいた時点で始まり、ＦｃＲ発現が最小値を通過した後に増加している時間までの時間ウィンドウ内に、ＩＵＩについて生じるほぼ最適な受精能状態の時点で精子を授精させることができる。
【００９０】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は一般に、精液サンプルを採取することを含む。これは、家庭で生産され、輸送されるのではなく、臨床または医師の事務所で生産されることが好ましい。特定の態様では、精液は生存能力について視覚的に検査される。サンプルは、純粋な精液または支持培地に再懸濁された洗浄された精子であり得る。一つの好ましい実施形態では、アッセイ時間中に試薬は２２〜２６℃で保存され、精液または洗浄された精子は、およそ周囲温度（例えば、室温または約２０℃）から約３７℃で保存される。特定の実施形態では、精液または洗浄された精子は約３７℃で保存される。精液を液化させるには生産から約３０分を要する（現在の手順と一致する）が、直ちに試験を開始することが好ましい。特定の実施形態では、５０μＬのサンプルアリコートは試験用に除去される。残りは授精用である。特定の例示的な実施形態では、アッセイは以下のように調製される。
ｉ．１．５ｍＬの管に、１００μＬの緑１、２０μＬの赤２を入れ、混合する。１０μＬの純粋な精液（または洗浄した精液）を添加し、５μＬの青３を加えて混合する。
ｉｉ．１５分または３０分の定期的な間隔でこの手順を繰り返し、アッセイには氷冷ではなく周囲温度またはそれに近い試薬を使用する。なぜなら冷たい試薬（氷など）は温度ショックによって新鮮な精液とのアーティファクトを引き起こす可能性があるという懸念があるが、冷たい試薬は最初の時点または二つの時点の後に、より許容される。
【００９１】
したがって、例えば、工程ａ、ウシ血清アルブミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳＫＵ  ＃００−３１１８）（緑１）で希釈した１００μｌの抗体を、２０μｌの一次抗体（ウサギ抗サルモネラス属種；サルモネラＨ抗血清Ａ−Ｚ製品番号２２４０６１；ミシガン州デトロイトのＢＤ／Ｄｉｆｃｏ；メーカーの指示に従って再構成するか、またはＰＢＴ錠剤から作製された本明細書で説明したリン酸緩衝生理食塩水によって再構成する）（赤２）と混合し、続いて５μｌの二次抗体をＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、カリフォルニア州カールスバッド、カタログ番号Ａ１１００８）（２ｍｇ／ｌ）（青３）とコンジュゲートした。本発明の実施に有用な他の希釈剤（緑１）の例には、リン酸緩衝生理食塩水（例えば、カルシウム、マグネシウム無しのＰＢＳ錠剤、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社ＬＬＣ、カタログ番号２８１０３０５、製造業者の指示に従って調製）、ＥＤＴＡおよびグルタミンを有するＨＴＦ  ＨＥＰＥＳ培養培地（ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅ  カタログ番号２００２）、Ｑｕｉｎｎｓ（商標）精子洗浄培地（Ｏｒｉｇｉｏカタログ番号ＡＲＴ−１００６）、およびその他の補助的緩衝細胞支持培地が含まれる。その他の抗体（赤２）には、Ｆｃ断片を有するか、または抗体のＦｃ断片と関連するＮ−グリコシル化を含むものが含まれ、それは以下を含むアッセイで使用できる。微生物試験に対するＤｉｆｃｏ抗血清、例えばＢＤ  Ｄｉｆｃｏ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｏ  Ａｎｔｉｓｅｒｕｍ  Ｐｏｌｙ  Ａ−Ｉ＆Ｖｉ（ＢＤ  Ｄｉｆｃｏカタログ番号２２２６４１）、およびＣｈｒｏｍｅＰｕｒｅウサギＩｇＧ、Ｆｃ断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎＯｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号０１１−０００−００８）、ならびにＩｇＭ分子。その他の接合体（青３）には以下が含まれる。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＤｙＬｉｇｈｔ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号３５５５２）、およびサイトメーター励起および発光フィルターが適切であるように選択されるＦＩＴＣまたはその他の蛍光体でコンジュゲートした二次抗体。
【００９２】
各アリコートについて、（Ｖｏｒｔｅｘを使用できる）約２秒間混合し、約２０分間インキュベートする。約２０分後、緩衝液で洗浄し、３０秒間遠心分離する。ペレットを妨害することなくできるだけ上清を除去する。通常は１００〜３００ｕｌの緩衝液をさらに加え、ペレットとボルテックスを約５秒間再懸濁する。サイトメーターＳＩＰチューブに配置する。サイトメーター上のサンプルを、細胞カウントに基づいて適切な速度で実行し、これによりスコアが解釈できるＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６サイトメータファイルにデータポイントが記録される。
【００９３】
図９Ａ（１）〜図９Ｆ（２）は、一つのアッセイのためのサイトメーターからのデータを示す。右側の図は、サイトメーター画像を示し、左側の対応する図は、サイトメーターの読取値から得られた、精子Ｆｃ受容体陽性対時間の割合のグラフを示す。
【００９４】
驚くべきことに、精子上のマーカーの発現と、好ましい受精能状態またはそれに近い精子の授精のための好ましい時期の範囲（ウィンドウ）との間に関係があることが発見された。本明細書によれば、授精のためのウィンドウは最大値に続くＦｃＲアッセイにおける最小値付近の期間であり、ウィンドウは最小値の両側に約２０分、好ましくは最小値の両側に約１５分、より好ましくは、最小値の両側に約１０分を含む。記載された方法により、異なるＡＲＴプラットフォームに対する好ましい受精能状態の判定も可能になる。この関係に関する情報を使用して、精子頭部上のＦｃ受容体の発現をモニターすることによって、精子群の活性化または成熟サイクルの好ましい受精能状態、またはそれに近い精子を導入するための授精手順を実施するのに適切な時間を決定することができる。このＦｃＲ発現関係は、同じ条件下でインキュベートされたか、または同じ条件下で保持されている同じ種からの個々のサンプル間で比較的一定である。
【００９５】
この関係を使用して、リアルタイムモニタリングは、各個々の射精液について精液処理を調整するための手段を提供し、その結果精子は好ましい受精能状態での授精の準備が整い、確実な妊娠結果の可能性が高まる。
【００９６】
適切な受精能状態を持つ精子を得る
本明細書によれば、アッセイは、受精能状態に関連する一つまたは複数のマーカーの時間ベースのモニタリングを含み、処理された精液が授精のための好ましい受精能またはそれに近くになるようにいつ精液を処理するかを決定する。マーカーはＦｃ受容体またはＦｃ受容体の発現と相関することができる別の生物学的マーカーであることが好ましい。
【００９７】
具体的には、精子を処理するための適切な時点は、モニターされるマーカーの時間ベースの発現と精子の受精能状態に依存する。これまでのＩＵＩ研究では、時間ベースのアッセイで、精子が、精子Ｆｃ受容体陽性の割合がおよそ最小値である４０分以内（ウィンドウ）に授精されたときに１００％の妊娠が発生した（図１０参照）。注目すべきことに、スイムアップ運動をモニターすることは、記載された方法に従って決定されるように、適切な受精能段階で処理し、次いで授精するための時間を許さない。したがって、一実施形態では、サンプルのアリコートは、様々な時点での対象の精液サンプルから取り除かれ、特定の選択マーカーの発現のためにアッセイして、処理時間を決定することができる。次に、特定の精液サンプルにおける精子を処理するための時点は、マーカーの時間ベースの発現によって決定される。
【００９８】
得られた精液サンプルのモニタリングは以下の工程を包含する。
ｉ．様々な時点での採取後のインキュベーション中、その代謝状態のマーカー／インジケーターを有する精液サンプル中の精子の精子の割合を決定し、それによって精液サンプルのマーカー発現の時間ベースのグラフを提供する工程と、
ｉｉ．処理が完了した時に、好ましい受精能状態またはそれに近い精液を獲得するために、凍結を介するなどして、精子を安定化させるまたは利用する時点を選択する工程。
【００９９】
上述のように、精子が好ましい受精能代謝状態（すなわち、およそほとんど適合性のある受精能状態）を達成する時間は、サンプルからサンプルへと変化するが、受精能代謝状態に関連するマーカーのアッセイによって予測され得る。アリコートは、精液サンプルが最初に採取された時点で始まる定期的な間隔で、インキュベートされた精液サンプルから取得できる。一実施形態では、アリコートは、５分ごと、１０分ごと、１５分ごと、２０分ごと、または３０分ごとにアッセイされる。アッセイを行う時間に応じて、最小の合理的な時間間隔でアリコートを取り出してアッセイすることが好ましい。アリコートのアッセイの間の時間間隔が小さければ小さいほど、プロセスが完了したときに精液サンプルを適切な精子受精能状態のために処理する能力が、妊娠結果の向上をもたらすための授精のためにより良好になる。
【０１００】
受精能臨床において、アッセイがほぼ最小値のＦｃＲまたは他のマーカー活性を指示したときに、授精の準備ができている残りのサンプルの少なくとも一部に洗浄および他の処理工程を実施しながら、採取直後に採取した精液サンプルのアリコートに対して本発明のアッセイを実施することが好ましい場合がある。
【０１０１】
精液サンプルのモニタリングは、当業者に公知の任意の手段によって実施することができる。モニタリングのための好ましい方法は、サイトメーターの使用によるものである。（図９Ａ（１）〜９Ｆ（２）を参照のこと）。
【０１０２】
利点
ＡＩの手順のための増加した受精能の完全な利点は、臨床内でのオンサイト使用に適した効果的な受精能技術の欠如により到達できなかった。必要とされるのは、人工授精の標準的な臨床方法と共に使用された場合に、受精能および妊娠の改善のための授精に好ましい時期を明らかにする方法である。処理のための精液採取後に起こる精子の生物学的プロセスをモニターする能力は、精液の各個別の採取に授精手順を含む精液処理を調整する方法を提供し、それによって精子の質を改善し、受精能を最大にする。本アッセイは、オンサイトに適用可能な方法で、受精能を向上させることができる解決策を提供する。
【０１０３】
代謝状態のマーカー
