(57)【要約】  ＡＬＳおよびハンチントン病に関連する染色体領域および相互作用を分析するためのプロセス。【特許請求の範囲】
【請求項１】
集団における疾患サブグループを示す染色体の状態を検出するプロセスであり、その染色体の状態に関係する染色体相互作用がゲノムの規定された領域内に存在するかまたは存在しないかを検出することを含むプロセスであって、前記疾患サブグループが筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）サブグループであり；そして
−前記染色体相互作用が、任意には、どの染色体相互作用が、集団のＡＬＳサブグループに対応する染色体の状態に関連付られるのかを決定する方法により同定されており、該方法は、染色体の種々の状態を有するサブグループ由来の核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させ、そして相補配列がハイブリダイズできるようにすることを含み、ここで、核酸の第１のセットおよび第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用に集まっている両染色体領域由来の配列を含むライゲーション産物を表し、かつ核酸の第１のセットおよび第２のセットの間のハイブリダイゼーションのパターンによりどの染色体相互作用がＡＬＳサブグループに特異的であるかの決定が可能となり；そして
−染色体相互作用が、
（ｉ）表１または表５に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（ii）表１または表５に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（iii）表１０または表１１に示される染色祭相互作用のいずれかに相当する；および／または
（iv）（ｉ）、（ii）または（iii）を含むか、または（ｉ）、（ii）または（iii）に隣接する４，０００塩基領域に存在する
プロセス。
【請求項２】
ＡＬＳと診断する、またはＡＬＳの予後を決定するために実行される請求項１記載のプロセス。
【請求項３】
染色体相互作用の特異的な組み合わせが、
（ｉ）表１または表５のプローブにより表されるすべての染色体相互作用を含む；または
（ii）表１または表５のプローブにより表される少なくとも４、５、６または７個の染色体相互作用を含む
（iii）表１または表５に挙げられる少なくとも４、５、６または７個の領域または遺伝子に一緒に存在する；または
（iv）表１または表５のプローブにより表される染色体相互作用を含むか、または表１または表５のプローブにより表される染色体相互作用に隣接する４，０００塩基領域に存在する少なくとも４、５、６または７個の染色体相互作用を含む、または
（ｖ）表１０または表１１に示されるすべての染色体相互作用を含む；または
（vi）表１０に示される少なくとも４、５、６または７個の染色体相互作用を含む
に分類される請求項１または２記載のプロセス。
【請求項４】
染色体相互作用が、
−個体由来のサンプルにおいて、および／または
−染色体相互作用の部位でのＤＮＡループの存在または非存在を検出することにより、および／または
−染色体コンフォメーションに集められる染色体の遠位領域の存在または非存在を検出することにより、および／または
−前記分類のあいだに生成され、その配列が、染色体相互作用に集められる染色体の領域に各々対応する２つの領域を含むライゲーションされた核酸の存在を検出することにより、ここで、ライゲーションされた核酸の検出が、好ましくは、（ｉ）表１または表５に記載される特異的プローブ配列のいずれかに少なくとも７０％の同一性を有するプローブを用いる、および／または（ii）表２または表７のいずれかのプライマーペアと少なくとも７０％の同一性を有するプライマーペアを用いるものである
分類される請求項１〜３のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項５】
−核酸の第２のセットが核酸の第１のセットより大きな個体のグループ由来である；および／または
−核酸の第１のセットが、少なくとも８個体由来である；および／または
−核酸の第１のセットは、第１のサブグループ由来の少なくとも４個体、および好ましくは第１のサブグループとは重複しない第２のサブグループからの少なくとも４個体由来である；および／または
−プロセスが医学的治療のために個体を選択するために実施される
請求項１〜４のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項６】
−核酸の第２のセットが非選択グループを表し；および／または
−核酸の第２のセットが、規定された位置でアレイするために結合され；および／または
−核酸の第２のセットが、少なくとも１００の異なる遺伝子における染色体相互作用を表し；および／または
−核酸の第２のセットが、少なくとも１，０００の異なる染色体相互作用を表す少なくとも１，０００の異なる核酸を含み；および／または
−核酸の第１のセットおよび核酸の第２のセットが、１０〜１００ヌクレオチド塩基長を有する少なくとも１００核酸を含む
請求項１〜５のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項７】
核酸の第１のセットが、
（ｉ）染色体相互作用に集まっている染色体領域の架橋工程；
（ii）前記架橋された領域を、任意には酵素による制限消化切断により、切断させる工程；および
（iii）前記架橋され切断されたＤＮＡ端をライゲーションして核酸の第１のセット（特にライゲーションされたＤＮＡを含む）を生成する工程
を含むプロセスにおいて得られる請求項１〜６のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項８】
少なくとも５〜９の異なる染色体相互作用が、好ましくは５〜９の異なる領域または遺伝子において分類される請求項１〜７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項９】
前記ゲノムの規定された領域が、
（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む；および／または
（ii）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現する；および／または
（iii）非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を発現する；および／または
（iv）少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基をコードする核酸配列を発現する；および／または
（ｖ）制御エレメントを発現する；および／または
（vii）ＣＴＣＦ結合部位を含む
請求項１〜８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１０】
染色体相互作用の変化を起こし、それにより治療効果を生じさせることのできる薬剤を選択することにより、ＡＬＳを治療するための治療剤を同定または設計する方法であって、
−染色体相互作用が表１または表５のいずれかのプローブにより表され；および／または
−染色体相互作用が表１または表５に挙げられるいずれかの領域または遺伝子に存在し；および／または
−染色体相互作用が表１０または表１１に示される相互作用のいずれか１つであり、任意には：
−染色体相互作用が、いずれの染色体相互作用が請求項１に規定された染色体の状態に関連するかを決定する方法により同定されており、および／または
−染色体相互作用の変化が、（ｉ）表１または表５に記載されているプローブ配列のいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプローブ、および／または（ii）表１または表５のプライマーペアのいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプライマーペアを用いてモニターされる；および／または
−候補薬剤が細胞と接触され、その細胞における染色体相互作用が、候補薬剤がＡＬＳを治療することができるかどうかを決定するためにモニターされる
方法。
【請求項１１】
（iv）染色体相互作用の検出であって、
−染色体相互作用が、表１または表５のプローブにより表される、および／または
−表１または表５に記載されるいずれかの領域または遺伝子に存在する；および／または
−染色体相互作用が表１０または表１１に示される相互作用のいずれか１つである
染色体相互作用の検出、または
（ｖ）表１または表５に記載されるプローブ配列のいずれかと少なくとも７０％同一性を有するプローブ、または
（vi）表２または表７に同定されたプライマーのいずれかと少なくとも７０％同一性を有するプライマーペア
の、ＡＬＳのための治療剤を同定または設計するための使用。
【請求項１２】
候補薬剤を投与すること、および前記染色体相互作用の検出、前記プローブまたは前記プライマーペアを、染色体の状態に変化があるかどうかを検出し、それにより候補薬剤が治療剤であるかどうかを決定するために使用することを含む治療剤を同定するための請求項１１記載の使用であって、使用が任意にはインビトロで、好ましくは細胞内で行われる使用。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか１項に記載のプロセスによって治療剤が必要であると同定されている個体におけるＡＬＳを予防または治療する方法において使用するためのＡＬＳの治療剤。
【請求項１４】
分類または検出が、ライゲーション産物を増幅可能なプライマーおよびＰＣＲ反応中にライゲーション部位に結合するプローブを用いる定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるライゲーション産物の特異的な検出を含み、前記プローブが染色体相互作用に集まっている各染色体領域由来の配列に相補的な配列を含み、好ましくは、前記プローブは、
前記ライゲーション産物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および／または
オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合される蛍光団、および／または
オリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合される消光団、および
任意に、
前記蛍光団がＨＥＸ、テキサスレッドおよびＦＡＭから選択され；および／または
前記プローブが１０〜４０ヌクレオチド塩基長、好ましくは２０〜３０ヌクレオチド塩基長の核酸配列
を含む請求項１〜１３のいずれか１項に記載のプロセス、方法または使用。
【請求項１５】
集団における疾患サブグループを示す染色体の状態を検出するプロセスであり、その染色体の状態に関係する染色体相互作用がゲノムの規定された領域内に存在するかまたは存在しないかを検出することを含むプロセスであって、前記疾患サブグループがハンチントン病サブグループであり；そして
−前記染色体相互作用が、任意には、どの染色体相互作用が、集団のハンチントン病サブグループに対応する染色体の状態に関連付られるのかを決定する方法により同定されており、該方法は、染色体の種々の状態を有するサブグループ由来の核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させ、そして相補配列がハイブリダイズできるようにすることを含み、ここで、核酸の第１のセットおよび第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用に集まっている両染色体領域由来の配列を含むライゲーション産物を表し、かつ核酸の第１のセットおよび第２のセットの間のハイブリダイゼーションのパターンによりどの染色体相互作用がハンチントン病サブグループに特異的であるかの決定が可能となり；そして
−染色体相互作用が、
（ｉ）表１２に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（ii）表１２に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（iii）表１２に示される染色祭相互作用のいずれかに相当する；および／または
（iv）（ｉ）、（ii）または（iii）を含むか、または（ｉ）、（ii）または（iii）に隣接する４，０００塩基領域に存在する
プロセス。
【請求項１６】
ハンチントン病と診断する、またはハンチントン病の予後を決定するために実行される請求項１５記載のプロセス。
【請求項１７】
染色体相互作用の特異的な組み合わせが、
（ｉ）表１２のプローブにより表されるすべての染色体相互作用を含む；または
（ii）表１２のプローブにより表される少なくとも４、５、６または７個の染色体相互作用を含む
（iii）表１２に挙げられる少なくとも４、５、６または７個の領域または遺伝子に一緒に存在する；または
（iv）表１２のプローブにより表される染色体相互作用を含むか、または表１または表５のプローブにより表される染色体相互作用に隣接する４，０００塩基領域に存在する少なくとも４、５、６または７個の染色体相互作用を含む
に分類される請求項１５または１６記載のプロセス。
【請求項１８】
染色体相互作用が、
−個体由来のサンプルにおいて、および／または
−染色体相互作用の部位でのＤＮＡループの存在または非存在を検出することにより、および／または
−染色体コンフォメーションに集められる染色体の遠位領域の存在または非存在を検出することにより、および／または
−前記分類のあいだに生成され、その配列が、染色体相互作用に集められる染色体の領域に各々対応する２つの領域を含むライゲーションされた核酸の存在を検出することにより、ここで、ライゲーションされた核酸の検出が、好ましくは、（ｉ）表１２に記載される特異的プローブ配列のいずれかに少なくとも７０％の同一性を有するプローブを用いる、および／または（ii）表１２のいずれかのプライマーペアと少なくとも７０％の同一性を有するプライマーペアを用いるものである
分類される請求項１５〜１７のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項１９】
−核酸の第２のセットが核酸の第１のセットより大きな個体のグループ由来である；および／または
−核酸の第１のセットが、少なくとも８個体由来である；および／または
−核酸の第１のセットは、第１のサブグループ由来の少なくとも４個体、および好ましくは第１のサブグループとは重複しない第２のサブグループからの少なくとも４個体由来である；および／または
−プロセスが医学的治療のために個体を選択するために実施される
請求項１５〜１８のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２０】
−核酸の第２のセットが非選択グループを表し；および／または
−核酸の第２のセットが、規定された位置でアレイするために結合され；および／または
−核酸の第２のセットが、少なくとも１００の異なる遺伝子における染色体相互作用を表し；および／または
−核酸の第２のセットが、少なくとも１，０００の異なる染色体相互作用を表す少なくとも１，０００の異なる核酸を含み；および／または
−核酸の第１のセットおよび核酸の第２のセットが、１０〜１００ヌクレオチド塩基長を有する少なくとも１００核酸を含む
請求項１５〜１９のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２１】
核酸の第１のセットが、
（ｉ）染色体相互作用に集まっている染色体領域の架橋工程；
（ii）前記架橋された領域を、任意には酵素による制限消化切断により、切断させる工程；および
（iii）前記架橋され切断されたＤＮＡ端をライゲーションして核酸の第１のセット（特にライゲーションされたＤＮＡを含む）を生成する工程
を含むプロセスにおいて得られる請求項１５〜２０のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２２】
少なくとも５〜９種の異なる染色体相互作用が分類される請求項１５〜２１のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記ゲノムの規定された領域が、
（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む；および／または
（ii）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現する；および／または
（iii）非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を発現する；および／または
（iv）少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基をコードする核酸配列を発現する；および／または
（ｖ）制御エレメントを発現する；および／または
（vi）ＣＴＣＦ結合部位を含む
請求項１５〜２２のいずれか１項に記載のプロセス。
【請求項２４】
染色体相互作用の変化を起こし、それにより治療効果を生じさせることのできる薬剤を選択することにより、ハンチントン病を治療するための治療剤を同定または設計する方法であって、
−染色体相互作用が表１２のいずれかのプローブにより表され、任意には、
−染色体相互作用が、いずれの染色体相互作用が請求項１５に規定された染色体の状態に関連するかを決定する方法により同定されており、および／または
−染色体相互作用の変化が、（ｉ）表１２に記載されているプローブ配列のいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプローブ、および／または（ii）表１２のプライマーペアのいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプライマーペアを用いてモニターされる；および／または
−候補薬剤が細胞と接触され、その細胞における染色体相互作用が、候補薬剤がハンチントン病を治療することができるかどうかを決定するためにモニターされる
方法。
【請求項２５】
−染色体相互作用の検出であって、該染色体相互作用が、表１２のプローブにより表されるものである検出；または
−表１２に記載されたプローブ配列のいずれかと少なくとも７０％同一性を有するプローブ、または
