(57)【要約】オリゴヌクレオチド、二環式ペプチドおよびペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、本明細書において提供される。それを必要とする被験体において、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を処置する方法であって、被験体に、本明細書において記載されているオリゴヌクレオチド、ペプチドおよびペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを投与するステップを含む、方法も、本明細書において提供される。一態様では、本明細書に記載の式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩が、本明細書において提供され、式Ｉは、二環式ペプチドに共有結合的に結合している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
【化５６】
2020537652.tif 000059
または薬学的に許容されるその塩であって、式中、
Ａ’は、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１〜６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化５７】
2020537652.tif 000060
から選択され、式中、
Ｒ５は、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであり、ｘは、３〜１０であり、各アルキル基は、各出現において独立して、Ｃ２〜６−アルキルであるか、またはＲ５は、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−（Ｃ１〜６−アルキル）Ｒ６、−（Ｃ１〜６−へテロアルキル）−Ｒ６、アリール−Ｒ６、ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１〜６−アルキル）−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６、および
【化５８】
2020537652.tif 000061
から選択され、
式中、Ｒ６は、ＯＨ、ＳＨおよびＮＨ２から選択されるか、またはＲ６は、固体支持体に共有結合的に連結しているＯ、ＳもしくはＮＨであり、
各Ｒ１は、ＯＨおよび−ＮＲ３Ｒ４から独立して選択され、各Ｒ３およびＲ４は、各出現において独立して、−Ｃ１〜６−アルキルであり、
各Ｒ２は、Ｈ、核酸塩基、および化学保護基で官能基化された核酸塩基から独立して選択され、前記核酸塩基は、各出現において独立して、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリンおよびデアザ−プリンから選択されるＣ３〜６−複素環式環を含み、
ｚは、８〜４０であり、
Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ１〜６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
【化５９】
2020537652.tif 000062
から選択され、式中、
Ｑは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ７は、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり、Ｒ８は、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり、
Ｌは、Ｊのアミノ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１〜６−Ｃ１〜６−ヘテロ芳香族−（ＣＨ２）１〜６Ｃ（Ｏ）であり、
ｔは、４〜１６であり、
各Ｊは、各出現において独立して、構造
【化６０】
2020537652.tif 000063
のアミノ酸から選択され、
式中、
ｒおよびｑは、それぞれ独立して、０、１、２、３または４であり、
各Ｒ９は、各出現において独立して、Ｈ、アミノ酸側鎖、および保護基で官能基化されたアミノ酸側鎖から選択され、
Ｒ９の３または４個のアミノ酸側鎖は、各出現において独立して、硫黄原子を含み、
ａ）硫黄原子の数が３である場合には、前記硫黄原子は、それらが付着している原子と一緒になって、構造
【化６１】
2020537652.tif 000064
を形成し、それにより、前記アミノ酸が二環式構造を形成するか、または
ｂ）硫黄原子の数が４である場合には、前記硫黄原子は、それらが付着している原子と一緒になって、構造
【化６２】
2020537652.tif 000065
の２回の出現を形成し、それにより、前記アミノ酸が二環式構造を形成し、
式中、ｄは、０または１であり、Ｍは、
【化６３】
2020537652.tif 000066
から選択され、
式中、各Ｒ１０は、各出現において独立して、Ｈまたはハロゲンであり、
Ｇは、Ｊのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、Ｇは、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜６−アルキル、ベンゾイルおよびステアロイルから選択され、
下記の条件の少なくとも１つが真である：
１）Ａ’は、
【化６４】
2020537652.tif 000067
であるか、または２）Ｅ’は、
【化６５】
2020537652.tif 000068
である、
ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは薬学的に許容されるその塩。
【請求項２】
Ａ’が、−Ｎ（Ｃ１〜６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化６６】
2020537652.tif 000069
から選択される、請求項１に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項３】
Ｅ’が、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、４−メトキシトリチル、および
【化６７】
2020537652.tif 000070
から選択される、請求項１から２のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項４】
前記式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、
【化６８】
2020537652.tif 000071
から選択されるペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートであり、式中、Ｅ’は、Ｈ、Ｃ１〜６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される、請求項１に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項５】
式（Ｉａ）のものである、請求項１または４に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項６】
式（Ｉｂ）のものである、請求項１または４に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項７】
各Ｒ１０が、フッ素である、請求項１から６のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項８】
Ｍが、
【化６９】
2020537652.tif 000072
である、請求項１から７のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項９】
各Ｊが、システインおよびアルギニンから独立して選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１０】
３個のＪ基が、システインである、請求項１から９のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１１】
４個のＪ基が、システインである、請求項１から１０のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１２】
各Ｒ１が、Ｎ（ＣＨ３）２である、請求項１から１１のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１３】
各Ｒ２が、各出現において独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンから選択される核酸塩基である、請求項１から１２のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１４】
Ｌが、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１〜６−トリアゾール−（ＣＨ２）１〜６Ｃ（Ｏ）−である、請求項１から１３のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１５】
Ｌが、
【化７０】
2020537652.tif 000073
である、請求項１から１４のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１６】
Ｇが、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１７】
Ｇが、Ｈである、請求項１から１６のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１８】
ｄが、１である、請求項１から１７に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項１９】
ｄが、０である、請求項１から１８のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２０】
以下：
【化７１】
2020537652.tif 000074
が、
【化７２】
2020537652.tif 000075
から選択される、請求項１から１９のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩であって、
式中、Ｒは、アルギニンであり、Ｃは、システインであり、
Ｇは、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルおよびステアロイルから選択され、Ｇは、前記ペプチドのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結している、
ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２１】
以下：
【化７３】
2020537652.tif 000076
から選択される、請求項１から１８および２０のいずれか一項に記載のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩であって、
式中、
Ｇは、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｇは、前記ペプチドのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合しており、
Ｃは、システインであり、
Ｒは、アルギニンであり、
Ｒ２は、各出現において独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンから選択される核酸塩基であり、
ｚは、８〜４０である、
ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩。
【請求項２２】
請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物、または薬学的に許容されるその塩と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項２３】
筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症の処置を必要とする被験体において、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を処置する方法であって、前記被験体に、請求項１から２１のいずれか一項に記載の化合物または請求項２２に記載の組成物を投与するステップを含む、方法。
【請求項２４】
前記筋疾患が、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルス感染症が、マールブルグウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルスおよびデングウイルスからなる群より選択されるウイルスによって引き起こされる、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１０月１７日に出願された米国仮出願第６２／５７３，４７３号の優先権を主張するものであり、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
アンチセンス技術は、選択的スプライス産物を含む１つまたは複数の特異的な遺伝子産物の発現をモジュレートするための手段を提供し、いくつかの治療的、診断的および研究適用において独自に有用である。アンチセンス技術の背後にある原理は、標的核酸とハイブリダイズするアンチセンス化合物、例えばオリゴヌクレオチドが、いくつかのアンチセンス機構のいずれか１つを通して、転写、スプライシングまたは翻訳等の遺伝子発現活性をモジュレートすることである。アンチセンス化合物の配列特異性は、それらを、標的検証および遺伝子機能化のためのツール、ならびに疾患に関与する遺伝子の発現を選択的にモジュレートするための治療薬として、魅力的なものにする。
【０００３】
アンチセンス技術の分野においては著しい進歩が為されてきたが、当該技術分野において、改善されたアンチセンスまたはアンチジーン性能を有するオリゴヌクレオチドおよびペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが依然として必要である。そのような改善されたアンチセンスまたはアンチジーン性能は、少なくとも、例えば、より低い毒性、配列選択性を損なわずにＤＮＡおよびＲＮＡに対するより強い親和性、改善された薬物動態および組織分布、改善された細胞送達、ならびに信頼性も高く制御可能でもあるｉｎ  ｖｉｖｏ分布を含む。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
