(57)【要約】  本発明は、週に１回以下または０．２４ｍｇ／ｍ２から９．９９ｍｇ／ｍ２の範囲の用量でベータ鎖を欠くＣ４ＢＰのアイソフォームまたはＣ４ＢＰのアルファ鎖のＣＣＰ６領域を含んでなるポリペプチドの皮下投与を特徴とする、免疫疾患、特に関節リウマチ、全身性エリテマトーデスおよびループス腎炎の予防および／または治療に使用するための化合物に関する。本発明はまた、前記疾患の予防および／または治療のための０．４５ｍｇから１８．９０ｍｇの前記化合物を含んでなる医薬組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療に使用するための、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される化合物：
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
であって、複数投与を含んでなる投与計画において皮下投与され、かつ、週１回以下で投与される化合物。
【請求項２】
各投与の用量が０．２４ｍｇ／ｍ２から９．９９ｍｇ／ｍ２の範囲にある、請求項１に記載の使用のための化合物。
【請求項３】
免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療に使用するための、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される化合物：
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
であって、０．２４ｍｇ／ｍ２から９．９９ｍｇ／ｍ２の用量で皮下投与される化合物。
【請求項４】
２週間に１回投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項５】
週に１回投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項６】
後の投与から７日未満の間隔で皮下投与される先の工程をさらに含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項７】
免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および関節リウマチからなる群から選択される自己免疫疾患である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項８】
自己免疫疾患が関節リウマチである、請求項７に記載の使用のための化合物。
【請求項９】
ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームが、α７β０、α６β０およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１０】
欠失変異体が、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３およびＣＣＰ４のドメインを欠く、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１１】
Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ８ドメイン中の各Ｌｙｓ残基が、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択される残基により置換されている、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１２】
Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５を含んでなるポリペプチドである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１３】
用量が４ｍｇ／ｍ２から６ｍｇ／ｍ２の範囲にある、請求項２〜１２のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１４】
化合物が、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の治療に有用な１以上の治療剤と組み合わせて投与されるものであり、前記治療剤がシクロスポリンＡ、タクロリムス、メトトレキサート、チオプリン、抗ＴＮＦ剤、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、エタネルセプト、リツキシマブ、エプラツズマブ、ベリムマブ、ラパマイシン、抗インターフェロン抗体、トシリズマブ、ラキニモド、タバルマブ、オファツムマブ、イキセキズマブ、ブロダルマブ、ブリアキヌマブ、サリルマブ、リロナセプト、アニフロルマブ、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、アンチカルシニューリン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビタミンＤ、血管作動性腸ペプチド、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、オクレリズマブ、アタシセプト、アバタセプト、アレムツズマブ、シルクマブ、エクリズマブおよびＴ細胞ワクチンからなる群から選択されるものである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の使用のための化合物。
【請求項１５】
下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される０．４５ｍｇから１８．９０ｍｇの化合物：
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
と、皮下投与に適した薬学上許容される賦形剤とを含んでなる、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療に使用するための医薬組成物であって、皮下投与される医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫の分野に関し、特に、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の治療または予防を目的とした低用量で週１回以下の皮下投与のための、ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームおよびＣ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫反応の異常な調節は広範なヒト疾患と関連するが、その理由はさまざまな自己抗原および外来抗原に対する免疫応答の不適切な増加が、自己免疫障害、喘息、アレルギー反応、移植片対宿主病、移植拒絶反応およびその他のさまざまな免疫疾患を含む、膨大な数の病態において因果的な役割を果たすからである。関節リウマチ、全身性エリテマトーデスまたは炎症性腸疾患は、この疾患群の例である。
【０００３】
関節リウマチ（ＲＡ）は、持続的な多関節滑膜炎、軟骨破壊、および関節機能の喪失にさえ関連する関節の慢性炎症を特徴とする全身性免疫介在疾患である。ＲＡの臨床治療において著しい進歩が遂げられたが、抗リウマチ薬の長期投与には、高用量および高頻度の薬物使用、ならびに心臓、肝臓、腎臓などの機能不全を含むかなり多くの欠点が依然として存在する。
【０００４】
自己免疫疾患の全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、１００，０００人あたり約７０人に影響を及ぼすが、国、人口、性別によって異なり、女性では６〜１０倍の頻度で増加する。ＳＬＥには、皮疹、慢性疲労、関節炎から、より重度の糸球体腎炎、漿膜炎、神経障害まで、さまざまな症状が含まれる。ループス腎炎は、ほとんどのＳＬＥ患者で組織学的に明らかである。ループス腎炎の症状は、一般にタンパク尿、高血圧、腎不全と関連する。ＳＬＥ患者のほとんどは、疾患経過の初期にループス腎炎を発症する。現在の治療には、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチルおよびカルシニューリン阻害剤などの免疫抑制剤の使用が含まれる。しかし、従来の免疫抑制剤は、有効性と毒性の点で理想的ではない。Ｂ細胞（リツキシマブ、オクレリズマブ、ベリムマブ、アタシセプト）、共刺激分子（アバタセプト）、Ｔ細胞（アレムツズマブ）、サイトカイン（シルクマブ、トシリズマブ、エタネルセプト）および補体系の成分（エクリズマブ）に対してこれまでに試験された新しい生物学的および免疫調節剤でさえ、コルチコイドや従来の免疫抑制因子よりも特異的であるが、臨床診療に必要な有効性および／または安全性をまだ欠いている。
【０００５】
ヒト単球由来樹状細胞は炎症誘発性刺激によって活性化され、自己免疫と移植に関連する膨大な数の状態の病因において樹状細胞が重要な役割を果たす可能性があるという概念を支持する証拠が増えている。
【０００６】
樹状細胞（ＤＣ）は、免疫系の専門的なＡＰＣである。未成熟の段階では、ＤＣはファゴサイトーシスまたはピノサイトーシスによって細胞外抗原を取り込み、抗原をエンドソームやファゴソームなどのエンドサイトーシス区画においてペプチドに処理し、そこでペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子に結合する。また、ＤＣは、ペプチドを外因性タンパク質からＭＨＣクラスＩ提示経路にロードする（「交差提示」と呼ばれるプロセス）という特有の能力をも有する。適切な分化シグナル（微生物産物など）が与えられると、未成熟ＤＣは、ナイーブＴ細胞とメモリーＴ細胞の両方を活性化する能力を備えた免疫原性ＤＣに発達し得る。スペクトルの反対側では、未成熟ＤＣは寛容原性表現型に分化することもあり、これは末梢性寛容の維持に重要な役割を果たすと考えられている（Steinman, Ann. Rev. Immunol. 2003, 21: 685-711; Morelli, Immunol Rev 2003: 125-146）。
【０００７】
ベータ鎖を欠くＣ４ｂ結合タンパク質（Ｃ４ＢＰ）アイソフォームが樹状細胞に寛容原性状態を誘導するヒト単球由来樹状細胞（Ｍｏ−ＤＣ）の活性化表現型をダウンレギュレートすること；および、Ｃ４ＢＰのＣＣＰ６ドメインがヒトＭｏ−ＤＣに対するＣ４ＢＰの寛容原性活性に必要であることが開示されている（WO2013/010998 A2）。
【０００８】
Blomらは、Ｃ４ＢＰが補体の阻害によりマウスの実験的関節炎の発症を阻害することを開示する（Blom A. M., et al. Ann Rheum Dis 2009; 68:136-142）。しかし、ヒトＣ４ＢＰは循環から急速に除去され、この研究の著者らは治療効果を達成するために２日ごとに１回、高用量のＣ４ＢＰ（２ｍｇ／マウス）を腹腔内投与する必要があった。
【０００９】
したがって、既存の治療法の欠点、特に高用量の使用および高頻度の投与を克服する免疫疾患の治療の代替方法が必要である。
【発明の概要】
【００１０】
第１の側面では、本発明は、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療に使用するための、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される化合物：
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
であって、複数投与を含んでなる投与計画において皮下投与され、かつ、週１回以下で投与される化合物に関する。
【００１１】
第２の側面では、本発明は、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療に使用するための、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される化合物：
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
であって、０．２４ｍｇ／ｍ２から９．９９ｍｇ／ｍ２の範囲の用量で皮下投与される化合物に関する。
【００１２】
別の側面では、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される０．４５ｍｇから１８．９０ｍｇの化合物：
（ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
（ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
（ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
と、皮下投与に適した薬学上許容される賦形剤とを含んでなる、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療に使用するための医薬組成物であって、皮下投与される医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、Ｃ４ＢＰα鎖および改変バリアントの概略図を示す。野生型Ｃ４ＢＰα鎖は、直線的に配置された８つのＣＣＰドメインで構成される。Ｎ末端ドメイン（ＣＣＰ１−ＣＣＰ４）は、補体Ｃ４ｂおよびさまざまな病原体および宿主タンパク質と結合する。Ｃ末端ＣＣＰ８ドメインはプラスミノーゲンおよび病原体との結合に関与する。内部ＣＣＰ６ドメインは免疫調節活性を有する。欠失変異体１はＮ末端ドメイン（ＣＣＰ１−ＣＣＰ４）を欠失しており、それゆえ、補体系を調節することができず、さまざまな病原体に結合することができない。欠失変異体２は、欠失変異体１に類似するが、プラスミノーゲン結合を避けるために、さらにＣＣＰ８ドメインの３つの正に帯電したＬｙｓ残基がＧｌｎ残基に置換されている。
【図２】図２は、ｒＣ４ＢＰ（β−）変異体の生成とオリゴマー化の電気泳動分析を示す。Ｃ４ＢＰ（β−）変異体１および２（Ｍ１、Ｍ２）の配置は、還元（Ｒ）および非還元（ＮＲ）の両方の条件下で１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって評価された。各レーンに精製タンパク質１０μｇを負荷し、クーマシーブルーで染色した。左レーンは分子量標準を示す。
【図３】図３は、ヒト単球由来ＤＣに対するｒＣ４ＢＰ（β−）およびその改変バリアントの免疫調節活性の機能的評価を示す。ヒトＤＣは、分化および成熟プロセス全体にわたって、指定された濃度（ｎＭ）の野生型組換えＣ４ＢＰ（β−）（ｒＣ４ＢＰ（β−）またはその欠失変異体１および２とともにインキュベートした。ＤＣ成熟はＬＰＳ処理によって行った。その後、細胞を収集、洗浄し、成熟マーカーＣＤ８３（Ａ）および共刺激分子ＣＤ８６（Ｂ）の細胞表面発現についてフローサイトメトリーで分析した。ＣＤ８３およびＣＤ８６細胞表面発現の相対中央蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。さらに、それぞれの細胞上清も収集し、炎症誘発性サイトカインＩＬ−１２（ｈＩＬ−１２ｐ７０）の放出をＥＬＩＳＡで評価した（Ｃ）。示されている結果は、５人の独立した献血者の平均値＋ＳＤである。ｉＤＣ、未処理の未成熟ＤＣ；ｍＤＣ、未処理のＬＰＳ成熟ＤＣ；Ｃ４ＢＰ  ＷＴ（血漿精製Ｃ４ＢＰ（β＋）アイソフォーム処理およびＬＰＳ成熟ＤＣ）；ｒＣ４ＢＰ（β−）（組換えＣ４ＢＰ（β−））アイソフォーム処理およびＬＰＳ成熟ＤＣ；Ｃ４ＢＰ  Ｍｕｔ、Ｃ４ＢＰ（β−）欠失変異体処理およびＬＰＳ成熟ＤＣ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１は、ｍＤＣと比較した場合の有意差を示す。
【図４】図４は、血漿精製および組換えＣ４ＢＰ（β−）アイソフォームの両方が、ＬＰＳで刺激されたヒトＭｏＤＣにおけるＣＤ８３およびＣＤ８６表面マーカー発現を同様に抑制することを示す。ヒトＭｏＤＣは、５μｇ／ｍｌの適切なＣ４ＢＰアイソフォームとともに、分化および成熟プロセス全体にわたってインキュベートした。ＤＣ成熟はＬＰＳ処理により行った（５μｇ／ｍｌ）。細胞を収集、洗浄し、ＣＤ８３およびＣＤ８６（分化クラスター８３および分化クラスター８６）細胞表面マーカーの発現を特異的な蛍光標識抗体でフローサイトメトリーにより分析した。ｉＤＣ、未処理の未成熟ＤＣ；ｍＤＣ、未処理のＬＰＳ成熟ＤＣ；Ｃ４ＢＰ（β＋）、Ｃ４ＢＰ主要アイソフォーム処理のＬＰＳ成熟ＤＣ；Ｃ４ＢＰ（β−）５．２ｍｇ／ｍｌ、血漿精製Ｃ４ＢＰマイナーアイソフォーム（Ｂｉｏｉｎｇｅｎｉｕｍのストック（５．２ｍｇ／ｍｌ）（バッチ＃１４１１２７）から）処理のＬＰＳ成熟ＤＣ；Ｃ４ＢＰ（β−）ｒｅｃ  １．４ｍｇ／ｍｌ、組換えＣ４ＢＰマイナーアイソフォーム（Ｂｉｏｉｎｇｅｎｉｕｍの最初の半精製ストック（１．４ｍｇ／ｍｌ）（バッチ＃０１５６１６０４２７）から）処理のＬＰＳ成熟ＤＣ；Ｃ４ＢＰ（β−）ｒｅｃ  ５．６ｍｇ／ｍｌ、組換えＣ４ＢＰマイナーアイソフォーム（本研究で使用したＢｉｏｉｎｇｅｎｉｕｍの最初のストック（バッチ＃Ｊａｎ１２００８−Ｐ０３；５．６ｍｇ／ｍｌ））処理のＬＰＳ成熟ＤＣ；Ｃ４ＢＰ（β−）ｒｅｃ  ４．８ｍｇ／ｍｌ、組換えＣ４ＢＰマイナーアイソフォーム（本研究で使用したＢｉｏｉｎｇｅｎｉｕｍの２番目のストック（バッチ＃Ｊａｎ１２００８−Ｐ０４；４．８ｍｇ／ｍｌ））処理のＬＰＳ成熟ＤＣ。示されている結果は、３から９までの独立したＰＢＭＣドナーの相対中央蛍光強度（ＭＦＩ）±ＳＤを示す。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１は、ｍＤＣと比較した場合の有意差を示す。
【図５】図５は、ループス易発性ＮＺＢＷＦ１マウスの腎機能の決定を示す。総２４時間尿タンパク質は、ピロガロールレッドモリブデン酸タンパク質色素結合アッセイによって決定した。ｒＣ４ＢＰ（β−）投与は、毎月投与される「Ｈ−ＳＣ５００ｅ」群を除き、指示された用量（５μｇ／マウス、５０μｇ／マウスまたは５００μｇ／マウス）に従って、腹腔内（ＩＰ）（Ａ）または皮下（ＳＣ）（Ｂ）で行った。矢印は、２４週目から始まる２週間に１回のｒＣ４ＢＰ（β−）接種スケジュールを示す。ＣＹＰ投与は、１０日ごとに１回、５０ｍｇ／ｋｇで行った。データはマウスの体重で正規化され、平均＋ＳＤ（ｎ＝６−８）として示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１は、対照群のＰＢＳ接種マウスと比較した場合の有意差を示す。
【図６】図６は、ループス易発性ＮＺＢＷＦ１マウスのカプラン−マイヤー生存曲線を示す。累積生存曲線は、ＣＹＰ処理群と一部のｒＣ４ＢＰ（β−）処理群における増加した生存を示す。ｒＣ４ＢＰ（β−）は、毎月投与される「Ｈ−ＳＣ５００ｅ」群を除き、指示された用量（５μｇ／マウス、５０μｇ／マウスまたは５００μｇ／マウス）に従って、２週間に１回、腹腔内（ＩＰ）（Ａ）、または皮下（ＳＣ）（Ｂ）に投与された。矢印は、処理期間の開始（１６８日目）と終了（２５２日目）を示す。ＣＹＰ投与は、１０日ごとに１回、５０ｍｇ／ｋｇで行った（ｎ＝６／群）。＊ｐ＜０．０５；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１は、対照群のＰＢＳ接種マウス（Ｉ−ＰＢＳ）と比較した場合の有意差を示す（長期検定）。
【図７】図７は、関節炎スコアを示す。マウスのＣＡＩＡモデルにおけるＣＡＩＡ対照群、Ｃ４ＢＰｄ３群（３日目および５日目に５０μｇのＣ４ＢＰ（β−）皮下投与。）、デキサメタゾン群（５〜１１日に１ｍｇ／ｋｇ、腹腔内投与）、およびエンブレル群（５〜１１日に３０ｍｇ／ｋｇ）、皮下投与）を示す。結果は平均値±ＳＥＭ（ｎ＝６−８）として示す。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１は、ＣＡＩＡ対照群に対する有意差を示す（２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。＊ｐ＜０．０５は、対照群に対する有意差を示す（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）。
【発明の具体的説明】
【００１４】
本発明者らは、驚くべきことに、２週間に１回、５０μｇなどの低用量でβ鎖を欠く組換えＣ４ＢＰアイソフォーム（ｒＣ４ＢＰ（β−））を皮下投与すると、腎機能のエンドポイントとしてのタンパク質尿の発症が顕著に減衰すること、および全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）のマウスモデルにおいて最高の生存率が導かれることを発見した（実施例２および図５−６参照）。さらに驚くべきことに、本発明者らは、５０μｇ／マウスの皮下投与が同じ投与計画での５００μｇ／マウスの腹腔内投与よりも効果的であることを実証した。本発明者らはまた、関節リウマチなどの他の免疫疾患に低用量および低頻度で投与されるＣ４ＢＰ（β−）の有効性も示し（実施例３参照）、ここで（ｒＣ４ＢＰ（β−））は少なくとも１週間有効である。
