(57)【要約】【課題】ＡＲＣカプシドの組成物及び使用方法を提供する。【解決手段】本明細書では、組換えＡｒｃカプシド、Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列を含むベクター、及びそのようなベクターを含む細胞を開示する。ｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、Ａｒｃカプシドを細胞に投与することを含み、Ａｒｃカプシドが関心対象のｍＲＮＡを含んでいる、当該方法を開示する。ｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、開示されるベクターのいずれか１つを細胞に投与すること、及び関心対象のｍＲＮＡを細胞に投与することを含み、核酸配列が細胞内でＡｒｃタンパク質をコードし、Ａｒｃカプシドが形成され、Ａｒｃカプシドが中に関心対象のｍＲＮＡを封入する、当該方法を開示する。Ａｒｃカプシドを形成する方法であって、細胞を含む溶液に、Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列を含むベクターを投与することを含み、核酸配列が細胞内でＡｒｃタンパク質をコードし、Ａｒｃカプシドが形成される、当該方法を開示する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列を含むベクター。
【請求項２】
標識部分をコードすることができる核酸配列をさらに含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
前記標識部分がＧＦＰである、請求項２に記載のベクター。
【請求項４】
前記標識部分が、前記Ａｒｃタンパク質をコードすることができる前記核酸配列に機能可能に繋げられている、請求項２〜３のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項５】
標的指向性部分をコードすることができる核酸配列をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項６】
前記標的指向性部分が、前記Ａｒｃタンパク質をコードすることができる前記核酸配列に機能可能に繋げられている、請求項５に記載のベクター。
【請求項７】
前記標的指向性部分が抗体、ペプチドまたはペプチドリガンドである、請求項５〜６のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項８】
前記Ａｒｃタンパク質をコードすることができる前記核酸配列に機能可能に繋げられたプロモーターをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項９】
前記プロモーターが誘導性プロモーターである、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
前記プロモーターが細胞特異的プロモーターである、請求項８〜９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項１１】
標識部分と複合したＡｒｃカプシド。
【請求項１２】
前記標識部分がＧＦＰである、請求項１１に記載のＡｒｃカプシド。
【請求項１３】
標的指向性部分と複合したＡｒｃカプシド。
【請求項１４】
前記標的指向性部分が細胞特異的な標的指向性部分である、請求項１３に記載のＡｒｃカプシド。
【請求項１５】
標識部分をさらに含む、請求項１３〜１４のいずれか１項に記載のＡｒｃカプシド。
【請求項１６】
異種ｍＲＮＡ配列を含むＡｒｃカプシド。
【請求項１７】
前記Ａｒｃカプシドが哺乳動物のものである、請求項１１〜１６のいずれか１項に記載のＡｒｃカプシド。
【請求項１８】
前記Ａｒｃカプシドが３０〜４０ｎｍである、請求項１１〜１７のいずれか１項に記載のＡｒｃカプシド。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２０】
前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項１９に記載の細胞。
【請求項２１】
請求項１１〜１８のいずれか１項に記載のＡｒｃカプシドを含む細胞。
【請求項２２】
Ａｒｃカプシドと薬学的に許容される担体とを含む組成物。
【請求項２３】
前記Ａｒｃカプシドが請求項１１〜１８に記載のＡｒｃカプシドのいずれか１つである、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
ｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、Ａｒｃカプシドを細胞に投与することを含み、前記Ａｒｃカプシドが関心対象のｍＲＮＡを含んでいる、前記方法。
【請求項２５】
前記細胞がニューロンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞がヒト細胞である、請求項２４〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記Ａｒｃカプシドが前記細胞にとって異種である、請求項２４〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
関心対象の前記ｍＲＮＡが治療薬である、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
関心対象の前記ｍＲＮＡがＡｒｃ  ｍＲＮＡではない、請求項２４〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
ｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、
請求項１〜１０に記載のベクターのいずれか１つを細胞に投与すること、及び
関心対象のｍＲＮＡを前記細胞に投与すること
を含み、前記核酸配列が前記細胞内でＡｒｃタンパク質をコードし、Ａｒｃカプシドが形成され、
前記Ａｒｃカプシドが中に関心対象の前記ｍＲＮＡを封入する、前記方法。
【請求項３１】
前記ベクターが関心対象の前記ｍＲＮＡを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
関心対象の前記ｍＲＮＡが治療薬である、請求項３０〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
関心対象の前記ｍＲＮＡがＡｒｃ  ｍＲＮＡではない、請求項３０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞がニューロンである、請求項３０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞がヒト細胞である、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記Ａｒｃカプシドが前記細胞にとって異種である、請求項３０〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
ｍＲＮＡを対象に送達する方法であって、請求項１９〜２１に記載の細胞のいずれか１つを、それを必要とする対象に１つ以上投与することを含む、前記方法。
【請求項３８】
前記細胞が異種のものである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞が自家性である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
Ａｒｃカプシドを形成する方法であって、
細胞を含む溶液に、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のベクターを投与すること
を含み、前記核酸配列が前記細胞内でＡｒｃタンパク質をコードし、Ａｒｃカプシドが形成される、前記方法。
【請求項４１】
関心対象のｍＲＮＡを投与することをさらに含み、Ａｒｃ形成中に前記ｍＲＮＡが前記Ａｒｃカプシド内にパッケージングされる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記溶液の塩濃度を１００〜３００ｍＭの範囲に増加させることをさらに含む、請求項４０〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記塩がＮａＣｌまたはＮａＰＯ4である、請求項４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の参照
２０１７年８月９日に作成されたサイズ７１，２００バイトの「２１１０１＿０３５２Ｕ２＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」と名付けたテキストファイルとして２０１７年８月９日に提出された配列表を、連邦規則集第３７巻第１．５２（ｅ）（５）節に準じて、これをもって参照により援用する。
【背景技術】
【０００２】
ニューロン関連遺伝子Ａｒｃは、哺乳動物の脳において永続的な情報記憶のために必須であり、様々なタイプのシナプス可塑性を媒介し、神経発達障害に関係があるとされてきた。しかしながら、Ａｒｃの分子機能及び進化的起源についてはほとんど知られていない。新たな研究は、Ａｒｃが、レトロウイルスに共通するＧａｇポリプロテインとの相同性を有するレトロトランスポゾンに由来することを示唆している。Ａｒｃの生化学は、レトロウイルスに類似した分子特性を呈する。
【発明の概要】
【０００３】
Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列を含むベクターを開示する。
【０００４】
組換えＡｒｃカプシドを開示する。標識部分または標的指向性部分またはその両方と複合した、Ａｒｃカプシドを開示する。
【０００５】
Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列を含むベクターを含む細胞を開示する。
【０００６】
Ａｒｃカプシドと薬学的に許容される担体とを含む組成物を開示する。
【０００７】
ｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、Ａｒｃカプシドを細胞に投与することを含み、Ａｒｃカプシドが関心対象のｍＲＮＡを含んでいる、当該方法を開示する。
【０００８】
ｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、開示されるベクターのいずれか１つを細胞に投与すること、及び関心対象のｍＲＮＡを細胞に投与することを含み、核酸配列が細胞内でＡｒｃタンパク質をコードし、Ａｒｃカプシドが形成され、Ａｒｃカプシドが中に関心対象のｍＲＮＡを封入する、当該方法を開示する。
【０００９】
ｍＲＮＡを対象に送達する方法であって、開示される細胞のいずれか１つを、それを必要とする対象に１つ以上投与することを含む、当該方法を開示する。
【００１０】
Ａｒｃカプシドを形成する方法であって、細胞を含む溶液に、Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列を含むベクターを投与することを含み、核酸配列が細胞内でＡｒｃタンパク質をコードし、Ａｒｃカプシドが形成される、当該方法を開示する。
【００１１】
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、その一部をなすものであるが、記述とともに開示される方法及び組成物のいくつかの実施形態を図示しており、開示される方法及び組成物の本質を説明する上で役に立つ。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】Ａ〜Ｄ。Ａｒｃは、保存されたレトロウイルスＧａｇ  ＣＡドメインによってウイルス様カプシドを形成する。（Ａ）四足類Ａｒｃ、ハエｄＡｒｃ１、及び関連Ｔｙ３／ｇｙｐｓｙレトロトランスポゾン由来のＧａｇ配列のアミノ酸アラインメントに基づく最尤系統図。Ｇａｇ単独のＡｒｃ遺伝子及びＴｙ３／ｇｙｐｓｙエレメントの模式図が系統樹の右側に入っている。Ａｒｃ遺伝子を除く系統においてＡｒｃと最も緊密な関係のある配列は、真性Ｔｙ３／ｇｙｐｓｙレトロトランスポゾンで予想されるような長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）に挟まれたＧａｇ−ｐｏｌポリプロテインである。（Ｂ）（上）完全長精製ラットＡｒｃ（ｐｒＡｒｃ）タンパク質（１ｍｇ／ｍＬ、４２，０００ｘ）の代表的な陰性染色ＥＭ画像。（ｉ〜ｉｖ）四角で囲んだ粒子の拡大図。スケールバー＝３０ｎｍ。ｐｒＡｒｃ（２ｍｇ／ｍＬ、６２，０００ｘ）の代表的なｃｒｙｏ−ＥＭ画像。（ｖ〜ｖｉｉ）二重の層になったカプシド殻を示すＡｒｃカプシドの拡大画像。スケールバー＝３０ｎｍ。（下）ｐｒＡｒｃカプシドの動的光散乱分析。重み付けした粒径分布プロファイルを粒子数の度数分布図として表す。（Ｃ）予測マトリックス（ＭＡ）（橙色）、ＣＡ−ＮＴＤ（緑色）及びＣＡ−ＣＴＤ（青色）ドメインを有するＡｒｃタンパク質の模式図。ΔＣＴＤ欠失突然変異体、及びＣＡドメイン構築物も描写されている。精製されたＧＳＴ、ｐｒＡｒｃ、ショウジョウバエＡｒｃ相同体ｄＡｒｃ１、ｐｒＡｒｃ−ΔＣＴＤ、及びＣＡ−ｐｒＡｒｃの代表的な陰性染色ＥＭ画像（全て１ｍｇ／ｍＬ、２０，０００ｘ）。挿入図スケールバー＝５０ｎｍ。（下）カプシド形成の定量。完全に形成されたカプシドは、透明な二重殻を有する２０〜６０ｎｍの球状粒子を含むが、部分的に形成されたカプシドは透明な二重殻を有しない（スケールバー＝１００ｎｍ）。データは３つの異なるｐｒＡｒｃ調製物を使用した３つの独立した実験の平均±標準誤差である。***ｐ＜０．００１、二元配置ＡＮＯＶＡと事後のｔ検定。（Ｄ）（上）Ａｒｃカプシド安定性の特性を決定するために、塩のモル濃度を漸増させた緩衝液の中にｐｒＡｒｃを入れ替え、陰性染色ＥＭによって調べた。１．５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度で各緩衝液条件でＡｒｃカプシドを手作業で計数し定量した。データは、異なるｐｒＡｒｃ調製物を使用した３つの独立した実験の平均±標準誤差である。**ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定。（下）０ＭのＮａＣｌ及び０．５ＭのＮａＰＯ４の条件下でのｐｒＡｒｃの代表的なＥＭ画像。
【図２】Ａ〜Ｅは、Ａｒｃタンパク質がｍＲＮＡと相互作用することを示す。（Ａ）（左）ｐｒＡｒｃからのＡｒｃ  ｍＲＮＡ及び細菌ｍＲＮＡ  ａｓｎＡのｑＲＴ−ＰＣＲ、（右）全細菌溶解物からのＡｒｃ及びａｓｎＡ  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ。データは、ａｓｎＡ群の平均に対して正規化した平均±標準誤差として表されている（スチューデントのｔ検定、ｎ＝３の独立したタンパク質調製物、*ｐ＜０．０５）。（Ｂ）タンパク質調製物に対してＲＮアーゼＡによる処理を１５分間行い、または行わず、そしてｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＲＮアーゼ処理はＡｒｃ及びａｓｎＡ  ｍＲＮＡレベルに影響を及ぼさなかった（対応t検定、ｎ＝５の独立したタンパク質試料）が、外来／遊離ＧＦＰ  ｍＲＮＡを有意に減成させた（対応t検定、ｎ＝３の独立した試料、*ｐ＜０．０５）。データは、未処理群の平均に対して正規化した±標準誤差として表されている。（Ｃ）（上）ＡｒｃまたはＩｇＧ抗体を使用してＷＴマウス皮質組織から免疫沈降（ＩＰ）させたＡｒｃタンパク質の代表的なウェスタンブロット。投入物（Ｉ）＝１０％全溶解物。（下、左）Ａｒｃ抗体を使用したＡｒｃタンパク質の顕著な濃縮を示す、Ａｒｃタンパク質ＩＰの定量。（下、右）ＩＰからの溶離画分に対してｑＲＴ−ＰＣＲを実施した。ＩＰにおいてＡｒｃ  ｍＲＮＡは特異的に沈められた（反復測定による二元配置ＡＮＯＶＡ及びＳｉｄａｋ多重比較：Ａｒｃ＋ＩｇＧに対するＡｒｃ＋Ａｒｃ、ｐ＝０．０１；ＧＡＰＤＨ＋Ａｒｃに対するＡｒｃ＋Ａｒｃ、ｐ＝０．０１３；ＧＡＰＤＨ＋ＩｇＧに対するＡｒｃ＋Ａｒｃ、ｐ＝０．０１１）。データは、ＩｇＧ群の平均に対して正規化した平均±標準誤差として表されている。（Ｄ）ｐｒＡｒｃ及びｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ−）からのＡｒｃ  ｍＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲ。ｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ−）調製物中のＡｒｃ  ｍＲＮＡは有意に少なかった。ｐｒＡｒｃ群の平均に対して正規化した平均±標準誤差として表されている（スチューデントのｔ検定、ｎ＝３の独立した試料、*ｐ＝０．０５）。（Ｅ）（左）ｐｒＡｒｃ、ｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ−）、及び７．３％（ｗ／ｗ）のＧＦＰ  ｍＲＮＡと共に室温で２時間インキュベートしたｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ−）の代表的な陰性染色ＥＭ画像（０．２５ｍｇ／ｍＬ、１５，０００ｘ）。完全に形成されたカプシドを赤色矢印で示す（スケールバー＝１００ｎｍ）。（右）図１Ｃと同様にカプシドを定量した。データを各条件からの６つの画像の平均±標準誤差として表す。***ｐ＜０．００１、独立ｔ検定。
【図３】Ａ〜Ｆは、Ａｒｃが細胞外小胞の中に入った状態で細胞から放出されることを示す。（Ａ）１０ｃｍ皿内のＨＥＫ細胞に完全長ラットＷＴ  ｍｙｃ−Ａｒｃをトランスフェクトし、培地を２４時間後に回収した。代表的なウェスタンブロット（ｎ＝３の独立した実験）はＡｒｃトランスフェクト（＋）及び未トランスフェクト（−）細胞において全細胞溶解物（細胞）中、及び細胞培地から精製されたＥＶ画分の中のＡｒｃタンパク質を示す。ＥＶ画分マーカーとしてＡＬＩＸを使用した。ポンソー染色剤を使用して各レーンのタンパク質の総量を可視化した。（Ｂ）ＨＥＫ２９３細胞にｍｙｃ−Ａｒｃ−ＷＴまたはｍｙｃ−Ａｒｃ−ΔＣＴＤをトランスフェクトし、培地を２４時間後に回収した。代表的なウェスタンブロット（ｎ＝３の独立した実験）は全細胞溶解物（細胞）中、及び細胞培地からのＥＶ画分の中のＡｒｃタンパク質を示す。各実験においてＥＶ画分のＡｒｃレベルは細胞溶解物のＡｒｃタンパク質レベルに対して正規化し、データはＷＴレベルに対して正規化して表されている（ｎ＝３）。*ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定。（Ｃ）ＨＥＫ  ＥＶ画分を処理しない（対照）で、またはＲＮアーゼ（ｎ＝６の独立した培養）で処理して、後にＲＮＡ抽出を行った。ｑＲＴ−ＰＣＲを使用してＡｒｃ  ｍＲＮＡレベルを測定し、データは、未処理群の平均に対して正規化した平均±標準誤差として表されている。対応t検定。（Ｄ）ＷＴ及びＡｒｃ  ＫＯマウスから得たＤＩＶ１５培養皮質ニューロンから培地を２４時間のインキュベーションの後に採集し、回収された培地からＥＶ画分を精製した。ブロットは全細胞溶解物（細胞）の上清（Ｓ）／可溶性画分及びペレット（Ｐ）／不溶性画分からのＡｒｃ、ＡＬＩＸ及びアクチンのレベルを示す。遠心分離精製プロトコールの（Ｓ）／最終洗浄液、及び精製ＥＶ画分（ＥＶ）としてのペレット（Ｐ）／ＥＶ画分。Ｓ及びＰの２．５％を細胞溶解物のために装填した。Ｓ及びＰの５％をＥＶ画分のために装填した。（Ｅ）ＷＴまたはＫＯマウス皮質組織、ＤＩＶ１５のＷＴまたはＫＯマウス皮質ニューロン（細胞）、及びＷＴまたはＫＯ培養ニューロンから回収した培地から精製されたＥＶに対して、Ａｒｃ及びＧＡＰＤＨプライマーを使用するＲＴ−ＰＣＲを実施した。Ａｒｃ  ｍＲＮＡは３つの調製物全ての中に存在していたが、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡはＥＶには存在していなかった。（Ｆ）（上）上記の（Ｄ）のＡｒｃ  ＫＯまたはＷＴ培養ニューロン培地から得たＥＶの中のＡｒｃに対するイムノゴールド標識。赤色矢印は１０ｎｍのイムノゴールド粒子を示す（２０，０００ｘ）。（下）イムノゴールド標識を使用する、Ａｒｃ陽性±標準誤差であったＥＶ（１００ｎｍ未満の小胞状構造体）の定量（ｎ＝３の独立した実験／ＥＶ調製物）。***ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定。
【図４】Ａｒｃ細胞外小胞がＨＥＫ２９３細胞におけるタンパク質及びｍＲＮＡの細胞間移動を媒介することを示す。（Ａ）１０ｃｍ皿内のドナーＨＥＫ細胞に６時間掛けてＧＦＰ−Ａｒｃ、ｍｙｃ−Ａｒｃ、またはｎｕｃｌｅａｒ  ＧＦＰ（ｎｕｃＧＦＰ）をトランスフェクトした。次いで、プラスミドＤＮＡ及びトランスフェクション試薬を含有する培養培地を除去し、新しい培養培地に替えた。１８時間後、この培地を取り出し、１２ウェルプレート内のカバースリップ上のナイーブレシピエントＨＥＫ細胞の培地を替えるために使用した。２４時間後、これらの細胞を固定し、Ａｒｃ  ｍＲＮＡのＦＩＳＨとＡｒｃタンパク質のＩＣＣとの組み合わせを実施した。（左）Ａｒｃタンパク質（ＩＣＣ）及びＡｒｃ  ｍＲＮＡ（ＦＩＳＨ）を示す、カバースリップ上で成長させ１０ｃｍ皿内での場合と同じプロトコールでトランスフェクトされたＨＥＫ細胞の代表的画像。（右）ｎｕｃＧＦＰではなくＧＦＰ−Ａｒｃ及びｍｙｃ−Ａｒｃをトランスフェクトされた細胞からの培地を与えた細胞にＡｒｃ  ｍＲＮＡ及びタンパク質が存在していたことを示す、レシピエントＨＥＫ細胞の代表的画像。スケールバー＝２０μｍ。７つの独立した実験及び培養を代表するもの。（Ｂ）１０ｃｍ皿内のドナーＨＥＫ細胞に膜ＧＦＰ（ｍＧＦＰ）、ｍｙｃ−Ａｒｃまたは両構築物を（Ａ）の場合と同様にトランスフェクトした。６時間後及び１８時間後に培地を替え、１２ウェルプレート内のナイーブレシピエントＨＥＫ細胞へ移した。２４時間後、細胞を固定し、ＧＦＰ  ｍＲＮＡ及びＡｒｃタンパク質に対してＦＩＳＨ／ＩＣＣの組み合わせを実施した。（左）ｍＧＦＰ蛍光、Ａｒｃタンパク質及びＧＦＰ  ｍＲＮＡを示す、カバースリップ上で成長したトランスフェクトされたＨＥＫ細胞の代表的画像。（右）ＧＦＰタンパク質及びｍＲＮＡと、Ａｒｃタンパク質との共移入を示す、レシピエントＨＥＫ細胞の代表的画像。ｍＧＦＰ単独の群ではＧＦＰ移入は観察されなかった。スケールバー＝２０μｍ。３つの独立した実験及び培養を代表するもの。
【図５】Ａ〜Ｄは、ＡｒｃカプシドがＡｒｃ  ｍＲＮＡをニューロン中に移入させることを示す。（Ａ）４ｍｇのｐｒＡｒｃで１時間もしくは４時間処理したＤＩＶ１５培養海馬Ａｒｃ  ＫＯニューロン、またはＷＴ対照ニューロンからの、Ａｒｃ  ＩＣＣの代表的画像。ｐｒＡｒｃ処理ニューロンは、未処理ＫＯニューロンに比べて向上した樹状突起Ａｒｃレベルを示す。（Ｂ）ニューロンを（Ａ）と同様に処理した。Ａｒｃ  ｍＲＮＡ（ＦＩＳＨ）の代表的画像を示す。４時間のｐｒＡｒｃ処理はＫＯニューロンの樹状突起Ａｒｃ  ｍＲＮＡレベルを有意に向上させた。（Ｃ）４ｍｇのｐｒＡｒｃ、ｐｒＡｒｃ−ΔＣＴＤ、またはＣＡ−ｐｒＡｒｃで４時間処理したＤＩＶ１５培養海馬ＫＯニューロンのＡｒｃ  ＩＣＣの代表的画像。ｐｒＡｒｃ−ΔＣＴＤ、及びＣＡ−ｐｒＡｒｃで処理されたＫＯニューロンはｐｒＡｒｃ処理ニューロンに比べてより低いＡｒｃタンパク質のレベルを示した。（Ｄ）ニューロンを（Ｃ）と同様に処理した。Ａｒｃ  ｍＲＮＡの代表的画像を示す。ｐｒＡｒｃ−ΔＣＴＤ、及びＣＡ−ｐｒＡｒｃで処理されたニューロンはｐｒＡｒｃ処理ニューロンに比べてより低いＡｒｃ  ｍＲＮＡのレベルを示した。白色四角で囲まれた樹状突起部分を拡大したものを各対応画像の下に示す。全ての群（ｎ＝１０のニューロン）において２つの樹状突起／ニューロンの３０ｍｍ部分を総合的密度測定のために分析した。Ａｒｃ  ｍＲＮＡ及びＡｒｃタンパク質レベルは未処理ＫＯニューロンに対して正規化して変化倍率±標準誤差として示した。スチューデントのｔ検定：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、及び***ｐ＜０．００１。スケールバー、１０ｍｍ。画像はＩｍａｇｅＪからのＳｍａｒｔ  ＬＵＴによって擬似色で色付けされている。全てのデータは、独立した３〜７つの、異なるタンパク質調製物を使用した実験及び培養を代表するものである。図１２も参照されたい。
【図６】Ａ及びＢは、ニューロン細胞外小胞の中の内因性ＡｒｃがＡｒｃ  ｍＲＮＡをニューロン中に移入させることを示す。（Ａ）ＤＩＶ１５の高密度皮質ＷＴまたはＡｒｃ  ＫＯニューロンの１０ｃｍ皿から調製したＥＶ画分１０ｍｇによって１時間または４時間処理されたＤＩＶ１５培養海馬Ａｒｃ  ＫＯニューロンからのＡｒｃ  ＩＣＣの代表的画像。ＫＯ  ＥＶによる１時間及び４時間の処理は樹状突起Ａｒｃレベルを向上させなかったが、ＷＴ  ＥＶによる１時間及び４時間の処理は樹状突起Ａｒｃタンパク質レベルを有意に向上させた。（Ｂ）ニューロンを（Ａ）と同様に処理した。Ａｒｃ  ｍＲＮＡ（ＦＩＳＨ）の代表的画像を示す。ＫＯ  ＥＶによる１時間及び４時間の処理は樹状突起Ａｒｃ  ｍＲＮＡレベルを向上させなかった。ＷＴ  ＥＶによる１時間の処理は樹状突起Ａｒｃレベルを有意には向上させなかったが、４時間の処理は樹状突起Ａｒｃ  ｍＲＮＡレベルを向上させた。全ての群（ｎ＝１０のニューロン）において２つの樹状突起／ニューロンの３０ｍｍ部分を総合的密度測定のために分析した。Ａｒｃ  ｍＲＮＡ及びＡｒｃタンパク質レベルは未処理ＫＯニューロンに対して正規化して変化倍率±標準誤差として示した。スチューデントのｔ検定：*ｐ＜０．０５。**ｐ＜０．０１。***ｐ＜０．００１。スケールバー、１０ｍｍ。独立した６つの、異なるＥＶ調製物を使用した実験及び培養を代表するもの。図１４も参照されたい。
【図７】Ａ及びＢは、Ａｒｃカプシドによって、ＥＶによって移されたＡｒｃ  ｍＲＮＡが活性依存的翻訳のために利用可能であることを示す。Ａ）４ｍｇのｐｒＡｒｃで４時間処理されたＤＩＶ１５培養海馬Ａｒｃ  ＫＯニューロンからのＡｒｃ  ＩＣＣの代表的画像。Ａｒｃ  ｍＲＮＡ翻訳を誘導するために、固定の３０分前に、ニューロンをｍＧｌｕＲ１／５作動薬ＤＨＰＧ（１００ｍＭ）で５分間処理してその後に薬物を洗い流した。固定の１時間前にはニューロンのサブセットをシクロヘキシミド（ＣＨＸ；１８０ｍＭ）で前処理してタンパク質翻訳を阻止した。ｐｒＡｒｃはＫＯニューロンにおける樹状突起Ａｒｃ発現を有意に増加させ、ＤＨＰＧ処理は樹状突起Ａｒｃレベルをさらに向上させたが、これはＣＨＸによる前処理によって阻止された。ＤＨＰＧは未処理ＫＯニューロンに対して何ら影響を及ぼさなかった。（Ｂ）ＤＩＶ１５の高密度皮質ＷＴまたはＡｒｃ  ＫＯニューロンの１０ｃｍ皿から調製したＥＶ画分１０ｍｇで４時間処理されたＤＩＶ１５海馬Ａｒｃ  ＫＯニューロンからのＡｒｃ  ＩＣＣの代表的画像。ニューロンのサブセットを（Ａ）と同様にＤＨＰＧ及びＣＨＸで処理した。ＷＴ  ＥＶはＫＯニューロンにおける樹状突起Ａｒｃ発現を有意に増加させたが、ＫＯ  ＥＶは何ら影響を及ぼさなかった。ＤＨＰＧ処理は未処理ＫＯニューロンまたはＫＯ  ＥＶ処理ＫＯニューロンにおける樹状突起Ａｒｃ発現に対して何ら影響を及ぼさなかった。他方、ＤＨＰＧ処理はＷＴ  ＥＶ処理ＫＯニューロンにおいて樹状突起Ａｒｃレベルを有意に向上させたが、これはＣＨＸによる前処理によって阻止された。全ての群（ｎ＝１０のニューロン）において２つの樹状突起／ニューロンの３０ｍｍ部分を総合的密度測定のために分析した。Ａｒｃ  ｍＲＮＡ及びＡｒｃタンパク質レベルは未処理ＫＯニューロンに対して正規化して変化倍率±標準誤差として示した。スチューデントのｔ検定：*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、及び***ｐ＜０．００１。スケールバー、１０ｍｍ。独立した３つの、異なるＥＶ／タンパク質調製物を使用した実験及び培養を代表するもの。
