(57)【要約】  本明細書では、ループスなどの自己免疫及び／又は炎症性疾患の処置のためのバイオマーカー及び治療、並びにＢＴＫ阻害剤を使用する方法が提供される。特に、ループスの患者選定及び予後のためのバイオマーカー、並びに治療的処置の方法、製造品及びそれらを作製するための方法、診断キット、検出方法及びそれらに関連する広告の方法が提供される。【選択図】図１Ａ−２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療的有効量のＢＴＫ阻害剤を個体に投与することを含む、自己免疫又は炎症性疾患を有する個体を治療するための方法であって、個体からの試料が、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる群より選択される増大したレベルの一又は複数のバイオマーカーを有することが発見されている、方法。
【請求項２】
個体おける自己免疫又は炎症性疾患を治療するための方法であって、
（ａ）個体からの試料が、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる群より選択される増大したレベルの一又は複数のバイオマーカーを含むことを決定すること；及び
（ｂ）有効量のＢＴＫ阻害剤を個体に投与し、それにより免疫学的疾患又は障害が治療されること
を含む、方法。
【請求項３】
ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる群より選択される一又は複数のバイオマーカーのレベルを決定すること；及びバイオマーカーのレベルに基づき医薬を選択することを含む、自己免疫又は炎症性疾患を有する個体のための治療を選択するための方法。
【請求項４】
個体からの試料において、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる群より選択される一又は複数のバイオマーカーのレベルを決定することにより、ＢＴＫ阻害剤を含む治療の恩恵を多かれ少なかれ示す可能性のある、自己免疫又は炎症性疾患を有する個体を同定する方法であって、試料中の増大したレベルのバイオマーカーが、個体がＢＴＫ阻害剤を含む治療の恩恵をより示しやすいことを示すか、又は、減少したレベルのバイオマーカーが、個体がＢＴＫ阻害剤を含む治療の恩恵を示しにくいことを示す、方法。
【請求項５】
ＢＴＫ阻害剤を受けるための自己免疫又は炎症性疾患を有する個体を同定するためのアッセイであって、
（ａ）個体からの試料において、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる群より選択される一又は複数のバイオマーカーのレベルを決定すること；及び
（ｂ）バイオマーカーのレベルに基づいてＢＴＫ阻害剤の投与を推奨すること
を含む、アッセイ。
【請求項６】
自己免疫又は炎症性疾患を有する個体からの試料において、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる群より選択される一又は複数のバイオマーカーのレベルを決定するための一又は複数の試薬を含む診断キットであって、増大したレベルのバイオマーカーの検出とは、個体がＢＴＫ阻害剤で治療されるときの増大した有効性を意味し、低い又は実質的に検出不可能なレベルのバイオマーカーの検出とは、自己免疫又は炎症性疾患を有する個体がＢＴＫ阻害剤で治療されるときの減少した有効性を意味する、診断キット。
【請求項７】
有効量のＢＴＫ阻害剤を個体に投与することをさらに含む、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項８】
バイオマーカーのレベルを決定することが、基準レベルに対するバイオマーカーのＲＮＡレベルを測定することにより実施される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法、アッセイ及び／又はキット。
【請求項９】
ＲＮＡレベルの測定が増幅を含む、請求項８に記載の方法、アッセイ及び／又はキット。
【請求項１０】
ＲＮＡレベルの測定が定量的ＰＣＲを含む、請求項９に記載の方法、アッセイ及び／又はキット。
【請求項１１】
ＲＮＡレベルの測定が、ＲＮＡを増幅させること及び増幅させた生成物を検出し、それにより基準レベルに対するＲＮＡのレベルを測定することを含む、請求項１０に記載の方法、アッセイ及び／又はキット。
【請求項１２】
試料が血液試料である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法、アッセイ及び／又はキット。
【請求項１３】
ＢＴＫ阻害剤が、抗体、結合ポリペプチド、小分子及び／又はポリヌクレオチドである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法、アッセイ及び／又はキット。
【請求項１４】
ＢＴＫ阻害剤が小分子である、請求項１３に記載の方法、アッセイ及び／又はキット。
【請求項１５】
小分子ＢＴＫ阻害剤が化合物（Ａ）：
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又はその薬学的に許容される塩である、請求項１４に記載の方法、アッセイ及び／又はキット。
【請求項１６】
自己免疫又は炎症性疾患が全身性エリテマトーデスである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法、アッセイ及び／又はキット。
【請求項１７】
自己免疫又は炎症性疾患がループス腎炎である、請求項１６に記載の方法、アッセイ及び／又はキット。
【請求項１８】
自己免疫又は炎症性疾患が腎外ループスである、請求項１６に記載の方法、アッセイ及び／又はキット。
【請求項１９】
二つのバイオマーカーが選択される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法、アッセイ及び／又はキット。
【請求項２０】
三つのバイオマーカーが選択される、請求項１から１８のいずれか一項に記載の方法、アッセイ及び／又はキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書では、自己免疫及び炎症性疾患の処置のためのバイオマーカー及び治療、並びにＢＴＫ阻害剤を使用する方法が提供される。特に、自己免疫及び炎症性疾患の患者選定及び予後のためのバイオマーカー、並びに治療的処置の方法、製造品及びそれらを作製するための方法、診断キット、検出方法及びそれらに関連する広告の方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
自己免疫及び炎症性疾患及び障害は、ヒトの健康にとって依然として大きな脅威である。自己免疫及び炎症性疾患の治療は著しく発展してきたが、改善された治療がいまだに求められている。多くの自己免疫及び炎症性疾患は、不均一性の証拠を呈する。例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、ＳＬＥ患者集団において不均一性の証拠を有する疾患である。Kennedy et al., Lupus Sci. & Med., 2015; 2:e000080を参照のこと。この不均一性を考慮すると、自己免疫及び炎症性疾患（例えばＳＬＥ）を治療する新たな方法に加えて、治療結果を改善し得る診断的バイオマーカーを使用して特定の患者を同定する方法が必要である。
【０００３】
形質芽細胞は、迅速に分裂し、短寿命の抗体分泌細胞である。形質芽細胞の増加は、若年性ループス患者の血液で同定されており、一般的にループス患者の抗体転写物の量は増加している。E. Arce et al., J. Immunol. 167, 2361-2369 (2001); L. Bennett et al., J. Exp. Med.197, 711-723 (2003)。形質芽細胞は血液中のＢ細胞の少ない割合を占めているが、全血ｍＲＮＡに見られる抗体転写物の大部分を担っている。
【０００４】
ヒト酵素の最大のファミリーであるプロテインキナーゼは、５００をはるかに上回るタンパク質を包含する。ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）は、チロシンキナーゼのＴｅｃファミリーのメンバーであり、早期Ｂ細胞発生、並びに成熟Ｂ細胞活性化、シグナル伝達、及び生存の制御因子である。アレルギー障害及び／又は自己免疫疾患及び／又は炎症性疾患におけるＢＴＫの役割の証拠は、ＢＴＫ欠損マウスモデルにおいて確立されている。例えば、ＳＬＥの標準的なマウス前臨床モデルにおいて、ＢＴＫ欠損は、疾患進行の顕著な改善をもたらすことが示されている。さらに、ＢＴＫ欠損マウスは、コラーゲン誘発性関節炎の発症に対して耐性があり、ブドウ球菌属誘発性関節炎の影響を受けにくい可能性がある。多数の証拠が、自己免疫及び／又は炎症性疾患の病因におけるＢ細胞及び液性免疫系の役割を支持している。例えば、国際公開第２０１２／１１８７５０号を参照のこと。タンパク質ベースの治療法（例えばリツキサン）は、Ｂ細胞を枯渇させるために開発され、多くの自己免疫及び／又は炎症性疾患の治療へのアプローチを代表する。Ｂ細胞活性化におけるＢＴＫの役割によって、ＢＴＫの阻害剤は、Ｂ細胞媒介性病原性活性（例えば自己抗体産生機序）の阻害剤として有用であり得る。ＢＴＫは破骨細胞、マスト細胞及び単球でも発現しており、これらの細胞の機能に重要であることが示されている。例えば、マウスのＢＴＫ欠損は、ＩｇＥを介したマスト細胞活性化障害（ＴＮＦ−アルファ及び他の炎症性サイトカイン放出の顕著な減少）と関連しており、ヒトのＢＴＫ欠損は、活性化単球によるＴＮＦ−アルファ産生の大幅な減少と関連している。
【０００５】
ＢＴＫ活性の阻害は、アレルギー障害及び／又は自己免疫及び／又は炎症性疾患、例えば：ＳＬＥ、関節リウマチ、多発性血管炎、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、重症筋無力症、アレルギー性鼻炎及び喘息の治療に有用であり得る（Di Paolo et al (2011) Nature Chem. Biol. 7(1):41-50; Liu et al (2011) Jour. of Pharm. and Exper. Ther. 338(1):154-163）。特定のＢＴＫ阻害剤が報告されている（Liu (2011) Drug Metab. and Disposition 39(10):1840-1849；米国特許第７，８８４，１０８号、国際公開第２０１０／０５６８７５号；米国特許第７，４０５，２９５号；同第７，３９３，８４８号；国際公開第２００６／０５３１２１号；米国特許第７，９４７，８３５号；米国特許公開第２００８／０１３９５５７号；米国特許第７，８３８，５２３号；米国特許公開第２００８／０１２５４１７号；同第２０１１／０１１８２３３号；２０１１年８月３１日提出のＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５００３４「PYRIDINONES/PYRAZINONES, METHOD OF MAKING, AND METHOD OF USE THEREOF」；２０１１年８月３１日提出のＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０５００１３「PYRIDAZINONES, METHOD OF MAKING, AND METHOD OF USE THEREOF」；２０１１年５月６日提出の米国特許出願番号第１３／１０２，７２０号「PYRIDONE AND AZA-PYRIDONE COMPOUNDS AND METHODS OF USE」）。
【０００６】
米国特許第８，７１６，２７４号（参照によりその全文が本明細書に援用される）は、ＢＴＫの阻害に有用なヘテロアリールピリジン及びアザ−ピリドン化合物のクラスを開示している。以下に示される化合物（Ａ）は、特定のＢＴＫ阻害剤化合物の一つである：
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。
【０００７】
化合物（Ａ）は：（Ｓ）−２−（３’−（ヒドロキシメチル）−１−メチル−５−（（５−（２−メチル−４−（オキセタン−３−イル）ピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イル）アミノ）−６−オキソ−１，６−ジヒドロ−［３，４’−ビピリジン］−２’−イル）−７，７−ジメチル−２，３，４，６，７，８−ヘキサヒドロ−１Ｈ−シクロペンタ［４，５］ピロロ［１，２−ａ］ピラジン−１−オンである。化学構造と化学名の間に矛盾がある場合、化学構造が優勢である。
【０００８】
特許出願及び特許公開を含む本明細書に引用されるすべての参考文献は、参照によりその全文が援用される。
【発明の概要】
【０００９】
本明細書では、治療的有効量のＢＴＫ阻害剤を個体に投与することを含む、自己免疫又は炎症性疾患を有する個体を治療するための方法が提供され、ここで、個体からの試料は、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる群より選択される増大したレベルの一又は複数のバイオマーカーを有することが発見されている。
【００１０】
また、本明細書では、個体における自己免疫又は炎症性疾患を治療するための方法であって、以下を含む方法も提供される。
（ａ）個体からの試料が、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる群より選択される増大したレベルの一又は複数のバイオマーカーを含むことを決定すること；及び
（ｂ）有効量のＢＴＫ阻害剤を個体に投与し、それにより免疫学的疾患又は障害が治療されること
【００１１】
また、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる群より選択される一又は複数のバイオマーカーのレベルを決定すること；及びバイオマーカーのレベルに基づき医薬を選択することを含む、自己免疫又は炎症性疾患を有する個体のための治療を選択するための方法が提供される。
【００１２】
また、本明細書では、個体からの試料において、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる群より選択される一又は複数のバイオマーカーのレベルを決定することにより、ＢＴＫ阻害剤を含む治療の恩恵を多かれ少なかれ示す可能性のある、自己免疫又は炎症性疾患を有する個体を同定する方法が提供され、ここで、試料中の増大したレベルのバイオマーカーは、個体がＢＴＫ阻害剤を含む治療の恩恵をより示しやすいことを示すか、又は、減少したレベルのバイオマーカーは、個体がＢＴＫ阻害剤を含む治療の恩恵を示しにくいことを示す。
【００１３】
また、本明細書では、ＢＴＫ阻害剤を受けるために自己免疫又は炎症性疾患を有する個体を同定するためのアッセイであって、該方法が以下を含むアッセイも提供される。
（ａ）個体からの試料において、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる群より選択される一又は複数のバイオマーカーのレベルを決定すること；及び
（ｂ）バイオマーカーのレベルに基づいてＢＴＫ阻害剤の投与を推奨すること。
【００１４】
また、本明細書では、自己免疫又は炎症性疾患を有する個体からの試料において、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる群より選択される一又は複数のバイオマーカーのレベルを決定するための一又は複数の試薬を含む診断キットが提供され、ここで、増大したレベルのバイオマーカーの検出とは、個体がＢＴＫ阻害剤で治療されるときの増大した有効性を意味し、低い又は実質的に検出不可能なレベルのバイオマーカーの検出とは、自己免疫又は炎症性疾患を有する個体がＢＴＫ阻害剤で治療されるときの減少した有効性を意味する。
【００１５】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施態様では、該方法は、有効量のＢＴＫ阻害剤を個体に投与することをさらに含む。
【００１６】
本明細書で提供される方法、アッセイ及び／又はキットのいくつかの実施態様では、試料は血液試料である。
【００１７】
本明細書で提供される方法、アッセイ及び／又はキットのいくつかの実施態様では、ＢＴＫ阻害剤は、抗体、結合ポリペプチド、小分子及び／又はポリヌクレオチドである。
【００１８】
本明細書で提供される方法、アッセイ及び／又はキットのいくつかの実施態様では、ＢＴＫ阻害剤は小分子である。いくつかの実施態様では、小分子ＢＴＫ阻害剤は、化合物（Ａ）又はその薬学的に許容される塩である。
【００１９】
本明細書で提供される方法、アッセイ及び／又はキットのいくつかの実施態様では、自己免疫又は炎症性疾患は、全身性エリテマトーデスである。いくつかの実施態様では、自己免疫又は炎症性疾患はループス腎炎である。いくつかの実施態様では、自己免疫又は炎症性疾患は腎外ループスである。
【００２０】
自己免疫疾患、例えば関節リウマチ、多発性硬化症及びループスにおけるＢ細胞アンタゴニスト（例えば抗ＣＤ２０抗体）での治療に対する応答を予測するための生物学的マーカー及びその使用方法は以前に開示されているが、現在の形質芽細胞遺伝子シグネチャーではなく、ＢＴＫ阻害に関するものではない。国際公開第２０１２／１１８７５０号を参照のこと。その全内容は、参照により本明細書に援用される。
【００２１】
本明細書で提供される場合、Ｂ細胞サブセットの転写プロファイリングは、形質芽細胞に特異的な遺伝子発現シグネチャーを同定した。このシグネチャーは、実験中のｉｎ  ｖｉｔｒｏスパイクにおける形質芽細胞の量と非常に相関している。ＲＮＡシークエンシングと組み合わされた、ＳＬＥ患者におけるＢ細胞サブセットのＦＡＣＳ分析を使用して、本発明の遺伝子発現シグネチャーは、全血における形質芽細胞の頻度との強力な相関を示した。形質芽細胞は血液中のＢ細胞の少ない割合を占めているが、全血ｍＲＮＡに見られる抗体転写物の大部分を担っている。二つの追加の第ＩＩ相臨床試験コホートに拡大すると、ＳＬＥＤＡＩ疾患活動性指標を使用して、形質芽細胞の特徴が疾患活動性と相関していることがわかった。この関連は、形質芽細胞と抗ＤＮＡ抗体の存在、低レベルの補体及び白血球減少症との相関関係によって引き起こされた。形質芽細胞シグネチャーの増加は、高レベルのインターフェロン活性とも関連していた。患者の人種／民族性も、疾患の重症度とは無関係に、形質芽細胞のシグネチャーのレベルを予測していた。標準治療薬、特にミコフェノール酸は、形質芽細胞マーカー遺伝子の発現を減少させた。例えば、リツキシマブによる患者の治療は、最終的に一過性ではあるものの、形質芽細胞シグネチャー発現の著しい減少をもたらす。
【００２２】
特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも一つの図面が含まれる。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公開のコピーは、要求及び必要な料金の支払いに応じて、特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ−１】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形質芽細胞の分化及び選別法。形質芽細胞は、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＦＮαと共に７日間、ＣｐＧを含有する培養条件下でＣＤ２０＋ＣＤ２７＋記憶Ｂ細胞から分化された。ナイーブＢ細胞（ＣＤ２０＋ＣＤ２７−）、及びＦＡＣＳ選別ＣＤ２０＋ＣＤ２７＋活性化Ｂ細胞及び分化ＣＤ２０ｌｏＣＤ３８＋形質芽細胞が、遺伝子発現プロファイリングに使用された。
【図１Ａ−２】ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形質芽細胞の分化及び選別法形質芽細胞は、サイトカインＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＦＮαと共に７日間、ＣｐＧを含有する培養条件下でＣＤ２０＋ＣＤ２７＋記憶Ｂ細胞から分化された。ナイーブＢ細胞（ＣＤ２０＋ＣＤ２７−）、及びＦＡＣＳ選別ＣＤ２０＋ＣＤ２７＋活性化Ｂ細胞及び分化ＣＤ２０ｌｏＣＤ３８＋形質芽細胞が、遺伝子発現プロファイリングに使用された。
【図１Ｂ】形質芽細胞により特異的に発現した遺伝子のヒートマップ。形質芽細胞によって０．００１のＦＤＲでナイーブＢ細胞及び活性化Ｂ細胞よりも少なくとも１０倍高度に発現され、形質芽細胞で＞５ＲＰＫＭの発現レベルを有した遺伝子が同定された。値は、各遺伝子内で平均０、標準偏差１に標準化された分散安定化データを表す。
【図２Ａ】増加する数の形質芽細胞が追加されたＰＢＭＣ試料の候補形質芽細胞シグネチャー遺伝子のヒートマップ。形質芽細胞は、ヒートマップの上に黒と灰色で示されているように、２人の別々のドナーからのＰＢＭＣにスパイクされた。値は、ＨＰＲＴ１に対する各遺伝子のΔＣｔを表し、平均０及び標準偏差１に標準化されている。
【図２Ｂ−１】各試料に存在する形質芽細胞の割合と比較した、ＨＰＲＴ１に対する形質芽細胞シグネチャー遺伝子又は三つすべての遺伝子の平均の発現レベル。点線及び破線は異なるＰＢＭＣドナーを示し、異なる記号は形質芽細胞の異なるドナーを表す。線形回帰分析を使用して、ＰＢＭＣドナー及び形質芽細胞ドナーをモデルに組み込み、形質芽細胞シグネチャー又はコンポーネント遺伝子の発現を予測した。四つすべてのモデルは、統計的に非常に有意であり、ｐ＜１×１０−１０である。モデルの予測力は、線形モデルからのｒ２として報告された。
