(57)【要約】本発明は、治療有効量のＡＴＦ３活性化剤を対象に投与することを含む、対象において腫瘍を治療する方法を開示する。本発明は、さらに、対象において腫瘍を治療するための医薬組成物を製造するためのＡＴＦ３活性化剤の使用を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療有効量のＡＴＦ３活性化剤を治療必要な対象に投与することを含む、対象において電離放射線耐性腫瘍を治療する方法。
【請求項２】
前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現する能力を保持する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＡＴＦ３活性化剤が、ＡＴＦ３発現を誘導することができる小分子、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持するベクター、及びＡＴＦ３発現阻害剤に対する非コード化ＲＮＡを担持するベクターから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＴＦ３発現を誘導することができる小分子が、クルクミン、非ステロイド性抗炎症薬、プロゲステロン、ホスファチジルイノシトール阻害剤、ｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、及びブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持するベクターが、ＡＴＦ３タンパク質をコードするウィルスベクター又は非ウィルスベクターである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ウィルスベクターが、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純ヘルペスウィルス、牛痘ウィルス、又はバキュロウィルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記ＡＴＦ３発現阻害剤に対する非コード化ＲＮＡが、アンチセンスオリゴマーであり、前記アンチセンスオリゴマーが、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びキメラオリゴヌクレオチドから選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記アンチセンスオリゴマーが、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記非コード化ＲＮＡを担持するベクターが、エキソソームである、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
前記腫瘍細胞における前記ＡＴＦ３活性化剤の投与が、ＡＴＦ３タンパク質の発現をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記腫瘍細胞における前記ＡＴＦ３活性化剤の投与が、ＡＴＦ３の発現の増加にもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記腫瘍細胞における前記ＡＴＦ３活性化剤の投与が、ＡＴＦ３タンパク質の蓄積を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記腫瘍細胞における前記ＡＴＦ３活性化剤の投与が、腫瘍細胞の死亡を引き起こす、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記対象が、哺乳動物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
対象において電離放射線耐性腫瘍を治療するための医薬組成物を製造するためのＡＴＦ３活性化剤の使用。
【請求項１８】
前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現しない、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現する能力を保持する、請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
前記ＡＴＦ３活性化剤が、ＡＴＦ３発現を誘導することができる小分子、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持するベクター、及びＡＴＦ３発現阻害剤に対する非コード化ＲＮＡを担持するベクターから選択される、請求項１７に記載の使用。
【請求項２１】
前記ＡＴＦ３発現を誘導することができる小分子が、クルクミン、非ステロイド性抗炎症薬、プロゲステロン、ホスファチジルイノシトール阻害剤、ｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、及びブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）から選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
前記ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持するベクターが、ＡＴＦ３タンパク質をコードするウィルスベクター又は非ウィルスベクターである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２３】
前記ウィルスベクターが、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純ヘルペスウィルス、牛痘ウィルス、又はバキュロウィルスである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２４】
前記ＡＴＦ３発現阻害剤に対する非コード化ＲＮＡが、アンチセンスオリゴマーであり、前記アンチセンスオリゴマーが、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びキメラオリゴヌクレオチドから選択される、請求項２０に記載の使用。
【請求項２５】
前記アンチセンスオリゴマーが、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡから選択される、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
前記非コード化ＲＮＡを担持するベクターが、エキソソームである、請求項２０に記載の使用。
【請求項２７】
前記対象が、哺乳動物である、請求項１７に記載の使用。
【請求項２８】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
対象において電離放射線耐性腫瘍を治療するための人工ベクターであって、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持する、人工ベクター。
【請求項３０】
前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＦ３タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列である、請求項２９に記載の人工ベクター。
【請求項３１】
前記人工ベクターが、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えウィルスである、請求項２９に記載の人工ベクター。
【請求項３２】
前記組み換えウィルスが、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純ヘルペスウィルス、牛痘ウィルス、又はバキュロウィルスである、請求項３１に記載の人工ベクター。
【請求項３３】
前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現しない、請求項２９に記載の人工ベクター。
【請求項３４】
前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現する能力を保持する、請求項２９に記載の人工ベクター。
【請求項３５】
前記人工ベクターを前記細胞に導入した後、前記ＡＴＦ３タンパク質が前記腫瘍細胞に安定的に発現される、請求項２９に記載の人工ベクター。
【請求項３６】
前記人工ベクターを前記細胞に導入した後、前記ＡＴＦ３タンパク質が前記腫瘍細胞に蓄積される、請求項２９に記載の人工ベクター。
【請求項３７】
請求項２９に記載の人工ベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、電離放射線に対する耐性をもつ腫瘍を治療するための方法及び組成物に関する。本発明は、腫瘍細胞における細胞シグナル伝導ネットワーク特性を変化させるための方法及び組成物を提供する。特定の実施形態では、本方法及び組成物は、活性化転写因子３（ＡＴＦ３）、その変異体、又はそれらに対する医薬製剤及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
全癌患者の６０％は、治癒及び緩和目的のため、放射線療法を受ける（腫瘍を治療用量の電離放射線に暴露する）。米国では、約６００，０００の患者が放射線療法を受けている。局所的な頭部及び頸部、ＣＮＳ、肺、乳房、ＧＩ（食道、膵臓及び直腸）、ＧＵ（前立腺、膀胱）、リンパ腫、皮膚及び軟組織肉腫、及び小児腫瘍を有する患者は、疾患の初期段階で手術の代わりに放射線療法を受けるが、疾患の後期段階で放射線療法と手術及び化学療法を組み合わせる。したがって、放射線療法は、化学療法及び手術と同じように、重要な癌治療方式の一つである。
【０００３】
放射線耐性は、治療用量の電離放射線下で生存する癌細胞を説明するための用語である。放射線耐性の原因は、完全には明確ではないが、癌細胞の特性とその環境との間の複合的な相互作用によると考えられる。指摘されたメカニズムは、例えば、グルタチオンである遊離基捕捉剤の発現が増加し、ＤＮＡの修復メカニズムを変化させ、免疫系のエフェクター細胞を抑制することを含む。
【０００４】
ＡＴＦ３（活性化転写因子３）はＡＴＦ／サイクリックＡＭＰ応答配列結合（ＡＴＦ／ＣＲＥＢ）転写因子ファミリーに属する。当該ファミリーは、異なるサイズ、配列及び生物学的機能を有するタンパク質を含む。当該ファミリーは、ＡＴＦ１（ＴＲＥＢ３６ともいう）、ＣＲＥＢ、ＣＲＥＭ、ＡＴＦ２（ＣＲＥ−ＢＰ１ともいう）、ＡＴＦ３、ＡＴＦ４、ＡＴＦ５（ＡＴＦＸともいう）、ＡＴＦ６、ＡＴＦ７、Ｂ−ＡＴＦを含む。これらのタンパク質の共通の特徴は、ｂＺＩＰ要素である。ｂＺＩＰ要素は、塩基性電荷を有するアミノ酸に富む領域とロイシンジッパー領域とを含む。当該構造ドメイン中の塩基性領域は、ＤＮＡ結合特異性を決定する一方、当該ロイシンジッパー領域は、ｂＺＩＰ要素を含む他のタンパク質との相互作用に必要なものである。ＡＴＦ／ＣＲＥＢタンパク質は、最初に、種々のプロモーターのうちサイクリックＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）と結合するタンパク質として同定された。ＣＲＥ応答配列は、共通配列としてＴＧＡＣＧＴＣＡを含む。ＡＴＦ／ＣＲＥＢファミリーの他のメンバーとは反対で、ＡＴＦ３の発現は、大きな範囲の細胞ストレスによって急速に誘導される。当該ストレスは、栄養欠損、酸化ストレス、ＤＮＡ損傷、細胞内病原体感染及び上記のような電離放射線を含む。ＡＴＦ３はまた、小分子によって誘導されることが報告されている。ＡＴＦ３を誘導すると報告された小分子は、クルクミン、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、プロゲステロン、ホスファチジルイノシトール阻害剤であるＬＹ２９４００２、及びｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）やブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）を含む。ＡＴＦ３は、多数のタンパク質と相互作用して、細胞生存及び死亡に関連するプロセスに影響を及ぼす。