【図８】Ａ及びＢは、Ｔｙ３／Ｇａｇエレメントと双翅類Ａｒｃ遺伝子の起源との一次アミノ酸配列のアラインメントを示す。（Ａ）Ａｒｃまたはｇｙｐｓｙ  Ｇａｇタンパク質に対応する翻訳されたゲノムＤＮＡ配列のアラインメントを、ＭＵＳＣＬＥ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／）を使用して行った。アラインメントされた配列に、ｂｏｘｓｈａｄｅプロットサーバー（ｗｗｗ．ｃｈ．ｅｍｂｎｅｔ．ｏｒｇ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＢＯＸ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）を使用してデフォルトパラメータ（アミノ酸同一性を共有している５０％の配列に陰影付け）を使用して陰影付けした。注記：アラインメントは、開始部位を有する完全長配列を含有しておらず、Ａｒｃ遺伝子の断片を含有しているにすぎない。種は、Ｍｍ−Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ−イエハツカネズミ、Ｈｓ−Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ−ヒト、Ａｃ−Ａｎｏｌｉｓ  ｃａｒｏｌｉｎｅｎｓｉｓ−グリーンアノールトカゲ、Ｌｃ−Ｌａｔｉｍｅｒｉａ  ｃｈａｌｕｍｎａｅ−西インド洋シーラカンス、Ｄｒ−Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ−ゼブラフィッシュ、Ｃｃ−Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ−コイ、Ｄｍ−Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ−キイロショウジョウバエ、Ｄｓ−Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｓｕｚｕｋｉｉ−オウトウショウジョウバエ、Ｓｃ−Ｓｔｏｍｏｘｙｓ  ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ−サシバエ、Ｌｈ−Ｌｉｎｅｐｉｔｈｅｍａ  ｈｕｍｉｌｅ−アルゼンチンアリ、Ｂｍ−Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ−カイコ、Ｔｃ−ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ−コクヌストモドキを含んでいた。（Ｂ）（左）ショウジョウバエ科、イエバエ科及びミバエ科のハエにみられるＡｒｃ相同体の最尤系統解析。ｄａｒｃ１の複数のコピーがミバエ全体、及びイエバエ、Ｍｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａに認められた。各配列には、省略された種名にちなんだＧｅｎｂａｎｋ受託番号が与えられる。ミバエ科：ＲＺ−Ｒｈａｇｏｌｅｔｉｓ  ｚｅｐｈｙｒｉａ、ＣＣ−Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ  ｃａｐｉｔａｔａ、ＢＤ−Ｂａｃｔｒｏｃｅｒａ  ｄｏｒｓａｌｉｓ。イエバエ科：ＭＤ−Ｍｕｓｃａ  Ｄｏｍｅｓｔｉｃａ、ＳＣ−Ｓｔｏｍｏｘｙｓ  ｃａｌｃｉｔｒａｎｓ。（右）（Ａ）での系統解析から推察される、額嚢節のハエのｄＡｒｃの推定上の重複歴。調べた額嚢節のハエは全てｄａｒｃ１及びｄａｒｃ２の相同体を保有していることから、これらの種の分岐（青色三角）よりも前に祖先におけるｄＡｒｃの重複が起こったはずである。この祖先における重複事象の後、いくつかの系統におけるｄａｒｃ１の複数回の重複（緑色三角）：ミバエ科の共通祖先における２回の重複事象、Ｃｅｒａｔｉｔｉｓ  ｃａｐｉｔａｔａの系統におけるさらに１回の重複、及びＢａｃｔｒｏｃｅｒａ  ｄｏｒｓａｌｉｓの系統におけるさらに１回の重複が続いた。独立して、ｄａｒｃ１はＭｕｓｃａ  ｄｏｍｅｓｔｉｃａの系統において３回の重複を経験した。対照的に、ｄａｒｃ２は、調べた種では明らかに単一コピー遺伝子のままであった。
【図９】Ａ〜Ｄは、組換えタンパク質精製及び図２に関係する実験を示す。Ａ）（左から右へ）完全長ラットＡｒｃ（ｐｒＡｒｃ）、ｐｒＡｒｃ−ΔＣＴＤ、ＣＡ−ｐｒＡｒｃ、ＧＳＴ、及びｐｒＡｒｃの場合と類似した発現レベルを示しているＥｎｄｏ３Ａの親和性精製の代表的なクーマシーゲル。ｐｒＡｒｃ−ΔＣＴＤ、及びＥｎｄｏ３ＡはｐｒＡｒｃと同様の方法で調製した。ＧＳＴは、１５ｍＭのＬ−グルタチオンを使用した親和性樹脂からすぐさま溶離された。Ｈｉｓタグ付きＣＡ−ｐｒＡｒｃは、２５０ｍＭのイミダゾールを使用したＮｉ２+親和性樹脂から溶離された。次いで、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ＰｒｏｔｅａｓｅによるＧＳＴタグ切断、または溶離の後に、全てのタンパク質の緩衝液を１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４に替えた。各実験のための全てのタンパク質について緩衝液条件をカプシド安定性のための５００ｍＭのＮａＰＯ４、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４に調節した。細菌によって発現したタンパク質の可溶性（上清）及び不溶性（ペレット）画分（レーン１、２）への分画、当該タンパク質のＧＳＴまたはＮｉ２＋親和性マトリックス上での捕捉（レーン３〜５はそれぞれ、素通り（ＦＴ）、洗浄、及び捕捉タンパク質を示す）を示す分析。このパネルは、タンパク質発現レベルならびに親和性捕捉の有効性及び効率を実証する。（Ｂ）Ｓ２００サイズ排除カラムから溶離されたｐｒＡｒｃ、ｐｒＡｒｃ−ΔＣＴＤ、及びＥｎｄｏ３Ａのピーク画分の代表的なクーマシーゲル。ピーク画分をプールし、１ｍｇ／ｍＬの最終原液濃度に濃縮した。記載がない限り、ｐｒＡｒｃは全ての生化学／ＥＭ実験に使用するために各精製によって１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。細胞生物学実験では、ｐｒＡｒｃを０．４ｍｇ／ｍＬに希釈し、１条件あたり４μｇの総タンパク質を使用した。（Ｃ）ラットｐｒＡｒｃに類似した発現レベルを実証している、ＢＬ２１細菌溶解物からのショウジョウバエｄＡｒｃ１の親和性精製の代表的なクーマシーゲル。（Ｄ）１２ウェルプレート内のＨＥＫ２９３細胞に完全長ラットＷＴ  ＡｒｃまたはＧＦＰプラスミドを、等しいＤＮＡ濃度でＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してトランスフェクトし、その場でホルムアルデヒド架橋に供した。細胞溶解物を抗ＧＦＰまたは抗Ａｒｃ抗体でブロッティングした。高分子種がＡｒｃ二量体に対応しており、三量体が認められる可能性が架橋Ａｒｃ試料においてはあるが、ＧＦＰ試料においてはない、ということに留意されたい。
【図１０】Ａ〜Ｄは、図２及び図３に関係するＲＮＡ結合実験及びＡｒｃ  ＥＶの特性を示す。（Ａ）ｐｒＡｒｃのヌクレオチド除去の代表的なクーマシーゲル。（左）細胞を２０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、２ｍＭのＭｇＣｌ2、５％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ８．０に溶解させた。示されている画分は、２１，０００ｘｇで４５分間掛けてペレット化した後の上清及びペレット画分である。このステップから得られた上清を０．１％のＰＥＩで処理して核酸を析出させた。この処理の結果としてＡ２６０／２８０比率が１．７１±０．０１８から１．２９±０．０２３にシフトし、核酸含有量の低下が示唆された。試料を２７，０００ｘｇで２０分間掛けてペレット化し、得られた上清を硫安（ＡｍＳｕｌｆ）沈殿によって処理してＡｒｃを濃縮し、１０，０００ｘｇで１０分間掛けてペレット化した。その後、Ａｒｃを含有するＡｍＳｕｌｆペレットを上記のように親和性精製に供した。（右）切断され親和性精製された、アニオン交換カラムからのＰＥＩ処理Ａｒｃのピーク画分の代表的なクーマシーゲル。このクロマトグラフィーステップは、結合している核酸をＡｒｃからさらに除去した。ピーク画分を１ｍｇ／ｍＬに濃縮し、これらの画分の最終測定Ａ２６０／２８０比率は０．６８±０．０３（ｎ＝３）であり、ＰＥＩ処理ｐｒＡｒｃが核酸をほとんど含んでいないことが示唆された。（Ｂ）（左）ウェスタンブロット分析に使用された、２４時間で回収したＡｒｃトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞培地からの精製ＥＶの代表的な陰性染色ＥＭ画像。（右）ウェスタンブロット分析に使用された、２４時間で回収したＷＴ培養ニューロン培地からの精製ＥＶの代表的な陰性染色ＥＭ画像。赤色矢印は精製ＥＶを示す。（Ｃ）（左）未処理ＥＶまたはトリプシン（０．０５ｍｇ／ｍＬ）で３０分間処理したＥＶの中のＡｒｃのウェスタンブロット。ｐｒＡｒｃをトリプシン活性の陽性対照として使用した。（右）総タンパク質に対して正規化したＡｒｃウェスタンブロットの定量。トリプシンはｐｒＡｒｃを減成させたが、ニューロンＥＶの中に存在するＡｒｃタンパク質に対しては何ら影響を及ぼさなかった。（Ｄ）Ａｒｃ分泌の活性依存性。未処理ＷＴニューロンからの１０ｃｍ皿内のＤＩＶ１５皮質ニューロンから回収した培地からの精製ＥＶ画分を、ＫＣｌによる処理と比較した。基礎培地、またはＫＣｌを補充した培地で新しく培地交換して５０ｍＭの終濃度にした。培地交換に続いて細胞を１時間インキュベートし、培地を回収してＥＶ画分を精製した。（左）培養ニューロン培地からの精製ＥＶ画分からのＡｒｃ及び総タンパク質のウェスタンブロット。（右）総タンパク質に対して正規化したＡｒｃタンパク質レベルの定量。ＫＣｌ処理の結果としてＡｒｃがやや多く培地中に放出された（ｎ＝２、ｐ＜０．０５）。
【図１１】Ａ〜Ｃは、図４に関係するＨＥＫ細胞実験及び特注Ａｒｃ抗体対照実験を示す。（Ａ）１０ｃｍ皿内のＨＥＫ２９３細胞にＧＦＰ−Ａｒｃを図４のようにトランスフェクトした。１８時間後、１０ｃｍ皿内のＧＦＰ−ＡｒｃトランスフェクトＨＥＫ細胞からの培地を１２ウェルプレート内のナイーブＨＥＫ細胞へと移し、１つの群には同時に８０ｍＭのＤｙｎａｓｏｒｅを添加してエンドサイトーシスを阻止した。６時間後にＤｙｎａｓｏｒｅ処理培地を新しいＨＥＫ培地に替えた。１８時間後に細胞を固定し、１８ｍｍカバースリップ上全体のＧＦＰ−Ａｒｃ発現細胞の塊を２０Ｘの対物レンズによって手作業で計数した（ｎ＝３のカバースリップ／群）。（左）１つの２０Ｘ視野の代表的画像。（右）Ｄｙｎａｓｏｒｅはカバースリップ上全体のＧＦＰ−Ａｒｃ陽性細胞の塊の数を有意に減少させた。スチューデントのｔ検定：*ｐ＜０．０５。スケールバー＝５０ｍｍ。類似した結果を有する３つの独立した実験及び培養を代表するもの。（Ｂ）ＤＩＶ１５の培養海馬Ａｒｃ  ＫＯ及びＷＴニューロンに対して、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５のみ（上段）、またはＭＡＰ２（Ａｌｅｘａ  ５５５）とＡｒｃ（Ａｌｅｘａ  ４８８；下２段）との両方による樹状突起タンパク質ＭＡＰ２の免疫染色を行った。Ａｒｃの撮像設定は、ＷＴニューロンのＡｒｃ免疫染色（下段）に基づいて決定した。これらの撮像条件下では、ＫＯニューロンにおいてＡｒｃ遺伝子座にノックインされたＧＦＰからのＧＦＰ蛍光は見えなかった。２つの独立した実験の例。（Ｃ）ＤＩＶ１５の培養海馬Ａｒｃ  ＫＯ及びＷＴニューロンを固定し、樹状突起タンパク質ＭＡＰ２は勿論のこと、特注のウサギポリクローナルＡｒｃ抗体（ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ）か市販のＳｙｎａｐｔｉｃ  ＳｙｓｔｅｍｓウサギポリクローナルＡｒｃ抗体かのどちらかによる免疫染色も行った。全ての群を同じ取得設定で撮像した。全ての群（ｎ＝１０のニューロン）において２つの樹状突起／ニューロンの３０ｍｍ部分を分析し、ＭＡＰ２染色を用いて選択した。どちらの抗体も、Ａｒｃ  ＫＯ及びＷＴニューロンの差異を検出することができたが、信号：雑音は特注抗体を使用した方が良好であった。基本条件下でどちらの抗体を使用しても体細胞／核内のＡｒｃはニューロンによって大きく変動する。スチューデントのｔ検定：**特注抗体でのＷＴに対するＡｒｃ  ＫＯ、ｐ＜０．０１。＃Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（「ＳｙＳｙ」）抗体でのＷＴに対するＡｒｃ  ＫＯ、ｐ＜０．０５。Ａｒｃ画像は、Ａｒｃ発現の差をより良好に表示するためにＩｍａｇｅＪの中のＳｍａｒｔ  ＬＵＴによって擬似色で色付けされている。２つの独立した実験の例。
【図１２】Ａ〜Ｄは、図５に関係する実験を示す。（Ａ）Ａｒｃ  ｍＲＮＡがｐｒＡｒｃカプシド内で保護されるか否かを試験するために、試料をＲＮアーゼＡによる１５分間の処理に供し、次いでＲＮアーゼ阻害薬（１Ｕ／ｍＬ）に供して失活させ、その後、ニューロンと共にインキュベートした。（左）処理済みまたは未処理のｐｒＡｒｃ試料と共に４時間インキュベートしたＤＩＶ１５培養海馬Ａｒｃ  ＫＯニューロンのＡｒｃ  ｍＲＮＡの代表的画像。（右）ｐｒＡｒｃ処理の結果としてＡｒｃ  ＫＯニューロンの樹状突起Ａｒｃ  ｍＲＮＡレベルが向上した。ＲＮアーゼで処理されたｐｒＡｒｃはＡｒｃ  ｍＲＮＡ移入に影響を及ぼさなかった。（Ｂ）ＤＩＶ１５の培養海馬Ａｒｃ  ＫＯニューロンを４ｍｇのｐｒＡｒｃによって４時間処理した。１つの群では、ｐｒＡｒｃ添加の３０分前にニューロンを８０ｍＭのＤｙｎａｓｏｒｅで前処理してエンドサイトーシスを阻止した。（左）Ａｒｃタンパク質及びｍＲＮＡレベルの代表的画像。（右）Ｄｙｎａｓｏｒｅによる前処理はｐｒＡｒｃタンパク質及びＡｒｃ  ｍＲＮＡの取込み／移入を有意に阻止した。スチューデントのｔ検定：*ｐ＜０．０５。***ｐ＜０．００１。３つの独立した実験（Ａ、Ｂ）の例。全てのパネルのスケールバー＝１０ｍｍ。（Ｃ）ＤＩＶ１５の培養海馬Ａｒｃ  ＫＯニューロンを４ｍｇのｐｒＡｒｃによって４時間処理した。Ａｒｃ  ｍＲＮＡ及びＲａｂ５タンパク質に対するＦＩＳＨ／ＩＣＣの組み合わせか、Ａｒｃ及びＲａｂ５タンパク質に対するＩＣＣかのどちらかを実施した。（左）Ａｒｃ  ｍＲＮＡとＲａｂ５タンパク質、またはＡｒｃ及びＲａｂ５タンパク質を示す、樹状突起の代表的画像。（右）Ａｒｃタンパク質及びｍＲＮＡは樹状突起におけるＲａｂ５との５０％程度の共局在化を示した。白色矢尻はＡｒｃ単独を示し、黄色矢尻はＡｒｃ／Ｒａｂ５共局在化を示す。２つの独立した実験の例。スケールバー＝１０ｍｍ。（Ｄ）ｐｒＡｒｃ、ｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ−）、ｐｒＡｒｃ−ΔＣＴＤ、及びＣＡ−ｐｒＡｒｃの精製タンパク質試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、得られたウェスタンブロットに対して本発明者らの特注Ａｒｃ抗体を使用してＡｒｃの免疫染色を行った。抗体は全ての突然変異構築物を検出することに成功し、移入実験で観察されたＡｒｃ免疫染色の欠如は抗体が突然変異体を検出できないことに起因していなかったことが示唆された。「総」は、各試料の総タンパク質に対するポンソー染色である。
【図１３】核酸を除去された精製Ａｒｃがニューロンの外側に結合し、内在化されないことを示す。ＤＩＶ１５の培養海馬Ａｒｃ  ＫＯニューロンを４ｍｇのｐｒＡｒｃまたはｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ−）によって４時間処理し、その後に固定した。各処理からの１つの群には、Ａｒｃ及びＭＡＰ２に対する免疫細胞化学手順の間、透過処理を行わなかった。透過処理されなかったｐｒＡｒｃ処理ニューロンはＭＡＰ２及びＡｒｃ免疫染色をほとんど〜全く示さなかった。他方、ｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ−）処理ニューロンは透過処理条件と非透過処理条件とでＡｒｃ免疫染色に差を示さなかったが、ＭＡＰ２免疫染色は非透過処理条件では依然として存在しておらず、ｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ−）がニューロンの外側に蓄積することが示唆された。白色四角で囲まれた樹状突起部分を拡大したものを各対応画像の下に示す。スケールバー＝１０ｍｍ。３つの独立した実験の例。Ａｒｃ画像は、Ａｒｃ発現の差を強調するためにＩｍａｇｅＪからのＳｍａｒｔ  ＬＵＴによって擬似色で色付けされている。融合画像はＭＡＰ２免疫染色をマゼンタで示し、Ａｒｃを緑色で示している。
【図１４】Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤは、図６に関係するＲＮアーゼ及び取込みの実験を示す。（Ａ）Ａｒｃ  ｍＲＮＡがニューロンＥＶ内で保護されるか否かを試験するために、ＤＩＶ１５の培養ＷＴ皮質ニューロンの１０ｃｍ皿から調製したＥＶをＲＮアーゼＡによる１５分間の処理に供し、次いでＲＮアーゼ阻害薬（１Ｕ／ｍＬ）に供して失活させ、その後、ニューロンと共にインキュベートした。処理済みまたは未処理のＷＴ  ＥＶ試料１０ｍｇと共にＤＩＶ１５の培養海馬Ａｒｃ  ＫＯニューロンを４時間インキュベートした。（左）ニューロンのＡｒｃ  ｍＲＮＡレベルの代表的画像。（右）ＷＴ  ＥＶ処理の結果としてＡｒｃ  ＫＯニューロンの樹状突起Ａｒｃ  ｍＲＮＡレベルが向上した。ＲＮアーゼで処理されたＷＴ  ＥＶはＡｒｃ  ｍＲＮＡ移入に影響を及ぼさなかった。（Ｂ）ＤＩＶ１５の高密度培養皮質ＷＴまたはＡｒｃ  ＫＯニューロンが入った１０ｃｍ皿の培地から採集したＥＶ画分１０ｍｇによってＤＩＶ１５の培養海馬Ａｒｃ  ＫＯニューロンを４時間処理した。１つの群では、ＥＶ添加の３０分前にニューロンを８０ｍＭのＤｙｎａｓｏｒｅで前処理してエンドサイトーシスを阻止した。（上）Ａｒｃタンパク質レベル（左）またはＡｒｃ  ｍＲＮＡレベル（右）の代表的画像。（下）Ｄｙｎａｓｏｒｅによる前処理はＷＴ  ＥＶからのＡｒｃタンパク質及びｍＲＮＡの取込みを有意に阻止した。Ａｒｃタンパク質及びｍＲＮＡ発現をＡｒｃ  ＫＯに対して正規化し、変化倍率±標準誤差として示す。白色で囲まれた樹状突起部分を拡大したものを各対応画像の下に示す。全ての群（ｎ＝１０のニューロン）において２つの樹状突起／ニューロンの３０ｍｍ部分を分析し、ＭＡＰ２染色を用いて選択した。スチューデントのｔ検定：***ｐ＜０．００１。スケールバー＝１０ｍｍ。３つの独立した実験の例。画像は、Ａｒｃ発現の差を強調するためにＩｍａｇｅＪからのＳｍａｒｔ  ＬＵＴによって擬似色で色付されている。（Ｃ）ＤＩＶ１５の培養海馬Ａｒｃ  ＫＯニューロンを１０ｍｇのＷＴ  ＥＶによって４時間処理し、次いで固定した。Ａｒｃ  ｍＲＮＡ及びＲａｂ５タンパク質についてのＦＩＳＨ／ＩＣＣの組み合わせか、Ａｒｃ及びＲａｂ５タンパク質についてのＩＣＣかのどちらかを実施した。（左）Ａｒｃ  ｍＲＮＡとＲａｂ５タンパク質、またはＡｒｃ及びＲａｂ５タンパク質を示す、樹状突起の代表的画像。（右）Ａｒｃ  ｍＲＮＡ及びタンパク質は樹状突起におけるＲａｂ５との３０〜４０％の共局在化を示した。白色矢尻はＡｒｃ単独を示し、黄色矢尻はＡｒｃ／Ｒａｂ５共局在化を示す。２つの独立した実験の例。スケールバー＝１０ｍｍ。（Ｄ）モデル：ＨＩＶ  ＧａｇとＡｒｃカプシドとの生活環の比較。（上）ＨＩＶ  Ｇａｇタンパク質が（ＣＡドメインによって）サイトゾル中で、及び（ＭＡドメインのミリストイル化によって）形質膜上で自己組織化する一方、カプシドは（ＮＣドメインによって）中にウイルスＲＮＡを封入する。未成熟ＨＩＶカプシドは、ウイルスエンベロープタンパク質（Ｅｎｖ）を含有する膜と共に（ｐ６ドメインによって）ＥＳＣＲＴ依存的に細胞から放出される。成熟ウイルス粒子は表面受容体（例えばＣＤ４）を介して宿主細胞に結合し、膜融合が起こ��。あるいは、いくつかの細胞種では、ウイルス粒子はまずエンドサイトーシスを受け、その後に融合し、完全な融合がエンドソーム内で起こった後、粒子が細胞内に放出される。ウイルスＲＮＡが放出され、その後、宿主ゲノム中に組み込まれるウイルスＤＮＡとして逆転写される。（下）Ａｒｃ  ｍＲＮＡは、選択された種々のｍＲＮＡを含有するＲＮＡ顆粒の中に入った状態で樹状突起内へと送り込まれる。ニューロン活動に応答して樹状突起内でＡｒｃ  ｍＲＮＡの局所翻訳が起こる。高濃度のＡｒｃタンパク質が自己組織化し、Ａｒｃ  ｍＲＮＡを含んで空間的に近くにある選択されたｍＲＮＡを中に封入したＡｒｃカプシドを形成する。Ａｒｃカプシドは、任意のＲＮＡを運ぶＡｒｃカプシド（Ａｒｃ  Ｃａｐｓｉｄｓ  Ｂｅａｒｉｎｇ  Ａｎｙ  ＲＮＡ）（ＡＣＢＡＲ）の中に入った状態で樹状突起から放出され、隣接する樹状突起でｍＲＮＡ、及びその他の推定上の積荷の移入が起こる。
【図１５】Ａ及びＢは、Ａｒｃタンパク質と共に移入したＲＮＡがレシピエント細胞で翻訳されることを示す。（Ａ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞である「ドナー」細胞にＷＴ  ｍｙｃ−Ａｒｃ及びＧＦＰを共トランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞から得られた培地を翻訳阻害薬シクロヘキシミド（ＣＨＸ）と共に、またはそれなしで、ナイーブ「レシピエント」細胞上に置いた。６時間後に細胞を固定し、ＧＦＰ  ＲＮＡについて蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを実施し、Ａｒｃタンパク質について免疫細胞化学を実施した。（Ｂ）積算周波数分布の左へのシフト、ならびに細胞１つあたりの平均ＧＦＰ及びＡｒｃタンパク質レベルの減少によって示されるように、ＣＨＸ処理は、レシピエント細胞で発現するＧＦＰタンパク質の量を、ＧＦＰ  ＲＮＡレベルに影響を及ぼすことなく有意に減少させた。これは、Ａｒｃタンパク質が、レシピエント細胞で新たに翻訳され得るＧＦＰ  ＲＮＡと共に移入する、ということを示唆している。*ｐ＜０．０５。**ｐ＜０．０１。***ｐ＜０．００１。スケールバー＝１０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
開示される方法及び組成物のさらなる利点は一部が以下の説明で示され、一部が当該説明から理解され、または、開示される方法及び組成物の実施によって分かる場合がある。開示される方法及び組成物の利点は、別記の特許請求の範囲の中で詳しく示されている要素及び組み合わせによって実現及び獲得される。上記一般的説明及び以下の詳しい説明が例示及び説明のためのものであるにすぎず、特許請求の範囲に記載の本発明を限定していない、ということは理解されるべきである。
【００１４】
開示される方法及び組成物は、以下の特定の実施形態についての詳しい説明及びその中に含まれている実施例、ならびに図及びそれについてのこれより前及び後の説明を参照することによってより容易に理解され得る。
【００１５】
特に明記しない限り、開示される方法及び組成物が特定の合成方法、特定の分析技術または特定の試薬に限定されず、それゆえ変化し得る、ということは理解されるべきである。本明細書中で使用する用語が特定の実施形態を説明する目的のためのものにすぎず、限定することを意図しない、ということも理解されるべきである。
【００１６】
開示される方法及び組成物のために使用され得る、それと一緒に使用され得る、それの調製に使用され得る、またはそれの産物である、材料、組成物及び成分を開示する。これら及びその他の材料は本明細書中に開示されており、また、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などを開示している場合、これらの化合物の様々な個々の及び集合的な組み合わせ及び並べ替えが各々明示的に開示されていない場合があるとはいえ、各々が本明細書において具体的に企図され記載されていることは理解される。例えば、Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列が開示及び記述されており、当該核酸配列を含む複数の分子に対してなされ得る複数の改変について記述されている場合には、核酸配列と改変との可能なありとあらゆる組み合わせ及び並べ替えが具体的に企図され、但しそうでないことが具体的に示されている場合を除く。したがって、分子Ａ、Ｂ及びＣの部類が開示されていると同時に、分子Ｄ、Ｅ及びＦの部類ならびに組み合わせた分子の例Ａ−Ｄが開示されている場合、たとえ各々が個々に列挙されておらずとも、各々は個別及び集合的に企図される。したがって、この例において、各々の組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、及びＣ−Ｆは具体的に企図され、Ａ、Ｂ及びＣ；Ｄ、Ｅ及びＦ；ならびに組み合わせＡ−Ｄの開示から、開示されているとみなされるべきである。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせも具体的に企図され開示されている。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ及びＣ−Ｅの小群は、具体的に企図され、Ａ、Ｂ及びＣ；Ｄ、Ｅ及びＦ；ならびに組み合わせＡ−Ｄの開示から、開示されているとみなされるべきである。この概念は、開示される組成物を作製及び使用する方法のステップが含まれるがこれに限定されない本願のあらゆる態様に当てはまる。したがって、実施され得る様々な追加ステップがある場合、これらの追加ステップの各々が、開示される方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせと共に実施され得ること、及びそのような組み合わせの各々が具体的に企図され、開示されているとみなされるべきであることは理解される。
【００１７】
Ａ．定義