−表１２に同定されたプライマーのいずれかと少なくとも７０％同一性を有するプライマーペア；
の、ハンチントン病のための治療剤を同定または設計するための使用。
【請求項２６】
候補薬剤を投与すること、および前記染色体相互作用の検出、前記プローブまたは前記プライマーペアを、染色体の状態に変化があるかどうかを検出し、それにより候補薬剤が治療剤であるかどうかを決定するために使用することを含む治療剤を同定するための請求項２５記載の使用であって、使用が任意にはインビトロで、好ましくは細胞内で行われる使用。
【請求項２７】
請求項１５〜２３のいずれか１項に記載のプロセスによって治療剤が必要であると同定されている個体におけるハンチントン病を予防または治療する方法において使用するためのハンチントン病の治療剤。
【請求項２８】
分類または検出が、ライゲーション産物を増幅可能なプライマーおよびＰＣＲ反応中にライゲーション部位に結合するプローブを用いる定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるライゲーション産物の特異的な検出を含み、前記プローブが染色体相互作用に集まっている各染色体領域由来の配列に相補的な配列を含み、好ましくは、前記プローブは、
前記ライゲーション産物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および／または
オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合される蛍光団、および／または
オリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合される消光団、および
任意に、
前記蛍光団がＨＥＸ、テキサスレッドおよびＦＡＭから選択され；および／または
前記プローブが１０〜４０ヌクレオチド塩基長、好ましくは２０〜３０ヌクレオチド塩基長の核酸配列
を含む請求項１〜２７のいずれか１項に記載のプロセス、方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、染色体相互作用を検出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマーカーにより、疾患の特徴を同定することが可能となる。現在一般に使用されるバイオマーカーには、ＲＮＡ発現パターンおよびタンパク質マーカーが含まれる。
【発明の概要】
【０００３】
座位の特定の染色体コンフォメーションシグネチャー（ＣＣＳｓ）が存在するか、または病理または治療に関連する調節エピジェネティック制御設定のために存在しない。ＣＣＳｓは、穏やかなオフレートを有し、特別な表現型または病理を表す場合、ＣＣＳｓは薬理学的シグナル伝達でのみ、新しい表現型に変化するか、または外部干渉の結果として変化する。さらに、これらの事象の測定はバイナリであり、そのためこの読み出しは、さまざまなレベルのＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、およびほとんどの非コーディングＲＮＡの連続読み出しとはまったく対照的である。特定のバイオマーカーの変化の大きさは患者ごとに大きく異なり、患者のコホートを層別化するために使用すると分類統計に問題が生じるため、これまでほとんどの分子バイオマーカーに使用されている連続読み出しはデータ分析に課題をもたらす。これらの分類統計は、大きさというものがなく、表現型の違いの「はい、または、いいえ」のバイナリスコアのみを提供するバイオマーカーを使用するのに適している−染色体コンフォメーション（ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標））バイオマーカーが、潜在的な診断、予後予測および予測のバイオマーカーのための優れたリソースであることを示す。
【０００４】
本発明者らは、染色体相互作用が筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはハンチントン病に関連するゲノムの領域を、集団におけるサブグループの同定を可能にするアプローチを使用して同定した。したがって、本発明は、集団におけるサブグループを表す染色体状態を検出するためのプロセスであって、染色体相互作用がゲノムの定義されたＡＬＳまたはハンチントン病である疾患関連領域内に存在するかまたは存在しないかを決定することを含むプロセスを提供する。染色体相互作用は、どの染色体相互作用が集団のＡＬＳまたはハンチントン病サブグループに対応する染色体状態に関連するかどうかを決定する方法であって、染色体の異なる状態のサブグループ由来の核酸の第１のセットを、指標核酸の第２のセットと接触させ、相補的な配列をハイブリダイズさせることを含み、核酸の第１のセットおよび第２のセットにおける核酸が、染色体相互作用に集まる両染色体領域由来の配列を含むライゲーション産物を表し、そして、核酸の第１のセットおよび第２のセットとの間のハイブリダイゼーションのパターンにより、どの染色体相互作用がＡＬＳまたはハンチントン病のサブグループに特異的であるかが決定可能となる方法により、任意に同定されているか、または同定可能（または導出可能）であってもよい。ＡＬＳまたはハンチントン病のサブグループは、診断（ＡＬＳまたはハンチントン病の存在）または予後（例えば、ＡＬＳまたはハンチントン病の進行速度）に関連し得る。本明細書に記載されている特異的な関連染色体相互作用（マーカー）のいずれも、マーカーの組み合わせを含めて、本発明の基礎として使用することができる。
【０００５】
本発明は、集団における疾患サブグループを示す染色体の状態を検出するプロセスであり、その染色体の状態に関係する染色体相互作用がゲノムの規定された領域内に存在するかまたは存在しないかを検出することを含むプロセスであって、前記疾患サブグループが筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）サブグループであり；そして
−前記染色体相互作用が、任意には、どの染色体相互作用が、集団のＡＬＳサブグループに対応する染色体の状態に関連付られるのかを決定する方法により同定されており、該方法は、染色体の種々の状態を有するサブグループ由来の核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させ、そして相補配列がハイブリダイズできるようにすることを含み、ここで、核酸の第１のセットおよび第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用に集まっている両染色体領域由来の配列を含むライゲーション産物を表し、かつ核酸の第１のセットおよび第２のセットの間のハイブリダイゼーションのパターンによりどの染色体相互作用がＡＬＳサブグループに特異的であるかの決定が可能となり；そして
−染色体相互作用が、
（ｉ）表１または表５に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（ii）表１または表５に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（iii）表１０または表１１に示される染色祭相互作用のいずれかに相当する；および／または
（iv）（ｉ）、（ii）または（iii）を含むか、または（ｉ）、（ii）または（iii）に隣接する４，０００塩基領域に存在する
プロセスを提供する。
【０００６】
本発明は、集団における疾患サブグループを示す染色体の状態を検出するプロセスであり、その染色体の状態に関係する染色体相互作用がゲノムの規定された領域内に存在するかまたは存在しないかを検出することを含むプロセスであって、前記疾患サブグループがハンチントン病サブグループであり；そして
−前記染色体相互作用が、任意には、どの染色体相互作用が、集団のハンチントン病サブグループに対応する染色体の状態に関連付られるのかを決定する方法により同定されており、該方法は、染色体の種々の状態を有するサブグループ由来の核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させ、そして相補配列がハイブリダイズできるようにすることを含み、ここで、核酸の第１のセットおよび第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用に集まっている両染色体領域由来の配列を含むライゲーション産物を表し、かつ核酸の第１のセットおよび第２のセットの間のハイブリダイゼーションのパターンによりどの染色体相互作用がハンチントン病サブグループに特異的であるかの決定が可能となり；そして
−染色体相互作用が、
（ｉ）表１２に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（ii）表１２に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（iii）表１２に示される染色祭相互作用のいずれかに相当する；および／または
（iv）（ｉ）、（ii）または（iii）を含むか、または（ｉ）、（ii）または（iii）に隣接する４，０００塩基領域に存在する
プロセスを提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】染色体の相互関係がどのように検出できるかを示す図である。
【図２】ハンチントン病研究において調査された遺伝領域の視覚的概観を示す図である。ＨＴＴ遺伝子座にわたる染色体４上の〜２２５ｋｂ領域が調べられた。アンカーポイント（トラック４における「アンカー」）は、ＨＴＴのエクソン１におけるＣＡＧリピートのわたる〜４２ｋｂ領域として定義された（図の頂部の紫矢印）。我々は、Ｅｐｉｓｗｉｔｃｈ部位（トラック３）、ＨＤに関連したＳＮＰｓ（トラック５）または他の疾患（トラック６）とのオーバーラップに基づいて５つのゾーン（トラック４におけるゾーン１〜５）を規定し、ＨＣおよびＨＤ（トラック７〜１２）との間のメチル化およびアセチル化（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３およびＨ３Ｋ２７Ａｃ）の違いを観察した。
【図３】７つの別個のＨＤ−Ｓｙｍサンプル中の６つにおいて、３つの条件付き相互作用（Ｉ５、Ｉ６およびＩ７）のうちの少なくとも１つの存在が観察されたことを示す図である。Ｉ５、すなわちｒｓ３６２３３１ＳＮＰを含む領域にわたる相互作用が非常に多くのサンプル（６／７）で観察された。
【図４】ハンチントン病の症状の進行を促進するエピジェネティック変化のためのモデルを提供する。ＨＤの進行と関連付けられる染色体コンフォメーション変化の概観を示す。患者が発症前段階から症候性疾患に進行するにつれて、ＨＴＴ遺伝子座でのゲノム構造において、離散的で、測定可能で、識別可能な変化が観察された。
【図５】同定されたすべてのハンチントン病の相互作用のまとめを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明のプロセス
本発明のプロセスは、ＡＬＳまたはハンチントン病に関連する染色体相互作用を検出する分類システムを含む。この分類は、本明細書において記載されるＥｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）システムであって、染色体相互作用に集まる染色体の架橋領域に基づくシステムを用い、染色体ＤＮＡを切断させ、その後、架橋エンティティーに存在する核酸をライゲーションし、染色体相互作用を形成した両領域由来の配列を有するライゲーションした拡散を誘導することにより行うことができる。このライゲーションした拡散の検出により、特定の染色体相互作用の存在または非存在の検出が可能となる。
【０００９】
染色体相互作用は、第１および第２の核酸の集団が使用される上述の方法を用いて同定することができる。これらの核酸は、Ｅｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）技術を用いて生み出すこともできる。
【００１０】
本発明に関連するエピジェネティックな相互作用
本明細書において使用する場合、「エピジェネティックな」および「染色体」相互作用という用語は、典型的には、染色体上の遺伝子座の遠位領域間での相互作用を意味し、該相互作用は、染色体の領域の状態に応じて動的であり、かつ変容し、形成され、または壊れる。
【００１１】
本発明の特定のプロセスにおいて、染色体相互作用は、その相互作用の一部である染色体の両領域由来の配列を含むライゲーションした核酸をまず生成することによって検出される。そのようなプロセスにおいて、両領域は、任意の適切な手段によって架橋され得る。好ましい態様において、相互作用は、ホルムアルデヒドを用いて架橋されるが、任意のアルデヒド、またはＤ−ビオチノイル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルもしくはジゴキシゲニン−３−Ｏ−メチルカルボニル−ｅ−アミノカプロン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって架橋してもよい。パラホルムアルデヒドは、４オングストローム離れているＤＮＡ鎖を架橋し得る。好ましくは、染色体相互作用は、同じ染色体上であり、任意には２〜１０オングストローム離れている。
【００１２】
染色体相互作用は、染色体の領域の状態、例えばそれが生理学的条件の変化に応答して転写されているまたは抑制されているかどうかを反映し得る。本明細書において規定されるサブグループに特異的である染色体相互作用は、安定であることが見出されており、ゆえに２つのサブグループ間での差を測定する確実な手段を提供する。
【００１３】
加えて、ある特徴（疾患状況など）に特異的な染色体相互作用は、通常、例えばメチル化またはヒストンタンパク質の結合への変化などの他のエピジェネティックマーカーと比較して、生物学的過程の初期に起こると考えられる。ゆえに、本発明のプロセスは、生物学的過程の初期ステージを検出することができる。このことは、結果として、より効果的であり得る早期介入（例えば治療）を可能とする。さらに、同じサブグループ内の個体間では、関連する染色体相互作用にほとんど変動がない。染色体相互作用を検出することは、１遺伝子あたり最大５０種の考え得る異なる相互作用を有して非常に有益であり、そのため本発明のプロセスは、５００，０００種の異なる相互作用を詮索し得る。
【００１４】
好ましいマーカーのセット
本明細書において、用語「マーカー」または「バイオマーカー」は、本発明において検出され得る（分類され得る）特異的な染色体相互作用を意味する。特異的マーカーが本明細書に開示される。それらのいずれかは、いずれのマーカーも本発明において使用することができる。さらなるマーカーのセットは、例えば、本明細書において開示される組み合わせまたは数で使用されてもよい。本明細書の表に開示されるマーカーが好ましい。これらは、任意の適切な方法、例えば、ｑＰＣＲ法などの本明細書に開示されるＰＣＲまたはプローブに基づく方法などにより分類され得る。マーカーは、位置により、またはプローブおよび／またはプライマー配列により本明細書において定義される。
【００１５】
エピジェネティックな相互作用の位置および原因
エピジェネティックな染色体相互作用は、関連するまたは記載されていない遺伝子をコードすることが示される染色体の領域と重複し得かつ含み得るが、同様に遺伝子間領域にあってもよい。さらに留意すべきは、本発明者らは、すべての領域におけるエピジェネティックな相互作用が、染色体座の状態を判定することにおいて同様に重要であることを発見したことである。これらの相互作用は、必ずしも遺伝子座に位置する特定の遺伝子のコード領域にあるわけではなく、遺伝子間領域にあってもよい。
【００１６】
本発明において検出される染色体相互作用は、基礎となるＤＮＡ配列への変化によって、環境因子、ＤＮＡメチル化、非コーディングアンチセンスＲＮＡ転写産物、非変異原性発癌物質、ヒストン修飾、クロマチン再構成、および特異的な局所ＤＮＡ相互作用によって引き起こされ得る。染色体相互作用につながる変化は、基礎となる核酸配列への変化であって、それ自体は遺伝子産物または遺伝子発現の様式に直接影響を及ぼさない変化によって引き起こされ得る。そのような変化は、例えば遺伝子の内部および／または外側のＳＮＰ、遺伝子融合、および／または遺伝子間ＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、および非コーディングＲＮＡの欠失であり得る。例えば、おおよそ２０％のＳＮＰが非コーディング領域にあることが知られており、それゆえ説明されるプロセスは、非コーディングの場面においても有益である。一態様において、一体となって相互作用を形成する染色体の領域は、同じ染色体上で５ｋｂ、３ｋｂ、１ｋｂ、５００塩基対、または２００塩基対未満離れている。
【００１７】
検出される染色体相互作用は、好ましくは表１または５において言及される遺伝子のいずれかの内部にある。しかしながら、それは、遺伝子の上流または下流、例えば遺伝子からまたはコーディング配列から最大５０，０００、最大３０，０００、最大２０，０００、最大１０，０００、または最大５０００塩基上流または下流にあってもよい。
【００１８】
サブグループ、診断および個別化治療
本発明の目的は、ＡＬＳまたはハンチントン病のサブグループに関連する染色体相互作用の検出を可能とすることである。したがって、そのプロセスは、ＡＬＳまたはハンチントン病の診断に使用されてもよく、または使用されなくてもよい。そのプロセスは、ＡＬＳまたはハンチントン病の予後のために使用されてもよく、または使用されなくてもよい。
【００１９】
プロセスがＡＬＳの診断に使用される場合、表１に関連するマーカーの分類が好ましい（すなわち、特定の開示されたマーカー、および表１に開示された遺伝子、領域および隣接領域におけるマーカー）。診断に関する一実施形態において、表１に関連するマーカーのみが分類され、他のマーカーは分類されない。診断に関する別の実施形態において、表５に関連する（例えば、挙げられたプローブ配列により表されるような）少なくとも１、２、３、４、５またはそれより多くのマーカーが分類されない。
【００２０】
プロセスが予後に使用される場合、表５に関連するマーカーの分類が好ましい（すなわち、特定の開示されたマーカー、および表５に開示された遺伝子、領域および隣接領域におけるマーカー）。予後に関する一実施形態において、表５に関連するマーカーのみが分類され、他のマーカーは分類されない。予後に関する別の実施形態において、表１に関連する（例えば、挙げられたプローブ配列により表されるような）少なくとも１、２、３、４、５またはそれより多くのマーカーが分類されない。