【発明の概要】
【０００５】
本発明では、選択された癌細胞株において、ＡＴＦ３の発現が死亡を誘導する、又は増殖を抑制する。いくつかの実施形態では、ＩＲが存在しない場合であっても、死亡が発生する可能性がある。科学的モデルは以下の通りである。ＩＲに感受性である腫瘍由来の癌細胞は、下流のエフェクタータンパク質にシグナルを送るＡＴＦ３を発現する。ＩＲに対する耐性をもつ腫瘍由来の細胞において、ＡＴＦ３が発現されなかったり、その細胞機能が損なわれたりする。ＡＴＦ３を強制的に発現させると、このような放射線耐性細胞は、電離放射線に無関係の方式で死亡する。
【０００６】
本発明の一態様では、対象において電離放射線に対する耐性をもつ腫瘍を治療する方法が提供される。当該方法は、治療有効量のＡＴＦ３活性化剤を治療必要な対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤は、例えば、クルクミン、非ステロイド性抗炎症薬、プロゲステロン、ホスファチジルイノシトール阻害剤、ｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、及びブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）のようなＡＴＦ３の発現を誘導することができる小分子である。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤は、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持するベクターであり、ＡＴＦ３タンパク質をコードするウィルスベクターと非ウィルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤は、ＡＴＦ３発現阻害剤に対する非コード化ＲＮＡを担持するベクターであり、例えば、ＡＴＦ３発現阻害剤に対するアンチセンスオリゴマーを担持するエキソソームである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、ＡＴＦ３タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、腫瘍はＡＴＦ３タンパク質を発現する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤の投与は、腫瘍細胞におけるＡＴＦ３タンパク質の発現をもたらす。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤の投与は、腫瘍細胞におけるＡＴＦ３の発現の増加をもたらす。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤の投与は、腫瘍細胞におけるＡＴＦ３タンパク質の蓄積を引き起こす。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤の投与は、腫瘍細胞の死亡を引き起こす。
【０００８】
本発明の別の態様では、対象において電離放射線耐性腫瘍を治療するための医薬組成物を製造するためのＡＴＦ３活性化剤の使用が提供される。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤は、例えば、クルクミン、非ステロイド性抗炎症薬、プロゲステロン、ホスファチジルイノシトール阻害剤、ｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、及びブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）のようなＡＴＦ３の発現を誘導することができる小分子である。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤は、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持するベクターであり、ＡＴＦ３タンパク質をコードするウィルスベクターと非ウィルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤は、ＡＴＦ３発現阻害剤に対する非コード化ＲＮＡを担持するベクターであり、例えば、ＡＴＦ３発現阻害剤に対するアンチセンスオリゴマーを担持するエキソソームである。いくつかの実施形態では、腫瘍は、ＡＴＦ３タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、腫瘍はＡＴＦ３タンパク質を発現する。
【０００９】
本発明の別の態様では、対象において電離放射線耐性腫瘍を治療するための人工ベクターであって、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持する、人工ベクターが提供される。いくつかの実施形態では、当該人工ベクターは、ＡＴＦ３タンパク質をコードするウィルスベクターである。いくつかの実施形態では、当該ウィルスベクターは、レンチウィルス、アデノ随伴ウィルス又は単純ヘルペスウィルスに由来する。いくつかの実施形態では、当該腫瘍は、ＡＴＦ３タンパク質を発現しない。いくつかの実施形態では、当該腫瘍は、ＡＴＦ３タンパク質を発現する。
【００１０】
本発明の別の態様では、対象において電離放射線に対する耐性をもつ腫瘍を治療するための、ＡＴＦ３活性化剤を含有する医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、当該医薬組成物は、治療有効量のＡＴＦ３活性化剤と、薬学的に許容される賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、当該ＡＴＦ３活性化剤は、ＡＴＦ３の発現を誘導することができる小分子であり、例えば、クルクミン、非ステロイド性抗炎症薬、プロゲステロン、ホスファチジルイノシトール阻害剤、ｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、及びブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）を含む。いくつかの実施形態では、当該ＡＴＦ３活性化剤は、ＡＴＦ３タンパク質又はその変異体をコードするポリヌクレオチドを担持するウィルスベクター又は非ウィルス性ベクターである。したがって、いくつかの実施形態では、当該医薬組成物は、本発明に特定されるウィルス性又は非ウィルス性の遺伝子送達ベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤は、ＡＴＦ３発現阻害剤に対する非コード化ＲＮＡ又はアンチセンスオリゴマーである。したがって、いくつかの実施形態では、当該組成物は、非コード化ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドの送達に適するウィルス又は非ウィルスベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】０〜８ＧｙのＩＲ線量範囲に暴露された後のＩＲ耐性細胞株及びＩＲ感受性細胞株の生存を示す。全ての細胞株に使用される手順は同一であった。簡単に言えば、６ウェルプレートにコロニーを形成するように細胞接種を行い、２日目に増加量のＩＲで処理した。少なくとも５０個の細胞を有する十分に大きなコロニー（１２〜１５日）が見えたとき、当該プレートをメタノールで固定し、クリスタルバイオレットで染色した。５０個を超える細胞を有するコロニーをカウントし、周知の方法を用いて生存率を計算した。細胞の生存率によれば、細胞が２つの群に区分された。８Ｇｙで処理された細胞（ＨＣＴ１１６、Ｄ５４、Ｕ２５１ＭＧ）のうち、生存率≦０．０５であるものが感受性細胞と呼ばれ、生存率≧０．５である細胞（Ｄｕ１４５、Ｗｉｄｒ、Ｔ２４）がＩＲ耐性細胞と呼ばれた。
【００１２】
【図２】ＩＲに暴露した後、ＡＴＦ３タンパク質が放射線感受性細胞株で誘導されたが、放射線耐性細胞株で誘導されなかったことを示す。放射線感受性細胞（Ｕ２５１ＭＧ、Ｄ５４、ＨＣＴ１１６（図Ａ））及び放射線耐性細胞（Ｔ２４、Ｄｕ１４５、Ｗｉｄｒ（図Ｂ））は、偽処理又は６Ｇｙで処理された。所定の時間で細胞を採取し、等量の全タンパク質に対して１２．５％変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動分離を行い、ニトロセルロース膜に移し、マウス抗β−アクチンモノクローナル抗体及びウサギ抗ＡＴＦ３ポリクローナル抗体を用いて検出した。
【００１３】
【図３】ＡＴＦ３の枯渇が感受性細胞のＩＲへの耐性をもたらすことを示す。材料及び方法に記載されるように、ＣＲＩＳＰＲ／ｃａｓ９技術を使用して、ＩＲ感受性細胞（ＨＣＴ１１６）中でＡＴＦ３を枯渇させた。図Ａ：ウエスタンブロットにより、クローン化されたＳｃｒ細胞、クローン化された７細胞及びクローン化された８細胞におけるＡＴＦ３の収率を検出したものである。図Ｂ：ＡＴＦが枯渇されたＨＣＴ１１６細胞を６Ｇｙ線量の電離放射線に暴露した。細胞の活性は、ＭＴＴアッセイを用いて測定した。
【００１４】
【図４】ＩＲの非存在下で、ＡＴＦ３の強制発現が放射線耐性細胞を死亡させたことを示す。図Ａ：ＡＴＦ３を安定的に発現させるＤｕ１４５細胞におけるＡＴＦ３の蓄積を示す。細胞株は、Ｎ末端にＦＬＡＧエピトープをタグ付けしたＡＴＦ３を発現するレンチウィルスをトランスフェクトされ、ピューロマイシンにより選択された。ウエスタンブロットにより、ＡＴＦ３を検出した。ＭＴＴ試験（図Ｃ）及びコロニー形成試験（図Ｂ）は、細胞生存度に対するＡＴＦ３の影響を検出した。図Ｄには、当該コロニーに形成された相対的な細胞生存度の定量を示す。
【００１５】
【図５】放射線耐性細胞においてＨＳＶ−１の感染によりＡＴＦ３タンパク質を誘導したことを示す。Ｄｕ１４５細胞（図Ａ）及びＷｉｄｒ細胞（図Ｂ）を、偽感染させるか、又は１０ＰＦＵ／細胞のＨＳＶ−１（Ｆ）に暴露した。細胞は、感染後の所定の時間で収集された。ＡＴＦ３の発現を測定するために、等量の全タンパク質に対して１２．５％変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動分離を行い、ニトロセルロース膜に移し、マウス抗β−アクチンモノクローナル抗体及びウサギ抗ＡＴＦ３ポリクローナル抗体を用いて検出した。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
・定義
なお、用語「一」又は「一つ」の物体は、１つ又は複数の物体を指す。例えば、「ＡＴＦ３活性化剤」は、１つ又は複数のＡＴＦ３活性化剤を表すことが理解されるべきである。したがって、用語「一」（又は「一つ」）、「１つ又は複数」、及び「少なくとも１つ」は、本明細書では互換的に使用することができる。
【００１７】