精子の受精能状態は、生存可能な精子の数、精子の運動性（運動性の割合と運動性の種類の両方）、精子の形態、アクロソームの完全性などの多数の属性に基づいて定義できる。射精が発生し、精子が精嚢からの精漿および他の体液と混合されると、すべての精子が一連の代謝変化を経験することが知られている。射精に続く「受精能獲得」を含む精子の「成熟」は、精子が受精能力を達成するのに必要である。多くの膜の変化がこれらのプロセスに関連している（Ｂｅａｒｅｒ  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｎｄ（１９９０）Ｊ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓ  Ｔｅｃｈ．１６：２８１〜２９７）。しかしながら、出願人は、Ｆｃ受容体が受精能段階に対する好ましいマーカーを提供することを見出した。したがって、Ｆｃ受容体と相関することができる任意の生物学的マーカーは、本発明の実施に有用である。
【０１０４】
受精能状態の好ましい発現マーカーは、精子の頭部上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）であることが分かっている。精子の頭部上で発現されるＦｃ受容体の量、および／またはそれらを発現する集団中の精子数を経時的にモニターして、Ｆｃ受容体発現対時間のプロットを提供することができる。Ｆｃ受容体の発現は、Ｆｃ受容体に結合するラベルリガンドの使用によってモニターすることができる。有用なそのようなリガンドには、精子によって発現されるかまたは脱落されるか、または精子培地中に存在するタンパク質に対して他の親和性を有さないラベル抗体が含まれる。Ｆｃ受容体発現対時間のプロットは、典型的には、Ｆｃ受容体を発現する精子の集団（群、バッチまたはコホート）が約最大値に達し、そして約最小値に減少し、続いてＦｃを発現する精子の第二の集団（コホート）が約最大値になり、続いて約最小値に減少し、次いで、Ｆｃを発現する精子の第三の集団（コホート）でさえも約最大値になり、続いて減少し、おそらくさらなるコホートが続くことを示す。
【０１０５】
本明細書によれば、精液がＩＵＩ用に採取されると、アリコートが時間ベースのアッセイのために定期的な間隔で採取され、そして受精能状態についてアッセイプロフィールをモニターする。残りの精液は、標準的な臨床方法に従ってＩＵＩのために処理される。時間ベースのアッセイおよびモニタリングによって決定される受精能状態により授精される。本発明によれば、授精は、ＦｃＲ発現が最小値に近い期間中、すなわち、好ましくは最小値ＦｃＲ発現の直前から最小値を通過した直後に終了するウィンドウ内に起こるべきである。ＦｃＲ発現が最小値になっている時点で授精する準備をするために、好ましくは残りの精液またはその一部を処理して授精のために使用することは、ＦｃＲ発現が増加しているとき、または処理がＦｃＲ最大値検出と理想的な授精時間との間で達成され得る場合、次の最小値まで低下する前に最大値に達するときに開始するべきである。
【０１０６】
さらに、本明細書に記載されるＦｃＲ発現を検出することによって、これには、特に限定されない限り、ＦｃＲ  ｍＲＮＡの検出、精子内のＦｃＲタンパク質の検出、精子によって周囲の環境（例えば、膣液またはインビトロ培地）に脱落されるＦｃＲの検出、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つが含まれることが考えられる。特定の実施形態では、ＦｃＲ発現の検出は、精子によって周囲環境に脱落したＦｃＲの検出を含む。
【０１０７】
当業者は、受精能に相関する他のマーカー、例えば、運動性、アクロソームの長さもしくは形態、アクロソーム膜の外観またはその構成要素が含まれ、これは原形質膜内の開窓を通して点状パターンで現れ、かかるパターンはアクロソーム吻から開始してさらに頭の方へと延び、精液サンプルの精子の細胞表面分子の発現、精液サンプルの精子の静電荷、および精液サンプルの精子または精子周囲の培地に脱落する精子由来物質（ＦｃＲなど）の精子またはその断片による染料の浸透性をアッセイし、モニターすることができる。時間ベースのアッセイが精子のＦｃＲ発現またはその脱落と相関する限り、妊娠率の増加が生じると予想され得る。本発明とは対照的に、他のマーカーは、医師または看護師が精液分量を回収して手順を実施するのに十分な時間を提供できない場合、あまり有用ではない可能性がある。したがって、本発明の予測的な性質は非常に有用である。
【０１０８】
従って、一態様では、授精または保存のために精液サンプルを利用するための最適な時間を決定するための方法があり、この方法は、
ｉ．試験される男性対象からの精液サンプルを提供し、前記サンプルを制御された条件下でインキュベートする工程と、
ｉｉ．精子の受精能状態を示すマーカーを選択する工程であって、ここでマーカーの発現が精子の受精能状態と相関し、ここでマーカーがＦｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方である、マーカーを選択する工程と、
ｉｉｉ．複数の時点で、精液サンプル中の精子により、ＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の発現レベルを決定する工程と、
ｉｖ．前記精液サンプル中の前記精子が前記ＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方を、前記精子のＦｃＲ発現が最大値に近づくことと相関する約最大値または所定のレベルで発現する前記時点を決定する工程と、
ｖ．前記精子が前記Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の最小値レベルの発現を示す時点を選択し、それによって投与の最適な時間または授精もしくは凍結のための前記精液サンプルを提供し、改善された妊娠結果を提供する工程とを含む、方法。
【０１０９】
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、ＦｃＲは、レクチンタンパク質を含むか、またはレクチンタンパク質である。態様または実施形態のいずれかにおいて、ＦｃＲは、フコース結合型レクチンタンパク質を含むか、またはフコース結合型レクチンタンパク質である。
【０１１０】
本明細書に記載の態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、一定の温度、ｐＨまたはその両方の下で精液をインキュベートすることを含む。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、約０℃〜約３７℃の温度で精液をインキュベートすることを含む。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、約２０℃〜約３７℃の温度で精液をインキュベートすることを含む。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、約２２℃〜約３７℃の温度で精液をインキュベートすることを含む。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、約３７℃の温度で精液をインキュベートすることを含む。
【０１１１】
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、工程（ｉｉｉ）の複数の時点は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、５５、６０分またはそれ以上離れている。態様または実施形態のいずれかにおいて、工程（ｉｉｉ）の複数の時点は、少なくとも１５、２０、２５、または３０分離れている。
【０１１２】
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、工程（ｖ）の時点は、ＦｃＲの発現、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の最小値レベルの約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０分前から約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０分後である。
【０１１３】
本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、検出する工程は、ＦｃＲの発現、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方に結合したリガンドの量を検出することを含む。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、リガンドは、検出可能なマーカーを含む小分子ラベルまたはペプチドまたはポリペプチドである。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、ポリペプチドは抗ＦｃＲ抗体またはその抗原結合断片である。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、ポリペプチドは検出可能なラベルを含む抗ＦｃＲ抗体またはその抗原結合断片である。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、抗体は、試験される動物、例えば、抗ヒト、抗ウシ、抗ブタ、または抗ウマに対して産生される。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、抗体はモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、例えば、抗ＦｃＲ抗体などのリガンドの結合は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、定量免疫蛍光（ＱＩＦ）アッセイ、表面プラズモン共鳴、顕微鏡、光メータまたは当分野に公知の他のアッセイで検出される。
【０１１４】
本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、アッセイは、合成培地中の精液のアリコートまたは洗浄された精子のアリコート上で行うことができ、これが望ましい場合、洗浄培地中の精子のアッセイを可能にし、洗浄培地中の活性化された精子の群に従い、授精の時間を決定することができる。
【０１１５】
特定の実施形態では、方法は、精液サンプル中の精子を授精のために調製する工程をさらに含み、それにより調製が完了し、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の発現が最小値である場合に近い期間中に授精が起こり得、それによって精液サンプルを授精のために使用するための好ましい時間を提供する。
【０１１６】
