(57)【要約】細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの凍結乾燥のための方法および組成物が提供される。細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む凍結乾燥された組成物を生産する方法、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む凍結乾燥用の製剤、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株、および凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を凍結乾燥用に調製する方法が提供される。一部のそのような方法は、緩衝液を含む製剤中の細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を提供するステップと、組成物を凍結ステップにおいて冷却するステップと、冷却された組成物を一次乾燥ステップにおいて真空および第１の温度上昇に曝露するステップと、一次乾燥ステップからの組成物を二次乾燥ステップにおいて真空および第２の温度上昇に曝露するステップとを含むことができ、それによって凍結乾燥された組成物が生産される。
2020533997.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含む凍結乾燥された組成物を生産する方法であって、
（ａ）緩衝液とスクロースとを含む製剤中においてＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を提供するステップ、
（ｂ）ステップ（ａ）で提供された組成物を凍結ステップにおいて約−３２℃〜約−８０℃の間の保持温度で冷却するステップ、
（ｃ）ステップ（ｂ）により生産された組成物を一次乾燥ステップにおいて約−１０℃〜約−３０℃の間の保持温度で真空に曝露するステップ、および
（ｄ）ステップ（ｃ）により生産された組成物を二次乾燥ステップにおいて約−５℃〜約２５℃の間の保持温度で真空に曝露するステップ
を含み、それによって凍結乾燥された組成物を生産する方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の前に、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を低下した温度に曝露することにより前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株においてストレス応答が誘導される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）の前に、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を低下した温度に曝露することにより前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株においてストレス応答が誘導されない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）における前記組成物に使用される前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、ステップ（ａ）の前に解凍される凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項５】
解凍される前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株の濃度が、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の間である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、約２℃〜約３７℃で解凍される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、約２０℃〜約３７℃で解凍される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、約３２℃および約３７℃で解凍される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、約３７℃で解凍される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、８時間以下の間、解凍される、請求項４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、解凍後２４時間以下の間、約２℃〜約８℃で保持される、請求項４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）における前記組成物に使用される前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、ステップ（ａ）の前に新鮮培養される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝液が、リン酸緩衝液である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１４】
前記製剤が、約１％〜約５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１５】
前記製剤が、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記製剤が、約２．５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記製剤が、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｉｓｔｅｒｉａを含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１８】
前記製剤が、トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）のうちの１つまたは複数を含まない、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項１９】
前記製剤が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記凍結ステップ（ｂ）における前記保持温度が、約−４０℃〜約−５０℃の間である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２１】
前記凍結ステップ（ｂ）における前記保持温度が、約−４５℃である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記凍結ステップ（ｂ）が、温度を毎分約１℃の速度で前記保持温度に低下させることを含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２３】
前記凍結ステップ（ｂ）における前記冷却が、約２時間〜約４時間の冷却である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２４】
前記凍結ステップ（ｂ）における前記冷却が、前記組成物を約２時間、前記保持温度で保持することを含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２５】
前記一次乾燥ステップ（ｃ）における前記保持温度が、約−１２℃〜約−２２℃の間である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２６】
前記一次乾燥ステップ（ｃ）における前記保持温度が、約−１７℃〜約−１９℃の間である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記一次乾燥ステップ（ｃ）における前記保持温度が、約−１８℃である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記一次乾燥ステップ（ｃ）が、温度を毎分約１℃の速度で前記保持温度に上昇させることを含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項２９】
前記一次乾燥ステップ（ｃ）が、約２５時間〜約３５時間である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項３０】
前記一次乾燥ステップ（ｃ）の終了が、前記組成物が保持温度に達した約１２〜約１６時間後である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項３１】
前記一次乾燥ステップ（ｃ）が、約０．０９ｍｂａｒの真空圧である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項３２】
前記二次乾燥ステップ（ｄ）における前記保持温度が、約−５℃〜約２０℃の間である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項３３】
前記二次乾燥ステップ（ｄ）における前記保持温度が、約−５℃〜約５℃の間である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記二次乾燥ステップ（ｄ）における前記保持温度が、約０℃である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記二次乾燥ステップ（ｄ）が、温度を毎分約０．２℃の速度で前記保持温度に上昇させることを含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項３６】
前記二次乾燥ステップ（ｄ）が、約１時間〜約１０時間である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項３７】
前記二次乾燥ステップ（ｄ）が、前記組成物を約２時間〜約６時間、前記保持温度で保持することを含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項３８】
前記二次乾燥ステップ（ｄ）が、前記組成物を約５時間〜約６時間、前記保持温度で保持することを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記二次乾燥ステップ（ｄ）が、約０．０９ｍｂａｒの真空圧である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項４０】
前記凍結乾燥された組成物中の残留水分が、約１％〜約５％の間である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項４１】
前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、約２％〜約４％の間である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、少なくとも約２．５％である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項４３】
前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、少なくとも約３％である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記凍結乾燥された組成物が、約−２０℃〜約４℃の間で約１２カ月保管された後、少なくとも約６０％の生存率を示す、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項４５】
前記凍結乾燥された組成物が、約−２０℃〜約４℃の間で約１２カ月保管された後、少なくとも約７５％の生存率を示す、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記凍結乾燥された組成物が、約−２０℃〜約４℃の間で約１２カ月保管された後、少なくとも約８０％の生存率を示す、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項４８】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、
前記緩衝液が、リン酸緩衝液であり、
前記製剤が、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含み、
前記製剤が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まず、
前記製剤が、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｉｓｔｅｒｉａを含み、
前記凍結ステップ（ａ）における前記保持温度が、約−４０℃〜約−５０℃の間であり、
前記一次乾燥ステップ（ｃ）における前記保持温度が、−１７℃〜−１９℃の間であり、
前記二次乾燥ステップ（ｄ）における前記保持温度が、−１℃〜１℃の間であり、
前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、約２．５％〜約４％の間である、
前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項４９】
ステップ（ａ）における前記組成物に使用される前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、ステップ（ａ）の前に解凍される凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株であり、
解凍される前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株の濃度が、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の間であり、
前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、約３７℃で解凍され、
前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、８時間以下の間、解凍され、
前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、解凍後２４時間以下の間、約２℃〜約８℃で保持される、
請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であり、前記融合ポリペプチドが、疾患関連抗原ペプチドに融合されたＰＥＳＴ含有ペプチドを含む、前記いずれかの請求項に記載の方法。
【請求項５１】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ｐｒｆＡ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
（１）Ｌｉｓｔｅｒｉａ株と、（２）リン酸緩衝液と、（３）スクロースとを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の凍結乾燥用の製剤。
【請求項５４】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を低下した温度に曝露することによりストレス応答が誘導された株である、請求項５３に記載の製剤。
【請求項５５】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａストックからである、請求項５３または５４に記載の製剤。
【請求項５６】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、新鮮培養されたＬｉｓｔｅｒｉａストックからである、請求項５３または５４に記載の製剤。
【請求項５７】
約１％〜約５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、請求項５３〜５６のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項５８】
約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、請求項５７に記載の製剤。
【請求項５９】
約２．５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、請求項５８に記載の製剤。
【請求項６０】
トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）のうちの１つまたは複数を含まない、請求項５３〜５９のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６１】
トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、請求項６０に記載の製剤。
【請求項６２】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、請求項５３〜６１のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６３】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、
前記製剤が、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含み、
前記製剤が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、
請求項５３〜６２のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６４】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であり、前記融合ポリペプチドが、疾患関連抗原ペプチドに融合されたＰＥＳＴ含有ペプチドを含む、請求項５３〜６３のいずれか一項に記載の製剤。
【請求項６５】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ｐｒｆＡ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、請求項６４に記載の製剤。
【請求項６６】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、請求項６４に記載の製剤。
【請求項６７】
請求項１〜５２のいずれか一項に記載の方法により生産される、凍結乾燥された組成物。
【請求項６８】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ株と、リン酸緩衝液と、スクロースとを含む、凍結乾燥された組成物。
【請求項６９】
トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）のうちの１つまたは複数を含まない、請求項６８に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項７０】
トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、請求項６９に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項７１】
前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、約１％〜約５％の間である、請求項６７〜７０のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項７２】
前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、約２％〜約４％の間である、請求項７１に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項７３】
前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、少なくとも約２．５％である、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項７４】
前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、少なくとも約３％である、請求項７３に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項７５】
凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、少なくとも約２．５％である、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含む凍結乾燥された組成物。
【請求項７６】
約−２０℃〜約４℃の間で約１２カ月保管された後、少なくとも約６０％の生存率を示す、請求項６７〜７５のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項７７】
約−２０℃〜約４℃の間で約１２カ月保管された後、少なくとも約７５％の生存率を示す、請求項７６に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項７８】
約−２０℃〜約４℃の間で約１２カ月保管された後、少なくとも約８０％の生存率を示す、請求項７７に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項７９】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、請求項６７〜７８のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項８０】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、
前記凍結乾燥された組成物が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まず、
前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、２．５％〜４％の間である、
請求項６７〜７９のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項８１】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であり、前記融合ポリペプチドが、疾患関連抗原ペプチドに融合されたＰＥＳＴ含有ペプチドを含む、請求項６７〜８０のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項８２】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ｐｒｆＡ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、請求項８１に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項８３】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、請求項８１に記載の凍結乾燥された組成物。
【請求項８４】
凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株を凍結乾燥用に調製する方法であって、前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株を約２０℃〜約３７℃の間の温度で解凍するステップを含む方法。
【請求項８５】
前記温度が、約３２℃〜約３７℃の間である、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記温度が、約３７℃である、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、８時間以下の間、解凍される、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、解凍後２４時間以下の間、約２℃〜約８℃で保持される、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、緩衝液とスクロースとを含む製剤中において解凍される、請求項８４〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記製剤が、約１％〜約５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記製剤が、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記製剤が、約２．５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記製剤が、トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）のうちの１つまたは複数を含まない、請求項８９〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記製剤が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、請求項８９〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、
前記製剤が、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含み、
前記製剤が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、
請求項８９〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年９月１９日に出願された米国特許出願番号第６２／５６０，３１８号の利益を主張するものであり、この出願は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＥＦＳウェブ経由でテキストファイルとして提出した配列表の参照
ファイル５１９１５２ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔに記載の配列表は、８９．２キロバイトであり、２０１８年８月２４日に作成したものであり、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
背景
凍結乾燥は、溶液から溶媒を除去して、液体より安定しており、高温での保管が容易である固体または粉末を形成するプロセスある。フリーズドライとしても公知の凍結乾燥は、凍結、続いて昇華を含む。結果として生じる凍結乾燥物は、冷凍せずにまたは液体より高温で保管することができ、このことにより、物質の保管および輸送コストが削減され、製品に必要とされる保管スペースも低減される。凍結乾燥は、製品の重量を低減させることもでき、したがって、同様に、出荷および関連コストが削減される。凍結乾燥は、様々な生体分子の保存および保管に特に有用である。なぜなら、凍結乾燥は、それらの保管寿命を延ばすからである。
【０００４】
液体製剤と比較して、固体製剤には、優れた保管安定性、分子移動度および望ましくない化学反応の低減、ならびに出荷および流通の容易さを増すためのより低い梱包重量などの、複数の利点がある。さらに、現在利用可能な市販のワクチンの全ては低温保管を必要とするので、目的は、固体状態安定化技術を利用して、それらの室温またはより高温での安定性を増大させること、ならびに有効性の維持および安全性の確保のためのコールドチェーンへの依存を低減することである。フリーズドライされた細菌培養物の低い保管および輸送コストは、凍結保存と比較して大きな利点であるため、凍結乾燥は、好ましい保存方法であるが、凍結乾燥は、特別な装置および訓練された人材を必要とする多くのパラメーターによる影響を受ける非常に複雑な物理的プロセスである。フリーズドライは、細菌などの細胞の生理、特性および機能に影響を与え得る、生存率の低下、代謝活性の低下、および細胞形態の変化を含む、細胞に多くのタイプの損傷を引き起こし得る。
【０００５】
加えて、様々な異なる凍結乾燥パラメーターの影響は非常に株特異的であり、この株依存性のため、いずれか１つの特定の株から一般的な結論またはガイダンスを導き出すことは困難である。細菌の高度な生物学的および代謝的多様性のため、細菌特異的な最適化フリーズドライ手順を開発することは困難であり、骨が折れる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどのＬｉｓｔｅｒｉａ菌株の凍結乾燥、ならびに凍結乾燥をＬｉｓｔｅｒｉａについて実行可能な選択肢にするためにどのパラメーターを最適化する必要があり、どのようにそれらのパラメーターを最適化するのかに関するデータは、非常に限られている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、の凍結乾燥のための方法および組成物が提供される。一態様では、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む凍結乾燥された組成物を生産するための方法が提供される。一部のそのような方法は、緩衝液を含む製剤中の細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を提供するステップと、組成物を凍結ステップにおいて冷却するステップと、冷却された組成物を一次乾燥ステップにおいて真空および第１の温度上昇に曝露するステップと、一次乾燥ステップからの組成物を二次乾燥ステップにおいて真空および第２の温度上昇に曝露するステップとを含むことができ、それによって凍結乾燥された組成物が生産される。
【０００７】
一部のそのような方法では、組成物に使用される細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、凍結ステップの前に解凍される凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株である。特定の例では、凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を約２℃〜約３７℃、約２０℃〜約３７℃、約２３℃〜約３７℃、約２５℃〜約３７℃、約３２℃〜約３７℃、または約３７℃の温度で解凍することができる。必要に応じて、解凍は、約８時間以下の間の解凍である。必要に応じて、解凍された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、約２℃〜約８℃の間の温度で約２４時間以下の間、保持される。特定の例では、解凍される細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の濃度は、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の間であり得る。
【０００８】
一部のそのような方法では、製剤は、緩衝液およびスクロースを含む。例えば、製剤緩衝液は、約１％〜約５％  ｗ／ｖ  スクロース、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロース、または約２．５％  ｗ／ｖ  スクロースを含み得る。必要に応じて、製剤は、トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）、または組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）などの１つまたは複数の他の賦形剤を含まない。
【０００９】
一部のそのような方法では、製剤は、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａを含む。
【００１０】
一部のそのような方法では、一次乾燥ステップにおける保持温度は、約−１０℃〜約−３０℃の間、約−１２℃〜約−２２℃の間、約−１７℃〜約−１９℃の間、または約−１８℃である。
【００１１】
一部のそのような方法では、凍結乾燥された組成物中の残留水分は、少なくとも約２．５％、少なくとも約３％、または少なくとも約３．５％である。一部のそのような方法では、残留水分は、約１％〜約５％の間、または約２％〜約４％の間である。
【００１２】
一部のそのような方法では、凍結乾燥された組成物は、約−２０℃〜約４℃の間での保管後、または約−２０℃もしくは約４℃で約６カ月、１２カ月、１８カ月もしくは２４カ月保管後、少なくとも約６０％、７０％、８０％または９０％の生存率を示す。
【００１３】
そのような方法は、例えば、（ａ）緩衝液とスクロースとを含む製剤中においてＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を提供するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で提供された組成物を凍結ステップにおいて約−３２℃〜約−８０℃の間の保持温度に冷却するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）により生産された組成物を一次乾燥ステップにおいて約−１０℃〜約−３０℃の間の保持温度で真空に曝露するステップ、および（ｄ）ステップ（ｃ）により生産された組成物を二次乾燥ステップにおいて約−５℃〜約２５℃の間の保持温度で真空に曝露するステップを含むことができ、それによって凍結乾燥された組成物を生産する。あるいは、そのような方法は、例えば、（ａ）緩衝液とスクロースとを含む製剤中のＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を提供するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で提供された組成物を凍結ステップにおいて約−３２℃〜約−８０℃の間の保持温度に冷却するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）により生産された組成物を一次乾燥ステップにおいて約−１０℃〜約−３０℃の間の保持温度で真空に曝露するステップ、および（ｄ）ステップ（ｃ）により生産された組成物を二次乾燥ステップにおいて約５℃〜約２５℃の間の保持温度で真空に曝露するステップを含むことができ、それによって凍結乾燥された組成物が生産される。一部のそのような方法では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を低下した温度に曝露することによりＬｉｓｔｅｒｉａ株においてストレス反応が誘導され、緩衝液は、リン酸緩衝液であり、製剤は、２％〜３％  ｗ／ｖ  スクロースを含み、製剤は、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まず、一次乾燥ステップ（ｃ）における温度は、−１７℃〜−１９℃の間であり、凍結乾燥された組成物中の残留水分は、３％〜４％の間である。一部のそのような方法は、次の要素の１つまたは複数または全てを有する：Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である；緩衝液は、リン酸緩衝液である；製剤は、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含む；製剤は、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない；製剤は、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｉｓｔｅｒｉａを含む；凍結ステップ（ａ）における保持温度は、約−４０℃〜約−５０℃の間である；一次乾燥ステップ（ｃ）における保持温度は、約−１７℃〜約−１９℃の間である；二次乾燥ステップ（ｄ）における保持温度は、−１℃〜１℃の間である；および凍結乾燥された組成物中の残留水分は、約２．５％〜約４％の間である。一部のそのような方法では、ステップ（ａ）における組成物に使用されるＬｉｓｔｅｒｉａ株は、ステップ（ａ）の前に解凍される凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株である。必要に応じて、そのような方法は、次の要素の１つまたは複数または全てを有する：解凍される凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株の濃度は、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）である；凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株は、約３７℃で解凍される；凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株は、８時間以下の間、解凍���れる；および凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株は、解凍後２４時間以下の間、約２℃〜約８℃で保持される。本明細書で開示される凍結乾燥方法により生産される、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株も、提供される。
【００１４】
別の態様では、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む凍結乾燥用の製剤が提供される。そのような製剤は、例えば、（１）Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、（２）リン酸緩衝液、および（３）スクロースを含み得る。一部のそのような製剤では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、製剤は、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含み、製剤は、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない。
【００１５】
別の態様では、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む凍結乾燥された組成物が提供される。一部のそのような凍結乾燥された組成物は、少なくとも約２．５％または少なくとも約３％の残留水分を有する。一部のそのような凍結乾燥された組成物は、リン酸緩衝液およびスクロースをさらに含み得る。一部のそのような凍結乾燥された組成物では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、凍結乾燥された組成物は、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まず、凍結乾燥された組成物中の残留水分は、３％〜４％の間である。
【００１６】
別の態様では、凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株を凍結乾燥用に調製する方法であって、凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株を約２０℃〜約３７℃の間の温度で解凍するステップを含む方法が、提供される。必要に応じて、そのような方法は、次の要素の１つまたは複数または全てを有する：解凍される凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株の濃度は、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）である；凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株は、約３７℃で解凍される；凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株は、８時間以下の間、解凍される；および凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株は、解凍後２４時間以下の間、約２℃〜約８℃で保持される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、異なる製剤緩衝液（クエン酸塩、リン酸塩およびＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸））、およびスクロース（Ｓｕｃ）対トレハロース（Ｔｒｅｈ）対グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）対組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の異なる比に関する、経時的な生存細胞計数（ＶＣＣ）データを示す。
【００１８】
【図２Ａ】図２Ａおよび図２Ｂは、１カ月間の安定性アンカーポイント（図２Ａ）および６ヶ月間の安定性アンカーポイント（図２Ｂ）での、加速された安定性試験におけるＶＣＣ多変量データ解析（ＭＶＤＡ）を示す。
【図２Ｂ】図２Ａおよび図２Ｂは、１カ月間の安定性アンカーポイント（図２Ａ）および６ヶ月間の安定性アンカーポイント（図２Ｂ）での、加速された安定性試験におけるＶＣＣ多変量データ解析（ＭＶＤＡ）を示す。
【００１９】
【図３】図３は、異なるＯＤレベルおよび安定剤組合せに関するＶＣＣデータを示す。各プロットの見出しは、バイアル内のＯＤ（２．０、３．０、１０．０、１２．５、１５．０、１７．５または２０．０）、安定剤（緩衝液２（２．５％スクロース）または緩衝液５（５％スクロースとアミノ酸ミックス）を指し示す。
【００２０】
【図４】図４は、異なるＯＤレベル、およびスクロース（Ｓｕｃ）対アミノ酸ミックス（ＡＡミックス）対組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の比に関するＶＣＣデータを示す。各プロットの見出しは、バイアル内のＯＤ（２または１０）、スクロース（１０、５、２．５）：アミノ酸ミックス（存在（１）または非存在（０））：ｒＨＳＡ（０、１または２．５）を指し示す。
【００２１】
【図５】図５は、異なるＯＤレベル、およびスクロース（Ｓｕｃ）対アミノ酸ミックス（ＡＡミックス）対組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の比に関する残留水分（ＲＭ）データを示す。
【００２２】
【図６】図６は、凍結乾燥サイクルにおける異なる時点での異なるパーセンテージのスクロース（体積当たりの重量）に関する残留水分データを示す。
【００２３】
【図７Ａ】図７Ａおよび図７Ｂは、Ｌｙｏ４実験における一次乾燥ステップ後、ランプ後、または二次乾燥ステップ後のＬｍ試料における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、凍結乾燥後ＶＣＣデータを示す。図７Ａは、２．５％体積当たりの重量（ｗ／ｖ）スクロースを有する製剤の結果を示す。図７Ｂは、５％ｗ／ｖスクロースを有する製剤の結果を示す。
【図７Ｂ】図７Ａおよび図７Ｂは、Ｌｙｏ４実験における一次乾燥ステップ後、ランプ後、または二次乾燥ステップ後のＬｍ試料における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、凍結乾燥後ＶＣＣデータを示す。図７Ａは、２．５％体積当たりの重量（ｗ／ｖ）スクロースを有する製剤の結果を示す。図７Ｂは、５％ｗ／ｖスクロースを有する製剤の結果を示す。
【００２４】
【図８】図８は、Ｌｙｏ５実験における、凍結乾燥前の氷浴における温度シフトによりストレスを与えたＬｍ試料、凍結乾燥前の酸処理によりストレスを与えてより低いｐＨにしたＬｍ試料、凍結乾燥前の温度シフトおよびｐＨシフトの両方によりストレスを与えたＬｍ試料、ならびに温度シフトもｐＨシフトもないＬｍ試料における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、凍結乾燥後ＶＣＣデータを示す。
【００２５】
【図９】図９は、Ｌｙｏ６実験における、凍結乾燥の前の（初期）、および異なる時間量の異なる温度での保管後の凍結乾燥後の（他の全試料）ＶＣＣデータ（平均凍結乾燥前ＶＣＣのパーセント）を示す。
【００２６】
【図１０】図１０は、Ｌｙｏ７実験における、凍結乾燥の前の、および異なる時間量の異なる温度での保管後の凍結乾燥後のＶＣＣデータ（平均凍結乾燥前ＶＣＣのパーセント）を示す。
【００２７】
【図１１】図１１は、Ｌｙｏ８実験における、新鮮なＬｍ試料（パートＡ）、および解凍した凍結Ｌｍ試料（パートＢ）に関する、異なる時間量の異なる温度での保管後の凍結乾燥後ＶＣＣデータ（平均凍結乾燥前ＶＣＣのパーセント）を示す。
【００２８】
【図１２】図１２は、Ｌｙｏ９実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、凍結乾燥後ＶＣＣデータを示す。
【００２９】
【図１３】図１３は、Ｌｙｏ１０実験における、凍結乾燥前の氷浴における温度シフトによりストレスを与えたＬｍ試料（パートＢ）、および温度シフトなしのＬｍ試料（パートＡ）における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、凍結乾燥後ＶＣＣデータを示す。
【００３０】
【図１４】図１４は、Ｌｙｏ１１実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、凍結乾燥後ＶＣＣデータを示す。
【００３１】
【図１５】図１５は、Ｌｙｏ１２実験における、新鮮なＬｍ試料（パートＡ）、凍結乾燥前に２〜８℃で解凍した凍結Ｌｍ試料（パートＢ）、および凍結乾燥前に３７℃で解凍し、４時間インキュベートした凍結Ｌｍ試料（パートＣ）における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、凍結乾燥後ＶＣＣデータを示す。
【００３２】
【図１６】図１６は、新鮮なＬｍ試料（パートＡ）、および２〜８℃で３日間保管したＬｍ試料における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、凍結乾燥後ＶＣＣデータを示す。
【００３３】
【図１７】図１７は、次の条件下のＬｍ試料における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、凍結乾燥後ＶＣＣデータを示す：２Ｒバイアル、１×１０９個のＶＣＣ、および１．２ｍＬ充填。
【００３４】
【図１８】図１８は、凍結乾燥の前、凍結乾燥の後、ならびに３０℃で１、２および３日間の加速された条件における（それぞれＴｌｉｑ、Ｔｌｙｏ、Ｔ４２時間、Ｔ４８時間およびＴ７２時間）、ＶＣＣデータ（ＣＦＵ／ｍＬ）を示す。
【００３５】
【図１９】図１９は、二次乾燥ステップにおける棚温度（ＳＤ温度）の関数としての残留水分含量（ＲＭ）を示す。
【００３６】
【図２０】図２０は、Ａｘａｌｉｍｏｇｅｎｅ  Ｆｉｌｏｌｉｓｂａｃ（ＡＤＸＳ−ＨＰＶ）のための原薬製造プロセスフローを示す。
【００３７】
【図２１】図２１は、Ａｘａｌｉｍｏｇｅｎｅ  Ｆｉｌｏｌｉｓｂａｃ（ＡＤＸＳ−ＨＰＶ）薬物製品の製造のためのフロー図を示す。
【００３８】
【図２２Ａ】図２２Ａは、Ｌｙｏ１実験における、凍結乾燥の前の、および異なる時間量の異なる温度での保管後の凍結乾燥後のＶＣＣデータ（平均凍結乾燥前ＶＣＣのパーセント）を示す。
【００３９】
【図２２Ｂ】図２２Ｂは、Ｌｙｏ１実験における凍結乾燥の直後および２〜８℃で６カ月後の残留水分を示す。
【００４０】
【図２３Ａ】図２３Ａは、Ｌｙｏ２実験における、凍結乾燥の前の、および異なる時間量（月数）の異なる温度での保管後の凍結乾燥後のＶＣＣデータ（平均凍結乾燥前ＶＣＣのパーセント）を示す。
【００４１】
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、Ｌｙｏ２実験における、凍結乾燥の直後および２〜８℃で６カ月後の残留水分を示す。
【００４２】
【図２４Ａ】図２４Ａは、Ｌｙｏ４実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、一次乾燥後、ランプ後、および二次乾燥後の、２．５％スクロースを使用した残留水分（ＲＭ）を示す。
【００４３】
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、Ｌｙｏ４実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、一次乾燥後、ランプ後、および二次乾燥後の、５．０％スクロースを使用した残留水分（ＲＭ）を示す。
【００４４】
【図２５】図２５は、Ｌｙｏ５実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、様々なストレス処理後の残留水分を示す。
【００４５】
【図２６】図２６は、Ｌｙｏ６実験における、凍結乾燥前、異なる時間量の異なる温度での保管後の、温度シフト処理後の残留水分を示す。
【００４６】
【図２７】図２７は、Ｌｙｏ７実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の残留水分を示す。
【００４７】
【図２８】図２８は、Ｌｙｏ８実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、直ちに凍結乾燥された試料（パートＡ）、または凍結され、解凍され、次いで凍結乾燥された試料（パートＢ）の残留水分を示す。
【００４８】
【図２９】図２９は、Ｌｙｏ９実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の残留水分を示す。
【００４９】
【図３０】図３０は、Ｌｙｏ１０実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の残留水分を示す。
【００５０】
【図３１】図３１は、Ｌｙｏ１１実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の残留水分を示す。
【００５１】
【図３２】図３２は、Ｌｙｏ１２実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の残留水分を示す。
【００５２】
【図３３】図３３は、Ｌｙｏ１３実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の残留水分を示す。
【００５３】
【図３４】図３４は、Ｌｙｏ１４実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の残留水分を示す。
【００５４】
【図３５】図３５は、バッチ規模実験における、異なる時間量の３０℃での保管後の、凍結乾燥前のパーセントとしての凍結乾燥後ＶＣＣデータを示す。
【００５５】
【図３６】図３６は、バッチ規模実験における、異なる時間量の３０℃での保管後の、凍結乾燥後のパーセントとしての凍結乾燥後ＶＣＣデータを示す。
【００５６】
【図３７】図３７は、バッチ規模実験における、残留水分（ＲＭ）ｖｓ．試料を示す。
【００５７】
【図３８】図３８は、バッチ規模実験における、凍結乾燥および３０℃での７２時間保管後の残留水分（ＲＭ）を示す。
【００５８】
【図３９】図３９は、Ｌｙｏ１１実験における、凍結乾燥されていない細菌および１０−ｍｅｒ対照と比較した、凍結乾燥された製品の生物活性およびＩＮＦγ誘導を示す。
【００５９】
【図４０】図４０Ａ〜図４０Ｂは、ＷＰ３実験における、凍結乾燥の前の、ならびに凍結乾燥の直後および２４、４８または７２時間の３０℃での保管後の凍結乾燥後の、ＶＣＣデータ（Ａ）、ならびに残留水分（Ｂ）を示す。
【００６０】
【図４１Ａ】図４１Ａ〜図４１Ｂは、ＷＰ６実験における、凍結乾燥の前の、ならびに凍結乾燥の直後および２４、４８または７２時間の３０℃での保管後の凍結乾燥後の、ＶＣＣデータ（Ａ）、ならびに残留水分（Ｂ）を示す。
【図４１Ｂ】図４１Ａ〜図４１Ｂは、ＷＰ６実験における、凍結乾燥の前の、ならびに凍結乾燥の直後および２４、４８または７２時間の３０℃での保管後の凍結乾燥後の、ＶＣＣデータ（Ａ）、ならびに残留水分（Ｂ）を示す。
【００６１】
【図４２】図４２Ａ〜図４２Ｂは、ＷＰ７実験における、凍結乾燥の直後および２４、４８または７２時間の３０℃での保管後の凍結乾燥後の、凍結乾燥ケーキ（Ａ）および復元時間（Ｂ）を示す。
【００６２】
【図４３】図４３は、ＷＰ７実験における、凍結乾燥の前の、ならびに凍結乾燥の直後、ならびに２４時間、７２時間および７日間の３０℃での保管後の凍結乾燥後の、ＶＣＣデータを示す。
【００６３】
【図４４Ａ】図４４Ａ〜図４４Ｂは、ＷＰ７実験における、ＶＣＣデータ（Ａ）およびパーセント生細胞（Ｂ）ｖｓ．３０℃における保管時間を示す。
【図４４Ｂ】図４４Ａ〜図４４Ｂは、ＷＰ７実験における、ＶＣＣデータ（Ａ）およびパーセント生細胞（Ｂ）ｖｓ．３０℃における保管時間を示す。
【００６４】
【図４５Ａ】図４５Ａ〜図４５Ｂは、ＷＰ７実験における、ＣＦＵ／ｍＬ（Ａ）およびパーセント生存細胞（Ｂ）ｖｓ．時間を示す。
【図４５Ｂ】図４５Ａ〜図４５Ｂは、ＷＰ７実験における、ＣＦＵ／ｍＬ（Ａ）およびパーセント生存細胞（Ｂ）ｖｓ．時間を示す。
【００６５】
【図４６】図４６Ａ〜図４６Ｂは、ＷＰ７実験における、凍結乾燥の前の、ならびに凍結乾燥の直後、ならびに２４および７２時間の３０℃での保管後の凍結乾燥後の、ＶＣＣデータを示す。
【００６６】
【図４７】図４７Ａ〜図４７Ｂは、ＷＰ７実験における、凍結乾燥の前の、ならびに凍結乾燥の直後、ならびに２４および７２時間の３０℃での保管後の凍結乾燥後の、ＶＣＣデータを示す。
【００６７】
【図４８】図４８は、ＡＤＸＳ１１−００１パイロットバッチに関するＶＣＣおよびＲＭの散布図を示す。
【００６８】
【図４９】図４９は、ロット＃５３２９ＰＤ−１７−０１（ＡＤＸＳ１１−００１パイロットバッチ）に関するＶＣＣの散布図を示す。
【００６９】
【図５０】図５０は、ロット＃５３２９ＰＤ−１７−０１（ＡＤＸＳ１１−００１パイロットバッチ）に関する％生細胞（％  ｌｉｖｅ）の散布図を示す。
【００７０】
【図５１】図５１は、ロット＃５３２９ＰＤ−１７−０１（ＡＤＸＳ１１−００１パイロットバッチ）に関するｐＨの散布図を示す。
【００７１】
【図５２】図５２は、３０℃で保管されたロット＃５３２９ＰＤ−１７−０１（ＡＤＸＳ１１−００１パイロットバッチ）に関するＶＣＣの散布図を示す。
【００７２】
【図５３】図５３は、３０℃で保管されたロット＃５３２９ＰＤ−１７−０１（ＡＤＸＳ１１−００１パイロットバッチ）に関する％生細胞の散布図を示す。
