(57)【要約】  誘導ラマン散乱顕微鏡法による抗生物質感受性の判定方法を開示する。方法は、サンプルの代謝をイメージングするために、細菌を有するサンプルからレーザー信号を収集するように構成されたイメージング装置を利用する。サンプルをイメージング用に抗生物質で処理して、その与えられた抗生物質に対する細菌の感受性を判定できる。
2020533573.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細菌の抗生物質感受性の判定方法であって、
細菌固定化ゲルを調製することと、
栄養源を有する培地で前記細菌を培養することと、
予め選択した抗生物質を前記培地に添加して、サンプルを形成することと、
前記抗生物質および細菌を、予め選択した期間、前記培地内で培養することと、
前記サンプルを遠心分離することと、
前記サンプルを洗浄することと、
前記サンプルを前記細胞固定化ゲル上に堆積させることと、
コヒーレントラマン顕微鏡法により、前記細菌固定化ゲル上の前記サンプルの画像を収集することと
を含む方法。
【請求項２】
前記サンプルの画像が、ハイパースペクトルコヒーレントラマン顕微鏡法により収集される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルの画像が、単一周波数コヒーレントラマン顕微鏡法により収集される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記固定化ゲルが、アガロースゲルを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
前記栄養源が、０．１〜１０％のグルコース−ｄ７のみから構成される炭素源を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記栄養源が、０〜１００％の二酸化重水素を有する培地から構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記炭素源が、グルコース−ｄ７および二酸化重水素の両方の組み合わせで構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ラマンイメージングが、誘導ラマン散乱イメージング、コヒーレント反ストークスラマン散乱イメージング、またはコヒーレントラマン誘導カー効果イメージングであり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
抗生物質感受性試験用の画像を収集するためのハイパースペクトル誘導ラマン散乱イメージング装置であって、
８０ＭＨｚの繰り返し率を有する二重出力フェムト秒パルスレーザーであって、
ポンプビームと、
ストークスビームと、
音響光学変調器によって変調される前記ストークスビームの経路と、
前記ポンプビームおよび前記ストークスビーム間の遅延を調整する並進ステージを有する前記ポンプビームの経路と、
コンバイナーであって、前記ポンプビームと前記ストークスビームとを結合するように構成されたコンバイナーと、
レーザー走査顕微鏡であって、サンプル上に前記ポンプビームおよび前記ストークスビームを集束させるよう構成された対物レンズを有するレーザー走査顕微鏡と、オイルコンデンサーであって、前記サンプルから前記レーザーを収集するよう構成されたオイルコンデンサーとを含む二重出力フェムト秒パルス層と、
フィルターであって、前記コンデンサーの後に配置され、前記ストークスビームを除去するように構成されたフィルターと、
フォトダイオードであって、前記フィルターの後に配置され、前記ポンプビームを検出するフォトダイオードと、
ロックインアンプであって、前記ポンプビーム信号損失を抽出するように構成されたロックインアンプと
を含むイメージング装置。
【請求項１０】
チャープ装置をさらに含み、前記チャープ装置が、前記ストークビームおよび前記ポンプビーム間で異なるパルス持続時間を形成するように構成される、請求項９に記載のイメージング装置。
【請求項１１】
前記チャープ装置が、長さ１５ｃｍの、２つのＳＦ５７ガラスロッドである、請求項１０に記載のイメージング装置。
【請求項１２】
一対のフィルターが使用される、請求項９に記載のイメージング装置。
【請求項１３】
前記レーザー走査顕微鏡対物レンズが、６０倍水対物レンズである、請求項９に記載のイメージング装置。
【請求項１４】
前記ポンプビームの前記パルス持続時間が、１．５〜２ｐｓの間であり、前記ストークスビームの前記パルス持続時間が、１．０〜１．４ｐｓの間である、請求項９に記載のイメージング装置。
【請求項１５】
前記チャープ装置が、前記ポンプビームに対して１．９ｐｓ、前記ストークスビームに対して１．３ｐｓのパルス持続時間を形成するように構成される、請求項９に記載のイメージング装置。
【請求項１６】
前記ポンプビームが、１２０ｆｓ波長可変レーザーであり、ポンプビーム経路を有し、前記ストークスビームが、１０４０ｎｍを中心波長とする２２０ｆｓレーザーであり、ストークスビーム経路を有する、請求項９に記載のイメージング装置。
【請求項１７】
顕微鏡法を使用した、細菌の抗生物質感受性の迅速な判定方法であって、
栄養源を有する培地で前記細菌を培養することと、
予め選択した濃度を有する、予め選択した抗生物質を前記培地に添加して、サンプルを形成すること、
前記サンプルを予め選択した期間、前記培地内で培養することと、
前記サンプルを遠心分離することと、
前記サンプルを洗浄することと、
前記サンプルを前記細菌固定化ゲル上に堆積させることと、
コヒーレントラマン顕微鏡法を使用して、前記細菌固定化ゲル上の前記サンプルをイメージングすることと
を含む方法。
【請求項１８】
前記コヒーレントラマン顕微鏡法が、誘導ラマン散乱システムを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記誘導ラマン散乱システムが、ポンプビームおよびストークスビームを使用し、両方のビームが１つ以上のガラスロッドでチャープされ、それにより前記ポンプビームおよびストークスビームの両方について１〜２ｐｓのパルス持続時間を創出する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記顕微鏡法システムが、前記ポンプビームおよび前記ストークスビーム間の遅延を調整する並進ステージをさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月８日に提出され、その開示が本出願の開示の一部とみなされ、全体が参照により本明細書に組み込まれる、「ＭＥＴＨＯＤ  ＦＯＲ  ＴＨＥ  ＤＥＴＥＲＭＩＮＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＡＮＴＩＢＩＯＴＩＣ  ＳＵＳＣＥＰＴＩＢＩＬＩＴＹ  ＴＨＲＯＵＧＨ  ＳＴＩＭＵＬＡＴＥＤ  ＲＡＭＡＮ  ＭＥＴＡＢＯＬＩＣ  ＩＭＡＧＩＮＧ」と題する、米国仮出願第６２／５５６，０１３の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、一般に、抗生物質感受性試験（ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔｉｎｇ）（ＡＳＴ）のための、ハイパースペクトル誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡法による生菌の代謝活性の検出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
様々な細菌感染症と戦う抗生物質の誤用および過剰使用が蔓延したため、耐性菌の数が増加している。したがって、特定の感染症を処置するには、抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）によって、所定の細菌の抗生物質反応をプロファイルすることが重要である。ＡＳＴの従来の方法は、一般に寒天プレートおよびブロス希釈アッセイを利用して培養物を増殖させ、細菌の種類により、通常は完了に少なくとも１６時間〜２４時間を要する。より迅速な試験のためにより新しい技術が開発されているが、これらの技術は特定の細菌にしか適用できないため、または時間のかかるサンプル濃縮を要するため、依然として限界がある。
【０００４】
