(57)【要約】  本明細書ではＧＤＦ１５分子が提供される。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、ＧＤＦ１５領域がＦｃ領域に融合したＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体である。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、リンカーを介してＦｃ領域に融合している。さらに、本明細書において提供されるのは、ＧＤＦ１５分子を作製及び使用するための方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーを介してＦｃ領域に連結されたＧＤＦ１５領域を含む融合タンパク質であって、前記ＧＤＦ１５領域は、配列番号６のアミノ酸配列及び少なくとも１つの変異を含み、前記変異の少なくとも１つは、５位のアスパルテートである、融合タンパク質。
【請求項２】
前記５位のアスパルテートは、グルタメートに変異している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＧＤＦ１５領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＧＤＦ１５領域は、３位のアスパラギンの変異をさらに含む、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
３位のアスパラギンは、グルタミンに変異している、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＧＤＦ１５領域は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー又は（Ｇ４Ｑ）ｎリンカーであり、ｎは、０より大きい、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ｎは、１又は２である、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
リンカーを介してＦｃ領域に連結されたＧＤＦ１５領域を含む融合タンパク質であって、前記ＧＤＦ１５領域は、配列番号６のアミノ酸配列及び少なくとも１つの変異を含み、前記変異の少なくとも１つは、３位のアスパラギン又は５位のアスパルテートであり、且つ前記リンカーは、（Ｇ４Ｑ）ｎリンカーであり、ｎは、２より大きい、融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ｎは、３又は４である、請求項７又は９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＧＤＦ１５領域は、５位のアスパルテートのグルタメートへの変異を含む、請求項９又は１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ＧＤＦ１５領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ＧＤＦ１５領域は、前記３位のアスパラギンのグルタミンへの変異を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ＧＤＦ１５領域は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記Ｆｃ領域は、電荷対の変異を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記Ｆｃ領域は、トランケートされたヒンジ領域を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記Ｆｃ領域は、表３から選択される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、代謝症候又は障害を処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全体を本明細書に援用する、２０１８年４月９日に出願された米国仮特許出願第６２／６５５，１０８号明細書の利益を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、電子フォーマットの配列表と共に提出されている。配列表は、２０１９年３月１５日に作成されたＡ−２２３９−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔという名称のファイル（サイズは１０９ｋｂ）として提供される。配列表の電子フォーマットにおける情報は、その全体を本明細書に援用する。
【０００３】
発明の属する技術分野
本開示は、ＧＤＦ１５融合タンパク質などのＧＤＦ１５分子、その組成物、並びにそうしたタンパク質を作製及び使用するための方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
増殖分化因子１５（ＧＤＦ１５）は、マクロファージ阻害性サイトカイン１（ＭＩＣ１）（Ｂｏｏｔｃｏｖ  ＭＲ，１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９４：１１５１４−９）、胎盤骨形成因子（ＰＬＡＢ）（Ｈｒｏｍａｓ  Ｒ  １９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１３５４：４０−４）、胎盤トランスフォーミング増殖因子β（ＰＴＧＦＢ）（Ｌａｗｔｏｎ  ＬＮ  １９９７，Ｇｅｎｅ．２０３：１７−２６）、前立腺由来因子（ＰＤＦ）（Ｐａｒａｌｋａｒ  ＶＭ  １９９８，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３：１３７６０−７）及び非ステロイド系抗炎症剤活性化遺伝子（ＮＡＧ−１）（Ｂａｅｋ  ＳＪ  ２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：３３３８４−９２）とも呼ばれ、約２５ｋＤａのホモ二量体として血漿中を循環する分泌タンパク質である。ＧＤＦ１５は、高親和性でＧＤＮＦファミリー受容体α様（ＧＦＲＡＬ）に結合する。ＧＤＦ１５誘導性細胞内シグナル伝達は、共受容体ＲＥＴとＧＦＲＡＬの相互作用を必要とすると考えられる。
【０００５】
ＧＤＦ１５は、複数の生物活性との関連性が指摘されている。ＧＤＦ１５の増加は、体重減少と相関関係にあることが示されており、ＧＤＦ１５の投与は、食物摂取量及び体重を減少させることが示されている。したがって、療法剤として投与できる有効なＧＤＦ１５分子が求められている。本開示は、この要求を満たすＧＤＦ１５分子を提供し、関連する利点を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｂｏｏｔｃｏｖ  ＭＲ，１９９７，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９４：１１５１４−９
【非特許文献２】Ｈｒｏｍａｓ  Ｒ  １９９７，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１３５４：４０−４
【非特許文献３】Ｌａｗｔｏｎ  ＬＮ  １９９７，Ｇｅｎｅ．２０３：１７−２６
【非特許文献４】Ｐａｒａｌｋａｒ  ＶＭ  １９９８，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７３：１３７６０−７
【非特許文献５】Ｂａｅｋ  ＳＪ  ２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７６：３３３８４−９２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書において提供されるのは、ＧＤＦ１５分子、その分子を作製する方法及びその分子を使用する方法である。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、ＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質である。融合タンパク質は、Ｆｃ領域に連結されたＧＤＦ１５領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、リンカーを介してＦｃに連結される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、配列番号６のアミノ酸配列と、少なくとも１つの変異、たとえば３位のアスパラギンの変異（Ｎ３）、５位のアスパルテートの変異（Ｄ５）又は３位のアスパラギン及び５位のアスパルテートの変異とを含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、５位のアスパルテートのグルタメートへの変異（Ｄ５Ｅ）を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、３位のアスパラギンのグルタミンへの変異（Ｎ３Ｑ）を含み、たとえば、アミノ酸配列配列番号１４を有する。なお他の実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、Ｎ３Ｑ変異及びＤ５Ｅ変異の両方を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｇ４Ｓ（配列番号１９）リンカー又はＧ４Ｑ（配列番号２４）リンカーであるリンカー、たとえば（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー又は（Ｇ４Ｑ）ｎリンカーを有し、ｎは、０より大きい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｇ４Ａ（配列番号５８）リンカーであるリンカー、たとえば（Ｇ４Ａ）ｎリンカーを有し、ｎは、０より大きい。いくつかの実施形態では、ｎは、１又は２である。いくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５、６、７又は８など２より大きい。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は５８のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、電荷対の変異を含むＦｃ領域を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、トランケートされたヒンジ領域を有する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、表３から選択される。
【００１１】
本明細書においてさらに提供されるのは、本明細書に開示された融合タンパク質を含む二量体及び四量体である。一実施形態では、二量体は、配列番号３９〜５７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体を含む。いくつかの実施形態では、表６に示したように、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６又は５７のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３２、３３、３４、３５、３６又は３７のアミノ酸配列を含むＦｃドメインと二量体化する。いくつかの実施形態では、二量体は、四量体を形成する。本明細書に開示されたＧＤＦ１５分子を産生及び使用する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ビヒクル、３ｍｇ／ｋｇの陽性対照ＦＧＦ２１−Ｆｃ、１．５ｍｇ／ｋｇのｓｃＦｃ−ＧＤＦ１５又は１．５ｍｇ／ｋｇの二量体ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）を週１回６週間投与し、続いて５週間の休薬期を設けたカニクイザルの体重に対する作用を示すグラフである。
【図２】ビヒクル、３ｍｇ／ｋｇの陽性対照ＦＧＦ２１−Ｆｃ、１．５ｍｇ／ｋｇのｓｃＦｃ−ＧＤＦ１５又は１．５ｍｇ／ｋｇの二量体ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）を週１回６週間投与し、続いて５週間の休薬期を設けたカニクイザルのトリグリセリドレベルに対する作用を示す図表である。
【図３】カチオン交換後のＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５のプロファイルを示す。
【図４】ＦｃΔ１０（＋）−（Ｇ４）−ＧＤＦ１５のペプチドマップである。
【図５】マウスにおける、二量体ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Δ３）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）（配列番号４１及び３２）；ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）（配列番号４２及び３２）；ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、ＣＣ）（配列番号４３及び３４）；ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、ＣＣ）（配列番号４４及び３４））及びＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）（配列番号３９及び３２）の用量の関数としての、食物摂取量に対する作用を示すグラフである。
【図６】マウスにおける、時間の関数としての、ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Δ３）（配列番号４１）；ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）（配列番号４２）；ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３）（配列番号４３）；及びＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）（配列番号４４））の血清中濃度のグラフである。
【図７】ビヒクル、３ｍｇ／ｋｇの陽性対照ＦＧＦ２１−Ｆｃ、０．５ｍｇ／ｋｇ若しくは３．０ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ、ＣＣ）（配列番号４５及び３５）、０．５ｍｇ／ｋｇ若しくは３．０ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ、ＣＣ））（配列番号４６及び３５）又は０．５ｍｇ／ｋｇ若しくは３．０ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）（配列番号４７及び３６）を週１回４週間投与し、続いて４週間の休薬期を設けたカニクイザルの体重に対する作用を示すグラフである。
【図８】ビヒクル、１．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）（配列番号３９及び３２）、１．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）（配列番号４９及び３６）；１．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）（配列番号５０及び３６）、１．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−）−Ｇ４Ｓ−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）（配列番号５４及び３６）又は１．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）（配列番号５７及び３７）を週１回２週間投与したカニクイザルの体重に対する作用を示すグラフである。