【００１５】
これらの結果は、Ｃ４ＢＰの腹腔内投与の２日後に初期量のわずか３％が循環中に残っているため、Ｃ４ＢＰが一過性の効果を有することが知られているという事実にもかかわらず（Blom AM, et al. Ann Rheum Dis 2009; 68:136-142）、その薬物動態を知っていると予想されるよりも少ない用量および／または少ない頻度でＣ４ＢＰ（β−）を皮下投与することにより、免疫疾患の治療のための治療計画を設計することが可能であることを示す。
【００１６】
低頻度の投与でのベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームおよびＣ４ＢＰのアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドの治療的使用
本発明者らは、ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームの皮下投与が、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチを含むいくつかの免疫疾患の治療に有効であり、その効果が少なくとも１週間は維持されることを実証した。
【００１７】
したがって、第１の側面では、本発明は、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療に使用するための、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される化合物：
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
であって、複数投与を含んでなる投与計画において皮下投与され、かつ、週１回以下で投与される化合物に関する。
【００１８】
別の側面では、本発明は、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療のための医薬品の製造のための、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される化合物：
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
であって、複数投与を含んでなる投与計画において皮下投与され、かつ、週１回以下で投与される化合物に関する。
【００１９】
別の側面では、本発明は、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療のための方法であって、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される化合物を必要とする対象に投与することを含んでなり；
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
前記化合物が複数回の投与を含んでなる投与計画において皮下投与され、かつ、前記化合物が週に１回以下で投与される、方法に関する。
【００２０】
ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム（Ｃ４ＢＰ（β−））は、ヒトＭｏ−ＤＣの活性化表現型をダウンレギュレートし、寛容原性樹状細胞の特徴を示す樹状細胞の生成を促進し、したがって、樹状細胞が関与する免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の治療において有用であることが知られている（WO 2013/010998 A2）。さらに、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインが（Ｃ４ＢＰ（β−））の寛容原性活性に必要であり、ＣＣＰ６ドメインの変異体からなるペプチドが前記寛容原性活性を保持することが実証されている（Olivar et al. 2013 J. Immunol., 190:2857-2872）。
【００２１】
本発明者らは、全長のアルファ鎖を有しかつベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームが免疫調節活性を有することを実証した（実施例１）。本発明者らはまた、ＣＣＰ６ドメインを保存するアルファ鎖の欠失変異体によって形成されるオリゴマーが免疫調節活性を保持することも示した（実施例１および図３）。
【００２２】
したがって、本発明の化合物は、ベータ鎖を欠く全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖のオリゴマーまたはＣＣＰ６ドメインが保存されているベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアルファ鎖の欠失変異体のオリゴマーであることができる。
【００２３】
したがって、本発明の第１の側面の項目（ａ）による実施形態では、本発明の化合物は、ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであり、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つが、ＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合に、ＣＣＰ６ドメインは前記アルファ鎖に保存されているものである。
【００２４】
本明細書で使用される「Ｃ４ＢＰ」という用語は、Ｃ３ｂおよびＣ４ｂの因子Ｉ依存性分解の補因子として作用し、かつ、古典的な経路Ｃ３／Ｃ５−転換酵素の崩壊を促進する肝細胞によって主に合成される古典的経路の調節成分である「Ｃ４ｂ結合タンパク質」を意味する。Ｃ４ＢＰは、いくつかの同一の７５ｋＤａのα鎖と多くの場合４０ｋＤａのβ鎖も有する、５００ｋＤａの大きな多量体タンパク質である。Ｃ４ＢＰは３つのアイソフォームとして血漿中を循環し、その割合はＣ４ＢＰα（７０ｋＤａ）およびＣ４ＢＰβ（４５ｋＤａ）鎖の相対レベルに依存する。Ｃ４ＢＰの主要なアイソフォームは、７つの同一のα鎖と１つのβ鎖（α７β１）で構成されるのに対し、炎症時には、α鎖（α７β０）のみで構成される通常より少ないアイソフォームがアップレギュレートされる。さらに、真核細胞におけるα鎖の組換え発現は、６つのα鎖（α６β０）を含んでなるオリゴマーを生じる。したがって、本発明の文脈における「Ｃ４ＢＰアイソフォーム」という用語は、複数のＣ４ＢＰα鎖の会合から生じ、β鎖を欠く任意のオリゴマーを意味する。
【００２５】
当業者は、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームは、以下に定義されるように天然由来のα鎖（例えば、ヒト、マウス、ラット、またはウシのＣ４ＢＰα鎖）のみによって形成されるか、または１つ以上のα鎖バリアントを含んでもよいと理解する。例えば、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つのα鎖バリアント（Ｃ４ＢＰアイソフォームがα６β０の場合）を含んでもよく、または、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つもしくは少なくとも７つのα鎖バリアント（Ｃ４ＢＰアイソフォームがα７β０である場合）を含んでもよい。アイソフォームが複数のα鎖バリアントを含む場合、前記バリアントは互いに異なっていても同一であってもよい。
【００２６】
本明細書で使用される「Ｃ４ＢＰα鎖」（ＰＲＰまたはプロリンリッチタンパク質としても知られる）という用語は、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（２０１１年４月５日リリース）の下で定義されたヒトポリペプチドの成熟プロセシング型を意味し、アミノ酸４９〜５９７を含んでなるものである。Ｃ４ＢＰα鎖という用語はまた、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０８６０７（アミノ酸５７〜４６９）で示されるポリペプチドの成熟型に対応するマウスＣ４ＢＰα鎖、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｑ６３５１４（アミノ酸１４〜５５８）で示されるポリペプチドの成熟型に対応するラットＣ４ＢＰα鎖またはＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｑ２８０６５（アミノ酸４９〜６１０）で示されるポリペプチドの成熟型に対応するウシＣ４ＢＰα鎖などのヒトＣ４ＢＰα鎖のオルソログの意味でも使用される。
【００２７】
Ｃ４ＢＰα鎖は、８つの補体制御タンパク質ドメイン（ＣＣＰ）を含む。α鎖とβ鎖の両方のＣ末端伸長は、それぞれ２つのシステイン残基と分子の細胞内重合に必要な両親媒性αヘリックス領域を含む。
【００２８】
本明細書で使用される「ＣＣＰドメイン」という用語は、Ｃ４ＢＰアルファ鎖に見られる補体制御ドメインの１つを意味する。ＣＣＰは、１−３  ２−４配列においてジスルフィド結合した４つのシステイン残基と、ほぼ不変のトリプトファン残基の周囲に構築された疎水性コアを含んでなる、６０アミノ酸残基である。
【００２９】
ＣＣＰ６ドメインは、ＮＣＢＩデータベースのアクセッション番号Ｐ０４００３（配列番号１）で提供される配列で定義されるヒトＣ４ＢＰアルファ鎖に関してアミノ酸３６３と４２４の間にある領域に対応し、次の配列に対応する：
【００３０】
LCCPEPKLNN GEITQHRKCR PANHCVYFYG DEISFSCHET CRFSAICQGD GTWSPRTPSC GD（配列番号：1）
【００３１】
一実施形態では、ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームは、アルファ鎖によって形成されるアイソフォームであり、アルファ鎖の少なくとも１つ、好ましくはすべてがＣＣＰ６ドメインを含むがＣ４ＢＰアルファ鎖の他のＣＣＰドメインのいずれも含まないものである。別の実施形態では、ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームは、アルファ鎖によって形成されるアイソフォームであり、アルファ鎖の少なくとも１つ、好ましくはすべてがＣ４ＢＰのＣＣＰ６ドメインからなる。
【００３２】
本発明のベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームは、天然由来のＣ４ＢＰα鎖のバリアントを含んでもよい。したがって、「Ｃ４ＢＰα鎖」という用語はまた、１つ以上のアミノ酸の修飾、挿入または欠失から生じ、他のＣ４ＢＰα鎖またはそのバリアントを有するオリゴマーの形成能を実質的に保持する、上記で定義される天然由来のＣ４ＢＰα鎖の任意のバリアントの意味で、本発明のアイソフォームの文脈において使用される。バリアントがオリゴマーを形成可能かを決定する方法は、当業者に利用可能であり、例えば、Blom et al.により記載された、真核細胞（例：２９３細胞）におけるバリアントα鎖の組換え発現により得られた精製Ｃ４ＢＰの天然条件下でのポリアクリルアミドゲル電気泳動とその後の欠失していないＣＣＰ領域の１つに特異的な抗体を使用したアフィニティ精製による分析に基づく方法が含まれる（J.Biol.Chem. 2001, 276:27136-27144）。
【００３３】
好ましい実施形態では、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームは、α７β０、α６β０およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００３４】
本発明に従って使用するためのＣ４ＢＰα鎖バリアントには、限定されるものではないが、以下が含まれる：
【００３５】
−天然由来の多型バリアント（すなわち、対立遺伝子バリアント）および組換え操作または操作されたα鎖バリアント。本発明による使用に適したバリアントＣ４ＢＰα鎖には、限定されるものではないが、上記で定義された天然由来のＣ４ＢＰα鎖ポリペプチド、特にヒト起源の天然由来のＣ４ＢＰα鎖と、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドが含まれる。
【００３６】
上記のアミノ酸配列に対するＣ４ＢＰα鎖バリアントのアミノ酸配列の同一性パーセントは、配列比較により当業者により容易に決定することができる。本明細書で使用されるように、２つのアミノ酸配列のアミノ酸残基が最大限の一致で整列するときに同じであるとした場合に、２つのアミノ酸配列は１００パーセントのアミノ酸配列同一性を有する。ポリペプチドおよびポリヌクレオチド（例えば、本明細書に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド）の配列比較は、当業者に周知のコンピューターアルゴリズムを使用するなどの任意の方法を使用して実施することができる。そのようなアルゴリズムには、AlignまたはBLASTアルゴリズムが含まれ（例えば、Altschul, J. Mol. Biol. 219:555-565, 1991; HenikoffおよびHenikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-10919, 1992を参照）、それらはNCBIウェブサイト（[オンライン]インターネットのncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLASTを参照）で利用可能である。デフォルトのパラメーターを使用してもよい。さらに、LASERGENEバイオインフォマティクスコンピューティングスイート（ウィスコンシン州マディソンのDNASTAR, Inc.）；CLUSTALWプログラム（Thompson et al., Nucleic Acids Res. 22:4673-80（1991））；および「GeneDoc」（Nicholas et al., EMBNEW News 4:14（1991））に含まれるような標準のソフトウェアプログラムも利用可能である。最適なアラインメントを決定することにより２つのアミノ酸配列を比較する他の方法は、当業者によって実施されている（例えば、Peruski and Peruski, The Internet and the New Biology: Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Tools for Genomic and Molecular Research (ASM Press, Inc. 1997); Wu et al.（eds。）, "Information Superhighway and Computer Databases of Nucleic Acids and Proteins、Methods in Gene Biotechnology、pages 123-151（CRC Press、Inc. 1997）; およびand Bishop（ed.）, Guide to Human Genome Computing, 2nd Ed. (Academic Press, Inc. 1998)参照）。
【００３７】
−ＣＣＰ１ドメイン、ＣＣＰ２ドメイン、ＣＣＰ３ドメイン、ＣＣＰ４ドメイン、ＣＣＰ５ドメイン、ＣＣＰ７ドメインおよび／またはＣＣＰ８を欠く変異体など、ＣＣＰ６ドメインが保存されている場合の、ＣＣＰ領域の少なくとも１つを欠く欠失変異体（実施例１参照）。
【００３８】
−Ｃ４ＢＰα鎖を含む第１の領域とＣ４ＢＰα鎖の一部を形成しないポリペプチドを含む第２の領域を含んでなる融合タンパク質。本発明の融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端方向に、（ａ）ＣＣＰ６ドメインを含む領域、および（ｂ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖の一部を形成しないポリペプチドを含む領域を含んでもよい。あるいは、本発明の融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端方向に、（ａ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖の一部を形成しないポリペプチドを含む領域、および（ｂ）ＣＣＰ６ドメインを含む領域を含んでもよい。薬物動態特性を改善する融合タンパク質の例には、限定されるものではないが、ヒトアルブミン、免疫グロブリンＦｃ領域、Ｆｃドメイン、ポリＧｌｕまたはポリＡｓｐ配列、フェリチンおよびトランスフェリンへの融合が含まれる。さらに、アミノ酸Ｐｒｏ、Ａｌａ、およびＳｅｒ（「ＰＡＳｙｌａｔｉｏｎ」）またはヒドロキシエチル化デンプン（HESylation.RTM.）から構成される立体構造的に乱れたポリペプチド配列との融合は、Ｃペプチドの流体力学的体積を増加させる簡単な方法を提供する。この追加の拡張は、嵩高いランダム構造を採用し、結果として生じる融合タンパク質のサイズを著しく増加させる。好ましい実施形態では、Ｃ４ＢＰアルファ鎖の一部を形成しないポリペプチドを含む領域は免疫グロブリンＦｃ領域である。
【００３９】
本明細書で使用する「免疫グロブリンＦｃ領域」という用語は、免疫グロブリン鎖定常領域のカルボキシル末端部分、好ましくは免疫グロブリン重鎖定常領域、またはその一部を意味すると理解される。例えば、免疫グロブリンＦｃ領域は、１）ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメイン、２）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ２ドメイン、３）ＣＨ１ドメインおよびＣＨ３ドメイン、４）ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン、または５）２つ以上のＣＨドメインと免疫グロブリンヒンジ領域の組み合わせを含んでもよい。本発明の融合タンパク質の免疫グロブリンＦｃ領域は、好ましくは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、さらに好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ｓＩｇＡ、より好ましくはＩｇＧ２またはＩｇＧ４、最も好ましくはＩｇＧ２から選択されるアイソタイプの免疫グロブリンのＦｃまたはＦｃの一部を含むまたはからなる。
【００４０】
好ましい実施形態では、バリアントは欠失変異体である。
【００４１】
本発明者らは、補体阻害活性を保持するドメインを欠く、またはプラスミノーゲン結合を担うドメインを変異させた欠失変異体が免疫調節活性を保持することを実証した（実施例１）。
【００４２】
したがって、好ましい実施形態では、欠失変異体は、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４および／またはＣＣＰ８ドメインの少なくとも１つが欠失している変異体である；好ましくは、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２およびＣＣＰ３ドメインが欠失している変異体である；より好ましくは、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３およびＣＣＰ４ドメインが欠失している変異体である。別の実施形態では、欠失変異体は、ＣＣＰ８ドメインが欠失している変異体である。好ましくは、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３およびＣＣＰ８が欠失している変異体である；より好ましくは、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４およびＣＣＰ８が欠失している変異体である。これらのドメインの欠失は完全な欠失であり、完全なドメインが除去されている。
【００４３】
本発明はまた、ドメインの欠失が完全ではない（すなわち、ドメインの一部のみ、好ましくは補体阻害活性に関与する部分および／またはプラスミノーゲン結合を担う部分を欠く）欠失変異体をも意図する。したがって、好ましい実施形態では、欠失変異体は、例えば、部分的にＣＣＰ１ドメインを欠く、部分的にＣＣＰ２ドメインを欠く、部分的にＣＣＰ３ドメインを欠く、部分的にＣＣＰ４ドメインを欠く、部分的にＣＣＰ５ドメインを欠く、部分的にＣＣＰ７ドメインを欠く、および／または部分的にＣＣＰ８ドメインを欠く変異体などのＣＣＰ６領域が保存されている場合に、ＣＣＰ領域の少なくとも１つが部分的に欠く欠失変異体である。別の実施形態では、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４および／またはＣＣＰ８のうちの少なくとも１つを部分的に欠く；好ましくは、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２およびＣＣＰ３ドメインを部分的に欠く；より好ましくは、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３およびＣＣＰ４ドメインを部分的に欠く変異体である。別の実施形態では、欠失変異体は、ＣＣＰ８ドメインを部分的に欠く；好ましくは、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３およびＣＣＰ８を部分的に欠く；より好ましくは、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４およびＣＣＰ８を部分的に欠く変異体である。