本明細書で使用される、用語「治療」とは、癌の進行などの望ましくない生理学的変化又は状態を予防又は減速（緩和）するための治療的処理及び予防的処置を意味する。有益又は望む臨床結果は、検出可能であるかないかに関わらず、症状の緩和、疾患の程度の減少、安定化した（すなわち、悪化しない）疾患状態、疾患の進行の遅延又は軽減、疾患状態の改善又は緩和、及び症状（一部又は全部に関わらず）の消失を含むが、これらに限定しない。「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して、生存期間を長くすることを意図し得る。治療必要な患者は、症状又は疾患をすでに患っているものと、症状又は疾患に患いやすいもの、もしくは、症状又は疾患を予防する必要があるものを含む。
【００１８】
「対象」又は「個体」又は「動物」又は「患者」又は「哺乳動物」とは、診断、予後診断又は治療を行うことが望まれる任意の対象、特に哺乳動物対象であることを意味する。哺乳動物対象は、ヒト、家庭動物、農場動物及び動物園動物、競技動物、又はペットを含み、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマ、ウシ、乳牛等が挙られる。本発明の対象がヒトであることが好ましい。
【００１９】
本明細書で使用される、例えば、「治療必要な患者」又は「治療必要な対象」のような語句とは、例えば検出、診断手順及び／又は治療のための本発明のＡＴＦ３活性化剤又は組成物の投与から利益を得ることができる対象を含み、例えば、哺乳動物対象である。
【００２０】
本明細書で使用される、例えば、「電離放射性耐性腫瘍」、「ＩＲ耐性腫瘍」、「放射線耐性腫瘍」、「電離放射線に対する耐性をもつ腫瘍」、又は「耐性腫瘍」という語句とは、放射線での治療に対する感受性が非常に低いため、その症状が放射線療法により改善、回復、緩和又は治癒することができない、腫瘍又は癌を指す。ＩＲ耐性腫瘍は、最初に放射線療法に対して耐性である腫瘍であってもよい。或いは、ＩＲ耐性腫瘍は、最初に耐性を持たないが、当該腫瘍細胞中の遺伝子が放射線の長期の投与によって突然変異し、又は他の状態で耐性をもつ、放射線に対して感受性がなくなる腫瘍であってもよい。本発明では、耐性腫瘍は、放射線療法に対する耐性を示す任意の腫瘍であってもよく、これらに限定されない。
【００２１】
本明細書で使用される、用語「腫瘍」とは、成長が制御されない形質転換細胞を含む悪性組織（すなわち過剰増殖性疾患）を意味する。腫瘍には、白血病、リンパ腫、骨髄腫、血漿細胞腫など、及び固形腫瘍が含まれる。本発明に従って治療され得る固形腫瘍の例は、肉腫及び癌腫を含み、例えば、黒色腫、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪由来肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ腺腫、リンパ内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍（Ｅｗｉｎｇ’ｓ  ｔｕｍｏｒ）、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞性腺癌、髄様癌、気管支癌、腎臓細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、精上皮腫、胚癌、ウィルムス腫瘍（Ｗｉｌｍｓ’  ｔｕｍｏｒ）、子宮頸癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫瘍、血管芽細胞腫、聴覚神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽細胞腫、及び網膜芽腫なとが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２２】
本明細書で使用される、用語「ＡＴＦ３活性化剤」とは、ＩＲ耐性腫瘍細胞におけるＡＴＦ３タンパク質の発現を誘導又は導入することができる化学的又は生物学的薬剤をいう。本発明は、ＩＲ耐性腫瘍細胞におけるＡＴＦ３タンパク質の蓄積が、最終的に腫瘍細胞の死亡を引き起こすことを証明した。「誘導」とは、一部のＡＴＦ３活性化剤が、腫瘍細胞にコードされたＡｔｆ３コーディング遺伝子を利用することにより、ＡＴＦ３タンパク質の発現を活性化することを意味する。誘導は、腫瘍細胞中のＡＴＦ３タンパク質の発現の開始及びその後又は同時の蓄積を引き起こし、最終的に細胞の死亡を引き起こす。「導入」とは、一部の活性化剤が、ＡＴＦ３タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを腫瘍細胞に導入することにより、ＡＴＦ３タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドが腫瘍細胞において安定的に発現されることを意味する。ＡＴＦ３タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドの発現（単独で、又は存在する場合の腫瘍細胞におけるＡＴＦ３タンパク質のベースライン発現と組み合わせ）は、腫瘍細胞におけるＡＴＦ３タンパク質の蓄積を引き起こし、最終的に細胞の死亡を引き起こす。
【００２３】
本明細書で使用される、用語「治療有効量」又は「薬学的に有効な量」とは、臨床的に有意な効果を果たすことができる各有効成分の量を意味する。製剤方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病状、食事、投与時間、投与間隔、投与通路、排泄通路及び応答感受性などの要因によって、単一用量のＡＴＦ３活性化剤の薬学的に有効な量を様々な方法で処方されることができる。例えば、単一用量のＡＴＦ３活性化剤の薬学的に有効な量は、０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ又は０．０２〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよいが、これらに限定されない。単一用量の薬学的に有効な量は、単位剤形の単一製剤として製造されたり、適切に分離された剤形として製造されたり、マルチ用量容器内に収容されるように製造されたりすることができる。
【００２４】
本明細書で使用される、用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」とは、任意の長さを有するヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド）のポリマー形態を意味する。これらの用語は、一本鎖、二本鎖又は三本鎖ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、又はポリマーを含む。当該ポリマーは、プリン及びピリミジン塩基、又は他の自然、化学的や生物学的に修飾された非自然又は誘導されたヌクレオチド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖及びリン酸基（通常、ＲＮＡ又はＤＮＡ中に発見され得る）、又は修飾又は置換された糖又はリン酸基を含むことができる。あるいは、ポリヌクレオチドの主鎖は、合成サブユニットのポリマー（例えば、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ））を含むことができ、従って、オリゴマーデオキシヌクレオシドホスホルアミデート（Ｐ−ＮＨ２）又は混合されたホスホルアミデート−リン酸ジエステルオリゴマーであってもよい。
【００２５】
本発明は、特に、アンチセンスオリゴマー及び類似物をＡＴＦ３タンパク質阻害剤をコードする核酸分子の機能又は作用を調節するために使用する。本明細書で使用される、ＡＴＦ３タンパク質阻害剤とは、ＡＴＦ３遺伝子の転写、ＡＴＦ３ｍＲＮＡのプロセシング又は翻訳又はＡＴＦ３タンパク質の安定性を妨害することによって、ＡＴＦ３タンパク質の発現を阻止又は減少させる分子と定義される。当該阻害剤は、ＩＲ耐性腫瘍細胞においてＡＴＦ３発現のカスケード経路を阻害する任意の分子であってもよい。これは、当該阻害剤をコードする１つ又は複数の核酸分子と特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを提供することによって達成される。本明細書で使用される、用語「標的核酸」及び「阻害剤をコードする核酸分子」とは、簡便のために、当該阻害剤をコードするＤＮＡ、ＤＮＡから転写又はデノボ合成（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｄｅ  ｎｏｖｏ）されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ前駆体及びｍＲＮＡ又はその一部を含む）、及びそのようなＲＮＡ由来のｃＤＮＡを含む。標的核酸とハイブリダイズした本発明のオリゴマーは、一般に「アンチセンス」と呼ばれる。したがって、本発明のいくつかの好ましい実施形態の実装に含まれると考えられる好ましいメカニズムは、本明細書では「アンチセンス抑制」と称される。このようなアンチセンス阻害は、典型的に、オリゴヌクレオチド鎖又はセグメントの水素結合に基づくハイブリダイゼーションを基礎として、少なくとも１つの鎖又はセグメントが切断、分解、又は他の方法で動作不能になるように構成される。この点で、標的特異的核酸分子及びその機能をそのようなアンチセンス阻害に使用することは、現在好ましい。
【００２６】
干渉を受けたＤＮＡの機能は、複製及び転写を含むことができる。例えば、複製及び転写は、内在性細胞鋳型、ベクター、プラスミド構築物又は他のものから得ることができる。干渉を受けたＲＮＡの機能は、当該ＲＮＡのタンパク質翻訳部位への移動、当該ＲＮＡのＲＮＡ合成部位から離れる細胞部位への移動、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１つ又は複数のＲＮＡ種の当該ＲＮＡのスプライスの発生、及び当該ＲＮＡが関与又は当該ＲＮＡが促進することができる当該ＲＮＡの触媒活性又は複合物の形成などを含む。標的核酸機能に対するこのような干渉の好ましい結果の一つとして、阻害剤の発現の調節が挙げられる。本発明の文脈において、「調節」と「発現調節」とは、遺伝子をコードする核酸分子（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）の量又はレベルの減少を意味する。ｍＲＮＡは、典型的には、好ましい標的核酸である。
【００２７】
本発明の文脈において、「ハイブリダイズ」とは、オリゴマーの相補鎖のペアリングを意味する。本発明では、好ましいペアリングメカニズムは、水素結合に関し、オリゴ化合物の鎖における相補的ヌクレオシド又はヌクレオチド塩基（核酸塩基）の間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ水素結合、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合又は逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合であってもよい。例えば、アデニン及びチミンは、水素結合を形成することによりペアリングする相補的な核酸塩基である。ハイブリダイゼーションは、異なる条件下で行うことができる。
【００２８】
オリゴマーと標的核酸との組み合わせが標的核酸の正常な機能に干渉し、活性の喪失を引き起こす場合、アンチセンスオリゴマーは、特異的にハイブリダイズするものであり、かつ、特異的結合の条件で（すなわち、生体内試験又は治療の場合に生理的条件で、体外試験の場合に試験を実施する条件で）非標的核酸配列との非特異的結合を回避するのに十分な程度の相補性が存在することが期待される。