態様または実施形態のいずれかでは、工程（ｉｖ）は、女性への投与のために精液サンプル中の精子の処理を開始することを含む。態様または実施形態のいずれかでは、処理には、精子の洗浄、緩衝液中の精子の再懸濁、宿主の体温での精子のインキュベート、またはそれらの組み合わせのうち少なくとも一つが含まれる。
【０１１７】
特定の追加的態様では、本開示は、改善された妊娠結果を得るための方法を提供し、方法は、
ｉ．試験される男性対象からの精液サンプルを提供し、サンプルを制御された条件下でインキュベートする工程と、
ｉｉ．精子の受精能状態を示すマーカーを選択する工程であって、ここで前記マーカーの発現が、時間と共に変化し、ここで前記マーカーがＦｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方である、マーカーを選択する工程と、
ｉｉｉ．複数の時点で、前記ＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の前記精液サンプル中の精子による発現レベルを検出する工程と、
ｉｖ．精液サンプル中の精子がＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方を、精子のＦｃＲ発現が最大値に近づくことと相関する約最大値または所定のレベルで発現する時点を決定する工程と、
ｖ．前記精子が前記Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の最小値レベルの発現を示す前に起こる時点を選択し、それによって前記精液サンプルを授精または凍結のために投与する最適な時間を提供する工程と、
ｖｉ．ＩＵＩまたは凍結によって処理された精子を女性に授精し、それによって改善された妊娠結果が得られる工程とを含む、方法。
【０１１８】
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、ＦｃＲは、レクチンタンパク質を含むか、またはレクチンタンパク質である。態様または実施形態のいずれかにおいて、ＦｃＲは、フコース結合型レクチンタンパク質を含むか、またはフコース結合型レクチンタンパク質である。
【０１１９】
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、「改善された妊娠結果」は、生物化学的に、例えば、女性におけるヒト絨毛性ゴナドトロピンレベルの増加、または胎児の心拍動、誕生またはそれらの組み合わせの検出によって決定または測定されうる。
【０１２０】
本明細書に記載の態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、一定の温度、ｐＨまたはその両方の下で精液をインキュベートすることを含む。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、約２０℃〜約３７℃の温度で精液をインキュベートすることを含む。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、約３７℃の温度で精液をインキュベートすることを含む。
【０１２１】
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、工程（ｉｉｉ）の複数の時点は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、５５、６０分またはそれ以上離れている。態様または実施形態のいずれかにおいて、工程（ｉｉｉ）の複数の時点は、少なくとも１５、２０、２５、または３０分離れている。
【０１２２】
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、工程（ｖｉ）の時点は、ＦｃＲの発現、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の最小値レベルの約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０分前から約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０分後である。
【０１２３】
本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、検出する工程は、ＦｃＲの発現、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方に結合したリガンドの量を検出することを含む。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、リガンドは、検出可能なマーカーを含む小分子ラベルまたはペプチドまたはポリペプチドである。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、ポリペプチドは抗ＦｃＲ抗体またはその抗原結合断片である。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、ポリペプチドは検出可能なラベルを含む抗ＦｃＲ抗体またはその抗原結合断片である。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、抗体は、試験される動物、例えば、抗ヒト、抗ウシ、抗ブタ、または抗ウマに対して産生される。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、抗体はモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、例えば、抗ＦｃＲ抗体などのリガンドの結合は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、定量免疫蛍光（ＱＩＦ）アッセイ、表面プラズモン共鳴、顕微鏡、光メータまたは当分野に公知の他のアッセイで検出される。
【０１２４】
本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、アッセイは、合成培地中の精液のアリコートまたは洗浄された精子のアリコート上で行うことができ、これが望ましい場合、洗浄培地中の精子のアッセイを可能にし、洗浄培地中の活性化された精子の群に従い、授精の時間を決定することができる。
【０１２５】
態様または実施形態のいずれかでは、工程（ｉｖ）は、女性への投与のために精液サンプル中の精子の処理を開始することを含む。態様または実施形態のいずれかでは、処理には、精子の洗浄、緩衝液中の精子の再懸濁、宿主の体温での精子のインキュベート、またはそれらの組み合わせのうち少なくとも一つが含まれる。
【０１２６】
特定の追加的態様では、本開示は、女性を授精させるための方法を提供し、方法は、
ｉ．試験される男性対象からの精液サンプルを提供し、サンプルを制御された条件下でインキュベートする工程と、
ｉｉ．精子の受精能状態を示すマーカーを選択する工程であって、ここでマーカーの発現が、時間と共に変化し、ここでマーカーがＦｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方である、マーカーを選択する工程と、
ｉｉｉ．複数の時点で、ＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の精液サンプル中の精子による発現レベルを検出する工程と、
ｉｖ．精液サンプル中の精子がＦｃＲ、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方を、精子のＦｃＲ発現が最大値に近づくことと相関する約最大値または所定のレベルで発現する時点を決定する工程と、
ｖ．精子がＦｃ受容体（ＦｃＲ）、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の最小値レベルの発現を示す前に起こる時点を選択し、それによって精液サンプルを授精のために投与する最適な時間を提供する工程と、
ｖｉ．ＩＵＩによって処理された精子を女性に授精し、それによって改善された妊娠結果が得られる工程とを含む。
【０１２７】
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、ＦｃＲは、レクチンタンパク質を含むか、またはレクチンタンパク質である。態様または実施形態のいずれかにおいて、ＦｃＲは、フコース結合型レクチンタンパク質を含むか、またはフコース結合型レクチンタンパク質である。
【０１２８】
本明細書に記載の態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、一定の温度、ｐＨまたはその両方の下で精液をインキュベートすることを含む。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、約２０℃〜約３７℃の温度で精液をインキュベートすることを含む。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、制御された条件は、約３７℃の温度で精液をインキュベートすることを含む。
【０１２９】
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、工程（ｉｉｉ）の複数の時点は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、２５、４０、４５、５０、５５、６０分またはそれ以上離れている。態様または実施形態のいずれかにおいて、工程（ｉｉｉ）の複数の時点は、少なくとも１５、２０、２５、または３０分離れている。
【０１３０】
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、工程（ｖｉ）の時点は、ＦｃＲの発現、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方の最小値レベルの約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０分前から約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０分後である。
【０１３１】