開示される方法及び組成物が、記載されている特定の方法論、プロトコール及び試薬に限定されないことは理解される、というのも、これらは変化し得るからである。本明細書中で使用する用語が特定の実施形態を説明する目的のためのものにすぎず、別記の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定することを意図しない、ということも理解されるべきである。
【００１８】
文脈による明らかな別段の規定がない限り、本明細書及び別記の特許請求の範囲において使用される場合に単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」が複数形での意味を含むことには留意されねばならない。したがって、例えば「Ａｒｃカプシド（ａｎ  Ａｒｃ  ｃａｐｓｉｄ）」への言及は、複数のそのようなＡｒｃカプシドを含んでおり、「Ａｒｃカプシド（ｔｈｅ  Ａｒｃ  ｃａｐｓｉｄ）」への言及は、１つ以上のＡｒｃカプシド及び当業者に知られているその等価体などへの言及である。
【００１９】
「任意選択の」または「場合によって」が意味しているのは、続けて記載されている事象、環境または材料が、起こるまたは存在することも、起こらないまたは存在しないこともあり、記載には、事象、環境または材料が起こるまたは存在する事例と、それが起こらないまたは存在しない事例とが含まれる、ということである。
【００２０】
範囲は、本明細書中では、「約」ある特定値から、及び／または「約」別の特定値までとして表現され得る。そのような範囲が表されている場合、文脈による別段の具体的指示がない限り、ある特定値から、及び／または他の特定値までの範囲もまた具体的に企図され、開示されているとみなされる。同様に、先行する「約」の使用によって値が近似として表されている場合、文脈による別段の具体的指示がない限り、特定値が、開示されているとみなされるべき具体的に企図される別の実施形態を形成することは理解される。さらに、各範囲の終点は、文脈による別段の具体的指示がない限り、他方の終点との関係においても、他方の終点との無関係においても、重要であることが理解される。最後に、明示的に開示される範囲の中に含まれる個々の値及び値の小範囲も全て、文脈による別段の具体的指示がない限り具体的に企図され、開示されているとみなされるべきであることは理解されねばならない。上記は、特定の場合にこれらの実施形態のいくつかまたは全てが明示的に開示されているか否かに関係なく当てはまる。
【００２１】
特に定義されていない限り、本明細書中で使用する全ての科学技術用語は、開示される方法及び組成物が属する分野において技量を有する者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。本明細書において開示されているものと類似した、または等価である任意の方法及び材料を本発明の方法及び組成物の実施及び試験で用いることができるが、特に有用な方法、装置及び材料は、記載されているとおりである。本明細書中で引用する刊行物、及びそれらを引用する所以である材料を、これをもって参照により具体的に援用する。本明細書中のいかなるものも、先行発明の効力によって本発明がそのような開示に先行する権利を有さないことの承認として解釈されるべきでない。何らかの参考文献が先行技術に相当するという承認は、何らなされていない。参考文献についての記述はそれらの著者が何を主張しているのかを述べており、出願人は、引用されている文書の正確性及び関連性に異議を唱える権利を保有している。本明細書中で複数の刊行物に言及しているが、そのような言及が、これらの文書のいずれかが当技術分野の通常の一般的知識の一部を形成するという承認には相当しないことは、明確に理解される。
【００２２】
本願の説明及び特許請求の範囲の全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語及び当該語の変化形、例えば「含んでいる」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「限定されないが含む」を意味しており、例えば他の添加剤、成分、整数またはステップを排除することを意図しない。詳しく述べると、１つ以上のステップまたは操作を含むと明記されている方法においては（そのステップが「からなる」などの限定用語を含んでいない限り）、ステップに列挙されていない例えば他の添加剤、成分、整数またはステップを排除することを各ステップが意図していないという意味で、列挙されているものを各ステップが含むことが具体的に企図される。
【００２３】
本明細書中で使用する場合、「突然変異」という用語は、アミノ酸または核酸の付加、欠失または置換を含む。
【００２４】
Ｂ．Ａｒｃカプシド
Ａｒｃカプシドを開示する。Ａｒｃカプシドは、１つ以上のＡｒｃタンパク質からなり得る。１つ以上のＡｒｃタンパク質は、全て同じ種からのもの、または１つ以上の種からのものであり得る。いくつかの態様では、Ａｒｃカプシドは、２つ以上の種からのＡｒｃタンパク質を含む組換えＡｒｃカプシドを含み得る。開示されるＡｒｃカプシドは、天然に存在しないという点で組換えである。組換えＡｒｃカプシドは、２つ以上の種からのＡｒｃタンパク質を含んでいるＡｒｃカプシドを含み得、または、Ａｒｃカプシドに天然にみられない核酸配列を保有しているＡｒｃカプシドを含み得る。いくつかの態様では、本明細書に開示されるＡｒｃカプシドは、天然及び非天然のＡｒｃタンパク質の組み合わせを含み得る。例えば、Ａｒｃカプシドは、天然に存在するＡｒｃタンパク質と、天然に存在しない組換えＡｒｃタンパク質配列とを含み得る。いくつかの態様では、Ａｒｃカプシドは１〜５０、１〜１００、１〜１５０、１〜２００、１〜２５０、１〜３００、１〜３５０、１〜４００、１〜４５０、１〜５００、１〜５５０、１〜６００、１〜６５０、１〜７００、１〜７５０、１〜８００、１〜８５０、１〜９００、１〜９５０、１〜１０００個のＡｒｃタンパク質を含み得る。
【００２５】
標識部分と複合したＡｒｃカプシドを開示する。標識部分は、限定されないが、蛍光分子、燐光分子、酵素、抗体、リガンド、タンパク質及び放射性同位体であり得る。標識部分の例としては、限定されないが、ＧＦＰ、ｍｙｃ、ＸＦＰ、ＨＡＬＯ、Ｈｉｓ、ＲＦＰ、ビオチン及びＦＩＴＣが挙げられる。いくつかの態様では、標識部分はＡｒｃカプシドを検出するために使用することができる。いくつかの態様では、標識部分はＡｒｃカプシドを精製するために使用することができる。いくつかの態様では、標識部分は特異的なタンパク質相互作用を標的化するために使用することができる。
【００２６】
標的指向性部分と複合したＡｒｃカプシドを開示する。標的指向性部分は、選択された標的に特異的に結合する、複合体の一部を指す。標的指向性部分は、例えば、多糖、ペプチド、ペプチドリガンド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、抗体もしくはその断片、抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、またはＦａｂ断片、またはナノボディであり得る。本明細書中で使用する場合、「標的指向性部分」は、例えばＢ細胞、Ｔ細胞またはニューロンなどの細胞または細胞集団の表面上の認識分子に対して特異的であり得る。したがって、標的指向性部分と複合したＡｒｃカプシドであって標的指向性部分が細胞特異的な標的指向性部分である当該Ａｒｃカプシドが開示される。
【００２７】
標識部分をさらに含む、標的指向性部分と複合したＡｒｃカプシドを開示する。
【００２８】
いくつかの態様では、Ａｒｃカプシドが保有する核酸配列はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。いくつかの態様では、ＤＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。いくつかの態様では、ＲＮＡ配列は、限定されないがｍＲＮＡ、ＲＮＡｉまたはマイクロＲＮＡであり得る。
【００２９】
異種核酸配列を含むＡｒｃカプシドを開示する。例えば、異種核酸配列は、Ａｒｃカプシドと同じ細胞に由来しない任意の核酸配列であり得る。いくつかの態様では、異種核酸配列は非Ａｒｃ  ｍＲＮＡ配列である。
【００３０】
いくつかの態様では、Ａｒｃカプシドは、Ａｒｃカプシドから細胞へと移入し得る核酸配列を保有し得る。いくつかの態様では、移入したｍＲＮＡ配列は細胞内で１回翻訳され得る。
【００３１】
いくつかの態様では、開示されるＡｒｃカプシドは哺乳動物のものであり得る。いくつかの態様では、Ａｒｃカプシドはショウジョウバエ由来Ａｒｃカプシドであり得る。いくつかの態様では、ＡｒｃカプシドはＡｒｃカプシド相同体であり得る。いくつかの態様では、Ａｒｃカプシド相同体は任意の種からのものであり得る。
【００３２】
いくつかの態様では、開示されるＡｒｃカプシドは１０〜２００ｎｍであり得る。いくつかの態様では、開示されるＡｒｃカプシドは１０〜８０ｎｍであり得る。いくつかの態様では、開示されるＡｒｃカプシドは３０〜４０ｎｍであり得る。いくつかの態様では、開示されるＡｒｃカプシドは１０〜１００ｎｍであり得る。いくつかの態様では、開示されるＡｒｃカプシドは１００〜２００ｎｍであり得る。
【００３３】
１．Ａｒｃタンパク質
任意の既知のＡｒｃタンパク質のアミノ酸配列を含むＡｒｃタンパク質を開示する。いくつかの態様では、アミノ酸配列は配列番号１のアミノ酸配列、ラットＡｒｃタンパク質であり得る：
ｍｅｌｄｈｍｔｔｇｇ  ｌｈａｙｐａｐｒｇｇ  ｐａａｋｐｎｖｉｌｑ  ｉｇｋｃｒａｅｍｌｅ  ｈｖｒｒｔｈｒｈｌｌ  ｔｅｖｓｋｑｖｅｒｅ  ｌｋｇｌｈｒｓｖｇｋ  ｌｅｎｎｌｄｇｙｖｐ  ｔｇｄｓｑｒｗｋｋｓ  ｉｋａｃｌｃｒｃｑｅ  ｔｉａｎｌｅｒｗｖｋ  ｒｅｍｈｖｗｒｅｖｆ  ｙｒｌｅｒｗａｄｒｌ  ｅｓｍｇｇｋｙｐｖｇ  ｓｅｐａｒｈｔｖｓｖ  ｇｖｇｇｐｅｐｙｃｑ  ｅａｄｇｙｄｙｔｖｓ  ｐｙａｉｔｐｐｐａａ  ｇｅｌｐｅｑｅｓｖｇ  ａｑｑｙｑｓｗｖｐｇ  ｅｄｇｑｐｓｐｇｌｄ  ｔｑｉｆｅｄｐｒｅｆ  ｌｓｈｌｅｅｙｌｒｑ  ｖｇｇｓｅｅｙｗｌｓ  ｑｉｑｎｈｍｎｇｐａ  ｋｋｗｗｅｆｋｑｇｓ  ｖｋｎｗｖｅｆｋｋｅ  ｆｌｑｙｓｅｇｔｌｓ  ｒｅａｉｑｒｅｌｄｌ  ｐｑｋｑｇｅｐｌｄｑ  ｆｌｗｒｋｒｄｌｙｑ  ｔｌｙｖｄａｅｅｅｅ  ｉｉｑｙｖｖｇｔｌｑ  ｐｋｆｋｒｆｌｒｈｐ  ｌｐｋｔｌｅｑｌｉｑ  ｒｇｍｅｖｑｄｇｌｅ  ｑａａｅｐｓｖｔｐｌ  ｐｔｅｄｅｔｅａｌｔ  ｐａｌｔｓｅｓｖａｓ  ｄｒｔｑｐｅ（配列番号１）。
【００３４】
いくつかの態様では、アミノ酸配列は配列番号２のアミノ酸配列、ヒトＡｒｃタンパク質であり得る：
ｍｅｌｄｈｒｔｓｇｇ  ｌｈａｙｐｇｐｒｇｇ  ｑｖａｋｐｎｖｉｌｑ  ｉｇｋｃｒａｅｍｌｅ  ｈｖｒｒｔｈｒｈｌｌ  ａｅｖｓｋｑｖｅｒｅ  ｌｋｇｌｈｒｓｖｇｋ  ｌｅｓｎｌｄｇｙｖｐ  ｔｓｄｓｑｒｗｋｋｓ  ｉｋａｃｌｃｒｃｑｅ  ｔｉａｎｌｅｒｗｖｋ  ｒｅｍｈｖｗｒｅｖｆ  ｙｒｌｅｒｗａｄｒｌ  ｅｓｔｇｇｋｙｐｖｇ  ｓｅｓａｒｈｔｖｓｖ  ｇｖｇｇｐｅｓｙｃｈ  ｅａｄｇｙｄｙｔｖｓ  ｐｙａｉｔｐｐｐａａ  ｇｅｌｐｇｑｅｐａｅ  ａｑｑｙｑｐｗｖｐｇ  ｅｄｇｑｐｓｐｇｖｄ  ｔｑｉｆｅｄｐｒｅｆ  ｌｓｈｌｅｅｙｌｒｑ  ｖｇｇｓｅｅｙｗｌｓ  ｑｉｑｎｈｍｎｇｐａ  ｋｋｗｗｅｆｋｑｇｓ  ｖｋｎｗｖｅｆｋｋｅ  ｆｌｑｙｓｅｇｔｌｓ  ｒｅａｉｑｒｅｌｄｌ  ｐｑｋｑｇｅｐｌｄｑ  ｆｌｗｒｋｒｄｌｙｑ  ｔｌｙｖｄａｄｅｅｅ  ｉｉｑｙｖｖｇｔｌｑ  ｐｋｌｋｒｆｌｒｈｐ  ｌｐｋｔｌｅｑｌｉｑ  ｒｇｍｅｖｑｄｄｌｅ  ｑａａｅｐａｇｐｈｌ  ｐｖｅｄｅａｅｔｌｔ  ｐａｐｎｓｅｓｖａｓ  ｄｒｔｑｐｅ（配列番号２）。
【００３５】
ＣＡドメイン（アミノ酸２０７〜３７０）に少なくとも１つの突然変異を含むＡｒｃタンパク質を開示する。いくつかの態様では、ＣＡドメインのＣ末端ドメイン（アミノ酸２７８〜３７０）に少なくとも１つの突然変異を含むＡｒｃタンパク質が開示される。配列番号１または配列番号２のアミノ酸２７８〜３７０に少なくとも１つの突然変異を含むＡｒｃタンパク質を開示する。配列番号１または配列番号２のアミノ酸２７８〜３７０に対応するアミノ酸に少なくとも１つの突然変異を含むＡｒｃタンパク質を開示する。いくつかの態様では、ＣＡドメインのアミノ酸２７８〜３７０の欠失を含むＡｒｃタンパク質が本明細書に開示される（ＣＡドメインは配列番号１または配列番号２のアミノ酸２０７〜３７０を含む）。
【００３６】
既知の、または開示されるＡｒｃアミノ酸配列のいずれかとの少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９．９％の同一性を含むＡｒｃタンパク質を開示する。例えば、配列番号１との少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９．９％の同一性を含むＡｒｃタンパク質を開示する。また、配列番号２との少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９．９％の同一性を含むＡｒｃタンパク質を開示する。
【００３７】
２．Ａｒｃ核酸
任意の既知Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列を開示する。配列番号１の配列を含むＡｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列を開示する。配列番号２の配列を含むＡｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列を開示する。例えば、配列番号３の配列を含む核酸配列、ラットＡｒｃ遺伝子の核酸配列を開示する。
ａｇｔｇｃｔｃｔｇｇ  ｃｇａｇｔａｇｔｃｃ  ｔｃｃｃｔｃａｇｃｃ  ｇｃａｇｔｃｔｃｔｇ  ｇｇｃｃｔｃｔｔｃａ  ｇｃｔｔｇａｇｃｇｇ  ｃｇｇｃｇａｇｃｃｔ  ｇｃｃａｃａｃｔｃｇ  ｃｔａａｇｃｔｃｃｔ  ｃｃｇｇｃａｃｃｇｃ  ｇｃａｃｔｔｇｃｃａ  ｃｔｇｃｃａｃｔｇｃ  ｃｇｃｔｔｃｇｃｇｃ  ｃｃｇｃｔｇｃａｇｃ  ｃｇｃｃｇｇｃｔｃｔ  ｇａａｔｃｃｔｔｃｔ  ｇｇｃｔｔｃｃｇｃｃ  ｔｃａｇａｇｇａｇｔ  ｔｃｔｔａｇｃｃｔｇ  ｔｃｃｃｇａａｃｃｇ  ｔａａｃｃｃｃｇｇｃ  ｇａｇｃａｇａｔｇｇ  ａｇｃｔｇｇａｃｃａ  ｔａｔｇａｃｇａｃｃ  ｇｇｃｇｇｃｃｔｃｃ  ａｃｇｃｃｔａｃｃｃ  ｔｇｃｃｃｃｇｃｇｇ  ｇｇｔｇｇｇｃｃｇｇ  ｃｃｇｃｃａａａｃｃ  ｃａａｔｇｔｇａｔｃ  ｃｔｇｃａｇａｔｔｇ  ｇｔａａｇｔｇｃｃｇ  ａｇｃｔｇａｇａｔｇ  ｃｔｇｇａｇｃａｃｇ  ｔａｃｇｇａｇｇａｃ  ｃｃａｃｃｇｇｃａｔ  ｃｔｇｔｔｇａｃｃｇ  ａａｇｔｇｔｃｃａａ  ｇｃａｇｇｔｇｇａｇ  ｃｇａｇａｇｃｔｇａ  ａａｇｇｇｔｔｇｃａ  ｃａｇｇｔｃｇｇｔｇ  ｇｇｃａａｇｃｔｇｇ  ａｇａａｃａａｃｔｔ  ｇｇａｃｇｇｃｔａｔ  ｇｔｇｃｃｃａｃｇｇ  ｇｃｇａｃｔｃａｃａ  ｇｃｇｃｔｇｇａａｇ  ａａｇｔｃｃａｔｃａ  ａｇｇｃｃｔｇｔｃｔ  ｃｔｇｃｃｇｃｔｇｃ  ｃａｇｇａｇａｃｃａ  ｔｃｇｃｃａａｃｃｔ  ｇｇａｇｃｇｃｔｇｇ  ｇｔｃａａｇｃｇｔｇ  ａｇａｔｇｃａｃｇｔ  ｇｔｇｇａｇｇｇａｇ  ｇｔｃｔｔｃｔａｃｃ  ｇｔｃｔｇｇａｇａｇ  ｇｔｇｇｇｃｃｇａｃ  ｃｇｃｃｔｇｇａｇｔ  ｃｃａｔｇｇｇｃｇｇ  ｃａａｇｔａｃｃｃａ  ｇｔｇｇｇｃａｇｃｇ  ａｇｃｃｇｇｃｃｃｇ  ｃｃａｃａｃｔｇｔｃ  ｔｃｔｇｔａｇｇｔｇ  ｔｇｇｇｇｇｇｔｃｃ  ａｇａｇｃｃｃｔａｃ  ｔｇｃｃａｇｇａａｇ  ｃｔｇａｔｇｇｃｔａ  ｃｇａｃｔａｃａｃｔ  ｇｔｔａｇｃｃｃｃｔ  ａｔｇｃｃａｔｃａｃ  ｃｃｃｇｃｃａｃｃｔ  ｇｃｃｇｃａｇｇａｇ  ａｇｃｔｇｃｃｔｇａ  ｇｃａｇｇａｇｔｃａ  ｇｔｔｇｇｇｇｃｔｃ  ａｇｃａａｔａｃｃａ  ｇｔｃｔｔｇｇｇｔｇ  ｃｃａｇｇｔｇａｇｇ  ａｔｇｇｇｃａａｃｃ  ａａｇｃｃｃａｇｇｔ  ｃｔｇｇａｔａｃｃｃ  ａｇａｔｃｔｔｔｇａ  ｇｇａｃｃｃａｃｇｇ  ｇａｇｔｔｃｃｔｇａ  ｇｃｃａｃｃｔｇｇａ  ａｇａｇｔａｃｃｔｇ  ｃｇｇｃａｇｇｔｇｇ  ｇｔｇｇｃｔｃｔｇａ  ａｇａａｔａｔｔｇｇ  ｃｔｇｔｃｃｃａｇａ  ｔｃｃａｇａａｃｃａ  ｃａｔｇａａｔｇｇｇ
ｃｃａｇｃｃａａｇａ  ａｇｔｇｇｔｇｇｇａ  ｇｔｔｃａａａｃａｇ  ｇｇｃｔｃｇｇｔｇａ  ａｇａａｃｔｇｇｇｔ  ｇｇａｇｔｔｃａａｇ  ａａｇｇａｇｔｔｔｃ  ｔｇｃａｇｔａｃａｇ  ｔｇａｇｇｇｔａｃｇ  ｃｔｃｔｃｃｃｇｃｇ  ａａｇｃｃａｔｔｃａ  ｇｃｇｇｇａｇｃｔｇ  ｇａｃｃｔｇｃｃａｃ  ａｇａａｇｃａｇｇｇ  ｔｇａｇｃｃａｃｔｔ  ｇａｃｃａｇｔｔｃｃ  ｔｃｔｇｇｃｇｔａａ  ｇｃｇｇｇａｃｃｔｇ  ｔａｃｃａｇａｃａｃ  ｔｇｔａｔｇｔｇｇａ  ｃｇｃｔｇａｇｇａｇ  ｇａｇｇａｇａｔｃａ  ｔｔｃａｇｔａｔｇｔ  ｇｇｔｇｇｇｃａｃｃ  ｃｔｇｃａｇｃｃｃａ  ａｇｔｔｃａａｇｃｇ  ｃｔｔｔｃｔｇｃｇｃ  ｃａｃｃｃａｃｔｔｃ  ｃｃａａｇａｃｃｃｔ  ｇｇａｇｃａｇｃｔｃ  ａｔｃｃａｇａｇｇｇ  ｇｃａｔｇｇａａｇｔ  ｔｃａｇｇａｃｇｇｃ  ｃｔｇｇａｇｃａｇｇ  ｃａｇｃｔｇａｇｃｃ  ｔｔｃｔｇｔｃａｃｃ  ｃｃｔｃｔｇｃｃｃａ  ｃａｇａｇｇａｔｇａ  ｇａｃｔｇａｇｇｃａ  ｃｔｃａｃｇｃｃｔｇ  ｃｔｃｔｔａｃｃａｇ  ｃｇａｇｔｃａｇｔａ  ｇｃｃａｇｔｇａｃａ  ｇｇａｃｃｃａｇｃｃ  ｔｇａａｔａｇａｇｇ  ｇｇｃｃａｇｃｃｃａ  ｇｇｇｔｃｃｃｃａｇ  ｃｃｔｇｃｃｔｇｃｃ  ａｃａｃｃｃａｇｔｃ  ｔｇｔｇｇｃｔｔｔｔ  ｇｔｃａａｃｔａｇｇ  ａｃｔｔｇａｔｔｇａ  ｇｃｔｇｇｇｇｃｔｇ  ａｃａｃｃｃａａｇｇ  ｇｇａｔｇｃｃｃｔｇ  ｔｃｃａｇｃｃａｇａ  ｃａｃｃｔｔｃｔｃａ  ｃｃｃａｃｔｇｇｃｃ  ｔｇａｃｔｃａｃａａ  ｃｔｇｃｃａｃａｃａ  ａｃｃａｔｇａｔｔｃ  ａｔｇｇａｃａｔｃａ  ａｇａａｇｃｃｃｃｔ  ｃｔｃｃｃａｔａｇｇ  ｇｃｔｃｃｃａｃｃｔ  ｇｃｃａｃｃｔａｃｃ  ｃｃｔｃａｃｃｔｇｔ  ｃｔｇｃｃｃｔａｇｔ  ｃｃｔｇｇｃｃｃｔｇ  ｔｃｔｃｃａｇｔｇｇ  ｃｃｔｃａｃｃｃｔｃ  ｔａｃａｃｔｃｔｃａ  ｇａｃｃａｔｃａｃａ  ｇａａｃａｃｃｔｔｔ  ｇｇｃｔｔｃｃｔｃａ  ｔｔｃｔｇｃａｔｃａ  ｇｔｇｔｃｃａｇｇｇ  ｃｃｃｔｔｔｇｇｇｔ  ａｇｔｃａａｇａａａ  ｔｃａａｇｔｇｔｃｔ  ｇａａａｇｇｃａａｔ  ｇａａａａｇｔａｇｇ  ｃａｃｃａａａｃｃｃ  ａａｇｇｇｇｃａｔｃ  ｃｃａｇｇｇｃａｇａ  ｔｇｃｔａａａｇｃａ  ｇａａｔｃａｇａｇａ  ｔｇｇｃｃｇａａｇｇ  ａａｃｃｔｃｔａｃｔ  ｔｃｃｇｇｇｇａｔｇ  ｃａｇｃｃｃｇｃｔｃ  ｃｔａｃａｇａｃａｃ  ａｇｃａｇａｔｃｃａ  ｇｃｔｇｇｔｇｃｃｃ  ｔａｃｃｔｇｃｃｔｃ  ｃｃａｇａｇｃａａｃ  ｔｇｇｃｃａｇｔｃｔ  ｔｇｇｇｃａｇｃａｔ  ａｇｃｔｃｃｃｃｔｃ  ｔｃａｇｇｇｔｇａｇ  ｃｔｇａａｇｃａｇｃ  ａｇａｃｃｔｇａｃｇ  ｃｇｃｔｇｇｃｇｃｃ  ｔｃｃｔｇｇｃｃｃｃ  ｃａｇｃａｇｔｇａｔ  ｔｃａｔａｃｃａｇｔ  ｇａａｇａａａａｇｃ  ａｇａｃｔｔｃｇｇｃ  ｔｃｃａｔｇａｃｔｃ  ａｇｃｃａｔｇｃｃａ  ｇｇｃｇｇａｇｇｇｔ  ｃｃｃａｇａｇｇｇｇ  ｃｔｇａｇｔｃｃｔｃ  ａｇｃｃｃｃａｇｃｔ  ｇａｇｇｃａｇｃａｇ  ｃｔｇｇａｇｔｃｔｔ  ｃａｇａｇｃｃａｇｇ  ｔｇａａｔｇａｃａｃ  ｃａｇｇｔｃｔｃａａ  ｇｃｔｇｃｔｇａｇａ  ａｇｔｃｔｔｔｃｃｇ  ｇｃｃａｔｇｔｃｔｇ  ｇａａｇｇｇｇｔａｃ  ｃａｃｃｃｃａｇｃａ  ｃｃａｇｃａｃｃｇｔ  ｃｃｃｃｔｃｃｔｃｔ  ｃｔｔｇａａｇｃｔｇ  ｃｃｔｇｃａｃａｇａ  ｇｇｔｔｃｃａａｇａ  ｃａｃｔｔｔｃａａｇ  ｇｃａｇａｇａａａａ  ｔａｇｇａｔｔａｃａ  ａａｇａｇｇａｇｇｔ  ｇｃｃｔｔｇｇｃａｇ  ａｇｇｇｃａｇｃａｃ  ｃｃａｇｃｔｃａｇｃ  ｃｔｃａｇａｇｃｔｇ  ａａｇｇｔｇａａｇａ  ｃａａｇｃｃａｇｃｇ  ｔｇａａａｃｃｃｃｇ  ｇｇｔｃｔｇｃｃａｃ  ｇａａｔｇｃｃｃｇｃ  ｔｃｃｇｃｔｇｇｃｃ  ａｃｔｃａｃｃａｇｃ  ｔｇｃｃｔｇｃｃａｃ  ａａｇｃｃａｃｔｇｃ  ａｇｃｔｔｇａｇｃａ  ｇｇｇｔｃｔｇｔｇｃ  ｃｃｔｃｔｃａｇｃａ  ｃａｇａｇｃｃｃａｇ  ｔｔｃｇｃｔｇｃｇｔ  ｇｇｃｃｔｔｔｇｇｃ  ｃｃｃｃｇｃｃａｇａ  ａｃｃｔｔｇｃａｇｇ  ａｇｃｃｔｔａａｇｇ  ｔｔｃｇｇｇｃｃｃｔ  ａｇｃｃｃａｇｃｃｔ  ｇａｃｃｔｔａｃｃｔ  ｇｃｔｇｔｇｃｃｃｔ  ｇｃｃｔｇｃｔｇｇｔ  ｃａａｇｔｃｃａｇｔ  ｃｃｃａｇｇａｇａｃ  ｃｃｃａｔｇｃｃｔｔ  ｇｇｃｔｃｃｔａｇｇ  ｃｔｇｔｔｃｃａｇｇ  ｃａｃｔｔｃｃｃｔｇ  ａｃｃｔｇｃｃｇｇｇ  ｔｇａｔｔｇｃｃｃａ  ｇｃｔｇｇａａｃｃｔ  ｃａｔｃｃａｃａｃｃ  ｃｃａｇｃａｃｃａａ  ｃｃａｃｃｔｃｇｔｇ  ｔｔｇｇｔａａｃｔｇ  ｃｔｃｇｔｇｔｃｔｇ  ｔａｇｔｃｔｇａｇｔ  ａｇｇｃｃａｔｇｔｔ  ｇａｇｇｔｔｃｃｔｃ  ｃａｔｃｔｇｃｃｔｇ  ｇｔｃｃａｔｔｇｇｔ  ｇｔｔｃｔｇａｇａｃ  ｃａｇｔｔｃｃａｃｔ  ｇｃｔｇｔｔｃｔｇａ  ｃａｇａｔｃｃｃｃｃ  ａｃｃｃｔｇｔｇｃｃ  ｃｃｔｇｃｃａｇｃｃ  ｃｃｃａｃａｇｇｔｔ  ｔａｔｔｔｔｔｇｃａ  ｃａｔａａａｃｃａｔ  ｇａｃｃｃａｔａｃｔ  ａａｔｔｔｇｇｃｔａ  ｇｃｔｃｔｇｇｇｇａ  ｃｔａｇｇｇａｇａｃ
ｃｃｔｇｇａｇａｔｃ  ｔｃａａｇａｇｔｇｔ  ｇｇｃｔａｔｃｃｃｃ  ｔａｔｔｔｔｃａｃｃ  ａａｇｃｃｔｔｃａａ  ｔａｔｃｃａｇｃｃａ  ｇｇｃｃａｔｃｔｇｇ  ｃｃｃａｃａｃｃａｔ  ｃｔｔａｃｃｔｃａａ  ａｇａｃａｇａｃａｔ  ａｔａｔａｔａｔａｔ  ａｔａｃａｔａｔａｔ  ａｔｇａｔｔｔｔｇｔ  ｔａａｔａａａａｃｔ  ａｔｇａａａｔｔｔａ  ａａ  （配列番号３）
【００３８】
また、配列番号４の配列を含む核酸配列、ヒトＡｒｃ遺伝子の核酸配列を開示する。
ｃｇｃｇｔｇｇｇｃｃ  ｇｃａｇｃａｇｃｃｇ  ａｇｃｃｇｇａｃｃｔ  ｇｃｃｔｃｃｃｃｇｇ  ｇｃｇｔｇｃｔｃｃｇ  ｃｃｇｇｃｃｃｃｇｃ  ｃｇｃｃｇｇｃｃｃｇ  ｃａｇｃｇａｃａｇａ  ｃａｇｇｃｇｃｔｃｃ  ｃｃｇｃａｇｃｔｃｃ  ｇｃａｃｇｇｇａｃｃ  ｃａｇｇｃｃｇｃｃｇ  ｇａｃｃｃｃａｇｃｇ  ｃｃｇｇａｃｃａｃｃ  ｇｔｃｃｇｔｃｃｇｃ  ｃｃｃｇａｇｇａｇｔ  ｔｔｇｃｃｇｃｃｔｇ  ｃｃｇｇａｇｃａｃｃ  ｔｇｃｇｃａｃａｇａ  ｔｇｇａｇｃｔｇｇａ  ｃｃａｃｃｇｇａｃｃ  ａｇｃｇｇｃｇｇｇｃ  ｔｃｃａｃｇｃｃｔａ  ｃｃｃｃｇｇｇｃｃｇ  ｃｇｇｇｇｃｇｇｇｃ  ａｇｇｔｇｇｃｃａａ  ｇｃｃｃａａｃｇｔｇ  ａｔｃｃｔｇｃａｇａ  ｔｃｇｇｇａａｇｔｇ  ｃｃｇｇｇｃｃｇａｇ  ａｔｇｃｔｇｇａｇｃ  ａｃｇｔｇｃｇｇｃｇ  ｇａｃｇｃａｃｃｇｇ  ｃａｃｃｔｇｃｔｇｇ  ｃｃｇａｇｇｔｇｔｃ  ｃａａｇｃａｇｇｔｇ  ｇａｇｃｇｃｇａｇｃ  ｔｇａａｇｇｇｇｃｔ  ｇｃａｃｃｇｇｔｃｇ  ｇｔｃｇｇｇａａｇｃ  ｔｇｇａｇａｇｃａａ  ｃｃｔｇｇａｃｇｇｃ  ｔａｃｇｔｇｃｃｃａ  ｃｇａｇｃｇａｃｔｃ  ｇｃａｇｃｇｃｔｇｇ  ａａｇａａｇｔｃｃａ  ｔｃａａｇｇｃｃｔｇ  ｃｃｔｇｔｇｃｃｇｃ  ｔｇｃｃａｇｇａｇａ  ｃｃａｔｃｇｃｃａａ  ｃｃｔｇｇａｇｃｇｃ  ｔｇｇｇｔｃａａｇｃ  ｇｃｇａｇａｔｇｃａ  ｃｇｔｇｔｇｇｃｇｃ  ｇａｇｇｔｇｔｔｃｔ  ａｃｃｇｃｃｔｇｇａ  ｇｃｇｃｔｇｇｇｃｃ  ｇａｃｃｇｃｃｔｇｇ  ａｇｔｃｃａｃｇｇｇ  ｃｇｇｃａａｇｔａｃ  ｃｃｇｇｔｇｇｇｃａ  ｇｃｇａｇｔｃａｇｃ  ｃｃｇｃｃａｃａｃｃ  ｇｔｔｔｃｃｇｔｇｇ  ｇｃｇｔｇｇｇｇｇｇ  ｔｃｃｃｇａｇａｇｃ  ｔａｃｔｇｃｃａｃｇ  ａｇｇｃａｇａｔｇｇ  ｃｔａｃｇａｃｔａｃ  ａｃｃｇｔｃａｇｃｃ  ｃｃｔａｃｇｃｃａｔ  ｃａｃｃｃｃｇｃｃｃ  ｃｃａｇｃｃｇｃｔｇ  ｇｃｇａｇｃｔｇｃｃ  ｃｇｇｇｃａｇｇａｇ  ｃｃｃｇｃｃｇａｇｇ  ｃｃｃａｇｃａｇｔａ  ｃｃａｇｃｃｇｔｇｇ  ｇｔｃｃｃｃｇｇｃｇ  ａｇｇａｃｇｇｇｃａ  ｇｃｃｃａｇｃｃｃｃ  ｇｇｃｇｔｇｇａｃａ  ｃｇｃａｇａｔｃｔｔ  ｃｇａｇｇａｃｃｃｔ  ｃｇａｇａｇｔｔｃｃ  ｔｇａｇｃｃａｃｃｔ  ａｇａｇｇａｇｔａｃ  ｔｔｇｃｇｇｃａｇｇ  ｔｇｇｇｃｇｇｃｔｃ  ｔｇａｇｇａｇｔａｃ  ｔｇｇｃｔｇｔｃｃｃ  ａｇａｔｃｃａｇａａ  ｔｃａｃａｔｇａａｃ  ｇｇｇｃｃｇｇｃｃａ  ａｇａａｇｔｇｇｔｇ  ｇｇａｇｔｔｃａａｇ  ｃａｇｇｇｃｔｃｃｇ  ｔｇａａｇａａｃｔｇ  ｇｇｔｇｇａｇｔｔｃ  ａａｇａａｇｇａｇｔ  ｔｃｃｔｇｃａｇｔａ  ｃａｇｃｇａｇｇｇｃ  ａｃｇｃｔｇｔｃｃｃ  ｇａｇａｇｇｃｃａｔ  ｃｃａｇｃｇｃｇａｇ  ｃｔｇｇａｃｃｔｇｃ  ｃｇｃａｇａａｇｃａ  ｇｇｇｃｇａｇｃｃｇ  ｃｔｇｇａｃｃａｇｔ  ｔｃｃｔｇｔｇｇｃｇ  ｃａａｇｃｇｇｇａｃ  ｃｔｇｔａｃｃａｇａ  ｃｇｃｔｃｔａｃｇｔ  ｇｇａｃｇｃｇｇａｃ  ｇａｇｇａｇｇａｇａ  ｔｃａｔｃｃａｇｔａ  ｃｇｔｇｇｔｇｇｇｃ  ａｃｃｃｔｇｃａｇｃ  ｃｃａａｇｃｔｃａａ  ｇｃｇｔｔｔｃｃｔｇ  ｃｇｃｃａｃｃｃｃｃ  ｔｇｃｃｃａａｇａｃ  ｃｃｔｇｇａｇｃａｇ  ｃｔｃａｔｃｃａｇａ  ｇｇｇｇｃａｔｇｇａ  ｇｇｔｇｃａｇｇａｔ  ｇａｃｃｔｇｇａｇｃ  ａｇｇｃｇｇｃｃｇａ  ｇｃｃｇｇｃｃｇｇｃ  ｃｃｃｃａｃｃｔｃｃ  ｃｇｇｔｇｇａｇｇａ  ｔｇａｇｇｃｇｇａｇ  ａｃｃｃｔｃａｃｇｃ  ｃｃｇｃｃｃｃｃａａ  ｃａｇｃｇａｇｔｃｃ  ｇｔｇｇｃｃａｇｔｇ  ａｃｃｇｇａｃｃｃａ  ｇｃｃｃｇａｇｔａｇ  ａｇｇｇｃａｔｃｃｃ  ｇｇａｇｃｃｃｃｃａ  ｇｃｃｔｇｃｃｃａｃ  ｔａｃａｔｃｃａｇｃ  ｃｔｇｔｇｇｃｔｔｔ  ｇｃｃｃａｃｃａｇｇ  ａｃｔｔｔｔｇａｇｃ  ｔｇｇｇｇｃｔｇａｃ  ｔｃｃｔｇｃａｇｇｇ  ｇａａｇｃｃｃｔｇｇ  ｔｃｃａｇｃｔｇｇｇ  ｔｇｃｃｃｃｃｔｃｇ  ａｇｃｔｃｃｇｇｇｃ  ｇｇａｃｔｃｇｃａｃ  ａｃａｃｔｃｇｔｇｔ  ｃａｔｃｃａｇａｔｇ  ｔｇａｇｃａｃｃｇｃ  ａｃｃｃａｇｃｇｇｃ  ａａａｇａｇｃｃｃｔ  ｃｃｃｃｃｃｔｇｃａ  ｇｇｇｃｔｃｃａｃｃ  ｃａｔｃａｃｃｃｔｃ  ｃｃｔｃｃｇｔｃｔｇ  ｔｃｔｔｔｃｃｇｇｃ  ｃｔｇｇａｃｃｃｃａ  ｃｃｃｔｃｃａｃａｃ  ｔｃｔｃａｇｇｃｃａ  ｔｃａｃａｇａａｃａ  ｃｃｃｃａｇｃｔｔｃ  ｃｔｃａｔｔｃｔｇｃ  ｔａｃａａｃａｃｃｃ  ａｇｇｃｃｃｔｃｔｇ  ｇａｃａｔｃｃａｇａ  ａａａｃｃａａｇｔｇ  ｔｃｃｇｇａｔｇｇｃ  ａｇｇｇｇｃｃａｇｃ  ｇｇｃｃａｃｃａａｇ  ｃｔｃａｔｇｇｇａｃ  ａｃｃｃａｇａｇｃａ  ｇａａｇｃｔａｇｇｇ  ｃａｇａｇｃｃａａｔ  ｇｃｔｇａｇｇｇａｇ  ｃｃｔｃｇａｃｔｔｃ  ｃｇｇｃｇｃｃｇｃｃ  ｇｃｃｃｔｃｔｃｃｃ  ｇｇｃａｔｃｃｇｃａ  ｇａｇｃｃａｇｃｔｇ  ａｃｇｃｃｃｔｃｃｃ  ｔｇｃｃｔｃｃｃａｇ  ｇｇｃａｇｃｔｇｇｃ  ｃａｇｃｃｔｃｇｇｇ  ｃａｇｃｇｃｇｇｃｃ  ｃｃｃｔｃｃｔｃｃｃ  ａｇｇｇｇａｇａｇｔ  ａｇａａｇｔｃｇｃａ  ｃａｃｇｃａｇｃａｇ  ａｇｃａｇａｃｃｔｇ  ａｔｇｔｃｃｃｇｇｔ  ｇｃｔｔｃｃｔｇｇｃ  ｃｃｃｔｃａｇｃｔｃ  ｃａｇｔｇａｔｔｃａ  ｃｇｃｃｃｇｃｃｔｇ  ｇａｇａａｇａａｔｃ  ａｇａｇｃｔｃａｇｃ  ｔｃａｔｇａｃｔｃａ  ｃｃｃａｔｇｇｃａｇ  ｇｃｇｇａｇｇｇｔｃ  ｃｃａｇａｇｇｇｇｃ  ｔｇａｇｔｃｃｔｃａ  ａａｔｃｃｇｇｃｔｇ  ａｇｇｃａｇｃａｇｃ  ｔｇｇｃａｃｃａｔｃ  ａｇａｇｃｃａｇｇａ  ｇａｇｔｇａｃａａｃ  ａｇｇｔｃｔｃａａｇ  ｇｔｔｃｃｃａｃａａ  ａｇｔｃｔｔｔｇｃｔ  ｇｃｔｇｔｇｃｔｇｇ  ｇｃａｃｃａｃｃｃａ  ｃｃｃｃｔｃａｃｃｔ  ｔｇｃａｇｇｃｔｇｃ  ｃｔｇｃｇｔｇｇｇａ  ｇｇｃｇａａｇｔｃｃ  ｃａｇｇａｃａｇｃｃ  ｃａｇａｇｇｇｇｇｇ  ｃｔａｃａｇａｇａｇ  ｇａｇｔｃｇｇｃｔｇ  ｃａｇｃａｇａｇｇｇ  ｃａｇｇａｇｃｃｃｃ  ａｇｃｔｔａｇｃｃｃ  ｔｇａｇｃｇｃｃａｇ  ｃｇｃｇａｇｇａｃｃ  ａｇｇｇｃｃｔｇｃｃ  ａｃｔａａｇｃｃｃｇ  ｃｃｃｃｇｃｔｇｇｃ  ｃｇｃｃａｇｃｔｇｃ  ｃｃｇｔｃｃｃｃａｇ  ａｇｃｃａｃｔｇｃａ  ｇｃａｇｇａｇｔｃｇ  ｇｇｃｃｃｔｇｃｃｔ  ｃｃｃｔｃｃｃａｇｃ  ａｇｇｇａａａｃｃｃ  ｃｇｃｃｃｇｃｔｇｃ  ｃａｇｇｃｃａｔｃｃ  ｔｃｔｃｔｇｃｃａｇ  ａｇｇｃｔｔｔｃａｔ  ｇａｇｃｃｃｃａａｇ  ｇｃｔｇｇｇｇｃｃａ  ｃａｇｃｔｃｃｔａｃ  ｃｃｃｔｇｃｃｃａｇ  ｃａｇｃｃｃｔｇａｇ  ｃｔｃａｇｃｔｇｃａ  ｇｇａａｇｇａｃａｔ  ｃｃｃａｇａａｇｃｃ  ａｔｇｇｃｔｃｃｔｇ  ｇｇｇｃｇｃｔｔｃｃ  ａｇｇｃａｔｔｃｔｇ  ｃｃｃｔｇｃｃｃｃｇ  ａｃａｃｃａｇａａｃ  ｃｃｔｇｇｔｇｃｔｇ  ｇｔｇｇｇｃｃａｃｔ  ａｇｃｇｔｃｔｇｃａ  ｇｃｃｔａａｇｃａｇ  ｇｔｇｃｔｇｇｃｔｃ  ａｇｇｇｔｔｃａｔｃ  ａｔｔｃｔｇｃｃｔｔ  ｇｔｃｃａｃｔｇｇｇ  ｇｇａｃｃａｇｃｃｃ  ｔｇｃａｇａｃｃａｃ  ｔｃｔｇａｃａａｇｔ  ｃｔｔｃａｇｃｃｃａ  ｃａｃｃｔｔｇｃｃａ  ｇｃｃｃｃａｃａｇａ  ｔｔｔｔａｔｔｔｔｔ  ｇｃａｃａｔａａｇｃ  ｃａｔａａｃｃａａｔ  ｃｃｔｃａａｇｇｃｔ  ｇｇｃａｃａｇｇｃｔ  ｔｔｇｇｇｇａａｇｃ  ｃｃｔｇｇａｇｃｃｔ  ｇｔｇａａｇａｃｃｃ  ｔｇｇａａａｃｃｔｃ  ａｔｇａｇｇｃｔｇｔ  ｇｇｃｃａａｃｃｃｃ  ｔｇｃｃｃｃｔｔｇｃ  ｃｃｃａｃａｃａｇａ  ｃｃａｇｇｃｃｔｔａ  ａａｔｇｔｃｇｇｔｃ  ｃａｇｇｃｃｃｔｇｔ  ｇｃａｃｃｔｔａｃｃ  ｃｃａｇａｇａｃａｇ  ａｃｔｃｔｔｔｔｔｇ  ｔａａｇａｔｔｔｔｇ  ｔｔａａｔａａａａｃ  ａｃｔｇａａａｃｔｔ  ｃ（配列番号４）
