(57)【要約】  本発明は，一般式Ａ−Ｓ−Ｎ（Ｘ）に従って，ヒアルロン酸及び／又はその誘導体と医療物質との複合体を含むことを特徴とする，ヒアルロナン及びその誘導体をベースとするキャリアーを含む医薬製剤に関し，式中，Ｎはヒアルロン酸及び／又はその誘導体に基づくキャリアーであり，ｍは１０〜１２５０であり，ｎは１００〜１２５００であり，それらの製造及び使用も同様である。この新規な医薬は医学及び化粧品の分野で使用できる。【選択図】図４
2020502251.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒアルロナン及び／又はその誘導体をベースとするキャリアーを有する医薬製剤であって，一般式（Ｘ）：
Ａ−Ｓ−Ｎ    （Ｘ），又は
2020502251.tif 000016
（式中，
Ａはアミノ酸及びペプチドを含む群から選択される医薬物質であり，
Ｓは−Ｏ−又は−ＮＨ−を含む群から選択され，
Ｎは１．５×１０４〜２．５×１０６g.mol-1の範囲の分子量のヒアルロン酸，パルミトイルヒアルロナン又はホルミルヒアルロナンを含む群から選択されるキャリアーであり，
ｍは１０〜１２５０であり，
ｎは１００〜１２５００である）
で表されるヒアルロン酸及び／又はその誘導体と医薬物質との複合体を含むこと，並びに
水不溶性かつ生物分解性であること，
を特徴とする医薬製剤。
【請求項２】
前記キャリアーＮがエンドレスファイバー，糸，織物，薄膜，ステープルファイバー及び／又は不織布の形態であることを特徴とする請求項１記載の医薬製剤。
【請求項３】
前記医薬物質Ａが，Ｏ原子を介してエステル結合により，又はＮ原子を介して還元アミノ化によって，直接又は疎水性アミノ酸Ｘａａから成るペプチドをベースとする線状のリンカーを介してヒアルロン酸及びその誘導体に固定化されていることを特徴とする請求項１又は２記載の医薬製剤。
【請求項４】
ヒアルロナン及び／又はその誘導体をベースとする医薬製剤の調製方法であって，
最初に，アミノ酸及びペプチドを含む群から選択され，かつ，末端のＮ−保護基及びカルボキシル基を有する医薬物質Ａに対して非プロトン性極性溶媒中での縮合剤によるカルボキシル基の活性化を行って反応中間体Ｉを形成し，続いてこれを１．５×１０４〜２．５×１０６g.mol-1の範囲の分子量のヒアルロン酸，パルミトイルヒアルロナン又はホルミルヒアルロナンであるキャリアーＮと，有機塩基と触媒の存在下で反応させて，一般式（Ｘ）：
Ａ−Ｓ−Ｎ    （Ｘ），又は
2020502251.tif 000017
（式中，
Ａはアミノ酸及びペプチドを含む群から選択される医薬物質であり，
Ｓは−Ｏ−又は−ＮＨ−を含む群から選択され，
Ｎは１．５×１０４〜２．５×１０６g.mol-1の範囲の分子量のヒアルロン酸，パルミトイルヒアルロナン又はホルミルヒアルロナンを含む群から選択されるキャリアーであり，
ｍは１０〜１２５０であり，
ｎは１００〜１２５００である）
で表されるヒアルロン酸及び／又はその誘導体と医薬物質Ａとの複合体を形成し，
そしてその後前記キャリアーに結合した前記医薬物質Ａの末端のＮ−保護基を塩基性環境下で切断する
（ここで，全調製を通してキャリアーＮは固相にあり，反応環境に不溶性であり，かつ生物分解性である）
ことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記医薬物質Ａが，前記キャリアーに直接又は疎水性アミノ酸Ｘａａによって形成されたペプチドをベースとする線状のリンカーを介して結合していることを特徴とする請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記医薬物質Ａが線状のリンカーＸａａ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ｘａａを介してキャリアーに結合していることを特徴とする請求項５記載の方法。
【請求項７】
ヒアルロン酸及びその誘導体の複合体の形成が２０〜４０℃の温度で２〜４８時間行なわれることを特徴とする請求項４〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記ヒアルロン酸及びその誘導体の複合体の形成が２２〜２５℃の温度で２４時間行なわれることを特徴とする請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記複合体を前工程の反応中間体Ｉと同じか又は異なり得る反応中間体Ｉとさらに繰り返し反応させることを特徴とする請求項４〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記縮合剤が，Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド，Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド，１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスファート，１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド，プロピルホスホン酸無水物，２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート，エチルクロロホルメート，ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウム  ヘキサフルオロホスファート，Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホウ酸塩，４−トリエチルアミノ−ジシクロヘキシルカルボジイミドｐ−トルエンスルホナート，４−ニトロフェノール，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド，２，４，５−トリクロロフェノール，２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェノール，２，３，４，５，６−ペンタクロロフェノールからなる群から選択されることを特徴とする請求項４〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記非プロトン性極性溶媒がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，ジメチルスルホキシド，Ｎ−メチル−２−ピロリドン，アセトニトリル，ジクロロメタン，テトラヒドロフラン，１，４−ジオキサンを含む群から選択されることを特徴とする請求項４〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記有機塩基がトリエチルアミン，ピリジン，モルホリン，Ｎ−メチルモルホリン，Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン，イミダゾールを含む群から選択されることを特徴とする請求項４〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記触媒が，エチル（ヒドロキシイミノ）シアノアセテート，ヒドロキシベンゾトリアゾール，１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール又はＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを含む群から選択されることを特徴とする請求項４〜１２のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記Ｎ末端保護基が切断される塩基性環境が，ＤＭＦの中の２０％ピペリジン，ＤＭＦの中の２％ＤＢＵ，ＤＭＦ中の３０％ｔ‐ブチルアミンを含む群から選択されることを特徴とする請求項４〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
