(57)【要約】【解決手段】  本発明は、ALDH1Aおよびその作動剤、触媒産物と阻害剤の使用を公開する。具体的に、ALDH1A、またはその作動剤、またはその触媒産物の使用であって、自閉症の治療および/または予防に使用される薬物組成物または製剤の製造のための使用を公開する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ALDH1A、またはその作動剤、またはその触媒産物、および/またはその触媒基質の使用であって、自閉症の治療および/または予防に使用される薬物組成物または製剤の製造のために使用されることを特徴とする使用。
【請求項２】
前記ALDH1Aは、ALDH1A1、ALDH1A2、ALDH1A3、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ALDH1A作動剤は、N-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イルメチル)-2,6-ジクロロベンズアミド（N-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-2,6-dichlorobenzamide）、N-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イルメチル)-2,6-ジクロロベンズアミド(N-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-2,6-dichlorobenzamide)、6-メチル-2-(フェニルアゾ)-3-ピリジノール(6-methyl-2-(phenylazo)-3-pyridinol)、2-(ベンゾ[d][1.3]ジオキソール-5-イル)-N-(5,6-ジヒドロ-4H-シクロペンタ[c]イソオキサゾール-3-イル)アセトアミド(2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(5,6-dihydro-4H-cyclopenta[c]isoxazol-3-yl)acetamide)およびこれらの各誘導体からなる群から選ばれることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記の作動剤は発現促進剤、タンパク質分解阻害剤を含むことを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項５】
レチノイン酸またはレチノイン酸類似体、またはその溶媒和物、またはその薬学的に許容される塩の使用であって、自閉症の治療および/または予防に使用される薬物組成物または製剤の製造のために使用されることを特徴とする使用。
【請求項６】
前記レチノイン酸類似体は、レチノール、レチナールデヒド、全トランスレチノイン酸、13-シスレチノイン酸、9-シスレチノイン酸、エトレチナート、アシトレチン、アダパレン、ベキサロテン、タザロテン、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項５に記載の使用。
【請求項７】
レチノイン酸合成原料化合物、またはレチノイン酸分解酵素阻害剤の使用であって、自閉症の治療および/または予防に使用される薬物組成物または製剤の製造のために使用されることを特徴とする使用。
【請求項８】
前記レチノイン酸分解酵素阻害剤は、リアロゾール（liarozole）、ケトコナゾール（ketoconazole）、タラロゾール（talarozole）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
ALDH1A阻害剤の使用であって、自閉症動物モデルの構築に使用される製剤の製造のために使用されることを特徴とする使用。
【請求項１０】
前記ALDH1A阻害剤は、ジスルフィラム（disulfiram）、4-(N,N-ジエチルアミノ)ベンズアルデヒド（DEAB）、WIN-18446、A37（CM037）、NCT-501塩酸化物、CVT-10216、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
自閉症を補助診断および/または予後する方法であって、
（1）血液、体液からなる群から選ばれる、被検サンプルを提供する工程と、
（2）マーカーの濃度、含有量、および/または活性を検出する工程と、
（3）基準値または検量線と比べることによって、補助診断および/または予後を行う工程とを含み、
ここで、前記マーカーはレチノイン酸、ALDH1A、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることを特徴とする方法。
【請求項１２】
被検物質の副作用リスクを評価する方法であって、前記の副作用リスクは自閉症を誘発または発症させるリスクで、かつ前記方法は、
（a） 被検物質を提供する工程と、
（b） 前記被検物質が施用される試験群では、前記被検物質の検出される指標に対する影響を測定し、かつ前記被検物質が施用されていない対照群では、同一の検出される指標のデータを測定し、ここで、前記の検出される指標はレチノイン酸のレベルまたは濃度、ALDH1Aの発現量または活性、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる工程と、
（c） 試験群の前記検出される指標の測定結果Tを対照群における前記検出される指標の測定結果Cと比較する工程とを含み、
測定結果Tが測定結果Cよりも顕著に低い場合、被検物質が妊婦および/または嬰幼児に副作用を発生させるリスクを有することを示唆することを特徴とする方法。
【請求項１３】
前記被検物質は、薬物、日用化学品、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれことを特徴とする請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
薬物の組み合わせまたは前記薬物の組み合わせを含むキットであって、前記薬物の組み合わせは、
（a） 薬学的に許容される担体と、クロトリマゾール、モンテルカスト、モンテルカストナトリウムからなる群から選ばれる第一の活性成分とを含有する第一の薬物組成物、および
（b） 薬学的に許容される担体と、ALDH1A、ALDH1A作動剤、ALDH1A触媒産物、ALDH1A触媒基質、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる第二の活性成分とを含有する第二の薬物組成物
を含むことを特徴とする薬物の組み合わせまたはキット。
【請求項１５】
（a） クロトリマゾール、モンテルカスト、モンテルカストナトリウムからなる群から選ばれる第一の活性成分と、
（b） ALDH1A、ALDH1A作動剤、ALDH1A触媒産物、ALDH1A触媒基質、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる第二の活性成分と
を含むことを特徴とする薬物組成物。
【請求項１６】
自閉症を治療または予防する候補薬物を選別する方法であって、
（a） 被験の候補物質を提供する工程と、
（b） 前記被験の候補物質が施用される試験群では、前記被験の候補物質の検出される指標に対する影響を測定し、かつ前記被験の候補物質が施用されていない対照群では、同一の検出される指標のデータを測定し、ここで、前記の検出される指標はレチノイン酸のレベルまたは濃度、ALDH1Aの発現量または活性、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる工程と、
（c） 試験群の前記検出される指標の測定結果Tを対照群における前記検出される指標の測定結果Cと比較する工程とを含み、
測定結果Tが測定結果Cよりも顕著に高い場合、前記被験の候補物質が自閉症を治療または予防する候補薬物として有用であることを示唆することを特徴とする方法。
【請求項１７】
UBE3AとALDH1Aファミリータンパク質の結合を遮断することができるポリペプチドまたは抗体または化合物の使用であって、自閉症の治療および/または予防に使用される薬物組成物または製剤の製造のために使用されることを特徴とする使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術の分野に属し、具体的に、ALDH1Aおよびその作動剤、触媒産物と阻害剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
自閉症スペクトラム障害は、「自閉症」と略され、「孤独症」とも呼ばれ、その中核症状は社会的交流・コミュニケーションの障害、限定的な反復行動で、重度の神経発達障害性疾患である。中では、自閉症の症例において、染色体15q11-q13のコピー数多型（CNV）が1-3％の比率を占め、当該CNVはUBE3A E3ユビキチンリガーゼの過剰な活性化を引き起こすが、具体的な発症機序がまだ明らかではない。
【０００３】
自閉症スペクトラム障害は、発症原因が様々な広汎性神経発達障害型疾患で、その中核症状は主に社会的相互作用、コミニュケーション能力の欠陥、限られた反復的な興味、行動または活動などの面に現れる。今まで、自閉症につながる遺伝的要素は点突然変異や染色体のコピー数多型を含み、これらの突然変異は多くの関連遺伝子が含まれ、異なるシグナル経路に関わる。自閉症につながる遺伝的要素は非常に複雑で多様化ではあるが、自閉症患者に同じような中核表現型症状が現れ、同時にいずれもシナプス安定状態の失調が現れ、これは自閉症疾患には共通の発症機序が存在することを示唆する。そのため、自閉症における遺伝的要素とシナプス安定状態の失調の間の分子的機序の解明は重要なことになる。
【０００４】
自閉症の症例において、母系染色体15q11-q13のコピー数多型は約1-3％を占める。中でも、複数群体の症例に対する研究では、E3ユビキチンリガーゼUBE3Aが15q11-q13 CNV症状において主要な役割を担うことが見出された。そして、複数の遺伝子組み換えマウスモデルにおいて、UBE3Aの過剰発現は同じくマウスの自閉症の表現型につながる。これらによってUBE3Aの過剰な活性化が自閉症サブタイプで最も明らかな発症要因であることが証明された。最近の報告では、また、自閉症と高度に関連するUBE3Aの点突然変異が発見され、当該点突然変異がプロテインキナーゼA（PKA）のUBE3Aに対するリン酸化を遮断することによって、UBE3Aの過剰な活性化およびシナプス形成の増加につながる（Yiら，2015）。現在、既にE3ユビキチンリガーゼUBE3Aのいくつかの基質が報告されたが、自閉症の発症機序を説明できるものがないため、ほかに未知の自閉症患者の大脳において機能不全になった基質タンパク質が存在する可能性がある。
【０００５】
そのため、系統的にUBE3Aの基質をスクリーニングし、ALDH1Aおよびその作動剤、触媒産物と阻害剤の関連使用を開発することが切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ALDH1Aおよびその作動剤、触媒産物と阻害剤の使用を提供することである。
【０００７】
本発明の第一の側面では、ALDH1A、またはその作動剤、またはその触媒産物、および/またはその触媒基質の使用であって、自閉症の治療および/または予防に使用される薬物組成物または製剤の製造のための使用を提供する。
【０００８】
もう一つの好適な例において、前記のALDH1A作動剤はUBE3Aの阻害剤ではない。
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記「UBE3Aの阻害剤ではない」とは、ALDH1A作動剤がUBE3Aの発現または活性に影響がないか、または基本的に影響がないことをいう（たとえば、前記ALDH1A作動剤が存在する実験群におけるUBE3Aの発現E1または活性A1とブランク対照群（前記ALDH1A作動剤が存在しない場合）におけるUBE3Aの発現E0または活性A0の比（すなわち、E1/E0またはA1/A0）は0.7-1.3、好ましくは0.8-1.2、より好ましくは0.9-1.1である）。
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記自閉症はヒト群体における自閉症である。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記ヒト群体は染色体15q11-q13のコピー数多型があるヒト群体である。
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記ヒト群体はUBE3Aの過剰発現または過剰活性化があるヒト群体である。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記ヒト群体はUBE3AのT508A突然変異があるヒト群体である。
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記ALDH1Aは、ALDH1A1、ALDH1A2、ALDH1A3、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００１５】