本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、検出する工程は、ＦｃＲの発現、またはその発現がＦｃＲ発現と相関するマーカー、またはその両方に結合したリガンドの量を検出することを含む。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、リガンドは、検出可能なマーカーを含む小分子ラベルまたはペプチドまたはポリペプチドである。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、ポリペプチドは抗ＦｃＲ抗体またはその抗原結合断片である。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、ポリペプチドは検出可能なラベルを含む抗ＦｃＲ抗体またはその抗原結合断片である。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、抗体は、試験される動物、例えば、抗ヒト、抗ウシ、抗ブタ、または抗ウマに対して産生される。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、抗体はモノクローナル抗体またはその抗原結合断片である。本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、例えば、抗ＦｃＲ抗体などのリガンドの結合は、ＥＬＩＳＡ、ウェスタンブロット、定量免疫蛍光（ＱＩＦ）アッセイ、表面プラズモン共鳴、顕微鏡、光メータまたは当分野に公知の他のアッセイで検出される。
【０１３２】
本明細書に記載される任意の態様または実施形態では、アッセイは、合成培地中の精液のアリコートまたは洗浄された精子のアリコート上で行うことができ、これが望ましい場合、洗浄培地中の精子のアッセイを可能にし、洗浄培地中の活性化された精子の群に従い、授精の時間を決定することができる。
【０１３３】
態様または実施形態のいずれかでは、工程（ｉｖ）は、女性への投与のために精液サンプル中の精子の処理を開始することを含む。態様または実施形態のいずれかでは、処理には、精子の洗浄、緩衝液中の精子の再懸濁、宿主の体温での精子のインキュベート、またはそれらの組み合わせのうち少なくとも一つが含まれる。
【０１３４】
前述のように、マーカーには、好ましくは限定されないが、アクロソームの長さもしくは形態、アクロソーム膜の外観またはその構成要素が含まれ、これは原形質膜内の開窓を通して点状パターンで現れ、かかるパターンはアクロソーム吻から開始してさらに頭の方へと延び、精液サンプルの精子の細胞表面分子の発現、精液サンプルの精子の静電荷、および精液サンプルの精子または精子周囲の培地に脱落する精子由来物質（ＦｃＲなど）の精子またはその断片による染料の浸透性、精液サンプルの精子の細胞表面分子の発現、精液サンプルの精子の静電荷、および精液サンプルの精子の精子またはその断片による染料の浸透性が含まれる。好ましいマーカーは、精子頭部の表面上のＦｃ受容体である。使用したマーカーがＦｃＲ発現に相関する限り、本発明に従って使用することができる。
【０１３５】
別の実施形態では、精液サンプルは、１、２、３、４、５、１０、１２、１５、２０、２５、３０分の範囲の間隔で該マーカーについてアッセイされ、これはマーカーの発現の変化の速度、アッセイを実施するのに必要な時間などに依存する。ある好ましい実施形態では、精液サンプルは１５分間または３０分間隔でアッセイされる。さらなる態様では、アッセイは、精液サンプルのアリコート、または精子のアリコートを利用して、分量中の精子に相関する結果を生成することが好ましい。
【０１３６】
別の実施形態では、精子サンプルは、代謝状態のマーカーのモニタリングの間、一定の温度でインキュベートされる。
【０１３７】
別の実施形態では、マーカーは、好ましくは限定されないが、精子の表面上または内部またはその両方で発現するリガンド、レクチン、酵素、または受容体から選択される。一実施形態では、リガンドは、好ましくは限定されないが、例えば脂質ラフトなどの異なる膜領域を識別するために、例えば、蛍光偏光測定の緩和時間に反映されるような（適切なラベル脂質プローブによって反射されるような）、脂質分子構造よりもむしろ相対膜流動性によって検出されるものを含む、タンパク質、糖タンパク質、炭水化物および糖脂質ならびに脂質を含む。別の実施形態では、マーカーは、好ましくは限定されないが、アクロソームの長さ、アクロソームの形態、アクロソームラフリング、細胞表面分子の発現、該精子の静電荷、および精子膜の浸透性、脂質、コレステロール、ホスファチジルセリン、糖およびタンパク質、細胞内イオン、ならびに重炭酸塩から選択される。前述のように、好ましいマーカーは、精子頭部の表面上のＦｃ受容体である。精子の変化状態、および精子上のＦｃ受容体の発現の変化と相関することができる任意のマーカーを使用することができる。
【０１３８】
本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、マーカーは、リガンド、レクチン、タンパク質、酵素、受容体、脂質、炭水化物、糖タンパク質、糖脂質、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つを含むＦｃＲであり、精子の表面上または内部または両方で発現される。一実施形態では、ＦｃＲはフコース結合レクチンである。
【０１３９】
一実施形態では、第一のリガンドの結合は、二次マーカーの出現を誘発し、それは二次マーカーを補助リガンドと接触させることによって検出される。あるいは、本発明によるアッセイは、結合しないが精子に進入するかまたは他の方法（精子内の脂質二重層の一つへの脂質挿入など）で相互作用する薬剤を用いて行い、好ましくは目に見える変化をモニターすることができる経時的な変化を誘発することができる。
【０１４０】
態様または実施形態のいずれかでは、マーカーの発現、例えば、ＦｃＲ発現または発現がＦｃＲ発現または両方と相関するマーカーであって、精子で検出され、精子は精液、膣液、培地、またはそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つに含まれる。
【０１４１】
別の実施形態では、該精子またはその断片による染料の浸透性は、精子またはその断片の該染料の強度によって該精液サンプルのアリコートでアッセイされる。精子は、精子膜上に精漿剤を結合することが知られている。データは、精子が実際には周囲の培地から薬剤を吸収する可能性があることを示唆する。したがって、精子の断片には、精巣や精巣上体に形成される精子だけでなく、精子が積荷として獲得する薬剤も含まれると解釈されるべきである。
【０１４２】
別の態様では、本明細書は、細胞表面マーカーの発現をモニタリングする方法を提供し、ここで精液サンプルを処理するために選択される時点は、サンプルがマーカーを最大値発現するより早い時点に関して決定される。特定の実施形態では、精液サンプルを処理するために選択される時点は、対照またはベースライン値と比較して、細胞表面マーカーの発現の第一の決定された増加に関して決定される。特定の実施形態では、第一の上向きは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、約１００％以上（その間のすべての値を含む）の発現において、相対的増加である。
【０１４３】
別の実施形態では、細胞表面マーカーの発現をモニターし、精液サンプルの洗浄された部分でＩＵＩ手順を実施するために選択された時点を、該サンプル中の該マーカーの発現がピーク発現に対して減少し、その後発現の最小値から増加し始めた早い時点に関して決定される。
【０１４４】
一実施形態では、アッセイは、指定されたマーカーを有する精液サンプル中の精子の割合に基づく。一態様では、特定マーカーは生化学的マーカーであり、これは随意に細胞表面上に存在する。いずれにしても、マーカーは、精子の代謝受精能状態を反映するか、または示す。マーカーは、精子特異的マーカーに限定されない。
【０１４５】
一実施形態では、アッセイは、精子の代謝受精能状態を反映するマーカーを有する精液サンプル中の精子の割合を決定することを包含する。アッセイは、ａ）精液サンプルからアリコートを除去する工程と、ｂ）アリコートを該マーカーに対する第一のリガンドと接触させる工程と、ｃ）該精子による該リガンドの結合を検出する工程と、ｄ）リガンドに結合する該アリコート中の精子の割合を決定する工程とを含む。この実施形態の代替の態様では、工程ｄ）は、マーカーまたはリガンドに直接または間接的に結合する検出可能なラベルによってマーカーのレベルを評価する工程によって置き換えることができる。
【０１４６】
別の実施形態では、アッセイは、該精液サンプルの精子中に検出された該マーカーの濃度を決定することを包含し、ａ）精液サンプルからアリコートを除去する工程と、ｂ）アリコートを該マーカーに対する第一のリガンドと接触させる工程と、ｃ）該精子による該リガンドの結合を検出する工程と、ｄ）リガンドによるマーカーの結合を定量化することによって、該アリコート中の精子によって発現されるマーカーの量を決定する工程と、それによって、該精液サンプルの精子中で検出された該マーカーの濃度を決定する工程とを含む。
【０１４７】
特定の実施形態では、リガンドは検出可能なラベル、好ましくは可視ラベルでラベルされる。特定の実施形態では、リガンドは標識抗体、例えば、抗ＦｃＲ抗体に結合する標識抗ＦｃＲ抗体または標識抗体である。
【０１４８】
このアッセイの別の実施形態では、精子によるリガンドの結合を検出することは、直接的または間接的に精子または精子の断片に結合したラベルを検出することを含む。一態様では、精子断片は、無傷の精子から関連付けられるか、または分離されているかのどちらかである。別の態様では、精子によるリガンドの結合を検出することは、最初に精液中に存在し、次いで精子と会合し、次いで精子から解離するかまたは精子から脱落する薬剤に結合したラベルを検出することを含む。
【０１４９】
別の実施形態では、精子によるリガンドの結合を検出することは、アリコート中の精子と第一のリガンドに結合する第二のリガンドとを接触させることを包含する。
【０１５０】
別の実施形態では、第一のリガンドおよび／または第二のリガンドは抗体である。抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれかであってもよく、一つまたは複数のラベルを含むことができる。
【０１５１】
本明細書に記載される方法およびアッセイの別の実施形態では、精子の代謝受精能状態のインジケーターは生化学的マーカーである。生化学的インジケーターは、以下の生化学的インジケーター、細胞表面分子、酵素および受容体のうちの一つまたは複数を含むが、これに限定されない。精子の状態のインジケーターは、精子を取り囲む培地からの染料、ビーズ、またはその他の薬剤を吸収し、公知の検出方法によって測定可能な信号を生成する精子の能力を使用することができる。
【０１５２】
