(57)【要約】  アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）生成物を製造する方法、アデノ随伴ウイルスを精製する方法、ならびに、空ＡＡＶカプシドおよび完全ＡＡＶカプシドを含む濃縮ＡＡＶ画分から完全ＡＡＶカプシドを精製する方法をここに提供する。
2020502997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
空ＡＡＶカプシドおよび完全ＡＡＶカプシドを含む濃縮ＡＡＶ画分から完全アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）カプシドを精製する方法であって、
（ｉ）ａ）濃縮ＡＡＶ画分、およびｂ）それぞれ異なる糖濃度を有し、かつそれぞれ約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む少なくとも２つの糖溶液を、ゾーナルロータにロードするステップ、
（ｉｉ）バッチモードで前記ゾーナルロータを含む超遠心機を運転して、糖密度勾配を形成するステップ、および
（ｉｉｉ）前記糖密度勾配の画分を取得して、ＡＡＶ画分中のＡＡＶ粒子の少なくともまたは約６０％が完全ＡＡＶカプシドであるＡＡＶ画分を得るステップ
を含み、（Ａ）糖溶液の体積はゾーナルロータの容積の約５０％以上であるか、（Ｂ）糖溶液およびＡＡＶ画分の総体積はゾーナルロータの容積以下であるか、（Ｃ）ＡＡＶ画分の体積に対する糖溶液の体積の比は１以下であるか、または（Ｄ）それらの組合せである、方法。
【請求項２】
各糖溶液は、約５０％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
各糖溶液は、約５５％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記糖溶液の少なくとも１つは、約５０％（ｗ／ｗ）ショ糖より高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記糖溶液の少なくとも１つは、約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖より高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記糖溶液の少なくとも１つは、約６０％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
１つの糖溶液は約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、第２の糖溶液は約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、さらに任意選択で、第３の糖溶液は約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、請求項１、２および４〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
２つの糖溶液がゾーナルロータにロードされる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
２つの糖溶液がゾーナルロータにロードされ、１つの糖溶液は約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、第２の糖溶液は約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、請求項１、２および４〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも３つの糖溶液がゾーナルロータにロードされる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
３つの糖溶液がゾーナルロータにロードされる、請求項１〜７および１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
３つの糖溶液がゾーナルロータにロードされ、１つの糖溶液は約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、第２の糖溶液は約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、第３の糖溶液は約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む、請求項１、２、４〜７、１０および１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（ｉ）において、濃縮ＡＡＶ画分は、約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされ、さらにその約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液は、約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされる、請求項１、２および４〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ｉ）において、濃縮ＡＡＶ画分は、約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされ、その約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液は、約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされ、さらにその約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液は、約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされる、請求項１、２、４〜７、および１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
各糖溶液は、等体積でゾーナルロータにロードされる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中の他の糖溶液の少なくとも１つの体積の２倍の体積でゾーナルロータにロードされる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中で組み合わされた全ての他の糖溶液の体積以上の体積でゾーナルロータにロードされる、請求項１〜１４および１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
最も低い糖濃度を有する糖溶液が、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積の少なくとも２倍の体積でゾーナルロータにロードされ、任意選択で、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積は、中間の糖濃度を有する糖溶液の体積に等しい、請求項１〜１４、１６および１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも２つの糖溶液がゾーナルロータにロードされ、最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中の少なくとも１つの他の糖溶液の体積の少なくとも２倍の体積でゾーナルロータにロードされる、請求項１〜１４、および１６〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも２つの糖溶液がゾーナルロータにロードされ、最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中の少なくとも１つの他の糖溶液の体積と同じ体積でゾーナルロータにロードされる、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
最も低い糖濃度を有する糖溶液が、濃縮ＡＡＶ画分の体積の半分の体積でゾーナルロータにロードされる、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
全糖密度勾配の体積のゾーナルロータにロードされるＡＡＶ画分の体積に対する比が約１：１〜約１：５である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＡＡＶ画分は緩衝溶液を含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記緩衝溶液はＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａＣｌを含む、請求項２３に記載の方法。請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約２０〜約５０ｍＭの濃度であり、かつＮａＣｌは約１５０ｍＭ〜約９００ｍＭの濃度である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記緩衝溶液は約７．４〜約９．０のｐＨを有する、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記緩衝溶液は４５〜５５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む、請求項２３〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
各糖溶液は二糖または三糖を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記二糖は、ショ糖、麦芽糖、乳糖、およびそれらの組合せを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
各糖溶液はショ糖を含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記糖溶液はそれぞれ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａＣｌをさらに含む、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約２０〜約５０ｍＭの濃度であり、かつＮａＣｌは約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記緩衝溶液は約７．４〜約８．５のｐＨを有する、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
超遠心機を、１０，０００ｒｐｍ未満の第１の回転速度で６０分未満、および約３０，０００〜約４０，０００ｒｐｍの範囲内の第２の回転速度で少なくとも４時間運転することを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
超遠心機を、１０，０００ｒｐｍ未満の第１の回転速度で６０分未満、および約３０，０００〜約４０，０００ｒｐｍの範囲内の第２の回転速度で少なくとも１２時間運転することを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１の回転速度は約３，０００ｒｐｍ〜約６，０００ｒｐｍであり、任意選択で約４，０００ｒｐｍである、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の回転速度は約３５，０００ｒｐｍであり、任意選択で、約４〜約６時間維持される、請求項３４または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第２の回転速度は少なくとも約１６時間または少なくとも２０時間維持される、請求項３４〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の回転速度は約３５，０００ｒｐｍであり、任意選択で、約１６〜約２０時間維持される、請求項３４〜３６および３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
ゾーナルロータにロードされる濃縮ＡＡＶ画分は、少なくとも１ｘ１０１２／ｍＬのＡＡＶカプシドを含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を含む細胞培養物から上清を採取することを含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションの約３〜約５日後、あるいは細胞培養物が約５ｘ１０６細胞／ｍＬ以上の細胞密度を有しかつ５０％超の細胞生存率を有するときに、上清を採取することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
デプスろ過を介して採取した上清をろ過することを含む、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
セルロースおよびパーライトを含みかつ約５００Ｌ／ｍ２の最小透過性を有するフィルターを通して採取した上清をろ過することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターを通して採取した上清をろ過することを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
（ｉ）ＡＡＶがＡＥＸクロマトグラフィカラムを素通りする条件下でＡＡＶ画分を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィカラムに添加し、さらに（ｉｉ）ＡＡＶを含む素通り液を回収することを含む、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
ＡＡＶ画分は、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭのＮａＣｌを含むローディングバッファーを用いてＡＥＸクロマトグラフィカラムに添加され、任意選択で、前記ローディングバッファーのｐＨは約８〜約９である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ローディングバッファーは約１１５ｍＭ〜約１３０ｍＭのＮａＣｌを含み、任意選択で、前記ローディングバッファーは約１２０ｍＭ〜約１２５ｍＭのＮａＣｌを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを用いてＡＡＶ画分を濃縮することを含む、請求項１〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
ＡＡＶがＡＥＸクロマトグラフィカラムを素通りする条件下でＡＡＶ画分を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィカラムに添加することを含むステップの前、後、または前後に、限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを用いてＡＡＶ画分を濃縮することを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
宿主細胞タンパク質が除去される、請求項１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記宿主細胞タンパク質はＨＳＰ７０および／またはＬＤＨである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
溶媒および／または界面活性剤を用いてＡＡＶ画分の脂質エンベロープウイルスを不活化することをさらに含む、請求項１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
ＡＡＶ画分をナノろ過して、３５ｎｍより大きいウイルスを除去することを含む、請求項１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
テンタクルゲルを含むカラムを用いてＡＥＸクロマトグラフィを実施することを含むポリッシングステップをさらに含む、請求項１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
（ｉ）３つのプラスミドを用いて宿主細胞をトランスフェクトし、（ｉｉ）トランスフェクト宿主細胞を含む細胞培養物の上清を回収し、さらに（ｉｉｉ）請求項１〜５５のいずれか１項に記載の方法を実施することを含む、ＡＡＶ生成物を製造する方法。
【請求項５７】
前記方法のステップが図１に示す順序で行われる、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＡＡＶ画分をＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより試験することを含む、請求項１〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
定量ＰＣＲにより力価を測定するステップを含まない、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡはＡＡＶに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡである、請求項５８または５９に記載の方法。
【請求項６１】
約５５％のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む第１の糖溶液、約６０％のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む第２の糖溶液、および任意選択で、約５０％のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む第３の糖溶液を含む、請求項１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０である、請求項１〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
ＡＡＶはＡＡＶ８である、請求項１〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法により製造されたＡＡＶ生成物。
【請求項６５】
請求項１〜６３のいずれか１項に記載の方法により製造されたＡＡＶ生成物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、参照することによってその全てが本願に援用される、２０１６年１１月４日出願の米国仮特許出願第６２／４１７，７７５号に基づく優先権を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する材料および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、線状一本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージングする小型の非エンベロープウイルスである。ＡＡＶによる増殖感染は、例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスの存在下でのみ生じるため、ＡＡＶはパルボウイルス科、ディペンドウイルス属に属する。ヘルパーウイルスの不在下ですら、ＡＡＶ（血清型２）は宿主ヒトゲノムの染色体１９ｑ１３．４中に組み込まれることにより潜伏を達成することができる。それは、部位特異的組込みができることが分かっている唯一の哺乳動物ＤＮＡウイルスである（非特許文献１）。
【０００４】
ＡＡＶを臨床で安全に使用するために、ＡＡＶはそのゲノム内のいくつかの位置で遺伝子改変されている。例えば、ウイルス複製に必要なＲｅｐ遺伝子、および部位特異的組込みに必要な因子が、多くのウイルスベクターにおいてＡＡＶゲノムから除去されている。これら組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、染色体外状態で存在し、ゲノムＤＮＡへの非常に低い組込み効率を有する。従って、ｒＡＡＶが宿主細胞においてランダム変異導入を生じさせる可能性は、全くなくなるとまではいかないとしても、低減される。これら特性および病原性欠如のため、ｒＡＡＶは前臨床および臨床適用の多様な態様で遺伝子治療ベクターとして大きな見込みを示している。新たな血清型および自己相補的ベクターが臨床で試験されている。これら進行中のベクター開発と並行して、高タイター量の高い純度および力価(potency)を有するｒＡＡＶベクターを効率的に生成できるスケーラブルな製造プロセスに対する継続的な取組みに力が入れられている。
【０００５】
ヒト投与に適したＡＡＶ生成物を精製する効率的で大規模な方法を設計する取組みにもかかわらず、より優れたＡＡＶ精製法に対する要求が依然としてある。例えば、細胞培養でＡＡＶを生成する現在の方法は、カプシド抗原に対するＴ細胞媒介免疫応答を引き起こすことが示されている「空」カプシドの形成をもたらし、それは低度の肝毒性および発現の部分的損失につながる（非特許文献２）。従って、最終ＡＡＶ生成物から空のＡＡＶカプシドを除去するステップを含むＡＡＶの精製法が望まれている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Daya and Berns, Clinical Microbiology Reviews, pages 583-593 (2008)
【非特許文献２】Wright, Molec Therapy 22(1): 1-2 (2014)
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
細胞培養でのＡＡＶベクター生成の特徴は、ベクターゲノムを欠く「空」カプシドの過剰量の形成である。そのような空カプシドは、導入遺伝子産物に関連する治療的恩恵を提供することができない。臨床成果に対する空カプシドの影響は明らかでない。しかしながら、ベクターに対する先天性または適応性免疫応答を高める可能性があり、従って空カプシドは遺伝子治療における懸念となる。Wright, Molecular Therapy 22: 1-2 (2014)。
【０００８】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）生成物を製造する方法、ＡＡＶを精製する方法、ならびに空ＡＡＶカプシドおよび完全ＡＡＶカプシドを含む濃縮ＡＡＶ画分から完全ＡＡＶカプシドを精製する方法をここに提供する。ここに提供する方法は、ＡＡＶの大規模生成に適しており、かつ臨床用途に適した高純度で強力な生成物を提供するため、本開示の方法は当業界で知られている方法よりも有利である。例示的態様では、本明細書に記載の方法は、均質な集団でかつ高純度のＡＡＶ粒子を含むＡＡＶ生成物を提供する。例示的態様では、本明細書に記載の方法は、完全長ベクターＤＮＡを含むＡＡＶ生成物を提供する。例示的実施形態では、本明細書に記載の方法は、不要な汚染物質を実質的に含まないＡＡＶ生成物を提供し、そのような汚染物質には、限定はされないが、空ＡＡＶ粒子（切断または不完全ベクターＤＮＡを含有することを含めて）、不完全なタンパク質組成およびオリゴマー化構造を有するＡＡＶ粒子、あるいは例えば非ＡＡＶ脂質エンベロープウイルスなどの汚染ウイルスが含まれる。例示的実施形態では、本明細書に記載の方法は、目的タンパク質をコードする多量のＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を含むＡＡＶ生成物を提供する。
【０００９】
例示的実施形態では、本開示の方法は、空ＡＡＶカプシドから完全ＡＡＶカプシドを分離する超遠心分離ステップを含む。例示的態様では、その方法は、（ｉ）それぞれ異なる糖濃度を有する少なくとも２つの糖溶液と共に濃縮ＡＡＶ画分をロータにロードするステップ、（ｉｉ）ロードされたロータを含む超遠心機をバッチモードで運転して糖密度勾配を形成するステップ、および（ｉｉｉ）糖密度勾配の画分を取得して完全ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ画分を得るステップを含む。例示的態様では、ロータはゾーナルロータである。
【００１０】
例示的態様では、少なくとも２つの糖溶液はそれぞれ、約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。例示的態様では、１つの糖溶液は約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、別の糖溶液は約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。任意選択で、約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む別の糖溶液がある。ロータまたはコンパートメントの底にロードするとき、ロードの順序は、最初に約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液、存在する場合には、次に約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液、さらにその後、約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液であってよい。