もう一つの好適な例において、前記の作動剤は発現促進剤、タンパク質分解阻害剤を含む。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記ALDH1A作動剤は、N-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イルメチル)-2,6-ジクロロベンズアミド（N-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-2,6-dichlorobenzamide）、N-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イルメチル)-2,6-ジクロロベンズアミド(N-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-2,6-dichlorobenzamide)、6-メチル-2-(フェニルアゾ)-3-ピリジノール(6-methyl-2-(phenylazo)-3-pyridinol)、2-(ベンゾ[d][1.3]ジオキソール-5-イル)-N-(5,6-ジヒドロ-4H-シクロペンタ[c]イソオキサゾール-3-イル)アセトアミド(2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(5,6-dihydro-4H-cyclopenta[c]isoxazol-3-yl)acetamide)およびこれらの各誘導体からなる群から選ばれる。
【００１７】
本発明の第二の側面では、レチノイン酸またはレチノイン酸類似体、またはその溶媒和物、またはその薬学的に許容される塩の使用であって、自閉症の治療および/または予防に使用される薬物組成物または製剤の製造のための使用を提供する。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記レチノイン酸類似体は、レチノール、レチナールデヒド、全トランスレチノイン酸、13-シスレチノイン酸、9-シスレチノイン酸、エトレチナート、アシトレチン、アダパレン、ベキサロテン、タザロテン、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００１９】
本発明の第三の側面では、レチノイン酸合成原料化合物、またはレチノイン酸分解酵素阻害剤の使用であって、自閉症の治療および/または予防に使用される薬物組成物または製剤の製造のための使用を提供する。
【００２０】
もう一つの好適な例において、前記レチノイン酸分解酵素阻害剤は、リアロゾール（liarozole）、ケトコナゾール（ketoconazole）、タラロゾール（talarozole）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００２１】
本発明の第四の側面では、ALDH1A阻害剤の使用であって、自閉症動物モデルの構築に使用される製剤の製造のための使用を提供する。
【００２２】
もう一つの好適な例において、前記のALDH1A阻害剤は、小分子化合物、抗体、核酸、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００２３】
もう一つの好適な例において、前記のALDH1A阻害剤はUBE3A作動剤である。
【００２４】
もう一つの好適な例において、前記酢酸は、miRNA、siRNA、sgRNA/Cas9複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００２５】
もう一つの好適な例において、前記ALDH1A阻害剤は、ジスルフィラム（disulfiram）、4-(N,N-ジエチルアミノ)ベンズアルデヒド（DEAB）、WIN-18446、A37（CM037）、NCT-501塩酸化物、CVT-10216、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００２６】
本発明の第五の側面では、自閉症を補助診断および/または予後する方法であって、（1）血液、体液からなる群から選ばれる、被検サンプルを提供する工程と、（2）マーカーの濃度、含有量、および/または活性を検出する工程と、（3）基準値または検量線と比べることによって、補助診断および/または予後を行う工程とを含み、ここで、前記マーカーはレチノイン酸、ALDH1A、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる方法を提供する。
【００２７】
もう一つの好適な例において、工程（3）では、前記サンプルにおけるレチノイン酸濃度が正常ドナーのサンプルにおけるレチノイン酸濃度（8-20nM）よりも低い場合、当該患者が自閉症を罹患するリスクが正常のヒト群体よりも高いか、予後不良であること、ならびに/あるいは前記サンプルにおけるALDH1Aの活性が正常ドナーのサンプルよりも低い場合、当該患者が自閉症を罹患するリスクが正常のヒト群体よりも高いか、予後不良であることを示す。
【００２８】
本発明の第六の側面では、被検物質の副作用リスクを評価する方法であって、前記の副作用リスクは自閉症を誘発または発症させるリスクで、かつ前記方法は、（a） 被検物質を提供する工程と、（b） 前記被検物質が施用される試験群では、前記被検物質の検出される指標に対する影響を測定し、かつ前記被検物質が施用されていない対照群では、同一の検出される指標のデータを測定し、ここで、前記の検出される指標はレチノイン酸のレベルまたは濃度、ALDH1Aの発現量または活性、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる工程と、（c） 試験群の前記検出される指標の測定結果Tを対照群における前記検出される指標の測定結果Cと比較する工程とを含み、測定結果Tが測定結果Cよりも顕著に低い場合、被検物質が妊婦および/または嬰幼児に副作用を発生させるリスクを有することを示唆する方法を提供する。
【００２９】
もう一つの好適な例において、前記被検物質は、薬物、日用化学品、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００３０】
もう一つの好適な例において、前記の副作用は、当該世代の自閉症の発生、次世代の自閉症の発生、またはこれらの組み合わせを含む。
【００３１】
もう一つの好適な例において、前記の「顕著に低い」とは、T/C比が0.7未満で、統計学的有意差があり、P＜0.05であることをいう。
【００３２】
もう一つの好適な例において、工程(b)では、モデル動物、または培養系において測定される。
【００３３】
もう一つの好適な例において、前記方法は、さらに、工程（c）で副作用があることが示唆された被検物質に対して、さらに動物実験によって検証する工程を含む。
【００３４】
本発明の第七の側面では、薬物の組み合わせまたは前記薬物の組み合わせを含むキットであって、前記薬物の組み合わせは、（a） 薬学的に許容される担体と、クロトリマゾール、モンテルカスト、モンテルカストナトリウムからなる群から選ばれる第一の活性成分とを含有する第一の薬物組成物、および（b） 薬学的に許容される担体と、ALDH1A、ALDH1A作動剤、ALDH1A触媒産物、ALDH1A触媒基質、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる第二の活性成分とを含有する第二の薬物組成物を含むものを提供する。
【００３５】
もう一つの好適な例において、前記の第二の薬物組成物は第一の薬物組成物の副作用リスクを低下させるためのもので、前記副作用リスクは自閉症を誘発または発症させるリスクである。
【００３６】
本発明の第八の側面では、（a） クロトリマゾール、モンテルカスト、モンテルカストナトリウムからなる群から選ばれる第一の活性成分と、（b） ALDH1A、ALDH1A作動剤、ALDH1A触媒産物、ALDH1A触媒基質、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる第二の活性成分とを含有する薬物組成物を提供する。
【００３７】
もう一つの好適な例において、前記の第二の活性成分は第一の活性成分の副作用リスクを低下させるためのもので、前記副作用リスクは自閉症を誘発または発症させるリスクである。
【００３８】
もう一つの好適な例において、前記の第二の薬物活性成分は、レチノイン酸およびその類似体、レチノイン酸分解酵素阻害剤、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００３９】
本発明の第九の側面では、自閉症を治療または予防する候補薬物（または潜在的治療剤）を選別する方法であって、（a） 被験の候補物質を提供する工程と、（b） 前記被験の候補物質が施用される試験群では、前記被験の候補物質の検出される指標に対する影響を測定し、かつ前記被験の候補物質が施用されていない対照群では、同一の検出される指標のデータを測定し、ここで、前記の検出される指標はレチノイン酸のレベルまたは濃度、ALDH1Aの発現量または活性、あるいはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる工程と、（c） 試験群の前記検出される指標の測定結果Tを対照群における前記検出される指標の測定結果Cと比較する工程とを含み、測定結果Tが測定結果Cよりも顕著に高い場合、前記被験の候補物質が自閉症を治療または予防する候補薬物として有用であることを示唆する方法を提供する。
【００４０】
もう一つの好適な例において、前記の「顕著に高い」とは、T/C比が1.2超で、統計学的有意差があり、P＜0.05であることをいう。
【００４１】
もう一つの好適な例において、工程(b)では、モデル動物、または培養系において測定される。
【００４２】
もう一つの好適な例において、前記方法は、さらに、工程（c）で自閉症を治療または予防する候補薬物として有用であることが示唆された被検物質に対して、さらに動物実験によって検証する工程を含む。
【００４３】
本発明の第十の側面では、UBE3AとALDH1Aファミリータンパク質の結合を遮断することができるポリペプチドまたは抗体または化合物の使用であって、自閉症の治療および/または予防に使用される薬物組成物または製剤の製造のための使用を提供する。
【００４４】
もう一つの好適な例において、前記のポリペプチドは、ペプチド-1、ペプチド-2、ペプチド-3からなる群から選ばれる。
【００４５】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組み合わせ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】自閉症患者のサンプルに染色体15q11.2-14のコピー数多型が発見されたことを示す。（a）3名のASD患者には、UBE3A領域のコピー数変異が含まれた。（b）3名のASD患者における重複のDNA領域(青色)がUCSCでhg18ヒトゲノムに投影され、15q11.2-q14が赤色の枠で表示されている。既知の遺伝子は底部で示され、UBE3A遺伝子が赤色で示されている。（c）ヒトUBE3Aタンパク質ドメインの概略図である。（d）UBE3A遺伝子が過剰なASD患者と正常対照の不死化リンパ球における静態のUBE3Aタンパク質のレベルである。
【図２】UBE3AのALDH1Aファミリーのメンバーとの結合を示す。（a） 酵母ツーハイブリッド分析において、ヒトUBE3Aタンパク質とALDH1A2の相互作用は、陽性クローンがSD-4培養プレートで生存できることも、X-galで青色を呈色することもできる。（b-c）293-FT細胞において、Flag-UBE3AはALDH1A2-HAまたは内因性タンパク質と相互作用がある。細胞によって発現されるタグタンパク質は特定の抗体でCo-IP分析が行われた（b）。IgGまたはALDH1A2抗体で内因性タンパク質のCo-IPが行われ、UBE3AまたはALDH1A2抗体でイムノブロットが行われた（d）。（d） SH-SY5Y細胞において、Flag-UBE3AおよびALDH1A2-RFPに対して免疫蛍光共局在化実験が行われ、細胞核はDAPIで染色された。縮尺は30 μmを示す。（e） 体外におけるUBE3AとALDH1A2タンパク質の間の相互作用である。（f） ALDH1A2とUBE3Aの結合領域の同定である。（g-h） 体外におけるUBE3AとALDH1A2ファミリーのほかのタンパク質の相互作用である。（i-j） 体内においてUBE3AはALDH1A2ファミリーのほかのメンバーと相互作用がある。  （k）GSTプルダウン実験において、UBE3AとALDH1A2の結合領域に対する3つの異なるペプチド断片（ペプチド-1、ペプチド-2、ペプチド-3）を入れ、異なる程度で競争的にGST-UBE3AとALDH1A2タンパク質の間の相互結合を遮断することができた。