【００４４】
Ｃ４ＢＰアルファ鎖ＣＣＰ１およびＣＣＰ２の正に帯電したアミノ酸のクラスターは、Ｃ４ｂ結合および因子Ｉ補因子機能、特に残基Ａｒｇ３９、Ａｒｇ６４およびＡｒｇ６６に重要であること（Blom AM et al. 1999. J Biol Chem, 274 (27), 19237-19245）、およびＣ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ１−ＣＣＰ３がＣ４ｂの結合に寄与すること（Blom AM et al. 2001. J Biol Chem, 276 (29):27136-27144）が知られている。また、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ８が、主にリジン残基のためにプラスミノーゲンとの相互作用を媒介することが開示されている（Agarwal V. et al. 2015. J. Biol. Chem, 290 (30):18333-42）。
【００４５】
本発明はまた、補体阻害活性を保持するドメインおよび／またはプラスミノーゲン結合を担うドメインが変異しており、好ましくは変異して前記活性を無効にするバリアントをも意図する。好ましい実施形態では、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のバリアントは、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４および／またはＣＣＰ８ドメインの少なくとも１つが変異したバリアントである；好ましくはＣＣＰ１、ＣＣＰ２およびＣＣＰ３ドメインが変異したバリアントである；より好ましくはＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３およびＣＣＰ４ドメインが変異したバリアントである。別の実施形態では、バリアントは、ＣＣＰ８ドメインが変異したバリアントである；好ましくはＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３およびＣＣＰ８が変異したバリアントである；より好ましくはＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４およびＣＣＰ８が変異したバリアントである。
【００４６】
より好ましい実施形態では、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のバリアントは、ＣＣＰ８ドメインのＬｙｓ残基の少なくとも１つが変異したバリアントである。好ましくは、ＣＣＰ８ドメインのＬｙｓ残基の少なくとも１つは、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択される；好ましくはＧｌｎおよびＡｓｎから選択される；より好ましくはＧｌｎである残基で置換されている。より好ましい実施形態では、ＣＣＰ８ドメインの３つのＬｙｓ残基は、それぞれ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択される；好ましくは、ＧｌｎおよびＡｓｎから選択される；より好ましくはＧｌｎである残基で置換されている。
【００４７】
別の実施形態では、バリアントは、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３および／またはＣＣＰ４ドメインの少なくとも１つを完全にまたは部分的に欠く、ＣＣＰ８のＬｙｓ残基の少なくとも１つが、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択される；好ましくはＧｌｎおよびＡｓｎから選択される；より好ましくはＧｌｎである残基で置換されているバリアントである。より好ましい実施形態では、バリアントは、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２およびＣＣＰ３ドメインを完全に欠き、ＣＣＰ８の３つのＬｙｓ残基がそれぞれＰｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択される；好ましくはＧｌｎおよびＡｓｎから選択される；より好ましくはＧｌｎである残基で置換されているバリアントである。より好ましい実施形態では、バリアントは、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３およびＣＣＰ４ドメインを完全に欠き、ＣＣＰ８の３つのＬｙｓ残基がそれぞれＰｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択される；好ましくはＧｌｎおよびＡｓｎから選択される；より好ましくはＧｌｎである残基で置換されているバリアントである。さらにより好ましい実施形態では、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３およびＣＣＰ４ドメインを完全に欠き、ＣＣＰ８の３つのＬｙｓ残基がＧｌｎにより置換されている。
【００４８】
本発明はまた、オリゴマーを形成しないポリペプチドの使用を意図する。
【００４９】
したがって、本発明の第１の側面の項目（ｂ）による好ましい実施形態では、本発明で使用される化合物は、全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチドである。
【００５０】
本発明の文脈で使用される「ポリペプチド」という表現は、ポリペプチドとペプチドの両方を包含する任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を意味し、ペプチド結合により結合した２つ以上のアミノ酸の直鎖に関する。
【００５１】
「全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖」という表現は、天然由来のＣ４ＢＰに存在するすべてのＣＣＰ（すなわち、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４、ＣＣＰ５、ＣＣＰ６、ＣＣＰ７およびＣＣＰ８）を含むアルファ鎖を意味する。「全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖」という表現はまた、１つ以上のアミノ酸の修飾、挿入または欠失から生じる、上記で定義された天然由来のＣ４ＢＰアルファ鎖の全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖バリアントをも意味する。一実施形態では、全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖の前記バリアントは、他のＣ４ＢＰアルファ鎖またはそのバリアントとオリゴマーを形成することができない。全長のＣ４ＢＰアルファ鎖バリアントは、天然由来の多型バリアント（すなわち、対立遺伝子バリアント）だけでなく、組換え操作または操作されたアルファ鎖バリアントであることもできる。本発明による使用に適した全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖のバリアントは、限定されるものではないが、上記で定義された天然由来のＣ４ＢＰα鎖ポリペプチド、特にヒト起源の天然由来のＣ４ＢＰα鎖と、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％、少なくとも５５％、少なくとも５０％の同一性を有するポリペプチドである。アミノ酸配列の同一性パーセントは、上記で開示されたように計算される。
【００５２】
本発明の項目（ｂ）に従って使用することもできる化合物は、ＣＣＰ６ドメインを保存する全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖の欠失変異体を含んでなるポリペプチドである。本発明の第１の側面の項目（ａ）について開示された同じ欠失変異体は、前記欠失変異体を含むポリペプチドがオリゴマーを形成しないことを除いて、本発明の第１の側面の項目（ｂ）にも適用可能である。
【００５３】
一実施形態では、ＣＣＰ６ドメインを保存する全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖の欠失変異体を含んでなるポリペプチドは、以下からなる群：
−Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ５、ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ドメインを含んでなり、Ｃ４ＢＰアルファ鎖に見られる他のＣＣＰドメインの１つ以上を欠く、特にＣＣＰ８を欠くペプチド、および
−Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ５、ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ドメインを含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＣ４ＢＰとは異なるタンパク質の領域を含まないポリペプチド
から選択されてもよい。
【００５４】
本発明の第１の側面の項目（ｂ）によるポリペプチドは、Ｃ４ＢＰアルファ鎖の一部を形成しない領域を含むことができる。特に、前記ポリペプチドは、投与される化合物がオリゴマーではないことを除いて、本発明の第１の側面の項目（ａ）の文脈において上記で開示した融合タンパク質であってもよい。
【００５５】
別の好ましい実施形態では、本発明の第１の側面の項目（ｃ）によると、本発明は、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチドに関する。
【００５６】
一実施形態では、前記ポリペプチドは全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖ではない。一実施形態では、ＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドは、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の領域を含んでなる。好ましい実施形態では、ＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドは、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の領域を含まない。別の実施形態では、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドは、Ｃ４ＢＰアルファ鎖の少なくともＣＣＰ１ドメイン、少なくともＣＣＰ２ドメイン、少なくともＣＣＰ３ドメイン、少なくともＣＣＰ４ドメイン、少なくともＣＣＰ５ドメイン、少なくともＣＣＰ７ドメインおよび／または少なくともＣＣＰ８ドメインを欠く。さらにより好ましい実施形態では、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドは、Ｃ４ＢＰアルファ鎖に見られる他のＣＣＰドメインのいずれも含まない。本発明による使用のためのＣ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなる適切なポリペプチドは、限定されるものではないが：
−Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ５、ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ドメインを含んでなるポリペプチド、
−Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ５、ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ドメインを含んでなるが、Ｃ４ＢＰアルファ鎖に見られる他のＣＣＰドメインのいずれかを１つ以上、特にＣＣＰ８を欠くポリペプチド、および
−Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ５、ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ドメインを含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＣ４ＢＰとは異なるタンパク質の領域を含まないポリペプチド
を含む。
【００５７】
「機能的に等価なバリアント」という用語は、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドを意味する場合、１つ以上のアミノ酸の挿入、欠失または置換により前記ポリペプチドに由来し、実質的に元のポリペプチドの機能的活性を保存する配列を有する任意のポリペプチドを意味する。本発明に包含される適切なバリアントは、ヒトのＣＣＰ６ドメインと、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％または６０％よりも低い同一性を示すＣＣＰ６ドメインのバリアントを含んでなるポリペプチドを含む。２つのポリペプチドの同一性を決定するための適切な方法は、上記で詳細に定義される。好ましい実施形態では、バリアントは、セリンで置換されるシステイン残基を１つ以上含む。本明細書で使用される「実質的に元のポリペプチドの機能的活性を保存する」という表現は、例えば、本発明の実施例１で示されるようにまたは国際特許出願WO2013/010998 A2で開示された方法で決定される樹状細胞の成熟を阻害することのできるポリペプチドを意味する。
【００５８】
したがって、ポリペプチドは、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、特にα７β０またはα６β０アイソフォームの活性の少なくとも１００％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％または少なくとも５０％を示す場合、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームと機能的に等価であるとみなされる。
【００５９】
例えば、受容体に対する親和性を調節し、循環半減期を調節し、治療半減期を調節し、ポリペプチドの安定性を調節し、プロテアーゼによる切断を調節し、用量を調節し、放出もしくはバイオアベイラビリティを調節し、精製の促進し、または特定の投与経路の改善もしくは変更するために、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドの機能的に等価なバリアントを修飾することができる。同様に、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドのバリアントは、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗体結合ドメイン（限定されるものではないが、ＦＬＡＧまたはｐｏｌｙ−Ｈｉｓを含む）または他の親和性に基づく配列（限定されるものではないが、ＦＬＡＧ、ｐｏｌｙ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなどを含む）またはポリペプチドの検出（限定されるものではないが、ＧＦＰを含む）、精製もしくは他の特性を改善する結合分子（限定されるものではないが、ビオチン）を含んでもよい。
【００６０】
別の実施形態では、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドの機能的に等価なバリアントは、ＣＣＰ６ドメインを含む第１領域と、Ｃ４ＢＰアルファ鎖の一部を形成しないポリペプチドを含む第２領域とを含んでなる融合タンパク質である。本発明の融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端方向に、（ａ）ＣＣＰ６ドメインを含んでなる領域と、（ｂ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖の一部を形成しないポリペプチドを含んでなる領域とを含んでもよい。あるいは、本発明の融合タンパク質は、アミノ末端からカルボキシ末端方向に、（ａ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖の一部を形成しないポリペプチドを含んでなる領域と、（ｂ）ＣＣＰ６ドメインを含んでなる領域とを含んでもよい。好ましくは、融合タンパク質の一部を形成し、ＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドは、Ｃ４ＢＰアルファ鎖の少なくともＣＣＰ１ドメイン、少なくともＣＣＰ２ドメイン、少なくともＣＣＰ３ドメイン、少なくともＣＣＰ４ドメイン、少なくともＣＣＰ５ドメイン、少なくともＣＣＰ７ドメインおよび／または少なくともＣＣＰ８ドメインを欠く。さらにより好ましい実施形態では、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなるポリペプチドは、Ｃ４ＢＰアルファ鎖に見られる他のＣＣＰドメインのいずれも含まない。本発明による融合タンパク質で使用するためのＣ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインを含んでなる適切なポリペプチドは、限定されるものではないが：
−Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ５、ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ドメインを含んでなるポリペプチド、
−Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ５、ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ドメインを含んでなるが、Ｃ４ＢＰアルファ鎖に見られる他のＣＣＰドメインのいずれか１つ以上を欠く、特にＣＣＰ８を欠くポリペプチド、および
−Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ５、ＣＣＰ６およびＣＣＰ７ドメインを含んでなるポリペプチドであって、前記ポリペプチドがＣ４ＢＰとは異なるタンパク質の領域を含まないポリペプチド
を含む。
【００６１】
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の領域を含まない。例えば、本発明のポリペプチドは、Ｃ４ＢＰとは異なるタンパク質の一部を形成する領域を含んでなる融合タンパク質にはなり得ない。
【００６２】
ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントはまた、実質的に元のポリペプチドの機能的活性を保存するＣ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインの断片であってもよい。好ましくは、１つ以上のシステイン残基がセリンで置換され、実質的に元のペプチドの機能的活性を保存しているＣ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインの断片である。これらの特徴を有するペプチドは以前に開示されている（WO2013/010998 A2）。
【００６３】
さらに別の側面では、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチドは、配列番号２、３、４および５からなる群から選択される配列を含んでなるポリペプチドである（表１参照）。
【００６４】
【表１】
2020517588.tif 000002
【００６５】
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、配列番号２、３、４および５からなる群から選択される配列からなる。
【００６６】
好ましい実施形態では、配列は配列番号５である。
【００６７】
前記配列番号２−５の機能的に等価なバリアントも本発明により意図される。
【００６８】