【００１１】
ある実施形態では、処理すべき試料を、糖溶液の添加の前に添加する。ある実施形態では、超遠心分離は連続フロー様式で実施され、遠心分離中、密度勾配が達成された後に試料をロードする。
【００１２】
ある実施形態では、本開示の方法は、空ＡＡＶカプシドから完全ＡＡＶカプシドを分離するために超遠心分離ステップを含む。例示的態様では、その方法は、（ｉ）それぞれ異なる糖濃度を有しかつそれぞれ約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む少なくとも２つの糖溶液と共に、濃縮ＡＡＶ画分をロータにロードするステップ、（ｉｉ）ロードされたロータを含む超遠心機をバッチモードで運転して糖密度勾配を形成するステップ、および（ｉｉｉ）糖密度勾配の画分を取得してＡＡＶ画分を得るステップであって、前記ＡＡＶ画分中のＡＡＶ粒子の少なくともまたは約６０％が完全ＡＡＶカプシドであるステップを含む。例示的態様では、ロータはゾーナルロータである。ある実施形態では、糖溶液の体積はゾーナルロータの容積の約５０％に等しいかまたはそれより多い。ある実施形態では、糖溶液およびＡＡＶ画分の総体積はゾーナルロータの容積に等しいかまたはそれより少ない。ある実施形態では、糖溶液の体積のＡＡＶ画分の体積に対する比は１に等しいかまたはそれより小さい。
【００１３】
ある実施形態では、各糖溶液は、約５０％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。ある実施形態では、各糖溶液は、約５５％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。ある実施形態では、糖溶液の少なくとも１つは、約５０％（ｗ／ｗ）ショ糖よりも高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。ある実施形態では、糖溶液の少なくとも１つは、約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖よりも高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。ある実施形態では、糖溶液の少なくとも１つは、約６０％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００１４】
ある実施形態では、１つの糖溶液は約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、第２の糖溶液は約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、さらに任意選択で、第３の糖溶液は約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００１５】
ある態様では、２つの糖溶液がゾーナルロータにロードされる。ある実施形態では、２つの糖溶液がゾーナルロータにロードされ、１つの糖溶液は約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、第２の糖溶液は約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００１６】
ある態様では、少なくとも３つの糖溶液がゾーナルロータにロードされる。ある実施形態では、３つの糖溶液がゾーナルロータにロードされる。ある実施形態では、３つの糖溶液がゾーナルロータにロードされ、１つの糖溶液は約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、第２の糖溶液は約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、第３の糖溶液は約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００１７】
ある実施形態では、濃縮ＡＡＶ画分は、約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされ、さらにその約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液は、約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされる。
【００１８】
ある実施形態では、濃縮ＡＡＶ画分は、約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされ、その約４７％（ｗ／ｗ）〜約５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液は、約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされ、さらにその約５２％（ｗ／ｗ）〜約５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液は、約５７％（ｗ／ｗ）〜約６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液の前にロードされる。
【００１９】
ある実施形態では、各糖溶液は、等体積でゾーナルロータにロードされる。ある実施形態では、最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中の他の糖溶液の少なくとも１つの体積の２倍の体積でゾーナルロータにロードされる。ある実施形態では、最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中で組み合わされる全ての他の糖溶液の体積以上の体積でゾーナルロータにロードされる。ある実施形態では、最も低い糖濃度を有する糖溶液が、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積の少なくとも２倍の体積でゾーナルロータにロードされ、任意選択で、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積は、中間の糖濃度を有する糖溶液の体積に等しい。ある実施形態では、少なくとも２つの糖溶液がゾーナルロータにロードされ、最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中の少なくとも１つの他の糖溶液の体積の少なくとも２倍の体積でゾーナルロータにロードされる。ある実施形態では、少なくとも２つの糖溶液がゾーナルロータにロードされ、最も低い糖濃度を有する糖溶液が、ゾーナルロータ中の少なくとも１つの他の糖溶液の体積と同じ体積でゾーナルロータにロードされる。ある実施形態では、最も低い糖濃度を有する糖溶液が、濃縮ＡＡＶ画分の体積の半分の体積でゾーナルロータにロードされる。ある実施形態では、全糖密度勾配の体積のゾーナルロータにロードされるＡＡＶ画分の体積に対する比が約１：１〜約１：５である。
【００２０】
ある態様では、ＡＡＶ画分は緩衝溶液(buffered solution)を含む。ある実施形態では、緩衝溶液には、限定はされないが、リン酸バッファー、ヒスチジン（例えば、Ｌ−ヒスチジン）、クエン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ビシン、グリシン、Ｎ−グリシルグリシン、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、グリシルグリシン、リシン、アルギニン、リン酸ナトリウム、およびそれらの混合物が含まれる。ある実施形態では、ＡＡＶ画分はＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａＣｌを含む。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約２０〜約５０ｍＭの濃度であり、ＮａＣｌは約１５０ｍＭ〜約９００ｍＭの濃度である。ある実施形態では、ＮａＣｌは約５００ｍＭ〜約７５０ｍＭの濃度である。ある実施形態では、緩衝溶液は約７．４〜約９．０のｐＨを有する。ある実施形態では、バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび約５００ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨは８．５である。ある実施形態では、バッファーは、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび約７５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨは８．０である。ある実施形態では、緩衝溶液は４５〜５５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む。
【００２１】
ある実施形態では、各糖溶液は二糖または三糖を含む。ある実施形態では、二糖には、ショ糖（スクロース）、麦芽糖（マルトース）、乳糖（ラクトース）、およびそれらの組合せが含まれる。ある実施形態では、各糖溶液はショ糖を含む。ある実施形態では、糖溶液はそれぞれ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａＣｌをさらに含む。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約２０〜約５０ｍＭの濃度であり、ＮａＣｌは約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度である。ある実施形態では、緩衝溶液は約７．４〜約８．５のｐＨを有する。ある実施形態では、バッファーは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび８ｇ／ＬのＮａＣｌを含み、ｐＨは７．４である。
【００２２】
ある態様では、その方法は、超遠心機を、１０，０００ｒｐｍ未満の第１の回転速度で６０分未満、および約３０，０００〜約４０，０００ｒｐｍの範囲内の第２の回転速度で少なくとも４時間運転することを含む。
【００２３】
ある態様では、その方法は、超遠心機を、１０，０００ｒｐｍ未満の第１の回転速度で６０分未満、および約３０，０００〜約４０，０００ｒｐｍの範囲内の第２の回転速度で少なくとも１２時間運転することを含む。
【００２４】
ある実施形態では、第１の回転速度は約３，０００ｒｐｍ〜約６，０００ｒｐｍであり、任意選択で約４，０００ｒｐｍである。ある実施形態では、第２の回転速度は約３５，０００ｒｐｍであり、任意選択で約４〜約６時間維持される。ある実施形態では、第２の回転速度は少なくとも約１６時間または少なくとも２０時間維持される。ある実施形態では、第２の回転速度は約３５，０００ｒｐｍであり、任意選択で約１６〜約２０時間維持される。
【００２５】
ある実施形態では、ゾーナルロータにロードされる濃縮ＡＡＶ画分は、少なくとも１ｘ１０１２／ｍＬのＡＡＶカプシドを含む。ある実施形態では、その方法は、トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞を含む細胞培養物から上清を採取することを含む。ある実施形態では、その方法は、（ｉ）ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションの約３〜約５日後、あるいは（ｉｉ）細胞培養物が約５ｘ１０６細胞／ｍＬまたはそれより高い細胞密度を有しかつ５０％超の細胞生存率を有するときに、上清を採取することを含む。ある実施形態では、その方法は、採取した上清をデプス（または深層）ろ過によりろ過することを含む。ある実施形態では、その方法は、セルロースおよびパーライトを含みかつ約５００Ｌ／ｍ２の最小透過性を有するフィルターを通して採取した上清をろ過することを含む。ある実施形態では、その方法は、約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターを通して採取した上清をろ過することを含む。ある実施形態では、その方法は、限外濾過／ダイアフィルトレーション（ultra/diafiltration）システムを用いてＡＡＶ画分を濃縮することを含む。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶがＡＥＸクロマトグラフィカラムを素通りする条件下でＡＡＶ画分を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィカラムに添加することを含むステップの前、後、または前後に、限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを用いてＡＡＶ画分を濃縮することを含む。ある実施形態では、その方法は、溶媒界面活性剤を用いてＡＡＶ画分の脂質エンベロープウイルスを不活化することを含む。ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ画分をナノろ過して３５ｎｍより大きいウイルスを除去することを含む。ある実施形態では、その方法は、テンタクルゲルを含むカラムを用いてＡＥＸクロマトグラフィを実施することを含むポリッシングステップを含む。
【００２６】
ある実施形態では、方法は、（ｉ）ＡＡＶがＡＥＸクロマトグラフィカラムを素通りする条件下でＡＡＶ画分を陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィカラムに添加し、さらに（ｉｉ）ＡＡＶを含む素通り画分を回収することを含む。ある実施形態では、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭのＮａＣｌを含むローディングバッファーを用いてＡＡＶ画分をＡＥＸクロマトグラフィカラムに添加し、任意選択でローディングバッファーのｐＨは約８〜約９である。ある実施形態では、ローディングバッファーは約１１５ｍＭ〜約１３０ｍＭのＮａＣｌを含み、任意選択でローディングバッファーは約１２０ｍＭ〜約１２５ｍＭのＮａＣｌを含む。
【００２７】
ある実施形態では、宿主細胞タンパク質は除去される。ある実施形態では、宿主細胞タンパク質はＨＳＰ７０および／またはＬＤＨである。
【００２８】
例示的態様では、糖密度勾配から得られる画分中のＡＡＶ粒子の少なくともまたは約５５％は完全ＡＡＶカプシドである。例示的態様では、糖密度勾配から得られる画分中のＡＡＶ粒子の約６０％またはそれより多くが完全ＡＡＶカプシドである。例示的態様では、糖密度勾配から得られる画分中のＡＡＶ粒子の約６１％以上、約６２％以上、約６３％以上、約６４％以上、約６５％以上、約６６％以上、約６７％以上、約６８％以上、約６９％以上、約７０％以上、約７１％以上、約７２％以上、約７３％以上、約７４％以上、約７５％以上、約７６％以上、約７７％以上、約７８％以上、約７９％以上、約８０％以上、約８１％以上、約８２％以上、約８３％以上、約８４％以上、約８５％以上、約８６％以上、約８７％以上、約８８％以上、約８９％以上、約９０％以上、約９１％以上、約９２％以上、約９３％以上、約９４％以上、約９５％以上、約９６％以上、約９７％以上、約９８％以上、約９９％以上、または約１００％が完全ＡＡＶカプシドである。
【００２９】
ある実施形態では、その方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡによりＡＡＶ画分を試験することを含む。ある実施形態では、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡである。ある実施形態では、その方法は、定量ＰＣＲにより力価を測定するステップは含まない。
【００３０】
ある実施形態では、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０である。ある実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ８である。
【００３１】
上記および本明細書に記載の方法により生成されるＡＡＶ生成物もここに提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】本開示の例示的方法の概要。
【図２】時間的経過（日）にわたりプロットしたトランスフェクト細胞培養物の上清のウイルス粒子の量（ウイルスのグラム（ｇ））／ｍｌのグラフ。２Ｌスケールでの既存の標準条件（例えば、ｐＨ、温度、撹拌速度）下におけるＨＥＫ２９３細胞の培養でのＡＡＶ８の増殖（２つの異なるＰＥＩロットを用いて４つ並行運転）：ＦＩＸ特異的ｑＰＣＲにより測定した経時的な細胞培養上清中のタイターの増加（Ｔ０１＝トランスフェクション１日目、Ｔ０２＝トランスフェクション２日目など）。３ｘ２ＬスケールのバイオリアクターにおいてＦＩＸ特異的ｑＰＣＲによりタイターを測定した。
【図３】時間的経過（日）にわたりプロットしたトランスフェクト細胞培養物の上清のウイルス粒子の量（ウイルスのグラム（ｇ））／ｍｌのグラフ。２Ｌスケールでの既存の標準条件（例えば、ｐＨ、温度、撹拌速度）下におけるＨＥＫ２９３細胞の培養でのＡＡＶ８の増殖（２つの異なるＰＥＩロットを用いて４つ並行運転）：ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより測定した経時的な細胞培養上清中のタイターの増加（Ｔ０１＝トランスフェクション１日目、Ｔ０２＝トランスフェクション２日目など）。３ｘ２ＬスケールのバイオリアクターにおいてＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡによりベクターゲノムタイターを測定した。
【図４】２つの圧力センサにより連続的に測定したデプスろ過ステップ中の圧力および流速のグラフ（デプスろ過前の圧力１、デプスフィルター後でメンブレンフィルター前の圧力２）；流速＝流量計を用いて測定した流速）。
【図５】ネガティブ（非結合）モードでのＡＥＸ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑクロマトグラフィの素通り生成物のグラフ。
【図６】指示画分の銀染色（左）およびウェスタンブロット（右）。
【図７】指示画分の銀染色（左）およびウェスタンブロット（右）。
【図８】完全カプシドと空カプシドとを分離する超遠心分離溶出プロファイルのグラフ。画分は５０ｍｌずつ。
【図９】指示画分の銀染色（左）およびウェスタンブロット（右）。
【図１０】Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）  ＴＭＡＥでのＡＡＶ８の最終ポリッシング。
【図１１】本開示の例示的方法の概要。
【図１２】異なるＤＮＡ配列変異体を含む粒子を含め、水溶液中の５０−５５−６０％プロトコルを用いて分離された完全ＡＡＶ８粒子と空ＡＡＶ８粒子の超遠心分離を示す曲線。ベクターＤＮＡは、ヒト血液凝固第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ、二本鎖完全長、およそ４．８ｋＢであった。ＵＣプロファイルで示される個々の画分を４ｍｌのＡＥＸ−ＴＭＡＥカラムで処理し、最終生成物を調製した。調製画分の各々を分析した。画分１０〜１４をプールし、それは完全長ベクターＤＮＡを有するＡＡＶ８を含む均質な最終生成物を表す。画分１５〜２１、加えて画分２５および２６を別個に処理し、それらはＡＡＶ８粒子中に封入されたベクターＤＮＡの長さの減少を示す。これは、図１４および１５のｘＤＮＡアガロースゲル、ならびに図１６に示す分析用超遠心分離（ＡＵＣ）データに示される。
【図１３】指示画分の銀染色（左）およびウェスタンブロット（右）。
【図１４】実施例９に記載されるＡＡＶ８粒子の超遠心分離から採取された以下の試料の１％アガロースゲルの写真：レーン１＝マーカー；レーン２＝ＰＶ００７（元のＣｈａｔｈａｍプロセスに由来するＡＡＶ８）；レーン３＝画分１５；レーン４＝画分１６；レーン５＝画分１７；レーン６＝画分１８；レーン７＝画分１９；レーン８＝画分２０；レーン９＝画分２１；レーン１０＝画分２５；レーン１１＝画分２６；レーン１２＝臨床投与用の製品ＡＡＶ８；およびレーン１３＝マーカー。ＢＤＳ＝原薬（最終希釈されたＴＭＡＥ溶出液）。この図は、超遠心分離においてより高いショ糖密度で得られたＵＶピークのプールされた画分１０〜１４が、ベクターＤＮＡのより小さなＤＮＡ変異体の兆候のない高純度の単一ＤＮＡバンドを含むことを示す。
【図１５】実施例９に記載されるＡＡＶ８粒子の超遠心分離から採取された以下の試料の０．８％アルカリアガロースゲルの写真：レーン１＝マーカー；レーン２＝ＰＶ００７（以前の製造プロセスに由来するＡＡＶ８）；レーン３＝画分１５；レーン４＝画分１６；レーン５＝画分１７；レーン６＝画分１８；レーン７＝画分１９；レーン８＝画分２０；レーン９＝画分２１；レーン１０＝画分２５；レーン１１＝画分２６；レーン１２＝臨床投与用の製品ＡＡＶ８；およびレーン１３＝マーカー；ＢＤＳ＝原薬（最終希釈したＴＭＡＥ溶出液）。この図は、超遠心分離においてより高いショ糖密度で得られたＵＶピークのプールされた画分１０〜１４が、ベクターＤＮＡのより小さなＤＮＡ変異体の兆候のない高純度の単一ＤＮＡバンドを含むことを示す。
【図１６Ａ】開始材料として分析用超遠心分離（ＡＵＣ）の指示画分に由来するＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥの溶出プロファイルを示す。完全カプシドおよび空カプシドを矢印で示す。不完全なベクターＤＮＡを含むカプシド（本明細書では空とも規定される）の亜集団も同定する。表１７にもデータを示す。画分に関して図１２を参照のこと。
【図１６Ｂ】図１６Ａの続き。
【図１７】Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌ中の５０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール緩衝溶液内のＡＡＶ８を、５５％および６０％ショ糖溶液を有するショ糖密度勾配を用いて３５，０００で２０時間超遠心分離する、超遠心分離の溶出プロファイルのグラフである。ロードするＡＡＶ８試料のショ糖密度勾配に対する比は１：１である。ベクターＤＮＡはヒト血液凝固第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ、一本鎖自己相補的完全長（２．６ｋＢ）である。
【図１８】５５−６０％糖層プロトコルを用いる超遠心分離を用いたヒト血液凝固第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ（２．６ｋＢ）の一本鎖ベクターＤＮＡを含むＡＡＶ８の分離のグラフであり、ＡＡＶ８試料をＴｒｉｓ／ＮａＣｌ中の５０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール緩衝溶液においてロードする。各画分を：ＡＡＶ８  ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ８抗原、ＷＡＸ（弱陰イオン交換体−完全カプシド）により試験し、ＤＮＡ／ＡＡＶ比はＩＴＲ  ｑＰＣＲベクターゲノム（ｖｇ／ｍｌ）／ＡＡＶ８カプシド抗原ＥＬＩＳＡ（ｃｐ／ｍｌ）の比である。同じ軸上にグラフを示すことを可能にするためにデータを正規化した。
【図１９】超遠心分離の溶出プロファイルのグラフであり、Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌバッファー中の５０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール中のＡＡＶ８を、５５％および６０％ショ糖溶液を有するショ糖密度勾配により３５０００で２０時間超遠心分離する。ロードするＡＡＶ８試料のショ糖密度勾配に対する比は１：１であり、３，２００ｍｌのコア容積を有する。ベクターＤＮＡはヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子、完全長（〜４．８ｋＢ）である。
【図２０】画分８〜１０（図１９を参照のこと）からの沈降係数グラフのオーバーレイであり、亜種の分離を示す。矢印は、ＵＣ勾配における高密度を有する画分から低密度を有する画分へと、より低い質量を有するＡＡＶ８へのシフトを示す。画分８＞画分９＞画分１０。
【図２１】５０−５５−６０％糖層プロトコルを用いる超遠心分離を用いたヒト血液凝固第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ（２．６ｋＢ）の一本鎖ベクターＤＮＡを含むＡＡＶ８の分離のグラフであり、ＡＡＶ８試料はＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌ緩衝溶液中においてロードする。各画分を：ＡＡＶ８  ＩＴＲ  ｑＰＣＲおよびＥＬＩＳＡにより試験する。ＤＮＡ／ＡＡＶ比は、ＩＴＲ  ｑＰＣＲベクターゲノム（ｖｇ／ｍｌ）／ＡＡＶ８カプシド抗原ＥＬＩＳＡ（ｃｐ／ｍｌ）の比である。同じ軸上にグラフを示すことを可能にするためにデータを正規化した。