【００７３】
【図５４】図５４は、移植および投薬スケジュール（ＡＤＸＳ１１−００１パイロットバッチ）を説明するチャートを示す。
【００７４】
【図５５】図５５は、凍結乾燥されたＡＸＡＬおよび臨床ＡＸＡＬの両方が、異なる用量で、ＴＣ−１腫瘍モデルにおいて腫瘍成長を阻害することを説明するグラフを示す。
【００７５】
【図５６】図５６は、凍結乾燥されたＡＸＡＬおよび臨床ＡＸＡＬの両方が、異なる用量で、ＴＣ−１腫瘍モデルにおいて動物生存を延長することを説明するグラフを示す。
【００７６】
【図５７】図５７は、サイクル１およびサイクル２と比較して、ＷＰ７サイクル３の復元時間を説明するグラフを示す。
【００７７】
【図５８Ａ】図５８Ａ〜図５８Ｂは、Ａ００８５（Ａ）およびＡ１３００（Ｂ）のＴｌｉｑ、Ｔｌｙｏ、ならびに３０℃で２４および７２時間の保管後のＭＦＩ解析を説明するグラフを示す。
【図５８Ｂ】図５８Ａ〜図５８Ｂは、Ａ００８５（Ａ）およびＡ１３００（Ｂ）のＴｌｉｑ、Ｔｌｙｏ、ならびに３０℃で２４および７２時間の保管後のＭＦＩ解析を説明するグラフを示す。
【００７８】
【図５８Ｃ】図５８Ｃ〜図５８Ｄは、Ｂ００８５（Ｃ）およびＢ１３００（Ｄ）のＴｌｉｑ、Ｔｌｙｏ、ならびに３０℃で２４および７２時間の保管後のＭＦＩ解析を説明するグラフを示す。
【図５８Ｄ】図５８Ｃ〜図５８Ｄは、Ｂ００８５（Ｃ）およびＢ１３００（Ｄ）のＴｌｉｑ、Ｔｌｙｏ、ならびに３０℃で２４および７２時間の保管後のＭＦＩ解析を説明するグラフを示す。
【００７９】
【図５９Ａ】図５９Ａ〜図５９Ｂは、Ａ．Ａ００８５（２００倍希釈）およびＢ．Ａ１３００（５，０００倍希釈）に関するＲＲＭ結果を説明するグラフを示す。
【図５９Ｂ】図５９Ａ〜図５９Ｂは、Ａ．Ａ００８５（２００倍希釈）およびＢ．Ａ１３００（５，０００倍希釈）に関するＲＲＭ結果を説明するグラフを示す。
【００８０】
【図５９Ｃ】図５９Ｃ〜図５９Ｄは、Ｃ．Ｂ００８５（２００倍希釈）およびＤ．Ｂ１３００（５，０００倍希釈）に関するＲＲＭ結果を説明するグラフを示す。
【図５９Ｄ】図５９Ｃ〜図５９Ｄは、Ｃ．Ｂ００８５（２００倍希釈）およびＤ．Ｂ１３００（５，０００倍希釈）に関するＲＲＭ結果を説明するグラフを示す。
【００８１】
【図６０Ａ】図６０Ａ〜図６０Ｂは、Ａ００８５（２００倍希釈）（Ａ）およびＡ１３００（５，０００倍希釈）（Ｂ）に関する負の浮力がある粒子の分布を説明するグラフを示す。
【図６０Ｂ】図６０Ａ〜図６０Ｂは、Ａ００８５（２００倍希釈）（Ａ）およびＡ１３００（５，０００倍希釈）（Ｂ）に関する負の浮力がある粒子の分布を説明するグラフを示す。
【００８２】
【図６０Ｃ】図６０Ｃ〜図６０Ｄは、Ｂ００８５（２００倍希釈）（Ｃ）およびＢ１３００（５，０００倍希釈）（Ｄ）に関する負の浮力がある粒子の分布を説明するグラフを示す。
【図６０Ｄ】図６０Ｃ〜図６０Ｄは、Ｂ００８５（２００倍希釈）（Ｃ）およびＢ１３００（５，０００倍希釈）（Ｄ）に関する負の浮力がある粒子の分布を説明するグラフを示す。
【００８３】
【図６１】図６１は、Ａ００８５、Ａ１３００、Ｂ００８５およびＢ１３００のＴｌｙｏにおける、５個のバイアルのカール・フィッシャー滴定解析を説明するグラフを示す。
【００８４】
【図６２】図６２は、Ｔｌｉｑ、Ｔｌｙｏ、ならびに３０℃での２４時間、４８時間および７２時間保管後で行われたＶＣＣアッセイの結果を説明するグラフを示す。前バイアルを解析前に−２０℃で７日間保管した。
【００８５】
【図６３Ａ】図６３Ａは、加速された安定性におけるＷＰ７サイクル３後のＶＣＣを説明する散布図を示す。
【００８６】
【図６３Ｂ】図６３Ｂは、加速された安定性におけるＷＰ７サイクル３後の％生細胞を説明する散布図を示す。
【００８７】
【図６４】図６４は、様々な温度およびＶＣＣレベルでの、ＢＤＳ（１Ｌ充填／１Ｌ  ＬＤＰＥバッグ）における反復した凍結／解凍サイクルのＶＣＣにおける影響を説明する散布図を示す。
【００８８】
【図６５】図６５は、様々な温度およびＶＣＣレベルでの、ＢＤＳ（１Ｌ充填／１Ｌ  ＬＤＰＥバッグ）における反復した凍結／解凍サイクルの％生細胞における影響を説明する散布図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００８９】
定義
本明細書において同じ意味で使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、コードされたおよびコードされていないアミノ酸、ならびに化学的にまたは生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸を含む、任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を指す。これらの用語は、修飾ペプチド骨格を有するポリペプチドなどの、修飾されたポリマーを含む。
【００９０】
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言われる。用語「Ｎ末端」は、遊離アミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸を末端に有する、タンパク質またはポリペプチドの始点に関する。用語「Ｃ末端」は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を末端に有するアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終点に関する。
【００９１】
用語「融合タンパク質」は、ペプチド結合または他の化学結合により互いに連結されている２つまたはそれより多くのペプチドを含むタンパク質を指す。ペプチドは、ペプチドまたは他の化学結合により互いに直接連結されていることもある。例えば、キメラ分子は、単鎖融合タンパク質として組換え発現され得る。あるいは、ペプチドは、２つまたはそれより多くのペプチド間で「リンカー」例えば、１つもしくは複数のアミノ酸または別の好適なリンカーにより互いに連結されていることもある。
【００９２】
本明細書において同じ意味で使用される用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらのアナログもしくは修飾バージョンを含む、任意の長さのポリマー形態のヌクレオチドを指す。それらは、一本鎖、二本鎖および多鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然の、化学的に修飾された、生化学的に修飾された、非天然のもしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。
【００９３】
核酸は、モノヌクレオチドが、１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸エステルがその隣の３’酸素にホスホジエステル連結によって一方向に結合するような方式で反応してオリゴヌクレオチドを生成するため、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われる。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸エステルがモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸エステルに連結されていない場合、「３’末端」と呼ばれる。核酸配列は、より大きいオリゴヌクレオチドの内部にあったとしても、５’および３’末端を有すると言われることもある。直鎖状または環状ＤＮＡ分子のどちらかにおいて、別個のエレメントは、「下流」または３’エレメントの「上流」または５’にあると言われる。
【００９４】
「コドン最適化」は、特定の宿主細胞における発現増強のために、ネイティブアミノ酸配列を維持しつつネイティブ配列の少なくとも１つのコドンを宿主細胞の遺伝子においてより使用頻度が高いまたは最も使用頻度が高いコドンで置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。例えば、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、所与のＬｉｓｔｅｒｉａ細胞または任意の他の宿主細胞において天然に存在する核酸配列と比較してより高い使用頻度を有するコドンで置換するように、修飾することができる。コドン使用頻度表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で、容易に入手可能である。各アミノ酸についてのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより利用される最適なコドンは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００７／０２０７１７０に示されている。これらの表を多数の方法で適応させることができる。その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現のために特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムも、入手可能である（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅを参照されたい）。
【００９５】
用語「プラスミド」または「ベクター」は、細菌送達ベクター、ウイルスベクター送達ベクター、ペプチド免疫療法用送達ベクター、ＤＮＡ免疫療法用送達ベクター、エピソームプラスミド、組込型プラスミド、またはファージベクターを含む、任意の公知送達ベクターを含む。用語「ベクター」は、１つまたは複数の融合ポリペプチドを、宿主細胞内に送達することおよび必要に応じて宿主細胞に発現させることができる、構築物を意味する。
【００９６】
用語「エピソームプラスミド」または「染色体外プラスミド」は、染色体ＤＮＡから物理的に離れている核酸ベクター（すなわち、エピソームのものであるかまたは染色体外のものであり、宿主細胞のゲノムに組み込まれていない）であって、染色体ＤＮＡから独立して複製する核酸ベクターを指す。プラスミドは、直鎖状であることもあり、または環状であることもあり、一本鎖であることもあり、または二本鎖であることもある。エピソームプラスミドは、必要に応じて、宿主細胞（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）の細胞質において複数のコピーで存続することができ、その結果、エピソームプラスミド内で目的の任意の遺伝子の増幅が生じることになる。
【００９７】
用語「ゲノムに組み込まれる」は、細胞内に導入された核酸配列であって、その導入の結果、細胞のゲノムに組み込まれ、その後代に遺伝され得る、核酸配列を指す。任意のプロトコールを細胞のゲノムへの核酸の安定した組込みに使用することができる。
【００９８】
用語「安定的に維持される」は、選択（例えば、抗生物質選択）の非存在下で検出可能な損失なしに少なくとも１０世代にわたって核酸分子またはプラスミドが維持されることを指す。例えば、この期間は、少なくとも１５世代、２０世代、少なくとも２５世代、少なくとも３０世代、少なくとも４０世代、少なくとも５０世代、少なくとも６０世代、少なくとも８０世代、少なくとも１００世代、少なくとも１５０世代、少なくとも２００世代、少なくとも３００世代、または少なくとも５００世代であり得る。「安定的に維持される」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（例えば、培養で）細胞内に安定的に維持されている、ｉｎ  ｖｉｖｏで安定的に維持されている、または両方の、核酸分子またはプラスミドを指すことができる。
【００９９】
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、タンパク質をコードする可能性があり得る塩基の配列を含有するＤＮＡの部分である。例えば、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード（ｓｔａｒｔ−ｃｏｄｅ）配列（開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）コドン）と停止コドン配列（終結コドン）の間に位置することができる。
【０１００】
「プロモーター」は、特定のポリヌクレオチド配列の適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを方向付けることができるＴＡＴＡボックスを通常は含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含むこともある。本明細書で開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写をモジュレートする。プロモーターは、本明細書で開示される細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯動物細胞、多能性細胞、一細胞期胚、分化した細胞、またはこれらの組合せ）の１つまたは複数において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的活性プロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時期特異的プロモーター（例えば、発生調節プロモーター）、または領域特異的プロモーター（例えば、細胞特異的もしくは組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２において見つけることができる。
【０１０１】
「作動可能な連結」または「作動可能に連結される」は、２つまたはそれより多くの成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）についての、両方の成分が正常に機能するような、およびそれらの成分の少なくとも１つが、他の成分の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介することができる可能性を許容するような、並置を指す。例えば、プロモーターが１つまたは複数の転写調節因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写レベルを制御する場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、互いに連続しているまたはトランスで作用するそのような配列を含み得る（例えば、調節配列は、少し離れてコード配列の転写を制御するように作用することができる）。
【０１０２】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関して「配列同一性」または「同一性」は、指定比較ウインドウにわたって最大に一致するようにアラインメントされたときに同じである、２配列中の残基に言及するものである。配列同一性パーセンテージがタンパク質に関して使用される場合、同一でない残基位置は、アミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、したがって、分子の機能特性を変化させない、保存的アミノ酸置換によって異なることが多いと認識される。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを上方修正して置換の保存的性質を補正することができる。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われる。この修正を行う手段は、周知である。典型的に、これは、保存的置換を完全ミスマッチではなく部分的ミスマッチとしてスコア化することによって配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１のスコアが与えられ、非保存的置換に０のスコアが与えられる場合、保存的置換には０と１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコア化は、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）の実装に従って、算出される。
【０１０３】
「配列同一性パーセンテージ」は、比較ウインドウにわたって最適にアラインメントされた２配列（完全マッチ残基の最大数）を比較することによって決定される値であって、前記比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部分は、前記２配列の最適アラインメントのための参照配列（これは、付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る値を指す。このパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を判定してマッチ位置の数を得、このマッチ位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００をかけて配列同一性パーセンテージを得ることによって算出される。別段の明記（例えば、短い方の配列が、連結されている異種配列を含む）がない限り、比較ウインドウは、比較される２配列の短い方の完全長である。
【０１０４】
別段の記述がない限り、配列同一性／類似性値は、次のパラメーターを使用してＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０を使用して得られる値を指す：ギャップの重み５０と、長さの重み３と、ｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア行列とを使用する、ヌクレオチド配列についての同一性％および類似性％；ギャップの重み８と、長さの重み２と、ＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列とを使用する、アミノ酸配列についての同一性％および類似性％；またはこれらと等価の任意のプログラム。「等価のプログラム」は、問題の任意の２配列について、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０により生成される対応するアラインメントと比較したときに同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチおよび同一の配列同一性パーセントを有するアラインメントを生成する、任意の配列比較プログラムを含む。
【０１０５】
用語「保存的アミノ酸置換」は、類似のサイズ、電荷または極性の別のアミノ酸での配列内に通常存在するアミノ酸の置換を指す。保存的置換の例としては、非極性（疎水性）残基、例えばイソロイシン、バリンまたはロイシンでの、別の非極性残基の置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例としては、ある極性（親水性）残基での別の残基の置換、例えば、アルギニンとリシン間の、グルタミンとアスパラギン間の、またはグリシンとセリン間の置換が挙げられる。加えて、塩基性残基、例えばリシン、アルギニンもしくはヒスチジンでの、別の残基の置換、またはある酸性残基、例えばアスパラギン酸もしくはグルタミン酸の、別の酸性残基での置換は、保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン、アラニンもしくはメチオニンでの、極性（親水性）残基、例えばシステイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリシンの置換、および／または極性残基での非極性残基の置換が挙げられる。典型的なアミノ酸分類が下記の表１に要約される。
【０１０６】
【表１】
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【０１０７】
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、それが、例えば、公知参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、公知参照配列と同一であるかまたはかなり類似している配列を指す。
【０１０８】
用語「野生型」は、正常な状態または状況（突然変異による、罹患した、変更されたなどの、状態または状況とは対照的に）で見られるような、構造および／または活性を有する実体を指す。野生型遺伝子およびポリペプチドは、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在することが多い。
【０１０９】
タンパク質および核酸に関する用語「単離される」は、通常はｉｎ  ｓｉｔｕに存在し得る他の細菌、ウイルスまたは細胞成分に関して比較的精製されているタンパク質および核酸を指し、それらは、タンパク質およびポリヌクレオチドの実質的に純粋な調製物までのものであり、これらを含む。用語「単離される」は、天然に存在しない対応物を有さない、化学合成されたため他のタンパク質もしくは核酸により実質的に夾雑されていない、またはそれらに天然に付随する大部分の他の細胞成分（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチドもしくは細胞成分）から分離もしくは精製されているタンパク質および核酸も含む。
【０１１０】
「外来性（の）」または「異種（の）」分子または配列は、細胞に通常は発現されない、または細胞内にその形態で通常は存在しない、分子または配列である。通常の存在は、細胞の特定の発生期および環境条件に関しての存在を含む。例えば、外来性または異種分子または配列は、細胞内の対応する内在性配列の突然変異バージョンを含むこともあり、または細胞内の、しかし異なる形態での（すなわち、染色体内にない）、内在性配列に対応する配列を含むこともある。特定の細胞内の外来性または異種分子または配列は、その細胞の参照種とは異なる種に由来するかまたは同じ種内の異なる生物に由来する分子または配列も含み得る。例えば、異種ポリペプチドを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、異種ポリペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株にとってネイティブでも内在性でもないポリペプチド、すなわち、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株により通常は発現されないポリペプチド、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株以外の供給源からのポリペプチド、同じ種内の異なる生物に由来するポリペプチドであり得る。
【０１１１】
対照的に、「内在性」分子もしくは配列または「ネイティブ」分子もしくは配列は、特定の環境条件下で特定の発達期の特定の細胞にその形態で通常は存在する分子または配列である。
【０１１２】
用語「バリアント」は、集団の大部分と異なるが、それでもなお、それらのうちの１つ（例えば、スプライスバリアント）と見なされるのに十分なほど共通様式に類似している、アミノ酸または核酸配列（または生物もしくは組織）を指す。
【０１１３】
用語「アイソフォーム」は、別のアイソフォーム、またはバージョン（例えば、同じタンパク質の）と比較してわずかにしか異ならない分子（タンパク質）のバージョンを指す。例えば、タンパク質アイソフォームは、関連しているが異なる遺伝子から産生されることがあり、同じ遺伝子から選択的スプライシングにより生じることがあり、または一塩基多型から生じることがある。
【０１１４】
タンパク質に言及するときの用語「断片」は、完全長タンパク質より短いタンパク質、または完全長タンパク質より少数のアミノ酸を有するタンパク質を意味する。核酸に言及するときの用語「断片」は、完全長核酸より短い核酸、または完全長核酸より少数のヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端部分の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端部分の除去）、または内部断片であり得る。断片はまた、例えば、機能性断片または免疫原性断片であり得る。
【０１１５】
タンパク質に言及するときの用語「アナログ」は、保存的アミノ酸の相違により、アミノ酸配列に影響を与えない修飾により、または両方により、天然に存在するタンパク質と異なるタンパク質を意味する。
【０１１６】
用語「機能性の」は、タンパク質または核酸（またはその断片、アイソフォームもしくはバリアント）の生物活性または生物学的機能を示す生来の能力を指す。そのような生物活性または生物学的機能は、例えば、対象に投与されたときに免疫応答を惹起する能力を含み得る。そのような生物活性または生物学的機能は、例えば、相互作用パートナーとの結合も含み得る。機能性断片、アイソフォームまたはバリアントの場合、これらの生物学的機能は、実際には、基本的な生物学的機能を保持しつつだが変化し得る（例えば、それらの特異性または選択性に関して）。
【０１１７】
用語「免疫原性」または「免疫原性の」は、対象に投与されたとき対象において免疫応答を惹起する分子（例えば、タンパク質、核酸、抗原または生物）の生来の能力を指す。免疫原性は、例えば、分子に対する抗体のより多い数、分子に対する抗体のより高い密度、分子に特異的なＴ細胞のより多い数、分子に対するより大きい細胞傷害性またはヘルパーＴ細胞応答などによって、測定され得る。
【０１１８】
用語「抗原」は、本明細書では、対象または生物と接触させたとき（例えば、対象もしく生物に存在するとき、または対象もしく生物により検出されたとき）に対象または生物からの検出可能な免疫応答を生じさせる結果となる物質を指すために使用される。抗原は、例えば、脂質、タンパク質、炭水化物、核酸、またはこれらの組合せおよび変形形態であり得る。例えば、「抗原ペプチド」は、対象もしく生物に存在するとき、または対象もしく生物により検出されたとき、対象または生物における免疫応答の増大をもたらすペプチドを指す。例えば、そのような「抗原ペプチド」は、宿主細胞の表面のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子上にロードおよび提示され、宿主の免疫細胞により認識または検出され得るタンパク質であって、認識または検出されることによってそのタンパク質に対する免疫応答の増大をもたらすタンパク質を包含し得る。そのような免疫応答は、同じタンパク質を発現する罹患細胞（例えば、腫瘍またはがん細胞）などの、宿主内の他の細胞にまで及ぶこともある。
【０１１９】
用語「エピトープ」は、免疫系により認識される抗原上の部位（例えば、抗体が結合する部位）を指す。エピトープは、連続するアミノ酸から形成されることもあり、または１つもしくは複数のタンパク質の三次フォールディングにより並置された非連続アミノ酸から形成されることもある。連続するアミノ酸から形成されるエピトープ（直線状エピトープとしても公知）は、変性溶媒に曝露されても通常は保持されるが、三次フォールディングによって形成されるエピトープ（立体構造エピトープとしても公知）は、変性溶媒で処置されると通常は失われる。エピトープは、概して少なくとも３個、より通常は少なくとも５または８〜１０個のアミノ酸を特有の空間的立体構造で含む。エピトープの空間的立体構造を判定する方法は、例えば、Ｘ線結晶解析および２次元核磁気共鳴を含む。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  ６６，  Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．  Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。
【０１２０】
用語「突然変異」は、遺伝子またはタンパク質の構造のあらゆる変化を指す。例えば、突然変異は、染色体またはタンパク質の欠失、挿入、置換または再配列の結果として生じ得る。「挿入」は、１つまたは複数の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を加えることにより、遺伝子中のヌクレオチドの数またはタンパク質中のアミノ酸の数を変化させる。「欠失」は、１つまたは複数の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を低減させることにより、遺伝子中のヌクレオチドの数またはタンパク質中のアミノ酸の数を変化させる。
【０１２１】
ＤＮＡの「フレームシフト」突然変異は、ヌクレオチドの追加または喪失が遺伝子のリーディングフレームを変化させたときに起こる。リーディングフレームは、各塩基がアミノ酸１個をコードする塩基３個の群からなる。フレームシフト突然変異は、これらの塩基の群化をシフトさせ、アミノ酸のコードを変化させる。結果として生じるタンパク質は、通常は非機能性である。挿入および欠失は、各々、フレームシフト突然変異である。
【０１２２】
「ミスセンス」突然変異または置換は、コードされているアミノ酸の変化を生じさせる結果となる、タンパク質の１個のアミノ酸の変化または単一ヌクレオチドの点突然変異を指す。１個のアミノ酸の変化を生じさせる結果となる、単一ヌクレオチドの点突然変異は、ＤＮＡ配列における「非同義」置換である。非同義置換は、コドンを未成熟停止コドンに変化させ、その結果、得られるタンパク質が短縮されることになる、「ナンセンス」突然変異を生じさせる結果となることもある。対照的に、ＤＮＡの「同義」突然変異は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない（コドン縮重に起因する）ものである。
【０１２３】
用語「体細胞突然変異」は、生殖細胞（例えば、精子または卵子）以外の細胞により獲得される遺伝的変更を含む。そのような突然変異は、遺伝性ではないが、細胞分裂の過程で突然変異した細胞の後代に継代され得る。対照的に、生殖細胞突然変異は、生殖系列で起こり、次世代の子孫に継代され得る。
【０１２４】
用語「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」は、人工環境を指し、かつ人工環境（例えば、試験管）で起こるプロセスまたは反応を指す。
【０１２５】
用語「ｉｎ  ｖｉｖｏ」は、天然環境（例えば、細胞または生物または身体）を指し、かつ天然環境で起こるプロセスまたは反応を指す。
【０１２６】
用語「凍結状態ガラス転移温度」（Ｔｇ’）は、次のことを指す。加熱されたとき、糖ガラスの溶液は、剛性状態から粘弾性ゴム状態への二次転移を経る。このガラス様の変態が起こる温度が、凍結状態ではガラス転移温度である。
【０１２７】
用語「固体状態ガラス転移温度」（Ｔｇ）は、次のことを指す。Ｔｇ’に類似して、これは、フリーズドライされたガラス状固体が粘弾性ゴム状態に変態する温度である。
【０１２８】
用語「崩壊温度」（Ｔｃ）は、製品が一次乾燥中にその物理的構造を失わずに耐えることができる最高温度を指す。
【０１２９】
用語「原薬」（ＤＳ）は、有効成分を指す。原薬は、疾患の診断、治癒、緩和、処置もしくは予防の際に薬理学的活性もしくは他の直接効果を提供すること、またはヒトもしくは他の動物の身体の構造もしくは任意の機能に作用することを目的とした薬物製品の任意の成分を指す。有効成分は、薬物製品の製造中に化学変化し得る、および指定の活性または効果を提供することを目的とした修飾形態で薬物製品中に存在し得る、製品の成分を含む。例えば、Ｌｍ（例えば、ＡＤＸＳ−ＨＰＶまたはＡＤＸＳ−ＨＥＲ２）は、原薬と見なされる。
【０１３０】
用語「バルク原薬」（ＢＤＳ）は、薬物における使用が意図されている、および薬物の製造、加工または包装に使用されるときには薬物の有効成分または完成剤形となる、任意の物質を指すが、この用語は、そのような物質の合成に使用される中間体を含まない。
【０１３１】
用語「薬物製品」（ＤＰ）は、必ずしも有効成分と会合している状態ではないが、一般には有効成分と会合している状態で医薬品有効成分を含有する完成剤形、例えば、錠剤、カプセルまたは溶液を指す。例えば、凍結乾燥されたＬｍ（例えば、ＡＤＸＳ−ＨＰＶまたはＡＤＸＳ−ＨＥＲ２）は、薬物製品と見なされる。
【０１３２】
列挙された１つまたは複数の要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）こともある。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」組成物は、タンパク質を単独で含有することもあり、または他の成分と組み合わせて含有することもある。
【０１３３】
値の範囲の指定は、範囲内のまたは範囲を定義する全ての整数、および範囲内の整数により定義される全ての部分的範囲を含む。
【０１３４】
文脈からそうではないことが明らかでない限り、用語「約」は、既定値から述べられている値または変動量±０．５％、１％、５％または１０％である測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内の値を包含する。
【０１３５】
単数形の冠詞「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈による別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、用語「抗原（ａｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）」または「少なくとも１つの抗原」は、複数の抗原を、それらの混合物を含めて、含むことができる。
【０１３６】
統計的に有意なは、ｐ≦０．０５を意味する。
詳細な説明
Ｉ．大要
【０１３７】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含む水性製剤を凍結乾燥させることにより調製される、安定した凍結乾燥された医薬製剤に関する組成物および方法が、本明細書で開示される。一部の実施形態では、凍結乾燥された製剤は、４℃または−２０℃で少なくとも６カ月、少なくとも１年、または少なくとも２年間、安定している。一部の実施形態では、凍結乾燥された製剤は、静脈内注射などの非経口投与に好適である。
【０１３８】
例えばＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含む、治療薬に現在使用されている凍結された液体製剤は、−８０℃で保管され、出荷される。この低温は、材料の出荷と臨床現場での保管の両方に関して、特に、南アメリカおよびアフリカの諸国では、サプライチェーン上の課題を提示する。それ故、冷凍または−２０℃サプライチェーンを有することが望ましい。本明細書に記載の製造プロセスの最適化によって、より高温で維持することができる安定した薬物製品を生成することが可能である。直感に反して、本明細書に記載される実施例は、より高い残留水分（例えば、通常の目標残留水分レベルより高い、例えば、一実施形態では約２．５％、３．０％または３．５％）が、凍結乾燥された製品の安定性を改善したことを示す。同様に、直感に反して、一次乾燥ステップ中のより高い棚温度（例えば、Ｔｇより十分高い、一実施形態での約−１７℃〜約−１９℃または約−１８℃）は、凍結乾燥された製品の安定性を改善した。加えて、凍結乾燥前の細胞の熱ショックによるプレコンディショニングは、凍結乾燥された製品の安定性を改善した。加えて、より高い生細菌濃度（生細胞計数値、またはＶＣＣ）の使用は、より低いＶＣＣと比較して凍結乾燥された薬物製品の安定性を改善する結果となる。加えて、直感に反して、凍結された原薬の凍結乾燥前の約３７℃での解凍は、室温または２〜８℃での解凍と比較して凍結乾燥された薬物製品の安定性を改善した。これらのプロセス向上は、液体凍結製剤と比較してより高温での安定性を改善し、その結果、より高温のサプライチェーンが可能になる。これによって、より扱いやすいサプライチェーンが可能になり、−８０℃での保管が実行可能でない諸国への流通が可能になる。
【０１３９】
凍結乾燥ケーキ中の残留水分の最適化（例えば、二次乾燥温度および必要に応じて二次乾燥時間を変更することにより達成され得る、通常の目標残留水分レベルより高い目標残留水分レベル、例えば、一実施形態では約３．５％の使用）に加えて、凍結乾燥前に温度シフトによってＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞内でストレス応答を誘導するプロセスは、凍結乾燥された薬物製品についてのより高温での安定性を改善する。同様に、リン酸緩衝液と、正常レベルより低レベルのスクロース（例えば、一実施形態では約２．５％  ｗ／ｖ  スクロース）とを含む製剤の使用、および高い一次乾燥ステップ温度（例えば、一実施形態では約−１８℃）の使用は、凍結乾燥された薬物製品についての、−２０℃、２〜８℃およびさらには室温（約２０℃〜約２５℃、または約２０℃、約２３℃または約２５℃）を含む、より高温での安定性を改善する。これらのプロセス向上は、より高温での安定性を液体凍結製剤と比較して改善し、その結果、より高温のサプライチェーンが可能になる。これによって、より扱いやすいサプライチェーンが可能になり、−８０℃での保管が実行可能でない諸国への流通が可能になる。
ＩＩ．細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａの凍結乾燥
【０１４０】
凍結乾燥を、３ステップ：凍結、一次乾燥および二次乾燥に、分けることができる。水は第１のステップで凍結するので、製剤中の溶解成分は、残留液（凍結濃縮液）中に残存する。最高氷形成点で、凍結濃縮液は、格子を構成する氷晶間で凝固する。適切な凍結乾燥条件下で、氷は、一次乾燥中に昇華により除去され、氷が存在したときと同じ物理的および化学的構造の残存凍結濃縮液が残る。凍結濃縮液中の残留水は、二次乾燥ステップで除去される。
【０１４１】
凍結乾燥は、溶媒相が液相／液体状態を経ずに凍結状態から気体状態に直接移行するように溶液の温度および圧力を操作することを含む。これは、水の三重点未満に、溶液を冷却することおよび圧力を低下させることにより実現される。これによって、製品を強熱にさらさなくても製品から溶媒を除去することが可能になる。凍結段階の間に、製剤は冷却される。純粋な結晶氷が液体から形成されることによって液体の残部は凍結濃縮されてより粘度の高い状態になり、これによってさらなる結晶化が阻害される。最終的には、この高濃度で粘度の高い溶液が凝固し、その結果、非晶相、結晶相、または複合非晶−結晶相が生じる。一次乾燥段階の間に、凍結中に形成された氷は、真空下、周囲温度未満の温度で昇華により除去される。この段階を通して、製品は、凍結ステップで確立された構造を保持して製品を乾燥させるために、製品の崩壊温度未満で、固体状態で維持される。この崩壊温度は、非晶質製品の場合はガラス転移温度（Ｔｇ’）であり、または結晶質製品については共晶温度（Ｔｅ）である。二次乾燥段階の間に、マトリックス中に残存する比較的少量の結合水が脱着により除去される。この段階の間に、妥当な脱着速度を促進するために、および所望の残留水分を達成するために、棚および製品の温度が上昇される。
【０１４２】
凍結乾燥薬物製品の目標プロファイルは、２〜８℃または−２０℃のどちらかで安定しており、かつ液体凍結製剤と同じ作用強度および生物活性を保持する、明確に定義されたケーキを目標残留水分で生じる、プロファイルである。フリーズドライしている間に細菌生存率を向上させることができる保護戦略は、例えば、乾燥培地に賦形剤を添加すること、プロセスパラメーターを制御すること、フリーズドライ前に細菌試料にプレストレスを与えること、および細菌の発酵条件を変化させることを含む。しかし、これらの戦略の効率は、株依存性である。なぜなら、乾燥プロセスに対する固有許容度も、株によって異なるからである。非常に近縁の細菌株であっても、ある株は、フリーズドライプロセスに対する耐性が他の株よりはるかに高いことがある。この株依存性のため、一般的な結論またはガイダンスを導き出すことは困難である。
【０１４３】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む凍結乾燥された組成物を生産するための方法が、本明細書で提供される。そのような方法は、緩衝液を含む製剤中の細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を提供するステップと、組成物を凍結ステップにおいて冷却するステップと、冷却された組成物を一次乾燥ステップにおいて真空および第１の温度上昇に曝露するステップと、一次乾燥ステップからの組成物を二次乾燥ステップにおいて真空および第２の温度上昇に曝露するステップとを含むことができ、それによって凍結乾燥された組成物が生産される。
【０１４４】
一部のそのような方法では、組成物に使用される細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、凍結ステップの前に解凍される凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株である。そのようなプレコンディショニングステップの例は、本明細書中の他の箇所でより詳細に説明される。特定の例では、凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を約２℃〜約３７℃、約２０℃〜約３７℃、約２３℃〜約３７℃、約２５℃〜約３７℃、約３２℃〜約３７℃、または約３７℃の温度で解凍することができる。必要に応じて、解凍は、約８時間以下の間の解凍である。必要に応じて、解凍された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、約２℃〜約８℃の間の温度で、約２４時間以下の間、保持される。特定の例では、解凍される細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の濃度は、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の間であり得る。
【０１４５】
一部のそのような方法では、製剤は、緩衝液およびスクロースを含む。例えば、製剤緩衝液は、約１％〜約５％  ｗ／ｖ  スクロース、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロース、または約２．５％  ｗ／ｖ  スクロースを含み得る。必要に応じて、製剤は、トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）、または組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）などの他の賦形剤を含まない。
【０１４６】
一部の実施形態では、製剤は、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａを含む。
【０１４７】
一部のそのような方法では、一次乾燥ステップにおける保持温度は、約−１０℃〜約−３０℃の間、約−１２℃〜約−２２℃の間、約−１７℃〜約−１９℃の間、または約−１８℃である。
【０１４８】
一部のそのような方法では、凍結乾燥された組成物中の残留水分は、少なくとも約２．５％、少なくとも約３％、または少なくとも約３．５％である。一部のそのような方法では、残留水分は、約１％〜約５％の間、または約２％〜約４％の間である。
【０１４９】
一部のそのような方法では、凍結乾燥された組成物は、約−２０℃〜約４℃の間での保管後、または約−２０℃もしくは約４℃で約６カ月、１２カ月、１８カ月もしくは２４カ月保管後、少なくとも約６０％、７０％、８０％または９０％の生存率を示す。
【０１５０】
一部のそのような方法は、（ａ）緩衝液とスクロースとを含む製剤中の細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を提供するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で提供された組成物を凍結ステップにおいて約−３２℃〜約−８０℃の間の保持温度で冷却するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）により生産された組成物を一次乾燥ステップにおいて約−１０℃〜約−３０℃の間の保持温度で真空に曝露するステップ、および（ｄ）ステップ（ｃ）により生産された組成物を二次乾燥ステップにおいて約−５℃〜約２５℃の間の保持温度で真空に曝露するステップを含む。
【０１５１】
細胞のプレコンディショニング、製剤、凍結ステップ、一次乾燥ステップ、二次乾燥ステップ、および凍結乾燥された製品についてのさらなる実施形態は、下記で提供される。
Ａ．細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａのプレコンディショニング
【０１５２】
本明細書で開示される凍結乾燥方法に使用される細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の培養物は、凍結ストックから、スタータ培養物から、またはコロニー（例えば、新鮮培養された細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ）からであり得る。
【０１５３】
凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を凍結乾燥用に調製するための方法であって、凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を解凍するステップを含む方法が、本明細書で提供される。細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が、凍結ストックからである場合、それを任意の手段により解凍することができる。解凍のための温度および時間は、安定性に影響を及ぼし得る。凍結された原薬を解凍するための適切な条件を同定することにより、凍結乾燥前の原薬の凍結および保持が可能になる。解凍から得られる高品質の健康な細胞であることを確保することにより、その結果生じる凍結乾燥された薬物製品も十分な品質のものであることが確実になる。一例では、それを、約−４℃、約２〜８℃、または約４℃で解凍することができ、そして例えば、約０．５、１、２、３、４時間またはそれより長時間インキュベートすることができる。別の例では、それを約３７℃で解凍することができ、そして例えば、約０．５、１、２、３、４時間またはそれより長時間インキュベートすることができる。
【０１５４】
一例では、凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を約４℃〜約３７℃の間、約１０℃〜約３７℃の間、約１５℃〜約３７℃の間、約２０℃〜約３７℃の間、約２３℃〜約３７℃の間、約２５℃〜約３７℃の間、約２５℃〜約３７℃の間、約３０℃〜約３７℃の間、約３２℃〜約３７℃の間、約３２℃〜約４２℃の間、約３４℃〜約４０℃の間、約３５℃〜約３９℃の間、約３６℃〜３８℃の間、または約３７℃の温度で解凍することができる。
【０１５５】
凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、例えば、約０．５、１、２、３、４、５、６、７または８時間、約０．５〜約８時間の間、約１〜約８時間の間、約２〜約８時間の間、約３〜約８時間の間、約４〜約８時間の間、約５〜約８時間の間、約６〜約８時間の間、または約７〜約８時間の間、解凍することができる。あるいは、凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、例えば、約０．５、１、２、３、４、５、６、７または８時間以下の間、解凍することができる。
【０１５６】
解凍される凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ凍結乾燥製剤中にあることもあり、または細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ凍結乾燥製剤中で解凍されることもある。そのような細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ凍結乾燥製剤は、本明細書中の他の箇所でより詳細に開示される。
【０１５７】
凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、解凍後、ある温度で保持することができる。例えば、凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、解凍後、約２℃〜約８℃の間の温度で保持することができる。凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、例えば、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３もしくは２４時間、または約０．５〜約２４時間の間、約１〜約２４時間の間、約２〜約２４時間の間、約５〜約２４時間の間、約１０〜約２４時間の間、約１２〜約２４時間の間、保持することができる。あるいは、凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、例えば、約０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４時間以下の間、保持することができる。特定の例では、凍結された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、約３７℃の温度で約８時間以下の間、解凍され、約２℃〜約８℃の間の温度で約２４時間以下の間、保持される。
【０１５８】
解凍される細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の濃度は、任意の好適な濃度であり得る。例えば、濃度は、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の間であり得る。
【０１５９】
凍結乾燥に使用される培養物は、任意の増殖期にあり得る。培養物は、例えば、対数増殖期中期、ほぼ対数増殖期中期、または別の増殖期にあり得る。
【０１６０】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の培養物を増殖させるために利用される栄養培地は、任意の好適な栄養培地であり得る。好適な培地の例としては、例えば、ルリアブロス（ＬＢ：ルリア・ベルターニブロス）；テリフィックブロス（ＴＢ）；動物質を含まない変性テリフィックブロス；または限定培地が挙げられる。細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、細胞を増殖させる任意の公知手段によって培養することができる。例えば、増殖ステップは、振盪フラスコ（例えば、バッフル付き振盪フラスコ）、回分式発酵槽、撹拌タンクもしくはフラスコ、エアリフト型発酵槽、フェッドバッチ、連続セル反応器、セル固定化反応器、または任意の他の細菌増殖手段を用いて行うことができる。
【０１６１】
必要に応じて、一定したｐＨが、培養物の（例えば、回分式発酵槽内での）増殖中に維持される。例えば、ｐＨを約６．０に、約６．５に、約７．０に、約７．５に、または約８．０に維持することができる。同様に、ｐＨは、例えば、約６．５〜約７．５、約６．０〜約８．０、約６．０〜約７．０、約６．０〜約７．０、または約６．５〜約７．５であり得る。あるいは、バイオリアクターから細胞を収集した直後、酸の添加によってｐＨを降下させてストレス応答を誘導することができ、このストレス応答によって、凍結乾燥用の細胞をよりよく調製することができる一連の遺伝子が活性化され得る。
【０１６２】
必要に応じて、一定した温度を、培養物の増殖中に維持することができる。例えば、温度を約３７℃で維持することができる。あるいは、温度を、約２５℃、約２７℃、約２８℃、約３０℃、約３２℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３８℃、または約３９℃で維持することができる。あるいは、バイオリアクターから細胞を収集した直後に、氷浴（例えば、約０℃または約４℃）内に細胞を置くことによって温度を降下させてストレス応答を誘導することができ、このストレス応答によって、凍結乾燥用の細胞をよりよく調製することができる一連の遺伝子が活性化され得る。
【０１６３】
必要に応じて、一定した溶存酸素濃度を、培養物の増殖中に維持することができる。例えば、溶存酸素濃度を、飽和度２０％、飽和度１５％、飽和度１６％、飽和度１８％、飽和度２２％、飽和度２５％、飽和度３０％、飽和度３５％、飽和度４０％、飽和度４５％、飽和度５０％、飽和度５５％、飽和度６０％、飽和度６５％、飽和度７０％、飽和度７５％、飽和度８０％、飽和度８５％、飽和度９０％、飽和度９５％、飽和度１００％、または飽和度ほぼ１００％で維持することができる。
【０１６４】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、必要に応じて、凍結乾燥前に動物宿主によって継代させることができる。このような継代は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のワクチンベクターとしての有効性を最大化することができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の免疫原性を安定させることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のビルレンスを安定させることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の免疫原性を増大させることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株のビルレンスを増大させることができ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の不安定な亜株を除去することができ、またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の不安定な亜株が広がることを抑えることができる。動物宿主によってＬｉｓｔｅｒｉａ株を継代させる方法は周知であり、例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００６／０２３３８３５に記載されている。
Ｂ．細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ凍結乾燥製剤
【０１６５】