ラマン分光法は、分子振動を測定する無標識技術であり、迅速な細菌ＡＳＴに使用されている。指紋領域のラマンピークまたは重水Ｄ２Ｏの代謝取り込みは、抗生物質処理に対する細菌の反応を特徴付けるバイオマーカーとして使用されている。ラマン分光法は、しかしながら、断面積が小さいため信号が非常に弱く、したがって、大きなサンプルまたは細胞毎に長い積分時間が必要である。ラマン信号は、金属コロイドまたは粗い金属表面を使用した表面増強ラマン分光法（ＳＥＲＳ）によって強化できる。ＳＥＲＳは、抗生物質処理によるラマンピークの変化に基づいた高速ＡＳＴに使用されているが、ＳＥＲＳは基質を必要とし、信号の変動が大きすぎるので実用的ではできない。
【０００５】
コヒーレントラマン散乱顕微鏡法、例えばコヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ）および誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡法は、自発ラマンよりも大幅に信号を改善する。ＳＲＳ顕微鏡法は、ＣＡＲＳとは異なり、非共鳴バックグラウンドに悩まされず、細胞、組織、およびモデル生物の代謝イメージングに使用されている。しかしながら、ＳＲＳは、完全にバックグラウンドがないわけではない。各ピクセルでスペクトルを記録するハイパースペクトルＳＲＳは、ＳＲＳ信号を、非線形吸収および相互位相変調によって引き起こされるバックグラウンドから区別するために開発された。
【０００６】
単一細菌の代謝活性のイメージングは、依然として非常に困難である。細菌のサイズ（直径約１μｍ）は、哺乳類細胞のサイズ（約１０μｍ）よりもはるかに小さく、ＣＡＲＳまたはＳＲＳ顕微鏡法の空間分解能に近い。さらに、Ｃ−Ｄラマン信号は、Ｃ−Ｈ信号よりもはるかに弱い。したがって、ＡＳＴの改善された方法が必要である。好ましくは、この方法は、サンプル濃縮のための時間延長なしで実施され、単一細胞レベルで様々な細菌に適用可能である。
【発明の概要】
【０００７】
一態様では、本開示は、すべての細菌に適用可能な、高速抗生物質感受性試験（ＡＳＴ）法に関する。
【０００８】
別の態様では、本開示は、ハイパースペクトル誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）イメージングを用いて、単一細胞レベルで細菌中のグルコース−ｄ７の代謝活性を監視する方法に関する。
【０００９】
別の態様では、本開示は、ハイパースペクトルＳＲＳイメージングを用いて、単一細胞レベルで生菌中のグルコース−ｄ７の代謝活性を監視することによる、一般にすべての細菌に適用可能な高速ＡＳＴ法に関する。この方法では、Ｄ２Ｏなど、他の栄養源も同様に使用できる。バンコマイシン感受性（ＶＳＥ）および耐性（ＶＲＥ）腸球菌をモデルとして使用して、ＳＲＳイメージングにより単一細胞レベルで細菌を検出でき、その代謝活性を定量的に監視できることを示せる。抗生物質処理に対する代謝反応を監視して、細菌の感受性および最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を３０分以内に判定できる。同様に、イメージング法は、細菌を阻害または死滅させる機構に関係なく、他の抗生物質にも適用できる。グルコースが、細菌増殖のための共通の炭素源であり、よって、我々の方法が一般に多くの細菌種に適用可能である、との予想は、理にかなっている。
【００１０】
別の態様では、本開示は、サンプル調製戦略、改善された細菌培養培地の方法、およびより整合性のある画像処理のために、信号対雑音比を最大化するように構成したイメージング設定に関する。
【００１１】
別の態様では、本開示は、高速ＡＳＴ試験用のラマンイメージングシステムであって、二重出力フェムト秒パルスレーザーを含む、ラマンイメージングシステムに関する。二重出力フェムト秒パルス層には、ポンプビーム（ｐｕｍｐ  ｂｅａｍ）およびストークスビームを含めることができる。ストークビーム経路は、音響光学変調器によって変調される。ポンプビーム経路は、ポンプビームとストークスビームとの間の遅延を調整する並進ステージを有する。ポンプビームとストークスビームとを結合するように、コンバイナー（ｃｏｍｂｉｎｅｒ）を構成する。ストークスビームとポンプビームとの間に異なるパルス持続時間を形成するように、チャープ装置（ｃｈｉｒｐｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）を構成する。レーザー走査顕微鏡には、サンプルにポンプビームおよびストークスビームの焦点を合わせるように構成された対物レンズを含めることができる。さらに、システムは、サンプルからレーザーを収集するように構成されたオイルコンデンサーを含むことができる。システムは、コンデンサーの後に配置され、ストークスビームを除去するように構成された１つ以上のフィルターを使用できる。フォトダイオードは、フィルターの後に配置でき、そこでポンプビームを検出する。ポンプビームの信号損失を抽出するように、ロックインアンプ（ｌｏｃｋ  ｉｎ  ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）を構成できる。
【００１２】
本開示の特徴および利点、ならびにそれらを達成する方法は、添付の図面と併せて開示されるシステムおよびプロセスの以下の説明を参照することにより、より明らかになり、よりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１Ａ】本開示による、例示的なハイパースペクトルＳＲＳイメージング設定の図である。
【００１４】
【図１Ｂ】本開示による、チャープ後のポンプとストークスとの間の遅延の図である。
【００１５】
【図２Ａ】本開示による、ＡＳＴ手順のプロセスを示す。
【００１６】
【図２Ｂ】本開示による、２０μｇ／ｍｌのバンコマイシン処理をした場合およびしない場合の、バンコマイシン感受性および耐性Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）のＣ−Ｄ振動領域（２１７８ｃｍ−１）でのＳＲＳ画像データを示す。
【００１７】
【図２Ｃ】本開示による、感受性細菌のＳＲＳスペクトルデータを示す。
【００１８】
【図２Ｄ】本開示による、耐性細菌のＳＲＳスペクトルデータを示す。
【００１９】
図３Ａ〜図３Ｄは、本開示による、細菌のＣ−Ｄ成分をゲルバックグラウンドから分離するためのハイパースペクトルＳＲＳイメージングデータの、多変量曲線分解（ＭＣＲ）分析データを示す。
【図３Ａ】アガロースゲル上に堆積した細菌のＣ−Ｄ振動領域におけるＳＲＳ画像である。
【図３Ｂ】グルコース−ｄ７およびゲル成分のＭＣＲ出力スペクトルである。
【図３Ｃ】ＭＣＲ後のゲル成分である。
【図３Ｄ】ＭＣＲ後のグルコース−ｄ７成分である。
【００２０】
【図４Ａ】ＳＲＳイメージングの相互位相変調雑音の結果を示す。
【図４Ｂ】ＳＲＳイメージングの相互位相変調雑音の結果を示す。
【００２１】
【図５Ａ】ＳＲＳ代謝イメージング法を使用したＭＩＣ判定の結果を示す。
【図５Ｂ】ＳＲＳ代謝イメージング法を使用したＭＩＣ判定の結果を示す。
【００２２】
【図６Ａ】２０μｇ／ｍｌバンコマイシンの存在下および非存在下で、グルコース−ｄ７含有培地で培養された細菌における、Ｃ−Ｄ成分変化の低速度撮影の結果を示す。
【図６Ｂ】２０μｇ／ｍｌバンコマイシンの存在下および非存在下で、グルコース−ｄ７含有培地で培養された細菌における、Ｃ−Ｄ成分変化の低速度撮影の結果を示す。
【図６Ｃ】２０μｇ／ｍｌバンコマイシンの存在下および非存在下で、グルコース−ｄ７含有培地で培養された細菌における、Ｃ−Ｄ成分変化の低速度撮影の結果を示す。
【図６Ｄ】２０μｇ／ｍｌバンコマイシンの存在下および非存在下で、グルコース−ｄ７含有培地で培養された細菌における、Ｃ−Ｄ成分変化の低速度撮影の結果を示す。
【００２３】
【図７Ａ】２１５０ｃｍ−１でのハイパースペクトルＳＲＳイメージングの結果を示す。
【００２４】
【図７Ｂ】Ｃ−Ｄ領域での、１Ｍグルコース−ｄ７溶液の対応するスペクトルのグラフ図である。
【００２５】
【図８】通常培地および２％グルコース−ｄ７含有培地で培養された、ＶＳＥ細菌の自発ラマンスペクトルの結果を示す。
【００２６】
【図９Ａ】Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）に対する、グルコース−ｄ７の細菌増殖測定のグラフ図である。
【図９Ｂ】Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）に対する、グルコース−ｄ７の細菌増殖測定のグラフ図である。
【００２７】
【図１０Ａ】様々な抗生物質に対する、Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）３１９７０の抗生物質感受性試験のＳＲＳ代謝イメージング結果を示す。