【図９】ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）（配列番号５０及び３６）を投与したｏｂ／ｏｂマウスにおける、用量の関数としての食物摂取量のグラフである。
【図１０】ＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）（配列番号５７及び３７）を投与したｏｂ／ｏｂマウスにおける、用量の関数としての食物摂取量のグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において提供されるのは、ＧＤＦ１５分子、その分子を作製する方法及びその分子を使用する方法である。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、ＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質である。融合タンパク質は、Ｆｃ領域に連結されたＧＤＦ１５領域を含んでもよい。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、リンカーを介してＦｃに連結される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、野生型ＧＤＦ１５を含む。ヒトＧＤＦ１５及びマウスＧＤＦ１５はどちらも、シグナルペプチド及びプロドメインを有する。全長ヒトＧＤＦ１５のヌクレオチド配列は、下記である。
【化１】
2020533271.tif 000002
【００１５】
全長ヒトＧＤＦ１５（３０８アミノ酸）のアミノ酸配列は、下記である。
【化２】
2020533271.tif 000003
【００１６】
そのシグナル配列を含まないヒトＧＤＦ１５のヌクレオチド配列は、下記である。
【化３】
2020533271.tif 000004
【００１７】
その２９アミノ酸のシグナル配列を含まないヒトＧＤＦ１５（２７９アミノ酸）のアミノ酸配列は、下記である。
【化４】
2020533271.tif 000005
【００１８】
そのシグナルペプチド又はプロドメインを含まないヒトＧＤＦ１５のヌクレオチド配列は、下記である。
【化５】
2020533271.tif 000006
【００１９】
そのシグナルペプチド又はプロドメインを含まないヒトＧＤＦ１５（１１２アミノ酸のＧＤＦ１５の活性ドメイン）のアミノ酸配列は、下記である。
【化６】
2020533271.tif 000007
【００２０】
全長マウスＧＤＦ１５のヌクレオチド配列は、下記である。
【化７】
2020533271.tif 000008
【００２１】
全長マウスＧＤＦ１５（３０３アミノ酸）のアミノ酸配列は、下記である。
【化８】
2020533271.tif 000009
【００２２】
そのシグナル配列を含まないマウスＧＤＦ１５のヌクレオチド配列は、下記である。
【化９】
2020533271.tif 000010
【００２３】
その３２アミノ酸のシグナル配列を含まないマウスＧＤＦ１５（２７１アミノ酸）のアミノ酸配列は、下記である。
【化１０】
2020533271.tif 000011
【００２４】
そのシグナル配列又はプロドメインを含まないマウスＧＤＦ１５のヌクレオチド配列は、下記である。
【化１１】
2020533271.tif 000012
【００２５】
そのシグナルペプチド又はプロドメインを含まないマウスＧＤＦ１５（１１５アミノ酸の活性ドメイン）のアミノ酸配列は、下記である。
【化１２】
2020533271.tif 000013
【００２６】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、ＧＤＦ１５の活性ドメイン、たとえば、そのシグナルペプチド又はプロドメインを含まないＧＤＦ１５を含むＧＤＦ１５領域を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、配列番号６又は１２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、ＧＤＦ１５の活性ドメインにおける少なくとも１つの変異など１つ又は複数の変異を有するＧＤＦ１５配列を含む。特定の実施形態では、１つ又は複数の変異は、ＧＤＦ１５の活性を低下又は消失させない。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、ヒトＧＤＦ１５の活性ドメイン内に変異を含む。一実施形態では、変異は、最初の３個のアミノ酸が除去されているヒトＧＤＦ１５の活性ドメインである「ＧＤＦ１５（Δ３）」（すなわち、配列番号１３）など活性ドメインの最初の３個のアミノ酸の欠失である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、ヒトＧＤＦ１５の活性ドメインの３位のアスパラギン（Ｎ３）の変異（配列番号６）を含む。Ｎ３変異は、配列番号６の３位のアスパラギン残基の変異をいっても、或いはＧＤＦ１５アミノ酸配列において配列番号６の３位のアスパラギンに相当するアスパラギン残基の変異をいってもよい。いくつかの実施形態では、３位のアスパラギンは、グルタミン（Ｎ３Ｑ）又はアスパルテート（Ｎ３Ｄ）に変異する。したがって、いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）のＧＤＦ１５領域を含む。他の実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）のＧＤＦ１５領域を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、ヒトＧＤＦ１５の活性ドメイン（配列番号６）の５位のアスパルテート（Ｄ５）の変異を含む。Ｄ５変異は、配列番号６の５位のアスパルテート残基の変異をいっても、或いはＧＤＦ１５アミノ酸配列において配列番号６の５位のアスパルテートに相当するアスパルテート残基の変異をいってもよい。一実施形態では、５位のアスパルテートは、グルタメート（Ｄ５Ｅ）に変異する。したがって、いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＧＤＦ１５（Ｄ５Ｅ）のＧＤＦ１５領域を含む。
【００２８】
なお他の実施形態では、ＧＤＦ１５領域は、Δ３及びＤ５変異の組み合わせ、たとえば、ＧＤＦ１５（Δ３／Ｄ５Ｅ）（配列番号１７）又はＮ３及びＤ５変異の組み合わせ、たとえば、ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ／Ｄ５Ｅ）若しくはＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）など変異の組み合わせを含む。ＧＤＦ１５領域は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
表１は、ＧＤＦ１５分子に使用できるＧＤＦ１５領域の例を提供する。
【００３０】
【表１】
2020533271.tif 000014
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、Ｆｃに直接融合される。他の実施形態では、Ｆｃは、リンカーを介してＧＤＦ１５分子に融合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、Ｇ４Ｓ（配列番号１９）リンカーを含む。他の実施形態では、リンカーは、Ｇ４Ｑ（配列番号２４）リンカーを含む。他の実施形態では、リンカーは、Ｇ４Ａ（配列番号５８）リンカーを含む。リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーでも或いは（Ｇ４Ｑ）ｎリンカーでもよく、ｎは、０より大きい。リンカーは、（Ｇ４Ａ）ｎリンカーでもよく、ｎは、０より大きい。いくつかの実施形態では、ｎは、１又は２である。いくつかの実施形態では、ｎは、３、４、５、６、７又は８など２と同等又はそれ以上である。いくつかの実施形態では、リンカーは、表２に示すような配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は５８のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
【表２】
2020533271.tif 000015
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、Ｆｃ領域を含む。Ｆｃ領域は、抗体の重鎖のＦｃドメインを含んでも、或いは抗体の重鎖のＦｃドメインに由来してもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、電荷対の変異、グリコシル化部位における変異又は非天然型アミノ酸の付加などの変異を有するＦｃドメインを含んでもよい。Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のヒトＩｇＧ定常ドメインに由来してもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＡ重鎖、ＩｇＤ重鎖、ＩｇＥ重鎖及びＩｇＭ重鎖の定常ドメインを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、電荷対の変異を有するＦｃドメインを含む。電荷を持つＦｃ領域が得られる変異を導入することにより、ＧＤＦ１５分子は、反対電荷を持つ対応するＦｃ分子と二量体化することができる。たとえば、アスパルテートからリジンへの変異（Ｅ３５６Ｋ、３５６は、ＥＵナンバリングによる位置であり、表３〜５に示した位置に相当する）及びグルタメートからリジンへの変異（Ｄ３９９Ｋ、３９９は、ＥＵナンバリングによる位置であり、表３〜５に示した位置に相当する）を、任意選択的にリンカーを介してＧＤＦ１５領域に連結されたＦｃ領域に導入して、ＧＤＦ１５分子に正電荷を持つＦｃ領域を得てもよい。リジンからアスパルテートへの変異（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ；３９２及び４０９は、ＥＵナンバリングによる位置であり、表３〜５に示した位置に相当する）を、別の分子のＦｃドメインに導入して、負電荷を持つＦｃ分子を得てもよい。負電荷を持つＦｃ分子におけるアスパルテート残基は、静電気力によりＧＤＦ１５分子の正電荷を持つＦｃ領域のリジン残基と結合し、ＧＤＦ１５分子のＦｃ領域とＦｃ分子との間のＦｃヘテロ二量体の形成を促進する一方、ＧＤＦ１５分子のＦｃ領域間又はＦｃ分子間のＦｃホモ二量体の形成を減少又は防止することができる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、１つ又は複数のリジンからアスパルテートへの変異（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）を、任意選択的にリンカーを介してＧＤＦ１５領域に連結されたＦｃ領域に導入し、アスパルテートからリジンへの変異（Ｅ３５６Ｋ）及びグルタメートからリジンへの変異（Ｄ３９９Ｋ）をもう１つの分子のＦｃドメインに導入する。ＧＤＦ１５分子のＦｃ領域におけるアスパルテート残基は、静電気力によりＦｃ分子のリジン残基と結合し、ＧＤＦ１５分子のＦｃ領域とＦｃ分子との間のＦｃヘテロ二量体の形成を促進して、ＧＤＦ１５分子のＦｃ領域間又はＦｃ分子間のＦｃホモ二量体の形成を減少又は防止することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、変異したヒンジ領域を有するＦｃドメインを含むＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジに欠失を含む。いくつかの実施形態では、ヒンジから１０アミノ酸が欠失される（たとえば、ＦｃΔ１０）。他の実施形態では、ヒンジから１６アミノ酸が欠失される（たとえば、ＦｃΔ１６）。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ欠失（たとえば、ＦｃΔ１０又はＦｃΔ１６）及び電荷対の変異を含むため、Ｆｃドメインは、正電荷又は負電荷を持つ。たとえば、Ｆｃドメインは、ＦｃΔ１０（−）などヒンジにおける１０アミノ酸欠失及びリジンからアスパルテートへの変異（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）を含んでもよい。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦｃΔ１０（＋）などヒンジにおける１０アミノ酸欠失と、アスパルテートからリジンへの変異（Ｅ３５６Ｋ）及びグルタメートからリジンへの変異（Ｄ３９９Ｋ）とを含んでもよい。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦｃΔ１６（−）などヒンジにおける１６アミノ酸欠失及びリジンからアスパルテートへの変異（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）を含んでもよい。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦｃΔ１６（＋）などヒンジにおける１６アミノ酸欠失と、アスパルテートからリジンへの変異（Ｅ３５６Ｋ）及びグルタメートからリジンへの変異（Ｄ３９９Ｋ）とを含んでもよい。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ヒンジ欠失及び電荷対の変異を含むＦｃ分子は、そうしたＧＤＦ１５分子とヘテロ二量体化する。たとえば、Ｆｃ分子は、ＧＤＦ１５分子のＦｃ領域のヒンジ欠失及び電荷対の変異に相補するヒンジ欠失及び電荷対の変異を有してもよい。たとえば、Ｆｃ分子は、ＦｃΔ１０（−）などヒンジにおける１０アミノ酸欠失及びリジンからアスパルテートへの変異（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）を有するＦｃドメインを含んでもよく、任意選択的にＣ末端リジンを含んでもよい（たとえば、ＦｃΔ１０（−、Ｋ））。このＦｃ分子は、ＦｃΔ１０（＋）を含むＧＤＦ１５分子とヘテロ二量体化することができる。別の実施形態では、Ｆｃ分子は、ＦｃΔ１０（＋）などヒンジにおける１０アミノ酸欠失とアスパルテートからリジンへの変異（Ｅ３５６Ｋ）及びグルタメートからリジンへの変異（Ｄ３９９Ｋ）とを含んでもよく、任意選択的にＣ末端リジンを含んでもよい（たとえば、ＦｃΔ１０（＋、Ｋ））。このＦｃ分子は、ＦｃΔ１０（−）を含むＧＤＦ１５分子とヘテロ二量体化することができる。別の実施形態では、Ｆｃ分子は、ＦｃΔ１６（−）などヒンジにおける１６アミノ酸欠失及びリジンからアスパルテートへの変異（Ｋ３９２Ｄ、Ｋ４０９Ｄ）を含んでもよく、任意選択的にＣ末端リジンを含んでもよい（たとえば、ＦｃΔ１６（−、Ｋ））。ＦｃΔ１６（＋）を含むＧＤＦ１５分子とヘテロ二量体化することができるＦｃ分子。別の実施形態では、Ｆｃ分子は、ＦｃΔ１６（＋）などヒンジにおける１６アミノ酸欠失とアスパルテートからリジンへの変異（Ｅ３５６Ｋ）及びグルタメートからリジンへの変異（Ｄ３９９Ｋ）とを含んでもよく、任意選択的にＣ末端リジンを含んでもよい（たとえば、ＦｃΔ１６（−、Ｋ））。このＦｃ分子は、ＦｃΔ１６（−）を含むＧＤＦ１５分子とヘテロ二量体化することができる。