本発明者らは、ＦｃＲ添加剤が、低精子数を有する男性（乏精子症）からＩＵＩを保護できることを予想外に発見した。いかなる特定の理論に束縛されるものではないが、これらの射精液は細胞数が低いために培地中に十分なＦｃＲを持たないと考えられる。低細胞数の悪影響の一つ、ＦｃＲの欠損量は培地中に脱落し、有効量の外因性ＦｃＲの投与を介して改善できる。したがって、さらなる態様において、本記載は、例えば、ブタ、ウシ、またはヒトを含む哺乳類などの動物の精子による卵子の受精改善方法を提供し、メスに対して有効量のＦｃ受容体を投与することを含む。本方法は、本明細書で説明した処理方法と合わせて、または単独で使用することができる。特定の実施形態では、Ｆｃ受容体は、例えば、ブタ、ウシ、またはヒトなどのメス哺乳類のメスの卵管または子宮に直接投与される。特定の実施形態では、ＦｃＲは、精液または精子、例えば、本明細書に記載される方法に従って処理された精液または精子と同時投与される。本明細書に記載される態様または実施形態のいずれかにおいて、有効量のＦｃＲは、例えば本明細書に記載される方法に従って処理される精液または精子などの精液または精子と組み合わせる前または後に、一つまたは複数の薬学的に許容可能な担体および／またはアジュバントを含む組成物中で製剤化されうる。治療用途のための許容可能な担体または希釈剤は、医薬品技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ編１９８５）に記載され、本明細書に参照により組み込まれている。ヒトを妊娠させる場合、精子を洗浄するときに脱落ＦｃＲを収集して授精のために精子を提供し、次いで授精のために脱落ＦｃＲを洗浄された精子に戻すことが好ましい。
【０１５３】
このように、特定の態様においては、この説明は、ＦｃＲの有効量を薬剤的に許容可能な担体と組み合わせて含む組成物を提供する。特定の実施形態では、有効量は、０．０１ｎｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの分量である。特定の実施形態では、有効量は、１、１０、１００ｐｇ；１、１０、１００ｎｇ；１、１０、１００μｇ；１、１０、１００ｍｇ；１、１０、１００ｇ；１ｋｇを含む、その間のすべての値を含む、約１ｐｇ〜約１ｋｇである。本明細書に記載される組成物または方法の特定の実施形態では、ＦｃＲは、その間のすべての値を含む、約０．０１ｎｇ／ｍｌ〜約１０００ｍｇ／ｍｌの濃度で投与される。特定の実施形態では、１ｍｇのＦｃＲが投与される。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「同時投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」および「同時投与する（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」という用語は、薬剤がある程度、好ましくは有効量で同時に女性に存在する限り、同時投与（二つ以上の治療薬の同時投与、例えば、精子およびＦｃＲを同時に加える）および時間を変えて投与すること（例えば精子および追加のＦｃＲなどの一つまたは複数の薬剤を、追加の薬剤の投与の時間とは異なる時間に投与すること）の両方を指す。
【０１５５】
この態様によれば、一つまたは複数のＦｃＲは、ＣＤ１６Ａ；ＣＤ１６ａ抗原；ＣＤ１６Ｂ；ＩｇＧ低親和性ＩＩＩａ受容体のＦｃ断片；ＩｇＧ、低親和性ＩＩＩ、（ＣＤ１６）の受容体のＦｃ断片；ＩｇＧ、低親和性ＩＩＩａ、受容体（ＣＤ１６ａ）のＦｃ断片；ＩｇＧ、低親和性ＩＩＩｂ、受容体（ＣＤ１６ｂ）のＦｃ断片；Ｆｃガンマ受容体３；Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩ；Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩ−Ａ；Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩａ；Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩｂ；Ｆｃ−ガンマ受容体ＩＩＩ−２（ＣＤ１６）；Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩｂ（ＣＤ１６）；Ｆｃガンマ受容体ＩＩＩｂ（ＣＤ１６）；ｆｃ−ガンマＲＩＩＩ；Ｆｃ−ガンマＲＩＩＩ−アルファ；ｆｃ−ガンマＲＩＩＩ−ベータ；Ｆｃ−ガンマＲＩＩＩａ；ｆｃ−ガンマＲＩＩＩｂ；ＦｃガンマＲＩＩＩＡ；ＦＣＧＲ３；ＦＣＧＲ３Ａ；ＦＣＧＲ３Ｂ；ＦＣＧＲＩＩＩ；ＦＣＲ−１０；ＦＣＲＩＩＩ；ＦＣＲＩＩＩＡ；ｉｇＧ  Ｆｃ受容体ＩＩＩ−１；ｉｇＧ  Ｆｃ受容体ＩＩＩ−２；免疫グロブリンＧ  Ｆｃ受容体ＩＩＩ；好中球特異抗原ＮＡ；ＲＰ１１〜５Ｋ２３．１；タンパク質Ａ；タンパク質Ｇ；または両方のタンパク質Ａおよびタンパク質Ｇのエレメントを含有する混合物または組み換え型分子のいずれかを含むそれらの組み合わせのうち少なくとも一つを含む、本明細書に記載される組成物に製剤化されおよび／または投与されうる。ＣＤ１６（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む市販されている多くのＦｃＲがある。
【０１５６】
本発明によれば、時間ベースのアッセイは、男性不妊症の診断アッセイとしても使用されうる。また、ＩＵＩの妊娠結果をより成功させるため、適切な受精能状態の精子を提供するために、後でＩＵＩで使用するための凍結または凍結融解分量の精子の調製にも使用できる。
【実施例】
【０１５７】
実施例１  ＩＵＩに対する好ましい精子洗浄手順
目的は、子宮内授精（ＩＵＩ）のために、密度勾配分離および／または遠心沈殿精子洗浄技術を使用して運動性精子を準備することである。
【０１５８】
本明細書に記載される密度勾配分離技術において、クランピングを引き起こし、子宮内授精（ＩＵＩ）のために使用される高濃度の高質の精子を含有する精漿剤を含まないサンプルを得るために、不連続な密度勾配の遠心分離を用いて、運動性精子を単離および精製する。流体の異なる濃度は、試験管中に密度（底部が最も重層である）の昇順で層状にされる。精液サンプルが最上層に配置され、遠心分離された時、任意の破片、丸い細胞、非運動性および低質の精子が上層に残る。運動性の精子だけが下層まで移動でき、その後ＩＵＩで使用するために濃縮される。
【０１５９】
ＩＵＩにおける遠心沈殿技術はまた、最終的な精子濃度および運動性を向上させる役割も果たす。この技術では、液化精液サンプルを精子洗浄培地と混合し、遠心分離し、上清を廃棄し、同量の洗浄培地で再懸濁する。
【０１６０】
密度勾配精子洗浄培地の調製
全ての試薬を室温にする。生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）内の精子洗浄培地の調製に必要なすべての装置および材料を配置する。
【０１６１】
必要な数の滅菌円錐状管を準備する。勾配または洗浄培地が分注されているかどうかに応じて、試薬瓶の割り当て数（受注伝票によって番号付けされた）および「８０％」または「Ｗ」で管をラベル付けする。試薬瓶全体を分注し、使用まで４℃で管を保存することができる。部分的に分注された場合には、開封された試薬瓶を４℃に保存する。適切な勾配および洗浄培地は、ＡＲＴ施設で一般的に使用される任意のそのような培地である。非限定的な例には、ＰｕｒｅＳｐｅｒｍ（Ｎｉｄａｃｏｎカタログ＃ＰＳＢ−１００）、Ｓｐｅｒｍｃａｒｅ  ｕｐｐｅｒ  ｌａｙｅｒ（４５％）およびＳｐｅｒｍｃａｒｅ  ｌｏｗｅｒ  ｌａｙｅｒ（９０％）、（それぞれＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅカタログ＃２２２１−１００および＃２２２２−１００）、Ｓｐｅｒｍｗａｓｈ（ＩｎＶｉｔｒｏＣａｒｅカタログ番号２００３）、Ｓｐｅｒｍ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｏｒｉｇｉｏ、カタログ番号１０６９００１０Ａ）が含まれる。
【０１６２】
１Ｌａｙｅｒ  Ｓｐｅｒｍ  Ｗａｓｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（８０％）を準備する：２ｍＬの８０％勾配培地（例えば、ＰｕｒｅＳｐｅｒｍ  ８０（Ｎｉｄａｃｏｎ、カタログ番号Ｐ５８０−１００）を、滅菌円錐管にピペッティングする。
【０１６３】
Ｓｐｅｒｍ  Ｗａｓｈ  Ｍｅｄｉｕｍを準備する：４ｍＬの精子洗浄培地（例えば、ＰｕｒｅＳｐｅｒｍ  Ｗａｓｈ（Ｎｉｄａｃｏｎ、カタログ番号ＰＳＷ−１００）を、滅菌円錐管にピペッティングする。
【０１６４】
作業日の開始時に、準備した密度勾配と精子洗浄培地を、使用するまで３７℃のインキュベーターに入れる。手順の番号に応じて、ＩＵＩ当たり２つの勾配管と１つの洗浄培地管を配置する。
【０１６５】
１．  層密度勾配分離技術
洗浄前の精液分析と適切な精子洗浄
５μＬの精液サンプルを使用して、洗浄前の精液分析用に２  Ｍａｋｌｅｒ（登録商標）Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒｓを準備する。滅菌パスツールピペットを使用して、最大２ｍＬの液化精液サンプルを勾配培地の上部に穏やかに分配する。
【０１６６】
手順書：  精液サンプル量が＞２ｍＬの場合、追加の勾配培地を使用する。
注：  精子洗浄手順を開始する前に、精液サンプルを視覚的に確認する。サンプルが所与の時間に十分に液体化されていない場合（サンプル生産から６０分未満）、液化が達成されるまで精子洗浄培地を添加する。
【０１６７】
サンプルを視覚化して、運動性の精子の存在を確立する。２８０×ｇで２０分間遠心分離する。準備した上記の計数チャンバーを使用して、洗浄前の精液分析を実施する。
【０１６８】
ブレーキを使用して遠心分離機を停止しない。
滅菌パスツールピペットを使用して、上清をペレットまで除去する。目に見えるペレットがない場合は、すべての上清を吸引し、３００μｌの流体を残す。
【０１６９】
別の滅菌円錐状管を準備し、ラベルを付け、３ｍＬの精子洗浄培地を注ぎ、この溶液から０．３ｍＬを使用して、ペレットを再懸濁する。再懸濁ペレットを、滅菌パスツールピペットを使用してこの管に移す。
【０１７０】
４２０×ｇで１０分間遠心分離する。
滅菌パスツールピペットを使用して、上清をペレットまで除去する。
【０１７１】
０．５ｍＬの精子洗浄培地でペレットを再懸濁する。
この時点で、５μＬの精液サンプルを使用して、洗浄後の精液分析用に２  Ｍａｋｌｅｒ（登録商標）Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒｓを準備する。
【０１７２】
洗浄後の精液分析
準備した上記の計数チャンバーを使用して、洗浄後の精液分析を実施する。
【０１７３】
凍結された精液サンプルの解凍
冷凍ストロー／ｓ−水浴で（３７℃）５分間、解凍する前に、ストロー／ｓをまず円錐形の管に入れ、解凍された精液サンプルを滅菌円錐状管に移す。混合する。
【０１７４】
クライオチューブ／バイアル−クライオチューブ／バイアルを、水浴で（３７℃）５分間、解凍する前に、まずクライオチューブフローティングラックに入れ、解凍された精液サンプルを滅菌円錐状管に移す。混合する。
【０１７５】
洗浄前の精液分析と精子洗浄
解凍した精液サンプルを水浴から得る。
【０１７６】