凍結乾燥の前に、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、緩衝液と賦形剤とを含む懸濁液（製剤）に供給することができる。凍結乾燥される製剤の設計は、医薬品有効成分および所期の投与経路の要件に依存し得る。製剤は、緩衝液と、１つまたは複数の機能を果たす１つまたは複数の賦形剤とからなり得る。そのような賦形剤は、例えば、ｐＨ調整剤、増量剤（例えば、スクロース、マンニトール、マルトース、トレハロース、デキストロースおよびラクトース）、安定化剤、例えば、抗凍結剤（例えば、ＰＥＧ）および凍結乾燥保護剤（例えば、二糖類）、または張度調節剤（例えば、ＮａＣｌ、マンニトール、スクロース、グリシンおよびグリセロール）であり得る。
【０１６６】
緩衝液は、任意の好適な緩衝液であり得る。緩衝液は、製剤のｐＨを安定させることができる。例えば、緩衝液は、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ヒスチジン緩衝液、クエン酸緩衝液、またはＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）緩衝液であり得る。特定の例では、緩衝液は、リン酸緩衝液である。リン酸緩衝液は、凍結乾燥製剤の開発では回避されることが多い。なぜなら、リン酸ナトリウムなどのリン酸緩衝液は、凍結中に極端なｐＨ変化をきたすことがあるからである。このため、低濃度の、凍結中にｐＨ変化をほとんどきたさない緩衝液、例えば、Ｔｒｉｓ、クエン酸およびヒスチジン緩衝液が、使用されることが多い。しかし、本明細書中の他の箇所に示されるように、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの好適な生存レベルは、リン酸緩衝液を使用して達成される。一部のそのような緩衝液では、ＫＨ２ＰＯ４（無水）の濃度が、約０．１〜０．３ｇ／Ｌの間、０．１２〜０．２８ｇ／Ｌ、０．１４〜０．２６ｇ／Ｌ、０．１６〜０．２４ｇ／Ｌ、０．１８〜０．２２ｇ／Ｌ、０．１９〜０．２１ｇ／Ｌ、または０．２ｇ／Ｌである。一部のそのような緩衝液では、Ｎａ２ＨＰＯ４（無水）の濃度が、約１．０〜１．３ｇ／Ｌの間、１．０２〜１．２８ｇ／Ｌ、１．０４〜１．２６ｇ／Ｌ、１．０６〜１．２４ｇ／Ｌ、１．０８〜１．２２ｇ／Ｌ、１．１〜１．２ｇ／Ｌ、１．１２〜１．１８ｇ／Ｌ、１．１４〜１．１６ｇ／Ｌ、または１．１５ｇ／Ｌである。一部のそのような緩衝液は、約５〜２０、６〜１８、７〜１６、８〜１４、９〜１２、９〜１１、または１０ｍＭである。一部のそのような緩衝液は、約６．８〜７．６、６．９〜７．５、７．０〜７．４、７．１〜７．３、または７．２のｐＨを有する。一例として、リン酸緩衝液は、約０．１９〜０．２１ｇ／Ｌの間（例えば、０．２ｇ／Ｌ）のＫＨ２ＰＯ４（無水）、約１．１４〜１．１６ｇ／Ｌの間（例えば、１．１５ｇ／Ｌ）のＮａ２ＨＰＯ４（無水）を有することができ、約７．１〜７．３（例えば、７．２）のｐＨを有することができる。
【０１６７】
抗凍結剤および凍結乾燥保護剤などの賦形剤を製剤に添加して、凍結乾燥プロセスの間、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を保護することができる。抗凍結剤は、水の融点を低下させる水溶性化学物質である。氷晶が形成されると、細菌細胞は、未凍結画分中に圧縮される。抗凍結剤の添加は、未凍結セクションを拡大して、より大きい空間を細菌細胞に与えることができ、これは、機械的ストレスまたは浸透圧ストレスによる細胞の損傷の軽減につながり得る。凍結乾燥保護剤は、乾燥ステップの間に水が除去されたときに細菌細胞を保護することができる。スクロースおよびトレハロースなどの一部の糖は、抗凍結剤としても凍結乾燥保護剤としても作用することができる。脱脂乳の使用も保護効果をもたらすことができる。賦形剤の他の例としては、グルコース、マルトース、ラクトース、マンニトール、グリシン、グリセロール、塩化ナトリウム、酵母抽出物、デキストラン、デキストロース、ポリデキストロース、グルタミン酸一ナトリウム、マルトデキストリン、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、糖類、二糖類、糖などが挙げられる。一例では、製剤に使用される賦形剤は、スクロース、トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）およびアミノ酸ミックスの、様々な組合せを含む。特定の例では、賦形剤は、約５％  ｗ／ｖ（単位体積当たりの重量）スクロースまたは約２．５％  ｗ／ｖ  スクロースなどの、スクロースを含むか、スクロースから本質的になるか、またはスクロースからなる。例えば、製剤緩衝液は、約１％〜約５％  ｗ／ｖ  スクロース、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロース、または約２．５％  ｗ／ｖ  スクロースを含み得る。
【０１６８】
必要に応じて、賦形剤は、トレハロース、ＭＳＧ、ｒＨＳＡ、アミノ酸ミックス、脱脂乳、グルコース、マルトース、ラクトース、マンニトール、グリシン、グリセロール、塩化ナトリウム、酵母抽出物、デキストラン、デキストロース、ポリデキストロース、グルタミン酸一ナトリウム、マルトデキストリン、アスコルビン酸、スクロース以外の糖類、スクロース以外の二糖類、スクロース以外の糖、または抗酸化剤の、１つまたは複数または全てを含まない。必要に応じて、賦形剤は、トレハロース、ＭＳＧおよびｒＨＳＡの１つまたは複数または全てを含まない。
【０１６９】
製剤中の細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａの濃度は、任意の好適な濃度であり得る。例えば、濃度は、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の間であり得る。
Ｃ．凍結ステップ
【０１７０】
凍結乾燥における第１のステップは、凍結ステップである。この段階の間に、製剤は冷却される。これは、例えば、棚式フリーズドライヤーにおいてその凍結乾燥器の棚の温度を低下させること（すなわち、棚温度を低下させること）により達成することができる。凍結中に氷晶が形成され、このことが細菌を損傷させ得る。氷晶の成長は、凍結速度および温度に依存する。一部の実施形態では、より速い凍結速度が利用される。より速い凍結速度は、より緩徐な凍結速度と比較して、より小さい氷晶の形成をもたらし、したがって、細胞の損傷を軽減することができる。氷晶の形成は、細菌にとって有害であり得る。水が結晶化すると、残存未凍結画分中の溶質が濃縮し、これは、化学的および浸透圧的損傷につながり得る。より低温での細菌の凍結は、より速い凍結速度に対応し、より小さい氷晶を生じさせる結果となり、これは細胞の損傷を制限するはずであるが、より速い凍結速度が、必ずしも最高の生存率結果と一致するとは限らない。最適な凍結条件は、製剤に使用される保護剤、および細菌の株によって異なり得る。
【０１７１】
温度（例えば、棚温度）を、例えば、毎分約０．２℃〜約２．０℃の速度で低下させることにより、凍結ステップの保持温度（例えば、棚温度）に到達することができる。あるいは、温度（例えば、棚温度）を、例えば、毎分約０．２℃〜約１．８℃、毎分約０．４℃〜約１．６℃、毎分約０．６℃〜約１．４℃、毎分約０．８℃〜約１．２℃、または毎分約０．９℃〜約１．１℃の速度で低下させることにより、凍結ステップの保持温度（例えば、棚温度）に到達することができる。例えば、温度を、毎分約０．２℃、約０．３℃、約０．４℃、約０．５℃、約０．６℃、約０．７℃、約０．８℃、約０．９℃、約１．０℃、約１．１℃、約１．２℃、約１．３℃、約１．４℃、約１．５℃、約１．６℃、約１．７℃、約１．８℃、約１．９℃、または約２．０℃の速度で、凍結温度に低下させることができる。特定の例では、温度を毎分約１℃の速度で保持温度に低下させることにより、凍結ステップの保持温度に到達される。
【０１７２】
凍結ステップは、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を凍結するための任意の好適な時間のステップであり得る。同様に、温度は、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を凍結するための任意の好適な時間、凍結温度で保持され得る。例えば、凍結ステップは、約２〜約６、約２．５〜約６、約１〜約６、約１〜約５、約１〜約４、約１〜約３、約１〜約２、約１．５〜約２．５、約１．５〜約５．５、約２〜約５、約２．５〜約４．５、約３〜約４、約１、約１．５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５もしくは約６時間のステップであり得、または温度は、前述の時間、凍結温度で保持され得る。特定の例では、凍結ステップは、３．５時間のステップであり得、または温度は、３．５時間、凍結温度で保持され得る。別の特定の例では、凍結ステップは、２時間のステップであり得、または温度は、２時間、凍結温度で保持され得る。別の特定の例では、凍結ステップは、１．５時間のステップであり得、または温度は、１．５時間、凍結温度で保持され得る。別の特定の例では、凍結ステップ全体の（例えば、温度を凍結温度に上昇させ、次いで、保持温度で保持する）時間は、約３．５〜４．５時間または約３．５時間である。
【０１７３】
凍結温度（すなわち、保持温度）は、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を凍結させるために好適な任意の温度であり得る。一部の実施形態では、凍結温度（例えば、棚温度）は、製剤の温度が溶液のガラス転移温度未満であるような凍結温度であり、スクロース製剤の場合は、例えば約−３２℃であり得る。この温度より高い温度は、溶液を真に凍結することができず、その場合、その溶液は、凍結乾燥中に崩壊をきたすことがあり、したがって、生存率の低下につながる可能性がある。例えば、温度（例えば、棚温度）は、約−４９℃〜約−２５℃の間、約−４７℃〜約−４０℃、約−４５℃〜約−３５℃、約−１０℃〜約−８０℃、約−１５℃〜約−７５℃、約−２０℃〜約−７０℃、約−２５℃〜約−６５℃、約−３０℃〜約−６０℃、約−３５℃〜約−５５℃、約−４０℃〜約−５０℃、約−４１℃〜約−４９℃、約−４２℃〜約−４８℃、約−４３℃〜約−４７℃、または約−４４℃〜約−４６℃であり得る。特定の例では、凍結温度は、約−４５℃であり得る。別の例では、温度は、約−４９℃〜約−３２℃の間、約−４７℃〜約−４０℃、約−４５℃〜約−３５℃、約−３２℃〜約−８０℃、約−３２℃〜約−７５℃、約−３２℃〜約−７０℃、約−３２℃〜約−６５℃、約−３２℃〜約−６０℃、−４９℃〜約−３３℃、約−３３℃〜約−８０℃、約−３３℃〜約−７５℃、約−３３℃〜約−７０℃、約−３３℃〜約−６５℃、約−３３℃〜約−６０℃、約−３５℃〜約−５５℃、約−４０℃〜約−５０℃、約−４１℃〜約−４９℃、約−４２℃〜約−４８℃、約−４３℃〜約−４７℃、または約−４４℃〜約−４６℃であり得る。一例では、凍結温度は、約−３９℃であり得る。別の例では、凍結温度は、約−４５℃であり得る。特定の例では、凍結ステップにおける保持温度は、約−４０℃〜約−５０℃の間（例えば、約−４５℃）であり、凍結ステップは、温度を毎分約１℃の速度で保持温度に低下させることを含み、凍結ステップにおける冷却は、約２時間〜約４時間の冷却である（例えば、凍結ステップは、組成物を保持温度で約２時間保持することを含む）。
Ｄ．一次乾燥ステップ
【０１７４】
凍結乾燥における第２のステップは、一次乾燥ステップである。一次乾燥ステップでは、凍結ステップにより生産された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を、上昇した温度で真空に曝露すること。このステップでは、凍結水は、真空下で昇華により除去される。
【０１７５】
例えば、温度（例えば、棚温度）を、毎分約０．２℃〜約２．０℃の速度で上昇させることにより、一次乾燥ステップの温度に到達することができる。あるいは、温度（例えば、棚温度）を、例えば、毎分約０．２℃〜約１．８℃、毎分約０．４℃〜約１．６℃、毎分約０．６℃〜約１．４℃、毎分約０．８℃〜約１．２℃、または毎分約０．９℃〜約１．１℃の速度で上昇させることにより一次乾燥ステップの保持温度（例えば、棚温度）に到達することができる。例えば、温度を、毎分約０．２℃、約０．３℃、約０．４℃、約０．５℃、約０．６℃、約０．７℃、約０．８℃、約０．９℃、約１．０℃、約１．１℃、約１．２℃、約１．３℃、約１．４℃、約１．５℃、約１．６℃、約１．７℃、約１．８℃、約１．９℃、または約２．０℃の速度で、一次乾燥温度に上昇させることができる。特定の例では、温度を毎分約１℃の速度で保持温度へと上昇させることにより、一次乾燥ステップの保持温度に到達される。
【０１７６】
一次乾燥ステップは、任意の好適な時間のステップであり得る。同様に、保持温度（例えば、棚温度）は、任意の好適な時間、一次乾燥温度で保持され得る。一次乾燥が完了するまで一次乾燥温度で温度を保持すべきである。この時間は、凍結乾燥器、バイアルサイズ、充填体積、バイアル数、圧力および他の可変要素によって変わり得る。例えば、製品温度が棚温度のまたはそれより上の値に上昇したとき、一次乾燥の終了を決定することができる。例えば、フリーズドライチャンバを真空ポンプから分離して、継続的な水の昇華に起因して上昇する圧力の量を判定する、圧力上昇試験により、それを決定することもできる。例えば、一次乾燥ステップは、約１０〜約２９、約２９〜約４２、約３６、約１０〜約８０、約１０〜約７０、約１０〜約６０、約１０〜約５０、約１０〜約４０、約１０〜約３０、もしくは約２０〜約３０時間のステップであり得、または温度は、前述の時間、一次乾燥温度で保持され得る。特定の例では、一次乾燥ステップは、約２５〜約３５、約２６〜約３４、約２７〜約３３、約２８〜約３２、約２９〜約３１、もしくは約３０時間のステップであり得、または温度は、前述の時間、一次乾燥温度で保持され得る。別の特定の例では、一次乾燥ステップは、約２０〜約３０、約２１〜約３０、約２２〜約３０、約２３〜約２９、約２４〜約２８、約２５〜約２７、もしくは約２６時間のステップであり得、または温度は、前述の時間、一次乾燥温度で保持され得る。
【０１７７】
一次乾燥ステップは、凍結乾燥器内のプローブ（例えば、凍結乾燥器の中央におけるものなどの、凍結乾燥器内のコールドスポットについてのプローブ）が、一次乾燥保持温度もしくはＴｓセットポイント（例えば、約−１８℃の）を通り過ぎた後約８〜約２０、約９〜約１９、約１０〜約１８、約１１〜約１７、約１２〜約１６、約１３〜約１５、もしくは約１４時間と定義される期間のステップであり得、または温度は、前述の期間、一次乾燥保持温度で保持され得る。あるいは、乾燥ステップは、凍結乾燥される組成物（例えば、凍結乾燥器のコールドスポットにおける組成物の試料、もしくは凍結乾燥器内の組成物の全ての試料）が、一次乾燥保持温度またはＴｓセットポイント（例えば、約−１８℃）に達した後約８〜約２０、約９〜約１９、約１０〜約１８、約１１〜約１７、約１２〜約１６、約１３〜約１５、もしくは約１４時間と定義される期間のステップであり得、または温度は、前述の期間、一次乾燥保持温度で保持され得る。特定の例では、一次乾燥ステップは、例えば、約３０時間であり得る、凍結乾燥器内のプローブ（例えば、凍結乾燥器の中央におけるものなどの、凍結乾燥器内のコールドスポットについてのプローブ）が一次乾燥保持温度もしくはＴｓセットポイント（例えば、約−１８℃の）を通り過ぎた後または凍結乾燥される組成物（例えば、凍結乾燥器のコールドスポットにおける組成物の試料、もしくは凍結乾燥器内の組成物の全ての試料）が一次乾燥保持温度もしくはＴｓセットポイント（例えば、約−１８℃）に達した後約１４時間と定義される期間のステップであり得、あるいは温度は、前述の期間、一次乾燥保持温度で保持され得る。
【０１７８】
一次乾燥ステップの終了は、凍結乾燥器内のプローブ（例えば、凍結乾燥器の中央におけるものなどの、凍結乾燥器内のコールドスポットのプローブ）が、一次乾燥保持温度またはＴｓセットポイント（例えば、約−１８℃）を通り過ぎた約８〜約２０、約９〜約１９、約１０〜約１８、約１１〜約１７、約１２〜約１６、約１３〜約１５、もしくは約１４時間後であり得る。あるいは、一次乾燥ステップの終了は、凍結乾燥される組成物（例えば、凍結乾燥器のコールドスポットにおける組成物の試料、または凍結乾燥器内の組成物の全ての試料）が、一次乾燥保持温度またはＴｓセットポイント（例えば、約−１８℃の）に達した約８〜約２０、約９〜約１９、約１０〜約１８、約１１〜約１７、約１２〜約１６、約１３〜約１５、もしくは約１４時間後であり得る。特定の例では、一次乾燥ステップの終了は、例えば、約３０時間であり得る、凍結乾燥器内のプローブ（例えば、凍結乾燥器の中央におけるものなどの、凍結乾燥器内のコールドスポットについてのプローブ）が一次乾燥保持温度もしくはＴｓセットポイント（例えば、約−１８℃の）を通り過ぎた約１４時間後、または凍結乾燥される組成物（例えば、凍結乾燥器のコールドスポットにおける組成物の試料、もしくは凍結乾燥器内の組成物の全ての試料）が一次乾燥保持温度もしくはＴｓセットポイント（例えば、約−１８℃の）に達した約１４時間後であり得る。
【０１７９】
一次乾燥温度（すなわち、棚温度または保持温度）は、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を乾燥させるための任意の好適な温度であり得る。例えば、保持温度は、約０℃〜約−３０℃の間、０℃〜約−１９℃、約−５℃〜約−３０℃、約−１０℃〜約−２５℃、約−１５℃〜約−２０℃、約−１７℃〜約−１９℃、約−１２℃〜約−３０℃、約−１２℃〜約−２４℃、約−１２℃〜約−２２℃、約−１４℃〜約−２２℃、約−１５℃〜約−２１℃、約−１６℃〜約−２０℃、約−１７℃〜約−１９℃、約−１８℃〜約−２２℃、約−３０°、約−２９°、約−２８°、約−２７°、約−２６°、約−２５°、約−２４°、約−２３°、約−２２°、約−２１°、約−２０°、約−１９°、約−１８°、約−１７°、約−１６°、約−１５°、約−１４°、約−１３°、約−１２°、約−１１°、約−１０°、約−９°、約−８°、約−７°、約−６°、約−５°、約−４°、約−３°、約−２°、約−１°、または約０°であり得る。例えば、温度は、約−３０°、約−２９°、約−２８°、約−２７°、約−２６°、約−２５°、約−２４°、約−２３°、約−２２°、約−２１°、約−２０°、約−１９°、約−１８°、約−１７°、約−１６°、約−１５°、約−１４°、約−１３°、約−１２°、約−１１°、または約−１０℃以下であり得る。特定の例では、一次乾燥温度は、約−２５℃〜約−３５℃、約−２６℃〜約−３７℃、約−２７℃〜約−３３℃、約−２８℃〜約−３２℃、約−２９℃〜約−３１℃、または約−３０℃であり得る。特定の例では、一次乾燥温度は、約−１７℃〜約−２７℃、約−１８℃〜約−２６℃、約−１９℃〜約−２５℃、約−２０℃〜約−２４℃、約−２１℃〜約−２３℃、または約−２２℃であり得る。別の特定の例では、一次乾燥温度は、約−７℃〜約−１７℃、約−８℃〜約−１６℃、約−９℃〜約−１５℃、約−１０℃〜約−１４℃、約−１１℃〜約−１３℃、または約−１２℃であり得る。別の特定の例では、一次乾燥温度は、約−１３℃〜約−２３℃、約−１４℃〜約−２２℃、約−１５℃〜約−２１℃、約−１６℃〜約−２０℃、約−１７℃〜約−１９℃、または約−１８℃であり得る。特定の例では、一次乾燥ステップにおける保持温度は、約−１７℃〜約−１９℃の間、または約−１８℃である。
【０１８０】
圧力（真空条件）は、任意の好適な圧力であり得る。一部の場合には、圧力は、製剤のガラス転移温度で氷の蒸気圧の５０％以下（例えば、約０．２７０ｍｂａｒ）であるべきである。圧力は、低すぎてはならない。例えば、圧力は、約０．１４０〜約０．０５０、約０．１００〜約０．０６０、約０．１００〜約０．０７０、約０．１００〜約０．０８０、約０．０９９〜約０．０８１、約０．０９８〜約０．０８２、約０．０９７〜約０．０８３、約０．０９６〜約０．０８４、約０．０９５〜約０．０８５、約０．０９４〜約０．０８６、約０．０９３〜約０．０８７、約０．０９２〜約０．０８８、約０．０９１〜約０．０８９、約０．０９０ｍｂａｒ、または約０．１２０ｍｂａｒであり得る。特定の例では、圧力は、約０．０９０ｍｂａｒである。
【０１８１】
特定の例では、一次乾燥ステップにおける保持温度は、約−１７℃〜約−１９℃の間（例えば、約−１８℃）であり、一次乾燥ステップは、温度を毎分約１℃の速度で保持温度に上昇させることを含み、一次乾燥ステップは、約１０時間〜約４０時間（例えば、約２０〜約４０時間、または約２５〜３５時間、例えば、約３０時間または約３２時間）のステップである。
Ｅ．二次乾燥ステップ
【０１８２】
凍結乾燥における第３のステップは、二次乾燥ステップである。二次乾燥ステップでは、一次乾燥ステップにより生産された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を、上昇した温度で真空に曝露すること。このステップでは、凍結していない水は、脱着により除去される。
【０１８３】
例えば、温度（例えば、棚温度）を、毎分約０．２℃〜約２．０℃の速度で上昇させることにより、二次乾燥ステップの温度に到達することができる。あるいは、温度（例えば、棚温度）を、例えば、毎分約０．２℃〜約１．８℃、毎分約０．２℃〜約１．６℃、毎分約０．２℃〜約１．４℃、毎分約０．２℃〜約１．２℃、毎分約０．２℃〜約１．０℃、毎分約０．２℃〜約０．８℃、毎分約０．２℃〜約０．６℃、または毎分約０．２℃〜約０．４℃の速度で上昇させることにより二次乾燥ステップの保持温度（例えば、棚温度）に到達することができる。例えば、温度を、毎分約０．２℃、約０．３℃、約０．４℃、約０．５℃、約０．６℃、約０．７℃、約０．８℃、約０．９℃、約１．０℃、約１．１℃、約１．２℃、約１．３℃、約１．４℃、約１．５℃、約１．６℃、約１．７℃、約１．８℃、約１．９℃、または約２．０℃の速度で、二次乾燥温度に上昇させることができる。特定の例では、温度を毎分約０．２℃の速度で保持温度へと上昇させることにより、二次乾燥ステップの保持温度に到達される。
【０１８４】
二次乾燥ステップは、任意の好適な時間のステップであり得る。同様に、温度（例えば、棚温度または保持温度）は、任意の好適な時間、二次乾燥温度で保持され得る。例えば、温度は、凍結乾燥された製品中の所望の残留水分レベルを達成するための任意の好適な時間、二次乾燥温度で保持され得る。例えば、二次乾燥ステップは、約５〜約４０、約１０〜約３０、約１５〜約２５、約２〜約２５、約２〜約２０、約２〜約１０、約２〜約４、約１〜約２５、約１〜約２０、約１〜約１０、約１〜約９、約１〜約８、約１〜約７、約１〜約６、約１〜約５、約１〜約４、約１〜約３、約１〜約２、約１．５〜約２．５、約２．５〜約３．５、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、もしくは約１時間のステップであり得、または温度は、前述の時間、二次乾燥温度で保持され得る。特定の例では、二次乾燥ステップは、１０時間以下のステップであり得、または二次乾燥時間は、１０時間以下である。別の特定の例では、二次乾燥保持時間は、６時間以下である。別の特定の例では、温度は、約３時間、二次乾燥温度で保持され得る。別の特定の例では、温度は、約２時間、二次乾燥温度で保持され得る。一例では、二次乾燥ステップは、約１時間〜約１０時間である。別の例では、二次乾燥ステップは、約２時間〜約６時間、約５時間〜約６時間、または約５時間または約６時間、保持温度で組成物を保持することを含む。
【０１８５】
二次乾燥温度（すなわち、棚温度または保持温度）は、凍結乾燥された製品中の所望の残留水分レベルを達成するために細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を乾燥させるために好適な任意の温度であり得る。例えば、温度は、約５℃〜約４０℃の間、約５℃〜約３０℃、約１０℃〜約３０℃、約２０℃〜約３０℃、または約１５℃〜約２５℃であり得る。特定の例では、二次乾燥温度は、約２５℃であり得る。別の特定の例では、二次乾燥温度は、約２０℃であり得る。別の特定の例では、二次乾燥温度は、約２０℃以下である。別の例では、温度は、約５℃〜約２０℃の間、約９℃〜約１５℃、約１０℃〜約１５℃、約１１℃〜約１４℃、約１１℃〜約１３℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、または約２０℃であり得る。特定の例では、二次乾燥温度は、約１２℃であり得る。あるいは、保持温度は、約−１０℃〜約３０℃の間、約−１０℃〜約２５℃の間、約−１０℃〜約２０℃の間、約−１０℃〜約１０℃の間、約−５℃〜約３０℃の間、約−５℃〜約２５℃の間、約−５℃〜約２０℃の間、約−５℃〜約１５℃の間、約−５℃〜約１０℃の間、約−５℃〜約５℃の間、約−４℃〜約４℃の間、約−３℃〜約３℃の間、約−２℃〜約２℃の間、約−１℃〜約１℃、または約０℃であり得る。特定の例では、保持温度は、約−５℃〜約５℃の間または約０℃であり得る。
【０１８６】
圧力（真空条件）は、任意の好適な圧力であり得る。一部の場合には、圧力は、一次乾燥ステップについてのものと同じ範囲内の圧力である。しかし、二次乾燥の間の一部のサイクルは、完全真空を有することもある。例えば、圧力は、約０．１４０〜約０．０２０、０．１４０〜約０．０３０、０．１４０〜約０．０４０、０．１４０〜約０．０５０、約０．１００〜約０．０６０、約０．１００〜約０．０７０、約０．１００〜約０．０８０、約０．０９９〜約０．０８１、約０．０９８〜約０．０８２、約０．０９７〜約０．０８３、約０．０９６〜約０．０８４、約０．０９５〜約０．０８５、約０．０９４〜約０．０８６、約０．０９３〜約０．０８７、約０．０９２〜約０．０８８、約０．０９１〜約０．０８９、約０．０９０ｍｂａｒ、または約０．１２０ｍｂａｒであり得る。特定の例では、圧力は、約０．０９０ｍｂａｒである。
【０１８７】
特定の例では、二次乾燥ステップにおける保持温度は、約−５℃〜約５℃の間（例えば、約０℃）であり、二次乾燥ステップは、温度を毎分約０．２℃の速度で保持温度に上昇させることを含み、二次乾燥ステップは、組成物を約５時間〜約６時間、保持温度で保持することを含む。
【０１８８】
二次乾燥ステップによって、任意の所望の残留水分を有する凍結乾燥された製品を得ることができる。例えば、残留水分は、約７．０％、約６．９％、約６．８％、約６．７％、約６．６％、約６．５％、約６．４％、約６．３％、約６．２％、約６．１％、約６．０％、約５．９％、約５．８％、約５．７％、約５．６％、約５．５％、約５．４％、約５．３％、約５．２％、約５．１％、約５．０％、約４．９％、約４．８％、約４．７％、約４．６％、約４．５％、約４．４％、約４．３％、約４．２％、約４．１％、約４．０％、約３．９％、約３．８％、約３．７％、約３．６％、約３．５％、約３．４％、約３．３％、約３．２％、約３．１％、約３．０％、約２．９％、約２．８％、約２．７％、約２．６％、約２．５％、約２．４％、約２．３％、約２．２％、約２．１％、約２．０％、約１．９％、約１．８％、約１．７％、約１．６％、約１．５％、約１．４％、約１．３％、約１．２％、約１．１％、または約１．０％以下であり得る。あるいは、残留水分は、少なくとも約７．０％、約６．９％、約６．８％、約６．７％、約６．６％、約６．５％、約６．４％、約６．３％、約６．２％、約６．１％、約６．０％、約５．９％、約５．８％、約５．７％、約５．６％、約５．５％、約５．４％、約５．３％、約５．２％、約５．１％、約５．０％、約４．９％、約４．８％、約４．７％、約４．６％、約４．５％、約４．４％、約４．３％、約４．２％、約４．１％、約４．０％、約３．９％、約３．８％、約３．７％、約３．６％、約３．５％、約３．４％、約３．３％、約３．２％、約３．１％、約３．０％、約２．９％、約２．８％、約２．７％、約２．６％、約２．５％、約２．４％、約２．３％、約２．２％、約２．１％、約２．０％、約１．９％、約１．８％、約１．７％、約１．６％、約１．５％、約１．４％、約１．３％、約１．２％、約１．１％、または約１．０％であり得る。特定の例では、残留水分は、少なくとも約１％、少なくとも約１．５％、または少なくとも約２％、かつ約７％以下であり得る。あるいは、残留水分は、約１％〜約７％の間、約１％〜約６．５％、約１％〜約６％、約１％〜約５．５％、約１％〜約５％、約１．５％〜約７％、約１．５％〜約６．５％、約１．５％〜約６％、約１．５％〜約５．５％、約１．５％〜約５％、約１．５％〜約４．５％、約２％〜約７％、約２％〜約６．５％、約２％〜約６％、約２％〜約５．５％、約２％〜約５％、約２％〜約４．５％、約２％〜約４％、約２％〜約３％、または約３％〜約４％であり得る。特定の例では、残留水分は、約３％〜約４％、約３．１％〜約３．９％、約３．２％〜約３．８％、約３．３％〜約３．７％、約３．４％〜約３．６％、または約３．５％であり得る。特定の例では、残留水分は、少なくとも約２％、少なくとも約２．５％、または少なくとも約３％である。別の特定の例では、残留水分は、約１％〜約５％の間、約２％〜約４％の間、約２．５％〜約３．５％の間、約２．５％〜約４％の間、約３％〜約４％、または約３％〜約３．５％の間である。
Ｆ．凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａの保管および復元
【０１８９】
結果として得られる凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、製剤セクションに列挙された成分の任意の組合せを含む、凍結乾燥された組成物であり得る。一例では、凍結乾燥された組成物は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、緩衝液（例えば、リン酸塩）、および賦形剤（例えば、スクロース）を含む。必要に応じて、凍結乾燥された組成物は、トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の１つまたは複数または全てを含まない。必要に応じて、凍結乾燥された組成物は、製剤セクションに列挙された、必要に応じた成分の１つまたは複数または全てを含まない。
【０１９０】
結果として得られる凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、本明細書中の他の箇所に列挙される残留水分レベルのいずれかを有する、凍結乾燥された組成物であり得る。一例では、残留水分レベルは、約１％〜約５％の間、約２％〜約４％の間、または約３％〜約４％の間であり得る。
【０１９１】
凍結乾燥された細菌は、任意の好適な温度、相対湿度および大気酸素レベルを含む、任意の好適な条件下で保管することができ、これらの条件は周知である。凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、定義された時間の保管後、復元すると少なくとも約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％の生存率を示すことができる。復元は、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａの、例えば、２日、３日、４日、１週間、２週間、３週間、１カ月、２カ月、３カ月、５カ月、６カ月、９カ月、１２カ月（１年）、１５カ月、１８カ月、２１カ月または２４カ月（２年）間の、保管後に行われ得る。
【０１９２】
凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａの保管温度は、例えば、約０℃〜約１０℃の間、約１℃〜約９℃、約２℃〜約８℃、約２℃〜約６℃、または約３℃〜約５℃であり得る。特定の例では、保管温度は、約２℃〜約８℃の間であり得、または保管温度は、約４℃であり得る。別の例では、保管温度は、約−１５℃〜約−２５℃、約−１６℃〜約−２４℃、約−１７℃〜約−２３℃、約−１８℃〜約−２２℃、または約−１９℃〜約−２１℃の間であり得る。特定の例では、保管温度は、約−２０℃であり得る。
【０１９３】
例えば、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、約２〜８℃（例えば４℃）または約−２０℃で約６カ月、約９カ月、約１２カ月、約１８カ月または約２４ヶ月間の保管後、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の生存率を示すことができる。凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、約３０℃で、約室温（すなわち、約２０〜２５℃（例えば、２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃もしくは２５℃）で、約２〜８℃（例えば４℃）または約−２０℃で、約１カ月、約２カ月、約３カ月、約４カ月、約５カ月、約６カ月、約９カ月、約１２カ月、約１８カ月または約２４ヶ月間の保管後、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の生存率を示すことができる。一例として、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、２〜８℃で６ヶ月後に少なくとも約７５％〜約８０％の生存率を示すことができる。別の例として、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、−２０℃で９ヶ月後に少なくとも約９５％〜約１００％の生存率を示すことができる。別の例として、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、室温でまたは３０℃で２ヶ月後に少なくとも約８０％〜約９０％の生存率を示すことができる。別の例として、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、約−２０℃で約１２カ月、１８カ月または２４ヶ月後に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％の生存率を示すことができる。別の例として、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、約２〜８℃で約１２カ月、１８カ月または２４ヶ月後に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％の生存率を示すことができる。別の例として、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、約２〜８℃で約１２カ月、１８カ月または２４ヶ月後に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％または８０％の生存率を示すことができる。
【０１９４】
保管後、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、必要に応じて、溶媒または希釈剤（例えば、水）で復元することができる。一例として、溶媒または希釈剤は、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を培養するための適切な培地であり得る。凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の復元および再水和のための方法は、周知である。一例では、使用される溶媒の体積は、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を作製するために使用された凍結乾燥前溶液の体積である。別の例では、使用される溶媒の体積は、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を作製するために使用された凍結乾燥前溶液の体積より多い。別の例では、使用される溶媒の体積は、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を作製するために使用された凍結乾燥前溶液の体積より少ない。
【０１９５】
復元時間は、任意の好適な復元時間であり得る。例えば、復元時間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０または３０分未満であり得る。特定の例では、復元時間は、約２分未満である。
ＩＩＩ．組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株
【０１９６】
本明細書で開示される凍結乾燥された組成物、および本明細書で開示される凍結乾燥方法を経る組成物は、細菌株、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含む。そのような細菌株は、組換え細菌株であることもある。そのような組換え細菌株は、本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドを含むこともあり、または本明細書中の他の箇所で開示されるような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含むこともある。一部の実施形態では、細菌株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）株である。Ｌｍは、ワクチンベクターとしての多数の固有の利点を有する。この細菌は、特別な要件なしにｉｎ  ｖｉｔｒｏで非常に効率的に増殖し、この細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａなどのグラム陰性菌における主要毒性因子であるＬＰＳを欠いている。遺伝的に弱毒化されたＬｍベクターは、重篤な有害効果が起こった場合に抗生物質でそれらを容易に除去することができ、一部のウイルスベクターとは異なり宿主ゲノムへの遺伝物質の組込みが起こらないので、さらなる安全性ももたらす。
【０１９７】
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、任意のＬｉｓｔｅｒｉａ株であり得る。好適なＬｉｓｔｅｒｉａ株の例としては、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｕｒｒａｙｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）、または任意の他の公知Ｌｉｓｔｅｒｉａ種が挙げられる。一部の実施形態では、組換えｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ種の株である。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株の例としては、次のものが挙げられる：Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ野生型（例えば、Ｂｉｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｈｉｎｒｉｃｈｓ  （１９８７）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３９：２００５−２００９；Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−４１８６を参照されたい）；ファージキュアリングされているＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０５６（例えば、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−４１８６を参照されたい）；ファージキュアリングされており、ｈｌｙ遺伝子欠失を有する、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２７（例えば、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−  ４１８６；Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｎｏｙ  （１９９４）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：５６０８−５６１３を参照されたい）；ファージキュアリングされており、ａｃｔＡ遺伝子欠失を有する、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９（例えば、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−４１８６；Ｓｋｏｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５０：５２７−  ５３８を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０４２（デルタＰＥＳＴ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０９７（ＬＬＯ−Ｓ４４Ａ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４３６４（デルタｌｐｌＡ；リポ酸タンパク質リガーゼ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４４０５（デルタｉｎｌＡ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４４０６（デルタｉｎｌＢ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３���３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＣＳ−ＬＯＯＯｌ（デルタａｃｔＡ；デルタｉｎｌＢ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＣＳ−Ｌ０００２（デルタａｃｔＡ；デルタｌｐｌＡ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＣＳ−Ｌ０００３（ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ；デルタｌｐｌＡ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０３８（デルタａｃｔＡ；ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４３８４（ＬＬＯ  Ｓ４４Ａ；ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および支援情報を参照されたい）；ｌｐｌＡ１の欠失を有するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株（リポ酸タンパク質リガーゼＬｐｌＡ１をコードする）（例えば、Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：４６２−４６４を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０１７（ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔを有する１０４０３Ｓ）（例えば、ＵＳ７，６９１，３９３を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＥＧＤ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＬ５９１８２４を参照されたい）。別の実施形態では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＥＧＤ−ｅ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３２１０；ＡＴＣＣ受託番号ＢＡＡ−６７９を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９（ａｃｔＡ欠失、必要に応じてｕｖｒＡＢ欠失を兼備）（ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ）（例えば、ＵＳ７，６９１，３９３を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−／ｉｎｌＢ−二重突然変異体（例えば、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−５５６２を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｌｐｌＡ突然変異体またはｈｌｙ突然変異体（例えばＵＳ２００４／００１３６９０を参照されたい）；Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｄａｌ／ｄａｔ二重突然変異体（例えば、ＵＳ２００５／００４８０８１を参照されたい）である。他のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株は、次の遺伝子：ｈｌｙ（ＬＬＯ；リステリオリジン）、ｉａｐ（ｐ６０）、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｄａｌ（アラニンラセマーゼ）、ｄａｔ（Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢ、ａｃｔＡの１つもしくは任意��組合せをコードする核酸；または単層小胞の成長、拡散、分解、二層小胞の分解、宿主細胞への結合もしくは宿主細胞による取込みを媒介する任意の核酸を含有するように（例えば、プラスミドにより、および／またはゲノム組込みにより）修飾されているものを含む。上記参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９８】
組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、野生型ビルレンスを有することもあり、弱毒化されたビルレンスを有することもあり、またはビルレンスがないこともある。例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａには、ファゴソームまたはファゴリソソームから逃れてサイトゾルに侵入するのに十分なビルレンスがあり得る。そのようなＬｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書中の他の箇所で開示される少なくとも１つの弱毒化突然変異、欠失または不活性化を含む生弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株であることもある。一部の実施形態では、組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、弱毒化栄養要求性株である。栄養要求性株は、その増殖に必要な特定の有機化合物を合成することができないものである。そのような株の例は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ８，１１４，４１４に記載されている。
【０１９９】
一部の実施形態では、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質耐性遺伝子を欠いている。例えば、そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質耐性遺伝子をコードしないプラスミドを含むこともある。しかし、本明細書で提供される一部の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸を含むプラスミドを含む。抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製に一般に利用される従来の選択およびクローニングプロセスに使用され得る。例示的な抗生物質耐性遺伝子としては、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびゲンタマイシンに対する耐性を付与する遺伝子産物が挙げられる。
Ａ．組換え融合ポリペプチドを含む、または組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株
【０２００】
本明細書で開示される組換え細菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）は、本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドを含むか、または本明細書中の他の箇所で開示されるような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０２０１】
組換え融合タンパク質をコードする核酸を含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株では、核酸は、コドン最適化され得る。各アミノ酸についてのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより利用される最適なコドンの例は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００７／０２０７１７０に示されている。核酸は、その核酸中の少なくとも１つのコドンが、元の配列でのそのコドンと比べてそのアミノ酸についてのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによる使用頻度が高いコドンで置き換えられている場合、コドン最適化されている。
【０２０２】
核酸は、細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株中のエピソームプラスミドに存在することもあり、および／または核酸は、細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノムに組み込まれていることもある。一部の組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書で開示の２種の組換え融合ポリペプチドをコードする２種の別個の核酸：核酸はエピソームプラスミド中にあるもの、および細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノムに組み込まれているものを含む。
【０２０３】
エピソームプラスミドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（細胞培養で）、ｉｎ  ｖｉｖｏで（宿主内で）、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で、安定して維持されるものであり得る。エピソームプラスミドにおける場合、組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、プラスミド中のプロモーター／調節配列に作動可能に連結されていることがある。細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株のゲノムに組み込まれている場合、組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、外来性プロモーター／調節配列に作動可能に連結されていることもあり、または内在性プロモーター／調節配列に作動可能に連結されていることもある。遺伝子の構成的発現の駆動に有用なプロモーター／調節配列の例は周知であり、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａのｈｌｙ、ｈｌｙＡ、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡおよびｐ６０プロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｃプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｇｉＡプロモーター、ならびにＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｐｈａＺプロモーターを含む。一部の場合には、目的の挿入された遺伝子は、分断されも、ゲノムＤＮＡへの組込みから生じることが多い調節的制約を受けもせず、一部の場合には、挿入された異種遺伝子の存在は、細胞自体の重要な領域の再配列も分断ももたらさない。
【０２０４】
そのような組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含むプラスミドまたはベクターで、細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株または本明細書中の他の箇所に記載の弱毒化細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を形質転換することにより、作製することができる。前記プラスミドは、宿主染色体に組み込まれないエピソームプラスミドであることがある。あるいは、プラスミドは、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の染色体に組み込まれる組込型プラスミドであることもある。本明細書で使用されるプラスミドはまた、多コピープラスミドであることもある。細菌を形質転換する方法は周知であり、塩化カルシウムコンピテント細胞に基づく方法、電子穿孔法、バクテリオファージ媒介形質導入、化学的形質転換技術、および物理的形質転換技術を含む。例えば、ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｃｅｌｌ  ５６：６４１−６４９；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ９：１９０−１９９；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９９４，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，  Ｄ．Ｃ．；およびＭｉｌｌｅｒ，  １９９２，  Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．を参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０５】
異種核酸がゲノムに組み込まれている細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、部位特異的組込ベクターを使用することによって作製することができ、それによって、組み込まれた遺伝子を含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａが、相同組換えを使用して作出される。組込ベクターは、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を感染させることができる、任意の部位特異的組込ベクターであり得る。そのような組込ベクターは、例えば、ＰＳＡ  ａｔｔＰＰ’部位、ＰＳＡインテグラーゼをコードする遺伝子、Ｕ１５３  ａｔｔＰＰ’部位、Ｕ１５３インテグラーゼをコードする遺伝子、Ａ１１８  ａｔｔＰＰ’部位、Ａ１１８インテグラーゼをコードする遺伝子、または任意の他の公知ａｔｔＰＰ’部位、または任意の他のファージインテグラーゼを含むことができる。