【００２９】
本分野では、アンチセンスオリゴマーの配列は、それと特異的にハイブリダイズすることができる標的核酸の配列に対して１００％相補的である必要はないことは理解される。さらに、オリゴヌクレオチドは、１つ又は複数の区画に亘って、介在する又は隣接する区画が、ハイブリダイゼーションイベントに関与しない（例えば、環構造又はヘアピン構造）ようにハイブリダイズすることができる。好ましくは、本発明のアンチセンス化合物は、標的核酸内の標的領域の少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％の配列相補性を有し、より好ましくは、少なくとも９０％の配列相補性を有し、さらにより好ましくは、標的核酸配列内の標的領域の少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の配列相補性を有する。例えば、アンチセンスオリゴマーの２０個の核酸塩基の１８個が標的領域に対して相補的であるため、特異的にハイブリダイズすることができるアンチセンス化合物は、９０％の相補性を表すことができる。この例では、残りの非相補的核酸塩基は、相補的な核酸塩基でクラスター化又は分散され得、必ずしも互いに隣接したり、相補的な核酸塩基に隣接したりすることがない。従って、１８個の核酸塩基長を有するアンチセンスオリゴマーが４つ（４個）の非相補的な核酸塩基を有し、その側面に標的核酸と完全に相補的である２つの領域が位置する場合、当該オリゴマーは、標的核酸と７７．８％の全体相補性を有するため、本発明の範囲内である。標的核酸の領域に対するアンチセンス化合物の相補性百分率は、当分野既知のＢＬＡＳＴプログラム（基礎局所比較検索ツール）とＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを用いて、容易に決定できる。
【００３０】
さらに、「非必須」アミノ酸領域において、保存的置換又は変化になるヌクレオチド又はアミノ酸の置換、欠失又は挿入を行うことができる。例えば、特定のタンパク質由来のポリペプチド又はアミノ酸配列、１つ又は複数の独立のアミノ酸の置換、挿入又は欠失（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６、７つ、８つ、９つ、１０つ、１５つ、２０つ又はそれ以上の独立のアミノ酸の置換、挿入又は欠失）以外、残りの部分は、起始配列と同一であってもよい。いくつかの実施形態では、特定のタンパク質由来のポリペプチド又はアミノ酸配列は、起始配列に対して、１〜５つ、１〜１０つ、１〜１５つ、又は１〜２０つの個々のアミノ酸の置換、挿入又は欠失を有する。
【００３１】
本発明の文脈において、用語「オリゴヌクレオチド」とは、リボ核酸（ＲＮＡ）又は核酸（ＤＮＡ）、又はそれらの模倣体、キメラ、アナログ及び相同体のオリゴマー又はポリマーを意味する。当該用語は、自然に存在する核酸塩基、糖及びヌクレオチド間（骨格）の共有結合によるオリゴヌクレオチド、及び同様の機能の非自然発生部分を有するオリゴヌクレオチドを含む。細胞取り込みの増強、標的核酸に対する親和性の増強、ヌクレアーゼの存在下での安定性の増大のような望ましい特性があるため、このように修飾された又は置換されたオリゴヌクレオチドは、通常、自然の形態よりも優れる。
【００３２】
・ＡＴＦ３活性化剤
本発明は、ＡＴＦ３活性化剤の適用に関する方法及び組成物に関する。ＡＴＦ３活性化剤は、ＩＲ耐性腫瘍細胞においてＡＴＦ３タンパク質の発現を誘導又は導入することができる化学的又は生物学的試薬として定義される。
【００３３】
小分子のようないくつかの活性化剤は、腫瘍細胞内に最初に存在するＡＴＦ３をコードする遺伝子を利用して、ＡＴＦ３タンパク質の発現を活性化する。このようなＡＴＦ３活性化剤の例としては、クルクミン、非ステロイド性抗炎症薬、プロゲステロン、ホスファチジルイノシトール阻害剤、ｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、及びブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）などのような小分子が挙げられ、ＡＴＦ３発現阻害剤に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを担持するベクターを含む。後者の例は、当分野既知の阻害剤がＩＲ耐性腫瘍細胞においてＡＴＦ３の発現を阻害する場合に、有用である。
【００３４】
あるいは、いくつかの活性化剤は、ＡＴＦ３タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを腫瘍細胞に導入することにより、ＡＴＦ３タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを腫瘍細胞において安定的に発現させる。これにより腫瘍細胞におけるＡＴＦ３タンパク質の蓄積を引き起こし、その後の相互作用の後、腫瘍細胞の死亡を引き起こす。このようなＡＴＦ３活性化剤は、ＡＴＦ３をコードするポリヌクレオチドを担持する、ウィルス及び非ウィルスベクターを含む、人工送達システムを含む。
【００３５】
・ウィルスベクター
本発明の一実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤は、ＡＴＦ３をコードするポリヌクレオチドを担持するウィルスベクターである。ウィルスベクターは、ベクター、ベクターウィルス粒子又はベクター粒子ともいうことができる。別の実施形態では、当該ウィルスベクターは、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純ヘルペスウィルス、牛痘ウィルス、又はバキュロウィルスから誘導される。
【００３６】
本発明にかかるレトロウィルスベクターは、任意の適切なレトロウィルスから誘導されたもの、又は誘導可能なものであってもよい。多くの異なる逆転写酵素ウィルスが同定される。例としては、マウス白血病ウィルス（ＭＬＶ）、ヒトＴ細胞白血病ウィルス（ＨＴＬＶ）、マウス乳房腫瘍ウィルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）、Ｆｕｊｉｎａｍｉ肉腫ウィルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウィルス（Ｍｏ  ＭＬＶ）、ＦＢＲマウス骨肉腫ウィルス（ＦＢＲ  ＭＳＶ）、モロニーマウス肉腫ウィルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、Ａｂｅｌｓｏｎマウス白血病ウィルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄細胞腫瘍ウィルス−２９（ＭＣ２９）、トリ赤芽球症ウィルス（ＡＥＶ）を含む。レトロウィルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．(１９９７)  "Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ"，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｅｄｓ：Ｊ  Ｍ  Ｃｏｆｆｉｎ，Ｓ  Ｍ  Ｈｕｇｈｅｓ，Ｈ  Ｅ  Ｖａｒｍｕｓ  ｐｐ  ７５８−７６３を参照する。別の実施形態では、レトロウィルスは、泡沫状ウィルスから誘導される。
【００３７】
レンチウィルスは、より大きな群のレトロウィルスの一部である。レンチウィルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．(１９９７)  「Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ」，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｅｄｓ：Ｊ  Ｍ  Ｃｏｆｆｉｎ，Ｓ  Ｍ  Ｈｕｇｈｅｓ，Ｈ  Ｅ  Ｖａｒｍｕｓ  ｐｐ  ７５８−７６３を参照する。要するに、レンチウィルスは、霊長類及び非霊長類群に区分されることができる。霊長類レンチウィルスの例としては、ヒト免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原体であるヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）、及びサル免疫不全ウィルス（ＳＩＶ）を含むが、これらに限定されない。非霊長類レンチウィルス群は、プロトタイプ「スローウィルス」ｖｉｓｎａ／ｍａｅｄｉウィルス（ＶＭＶ）、及び関連するヤギ関節炎−脳炎ウィルス（ＣＡＥＶ）、ウマ感染性貧血ウィルス（ＥＩＡＶ）、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）及びウシ免疫不全ウィルス（ＢＩＶ）を含む。本明細書中で使用される、レンチウィルスベクターは、レンチウィルスから誘導され得る少なくとも１つの構成部を含むベクターである。好ましくは、当該構成部は、ベクターが細胞に感染し、遺伝子を発現するか、又は複製される生物学的メカニズムに関係する。レンチウィルスベクターは、霊長類レンチウィルス（例えば、ＨＩＶ−１）又は非霊長類レンチウィルスから誘導することができる。非霊長類レンチウィルスの例として、自然で霊長類に感染しないレンチウィルスファミリーの任意のメンバーであってもよく、ネコ免疫不全ウィルス（ＦＩＶ）、ウシ免疫不全ウィルス（ＢＩＶ）、ヤギ関節炎脳炎ウィルス（ＣＡＥＶ）、Ｍａｅｄｉ  ｖｉｓｎａウィルス（ＭＶＶ）又はウマ感染性貧血症（ＥＩＡＶ）を含むことができる。他の実施形態では、レンチウィルスベクターは、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＦＩＶ、ＢＩＶ、ＥＩＡＶ、ＣＡＥＶ、又はｖｉｓｎａレンチウィルスから誘導される。本発明の他の実施形態では、ウィルスベクターは、アデノウィルスベクターであってもよい。アデノウィルスは、ＲＮＡ中間体によって複製されない二本鎖の直鎖ＤＮＡウィルスである。アデノウィルスは、二本鎖ＤＮＡの非エンベロープウィルスであり、生体内、ｅｘ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで、広い範囲のヒト及び非ヒト由来の細胞型に形質導入することができる。これらの細胞は、気道上皮細胞、肝細胞、筋細胞、心筋細胞、滑膜細胞、原発性乳房上皮細胞、及び有糸分裂後の末端分化（例えば、ニューロン）を含む。アデノウィルスは、遺伝子治療用及び異種遺伝子発現用のベクターとして使用される。大きな（３６ｋｂ）ゲノムは、８ｋｂまでの外来性挿入ＤＮＡを収容することができ、相補的な細胞系において効果的に複製されて、１ミリリットルあたり１０１２形質導入単位(transducing unit)までの非常に高い力価を産生することができる。そのため、アデノウィルスは、一次非複製細胞における遺伝子発現を検討するための最良のシステムの一つである。アデノウィルスゲノム由来のウィルス遺伝子又は外因性遺伝子の発現は、細胞を複製する必要はない。アデノウィルスベクターは、受容体介在エンドサイトーシス機能を介して細胞に入る。いったん細胞に入ると、アデノ��ィルスベクターが宿主染色体中に組み込まれることは稀である。その代わりに、それらは、宿主細胞核における線形ゲノムとして、アドオン（宿主ゲノムとは独立して）として存在する。
【００３８】
アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）は、高集積頻度を有し、非分裂細胞に感染し得るので、本発明で使用するための魅力的なベクターシステムである。これにより、哺乳動物細胞への遺伝子の送達に使用することができる。ＡＡＶは、広い感染性宿主範囲を有する。米国特許第５，１３９，９４１及び米国特許第４，７９７，３６８号において、ｒＡＡＶベクターの生成及び適用に関する詳細事項が記載され、それらの各々は、ここで参考として援用される。組換えＡＡＶベクターは、マーカー遺伝子、及び、ヒト疾患に関連する遺伝子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ及び生体内の形質導入のために用いることに成功した。特定のＡＡＶベクターが開発され、これは、大きな有効負荷（８〜９ｋｂまで高い）を効果的に取り込むことができる。そのようなベクターの１つは、ＡＡＶ５キャプシッドとＡＡＶ２  ＩＴＲを有する(Ａｌｌｏｃｃａ  Ｍ，  ｅｔ  ａｌ  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  (２００８)  １１８:  １９５５−１９６４)。
【００３９】
単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）は、自然にニューロンに感染する、エンベロープ二本鎖ＤＮＡウィルスである。外因性ＤＮＡの大部分を収容することができる結果、ベクターシステムとして魅力的である。そして、ニューロンへの遺伝子送達のためのベクターとして使用されてきた（Ｍａｎｓｅｒｖｉｇｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ  Ｏｐｅｎ  Ｖｉｒｏｌ  Ｊ．  (２０１０)  ４:１２３−１５６）。治療中のＨＳＶの使用は、溶解サイクルを確立できないように、株の毒性を減少させる必要がある。特に、ＨＳＶベクターがヒトの遺伝子治療に使用される場合、好ましくは、ポリヌクレオチドを必須遺伝子に挿入する。これは、ウィルスベクターが野生型ウィルスに遭遇すると、組換えにより異種遺伝子を野生型ウィルスに転移させることができるからである。しかし、組換えウィルスが複製を防止するように構築されていれば、これはオリゴヌクレオチドを複製に必要なウィルス遺伝子に挿入することにより達成することができる。
【００４０】
本発明にかかるウィルスベクターは、ＭＶＡ又はＭＹＶＡＣのような牛痘ウィルスベクターであってもよい。牛痘ウィルスベクターの代替物として、例えば、ＡＬＶＡＣと呼ばれる鶏痘、又はカナリア痘ウィルスである鳥類痘（Ａｖｉｐｏｘ）ベクター、及びこれらから誘導され、ヒト細胞中に感染又は組換えタンパク質の発現ができるが複製することができないウィルス株が挙げられる。なお、組換え遺伝子の挿入後に、ウィルスゲノムの一部を完全に保持することができる。これは、ウィルスベクターが細胞に感染することを加えて、その他の遺伝子を発現することができる能力を意味する。当該その他の遺伝子は、その複製に寄与し、おそらく感染細胞の溶解及び死亡を促進する。
【００４１】
ＡＴＦ３タンパク質をコードする組換え遺伝子は、タンパク質をコードする核酸と、タンパク質の発現のためのレギュレーターとを含む。一般的に、組換え遺伝子に存在するレギュレーターは、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択される。そのようなレギュレーターは、典型的には、発現される核酸配列に機能的に連結され、転写プロモーター、リボソーム結合部位、及びターミネーターを含む。組換え発現ベクター内で、「機能的に連結される」とは、目的のヌクレオチド配列が、当該ヌクレオチド配列の発現（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳システムにおける発現、又は当該ウィルスが宿主細胞に導入され宿主細胞で発現されること）を可能にするように、調節配列に連結することを意味する。用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。調節配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指令するための調節配列と、特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指令する調節配列（例えば、組織特異的調節配列）を含む。
【００４２】
新たに発見された調節配列は、細胞染色体上に見出される一種類のＤＮＡ要素を含むインスレーターであり、染色体における一方の領域の遺伝子が、他方の領域の調節に影響されないように保護されている。Ａｄｍｅｌｉｏらは、ＬＡＴ領域中のＣＴＣＦモチーフのクラスターを含有する１．５ｋｂ領域が、インスレーター活性を有し、特に、エンハンサーに対する阻害及びサイレンシングを示すことを発見した(Ａｍｅｌｉｏ  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｉｎｓｕｌａｔｏｒ−Ｌｉｋｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｅｒｐｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔｙｐｅ  １  Ｌａｔｅｎｃｙ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ＲｅｇｉｏｎＢｉｎｄｓ  ＣＣＣＴＣ−Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｙｓ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ−Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ８０，  Ｎｏ．  ５，  Ｍａｒ．  ２００６，  ｐ．  ２３５８−２３６８)。
【００４３】
プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡとの結合を指令し、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡを高レベルに発現させる。真核細胞におけるプロセッシングのための適切な要素は、ポリアデニル化シグナルである。イントロンはまた、遺伝子に存在し得る。遺伝子又は遺伝子フラグメント用の発現カセットの例は、当分野において周知である。
【００４４】
当業者は、例えば、所望の組織特異性及び発現レベルに基づいて適切なレギュレーターを選択することができる。例えば、細胞型特異的又は腫瘍特異的プロモーターは、遺伝子産物の発現を特定の細胞型に制限するように用いられる。組織特異的プロモーターを使用することに加えて、ウィルスの局所投与は、局所的な発現及び効果をもたらすことができる。使用可能な非組織特異的プロモーターの例としては、初期サイトメガロウィルス（ＣＭＶ）プロモーター（米国特許第４，１６８，０６２号）及びラウス肉腫ウィルスプロモーターが挙げられる。また、ＨＳＶ−１１ＥとＩＥ４／５プロモーターのようなＨＳＶプロモーターを使用することができる。いくつかの実施形態では、プロモーターは、以下の表のプロモーターから選択される。
【表１】
2020517580.tif 000002
【００４５】
例えば、当該技術に使用され得る組織特異的プロモーターの例は、前立腺細胞に特異的である前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、筋細胞に特異的であるデスミンプロモーター、ニューロンに特異的であるエノラーゼプロモーター、赤血球系細胞に特異的であるβ−グロビンプロモーター、同様に赤血球系細胞に特異的なτ−グロビンプロモーター、下垂体細胞に特異的な成長ホルモンプロモーター、膵臓β細胞に特異的なインスリンプロモーター、星状細胞に特異的なグリア線維性酸性タンパク質プロモーター、カテコールアミン作動性ニューロンに特異的であるチロシンヒドロキシラーゼプロモーター、ニューロンに特異的であるアミロイド前駆体タンパク質プロモーター、ノルアドレナリン作動性及びアドレナリン作動性ニューロンに特異的であるドーパミンβ−ヒドロキシラーゼプロモーター、セロトニン／松果体細胞に特異的であるトリプトファンヒドロキシラーゼプロモーター、コリン作動性ニューロンに特異的であるコリンアセチルトランスフェラーゼプロモーター、カテコールアミン作動性／５−ＨＴ／Ｄ型細胞に特異的である芳香族Ｌ−アミノ酸デカルボキシラーゼ（ＡＡＤＣ）プロモーター、ニューロン／精子形成精巣上体細胞に特異的であるエンケファリンプロモーター、結腸及び直腸腫瘍ならびに膵臓及び腎臓細胞に特異であるｒｅｇ（膵石タンパク質）プロモーター、肝臓及び盲腸腫瘍並びに神経膠腫、腎臓細胞、膵臓細胞及び副腎細胞に特異的である副甲状腺ホルモン関連ペプチド（ＰＴＨｒＰ）プロモーターを含む。
【００４６】
腫瘍細胞に特異的に作用するプロモーターの例は、乳癌細胞に特異的であるストロメリシン３プロモーター、非小細胞肺癌細胞に特異的であるサーファクタントタンパク質Ａプロモーター、ＳＬＰＩ発現癌に特異的である分泌性白血球プロテアーゼ阻害剤（ＳＬＰＩ）プロモーター、メラノーマ細胞に特異的であるチロシナーゼプロモーター、線維肉腫／腫瘍芽細胞に特異的であるストレス誘発ｇｒｐ７８／ＢｉＰプロモーター、脂肪細胞に特異的であるＡＰ２脂肪エンハンサー、肝細胞に特異的であるａ−１アンチトリプシントランスサイレチンタンパク質プロモーター、多形神経膠芽腫細胞に特異的であるインターロイキン−１０プロモーター、膵臓、乳房、胃、卵巣及び非小細胞肺細胞に特異的であるｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター、脳腫瘍細胞に特異的であるａ−Ｂ−クリスタリン／熱ショックタンパク質２７プロモーター、神経膠腫及び髄膜腫細胞に特異的である塩基性線維芽細胞増殖因子プロモーター、扁平上皮癌、神経膠腫及び乳房腫瘍細胞に特異的である上皮増殖因子受容体プロモーター、乳癌細胞に特異的であるムチン様糖タンパク質（ＤＦ３、ＭＵＣ１）プロモーター、転移性腫瘍に特異的であるｍｔｓｌプロモーター、小細胞肺癌細胞に特異的であるＮＳＥプロモーター、小細胞肺癌細胞に特異的であるソマトスタチン受容体プロモーター、乳癌細胞に特異的であるｃ−ｅｒｂＢ−３及びｃ−ｅｒｂＢ−２プロモーター、乳癌及び胃癌に特異的であるｃ−ｅｒｂＢ４プロモーター、甲状腺癌細胞に特異的であるサイログロブリンプロモーター、肝細胞癌細胞に特異的であるα-フェトプロテインプロモーター、胃癌細胞に特異的であるｖｉｌｌｉｎプロモーター、及び、肝細胞癌細胞に特異的であるアルブミンプロモーターを含む。別の実施形態では、ＴＥＲＴプロモーター又は生存するタンパク質プロモーターが使用される。
【００４７】
例えば、いくつかの実施形態では、ＡＴＦ３タンパク質をコードする異種核酸配列（遺伝子ＩＤ：４６７、ＮＣ_０００００１．１１）は、ＣＭＶプロモーター又はＥｇｒプロモーターのようなプロモーターに機能的に連結される。
【００４８】
・非ウィルス性ベクター
任意の適切な非ウィルスベクターを用いて、ＡＴＦ３遺伝子を腫瘍細胞に導入することができる。非ウィルスベクターの例としては、プラスミドＤＮＡ又はＲＮＡに基づくベクター、逆転写要素、トランスポゾン及びエピソームベクターが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ベクターは、核トランスフェクション（エレクトロポレーションの一種）によって細胞に送達される。一実施形態では、ベクターは、例えば、高分子化合物、ナノカプセル、微小ボール、磁気ビーズ及び脂質ベースのシステムを含むコロイド分散系によって細胞に送達される。前記脂質系システムは、水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む。