【図２２】Ｔｒｉｓ／ＮａＣｌバッファー中の５０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール中のＡＡＶ８を、５５％および６０％ショ糖溶液を有するショ糖密度勾配により３５０００で２０時間超遠心分離する、超遠心分離の溶出プロファイルのグラフである。ロードするＡＡＶ８試料のショ糖密度勾配に対する比は１：１であり、７，７００ｍｌのコア容積を有する。ベクターＤＮＡは、ヒト血液凝固第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ、一本鎖自己相補的完全長（〜２．６ｋＢ）である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）生成物を製造する方法、ＡＡＶを精製する方法、ならびに空ＡＡＶカプシドおよび完全ＡＡＶカプシドを含む濃縮ＡＡＶ画分から完全ＡＡＶカプシドを精製する方法をここに提供する。
【００３４】
有利なことに、本開示の方法は、大量の開始材料（例えば細胞培養物）に拡大可能である。ある実施形態では、本明細書に提供される方法は、少なくともまたは約１５０Ｌ、少なくともまたは約２５０Ｌ、少なくともまたは約５００Ｌ、少なくともまたは約６００Ｌ、少なくともまたは約７００Ｌ、少なくともまたは約８００Ｌ、少なくともまたは約９００Ｌ、あるいは少なくともまたは約１０００Ｌの体積からＡＡＶを精製することができる大規模法である。ある実施形態では、本方法は、少なくともまたは約１２５０Ｌ、少なくともまたは約１５００Ｌ、少なくともまたは約２０００Ｌ、少なくともまたは約２５００Ｌ、少なくともまたは約３０００Ｌ、少なくともまたは約４０００Ｌ、少なくともまたは約５０００Ｌ、少なくともまたは約６０００Ｌ、少なくともまたは約７０００Ｌ、少なくともまたは約８０００Ｌ、少なくともまたは約９０００Ｌ、少なくともまたは約１０，０００Ｌ、あるいはそれより多い開始材料（例えば、細胞培養物）の最小体積に拡大可能である。例えば、本開示の方法は、約１０００Ｌ、または約１０，０００Ｌ、または２５，０００Ｌ、あるいはそれらより多くの、ＡＡＶ産生細胞培養物の最小体積で実施される。
【００３５】
本明細書に記載されるＡＡＶを製造および精製する方法も、高タイターのＡＡＶ製造をもたらすため、利点を有する。ある実施形態では、少なくとも約１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が、約１０００Ｌの開始材料（例えば、細胞培養物）から製造される。ある実施形態では、少なくとも約１０１１ウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が約１０００Ｌの開始材料（例えば、細胞培養物）から製造される。ある実施形態では、少なくとも約１０１２ウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が約１０００Ｌの開始材料（例えば、細胞培養物）から製造される。ある実施形態では、少なくとも約１０１３ウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が約１０００Ｌの開始材料（例えば、細胞培養物）から製造される。ある実施形態では、少なくとも約１０１４ウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が約１０００Ｌの開始材料（例えば、細胞培養物）から製造される。ある実施形態では、少なくとも約１０１５ウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が約１０００Ｌの開始材料（例えば、細胞培養物）から製造される。ある実施形態では、少なくとも約２ｘ１０１５ウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が約１０００Ｌの開始材料（例えば、細胞培養物）から製造される。ある実施形態では、少なくとも約５ｘ１０１５ウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ生成物が約１０００Ｌの開始材料（例えば、細胞培養物）から製造される。
【００３６】
高収率のＡＡＶを提供する本開示の方法は、ある実施形態では、ナノろ過ステップで用いられるフィルターの排除規格よりも大きいウイルスを除去するためのナノろ過ステップを含む。このろ過ステップは、他の方法により得られるＡＡＶ生成物と比較して、最終ＡＡＶ生成物をヒト投与のためにより安全な生成物とすることができる。ナノろ過ステップは、ナノろ過ステップで用いられるフィルターの排除規格よりも大きいウイルスに関して有効なウイルス低減ステップであり、ある実施形態では、本明細書で更に説明するように、その方法がナノろ過によりＡＡＶ生成物から４ｌｏｇｓ超の汚染ウイルスを除去する能力を有することを意味する。
【００３７】
明細書に記載の方法の別の利点は、その方法が高純度のＡＡＶ生成物をもたらすことである。ある実施形態では、本開示の方法により製造されるＡＡＶ生成物は：宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸（例えば、宿主細胞ＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、空ウイルスベクター（切断または不完全ベクターＤＮＡを含むものを包含する）、不完全なタンパク質組成およびオリゴマー化構造を有するＡＡＶ粒子、または例えば非ＡＡＶ、脂質エンベロープウイルスなどの汚染ウイルス、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、プロテアソーム、汚染非ＡＡＶウイルス（例えば、脂質エンベロープウイルス）、宿主細胞培養成分（例えば、ペプチド、抗生物質）、プロセス関連成分（例えば、０．３％トリ−ｎ−ブチルホスファート；１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ポリエチレンアミン）、マイコプラズマ、発熱物質、細菌内毒素（エンドトキシン）、および外来性感染性物質：の内の１つ以上の汚染物質を実質的に含まない。ＡＡＶ生成物は、限定はされないが、そのような純度を調べるために当業者により用いられている、薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）、ゲル電気泳動、および高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、またはＩＴＲ  ｑＰＣＲなどの、標準的な分析方法により決定して、不純物を含まないと思われる場合、あるいは更なる精製が物質の酵素活性および生物活性などの物理的および化学的特性を検出可能に変化させないほど十分純粋である場合に、実質的に含まないと決定することができる。一実施形態では、用語「不純物を実質的に含まない」は、約５０％未満（乾燥質量で）、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満の非完全カプシドＡＡＶ物質を有するＡＡＶの調製物を包含する。別の実施形態では、用語「不純物を実質的に含まない」は、不純物が、ＡＡＶ生成物の体積の約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下、約３５％以下、約３０％以下、約２５％以下、約２０％以下、約１５％以下、約１０％以下、約５％以下、約４％以下、約３％以下、約２％以下、または約１％以下を表す調製物を包含する。
【００３８】
例示的実施形態では、本開示の方法は、開始材料（例えば、細胞培養物）中に見られる汚染物質の少なくともまたは約５０％が除去された精製ＡＡＶ生成物を提供する。例示的実施形態では、本開示の方法は、開始材料（例えば、細胞培養物）中に見られる汚染物質の少なくともまたは約６０％が除去された精製ＡＡＶ生成物を提供する。例示的実施形態では、本開示の方法は、開始材料（例えば、細胞培養物）中に見られる汚染物質の少なくともまたは約７０％が除去された精製ＡＡＶ生成物を提供する。例示的実施形態では、本開示の方法は、開始材料（例えば、細胞培養物）中に見られる汚染物質の少なくともまたは約８０％が除去された精製ＡＡＶ生成物を提供する。例示的実施形態では、本開示の方法は、開始材料（例えば、細胞培養物）中に見られる汚染物質の少なくともまたは約９０％が除去された精製ＡＡＶ生成物を提供する。
【００３９】
ある実施形態では、本開示の方法により製造されるＡＡＶ生成物は、ヒトへの投与に適している。ある実施形態では、ＡＡＶは組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。ある実施形態では、本開示の方法により製造されるＡＡＶ生成物は、無菌および／または適正製造基準（ＧＭＰ）グレードである。ある実施形態では、本開示の方法により製造されるＡＡＶ生成物は、遺伝子治療用医薬品に関して米国薬局方Ｃｈａｐｔｅｒ  １０４６または欧州薬局方に記載されている、あるいはアメリカ食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ）により定められている要件に適合する。
【００４０】
加えて、本明細書に記載の方法から製造されるＡＡＶ生成物は高力価である。ＡＡＶ生成物、例えばＡＡＶ８生成物の力価は、（１）マウス血漿１ｍＬ当たりの単位（ＦＩＸまたはＦＶＩＩＩ）として与えられるｉｎ  ｖｉｖｏ生物力価（biopotency）（例えば、マウスでの活性タンパク質の産生）；または（２）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物力価に関して記載することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物力価試験は、ＡＡＶベクターが細胞（例えばＨｅｐＧ２細胞）に形質導入する能力を測定し、そこでその細胞は目的タンパク質を培養液中に発現および分泌し、ＥＬＩＳＡ技術および／または酵素活性によりその量を決定する。ｉｎ  ｖｉｖｏ  およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで生物力価を測定する適切な方法は当業界で知られており、また実施例１２として本明細書にも記載されている。
【００４１】
さらなる実施形態では、本明細書に記載の方法から製造されるＡＡＶ生成物は、優れたＤＮＡ／ＡＡＶ比を実証する。例示的実施形態では、本明細書に記載の方法から製造されるＡＡＶ生成は、ベクターゲノム／ＡＡＶ（μｇ）の優れた比を示し、ＡＡＶ生成物が大量の完全ウイルス粒子を有することを実証する。ある実施形態では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳによりＡＡＶ画分を試験することを含む。ある実施形態では、ＡＡＶ画分中のカプシドの大部分は完全カプシドであるため、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ画分の力価に関する代理の読み出しを提供するのに十分である。
【００４２】
糖密度勾配超遠心分離
例示的実施形態では、本開示の方法は、超遠心分離ステップを含み、そのステップ中に密度勾配が形成される。特定の理論に束縛されるものではないが、超遠心分離ステップは空ＡＡＶカプシドから完全ＡＡＶカプシドを分離させることを可能にすると考えられる。本明細書で用いられる場合、ＡＡＶまたはＡＡＶカプシドまたはＡＡＶ粒子に関して、用語「完全ＡＡＶカプシド」は、完全なベクターゲノムを含むものを意味する。完全ＡＡＶカプシドは、レシピエントの患者に治療的利益をもたらすことができる。明細書で用いられる場合、ＡＡＶまたはＡＡＶカプシドまたはＡＡＶ粒子に関して、用語「空」は、完全な（すなわち全ての）ベクターゲノムを欠くものを意味する。ある実施形態では、「空」は、「不完全なベクターＤＮＡ」または「切断ベクターＤＮＡ」を含んでいてもよい。そのような空ＡＡＶまたは空ＡＡＶカプシドまたは空ＡＡＶ粒子は、ベクターゲノムの部分または全部を欠いていてよく、すなわち、それらは部分的に空または完全に空であってよく、従って、治療的利益をもたらすことはできない。
【００４３】
従って、本開示は、空ＡＡＶカプシドから完全ＡＡＶカプシドを分離する方法、または完全ＡＡＶカプシドおよび空ＡＡＶカプシドを含む濃縮ＡＡＶ画分から完全ＡＡＶカプシドを精製する方法を提供する。例示的態様では、本開示の方法は、（ｉ）それぞれ異なる糖濃度を有する少なくとも２つの糖溶液と共にＡＡＶ画分（例えばＡＡＶを含む溶液）をロータにロードするステップ、（ｉｉ）ロードされたロータを含む超遠心機をバッチモードで運転して糖密度勾配を形成するステップ、および（ｉｉｉ）前記糖密度勾配の画分を取得して完全ＡＡＶカプシドを含むＡＡＶ画分を得るステップを含む。ある実施形態では、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、または少なくとも６つの糖溶液をロードする。ある実施形態では、２つの糖溶液をロードする。ある実施形態では、３つの糖溶液をロードする。
【００４４】
ロードの順序は、最初にＡＡＶ画分（例えば、ＡＡＶを含む溶液）、次いで最も低い濃度の糖溶液、その後、次に高い濃度の糖溶液、などといった順序でよい。
【００４５】
例示的態様では、その方法は、少なくとも２つの糖溶液と共にＡＡＶ画分（例えばＡＡＶを含む溶液）をロータにロードすることを含み、その各糖溶液は、（ａ）異なる糖濃度を有し、かつ（ｂ）約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。ある実施形態では、その方法は、約５０％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖または約５５％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００４６】
ある実施形態では、少なくとも１つの糖溶液は５２〜５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、少なくとも別の１つの糖溶液は５７〜６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、さらに任意選択で、別の糖溶液は４７〜５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００４７】
ある実施形態では、少なくとも１つの糖溶液は５４〜５６％（ｗ／ｗ）の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、少なくとも別の１つの糖溶液は５９〜６１％（ｗ／ｗ）の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、さらに任意選択で、別の糖溶液は４９〜５１％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００４８】
ある実施形態では、少なくとも１つの糖溶液は約５４％（ｗ／ｗ）ショ糖より高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、少なくとも別の１つの糖溶液は約５９％（ｗ／ｗ）ショ糖より高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、さらに任意選択で、別の糖溶液は約４９％（ｗ／ｗ）ショ糖より高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００４９】
ある実施形態では、少なくとも１つの糖溶液は約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはそれより高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、少なくとも別の１つの糖溶液は約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはそれより高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、さらに任意選択で、別の糖溶液は約５０％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはそれより高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００５０】
ある実施形態では、少なくとも１つの糖溶液は約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、少なくとも別の１つの糖溶液は約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、さらに任意選択で、別の糖溶液は約５０％（ｗ／ｗ）ショ糖のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００５１】
ロードする順序は、最初にＡＡＶ画分（例えば、ＡＡＶを含む溶液）、次いで最も低い濃度の糖溶液、その後、次に高い濃度の糖溶液（例えば、最初に４７〜５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液、存在する場合には、次に５２〜５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液、およびその後、５７〜６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液）であってよい。
【００５２】
５２〜５８％（ｗ／ｗ）ショ糖、５３〜５７％（ｗ／ｗ）ショ糖、または約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む少なくとも１つの糖溶液、ならびに５７〜６３％（ｗ／ｗ）ショ糖、５８〜６２％（ｗ／ｗ）ショ糖、または約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む少なくとも別の１つの糖溶液を用いる実施形態の利点は、そのような糖溶液により形成される密度勾配がＡＡＶカプシドの分離の改善をもたらすことができることである。
【００５３】
例示的態様では、その方法は、少なくとも３つの糖溶液と共にＡＡＶ画分（例えばＡＡＶを含む溶液）をロータにロードすることを含み、その各糖溶液は、（ａ）異なる糖濃度を有し、かつ（ｂ）約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。ある実施形態では、その方法は、約５０％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００５４】
ある実施形態では、少なくとも１つの糖溶液は４７〜５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、少なくとも別の１つの糖溶液は５２〜５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、さらに少なくとも別の１つの糖溶液は、５７〜６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００５５】
ある実施形態では、少なくとも１つの糖溶液は４９〜５１％（ｗ／ｗ）の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、少なくとも別の１つの糖溶液は５４〜５６％（ｗ／ｗ）の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、さらに少なくとも別の１つの糖溶液は５９〜６１％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００５６】
ある実施形態では、少なくとも１つの糖溶液は約４９％（ｗ／ｗ）ショ糖より高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、少なくとも別の１つの糖溶液は約５４％（ｗ／ｗ）ショ糖より高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、さらに少なくとも別の１つの糖溶液は約４９％（ｗ／ｗ）ショ糖より高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００５７】
ある実施形態では、少なくとも１つの糖溶液は約５０％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはそれより高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、少なくとも別の１つの糖溶液は約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはそれより高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、さらに少なくとも別の１つの糖溶液は約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはそれより高いショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００５８】
ある実施形態では、少なくとも１つの糖溶液は約５０％（ｗ／ｗ）ショ糖のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、少なくとも別の１つの糖溶液は約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、さらに少なくとも別の１つの糖溶液は約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。
【００５９】
ある実施形態では、ロードする順序は、最初に４７〜５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液、次に５２〜５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液、さらにその後、５７〜６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液であってよい。
【００６０】
ロードする順序は、最初にＡＡＶ画分（例えば、ＡＡＶを含む溶液）、次いで最も低い濃度の糖溶液、その後、次に高い濃度の糖溶液（例えば、最初に４７〜５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液、次に５２〜５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液、さらにその後、５７〜６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む糖溶液）であってよい。
【００６１】
例示的態様では、ＡＡＶ画分および／または糖溶液の各々は、例えば、緩衝剤、塩などの付加的成分を含んでいてよい。ある実施形態では、ＡＡＶ画分および／または糖溶液の各々は、それぞれ、約５．５〜約８．５のｐＨを安定化させるために任意の緩衝物質またはその組合せを含む。許容可能な緩衝剤の例は当業界でよく知られており、限定はされないが、リン酸バッファー、ヒスチジン（例えば、Ｌ−ヒスチジン）、クエン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ビシン、グリシン、Ｎ−グリシルグリシン、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、グリシルグリシン、リシン、アルギニン、リン酸ナトリウム、およびそれらの混合物が含まれる。ある実施形態では、バッファーは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌである。バッファー／画分／溶液のｐＨは、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０であってよい。バッファー／画分／溶液のｐＨは、７．０〜９．０、７．１〜８．９、７．２〜９．０、７．０〜８．８、７．２〜８．８、７．１〜８．６、７．３〜８．９、７．４〜９．０、または７．４〜８．５であってよい。ある実施形態では、バッファー、ＡＡＶ画分および／または糖溶液の各々は、それぞれ約７．４のｐＨを有する。ある実施形態では、バッファー、ＡＡＶ画分および／または糖溶液の各々は、それぞれ約８．０のｐＨを有する。ある実施形態では、バッファー、ＡＡＶ画分および／または糖溶液の各々は、それぞれ約８．５のｐＨを有する。
【００６２】