前記縮合剤がＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドであり，前記非プロトン性極性溶媒がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであり，前記触媒がエチル（ヒドロキシイミノ）シアノアセテート及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンの組み合わせであり，かつ前記塩基性環境がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％ピペリジンであることを特徴とする請求項４〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記医薬物質Ａの量がヒアルロン酸又はその誘導体の二量体に対して１〜５当量に相当することを特徴とする請求項４〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
前記縮合剤の量がヒアルロン酸又はその誘導体の二量体に対して０．１〜５当量に相当することを特徴とする請求項４〜１６のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記有機塩基の量がヒアルロン酸又はその誘導体の二量体に対して１０当量以下に相当することを特徴とする請求項４〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記触媒の量がヒアルロン酸又はその誘導体の二量体に対して０．１〜５当量に相当し，好ましくは３当量のエチル（ヒドロキシイミノ）シアノアセテート及び０．３当量のＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンを使用することを特徴とする請求項４〜１８のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
ヒアルロン酸又はその誘導体の二量体に対して，前記医薬物質Ａの量が３当量に相当し，前記縮合剤の量が３当量に相当し，前記触媒の量が３当量に相当することを特徴とする請求項４〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
ヒアルロン酸又はその誘導体の二量体に対して，前記医薬物質Ａの量が１当量に相当し，前記縮合剤の量が１当量に相当し，前記触媒の量が１当量に相当することを特徴とする請求項４〜１９のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
経皮投与，舌下投与，口腔内投与又は開放創への局所投与で投与される活性ペプチド又はアミノ酸の剤形として医療用途に使用するための請求項１〜３記載の医薬製剤。
【請求項２３】
前記医薬物質としてペプチドダラルジンを含む経皮投与のための請求項２２記載の医薬製剤。
【請求項２４】
前記医薬物質として，デスモプレシン，リシプレシン又はグリプレシンの群から選択されるペプチドを含む経口投与又は舌下投与のための請求項２２記載の医薬製剤。
【請求項２５】
前記医薬物質として，抗ウィルス剤及び助剤の群から選択されるペプチド，又は黄体及び卵胞刺激ホルモンの放出因子を含む口腔内投与のための請求項２２記載の医薬製剤。
【請求項２６】
前記医薬物質として，グリプレシン，ダラルジン及びＡｄＤＰを含む群から選択されるペプチドを含む，開放創への直接の投与のための請求項２２記載の医薬製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は，使用されるキャリアーが直接活性物質を運び，様々な形態で存在するヒアルロナン及び／又はその誘導体をベースとするキャリアーを含む医薬製剤に関する。本発明はさらに前記医薬製剤の調製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒアルロン酸（ヒアルロナン，ＨＡ）は，図１に示されるように，β（１→４）及びβ（１→３）グリコシド結合によって結合されたＤ−グルクロン酸及びＮ−アセチル−Ｄ−グルコサミンの二つの反復単位から構成される非硫酸化グリコサミノグリカンとして知られている。天然のヒアルロン酸の分子量は５×１０４〜５×１０６g.mol−１の範囲にある。この著しく親水性の多糖類は，結合組織，皮膚，関節の関節液の一部を形成し，プロテオグリカン類の組織化，水和及び細胞分化のような多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。このポリマーが生体適合性で，身体に固有で，分解可能であるという事実を考慮すると，組織工学に好適な基材又は生物活性物質のキャリアーとなる。
【０００３】
ヒアルロナン及び修飾された又は改善された特性を有するその誘導体の医学分野における用途は極めて広い。ヒアルロナンの化学的修飾は，通常二つの反応中心：カルボキシル基及び一級水酸基に行われる。アミノ基もＮ−アセチル基の切断後に使用できる。糖単位の水酸基のどれが反応に関与するかは明らかではないが；多くの結果が，Ｎ‐アセチルグルコサミン単位の一級水酸基（Ｃ６）がこの基の最も高い反応性により好ましいことを示す。
【０００４】
カルボキシル基はアミド又はエステルへ転化できる。カルボジイミド2-5又は他の薬剤，例えば２−クロロ−１−メチルピリジニウムヨージド6，２−クロロ−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン7，カルボニルジイミダゾール8等のようなペプチドの化学的調製に通常使用される活性化剤を，カルボキシ基のアミドへの転化に使用できる。より反応性の高い中間体への転化によりカルボキシルの反応性を増加させた後，アミンを添加し，縮合反応によってアミドを提供する。エステルは，ハロゲン化アルキル9,10を用いたアルキル化反応，ジアゾメタン11,12との反応によるメチルエステル合成，エポキシド13-16などを使用すること等により生じさせることができる。
【０００５】
水酸基の修飾はエーテル又はエステル結合の形成をもたらす。エーテルは，エポキシド17-20，ジビニルスルホン21-23，エチレンスルフィド24との反応によって，又はグルタルアルデヒド（glutardehyde）を用いたヘミアセタールの形成によって容易に調製できる。対称無水物又は混合無水物27-29をエステル合成に使用でき，又はＯ−アシル−Ｏ’−アルキルカーボネートを活性化剤として使用する。これらの構造的修飾はヒドロゲルを形成するための架橋反応を導く。
【０００６】
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）は，個々のアミノ基がポリマーキャリアーに徐々に結合される方法である。副反応のリスク及び望ましくない配列の生成を減らすために全てのアミノ酸に保護基（永続的又は一時的）が使用される。Ｆｍｏｃ及びＢｏｃのような保護基が最も頻繁に使用され，Ｆｍｏｃ保護基は塩基性環境で切断することができ，Ｂｏｃ保護基は酸性環境で切断することができる。固相ペプチド合成は，「縮合−洗浄−保護基の切断−洗浄」のサイクルの繰り返しを含む。合成されたペプチドは，所望の配列が得られるまでポリマーキャリアーに固定化されたままである。その後，キャリアーからの切断及び精製が行なわれる。
【０００７】
最近では，生体適合性で所望により生物分解性であり得るキャリアーを使用する取り組みがある。アルギン酸塩，寒天，キチン，ヒアルロナン又は綿由来の多糖をベースとするキャリアーが記載されてきた。これまでのところ，常にペプチドはキャリアーから切断されてきた。キャリアー上で合成された又は固定化されたペプチド31,32の生物学的特性に相互に確実に影響することができるというその有益な生物学的特性は使用されてこなかった。
【０００８】
アルギン酸塩は，ペプチド及びアミノ酸と多糖類との反応に使用される最も一般的なキャリアーである。アルギン酸塩は，図２のアルギン酸塩の構造式に示されるように，（１→４）Ｏ−グルコシド結合により結合されたβ−Ｄ−マンヌリック（mannuric）酸とα−Ｌ−グルロン酸の繰り返し単位から成る負に帯電した線状の多糖類である。
【０００９】