【００３８】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域又はＦｃ分子は、Ｌ２３４Ａ変異及び／又はＬ２３５Ａ変異を有するＦｃドメインを含み、２３４及び２３５は、ＥＵナンバリングによる位置であり、表３〜５に示した位置に相当する。Ｆｃドメインは、Ｌ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異、電荷対の変異、ヒンジ欠失又はこれらの任意の組み合わせを含んでもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４Ａ変異及びＬ２３５Ａ変異の両方を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ欠失、Ｌ２３４Ａ変異、Ｌ２３５Ａ変異及び電荷対の変異、たとえばＦｃΔ１０（＋、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）、ＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）、ＦｃΔ１６（＋、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）又はＦｃΔ１６（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、任意選択的なＣ末端リジン、たとえば、ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）、ＦｃΔ１０（−、Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）、ＦｃΔ１６（＋、Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）又はＦｃΔ１６（−、Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）を含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域又はＦｃ分子は、「システインクランプ」を有するＦｃドメインを含む。システインクランプ変異は、変異により特定の位置でシステインをＦｃドメインに導入することを含むので、やはり変異により特定の位置で導入されたシステインを有するもう１つのＦｃドメインとインキュベートすると、２つのＦｃドメイン間で（たとえば、「システインクランプ」変異を有するＦｃΔ１６（＋）ドメインと「システインクランプ」変異を有するＦｃΔ１６（−）ドメインとの間で）ジスルフィド結合（システインクランプ）が形成され得る。システインは、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインに導入してもよい。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、１つ又は複数のそうしたシステインクランプ変異を含んでもよい。一実施形態では、システインクランプは、セリンからシステインへの変異（Ｓ３５４Ｃ、３５４は、ＥＵナンバリングによる位置であり、表３〜５に示した位置に相当する）を第１のＦｃドメインに、チロシンからシステインへの変異（Ｙ３４９Ｃ、３４９は、ＥＵナンバリングによる位置であり、表３〜５に示した位置に相当する）を第２のＦｃドメインに導入することにより生じる。一実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、システインクランプ、負電荷対の変異及び１６アミノ酸ヒンジ欠失を有するＦｃドメイン（たとえば、ＧＤＦ１５−ＦｃΔ１６（−、ＣＣ））を含むＦｃ領域を含み、システインクランプ、正電荷対の変異及び１６アミノ酸ヒンジ欠失、さらに任意選択的なＣ末端リジンを含むＦｃドメイン（たとえば、ＦｃΔ１６（＋、Ｋ、ＣＣ））を含むＦｃ分子。システインクランプは、ＧＤＦ−Ｆｃ分子のＦｃ分子とのヘテロ二量体化を増大させ得る。
【００４０】
ＧＤＦ１５分子に使用してもよいＦｃ領域の例を表３に示す。
【００４１】
【表３】
2020533271.tif 000016
【００４２】
【表４】
2020533271.tif 000017
【００４３】
Ｆｃ分子の例を表４に示すが、Ｃ末端リジンは、任意選択である。
【００４４】
【表５】
2020533271.tif 000018
【００４５】
【表６】
2020533271.tif 000019
【００４６】
Ｆｃ分子は、相補的Ｆｃドメインを含む分子と二量体化するのに使用してもよい。たとえば、ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）のＦｃ分子は、ＦｃΔ１０（−）など１０アミノ酸ヒンジ欠失及び負電荷対の変異を含むＦｃ領域を含む分子（たとえば、ＦｃΔ１０（−）のＦｃ領域を含むＧＤＦ１５分子）と二量体化してもよい。ＦｃΔ１０（−、Ｋ）のＦｃ分子は、ＦｃΔ１０（＋）など１０アミノ酸ヒンジ欠失及び負電荷対の変異を含むＦｃ領域を含む分子（たとえば、ＦｃΔ１０（＋）のＦｃ領域を含むＧＤＦ１５分子）と二量体化してもよい。
【００４７】
ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、ＣＣ）のＦｃ分子は、ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）など１０アミノ酸ヒンジ欠失及び負電荷対の変異を含むＦｃ領域を含む分子（たとえば、ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）のＦｃ領域を含むＧＤＦ１５分子）と二量体化することができる。ＦｃΔ１６（＋、Ｋ、ＣＣ）のＦｃ分子は、ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）など１０アミノ酸ヒンジ欠失及び負電荷対の変異を含むＦｃ領域を含む分子（たとえば、ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）のＦｃ領域を含むＧＤＦ１５分子）と二量体化することができる。ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）のＦｃ分子は、ＦｃΔ１６（−）など１０アミノ酸ヒンジ欠失及び負電荷対の変異を含むＦｃ領域を含む分子（たとえば、ＦｃΔ１６（＋）のＦｃ領域を含むＧＤＦ１５分子）と二量体化することができる。ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）のＦｃ分子は、ＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）など１０アミノ酸ヒンジ欠失及び負電荷対の変異を含むＦｃ領域を含む分子（たとえば、ＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）のＦｃ領域を含むＧＤＦ１５分子）と二量体化することができる。
【００４８】
ＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質であるＧＤＦ１５分子の例を表５に示す。
【００４９】
【表７】
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【００５０】
【表８】
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【００５１】
【表９】
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【００５２】
【表１０】
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【００５３】
【表１１】
2020533271.tif 000024
【００５４】
【表１２】
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【００５５】
【表１３】
2020533271.tif 000026
【００５６】
【表１４】
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【００５７】
【表１５】
2020533271.tif 000028
【００５８】
【表１６】
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【００５９】
【表１７】
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【００６０】
【表１８】
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【００６１】
いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＧＤＦ１５領域が２つのＦｃ領域に連結されたｓｃＦｃ−ＧＤＦ１５である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３８と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３８のアミノ酸配列を含む。パーセント配列同一性を計算する際は、比較されている配列を配列間で最大のマッチを与える方法で整列させる。パーセント同一性を決定するのに使用できるコンピュータープログラムは、ＧＡＰ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）を含むＧＣＧプログラムパッケージである。コンピューターアルゴリズムＧＡＰを使用して、パーセント配列同一性を決定することになっている２つのポリペプチド又はポリヌクレオチドを整列することができる。配列は、そのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドの最適なマッチングが得られるように整列される（「マッチドスパン（ｍａｔｃｈｅｄ  ｓｐａｎ）」、アルゴリズムにより決定される）。アルゴリズムと共に、ギャップ開始ペナルティー（平均ダイアゴナル（ｄｉａｇｏｎａｌ）の３倍として計算され、「平均ダイアゴナル」は、使用している比較マトリックスのダイアゴナルの平均であり；「ダイアゴナル」は、特定の比較マトリックスによりそれぞれの完全なアミノ酸マッチに割り当てられたスコア又は数字である）及びギャップ伸長ペナルティー（通常、ギャップ開始ペナルティーの１／１０倍である）のほか、ＰＡＭ２５０又はＢＬＯＳＵＭ６２などの比較マトリックスが使用される。ある種の実施形態では、標準的なマトリックス（（ＰＡＭ２５０比較マトリックスではＤａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２）；（ＢＬＯＳＵＭ６２比較マトリックスではＨｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９：１０９１５−１０９１９）を参照）は、アルゴリズムでも使用される。ＧＡＰプログラムを用いたパーセント同一性の決定に使用できるパラメーターは、以下である：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ｓｕｐｒａによるＢＬＯＳＵＭ６２；
ギャップペナルティー：１２（但し、エンドギャップにペナルティーはない）
ギャップ長ペナルティー：４
類似性の閾値：０
【００６２】
２つのアミノ酸配列を整列させるためのある種のアライメントスキームでは、２つの配列の短い領域のみのマッチングが生じることがあり、この整列された小さな領域は、２つの全長配列間で顕著な関係がない場合でも、非常に高い配列同一性を有することがある。したがって、選択したアライメント法（たとえば、ＧＡＰプログラム）は、望ましい場合、標的ポリペプチドの少なくとも連続する５０アミノ酸にわたるアライメントが生じるように調整してもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５、ＦｃΔ１０（＋）−（Ｇ４）−ＧＤＦ１５、ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Δ３）、ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）、ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３）、ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）、ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３／Ｄ５Ｅ）、ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）、ＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）、ＦｃΔ１６（−）−Ｇ４Ｓ−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）、ＦｃΔ１６（−）−Ｇ４Ｓ−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）、ＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）、ＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）又はＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）である。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６又は５７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６又は５７と８０〜９９％、８５％〜９９％、９０〜９９％又は９５〜９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６又は５７と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６又は５７と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６又は５７と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６又は５７と少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００６５】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５分子、ＦｃΔ１０（＋）−（Ｇ４）−ＧＤＦ１５分子、ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Δ３）分子、ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）分子、ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３）分子、ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）分子、ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−Ｇ４Ｓ−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子、ＦｃΔ１６（−）−Ｇ４Ｓ−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子、ＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子又はＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子である。いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、そのＦｃ領域及び／又はＧＤＦ１５領域と８０〜９９％、８５％〜９９％、９０〜９９％又は９５〜９９％の配列同一性を有するＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５分子、ＦｃΔ１０（＋）−（Ｇ４）−ＧＤＦ１５分子、ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Δ３）分子、ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）分子、ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３）分子、ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）分子、ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−Ｇ４Ｓ−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子、ＦｃΔ１６（−）−Ｇ４Ｓ−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子、ＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子又はＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、ＧＤＦ１５分子は、そのＦｃ領域及び／又はＧＤＦ１５領域と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５分子、ＦｃΔ１０（＋）−（Ｇ４）−ＧＤＦ１５分子、ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Δ３）分子、ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）分子、ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３）分子、ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）分子、ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−Ｇ４Ｓ−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子、ＦｃΔ１６（−）−Ｇ４Ｓ−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子、ＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子、ＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）分子又はＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子である。たとえば、そのＦｃ領域及び／又はＧＤＦ１５領域と８０〜９９％、８５％〜９９％、９０〜９９％又は９５〜９９％の配列同一性を有するＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５分子は、ヒンジ領域の１０アミノ酸欠失及び負電荷対の変異を有し、且つ配列番号２６と８０〜９９％、８５％〜９９％、９０〜９９％又は９５〜９９％の配列同一性を有するＦｃ領域、及び／又は、配列番号６と８０〜９９％、８５％〜９９％、９０〜９９％又は９５〜９９％の配列同一性を有するＧＤＦ１５領域を有するＧＤＦ１５分子を含む。たとえば、そのＦｃ領域及び／又はＧＤＦ１５領域と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５分子は、ヒンジ領域の１０アミノ酸欠失及び負電荷対の変異を有し、且つ配列番号２６と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＦｃ領域、及び／又は、配列番号６と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＧＤＦ１５領域を有するＧＤＦ１５分子を含む。
【００６７】
別の例では、そのＦｃ領域及び／又はＧＤＦ１５領域と８０〜９９％、８５％〜９９％、９０〜９９％又は９５〜９９％の配列同一性を有するＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子は、ヒンジ領域の１６アミノ酸欠失及び負電荷対の変異を有し、且つ配列番号３０と８０〜９９％、８５％〜９９％、９０〜９９％又は９５〜９９％の配列同一性を有するＦｃ領域、及び／又は、配列番号１８と８０〜９９％、８５％〜９９％、９０〜９９％又は９５〜９９％の配列同一性を有するＧＤＦ１５領域を有するＧＤＦ１５分子を含む。別の例では、そのＦｃ領域及び／又はＧＤＦ１５領域と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子は、ヒンジ領域の１６アミノ酸欠失及び負電荷対の変異を有し、且つ配列番号３０と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＦｃ領域、及び／又は、配列番号１８と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＧＤＦ１５領域を有するＧＤＦ１５分子を含む。
【００６８】
なお別の例では、そのＦｃ領域及び／又はＧＤＦ１５領域と８０〜９９％、８５％〜９９％、９０〜９９％又は９５〜９９％の配列同一性を有するＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子は、ヒンジ領域の１０アミノ酸欠失、負電荷対の変異並びに２３４位及び２３５位のロイシンからアラニンへの変異を有し、且つ配列番号３１と８０〜９９％、８５％〜９９％、９０〜９９％又は９５〜９９％の配列同一性を有するＦｃ領域、及び／又は、配列番号１８と８０〜９９％、８５％〜９９％、９０〜９９％又は９５〜９９％の配列同一性を有するＧＤＦ１５領域を有するＧＤＦ１５分子を含む。なお別の例では、そのＦｃ領域及び／又はＧＤＦ１５領域と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）分子は、ヒンジ領域の１０アミノ酸欠失、負電荷対の変異並びに２３４位及び２３５位のロイシンからアラニンへの変異を有し、且つ配列番号３１と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＦｃ領域、及び／又は、配列番号１８と少なくとも８５％、９０％、９５％又は９９％の配列同一性を有するＧＤＦ１５領域を有するＧＤＦ１５分子を含む。
【００６９】
さらに本明細書において提供されるのは、本明細書で提供されるＧＤＦ１５分子を含む二量体及び四量体である。一実施形態では、二量体は、配列番号３９〜５７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体を含む。いくつかの実施形態では、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６又は５７のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、たとえば表６に示したように、配列番号３２、３３、３４、３５、３６又は３７（Ｃ末端リジンは、任意選択である）のアミノ酸配列を含むＦｃ分子と二量体化する。たとえば、いくつかの実施形態では、二量体は、ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）である。別の実施形態では、二量体は、ＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）である。なお別の実施形態では、二量体は、ＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）である。
【００７０】
【表１９】
2020533271.tif 000032
【００７１】
一実施形態では、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３２（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３３（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３２（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３２（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３４（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３４（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３４（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３５（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３５（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３６（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３６（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３６（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３６（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３６（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３６（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３６（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３６（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３６（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３７（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。別の実施形態では、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５−Ｆｃ融合体は、配列番号３７（Ｃ末端リジンは任意選択）を含むＦｃ分子と二量体化する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、二量体は、四量体を形成する。たとえば、表６の二量体は、四量体を形成することができる。いくつかの実施形態では、四量体は、同じ二量体から形成される。いくつかの実施形態では、ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）；ＦｃΔ１０（＋）−（Ｇ４）−ＧＤＦ１５：ＦｃΔ１０（−、Ｋ）；ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Δ３）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）；ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）；ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、ＣＣ）；ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、ＣＣ）；ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ、ＣＣ）；ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ、ＣＣ）；ＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）；ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）；ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）；ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）；ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）；ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｓ）２−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）；ＦｃΔ１６（−）−Ｇ４Ｓ−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）；ＦｃΔ１６（−）−Ｇ４Ｓ−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）；ＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）；ＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）；又はＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）のうち２つの二量体が、２つのＧＤＦ１５領域の二量体化などにより四量体を形成する。
【００７３】
本明細書においてさらに提供されるのは、本明細書に開示されたＧＤＦ１５分子及びＦｃ分子を産生させるための核酸及びベクターを含む宿主細胞である。種々の実施形態では、ベクター又は核酸は、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、他の実施形態ではベクター又は核酸は、染色体外にある。
【００７４】
そうした核酸、ベクター又はそのどちらか一方若しくは両方の組み合わせを含む酵母細胞、細菌細胞（たとえば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び哺乳動物細胞（たとえば、不死化した哺乳動物細胞）などの組換え細胞を提供する。種々の実施形態では、ＧＤＦ１５分子及び／又はＦｃ分子の発現をコードする配列を含む、プラスミド、コスミド、ファージミド又は線形発現エレメントなど組み込まれていない核酸を含む細胞。いくつかの実施形態では、細胞は、ＧＤＦ１５分子を産生するための核酸を含み、もう１つの細胞が、ＧＤＦ１５分子との二量体化のためのＦｃ分子を産生するための核酸（たとえば、第１の細胞内にＧＤＦ１５分子をコードするためのベクター及び第２の細胞内にＦｃ分子をコードするための第２のベクター）を含む。他の実施形態では、宿主細胞は、ＧＤＦ１５分子及びＦｃ分子を産生するための核酸（たとえば、両方の分子をコードするベクター）を含む。別の実施形態では、宿主細胞は、ＧＤＦ１５分子を産生するための核酸、及びＦｃ分子を産生するためのもう１つの核酸（たとえば、単一の宿主細胞内に２つの別のベクター、ＧＤＦ１５分子をコードするベクター及びＦｃ分子をコードするベクター）を含む。
【００７５】
ＧＤＦ１５分子及び／又はＦｃ分子をコードする核酸配列を含むベクターは、当該技術分野において公知の方法などによって、形質転換又はトランスフェクションにより宿主細胞に導入することができる。
【００７６】