二環式ペプチドに共有結合的に結合しているオリゴヌクレオチドを含む、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、本明細書において提供される。それを必要とする被験体において疾患を処置する方法であって、被験体に、本明細書において記載されているペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを投与するステップを含む、方法も、本明細書において提供される。
【０００５】
したがって、一態様では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
【化１】
2020537652.tif 000002
または薬学的に許容されるその塩
が、本明細書において提供され、式Ｉは、二環式ペプチドに共有結合的に結合している。
【０００６】
一実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式Ｉａのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
【化２】
2020537652.tif 000003
または薬学的に許容されるその塩
［式中、（Ｊ）ｔ−Ｇは、二環式ペプチドである］
である。
【０００７】
別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式Ｉｂのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
【化３】
2020537652.tif 000004
または薬学的に許容されるその塩
［式中、（Ｊ）ｔ−Ｇは、二環式ペプチドである］
である。
【０００８】
さらに別の態様では、それを必要とする被験体において、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を処置する方法であって、被験体に、本開示のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、ＰＭＯ−ＩＶＳ２−６５４（実施例６において記載されている）にカップリングされた環式および二環式ペプチドが、細胞エクソンスキッピングアッセイにおいて活性の増大を実証することを示す。ＩＶＳ２−６５４は、変異したｅＧＦＰプレｍＲＮＡのスプライシングを訂正する。スプライス訂正の増大は、蛍光の増大につながる。結果は、コンジュゲートされていないＩＶＳ２−６５４ＰＭＯに対して正規化した。
【図２】図２は、二環式ペプチドが、単環式ペプチドと比べて強化されたタンパク質分解安定性を実証することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
二環式ペプチドに共有結合的に結合しているオリゴヌクレオチドを含む、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートが、本明細書において提供される。それを必要とする被験体において疾患を処置する方法であって、被験体に、本明細書において記載されているペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを投与するステップを含む、方法も、本明細書において提供される。本明細書において記載されているオリゴヌクレオチドおよびそれによりペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、天然または修飾されていないオリゴヌクレオチドと比べて、配列選択性を損なわずにＤＮＡおよびＲＮＡに対するより強い親和性を示す。一部の実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨによる開裂を最小化または防止する。一部の実施形態では、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮアーゼＨを活性化しない。
【００１１】
本明細書において記載されているペプチドは、それらの対応するペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートに、より低い毒性、オリゴヌクレオチドの活性の強化を付与し、薬物動態および組織分布を改善し、細胞送達を改善し、信頼性も高く制御可能でもあるｉｎ  ｖｉｖｏ分布を付与する。
【００１２】
定義
本開示を記載するために使用される種々の用語の定義を、以下に列挙する。これらの定義は、具体的な事例において別段限定されない限り、個々にまたはより大きい群の一部としてのいずれかで、本明細書および特許請求の範囲の全体を通して使用される場合の用語に当てはまる。
【００１３】
用語「約」は、当業者には理解され、それが使用される文脈によってある程度変動する。本明細書で使用される場合、量、時間的持続期間等の測定可能な値に言及する際、用語「約」は、指定値から±５％、±１％および±０．１％を含む±２０％または±１０％の変動を包含することを意味するが、これは、そのような変動が、開示されている方法を実施するために適切であるからである。
【００１４】
用語「アルキル」は、ある特定の実施形態では、１〜６個または１〜８個の間の炭素原子をそれぞれ含有する、飽和、直鎖または分枝鎖炭化水素部分を指す。Ｃ１〜６−アルキル部分の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル部分を含むがこれらに限定されず、Ｃ１〜８−アルキル部分の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、ヘプチルおよびオクチル部分を含むがこれらに限定されない。
【００１５】
アルキル置換基における炭素原子の数は、接頭辞「Ｃｘ〜ｙ」によって示すことができ、ｘは、置換基における炭素原子の最小数であり、ｙは、最大数である。同様に、Ｃｘ鎖は、ｘ個の炭素原子を含有するアルキル鎖を意味する。
【００１６】
用語「へテロアルキル」は、それ自体がまたは別の用語と組み合わせて、別段の記載がない限り、記載されている数の炭素原子ならびにＯ、ＮおよびＳからなる群より選択される１個または２個のヘテロ原子からなる、安定な直鎖または分枝鎖アルキル基を意味し、窒素および硫黄原子は、必要に応じて酸化されていてよく、窒素ヘテロ原子は、必要に応じて四級化されていてよい。ヘテロ原子は、ヘテロアルキル基の残りとそれが付着している断片との間を含むヘテロアルキル基の任意の位置に置かれ、かつヘテロアルキル基における最も遠位の炭素原子に付着されていてよい。例は、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＯＨ、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３および−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（＝Ｏ）−ＣＨ３を含む。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３または−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−Ｓ−ＣＨ３等、最大２個のヘテロ原子が連続してよい。
【００１７】
用語「アリール」は、単独でまたは他の用語と組み合わせて用いられ、別段の記載がない限り、１個または複数の環（典型的には、１、２または３個の環）を含有する炭素環式芳香族系を意味し、そのような環は、ビフェニル等、ペンダント様式で一緒に付着されていてよく、または、ナフタレン等、縮合されていてよい。アリール基の例は、フェニル、アントラシルおよびナフチルを含む。種々の実施形態では、アリール基の例は、フェニル（例えば、Ｃ６−アリール）およびビフェニル（例えば、Ｃ１２−アリール）を含んでよい。一部の実施形態では、アリール基は、６〜１６個の炭素原子を有する。一部の実施形態では、アリール基は、６〜１２個の炭素原子を有する（例えば、Ｃ６〜１２−アリール）。一部の実施形態では、アリール基は、６個の炭素原子を有する（例えば、Ｃ６−アリール）。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「ヘテロアリール」または「ヘテロ芳香族」は、芳香族の特徴を有する複素環を指す。ヘテロアリール置換基は、炭素原子の数によって定義されてよく、例えば、Ｃ１〜９−ヘテロアリールは、ヘテロ原子の数を含まず、ヘテロアリール基に含有される炭素原子の数を示す。例えば、Ｃ１〜９−ヘテロアリールは、追加で１〜４個のヘテロ原子を含むことになる。多環式ヘテロアリールは、部分的に飽和した１個または複数の環を含んでよい。ヘテロアリールの非限定的な例は、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル（例えば、２−および４−ピリミジニルを含む）、ピリダジニル、チエニル、フリル、ピロリル（例えば、２−ピロリルを含む）、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル（例えば、３−および５−ピラゾリルを含む）、イソチアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，３，４−トリアゾリル、テトラゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，３，４−チアジアゾリルおよび１，３，４−オキサジアゾリルを含む。
【００１９】
多環式複素環およびヘテロアリールの非限定的な例は、インドリル（例えば、３−、４−、５−、６−および７−インドリルを含む）、インドリニル、キノリル、テトラヒドロキノリル、イソキノリル（例えば、１−および５−イソキノリルを含む）、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリル、シンノリニル、キノキサリニル（例えば、２−および５−キノキサリニルを含む）、キナゾリニル、フタラジニル、１，８−ナフチリジニル、１，４−ベンゾジオキサニル、クマリン、ジヒドロクマリン、１，５−ナフチリジニル、ベンゾフリル（例えば、３−、４−、５−、６−および７−ベンゾフリルを含む）、２，３−ジヒドロベンゾフリル、１，２−ベンズイソオキサゾリル、ベンゾチエニル（例えば、３−、４−、５−、６−および７−ベンゾチエニルを含む）、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル（例えば、２−ベンゾチアゾリルおよび５−ベンゾチアゾリルを含む）、プリニル、ベンズイミダゾリル（例えば、２−ベンズイミダゾリルを含む）、ベンゾトリアゾリル、チオキサンチニル、カルバゾリル、カルボリニル、アクリジニル、ピロリジジニルおよびキノリジジニルを含む。
【００２０】
用語「保護基」または「化学保護基」は、化合物の一部またはすべての反応性部分をブロックし、保護基が除去されるまで、そのような部分が化学反応に関わるのを防止する化学部分、例えば、Ｔ．Ｗ．  Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｐ．Ｇ．Ｍ．  Ｗｕｔｓ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  ３ｒｄ  ｅｄ．  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  （１９９９）において列挙され記載されている部分を指す。異なる保護基が用いられる場合、各（異なる）保護基は異なる手段によって除去可能であることが有利であり得る。全く異質な反応条件下で開裂される保護基は、そのような保護基の差次的な除去を可能にする。例えば、保護基は、酸、塩基および水素化分解によって除去され得る。トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、アセタールおよびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル等の基は、酸不安定性であり、水素化分解によって除去可能なＣｂｚ基および塩基不安定性であるＦｍｏｃ基で保護されたアミノ基の存在下、カルボキシおよびヒドロキシ反応性部分を保護するために使用されてよい。カルボン酸部分は、限定なく、メチルまたはエチル等の塩基不安定性基でブロックされてよく、ヒドロキシ反応性部分は、カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチル等の酸不安定性基でブロックされたアミンの存在下、アセチル等の塩基不安定性基で、または、酸および塩基の両方に安定であるが加水分解的に除去可能なカルバメートで、ブロックされてよい。
【００２１】
カルボン酸およびヒドロキシル反応性部分は、ベンジル基等の加水分解的に除去可能な保護基でブロックされてもよく、一方、アミン基は、Ｆｍｏｃ等の塩基不安定性基でブロックされてよい。式（Ｉ）の化合物の合成に特に有用なアミン保護基は、トリフルオロアセトアミドである。カルボン酸反応性部分は、２，４−ジメトキシベンジル等の酸化的に除去可能な保護基でブロックされてよく、一方、共存するアミノ基は、フッ化物不安定性シリルカルバメートでブロックされてよい。
【００２２】
アリルブロッキング基は、酸および塩基保護基の存在下で有用であり、これは、前者が安定であり、その後金属またはパイ酸触媒によって除去され得るからである。例えば、アリルでブロックされたカルボン酸は、酸不安定性カルバミン酸ｔｅｒｔ−ブチルまたは塩基不安定性酢酸アミン保護基の存在下、パラジウム（０）触媒反応で脱保護され得る。保護基のさらに別の形態は、化合物または中間体が付着し得る樹脂である。残基が樹脂に付着している限り、その官能基はブロックされ、反応することができない。樹脂から解放されると、官能基は反応するために利用可能になる。
【００２３】
用語「核酸塩基」、「塩基対合部分」、「核酸塩基対合部分」または「塩基」は、ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび／またはモルホリノサブユニットの複素環式環部を指す。核酸塩基は、天然に存在してよく、または、修飾されているかもしくはこれらの天然に存在する核酸塩基の類似体であってよく、例えば、核酸塩基の１個または複数の窒素原子は、各出現において独立して、炭素によって置き換えられていてよい。例示的な類似体は、ヒポキサンチン（ヌクレオシドイノシンの塩基成分）、２，６−ジアミノプリン、５−メチルシトシン、Ｃ５−プロピニル修飾ピリミジン、１０−（９−（アミノエトキシ）フェノキサジニル）（Ｇ−クランプ）等を含む。
【００２４】