【００３９】
配列番号３との少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９．９％の配列同一性を含む核酸配列を開示する。配列番号４との少なくとも６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または９９．９％の配列同一性を含む核酸配列を開示する。
【００４０】
配列番号１または配列番号２のアミノ酸２７８〜３７０をコードすることができる配列に少なくとも１つの突然変異を含む核酸配列を開示する。換言すれば、配列番号３または配列番号４の核酸８３２〜１１１０に少なくとも１つの突然変異を含む核酸配列を開示する。また、配列番号１または配列番号２のアミノ酸２０７〜３７０をコードすることができる配列に少なくとも１つの突然変異を含む核酸配列を開示する。換言すれば、配列番号３または配列番号４の核酸６１９〜１１１０に少なくとも１つの突然変異を含む核酸配列を開示する。
【００４１】
また、二次または三次構造が本明細書に記載のＡｒｃタンパク質と共通しているタンパク質をコードすることができる核酸配列を開示する。
【００４２】
Ｃ．ベクター
Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列を含むベクターを開示する。いくつかの態様では、Ａｒｃタンパク質は、本明細書に開示されるＡｒｃタンパク質のいずれかであり得る。
【００４３】
二次または三次構造が本明細書に記載のＡｒｃタンパク質と共通するタンパク質をコードすることができる核酸配列を含むベクターを開示する。
【００４４】
いくつかの態様では、開示されるベクターはさらに、標識部分をコードすることができる核酸配列を含み得る。いくつかの態様では、標識部分は、核酸にコードされる任意のペプチドまたはタンパク質であり得る。例えば、標識部分は、限定されないが、ＧＳＴ、ｍｙｃ、ＨｉｓまたはＧＦＰであり得る。
【００４５】
いくつかの態様では、標識部分は、Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列に機能可能に繋げられ得る。かくして、標識部分とＡｒｃタンパク質とが一緒に転写され得る。
【００４６】
いくつかの態様では、開示されるベクターはさらに、標的指向性部分をコードすることができる核酸配列を含み得る。いくつかの態様では、標的指向性部分は、Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列に機能可能に繋げられ得る。かくして、標的指向性部分とＡｒｃタンパク質とが一緒に転写され得る。いくつかの態様では、標的指向性部分は、限定されないが、多糖、ペプチド、ペプチドリガンド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、抗体もしくはその断片、抗体の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、またはＦａｂ断片、またはナノボディであり得る。
【００４７】
Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列に加えて、開示されるベクターは、宿主細胞におけるＡｒｃタンパク質の発現を制御する調節配列を保有し得る。当業者であれば、調節配列の選択を含めたベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベルなどの因子によって決まり得ることを認識する。哺乳動物宿主細胞発現のために好ましい調節配列としては、哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を促すウイルスエレメント、例えば、レトロウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（例えばＣＭＶプロモーター／エンハンサー）、サルウイルス４０（ＳＶ４０）（例えばＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えばアデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマに由来するプロモーター及び／またはエンハンサー、ならびに強力な哺乳動物プロモーター、例えばナイーブ免疫グロブリン及びアクチンプロモーターが挙げられる。ウイルス調節エレメント及びその配列のさらなる記載については、例えば、米国特許第５，１６８，０６２号、第４，５１０，２４５号及び第４，９６８，６１５号を参照されたい。細菌細胞または真菌細胞、例えば酵母細胞においてポリペプチドを発現させる方法も当技術分野でよく知られている。
【００４８】
いくつかの態様では、開示されるベクターはさらに、Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列に機能可能に繋げられたプロモーターを含む。いくつかの態様では、プロモーターは誘導性プロモーターであり得る。いくつかの態様では、プロモーターは細胞特異的プロモーターであり得る。Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列はプロモーターに機能的に繋げられ得る。「機能的に繋げられる」とは、プロモーターが核酸配列の発現を促進することができること、したがって核酸配列に対するプロモーターの適切な配向を有していることを意味する。
【００４９】
Ｄ．細胞
開示されるベクターのいずれかを含む細胞を開示する。開示されるＡｒｃタンパク質のいずれかを含む細胞を開示する。開示されるＡｒｃカプシドのいずれかを含む細胞を開示する。
【００５０】
いくつかの態様では、開示される細胞は哺乳動物細胞であり得る。
【００５１】
いくつかの事例では、細胞は、当技術分野でよく知られている培養技術を用いて培養され得る。任意の既知の細胞株を使用することができる。いくつかの事例では、細胞は、任意の宿主に由来し得る。例えば、細胞は、限定されないが、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ネコ、ウマ、細菌または真菌宿主に由来し得る。
【００５２】
Ｅ．医薬組成物
Ａｒｃカプシドと薬学的に許容される担体とを含む組成物を開示する。Ａｒｃカプシドは、開示されるＡｒｃカプシドのいずれかであり得る。
【００５３】
いくつかの態様では、開示されるＡｒｃカプシドを、薬学的に許容される担体の中に入れて、またはそれと共に、製剤化及び／または投与することができる。本明細書中で使用する場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、無菌の水性または非水性の溶液、分散体、懸濁液またはエマルジョン、及び使用直前に無菌の注射用の溶液または分散体に入れて再構成するための無菌粉末を指す。好適な水性及び非水性の担体、希釈剤、溶媒またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、カルボキシメチルセルロース及びそれらの好適な混合物、植物油（例えばオリーブ油）及び注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルが挙げられる。レシチンなどのコーティング材料を使用すること、分散体の場合に要求される粒径を維持すること、及び界面活性剤を使用することによって、適度な流動性を維持することができる。これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤及び分散剤などの佐剤も含有することができる。様々な抗菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などを含ませることによって微生物の作用の防止を確保することができる。等張化剤、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むことが望ましい場合もある。吸収を遅延させるモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなどの薬剤を含ませることによって注射用医薬剤形の吸収延長をもたらすことができる。注射用デポ剤形は、薬物をポリラクチド−ポリグリコライド、ポリ（オルトエステル）及びポリ（無水物）などの生分解性ポリマーの中に入れたマイクロカプセルマトリックスを形成することによって作られる。薬物対ポリマーの比率及び採用する特定ポリマーの性質に応じて薬物放出の速度を制御することができる。デポ注射用製剤は、体組織との適合性を有するリポソームまたはマイクロエマルジョンの中に薬物を捕捉することによっても調製される。注射用製剤は、例えば、細菌保持フィルターによる濾過、または使用直前に無菌水もしくはその他の無菌注射用媒体に溶解もしくは分散させることができる無菌固体組成物の形態の滅菌剤の組込みによって滅菌され得る。好適な不活性担体にはラクトースなどの糖が含まれ得る。活性成分の粒子の少なくとも９５重量％が０．０１〜１０マイクロメートルの範囲の有効粒径を有することが望ましい。
【００５４】
したがって、本明細書に開示される組成物は、脂質、例えばリポソーム、例えばカチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）またはアニオン性リポソームを含み得る。リポソームはさらに、特定の細胞を指向することを容易にするタンパク質を所望により含み得る。ペプチドとカチオン性リポソームとを含む組成物の投与は、血液に対して施され得るか、標的臓器に対して施され得るか、または呼吸器の細胞を標的とすべく呼吸器内に吸入され得る。例えば、本明細書に記載のペプチドまたは核酸配列と、カチオン性リポソームとを含む組成物を対象の肺細胞に投与することができる。リポソームに関しては例えばＢｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５  １００（１９８９）、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３  ７４１７（１９８７）、米国特許第４，８９７，３５５号を参照されたい。さらに、マクロファージなどの特定の細胞種へ、または特定の速度もしくは投薬量のために化合物の拡散もしくはマイクロカプセルからの化合物の送達が企図されている場所へと指向され得るマイクロカプセルの成分として、化合物を投与することができる。
【００５５】
一態様では、本明細書に記載の開示されるＡｒｃカプシドもしくはタンパク質のいずれかまたは薬学的に許容されるその塩もしくは溶媒和物と、薬学的に許容される担体、緩衝液もしくは希釈剤とを含む医薬組成物が開示される。様々な態様において、医薬組成物のＡｒｃカプシドまたはタンパク質は送達ビヒクルの中に封入される。さらなる態様では、送達ビヒクルはリポソーム、マイクロカプセルまたはナノ粒子である。さらなる他の態様では、送達ビヒクルはＰＥＧ化される。
【００５６】
本明細書に記載の方法において、細胞への組成物の送達は、様々な機序を介したものであり得る。上に定義したとおり、本明細書に記載のＡｒｃカプシドまたはタンパク質のいずれか１つ以上を含む組成物が本明細書に開示され、これはさらに担体、例えば薬学的に許容される担体を含み得る。例えば、本明細書に開示されるＡｒｃカプシド及びタンパク質と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物が開示される。一態様では、開示されるＡｒｃカプシド及びタンパク質を含む医薬組成物が開示される。つまり、医薬組成物は、治療的有効量の少なくとも１つの開示されるＡｒｃカプシドまたは開示される方法の少なくとも１つの産物と、薬学的に許容される担体とを含んだ状態で提供され得る。
【００５７】
特定の態様では、開示される医薬組成物は、活性成分としての開示されるＡｒｃカプシドまたはタンパク質（薬学的に許容されるその塩（複数可）を含む）、薬学的に許容される担体及び、任意選択の他の治療薬成分または佐剤を含む。目下の組成物には、経口、直腸、局所及び非経口（皮下、筋肉内及び静脈内を含む）投与に適するものが含まれるが、何らかの所与の症例で最も適する経路は特定の宿主、ならびに活性成分を投与する所以である症状の性質及び重症度によって決まる。医薬組成物は、単位剤形で簡便に提供され得、薬学分野でよく知られている方法のいずれかによって調製され得る。
【００５８】
実際上、本発明の、本明細書に記載のＡｒｃカプシド及びタンパク質、または薬学的に許容されるその塩は、従来の医薬配合技術に従って、医薬担体との緻密な混合物の中の活性成分として混合され得る。担体は、例えば経口または非経口（静脈内を含む）での投与にとって望ましい調合剤の形態に応じて多種多様な形態をとることができる。かくして、本発明の医薬組成物は、所定量の活性成分を各々含有している経口投与に適した不連続単位、例えば、カプセル、カシェ剤または錠剤として提供され得る。さらに、組成物は、散剤、顆粒剤、溶液、水性液体中の懸濁液、非水性液体、水中油エマルジョン、または油中水液体エマルジョンとして提供され得る。上に挙げた一般的な剤形の他にも、制御された放出手段及び／または送達装置によって本発明の化合物及び／または薬学的に許容されるその塩（複数可）を投与することもできる。組成物は薬学の方法のいずれかによって調製され得る。そのような方法は大抵、活性成分と１つ以上の必要な成分をなす担体とを合わせるステップを含む。組成物は大抵、活性成分と、液体担体もしくは微粉化固体担体またはその両方とを均質及び緻密に混合することによって調製される。その後、好都合となるように製品が所望の体裁に形作られ得る。
【００５９】
当業者によく知られているであろうように、「薬学的に許容される」とは、活性成分のいかなる分解も最小限に抑えるように、かつ対象におけるいかなる有害な副作用も最小限に抑えるように選択されることになるであろう材料または担体を意味する。本明細書に記載のＡｒｃカプシドもしくはタンパク質、または薬学的に許容されるその塩を、１つ以上の他の治療的活性化合物と組み合わせて医薬組成物中に含ませることもできる。
【００６０】
採用される医薬担体は、例えば、固体、液体または気体であり得る。固体担体の例としては、ラクトース、石膏、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアガム、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸が挙げられる。液体担体の例は、シュガーシロップ、ピーナッツ油、オリーブ油及び水である。気体担体の例としては、二酸化炭素及び窒素が挙げられる。その他の担体の例としては、ジミリストイルホスファチジル（ＤＭＰＣ）、リン酸緩衝生理食塩水または多胞性リポソームが挙げられる。例えば、ＰＧ：ＰＣ：コレステロール：ペプチドまたはＰＣ：ペプチドを担体として本発明に使用することができる。他の好適な薬学的に許容される担体及びその製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（１９ｔｈ  ｅｄ．）ｅｄ．Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ  １９９５に記載されている。典型的には、適切な量の薬学的に許容される塩を製剤に使用して製剤を等張にする。薬学的に許容される担体のその他の例としては、限定されないが、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは約５〜約８、または約７〜約７．５であり得る。さらなる担体としては、組成物を含有する固体疎水性ポリマーの半浸透性マトリックスなどの持続放出性調合剤が挙げられるが、このマトリックスは、成形品、例えば、フィルム、（血管形成手術中に血管内に埋植される）ステント、リポソームまたは微粒子の形態である。例えば投与経路及び投与される組成物の濃度によっては特定の担体がより好ましい場合があることは、当業者には明らかである。これらは、水、生理食塩水及び生理的ｐＨの緩衝液を含めてヒトへの薬物投与のための標準的担体であることが最も典型的であろう。
【００６１】
医薬組成物中の開示されるＡｒｃカプシドまたはタンパク質の溶解性及び／または安定性を高めるためには、α−、β−もしくはγ−シクロデキストリンまたはそれらの誘導体、特に、ヒドロキシアルキル置換シクロデキストリン、例えば、２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンもしくはスルホブチル−β−シクロデキストリンを採用することが有益となり得る。アルコールなどの共溶媒も、医薬組成物中の本発明に係る化合物の溶解性及び／または安定性を高める場合がある。
【００６２】
医薬組成物は、本発明のポリペプチド、ペプチド、核酸、ベクターの意図された活性が損なわれない限り、担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤なども含むことができる。医薬組成物はまた、（本発明の組成物に加えて）１つ以上の活性成分、例えば、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔剤などを含んでもよい。医薬組成物は、局所処置が望まれるか全身処置が望まれるかに応じて、及び処置される領域に応じて複数の方法で投与されてもよい。
【００６３】
投与の簡単さゆえに経口投与を用いることができ、錠剤及びカプセルは、固体医薬担体を当然ながら採用する最も有益な経口用単位剤形に相当する。経口用剤形のための組成物を調製する際、任意の好都合な医薬媒体を採用することができる。例えば、水、グリコール、油、アルコール、着香剤、保存剤、着色剤などを使用して経口用調合液、例えば、懸濁液、エリキシル及び溶液を形成することができる一方、澱粉、糖、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などの担体を使用して経口用固体調合剤、例えば、散剤、カプセル及び錠剤を形成することができる。投与の簡単さゆえに錠剤及びカプセルは、固体医薬担体を採用するのに好ましい経口用投薬量単位である。場合によって、錠剤を標準的な水性または非水性の技術によってコーティングすることができる。
【００６４】
経口投与のための組成物は、散剤または顆粒剤、水中または非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェまたは錠剤を含む。増粘剤、着香剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤または結合剤が望ましい場合がある。組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸及びリン酸などの無機酸ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸及びフマル酸などの有機酸との反応、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウムなどの無機塩基ならびにモノ−、ジ−、トリアルキル及びアリールアミン及び置換エタノールアミンなどの有機塩基との反応によって形成される薬学的に許容される酸性または塩基性付加塩として投与されてもよい可能性がある。
【００６５】
本発明の組成物を含有する錠剤は、場合によって１つ以上の補助成分または佐剤と共に、圧縮または成型によって調製され得る。圧縮錠剤は、粉末または顆粒などの自由流動形態の活性剤を、場合によって結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、界面活性剤または分散剤と混合して、好適な機械で圧縮することによって調製され得る。成型錠剤は、不活性希釈液で湿らせた粉末化合物の混合物を好適な機械で成型することによって作られ得る。
【００６６】
本発明の医薬組成物は、活性成分としてのタンパク質、例えばＡｒｃタンパク質またはカプシド（または薬学的に許容されるその塩）、薬学的に許容される担体及び、任意選択の１つ以上の追加の治療薬成分または佐剤を含む。目下の組成物には、経口、直腸、局所及び非経口（皮下、筋肉内及び静脈内を含む）投与に適する組成物が含まれるが、何らかの所与の症例で最も適する経路は特定の宿主、ならびに活性成分を投与する所以である症状の性質及び重症度によって決まる。医薬組成物は、単位剤形で簡便に提供され得、薬学分野でよく知られている方法のいずれかによって調製され得る。
【００６７】
非経口投与に適する本発明の医薬組成物は、活性化合物の水溶液または水懸濁液として調製され得る。例えばヒドロキシプロピルセルロースなどの好適な界面活性剤を含ませることができる。油中のグリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物で分散体を調製することもできる。さらに、弊害をもたらす微生物の増殖を防止するために保存剤を含ませることができる。
【００６８】
注射剤用途に適する本発明の医薬組成物には、無菌の水溶液または分散体が含まれる。さらに、組成物は、そのような無菌注射剤溶液または分散体の即席調合剤のための無菌粉末の形態であり得る。典型的には、最終的な注射剤形態は無菌でなくてはならず、シリンジ操作を簡単にするのに効果的な流動性を有していなくてはならない。医薬組成物は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、よって好ましくは細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール）、植物油及びそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒体であり得る。
【００６９】
例えば、担体が生理食塩水溶液、グルコース溶液または、生理食塩水及びグルコース溶液の混合物を含んでいる注射剤溶液を調製することができる。注射剤懸濁液も調製され得、この場合は適切な液体担体、懸濁化剤などが採用され得る。さらに、使用の少し前に液体形態の調合剤に作り替えることを意図した固体形態の調合剤も含まれる。
【００７０】
非経口投与の調合剤には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液及びエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、生理食塩水及び緩衝液媒体を含む水、アルコール／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液が挙げられる。非経口用ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンガー液デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンガー液、または固定油が挙げられる。静脈内用ビヒクルとしては、流体及び栄養補充薬、電解質補充薬（例えば、リンガー液デキストロースに基づくもの）などが挙げられる。保存剤及びその他の添加剤、例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤及び不活性ガスなどが存在していてもよい。
【００７１】
本発明の医薬組成物は、局所使用に適する形態、例えば、エアゾール、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、散布剤、洗口剤、うがい薬などであり得る。さらに、組成物は、経皮用装置に使用するのに適した形態であり得る。これらの製剤は、本発明の化合物または薬学的に許容されるその塩を利用して従来の処理方法によって調製することができる。一例として、クリーム剤または軟膏剤は、親水性材料と水とを約５ｗｔ％〜約１０ｗｔ％の化合物と一緒に混合して所望の稠度を有するクリーム剤または軟膏剤を製造することによって調製される。
【００７２】
経皮投与に適する組成物において、担体は、場合によって浸透強化剤及び／または好適な湿潤剤を、場合によって少量の任意の性質の好適な添加剤と合わせて含むが、この添加剤は、皮膚に有害作用をあまり生じさせないものである。上記添加剤は、皮膚への投与を容易にする場合があり、及び／または所望の組成物を調製するのに役立つ場合がある。これらの組成物は、様々な方法で、例えば、経皮吸収パッチとして、スポットオンとして、軟膏剤として、投与され得る。
【００７３】