【図１０Ｂ】様々な抗生物質に対する、Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）３１９７０の抗生物質感受性試験のＳＲＳ代謝イメージング結果を示す。
【図１０Ｃ】様々な抗生物質に対する、Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）３１９７０の抗生物質感受性試験のＳＲＳ代謝イメージング結果を示す。
【図１０Ｄ】様々な抗生物質に対する、Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）３１９７０の抗生物質感受性試験のＳＲＳ代謝イメージング結果を示す。
【図１０Ｅ】様々な抗生物質に対する、Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）３１９７０の抗生物質感受性試験のＳＲＳ代謝イメージング結果を示す。
【図１０Ｆ】様々な抗生物質に対する、Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）３１９７０の抗生物質感受性試験のＳＲＳ代謝イメージング結果を示す。
【００２８】
【図１１Ａ】オキサシリン感受性および耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の、０．５時間での分化の結果を示す。
【図１１Ｂ】オキサシリン感受性および耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の、０．５時間での分化の結果を示す。
【図１１Ｃ】オキサシリン感受性および耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の、０．５時間での分化の結果を示す。
【図１１Ｄ】オキサシリン感受性および耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の、０．５時間での分化の結果を示す。
【００２９】
【図１２】グルコース−ｄ７含有培地で１時間培養した細菌の、ＳＲＳイメージングの結果および対応するスペクトルデータを示す。
【００３０】
【図１３Ａ】グルコース−ｄ７含有培地で３時間培養された細菌の、ＳＲＳイメージングの結果を示す。
【図１３Ｂ】グルコース−ｄ７含有培地で３時間培養された細菌の、対応するスペクトルデータを示す。
【図１３Ｃ】グルコース−ｄ７含有培地で３時間培養された細菌の、対応するスペクトルデータを示す。
【００３１】
【図１４】本開示による、ＡＳＴ手順の方法を示す。
【００３２】
【図１５Ａ】通常培地および７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で２時間培養された、大量の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の自発ラマンスペクトルの結果を示す。
【００３３】
【図１５Ｂ】通常培地および７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で２時間培養された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の、２１６２ｃｍ−１でのＣ−Ｄ  ＳＲＳイメージングの結果および対応する透過イメージングを示す。
【００３４】
【図１５Ｃ】図１５Ｂの単一細菌の対応するＳＲＳスペクトルの結果を示す。
【００３５】
【図１６Ａ】７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で３０分間培養された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の、２本のガラスＳＦ５７ロッドでチャープした後のピコ秒ＳＲＳによる、２１６２ｃｍ−１でのＳＲＳイメージングの結果を示す。
【００３６】
【図１６Ｂ】図１６Ａの細菌の強度プロットの破線である。
【００３７】
【図１６Ｃ】７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で３０分間培養された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の、チャープなしのピコ秒ＳＲＳによる、２１６２ｃｍ−１でのＳＲＳイメージングの結果を示す。
【００３８】
【図１６Ｄ】図１６Ｃの細菌の強度プロットの破線である。
【００３９】
【図１７Ａ】７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で０〜３時間まで培養した緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＣ−Ｄ  ＳＲＳイメージングの結果を示す。
【００４０】
【図１７Ｂ】図１７Ａの拡大画像を示す。
【００４１】
【図１７Ｃ】図１７Ａの各々の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の平均ＳＲＳ強度の動態を示し、エラーバーは標準偏差を示した（Ｎ＞１０）。
【００４２】
【図１７Ｄ】図１７Ｂの１０分の結果からの、細菌の強度プロットの破線である。
【００４３】
【図１７Ｅ】図１７Ｂの３０分の結果からの、細菌の強度プロットの破線である。
【００４４】
【図１８Ａ】７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で０〜３時間まで培養した緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＣ−Ｄ  ＳＲＳイメージングを使用した、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）におけるＤ２Ｏ生合成の低速度撮影の結果を示す。
【００４５】
【図１８Ｂ】図１８Ｂの四角形内の各々の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の拡大画像である。
【００４６】
【図１８Ｃ】図１８Ａの各々の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の平均ＳＲＳ強度の動態のグラフ図であり、エラーバーは標準偏差を示す。（Ｎ＞１０）。
【００４７】
【図１８Ｄ】図１８Ｂの１０分の結果からの、細菌の強度プロットの破線である。
【００４８】
【図１８Ｅ】図１８Ｂの３０分の結果からの、細菌の強度プロットの破線である。
【００４９】
【図１９Ａ】７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で、２０μｇ／ｍｌのゲンタマイシンを添加して培養された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の、２１６２ｃｍ−１でのＣ−Ｄ  ＳＲＳイメージングおよび透過イメージングの結果を示す。
【００５０】
【図１９Ｂ】７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で、２０μｇ／ｍｌのセフォタキシムを添加して培養された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の、２１６２ｃｍ−１でのＣ−Ｄ  ＳＲＳイメージングおよび透過イメージングの結果を示す。
【００５１】
【図１９Ｃ】７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で培養した緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の、抗生物質処理しない場合（対照（Ｃｔｒｌ））、およびゲンタマイシン（Ｇｅｎ）またはセフォタキシム（Ｃｅｆ）で様々な時間処理した場合の平均Ｃ−Ｄ  ＳＲＳ強度のプロットである。
【図１９Ｄ】７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で培養した緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の、抗生物質処理しない場合（対照）、およびゲンタマイシンまたはセフォタキシムで様々な時間処理した場合の平均Ｃ−Ｄ  ＳＲＳ強度のプロットである。
【図１９Ｅ】７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で培養した緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の、抗生物質処理しない場合（対照）、およびゲンタマイシンまたはセフォタキシムで様々な時間処理した場合の平均Ｃ−Ｄ  ＳＲＳ強度のプロットである。