配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５からなる群から選択される配列を含んでなるポリペプチドの機能的に等価なバリアントは、限定されるものではないが、上述の１つ以上のポリペプチドのアミノ酸の挿入、欠失または置換、ならびに前記ポリペプチドの活性を実質的に維持するそれらのペプチド模倣物を含む。所定のポリペプチドまたはペプチドが、単離されたＣＣＰ６ポリペプチド（配列番号１）または配列番号２−５のポリペプチドの機能的に等価なバリアントとみなせるかどうかを決定するのに適切な方法は、例えば、国際特許出願WO2013/010998 A2の実施例８で提供されるアッセイを含み、そのアッセイでは、未成熟樹状細胞への分化段階で単球細胞に加えられたときおよび／または成熟樹状細胞への成熟段階で未成熟樹状細胞に加えられたときに寛容原性樹状細胞を生成する能力を示す場合に、ペプチドはβ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームのバリアントとみなすことができる。寛容原性樹状細胞の生成を促進するバリアントの能力は、例えば、バリアントの存在下で成熟した樹状細胞のＣＤ８３、ＣＤ１４および／またはＣＤ１ａなどの成熟マーカーの樹状細胞における発現レベルを測定することにより決定することができる（国際特許出願WO2013/010998 A2の例１および２）。したがって、ペプチドは、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォーム、特にα７β０またはα６β０の活性の少なくとも１００％、少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６５％、少なくとも６０％または少なくとも５０％を示す場合、β鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームと機能的に等価とみなすことができる。
【００６９】
本発明での使用に適した、単離されたＣＣＰ６ポリペプチド（配列番号１）または配列番号２〜５のポリペプチドの機能的に等価なバリアントは、以下を含むが、これらに限定されるものではない；
【００７０】
−アシル化、アミド化、エステル化誘導体などを含む上記ペプチドのいずれかの誘導体化から生じるペプチド。
【００７１】
−置換（例えば、保存的アミノ酸置換）および／または挿入（例えば、小さな、単一のアミノ酸挿入、または２、３、４、５、１０、１５、２０もしくはそれ以上の連続したアミノ酸を含む挿入）および／または欠失（例えば、小さな単一のアミノ酸の欠失、または２、３、４、５、１０、１５、２０もしくはそれ以上の連続したアミノ酸を含む欠失）による上記ペプチドのいずれかの修飾から生じるペプチド。したがって、ある実施形態では、天然ペプチド配列のバリアントは、（ｉ）１つ以上（例えば、２、３、４、５、６またはそれ以上）の保存的アミノ酸置換、（ｉｉ）１つ以上（例えば、２、３、４、５、６またはそれ以上）のアミノ酸の欠失、または（ｉｉｉ）それらの組合せによって天然由来配列とは異なるものである。欠失または挿入されたアミノ酸は、連続的または非連続的である。
【００７２】
このような変更を行う場合には、あるアミノ酸が同様のヒドロパシーインデックスまたはスコアを有する他のアミノ酸に置換され、同様の生物学的活性を有するポリペプチドを生じることが知られているため、アミノ酸のヒドロパシーインデックスが考慮される。例えば、アミノ酸残基の相対的なヒドロパシー特性は、結果として生じるポリペプチドの二次および三次構造に影響を及ぼし、それは、さらにポリペプチドと酵素、基質、受容体、抗体、抗原などの他の分子との相互作用を定義する。上記で概説したように、アミノ酸置換は、一般にアミノ酸側鎖置換基の相対的な類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づくものである。前述の様々な特徴を考慮した例示的な置換は、当業者に周知であり、以下の表２に記載されている。
【００７３】
【表２】
2020517588.tif 000003
【００７４】
好ましい実施形態では、ペプチドは、１つ以上のセリン残基をシステインで置換することにより修飾される。
【００７５】
−上記の配列のいずれかを有するが、様々な既知の化学基または分子のいずれかを含むように修飾されたペプチド。そのような修飾は、限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、ポリエチレングリコールへの共有結合（例えば、ＰＥＧ化）、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、共有架橋の形成、シスチンの形成、ピログルタメートの形成、ホルミル化、ガンマカルボキシル化、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、ヒドロキシル化、アシル化、アミド化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、タンパク質分解処理、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ユビキチン化、脂肪酸による修飾、アルギニル化などのトランスファーＲＮＡを介したタンパク質へのアミノ酸の付加などを含む。アミノ酸の類似体（非天然アミノ酸を含む）および置換された結合を有するペプチドも含まれる。
【００７６】
−上記ペプチドのペプチド模倣物（ミメティクス）。「ペプチド模倣物（peptide mimetic）」または「ペプチド模倣物（peptidomimetics）」は、得られた分子が所望のポリペプチド二次（または局在化三次）構造要素を模倣または類似している限り、様々なタイプまたはクラスの分子を意味する。例えば、ペプチド模倣物は、アミド結合アイソスターの使用および／または天然ペプチド骨格の修飾を通じてペプチド二次構造を模倣するオリゴマーであり、鎖伸長またはヘテロ原子取り込みを含む。その例には、アザペプチド、オリゴカルバメート、オリゴ尿素、ベータペプチド、ガンマペプチド、オリゴ（フェニレンエチニレン）、ビニログスルホンペプチド、ポリ−Ｎ−置換グリシン（ペプトイド）などが含まれる。ペプチド模倣物を設計および合成する方法は、当業者に周知である。ある実施形態では、ペプチド模倣体を使用して、プロテアーゼ感受性を克服し、二次構造を安定化し、および／または天然由来のＣＣＰ６ペプチド類似体と比較して生物学的利用能を改善することが意図される。ある実施形態では、本発明のペプチド模倣物は、逆方向ターン模倣物、例えば、アルファターン模倣物、単環式ベータターン模倣物、二環式ベータターン模倣物、ガンマターン模倣物または単環ガンマターン模倣物である。
【００７７】
上記で開示された化合物は、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療に使用することができる。
【００７８】
本明細書で使用する「予防」という用語は、疾患の初期または初期段階での本発明の化合物の投与、またはその発症の予防も意味する。
【００７９】
「治療」という用語は、臨床徴候が現れる前または後に疾患の進行を制御するための本発明の化合物の投与の意味で使用される。疾患の進行の制御は、限定されるものではないが、症状の軽減、疾患の持続期間の短縮、病状の安定化（特に追加の障害の回避）、進行の遅延、病状の改善および寛解（部分的および完全な両方）を含む有益または望ましい臨床結果として理解される。疾患の進行の制御には、治療が適用されなかった場合に予想される生存期間との比較における生存期間の延長も含まれる。
【００８０】
「免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患」という表現は、免疫システムの望ましくない活性化に起因する疾患を意味し、先天性または適応免疫系、ならびに免疫系の体液性または細胞分枝を含む。好ましくは、本発明の免疫疾患は、免疫系が同種抗原または自己抗原に応答して活性化される疾患である。したがって、免疫系が低下している免疫疾患は、本発明に含まれない。
【００８１】
好ましい実施形態では、免疫疾患は、免疫炎症性疾患、敗血症、自己免疫疾患、移植拒絶、移植片対宿主病および過敏性疾患からなる群から選択される。
【００８２】
本明細書で使用される「免疫炎症性疾患」という用語は、免疫細胞および／またはサイトカインが疾患または障害の病態生理に関与する炎症性疾患および障害を意味する。免疫炎症性疾患の例には、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、急性呼吸促迫症候群および喘息などの状態が含まれる。免疫炎症性疾患という用語には、急性および慢性の炎症性障害の両方が含まれる。「急性炎症性障害」という用語は、炎症反応に関連する症状の急速な発症および症状の比較的短い持続時間を特徴とする障害および障害のエピソードを含むことを意図しているのに対し、「慢性炎症性障害」は、炎症反応に関連する症状の継続的な存在および進行中の症状の継続時間を特徴とする障害を含むことを意図する。本発明による方法で治療できる免疫炎症性疾患は、限定されるものではないが、梗塞または脳卒中などの心血管疾患、アテローム性動脈硬化症、肺線維症、関節リウマチ、若年性関節リウマチ、変形性関節症、急性呼吸促迫症候群、喘息および癌が含まれる。本発明により治療することができる免疫炎症性疾患には、妊娠中毒症および子癇などの妊娠中に現れる疾患も含まれる。妊娠中毒症は、高血圧、タンパク尿、浮腫を特徴とする妊娠関連疾患である。妊娠中毒症は、胎盤機能不全、子宮内発育遅延、早期流産、早産、子宮内死および子癇を含む、妊娠中毒症の障害の範囲内にあると理解され、本明細書で定義されるものとする。
【００８３】
本明細書で使用される「敗血症」という用語は、感染の主要部位から離れた末端器官の機能不全を特徴とする以前に滅菌された組織中の微生物に対する全身性宿主応答を意味する。敗血症と認定するには、感染が疑われるか証明されるか（培養、染色、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって）、または感染に特徴的な臨床的症候群がなければならない。感染の具体的な証拠には、通常は無菌である体液（尿または脳脊髄液（ＣＳＦ）など）中の白血球、穿孔性内臓（腹部Ｘ線またはＣＴスキャンでの遊離空気、急性腹膜炎の徴候）、肺炎（限局性混濁を伴う）と一致する異常な胸部Ｘ線（ＣＸＲ）、または点状出血、紫斑病、または紫斑病が含まれる。敗血症のより重要なサブセットは、重症敗血症（急性臓器不全を伴う敗血症）および敗血症性ショック（難治性動脈性低血圧を伴う敗血症）である。あるいは、２つ以上の全身性炎症反応症候群の基準が感染の証拠なしに満たされた場合、患者は単に「ＳＩＲＳ」と診断されることがある。ＳＩＲＳおよび急性臓器機能障害の患者は、「重度のＳＩＲＳ」と呼ばれることがある。患者は、敗血症に加えて全身性低灌流の徴候がある場合、「重度の敗血症」を有すると定義される：臓器機能障害または４ｍｍｏｌ／ｄＬを超える血清乳酸のいずれかである場合。その他の徴候には、乏尿および精神状態の変化が含まれる。患者は、積極的な輸液蘇生後に敗血症に加えて低血圧症がある場合、敗血症性ショックを有すると定義される（通常６リットル以上または４０ｍｌ／ｋｇの晶質液）。終末器官の機能不全の例には、急性肺傷害または急性呼吸促迫症候群、脳症、または肝臓に影響を及ぼす機能不全（タンパク質合成機能および代謝機能の破壊）、腎臓（乏尿および無尿、電解質異常、体積過負荷）、および心臓（収縮期）および拡張期心不全）が含まれる。
【００８４】
本発明の化合物で治療することができる適切な敗血症状態には、限定されるものではないが、重度の敗血症および敗血症性ショックが含まれる。一実施形態では、敗血症症候群に関連する状態は、臓器機能不全、好ましくは腎機能不全または肝機能不全、多臓器不全症候群（ＭＯＤＳ）、急性呼吸促迫症候群（ＡＲＤＳ）、および管内凝固症候群（ＤＩＣ）からなる群から選択される。
【００８５】
敗血症は、細菌またはグラム陰性細菌およびグラム陽性細菌からなる群から選択される１つ以上の細菌によって誘発される。好ましくは、グラム陰性細菌は、大腸菌、クレブシエラ種、セラチア種、エンテロバクター種、プロテウス種、緑膿菌、インフルエンザ菌、ナイセリア種、およびリステリア種からなる群から選択される。あるいは、グラム陽性細菌は、黄色ブドウ球菌、肺炎連鎖球菌、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌、腸球菌種、化膿連鎖球菌、および連鎖球菌からなる群から選択される。一実施形態において、敗血症症候群はＬＰＳにより誘発される。さらに別の実施形態では、敗血症は、嫌気性細菌、真菌、リケッチア、クラミジア、マイコプラズマ、スピロヘータ、およびウイルスからなる群から選択される１つ以上の微生物によって誘導される。
【００８６】
好ましい実施形態では、免疫疾患は自己免疫疾患である。
【００８７】
用語「自己免疫疾患」、「免疫機能不全／調節不全に関連する疾患」または「免疫炎症性疾患」は、明細書全体を通して、患者の免疫系が自己抗原（自己免疫）または外来抗原（免疫機能不全／調節不全または免疫炎症性疾患）由来の疾患で生じる病態の意味で使用される。自己免疫はすべての人にある程度存在する。それは通常無害であり、おそらく脊椎動物の生命の普遍的な現象である。しかし、自己免疫は、自己免疫疾患として知られる広範なヒトの疾病の原因になる可能性がある。ヒトの疾病の原因としてのこの自己免疫の概念は比較的新しく、１９５０年代と１９６０年代まで医学的思考の主流には受け入れられていなかった。したがって、自己免疫疾患は、良性の自己免疫から病原性自己免疫への進行が起こる時に定義される。この進行は、遺伝的影響と環境的トリガーの両方によって決定される。ヒトの疾病の実際の原因としての自己免疫の概念（結果または無害な付随物ではなく）は、疾患を自己免疫疾患として定義する基準を確立するために使用できる。自己免疫疾患または免疫機能障害または調節不全を伴うことを特徴とする疾患（免疫炎症性疾患）は、本発明によって治療することができ、とりわけ全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、中枢神経系（ＣＮＳ）ループス、糖尿病（Ｉ型）、喘息、潰瘍性大腸炎、クローン病、グレーブ病、関節リウマチおよび変形性関節症を含む関節炎、悪性貧血、多発性硬化症を含む。本発明の方法を使用して、とりわけ、悪性貧血、自己免疫性溶血性貧血、再生不良性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、強直性脊椎炎などの自己免疫性血液疾患；多発性筋炎および皮膚筋炎を含む筋肉組織の自己免疫疾患、自己免疫性難聴およびメニエール症候群を含む耳の自己免疫疾患、モーレン病、ライター症候群、フォークト−小柳−原田病などの自己免疫性眼疾患、糸球体腎炎、ＩｇＡ腎症、ループス腎炎を含む腎臓の自己免疫疾患；糖尿病（Ｉ型）；尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、紅斑性天疱瘡などの天疱瘡（自己免疫水疱性疾患）、水疱性類天疱瘡、白斑、後天性表皮水疱症、乾癬および円形脱毛症を含む自己免疫性皮膚疾患；自己免疫性心筋炎、チャーグ−ストラウス症候群を含む血管炎、巨細胞性動脈炎、川崎病、結節性多発性動脈炎、高安動脈炎およびウェゲナー肉芽腫症を含む心血管自己免疫疾患；アジソン病、自己免疫性副甲状腺機能低下症、自己免疫性下垂体炎、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性精巣炎、グレーブス病、橋本甲状腺炎、多腺性自己免疫症候群１型（ＰＡＳ−Ｉ）多腺性自己免疫症候群２型（ＰＡＳ−２）、および多腺性自己免疫症候群３型（ＰＡＳ−３）を含む内分泌自己免疫疾患；自己免疫性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、炎症性腸疾患、セリアック病、クローン病などの自己免疫性胃腸疾患；多発性硬化症、重症筋無力症、ギランバレー症候群および慢性炎症性脱髄性ニューロパシーを含む自己免疫性神経疾患；および全身性エリテマトーデス、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫性リンパ増殖性疾患、自己免疫性多発性内分泌障害、ベーチェット病、グッドパスチャー病などの全身性自己免疫疾患、関節リウマチ、変形性関節症、敗血症性関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群および乾癬を含む関節炎などの多数の自己免疫疾患を治療することができる。
【００８８】
一実施形態では、自己免疫疾患はエリテマトーデスである。本明細書で使用される表現「エリテマトーデス」は、関節、皮膚、腎臓、血液細胞、心臓および肺に影響を及ぼす共通の症状を有する自己免疫疾患のコレクションに与えられた名前を意味する。エリテマトーデスは、全身性疾患として、または不完全エリテマトーデスとしても知られる純粋な皮膚の形で現れることがある。ループスには、全身性、円盤状、薬物誘発性、新生児の４つの主要なタイプがある。本発明の文脈における用語「エリテマトーデス」は、限定されるものではないが、急性皮膚エリテマトーデス、亜急性皮膚エリテマトーデス、円盤状エリテマトーデス（慢性皮膚）、小児円盤状エリテマトーデス、全身性円盤状エリテマトーデス、限局性円板状エリテマトーデス、チリブランエリテマトーデス（ハッチンソン）、ループスエリテマトーデス−扁平苔癬重複症候群、ループスエリテマトーデス汎脂肪炎（深在性エリテマトーデス）、湿性エリテマトーデス、疣状性エリテマトーデス（肥大型エリテマトーデス）、皮膚ループス粘液症、補体欠損症候群、薬物誘発性エリテマトーデス、新生児エリテマトーデス、全身性エリテマトーデスを包含する。最も一般的な重症型は全身性エリテマトーデスである。
【００８９】
好ましい実施形態では、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、関節リウマチおよび潰瘍性大腸炎からなる群から選択される；より好ましくは、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎および関節リウマチからなる群から選択される。好ましい実施形態では、自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデスおよびループス腎炎からなる群から選択される。好ましい実施形態では、自己免疫疾患は全身性エリテマトーデスである。
【００９０】
別の好ましい実施形態では、自己免疫疾患は関節リウマチである。
【００９１】
本明細書で使用される表現「全身性エリテマトーデス」または「ＳＬＥ」は、体の免疫系が体の多くの部分の健康な組織を誤って攻撃する全身性自己免疫疾患を意味する。症状は人によって異なり、軽度から重度の場合がある。一般的な症状には、痛みを伴う関節の腫れ、発熱、胸痛、脱毛、口の潰瘍、リンパ節の腫れ、疲労感、および最も一般的に顔に現れる赤い発疹が含まれる。しばしば、フレアと呼ばれる疾病の期間と、症状がほとんどない寛解の期間がある。ＳＬＥであるほとんどすべての人は、関節痛と腫れを有する。中には関節炎を発症する人もいる。ＳＬＥは、多くの場合、指、手、手首、および膝の関節に影響を与える。ＳＬＥの腎疾患は、重大な罹患率と死亡率をもたらす。ループス腎炎では急性または慢性の腎機能障害を発症し、急性または末期の腎不全に至ることがある。
【００９２】
ＳＬＥ腎炎としても知られる「ループス腎炎」または「ＬＮ」という表現は、全身性エリテマトーデスに起因する腎臓の炎症である。これは、糸球体が炎症を起こす糸球体腎炎の一種である。ＳＬＥの結果として、糸球体腎炎の原因は続発性であると言われ、腎臓に起因する主な原因の状態とは異なるパターンと結果を有する。ループス腎炎の一般的な症状には、発熱、浮腫、高血圧、関節痛、筋肉痛、頬の発疹および泡沫状尿が含まれる。
【００９３】
本明細書で使用される「関節リウマチ」または「ＲＡ」という表現は、関節の慢性炎症およびその後の軟骨および骨の破壊を特徴とする長期全身性自己免疫障害を意味する。通常、温かい、腫れた、そして痛みを伴う関節になる。休息後に痛みとこわばりが悪化することがよくある。最も一般的には、手首と手が関与し、同じ関節が通常身体の両側に関与する。疾病はまた体の他の部分にも影響を及ぼす。これにより、赤血球数が少なくなり、肺の周りの炎症および心臓の周りの炎症を生じる場合がある。発熱と低エネルギーも存在する場合がある。多くの場合、症状は数週間から数ヶ月かけて徐々に現れる。ＲＡは主に、持続的な細胞活性化の状態として始まり、関節およびそれが現れる他の臓器の両方で自己免疫および免疫複合体をもたらす。疾病の最初の部位は滑膜であり、そこでは腫れや鬱血が免疫細胞の浸潤につながる。ＲＡの進行の様々な段階は次の通りである；
・非特異的な炎症による開始段階。
・Ｔ細胞の活性化による増幅段階
・サイトカインＩＬ−１、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６による組織損傷を伴う慢性炎症段階。
【００９４】
本明細書で使用される「移植拒絶反応」という表現は、移植された細胞、組織、または臓器が移植レシピエントの身体によって受け入れられない免疫状態を意味する。移植片拒絶反応という表現は、急性および慢性の両方の移植片拒絶反応を包含する。
【００９５】