塩基対合部分のさらなる例は、それらのそれぞれのアミノ基がアシル保護基によって保護されたウラシル、チミン、アデニン、シトシン、グアニンおよびヒポキサンチン、２−フルオロウラシル、２−フルオロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、２，６−ジアミノプリン、アザシトシン、ピリミジン類似体、例えば、シュードイソシトシンおよびシュードウラシル、ならびに他の修飾された核酸塩基、例えば、８−置換プリン、キサンチンまたはヒポキサンチン（後半の２つは自然分解生成物である）を含むがこれらに限定されない。Ｃｈｉｕ  ａｎｄ  Ｒａｎａ，  ＲＮＡ，  ２００３，  ９，  １０３４−１０４８，  Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  １９９４，  ２２，  ２１８３−２１９６およびＲｅｖａｎｋａｒ  ａｎｄ  Ｒａｏ，  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ｖｏｌ．  ７，  ３１３において開示されている修飾された核酸塩基も企図されており、その内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
塩基対合部分のさらなる例は、１個または複数のベンゼン環が付加された拡大サイズの核酸塩基を含むがこれらに限定されない。その内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｃａｔａｌｏｇ  （ｗｗｗ．ｇｌｅｎｒｅｓｅａｒｃｈ．ｃｏｍ）；  Ｋｒｕｅｇｅｒ  ＡＴ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．，  ２００７，  ４０，  １４１−１５０；  Ｋｏｏｌ，  ＥＴ，  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．，  ２００２，  ３５，  ９３６−９４３；  Ｂｅｎｎｅｒ  Ｓ．Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ２００５，  ６，  ５５３−５４３；  Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ，  Ｆ．Ｅ．，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００３，  ７，  ７２３−７３３；  Ｈｉｒａｏ，  Ｉ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ２００６，  １０，  ６２２−６２７において記載されている核酸塩基置き換えは、本明細書において記載されているオリゴマーの合成に有用であるとして企図されている。拡大サイズの核酸塩基の例を以下に示す。
【化４】
2020537652.tif 000005
【００２６】
用語「オリゴヌクレオチド」または「オリゴマー」は、複数の連結したヌクレオシド、ヌクレオチド、またはヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方の組合せを含む化合物を指す。本明細書において提供される具体的な実施形態では、オリゴヌクレオチドは、モルホリノオリゴヌクレオチドである。
【００２７】
語句「モルホリノオリゴヌクレオチド」または「ＰＭＯ」は、１つのサブユニットのモルホリノ窒素を隣接するサブユニットの５’−環外炭素に接合するホスホルアミデートまたはホスホロジアミデート連結によって一緒に連結したモルホリノサブユニットを有する修飾されたオリゴヌクレオチドを指す。各モルホリノサブユニットは、標的における核酸塩基に核酸塩基特異的水素結合によって結合するために有効な核酸塩基対合部分を含む。
【００２８】
用語「アンチセンスオリゴマー」、「アンチセンス化合物」および「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、交換可能に使用され、それぞれが塩基対合部分を有し、塩基対合部分を核酸（典型的にはＲＮＡ）における標的配列にワトソン−クリック塩基対合によってハイブリダイズさせて、標的配列内に核酸：オリゴマーヘテロ二本鎖を形成する、サブユニット間連結によって連結しているサブユニットの配列を指す。オリゴマーは、標的配列に対して厳密な（完璧な）または近接した（十分な）配列相補性を有してよく、オリゴマーの末端付近の配列における変動は、概して、内部における変動よりも好ましい。
【００２９】
そのようなアンチセンスオリゴマーは、ｍＲＮＡの翻訳をブロックもしくは阻害するまたは天然もしくは異常なプレｍＲＮＡスプライスプロセシングを阻害する／変更するように設計することができ、それがハイブリダイズする標的配列「に向けられる」または「に対して標的化される」と言うことができる。標的配列は、典型的には、ｍＲＮＡのＡＵＧ開始コドン、翻訳抑制オリゴマー、または前処理された（ｐｒｅ−ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ）ｍＲＮＡのスプライス部位、スプライス抑制オリゴマー（ＳＳＯ）を含む領域である。スプライス部位の標的配列は、前処理されたｍＲＮＡにおける通常のスプライスアクセプタージャンクションの下流にその５’末端の１〜約２５個の塩基対を有するｍＲＮＡ配列を含んでよい。種々の実施形態では、標的配列は、スプライス部位を含む、またはエクソンコード配列内に完全に含有されるもしくはスプライスアクセプターもしくはドナー部位に及ぶ、前処理されたｍＲＮＡの任意の領域であってよい。オリゴマーは、より一般的には、標的の核酸に対して上述した様式で標的化される場合、タンパク質、ウイルスまたは細菌等の生物学的に関連する標的「に対して標的化される」と言われる。
【００３０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび標的ＲＮＡは、各分子における十分な数の対応する位置が、互いに水素結合できるヌクレオチドによって占有されており、それにより、オリゴヌクレオチドと標的との間に安定かつ特異的な結合が出現する場合、互いに相補的である。故に、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、オリゴヌクレオチドと標的との間に安定かつ特異的な結合が出現するような、十分な程度の相補性または正確な対合を示すために使用される用語である。当該技術分野において、オリゴヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるその標的配列のものに対して１００％相補的である必要はないことが理解される。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの標的分子への結合が標的ＲＮＡの正常機能に干渉する場合に、特異的にハイブリダイズ可能であり、特異的結合が望ましい条件下、すなわち、ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイまたは治療的処置の場合には生理的条件下、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの場合にはアッセイが実施される条件下で、アンチセンスオリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を回避するために、十分な程度の相補性がある。
【００３１】
オリゴヌクレオチドは、核酸塩基（多くの場合、当該技術分野においては単に「塩基」と称される）修飾または置換も含み得る。修飾または置換された塩基を含有するオリゴヌクレオチドは、核酸において最も一般的に見られる１個または複数のプリンまたはピリミジン塩基が、あまり一般的ではないまたは非天然塩基で置き換えられている、オリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、核酸塩基は、プリン塩基のＮ９原子においてまたはピリミジン塩基のＮ１原子において、ヌクレオチドまたはヌクレオシドのモルホリン環に共有結合的に連結している。
【００３２】
プリン塩基は、一般式：
【化５】
2020537652.tif 000006
によって記載される通りの、イミダゾール環に縮合したピリミジン環を含む。
【００３３】
アデニンおよびグアニンは、核酸において最も一般的に見られる２個のプリン核酸塩基である。これらは、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ２−メチルグアニン、ヒポキサンチンおよび７−メチルグアニンを含むがこれらに限定されない他の天然に存在するプリンで置換されていてよい。
【００３４】
ピリミジン塩基は、一般式：
【化６】
2020537652.tif 000007
によって記載される通りの６員ピリミジン環を含む。
【００３５】
シトシン、ウラシルおよびチミンは、核酸において最も一般的に見られるピリミジン塩基である。これらは、５−メチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、シュードウラシルおよび４−チオウラシルを含むがこれらに限定されない他の天然に存在するピリミジンで置換されていてよい。一実施形態では、本明細書において記載されているオリゴヌクレオチドは、ウラシルの代わりにチミン塩基を含有する。
【００３６】
他の修飾または置換された塩基は、２，６−ジアミノプリン、オロチン酸、アグマチジン、リシジン、２−チオピリミジン（例えば、２−チオウラシル、２−チオチミン）、Ｇ−クランプおよびその誘導体、５−置換ピリミジン（例えば、５−ハロウラシル、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシン、５−アミノメチルウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−アミノメチルシトシン、５−ヒドロキシメチルシトシン、スーパーＴ）、７−デアザグアニン、７−デアザアデニン、７−アザ−２，６−ジアミノプリン、８−アザ−７−デアザグアニン、８−アザ−７−デアザアデニン、８−アザ−７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、スーパーＧ、スーパーＡおよびＮ４−エチルシトシン、またはその誘導体；Ｎ２−シクロペンチルグアニン（ｃＰｅｎｔ−Ｇ）、Ｎ２−シクロペンチル−２−アミノプリン（ｃＰｅｎｔ−ＡＰ）、およびＮ２−プロピル−２−アミノプリン（Ｐｒ−ＡＰ）、シュードウラシルまたはその誘導体；ならびに２，６−ジフルオロトルエンのような縮重もしくはユニバーサル塩基または塩基脱落部位のような欠損塩基（例えば、１−デオキシリボース、１，２−ジデオキシリボース、ｌ−デオキシ−２−Ｏ−メチルリボース；または環酸素が窒素で置き換えられたピロリジン誘導体（アザリボース））を含むがこれらに限定されない。シュードウラシルは、ウリジンにあるような正規のＮ−グリコシドではなくＣ−グリコシドを有する、ウラシルの天然に存在する異性化バージョンである。
【００３７】
ある特定の修飾または置換された核酸塩基は、本開示のアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるために特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６および０〜６置換プリンを含む。種々の実施形態では、核酸塩基は、５−メチルシトシン置換を含んでよく、これは、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２°Ｃだけ増大させることが示されている。
【００３８】
一部の実施形態では、修飾または置換された核酸塩基は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの精製を容易にするために有用である。例えば、ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、３個またはそれよりも多い（例えば、３、４、５、６個またはそれよりも多い）連続するグアニン塩基を含有してよい。ある特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、一連の３個またはそれよりも多い連続するグアニン塩基は、精製を複雑化する、オリゴヌクレオチドの凝集をもたらし得る。そのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドにおいて、連続するグアニンの１つまたは複数は、ヒポキサンチンで置換され得る。一連の３個またはそれよりも多い連続するグアニン塩基における１個または複数のグアニンのヒポキサンチンによる置換は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの凝集を低減させ、それにより、精製を容易にすることができる。
【００３９】
本明細書において提供されるオリゴヌクレオチドは、合成され、生物起源のアンチセンス組成物を含まない。本開示の分子は、取り込み、分布もしくは吸収またはそれらの組合せを補助するために、他の分子、分子構造または化合物の混合物、例えば、リポソーム、受容体標的化分子、経口、直腸、局所または他の製剤と、混合、カプセル化、コンジュゲートまたは別様に会合されてもよい。
【００４０】
用語「相補的な」および「相補性」は、塩基対合則によって関係付けられたオリゴヌクレオチド（すなわち、ヌクレオチドの配列）を指す。例えば、配列「Ｔ−Ｇ−Ａ（５’−３’）」は、配列「Ｔ−Ｃ−Ａ（５’−３’）」に対して相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合則に従って適合する、「部分的」であってよい。あるいは、核酸間に、「完全な」、「全くの」または「完璧な」（１００％）相補性があってよい。核酸ストランド間の相補性の程度は、核酸ストランド間のハイブリダイゼーションの効率および強さに対して顕著な効果を有する。完璧な相補性が多くの場合望ましいが、一部の実施形態は、標的ＲＮＡに関して、１つまたは複数であるが好ましくは６、５、４、３、２または１つのミスマッチを含み得る。そのようなハイブリダイゼーションは、アンチセンスオリゴマーの標的配列に対する「近接した」または「実質的な」相補性でおよび厳密な相補性で出現し得る。一部の実施形態では、オリゴマーは、標的配列に、約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の相補性でハイブリダイズしてよい。オリゴマー内の任意の場所における変動が含まれる。ある特定の実施形態では、オリゴマーの末端付近の配列における変動は、概して、内部における変動よりも好ましく、存在する場合、典型的には、５’末端、３’末端または両方の末端の約６、５、４、３、２または１ヌクレオチド内である。
【００４１】
用語「ペプチド」は、複数の連結されたアミノ酸を含む化合物を指す。本明細書において提供されるペプチドは、細胞透過性ペプチドであるとみなされ得る。
【００４２】