この時点で、５μＬの精液サンプルを使用して、洗浄前の精液分析用に２  Ｍａｋｌｅｒ（登録商標）Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｃｈａｍｂｅｒｓを準備する。
【０１７７】
準備した上記の計数チャンバーを使用して、洗浄前の精液分析を実施する。
３ｍＬの精子洗浄培地を解凍したサンプルに加え、円錐状管の側面上に洗浄培地を注意深く分配する。
【０１７８】
４２０ｇで１０分間遠心分離する。
滅菌移動ピペットを使用して、上清をペレットまで除去する。
【０１７９】
０．５ｍＬの精子洗浄培地でペレットを再懸濁する。
洗浄された精子懸濁液を、授精までインキュベーター（３７℃）の中に配置する。
【０１８０】
洗浄後の精液分析
準備した上記の計数チャンバーを使用して、洗浄後の精液分析を実施する。
【０１８１】
基準範囲／予想値
【０１８２】
【表１】
2020514772.tif 000003
【０１８３】
実施例２
Ｆｃ受容体アッセイ
アッセイは、純粋な精液、合成培地中の解凍洗浄精液、または合成培地中の洗浄精液のアリコート２．５〜１０μｌに対して直接行われる。大量の純粋な精液を乏精子症サンプルに使用することができるが、乏精子症サンプルの細胞計数の好ましい方法は、可能であれば、サイトメトリー分析のために、細胞をより少ない１００μｌくらいの緩衝液量に再懸濁させ、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  ｃ６サイトメーターの最速流速に対応するイベントを収集することである。精液は採取カップに採取される。
【０１８４】
このアッセイを実施する前に、（１）精液を回収し、作業実施例１に記載されているようにインキュベートして、プロセスの失敗を最小化し、（２）アッセイ試薬が使用前に周囲温度であることを確認する（２２〜２６℃）。緑１、赤２および青３を上記で考察する。
【０１８５】
アッセイ混合物を調製する（予混合されていない）
ｉ．１．５ｍｌの管に、使用前に以下を下記の順序で直ちにピペッティングする。
【０１８６】
ｉｉ．１００μｌの緑
ｉｉｉ．２０μｌの赤２、混合する
ｉｖ．１０μｌの純粋な精液、混合する
ｖ．５μｌの青３、混合する。
【０１８７】
ｖｉ．このアッセイを３０分間隔で繰り返すが、理想的には１５分間隔である。アッセイ実行中は常に試薬を常に周囲温度に保つ。
【０１８８】
アッセイ混合物を調製する（予混合された試薬、および予め分注した試薬）
ｉ．１．５ｍｌの管に、使用前に以下を下記の順序で直ちにピペッティングするか、または任意選択で予め分注した１２０μｌの緑１／赤２混合物を１．５ｍｌ管に入れる。
【０１８９】
ｉｉ．１２０μｌ緑１／赤２混合物（混合５：１ｖ／ｖ）
ｉｉｉ．１０μｌの純粋な精液、混合する
ｉｖ．５μｌ青３、混合する。
【０１９０】
ｖ．このアッセイを３０分間隔で繰り返すことができるが、理想的には１５分間隔である。アッセイ実行中は常に試薬を常に周囲温度に保つ。
【０１９１】
インキュベート
管を周囲温度で２０分間インキュベートする（１５分間のインキュベーションが可能だが、アッセイが過度に短くなると、アーティファクトのリスクが増加する）。
【０１９２】
洗浄
ｉ．周囲温度で１ｍｌの緩衝液（ＰＢＳ緩衝液（８ｇ  Ｎａｃｌ）；０．２ｇ  ＫＣｌ；１．４４ｇ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ；０．２４ｇ  ＫＨ２ＰＯ４；Ｈ２Ｏ〜１リットル、ＰＨ７．２））を加える。
【０１９３】
ｉｉ．２０００×ｇ（マイクロフュージで約６，０００ｒｐｍ）で３０秒間マイクロフュージする。
【０１９４】
ｉｉｉ．上清を１ｍｌピペットで注意深く取り除く。ペレットを妨害するのを避けるために、少量の流体（典型的には、精子ペレットの硬度に応じて４０〜７０μｌ）を残す。
【０１９５】
スコア
約３００μｌの緩衝液を細胞ペレットに加え、穏やかに混合して再懸濁する。スコアリングのための再懸濁容積は、精子濃度に関連するものであり、乏精子症サンプルは、１００μｌほどの低い再懸濁量を必要とするか、または必要なイベント数を分析するためにカウント時間が長くなることになる。細胞数が低い場合、サイトメーターの流速を最初に増やすことが好ましい。これにより、約６０秒以内に５，０００のイベントを取得することができれば好ましい。これを可能にするのに精子カウントが低すぎる場合、再懸濁時の容積減少が求められる。あるいは、もし精子数が少ないことが、射精液に対するアッセイ実行を開始する前に問題になると疑われる場合、すべての時点で、少なくとも１０μｌのアリコートをアッセイする。最良の結果を得るために、特定の射精液から各マルチポイントアッセイで同じ容積のサンプルを使用することが好ましい。
【０１９６】
再懸濁細胞を含む管をサイトメーターＳＩＰ管上に配置し、「サイトメータースコアリング」テンプレートを使用して較正されたサイトメーター上で分析する（詳細についてはサイトメータースコアリングＳＯＰを参照）。
【０１９７】
診断結果を分析し、最適な受精能のための処理時間を決定する。
診断分析
ＦｃＲ初期状態−−（注意：この診断は、採取後ただちに一つまたは複数の凝固サンプルが試験された場合のみ実行できる。液化サンプルは、正常なコホートがすでに成熟している可能性があり、スコアは高くなるがそれでも正常である）最初の時点での陽性の精子の割合を決定する。３５％を超える場合、採取物はＦｃＲの異常な早期展開を示す。これは、家畜のＩＵＩにおける不妊症と関連する。凝固サンプルで１５％の初期結果であっても、男性因子の不妊症の疑いの指標が上昇する。
【０１９８】
ＦｃＲ動態−時間に対して陽性のＦｃＲの割合をプロットする。図９Ａ（１）〜図９Ｆ（２）を参照のこと。２．５時間にわたる正常な動態は、一つ以上の群の精子の成熟を伴い、通常の周期は１．０〜２時間（通常１時間）であるが、集団によってはより短い間隔で成熟する群もある。ヒト、ウシ、およびブタでは、最大値のＦｃＲ陽性の約０．５時間後に、ウシＩＵＩにおける既知の受精能マーカーであるスイムアップ収量がヒトで最大であり、ＦｃＲ動態を予測的アッセイにする。ＦｃＲによって活性化される単一のコホートまたは精子群のみを示す射精液は、場合によっては他の異常も有することが見出されている。単一コホートの射精液は家畜では見られない。これらの結果は、単一コホートの射精液が、妊娠結果を妥協し得るプレＡＲＴ（ＩＵＩ）において男性因子の問題を有する可能性があるという疑いの指標を高めている。
【０１９９】
耐凍結損傷性の改善―膜の流動性を高めることは、凍結能の改善と相関することが知られている。本明細書に記載の方法は、流動性の増加をもたらす膜変化を反映して、ＦｃＲ受容体発現を測定するので、アッセイは、解凍時に起こる細胞損傷を最小限に抑える状態で凍結させることによって凍結されるサンプルの生存率を最適化するために使用できる。凍結のための精子処理条件は実験室間で異なるので、各実験室は、それらの特定のプロセスと組み合わせたときに、解凍後生存率を改善するのに最良である精子状態を較正することが最良である。これは、アッセイを実行し、アッセイ時点ごとの開始時にアリコートを処理／凍結することによって行うことができる。アッセイによって特定され、解凍後の好ましい属性（例えば、解凍後分析における最高の生存率、高いスイムアップ収量、精子による卵子の結合および透過を測定する精子透過試験における最良の結果を生じる精子状態。または他の好ましい指標）は、その特定の実験室における手順による分量凍結に最も適した状態である。好ましい解凍後属性の最大値達成は、解凍直後ではなく、ある程度の時間が経過した後にのみ発生する可能性があることに注意されたい。これは、精子の凍結能に対する好ましい状態の達成時間と好ましい解凍後属性の達成時間との間に起こりうる差異によるものである。
【０２００】
ＩＵＩ用の状態調整された精子での処理
陽性細胞の割合をプロットする。Ｆｃ受容体に対する陽性細胞の割合は、通常凝固サンプルについて採取後３０分〜２．５時間の時間ウィンドウで増加し始め、早期成熟精子群を有する液化後サンプルについては第一のアッセイポイントで既に上昇している可能性があり、第一のＦｃＲピークの解釈を混乱させる。時間０＝アッセイ開始の時間。
【０２０１】
約３０分間隔で、２点間で少なくとも３０％の増加を探す、グラフポイント。３点間の増加は、約１５分間隔で試験された場合に少なくとも３０％とする必要がある。特定の実施形態では、間隔は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２、６  ２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７、９  ８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０分以上である。このような細胞の陽性の増加が見られた時、この目的のために調製されたサンプルの一部を用いて、アッセイ終了時点（読み取りが利用可能になる時）からそのアッセイ終了時点が得られた２０分後までのウィンドウでＩＵＩ授精手順を行う。図９の例を参照のこと。理想的な時間ウィンドウは約３０〜６０分以内であり、そして処理時間は、アッセイ開始時間（終了時間ではない）から決定される最大値ＦｃＲピークの時間から約４５〜６０分での授精を必要とし得る。しかしながら、可能であれば、最小値を超えて上昇するのとは対照的に、それらのＦｃＲの発現が低下しそして最小値に達する時点で、精子をＩＵＩによって子宮に導入することが好ましい。
【０２０２】
実際のサンプル例については、図９Ａ（１）〜図９Ｆ（２）を参照のこと。なお、陽性ＦｃＲ割合のわずかな増加は依然として良好な結果と関連し得るが、精子の受精能状態の調整には好ましくない。
【０２０３】
図９Ａ（１）〜図９Ｆ（２）は、ＦｃＲピークおよび所望のＩＵＩ時間の識別のための例を示す。図９Ｂ（２）は、ＦｃＲ陽性精子の減少する集団を示し、これは多くの場合、増加状態を示す時点に先行し、そこから精子ＩＵＩのタイミングが発生するべきである。したがって、図９Ｂ（２）および図９Ｃ（２）は、臨床に精子の危険な状態が近づいていること、その後その状態に達することを知らせるものである。ここで示される３０分のサンプリング間隔については、１０．１５時計の時刻でのＦｃＲ高い割合の陽性は、±１５分のウィンドウに対して１０．３０〜１１．００、または±２０分のウィンドウに対して１０．３０〜１１．０５の間でＩＵＩを実行する必要があることを示す。これは、この時点のデータが利用可能になった時、アッセイ終了間の実践手段であり、３０分のアッセイ間隔は１０．４０、最大１１．００、優先的には１０．４０に近い。時間ウィンドウは、理想的には１０．３０〜１１．００、または最小値でＦｃＲの時点から授精まで±２０分を許容する場合には最大で１０．２５〜１１．０５に及ぶであろう。臨床では精子調製中に曲線全体を見ることはなく、精子状態をＩＵＩ適合状態に調整するのに必要な領域だけが見えるので、アッセイが提供する予測シグナルは重要である。明らかに、より良好な曲線の定義と、ＩＵＩ手順の実行のために好ましい精子状態を含むウィンドウのより大きな部分の使用を可能にすることの両方のために、より頻繁なサンプリングが望ましい。しかし、ＩＵＩウィンドウの正確さは、アッセイが１０．４５ａｍに開始された時点でＦｃＲ陽性の割合が急激に減少し、続いて１１．１５に開始したアッセイ実行においてさらに増加することによって確認される。