【０２０６】
組み込まれた遺伝子を含むそのような細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、異種核酸を細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ染色体に組み込むための任意の他の公知の方法を使用して作出することもできる。相同組換えの技術は周知であり、例えば、Ｂａｌｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０９（１−２）：１１−１７）；Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５）  Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ  （Ｓｈａｎｇｈａｉ）  ３７（１）：１９−２４）、およびＵＳ６，８５５，３２０に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０７】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａの染色体への組込みを、トランスポゾン挿入を使用して達成することもできる。トランスポゾン挿入の技術は周知であり、例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５８：  ３７７０−３７７８によりＤＰ−Ｌ９６７の構築について記載されている。トランスポゾン突然変異誘発は、安定したゲノム挿入を達成することができるが、異種核酸が挿入されたゲノム内の位置が分からない。
【０２０８】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａの染色体への組込みを、ファージ組込み部位を使用して達成することもできる（例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４（１５）：４１７７−４１８６を参照されたい）。例えば、インテグラーゼ遺伝子、およびバクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）の結合部位を使用して、対応する結合部位に異種遺伝子を挿入することができ、前記対応する結合部位は、ゲノム内の任意の適切な部位（例えば、ｃｏｍＫ、またはａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子の３’末端）であり得る。利用する結合部位から内在性プロファージを異種核酸の組込みの前にキュアリングすることができる。そのような方法によって、例えば、単一コピー組込み体を得ることができる。「ファージキュアリングステップ」を回避するために、ＰＳＡファージに基づくファージ組込み系を使用することができる（例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４：４１７７−４１８６を参照されたい）。組み込まれた遺伝子の維持は、例えば、抗生物質による連続選択を必要とし得る。あるいは、抗生物質での選択を必要としない、ファージに基づく染色体組込み系を確立することができる。その代わりに、栄養要求性宿主株を相補することができる。例えば、臨床応用のためのファージに基づく染色体組込み系を使用することができ、その場合、例えばＤ−アラニンラセマーゼをはじめとする必須酵素に対する栄養要求性がある宿主株（例えば、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−））が使用される。
【０２０９】
コンジュゲーションを使用して、遺伝物質および／またはプラスミドを細菌に導入することもできる。コンジュゲーションの方法は周知であり、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｐｌａｓｍｉｄ  ５６（３）：２２３−２２７およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２（３５）：１２５５４−１２５５９に記載されており、これらの参照文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０２１０】
特定の例では、組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性ａｃｔＡ配列（ＡｃｔＡタンパク質をコードする）または内在性ｈｌｙ配列（ＬＬＯタンパク質をコードする）を有するオープンリーディングフレームとしてその細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａゲノムに組み込まれている組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。例えば、融合ポリペプチドの発現および分泌は、内在性ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列の制御下にあることもあり、または内在性ｈｌｙプロモーターおよびＬＬＯシグナル配列の制御下にあることもある。別の例では、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸は、ＡｃｔＡタンパク質をコードするａｃｔＡ配列、またはＬＬＯタンパク質をコードするｈｌｙ配列を代替することができる。
【０２１１】
組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の選択を、任意の手段により達成することができる。例えば、抗生物質選択を使用することができる。抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製に一般に利用される従来の選択およびクローニングプロセスに使用され得る。例示的な抗生物質耐性遺伝子としては、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびゲンタマイシンに対する耐性を付与する遺伝子産物が挙げられる。あるいは、栄養要求性株を使用することができ、外来性代謝関連遺伝子を、抗生物質耐性遺伝子の代わりに、または抗生物質耐性遺伝子に加えて、選択に使用することができる。一例として、本明細書で提供される代謝酵素または相補遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌について選択するために、代謝酵素をコードする遺伝子（例えば、アミノ酸代謝関連遺伝子）または相補遺伝子の発現について選択することになる培地において、形質転換された栄養要求性細菌を増殖させることができる。あるいは、温度感受性プラスミドを、組換え体を選択するために使用することができ、または任意の他の公知手段を、組換え体を選択するために使用することができる。
Ｂ．細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の弱毒化
【０２１２】
本明細書で開示される組換え細菌株（例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株）を弱毒化することができる。用語「弱毒化」は、宿主動物において疾患を引き起こす細菌の能力の低下を包含する。例えば、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａは培養での増殖および維持が可能であるが、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の病原特性は、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａと比較して低下され得る。一部の実施形態では、ＢＡＬＢ／ｃマウスへの弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａの静脈内接種を一例として使用すると、接種された動物の５０％が生き残る致死量（ＬＤ５０）は、野生型ＬｉｓｔｅｒｉａのＬＤ５０より少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約１０，０００倍、または少なくとも約１００，０００倍に増加される。したがって、Ｌｉｓｔｅｒｉａの弱毒化株は、それが投与された動物を死滅させないものであるか、または投与された細菌数が、同じ動物を死滅させるために必要となる野生型非弱毒化細菌の数より非常に多い場合にのみ、動物を死滅させるものである。弱毒化細菌はまた、一般的な環境では、その増殖に必要な栄養素がそこに存在しないため、複製することができないものを意味すると解釈すべきである。したがって、細菌は、必要な栄養素が提供される制御された環境での複製に限定される。弱毒化株は、無制御複製ができないことから環境上安全である。
（１）細菌およびＬｉｓｔｅｒｉａ株を弱毒化する方法
【０２１３】
弱毒化を任意の公知手段により遂行することができる。例えば、そのような弱毒化株は、１つもしくは複数の内在性ビルレンス遺伝子が欠損していることもあり、または１つもしくは複数の内在性代謝関連遺伝子が欠損していることもある。そのような遺伝子の例は、本明細書で開示され、弱毒化は、本明細書で開示される遺伝子のいずれか１つまたは任意の組合せの不活性化により達成することができる。不活性化を、例えば、欠失によって、または突然変異（例えば、不活性化突然変異）によって、達成することができる。用語「突然変異」は、配列（核酸またはアミノ酸配列）に対する任意のタイプの突然変異または修飾を含み、欠失、短縮化、挿入、置換、破壊または転座を包含し得る。例えば、突然変異は、フレームシフト突然変異、タンパク質の未成熟終結を引き起こす突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節配列の突然変異を含むことができる。突然変異誘発は、組換えＤＮＡ技術を使用して達成することができ、または突然変異原性化学物質もしくは放射線を使用する旧来の突然変異誘発技術およびその後の突然変異体の選択を使用して達成することができる。一部の実施形態では、復帰が付随して起こる確率が低いため、欠失突然変異体が使用される。用語「代謝関連遺伝子」は、宿主細菌によって利用または必要とされる栄養素の合成に関与するまたは必要とされる酵素をコードする遺伝子を指す。例えば、この酵素は、宿主細菌の持続的増殖に必要な栄養素の合成に、関与し得る、または必要とされ得る。用語「ビルレンス」遺伝子は、生物のゲノムにおけるその存在または活性がその生物の病原性に寄与する（例えば、生物による宿主におけるニッチへの定着（細胞への接着を含む）、免疫回避（宿主の免疫応答の回避）、免疫抑制（宿主の免疫応答の阻害）、細胞への侵入および細胞からの退出、または宿主からの栄養の獲得を可能にする）遺伝子を含む。
【０２１４】
そのような弱毒化株の特定の例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。そのような弱毒化株の別の例は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１１／０１４２７９１を参照されたい。ＬｍｄｄＡは、内在性ビルレンス遺伝子ａｃｔＡの欠失に起因して弱毒化されているＬｉｓｔｅｒｉａ株に基づく。そのような株は、ｄａｌ遺伝子の相補性によりｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの抗原発現のためのプラスミドを保持することができる。あるいは、ＬｍｄｄＡは、内在性ｄａｌ、ｄａｔおよびａｃｔＡ遺伝子の突然変異を有するｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ  Ｌｉｓｔｅｒｉａであることもある。そのような突然変異は、例えば、欠失または他の不活性化突然変異であり得る。
【０２１５】
弱毒化株の別の特定の例は、Ｌｍ  ｐｒｆＡ（−）、またはｐｒｆＡ遺伝子の部分的欠失もしくは不活性化突然変異を有する株である。ＰｒｆＡタンパク質は、Ｌｍがその脊椎動物宿主に定着するために必要とする必須ビルレンス遺伝子を含むレギュロンの発現を制御する。したがって、ｐｒｆＡ突然変異は、ＰｒｆＡ依存性ビルレンス遺伝子の発現を活性化するＰｒｆＡの能力を強く損なわせる。
【０２１６】
弱毒化株のさらに別の特定の例は、細菌の自然ビルレンスに重要な２つの遺伝子−インターナリンＢおよびａｃｔＡ−が欠失しているＬｍ  ｉｎｌＢ（−）ａｃｔＡ（−）である。
【０２１７】
弱毒化細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の他の例としては、１つまたは複数の内在性ビルレンス遺伝子が欠損している、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が挙げられる。そのような遺伝子の例としては、ＬｉｓｔｅｒｉａにおけるａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＢ、ｐｌｃＡ、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｉｎｌＪおよびｂｓｈが挙げられる。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、上述の株のいずれかの二重突然変異体または三重突然変異体であることもある。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書で提供される（例えば、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む）遺伝子のうちの各遺伝子についての突然変異もしくは欠失を含むことがあり、または例えば、前記遺伝子のうちのいずれかの１０以下についての、突然変異もしくは欠失を含むこともある。例えば、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性インターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の突然変異もしくは欠失、および／または内在性ａｃｔＡ遺伝子の突然変異もしくは欠失を含むことがある。あるいは、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性インターナリンＢ（ｉｎｌＢ）遺伝子の突然変異もしくは欠失、および／または内在性ａｃｔＡ遺伝子の突然変異もしくは欠失を含むことがある。あるいは、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣおよびａｃｔＡ遺伝子の突然変異または欠失を含むことがある。隣接細胞へのＬｉｓｔｅｒｉａの移行は、そのプロセスに関与する内在性ａｃｔＡ遺伝子および／または内在性ｉｎｌＣ遺伝子または内在性ｉｎｌＢ遺伝子の欠失により阻害され、それによって、高レベルの弱毒化とともに、免疫原性の増大および株骨格としての有用性が生じる結果となる。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ｐｌｃＡとｐｌｃＢ両方の突然変異または欠失を含む、二重突然変異体であることもある。一部の場合には、株は、ＥＧＤ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ骨格から構築され得る。
【０２１８】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝関連遺伝子の突然変異を有する栄養要求性株であることもある。一例として、株は、１つまたは複数の内在性アミノ酸代謝関連遺伝子が欠損していることがある。例えば、Ｄ−アラニンが欠損しているＬｉｓｔｅｒｉａの栄養要求性株の生成は、多数の方法で達成することができ、これらの方法は周知であり、例えば、欠失突然変異、挿入突然変異、フレームシフト突然変異、タンパク質の未成熟終結を引き起こす突然変異、または遺伝子発現に影響を与える調節配列の突然変異を含む。一部の実施形態では、栄養要求性表現型の復帰が付随して起こる確率が低いため、欠失突然変異体が使用される。一例として、本明細書で提示されるプロトコールに従って生成されるＤ−アラニンの突然変異体を、Ｄ−アラニンの非存在下で増殖する能力について単純な実験室培養アッセイで試験することができる。この化合物の非存在下で増殖することができない突然変異体を選択することができる。
【０２１９】
内在性アミノ酸代謝関連遺伝子の例としては、ビタミン合成遺伝子、パントテン酸シンターゼをコードする遺伝子、Ｄ−グルタミン酸シンターゼ遺伝子、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子、Ｄ−アラニンラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子、ｄｇａ、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関与する遺伝子、システインシンターゼＡの合成に関与する遺伝子（ｃｙｓＫ）、ビタミンＢ１２依存性メチオニンシンターゼ、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＥ、ａｓｎＢ、ｇｌｔＤ、ｇｌｔＢ、ｌｅｕＡ、ａｒｇＧおよびｔｈｒＣが挙げられる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、２つまたはそれより多くのそのような遺伝子（例えば、ｄａｔおよびｄａｌ）が欠損していることもある。Ｄ−グルタミン酸合成は、Ｄ−ｇｌｕ＋ｐｙｒのアルファ−ケトグルタル酸塩＋Ｄ−ａｌａへの変換および逆反応に関与するｄａｌ遺伝子によって、一部は制御される。
【０２２０】
別の例として、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、アミノ酸合成遺伝子などの内在性シンターゼ遺伝子が欠損していることもある。そのような遺伝子の例としては、ｆｏｌＰ、ジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質をコードする遺伝子、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子、ｈｉｓＦ、ｈｉｓＨ、ｆｌｉＩ、リボソーム大サブユニットプソイドウリジンシンターゼをコードする遺伝子、ｉｓｐＤ、二官能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子、ｃｏｂＳ、ｃｏｂＢ、ｃｂｉＤ、ウロポルフィリン−ＩＩＩ  Ｃ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノーゲン−ＩＩＩシンターゼをコードする遺伝子、ｃｏｂＱ、ｕｐｐＳ、ｔｒｕＢ、ｄｘｓ、ｍｖａＳ、ｄａｐＡ、ｉｓｐＧ、ｆｏｌＣ、クエン酸シンターゼをコードする遺伝子、ａｒｇＪ、３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼをコードする遺伝子、インドール−３−グリセロールリン酸シンターゼをコードする遺伝子、アントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ成分をコードする遺伝子、ｍｅｎＢ、メナキノン特異的イソコリスミン酸シンターゼをコードする遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシンアミジンシンターゼＩまたはＩＩをコードする遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼをコードする遺伝子、ｃａｒＢ、ｃａｒＡ、ｔｈｙＡ、ｍｇｓＡ、ａｒｏＢ、ｈｅｐＢ、ｒｌｕＢ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ａｌｓＳ、ｆａｂＦ、ｆａｂＨ、プソイドウリジンシンターゼをコードする遺伝子、ｐｙｒＧ、ｔｒｕＡ、ｐａｂＢ、およびＡＴＰシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２など）が挙げられる。
【０２２１】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性ｐｈｏＰ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤまたはｐｌｃＢが欠損していることもある。さらに別の例として、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内在性ペプチド輸送体が欠損していることもある。例としては、ＡＢＣ輸送体／ＡＴＰ結合／パーミアーゼタンパク質、オリゴペプチドＡＢＣ輸送体／オリゴペプチド結合タンパク質、オリゴペプチドＡＢＣ輸送体／パーミアーゼタンパク質、亜鉛ＡＢＣ輸送体／亜鉛結合タンパク質、糖ＡＢＣ輸送体、リン酸輸送体、ＺＩＰ亜鉛輸送体、ＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬物耐性輸送体、硫酸輸送体、プロトン依存性オリゴペプチド輸送体、マグネシウム輸送体、葉酸／硝酸輸送体、スペルミジン／プトレシンＡＢＣ輸送体、Ｎａ／Ｐｉ共輸送体、糖リン酸輸送体、グルタミンＡＢＣ輸送体、主要促進剤ファミリー輸送体、グリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣ輸送体、モリブデンＡＢＣ輸送体、タイコ酸（ｔｅｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）ＡＢＣ輸送体、コバルトＡＢＣ輸送体、アンモニウム輸送体、アミノ酸ＡＢＣ輸送体、細胞分裂ＡＢＣ輸送体、マンガンＡＢＣ輸送体、鉄化合物ＡＢＣ輸送体、マルトース／マルトデキストリンＡＢＣ輸送体、Ｂｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬物耐性輸送体、および上記タンパク質のうちの１つについてのサブユニットをコードする遺伝子が挙げられる。
【０２２２】
他の弱毒化細菌およびＬｉｓｔｅｒｉａ株は、細菌増殖プロセス、複製プロセス、細胞壁合成、タンパク質合成、脂肪酸の代謝に、または任意の他の増殖もしくは複製プロセスに使用されるアミノ酸を代謝する内因性代謝酵素が欠損していることがある。同様に、弱毒化株は、細胞壁合成に使用されるアミノ酸の形成を触媒することができる内在性代謝酵素、細胞壁合成に使用されるアミノ酸の合成を触媒することができる内在性代謝酵素、または細胞壁合成に使用されるアミノ酸の合成に関与することができる内在性代謝酵素が欠損していることがある。あるいは、アミノ酸が細胞壁生合成に使用されることもある。あるいは、代謝酵素は、細胞壁成分であるＤ−グルタミン酸の合成酵素である。
【０２２３】
他の弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｄ−グルタミン酸合成遺伝子、ｄｇａ、ａｌｒ（アラニンラセマーゼ）遺伝子によってコードされる代謝酵素、またはアラニン合成に関与する任意の他の酵素が、欠損していることもある。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に欠損していることがある代謝酵素のさらに他の例としては、ｓｅｒＣによってコードされる酵素（ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ）、ａｓｄによってコードされる酵素（アスパラギン酸ベータセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ；細胞壁構成要素ジアミノピメリン酸の合成に関与する）、ｇｓａＢ−グルタミン酸−１−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子によってコードされる酵素（（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノエートからの５−アミノレブリネートの形成を触媒する）、ｈｅｍＬによってコードされる酵素（（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノエートからの５−アミノレブリネートの形成を触媒する）、ａｓｐＢによってコードされる酵素（Ｌ−アスパルテートおよび２−オキソグルタレートからのオキサロアセテート（ｏｘａｌｏｚｃｅｔａｔｅ）およびＬ−グルタメートの形成を触媒するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ａｒｇＦ−１によってコードされる酵素（アルギニン生合成に関与する）、ａｒｏＥによってコードされる酵素（アミノ酸生合成に関与する）、ａｒｏＢによってコードされる酵素（３−デヒドロキネート生合成に関与する）、ａｒｏＤによってコードされる酵素（アミノ酸生合成に関与する）、ａｒｏＣによってコードされる酵素（アミノ酸生合成に関与する）、ｈｉｓＢによってコードされる酵素（ヒスチジン生合成に関与する）、ｈｉｓＤによってコードされる酵素（ヒスチジン生合成に関与する）、ｈｉｓＧによってコードされる酵素（ヒスチジン生合成に関与する）、ｍｅｔＸによってコードされる酵素（メチオニン生合成に関与する）、ｐｒｏＢによってコードされる酵素（プロリン生合成に関与する）、ａｒｇＲによってコードされる酵素（アルギニン生合成に関与する）、ａｒｇＪによってコードされる酵素（アルギニン生合成に関与する）、ｔｈｉｌ（チアミン生合成に関与する）、ＬＭＯｆ２３６５＿１６５２によってコードされる酵素（トリプトファン生合成に関与する）、ａｒｏＡによってコードされる酵素（トリプトファン生合成に関与する）、ｉｌｖＤによってコードされる酵素（バリンおよびイソロイシン生合成に関与する）、ｉｌｖＣによってコードされる酵素（バリンおよびイソロイシン生合成に関与する）、ｌｅｕＡによってコードされる酵素（ロイシン生合成に関与する）、ｄａｐＦによってコードされる酵素（リシン生合成に関与する）、およびｔｈｒＢによってコードされる酵素（トレオニン生合成に関与する）（全てＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２９７３）が挙げられる。
【０２２４】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、ｔＲＮＡシンテターゼなどの他の代謝酵素の突然変異により生成されることもある。例えば、代謝酵素は、トリプトファニル−ｔＲＮＡシンテターゼをコードするｔｒｐＳ遺伝子によってコードされることがある。例えば、宿主株細菌は、Δ（ｔｒｐＳ  ａｒｏＡ）であることがあり、両方のマーカーが組込ベクターに含有されていることもある。
【０２２５】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するように突然変異させることができる代謝酵素の他の例としては、ｍｕｒＥによってコードされる酵素（ジアミノピメリン酸の合成に関与する；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００３４８５）、ＬＭＯｆ２３６５＿２４９４によってコードされる酵素（タイコ酸生合成に関与する）、ＷｅｃＥによってコードされる酵素（リポ多糖生合成タンパク質ｒｆｆＡ；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＥ０１４０７５．１）、またはａｍｉＡによってコードされる酵素（Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）が挙げられる。代謝酵素のさらに他の例としては、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿４６６３４７）、または細胞壁タイコ酸グリコシル化タンパク質ＧｔｃＡが挙げられる。
【０２２６】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するように突然変異させることができる代謝酵素の他の例としては、ペプチドグリカン成分または前駆体の合成酵素が挙げられる。この成分は、例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチド、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＭｕｒＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリル−ウンデカプレノール、ＧｌｃＮＡｃ−ｐ−（１，４）−ＭｕｒＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリルウンデカプレノール、または任意の他のペプチドグリカン成分もしくは前駆体であり得る。
【０２２７】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するように突然変異させることができる代謝酵素のさらに他の例としては、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＡ−１またはｍｕｒＡ−２によってコードされる代謝酵素（全てＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ＿００２９７３に記載されている）が挙げられる。あるいは、代謝酵素は、ペプチドグリカン成分または前駆体の任意の他の合成酵素であり得る。代謝酵素は、トランス−グリコシラーゼ、トランス−ペプチダーゼ、カルボキシ−ペプチダーゼ、任意の他のクラスの代謝酵素、または任意の他の代謝酵素であることもある。例えば、代謝酵素は、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ代謝酵素であり得、または任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ代謝酵素であり得る。
【０２２８】
他の細菌株中の対応するオルソロガス遺伝子を突然変異させることにより、Ｌｉｓｔｅｒｉａについて上で説明したように他の細菌株を弱毒化することができる。
（２）弱毒化細菌およびＬｉｓｔｅｒｉａ株を相補する方法
【０２２９】
本明細書で開示される弱毒化細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、相補遺伝子を含む核酸、または弱毒化突然変異を相補する（例えば、栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の栄養要求性を相補する）代謝酵素をコードする核酸をさらに含むことができる。例えば、本明細書で開示されるような融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを有する核酸は、相補遺伝子を含むかまたは相補代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを、さらに含むことができる。あるいは、第１の核酸は、融合ポリペプチドをコードすることができ、別の第２の核酸は、相補遺伝子を含むことができ、または相補代謝酵素をコードすることができる。
【０２３０】
相補遺伝子は、染色体外のものであることもあり、または細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａゲノムに組み込まれていることもある。例えば、栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝酵素をコードする核酸を含むエピソームプラスミドを含むことができる。そのようなプラスミドは、エピソームまたは染色体外様式でＬｉｓｔｅｒｉａに含有されることになる。あるいは、栄養要求性Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝酵素をコードする核酸を含む組込型プラスミド（すなわち、組込ベクター）を含むことができる。そのような組込型プラスミドをＬｉｓｔｅｒｉａ染色体への組込みに使用することができる。一部の実施形態では、エピソームプラスミドまたは組込型プラスミドは、抗生物質耐性マーカーを欠いている。
【０２３１】
抗生物質耐性遺伝子の代わりに、または抗生物質耐性遺伝子に加えて、代謝関連遺伝子を選択に使用することができる。一例として、本明細書で提供される代謝酵素または相補遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌について選択するために、代謝酵素をコードする遺伝子（例えば、アミノ酸代謝関連遺伝子）または相補遺伝子の発現について選択することになる培地において、形質転換された栄養要求性細菌を増殖させることができる。例えば、Ｄ−グルタミン酸合成に対する栄養要求性がある細菌を、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドで形質転換することができ、その栄養要求性細菌は、Ｄ−グルタミン酸の非存在下で増殖するであろうが、前記プラスミドで形質転換されていない栄養要求性細菌も、Ｄ−グルタミン酸合成のためのタンパク質をコードするプラスミドを発現しない栄養要求性細菌も、増殖しないであろう。同様に、Ｄ−アラニン合成に対する栄養要求性がある細菌は、形質転換され、Ｄ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする核酸を含むプラスミドを発現する場合、Ｄ−アラニンの非存在下で増殖するであろう。必要な増殖因子、栄養補助剤、アミノ酸、ビタミン、抗生物質などを含むまたは欠いている適切な培地を作製するためのそのような方法は周知であり、そのような方法を商業的に入手することができる。
【０２３２】
本明細書で提供される代謝酵素または相補遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養要求性細菌を適切な培地で選択してしまえば、それらの細菌を選択圧の存在下で繁殖させることができる。そのような繁殖は、栄養要求性因子を含有しない培地における細菌の増殖を含み得る。栄養要求性細菌における代謝酵素または相補遺伝子を発現するプラスミドの存在により、確実に、プラスミドは細菌とともに複製することになり、したがって、プラスミドを保有する細菌は連続的に選択されることになる。細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の生産は、プラスミドを含む栄養要求性細菌が増殖している培地の体積を調整することによって容易に規模拡大することができる。
【０２３３】
１つの特定の例では、弱毒化株は、ｄａｌおよびｄａｔ中の欠失または不活性化突然変異を有する株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）もしくはＬｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ））であり、相補遺伝子は、アラニンラセマーゼ酵素（例えば、ｄａｌ遺伝子によってコードされる）、またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素（例えば、ｄａｔ遺伝子によってコードされる）をコードする。例示的なアラニンラセマーゼタンパク質は、配列番号７６に記載の配列（配列番号７８によってコードされる；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０３８４３８）を有することがあり、または配列番号７６のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、もしくはアイソフォームの断片であることもある。アラニンラセマーゼタンパク質はまた、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａアラニンラセマーゼタンパク質であり得る。あるいは、アラニンラセマーゼタンパク質は、任意の他のグラム陽性アラニンラセマーゼタンパク質、または任意の他のアラニンラセマーゼタンパク質であり得る。例示的なＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号７７に記載の配列（配列番号７９によってコードされる；ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＦ０３８４３９）を有することがあり、または配列番号７７のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、もしくはアイソフォームの断片であることもある。Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質はまた、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質であり得る。あるいは、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質は、任意の他のグラム陽性Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質、または任意の他のＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質であり得る。
【０２３４】
別の特定の例では、弱毒化株は、ｐｒｆＡ中の欠失または不活性化突然変異を有する株（例えば、Ｌｍ  ｐｒｆＡ（−））であり、相補遺伝子は、ＰｒｆＡタンパク質をコードする。例えば、相補遺伝子は、一部のＰｒｆＡ機能を回復させる突然変異ＰｒｆＡ（Ｄ１３３Ｖ）タンパク質をコードし得る。野生型ＰｒｆＡタンパク質の例は、配列番号８０に記載され（配列番号８１に記載の核酸配列によってコードされ）、Ｄ１３３Ｖ突然変異ＰｒｆＡタンパク質の一例は、配列番号８２に記載される（配列番号８３に記載の核酸によってコードされる）。相補ＰｒｆＡタンパク質は、配列番号８０または８２のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片、またはアイソフォームの断片であることもある。ＰｒｆＡタンパク質はまた、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  ＰｒｆＡタンパク質であり得る。あるいは、ＰｒｆＡタンパク質は、任意の他のグラム陽性ＰｒｆＡタンパク質、または任意の他のＰｒｆＡタンパク質であり得る。
【０２３５】
別の例では、菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、ａｃｔＡ遺伝子の欠失または不活性化突然変異を含むことがあり、相補遺伝子は、その突然変異を相補してＬｉｓｔｅｒｉａ株の機能を回復するためのａｃｔＡ遺伝子を含むことがある。
【０２３６】
他の栄養要求株および相補系を、本明細書で提供される方法および組成物に伴う使用に採用することもできる。
ＩＶ．組換え融合ポリペプチド
【０２３７】
本明細書で開示される組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株中の組換え融合ポリペプチドは、任意の形態であり得る。一部のそのような融合ポリペプチドは、１つまたは複数の疾患関連抗原ペプチドに融合されているＰＥＳＴ含有ペプチドを含むことができる。他のそのような組換え融合ポリペプチドは、１つまたは複数の疾患関連抗原ペプチドを含むことができ、前記融合ポリペプチドは、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含まない。
【０２３８】
組換え融合ポリペプチドの別の例は、Ｎ末端からＣ末端へ、細菌分泌配列、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質および１つまたは複数の疾患関連抗原ペプチド（すなわち、直列に、例えば、Ｕｂ−ペプチド１−ペプチド２）を含む。あるいは、２つまたはそれより多くの疾患関連抗原ペプチドが使用される場合、各抗原ペプチドがその独自の分泌配列およびＵｂタンパク質と融合されている（例えば、Ｕｂ１−ペプチド１；Ｕｂ２−ペプチド２）、別個の融合ポリペプチドの組合せが使用されることもある。
【０２３９】
そのような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸（ミニ遺伝子構築物と称される）も開示される。そのようなミニ遺伝子核酸構築物は、Ｓｈｉｎｅ・Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つまたはそれより多くのオープンリーディングフレームを各オープンリーディングフレーム間にさらに含むことができる。例えば、ミニ遺伝子核酸構築物は、Ｓｈｉｎｅ・Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームを各オープンリーディングフレーム間にさらに含むことができる。各オープンリーディングフレームは、異なるペプチドをコードすることができる。一部の核酸構築物では、融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンの後に、タンパク質合成の終結を確実にするための２つの停止コドンが続くことがある。
【０２４０】
細菌シグナル配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａのシグナル配列、例えば、ＨｌｙもしくはＡｃｔＡシグナル配列、または任意の他の公知シグナル配列であり得る。他の場合には、シグナル配列は、ＬＬＯシグナル配列であり得る。例示的なＬＬＯシグナル配列は、配列番号９７に記載される。シグナル配列は、細菌のものであることもあり、宿主細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、例えばｓｅｃＡ１シグナルペプチド）に特有のものであることもあり、または宿主細菌にとって異質のものであることもある。シグナルペプチドの特定の例としては、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５シグナルペプチド；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチド；Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチドなどのｓｅｃＡ２シグナルペプチド；およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｔａｔシグナルペプチド（例えば、ＰｈｏＤ）などのＴａｔシグナルペプチドが挙げられる。特定の例では、分泌シグナル配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａタンパク質から、例えば、ＡｃｔＡ３００分泌シグナル、またはＡｃｔＡ１００分泌シグナルである。例示的なＡｃｔＡシグナル配列は、配列番号９８に記載される。
【０２４１】
ユビキチンは、例えば、完全長タンパク質であり得る。本明細書で提供される核酸構築物から発現されたユビキチンは、宿主細胞サイトゾルに侵入すると、核酸構築物から発現された組換え融合ポリペプチドの残部からカルボキシ末端で加水分解作用によって切断され得る。この切断が融合ポリペプチドのアミノ末端を遊離させ、その結果、宿主細胞サイトゾル中でペプチドが産生される。
【０２４２】
融合ポリペプチド中の抗原ペプチドの選択、可変性および構成は、本明細書中の他の箇所で詳細に論じられ、疾患関連抗原ペプチドの例は、本明細書中の他の箇所でより詳細に論じられる。
【０２４３】
組換え融合ポリペプチドは、１つまたは複数のタグを含むことができる。例えば、組換え融合ポリペプチドは、１つもしくは複数の抗原ペプチドのＮ末端および／もしくはＣ末端側に１つまたは複数のペプチドタグを含むことができる。タグを抗原ペプチドに直接融合させることができ、またはリンカー（その例は、本明細書中の他の箇所で開示される）を介して抗原ペプチドに連結させることができる。タグの例としては、次のものを挙げられる：ＦＬＡＧタグ、２×ＦＬＡＧタグ、３×ＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、６×Ｈｉｓタグ、およびＳＩＩＮＦＥＫＬタグ。例示的なＳＩＩＮＦＥＫＬタグは、配列番号１６に記載される（配列番号１〜１５に記載の核酸のいずれか１つによりコードされる）。例示的な３×ＦＬＡＧタグは、配列番号３２に記載される（配列番号１７〜３１に記載の核酸のいずれか１つによりコードされる）。例示的なバリアント３×ＦＬＡＧタグは、配列番号９９に記載される。２つまたはそれより多くのタグ、例えば、２×ＦＬＡＧタグとＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、３×ＦＬＡＧタグとＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、または６×ＨｉｓタグとＳＩＩＮＦＥＫＬタグを、一緒に使用することができる。２つまたはそれより多くのタグを使用する場合、それらは、組換え融合ポリペプチド内のいずれの箇所にいずれの順序で位置してもよい。例えば、２つのタグが、組換え融合ポリペプチドのＣ末端にあってもよく、２つのタグが、組換え融合ポリペプチドのＮ末端にあってもよく、２つのタグが、組換え融合ポリペプチドの内部に位置してもよく、組換え融合ポリペプチドのＣ末端に１つのタグがあってＮ末端に１つのタグがあってもよく、組換え融合ポリペプチドのＣ末端に１つのタグがあって内部に１つのタグがあってもよく、または組換え融合ポリペプチドのＮ末端に１つのタグがあって内部に１つのタグがあってもよい。他のタグには、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、およびポリ（ＮＡＮＰ）が含まれる。特定の組換え融合ポリペプチドは、Ｃ末端ＳＩＩＮＦＥＫＬタグを含む。そのようなタグによって、これらの「タグ」配列ペプチドに対する免疫応答を追跡することにより、組換え融合タンパク質の容易な検出、組換え融合タンパク質の分泌の確認、または分泌された融合ポリペプチドの免疫原性の追跡が可能になり得る。そのような免疫応答を、例えば、これらのタグに特異的なモノクローナル抗体およびＤＮＡまたはＲＮＡプローブを含む、多数の試薬を使用してモニターすることができる。
【０２４４】
本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株により発現されることもあり、またはタンパク質発現および単離に使用される他のベクターおよび細胞系から発現され、単離されることもある。そのような抗原ペプチドの発現を有する組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａを含む免疫原性組成物に、および組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株とアジュバントとを含むワクチンに使用することができる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の宿主細胞系における、およびＬｉｓｔｅｒｉａ以外の宿主細胞系における、非溶血性短縮型のＬＬＯ、ＡｃｔＡまたはＰＥＳＴ様配列を有する融合ポリペプチドとしての１つまたは複数の抗原ペプチドの発現は、抗原ペプチドの免疫原性を増強する結果となり得る。
【０２４５】
そのような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸も開示される。核酸は、任意の形態のものであり得る。核酸は、ＤＮＡもしくはＲＮＡを含むこともあり、またはＤＮＡもしくはＲＮＡからなることもあり、一本鎖であることもあり、または二本鎖であることもある。核酸は、エピソームプラスミド、多コピーエピソームプラスミド、または組込型プラスミドなどの、プラスミドの形態であることもある。あるいは、核酸は、ウイルスベクターの形態であることもあり、ファージベクターの形態であることもあり、または細菌人工染色体内にあることもある。そのような核酸は、１つのオープンリーディングフレームを有することもあり、または２つもしくはそれより多くのオープンリーディングフレーム（例えば、組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、および代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレーム）を有することもある。一例では、そのような核酸は、Ｓｈｉｎｅ・Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つまたはそれより多くのオープンリーディングフレームを各オープンリーディングフレーム間に含むことができる。例えば、核酸は、Ｓｈｉｎｅ・Ｄａｌｇａｒｎｏリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームを各オープンリーディングフレーム間に含むことができる。各オープンリーディングフレームは、異なるポリペプチドをコードすることができる。一部の核酸では、融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンの後に、タンパク質合成の終結を確実にするための２つの停止コドンが続く。
Ａ．抗原ペプチド
【０２４６】
疾患関連ペプチドは、特定の疾患の際に発現されるタンパク質からのペプチドを含む。例えば、そのようなペプチドは、疾患組織に発現されるが対応する正常組織には発現されないタンパク質から、または疾患組織に異常に高レベルで発現されるタンパク質からであり得る。用語「疾患」は、本明細書で使用される場合、用語「障害」および「状態」（医学的状態などの場合）と、一般に同義であるように意図され、それら全てが、正常な機能を損なわせる、特徴的な徴候および症状として典型的に顕在化する、ならびにヒトまたは動物の寿命の短縮または生活の質の低下の原因となる、ヒトもしくは動物の身体についてのまたはその部分のうちの１つについての異常な状態を示すという意味で、同じ意味で使用される。疾患関連抗原ペプチドの例としては、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７またはＥ６、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、キメラＨｅｒ２抗原、Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原を挙げることができる。疾患関連抗原ペプチドの別の例は、ＷＴ１抗原ペプチドである。ヒトパピローマウイルスは、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８であり得る。抗原ペプチドは、直列に作動可能に連結されているＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７、ＨＰＶ１８  Ｅ６、ＨＰＶ１８  Ｅ７抗原、またはＨＰＶ抗原ペプチドと直列に作動可能に連結されているＨＰＶ１６抗原ペプチドも含み得る。
【０２４７】
融合ポリペプチドは、単一の抗原ペプチドを含むこともあり、または２つもしくはそれより多くの抗原ペプチドを含むこともある。各抗原ペプチドは、免疫応答を誘導するのに十分な任意の長さであり得、各抗原ペプチドが同じ長さであることもあり、または抗原ペプチドが異なる長さを有することもある。例えば、本明細書で開示される抗原ペプチドは、長さ５〜１００、１５〜５０、もしくは２１〜２７アミノ酸であることもあり、または長さ１５〜１００、１５〜９５、１５〜９０、１５〜８５、１５〜８０、１５〜７５、１５〜７０、１５〜６５、１５〜６０、１５〜５５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、２０〜１００、２０〜９５、２０〜９０、２０〜８５、２０〜８０、２０〜７５、２０〜７０、２０〜６５、２０〜６０、２０〜５５、２０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、１１〜２１、１５〜２１、２１〜３１、３１〜４１、４１〜５１、５１〜６１、６１〜７１、７１〜８１、８１〜９１、９１〜１０１、１０１〜１２１、１２１〜１４１、１４１〜１６１、１６１〜１８１、１８１〜２０１、８〜２７、１０〜３０、１０〜４０、１５〜３０、１５〜４０、１５〜２５、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、１〜１００、５〜７５、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、８〜１１、もしくは１１〜１６アミノ酸であることもある。例えば、抗原ペプチドは、長さ少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９または６０アミノ酸であり得る。抗原ペプチドの一部の特定の例は、長さ２１または２７アミノ酸である。他の抗原ペプチドは、完全長タンパク質またはそれらの断片であり得る。
【０２４８】
一例として、抗原ペプチドは、ネオエピトープを含み得る。これらのネオエピトープは、例えば、患者特異的（すなわち、対象特異的）がん突然変異であり得る。ネオエピトープを含む抗原ペプチドは、対象からのがん試料から抽出した核酸を正常または健常参照試料から抽出した核酸と比較して、正常または健常試料と比較してがん試料中に存在する体細胞突然変異または配列差異を同定することを含む、個別化免疫療法を創出するプロセスで、生成され得る。例えば、これらの突然変異または配列差異は、体細胞非同義ミスセンス突然変異または体細胞フレームシフト突然変異であり得、発現されたアミノ酸配列をコードし得る。そのような体細胞突然変異または配列差異を発現するペプチドを、「ネオエピトープ」と呼ぶことができる。がん特異的ネオエピトープは、がん試料では見つけられるが参照試料（例えば、正常な非がん性または生殖系列細胞または組織）には存在しないエピトープを指すこともある。これは、例えば、正常な非がん性または生殖系列細胞では対応するエピトープが見つけられるが、がん細胞では１つまたは複数の突然変異に起因してエピトープの配列が変化してネオエピトープが生じる結果となる、状況を含む。ネオエピトープは、突然変異したエピトープを含むこともあり、突然変異の片側または両側に突然変異していない配列を含むこともある。
【０２４９】