【図３】組み換えユビキチン化系においてUBE3Aがポリユビキチン鎖をALDH1A2に結合させることを示す。（a） 組み換えユビキチン化系においてUBE3Aがポリユビキチン鎖をALDH1A2に結合させた。（b） 体外においてUBE3AがALDH1A2のユビキチン化を促進した。ユビキチン化タンパク質はHA抗体で集め、そしてHis抗体でイムノブロット分析を行った。（c）異なる細胞系における内因性ALDH1A1、2、3タンパク質の静態含有量を検出した。（d）H1299細胞におけるCRISPRによるUBE3A遺伝子を標的とする配列である。上段はUBE3Aにおけるノックアウトされた後の遺伝子配列で、下段はUBE3A-/-細胞のシークエンシングピークの図である。赤色の矢印はの開始点を示す（4bp欠失）。（e）野生型H1299細胞と比較すると、IB分析でH1299 UBE3A-/-細胞におけるUEB3A遺伝子のノックアウトが確認された。（f） H1299細胞の異なるUBE3A(+/+、+/-、および-/-)遺伝子型で、ALDH1A2ユビキチン化がUBE3Aの欠失に伴って減少した。（g-h）MEF細胞またはHEK-293FT細胞において、内因性Aldh1a2ユビキチン化レベルがUbe3aタンパク質のレベルと正関連する。（i） ASD患者由来のリンパ球において、内因性ALDH1A2タンパク質のユビキチン化レベルがUBE3Aタンパク質のレベルの増加に伴って増加した。（j）UBE3Aのリン酸化状態はそのALDH1A2に対するE3リガーゼ活性に影響した。（k）組み換えユビキチン化系におけるUBE3Aによってユビキチン化されたALDH1Aファミリーのほかのメンバーである。（l-m）体内におけるUBE3Aによってユビキチン化されたALDH1Aファミリーのほかのメンバーである。
【図４】ヒトUBE3Aが非タンパク質分解のUb連結形態でユビキチン化によってALDH1A2を修飾することを示す。（a-b） HEK-293FT細胞における発現量が外因的に増加したFlag-UBE3Aタンパク質またはMEF細胞における野生型Ube3a、欠失またはノックアウト(Ube3a+/+、+/-、-/-)の場合の内因性ALDH1A2タンパク質のレベルである。（c-e） UBE3AがK29およびK63ポリユビキチン鎖の連結形態でALDH1A2のユビキチン化を調整した。H1299細胞において、Myc-UBE3A、ALDH1A2-HA(または-Flag)が共形質転換され、そして特定の位置にLysが1個のみ残ったHis-Ub突然変異体(c)、あるいはK29番(d)または63番(e)でKをRに突然変異させた突然変異体である。HAまたはFlagタグのALDH1A2タンパク質は細胞から集め、そしてHAまたはFlag抗体で検出した。（f） H1299細胞において、His6-Ub、Myc-UBE3Aが共形質転換され、そして所定の部位にK-Rを含有するHA-ALDH1A2である。ALDH1A2-HAはHA抗体で集めた後、ユビキチン化を検出した。3R： ALDH1A2-HAはK269、K370、K515の部位でKがRに突然変異した。（g） ヒトALDH1A2タンパク質の単量体の結晶構造で、ここで、3つの主なユビキチン化部位が（赤色で表示されている）活性中心（Cys320、明るい黄色で示されている）の近くにあり、補酵素NAD+は紫色で示されている。結晶構造はPDBデータベースから獲得された(DOI: 10.2210/pdb4x2q/pdb)。（h） ヒトALDH1Aファミリーのタンパク質のユビキチン化部位の周囲領域のペプチド配列の比較で、ユビキチン化部位はオレンジ色で示されている。
【図５】UBE3Aによるユビキチン化がALDH1A2のレチナールデヒドデヒドロゲナーゼの活性を阻害したことを示す。（a） ALDH1A2-Flagのユビキチン化レベルを検出した。HEK-293FT細胞に所定のプラスミドが共形質転換され、ALDH1A2-Flagタンパク質はFlag抗体で沈殿させた後、Flag短鎖ペプチドで溶離させ、そして4℃一晩USP2ccで処理した。（b-c）UBE3AによってALDH1A2に結合されたポリユビキチン鎖はそのレチナールデヒドに対する脱水素酵素を低下させた。ALDH1A2-Flagタンパク質はMyc-UBE3A、His6-UbおよびALDH1A2-Flagを過剰発現する293FT細胞において集まり（b）、USP2cc酵素によって処理するか、または処理せずにポリユビキチン鎖を除去した(c)。集まったALDH1A2タンパク質はオールトランスレチナールデヒドを基質として脱水素酵素活性を分析した。ユビキチン化ALDH1A2タンパク質の酵素活性は対照群で校正した（b: n = 4、c: n = 3）。（d）ALDH1A2-Flagのユビキチン化の有無でのプロピオンアルデヒドに対する脱水素酵素活性の分析である。***：P＜0.001、両側t検定、n = 4。（e）ALDH1A2-Flagタンパク質のUSP2cc処理の有無でのプロピオンアルデヒドに対する脱水素酵素活性の分析である。**：P＜0.01、両側t検定、n = 3。（f）野生型ALDH1A2タンパク質または3KRタンパク質のプロピオンアルデヒドに対する脱水素酵素活性の分析である。酵素活性は校正後のNADH生成量（左）および相対酵素活性（右）で表示された。***：P＜0.0001、両側t検定、n = 3。（g）異なる種における3つの主なユビキチン化部位（K269、K370、K415）の周囲のアミノ酸配列の比較である。（h-i） AldeFluor分析（h）またはRARE-ルシフェラーゼ報告分析（i）において、ASD患者由来の不死化リンパ球の全ALDH1A活性は正常対照よりも低かった。数値は平均値および分散で表示されている。*：P＜0.05、**：P＜0.01、***：P＜0.001。（b、c）両側t検定、一元配置ANOVAダネット事後検定（h、i）。
【図６】高すぎたUBE3A活性がシナプス伝達の可塑性を破壊したことを示す。（a）神経活動を1 μMと100 μMのTTXで遮断した後、初代PFC神経細胞におけるRARE-hrGFP輝度が顕著に増強した。代表的な図は上段に示され（縮尺、50 μm）、下段は蛍光強度がDMSO群で校正されたものである。DMSO、n = 8；APV/TTX、n = 11。（b） 初代神経細胞を1 μMと100 μMのTTXで処理した後、ブランクベクターまたはT508E突然変異体と比べ、UBE3Aの導入によってRARE-hrGFPのシグナルが顕著に低下した。相対蛍光強度の代表的な図は右側に示された。ベクター、n = 11；UBE3A、n = 14；T508E、n = 12。縮尺: 40 μm。（c） 1 μMと100 μMのTTXで処理された初代神経細胞は、電気生理試験においてmEPSCの幅と頻度はいずれも顕著に増加した。上段はmEPSCの軌跡を示し、下段は幅と頻度の定量である（DMSO、n = 15；APV/TTX、n = 12）。（d） ブランクベクターおよびT508E群と比べ、1 μM APVと100 μM TTXで刺激した後、神経細胞へのUBE3Aの導入はmEPSCの頻度を低下させた。ベクター、n = 15；UBE3A、n = 17；T508E、n = 18。（e） DMSOまたはAPV/TTXで24h処理した後、PFC神経細胞の膜表面のGluR1およびPSD-95を染色した（DMSO、n = 31；APV/TTX、n = 33）。PSD-95と共局在化するGluR1の強度を定量した。（f）神経活動の遮断によって特定の遺伝子の初代PFC細胞における転写レベルが変わらなかった。（g）神経活動の遮断によって、GluR2タンパク質のレベルではなく、初代PFC細胞の膜表面におけるGluR1が上方調節された。（h）APV/TTXで24h処理した後、ブランクベクター、T508EまたはUBE3Aで形質転換した後、神経細胞の膜表面におけるGluR1およびPSD-95を染色した。turboRFP陽性の樹状突起においてPSD-95と共局在化するGluR1を定量的に分析した（ベクター、n = 21；UBE3A、n = 28；T508E、n = 24）。数値は平均値および分散で表示されている。*：P＜0.05、**：P＜0.01、***：P＜0.001。（a、c、e）両側t検定、（b、d、h）一元配置ANOVAボンフェローニ事後検定。
【図７】過剰量のUBE3Aタンパク質によってRAの内部安定状態が下方調節され、そしてマウスでASDと類似する表現型が誘導された。（a） PFC領域への定位注射の脳部の概略図（左）、hSynI-プロモーターによってFlag- EGFP、Flag-UBE3AまたはFlag-T508Eの発現が駆動される構造図（右）である。（b）AAV-SynI-Flag-EGFPがPFC領域へ注射されたマウスの脳部冠状切片の代表的な図である。縮尺は100 μMである。（c）PFC領域にはFlagタグのEGFP、UBE3AおよびT508Eタンパク質が見られた。細胞核はDAPIで二重染色された。縮尺は100 μMである。（d） AAVウイルスに担持されたEGFP、UEB3A、UBE3A-T508Eが定位注射された群におけるマウスのセルフグルーミングの時間である。EGFP (n = 11)、UBE3A (n = 14)、UBE3A-T508E (n = 9)。（e） 3群のマウスのストレンジャーマウスおよび物体との交流時間を比較した。GFP、n = 12；UBE3A、n = 13；T508E、n = 11。（f） 3群のマウスのストレンジャーマウスIおよびストレンジャーマウスIIとの交流時間を比較した。EGFP (n = 10)、UBE3A (n = 14)、T508E (n = 11)。*：P＜0.05、**：P＜0.01、***：P＜0.001。（g）EGFP、UBE3AまたはT508E AAVウイルスを注射されたマウスのオープンフィールドの中央区域における滞在時間である。（h）EGFP、UBE3AまたはT508E AAVウイルスを注射されたマウスのオープンフィールドの中央区域における移動距離と総距離の比である。（i）異なるAAVウイルスを注射されたマウスのロータロッド試験における落下までの維持時間を比較した。
【図８】ATRAの経口投与によってUBE3Aを過剰発現するマウスに現れた自閉症の表現型を逆転させることができたことを示す。（a） AAV定位注射の過程およびマウスモデルにおけるATRAによるレスキュー実験の概略図である。（b） AAV注射マウスの溶媒またはATRAを注射された後のセルフグルーミングに使われた時間である。オリーブオイル、n = 9；ATRA、n = 10。（c-d）AAV注射マウスが溶媒またはATRAを注射された後のストレンジャーマウスIおよび物体（c）との交流時間またはストレンジャーマウスIおよびストレンジャーマウスII（d）との交流時間を比較した。（e）溶媒またはATRAを経口投与されたマウスのオープンフィールドの中央における滞在時間を比較した。（f）UBE3A AAVウイルスを注射されたマウスが溶媒またはATRAを経口投与された後のオープンフィールドの中央区域における移動距離と総距離の比を比較した。（g）UBE3A AAVウイルスを注射されたマウスが溶媒またはATRAを経口投与された後のロータロッド試験における落下までの維持時間を比較した。（h） 野生型マウスの溶媒またはATRAが注射された後のセルフグルーミングに使われた時間を比較した。（i-j）野生型マウスが溶媒またはATRAを経口投与された後のストレンジャーマウスIおよび物体（i）またはストレンジャーマウスIおよびストレンジャーマウスII（j）を探索する時間を比較した。（k-l）野生型マウスが溶媒またはATRAを経口投与された後のオープンフィールドの中央における滞在時間（k）または中央区域における移動距離（l）の百分率を比較した。（m）野生型マウスが溶媒またはATRAを経口投与された後のロータロッド試験における落下までの維持時間を比較した。数値は平均値および分散で表示されている。
【図９】マウスにALDH1A阻害剤DSFを経口投与することによって誘導されたASDと類似する表現型の出現を示す。（a）マウスが溶媒または異なる投与量のDSF（0.1または0.3 mg/g）を6週間経口投与された後、HPLC-MS/MS法によって相対ATRA含有量を測定し、対照群で校正した。（b）異なる群では、マウスの体重に有意差がなかった。溶媒群、n = 10；DSF、0.1 mg/g、n = 9；DSF、0.3 mg/g、n = 12。（c）3群のマウスのセルフグルーミングに使われた時間を比較した。（d）3群のマウスのストレンジャーマウス、中央、物体の部屋における滞在時間を比較した。（e） 3群のマウスのストレンジャーマウスおよび物体との交流時間を比較した。（f）マウスのストレンジャーマウスI、中央、ストレンジャーマウスIIの部屋における滞在時間を比較した。（g） 3群のマウスのストレンジャーマウスIおよびストレンジャーマウスIIとの交流時間を比較した。（h-i）マウスが溶媒または0.1/0.3mg/gを胃内投与された後のオープンフィールドの中央における滞在時間および中央における活動距離の比率を比較した。（j）異なる群における高架式十字からオープンアームに入る回数の比率を比較した。（k）異なる群のマウスのロータロッド試験における落下までの維持時間を比較した。数値は平均値および分散で表示されている。*：P＜0.05、**：P＜0.01、***：P＜0.001、NS、有意差がなかった。（e、g） 両側t検定、（a-d、f） 一元配置ANOVAボンフェローニ事後検定。溶媒群、n = 15；DSF、0.1 mg/g、n = 17；およびDSF、0.3 mg/g、n = 19。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