【図２Ｂ−２】各試料に存在する形質芽細胞の割合と比較した、ＨＰＲＴ１に対する形質芽細胞シグネチャー遺伝子又は三つすべての遺伝子の平均の発現レベル。点線及び破線は異なるＰＢＭＣドナーを示し、異なる記号は形質芽細胞の異なるドナーを表す。線形回帰分析を使用して、ＰＢＭＣドナー及び形質芽細胞ドナーをモデルに組み込み、形質芽細胞シグネチャー又はコンポーネント遺伝子の発現を予測した。四つすべてのモデルは、統計的に非常に有意であり、ｐ＜１×１０−１０である。モデルの予測力は、線形モデルからのｒ２として報告された。
【図２Ｂ−３】各試料に存在する形質芽細胞の割合と比較した、ＨＰＲＴ１に対する形質芽細胞シグネチャー遺伝子又は三つすべての遺伝子の平均の発現レベル。点線及び破線は異なるＰＢＭＣドナーを示し、異なる記号は形質芽細胞の異なるドナーを表す。線形回帰分析を使用して、ＰＢＭＣドナー及び形質芽細胞ドナーをモデルに組み込み、形質芽細胞シグネチャー又はコンポーネント遺伝子の発現を予測した。四つすべてのモデルは、統計的に非常に有意であり、ｐ＜１×１０−１０である。モデルの予測力は、線形モデルからのｒ２として報告された。
【図２Ｂ−４】各試料に存在する形質芽細胞の割合と比較した、ＨＰＲＴ１に対する形質芽細胞シグネチャー遺伝子又は三つすべての遺伝子の平均の発現レベル。点線及び破線は異なるＰＢＭＣドナーを示し、異なる記号は形質芽細胞の異なるドナーを表す。線形回帰分析を使用して、ＰＢＭＣドナー及び形質芽細胞ドナーをモデルに組み込み、形質芽細胞シグネチャー又はコンポーネント遺伝子の発現を予測した。四つすべてのモデルは、統計的に非常に有意であり、ｐ＜１×１０−１０である。モデルの予測力は、線形モデルからのｒ２として報告された。
【図２Ｃ−１】ＨＰＲＴ１に対する形質芽細胞遺伝子の相対的発現、又はインフルエンザワクチン接種の１週間後の健康なドナーから単位されたＢ細胞集団で測定された三つすべてのシグネチャー遺伝子の平均。Ｎ＝ナイーブＢ細胞、Ｍ＝記憶Ｂ細胞、ＰＢ＝形質芽細胞。形質芽細胞は、他の集団と比較して、マーカー遺伝子の発現が最も高い。星印は、共変量としてドナーを含む線形回帰を使用して、Ｂ細胞集団間の差の統計的有意性を示す；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図２Ｃ−２】ＨＰＲＴ１に対する形質芽細胞遺伝子の相対的発現、又はインフルエンザワクチン接種の１週間後の健康なドナーから単位されたＢ細胞集団で測定された三つすべてのシグネチャー遺伝子の平均。Ｎ＝ナイーブＢ細胞、Ｍ＝記憶Ｂ細胞、ＰＢ＝形質芽細胞。形質芽細胞は、他の集団と比較して、マーカー遺伝子の発現が最も高い。星印は、共変量としてドナーを含む線形回帰を使用して、Ｂ細胞集団間の差の統計的有意性を示す；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図２Ｃ−３】ＨＰＲＴ１に対する形質芽細胞遺伝子の相対的発現、又はインフルエンザワクチン接種の１週間後の健康なドナーから単位されたＢ細胞集団で測定された三つすべてのシグネチャー遺伝子の平均。Ｎ＝ナイーブＢ細胞、Ｍ＝記憶Ｂ細胞、ＰＢ＝形質芽細胞。形質芽細胞は、他の集団と比較して、マーカー遺伝子の発現が最も高い。星印は、共変量としてドナーを含む線形回帰を使用して、Ｂ細胞集団間の差の統計的有意性を示す；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図２Ｃ−４】ＨＰＲＴ１に対する形質芽細胞遺伝子の相対的発現、又はインフルエンザワクチン接種の１週間後の健康なドナーから単位されたＢ細胞集団で測定された三つすべてのシグネチャー遺伝子の平均。Ｎ＝ナイーブＢ細胞、Ｍ＝記憶Ｂ細胞、ＰＢ＝形質芽細胞。形質芽細胞は、他の集団と比較して、マーカー遺伝子の発現が最も高い。星印は、共変量としてドナーを含む線形回帰を使用して、Ｂ細胞集団間の差の統計的有意性を示す；＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図２Ｄ−１】形質芽細胞シグネチャー及びコンポーネント遺伝子は、ループス患者の血液中のＦＡＣＳによって測定される形質芽細胞の頻度と相関している。ＩｇＤ−ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋＋ＣＤ３８＋＋形質芽細胞は、合計９６の試料について、３つの時点で４３人の患者の全血細胞の割合として測定された、ＲＮＡシークエンシングデータを付随している。遺伝子発現値は、個々の遺伝子のＲＰＫＭとして、又は３遺伝子シグネチャーの幾何平均ＲＰＫＭとして表される。相関係数は、スピアマンの順位法を使用して計算された。
【図２Ｄ−２】形質芽細胞シグネチャー及びコンポーネント遺伝子は、ループス患者の血液中のＦＡＣＳによって測定される形質芽細胞の頻度と相関している。ＩｇＤ−ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋＋ＣＤ３８＋＋形質芽細胞は、合計９６の試料について、３つの時点で４３人の患者の全血細胞の割合として測定された、ＲＮＡシークエンシングデータを付随している。遺伝子発現値は、個々の遺伝子のＲＰＫＭとして、又は三つの遺伝子シグネチャーの幾何平均ＲＰＫＭとして表される。相関係数は、スピアマンの順位法を使用して計算された。
【図２Ｄ−３】形質芽細胞シグネチャー及びコンポーネント遺伝子は、ループス患者の血液中のＦＡＣＳによって測定される形質芽細胞の頻度と相関している。ＩｇＤ−ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋＋ＣＤ３８＋＋形質芽細胞は、合計９６の試料について、３つの時点で４３人の患者の全血細胞の割合として測定された、ＲＮＡシークエンシングデータを付随している。遺伝子発現値は、個々の遺伝子のＲＰＫＭとして、又は三つの遺伝子シグネチャーの幾何平均ＲＰＫＭとして表される。相関係数は、スピアマンの順位法を使用して計算された。
【図２Ｄ−４】形質芽細胞シグネチャー及びコンポーネント遺伝子は、ループス患者の血液中のＦＡＣＳによって測定される形質芽細胞の頻度と相関している。ＩｇＤ−ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋＋ＣＤ３８＋＋形質芽細胞は、合計９６の試料について、３つの時点で４３人の患者の全血細胞の割合として測定された、ＲＮＡシークエンシングデータを付随している。遺伝子発現値は、個々の遺伝子のＲＰＫＭとして、又は３遺伝子シグネチャーの幾何平均ＲＰＫＭとして表される。相関係数は、スピアマンの順位法を使用して計算された。
【図３Ａ】形質芽細胞シグネチャーは、ＳＬＥＤＡＩにより測定される疾患活動性と相関している。値は、ＨＰＲＴ１に対する形質芽細胞シグネチャー遺伝子の平均発現を表す。ＳＬＥＤＡＩ及び形質芽細胞シグネチャー値は、処置開始前に回収された試料からのものである。相関係数は、スピアマンの順位法を使用して決定された。
【図３Ｂ−１】ＳＬＥＤＡＩ複合インデックスの個々の構成要素は、形質芽細胞シグネチャー遺伝子の発現の増加に関連している。線形回帰を使用して、それぞれの症候を示した患者と症候を示さなかった患者との間の統計的優位性を評価した；星印はこの試験における有意性レベルを示す：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図３Ｂ−２】ＳＬＥＤＡＩ複合インデックスの個々の構成要素は、形質芽細胞シグネチャー遺伝子の発現の増加に関連している。線形回帰を使用して、それぞれの症候を示した患者と症候を示さなかった患者との間の統計的優位性を評価した；星印はこの試験における有意性レベルを示す：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図３Ｂ−３】ＳＬＥＤＡＩ複合インデックスの個々の構成要素は、形質芽細胞シグネチャー遺伝子の発現の増加に関連している。線形回帰を使用して、それぞれの症候を示した患者と症候を示さなかった患者との間の統計的優位性を評価した；星印はこの試験における有意性レベルを示す：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図３Ｃ−１】血清Ｃ３及びＣ４補体レベル並びに血清抗ｄｓＤＮＡ抗体価は、形質芽細胞シグネチャー発現と相関している。相関係数は、スピアマンの順位法を使用して計算された。
【図３Ｃ−２】血清Ｃ３及びＣ４補体レベル並びに血清抗ｄｓＤＮＡ抗体価は、形質芽細胞シグネチャー発現と相関している。相関係数は、スピアマンの順位法を使用して計算された。
【図３Ｃ−３】血清Ｃ３及びＣ４補体レベル並びに血清抗ｄｓＤＮＡ抗体価は、形質芽細胞シグネチャー発現と相関している。相関係数は、スピアマンの順位法を使用して計算された。
【図３Ｄ−１】全血インターフェロンシグネチャー発現（ＩＳＭ）は、形質芽細胞シグネチャー値と相関している。相関係数は、スピアマンの順位法を使用して計算された。
【図３Ｄ−２】全血インターフェロンシグネチャー発現（ＩＳＭ）は、形質芽細胞シグネチャー値と相関している。相関係数は、スピアマンの順位法を使用して計算された。
【図４Ａ】リツキシマブでの患者の治療は、形質芽細胞シグネチャー発現レベルを減少させる。線は、リツキシマブ治療コホート（破線）又はプラセボコホート（実線）内の平均発現レベルを示し、エラーバーは平均の標準誤差を示す。黒い矢印は、患者が薬物又はプラセボの点滴を受ける時点を示す。形質芽細胞シグネチャー遺伝子の発現は、線形混合効果モデルを使用してモデル化され、年齢、人種／民族、使用された併用薬、インターフェロン活性、ＳＬＥＤＡＩ、治療群及び時点並びにそれらの相互作用が固定効果として、患者がランダム効果として組み込んだ。赤い星印は、リツキシマブ治療群で特異的に著しく異なる時点を示す：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図４Ｂ】ミコフェノール酸及びリツキシマブでの治療は、形質芽細胞シグネチャー発現レベルを独立して減少させる。線は、プラセボコホート（実線）又はリツキシマブ治療コホート（破線）の平均を示し、平均の標準誤差は、エラーバーで示される。矢印は、患者がプラセボ又はリツキシマブの点滴を受ける時点を示す。発現値は、線形混合効果モデルを使用してモデル化され、年齢、インターフェロン活性及び治療群及び検査及びそれらの相互作用を組み込み、患者をランダム硬化として組み込んだ。グラフ上部の星印は、リツキシマブで治療された患者がプラセボ群を下回るベースラインから有意な減少を示した時点を示し、グラフ下部の星印は、治療にかかわらずベースラインとは異なる時点を示す：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図４Ｃ】検出可能な抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）を有した患者は、形質芽細胞マーカー遺伝子のより高い発現を有する。線は、検出可能なＨＡＣＡを有したリツキシマブで治療された患者（実線）、又は検出可能なＨＡＣＡを有しなかったリツキシマブで治療された患者（破線）における形質芽細胞マーカー遺伝子の平均発現を示す。
【図５Ａ】ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）又はメトトレキサート（ＭＴＸ）で治療された患者は、アザチオプリン（ＡＺＡ）で治療された患者よりも低い形質芽細胞発現を示す。形質芽細胞シグネチャー値のスクリーニングは、異なる免疫抑制レジメンの患者との間で比較された。統計的有意性は、ＡＺＡを他の二つの治療のそれぞれと比較して、線形回帰を使用して試験された。星印は、治療間の有意な差異を示す：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図５Ｂ】スクリーニングでＭＭＦ治療を受けている患者は、ＭＭＦ治療を受けなかった患者よりも少ない形質芽細胞シグネチャーを有する傾向にある。ｐ値は、スクリーニング検査時にＭＭＦを受けた患者とＭＭＦを受けていない患者との間の線形回帰を使用して計算された。
【図６Ａ】ＥＸＰＬＯＲＥＲ臨床試験コホートでは、ヨーロッパ人の祖先を有する患者は、他の民族よりも低レベルの形質芽細胞発現を有する。値は、ＨＰＲＴ１に対する形質芽細胞遺伝子の平均発現レベルを表す。スクリーニング検査値は、線形回帰を使用して、自己報告の人種／民族にわたって比較された。星印は、ホワイト／白人として自己報告している患者と比較した差異の有意性を示す：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図６Ｂ】ＬＵＮＡＲ患者は、人種／民族に基づく有意な差異を示さない。線形回帰を使用すると、民族間では有意な差異は観察されなかった。
【図６Ｃ】ＲＯＳＥ臨床試験コホートでは、ヨーロッパ人の祖先を有する患者は、低発現の形質芽細胞マーカーを示す。値は、形質芽細胞遺伝子の幾何平均ＲＰＫＭを表す。スクリーニング検査値は、ｌｏｇ２形質転換平均ＲＰＫＭに対し、線形回帰を使用して、自己報告の人種／民族にわたって比較された。星印は、ホワイト／白人として自己報告している患者と比較した差異の有意性を示す：＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１。
【図７】ＢＴＫ阻害剤ＧＤＣ−０８５２によるＣＤ４０Ｌ媒介形質芽細胞分化の阻害の用量反応曲線は、用量依存方式における形質芽細胞の分化の阻害を示す。４人の健康なドナーの形質芽細胞の割合は、ＦＡＣＳ分析を使用して決定され、各ドナーのＩＣ５０値が計算された。
【図８Ａ】ＢＴＫ阻害は、形質芽細胞遺伝子シグネチャーを減少させる。４人の健康なドナーからの記憶Ｂ細胞を、ＤＭＳＯビヒクル又は３７０ｎＭ  ＧＤＣ−０８５２の存在下で上記の条件を使用して形質芽細胞に分化させた。形質芽細胞シグネチャー遺伝子の発現は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍにより測定され、ハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ１）に正規化された。発現値は、ハウスキーピング遺伝子に対する相対的な転写産物量としてプロットされる。形質芽細胞シグネチャーは、三つの個々の遺伝子の相対的な量の幾何平均として計算された。
【図８Ｂ】ＢＴＫ阻害は、形質芽細胞遺伝子シグネチャーを減少させる。４人の健康なドナーからの記憶Ｂ細胞を、ＤＭＳＯビヒクル又は３７０ｎＭ  ＧＤＣ−０８５２の存在下で上記の条件を使用して形質芽細胞に分化させた。形質芽細胞シグネチャー遺伝子の発現は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍにより測定され、ハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ１）に正規化された。発現値は、ハウスキーピング遺伝子に対する相対的な転写産物量としてプロットされる。形質芽細胞シグネチャーは、三つの個々の遺伝子の相対的な量の幾何平均として計算された。
【図８Ｃ】ＢＴＫ阻害は、形質芽細胞遺伝子シグネチャーを減少させる。４人の健康なドナーからの記憶Ｂ細胞を、ＤＭＳＯビヒクル又は３７０ｎＭ  ＧＤＣ−０８５２の存在下で上記の条件を使用して形質芽細胞に分化させた。形質芽細胞シグネチャー遺伝子の発現は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍにより測定され、ハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ１）に正規化された。発現値は、ハウスキーピング遺伝子に対する相対的な転写産物量としてプロットされる。形質芽細胞シグネチャーは、三つの個々の遺伝子の相対的な量の幾何平均として計算された。
【図８Ｄ】ＢＴＫ阻害は、形質芽細胞遺伝子シグネチャーを減少させる。４人の健康なドナーからの記憶Ｂ細胞を、ＤＭＳＯビヒクル又は３７０ｎＭ  ＧＤＣ−０８５２の存在下で上記の条件を使用して形質芽細胞に分化させた。形質芽細胞シグネチャー遺伝子の発現は、Ｆｌｕｉｄｉｇｍにより測定され、ハウスキーピング遺伝子（ＨＰＲＴ１）に正規化された。発現値は、ハウスキーピング遺伝子に対する相対的な転写産物量としてプロットされる。形質芽細胞シグネチャーは、三つの個々の遺伝子の相対的な量の幾何平均として計算された。
【図９】形質芽細胞遺伝子発現は、形質芽細胞の細胞数と相関している。ＦＡＣＳ分析により決定される形質芽細胞の割合は、図８Ｄ（スピアマンロー＝０．８１）で決定されるように、形質芽細胞シグネチャーと相関している。白い点はＤＭＳＯの存在下で分化された試料を示し、黒い点はＧＤＣ−０８５２で処置された試料を表す。
【図１０】ＢＴＫ阻害剤ＧＤＣ−０８５２は、用量依存方式でＣｐＧ媒介形質芽細胞の分化を阻害する。４人の健康なドナーの形質芽細胞の割合は、ＦＡＣＳ分析を使用して決定され、各ドナーのＩＣ５０値が計算された。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
Ｉ．定義
本明細書で互換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、或いはＤＮＡ若しくはＲＮＡポリメラーゼにより、又は合成反応によりポリマー中に取り込み可能な任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは合成後に標識とのコンジュゲーションによるなどして更に修飾されてもよい。この他の修飾の種類は、例えば「キャップ（ｃａｐ）」、天然の一又は複数のヌクレオチドの類似体での置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電結合（例：メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）を有するもの及び荷電結合（例：ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質（例：クレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ−Ｌ−リジン等）を含有するもの、インターカレーター（例：アクリジン、プソラレン等）を有するもの、キレート剤（例：金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属等）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾された結合（例：アルファアノマー核酸等）を有するもの、並びにポリヌクレオチド（類）の未修飾形態を含む。更に、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えば、ホスホン酸基、リン酸基で置き換えられてもよく、標準的な保護基により保護されてもよく、又は更なるヌクレオチドへの更なる結合を作るように活性化されてもよく、又は固体若しくは半固体支持体にコンジュゲートされていてもよい。５’及び３’末端のＯＨはリン酸化され得、又はアミン若しくは１から２０の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換され得る。また他のヒドロキシル類は標準的な保護基に誘導体化されてもよい。またポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のもの、例えば２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−又は２’−アジド−リボース、炭素環式糖の類似体、α−アノマー糖類、エピマー糖類（例えばアラビノース）、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖類、フラノース糖類、セドヘプツロース類、非環式類似体、及び脱塩基性ヌクレオシド類似体（例えばメチルリボシド）も含有し得る。一又は複数のホスホジエステル結合は代替の結合基で置換され得る。こうした代替の結合基は、限定されはないが、ホスファートがＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、「（Ｏ）ＮＲ２（「アミダート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ又はＣＨ２（「ホルムアセタール」）で置換される実施態様のものを含み、ここで各Ｒ又はＲ’は独立にＨであるか、又は、場合によってエーテル（−Ｏ−）結合を含んでいてもよい置換若しくは非置換のアルキル（１−２０Ｃ）、アリ���ル、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）である。ポリヌクレオチド中のすべての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含めた、本明細書で言及されるすべてのポリヌクレオチドに適用される。
【００２５】
「オリゴヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、概して、長さが約２５０ヌクレオチド未満である（必ずしもそうではない）、短い一本鎖ポリヌクレオチドを指す。オリゴヌクレオチは合成でもよい。用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」は相互に排他的ではない。ポリヌクレオチドについての上記の説明は、等しく十分にオリゴヌクレオチドにも適用可能である。