ある実施形態では、バッファーはＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌであってよい。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約２０〜約５０ｍＭの濃度である。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、または約１００ｍＭの濃度である。ある実施形態では、ＮａＣｌは、約１００ｍＭ〜約１Ｍ、約１５０ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、または約５００ｍＭ〜約７５０ｍＭの濃度である。ある実施形態では、ＮａＣｌの濃度は、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１２５ｍＭ約１３０ｍＭ、約１３６ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、約４００ｍＭ、約４２５ｍＭ、約４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、約５００ｍＭ、約５２５ｍＭ、約５５０ｍＭ、約５７５ｍＭ、約６００ｍＭ、約６２５ｍＭ、約６５０ｍＭ、約６７５ｍＭ、約７００ｍＭ、約７２５ｍＭ、約７５０ｍＭ、約７７５ｍＭ、約８００ｍＭ、約８２５ｍＭ、約８５０ｍＭ、約８７５ｍＭ、約９００ｍＭ、約９２５ｍＭ、約９５０ｍＭ、約９７５ｍＭ、または約１Ｍである。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、または約２０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度であり、かつＮａＣｌは、約１００ｍＭ〜約１Ｍ、約１５０ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、または約５００ｍＭ〜約７５０ｍＭの濃度である。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約５０ｍＭの濃度であり、かつＮａＣｌは約５００ｍＭの濃度である。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約２０ｍＭの濃度であり、かつＮａＣｌは約１３６ｍＭの濃度である。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約５０ｍＭの濃度であり、かつＮａＣｌは約７５０ｍＭの濃度である。ある実施形態では、バッファーは約７．４のｐＨを有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌバッファーである。ある実施形態では、バッファーは、約８．０のｐＨを有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌバッファーである。ある実施形態では、バッファーは、約８．５のｐＨを有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌである。
【００６３】
ある実施形態では、ＡＡＶ画分溶液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび５００ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ８．５である。ある実施形態では、ＡＡＶ画分溶液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび７５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ８．０である。ある実施形態では、糖溶液は、約２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび１３６ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ７．４である。
【００６４】
例示的態様では、その方法は、緩衝エチレングリコール溶液を含むＡＡＶ画分（例えばＡＡＶを含む溶液）、ならびに少なくとも２つの糖溶液をロータにロードすることを含み、その各糖溶液は、（ａ）異なる糖濃度を有し、かつ（ｂ）約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。ある実施形態では、その方法は、約５０％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖または約５５％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。糖濃度の範囲は上述したものと同じである。緩衝エチレングリコール溶液を使用することの利点は、緩やかな密度勾配を実施できることである。特定の理論に束縛されるものではないが、エチレングリコール溶液は超遠心マトリックスの粘度および／または密度特性を変化させうる。驚くべきことに、処理時間の増加と組み合わせたエチレングリコールの添加は緩やかな密度勾配を作り出し、それは、空カプシド由来のより小さいベクターＤＮＡ（例えば、≦３ｋｂまたは≦５ｋｂ）を含む空カプシドからの完全カプシドの分離を可能にすることが見いだされた。本明細書で用いられる場合、「緩やかな密度勾配（shallow gradients）」は、溶液密度または勾配形成溶質濃度（例えば、ショ糖密度勾配）が距離に対して徐々に変化する勾配である。これは、溶液密度または勾配形成溶質濃度が距離に対して急速に変化する勾配と対照的である。例えば、約２．５〜約５．０ｋｂのＤＮＡベクターを有するＡＡＶは、ローディングバッファーが約４５％〜約５５％のエチレングリコール溶液を含む場合により効率的に分離される。ある実施形態では、ＡＡＶ画分溶液でのエチレングリコールの使用は、約２．５〜約３．０ｋｂを有するＤＮＡベクターの分離を可能にする。ある実施形態では、その方法は、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３．０、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４．０、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、または約５．０ｋｂを有するＤＮＡベクターのより高い分離度（resolution）を可能にする。ある実施形態では、分離度の向上は少なくとも３つの異なる糖濃度を有する糖溶液を用いて生じる。ある実施形態では、分離度の向上は少なくとも２つの異なる糖濃度を有する糖溶液を用いて生じる。ある実施形態では、分離度の向上は２つの異なる糖濃度を有する糖溶液を用いて生じる。ある実施形態では、分離度の向上は、５２〜５８％（ｗ／ｗ）ショ糖、５３〜５７％（ｗ／ｗ）ショ糖、または約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む１つの糖溶液、および５７〜６３％（ｗ／ｗ）ショ糖、５８〜６２％（ｗ／ｗ）ショ糖、または約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖のショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む少なくとも別の１つの糖溶液を用いる場合に生じる。
【００６５】
例示的態様では、その方法は、緩衝エチレングリコール溶液と共にＡＡＶ画分（例えばＡＡＶを含む溶液）、ならびに少なくとも３つの糖溶液をロータにロードすることを含み、その各糖溶液は、（ａ）異なる糖濃度を有し、かつ（ｂ）約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。ある実施形態では、その方法は、約５０％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含む。糖濃度の範囲は上述したものと同じである。
【００６６】
緩衝エチレングリコール溶液は、約５．５〜約８．５のｐＨを安定化させるために任意の緩衝物質またはその組合せを含んでいてよい。許容可能な緩衝剤の例は当業界でよく知られており、限定はされないが、リン酸バッファー、ヒスチジン、クエン酸ナトリウム、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ、ビシン、グリシン、Ｎ−グリシルグリシン、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、グリシルグリシン、リシン、アルギニン、リン酸ナトリウム、およびそれらの混合物が含まれる。バッファーは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌまたはＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌである。バッファー／溶液のｐＨは、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８．０、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、または９．０であってよい。バッファー／溶液のｐＨは、７．０〜９．０、７．１〜８．９、７．２〜９．０、７．０〜８．８、７．２〜８．８、７．１〜８．６、７．３〜８．９、７．４〜９．０、または７．４〜８．５であってよい。ある実施形態では、バッファー／溶液は、約７．４のｐＨを有する。ある実施形態では、バッファー／溶液は、約８．０のｐＨを有する。ある実施形態では、バッファー／溶液は、約８．５のｐＨを有する。
【００６７】
ある実施形態では、緩衝エチレングリコール溶液は、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌを含む。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭまたは約２０〜約５０ｍＭの濃度である。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、または約１００ｍＭの濃度である。ある実施形態では、ＮａＣｌは、約１００ｍＭ〜約１Ｍ、約１５０ｍＭ〜約７５０ｍＭ、または約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度である。ある実施形態では、ＮａＣｌの濃度は、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１２５ｍＭ約１３０ｍＭ、約１３６ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２２５ｍＭ、約２５０ｍＭ、約２７５ｍＭ、約３００ｍＭ、約３２５ｍＭ、約３５０ｍＭ、約３７５ｍＭ、約４００ｍＭ、約４２５ｍＭ、約４５０ｍＭ、約４７５ｍＭ、約５００ｍＭ、約５２５ｍＭ、約５５０ｍＭ、約５７５ｍＭ、約６００ｍＭ、約６２５ｍＭ、約６５０ｍＭ、約６７５ｍＭ、約７００ｍＭ、約７２５ｍＭ、約７５０ｍＭ、約７７５ｍＭ、約８００ｍＭ、約８２５ｍＭ、約８５０ｍＭ、約８７５ｍＭ、約９００ｍＭ、約９２５ｍＭ、約９５０ｍＭ、約９７５ｍＭ、または約１Ｍである。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭまたは約２０ｍＭ〜約５０ｍＭの濃度であり、およびＮａＣｌは、約１００ｍＭ〜約１Ｍ、約１５０ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、または約５００ｍＭ〜約７５０ｍＭの濃度である。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約５０ｍＭの濃度であり、かつＮａＣｌは約５００ｍＭの濃度である。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ約２０ｍＭの濃度であり、かつＮａＣｌは約１３６ｍＭの濃度である。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約５０ｍＭの濃度であり、かつＮａＣｌは約７５０ｍＭの濃度である。ある実施形態では、バッファーは約７．４のｐＨを有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌバッファーである。ある実施形態では、バッファーは、約８．０のｐＨを有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌバッファーである。ある実施形態では、バッファーは、約８．５のｐＨを有するＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌバッファーである。
【００６８】
緩衝エチレングリコール溶液は、４５％〜５５％（ｗ／ｗ）、４６％〜５４％（ｗ／ｗ）、４５％〜５３％（ｗ／ｗ）、４７％〜５５％（ｗ／ｗ）、または４８％〜５２％（ｗ／ｗ）のバッファー（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌ）を含んでいてよい。緩衝エチレングリコール溶液は、４０％（ｗ／ｗ）、４１％（ｗ／ｗ）、４２％（ｗ／ｗ）、４３％（ｗ／ｗ）、４４％（ｗ／ｗ）、４５％（ｗ／ｗ）、４６％（ｗ／ｗ）、４７％（ｗ／ｗ）、４８％（ｗ／ｗ）、４９％（ｗ／ｗ）、５０％（ｗ／ｗ）、５１％（ｗ／ｗ）、５２％（ｗ／ｗ）、５３％（ｗ／ｗ）、５４％（ｗ／ｗ）、５５％（ｗ／ｗ）、５６％（ｗ／ｗ）、５７％（ｗ／ｗ）、５８％（ｗ／ｗ）、５９％（ｗ／ｗ）、または６０％（ｗ／ｗ）のバッファー（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌ）を含んでいてよい。緩衝エチレングリコール溶液は水溶液であってよい。
【００６９】
ある実施形態では、緩衝エチレングリコール溶液は、４５〜５５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、および７５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ８．０である。ある実施形態では、緩衝エチレングリコール溶液は、５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、および７５０ｍＭのＮａＣｌを含み、ｐＨ８．０である。
【００７０】
ある実施形態では、超遠心機ロータコアの容積は約８００ｍｌ〜約９０００ｍｌである。ある実施形態では、超遠心機ロータコアの容積は約８００ｍｌ〜約７７００ｍｌである。ある実施形態では、超遠心機ロータコアの容積は約８００ｍｌである。ある実施形態では、超遠心機ロータコアの容積は約１６００ｍｌである。ある実施形態では、超遠心機ロータコアの容積は約３２００ｍｌである。ある実施形態では、超遠心機ロータコアの容積は約７７００ｍｌである。
【００７１】
ある実施形態では、糖溶液は一定流速でロードされる。ある実施形態では、一定流速は、約０．２５Ｌ／ｈ（時）〜約１０Ｌ／ｈまたは約１．５Ｌ／ｈ〜約７Ｌ／ｈである。ある実施形態では、一定流速は、約０．２５Ｌ／ｈ、約０．５Ｌ／ｈ、約０．７５Ｌ／ｈ、約１Ｌ／ｈ、約１．２５Ｌ／ｈ、約１．５Ｌ／ｈ、約１．７５Ｌ／ｈ、約２Ｌ／ｈ、約２．５Ｌ／ｈ、約３Ｌ／ｈ、約３．５Ｌ／ｈ、約４Ｌ／ｈ、約４．５Ｌ／ｈ、約５Ｌ／ｈ、約５．５Ｌ／ｈ、約６Ｌ／ｈ、約６．５Ｌ／ｈ、約７Ｌ／ｈ、約７．５Ｌ／ｈ、約８Ｌ／ｈ、約８．５Ｌ／ｈ、約９Ｌ／ｈ、約９．５Ｌ／ｈ、または約１０Ｌ／ｈである。
【００７２】
ある実施形態では、その方法は、ロータに約４５〜５５％（ｗ／ｗ）のＡＡＶ画分（緩衝エチレングリコール溶液と共にまたは無しで）および約４５〜５５％（ｗ／ｗ）の少なくとも２つの糖溶液をロードすることを含む。例示的実施形態では、その方法は、ロータに約５０％（ｗ／ｗ）のＡＡＶ画分（緩衝エチレングリコール溶液と共にまたは無しで）および約５０％（ｗ／ｗ）の少なくとも２つの糖溶液をロードすることを含む。ある実施形態では、超遠心機ロータコアの容積は約８００ｍｌ〜約３２００ｍｌであり、ロータに約４５〜５５％（ｗ／ｗ）のＡＡＶ画分（緩衝エチレングリコール溶液と共にまたは無しで）および約４５〜５５％（ｗ／ｗ）の少なくとも２つの糖溶液をロードする。ある実施形態では、超遠心機ロータコアの容積は約８００ｍｌ〜約３２００ｍｌであり、ロータ全体に、約５０％（ｗ／ｗ）ＡＡＶ画分（緩衝エチレングリコール溶液と共にまたは無しで）および約５０％（ｗ／ｗ）の少なくとも２つの糖溶液をロードする。例えば、ロータコアが８００ｍｌの場合、ＡＡＶ画分は４００ｍｌであってよく、全体の糖溶液部分は４００ｍｌである。
【００７３】
ある実施形態では、その方法は、ロータに約６５〜８５％（ｗ／ｗ）のＡＡＶ画分（緩衝エチレングリコール溶液と共にまたは無しで）および約１５〜３５％（ｗ／ｗ）の少なくとも２つの糖溶液をロードすることを含む。ある実施形態では、その方法は、ロータに約７０〜８０％（ｗ／ｗ）のＡＡＶ画分（緩衝エチレングリコール溶液と共にまたは無しで）および約２０〜３０％（ｗ／ｗ）の少なくとも２つの糖溶液をロードすることを含む。例示的実施形態では、その方法は、ロータに約７５％（ｗ／ｗ）のＡＡＶ画分（緩衝エチレングリコール溶液と共にまたは無しで）および約２５％（ｗ／ｗ）の少なくとも２つの糖溶液をロードすることを含む。例示的実施形態では、その方法は、ロータに約７４％（ｗ／ｗ）のＡＡＶ画分（緩衝エチレングリコール溶液と共にまたは無しで）および約２６％（ｗ／ｗ）の少なくとも２つの糖溶液をロードすることを含む。ある実施形態では、超遠心機ロータコアの容積は、約７７００ｍｌ〜約９０００ｍｌであり、ロータに約７０〜８０％（ｗ／ｗ）のＡＡＶ画分（緩衝エチレングリコール溶液と共にまたは無しで）および約２０〜３０％（ｗ／ｗ）の少なくとも２つの糖溶液をロードする。ある実施形態では、超遠心機ロータコアの容積は、約７７００ｍｌ〜約９０００ｍｌであり、ロータに約７５％（ｗ／ｗ）のＡＡＶ画分（緩衝エチレングリコール溶液と共にまたは無しで）および約２５％（ｗ／ｗ）の少なくとも２つの糖溶液をロードする。ある実施形態では、超遠心機ロータコアの容積は約７７００ｍｌ〜約９０００ｍｌであり、ロータに約７４％（ｗ／ｗ）のＡＡＶ画分（緩衝エチレングリコール溶液と共にまたは無しで）および約２６％（ｗ／ｗ）の少なくとも２つの糖溶液をロードする。例えば、ロータコアが７７００ｍｌの場合、ＡＡＶ画分は６１００ｍｌであってよく、全体の糖溶液部分は１６００ｍｌであってよい。
【００７４】
ある実施形態では、糖溶液はおよそ同じ体積で添加される。ある実施形態では、その方法は、少なくとも２つの糖溶液をロードすることを含み、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、ロータ中の他の糖溶液の体積と等しい体積でロータにロードされる。ある実施形態では、その方法は、少なくとも２つの糖溶液をロードすることを含み、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、ロータ中の他の糖溶液の１つの体積の２倍の体積でロータにロードされる。ある実施形態では、その方法は、少なくとも２つの糖溶液をロードすることを含み、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、ロータ中の他の糖溶液の１つの体積の約１．６倍または約２．６倍の体積でロータにロードされる。ある実施形態では、その方法は、少なくとも２つの糖溶液をロードすることを含み、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、ロータ中の他の糖溶液の１つの体積の半分の体積でロータにロードされる。ある実施形態では、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積の２倍の体積でロータにロードされ、任意選択で、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積は、中間の糖濃度を有する糖溶液の体積に等しい。ある実施形態では、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積の約２．６倍の体積でロータにロードされ、任意選択で、中間の糖濃度を有する糖溶液の体積は、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積の約１．６倍である。ある実施形態では、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積に等しい体積でロータにロードされ、任意選択で、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積は、中間の糖濃度を有する糖溶液の体積の半分である。ある実施形態では、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、ＡＡＶ画分の体積の半分の体積でロータにロードされる。ある実施形態では、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、ＡＡＶ画分の体積の四分の三（３／４）の体積でロータにロードされる。ある実施形態では、ＡＡＶ画分の体積に対する糖溶液の体積の比は、１未満であるかまたは１に等しい。
【００７５】
ある実施形態では、その方法は、２つの糖溶液をロードすることを含み、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、ロータ中の最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積と等しい体積でロータにロードされる。ある実施形態では、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、ＡＡＶ画分の体積の半分の体積でロータにロードされる。ある実施形態では、ＡＡＶ画分の体積に対する糖溶液の体積の比は、１未満であるかまたは１に等しい。
【００７６】
ある実施形態では、その方法は、３つの糖溶液をロードすることを含み、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、ロータ中の他の２つの糖溶液の１つの体積の少なくとも２倍の体積でロータにロードされる。ある実施形態では、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積の２倍の体積でロータにロードされ、任意選択で、最も高い糖濃度を有する糖溶液の体積は、中間の糖濃度を有する糖溶液の体積に等しい。例えば、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、約７５０ｍｌ〜約９００ｍｌまたは約８００ｍｌの体積であってよく、中間の糖濃度を有する糖溶液は、約３５０ｍｌ〜約４５０ｍｌまたは約４００ｍｌの体積であってよく、さらに最も高い糖濃度を有する糖溶液は、約３５０ｍｌ〜約４５０ｍｌまたは約４００ｍｌの体積であってよい。ある実施形態では、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、ＡＡＶ画分の体積の半分の体積でロータにロードされる。ある実施形態では、最も低い糖濃度を有する糖溶液は、ＡＡＶ画分の体積の３／４の体積でロータにロードされる。ある実施形態では、ＡＡＶ画分の体積に対する糖溶液の体積の比は、１未満であるかまたは１に等しい。例示的態様では、ロータはゾーナルロータである。ある実施形態では、糖溶液およびＡＡＶ画分の総体積は、ゾーナルロータの容積未満であるかまたはそれに等しい。ある実施形態では、ゾーナルロータ中の溶液の総体積は約８００ｍｌ〜９Ｌである。ある実施形態では、糖溶液の体積はゾーナルロータの容積の約５０％超であるかまたは約５０％に等しい。例えば、糖溶液の体積は、約３２００ｍｌ以下（例えば、約３２００ｍｌ、約１６００ｍｌ、または約８００ｍｌ）の体積を有するゾーナルロータの容積の約５０％超であるかまたは約５０％に等しい。ある実施形態では、例えば、７Ｌより大きい（例えば７．７Ｌ）コアが用いられる場合、糖溶液の体積は、ゾーナルロータの容積の約２５％未満であるかまたは約２５％に等しい。
【００７７】
ある実施形態では、全糖密度勾配の体積の、ゾーナルロータにロードされるＡＡＶ画分の体積に対する比は、約１：１〜約１：５である。ある実施形態では、全糖密度勾配の体積の、ゾーナルロータにロードされるＡＡＶ画分の体積に対する比は、約１：１、約１：１．２５、約１：１．５、約１：１．７５、約１：２、約１：２．２５、約１：２．５、約１：２．７５、約１：３、約１：３．２５、約１：３．５、約１：３．７５、約１：４、約１：４．２５、約１：４．５、約１：４．７５、または約１：５である。
【００７８】
例示的態様では、その方法は、少なくとも２つの糖溶液と共に、濃縮ＡＡＶ画分をゾーナルロータにロードすることを含み、その各糖溶液は異なる糖濃度を有し、かつ各々約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度に相当する濃度で糖を含み、（Ａ）糖溶液の体積はゾーナルロータの容積の約５０％超であるかまたは約５０％に等しい、（Ｂ）糖溶液およびＡＡＶ画分の総体積は、ゾーナルロータの容積未満であるかまたはそれに等しい、（Ｃ）ＡＡＶ画分の体積に対する糖溶液の体積の比は１未満であるかまたは１に等しい、あるいは（Ｄ）（Ａ）、（Ｂ）および（Ｃ）の組合せである。ある実施形態では、ゾーナルロータ中の溶液の総体積は約８００ｍｌ〜９Ｌである。ある実施形態では、糖溶液の体積は、ゾーナルロータの容積の約５０％超であるかまたは約５０％に等しい。例えば、糖溶液の体積は、約３２００ｍｌ以下の体積（例えば、約３２００ｍｌ、約１６００ｍｌ、または約８００ｍｌ）のゾーナルロータの容積の約５０％超であるかまたは約５０％に等しい。ある実施形態では、例えば、７Ｌより大きい（例えば７．７Ｌ）コアが用いられる場合、糖溶液の体積は、ゾーナルロータの容積の約２５％未満であるかまたは約２５％に等しい。
【００７９】