【図１９Ｆ】７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で培養した緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の、抗生物質処理しない場合（対照）、およびゲンタマイシンまたはセフォタキシムで様々な時間処理した場合の平均Ｃ−Ｄ  ＳＲＳ強度のプロットである。
【図１９Ｇ】７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で培養した緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の、抗生物質処理しない場合（対照）、およびゲンタマイシンまたはセフォタキシムで様々な時間処理した場合の平均Ｃ−Ｄ  ＳＲＳ強度のプロットである。
【図１９Ｈ】７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で培養した緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の、抗生物質処理しない場合（対照）、およびゲンタマイシンまたはセフォタキシムで様々な時間処理した場合の平均Ｃ−Ｄ  ＳＲＳ強度のプロットである。
【００５２】
【図２０Ａ】通常ＬＢ培地（対照）または種々の濃度のゲンタマイシン添加した７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で培養された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の、２１６２ｃｍ−１でのＣ−Ｄ  ＳＲＳイメージングおよび透過イメージングの結果を示す。
【００５３】
【図２０Ｂ】図１９Ａの各々の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の平均ＳＲＳ強度プロットである。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
本明細書の様々な実施形態の詳細な説明は、添付の図面を参照する。それは、様々な実施形態およびその実施を例示および最良の形態によって示すものであって、限定ではない。これらの実施形態は、当業者が実施形態を実施できるように十分に詳細に説明されているが、他の実施形態が実現され得ること、ならびに本開示の精神および範囲から逸脱することなく機械的および他の変更がなされ得ることを理解されたい。さらに、単数形への言及には複数の実施形態が含まれ、複数の構成要素へのあらゆる言及には、単数の実施形態が含まれ得る。同様に、装置または装置の構成要素または装置の部分の指定の順番、例えば「第１」および「第２」などは、利便性および明確性のためであり、任意の区別を超えた制限または表示と解釈されるべきではない。さらに、述べられた特徴を有する複数の実施形態の列挙は、追加の特徴を有する他の実施形態、または述べられた特徴の異なる組み合わせを組み込んだ他の実施形態を除外することを意図しない。
【００５５】
本開示の様々な実施形態において、システム、方法、およびコンピュータプログラム製品を提供する。「様々な実施形態」、「一実施形態」、「実施形態」、「実施形態例」などへの言及は、説明された実施形態が、特定の性質、構造、または特性を含み得ることを示すが、すべての実施形態が、必ずしも特定の特徴、構造、または特性を含むとは限らない。さらに、そのような句は、必ずしも同じ実施形態を指すとは限らない。さらに、特定の性質、構造、または特性が実施形態に関連して説明される場合、他の実施形態に関連するそのような性質、構造、または特性に影響を及ぼすことは、明示的な説明の有無に関わりなく、当業者の知識の範囲内であることを提示する。説明を読めば、本開示を代替実施形態でどのように実施するかは、当業者には明らかであろう。
【００５６】
これより、ラマン代謝イメージングによる抗生物質感受性の判定方法の図１Ａ〜図１Ｂを参照する。イメージングシステムは、これらに限定されないが、誘導ラマン散乱イメージング、コヒーレント反ストークスラマン散乱イメージング、またはコヒーレントラマン誘導カー効果イメージング（ｃｏｈｅｒｅｎｔ  Ｒａｍａｎ  ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｋｅｒｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｉｍａｇｉｎｇ）を含む、あらゆるタイプのラマンイメージングを含むことができる。例示的な一実施形態では、本開示は、ハイパースペクトル誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）イメージング設定を開示する。本開示のイメージングシステム内で、システムは、光源１０１を含むことができる。例示的な一実施形態では、光源は、約８０ＭＨｚの繰り返し率を有し得る二重出力フェムト秒パルスレーザー（（ＩｎＳｉｇｈｔ  ＤｅｅｐＳｅｅ，Ｓｐｅｃｔｒａ−Ｐｈｙｓｉｃｓ）であり得るが、任意の好適な繰り返し率を使用できる。光源１０１は、ハイパースペクトルＳＲＳイメージングに使用することができる。同様に、イメージングシステムは、単色ＳＲＳイメージングを使用できる。Ｃ−Ｄ振動領域でのイメージングは、光源１０１、例えば波長可変レーザー１０３などを使用して実施できる。例示的な一実施形態では、波長可変レーザーは、約８４７ｎｍに調整された１２０ｆｓ波長可変レーザーであり得る。さらに、フィルターを組み込んで、レーザービームを鮮明にすることができる。このビーム１０３は、ポンプビームとして機能できる。２２０ｆｓレーザーなどの第２の光ビーム１０５の中心波長は、約１０４０ｎｍである。第２のビーム１０５は、２．３５ＭＨｚで音響光学変調器１０７（ＡＯＭ、１２０５−Ｃ、Ｉｓｏｍｅｔ）により変調され得るストークスビームとして機能できる。各ビームは、１つ以上のフィルターまたはレンズを通過できる。同様に、各ビームは、偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ）１３３を通過できる。例示的な一実施形態では、電動並進ステージ１０９（Ｔ−ＬＳ２８Ｅ、Ｚａｂｅｒ）をポンプ経路に設置して、ポンプビーム１０３とストークスビーム１０５との間の遅延を調整することができる。次に、コンバイナー１１１を使用して、２つのビームを結合できる。その後、１本以上のガラスロッド１１３で、両方のビームをチャープできる。例示的な一実施形態では、長さが約１５ｃｍの２本のガラスロッドを使用できる。同様に、ガラスロッドは、ＳＦ５７ガラスロッドであってもよい。
【００５７】
チャープ後、いくつかの例示的な実施形態におけるポンプおよびストークスのパルス持続時間は、約１〜２ｐｓの間、または１．３〜１．９ｐｓの間であり得る。例示的な一実施形態では、ポンプビームおよびストークビームは、それぞれ約１．９ｐｓおよび１．３ｐｓであり得る。他の実施形態では、イメージングシステムは、ビームのチャープを使用しなくてもよい。次いで、ポンプビーム１０３およびストークスビーム１０５を、走査装置１１５および１つ以上のレンズ１１７を有するレーザー走査顕微鏡に向けてもよい。例示的な一実施形態では、レンズ１１７は、レーザーをサンプル１１９に集束させるのに使用できる、約６０倍の水対物レンズ（ＮＡ＝１．２、ＵＰｌａｎＡｐｏ／ＩＲ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）であり得る。オイルコンデンサー１２１（ＮＡ＝１．４、Ｕ−ＡＡＣ、Ｏｌｙｍｐｕｓ）を使用して、サンプル１２３から結合レーザービーム１２０を収集できる。１つ以上のフィルター１２５（ＨＱ８２５／１５０ｍ、Ｃｈｒｏｍａ）を使用してストークスビームを除去し、ポンプビームをフォトダイオード１２７（Ｓ３９９４−０１、Ｈａｍａｍａｔｓｕ）で検出し、ポンプビーム損失信号をロックインアンプ（ＨＦ２ＬＩ、Ｚｕｒｉｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）で抽出することができる。システムは、装置の様々な構成要素全体に各ビームを向けるために、１つ以上のミラーを含むことができる。いくつかの例示的な実施形態では、１つ以上のミラー１２９は、二色性ミラー１３１であり得る。図１Ｂで示すように、Δω１およびΔω２は、本開示の例示的なイメージングシステムによって測定され得る、可能なラマンピークを示している。チャープ後のポンプおよびストークス間の各遅延は、イメージングシステムによって検出された分子振動モードに対応する。
【００５８】