【００４９】
非ウィルスベクターはまた、人工膜小胞であるリポソームによって細胞に送達されることができる。リポソームの組成は、典型的に、リン脂質（特に相転移温度が高いリン脂質）の組合せであり、典型的にステロイド（特にコレステロール）と組み合わせる。他のリン脂質又は他の脂質も使用することができる。リポソームの物理的性質は、ｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。形質転換期間中にジオレオイルホスファチジルエタノールアミンを用いることにより、リポソームの形質導入効率を高めることができる。高効率のリポソームは市販されている。
【００５０】
一実施形態では、非ウィルスベクターは、エピソームベクターである。エピソームベクターは、因子を発現するための少なくとも１つの調節配列に機能的に連結された１つ又は複数の多能性遺伝子を含むことができる。本発明のエピソームベクターはまた、当該ベクターの細胞中の複製を可能にする成分を含むことができる。例えば、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｏｒｉＰ／核抗原−１（ＥＢＮＡ−１）の組み合わせは、哺乳動物細胞（特に、霊長類の動物細胞）におけるベクターの自己複製をサポートすることができる。ＥＢＶゲノム由来のＥＢＮＡ１トランスエレメント及びＯｒｉＰシスエレメントは、単純なプラスミドが増殖中のヒト細胞においてエピソームとして複製及び維持されることを可能にする。
【００５１】
本発明は、上記に挙げられたＡＴＦ３活性化剤に限定されない。当業者は、薬剤が、過度の努力なしで、上記に提供された定義に記載される基準を満たすかを判断することができる。
【００５２】
・方法及び治療
本発明の別の態様は、対象においてＩＲ耐性腫瘍を治療する方法に関する。当該方法は、必要とする対象に、治療有効量のＡＴＦ３活性化剤を投与することを含む。さらに、本発明は、対象においてＩＲ耐性腫瘍を治療するための医薬組成物を製造するためのＡＴＦ３活性化剤の使用を提供する。さらに、本発明は、対象においてＩＲ耐性腫瘍を治療するためのＡＴＦ３活性化剤の使用を提供する。本発明はまた、ＩＲ抵抗性腫瘍に関連する症状を治療するための上記ＡＴＦ３活性化剤を提供する。
【００５３】
ある実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤又はＡＴＦ３活性化剤を含む医薬組成物を非経口（例えば、静脈内、筋肉内、経皮又は皮内）に投与する。
【００５４】
いくつかの実施形態では、ＡＴＦ３活性化剤を、他の治療薬（例えば、ＩＲ耐性腫瘍の治療に有効な化学療法剤）と組み合わせることが望ましいことがある。例えば、ＩＲ耐性腫瘍の治療は、ＡＴＦ３活性化剤及び市販される他の耐性腫瘍治療を用いて実施することができる。
【００５５】
ある実施形態において、ＩＲ耐性腫瘍を治療する方法は、腫瘍の進行及び／又は腫瘍に起因する疾患の発症を予防する。したがって、いくつかの実施形態では、必要とする対象に有効量のＡＴＦ３活性化剤を投与することを含む、ＩＲ耐性腫瘍の進行を防止する方法、及び／又は、ＩＲ耐性腫瘍に起因する疾患の発症を防止する方法を提供する。ある実施形態では、前記方法は、腫瘍に関連する症状の発症、進行及び／又は再発を予防するように、ＩＲ耐性腫瘍を治療することからなる。ある実施形態では、必要とする対象物に有効量のＡＴＦ３活性化剤を投与することを含む、対象においてＩＲ耐性腫瘍に関連する症状を予防するための方法を提供する。
【００５６】
・組成物
本発明のさらなる別の態様は、治療有効量のＡＴＦ３活性化剤及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。当該医薬組成物は、対象においてＩＲ耐性腫瘍を治療するために使用されることが意図される。ＡＴＦ３活性化剤は、適切な薬学的に許容される担体又は賦形剤中で製造されることができる。通常の保存及び使用の条件下では、これらの製剤は、微生物の成長を防止するための保存剤を含むことができる。注射可能な用途に適した剤形は、無菌の水溶液又は分散剤、及び無菌の注射可能な溶液又は分散剤の現場配合のための無菌の粉末を含む。いずれの場合には、当該剤形は無菌でなければならず、注射の容易さのために流体でなければならない。製造及び保存の条件下では、安定でなければならず、細菌や真菌等のような微生物の汚染を防止する必要がある。
【００５７】
担体は、溶媒又は分散媒体であってもよく、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物及び／又は植物油を含む。例えば、レシチンなどのコーティングを用いることにより、分散時に所望の粒径を維持し、界面活性剤を用いることにより、適切な流動性を維持することができる。抗菌剤は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど）により、微生物を防止することを実現する。多くの場合、好ましくは、糖又は塩化ナトリウムなどのような等張剤を含む。注射可能な組成物の延長された吸収は、組成物中のモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンのような遅延吸収剤を使用することにより実現することができる。
【００５８】
例えば、水溶液中での非経口投与に対して、溶液が必要の場合、適切に緩衝され、まず十分な生理食塩水又はグルコースで液体希釈剤を等張させる。これらの特定の水溶液は、特に、静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍及び腹腔内投与に適する。この点に関して、本発明に従って使用可能な滅菌水性媒体は、当業者に公知である。例えば、単一用量を１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解し、１０００ｍＬの皮下注射液に添加したり、推奨注入部位に注射したりする（例えば、"Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"  １５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐａｇｅｓ  １０３５−１０３８  ａｎｄ  １５７０−１５８０参照）。治療される対象の状態に応じて、用量が必然的に変化する。いずれの場合にも、投与を担当する人は、個々の対象に対する適切な用量を決定する。また、ヒトへの投与に対して、製剤はＦＤＡの生物学的製品規格に準ずる無菌性、免疫原性、一般的な安全性及び純度の標準を満たさなければならない。
【００５９】
活性化合物を、所望の量で、必要に応じて上記に列挙した種々の他の成分と適切な溶媒に混合した後、濾過及び滅菌することにより、滅菌された注射可能な溶液を製造する。一般的に、分散剤は、無菌担体中に種々の無菌活性成分を含有させることにより製造され、前記滅菌担体が、基礎分散媒体及び上記に挙げたもののうち必要な他の成分を含有する。無菌注射可能な溶液を製造するための無菌の粉末の場合、好ましい製造方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術である。前記技術は、予め無菌濾過された溶液から活性成分及び他の必要な成分粉末を生成する。
【００６０】
本発明に記載される組成物は、中性又は塩形態に製造することができる。薬学的に許容される塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基との付加塩）を含み、これは、無機酸（例えば、塩酸又はリン酸）又は有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸）などと形成される。遊離のカルボキシル基との塩は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化鉄のような無機塩基から誘導されることができ、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカイン等の有機塩基から誘導されることができる。製造中、溶液は、用量配合に適合する方式で、治療有効量で投与される。当該製剤は、種々の剤形（例えば、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなど）として容易に投与される。
【００６１】
本明細書で使用される、「担体」とは、いずれかの溶媒、分散媒体、媒体、コーティング、希釈剤、抗細菌剤、抗真菌剤、等張剤と吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁剤、コロイド等を含む。薬学的活性物質用のそのような媒体及び薬物の適用は、当分野において周知である。活性成分と相溶しない一般的な媒体又は薬剤以外、他の媒体又は薬剤を治療組成物中に使用可能と想定する。補助的な活性成分は、組成物中に組み込まれてもよい。
【００６２】
「薬学的に許容される」という語句は、人に投与されたときにアレルギー又は類似の副作用を生じない分子実体及び成分を意味する。タンパク質を有効成分として含有する水性組成物の製造は、当分野において十分に理解されている。通常、このような組成物は、注射剤に製造され、液体溶液又は懸濁液とすることができ、注射前の液体に溶解又は懸濁させるのに適した固体形態を製造することもできる。
【実施例】
【００６３】
材料及び方法
細胞及びウィルス。ＨＣＴ１１６、Ｄ５４、Ｕ２５１ＭＧ、Ｔ２４、Ｗｉｄｒ及びＤｕ１４５細胞株は、アメリカンタイプカルチャーコレクションライブラリから得られ、１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ培地で培養した。制限継代ＨＳＶ−１（ＨＳＶ）はＨＳＶ−１プロトタイプ株であった。
【００６４】
抗体。マウス抗Ｆｌａｇ及びβ−アクチンモノクローナル抗体は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入された。マウス抗ＩＣＰ８ポリクローナル抗体は、別途に記載された。ウサギ抗ＡＴＦ３ポリクローナル抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚから購入された。全ての抗体は、１：１，０００で希釈して使用された。
【００６５】
レンチウィルスを用いてＡＴＦ３過剰発現細胞株を生成する。Ｄｕ１４５細胞は、感染前２４時間、６ウェルプレートに接種された。スクランブル配列又はアミノ酸末端にＡＴＦ３のＦｌａｇタグ付きコード配列をコードするレンチウィルスで、ポリブレン（８μｇ／ｍｌ）培地中、細胞を３０時間感染させた。細胞は、さらに、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンにより３日間選択された。生存細胞は収集され、ＦＬＡＧタグを有するＡＴＦ３タンパク質は、免疫ブロットにより検出された。
【００６６】
ＣＲＩＳＰＲを使用したＡＴＦ３枯渇細胞株の生成。ヒトＡＴＦ３遺伝子の第２エクソンを標的するＣＲＩＳＰＲキットは、Ｏｒｉｇｅｎｅ（ロット番号ＫＮ２０２８９７）から得られた。標的配列５’−ＣＴＴＣＣＴＴＧＡＣＡＡＡＧＧＧＣＧＴＣ−３’（エクソン２における第１１５〜１３４ｂｐ）又は５’−ＣＣＡＣＣＧＧＡＴＧＴＣＣＴＣＴＧＣＧＣ−３’（エキソン２における第１６９〜１８８ｂｐ）のｇＲＮＡベクタープラスミドを使用して、親ＨＣＴ１１６細胞をコトランスフェクションし、ＧＦＰ−ピューロマイシンを発現する選択ボックスを含むドナーベクターをヒトＡＴＦ３遺伝子の標的部位に挿入した。選択された細胞（ピューロマイシン耐性）を連続的に希釈して単一細胞由来のコロニーを形成した。コロニーのＡＴＦ３発現は、免疫ブロットによりさらにスクリーニングされた。クローン７と８は、主にＡＴＦ３−／−細胞から構成された。