例示的態様では、各糖溶液は、可溶性炭水化物または炭水化物混合物を含む。ある実施形態では、各糖溶液は、二糖（例えば、ショ糖（スクロース）、麦芽糖（マルトース）、乳糖（ラクトース））および／または三糖を含む。ある実施形態では、糖溶液の密度は、約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）の範囲の濃度を有するショ糖溶液の密度に等しい。ある実施形態では、糖溶液の少なくとも１つは、所定の温度で、約６０％ショ糖に等しい密度を有する。ある実施形態では、その範囲は上述した通りである。
【００８０】
本明細書での目的のために、糖溶液中の糖が、特定範囲内のまたは特定量（％（ｗ／ｗ））のショ糖濃度に相当する濃度を有することを条件として、ショ糖以外の糖を用いてもよい。ショ糖の濃度は、ブリックス度（「°Ｂｘ」）での水溶液の糖含量を決定する屈折率法を用いて決定することができ、１ブリックス度は、１００ｇの溶液中の１ｇのショ糖である。ブリックス度は、質量％としての溶液の強度を表す−溶液が純粋なショ糖以外の溶解固形物を含有する場合、°Ｂｘは単に溶解固形物含量を概算する。ショ糖の濃度は、純粋な溶液の場合、密度測定によっても特定することができる。同一性および濃度の両方の決定が必要な場合、市販の酵素キットを用いて濃度を決定しさらに他の二糖および炭水化物からショ糖を識別することができる。例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）からカタログ番号ＳＣＡ２０として販売されているものなどのショ糖アッセイキットを用いることができる。
【００８１】
例示的態様では、各糖溶液はショ糖を含む。例示的態様では、その方法は、少なくとも２つのショ糖溶液と共に、ＡＡＶ画分（例えばＡＡＶを含む溶液）をロータ（例えばゾーナルロータ）にロードすることを含み、その各ショ糖溶液は、（ａ）異なるショ糖濃度を有し、かつ（ｂ）約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶ濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は５２〜５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含み、少なくとも別の１つの溶液は５７〜６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含み、さらに任意選択で、少なくとも別の１つの溶液は４７〜５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は５４〜５６％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含み、少なくとも別の１つの溶液は５９〜６１％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含み、さらに任意選択で、少なくとも別の１つの溶液は４９〜５１％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は約５４％（ｗ／ｗ）ショ糖より高い濃度でショ糖を含み、少なくとも別の１つの溶液は約５９％（ｗ／ｗ）ショ糖より高い濃度でショ糖を含み、さらに任意選択で、少なくとも別の１つの溶液は約４９％（ｗ／ｗ）ショ糖より高い濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはそれより高い濃度でショ糖を含み、少なくとも１つの溶液は約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはそれより高い濃度でショ糖を含み、さらに任意選択で、少なくとも１つの溶液は約５０％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはより高い濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖の濃度でショ糖を含み、少なくとも１つの溶液は約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の濃度でショ糖を含み、さらに任意選択で、少なくとも１つの溶液は約５０％（ｗ／ｗ）ショ糖の濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、ＡＡＶを含む溶液は緩衝溶液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌバッファー）である。ある実施形態では、ＡＡＶを含む溶液は、上述したような緩衝エチレングリコール溶液である。ある実施形態では、緩衝エチレングリコール溶液は水溶液である。ある実施形態では、緩衝エチレングリコール溶液は、４５〜５５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、ならびにＴｒｉｓ−ＨＣｌおよびＮａＣｌを含有するバッファーを含む水溶液である。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約２０〜約５０ｍＭの濃度である。ある実施形態では、ＮａＣｌは約１００ｍＭ〜約７５０ｍＭまたは約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭの濃度である。ある実施形態では、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは約２０〜約５０ｍＭの濃度であり、かつＮａＣｌは約１００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、または約５００ｍＭ〜約７５０ｍＭの濃度である。ある実施形態では、ＡＡＶを含む溶液のｐＨは、７．４〜８．５、７．６〜８．３、７．８〜８．５、７．４〜７．８、７．６〜８．０、７．８〜８．２、または８．０〜８．５である。
【００８２】
例示的態様では、その方法は、少なくとも２つのショ糖溶液と共に、ＡＡＶ画分（例えばＡＡＶを含む溶液）をロータ（例えばゾーナルロータ）にロードすることを含み、その各ショ糖溶液は、（ａ）異なるショ糖濃度を有し、かつ（ｂ）約５０％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶ濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は５２〜５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含み、少なくとも別の１つの溶液は５７〜６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は５４〜５６％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含み、少なくとも別の１つの溶液は５９〜６１％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は約５４％（ｗ／ｗ）ショ糖より高い濃度でショ糖を含み、少なくとも別の１つの溶液は約５９％（ｗ／ｗ）ショ糖より高い濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはそれより高い濃度でショ糖を含み、少なくとも１つの溶液は約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはそれより高い濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しい濃度でショ糖を含み、少なくとも１つの溶液は約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、ＡＡＶを含む溶液は緩衝溶液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌバッファー）である。ある実施形態では、ＡＡＶを含む溶液は上述したような緩衝エチレングリコール溶液である。
【００８３】
例示的態様では、その方法は、少なくとも３つのショ糖溶液と共に、ＡＡＶ画分（例えばＡＡＶを含む溶液）をロータ（例えばゾーナルロータ）にロードすることを含み、その各ショ糖溶液は、（ａ）異なるショ糖濃度を有し、かつ（ｂ）約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲、任意選択で約５０％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は４７〜５３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含み、少なくとも別の１つの溶液は５２〜５８％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含み、および少なくとも別の１つの溶液は５７〜６３％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は４９〜５１％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含み、少なくとも別の１つの溶液は５４〜５６％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含み、および少なくとも別の１つの溶液は５９〜６１％（ｗ／ｗ）ショ糖の間の濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は約４９％（ｗ／ｗ）ショ糖より高い濃度でショ糖を含み、少なくとも別の１つの溶液は約５４％（ｗ／ｗ）ショ糖より高い濃度でショ糖を含み、および少なくとも別の１つの溶液は約５９％（ｗ／ｗ）ショ糖より高い濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は約５０％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはそれより高い濃度でショ糖を含み、少なくとも１つの溶液は約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはそれより高い濃度でショ糖を含み、および少なくとも１つの溶液は約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しいまたはそれより高い濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、少なくとも１つの溶液は約５０％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しい濃度でショ糖を含み、少なくとも１つの溶液は約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖の濃度でショ糖を含み、および少なくとも１つの溶液は約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の濃度でショ糖を含む。ある実施形態では、ＡＡＶを含む溶液は緩衝溶液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌバッファー）である。ある実施形態では、ＡＡＶを含む溶液は上述したような緩衝エチレングリコール溶液である。
【００８４】
例示的態様では、その方法は、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上のショ糖溶液をロータ（例えばゾーナルロータ）にロードすることを含み、その各ショ糖溶液は、（ａ）異なるショ糖濃度を有し、かつ（ｂ）約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲、任意選択で約５０％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲、さらに任意選択で約５５％（ｗ／ｗ）〜約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の範囲に及ぶショ糖濃度でショ糖を含む。ショ糖濃度の完全な範囲は糖溶液の範囲に関して上述した通りである。ショ糖溶液のＡＡＶ画分および／または他の糖溶液に対する比は上述した通りである。
【００８５】
例示的態様では、最も低いショ糖濃度を有するショ糖溶液の体積、および最も高いショ糖濃度を有するショ糖溶液の体積はそれぞれ、ロータ容積の約２０％〜約３０％および約２０％〜約３０％である。ある実施形態では、最も低いショ糖濃度を有するショ糖溶液の体積、中間のショ糖濃度を有するショ糖溶液の体積、および最も高いショ糖濃度を有するショ糖溶液の体積は各々、ロータ容積の約２５％である。例示的態様では、最も低いショ糖濃度を有するショ糖溶液の体積、中間のショ糖濃度を有するショ糖溶液の体積、および最も高いショ糖濃度を有するショ糖溶液の体積はそれぞれ、ロータ容積の約２０％〜約３０％、約１０％〜約１５％、および約１０％〜約１５％である。ある実施形態では、最も低いショ糖濃度を有するショ糖溶液の体積、中間のショ糖濃度を有するショ糖溶液の体積、および最も高いショ糖濃度を有するショ糖溶液の体積はそれぞれ、ロータ容積の約２５％、約１２．５％、および約１２．５％である。ある実施形態では、超遠心分離コア容積またはロータ容積は、約２００ｍＬ〜約１０，０００ｍＬの範囲内、約７００ｍＬ〜約８５００ｍＬの範囲内、または約７００ｍＬ〜約７、７００ｍＬの範囲内である。
【００８６】
様々な超遠心分離コアが利用可能であり、当業者に良く知られている。例えば、利用可能な最小の超遠心分離コアは、２００ｍＬ  日立  ＣＣ４０Ｓであり、一方、最大のコアは８，０００ｍＬ  日立  ＣＣ４０である。ＣＣ４０ＣＴ３コアＥ、他の供給業者からの全ての他の連続フロー超遠心機およびコアも使用してよい。
【００８７】
例示的態様では、その方法は、バッチモードでロータ（例えば、ゾーナルロータ）を含む超遠心機を運転することを含み、そうすると糖密度勾配が形成される。ある実施形態では、超遠心機は１０，０００ｒｐｍ未満の第１の回転速度で運転される。ある実施形態では、第１の回転速度は約３，０００ｒｐｍ〜約６，０００ｒｐｍ（例えば、４，０００ｒｐｍまたは５，０００ｒｐｍ）であり、第１の回転速度は約１５〜約２５分以内に達成される。ある実施形態では、超遠心機は、約２℃と約１０℃の間の温度において、第１の速度で運転される。ある実施形態では、超遠心機は、最終的により高い回転速度を達成する目的で、第１の回転速度で運転される。ある実施形態では、超遠心機は、第１の回転速度よりも少なくとも２倍または少なくとも３倍高い第２の回転速度に加速される。ある実施形態では、第２の回転速度は、約５〜約６０分間、超遠心機を加速することにより達成される。ある実施形態では、超遠心機は約３０，０００ｒｐｍまたはそれより高い第２の回転速度で運転される。ある実施形態では、超遠心機は、約３０，０００ｒｐｍ以上でかつ約５０，０００ｒｐｍ以下の第２の回転速度で運転される。ある実施形態では、第２の回転速度は約３０，０００ｒｐｍと約４０，０００ｒｐｍの間、例えば約３５，０００ｒｐｍである。ある実施形態では、超遠心機は、少なくともまたは約３時間、少なくともまたは約４時間、少なくともまたは約５時間、少なくともまたは約６時間、少なくともまたは約１０時間、少なくともまたは約１２時間、少なくともまたは約１４時間、少なくともまたは約１６時間、少なくともまたは約１８時間、少なくともまたは約２０時間、あるいは、少なくともまたは約２２時間、第２の回転速度で運転される。ある実施形態では、超遠心機は少なくともまたは約４時間、第２の回転速度で運転される。ある実施形態では、超遠心機は約１６〜約２０時間、第２の回転速度で運転される。ある実施形態では、超遠心機は、少なくともまたは約１６時間、第２の回転速度で運転される。ある実施形態では、超遠心機は、約１５℃と約３０℃の間の温度、例えば、約１８℃以上、約２０℃と約２５℃の間の温度（例えば、約２２℃）において、第２の回転速度で運転される。ある実施形態では、超遠心機は、次いで、例えば第１の回転速度（例えば約４，０００ｒｐｍ）まで、任意選択で約５〜約９０分にわたり、回転速度を減速するように運転される。ある実施形態では、減速は約１８℃未満、約２℃と約１０℃の間、または約８℃未満の温度で生じる。ある実施形態では、超遠心機は、超遠心機が停止する前に少なくとも３０分、約８℃未満の温度で運転される。
【００８８】
例示的態様では、その方法は、糖密度勾配の画分を取得してＡＡＶ画分を得るステップを含む。ある実施形態では、得られるＡＡＶ画分は６０％超の完全カプシドを有する。ある実施形態では、得られるＡＡＶ画分は７０〜８０％の完全カプシドを有する。ある実施形態では、糖密度勾配の１つまたは複数の画分が取得され、ある実施形態では、その画分は、より高い密度の画分を含む勾配から得られる。ある実施形態では、図８に示すように画分７〜１１に相当する画分が取得される。ある実施形態では、実施例９に記載するように画分１０〜１４に相当する画分が取得される。ある実施形態では、実施例１６に記載するように画分１〜８に相当する画分が取得される。ある実施形態では、完全カプシドを含むあらゆる画分が、密度勾配においてロータから溶出するときにそれらの密度差により空カプシドから分離される。分離の制御は、小量に分取し、次いで分析試験を［例えば、実施例９に記載のように］）行うことにより、あるいはＵＮ信号のインライン測定からのＵＶ信号（例えば、ＵＶ２５４ｎｍ／ＵＶ２８０ｎｍ信号、およびそれらの比のインラインコントロール）に従い分取を行うことにより、達成することができる。ある実施形態では、ＡＡＶ画分は、ステップ超遠心分離でより高いショ糖密度を有するゾーンから取得される。得られるＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ８）画分は、用いられるＵＣコアの容積から独立した［２５４ｎｍでのＵＶ信号］／［２８０ｎｍでのＵＶ信号］の比により、大部分が完全カプシド（例えば、＞６０％完全カプシド）であると確認される。この比（ＯＤ２５４ｎｍ／ＯＤ２８０ｎｍ）が＞１であれば、その画分は完全カプシドである。
【００８９】
例示的態様では、本開示の方法は、少なくとも５０％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドであるＡＡＶ生成物をもたらす。ある実施形態では、本開示の方法は、少なくとも５５％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドであるＡＡＶ生成物をもたらす。ある実施形態では、本開示の方法は、少なくとも６０％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドであるＡＡＶ生成物をもたらす。ある実施形態では、本開示の方法は、少なくとも７０％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドであるＡＡＶ生成物をもたらす。ある実施形態では、本開示の方法は、少なくとも８０％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドであるＡＡＶ生成物をもたらす。ある実施形態では、本開示の方法は、少なくとも９０％のＡＡＶカプシドが完全ＡＡＶカプシドであるＡＡＶ生成物をもたらす。「少なくとも５０％」とは、５０％が最低パーセンテージである範囲を意味することが理解されるであろう。そのような範囲の最大パーセンテージは、様々な実施形態で１００％であるが、最大パーセンテージが、例えば、９９％、９８％、９５％、８０％、８５％などである、部分範囲も企図されている。完全カプシド対空カプシドの量を測定する適切な方法は当業界で知られており、例えば、完全カプシドと空カプシドとの間の識別を可能にする検出設定を用いる、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡、および分析用陰イオン交換クロマトグラフィが挙げられる。例えば、Lock et al., Human Gene Ther Part B 23:56-64 (2012); およびQu et al., J Virol Methods 140: 183-192 (2007)を参照のこと。
【００９０】
例示的態様では、糖（例えばショ糖）溶液は、約５％（ｗ／ｗ）〜約１５％（ｗ／ｗ）濃度が異なる。ある実施形態では、糖溶液は、約５％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）〜約８％（ｗ／ｗ）、または約２％（ｗ／ｗ）〜約３％（ｗ／ｗ）ショ糖当量濃度が異なる。ある実施形態では、糖溶液はショ糖を含み、約５％（ｗ／ｗ）〜約１０％（ｗ／ｗ）、約４％（ｗ／ｗ）〜約８％（ｗ／ｗ）、または約２％（ｗ／ｗ）〜約３％（ｗ／ｗ）ショ糖濃度が異なる。
【００９１】
例示的態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製する方法および／または空カプシドから完全ウイルス粒子を分離する方法は、各ショ糖溶液が約５０％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）の範囲に及ぶ異なるショ糖濃度を含む２つのショ糖溶液を用いて、ｒＡＡＶ粒子を含む画分を、１０，０００ｒｐｍ未満（例えば、４，０００ｒｐｍ）の第１の回転速度で約１５分〜約４５分または約１７分〜約２５分間、および約３０，０００〜約４０，０００ｒｐｍの範囲内（例えば、３５，０００ｒｐｍ）の第２の回転速度で少なくとも４時間または約１６〜約２０時間、超遠心分離することを含む。ある実施形態では、１つの溶液は約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しい濃度でショ糖を含み、かつ１つの溶液は約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の濃度で糖を含む。例示的態様では、超遠心分離ステップは、本質的に実施例６に記載のように実施される。
【００９２】
例示的態様では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を精製する方法および／または空カプシドから完全ウイルス粒子を分離する方法は、各ショ糖溶液が約４５％（ｗ／ｗ）〜約６５％（ｗ／ｗ）の範囲に及ぶ異なるショ糖濃度を含む３つのショ糖溶液を用いて、ｒＡＡＶ粒子を含む画分を、１０，０００ｒｐｍ未満（例えば、４，０００ｒｐｍ）の第１の回転速度で約１５分〜約４５分または約１７分〜約２５分間、および約３０，０００〜約４０，０００ｒｐｍの範囲内（例えば、３５，０００ｒｐｍ）の第２の回転速度で少なくとも４時間または約１６〜約２０時間、超遠心分離することを含む。ある実施形態では、１つの溶液は約５０％（ｗ／ｗ）ショ糖に等しい濃度でショ糖を含み、１つの溶液は約５５％（ｗ／ｗ）ショ糖の濃度で糖を含み、かつ１つの溶液は約６０％（ｗ／ｗ）ショ糖の濃度で糖を含む。例示的態様では、超遠心分離ステップは、本質的に実施例７または９に記載のように実施される。
【００９３】
ｒＡＡＶ粒子の起源
本開示の方法に関して、ＡＡＶはあらゆるＡＡＶ血清型であってよい。ある実施形態では、本明細書に記載の方法により精製されるＡＡＶは、ＡＡＶ１血清型、ＡＡＶ２血清型、ＡＡＶ３血清型、ＡＡＶ４血清型、ＡＡＶ５血清型、ＡＡＶ６血清型、ＡＡＶ７血清型、ＡＡＶ８血清型、ＡＡＶ９血清型、またはＡＡＶ１０血清型であってよい。ある実施形態では、本明細書に記載の方法により精製されるＡＡＶは、ＡＡＶ８血清型である。本発明の方法に関して、ロータにロードされるＡＡＶ画分は、例示的態様では、濃縮ＡＡＶ画分である。ある実施形態では、ロータにロードされるＡＡＶ画分は、少なくとも１ｘ１０１０、少なくとも１ｘ１０１１、または少なくとも１ｘ１０１２のＡＡＶカプシド／ｍｌを含む．ある実施形態では、ロータにロードされるＡＡＶ画分は、少なくとも１ｘ１０１２のＡＡＶカプシド／ｍｌを含み、ＡＡＶカプシドは空ＡＡＶカプシドおよび完全ＡＡＶカプシドを含む。
【００９４】
ある実施形態では、ＡＡＶ画分は、トランスフェクト宿主細胞により生成されるＡＡＶ画分を表す。ある実施形態では、ＡＡＶ画分は、トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトされた宿主細胞を含む細胞培養物から採取された上清を表し、そのシステムの１つのプラスミドは目的遺伝子またはｃＤＮＡを含み、１つのプラスミドはカプシドタンパク質ＶＰ１、カプシドタンパク質ＶＰ２および／またはカプシドタンパク質ＶＰ３をコードする。ある実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３は、ＡＡＶ８  ＶＰ１、ＡＡＶ８  ＶＰ２、および／またはＡＡＶ８  ＶＰ３である。ｒＡＡＶ生成のためのトリプルプラスミドトランスフェクションは当業界で知られている。例えば、上記のQu et al.、およびMizukami et al., “A Protocol for AAV vector production and purification.” PhD dissertation, Division of Genetic Therapeutics, Center for Molecular Medicine, 1998;およびKotin et al., Hum Mol Genet 20(R1): R2-R6 (2011)を参照のこと。ある実施形態では、トランスフェクションは、例えばリン酸カルシウムなどの無機化合物、またはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）などの有機化合物、または例えばエレクトロポレーションなどの非化学的手段を用いて実施されうる。