【００２６】
用語「プライマー」は、通常、遊離３’−ＯＨ基を提供することによって、核酸にハイブリダイズし、その後相補的な核酸を重合することができる一本鎖ポリヌクレオチドを指す。
【００２７】
用語「小分子」とは、約２０００ダルトン以下、好ましくは５００ダルトン以下の分子量を有する任意の分子を指す。
【００２８】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養物」は互換的に使用され、外因性の核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含める。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換された細胞」を含み、継代の数に関係なく、それに由来する一次形質転換細胞及び子孫が含まれる。子孫は親細胞と核酸含量が完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。本明細書には、最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異型子孫が含まれる。
【００２９】
本明細書で使用される用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を伝播することができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。ある種のベクターは、それが作動可能に連結された核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と言う。
【００３０】
「単離された」抗体とは、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施態様において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）により決定されるように、９５％以上又は９９％の純度に精製される。抗体純度の評価法の総説としては、例えばFlatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００３１】
「単離された」核酸とは、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、核酸分子を通常含む細胞に含まれる核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外又はその自然の染色体上の位置とは異なる染色体位置に存在している。
【００３２】
本明細書における用語「抗体」は最も広い意味で用いられ、種々の抗体構造を包含し、限定されるものではない、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び、所望の抗原結合活性を示す限り、抗体断片を含む。
【００３３】
「阻止」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物活性を阻害又は低減する抗体である。好ましい阻止抗体又はアンタゴニスト抗体は、実質的に又は完全に抗原の生物活性を阻害する。
【００３４】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強度を指す。本明細書では、特に明記しない限り、「結合親和性」は、結合対（例えば抗体と抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。一般的に、分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、解離定数（ｋｄ）によって表される。親和性は、本明細書に記載したものを含む、当技術分野で知られている一般的な方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための具体的な説明的且つ例示的な実施態様は、以下で説明される。
【００３５】
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較して、一又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）に一又は複数の変化があり、かかる変化が抗原に対する抗体の親和性の改善をもたらす抗体を指す。
【００３６】
用語「検出」は、直接的及び間接的な検出を含む検出する任意の手段を含む。
【００３７】
本明細書で使用される用語「バイオマーカー」は、試料中で検出することができる、例えば、予測、診断及び／又は予後の指標である。バイオマーカーは、特定の分子、病理学、組織学的及び／又は臨床的特徴により特徴づけられた疾患又は障害（例えば、がん）の特定のサブタイプの指標として機能し得る。いくつかの実施態様では、バイオマーカーは遺伝子である。バイオマーカーには、限定されないが、ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）、ポリペプチド、ポリペプチド及びポリヌクレオチド修飾物、糖、及び／又は糖脂質ベースの分子マーカーが含まれる。
【００３８】
用語「バイオマーカーシグネチャー」、「シグネチャー」、「バイオマーカー発現シグネチャー」又は「発現シグネチャー」は、本明細書では区別せずに使用され、その発現が例えば予測、診断、及び／又は予後の指標であるバイオマーカーの一つ又は組み合わせを指す。バイオマーカーシグネチャーは、特定の分子、病理学、組織学的及び／又は臨床的特徴により特徴づけられた疾患又は障害（例えば、がん）の特定のサブタイプの指標として機能し得る。いくつかの実施態様では、バイオマーカーシグネチャーは「遺伝子シグネチャー」である。用語「遺伝子シグネチャー」は、「遺伝子発現シグネチャー」と区別せずに使用され、その発現が例えば予測、診断及び／又は予後の指標であるポリヌクレオチドの一つ又は組み合わせを指す。いくつかの実施態様では、バイオマーカーシグネチャーは「タンパク質シグネチャー」である。用語「タンパク質シグネチャー」は、「タンパク質発現シグネチャー」と区別せずに使用され、その発現が例えば予測、診断、及び／又は予後の指標であるポリペプチドの一つ又は組み合わせを指す。
【００３９】
個体に対する臨床的恩恵の増加に関連するバイオマーカーの「量」又は「レベル」は、生物学的試料中で検出可能なレベルである。これらは、当業者に既知で、本明細書に開示の方法により測定され得る。評価されるバイオマーカーの発現レベル又は量は、治療に対する応答を決定するために使用することができる。
【００４０】
用語「発現のレベル」又は「発現レベル」は、通常区別せずに使用され、一般的に、生物学的試料中のバイオマーカーの量を指す。「発現」は、一般的に、情報（例えば遺伝子コード及び／又はエピジェネティック）が、細胞中に存在し作用する構造に変換されるプロセスを指す。したがって、本明細書で使用される場合、「発現」とは、ポリヌクレオチドへの転写、ポリペプチドへの翻訳、又はポリヌクレオチド及び／又はポリペプチドの修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）を意味し得る。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたポリペプチド、又はポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）の断片もまた、選択的スプライシングにより生成された転写物、又は分解された転写物に由来するか、又は例えばタンパク質分解によるポリペプチドの翻訳後プロセシングに由来しようが、発現したとみなされる。「発現した遺伝子」は、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写され、ついでポリペプチドに翻訳されたもの、及びＲＮＡに転写はされたが、ポリペプチドには翻訳されていないもの（例えば、転移ＲＮＡ及びリボソームＲＮＡ）を含む。
【００４１】
「増大した発現」、「増大した発現レベル」又は「増大したレベル」とは、疾患又は障害（例えばがん）に罹患していない個体などのコントロール又は内部コントロール（例えばハウスキーピングバイオマーカー）に対する個体のバイオマーカーの増加した発現又は増加したレベルを指す。
【００４２】
「減少した発現」、「減少した発現レベル」又は「減少したレベル」とは、疾患又は障害（例えばがん）に罹患していない個体などのコントロール又は内部コントロール（例えばハウスキーピングバイオマーカー）に対する個体のバイオマーカーの減少した発現又は減少したレベルを指す。いくつかの実施態様では、減少した発現は、発現があまりないか、発現がまったくない。
【００４３】
いくつかの実施態様では、用語「基準レベルで」とは、基準レベルと本質的に同一である個体又は患者からの試料中のバイオマーカーのレベル、又は最大１％、最大２％、最大３％、最大４％、最大５％基準レベルと異なるレベルを指す。いくつかの実施態様では、基準レベルは基準集団中のバイオマーカーの中央レベルである。いくつかの実施態様では、マーカーの基準レベルは基準集団中のマーカーの平均レベルである。いくつかの実施態様では、マーカーの基準レベルは基準集団中のマーカーの平均レベルである。
【００４４】
特定の実施態様では、用語「基準レベルを超える」とは、基準レベルと比較して、上記の方法により決定された、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％以上基準レベルを超える個体又は患者からの試料中のバイオマーカーのレベルを指す。いくつかの実施態様では、基準レベルは基準集団中の中央レベルである。いくつかの実施態様では、マーカーの基準レベルは基準集団中のマーカーの平均レベルである。
【００４５】
特定の実施態様では、用語「基準レベルを超える」とは、基準レベルと比較して、上記の方法により決定された、少なくとも５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％以上基準レベル未満の個体又は患者からの試料中のバイオマーカーのレベルを指す。いくつかの実施態様では、基準レベルは基準集団中の中央レベルである。いくつかの実施態様では、マーカーの基準レベルは基準集団中のマーカーの平均レベルである。いくつかの実施態様では、マーカーの基準レベルは基準集団中のマーカーの平均レベルである。
【００４６】
用語「ハウスキーピング遺伝子」とは、典型的に全ての細胞型に同様に存在するバイオマーカー又はバイオマーカー群（例えば、ポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド）を指す。いくつかの実施態様では、ハウスキーピングバイオマーカーは、「ハウスキーピング遺伝子」である。本明細書では「ハウスキーピング遺伝子」とは、その活性が細胞機能の維持に不可欠であり、典型的に全ての細胞型に同様に存在するタンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子群を指す。
【００４７】
「増幅」とは、本明細書で使用される場合、概して、所望の配列の複数のコピーを生成するプロセスを指す。「複数のコピー」とは、少なくとも二つのコピーを意味する。「コピー」は、鋳型配列に対して必ずしも完全な配列相補性又は同一性を意味するものではない。例えば、コピーは、デオキシイノシン等のヌクレオチド類似体、意図的な配列改変（例えば、鋳型とハイブリダイズ可能だが相補的ではない配列を含むプライマーを介して導入される配列変化）及び／又は増幅の間に発生する配列の誤りを含み得る。
【００４８】
用語「多重ＰＣＲ」は、単一の反応内で二以上のＤＮＡ配列を増幅する目的で複数のプライマーセットを使用して、単一の供給源（例えば、個体）から得られた核酸上で実施される単一のＰＣＲ反応を指す。
【００４９】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は、当業者であれば容易に決定することができ、通常はプローブ長、洗浄温度、及び塩濃度に基づく経験的計算である。通常、プローブが長いほど、適切なアニーリングに高い温度が必要であり、プローブが短い程温度は低くてよい。ハイブリダイゼーションは、通常、変性ＤＮＡの、相補鎖がその溶解温度未満の環境中に存在するときに再アニーリングする能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能配列との間の所望の相同性度が高い程、使用可能な相対温度が高くなる。結果として、相対温度が高い程反応条件のストリンジェンシーが高まる傾向があり、低い程その傾向が小さくなる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーの更なる詳細及び説明については、Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley IntersciencePublishers, (1995)を参照されたい。
【００５０】
本明細書に定義される「ストリンジェントな条件」又は「高ストリンジェンシー条件」は、以下のように指定される。（１）洗浄に、低いイオン強度と高い温度、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いること；（２）ハイブリダイゼーション中に、４２℃で、ホルムアミドのような変性剤、例えば、０．１％のウシ血清アルブミンを含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のフィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ６．５）を用いること；又は（３）５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハート液、超音波分解したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、及び１０％デキストラン硫酸塩を用いた４２℃の溶液中において一晩ハイブリダイズし、０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）中において４２℃で１０分間洗浄した後、５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンシー洗浄を１０分間行うこと。
【００５１】
「中程度にストリンジェントな条件」は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989によって記載されているように指定することができ、上述したものよりストリンジェンシーの低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件（例えば、温度、イオン強度、及び％ＳＤＳ）の使用を含む。中程度にストリンジェントな条件の例は、２０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５×デンハート溶液、１０％の硫酸デキストラン、及び２０ｍｇ／ｍｌの変性せん断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中において３７℃で一晩インキュベートした後、約３７〜５０℃の１×ＳＳＣでフィルタを洗浄することである。当業者であれば、プローブ長などの要因に適合させるために必要な温度、イオン強度などの調節方法を認識するであろう。
【００５２】
用語「診断」は、本明細書では、分子又は病理学的状態、疾患又は病態（例えば、がん）の同定又は分類を意味するために用いられる。例えば、「診断」は、特定の種類のがんの同定を指してもよい。「診断」はまた、例えば組織病理学的な基準による、又は分子的特徴（例えば、バイオマーカー（例えば特定の遺伝子又は前記遺伝子によりコードされるタンパク質）の一又はそれらの組み合わせの発現により特徴づけられるサブタイプ）によるがんの特定のサブタイプの分類も意味し得る。
【００５３】
用語「診断を支援する」とは、例えば疾患又は障害（例えば、がん）の症状又は病態の特定のタイプの存在又は性質に関する臨床判断を下すのに役立つ方法を指すために本明細書中で使用される。例えば、疾患又は病態（例えば、がん）の診断を支援する方法は、個体からの生物学的試料中の特定のバイオマーカーを測定することを含み得る。
【００５４】
本明細書で使用される用語「試料」は、例えば、物理的、生化学的、化学的及び／又は生理学的特性に基づいて特徴付けられる及び／又は同定される細胞実体及び／又は他の分子実体を含有する、目的の対象及び／又は個体から得られるか又は由来する組成物を指す。例えば、「疾患試料」及びその変形は、特徴づけられる細胞及び／又は分子実体を含有することが予想されるか又は含有すると知られる、関係する対象から得られる任意の試料を指す。試料は、限定されないが、初代若しくは培養細胞又は細胞株、細胞上清、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、硝子体液、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、乳、全血、血液由来細胞、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液、腫瘍溶解物、及び組織培養培地、組織抽出物、例えば均質化組織、腫瘍組織、細胞抽出物、並びにそれらの組み合わせを含む。
【００５５】
「組織試料」又は「細胞試料」は、対象又は個体の組織から得られた類似の細胞の集合を意味する。組織試料又は細胞試料の供給源は、新鮮な、冷凍の、及び／又は保存された器官、組織試料、生検、及び／又は吸引物由来の固体組織；血液又は血漿のような何らかの血液成分；脳脊髄液、羊水、腹水、又は間質液のような体液；対象の妊娠又は発育の任意の時期に由来する細胞であり得る。組織試料は、初代若しくは培養細胞又は細胞株でもよい。任意選択的に、組織又は細胞試料は疾患組織／器官から得られる。組織試料は、本質的に組織と自然に混在しない化合物、例えば、防腐剤、抗凝血剤、緩衝剤、定着剤、栄養剤、抗生物質などを含む場合がある。
【００５６】
本明細書で使用される「基準試料」、「基準細胞」、「基準組織」、「コントロール試料」、「コントロール細胞」、又は「コントロール組織」は、比較を目的として使用される試料、細胞、組織、標準、又はレベルを指す。一実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、同じ対象又は個体の身体（例えば、組織又は細胞）の健常な及び／又は非疾患性の部分から得られる。例えば、健常な及び／又は非疾患性の細胞又は組織は、疾患細胞又は組織に隣接している（例えば、腫瘍に隣接する細胞又は組織）。別の実施態様では、基準試料は同じ対象又は個体の身体の未処理組織及び／又は細胞から得られる。また別の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、対象又は個体ではない個体の身体（例えば、組織又は細胞）の、健常な及び／又は非疾患性の部分から得られる。さらに別の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、対象又は個体ではない個体の身体の未処理組織及び／又は細胞から得られる。
【００５７】
本明細書の目的のために、組織標本の「切片」は、組織標本の単一の部分又は片、例えば、組織標本から切り出した組織又は細胞の薄片を意味する。組織試料の同じ切片が形態レベル及び分子レベルの両方で分析され得るか、又はポリペプチドとポリヌクレオチドの両方に関して分析され得ることが理解されれば、組織試料の複数の切片が採取され、分析され得ることが理解される。
【００５８】
「相関」又は「相関する」は、任意の方法で、第一の分析又はプロトコールの成績及び／又は結果を、第二の分析又はプロトコールの成績及び／又は結果と比較することを意味する。例えば、第二のプロトコールを行う際に第一の分析又はプロトコールの結果を用いてもよいし、及び／又は第一の分析又はプロトコールの結果を用いて、第二の分析又はプロトコールを行うかどうかを決定してもよい。ポリヌクレオチド分析又はプロトコールの実施態様に関して、特定の治療法を実施すべきかどうかを決定するためにポリヌクレオチド発現分析又はプロトコールの結果を使用してもよい。
【００５９】
「個体応答」又は「応答」は、（１）ある程度の疾患進行（例えばがんの進行）の阻害（遅延及び完全停止を含む）；（２）腫瘍サイズの縮小；（３）隣接する周辺器官及び／又は組織へのがん細胞浸潤の阻害（すなわち、縮小、遅延又は完全停止）；（４）転移の阻害（すなわち、縮小、遅延又は完全停止；（５）疾患又は障害（例えばがん）に関連する一又は複数の症候のある程度の軽減；（６）無増悪生存の長さの増加；及び／又は（９）治療後の所与の時点での死亡率の減少を含むが、これらに限定されない、個体にとっての利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価され得る。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「実質的に同じ」は、当業者が、二つの値の間の差異が、前記値（例えばＫｄ値又は発現）によって測定される生物学的特性という文脈において、殆ど又は全く生物学的及び／又は統計学的有意性を持たないと考慮するために、二つの数値間の類似性が十分に高いことを指す。前記二つの値の間の差異は、基準／比較値に応じて、例えば約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、及び／又は約１０％未満である。