別の例として、抗原ペプチドは、反復がん突然変異を含み得る。各抗原ペプチドは、単一の反復がん突然変異を含むこともあり、または２つまたはそれより多くの反復がん突然変異（例えば、２つの反復がん突然変異）を含むこともある。例えば、抗原ペプチドは、がん関連タンパク質中の突然変異した残基が互いに近くにあるために、１つより多くの反復がん突然変異（例えば、２つまたは３つの反復がん突然変異）を含むことがある。反復がん突然変異は、任意のタイプの突然変異（例えば、体細胞ミスセンス突然変異またはフレームシフト突然変異）であり得る。例えば、本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドは、２つもしくはそれより多くの抗原ペプチドと融合されているＰＥＳＴ含有ペプチドを（すなわち、直列に、例えば、ＰＥＳＴ−ペプチド１−ペプチド２で）含むこともあり、またはＰＥＳＴ含有ペプチドと融合されていない２つもしくはそれより多くの抗原ペプチドを含むこともあり、前記抗原ペプチドの各々は、単一の反復がん突然変異（すなわち、タンパク質のアミノ酸配列の単一の反復変化、または遺伝子内の単一の、異なる、非同義の、反復がん突然変異によってコードされる配列）を含み、前記抗原ペプチドの少なくとも２つは、異なる反復がん突然変異を含み、同じがん関連タンパク質の断片である。あるいは、抗原ペプチドの各々は、異なるがん関連タンパク質からの異なる反復がん突然変異を含むことがある。あるいは、各抗原ペプチドがその独自のＰＥＳＴ含有ペプチドと融合されている（または融合されていない）別個の融合ポリペプチドの組合せを使用することができる（例えば、ＰＥＳＴ１−ペプチド１；ＰＥＳＴ２−ペプチド２）。必要に応じて、断片の一部または全ては、同じがん関連タンパク質の非連続断片である。非連続的断片は、タンパク質配列中に逐次的に存在しない断片である（例えば、第１の断片は、残基１０〜３０からなり、第２の断片は、残基１００〜１２０からなるか、または第１の断片は、残基１０〜３０からなり、第２の断片は、残基２０〜４０からなる）。必要に応じて、抗原ペプチドの各々は、単一の種類のがんからの異なる反復がん突然変異を含む。
【０２５０】
反復がん突然変異は、がん関連タンパク質からであることもある。用語「がん関連タンパク質」は、複数の種類のがんに起こる突然変異を有するタンパク質、特定の種類のがんを有する複数の対象に起こる突然変異を有するタンパク質、または１もしくは複数の種類のがんの発生もしくは進行と相関する突然変異を有するタンパク質を含む。例えば、がん関連タンパク質は、発癌タンパク質（すなわち、がん進行に寄与し得る活性を有するタンパク質、例えば、細胞増殖を調節するタンパク質）であることもあり、または腫瘍抑制タンパク質（すなわち、がん形成の可能性を、例えば、細胞周期の負の調節によって、もしくはアポトーシスを促進することにより、軽減するように概して作用するタンパク質）であることもある。一部の実施形態では、がん関連タンパク質は、「突然変異ホットスポット」を有する。突然変異ホットスポットは、選択の非存在下で予想されるより高頻度に（例えば、体細胞異常ではなく体細胞置換、例えば、転座、増幅および欠失による）変異が見られる、タンパク質コード遺伝子内のアミノ酸位置である。そのようなホットスポット突然変異は、複数の種類のがんにわたって起こることもあり、および／または複数の患者間で共有されることもある。突然変異ホットスポットは、腫瘍試料の集団にわたって選択圧を示す。腫瘍ゲノムは、変更時に腫瘍細胞に選択的増殖優位性をもたらす遺伝子（すなわち、腫瘍ドライバー遺伝子）に作用することにより腫瘍発生を「駆動する」反復がん突然変異を含有する。そのような腫瘍ドライバー遺伝子は、例えば、バックグラウンド突然変異率から予想されるより高頻度に突然変異が見られる遺伝子（すなわち、反復）を同定することによって；腫瘍試料にわたって他の正の選択シグナル（例えば、サイレント突然変異と比較して高い非サイレント突然変異率、もしくは機能的変異の蓄積への偏り）を示す遺伝子を同定することによって；不活性化突然変異はタンパク質配列に沿って分布しているが、機能獲得型変異は特定の残基もしくはドメインにおいて特異的に起こる傾向があるという知見に基づいて、タンパク質配列のある特定の領域の突然変異を持続する傾向を活用することによって；またはリン酸化部位などの特定の機能性残基の突然変異の過剰提示を活用することによって、同定することができる。これらの突然変異の多くは、多くの場合、生物活性タンパク質の機能性領域（例えば、キナーゼドメインもしくは結合ドメイン）で起こりもしくは活性部位（例えば、リン酸化部位）を遮断し、その結果、機能喪失型もしくは機能獲得型突然変異となり、またはそれらは、タンパク質の三次元構造および／もしくは電荷平衡を、正常な機能に干渉するのに十分なほど乱さないような形で起こり得る。多数の腫瘍についてのゲノム分析は、突然変異が、限られた数のアミノ酸位置で起こることが多いことを明示する。したがって、共通突然変異の大多数は、比較的少数の潜在的腫瘍関連抗原またはＴ細胞エピトープによって提示され得る。
【０２５１】
「反復がん突然変異」は、複数の種類のがんにおよび／または特定の種類のがんを有する複数の対象に起こる、タンパク質のアミノ酸配列の変化である。がんに関連するそのような突然変異は、対応する健常組織に通常は存在しない腫瘍関連抗原を生じさせる結果となり得る。
【０２５２】
複数のがんにわたってまたは複数のがん患者間で起こる共通突然変異を有する腫瘍ドライバー遺伝子およびがん関連タンパク質は公知であり、複数の腫瘍試料および複数の腫瘍型にわたって配列データが存在する。例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４（２）：１５５−１６３；Ｔａｍｂｏｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ３：２６５０を参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２５３】
別の例として、抗原ペプチドは、ヘテロクリティック抗原ペプチドであり得る。例えば、ヘテロクリティック抗原ペプチドは、ヘテロクリティック突然変異を含むがん関連タンパク質の断片（すなわち、がん関連タンパク質からのアミノ酸の連続した配列）であり得る。ヘテロクリティック抗原ペプチドは、単一のヘテロクリティック突然変異を含むこともあり、または２つもしくはそれより多くのヘテロクリティック突然変異（例えば、２つのヘテロクリティック突然変異）を含むこともある。用語「ヘテロクリティック」は、ヘテロクリティックペプチドの元になったネイティブペプチド（例えば、アンカー残基突然変異を含有しないペプチド）を認識する免疫応答を生じさせるペプチドを指す。
【０２５４】
本明細書で開示される一部の組換え融合ポリペプチドは、反復がん突然変異を含む抗原ペプチド、ヘテロクリティック突然変異を含む抗原ペプチド（例えば、がん関連タンパク質から）、およびミニ遺伝子構築物から発現された抗原ペプチド（例えば、がん関連タンパク質から）（すなわち、ユビキチンと融合されているヘテロクリティック抗原ペプチドなどの、抗原ペプチド）の、任意の組合せを含み得る。例えば、そのような組換え融合ポリペプチドは、少なくとも１つの抗原ペプチドが、がん関連タンパク質からであり、反復がん突然変異を含み、および少なくとも１つの抗原ペプチドが、がん関連タンパク質からであり、ヘテロクリティック突然変異を含む、２つまたはそれより多くの抗原ペプチドと融合されているＰＥＳＴ含有ペプチドを含み得る。必要に応じて、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、細菌分泌シグナル配列を含み、融合ポリペプチドは、カルボキシ末端抗原ペプチドに融合されているユビキチンタンパク質をさらに含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチド、前記２つまたはそれより多くの抗原ペプチド、前記ユビキチン、および前記カルボキシ末端抗原ペプチドは、前記融合タンパク質のアミノ末端からカルボキシ末端へ直列に配列されている。
【０２５５】
各抗原ペプチドはまた、親水性であることがあり、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓもしくは目的の別の細菌における分泌可能性を予示し得る、最大で、ある特定のハイドロパシー閾値またはそれ未満のスコアを有することがある。例えば、抗原ペプチドをＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数２１アミノ酸ウインドウによってスコア化することができ、カットオフ（およそ１．６）より上のスコアを有する全てを除外することができる。それらは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより分泌される可能性が低いからである。同様に、抗原ペプチドまたは融合ポリペプチドの組合せは、親水性であることがあり、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓもしくは目的の別の細菌における分泌可能性を予示し得る、最大で、ある特定のハイドロパシー閾値またはそれ未満のスコアを有することがある。
【０２５６】
抗原ペプチドを任意の方法で互いに連結させることができる。例えば、抗原ペプチドを介在配列なしで互いに直接融合させることができる。あるいは、抗原ペプチドを、ペプチドリンカーなどの１つまたは複数のリンカーを介して、互いに間接的に連結させることができる。一部の場合には、隣接する抗原ペプチドの一部のペアを互いに直接融合させることができ、抗原ペプチドの他のペアを１つまたは複数のリンカーを介して互いに間接的に連結させることができる。同じリンカーを、隣接する抗原ペプチドの各ペア間に使用することができ、または任意の数の異なるリンカーを、隣接する抗原ペプチドの異なるペア間に使用することができる。加えて、１つのリンカーを、隣接する抗原ペプチドのペア間に使用することができ、または複数のリンカーを、隣接する抗原ペプチドのペア間に使用することができる。
【０２５７】
任意の好適な配列をペプチドリンカーに使用することができる。一例として、リンカー配列は、例えば、長さ１〜約５０アミノ酸であり得る。一部のリンカーは、親水性であり得る。リンカーは、様々な目的に役立つことができる。例えば、リンカーは、細菌分泌を増加させること、抗原プロセシングを助長すること、融合ポリペプチドの柔軟性を増大させること、融合ポリペプチドの剛直性を増大させること、または任意の他の目的に役立つことができる。一部の場合には、反復を最小にするために、異なるアミノ酸リンカー配列が抗原ペプチド間に分布しており、または同じアミノ酸リンカー配列をコードする異なる核酸が抗原ペプチド間に分布している（例えば、配列番号８４〜９４）。これは、二次構造を低減させることによって、Ｌｍ組換えベクター株集団内の融合ポリペプチドをコードする核酸（例えば、プラスミド）の十分な転写、翻訳、分泌、維持または安定化を可能にすることにも役立ち得る。他の好適なペプチドリンカー配列は、例えば、次の要因の１つまたは複数に基づいて選択することができる：（１）柔軟な伸長立体構造を採ることができること、（２）抗原ペプチド上の機能性エピトープと相互作用し得る二次構造を採ることができないこと、および（３）機能性エピトープと反応する可能性がある疎水性または荷電残基を欠いていること。例えば、ペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、ＡｓｎおよびＳｅｒ残基を含有し得る。他のほぼ中性のアミノ酸、例えば、ＴｈｒおよびＡｌａも、リンカー配列に使用され得る。リンカーとして役立つように用いることができるアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６；Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２；ＵＳ４，９３５，２３３；およびＵＳ４，７５１，１８０において開示されているものを含み、前記参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。リンカーの特定の例は、表２におけるもの（これらの各々は、単独でリンカーとして使用されることもあり、配列の反復を含むリンカーの状態で使用されることもあり、または表中の他の配列の１つもしくは複数をさらに含むリンカーで使用されることもある）を含むが、他のものも想定され得る（例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｄｄｙ  Ｃｈｉｃｈｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２：１５３−１６７を参照されたい）。指定されていない限り、「ｎ」は、列挙されているリンカー内の反復の未確定数を表す。
【０２５８】
【表２】
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Ｂ．ＰＥＳＴ含有ペプチド
【０２５９】
本明細書で開示される組換え融合タンパク質は、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含む。ＰＥＳＴ含有ペプチドは、融合ポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）（すなわち、抗原ペプチドのＮ末端）にあることもあり、融合ポリペプチドのカルボキシ末端（Ｃ末端）（すなわち、抗原ペプチドのＣ末端）にあることもあり、または抗原ペプチド中に埋め込まれていることもある。一部の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株および方法では、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、融合ポリペプチドの一部ではなく、融合ポリペプチドとは別である。ＬＬＯペプチドなどの抗原ペプチドのＰＥＳＴ様配列への融合は、抗原ペプチドの免疫原性を増強することができ、細胞により媒介される抗腫瘍免疫応答を増大させる（すなわち、細胞により媒介される抗腫瘍免疫を増大させる）ことができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５（６）：３６６３−３６７３を参照されたい。
【０２６０】
ＰＥＳＴ含有ペプチドは、ＰＥＳＴ配列またはＰＥＳＴ様配列を含むものである。真核生物タンパク質中のＰＥＳＴ配列は、かなり前に同定されている。例えば、いくつかの正荷電アミノ酸を含有するクラスターに常にではないが一般に隣接している、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）（ＰＥＳＴ）を多く含むアミノ酸配列を含有するタンパク質は、急速な細胞内半減期を有する（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：３６４−３６９）。さらに、これらの配列は、タンパク質を、分解のためにユビキチン−プロテアソーム経路の標的にすることが報告されている（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ  （１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｓｃｉ．  ２１：２６７−２７１）。この経路は、ＭＨＣクラスＩと結合する免疫原性ペプチドを生成するために真核細胞によっても使用され、ＰＥＳＴ配列が免疫原性ペプチドを生じさせる真核生物タンパク質において大量に存在するという仮説が立てられている（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４８：１０９−１１３）。原核生物タンパク質は、ＰＥＳＴ配列を通常は含有しない。なぜなら、これらのタンパク質は、この酵素経路を有さないからである。しかし、アミノ酸プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）を多く含むＰＥＳＴ様配列が、ＬＬＯのアミノ末端で報告されており、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ病原性に不可欠であると報告されている（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｅｃａｔｕｒ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｎｏｙ  （２０００）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：９９２−９９５）。ＬＬＯにおけるこのＰＥＳＴ様配列の存在によって、タンパク質は、宿主細胞のタンパク質分解機構による分解の標的にされ、その結果、ＬＬＯが、その機能を果たし、ファゴソームまたはファゴリソソームの空胞からのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの逃避を助長したら後、そのタンパク質は、細胞を損傷させ得る前に破壊される。
【０２６１】
ＰＥＳＴおよびＰＥＳＴ様配列の同定は周知であり、例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４（４７７４）：３６４−３７８に、およびＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ  （１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。ＰＥＳＴまたはＰＥＳＴ様配列は、ＰＥＳＴ発見プログラムを使用して同定することができる。例えば、ＰＥＳＴ様配列は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）残基を多く含む領域であり得る。必要に応じて、ＰＥＳＴ様配列に、いくつかの正荷電アミノ酸を含有する１つまたは複数のクラスターを隣接させることができる。例えば、ＰＥＳＴ様配列は、プロリン（Ｐ）、アスパルテート（Ｄ）、グルタメート（Ｅ）、セリン（Ｓ）および／またはトレオニン（Ｔ）残基の高い局所的濃度を有する長さ少なくとも１２アミノ酸の親水性ストレッチと定義され得る。一部の場合には、ＰＥＳＴ様配列は、正荷電アミノ酸、すなわち、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）およびリシン（Ｋ）を含有しない。一部のＰＥＳＴ様配列は、１つまたは複数の内部リン酸化部位を含有することがあり、これらの部位でのリン酸化がタンパク質分解に先行する。
【０２６２】
一例では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．において開示されているアルゴリズムに適合する。別の例では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓにおいて開示されているアルゴリズムに適合する。ＰＥＳＴ様配列を、指定タンパク質配列内の正荷電アミノ酸Ｒ、ＨおよびＫについて最初にスキャンすることにより同定することもできる。両脇が正電荷を有する全てのアミノ酸が計数され、ウインドウサイズパラメーターと等しいまたはそれより多い数のアミノ酸を含有するモチーフのみがさらに考慮される。必要に応じて、ＰＥＳＴ様配列は、少なくとも１つのＰ、少なくとも１つのＤまたはＥ、および少なくとも１つのＳまたはＴを含有しなければならない。
【０２６３】
ＰＥＳＴモチーフの質を、重要なアミノ酸の局所的濃縮とモチーフの疎水性とに基づくスコアリングパラメーターによって、改善することができる。Ｄ、Ｅ、Ｐ、ＳおよびＴの濃縮は、質量パーセント（ｗ／ｗ）で表され、１個相当のＤまたはＥ、１個相当のＰ、および１個相当のＳまたはＴについて補正される。疎水性の計算はまた、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  （１９８２）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  １５７：１０５の方法に、原則的に従うこともある。簡易計算のために、元々はアルギニンについての−４．５からイソロイシンについての＋４．５までの範囲であるＫｙｔｅ・Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数が、次の線形変換を使用して正の整数に変換され、この変換によってアルギニンについての０からイソロイシンについての９０までの値が得られた：ハイドロパシー指数＝１０×Ｋｙｔｅ・Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数＋４５。
【０２６４】
可能性のあるＰＥＳＴモチーフの疎水性を、各アミノ酸種についての（モルパーセントと疎水性指数の積の和として計算することもできる。所望のＰＥＳＴスコアは、次の方程式によって表されるような、局所的濃縮の項と疎水性の項の組合せとして得られる：ＰＥＳＴスコア＝０．５５×ＤＥＰＳＴ−０．５×疎水性指数。
【０２６５】
したがって、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、上記アルゴリズムを使用して少なくとも＋５のスコアを有するペプチドを指すことができる。あるいは、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３２、少なくとも３５、少なくとも３８、少なくとも４０、または少なくとも４５のスコアを有するペプチドを指すことができる。
【０２６６】
任意の他の公知の利用可能な方法またはアルゴリズムを使用してＰＥＳＴ様配列を同定することもできる。例えば、ＣａＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｇａｒａｙ−Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１  Ｓｕｐｐｌ  １：ｉ１６９−７６）を参照されたい。使用することができる別の方法は、次のものである：アミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、ＡｓｎまたはＧｌｎに１の値を割り当てることにより、適切な長さの各ストレッチ（例えば、３０〜３５アミノ酸ストレッチ）についてＰＥＳＴ指数が算出される。ＰＥＳＴ残基の各々についての係数値（ＣＶ）は１であり、他のＡＡ（非ＰＥＳＴ）の各々についてのＣＶはゼロである。
【０２６７】
ＰＥＳＴ様アミノ酸配列の例は、配列番号４３〜５１に記載される。ＰＥＳＴ様配列の一例は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号４３）である。ＰＥＳＴ様配列の別の例は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号４４）である。しかし、任意のＰＥＳＴまたはＰＥＳＴ様アミノ酸配列を使用することができる。ＰＥＳＴ配列ペプチドは公知であり、例えば、ＵＳ７，６３５，４７９、ＵＳ７，６６５，２３８、およびＵＳ２０１４／０１８６３８７に記載されており、これらの参考特許文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６８】
ＰＥＳＴ様配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ種から、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからであり得る。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＡｃｔＡタンパク質は、少なくとも４つのそのような配列（配列番号４５〜４８）を含有し、これらのいずれの配列も、本明細書で開示される組成物および方法での使用に好適である。他の類似のＰＥＳＴ様配列としては、配列番号５２〜５４が挙げられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．からのストレプトリジンＯタンパク質も、ＰＥＳＴ配列を含有する。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓストレプトリジンＯは、ＰＥＳＴ配列ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号４９）をアミノ酸３５〜５１に含み、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓストレプトリジンＯは、ＰＥＳＴ様配列ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号５０）をアミノ酸３８〜５４に含む。ＰＥＳＴ様配列の別の例は、ｌｓｏ遺伝子によってコードされる、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ細胞溶解素から：ＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（例えば、配列番号５１）である。
【０２６９】
あるいは、ＰＥＳＴ様配列は、他の原核生物に由来することもある。ＰＥＳＴ様アミノ酸配列が予想される他の原核生物は、例えば、他のＬｉｓｔｅｒｉａ種を含む。
（１）リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）
【０２７０】
本明細書で開示される組成物および方法において利用することができるＰＥＳＴ含有ペプチドの一例は、リステリオリジンＯ（ＬＬＯ）ペプチドである。ＬＬＯタンパク質の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ１３１２８（配列番号５５；核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｘ１５１２７に記載されている）で指定されるタンパク質である。配列番号５５は、シグナル配列を含むプロタンパク質である。このプロタンパク質の最初の２５アミノ酸は、シグナル配列であり、それが細菌により分泌されるときにＬＬＯから切断されることによって、シグナル配列のない５０４アミノ酸の完全長活性ＬＬＯタンパク質が生じる結果となる。本明細書で開示されるＬＬＯペプチドは、シグナル配列を含むこともあり、またはシグナル配列を含まないペプチドを含むこともある。使用することができる例示的なＬＬＯタンパク質は、配列番号５５に記載の配列、もしくは配列番号５５のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片およびアイソフォームの断片を含むか、そのようなものから本質的になるか、またはそのようなものからなる。ＬＬＯタンパク質の断片、またはＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、ホモログの断片、バリアントの断片もしくはアナログの断片をコードする、任意の配列を使用することができる。相同ＬＬＯタンパク質は、参照ＬＬＯタンパク質との配列同一性、例えば、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い配列同一性を有することができる。
【０２７１】
ＬＬＯタンパク質の別の例は、配列番号５６に記載される。使用することができるＬＬＯタンパク質は、配列番号５６に記載の配列、もしくは配列番号５６のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片およびアイソフォームの断片を含み得るか、そのようなものから本質的になり得るか、またはそのようなものからなり得る。
【０２７２】
ＬＬＯタンパク質の別の例は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＺＰ＿０１９４２３３０もしくはＥＢＡ２１８３３に記載されているような、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＲＺ０１００００１５またはＡＡＲＺ０１００００１５．１に記載の核酸配列によってコードされるような、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ株からのＬＬＯタンパク質である。ＬＬＯタンパク質の別の例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ４ｂ  Ｆ２３６５株からのＬＬＯタンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＹＰ＿０１２８２３を参照されたい）、ＥＧＤ−ｅ株からのＬＬＯタンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿４６３７３３を参照されたい）、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの任意の他の株からのＬＬＯタンパク質である。ＬＬＯタンパク質のさらに別の例は、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓ細菌ＨＴＣＣ２１７０からのＬＬＯタンパク質（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＺＰ＿０１１０６７４７もしくはＥＡＲ０１４３３を参照されたく、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＺ＿ＡＡＯＣ０１０００００３によってコードされる）である。使用することができるＬＬＯタンパク質は、上記ＬＬＯタンパク質、もしくは上記ＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片およびアイソフォームの断片のいずれかを含み得るか、そのようなものから本質的になり得るか、またはそのようなものからなり得る。
【０２７３】
ＬＬＯの相同なタンパク質、またはそれらのホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片およびアイソフォームの断片も、使用することができる。１つのそのような例は、例えばＰａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉにおいて見つけることができる、アルベオリジンである（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ２３５６４もしくはＡＡＡ２２２２４を参照されたく、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ６２７０９によりコードされる）。他のそのような相同タンパク質は公知である。
【０２７４】
ＬＬＯペプチドは、完全長ＬＬＯタンパク質、短縮型ＬＬＯタンパク質、またはＬＬＯ断片であり得る。同様に、ＬＬＯペプチドは、ネイティブＬＬＯタンパク質の１つもしくは複数の機能性を保持するものであることもあり、またはネイティブＬＬＯタンパク質の１つもしくは複数の機能性を欠いているものであることもある。例えば、保持されるＬＬＯ機能性は、細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）によるファゴソームもしくはファゴリソソームからの逃避を可能にすること、またはそれと融合されているペプチドの免疫原性を増強することであり得る。保持される機能性は、溶血機能または抗原機能でもあり得る。あるいは、ＬＬＯペプチドは、非溶血性ＬＬＯであり得る。ＬＬＯの他の機能は公知であり、ＬＬＯ機能性を評価するための方法およびアッセイも公知である。
【０２７５】
ＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴ様配列であることもあり、またはＰＥＳＴ様配列を含むこともある。ＬＬＯ断片は、内部欠失、Ｃ末端からの短縮化およびＮ末端からの短縮化の１つまたは複数を含み得る。一部の場合には、ＬＬＯ断片は、１つより多くの内部欠失を含み得る。他のＬＬＯペプチドは、１つまたは複数の突然変異を有する完全長ＬＬＯタンパク質であり得る。
【０２７６】
一部のＬＬＯタンパク質または断片は、野生型ＬＬＯと比較して低下した溶血活性を有するか、または非溶血性断片である。例えば、ＬＬＯタンパク質を、カルボキシ末端における活性化ドメインの欠失もしくは突然変異によって、システイン４８４の欠失もしくは突然変異によって、または別の位置における欠失もしくは突然変異によって非溶血性にすることができる。
【０２７７】
他のＬＬＯタンパク質は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，７７１，７０２において詳述されているようなコレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の欠失または突然変異によって非溶血性にされる。突然変異は、例えば、置換または欠失を含み得る。ＣＢＤ全体を突然変異させることができ、ＣＢＤの部分を突然変異させることができ、またはＣＢＤ内の特定の残基を突然変異させることができる。例えば、ＬＬＯタンパク質は、配列番号５５の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１およびＷ４９２の１つもしくは複数（例えば、Ｃ４８４、Ｗ４９１、Ｗ４９２、Ｃ４８４およびＷ４９１、Ｃ４８４およびＷ４９２、Ｗ４９１およびＷ４９２、もしくは３つの残基全て）の突然変異、または配列番号５５と最適にアラインメントされたときに一致する残基（例えば、一致するシステインもしくはトリプトファン残基）の突然変異を含み得る。例として、ＬＬＯの残基Ｃ４８４、Ｗ４９１およびＷ４９２がアラニン残基で置換されている突然変異ＬＬＯタンパク質を作出することができ、この置換によって、溶血活性が野生型ＬＬＯと比較して実質的に低下されることになる。Ｃ４８４Ａ、Ｗ４９１ＡおよびＷ４９２Ａ突然変異を有する突然変異ＬＬＯタンパク質は、「ｍｕｔＬＬＯ」と称される。
【０２７８】
別の例として、コレステロール結合ドメインを含む内部欠失を有する突然変異ＬＬＯタンパク質を作出することができる。配列番号７４に記載される、配列番号５５のコレステロール結合ドメインの配列。例えば、内部欠失は、１〜１１アミノ酸欠失であることもあり、１１〜５０アミノ酸欠失であることもあり、またはそれより長いこともある。同様に、突然変異した領域は、１〜１１アミノ酸であることもあり、１１〜５０アミノ酸であることもあり、またはそれより長いこともある（例えば、１〜５０、１〜１１、２〜１１、３〜１１、４〜１１、５〜１１、６〜１１、７〜１１、８〜１１、９〜１１、１０〜１１、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、１２〜５０、１１〜１５、１１〜２０、１１〜２５、１１〜３０、１１〜３５、１１〜４０、１１〜５０、１１〜６０、１１〜７０、１１〜８０、１１〜９０、１１〜１００、１１〜１５０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜５０、１５〜６０、１５〜７０、１５〜８０、１５〜９０、１５〜１００、１５〜１５０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜１００、２０〜１５０、３０〜３５、３０〜４０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、３０〜１００、もしくは３０〜１５０アミノ酸）。例えば、配列番号５５の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０〜５００からなる突然変異した領域は、ＣＢＤを含む欠失した配列（配列番号５５の残基４８３〜４９３）をもたらすことになる。しかし、突然変異した領域は、ＣＢＤの断片であることもあり、またはＣＢＤの一部分と重複することもある。例えば、突然変異した領域は、配列番号５５の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４８５〜４９０、４８６〜４８８、４９０〜５００、または４８６〜５１０からなり得る。例えば、ＣＢＤの断片（残基４８４〜４９２）を異種配列で置き換えることができ、これによって溶血活性が野生型ＬＬＯと比較して実質的に低下されることになる。例えば、ＣＢＤ（ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ；配列番号７４）を、ＮＹ−ＥＯＳ−１からのＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ１５７〜１６５を含有する、抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１からのＣＴＬエピトープ（ＥＳＬＬＭＷＩＴＱＣＲ；配列番号７５）で、置き換えることができる。結果として生じるＬＬＯは、「ｃｔＬＬＯ」と称される。
【０２７９】
一部の突然変異したＬＬＯタンパク質では、突然変異した領域は、異種配列によって置き換えられていることがある。例えば、突然変異した領域は、等数の異種アミノ酸、より少数の異種アミノ酸、またはより多数のアミノ酸（例えば、１〜５０、１〜１１、２〜１１、３〜１１、４〜１１、５〜１１、６〜１１、７〜１１、８〜１１、９〜１１、１０〜１１、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、１２〜５０、１１〜１５、１１〜２０、１１〜２５、１１〜３０、１１〜３５、１１〜４０、１１〜５０、１１〜６０、１１〜７０、１１〜８０、１１〜９０、１１〜１００、１１〜１５０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜５０、１５〜６０、１５〜７０、１５〜８０、１５〜９０、１５〜１００、１５〜１５０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜１００、２０〜１５０、３０〜３５、３０〜４０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、３０〜１００、もしくは３０〜１５０アミノ酸）によって置き換えられていることがある。他の突然変異したＬＬＯタンパク質は、１つまたは複数の点突然変異（例えば、１残基、２残基、３残基、またはそれより多くの残基の点突然変異）を有する。突然変異した残基は、連続していることもあり、または連続していないこともある。
【０２８０】
１つの例の実施形態では、ＬＬＯペプチドは、シグナル配列に欠失を、およびＣＢＤに突然変異または置換を有し得る。
【０２８１】
一部のＬＬＯペプチドは、Ｎ末端ＬＬＯ断片（すなわち、Ｃ末端欠失を有するＬＬＯタンパク質）である。一部のＬＬＯペプチドは、長さ少なくとも４９４、４８９、４９２、４９３、５００、５０５、５１０、５１５、５２０もしくは５２５アミノ酸であるか、または長さ４９２〜５２８アミノ酸である。例えば、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の約４４０または４４１アミノ酸（例えば、配列番号５５もしくは５６の最初の４４１アミノ酸、または別のＬＬＯタンパク質の配列番号５５もしくは５６と最適にアラインメントされたときに一致する断片）からなり得る。他のＮ末端ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の４２０アミノ酸（例えば、配列番号５５もしくは５６の最初の４２０アミノ酸、または別のＬＬＯタンパク質の配列番号５５もしくは５６と最適にアラインメントされたときに一致する断片）からなり得る。他のＮ末端断片は、ＬＬＯタンパク質の約アミノ酸２０〜４４２（例えば、配列番号５５もしくは５６のアミノ酸２０〜４４２、または別のＬＬＯタンパク質の配列番号５５もしくは５６と最適にアラインメントされたときに一致する断片）からなり得る。他のＮ末端ＬＬＯ断片は、システイン４８４を含む活性化ドメインのない、特に、システイン４８４のない、任意のΔＬＬＯを含む。例えば、Ｎ末端ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０または２５アミノ酸（例えば、配列番号５５もしくは５６の最初の４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０もしくは２５アミノ酸、または別のＬＬＯタンパク質の配列番号５５もしくは５６と最適にアラインメントされたときに一致する断片）に相当し得る。一部の実施形態では、断片は、１つまたは複数のＰＥＳＴ様配列を含む。ＬＬＯ断片および短縮型ＬＬＯタンパク質は、上記の特定のアミノ酸範囲のいずれか１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有し得る。残基数は、上に列挙した残基数と正確に一致する必要はない（例えば、相同ＬＬＯタンパク質が、本明細書で開示される特定のＬＬＯタンパク質と比較して挿入または欠失を有する場合）。Ｎ末端ＬＬＯ断片の例としては、配列番号５７、５８および５９が挙げられる。使用することができるＬＬＯタンパク質は、配列番号５７、５８もしくは５９に記載の配列、または配列番号５７、５８もしくは５９のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片およびアイソフォームの断片を含むか、そのようなものから本質的になるか、あるいはそのようなものからなる。一部の組成物および方法では、配列番号５９に記載のＮ末端ＬＬＯ断片が使用される。配列番号５９に記載のＮ末端ＬＬＯ断片をコードする核酸配列の例は、配列番号６０である。
（２）ＡｃｔＡ
【０２８２】
本明細書で開示される組成物および方法に利用することができるＰＥＳＴ含有ペプチドの別の例は、ＡｃｔＡペプチドである。ＡｃｔＡは、表面結合タンパク質であり、感染した宿主細胞において細胞質を通ってＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを前進させるための宿主アクチンポリマーの重合、集合および活性化を助長するために足場として作用する。哺乳動物細胞サイトゾルへの侵入の直後に、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、宿主アクチンフィラメントの重合を誘導し、アクチン重合によって生じた力を使用して先ずは細胞内に移動し、次いで細胞から細胞へと移動する。ＡｃｔＡは、アクチン核形成およびアクチンに基づく運動性の媒介に関与している。ＡｃｔＡタンパク質は、宿主細胞骨格成分のための複数の結合部位を提供することによって、細胞のアクチン重合機構を集合させるための足場として作用する。ＡｃｔＡのＮ末端は、モノマーアクチンと結合し、内因性アクチン核形成活性を刺激することにより構成的に活性な核形成促進因子として作用する。ａｃｔＡおよびｈｌｙ遺伝子は両方とも、転写活性化因子ＰｒｆＡにより調節される１０ｋｂ遺伝子クラスターのメンバーであり、ａｃｔＡは、哺乳動物サイトゾルにおいておおよそ２２６倍上方調節される。ＡｃｔＡタンパク質、またはＡｃｔＡタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、ホモログの断片、バリアントの断片もしくはアナログの断片をコードする、任意の配列を、使用することができる。相同ＡｃｔＡタンパク質は、参照ＡｃｔＡタンパク質との配列同一性、例えば、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％より高い配列同一性を有することができる。
【０２８３】
ＡｃｔＡタンパク質の一例は、配列番号６１に記載の配列を含むか、この配列から本質的になるか、この配列からなる。ＡｃｔＡタンパク質の別の例は、配列番号６２に記載の配列を含むか、この配列から本質的になるか、またはこの配列からなる。これらの配列のどちらかに対応するプロタンパク質の最初の２９アミノ酸は、シグナル配列であり、そのプロタンパク質が細菌により分泌されるときにＡｃｔＡタンパク質から切断される。ＡｃｔＡペプチドは、シグナル配列（例えば、配列番号６１もしくは６２のアミノ酸１〜２９）を含むこともあり、またはシグナル配列を含まないペプチドを含むこともある。ＡｃｔＡタンパク質の他の例は、配列番号６１または６２のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、アイソフォームの断片またはアナログの断片を含むか、そのようなものから本質的になるか、またはそのようなものからなる。
【０２８４】
ＡｃｔＡタンパク質の別の例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ０５４５８５）、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００２株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３９４９５９）、Ｓ３株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３９４９６０）、ＮＣＴＣ  ５３４８株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３９４９６１）、ＮＩＣＰＢＰ  ５４００６株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３９４９６２）、Ｍ７株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３９４９６３）、Ｓ１９株からのＡｃｔＡタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＵ３９４９６４）、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの任意の他の株からのＡｃｔＡタンパク質である。使用することができるＬＬＯタンパク質は、上記ＬＬＯタンパク質、または上記ＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、アナログの断片およびアイソフォームの断片のいずれかを含み得るか、そのようなものから本質的になり得るか、またはそのようなものからなり得る。
【０２８５】
ＡｃｔＡペプチドは、完全長ＡｃｔＡタンパク質、または短縮型ＡｃｔＡタンパク質、またはＡｃｔＡ断片（例えば、Ｃ末端部分が除去されたＮ末端ＡｃｔＡ断片）であり得る。一部の実施形態では、短縮型ＡｃｔＡタンパク質は、少なくとも１つのＰＥＳＴ配列（例えば、１つより多くのＰＥＳＴ配列）を含む。加えて、短縮型ＡｃｔＡタンパク質は、必要に応じて、ＡｃｔＡシグナルペプチドを含み得る。短縮型ＡｃｔＡタンパク質に含有されるＰＥＳＴ様配列の例としては、配列番号４５〜４８が挙げられる。一部のそのような短縮型ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号４５〜４８に記載のＰＥＳＴ様配列のうちの少なくとも２つもしくはそれらのホモログ、配列番号４５〜４８に記載のＰＥＳＴ様配列のうちの少なくとも３つもしくはそれらのホモログ、または配列番号４５〜４８に記載のＰＥＳＴ様配列の４つ全てもしくはそれらのホモログを含む。短縮型ＡｃｔＡタンパク質の例としては、完全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば、配列番号６２）の約残基３０〜１２２、約残基３０〜２２９、約残基３０〜３３２、約残基３０〜２００、もしくは約残基３０〜３９９を含むもの、そのような残基から本質的になるもの、またはそのような残基からなるものが挙げられる。短縮型ＡｃｔＡタンパク質の他の例としては、完全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば、配列番号６２）の最初の約５０、１００、１５０、２００、２３３、２５０、３００、３９０、４００もしくは４１８残基を含むもの、そのような残基から本質的になるもの、またはそのような残基からなるものが挙げられる。短縮型ＡｃｔＡタンパク質の他の例としては、完全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば、配列番号６２）の約残基２００〜３００もしくは残基３００〜４００を含むもの、そのような残基から本質的になるもの、またはそのような残基からなるものが挙げられる。例えば、短縮型ＡｃｔＡは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ７，６５５，２３８に記載されているような野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０アミノ酸からなる。別の例として、短縮型ＡｃｔＡは、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０１８６３８７に記載されているような、ＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修飾バージョン（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と呼ばれる）であり得、前記修飾バージョンは、ＰＥＳＴモチーフが欠失されており、非保存的ＱＤＮＫＲ（配列番号７３）置換を含有する。あるいは、短縮型ＡｃｔＡタンパク質は、上記アミノ酸範囲または本明細書で開示されるＡｃｔＡペプチドのいずれかについてのアミノ酸範囲のうちの１つに対応する、相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含有し得る。残基数は、本明細書に列挙される残基数と正確に一致する必要はない（例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が、本明細書で用いられるＡｃｔＡタンパク質と比較して挿入または欠失を有する場合には、それに応じて残基数を調整することができる）。
【０２８６】
短縮型ＡｃｔＡタンパク質の例としては、例えば、配列番号６３、６４、６５もしくは６６に記載の配列、または配列番号６３、６４、６５もしくは６６のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、バリアントの断片、アイソフォームの断片もしくはアナログの断片を含むタンパク質、そのようなものから本質的になるタンパク質、あるいはそのようなものからなるタンパク質が挙げられる。配列番号６３は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ１と呼ばれ、配列番号６２に記載の完全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜１２２からなる。配列番号６４は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２またはＬＡ２２９と呼ばれ、配列番号６２に記載の完全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜２２９からなる。配列番号６５は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３と呼ばれ、配列番号６２に記載の完全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜３３２からなる。配列番号６６は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ４と呼ばれ、配列番号６２に記載の完全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜３９９からなる。特定の例として、配列番号６４に記載の配列からなる短縮型ＡｃｔＡタンパク質を使用することができる。
【０２８７】
短縮型ＡｃｔＡタンパク質の例としては、例えば、配列番号６７、６９、７０もしくは７２に記載の配列、または配列番号６７、６９、７０もしくは７２のホモログ、バリアント、アイソフォーム、アナログ、バリアントの断片、アイソフォームの断片もしくはアナログの断片を含むタンパク質、そのようなものから本質的になるタンパク質、あるいはそのようなものからなるタンパク質が挙げられる。特定の例として、配列番号６７に記載の配列（配列番号６８に記載の核酸によってコードされる）からなる短縮型ＡｃｔＡタンパク質を使用することができる。別の特定の例として、配列番号７０に記載の配列（配列番号７１に記載の核酸によってコードされる）からなる短縮型ＡｃｔＡタンパク質を使用することができる。配列番号７１は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ株におけるＡｃｔＡをコードする最初の１１７０ヌクレオチドである。一部の場合には、ＡｃｔＡ断片を異種シグナルペプチドに融合させることができる。例えば、配列番号７２は、Ｈｌｙシグナルペプチドに融合されているＡｃｔＡ断片を示す。
Ｃ．組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物の生成
【０２８８】
本明細書で開示される組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物または前記組換え融合ポリペプチドを含む組成物を生成する方法も、本明細書で提供される。例えば、そのような方法は、免疫療法構築物に含めるための抗原ペプチドを選択するおよび設計する（および、例えば、各抗原ペプチドのハイドロパシーを試験し、抗原ペプチドを、それが選択されたハイドロパシー指数閾値より上のスコアを有する場合、修飾するまたは選択から外す）ステップと、選択された抗原ペプチドの各々を含む１つまたは複数の融合ポリペプチドを設計するステップと、融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成するステップとを含むことができる。
【０２８９】
抗原ペプチドを疎水性または親水性についてスクリーニングすることができる。抗原ペプチドを、例えば、それらが親水性である場合、またはそれらが、目的の特定の細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）における分泌可能性を予示し得る、最大で、ある特定のハイドロパシー閾値もしくはそれ未満のスコアを有する場合、選択することができる。例えば、抗原ペプチドをＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数によって２１アミノ酸ウインドウでスコア化することができ、カットオフ（およそ１．６）より上のスコアを有する全てが除外される。それらは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓにより分泌される可能性が低いからである。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  （１９８２）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５７（１）：１０５−１３２を参照されたい。あるいは、約選択カットオフのスコアを有する抗原ペプチドを変更することができる（例えば、抗原ペプチドの長さを変えること）。使用することができる他のスライディングウインドウサイズとしては、例えば、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７アミノ酸またはそれより多いアミノ酸数が挙げられる。例えば、スライディングウインドウサイズは、９〜１１アミノ酸、１１〜１３アミノ酸、１３〜１５アミノ酸、１５〜１７アミノ酸、１７〜１９アミノ酸、１９〜２１アミノ酸、２１〜２３アミノ酸、２３〜２５アミノ酸、または２５〜２７アミノ酸であり得る。使用することができる他のカットオフとしては、例えば、次の範囲１．２〜１．４、１．４〜１．６、１．６〜１．８、１．８〜２．０、２．０〜２．２、２．２〜２．５、２．５〜３．０、３．０〜３．５、３．５〜４．０、もしくは４．０〜４．５が挙げられ、またはカットオフは、１．４、１．５、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．３、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、もしくは４．５であり得る。カットオフは、例えば、融合ポリペプチドを送達するために使用される細菌の属または種によって変わり得る。