医薬品の剤形としてのアルギン酸塩の使用が記載されているが；その方法は，マトリックス又はゲル中でこれらの医薬品を非共有結合により固定化するために使用されることが最も多い。アルギン酸塩ゲルは，さらに高分子ペプチド，主として酵素，細胞小器官又は細胞全体を捉える分析方法にも使用されてきた33,34。
【００１０】
ペプチドと医薬の共有結合の形成は，医薬の臨床ポテンシャルを上げるファルマコキネティクス及び生物学的利用能を増強する精巧な投与システムとしてのそれらの使用を可能にする。アルギン酸塩・ペプチド複合体は，アルギン酸塩のカルボキシル基とペプチドのアミノ基の間のアミド結合によって形成される33-35。
【００１１】
共有結合したペプチドを有するアルギン酸塩は，創傷の治療にも使用できる。創傷治癒はその創傷に対する組織反応である。それは，走化性，細胞増殖，細胞外タンパク質の生産，血管新生などを含む複雑な生物学的プロセスである。創傷治癒処置の可能性の一つは，増殖因子のような天然の刺激剤により治癒プロセスに影響を及ぼすことである。
【００１２】
アルギン酸塩をベースとする材料が調製され，ペプチドにより修飾され，創傷治癒プロセスにおけるそれらの有効性が傷ついた皮膚上でin vivoで研究された。ハイブリッドペプチドＳｅｒ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｘ−Ｖａｌ−Ｘ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ（Ｘ＝Ａｌａ又はＧｌｙ）を含むアルギン酸塩包帯で処置したウサギは，アルギン酸塩包帯上に固定した他のペプチドＳｅｒ−Ｉｌｅ−−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ及びＶａｌ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙと比べて，著しく高い上皮化，及びより大きい体積の再生した組織を示した。
【００１３】
紙の形態のセルロースもペプチドの調製に使用された。化学的観点から，セルロースは，図３中の構造式に従いβ（１→４）Ｏ−グリコシド結合によって結合したｄ−グルコースの反復モノマー単位から成る線状の多糖類である。ペプチドが低収率でしか得られないことが望ましくない点である。また，紙は機械的安定性が低い等の欠点もある。
【００１４】
綿（cotton）は，微生物セルロースの場合をのぞき，セルロースの最も純粋な形態であり，様々な形態及び形状で得ることが可能であり；ＳＰＰＳのためのキャリアーとしての綿の使用の可能性が研究された。この場合，ペプチドの固定化は，綿の水酸基とペプチドのカルボキシル基の間のエステル結合によって行なわれた。この合成は，ＤＭＦ中のＤＩＣ／ＨＯＢｔ／ＤＭＡＰで行われることが最も多かった31, 37, 38。
【００１５】
最近では，ファイバー39-42，薄膜43-44，又は不織布40の形態のヒアルロナンをベースとするキャリアーが利用可能である。これらの多角的な形態の使用により，今まで使用されている多糖類キャリアーの記述された欠点のうちのいくつかを除去することができた。医薬品の適切なキャリアーはまだなお不足している。
【００１６】
本発明に記載されている新規な方法は，ファイバー，薄膜又は不織布の形態のヒアルロナンをベースとするキャリアーの固相合成のための使用の利点を有する。このキャリアーは反応の間に変化しない。即ち，それは，ファイバー，薄膜又は不織布の形態をとどめる。従って，それは，そこでペプチドが個々のアミノ酸によって構築されるか，又はそれがヒアルロナン材料に全体として結合される固相合成である。これまではヒアルロナンは溶液中での修飾に使用されてきた。即ち，ヒアルロナンを溶解し反応を行っていた。その後，該誘導体を該材料の調製に使用した。液相合成と固相合成の違いは，溶液合成及びその後の紡糸の場合には，ペプチドがファイバーの内部にも存在するということであり，そのためそれは利用可能性がより低くなる。ペプチドが表面上にのみある固相合成はコストを下げるだけでなく，個々の誘導体によって異なる紡糸工程の最適化を行わずにすむ。
【００１７】
発明の要約
上述の欠点は，添付の請求の範囲に記載された，ヒアルロナン及び／又はその誘導体をベースとするキャリアーを含む医薬製剤の調製方法，並びにヒアルロナン及びその誘導体をベースとするキャリアーを含む医薬製剤によって解決される。
【００１８】
本発明のヒアルロン酸及びその誘導体と以下の一般式の医薬物質との複合体を含み， 
Ａ−Ｓ−Ｎ    （Ｘ），又は
2020502251.tif 000003
式中，
Ａはアミノ酸及びペプチドを含む群から選択される医薬物質であり，
Ｓは−Ｏ−又は−ＮＨ−を含む群から選択され，前記医薬物質をキャリアーと結合する方法であり，
Ｎはヒアルロン酸及び／又はその誘導体であり，
ｍは１０〜１２５０であり，
ｎは１００〜１２５００である。
【００１９】
本発明による医薬製剤はそれが水不溶性であること及びそれが生物分解性であることを特徴とする。
【００２０】
本発明による医薬製剤はさらに，前記キャリアーが，該キャリアーを溶解させることなく，そこに結合された複合体を調製することができることを特徴とする。言いかえれば，該キャリアーは全調製工程をとおして不溶性のままであり，即ち固相であり，同時に生物分解性を維持している。
【００２１】
本発明による医薬製剤は，前記キャリアーがエンドレスファイバー，糸，織物，薄膜，ステープルファイバー及び／又は不織布の織物の形態であることを特徴とする
【００２２】
さらに，本発明による医薬製剤は，前記医薬物質が一般式Ｘで表されるヒアルロン酸及びその誘導体の複合体のグルコサミン部分の６位において前記キャリアー上に結合していることを特徴とする。
【００２３】
該医薬物質は，好ましくはエステル結合によって（スキーム１），又は還元アミノ化によって（スキーム２）ヒアルロン酸及びその誘導体に固定化される。
2020502251.tif 000004
スキーム１−エステル化，Ｒ−ＣＯＯＨはアミノ酸又はペプチドである。
2020502251.tif 000005
スキーム２−還元アミノ化，Ｒはペプチド又はアミノ酸であり，Ｒ１はアミド又はメチルエステルである。
【００２４】
該キャリアーは好ましくはヒアルロン酸，パルミトイルヒアルロナン又はホルミルヒアルロナンであり，該キャリアーは，好ましくは１．５×１０４〜２．５×１０６g.mol-1の範囲の分子量を有する。
【００２５】
また，本発明の主題は，医薬物質Ａ（該医薬物質はさらにＮ末端保護基をも含む）におけるアミノ酸又はペプチドのカルボキシル基を非プロトン性極性溶媒中で縮合剤により活性化して反応中間体Ｉを形成し，それを有機塩基と触媒の存在下でキャリアーと反応させてヒアルロン酸及びその誘導体と医薬物質との複合体を形成することを特徴とする，ヒアルロナン及びその誘導体をベースとするキャリアーを含む医薬製剤の調製方法でもある。その後，該医薬物質の末端のＮ保護基を，塩基性媒体中，好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％のピペリジン，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２％の１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン，Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の３０％のｔ‐ブチルアミンの群から選択される媒体中，好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の２０％のピペリジン中で切断する。
【００２６】
医薬物質Ａはアミノ酸及びペプチドを含む群から選択され，それはキャリアーに直接又は疎水性アミノ酸Ｘａａ，好ましくはＸａａ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ｘａａによって形成されるペプチドをベースとする線状リンカーを介して結合される。
【００２７】
本発明による方法は，ヒアルロン酸及びその誘導体の複合体の形成が２０℃〜４０℃の温度で，好ましくは２２℃〜２５℃の温度で，２〜４８時間好ましくは２４時間行なわれることを特徴とする。
【００２８】