【００２１】
通常、「予後（prognosis）」は、ＡＬＳの進行に関し、個体を進行速度のサブグループに分類することができる。進行波、ＡＬＳ−ＦＲＳ−Ｒスコア（ＡＬＳ機能評価尺度）を用いて測定することができ、個体は、特定の値よりも大きいまたは小さいとして、例えば、３０日当たりのポイントの減少が０．５よりも大きいまたは小さいとして分類することができる。これにより、予測的な予後を行うことができる。
【００２２】
本明細書において使用するとき、「サブグループ」とは、好ましくは、集団サブグループ（集団内のサブグループ）、より好ましくは特定の真核細胞または哺乳類（例えば、ヒト、非ヒト、非ヒト霊長類、または齧歯類、例えばマウスもしくはラット）などの特定の動物の集団内のサブグループを意味する。最も好ましくは、「サブグループ」とは、ヒト集団内のサブグループを意味する。
【００２３】
本発明は、集団における特定のサブグループを検出することおよび治療することに関する。本発明者らは、染色体相互作用が、所与の集団における部分集合（例えば少なくとも２つの部分集合）の間で異なることを発見した。これらの違いを同定することにより、医師は、プロセスにおいて説明される集団の１つの部分集合の一部として彼らの患者を類別することが可能となる。それゆえ、本発明は、エピジェネティックな染色体相互作用に基づき、患者に対して薬物療法を個別化するプロセスを医師に提供する。
【００２４】
一実施形態において、サブグループ（例えば、予後に関するサブグループ）は、ＡＬＳ機能評価尺度（例えば、Cedarbaum, J.M., Stambler, N., Malta, E., Fuller, C., Hilt, D., Thurmond, B. and Nakanishi, A. (1999) The ALSFRS-R: a revised ALS functional rating scale that incorporates assessments of respiratory function. BDNF ALS Study Group (Phase III), Journal of the Neurological Sciences. 169(1-2), 13-21.に記載されている）により定義される。
【００２５】
一実施形態において、サブグループ（例えば、予後に関するサブグループ）は、努力肺活量（ＦＶＣ）（例えば、Talakad, N.S., Pradhan, C., Nalini, A., Thennarasu, K. and Raju T.R. (2009) Assessment of Pulmonary Function in Amyotrophic Lateral Sclerosis, Indian J Chest Dis Allied Sci. 51(2):87-91.に記載されている）により定義される。
【００２６】
ライゲーションした核酸を生成する
本発明のある特定の形態は、ライゲーションした核酸、とくにライゲーションしたＤＮＡを利用する。これらは、染色体相互作用に集まる両領域由来の配列を含み、それゆえ、相互作用についての情報を提供する。本明細書において記載されるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）法は、そのようなライゲーションした核酸の生成を用いて、染色体相互作用を検出する。
【００２７】
したがって、本発明のプロセスは、次の工程（これらの工程を含む方法など）：
（ｉ）染色体座に存在するエピジェネティックな染色体相互作用を、好ましくはインビトロで架橋する工程；
（ii）任意に、架橋したＤＮＡを染色体座から単離する工程；
（iii）架橋したＤＮＡを、例えば少なくとも１回それを切る酵素（とくに、該染色体座内で少なくとも１回切る酵素）で制限消化により切断させる工程；
（iv）架橋した切断されたＤＮＡ端を（特に、ＤＮＡループを形成するために、）ライゲーションする工程；ならびに
（ｖ）任意に、ライゲーションしたＤＮＡおよび／またはＤＮＡループの存在を、特にＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）などの技法を用いて、同定し、特異的な染色体相互作用の存在を同定する工程
によりライゲーションした核酸（例えば、ＤＮＡ）を生成する工程を含む。
【００２８】
これらの工程は、個体が、ＡＬＳまたはハンチントン病のサブグループの一員であるかどうかを決定するためなど、本明細書に記載されるいずれかの実施形態のために染色体相互作用を検出するために行われてもよい。工程はまた、本明細書に記載される核酸の第１のセットおよび／または第２のセットを生成するために行われてもよい。
【００２９】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、ライゲーションした核酸を検出するまたは同定するために用いることができ、例えば産生されたＰＣＲ産物のサイズは、特異的染色体相互作用が存在することを示すことができ、それゆえ遺伝子座の状態を同定するために用いられ得る。好ましい実施形態においては、表２または７に示される少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８このプライマーまたはプライマーペアがＰＣＲ反応において使用される。別の好ましい実施形態においては、別の表に示される少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８このプライマーまたはプライマーペアがＰＣＲ反応において使用される。当業者であれば、目的の染色体座内でＤＮＡを切るために用いられ得る無数の制限酵素を承知しているであろう。用いられる特定の酵素が、調査される遺伝子座およびそこに位置するＤＮＡの配列に依存することは明らかであろう。本発明において説明されるようにＤＮＡを切るために用いられ得る制限酵素の非限定的な例は、ＴａｑＩである。
【００３０】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術などの実施形態
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術は、表現型に特異的なエピジェネティックな染色体コンフォメーションシグネチャーの検出における、マイクロアレイＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーデータの使用に関する。本明細書において記載される様式で、ライゲーションした核酸を利用するＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）などの実施形態は、いくつかの利点を有する。例えば本発明の核酸の第１のセット由来の核酸配列は、核酸の第２のセットとハイブリダイズするまたはハイブリダイズしないため、それらの確率的ノイズは低レベルである。これは、エピジェネティックなレベルにおける複雑なメカニズムを測定する比較的簡潔なやり方を可能にする二元的結果を提供する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術は、迅速な処理時間および低コストも有する。一実施形態において、処理時間は３〜６時間である。
【００３１】
サンプルおよびサンプル処置
本発明のプロセスは、普通、サンプル上で行われるであろう。サンプルは、普通、個体由来のＤＮＡを含有すると考えられる。それは、通常細胞を含有すると考えられる。一実施形態において、サンプルは、最小限に侵襲的な手段によって獲得され、例えば血液サンプルであり得る。ＤＮＡが抽出されてもよく、標準的な制限酵素で細かく切断されてもよい。これは、どの染色体コンフォメーションが保持されかつＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームで検出されるかをあらかじめ判定し得る。水平移動を含めた、組織と血液との間での染色体相互作用の同期により、血液サンプルを用いて、疾患に関連した組織などの組織における染色体相互作用を検出することができる。がんなどのある特定の病状に関しては、変異による遺伝子ノイズが、関連組織における染色体相互作用「シグナル」に影響を及ぼし得、それゆえ血液を用いることが有利である。
【００３２】
本発明の核酸の特性
本発明は、本明細書において、本発明のプロセスにおいて使用される、または生成されるものとして説明されるライゲーションした核酸などの特定の核酸に関する。これらは、本明細書に記載された第１および第２の核酸と同じであってもよく、第１および第２の核酸の特性のいずれかを有していてもよい。本発明の核酸は、典型的に、染色体相互作用に集まる染色体の２つの領域の一方由来の配列をそれぞれが含む２つの部分を含む。典型的には、それぞれの部分は、少なくとも８、１０、１５、２０、３０、または４０ヌクレオチド長、例えば１０〜４０ヌクレオチド長である。好ましい核酸は、とくに核酸がいずれかの表に記載される遺伝子のいずれか由来の配列を含む。典型的には、好ましい核酸は、表１または５に記載される特定のプローブ配列、またはそのような配列のフラグメントおよび／またはホモログを含む。別の好ましい核酸は、表１０、１１または１２に記載される特定のプローブ配列、またはそのような配列のフラグメントおよび／またはホモログを含む。好ましくは、核酸はＤＮＡである。特異的配列が提供される場合、本発明は、特定の実施形態において必要とされる相補的配列を使用してもよいと理解される。
【００３３】
表２または７に示されるプライマーも、本明細書に記載されているように本発明において使用されてもよい。一実施形態において、表２または７に示される配列；または表２または７に示されるいずれかの配列のフラグメントおよび／またはホモログ、のいずれかを含むプライマーが使用される。
【００３４】
核酸の第二のセット−「インデックス」配列
核酸の第二のセットは、インデックス配列のセットであるという機能を有し、かつ本質的に、サブグループ特異的配列を同定するのに適している核酸配列のセットである。それらは、「バックグラウンド」染色体相互作用を表すことができ、かつ何らかのやり方で選択されてもよく、または選択されなくてもよい。それらは、一般に、すべての考え得る染色体相互作用の部分集合である。
【００３５】
核酸の第二のセットは、任意の適切な方法によって導き出され得る。それらは、コンピューターにより導き出されてもよく、またはそれらは、個体における染色体相互作用に基づいてもよい。それらは、典型的に、核酸の第一のセットよりも大きな集団グループを表す。一つの特定の実施形態において、核酸の第二のセットは、特定の遺伝子セットにおけるすべての考え得るエピジェネティックな染色体相互作用を表す。別の特定の実施形態において、核酸の第二のセットは、本明細書において記載される集団に存在するすべての考え得るエピジェネティックな染色体相互作用の大部分を表す。一つの特定の実施形態において、核酸の第二のセットは、少なくとも２０、５０、１００または５００の遺伝子、例えば２０〜１００、または５０〜５００の遺伝子におけるエピジェネティックな染色体相互作用の少なくとも５０％または少なくとも８０％を表す。
【００３６】
核酸の第二のセットは、典型的に、集団における疾患状態／表現型を改変する、調節する、または何らかのやり方で仲介する少なくとも１００の考え得るエピジェネティックな染色体相互作用を表す。核酸の第二のセットは、種における疾患状態（典型的には診断または予後に関する）に影響を及ぼす染色体相互作用を表してもよい。核酸の第二のセットは、典型的には、ＡＬＳサブグループに関連するおよび関連しない両方のエピジェネティックな相互作用に表す配列を含む。一つの特定の実施形態において、核酸の第二のセットは、集団における天然に生じる配列に少なくとも部分的に由来し、かつ典型的には、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ法によって得られる。該核酸は、天然に生じる核酸に存在する核酸の対応する部分と比較して、単一のまたは複数の変異をさらに含んでもよい。変異には、１つまたは複数のヌクレオチド塩基対の欠失、置換、および／または付加が含まれる。一つの特定の実施形態において、核酸の第二のセットは、天然に生じる種に存在する核酸の対応する部分と少なくとも７０％の配列同一性を有するホモログおよび／またはオルソログを表す配列を含んでもよい。別の特定の実施形態において、天然に生じる種に存在する核酸の対応する部分と少なくとも８０％の配列同一性または少なくとも９０％の配列同一性が提供される。
【００３７】
核酸の第二のセットの特性
一つの特定の実施形態において、核酸の第二のセットには、少なくとも１００の異なる核酸配列、好ましくは少なくとも１０００、２０００、または５０００の異なる核酸配列、最大で１００，０００、１，０００，０００、または１０，０００，０００の異なる核酸配列が存在する。典型的な数は、１，０００〜１００，０００の異なる核酸配列など、１００〜１，０００，０００であろう。これらのすべてまたは少なくとも９０％または少なくとも５０％は、異なる染色体相互作用に相当するであろう。
【００３８】
一つの特定の実施形態において、核酸の第二のセットは、１００〜１０，０００の異なる遺伝子座または遺伝子など、少なくとも２０の異なる遺伝子座もしくは遺伝子、好ましくは少なくとも４０の異なる遺伝子座もしくは遺伝子、およびより好ましくは少なくとも１００、少なくとも５００、少なくとも１０００、または少なくとも５０００の異なる遺伝子座もしくは遺伝子における染色体相互作用を表す。核酸の第二のセットの長さは、それらが、ワトソン・クリック塩基ペアリングに従って核酸の第一のセットに特異的にハイブリダイズし、サブグループに特異的な染色体相互作用の同定を可能にするのに適したものである。典型的には、核酸の第二のセットは、染色体相互作用に集まる２つの染色体領域に配列が対応する２つの部分を含むであろう。核酸の第二のセットは、典型的に、長さが少なくとも１０、好ましくは２０、およびさらに好ましくは３０塩基（ヌクレオチド）である核酸配列を含む。別の実施形態において、核酸配列は、長さが多くても５００、好ましくは多くても１００、およびさらに好ましくは多くても５０塩基対であり得る。好ましい実施形態において、核酸の第二のセットは、１７〜２５の間の塩基対の核酸配列を含む。一実施形態において、核酸配列の第二のセットの少なくとも１００、８０％、または５０％は、上述の長さを有する。好ましくは、異なる核酸は、いかなる重複する配列も有さず、例えば該核酸の少なくとも１００％、９０％、８０％、または５０％は、少なくとも５連続ヌクレオチドにわたって同じ配列を有しない。
【００３９】
核酸の第二のセットが「インデックス」として作用することを考慮すると、第二核酸の同じセットは、サブグループの種々の特徴を表す第一核酸の種々のセットとともに用いてもよく、すなわち核酸の第二のセットは、種々の特徴に関連する染色体相互作用を同定するために用いることができる核酸の「普遍的な（universal）」コレクションを表してもよい。
【００４０】
核酸の第一のセット
核酸の第一のセットは、通常、ＡＬＳまたはハンチントン病の診断および予後に関連するサブグループ由来である。第一核酸は、本明細書において言及される核酸の第二のセットの特徴および特性のいずれかを有してもよい。核酸の第一のセットは、通常、本明細書に説明される処置および処理、とくにＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）の架橋および切断工程を受けている個体由来のサンプルに由来する。典型的には、核酸の第一のセットは、個体から採取されたサンプルに存在する染色体相互作用のすべてまたは少なくとも８０％または５０％を表す。
【００４１】
典型的には、核酸の第一のセットは、核酸の第二のセットによって表される染色体相互作用と比較して、核酸の第二のセットによって表される遺伝子座または遺伝子にわたる染色体相互作用のより小さな集団を表す、すなわち核酸の第二のセットは、遺伝子座または遺伝子の規定のセットにおける相互作用のバックグラウンドまたはインデックスセットを表している。
【００４２】
核酸のライブラリ
本明細書において言及される核酸集団の種類のいずれかは、「第一」または「第二」核酸などの、その種類の少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００の異なる核酸を含むライブラリの形態で存在してもよい。そのようなライブラリは、アレイに結合している形態であってもよい。
【００４３】
ハイブリダイゼーション
本発明は、核酸の第一のセットおよび核酸の第二のセット由来の全体的にまたは部分的に相補的な核酸配列がハイブリダイズするのを可能にするための手段を要する。一実施形態において、核酸の第一のセットのすべてと核酸の第二のセットのすべてとを単一アッセイで、すなわち単一ハイブリダイゼーション工程で接触させる。しかしながら、任意の適切なアッセイを用いることができる。
【００４４】
標識された核酸およびハイブリダイゼーションのパターン
本明細書において言及される核酸は、好ましくは達成できたハイブリダイゼーションの検出を支援する蛍光団（蛍光分子）または放射性標識などの独立した標識を用いて標識され得る。ある特定の標識は、ＵＶ光の下で検出することができる。例えば、本明細書に説明されるアレイ上でのハイブリダイゼーションのパターンは、２つのサブグループ間のエピジェネティックな染色体相互作用の相違点を表し、したがって、エピジェネティックな染色体比較するプロセス、およびどのエピジェネティックな染色体相互作用が本発明の集団のサブグループに特異的であるかの決定を提供する。
【００４５】
用語「ハイブリダイゼーションのパターン」は、核酸の第一のセットと第二のセットとの間のハイブリダイゼーションの存在および非存在、すなわち、どの特定の第一セット由来の核酸がどの特定の第二セット由来の核酸とハイブリダイズするかを広くカバーし、それは、任意の特別なアッセイまたは技術に限定されるものではないが、「パターン」を検出できる表面またはアレイを必要とする。
【００４６】
特別な特徴を有するサブグループを選択