【０２０４】
サイトメータースコアリング
このアッセイをスコアリングする前に、精液が採取され、上述のように正確にインキュベートされ、アッセイが上述のように確実に実行されてプロセスの失敗を最小限に抑えるようにする。
【０２０５】
機器の開始
ｉ．コンピュータをオンにする
ｉｉ．サイトメーターをオンにする（ＢＤ／Ａｃｃｕｒｉ、カリフォルニア州サンノゼ）
ｉｉｉ．必要に応じて、廃棄ボトルを空にし、シースボトルをＤＩ水で充填する
テンプレートを開きファイルに名前をつける
ｉ．アッセイ１テンプレートをクリックする
ｉｉ．ファイルを選択＞ＣＦｌｏｗファイルを保存する…；
ｉｉｉ．日付コードをファイル名に入力することによって、日付別でファイルに名前をつける
ｉｖ．保存をクリックする。
【０２０６】
データ収集
ｉ．赤い収集タブの下で、目的のサイトメーターグリッド（１Ａは第一のドナーの第一のサンプル、１Ｂは第一のドナーの第二のサンプルである。２Ａは第二のドナーの第一のサンプルなど）をクリックする。
【０２０７】
ｉｉ．サイトメータグリッド（例えば、Ａ０１）の隣に、サンプル情報およびアッセイ時間（採取物がアッセイされたときの時間）を入力する。
【０２０８】
ｉｉｉ．停止信号が緑色を示していることを確認する。サイトメーター上のＳＩＰ管にサンプルをロードし、管の下のプラスチック製の管サポートを引き出す。
【０２０９】
ｉｖ．実行をクリックする。
ｖ．データが取得された後、陽性の精子（右側の母集団）の割合を決定できるように密度プロットのゲートを調整する。この番号を記録する。ＳＩＰ管からサンプルを取り除く。
【０２１０】
ｖｉ．次のサンプルについては、工程３ａから始まる上記のプロセスを繰り返す。
ｖｉｉ．そのアッセイ時間のサンプルが終了したら、バックフラッシュをクリックし、停止信号が緑色を示すのを待ってから、除去（Ｕｎｃｌｏｇ）をクリックする。
【０２１１】
機器の清掃および停止
ｉ．５〜１０個のサンプルごとに、廃棄物カップをＳＩＰの下に配置し、バックフラッシュまたは除去（Ｕｎｃｌｏｇ）を選択する。
【０２１２】
ｉｉ．一日の終わりに、サイトメーター上に洗浄液の管を配置し、ウェルＨ１１を選択し、実行をクリックする。２分間実行。次に、サイトメーターに水の管を配置し、ウェルＨ１１を選択し、実行をクリックする。２分間実行。少なくとも２分間、水で機器を洗浄する（稀なサンプル上の陰性プールのいくらかの移動のために、それと陰性プールとの間にいくらかのスペースを置いて陽性蛍光ゲートを設定することが好ましい。これにより、陰性のイベントが陽性プールに入り込むことなく、いくつかの陰性プールの動きに対応できる。深刻な異常な陰性プール移動を伴う時点を再ゲートすることは好ましくないが、時々これは異常の程度により必要である。）。
【０２１３】
サイトメーターをオフにし、コンピュータをオフにする。
ｉ．製造業者の計器マニュアルに詳述されているように、操作、清掃、予防保守のためのすべての指示に従う。
【０２１４】
実施例３
アッセイの信号の増加
ヒトの受精能臨床は、乏精子症（低精子数）またはその他の異常なサンプルに直面する。これらのサンプルについて、アッセイの信号強度を増加させることが望ましい場合がある。これを行うための二つの方法を本明細書に記載する。（１）洗浄された細胞の使用、および（２）異なるアッセイ希釈剤の使用。洗浄媒体の例には、多数の販売業者によって販売されているＳｐｅｒｍ  Ｗａｓｈ  Ｍｅｄｉｕｍ、例えば、Ｓｐｅｒｍ  ｗａｓｈ  ｍｅｄｉｕｍ（ＩｎｖｉｔｒｏＣａｒｅ  カタログ＃２００５）またはＳｐｅｒｍ  Ｗａｓｈｉｎｇ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  カタログＩＤ  ９９８３）が含まれる。異なるアッセイ希釈剤の例には、緑色１で置換可能な緩衝液が含まれる。緩衝液が推奨されるサンプルは、以下のプロトコルに示されている。サンプルタイプおよび希釈剤タイプを変更することができるが、好ましい実施形態を以下のプロトコルに提示する。いくつかのサンプルは洗浄媒体中で良好な性能を示すかもしれないが、いくつかの射精液は洗浄媒体中でサイクリングを示すことができず、精子が精液中でアッセイされるときのサイクリング失敗に関して真実であるように、妊娠の達成の失敗と関連する。
【０２１５】
アッセイ混合物を調製する
ｉ．１．５ｍｌの管に、使用前に以下を下記の順序で直ちにピペッティングする。
【０２１６】
ｉｉ．１００μｌの緑１（または純粋な精液を使用する場合は緩衝液）
ｉｉｉ．２０μｌの赤２、混合する
ｉｖ．洗浄された細胞１０μｌ−−純粋な射精液と同程度の濃度であるが、そうでない場合、分析容量または使用した試薬の量を調整し、混合する
または
１０μｌの純粋な精液（緩衝液を使用する場合）、混合する
ｖ．５μｌの青３、混合する。
【０２１７】
ｖｉ．このアッセイを少なくとも３０分間隔で繰り返すが、理想的には１５分以下の間隔である。アッセイ実行中は常に試薬を常に周囲温度に保つ。
【０２１８】
インキュベート
管を周囲温度で２０分間インキュベートする（１５分間のインキュベーションが可能だが、アッセイが過度に短くなると、アーティファクトのリスクが増加する）。
【０２１９】
洗浄
ｉ．周囲温度で１ｍｌの緩衝液を加え、反転により混合する
ｉｉ．２０００×ｇ（マイクロフュージで約６，０００ｒｐｍ）で３０秒間マイクロフュージする。
【０２２０】
ｉｉｉ．上清を１ｍｌピペットで注意深く取り除く。ペレットを妨害するのを避けるために、ペレットの硬さに応じて、通常は３０〜８０μｌの範囲であり得る少量の流体を残しておく。
【０２２１】
スコア
ｉ．約３００μｌの緩衝液を細胞ペレットに加え、穏やかに混合して再懸濁する。スコアリングのための再懸濁容積は、精子濃度に関連するものであり、乏精子症サンプルは、１００μｌほどの低い再懸濁量を必要とするか、または必要なイベント数を分析するためにカウント時間が長くなることになる。
【０２２２】
ｉｉ．再懸濁細胞を含む管をサイトメータＳＩＰ管上に配置し、較正されたサイトメーター上で分析する。
【０２２３】
診断結果を分析し、最適な受精能のための処理時間を決定する。
図１１は、洗浄された精子アッセイおよび純粋な精液アッセイの実施例の比較を示す。
【０２２４】
実線は純粋な精液を示している。破線は、アッセイ前に密度勾配で遠心分離（ｄｇｘ）することによって洗浄された同一の射精液からの精子を示す。純粋な精液の平均ＦｃＲ陽性の割合は４．０であり、洗浄された精子については、３０分間隔で実行されたアッセイの過程にわたって７．７である。純粋な精液についての時点２および洗浄された精子についての時点４における完全なピークについてのコホート陽性の比率は２．１であり（洗浄９．１％／純粋４．４％）、洗浄された精子におけるコホートシグナルが純粋な精液におけるそれの二倍であることを意味する。サンプルが同じ射精液からのものであるため、コホートサイズ比較は簡単であるが、絶対的ではない。しかしながら、純粋な精子コホートが、洗浄された精子コホートよりも低い割合でピークに達することは明らかである（１４．５％陽性の部分的なものが、洗浄された精子の最初の時点で見られる）。洗浄条件により、同一のタイミングのアッセイを実行することが言及されているように困難であることを留意されたい。これらのデータは陽性の程度を比較するためのものであり、対応がゆるいため、洗浄アッセイと純粋なアッセイを時点ごとに比較するためのものではない。
【０２２５】
実施例４
精液分量凍結
精子バンク手順では、凍結解凍損傷に対して耐性のある精液を提供するために、以下のように本発明にしたがって時間ベースのアッセイを実施する。
【０２２６】
アッセイ用採取のアリコートを取得する。
実験室で受領したら直ちに１０μｌサンプルでアッセイを行う。プレＡＲＴでの精子使用の診断としてこれを使用する。第一時点でのＦｃＲ陽性精子の割合が３５％を超える場合、手順を実行することが可能であるが、採取物は潜在的に異常としてフラグを付けるべきである。プレＡＲＴでは妊娠が効率的に発生しない場合がある（注意：アッセイアーティファクトの生成を避けるために、試薬が周囲温度にあることを確認する。）。
【０２２７】
即時サンプルは採取できないが、液化後のサンプルのみ採取できる場合は、サンプル受領から３０分以内に５０μｌのアリコートを除去し、３７℃に保存する。実験室が周囲温度保存を使用することを好む場合、これは試験と適合性はあるが、処理記録のこの偏差に注意されたい。
【０２２８】
アッセイ
精子細胞を評価し、さらなる処理を実施するために実施例２の指示に従う。
【０２２９】
本明細書で引用した全ての特許、特許出願、および公表文献は、その全てが参照によってここに組み込まれる。本明細書に記載される本開示は、その好ましい実施形態に関連して特に示され、記載されているが、当業者であれば、形態および詳細の様々な変更を、添付の請求項によって包含される範囲から逸脱することなく行うことができることが理解されるであろう。
【０２３０】
実施例５
ＦｃＲの投与
ＦｃＲのアリコートを微量天秤で１．７ｍｌのマイクロフュージ管に秤量し、蓋をしてフリーザー（Ｅ．ｃｏｌｉ製のＦｃＲ  Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ／Ｇ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ、カタログ番号ＰＲＯ−６４６、ロットＱＧ２２１９２３）中に保存した。増量剤については、１２／１１／１６に受領し、ＩＭＶによって作製され、有効期限２０１６年０３月のＢｉｏＸｃｅｌｌ（ＢｉｏＸｃｅｌｌ  ５０３２４０１）を使用した。
【０２３１】
混合物を、ＩＭＶからの２ｍｌの濃縮物を８ｍｌの水中に添加することによってＢｉｏＸｃｅｌｌを使用して作製し、よく混合した。この１０ｍｌの増量剤に、ＡＩで１ｍｇ／分量を有する０．５ｍｌ分量の調製用に２０ｍｇのＰｒ  Ａ／Ｇを入れる。これらを、約２ｍｇ／ｍｌの濃度で１１ｍｌの希釈された（ＡＩ濃度）ＢｉｏＸｃｅｌｌに入れた（０．５ｍｌの分量は、女性に挿入された場合、ＡＩ当たり１ｍｇのＦｃＲ分量を生成する［人工授精、この場合はウシＩＵＩ］）。これに続いて、精液を得た。
【０２３２】
実施例６
洗浄された精子
ＩＵＩ手順には、精子を洗浄することが含まれており、女性への授精のために調製される。洗浄された精子サンプルを調製し、純粋な精液を解析するためのものと同じ、上記の実施例２に記載されるＫｉｎｅｔｉｘ（商標）手順を使用して分析した。
【０２３３】