【００６１】
本明細書で用いられる表現「実質的に異なる」は、当業者が、二つの値の間の差異が、前記値（例えばＫｄ値）によって測定される生物学的特性という文脈において、統計学的有意性を持つと考慮するために、二つの数値間の差異が十分に大きいことを指す。前記二つの値の間の差異は、参照／比較分子の値に応じて、例えば約１０％より大きい、約２０％より大きい、約３０％より大きい、４０％より大きい、及び／又は約５０％より大きい。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「標識」という語は、検出可能な化合物又は組成物を指す。標識は、典型的にポリヌクレオチドプローブ又は抗体などの試薬に直接的若しくは間接的にコンジュゲート又は縮合しており、コンジュゲート又は縮合している試薬の検出を容易にする。標識は、それ自体が検出可能（例えば放射性同位元素標識又は蛍光標識）なもの、又は酵素標識の場合、検出可能な生成物をもたらす基質化合物又は組成物の化学変成を触媒するものであってもよい。
【００６３】
薬剤の「有効量」とは、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な用量及び期間において有効な量を指す。
【００６４】
物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの「治療的有効量」は、個体の病状、年齢、性別及び体重、また、個体に所望の反応を引き出すための物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力等の要因によって変わり得る。また、治療的有効量とは、物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの毒性又は有害作用よりも治療的に有益な作用が上回る量である。「予防的有効量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な用量及び期間での、有効な量を指す。必ずではないが、通常、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に対象に使用されるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。
【００６５】
用語「薬学的製剤」は、その中に含有される活性成分の生物学的活性が有効になることを可能にするような形態であって、製剤が投与される対象にとって許容できない毒性を有する他の成分を含まない調製物を指す。
【００６６】
「薬学的に許容される担体」は、対象に非毒性であり、有効成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体は、限定されないが、バッファー、添加剤、安定剤、又は保存剤を含む。
【００６７】
本明細書で用いられる場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及び「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」など、その文法的変形）は、治療されている個体の自然経過を変えようと試みる臨床的介入を指し、予防のため、又は臨床病理の過程において実施されうる。治療の望ましい効果には、限定されないが、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的帰結の縮小、転移を予防すること、疾患の進行の速度を遅らせること、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。いくつかの実施態様では、抗体は、疾患の発症を遅延させるか又は疾患の進行を遅くするために使用される。
【００６８】
本明細書において使用される用語「プロドラッグ」は、親薬物と比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、且つ酵素的に活性化可能若しくは更に活性な親形態に変換可能な薬学的に活性な物質の前駆体若しくは誘導体形態を指す。例えば、Wilman, “Prodrugs in Cancer Chemotherapy” Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) 及び Stella et al., “Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery,” Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985)を参照のこと。本発明のプロドラッグには、限定されないが、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、硫酸塩含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾されたプロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、置換されていてもよいフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ若しくは置換されていてもよいフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、更に活性な細胞傷害性のない薬物に変換可能な５−フルオロサイトシン及びその他５−フルオロウリジンプロドラッグが含まれる。本発明における使用のためにプロドラッグ形態に誘導化することのできる細胞傷害性薬物の例には、限定されないが、上記のような化学療法剤が含まれる。
【００６９】
「個体」又は「対象」とは、哺乳動物である。哺乳動物は、限定されるものではないが、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えばヒト、及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）を含む。特定の実施態様では、個体又は対象はヒトである。
【００７０】
用語「同時に」とは、投与の少なくとも一部が時間的に重複する二つ以上の治療剤の投与を指すために本明細書で使用される。したがって、同時投与には、一又は複数の薬剤の投与が、一又は複数の他の薬剤の投与を中断した後に継続する投与計画が含まれる。
【００７１】
「低減する又は阻害する」とは、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の全体的減少を引き起こす能力を意味する。低減する又は阻害するとは、治療する疾患の症状、転移の存在又は大きさ、又は原発腫瘍の大きさに言及することができる。
【００７２】
「添付文書」という用語は、治療製品の商品包装に通例含まれる説明書を指すのに用いられ、そのような治療製品の適応症、用法、用量、投与、併用療法、使用に関する禁忌及び／又は注意事項についての情報を含む。
【００７３】
「製造品」は、少なくとも一つの試薬、例えば疾患又は障害（例えばがん）の治療のための医薬又は本明細書に記載のバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含む任意の製造物（例えばパッケージ又は容器）又はキットである。特定の実施態様では、製造品又はキットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして、奨励され、流通され、又は販売される。
【００７４】
本明細書で使用される場合、語句「〜に基づく」とは、一又は複数のバイオマーカーについての情報が、治療決定、添付文書に提供される情報、又は販売／プロモーションガイダンス等の情報提供のために使用されることを意味する。
【００７５】
当業者によって理解されるように、本明細書において値又はパラメーター「について」という場合、その値又はパラメーター自体を対象とする実施態様を含む（記載する）。例えば、「Ｘについて」との記載には「Ｘ」の記載が含まれる。
【００７６】
本明細書に記載される態様及び実施態様は、態様及び実施態様「からなる」及び／又は「から本質的になる」ことを含む。本明細書で使用されるように、単数形の「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に指示がない限り、複数への言及を含む。
【００７７】
ＩＩ．方法及び使用
本明細書では、形質芽細胞バイオマーカーを利用する方法が提供される。特に、ＢＴＫ阻害剤及び形質芽細胞バイオマーカーを利用する方法が提供される。例えば、個体が形質芽細胞バイオマーカーの存在及び／又は増大したレベルを有することが発見された場合に治療的有効量のＢＴＫ阻害剤を個体に投与することを含む、疾患又は障害を有する個体を治療するための方法が提供される。さらに、個体における疾患又は障害を治療するための方法であって、個体からの試料が増大したレベルの形質芽細胞バイオマーカーを含むことを決定すること、及び有効量のＢＴＫ阻害剤を個体に投与することにより、疾患及び障害が治療されることを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーは、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる遺伝子シグネチャーの群より選択される。いくつかの実施態様では、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５の遺伝子発現は、基準レベルに対する患者の血液中の前記遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定することにより決定される。ポリペプチド発現である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は、自己免疫又は炎症性疾患又は障害である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はＳＬＥである。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はループス腎炎である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は腎外ループスである。
【００７８】
個体に有効量のＢＴＫ阻害剤を提供することを含む個体における疾患又は障害を治療する方法であって、治療が、個体からの試料中の形質芽細胞バイオマーカーの存在及び／又は増大したレベルに基づく、方法が提供される。いくつかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーは、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５の一又は複数の発現である。いくつかの実施態様では、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５の遺伝子発現は、基準レベルに対する患者の血液中の前記遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定することにより決定される。ポリペプチド発現である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は、自己免疫又は炎症性疾患又は障害である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はＳＬＥである。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はループス腎炎である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は腎外ループスである。
【００７９】
さらに、形質芽細胞バイオマーカーの存在及び／又はレベルを決定すること、及びバイオマーカーの存在及び／又はレベルに基づき医薬を選択することを含む、疾患又は障害を有する個体のための治療を選択するための方法が提供される。いくつかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーの増大したレベルに基づいて、医薬が選択される。いくつかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーは、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる遺伝子シグネチャーの群より選択される。いくつかの実施態様では、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５の遺伝子発現は、基準レベルに対する患者の血液中の前記遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定することにより決定される。ポリペプチド発現である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は、自己免疫又は炎症性疾患又は障害である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はＳＬＥである。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はループス腎炎である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は腎外ループスである。
【００８０】
本明細書では、個体からの試料中の形質芽細胞バイオマーカーの存在及び／又はレベルを決定することを含む、ＢＴＫ阻害剤を含む治療による恩恵を示しやすいか又は示しにくい、疾患又は障害を有する個体を同定する方法であって、試料中の形質芽細胞バイオマーカーの存在及び／又は増大したレベルが、個体がＢＴＫ阻害剤を含む治療からの恩恵をより示しやすいことを示し、又は形質芽細胞バイオマーカーの不存在及び／又は減少したレベルが、個体がＢＴＫ阻害剤を含む治療からの恩恵を示しにくいことを示す、方法が提供される。いくつかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーは、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる遺伝子シグネチャーの群より選択される。いくつかの実施態様では、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５の遺伝子発現は、基準レベルに対する患者の血液中の前記遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定することにより決定される。ポリペプチド発現である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は、自己免疫又は炎症性疾患又は障害である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はＳＬＥである。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はループス腎炎である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は腎外ループスである。
【００８１】
本明細書では、ＢＴＫ阻害剤を受けるために疾患又は障害を有する個体を同定するためのアッセイであって、該方法が以下を含むアッセイも提供される。（ａ）個体からの試料において、形質芽細胞バイオマーカーの存在及び／又はレベルを決定すること；（ｂ）形質芽細胞バイオマーカーの存在及び／又はレベルに基づいてＢＴＫ阻害剤を推奨すること。いくつかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーの増大したレベルに基づいて、ＢＴＫ阻害剤が推奨される。いくつかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーは、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる遺伝子シグネチャーの群より選択される。いくつかの実施態様では、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５の遺伝子発現は、基準レベルに対する患者の血液中の前記遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定することにより決定される。ポリペプチド発現である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は、自己免疫又は炎症性疾患又は障害である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はＳＬＥである。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はループス腎炎である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は腎外ループスである。
【００８２】
本明細書では、疾患又は障害を有する個体からの試料中の形質芽細胞のバイオマーカーのレベルを決定するための一又は複数の試薬を含む診断キットであって、形質芽細胞バイオマーカーの存在及び／又は増大したレベルの検出が、個体がＢＴＫ阻害剤で治療されるときの有効性の増加を意味し、形質芽細胞バイオマーカーの低レベル又は実質的に検出不可能なレベルの検出が、疾患を有する個体がＢＴＫ阻害剤で治療されるときの有効性の減少を意味する、診断キットが提供される。本明細書では、また、一緒に包装される、ＢＴＫ阻害剤を含む薬学的組成物と、ＢＴＫ阻害剤は、形質芽細胞バイオマーカーの発現に基づく疾患又は障害を有する患者を治療するためのものであることを示す添付文書とを含む製造品も提供される。いくつかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーは、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる遺伝子シグネチャーの群より選択される。いくつかの実施態様では、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５の遺伝子発現は、基準レベルに対する患者の血液中の前記遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定することにより決定される。ポリペプチド発現である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は、自己免疫又は炎症性疾患又は障害である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はＳＬＥである。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はループス腎炎である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は腎外ループスである。
【００８３】
さらに、本明細書では、個体に有効量のＢＴＫ阻害剤を投与すること、及びＢＴＫ阻害剤での治療中（例えば基準と比較して）個体からの試料中の一又は複数の形質芽細胞バイオマーカーのレベルを評価することを含む、個体における疾患又は障害を治療するための方法が提供される。また、個体に有効量のＢＴＫ阻害剤を投与することを含む個体における疾患又は障害を治療する方法であって、治療が、（基準と比較して）個体からの試料中の一又は複数の形質芽細胞バイオマーカーのレベルに基づく、方法が提供される。個体からの試料中の一又は複数の形質芽細胞バイオマーカーのレベルを決定することを含む、ＢＴＫ阻害剤を含む治療に対する個体における応答性をモニターする方法であって、試料中の一又は複数の形質芽細胞バイオマーカーの減少したレベル（例えば、基準と比較して）は、個体がＢＴＫ阻害剤を含む治療に対して応答をより受けやすいことを示すか、又は一又は複数の形質芽細胞バイオマーカーの増大したレベル及び／又は前治療レベルと実質的に同じレベル（例えば、基準と比較して）は、個体がＢＴＫ阻害剤を含む治療に対して応答を受けにくいことを示す、方法が提供される。いくつかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーは、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる遺伝子シグネチャーの群より選択される。いくつかの実施態様では、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５の遺伝子発現は、基準レベルに対する患者の血液中の前記遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定することにより決定される。ポリペプチド発現である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は、自己免疫又は炎症性疾患又は障害である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はＳＬＥである。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はループス腎炎である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は腎外ループスである。