本発明は、染色体相互作用、典型的には５〜２０または５〜５００のそのような相互作用、好ましくは２０〜３００または５０〜１００の相互作用の有無を検出して、個体におけるＡＬＳまたはハンチントン病に関連する特徴の有無を決定することを含むプロセスを提供する。好ましくは、染色体相互作用は、本明細書において言及される遺伝子のいずれかにおけるものである。一実施形態において、分類される染色体相互作用は、表１または表５の核酸により表されるものである。好ましくは、分類される染色体相互作用は、表１０、表１１または表１２の核酸により表されるものである。表中、「検出されたループ」と名付けられた欄は、どのサブグループが各プローブにより検出されるか（ＡＬＳまたは対照）を示す。見てわかるように、本発明のプロセスは、テストの一環として、ＡＬＳサブグループおよび／または対照グループ（非ＡＬＳ）のいずれかを検出することができる。
【００４７】
試験される個体
試験される個体の由来となる種の例は、本明細書において言及される。加えて、本発明のプロセスにおいて試験される個体は、いくつかの方法で選択されていてもよい。個体は、例えばＡＬＳまたはハンチントン病に罹りやすくてもよい。
【００４８】
好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用
本発明のすべての実施態様に関して、好ましい遺伝子領域、遺伝子座、遺伝子、および染色体相互作用が、表、例えば表１および表５に言及される。典型的には、本発明のプロセスにおいて、染色体相互作用は、表１または表５に挙げられる少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８の関連遺伝子から検出される。好ましくは、表１または表５のプローブ配列によって表される少なくとも１、２、３、４、５、６、７または８の関連する特異的染色体相互作用の有無が検出される。染色体相互作用は、本明細書において言及される遺伝子のいずれかの上流または下流、例えばコーディング配列から、例えば５０ｋｂ上流または２０ｋｂ下流にあり得る。
【００４９】
好ましくは、表１の少なくとも５、８、１０、１５またはすべての染色体相互作用が分類される。
【００５０】
典型的な実施形態では、表５の少なくとも５、７、８またはすべての染色体相互作用が分類される。
【００５１】
好ましくは、表１０の少なくとも４、６またはすべての染色体相互作用が分類される。
【００５２】
典型的には、表１１の少なくとも１、２またはすべての染色体相互作用が分類される。
【００５３】
好ましくは、表１２の少なくとも４、６またはすべての染色体相互作用が分類される。
【００５４】
染色体相互作用は、疾患の存在を決定するために分類されてもよい。染色体相互は、その個体が速くまたはゆっくり進行するかどうかを決定するために分類されてもよい。
【００５５】
表に開示された特異的プローブおよびプライマー配列（またはフラグメントやホモログなどの誘導体）は、本明細書に開示されるいずれかの分類法のために使用することができる。診断または予後の方法におけるそれらの使用が提供される。
【００５６】
一実施形態において、遺伝子座（染色体相互作用が検出される遺伝子および／または場所を含む）は、ＣＴＣＦ結合部位を含んでもよい。これは、転写抑制因子ＣＴＣＦに結合することができる任意の配列である。その配列は、遺伝子座において１、２または３コピーで存在し得るCCCTC配列からなってもよく、またはCCCTC配列を含んでもよい。ＣＴＣＦ結合部位配列は、CCGCGNGGNGGCAG配列（ＩＵＰＡＣ表記法で）を含み得る。ＣＴＣＦ結合部位は、染色体相互作用の少なくとも１００、５００、１０００または４０００塩基以内、または表１または表５に示される染色体領域のいずれかの内部にあり得る。
【００５７】
一実施形態において、検出される染色体相互作用は、表１または５に示される遺伝領域のいずれかに存在する。ライゲーションした核酸がプロセスにおいて検出される場合には、その後、表１または５のプローブ配列のいずれかに示される配列が検出され得る。
【００５８】
ゆえに、典型的に、プローブの両方の領域由来（すなわち、染色体相互作用の両方の部位由来）の配列が検出され得る。好ましい実施形態において、任意の表に示されるプローブと同じまたは相補的な配列を含むまたはそれからなるプローブが、プロセスにおいて用いられる。いくつかの実施形態において、表に示されるプローブ配列のいずれかと相同である配列を含むプローブが用いられる。
【００５９】
本明細書に提供される表
表１および５は、ＡＬＳに関連する染色体相互作用を表すプローブ（Ｅｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）マーカー）データおよび遺伝子データを示す。プローブ配列は、染色体相互作用に集まる遺伝子領域の両部位から産生されるライゲーション産物を検出するために使用することのできる配列を示す。すなわち、プローブは、ライゲーション産物の配列に相補的な配列を含む。第１のＳｔａｒｔ−Ｅｎｄ位置の２セットは、プローブ位置を示し、第２のＳｔａｒｔ−Ｅｎｄ位置の２セットは、関連する４ｋｂ領域を示す。次の情報は、プローブデータの表に提供される。
−ＨｙｐｅｒＧ＿Ｓｔａｔｅｓ：超幾何学的富化のパラメータに基づいて遺伝子座における有意なＥｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）マーカーのその数を見出す確率に対するｐ値
−Ｐｒｏｂｅ＿Ｃｏｕｎｔ＿Ｔｏｔａｌ：その遺伝子座で試験されたＥｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）コンフォメーションの総数
−Ｐｒｏｂｅ＿Ｃｏｕｎｔ＿Ｓｉｇ：その遺伝子座で統計的に有意であることが見出されたＥｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）コンフォメーションの数
−ＦＤＲ  ＨｙｐｅｒＧ：多重試験（偽発見率）補正された超幾何的ｐ値
−Ｐｅｒｃｅｎｔ＿Ｓｉｇ：その遺伝子座で試験されたマーカーの数に対する有意なＥｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの割合
−ｌｏｇＦＣ：エピジェネティック比率（ＦＣ）の対数の底２
−ＡｖｅＥｘｐｒ：すべてのアレイおよびチャネルのプローブに対する平均ｌｏｇ２−発現
−Ｔ：モデレートｔ−統計
−ｐ−値：未調整ｐ−値
−ａｄｊ．ｐ−値：調整ｐ−値またはｑ−値
−Ｂ：Ｂ−統計量（ｌｏｄまたはＢ）は、その遺伝子が別個に発現される対数オッズである。
−ＦＣ：非ログ倍率変化（Fold Change）
−ＦＣ＿１：ゼロを中心とする非ログ倍率変化
−ＬＳ：バイナリ値はＦＣ＿１値に関する。１．１未満のＦＣ＿１値は、−１に設定され、ＦＣ＿１値が１．１より大きい場合、１に設定される。これらの値の間は、その値は０である。
【００６０】
表１および５は、関連する染色体相互作用が生じることが見出されている遺伝子を示す遺伝子座の表におけるｐ−値は、ＨｙｐｅｒＧ＿Ｓｔａｔｓ（超幾何学的富化のパラメータに基づいて遺伝子座における有意なＥｐｉｓｗｉｔｃｈ（商標）マーカーのその数を見出す確率に対するｐ−値）と同じである。
【００６１】
プローブは、Ｔａｑ１部位から３０ｂｐ離れた位置に設計される。ＰＣＲの場合、ＰＣＲプライマーもライゲーション産物を検出するように設計されているが、Ｔａｑ１からの位置は異なる。
【００６２】
プローブ位置：
Ｓｔａｒｔ１−フラグメント１上のＴａｑＩの３０塩基上流
Ｅｎｄ１−フラグメント１上のＴａｑＩ制限部位
Ｓａｒｔ２−フラグメント２上のＴａｑＩ制限部位
Ｅｎｄ２−フラグメント２上のＴａｑＩの３０塩基下流
【００６３】
４ｋｂ配列位置：
Ｓｔａｒｔ１−フラグメント１上のＴａｑＩの４０００塩基上流
Ｅｎｄ１−フラグメント１上のＴａｑＩ制限部位
Ｓａｒｔ２−フラグメント２上のＴａｑＩ制限部位
Ｅｎｄ２−フラグメント２上のＴａｑＩの４０００塩基下流
【００６４】
ｌａｓｓｏ全体またはｅｌａｓｔｉｃ−ｎｅｔ正則化をフィッティングするための手順に関連したＧＬＭＮＥＴ値（０．５に設定されたλ（ｅｌａｓｔｉｃ−ｎｅｔ））。
【００６５】
表１〜４はＡＬＳの診断に関し、表５〜９はＡＬＳの予後に関し、そして一実施形態では、診断に関連する検出は表１および４に基づいて行われ、予後に関連する検出は表５〜９に基づいて行われる。
【００６６】
表１−ＬＳ列は、ＡＬＳケースに存在することを意味する１または−１．１、およびＡＬＳ症例に存在しないことを意味する−１を示す。
【００６７】
表５−ＬＳ列は、マーカーが速い進行者（progressor）に存在し、かつ遅い進行者には存在しないことを意味する１または−１、およびマーカーが遅い進行者には存在するが、速い進行者には存在しないことを意味する−１を示す。
【００６８】
表１０および表１１はＡＬＳの予後に関する。表１０には、以前の表に示されたマーカーが含まれる。表１１の「検出されたループ」列は、マーカーが速い進行者には存在し、遅い進行者には存在しないことを意味する。
【００６９】
マーカーは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ３Ｃ方法の産物に対する関連プローブを参照して、表において独自に同定される。加水分解プローブの場合、これらはＴａｑ部位（ＴＣＧＡ）の上にあり、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ相互作用における両方のゲノム部位を覆う。６０塩基アレイプローブ（配列タグの両端に３０塩基）と同じジャンクションを評価するが、両端の配列の調整された長さにわたる。表１９に、この例を提供する。
【００７０】
サンプル調製および染色体相互作用検出のための好ましい実施形態
サンプルを調製する方法および染色体コンフォメーションを検出する方法が、本明細書において説明される。例えばこの節で記載されるように、これらの方法の最適化された（非従来的な）バージョンが用いられ得る。
【００７１】
典型的に、サンプルは、少なくとも２×１０5個の細胞を含有するであろう。サンプルは、最大５×１０5個の細胞を含有し得る。一実施形態において、サンプルは、２×１０5〜５．５×１０5個の細胞を含有するであろう。
【００７２】
染色体座に存在するエピジェネティックな染色体相互作用の架橋が、本明細書において説明される。これは、細胞溶解が起きる前に実施され得る。細胞溶解は、４〜６または約５分間など、３〜７分間実施され得る。いくつかの実施形態において、細胞溶解は、少なくとも５分間かつ１０分間未満実施される。
【００７３】
制限酵素でＤＮＡを消化することが、本明細書において説明される。典型的には、ＤＮＡ制限は、約６５℃などの約５５℃〜約７０℃で、約２０分間などの約１０〜３０分間の期間実施される。
【００７４】
好ましくは、最大４０００塩基対の平均フラグメントサイズを有する、ライゲーションしたＤＮＡのフラグメントをもたらす高頻度カッター制限酵素が用いられる。任意で、制限酵素は、約２５６塩基対などの約２００〜３００塩基対の平均フラグメントサイズを有する、ライゲーションしたＤＮＡのフラグメントをもたらす。一実施形態において、典型的なフラグメントサイズは、４００〜２，０００または５００〜１，０００塩基対など、２００塩基対〜４，０００塩基対である。
【００７５】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ法の一実施形態において、ＤＮＡ沈殿工程は、ＤＮＡ制限消化工程とＤＮＡライゲーション工程との間では実施されない。
【００７６】
ＤＮＡライゲーションが本明細書において説明される。典型的には、ＤＮＡライゲーションは、約１０分間など、５〜３０分間実施される。
【００７７】
サンプル中のタンパク質は、例えばプロテイナーゼ、任意でプロテイナーゼＫを用いて酵素的に消化され得る。タンパク質は、約３０分間〜１時間の期間、例えば約４５分間酵素的に消化され得る。一実施形態において、タンパク質の消化、例えばプロテイナーゼＫ消化の後に、架橋反転またはフェノールＤＮＡ抽出の工程はない。
【００７８】
一実施形態において、ＰＣＲ検出は、好ましくはライゲーションした核酸の存在／非存在に対するバイナリ読み出しを備え、ライゲーションした核酸の単一コピーを検出することができる。
【００７９】
本発明のプロセスおよび使用
本発明のプロセスは、種々のやり方で説明することができる。それは、（ｉ）染色体相互作用に集まる染色体領域をインビトロ架橋する工程；（ii）該架橋したＤＮＡを切り取りまたは制限消化切断に供する工程；および（iii）該架橋し切断されたＤＮＡ末端をライゲーションして、ライゲーションした核酸を形成する工程、を含むライゲーションした核酸を作製する方法であって、該ライゲーションした核酸の検出を用いて、遺伝子座における染色体状態を判定し得、そして好ましくは、
−遺伝子座は、表１または表５に言及される遺伝子座、領域または遺伝子のいずれかであり得、
−および／または、染色体相互作用は、本明細書において言及される、または表１または表５に開示されるいずれかのプローブに対応する、いずれかの染色体相互作用であり得、および／または
−ライゲーションした産物は、（ｉ）表１または表５に開示されるいずれかのプローブ配列と同じであるかまたは相同である配列；または（ii）（ii）と相補的である配列を有し得るまたは含み得る
方法として説明され得る。
【００８０】
本発明のプロセスは、染色体相互作用が、ゲノムの規定のエピジェネティックに活性な（疾患関連の）領域内に存在するまたは存在しないかどうかを判定する工程を含む、集団内の種々のサブグループを表す染色体状態を検出するための方法であって、好ましくは、
−サブグループは、ＡＬＳ、またはＡＬＳに関連する特徴（予後または進行など）の有無によって規定され、および／または
−染色体状態は、表１または表５に言及されるいずれかの遺伝子座、領域または遺伝子にあり得；および／または
−染色体相互作用は、表１または表５に言及されるいずれかのもの、もしくはその表に開示されるいずれかのプローブに対応するいずれかのものであり得る
方法として説明され得る。
【００８１】
本発明は、表１または５に言及されるいずれかの遺伝子座、遺伝子または領域での染色体相互作用の検出を含む。本発明は、染色体相互作用を検出するための本明細書に記載の核酸およびプローブの使用、例えば、少なくとも１、２、４、６または８の異なる遺伝子座または遺伝子における染色体相互作用を検出するための少なくとも１、２、４、６または８のそのような核酸またはプローブの使用を含む。本発明は、表２または７に挙げられるいずれかのプライマーまたはプライマー対を使用する、または本明細書に記載のこれらのプライマーの変異体を使用する染色体相互作用の検出を含む（プライマー配列を含むまたはプライマー配列のフラグメントおよび／またはホモログを含む配列）。
【００８２】
染色体相互作用が定義された遺伝子、領域、または場所の「内（within）」で生じるかどうかを分析する場合、相互作用に集まる染色体の両方の部分が定義された遺伝子、領域または場所内にあるか、またはいくつかの実施形態においては染色体の一部のみが定義された遺伝子、領域または場所内にある。
【００８３】
新たな治療を同定するための本発明の方法の使用
染色体相互作用に関する知識は、疾患状態に対する新しい治療を同定するために使用することができる。本発明は、ＡＬＳに関する新規治療剤（予後に関する治療を含む）を同定または設計するために本明細書において定義される染色体の方法および使用を提供する。
【００８４】
ホモログ
ポリヌクレオチド／核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のホモログが、本明細書において言及される。そのようなホモログは、典型的に、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、１００またはそれよりも多くの連続ヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体の領域由来である核酸の部分にわたり、少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の相同性を有する。相同性は、ヌクレオチド同一性に基づいて算出され得る（時には、「厳密な相同性（hard homology）」と称される）。
【００８５】
それゆえ、特定の態様において、ポリヌクレオチド／核酸（例えば、ＤＮＡ）配列のホモログは、本明細書において配列同一性％を参照して触れられる。典型的に、そのようなホモログは、例えば少なくとも１０、１５、２０、３０、１００個以上の連続ヌクレオチドの領域にわたって、または染色体相互作用に関与する染色体の領域由来である核酸の部分にわたり、少なくとも７０％の配列同一性、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００８６】
例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性および／または配列同一性％を算出するために用いられ得るＢＥＳＴＦＩＴプログラム（例えば、そのデフォルト設定で用いられる）を提供する（Devereux et al (1984) Nucleic Acids Research 12, p387-395）。例えばAltschul S. F. (1993) J Mol Evol 36:290-300；Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215:403-10に記載されているように、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、相同性および／または配列同一性％を算出し得、および／または配列を整列させ得る（（典型的にそれらのデフォルト設定で）同等のまたは対応する配列を同定するなど）。
【００８７】
ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウェアは、国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）を通じて公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列において同じ長さのワードでアライメントした場合に合致する、またはある正の値を有する閾値スコアＴを満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することによって、高スコア配列ペア（ＨＳＰ）をまず同定する工程を伴う。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される(Altschul et al、上記）。これらの初回の近隣ワードヒットは、それらを含有するＨＳＰを見出す検索を始めるための種として作用する。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。それぞれの方向におけるワードヒットの拡張は、累積アライメントスコアがその最大限に達した値から分量Ｘだけ下落する；負のスコアを取る１つもしくは複数の残基アライメントの累積により、累積スコアがゼロもしくはそれより下に行く；または、いずれかの配列の末端に到達する場合に停止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターのＷ５  ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff and Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919を参照されたい）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、および両鎖の比較をデフォルトとして用いる。
【００８８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間での類似性についての統計解析を実施する；例えば、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性についての１つの測定は、最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、それは、２つのポリヌクレオチド配列間の合致が偶然に生じるであろう確率の表示を提供する。例えば、第一の配列を第二の配列と比較した最小和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満である場合、配列はもう一方の配列と類似していると見なされる。
【００８９】
相同な配列は、典型的に、１０、１５、または２０塩基未満など、１、２、３、４個、またはそれを上回る数の塩基だけ異なる（それはヌクレオチドの置換、欠失、または挿入であり得る）。これらの変化は、相同性および／または配列同一性％を算出する工程に関して上記で言及された領域のいずれかにわたり測定され得る。
【００９０】
「プライマー対」の相同性は、例えば、２つの配列を単一の配列と見なすことで（２つの配列が連結されているかのように）計算することができ、その後に単一配列として再度考慮される別のプライマー対と比較することができる。
【００９１】
アレイ
核酸の第二のセットがアレイに結合され得、そして一実施形態において、好ましくは少なくとも３００、９００、２０００、または５０００個の遺伝子座に相当する、アレイに結合している少なくとも１５，０００、４５，０００、１００，０００、または２５０，０００種の異なる第二の核酸が存在する。一実施形態において、第二の核酸の種々の集団のうちの１つ、または複数、またはすべては、アレイの１つを上回る数の個別の領域に結合され、事実上アレイで反復され、エラー検出を可能にする。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに基づく。アレイへの第一の核酸の結合の検出は、二色システムによって実施され得る。
【００９２】
治療剤
治療剤が本明細書において言及される。本発明は、ある個体、例えば本発明のプロセスにより同定される個体においてＡＬＳを予防または治療することにおける使用のためのそのような薬剤を提供する。これは、必要としている個体に治療上効果的な量の薬剤を投与することを含み得る。本発明は、ある個体においてＡＬＳを予防または治療するための医薬の製造におけるその薬剤の使用を提供する。
【００９３】
ＡＬＳのための好ましい治療剤は次のとおりである。
リルゾール（Ｒｉｌｕｔｅｋ）：この薬物は、通常ピルとして服用され、脳内のメッセンジャー（グルタミン酸）のレベルを低下させることにより、病気の進行を抑える。グルタミン酸は、ＡＬＳ患者に高レベルで存在する。
エダラボン（Ｒａｄｉｃａｖａ）：この薬物は、ＡＬＳに関する毎日のパフォーマンスの低下を軽減する。薬剤は、通常、月１回、連続して１０〜１４日間、静脈内注入によって患者に投与される。
アリモクロモール：この薬物は、運動ニューロンの熱ショック応答誘導剤として機能し、神経障害や細胞死を防ぐ。
タラムパネル：この薬物は、筋力低下と症状進行の速度を低下させる。
ベータ−ラクタム系抗生物質：ペニシリンやセファロスポリンなどのこれらの抗体は、ＧＬＴ１、グリアグルタミン酸トランスポーター１のレベルを上方制御することにより、筋肉の安定性を維持し、寿命を延ばす。
ブロモクリプチン：この薬物は、ストレスによって引き起こされる酸化的細胞死を阻害するフリーラジカルスカベンジャーである。
プラミペキソールおよびデクスプラミペキソール：これらの薬物はドーパミンアゴニストとして作用し、フリーラジカル消去機能を有する。これらの薬物はミトコンドリアの機能不全に関与している。デクプラミペキソールはプラミペキソールの光学鏡像異性体である。
幹細胞療法：幹細胞の成長は、ニューロン疾患の進行を減少させるか、運動ニューロンを置き換える。幹細胞は、脊髄運動ニューロンを作り、軸索を拡張し、筋肉とのシナプスを受け取り、生成する可能性がある。成体幹細胞に由来する間葉系幹細胞（ＭＳＣｓ）は、栄養因子、抗炎症性サイトカイン、免疫調節性ケモカインを放出し、疾患の進行を遅らせる。
免疫療法：ＩＣＶルートによるＤ３Ｈ５抗体注入などの抗体療法は、体重を長期間維持し、ＡＬＳの形質転換マウスモデルの寿命を延ばす。
【００９４】
以下はハンチントン病のための治療剤のリストである。これらは、運動や精神疾患のいくつかの症状を減少させることを助けることができる。
【００９５】
運動障害のための医薬
・テトラベナジン（Ｘｅｎａｚｉｎｅ）
・ハロペリドール（Ｈａｌｄｏｌ）、クロロプロマジン、リスペリドン（Ｒｉｓｐｅｒｄａｌ）およびケチアピン（Ｓｅｒｏｑｕｅｌ）などの抗精神薬
・他の医薬は、アマンタジン、レベチラセタム（Ｋｅｐｐｒａ他）およびクロナゼパム（Ｋｌｏｎｏｐｉｎ）を含む。
神経障害のための医薬
・抗うつ薬は、シタロプラム（Ｃｅｌｅｘａ）、エスシタロプラム（Ｌｅｘａｐｒｏ）、フルオキセチン（Ｐｒｏｚａｃ，  Ｓａｒａｆｅｍ）およびセルトラリン（Ｚｏｌｏｆｔ）を含む。
・抗精神病薬は、ケチアピン（Ｓｅｒｏｑｕｅｌ）、リスペリドン（Ｒｉｓｐｅｒｄａｌ）およびオランザピン（Ｚｙｐｒｅｘａ）を含む。
・精神安定薬は、バルプロエート（Ｄｅｐａｃｏｎ）、カルバマゼピン（Ｃａｒｂａｔｒｏｌ、Ｅｐｉｔｏｌ、Ｔｅｇｒｅｔｏｌ）およびラモトリジン（Ｌａｍｉｃｔａｌ）を含む。
【００９６】
ハンチントン病の早期診断は、病気の経過に伴う症状の治療を管理するための助けとなる。
【００９７】
（ＡＬＳまたはハンチントン病のための）薬剤の製剤化は、該薬剤の性質に依存すると考えられる。薬剤は、該薬剤および薬学的に許容されるキャリアまたは希釈剤を含有する薬学的組成物の形態で提供される。適切なキャリアおよび希釈剤には、等張生理食塩溶液、例えばリン酸緩衝生理食塩水が含まれる。典型的な経口投薬組成物には、錠剤、カプセル、液体溶液、および液体懸濁液が含まれる。薬剤は、非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、または経口の投与のために製剤化され得る。
【００９８】
薬剤の用量は、様々なパラメータに従って、とりわけ用いられる物質；治療される対象となる個体の年齢、重量、および病状；投与の経路；ならびに要求されるレジメンに従って決定され得る。医師は、任意の特定の薬剤に対する投与の要求経路、および投薬量を決定することができる。しかしながら、適切な用量は、例えば１日に１〜３回摂取されるべき、１〜４０ｍｇ／ｋｇ体重などの０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
【００９９】
本明細書において言及される物質の形態
本明細書において言及される核酸または治療剤などの物質のいずれも、精製したまたは単離した形態にあり得る。それらは（The）、天然に見出されるものとは異なる形態にあり得、例えばそれらは、それらが天然ではともに生じない他の物質と組み合わせて存在し得る。核酸（本明細書において規定される配列の一部分を含む）は、天然に見出されるものと異なる配列を有し得、例えば、相同性に関する節で記載される配列において、少なくとも１、２、３、４個、またはそれを上回る数のヌクレオチド変化を有する。核酸は、５’または３’末端に異種配列を有し得る。核酸は、天然に見出されるものとは化学的に異なり得、例えばそれらは何らかのやり方で修飾され得るが、好ましくはなおもワトソン・クリック塩基対合が可能である。適当な場合には、核酸は、二重鎖または一本鎖の形態で提供される。本発明は、本明細書において言及される特異的核酸配列のすべてを一本鎖または二本鎖の形態で提供し、ゆえに開示される任意の配列に対する相補鎖を含む。
【０１００】
本発明は、特定のサブグループと関連がある染色体相互作用の検出を含む、本発明の任意の方法を行うためのキットも提供する。そのようなキットは、本発明の方法によって生成されるライゲーションした核酸を検出し得る薬剤など、関連する染色体相互作用を検出し得る特異的な結合薬剤を含み得る。キットに存在する好ましい薬剤には、ライゲーションした核酸、または例えば本明細書において記載されるように、ライゲーションした核酸をＰＣＲ反応において増幅し得るプライマーペアにハイブリダイズし得るプローブが含まれる。
【０１０１】
本発明は、関連する染色体相互作用を検出し得るデバイスも提供する。デバイスは、好ましくは、本明細書において記載される任意のそのような薬剤、プローブ、またはプライマーペアなど、染色体相互作用を検出し得る任意の特異的な結合薬剤、プローブ、またはプライマーペアを含む。
【０１０２】
検出方法
一実施形態において、染色体相互作用に関連するライゲーションされた配列の定量的検出は、ＰＣＲ反応中の活性化時に検出可能なプローブを使用して実施され、該ライゲーションされた配列は、エピジェネティックな染色体相互作用に集まる２つの染色体領域由来の配列を含み、該方法は、ライゲーションされた配列をＰＣＲ反応中にプローブと接触させること、およびプローブの活性化の程度を検出することを含み、該プローブは、ライゲーション部位に結合する。この方法は、典型的には、二重標識蛍光加水分解プローブを使用して、特定の相互作用をＭＩＱＥに準拠した方法で検出可能とする。
【０１０３】
プローブは一般に、活性化された場合にのみ検出されるように、不活性状態および活性状態を有する検出可能な標識で標識される。活性化の程度は、ＰＣＲ反応に存在するテンプレート（ライゲーション産物）の程度に関連するであろう。検出は、ＰＣＲの全期間または一部、例えば、ＰＣＲのサイクルの少なくとも５０％または８０％の間に実行されてもよい。
【０１０４】
プローブは、オリゴヌクレオチドの一端に共有結合された蛍光団、およびヌクレオチドの他端に結合された消光団を含むことができ、蛍光団の蛍光は、消光団によって消光される。一実施形態において、蛍光団はオリゴヌクレオチドの５’末端に結合され、消光団はオリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合される。本発明の方法で使用できる蛍光団には、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ヤキマイエロー、ＨＥＸ、シアニン３、ＡＴＴＯ  ５５０、ＴＡＭＲＡ、ＲＯＸ、テキサスレッド、シアニン３．５、ＬＣ６１０、ＬＣ  ６４０、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、シアニン５、シアニンが５．５およびＡＴＴＰ  ６８０が含まれる。適切な蛍光団と一緒に使用できる消光団には、ＴＡＭ、ＢＨＱ１、ＤＡＢ、Ｅｃｌｉｐ、ＢＨＱ２およびＢＢＱ６５０が含まれ、任意には、蛍光団がＨＥＸ、テキサスレッドおよびＦＡＭから選択される。蛍光団と消光団との好ましい組み合わせには、ＦＡＭとＢＨＱ１およびテキサスレッドとＢＨＱ２が含まれる。
【０１０５】
ｑＰＣＲアッセイにおけるプローブの使用
本発明の加水分解プローブは、典型的には、濃度を適合させた陰性対照で最適化された温度勾配である。好ましくは、単一工程ＰＣＲ反応が最適化される。より好ましくは、標準曲線が計算される。ライゲーションされた配列の連結におよび結合する特定のプローブを使用する利点は、ネスト化されたＰＣＲアプローチを使用せずに、ライゲーションされた配列の特異性を実現できることである。本明細書に記載される方法は、低コピー数の標的の正確かつ精細な定量を可能にする。標的のライゲーションされた配列は、温度勾配最適化の前に、精製、例えばゲル精製することができる。ターゲットのライゲーションされた配列は配列決定され得る。好ましくは、ＰＣＲ反応は、約１０ｎｇ、または５〜１５ｎｇ、または１０〜２０ｎｇ、または１０〜５０ｎｇ、または１０〜２００ｎｇのテンプレートＤＮＡを使用して行われる。フォワードプライマーとリバースプライマーは、例えば、配列に相補的であることにより、一方のプライマーがライゲーションされたＤＮＡ配列で表される染色体領域の１つの配列に結合し、他方のプライマーがライゲーションされたＤＮＡ配列で表される他の染色体領域に結合するように設計される。
【０１０６】
ライゲーションしたＤＮＡ標的の選択
本発明は、ライゲーションされた配列に結合および増幅する能力に基づいてプライマーを選択し、そして特にそれが標的配列の曲率で結合する標的配列のプローブ配列に基づく特性を選択することを含む、本明細書で定義されるＰＣＲ法で使用するプライマーおよびプローブの選択を含む。
【０１０７】
プローブは、典型的には、制限部位にまたがる制限断片が並置されるライゲーションされた配列に結合するように設計／選択される。本発明の一実施形態では、特定の染色体相互作用に関連する可能性のあるライゲーションされた配列の予測曲率は、例えば、本明細書で参照される特定のアルゴリズムを使用して計算される。曲率は、ヘリカルターンあたりの度数で表すことができ、例えばヘリカルターンあたり１０．５°である。ライゲーションされた配列は、ヘリカルターンあたり少なくとも５°、通常はヘリカルターンあたり少なくとも１０°、１５°または２０°、例えばヘリカルターンあたり５°〜２０°の曲率傾向ピークスコアを有するターゲットに対して選択される。好ましくは、ヘリカルターンあたりの曲率傾向スコアは、ライゲーション部位の上流および／または下流の少なくとも２０、５０、１００、２００または４００塩基、例えば、２０〜４００塩基について計算される。したがって、一実施形態では、ライゲーション産物の標的配列は、これらのレベルの湾曲のいずれかを有する。ターゲット配列は、最低の熱力学的構造自由エネルギーに基づいて選択することもできる。
【０１０８】
好ましいＡＬＳ態様
１項．集団における疾患サブグループを示す染色体の状態を検出するプロセスであり、その染色体の状態に関係する染色体相互作用がゲノムの規定された領域内に存在するかまたは存在しないかを検出することを含むプロセスであって、前記疾患サブグループが筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）サブグループであり；そして
−前記染色体相互作用が、任意には、どの染色体相互作用が、集団のＡＬＳサブグループに対応する染色体の状態に関連付られるのかを決定する方法により同定されており、該方法は、染色体の種々の状態を有するサブグループ由来の核酸の第１のセットをインデックス核酸の第２のセットと接触させ、そして相補配列がハイブリダイズできるようにすることを含み、ここで、核酸の第１のセットおよび第２のセットにおける核酸は、染色体相互作用に集まっている両染色体領域由来の配列を含むライゲーション産物を表し、かつ核酸の第１のセットおよび第２のセットの間のハイブリダイゼーションのパターンによりどの染色体相互作用がＡＬＳサブグループに特異的であるかの決定が可能となり；そして
−染色体相互作用が、
（ｉ）表１または表５に挙げられた領域または遺伝子のいずれかに存在する；および／または
（ii）表１または表５に示されるいずれかのプローブにより表される染色体相互作用のいずれかに相当する；および／または
（iii）表１０または表１１に示される染色祭相互作用のいずれかに相当する；および／または
（iv）（ｉ）、（ii）または（iii）を含むか、または（ｉ）、（ii）または（iii）に隣接する４，０００塩基領域に存在する
プロセス。
【０１０９】
２項．ＡＬＳと診断する、またはＡＬＳの予後を決定するために実行される１項記載のプロセス。
【０１１０】
３項．染色体相互作用の特異的な組み合わせが、
（ｉ）表１または表５のプローブにより表されるすべての染色体相互作用を含む；または
（ii）表１または表５のプローブにより表される少なくとも４、５、６または７個の染色体相互作用を含む
（iii）表１または表５に挙げられる少なくとも４、５、６または７個の領域または遺伝子に一緒に存在する；または
（iv）表１または表５のプローブにより表される染色体相互作用を含むか、または表１または表５のプローブにより表される染色体相互作用に隣接する４，０００塩基領域に存在する少なくとも４、５、６または７個の染色体相互作用を含む、または
（ｖ）表１０または表１１に示されるすべての染色体相互作用を含む；または
（vi）表１０に示される少なくとも４、５、６または７個の染色体相互作用を含む
に分類される１項または２項記載のプロセス。
【０１１１】
４項．染色体相互作用が、
−個体由来のサンプルにおいて、および／または
−染色体相互作用の部位でのＤＮＡループの存在または非存在を検出することにより、および／または
−染色体コンフォメーションに集められる染色体の遠位領域の存在または非存在を検出することにより、および／または
−前記分類のあいだに生成され、その配列が、染色体相互作用に集められる染色体の領域に各々対応する２つの領域を含むライゲーションされた核酸の存在を検出することにより、ここで、ライゲーションされた核酸の検出が、好ましくは、（ｉ）表１または表５に記載される特異的プローブ配列のいずれかに少なくとも７０％の同一性を有するプローブを用いる、および／または（ii）表２または表７のいずれかのプライマーペアと少なくとも７０％の同一性を有するプライマーペアを用いるものである
分類される１〜３項のいずれかに記載のプロセス。
【０１１２】
５項．−核酸の第２のセットが核酸の第１のセットより大きな個体のグループ由来である；および／または