【００６７】
免疫ブロット分析。照射又は感染後に、特定の時間で細胞を収集した。等量の全タンパク質を１２．５％変性ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動分離を行い、ニトロセルロース膜に移し、上記のようなマウス抗β−アクチンモノクローナル抗体、マウス抗ＩＣＰ８ポリクローナル抗体及びウサギ抗ＡＴＦ３ポリクローナル抗体を用いて検出した。
【００６８】
ＭＴＴアッセイ。３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾールブロマイド（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ））により、細胞活性を決定した。要するに、細胞を、２，０００細胞／ウェルで９６ウェルプレートに接種し、一晩インキュベートした後、偽又は増加量のＩＲで処理した。ＭＴＴ溶液（ＰＢＳ溶液５ｍｇ／ｍｌ、２０μｌ／ウェル）を細胞に添加してホルマザン結晶を生成させた。４時間後、ＭＴＴ溶液を１５０μｌのＤＭＳＯに置換して、ホルマザン結晶を溶解させた。ｉＭａｒｋマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、ＵＳＡ）を用いて、４９０ｎｍで光学的吸光度を測定した。
【００６９】
コロニー形成試験。細胞を接種して６ウェルプレート内にコロニーを形成し、翌日ＩＲの量を増加させて処理を行った。少なくとも５０個の細胞を有する十分に大きなコロニーが見えた際に（１２〜１５日）、当該プレートをメタノールによって固定し、クリスタルバイオレットで染色した。５０個より多い細胞を有すコロニーを計測し、生存率を計算した。
【００７０】
結果
ＡＴＦ３がＩＲ感受性細胞系に誘導されたが、６Ｇｙに暴露されたＩＲ耐性細胞系に誘導されなかった。
本報告書に記載された研究では、６種類の細胞株が試験された。６種類のうち、前立腺、大腸及び膀胱由来のＤｕ１４５、Ｗｉｄｒ、Ｔ２４は、ＩＲ耐性として報告された。他の３種類の細胞系（すなわち、ＨＣＴ１１６（結腸）、Ｄ５４（ＣＮＳ、中枢神経系）及びＵ２５１ＭＧ（ＣＮＳ））は、ＩＲに対して感受性であることが報告された。図１に示すように、コロニー形成試験により、異なる用量に暴露された後の細胞活性を測定した。
【００７１】
６Ｇｙが投与された後、６種類の細胞系のＡＴＦ３の産生量を試験した。図２のパネルＡに示すように、３種類のＩＲ感受性細胞株はいずれも低レベルでＡＴＦ３を構成的に発現したが、ＩＲに暴露された後の数時間以内に増加レベルでＡＴＦ３を発現した。一方、図２のパネルＢに示すように、６Ｇｙに暴露した前又は後に、ＡＴＦ３は全てのＩＲ耐性細胞系において検出されなかった。
【００７２】
ＡＴＦ３の枯渇が感受性細胞のＩＲへの耐性をもたらした。
ＩＲ感受性細胞におけるＡＴＦ３の枯渇の効果を試験するために、材料及び方法に記載されるように、ＡＴＦ３をＨＣＴ１１６細胞からノックアウトし、以下の研究のために３種類の細胞クローンを選択した。Ｓｃｒと名付けられたクローン１は、スクランブル配列でトランスフェクトされ、コントロールとして使用された。クローン７と８は、一部のみ精製され、ＡＴＦ３−／−細胞とＡＴＦ３＋／＋細胞との混合物から構成された（図３のパネルＡ）。３種類の細胞株を６Ｇｙに供し、ＭＴＴアッセイを用いて生存度をモニターした。結果は、ＩＲに対する感受性がＡＴＦ３と負の関係を示した。従って、Ｓｃｒクローンが最も敏感であるが、含有量が最も少ないＡＴＦ３＋／＋細胞を含むクローン７は、最も耐性を示した。これらの結果は、ＡＴＦ３の発現が、細胞をＩＲに対して感受性とするために必要であることを示した。
【００７３】
ＩＲへの暴露がない場合、Ｄｕ１４５細胞（ＩＲ耐性細胞株）におけるＡＴＦ３の安定な発現は、細胞の死亡をもたらした。
一連の実験において、まず、Ｆｌａｇ標記されたＡＴＦ３をコードするレンチウィルス、又はＡＴＦ３をコードする核酸配列がスクランブルであるレンチウィルスで、Ｄｕ１４５細胞を変換した。培養物は、６ウェルプレートに接種され、毎日監視した。結果は以下の通りであった。
【００７４】
（ｉ）図４のパネルＡは、スクランブル配列により形質転換された細胞でなく、Ｆｌａｇタグ付きＡＴＦ３をコードするレンチウィルスにより形質転換された細胞がＡＴＦ３を発現したことを示す。
【００７５】
（ｉｉ）図４のパネルＢは、形質転換細胞を６ウェルプレートに接種した後１４日のＤｕ１４５細胞のコロニーの外観を示す。パネルＣ及びＡＴＦ３をコードするレンチウィルスにより形質転換された細胞生存の相対的な割合（接種後１４日目、パネルＤ）に示されるように、ＡＴＦ３により形質転換されたＤｕ１４５細胞群の減少は、相対的な細胞生存度（ＭＴＴアッセイ））により反映される。
【００７６】
ＩＲ抵抗細胞株Ｄｕ１４５及びＷｉｄｒがＩＲ以外の方式により刺激された後、ＡＴＦ３を発現する能力を保持した。
当該実験は、以下の仮説を検証することを目的とした。ＩＲ耐性の細胞において、ＩＲによりＰＫＲを活性化する経路が損傷するが、他の形態のストレスに対する応答において、ＡＴＦ３が誘導され得る。以前の研究でわかるように、ＨＳＶ−１感染の応答においてＡＴＦ３発現が活性化された。上記仮説を検証するために、細胞当たり１０ＰＦＵのＨＳＶ−１（Ｆ）に暴露されたＤｕ１４５及びＷｉｄｒ細胞におけるＡＴＦ３の蓄積を監視した。ＡＴＦ３に加えて、ＩＣＰ８の蓄積も監視した。ＩＣＰ８は、一種のウィルスタンパク質であり、細胞が実際に感染され、ウィルス遺伝子産物を産生する指標として用いられた。図５に示す結果でわかるように、Ｄｕ１４５及びＷｉｄｒ感染細胞がＡＴＦ３の生成により、感染に応答した。本発明者らは、ＩＲ耐性細胞がＡＴＦ３を発現する能力を保持するという結論を得た。
【００７７】
本発明での主な発見は二つある。まず、ＡＴＦ３は、細胞の死亡のエフェクターである。したがって、ＡＴＦ３の枯渇は、ＩＲ感受性細胞がＩＲに対して耐性になるようにする。次は、ＩＲ耐性細胞は、ＡＴＦ３を発現しない。当該タンパク質をコードするレンチウィルスの感染により、ＡＴＦ３の強制発現がＩＲ耐性細胞の死亡を誘導する。
【００７８】
第２の重要な発見として、ＡＴＦ３を発生させることにより、ＩＲ以外の方法により誘発されたストレスに応答し、ＩＲ耐性細胞がストレスに応答する証拠が挙げられる。結果として、（ａ）ＡＴＦ３は、複数の経路により活性化され、（ｂ）ＩＲ耐性細胞において、選択的突然変異の結果により、ＡＴＦ３活性化経路が無効であるが、その他の方式により、ＡＴＦ３が依然として誘導可能である。
【００７９】
上述したように、ＡＴＦ３は、種々の受容体により介在するストレスに応答して製造される。ＩＲストレス受容体の経路成分への損失は、ＩＲに対する耐性の発展をもたらす。耐性細胞がＡＴＦ３を製造することにより感染ストレスに応答するため、小分子、非コード化ＲＮＡを担持するエキソソームなどにより、放射線療法を受けた患者においてＡＴＦ３を誘導することが可能であると予測できる。本発明の結果は、ＡＴＦ３の合成が、ＩＲ耐性細胞の死亡をもたらすが、当該プロセスが、ＡＴＦ３を製造することによりＩＲに応答するＩＲ感受性細胞に影響を及ぼさないと予測する。
【００８０】
なお、活性化されたＡＴＦ３は、放射線増感剤ではないことを強調すべきである。ＡＴＦ３は、ストレス細胞の運命を規定するが、多くの実例において、特にニューロンにおいて、細胞の死亡につながる経路ではなく保護経路を活性化する。データから明確にわかるように、ＩＲ耐性細胞及び感受性細胞において、ＩＲ細胞の死亡活性化剤（ＩＲＣＤＡ）として重要な役割を果たし、そのように定義されるべきである。
【００８１】
なお、本発明は、好ましい実施形態及び任意の特徴により具体的に開示されたが、当業者であれば、ここで開示された内容に対する修正、改善及び変形を採用し、かつこのような修正、改善及び変形が本発明の範囲内であると考えられる。ここで提供される材料、方法、及び実施例は、好ましい実施形態を代表するものであり、例示的であり、本発明の範囲に対して限定することを意図しない。
【００８２】
本発明は、広く一般的にここで記載される。一般的な本発明の内容に含まれるより狭い種及び下位概念群の各々は、本発明の一部を構成する。ここで排除すべき材料が具体的に記載されているか否かにかかわらず、これは、これは、群から任意の主題を排除する付加条件又は負の制限を有する本発明の一般的な説明を含む。さらに、本発明の特徴又は態様がマーカッシュ群に従って記載されている場合、当業者であれば、本発明がマーカッシュ群のいずれかのメンバー又はメンバーのサブグループとしても記載されることを理解する。
【００８３】
本明細書に記載された全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により、各々単独して参照により援用されるように、本明細書に明示的に援用される。競合の場合、定義された本明細書が主となる。本明細書に記載された説明的な開示は、本明細書で具体的に開示されない任意の要素及び制限なしに、適切に実施することができる。したがって、例えば、用語「含む」、「包含」、「含有」などは、広く理解されて、限定されるべきではない。さらに、本明細書で使用される用語及び表現は、限定することなく説明的用語として使用される。これらの用語及び表現を使用するにより、説明又は記載された特徴の等価又は一部を除外することを意図しない。なお、本発明の請求の範囲内に、種々の変更が可能であることを理解すべきである。
【図１】
2020517580.tif 000003
【図２】
2020517580.tif 000004
【図３】
2020517580.tif 000005
【図４】
2020517580.tif 000006
【図５】
2020517580.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】令和1年10月23日(2019.10.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＡＴＦ３活性化剤を含む、対象において電離放射線耐性腫瘍を治療するための医薬組成物。
【請求項２】