「急性拒絶反応またはＡＲ」とは、移植された組織が免疫的に異物である場合、組織移植レシピエントの免疫系による拒絶反応である。急性拒絶反応は、レシピエントの免疫細胞による移植組織への浸潤を特徴とし、免疫細胞はエフェクター機能を実行し、移植組織を破壊する。急性拒絶反応の発症は急速であり、一般的に移植手術後数週間以内にヒトで発生する。
【００９６】
「慢性移植片拒絶反応またはＣＲ」は、急性拒絶反応の免疫抑制が成功した場合でも、一般的に移植後数ヶ月から数年以内にヒトで発生する。線維症は、あらゆる種類の臓器移植の慢性拒絶反応の共通の要因である。慢性拒絶反応は通常、特定の臓器に特有のさまざまな特定の障害によって説明される。例えば、肺移植では、そのような障害に気道の線維増殖性破壊（閉塞性細気管支炎）が含まれ；心臓移植または弁置換などの心臓組織の移植では、そのような障害には線維性アテローム性動脈硬化が含まれ；腎臓移植では、そのような障害には、閉塞性腎症、腎硬化症、尿細管間質性腎症が含まれ；および肝移植では、そのような障害に胆管消失症候群が含まれる。慢性拒絶反応は、虚血抑制、移植組織の除神経、免疫抑制剤に関連する高脂血症および高血圧によっても特徴付けられる。
【００９７】
移植分野で知られているように、移植臓器、組織または細胞は同種または異種であり、その結果、移植片は同種移植片または異種移植片である。本発明の方法により検出または同定される移植片耐性表現型の特徴は、それが免疫抑制療法なしで生じる表現型であること、すなわち、免疫抑制剤が投与されないように免疫抑制療法を受けていない宿主に存在することである。移植片は、任意の固形臓器および皮膚移植であってよい。本明細書に記載の方法で治療できる臓器移植の例には、限定されるものではないが、腎臓移植、膵臓移植、肝臓移植、心臓移植、肺移植、腸移植、腎臓移植後の膵臓、および同時膵臓−腎臓移植が含まれる。
【００９８】
本発明による方法はまた、虚血再灌流傷害による臓器移植後臓器機能障害（ＤＧＦ）の予防および／または治療にも適している。本明細書で使用される「臓器移植後臓器機能障害」という用語は、移植後乏尿、同種移植片免疫原性の増加および急性拒絶エピソードのリスク、ならびに長期生存の低下をもたらす急性腎不全の一形態を意味する。ＤＧＦは、ドナーに関連するさまざまな要因と、レシピエントに関連する腎前、腎、または腎後の移植要因に起因する場合がある。しかし、移植片機能の遅延の主な原因は、低体温保存後の虚血および虚血損傷腎臓の血流の再構成である。
【００９９】
本明細書で使用する「移植片対宿主病」またはＧＶＨＤという用語は、ドナー組織に存在するＴ細胞が移植細胞または移植組織の宿主またはレシピエントを攻撃するときに生じる状態を意味する。急性ＧＶＨＤおよび慢性ＧＶＨＤを含む、あらゆるタイプのＧＶＨＤを本発明の治療剤により治療することができる。
【０１００】
「過敏性疾患」という用語は、対象がアレルゲンとして知られる無害な薬剤に対する異常な感受性を有する状態を意味する。過敏性疾患は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型の４つのタイプに分類できる。Ｉ型は、ＩｇＥ感作好塩基球およびマスト細胞からのメディエーターの放出に起因するアトピー性またはアナフィラキシーとして説明される。ＩＩ型は、細胞溶解または抗体依存性細胞傷害性を伴う補体結合抗体を含む細胞傷害性として説明される。ＩＩＩ型は、可溶性抗原抗体複合体に関連する免疫複合体媒介として説明される。ＩＶ型は、抗原との接触後の感作Ｔリンパ球によるリンホカインの放出に起因する細胞性または遅延型過敏症として説明される。
【０１０１】
好ましい実施形態では、免疫疾患は炎症性腸疾患、より好ましくは潰瘍性大腸炎である。別の実施形態では、免疫疾患はクローン病である。
【０１０２】
本発明の第１の側面では、化合物は皮下投与される。本明細書で使用される「皮下」という用語は、皮下注射による投与経路を意味し、化合物は、真皮および表皮の真下の皮膚層である皮下にボーラスとして投与される。化合物を皮下投与する方法は、当業者に周知である。
【０１０３】
本発明の第１の側面では、化合物は、複数の投与（すなわち、少なくとも２回の投与）を含んでなる投与計画において投与される。好ましい実施形態では、投与計画は、少なくとも２回の投与、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも３０、少なくとも５０、少なくとも１００以上またはそれ以上を含んでなる。好ましくは、化合物は慢性的に投与される。好ましくは、化合物は、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも５年間またはそれ以上投与される。
【０１０４】
本発明の第１の側面では、化合物は週に１回のみ投与される。「化合物は週に１回しか投与されない」という表現は、１週間の最大投与数が１回であることを意味する。これは、化合物が１日目に投与される場合、その後の投与は２、３、４、５、６または７日目にはできないことを意味する。ただし、「化合物は１週間に１回以上投与されない」という表現は、たとえば、化合物は２週間に１回投与されるため、１週間は投与されないという可能性を包含するものである。したがって、本発明によれば、ある投与は別の投与から少なくとも７日間隔てられている。したがって、好ましい実施形態では、各投与は、別の投与から少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、少なくとも２０日、少なくとも２１日、少なくとも２２日、少なくとも２３日、少なくとも２４日、少なくとも２５日、少なくとも２６日、少なくとも２７日、少なくとも２８日、少なくとも２９日、少なくとも３０日、少なくとも３１日、少なくとも３２日、少なくとも３３日、少なくとも３４日、少なくとも３５日、少なくとも３６日、少なくとも３７日、少なくとも３８日、少なくとも３９日、少なくとも４０日、少なくとも４１日、少なくとも４２日、少なくとも４３日、少なくとも４４日、少なくとも４５日、少なくとも４６日、少なくとも４７日、少なくとも４８日、少なくとも４９日、少なくとも５０日ａｙｓ、少なくとも５１日、少なくとも５２日、少なくとも５３日、少なくとも５４日、少なくとも５５日、少なくとも５６日、少なくとも５７日、少なくとも５８日、少なくとも５９日、少なくとも６０日またはそれ以上隔てられている。
【０１０５】
好ましい実施形態では、化合物は週に１回投与される。別の好ましい実施形態では、化合物は２週間に１回投与される。別の実施形態では、化合物は３週間に１回投与される。別の実施形態では、化合物は４週間に１回投与される。別の実施形態では、化合物は５週間に１回投与される。別の実施形態では、化合物は６週間に１回投与される。別の実施形態では、化合物は７週間に１回投与される。別の実施形態では、化合物は８週間に１回投与される。別の実施形態では、化合物は９週間に１回投与される。別の実施形態では、化合物は１０週間に１回投与される。別の実施形態では、化合物は１１週間に１回投与される。別の実施形態では、化合物は１２週間に１回投与される。一実施形態では、化合物は毎月投与される。別の実施形態では、化合物は２ヶ月ごとに１回投与される。
【０１０６】
免疫疾患または障害を治療するための組成物の用量は、医学分野の当業者に理解されているパラメーターに従って決定することができる。したがって、適切な用量は、患者（例えば、ヒト）の状態、すなわち、疾患の段階、一般的な健康状態、ならびに年齢、性別、および体重、および医療分野の当業者によく知られている他の要因に依存し得る。
【０１０７】
本発明の化合物は、低用量で効力を有する。したがって、好ましい実施形態では、各投与の用量は０．２４ｍｇ／ｍ２から９．９９ｍｇ／ｍ２の範囲である。より好ましい実施形態では、各投与の用量は、０．２４ｍｇ／ｍ２から５ｍｇ／ｍ２、好ましくは０．３ｍｇ／ｍ２から４．５ｍｇ／ｍ２、好ましくは０．４ｇ／ｍ２から４．３ｍｇ／ｍ２、さらにより好ましく０．４２ｍｇ／ｍ２から４．２６ｍｇ／ｍ２は変動する。好ましい実施形態では、用量は０．４２ｍｇ／ｍ２である。別の好ましい実施形態では、用量は４．２６ｍｇ／ｍ２である。
【０１０８】
一実施形態では、各投与の用量は、４ｍｇ／ｍ２から９．９９ｍｇ／ｍ２、好ましくは５ｍｇ／ｍ２から８ｍｇ／ｍ２、好ましくは６ｍｇ／ｍ２から８ｍｇ／ｍ２、好ましくは７ｍｇ／ｍ２から８ｍｇ／ｍ２までの範囲である。
【０１０９】
一実施形態では、各投与の用量は、１ｍｇ／ｍ２から９ｍｇ／ｍ２、好ましくは２ｍｇ／ｍ２から８ｍｇ／ｍ２、好ましくは３ｍｇ／ｍ２から７ｍｇ／ｍ２、より好ましくは４ｍｇ／ｍ２から６ｍｇ／ｍ２の範囲である。
【０１１０】
別の実施形態では、化合物は、０．２４μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２、好ましくは１μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２、好ましくは１０μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２、好ましくは５０μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２、より好ましくは１００μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２、より好ましくは１５０μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２、より好ましくは２００μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１１１】
そのような治療を必要とする対象は、免疫疾患の症状を発症したか、免疫疾患を発症するリスクのあるヒトまたは非ヒト霊長類または他の動物（すなわち、獣医学的使用）であってよい。非ヒト霊長類およびその他の動物の例には、限定されるものではないが、家畜、ペット、動物園の動物が含まれる（例えば、馬、牛、水牛、ラマ、ヤギ、ウサギ、猫、犬、チンパンジー、オランウータン、ゴリラ、サル、象、熊、大型猫など）。好ましい実施形態では、化合物は哺乳動物、好ましくはヒトに投与される。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、患者（または対象）は、免疫疾患または障害を有するかまたは罹患している、または検出可能な疾患がない可能性がある、ヒトを含む任意の哺乳動物であってよい。したがって、既存の疾患を有する対象に治療を施してもよいし、疾患または状態を発症するリスクのある対象に治療を予防的に施してもよい。
【０１１３】
本発明の治療はまた、その後の投与から７日離れる必要のない前の投与工程を含んでもよい。特定の場合、これは誘導工程とみなすことができる。したがって、一実施形態では、投与は、後続の投与から７日未満離れた化合物の皮下投与の先の工程をさらに含んでなる。好ましくは、先の工程は、その後の投与から６日未満、より好ましくは５日未満、より好ましくは４日未満、より好ましくは３日未満、より好ましくは２日未満、好ましくは１日未満離れている。
【０１１４】
より好ましい実施形態では、皮下投与の先の工程は、後続の工程から２日離れている。好ましくは、関節リウマチの治療の先の工程は、次の工程から３日未満、好ましくは２日、好ましくは２日未満、好ましくは１日、好ましくは１日未満離れている。
【０１１５】
好ましい実施形態では、先の工程で投与される用量と、その後の各投与で投与される用量は同じである。
【０１１６】
別の好ましい実施形態では、先の工程で投与される用量は、その後の各投与で投与される用量よりも高い。好ましい実施形態では、前記用量は、４０〜４５ｍｇ／ｍ２の間であり、好ましくは４２．８４ｍｇ／ｍ２である。好ましくは、前記用量は関節リウマチの治療に投与される。別の好ましい実施形態では、前記用量は、全身性エリテマトーデスまたはループス腎炎の治療において投与される。
【０１１７】
一実施形態では、薬剤は、単独の治療剤として本発明の化合物を含む。
【０１１８】
別の実施形態では、化合物は、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の治療に有用な１つ以上の治療剤との組合せで投与される。
【０１１９】
本明細書で使用される「組合せ」という表現は、本発明の化合物を、任意の順序での免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の治療に有用な治療剤と一緒にまたは別々に、同時に（simultaneously）、同時に（concurrently）または連続して投与できることを理解される必要があり、例えば、本発明の化合物の投与を最初に行い、続いて疾患の治療に有用な１つ以上の治療剤を投与することができる；または、本発明の化合物の投与は最後に行い、疾患の治療に有用な１つ以上の治療剤を先行して投与することができる；または、本発明の化合物の投与は、疾患の治療に有用な１つ以上の治療剤と同時に行うことができる。
【０１２０】
当業者は、本発明の化合物と免疫疾患の治療に有用な追加の治療剤との組合せ投与のための薬剤が、単一剤形または別個の剤形であり得ることを理解する。
【０１２１】
本明細書で使用される「免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の治療に有用な治療剤」という表現は、上記の疾患の１つを治療するために使用するのに適した薬剤を意味する。
【０１２２】
好ましい実施形態では、全身性エリテマトーデス、好ましくはループス腎炎を治療するための治療剤は、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、カルシニューリン阻害剤、リツキシマブ、オクレリズマブ、ベリムマブ、アタシセプト、アバタセプト、アレムツズマブ、シルクマブ、トシリズマブ、エタネルセプト、エクリズマブ、エプラツズマブ、アベチマス／ＬＪＰ−３９４、ＢＧ９５８８／ＩＤＥＣ１３１、静脈内免疫グロブリン、ヒドロキシクロロキン、タクロリムスおよびコルチコイドからなる群から選択される。
【０１２３】
好ましい実施形態では、関節リウマチを治療するための治療剤は、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブおよびエタネルセプトからなる群から選択される。
【０１２４】
好ましい実施形態では、炎症性腸疾患を治療するための治療剤は、シクロスポリンＡ、タクロリムス、メトトレキサート、チオプリンおよび抗ＴＮＦ剤からなる群から選択される。
【０１２５】
自己免疫疾患、特に自己免疫腎疾患、より具体的にはループス腎炎の治療のための治療剤は、免疫抑制剤、ステロイド、ビタミンＤ、ＶＩＰ（血管作用性腸管ペプチド）、ヒドロキシクロロキン、クロロキンおよびＴ細胞ワクチン接種からなる群から選択することができる。
【０１２６】
一実施形態では、免疫抑制剤は、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、およびアンチカルシニューリンからなる群から選択される。
【０１２７】
一実施形態では、ステロイドは、プレドニゾロンおよびメチルプレドニゾロンからなる群から選択することができる。
【０１２８】
自己免疫疾患、特に自己免疫腎疾患、より具体的にはループス腎炎の治療のための治療剤は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、共刺激阻害、炎症性サイトカイン、細胞接着分子および補体成分からなる群から選択される標的を標的とする化合物であり得る。
【０１２９】
一実施形態では、Ｔ細胞標的は、ＣＤ３、ＣＤ５２、ＩＬ−２およびＬＦＡ−１からなる群から選択することができる。好ましくは、Ｔ細胞を標的とする化合物は、ＯＫＴ３、アレムツズマブ、バシルキシマブ、エファリズマブ、ラキニモドおよびラパマイシンからなる群から選択される。
【０１３０】
一実施形態では、Ｂ細胞標的は、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＣＤ７４からなる群から選択することができる。好ましくは、Ｂ細胞を標的とする化合物は、リツキシマブ、オクレリズマブ、オフツムマブ、ベルツズマブ、オビヌツズマブ、エプラツズマブ、ベリムマブ、ブリシビモド、アタシセプト、可溶性ＦｃγＲＩＩｂ、ミラツズマブおよびタバルマブからなる群から選択される。
【０１３１】
一実施形態では、共刺激阻害は、ＣＤ４０およびＣＤ８０／８６からなる群から選択することができる。好ましくは、共刺激阻害を標的とする化合物は、ＡＳＫＰ１２４０、アバタセプト、およびベラタセプトからなる群から選択される。
【０１３２】
一実施形態では、炎症性サイトカイン標的は、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＴＮＦ、ＴＷＥＡＫ、ＩＦＮα、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１２／ＩＬ−２３、ＩＦＮγ、ＭＩＦおよびＩＬ−５からなる群から選択することができる。好ましくは、炎症性サイトカインを標的とする化合物は、カナキヌマブ、アナキンラ、シルクマブ、トシリズマブ、エタネルセプト、インフリキシマブ、アダリムマブ、ゴリムマブ、セルトリズマブ、ＢＩＩＢ０２３、シファリムマブ、ロンタリズマブ、セクキヌマブ、ウステキヌマブ、ＡＭＧ８１１、イマルマブ、メポリズマブ、ブロダルマブ、ブリアキヌマブ、サリルマブ、リロナセプトおよびアニフロルマブからなる群から選択される。
【０１３３】
一実施形態では、標的細胞接着分子は、ＶＬＡ−１である。好ましくは、細胞接着分子を標的とする化合物は、ナタリズマブである。
【０１３４】
一実施形態では、補体成分標的は、Ｃ５およびＣ５ａＲからなる群から選択される。好ましくは、補体成分を標的とする化合物は、エクリズマブ、ムボジナ、ＬＦＧ３１６およびＣＣＸ１６８からなる群から選択される。
【０１３５】
表３に、上記のさまざまな化合物とその標的を示す。
【０１３６】
【表３】
2020517588.tif 000004
2020517588.tif 000005
【０１３７】
好ましい実施形態では、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の治療に有用な治療剤は、シクロスポリンＡ、タクロリムス、メトトレキサート、チオプリン、抗ＴＮＦ剤、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、エタネルセプト、リツキシマブ、エプラツズマブ、ベリムマブ、ラパマイシン、抗インターフェロン抗体、トシリズマブ、ラキニモド、タバルマブ、オファツムマブ、イキセズマブ、ブロダルマブ、ブリアキヌマブ、サリルマブ、リロナセプト、アニフロルマブ、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、アンチカルシニューリン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビタミンＤ、血管作用性腸管ペプチド、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、オクレリズマブ、アタシセプト、アバタセプト、アレムツズマブ、シルクマブ、エクリズマブおよびＴ細胞ワクチンからなる群から選択される。
【０１３８】
低用量でのベータ鎖を欠くＣ４ＢＰとＣ４ＢＰのアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインとを含んでなるポリペプチドの低用量での治療的使用。
【０１３９】
本発明者は、驚くべきことに、２週間に１回皮下投与した５０μｇのｒＣ４ＢＰ（β−）が、同じ投与計画に従って同じ用量を腹腔内投与した場合よりも治療効果が高いことを実証した。投与量が５μｇの場合にも、同じ驚くべき効果が得られる（図５）。腹腔内経路と比較して、５μｇと５０μｇの用量を皮下経路で投与した場合の生存率も高かった（図６）。
【０１４０】
第２の側面では、本発明は、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療で使用するための、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される化合物：
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
であって、前記化合物が０．２４ｍｇ／ｍ２から９．９９ｍｇ／ｍ２の用量で投与される化合物に関する。
【０１４１】
さらなる側面では、本発明は、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療の薬剤を製造するための、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される化合物：
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
であって、前記化合物が０．２４ｍｇ／ｍ２から９．９９ｍｇ／ｍ２の用量で皮下投与される化合物の使用に関する。
【０１４２】