用語「細胞透過性ペプチド」および「ＣＰＰ」は、交換可能に使用され、輸送ペプチド、担体ペプチドまたはペプチド形質導入ドメインとも称される、カチオン性細胞透過性ペプチドを指す。本明細書において提供されるペプチドは、所与の細胞培養集団の細胞の１００％以内で細胞透過を誘導する能力を有し、複数の組織内における巨大分子トランスロケーションを、全身投与時にｉｎ  ｖｉｖｏで可能にする。種々の実施形態では、本開示のＣＰＰ実施形態は、さらに以下で記載する通り、アルギニンリッチペプチドを含んでよい。
【００４３】
用語「処置」は、疾患の好転（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）に使用される１つまたは複数の特定の手順の適用を指す。ある特定の実施形態では、具体的な手順は、１つまたは複数の薬学的作用物質の投与である。個体（例えば、ヒト等の哺乳動物）または細胞の「処置」は、個体または細胞の自然経過を変更するための試みにおいて使用される任意の種類の介入である。処置は、医薬組成物の投与を含むがこれに限定されず、予防的にまたは病理学的事象の開始もしくは病原体との接触に続いてのいずれかで実施されてよい。処置は、疾患または状態の症状または病理学に対するあらゆる望ましい効果を含み、例えば、処置されている疾患または状態の１つまたは複数の測定可能なマーカーにおける最小限の変化または改善を含んでよい。処置されている疾患もしくは状態の進行速度を低減させること、その疾患もしくは状態の発症を遅延させること、またはその発症の重症度を低減させることに向けられ得る、「予防的」処置も含まれる。
【００４４】
「有効量」または「治療有効量」は、単回用量としてまたは一連の用量の一部としてのいずれかで哺乳動物被験体に投与される、所望の治療効果を産生するために有効なアンチセンスオリゴマー等の治療用化合物の量を指す。
【００４５】
用語「好転」は、状態または疾患の少なくとも１つの指標の重症度の軽減を意味する。ある特定の実施形態では、好転は、状態または疾患の１つまたは複数の指標の進行における遅延または減速を含む。指標の重症度は、当業者に公知である主観的または客観的尺度によって決定され得る。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、既存の酸または塩基部分をその塩形態に変換することによって親オリゴヌクレオチドが修飾された、開示されているオリゴヌクレオチドの誘導体を指す。好適な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７ｔｈ  ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  １９８５，  ｐ．  １４１８およびＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ６６，  ２  （１９７７）において見られ、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００４７】
ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート
二環式細胞透過性ペプチドに化学的に連結しているオリゴヌクレオチドが、本明細書において提供される。二環式細胞透過性ペプチドは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みを強化する。一部の実施形態では、ＣＰＰは、アルギニンリッチペプチドであり得る。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布または細胞取り込みをさらに強化する、１つまたは複数のへテロアルキル部分（例えば、ポリエチレングリコール）に、付加的に化学的に連結することができる。１つの例示的な実施形態では、ポリペプチド、例えばアルギニンリッチポリペプチドは、そのＮ末端またはＣ末端残基において、オリゴヌクレオチドのいずれかの末端または両方の末端に共有結合的にカップリングされる。
【００４８】
故に、一態様では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
【化７】
2020537652.tif 000008
または薬学的に許容されるその塩が、本明細書において提供され、式中、
Ａ’は、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１〜６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化８】
2020537652.tif 000009
から選択され、式中、
Ｒ５は、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであり、ｘは、３〜１０であり、各アルキル基は、各出現において独立して、Ｃ２〜６−アルキルであるか、またはＲ５は、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−（Ｃ１〜６−アルキル）Ｒ６、−（Ｃ１〜６−へテロアルキル）−Ｒ６、アリール−Ｒ６、ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−（Ｃ１〜６−アルキル）−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６、および
【化９】
2020537652.tif 000010
から選択され、
式中、Ｒ６は、ＯＨ、ＳＨおよびＮＨ２から選択されるか、またはＲ６は、固体支持体に共有結合的に連結しているＯ、ＳもしくはＮＨであり、
各Ｒ１は、ＯＨおよび−ＮＲ３Ｒ４から独立して選択され、各Ｒ３およびＲ４は、各出現において独立して、−Ｃ１〜６−アルキルであり、
各Ｒ２は、Ｈ、核酸塩基、および化学保護基で官能基化された核酸塩基から独立して選択され、核酸塩基は、各出現において独立して、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリンおよびデアザ−プリンから選択されるＣ３〜６−複素環式環を含み、
ｚは、８〜４０であり、
Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ１〜６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、
【化１０】
2020537652.tif 000011
から選択され、式中、
Ｑは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ７は、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり、Ｒ８は、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２であり、
Ｌは、Ｊのアミノ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１〜６−Ｃ１〜６−ヘテロ芳香族−（ＣＨ２）１〜６Ｃ（Ｏ）であり、
ｔは、４〜１６であり、
各Ｊは、各出現において独立して、構造
【化１１】
2020537652.tif 000012
のアミノ酸から選択され、
式中、
ｒおよびｑは、それぞれ独立して、０、１、２、３または４であり、
各Ｒ９は、各出現において独立して、Ｈ、アミノ酸側鎖、および保護基で官能基化されたアミノ酸側鎖から選択され、
Ｒ９の３または４個のアミノ酸側鎖は、各出現において独立して、硫黄原子を含み、
ａ）硫黄原子の数が３である場合には、硫黄原子は、それらが付着している原子と一緒になって、構造
【化１２】
2020537652.tif 000013
を形成し、それにより、アミノ酸が二環式構造を形成するか、または
ｂ）硫黄原子の数が４である場合には、硫黄原子は、それらが付着している原子と一緒になって、構造
【化１３】
2020537652.tif 000014
の２回の出現を形成し、それにより、アミノ酸が二環式構造を形成し、
式中、ｄは、０または１であり、Ｍは、
【化１４】
2020537652.tif 000015
から選択され、
式中、各Ｒ１０は、各出現において独立して、Ｈまたはハロゲンであり、
Ｇは、Ｊのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、Ｇは、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜６−アルキル、ベンゾイルおよびステアロイルから選択され、
下記の条件の少なくとも１つが真である：
１）Ａ’は、
【化１５】
2020537652.tif 000016
であるか、または２）Ｅ’は、
【化１６】
2020537652.tif 000017
である。
【００４９】
一実施形態では、Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ１〜６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、および
【化１７】
2020537652.tif 000018
から選択される。
【００５０】
さらに別の実施形態では、Ａ’は、−Ｎ（Ｃ１〜６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化１８】
2020537652.tif 000019
から選択される。
【００５１】
別の実施形態では、Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、４−メトキシトリチル、および
【化１９】
2020537652.tif 000020
から選択される。
【００５２】
また別の実施形態では、Ａ’は、−Ｎ（Ｃ１〜６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化２０】
2020537652.tif 000021
から選択され、
Ｅ’は、
【化２１】
2020537652.tif 000022
である。
【００５３】
さらに別の実施形態では、Ａ’は、
【化２２】
2020537652.tif 000023
である。
【００５４】
別の実施形態では、Ｅ’は、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、トリチル、４−メトキシトリチル、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される。
【００５５】
さらに別の実施形態では、Ｅ’は、Ｈおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３から選択される。
【００５６】
また別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式Ｉａのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
【化２３】
2020537652.tif 000024
である。
【００５７】
別の実施形態では、式Ｉのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、式Ｉｂのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
【化２４】
2020537652.tif 000025
である。
【００５８】
式ＩおよびＩｂのある実施形態では、Ｅ’は、Ｈ、Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される。
【００５９】
式ＩおよびＩｂの別の実施形態では、Ｅ’は、Ｈおよび−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３から選択される。
【００６０】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのある実施形態では、各Ｒ１０は、独立して、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素から選択されるハロゲンである。
【００６１】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、各Ｒ１０は、フッ素である。
【００６２】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのまた別の実施形態では、Ｍは、
【化２５】
2020537652.tif 000026
である。
【００６３】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、３個のアミノ酸側鎖基は、各出現において独立して、システインまたはホモシステインアミノ酸側鎖基である。
【００６４】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、４個のアミノ酸側鎖基は、各出現において独立して、システインまたはホモシステインアミノ酸側鎖基である。
【００６５】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのまた別の実施形態では、各Ｊは、各出現において独立して、α−アミノ酸、β２−アミノ酸およびβ３−アミノ酸から選択される。
【００６６】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、ｒおよびｑは、それぞれ０である。
【００６７】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、Ｊは、システインおよびアルギニンから独立して選択される。
【００６８】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのまた別の実施形態では、３個のＪ基は、システインである。
【００６９】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのまた別の実施形態では、４個のＪ基は、システインである。
【００７０】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、ｚは、９〜１６である。
【００７１】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、各Ｒ１は、独立して、ＮＲ３Ｒ４であり、各Ｒ３およびＲ４は、各出現において独立して、Ｃ１〜３−アルキルである。
【００７２】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのまた別の実施形態では、各Ｒ１は、Ｎ（ＣＨ３）２である。
【００７３】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、各Ｒ２は、核酸塩基であり、核酸塩基は、各出現において独立して、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリンおよびデアザ−プリンから選択されるＣ４〜６−複素環式環を含む。