本開示は、ＳＲＳイメージングシステム（これに限定されない）を含む例示的なイメージングシステムで使用する、サンプルの例示的な調製方法にも関する。サンプルの調製方法は、細菌固定化パッドを利用できる。例示的な一実施形態では、固定化パッドは、溶液中の細菌をライブイメージング用ゲルパッドに配置するための、アガロースゲルパッドを含むことができる。いくつかの例示的な実施形態では、アガロースゲルパッドは、以下の工程、すなわち、（１）１重量％のアガロース粉末をプラスチックチューブ内の約２ｍＬの精製水に加えること、（２）チューブをアガロース粉末が完全に溶けるまで、約２０秒間マイクロ波で加熱すること、（３）加熱したアガロースゲル溶液約１０μＬをピペットでカバーガラスに添加すること、（４）直ちに第２のカバーガラスをアガロースゲル溶液の上に置いて、平らにし、通常は第１のカバーガラスと第２のカバーガラスとの間にゲル溶液を挟むこと、（５）約２分後、２つのカバーガラスをスライドさせて、カバーガラスの１つをアガロースゲルから除去すること、（６）カバーグラスの１つに残っているアガロースゲルの固体をパッドにすることに従って調製できる。
【００５９】
本開示のＡＳＴ手順は、細菌のＡＳＴを使用し、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ）顕微鏡法などのラマンイメージングで細菌の代謝活性を測定することにより、１細胞周期（約３０分）内に判定することができる。イメージングは、グルコース−ｄ７などの重水素化グルコースの代謝活性を、Ｃ−Ｄ振動周波数でチャープされたピコ秒ＳＲＳで監視でき、Ｃ−Ｄ信号をマーカーとして使用してＡＳＴを実施する。
【００６０】
同様に、水は、細菌の生体分子合成にも使用でき、その代謝はラマン分光法により、Ｃ−Ｄ周波数で重水（Ｄ２Ｏ）を使用して監視できる。グルコースｄ７とは異なり、Ｄ２Ｏ自体はＣ−Ｄ結合を有さず、その結果Ｄ２Ｏ代謝活性は、グルコースｄ７よりも良好な、高速ＡＳＴのための対照をもたらす。Ｄ２Ｏの代謝活性は、自発ラマン分光法で代謝活性細菌をイメージングするために使用されている。ＳＲＳイメージングは、数桁の信号エンハンスメントを有し、それにより高速イメージングが可能になる。さらに、Ｄ２Ｏ代謝のＳＲＳイメージングは、哺乳類の細胞および動物の代謝動態を視覚化する、非侵襲的で正確な方法である。
本開示の方法に基づくＳＲＳイメージングは、抗生物質に対する細菌の感受性を、約１０分以内に判定することができる。ＳＲＳイメージングによる試験およびアガロースゲルパッドへの配置用の細菌溶液は、ブロス、例えば溶原性ブロス（ＬＢ）（ＬＢブロス、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中で約２時間培養して、対数期に到達させることで調製できる。次いで、細菌は、２ｍＬの様々なタイプの培地に対して、約０．１：１００から約１０：１００の比率で添加され得る。例示的な一実施形態では、比率は、２ＭＬの特殊培地などの培地に対して、約１：１００であり得る。いくつかの例示的な実施形態は、Ｄ２Ｏ培地、または本明細書でＭ９培地と呼ばれ、約２％のグルコース−ｄ７が唯一の炭素源であり得る、他の特殊培地を使用することができる。Ｍ９培地は、Ｃ−Ｄ振動領域内の信号を最大化するように開発および選択される。所定の細菌の抗生物質への耐性を測定するために、抗生物質を約２０  μｇ／ｍＬの濃度で特殊培地に添加する。少なくとも約３０分の培養後、約５００μＬのサンプルを遠心分離し、精製水で２回洗浄し、イメージングのためにアガロースゲルパッド上に配置する。図１Ａに示すイメージング設定を使用して、サンプルを処理できる。
【００６１】
ここで図２Ａ〜図２Ｄを参照すると、本開示の方法は、一般に例示的な方法で実施して、バンコマイシンなどの抗生物質を利用することの有効性を判定できる。したがって、この方法を利用して、細菌によるグルコース−ｄ７の代謝取り込みに対する抗生物質の影響を調べることができる。バンコマイシン感受性（ＶＳＥ）およびバンコマイシン耐性（ＶＲＥ）腸球菌Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）は、最初にＬＢ培地で約２時間培養することにより対数期まで増殖でき、その後、ＶＳＥおよびＶＲＥは、それぞれバンコマイシンを最終濃度の約２０μｇ／ｍＬまで添加して、約２％グルコース−ｄ７を唯一の炭素源として含むＭ９培地でさらに培養できる（図２Ａ）。他の実施形態は、様々なタイプの炭素源を唯一の炭素源として、または他の炭素源もしくは栄養源と組み合わせて含むことができる。例示的な一実施形態は、約０〜１００％の二酸化重水素の栄養源を使用することができる。同様に、炭素源は、二酸化重水素とグルコース−ｄ７との組み合わせを含むことができる。この濃度は、ＶＳＥに対するバンコマイシンの最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）（ＭＩＣは１μｇ／ｍＬ）とＶＲＥに対するＭＩＣ（ＭＩＣは１００μｇ／ｍＬ超）との間であるので、選択された。対照（ｃｏｎｔｒｏｌ）として、ＶＳＥおよびＶＲＥを、バンコマイシンを添加しないグルコース−ｄ７含有培地で培養した（図２ａ）。３０分（０．５時間）〜３時間の培養後、各サンプルを遠心分離し、水で２回洗浄し、その後ＳＲＳイメージング用のアガロースゲルパッド上に堆積させた。
【００６２】
図２Ｂは、グルコースｄ７含有培地で３０分間培養したＶＳＥおよびＶＲＥの、バンコマイシンを添加した場合と添加しない場合の、Ｃ−Ｄ振動領域（約２１６０ｃｍ−１）におけるＳＲＳイメージングを示す。対照群では、ＶＳＥとＶＲＥの両方に強いＣ−Ｄ信号があり、細菌によるグルコースｄ７の高い代謝取り込みを示しており、個々の細菌を明確に確認できる。バンコマイシン処理群では、個々のＶＳＥのＣ−Ｄ信号の強度は、対照群の個々のＶＳＥのＣ−Ｄ信号の強度の約１／３に減少した。グルコース−ｄ７のＳＲＳ信号強度はその濃度に比例するため、信号の減少は、グルコース−ｄ７の取り込みが減少したことを示す。それに比べて、それぞれのＶＲＥのＣ−Ｄ信号の強度は、対照群と類似する
【００６３】
図２Ｃおよび図２Ｄは、図２Ａに示すＶＳＥおよびＶＲＥに対応する、正規化されたＳＲＳスペクトルを示す。すべてのスペクトルはＣ−Ｄ振動領域にピークを示すが、バンコマイシン処理したものは、対照と比較してＶＳＥの信号強度が減少し、一方、ＶＲＥの信号強度は、バンコマイシン処理の有無にかかわらず同じままであり、それは、図２Ｂに示すＳＲＳイメージングと一致する。これらの結果は、ＶＳＥおよびＶＲＥの代謝活性がバンコマイシン処理に対して異なる反応を示し、よってＶＳＥおよびＶＲＥの感受性が３０分以内に判定できることを示しており、これは、Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）の１細胞周期に近い。１時間および３時間のバンコマイシン処理の場合も同様の効果が確認された。したがって、本開示のイメージング法によるＥ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）のＡＳＴにとって、時間は重要ではない。
【００６４】
Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）細胞のＣ−Ｄ内容および抗生物質処理に対する細菌の反応を定量化するために、多変量曲線分解（ＭＣＲ）分析を適用して、図３Ａ〜図３Ｄに示すハイパースペクトルＳＲＳイメージングデータからＣ−Ｄ成分を取り出す。ＭＣＲは、各ピクセルのスペクトルを含む実験データ基盤を、濃度マップと主要成分のスペクトルとに分解するバイリニアモデルである。各成分の初期推定スペクトルを入力として用いて、収束に達するまで、交互最小二乗アルゴリズムを使用してＭＣＲを反復的に計算し、最適化する。ＭＣＲの出力には、各成分の濃度マップおよびスペクトルが含まれる。ここで図３Ａ〜図３Ｄを参照すると、Ｃ−Ｄ成分を表すグルコース−ｄ７のスペクトル、およびバックグラウンドを表すゲルが入力要素として使用された。ＭＣＲ分析後、Ｃ−Ｄ成分はバックグラウンドから明確に分離され、収集されたＳＲＳイメージングデータの内容を定量化するために利用できる。
【００６５】
本方法は、一般に代謝イメージングに基づくＡＳＴ用のハイパースペクトルＳＲＳ顕微鏡法を開示するが、別の例示的な実施形態は、改善されたサンプル調製方法を伴う単一周波数ＳＲＳ顕微鏡法を使用できる。過去の単一周波数ＳＲＳの結果では、測定中に細菌が移動するのを避けるため、ガラス上で乾燥させた細菌を使用したことにより、ＳＲＳ信号に強い雑音が発生した。アガロースゲルサンプルを調製し、溶液中の細菌をアガロースゲルパッド上に堆積させることで、細菌の生存を維持し、ノイズを除去する。このように、Ｃ−Ｄ振動周波数の細菌のＳＲＳ信号は、ほとんどがＣ−Ｄ成分からのものである。したがって、代謝イメージングに基づくＡＳＴ法では、Ｃ−Ｄ成分を監視することで、単一周波数のＳＲＳイメージングにより細菌の変化を検出できる。それは、大量の画像ではなく１つの画像のみを撮るので、ハイパースペクトルＳＲＳイメージングよりも、要する時間がはるかに少ない。