本発明による方法は，さらに，使用される縮合剤が好ましくは４−ニトロフェノール，Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド，２，４，５−トリクロロフェノール，２，３，４，５，６−ペンタフルオロフェノール，２，３，４，５，６−ペンタクロロフェノール，Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド，Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド，１−［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ［４，５−ｂ］ピリジニウム３−オキシドヘキサフルオロホスファート，１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド，エチルクロロホルメート，２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスファート，ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート，Ｏ−（ベンゾトリアゾール−１−イル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩，４−トリエチルアミノ−ジシクロヘキシルカルボジイミドｐ−トルエンスルホナート，プロピルホスホン酸無水物の群から選択され，好ましくはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミドであることを特徴とする。
【００２９】
本発明による方法は，使用される極性非プロトン性溶媒がＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド，ジメチルスルホキシド，Ｎ−メチル−２−ピロリドン，アセトニトリル，ジクロロメタン，テトラヒドロフラン，１，４−ジオキサンの群から選択され，好ましくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドであることを特徴とする。
【００３０】
本発明による方法は，使用される有機塩基が，トリエチルアミン，ピリジン，モルホリン，Ｎ−メチルモルホリン，Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン，イミダゾールを含む群から選択されることを特徴とする。
【００３１】
本発明による方法は，また，使用される触媒が，エチル（ヒドロキシイミノ）シアノアセテート，ヒドロキシベンゾトリアゾール，Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン又は１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾールを含む群から選択され，好ましくはエチル（ヒドロキシイミノ）シアノアセテートとＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジンの組み合わせであることを特徴とする。
【００３２】
本発明による方法は，また，使用されるアミノ酸又はペプチド，即ち医薬物質の量が，ヒアルロン酸又はその誘導体の二量体をベースとして１〜５当量，好ましくは３当量に相当し，使用される活性化（縮合）剤の量がヒアルロン酸又はその誘導体の二量体をベースとして，０．１〜５当量，好ましくは３当量に相当し，使用される塩基の量がヒアルロン酸又はその誘導体の二量体をベースとして，１０当量以下に相当し，使用される触媒の量がヒアルロン酸又はその誘導体の二量体当たり０．１〜５当量，好ましくはエチル（ヒドロキシイミノ）シアノアセテート３当量及びＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン０．３当量に相当することを特徴とする。本発明の好ましい実施態様においては，医薬物質，縮合剤，触媒及びヒアルロン酸二量体のモル比は，１：１：１：１である。
【００３３】
本発明による複合体の形態の医薬製剤は，活性なペプチド又はアミノ酸の剤型として，経皮投与，舌下投与，経口投与，口腔投与，又は開放創への局所投与を意図した医療用のものである。
【００３４】
経皮投与のための本発明による医薬製剤は，医薬物質として例えばペプチドダラルジン（Dalargin）を含むことができる。口腔投与又は舌下投与のための本発明による医薬製剤は，医薬物質として，例えばデスモプレシン，リシプレシン又はグリプレシンの群から選択されるペプチドを含むことができる。口腔投与のための本発明による医薬製剤は，例えば抗ウィルス薬及び助剤，又は黄体組織形成及び卵胞刺激ホルモンのための放出因子の群から選択されるペプチドを含むことができる。開放創への直接の投与のための本発明による医薬製剤は，医薬物質として，例えば免疫賦活剤としてグリプレシン，ダラルジン又はＡｄＤＰを含む群から選択されるペプチドを含むことができる。
【００３５】
従って，本発明の主題は一般式：Ａ−Ｓ−Ｎ（Ｘ）
（式中，固体キャリアーＮは，エンドレスファイバー，糸，織物，薄膜，ステープルファイバー及び不織布の形態のヒアルロナン及びその誘導体からなり，結合Ｓによって結合した医薬物質Ａを含む）の新規化合物，並びに，下記の実施例に述べられているように固相での処理によるか又は複合システムに医薬物質を結合することによるこの複合システムの調製方法である。
【００３６】
医薬物質をキャリアーと結合する方法は，エステル結合，又は還元アミノ化によって行なわれる。この生体適合性且つ生物分解性の固体キャリアーはその様々な，主として医学的作用の間，医薬物質から切断する必要がないことを特徴とし，好ましくはさらに，該生体適合性のキャリアーに結合した生物学的に活性なペプチド又はアミノ酸の粘膜及び皮膚を通っての浸透を促進する現代の非侵襲性の剤形として作用し，これにより医学及び獣医学における医療用に使用される複合的かつ適切な材料として寄与する。本発明による医薬製剤は，生物活性の間に全体として作用し，医薬物質をキャリアーから持続性の方式でゆっくり放出することができ，それは続いて自然に且つ本質的に除去される。該キャリアーは，さらにそこに結合した医薬物質の総合的な効果に影響し，その使用を促進できる。
【００３７】
表１はペプチド及びそれらの薬理効果及びそれらの投与方法を示す。
それは，経皮投与のための本発明による医薬製剤が，治癒効果を有する医薬物質としてのペプチドであるダラグリン，又はホルモン効果を有するオキシトシンを含むことを示す。経口投与，口腔投与又は舌下投与については，本発明による医薬製剤は抗利尿性効果，第VIII因子の増加による血液凝固に対する影響を示すペプチドデスモプレシン，主に歯科外科中でプレソリック（presoric）効果を有するリシプレシン，又は出血を止めるのに適する持続性のプレソリック（pressoric）効果を有するグリプレシン（テルリプレシン）を含む。口腔投与については，本発明による医薬製剤は，抗ウィルス剤として使用される医薬物質としてのペプチド及び助剤，例えばＡｄＤＰ，又は黄体及び卵胞刺激ホルモン放出因子（フェルチレリン，レシレリン）を含む。開放創への局所投与のための本発明による医薬製剤は，出血を止めるために使用される医薬物質としてペプチド（テルリプレシン）及び創傷治癒を加速するためのダラルジン（Dalargin），及び所望により免疫系の局所的刺激用のＡｄＤＰを含む。
（表１）
ペプチドの表
2020502251.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＲがＨ＋又はＮａ＋でありｎが１００〜１２５００に等しいヒアルロナンを示す。
【図２】アルギン酸塩の構造式を示す。
【図３】セルロースの構造式を示す。
【図４】本発明による医薬製剤の構造式を示し，ここでＡは医薬物質であり，Ｓは医薬物質とキャリアーを結合する方法であり，Ｎはヒアルロン酸及びその誘導体をベースとするキャリアーであり，ｍは１０〜１２５０であり，ｎは１００〜１２５００である。
【図５】ＨＹＡがヒアルロン酸又はその誘導体であり，ペプチドがデンドリマー構造で配列された７個のリジン単位を含む，結合したペプチドを有するヒアルロン酸又はヒアルロン酸誘導体の構造式を示す。