−核酸の第１のセットが、少なくとも８個体由来である；および／または
−核酸の第１のセットは、第１のサブグループ由来の少なくとも４個体、および好ましくは第１のサブグループとは重複しない第２のサブグループからの少なくとも４個体由来である；および／または
−プロセスが医学的治療のために個体を選択するために実施される
１〜４項のいずれかに記載のプロセス。
【０１１３】
６項．−核酸の第２のセットが非選択グループを表し；および／または
−核酸の第２のセットが、規定された位置でアレイするために結合され；および／または
−核酸の第２のセットが、少なくとも１００の異なる遺伝子における染色体相互作用を表し；および／または
−核酸の第２のセットが、少なくとも１，０００の異なる染色体相互作用を表す少なくとも１，０００の異なる核酸を含み；および／または
−核酸の第１のセットおよび核酸の第２のセットが、１０〜１００ヌクレオチド塩基長を有する少なくとも１００核酸を含む
１〜５項のいずれかに記載のプロセス。
【０１１４】
７項．核酸の第１のセットが、
（ｉ）染色体相互作用に集まっている染色体領域の架橋工程；
（ii）前記架橋された領域を、任意には酵素による制限消化切断により、切断させる工程；および
（iii）前記架橋され切断されたＤＮＡ端をライゲーションして核酸の第１のセット（特にライゲーションされたＤＮＡを含む）を生成する工程
を含むプロセスにおいて得られる１〜６項のいずれかに記載のプロセス。
【０１１５】
８項．少なくとも５〜９の異なる染色体相互作用が、好ましくは５〜９の異なる領域または遺伝子において分類される１〜７項のいずれかに記載のプロセス。
【０１１６】
９項．前記ゲノムの規定された領域が、
（ｉ）一塩基多型（ＳＮＰ）を含む；および／または
（ii）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を発現する；および／または
（iii）非コーディングＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を発現する；および／または
（iv）少なくとも１０個の連続するアミノ酸残基をコードする核酸配列を発現する；および／または
（ｖ）制御エレメントを発現する；および／または
（vii）ＣＴＣＦ結合部位を含む
１〜８項のいずれかに記載のプロセス。
【０１１７】
１０項．染色体相互作用の変化を起こし、それにより治療効果を生じさせることのできる薬剤を選択することにより、ＡＬＳを治療するための治療剤を同定または設計する方法であって、
−染色体相互作用が表１または表５のいずれかのプローブにより表され；および／または
−染色体相互作用が表１または表５に挙げられるいずれかの領域または遺伝子に存在し；および／または
−染色体相互作用が表１０または表１１に示される相互作用のいずれか１つであり、任意には：
−染色体相互作用が、いずれの染色体相互作用が請求項１に規定された染色体の状態に関連するかを決定する方法により同定されており、および／または
−染色体相互作用の変化が、（ｉ）表１または表５に記載されているプローブ配列のいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプローブ、および／または（ii）表１または表５のプライマーペアのいずれかに少なくとも７０％同一性を有するプライマーペアを用いてモニターされる；および／または
−候補薬剤が細胞と接触され、その細胞における染色体相互作用が、候補薬剤がＡＬＳを治療することができるかどうかを決定するためにモニターされる
方法。
【０１１８】
１１項．（iv）染色体相互作用の検出であって、
−染色体相互作用が、表１または表５のプローブにより表される、および／または
−表１または表５に記載されるいずれかの領域または遺伝子に存在する；および／または
−染色体相互作用が表１０または表１１に示される相互作用のいずれか１つである
染色体相互作用の検出、または
（ｖ）表１または表５に記載されるプローブ配列のいずれかと少なくとも７０％同一性を有するプローブ、または
（vi）表２または表７に同定されたプライマーのいずれかと少なくとも７０％同一性を有するプライマーペア
の、ＡＬＳのための治療剤を同定または設計するための使用。
【０１１９】
１２項．候補薬剤を投与すること、および前記染色体相互作用の検出、前記プローブまたは前記プライマーペアを、染色体の状態に変化があるかどうかを検出し、それにより候補薬剤が治療剤であるかどうかを決定するために使用することを含む治療剤を同定するための１１項記載の使用であって、使用が任意にはインビトロで、好ましくは細胞内で行われる使用。
【０１２０】
１３項．１〜９項のいずれかに記載のプロセスによって治療剤が必要であると同定されている個体におけるＡＬＳを予防または治療する方法において使用するためのＡＬＳの治療剤。
【０１２１】
１４項．分類または検出が、ライゲーション産物を増幅可能なプライマーおよびＰＣＲ反応中にライゲーション部位に結合するプローブを用いる定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）によるライゲーション産物の特異的な検出を含み、前記プローブが染色体相互作用に集まっている各染色体領域由来の配列に相補的な配列を含み、好ましくは、前記プローブは、
前記ライゲーション産物に特異的に結合するオリゴヌクレオチド、および／または
オリゴヌクレオチドの５’末端に共有結合される蛍光団、および／または
オリゴヌクレオチドの３’末端に共有結合される消光団、および
任意に、
前記蛍光団がＨＥＸ、テキサスレッドおよびＦＡＭから選択され；および／または
前記プローブが１０〜４０ヌクレオチド塩基長、好ましくは２０〜３０ヌクレオチド塩基長の核酸配列
を含む１〜１３項のいずれかに記載のプロセス、方法または使用。
【０１２２】
特別な実施態様
一実施形態においては、染色体内相互作用のみが分類／検出され、染色体外相互作用（異なる染色体間）は分類／検出されない。
【０１２３】
刊行物
本明細書において言及されるすべての刊行物の内容は、参照により本明細書に組み入れられ、そして本発明に関連する特質をさらに規定するために用いられ得る。
【０１２４】
具体的な態様
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォーム技術は、遺伝子座における正常および異常な病状の間での調節的変化についてのエピジェネティックな調節的シグネチャーを検出する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームは、染色体コンフォメーションシグネチャーとしても知られるヒト染色体の調節的高次構造と関連がある遺伝子調節の基本的なエピジェネティックレベルを同定しかつモニターする。染色体シグネチャーは、遺伝子脱調節のカスケードにおける個別の一次工程である。それらは、ＤＮＡメチル化およびＲＮＡプロファイリングなど、後期エピジェネティックおよび遺伝子発現のバイオマーカーを利用するバイオマーカープラットフォームに対して、固有の一連の利点を有する高次バイオマーカーである。
【０１２５】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイアッセイ
カスタムＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイスクリーニングプラットフォームは、１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋの固有の染色体コンフォメーションという４つの密度があり、それぞれのキメラフラグメントはアレイで４回反復され、それぞれ６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１０万という効果的な密度を作製する。
【０１２６】
カスタム設計されたＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ
１５ＫのＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー発見技術で詮索された３００個前後の遺伝子座を含むゲノム全体をスクリーニングし得る。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＰｒｉｎｔ  Ｇ３  Ｃｕｓｔｏｍ  ＣＧＨマイクロアレイプラットフォームに構築され；この技術は、６０Ｋ、１８０Ｋ、４００Ｋ、および１０万個という４つの密度のプローブを付与する。各ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プローブは四つ組として提示されるため、アレイあたりの密度は１５Ｋ、４５Ｋ、１００Ｋ、および２５０Ｋに減り、ゆえに再現性についての統計的評価を可能にする。遺伝子座あたりの詮索される潜在的ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーの平均数は５０であり；そのため、検討され得る遺伝子座の数は３００、９００、２０００、および５０００である。
【０１２７】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）カスタムアレイパイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイは、１組のサンプルを有する二色システムであり、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ライブラリ生成の後、Ｃｙ５で標識され、かつ比較／解析される対象となるサンプル（対照）の他方はＣｙ３で標識される。アレイは、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＳｃａｎスキャナーを用いてスキャンされ、かつ結果として生じた特質は、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｆｅａｔｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを用いて抽出される。次いで、データは、ＲにおけるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイ処理スクリプトを用いて処理される。アレイは、ＲにおけるＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒにおける標準的な二色パッケージ：Ｌｉｍｍａ*を用いて処理される。アレイの正規化は、Ｌｉｍｍａ*におけるアレイ内正規化機能を用いてなされ、かつこれは、オンチップのＡｇｉｌｅｎｔ陽性対照およびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）陽性対照に対してなされる。データはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｆｌａｇコールに基づいてフィルターにかけられ、Ａｇｉｌｅｎｔ対照プローブは除去され、かつ技術的複製プローブは平均化されて、それらはＬｉｍｍａ*を用いて解析される。プローブは、比較されておりかつ次いで偽発見率（Ｆａｌｓｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ  ｒａｔｅ）を用いることによって補正されている２つのシナリオ間でのそれらの差に基づいてモデル化される。＜１または＞１でありかつｐ＝０．０１のＦＤＲ  ｐ値を通過する、＜３０％の変動係数（ＣＶ）を有するプローブが、さらなるスクリーニングに用いられる。プローブセットを縮小するために、さらなる多因子分析が、ＲにおけるＦａｃｔｏｒＭｉｎｅＲパッケージを用いて実施される。
【０１２８】
*注記：ＬＩＭＭＡは、マイクロアレイ実験における差異的発現を評価するための線形モデルおよび経験ベイズ法である。Ｌｉｍｍａは、マイクロアレイまたはＲＮＡ−Ｓｅｑにより生じる遺伝子発現データの解析のためのＲパッケージである。
【０１２９】
プローブのプールは、最終選抜のために、調整されたｐ値、ＦＣ、および＜３０％のＣＶ（任意のカットオフポイント）のパラメータに基づいて初めに選択される。さらなる解析および最終リストは、最初の２つのパラメータ（調整されたｐ値；ＦＣ）のみに基づいて導出される。
【実施例】
【０１３０】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって例証される。
【０１３１】
実施例１
統計的パイプライン
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームへの転換のための高値ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）マーカーを選択するために、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）スクリーニングアレイを、ＲにおけるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）解析パッケージを用いて処理する。
【０１３２】
工程１
プローブを、改変した線形回帰モデルの産物であるそれらの補正ｐ値（偽発見率、ＦＤＲ）に基づいて選択する。ｐ値≦０．１より下のプローブが選択され、次いでそれらのエピジェネティック比（ＥＲ）によってさらに減らされ、さらなる解析に選択されるためにプローブＥＲは≦−１．１または≧１．１でなければならない。最後のフィルターは変動係数（ＣＶ）であり、プローブは≦０．３より下でなければならない。
【０１３３】
工程２
統計リストの上位４０種のマーカーが、ＰＣＲ転換に対するマーカーとしての選択のためにそれらのＥＲに基づいて選択される。最も大きい負のＥＲ負荷を有する上位２０種のマーカー、および最も大きい正のＥＲ負荷を有する上位２０種のマーカーがリストを形成する。
【０１３４】
工程３
工程１からの結果として生じたマーカーである統計的に有意なプローブが、超幾何学的濃縮（ＨＥ）を用いたエンリッチメント解析の基盤を形成する。この解析は、有意なプローブリストからのマーカー縮小を可能にし、かつ工程２からのマーカーとともに、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲプラットフォームに転換されるプローブのリストを形成する。
【０１３５】
統計的プローブをＨＥによって処理して、どの遺伝的位置が統計的に有意なプローブの濃縮を奏するかを判定し、どの遺伝的位置がエピジェネティックな差の中心地であるかが示される。
【０１３６】
補正されたｐ値に基づく最も有意な濃縮された遺伝子座が、プローブリスト作成のために選択される。０．３または０．２のｐ値より下の遺伝的位置が選択される。工程２からのマーカーとともに、これらの遺伝的位置にマッピングする統計的プローブが、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ転換のための高値マーカーを形成する。
【０１３７】
アレイの設計および処理
アレイの設計
１．遺伝子座をＳＩＩソフトウェア（現在、ｖ３．２）を用いて処理して、
ａ．これらの特異的遺伝子座におけるゲノムの配列（５０ｋｂ上流および２０ｋｂ下流を有する遺伝子配列）を取り出す。
ｂ．この領域内の配列がＣＣｓに関与している確率を規定する。
ｃ．特異的ＲＥを用いて配列を切る。
ｄ．制限フラグメントが、ある特定の配向で相互作用する可能性があるかを判定する。
ｅ．一緒に相互作用する種々のＣＣｓの可能性をランク付けする。
２．アレイサイズ、それゆえ利用可能なプローブ箇所の数（ｘ）を判定する。
３．ｘ／４個の相互作用を取り出す。
４．各相互作用に対して、パート１から制限部位まで３０ｂｐおよびパート２の制限部位まで３０ｂｐの配列を規定する。それらの領域がリピートでないことをチェックし、そうであれば除外し、かつリストの下にある次の相互作用を選ぶ。両方の３０ｂｐをつなぎ合わせてプローブを規定する。
５．ｘ／４個のプローブ、それに加えて規定の対照プローブのリストを創出し、かつ４回複製して、アレイ上に創出されるべきリストを創出する。
６．カスタムＣＧＨアレイに対するＡｇｉｌｅｎｔ  Ｓｕｒｅ  ｄｅｓｉｇｎウェブサイトにプローブのリストをアップロードする。
７．プローブ群を用いて、ＡｇｉｌｅｎｔカスタムＣＧＨアレイを設計する。
【０１３８】
アレイの処理
１．鋳型産生のために、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）Ｓｔａｎｄａｒｄ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ（ＳＯＰ）を用いてサンプルを処理する。
２．アレイ処理ラボラトリーによって、エタノール沈殿で浄化する。
３．Ａｇｉｌｅｎｔ  ＳｕｒｅＴａｇ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ標識キット−Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙ−ｂａｓｅｄ  ＣＧＨ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｂｌｏｏｄ，  Ｃｅｉｌｓ  ｏｒ  Ｔｉｓｓｕｅｓのとおりサンプルを処理する。
４．Ａｇｉｌｅｎｔ  ｆｅａｔｕｒｅ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアを用いるＡｇｉｌｅｎｔ  Ｃ  Ｓｃａｎｎｅｒを用いてスキャンする。
【０１３９】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）技術の概要
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）プラットフォームは、異常で応答性の高い遺伝子発現に関連する主要な疾患のスクリーニング、早期検出、コンパニオン診断、モニタリングおよび予後分析の非常に効果的な手段を提供する。このアプローチの主な利点は、非侵襲的で迅速なことであり、不安定なタンパク質／ＲＮＡ分子ではなく、染色体シグネチャーの一部としての非常に安定したＤＮＡベースのターゲットによるものである。