【００６６】
さらに、別の例示的な実施形態は、追加の工程を使用してサンプルを調製できる。例示的な一実施形態では、ガラス上の細菌を乾燥させることにより、ＳＲＳイメージング用のサンプルを調製した。図４Ａ〜図４Ｂに示すように、アガロースゲル上に堆積した細菌では、ＳＲＳイメージングの相互位相変調雑音が大幅に減少した。図４Ａは、通常培地で培養され、ガラス上で乾燥させた細菌の２１７８ｃｍ−１でのＳＲＳイメージングであり、図４Ｂは、通常培地で培養され、アガロースゲルパッド上に堆積させた細菌の２１７８ｃｍ−１でのＳＲＳイメージングを示す。ガラス上の乾燥細菌を使用したイメージングでは、おそらくは相互位相変調による、強いバックグラウンドが見られた。生菌イメージングのために、アガロースゲルパッドを使用し、このゲルパッドに溶液中の細菌を体積させた。図４Ｂに示すように、このサンプルを調製することにより、ＳＲＳイメージングのバックグラウンドが大幅に減少した。Ｃ−Ｄ信号レベルを最大化するために、培養培地を通常のグルコースを含むＬＢ培地から、グルコース−ｄ７が唯一の炭素源である、特別仕様のＭ９培地へと変更し、グルコース−ｄ７濃度を２％に上げた。信号およびスペクトル分解能を確保するために、長さ１５ｃｍの２本のＳＦ５７ガラスロッドを使用した２本のロッド設定を構成して、ポンプビームおよびストークスビームをハイパースペクトルＳＲＳイメージング用にチャープし、Ｃ−Ｄ振動領域での単一細菌のＳＮＲ、約５を、約２０ｃｍ−１のスペクトル分解能と共に達成する
【００６７】
細菌に対するグルコース−ｄ７の毒性を試験するために、Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）３１９７０および３１９７２を特別仕様のＭ９培地で培養し、１つは対照用の通常グルコースを含み、もう１つはグルコース−ｄ７を含む。細菌の増殖は、６００ｎｍの光学密度（ＯＤ）測定により、最長２２時間監視した（図９）。同様の増殖曲線が、対照培地およびグルコース−ｄ７含有培地で培養されたＥ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）３１９７０およびＥ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）３１９７２の両方で確認され、細菌の増殖に対するグルコース−ｄ７の毒性がないことが示された。図９Ａは、２％通常グルコースまたは２％グルコース−ｄ７のいずれかを含むＭ９培地で培養された、バンコマイシン感受性腸球菌のＯＤ測定を示し、図９Ｂは、２％通常グルコースまたは２％グルコース−ｄ７のいずれかを含むＭ９培地で培養された、バンコマイシン耐性腸球菌のＯＤ測定を示す。
【００６８】
ＭＩＣは、生体外で目に見える細菌増殖を阻害できる抗生物質の最低濃度として定義され、我々の代謝イメージング法によって決定できる。ＶＳＥは、グルコース−ｄ７含有Ｍ９培地で、異なる濃度のバンコマイシンを添加して培養した。１時間の培養後、各サンプルを遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＳＲＳイメージング用のアガロースゲルパッド上に堆積させた。図５Ａは、ＭＣＲ分析後の各サンプルのＣ−Ｄ成分を示す。細菌のグルコース−ｄ７取り込みの変化をバンコマイシン処理と定量的に比較するために、視野内の各々の細菌のＣ−Ｄ成分の強度を統計的に分析し、プロットした（図５Ｂ）。バンコマイシン処理なしの対照と比較して、２μｇ／ｍＬ以上の濃度でバンコマイシン処理した場合、Ｃ−Ｄ成分の強度が大幅に低下した。それに比べて、１μｇ／ｍＬのバンコマイシン処理では、この強度は低下しなかった。したがって、我々の代謝イメージング法によって決定されるＶＳＥのＭＩＣは２μｇ／ｍＬであり、これは従来の培養ベースの方法で決定されるＭＩＣの２倍である。この不一致は、主に従来のＡＳＴでの手動による抗生物質の段階希釈の実施によるもので、許容可能かつ精度範囲内である。図５Ａは、異なるバンコマイシン濃度で、グルコース−ｄ７含有培地で１時間培養した細菌のＣ−Ｄ成分の濃度マップの結果を示す。図５Ｂは、Ｃ−Ｄ成分強度の定量化を示すグラフである。２μｇ／ｍｌ以上のバンコマイシンで処理した細菌のＣ−Ｄ成分強度は、バンコマイシン処理を行わなかった対照と比較して、大幅に低下する。図５Ｃに、従来の培養ベースの方法から決定されたＭＩＣと、我々の代謝イメージング方法から決定されたＭＩＣとの比較を示す。
【００６９】
ＳＲＳイメージングによる細菌代謝活性の評価は、通常のグルコース８０１含有培地およびグルコース−ｄ７  ８０３含有培地で培養し、その後ＰＢＳで洗浄して培地の痕跡を除去し、ＳＲＳイメージング用のアガロースゲルパッド上に堆積させた、Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）の試験により実施した。図７Ｂに示すとおり、１Ｍグルコース−ｄ７溶液のハイパースペクトルＳＲＳイメージングは、Ｃ−Ｄ振動モードから２１３０ｃｍ−１付近にピークを示す。このピークは、ラマンスペクトルの細胞のサイレント領域にあり、重水素標識代謝物の代謝取り込みをイメージングするための優れたコントラストをもたらす。グルコース−ｄ７含有培地で培養された細菌のＳＲＳイメージングは、Ｃ−Ｄ振動領域で強い信号を示し、グルコース−ｄ７の取り込みおよび利用の成功を示している。対照として、通常のグルコース培地で培養された細菌では、信号は確認されなかった。これらの結果は、図８に示すように自発ラマン測定によってさらに立証され、そこでは、グルコース−ｄ７  ８０３含有培地で培養された細菌でのみ、Ｃ−Ｄ領域でのピークが確認された。これらのデータは、細菌によるグルコース−ｄ７取り込みの代謝活性が、単一細胞レベルでのハイパースペクトルＳＲＳイメージングによって監視できることを共同で示す。灰色のバー８０５は、約２１５０ｃｍ−１付近のＣ−Ｄ領域を示す。
【００７０】
図６Ａ〜図６Ｄは、２０μｇ／ｍｌのバンコマイシンの存在下および不存在下で、グルコース−ｄ７含有培地で培養された細菌の、Ｃ−Ｄ成分の変化の結果を示す。図６Ａおよび図６Ｂは、それぞれＶＳＥおよびＶＲＥのＭＣＲ分析後のＣ−Ｄ成分の時間的動態を示す。それぞれの細菌のＣ−Ｄ成分の平均強度を定量化し、ＶＳＥおよびＶＲＥについてそれぞれ図６Ｃおよび図６Ｄにプロットした。バンコマイシン処理なしの対照ＶＳＥでは、グルコース−ｄ７培地で約０．５および１時間培養した細菌のＣ−Ｄ成分の強度は相似しているが、３時間培養した細菌のＣ−Ｄ成分の強度はより高く（図６Ｃ）、グルコース−ｄ７の取り込みが、時間とともにやや増加することを示している。対照ＶＲＥでは、それぞれの細菌のＣ−Ｄ成分の強度は、約０．５〜３時間まで相似している（図６Ｄ）。バンコマイシン処理により、ＶＳＥのＣ−Ｄ成分の強度が大幅に低下した。スチューデントのｔ検定を使用して、ＶＳＥの対照群と処理群との間の有意差を分析した。ｐ値は、約０．５、１、および３時間の結果に対して、それぞれ２．２×１０−１３、２．０×１０−１１、および３．９×１０−１５である。バンコマイシン処理は、ＶＲＥのＣ−Ｄ成分の強度は大きく低下させなかった。興味深いことに、ＶＲＥを３時間バンコマイシンで処理すると、Ｃ−Ｄ成分の強度は対照群よりも高くなり（ｐ値は５×１０−４）、これはおそらく、抗生物質のストレスと戦うために細胞がグルコースの取り込みを増やすという、ＶＲＥのバンコマイシン処理に対する代謝反応に起因する。結果は、バンコマイシン処理により、ＶＳＥのグルコース−ｄ７取り込みが大幅に減少する一方で、ＶＲＥのグルコース−ｄ７の取り込みは、３時間にわたって減少しないことを示す。したがって、バンコマイシンに対するＶＳＥおよびＶＲＥの感受性を迅速に判定できる。図１２Ａ〜図１２Ｃは、グルコース−ｄ７含有培地で１時間培養した細菌の対応データおよびイメージングデータを示す。図１２Ａは、グルコース−ｄ７含有培地で培養された、バンコマイシン感受性および耐性Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）の、２０μｇ／ｍｌのバンコマイシン処理をした場合およびしない場合のＣ−Ｄ振動領域でのＳＲＳイメージングを示す。図１２Ｂは、バンコマイシン感受性Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）についてバンコマイシン処理した場合１２０３、およびバンコマイシン処理しない場合１２０１の対応するスペクトルを示す。さらに、図１２Ｃは、バンコマイシン処理および非処理のバンコマイシン感受性Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）の対応するスペクトルを示しており、イメージングデータの変化がないことを示す。同様に、図１３Ａ〜図１３Ｃは、それぞれグルコース−ｄ７含有培地で３時間培養した細菌の対応データおよびイメージングデータを示す。図１３Ｂは、バンコマイシン感受性Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）についてバンコマイシン処理した場合１３０３、およびバンコマイシン処理しない場合１３０１の対応するスペクトルを示す。図１３Ｃは、バンコマイシン処理および非処理のバンコマイシン感受性Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）の、対応するスペクトルを示しており、イメージングデータの変化がないことを示す。