ＧＤＦ１５分子をコードする核酸は、ウイルスベクターを介して宿主細胞又は宿主動物に配置及び／又は送達することができる。ウイルスベクターは、単独で又は所望の宿主細胞において本発明の核酸の送達、複製及び／又は発現を促進する１つ又は複数のウイルスタンパク質と組み合わせて、どのようなウイルスポリヌクレオチドを含んでもよい。ウイルスベクターは、ウイルスゲノムの全部若しくは一部を含むポリヌクレオチド、ウイルスタンパク質／核酸コンジュゲート、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、又はウイルス核酸とＧＤＦ１５領域を含むポリペプチドをコードする核酸とを含むインタクトなウイルス粒子であってもよい。ウイルス粒子のウイルスベクターは、野生型ウイルス粒子又は改変ウイルス粒子を含んでもよい。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター単位複製配列など複製及び／又は発現のためにもう１つのベクター又は野生型ウイルスの存在を必要とするベクターであってもよい（たとえば、ウイルスベクターは、ヘルパー依存ウイルスであってもよい）。この点において好適なウイルスベクター粒子として、たとえば、アデノウイルスベクター粒子（アデノウイルス科の又はアデノウイルス科のウイルスに由来する、任意のウイルスを含む）、アデノ随伴ウイルスベクター粒子（ＡＡＶベクター粒子）又は他のパルボウイルス及びパルボウイルスベクター粒子、パピローマウイルスベクター粒子、フラビウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターが挙げられる。
【００７７】
ＧＤＦ１５分子は、標準的なタンパク質精製法を用いて単離することができる。ＧＤＦ１５領域を含むポリペプチドは、ＧＤＦ１５領域を含むポリペプチドを発現するように設計された細胞、たとえばネイティブなＧＤＦ１５を自然に発現しない細胞から単離することができる。当該技術分野において公知のタンパク質精製法を採用して、ＧＤＦ１５分子のほか、関連材料及び試薬を単離することができる。ＧＤＦ１５分子を精製する方法も、本明細書の実施例において提供される。ＧＤＦ１５分子を単離するのに有用であり得る追加の精製法は、Ｂｏｏｔｃｏｖ  ＭＲ，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１１５１４−９，Ｆａｉｒｌｉｅ  ＷＤ，２０００，Ｇｅｎｅ  ２５４：６７−７６などの参考文献で確認することができる。
【００７８】
ＧＤＦ１５分子（及び任意選択的に、本明細書に開示された二量体又は四量体などのＦｃ分子）を含む医薬組成物も提供される。そうしたポリペプチド医薬組成物は、投与モードとの適合性で選択された薬学的又は生理学的に許容される製剤用剤又はキャリアと混合した治療有効量のＧＤＦ１５分子を含んでもよい。薬学的又は生理学的に許容される製剤用剤は、ヒト又は非ヒト被検体の体内へのＧＤＦ１５分子の送達を達成又は促進するのに好適な１種又は複数種の製剤用剤であってもよい。ＧＤＦ１５分子の有効期間又は有効性を大きくする湿潤剤又は乳化剤、防腐剤又は緩衝液などの薬学的に許容される物質はさらに、製剤キャリアとして働いてもよく、或いは製剤キャリアの構成要素を形成してもよい。許容可能な薬学的に許容されるキャリアは、好ましくは採用された投与量及び濃度でレシピエントに無毒である。医薬組成物は、たとえば、組成物のｐＨ、モル浸透圧濃度、粘度、清澄度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解若しくは放出速度、吸着又は浸透性を変更、維持又は保護するため製剤用剤（単数又は複数）を含んでもよい。
【００７９】
治療的に使用しようとするＧＤＦ１５分子を含む医薬組成物の有効量は、たとえば、治療の背景及び目的によって異なる。したがって、当業者は、処置に適切な投与量レベルが、送達される分子、ＧＤＦ１５分子が使用されている徴候、投与経路並びに被検体の大きさ（体重、体表面積又は臓器の大きさ）及び状態（年齢及び一般的な健康状態）によってある程度異なることを理解するであろう。投薬頻度は、使用されている製剤におけるＧＤＦ１５分子の薬物動態パラメーターによって異なる。
【００８０】
医薬組成物の投与経路は、経口であっても；静脈内経路、腹腔内経路、脳内（実質内）経路、脳室内経路、筋肉内経路、眼内経路、動脈内経路、門脈内経路又は病巣内経路による注射によっても；徐放システム（やはり注射されてもよい）によっても；或いは埋め込み装置によってもよい。望ましい場合、組成物は、ボーラス注射により投与しても、或いは注入若しくは埋め込み装置により連続的に投与してもよい。組成物はまた、所望の分子が吸収又は封入された膜、スポンジ又は他の適切な材料の埋め込みにより局所投与してもよい。埋め込み装置を使用する場合、装置は、任意の好適な組織又は臓器に埋め込んでもよく、所望の分子の送達は、拡散、徐放性ボーラス（ｔｉｍｅｄ−ｒｅｌｅａｓｅ  ｂｏｌｕｓ）又は連続投与によるものであってもよい。
【００８１】
ＧＤＦ１５分子は、代謝症候又は障害を処置、診断又は軽減するのに使用することができる。一実施形態では、代謝障害は、糖尿病、たとえば、２型糖尿病である。別の実施形態では、代謝症候又は障害は、肥満である。他の実施形態では、代謝症候又は障害は、脂質代謝異常、高グルコースレベル、高インスリンレベル又は糖尿病性ニューロパチーである。たとえば、ＧＤＦ１５分子を用いて処置又は軽減できる代謝症候又は障害は、ヒト被検体が、１２５ｍｇ／ｄＬ又はそれより高い、たとえば１３０ｍｇ／ｄＬ、１３５ｍｇ／ｄＬ、１４０ｍｇ／ｄＬ、１４５ｍｇ／ｄＬ、１５０ｍｇ／ｄＬ、１５５ｍｇ／ｄＬ、１６０ｍｇ／ｄＬ、１６５ｍｇ／ｄＬ、１７０ｍｇ／ｄＬ、１７５ｍｇ／ｄＬ、１８０ｍｇ／ｄＬ、１８５ｍｇ／ｄＬ、１９０ｍｇ／ｄＬ、１９５ｍｇ／ｄＬ、２００ｍｇ／ｄＬ又は２００ｍｇ／ｄＬ超の空腹時血糖レベルを有する状態を含む。血糖レベルは、摂食若しくは絶食状態で又は無作為に測定してもよい。代謝症候又は障害は、被検体が代謝症候を示すリスクが高い症候をさらに含んでもよい。ヒト被検体では、そうした症候は、１００ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベルを含む。ＧＤＦ１５分子を含む医薬組成物を用いて処置できる症候は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃａｒｅ  ｉｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２０１１，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １，Ｓ１１−Ｓ６１，２０１０でも確認することができる。
【００８２】
投与は、たとえば静脈内（ＩＶ）注射、腹腔内（ＩＰ）注射、皮下注射、筋肉内注射により行っても、或いは錠剤若しくは液状の形態で経口的に行ってもよい。ＧＤＦ１５分子の治療有効用量は、投与スケジュール、投与される作用物質の単位用量、ＧＤＦ１５分子が他の治療薬と組み合わせて投与されるかどうか、免疫状態及びレシピエントの健康状態によって異なる。治療有効用量は、処置されている疾患又は障害の症状の緩和又は軽減を含む、研究者、医師又は他の臨床医が求めている、組織系、動物又はヒトにおける生物学的反応又は薬効反応を惹起するＧＤＦ１５分子の量、すなわち、観察可能なレベルの１つ又は複数の所望の生物学的反応又は薬効反応、たとえば、血糖レベル、インスリンレベル、トリグリセリドレベル又はコレステロールレベルの低下；体重の減少；耐糖能、エネルギー消費又はインスリン感受性の改善；或いは食物摂取量の減少を助けるＧＤＦ１５分子の量である。ＧＤＦ１５分子の治療有効用量はさらに、所望の成果によって異なってもよい。
【００８３】
本明細書においてさらに提供されるのは、被検体においてグルコース、インスリン、コレステロール、脂質などの１つ又は複数の代謝関連化合物のベースラインレベルを測定すること、ＧＤＦ１５分子を含む医薬組成物を被検体に投与すること、及び所望の期間後、被検体において１つ又は複数の代謝関連化合物（たとえば、血糖、インスリン、コレステロール、脂質）のレベルを測定することを含む方法である。次いで２つのレベルを比較して、被検体における代謝関連化合物の相対的変化を判定してもよい。その比較の結果に応じて、別の用量の医薬組成物を投与して、１つ又は複数の代謝関連化合物の所望のレベルを達成してもよい。
【００８４】
ＧＤＦ１５分子を含む医薬組成物は、もう１つの化合物又は治療薬と併用投与してもよい。ＧＤＦ１５分子（及び任意選択的に、その対応するＦｃ分子）は、血糖レベル、インスリンレベル、トリグリセリドレベル又はコレステロールレベルを低下させる作用物質；体重を減少させる作用物質；食物摂取量を減少させる作用物質；耐糖能、エネルギー消費又はインスリン感受性を改善させる作用物質；或いはこれら（たとえば、抗糖尿病薬、高脂血症薬、抗肥満薬、降圧薬又はペルオキシソーム増殖剤活性化受容体のアゴニスト）の任意の組み合わせなどもう１つの治療薬と組み合わせて投与してもよい。ＧＤＦ１５分子と併用投与される化合物の種類及び特性は、処置又は軽減されようとする症候の性質によって異なる。本明細書に開示されたＧＤＦ１５分子と一緒に投与される作用物質は、ＧＬＰ−１若しくはそのアナログ；又はエクセンディン、エクセンディンアナログ若しくはエクセンディンアゴニストなどのＧＬＰ−１Ｒアゴニストであってもよい。医薬組成物と組み合わせて投与してもよい化合物の例の非限定的なリストとして、リラグルチド、ロシグリチゾン、ピオグリチゾン、レパグリニド、ナテグリチニド、メトホルミン、エクセナチド、スチアグリプチン、プラムリンチド、グリピジド、グリメプリリデアカルボース、オーリスタット、ロルカセリン、フェンテルミネトピラマート、ナルトレクソンブプロピオン、セトメラノチド、セマグルチド、エフペグレナチド（ｅｆｐｅｇｌｅｎａｔｉｄｅ）、カナグリフロジン、ＬＩＫ−０６６、ＳＡＲ−４２５８９９、Ｔｔ−４０１、ＦＧＦＲ４Ｒｘ、ＨＤＶ−ビオチン及びミグリトールが挙げられる。
【００８５】
一実施形態では、配列番号３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６又は５７のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５分子は、もう１つの化合物又は治療薬、たとえばリラグルチドと一緒に投与される。
【００８６】
別の実施形態では、それぞれ配列番号３９及び３２（Ｃ末端リジンは任意選択）；配列番号４０及び３３（Ｃ末端リジンは任意選択）、それぞれ配列番号４１及び３２（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４２及び３２（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４３及び３４（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４４及び３４（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４５及び３５（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４６及び３５（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４７及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４８及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４９及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５０及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５１及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５２及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５３及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５４及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５５及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５６及び３７（Ｃ末端リジンは任意選択）；又はそれぞれ配列番号５７及び３７（Ｃ末端リジンは任意選択）のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５分子及び対応するＦｃ分子は、もう１つの化合物又は治療薬、たとえばリラグルチドと一緒に投与される。
【００８７】
別の実施形態では、それぞれ配列番号５０及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５分子及び対応するＦｃ分子は、もう１つの化合物又は治療薬、たとえばリラグルチドと一緒に投与される。別の実施形態では、それぞれ配列番号５７及び３７（Ｃ末端リジンは任意選択）のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５分子及び対応するＦｃ分子は、もう１つの化合物又は治療薬、たとえばリラグルチドと一緒に投与される。
【００８８】
もう１つの治療薬と一緒に投与されるＧＤＦ１５分子は、治療有効量のＧＤＦ１５分子（及び任意選択的に、その対応するＦｃ分子）と治療有効量の他方の治療薬との同時投与を含んでもよい。もう１つの治療薬と一緒に投与されるＧＤＦ１５分子は、治療有効量のＧＤＦ１５分子（及び任意選択的に、その対応するＦｃ分子）及び治療有効量の他方の治療薬の連続投与、たとえば、治療有効量のＧＤＦ１５分子（及び任意選択的に、その対応するＦｃ分子）、続いて治療有効量の他方の治療薬の投与、又は治療有効量の他方の治療薬の投与、続いて治療有効量のＧＤＦ１５分子（及び任意選択的に、その対応するＦｃ分子）の投与を含んでもよい。治療有効量のＧＤＦ１５分子（及び任意選択的に、その対応するＦｃ分子）の投与は、治療有効量の他方の治療薬の投与から少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後又は７日後であってもよい。別の実施形態では、治療有効量の治療有効量の他方の治療薬の投与は、治療有効量のＧＤＦ１５分子（及び任意選択的に、その対応するＦｃ分子）の投与から少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後又は７日後の少なくとも１日後、２日後、３日後、４日後、５日後、６日後又は７日後であってもよい。
【００８９】