【０２９０】
他の好適なハイドロパシープロットまたは他の適切な尺度は、例えば、Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  ２２：３８１−４１５；Ｂｉｓｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  １０００：６３７−６５５；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  （１９８４）  Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５３：５９５−６２３；Ａｂｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｌｅｏ  （１９８７）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１３０−１５２；Ｓｗｅｅｔ  ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  （１９８３）  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７１：４７９−４８８；Ｂｕｌｌ  ａｎｄ  Ｂｒｅｅｓｅ  （１９７４）  Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  １６１：６６５−６７０；Ｇｕｙ  （１９８５）  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ４７：６１−７０；Ｍｉｙａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １８：５３４−５５２；Ｒｏｓｅｍａｎ  （１９８８）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００：５１３−５２２；Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８１）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：８４９−８５５；Ｗｉｌｓｏｎ  （１９８１）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９：３１−４１；Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  （１９９０）  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：７５−８０；Ａｂｏｄｅｒｉｎ  （１９７１）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２：５３７−５４４；Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７９：１２５−１４２；Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ  （１９８１）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８；Ｍａｎａｖａｌａｎ  ａｎｄ  Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ  （１９７８）  Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６７３−６７４；Ｂｌａｃｋ  ａｎｄ  Ｍｏｕｌｄ  （１９９１）  Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９３：７２−８２；Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ａｎｄ  Ｐｌｉｓｋａ  （１９８３）  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １８：３６９−３７５；Ｊａｎｉｎ  （１９７９）  Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：４９１−４９２；Ｒａｏ  ａｎｄ  Ａｒｇｏｓ  （１９８６）  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ８６９：１９７−２１４；Ｔａｎｆｏｒｄ  （１９６２）  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８４：４２４０−４２７４；Ｗｅｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １８８：２１５−２１８；Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５４２５−５４３１；およびＣｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  （１９９０）  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：７５−８０において報告されているものを含み、前記参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９１】
必要に応じて、抗原ペプチドを、対象ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型と結合するそれらの能力について（例えば、ｎｅｔＭＨＣｐａｎ、ＡＮＮ、ＳＭＭＰＭＢＥＣ．ＳＭＭ、ＣｏｍｂＬｉｂ＿Ｓｉｄｎｅｙ２００８、ＰｉｃｋＰｏｃｋｅｔ、およびｎｅｔＭＨＣｃｏｎｓを含む、ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇで入手可能なＩｍｍｕｎｅ  Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＥＤ）を使用することによって）スコア化し、各抗原ペプチドからの最高ＭＨＣ結合スコアによって順位付けすることができる。他の情報源は、ＴＥｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｐｒｅｄｉｃｔ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）または他の入手可能なＭＨＣ結合測定尺度を含む。異なる発現ベクター、例えばＳａｌｍｏｎｅｌｌａについては、カットオフが異なり得る。
【０２９２】
必要に応じて、抗原ペプチドを免疫抑制性エピトープ（例えば、Ｔ−ｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導ヘルパーＴエピトープなど）についてスクリーニングして、抗原ペプチドを選択から外すこと、または免疫抑制の影響を回避することができる。
【０２９３】
必要に応じて、エピトープの免疫原性についての予測アルゴリズム使用して抗原ペプチドをスクリーニングすることができる。しかし、これらのアルゴリズムは、どのペプチドがＴ細胞応答を生じさせるかを予測する点での正確度が最高２０％である。あるいは、いかなるスクリーニング／予測アルゴリズムも使用されない。あるいは、抗原ペプチドを免疫原性についてスクリーニングすることができる。例えば、このスクリーニングは、１つまたは複数のＴ細胞を抗原ペプチドと接触させるステップと、免疫原性Ｔ細胞応答について分析するステップとを含むことができ、前記分析において免疫原性Ｔ細胞応答によりペプチドは免疫原性ペプチドとして同定される。このスクリーニングは、免疫原性アッセイを使用して、１つもしくは複数のＴ細胞をペプチドと接触させることによって、ＣＤ２５、ＣＤ４４もしくはＣＤ６９のうちの少なくとも１つの分泌を測定する、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１およびＩＬ−２を含む群から選択されるサイトカインの分泌を測定するステップも含むことができ、前記測定において分泌の増加により前記ペプチドは１つまたは複数のＴ細胞エピトープを含むと同定される。
【０２９４】
選択された抗原ペプチドを、可能性のある融合ポリペプチドの１つまたは複数の候補順序に配列することができる。抗原ペプチドが、単一のプラスミドに適合し得るばかりでなくそれ以外に使用可能である場合、異なる抗原ペプチドに必要／所望に応じて優先順位を指定することができ、および／または異なる抗原ペプチドを異なる融合ポリペプチドに（例えば、異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株への組み入れのために）分配することができる。優先順位は、翻訳されたポリペプチドの相対サイズ、転写の優先度、および／または全体の疎水性などの要因によって決定することができる。抗原ペプチドを、本明細書中の他の箇所でより詳細に開示されるように、それらが、リンカーもリンカーのいずれの組合せも伴わずに任意の数の抗原ペプチドペア間で直接連結されるように配列することができる。含めることになる直鎖状抗原ペプチドの数は、突然変異量に対する必要とされる構築物の数、単一のプラスミドからの複数のエピトープの翻訳および分泌効率、ならびにプラスミドを含む各細菌またはＬｍに必要とされるＭＯＩについての考慮に基づいて、決定することができる。
【０２９５】
疎水性について同じくスコア化される、抗原ペプチドの組合せ、または全融合ポリペプチド（すなわち、抗原ペプチドとＰＥＳＴ含有ペプチドと任意のタグとを含む）。例えば、融合した抗原ペプチドの全体、または全融合ポリペプチドを、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数によりスライディング２１アミノ酸ウインドウでハイドロパシーについてスコア化することができる。いずれかの領域が、カットオフ（例えば、およそ１．６）より上のスコアを有する場合、抗原ペプチドを、融合ポリペプチド内で、抗原ペプチドの許容される順序（すなわち、いずれの領域もカットオフより上のスコアを有さないもの）が見出されるまで、並べ替えるまたはシャッフルすることができる。あるいは、任意の問題のある抗原ペプチドを除去することができ、または異なるサイズのものになるように再設計することができる。あるいはまたは加えて、本明細書中の他の箇所で開示されるような抗原ペプチド間の１つまたは複数のリンカーを付加または修飾して疎水性を変化させることができる。個々の抗原ペプチドについてのハイドロパシー試験と同様に、他のウインドウサイズを使用することができ、または他のカットオフを使用することができる（例えば、融合ポリペプチドを送達するために使用される細菌の属または種に依存して）。加えて、他の好適なハイドロパシープロットまたは他の適切な尺度を使用することができよう。
【０２９６】
必要に応じて、抗原ペプチドの組合せまたは全融合ポリペプチドを、免疫抑制性エピトープ（例えば、Ｔ−ｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導ヘルパーＴエピトープなど）についてさらにスクリーニングして、抗原ペプチドを選択から外すこと、または免疫抑制の影響を回避することができる。
【０２９７】
次いで、抗原ペプチドの組合せ候補または融合ポリペプチドをコードする核酸を設計および最適化することができる。例えば、配列を、翻訳レベル、発現期間、分泌レベル、転写レベルおよびこれらの任意の組合せの増加のために、最適化することができる。例えば、増加は、対照、非最適化配列と比較して、２倍〜１０００倍、２倍〜５００倍、２倍〜１００倍、２倍〜５０倍、２倍〜２０倍、２倍〜１０倍、または３倍〜５倍であり得る。
【０２９８】
例えば、融合ポリペプチド、または融合ポリペプチドをコードする核酸を、オリゴヌクレオチド配列において形成される可能性のある二次構造のレベルの低下のために最適化することができ、または代替的に、配列を修飾し得る任意の酵素の結合を防止するために最適化することができる。細菌細胞における発現は、例えば、転写サイレンシング、短いｍＲＮＡ半減期、二次構造形成、リプレッサーおよび阻害剤などのオリゴヌクレオチド結合分子の結合部位、ならびに希少ｔＲＮＡプールの利用可能性によって妨げられることがある。細菌発現に関する多くの問題の原因は、元の配列内に見られる。ＲＮＡの最適化は、シス作用性エレメントの修飾、そのＧＣ含量の適応、細菌細胞の非限定的ｔＲＮＡプールに対するコドンバイアスの修正、および内部相同領域の回避を含み得る。したがって、配列を最適化することは、例えば、非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域を調整することを、必然的に伴い得る。配列を最適化することは、例えば、次のシス作用性モチーフのうちの１つまたは複数を回避することも、必然的に伴い得る：内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位およびリボソーム侵入部位；ＡＴリッチもしくはＧＣリッチ配列ストレッチ；反復配列およびＲＮＡ二次構造；（隠れた）スプライスドナーおよびアクセプター部位；分岐点；またはこれらの組合せ。発現を最適化することは、プラスミド内の遺伝子の隣接領域および／または他の場所に配列エレメントを付加させることも、必然的に伴う。
【０２９９】
配列を最適化することは、例えば、宿主遺伝子（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ遺伝子）のコドンバイアスにコドン使用頻度を適応させることも、必然的に伴い得る。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに使用され得るコドンとしては、Ａ＝ＧＣＡ、Ｇ＝ＧＧＴ、Ｌ＝ＴＴＡ、Ｑ＝ＣＡＡ、Ｖ＝ＧＴＴ、Ｃ＝ＴＧＴ、Ｈ＝ＣＡＴ、Ｍ＝ＡＴＧ、Ｒ＝ＣＧＴ、Ｗ＝ＴＧＧ、Ｄ＝ＧＡＴ、Ｉ＝ＡＴＴ、Ｎ＝ＡＡＣ、Ｓ＝ＴＣＴ、Ｙ＝ＴＡＴ、Ｅ＝ＧＡＡ、Ｋ＝ＡＡＡ、Ｐ＝ＣＣＡ、Ｔ＝ＡＣＡ、Ｆ＝ＴＴＣ、およびＳＴＯＰ＝ＴＡＡが挙げられる。
【０３００】
融合ポリペプチドをコードする核酸を生成し、送達ビヒクル、例えば、細菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株に導入することができる。ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子などの、他の送達ビヒクルは、ＤＮＡ免疫療法またはペプチド免疫療法に好適であり得る。融合ポリペプチドをコードするプラスミドを生成し、細菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株に導入すると、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を培養し、特徴付けて、抗原ペプチドを含む融合ポリペプチドの発現および分泌を確認することができる。
Ｖ．免疫原性組成物、医薬組成物およびワクチン
【０３０１】
本明細書で開示されるような凍結乾燥された組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンであって、必要に応じて、前記凍結乾燥された組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ある量の溶媒に溶解することにより復元される、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンも、提供される。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物は、それがＬｉｓｔｅｒｉａ株を含むという理由で本質的に免疫原性であり得、および／または前記組成物は、アジュバントもさらに含み得る。他の免疫原性組成物は、ＤＮＡ免疫療法またはペプチド免疫療法組成物を含む。
【０３０２】
用語「免疫原性組成物」は、抗原を含有する組成物であって、前記抗原が、その組成物への曝露時に対象における前記抗原に対する免疫応答を惹起する、任意の組成物を指す。免疫原性組成物により惹起される免疫応答は、特定の抗原に対するものであることもあり、または抗原上の特定のエピトープに対するものであることもある。
【０３０３】
免疫原性組成物は、本明細書で開示されるような、単一の凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含むこともあり、または本明細書で開示されるような複数の異なる凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含むこともある。第１の組換え融合ポリペプチドを含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、第１の組換え融合ポリペプチドが、第２の組換え融合ポリペプチドが含まない１つの抗原ペプチドを含む場合、第２の組換え融合ポリペプチドを含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株と異なる。２つの組換え融合ポリペプチドが、同じ抗原ペプチドのいくつかを含み、それにもかかわらず異なると見なされることもある。そのような異なる凍結乾燥または復元された組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、同時に対象に投与することができ、または逐次的に対象に投与することができる。逐次投与は、本明細書で開示される凍結乾燥または復元された組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株（または組換え融合ポリペプチドまたは核酸）を含む原薬が、異なる剤形である、および／または異なる投薬スケジュールで投与される（例えば、混合物からの１つの組成物が少なくとも１日１回投与され、別のものが、より低い頻度で、例えば、週１回、２週間に１回、もしくは３週間に１回投与される）場合、特に有用である。複数の凍結乾燥または復元された組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が、各々、抗原ペプチドの異なるセットを含むこともある。あるいは、２つまたはそれより多くの凍結乾燥または復元された組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が、抗原ペプチドの同じセット（例えば、異なる順序で抗原ペプチドの同じセット）を含むこともある。
【０３０４】
免疫原性組成物は、アジュバント（例えば、２つもしくはそれより多くのアジュバント）、サイトカイン、ケモカイン、またはそれらの組合せをさらに含み得る。必要に応じて、免疫原性組成物は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）をさらに含むこともあり、前記ＡＰＣは、対象にとって自己のものであってもよく、または同種異系のものであってもよい。
【０３０５】
用語アジュバントは、抗原に対する免疫応答を増強する化合物または混合物を含む。例えば、アジュバントは、本明細書で開示される免疫原性組成物と組み合わせられたとき、よりいっそう増強されたおよび／または長期の免疫応答をもたらす、免疫応答の非特異的刺激物質、または対象においてデポーの生成を可能にする物質であり得る。アジュバントは、例えば、Ｔｈ１により主として媒介される免疫応答、Ｔｈ１型免疫応答、またはＴｈ１媒介免疫応答に有利に働くことができる。同様に、アジュバントは、抗体媒介応答より細胞媒介免疫応答に有利に働くことができる。あるいは、アジュバントは、抗体媒介応答に有利に働くことができる。一部のアジュバントは、抗原を緩徐に放出することにより免疫応答を増強することができ、その一方で他のアジュバントは、それらの効果を次の機序のいずれかにより媒介することができる：細胞の浸潤、炎症および注射部位への輸送を、特に抗原提示細胞（ＡＰＣ）について、増加させる機序、共刺激性シグナルもしくは主要組織適合複合体（ＭＨＣ）発現を上方調節することによりＡＰＣの活性状態を促進する機序、抗原提示を増強させる機序、または間接的効果のためにサイトカイン放出を誘導する機序。
【０３０６】
アジュバントの例としては、サポニンＱＳ２１、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、非メチル化ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、ＭＰＬ、ＴＬＲアゴニスト、ＴＬＲ４アゴニスト、ＴＬＲ９アゴニスト、Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ（登録商標）、イミキモド、サイトカインまたはそれをコードする核酸、ケモカインまたはそれをコードする核酸、ＩＬ−１２またはそれをコードする核酸、ＩＬ−６またはそれをコードする核酸、およびリポ多糖が挙げられる。好適なアジュバントの別の例は、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１である。Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ５１は、天然の代謝可能な油、または精製された乳化剤を含有する。好適なアジュバントの他の例としては、顆粒細胞／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）またはそれをコードする核酸、およびキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）タンパク質またはそれをコードする核酸が挙げられる。ＧＭ−ＣＳＦは、例えば、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ベクター内で成長したヒトタンパク質であることもある。ＧＭ−ＣＳＦは、造血前駆細胞、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、樹状細胞およびＴ細胞のクローン拡大および分化を促進する。
【０３０７】
好適なアジュバントのさらに別の例は、無毒化リステリオリジンＯ（ｄｔＬＬＯ）タンパク質である。無毒化は、コレステロールへのＬＬＯの結合におよび最終的な膜細孔形成に重要な３つの選択されたアミノ酸に点突然変異を導入することによって達成することができる。標的となる３つのアミノ酸は、ＬＬＯのコレステロール結合ドメイン（ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ；配列番号７４）に存在し、ＰＣＲによりＤＮＡ配列に導入された点突然変異によって配列内で修飾され得る（ＥＡＴＧＬＡＷＥＡＡＲ；配列番号９６）。アジュバントとしての使用に好適なｄｔＬＬＯの一例は、配列番号９５によってコードされる。ＬＬＯの無毒化された非溶血性形態（ｄｔＬＬＯ）は、腫瘍免疫療法における有効なアジュバントであり、ＰＡＭＰとして作用することにより自然免疫応答および細胞免疫応答を活性化することができる。配列番号９５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一の配列によってコードされるｄｔＬＬＯも、アジュバントとしての使用に好適である。
【０３０８】
アジュバントのさらに他の例としては、増殖因子もしくはそれをコードする核酸、細胞集団、フロント不完全アジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）、ミョウバン、インターロイキンもしくはそれをコードする核酸、クイルグリコシド、モノホスホリルリピドＡ、リポソーム、細菌マイトジェン、細菌毒素、または任意の他のタイプの公知アジュバント（例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ５ｔｈ  ｅｄ．  （Ａｕｇｕｓｔ  ２００３）：  Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｅ．  Ｐａｕｌ  （Ｅｄｉｔｏｒ）；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ；Ｃｈａｐｔｅｒ  ４３：  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，  ＧＪＶ  Ｎｏｓｓａｌを参照されたい）が挙げられる。
【０３０９】
免疫原性組成物は、１つまたは複数の免疫調節分子をさらに含み得る。例としては、インターフェロンガンマ、サイトカイン、ケモカイン、およびＴ細胞刺激物質が挙げられる。
【０３１０】
免疫原性組成物は、ワクチンまたは医薬組成物の形態であることもある。用語「ワクチン」および「医薬組成物」は、同じ意味であり、これらの用語は、対象へのｉｎ  ｖｉｖｏ投与のための薬学的に許容される担体中の免疫原性組成物を指す。ワクチンは、例えば、細胞（例えば、本明細書で開示されるような組換えＬｉｓｔｅｒｉａ）内に含有され、前記細胞により送達されるワクチンであることがある。ワクチンは、対象が疾患に罹患しないように、もしくは疾患を発症しないように予防することもあり、および／またはワクチンは、疾患を有する対象に対して治療的であることもある。
【０３１１】
「薬学的に許容される担体」は、有意な有害効果なく対象に導入することができる免疫原性組成物を収容するビヒクルであって、免疫原性組成物に対して有害な効果をもたらさないビヒクルを指す。すなわち、「薬学的に許容される」は、安全であり、かつ本明細書で開示される方法における使用のための少なくとも１つの免疫原性組成物の有効量の所望の投与経路に適した送達をもたらす、任意の製剤を指す。薬学的に許容される担体またはビヒクルまたは賦形剤は、周知である。好適な薬学的に許容される担体、およびそれらの選択に関与する要因についての記載は、例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  ｅｄ．，  １９９０などの、様々な容易に入手できる情報源で見つけられる。そのような担体は、任意の投与経路（例えば、非経口、経腸（例えば、経口）または局所的適用）に好適であり得る。そのような医薬組成物を緩衝することができ、例えば、その場合、ｐＨは、免疫原性組成物の安定性および投与経路に従ってｐＨ４．０〜ｐＨ９．０の範囲の特定の所望の値で維持される。
【０３１２】
好適な薬学的に許容される担体としては、例えば、滅菌水、塩類溶液、例えば食塩水、グルコース、緩衝溶液、例えばリン酸緩衝溶液または重炭酸緩衝溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（例えば、ラクトース、アミロースまたはデンプン）、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、白色パラフィン、グリセロール、アルギン酸塩、ヒアルロン酸、コラーゲン、香油、脂肪酸モノグリセリドおよびジグリセリド、ペンタエリトリトール脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。医薬組成物またはワクチンは、例えば、免疫原性組成物と有害に反応しない、希釈剤、安定剤（例えば、糖およびアミノ酸）、保存剤、湿潤剤、乳化剤、ｐＨ緩衝液、増粘用添加剤、滑沢剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、ビタミン、着色、着香、芳香物質などを含む、助剤も含み得る。
【０３１３】
液体製剤について（例えば、凍結乾燥された組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ある量の溶媒に溶解することにより復元される実施形態では）、例えば、薬学的に許容される担体は、水性または非水性溶液、懸濁液、エマルジョン、または油であり得る。非水性溶媒には、例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルが含まれる。水性担体には、例えば、水、アルコール性／水性の溶液、エマルジョンまたは懸濁液（生理食塩水および緩衝媒体を含む）が含まれる。油の例としては、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、オリーブ油、ヒマワリ油、および魚肝油が挙げられる。固体担体／希釈剤には、例えば、ゴム、デンプン（例えば、トウモロコシデンプン、アルファ化デンプン）、糖（例えば、ラクトース、マンニトール、スクロースもしくはデキストロース）、セルロース系材料（例えば、微結晶性セルロース）、アクリレート（例えば、ポリメチルアクリレート）、炭酸カルシウム、酸化マグネシウム、タルク、またはこれらの混合物が含まれる。
【０３１４】
必要に応じて、持続放出性または誘導放出性医薬組成物またはワクチンを製剤化することができる。この製剤化は、例えば、活性化合物が段階的分解性のコーティングで（例えば、マイクロカプセル化、複数のコーティングなどにより）保護されるリポソームまたは組成物の使用によって、達成することができる。そのような組成物を即時放出用に製剤化することができ、または徐放用に製剤化することもできる。組成物をフリーズドライし、得られた凍結乾燥物を（例えば、注射用製品の調製に）使用することも可能である。
【０３１５】
本明細書で開示される免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、がんの予防または処置に有効な１つまたは複数のさらなる化合物を含むことができる。例えば、さらなる化合物は、化学療法に有用な化合物、例えば、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、グリアデルインプラント（ｇｌｉａｄｅｌｉｍｐｌａｎｔ）、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル（タキソール）、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール・ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはこれらの組合せを含み得る。さらなる化合物は、他の生物製剤も含むことがあり、そのような生物製剤としては、ＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、またはＥＧＦ受容体に対する抗体、例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）およびＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）が挙げられる。さらなる化合物は、例えば、さらなる免疫療法薬も含むことができる。
【０３１６】
さらなる化合物は、免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニスト、例えば、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ−８０／８６およびＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害剤、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）シグナル伝達経路阻害剤、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）シグナル伝達経路阻害剤、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）シグナル伝達経路阻害剤、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ４０シグナル伝達経路阻害剤、または任意の他の抗原提示細胞／Ｔ細胞シグナル伝達経路阻害剤も含み得る。免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニストの例としては、抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体もしくはその断片、抗ＰＤ−１抗体もしくはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片が挙げられる。さらなる化合物は、Ｔ細胞刺激物質、例えば、Ｔ細胞受容体共刺激分子と結合する抗体もしくはその機能性断片、共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーも含み得る。Ｔ細胞受容体共刺激分子は、例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含み得る。共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体は、例えば、ＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体、またはＣＤ４６受容体を含み得る。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、例えば、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）、またはＴＮＦＲ２５を含み得る。例えば、ＷＯ２０１６１００９２９、ＷＯ２０１６０１１３６２、およびＷＯ２０１６０１１３５７を参照されたく、これらの特許文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
ＶＩ．治療方法
【０３１７】
本明細書で開示される、凍結乾燥された細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株（必要に応じて、前記凍結乾燥された組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、ある量の溶媒に溶解することにより復元される）、免疫原性組成物、医薬組成物およびワクチンを、様々な方法に使用することができる。例えば、それらを、対象における抗疾患関連抗原（例えば、がん関連抗原もしくは腫瘍関連抗原）免疫応答を誘導もしくは増強する方法に、対象における抗疾患（例えば、抗腫瘍もしくは抗がん）免疫応答を誘導もしくは増強する方法に、対象における疾患（例えば、腫瘍もしくはがん）を処置する方法に、対象における疾患（例えば、腫瘍もしくはがん）を予防する方法に、または疾患（例えば、腫瘍もしくはがん）から対象を保護する方法に使用することができる。それらを、対象の脾臓および腫瘍におけるエフェクターＴ細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を上昇させる方法であって、前記エフェクターＴ細胞が疾患関連抗原へと標的化される方法に使用することもできる。それらを、対象における疾患関連抗原抗原Ｔ細胞を増加させる方法、疾患を有する対象の生存期間を延長する方法、対象における疾患の開始を遅延させる方法、または対象における疾患の症状を軽減する方法に、使用することもできる。
【０３１８】
対象における抗疾患関連抗原免疫応答を誘導または増強する方法は、例えば、本明細書で開示される凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含むことができる。それによって、抗疾患関連抗原免疫応答を対象において誘導または増強することができる。例えば、組凍結乾燥または復元された組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、融合ポリペプチドを発現することができ、それによって対象において免疫応答が惹起される。免疫応答は、例えば、Ｔ細胞応答、例えば、ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−Ｔ細胞応答、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答、またはＣＤ４＋ＦｏｘＰ３−およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を含み得る。そのような方法は、対象の脾臓および腫瘍微小環境におけるエフェクターＴ細胞の調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比を上昇させることもでき、その結果、対象におけるより顕著な抗腫瘍応答が可能になる。
【０３１９】
対象における抗疾患（例えば、抗がんまたは抗腫瘍）免疫応答を誘導または増強する方法は、例えば、本明細書で開示される凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含むことができる。それによって、抗疾患免疫応答を対象において誘導または増強することができる。例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、融合ポリペプチドを発現することができ、それによって対象において疾患関連応答が惹起される。
【０３２０】
対象における疾患（例えば、がんまたは腫瘍）を処置する方法は、例えば、本明細書で開示される凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含むことができる。その結果、対象は、疾患関連抗原を発現する疾患に対する免疫応答を開始することができ、それによって対象における疾患が処置される。
【０３２１】
対象における疾患（例えば、がんもしくは腫瘍）を予防する方法、または疾患を発症しないように対象を保護する方法は、例えば、本明細書で開示される凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを対象に投与するステップを含むことができる。その結果、対象は、疾患関連抗原に対する免疫応答を開始することができ、それによって疾患が予防されるか、または対象が疾患を発症しないように保護される。
【０３２２】
上記方法の一部では、２つまたはそれより多くの凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンが投与される。複数の組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを、任意の順序もしくは組合せで逐次的に投与することができ、または任意の組合せで同時に投与することができる。例として、４つの異なるＬｉｓｔｅｒｉａ株が、投与されることになる場合、それらを逐次的に投与することができ、それらを同時に投与することができ、またはそれらを任意の組合せで投与すること（例えば、第１の株と第２の株を同時に投与し、その後、第３の株と第４の株を同時に投与すること）ができる。必要に応じて、逐次投与の場合、組成物を同じ免疫応答の間に投与することができる。一部の実施形態では、組成物は、互いに０〜１０または３〜７日以内に投与される。複数の組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、各々が抗原ペプチドの異なるセットを含むことがある。あるいは、２つまたはそれより多くが、抗原ペプチドの同じセット（例えば、異なる順序での抗原ペプチドの同じセット）を含むこともある。
【０３２３】
一部の実施方法では、疾患はがんまたは腫瘍である。がんは、非調節細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を典型的に特徴とする、哺乳動物における生理状態である。がんは、造血器悪性腫瘍または固形腫瘍（すなわち、前がん病変を含む、過度の細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）および増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の結果として生じる細胞塊）であることもある。転移性がんは、最初に開始した場所から体内の別の場所に拡散したがんを指す。転移性がん細胞により形成される腫瘍は、転移性腫瘍または転移と呼ばれ、転移は、がん細胞が身体の他の部分に拡散するプロセスを指すためにも使用される用語である。一般に、転移性がんは、元の、または原発性の、がんと同じ名称および同じ種類のがん細胞を有する。固形腫瘍の例としては、黒色腫、癌腫、芽腫および肉腫が挙げられる。血液学的悪性腫瘍は、例えば、白血病またはリンパ系悪性腫瘍、例えばリンパ腫を含む。がんの例示的なカテゴリーは、脳がん、乳がん、消化器がん、泌尿生殖器がん、婦人科がん、頭頸部がん、ヘムがん、皮膚がんおよび胸部がんカテゴリーを含む。脳悪性腫瘍は、例えば、神経膠芽腫、高悪性度橋神経膠腫、低悪性度神経膠腫、髄芽腫、神経芽腫、および毛様細胞性星細胞腫を含む。消化器がんは、例えば、結腸直腸がん、胆嚢がん、肝細胞がん、膵臓がん、ＰＮＥＴ、胃がんおよび食道がんを含む。泌尿生殖器がんは、例えば、副腎皮質がん、膀胱がん、嫌色素性腎臓がん、腎（明細胞）がん、腎（乳頭）がん、ラブドイドがん、および前立腺がんを含む。婦人科がんは、例えば、子宮癌肉腫、子宮内膜がん、漿液性卵巣がん、および子宮頸がんを含む。頭頸部がんは、例えば、甲状腺がん、上咽頭がん、頭頸部がん、および腺様嚢胞がんを含む。ヘムがんは、例えば、多発性骨髄腫、脊髄形成異常、マントル細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非リンパ腫、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を含む。皮膚がんは、例えば、皮膚黒色腫および扁平上皮癌を含む。胸部がんは、例えば、扁平上皮肺がん、小細胞肺がん、および肺腺癌を含む。
【０３２４】
そのようながんのより詳細な例としては、扁平上皮がんまたは癌（例えば、口腔扁平上皮癌）、骨髄腫、口腔がん、若年性鼻咽喉血管線維腫、神経内分泌腫瘍、肺がん、腹膜がん、肝細胞がん、消化器がんを含む胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｏｒ  ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、膵臓がん、神経膠腫、神経膠芽腫、グリア系腫瘍、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、ヘパトーマ、肝細胞癌、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、結腸がん、直腸がん、結腸直腸がん、子宮内膜がんまたは子宮がんもしくは癌、唾液腺癌、腎臓または腎がん（例えば、腎細胞癌）、前立腺がん、外陰部がん、甲状腺がん、肝癌、肛門癌、陰茎癌、線維肉腫、胆嚢がん、骨肉腫、中皮腫、および頭頸部がんが挙げられる。がんは、脳がんまたは別の種類のＣＮＳもしくは頭蓋内腫瘍であることもある。例えば、対象は、星細胞系腫瘍（例えば、星細胞腫、未分化星細胞腫、神経膠芽腫、毛様細胞性星細胞腫、上衣下巨細胞性星細胞腫、多形黄色星細胞腫）、乏突起膠細胞系腫瘍（例えば、乏突起神経膠腫、退形成性乏突起神経膠腫）、上衣細胞腫瘍（例えば、上衣腫、退形成性上衣腫、粘液乳頭状上衣腫、上衣下腫）、混合型神経膠腫（例えば、混合型乏突起星細胞腫、退形成性乏突起星細胞腫）、原因不明の神経上皮腫瘍（例えば、極性海綿芽腫、星状芽細胞腫、大脳神経膠腫症）、脈絡叢の腫瘍（例えば、脈絡叢乳頭腫、脈絡叢癌）、神経細胞性もしくは混合型神経細胞膠細胞性腫瘍（例えば、神経節細胞腫、小脳異形成性神経節細胞腫、神経節膠腫、退形成性神経節膠腫、線維形成性乳児神経節腫、中枢性神経細胞腫、胚芽異形成性神経上皮腫瘍、嗅神経芽腫）、松果体実質腫瘍（例えば、松果体細胞腫、松果体芽腫、松果体細胞腫／松果体芽腫混合型）、または混合型神経細胞性もしくは神経芽細胞性要素を有する腫瘍（例えば、髄上皮腫、膠芽腫、神経芽腫、網膜芽腫、上衣芽腫）を有することができる。
【０３２５】
用語「処置する」または「処置すること」は、目的が標的疾患の症状を予防または緩和することである、治療的処置と発症予防対策または予防対策との両方を指す。処置することは、疾患に直接影響を及ぼすこと、もしくは疾患を直接治癒させること、抑制すること、阻害すること、予防すること、疾患の重症度を低下させること、疾患の開始を遅延させること、疾患の進行を緩徐化すること、疾患の進行を安定させること、疾患の寛解を誘導すること、疾患の転移を予防するもしくは遅延させること、疾患に関連する症状を軽減／改善することのうちの１つもしくは複数、またはこれらの組合せを含み得る。例えば、処置することは、予想生存期間を延長することを含み得る。効果（例えば、抑制すること、阻害すること、予防すること、〜の重症度を低下させること、〜の開始を遅らせること、〜の進行を緩徐化すること、〜の進行を安定させること、〜の寛解を誘導すること、〜を予防するまたは遅延させること、〜の症状を軽減／改善することなど）は、処置を受けていないまたはプラセボ処置を受けている対照対象と比較しての効果であり得る。用語「処置する」または「処置すること」は、疾患を有する対象について（例えば、処置を受けていないまたはプラセボ処置を受けている対照対象と比較して）生存の可能性のパーセントを上昇させることまたは予想生存期間を延長することを指すこともある。一例では、「処置すること」は、（例えば、処置を受けていないまたはプラセボ処置を受けている対照対象と比較して）進行を遅延させること、寛解を促進すること、寛解を誘導すること、寛解を増加させること、回復を加速させること、代替療法の有効性を増大させること、代替療法に対する抵抗性を低下させること、またはこれらの組合せを指す。用語「予防すること」または「妨げること」は、例えば、症状の開始を遅延させること、疾患の再発を予防すること、再発エピソードの数もしくは頻度を減少させること、症候性エピソード間の潜伏期間を延長すること、またはこれらの組合せを指すことができる。用語「抑制すること」または「阻害すること」は、例えば、症状の重症度を低下させること、急性エピソードの重症度を低下させること、症状の数を低減させること、疾患関連症状の発生率を低下させること、症状の潜伏期間を短縮すること、症状を改善すること、二次症状を軽減すること、二次感染を低減させること、患者生存期間を延長すること、またはこれらの組合せを指すことができる。
【０３２６】
用語「対象」は、疾患の治療を必要する、または疾患を発症しやすい、哺乳動物（例えば、ヒト）を指す。用語対象は、発病予防的処置または治療的処理のいずれかを受ける哺乳動物（例えば、ヒト）も指す。対象は、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、マウス、非ヒト哺乳動物、およびヒトを含み得る。用語「対象」は、あらゆる点で健康であり、疾患を有さないか疾患の徴候を示さない個体を、必ずしも除外するとは限らない。
【０３２７】
個体は、リスク因子（例えば、遺伝的、生化学的、家族歴、および状況的曝露）であって、そのリスク因子を有する個体が疾患を発症するリスクを、そのリスク因子を有さない個体より統計学的に有意に高くすることが公知の少なくとも１つのリスク因子を対象が有する場合、疾患を発症するリスクが高い。
【０３２８】
「症状」または「徴候」は、医師によって観察される疾患の客観的証拠、または対象によって知覚される疾患の主観的証拠、例えば歩行の変化を指す。症状または徴候は、疾患のあらゆる顕現であり得る。症状は、一次のものであることもあり、二次的なものであることもある。用語「一次（の）」は、特定の疾患または障害（例えば、腫瘍またはがん）の直接的結果である症状を指し、その一方で用語「二次（的）」は、一次原因に由来するまたはその結果として生じる症状を指す。本明細書で開示される凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、一次もしくは二次症状または二次的合併症を処置することができる。
【０３２９】
凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、有効なレジメンで投与され、この有効なレジメンは、疾患の少なくとも１つの徴候もしくは症状の開始を遅延させる、重症度を低下させる、さらなる悪化を阻害する、および／または改善する、投薬量、投与経路および投与頻度を意味する。あるいは、凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、有効なレジメンで投与され、この有効なレジメンは、凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチン中の疾患関連抗原に対する免疫応答を誘導する、あるいは前記細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株自体に対する免疫応答を誘導する投薬量、投与経路および投与頻度を意味する。対象が既に疾患に罹患している場合、そのレジメンを治療有効レジメンと呼ぶことができる。対象が、一般集団と比較して疾患を発症するリスクが高いが、まだ症状を経験していない場合、そのレジメンを発病予防有効レジメンと呼ぶことができる。一部の事例では、治療有効性または発病予防的有効性は、個々の患者において歴史的対照と比較してまたは同じ患者における過去の経験と比較して観察され得る。他の事例では、治療有効性または発病予防的有効性は、前臨床または臨床試験で処置を受けた患者の集団において未処置の患者の対照集団と比較して実証され得る。例えば、本明細書に記載される方法による処置を受けた個々の患者が、処置を受けていない比較対象患者の対照集団における平均成績より好ましい成績を達成した場合、あるいはより好ましい成績が、処置を受けた患者において、対照臨床試験（例えば、第ＩＩ相、第ＩＩ／ＩＩＩ相または第ＩＩＩ相試験）で対照患者に対してｐ＜０．０５もしくは０．０１またはさらには０．００１レベルで実証された場合、レジメンを治療的にまたは発病予防的に有効と見なすことができる。
【０３３０】
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株についての例示的投薬量は、例えば、１×１０６〜１×１０７ＣＦＵ、１×１０７〜１×１０８ＣＦＵ、１×１０８〜３．３１×１０１０ＣＦＵ、１×１０９〜３．３１×１０１０ＣＦＵ、５〜５００×１０８ＣＦＵ、７〜５００×１０８ＣＦＵ、１０〜５００×１０８ＣＦＵ、２０〜５００×１０８ＣＦＵ、３０〜５００×１０８ＣＦＵ、５０〜５００×１０８ＣＦＵ、７０〜５００×１０８ＣＦＵ、１００〜５００×１０８ＣＦＵ、１５０〜５００×１０８ＣＦＵ、５〜３００×１０８ＣＦＵ、５〜２００×１０８ＣＦＵ、５〜１５×１０８ＣＦＵ、５〜１００×１０８ＣＦＵ、５〜７０×１０８ＣＦＵ、５〜５０×１０８ＣＦＵ、５〜３０×１０８ＣＦＵ、５〜２０×１０８ＣＦＵ、１〜３０×１０９ＣＦＵ、１〜２０×１０９ＣＦＵ、２〜３０×１０９ＣＦＵ、１〜１０×１０９ＣＦＵ、２〜１０×１０９ＣＦＵ、３〜１０×１０９ＣＦＵ、２〜７×１０９ＣＦＵ、２〜５×１０９ＣＦＵ、および３〜５×１０９ＣＦＵである。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株についての他の例示的投薬量は、例えば、１×１０７生物、１．５×１０７生物、２×１０８生物、３×１０７生物、４×１０７生物、５×１０７生物、６×１０７生物、７×１０７生物、８×１０７生物、１０×１０７生物、１．５×１０８生物、２×１０８生物、２．５×１０８生物、３×１０８生物、３．３×１０８生物、４×１０８生物、５×１０８生物、１×１０９生物、１．５×１０９生物、２×１０９生物、３×１０９生物、４×１０９生物、５×１０９生物、６×１０９生物、７×１０９生物、８×１０９生物、１０×１０９生物、１．５×１０１０生物、２×１０１０生物、２．５×１０１０生物、３×１０１０生物、３．３×１０１０生物、４×１０１０生物、および５×１０１０生物である。投薬量は、患者の状態に依存することもあり、もしあれば、以前の処置に対する応答に、その処置が発病予防的であったにせよ治療的であったにせよ、依存することもあり、他の要因に依存することもある。
【０３３１】
投与は、任意の好適な手段により得る。例えば、投与は、非経口、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、腹腔内、局所、鼻腔内、筋肉内、眼内、直腸内、結膜、経皮、皮内、経膣、直腸、腫瘍内、傍がん（ｐａｒｃａｎｃｅｒａｌ）、経粘膜、血管内、心室内、吸入（エアロゾル）、鼻吸引（スプレー）、舌下、エアロゾル、坐剤、またはこれらの組合せであり得る。吸入による鼻腔内投与または適用には、適切な担体の存在下で混合され、エアロゾル化または霧化される、組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンの、溶液または懸濁液が、好適である。そのようなエアロゾルは、本明細書に記載される任意の凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを含み得る。投与は、坐剤（例えば、肛門坐剤もしくは尿道坐剤）の形態、皮下移植用の（例えば、ある期間にわたって制御放出をもたらす）ペレットの形態、またはカプセルの形態であることもある。投与はまた、疾患部位への注射によるものであることもある。投与レジメンは、処置されることになる疾患の正確な性質および種類、疾患の重症度、対象の年齢および全身健康状態、対象の体重、個々の対象の応答などのような要因に基づいて、容易に決定することができる。
【０３３２】