【００９５】
ある実施形態では、宿主細胞は接着細胞である。ある実施形態では、宿主細胞は懸濁細胞である。ある実施形態では、宿主細胞はＨＥＫ２９３細胞またはＳｆ９細胞（例えば、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞）である。ある実施形態では、細胞培養物は、血清およびタンパク質を含まない培地を含む。ある実施形態では、培地は既知組成培地であり、動物由来成分、例えば加水分解物などを含まない。
【００９６】
ある実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む画分は、トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を含む画分を表す。ある実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む画分は、トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションの約３〜約５日後、あるいは細胞培養物が約５ｘ１０６細胞／ｍＬまたはそれより高い細胞密度を有しかつ約５０％またはそれより高い細胞生存率を有するときに採取された上清の画分を表す。ある実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む画分は、実施例１に記載のようにＨＥＫ２９３細胞を含む画分を表す。
【００９７】
ある実施形態では、ＡＡＶは、トリプルプラスミドトランスフェクション、次いで１〜５日後の採取により調製される。ある実施形態では、ＡＡＶは細胞破壊から調製される。
【００９８】
ある実施形態では、ＡＡＶは以下のように調製される：ＨＥＫ２９３細胞を、既知組成でよくかつ例えば血清およびタンパク質などの動物由来成分を含まなくてよい、市販の培地中で接着および増殖させる。その細胞を約３ｘ１０６〜約１２細胞／ｍｌ、例えば、約６ｘ１０６〜約１０細胞／ｍｌの細胞密度まで培養する。その後、細胞密度が約３〜５ｘ１０６細胞／ｍｌになるように約１：２の比で細胞を分割する。分割の後、（１）ＡＡＶ生成に不可欠な１つまたは複数のヘルパーウイルス機能を提供することができるヘルパープラスミド、（２）ウイルスのカプシド生成、複製およびパッケージングに関連する１つまたは複数の遺伝子をコードするプラスミド、および（３）結果として生じるｒＡＡＶ粒子内にパッケージングされるべき目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むプラスミドを含む、３つのプラスミドで細胞をトランスフェクトしてよい。例えば、ＧＯＩは、一本鎖自己相補的な形態でヒト血液凝固第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを含むベクターＤＮＡであってよく、そのベクターＤＮＡは２．６ｋＢの完全長を有する。別の例として、ＧＯＩは、二本鎖自己相補的な形態でヒト血液凝固第ＩＸ因子Ｐａｄｕａを含むベクターＤＮＡであってよく、そのベクターＤＮＡは４．８ｋＢの完全長を有する。別の例として、ＧＯＩは、一本鎖自己相補的な形態でＢドメイン欠失ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子を含むベクターＤＮＡであってよく、そのベクターＤＮＡは４．８ｋＢの完全長を有する。他のＧＯＩを用いてもよい。トランスフェクションは、例えばカチオンポリマーを用いることにより、一過性に行ってよい。溶出の前に、ＨＥＫ２９３細胞株を、採取の前に少なくとも約３日間、例えば３〜５日間培養してよい。
【００９９】
追加ステップ
本開示の方法は、本明細書に開示されるステップのあらゆる組合せを含み、任意選択で、１つまたは複数の追加ステップと組み合わせてもよい。従って、例示的態様では、本開示の方法は、本明細書に記載のように、トリプルプラスミドシステムで宿主細胞をトランスフェクトするステップをさらに含む。例示的態様では、本開示の方法は、トリプルプラスミドシステムでトランスフェクトした宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞またはＳｆ９細胞（例えば、バキュロウイルス感染Ｓｆ９細胞）、を含む細胞培養物から上清を採取することを含む。例示的態様では、本開示の方法は、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションの約３〜約５日後、あるいは細胞培養物が約５ｘ１０６細胞／ｍＬまたはそれより高い細胞密度を有しかつ５０％超の細胞生存率を有するときに、上清を採取することを含む。ある実施形態では、ＡＡＶは細胞破壊から調製される。例示的態様では、トランスフェクションおよび採取ステップは、本明細書に記載の超遠心分離ステップの前に行われる。本開示の方法は、ＡＡＶの純度を更に高め、かつ他の不要な成分を除去し得る、および／または画分を濃縮し得る、および／または後のステップのために画分を状態調節(condition)し得る、更に他の追加ステップを含んでいてよい。追加ステップは、上記の超遠心分離ステップの前または後のいずれに行ってもよい。
【０１００】
例示的態様では、その方法はデプスろ過ステップを含む。例示的態様では、その方法は、セルロースおよびパーライトを含みかつ約５００Ｌ／ｍ２の最小透過性を有するフィルターを用いて、トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の培養物上清の画分をデプスろ過にかけることを含む。例示的態様では、その方法は、約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターの使用をさらに含む。例示的態様では、デプスろ過の後、約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターを通してろ過を行う。例示的態様では、デプスフィルターと約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターの一方または両方を洗浄し、その洗浄液を回収する。例示的態様では、洗浄液を一緒にプールし、デプスろ過および約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターを用いたろ過で得られるろ液と合わせる。実施例２は、デプスろ過および約０．２μｍの最小孔径を有するフィルターをを通したろ過の例示的方法を提供する。例示的態様では、デプスろ過ステップおよび他のろ過ステップは、本明細書に記載の超遠心分離ステップの前に行われる。
【０１０１】
ある実施形態では、採取は以下のように行われる：例えば、約１５０〜約２５０ＬのＡＡＶ含有細胞上清をデプスフィルターエレメントおよびポリエーテルスルホンエレメントに通してろ過することにより、デプスろ過を介してこの時点で細胞培養物の上清を採取する。流速は、約４０ｋｇ／ｈ〜約２８０ｋｇ／ｈ、または約６０ｋｇ／ｈ〜２４０ｋｇ／ｈであってよい。全圧は１．７バール未満である。２つのフィルターを約１０〜約３０ＬのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）バッファーでフラッシングする。次に、ろ過した発酵ブロス（培養液）、または採取物を回収する。デプスろ過処理は、少なくとも６０％または６５％のＡＡＶ粒子を保持しながら、少なくとも７０％のタンパク質、および少なくとも６０％のＨＥＫ２９３細胞ＤＮＡを除去することができる。
【０１０２】
ある実施形態では、以下のように、ＡＡＶ画分を含む採取物を限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）およびＴＦＦにかけて採取物を濃縮および状態調節する：ＴＦＦを用いて採取物を約１０Ｌ〜約１５Ｌの目標体積まで約１０倍〜約２０倍濃縮する。次いで、濃縮した採取物を２回のダイアフィルトレーション（透析ろ過）ステップにかけて濃縮採取物を約８．３〜約８．７のｐＨおよび約１３ｍＳ／ｃｍ〜約１７ｍＳ／ｃｍの導電率に状態調節する。各ダイアフィルトレーションステップは、ダイアフィルトレーションバッファーとの５倍体積交換により実施することができ、例えば、第１のバッファーは５０ｍＭ  ＴＲＩＳおよび５００ｍＭ  ＮａＣｌを含み、ｐＨ８．５±０．２のｐＨを有し、かつ２５℃であり、第２のバッファーは、５０ｍＭ  ＴＲＩＳおよび１２５ｍＭ  ＮａＣｌを含み、８．５±０．２のｐＨを有し、かつ２５℃である。次に、ＴＦＦが行われて約８Ｌ〜約１２Ｌの最終目標体積まで保持液を濃縮する。次いで、０．２μｍのフィルターエレメントを通して濃縮物をろ過する。ＡＡＶ収率は、約１．５〜約２．５の第２のダイアフィルトレーションバッファーでフィルターエレメントをフラッシングすることにより上昇し得る。
【０１０３】
例示的態様では、本開示の方法は、１つまたは複数のクロマトグラフィステップを含む。例示的態様では、その方法は、ネガティブクロマトグラフィステップを含み、それによって不要な成分がクロマトグラフィ樹脂に結合し、所望のＡＡＶはクロマトグラフィ樹脂に結合しない。例示的態様では、その方法は、ネガティブ陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィステップ、または「非結合モード」でのＡＥＸクロマトグラフィステップを含む。実施例４はそのようなステップを説明する。従って、例示的実施形態では、ＡＡＶ粒子を精製する方法は、ＡＡＶがＡＥＸクロマトグラフィカラムまたはメンブレンを素通りする条件下で、ＡＡＶ粒子を含む画分をＡＥＸクロマトグラフィカラムまたはメンブレンに添加し、さらにＡＡＶ粒子を回収することにより、ＡＡＶ粒子を含む画分においてネガティブ陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィを実施することを含む。例示的態様では、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭの塩（例えばＮａＣｌ）を含むローディングバッファーを用いて、画分をＡＥＸクロマトグラフィカラムまたはメンブレンに添加し、任意選択で、ローディングバッファーのｐＨは約８〜約９である。例示的態様では、ローディングバッファーは、約１１５ｍＭ〜約１３０ｍＭの塩（例えばＮａＣｌ）を含み、任意選択で、ローディングバッファーは約１２０ｍＭ〜約１２５ｍＭの塩（例えばＮａＣｌ）を含む。例示的態様では、ネガティブＡＥＸステップは、本明細書に記載の超遠心分離ステップの前に行われる。
【０１０４】
例示的態様では、本開示の方法は、限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを用いてＡＡＶ画分を濃縮することを含む。例示的態様では、本開示の方法は、１つまたは複数のタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）ステップを含む。例示的態様では、ＡＡＶ画分は、限外ろ過／ダイアフィルトレーションを受ける。例示的態様では、ＡＡＶ画分は、ネガティブＡＥＸクロマトグラフィを実施することを含むステップの前に、ネガティブＡＥＸクロマトグラフィを実施することを含むステップの後に、あるいはネガティブＡＥＸクロマトグラフィを実施することを含むステップの前後に、限外濾過／ダイアフィルトレーションシステムを用いて濃縮される。実施例３および５は、そのようなＴＦＦステップを説明する。例示的態様では、ＴＦＦステップは、本明細書に記載の超遠心分離ステップの前に行われる。
【０１０５】
ある実施形態では、以下のように、ネガティブＡＥＸクロマトグラフィの後に追加のＴＦＦステップが行われる：ＡＥＸクロマトグラフィから得られるＡＡＶ含有素通り画分を濃縮し、さらに例えば約５００ｍＭのＮａＣｌ、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含み；約８．３〜約８．７のｐＨであるバッファーなどの、バッファーに対してダイアフィルトレーションを行って、超遠心分離のために生成物を状態調節する。次いで、ＴＦＦステップを実施する。
【０１０６】
ある実施形態では、以下のように、「２ショ糖プロコル」超遠心分離によって空ＡＡＶ粒子と完全ＡＡＶ粒子とを互いに分離する。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌバッファー中にＡＡＶを含む濃縮物の後に、５５％（ｗ／ｗ）ショ糖濃度でショ糖を含む第１のショ糖溶液、およびその後に６０％（ｗ／ｗ）ショ糖濃度でショ糖を含む第２のショ糖溶液が続く。ある実施形態では、ＡＡＶ溶液は約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、および約５００ｍＭのＮａＣｌを含む。ある実施形態では、ショ糖溶液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび約１３６ｍＭのＮａＣｌを含む。超遠心分離は、最初に２〜１０℃の温度において約４，０００ｒｐｍで実施し、約３３，０００ｒｐｍ〜約３７，０００ｒｐｍまで速度を高め、約２０℃〜約２５℃まで温度を高め、さらにその後、約４時間〜、約１４時間〜約２０時間、または約１６時間〜約２０時間維持する。その後、画分を回収する。
【０１０７】
ある実施形態では、以下のように、「２ショ糖プロコル」超遠心分離によって空ＡＡＶ粒子と完全ＡＡＶ粒子とを互いに分離する。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌバッファー中にＡＡＶ、および４５〜５０％（ｗ／ｗ）エチレングリコールを含む緩衝エチレングリコール溶液を含む濃縮物の後に、５５％（ｗ／ｗ）ショ糖濃度でショ糖を含む第１のショ糖溶液、およびその後に６０％（ｗ／ｗ）ショ糖濃度でショ糖を含む第２のショ糖溶液が続く。ある実施形態では、ＡＡＶ溶液は、約５５％エチレングリコール、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、および約７５０ｍＭのＮａＣｌを含む。ある実施形態では、ショ糖溶液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび約１３６ｍＭのＮａＣｌを含む。超遠心分離は、最初に２〜１０℃の温度において約４，０００ｒｐｍで実施し、約３３，０００ｒｐｍ〜約３７，０００ｒｐｍまで速度を高め、約２０℃〜約２５℃まで温度を高め、さらにその後、約４時間〜、約１４時間〜約２０時間、または約１６時間〜約２０時間維持する。その後、画分を回収する。
【０１０８】
ある実施形態では、以下のように、「３ショ糖プロコル」超遠心分離によって空ＡＡＶ粒子と完全ＡＡＶ粒子とを互いに分離する。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌバッファー中にＡＡＶを含む濃縮物の後に、５０％（ｗ／ｗ）ショ糖濃度でショ糖を含む第１のショ糖溶液、５５％（ｗ／ｗ）ショ糖濃度でショ糖を含む第２のショ糖溶液、およびその後に６０％（ｗ／ｗ）ショ糖濃度でショ糖を含む第３のショ糖溶液が続く。第１のショ糖溶液をロータの底にロードし；次いで、第２のショ糖溶液および第３のショ糖溶液をロードする。ある実施形態では、ＡＡＶ溶液は約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、および約５００ｍＭのＮａＣｌを含む。ある実施形態では、ショ糖溶液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび約１３６ｍＭのＮａＣｌを含む。超遠心分離は、最初に２〜１０℃の温度において約４，０００ｒｐｍで実施し、約３３，０００ｒｐｍ〜約３７，０００ｒｐｍまで速度を高め、約２０℃〜約２５℃まで温度を高め、さらにその後、約３時間〜約６時間、約４時間〜、約１４時間〜約２０時間、または約１６時間〜約２０時間維持する。その後、画分を回収する。
【０１０９】
ある実施形態では、以下のように、「３ショ糖プロコル」超遠心分離によって空ＡＡＶ粒子と完全ＡＡＶ粒子とを互いに分離する。Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌバッファー中にＡＡＶ、および４５〜５０％（ｗ／ｗ）エチレングリコールを含む緩衝エチレングリコール溶液を含む濃縮物の後に、５０％（ｗ／ｗ）ショ糖濃度でショ糖を含む第１のショ糖溶液、５５％（ｗ／ｗ）ショ糖濃度でショ糖を含む第２のショ糖溶液、およびその後に６０％（ｗ／ｗ）ショ糖濃度でショ糖を含む第３のショ糖溶液が続く。第１のショ糖溶液をロータの底にロードし；次いで、第２のショ糖溶液および第３のショ糖溶液をロードする。ある実施形態では、ＡＡＶ溶液は、約５５％エチレングリコール、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、および約７５０ｍＭのＮａＣｌを含む。ある実施形態では、ショ糖溶液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび約１３６ｍＭのＮａＣｌを含む。超遠心分離は、最初に２〜１０℃の温度において約４，０００ｒｐｍで実施し、約３３，０００ｒｐｍ〜約３７，０００ｒｐｍまで速度を高め、約２０℃〜約２５℃まで温度を高め、さらにその後、約３時間〜約６時間、約４時間〜、約１４時間〜約２０時間、または約１６時間〜約２０時間維持する。その後、画分を回収する。
【０１１０】
例示的態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ粒子を含む画分を溶媒界面活性剤で処理して脂質エンベロープウイルスを不活化することを含む。実施例８は脂質エンベロープウイルスの不活化の例示的方法を記載する。例示的態様では、溶媒界面活性剤処理ステップは、本明細書に記載の超遠心分離ステップの後に行われる。
【０１１１】
例示的態様では、本開示の方法は、ｒＡＡＶ粒子を含む画分をろ過して、その画分中のｒＡＡＶ粒子より大きいサイズのウイルスを除去することを含む。例示的態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ粒子を含む画分をろ過して、約３５ｎｍより大きいサイズのウイルスを除去することを含む。例示的態様では、フィルターの孔径はナノメートル範囲であり、例示的態様では、その方法はナノろ過を含む。例示的態様では、本開示の方法は、水流法により決定して、３５ｎｍ±２ｎｍの範囲内の孔径のナノフィルターの使用を含む。そのような孔径を有する例示的ナノフィルターは、天然親水性の銅アンモニア法再生セルロースで構成される微多孔質中空糸の束を含む。フィルターのタイプの分類は、メンブレン構造、材料、および供給メーカーによる。例示的態様では、完全性のリーク試験を用いてナノフィルターを試験して、フィルターにピンホールまたは大きな欠陥がないことを確認し、さらに調合バッファーで予備洗浄する。
【０１１２】
例示的ナノろ過を実施例１０として本明細書に記載する。
【０１１３】
例示的態様では、ｒＡＡＶ粒子を含む画分、例えば、陰イオン交換溶出液を、溶出バッファー（ＰＢＳ＋６００ｍＭ  ＮａＣｌ）で予備希釈して、ウイルス粒子の濃度を調整する。
【０１１４】
例示的態様では、ろ過ステップ中、フィルターを横切る圧力差を維持する。例示的態様では、その圧力（例えば、フィルターを挟んだ圧力降下）は約０．０２ＭＰａ〜約０．１ＭＰａである。例示的態様では、その圧力（例えば、フィルターを挟んだ圧力降下）は約０．０２ＭＰａ〜約０．０８ＭＰａである。フィルターをデッドエンドモードで使用する場合、圧力差は、添加する試料のフィード圧により（すなわち、フィード圧に影響する、特定の流量へのポンプの調整により）もたらされ得る。例示的態様では、ナノフィルターを通して、デッドエンドモードで、０．１ＭＰａを越えない一定圧力下でろ過を実施する。例示的態様では、タンジェンシャルフロー法でフィルターを用いる。例示的態様では、回収ウイルス粒子の収率は、バッファー（例えば、調合バッファー）でナノフィルターを後洗浄することにより上昇する。例示的態様では、ナノフィルターの後完全性試験をリーク試験および／または金粒子試験を用いて実施して、ナノフィルター孔径分布が変化していないこと、およびろ過中にナノフィルターがその完全性を維持していることを特定する。例示的態様では、フィルター面積１ｍ２当たり５０Ｌより多くの溶液を添加して試料の収率を高める。
【０１１５】
例示的態様では、ｒＡＡＶ粒子より大きいウイルスの除去のためのろ過ステップは、本開示のプロセス中に１回行われる。例示的態様では、そのろ過ステップはプロセス中に２回行われる。例示的態様では、ｒＡＡＶ粒子より大きいウイルスの除去のためのろ過ステップは、本明細書に記載の超遠心分離ステップの後に行われる。例示的態様では、ｒＡＡＶ粒子より大きいウイルスの除去のためのろ過ステップは、ポリッシングステップの後に行われる。
【０１１６】
例示的態様では、本開示の方法は、ＡＥＸクロマトグラフィを、任意選択でテンタクルゲルを含むカラムを用いて、実施することを含む、ポリッシングステップを含む。実施例８は、そのようなポリッシングステップを含む例示的方法を記載する。例示的態様では、ポリッシングステップは、本明細書に記載の超遠心分離ステップの後に行われる。
【０１１７】
例示的態様では、本開示の方法は、１つまたは複数の品質管理ステップ、例えば、プロセスの１つまたは複数のステップの後（例えば、各ステップの後）に得られるＡＡＶ画分の力価、ＤＮＡ／ＡＡＶ比、または比活性を測定するステップ、を含む。例示的態様では、本開示の方法は、ｑＰＣＲ、例えばＩＴＲ  ｑＰＣＲを用いることにより、画分中のＡＡＶの存在についてアッセイすることを含む。ＩＴＲ  ｑＰＣＲは、画分中のＡＡＶの逆方向末端反復（ＩＴＲ）核酸の量を測定するための定量ＰＣＲベースのアッセイである。他のＡＡＶ特異的またはＡＡＶ８特異的な配列もｑＰＣＲにより測定することができる。
【０１１８】
例示的態様では、本開示の方法は、ＥＬＩＳＡを用いることにより画分中のＡＡＶの存在に関してアッセイすることを含む。例示的態様では、ＥＬＩＳＡはサンドイッチＥＬＩＳＡである。例示的態様では、サンドイッチＥＬＩＳＡは、ＡＡＶエピトープに特異的な抗体を含む。例示的態様では、ＡＡＶエピトープは、会合したＡＡＶカプシドに存在する立体構造エピトープである。ＤＮＡ／ＡＡＶ比を試験する適切な方法は実施例１２として本明細書に記載されている。本明細書に記載するように、ＥＬＩＳＡはＡＡＶ画分の力価を決定する方法としてｑＰＣＲに置き換わることができる。例示的態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡによりＡＡＶ画分を試験することを含み、その方法は、定量ＰＣＲにより力価を測定する方法を含まない。例示的態様では、ＡＡＶ画分中の大部分のカプシドは完全カプシドであるため、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ画分の力価の代理の読み出しを提供するのに十分である。
【０１１９】
例示的態様では、本開示の方法は、本開示のステップの１つまたは複数の後にＡＡＶに特異的なＥＬＩＳＡを含む。例示的態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより、超遠心分離の後に得られるＡＡＶ画分を試験して、その画分中のＡＡＶのＤＮＡ／ＡＡＶ比を決定することを含む。例示的態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより、デプスろ過の後に得られるＡＡＶ画分を試験して、その画分中のＡＡＶのＤＮＡ／ＡＡＶ比を決定することを含む。例示的態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより、限外ろ過／ダイアフィルトレーションシステムを用いてＡＡＶ画分を濃縮した後に得られるＡＡＶ画分を試験して、その画分中のＡＡＶのＤＮＡ／ＡＡＶ比を決定することを含む。例示的態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）ステップの後に得られるＡＡＶ画分を試験して、その画分中のＡＡＶのＤＮＡ／ＡＡＶ比を決定することを含む。例示的態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより、ネガティブ陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィの後に得られるＡＡＶ画分を試験して、その画分中のＡＡＶのＤＮＡ／ＡＡＶ比を決定することを含む。例示的態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡにより、ポリッシングステップの後に得られるＡＡＶ画分を試験して、その画分中のＡＡＶのＤＮＡ／ＡＡＶ比を決定することを含む。
【０１２０】
例示的態様では、本開示の方法は、図１に示すステップの１つまたは組合せを含む。例示的態様では、本開示の方法は、図１に示す全てのステップを含む。
【０１２１】