もう１つの治療薬と同時に投与されるＧＤＦ１５分子は、ＧＤＦ１５分子（及び任意選択的に、その対応するＦｃ分子）及び他方の治療薬の両方を含む組成物の投与を含んでもよく、たとえば、治療有効量のＧＤＦ１５分子（及び任意選択的に、その対応するＦｃ分子）は、投与前に治療有効量の他方の作用物質と一緒にしてもよい。別の実施形態では、ＧＤＦ１５分子（及び任意選択的に、その対応するＦｃ分子）及びもう１つの治療薬の同時投与は、ＧＤＦ１５分子を含む第１の組成物及び他方の治療薬を含む第２の組成物の同時投与を含んでもよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、もう１つの治療薬とのＧＤＦ１５分子の投与は、相乗効果を有する。一実施形態では、効果は、ＧＤＦ１５分子（及び任意選択的に、その対応するＦｃ分子）単独又は他方の作用物質より大きい。別の実施形態では、効果は、両方の作用物質（ＧＤＦ１５分子、及び任意選択的に、その対応するＦｃ分子と、他方の作用物質）の相加効果より大きい。一実施形態では、併用療法（すなわち、もう１つの治療薬と、任意選択的に、その対応するＦｃ分子と、ＧＤＦ１５分子の投与）は、ＧＤＦ１５単独療法（ＧＤＦ１５分子、及び任意選択的に、その対応するＦｃ分子）より１．１倍超、１．２倍超、１．３倍超、１．４倍超、１．５倍超、１．６倍超、１．７倍超、１．８倍超、１．９倍超、２．０倍超、２．５倍超、３．０倍超、３．５倍超、４．０倍超、４．５倍超、５．０倍超、５．５倍超、６．０倍超、６．５倍超、７．０倍超、７．５倍超、８．０倍超、８．５倍超、９．０倍超、９．５倍超、１０倍超、１１倍超、１２倍超、１３倍超、１４倍超、１５倍超、１６倍超、１７倍超、１８倍超、１９倍超、２０倍超、２１倍超、２２倍超、２３倍超、２４倍超、２５倍超、２６倍超、２７倍超、２８倍超、２９倍超又は３０倍超の効果を有する。別の実施形態では、併用療法（すなわち、もう１つの治療薬と、任意選択的に、その対応するＦｃ分子と、ＧＤＦ１５分子の投与）は、他方の作用物質の単独療法より１．１倍超、１．２倍超、１．３倍超、１．４倍超、１．５倍超、１．６倍超、１．７倍超、１．８倍超、１．９倍超、２．０倍超、２．５倍超、３．０倍超、３．５倍超、４．０倍超、４．５倍超、５．０倍超、５．５倍超、６．０倍超、６．５倍超、７．０倍超、７．５倍超、８．０倍超、８．５倍超、９．０倍超、９．５倍超、１０倍超、１１倍超、１２倍超、１３倍超、１４倍超、１５倍超、１６倍超、１７倍超、１８倍超、１９倍超、２０倍超、２１倍超、２２倍超、２３倍超、２４倍超、２５倍超、２６倍超、２７倍超、２８倍超、２９倍超又は３０倍超の効果を有する。効果は、体重減少の量（たとえば、総重量又は重量変化率の減少）；血糖レベル、インスリンレベル、トリグリセリドレベル又はコレステロールレベルの減少；耐糖能、エネルギー消費又はインスリン感受性の改善；或いは食物摂取量の減少であってもよい。相乗効果は、投与から約１日後、約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、約１０日後、約１１日後、約１２日後、約１３日後、約１４日後、約２１日後、約２８日後、約３５日後、約４２日後、約４９日後、約５６日後、約６３日後又は約７０日後であってもよい。
【００９１】
一実施形態では、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト（たとえば、リラグルチド若しくはエクセンディン又はそのアナログ若しくはアゴニスト）と一緒に投与され、それぞれ配列番号３９及び３２（Ｃ末端リジンは任意選択）；配列番号４０及び３３（Ｃ末端リジンは任意選択）、それぞれ配列番号４１及び３２（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４２及び３２（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４３及び３４（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４４及び３４（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４５及び３５（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４６及び３５（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４７及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４８及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号４９及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５０及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５１及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５２及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５３及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５４及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５５及び３６（Ｃ末端リジンは任意選択）；それぞれ配列番号５６及び３７（Ｃ末端リジンは任意選択）；又はそれぞれ配列番号５７及び３７（Ｃ末端リジンは任意選択）のアミノ酸配列を含むＧＤＦ１５分子及び対応するＦｃ分子は、ＧＤＦ１５単独療法より１．１倍超、１．２倍超、１．３倍超、１．４倍超、１．５倍超、１．６倍超、１．７倍超、１．８倍超、１．９倍超、２．０倍超、２．５倍超、３．０倍超、３．５倍超、４．０倍超、４．５倍超、５．０倍超、５．５倍超、６．０倍超、６．５倍超、７．０倍超、７．５倍超、８．０倍超、８．５倍超、９．０倍超、９．５倍超、１０倍超、１１倍超、１２倍超、１３倍超、１４倍超、１５倍超、１６倍超、１７倍超、１８倍超、１９倍超、２０倍超、２１倍超、２２倍超、２３倍超、２４倍超、２５倍超、２６倍超、２７倍超、２８倍超、２９倍超又は３０倍超の効果を有し；ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト単独療法（すなわち、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト単独の投与）より１．１倍超、１．２倍超、１．３倍超、１．４倍超、１．５倍超、１．６倍超、１．７倍超、１．８倍超、１．９倍超、２．０倍超、２．５倍超、３．０倍超、３．５倍超、４．０倍超、４．５倍超、５．０倍超、５．５倍超、６．０倍超、６．５倍超、７．０倍超、７．５倍超、８．０倍超、８．５倍超、９．０倍超、９．５倍超、１０倍超、１１倍超、１２倍超、１３倍超、１４倍超、１５倍超、１６倍超、１７倍超、１８倍超、１９倍超、２０倍超、２１倍超、２２倍超、２３倍超、２４倍超、２５倍超、２６倍超、２７倍超、２８倍超、２９倍超又は３０倍超の効果を有し；又は両方、作用物質の投与から約１日後、約２日後、約３日後、約４日後、約５日後、約６日後、約７日後、約８日後、約９日後、約１０日後、約１１日後、約１２日後、約１３日後、約１４日後、約２１日後、約２８日後、約３５日後、約４２日後、約４９日後、約５６日後、約６３日後又は約７０日後有する。
【００９２】
詳細な説明及び以下の例は、本発明を説明するものであり、本発明をそれに限定するものと解釈してはならない。本発明の説明に基づき当業者により様々な変更及び修正がなされ得、そうした変更及び修正も本発明に含まれる。
【実施例】
【００９３】
実施した実験及び得られた結果を含む以下の例は、説明のみを目的として提供するものであり、本発明を限定するものと解釈してはならない。
【００９４】
実施例１：ＧＤＦ１５（ＷＴ）−リンカー−Ｆｃ分子
ｓｃＦｃ−ＧＤＦ１５（配列番号３８）及びＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（配列番号３９）のＧＤＦ１５分子を産生し、分子の活性を試験した。
【００９５】
ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（配列番号３９）を無血清浮遊培養に適応したＣＨＯ−Ｋ１細胞株で安定発現させた。それをピューロマイシン耐性を持つ安定な発現ベクターにクローニングする一方、ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５とヘテロ二量体を形成するためのＦｃ鎖、ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）（配列番号３２）を、ハイグロマイシンを含む発現ベクター（Ｓｅｌｅｘｉｓ，Ｉｎｃ．）にクローニングした。これらのプラスミドを、リポフェクタミンＬＴＸを用いて１：１の割合でトランスフェクトし、トランスフェクションの２日後に１０ｕｇ／ｍＬのピューロマイシン及び６００ｕｇ／ｍＬのハイグロマイシンを含む独自の増殖培地で細胞を選択した。選択中に週２回培地を交換した。細胞の生存率が約９０％になったとき、それらをバッチ培養生産工程用にスケールアップした。細胞を生産培地に２×１０６／ｍＬで播種した。細胞により作られたコンディション培地（ＣＭ）を７日目に回収し、清澄化した。エンドポイントの生存率は、典型的には９０％超であった。
【００９６】
ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（配列番号３９）（及び対をなした任意のＦｃ）を清澄化した。コンディション培地を、２段階クロマトグラフィー手順を用いて精製した。約５ＬのＣＭを、ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですでに平衡化してあったＧＥ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラムに直接アプライした。結合したタンパク質に以下の３つの洗浄ステップを行った。最初に、３カラム体積（ＣＶ）のＰＢＳ；次に、１ＣＶの２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４の１００ｍＭの塩化ナトリウム；最後に、３ＣＶの５００ｍＭのＬ−アルギニン、ｐＨ７．５。これらの洗浄ステップにより、非結合又は軽く結合した培地成分及び宿主細胞の不純物が除去される。次いでカラムを、５ＣＶの２０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４の１００ｍＭの塩化ナトリウムで再平衡化し、ＵＶ吸光度をベースラインに戻した。所望のタンパク質をｐＨ３．６の１００ｍＭの酢酸にて溶出し、大量に集めた。タンパク質プールを１Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２で５．０〜５．５のｐＨ範囲にすぐに滴定した。次にｐＨ調整したタンパク質プールを、ｐＨ６．０の２０ｍＭの２−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）ですでに平衡化してあったＧＥ  ＳＰ  セファロース（登録商標）ＨＰカラムに充填した。次いで結合したタンパク質を５ＣＶの平衡化緩衝液で洗浄し、最後にｐＨ６．０の２０ｍＭのＭＥＳ中、０〜４００ｍＭの塩化ナトリウムの２０ＣＶ、０〜５０％のリニアグラジエントで溶出した。溶出中に画分を集め、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ（登録商標）２００）により解析して均一な産物のためプールするのに適切な画分を決定した。ＳＰ  ＨＰクロマトグラフィーにより、遊離Ｆｃ、切除された種及びＦｃ−ＧＤＦ１５多量体などの産物関連不純物が除去される。次いで透析によりＳＰ  ＨＰプールの緩衝液を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、５％プロリン、ｐＨ５．２にした。それを、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｖｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）２０  １０キロダルトン分子量カットオフ遠心装置を用いて約１５ｍｇ／ｍｌに濃縮した。最後に、それを濾過滅菌し、精製されたＦｃ−ＧＤＦ１５分子を含む得られた溶液を５℃で保存した。最終産物について、質量スペクトル解析、硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミド電気泳動及びサイズ排除高速液体クロマトグラフィーを用いて同一性及び純度を評価した。
【００９７】
同様にしてＳｃＦｃ−ＧＤＦ１５（配列番号３８）を産生した。このＧＤＦ１５分子をＣＨＯ／ＣＳ９細胞株で安定発現させた。分子を安定な発現ベクターにクローニングした。プラスミド（直線化）を、エレクトロポレーションを用いて１：１の割合でトランスフェクトし、トランスフェクションの２日後に細胞を選択した。選択中に週３回培地を交換した。細胞の生存率が約９０％になったとき、それらを流加培養生産工程用にスケールアップした。細胞を生産培地中、１×１０６／ｍＬで播種し、細胞数が４〜５×１０６／ｍｌになったとき１回流加した。細胞により作られたコンディション培地（ＣＭ）を１０日目に回収し、清澄化した。エンドポイントの生存率は、典型的には９０％超であった。ＳｃＦｃ−ＧＤＦ１５を清澄化し、コンディション培地を、２段階連結クロマトグラフィー手順を用いて精製した。複数の回収物由来のコンディション培地をプールし、タンジェンシャルフロー濾過による１ｓｑ  ｆｔのＰｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）２  １０ｋＤ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いた限外濾過により約５倍に濃縮した。約５Ｌの濃縮ＣＭを、ダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ですでに平衡化してあったＧＥ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅカラムに直接アプライした。非特異的に結合したタンパク質を、１２ＣＶのＰＢＳ洗浄ステップにより除去した。所望のタンパク質を、３ＣＶのｐＨ３．５の０．５％酢酸、１５０ｍＭのＮａＣｌで溶出し、ストレージループ（ｓｔｏｒａｇｅ  ｌｏｏｐ）に集めた。集めたタンパク質プールを、ｐＨ５．０の３０ｍＭのアセテート、１５０ｍＭのＮａＣｌですでに平衡化してあったＧＥ  ＨｉＬｏａｄ  ２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｐｒｅｐ  Ｇｒａｄｅサイズ分離カラムに直接充填した。サイズ分離実行中に集められたピーク画分を硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動により解析し、均一な産物用のプールに適切な画分を決定した。最終的なサイズ分離プールのｐＨを、１０％氷酢酸を添加してｐＨ４．５に調整し、次いで透析により緩衝液を１０ｍＭの酢酸ナトリウム、９％（ｗ／ｖ）スクロース、ｐＨ４．５にした。それを、１０キロダルトン分子量カットオフ遠心装置を用いて１５ｍｇ／ｍｌ超に濃縮した。凍結に対するタンパク質安定性を３サイクルの凍結及び解凍により試験した。最後に、最終ロットを濾過滅菌し、精製されたＧＤＦ１５分子を含む得られた溶液を−８０℃で保存した。最終産物について、質量スペクトル解析、ｎ末端シーケンシング、硫酸ドデシルナトリウムポリアクリルアミド電気泳動及びサイズ排除高速液体クロマトグラフィーを用いて同一性及び純度を評価した。
【００９８】
次いでｓｃＦｃ−ＧＤＦ１５及びＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５の活性について、インビボ活性を解析した。カニクイザル（各群ｎ＝１０）にビヒクル、３ｍｇ／ｋｇの陽性対照ＦＧＦ２１−Ｆｃ、１．５ｍｇ／ｋｇのｓｃＦｃ−ＧＤＦ１５又は１．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）を週１回６週間投与し、続いて５週間の休薬期を設けた。体重及びトリグリセリドレベルを測定した。自然発症肥満のナイーブな雄カニクイザルについて、健康を事前スクリーニングし、ボディマスインデックスは＞４１であった。サルを処置の６週間前に個別飼育、実験手順及び取り扱いに慣れさせた。サルを４群に分け、同様のベースラインを有するように各群にＳＣ注射を週１回６週間（０日目、７日目、１４日目、２１日目、２８日目及び３５日目）を行った。夜間絶食後の血液サンプルを、投与２４日前、１７日前及び１０日前、並びに処置期中の６日目、１３日目、２０日目、２７日目、３４日目及び４１日目（各々週１回の投与の６日後）に集めた。休薬期中の血液サンプルは４８日目、５５日目、６２日目、６９日目及び７６日目に集めた。本試験を通してサルごとに体重を週１回測定し、餌摂取量を毎日モニターした。各サルに約８時間間隔を置いた朝及び夕の給餌時に、限られた時間（１時間）無制限の餌を与えた。食間に限られた時間（１時間）１５０ｇのリンゴの軽食を与えた。毎回の食事又は軽食後、残った餌又はリンゴを除去し体重を測って食物摂取量を計算した。