投与頻度は、数ある要因の中でも特に、対象における凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンの半減期、対象の状態、および投与経路に依存し得る。頻度は、例えば、対象の状態の変化、または処置下の腫瘍もしくはがんの進行に応じて、１日１回、週１回、月１回、年４回、または不定期間隔であり得る。処置コースは、対象の状態および他の要因に依存し得る。例えば、処置コースは、数週間、数ヶ月、または数年（例えば、最大２年）であり得る。例えば、疾患の退行または抑制を達成するために、初回処置コースの直後に、または数日、数週間もしくは数ヶ月おいて、反復投与（用量）を始めることができる。診断方法、例えば、イメージング技術、血清バイオマーカー、生検、または疾患関連症状の存在、非存在もしくは改善の分析を含む、任意の公知の技術によって、評定を決定することができる。特定の例として、凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを、最大２年の間、３週間に１回投与することができる。一例では、本明細書で開示される凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、エフェクターＴ細胞対調節性Ｔ細胞比を上昇させ、より強力な抗疾患免疫応答を生じさせるために、漸増用量で投与される。例えば、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、および細胞免疫応答を増強することが公知の他のサイトカインを含む、サイトカインを対象に提供することによって、抗疾患応答をさらに強化することができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ６，９９１，７８５を参照されたい。
【０３３３】
一部の方法は、追加の凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンで対象に「追加免疫すること」、あるいは凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンを複数回投与することをさらに含み得る。「追加免疫すること」は、対象に追加の用量を投与することを指す。例えば、一部の方法では、２回の追加免疫（または合計３回の接種）が投与され、３回の追加免疫が投与され、４回の追加免疫が投与され、５回の追加免疫が投与され、または６回もしくはそれより多くの追加免疫が投与される。投与される投薬数は、例えば、処置に対する疾患の応答に依存し得る。
【０３３４】
必要に応じて、追加免疫接種に使用される凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンは、最初の「初回抗原刺激」接種で使用される凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンと同じである。あるいは、追加免疫剤は、初回抗原刺激の組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンと異なる。必要に応じて、同じ投薬量が、初回抗原刺激接種および追加免疫接種において使用される。あるいは、より多い投薬量が、追加免疫剤に使用され、またはより少ない投薬量が追加免疫剤に使用される。初回抗原刺激接種と追加免疫接種の間の期間は、実験に基づいて決定することができる。例えば、初回抗原刺激接種と追加免疫接種の間の期間は、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６〜８週間、または８〜１０週間であり得る。
【０３３５】
異種初回抗原刺激追加免疫戦略は、非常に多くの病原体に対する免疫応答および保護の増強に効果をあげている。例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｒｅｖ．  １７０：２９−３８；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  （２００２）  Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２：２３９−２５０；Ｇｏｎｚａｌｏ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１２２６−１２３１；およびＴａｎｇｈｅ  （２００１）  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｉｍｍｕｎ．  ６９：３０４１−３０４７を参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。初回抗原刺激注射および追加免疫注射において異なる形態の抗原を提供することで、抗原に対する免疫応答を最大化することができる。ＤＮＡワクチンでの初回抗原刺激、その後のアジュバント中のタンパク質での追加免疫または抗原をコードするＤＮＡのウイルスベクター送達は、抗原特異的抗体およびＣＤ４＋Ｔ細胞応答またはＣＤ８＋Ｔ細胞応答を改善する１つの有効な方法である。例えば、Ｓｈｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：  ３３１−３３５；Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：１０３９−１０４５；Ｂｉｌｌａｕｔ−Ｍｕｌｏｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：９５−１０２；およびＳｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：７７１−７７９を参照されたく、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。一例として、対象が、ＤＮＡ初回抗原刺激、その後の抗原を発現するアデノウイルスベクターでの追加免疫によるワクチン接種を受ける場合、抗原をコードするＤＮＡにＣＲＬ１００５ポロクサマー（１２ｋＤａ、５％ＰＯＥ）を加えることで、Ｔ細胞応答を増強することができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｈｉｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１５：３３１−３３５を参照されたい。別の例として、抗原の免疫原性部分をコードするベクター構築物、および抗原の免疫原性部分を含むタンパク質を、投与することができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２００２／０１６５１７２を参照されたい。同様に、核酸ワクチン接種に対する免疫応答を、目的のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの（例えば、同じ免疫応答の間の、一部の実施形態では、互いに０〜１０または３〜７日以内の）同時投与によって増強することができる。例えば、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ６，５００，４３２を参照されたい。
【０３３６】
本明細書で開示される治療方法は、疾患（例えば、腫瘍またはがん）の予防または処置に有効な１つまたは複数のさらなる化合物を投与するステップも含むことができる。例えば、さらなる化合物は、化学療法に有用な化合物、例えば、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン、グリアデルインプラント、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロイコボリン、リポソームドキソルビシン、リポソームダウノルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル（タキソール）、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テガフール・ウラシル、テモゾロミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、またはこれらの組合せを含み得る。あるいは、さらなる化合物は、他の生物製剤も含むことができ、そのような生物製剤としては、ＨＥＲ２抗原に対するＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）（トラスツズマブ）、ＶＥＧＦに対するＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）（ベバシズマブ）、またはＥＧＦ受容体に対する抗体、例えば、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（セツキシマブ）およびＶｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）（パニツムマブ）が挙げられる。あるいは、さらなる化合物は、他の免疫療法薬を含むことができる。あるいは、さらなる化合物は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）経路阻害剤、例えば、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、１−メチルトリプトファン（１ＭＴ）、ネクロスタチン−１、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラゾン、エブセレン、５−メチルインドール−３−カルボキシアルデヒド、ＣＡＹ１０５８１、抗ＩＤＯ抗体、または小分子ＩＤＯ阻害剤であり得る。ＩＤＯ阻害は、化学療法剤の有効性を増強することができる。本明細書で開示される治療方法を、放射線、幹細胞処置、外科手術または任意の他の処置と組み合わせることもできる。
【０３３７】
そのようなさらなる化合物または処置は、本明細書で開示される凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンの投与に先行することもあり、本明細書で開示される凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンの投与の後に続くこともあり、あるいは本明細書で開示される凍結乾燥もしくは復元された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンの投与と同時であることもある。
【０３３８】
標的免疫調節療法は、例えば、４−１ＢＢ、ＯＸ４０およびＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体関連）を含む腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーを標的とするアゴニスト抗体を使用することによる、共刺激受容体の活性化に主な重点を置いている。ＧＩＴＲのモジュレーションは、抗腫瘍設定でもワクチン設定でも可能性を実証してきた。アゴニスト抗体の別の標的は、Ｔ細胞活性化のための共刺激シグナル分子である。共刺激シグナル分子の標的化は、Ｔ細胞の活性化増強およびより強力な免疫応答の助長をもたらすことができる。共刺激は、チェックポイント阻害からの阻害の影響を防止することおよび抗原特異的Ｔ細胞増殖を増加させることにも役立ち得る。
【０３３９】
Ｌｉｓｔｅｒｉａに基づく免疫療法は、腫瘍に浸潤して破壊する腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の新規生成を誘導することにより、ならびに腫瘍微小環境における免疫抑制性調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の数および活性を低下させることにより作用する。Ｔ細胞共阻害または共刺激受容体（例えば、チェックポイント阻害剤ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ３ならびに共刺激物質ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲおよびＣＤ４０）に対する抗体（またはその機能性断片）は、Ｌｉｓｔｅｒｉａに基づく免疫療法との相乗効果を有することができる。
【０３４０】
したがって、一部の方法は、さらに、ＰＤ−１シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ−８０／８６およびＣＴＬＡ−４シグナル伝達経路阻害剤、Ｔ細胞膜タンパク質３（ＴＩＭ３）シグナル伝達経路阻害剤、アデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）シグナル伝達経路阻害剤、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）シグナル伝達経路阻害剤、キラー免疫グロブリン受容体（ＫＩＲ）シグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ４０シグナル伝達経路阻害剤または任意の他の抗原提示細胞／Ｔ細胞シグナル伝達経路阻害剤などの、免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニストを含む組成物を投与するステップを含むことができる。免疫チェックポイント阻害剤アンタゴニストの例としては、抗ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２抗体もしくはその断片、抗ＰＤ−１抗体もしくはその断片、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその断片、または抗Ｂ７−Ｈ４抗体もしくはその断片が挙げられる。例えば、抗ＰＤ−１抗体を、対象に、２週間に１回５〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週間に１回５〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週間に１回１〜２ｍｇ／ｋｇ、１週間に１回１〜１０ｍｇ／ｋｇ、２週間に１回１〜１０ｍｇ／ｋｇ、３週間に１回１〜１０ｍｇ／ｋｇ、または４週間に１回１〜１０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。
【０３４１】
同様に、一部の方法は、Ｔ細胞刺激物質、例えば、Ｔ細胞受容体共刺激分子と結合する抗体もしくはその機能性断片、共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体、またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーを投与するステップをさらに含むことができる。Ｔ細胞受容体共刺激分子は、例えば、ＣＤ２８またはＩＣＯＳを含み得る。共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体は、例えば、ＣＤ８０受容体、ＣＤ８６受容体、またはＣＤ４６受容体を含み得る。ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーは、例えば、グルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）、またはＴＮＦＲ２５を含み得る。
【０３４２】
例えば、一部の方法は、Ｔ細胞受容体共刺激分子と結合する抗体もしくはその機能性断片または共刺激分子に結合する抗原提示細胞受容体と結合する抗体もしくはその機能性断片を含む組成物の有効量を投与するステップをさらに含むことができる。抗体は、例えば、抗ＴＮＦ受容体抗体もしくはその抗原結合性断片（例えば、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバーグルココルチコイド誘導性ＴＮＦ受容体（ＧＩＴＲ）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４受容体）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７受容体）、もしくはＴＮＦＲ２５）、抗ＯＸ４０抗体もしくはその抗原結合性断片、または抗ＧＩＴＲ抗体もしくはその抗原結合性断片であり得る。あるいは、他のアゴニスト性分子（例えば、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬの活性断片、ＧＩＴＲＬを含有する融合タンパク質、ＧＩＴＲＬの活性断片を含有する融合タンパク質、抗原提示細胞（ＡＰＣ）／Ｔ細胞アゴニスト、ＣＤ１３４またはそのリガンドもしくは断片、ＣＤ１３７またはそのリガンドもしくは断片、あるいは誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ）（ＩＣＯＳ）またはそのリガンドもしくは断片、あるいはアゴニスト性小分子）を投与することができる。
【０３４３】
特定の例では、一部の方法は、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその機能性断片および／または抗ＣＤ１３７抗体もしくはその機能性断片を投与するステップをさらに含むことができる。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその機能性断片または抗ＣＤ１３７抗体もしくはその機能性断片を、組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの初回用量の約７２時間後に投与することができ、あるいは組換え融合ポリペプチド、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸、組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物、またはワクチンの初回用量の約４８時間後に投与することができる。抗ＣＴＬＡ−４抗体もしくはその機能性断片または抗ＣＤ１３７抗体もしくはその機能性断片を、例えば、約０．０５ｍｇ／ｋｇおよび約５ｍｇ／ｋｇの用量で、投与することができる。組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株、または組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む免疫原性組成物を、例えば、約１×１０９ＣＦＵの用量で投与することができる。一部のそのような方法は、抗ＰＤ−１抗体またはその機能性断片の有効量を投与するステップをさらに含むことができる。
【０３４４】
がん免疫療法の有効性を評定する方法は周知であり、例えば、Ｄｚｏｊｉｃ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｐｒｏｓｔａｔｅ  ６６（８）：８３１−８３８；Ｎａｒｕｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １３（７）：６５８−６６３、Ｓｅｈｇａｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔ．  ６：２１）、およびＨｅｉｎｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５６（５）：７２５−７３０に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。一例として、前立腺がんについては、前立腺がんモデル、例えば、ＴＲＡＭＰ−Ｃ２マウスモデル、１７８−２  ＢＭＡ細胞モデル、ＰＡＩＩＩ腺癌細胞モデル、ＰＣ−３Ｍモデル、または任意の他の前立腺がんモデルを使用して、本明細書で開示される方法および組成物を試験することができる。
【０３４５】
あるいは、または加えて、免疫療法をヒト対象において試験することができ、公知の＿＿＿を使用して有効性をモニターすることができる。そのような方法は、例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を直接測定するステップ、または疾患進行を（例えば、腫瘍転移の数もしくはサイズを判定すること、または疾患症状、例えば咳、胸痛、体重減少などをモニターすることにより）測定するステップを含むことができる。ヒト対象におけるがん免疫療法の有効性を評定する方法は周知であり、例えば、Ｕｅｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．  ７：９およびＴｈｏｍａｓ−Ｋａｓｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １１９（１０）：２４２８−２４３４に記載されており、これらの参考文献の各々は、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
ＶＩＩ．キット
【０３４６】
本明細書で開示される方法を行う際に利用される試薬を含むキット、または本明細書で開示される組成物、ツールまたは器具を含むキットも、提供される。
【０３４７】
例えば、そのようなキットは、本明細書で開示される凍結乾燥された組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株、本明細書で開示される免疫原性組成物、本明細書で開示される医薬組成物、または本明細書で開示されるワクチンを含み得る。そのようなキットは、凍結乾燥された組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を復元するための溶媒または希釈剤も含み得る。加えて、そのようなキットは、本明細書で開示される方法を行うための凍結乾燥された組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株、免疫原性組成物、医薬組成物またはワクチンの使用を説明する説明資料をさらに含み得る。そのようなキットは、必要に応じてアプリケーターをさらに含み得る。モデルキットが下で説明されるが、他の有用なキットの内容は、本開示に照らせば明白であろう。
【０３４８】
上記または下記の全ての特許出願、ウェブサイト、他の公表文献、受託番号などは、それら全体があらゆる目的で参照により組み込まれ、この組込みは、各々の個々の事柄が参照によりそのように組み込まれると具体的にかつ個々に示されている場合と同程度のものである。異なるバージョンの配列が、異なる時点で、ある受託番号に結び付けられたとしても、本出願の有効出願日の時点でその受託番号に結び付けられるバージョンを意図している。この有効出願日は、該当する場合、受託番号を参照して実際の出願日または優先権出願の出願日のどちらか早いほうの日を意味する。同様に、異なるバージョンの公表文献、ウェブサイトなどが、異なる時点で公表されていたとしても、別段の指示がない限り、本出願の有効出願日の最も近日に公表されたバージョンを意図している。別段の具体的な指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態または態様を任意の他のものと組み合わせて使用することができる。明確化および理解を目的として例証および例によってある程度詳細に本発明を説明したが、ある特定の変更および修飾を添付の特許請求の範囲に記載の範囲内で行うことができることは明らかであろう。
実施形態の列挙
【０３４９】
本明細書で開示される主題は、以下の実施形態を含むが、これらに限定されない。
【０３５０】
１．  Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含む凍結乾燥された組成物を生産する方法であって、（ａ）緩衝液とスクロースとを含む製剤中においてＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を提供するステップ、（ｂ）ステップ（ａ）で提供された組成物を凍結ステップにおいて約−３２℃〜約−８０℃の間の保持温度で冷却するステップ、（ｃ）ステップ（ｂ）により生産された組成物を一次乾燥ステップにおいて約−１０℃〜約−３０℃の間の保持温度で真空に曝露するステップ、および（ｄ）ステップ（ｃ）により生産された組成物を二次乾燥ステップにおいて約−５℃〜約２５℃の間の保持温度で真空に曝露するステップを含み、それによって凍結乾燥された組成物を生産する方法。
【０３５１】
２．  ステップ（ａ）の前に、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を低下した温度に曝露することにより前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株においてストレス応答が誘導される、実施形態１に記載の方法。
【０３５２】
３．  ステップ（ａ）の前に、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を低下した温度に曝露することにより前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株においてストレス応答が誘導されない、実施形態１に記載の方法。
【０３５３】
４．  ステップ（ａ）における前記組成物に使用される前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、ステップ（ａ）の前に解凍される凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３５４】
５．  解凍される前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株の濃度が、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の間である、実施形態４に記載の方法。
【０３５５】
６．  前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、約２℃〜約３７℃で解凍される、実施形態４または５に記載の方法。
【０３５６】
７．  前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、約２０℃〜約３７℃で解凍される、実施形態６に記載の方法。
【０３５７】
８．  前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、約３２℃および約３７℃で解凍される、実施形態７に記載の方法。
【０３５８】
９．  前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、約３７℃で解凍される、実施形態８に記載の方法。
【０３５９】
１０．  前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、８時間以下の間、解凍される、実施形態４〜９のいずれか一項に記載の方法。
【０３６０】
１１．  前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、解凍後２４時間以下の間、約２℃〜約８℃で保持される、実施形態４〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【０３６１】
１２．  ステップ（ａ）における前記組成物に使用される前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、ステップ（ａ）の前に新鮮培養される、実施形態１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【０３６２】
１３．  前記緩衝液が、リン酸緩衝液である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３６３】
１４．  前記製剤が、約１％〜約５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３６４】
１５．  前記製剤が、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、実施形態１４に記載の方法。
【０３６５】
１６．  前記製剤が、約２．５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、実施形態１５に記載の方法。
【０３６６】
１７．  前記製剤が、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｉｓｔｅｒｉａを含む、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３６７】
１８．  前記製剤が、トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）のうちの１つまたは複数を含まない、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３６８】
１９．  前記製剤が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、実施形態１８に記載の方法。
【０３６９】
２０．  前記凍結ステップ（ｂ）における前記保持温度が、約−４０℃〜約−５０℃の間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３７０】
２１．  前記凍結ステップ（ｂ）における前記保持温度が、約−４５℃である、実施形態２０に記載の方法。
【０３７１】
２２．  前記凍結ステップ（ｂ）が、温度を毎分約１℃の速度で前記保持温度に低下させることを含む、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３７２】
２３．  前記凍結ステップ（ｂ）における前記冷却が、約２時間〜約４時間の冷却である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３７３】
２４．  前記凍結ステップ（ｂ）における前記冷却が、前記組成物を約２時間、前記保持温度で保持することを含む、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３７４】
２５．  前記一次乾燥ステップ（ｃ）における前記保持温度が、約−１２℃〜約−２２℃の間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３７５】
２６．  前記一次乾燥ステップ（ｃ）における前記保持温度が、約−１７℃〜約−１９℃の間である、実施形態２５に記載の方法。
【０３７６】
２７．  前記一次乾燥ステップ（ｃ）における前記保持温度が、約−１８℃である、実施形態２６に記載の方法。
【０３７７】
２８．  前記一次乾燥ステップ（ｃ）が、温度を毎分約１℃の速度で前記保持温度に上昇させることを含む、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３７８】
２９．  前記一次乾燥ステップ（ｃ）が、約２５時間〜約３５時間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３７９】
３０．  前記一次乾燥ステップ（ｃ）の終了が、前記組成物が保持温度に達した約１２〜約１６時間後である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３８０】
３１．  前記一次乾燥ステップ（ｃ）が、約０．０９ｍｂａｒの真空圧である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３８１】
３２．  前記二次乾燥ステップ（ｄ）における前記保持温度が、約−５℃〜約２０℃の間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３８２】
３３．  前記二次乾燥ステップ（ｄ）における前記保持温度が、約−５℃〜約５℃の間である、実施形態３２に記載の方法。
【０３８３】
３４．  前記二次乾燥ステップ（ｄ）における前記保持温度が、約０℃である、実施形態３３に記載の方法。
【０３８４】
３５．  前記二次乾燥ステップ（ｄ）が、温度を毎分約０．２℃の速度で前記保持温度に上昇させることを含む、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３８５】
３６．  前記二次乾燥ステップ（ｄ）が、約１時間〜約１０時間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３８６】
３７．  前記二次乾燥ステップ（ｄ）が、前記組成物を約２時間〜約６時間、前記保持温度で保持することを含む、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３８７】
３８．  前記二次乾燥ステップ（ｄ）が、前記組成物を約５時間〜約６時間、前記保持温度で保持することを含む、実施形態３７に記載の方法。
【０３８８】
３９．  前記二次乾燥ステップ（ｄ）が、約０．０９ｍｂａｒの真空圧である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３８９】
４０．  前記凍結乾燥された組成物中の残留水分が、約１％〜約５％の間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３９０】
４１．  前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、約２％〜約４％の間である、実施形態４０に記載の方法。
【０３９１】
４２．  前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、少なくとも約２．５％である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３９２】
４３．  前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、少なくとも約３％である、実施形態４２に記載の方法。
【０３９３】
４４．  前記凍結乾燥された組成物が、約−２０℃〜約４℃の間で約１２カ月保管された後、少なくとも約６０％の生存率を示す、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３９４】
４５．  前記凍結乾燥された組成物が、約−２０℃〜約４℃の間で約１２カ月保管された後、少なくとも約７５％の生存率を示す、実施形態４４に記載の方法。
【０３９５】
４６．  前記凍結乾燥された組成物が、約−２０℃〜約４℃の間で約１２カ月保管された後、少なくとも約８０％の生存率を示す、実施形態４５に記載の方法。
【０３９６】
４７．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３９７】
４８．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記緩衝液が、リン酸緩衝液であり、前記製剤が、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含み、前記製剤が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まず、前記製剤が、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）のＬｉｓｔｅｒｉａを含み、前記凍結ステップ（ａ）における前記保持温度が、約−４０℃〜約−５０℃の間であり、前記一次乾燥ステップ（ｃ）における前記保持温度が、−１７℃〜−１９℃の間であり、前記二次乾燥ステップ（ｄ）における前記保持温度が、−１℃〜１℃の間であり、前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、約２．５％〜約４％の間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０３９８】
４９．  ステップ（ａ）における前記組成物に使用される前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、ステップ（ａ）の前に解凍される凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株であり、解凍される前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株の濃度が、１ミリリットル当たり約１×１０９〜約１×１０１０コロニー形成単位（ＣＦＵ）の間であり、前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、約３７℃で解凍され、前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、８時間以下の間、解凍され、前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、解凍後２４時間以下の間、約２℃〜約８℃で保持される、４８に記載の方法。
【０３９９】
５０．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であり、前記融合ポリペプチドが、疾患関連抗原ペプチドに融合されたＰＥＳＴ含有ペプチドを含む、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４００】
５１．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ｐｒｆＡ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、実施形態５０に記載の方法。
【０４０１】
５２．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、実施形態５０に記載の方法。
【０４０２】
５３．  （１）Ｌｉｓｔｅｒｉａ株と、（２）リン酸緩衝液と、（３）スクロースとを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の凍結乾燥用の製剤。
【０４０３】
５４．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を低下した温度に曝露することによりストレス応答が誘導された株である、実施形態５３に記載の製剤。
【０４０４】
５５．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａストックからである、実施形態５３または５４に記載の製剤。
【０４０５】
５６．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、新鮮培養されたＬｉｓｔｅｒｉａストックからである、実施形態５３または５４に記載の製剤。
【０４０６】
５７．  約１％〜約５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、実施形態５３〜５６のいずれか一項に記載の製剤。
【０４０７】
５８．  約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、実施形態５７に記載の製剤。
【０４０８】
５９．  約２．５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、実施形態５８に記載の製剤。
【０４０９】
６０．  トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）のうちの１つまたは複数を含まない、実施形態５３〜５９のいずれか一項に記載の製剤。
【０４１０】
６１．  トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、実施形態６０に記載の製剤。
【０４１１】
６２．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、実施形態５３〜６１のいずれか一項に記載の製剤。
【０４１２】
６３．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記製剤が、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含み、前記製剤が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、実施形態５３〜６２のいずれか一項に記載の製剤。
【０４１３】
６４．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であり、前記融合ポリペプチドが、疾患関連抗原ペプチドに融合されたＰＥＳＴ含有ペプチドを含む、実施形態５３〜６３のいずれか一項に記載の製剤。
【０４１４】
６５．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ｐｒｆＡ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、実施形態６４に記載の製剤。
【０４１５】
６６．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、実施形態６４に記載の製剤。
【０４１６】
６７．  実施形態１〜５２のいずれか一項に記載の方法により生産される、凍結乾燥された組成物。
【０４１７】
６８．  Ｌｉｓｔｅｒｉａ株と、リン酸緩衝液と、スクロースとを含む、凍結乾燥された組成物。
【０４１８】
６９．  トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）のうちの１つまたは複数を含まない、実施形態６８に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４１９】
７０．  トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、実施形態６９に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４２０】
７１．  前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、約１％〜約５％の間である、実施形態６７〜７０のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４２１】
７２．  前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、約２％〜約４％の間である、実施形態７１に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４２２】
７３．  前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、少なくとも約２．５％である、実施形態６７〜７２のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４２３】
７４．  前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、少なくとも約３％である、実施形態７３に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４２４】
７５．  凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、少なくとも約２．５％である、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含む凍結乾燥された組成物。
【０４２５】
７６．  約−２０℃〜約４℃の間で約１２カ月保管された後、少なくとも約６０％の生存率を示す、実施形態６７〜７５のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４２６】
７７．  約−２０℃〜約４℃の間で約１２カ月保管された後、少なくとも約７５％の生存率を示す、実施形態７６に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４２７】
７８．  約−２０℃〜約４℃の間で約１２カ月保管された後、少なくとも約８０％の生存率を示す、実施形態７７に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４２８】
７９．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、実施形態６７〜７８のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４２９】
８０．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記凍結乾燥された組成物が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まず、前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、２．５％〜４％の間である、実施形態６７〜７９のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４３０】
８１．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であり、前記融合ポリペプチドが、疾患関連抗原ペプチドに融合されたＰＥＳＴ含有ペプチドを含む、実施形態６７〜８０のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４３１】
８２．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ｐｒｆＡ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、実施形態８１に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４３２】
８３．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、実施形態８１に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４３３】
８４．  凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株を凍結乾燥用に調製する方法であって、前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株を約２０℃〜約３７℃の間の温度で解凍するステップを含む方法。
【０４３４】
８５．  前記温度が、約３２℃〜約３７℃の間である、実施形態８４に記載の方法。
【０４３５】
８６．  前記温度が、約３７℃である、実施形態８５に記載の方法。
【０４３６】
８７．  前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、８時間以下の間、解凍される、実施形態８４〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【０４３７】
８８．  前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、解凍後２４時間以下の間、約２℃〜約８℃で保持される、実施形態８４〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【０４３８】
８９．  前記凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株が、緩衝液とスクロースとを含む製剤中において解凍される、実施形態８４〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【０４３９】
９０．  前記製剤が、約１％〜約５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、実施形態８９に記載の方法。
【０４４０】
９１．  前記製剤が、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、実施形態９０に記載の方法。
【０４４１】
９２．  前記製剤が、約２．５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、実施形態９１に記載の方法。
【０４４２】
９３．  前記製剤が、トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）のうちの１つまたは複数を含まない、実施形態８９〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【０４４３】
９４．  前記製剤が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、実施形態９３に記載の方法。
【０４４４】
９５．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、実施形態８９〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【０４４５】
９６．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記製剤が、約２％〜約３％  ｗ／ｖ  スクロースを含み、前記製剤が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、実施形態８９〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【０４４６】
本明細書で開示される主題は、以下の実施形態も含むが、これらに限定されない。
【０４４７】
１．  Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を含む凍結乾燥された組成物を生産する方法であって、（ａ）緩衝液とスクロースとを含む製剤中のＬｉｓｔｅｒｉａ株を含む組成物を提供するステップ；（ｂ）必要に応じて温度が約−３２℃〜−８０℃の間である、凍結ステップにおいてステップ（ａ）で提供された組成物を冷却するステップ；（ｃ）必要に応じて温度が約−１０℃〜−３０℃の間である、一次乾燥ステップにおいてステップ（ｂ）により生産された組成物を真空に曝露するステップ；および（ｄ）必要に応じて温度が約５℃〜２５℃の間であり、必要に応じて温度が約５℃〜２０℃の間である、二次乾燥ステップにおいてステップ（ｃ）により生産された組成物を真空に曝露するステップを含み、それによって凍結乾燥された組成物を生産する方法。
【０４４８】
２．  ステップ（ａ）の前に、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を低下した温度に曝露することにより前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株においてストレス応答が誘導される、実施形態１に記載の方法。
【０４４９】
３．  ステップ（ａ）の前に、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を低下した温度に曝露することにより前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株においてストレス応答が誘導されない、実施形態１に記載の方法。
【０４５０】
４．  ステップ（ａ）における前記組成物に使用される前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、ステップ（ａ）の前に解凍される凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａ株である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４５１】
５．  ステップ（ａ）における前記組成物に使用される前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、ステップ（ａ）の前に新鮮培養された、実施形態１〜３のいずれか一実施形態に記載の方法。
【０４５２】
６．  前記緩衝液が、リン酸緩衝液である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４５３】
７．  前記製剤が、１％〜５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４５４】
８．  前記製剤が、２％〜３％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、実施形態７に記載の方法。
【０４５５】
９．  前記製剤が、トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の１つまたは複数を含まない、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４５６】
１０．  前記製剤が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、実施形態９に記載の方法。
【０４５７】
１１．  前記凍結ステップ（ｂ）における前記温度が、−４０℃〜−５０℃の間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４５８】
１２．  前記凍結ステップ（ｂ）における前記冷却が、２〜４時間の冷却である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４５９】
１３．  前記一次乾燥ステップ（ｃ）における前記温度が、−１２℃〜−２２℃の間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４６０】
１４．  前記一次乾燥ステップ（ｃ）における前記温度が、−１７℃〜−１９℃の間である実施形態１３に記載の方法。
【０４６１】
１５．  前記一次乾燥ステップ（ｃ）が、２０〜３０時間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４６２】
１６．  前記二次乾燥ステップ（ｄ）における前記温度が、１０℃〜２０℃の間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４６３】
１７．  前記二次乾燥ステップ（ｄ）が、１〜１０時間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４６４】
１８．  前記二次乾燥ステップ（ｄ）が、１〜３時間である、実施形態１７に記載の方法。
【０４６５】
１９．  前記凍結乾燥された組成物中の残留水分が、１％〜５％の間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４６６】
２０．  前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、３％〜４％の間である、実施形態１９に記載の方法。
【０４６７】