本発明者は幅広く深く研究したところ、初めて意外に自閉症に関連する新規な経路を見出した。本発明者は、初めて、経路の中核タンパク質、すなわち、合成酵素ALDH1Aと自閉症の発生に顕著な関連性があることを見出した。前記合成酵素ALDH1A、またはその作動剤、またはその合成産物、またはその触媒基質を補充することによって、いずれも自閉症および自閉症に関連する症状の予防および改善に役に立つ。これに基づき、本発明を完成させた。
【００４８】
具体的に、実験では、レチノイン酸（RA）の律速合成酵素（ALDH1A2）はUBE3Aによってユビキチン化修飾に依存する形で負調節されることが示された。自閉症に関連するUBE3Aタンパク質の高含有量または過剰活性化はいずれもRAが介するニューロンのシナプス安定状態を破壊することができた。マウス動物モデルにおいて、UBE3Aタンパク質のマウス大脳前頭前皮質（PFC）における過剰発現およびALDH1A阻害剤の投与はいずれもマウスの自閉症に類似する症状の出現につながった。RAの補充によって、UBE3Aの過剰発現によるマウスの自閉症の症状を顕著に改善することができた。これらの結果から、RA経路の関与のUBE3Aの過剰活性化と自閉症の表現型の間の関連における潜在的な機序が示された。
【００４９】
レチノイン酸およびその誘導体
レチノイン酸およびその誘導体は、大きく、レチノール、レチナール、トレチノイン（オールトランスレチノイン酸）、イソトレチノイン（13-シスレチノイン酸）、アリトレチノイン（9-シスレチノイン酸）を含む第一世代、エトレチナート、アシトレチンを含む第二世代、アダパレン、ベキサロテン、タザロテンを含む第三世代に分かれる。（レチノール、レチナールデヒド、全トランスレチノイン酸、13-シスレチノイン酸、9-シスレチノイン酸、エトレチナート、アシトレチン、アダパレン、ベキサロテン、タザロテン）
【００５０】
また、誘導体は各化合物のエステル系誘導体も含み、いずれも体内において酸または塩の形態に加水分解される。その一部の化合物の構造式は以下の通りである。
【００５１】
【化１】
2020514398.tif 000002
【００５２】
ALDH1Aタンパク質およびその作動剤
本明細書で用いられるように、用語「ALDH1A」とはレチナールデヒドデヒドロゲナーゼファミリー1メンバーA（Aldehyde dehydrogenase family 1 member A）をいう。
【００５３】
本発明において、ALDH1Aは異なる哺乳動物由来の同種タンパク質、たとえばヒトおよびヒト以外の哺乳動物（たとえば齧歯動物（たとえばマウス、ラット）、ウシ、ヒツジ、イヌなど）由来のALDH1Aを含む。本発明において、当該用語は野生型ALDH1Aのみならず、突然変異型ALDH1A（野生型ALDH1Aと比べ、当該突然変異が類似するか、近い活性を有する）も含む。
【００５４】
本発明において、代表的なALDH1AはALDH1A1、ALDH1A2、ALDH1A3、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００５５】
本明細書で使用されるように、用語「ALDH1Aタンパク質の作動剤」とはALDH1Aの発現および/または活性を向上させる物質である。たとえば、ALDH1Aタンパク質と高親和力を有し、ALDH1Aと結合するとALDH1Aの効果を向上させる物質が挙げられる。
【００５６】
本発明の一つの好適な実施例において、ALDH1Aタンパク質の作動剤は、N-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イルメチル)-2,6-ジクロロベンズアミド（N-(1,3-Benzodioxol-5-ylmethyl)-2,6-dichlorobenzamide、ALDA-1と略する）、N-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イルメチル)-2,6-ジクロロベンズアミド、2-(ベンゾ[d][1.3]ジオキソール-5-イル)-N-(5,6-ジヒドロ-4H-シクロペンタ[c]イソオキサゾール-3-イル)アセトアミド、6-メチル-2-(フェニルアゾ)-3-ピリジノールからなる群の化合物およびその相応する誘導体から選ばれる。
【００５７】
【化２】
2020514398.tif 000003
【００５８】
ALDH1A阻害剤
ALDH1A阻害剤（またはALDH1Aファミリー阻害剤）とは生物化学反応においてALDH1Aおよびそのファミリーのタンパク質の化学反応を遮断するか、その速度を低下させることができる物質である。また、当該用語はALDH1Aの発現または活性を低下させる阻害剤、たとえばアンチセンスRNA、miRNA、または抗体を含む。
【００５９】
本発明の一つの好適な実施例において、ALDH1Aおよびそのファミリーの阻害剤は以下の群の化合物およびその相応する誘導体から選ばれる。
【００６０】
【化３】
2020514398.tif 000004
【００６１】
RA分解酵素CYP26A1阻害剤
RA分解酵素CYP26A1阻害剤とは生物化学反応においてCYP26A1タンパク質によるレチノイン酸の分解を遮断するか、その速度を低下させることができる物質である。
【００６２】
本発明の一つの好適な実施例において、RA分解酵素CYP26A1阻害剤は以下の群の化合物およびその相応する誘導体から選ばれる。
【００６３】
【化４】
2020514398.tif 000005
【００６４】
候補薬物または治療剤
また、本発明において、自閉症を治療または予防する候補薬物（または潜在的治療剤）を選別する方法を提供する。
【００６５】
本発明において、候補薬物または治療剤とは、ある薬理学的活性を有することが知られた物質または検証されている、ある薬理学的活性を有する可能性がある物質で、核酸、タンパク質、化学合成された小分子または大分子化合物、細胞などを含むが、これらに限定されない。候補薬物または治療剤の投与形態は、経口投与、静脈内注射、腹腔内注射、皮下注射、または脊椎内投与でもよい。
【００６６】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（1）本発明は、新規な自閉症治療の標的を提供するため、本発明によれば、自閉症を治療する薬物を選別・開発することができる。
【００６７】
（2）また、本発明は潜在の妊婦の薬物および日用化学品の摂取の副作用による後代に自閉症が現れるリスク（ならびに嬰幼児の薬物および日用化学品などの摂取の副作用）のスクリーニングへの使用が可能で、有効に臨床評価をする診断ツールの開発が期待できる。
【００６８】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、例えばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」(ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、1989) に記載の条件などの通常の条件に、或いは、メーカーのお薦めの条件に従った。特に断らない限り、％と部は、重量で計算された。本発明に係る実験材料は、特に説明しない限り、いずれも市販品として得られた。
【００６９】
材料と方法
1．被験者およびサンプル
被験者の募集および評価はいずれも中南大学生命科学院、医学遺伝学国家重点実験室審査委員会の規則に従い、そしてヘルシンキ宣言の原則に厳格に遵守した。被験者の募集および診断の詳細はいずれも従来の報告に従った（Xiaら, 2013; Wangら, 2016）。すべての血液サンプルの採取はいずれも書面の同意書を受け取った。
【００７０】
2．コピー数多型（CNV）の配列分析
3名の漢族の患者のコピー数多型（男性、年齢：3-6歳）には、Human660W-Quadマイクロアレイチップが使用された（Illumina）。チップ分析はGenomeStudio v2011.1（Illumina）によって行われ、従来の報告に従った（Navaら, 2013）。ヒト参照ゲノムhg18を参照としてコピー数多型の作図を行った。
【００７１】
3．細胞培養および形質移入
標準化方法(Andersonら, 1984)に従い、EBVウイルスで血球を形質転換させて不死化リンパ球を得、そして10％牛胎児血清（Biochrom）を含有するRPMI-1640（Gibco）培地において培養した。HEK-293FT (Life Technologies)、HEK-293 (ATCC)、SH-SY5Y (ATCC)、H1299(ATCC)およびA549 (ATCC)の細胞はいずれも10％牛胎児血清およびペニシリン/ストレプトマイシン(Life Technologies)を含有するDMEM(Corning)培地で培養した。報告された方法に従ってマウス線維芽細胞を準備・構築した（Xuら, 2005）。初代ニューロン細胞は妊娠18日のラット（Sprague Dawley）の胎児の大脳の前頭前皮質から分離し、そして10％牛胎児血清を含有するDMEM/F12培地で培養した。翌日に、細胞の培地をB-27補充物（Gibco）およびGlutaMax（Gibco）を含有する無血清神経基礎培地（Gibco）に換えて培養した。細胞は5％ CO2を含有する飽和湿度のインキュベーターで培養した。すべての細胞系はいずれも定期的にマイコプラズマの検出を行った。
【００７２】
HEK-293FT細胞はポリエチレンイミン（Sigma）で関連するプラスミドを形質移入し、SH-SY5YおよびH1299はLipofectamine 2000（Life Technologies）で形質移入し、いずれもメーカーの指示に従って操作した。H1299細胞を基にしたUBE3Aモノアリル遺伝子および二対立遺伝子ノックアウト細胞系はCRISPR/Cas9システムによってゲノム編集を行った後、選別して得られた。UBE3A遺伝子のsgRNAプライマーの設計は既存の報告（Hsuら, 2013）に従い、配列は以下の通りである（標的配列は下線で示された）。
【００７３】
(1) 5''-CACCGAGCACAAAACTCATTCGTGC-3''(配列番号1)
(2) 5''- AAACGCACGAATGAGTTTTGTGCTC-3''(配列番号2)
【００７４】
初代ニューロン細胞はリン酸カルシウム形質移入試薬（碧雲天）でメーカーのプロトコールに従って関連するプラスミドを形質移入した。
【００７５】
4．プラスミドの構築
本課題におけるプラスミドの構築は制限酵素による消化および連結反応（NEB）を含み、いずれも従来のクローニング方法によって行われた。酵母ツーハイブリッドスクリーニングに使用されたプラスミドはGateway LRクロナーゼ（ThermoFisher）でメーカーのプロトコールに従って反応させて得られた。関連するプラスミドの点突然変異は部位特異的突然変異法によって導入された。さらに、複数のエレメントを含有するプラスミドはギブソン・アセンブリ法によって構築された。本工程において、UBE3A融合発現タグはいずれもN末端に位置した。
【００７６】
5．酵母ツーハイブリッド
ベイトタンパク質としてUBE3Aを使用し、pDEST32-UBE3A（ThermoFisher）およびpDEST22骨格に基づいたヒト由来cDNAライブラリー（ThermoFisher）を酵母菌株Mav203（ThermoFisher）に共形質移入した。陽性クローンは同時にウラシル、ヒスチジン、ロイシンおよびトリプトファンの4つの成分が欠乏している培地（Clontech）において生存することができ、X-Gal（Sigma）が存在する条件において青色を呈色することもできる。
【００７７】
6．GSTプルダウン実験
GST、GST-UBE3Aおよび短縮されたGST-UBE3Aタンパク質をBL21感受性細胞（NEB）を誘導発現し、グルタチオンアガロース（GE Healthcare）によって精製した。ALDH1A1-His6、ALDH1A2-His6およびALDH1A3-His6タンパク質はNi-NTAアガロース（Qiagen）によって精製した。精製後のALDH1A2-His6およびGST-UBE3Aタンパク質はプルダウン緩衝液（50 mM Tris-Cl、pH 8.0、200 mM NaCl、1 mM EDTA、1％ NP-40、1 mM DTT、10 mM MgCl2）において4℃で2時間インキュベートした。ビーズをプルダウン緩衝液で4回洗浄し、イムノブロット法によって分析した。ほかのタンパク質のプルダウン分析は同様の手順に沿った。
【００７８】
7．細菌ユビキチン化系の再構築