さらなる側面では、本発明は、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療の方法であって、それを必要とする対象に、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される化合物：
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
の投与を含んでなる、方法に関する。
【０１４３】
本発明の第１の側面に関して開示されたすべての実施形態は、本発明の第２の側面に適用可能である。
【０１４４】
本発明の化合物の用量は、体重１ｋｇあたりのアイソフォームまたはポリペプチドのｍｇで、または体表面積１平方メートルあたりのアイソフォームまたはポリペプチドのｍｇで表すことができる。Ｒｅａｇａｎ−ＳｈａｗＳ．らの論文（Reagan-Shaw S. et al. “Dose translation from animal to human studies revisited”. FASEB J 2008, 22(3):659-661）は、ｍｇ／ｋｇをｍｇ／ｍ２に変換するために使用される標準変換係数を提供する。
【０１４５】
【数１】
2020517588.tif 000006
【０１４６】
その論文はまた、この変換は第１の動物種の用量を第２の動物種の用量に変換するための基礎となる（相対線量変換）と説明する。したがって、ｍｇ／ｋｇ単位の動物用量（ＡＤ）は、次の式を使用してｍｇ／ｋｇ単位のヒト等価用量（ＨＥＤ）に変換できる。
【０１４７】
【数２】
2020517588.tif 000007
【０１４８】
ここで、各種のＫｍは表４に示される（Reagan-Shaw S. et al. “Dose translation from animal to human studies revisited”. FASEB J 2008, 22(3):659-661から抽出されたデータ）。
【０１４９】
【表４】
2020517588.tif 000008
【０１５０】
したがって、マウスで５μｇと５０μｇの用量での実験は、哺乳類の０．４２ｍｇ／ｍ２と４．２６ｍｇ／ｍ２の一般的な用量に対応する。
【０１５１】
本発明の化合物は、低用量で効力を有する。したがって、好ましい実施形態では、各投与の用量は０．２４ｍｇ／ｍ２から９．９９ｍｇ／ｍ２の範囲である。より好ましい実施形態では、各投与の用量は、０．２４ｍｇ／ｍ２から５ｍｇ／ｍ２、好ましくは０．３ｍｇ／ｍ２から４．５ｍｇ／ｍ２、好ましくは０．４ｍｇ／ｍ２から４．３ｍｇ／ｍ２、さらにより好ましくは０．４２ｍｇ／ｍ２から４．２６ｍｇ／ｍ２の範囲である。好ましい実施形態では、用量は０．４２ｍｇ／ｍ２である。別の好ましい実施形態では、用量は４．２６ｍｇ／ｍ２である。
【０１５２】
一実施形態では、各投与の用量は、４ｍｇ／ｍ２から９．９９ｍｇ／ｍ２、好ましくは５ｍｇ／ｍ２から８ｍｇ／ｍ２、好ましくは６ｍｇ／ｍ２から８ｍｇ／ｍ２、好ましくは７ｍｇ／ｍ２から８ｍｇ／ｍ２の範囲である。
【０１５３】
一実施形態では、各投与の用量は、１ｍｇ／ｍ２から９ｍｇ／ｍ２、好ましくは２ｍｇ／ｍ２から８ｍｇ／ｍ２、好ましくは３ｍｇ／ｍ２から７ｍｇ／ｍ２、より好ましくは４ｍｇ／ｍ２から６ｍｇ／ｍ２の範囲である。
【０１５４】
本発明の医薬組成物およびその使用
第３の側面では、本発明は、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される０．４５ｍｇから１８．９０ｍｇの化合物：
（ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
（ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
（ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
と、皮下投与に適した薬学上許容される賦形剤とを含んでなる、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療に使用するための医薬組成物であって、皮下投与される医薬組成物に関する。
【０１５５】
さらなる側面では、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される０．４５ｍｇ〜１８．９０ｍｇの化合物： 
（ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
（ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
（ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
と、皮下投与に適した薬学上許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物であって、化合物がα７β０、α６β０およびそれらの組合せからなる群から選択されるβ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームである場合、前記組成物は０．５ｍｇの前記アイソフォームの組成物ではない、医薬組成物に関する。
【０１５６】
さらなる側面では、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される０．４５ｍｇ〜１８．９０ｍｇの化合物： 
（ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
（ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
（ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
と、皮下投与に適した薬学上許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物であって、化合物がα７β０、α６β０およびそれらの組合せからなる群より選択されるβ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームである場合、前記組成物は４ｍｇの前記アイソフォームの組成物ではない、医薬組成物に関する。
【０１５７】
さらなる側面では、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される０．４５ｍｇ〜１８．９０ｍｇの化合物： 
（ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
（ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
（ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
と、皮下投与に適した薬学上許容可能な賦形剤とを含んでなる医薬組成物であって、化合物がα７β０、α６β０およびそれらの組合せからなる群より選択されるβ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームである場合、前記組成物は下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群から選択される組成物：
（ｉ）０．４５ｍｇから０．４９ｍｇを含んでなる組成物；
（ｉｉ）０．５１ｍｇから３．９９ｍｇを含んでなる組成物；
（ｉｉｉ）４．１０ｍｇから１８．９０ｍｇを含んでなる組成物；
である医薬組成物に関する。
【０１５８】
本発明の第１および第２の側面の文脈で開示された実施形態はすべて、これらの側面にも適用可能である。
【０１５９】
本発明の医薬組成物は、０．４５ｍｇから１８．９０ｍｇ、より好ましくは０．４５ｍｇから９．４５ｍｇ、より好ましくは０．５６ｍｇから８．５１ｍｇ、より好ましくは０．７５ｍｇから８．１３ｍｇ、さらにより好ましくは０．７９ｍｇから８．０５ｍｇの本発明の化合物を含んでなる。好ましい実施形態では、用量は０．７９ｍｇである。別の好ましい実施形態では、用量は０．８ｍｇである。別の好ましい実施形態では、用量は８ｍｇである。別の好ましい実施形態では、用量は８．０５ｍｇである。
【０１６０】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、７．５６ｍｇから１８．９０ｍｇ、好ましくは９．４５ｍｇから１５．１３ｍｇ、好ましくは１１．３５ｍｇから１５．１３ｍｇ、好ましくは１３．２４ｍｇから１５．１３ｍｇの本発明の化合物を含んでなる。
【０１６１】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、１．８９ｍｇから１７．０２ｍｇ、好ましくは３．７８ｍｇから１５．１３ｍｇ、好ましくは５．６７ｍｇから１３．２４ｍｇ、より好ましくは７．５６ｍｇから１１．３５ｍｇの本発明の化合物を含んでなる。
【０１６２】
一実施形態では、本発明の医薬組成物は、０．５ｍｇから９ｍｇ、より好ましくは０．７５ｍｇから８．５ｍｇの本発明の化合物を含んでなる。別の実施形態では、組成物は、７ｍｇから１８．９０ｍｇ、より好ましくは７．５ｍｇから１８ｍｇ、より好ましくは９ｍｇから１５ｍｇ、より好ましくは１１ｍｇから１５ｍｇ、さらにより好ましくは１３ｍｇから１５ｍｇ本発明の化合物を含んでなる。別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、１ｍｇから１７ｍｇ、好ましくは３ｍｇから１５ｍｇ、好ましくは５ｍｇから１３ｍｇ、より好ましくは７ｍｇから１１ｍｇの本発明の化合物を含んでなる。
【０１６３】
組成物は、生理学的に許容されるまたは適切な担体をさらに含んでなる、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液またはエマルジョンである医薬組成物であってもよい。薬学的に許容されるまたは適切な担体は、賦形剤（すなわち、活性成分の活性を妨げない非毒性物質）および／または希釈剤を含んでもよい（または意味する）。あるいは、本明細書に記載の組成物は、凍結乾燥物として製剤化されてもよく、または化合物は、当該技術分野で公知の技術を使用してリポソーム内にカプセル化されてもよい。医薬組成物は、生物学的に活性または不活性である他の成分も含んでもよい。そのような成分には、限定されるものではないが、緩衝液（例えば、中性緩衝生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、安定剤、染料、香料、および懸濁化剤および／または防腐剤が含まれる。
【０１６４】
医薬組成物で使用するための当業者に知られている皮下投与用の任意の適切な賦形剤または担体を、本明細書に記載の組成物で使用することができる。  治療的使用のための賦形剤は周知であり、例えば、Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.（A.R. Gennaro ed. 1985）に記載されている。非経口投与の場合、担体は、好ましくは、水、生理食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたは緩衝液を含んでなる。皮下投与に適した賦形剤は、限定されるものではないが、アルキルサッカライド、中性ポリマー（ポリビニルピロリドン、Ｆｉｃｏｌｌ−７００００、ヒドロキシエチル（ヘタ）デンプン、またはＰＥＧ４０００）、塩化アルミニウム、水酸化アルミニウム、Ｌ−アルギニン、ｍ−クレゾール、ヒト血清アルブミン、加水分解ゼラチン、Ｄ、Ｌ−メチオニン、一塩基性リン酸ナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ピロ亜硫酸カリウム、チオグリコール酸ナトリウム、α−チオグリセロールおよび塩化亜鉛溶液である。
【０１６５】
医薬組成物（注射による送達用）は液体の形態であってもよい。液体医薬組成物は、例えば、以下の１つ以上を含んでもよい：注射用水、生理食塩水、好ましくは生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁剤として機能し得る固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の溶媒などの滅菌希釈剤；抗菌剤；抗酸化剤；キレート剤；塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性を調整するための緩衝液および薬剤。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、使い捨て注射器、または複数回投与バイアルに封入することができる。生理食塩水の使用が好ましく、注射可能な医薬組成物は好ましくは無菌である。
【０１６６】
本明細書に記載の薬剤は、持続放出または徐放用に製剤化してもよい。そのような組成物は、一般に周知の技術を使用して調製され、皮下埋め込みにより投与することができる。徐放性製剤は、担体マトリックスに分散した、および／または速度制御膜に囲まれたリザーバー内に含まれる薬剤を含んでもよい。そのような製剤内で使用する賦形剤は生体適合性であり、生分解性であってもよい；好ましくは、製剤は、比較的一定レベルの活性成分放出を提供する。持続放出製剤に含まれる活性化合物の量は、移植部位、放出の速度および予想される持続時間、ならびに治療または予防される状態の性質に依存する。
【０１６７】
医薬組成物は、医療分野の当業者によって決定されるように、治療（または予防）される疾患に適切な方法で投与される。
【０１６８】
患者は、一般に治療または予防されている状態に適したアッセイを使用して、治療または予防の有効性についてモニターされ、このアッセイは当業者によく知られている。液体形態で投与される場合、適切な用量サイズは患者のサイズによって異なるが、典型的には約１ｍｌから約５００ｍｌの範囲である。
【０１６９】
好ましい実施形態では、医薬組成物は、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の治療に有用な１つ以上の治療剤と組み合わせて投与される。
【０１７０】
好ましい実施形態では、医薬組成物は複数回の投与を含んでなる投与計画で投与され、医薬組成物は週に１回以下で投与される。
【０１７１】
追加の側面
別の側面では、本発明は、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療で使用するための、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される化合物：
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
であって、前記化合物が０．２４μｇ／ｍ２から９．９９ｍｇ／ｍ２の用量で皮下投与される化合物に関する。
【０１７２】
一実施形態では、化合物は、０．２４μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２、好ましくは１μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２、好ましくは１０μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２、好ましくは５０μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２、より好ましくは１００μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２、より好ましくは１５０μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２、より好ましくは２００μｇ／ｍ２から０．２４ｍｇ／ｍ２の用量で投与される。
【０１７３】
前の側面の文脈で開示されたすべての実施形態は、この追加の側面に適用可能である。
【０１７４】
別の側面では、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される４．５μｇから１８．９０ｍｇの化合物：
（ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
（ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
（ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
と、皮下投与に適した薬学上許容される賦形剤とを含んでなる、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療に使用するための医薬組成物であって、皮下投与される医薬組成物に関する。
【０１７５】
さらなる側面では、本発明は、本発明は、下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される０．４５μｇから１８．９０ｍｇの化合物：
（ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
（ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
（ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
と、皮下投与に適した薬学上許容される賦形剤とを含んでなる医薬組成物であって、化合物がα７β０、α６β０およびそれらの組合せからなる群より選択されるβ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームである場合、前記組成物は下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）からなる群から選択される組成物：
（ｉ）０．４５μｇから０．４９ｍｇを含んでなる組成物；
（ｉｉ）０．５１ｍｇから３．９９ｍｇを含んでなる組成物；
（ｉｉｉ）４．１０ｍｇから１８．９０ｍｇを含んでなる組成物；
である医薬組成物に関する。
【０１７６】
一実施形態では、医薬組成物は、４．５μｇから４．５ｍｇ、好ましくは１０μｇから４．５ｍｇ、より好ましくは２５μｇから４．５ｍｇ、より好ましくは５０μｇから４．５ｍｇ、より好ましくは１００μｇから４．５ｍｇ、より好ましくは１５０μｇから４．５ｍｇ、より好ましくは２００μｇから４．５ｍｇ、さらに好ましくは２５０μｇから４．５ｍｇ、好ましくは５００μｇから４．５ｍｇ、好ましくは１０００μｇから４．５ｍｇ、好ましくは１５００μｇから４．５ｍｇ、好ましくは２０００μｇから４．５ｍｇ、好ましくは２５００μｇから４．５ｍｇ、好ましくは３０００μｇから４．５ｍｇ、好ましくは３５００μｇから４．５ｍｇ、より好ましくは４０００μｇから４．５ｍｇを含んでなる。
【０１７７】
前の側面の文脈で開示されたすべての実施形態は、前記追加の側面に適用可能である。
【０１７８】
本発明はまた、以下に関する。
［１］免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療に使用するための、下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される化合物：
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
であって、複数投与を含んでなる投与計画において皮下投与され、かつ、週１回以下で投与される化合物。
［２］各投与の用量が０．２４ｍｇ／ｍ２から９．９９ｍｇ／ｍ２の範囲にある、上記［１］に記載の使用のための化合物。
［３］下記ａ）〜ｃ）からなる群から選択される化合物：
ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォームを形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
であって、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療に使用するための、０．２４ｍｇ／ｍ２から９．９９ｍｇ／ｍ２の用量で皮下投与される化合物。
［４］２週間に１回投与される、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の使用のための化合物。
［５］週に１回投与される、上記［１］〜［３］のいずれかに記載の使用のための化合物。
［６］後の投与から７日未満の間隔で皮下投与される先の工程をさらに含んでなる、上記［１］〜［５］のいずれかに記載の使用のための化合物。
［７］先の工程で投与される用量と、その後の各投与で投与される用量が同じである、上記［６］に記載の使用のための化合物。
［８］先の工程で投与された用量が、その後の各投与で投与された用量よりも多い、上記［６］に記載の使用のための化合物。
［９］免疫疾患が自己免疫疾患である、上記［１］〜［８］のいずれかに記載の使用のための化合物。
［１０］自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、および関節リウマチからなる群から選択されるものである、上記［９］に記載の使用のための化合物。