【００７４】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、各Ｒ２は、核酸塩基であり、核酸塩基は、各出現において独立して、ピリミジン、プリンおよびデアザ−プリンから選択されるＣ４〜６−複素環式環を含む。
【００７５】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのまた別の実施形態では、各Ｒ２は、各出現において独立して、アデニン、２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、グアニン、７−デアザ−グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンから選択される核酸塩基である。
【００７６】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、各Ｒ２は、各出現において独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンから選択される核酸塩基である。
【００７７】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、Ｌは、
【化２６】
2020537652.tif 000027
である。
【００７８】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、Ｇは、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルおよびステアロイルから選択される。
【００７９】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのまた別の実施形態では、Ｇは、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【００８０】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、Ｇは、Ｈである、
【００８１】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【００８２】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂの別の実施形態では、ｄは、１である。
【００８３】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのまた別の実施形態では、ｄは、０である。
【００８４】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、
【化２７】
2020537652.tif 000028
は、
【化２８】
2020537652.tif 000029
［式中、［Ｌ］は、
【化２９】
2020537652.tif 000030
であり、
Ｘは、各出現において独立して、アルギニンまたはシステインから選択され、
Ｃは、システインであり、
ｎは、３〜８から選択される整数であり、
ｍは、３〜８から選択される整数である］
または
【化３０】
2020537652.tif 000031
［式中、［Ｌ］は、
【化３１】
2020537652.tif 000032
であり、
Ｘは、各出現において独立して、アルギニンまたはシステインから選択され、
Ｃは、システインであり、
Ｇは、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルおよびステアロイルから選択され、Ｇは、ペプチドのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、
ｎは、３〜８から選択される整数であり、
ｍは、３〜８から選択される整数である］
から選択される。
【００８５】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、
【化３２】
2020537652.tif 000033
は、
【化３３】
2020537652.tif 000034
［式中、Ｘは、各出現において独立して、アルギニンまたはシステインから選択され、
Ｃは、システインであり、
Ｇは、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルおよびステアロイルから選択され、Ｇは、ペプチドのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結している］
から選択される。
【００８６】
ある実施形態では、Ｘの少なくとも１つの事例は、アルギニンである。
【００８７】
別の実施形態では、Ｘの少なくとも２つの事例は、アルギニンである。
【００８８】
さらに別の実施形態では、Ｘの少なくとも３つの事例は、アルギニンである。
【００８９】
ある実施形態では、Ｘの少なくとも４つの事例は、アルギニンである。
【００９０】
さらなる実施形態では、Ｘの少なくとも５つの事例は、アルギニンである。
【００９１】
さらに別の実施形態では、Ｘの少なくとも６つの事例は、アルギニンである。
【００９２】
ある実施形態では、Ｘの少なくとも７つの事例は、アルギニンである。
【００９３】
式Ｉ、ＩａおよびＩｂのさらに別の実施形態では、
【化３４】
2020537652.tif 000035
は、
【化３５】
2020537652.tif 000036
［式中、Ｒは、アルギニンであり、Ｃは、システインであり、
Ｇは、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルおよびステアロイルから選択され、Ｇは、ペプチドのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結している］
から選択される。
【００９４】
さらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ標的に対して配列相補性を有する標的化配列を含む。具体的な実施形態では、ＲＮＡ標的は、細胞ＲＮＡ標的である。別の具体的な実施形態では、標的化配列は、ＲＮＡ標的に結合するために十分な配列相補性を有する。さらに別の具体的な実施形態では、標的化配列は、ＲＮＡ標的に対して完璧な配列相補性を有する。
【００９５】
本開示の代表的なペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、数ある中でも、下記の構造のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート：
【化３６】
2020537652.tif 000037
または薬学的に許容されるその塩［式中、
Ｇは、Ｈまたは−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３であり、Ｇは、ペプチドのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、
Ｃは、システインであり、
Ｒは、アルギニンであり、
Ｒ２は、各出現において独立して、アデニン、グアニン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンから選択される核酸塩基であり、
ｚは、８〜４０である］
を含む。
【００９６】
本開示のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの一実施形態では、Ｇは、Ｈである。
【００９７】
本開示のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの別の実施形態では、Ｇは、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【００９８】
ある実施形態では、Ｌは、ペプチドのカルボキシ末端に共有結合的に連結しており、Ｇは、ペプチドのアミノ末端に共有結合的に連結している。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「Ｇは、Ｊのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結している」は、Ｊ（−ＣＯＯＨ）のカルボキシ末端が、Ｎ（Ｈ）基を介して変数Ｇに共有結合的に結合していることを示し、Ｊのカルボキシ末端のヒドロキシル基は、Ｎ（Ｈ）で置き換えられている。例えば、ＧがＨである場合、下記の構造は、ＪおよびＧによって形成される。
【化３７】
2020537652.tif 000038
【０１００】
一部の実施形態では、本明細書において記載されているペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、溶媒和されていない。他の実施形態では、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つまたは複数は、溶媒和形態である。当該技術分野において公知の通り、溶媒和物は、水、エタノール等の薬学的に許容される溶媒のいずれかであり得る。
【０１０１】
式Ｉ、Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、ＩｅおよびＩＶのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートはそれらの中性形態で示されているが、一部の実施形態では、これらのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、薬学的に許容される塩形態で使用される。
【０１０２】
オリゴヌクレオチド
モルホリノベースのサブユニットの重要な特性は、１）安定な非荷電または正に荷電された骨格連結によってオリゴマー形態で連結される能力；２）ヌクレオチド塩基（例えば、アデニン、シトシン、グアニン、チミジン、ウラシル、５−メチル−シトシンおよびヒポキサンチン）を支持し、それにより、形成されたポリマーが、標的ＲＮＡを含む相補的塩基標的核酸と、比較的短いオリゴヌクレオチド（例えば、１０〜１５塩基）で約４５℃を上回るＴＭ値でハイブリダイズすることができる能力；３）哺乳動物の細胞に能動的にまたは受動的に輸送されるオリゴヌクレオチドの能力；ならびに４）ＲＮアーゼおよびＲＮアーゼＨ分解にそれぞれ抵抗する、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド：ＲＮＡヘテロ二本鎖の能力を含む。
【０１０３】
オリゴマーと標的配列との間に形成される二本鎖の安定性は、結合ＴＭおよび二本鎖の細胞の酵素的開裂に対する感受性の関数である。相補的配列ＲＮＡに関するオリゴマーのＴＭは、Ｈａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８５，  ｐｐ．  １０７−１０８によって記載されたもの等の従来の方法によって、またはＭｉｙａｄａ  Ｃ．  Ｇ．  ａｎｄ  Ｗａｌｌａｃｅ  Ｒ．  Ｂ．，  １９８７，  Ｏｌｉｇｏｍｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  Ｖｏｌ．  １５４  ｐｐ．  ９４−１０７において記載されている通りに、測定され得る。ある特定の実施形態では、アンチセンスオリゴマーは、相補的配列ＲＮＡに関して、体温よりも高い、および一実施形態では約４５℃または５０℃よりも高い、結合ＴＭを有してよい。６０〜８０℃の範囲内またはそれよりも高いＴＭも含まれる。周知の原理によれば、相補的塩基（ｂａｓｅｄ）ＲＮＡハイブリッドに関して、オリゴマーのＴＭは、二本鎖におけるＣ：Ｇ対合塩基の比を増大させることによって、もしくはヘテロ二本鎖の長さを（塩基対で）増大させることによって、または両方によって、増大できる。同時に、細胞取り込みを最適化することを目的として、オリゴマーのサイズを限定することが有利であり得る。この理由から、本開示の化合物は、２５塩基またはそれよりも短い長さで高ＴＭ（４５〜５０℃またはそれよりも高い）を示す化合物を含む。
【０１０４】
オリゴヌクレオチドの長さは、プレｍＲＮＡ分子内の意図した場所に選択的に結合することができる限り、変動してよい。そのような配列の長さは、本明細書において記載されている選択手順に従って決定することができる。概して、オリゴヌクレオチドは、長さ約８ヌクレオチド〜長さ最大約５０ヌクレオチドである。例えば、オリゴヌクレオチドの長さ（ｚ）は、８〜３８、８〜２５、１５〜２５、１７〜２１、または約１８であり得る。しかしながら、この範囲内のヌクレオチドの任意の長さが、本明細書において記載されている方法において使用され得ることが分かるであろう。
【０１０５】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、塩基修飾または置換を含有する。例えば、ある特定の核酸塩基は、本明細書において記載されているアンチセンスオリゴヌクレオチドの結合親和性を増大させるように選択されてよい。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびに２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、５−プロピニルシトシンおよび２，６−ジアミノプリンを含むＮ−２、Ｎ−６および０〜６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、核酸二本鎖の安定性を０．６〜１．２°Ｃだけ増大させることが示されており、本明細書において記載されているアンチセンスオリゴヌクレオチドに組み込まれてよい。一実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのピリミジン塩基は、５−置換ピリミジン塩基を含み、ピリミジン塩基は、シトシン、チミンおよびウラシルからなる群より選択される。一実施形態では、５−置換ピリミジン塩基は、５−メチルシトシンである。別の実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくとも１つのプリン塩基は、Ｎ−２、Ｎ−６置換プリン塩基を含む。一実施形態では、Ｎ−２、Ｎ−６置換プリン塩基は、２，６−ジアミノプリンである。
【０１０６】
モルホリノベースのオリゴマー（アンチセンスオリゴマーを含む）が、例えば、米国特許第５，６９８，６８５号、同第５，２１７，８６６号、同第５，１４２，０４７号、同第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，５２１，０６３号、同第５，５０６，３３７号および係属中の米国特許出願第１２／２７１，０３６号、同第１２／２７１，０４０号、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ／２００９／０６４４７１号および同第ＷＯ／２０１２／０４３７３０号ならびにＳｕｍｍｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  １９９７，  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，  ７，  １８７−１９５において詳述されており、これらは、これにより参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１０７】