ユビキチン化系のすべての構成要素を従来のクローニング方法によって二重発現系ベクター骨格pACYCDuet-1（Novagen）に導入した。HA-UB、UBCH7およびUba1を1つ目のマルチクローニングサイトに挿入し、T7プロモーター/乳糖オペロンおよびリボソーム結合部位の下流に連結させ、各構成要素の間にいずれもShine-Dalgarno（SD）配列によって分画することによってマルチシストロン性のエレメントを形成した。UBE3Aを2つ目のマルチクローニングサイトに挿入し、pACYC-HA-UB-UBCH7-Uba1-UBE3Aプラスミドを生成した。BL21感受性細胞を電気形質転換法によってpACYCおよびpET22b-ALDH1A2-His6プラスミド（Novagen）で形質転換し、そしてクロラムフェニコールおよびアンピシリン（Sigma）でスクーニングした。大腸菌はOD600吸光値が0.8に達した時点で、0.25mMのイソプロピル-β-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG、Sigma）で18℃の条件において16時間誘導培養した。細胞を収集してRIPA緩衝液（150 mM NaCl、50 mM Tris-Cl、pH 7.4、1％ NP-40、0.1％ SDS）に再懸濁させた後、細胞をVibra-Cellリアクター（SONICS）で超音波処理し、遠心によって沈殿を除去した。上清をNi-NTAアガロースによって精製した。Usp2cc処理群では、Ni-NTAビーズに結合した精製タンパク質をUsp2cc酵素と4℃で一晩インキュベートした。ALDH1A2タンパク質のユビキチン化レベルをイムノブロット法によって分析した。
【００７９】
8．免疫沈殿・イムノブロット実験
内因性または外因性タンパク質を発現する細胞をプロテアーゼ阻害剤混合物（Roche）を入れたIP緩衝液（50 mM Tris-Cl、pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1％ NP-40、10％グリセリン）において分解させ、そしてVibra-Cellリアクターで超音波処理した。遠心後、細胞破片を除去し、上清に特異性抗体およびプロテインGアガロースビーズ（Merck Millipore）を入れて4℃で一晩インキュベートした。使用された一次抗体は、正常のウサギIgG抗体（sc-2027、Santa Cruz）、Flag抗体（F1804、Sigma）、ALDH1A2抗体（sc-367527、Santa Cruz）、HA抗体（H6908、Sigma）である。免疫沈殿を収集した後、2×SDS-PAGE仕込み緩衝液を入れ、95℃で10分間変性させた。出発タンパク質、免疫沈殿収集タンパク質およびほかの細胞分解サンプルをSDS-PAGEゲルで分離させ、PVDF膜（Bio-Rad）に転写させた。膜をUBE3A抗体（sc-166689、Santa Cruz、1:500希釈）、Flagタグ抗体 （F1804、Sigma、1:8000希釈）、HAタグ抗体（H6908、Sigma、1:4000希釈）、ALDH1A2抗体（sc-367527、Santa Cruz、1:500抗体）、ALDH1A1抗体（15910-1-AP、Proteintech、1:500抗体）、ALDH1A3抗体（25167-1-AP、Proteintech、1:500希釈）、Hisタグ抗体（H1029、Sigma、1:4000希釈）、GSTタグ抗体（66001-1-lg、Proteintech、1:5000希釈）、Mycタグ抗体（sc-40、Santa Cruz、1:1000希釈）、アクチン抗体（A2228、Sigma、1:8000希釈）、GAPDH抗体（sc-32233、Santa Cruz、1:4000希釈）といった特異的抗体でイムノブロットを行った。
【００８０】
9．免疫蛍光
SH-SY5Y細胞（ATCC）に特定のプラスミドを形質移入した後、さらに24時間培養し、その後4％パラホルムアルデヒド（Sigma）で固定した。細胞を破裂させた後、一次抗体（Flagタグ抗体、F1804、Sigma）を入れて4℃で一晩インキュベートした後、Alexa Fluor 488が結合した蛍光二次抗体（A11029，ThermoFisher）で室温で1時間インキュベートした。細胞核を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI、ThermoFisher）で二重染色した。ラットの初代ニューロン細胞に体外で10日目にリン酸カルシウム形質移入法によって特定のプラスミドを形質移入し、DIV12の時にDMSO（Sigma）または1μMテトロドトキシン（TTX、上海Aladdin社）および100 μM D-(-)-2-アミノ-5-ホスホノ吉草酸（D-APV、Tocris）で24時間処理した。細胞を固定した後、前記のプロトコールに従ってそれぞれ一次抗体としてGluR1抗体（sc-55509、Santa Cruz）、PSD95抗体（ab18258、Abcam）およびAlexa Fluor 488（A11029、ThermoFisher）、Alexa Fluor 647（A21245、ThermoFisher）が結合した二次抗体で染色を行った。Olympus FV1200共焦点顕微鏡によって写真を撮影し、撮影解像度は1024×1024ピクセルであった。同実験において共焦点顕微鏡の設定パラメーターを一定に維持した。蛍光強度分析の定量はImage-Pro plus（Media Cybernetics）ソフトを使用した。
【００８１】
10．免疫組織化学
ウイルスが定位注射されたマウスから取り出された大脳は4％パラホルムアルデヒドを含有するPBSで4℃で一晩固定し、さらに30％ショ糖(Sigma)を含有するPBSに浸漬した。Leica CM3050 Sクリオスタット(Leica Biosystems)によって厚さ40 μMの大脳冠状切片を切り出し、切片をPBST(0.3％ Triton X-100)で室温で15分間処理した。その後、脳部切片を3％正常ヤギ血清(BOSTER)によってブロッキングし、Flagタグ抗体(14793, Cell Signaling, 1:800希釈)で4℃で一晩インキュベートした。切片をCy3結合二次抗体(111-165-045, Jackson ImmunoResearch)で室温で1時間インキュベートした後、DAPIで細胞核を二重染色し、封入剤Mowiol(Sigma)で封じた。蛍光写真はOlympus FV1200共焦点顕微鏡によって撮影した。
【００８２】
11．ALDH1Aの酵素活性の検出
UBE3Aで形質移入されたHEK-293FT細胞または形質移入されていない細胞において、Flagでカップリングされたアガロースカラム(Sigma)によって外来的に発現されたALDH1A2-Flagタンパク質を集め、さらにALDH1A酵素活性検出緩衝液(0.1 M ピロリン酸ナトリウム、pH 8.0、1.0 mM EDTA、2.0 mM DTT)に配合されたFlag短鎖ペプチドで溶離させた。ALDH1A2酵素の脱ユビキチン化の有無についての研究において、それぞれUSP2cc酵素またはウシ血清アルブミン(BSA)でタンパク質を溶離させて4℃で一晩インキュベートした。酵素活性反応系は酵素活性検出緩衝液に溶解させた2.5 mM NAD+、20 mM DTTおよび100 μMプロピオンアルデヒド(Sigma)を含み、脱水素酵素活性はBioTek Synergy Neo分光光度計において波長340nmで室温の条件で3分間おきに1回検出された。すべてのサンプルに対して吸光値がプラトー期に達したら反応を停止させた。NADHを標準品とし、ALDH1A2の脱水素酵素活性の計算方法は、(反応時間内でNADHの総生成量(nmol)×サンプルの希釈倍数)/(反応時間×反応体積)である。基質であるオールトランスレチナールデヒド(Sigma)を測定する場合、アセトアルデヒド脱水素酵素活性分析キット(Cayman)が使用された。それは蛍光定量に基づいた方法によって検出・分析された。つまり、100 μMのオールトランスレチナールデヒドが存在する時、酵素活性は蛍光基の吸収波長530-540 nmおよび放出波長585-595 nmにおけるパラメーターを検出することによってレチナールデヒドの吸収値に対する干渉を最低限にした。
【００８３】
12．ALDEFLUORアッセイ
ALDEFLUORアッセイはALDEFLUORキット(STEMCELL Technologies)によってメーカーが提供したプロトコールに従って行われた。つまり、1×106個の不死化リンパ球を蛍光基質であるBODIPY-アミノアミノアセトアルデヒドジエチルアセタール(BAAA-DA)(1.5 μM)と37℃で30分間インキュベートした。各細胞を二つに分けた。半分は蛍光分析に使用され、もう半分の細胞はまずキットで提供されたALDH阻害剤であるジエチルアミノベンズアルデヒド（DEAB）で前処理し、フローサイトメトリー分析において陰性対照とされた。
【００８４】
13．RARE-ルシフェラーゼ活性の検出
pGL4.22-RARE-TK-luciferaseプラスミドの構築方法は、3X RARE(RA-応答エレメント)をpGL4.22ベクター(Promega)にクローニングすることを含む。RA受容器細胞系の構築方法は、H1299細胞にpGL4.22-RARE-TK-luciferaseプラスミドを形質移入し、そしてピューロマイシン(1 μg/mL、Sigma)で安定形質移入細胞株を選別することを含む。RA受容器細胞をRAドナーとして不死化リンパ球と細胞数1:1でVP-SFM(virus production serum-free medium、Gibco)培地において共培養した。1 μMのオールトランスレチナールデヒド(Sigma)を入れて8時間処理した後、培養細胞のルシフェラーゼ活性を検出した。
【００８５】
14．電気生理実験
初代ニューロン細胞および体外で12-14培養した形質移入のニューロン細胞を1 μM TTX(Aladdin)および100 μM D-APV(Tocris)で24時間処理し、室温の条件においてパッチクランプのデータを記録した。ここで、パッチクランプ内液(単位mM)は、20 KCl、5 MgCl2、20 HEPES、110 グルコン酸カリウム（K-gluconate）、0.6 EGTA、2 Na2-ATP、0.2 Na3-GTPを含み、pH 7.3で、290 mOsmで、内液の電気抵抗が約3-6 MΩである。培養された細胞を外液に置き、ここで、外液の成分(単位mM)は、129 NaCl、5 KCl、1 MgCl2、25 HEPES、2 CaCl2、30 グルコースを含み、pH 7.3で、310 mOsmである。細胞外液には、さらに、1 μM TTXおよび100 μM ピクロトキシン(Tocris)が含まれ、電圧-70mVの条件においてmEPSCを記録した。結果はMini Analysisソフト(Synaptosoft)によって分析した。
【００８６】
15.定量RT-PCR
初代ニューロン細胞を所定の化合物で(1 μM TTXおよび100 μM D-APVで24時間、あるいは0.5 μM ATRAで8時間)処理した後、RNAsimple total RNAキット(Tiangen)によって全RNAを抽出した。ReverTra Ace qPCR RT Master Mix (Toyobo)によって逆転写してcDNAサンプルを得た。SYBR Green Master Mix(Toyobo)によってCFX96 real-time PCR装置(Bio-Rad)によってqRT-PCR検出を行った。所定の遺伝子の転写相対量はΔΔCt方法によってGapdhを内部参照として校正した。本操作においてQPCRプライマー配列は以下の通りである。
【００８７】
Gapdh 
5''AGGTCGGTGTGAACGGATTTG3''(配列番号3)、
5''GGGGTCGTTGATGGCAACA3''(配列番号4)、
GluR1 
5''AACCACCGAGGAAGGATACC3''(配列番号5)、
5''CGTTGAGGCGTTCTGATTCA 3''(配列番号6)、
GluR2
5''TTCTCCTGTTTTATGGGGACTGA3''(配列番号7)、
5''CCCTACCCGAAATGCACTGT3''(配列番号8)。
【００８８】
16．ビオチン標識細胞膜表面タンパク質分析
ビオチン標識細胞膜表面タンパク質分析は従来報告された方法に従った(Aotoら, 2008)。つまり、DMSOまたは1 μM TTXおよび100 μM D-APVで24時間処理した後、初代PFCニューロン細胞をPBSで洗浄し、さらにビオチン溶液(1 mg/ml EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin, Pierce)と4℃で2時間インキュベートした。0.1 Mグリシンを入れて反応そ停止させた後、PBSで3回洗浄し、ビオチンで標識された細胞を細胞分解液(25 mM MgCl2、1％NP-40、1％ Triton X-100、10％ グリセリンおよびプロテアーゼ阻害剤を含有するPBS)において分解させた。遠心で細胞破片を除去した後、上清をUltraLink Streptavidin樹脂(Pierce)と4℃で一晩回転させながらインキュベートした。ビオチンで標識されたタンパク質を遠心で収集し、そして細胞分解緩衝液で3回洗浄した。タンパク質を2×SDS-PAGE仕込み緩衝液で75℃で30分間変性させ、そしてGluR1抗体(13185、Cell Signaling、1:500希釈)およびGluR2抗体(13607、Cell Signaling、1:500希釈)でイムノブロット分析を行った。