【図６】ＲＧＤモチーフを含む天然ＨＹＡのファイバーに接着させたＤｉｌ染色したＮＨＤＦ細胞を示す。画像は４８時間の培養後に螢光顕微鏡によって得られた。
【図７】接着しなかったＤｉｌ染色ＮＨＤＦ細胞集団の存在の変化を示す。画像は，１，２，４及び７日間の培養後に螢光顕微鏡によって得られた。
【００３９】
本発明によるペプチドとヒアルロナンをベースとする材料との複合体は，本願出願人の機関コンティプロ  アクチオヴァ  スポレチノスト（Contipro a.s.,Dolni Dobruc, CZ）の著者により調製し試験することに成功している。
【００４０】
発明の好ましい実施態様
天然ＨＹＡ製ファイバー及び天然ＨＹＡ製不織布は，特許ＷＯ／２０１３／１６７０９８に記載された方法により製造された。パルミトイルＨＹＡ製ファイバーは，特許ＷＯ／２０１４／０８２６１１に記載された方法によって製造された。
【００４１】
下記の実施例で，用語「当量（eq.)」はヒアルロナンのそれぞれの形態の反復単位に対するものである。パーセンテージは特記しない限り体積基準である。
【００４２】
ヒアルロナンの出発形態の分子量は，ＳＥＣ−ＭＡＬＬＳ法によって特定された重量平均分子量である。
【００４３】
実施例においては，単に後の分析の目的で，アミノ酸の出現頻度(proportional occurrence)を容易に決定するために，最初に可欠アミノ酸としてノルロイシンを結合した。しかしながら，ノルロイシンの結合は必要条件ではなく，本発明の範囲を制限することを意図しない。
【００４４】
実施例１
天然ＨＹＡのファイバーへのＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨの固定化
天然ＨＹＡ（１２mg，０．０３mmol，Ｍｗ＝３×１０５g.mol-1）のファイバー１mを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該ファイバーをＤＭＦで繰り返し洗浄した。０．５mlの無水ＤＭＦ中の３当量のＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ，３当量のオキシマピュア（OxymaPure）及び０．３当量のＤＭＡＰの溶液を，反応器の外部で調製し；全ての成分を溶解させた後，３当量のＤＩＣを添加してアミノ酸のカルボキシル基を活性化させた。この溶液を前記反応器中に前記ファイバーに対して移した。続いての２０時間，１８〜２３℃の温度で反応を進め，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，該ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＥＥで洗浄した。
縮合反応の生成物はＦｍｏｃ脱離試験によって置換度Ｓ＝０．０１８６２mmol/gとして特定された。
【００４５】
実施例２
Ｈ−Ｎｌｅ−Ｏ−ＨＹＡの調製
実施例１によって調製されたＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−Ｏ−ＨＹＡのファイバー１mを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該ファイバーをＤＭＦで繰り返し洗浄した。該反応器中に該ファイバーに対してＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液１．５mlを加えることによってＦｍｏｃ保護基を切断した。この反応は１８〜２３℃の温度で５分間行われた。切断時間を２０分間まで延長してこの反応を繰り返し，その後，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＥＥで洗浄した。
この反応は定量的である。アミノ基の脱離はニンヒドリン確認反応（カイザー試験）を行なうことにより確認された。
【００４６】
実施例３
天然ＨＹＡファイバーへのＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨの固定化
天然ＨＹＡ（１２mg，０．０３mmol，Ｍｗ＝３×１０５g.mol-1）のファイバー１mをフリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ，該ファイバーをＴＨＦで繰り返し洗浄した。０．５mlのＴＨＦ中の３当量のＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ，３当量のオキシマピュア及び０．５当量のＤＭＡＰの溶液；全ての成分を溶解させた後，３当量のＤＩＣを添加してアミノ酸のカルボキシル基を活性化させた。この溶液を前記ファイバーを含む反応器に移した。続いての２０時間，１８〜２３℃の温度で反応を進め，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，該ファイバーを，３×１．５mlのＴＨＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＥＥで洗浄した。縮合反応の生成物はＦｍｏｃ脱離試験によって置換度Ｓ＝０．０１７５９mmol/gとして特定された。
【００４７】
実施例４
天然ＨＹＡファイバーへのＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨの固定化
天然ＨＹＡ（１２mg，０．０３mmol，Ｍｗ＝３×１０５g.mol-1）のファイバー１mを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該ファイバーをＤＭＦで繰り返し洗浄した。０．５mlの無水ＤＭＦ中の１当量のＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ，１当量のオキシマピュア及び０．３当量のＤＭＡＰの溶液を，反応器の外部で調製し；全ての成分を溶解させた後，１当量のＤＩＣを添加してアミノ酸のカルボキシル基を活性化させた。この溶液を該反応器中に該ファイバーに対して移した。続いての２０時間，１８〜２３℃の温度で反応を進め，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，該ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＥＥで洗浄した。
縮合反応の生成物はＦｍｏｃ脱離試験によって置換度Ｓ＝０．０１８０４mmol/gとして特定された。
【００４８】
実施例５
Ｆｍｏｃ−［Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）］４−Ｎｌｅ−Ｏ−ＨＹＡの調製
実施例２によって調製された１ｍのＨ−Ｎｌｅ−Ｏ−ＨＹＡを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該ファイバーを，ＤＭＦで繰り返し洗浄した。０．５mlの無水ＤＭＦ中の３当量のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ及び３当量のオキシマピュアの溶液を反応器の外部で調製し；全ての成分を溶解させた後，３当量のＤＩＣを添加してアミノ酸のカルボキシル基を活性化させた。この溶液を該反応器中に該ファイバーに対して移した。続いての２０時間，１８〜２３℃の温度で反応を進め，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，該ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＭＦで洗浄した。ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液１．５mlを前記ファイバーを含む反応器中へ加えることによってＦｍｏｃ保護基を切断した。この反応は１８〜２３℃の温度で５分間行われた。切断時間を２０分間まで延長してこの反応を繰り返し，その後，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，該ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＭＦで洗浄した。この手順を４回繰り返した。