【０１４０】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカーシグネチャーは、複雑な疾患表現型の層別化において高い構造安定性、感度、および特異性を示す。この技術は、エピジェネティクスの化学、染色体コンフォメーションシグネチャーのモニタリングおよび評価における最新のブレークスルーを、エピジェネティックバイオマーカーの非常に有益なクラスとして活用する。学術環境において展開されている現在の研究方法論は、ＣＣＳｓを検出するために細胞材料の生化学的処理に３〜７日を必要とする。これらの手順により、感度および再現性が制限され、さらに、設計段階ではＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）分析パッケージによって提供されるターゲットを絞った洞察の利点をもたない。
【０１４１】
コンピューターによるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイマーカー同定
ゲノム中のＣＣＳ部位は、関連するすべての層別化されたリードバイオマーカーを特定するために、試験コホートの臨床サンプルについてＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイによって直接評価される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイプラットフォームは、その高スループット容量と、多数の遺伝子座を迅速にスクリーニングする機能により、マーカーの同定に使用される。使用したアレイは、問い合わせされるｉｎ  ｓｉｌｉｃｏソフトウェアによりマーカーを同定することが可能となるＡｇｉｌｅｎｔカスタムＣＧＨアレイであった。
【０１４２】
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲ
ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイによって同定された潜在的なマーカーは、その後、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲまたはＤＮＡシーケンサー（すなわち、Ｒｏｃｈｅ  ４５４、Ｎａｎｏｐｏｒｅ  ＭｉｎＩＯＮなど）によって検証される。統計的に有意であり、最高の再現性を示す上位のＰＣＲマーカーは、最終的なＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）シグネチャセットにさらに削減するために選択され、サンプルの独立したコホートで検証される。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲは、確立された標準化された操作手順プロトコルに従って、訓練を受けた技術者により実行される。すべてのプロトコルおよび試薬の製造は、ＩＳＯ  １３４８５および９００１認定の下で行われ、作業の品質とプロトコルの移転能力を保証する。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）ＰＣＲおよびＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）アレイバイオマーカープラットフォームは、全血および細胞株両方の分析に適合する。試験は、少量の血液を使用して非常に低いコピー数の異常を検出するのに十分な感度である。
【０１４３】
ＡＬＳコホートの分析
本発明者らは、ＡＬＳのコンパニオン診断法として使用されるバイオマーカーを同定するための基礎として、エピジェネティックな染色体相互作用を使用した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー探索プラットフォームは、ＡＬＳに関連する表現型の変化を促進するようなエピジェネティックな制御シグネチャー変化を検出するために発明者らによって開発された。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー探索プラットフォームは、環境の手がかりをエピジェネティックな転写機構に統合する際の初期の規制プロセスを規定するＣＣＳｓを同定する。ＣＣＳｓ自身、遺伝子調節のカスケードにおける主要なステップである。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）バイオマーカー探索プラットフォームによって単離されたＣＣＳｓは、極端な生化学的および生理学的安定性；それらのバイナリの性質および読み出し；ならびに遺伝子調節の真核生物カスケードにおけるそれらの主要な位置付けという、十分に実証されたいくつかの利点を有する。
【０１４４】
遺伝子発現の全身性エピジェネティック制御における摂動を検出する能力により、ＡＬＳの早期診断と患者の予後の確立の両方が可能となる。健常者および罹患した患者の血液サンプルからの細胞制御ゲノム構造の比較調査により、２つのＡＬＳ関連のエピジェネティックなシグネチャー（１つは診断の可能性を有し、２つ目は予後予測のためのもの）が明らかとなった。このプロスペクティブ研究では、オックスフォード大学ナフィールド臨床神経科学部門（ＮＤＣＮ）のオックスフォード運動ニューロン障害クリニックの臨床研究グループが収集したサンプルを、染色体コンフォメーションシグネチャーをモニターするためにオックスフォードバイオダイナミクスが開発したハイスループットプラットフォームであるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）を使用して分析した。この研究では、ＡＬＳ−ＦＲＳ−Ｒ、強制肺活量（ＦＶＣ）、およびその他の臨床所見の臨床注釈を比較し、エピジェネティックなシグネチャーの分析により、ＡＬＳ進行サブタイプを割り当てる。
【０１４５】
オックスフォード運動ニューロン障害クリニックを受診した合計１００人の患者が研究に参加し、３ヵ月および６ヵ月での復帰を求められた。対照（ｎ＝１００）が集められた。各訪問中に、参加者はＡＬＳ−ＦＲＳ−ＲおよびＦＶＣテストを受け、血液サンプルを提供した。サンプルを分析して、ＡＬＳ疾患関連の診断シグネチャーまたは予後疾患関連シグネチャーを同定した（３ヵ月および６ヵ月で）。臨床評価の結果を、０、３、６ヵ月のＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）分析と比較した。ＡＬＳ−ＦＲＳ−Ｒスコアの１ヵ月当たり０．５ポイントの低下のカットオフを用い、ＡＬＳ患者を進行サブタイプに分けた。
【０１４６】
ＡＬＳ−ＦＲＳ−Ｒスコアの低下率に基づいて、３ヵ月のサンプルと６ヵ月のサンプルからの予備結果は、８０％の感度と特異性でエピジェネティクなシグネチャーが、ＡＬＳ患者の進行が速い（＞０．５）および遅い（＜０．５）を選択したことを証明した。これまでの結果は、予後シグネチャーが、時を超えてＡＬＳのサブタイプを選択することに対して安定している（robust）ことを示している。表に示される結果は、独立したサンプルコホート（ｎ＝５０）を使用して、７５人のＡＬＳサンプルおよび７５人の対照サンプル（ｎ＝１５０）の診断および予後分析に関する。
【０１４７】
さらなる結果（表１１を含む）は、ベースライン、３ヵ月および６ヵ月の生存時にＡＬＳＦＲＳ−ＲスコアおよびＦＶＣ（強制肺活量）の標準的プラクティスによって観察および評価された１００人のＡＬＳ患者に基く。ベースラインおよび３ヵ月での測定に基づいて、これらの患者は遅いまたは速いＡＬＳとして分類された（標準分類）。ベースラインのみで３つのマーカーを読み出し、すべての患者を遅いまたは速いとして分類した（ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ分類）。次に、これらの患者を６ヵ月での生存率に基づき評価し、遅いグループと速いグループの生存率を比較した。標準分類では、遅いグループにかなりの数の致死的な転帰があり、統計的に遅いおよび速い間のｐ値による生存率の差は有意ではなかった（ｐ＝０．０５２）。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ分類では、６ヵ月での遅いと速いの境界は非常に有意であり（ｐ＝０．００９７）、ほとんどの死亡は速いグループで起こった。
【０１４８】
実施例２
ＨＴＴ遺伝子座におけるゲノム構造の違いは、ハンチントン病の症候性症例および発症前症例の基礎となる。
【０１４９】
ハンチントン病（ＨＤ）は進行性の神経変性症状であり、成人の脳のニューロンの広範な変性を引き起こし、最終的には死に至る遺伝的障害である。ＨＤの根本的な原因は、「ハンチンチン遺伝子」（ＨＴＴ）の長く伸びたトリヌクレオチドシトシン−アデニン−グアニン（ＣＡＧ）リピートであり、これにより、細胞内凝集体を形成し、神経細胞死を引き起こす傾向の高い変異ハンチンチンタンパク質が生じる。重要なことに、ＣＡＧリピートの数は疾患の発症および重症度と相関し、ＣＡＧリピートが３９を超える患者は人生のある時点でＨＤを発症する。疾患の発症は個々内で数十年変化し得、この発症前段階についてはほとんどわかっていない。エピジェネティックなアプローチの進歩と、ＤＮＡメチル化、ヒストン修飾、非コーディングＲＮＡ、およびゲノム構造の理解の一環としての染色体コンフォメーションシグネチャーのためのエピジェネティックな調節マーカーの検出のための新技術の出現とにより、我々は、ＨＴＴ遺伝子付近のゲノム構造における全身性調節変化とその疾患兆候との関係を分析することに興味を持った。ここで、病気にかかっていない対照と比較して、発症前および症候性のＨＤ患者の間のＨＴＴ遺伝子座における検出可能な全身性の非侵襲的なエピジェネティックな相違を調べた。
【０１５０】
方法：ＨＤ患者および健常対照の血液サンプルを使用して、染色体コンフォメーションの検出のための検証済み高解像度産業プラットフォームであるＥｐｉＳｗｉｔｃｈ（商標）を使用して、ＨＴＴ遺伝子のすぐ近くのクロマチン構造を評価した。ＨＴＴ遺伝子座の２２５ｋｂにわたって２０の相互作用部位での条件付きで安定したクロマチン構造の有無を評価し、得られた染色体コンフォメーションを、健常対照のグループ、検証された症候性ＨＤ患者（ＣＡＧ、ｎ＞３９）、およびＨＤの臨床症状を示さなかった遺伝的に検証されたＣＡＧ拡張を有する患者の間で比較した。
【０１５１】
結果：末梢血サンプルで試験したところ、一貫して安定な染色体コンフォメーションが患者グループ全体で観察された。２つの構造的相互作用（すべての患者グループおよび対照で発生）と、ＨＤには存在するが健常対照には存在しない７つの条件付き相互作用が見出された。最も重要なことは、臨床症状を示すＨＤ患者（症候性症例）にのみ存在し、発症前症例には存在しない３つの条件付き相互作用が観察されたことである。症候性ＨＤコホートの患者の８５％（７人中６人）は、症候性ＨＤに関連する特定の染色体コンフォメーションの少なくとも１つを示した。
【０１５２】
結論：我々の結果は、ＨＴＴ遺伝子座での調節性クロマチン構造がＨＤ患者において全身的に変更されているという最初の証拠である。さらに、ＨＴＴ遺伝子座のクロマチン構造はまた、症候性ＨＤ患者の臨床病期と発症前ＨＤ患者の臨床病期との間の条件付き相違も示す。ＨＤにおける疾患の進行を評価するための分子ツールを有するという高い臨床的有用性を考慮すれば、これらの結果は、全身性染色体コンフォメーションシグネチャー（ＣＣＳ）の非侵襲的評価がＨＤ患者の予後評価への貴重な補強となり得ることを強く示唆する。
【０１５３】
序章
ハンチントン病（ＨＤ）は、細胞的には大脳基底核におけるニューロンの喪失により、臨床的には制御不能な動き、感情的な問題、および認知力の喪失により特徴付けられる神経変性症状です。ＨＤは常染色体優性遺伝性疾患であり、罹患率は地理的および民族性によって大きく異なるが、米国およびヨーロッパだけで５万人を超える人々に影響を与えると考えられている。根本的な遺伝的原因は、１９８３年にマサチューセッツ総合病院のＪａｍｅｓ  Ｇｕｓｅｌｌａによって遺伝マーカーとして発見されたハンチンチン遺伝子（ＨＴＴ）のトリヌクレオチドＣＡＧ伸長であり、これが、毒性のあるグルタミン（ｐｏｌｙＱ）路（tract）を有する変異ハンチンチンタンパク質（ｍＨＴＴ）を生じる。したがって、何十年にも及ぶ研究と臨床試験にもかかわらず、成功した治療法はまだ開発されていない。ＨＤの「典型的な」発症は４０〜５０歳の間であるが、症例の１５％までは発症が非常に遅く、６０歳を過ぎるまで臨床症状を示さない。最近の後期発症ＨＤ（ＬｏＨＤ）の症例を調べている研究のメタ分析では、患者の９０％超が４４以下のＣＡＧリピート長を有する。ＨＤにおけるより興味深い観察の１つは、ｐｏｌｙＱリピート路の長さと疾患の発症および重症度との間によく知られている相関関係がある一方で、個々の患者にはかなりのばらつきがあるということである。例えば、中程度のリピート長（ここでは４０〜５０と定義）を有する患者では、個々の患者で疾患の発症が６０年異なり得る。これは、病気の発症の素因となるｐｏｌｙＱ路の保因者である多くの患者が、「発症前」の状態で何十年も生きることができるということを意味する。臨床症状の発症を制御するものは現在のところ不明であり、ＨＤ患者の予後評価を複雑にする。
【０１５４】
歴史的には単一遺伝子疾患と考えられていたが、ＨＤの根本的な病理に関する広範な研究は、疾患の発症と進行につながる機序が当初考えられていたよりも複雑であることを示唆している。多くの異なる技術が、遺伝子発現、プロテオミクス、メタボロミクス、ネットワーク解析、ゲノミクス、一塩基多型（ＳＮＰ）プロファイリングなどを含むＨＤの疾患進行の根底にある分子変化を調べるために使用される。ＨＤはエピジェネティックな調節不全を特徴とする疾患のパラダイムと見なされているため、最近では、病理学関連の変化を評価するための有望な新しいツールとして、エピジェネティックなアプローチが登場している。ＨＤでのほとんどのエピジェネティックな研究は、ゲノムワイドなヒストン修飾（アセチル化、メチル化）またはＨＤに関連する特定の遺伝子座でのヒストン修飾を調べることに焦点を当てている。これらのアプローチは疾患への興味深い洞察を提供しているが、それらはしばしば相反する結果を生み出し、マウスモデルと人間の疾患との間の不一致を示した。このように、ヒストン修飾読み出しを用いるＨＤにおけるエピジェネティックな規制緩和の合意図はまだ具体化されていない。しかしながら、エピジェネティック制御に関連するすべての分子機序がＨＤの脈絡で評価されているわけではない。エピジェネティック制御の重要な側面は、３次元（３Ｄ）ゲノム構造のレベルである。
【０１５５】
ゲノムの３Ｄ構成は、外部環境の手がかりおよび入力の不均一な影響を反映しており、染色体コンフォメーションの評価によって、または複数のコンフォメーションが同時に測定される場合、染色体コンフォメーションシグネチャ（ＣＣＳ）の評価によって測定され得る。ＣＣＳｓは、所定の細胞集団のエピジェネティックな景観を読み取る分子バーコードと考えることができる。我々は、ＨＤの開発におけるｍＨＴＴの中心的な役割を考えると、ＨＴＴ遺伝子座におけるゲノム構造の制御的相違は、罹患した個体と健常者、つまり罹患していない対照との間に存在する可能性があると仮定した。我々は、ＣＣＳｓをモニターするための確立された独自の産業用プラットフォームであるＥｐｉＳｗｉｔｃｈを使用し、発症前および症候性のＨＤ患者と健常者、つまり罹患していない個人との間のクロマチン構造の違いを評価した。ＥｐｉＳｗｉｔｃｈ読み出しは、ＣＣＳｓの高解像度、信頼性、高スループットの検出を提供すると同時に、品質管理に関する業界標準の高い基準を満たす。
【０１５６】
方法
サンプルコレクション
すべてのサンプルは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  ＢｉｏＳｅｒｖｉｃｅ、ＬＬＣから入手した。この研究では、１０の健常対照（ＨＣ）サンプル（ＣＡＧリピート、ｎ＜３５）および１０のＨＤサンプル（ＣＡＧリピート、ｎ＞３９）の合計で２０個のサンプルが使用された。ＨＤサンプルについては、７つは症候性患者（ＨＤ−Ｓｙｍ）由来であり、３つはＨＤと診断されたがまだ臨床症状を示さない発症前患者（ＨＤ−Ｐｒｅ）由来であった。１人のＨＤ患者がテトラベナジンを服用しており、１人の患者がセルトラリンを服用していた。すべてのサンプルで、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、梅毒が陰性であった（表１４）。
【０１５７】
研究デザイン
我々は、健常対照（低ＣＡＧ）、発症前ＨＤ患者（高ＣＡＧ、疾患の兆候なし）および症候性ＨＤ患者（高ＣＡＧ、疾患の兆候）間で異なる染色体メーションを同定したいと考えた。我々は、我々の分析に関し、ＨＴＴ遺伝子座（ｃｈｒ４：３，０３３，５８８から３，２５８，１７０  ｈｇ３８での注釈として）を囲む約２２５ｋｂの領域に焦点を当てた。ＨＴＴのエクソン１のＣＡＧリピート拡張路（ｃｈｒ４：３，０５４，１６２から３，０９５，９３０）をアンカーポイント（「アンカー」）として使用し、アンカーを囲む５つのゲノムゾーンを定義し、サンプルグループ間で異なる染色体コンフォメーションを調べた（図２および表１５）。これらのゾーンは、潜在的なＥｐｉＳｗｉｔｃｈアンカー部位の存在；既知の疾患関連ＳＮＰ（ＨＤおよびその他の疾患）の存在；およびＧＷＡＳｄｖＶ２データベース（http://jjwanglab.org/gwasdb）に見られるようなＨＤにおける既知のヒストン修飾部位（Ｈ３Ｋ４ｍｅ３、Ｈ３Ｋ３６ｍｅ３、およびＨ３Ｋ２７ａｃ）の濃縮に基づいて選択された。（図２）。
【０１５８】
染色体コンフォメーション同一性
ＮＣＢＩの検索：すでに報告されたＨＤエピジェネティックデータに関するＧＥＯデータベースが２０１８年２月に実行された。１２（６ＨＤおよび６対照サンプル）の死後の前頭前野皮質脳サンプル（ベッド形式）からのＨ３Ｋ４ｍｅ３のＣｈＩＰ−ｓｅｑデータと呼ばれるピークが得られた（ＧＳＥ６８９５２）。さらに、ＨＤ  ｉＰＳＣ由来の神経細胞株および対照細胞株からのＨ３Ｋ２７ａｃおよびＨ３Ｋ３６ｍｅ３のＣｈＩＰ−ｓｅｑデータのＢｉｇｗｉｇトラックもダウンロードされた（ＧＳＥ９５３４２）。データトラックは、ＥｐｉＳｗｉｔｃｈおよび参照配列アノテーションと一緒にＩｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｖｉｅｗｅｒ（ＩＧＶ）［４１］に読み込まれた。視覚的比較とプログラム的比較（ＢＥＤｔｏｏｌｓ）の両方を、目的の５つのゾーンを同定するために、ＨＴＴ遺伝子座で行われた。
【０１５９】