［１１］自己免疫疾患が関節リウマチである、上記［１０］に記載の使用のための化合物。
［１２］自己免疫疾患が、全身性エリテマトーデスおよびループス腎炎からなる群より選択される、上記［１０］に記載の使用のための化合物。
［１３］ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームが、α７β０、α６β０およびそれらの組合せからなる群から選択される、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の使用のための化合物。
［１４］欠失変異体が、Ｃ４ＢＰアルファ鎖のドメインＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３およびＣＣＰ４を欠く、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の使用のための化合物。
［１５］Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ８ドメイン中の各Ｌｙｓ残基が、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＧｌｎおよびＡｓｎからなる群から選択される残基により置換されている、上記［１］〜［１４］のいずれかに記載の使用のための化合物。
［１６］Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチドが、配列番号２、配列番号３、配列番号４または配列番号５を含んでなるポリペプチドである、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の使用のための化合物。
［１７］哺乳動物に投与される、上記［１］〜［１６］のいずれかに記載の使用のための化合物。
［１８］哺乳動物がヒトである、上記［１７］に記載の使用のための化合物。
［１９］用量が４ｍｇ／ｍ２から６ｍｇ／ｍ２の範囲にある、上記［２］〜［１８］のいずれかに記載の使用のための化合物。
［２０］化合物が、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の治療に有用な１つ以上の治療剤と組み合わせて投与される、上記［１］〜［１９］のいずれかに記載の使用のための化合物。
［２１］免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の治療に有用な治療剤が、インフリキシマブ、アダリムマブ、セルトリズマブ、ゴリムマブ、エタネルセプト、リツキシマブ、エプラツズマブ、ベリムマブ、ラパマイシン、抗インターフェロン抗体、トシリズマブ、ラキニモド、タバルマブ、オファツムマブ、イキセキズマブ、ブロダルマブ、ブリアキヌマブ、サリルマブ、リロナセプト、アニフロルマブ、シクロホスファミド、ミコフェノール酸モフェチル、アザチオプリン、アンチカルシニューリン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ビタミンＤ、血管作用性腸管ペプチド、ヒドロキシクロロキン、クロロキン、オクレリズマブ、アタシセプト、アバタセプト、アレムツズマブ、シルクマクブ、エクリズマブおよびＴ細胞ワクチンからなる群から選択されるものである、上記［２０］に記載の使用のための化合物。
［２２］下記（ａ）〜（ｃ）からなる群から選択される０．４５ｍｇから１８．９０ｍｇの化合物：
（ａ）ベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームであって、前記アイソフォーム
を形成するアルファ鎖の少なくとも１つがＣＣＰドメインの少なくとも１つを欠く欠失変異体である場合、ＣＣＰ６ドメインが前記アルファ鎖において保存されているＣ４ＢＰアイソフォーム；
（ｂ）全長Ｃ４ＢＰアルファ鎖またはＣＣＰ６ドメインを保存するその欠失変異体を含んでなるポリペプチド；および
（ｃ）Ｃ４ＢＰアルファ鎖のＣＣＰ６ドメインまたは前記ＣＣＰ６ドメインの機能的に等価なバリアントを含んでなるポリペプチド
と、皮下投与に適した薬学上許容される賦形剤とを含んでなる、免疫系の望ましくない活性化に起因する免疫疾患の予防および／または治療に使用するための医薬組成物であって、皮下投与される医薬組成物。
［２３］複数投与を含んでなる投与計画で投与され、かつ、週に１回以下で投与されるものである、上記［２２］に記載の使用のための医薬組成物。
【０１７９】
以下の実施例により本発明を詳細に説明するが、これらの実施例は単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０１８０】
実施例１：新規なＣ４ＢＰ（β−）に基づく免疫調節分子の設計
１）自己免疫のイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）動物モデルを使用して、炎症性ＤＣにおけるＣ４ＢＰ（β−）の補体阻害および免疫調節への相対的な寄与の区別；および２）特定のＣ４ＢＰ（β−）病原体およびプラスミノーゲンに結合するドメインの一般的な免疫抑制への寄与をなくすために、本発明者らはＣ４ＢＰα鎖の変異体を遺伝子操作した：
−変異体１：ＣＣＰ１−ＣＣＰ４α鎖欠失変異体：変異体の構造はＣ４ＢＰ（ＣＣＰ５−ＣＣＰ８）（α７β０）である。この変異体は補体阻害活性（ＣＣＰ１−ＣＣＰ３ドメインに保持される）を欠き、この領域を介してＣ４ＢＰに結合する種々の病原体にも結合しない。ただし、ＣＣＰ６に起因するＤＣに対する免疫調節活性は保持する。
−変異体２：ＣＣＰ１−ＣＣＰ４欠失とＣＣＰ８ｌｙｓα鎖変異の組合せ：この変異体は補体阻害活性（ＣＣＰ１−ＣＣＰ３ドメインに保持される）を欠いており、したがってこの領域を介してＣ４ＢＰに結合する種々の病原体に結合しない。さらに、本発明者らは、Ｃ４ＢＰ（β−）の免疫調節活性を損なうことなくプラスミノーゲン結合を減少させるために、Ｃ４ＢＰ  ＣＣＰ８α鎖の３つの正荷電Ｌｙｓ残基をＧｌｎ残基に置換した。
【０１８１】
方法
変異体
変異体１および２のＤＮＡをｐＣＤＮＡ３．１（＋）発現ベクターにクローニングした。プラスミドＤＮＡを増幅し、Qiafilter Plasmid MegaKit（Qiagen）を使用して精製した。
【０１８２】
タンパク質
組換えＣ４ＢＰ（β−）（ｒＣ４ＢＰ（β−）および変異体１と２は、ＨＥＫ２９３細胞（Ｅｘｐｉ２９３細胞）で一過性に産生した。ｒＣ４ＢＰ（β−）は、遠心分離工程と３つのクロマトグラフィー工程、具体的には遠心分離工程の後にサンプルにＮａＣｌを添加し、疎水性相互作用クロマトグラフィーカラム（HiScreen Butyl FFカラム）、濃縮およびダイアフィルトレーション、陰イオン交換クロマトグラフィーカラム（HiScreen Q HPカラム）、濃縮およびサイズ排除クロマトグラフィーカラム（HiLoad 16/60 superdex 200 pg カラム）にかける工程を含んでなる、「Bioingenium」プロトコルによって細胞培養上清から精製した。サンプルは最後に濃縮および透析工程にかけた。変異体はブチルクロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した後、濃縮およびダイアフィルトレーションを行った。その後、サンプル変異体をＱ陰イオン交換クロマトグラフィーにかけ透析を行った。
【０１８３】
ポリアクリルアミドゲル電気泳動
Ｃ４ＢＰ（β−）変異体がオリゴマー構造を形成するかどうかを分析するために、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥのクマシー染色を還元および非還元条件で行った。
【０１８４】
ＤＣ上の全長Ｃ４ＢＰ（β−）およびＣ４ＢＰ（β−）バリアントの免疫調節活性のイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）機能評価
本発明者らは、Ｃ４ＢＰ（β＋）（野生型（ＷＴ））および組換えＣ４ＢＰ（β−）アイソフォームの両方、ならびに上記の変異体またはバリアント（変異体１および変異体２）をイン・ビトロ研究に使用した。Ｃ４ＢＰ（β＋）アイソフォームは、プールされたヒト血漿から精製された、主要なＣ４ＢＰα７β１に加えてマイナーなＣ４ＢＰα６β１アイソフォーム（両方ともＰｒｏＳとの複合体中にある）を意味する。Ｃ４ＢＰ（β＋）は免疫調節活性がなく、アッセイにおいて陰性対照群として使用した（Olivar et al. 2013. J. Immunol. 190:2857-72）。
【０１８５】
ＲＰＭＩ１６４０には、特に明記しない限り、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、２ｍＭのＬ−グルタミン（すべてInvitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州）および１０％熱不活化ウシ胎児血清（Linus、カルテック、スペイン）（完全培地）が補充された。
【０１８６】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）密度遠心分離（GE Healthcare Bio-Sciences AB、ウプサラ、スウェーデン）の後に、Blood and Tissue Bank（バルセロナ、スペイン）の健康なドナーから収集したバフィーコート標本から得た。表面表現型の決定のために、単球を、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地の６０ｍｍ培養プレート（Corning、スペイン）に１×１０６細胞／ｍｌでプレーティングし、５％ＣＯ２、３７℃で２時間接着させた。ＰＢＳの洗浄により、非接着細胞を除去した。抗ＣＤ１４染色分離株のフローサイトメトリーで示されるように、最終集団には７５％を超える単球が含まれる。
【０１８７】
単球由来ＤＣは、培養の０日目と３日目に、単球培養物にＧＭ−ＣＳＦ（８００ＵＩ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００ＵＩ／ｍｌ）（両方ともGentaur、カンペンハウト、ベルギー）を加えた完全なＲＰＭＩ１６４０培地を補充して生成した。ＤＣ成熟のために、５日目に５μｇ／ｍｌＬＰＳ（Escherichia coli 055.B5, Sigma L2880、コペンハーゲン、デンマーク）で４８時間ｉＤＣをさらに刺激した。
【０１８８】
蛍光色素７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）（BD Pharmingen）を使用した染色およびフローサイトメトリー分析により、Ｃ４ＢＰ処理および未処理ＤＣの生存率を評価した。
【０１８９】
細胞表面の表現型は、以下のｍＡｂｓを使用したフローサイトメトリーにより分析した：ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８３（ＨＢ１５ａ）およびＰＥ結合抗ＣＤ８６（ＨＡ５．２Ｂ７）（すべてBeckman-Coulter）。それぞれのアイソタイプ対照のＦＩＴＣ結合抗ＩｇＧ２ｂ（Ｈ２）およびＰＥ結合抗ＩｇＧ２ｂ（Ｈ２）は、同じ商業ソース由来のものである。ＰＢＳで洗浄後、続いて細胞を１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中の３μｌｍＡｂ／１０５細胞で室温で２０分間染色した。死んだ細胞や破片を除外するために、ＤＣは前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）パラメーターに従って開閉した。ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏソフトウェア（Becton Dickinson）を装備したＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（Becton Dickinson、フランクリンレイクス、ニュージャージー州）を使用して染色細胞を分析した。
【０１９０】
ＥＬＩＳＡアッセイ
研究中のＣ４ＢＰアイソフォームおよびバリアントを伴う未処理または処理ＤＣの両方からのＩＬ−１２ｐ７０の分泌を、製造業者の指示に従って「DuoSet ELISA kit」（R&D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州）で評価した。
【０１９１】
結果
異なるＣ４ＢＰ（β−）活性を分析するために、本発明者らはＣ４ＢＰβ鎖を遺伝子操作してタンパク質変異体を得た：ｉ）変異体１、ドメインＣＣＰ１−ＣＣＰ４を欠く（補体阻害および病原体結合を避けるため）、およびｉｉ）変異体２、ＣＣＰ１−ＣＣＰ４欠失とＣＣＰ８Ｌｙｓ→Ｇｌｎ変異の組合せ（補体阻害、病原体結合およびプラスミノーゲン結合を避けるため）（図１）。すべてのバリアントは、Ｃ４ＢＰ（β−）のＣＣＰ６ドメインにマップされた免疫調節活性を保持する必要がある。
【０１９２】
精製されたタンパク質は、還元条件下と非還元条件下の両方でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって最初に検出された。還元状態と比較して、非還元状態でより高い分子量バンドが見られ、操作された変異体の正しいサイズとオリゴマー化状態（〜２４０ｋＤａ）が確認された（図２）。
【０１９３】
次に、本発明者らは、ＤＣに対する免疫調節活性または「寛容原性」活性について、Ｃ４ＢＰ（β−）アイソフォームの構造変異体をさらに特徴付けることを目的とした。したがって、異なるＣＣＰドメインを欠くが、すべての場合にＣＣＰ６ドメイン（図１）を保持している組換えＣ４ＢＰ（α６β０）変異体を、ＤＣの活性化表現型に影響を及ぼす能力について検討した。すべての個々の欠失変異体は、ＣＤ８３およびＣＤ８６  ＤＣ表面成熟マーカーのアップレギュレーションを有意に防ぐことができただけでなく（図３Ａおよび３Ｂ）、Ｔｈ１分極を媒介する中心的なＤＣ炎症誘発性サイトカインであるＩＬ−１２ｐ７０産生を妨げることができた（図３Ｃ）。
【０１９４】
実施例２：用量反応試験。マウスモデルにおける全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を予防および／または減弱するＣ４ＢＰ（β−）の治療効果
この試験では、自然発症のＳＬＥマウスモデルＮＺＢＷＦ１（ＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１）で生じるループス腎炎の進行の減弱における組換えＣ４ＢＰ（β−）（寛容原性、抗炎症性表現型の誘導を通じて樹状細胞（ＤＣ）に対して作用することが示されている）の有効性を評価した。検討された他の変数は、投与経路と用量であった。
【０１９５】
材料および方法
タンパク質と薬剤
組換えＣ４ＢＰ（β−）（ｒＣ４ＢＰ（β−））（バッチ#Jan12008-P03）は、ＨＥＫ２９３細胞（Ｅｘｐｉ２９３細胞）で一過性に産生され、実施例１のプロトコルに従って細胞培養上清から精製した。ｒＣ４ＢＰ（β−）は、濃度５．６ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液中で供給した（１．０ｍｌの７つのアリコートと０．２ｍｌの１つのアリコート；４０．３２ｍｇの総タンパク質）。本発明者らは、精製ｒＣ４ＢＰ（β−）の第２のバッチ（バッチ#Jan12008-P04）を４．８ｍｇ／ｍｌの濃度で使用した（１．０ｍｌの４つのアリコートおよび０．０５ｍｌの１つのアリコート；１９．３ｍｇの総タンパク質）。両方のタンパク質バッチの純度は、ＳＤＳ電気泳動による評価としては〜８０％であった。
【０１９６】
シクロホスファミド（Genoxal（商標名）、Baxter；バッチ#88057）は、生理食塩水中で希釈し、０．１３ｍｌの最終容量に２．５ｍｇの用量で投与した。
【０１９７】
ＤＣに対するＣ４ＢＰ（β−）免疫調節活性のイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）機能評価
本発明者らは、イン・ビトロ研究にＣ４ＢＰ（β＋）およびＣ４ＢＰ（β−）アイソフォームの両方を使用した。Ｃ４ＢＰ（β＋）アイソフォームは、前述のように、プールされたヒト血漿から精製された主要なＣ４ＢＰα７β１に加えてマイナーなＣ４ＢＰα６β１アイソフォーム（両方ともＰｒｏＳとの複合体中にある）を意味する（DahlbackB. 1983. Biochem J., 209:847-56）。Ｃ４ＢＰ（β＋）は免疫調節活性を有さず、アッセイの陰性対照として使用されている（Olivar et al. 2013. J. Immunol., 190:2857-72）。
【０１９８】
ＲＰＭＩ１６４０は、特に明記しない限り、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、２ｍＭＬ−グルタミン（すべてInvitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州）および１０％熱不活化ウシ胎児血清（Linus、カルテック、スペイン）を補充した（完全培地）。
【０１９９】
末梢血単核細胞（PBMC）は、Ficoll-Paque（商標）密度遠心分離（（GE Healthcare Bio-Sciences AB; ウプサラ、スウェーデン）の後に、Blood and Tissue Bank（バルセロナ、スペイン）の健康なドナーから収集したバフィーコート標本から得た。表面表現型の決定のために、単球を、血清を含まないＲＰＭＩ１６４０培地の６０ｍｍ培養プレート（Corning、スペイン）に１×１０６細胞／ｍｌでプレーティングし、５％ＣＯ２、３７℃で２時間接着させた。ＰＢＳで洗浄することにより、非接着細胞を除去した。抗ＣＤ１４染色分離株のフローサイトメトリーで実証されたように、最終集団には７５％を超える単球が含まれていた。
【０２００】
培養の０日目と３日目に、完全なＲＰＭＩ１６４０培地に加えてＧＭ−ＣＳＦ（８００ＵＩ／ｍｌ）およびＩＬ−４（５００ＵＩ／ｍｌ）（両方ともGentaur、Kampenhout、ベルギー）を単球培養物に補充し、単球由来ＤＣを生成した。ＤＣ成熟には、５日目に５μｇ／ｍｌのＬＰＳ（Escherichia coli 055.B5, Sigma L2880、コペンハーゲン、デンマーク）で４８時間ｉＤＣをさらに刺激した。
【０２０１】
蛍光色素７−アミノ−アクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ）（BD Pharmingen）を使用した染色およびフローサイトメトリー分析により、Ｃ４ＢＰ治療と未処治療のＤＣの生存率を評価した。
【０２０２】
細胞表面の表現型は、以下のｍＡｂｓを使用したフローサイトメトリーにより分析した：ＦＩＴＣ結合抗ＣＤ８３（HB15a）およびＰＥ結合抗ＣＤ８６（ＨＡ５．２Ｂ７）（すべてBeckman-Coulter）。ＦＩＴＣ結合抗ＩｇＧ２ｂ（Ｈ２）およびＰＥ結合抗ＩｇＧ２ｂ（Ｈ２）を制御するそれぞれのアイソタイプは、同じ商業ソースからのものを使用した。ＰＢＳで洗浄後、続いて細胞を１００μｌのＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡおよび０．１％アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ）中の３μｌのｍＡｂ／１０５細胞で室温で２０分間染色した。死んだ細胞や破片を除外するために、ＤＣは前方散乱（ＦＳＣ）および側方散乱（ＳＳＣ）パラメーターに従って開閉した。CellQuestProソフトウェア（Becton Dickinson）を装備したFACSCalibur（Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ）を使用して染色細胞を分析した。
【０２０３】
マウス、試験計画、および経過観察
ＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１またはＮＺＢＷＦ１／Ｊ（Charles-River）、ＮＺＢ／ＮＺＷ  Ｆ１（Jackson、コード100008）は、ＮＺＢ／ＢｌＮＪ（Jackson、コード000684）雌とｘＮＺＷ／ＬａｃＪ（Jackson、コード001058）雄のハイブリッド交雑種である。ＮＺＢＷＦ１／Ｊマウスは、ヒトの全身性エリテマトーデスに似た自己免疫疾患を発症する。本発明者らは、試験のために１５週齢の５８匹の雌（各３０〜３５ｇ／匹）を使用した（ケージあたり４〜５匹の動物）。動物は、標準的な実験室条件下で、２０〜２４℃、４０〜７０％の相対湿度、１２時間の蛍光灯／１２時間の暗サイクルで飼育し、標準食と水道水を自由に摂取させた。
【０２０４】