したがって、一態様では、式ＩＩのオリゴヌクレオチド：
【化３８】
2020537652.tif 000039
または薬学的に許容されるその塩
［式中、
Ａは、ＯＨ、−ＮＨＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１〜６−アルキル）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、
【化３９】
2020537652.tif 000040
からなる群より選択され、
Ｒ５は、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘＯＨであり、ｘは、３〜１０であり、各アルキル基は、各出現において独立して、−Ｃ２〜６−アルキルであるか、またはＲ５は、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜６−アルキル、トリチル、モノメトキシトリチル、−Ｃ１〜６−アルキル−Ｒ６、−Ｃ１〜６−へテロアルキル−Ｒ６、−アリール−Ｒ６、−ヘテロアリール−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１〜６−アルキル−Ｒ６、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール−Ｒ６および−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール−Ｒ６からなる群より選択され、
Ｒ６は、ＯＨ、ＳＨおよびＮＨ２からなる群より選択されるか、あるいはＲ６は、固体支持体に共有結合的に連結しているＯ、ＳまたはＮＨであり、
各Ｒ１は、独立して、ＯＨまたは−ＮＲ３Ｒ４であり、
各Ｒ３およびＲ４は、各出現において独立して、−Ｃ１〜６−アルキルであり、
各Ｒ２は、Ｈ、核酸塩基、および化学保護基で官能基化された核酸塩基からなる群より独立して選択され、核酸塩基は、各出現において独立して、ピリジン、ピリミジン、トリアジナン、プリンおよびデアザ−プリンからなる群より選択されるＣ３〜６−複素環式環を含み、
ｚは、８〜４０であり、
Ｅは、Ｈ、−Ｃ１〜６−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜６−アルキル、ベンゾイル、ステアロイル、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチル、トリメトキシトリチル、および
【化４０】
2020537652.tif 000041
からなる群より選択され、
Ｑは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）６Ｃ（Ｏ）−または−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）２Ｓ２（ＣＨ２）２Ｃ（Ｏ）−であり、
Ｒ７は、−（ＣＨ２）２ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ８）２であり、
Ｒ８は、−（ＣＨ２）６ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ２である］
が、本明細書において提供される。
【０１０８】
式ＩＩの一実施形態では、Ａは、
【化４１】
2020537652.tif 000042
であり、
Ｅは、Ｈ、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルおよびステアロイルからなる群より選択され、
Ｒ５は、−Ｃ（Ｏ）（Ｏ−アルキル）ｘ−ＯＨであり、各アルキル基は、各出現において独立して、−Ｃ２〜６−アルキル、トリチルおよび４−メトキシトリチルであり、
各Ｒ２は、独立して、核酸塩基であり、核酸塩基は、各出現において独立して、ピリジン、ピリミジン、プリン、およびデアザ−プリンからなる群より選択されるＣ４〜６−複素環式環を含む。
【０１０９】
式ＩＩの別の実施形態では、Ｒ５は、Ｃ（Ｏ）（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）３−ＯＨであり、
各Ｒ２は、独立して、核酸塩基であり、核酸塩基は、各出現において独立して、ピリミジンまたはプリンを含む。
【０１１０】
また別の実施形態では、式ＩＩのオリゴヌクレオチドは、式ＩＩａのオリゴヌクレオチド：
【化４２】
2020537652.tif 000043
である。
【０１１１】
式ＩＩおよびＩＩａのある実施形態では、Ｒ２は、各出現において独立して、アデニン、２，６−ジアミノプリン、グアニン、ヒポキサンチン、シトシン、５−メチル−シトシン、チミン、ウラシルおよびヒポキサンチンであり、
各Ｒ１は、−Ｎ（ＣＨ３）２である。
【０１１２】
本明細書において記載されている通りのヌクレオチド部分の種々の実施形態が、表１において提供される。
【表１】
2020537652.tif 000044
【０１１３】
一部の実施形態では、本明細書において記載されているオリゴヌクレオチドは、溶媒和されていない。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドの１つまたは複数は、溶媒和形態である。当該技術分野において公知の通り、溶媒和物は、水、エタノール等の薬学的に許容される溶媒のいずれかであり得る。
【０１１４】
式ＩＩおよびＩＩａのオリゴヌクレオチドはそれらの中性形態で示されているが、一部の実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される塩形態で使用される。
【０１１５】
ペプチド
本明細書において提供されるオリゴヌクレオチドは、ＣＰＰにコンジュゲートされたオリゴヌクレオチド部分を含み、ＣＰＰは、二環式ペプチドを含む。一部の実施形態では、ＣＰＰは、化合物の細胞への輸送を強化するために有効な、アルギニンリッチペプチド輸送部分であり得る。輸送部分は、一部の実施形態では、オリゴマーの末端に付着している。ペプチドは、所与の細胞培養集団の細胞の、間にあるすべての整数を含む３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％以内で細胞透過を誘導する能力を有し、複数の組織内における巨大分子トランスロケーションを、全身投与時にｉｎ  ｖｉｖｏで可能にする。一実施形態では、細胞透過性ペプチドは、アルギニンリッチペプチド輸送体であってよい。種々の実施形態では、本開示のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ＣＰＰとアンチセンスオリゴヌクレオチドとの間のリンカーとして、グリシンを利用してよい。
【０１１６】
上述した通りの輸送部分は、付着した輸送部分の非存在下におけるオリゴマーの取り込みと比べて、付着したオリゴマーの細胞移入を大幅に強化することが示されている。取り込みは、コンジュゲートされていない化合物と比べて少なくとも１０倍、一部の実施形態では２０倍強化され得る。
【０１１７】
アルギニンリッチペプチド輸送体（すなわち、細胞透過性ペプチド）の使用は、本開示を実施する際に特に有用である。ある特定のペプチド輸送体は、アンチセンス化合物の、筋細胞を含む初代細胞への送達において高度に有効であることが示されている。さらに、ペネトラチンおよびＴａｔペプチド等の他の公知のペプチド輸送体と比較して、本明細書において記載されているペプチド輸送体は、アンチセンスＰＭＯにコンジュゲートされた場合、いくつかの遺伝子転写物のスプライシングを変更する能力の強化を実証する。
【０１１８】
故に、一態様では、式ＩＩＩのペプチド：
【化４３】
2020537652.tif 000045
または薬学的に許容されるその塩
［式中、
Ｇは、Ｈ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜６−アルキル、ベンゾイルおよびステアロイルからなる群より選択され、Ｇは、ペプチドのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結しており、
各Ｊは、各出現において独立して、構造
【化４４】
2020537652.tif 000046
のアミノ酸から選択され、
各Ｒ９は、各出現において独立して、Ｈ、アミノ酸側鎖、および化学保護基で官能基化されたアミノ酸側鎖からなる群より選択され、
Ｒ９の３または４個のアミノ酸側鎖基は、各出現において独立して、チオールまたは化学保護基で官能基化されたチオールを含み、
ｒおよびｑは、独立して、０、１、２、３または４であり、
Ｌは、固体支持体に共有結合的に連結していてよい−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１〜６−Ｃ１〜６−ヘテロ芳香族−（ＣＨ２）１〜６Ｃ（Ｏ）であり、
ｔは、４〜１６である］
が、本明細書において提供される。
【０１１９】
一実施形態では、Ｒ９の３または４個のアミノ酸側鎖は、各出現において独立して、硫黄原子を含み、
ａ）硫黄原子の数が３である場合には、硫黄原子は、それらが付着している原子と一緒になって、構造
【化４５】
2020537652.tif 000047
を形成し、それにより、アミノ酸が二環式構造を形成するか、または
ｂ）硫黄原子の数が４である場合には、硫黄原子は、それらが付着している原子と一緒になって、構造
【化４６】
2020537652.tif 000048
の２回の出現を形成し、それにより、アミノ酸が二環式構造を形成し、
式中、ｄは、０または１であり、Ｍは、
【化４７】
2020537652.tif 000049
から選択され、
式中、各Ｒ１０は、各出現において独立して、Ｈまたはハロゲンである。
【０１２０】
別の実施形態では、Ｍは、
【化４８】
2020537652.tif 000050
である。
【０１２１】
さらに別の実施形態では、３個のアミノ酸側鎖基は、各出現において独立して、システインまたはホモシステインアミノ酸側鎖基である。
【０１２２】
さらに別の実施形態では、４個のアミノ酸側鎖基は、各出現において独立して、システインまたはホモシステインアミノ酸側鎖基である。
【０１２３】
また別の実施形態では、各Ｊは、各出現において独立して、α−アミノ酸、β２−アミノ酸およびβ３−アミノ酸から選択される。
【０１２４】
別の実施形態では、ｒおよびｑは、それぞれ０である。
【０１２５】
別の実施形態では、Ｊは、システインおよびアルギニンから独立して選択される。
【０１２６】
さらに別の実施形態では、３個のＪ基は、システインである。
【０１２７】
さらに別の実施形態では、４個のＪ基は、システインである。
【０１２８】
また別の実施形態では、Ｌは、−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）１〜６−Ｃ１〜６−ヘテロ芳香族−（ＣＨ２）１〜６Ｃ（Ｏ）である。
【０１２９】
別の実施形態では、Ｌは、
【化４９】
2020537652.tif 000051
である。
【０１３０】
さらに別の実施形態では、Ｇは、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、ベンゾイルおよびステアロイルからなる群より選択される。
【０１３１】
また別の実施形態では、Ｇは、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３またはＨである。
【０１３２】
別の実施形態では、Ｇは、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３である。
【０１３３】
別の実施形態では、Ｇは、Ｈである。
【０１３４】
さらに別の実施形態では、Ｇは、Ｊのカルボキシ末端にアミド結合によって共有結合的に連結している。さらなる実施形態では、Ｌは、Ｊのアミノ末端にアミド結合によって共有結合的に連結している。
【０１３５】
別の実施形態では、ｄは、０である。
【０１３６】
さらに別の実施形態では、ｄは、１である。
【０１３７】
一部の実施形態では、本明細書において記載されているペプチドは、溶媒和されていない。他の実施形態では、ペプチドの１つまたは複数は、溶媒和形態である。当該技術分野において公知の通り、溶媒和物は、水、エタノール等の薬学的に許容される溶媒のいずれかであり得る。
【０１３８】
式ＩＩＩのペプチドはそれらの中性形態で示されているが、一部の実施形態では、これらのオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される塩形態で使用される。
【０１３９】
方法
それを必要とする被験体において、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を処置する方法であって、被験体に、式Ｉ、ＩａまたはＩｂのペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【０１４０】
したがって、一態様では、それを必要とする被験体において、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を処置する方法であって、被験体に、本開示のペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートを投与するステップを含む、方法が、本明細書において提供される。
【０１４１】
一実施形態では、筋疾患は、デュシェンヌ型筋ジストロフィーである。
【０１４２】
別の実施形態では、ウイルス感染症は、マールブルグウイルス、エボラウイルス、インフルエンザウイルスおよびデングウイルスからなる群より選択されるウイルスによって引き起こされる。
【０１４３】
別の実施形態では、細菌感染症は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓによって引き起こされる。
【０１４４】
本明細書で考慮される被験体は、典型的には、ヒトである。しかしながら、被験体は、処置が所望される任意の哺乳動物であり得る。故に、本明細書において記載されている方法は、ヒトおよび獣医学的適用の両方に適用され得る。
【０１４５】
投与／用量
治療用組成物の製剤およびそれらのその後の投与（投薬）は、当業者の技量内である。投薬は、処置される疾患状況の重症度および応答性に依存し、処置の経過は、数日間から数か月間、または疾患状況の十分な縮小が達成されるまで継続する。最適な投薬スケジュールは、患者の体内における薬物蓄積の測定から算出することができる。
【０１４６】