【００８４】
さらに、個体からの試料中の一又は複数の形質芽細胞バイオマーカーのレベルを測定することを含む、疾患又は障害を有する個体が、ＢＴＫ阻害剤を含む治療を継続すべきか又は中断すべきかを決定する方法であって、一又は複数の形質芽細胞バイオマーカーの増大したレベル及び／又は前処理レベルと実質的に同じレベル（例えば、基準と比較して）が、個体がＢＴＫ阻害剤を含む治療を中断すべきかを決定し、且つ一又は複数の形質芽細胞バイオマーカーの減少したレベル（例えば、基準と比較して）が、個体がＢＴＫ阻害剤を含む治療を継続すべきかを決定する、方法が提供される。いくつかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーは、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５からなる遺伝子シグネチャーの群より選択される。いくつかの実施態様では、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５の遺伝子発現は、基準レベルに対する患者の血液中の前記遺伝子のｍＲＮＡのレベルを測定することにより決定される。ポリペプチド発現である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は、自己免疫又は炎症性疾患又は障害である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はＳＬＥである。いくつかの実施態様では、疾患又は障害はループス腎炎である。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は腎外ループスである。
【００８５】
いくつかの実施態様では、該方法は、以下を含む：（ａ）患者からの生物学的試料中ＩｇＪ、ＴＸＮＤＣ５及びＭＺＢ１から選択される一つ、二つ又は三つのバイオマーカーのＲＮＡレベルを測定すること；（ｂ）（ａ）で測定されたＲＮＡレベルを基準レベルと比較すること；及び（ｃ）（ａ）で測定されたＲＮＡレベルが基準レベルを超える場合、ＢＴＫ阻害剤治療による恩恵を受ける可能性が高い患者を同定すること。いくつかの実施態様では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。いくつかの実施態様では、ｍＲＮＡレベルを測定することは、増幅を含む。いくつかの実施態様では、ｍＲＮＡレベルを測定することは、定量ＰＣＲを含む。いくつかの実施態様では、ｍＲＮＡレベルを測定することは、ｍＲＮＡを増幅させること及び増幅させた生成物を検出し、それによりｍＲＮＡのレベルを測定することを含む。いくつかの実施態様では、基準レベルは基準集団中のそれぞれのマーカーの中央レベルである。
【００８６】
いくつかの実施態様では、マーカーの基準レベルは基準集団中のマーカーの中央レベルである。上記の実施態様のいずれかでは、基準レベルは基準集団中のそれぞれのマーカーの平均レベルであり得る。いくつかの実施態様では、マーカーの基準レベルは基準集団中のマーカーの平均レベルである。非制限的な例示的な基準集団には、免疫又は炎症性疾患を有する患者、健康な個体、及び健康な個体と免疫又は炎症性疾患を有する患者とを含む群が含まれる。いくつかの実施態様では、基準集団はＳＬＥを有する患者を含む。
【００８７】
いくつかの実施態様では、バイオマーカーの分析又は検出の方法は、０．０５未満であるｐ値を有する。いくつかの実施態様では、該方法は、８０％より高い特異性を有する。いくつかの実施態様では、該方法は、８０％より高い感受性を有する。いくつかの実施態様では、該方法は、７０％より高いＲＯＣを有する。いくつかの実施態様では、該方法は、７０％より高いＡＵＣを有する。いくつかの実施態様では、該方法は、７０％より高い陽性予測値を有する。いくつかの実施態様では、該方法は、７０％より高い陰性予測値を有する。いくつかの実施態様では、前記基準遺伝子発現プロファイルは、患者及び／又は健康なボランティアの基準集団における対象からのものである。いくつかの実施態様では、比較の工程は、発現プロファイルのデジタル画像を比較すること及び発現データのデータベースを比較することの少なくとも一つを含む。
【００８８】
上記の方法のいずれかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーはＩｇＪである。上記の方法のいずれかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーはＭｚｂ１である。上記の方法のいずれかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーはＴｘｎｄｃ５である。上記の方法のいずれかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーはＩｇＪ及びＭｚｂ１である。上記の方法のいずれかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーはＩｇＪ及びＴｘｎｄｃ５である。上記の方法のいずれかの実施態様では、一又は複数の形質芽細胞バイオマーカーはＴｘｎｄｃ５及びＭｚｂ１である。上記の方法のいずれかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーはＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５である。
【００８９】
上記の実施態様のいくつかでは、試料は尿試料である。いくつかの実施態様において、試料は血液試料である。いくつかの実施態様では、生物学的試料は、血液、血清、血漿、及び末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から選択される。いくつかの実施態様では、生物学的試料は、血液、例えば全血、又は血液の細胞分画、例えばＰＢＭＣから得られるＲＮＡである。いくつかの実施態様では、生物学的試料は血清又は血漿である。試料は、治療前、治療中又は治療後に採取され得る。試料は、ＳＬＥ又は他の免疫若しくは炎症性疾患を有する疑いのある、又は有すると診断されているため、治療を必要とする可能性が高い患者から採取され得る。あるいは、試料は、あらゆる疾患を有する疑いのない正常な個体から採取され得る。いくつかの実施態様では、ＲＮＡは、マーカーのｍＲＮＡレベルを検出又は測定する前に、上記の生物学的試料から抽出される。
【００９０】
バイオマーカーの存在及び／又は発現レベル／量は、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片及び／又は遺伝子コピー数を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で知られる任意の適切な基準に基づいて、定性的及び／又は定量的に決定され得る。特定の実施態様では、第１の試料中のバイオマーカーの存在及び／又は発現レベル／量は、第２の試料中の存在／不存在及び／又は発現レベル／量と比較して、増加する。特定の実施態様では、第１の試料中のバイオマーカーの存在／不存在及び／又は発現レベル／量は、第２の試料中の存在及び／又は発現レベル／量と比較して、減少する。特定の実施態様では、第２の試料は、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織である。遺伝子の存在／不存在及び／又は発現レベル／量を決定するための追加の開示が本明細書で記載される。
【００９１】
いずれかの方法のいくつかの実施態様では、増大した発現レベルとは、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織と比較して、上記の方法のような当該技術分野で知られる標準的な方法によって検出される、バイオマーカー（例えばタンパク質又は核酸（例えば遺伝子若しくはｍＲＮＡ））のレベルにおける、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれかの全体的な増加を指す。特定の実施態様では、増大した発現とは、試料中のバイオマーカーの発現レベル／量における増加を指し、ここで、増加は、少なくとも約１．５×、１．７５×、２×、３×、４×、５×、６×、７×、８×、９×、１０×、２５×、５０×、７５×、又は１００Ｘの、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織中のそれぞれのバイオマーカーの発現レベル／量である。いくつかの実施態様では、増大した発現とは、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、コントロール組織、又は内部コントロール（例えばハウスキーピング遺伝子）と比較して、約１．５倍超、約１．７５倍超、約２倍超、約２．２５倍超、約２．５倍超、約２．７５倍超、約３．０倍超、又は約３．２５倍超の全体的な増加を指す。
【００９２】
いずれかの方法のいくつかの実施態様では、減少した発現レベルとは、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織と比較して、上記の方法のような当該技術分野で知られる標準的な方法によって検出される、バイオマーカー（例えばタンパク質又は核酸（例えば遺伝子若しくはｍＲＮＡ））のレベルにおける、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上のいずれかの全体的な減少を指す。特定の実施態様では、減少した発現とは、試料中のバイオマーカーの発現レベル／量における減少を指し、ここで、減少は、少なくとも約０．９×、０．８×、０．７×、０．６×、０．５×、０．４×、０．３×、０．２×、０．１×、０．０５×、又は０．０１×の、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織中のそれぞれのバイオマーカーの発現レベル／量である。
【００９３】
試料中の様々なバイオマーカーの存在及び／又は発現レベル／量は、数多くの方法によって分析することができ、その多くは、当該技術分野で知られており、当業者により理解されており、限定されないが、免疫組織化学（「ＩＨＣ」）、ウェスタンブロット分析、免疫沈降法、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光活性化セルソーティング（「ＦＡＣＳ」）、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ、プロテオミクス、定量的血液ベースアッセイ（例えば血清ＥＬＩＳＡ）、生化学的酵素活性アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、サザン分析、ノーザン分析、全ゲノム配列決定、定量的実時間ＰＣＲ（「ｑＲＴ−ＰＣＲ」）及びその他増幅式検出方法を含むポリメラーゼ連鎖反応（「ＰＣＲ」）、例えば、分枝ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど、ＲＮＡ−Ｓｅｑ、ＦＩＳＨ、マイクロアレイ解析、遺伝子発現プロファイリング、及び／又は遺伝子発現の連続分析（「ＳＡＧＥ」）、並びにタンパク質、遺伝子、及び／又は組織アレイ分析によって実施することのできる多種多様なアッセイのいずれかを含む。遺伝子及び遺伝子産物の状態を評価するための典型的なプロトコールは、例えば、Ausubel et al., eds., 1995, Current Protocols In Molecular BiologyのＵｎｉｔｓ  ２（ノーザンブロット法）、４（サザンブロット法）、１５（イムノブロット法）及び１８（ＰＣＲ分析）に見られる。Rules Based Medicine又はMeso Scale Discovery（「ＭＳＤ」）から入手可能であるような多重イムノアッセイも使用され得る。
【００９４】
いくつかの実施態様では、バイオマーカーの存在及び／又は発現レベル／量は、以下を含む方法を使用して決定される：（ａ）試料（例えば対象のがん試料）について遺伝子発現プロファイリング、ＰＣＲ（例えばｒｔＰＣＲ）、ＲＮＡ−ｓｅｑ、マイクロアレイ解析、ＳＡＧＥ、ＭａｓｓＡＲＲＡＹ技術、又はＦＩＳＨを実施すること；及びｂ）試料中のバイオマーカーの存在及び／又は発現レベル／量を決定すること。いくつかの実施形態では、マイクロアレイ法は、厳しい条件下で上記の遺伝子をコードする核酸分子にハイブリダイゼーションできる一又は複数の核酸分子を有するか、又は上記の遺伝子によってエンコードされたタンパク質の一又は複数に結合することができる一又は複数のポリペプチド（例えばペプチド又は抗体）を有するマイクロアレイチップの使用を含む。一実施態様では、ＰＣＲ法はｑＲＴ−ＰＣＲである。一実施態様では、ＰＣＲ法は多重ＰＣＲである。いくつかの実施態様では、遺伝子発現はマイクロアレイによって測定される。いくつかの実施態様では、遺伝子発現はｑＲＴ−ＰＣＲによって測定される。いくつかの実施態様では、発現は多重ＰＣＲによって測定される。
【００９５】
細胞内のｍＲＮＡを評価するための方法はよく知られており、例えば、相補的ＤＮＡプローブを使用したハイブリダイゼーションアッセイ（一又は複数の遺伝子に特異的な標識リボプローブを使用したｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及び関連技術等）及びさまざまな核酸増幅アッセイ（一又は複数の遺伝子に特異的な相補的プライマーを使用したＲＴ−ＰＣＲ、並びに他の増幅タイプの検出方法（分岐ＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡ等）を含む。
【００９６】
哺乳動物からの試料は、ノーザン、ドットブロット又はＰＣＲ分析を使用して、ｍＲＮＡについて簡便に化学分析され得る。さらに、そのような方法は、（例えば、アクチンファミリーメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子の比較対照ｍＲＮＡ配列のレベルを同時に調べることにより）生体試料中の標的ｍＲＮＡのレベルを決定することを可能にする一又は複数の工程を含み得る。任意選択的には、増幅した標的ｃＤＮＡの配列が決定され得る。
【００９７】
任意選択的な方法は、マイクロアレイ技術により、組織又は細胞試料中の標的ｍＲＮＡ等のｍＲＮＡを調べる又は検出するプロトコールを含む。核酸マイクロアレイを使用して、試験組織試料及びコントロール組織試料からの試験及びコントロールｍＲＮＡ試料は、逆転写され、ｃＤＮＡプローブを発生させるよう標識される。その後、プローブは、固体支持体上に固定化されている核酸のアレイにハイブリダイゼーションされる。アレイは、アレイの各メンバーの配列及び位置が分かるように構成される。例えば、その発現が抗血管新生治療の臨床的な利益の増加及び減少と相関する遺伝子の選択は、固体支持体上に配列される。特定のアレイメンバーと標識プローブのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現することを示す。
【００９８】
いくつかの実施態様によれば、存在及び／又は発現レベル／量は、上記の遺伝子のタンパク質発現レベルを観察することによって測定される。特定の実施態様では、方法は、抗体を含む生物学的試料を、バイオマーカーの結合を許容する条件下において本明細書に記載されるバイオマーカーと接触させること、及び抗体とバイオマーカーとの間に複合体が形成されたかどうかを検出することを含む。このような方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法又はｉｎ  ｖｉｖｏ法とすることができる。一実施態様では、抗体は、ＢＴＫ阻害剤での療法に適した対象を選択するために使用され、例えば、個体の選択のためのバイオマーカーである。
【００９９】
特定の実施態様では、試料中のバイオマーカータンパク質の存在及び／又は発現レベル／量が、ＩＨＣ及び染色プロトコールを用いて試験される。組織切片のＩＨＣ染色は、試料中のタンパク質の存在を決定又は検出する信頼性の高い方法であることが示された。方法、アッセイ及び／又はキットのいずれかの実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーは、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及びＴｘｎｄｃ５の一又は複数から選択される。いくつかの実施態様では、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１及び／又はＴｘｎｄｃ５は、免疫組織化学により検出される。いくつかの実施態様では、個体由来の試料中の形質芽細胞バイオマーカーの増大した発現は、増大したタンパク質発現であり、さらなる実施態様では、ＩＨＣを用いて決定される。一実施態様では、バイオマーカーの発現レベルは、以下を含む方法を使用して決定される：（ａ）抗体を用いて試料のＩＨＣ分析を実施すること；及びｂ）試料中のバイオマーカーの発現レベルを決定すること。いくつかの実施態様では、ＩＨＣ染色強度は基準との比較において決定される。いくつかの実施態様では、基準は参照値である。いくつかの実施態様では、基準は基準試料（例えば、コントロール細胞株染色試料）である。いくつかの実施態様では、組織は腎性組織である。他の実施態様では、上記の技術は、ＩＨＣの代わりに蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して実施される。
【０１００】
ＩＨＣは、形態染色及び／又は蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションといった追加的技術と組み合わせて実施されうる。ＩＨＣの二つの一般的方法、即ち直接的及び間接的アッセイが利用可能である。第１のアッセイによれば、標的抗原に対する抗体の結合が直接的に決定される。この直接的アッセイは、さらなる抗体相互作用なしで可視化することが可能な、標識された試薬、例えば蛍光性タグ又は酵素標識された一次抗体を用いる。典型的な間接的アッセイでは、非コンジュゲート一次抗体が抗原に結合し、次いで標識された二次抗体が一次抗体に結合する。二次抗体が酵素標識にコンジュゲートしている場合、抗原を可視化するために発色性又は発蛍光性基質が付加される。複数の二次抗体が一次抗体上の異なるエピトープと反応しうるため、シグナル増幅が起こる。
【０１０１】
ＩＨＣのために使用される一次及び／又は二次抗体は、典型的に、検出可能部分を用いて標識される。多数の標識が利用可能であり、それらは一般に以下のカテゴリーに分類される：（ａ）放射性同位体、例えば３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、及び１３１Ｉ；（ｂ）コロイド金粒子；（ｃ）限定されないが、希土類キレート（ユーロピウムキレート）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン、ウンベリフェロン、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｃｒｙｔｈｅｒｉｎ）、フィコシアニン、又は市販のフルオロフォア、例えばＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＯＲＡＮＧＥ７及びＳＰＥＣＴＲＵＭ  ＧＲＥＥＮ７及び／又は上記のいずれか一つ又は複数の誘導体を含む蛍光標識；（ｄ）様々な酵素−基質標識が利用可能であり、米国特許第４，２７５，１４９号でこれらのいくつかの総説が提供されている。酵素標識の例は、ルシフェラーゼ類（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４７３７４５６号）、ルシフェリン、２，３−ジヒドロフタラジンジオン類、マレートデヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼ類（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）、複素環式オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等を含む。
【０１０２】
酵素−基質の組み合わせの例には、例えば、基質として水素ペルオキシダーゼを有するホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）；発色性基質としてパラ−ニトロフェニル  ホスフェートを有するアルカリホスファターゼ（ＡＰ）；及び発色性基質（例えば、ｐ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）又は発蛍光性基質（例えば、４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）を有するβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ（β−Ｄ−Ｇａｌ）が含まれる。これらの総説に関しては、米国特許第４２７５１４９号及び同第４３１８９８０号を参照されたい。