本発明の医薬組成物は、担体を固体とする、直腸投与に適した形態であり得る。混合物が単回用量坐剤を形成していることが好ましい。好適な担体としては、カカオバター、及び当技術分野で一般的に使用されるその他の材料が挙げられる。坐剤は、まず組成物を、軟化または融解させた担体（複数可）と混合し、続いて型内で冷却及び成型することによって、簡便に形成され得る。
【００７４】
最適な投与のための製剤には、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、坐剤、スプレー剤、液剤及び散剤が含まれ得る。従来の医薬担体、水性、粉末または油状の基剤、増粘剤などが望ましい場合がある。
【００７５】
上記担体成分に加えて、上記の医薬製剤は、適宜、１つ以上の追加担体成分、例えば、希釈剤、緩衝剤、着香剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、潤滑剤、保存剤（酸化防止剤を含む）などを含み得る。さらに、他の佐剤を含ませて製剤を、意図したレシピエントの血液と等張にすることができる。開示されるペプチド及び／または薬学的に許容されるその塩を含有する組成物を粉末または液体濃縮物の形態に調製することもできる。
【００７６】
正確な投薬量及び投与頻度は、当業者によく知られているように、特定の開示されるＡｒｃカプシドまたはタンパク質、開示される製造方法の産物、薬学的に許容されるその塩、溶媒和物もしくは多型、その水和物、その溶媒和物、その多型、またはその立体化学的異性体形態；治療しようとする特定の症状及び治療しようとする症状の重症度；投薬を施す対象の治療歴に固有の様々な因子、例えば年齢；特定の対象の体重、性別、障害の程度及び全身の健康状態、ならびに個体が服用している可能性がある他の薬によって決まる。さらに、上記有効一日量が、治療する対象における奏効に応じて、及び／または組成物を処方する医師の評価に応じて増減される場合があることは明らかである。
【００７７】
投与様式に応じて医薬組成物は、どの百分率も組成物の総重量を基準として、０．０５〜９９重量％、好ましくは０．１〜７０重量％、より好ましくは０．１〜５０重量％の活性成分と、１〜９９．９５重量％、好ましくは３０〜９９．９重量％、より好ましくは５０〜９９．９重量％の薬学的に許容される担体とを含むことになる。
【００７８】
Ｆ．ｍＲＮＡを送達する方法
ｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、Ａｒｃカプシドを細胞に投与することを含み、Ａｒｃカプシドが関心対象のｍＲＮＡを含むものである、当該方法を開示する。「関心対象のｍＲＮＡ配列」または「関心対象のｍＲＮＡ」という用語は、導入先となる細胞に対して一部または全体が異種すなわち外来のものであるｍＲＮＡ核酸配列（例えば治療遺伝子）を意味し得る。「関心対象のｍＲＮＡ配列」または「関心対象のｍＲＮＡ」という用語はまた、導入先となる細胞の内因性遺伝子に対して一部または全体が同種であるがしかし当該細胞に導入されるように設計されている、ｍＲＮＡ核酸配列も意味し得る。「関心対象のｍＲＮＡ配列」または「関心対象のｍＲＮＡ」という用語はまた、導入先となる細胞の内因性遺伝子に対して一部または全体が相補的であるｍＲＮＡ核酸配列も意味し得る。例えば、関心対象のｍＲＮＡ配列は、マイクロＲＮＡ、ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡであり得る。「関心対象のｍＲＮＡ配列」または「関心対象のｍＲＮＡ」は、１つ以上の転写調節配列、及び選択された核酸の最適な発現のために必要となる可能性があるその他の任意の核酸、例えばイントロンも含み得る。
【００７９】
開示されるＡｒｃカプシドのいずれかが、本明細書に記載のこれらの方法に使用され得る。
【００８０】
いくつかの態様では、Ａｒｃカプシドは細胞にとって異種であり得る。いくつかの態様では、細胞にとって異種であるＡｒｃカプシドは、その送達先である細胞に由来しない任意のＡｒｃカプシドである。
【００８１】
ｍＲＮＡを細胞に送達する方法であって、開示されるベクターのいずれか１つ以上を細胞に投与すること、及び関心対象のｍＲＮＡを細胞に投与することを含み、ベクター中の核酸配列がＡｒｃタンパク質をコードし、これが後に細胞内で翻訳され、Ａｒｃカプシドが形成され、Ａｒｃカプシドが中に関心対象のｍＲＮＡを封入する、当該方法を開示する。
【００８２】
開示される送達方法のいくつかの態様では、細胞はニューロンであり得る。いくつかの態様では、細胞は哺乳動物細胞、例えば、限定されないが、ヒト細胞であり得る。いくつかの態様では、細胞は、限定されないが、神経細胞、筋肉細胞、骨細胞、腺細胞、血液細胞または生殖細胞であり得る。例えば、細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、上皮細胞、軟骨細胞または幹細胞であり得る。
【００８３】
いくつかの態様では、関心対象のｍＲＮＡは治療薬である。例えば、治療薬は、限定されないが、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡにコードされるサイトカインなどの免疫調節剤、またはｍＲＮＡにコードされる阻害剤であり得る。このように、いくつかの態様においてＡｒｃカプシドは治療薬を細胞に送達するために使用され、治療薬は細胞の任意の症状を治療することができる。例えば、細胞の症状は、対象に対して診断された疾患または障害によって引き起こされたいかなるものでもあり得、当該細胞は上記対象からのものである。いくつかの態様では、関心対象のｍＲＮＡはＡｒｃ  ｍＲＮＡではない。
【００８４】
いくつかの態様では、ベクターは関心対象のｍＲＮＡを含む。例えば、いくつかの態様では、Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列を含むベクターが、さらに、関心対象のｍＲＮＡを含み得る。いくつかの態様では、Ａｒｃタンパク質をコードすることができる核酸配列を含むベクターとは別個の第２のベクターの中に、関心対象のｍＲＮＡが投与され得る。
【００８５】
ｍＲＮＡを対象に送達する方法であって、開示される細胞のいずれか１つを、それを必要とする対象に１つ以上投与することを含む、当該方法を開示する。いくつかの態様では、細胞は異種のものであり得る。いくつかの態様では、細胞は自家性であり得る。
【００８６】
関心対象のｍＲＮＡを対象に送達する方法であって、関心対象のｍＲＮＡ配列を含む開示されるＡｒｃカプシドのいずれか１つに対象から得られた細胞を曝露することを含み、Ａｒｃカプシドに曝露された細胞がＡｒｃカプシドを取り込んで、関心対象のｍＲＮＡを含むＡｒｃカプシドを含む細胞を形成し；さらに、関心対象のｍＲＮＡを含むＡｒｃカプシドを含む細胞を、細胞の入手先となった対象に投与することを含む、当該方法を本明細書に開示する。いくつかの態様では、Ａｒｃカプシドは異種ｍＲＮＡ配列を含む。異種ｍＲＮＡ配列は、Ａｒｃカプシドと同じ細胞に由来しない任意のｍＲＮＡ配列であり得る。いくつかの態様では、異種ｍＲＮＡ配列は非Ａｒｃ  ｍＲＮＡ配列である。
【００８７】
関心対象のｍＲＮＡを対象に送達する方法であって、関心対象のｍＲＮＡ配列を含む開示されるＡｒｃカプシドのいずれか１つに対象から得られた細胞を曝露することを含み、Ａｒｃカプシドに曝露された細胞がＡｒｃカプシドを取り込んで、関心対象のｍＲＮＡを含むＡｒｃカプシドを含む細胞を形成し；さらに、関心対象のｍＲＮＡを含むＡｒｃカプシドを含む細胞を、細胞の入手先となった対象とは異なる対象に投与することを含む、当該方法を本明細書に開示する。
【００８８】
Ｇ．Ａｒｃカプシドを形成する方法
Ａｒｃカプシドを形成する方法であって、細胞を含む溶液に、開示されるベクターのいずれかを投与することを含み、核酸配列が細胞内でＡｒｃタンパク質をコードし、Ａｒｃカプシドが形成される、当該方法を開示する。
【００８９】
Ａｒｃカプシドを形成する方法であって、細胞を含む溶液に、開示されるベクターのいずれかを投与することを含み、核酸配列が細胞内でＡｒｃタンパク質をコードし、Ａｒｃカプシドが形成され、さらに、関心対象のｍＲＮＡを投与することを含み、Ａｒｃ形成中にｍＲＮＡがＡｒｃカプシド内にパッケージングされる、当該方法を開示する。
【００９０】
いくつかの態様では、Ａｒｃカプシドを形成する開示される方法は、溶液の塩濃度を１００〜３００ｍＭの範囲に増加させることをさらに含む。いくつかの態様では、塩は、限定されないが、ＮａＣｌまたはＮａＰＯ４であり得る。
【００９１】
いくつかの態様では、形成されるＡｒｃカプシドは、細胞外小胞によって細胞から放出される。いくつかの態様では、細胞は、細胞外小胞の形成に関与する細胞膜を含む組換え細胞であり、細胞外小胞はＡｒｃカプシドの標的指向化のための細胞特異性を提供する。いくつかの態様では、Ａｒｃカプシドは、Ａｒｃカプシド組立てを制御することができる外来核酸の存在下で形成され得る。
【００９２】
いくつかの態様では、Ａｒｃカプシドは、細胞内で作られたエクソソームまたは細胞外小胞によって産生または送達され得る。例えば、エクソソームまたは細胞外小胞はＡｒｃカプシドの産生及び拡散のための潜在的なベクターとして使用され得る。
【００９３】
Ｈ．Ａｒｃ結合を阻止する方法
脂質に対するＡｒｃカプシド結合を阻止する方法であって、遮断薬を投与することを含み、遮断薬が脂質に対するＡｒｃカプシドの結合を妨害する、当該方法。いくつかの態様では、遮断薬は、Ａｒｃカプシドに結合して脂質結合部位を遮断するかまたは脂質に結合してＡｒｃカプシド結合部位を遮断する、任意の分子であり得る。いくつかの態様では、遮断薬はＡｒｃタンパク質またはその断片であり得る。
【００９４】
Ｉ．キット
上記材料及びその他の材料は、開示される方法を実施するかまたはその実施を助けるのに有用なキットとして任意の好適な組み合わせで一緒に包装され得る。所与のキットにおいて、キット構成要素が、開示される方法と併せた使用のために設計され適合しているならば有用である。例えば、Ａｒｃカプシドを生成するキットであって、開示されるＡｒｃタンパク質、Ａｒｃ核酸、ベクターまたは細胞のいずれかを含む、当該キットを開示する。
【実施例】
【００９５】
脳は、相互連結されたニューロン網同士のシナプス結合によって外界からの情報を処理及び記憶するように進化してきた。脳における情報記憶の基礎的重要性にもかかわらず、関与するプロセス及びその進化的起源についての詳細な分子的及び細胞的理解はいまだに欠如している。過去数十年間にわたる研究から、真核生物ゲノムにはウイルスまたはトランスポゾンを起源とするＤＮＡが散在し、これらがほとんどの哺乳動物ゲノムの約半分を構成しているということが示された（Ｓｍｉｔ，１９９９）。これらのエレメントにコードされる配列が新たな機能及び調節エレメントの発生のための原材料を提供し得ることはますます認識されてきている（Ｃｈｕｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７、Ｌｅｖｉｎ  ａｎｄ  Ｍｏｒａｎ，２０１１）。脊椎動物においてこれらは、以前にトランスポゾン（Ｆｅｓｃｈｏｔｔｅ  ａｎｄ  Ｐｒｉｔｈａｍ，２００７、Ｎａｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）またはレトロウイルス（Ｋａｎｅｋｏ−Ｉｓｈｉｎｏ  ａｎｄ  Ｉｓｈｉｎｏ，２０１２）にコードされた配列に由来する多数のタンパク質コード遺伝子を含む。興味深いことにこれらのトランスポゾン由来遺伝子の多くは脳に発現するが、それらの分子機能はいまだ解明されていないままである。
【００９６】
ニューロン遺伝子Ａｒｃは、Ｔｙ３／ｇｙｐｓｙレトロトランスポゾンファミリーを起源とする可能性があるウイルス群特異的抗原（Ｇａｇ）ポリプロテインにみられる構造エレメントを含有するが（Ｃａｍｐｉｌｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｄａｙ  ａｎｄ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，２０１５、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、Ａｒｃ機能においてこれらのＧａｇエレメントが果たす役割は探究されていない。Ａｒｃは哺乳動物のシナプス可塑性の主たる調節因子であり、長期増強（ＬＴＰ）及び長期抑圧（ＬＴＤ）のタンパク質合成依存的形態に必要とされる（Ｂｒａｍｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｂｅａｒ，２０１１）。Ａｒｃは、エンドサイトーシス機構によるＡＭＰＡ型グルタミン酸受容体（ＡＭＰＡＲ）の輸送によってシナプス可塑性を調節することができる（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。このエンドサイトーシス経路は、ニューロン活性のシナプススケーリングによる長期的変化に応答して表面ＡＭＰＡＲのレベルを維持し、かくしてニューロン強度の恒常性に寄与する（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。脳におけるＡｒｃの発現は非常に動的であり、その転写は、生体内でのニューロン回路における情報のコード化と密接なつながりがある（Ｇｕｚｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。Ａｒｃ  ｍＲＮＡは樹状突起へ搬送され、局所シナプス活動部位で豊富になり、そこでタンパク質へと翻訳される（Ｓｔｅｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、Ｗａｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）。興味深いことに、Ａｒｃ  ｍＲＮＡ調節の態様はいくつかのウイルスＲＮＡに類似している、というのも、Ａｒｃはｃａｐ非依存的翻訳を可能にするリボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）を含有するからである（Ｂａｌｖａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００７、Ｐｉｎｋｓｔａｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。生体内でＡｒｃは、経験を視覚野可塑性の長期継続的変化に変換するため（ＭｃＣｕｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）及び長期間の記憶のために（Ｇｕｚｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０００、Ｐｌａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）必要とされる。加えて、Ａｒｃは、アルツハイマー病（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）、単一遺伝子型の知的障害、例えばアンジェルマン（Ｇｒｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０、Ｐａｓｔｕｚｙｎ  ａｎｄ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，２０１７）及び脆弱Ｘ症候群（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）ならびに統合失調症（Ｆｒｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４、Ｍａｎａｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｐｕｒｃｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）を含めた様々な神経障害に関係があるとされている。このように、神経系におけるＡｒｃ発現及び活性の精密な調節は正常な認知のために必須であるらしい。
【００９７】
Ａｒｃタンパク質の生化学及び分子機能についてはその重要性にもかかわらずほとんど知られていない。Ａｒｃの１つの役割は、細胞外小胞（ＥＶ）による細胞間伝達を媒介することである。シナプス伝達は、グリア−ニューロン相互作用を含めた多くの他の伝達経路によって補足または調節され、現れつつある証拠は、神経系においてＥＶが細胞間シグナル伝達を媒介することを示唆している（Ｂｕｄｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｚａｐｐｕｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＥＶは大まかには微小小胞とエクソソームとの２つの群に分けて定義することができるが、これらは両方ともＥＶの径及び細胞内起源によって定義される。微小小胞は形質膜から直接くびれ切れ、直径が通常１００〜３００ｎｍである一方、エクソソームは、多胞体（ＭＶＢ）から生じる腔内小胞に由来し、径が通常１００ｎｍ未満である。ＥＶは、形質膜を容易に横切らない積荷、例えば膜タンパク質及び様々な形態のＲＮＡを輸送することができる。ＥＶが神経系内でこれらの分子の細胞間輸送において機能することができるということの観察結果は、脳内の細胞間伝達についての全く新しい見通しを切り開く。
【００９８】
Ａｒｃタンパク質は、自己組織化してウイルスカプシドに類似したオリゴマーとなり、レトロウイルスＧａｇタンパク質にみられるいくつかの他の生化学的特性、例えば脂質及びＲＮＡとの結合性を呈する。その上、ＡｒｃはＥＶ内に入った状態でニューロンから放出され、それ自体のｍＲＮＡをニューロン中に移入させることができる。ショウジョウバエＡｒｃ相同体ｄＡｒｃ１も、別個のレトロトランスポゾン系統を起源としているにもかかわらずカプシドを形成してハエ神経筋接合部でそれ自体のｍＲＮＡの細胞間移入を媒介する。これらのデータは、レトロウイルス様Ｇａｇエレメントの選入が、細胞間シグナル伝達を媒介する新規な機序のための進化経路を提供し、シナプス可塑性及び動物認知の進化に複雑に関与した可能性があることを示している。
【００９９】
１．結果
ｉ．ハエ及び四足類のＡｒｃ遺伝子は独立してＴｙ３／ｇｙｐｓｙレトロトランスポゾンの別個の系統から生じた
Ａｒｃの進化的起源に注目するために系統解析を実施した（図１Ａ及び図８Ａ）。マウスＡｒｃ遺伝子の高度に保存された特有のオーソログが四足類（哺乳類、鳥類、爬虫類、両生類）の全体にわたって同定されたが、魚類系統が全く存在しないのが目立ち、他の新口動物を調べた（９４種）。シーラカンス、ゼブラフィッシュ及びコイのゲノムにおいてＡｒｃの最たる近縁種は原型Ｔｙ３／ｇｙｐｓｙレトロトランスポゾンにコードされており、最近の転移活性が示唆された。同様に、ショウジョウバエＡｒｃ（ｄａｒｃ１、ｄａｒｃ２）のオーソログ及びパラログはデータベースに表された全ての額嚢節（真性）ハエにおいて同定されたが、他の任意の双翅類（例えば蚊）または前口動物では検出されなかった（２８６種、図８Ｂ）。ハエＡｒｃ遺伝子の最たるレトロトランスポゾン近縁種はカイコ及びアルゼンチンアリのゲノムに見つかった。興味深いことに、調べた全ての四足類ではＡｒｃが単一コピー遺伝子であると見受けられるものの、当該遺伝子は双翅類進化の間に複数回の重複を経験している（図８Ｂ）。系統発生学的には四足類Ａｒｃ遺伝子が魚類からのＴｙ３／ｇｙｐｓｙレトロトランスポゾンと共にクラスタを形成するのに対し、ハエＡｒｃ相同体は昆虫とは別個のＴｙ３／ｇｙｐｓｙレトロトランスポゾンの系統と共に群をなしている（図１Ａ）。これらの結果は、以前（Ａｂｒｕｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に憶測されたように四足類及びハエのＡｒｃ遺伝子の起源が独立してＴｙ３／ｇｙｐｓｙレトロトランスポゾンの別個の系統を起源としており、それでもなおレトロウイルスＧａｇドメインにおいてかなりの相同性を共有している、ということを示している。
【０１００】
ｉｉ．Ａｒｃタンパク質は自己組織化してウイルス様カプシドとなる
Ｔｙ３レトロトランスポゾンは、レトロウイルスカプシドに類似したオリゴマー粒子を形成することができ（Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）、またＡｒｃも、オリゴマー化する特性を有する（Ｍｙｒｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。レトロウイルスカプシド形成は感染性にとって必須であり、主にＧａｇポリプロテインによって媒介されるが、これはＨＩＶでは４つの主要な機能性ドメイン：マトリックス／ＭＡ、カプシド／ＣＡ、ヌクレオカプシド／ＮＣ、及びｐ６を含有する（Ｆｒｅｅｄ，２０１５）。Ａｒｃは、ＨＩＶのＣＡ及び泡沫ウイルスＧａｇポリプロテインとの一次配列類似性（Ｃａｍｐｉｌｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）だけでなく構造類似性（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）も有し、ＡｒｃがＧａｇタンパク質との機能的類似性を共有している可能性があることを示唆している。Ａｒｃタンパク質の生化学的特性を評価するために、ラットＡｒｃを細菌においてグルタチオンＳ転移酵素（ＧＳＴ）融合タンパク質として発現させた。発現したタンパク質を親和性及びサイズ排除クロマトグラフィーによって精製し、ＧＳＴタグをタンパク質分解によって除去した（図９のＡ及びＢ）。ラットＡｒｃの精製調製物（ｐｒＡｒｃ）を、陰性染色電子顕微鏡法（ＥＭ）及び低温電子顕微鏡法（ｃｒｙｏ−ＥＭ）を用いて分析した。これらの実験から、ｐｒＡｒｃが自発的にウイルス様カプシドに類似したオリゴマー構造体を形成することが明らかとなった（図１Ｂ）。ｐｒＡｒｃカプシドは二重殻構造を呈し、平均直径が３２±０．２ｎｍである。同様に、細菌発現させ精製したショウジョウバエＡｒｃ相同体であるｄＡｒｃ１（図９Ｃ）も自己組織化してカプシド様構造体（図１Ｃ）となる。昆虫細胞発現系で発現させた精製Ａｒｃタンパク質も、組織化して同様のウイルス様カプシドとなり（データ示さず）、オリゴマー化が細菌発現の人為現象でないことが示された。未成熟レトロウイルスカプシドは未切断Ｇａｇポリプロテインによって形成され、主要な安定化相互作用はＣＡ領域のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）によってなされる（Ｍａｔｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。自己組織化に推定上のＡｒｃ  ＣＡ  ＣＴＤも必要とされるか否かを試験するために、このドメインを欠くラットＡｒｃ突然変異タンパク質（ｐｒＡｒｃ−ΔＣＴＤ、アミノ酸［ａａ］２７７〜３７４が欠如、図１Ｃ、図９のＡ及びＢ）を発現させ精製した（Ｚｈａｎｇｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＥＭ分析から、ｐｒＡｒｃ−ΔＣＴＤが二重殻カプシドを形成することができないことが明らかになったが、中間体である不規則な構造体が時として観察された（図１Ｃ）。
【０１０１】
Ａｒｃ  ＣＡドメインがカプシド組立てにとって十分であるか否かを試験するために、ａａ１９５〜３６４を含有する突然変異Ａｒｃタンパク質（ＣＡ−ｐｒＡｒｃ；図１Ｃ及び図９Ａ）を作出した。ＣＡ−ｐｒＡｒｃはカプシド様構造体を形成するのに十分ではなかった。Ａｒｃカプシドは、ＨＩＶカプシドと類似した他の特性、例えば、塩及びホスフェートレベルに対する感受性を呈し（Ｐｕｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）；ＮａＣｌ濃度を０から３００ｍＭに上昇させることで安定なｐｒＡｒｃカプシドがもたらされ、高ＮａＰＯ４はカプシド形成をさらに安定化させた（図１Ｄ）。Ａｒｃがオリゴマーを細胞内で形成するか否かを試験するために、内因性Ａｒｃを欠くＨＥＫ２９３細胞においてＡｒｃを発現させ、オリゴマー種の存在について試験するために化学架橋を実施した。Ａｒｃタンパク質は系中で架橋し、二量体及び三量体サブユニットを予想されるＳＤＳ−ＰＡＧＥ移動度を有してより高い分子量種を形成したが（図９Ｄ）、これは、類似した架橋アッセイを用いるＨＩＶ  Ｇａｇサブユニットを思い起こさせる（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｒｅｉｎ，１９９９）。対照的に、トランスフェクトされたＧＦＰは同じ条件下でより高い分子量の架橋を形成しなかった。
【０１０２】
ｉｉｉ．ＡｒｃはＲＮＡに結合し、それを中に封入する
レトロウイルス中へのウイルスゲノムＲＮＡの封入は、ＧａｇとＲＮＡと脂質膜との間の相互作用ネットワークによって媒介される複雑なプロセスである（Ｍａｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＨＩＶ  Ｇａｇは、ウイルスＲＮＡ結合及び選択を媒介するＮＣドメイン内の亜鉛フィンガーナックルモチーフを含有するものの（Ｃａｒｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、ウイルスＲＮＡの非存在下ではＧａｇは細胞ｍＲＮＡにも結合することができ、これは、基礎的なＭＡ及びＮＣドメインとの非特異的ＲＮＡ相互作用を反映している可能性がある（Ｃｏｍａｓ−Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。興味深いことに、泡沫ウイルスＧａｇは亜鉛フィンガードメインを含有せず、Ｃ末端のグリシン−アルギニンに富む部分によってＲＮＡに結合し（Ｈａｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｅｒｍａｎｎ，２０１６）、異なるウイルスファミリーからの別個のＧａｇドメインが類似した生化学的プロセスを実施するように進化したことを示唆する。泡沫ウイルスＧａｇと同様に、Ａｒｃは亜鉛フィンガードメインを含有しないようであるが、そのＮ末端におけるイオン相互作用によってＲＮＡに結合する可能性がある。ｐｒＡｒｃはＲＮＡまたは他の核酸と同時に精製されるようであった、というのも、調製物は純粋な組換えタンパク質について予想されるよりも高いＡ２６０／２８０分光光度測定比率を有していたからである（ｐｒＡｒｃ  １．０４±０．０２４；エンドフィリン３Ａ  ０．５５±０．００６、ｎ＝３、ｐ＜０．０１、図９Ｂ）。ＡｒｃはＲＮＡに結合してそれを中に封入することができると考えられた。ｐｒＡｒｃカプシドがｍＲＮＡを収容するか否かを確認するために、Ａｒｃ  ｍＲＮＡ及び非常に豊富に存在している細菌ｍＲＮＡであるａｓｎＡ（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）のレベルを、ｑＲＴ−ＰＣＲを用いて測定した。Ａｒｃ及びａｓｎＡ  ｍＲＮＡ（図２Ａ）はどちらも測定された。しかしながら、Ａｒｃ  ｍＲＮＡレベルの方がａｓｎＡよりも１０倍高かった。細菌細胞溶解物はａｓｎＡよりも１５倍高いＡｒｃ  ｍＲＮＡレベルを含有し（図２Ａ）、ｐｒＡｒｃカプシドが特定のｍＲＮＡに対する特異性をほとんど示さないが化学量論に従って豊富に存在しているＲＮＡを中に封入するということを示していた。ｍＲＮＡがカプシドの中に封入される場合、それはリボヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）処理に対して耐性でなければならない。ＲＮアーゼはＡｒｃ  ｍＲＮＡもａｓｎＡ  ｍＲＮＡも減成させなかったが外来遊離ＧＦＰ  ｍＲＮＡを有意に減成させ（図２Ｂ）、Ａｒｃ及びａｓｎＡ  ｍＲＮＡがＲＮアーゼによる減成から保護されたことが示された。