縮合反応の生成物はＦｍｏｃ脱離試験によって置換度（mmol/g）として特定された。生成物組成（nfound）は表２に示されるようにアミノ酸分析によって確認された。それは段階的な方法によって行なわれる一連の合成である；しかしながら，この手順は前記誘導体の全てに対して繰り返された。個々の列は，前記サイクル終了後の調製された複合体の組成を示す；即ち実施例３に記載された方法を終了した後に第１列に記載された組成を有する生成物が得られる。その後，その手順を繰り返して第２列に記載された生成物が得られる等である。
（表２）
2020502251.tif 000007
【００４９】
実施例６
デンドリマー構造に配列された７個のリジン単位を含むペプチドの調製−天然ＨＹＡファイバーの使用
実施例２によって調製された１mのＨ−Ｎｌｅ−Ｏ−ＨＹＡを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該ファイバーを，ＤＭＦで繰り返し洗浄した。０．５mlの無水ＤＭＦ中の３当量のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ及び３当量のオキシマピュアの溶液を，反応器の外部で調製し；全ての成分を溶解させた後，３当量のＤＩＣを添加してアミノ酸のカルボキシル基を活性化させた。この溶液を前記ファイバーを含む反応器中に移した。続いての２０時間，１８〜２３℃の温度で反応を進めた。この反応を反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，そのファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＭＦで洗浄した。ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液１．５mlを前記ファイバーを含む反応器中へ加えることによってＦｍｏｃ保護基を切断した。この反応は１８〜２３℃の温度で５分間進行させた。切断時間を２０分間まで延長してこの反応を繰り返した。反応溶液を瀘去することによりこの反応を終了させた。その後，このファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＭＦで洗浄した。この手順を２回繰り返した。
この反応をＦｍｏｃ脱離試験によってモニターした。生成物はＦｍｏｃ脱離試験によって特定された。図５に示される生成物の組成は表３に示されるようにアミノ酸分析によって確認された。それは段階的な方法によって行なわれる一連の合成である；しかしながら，この手順は前記誘導体の全てに対して繰り返された。個々の列は，該サイクル終了後に調製された複合体の組成を示す；即ち実施例３に記載された方法を終了した後に，第１列に記載された組成を有する生成物が得られる。その後，その手順が繰り返され，第２列に記載された生成物が得られる等である。
（表３）
2020502251.tif 000008
【００５０】
実施例７
天然ＨＹＡファイバー上の７個のアラニン単位を含むペプチドの調製
実施例２によって調製された１ｍのＨ−Ｎｌｅ−Ｏ−ＨＹＡを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該ファイバーをＤＭＦで繰り返し洗浄した。０．５mlの無水ＤＭＦ中の３当量のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ及び３当量のオキシマピュアの溶液を，反応器の外部で調製し；全ての成分を溶解させた後，３当量のＤＩＣを添加してアミノ酸のカルボキシル基を活性化させた。この溶液を該反応器中に該ファイバーに対して移した。続いての２０時間，１８〜２３℃の温度で反応を進めた。該反応は反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＭＦで洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基の切断を，ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液１．５mlを該反応器中へ該ファイバーに対して加えることによって行った。この反応は１８〜２３℃の温度で５分間進行させた。切断時間を２０分間まで延長してこの反応を繰り返し，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，このファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＭＦで洗浄した。この手順を，Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨについて７回繰り返した。
縮合反応の生成物はＦｍｏｃ脱離試験によって置換度（mmol/g）として特定された。生成物組成はアミノ酸分析によって個々のアミノ酸の出現頻度として確認された。該物質の純度は該物質の分解後にＭＳ−ＨＰＬＣによって特定された。個々の分析の結果を次の表４に示す：
（表４）
2020502251.tif 000009
【００５１】
実施例８
Ｆｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨのパルミトイルＨＹＡファイバーへの固定化
パルミトイルＨＹＡ（１５mg，０．０３mmol，Ｍｗ＝３×１０５g.mol-1）のファイバー１mを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該ファイバーをＤＭＦで繰り返し洗浄した。０．５mlの無水ＤＭＦ中の３当量のＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−ＯＨ，３当量のオキシマピュア及び０．３当量のＤＭＡＰの溶液を，反応器の外部で調製し；全ての成分を溶解させた後，３当量のＤＩＣを添加してアミノ酸のカルボキシル基を活性化させた。この溶液を反応器中にファイバーに対して移した。続いての２０時間１８〜２３℃の温度で反応を進め，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＭＦで洗浄した。
縮合反応の生成物はＦｍｏｃ脱離試験によって置換度Ｓ＝０．０１０２９mmol/gとして特定された。
【００５２】
実施例９
Ｈ−Ｎｌｅ−Ｏ−パルミトイルＨＹＡの調製
実施例８によって調製された１ｍのＦｍｏｃ−Ｎｌｅ−Ｏ−パルミトイルＨＹＡを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該ファイバーを，ＤＭＦで繰り返し洗浄した。ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液１．５mlを該反応器中に該ファイバーに対して加えることによってＦｍｏｃ保護基を切断した。この反応は１８〜２３℃の温度で５分間進行させた。切断時間を２０分間まで延長してこの反応を繰り返し，その後，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＥＥで洗浄した。
この反応は定量的である。アミノ基の脱離はニンヒドリン確認反応（カイザー試験）を行なうことにより確認された。
【００５３】
実施例１０
Ｆｍｏｃ−［Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）］４−Ｎｌｅ−Ｏ−パルミトイルＨＹＡの調製