本開示の方法により製造されるＡＡＶ生成物をここにさらに提供する。例示的態様では、ＡＡＶ生成物は、約１０００Ｌの開始材料（例えば、細胞培養物）から製造される少なくとも約１０１２のウイルス粒子（ｖｐ）、または約１０００Ｌの開始材料（例えば、細胞培養物）から製造される少なくとも約１０１３ウイルス粒子（ｖｐ）を含み、ＡＡＶ生成物中に存在するＡＡＶカプシドの少なくとも５０％または少なくとも５５％は完全ＡＡＶカプシドである。例示的態様では、本開示のＡＡＶ生成物は、高純度で、高力価で、かつヒトでの臨床用途に適している。例示的態様では、ＡＡＶ生成物は、均質な集団でかつ高純度のＡＡＶ粒子を含む。例示的態様では、ＡＡＶ生成物は、完全長ベクターＤＮＡを含む。例示的実施形態では、ＡＡＶ生成物は、不要な汚染物質を実質的に含まず、そのような汚染物質として、限定はされないが、切断または不完全ベクターＤＮＡを含むＡＡＶ粒子、不完全タンパク質組成およびオリゴマー化構造を有するＡＡＶ粒子、または例えば非ＡＡＶ、脂質エンベロープウイルスなどの汚染ウイルスが挙げられる。例示的実施形態では、ＡＡＶ生成物は、目的タンパク質をコードする大量のｃＤＮＡを含む。例示的態様では、本開示のＡＡＶ生成物はヒトに投与するのに適している。例示的態様では、ＡＡＶ生成物は滅菌および／または適正製造基準（ＧＭＰ）グレードである。例示的態様では、ＡＡＶ生成物は、遺伝子治療用医薬品に関して米国薬局方Ｃｈａｐｔｅｒ  １０４６または欧州薬局方に記載されている、あるいはアメリカ食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ）により定められている要件に適合する。例示的態様では、ＡＡＶ生成物は、ほとんどまたは全く処理も操作も無しにヒトに直接投与するためのすぐに使用可能な製品である。
【０１２２】
以下の実施例は、単に本発明を説明するためのものであり、決してその範囲を限定するためのものではない。
【実施例】
【０１２３】
実施例１
以下の実施例は、トリプルプラスミドシステムでＨＥＫ２９３細胞株をトランスフェクトして目的タンパク質をコードする核酸を含むｒＡＡＶ粒子を生成する例示的方法を記載する。
【０１２４】
接着性ＨＥＫ２９３細胞を、既知組成でかつ動物由来成分、タンパク質および血清を含まない市販の培地中、懸濁条件で増殖させる。細胞密度がおよそ６〜１０ｘ１０６細胞／ｍｌになるまで培養する。トランスフェクション前に、およそ３〜５ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞密度になるように約１：２の分割を行う。
【０１２５】
３つのプラスミド：１）増殖性ＡＡＶ感染に不可欠なヘルパーウイルス機能を提供するヘルパープラスミド、（２）ウイルスのカプシド生成、複製およびパッケージングに関する全ての情報を運ぶｒｅｐｃａｐ−プラスミド、および（３）結果として生じるｒＡＡＶ粒子内にパッケージングされる目的遺伝子（ＧＯＩ）を含むプラスミド；で細胞をトランスフェクトする。例えば、ＧＯＩは、第ＩＸ因子ＰａｄｕａベクターＤＮＡ（一本鎖（〜２．６ｋｂ）または二本鎖（〜４．８ｋｂ））、あるいは第ＶＩＩＩ因子一本鎖ベクターＤＮＡ（〜４．８ｋｂ）であってよい。
【０１２６】
カチオン系ポリマーであるポリエチレンアミン（ＰＥＩ）を用いてＨＥＫ２９３細胞の一過性トランスフェクションを実施する。簡単に説明すると、ＰＥＩとプラスミドＤＮＡとの予備複合体形成を生じさせるために、トランスフェクション用混合試薬を細胞培養物と混合する前にＰＥＩとプラスミドＤＮＡとを４〜３７℃の間の温度で１０分より長い時間インキュベートする。予備形成された複合体をトランスフェクション用混合試薬と共に細胞培養物に添加して、３０℃と４０℃の間の温度（例えば約３７℃）で約３〜４時間インキュベートする。例えば、０．６ｇ／Ｌのグルタミンを含む、例えば既知組成で動物由来成分、タンパク質および血清を含まない市販の培地Ｈｙｃｌｏｎｅ（商標）ＣＤＭ４ＨＥＫ２９３などの培地を含む、公知の停止培地をトランスフェクト培養物中に添加することにより、トランスフェクションを停止させる。
【０１２７】
ＧＯＩを担持するｒＡＡＶ粒子は、トランスフェクション後３〜５日の期間にわたりＨＥＫ２９３細胞株中にある。図２および３に示すように、ＨＥＫ２９３細胞培養物は、トランスフェクションの約５日後に＞５０％の生存性と共に高い細胞密度（例えば、約５ｘ１０６細胞／ｍＬ超）を示す。
【０１２８】
実施例２
以下の実施例は、トランスフェクトＨＥＫ２９３細胞培養物の上清を採取する例示的方法を記載する。
【０１２９】
実施例１で述べたように、ｒＡＡＶ生成はトランスフェクション後最初の３〜約５日以内に生じる。この期間の最後に、ＨＥＫ２９３細胞培養物は、＞５０％の生存性と共に高い密度（例えば、約５ｘ１０６細胞／ｍＬ超）を示す。デプスろ過を介してこの時点で細胞培養物の上清を採取する。約２００Ｌ（±２０Ｌ）のＡＡＶ含有細胞懸濁液を、セルロース系デプスフィルターエレメント（例えば、Ｐａｌｌ、ＳＴＡＸ  Ｋ９００Ｐ；４ｍ２）および０．２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターエレメント（例えば、Ｐａｌｌ、ＥＣＶ；２ｘ５インチ、並列）を通してろ過することにより、ＡＡＶ粒子を細胞および細胞片から分離した。フィルターを通る標準的な流速は１６０±１００ｋｇ／ｈであり、全圧は＜１．７バールであった。それら２つのフィルターを約１０〜３０ＬのＴｒｉｓ緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、８ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、２５℃でｐＨ７．４±０．２）でフラッシングした。フィルターフラッシング液と一緒に、ろ過した発酵ブロスを５００Ｌのバッグに回収し、これを採取物とする。採取ステップのパラメータ、および採取ステップ後の採取物の特徴付け（収率）をそれぞれ表１および２に示す。図４は、採取ステップの圧力および流速の連続記録を提供する。
【０１３０】
【表１】
2020502997.tif 000003
【０１３１】
【表２】
2020502997.tif 000004
【０１３２】
表２に示すように、ろ過前の細胞懸濁液中に見られるタンパク質の７０％超、およびＨＥＫ  ＤＮＡの６２％より多くがこのろ過ステップで除去された。定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により測定して、採取物およびフィルターフラッシング液を含むプール画分（Ｐ）中のＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）核酸の量は、ろ過前の細胞懸濁液中に見られる量の約半分であった。また、ＥＬＩＳＡで測定して、ろ過前の細胞懸濁液のＡＡＶの６５％超がろ過で保持された。
【０１３３】
実施例３
以下の実施例は、限外ろ過／ダイアフィルトレーション（ＵＦ／ＤＦ）タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）システムにより採取物を濃縮および状態調節する例示的方法を記載する。
【０１３４】
実施例２で得られた採取物をＵＦ／ＤＦ  ＴＦＦシステムにかけて採取物を濃縮および状態調節した。最初のステップでは、３ｘ０．５ｍ２  Ｐａｌｌ  Ｔ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｏｍｅｇａ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  １００ｋＤａ（品番：ＯＳ１００Ｔ０６）を用いるＴＦＦにより１２Ｌの目標体積まで採取物をおよそ１６倍濃縮した。次いで、濃縮採取物を２回のダイアフィルトレーションステップにかけて培地成分を減らし、また濃縮採取物をｐＨ８．５および導電率１５ｍＳ／ｃｍに状態調節した。１回目のダイアフィルトレーションステップは、ダイアフィルトレーションバッファー１（ＤＢ１：５０ｍＭ  ＴＲＩＳ／５００ｍＭ  ＮａＣｌ／２５℃でｐＨ８．５±０．２）との５倍体積交換により実施した。２回目のダイアフィルトレーションステップは、ダイアフィルトレーションバッファー２（ＤＢ２：５０ｍＭ  ＴＲＩＳ／１２５ｍＭ  ＮａＣｌ／２５℃でｐＨ８．５±０．２）との５倍体積交換により実施した。各ダイアフィルトレーションステップは、３ｘ０．５ｍ２  Ｐａｌｌ  Ｔ−ｓｅｒｉｅｓ  Ｏｍｅｇａ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  １００ｋＤａ（品番：ＯＳ１００Ｔ０６）を用いて実施した。２回目のダイアフィルトレーションステップの後、保持液を上記のようにＴＦＦにより１０Ｌの最終目標体積まで濃縮した。次に、１０Ｌの濃縮物を０．２μｍフィルターエレメント（５インチ、Ｐａｌｌ  ＥＣＶフィルター、品番：ＮＰ５ＬＵＥＣＶＰ１Ｓ）を通してろ過した。ＡＡＶ８収率を高めるために、ＵＦ／ＤＦメンブレン、ＵＦ／ＤＦシステム、および０．２μｍフィルターをおよそ２ＬのＤＢ２でフラッシングした。次の捕獲ステップ用にそれを準備するために、保持液およびフィルターフラッシング液を回収してバッグ中で混合した。図７は、銀染色（左）およびウェスタンブロット（右）でＴＦＦの中間ステップを示す。ＵＦ／ＤＦ  ＴＦＦステップのパラメータ、ならびに結果として生じる状態調節した濃縮物［ＵＦ／ＤＦ  ＴＦＦステップ後］の特徴付けを表３および４にそれぞれ示す。
【０１３５】
銀染色の説明
ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｍｉｄｉ  Ｇｅｌ  １．０ｍｍ、２０ウェル、カタログ番号ＷＧ１４０２ＢＸ１０
ＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００２
ＳＢ＋ＤＴＴインキュベーション、７０℃で１０分；１０分冷却ＪＡＡ処理
【０１３６】
ウェスタンブロットの説明
ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｍｉｄｉ  Ｇｅｌ  １．０ｍｍ、２０ウェル、カタログ番号ＷＧ１４０２ＢＸ１０
ＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００２
ＳＢ＋ＤＴＴインキュベーション、７０℃で１０分、１０分冷却ＪＡＡ処理
一次抗体：ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）
プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ
ＰＲＯＧＥＮ６１０５８
二次抗体：ヤギ抗マウスＡＬＰ
ＳＩＧＭＡ  Ａ４６５６、１：２０００、１時間
【０１３７】
【表３】
2020502997.tif 000005
【０１３８】
【表４】
2020502997.tif 000006
【０１３９】
表４に示すように、結果として生じる状態調節した濃縮物の体積は最初の体積の約６％であったが、ＥＬＩＳＡで測定して、濃縮物中のＡＡＶのパーセンテージは７４％であった。
【０１４０】
実施例４
この実施例は、陰イオン交換体を用いるネガティブクロマトグラフィの例示的方法を実証する。
【０１４１】
実施例３に記載のようにＴＦＦにより採取物を濃縮およびダイアフィルトレーションした後、ＡＡＶ含有バッファーを、Ｍｕｓｔａｎｇ陰イオン交換メンブレン（Ｐａｌｌ  品番ＸＴ５０００ＭＳＴＧＱＰ１）を用いるネガティブクロマトグラフィのために１２５ｍＭ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ８．５に状態調節する。この条件では、ＡＡＶは陰イオン交換メンブレンに結合せず、カラムを素通りする。カラムにロードした後、全容積の２倍（２ｘメンブレンカプセルに等しい）のフラッシングバッファー（１２５ｍＭ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．５）を用いてカラムから全ての非結合ＡＡＶ８をフラッシングした（洗い流した）。図５は、ネガティブ（非結合）モードでのＡＥＸ  Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑクロマトグラフィの素通り生成物のクロマトグラムを提供する。結合タンパク質を調べるために溶出を実施した。表５は、ネガティブクロマトグラフィステップのスキームを列挙し、また表６はその収率を列挙する。
【０１４２】
【表５】
2020502997.tif 000007
【０１４３】
【表６】
2020502997.tif 000008
【０１４４】
表６に示すように、ネガティブクロマトグラフィステップは、かなりの量のＡＡＶを保持しながら実質的な量の総タンパク質をうまく除去した。この純度の上昇は、図６における銀染色およびウェスタンブロットによっても示される。素通り画分は、ＡＡＶの最初の量の約６５％を含み、６％未満のＡＡＶが溶出画分中に存在していた。素通り画分の総タンパク質量は有意に低減された。総タンパク質の約３４％のみがＦＴ画分中に残存した。
【０１４５】
銀染色の説明
ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｍｉｄｉ  Ｇｅｌ  １．０ｍｍ、２０ウェル、カタログ番号ＷＧ１４０２ＢＸ１０
ＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００２
ＳＢ＋ＤＴＴインキュベーション、７０℃で１０分；１０分冷却ＪＡＡ処理
【０１４６】
ウェスタンブロットの説明
ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｍｉｄｉ  Ｇｅｌ  １．０ｍｍ、２０ウェル、カタログ番号ＷＧ１４０２ＢＸ１０
ＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００２
ＳＢ＋ＤＴＴインキュベーション、７０℃で１０分、１０分冷却ＪＡＡ処理
一次抗体：ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）
プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ
ＰＲＯＧＥＮ６１０５８
二次抗体：ヤギ抗マウスＡＬＰ
ＳＩＧＭＡ  Ａ４６５６、１：２０００、１時間
【０１４７】
実施例５
この実施例は、第２のＴＦＦステップの例示的方法を実証する。
【０１４８】
ネガティブクロマトグラフィを通して得られたＡＡＶ８含有素通り画分（実施例４）を濃縮し、さらに５００ｍＭ  ＮａＣｌ／５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌを含み、ｐＨ８．５のダイアフィルトレーションバッファー（ＤＢ１）に対してダイアフィルトレーションして、次の超遠心分離（ＵＣ）ステップ（例えば、実施例６、７、９、１４、または１６）のために生成物を状態調節した。第２のＴＦＦステップ（ＴＦＦ２）は、４ｘ０．１ｍ２  Ｐａｌｌ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｏｍｅｇａ  Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ  １００ｋＤａ（４ｘＰａｌｌ．品番：ＯＳ１００Ｔ１２）およびＰａｌｌ  ＵＦ／ＤＦシステムＣＭ５００を用いて実施した。超遠心分離／ダイアフィルトレーションの後、生成物を１２００ｍｌの目標体積まで濃縮し、システムから流出させた。ＡＡＶ８の収率を高めるために、その後およそ４００ｍｌのダイアフィルトレーションバッファーでメンブレンおよびＵＦ／ＤＦシステムをフラッシングした（１０分、１バールのフィード圧で保持液側を循環）。メンブレンフラッシング液および濃縮生成物をプールし、バイオバーデンの低減のために０．２μｍフィルター（ＰＡＬＬ品番：ＫＡ０２ＥＡＶＰ２Ｓ）を用いてろ過した。表７はＴＦＦ２のスキームを列挙し、表８はこのステップの収率を列挙する。
【０１４９】
【表７】
2020502997.tif 000009
【０１５０】
【表８】
2020502997.tif 000010
【０１５１】
表８に示すように、ＴＦＦ２ステップは、最初のＡＡＶの８８％を保持しながら、元の体積（ロード体積）の約７．５％まで体積をうまく低減させた。
【０１５２】
実施例６
この実施例は、５０％（ｗ／ｗ）緩衝エチレングリコール溶液および５０％（ｗ／ｗ）ショ糖密度勾配を用いて超遠心分離により完全ＡＡＶ粒子から空ＡＡＶ粒子を分離する例示的方法を実証する。このステップはさらに、宿主細胞タンパク質（例えば、ＨＳＰ７０）を除去する。「空カプシド」などの生成物関連不純物、ならびに例えばＨＳＰ７０およびＬＤＨなどの宿主細胞タンパク質も、このステップにより除去される。
【０１５３】
一本鎖で自己相補的形態のヒト血液凝固第ＩＸ因子ＰａｄｕａのベクターＤＮＡ（２．６ｋｂ）を含むＡＡＶ８試料を含有する、ｐＨ８．０の５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／７５０ｍＭ  ＮａＣｌ中の５０％（ｗ／ｗ）エチレングリコール緩衝溶液を、超遠心機（ＵＣ）にロードし、次いでショ糖濃度の異なる２つの異なるショ糖溶液をロードした。ＵＣに最初にロードされるショ糖溶液は５５％ショ糖濃度を有していた。最初のショ糖溶液の直後にＵＣにロードされるショ糖溶液は６０％ショ糖濃度を有していた。ロードした試料のショ糖密度勾配に対する比は１：１であり、各ショ糖溶液は等体積であった。全コア容積は１，６００ｍｌである。
【０１５４】
２．４２ｇのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トロメタモール）を８．００ｇの塩化ナトリウムおよび５５０．００ｇのショ糖と混合することにより、１ｋｇの５５％ショ糖濃度を有する緩衝ショ糖溶液を調製した。ＷＦＩを１ｋｇ近くまで添加し、必要に応じて１Ｍ  ＮａＯＨおよび２５％ＨＣｌを用いてｐＨを調整した。その後、ＷＦＩを１ｋｇまで添加した。
【０１５５】
２．４２ｇのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トロメタモール）を８．００ｇの塩化ナトリウムおよび６００．００ｇショ糖と混合することにより、１ｋｇの６０％ショ糖濃度を有する緩衝ショ糖溶液を調製した。ＷＦＩを１ｋｇ近くまで添加し、必要に応じて１Ｍ  ＮａＯＨおよび２５％ＨＣｌを用いてｐＨを調整した。その後、ＷＦＩを１ｋｇまで添加した。
【０１５６】
密度勾配は第１のＵＣ段階中に形成し、その際に回転速度を４，０００ｒｐｍに設定し、温度を２〜１０℃に維持した。第１の段階の後、回転速度を３５，０００ｒｐｍまで上げ、温度を２２℃に高めた。この高速および高温での第２の段階中に、完全ＡＡＶ粒子が空カプシドから分離された。２０時間後、超遠心機を停止させ、完全ＡＡＶ粒子の大部分を含む画分を回収した。密度勾配を築き、完全粒子を含む画分を回収するための入力パラメータ、溶出速度等に関する詳細を含む、実施されたＵＣステップに関する更なる詳細を下記の表９に示す。
【０１５７】
【表９】
2020502997.tif 000011
【０１５８】
結果を図１７に示しており、空カプシド（画分１５）が完全カプシド（画分１１）から分解された。
【０１５９】
図１８は、図１７に示す画分の各々において４つの異なるアッセイを実施した結果を示す。ｑＰＣＲはＡＡＶ８のＩＴＲの定量ＰＣＲ（ＩＴＲ−ｑＰＣＲ）を意味する。ＡＡＶ８：ＡＧは、ＡＡＶ８抗原に対するＥＬＩＳＡを意味する。ＷＡＸ％は、弱陰イオン交換により定量化した完全カプシドのパーセンテージを意味する。ＤＮＡ／ＡＡＶ比（本明細書では、しばしば、Ｓｐｅｃ．Ａｃｔ．または比活性とも称される）は、全ベクターゲノム（ＩＴＲ−ｑＰＣＲ）のｒＡＡＶ８粒子の全量（ＡＡＶ８：ＡＧ）に対する比を意味し、それは、ＤＮＡ含有カプシドならびに完全カプシドの割合に関する指標を与える。より高いＤＮＡ／ＡＡＶ比は、より多量の完全カプシドに相関する。完全カプシドから空カプシドへの移行は、画分１３から画分１５での比活性の急激な低下により示される。Ｙ軸に示すように、各アッセイに関する値を互いに正規化した。
【０１６０】
【表１０】
2020502997.tif 000012
【０１６１】
実施例７
この実施例は、ショ糖密度勾配を用いて超遠心分離により完全ＡＡＶ粒子から空ＡＡＶ粒子を分離する例示的方法を実証する。このステップはさらに、宿主細胞タンパク質（例えば、ＨＳＰ７０）を除去する。（上述したような）「空カプシド」などの生成物関連不純物も、このステップにより除去される。
【０１６２】
実施例５のＴＦＦ２を介して得られたＢドメイン欠失ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子を含む一本鎖ＤＮＡを含むベクターＤＮＡを含有する濃縮画分を、超遠心機（ＵＣ）にロードし、次いでショ糖濃度の異なる３つの異なるショ糖溶液をロードした。ＵＣに最初にロードされるショ糖溶液は５０％ショ糖濃度を有していた。最初のショ糖溶液の直後にＵＣにロードされるショ糖溶液は５５％ショ糖濃度を有し、最後にＵＣにロードされるショ糖溶液は６０％ショ糖濃度を有していた。
【０１６３】
２．４２ｇのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トロメタモール）を８．００ｇの塩化ナトリウムおよび５００．００ｇのショ糖と混合することにより、１ｋｇの５０％ショ糖濃度を有する緩衝ショ糖溶液を調製した。ＷＦＩを１ｋｇ近くまで添加し、必要に応じて１Ｍ  ＮａＯＨおよび２５％ＨＣｌを用いてｐＨを調整した。その後、ＷＦＩを１ｋｇまで添加した。
【０１６４】
２．４２ｇのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トロメタモール）を８．００ｇの塩化ナトリウムおよび５５０．００ｇショ糖と混合することにより、１ｋｇの５５％ショ糖濃度を有する緩衝ショ糖溶液を調製した。ＷＦＩを１ｋｇ近くまで添加し、必要に応じて１Ｍ  ＮａＯＨおよび２５％ＨＣｌを用いてｐＨを調整した。その後、ＷＦＩを１ｋｇまで添加した。
【０１６５】
２．４２ｇのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トロメタモール）を８．００ｇの塩化ナトリウムおよび６００．００ｇショ糖と混合することにより、１ｋｇの６０％ショ糖濃度を有する緩衝ショ糖溶液を調製した。ＷＦＩを１ｋｇ近くまで添加し、必要に応じて１Ｍ  ＮａＯＨおよび２５％ＨＣｌを用いてｐＨを調整した。その後、ＷＦＩを１ｋｇまで添加した。
【０１６６】
密度勾配は第１のＵＣ段階中に形成し、その際に回転速度を４０００ｒｐｍに設定し、温度を２〜１０℃に維持した。第１の段階の後、回転速度を３５０００ｒｐｍまで上げ、温度を２２℃に高めた。この高速および高温での第２の段階中に、完全ＡＡＶ粒子が空カプシドから分離された。およそ５時間後、超遠心機を停止させ、完全ＡＡＶ粒子の大部分を含む画分を回収した。密度勾配を築き、完全粒子を含む画分を回収するための入力パラメータ、溶出速度等に関する詳細を含む、実施されたＵＣステップに関する更なる詳細を下記の表１１および１２に示す。
【０１６７】
【表１１】
2020502997.tif 000013
【０１６８】
【表１２】
2020502997.tif 000014
【０１６９】
溶出パターンを図８に示し、またロード試料および個々の画分の銀染色およびウェスタンブロットを図９に示す。表１２に示すように、ピークプール中の粒子の８２％が完全粒子と考えられる。
【０１７０】
銀染色の説明
ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｍｉｄｉ  Ｇｅｌ  １．０ｍｍ、２０ウェル、カタログ番号ＷＧ１４０２ＢＸ１０
ＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００２
ＳＢ＋ＤＴＴインキュベーション、７０℃で１０分；１０分冷却ＪＡＡ処理
ウェスタンブロットの説明
ＮｕＰＡＧＥ  ４−１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｍｉｄｉ  Ｇｅｌ  １．０ｍｍ、２０ウェル、カタログ番号ＷＧ１４０２ＢＸ１０
ＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファー、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０００２
ＳＢ＋ＤＴＴインキュベーション、７０℃で１０分、１０分冷却ＪＡＡ処理
一次抗体：ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対するモノクローナル抗体（Ｍａｂ）
プロテインＡアフィニティクロマトグラフィ
ＰＲＯＧＥＮ６１０５８
二次抗体：ヤギ抗マウスＡＬＰ
ＳＩＧＭＡ  Ａ４６５６、１：２０００、１時間
【０１７１】
実施例８
この実施例は、脂質エンベロープウイルスを不活化する例示的方法、およびポリッシングステップを実証する。
【０１７２】