前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現しない、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現する能力を保持する、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＡＴＦ３活性化剤が、ＡＴＦ３発現を誘導することができる小分子、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持するベクター、及びＡＴＦ３発現阻害剤に対する非コード化ＲＮＡを担持するベクターから選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＡＴＦ３発現を誘導することができる小分子が、クルクミン、非ステロイド性抗炎症薬、プロゲステロン、ホスファチジルイノシトール阻害剤、ｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、及びブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）から選択される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持するベクターが、ＡＴＦ３タンパク質をコードするウィルスベクター又は非ウィルスベクターである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ウィルスベクターが、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純ヘルペスウィルス、牛痘ウィルス、又はバキュロウィルスである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＡＴＦ３発現阻害剤に対する非コード化ＲＮＡが、アンチセンスオリゴマーである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記アンチセンスオリゴマーが、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡから選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記非コード化ＲＮＡを担持するベクターが、エキソソームである、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記対象が、哺乳動物である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記哺乳動物が、ヒトである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
対象において電離放射線耐性腫瘍を治療するための人工ベクターであって、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持する、人工ベクター。
【請求項１４】
前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＦ３タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列である、請求項１３に記載の人工ベクター。
【請求項１５】
前記人工ベクターが、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えウィルスである、請求項１３に記載の人工ベクター。
【請求項１６】
前記組み換えウィルスが、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純ヘルペスウィルス、牛痘ウィルス、又はバキュロウィルスである、請求項１５に記載の人工ベクター。
【請求項１７】
前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現しない、請求項１３に記載の人工ベクター。
【請求項１８】
前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現する能力を保持する、請求項１３に記載の人工ベクター。
【請求項１９】
前記人工ベクターを前記細胞に導入した後、(ａ)前記ＡＴＦ３タンパク質が前記腫瘍細胞に安定的に発現されるまたは(ｂ)前記ＡＴＦ３タンパク質が前記腫瘍細胞に蓄積される、請求項１３に記載の人工ベクター。
【請求項２０】
請求項１３に記載の人工ベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８３】
本明細書に記載された全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、その全体が参照により、各々単独して参照により援用されるように、本明細書に明示的に援用される。競合の場合、定義された本明細書が主となる。本明細書に記載された説明的な開示は、本明細書で具体的に開示されない任意の要素及び制限なしに、適切に実施することができる。したがって、例えば、用語「含む」、「包含」、「含有」などは、広く理解されて、限定されるべきではない。さらに、本明細書で使用される用語及び表現は、限定することなく説明的用語として使用される。これらの用語及び表現を使用するにより、説明又は記載された特徴の等価又は一部を除外することを意図しない。なお、本発明の請求の範囲内に、種々の変更が可能であることを理解すべきである。
本願は、さらに次の態様を含む。
１. 治療有効量のＡＴＦ３活性化剤を治療必要な対象に投与することを含む、対象において電離放射線耐性腫瘍を治療する方法。
２. 前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現しない、項１に記載の方法。
３. 前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現する能力を保持する、項２に記載の方法。
４. 前記ＡＴＦ３活性化剤が、ＡＴＦ３発現を誘導することができる小分子、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持するベクター、及びＡＴＦ３発現阻害剤に対する非コード化ＲＮＡを担持するベクターから選択される、項１に記載の方法。
５. 前記ＡＴＦ３発現を誘導することができる小分子が、クルクミン、非ステロイド性抗炎症薬、プロゲステロン、ホスファチジルイノシトール阻害剤、ｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、及びブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）から選択される、項４に記載の方法。
６. 前記ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持するベクターが、ＡＴＦ３タンパク質をコードするウィルスベクター又は非ウィルスベクターである、項４に記載の方法。
７. 前記ウィルスベクターが、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純ヘルペスウィルス、牛痘ウィルス、又はバキュロウィルスである、項４に記載の方法。
８. 前記ＡＴＦ３発現阻害剤に対する非コード化ＲＮＡが、アンチセンスオリゴマーであり、前記アンチセンスオリゴマーが、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びキメラオリゴヌクレオチドから選択される、項４に記載の方法。
９. 前記アンチセンスオリゴマーが、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡから選択される、項８に記載の方法。
１０. 前記非コード化ＲＮＡを担持するベクターが、エキソソームである、項４に記載の方法。
１１. 前記腫瘍細胞における前記ＡＴＦ３活性化剤の投与が、ＡＴＦ３タンパク質の発現をもたらす、項１に記載の方法。
１２. 前記腫瘍細胞における前記ＡＴＦ３活性化剤の投与が、ＡＴＦ３の発現の増加にもたらす、項１に記載の方法。
１３. 前記腫瘍細胞における前記ＡＴＦ３活性化剤の投与が、ＡＴＦ３タンパク質の蓄積を引き起こす、項１に記載の方法。
１４. 前記腫瘍細胞における前記ＡＴＦ３活性化剤の投与が、腫瘍細胞の死亡を引き起こす、項１に記載の方法。
１５. 前記対象が、哺乳動物である、項１に記載の方法。
１６. 前記哺乳動物が、ヒトである、項１５に記載の方法。
１７. 対象において電離放射線耐性腫瘍を治療するための医薬組成物を製造するためのＡＴＦ３活性化剤の使用。
１８. 前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現しない、項１７に記載の使用。
１９. 前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現する能力を保持する、項１７に記載の使用。
２０. 前記ＡＴＦ３活性化剤が、ＡＴＦ３発現を誘導することができる小分子、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持するベクター、及びＡＴＦ３発現阻害剤に対する非コード化ＲＮＡを担持するベクターから選択される、項１７に記載の使用。
２１. 前記ＡＴＦ３発現を誘導することができる小分子が、クルクミン、非ステロイド性抗炎症薬、プロゲステロン、ホスファチジルイノシトール阻害剤、ｔ−ブチルヒドロキノン（ｔＢＨＱ）、及びブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）から選択される、項２０に記載の使用。
２２. 前記ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持するベクターが、ＡＴＦ３タンパク質をコードするウィルスベクター又は非ウィルスベクターである、項２０に記載の使用。
２３. 前記ウィルスベクターが、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純ヘルペスウィルス、牛痘ウィルス、又はバキュロウィルスである、項２０に記載の使用。
２４. 前記ＡＴＦ３発現阻害剤に対する非コード化ＲＮＡが、アンチセンスオリゴマーであり、前記アンチセンスオリゴマーが、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、及びキメラオリゴヌクレオチドから選択される、項２０に記載の使用。
２５. 前記アンチセンスオリゴマーが、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡから選択される、項２４に記載の使用。
２６. 前記非コード化ＲＮＡを担持するベクターが、エキソソームである、項２０に記載の使用。
２７. 前記対象が、哺乳動物である、項１７に記載の使用。
２８. 前記哺乳動物が、ヒトである、項２７に記載の使用。
２９. 対象において電離放射線耐性腫瘍を治療するための人工ベクターであって、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを担持する、人工ベクター。
３０. 前記ポリヌクレオチドが、ＡＴＦ３タンパク質をコードするＤＮＡ又はＲＮＡ配列である、項２９に記載の人工ベクター。
３１. 前記人工ベクターが、ＡＴＦ３タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えウィルスである、項２９に記載の人工ベクター。
３２. 前記組み換えウィルスが、レトロウィルス、アデノウィルス、アデノ随伴ウィルス、単純ヘルペスウィルス、牛痘ウィルス、又はバキュロウィルスである、項３１に記載の人工ベクター。
３３. 前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現しない、項２９に記載の人工ベクター。
３４. 前記腫瘍がＡＴＦ３タンパク質を発現する能力を保持する、項２９に記載の人工ベクター。
３５. 前記人工ベクターを前記細胞に導入した後、前記ＡＴＦ３タンパク質が前記腫瘍細胞に安定的に発現される、項２９に記載の人工ベクター。
３６. 前記人工ベクターを前記細胞に導入した後、前記ＡＴＦ３タンパク質が前記腫瘍細胞に蓄積される、項２９に記載の人工ベクター。
３７. 項２９に記載の人工ベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【国際調査報告】
2020517580.tif 000008
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