追加の試験を実施して、代謝イメージングに基づくＡＳＴ法が、他の抗生物質に対して機能するかどうかを判定した。ＶＳＥ  Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）３１９７０を、５つの異なる抗生物質、バンコマイシン、リネゾリド、ダプトマイシン、ゲンタマイシンおよびエリスロマイシンと共に、グルコース−ｄ７含有Ｍ９培地で培養した。これらの抗生物質は、細菌感染治療のために診療所で一般的に処方されており、異なる作用機序を有する。図１０Ａ〜図１０Ｆは、グルコース−ｄ７含有培地で１時間培養した後のＶＳＥにおける、抗生物質を添加しない場合（対照）、および各抗生物質を最終濃度の２０μｇ／ｍＬ添加した場合のＳＲＳイメージングを示す。バンコマイシンおよびリネゾリドで処理した細菌でのみ、Ｃ−Ｄ信号の著しい減少が確認された。したがって、Ｅ．フェカーリス（Ｅ．ｆａｅｃａｌｉｓ）３１９７０は、バンコマイシンおよびリネゾリドには感受性があるが、ダプトマイシン、ゲンタマイシンおよびエリスロマイシンには耐性がある、と我々の代謝イメージング法に基づいて結論付けられる。ＶＳＥに対するこれらの抗生物質のＭＩＣを、従来の培養ベースの方法により決定し、これを以下の表１に示して確認した。これら５つの抗生物質に対するＶＳＥの感受性は、我々の代謝イメージング法によって判定された結果と一致する。
【表１】
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【００７１】
この方法が他の細菌種でも機能することを確認するために、１つのオキサシリン感受性（ＭＩＣ  ０．０６２５μｇ／ｍｌ）菌株および１つのオキサシリン耐性菌株を使用して、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を試験した。グルコース−ｄ７の代謝活性は、グルコース−ｄ７含有培地で０．５時間培養された単一細菌において、ＳＲＳイメージングによって確認できる（図１１Ｂ）。細菌を１．３μｇ／ｍｌオキサシリンで０．５時間処理した場合、感受性菌株１１０３では、オキサシリンで処理されていない対照１１０１と比較して、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）のＣ−Ｄピークの低下が確認され（図１１Ｃ）、耐性菌株では著しい変化は確認されなかった（図１１Ｄ）。したがって、感受性および耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、約０．５時間で判定できる。
【００７２】
本開示はさらに、単一細胞レベルで細菌の代謝活性を監視することにより、約３０分以内に生菌の感受性および抗生物質のＭＩＣを判定できる代謝イメージング法を提供する。この方法により、従来の培養ベースの方法でのＡＳＴに必要な時間、少なくとも１６時間〜２４時間が、０．５時間に短縮される。代謝イメージングに基づく単一細菌レベルでのＡＳＴは、非培養性または偏好性細菌に特に有用である。なぜなら、代謝活動は表現型の増殖よりも速く起こるため、抗生物質処理に対する代謝活性の反応を検出するために、必ずしも細菌を複製する必要がないからである。
【００７３】
Ｄ２Ｏ法の場合、ＳＲＳイメージングベースの方法は、重水（Ｄ２Ｏ）を使用して代謝活性が現れることを、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を使用して実証した。広いＣ−Ｄ振動スペクトルの場合、細菌の信号は、チャープのないフェムト秒ＳＲＳによって、チャープされるＳＲＳと比較して約５倍超改善され得る。細菌のＤ２Ｏ代謝は、種々の抗生物質に対して約１０分程で、単一細菌の代謝活性研究のための、および異なる細菌に対して一般的に機能する高速ＡＳＴのためのＳＲＳ顕微鏡法で使用される細菌の感受性により異なって反応し得る。
【００７４】
Ｄ２Ｏの毒性は、Ｄ２Ｏ含有培地での増殖を測定することにより、最初に細菌で試験した。３種類の細菌（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、および緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ））を異なる濃度のＤ２Ｏを含有するＬＢ培地で培養し、約６００ｎｍで光学密度（ＯＤ）を測定して、その増殖を監視した。様々な濃度のＤ２Ｏ培地での増殖曲線が示すように、１００％までのＤ２Ｏ濃度では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の増殖に対して著しい毒性を示さなかった（図１５Ａ〜図１５Ｂ）。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の増殖は、Ｄ２Ｏ濃度が７０％以上のＬＢ培地では初めに遅くなったが、７０％および８０％濃度のＤ２Ｏでは約１８時間後、１００％のＤ２Ｏ濃度では約２２時間後に正常な増殖へと回復した（図１５ｃ）。したがって、培地中のＤ２Ｏは、細菌に対して著しい毒性を誘発しない。
【００７５】
７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地を使用して細菌を培養し、モデルとして緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を使用して、単一細菌でのＤ２Ｏ代謝活性をＳＲＳ顕微鏡で監視できるかどうか試験した。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を、通常のＬＢ培地および７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で約２時間別々に培養した後、遠心分離し、水で洗浄して培地を除去した。図１６Ａを参照すると、高密度細菌の自発ラマンスペクトルは、Ｄ２Ｏ含有培地で培養された細菌のＣ−Ｄ振動領域で、約２０７０から約２２５０ｃｍ−１の広いピーク１６０１を示し、生体分子合成で、Ｄ２Ｏが上手く利用されたことを示す。対照として、通常の培地１６０３で培養された細菌では、この領域にこのピークが見られなかった（図１６Ａ）。単一の細菌をイメージングするために、細菌をさらに希釈し、アガロースゲルパッド上に堆積させた。ＳＲＳ周波数を約２１６２ｃｍ−１のＣ−Ｄ領域に調整することにより、Ｄ２Ｏ含有培地で培養された個々の細菌について、強い信号が確認された（図１６Ｂ、右）。対照として、通常の培地で培養された細菌ではＣ−Ｄ信号は確認されなかった（図１６Ｂ、左）。結果は、チャープポンプおよびストークスフェムト秒パルスの時間調整によって得られた、ＳＲＳスペクトル（図１６Ｃ）によって確認されまた。
【００７６】
単一細菌のＣ−Ｄ信号をさらに改善するために、チャープなしのフェムト秒パルスを試験して、チャープされたピコ秒パルスの信号対雑音（ＳＮＲ）比を改善した。Ｃ−Ｄ振動帯は幅が約１８０ｃｍ−１と比較的広いため（図１６Ｃ）、チャープなしのフェムト秒ＳＲＳは、ＳＮＲをさらに向上させ得る。これを試験するために、７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で約３０分間緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を培養し、それらをチャープされたピコ秒パルス、およびチャープなしフェムト秒パルスによって、２１６２ｃｍ−１でイメージングし、それぞれ図１７Ａおよび図１７Ｃに示した。ポンプおよびストークスの出力を調整して、サンプルで使用するポンプおよびストークスの平均出力が、同じであることを確認した。ピコ秒およびフェムト秒ＳＲＳの個々の細菌のＳＮＲは、それぞれ図１７Ｂおよび１７Ｄに示すように、それぞれ１．４３および７．８１であり、フェムト秒ＳＲＳのＳＮＲが、ピコ秒ＳＲＳに対して約５．４６倍の改善を示している。この改善は、設定の２つの異なる側面に起因する。１つめは、Ｃ−Ｄ振動帯域が広く、フェムト秒ＳＲＳがチャープされたピコ秒ＳＲＳよりも広い帯域信号を検出できることであり、２つめは、チャープされるパルスが、パルスのピーク出力を低下させ得ることであるサンプルでは同じ平均出力が使用されたが、ピーク出力の低下は、ＳＲＳの非線形効果によりＳＮＲを大幅に低下させた。