自然発症ＳＬＥのＮＺＢＷＦ１モデルは、ＳＬＥの古典的なモデルの中で最も古く、最も一般的に使用されている（Rottman and Willis. 2010. Vet. Pathol., 47:664-76）。ニュージーランドブラックとニュージーランドホワイト（NZB / W）マウスの交雑種である、Ｆ１ハイブリッド系統は、ヒトＳＬＥに似た重度のループス様表現型を発症する（Perry et al. 2011. J. Biomed. Biotechnol., 2011:271694）。ヒトの場合と同様に、複数の遺伝子がＳＬＥの病因に寄与する。ＮＺＢＷＦ１マウスでは、これらの遺伝子には主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）といくつかの非ＭＨＣ遺伝子が含まれる。ヒトＳＬＥと同様に、ＮＺＢＷＦ１マウスの疾患は雌に強い偏りがあり、これはエストロゲンの病原性の役割も示唆している。このモデルにおけるＳＬＥの臨床症状には、活動亢進性Ｂ細胞およびＴ細胞、核抗原に対する高力価のいくつかの自己抗体、免疫複合体の不完全なクリアランス、および致命的な免疫糸球体腎炎が含まれる。このモデルは１９６０年代前半から使用されているため、多くの比較データが利用できるという特徴がある。
【０２０５】
用量の選択と投与。イン・ビボ投与のためのＣ４ＢＰ（β−）用量の選択は、免疫炎症性病態において補体関連タンパク質を使用する以前の研究に基づいた。Blomらは（Blom et al. 2009. Ann. Rheum. Dis., 68:136-42）、実験的コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）およびコラーゲン抗体誘発関節炎（ＣＡＩＡ）マウスでβ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームを使用して、関節リウマチの治療における補体活性の影響を検討した。これらの著者は、予防および治療実験で２日ごとに１回、複数投与の投与計画を使用してＣ４ＢＰ（２ｍｇ／マウス）を腹腔内投与した。したがって、現在の試験では、Ｃ４ＢＰ（β−）をＮＺＢＷＦ１マウスの腹腔内（ＩＰ）と皮下（ＳＣ）の両方に３ヶ月（６〜９ヶ月の月齢）投与した。
【０２０６】
シクロホスファミドは、ＳＬＥの治療剤として報告されている。Alperovich らは（Alperovich et al. 2007. Lupus, 16:18-24）、シクロホスファミド（ＣＹＰ）をＮＺＢＷＦ１マウスに１０日ごとに５０ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した。これらの著者は、血清抗ＤＮＡ抗体がＣＹＰ群で適切に制御され、ＣＹＰがほぼすべての組織学的病変を抑止し逆転させたことを示した。
【０２０７】
Ｃ４ＢＰ（β−）、ＣＹＰおよびＰＢＳ（１５０μｌ／各）の腹腔内と皮下投与は、皮膚を７０％エタノールですすいだ後、３０秒間に２５ゲージ針で行った。
【０２０８】
詳細な投与スケジュールは次の通りである（表５）。
【０２０９】
【表５】
2020517588.tif 000009
【０２１０】
３３週目のタンパク尿の結果を考慮して、本発明者らは３６週目に１回の追加投与を行うことを決定した。ｒＣ４ＢＰ（β−）精製の技術的困難のため、利用可能な組換えタンパク質はすべてのマウス群のこの追加投与を３６週目に完了するには不十分であった。したがって、イン・ビトロ機能アッセイでｒＣ４ＢＰ（β−）と血漿精製Ｃ４ＢＰ（β−）の類似の機能性能を考慮して（図４参照）、本発明者らは両方のタンパク質を混合することを決定した。
【０２１１】
その結果、動物は３６週目に１，２００μｌの血漿精製Ｃ４ＢＰ（β−）（ストック：５．２ｍｇ／ｍｌ；バッチ＃１５０２０６）＋４８４．８μｌ  ｒＣ４ＢＰ（β−）（ストック：５．６ｍｇ／ｍｌ；バッチ＃Jan12008-P03）の混合物、タンパク質混合物の最終濃度：５．３ｍｇ／ｍｌを接種した。
【０２１２】
サンプルの収集スケジュールは次の通りである（表６）。
【０２１３】
【表６】
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【０２１４】
動物は実験期間を通して毎日観察され、治療に対する局所的および全身的反応、ならびに耐性および毒物学的情報を得るために他の病気の徴候および／または行動変化を調べた。体重は経過観察の開始から終了まで毎月２回決定した。マウスを代謝ケージに入れて、治療開始前およびその後毎月２４時間尿検体を収集した。血液は毎月間隔で尾静脈から採取した。
【０２１５】
生存率分析では、安楽死前の対照（ＰＢＳ）とＣ４ＢＰ（β−）またはＣＹＰ治療マウスの両方に標準のエンドポイント基準を採用した（２０％の体重減少、および／または動物の状態：外観、測定可能な臨床徴候、誘発されない行動と外部刺激に対する反応）（NRC (National Research Council). 2010. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Washington D.C.: National Academy of Sciences）。
【０２１６】
実験は、動物実験に関する現在のＥＵの法律に従って実施され、動物実験のための「CEEA：Animal Experimentalation Ethic Committee」、Instituteal Ethics UB Committeeによって承認された。対応する動物実験手順は、カタルーニャ州政府によって承認された（DARP：8765）。
【０２１７】
腎機能分析：タンパク尿
２４時間の尿タンパクは、バルセロナのUniversitat Autonomaの獣医臨床生化学研究所でピロガロールレッド（Olympum Autoanalyzer AU400、ハンブルグ、ドイツ）によって測定した。
【０２１８】
統計分析
事後検定を伴う１−ｗａｙ分散分析（ANOVA）を実施して、経過観察全体でタンパク尿を比較した。生存データは、カプラン・マイヤー曲線と長期検定を使用して分析した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。データは平均＋ＳＥＭとして表す。
【０２１９】
結果
ＭｏＤＣに対するｒＣ４ＢＰ（β−）の免疫調節活性
用量反応イン・ビボ研究で使用するｒＣ４ＢＰ（β−）の免疫調節活性を評価するために、本発明者らは、炎症誘発性および成熟刺激ＬＰＳでこれらの細胞に曝露した後、異なるバッチからの５μｇ／ｍｌの精製ｒＣ４ＢＰ（β−）でＭｏＤＣをプレインキュベートし、以前のアッセイで試験した活性血漿精製Ｃ４ＢＰ（β−）アイソフォーム、または不活性Ｃ４ＢＰ（β＋）アイソフォームに対する性能を比較した。以前に公開されたように（Olivar et al. 2013. J. Immunol., 190:2857-72）、血漿精製およびｒＣ４ＢＰ（β−）の両方が、Ｃ４ＢＰ（β＋）ではなく、類似の半成熟、抗炎症表現型をＬＰＳ成熟ＭｏＤＣに付与することができ、Bioingeniumの精製Ｃ４ＢＰ（β−）タンパク質の免疫調節活性が確認された（図４）。
【０２２０】
ｒＣ４ＢＰ（β−）はループスを起こしやすいＮＺＢＷＦ１マウスの腎機能と生存に影響する：投与経路と用量反応研究の影響
タンパク尿は、ループスマウスで最も顕著で生命を脅かす症状である。それは腎臓への損傷を反映し、病気の結果と密接に関連する。したがって、本研究では、本発明者らは、１）ｒＣ４ＢＰ（β−）投与経路（腹腔内または皮下）、および／または、２）ｒＣ４ＢＰ（β−）の投与量の減少と投与スケジュールが、ＰＢＳ処理対照ＮＺＢＷＦ１マウスと比較してｒＣ４ＢＰ（β−）処理ＮＺＢＷＦ１マウスの腎機能と生存結果に正または負の影響を与えるかどうかを検討した。
【０２２１】
腹腔内（ＩＰ）投与経路に関しては、ＰＢＳ投与対照マウスのタンパク尿は２７週目に発症し始め、３１週（生後８か月近く）から研究終了（３７週目）までに重度のタンパク尿（＞３００ｍｇ／ｋｇ）に着実に進行した。（図５Ａ）。それに対して、ｒＣ４ＢＰ（β−）治療は、投与量に比例してタンパク尿の発症を遅らせた。したがって、２週間に１回、５０μｇ  ｒＣ４ＢＰ（β−）／マウスまたは５μｇ  ｒＣ４ＢＰ（β−）／マウスのいずれかを投与すると、タンパク尿の発症が２週間遅れたが、３７週目までに両方のマウス群が重度のタンパク尿に達し、ＰＢＳ処理対照群と区別できなかった（図５Ａ）。興味深いことに、５００μｇ  ｒＣ４ＢＰ（β−）／マウスを２週間に１回投与すると、ＰＢＳ処理対照マウスと比較してタンパク尿の発症を６週間遅らせることができた。したがって、３３週目までに、両群の対応する平均タンパク尿値は有意に異なった（ｐ＜０．０５）。それにもかかわらず、５００μｇ接種を受けたマウスは３３週目からタンパク尿レベルを着実に増加させ始め、研究終了時（３７週目）に尿中の臨界３００ｍｇタンパク質／ｋｇにほぼ達した。この結果は、５００μｇの血漿精製Ｃ４ＢＰ（β−）／マウスを週２回投与した以前の研究で達成された結果と同等であった。標準的なＣＹＰ投与（１０日ごとに５０ｍｇ／ｋｇ）により、研究終了時（３７週目）までタンパク尿の発生が防止された（図５Ａ）。
【０２２２】
皮下投与経路（ＳＣ）に関して、より低いｒＣ４ＢＰ（β−）用量（特に、２週間に１回の５０μｇｒＣ４ＢＰ（β−））で皮下投与により処理したマウスでは、タンパク尿の発症が有意に遅延したが（３３週目でｐ＜０．０５）、３７週目（研究終了時）までタンパク尿のわずかな増加（＜２００ｍｇ／ｋｇ）が観察された（図５Ｂ）。
【０２２３】
注目すべきことに、Ｃ４ＢＰ（β−）またはＣＹＰ投与の結果として、マウスでは毒性も行動変化も観察されなかった。
【０２２４】
群間の生存率の違いを検討するために、各治療群についてカプラン・マイヤー曲線もプロットした。したがって、対照ＰＢＳで処理されたＮＺＢＷＦ１マウスはすべて観察期間中に死亡し、それらの５０％は３００日で死亡した。対照的に、標準化された免疫抑制ＣＹＰ治療を受けたすべてのマウスは、観察期間を通じて生存したが、ｒＣ４ＢＰ（β−）治療群はさまざまな結果をもたらした。腹腔内経路に関しては、低濃度のｒＣ４ＢＰ（β−）用量（５μｇ）の投与群は、対照ＰＢＳ投与群と同様に機能し、すべてのマウスは研究終了（３３０日）で死亡した。対照的に、より高いｒＣ４ＢＰ（β−）投与量（５０および５００μｇ）を投与されたマウスは生存期間を延長し、２０−３０％近くが研究終了時にまだ生存していた（図６Ａ）。皮下経路に関しては、５０μｇのｒＣ４ＢＰ（β−）で処理したマウスのみが、対照ＰＢＳで処理したマウスと比較して、生存をかなり遅らせるように見えた。それにもかかわらず、すべてのｒＣ４ＢＰ（β−）治療群は、研究の終わりにマウスを活動状態に維持した。興味深いことに、５０μｇのｒＣ４ＢＰ（β−）処理群では、３３０日目に６０％以上のマウスが生存していた。それにもかかわらず、群のサイズが縮小したため（ｎ＝６）、ＮＺＢＷＦ１マウスのカプラン・マイヤー生存曲線の統計分析では、ｒＣ４ＢＰ（β−）処理群と対照ＰＢＳ処理群の間に統計的に有意な差は示されなかった（図６Ｂ）。
【０２２５】
したがって、タンパク尿の結果と一致して、５０μｇのｒＣ４ＢＰ（β−）を皮下投与で処理したＮＺＢＷＦ１マウスでは、疾患の進行の実質的な遅延が明らかであった。
【０２２６】
実施例３：マウスのＣＡＩＡモデルにおけるベータ鎖を欠くＣ４ＢＰアイソフォームの有効性の評価
コラーゲン抗体誘発性関節炎（ＣＡＩＡ）は、保存された自己抗原性コラーゲンタイプＩＩエピトープに対するモノクローナル抗体のカクテルの全身投与と、その後のリポ多糖（ＬＰＳ）の単回注射によって誘発される、ヒト関節リウマチ（ＲＡ）の単純なマウスモデルである。ＣＡＩＡは、免疫応答のプライミングフェーズを伴うことなく、関節炎のエフェクター炎症フェーズを研究するための有用なモデルである。マウスＣＡＩＡモデルは、ＲＡといくつかの臨床的、免疫学的、病理学的特徴を共有する。したがって、このモデルは、ＲＡ疾患に関与する病原性メカニズムの研究や、新しい治療法の試験に有用である。
【０２２７】
この研究の目的は、マウスのＣＡＩＡモデルで異なる時間に皮下投与されたＣ４ＢＰ（β−）の有効性を評価することであった。
【０２２８】
材料および方法
実験系と飼育条件
７−８週齢のＢａｌｂ／ｃ雄マウスはEnvigoから提供された。動物は１２日間順応させた。動物は、換気、温度（２２±２℃）、相対湿度（３５−６５％）、明暗のサイクル（１２時間／１２時間）の環境制御された部屋で飼育された。動物は３−５匹／ケージの群で収容した。食餌は、Harlan Interfauna Iberica, S.L.（「2014 Harlan Teklad Global Diets」）を供給し、食餌と水を自由に摂取させた。
【０２２９】
試験項目と処方
血漿Ｃ４ＢＰ（β−）は、６．２ｍｇ／ｍｌの濃度で供給した。Ｃ４ＢＰ（β−）溶液は、Ｃ４ＢＰ（β−）６．２ｍｇ／ｍｌストック溶液のダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で希釈することで０．３３ｍｇ／ｍｌ（５０μｇ用量）の所望の濃度に調製した。
【０２３０】
２つの参照化合物を使用した：デキサメタゾン（Sigma、Ref.D1756）およびエンブレル（商標名）（エタネルセプト）（Pfizer、Ref.655950）。
【０２３１】
参照化合物のデキサメタゾンは、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度でビヒクル（０．１％Ｔｗｅｅｎ−８０＋９９％カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（０．５％ｗ／ｖ）に溶解した。
【０２３２】
エンブレル（商標名）は、５０ｍｇ／ｍＬストック溶液を希釈することにより、ＤＰＢＳで６ｍｇ／ｍｌに調製した。
【０２３３】
動物に投与する直前に溶液を調製した（表７参照）。
【０２３４】
【表７】
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【０２３５】
実験手順
０日目：関節炎の誘発
０日目に、実験群Ｃ４ＢＰｄ３の動物を無作為に選択し（ｎ＝８）、テールコード番号を使用して識別し、体重を量った。
【０２３６】
各マウスは、尾静脈に２ｍｇの抗ＩＩ型コラーゲン抗体カクテル（ArthritoMA（商標）カクテル溶液、０．２ｍＬ、静脈内、０日目）を投与することにより感作した。
【０２３７】
３日目：ＬＰＳの同期
動物に０．１ｍＬのＬＰＳ溶液（０．７ｍｇ／ｍｌ、７０μｇ／動物）を腹腔内投与した。
【０２３８】
３日目：治療
５０μｇのＣ４ＢＰ（β−）を３日目に治療群Ｃ４ＢＰｄ３に皮下投与した。
【０２３９】
５日目：治療
５０μｇのＣ４ＢＰ（β−）を５日目に治療群Ｃ４ＢＰｄ３に皮下投与した。
【０２４０】
５日目：動物の分布
感作後５日目に、関節炎の臨床徴候を生じている残りの動物（ｎ＝１８）を評価し、ＣＡＩＡ＋発生率のベースで分布させた。動物をＣＡＩＡ対照群、デキサメタゾン投与群（５−１１日目で１ｍｇ／ｋｇ、経口）およびエンブレル（商標名）投与群（５−１１日目で３０ｍｇ／ｋｇ、皮下注射）（ｎ＝６）に均一にランダム化した。動物はテールコード番号を使用して識別し、体重を量った。
【０２４１】
群２は先の試験項目管理のため分布に含めなかった。実験群は表８に示す。
【０２４２】
【表８】
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【０２４３】
関節炎の評価：
関節炎スコアは、表９の基準を使用して決定した。
【０２４４】
【表９】
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【０２４５】
治療：
−Ｃ４ＢＰｄ３群：５０μｇのＣ４ＢＰ（β−）を３日目と５日目に動物に皮下注射した。容量：０．１５０ｍＬ。
−参照化合物治療およびＣＡＩＡ対照群（５−１１日目）：
・エンブレル（商標名）：３０ｍｇ／ｋｇのエンブレル（商標名）を５日目から１１日目までエンブレル群に皮下投与した。容量：５ｍＬ／ｋｇ。
・デキサメタゾン：１ｍｇ／ｋｇのデキサメタゾンを５日目から１１日目までデキサメタゾン群に経口投与した。容量：１０ｍＬ／ｋｇ。
・ＣＡＩＡ対照群：０．１５０ｍＬのＤＰＢＳを５日目から１１日目まで皮下投与した。
【０２４６】
関節炎のモニタリング：
体重は、Ｃ４ＢＰｄ３群では０−１２日から、ＣＡＩＡ対照群、デキサメタゾン群およびエンブレル（商標名）群では５−１２日から毎日登録した。観察者のバイアスを避けるために、同じ観察者が関節炎スコアを決定した。
【０２４７】
試験終了：
調査は１２日目に終了した。
動物はイソフルランで麻酔した。足首と手首の厚さは、ダイヤルシックネスゲージを使用して測定した。血清サンプルを収集し、−２０℃で保存した。左前肢と後肢を解剖し、１０％ホルマリンに入れ、右前肢と後肢を液体窒素で凍結し、−８０℃で保存した。
【０２４８】
脾臓の重さを量り、２つの横断断片に分けた。切片の１つを液体窒素で凍結し、−８０℃で保存し、もう１つを１０％ホルマリンで保存した。
【０２４９】
データ処理と統計分析：
データは表にまとめ、平均±ＳＥＭとして表し、適切な統計検定を使用して分析した。すべての試験の有意差はｐ≦０．０５に設定した。統計分析は、Graph Pad Prismバージョン5.0を使用して行った。
【０２５０】
関節炎スコアデータは、２−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡを使用して分析し、その後、ボンフェローニの事後検定を行った。投与曲線下面積（ＡＵＣ）も決定し、１−ｗａｙ分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用して分析し、その後、ボンフェローニの事後検定を行った。
対照群と比較した阻害率を計算した。
阻害率＝１００−（Ｂ／Ａｘ１００）
Ａ＝平均ビヒクル対照
Ｂ＝平均処理
【０２５１】
足首と手首の厚さ、脾臓／体重比は、１−ｗａｙ分散分析（１−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用して分析され、その後、ボンフェローニの事後検定を行った。
【０２５２】
体重データは、５日目からの２−ｗａｙ分散分析（２ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）を使用して分析し、その後、ボンフェローニの事後検定を行った。
【０２５３】
結果
２ｍｇの抗ＣＩＩ  ｍＡｂカクテルの静脈内投与と、その後の７０μｇのＬＰＳ投与により、検証した動物の９３％で関節炎の兆候が生じた（関節炎の兆候のない３匹の動物は５日目に試験から除外した）。発病は４−５日目に達した。
【０２５４】
ＣＡＩＡ対照群では、疾患の重症度は疾患のピーク（１０日目）まで徐々に増加した。図７は、さまざまな実験群における関節炎スコアの進展を示す。図７は、３日目および５日目に皮下投与された５０μｇのＣ４ＢＰ（β−）の用量が、関節炎誘発後少なくとも１２日まで保護することを示す。３日目と５日目（それぞれ同期と関節炎の発症）に５０μｇのＣ４ＢＰ（β−）を皮下投与したＣ４ＢＰｄ３群は、関節炎の進行を有意に改善し、ＣＡＩＡ対照群（それぞれ、ＣＡＩＡ対照群のＡＵＣに対して４７％阻害）と比較して疾患のピーク時に関節炎スコアの低下を示した（８日から１１日）。１２日目に測定された足首の厚さは、ＣＡＩＡ対照群と比較して有意に低かった（２．７４±０．０８ｍｍ対３．０１±０．０８ｍｍ  ＣＡＩＡ対照、ｐ＜０．０５）。手首の太さにはＣＡＩＡ対照に対して変化は見られなかった。
【０２５５】
参照化合物デキサメタゾン（５−１１日目に１ｍｇ／ｋｇ、経口投与）はマウスＣＡＩＡモデルに非常に有効であり、７日目から１２日目までの関節炎の臨床徴候を有意に減少させた（ＣＡＩＡ対照のＡＵＣに対して７３％抑制、ｐ＜０．０５）。足首の厚さは、ＣＡＩＡ対照群と比較して有意に低かった（ＣＡＩＡ対照に対して２．６３±０．０５ｍｍ、ｐ＜０．０５）。手首の太さにはＣＡＩＡ対照に対して変化は見られなかった。
【０２５６】
エンブレル（５−１１日目、３０ｍｇ／ｋｇ、皮下注射）は、経時的に関節炎スコアの進行性の低下を示し、１０日目から１２日目までＣＡＩＡ対照群よりも関節炎スコアが有意に低かった（ＣＡＩＡ対照の１２日目に対して４７％抑制、ｐ＜０．０５）。足首の厚さは、ＣＡＩＡ対照群と比較して有意に低かった（ＣＡＩＡ対照に対して２．７３±０．０４ｍｍ、ｐ＜０．０５）。手首の太さにはＣＡＩＡ対照に対して変化は見られなかった。
【０２５７】
治療群（Ｃ４ＢＰｄ３、デキサメタゾン、エンブレル（商標名））とＣＡＩＡ対照群の間に顕著な違いは見られなかった。ＬＰＳ注射（３日目）後、動物は徐々に体重が回復したが、中程度の体重減少（５−１０％）が観察された。
【０２５８】
脾臓／ＢＷ比は、ＣＡＩＡ対照群（５．７７±０．４２ｍｇ／ｇ）とＣ４ＢＰｄ３群（５．１０±０．１７ｍｇ／ｇ）およびＥｎｂｒｅｌ群（５．１３±０．１５ｍｇ／ｇ）で類似していた。デキサメタゾンは、ＣＡＩＡ対照に対して脾臓／ＢＷ比の有意な低下を誘発した（３．００±０．１ｍｇ／ｇ、ｐ＜０．００１）。
【０２５９】
この試験の結果は、最初のＣＡＩＡのフェーズ（同期）で投与されたＣ４ＢＰ（β−）が関節炎の進行を止めるのに有効であることを示唆する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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