【００９９】
ＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質は、ＦＧＦ２１−Ｆｃと同様に体重（図１）及びトリグリセリドレベル（図２）を減少させた。
【０１００】
実施例２：ＧＤＦ１５（ＷＴ）−リンカー−Ｆｃ分子の属性
実施例１に記載されているようなＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（配列番号３９）分子及びＦｃΔ１０（＋）−（Ｇ４）−ＧＤＦ１５（配列番号４０）について、その安定性及び製造性（たとえば、商業生産のため）に影響を与え得る属性を解析した。ＧＤＦ１５分子（たとえば、ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５及びＦｃΔ１０（＋）−（Ｇ４）−ＧＤＦ１５）は、分子の製造性に望ましくない特徴、非常に不均一であること（たとえば、ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５のイオン交換カラム画分の解析から、分子が非常に不均一であることが示される、図３）が確認された。非常に不均一な集団が生じるＧＤＦ１５分子の属性を決定するため、サイズ排除クロマトグラフィー、ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル及び質量分析法による分子の解析を行った。サイズ排除クロマトグラフィーによる保持時間に差がないことから、凝集又は著しい分解が不均一性の原因ではなさそうであることが示された。ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルにも差がなかったことから、ジスルフィド対の誤り又は著しい分解も不均一性の原因ではなさそうであることが示された。
【０１０１】
ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（配列番号３９）の不均一性を評価するため、ＭＳ解析も行った。ＧＤＦ１５分子をｍｏｎｏ  Ｓ、１ｍｌカラムを用いて精製し、画分番号２５（Ｐ１）、画分番号２８（Ｐ２）及び画分番号３１（Ｐ３）（図３）を集め、ＭＳ解析に供した。約５０μｇの画分を乾燥させ、２５μＬの１５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．５／８Ｍの尿素／４０ｍＭのヒドロキシルアミン／１０ｍＭのＤＴＴに再懸濁し、次いで３７℃で１時間インキュベートした。サンプルを室温、暗所で３０分間、２０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）でアルキル化した。次いでサンプルを水及び２μｇのトリプシン（１：２５）で１００μＬに希釈し、３７℃で一晩消化させた。消化物を酸性化し、続いてＷａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍに注入した。サンプルを最初に１５μＬ／ｍｉｎで１８０μｍ×２０ｍｍ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８トラップカラムに充填し、続いてＡｇｉｌｅｎｔ（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）Ｚｏｒｂａｘ  ０．５ｍｍ×２５０ｍｍ  ３００ＳＢ−Ｃ１８カラムでペプチドの分離を行った。緩衝液Ａは、０．１％ギ酸／水で、一方緩衝液Ｂは、０．１％ギ酸／９９．９％アセトニトリルであった。グラジエントは、１％Ｂを初期条件をとし、続いて８５分かけて４５％Ｂに増加させ、１分かけて９７％Ｂにし、９７％Ｂで６分間イソクラティックとし、３分かけて１％Ｂにし、次いで２０分間１％Ｂでイソクラティックとした。ＵＰＬＣカラム溶出物を、標準的な加熱エレクトロスプレーイオン化ＩＩ（ＨＥＳＩ  ＩＩ）イオン化源を用いてＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ  Ｐｒｏ質量分析計に噴霧した。質量分析計法は、３０Ｋ分解能でのｍ／ｚ［３００〜２０００］のフルスキャンＭＳ、続いて最も豊富な上位１０のプリカーサーイオンＭＳ／ＭＳ（ＣＩＤの実行）からなった。解析には以下の装置パラメーターを使用した：ソース電圧＝３．５ｋＶ；キャピラリー温度＝２７５℃；ＳレンズＲＦレベル＝５０％；実行時間＝１０ｍｓｅｃ；補正コリジョンエネルギー＝３５；単離幅＝２．０Ｄａ；及び閾値＝１．０Ｅ４。高分解能ＭＳデータのデコンボリューションには、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｘｃａｌｉｂｕｒ２．１ソフトウェアのＸｔｒａｃｔコンポーネントを使用した。１．２のＳ／Ｎ閾値及びｍ／ｚ４００における分解能１００，０００を用いて、［３００〜２０００］からの平均データをデコンボリューションした。デコンボリューションしたペプチド質量（グリコシル化及び非グリコシル化）をモノアイソトピック［Ｍ＋Ｈ］＋として示した。グリカンサブユニットの段階的な消失及びＣＩＤ実行後の最も強いフラグメントとしての非グリコシル化プリカーサーイオンの存在により、様々なグリコシル化種が確認された。
【０１０２】
ＭＳ結果から、様々な程度の脱アミド化種（たとえば、Ｐ１の７０％、Ｐ２の４７％及びＰ３の２４％）及びリンカー上のグリコシル化の分布（主に単糖及び三糖）が、そのＣＥＸプロファイル（図３）に示すようにＧＤＦ１５分子の非常に不均一な性質に寄与することが示された。（Ｇ４Ｓ）４リンカー（たとえば、ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５に存在する）は、様々な程度及び種類のグリコシル化及び／又はリン酸化を伴い高度にグリコシル化及びリン酸化されること、及び野生型ヒトＧＤＦ１５の活性フラグメントのＮ末端は、脱アミド化及び異性化の影響を非常に受けやすいこと（たとえば、図４を参照、図４は、３位にアスパラギンを含むペプチドの非修飾種、脱アミド化種及び異性化種に相当する、フルマススペクトルデータから抽出されたいくつかの質量を示す。抽出された質量は、ペプチドの二価体由来のｍ／ｚ［５９０．２５〜５９０．７５］であった）が確認された。３位のアスパラギン（ｈＧＤＦ１５の活性フラグメントをコードするアミノ酸配列、配列番号６の場合）は、脱アミド化及び異性化の影響を非常に受けやすく、５位のアスパルテート（ｈＧＤＦ１５の活性フラグメントをコードするアミノ酸配列、配列番号６の場合）は、異性化の影響を非常に受けやすかった。
【０１０３】
これらの属性に基づき、Ｆｃ領域へのリンカーと共に野生型ヒトＧＤＦ１５の活性フラグメントを有するＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質の全体に均一な集団を製造すること（たとえば、商業生産のため）は、困難であると考えられる。
【０１０４】
実施例３：リンカーを用いないＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質の活性
実施例２に記載した不均一性問題に対応するため、１）ＧＤＦ１５領域とＦｃ領域との間のリンカーを除去し、２）野生型ヒトＧＤＦ１５の活性フラグメントのＮ末端残基を除去又は置換した新規なＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質（たとえば、野生型ヒトＧＤＦ１５の活性フラグメントの最初の３アミノ酸が欠失されるＧＤＦ１５（Δ３）（配列番号１３）、又は野生型ヒトＧＤＦ１５の活性フラグメントの３位のアスパラギンがアスパルテートに変異されたＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）（配列番号１６））。
【０１０５】
Ｆｃ分子がＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ領域に非共有結合的に会合してヘテロ二量体を形成するのに適した、ＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ領域及びＦｃ分子における電荷対の変異に加えて、ＧＤＦ−Ｆｃ分子のＦｃ分子とのヘテロ二量体化を増大させるため、新規な分子のいくつかは、ＣＨ３領域に鎖間ジスルフィド結合、又は「システインクランプ」（その記号内に「ＣＣ」を含む分子）をさらに含むように設計した。
【０１０６】
１）ＧＤＦ１５領域とＦｃ領域との間のリンカーを欠失させ、２）ＧＤＦ１５のＮ末端残基を消失させた又は置換させた４つの新規なＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質を生成した。４分子のうち２つでは、ＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ領域のＣＨ３ドメイン（さらにはヘテロ二量体化のためその対応するＦｃ分子）に鎖間ジスルフィド結合も導入した。これらの分子（ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Δ３）（配列番号４１）；ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）（配列番号４２）；ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３）（配列番号４３）；ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）（配列番号４４））の効力及び薬物動態学的（ＰＫ）特性を、マウスにおいて前世代ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（配列番号３９）と比較した。
【０１０７】
分子の効力を判定するため、食物摂取量を測定した。個別飼育した７〜８週齢雄ｏｂ／ｏｂマウスを、各群が同程度の処置前体重レベル及び食物摂取レベルを有する種々の処置群に分けた。動物を皮下注射により０．３２ｕｇ／ｋｇ、１．６ｕｇ／ｋｇ、８ｕｇ／ｋｇ、４０ｕｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇのＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質（ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Δ３）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）（配列番号４１及び３２）；ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）（配列番号４２及び３２）；又はＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、ＣＣ）（配列番号３９及び３２）の二量体）で処置し、夜間の食物摂取量を測定した。示したデータは、２〜４回の独立した試験の平均である（図５）。４つの新規な分子、ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Δ３）（配列番号４１）；ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）（配列番号４２）；ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３）（配列番号４３）；及びＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）（配列番号４４）は、前世代ＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質、ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（配列番号３９）と同程度の効力を有した。
【０１０８】
分子の薬物動態を判定するため、１８週齢雄の食餌性肥満Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１ｍｇ／ｋｇのタンパク質を皮下投与し、投与１時間後、４時間後、８時間後、２４時間後、７２時間後、１６８時間後、２４０時間後及び３３６時間後に連続サンプリングを行った。４つの新規な分子、ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Δ３）（配列番号４１）；ＦｃΔ１０（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）（配列番号４２）；ＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３）（配列番号４３）；及びＦｃΔ１０（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｄ）（配列番号４４）は、前世代ＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質、ＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（配列番号３９）と同程度の薬物動態特性を有した（図６）。
【０１０９】
実施例４：リンカーを用いないＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質のさらなる操作
製造性及び安定性の属性が改善された新設計の分子が前世代分子と同様の効力特性及びＰＫ特性を有したため、起こり得る不均一性を低下させ、Ｆｃエフェクター機能を低下させて効力を増大させるように分子をさらに操作した。
【０１１０】
ＧＤＦ１５領域の不均一性をさらに低下させるため、３位のアスパラギンをアスパルテートで置換する代わりに、アスパラギンをグルタミンで置換した。さらに、天然のＧＤＦ１５タンパク質の高い脱アミド化率及び異性化率を排除するため、ＧＤＦ１５のＮ末端に２つの変化、たとえば、ＧＤＦ１５（Δ３／Ｄ５Ｅ）（配列番号１７）、ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（配列番号１８）が導入されるように分子を操作した。Ｆｃエフェクター機能を低下させて効力を向上させるため、Ｆｃヒンジ領域から追加の６アミノ酸を欠失させること（たとえば、ＦｃΔ１０ではなくＦｃΔ１６）によりＦｃ領域のヒンジ領域がさらに欠失してＦｃγＲへの結合を減少させるように分子をさらに操作した。ヒンジ領域の同じ操作は、ＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質がヘテロ二量体化する対応するＦｃ分子についても行った。
【０１１１】