実施例７のＵＣステップにより得られたＡＡＶ８含有画分をプールし、平衡化バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ；ｐＨ８．５±０．２）で１：２．５に希釈した。溶媒界面活性剤（０．３％トリ−ｎ−ブチルホスファート；１．０％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００；０．３％ポリソルベート８０）での処理を実施した。その後、さらに１：２に希釈し、溶媒の導電率を３．６±０．２ｍＳ／ｃｍに調整した。得られた溶液をＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｍ）（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．：１１６８８１）ＩＤ  ２２ｍｍ、ベッド高５７ｍｍ（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＶＬ  ２２ｘ２５０．カタログ番号：９６２２０２５０）を含むクロマトグラフィカラムにロードし、次いで平衡化バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５±０．２）で洗浄した。バッファー（８．０９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；２．６８ｍＭ  ＫＣｌ；５％ソルビトール）を用いて第２の洗浄ステップを実施した。８．０９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；２．６８ｍＭ  ＫＣｌ；５％ソルビトールを含む第１の溶出バッファーから、８．０９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４；１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４；２．６８ｍＭ  ＫＣｌ；５％ソルビトール＋６００ｍＭ  ＮａＣｌを含む最後の溶出バッファーまでの、１２カラム体積のＮａＣｌ勾配によりカラム溶出を行った。主な量のＡＡＶ８は、明確なシャープなピークとして溶出し、精製ＡＡＶ８生成物を表すＥ２（溶出液２）として回収された。最後に、２Ｍ塩化ナトリウムでカラムを剥がし、次いで再生処理を行った。表１３および１４は、これらステップ、ならびにこれらステップを実施した後に得られる収率を列挙する。図１０は、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥでのＡＡＶ８の最終ポリッシングである。
【０１７３】
【表１３】
2020502997.tif 000015
【０１７４】
【表１４】
2020502997.tif 000016
【０１７５】
実施例９
この実施例は、その間に密度勾配が形成する超遠心分離ステップを含む、未精製画分からＡＡＶを精製する例示的方法を実証する。
【０１７６】
図１１は、その例示的方法で実施されるステップの概要である。３．２Ｌ体積（１．６Ｌの生成物＋１．６Ｌの密度勾配／ＴＢＳバッファー）の容量を有するコアを用いて超遠心分離ステップを実施した。
【０１７７】
ＵＳを停止させた状態で、１．６Ｌの開始材料（前の処理ステップからの中間生成物＝ＵＦＢ）を６Ｌ／ｈの一定流速でロータにロードし、次いで異なる密度の３つのショ糖溶液をロードした。ショ糖溶液は、以下の順序：８００ｍＬの５０％ショ糖、４００ｍＬの５５％ショ糖、および４００ｍＬの６０％ショ糖：で、１．５Ｌ／ｈ一定流速でロードした。
【０１７８】
ゾーナルモードを達成して密度が上昇するショ糖密度勾配を構築するために満たしたロータを０から４０００ｒｐｍまで加速させ、次いで４０００から３５０００ｒｐｍまで第２の加速を行った。ＵＣは３５０００ｒｐｍ（およそ９００００ｇ遠心力）で５時間行われた。最終速度が達成されると、温度を＋４℃から＋２２℃に変えた。開始材料中に含まれるＡＡＶ粒子は、それらの密度が周囲の勾配の密度と一致する地点に達するまでショ糖密度勾配中を移動する。完全カプシドと空カプシドはその密度が異なり、空ウイルスカプシドから完全ウイルスカプシドを分離するためにこの特徴を利用する。遠心分離ステップを終える１時間前に、温度を＋２２℃から＋４℃に手動で変えた。３５，０００から０ｒｐｍまでのＵＣの停止は、２ステップで：３５，０００から４，０００ｒｐｍまで減速により、および４，０００ｒｐｍから０ｒｐｍまでロータをフェードアウトさせたままにすることにより：実施した。
【０１７９】
２５ｍＬの画分、ならびに溶出の最後の廃棄画分を回収することにより、６Ｌ／ｈの流速で生成物を回収した。
【０１８０】
２５ｍＬの画分の回収は各々、画分７で始まり廃棄物ピークの開始で終わる。図１２の高ショ糖密度での第１のピークは「完全カプシド」を表す。第２のピークは「主に空カプシド」を表す。
【０１８１】
他のＡＡＶ８含有画分と同じ方法で、標準ＡＡＶ８「完全カプシド」として、画分Ｆ１０〜Ｆ１４をプールし、さらにＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｍ）でさらに精製した。表１５はＴＭＡＥクロマトグラフィステップの詳細を示し、表１６は用いられるバッファーを列挙する。
【０１８２】
【表１５】
2020502997.tif 000017
【０１８３】
【表１６】
2020502997.tif 000018
【０１８４】
およそ２５ｍｌの個々の超遠心分離画分を平衡化バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５±０．２）での１：２．５の希釈によって、別々に４ｍｌ  ＴＭＡＥカラムに添加した。０．３％トリ−ｎ−ブチルホスファート、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および０．３％ポリソルベート８０の存在下での溶媒界面活性剤処理の後、さらに１：２に希釈して導電率を３．６±０．２ｍＳ／ｃｍに調整し、さらにＡＡＶ８含有溶液を、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｍ）（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号１１６８８１）ＩＤ  １０ｍｍ、ベッド高５０ｍｍ±５ｍｍ（Ｍｅｒｃｋ−Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｖａｎｔａｇｅ  ＶＬ  １０ｘ２５０または同様のもの）を含むクロマトグラフィカラムに添加し、次いで平衡化バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．５±０．２）での第１の洗浄ステップ、および８．０９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、５％ソルビトール、ｐＨ７．４での第２の洗浄ステップを行った。８．０９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、５％ソルビトール、ｐＨ７．４から、８．０９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、５％ソルビトール＋６００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４までの１２カラム体積の勾配により溶出を行った。主な量のＡＡＶ８は、明確なシャープなピークとして溶出し、精製ＡＡＶ８生成物を表すＥ２（溶出液２）として回収された。得られたＡＡＶ８含有溶出液Ｅ２（溶出液２）を８．０９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、５％ソルビトール＋６００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４で１：２に希釈して、調合バッファー（８．０９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、５％ソルビトール＋３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）のマトリックスに調整した。最後に、２Ｍ塩化ナトリウムでカラムを剥がし、次いで再生処理を行った。クロマトグラフィシステムは＋１８℃〜＋２５℃の周囲温度で設置した。
【０１８５】
画分１０〜２１を分析用超遠心分離（ＡＵＣ）で分析し、さらにネイティブアガロースゲル電気泳動およびアルカリアガロースゲル電気泳動によりＡＡＶ８−ベクター（第ＩＸ因子Ｐａｄｕａ二本鎖（４．８ｋｂ）を含む）のＤＮＡ分析を実施した。図１３〜１６は、ＴＭＡＥでのポリッシング後のＵＣにより得られた各画分の分析データを示す。図１４はネイティブアガロース１％の写真であり、図１５はアルカリアガロース０．８％の写真である。図１５に示すように、超遠心分離において高ショ糖密度で得られたＵＶピークの画分Ｘ１０〜Ｘ１４のプールが、ベクターＤＮＡのより小さなＤＮＡ変異体の兆候なしに高純度の単一ＤＮＡバンドを含んでいた。
【０１８６】
分析用ＵＣのデータを表１７に示す
【表１７】
2020502997.tif 000019
【０１８７】
表１７に示すように、画分１０〜１５は、最大量の完全に含む(filled)ＡＡＶを含んでいた。相当量の完全カプシドが画分１６および１７に見られたが、画分１０〜１５と比べて、その量はわずかに少なく、空カプシドの量が増大している。完全カプシドの量の更なる減少および空カプシドの更なる増加が画分１９および２０で見られた。
【０１８８】
図１６は、指示ＵＣ画分からの単一のＢＤＳのデータを示す。これら結果は、ＡＵＣおよびアガロースゲル電気泳動で不完全ベクターＤＮＡの含有の検出のない、ＵＣ画分１０〜１５からの均質なＡＡＶ８生成物を示す。不完全ベクターＤＮＡは、画分１７から出現し、「主に空カプシド」ゾーンの後の画分で検出された。当業者はそのような幅広い分解能を有することを予測しなかったため、不完全ベクターの検出は驚きであった。従って、開発された分離法は、「全部」を含むカプシドから完全に空（すなわちＤＮＡを全く含まない）カプシドを分解することに限定されず、驚くことに、互いからは分解できない様々な長さのベクターＤＮＡの分離も可能にする。「空カプシド」集団中のＤＮＡの長さに関係なく、「空カプシド」からの「完全カプシド」の有意義な分離があることも示されている。すなわち、この方法は、空ベクター（切断および不完全ＤＮＡを含む）を枯渇させて、高含量の完全ＡＡＶカプシドを有するＡＡＶを得ることを可能にする。
【０１８９】
実施例１０
この方法は、ＡＡＶより大きくかつ適用されるナノフィルターの孔径よりも大きいウイルスの除去のためのナノろ過の例示的方法を記載する。
【０１９０】
３５ｎｍ＋／−２ｎｍの狭い孔径範囲を有する天然親水性の銅アンモニア法再生セルロースで構成された微多孔質中空糸の束を含む旭化成のプラノバ３５ｎｍフィルターを完全性のリーク試験で試験して、そのフィルターにピンホールまたは大きな欠陥がないことを確認し、さらに調合バッファーで予備洗浄した。陰イオン交換溶出液を取り、ナノフィルターを通して、デッドエンドモードで、０．１ＭＰａを越えない一定圧力下でろ過した。あるいは、タンジェンシャルフローろ過法でフィルターを用いてもよい。陰イオン交換溶出液を溶出バッファー（ＰＢＳ＋６００ｍＭ  ＮａＣｌ）で予備希釈してウイルス粒子の濃度を調整してもよい。全てのウイルス粒子を回収するために、ナノフィルターをバッファー（例えば、調合バッファー）で後洗浄する。ナノフィルターの後完全性試験をリーク試験および金粒子試験を用いて実施して、ナノフィルター孔径分布が変化していないこと、およびろ過中にナノフィルターがその完全性を維持していることを証明する。より多くの試料をロードすると高収率をもたらす。従って、典型的には、フィルター面積１ｍ２当たり５０Ｌより多くの溶液を添加する。
【０１９１】
実施例１１
この方法は、ＡＡＶより大きくかつ適用されるナノフィルターの孔径よりも大きいウイルスの除去のためのナノろ過の例示的方法を記載する。
【０１９２】
３５ｎｍ＋／−２ｎｍの狭い孔径範囲を有する天然親水性の銅アンモニア法再生セルロースで構成された微多孔質中空糸の束を含む旭化成のプラノバ３５ｎｍフィルターを完全性のリーク試験で試験して、そのフィルターにピンホールまたは大きな欠陥がないことを確認し、さらに調合バッファーで予備洗浄した。次に、２８７０．９８μｇ／ｍｌ（ＥＬＩＳＡで決定した濃度）のＡＡＶ８を含む４．０５ｍｌのプール画分を、最初に４．０５ｍｌのバッファー（１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、８．０９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、６００ｍＭ  ＮａＣｌおよび５％ソルビトール、ｐＨ７．４）中に希釈した。希釈倍率は１：２であった。次いで、８．１０ｇの第１の希釈物を６１．５７ｇのバッファー（１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、８．０９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５％ソルビトール、ｐＨ７．４）中に希釈して、ローディングバッファーをもたらす。ローディングバッファーの希釈倍率は、第１の希釈物と比較して１：８．６であり、プール画分と比較して１：１７．２であった。
【０１９３】
ナノフィルターを、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、８．０９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３５０ｍＭ  ＮａＣｌ、および５％ソルビトールを含み、ｐＨ７．４であるバッファー２５ｍｌで状態調節した。その状態調節中、加圧なしでかつ保持液の出口を開いた状態で、１０ｍｌのバッファーを用いてフィルターをパージした。その後、０．９バールの一定圧力を加えかつ保持液出口を閉じた状態で、約１５ｍｌのバッファーを中空糸に通してろ過した。
【０１９４】
その後、０．９バールの一定圧力下で９ｍｌのフラッシングバッファーをリザーバタンクに加えた。フラッシングバッファーは、１．４７ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、２．６８ｍＭ  ＫＣｌ、８．０９ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび５％ソルビトールを含み、ｐＨ７．４であった。次いで、フラッシングの後に試料を採取した。試料を採取した後、６０ｇの上記ローディングバッファーを、ナノフィルターを通して、デッドエンドモードで、０．９バールの一定圧力下でろ過した。
【０１９５】
ろ過からのデータを下記表１８に示す。ろ過からのＡＡＶの収率は少なくとも７７％である。
【表１８】
2020502997.tif 000020
【０１９６】
実施例１２
以下の実施例は、ＡＡＶ生成物の生物力価を試験する例示的方法を記載する。
【０１９７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生物力価アッセイにおいて、ウイルスベクターＡＡＶ８−ＦＩＸで肝標的細胞株をトランスフェクトし、その後それは機能的で測定可能なＦＩＸタンパク質を培地中に分泌する。
【０１９８】
第１のステップにおいて、ＡＡＶ８−ＦＩＸによりＨｅｐＧ２標的細胞に形質導入する。インキュベーション時間中にＦＩＸが細胞上清中に放出される。第２のステップにおいて、細胞培養物上清の第ＩＸ因子活性をＦＩＸ比色法により直接測定する。ＡＡＶ８−ＦＩＸ試料の測定値は、基準物質に対するパーセンテージとして与えられる。その方法は、ＡＡＶ８−ＦＩＸ遺伝子治療ベクターの生物学的機能の定量的評価を可能にする。
【０１９９】
実施例１３
この実施例は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを実証する。
【０２００】
上記の実施例において、本開示のプロセスのステップの後にＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを実施して、ＡＡＶ含有画分を同定し、またｑＰＣＲのＡＡＶ８（μｇ）に対する比により表されるＤＮＡ／ＡＡＶ比またはＡＡＶの「比活性」を計算する。ＤＮＡ／ＡＡＶ比は、ＡＡＶ粒子中に封入されたベクターＤＮＡを反映する。
【０２０１】
ＡＡＶ８  ＥＬＩＳＡは、ＴＥＣＡＮロボットシステムでＡＡＶ８滴定ＥＬＩＳＡキット（Ａｒｔ．Ｎｏ．ＰＲＡＡＶ８；Ｐｒｏｇｅｎ（ハイデルベルク、ドイツ）を用いて実施した。簡単に説明すると、会合したＡＡＶカプシド（ＡＤＫ８）上の立体構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体をマイクロタイターストリップにコーティングし、ＡＡＶ画分からＡＡＶ８粒子を捕獲するのに用いた。捕獲ＡＡＶ粒子を２つのステップにより検出した。第１のステップでは、ＡＤＫ８抗体に特異的なビオチンコンジュゲートモノクローナル抗体を（ＡＤＫ８とＡＤＫ８抗体との）免疫複合体に結合させた。ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートを、ビオチンコンジュゲートモノクローナル抗体に結合した免疫複合体に添加し、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼコンジュゲートをビオチンと反応させた。ペルオキシダーゼの基質溶液を添加し、結合したＡＡＶ粒子の量に比例する呈色反応が生じる。呈色反応を４５０ｎｍで光度測定により測定する。
【０２０２】
ＥＬＩＳＡは、試験画分中に存在するＡＡＶ８粒子の量を決定する。
【０２０３】
実施例１４
この実施例は、５０％エチレングリコール緩衝ローディング溶液、および５０％ショ糖密度勾配（すなわち、１：１比）を用いて超遠心分離により完全ＡＡＶ粒子から空ＡＡＶ粒子を分離する例示的方法を実証する。「空カプシド」などの生成物関連不純物、ならびに例えばＨＳＰ７０およびＬＤＨなどの宿主細胞タンパク質も、このステップにより除去される。
【０２０４】
ヒト血液凝固第ＶＩＩＩ因子（完全長〜４．８ｋｂ）を有するＡＡＶ８を含む緩衝エチレングリコール溶液（Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ＮａＣｌ中５０％（ｗ／ｗ））を超遠心機（ＵＣ）にロードし、次いでショ糖濃度が異なる２つの異なるショ糖溶液で形成されるショ糖密度勾配をロードした。ロード試料のショ糖密度勾配に対する比は１：１である。ＵＣに最初にロードされるショ糖溶液は５５％ショ糖濃度を有していた。第１のショ糖溶液の直後にＵＣにロードされたショ糖溶液は６０％ショ糖濃度を有していた。
【０２０５】
２．４２ｇのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トロメタモール）を８．００ｇの塩化ナトリウムおよび５５０．００ｇショ糖と混合することにより、１ｋｇの５５％ショ糖濃度を有する緩衝ショ糖溶液を調製した。ＷＦＩを１ｋｇ近くまで添加し、必要に応じて１Ｍ  ＮａＯＨおよび２５％ＨＣｌを用いてｐＨを調整した。その後、ＷＦＩを１ｋｇまで添加した。
【０２０６】
２．４２ｇのトリスヒドロキシメチルアミノメタン（トロメタモール）を８．００ｇの塩化ナトリウムおよび６００．００ｇショ糖と混合することにより、１ｋｇの６０％ショ糖濃度を有する緩衝ショ糖溶液を調製した。ＷＦＩを１ｋｇ近くまで添加し、必要に応じて１Ｍ  ＮａＯＨおよび２５％ＨＣｌを用いてｐＨを調整した。その後、ＷＦＩを１ｋｇまで添加した。
【０２０７】
この実施例では、３，２００ｍｌのコアが用いられ、ＡＡＶ８を含有する５０％エチレングリコール緩衝溶液は１，６００ｍｌであり、５５％（ｗ／ｗ）のショ糖溶液は８００ｍｌであり、６０％（ｗ／ｗ）のショ糖溶液は８００ｍｌであった。
【０２０８】
密度勾配は第１のＵＣ段階中に形成し、その際に回転速度を４０００ｒｐｍに設定し、温度を２〜１０℃に維持した。第１の段階の後、回転速度を３５０００ｒｐｍまで上げ、温度を２２℃に高めた。この高速および高温での第２の段階中に、完全ＡＡＶ粒子が空カプシドから分離された。２０時間後、超遠心機を停止させ、完全ＡＡＶ粒子の大部分を含む画分を回収した。
【０２０９】
結果を図１９に示しており、完全カプシド（画分１〜６）は空カプシド（画分８〜１７）から分解された。
【０２１０】
図２０は、画分８〜１０からの沈降係数グラフのオーバーレイであり、亜種（すなわち、不完全ベクターＤＮＡ）の分離を示す。矢印は、ＵＣ勾配における高密度を有する画分から低密度を有する画分へと、より低い質量を有するＡＡＶ８へのシフトを示す（すなわち、密度：画分８＞画分９＞画分１０）。これは、このプロトコルを用いて、適切な分解能で、ベクターＤＮＡをサイズに基づき分離できることのさらなる裏付けである。表１９も参照のこと。
【０２１１】
【表１９】
2020502997.tif 000021
【０２１２】
実施例１５
この実施例は、５０−５５−６０ショ糖溶液法を用いる、ショ糖密度勾配を用いた超遠心分離を実証する。その方法は、ＡＡＶ粒子がヒト血液凝固第ＩＸ因子Ｐａｄｕａの一本鎖ベクターＤＮＡ（２．６ｋＢ）を含むことを除いて、実施例７に示したのと同じである。図２１に示すように、完全カプシドと空カプシドとの間の分離は、ＩＴＲ  ｐＰＣＲとＡＡＶ  ＥＬＩＳＡの重なりにより示されるほど分解されない。
【０２１３】
実施例１６
この実施例は、合計７，７００ｍｌのコア容積を用いることを除いて、実施例６に記載のように５５−６０ショ糖溶液法を用いて、ショ糖密度勾配を用いた超遠心分離を実証する。従って、ロード体積は５０％エチレングリコールＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液中６，１００ｍｌであり、５５％ショ糖溶液の体積は８００ｍｌであり、６０％ショ糖溶液の体積も８００ｍｌである。超遠心分離溶出プロファイルを図２２に表す。ここで、ＡＡＶは高純度であるため、「廃棄物ピーク」はない。完全ＡＡＶ８を画分１〜８（各５０ｍｌ）から回収する。「空」ＡＡＶを画分９〜１５（各５０ｍｌ）から回収する。更なる画分１５〜２１（各１００ｍｌ）も回収する。図２２における高ショ糖密度での第１のピークは「完全カプシド」を表す。第２のピークは「空カプシド」を表す。
【０２１４】
本明細書で引用される、出版物、特許出願および特許を含むあらゆる参考文献は、各参考文献が個別におよび具体的にその全体が参照により組み込まれることが指摘されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１５】
本開示を説明する文脈（特に添付の特許請求の範囲の文脈）において使用される用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」および同様の指示対象の用語は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈において明らかに矛盾しない限り、単数形および複数形の両方を含むと解釈される。用語「含む」、「有する」、「包含する」および「含有する」は、特に断りのない限り、開放型用語（すなわち、「含むがそれに限定はされない」ことを意味する）として解釈される。
【０２１６】
本明細書における数値範囲の列挙は、別段の指示がない限り、単にその範囲内に含まれる各個別の値および各終点の値に対して個々に言及する省略方法としての役割を果たすことが意図され、各個別の値および各終点の値は、それが本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書内に組み込まれる。
【０２１７】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈において明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書に提供される任意のおよび全ての例、または例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をより明確に説明することを意図しており、別段に特許請求の範囲に記載されていない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書における言語は、特許請求の範囲に記載されていないいずれの要素も本開示の実施に必須であるとして指示すると解釈されるべきではない。
【０２１８】
本開示を実施するために発明者に分かっているベストモードを含む、本開示の好ましい実施形態を明細書中に記載する。それら好ましい実施形態の変形は、上記の説明を読むことにより当業者に明らかになるであろう。発明者は、当業者がそのような変形が適切であるとして利用することを予測し、さらに発明者は、具体的に明細書中に記載されているものとは別のやり方でその発明が実施されることを意図している。従って、本開示は、適用法に容認される、添付の特許請求の範囲に記載の主題の全ての変形および等価物を包含する。さらには、本明細書に別段の指示がない限り、または文脈において明らかに矛盾しない限り、上記の要素のあらゆる組合せもその全ての可能な変形において本開示に包含される。
【図１】
2020502997.tif 000022
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
2020502997.tif 000034
【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
2020502997.tif 000039
【図１８】
2020502997.tif 000040
【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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