一つのデータセットには、一回は適合性射精液を、一回は非適合性射精液を、連続して二日間に二回のＩＵＩを受けた、洗浄された精子の患者が含まれる。このデータセットは、ＷＩＵＩ  １０とＷＩＵＩ  １３としてコード化され、以下の表から省略された。どのサンプルが妊娠につながったか確認できなかったからである。適合性とは、最小値から＋／−２０分の、最小値ＦｃＲについてのウィンドウ内の授精を意味する。表で分かるように、１年目の試験は２年目の試験中に正確に再現された：全ての妊娠は、ＦｃＲ最小値の±１５〜２０分のウィンドウ内であった。
【０２３４】
以下の表は、精子射精液サンプルが適合性または非適合性の場合に、達成された妊娠を示す試験の結果を示す。曲線の理想的な解釈、ｆ（ｘ）は、時間の経過に伴うアッセイ関数の変化率、すなわち曲線の最大値、最小値、およびｄ（ｘ）／ｄｔが符号を変える（正から負へ、または負から正へ）、または最も急速に変化する変曲点を特定するためのｄ（ｘ）／ｄｔに従うという理解のもとで、曲線形状によってスコアリングされた。符号の変化は、最大点と最小点で発生するが、最も急速な変化率は、正弦曲線の立ち上がり側と立ち下がり側の変曲点で発生する。理想的な正弦曲線では、ｄ（ｘ）／ｄｔ＝１（正弦曲線の立ち上がり側の変曲点、ｄ（ｘ）ｄｔ＝０によるＦｃＲの増加の確認、および最小値の±１５分以内のｄ（ｘ）／ｄｔにおけるＩＵＩであり、ここでｄ（ｘ）ｄｔ＝０であり、負から正に変化した）を検出して、ＦｃＲの最小値を予測する。
【０２３５】
１年目の試験、精液中の精子。
射精液の実験室サンプルを本発明により３０分間隔でアッセイし、残りの射精液中の精子を授精のために処理した。アッセイ時間には、患者の授精が発生した時間が含まれた。動態適合性ＩＵＩは、アッセイによるＦｃＲ最小近似値の＋／−２０分以内に起こる授精手順として定義された。動態非適合性ＩＵＩは、ＦｃＲ最小近似値の＋／−２０分ウィンドウ外に起こる授精として定義された。
【０２３６】
【表２】
2020514772.tif 000004
【０２３７】
２年目の試験、洗浄培地の精子。洗浄培地中の精子を、本発明による３０分間隔で、通常のアッセイ試薬容量の半分の２．５μｌサンプルで二回アッセイし、そして複製点を平均して曲線を作成した。アッセイ時間には、患者の授精が発生した時間が含まれた。動態適合性ＩＵＩは、アッセイによるＦｃＲ最小値の＋／−２０分以内に起こる授精手順として定義された。動態非適合性ＩＵＩは、ＦｃＲ最小近似値の＋／−２０分ウィンドウ外に起こる授精として定義された。
【０２３８】
【表３】
2020514772.tif 000005
【０２３９】
両方の年の精子サンプルの凝集により、以下のものが得られる：
【０２４０】
【表４】
2020514772.tif 000006
【０２４１】
ここで、比率の等しい二つのサンプル試験を、この２ｘ２表上で実施することができる。この表の一部の細胞は、低いカウント数（例えば、両方の動態適合性群における妊娠数が１０未満）を有するため、イェーツの継続補正をデータに適用することに注意されたい。この継続的補正は、低細胞カウントを補正し、保存的統計試験をもたらす。つまり、妊娠の二つの比率が互いに真に異なる場合、イェーツ継続補正を組み込んだ試験は、この差異を少なく見積もっている可能性がある。
【０２４２】
比率の同等性のこの試験は、１自由度を有する。得られたカイ二乗統計は２３４＝５．７４８５であり、対応するｐ値は％＝０．００８２５１である。このｐ値は＞＝０．０５の有意レベル未満であるため、我々はヌル仮説を否定し、動態アッセイ適合性患者の間で観察された妊娠の比率が、非適合性患者の間で観察された妊娠の割合よりも統計的に有意に大きいことを結論付ける。９５％の確実性を持って、データは、動態アッセイ適合性患者について０．１２２〜１．００の妊娠達成率と一致する。
【０２４３】
実施例７
アッセイサイクリング率は妊娠率に相関する
精液サンプルは、上記実施例２に記載されたようにアッセイされた。グラフは、射精液からの純粋な精液アッセイであり、Ｙ軸上に動態陽性の割合およびＸ軸上に時間を示す。グループＩは最小値を有さない；グループＩＩは一つ（１）の最小値を有する；グループＩＩＩは二つ（２）の最小値を有する。
【０２４４】
射精液動態サイクリング率とＩＵＩ妊娠達成との関係
【０２４５】
【表５】
2020514772.tif 000007
【０２４６】
純粋な射精液を記載されているようにアッセイし、精子処理および授精のためのＩＵＩ手順を盲検方式で行い、授精は許容される手順ウィンドウ全体にわたって無作為に発生した。サイクリングなし、低速サイクリング、または高速サイクリングを示す射精液の割合を、妊娠結果について評価した。
【０２４７】
これらのデータは、例えば精子バンクによる、最初の射精液でＫｉｎｅｔｉｘ（商標）アッセイの最小値を生成しない場合、または一つの最小値を生成したが、翌日の射精液で二つの最小値を試したいと思う可能性のあるにカップルに再び来てもらいたいＩＵＩ臨床による、診断目的でのサイクリングの使用を示す。２４時間離れたＩＵＩ手順は、特定の患者のための臨床で確立された実践である。
【０２４８】
したがって、臨床および精子バンクは、Ｋｉｎｅｔｉｘ（商標）アッセイを−均一な精子状態であるＩＵＩのための精液分量を作るための製造プロセス管理としてだけではなく−診断として使用することができる。高速サイクリングの射精液は、ＩＵＩにおいてより受精能が高まることになる。男性患者がグループＩまたはグループＩＩの射精液を生成する場合、医師は２４時間後にもう一度カップルを呼んで別の射精液を処理することを希望してもよく、その結果、妊娠の達成確率は増加する（最初の射精液が最適以下であった場合）。精子バンクは、ＩＵＩ用の急速なサイクリング射精液のみを保存し、グループ０の非サイクラーを拒否したがる場合がある。Ｋｉｎｅｔｉｘ（商標）アッセイは、上記の実施例２に開示されるように、純粋な精液で正確に実行される。現在、臨床または精子バンクで使用する正確なプロセスは、ＩＵＩの精液処理に使用される。唯一の変更点は、精子分量のＩＵＩ質を決定するため、または単一ＩＵＩもしくは繰り返しＩＵＩ手順への患者の階層化を決定するための射精液のＫｉｎｅｔｉｘ（商標）サイクリング率を特定することである。
【０２４９】
実施例８
洗浄された精子Ｋｉｎｅｔｉｘ（商標）アッセイ振幅
洗浄された細胞のためのＫｉｎｅｔｉｘＸ（商標）アッセイ振幅は、妊娠の達成に関連している。洗浄された精子細胞については、適合性サンプルの中でも（すなわち、アッセイ結果に基づいて妊娠を引き起こす可能性があると考えられるサンプル）、確実に妊娠を達成する洗浄された精子サンプルのＫｉｎｅｔｉｘ（商標）の振幅は、約５．９％〜６．７％であったと決定した。これは、適合する妊娠を引き起こさない洗浄された精子についての３．１％の正の振幅に対して、対照的でありうる。
【０２５０】
これは、好ましいＩＵＩ処理に対して重要な観察事項である。というのも、Ｋｉｎｅｔｉｘ（商標）振幅は、純粋な精液サンプル（雄牛の精子は洗浄されない）としてアッセイされた雄牛の射精液によっては大きく変わり得るからであり、妊娠には効果はない。しかし、時間が経過すると、洗浄されたヒトの精子は古くなり、サイクリングを停止したものは妊娠を引き起こさないことがわかる。
【０２５１】
洗浄された精子のレトロスペクティブ試験、ピーク振幅対動態適合性および妊娠結果。
洗浄された複製については、もっとも高いＦｃＲ最大値を持つピークの時点を決定し、同時点についての他の複製値をそれと平均化した。射精液は三つのグループに割り当てた：妊娠を引き起こす適合性、妊娠を引き起こさない適合性、非適合性。射精液についてＦｃＲ平均最大値を決定し、次いでこれをグループごとに平均して、ピーク振幅が状態と相関するかどうかを決定した。これは示されるとおりであった。
【０２５２】
同じ女性患者が、一つが適合性で一つが非適合性の＃１０および＃１３の射精液を受けたため、どちらが妊娠を引き起こしたのか明言できなかった。しかし、それが適合性射精液であったと推定することはできる。なぜなら、単一の射精液での女性患者の単一の授精により明白にスコアリングすることができた場合、非適合性射精液は妊娠を引き起こさなかったからである。これを確実に知ることができなかったので、適合性および非適合性の両方の射精液が、ピーク振幅計算で「妊娠」のカテゴリーに含まれた。これにより、二つのうち非適合性の射精液が除去された場合、妊娠したグループの振幅は保存的になり、妊娠したカテゴリーのピーク振幅が増加し、その他のカテゴリーとは異なるようになる。ここで提示された他の計算については、この患者および射精液は取り除かれた。
【０２５３】
【表６】
2020514772.tif 000008
【０２５４】
異なるＦｃＲ状態の授精についての平均ピーク振幅および妊娠結果
【０２５５】
【表７】
2020514772.tif 000009
【０２５６】
参考文献
以下の参考資料は、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５７】
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【０２５８】
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【０２６３】
Ｓｅｄｏｒ  Ｊ、Ｃａｌｌａｈａｎ  ＨＪ、Ｐｅｒｕｓｓｉａ  Ｂ、Ｌａｔｔｉｍｅ  ＥＣ、Ｈｉｒｓｃｈ  ＩＨ．Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ｆｃ  γ  ＲＩＩＩ（ＣＤ１６）ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｓｅｍｉｎａｌ  ｐｌａｓｍａ  ｏｆ  ｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．Ｊ．Ａｎｄｒｏｌ．１４、１８７〜１９３（１９９３）。
【０２６４】
Ｌｕ、Ｊ．−Ｃ．、Ｈｕａｎｇ、Ｙ．−Ｆ．、Ｌｕ、Ｎ．−Ｑ．Ａｎｔｉｓｐｅｒｍ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４（１）：１１３〜１２６（２００８）。
【０２６５】
Ｐｉｔｕｃｈ−Ｎｏｗｏｒｏｌｓｋａ、Ａ．ら、Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｓｈｅｄ  Ｆｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ（ＰＨＡ）．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５５：６９３〜７０１（１９８５）．
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【国際調査報告】
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