当業者ならば、最適投薬量、投薬方法論および繰り返し率を簡単に決定することができる。最適投薬量は、個々のオリゴマーの相対的効力に応じて変動してよく、概して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であることが分かっているＥＣ５０に基づいて推定することができる。概して、投薬量は、０．０１μｇ〜１００ｇ／体重１ｋｇであり、１日、１週間、１か月または１年に１回または複数回、またはさらには２〜２０年ごとに１回、与えられてよい。当業者ならば、体液または組織中における測定された滞留時間および薬物の濃度に基づき、投薬の繰り返し率を簡単に推定することができる。処置成功後、疾患状況の再発を防止するために、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合があり、オリゴマーは、０．０１μｇ〜１００ｇ／体重１ｋｇの範囲内の維持用量で、１日に１回または複数回〜２０年ごとに１回、投与される。
【０１４７】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチド（式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチド）は、単独で投与される。
【０１４８】
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、治療有効量または投薬量で投与される。「治療有効量」は、それ単独で患者に投与された場合、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を有効に処置する、式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチドの量である。所与の事例において特定の被験体に対して「治療有効量」であることが判明している量は、そのような投薬量が当業者によって「治療有効量」であると考えられているにもかかわらず、検討中の疾患または状態を同様に処置されている被験体の１００％には有効でない場合がある。治療有効量に対応するオリゴヌクレオチドの量は、疾患の種類、疾患の段階、処置されている患者の年齢、および他の事実に強く依存する。
【０１４９】
異なる実施形態では、式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチドおよび使用される有効量に応じて、オリゴヌクレオチドは、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症に関与する遺伝子の発現をモジュレートすることができる。
【０１５０】
式ＩＩまたはＩＩａのオリゴヌクレオチドの量は、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症の有効な処置をもたらすべきであるが、量は、好ましくは、患者にとって過度に毒性ではない（すなわち、量は、好ましくは、医療ガイドラインによって確立された通りの毒性限界内である）。一部の実施形態では、過度の毒性を防止するまたは筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症のより効果的な処置を提供することのいずれかまたは両方のために、投与される総投薬量に対する限定が提供される。典型的には、本明細書で考慮される量は、１日当たりであるが、半日および２日または３日サイクルも本明細書で考慮される。
【０１５１】
異なる投薬量レジメンが、筋疾患、ウイルス感染症または細菌感染症を処置するために使用されてよい。一部の実施形態では、上述した例示的な投薬量のいずれか等の１日投薬量が、１日に１回、２回、３回、または４回、３、４、５、６、７、８、９、または１０日間投与される。処置されている疾患の段階および重症度に応じて、より短い処置時間（例えば、最大５日間）が高い投薬量とともに用いられてよく、またはより長い処置時間（例えば、１０またはそれよりも多い日数、または週数、または月数、またはそれよりも長い）が低い投薬量とともに用いられてよい。一部の実施形態では、１日に１回または２回の投薬量は、１日おきに投与される。
【０１５２】
式ＩＩおよびＩＩａのオリゴヌクレオチドまたはそれらの薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物形態は、純粋な形態でまたは適切な医薬組成物で、当該技術分野において公知の許容される投与モードまたは作用物質のいずれかを介して投与され得る。オリゴヌクレオチドは、例えば、経口的に、鼻に、非経口的に（静脈内、筋肉内または皮下）、局所的に、経皮的に、膣内に、膀胱内に、大槽内にまたは直腸的に、投与され得る。剤形は、例えば、固体、半固体、凍結乾燥粉末または液体剤形、例えば、錠剤、丸剤、軟質弾性または硬質ゼラチンカプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤、坐剤、エアゾール剤等、例えば、正確な投薬量の単純な投与に好適な単位剤形であり得る。特定の投与経路は、経口、特に、好都合な１日投薬量レジメンを、処置される疾患の重症度に従って調整することができるものである。
【０１５３】
助剤およびアジュバント剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、懸濁化剤、甘味剤、矯味矯臭剤、着香剤、乳化剤および分注剤（ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含んでよい。微生物の活動の防止は、概して、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等、種々の抗菌および抗真菌剤によって提供される。糖、塩化ナトリウム等の等張剤も含まれてよい。注射可能薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。助剤は、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝剤および酸化防止剤、例えば、クエン酸、ソルビタンモノラウレート、オレイン酸トリエタノールアミン、ブチル化ヒドロキシトルエン等も含むことができる。
【０１５４】
固体剤形は、コーティングおよびシェル、例えば、腸溶コーティングおよび当該技術分野において周知である他のものを用いて調製することができる。これらは、乳白剤を含有することができ、腸管のある特定の部分において活性オリゴヌクレオチド（単数または複数）を遅延方式で放出するような組成のものであり得る。使用され得る包理組成物の例は、ポリマー性物質およびワックスである。活性オリゴヌクレオチドは、適切ならば、上で言及した賦形剤の１つまたは複数を加えたマイクロカプセル化形態であることもできる。
【０１５５】
経口投与のための液体剤形は、薬学的に許容される乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤を含む。そのような剤形は、例えば、本明細書において記載されているＨＤＡＣ阻害剤もしくはレチノイン酸または薬学的に許容されるその塩および必要に応じた薬学的アジュバントを、担体、例えば、水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノール等；可溶化剤および乳化剤、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド；油、特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油およびゴマ油、グリセロール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル；またはこれらの物質の混合物等に、溶解する、分散する等して、それにより、溶液または懸濁液を形成することによって、調製される。
【０１５６】
概して、意図される投与モードに応じて、薬学的に許容される組成物は、約１重量％〜約９９重量％の本明細書において記載されているオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩および９９重量％〜１重量％の薬学的に許容される賦形剤を含有することになる。一例では、組成物は、約５重量％〜約７５重量％の間の本明細書において記載されているオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容されるその塩となり、残りは、好適な薬学的賦形剤である。
【０１５７】
そのような剤形を調製する実際の方法は、当業者に公知であるかまたは明らかとなるであろう。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  １９９０）を参照されたい。
【０１５８】
キット
他の実施形態では、キットが提供される。本開示に従うキットは、本開示のオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲートまたは組成物を含む、パッケージを含む。一部の実施形態では、キットは、式Ｉ、ＩａもしくはＩｂに従うペプチド−オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的に許容されるその塩を含む。他の実施形態では、キットは、式ＩＩもしくはＩＩａに従うオリゴヌクレオチド、または薬学的に許容されるその塩を含む。また他の実施形態では、キットは、式ＩＩＩに従うペプチド、または薬学的に許容されるその塩を含む。
【０１５９】
語句「パッケージ」は、本明細書において提示されるオリゴヌクレオチドまたは組成物を含有する任意の容器を意味する。一部の実施形態では、パッケージは、箱または包装紙であり得る。薬学的製品を包装する際に使用するための包装材料は、当業者に周知である。薬学的包装材料の例は、ボトル、管、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、コンテナ、シリンジ、ボトル、ならびに、選択された製剤ならびに意図される投与モードおよび処置に好適な任意の包装材料を含むがこれらに限定されない。
【０１６０】
キットは、パッケージ内に含有されていないがパッケージの外側に付着している物品、例えばピペットも含有することができる。
【０１６１】
キットは、本開示のオリゴヌクレオチドまたは組成物を患者に投与するための指示をさらに含有することができる。キットは、米国食品医薬品局等の規制機関によって承認された本明細書におけるオリゴヌクレオチドの使用の指示も含むことができる。キットは、オリゴヌクレオチドについてのラベリングまたは製品添付文書も含有することができる。パッケージもしくは任意の製品添付文書または両方は、それら自体が規制機関によって承認されてよい。キットは、パッケージ内に、固相または液相（提供される緩衝液等）のオリゴヌクレオチドを含むことができる。キットは、方法を行うために溶液を調製するための緩衝液、および液体を１つのコンテナから別のコンテナへ移すためのピペットも含むことができる。
【実施例】
【０１６２】
例証を目的としておよび本開示のある特定の具体的な実施形態を記載するために、実施例が以下で明記されている。しかしながら、特許請求の範囲は、本明細書において明記されている実施例によって決して限定されるものではない。開示されている実施形態への種々の変更および修正は、当業者に明らかであろうし、限定なく、本開示の化学構造、置換基、誘導体、製剤または方法に関連するものを含むそのような変更および修正は、本開示の趣旨および添付の特許請求の範囲から逸脱することなく、為され得る。本明細書におけるスキーム内の構造における変数の定義は、本明細書において提示される式中の対応する位置のものに見合っている。
【０１６３】
（実施例１）
ペプチド調製および精製のための一般的方法
高速流動ペプチド合成
ペプチドは、自動流動ペプチド合成装置を使用して０．１ｍｍｏｌスケールで合成した。ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ  Ｒｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＨＹＲ樹脂（２００ｍｇ）を、９０℃で維持した反応器にロードした。すべての試薬を、９０℃で維持したステンレス鋼ループに通すＨＰＬＣポンプを用いて８０ｍＬ／分で流した後、反応器に導入した。各カップリングについて、ＤＭＦ中０．２Ｍアミノ酸および０．２Ｍ  ＨＡＴＵを含有する１０ｍＬの溶液を、２００μＬのジイソプロピルエチルアミンと混合し、反応器に送達した。１０．４ｍＬの２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンを使用して、Ｆｍｏｃ除去を遂行した。各ステップの間に、１５ｍＬのＤＭＦを使用して、反応器を洗い流した。最終カップリングはアミノ酸ではなく４−ペンチン酸とであったが、同じ条件を使用した。合成の完了後、樹脂をＤＣＭで３回洗浄し、真空下で乾燥させた。
【０１６４】
ペプチド開裂および脱保護
各ペプチドを、６ｍＬのＲｅａｇｅｎｔ  Ｋ（８２．５％トリフルオロ酢酸、５％フェノール、５％水、５％チオアニソールおよび２．５％  １，２−エタンジチオール（ＥＤＴ））での処理による同時包括的な側鎖脱保護および樹脂からの開裂に供した。開裂物を室温で１６時間放置して、Ｐｂｆの完全な除去を確実にした。開裂カクテルを濾過して樹脂を除去し、Ｎ２を混合物に吹き込むことによって、蒸発させた。次いで、約３５ｍＬの冷エーテルを添加し、粗生成物を、３分間の遠心分離を通してペレット化した。このエーテル研和および遠心分離をもう２回繰り返した。第３の洗浄の後、ペレットを５０％水および５０％アセトニトリルに再溶解し、凍結乾燥した。
【０１６５】
ペプチド精製
溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡを含有する水
溶媒Ｂ：０．１％ＴＦＡを含有するアセトニトリル
凍結乾燥したペプチドを、最小体積の移動相（９５％Ａ、５％Ｂ）に溶解した。溶液を、質量ベースの精製システムに付着させた逆相ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ１８カラム：９．４×２５０ｍｍ、５μｍまたはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ３カラム：９．４×２５０ｍｍ、５μｍ）にロードした。線形勾配は０．５％Ｂ／分で５％Ｂから５５％Ｂまで実行した。機器からの各画分についての質量データを使用して、純粋な画分のみをプールし、凍結乾燥した。画分プールの純度をＬＣ−ＭＳによって確認した。
【０１６６】
実施例１のプロトコールを使用して、表２のペプチドを合成した。
【表２】
2020537652.tif 000052
【０１６７】
（実施例２）
１ａおよび２ａの合成
【化５０】
2020537652.tif 000053