実施例９で調製された１ｍのＨ−Ｎｌｅ−Ｏ−パルミトイルＨＹＡを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該ファイバーをＤＭＦで繰り返し洗浄した。０．５mlの無水ＤＭＦの中の３当量のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ及び３当量のオキシマピュアの溶液を反応器の外部で調製し；全ての成分を溶解させた後，３当量のＤＩＣを添加してアミノ酸のカルボキシル基を活性化させた。この溶液を反応器中にファイバーに対して移した。続いての２０時間１８〜２３℃の温度で反応を進め，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，該ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＭＦで洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基の切断は，ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液１．５mlを該反応器中に該ファイバーに対して加えることによって行われた。この反応は１８〜２３℃の温度で５分間進行させた。切断時間を２０分間まで延長してこの反応を繰り返し，その後，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＭＦで洗浄した。この手順を４回繰り返した。
縮合反応の生成物はＦｍｏｃ脱離試験によって置換度（mmol/g）として特定された。生成物組成（nfound）は下記の表５に示されるようにアミノ酸分析によって確認された。それは段階的な方法によって行なわれる一連の合成である；しかしながら，この手順は前記誘導体の全てに対して繰り返された。個々の列は，そのサイクル終了後に調製された複合体の組成を示す；即ち実施例３に記載された方法を終了した後に，第１列に記載された組成を有する生成物が得られる。その後，その手順が繰り返され，第２列に記載された生成物が得られる等である。
（表５）
2020502251.tif 000010
【００５４】
実施例１１
デンドリマー構造に配列された７個のリジン単位を含むペプチドの調製−パルミトイルＨＹＡファイバーの使用
実施例９によって調製された１ｍのＨ−Ｎｌｅ−Ｏ−パルミトイルＨＹＡを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；そのファイバーをＤＭＦで繰り返し洗浄した。０．５mlの無水ＤＭＦの中の３当量のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ及び３当量のオキシマピュアの溶液を，反応器の外部で調製し；全ての成分を溶解させた後，３当量のＤＩＣを添加してアミノ酸のカルボキシル基を活性化させた。この溶液を反応器中にファイバーに対して移した。続いての２０時間，１８〜２３℃の温度で反応を進めた。該反応は反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＭＦで洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基の切断は，ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液１．５mlを反応器中にファイバーに対して加えることによって行われた。この反応は１８〜２３℃の温度で５分間進行させた。切断時間を２０分間まで延長してこの反応を繰り返した。該反応を反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＭＦで洗浄した。この手順を２回繰り返した。
この反応はＦｍｏｃ脱離試験によってモニターされた。生成物はＦｍｏｃ脱離試験によって特定された。図５（ここでＨＹＡはパルミトイルヒアルロナンを表す）に示される生成物の組成は表６に示されるようにアミノ酸分析によって確認された。それは段階的な方法によって行なわれる一連の合成である；しかしながら，この手順は前記誘導体の全てに対して繰り返された。個々の列は，該サイクル終了後に調製された複合体の組成を示す；即ち実施例３に記載された方法を終了した後に，第１列に記載された組成を有する生成物が得られる。その後，その手順が繰り返され，第２列に記載された生成物が得られる等である。
（表６）
2020502251.tif 000011
【００５５】
実施例１２
ホルミルＨＹＡファイバーへのＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＨ２の固定化
１ｍのホルミルＨＹＡ（１１mg，０．０２８mmol，Ｍｗ＝３×１０５g.mol-1）のファイバーを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該ファイバーを，ＤＭＦで繰り返し洗浄した。０．５mlの無水ＤＭＦ中の３当量のＦｍｏｃ−Ｌｙｓ−ＮＨ２の溶液を，反応器の外部で調製し，反応器中にファイバーに対して移した。続いての２０時間，１８〜２３℃の温度で反応を進めた。その後３当量のｐｉｃＢＨ３を添加し，反応を１８〜２３℃で２４時間行い，その後反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，該ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＥＥで洗浄した。Ｆｍｏｃ保護基の切断は，ＤＭＦ中のピペリジンの２０％溶液１．５mlを反応器中に溶液に対して加えることによって行われた。この反応は１８〜２３℃の温度で５分間進行させた。切断時間を２０分間まで延長してこの反応を繰り返し，その後，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＥＥで洗浄した。
アミノ基の脱離はニンヒドリン確認反応（カイザー試験）を行なうことにより確認された。
【００５６】
実施例１３
天然ＨＹＡファイバーへのＲＧＤモチーフを有するペプチドの固定化
１mの天然ＨＹＡ（１２mg，０．０３mmol，Ｍｗ＝３×１０５g.mol-1）のファイバーを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該ファイバーを，ＤＭＦで繰り返し洗浄した。０．５mlの無水ＤＭＦの中の３当量の適当な配列を有するペプチドの溶液，０．３当量のＤＭＡＰ中の３当量のオキシマピュアを，反応器の外部で調製し；全ての成分を溶解させた後，３当量のＤＩＣを添加してアミノ酸のカルボキシル基を活性化させた。この溶液を反応器中にファイバーに対して移した。続いての２０時間，１８〜２３℃の温度で反応を進めた。該反応は反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，このファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＥＥで洗浄した。
縮合反応の生成物はＦｍｏｃ脱離試験によって置換度（mmol/g）として特定された。生成物の組成は個々のアミノ酸の割合としてアミノ酸分析によって確認された。該物質の純度は該物質の分解の後にＭＳ−ＨＰＬＣによって特定された。個々の分析の結果を次の表７に示す：
（表７）
2020502251.tif 000012
【００５７】
実施例１４
天然ＨＹＡ不織布へのＲＧＤモチーフを有するペプチドの固定化
天然ＨＹＡ（１０．５mg，０．０３mmol，Ｍｗ＝１．０４×１０６g.mol-1）の不織布で作られた一辺５mmの四角片５枚を，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該材料をＤＭＦで繰り返し洗浄した。０．５mlの無水ＤＭＦ中の３当量の適当な配列を有するペプチド及び３当量のオキシマピュアの溶液を，反応器の外部で調製し；全ての成分を溶解させた後，３当量のＤＩＣを添加してアミノ酸のカルボキシル基を活性化させた。この溶液を反応器中に該物質に対して移した。続いての２０時間，１８〜２３℃の温度で反応を進めた。該反応は反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，該布を，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＥＥで洗浄した。
縮合反応の生成物はＦｍｏｃ脱離試験によって置換度（mmol/g）として特定された。生成物の組成は個々のアミノ酸の出現頻度としてアミノ酸分析によって確認された。該物質の純度は該物質の分解後にＭＳ−ＨＰＬＣによって特定された。個々の分析の結果を下記の表８に示す：
（表８）