【０１０３】
ｉｖ．Ａｒｃタンパク質がＡｒｃ  ｍＲＮＡと会合するか否かを生体内で、マウス皮質溶解物からＡｒｃタンパク質を免疫沈降させること及びその後のｑＲＴ−ＰＣＲによって試験した（図２Ｃ）。Ａｒｃ  ｍＲＮＡは選択的にＡｒｃタンパク質と共に免疫沈降（ＩＰ）することが分かったが、その一方でＧＡＰＤＨはＩＰでは強化されなかった。これらの結果は、生体内でＡｒｃタンパク質とそのｍＲＮＡとがニューロン中で複合体を形成することを示している。Ａｒｃカプシド組立てにはＲＮＡが必要である
未成熟ウイルスカプシドを形成するためにはＨＩＶ  ＧａｇがＲＮＡと結合しなければならない（Ｍａｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。Ａｒｃカプシド形成がＲＮＡを必要とするか否かを試験するために、完全長Ａｒｃタンパク質を上記のとおりに精製し、その後、以前（Ｇａｎｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）にＨＩＶ  Ｇａｇに対して実施されたとおりに結合核酸を除去した（「ｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ）」、図Ｓ３Ａ）。この手順はＡ２６０／２８０比率を有意に低下させ（ｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ）  ０．６８±０．０３、ｐｒＡｒｃ  １．０４±０．０２４；ｎ＝３、ｐ＜０．０５）、ｑＲＴ−ＰＣＲではＡｒｃ  ｍＲＮＡ会合を検出することができなかった（図２Ｄ）。ＲＮＡを除去することによって、完全に形成されたカプシドが有意により少なくなり（図２Ｅ）、Ａｒｃカプシドが正常な組立てのためにＲＮＡを必要とすることが示唆された。ＲＮＡが直接Ａｒｃカプシド組立てを促進したことを示すために、ｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ）にＧＦＰ  ｍＲＮＡを外因的に加えたが（７．３％ｗ／ｗ）、その結果、完全に形成されたＡｒｃカプシドは有意により多くなった。
【０１０４】
ｖ．Ａｒｃタンパク質及びＡｒｃ  ｍＲＮＡは細胞外小胞の中に入った状態でニューロンによって放出される
レトロウイルスカプシド及びＥＶは、類似した細胞機構、例えばＭＶＢ経路を用いて細胞から放出される（Ｎｏｌｔｅ’ｔ  Ｈｏｅｎｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＡｒｃはウイルスＧａｇタンパク質の生化学的特性の多くを呈するので、Ａｒｃタンパク質が同様に細胞から放出され得るか否かを試験した。ＡｒｃトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞から培地を採集し、ＥＶ画分を精製した。この画分は１００ｎｍ未満の小胞状構造体を含有し、エクソソームに類似していた（図Ｓ３Ｂ）。Ａｒｃタンパク質はＥＶ画分中に検出され、これはＥＶマーカーＡＬＩＸに対しても陽性であったがアクチンを欠いていた（図３Ａ）。逆に、Ａｒｃ−ΔＣＴＤトランスフェクトＨＥＫ細胞はＥＶ画分において発現をほとんど呈さず（図３Ｂ）、ＥＶを介したＡｒｃ放出には適切なＡｒｃカプシド組立てが必要とされ得ることを示していた。ｑＲＴ−ＰＣＲをＨＥＫ細胞培地からのＥＶ画分に対して実施し、ＲＮアーゼ処理に対して耐性であるＡｒｃ  ｍＲＮＡを検出した（図３Ｃ）。
【０１０５】
ＩＶ１５の培養皮質マウスニューロンから採集した培地から調製したＥＶ画分中には天然Ａｒｃタンパク質も見つかった（図３Ｄ）。Ａｒｃ  ｍＲＮＡは脳溶解物中でＡｒｃタンパク質と会合するので、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ニューロンから精製されたＥＶの中にもＡｒｃ  ｍＲＮＡが存在することを示した（図３Ｅ）。ＥＶ内のＡｒｃタンパク質はトリプシン消化に対して耐性であり（図１０Ｃ）、Ａｒｃタンパク質及びＲＮＡがＥＶ内で複合体となって保護されているかまたは結合していることが示唆された。Ａｒｃタンパク質がＥＶ内に存在するか否かを直接判定するために、培養ニューロンからのＥＶ画分において内因性Ａｒｃのイムノゴールド標識を行い、ＡｒｃがＥＶの亜集団の中に存在することを発見した（図３Ｆ）。ＥＶ内に入った状態でのＡｒｃの放出が活性依存性であるか否かを試験するために、未処理またはＫＣｌ処理野生型（ＷＴ）培養皮質ニューロンから回収した培地からＥＶ画分を精製した（図１０Ｄ）。ニューロン活性を増大させるＫＣｌ処理の結果として、培地中に放出されるＡｒｃが有意により多くなった。
【０１０６】
ｖｉ．細胞外小胞においてＡｒｃはそれ自体のｍＲＮＡの細胞間移動を媒介する
ウイルス粒子がウイルスエンベロープと宿主細胞膜との複雑な相互作用によって細胞に感染することができる一方、ＥＶもＲＮＡなどの積荷を細胞間で移動させることができる（Ｖａｌａｄｉｅｔ  ａｌ．，２００７）。ＡｒｃはｍＲＮＡを、ｐｒＡｒｃの中に封入されたｍＲＮＡによって直接移動させるか、Ａｒｃ含有ＥＶの中に入った状態で移動させるかのどちらかであり得る。ＧＦＰ／ｍｙｃ−Ａｒｃまたはｎｕｃｌｅａｒ−ＧＦＰをＨＥＫ（ドナー）細胞にトランスフェクトし、１８時間後にこれらの細胞から培地を回収し、次いでこれを未トランスフェクトナイーブＨＥＫ（レシピエント／「移入される」）細胞と共に２４時間インキュベートした。高いＡｒｃ発現がナイーブＨＥＫ細胞のまばらな集団に認められた（図４Ａ）一方、ｎｕｃｌｅａｒ−ＧＦＰのみがトランスフェクトされた細胞からの培地と共にインキュベートされた細胞はｎｕｃｌｅａｒ−ＧＦＰを発現させなかった。Ａｒｃ  ｍＲＮＡの蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）はレシピエント細胞において高レベルのＡｒｃ  ｍＲＮＡを明らかにした。Ａｒｃタンパク質及びｍＲＮＡの取込みはエンドサイトーシス依存性であった、というのも、Ｄｙｎａｓｏｒｅ（クラスリン依存性エンドサイトーシスの強力な阻害薬［Ｍａｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２００６］）の適用によってＡｒｃタンパク質の移動が有意に阻止されたからである（図１１Ａ）。試験管内ではＡｒｃカプシドによるＲＮＡの封入が非特異的であるので、非常に豊富に存在しているｍＲＮＡと共にＡｒｃが移入することができるか否かを試験した。ドナーＨＥＫ細胞にｍｙｃ−Ａｒｃ及び／または膜結合ＧＦＰ（ｍＧＦＰ）をトランスフェクトし、２４時間後に培地を回収した。ドナー細胞がＡｒｃを含有していた場合、レシピエントＨＥＫ細胞はＧＦＰタンパク質及びｍＲＮＡの両方の明瞭な移入を示した（図４Ｂ）。ｍＧＦＰのみをトランスフェクトされた細胞からは、移入が認められなかった。これらのデータは、ＨＥＫ細胞から放出されたＡｒｃ  ＥＶが、非常に豊富に存在しているｍＲＮＡを細胞間で移動させることができるということを示している。
【０１０７】
ＡｒｃカプシドがＡｒｃ  ｍＲＮＡをニューロン中に移入させることができるか否かを試験するために、Ａｒｃノックアウト（ＫＯ）マウスからの培養海馬ニューロンをｐｒＡｒｃと共にインキュベートした。Ａｒｃ  ＫＯ株はＡｒｃ遺伝子座の中にノックインされたＧＦＰを含有するため（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、Ａｒｃは赤色チャンネルで撮像され、緑色チャンネルでＧＦＰ蛍光を検出することはできなかった（図１１Ｂ）。タンパク質インキュベーションの１時間以内にＫＯニューロン中へのＡｒｃタンパク質の取込みが抗体バックグラウンドレベル（抗体特異性について図１１Ｃ参照）よりも高く認められたが、これはインキュベーション４時間目あたりをピークとしていた（図５Ａ）。ＡｒｃカプシドがＡｒｃ  ｍＲＮＡをニューロンの中に移入させることができるか否かを直接判定するために、ｐｒＡｒｃと共にインキュベートしたＡｒｃ  ＫＯニューロンにおいてＡｒｃ  ｍＲＮＡレベルを測定した。ｐｒＡｒｃとのインキュベーションの４時間後にＡｒｃ  ＦＩＳＨは堅牢な高レベルの移入Ａｒｃ  ｍＲＮＡを示した（図５Ｂ）。ＡｒｃカプシドがＡｒｃ  ｍＲＮＡを保護して中に封入することができることをさらに示唆して、インキュベーション前のｐｒＡｒｃのＲＮアーゼ処理はｍＲＮＡ移入に対して何ら影響を与えなかった（図１２Ａ）。Ｄｙｎａｓｏｒｅを使用したエンドサイトーシスの阻止はｐｒＡｒｃタンパク質及びＡｒｃ  ｍＲＮＡの取込みを両方とも妨げた（図１２Ｂ）。樹状突起において（Ｒａｂ５を特徴とする）初期エンドソームでも非エンドソーム画分でも、移入したｍＲＮＡ及びタンパク質は明らかであった（図１２Ｃ）。精製ｐｒＡｒｃ−ΔＣＴＤ及びＣＡ−ｐｒＡｒｃタンパク質及びｍＲＮＡの取込み及び移入はどちらも有意に完全長タンパク質に比べてより少なく、カプシド形成がニューロン中への取込みに必要とされることが示唆された（図５のＣ及びＤ）。タンパク質取込みの欠如は、特注Ａｒｃポリクローナル抗体による検出不良を原因とするものではなかった（図１２Ｄ）。印象深いことに、完全なＡｒｃカプシドが取込み及び移入に必要とされることをさらに示唆して、ｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ）は取り込まれることができなかったがその代わりにニューロンの外側を覆った（図１３）。
【０１０８】
内因性ＡｒｃがｍＲＮＡを移入させることができるか否かを試験するために、Ａｒｃ  ＫＯ培養海馬ニューロンを、ＷＴまたはＫＯ皮質ニューロンからの培地から調製した精製ＥＶと共にインキュベートした。ＷＴ  ＥＶと共にインキュベートされたＡｒｃ  ＫＯニューロンが樹状突起Ａｒｃレベルの明らかな上昇を示した一方、ＫＯ細胞に由来するＥＶと共にインキュベートされたＫＯニューロンは樹状突起Ａｒｃレベルの上昇を呈さなかった（図６Ａ）。さらに、ＦＩＳＨはＷＴ  ＥＶ内のＡｒｃ  ｍＲＮＡがＫＯニューロン中に移入したことを示した（図６Ｂ）。Ａｒｃ  ｍＲＮＡの取込みは、取込みがＥＶ画分中の遊離または未結合Ａｒｃ  ｍＲＮＡに起因していないことを示唆して、ＲＮアーゼによるＥＶの前処理によって有意に影響を受けなかった（図１４Ａ）。Ｄｙｎａｓｏｒｅによるエンドサイトーシスの阻止は、ＥＶからのＡｒｃタンパク質及びｍＲＮＡの取込みを妨げた（図１４Ｂ）。とりわけ、移入Ａｒｃ  ｍＲＮＡ発現は初期エンドソームにおいても非エンドソーム画分においても細胞全体への局在化を呈し（図１４Ｃ）、事実上、ＷＴニューロンにおけるＡｒｃ  ｍＲＮＡ分布との区別がつかなかった。これらのデータは、ＥＶによって放出された内因性ＡｒｃがＡｒｃ  ｍＲＮＡをニューロン間で移動させることができることを示している。
【０１０９】
ｖｉｉ．移入したＡｒｃ  ｍＲＮＡは活性依存的な翻訳を受けることができる
Ａｒｃカプシドと会合したＡｒｃ  ｍＲＮＡはニューロンの細胞質中に移入し、以前に内因性Ａｒｃについて示されているように（Ｗａｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、作動薬ＤＨＰＧによる代謝型グルタミン酸受容体１型（ｍＧｌｕＲ１／５）の活性化によってＡｒｃ  ｍＲＮＡの翻訳を誘導することによる樹状突起Ａｒｃタンパク質の増加が認められるであろう。予測されるように、Ａｒｃ  ＫＯニューロンの樹状突起においてＡｒｃタンパク質レベルは、ｐｒＡｒｃと共にインキュベートされた細胞にＤＨＰＧ（５分、１００ｍＭ）を適用した後に有意に上昇した（図７Ａ）。この上昇は、ＤＨＰＧ適用前にタンパク質合成阻害薬（シクロヘキシミド、１８０ｍＭ）を添加した場合には明瞭とならなかった。ＷＴ  ＥＶと共に４時間インキュベートされその後にＤＨＰＧで処理されたＫＯニューロンは、同様にタンパク質合成に依存した樹状突起Ａｒｃレベルの上昇を呈した（図７Ｂ）。これらの実験は新たに翻訳されたＡｒｃと取り込まれたタンパク質とを明確に区別することはできなかったが、これらのデータは、ＡｒｃカプシドまたはＥＶがＡｒｃ  ｍＲＮＡをニューロン間で移動させることができること、及びこのｍＲＮＡが樹状突起の細胞質において活性依存的翻訳のために利用可能であることを示唆している。
【０１１０】
哺乳動物Ａｒｃタンパク質は、レトロウイルス及びレトロトランスポゾンによってコードされるＧａｇタンパク質の主な特質を呈する：カプシドへの自己組織化、ＲＮＡ封入、脂質結合、ＥＶの中に入った状態での放出、及び細胞間でのＲＮＡの転送。これらのデータは、Ａｒｃ  ＥＶ（本発明者らはこれを、Ａｒｃ  ＲＮＡを運ぶＡｒｃカプシド（Ａｒｃ  Ｃａｐｓｉｄｓ  Ｂｅａｒｉｎｇ  Ａｒｃ  ＲＮＡ）という意味でＡＣＢＡＲと呼ぶ）を介してＡｒｃがｍＲＮＡの細胞間輸送を媒介することを示唆しており、ニューロン間で遺伝情報を転移させ得る新規な分子的機序を明らかにしている。
【０１１１】
ｖｉｉｉ．Ａｒｃは転用されたＧａｇタンパク質として機能する
データは、ＡｒｃにおけるウイルスＧａｇ特性の注目すべき保存を示している。ＡｒｃはＧａｇ  ＣＡドメインとの構造的相同性を示す（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）ことから、自己組織化してオリゴマーカプシドとなる能力はおそらくあまり驚くことではない。しかしながら、Ａｒｃは、その配列から直感されないＧａｇの他の重要な生化学的特性を保持しているとみられる。ＨＩＶ  Ｇａｇにあるような明瞭な亜鉛フィンガーＲＮＡ結合領域が欠如しているにもかかわらずＡｒｃは中にＲＮＡを封入し、ＲＮＡ結合はカプシド形成にとって必須であるとみられる。これは、ＨＩＶ  Ｇａｇとは異なるＲＮＡ結合モチーフを進化させ（Ｈａｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ，２０１６）なおかつ構造的にＡｒｃと類似している（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）泡沫ウイルスＧａｇを思い起こさせる。ＨＩＶ  Ｇａｇ−ＲＮＡ相互作用は複雑であり、ＭＡドメインを含めたＧａｇの複数の構成部分が関与しており、宿主細胞因子によって調節される（Ｍａｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。Ｇａｇ  ＭＡ−ＲＮＡ相互作用はさらに膜におけるウイルス粒子形成にとって必須である（Ｋｕｔｌｕａｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。しかも、ウイルスＲＮＡが存在していない場合にＧａｇは中に宿主ＲＮＡを封入し、２０〜３０ｎｔよりも長い任意の一本鎖核酸はカプシド組立てを支援する可能性があり（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｒｅｉｎ，１９９９）、豊富に存在しているＲＮＡと結合する全般的な傾向が示唆される。実際、厳密にどのようにして細胞内でウイルスＲＮＡが優先的にＧａｇカプシドの中にパッケージングされるのかは、集中的研究分野であり続けている（Ｃｏｍａｓ−Ｇａｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。
【０１１２】
精製Ａｒｃタンパク質によるＲＮＡの取込み及び移入は驚くべきことである、というのも、これは「エンベロープ」または脂質二重膜の非存在下で起こるからである。精製Ａｒｃカプシド及び内因性ＥＶの両方の取込みはエンドサイトーシスによって起こる。ＥＶ及びエクソソームはエンドソーム経路によって簡単に取り込まれるが、ＲＮＡが膜融合タンパク質なしでどのようにしてエンドソーム膜を横切ることができるのかは不明なままである（Ｔｋａｃｈ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒｙ，２０１６）。データは、無エンベロープウイルスのようにＡｒｃタンパク質自体がＲＮＡをエンドソーム膜の向こう側へ移動させる能力を含んでいることを示している。無エンベロープカプシドがどのようにしてＲＮＡを細胞質中へ移入させるのかは不明なままであるが、いくつかの研究は、これが特異的な受容体−カプシド相互作用によって、または膜の孔形成か溶解的減成かのどちらかを可能にするカプシドのｐＨ依存的な配座変化によって起こる可能性があると提案している（Ｔｓａｉ，２００７）。Ａｒｃタンパク質はエンドソーム膜と相互作用して、カプシドが解体される時に細胞質中へのｍＲＮＡの移入を可能にすることができる。これは、これらの実験でみられるタンパク質取込みとｍＲＮＡ発現との時間差に反映されており、この時間差は、ｍＲＮＡが本発明者らのＦＩＳＨプローブに到達できるようになるまでに要する時間の結果であり得る。生体内でＡＣＢＡＲの周囲の脂質膜が標的指向化及び取込みを要求し得るのに対し、中に入っているＡｒｃカプシドはＲＮＡを保護しその移入を可能にする。興味深いことに、ＲＮＡを欠くｐｒＡｒｃはカプシドを形成することができず、取り込まれることができず、取込みが、適切に形成されたカプシドを必要とする調節されたプロセスであり得るということが示唆される。Ａｒｃは天然に存在するＲＮＡ移動機序を調節するとみられることから、この経路を利用することは、免疫活性化の障壁を回避することができるＡＣＢＡＲを使用する遺伝子操作または細胞内へのＲＮＡ送達の新たな手段を可能にすることができる。
【０１１３】
ｉｘ．ＡｒｃのＧａｇ相同性はニューロンの新たなシグナル伝達経路を明らかにする
エクソソーム及びＥＶシグナル伝達は、とりわけ免疫系及びがん生物学において、細胞内伝達の必須の機序として浮かび上がった（Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。しかしながら、神経系におけるＥＶによる細胞間シグナル伝達の役割は最近になってようやく調査されたものであり、研究はこれらの経路がシナプス可塑性において重要な役割を果たしている可能性があることを示唆している（Ｂｕｄｎｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６、Ｚａｐｐｕｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。標準的なエクソソームはＭＶＢ内に形成されるが、これはエンドソーム経路に由来するものであり、放出されるには大抵ＥＳＣＲＴ複合体を必要とし（Ｒａｐｏｓｏ  ａｎｄ  Ｓｔｏｏｒｖｏｇｅｌ，２０１３）、但し一般的にＥＶの生合成にはもっと様々なものがある。ＨＩＶ  Ｇａｇは、ＭＶＢとは無関係にビリオンを形成することができるが、ＥＳＣＲＴ機構はなおも粒子放出のために必要とされ、このことから、Ａｒｃは標準的なエクソソーム経路とは無関係にＡＣＢＡＲを形成する可能性がある。これらの経路は相互に排他的ではなく、ニューロン中でのＡＣＢＡＲの生合成を解明するにはさらなる調査が必要である。
【０１１４】
Ａｒｃは樹状突起において局所的に速やかに合成されるので（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｗａｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）、樹状突起に局在化したｍＲＮＡの封入が起こり得る樹状突起においてＡｒｃタンパク質の高い局所濃度がカプシド組立てを促進するということは考えられる。試験管内でＡｒｃカプシドはＲＮＡ結合において特異性を示すようではなく、Ａｒｃ  ＥＶは、非常に豊富に存在しているｍＲＮＡを移動させることができることから、本発明者らは、ＡＣＢＡＲ積荷の特異性がニューロンにおけるＡｒｃタンパク質の正確な空間的及び一時的発現によって付与されると推測する（図１４Ｄ）。脳からのＡｒｃタンパク質と会合したＡｒｃ  ｍＲＮＡの同定と一貫してＡｒｃ  ｍＲＮＡレベルは、生体内でニューロン活動または経験が起こった後に樹状突起において比類なく非常に豊富に存在する（ｄｅ  Ｓｏｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。Ｇａｇ−ＲＮＡ相互作用は、ニューロンにおけるＡｒｃ  ｍＲＮＡを含めた樹状突起ｍＲＮＡ輸送の必須の調節因子でもあるタンパク質であるＳｔａｕｆｅｎ（Ｍｏｕｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）などの宿主細胞タンパク質によって調節される（Ｈｅｒａｕｄ−Ｆａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｋｉｅｂｌｅｒ，２０１４）。樹状突起ｍＲＮＡ調節とウイルス−ＲＮＡ相互作用との並行は印象深いものであり、細胞因子がＡＣＢＡＲ生合成及びＲＮＡ充填において重要な役割を果たすことができることを示している。
【０１１５】
データはさらに、Ａｒｃが細胞間シグナル伝達を媒介して非細胞自律的にシナプス機能及び可塑性を制御することができることを示している。ニューロンＥＶについてのデータが不足しているが、以前の研究は、ＥＶが活性依存的に分泌され得、積荷としてＡＭＰＡＲを含み得るということを示した（Ｆａｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。Ａｒｃは以前に弱いシナプス（Ｏｋｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）でのシナプス及び棘の刈り込み（Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００６、Ｍｉｋｕｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）の時にＡＭＰＡＲ輸送に関係があるとされたことから、ＡＣＢＡＲの潜在的役割はシナプス物質を刈り込むことである可能性がある。Ａｒｃはまた、ＡＭＰＡＲスケーリング（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）及び種々の脳領域にわたる異種感覚間の可塑性（Ｋｒａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）などの可塑性の恒常性形態も調節するが、これらは回路レベルで非細胞自律的に調節されている可能性がある。細胞の情報固定化に必要とされる、隣接細胞の状態を変化させる細胞間積荷を運ぶＡｒｃ機能の解放。
【０１１６】
以前の研究は、ショウジョウバエ神経筋接合部可塑性が、エクソソームにおいてＷｎｔ経路によって媒介されるシナプス間シグナル伝達を必要とすることを示した（Ｋｏｒｋｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。興味深いことに、ショウジョウバエＡｒｃ相同体ｄＡｒｃ１は、ハエ神経系におけるｍＲＮＡの細胞間移動の類似した特性を呈し、ショウジョウバエＥＶ内に最も豊富に存在するタンパク質の１つであり（Ａｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８、Ｌｅｆｅｂｖｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）、これらの種の広い進化分岐にもかかわらず注目すべき生物学的収斂が示唆される。近年の研究はさらに、Ａｒｃが哺乳動物免疫系に関係があるとしており（Ｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６）、この場合、Ａｒｃは樹状細胞依存的Ｔ細胞活性化を制御し、神経系を超えてＡｒｃ依存性細胞間シグナル伝達の潜在的レパートリー及び重要性を拡張する。しかも、ＥＶは様々な神経変性障害の病理に関係があるとされている、というのも、いくつかの病原体タンパク質、例えば、プリオン、β−アミロイドペプチド、及びα−シヌクレインはＥＶと会合した状態で細胞から放出されるからである（Ｚａｐｐｕｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。ＡＤでは、ＡＤを有する患者からの脳切片における免疫組織化学的分析は、老人斑の周辺にエクソソームマーカーＡＬＩＸが豊富に存在することを示した（Ｒａｊｅｎｄｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）。これは、ＥＶが細胞外Ａβペプチドの重要な供給源を提供している可能性があることを示唆している。Ａｒｃは、ＡＣＢＡＲがＡＤ病理にも関与している可能性があることを示唆して、プレセニリンとの相互作用によってＡＰＰの活性依存的切断及びｂ−アミロイド産生を調節する（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１１７】
ｘ．シナプス可塑性及び認知の進化
Ｔｙ３／ｇｙｐｓｙレトロトランスポゾンは、真核生物ゲノムに広く分布しておりしばしば豊富に存在している古来の移動性エレメントであり、現在のレトロウイルスの祖先であると考えられる（Ｍａｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。Ｔｙ３／ｇｙｐｓｙ及びその他のレトロウイルス様エレメントに由来するコード配列は、進化の間に繰り返し細胞機能に転用された証拠がある（Ｆｅｓｃｈｏｔｔｅ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，２０１２）。例えば、レトロウイルス起源の複数のエンベロープ遺伝子は、哺乳類進化の間に選入されて細胞間融合、及び発達中の胎盤における合胞体栄養細胞層形成を促進した（Ｃｏｒｎｅｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ヒトゲノムだけで１００種より多くのＧａｇ由来遺伝子が存在し（Ｃａｍｐｉｌｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）、それらのマウスオーソログの遺伝子ＫＯは、Ａｒｃのようにいくつかが認知に不可欠であることを明らかにした（Ｉｒｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。しかしながら、これらのＧａｇ由来タンパク質の分子機能は十分に特性評価されておらず、それらが類似した細胞プロセスを提供すべく選入されたか否かについては疑問であり続けている。この研究及び付随するＡｓｈｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）による論文はいま、２つの遠縁のＧａｇ由来遺伝子が独立してハエ及び四足類祖先に選入されて神経系におけるＲＮＡのＥＶ依存性細胞間輸送の類似したプロセスに関与していることを明らかにする。