【０１０３】
いずれかの方法の実施態様では、形質芽細胞バイオマーカーは、診断用抗体（すなわち一次抗体）を使用して免疫組織化学によって検出される。いくつかの実施態様では、分析される組織は腎性組織である。いくつかの実施態様では、診断用抗体は、ＩｇＪ、Ｍｚｂ１又はＴｘｎｄｃ５に特異的に結合する。いずれかの診断用抗体のいくつかの実施態様では、診断用抗体は非ヒト抗体である。いくつかの実施態様では、診断用抗体は、ラット、マウス又はウサギ抗体である。いくつかの実施態様では、診断用抗体はモノクローナル抗体である。いくつかの実施態様では、診断用抗体は直接的に標識される。
【０１０４】
代替的方法では、試料は、前記バイオマーカーに特異的な抗体と、抗体−バイオマーカー複合体が形成されるために十分な条件下で接触し、その後前記複合体を検出し得る。バイオマーカーの存在は、複数の方法で、例えば血漿又は血清を含む多種多様の組織及び試料をアッセイするためのウェスタンブロット法及びＥＬＩＳＡ手順により検出可能である。このようなアッセイフォーマットを使用した多種多様のイムノアッセイ技術が利用可能である。例えば米国特許第４，０１６，０４３号及び同第４，４２４，２７９号を参照のこと。これらには、非競合タイプのシングルサイト及び２サイトの両方又は「サンドイッチ」アッセイと、従来の競合結合アッセイとが含まれる。これらアッセイは、標的バイオマーカーに対する標識化抗体の直接的結合も含む。
【０１０５】
組織又は細胞試料中の選択されたバイオマーカーの存在及び／又は発現レベル／量は、機能アッセイ又は活性に基づくアッセイによっても試験することができる。例えば、バイオマーカーが酵素である場合、当技術分野で既知のアッセイを実施して、組織又は細胞試料中の所与の酵素活性の存在を決定又は検出することができる。
【０１０６】
特定の実施態様では、試料は、アッセイされるバイオマーカーの量の差及び使用される試料の品質の変動の両方、並びにアッセイの実行間の変動について正規化される。そのような正規化は、よく知られたハウスキーピング遺伝子、例えばＡＣＴＢを含む特定の正規化バイオマーカーの発現を検出及び取り込むことにより達成され得る。あるいは、正規化は、化学分析された遺伝子のすべての平均若しくは中央シグナル又はその大きなサブセットに基づいてもよい（グローバル正規化アプローチ）。遺伝子ごとに、対象試料ｍＲＮＡ又はタンパク質の測定された正規化された量は、基準セットに見られる量と比較される。対象ごとに試験された試料当たりの各ｍＲＮＡ又はタンパク質の正規化された発現レベルは、基準セットで測定された発現レベルの割合として表すことができる。分析される特定の対象試料で測定される存在及び／又現レベル／量は、この範囲内のある百分位にあり、これは、当該技術分野で周知の方法によって決定することができる。
【０１０７】
特定の実施態様では、遺伝子の相対的な発現レベルは以下の通り決定される：
相対的発現遺伝子１試料１＝２ｅｘｐ（Ｃｔハウスキーピング遺伝子−Ｃｔ遺伝子１）であり、Ｃｔは試料で決定される。
相対的発現遺伝子１基準ＲＮＡ＝２ｅｘｐ（Ｃｔハウスキーピング遺伝子−Ｃｔ遺伝子１）であり、Ｃｔは基準試料で決定される。
正規化された相対的発現レベル１試料１＝（相対的発現遺伝子１試料１／相対的発現遺伝子１基準ＲＮＡ）ｘ１００である。
Ｃｔは閾値サイクルである。Ｃｔは、反応内で生成された蛍光が閾値ラインを超えるサイクル数である。
【０１０８】
すべての実験は、様々な組織供給源（例えば、Clontech, Mountain View, CAからの基準ＲＮＡ＃６３６５３８）からのＲＮＡの包括的な混合物である参照ＲＮＡに正規化される。同一の基準ＲＮＡが各ｑＲＴ−ＰＣＲ実行に含まれており、異なる実験を実行する間に結果を比較することを可能にする。
【０１０９】
一実施態様において、試料は臨床試料である。別の実施態様では、試料は診断アッセイで用いられる。いくつかの実施態様では、試料は組織から得られる。組織生検は、代表的な組織片を得るためにしばしば使用される。あるいは、腫瘍細胞は、関係する細胞を含有すると知られているか又は考えられている組織又は流体の形態で間接的に得ることができる。遺伝子又は遺伝子産物は、組織、又は尿、痰、血清若しくは血漿等の他の身体試料から検出することができる。そのような身体試料をスクリーニングすることにより、標的遺伝子又は遺伝子産物についてそのような身体試料を試験することによって治療の進展をより容易にモニターすることができる。
【０１１０】
特定の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、単一試料、又は試験試料が得られたときとは異なる一又は複数の時点で得られる同一の対象若しくは個体からの組み合わされた複数の試料である。例えば、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞又はコントロール組織は、試験試料が得られたときよりも早い時点で同一の対象又は個体から得られる。このような基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、疾患の初期診断中に基準試料が得られ、疾患が進行したときに試験試料が後に得られる場合に有用であり得る。
【０１１１】
特定の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、対象又は個体ではない一又は複数の健康な個体からの組み合わされた多数の試料である。特定の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、対象又は個体ではない疾患又は障害を有する一又は複数の個体からの組み合わされた多数の試料である。特定の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、正常組織からのプールＲＮＡ試料、又は対象又は個体ではない一又は複数の個体からのプール血漿若しくは血清試料である。特定の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、組織からのプールＲＮＡ試料、又は対象又は個体ではない疾患又は障害を有する一又は複数の個体からのプール血漿若しくは血清試料である。
【０１１２】
特定の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は、試料細胞株である。特定の実施態様では、基準試料、基準細胞、基準組織、コントロール試料、コントロール細胞、又はコントロール組織は血液である。
【０１１３】
いくつかの実施態様では、試料は個体からの組織試料である。いくつかの実施態様では、組織試料は、血液又は尿試料である。いくつかの実施態様では、組織試料は血液試料である。
【０１１４】
いずれかの方法のいくつかの実施態様では、ＢＴＫ阻害剤は小分子ＢＴＫ阻害剤である。いくつかの実施態様では、小分子ＢＴＫ阻害剤は、化合物（Ａ）又はその薬学的に許容される塩である。
【０１１５】
いずれかの方法のいくつかの実施態様では、上記の実施態様のいずれかによる個体又は患者はヒトであってもよい。
【０１１６】
さらなる実施態様では、本明細書ではＳＬＥを治療するための方法が提供される。一実施態様では、方法は、ＳＬＥを有する個体に有効量の小分子ＢＴＫ阻害剤を投与することを含む。このような一実施態様では、方法は更に、個体に対し、後述するような少なくとも一の追加的な治療剤の有効量を投与することを含む。いくつかの実施態様では、個体はヒトであってもよい。
【０１１７】
本明細書に記載のＢＴＫ阻害剤は、単独で又は他の薬剤と組み合わせて治療に使用することができる。例えば、追加の治療薬は、抗炎症剤、免疫調節剤、化学療法剤、アポトーシス促進剤、神経栄養因子、心血管疾患を治療するための薬剤、肝疾患を治療するための薬剤、抗ウイルス剤、血液障害を治療するための薬剤、糖尿病を治療するための薬剤、及び免疫不全障害を治療するための薬剤であり得る。第二の治療剤は、ＮＳＡＩＤ抗炎症剤であってもよい。第二の治療剤は、化学療法剤であってもよい。組み合わせ医薬製剤又は投与計画の第２の化合物は、好ましくは、互いに悪影響を与えないように化合物（Ｉ）を補完する活性を有する。
【０１１８】
いくつかの実施態様では、追加の治療薬は、以下からなる群より選択される：コルチコステロイド（例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン及びヒドロコルチゾン）；疾患修飾性抗リウマチ薬（ｄｉｓｅａｓｅ−ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  ａｎｔｉｈｒｅｕｍａｔｉｃ  ｄｒｕｇ）（「ＤＭＡＲＤ」、例えば、免疫抑制又は抗炎症剤）；抗マラリア剤（例えば、ヒドロキシクロロキン及びクロロキン）；免疫抑制剤（例えば、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、メトトレキサート）；抗炎症剤（例えば、アスピリン、ＮＳＡＩＤ（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、ナブメトン、セレコキシブ））；抗高血圧剤（例えば、カルシウムチャネル遮断薬（例えば、アムロジピン、ニフェジピン）及び利尿薬（例えば、フロセミド））；スタチン（例えば、アトルバスタチン、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン及びシンバスタチンなど）；抗Ｂ細胞剤（例えば、抗ＣＤ２０（例えば、リツキシマブ）、抗ＣＤ２２）；抗Ｂリンパ球刺激剤（「抗ＢＬｙＳ」、例えば、ベリムマブ、ブリシビモド）；１型インターフェロン受容体アンタゴニスト（例えば、アニフロルマブ）；Ｔ細胞調節因子（例えば、リゲリモド）；アバタセプト；抗凝固剤（例えば、ヘパリン、ワーファリン）；及びビタミンＤ補給剤。
【０１１９】
併用療法は、同時又は逐次レジメンで投与され得る。逐次的に投与される場合、その組み合わせは、二回以上の投与で投薬され得る。併用投与には、別個の製剤又は単一の薬学的製剤を使用する共投与及びいずれかの順序での連続投与が含まれ、好ましくは双方の（又はすべての）活性剤がその生物学的活性を同時に発揮する期間がある。上記の共投与される薬剤のいずれについても、好適な投与量は、現在使用されているものであり、追加の治療剤の混合作用（相乗効果）により減じられる可能性がある。
【０１２０】
併用療法は、一緒に使用される活性成分が、化合物を別々に使用することにより得られる効果の和を上回るように、相乗的であり得る。相乗効果は、活性成分が：（１）同時に投与又は送達されるとき；（２）交互に又は並行して投与されるとき；又は（３）他の何らかのレジメンによって、達成され得る。交互療法で送達される場合、化合物が逐次的に投与又は送達されるときに、相乗効果が達成され得る。一般に、交互療法中、各活性成分の有効用量は逐次的に、即ち連続して投与されるが、併用療法では、二つ以上の活性成分の有効用量が一緒に投与される。
【０１２１】
併用両方では、キットは（ａ）本開示の投与形態組成物を含む第１の容器、及び任意選択的に（ｂ）本開示の投与形態組成物との共投与のための、そこに含有される第２の薬学的製剤を含む第２の容器を含み得る。そのような態様では、キットは、分けられた瓶又は分けられたホイル小包（ｐａｃｋｅｔ）などの別個の組成物を含有するための容器を含むことができるが、別個の組成物は、分けられていない単一の容器の中に含有されてもよい。一般的に、キットは、個別の成分を投与するための指示書を含む。キット形態は、個々の成分を異なる投与形態（例えば経口と非経口）で投与することが好ましいとき、異なる投与間隔で投与するとき、又は組み合わせの個々の成分の滴定が処方する医師により望まれるとき、特に有利である。
【０１２２】
ＢＴＫ阻害剤は、経口、非経口、肺内、及び鼻腔内を含めた任意の適切な手段により投与することができ、また、局所治療が望まれるのであれば、病巣内投与であってもよい。好ましい実施態様によれば、ＢＴＫ阻害剤は経口投与される。
【０１２３】
ＢＴＫ阻害剤を含む経口投与形態は、限定されないが、ＢＴＫ阻害剤を含む錠剤若しくはカプセル又はその薬学的に許容される塩、及び一又は複数の薬学的添加剤が含まれる。いくつかの実施態様では、ＢＴＫ阻害剤を含む錠剤又はカプセルは、本明細書で提供される方法によって１日１回又は２回投与され得る。本明細書で提供される特定の実施態様では、経口投与形態は、化合物（Ａ）又はその薬学的に許容される塩、及び一又は複数の薬学的に許容される添加剤を含む錠剤である。
【０１２４】
非経口注入には、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与が含まれる。投薬は、その投与が短期間か又は長期であるかどうかに部分的に依存し、任意の適切な経路、例えば、静脈内又は皮下注射などの注射により行うことができる。限定されないが、様々な時点にわたる、単一回又は複数回投与、ボーラス投与、パルス注入を含む様々な投与スケジュールが本明細書で考慮される。
【０１２５】
本明細書に記載のＢＴＫ阻害剤は、医学行動規範に合致した様式で製剤化され、投薬され、投与され得る。この文脈において考慮すべき因子としては、治療される特定の疾患又は障害、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患又は障害の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール及び医師にとって既知の他の因子が挙げられる。ＢＴＴＫ阻害剤は、必要ではないが任意で、問題の疾患又は障害の予防又は治療のために現在使用されている一又は複数の薬剤とともに製剤化される。このような他の薬剤の有効量は、製剤中に存在するＢＴＫ阻害剤の量、疾患又は障害又は治療の種類、及び上記の他の要因によって決まる。そのような他の薬剤は、一般的には本明細書に記載されているのと同じ用量及び投与経路で、又は本明細書に記載の用量の約１から９９％で、又は経験的に／臨床的に妥当であると決定された任意の用量及び任意の経路で使用される。
【０１２６】
ＩＩＩ．ＢＴＫ阻害剤を含む治療組成物
本明細書の組成物、方法及びキットには、小分子ＢＴＫ阻害剤が提供されている。本明細書で提供される小分子ＢＴＫ阻害剤は、好ましくは、結合ポリペプチド又は抗体以外の有機分子であり、既知の方法を使用して、同定及び化学的に合成され得る。結合有機分子のサイズは、通常２０００ダルトン未満、あるいは約１５００、７５０、５００、２５０又は２００ダルトン未満であり、本明細書に記載のＢＴＫに好ましくは特異的に結合することができるそのような有機小分子は、既知の技術を使用して、過度の実験をすることなく同定され得る。この点については、ポリペプチド標的に結合することができる分子の有機小分子ライブラリをスクリーニングするための技術が当該技術分野でよく知られていることが記述されている（例えば、ＰＣＴ出願国際公開第２０００／００８２３号及び同第２０００／３９５８５号を参照のこと）。結合有機小分子は、例えば、アルデヒド、ケトン、オキシム、ヒドラゾン、セミカルバゾン、カルバジド、一級アミン、二級アミン、三級アミン、Ｎ−置換ヒドラジン、ヒドラジド、アルコール、エーテル、チオール、チオエーテル、ジスルフィド、カルボン酸、エステル、アミド、尿素、カルバメート、カーボネート、ケタール、チオケタール、アセタール、チオアセタール、アリールハロゲン化物、アリールスルホネート、アルキルハロゲン化物、アルキルスルホネート、芳香族化合物、複素環式化合物、アニリン、アルケン、アルキン、ジオール、アミノアルコール、オキサゾリジン、オキサゾリン、チアゾリジン、チアゾリン、エナミン、スルホンアミド、エポキシド、アジリジン、イソシアネート、スルホニルクロリド、ジアゾ化合物、酸塩化物等であり得る。
【０１２７】
いずれかの方法のいくつかの実施態様では、ＢＴＫ阻害剤は、以下からなる群より選択される：イブルチニブ、アカラブルチニブ、スペブルチニブ、ＢＩＩＢ０６８（Ｂｉｏｇｅｎ）、ＢＭＳ−９８６１９５（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＢＭＳ−９８６１４２（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、ＢＭＳ−９３５１７７（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ）、Ｍ２９５１（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）、ＰＲＮ−１００８（Ｐｒｉｎｃｉｐｉａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、ＨＭ７１２２４／ＬＹ３３３７６４１（Ｈａｎｍｉ／Ｌｉｌｌｙ）、ＯＮＯ−４０５９／ＧＳ−４０５９（Ｇｉｌｅａｄ／Ｏｎｏ）、ＡＣ００５８（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＣ００２５（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、  ＡＢＢＶ−５９９（ＡｂｂＶｉｅ）、ＡＢＢＶ−１０５（ＡｂｂＶｉｅ）、ＰＦ−３０３（Ｐｆｉｚｅｒ）、ＢＩ−ＢＴＫ１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ＣＣ９０００８（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＡＳ５５０（Ｃａｒｎａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＲＱ  ５３１（Ａｒｑｕｌｅ）、ＡＥＧ４２７６６（Ａｅｇｅｒａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＢＧＢ−３１１１（Ｂｅｉｇｅｎｅ）、ＲＮ４８６（Ｓｉｍｃｅｒｅ  Ｐｈａｒｍａ）、ＨＣＩ−１４０１（ＬＳＫ  ＢｉｏＰｈａｒｍａ／Ｈｕｓｔｍａｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．）、ＫＢＰ−７５３６（ＫＢＰ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＲＤＸ００２（ＲｅｄＸ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ）、ＳＮＳ−０６２（Ｓｕｎｅｓｉｓ）、ＴＡＳ５３１５（大鵬薬品）、ＴＡＸ−０２０（武田）、ＷＸ４８６／ＷＸＦＬ−１０２３０４８６（ＷｕＸｉ  ＡｐｐＴｅｃ／Ｈｕｍａｎｗｅｌｌ）、及びＸ−０２２（Ｘ−Ｒｘ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）。
【０１２８】
いくつかの実施態様では、ＢＴＫ阻害剤は、化合物（Ａ）又はその薬学的に許容される塩である。本明細書で提供されるＢＴＫの薬学的に許容される塩は、本明細書の方法に使用され得る。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される塩」とは、本明細書に記載の化合物に見られる特定の置換基に応じて、比較的非毒性の酸又は塩基で調製される活性化合物の塩を含むことを意味する。本発明の化合物が比較的酸性の官能基を含有するとき、そのような化合物の中性形態を純粋な又は適切な不活性溶媒中の十分な量の所望の塩基と接触させることにより、塩基付加塩を得ることができる。薬学的に許容される無機塩基由来の塩の例には、アルミニウム、アンモニウム、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン、亜マンガン、カリウム、ナトリウム、亜鉛等が含まれる。薬学的に許容される有機塩基由来の塩には、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ、Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチルモルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの置換アミン、環状アミン、天然アミンなどを含む、一級、二級および三級アミンの塩が含まれる。本発明の化合物が比較的塩基性の官能基を含有するとき、そのような化合物の中性形態を純粋な又は適切な不活性溶媒中の十分な量の所望の酸と接触させることにより、酸付加塩を得ることができる。薬学的に許容される酸付加塩の例には、塩酸、臭化水素酸、硝酸、炭酸、一水素炭酸、リン酸、一水素リン酸、二水素リン酸、硫酸、一水素硫酸、ヨウ化水素酸又は亜リン酸等のような無機酸由来のもの、並びに酢酸、プロピオン酸、イソブチル酸、マロン酸、安息香酸、コハク酸、スベリン酸、フマル酸、マンデル酸、フタル酸、ベンゼンスルホン酸、ｐ−トリルスルホン酸、クエン酸、酒石酸、メタンスルホン酸等のような比較的非毒性の有機酸由来の塩が含まれる。また、アルギン酸塩等のアミノ酸の塩、及びグルクロン酸又はガラクツリン酸等の有機酸の塩も含まれる（例えば、Berge, S. M., et al., 「Pharmaceutical Salts」, Journal of Pharmaceutical Science, 1977, 66, 1-19を参照のこと）。本発明の特定の化合物は、化合物が塩基付加塩又は酸付加塩のいずれかに変換することを可能にする塩基性官能基と酸性官能基の両方を含有する。