さらに操作したＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質、ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３／Ｄ５Ｅ）（配列番号４５）、ＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（配列番号４６）及びＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（配列番号４７）の活性を、カニクイザルにおいて試験した。自然発症肥満のナイーブな雄カニクイザルに、処置開始の前の１０週間手順上の操作（たとえば、血液採取、皮下注射、体重測定、給餌スケジュール）への馴化／訓練を行った。馴化／訓練期中に収集したデータ（血液化学検査及び体重）に基づき、８０匹のサルを各々ｎ＝サル１０匹の８つの処置群に分けた。各処置群にビヒクル、３ｍｇ／ｋｇの陽性対照ＦＧＦ２１−Ｆｃ、０．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３／Ｄ５Ｅ）（そのヘテロ二量体化パートナー、ＦｃΔ１６（＋、Ｋ、ＣＣ）（配列番号３５）と共に）、３．０ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Δ３／Ｄ５Ｅ）（そのヘテロ二量体化パートナー、ＦｃΔ１６（＋、Ｋ、ＣＣ）（配列番号３５）と共に）、０．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（そのヘテロ二量体化パートナー、ＦｃΔ１６（＋、Ｋ、ＣＣ）と共に）、３．０ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−、ＣＣ）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（そのヘテロ二量体化パートナー、ＦｃΔ１６（＋、Ｋ、ＣＣ）と共に）、０．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（そのヘテロ二量体化パートナー、ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）（配列番号３６）と共に）又は３．０ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−）−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（そのヘテロ二量体化パートナー、ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）（配列番号３６）と共に）を投与した。各々の皮下注射を処置期中の４週間週１回行い、続いて４週間の休薬期を設け；処置期及び休薬期中に血液採取及び体重のモニタリングを週１回行い、食物摂取を毎日行った。グラフは、ｎ＝５〜６／群を表し、データは群平均＋ＳＥＭで表される。統計解析は、ＡＮＣＯＶＡにより行った。統計学的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１対ビヒクルとして示される。薬剤の急速なクリアランスを示したサルは、抗薬物抗体（ＡＤＡ）の疑いがあり、解析から除外した。
【０１１２】
意外にも、新たに操作したＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質は、ほとんどすべての効力を失った（図７）。前に生成したＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質とは異なり、新たに操作したＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質で、ＦＧＦ２１−Ｆｃと同程度まで体重を減少させたものはなかった（実施例１、図１を参照）
【０１１３】
実施例５：カニクイザルにおけるＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質活性の回復
実施例４のＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質は、実施例１のＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、表７に示すような以下の相違を有した。
【０１１４】
【表２０】
2020533271.tif 000033
【０１１５】
効力を回復させるため、サルにおいて有効であった分子の様々な態様を、新規なＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質に再導入した。ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）（配列番号４９）；ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（配列番号５０）及びＦｃΔ１６（−）−Ｇ４Ｓ−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（配列番号５４）では、システインクランプ（ＣＨ３鎖間のジスルフィド結合）を排除し、リンカーを再導入した。しかしながら、本実施例で使用したリンカーは、グリコシル化を減少させるため、グリコシル化され得ないものであるか（たとえば、Ｇ４Ｑ）、或いはより短いものであった（（Ｇ４Ｓ）４ではなくＧ４Ｓ）。さらに、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）では、５位の変異を排除した。最後に、新規な分子ＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（配列番号５７）では、Ｆｃ領域のヒンジ領域の小さい方の欠失を再導入したが、但しＦｃγＲ結合を排除すると考えられるＦｃ領域のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異と共に再導入した。
【０１１６】
これらの新規な分子を、実施例１でカニクイザルにおいて有効であることが示されたＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５と比較した。自然発症肥満のナイーブな雄カニクイザルに、処置開始の前の２週間手順上の操作（たとえば、血液採取、皮下注射、体重測定、給餌スケジュール）への馴化／訓練を行った。馴化／訓練期中に収集したデータ（血液化学検査及び体重）に基づき、４２匹のサルを各々ｎ＝サル７匹の６つの処置群に分けた。各処置群にビヒクル、１．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１０（−）−（Ｇ４Ｓ）４−ＧＤＦ１５（そのヘテロ二量体化パートナー、ＦｃΔ１０（＋、Ｋ）と共に）、１．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ）（そのヘテロ二量体化パートナー、ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）と共に）、１．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（そのヘテロ二量体化パートナー、ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）と共に）、１．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１６（−）−Ｇ４Ｓ−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（そのヘテロ二量体化パートナー、ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）と共に）又は１．５ｍｇ／ｋｇのＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（そのヘテロ二量体化パートナー、ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）（配列番号３７）と共にを投与した。皮下注射を処置期中の２週間週１回行い；処置期中、血液採取及び体重モニタリングを週１回行い、食物摂取量を毎日モニターした。グラフは、ｎ＝７／群を表し、データは、群平均＋ＳＥＭで表される。統計解析は、ＡＮＣＯＶＡにより行った。統計学的有意性は、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１及び＊＊＊ｐ＜０．００１対ビヒクルとして示される。新規な分子は効力を回復した（図８）。
【０１１７】
これらの結果に基づき、Ｎ３Ｑ変異は、サルにおいてＧＤＦ１５活性に影響を与えず、ＧＤＦ１５の二重変異（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）もサルにおいてＧＤＦ１５活性に影響を与えないと判定された。さらに１６アミノ酸Ｆｃヒンジ欠失（Δ１６）は、サルにおいて１０アミノ酸Ｆｃヒンジ欠失（Δ１０）と同様の作用を有することも示された。最後に、リンカーが、サルにおいて活性の決定的な成分であることが示された。リンカーがＧ４ＳかそれともＧ４Ｑであるかは活性に影響を与えないけれども、リンカーの長さは、活性にとって重要である。より長いリンカー（たとえば、図８における（Ｇ４Ｓ）４及び（Ｇ４Ｑ）４）は、より短いリンカー（たとえば、Ｇ４Ｓ）と比較してより強力である。
【０１１８】
実施例６：ｏｂ／ｏｂマウスを用いたＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）及びＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）の食物摂取量アッセイ
食物摂取量アッセイを用いて、２つの異なるＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質の有効性を評価した。７〜８週齢の個別飼育した雄ｏｂ／ｏｂマウスを、各群が同程度の処置前体重レベル及び食物摂取レベルを有する種々の処置群（各群ｎ＝５）に分けた。動物を皮下注射により０．３２ｕｇ／ｋｇ、１．６ｕｇ／ｋｇ、８ｕｇ／ｋｇ、４０ｕｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ又は５ｍｇ／ｋｇのヘテロ二量体ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１６（＋、Ｋ）又はＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）：ＦｃΔ１０（＋、Ｋ、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）で処置し、夜間の食物摂取量を測定した。各ＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質の代表的な実験の結果を、ＦｃΔ１６（−）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（図９）及びＦｃΔ１０（−、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）−（Ｇ４Ｑ）４−ＧＤＦ１５（Ｎ３Ｑ／Ｄ５Ｅ）（図１０）の用量反応曲線で示す。結果から、どちらのＧＤＦ１５−Ｆｃ融合タンパク質も、急性ｏｂ／ｏｂマウスにおいて食物摂取量を減少させることが示される。本アッセイにおけるＥＤ５０を表８に示す。
【０１１９】
【表２１】
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【０１２０】
種々の実施形態によって本発明を記載してきたが、当業者ならば変形及び修正を思いつくことが理解されよう。したがって、添付の特許請求の範囲は、特許請求の範囲に記載の本発明の範囲内にある、そうしたすべての等価な変形を包含することを意図している。さらに、本明細書に使用するセクション見出しは、整理することのみを目的とするものであり、記載された主題を限定するものと解釈してはならない。
【０１２１】
本出願に引用された参考文献はすべて、いかなる目的においても明示的に本明細書に援用する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月13日(2020.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンカーを介してＦｃ領域に連結されたＧＤＦ１５領域を含む融合タンパク質であって、前記ＧＤＦ１５領域は、配列番号６のアミノ酸配列及び少なくとも１つの変異を含み、前記変異の少なくとも１つは、５位のアスパルテートである、融合タンパク質。
【請求項２】
前記５位のアスパルテートは、グルタメートに変異している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記ＧＤＦ１５領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＧＤＦ１５領域は、３位のアスパラギンの変異をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
３位のアスパラギンが、グルタミンに変異している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＧＤＦ１５領域は、配列番号１８のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー又は（Ｇ４Ｑ）ｎリンカーであり、ｎは、０より大きい、請求項１〜６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ｎは、１又は２である、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
リンカーを介してＦｃ領域に連結されたＧＤＦ１５領域を含む融合タンパク質であって、前記ＧＤＦ１５領域は、配列番号６のアミノ酸配列及び少なくとも１つの変異を含み、前記変異の少なくとも１つは、３位のアスパラギン又は５位のアスパルテートであり、且つ前記リンカーは、（Ｇ４Ｑ）ｎリンカーであり、ｎは、２より大きい、融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ｎは、３又は４である、請求項７又は９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＧＤＦ１５領域は、５位のアスパルテートのグルタメートへの変異を含む、請求項９又は１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ＧＤＦ１５領域は、配列番号１６のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ＧＤＦ１５領域は、前記３位のアスパラギンのグルタミンへの変異を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ＧＤＦ１５領域は、配列番号１４又は１８のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記Ｆｃ領域は、電荷対の変異を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記Ｆｃ領域は、トランケートされたヒンジ領域を含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記Ｆｃ領域は、表３から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１〜１７及び１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む、代謝障害を治療するための医薬組成物。
【請求項１９】
配列番号５０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
代謝症候又は障害が、糖尿病、肥満、脂質代謝異常、高グルコースレベル、高インスリンレベル又は糖尿病性ニューロパチーである、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
代謝症候又は障害が、２型糖尿病である、請求項２０に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
１００ｍｇ／ｄＬ超の空腹時血糖レベルを有する被検体を治療するための、請求項１〜１７及び１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
【請求項２３】
少なくとも１２５ｍｇ／ｄＬの空腹時血糖レベルを有する被検体を治療するための、請求項１〜１７及び１９のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
【国際調査報告】
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