【０１１８】
２．方法
ｉ．プラスミド
完全長ラットＡｒｃ（ＮＰ＿０６２２３４．１）ｃＤＮＡのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をｐＲＫ５−ｍｙｃ−Ａｒｃからサブクローニングした。インサートをＰＣＲによって増幅し、ＢａｍＨ１及びＸｈｏ１によって消化し、ｐＧＥＸ−６ｐ１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）発現ベクターのＢａｍＨ１及びＸｈｏ１制限部位の間にライゲートした。ＧＳＴ−Ａｒｃ  ＯＲＦを同様に増幅し、ｐＦａｓｔＢａｃ１ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にＢａｍＨ１及びＸｈｏ１制限部位の間でクローニングした。ｐｒＡｒｃ−ΔＣＴＤは、ａａ２７７〜３７４をコードする配列を除いてｐＧＥＸ−６ｐ１−ＡｒｃからＡｒｃ  ＯＲＦをＰＣＲ増幅した後に平滑末端クローニングによって生成された。同様にＡｒｃ  ＯＲＦのａａ１９５〜３６４（ＣＡ−ｐｒＡｒｃ）をｐＥＴ１１ａベクターにクローニングしたが、これはＨｉｓタグを含有するものであった。ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫＩＩ−ＧＦＰは、（東京大学のＨａｒｕｈｉｋｏ  Ｂｉｔｏ博士の厚意により提供された）ｐＧＬ４．１１−ａｒｃ７０００−ｍＥＧＦＰ−ＡｒｃＵＴＲｓからのｍＥＧＦＰ（ＢＢＡ１６８８１．１）の制限消化、及びその後の（ユタ大学のＫｒｉｓｔｅｎ  Ｋｅｅｆｅ博士の厚意により提供された）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫＩＩ−ＡｒｃＵＴＲｓプラスミド中のインサートに隣接するＫｐｎＩ及びＳａｃＩ制限部位へのライゲーションによって生成された。ｐＧＥＸ−４Ｔ−１ショウジョウバエＡｒｃ１（ＮＰ＿６１０９５５．１）構築物は、ユタ大学のＭａｒｋ  Ｍｅｔｚｓｔｅｉｎ博士により提供された。ＥＧＦＰ−Ｃ３−Ａｒｃ及びｐＲＫ５−ｍｙｃ−ＡｒｃはそれぞれＫｉｍｂｅｒｌｙ  Ｈｕｂｅｒ博士（ＵＴ  Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ）及びＰａｕｌ  Ｗｏｒｌｅｙ博士（ジョンズ・ホプキンス大学）の厚意により提供された。全てのタンパク質発現構築物でＤＨ５  ａ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換し、個々のコロニーを、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成されたプライマーを使用してサンガーシーケンシング（ＧｅｎｅＷｉｚ，Ｓｏｕｔｈ  Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ，ＮＪ）配列決定サービスによってスクリーニングした。ユタ大学から入手することができるＡ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｅｄｉｔｏｒ（ＡＰＥ）フリーウェアを使用してトレースファイルを解析した。次いで、配列決定され検証された構築物でＢＬ２１−ＤＥ３細菌細胞をタンパク質発現のために形質転換した。
【０１１９】
ｉｉ．タンパク質精製
タンパク質発現のための初発細菌培養物を、アンピシリン及びクロラムフェニコールを補充したＬＢの中で一晩３７℃で成長させた。初発培養物を使用してＺＹ自動誘導培地の大型５００ｍＬ培養物に接種した。大型培養物を３７℃で１５０ｒｐｍで０．６〜０．８のＯＤ６００にまで成長させ、その後１５０ｒｐｍで１９℃に遷移させて１６〜２０時間経過させた。次いで、培養物を４℃で５０００ｘｇで１５分間ペレット化し、細胞ペレットを３０ｍＬの溶解用緩衝液（Ａｒｃ構築物及びＧＳＴについては５００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、５％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、室温（ＲＴ）でｐＨ８．０；エンドフィリン３Ａについては３００ｍＭのＫＣｌ、５０ｍＭのトリス、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１ｍＭのＤＴＴ、ＲＴでｐＨ７．４）の中に懸濁させ、液体窒素中で瞬間冷凍した。冷凍ペレットを３７℃で素早く解凍し、ＤＮアーゼ、リゾチーム、アプロチニン、ロイペプチン、ＰＭＳＦ及びペプスタチンを補充した１０ｍＬの溶解用緩衝液に対して１ｇのペレットとなる終体積にした。次いで溶解物を９０％のデューティーサイクルで８〜１０回の４５秒のパルスの超音波処理に掛け、２１，０００ｘｇで４５分間ペレット化した。ＧＳＴタグ付き構築物のために、清澄化した上清をその後０．４５ｍｍのフィルターに通し、前もって平衡化したＧＳＴセファロース４Ｂ親和性樹脂と共に自然落下式カラム内で一晩４℃でインキュベートした。その後、結合タンパク質を２カラムボリューム（各々２０の樹脂床体積）の溶解用緩衝液で２回洗浄し、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、ＲＴでｐＨ７．２によって再平衡化し、ＧＳＴタグ付き構築物に対してＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、またはｄＡｒｃ１に対してトロンビン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して樹脂上で一晩４℃で切断を行った。その後、切断されたタンパク質の緩衝液を１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、ＲＴでｐＨ７．４に替えてプロテアーゼ活性をなくし、Ｓ２００サイズ排除カラムに流して切断されたタンパク質を分離し、ピーク画分をプールした。セファロース４Ｂ樹脂を使用してＧＳＴを上記のとおりに親和性精製し、１５ｍＭの還元型Ｌ−グルタチオン、１０ｍＭのトリス、ＲＴでｐＨ７．４を使用して直接溶離させた。Ｎｉ＋樹脂（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用してＨｉｓタグ付きＣＡ−ｐｒＡｒｃを上記のとおりに親和性精製し、２５０ｍＭのイミダゾール、１０ｍＭのトリス、ＲＴでｐＨ７．４を使用して直接溶離させた。その後、ＧＳＴ及びＣＡ−ｐｒＡｒｃの緩衝液を１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、ＲＴでｐＨ７．４に替えた。ｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ−）調製物のために核酸からＡｒｃタンパク質を除去すべく２０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、５％のグリセロール、２ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、ＲＴでｐＨ８．０の中に細胞ペレットを上記のように溶解させた。細胞上清から、１０％のＰＥＩ、ｐＨ８．０を滴加して０．１％の終濃度にすること及びそれに続く４℃で２０分間のインキュベーション、及び２７，０００ｘｇで２０分間ペレット化することによって核酸を析出させた。その後、得られた上清に飽和硫酸アンモニウムを３０％の終濃度になるまで添加することによって沈殿させた。沈殿したタンパク質を１０，０００ｘｇで１０分間ペレット化し、６０ｍＬの溶解用緩衝液の中に再懸濁させ、そして親和性精製した。切断された親和性精製生成物をその後Ｑ−カラム用緩衝液Ａ（Ｑ−Ａ；２０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、ＲＴでｐＨ７．４）で一晩透析した。透析したタンパク質をその後、Ｑ−Ａ緩衝液からＱ−Ｂ緩衝液（１ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４）までの勾配でアニオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に供した。精製タンパク質の平均収率は細胞培養物１リットルあたり１０．５ｍｇ（８〜１３ｍｇ）であった。電子顕微鏡法
【０１２０】
ｉｉｉ．陰性染色
全ての陰性染色検体のためにＦｏｒｍｖａｒ及びカーボンで被覆された銅製２００メッシュ格子（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｒ  ＴｅｄＰｅｌｌａ，Ｒｅｄｄｉｎｇ，ＣＡ）を真空チャンバ内で３０ｍＡで２０〜４５秒間グロー放電させた。その後、３．５ｍＬの試料を格子に塗布して３５〜４５秒間経過させ、そして濾紙を使用して余剰の試料を吸い取らせた。次いで、格子をすぐさま２〜４回、３０ｍＬの水滴で５秒間洗浄し、その後、パラフィルム上で１％の酢酸ウラン（ＵＡ）で１回洗浄した。余剰の水／ＵＡを吸い取らせ、次いで最終のＵＡの液滴を塗布して３０秒間経過させた。余剰のＵＡを吸い取らせ、格子を３０〜６０秒間掛けて風乾した。Ｇａｔａｎ  Ｏｒｉｕｓ  ＳＣ２００Ｂ  ＣＣＤカメラを装備し１２０ｋＶで作動させたＦＥＩ  Ｔ１２、ＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｓｐｉｒｉｔ顕微鏡か、ＪＥＯＬ  １４００電子顕微鏡かのどちらかを使用して撮像を実施した。
【０１２１】
ａ．低温ＥＭ
精製Ａｒｃタンパク質を３００ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、ｐＨ７．４で透析し、Ａｍｉｃｏｎ  １００  ＭＷＣＯ遠心分離フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を使用して２回濃縮して２ｍｇ／ｍＬの終タンパク質濃度にした。直径１０ｎｍの金ビーズを試料に添加した。脱気した２／２−３Ｃ  Ｃ−平板格子（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）を３０ｍＡで４５秒間グロー放電させた。試料を格子に２回塗布して３０秒間経過させ、ＦＥＩ  Ｖｉｔｒｏｂｏｔ  Ｍａｒｋ  ＩＶを使用して格子を液体エタン中に投入し凍結させた。ＦＥＩ  Ｆａｌｃｏｎ  ＩＩ直接検出器を装備し２００ｋＶで作動させたＦＥＩ  Ｔｅｃｎａｉ  Ｇ２  Ｆ２０顕微鏡を使用して顕微鏡写真を取得した。公称焦点ぼけは１．３ｍｍであった。
【０１２２】
ｂ．ＥＭ定量
格子を目視で調べて試料塗布が均一になされているかを確認した。各実験において、無作為的に選択した正方形格子から６つの画像を撮った。その後、完全及び部分的に形成された２０〜４０ｎｍの粒子を手作業でＩｍａｇｅＪを使用して計数した。計数を画像視野（２．０７ｍｍ２）で割ってデータをオリゴマー計数／ｍｍ２として表した。
【０１２３】
ｃ．Ａｒｃカプシド組立てアッセイ
ＧＦＰ  ｍＲＮＡをｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ−）（低塩緩衝液：２０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、ＲＴでｐＨ７．４の中に、５ｍｇ／ｍＬ）に７．３％（ｗ／ｗ）の核酸：タンパク質比率で添加した（１０ヌクレオチドに対して１分子のＡｒｃに対応する）。次いで反応系を低塩緩衝液またはカプシド組立て用緩衝液（５００ｍＭのＮａＰＯ４、５０ｍＭのトリス、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、ＲＴでｐＨ７．５）の滴加によって１ｍｇ／ｍＬのｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ−）に希釈し、ＲＴで２時間インキュベートした。インキュベート後に０．２５ｍｇ／ｍＬの各反応系で陰性染色ＥＭ格子を作製し、カプシド形成を手作業による６つの画像の計数によって定量した。完全に形成されたカプシドは明瞭な二重殻を有する２０〜５０ｎｍの球形粒子を含んでいた。同様の結果が３つの独立したタンパク質調製物にみられた。
【０１２４】
ｄ．動的光散乱
精製Ａｒｃタンパク質をＭａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳＰ装置による動的光散乱測定に供した。散乱は２５℃で１７３の固定角度（後方散乱）で行った。散乱強度は、球形粒子からの散乱強度が粒径の６乗に比例するという仮定の下で粒子数として表される。系統学的再構築
【０１２５】
ｅ．動物
ヒトまたはキイロショウジョウバエＡｒｃタンパク質配列を使用してｔＢＬＡＳＴｎを使用してＮＣＢＩゲノム配列データベースを照会した。ＣＥＮＳＯＲプログラムを使用してＲｅｐｂａｓｅも照会して、哺乳動物またはハエ亜目Ａｒｃ遺伝子との高い配列類似性を有する既知の反復ファミリーをそれぞれ同定した。以下の配列ＩＤを解析に使用した：（ＧｅｎＢａｎｋ遺伝子座）Ｍｍ  ＡＲＣ−−ＡＨＢＢ０１０８９５６９；Ｈｓ  ＡＲＣ−−ＬＩＱＫ０２０１６５４９；Ａｃ  ＡＲＣ−−ＡＡＷＺ０２０２０３５４；Ｌｃ  ｇｙｐｓｙ２−−ＡＦＹＨ０１０３０２０３；ＣＣ  ｇｙｐｓｙ−−ＬＨＱＰ０１０４６００８；Ｄｍ  ＡＲＣ１−−ＪＳＡＥ０１０００５７２；Ｄｓ  ＡＲＣ１−−ＣＡＫＧ０１０２０４７１；Ｓｃ  ＡＲＣ１−−ＬＤＮＷ０１０１９６７１；Ｄｍ  ＡＲＣ２−−ＪＸＯＺ０１００３７５２；Ｄｓ  ＡＲＣ２−−ＡＷＵＴ０１００１０００；Ｓｃ  ＡＲＣ２−−ＬＤＮＷ０１０１９６７０；Ｂｍ  ｇｙｐｓｙ−−ＢＡＢＨ０１０４６９８７；Ｔｃ  ｇｙｐｓｙ−−ＡＡＪＪ０２００３８１０。Ｒｅｐｂａｓｅ：Ｌｃ  ｇｙｐｓｙ−−Ｇｙｐｓｙ２−１−Ｉ＿Ｌｃｈ；Ｄｒ  ｇｙｐｓｙ２６−−Ｇｙｐｓｙ−２６−Ｉ＿ＤＲ；Ｌｈ  ｇｙｐｓｙ１１−−Ｇｙｐｓｙ−１１＿ＬＨ−Ｉ；Ｄｍ  ｇｙｐｓｙ１−−Ｇｙｐｓｙ１−Ｉ＿ＤＭ；ｔｙ３−−ＴＹ３。Ａｒｃタンパク質及び他の関連Ｔｙ３／ｇｙｐｓｙエレメントとの高い類似性を有することが分かったタンパク質（Ａｒｃ及びＧａｇ）配列のアラインメントを、ＭＵＳＣＬＥプログラムを使用して行った。後のデフォルトパラメータを使用する最尤度系統学的再構築のために、切り取ったＡｒｃ／ＧａｇアラインメントをＭＥＧＡ７にアップロードし、５００のブートストラップ反復を実施して系統樹を生成した。キイロショウジョウバエｄＡｒｃ１及びｄＡｒｃ２タンパク質配列を使用してＢＬＡＳＴｐを使用して額嚢節ハエタンパク質データベースを照会した。調べた種の１対１のオーソログにｄａｒｃ１が存在する場合、予想以上に多くのヒットが認められた。ＭＵＳＣＬＥを使用してタンパク質ＦＡＳＴＡ配列のアラインメントを行い、ＭＥＧＡを使用して最尤度系統図を生成した。動物
【０１２６】
Ａｒｃ  ＯＲＦ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）の中にＧＦＰがノックインされているＡｒｃノックアウト（ＫＯ）マウス（ＮＩＨのＫｕａｎ  Ｗａｎｇ博士からの寄贈）、及び野生型（ＷＴ）Ｃ５７ＢＬ／６同腹仔を海馬及び皮質溶解物実験に使用した。海馬及び皮質初代ニューロン培養物をＷＴまたはＫＯ  Ｅ１８胚から調製した。
【０１２７】
ｉｖ．細胞培養
初代ニューロン培養物を、以前（Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００６）に記載されているとおりにＥ１８マウスの皮質及び海馬から調製した。組織をＤＮアーゼ（０．０１％；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）及びパパイン（０．０６７％；Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）で引き離し、その後、火炎研磨したガラスピペットで粉砕して単細胞懸濁液を得た。１０００ｘｇで４分間、細胞をペレット化し、上清を除去し、細胞を再懸濁させ、ＴＣ−２０細胞計数装置（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で計数した。１２ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ，Ｍｏｎｒｏｅ，ＮＣ）内に９０，０００細胞／ｍＬ、または１０ｃｍプラスチック皿内に８００，０００細胞／ｍＬのニューロンを、ポリ−Ｌ−リジン（０．２ｍｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で被覆されたカバースリップ（Ｃａｒｏｌｉｎａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｕｐｐｌｙ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）の上に播種した。ニューロンをまず、５％のＣＯ２を含有する３７℃のインキュベータ内で、５％のウマ血清、２％のＧｌｕｔａＭＡＸ、２％のＢ−２７、及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種した。ＤＩＶ４に、１％のウマ血清、ＧｌｕｔａＭＡＸ、及びペニシリン／ストレプトマイシン、２％のＢ−２７、及び５μＭのシトシン□−Ｄ−アラビノフラノシド（ＡｒａＣ）を含有するアストロサイト調整Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を半量培地交換によってニューロンに供給した。その後３日ごとにアストロサイト調整培地をニューロンに供給した。
【０１２８】
１０％のウシ胎仔血清及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＨＥＫ２９３細胞を維持し、７０％の集密度で３〜４日ごとに継代した。トランスフェクション及び移入実験のためにＨＥＫ細胞を１０ｃｍ皿、または１２ウェルプレート内のコラーゲン被覆カバースリップに播種した。
【０１２９】
ｖ．トランスフェクション
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で希釈した１ｍｇのＤＮＡに対して３ｍｇのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の比率で、ＰＥＩを使用してＨＥＫ細胞にトランスフェクトした。およそ６０〜７０％の集密度の時に細胞にトランスフェクトした。ＥＶ単離及び培地移入実験のために、トランスフェクションから４〜６時間後に培養培地を替えてＰＥＩ及びＤＮＡを除去し、２４時間後に培地を採集した。ＨＥＫ細胞移入実験
【０１３０】
ｖｉ．トランスフェクション及び移入
トランスフェクトされたＨＥＫ細胞からの培地を、トランスフェクションから２４時間後に採集し、５００ｘｇで４分間遠心分離に掛けて死細胞及び残屑を除去した。トランスフェクトされていないナイーブ細胞からの培地を除去し、清澄化したトランスフェクト済み培地に替え、さらに２４時間インキュベートした。インキュベート後、細胞を固定し、ＡｒｃまたはＧＦＰタンパク質及びＲＮＡについての組み合わせた免疫細胞化学／蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＣＣ／ＦＩＳＨ）を以下に記載するとおりに実施した。
【０１３１】
ａ．エンドサイトーシスの阻止
エンドサイトーシスを阻止するために、１２ウェルプレート内でカバースリップ上に播種されＧＦＰ−ＡｒｃトランスフェクトＨＥＫ細胞からの培地を与えているナイーブＨＥＫ細胞の群を同時に８０ｍＭ  Ｄｙｎａｓｏｒｅ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で最初の６時間にわたって処理し、その後、培地を除去して新しいＨＥＫ培地に替えた。１８時間後、Ｄｙｎａｓｏｒｅ処理済み及び未処理のＨＥＫ細胞を固定した。１８ｍｍカバースリップ全体を２０ｘの対物レンズで観察し、ＧＦＰ−Ａｒｃ移入細胞の集合体の数を手作業で計数した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００共焦点顕微鏡（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で２０Ｘの対物レンズを使用して代表的画像を得た。
【０１３２】
ｖｉｉ．ニューロン移入実験
ａ．撮像
ＤＩＶ１５の培養ニューロンを全てのニューロン実験に使用した。精製Ａｒｃタンパク質インキュベーション実験の場合、ニューロンを標準ニューロン栄養培地中で４ｍｇの精製ｐｒＡｒｃ、ｐｒＡｒｃ−ΔＣＴＤ、ＣＡ−ｐｒＡｒｃ、またはｐｒＡｒｃ（ＲＮＡ−）タンパク質で処理し、１時間または４時間インキュベートした。細胞外小胞（ＥＶ）インキュベーション実験の場合、８００，０００細胞／ｍＬとなるようにＥ１８  ＷＴ皮質ニューロンが播種されたＤＩＶ１５の培養皮質ニューロン（「細胞培養」方法を参照）の８つの１０ｃｍ皿から得た精製ＥＶ画分からの１０ｍｇのタンパク質でニューロンを処理し、１時間または４時間インキュベートした。精製タンパク質及びＥＶ処理実験ではニューロンのサブセットを１００ｍＭのｍＧｌｕＲ１型作動薬ジヒドロキシフェニルグリシン（（Ｓ）−３，５−ＤＨＰＧ；Ｔｏｃｒｉｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｒｉｓｔｏｌ，ＵＫ）で５分間処理し、その後、これを洗い流し、先に調整しておいたニューロン培地に替え、そのままニューロンを２５分間置き、その後、固定した。ＤＨＰＧ処理中のタンパク質翻訳を阻止するために、ＤＨＰＧの前にニューロンのサブセットを１８０ｍＭのシクロヘキシミド（ＣＨＸ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３０分間前処理した。ＣＨＸは培地中に合計１時間入れたままにした。エンドサイトーシスを阻止するためにニューロンを３０分間、８０ｍＭのＤｙｎａｓｏｒｅ（Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）で前処理し、その後、精製タンパク質を添加した。ＲＮアーゼ処理のために、ｐｒＡｒｃかＷＴ  ＥＶかのどちらかの試料をＲＮアーゼＡ（１：１０００；Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−ｔｅｋ，Ｎｏｒｃｒｏｓｓ，ＧＡ）と共に１５分間インキュベートし、その後、ニューロンに添加する直前にＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ  ＲＮアーゼ阻害薬（１Ｕ／ｍＬ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にインキュベートした。処理した試料をその後ニューロンに添加し、４時間インキュベートした。
【０１３３】
処理後、ニューロンを２回、３７℃の４％スクロース／１Ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；１０Ｘ：１．４ＭのＮａＣｌ、２６．８ｍＭＫＣｌ、６２ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、３５．３ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４）で洗浄し、その後、１Ｘ  ＰＢＳ中の４％スクロース／４％ホルムアルデヒド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で１５分間固定した。ニューロンを１ＸのＰＢＳで３３５分洗浄し、１Ｘ  ＰＢＳ中０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ａｍｒｅｓｃｏ，Ｓｏｌｏｎ，ＯＨ）で１０分間透過化し、１Ｘ  ＰＢＳ中５％の標準ロバ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）の中で遮断した。その後、ひとまとめにして希釈した一次抗体の中でニューロンをＲＴで１時間インキュベートし、１Ｘ  ＰＢＳ中で３３５分洗浄し、ひとまとめにして希釈した二次抗体の中でＲＴで１時間インキュベートした。カバースリップ上のニューロンをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に含ませてスライドガラス上に固定し、ＲＴで一晩乾燥させた。使用した一次抗体は、ウサギ抗Ａｒｃ（１：１０００；特注品；ＰｒｏｔｅｉｎＴｅｃｈ，Ｒｏｓｅｍｏｎｔ，ＩＬ）；ウサギ抗Ａｒｃ（１：１０００；Ｓｙｎａｐｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）；ニワトリ抗ＭＡＰ２（１：５０００；ａｂ５３９２；Ａｂｃａｍ）；マウス抗Ｒａｂ５（１：１０００；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）；ＤＡＰＩ核染色剤（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であった。使用した二次抗体は、適切な動物宿主のためのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４０５、４８８、５５５または６４７（１：７５０；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、またはＪａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）であった。
【０１３４】