【００８９】
17．動物の飼育
マウスは標準の明期12時間/暗期12時間のサイクルで、各ケージに3-5匹ずつ飼育し、自由に飲食・飲水ができるようにした。すべての行動学実験は明期12時間の条件において行われた。すべての動物学の研究は厳格に中国科学院生化細胞所動物維護・使用委員会（IACUC）の規約に従った。すべての実験におけるマウスはC57BL/6背景のオスマウスであった（SLAC、中国）。
【００９０】
18．ウイルスの製造と脳への定位注射
所定の遺伝子はいずれもSynapsin I(SynI)プロモーターによって駆動され、そしてN末端にFlagタグが融合した。アデノ随伴ウイルス(AAV)の外被タンパク質の血清型はAAV2/9で、上海禾元生物技術公司(Obio)によってパッケージングされた。AAV-SynI-Flag-UBE3AおよびAAV-SynI-Flag-UBE3A-T508Eウイルスの力価は約1.5×1013コピー数/mLで、AAV-SynI-Flag-EGFPウイルスの力価は約9.5×1012コピー数/mLであった。
【００９１】
3週齢のマウスにペントバルビタールトン(50 mg/kg)を腹腔注射して麻酔した後、定位固定装置に固定した(リワード生命科技有限公司、中国)。マウスの大脳内側のPFC領域の両側に定量注射ポンプ(Stoelting)によって速度0.2 μL/minで1 μLのPBSで希釈されたAAVウイルスを注射した。定位注射の位置(前泉門に対して)：AP, +2 mm; ML, ±0.5 mm; DV, -1.3 mm。各注射点のウイルス注射の量は、それぞれAAV-SynI-Flag-UBE3Aおよび突然変異体 T508Eは3×109で、AAV-SynI-Flag-EGFPは1.5×109であった。注射針は、ウイルスの逆流を防ぐために、さらにその位置のままで3分間維持した。マウスを麻酔状態から完全に回復するまで37℃の電気毛布に置いた。手術後の1-2日は、マウスに0.5 mg/mlのメロキシカム(Sigma、2 mg/kg)を腹腔注射して痛みを緩和させた。手術から4週間後、マウスに行動学のテストを行った。ATRA補償実験において、AAV-SynI-Flag-UBE3Aウイルスを注射して1週間後、マウスに毎週5日連続でATRA(Sigma、オリーブオイルに溶解、3 mg/kg)またはオリーブオイルを胃内投与した。投与から4週間後、行動学のテストを行った。
【００９２】
19．ジスルフィラム（DSF）の投与
4週齢のマウスに連続6週間で1日おきに低投与量(0.1 mg/g)、または高投与量(0.3 mg/g)のDSF(Sigma、オリーブオイルに溶解)を胃内投与した。対照群では、溶媒のオリーブオイル（Aladdin）のみを胃内投与した。毎週マウスの体重を測定した。胃内投与から6週間後、マウスの行動学のテストを始めた。対照群およびDSF群のマウスの大脳を解剖し、液体窒素で快速凍結後、組織を均質化し、後記のHPLC-MS/MS方法によってATRAを定量した。
【００９３】
20．HPLC-MS/MSによるRA定量検出実験
従来報告された手順によってサンプルの調製、レチノイドの抽出および後続のHPLC-MS/MS分析を行った(Kaneら, 2010)。赤色光の条件において、快速凍結されたマウスの大脳を氷の上で2 mLの0.9％生理食塩水で均質化した。13-シスレチノイン酸-d5 (20 ng/mL、TRC)を内部参照として組織均質液に入れた。その後、均質液に1.5 mLのエタノールに溶解させた0.025 Mの水酸化カリウムを入れ、さらに7 mLのn-ヘキサンを入れた後、均一に混合して水相を抽出し、さらに120 μLの4 M塩酸で中和した。その後、RAおよび極性レチノイドを含有する油相をさらに入れた7 mLのn-ヘキサンで抽出した。抽出物を窒素ガスの雰囲気において蒸発させ、乾燥した抽出物を50 μLのアセトニトリルで再懸濁させた。サンプルを2.1×100 mm Supelcosil ABZ+PLUS column(3 μm、Sigma)カラムによってHPLC分析を行ったが、移動相はそれぞれAは0.1％ギ酸を含有する水で、Bは0.1％ギ酸を含有するアセトニトリルであった。検出装置はAB Sciex 4000 QTRAP LC-MS/MSシステムで、APCIカチオンモードでATRA成分を定量し、各サンプルにおける含有量を標準ATRA曲線によって校正した。
【００９４】
21．セルフグルーミング実験
セルフグルーミング実験に使用されるマウスは厚さが約0.5-1cmのフィラーが敷かれたケージにおいて事前に10分間馴化させた。その後、10分間内で、マウスのセルフグルーミングに使用された時間は二重盲検の実験者によってストップウオッチで記録された。
【００９５】
22．三部屋式社会性行動試験
従来報告された手順で三部屋式社会性行動試験を行った(Sztainbergら, 2015)。つまり、社会性行動試験を行う透明のアクリルボックスを三つの同じ大きさの部屋に分け、仕切りの板に移動可能なドアを取り付けた。そして、左右の部屋にそれぞれ逆さにした鉄網カップを置いた。実験の2日前に、二つのカップにそれぞれ親が違う、年齢・性別が被験マウスとマッチするC57BL/6マウスをストレンジャーマウスとして置き、毎日1時間馴化させた。被験マウスをランダムに分け、そして試験開始前に試験部屋で事前に1時間馴化させた。各被験マウスを中央の部屋に置いて10分間自由に探索させた後、部屋のドアを閉めた。第一段階で、ストレンジャーマウスを1匹ランダムに左か右のカップに置き（位置の偏向性がないように）、もう一方のカップに非生命の物体を置いた。各被験マウスを開放の三つの部屋で10分間探索させ、手動で被験マウスがそれぞれストレンジャーマウスおよび物体との交流時間を記録した。第二段階では、被験マウスをストレンジャーマウスの部屋に続いて5分間置いた後、もう1匹のストレンジャーマウスを先に物体が置かれたカップに置いた。被験マウスを続いて10分間探索させ、手動で被験マウスがそれぞれ馴染んだ動物および新しい動物との交流時間を記録した。観測者が被験マウスの群分けを知らないようにした。
【００９６】
23．オープンフィールド試験
マウスをランダムに分けた後、オープンフィールド装置(Med Associates)に置いて30分間探索させた。Ethovision自動記録ソフト(Noldus)によってマウスの中央区域(区域の各辺の長さ1/3〜2/3)にかけた時間を記録し、そしてその中央区域で移動した距離の総距離における比率を算出した。
【００９７】
24．高架式十字迷路実験
マウスを高架式十字迷路(Med Associates)のクローズドアームに置き、記録を開始し、計5分間記録した。上方に設置されたカメラで撮影して記録し、ANY-mazeソフト（Stoelting）によってマウスの5分間内でオープンアームとクローズドアームに入った回数を記録して分析した。
【００９８】
25．ロータロッド試験
マウスをランダムに分けた後、Rotamex rotarod装置(Columnbus Instruments)でマウスの運動協調性を記録した。同じ日に、被験マウスを3回テストし、試験は毎回5分間持続し、ロータロッドは4回/秒から40回/秒まで加速した。各試験の間隔は30分間以上であった。被験マウスのロータロッドから落下するまでの時間を赤外検出システムによって自動的に記録し、最後の試験の結果で最終の比較を行った。
【００９９】
26．統計的分析
すべてのデータ分析はGraphPad Prismソフトで行われた。データの有意性検定はそれぞれスチューデント両側t検定、一元配置ANOVA（ボンフェローニ事後検定またはダネット事後検定）が使用された。すべてのデータは平均値と分散で表示された。各データ統計の詳細はいずれも注釈で示された。すべてのデータは3回以上の独立の反復試験から採取された。サンプル量は事前に予想しなかった。すべてのマウスはランダムに各群に分けた。
【０１００】
実施例1 自閉症患者のサンプルにおける染色体15q11.2-14のコピー数多型の発見
前期は臨床で自閉症表現型と診断された患者3名を集めたが、彼らの末梢血に対してゲノムDNAの抽出およびBeadChipチップによる検出を行ったところ、染色体15q11.2-14の多型が発見された（図1a-b）。当該多型領域には、一連の遺伝子が含まれるが、一般的に実証された15q重複症候群において重要な役割を担うUBE3A遺伝子以外、これらの自閉症との関連性が不明である（図1b-c）。後続の機能研究のために、EBVウイルス感染の方法によってこれらの患者の末梢血リンパ球で不死化細胞系を構築した。中では、健常者のボランティアの対照細胞と比べ、この三つの自閉症細胞のUBE3Aタンパク質の発現レベルが顕著に増加した（図1d）。
【０１０１】
実施例2  UBE3Aの新規な基質であるALDH1Aタンパク質ファミリーの選別
今まで機序の点からASDの発症とUBE3Aの過剰活性化の関連性を説明できるようなUBE3Aの既知の基質がなかったため(Glessnerら, 2009)、まず、ヒトUBE3Aタンパク質をエサに、酵母ツーハイブリッドの方法によって未知の基質タンパク質を選別した。中では、多くの陽性クローンはいずれもRA合成の律速酵素ALDH1A2の遺伝子のcDNAを持つことが見出された（図2a）。レチノイン酸RAはビタミンA（レチノール、retinol）の活性代謝物として、ヒトを含む高等動物の発育と成長に必要である。中では、RAの合成は、レチノールからレチナールデヒドへ触媒するレチノールデヒドロゲナーゼ（RDH10）、およびレチナールデヒドからレチノイン酸へ触媒するレチナールデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH1A1、2、3ファミリー）を含む二つのステップで完成される。免疫共沈実験によって、内因または外因的に発現されたUBE3AがALDH1A2タンパク質とHEK-293FT細胞において複合体を形成することが証明された(図2b-c)。免疫蛍光実験において、それぞれFlagとRFPタグが付いたUBE3AとALDH1A2タンパク質は神経膠腫細胞SH-SY5Yの細胞質内に共局在化した(図2d)。GSTプルダウン実験によって、さらに、組み換えタンパク質UBE3AとALDH1A2が体外で直接結合し(図2e)、そしてUBE3AのN末端(1-280番目のアミノ酸)を介して結合することが証明された(図2f)。ALDH1A2タンパク質はほかのファミリーのメンバーであるALDH1A1および3と高い配列の類似度を有するため、UBE3Aがそれぞれ体外と体内で直接ALDH1A1および3と結合することが証明された(図2g-j)。GSTプルダウン実験において、UBE3AとALDH1A2の結合領域に対する3つの異なるペプチド断片（ペプチド-1、ペプチド-2、ペプチド-3）を入れ、異なる程度で競争的にGST-UBE3AとALDH1A2タンパク質の間の相互結合を遮断することができた（図2k）。ここで、ペプチド-1、ペプチド-2、ペプチド-3の配列は以下の通りである。
【０１０２】
ペプチド-1（peptide-1）：ASRMKRAAAKHLIERYYHQLTEGCG(配列番号9)
ペプチド-2（peptide-2）：NNAAAIKALELYKINAKLCDPH(配列番号10)
ペプチド-3（peptide-3）：AEALVQSFRKVKQHTKEELKSLQAKDEDKD(配列番号11)
【０１０３】
実施例3  UBE3AによるALDH1A2のユビキチン化修飾
次に、UBE3AがALDH1A2に対してユビキチン化修飾を行うことができるか、さらに検証した。まず、大腸菌においてユビキチン化系を構築し(詳細は方法の部分を参照する)(Keren-Kaplanら, 2012)、ALDH1A2およびユビキチン化反応に必要なメンバーを細菌に共形質転換し、IPTGでタンパク質の発現を誘導した。図3aに示すように、UBE3Aタンパク質が存在する条件において、ALDH1A2タンパク質は高度にユビキチン化され、そして当該ユビキチンバンドは脱ユビキチン化酵素USP2の触媒コア部分であるUSP2ccタンパク質によって消されたが、これはALDH1A2がUBE3Aによってユビキチン化修飾を行われることを示唆した。HEK-293FT細胞において、UBE3Aタンパク質の過剰発現も同様にALDH1A2のユビキチン化を促進した(図3b)。
【０１０４】
ALDH1A2に対するさらなる研究において、内因性タンパク質の干渉をなくすために、様々な各細胞系におけるALDH1Aファミリーのタンパク質の発現状況をスクリーニングした。その結果、H1299細胞系では、ALDH1Aファミリーのタンパク質の内因的発現がほとんど検出されなかった（図3c）。Crispr/Cas9方法によって、H1299細胞におけるUBE3A遺伝子をノックアウトした結果、形質転換されたALDH1A2タンパク質のユビキチン化レベルが顕著に低下したことがわかった(図3d-f)。同様に、対照正常群のMEF細胞と比べ、UBE3aノックアウトマウスからのMEF細胞において、Ube3aタンパク質の減少とともに、Aldh1a2タンパク質のユビキチン化レベルも相応的に低下した(図3g)。ヒトUBE3A-/-およびマウスうUbe3a-/-細胞においてALDH1A2タンパク質にある程度のユビキチン化修飾があったため、ALDH1A2タンパク質をユビキチン化修飾できるほかの未知のE3ユビキチンリガーゼが存在する可能性がある。つまり、これらの結果によって、ALDH1A2を含むALDH1Aタンパク質ファミリーｈじれもE3ユビキチンリガーゼUBE3Aの基質であることが明確に証明された。