【００７７】
Ｄ２Ｏ代謝活性の低速度撮影は、フェムト秒ＳＲＳイメージングによって、単一の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）で実施できる。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を最初に約７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で最大約３時間培養し、異なる時点で、約５００μｌの細菌を遠心分離し、洗浄し、イメージング用にアガロースゲルパッド上に堆積させた。図１８Ａは、約２１６２ｃｍ−１での単一の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＳＲＳイメージングを示し、個々の緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＣ−Ｄ信号は、約１０分という短い時間後に確認できる。統計解析により、個々の細菌の平均Ｃ−Ｄ信号強度は時間とともに増加し、ＬＢ培地で培養された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の世代時間は２４〜２７分であるため、約３世代となる約１．５時間で、図１８Ｃに示すように飽和することが示された。個々の細菌をより明確に見るために、図１８Ａの画像を図１８Ｂでさらに拡大した。興味深いことに、図１８Ｂに示す１０分の結果で、図１８Ｄに示す細菌の強度プロットで示されるように、細菌の細胞周辺の信号がより強いことが確認された。対照的に、３０分および３０分後では、図１７Ｂは、図１８Ｅに示す３０分の細菌の強度プロットの結果で示されるように、細菌の細胞中心で信号強度がより強いことを示す。まとめると、これらの結果は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の細胞膜および／または細胞壁を合成するために、最初に水が使用されることを示唆している。
【００７８】
緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で培養し、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシンまたはセフォタキシムを添加して、細菌のＤ２Ｏの代謝活性に対する抗生物質の効果を判定した。それはＳＲＳイメージングによる高速ＡＳＴでの使用に適している。緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の感受性は、従来の培養ベースの微量希釈法を使用して、この濃度でゲンタマイシンに感受性があり、セフォタキシムに耐性があると、事前に判定された。約２１６２ｃｍ−１でのＳＲＳイメージングでは、図１９Ａに示すように、２０μｇ／ｍｌゲンタマイシンでの培養後にＣ−Ｄ信号が大幅に減少し、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＤ２Ｏの代謝活性がゲンタマイシンによって阻害されたことを示している。対照的に、セフォタキシムで培養された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、約２１６２ｃｍ−１でのＳＲＳイメージングで、すべての時点において確認され、セフォタキシムで培養された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＤ２Ｏの代謝活性が活発であることを示している。セフォタキシムで培養された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、図１９Ｂに示すように、長い棒状体を形成する傾向があることが確認された。これは、セフォタキシムが細菌の細胞壁合成を阻害するβ−ラクタム抗生物質であるため、セフォタキシムで培養された緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）は、依然として増殖はできるが、分裂できないことに起因し得る。このフィラメント状の形成は、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）が他のβ−ラクタム系抗生物質１０で処理された場合にも確認され得る。
【００７９】
細菌のＤ２Ｏ代謝活性を使用して、図１９Ｃ〜図１９Ｈに示す３つのグループ、すなわち抗生物質処理なしの対照（図１８Ａ）、ゲンタマイシン処理（図１９Ａ）、およびセフォタキシム処理（図１９Ｂ）間で比較される細菌の平均Ｃ−Ｄ信号強度を使用して、細菌の抗生物質感受性を迅速に識別することができる。感受性群と耐性群とを区別するために、図１９Ｃ〜図１９Ｈに示す、約１０分から約３時間の結果のすべてのプロットにおいて、対照細菌の平均Ｃ−Ｄ強度である約６５％で閾値線を決定した。この閾値は、感受性群と耐性群とを明確に分けることができ、ゲンタマイシン処理群は常に閾値を下回り、セフォタキシム処理群は常に閾値を上回った。したがって、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のゲンタマイシンおよびセフォタキシムに対する感受性は、約１０分という短い時間で判定できる。
【００８０】
ＳＲＳ代謝イメージング法は、細菌に対する抗生物質の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定でき、約７０％Ｄ２Ｏ含有ＬＢ培地で約１時間、希釈濃度が連続的に異なるゲンタマイシンを添加して緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）を培養することにより実施された。図２０Ａに示すように、２１６２ｃｍ−１でのＳＲＳイメージングは、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）のＤ２Ｏ代謝活性が、８μｇ／ｍｌ以上の濃度のゲンタマイシン培養で阻害されることを示した。対照として、通常のＬＢ培地で培養した緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）では、Ｃ−Ｄ信号は確認されなかった。図２０Ｂに示すように、緑膿菌（Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）Ｃ−Ｄ信号の平均強度をプロットして比較した。６５％の強度閾値では、ＭＩＣは、ＳＲＳベースのＤ２Ｏ代謝イメージング法で約８μｇ／ｍｌと判定された。これは、従来の培養ベースの方法で判定された結果と一致する。
【００８１】
当業者は、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多数の様々な他の構成を容易に考案することができる。さらに、本発明の原理、態様および実施形態、ならびにその特定の例を列挙する本明細書のすべての記述は、その構造的および機能的同等物の両方を包含することを意図している。さらに、そのような同等物には、現在知られている同等物、および将来開発される同等物、つまり構造に関係なく同じ機能を実行する開発された要素の両方が含まれることが意図される。本明細書に引用されるすべての参考文献は、参照により組み込まれる。追加の開示は付録Ａにあり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図１９Ｆ】
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【図１９Ｇ】
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【図１９Ｈ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【国際調査報告】
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