ペプチド１（２８ｍｇ、１０μｍｏｌ）または２（２０ｍｇ、１２μｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、ＤＭＦおよびジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）中のデカフルオロビフェニルのストック溶液を、１ｍＭペプチド、１００ｍＭデカフルオロビフェニルおよび５０ｍＭ  ＤＩＥＡの反応容器における最終濃度のために添加した。２時間後、ＤＭＦを回転蒸発によって除去して、１ｍＬの最終体積とし、２％ＴＦＡを含有する３９ｍＬの８５：１５  水：アセトニトリルを添加することによって、反応物をクエンチした。粗反応物を遠心分離し、濾過し、質量指向（ｍａｓｓ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ）半分取逆相ＨＰＬＣによって上述した通りに精製して、１ａ（１３ｍｇ、３５％）または２ａ（１１ｍｇ、３５％）を得た。
【０１６８】
（実施例３）
１ｂおよび２ｂの合成
【化５１】
2020537652.tif 000054
精製したペプチド１ａ（１０ｍｇ、２．５６μｍｏｌ）または２ａ（５ｍｇ、１．９μｍｏｌ）をＤＭＦに溶解し、反応容器における最終濃度が、１ｍＭペプチド、１ｍＭ  １，３，５−ベンゼントリチオールおよび５０ｍＭ  ＤＩＥＡとなるように、ＤＭＦおよびＤＩＥＡ中の１，３，５−ベンゼントリチオールのストック溶液を添加した。粗反応物を、質量指向半分取逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ３カラム：９．４×２５０ｍｍ、５μｍ）によって精製した。２時間後、ＤＭＦを回転蒸発によって除去して、１ｍＬの最終体積とし、２％ＴＦＡを含有する３９ｍＬの８５：１５  水：アセトニトリルを添加することによって、反応物をクエンチした。粗反応物を質量指向半分取逆相ＨＰＬＣによって上述した通りに精製して、１ｂ（６．４ｍｇ、６２％）または２ｂ（１．８ｍｇ、３５％）を得た。
【０１６９】
（実施例４）
直交脱保護を使用する３ｂの合成
【化５２】
2020537652.tif 000055
ペプチド３は、ｔｅｒｔ−ブチルチオール保護システインをシステイン残基１および２に組み込んだこと、ならびにトリチル保護システインをシステイン残基３および４に組み込んだことを除き、標準的な自動流動化学を使用して合成した。開裂および脱保護の後、ペプチドを逆相ＨＰＬＣによって精製した。実施例３に類似する手順を使用して、ペプチドを大環状化（ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｚｅ）した。ペプチド（１ｍＭ）を水中のＤＴＴ（５０ｍＭ）およびトリス（２５ｍＭ  ｐＨ８）とともにインキュベートすることによって、ｔｅｒｔ−ブチルチオール保護システイン残基１および２を脱保護した。残留ＤＴＴを除去するための固相抽出（ＳＰＥ）後、実施例３に類似する手順を使用して、残り２つの遊離システイン残基を大環状化した。
【０１７０】
（実施例５）
制御二環化を使用する３ｂの合成
【化５３】
2020537652.tif 000056
３ａの合成のための手順
ペプチド３は、ｔｅｒｔ−ブチルチオール保護システインをシステイン残基１および３に組み込んだこと、ならびにトリチル保護システインをシステイン残基２および４に組み込んだことを除き、２００ｍｇの樹脂を使用する標準的な自動流動化学を使用して合成した。ｔｅｒｔ−ブチルチオール基は、０．２５ｍＬのＤＩＥＡを加えた２．５ｍＬのＤＭＦ中の３．８ｍｍｏｌ  ＤＴＴを使用し、樹脂上で脱保護した。反応を６０℃で２０分間進めた。樹脂をＤＭＦで３回洗浄し、続いて、デカフルオロビフェニル（１ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬのＤＭＦおよび０．２５ｍＬのＤＩＥＡとともに添加した。反応を室温で２時間進め、次いで、樹脂をＤＭＦ（３×）およびＤＣＭ（３×）で洗浄した。次いで、ペプチドを樹脂から開裂し、通常通りに精製して、３ａを得た。
【０１７１】
二環３ｂ制御二環化の合成のための手順
ペプチド３ａ（１５ｍｇ、４μｍｏｌ、６配位ＴＦＡ塩と仮定する）を４ｍＬのＤＭＦに懸濁した。ニートのＤＩＥＡ（３５．４μＬ）を添加して、５０ｍＭの濃度を達成した。反応を５分間進めさせ、その後、完全変換が観察される。ＤＭＦを回転蒸発によって除去して、１ｍＬの最終体積とし、２％ＴＦＡを含有する３９ｍＬの水を添加することによって、反応物をクエンチした。反応物を質量指向半分取逆相ＨＰＬＣによって精製して、ペプチド３ｂ（１２．０ｍｇ、８１％収率）を得た。
【０１７２】
（実施例６）
６ｃの合成
【化５４】
2020537652.tif 000057
ペプチド６は、ｔｅｒｔ−ブチルチオール保護システインをシステイン残基１に組み込んだこと、およびトリチル保護システインをシステイン残基２に組み込んだことを除き、２００ｍｇの樹脂を使用する標準的な自動流動化学を使用して合成した。ｔｅｒｔ−ブチル基は、０．２５ｍＬのＤＩＥＡを加えた２．５ｍＬのＤＭＦ中の３．８ｍｍｏｌ  ＤＴＴを使用し、樹脂上で脱保護した。反応を６０℃で２０分間進めた。樹脂をＤＭＦで３回洗浄し、続いて、デカフルオロビフェニル（１ｍｍｏｌ）を２．５ｍＬのＤＭＦおよび０．２５ｍＬのＤＩＥＡとともに添加した。反応を室温で２時間進め、次いで、樹脂をＤＭＦ（３×）およびＤＣＭ（３×）で洗浄した。次いで、ペプチドを樹脂から開裂し、通常通りに精製して、モノアリール６ａを得た。
【０１７３】
ペプチド（１２ｍｇ、３．９μｍｏｌ、６配位ＴＦＡ塩と仮定する）を３．９ｍＬのＤＭＦに懸濁することによって、ペプチド６ａを大環状化した。ニートのＤＩＥＡ（３３．８μＬ）を添加して、５０ｍＭの濃度を達成した。反応を５分間進めさせ、その後、完全変換が観察された。ＤＭＦを回転蒸発によって除去して、１ｍＬの最終体積とし、２％ＴＦＡを含有する３９ｍＬの水を添加することによって、反応物をクエンチした。反応物を質量指向半分取逆相ＨＰＬＣによって精製して、ペプチド６ｃ（８．４ｍｇ、８８％収率）を得た。
【０１７４】
（実施例６）
ペプチドコンジュゲーション
【化５５】
2020537652.tif 000058
５−アジドペンタン酸をＰＭＯにカップリングするための手順
ＰＭＯ  ＩＶＳ−６５４（Ｒ２＝５’−ＧＣＴ  ＡＴＴ  ＡＣＣ  ＴＴＡ  ＡＣＣ  ＣＡＧ−３’；ｚ＝１８）（２００ｍｇ、３２μｍｏｌ）を、６００μＬのＤＭＳＯに溶解した。溶液に、２４４μＬのＤＭＦ中のＨＢＴＵ（３２０μＬのＤＭＦ中０．４Ｍ  ＨＢＴＵ、１２８μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（２２．３μＬ、１２８μｍｏｌ）で活性化させた４当量の５−アジドペンタン酸（１３．６μＬ、１２８μｍｏｌ）を含有する溶液を添加した（最終反応体積＝１．２ｍＬ）。反応を２５分間進めた後、１ｍＬの水および２ｍＬの水酸化アンモニウムでクエンチした。水酸化アンモニウムは、反応過程中に形成されたあらゆるエステルを加水分解する。１時間後、溶液を４０ｍＬに希釈し、逆相ＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ３カラム：２１．２×１００ｍｍ、５μｍ）および５８分間かけて（１％Ｂ／分）２から６０％Ｂまでの線形勾配（溶媒Ａ：水；溶媒Ｂ：アセトニトリル）を使用して精製した。機器からの各画分についての質量データを使用して、純粋な画分のみをプールし、凍結乾燥した。画分プールの純度をＬＣ−ＭＳによって確認した。凍結乾燥により、１７１ｍｇの乾燥粉末（８４％収率）を得た。
【０１７５】
アジド／アルキンヒュスゲン環化付加によるＰＭＯ−ペプチドコンジュゲーションのための一般的手順
セプタムキャップ付きの２０ｍＬのシンチレーションバイアルに、ペプチドアルキン（１．１μｍｏｌ）、ＩＳＶ２−６５４アジド（０．９５μｍｏｌ）および臭化銅（０．０５ｍｍｏｌ）を投入した。バイアルを窒素で５分間パージして、酸素の除去を確実にした後、セプタムを通して約１ｍＬのＤＭＦを添加した。反応混合物を１分間ボルテックスした。２時間後、反応混合物を１０ｍＬの５０ｍＭトリス（ｐＨ８）で希釈し、逆相ＨＰＬＣカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＳＢ  Ｃ３  ９．４×５０ｍｍ、５μｍ）にロードした。２０分間かけて５〜４５％Ｂの線形勾配を使用して、クロマトグラフィーを実施した。溶媒Ａ：水中５ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ＝８；溶媒Ｂ：９０％アセトニトリル  １０％水中５ｍＭ酢酸アンモニウム  ｐＨ＝８。機器からの各画分についての質量データを使用して、純粋な画分のみをプールし、凍結乾燥した。画分プールの純度をＬＣ−ＭＳによって確認した。
【０１７６】
（実施例７）
タンパク質分解アッセイ
各ペプチドについて、１９．６μＬのＰＢＳ、０．２μＬのトリプシン（１ｍＭ  ＨＣｌ中０．００５ｍｇ／ｍＬストック溶液）および０．２μＬのペプチド（１ｍＭ  ＤＭＳＯストック溶液）を、ＰＣＲ管中で合わせた。得られた反応混合物をキャップし、３７℃でインキュベートした。各時点で、１．０μＬの粗反応物をＬＣ−ＭＳバイアルに移し、０．１％ＴＦＡを含有する９９μＬの５０：５０  水：アセトニトリルの添加によってクエンチした。１．０μＬのクエンチした反応物を、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５５０  ｉＦｕｎｎｅｌ  Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳに注入した。時点は、ｔ＝０分、２０分、４０分および６０分で取った。＋５電荷状態ｍ／ｚについて抽出イオン電流（ＥＩＣ）を、ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒソフトウェアを使用して分析した。ＥＩＣピークを積分し、インタクトなペプチドのパーセントを、（ＥＩＣｔ１／ＥＩＣｔ０）×１００［式中、ＥＩＣｔ１は所与の時点におけるピーク積分であり、ＥＩＣｔ０は時刻ｔ＝０におけるピーク積分である］によって決定した。結果を図２に示す。
【０１７７】
（実施例８）
ＥＧＦＰ−６５４マウスにおけるペプチド−ＰＭＯコンジュゲートのｉｎ  ｖｉｖｏ投与
ｉｎ  ｖｉｖｏアンチセンス活性についてのｅＧＦＰベースのアッセイを使用して、修飾されたサブユニット間連結を含むオリゴマーを評価した。ｅＧＦＰ−６５４導入遺伝子が体全体に均一に発現されているトランスジェニックｅＧＦＰマウスモデルについては、以前に記載されている。このモデルは、本発明の修飾されたオリゴマーが異常なスプライシングをブロックし、修飾され強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）プレｍＲＮＡの正しいスプライシングを回復する、活性のためのスプライシングアッセイを使用する。このアプローチにおいて、各オリゴマーのアンチセンス活性は、ｅＧＦＰレポーターの上方調節に直接比例する。結果として、同じオリゴマーの機能的効果を、ほとんどすべての組織においてモニターすることができる。これは、その発現がある特定の組織のみに制限されているまたは表現型的に関連している遺伝子を標的化するオリゴマーとは対照的である。ｅＧＦＰ−６５４マウスにおいて、プレｍＲＮＡはすべての組織において容易に検出可能であったが、骨髄、皮膚および脳においてはより少量が見られた。翻訳されたｅＧＦＰのレベルは、アンチセンスオリゴマーの効力および作用部位におけるそれらの濃度に比例する。種々の組織から単離された全ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲは、調査したすべての組織におけるｅＧＦＰ−６５４転写物の発現を示した。
【０１７８】
この実施例において記載される具体的なペプチド−ＰＭＯコンジュゲートは、ＰＭＯ−ＩＶＳ２−６５４（実施例６において記載されている）にカップリングされた環式および二環式ペプチドである。
【０１７９】
ｅＧＦＰ導入遺伝子を標的化するこれらのペプチド−ＰＭＯコンジュゲートを、定位固定装置（ｔｅｒｅｏｔａｘｉｓ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）を使用する単一の脳室内（ｉｎｔｒａｃｅｂｒｅｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）（ＩＣＶ）注射によって、ＥＧＦＰ−６５４マウスの左側脳室に投与した。用量は、すべてのマウスについて５ｍｇ／ｋｇからなるか、またはある用量範囲にまたがるものであった。注射２週間後、マウスを安楽死させ、脳を除去し、正中線で矢状に、左右の半球に半分に切断した。切断表面を下向きにフラットベッドプラテンに置くことによって、各半球をＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ（ＧＥ）で画像化した。ｅＧＦＰ蛍光を励起する４８８ｎｍレーザーを使用して、スキャンを収集した。得られた画像をＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ）で分析して、各半球の蛍光強度を定量化した。各半球内の検出された全蛍光強度を、その半球中に存在するピクセル数で割って、脳の各半分について面積非依存的平均蛍光値を得た。処置群における各生存動物の活性の結果を、散布図上の点として表現する。群の平均蛍光は、水平線、＋／−ＳＤによって示される。
【０１８０】
図１は、ＰＭＯ−ＩＶＳ２−６５４（実施例６において記載されている）にカップリングされた環式および二環式ペプチドが、細胞エクソンスキッピングアッセイにおいて活性の増大を実証することを示す。ＩＶＳ２−６５４は、変異したｅＧＦＰプレｍＲＮＡのスプライシングを訂正する。スプライス訂正の増大は、蛍光の増大につながる。結果は、コンジュゲートされていないＩＶＳ２−６５４ＰＭＯに対して正規化したものである。
【０１８１】
参照による組み込み
本出願全体を通して引用されるすべての参考文献（文献参照、発行済み特許、公開された特許出願および同時係属中の特許出願を含む）の内容は、これによりその全体が本明細書に明示的に組み込まれる。別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての技術的および科学的用語は、当業者に一般的に公知の意味と一致する。
【０１８２】
均等物
当業者ならば、日常実験以上のものを使用することなく、本明細書において記載されている開示の具体的な実施形態の多くの均等物を認識または解明することができるであろう。そのような均等物は、下記の特許請求の範囲によって包含されるように意図されている。
【図１】
2020537652.tif 000077
【図２】
2020537652.tif 000078
【配列表】
2020537652000001.app
【国際調査報告】
2020537652.tif 000079
2020537652.tif 000080