【０１０５】
UBE3Aの過剰活性化が自閉症と密接に関連するため、さらに、UBE3Aの高活性によって体内でALDH1A2のユビキチン化修飾が増加するか、検証した。HEK-293FT細胞では、ALDH1A2のユビキチン化レベルがUBE3A投与量に依存して顕著に増加した(図3h)。そして、不死化自閉症リンパ球株における内因性ALDH1A2タンパク質のユビキチン化レベルは正常対照群と比べて顕著に上昇したが(図3i)、これは自閉症に関連する高含有量のUBE3Aタンパク質が確かにより多いALDH1A2ユビキチン化レベルを触媒できることを示した。
【０１０６】
以前の研究では、UBE3Aのスレオニン508部位(T508)はすでにプロテインキナーゼA(PKA)によってリン酸化修飾されることによって自身のユビキチンリガーゼの活性が抑制されるが、自閉症の症例において発見されたT508A突然変異体はリン酸化修飾されないため、ユビキチンリガーゼの活性が過剰に活性化することが報告された(Yiら, 2015)。同時に、UBE3Aリン酸化擬似突然変異体T508EはE3ユビキチンリガーゼの活性が完全になくなったことが発見されたため、本明細書においてリガーゼが不活性化した突然変異体として使用された。HEK-293FT細胞から集めたFlag-ALDH1A2タンパク質を検出したところ、UBE3Aタンパク質の過剰発現は顕著にALDH1A2のユビキチン化を増加し、T508A突然変異体では増加がより顕著であったが、T508E突然変異体の過剰発現はALDH1A2のユビキチン化レベルを全然増加しなかったことがわかった(図3j)。これらの結果によって、UBE3AT508Eは少なくともALDH1A2のユビキチン化を触媒する点から、確かにE3ユビキチンリガーゼ活性が完全になくなったことが実証された。つまり、検出されたいくつかの細胞系において、ALDH1A2ユビキチン化レベルがUBE3Aタンパク質の投与量と密接に関連することがわかった。
【０１０７】
同様に、ALDH1Aタンパク質ファミリーの高度類似性および前記の各メンバーがいずれもUBE3Aと直接結合することを考慮すると、さらに、UBE3AがALDH1A1およびALDH1A3をユビキチン化修飾できるか、検証した。その結果、原核細胞および哺乳動物細胞において、ALDH1A1および3はいずれもUBE3Aによってユビキチン化修飾されることがわかった(図3k-m)。
【０１０８】
そのため、UBE3AはRA合成ファミリーの唯一のレチナールデヒドデヒドロゲナーゼファミリーALDH1Aをユビキチン化修飾することができる。よって、UBE3Aが細胞におけるRA合成代謝に影響することも推測された。
【０１０９】
実施例4  UBE3AによるALDH1A2のプロテアソームに依存しないユビキチン化修飾
従来の報告では、一部のUBE3Aの基質タンパク質、たとえばHHR23A(Kumarら, 1999)、およびRING1B(Zaaroor-Regevら, 2010)は、ヒトパピローマウイルス遺伝子E6が欠失した条件において、ユビキチン化修飾およびプロテアソームに依存する分解が可能であることがわかった。しかし、p53タンパク質にE6が欠失した場合、UBE3Aは単独でそれに対してユビキチン化修飾およびさらなるタンパク質の分解を行うことができない(Ansariら, 2012)。しかしながら、HEK-293FT細胞において、UBE3Aタンパク質の発現レベルの増加とともに、内因性ALDH1A2の発現レベルに変化が現れなかった(図4a)。同時に、異なるUbe3aタンパク質レベルを有するマウスMEF細胞において、Aldh1a2タンパク質の発現レベルに同様に変化がなかった(図4b)。不死化リンパ球において、自閉症患者由来の細胞および健常者由来の細胞を含め、ALDH1A2タンパク質レベルも同じように維持した(図3i)。これらの結果から、UBE3AによるALDH1A2のユビキチン化修飾はほかの基質のように、基質の分解を促進することがないことが示された。
【０１１０】
ユビキチンは7つのリシン(Lys)残基を含むため、ユビキチン鎖を形成する過程において、各リシン残基は、N末端のメチオニンにおけるα-アミノ基とともに、いずれも次のユビキチン分子の共役結合の部位になる可能性があるため、最終的に異なるリシンの連結形態のポリユビキチン化鎖(poly-Ub)が形成する。ユビキチンタンパク質における特定の位置のリシンが残り、ほかのすべてのリシンがアルギニンに突然変異する(K-to-R)方法によって、ポリユビキチン化鎖の具体的な連結形態を同定することができる。図4cでは、ALDH1A2タンパク質に連結したポリユビキチン化鎖の形態は主にLys29およびLys63である。同時に、それぞれK29およびK63におけるリシンをアルギニンに突然変異させた後、ALDH1A2に結合したポリユビキチン化鎖が顕著に減少した(図4d-e)。これらの結果から、UBE3AによるALDH1A2のユビキチン化修飾は主にK29およびK63の連結形態であることが示され、この2種類のユビキチン鎖は一般的に基質のプロテアソームによる分解を触媒しない。
【０１１１】
次に、UBE3AによるALDH1A2タンパク質の触媒連結のユビキチン化修飾部位を探すため、タンパク質質量分析技術によって細菌から集められたALDH1A2タンパク質を分析したところ、可能な触媒修飾部位としてK269、K370およびK415が見つかった。H1299細胞において、ALDH1A2におけるK269、K370およびK415の三つの部位を同時にアルギニンに突然変異させた後、ALDH1A2突然変異体タンパク質におけるユビキチン化レベルが顕著に減少した(図4f)。さらに、タンパク質の構造分析によって、この三つの部位はいずれも脱水酵素の活性中心の近くに分布することがわかった（図4g）。そして、これらはALDH1Aの三つのメンバー間でも高度に保存的である（図4h）。そのため、UBE3AによるALDH1Aタンパク質ファミリーのユビキチン化修飾は主に脱水酵素の活性中心の近くにある部位で発生し、そして基質の分解を促進することがない。
【０１１２】
実施例5  UBE3Aによるユビキチン化のALDH1A2の脱水酵素活性に対する抑制
さらに、UBE3Aによるユビキチン化修飾後のALDH1A2の脱水酵素活性、特にレチナールデヒドからレチノイン酸へ触媒する活性が影響を受けるか、検証する必要がある。その結果、対照細胞サンプルと比べ、UBE3Aタンパク質を過剰発現するHEK-293FT細胞から集められた高度にユビキチン化されたALDH1A2タンパク質のレチナールデヒドデヒドロゲナーゼ活性が半分低下したが、当該タンパク質をUSP2cc脱ユビキチン化酵素で体外で処理すると、活性が顕著に回復したことがわかった(図5a-c)。これによって、UBE3A段階のALDH1A2ユビキチン化修飾が確かに顕著にレチナールデヒドデヒドロゲナーゼ活性を下方調節したことが示された。同様に、ALDH1A2のもう一つの基質であるプロピオンアルデヒドを検出したところ、UBE3Aは同様にALDH1A2のプロピオンアルデヒドヒドロゲナーゼ活性を低下させ、USP2ccタンパク質はこの現象を逆転させることができることがわかった(図5d-e)。そして、ALDH1A2のK269/K370/K415の三つの突然変異体が完全に脱水素酵素活性を失ったが(図5f)、これはこの三つのリシン残基の完全性がALDH1A2の脱水素酵素活性、ひいてはALDH1Aタンパク質ファミリーの脱水素酵素活性には非常に重要であることを示唆した(図5g)。
【０１１３】
細胞のALDH活性を研究する場合、びフローサイトメーターによるALDEFLUORアッセイは汎用されている(Stormsら, 1999)。その原理は、細胞内におけるALDHがBAAA(BODIPY-アミノアセトアルデヒド)をBAA(BODIPY-アミノアセテート)に酸化することができ、BAAは負電荷産物として細胞内に留まるため、細胞のALDHの脱水素活性はBAAを含有する細胞の蛍光強度によって定量することができることである。図5hに示すように、正常対照群のリンパ球と比べ、自閉症のリンパ球のALDH陽性細胞の比率が約20％〜50％減少した。これによって、自閉症に関連するUBE3Aの高含有量が細胞におけるALDH酵素活性の下方調節につながることが示唆された。
【０１１４】
同時に、共培養細胞系を構築してさらに自閉症細胞におけるALDH1A脱水素酵素活性の状況を検証した。まず、RA応答エレメントRAREを担持したルシフェラーゼプラスミドをH1299細胞に導入し、RA応答細胞とした。同時に不死化リンパ球株をRA発生細胞とした。両者を1:1の細胞数比で無血清培地VP-SFMにおいて共培養し、レチナールデヒドを入れて8時間処理した後、ルシフェラーゼ活性を検出した。図5iに示すように、正常対照のリンパ球と比べ、自閉症のリンパ球と共培養したH1299はルシフェラーゼ活性が60％低下した。
【０１１５】
つまり、これらの結果から、自閉症に関連するUBE3Aの過剰活性化がRAの生合成を抑制することで、全体のRA内部安定状態レベルを下方調節することが示唆された。
【０１１６】
実施例6  UBE3Aの過剰活性化によるシナプス伝達の安定状態の失調
成年の神経系において、RAが内部安定状態のシナプス可塑性で重要な役割を果たすことがわかってきた(Chenら, 2014)。ニューロン細胞において、シナプス伝達が遮断されると、シナプスのカルシウムイオンレベルがすぐに低下し、RAがALDH1A脱水素酵素の合成過程によって活性化される(Chenら, 2014; Aotoら, 2008)。RAはシナプスに局在化するRARαタンパク質と結合することによって、RARαによるタンパク質の翻訳過程の遮断を解除し、調節されるタンパク質はAMPA受容体を含み、よってシナプス伝達が上方調節される(Aotoら, 2008)。ラットPFC皮質からの初代ニューロン細胞において、D-APVおよびTTXでシナプス活性を抑制すると、細胞におけるRAレベルが上昇することによって、RAREによって駆動されるヒト化レニラ・レニフォルミス緑色蛍光タンパク質（hrGFP）の顕著な発現が誘導される（図6a）。しかし、ニューロン細胞において、UBE3A-IRES-turboRFPおよびRARE-hrGFPレポータープラスミドを共形質移入すると、D-APVおよびTTXによる処理はhrGFPタンパク質の発現を誘導しなくなった(図6b)。しかし、UBE3Aリガーゼ活性が欠失した突然変異体T508EをRARE-hrGFPレポータープラスミドと共形質移入すると、D-APVおよびTTXによる処理は対照群と類似するレベルまでhrGFPタンパク質の発現を誘導するようになった(図6b)。これらの結果によって、UBE3Aの過剰活性化がシナプス伝達の遮断によるRA生成を阻止することが証明された。
【０１１７】
次に、UBE3Aの過剰活性化がニューロンの活性が阻害された場合RAによって調節されるシナプスの内部安定状態の過程に影響するか、検証した。まず、初代PFCニューロン細胞において、APVとTTXの共同処理によってmEPSC(微小興奮性シナプス後電流)の幅と頻度の顕著な上昇が生じた(図6c)。これは、ニューロン細胞において、興奮性シナプスはシナプス前とシナプス後の異なる機序によって代償的増加を実現することを示唆する。しかし、UBE3Aを過剰発現するニューロン細胞において、対照群と比べ、同様の活性が阻害されてmEPSCの幅が約30％低下した。しかし、UBE3AT508Eを過剰発現するニューロン細胞において、mEPSCの上昇の幅が対照群と類似した（図6d）。そして、UBE3AおよびUBE3AT508Eを過剰発現する細胞において、mEPSCの頻度が対照群とほぼ同等であった（図6d）。そのため、これらの結果から、ニューロンの活性が阻害された条件において、UBE3Aの過剰活性化はシナプス前の機序ではなく、シナプス後の機序によってRAによって調節されるシナプスの内部安定状態の過程を破壊する可能性が高いことが示唆された。
【０１１８】
現在、シナプスの縮小・拡大のシナプス後の機序は主にシナプス受容体の翻訳を促進することによって興奮性シナプス受容体の数を増加することであることが知られている(Hanら, 2009)。従来の報告に一致し(Aotoら, 2008)、ニューロンの活性が阻害された場合、GluR1受容体のタンパク質レベルが増加したが、GluR2のタンパク質レベルが変わらなかった。そして、その転写レベルが影響されなかった(図6e-g)。しかしながら、UBE3Aを発現するニューロン細胞において、ニューロン活性の遮断はシナプス後GluR1のタンパク質レベルを増加しなかった(図6h)。一方、UBE3AT508Eを発現するニューロン細胞において、ニューロン活性の遮断はGluR1のタンパク質レベルがUBE3A発現群よりも顕著に増加することを誘導した。これらの結果のいずれも、UBE3Aの過剰活性化によるシナプスの内部安定状態の失調は、主にRAが上方調節するシナプス後のタンパク質の翻訳過程を影響することによるものである。