2020502251.tif 000013
【００５８】
実施例１５
天然ＨＹＡファイバーへのペプチドＦｍｏｃ−（ＶＰＧＬＧ）２−ＯＨの固定化
１mの天然ＨＹＡ（１２mg，０．０３mmol，Ｍｗ＝３×１０５g.mol-1）のファイバーを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該ファイバーをＤＭＦで繰り返し洗浄した。０．５mlの無水ＤＭＦ中の３当量のペプチドＦｍｏｃ−（ＶＰＧＬＧ）２−ＯＨ，３当量のオキシマピュア及び０．３当量のＤＭＡＰの溶液を，反応器の外部で調製し；全ての成分を溶解させた後，３当量のＤＩＣを添加してアミノ酸のカルボキシル基を活性化させた。この溶液を反応器中に該ファイバーに対して移した。続いての２０時間，１８〜２３℃の温度で反応を進め，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＥＥで洗浄した。
縮合反応の生成物はＦｍｏｃ脱離試験によって置換度（mmol/g）として特定された。生成物の組成は個々のアミノ酸の出現頻度としてアミノ酸分析によって確認された。該物質の純度は該物質の分解後にＭＳ−ＨＰＬＣによって特定された。個々の分析の結果を次の表９に示す：
（表９）
2020502251.tif 000014
【００５９】
実施例１６
天然ＨＹＡファイバーへのダラグリン（Dalagrin）の固定
天然ＨＹＡ（１２mg，０．０３mmol，Ｍｗ＝３×１０５g.mol-1）のファイバー１mを，フリットを装着した２mlのシリンジ反応器に入れ；該ファイバーをＤＭＦで繰り返し洗浄した。０．５mlの無水ＤＭＦ中の３当量のペプチドＦｍｏｃ−ダラグリン，３当量のオキシマピュア及び０．３当量のＤＭＡＰの溶液を，該反応器の外部で調製し；全ての成分を溶解させた後，３当量のＤＩＣを添加してアミノ酸のカルボキシル基を活性化させた。この溶液を該反応器中に該ファイバーに対して移した。１８〜２３℃の温度でさらに２０時間反応を進め，反応溶液を瀘去することにより終了させた。その後，該ファイバーを，３×１．５mlのＤＭＦ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＩＰＡ，３×１．５mlのＤＣＭ，３×１．５mlのＤＥＥで洗浄した。
縮合反応の生成物はＦｍｏｃ脱離試験によって置換度（mmol/g）として特定された。生成物の組成は個々のアミノ酸の出現頻度としてアミノ酸分析によって確認された。該物質の純度は該物質の分解後にＭＳ−ＨＰＬＣによって特定された。個々の分析の結果を下記の表１０に示す：
（表１０）
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【００６０】
実施例１７
ＲＧＤモチーフを含むファイバー上へのin vitroでの細胞接着
実施例１４に記載された方法により製造されたＲＧＤモチーフを含む天然ＨＹＡファイバー及びコントロールのファイバーを，１cmの断片に切断し，２４個のウェルを有する非粘着性のパネル上に移した。初代ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を蛍光染料ＤｉＩ（Ｅｘｍａｘ／Ｅmmａｘ，５４９／５６５）であらかじめ標識し，試験サンプルを満たしたウェルに１０５細胞の量で接種した。その後，このパネルを培養条件（３７℃，５％ＣＯ２）下，振とう機で振とうさせて（５時間／１６０rpm）細胞を懸濁状態に保った。２４時間培養した後，該ファイバーを新鮮な培養培地を含むウェルに移した。その後，細胞を，ＴＲＩＴＣフィルター（Ｅｘｍａｘ／Ｅmmａｘ，５４９／５６５）を使用した螢光顕微鏡ニコンTi-Eclipseによって観察し検知した。この繊維芽細胞の増殖を７日間の培養の間モニターした。
ヒト皮膚繊維芽細胞は，その期間中，２単位の６−アミノヘキサン酸を介してＨＹＡに結合した，堅牢で柔軟なリンカーを形成してＲＧＤペプチドを細胞接着レセプターにアクセス可能にするペプチドＨ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ｎｌｅ−ＯＨを有するファイバー上でのみ接着しかつ増殖した。これに反して，図６に見られるように，トリグリシンリンカーによる，ペプチドＨ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｎｌｅ−ＯＨ並びにペプチドＨ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｎｌｅ−ＯＨ及びＨ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｎｌｅ−ＯＨとの結合は，細胞接着をサポートしなかった。これらのデータに基づいて，我々は，細胞接着をサポートするのはＲＧＤモチーフであり，細胞受容体によって認識され得る最小の領域は，結局Ａｈｘリンカーであると推定し得る。そして，Ａｈｘリンカーの確実な効果は，ＮＨＤＦがＲＧＤを有するペプチドに排他的に接着する場合，ＲＧＤ又はＲＧＤモチーフを含むペプチドが結合したファイバーを試験することにより置き換えられた（displaced）。
【００６１】
実施例１８
in vitroでのＲＧＤモチーフを含む天然ＨＹＡ不織布上への細胞接着
実施例１４に記載された方法によって調製された，固定化されたペプチドＨ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｈｘ−Ａｈｘ−Ｎｌｅ−ＯＨを有するＨＹＡ不織布及びコントロールの布を，一辺０．５cmの正方形に切断し，非粘着性のパネルの２４ウェルプレート上に移した。初代ヒト線維芽細胞（ＮＨＤＦ）を，蛍光染料ＤｉＩ（Exmax/Emmax,549/565）であらかじめ標識し，試験サンプルを満たしたウェルへ１０５細胞の量で接種した。その後，このパネルを培養条件（３７℃，５％ＣＯ２）下，振とう機で振とう（５時間／１６０rpm）させて細胞を懸濁状態に保った。２４時間培養した後，該ファイバーを新鮮な培養培地を含むウェルに移した。その後，細胞を，ＴＲＩＴＣフィルター（Exmax/Emmax,549/565）を使用した螢光顕微鏡ニコンTi-Eclipseによって観察し検知した。図７に示されるように，この繊維芽細胞の増殖を７日間の培養の間モニターした。ＮＨＤＦは，布の表面上に一様に接着した。そして４８時間後，それらは特有の方式で伸長した。
【００６２】
産業上の利用可能性
ヒアルロナン及びその誘導体をベースとするキャリアーを有する新規な医薬製剤は，結合した医薬物質による治療のための適切な剤形として使用され得る。この新しい剤形は，複合システムの固体キャリアーに結合した医薬物質の改善され延長された活性をもたらす。結合した医薬物質を含むヒアルロナンの適切な形態は，医学及び獣医学において好ましく使用できる。
【００６３】
略号のリスト
ＡｄＤＰ：１−アダマンチルアミド−（Ｌ）−アラニル−（Ｄ）−イソグルタミン
Ａｈｘ：アミノヘキサノン酸
Ｂｏｃ：第三ブチルオキシカルボニル
Castro reagent：ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
ＤＢＵ：１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン
ＤＣＣ：Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＥＥ：ジエチルエーテル
ＤＩＣ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド
Ｄｉｌ：１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’３’−テトラメチルインドカルボシアニンペルクロラート
ＤＩＰＥＡ：Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＡＰ：Ｎ，Ｎ’−ジメチルアミノピリジン
ＤＭＦ：Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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