適切なソフトウェアを使用して、ＣＡＧリピートの近位のアンカーゾーンで生じる「エンド」と、目的の５つのゾーンのいずれかで生じるもう一方の「エンド」とのクロマチン折りたたみ相互作用を高い確率で同定した。合計６１の相互作用がこれらの基準に一致し、実際的な理由により、アンカー部位と目的のすべてのゾーン間の相互作用をカバーするために２０の相互作用が選択された。自動化されたプライマー設計アプリケーションを使用して、染色体コンフォメーション捕捉アッセイに付した際の相互作用によって引き起こされる予想されるＤＮＡ配列を増幅するオリゴヌクレオチド対を設計した。
【０１６０】
３ＣおよびＰＣＲ
ＰＣＲによる染色体コンフォメーションの捕捉および検出を行った。各患者サンプルからの５０μｌの血液サンプルからインタクトな染色体構造を有するクロマチンを、製造元の指示（オックスフォードバイオダイナミクスＰｌｃ）にしたがいＥｐｉＳｗｉｔｃｈアッセイを用いて抽出した。すべてのサンプルの品質管理は、３Ｃ分析に対する歴史的インターナルコントロールであるＭＭＰ１遺伝子座でのクロマチンループの検出を用いて行なった。各サンプルタイプのプールされた３Ｃライブラリは、各サンプルサブグループの一般化された母集団サンプルを提供するために生成された。ＣＦＸ−９６（バイオ−ラッド）マシンでＳＹＢＲグリーンを使用してリアルタイムＰＣＲを実行し、サンプルタイプ間の異なるＰＣＲ産物検出パターンで相互作用を同定した。オリゴヌクレオチドをコントロールテンプレートでテストして、各プライマーセットが正しく機能していることを確認した。ＰＣＲ検出のためのＲｏｙａｌ  Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌに沿って、個々のＨＤ患者のフォローアップデータについて、各サンプルで３回ずつ、最終ネスト化ＰＣＲを実行した。この手順により、制限されたコピー数のテンプレートをより正確に検出することができた。すべてのＰＣＲ増幅産物は、ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＤＮＡ  １Ｋバージョン２キット（パーキンエルマー）を用いて、パーキンエルマーのＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）ＧＸでモニターされ、内部ＤＮＡマーカーを、蛍光色素を使用する製造元のプロトコルに従ってＤＮＡチップにロードした。蛍光はレーザーで検出され、電気泳動図の読み取り値を、機器のソフトウェアを用いてゲル画像上のシミュレートされたバンドに変換した。機器の検出閾値は、３０蛍光単位以上から製造業者によって設定された。
【０１６１】
統計分析
データ分析はＲ（統計計算のための言語と環境）で実行された。これには、ｔ検定およびＲ二乗分析用の統計およびｄｐｌｙｒパッケージと、箱ひげ図および回帰プロット用のｇｇｐｌｏｔ２パッケージとが含まれていた。
【０１６２】
結果
患者の臨床的特徴
ＨＣおよびＨＤのサンプルは、年齢（ＨＣの平均３６．９およびＨＤの平均３５．３）および性別一致（１／２男性および１／２女性）であり、ＨＤ症例の大部分（７０％）は症候性である（表１６）。すべてのサンプルは非ヒスパニック系またはラテン系の白人由来であった。ＣＡＧリピートの長さの平均は、ＨＣでは２５．７、ＨＤでは４４．２であった（表１６）。ＨＣとＨＤのサンプルでは、年齢に統計的な差はなかった。ＨＣ患者は、ＨＤ−Ｓｙｍと年齢に統計的な違いは示さなかった。ＨＤ−Ｐｒｅ患者は、ＨＤ−Ｓｙｍ患者（平均年齢＝３９．６）よりも若かった（平均年齢＝２５．３）（ｐ＝０．０２）。どちらも統計的に有意ではなかったが、疾患期間とＣＡＧリピートサイズの間には緩やかな負の関係があり、診断時の年齢とＣＡＧリピートサイズの間には緩やかな正の関係があった。
【０１６３】
ＨＣと比較してＨＤ患者のＣＡＧリピート長には統計的に有意な増加があった（ｐ＝１．０８Ｅ-7）。ＨＣとＨＤ−Ｐｒｅ（ｐ＝３．４３Ｅ-6）およびＨＤ−Ｓｙｍ（ｐ＝９．５０Ｅ-8）の間でＣＡＧリピート長に統計的に有意な増加はなかった。ＨＤ−ＰｒｅとＨＤ−Ｓｙｍの間でＣＡＧリピート長に統計的な差はなかった（ｐ＝０．０９）。
【０１６４】
ＨＤサンプルの診断時の平均年齢は３５．３歳で、平均罹患期間は３．８年であり、１０人中７人の患者が非刺激性、舞踏運動、またはその両方の症状を報告した（表１６）。
【０１６５】
ＨＣ、ＨＤ−ＰｒｅおよびＨＤ−Ｓｙｍの染色体コンフォメーション
評価された２０の相互作用（表１７）のうち、我々は９つの有益な相互作用を同定した。我々は、ＨＤには存在し、健常対照には存在しない２つの構成的相互作用と７つの条件付き相互作用を同定した。７つの条件付き相互作用のうち３つはＨＤ−Ｓｙｍにのみ存在し、ＨＤ−Ｐｒｅには存在しなかった。
【０１６６】
構成的コンフォメーション
すべてのサンプルは、ＭＭＰ１相互作用に関する内部ＱＣ分析を通過した。２つの構成的（すべてのサンプルで同定された）クロマチンループが同定された。両方のループはアンカーとゾーン２の間にあり、最初のループは２８ｋｂに、２番目のループは３４ｋｂにわたっていた。すべての患者（ＨＤ−Ｓｙｍ、ＨＤ−ＰｒｅおよびＨＣ）に生じる２つの構成的相互作用がこの研究において観察された。両方の相互作用（ＣＣ１＆ＣＣ２）は、アンカーとゾーン２の間にあり、ＣＣ１は２８ｋｂに、ＣＣ２は３４ｋｂにわたっていた。
【０１６７】
条件付きコンフォメーション
我々は、この研究において評価された異なる患者サブグループを区別できる７つの条件付き染色体コンフォメーションを同定した。具体的には、ＨＣには存在するがすべてのＨＤサンプルには存在しない２つの染色体相互作用を同定した。最初の相互作用（Ｉ１）はアンカーとゾーン４にわたり７７ｋｂをカバーし、２番目の相互作用（Ｉ２）はアンカーとゾーン３にわたり１４０ｋｂをカバーした。我々はまた、ＨＣおよびＨＤ−Ｐｒｅには存在するが、ＨＤ−Ｓｙｍサンプルには存在しない２つの染色体相互作用を同定した。両方の相互作用（Ｉ３とＩ４）はアンカーとゾーン４にわたり、それぞれ９２ｋｂおよび１０４ｋｂをカバーした。最後に、我々は、ＨＤ−Ｓｙｍサンプルには存在するが、ＨＤ−ＰｒｅおよびＨＣサンプルには存在しない３つの染色体相互作用を同定した。最初の相互作用（Ｉ５）はアンカーとゾーン３にわたり、１２２ｋｂをカバーした。興味深いことに、この相互作用は、ＨＤを発症する素因の要因であると知られているＳＮＰ（ｒｓ３６２３３１）を含んでいた。２番目および３番目の相互作用（Ｉ６およびＩ７）はアンカーとゾーン１にわたり、それぞれ１８５ｋｂおよび１７４ｋｂをカバーした。最後に、我々は、個々のＨＤサンプルにおいてすべての条件付き相互作用の有無をテストした。ＨＤ−Ｓｙｍサンプルでは、７つのサンプルのうち６つに条件付きマーカー（Ｉ５、Ｉ６およびＩ７）の少なくとも１つが存在することが見出された（図３）。この研究において評価されたすべての相互作用の概要を図４および図５に示す。表１８にオッズ比を示す。表１３は、サブグループ間に何らの相違も示さなかった染色体相互作用を示す。
【０１６８】
ディスカッション
問題の説明と結果のまとめ
ＣＡＧリピートが３９を超える個人がＨＤになることはよく知られているが、疾患の臨床的発症は個々の患者によって大きく異なり、疾患が臨床的に顕在化する場合に影響を与える要因はあまり特徴付けられていない。ここでは、クロマチン構造を評価するための産業用プラットフォームであるＥｐｉＳｗｉｔｃｈを使用して、ＨＤ患者および健常者（罹患していない対照）におけるＨＴＴ遺伝子座のエピジェノミックな状況（landscape）を評価した。ＣＣＳとしてまとめると、罹患していない対照からＨＤを区別でき、さらに重要なことに、発症前および症候性のＨＤ患者を区別できる７つの相互作用のセットを同定した。症候性ＨＤに特異的なこれらの相互作用の１つには、素因となる疾患のハプログループに関連することが示されているＳＮＰ（ｒｓ３６２３３１）が含まれる。まとめると、これらの結果は、ＣＣＳを評価する単純で非侵襲的な血液に基づくテストが、ＨＤの疾患の進行を評価するための代理バイオマーカーとして役立つことを示す。
【０１６９】
生物学的関連性
ポリＱリピート路の拡大とｍＨＴＴの生成がＨＤの根本的な原因であることが知られているが、臨床症状の発症につながる分子イベントはあまり特徴付けられていない。いくつかの研究では、ＨＴＴ遺伝子座内のＳＮＰが疾患の発症の潜在的な原因として検討されている。最近のＨＤ患者によるＳＮＰ遺伝子分類研究では、ＨＴＴ遺伝子のエクソン５０のｒｓ３６２３３１Ｃ／Ｔ  ＳＮＰを含む、少なくとも３０％の患者にヘテロ接合性の４１のＳＮＰが同定された。おそらくより生物学的に関連性があるのは、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡまたはｍｉＲＮＡを使用してｒｓ３６２３３１  ＳＮＰを対立遺伝子選択的にノックダウンすると、ｍＨＴＴタンパク質のレベルの劇的な低下が、インビトロとインビボの両方で達成され、このＳＮＰとその周囲のゲノム状況が、ｍＨＴＴレベルの調節に重要な役割を果すことが示唆される。この研究では、ＨＤ−Ｓｙｍ患者にのみ存在し、ＨＤ−Ａｓｙ患者には存在しない染色体紺帆メーション（Ｉ５）およびｒｓ３６２３３１  ＳＮＰと重複するＨＣｓを観察した。これは、ポリＱ路が増加した患者における神経毒性ｍＨＴＴの生成と、ｒｓ３６２３３１  ＳＮＰの存在によるＨＤの早期発生に対する遺伝的素因が、高次クロマチン構造のレベルで調節されることを示唆している。ＨＤにおけるもう１つの未解決の問題は、どちらの親も診断を受けていない場合で病気がどのように遺伝するかである。２つの主な一般的な仮説は、１）キャリアの親が疾患の発症前に別の要因から死亡している、２）「不安定な」ＣＡＧリピート路が世代ごとに拡大している、ということを指し示す。３番目の可能性も存在し、中程度（３５〜５０）のリピートでは、個体は疾患の兆候のないキャリアであり得るが、その子孫は規定されていない機序を通じて遺伝的欠陥を補償できず、疾患を発症し得るというものである。この研究で評価されるＨＤ患者はすべて、この中程度の範囲のＣＡＧリピートを有し、疾患発生の潜在的な代償機序がゲノム構造の違いによって仲介され得る可能性を高めている。
【０１７０】
臨床関連性
ＨＤは、疾患を確定的に診断するための簡単な検査、ＨＴＴ遺伝子配列決定、およびＣＡＧリピート数の測定が存在するという点で独特である。臨床ケアと臨床試験については、統合ハンチントン病評価スケール（ＵＨＤＲＳ）、Ｓｈｏｕｌｓｏｎ−Ｆａｈｎスケール、ミニメンタルステートテスト（ＭＭＳＥ）など、疾患の重症度を測定するいくつかのテストもある。これらの評価は、ＨＤ患者の身体的および精神的な健康の様々な要素を疾患の重症度の代用として測定するが、これらはすべて主観的であり、ほとんどがＨＤに特異的なものではない。欠けているものは、疾患の進行をモニターするための具体的な分子ツールである。
【０１７１】
現在、前臨床および臨床開発のさまざまな段階でＨＤを治療するための２２種の治療薬があり、その半分はフェーズ２またはフェーズ３にある。さらに検証されると、ここに報告されるＣＣＳは、問題の薬物の治療効果を評価する代理転帰バイオマーカーとして臨床試験において使用できる。臨床試験で特定の治療に対する症候性患者の反応をモニターすることに加えて、本明細書において説明するアプローチのもう１つの利点は、発症前患者について入手できる情報にある。ほとんどのＨＤ患者については、発症前の期間は数十年続くことがある。本明細書において同定された７つ（ｉ３−ｉ７）の相互作用のうちの５つは、発症前のＨＤ患者と症候性の患者とを明確に区別し、さらに検証すると、発症前キャリアにおけるＨＤ症状の発症の「早期警告」インジケーターテストとして役立てることができる。
【０１７２】
この研究は、ＨＤの症状発現に特異的で、既知の疾患ハプロタイプと相関するクロマチン構造の検出可能な状態の相違の最初の証拠を与える。この研究の主な強みは、ゲノム構造の規制的な役割を理解する上での最新の開発に基づく独自のアプローチにある。臨床、画像、分子測定に基づく疾患進行バイオマーカーの開発を目的としたＨＤの歴史的研究はいくつかあるが、我々の知る限り、これは臨床的にアクセス可能な生体液の高次クロマチン構造の評価を初めてＨＤで適用されたものである。
【０１７３】
【表１】
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【０１７４】
【表２】
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【０１７５】
【表３】
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2020537514.tif 000005
【０１７６】
【表４】
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【０１７７】
【表５】
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2020537514.tif 000008
【０１７８】
【表６】
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【０１７９】
【表７】
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【０１８０】
【表８】
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【０１８１】
【表９】
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【０１８２】
【表１０】
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【０１８３】
【表１１】
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【０１８４】
【表１２】
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【０１８５】
【表１３】
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【０１８６】
【表１４】
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【０１８７】
【表１５】
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【０１８８】
【表１６】
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【０１８９】
【表１７】
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【０１９０】
【表１８】
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【０１９１】
【表１９】
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【０１９２】
【表２０】
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【０１９３】
【表２１】
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【０１９４】
【表２２】
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【０１９５】
【表２３】
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【０１９６】
【表２４】
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【０１９７】
【表２５】
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【０１９８】
【表２６】
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【０１９９】
【表２７】
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【０２００】
【表２８】
2020537514.tif 000033
【０２０１】
【表２９】
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【０２０２】
【表３０】
2020537514.tif 000035
【０２０３】
【表３１】
2020537514.tif 000036
【０２０４】
【表３２】
2020537514.tif 000037
【０２０５】
【表３３】
2020537514.tif 000038
【０２０６】
【表３４】
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【０２０７】
【表３５】
2020537514.tif 000040
【０２０８】
【表３６】
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【０２０９】
【表３７】
2020537514.tif 000042
【０２１０】
【表３８】
2020537514.tif 000043
【０２１１】
【表３９】
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【０２１２】
【表４０】
2020537514.tif 000045
【０２１３】
【表４１】
2020537514.tif 000046
【０２１４】
【表４２】
2020537514.tif 000047
【０２１５】
【表４３】
2020537514.tif 000048
【０２１６】
【表４４】
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【０２１７】
【表４５】
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【０２１８】
【表４６】
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【０２１９】
【表４７】
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【０２２０】
【表４８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020537514.tif 000060
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