Ａｒｃ及びＧＦＰの蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）手順は、以前に公開されたプロトコール（Ｄａｂｅｒｋｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）に基づくものであった。本発明者らは、公開されたプロトコールにあるとおりに完全長ラットＡｒｃリボヌクレオチドプローブ（ラット及びマウスＡｒｃはａａレベルで９９％同一である）またはＥＧＦＰ（「プラスミド」の中で上に記したクローニング方策を参照）を使用したが、但し、脳切片の代わりに培養ニューロン及びＨＥＫ細胞に使用するためにプロトコールを改変した。Ａｒｃ及びＧＦＰプラスミドをＮｏｔ１と共に線状化し、標準的なフェノール／クロロホルム抽出によって精製した。線状化したアンチセンスＡｒｃまたはＧＦＰを使用し、Ｔ７  ＤＩＧ  ＲＮＡ標識キット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してＤＩＧ−ＵＴＰが組み込まれたリボヌクレオチドプローブを作り、次いでＧ−５０スピンカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製した。細胞を３７℃で４％スクロース／１Ｘ  ＰＢＳで１回洗浄し、その後、１Ｘ  ＰＢＳ中の４％スクロース／４％ホルムアルデヒドで１５分間固定した。細胞を１ＸのＰＢＳで３３５分洗浄し、０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００の中で１０分間透過化し、１ＸのＰＢＳで２３５分、その後２Ｘの生理食塩水−クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ；２０Ｘ：３ＭのＮａＣｌ、３００ｍＭのクエン酸三ナトリウム塩二水和物、ｐＨ７）で５分洗浄した。細胞を１Ｘのプレハイブリダイゼーション液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で３０分間プレハイブリダイズした。ＤＩＧ標識ＡｒｃまたはＧＦＰリボヌクレオチドプローブをｄｄＨ２Ｏで１：３に希釈し、９０℃で５分間変性させ、濡れた氷の上に２分間置き、その後、ＲＮＡハイブリダイゼーション用緩衝液（２３．７５ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１．１９ｍＭのＥＤＴＡ、３５７ｍＭのＮａＣｌ、１１．９％のデキストラン硫酸、１．１９Ｘのデンハルト液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２．５％のヌクレアーゼ不含水、６０％のホルムアミド（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ，ＮＨ））と混合した。Ａｒｃプローブ（１：５００）またはＧＦＰプローブ（１：７５０）を５６℃で１６時間、培養細胞とハイブリダイズした。次の日、バックグラウンド信号を減らすために細胞に対して一連の洗浄を行った：２ＸのＳＳＣで３３５分、ＲＮアーゼＡ（１：１０００；Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ−ｔｅｋ）で３７℃で１５分、２ＸのＳＳＣでＲＴで１０分、０．２ＸのＳＳＣでＲＴで１０分、０．２ＸのＳＳＣで５６℃で１５分、０．２ＸのＳＳＣでＲＴで１０分、ＴＮＴ（０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．５）で５分。その後、細胞をＴＮＢ（０．１Ｍのトリス−ＨＣｌ、０．１５ＭのＮａＣｌ、０．５％ｗ／ｖの遮断薬（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ｐＨ７．５）中で２．５％のヒツジ血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）及び２．５％のロバ血清によって３０分間遮断した。一次抗体ステップでは、ＤＩＧ−ＨＲＰ（１：１０００；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と、ＭＡＰ２抗体（１：２５００；Ａｂｃａｍ）か��ｒｃ抗体（１：５００；特注品）かＲａｂ５抗体（１：５００；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）かのいずれかとを一緒に、２．５％のヒツジ血清及び２．５％のロバ血清を含有するＴＮＢで希釈し、細胞上で１時間インキュベートした。ＴＮＴ中で３３５分洗浄した後、３０分にわたってＴＳＡ  Ｐｌｕｓ  Ｃｙａｎｉｎｅ３キット（１：５０；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してＤＩＧ−ＨＲＰ信号を生じさせた。細胞をＴＮＴで５分間、及び１ＸのＰＢＳで５分間洗浄し、その後、二次抗体を５％ロバ血清及び１Ｘ  ＰＢＳで１：７５０に希釈し、細胞上で１時間インキュベートしてＭＡＰ２、ＡｒｃまたはＲａｂ５を検出した。核をＤＡＰＩ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色し、その後、カバースリップをＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔでスライドガラス上に固定し、ＲＴで一晩乾燥させた。
【０１３５】
ｂ．撮像
Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１０００共焦点顕微鏡（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で６０Ｘの油浸対物レンズを使用してカバースリップを撮像し、ＩｍａｇｅＪソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を使用して画像を分析した。分析に含めるニューロンは、細胞が健康であるかをＭＡＰ２樹状突起形態を調べることによって不偏となるように選択した。各々の独立した実験においてカバースリップは最高輝度の免疫蛍光を見つけるために自動観察され、この値を後にその実験の画像取得環境を設定するために使用した。そうして、その実験において全てのカバースリップからの画像が、全く同じ環境を用いて取得された。
【０１３６】
ｃ．樹状突起Ａｒｃタンパク質及びｍＲＮＡ発現の分析
分析中、個々の実験において画像は（バックグラウンド蛍光を除去するために、及び画像が直線範囲で分析されることを確保するために）最高輝度の免疫蛍光のところでブラインドで閾値処理され、その実験の中で同じ閾値を他の全ての画像に適用した。２つの３０ｍｍ樹状突起部分／ニューロンの積分密度（平均画素強度×面積）を各カバースリップから測定した。総じて、本発明者らによる分析では、樹状突起量の潜在的な差を制御するために、密集して近傍にある樹状突起枝を避けた。各実験において、対照群をＩＣＣであろうとＦＩＳＨであろうと「１」に設定し、他の群の積分密度値をこれに対して正規化し、グラフ中に変化倍率±ＳＥＭとして表示する。図中の代表的画像では、群間でのＡｒｃ発現の差を強調するためにＩｍａｇｅＪのＳｍａｒｔ参照テーブル（ＬＵＴ）を適用した。Ａｒｃ／Ｒａｂ５共局在化の分析では２つの３０ｍｍ樹状突起部分／ニューロンをＡｒｃタンパク質またはｍＲＮＡとＲａｂ５タンパク質との共局在化の分析のために選択した。Ａｒｃチャンネル及びＲａｂ５チャンネルを全ての画像にわたって同じ値に閾値処理した。ＩｍａｇｅＪを使用して、Ｒａｂ５及びＡｒｃの両方について閾値処理された樹状突起の区画でマスクを作った。ＡｒｃマスクをＲａｂ５マスクに適用し、重複点の数を定量した。Ｒａｂ５と重複しているＡｒｃ粒子の数を樹状突起の広がりの中のＡｒｃ粒子の総数で割ってＡｒｃ／Ｒａｂ５共局在化を判定した。
【０１３７】
ｄ．ウェスタンブロットによるイムノブロット及び分析
ウェスタンブロット試料を４ＸのＬａｅｍｌｌｉ緩衝液（４０％のグリセロール、２５０ｍＭのトリス、４％のＳＤＳ、５０ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ６．８）と混合し、７０℃で５分間加熱した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動を用いてタンパク質試料を分離した。分離した試料をニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に転写した。転写後、膜を０．１％のポンソー染色剤でしばらく染色し、その後、総タンパク質の撮像のために１％の酢酸で脱染して総バックグラウンドを除去した。膜をＲＴで３０分間、５％ミルク＋１Ｘ  トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ；１０Ｘ：１５２．３ｍＭのトリス−ＨＣｌ、４６．２ｍＭのトリス塩基、１．５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．６）で遮断し、その後、１Ｘ  ＴＢＳ中の一次抗体の中で、ＲＴで１時間か４℃で一晩かのどちらかのインキュベートを行った。膜を１ＸのＴＢＳで３×１０分洗浄し、その後、ＨＲＰ複合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）中でひとまとめにしてＲＴで１時間インキュベートした。１Ｘ  ＴＢＳによる３×１０分の後、化学発光キット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用してタンパク質バンドを検出し、膜をＡｚｕｒｅ  ｃ３００  ｇｅｌ  ｄｏｃｋ（Ａｚｕｒｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｕｂｌｉｎ，ＣＡ）で撮像した。ＩｍａｇｅＪのＧｅｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｌｕｇｉｎを使用してブロットを分析及び定量した。
【０１３８】
ｅ．抗体
抗体を以下の濃度で使用した：Ａｒｃ（１：０００；マウスモノクローナル、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、Ａｒｃ（１：０００；ウサギポリクローナル、特注品、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈ）、ＡＬＩＸ（１：５００；ウサギポリクローナル、特注品、Ｗｅｓｌｅｙ  Ｓｕｎｄｑｕｉｓｔ博士により提供）、アクチン（１：１０００；ＨＲＰ複合化物、Ａｂｃａｍ）、ＧＦＰ（１：１０００；ニワトリポリクローナル、Ａｖｅｓ）。二次抗体は全て１：１０，０００の希釈度で使用した（ＨＲＰ複合ヤギ抗ウサギ、ヤギ抗マウス、ヤギ抗ニワトリ、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）。クーマシーゲル
【０１３９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析のための試料を４ＸのＬａｅｍｌｌｉ緩衝液と混合し、７０℃で５分間加熱した。タンパク質試料を１０％ＳＤＳゲルで分離した。その後、ゲルを０．１％のクーマシーブルー染色剤（０．１％ｗ／ｖのクーマシーブルー、５０％のメタノール、１０％の酢酸、４０％の水）で３０分間染色し、脱染液（５０％のメタノール、１０％の酢酸、４０％の水）で一晩脱染した。Ａｚｕｒｅ  ｃ３００  ｇｅｌ  ｄｏｃｋを可視チャンネルで自動露光設定の下で使用してゲルを可視化した。ＩｍａｇｅＪのＧｅｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｌｕｇｉｎを使用してゲル露出を分析及び定量した。
【０１４０】
ｖｉｉｉ．免疫沈降
ＷＴ及びＡｒｃ  ＫＯ皮質を切り出し、添加したてのプロテアーゼ阻害薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、０．０５％のＳＤＳ、ｐＨ７．４（ＩＰ溶解用緩衝液）の中で均質化した。ホモジネートを２００ｘｇで５分間、４℃でペレット化して組織残屑を除去した。上清を除去し、２〜４ｍＬに希釈し、４℃で１０分間振盪し、その後、１７，０００ｘｇで１０分間、４℃でペレット化して不溶物質を除去した。清澄化した上清を取り出し、少量のアリコートを投入物として採取し、残りは免疫沈降のために使用した。上清の免疫沈降を、４℃で２時間緩やかに振盪しながら１ｍｇ／５００ｍＬ溶解物のＡｒｃ抗体（ウサギポリクローナル、特注品、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈ）または標準ウサギＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）を使用して行った。抗体インキュベーションの後、１０％体積の洗浄済み５０／５０プロテインＡビーズスラリー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を抗体／溶解物混合物に添加し、振盪しながら４℃でさらに１時間インキュベートした。その後、ビーズ−抗体複合体を低速で手短にペレット化し、上清を除去し、ビーズをＩＰ用緩衝液で３回洗浄した。その後、洗浄済みビーズを２００ｍＬのＩＰ用緩衝液の中に再懸濁させた。ビーズスラリーの半量を使用してＲＴで５分掛けて１７ｍＬの４ＸのＬａｅｍｌｌｉ緩衝液でタンパク質をビーズから溶離させ、次いで５０ｍＬのＩＰ用緩衝液を添加し、溶液をビーズから除去して新しいチューブに入れ、７０℃で５分間加熱した。投入物（１０％の溶解物体積）ならびに各々３０ｍＬのＩｇＧ及び抗体溶離液をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって１０％アクリルアミドゲル上で分離し、上記のとおりにイムノブロットを行った。投入物ならびにＩｇＧ及びＡｒｃ溶離液のバンドを、ＩｍａｇｅＪのＧｅｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｌｕｇｉｎを使用して分析し、データを各個のマウスからの投入物信号に対する各溶離液からの信号の比率としてグラフで表した。ビーズスラリーのもう一方の半量を使用してＩＰ用緩衝液を１％ＳＤＳに調節し、０．８ｍｇのプロテイナーゼＫ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ）を添加した。その後、試料を振盪しながらＲＴで３０分間インキュベートし、総ＲＮＡを以下に記載するとおりに抽出した。
【０１４１】
ｉｘ．系中でのＡｒｃタンパク質の化学架橋
ｍｙｃ−Ａｒｃ−ＷＴまたはＧＦＰ対照が発現しているトランスフェクトＨＥＫ細胞を手短にトリプシン処理し、ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で失活させ、ペレット化した。培地を除去し、ペレット化した細胞をその後に０．４％のホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液で１０分間、ＲＴで振盪しながら架橋させた。細胞懸濁液をすぐさまトリスで失活させて５０ｍＭの濃度にし、再ペレット化した。上清を除去し、その後、細胞ペレットを１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのトリス、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．４（溶解用緩衝液）で２０分間４℃で振盪しながら溶解させた。溶解物を２１，０００ｘｇで１０分間４℃で遠心分離することによって清澄化させ、清澄化した上清をその後、４〜８％の勾配を付けたゲルに流し、Ａｒｃ（マウスモノクローナル、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）及びＧＦＰ（ニワトリポリクローナル、Ａｖｅｓ）に対する抗体を使用してウェスタンブロットによって分析した。
【０１４２】
ｘ．ＲＮＡ抽出
全ての試料について、ＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して総ＲＮＡを抽出した。ＴＲＩｚｏｌで抽出した試料をクロロホルムと５：１で混合し、ＲＴで３分間インキュベートし、４℃で１０分間１２，０００ｘｇでペレット化した。得られた水相を採取し、イソプロパノールと１：１で混合し、ＲＴでインキュベートし、４℃で１０分間１２，０００ｘｇでペレット化した。得られた上清を除去し、ペレットを７５％の冷エタノールで洗浄した。洗浄済みペレットをその後、４℃で５分間７５００ｘｇで再ペレット化した。上清を除去し、乾燥ペレットをｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁させた。
【０１４３】
ｘｉ．ＲＴ−ＰＣＲ
総ＲＮＡ濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でＡ２６０／２８０によって測定した。１００〜２００ｎｇのＲＮＡを鋳型としてＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して逆転写反応を行った。得られたｃＤＮＡを、６０℃のアニーリング温度でラットＡｒｃ、ＧＡＰＤＨプライマーセットを使用して３５サイクル増幅した。得られたＰＣＲ産物を、ＳＹＢＲ  Ｓａｆｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で染色した１．５％アガロースゲルで分析した。ラットＡｒｃプライマー：順方向、ＡＣＣＡＴＡＴＧＡＣＣＡＣＣＧＧＣＧＧＣ；逆方向、ＴＣＣＡＧＣＡＴＣＴＣＡＧＣＴＣＧＧＣＡＣ。ＧＡＰＤＨプライマー：順方向、ＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣＣＧＴＧＴＴＣＣＴＡ；逆方向、ＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＴＴ。ＲＴ−ＰＣＲゲルを、ＩｍａｇｅＪ  ｇｅｌ  ａｎａｌｙｚｅｒツールを使用して定量した。
【０１４４】
ｘｉｉ．ｑＲＴ−ＰＣＲ
Ａｒｃタンパク質と会合しているＲＮＡの量を決定するために、１：Ａｒｃ及びＩｇＧタンパク質を使用して免疫沈降させた全マウス皮質、２：ＨＥＫ細胞から調製したＥＶ画分（以下の「細胞外小胞精製」参照）、ならびに３：ラットＡｒｃプラスミド（ｐＧＥＸ−ＧＳＴ−ＡｒｃＦＬ）をトランスフェクトされた細菌（ＢＬ２１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）からの溶解物及び精製タンパク質から調製したｍＲＮＡに対して、定量的ＲＴ−ＰＣＲを実施した。外因的に加えた（線状化ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫＩＩ−ＧＦＰからのＴ７ＲＮＡポリメラーゼを使用して生成する）ＧＦＰアンチセンスＲＮＡと比較して、Ａｒｃタンパク質と会合しているｍＲＮＡが分解から保護されるか否かを判定するために、いくつかの試料をＲＮアーゼ（２５ｍｇ、ＲＮアーゼＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で処理した。調製物１：マウスを、暗い筐体に２４時間、及び豊かな環境に２時間置いた後に、屠殺した。全皮質を切り離し、上記のとおりにＩＰ溶解用緩衝液中で均質化させた。免疫沈降後、ＲＬＴ溶解用緩衝液を含有するグアニジンチオシアネートの中でビーズスラリーをインキュベートし、ＱＩＡＧＥＮ  ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｃｒｏキット（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用してＲＮＡのカラム精製を実施した。全溶離液を、５０ＵのＭｕｌｔｉｓｃｒｉｂｅ逆転写酵素及びｒａｎｄｏｍ  ｏｌｉｇｏプライマー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と共にＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キットを使用する逆転写のために使用した。調製物２及び３：ＴＲＩｚｏｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を上記（「ＲＮＡ抽出」）のとおりに使用して全ＲＮＡを抽出した。Ｈｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キットを使用して逆転写反応（２５℃で１０分間、３７℃で２時間、８５℃で５分間）を行った。ラットＡｒｃ、ＧＡＰＤＨ及びａｓｎＡに対するプライマー（上記「ＲＴ−ＰＣＲ」参照；ａｓｎＡプライマー：順方向、ＧＣＧＴＧＧＡＴＧＣＣＧＡＣＡＣＧＴＴＧ；逆方向、ＡＴＡＣＣＧＣＣＧＣＣＧＡＴＧＧＴＣＴＧ）を使用して９６ウェルプレート内でＰｏｗｅｒＵｐ  ＳＹＢＲｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するｑＰＣＲのために、得られたｃＤＮＡを調製した。ｑＰＣＲをＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ３リアルタイムＰＣＲシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で以下のプロトコールを用いて実施した：事前のインキュベーション：５０℃で２分間、９５℃で２分間。増幅：９５℃で１５秒間、６０℃で１５秒間、及び７２℃で１分間を、４０サイクル。融解曲線：９５℃で１秒間、６０℃で２０秒間、０．１５℃／秒で９５℃までの連続昇温。３０より高いＣｔ値を検出不可とみなした。標準ＤＮＡ試料を段階的に希釈（１０倍）し、関心対象の遺伝子を分析し、線形方程式を算出する、という検量線法を用いて発現の差を決定した。結果として得られた線形方程式を使用して試験試料のＣｔ値が検量線のどこに対応するかを決定し、結果を変換（ｌｏｇ１０）して標準試料の希釈度を反���させた。任意の所与の群の対照値の平均からの変化倍率（試験／平均対照）を測定して差を算出した。
【０１４５】
ｘｉｉｉ．細胞外小胞の精製
以前（Ｌａｃｈｅｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）に記載されているとおりに細胞外小胞（ＥＶ）をＨＥＫ細胞及び初代ニューロン培養物から精製した。培地を２，０００及び２０，０００ｘｇで連続して回転させて死細胞及び残屑を除去し、その後、１００，０００ｘｇで回転させてＥＶをペレット化した。最初の高速回転の後に得られた粗ＥＶペレットを冷ＰＢＳ中に再懸濁させ、ＳＷ４１ローターの中で１００，０００ｘｇで１時間４℃で再ペレット化した。洗浄したＥＶペレットを、４℃で１０〜２０％のスクロース−ＰＢＳ勾配で１００，０００ｘｇの遠心分離に一晩掛けることによってさらに精製した。得られたペレットを冷ＰＢＳで洗浄して余剰のスクロースを除去し、その後、４℃で１時間１００，０００ｘｇで再ペレット化した。最終的な洗浄済みペレットをＰＢＳに再懸濁させて下流のＥＭによる分析、ウェスタンブロッティング及びニューロン処理のために使用した。トリプシン消化及びＲＮアーゼアッセイではｐｒＡｒｃ及びＥＶにトリプシンを０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように添加してＲＴで３０分経過させ、続いて１ｍＭのＰＭＳＦを添加して１０分経過させてトリプシンを不活化させた。その後、未処理及びトリプシン処理済みの試料をウェスタンブロットで分析した。ＷＴニューロン溶解物及びＥＶにＲＮアーゼＡを５０ｍｇ／ｍＬとなるように添加して３７℃で１５分経過させた。ＲＴ−ＰＣＲのための未処理及びＲＮアーゼ処理済みの試料をその後ＴＲＩｚｏｌで直接抽出した。トリプシン消化及びＲＮアーゼアッセイ
【０１４６】
ｐｒＡｒｃ及びＥＶにトリプシンを０．０５ｍｇ／ｍＬとなるように添加してＲＴで３０分経過させ、続いて１ｍＭのＰＭＳＦを添加して１０分経過させてトリプシンを不活化させた。その後、未処理及びトリプシン処理済みの試料をウェスタンブロットで分析した。ＷＴニューロン溶解物及びＥＶにＲＮアーゼＡを５０ｕｇ／ｍｌとなるように添加して３７℃で１５分経過させた。ＲＴ−ＰＣＲのための未処理及びＲＮアーゼ処理済みの試料をその後ＴＲＩｚｏｌで直接抽出した。
【０１４７】
ｘｉｖ．イムノゴールド標識
以前（Ｋｏｒｋｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）に記載されているとおりに改変を加えてイムノゴールド標識を実施した。試料を２％のホルムアルデヒド中で４℃で緩やかに振盪しながら一晩固定した。その後、試料をグロー放電済みのＦｏｒｍｖａｒ銅メッシュ格子（Ｔｅｄ  Ｐｅｌｌａ）に塗布し、室温で１０分掛けて付着させた。その後、試料を０．１Ｍのトリス、ｐＨ７．４による３回の洗浄によって失活させた。その後、試料をＲＴで１０分間透過化し、遮断し、そしてＡｒｃの染色を行った（１：５００；特注品）。５ｎｍ金複合二次抗体を銀強化なしで染色に使用した。抗体標識後、上記のとおりに格子に対して陰性染色を行った。
【０１４８】
ｘｖ．統計
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）またはＪＭＰ  Ｐｒｏ統計ソフトウェア（ＳＡＳ；Ｃａｒｙ，ＮＣ）を使用して、反復測定を伴うかまたは伴わない（事後Ｓｉｄａｋ検定を伴う）二元配置ＡＮＯＶＡ、または独立両側ｔ検定を実施した。有意性をｐ＜０．０５に定めた。示されている全てのデータは少なくとも２つの実験反復を代表するものである。統計の詳細（Ｎ、実験反復回数、データの表示のされ方についての説明）は図の凡例または結果の節の中に見つけることができる。当業者であれば、本明細書に記載の方法及び組成物の特定の実施形態との多くの均等物を認識することになるか、または慣例的な実験しか用いずにそれを確認することができる。そのような均等物は以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図１Ａ】
2020523983.tif 000002
【図１Ｂ】
2020523983.tif 000003
【図１Ｃ】
2020523983.tif 000004
【図１Ｄ】
2020523983.tif 000005
【図２Ａ−Ｂ】
2020523983.tif 000006
【図２Ｃ−Ｄ】
2020523983.tif 000007
【図２Ｅ】
2020523983.tif 000008
【図３Ａ−Ｃ】
2020523983.tif 000009
【図３Ｄ−Ｆ】
2020523983.tif 000010
【図４Ａ】
2020523983.tif 000011
【図４Ｂ】
2020523983.tif 000012
【図５Ａ−Ｂ】
2020523983.tif 000013
【図５Ｃ−Ｄ】
2020523983.tif 000014
【図６Ａ】
2020523983.tif 000015
【図６Ｂ】
2020523983.tif 000016
【図７Ａ】
2020523983.tif 000017
【図７Ｂ】
2020523983.tif 000018
【図８Ａ−１】
2020523983.tif 000019
【図８Ａ−２】
2020523983.tif 000020
【図８Ａ−３】
2020523983.tif 000021
【図８Ｂ−１】
2020523983.tif 000022
【図８Ｂ−２】
2020523983.tif 000023
【図９Ａ−Ｄ】
2020523983.tif 000024
【図１０Ａ】
2020523983.tif 000025
【図１０Ｂ−Ｄ】
2020523983.tif 000026
【図１１Ａ−Ｃ】
2020523983.tif 000027
【図１２Ａ−Ｂ】
2020523983.tif 000028
【図１２Ｃ−Ｄ】
2020523983.tif 000029
【図１３】
2020523983.tif 000030
【図１４Ａ−Ｂ】
2020523983.tif 000031
【図１４Ｃ】
2020523983.tif 000032
【図１４Ｄ】
2020523983.tif 000033
【図１５Ａ】
2020523983.tif 000034
【図１５Ｂ】
2020523983.tif 000035
【配列表】
2020523983000001.app
【国際調査報告】
2020523983.tif 000036
2020523983.tif 000037
2020523983.tif 000038