【０１２９】
化合物の中性形態は、塩を塩基又は酸と接触させること及び従来の方法で親化合物を単離することにより、再生することができる。化合物の親形態は、極性溶媒中の溶解度等の特定の物理的特性において様々な塩形態とは異なるが、それ以外は、塩は、本発明の目的では、化合物の親形態と同等である。
【０１３０】
塩形態に加えて、本発明は、プロドラッグ形態である化合物を提供する。本明細書で使用される場合、用語「プロドラッグ」とは、生理的条件下で容易に化学変化を受け、本発明の化合物を提供する化合物を指す。さらに、プロドラッグは、ｅｘ  ｖｉｖｏ環境において化学的又は生化学的方法によって本発明の化合物に変換され得る。例えば、プロドラッグは、適切な酵素又は化学試薬と共に経皮パッチ容器に置かれたとき、本発明の化合物にゆっくりと変換され得る。
【０１３１】
本発明のプロドラッグは、アミノ酸残基、又は二以上（例えば、二、三又は四）のアミノ酸残基のポリペプチド鎖がアミド又はエステル結合を通じて、本発明の化合物の遊離アミノ、ヒドロキシ又はカルボン酸基に共有結合する化合物を含む。アミノ酸残基は、限定されないが、通常三文字の記号で表される２０の天然に存在するアミノ酸を含み、また、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、デモシン、イソデモシン、ガンマ−カルボキシグルタメート、馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、３−メチルヒスチジン、ノルバリン、ベータ−アラニン、ガンマ−アミノ酪酸、シトルリン、ホモシステイン、ホモセリン、メチル−アラニン、パラ−ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、メチオニンスルホン及びｔｅｒｔ−ブチルグリシンも含む。
【０１３２】
追加の種類のプロドラッグも包含される。例えば、本発明の化合物の遊離カルボキシル基は、アミド又はアルキルエステルとして誘導体化され得る。別の例として、遊離ヒドロキシ基を含む本発明の化合物は、ヒドロキシ基を、限定されないが、Fleisher, D. et al., (1996) Improved oral drug delivery: solubility limitations overcome by the use of prodrugs Advanced Drug Delivery Reviews, 19:115に概説されるように、リン酸エステル、ヘミスクシネート、ジメチルアミノアセテート又はホスホリルオキシメチルオキシカルボニル基等の基に変換することにより、プロドラッグとして誘導体化され得る。ヒドロキシ及びアミノ基のカルバメートプロドラッグも含まれ、ヒドロキシ基の炭酸プロドラッグ、スルホン酸エステル及び硫酸エステルも含まれる。アシル基が、限定されないが、エーテル、アミン及びカルボン酸官能基で置換されていてもよいアルキルエステルであり得るか、アシル基が上記のアミノ酸エステルである、（アシルオキシ）メチル及び（アシルオキシ）エチルエステルとしてのヒドロキシ基の誘導体化も、包含される。このタイプのプロドラッグは、J. Med. Chem., (1996), 39:10に記載される。より具体的な例には、アルコール基の水素原子の、（Ｃ１−６）アルカノイルオキシメチル、１−（（Ｃ１−６）アルカノイルオキシ）エチル、１−メチル−１−（（Ｃ１−６）アルカノイルオキシ）エチル，（Ｃ１−６）アルコキシカルボニルオキシメチル、Ｎ−（Ｃ１−６）アルコキシカルボニルアミノメチル、サクシノイル，（Ｃ１−６）アルカノイル、アルファ−アミノ（Ｃ１−４）アルカノイル、アリールアシル及びアルファ−アミノアシル、又はアルファ−アミノアシル−アルファ−アミノアシル（各アルファ−アミノアシル基は、独立して、天然に存在するＬ−アミノ酸、Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）２、−Ｐ（Ｏ）（Ｏ（Ｃ１−６）アルキル）２又はグリコシル（炭水化物のヘミアセタール形態のヒドロキシル基の除去から得られるラジカル）から選択される）などの基での置換が含まれる。
【０１３３】
プロドラッグ誘導体の追加の例については、例えば、a) Design of Prodrugs, edited by H. Bundgaard, (Elsevier, 1985) and Methods in Enzymology, Vol. 42, p. 309-396、K. Widder, et al．編(Academic Press, 1985)；b) A Textbook of Drug Design and Development, Krogsgaard-Larsen及びH. Bundgaard編、Chapter 5 「Design and Application of Prodrugs」, by H. Bundgaard p. 113-191 (1991); c) H. Bundgaard, Advanced Drug Delivery Reviews, 8:1-38 (1992); d) H. Bundgaard, et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, 77:285 (1988)；及びe) N. Kakeya, et al., Chem. Pharm. Bull., 32:692 (1984)を参照のこと。これらは参照により本明細書に具体的に援用される。
【０１３４】
本発明の特定の化合物は、非溶媒和形態、及び水和形態を含む溶媒和形態で存在し得る。概して、溶媒和形態は、非溶媒和形態と同等であり、本発明の範囲内に包含されることが意図される。本発明の特定の化合物は、多数の結晶質又は非晶質形態で存在し得る。概して、全ての物理的形態は、本発明で検討される使用について同等であり、本発明の範囲内であることが意図される。
【０１３５】
本発明の特定の化合物は、不斉炭素原子（光学中心）又は二重結合を有する；ラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体、位置異性体及び個々の異性体（例えば、別個の光学異性体）はすべて、本発明の範囲内に包含されることが意図される。
【０１３６】
ＩＶ．薬学的製剤
ＢＴＫ阻害剤の薬学的製剤が、本明細書の方法及びキットで提供される。
【０１３７】
いずれかの方法のいくつかの実施態様では、ＢＴＫ阻害剤（例えば化合物（Ａ）又はその薬学的に許容される塩）は、患者の体重に基づき、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約１００ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５ｍｇ／ｋｇ／日から約２０ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日から約１０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。いくつかの実施態様では、化合物（Ａ）又はその薬学的に許容される塩は、約１０から８００ｍｇの投与量で錠剤として投与される。いくつかの実施態様では、化合物（Ａ）は、約２５から３００ｍｇの投与量で錠剤中の遊離塩基として投与される。いくつかの実施態様では、錠剤は、遊離塩基として２５から３００ｍｇの化合物（Ａ）及びフマル酸を含み、ここで、化合物（Ａ）対フマル酸の重量比は、約１：５から約３：１；又は約１：２から約２：１；又は約１：１．５から約１．５：１である。いくつかの実施態様では、錠剤は、遊離塩基として２５から３００ｍｇの化合物（Ａ）、及びフマル酸を含み、ここで、フマル酸含有量は、約５重量％から約５０重量％、約５重量％から約４０重量％、約５重量％から約３０重量％、約１０重量％から約３０重量％、約２０重量％から約２５重量％、約５重量％から約１５重量％、又は約１０重量％から約１５重量％である。上記の実施態様のいくつかでは、錠剤の重量は、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、又は約１０００ｍｇである。いくつかの実施態様では、錠剤は、充填剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤及び流動促進剤から選択される少なくとも一つの薬学的に許容される添加剤をさらに含む。いくつかの実施態様では、錠剤は、ラクトース及び微結晶性セルロースを含む。
【０１３８】
本開示の錠剤組成物は、限定されないが、充填剤（希釈剤）、崩壊剤、結合剤、流動促進剤及び潤滑剤から選択される一又は複数の薬学的に許容される添加剤をさらに適切に含み得る。充填剤（又は希釈剤）は、錠剤を作製する粉末状の薬剤のかさ容積を増加させるために使用され得る。崩壊剤は、摂取時に錠剤が小さな破片、理想的には個々の薬物粒子に分解することを促し、それにより薬物の急速な溶解と吸収を促進するために使用され得る。結合剤は、顆粒及び錠剤が必要な機械的強度で形成され、圧縮後に錠剤を一緒に保持することができ、包装、輸送、及び通常の取り扱い中に成分粉末に崩壊するのを防ぐことを確実にするために使用され得る。流動促進剤は、製造中に錠剤を作製する粉末の流動性を改善するために使用され得る。潤滑剤は、錠剤化粉末が製造中に錠剤をプレスするために使用される機器に接着しないことを確実にするため、混合及びプレス中に粉末の流れを改善するため、及び完成した錠剤が機器から取り出されるときの摩擦及び崩壊を最小限にすることを確実にするために使用され得る。
【０１３９】
充填剤及び結合剤は、リン酸水素カルシウム、微結晶性セルロース（Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））、ラクトース、又は任意の他の適切なバルク化剤を含み得る。適切な充填剤の例には、微結晶性セルロース、例えばＡｖｉｃｅｌ  ＰＨ  １０１、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ１０２、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ  ２００、Ａｖｉｃｅｌ  ＰＨ  １０５、Ａｖｉｃｅｌ  ＤＧ、Ｃｅｏｌｕｓ  ＫＧ  ８０２、Ｃｅｏｌｕｓ  ＫＧ  １０００、ＳＭＣＣＳＯ及びＶｉｖａｐｕｒ  ２００；ラクトース一水和物、例えばＬａｃｔｏｓｅ  ＦａｓｔＦｌｏ；他の添加剤と共に加工処理された微結晶性セルロース、例えばラクトース一水和物と共に加工処理された微結晶性セルロース（ＭｉｃｒｏｃｅＬａｃ  １００）及びコロイド状二酸化ケイ素と共に加工処理された微結晶性セルロース（ＳＭＣＣＳＯ、Ｐｒｏｓｏｌｖ  ５０及びＰｒｏｓｏｌｖ  ＨＤ  ９０）；イソマルツロース誘導体の混合物、例えばｇａｌｅｎＩＱ；及び他の適切な充填剤とそれらの組み合わせが含まれる。充填剤は、顆粒内成分及び／又は顆粒外成分として存在し得る。いくつかの特定の態様では、本開示の錠剤組成物は、ラクトース及び微結晶性セルロースを含む。
【０１４０】
崩壊剤は、開示される製剤に含まれ得る。
コンパクト内の顆粒を互いに分離することを促進させるため、及び遊離された顆粒の分離を維持するために含まれ得る。崩壊剤は、顆粒内成分及び／又は顆粒外成分として存在し得る。崩壊剤は、架橋ポリマー、例えば架橋ポリビニルピロリドン及び架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム又はククロスカルメロースナトリウムなどの任意の適切な崩壊剤を含み得る。いくつかの特定の態様では、崩壊剤はクロスカルメロースナトリウムである。崩壊剤含有量は、適切には、約１重量％、約１．５重量％、約２重量％、約２．５重量％、約３重量％、約３．５重量％、約４重量％、約４．５重量％又は約５重量％及びその範囲、例えば１重量％から約５重量％、又は約２重量％から約４重量％である。
【０１４１】
流動促進剤は、例えば、コロイド状二酸化ケイ素（高度に分散したシリカ（Ａｅｒｏｓｉｌ（登録商標））を含む）、又は任意の他の適切な流動促進剤、例えば動物性若しくは植物性脂肪又はワックスを含み得る。いくつかの特定の態様では、流動促進剤はヒュームドシリカである。流動促進剤含有量は、適切には、０．１重量％、約０．５重量％、約１重量％、約１．５重量％、約２重量％、約２．５重量％又は約３重量％、及びその範囲、例えば約０．１重量％から約３重量％、約０．５重量％から約２重量％、約０．５重量％から約１．５重量％である。
【０１４２】
潤滑剤は、薬学的組成物中の顆粒の圧縮に使用され得る。潤滑剤は、例えば、ポリエチレングリコール（例えば約１０００から約６０００の分子量を有する）、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、フマル酸ステアリルナトリウム、タルク、又は任意の他の適切な潤滑剤を含み得る。いくつかの特定の態様では、潤滑剤は、ステアリン酸マグネシウム及び／又はフマル酸ステアリルナトリウムである。潤滑剤は、顆粒内成分及び／又は顆粒外成分として存在し得る。潤滑剤含有量は、適切には、約０．５重量％、約１重量％、約１．５重量％、約２重量％、約２．５重量％、約３重量％、約３．５重量％、約４重量％、約４．５重量％又は約５重量％、及びその範囲、例えば約０．５重量％から約５重量％、約１重量％から約４重量％、約１重量％から約３重量％、又は約１重量％から約２重量％である。
【０１４３】
フィルムコーティング等のコーティングは、本開示の錠剤に塗布されてもよい。フィルムコーティングは、例えば、錠剤を飲み込むことを容易にするのに役立つように使用され得る。フィルムコーティングは、味及び外見を改善するためにも利用され得る。必要に応じて、フィルムコーティングは脂溶性コーティングであってもよい。フィルムコーティングは、ポリマーフィルム形成材料、例えばヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、アクリレート又はメタクリレートコポリマー、及びポリビニルアルコール−ポリエチレングリコールグラフトコポリマー、例えばＯｐａｄｒｙ及びＩＲを含み得る。フィルム形成ポリマーに加えて、フィルムコーティングは、可塑剤、例えばポリエチレングリコール、界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ（登録商標）タイプ、及び任意選択的に顔料、例えば二酸化チタン又は酸化鉄をさらに含み得る。フィルムコーティングは、粘着防止剤としてタルクを含み得る。フィルムコーティングは、典型的には、投与形態の約５重量％未満を占める。
【０１４４】
本明細書中の製剤はまた、治療される特定の適応症に必要な一を超える活性成分、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを含有してもよい。そのような活性成分は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
【０１４５】
活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合法によって調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースマイクロカプセル又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセルに、コロイド薬物送達システム（例えばリポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）に、又はマクロエマルジョンに封入することができる。そのような技術は、RemingtonのPharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【０１４６】
徐放性製剤が調製されてもよい。徐放性製剤の好適な例は、ＢＴＫ阻害剤を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのようなマトリックスは、成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。
【０１４７】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、一般的に滅菌されている。滅菌状態は、例えば滅菌濾過膜を通して濾過により容易に達成することができる。
【０１４８】
Ｖ．製造品
別の実施態様では、上述した疾患の治療、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有する製造品が提供される。製造品は、容器と容器上又は容器に付随するラベル又は添付文書を含む。好適な容器は、例としてボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ輸液バッグなどを含む。容器はガラス又はプラスチックなどの様々な材料から形成されうる。容器は、病状の治療、予防、及び／又は診断に効果的である、単独の又は別の組成物と併用の組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイアルであってもよい）。該組成物中の少なくとも一の活性剤は、本明細書に記載のＢＴＫ阻害剤である。ラベル又は添付文書は、組成物が選択された状態の治療のために使用されることを示している。さらに、製造品は、（ａ）ＢＴＫ阻害剤を含む組成物を中に収容する第１の容器；及び（ｂ）更なる細胞傷害性剤又はその他の治療剤を含む組成物を中に収容する第２の容器を含み得る。
【０１４９】
いくつかの実施態様では、製造品は、容器、前記容器上のラベル、及び前記容器中に含有される組成物を含み；ここで、組成物は、一又は複数の試薬（例えば、一又は複数のバイオマーカー、又は本明細書に記載の一又は複数のバイオマーカーに対するプローブ及び／又はプライマーに結合する一次抗体（例えば、Ｂ−９  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ抗体）、組成物が試料中の一又は複数のバイオマーカーの存在を評価するために使用され得ることを示す容器のラベル、並びに試料中の一又は複数のバイオマーカーの存在を評価するための試薬を使用するための説明書を含む。製造品は、試料を調製するため及び試薬を利用するための説明書及び材料のセットをさらに含み得る。いくつかの実施態様では、製造品は、一次抗体及び二次抗体の両方のような試薬を含んでもよく、二次抗体は、標識、例えば酵素標識にコンジュゲートしている。いくつかの実施態様では、製造品は、本明細書に記載の一又は複数のバイオマーカーに対する一又は複数のプローブ及び／又はプライマーをさらに含み得る。
【０１５０】
本実施態様における製造品は、組成物が特定の病態を治療するために使用され得ることを示す添付文書を更に含んでもよい。或いは、又は加えて、製造品は、薬学的に許容可能な緩衝液、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液を含む第二（又は第三）の容器を更に含んでもよい。製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルタ、針、及びシリンジを含めた、商業的及び使用者の観点から望ましいその他の材料をさらに含んでもよい。
【０１５１】
製造品中の他の任意の成分は、一又は複数のバッファー（例えば、ブロックバッファー、洗浄バッファー、基質バッファー等）、酵素標識によって化学的に改変される基質（例えば色素原）等の他の試薬、エピトープ回収溶液、コントロール試料（ポジティブ及び／又はネガティブコントロール）、コントロールスライド（単数及び複数）を含む。
【実施例】
【０１５２】
以下は、方法及び組成物の実施例である。上に提供された一般的な説明を前提として、他の様々な実施態様が実施され得ることが理解される。
【０１５３】
血液試料分析：３遺伝子形質芽細胞シグネチャー発現アッセイ。ＰＡＸｇｅｎｅ  ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉＸ）中に血液を回収し；製造業者の指示に従い（Ｑｉａｇｅｎ）市販のキットを使用して、総ＲＮＡを抽出した。
バイオマーカー：ＩｇＪ、ＴＸＮＤＣ５、ＭＺＢ１。基準遺伝子：ＴＭＥＭ５５Ｂ
【０１５４】
Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３  Ｐｌｕｓ  ２．０アレイ（Affymetrix Inc., Santa Clara, CA）により、血液試料中の候補バイオマーカー遺伝子の発現を評価した。Ａｓｕｒａｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Austin, TX）により、マイクロアレイハイブリダイゼーションを実施した。ロバストマルチアレイ平均法（Ｒｏｂｕｓｔ  Ｍｕｌｔｉ−ａｒｒａｙ  Ａｖｅｒａｇｉｎｇ）（ＲＭＡ）を使用して未加工のＣＥＬファイルデータを要約及び正規化し、Ｒ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒを使用して分析した。
【０１５５】
あるいは、Ｆｌｕｉｄｉｇｍ  ｑＰＣＲアッセイにより血液試料中の候補バイオマーカー遺伝子を数値化した。ＩｇＪ、ＴＸＮＤＣ５及びＭＺＢ１の平均から３遺伝子スコアを計算し、基準遺伝子ＴＭＥＭ５５Ｂをして正規化した。Ｃｏｂａｓ  ４８００プラットフォーム（Roche Molecular Systems）上で展開されたこのアッセイを使用して、血液試料を評価した。