【０１１９】
実施例7  マウスにおけるUBE3Aの過剰活性化による自閉症の表現型
大脳におけるPFC領域は、決定、移動の認知、社会性行為、学習や社会的コミニュケーションを含む、大脳の様々な執行機能および高等認知過程を調節する。最近、PFC領域の解剖学的構造およびほかの脳領域の連結構造の異常は、一般的に、自閉症患者の大脳に存在することが見出され、これはPFCの機能異常が自閉症の病因に密接に関連することも示唆した(Stonerら, 2014; Chowら, 2012)。過剰活性化されたUBE3Aが自閉症行為の発生を誘導することを検証するために、それぞれEGFP、UBE3AおよびT508Eがパッケージングされたアデノ随伴ウイルス(AAV)を定位注射の方法によってマウスの大脳内側のPFC領域に入れた(図7a-b)。大脳を凍結切片した後の免疫蛍光の結果から、UBE3AおよびT508EのPFC領域におけるタンパク質の発現レベルが同等であったことが示された(図7c)。
【０１２０】
大脳への注射から4週間後、マウスに行動学のテストを行った。図7dに示すように、マウスのセルフグルーミング実験において、EGFPを発現するマウスと比べ、UBE3Aを過剰発現するマウスはセルフグルーミング行為にかけた時間が倍に増えたが、T508Eを発現するマウスがかけた時間が30％しか増えなかった。これは、UBE3Aを過剰発現するマウスに反復性限定的な行動が現れたことを示した。そして、三部屋式社会性行動試験によってマウスの社会性動物または非社会性物体との交流時間を記録して比較分析した。EGFPおよびT508Eを発現するマウスでは、社会性マウスと交流する時間が(50秒)物体と交流する時間(23秒)よりも約倍に多かったが、UBE3Aを発現するマウスでは、社会性マウスおよび物体と交流する時間がほぼ同等で、いずれも30秒であった(図7e)。これは、UBE3Aを過剰発現するマウスに重度な社会的相互作用障害が現れたことを示した。同時に、マウスの馴染んだ社会性マウスおよびストレンジャーマウスとの交流時間も記録して比較分析した。中では、EGFPおよびT508Eを発現するマウスでは、ストレンジャーマウスよりも馴染んだ社会性マウスよりも興味を示し、より多い時間をかけて交流した(約60-100％増加した)。しかしならが、UBE3Aを過剰発現するマウスは馴染んだマウスおよびストレンジャーマウスとの交流にかけた時間は同等であった（図7f）。これは、UBE3Aタンパク質はマウスに対して社会的な新規性の認知を抑制することを示した。これらの行動学実験からも、マウスPFC脳領域においてユビキチンリガーゼが不活性した突然変異体T508Eではなく、過剰発現のUBE3Aタンパク質が顕著に反復性限定的な行動、社会的相互作用障害や社交的新規性の認知の欠失を含む、マウスの自閉症表現型の出現を誘導することが示された。
【０１２１】
さらにUBE3AまたはT508Eタンパク質の発現による潜在的な表現型の変化を研究するために、マウスに対してほかの行動学実験を行った。実際に、オープンフィールド実験において、この三つのタンパク質を発現するマウスはいずれも同等のレベルの走触性を示した（図7g-h）。そして、ロータロッド試験の結果から、対照群と比べ、UBE3Aの過剰発現はマウスの活動能力に影響しなかったことが示された(図7i)。
【０１２２】
そのため、マウスPFC脳領域におけるUBE3Aタンパク質の過剰発現は特異的にマウスの自閉症の中核症状の出現を誘導する。
【０１２３】
実施例8  RAの補償によるUBE3Aの過剰活性化によるマウスの自閉症の表現型の軽減
さらに、UBE3Aの過剰発現によるマウスの自閉症の表現型の誘導はRAの生成過程の損傷によるものであることを検証するために、PFCにUBE3Aを担持するAAVウイルスを注射したマウスを分けて溶媒(オリーブオイル)またはATRA(3 mg/kg、毎週5日連続で投与した)を計4週間経口投与した後、マウスに行動学実験を行った(図8a)。マウスのセルフグルーミング実験において、溶媒経口投与群と比べ、ATRAを経口投与したマウスはのセルフグルーミング行為にかけた時間が顕著に減少した（図8b）。同時に、溶媒群と比べ、ATRAを投与したマウスは社会的相互作用にも完全な逆転が現れ、社会性動物と交流する時間が非社会性の物体よりも倍近く多かった（図8c）。図8dに示すように、これらのマウスの社交的新規性の認知の欠失もATRA投与後緩和が現れ、ストレンジャーマウスとの交流時間が馴染んだマウスよりも倍近く多かった。そのため、4週間のATRA投与は大幅にUBE3A過剰発現マウスの自閉症の中核症状を改善することができた。
【０１２４】
説明したいのは、オープンフィールド実験において、ATRA投与のマウスはオープンフィールドの中央領域に滞在した時間および移動の距離が溶媒群よりも少なかったが（図8e-f）、これはATRAがこの投与量の条件においてUBE3A過剰発現マウスにある程度の不安症状を引き起こすことを示唆した。しかし、ロータロッドの結果から、ATRAの投与がマウスの運動能力に影響しなかったことが示された（図8g）。
【０１２５】
ATRAの投与が野生型マウスにも不安症状を引き起こすかという可能性を排除するために、野生型マウスに同じ投与プランおよび行動学実験を行った（図8a）。実際に、溶媒またはATRAの投与は、野生型マウスのセルフグルーミング実験、三部屋式社会性行動試験、オープンフィールド実験およびロータロッド試験のいずれにも違いを引き起こさなかった（図8h-m）。これらの観察結果から、ATRAの投与はUBE3A過剰発現マウスのみに軽度の不安症状を引き起こすが、野生型マウスにまったく影響しないことが示された。これは、後でATRAで自閉症を治療しようとする場合、潜在的な副作用を考慮および評価する必要があることを示唆した。
【０１２６】
つまり、これらのATRAの補償実験によって初めてRAの安定状態の調節のUBE3A過剰発現による自閉症の発生過程における重要な役割が証明された。同時に、RAの補償は理論上UBE3Aの過剰活性化による自閉症のサブタイプの疾患の緩和にも有用である。
【０１２７】
実施例9  化合物によるRAの安定状態の失調によて誘導されるマウスの自閉症の表現型の発生
単独のALDH1A活性の阻害がマウスの自閉症の表現型の発生を誘導することができるか、検証するために、4週齢の野生型C57BL/6マウスにAldh1a阻害剤であるジスルフィラム(DSF)を経口投与した。投与時間は計6週間で、投与量はそれぞれ0.1または0.3 mg/gで、1日おきに投与した。DSFを6週間投与した後、マウスの大脳を取り出し、HPLC-MS/MS方法によってそのATRAレベルを検出した(Kaneら, 2010)。図9aに示すように、DSFを6週間投与したマウスの大脳組織におけるATRAのレベルは溶媒群と比べ、それぞれ30％(投与量0.1 mg/g)と60％(投与量0.3 mg/g)低下した。これはDSFの投与は投与量に依存してマウスの大脳におけるATRAの合成を阻害することができることを示した。同時に、マウスの体重を毎週測定したところ、各群間で体重に有意差がなかった（図9b）。これはここのDSF投与量がマウスに顕著な毒性作用を引き起こさないことを示した。
【０１２８】
次に、DSFを6週間投与したマウスに二重盲検の行動学実験を行った。図9cに示すように、セルフグルーミング実験において、溶媒群(15秒)と比べ、DSF投与マウスのセルフグルーミング行為の時間が顕著に1倍(30秒、投与量0.1 mg/g)と2倍(42秒、投与量0.3 mg/g)増えた。また、三部屋式社会性行動試験において、溶媒群のマウスは社会性マウスと交流する時間が非社会性物体の時間よりも顕著に多かったが、0.1 mg/gでDSFを投与したマウスでは、このような顕著な傾向がまったくなかった(図9d-e)。そして、0.3 mg/gでDSFを投与したマウスでは、社会性マウスと交流する時間および非社会性物体との交流時間にまったく差がなかった(図9d-e)。社交的新規性の点から、0.3 mg/g DSF投与群は溶媒群と比べ、馴染んだ社会性マウスの部屋に滞在した時間が0.5倍増えたが、ストレンジャーマウスの部屋に滞在した時間が0.3倍減った（図9f-g）。社会性マウスとの交流時間について、DSF投与マウスも馴染んだマウスまたはストレンジャーマウスとの交流時間でまったく差がなかった。つまり、RAの安定状態の調節が化合物によって抑制されると、マウスの自閉症の表現型が顕著に現れる。
【０１２９】
同時に、行動学のほかの観点からDSF投与のマウスに対する影響を評価した。オープンフィールド実験において、三つの群の間で中央区域に滞在する時間および移動距離のいずれにも差がなかった（図9h-i）。高架式十字迷路実験において、三つの群のマウスはオープンアームに入った回数のすべてのアームに入った回数に占める比率は有意差がなかった（図9j）。この二つの結果から、DSFの本研究における投与量はマウスの不安または探索性行為に影響しないことが示された。同時に、ロータロッド実験でも、DSFの投与がマウスの運動能力に影響しなかったことが示された（図9k）。これらの行動学実験から、DSFによるマウスの自閉症の表現型の発生はその化学毒性・副作用によるものではないことも示され、これは前記のマウス体重の結果にも一致する（図9b）。
【０１３０】
つまり、化合物のRAの安定状態の調節に対する抑制はマウスの自閉症の表現型の出現を誘導し、再び、UBE3Aの過剰活性化のALDH1Aのユビキチン化に対する誘導によるRAレベルの下方調節の自閉症の病因における重要性が強調された。
【０１３１】
総括と検討
（1）UBE3AがALDH1A2と結合してユビキチン化することによって、ALDH1A2の脱水素酵素の活性を抑制する。同様に、ALDH1AのほかのファミリーメンバーであるALDH1A1およびALDH1A3もUBE3Aの基質であることが証明された。
【０１３２】
（2）自閉症に関連するUBE3Aの過剰活性化が細胞内におけるRAレベルを下方調節することによって、RAのシグナル経路、特にそのニューロン細胞におけるシナプスの縮小・拡大の角度の調節作用に影響する。
【０１３３】
（3）UBE3Aのマウスの大脳PFC領域における過剰発現が自閉症の表現型を引き起こし、そしてRAの補償によって疾患の表現型が緩和される。これはそのまま人類の自閉症の臨床治療に広げることができる。
【０１３４】
（4）ALDH1Aの化合物阻害剤であるDSFはマウスの体内においてRAレベルの低下を引き起こし、マウスの自閉症に類似する表現型の発生を誘導することもできる。
【０１３５】
（5）本研究は人類の臨床上の自閉症の診断まで広げ、新規な自閉症の診断および治療の標的を提供し、RAレベルの変化の有無およびその上流調節の要素を自閉症の診断ツールに取り入れるべきで、同時にこの発明によって自閉症を治療する薬物を選別・開発することができる。
【０１３６】
（6）同時に、本発明は潜在の妊婦の薬物および日用化学品の摂取の副作用による後代に自閉症が現れるリスク（ならびに嬰幼児の薬物および日用化学品などの摂取の副作用）のスクリーニングへの使用も可能で、有効に臨床評価をする診断ツールの開発が期待できる。
【０１３７】
（7）また、リアルタイムでレチノイン酸レベルをモニタリングする細胞モデルを構築し、ハイスループットスクリーニング技術によって、FDAによって商品化を許可された薬物をスクリーニングし、いくつかレチノイン酸レベルを干渉できる薬物が見つかり、そして後続の検証を行い、検証結果が完全に予想に一致した。現在、動物実験によってこれらの薬物が隔世で自閉症を誘導する現象があるか、検証している。
【０１３８】
上記のように、本発明は、初めて、UBE3AがALDH1Aファミリーのタンパク質と結合してプロテアソームによる分解以外の形態でユビキチン化修飾することによって、RAの合成を抑制し、細胞内におけるRAの内部安定状態を下方調節することができる。培養された初代ニューロン細胞において、ニューロンの活性の遮断がRAの快速の生成を引き起こすことによって、ニューロンのシナプスの縮小・拡大の過程を調節するが、UBEAの過剰活性化がRAの生成を遮断することによってRAのニューロンのシナプスの安定状態に対する調節を干渉する。マウスの行動学の研究でも、UBE3Aの過剰発現またはALDH1Aの阻害剤であるジスルフィラム（DSF）の投与はいずれも自閉症の表現型を再建することができる。そのため、UBE3Aの過剰活性化は自閉症の表現型と関連性がある。しかしながら、UBE3Aが幅広い生理作用を有するため、ほかの副作用につながる可能性があるため、直接UBE3Aを抑制することがよくない。本発明の研究結果に基づいて、UBE3Aを干渉しないか、過剰に干渉しないまま、自閉症を予防および/治療する標的、薬物および治療手段を提供する。
【０１３９】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【０１４０】
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配列表
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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