【０１５６】
実施例１：形質芽細胞トランスクリプトームの特徴づけ
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化ＣＤ２０ｌｏＣＤ３８＋形質芽細胞、ＣＤ２０＋ＣＤ２７＋活性化Ｂ細胞及びＣＤ２０＋ＣＤ２７−ナイーブＢ細胞の転写プロファイリングを実施し、Ｂ細胞サブセット間の強力な分化発現で遺伝子を同定した（図１Ａ−１）。０．００１の偽発見率（ＦＤＲ）で活性化Ｂ細胞又はナイーブＢ細胞のいずれかよりも形質芽細胞で＞１０倍高く発現した８６の遺伝子を同定した。これらのデータのさらなる改良を実施して、形質芽細胞に＞５ｎＲＰＫＭを有する遺伝子のみを含め、合計４０の遺伝子を得た。これらの遺伝子の多くには、重鎖及び軽鎖セグメント、さらには免疫グロブリンタンパク質の生合成に関与する遺伝子が含まれていた。免疫グロブリン遺伝子座の一部ではないバイオマーカー候補が選択されたため、これらは候補遺伝子のリストから削除された（図１Ｂ）。
【０１５７】
形質芽細胞の分化は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形質芽細胞分化アッセイ（ヒト記憶Ｂ細胞が分化条件に置かれ、続いて、ＣＤ２０ｌｏＣＤ３８＋＋形質芽細胞についてのフローサイトメトリー定量化を使用して５日後に測定された）を実施することによる、ブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）の活性により制御されたことを確認した。ＢＴＫキナーゼ活性の特異的且つ強力な阻害剤であるＧＤＣ−０８５２の使用は、ＣＤ４０Ｌ誘導形質芽細胞分化が用量依存的に阻害された（図７）。ＧＤＣ−０８５２は、（Ｓ）−２−（５−フルオロ−２−（ヒドロキシメチル）−３−（１−メチル−５−（５−（２−メチル−４−（オキセタン−３−ｙ−ｌ）ピペラジン−１−イル）ピリジン−２−イルアミノ）−６−オキソ−１，６−ジヒドロピリジン−３−イル）−フェニル）−３，４，６，７，８，９−ヘキサヒドロピリド［３，４−ｂ］インドリジン−１（２Ｈ）−オンであり、その構造は以下に示す：
2020514384.tif 000004
。
【０１５８】
選択されたバイオマーカーの候補が、高い感受性及び特異性で試料中の形質芽細胞の画分を正確に決定し得ることを確実にするために、３人のドナーに由来するｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した形質芽細胞を４０，０００から３９細胞まで段階的に２倍希釈し、２人の別々のドナーに由来する１，０００，０００  ＰＢＭＣにした。候補形質芽細胞マーカー遺伝子の発現レベルを、Ｆｌｕｉｄｉｇｍを使用して評価し、ハウスキーピング遺伝子、ＨＰＲＴ１に対するΔＣｔとして報告した。線形回帰を使用してｌｏｇ１０形質芽細胞頻度により予測された候補遺伝子のΔＣｔをモデル化し、形質芽細胞ドナー及びＰＢＭＣドナーを共変量として使用した。候補遺伝子の大部分は、形質芽細胞の頻度と強い関連性を示し、形質芽細胞ドナー間の差は最小限であった。３遺伝子、ＩＧＪ、ＭＺＢ１及びＴＸＮＤＣ５は、特に良好に機能し、それぞれ、０．８４、０．７５及び０．６９のｒ２を示した（図２Ｂ−１、２Ｂ−２、２Ｂ−３、２Ｂ−４）。３遺伝子の平均をシグネチャースコアとして取得すると、ｒ２が０．７９のシグネチャースコアが得られた。
【０１５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏで分化した形質芽細胞の遺伝子シグネチャーを検証するために、１週間前にインフルエンザワクチンを接種された５人の健康なドナーから直接選別された形質芽細胞での発現を測定した。三つの候補バイオマーカー遺伝子の全ては、ナイーブ及び記憶Ｂ細胞の両方と比較して、形質芽細胞でより高度に発現した（図２Ｃ−１、２Ｃ−２、２Ｃ−３、２Ｃ−４）。
【０１６０】
実施例２：形質芽細胞マーカー遺伝子は、ｉｎ  Ｖｉｖｏでの形質芽細胞の頻度と相関している。
対にされたＲＮＡ配列決定データを有するＲＯＳＥフェーズＩＩ臨床試験［３］のループス患者のコホートでフローサイトメトリーを使用して、全血中の形質芽細胞の頻度を測定した。選択された形質芽細胞シグネチャー遺伝子は、ＩｇＤ−ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋＋ＣＤ３８＋＋形質芽細胞の頻度との高度な相関を表すことを示した（図２Ｄ−１、２Ｄ−２、２Ｄ−３、２Ｄ−４）。ＩＧＪ、ＭＺＢ１及びＴＸＮＤＣ５は、形質芽細胞含有量と最高の相関係数を示し、それぞれスピアマン相関係数は０．６６、０．７１、及び０．７１である。三つのシグネチャー遺伝子の平均をシグネチャーとして取得することにより、形質芽細胞の頻度との強い相関を示す（スピアマンρ＝０．７１）。これらの結果は、形質芽細胞の相対存在量が、選択された３遺伝子シグネチャーを使用して全血試料中で測定することができることを実証している。
【０１６１】
実施例３：形質芽細胞シグネチャーは、ＳＬＥの疾患活動性の増加と相関している。
先の研究は、形質芽細胞の頻度と、エリテマトーデスのエストロゲンの安全性−全身性エリテマトーデスの疾患活動性指数（ＳＬＥＤＡＩ）スコアによって測定された疾患重症度との間の強い相関を実証している。この相関は、静止状態の疾患を有する患者と活動性疾患を有する患者との差異により引き起こされるとみられる。ＥＸＰＬＯＲＥＲフェーズＩＩ臨床試験［４］の中程度から重症の腎外ループスのコホート内を見ると、形質芽細胞シグネチャーは、疾患活動性と低いが有意である相関を示すことが分かった（スピアマンρ＝０．１９、ｐ＝０．０３、図３Ａ）。この相関を引き起こすＳＬＥＤＡＩの項目をより詳しく見ると、特に三つのサブスコアがより高い形質芽細胞の存在量と関連していることがわかった：ＤＮＡ結合、低い補体値及びリンパ球減少（図３Ｂ−１、３Ｂ−２、３Ｂ−３）。
【０１６２】
多数のループス患者のコホートにおける形質芽細胞の存在量と補体成分Ｃ３及びＣ４の血清濃度との間に中程度の負の相関を発見した（それぞれスピアマンρ＝−０．３４、−０．３８、図３Ｃ）。これらのコホートにおける形質芽細胞含有量と抗二本鎖ＤＮＡ抗体の力価との間にも中程度の相関を観察した（スピアマンρ＝０．３９、図３Ｃ−１、３Ｃ−２、３Ｃ−３）。
【０１６３】
ループス患者の大部分は、インターフェロン活性の転写シグネチャーを示す［２，５］。形質芽細胞シグネチャーは、３遺伝子シグネチャーを使用して測定されたインターフェロン活性と中程度の相関を示した（図３Ｄ−１及び３Ｄ−２；［５］）。相関は、高レベルのインターフェロン活性を有する患者と形質芽細胞遺伝子が低発現である最低のインターフェロンシグネチャー患者とのサブセットにおける形質芽細胞シグネチャー発現の増大により引き起こされると見られ、その一方、高インターフェロン活性を有する患者は、低レベルと高レベルが混合した形質芽細胞遺伝子発現を示した。しかしながら、形質芽細胞シグネチャーは、インターフェロンシグネチャーと独立して、疾患重症度及び血清学的活性と相関し、赤池の情報量基準を指標とする後方モデル選択を使用して、形質芽細胞及びインターフェロンシグネチャーは、血清補体レベルを予測し、形質芽細胞シグネチャー単独で抗ｄｓＤＮＡ抗体価及びＳＬＥＤＡＩを予測した。
【０１６４】
複合スコアとして、又は個別の疾患ドメインについての、形質芽細胞シグネチャーと、英国ループス評価グループ（ＢＩＬＡＧ）活動性指数との間に関連は見られなかった。これらのデータは、自己抗体、リンパ球減少症、低補体血症により引き起こされる血清学的疾患活動性における形質芽細胞の役割を支持する。
【０１６５】
実施例４：リツキシマブ治療は、形質芽細胞シグネチャーを減少させる
ＳＬＥにおけるリツキシマブの安全性及び有効性を評価するフェーズＩＩ臨床治験の中程度から重症のループス患者の二つのコホートから、形質芽細胞シグネチャー値を回収した。コホートは、ループス腎炎（ＬＵＮＡＲ）又は腎外ループスのいずれかを有する患者であった（ＥＸＰＬＯＲＥＲ）［４，６］。年齢、人種、併用薬、インターフェロン活性、ＳＬＥＤＡＩ、診察、治療群及びそれらの相互作用の共変量を組み入れる、ランダム効果としてモデル化された患者との治療中の形質芽細胞シグネチャー値の混合効果のモデル化は、特にリツキシマブで治療された患者内の形質芽細胞シグネチャーにおける深刻な減少を同定した（図４Ａ、４Ｂ）。この効果は、リツキシマブ注入後２週間の時点で最も顕著であり、時間の経過とともに効果が減少した。ＥＸＰＬＯＲＥＲ治験では、リツキシマブの４回目の注入の２週間後、第２８週で３．４８倍の最大減少が観察された（ｐ＝２×１０−１１）。同様に、ＬＵＮＡＲ治験では、最低レベルの形質芽細胞シグネチャー発現が、第２８週の時点で３．３１倍の減少で観察された（ｐ＝０．００１１）。
【０１６６】
ＥＸＰＬＯＲＥＲ治験では、マウス−ヒトキメラ抗体（ＨＡＣＡ）に対する抗体の存在について患者をモニターした。大抵のリツキシマブで治療された患者は、形質芽細胞シグネチャーの減少を示したが、抗薬物抗体を生じ続けた患者は、リツキシマブ治療後の形質芽細胞シグネチャーの減少がないことを示す（図４Ｃ）。上記と同一の線形混合効果モデルを使用して、ＨＡＣＡを生じ続ける患者において２．８倍高い形質芽細胞マーカー遺伝子の発現を発見した（ｐ＝０．０００７）。
【０１６７】
実施例５：ループス標準治療の治療は形質芽細胞シグネチャーを変える
以前の研究は、異なる免疫抑制剤治療と形質芽細胞関連遺伝子の発現の減少との関連を同定した［７］。ＥＸＰＬＯＲＥＲ臨床治験からのスクリーニング試料を見ると、アザチオプリンで治療された患者と比較して、ミコフェノール酸又はメトトレキサートで治療された患者においては、はるかに低い形質芽細胞シグネチャー発現が見られた（図５Ａ）。ＬＵＮＡＲ治験の患者において形質芽細胞シグネチャー遺伝子の発現が低下する傾向は、ベースラインでミコフェノール酸治療を受けていた患者で観察された（図５Ｂ）が、ＭＭＦ治療プールには比較的少数の患者が存在した。
【０１６８】
実施例６：患者の人種／民族性は形質芽細胞シグネチャーレベルに影響する
バイオマーカーレベルは、患者集団間で異なることが多い。データ分析により、ＥＸＰＬＯＲＥＲ及びＲＯＳＥの両方の臨床治験集団において、アフリカ系又はヒスパニック系の患者と比較して、ヨーロッパ系の患者の形質芽細胞シグネチャーのレベルが有意に低いことが明らかになった。これは、インターフェロン活性、年齢、及び疾患の重症度を説明するときに当てはまった（図６Ａ、６Ｂ、６Ｃ）。
【０１６９】
実施例７：形質芽細胞の分化に対するＢＴＫ阻害の効果
形質芽細胞の分化：健康なドナーＰＢＭＣから記憶Ｂ細胞を単離した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ記憶Ｂ細胞単離キット）。形質芽細胞の分化のために、その後、サイトカイン、ＩＬ−２（２０Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−１０（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−６（５０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮａ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下で１．５×１０＾５／ｍｌの記憶Ｂ細胞を培養し、ＯＤＮ２００６（ＴＬＲ−９リガンド）５ｕｇ／ｍｌ又はＣＤ４０Ｌ（３ｕｇ／ｍｌ）のいずれかで５日間刺激した。１０ｕＭから開始する阻害剤の３倍用量漸増法を使用して、ビヒクル単独（ＤＭＳＯ）及び様々な濃度のＧＤＣ−０８５２の存在下で形質芽細胞の分化を実施した。フローサイトメトリーを実施して、（ＣＤ２０−ＣＤ３８＋＋）形質芽細胞の割合を列挙し、ＧＤＣ−０８５２による阻害を評価した。
【０１７０】
ＲＮＡの調製：ＤＭＳＯ及びＧＤＣ−０８５２（３７０ｎＭ）処理細胞（ｎ＝４）から５日目の培養細胞からＲＮＡを抽出した。Ｑｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ（Qiagen, Valencia, CA）を使用してＲＬＴバッファーで細胞を破壊し、その後、オンカラムＤＮａｓｅ消化を含むＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ＮａｎｏＤｒｏｐ  ８０００（Thermo Scientific）を使用して、合計ＲＮＡの濃度及びＲＮＡ試料の完全性を決定した。Ｆｌｕｉｄｉｇｍ定量ＲＴ−ＰＣＲ分析のために単離されたＲＮＡを使用した。
【０１７１】
ＱＴ  ＰＣＲ：ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Biorad, Hercules, CA）を使用して、１００ｎｇの合計ＲＮＡでｃＤＮＡ合成を実施した。３つの遺伝子（ハウスキーピング遺伝子ＴＭＥＭ５５Ｂを含むＩｇＪ、ＭＺＢ１、ＴＸＮＤＣ５）について遺伝子特異的前増幅を実施した（Applied Biosystems）。製造業者のプロトコールを使用したＢｉｏＭａｒｋ  ４８．４８  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ａｒｒａｙｓ（FluidigmCorporation）を使用してＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＢｉｏＭａｒｋ  Ｄａｔａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用してデータを回収し、ＢｉｏＭａｒｋ  ＲＴ−ＰＣＲ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（V.2.1.1, Fluidigm）を使用してＣＴ値を得た。ＨＰＲＴ１に対する相対存在量（ｄＣｔ）を計算した：２ｌｏｇ−（平均Ｃｔ遺伝子−平均Ｃｔ  ＨＰＲＴ１）。統計的分析のために、検出下限値を下回る値を最低記録値よりも１Ｃｔ低く設定した。
【０１７２】
Ｒプログラミング言語で書かれた＜＞又はカスタムスクリプトのいずれかを使用して、統計的分析を実施した。遺伝子発現における差異を同定するために、線形混合効果モデルをｌｏｇ２−形質転換相対的転写産物量に適合させ、治療を固定効果とし、ドナーをランダム効果とする。ＤＭＳＯ試料と化合物で処理された試料との間の形質芽細胞の割合を比較するために、ウイルコクソンの順位和検定を使用した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ＢＴＫ阻害のＩＣ５０値を計算した。ヒト組換えインターロイキン（ＩＬ）−２、及びインターフェロン−α（ＩＦＮ−α）をＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Minneapolis, MN）から購入し、ＩＬ−１０、ＩＬ−６及びＩＬ−１５をＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（Rocky Hill, NJ）から購入した。ＣｐＧ（ＯＤＮ２００６）はＩｎｖｉｖｏｇｅｎ（San Deigo, CA）から購入し、ＣＤ４０ＬはＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ（Minneapolis, MN）から購入した。
【０１７３】
結果：Ｂ細胞の形質芽細胞への分化は、複数の活性化刺激を通じて起こり、明確な分子変化を伴い得る。ＣＤ４０、及び／又はＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）を通じたＢ細胞の活性化は、ＣＤ２０＋ＣＤ２７＋＋記憶Ｂ細胞のＣＤ２０−ＣＤ３８＋＋形質芽細胞への分化をもたらす。ＣＤ４０Ｌ刺激を使用したＴ細胞媒介性応答又はＴｏｌｌ様受容体リガンド、ＣｐＧを使用したＴ細胞非依存性応答のいずれかにより、形質芽細胞分化プロセスにおけるＢＴＫ阻害剤ＧＤＣ−０８５２の効果を評価した。
【０１７４】
ＧＤＣ−０８５２阻害ＣＤ４０Ｌは、第５日目に２０．０ｎＭ（＋／−０．００２）のＩＣ５０力価で用量依存的に形質芽細胞の分化を誘導する（図７）。ＤＭＳＯ処理細胞及びＧＤＣ−０８５２処理細胞の遺伝子発現分析は、形質芽細胞シグネチャー遺伝子ＩｇＪ（ｐ＝０．０１１）、ＭＺＢ１（ｐ＝０．００２３）、ＴＸＮＤＣ５（ｐ＝０．００３２）及び複合形質芽細胞３遺伝子シグネチャー（ｐ＝０．００２６）において有意な減少を示したが、ナイーブＢ細胞は、非常に低いレベルのシグネチャー遺伝子の発現を示した（ｐ＜１×１０−６）（図８）。遺伝子発現値を形質芽細胞存在量と比較すると、３遺伝子シグネチャーと形質芽細胞の割合との間に強い相関がある（スピアマンロー＝０．８１）（図９）。ＣｐＧ媒介性の形質芽細胞の分化（ｎ＝３）も、４８ｎＭ（＋／−５７）のＩＣ５０でＧＤＣ−０８５２により阻害された（図１０）。
【０１７５】
本開示又はその好ましい実施形態の要素を説明するとき、冠詞「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、及び「前記（ｓａｉｄ）」は、一又は複数の要素があることを意味するものとする。用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」とは、包括的であり、列挙された要素以外に追加の要素が存在し得ることを意味するものとする。
【０１７６】
前述の発明は明確な理解のために例示及び実施例によってある程度詳細に説明されているが、説明及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本明細書に引用されるすべての特許及び科学文献の開示内容は、その全体が出典明示により本明細書に援用される。
【０１７７】
参考文献
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２．Bennett L, Palucka  a K, Arce E, Cantrell V, Borvak J, Banchereau J, et al. Interferon and granulopoiesis signatures in systemic lupus erythematosus blood. J Exp Med. 2003;197: 711-723. doi:10.1084/jem.20021553
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【図１Ａ−１】
2020514384.tif 000006
【図１Ａ−２】
2020514384.tif 000007
【図１Ｂ】
2020514384.tif 000008
【図２Ａ】
2020514384.tif 000009
【図２Ｂ−１】
2020514384.tif 000010
【図２Ｂ−２】
2020514384.tif 000011
【図２Ｂ−３】
2020514384.tif 000012
【図２Ｂ−４】
2020514384.tif 000013
【図２Ｃ−１】
2020514384.tif 000014
【図２Ｃ−２】
2020514384.tif 000015
【図２Ｃ−３】
2020514384.tif 000016
【図２Ｃ−４】
2020514384.tif 000017
【図２Ｄ−１】
2020514384.tif 000018
【図２Ｄ−２】
2020514384.tif 000019
【図２Ｄ−３】
2020514384.tif 000020
【図２Ｄ−４】
2020514384.tif 000021
【図３Ａ】
2020514384.tif 000022
【図３Ｂ−１】
2020514384.tif 000023
【図３Ｂ−２】
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【図３Ｂ−３】
2020514384.tif 000025
【図３Ｃ−１】
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【図３Ｃ−２】
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【図３Ｃ−３】
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【図３Ｄ−１】
2020514384.tif 000029
【図３Ｄ−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2020514384.tif 000032
【図４Ｃ】
2020514384.tif 000033
【図５Ａ】
2020514384.tif 000034
【図５Ｂ】
2020514384.tif 000035
【図６Ａ】
2020514384.tif 000036
【図６Ｂ】
2020514384.tif 000037
【図６Ｃ】
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【図７】
2020514384.tif 000039
【図８Ａ】
2020514384.tif 000040
【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
2020514384.tif 000042
【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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