２１．  前記凍結乾燥された組成物が、−２０℃または４℃で６カ月保管された後、少なくとも６０％の生存率を示す、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４６８】
２２．  前記凍結乾燥された組成物が、−２０℃または４℃で６カ月保管された後、少なくとも７５％の生存率を示す、実施形態２１に記載の方法。
【０４６９】
２３．  前記凍結乾燥された組成物が、−２０℃または４℃で６カ月保管された後、少なくとも８０％の生存率を示す実施形態２２に記載の方法。
【０４７０】
２４．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４７１】
２５．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記緩衝液が、リン酸緩衝液であり、前記製剤が、２％〜３％  ｗ／ｖ  スクロースを含み、前記製剤が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まず、前記一次乾燥ステップ（ｃ）における前記保持温度が、−１７℃〜−１９℃の間であり、前記二次乾燥ステップ（ｄ）における前記温度が、−１０℃〜２０℃の間であり、前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、３％〜４％の間である、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４７２】
２６．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であり、前記融合ポリペプチドが、疾患関連抗原ペプチドに融合されたＰＥＳＴ含有ペプチドを含む、前記いずれかの実施形態に記載の方法。
【０４７３】
２７．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ｐｒｆＡ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、実施形態２６に記載の方法。
【０４７４】
２８．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、実施形態２６に記載の方法。
【０４７５】
２９．  （１）Ｌｉｓｔｅｒｉａ株と、（２）リン酸緩衝液と、（３）スクロースとを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の凍結乾燥用の製剤。
【０４７６】
３０．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を低下した温度に曝露することによりストレス応答が誘導された株である、実施形態２９に記載の製剤。
【０４７７】
３１．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、凍結されたＬｉｓｔｅｒｉａストックからである、実施形態２９または３０に記載の製剤。
【０４７８】
３２．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、新鮮培養されたＬｉｓｔｅｒｉａストックからである、実施形態２９または３０に記載の製剤。
【０４７９】
３３．  １％〜５％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、実施形態２９〜３２のいずれか一項に記載の製剤。
【０４８０】
３４．  ２％〜３％  ｗ／ｖ  スクロースを含む、実施形態３３に記載の製剤。
【０４８１】
３５．  トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）のうちの１つまたは複数を含まない、実施形態２９〜３４のいずれか一項に記載の製剤。
【０４８２】
３６．  トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、実施形態３５に記載の製剤。
【０４８３】
３７．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、実施形態２９〜３６のいずれか一項に記載の製剤。
【０４８４】
３８．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記製剤が、２％〜３％  ｗ／ｖ  スクロースを含み、前記製剤が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、実施形態２９〜３７のいずれか一項に記載の製剤。
【０４８５】
３９．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であり、前記融合ポリペプチドが、疾患関連抗原ペプチドに融合されたＰＥＳＴ含有ペプチドを含む、実施形態２９〜３８のいずれか一項に記載の製剤。
【０４８６】
４０．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ｐｒｆＡ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、実施形態３９に記載の製剤。
【０４８７】
４１．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、実施形態３９に記載の製剤。
【０４８８】
４２．  実施形態１〜２８のいずれか一項に記載の方法により生産される、凍結乾燥された組成物。
【０４８９】
４３．  Ｌｉｓｔｅｒｉａ株と、リン酸緩衝液と、スクロースとを含む、凍結乾燥された組成物。
【０４９０】
４４．  トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）のうちの１つまたは複数を含まない、実施形態４３に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４９１】
４５．  トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まない、実施形態４４に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４９２】
４６．  前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、１％〜５％の間である、実施形態４２〜４５のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４９３】
４７．  前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、２％〜４％の間である、実施形態４６に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４９４】
４８．  前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、３％〜４％の間である、実施形態４７に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４９５】
４９．  −２０℃または４℃で６カ月保管された後、少なくとも６０％の生存率を示す、実施形態４２〜４８のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４９６】
５０．  −２０℃または４℃で６カ月保管された後、少なくとも７５％の生存率を示す、実施形態４９に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４９７】
５１．  −２０℃または４℃で６カ月保管された後、少なくとも８０％の生存率を示す、実施形態５０に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４９８】
５２．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、実施形態４２〜５１のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【０４９９】
５３．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記凍結乾燥された組成物が、トレハロース、ＭＳＧ、またはｒＨＳＡを含まず、前記凍結乾燥された組成物中の前記残留水分が、３％〜４％の間である、実施形態４２〜５２のいずれか一項に記載の凍結乾燥された組成物。
【０５００】
５４．  前記Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であり、前記融合ポリペプチドが、疾患関連抗原ペプチドに融合されたＰＥＳＴ含有ペプチドを含む、実施形態４２〜５３のいずれか一項に記載の製剤。
【０５０１】
５５．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ｐｒｆＡ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ突然変異タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、実施形態５４に記載の製剤。
【０５０２】
５６．  前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌおよびｄａｔ中の欠失または不活性化突然変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、ＬＬＯのＮ末端断片である、実施形態５４に記載の製剤。
配列の簡単な説明
【０５０３】
添付の配列表に列挙されるヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基の標準文字略語、およびアミノ酸の３文字コードを使用して示される。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端で始まり、フォワード方向に（すなわち、各列の左から右に）３’末端へと進む、標準的慣行に従う。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されるが、表示される鎖へのいずれの言及も相補鎖を含むように解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端で始まり、フォワード方向に（すなわち、各列の左から右に）カルボキシ末端へと進む、標準的慣行に従う。
【０５０４】
【表３−１】
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【表３−２】
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【実施例】
【０５０５】
（実施例１）
代表的な原薬調製および凍結乾燥サイクル
ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２およびＡＤＸＳ−ＨＰＶ（最終液体薬物製品）のための典型的な現在の保管温度は、−８０℃であり、このことは、コールドチェーン（ｃｏｌｄ  ｃｈａｉｎ）メンテナンスを妨げ、サプライチェーンの課題を課す。コールドチェーンは、薬物製品有効性を保証し、潜在的な患者リスクを回避するために常に厳密に保たれなくてはならないことから、凍結状態でのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ最終薬物製品（液体）の保管は不便である。ＨＥＲ２／Ｎｅｕ融合タンパク質により形質転換された弱毒化組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）であるＡＤＸＳ−ＨＥＲ２は、ＨＥＲ２発現がんを標的とするように開発されているＬｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）免疫療法製品候補である。Ａｘａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｆｉｌｏｌｉｓｂａｃ（ＡＤＸＳ−ＨＰＶ）は、ＨＰＶ関連がんの処置のために開発されたＬｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（商標）免疫療法候補である。これは、ＨＰＶ関連腫瘍を標的とする融合タンパク質Ｌｍ−ＬＬＯ−Ｅ７を分泌する、生きた弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに基づく免疫療法である。コールドチェーンは、薬物有効性を保証し、潜在的な患者リスクを回避するために常に保たれなくてはならないことから、凍結液体状態での最終薬物製品の保管は不便である。コールドチェーンを維持しつつ、−２０℃での薬物製品の長期保管を支持する凍結乾燥（ｌｙｏ）サイクルの開発は、有益となるであろう。したがって、薬物製品の長期保管を支持する凍結乾燥サイクルを開発するための試験を行った。
ＡＤＸＳ−ＨＰＶ液体凍結された製剤のための原薬プロセス概要
【０５０６】
ＡＤＸＳ−ＨＰＶ繁殖を、揺動波動型生物反応器技術によって提供される使い捨ての閉鎖系内で全て実行した。使い捨ての閉鎖系は、発酵のための製品２０Ｌ培養バッグ、濃縮および緩衝液交換のための接線流濾過（ＴＦＦ）、ならびにＤＳ容器充填のための製品マニフォールドからなる。これらの構成成分はそれぞれ、ガンマ線照射によって滅菌した。インプロセス（ｉｎ−ｐｒｏｃｅｓｓ）制御による原薬製造プロセスフロー図を図２０に示す。
【０５０７】
ｐＨ制御のための１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を調製し、順次に２個の０．２μｍフィルターを使用して濾過滅菌して、１Ｌ  ｐＨ制御バッグに入れた。滅菌フィルターは、チューブのヒートシールされたセクションを切り開くことにより除去した。発酵培地およびｐＨ制御溶液を表４に従って調製し、順次に２個の０．２μｍフィルターに通して濾過滅菌して、無菌５Ｌ培地添加バッグに入れた。滅菌フィルターは、チューブのヒートシールされたセクションを切り開くことにより除去した。
【０５０８】
【表４】
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【０５０９】
透析濾過／洗浄緩衝液を表５に従って調製し、順次に２個の０．２μｍフィルターに通して濾過滅菌して、無菌２×１０Ｌバッグに入れた。滅菌フィルターは、チューブのヒートシールされたセクションを切り開くことにより除去した。
【０５１０】
【表５】
2020533997.tif 000008
【０５１１】
２０Ｌ培養バッグは、溶存酸素およびｐＨモニタリングのためのプローブと予め接続させた。次に、バッグに、５Ｌの増殖培地を無菌的に充填した。次に、培地添加バッグを、チューブのヒートシールされたセクションを切り開くことにより除去した。
【０５１２】
波動バッグを濾過滅菌された圧縮Ｏ２で膨張させた。濾過滅菌された圧縮Ｏ２を繁殖の間、１Ｌ／分の速度で連続的に供給し、出口ポートを通して除去した。毎分１８の揺動速度で、揺動角度を１０°に設定した。
【０５１３】
ｐＨ制御バッグおよびグルコース供給バッグを培養バッグに無菌的に接続した。繁殖の間、プロセスは、統合された制御システムによって、温度、ｐＨおよび溶存酸素に関して自動的にモニターおよび制御された。
【０５１４】
１ｍＬのＷＣＢをピペッティングして１００ｍＬのＴＳＢに入れることにより、ＷＣＢから一晩培養を開始し、ＯＤ６００がおよそ４になるまでおよそ１２〜１６時間増殖させた。次に、１００ｍＬの一晩培養物を、波動バッグへと無菌的に移動することにより生産培養への接種に使用した。
【０５１５】
接種後４時間目に、２００ｍＬのグルコースを培養物に添加した。７．５〜８．５の間のＯＤ６００になるまで増殖を進めた。この値は、およそ１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬに対応する。
【０５１６】
ＯＤ６００が目標濃度に達したら、培養バッグを、Ｒｅａｄｙｍａｔｅを使用して、製剤緩衝液に対する濃縮および透析濾過のための無菌ＴＦＦマニフォールドに接続した。ＴＦＦモジュールは、細胞分離適用の低剪断要件のために０．２μｍポアサイズホローファイバーフィルターを使用した。
【０５１７】
蠕動ポンプを使用して、製剤緩衝液でプライミングしたＴＦＦシステムへと発酵培養物を供給した。再循環ループにおけるバルク培養を、８Ｌ／時間の流速に設定した。発酵ブロスを、およそ１０００ｇの質量まで５倍濃縮した。
【０５１８】
収集濃縮物の透析濾過／洗浄を、≧８透析体積（ｄｉａｖｏｌｕｍｅ）（≧８Ｌ）で行った。ＴＦＦに溶接されたサンプリングマニフォールドを使用して、ＴＦＦアセンブリから収集物ＤＳをサンプリングした。各試料バッグポートを除去のためにヒートシールした。
【０５１９】
試料のＯＤ６００を測定し、８．０±０．５のＯＤ６００に達するのに必要とされる希釈体積の量の計算に使用した。要求される量の製剤緩衝液をポンピングして、残余分バッグに入れて、要求される濃度に収集物を希釈した。全ての体積移動は、それぞれのバッグにおける重量変化によって制御された。収集物をサンプリングし、測定して、１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬの要求される製品濃度が達成されたことを確認した。サンプリングマニフォールドを使用して、ＱＣ解析のためにＤＳをサンプリングした。
【０５２０】
ＤＳを、４個の１Ｌ製品バッグにおいて１Ｌアリコートに分配し、第５のバッグには、残っているＤＳの全てを充填した。アセンブリからの除去のために各バッグをヒートシールした。各バッグに、適切な情報について個々にラベルを付け、次いで−８０±１０℃で保管した。
【０５２１】
【表６】
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ＡＤＸＳ−ＨＰＶ液体凍結された製剤のための薬物製品プロセス概要
【０５２２】
薬物製品（ＤＰ）の製造プロセスは、１×１０９ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度までＢＤＳを希釈することと、無菌４ｍＬガラスバイアル内に製剤化されたａｘａｌｉｍｏｇｅｎｅ  ｆｉｌｏｌｉｓｂａｃを無菌的に充填し、１３ｍｍクロロブチルストッパーで塞ぎ、ポリプロピレンディスクを備えるアルミニウムフリップオフ（ｆｌｉｐ−ｏｆｆ）封着で外封着する（ｏｖｅｒ−ｓｅａｌ）ことを含む。プロセスフロー図を図２１に示す。
【０５２３】
１Ｌアリコートで最大５Ｌを含有する、１Ｌバッグ内の凍結原薬（ＤＳ）を、ＤＰの製造まで−８０±１０℃で保管した。３時間を目標として、外界温度でＤＳを解凍して、ＤＰの製造を開始した。
【０５２４】
グレードＡ条件下で、最大５Ｌを、ポンプにより、専用の無菌ガラスカーボイアセンブリへと無菌的に移動した。カーボイ内のプールされたバルク材料を、材料移動の間に８０〜３００ｒｐｍで撹拌し、次いで、無菌管溶接機を使用して、無菌ディスポーザブル充填モジュールに接続した。提案される商業的プロセスのため、１×１０９ＣＦＵ／ｍＬの目標ＣＦＵとなるように、最終製剤緩衝液により１：１０希釈ステップを行った。
【０５２５】
無菌で使い捨ての充填ラインおよび充填針を使用して、脱パイロジェンした（ｄｅｐｙｒｏｇｅｎａｔｅｄ）４ｍＬ（ＤＩＮ  ２Ｒ  Ｉ型ホウケイ酸塩）ガラスバイアルに、蠕動ポンプにより、１．２ｍＬのＤＳを半自動的に充填した。充填されたバイアルを、滅菌クロロブチルストッパーで直ちに塞いだ。充填の間、充填体積は、３００±５０個の充填されたバイアル毎に１個のバイアルで、重量チェックによって制御された。
【０５２６】
完了されたバイアルを、ポリプロピレンディスクを備えるアルミニウム圧着フリップオフ封着で外封着した。バイアルの外側を０．３５％酢酸溶液で拭き取り、１００％目視検査のためにグレードＤ室に移動させた。
【０５２７】
製品の容器閉鎖欠陥または標準に合致しない外観に関して、バイアルを目視により検査した。ラベルを付け包装する場所へと輸送するまで、バルク包装されたバイアルを−８０±１０℃で保管した。
【０５２８】
【表７】
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【０５２９】
【表８−１】
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【０５３０】
【表８−２】
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代替としての凍結乾燥
【０５３１】
薬物製品は、長期保管のために凍結乾燥することもできる。薬物製品の入ったバイアルを、冷蔵温度、一部の実施形態では、約４℃に冷やしておいた凍結乾燥器の棚の上にローディングした。チャンバーのドアを閉鎖し、棚温度を−４℃前後に低下させ、これをその温度に約３０分間保持することにより、製剤の凝固点のすぐ上の温度にバイアルを冷却した。次に、およそ０．５℃／分の速度で棚温度を−４０℃〜−５０℃の間の温度または約−４５℃へとランプさせ、全バイアルが凍結され、製品温度が棚温度に近くなるまで、当該温度を数時間維持することにより、製剤を凍結した。一次乾燥を行うために、チャンバーを真空状態にし、無菌窒素により圧力を約０．０９ｍｂａｒに維持した。棚温度を、−１８℃〜−２２℃の間の温度または約−１８℃まで約１℃／分で上昇させ、最小で約１０時間全製品温度が棚温度を超えるまで当該値に維持した。二次乾燥を行うために、棚温度を、２０℃の最終値まで約０．２℃／分で上昇させ、圧力を約０．０９ｍｂａｒに維持しつつ、その温度に少なくとも２時間保った。この二次乾燥時間の終わりに、棚温度を約１０℃に低下させ、次いで、窒素により圧力を約５００ｍｂａｒに増加させ、凍結乾燥器内でバイアルをストッパーで塞いだ。代表的な凍結乾燥サイクルを表９に示す。
【０５３２】
【表９】
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（実施例２）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの凍結乾燥パラメーターの最適化
【０５３３】
ＡＤＸＳ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）薬物製品は、−８０℃の推奨される保管条件で、２．０％スクロースを含有するリン酸緩衝食塩水（ＫＨ２ＰＯ４、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＫＣｌ、ＮａＣｌ）中に現在製剤化されている。超低温の保管温度は、コールドチェーンメンテナンスおよびサプライチェーンに関する課題を課す。したがって、安定した凍結乾燥された薬物製品（ＤＰ）の開発のための開発プログラムを開始した。プログラムの目標は、−２０℃または２〜８℃における薬物製品の長期保管を支持する凍結乾燥（Ｌｙｏ）プロセスを開発することであった。製剤、細胞のプレコンディショニング、原薬の保管／取り扱い、および凍結乾燥サイクルを開発および最適化するための異なるパラメーターにより、一連の実験を行った。様々なパラメーターの最適化により、２〜８℃および−２０℃の両方における実証された長期（１８カ月間）安定性を有する、安定した凍結乾燥された製剤が開発された。
【０５３４】
下に示す実験において検査されたパラメーターは、製剤パラメーター（緩衝液組成（その中で細胞が凍結乾燥される溶液）、賦形剤組成（安定性に役立つように使用される不活性物質）、および凍結乾燥時のＯＤ６００）を含む。
【０５３５】
製剤、細胞のプレコンディショニング、および凍結乾燥サイクルを開発および最適化するための異なる検査パラメーターにより、一連の実験を行った。検査された製剤パラメーターは、緩衝液組成（その中で細胞が凍結乾燥される溶液）、賦形剤組成（安定性に役立つように使用される不活性物質）、および凍結乾燥時のＯＤ６００を含んだ。検査された細胞のプレコンディショニングパラメーターは、新鮮／凍結（凍結乾燥の前の原薬の保管条件）、凍結乾燥前のストレス応答の誘導（ｐＨおよび／または温度のシフト）、および原薬保持時間／温度（凍結乾燥前に原薬が解凍および保持される条件）を含んだ。検査された凍結乾燥サイクルパラメーターは、一次乾燥棚温度（凍結した水の昇華のための入熱）、二次乾燥棚温度（一次乾燥後に残っている水分の脱離のための入熱）、およびアニーリングステップの追加（氷のポア構造の再編成を可能にし、おそらく一次乾燥を改善するための、０℃を下回る温度への凍結された製剤の加熱）を含んだ。凍結乾燥ランの成功を評定するために測定された成績は、経時的なおよび異なる条件下での（−８０℃における安定性、２〜８℃における安定性、−２０℃における安定性および３０℃における加速された安定性）生存細胞計数（ＶＣＣ）、残留水分、ならびに復元時間を含んだ。
【０５３６】
後述する実験は、凍結乾燥された製品の安定性を増強すると思われるいくつかの知見を同定した：（１）より高い残留水分は、凍結乾燥された製品の安定性を改善した（ＷＰ７−Ｌｙｏ４）；（２）一次乾燥におけるより高い棚温度は、凍結乾燥された製品の安定性を改善した（ＷＰ７−Ｌｙｏ９）；（３）熱ショックによる凍結乾燥前の細胞のプレコンディショニングは、凍結乾燥された製品の安定性を改善した（ＷＰ７−Ｌｙｏ５）；（４）より高いＶＣＣは、より低いＶＣＣと比べて、凍結乾燥された薬物製品の安定性における僅かな改善を実証した（ＷＰ７、サイクル３）；ならびに（５）データは、凍結乾燥前の１Ｌ  ＬＤＰＥバッグにおける原薬の保管および３７℃における解凍が、凍結乾燥された薬物製品の安定性を改善したことを実証する（ＷＰ７、サイクル３）。データは、−２０℃および２〜８℃の両方で長期に安定した凍結乾燥された薬物製品の開発に成功したことを示す。その結果生じる薬物製品は、加速されたおよび意図された保管条件の両方における優れた安定性、ならびに凍結乾燥による低い効力損失を実証した。
【０５３７】
リード製剤を同定および特徴付けするために、５％スクロースおよび５％スクロースプラスアミノ酸（ＡＡ）ミックス（最終濃度：３６ｍＭアルギニン、５７ｍＭグルタミン酸および７ｍＭイソロイシン）を有する２種のリン酸塩に基づく製剤の同定をもたらす、Ｌｙｏ１およびＬｙｏ２実験を行った。これらのリード製剤の特徴付けは、これらの臨界温度が互いに近いことを示し、両方の製剤のための１サイクルの開発を可能にした。残留水分目標および評価実験であるＬｙｏ３およびＬｙｏ４は、２．５％のスクロースレベルにおいてより高い水分レベルに関する最良の結果を示し、さらなるサイクル開発のために２．５％におけるスクロースレベルの最適化を可能にした。
【０５３８】
凍結乾燥サイクル開発試験のための評価の３つの主要分野は、次のものを含んだ：（１）緩衝液および賦形剤のスクリーニングのための製剤開発；（２）凍結乾燥前の細胞のプレコンディショニングのための細胞培養開発；ならびに（３）目標残留水分（ＲＭ）のための凍結乾燥サイクルの最適化。検査された異なるパラメーターにより凍結乾燥（ｌｙｏ）サイクル開発において行われた一連の実験を、表１０に要約する。
【０５３９】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【表１０−３】
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実験の説明
２．１．凍結乾燥製剤のスクリーニングおよび特徴付け
【０５４０】
さらなるサイクル開発において続けることができる優れた安定性を有する２〜３種のリード製剤の同定、最適化および特徴付けのため、２種の凍結乾燥実験（Ｌｙｏ１、Ｌｙｏ２）を遂行し、６カ月間の安定性データを作成した。本試験のリード製剤を次に、その臨界温度Ｔｃ（崩壊温度）、Ｔｇ’（凍結された製剤のガラス転移温度）およびＴｇ（凍結乾燥された製品のガラス転移温度）に関して特徴付けた。
【０５４１】
Ｌｙｏ１において使用された製剤は、クエン酸塩、リン酸塩およびＭＯＰＳに基づく製剤であった。Ｌｙｏ２において使用された製剤は、リン酸塩に基づく製剤のみであったが、その理由として、リン酸塩に基づく製剤は、クエン酸塩およびＭＯＰＳに基づく緩衝液と比較してより良い性能を有し、現在の原薬製剤に最も近いことから、最小のプロセス変化を要求したことが挙げられる。
２．１．１．ＷＰ５−Ｌｙｏ１
【０５４２】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２薬物製品を本試験に使用した。ＯＤ６００＝１０を評価した。製剤において使用された緩衝液および賦形剤は、次の通りであった：製剤において３種の異なる緩衝液を使用した：クエン酸塩；リン酸塩；およびＭＯＰＳ（３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸）。製剤において使用された安定剤ミックス構成成分（賦形剤）は、スクロース、トレハロース、グルタミン酸一ナトリウム（ＭＳＧ）および組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ）の様々な組合せを含んだ。
【０５４３】
試験設計。６種の異なる賦形剤組合せと組み合わせた３種の異なるｐＨ緩衝液は、１８種の異なる製剤をもたらした。製剤毎に、２０×６Ｒバイアルに、２ｍＬを充填し、約６．５４ｍｍのケーキ高さをもたらした。３６０個のバイアルを、凍結乾燥機械の３つの棚の上にランダムに分配して、周縁効果を平均化した。約４４時間３０分後に凍結乾燥ランを完了した。６００ｍｂａｒの０．２μｍ濾過空気によりバイアルを閉鎖した。バイアルを２℃〜８℃保管へと移動させ、圧着した。凍結乾燥の直後および６カ月間の保管後に残留水分を測定した。凍結乾燥の前および後の生存細胞計数（ＶＣＣ）ならびに対応する％生存データを解析した。細胞培養物１ｍＬ当たりに存在する微生物の総生存細胞計数を決定するために、延展プレート方法を使用した。生存細胞計数を行うために使用される培地は、変動する場合があり、その微生物の増殖要件によって決定される。トリプチケースソイ寒天（Ｔｒｙｐｔｉｃａｓｅ  Ｓｏｙ  Ａｇａｒ）（ＴＳＡ）においてＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ試料を培養した。
【０５４４】
結果。リン酸塩およびクエン酸塩に基づく緩衝液は、匹敵する回収結果を生じた。図１を参照されたい。残留水分（ＲＭ）解析は、ＭＳＧの添加が、全緩衝系においてＲＭを約１．０％〜１．５％増加させたことを明らかにした。ＭＳＧなしでは、ＲＭ値は、約１．８％〜約３．０％に及んだ。％ＲＭの増加または減少の明らかな傾向はなく、アッセイ間可変性を指し示す。
【０５４５】
ある１つの緩衝系の明らかな優位性はなく、リン酸塩は、ごく僅かなプロセス変化を要求するため、多変量データ解析（ＭＶＤＡ）は、リン酸塩に基づく製剤開発を続ける決断を確認した。図１を参照されたい。４℃における安定性を使用した回帰直線は、５：０：０：０安定剤ミックス組合せ（スクロース：トレハロース：ＭＳＧ：ｒＨＳＡ）において、最も一貫性を示した。図１を参照されたい。
【０５４６】
ＭＶＤＡ解析は、加速された安定性試験において、３０℃で３日間保管された試料が、４℃で６カ月間保管された試料と匹敵する回収を示すことも示した。図２Ａおよび図２Ｂを参照されたい。この結果は、より高い保管温度が、より速い生存率損失をもたらすことと、加速された条件が、２℃〜８℃における長期保管の予測可能なデータとなり得ることを指し示した。ｌｙｏケーキ外観は、全体的に優れており、大きな欠陥も再融解（ｍｅｌｔ−ｂａｃｋ）もなかった。スクロースに基づく製剤は、周縁（バイアルの頭頂部および底）に僅かなケーキ縮小を示した。３０℃で３日間におけるＶＣＣの変化は、４℃で６カ月間に見られる変化と同様であった。図２２Ａは、Ｌｙｏ１実験における、凍結乾燥の前、および異なる時間量の異なる温度での保管後の凍結乾燥後のＶＣＣデータ（平均凍結乾燥前ＶＣＣのパーセント）を示す。３０℃で３日間の加速された安定性は、４℃における６カ月間の安定性と同様であった。図２２Ｂは、Ｌｙｏ１実験における凍結乾燥の直後および２〜８℃で６カ月後の残留水分を示す。
２．１．２．ＷＰ７−Ｌｙｏ２
【０５４７】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２薬物製品を本試験に使用した。２〜２０に及ぶＯＤ６００値（バイアル内のＯＤは、細胞濃度を代表する）を評価し、２種の異なる最終ＯＤ６００値を評価した：ＯＤ６００＝１０（Ｌｙｏ１と同じ）；およびＯＤ６００＝２．０。使用された緩衝液は、リン酸塩に基づく緩衝液であり、使用された安定剤ミックス構成成分（賦形剤）は、スクロース、アミノ酸（ＡＡ）ミックスおよびｒＨＳＡを含んだ。
【０５４８】
試験設計。１種のｐＨ緩衝液、９種の異なる賦形剤組合せ、および２種の細菌濃度は、１８種の異なる製剤をもたらした。Ｌｙｏ１と同様に凍結乾燥ランを行った。凍結乾燥の前の試料、凍結乾燥の前の凍結された試料（−８０℃）、凍結乾燥の後の試料、ならびに凍結乾燥の後かつ１、２、３、６、９、１２または１８カ月間２〜８℃、−２０℃および−８０℃での保管後の試料において、ＶＣＣを評定した。
【０５４９】
結果。ＯＤ６００＝２およびＯＤ６００＝１０群の両方において、最高の回収は、スクロースのみ製剤によるものであった：ＯＤ６００＝１０における２．５％；およびＯＤ６００＝２．０における５％スクロース。Ｌｙｏ１に沿って、製剤および残留水分の間に相関があった。スクロースのみまたはスクロース＋ＡＡの混合物を含有する製剤は、より乾燥していたｒＨＳＡ製剤と比較してより良い残留水分を有していた。凍結乾燥の後と比較した６カ月目のパーセントＲＭは、全試料で増加した。ＭＶＤＡ解析は、ｒＨＳＡが、安定性に有害効果を有することを示した。最高の回収（および最低の可変性）が、最低スクロース濃度（２．５％）およびより高いＯＤ６００値（１０対２）で観察された。ｌｙｏケーキ外観は、Ｌｙｏ１と同様であり、２種のＯＤ６００バイアルの間に有意差はなかった。図３は、異なるＯＤレベルおよび安定剤組合せ（ＯＤ、安定剤）のＶＣＣデータを示す。２．０、３．０、１０．０、１２．５、１５．０、１７．５および２０．０のＯＤレベルを検査した。必要に応じてＡＡミックスと組み合わせて、２％および５％スクロースを含む安定剤を検査した。凍結乾燥の前の計数のパーセンテージとしてのＶＣＣは、全ＯＤレベルおよび安定剤組合せで同様の傾きを示した。−２０℃で１カ月間保管された凍結乾燥試料は、中間のＶＣＣ結果を示した。図２３Ａは、Ｌｙｏ２実験における、凍結乾燥の前の、および異なる温度で異なる時間量（月数）の保管後の凍結乾燥後のＶＣＣデータ（平均凍結乾燥前ＶＣＣのパーセント）を示す。図２３Ｂは、Ｌｙｏ２実験における、凍結乾燥の直後および２〜８℃で６カ月後の残留水分を示す。
【０５５０】
【表１１】
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【０５５１】
結論。本試験では、Ｌｙｏ１における１８種の異なる製剤およびＬｙｏ２における９種の異なる製剤を解析した。Ｌｙｏ１およびＬｙｏ２由来の２種の製剤は同一であり、したがって、総計１８＋７＝２５種の異なる製剤を解析した（Ｌｙｏ１の製剤−１は、Ｌｙｏ２の製剤−２であり、Ｌｙｏ１の製剤−５は、Ｌｙｏ２の製剤−６である）。Ｌｙｏ１由来のＶＣＣ結果に基づき、リン酸塩の優位な性能および現在のプロセスに対するごく僅かな変化に基づいて、リン酸塩に基づく製剤によりＬｙｏ２における最適化を行った。Ｌｙｏ１のリード製剤は、５％スクロースであり、これは、Ｌｙｏ２における他の緩衝液と比較してより良いまたは等しく良い成績であった。Ｌｙｏ２において、アミノ酸混合物は、長期保管の際に追加的な保護効果を示すと予想された。次に、Ｌｙｏ１のリード製剤（５％スクロース）およびアミノ酸による製剤の両方を、それらの臨界温度（Ｔｃ、ＴｇおよびＴｇ’）に関して特徴付けたところ、これらは、互いに近いことが判明し、両方の製剤に対する単一のサイクルの開発を可能にした。
２．２．残留水分目標
【０５５２】
凍結乾燥サイクルにおいて試料を乾燥させるプロセスに関する情報を得て、二次乾燥および残留水分含量の間の相関を確立するために、Ｌｙｏ３実験を行った。これにより、将来の凍結乾燥実験における特異的な残留水分含量を目標とすることが可能となった。
２．２．１．ＷＰ５−Ｌｙｏ３
【０５５３】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２薬物製品を本試験に使用した。使用された製剤は、リン酸塩に基づき、２．５％スクロース、５％スクロースおよび１０％スクロースを有した。安定剤ミックスは、スクロース、ＡＡミックスおよびｒＨＳＡの異なる組合せを含んだ。２種の異なるＯＤ６００値を評価した：ＯＤ６００＝１０およびＯＤ６００＝２．０。
【０５５４】
試験設計。４℃で１３日間、１カ月間、３カ月間および６カ月間、安定性を検査した。３０℃で１日間、２日間または３日間で加速する前に１３日間４℃で保管された試料を使用して、加速された安定性を検査した。ＶＣＣを凍結乾燥の前に測定し、ＶＣＣおよびＲＭを凍結乾燥の後および安定性に関して測定し、ＲＭを凍結乾燥の後に測定した。
【０５５５】
乾燥させるプロセスに関する情報を得るために、サイクルを異なる時点で中断して、試料を採取して、残留水分（ＲＭ）を解析した。第１の試料は、一次乾燥の終わりに即座に採取した。二次乾燥に向けたランプにおいて０．２℃／分の加熱速度を使用し、二次乾燥に向けたランプの直後にさらに試料を採取した。二次乾燥を＋２０℃で８時間（Ｌｙｏ２よりも３時間長い）行った。試料を２時間毎に採取し、直ちに解析した。生のＲＭデータに基づき、＜１％の目標に達していない場合、二次乾燥を延長することができる。
【０５５６】
結果／結論。図４に示す通り、未加工のＶＣＣレベルから、ｒＨＳＡの増加が、不安定性に関連し、計数が、ＯＤ６００＝１０においてより高く、結果の最低の可変性が、低レベルのスクロース（２．５％）において見られたことが明らかである。この結果は、６カ月間のデータによって補強される。
【０５５７】
図５に示す通り、水分の結果は、ＯＤに基づく差異をほとんど示さず、１０％および５％のスクロースレベルにおけるｒＨＳＡ増加に伴うより低いＲＭ、ならびに最低レベルのスクロース（２．５％）およびｒＨＳＡなしで結果の最低の可変性を示す。
【０５５８】
これらの実験は、一次乾燥の終わり、二次乾燥に向けたランプの終わり、および二次乾燥における異なる時点を含む別個のプロセスステップにおいてフリーズドライヤーの中から製品を採取することにより、約５％〜＜１％の所望の範囲内のＲＭを有する材料を作製することができることも示した。
２．３  安定性における最適残留水分の評価
【０５５９】
凍結乾燥の後の目標残留水分および回収を最適化するために、Ｌｙｏ４安定性試験を行った。
２．３．１  ＷＰ７−Ｌｙｏ４
【０５６０】
ＷＰ７−Ｌｙｏ３において作成されたデータは、別個のプロセスステップ：（１）一次乾燥の終わり；（２）二次乾燥に向けたランプの終わり；および（３）二次乾燥における異なる時点においてフリーズドライヤーから試料を除去することにより、約５％〜＜１％の目標とされた範囲内の残留水分を有する材料を作製することができることの原理の証明を実証した。初期データに基づき、２〜８℃における長期安定性試験のためおよび３０℃、６５％ＲＨにおける短期の加速されたストレス安定性のための材料を作製した。％残留水分（ＲＭ）目標は、約５％、約３％および約１％であった。その時点で利用できた利用可能な全データに基づき、２種のリード製剤：（１）リン酸緩衝液、ｐＨ７．２、５％スクロース；および（２）リン酸緩衝液、ｐＨ７．２、２．５％スクロースのための材料が作製された。
【０５６１】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２薬物製品を本試験に使用した。使用された製剤は、リン酸塩に基づき、２．５％スクロースおよび５％スクロースを有した。ＯＤ６００値は、ＯＤ６００＝２０（約２×１０１０ＣＦＵ／ｍＬ）であった。別個のプロセスステップ：（１）一次乾燥の終わり（残留水分目標約５％）；（２）二次乾燥に向けたランプの終わり（残留水分目標約３％）；および（３）二次乾燥の終わり（残留水分目標約１％）においてフリーズドライヤーの中から試料を除去することにより、水分レベルを制御した。
【０５６２】
試験設計。初期ＯＤ値が２０であったことを除いてＬｙｏ３と同様に、凍結乾燥ランを行った。Ｌｙｏ２に記載されている通りに、ＯＤ６００約２０（約２×１０１０ＣＦＵ／ｍＬ）となるように、細菌を生育させ、遠心分離によって濃縮した。凍結乾燥サイクルにおける試料を採取した局面によって、水分レベルを制御した：（１）高い水分；一次乾燥後；水分約５．４〜５．８％；（２）中間の水分；ランプ後（一次乾燥温度から二次乾燥温度への棚温度のランプの直後）；水分約３．７〜４．５％；および（３）低い水分；二次乾燥後；水分約１．１〜１．３％。第１の試料は、一次乾燥の終わりに即座に採取し（ＲＭ目標は約５％）、試料の第２のロットは、二次乾燥に向けたランプの直後に採取した（ＲＭ目標は約３％）。二次乾燥を１２時間行い、その後、試料の第３のロットを除去した（ＲＭ目標は約１％）。除去後に、全バイアルを圧着し、２〜８℃で保管した（後のストレス安定性試験のためのバイアルを含む）。凍結乾燥の前、凍結乾燥の後、ならびに１、２および３日間の加速された条件（３０℃）におけるＲＭおよびＶＣＣを解析した。ＶＣＣ力価を、計数および凍結乾燥の前の計数のパーセントの両方として測定した。
【０５６３】
結果。本試験において達成された水分は、以前に見られた水分を一括する（ｂｒａｃｋｅｔ）。Ｌｙｏ４およびＬｙｏ２試験を組み合わせ、スクロース２．５％および５．０％のみに着目し、ｒＨＳＡによる試験への全参照を除去すると、加速された条件における比較性が見られた。最良の結果は、２．５％のスクロースレベルに関してより高い水分レベルであった。図６に示す通り、本試験において達成されたＲＭは、以前に見られた水分を「一括する」。個々の値および平均の両方としてＲＭ結果を示す。点線は、Ｌｙｏ２の長期試験において見られた結果の範囲（高および低）の輪郭を描く。加速された条件での比較性を図７Ａ、図７Ｂ、図２４Ａおよび図２４Ｂに示す。図７Ａおよび図７Ｂに示す通り、最良の結果は、２．５％のスクロースレベルに関してより高い水分レベルである。図２４Ａは、Ｌｙｏ４実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、一次乾燥後、ランプ後、および二次乾燥後の、２．５％スクロースを使用した残留水分（ＲＭ）を示す。図２４Ｂは、Ｌｙｏ４実験における、異なる時間量の異なる温度での保管後の、一次乾燥後、ランプ後、および二次乾燥後の、５．０％スクロースを使用した残留水分（ＲＭ）を示す。
【０５６４】
結論。本試験は、より高い残留水分（ＲＭ）が、ＯＤ６００＝２０における加速された条件下でより良いＶＣＣプロファイルをもたらすことを確認した。加速された安定性において得られた最良のＶＣＣプロファイルは、２．５％のスクロースレベルに関してより高い水分レベルであった。したがって、スクロースレベルは、２．５％に固定され、将来の開発実験のための目標残留水分レベルは、２．５〜３．５％を目標とした。
２．４．凍結乾燥前のストレス処理の評価
【０５６５】
凍結乾燥前のストレス処理および凍結乾燥された材料の安定性におけるその効果を評価するために、Ｌｙｏ５を行った。本試験は、発酵プロセスにおいて経験される可能性があるストレス条件をシミュレートした。
【０５６６】
細胞に対する寒冷ショック、熱ショックおよび浸透圧ショックは、一般ストレス応答に関与する遺伝子の発現を誘導することができる。これらのショック条件に対する遺伝的応答は、ストレス損傷および死からの細胞の防御に必要である。よって、凍結乾燥におけるより優れた細胞生存は、ストレス応答を活性化させることにより達成することができる。凍結乾燥前のＬｍにおけるストレス応答の誘導、および凍結乾燥された材料の安定性におけるその効果を評価するために、ＷＰ７−Ｌｙｏ５を行った。本試験は、製剤化および凍結乾燥前に、ｐＨシフトまたは寒冷ショックのいずれかによってストレス応答を誘導した。
２．４．１．ＷＰ７−Ｌｙｏ５
【０５６７】
ＷＰ７−Ｌｙｏ５の試験目標は、Ｌｍにおけるストレス応答（寒冷ショックおよびｐＨシフト）の誘導が、復元された薬物製品における生存率を改善することができるか評価することであった。
【０５６８】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２薬物製品を本試験に使用した。実験は、次の４種のアーム（ａｒｍ）で構成された：（１）群−１：対照培養；（２）群−２：温度シフト培養；（３）群−３：ｐＨシフト培養；ならびに（４）群−４：ｐＨおよび温度シフト培養（先ずｐＨシフト、続いて温度シフト）。温度シフトおよびｐＨシフトを達成するために、生物反応器からの細胞の収集の直後に、細胞を、氷浴中に置いた、または酸の添加によりｐＨを降下させた。この操作は、細胞においてストレス応答を誘導し、これにより、凍結乾燥のために細胞をより良く準備させると思われる遺伝子のセットが活性化される。製剤は、リン酸塩に基づき、２．５％スクロースを有し、残留水分目標は、３．５％であり、ＯＤ６００＝１０（約１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬ）であった。６Ｒバイアルに、およそ２ｍＬの薬物製品を充填した。３０℃で１、２および３日間、加速された安定性を評価した。
【０５６９】
試験設計。生物反応器内の材料が、目標ＯＤ６００に達したら、群−１（対照）および群−２（温度シフト）のための材料を除去した。製剤化されたバルク（バルク原薬）が得られるまで、群−１のための材料をさらに加工し、これは次いで、バイアル充填まで２〜８℃で保管した。群−２に関して、氷／塩／水浴において温度シフトを行い、その後、材料を２〜８℃で３０分間保管した。次に、製剤化されたバルクが得られるまで、材料をさらに加工し、これは、バイアル充填まで２〜８℃で保管した。その一方で、ｐＨ＝５．２５となるまで２Ｍ  ＨＣｌを使用して、生物反応器内でｐＨシフトを行った。次に、群−３（ｐＨシフト）および群−４（ｐＨ／温度シフト）のための材料を除去した。製剤化されたバルクが得られるまで、群−３由来の材料をさらに加工し、バイアル充填まで２〜８℃で保管した。群−４に関して、上述の通りに温度シフトを行い、材料を２〜８℃で３０分間保管した。次に、製剤化されたバルクが得られるまで、材料をさらに加工した。全群のための製剤化されたバルクが得られたら、ＶＣＣを解析し、凍結乾燥を開始した。
【０５７０】
Ｌｙｏ４と同様に、凍結乾燥ランを行った。３．５％の目標残留水分のため、２時間の二次乾燥時間を使用した。凍結乾燥の前、凍結乾燥の後、ならびに１、２および３日間の加速された条件（３０℃）において、ＶＣＣを解析した。ＶＣＣ力価を測定し、計数および凍結乾燥の前の計数のパーセントの両方として表現した。
【０５７１】
結果。−２０℃および２〜８℃の両方で３および６カ月間（ならびに９、１２および１８カ月間）におけるデータは、全４群にわたる優れた比較性を実証する。図８（ＶＣＣ）および図２５（ＲＭ）を参照されたい。図８は、−２０℃、２〜８℃での安定性および加速された安定性において評価された実験条件（ｐＨシフト、温度シフト、ｐＨ／温度シフトおよび対照）毎の凍結乾燥の後のＶＣＣのパーセンテージを示す。図２５は、２〜８℃での安定性において評価された実験条件（ｐＨシフト、温度シフト、ｐＨ／温度シフトおよび対照）毎のＴ＝０での残留水分レベルを示す。温度シフト条件は、対照またはｐＨシフトと比較して、長期安定性においてより安定したプロファイルを示した。
【０５７２】
データは、試験の他のアームと比べて、温度シフト試料に関して、−２０℃および２〜８℃の両方で優れた安定性プロファイルを実証した。ｐＨシフトまたはｐＨ＋温度シフト前処理に対する利益があるとは思われない。データは、凍結乾燥前の細胞のプレコンディショニングが、製品の長期安定性を増加させることができることを指し示す。データは、処理アームにわたるまたは長期保管における残留水分に関していかなる明らかな傾向も示さない。
【０５７３】
結論。本試験は、対照またはｐＨシフトと比較して、長期安定性および加速された安定性条件におけるより安定したプロファイルが、温度シフト条件により得られたことを示した。
２．５．凍結乾燥前の温度シフトの評価
【０５７４】
凍結乾燥前の温度シフト処理、および凍結乾燥された材料の安定性におけるその効果を評価するために、Ｌｙｏ６を行った。本試験は、発酵プロセスにおいて経験される可能性があるストレス条件をシミュレートし、凍結乾燥における凍結プロセスに対して細胞をコンディショニングするための尺度であった。
２．５．１．ＷＰ７−Ｌｙｏ６
【０５７５】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＰＶ薬物製品を本試験に使用した。対照群は含まれなかった。製剤は、リン酸塩に基づき、２．５％スクロースを有し、残留水分目標は、３．５％であり、ＯＤ６００＝１０であった。
【０５７６】
試験設計。生物反応器内の材料が、目標ＯＤ６００に達したら、要求される体積を収集し、氷／塩／水浴において温度シフトを行い、その後、材料を２〜８℃で３０分間保管した。次に、製剤化されたバルクが得られるまで、材料をさらに加工した。凍結乾燥ランの前および後にＶＣＣを解析し、これは、Ｌｙｏ５と同様に、１、２および３日間の加速された条件（３０℃）で行った。ＶＣＣ力価を測定し、計数および凍結乾燥の前の計数のパーセントの両方として表現した。
【０５７７】
結果。ＡＤＸＳ−ＨＰＶに関する加速された結果は、ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２に匹敵した。１カ月間の安定性は、加速された安定性の結果と一致した。図９（ＶＣＣ）および図２６（ＲＭ）を参照されたい。データは、短期の加速された条件下での優れた安定性を実証する。−２０℃におけるデータは、１２カ月目で優れた安定性を示す一方、２〜８℃保管は、１２カ月後にＶＣＣの損失を示し始める。データは、−２０℃または２〜８℃のいずれかでの長期保管におけるＲＭに明らかな傾向を示さない。
【０５７８】
結論。本試験は、凍結乾燥されたＡＤＸＳ−ＨＰＶ構築物が、ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２と一致した結果を生じたことを確認し、構築物にわたる凍結乾燥プラットフォームの適用性を実証した。
２．６．低下した一次乾燥棚温度および低下した凍結温度の評価
【０５７９】
凍結温度および一次乾燥棚温度、ならびに凍結乾燥された材料の安定性におけるこれらの効果を評価するために、Ｌｙｏ７を行った。
２．６．１．ＷＰ７−Ｌｙｏ７
【０５８０】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＰＶ薬物製品を本試験に使用した。対照群は含まれなかった。製剤は、リン酸塩に基づき、２．５％スクロースを有し、残留水分目標は、３．５％であり、ＯＤ６００＝１０であった。使用された安定性条件は、２〜８℃、−２０℃、ならびに３０℃で１、２および３日間の加速された条件であった。
【０５８１】
試験設計。生物反応器内の材料が、目標ＯＤ６００に達したら、要求される体積を収集し、氷／塩／水浴において温度シフトを行い、その後、材料を２〜８℃で３０分間保管した。次に、製剤化されたバルクが得られるまで、材料をさらに加工した。−４０℃から−４５℃へと減少させた凍結温度により、凍結乾燥ランを行い、一次乾燥棚温度を−２２℃から−３０℃へと減少させた。凍結乾燥の前および後に、ならびに加速された条件で、ＶＣＣを解析した。ＶＣＣ力価を測定し、計数および凍結乾燥の前の計数のパーセントの両方として表現した。
【０５８２】
結果。減少させた棚温度による加速された安定性において、有意な損失が観察された。図１０（ＶＣＣ）および図２７（ＲＭ）を参照されたい。凍結の際の棚温度の減少は、凍結乾燥された製品の安定性を改善しなかった。
２．７．保持時間試験
【０５８３】
薬物製品（ＤＰ）が、製剤化の直後に凍結乾燥される、または凍結され、解凍され、次いで凍結乾燥されるいずれかの場合の、保持時間試験を行った。
２．７．１．ＷＰ７−Ｌｙｏ８
【０５８４】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＰＶ薬物製品を本試験に使用した。製剤は、リン酸塩に基づき、２．５％スクロースを有し、残留水分目標は、３．５％であり、最終製剤化材料のＯＤ６００＝１０であった。使用された安定性条件は、２〜８℃、−２０℃、ならびに３０℃で１、２および３日間の加速された条件であった。
【０５８５】
試験設計。ある群（パートＡ）において、試料は直ちに凍結乾燥した。他の群（パートＢ）において、試料は、−８０℃で凍結し、２〜８℃で一晩解凍し、次いで凍結乾燥した。ｌｙｏ前、ｌｙｏ後、ならびに１、２および３日間の加速された条件（３０℃）におけるＶＣＣを解析した。ＶＣＣ力価を測定し、計数および凍結乾燥の前の計数のパーセントの両方として表現した。
【０５８６】
結果。パートＡ（連続的加工）は、パートＢ（凍結保持）と比較して、加速された条件下でより良い安定性プロファイルを実証した。図１１（ＶＣＣ）および図２８（ＲＭ）を参照されたい。
２．８．増加させた一次乾燥棚温度の評価
【０５８７】
一次乾燥における増加させた棚温度、および凍結乾燥された材料の安定性におけるその効果を評価するために、Ｌｙｏ９を行った。
２．８．１．ＷＰ７−Ｌｙｏ９
【０５８８】
より低い一次乾燥棚温度が、その結果生じる薬物製品の安定性を低下させたという以前の観察に基づき、ＷＰ７−Ｌｙｏ９の目標は、新鮮に（連続的に加工された）凍結乾燥された原薬ＡＤＸＳ１１−００１（ＨＰＶ）の安定性における一次乾燥におけるより高い棚温度の効果を評価することであった。一次乾燥における−１８℃の棚温度を評価した。凍結乾燥された材料を、２〜８℃および−２０℃における安定性に関してステージ分類した。さらに、３０℃／６５％ＲＨで１、２および３日間の加速された安定性を加える。
【０５８９】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＰＶ薬物製品を本試験に使用した。−１８℃の棚温度を評価した。先の実験と同様に、温度シフトを行った。製剤は、リン酸塩に基づき、２．５％スクロースを有し、残留水分目標は、３．５％であり、ＯＤ６００＝１０であった。使用された安定性条件は、２〜８℃、−２０℃、ならびに３０℃で１、２および３日間の加速された条件であった。
【０５９０】
試験設計。生物反応器内の材料が、目標ＯＤ６００に達したら、要求される体積を収集し、氷／塩／水浴において温度シフトを行い、その後、材料を２〜８℃で３０分間保管した。次に、製剤化されたバルクが得られるまで、材料をさらに加工した。−１８℃の一次乾燥棚温度により、凍結乾燥ランを行った。凍結乾燥の前および後に、ならびに加速された条件で、ＶＣＣを解析した。ＶＣＣ力価を測定し、計数および凍結乾燥の前の計数のパーセントの両方として表現した。
【０５９１】
結果。図１２は、３０℃、−２０℃および２〜８℃での安定性に関して評価された、凍結乾燥の後の％ＶＣＣを示す。図２９は、３０℃、−２０℃および２〜８°での安定性に関して評価された残留水分レベルを示す。データは、−２０℃および２〜８℃の両方が、最大１２カ月間安定することを実証する。棚温度増加により、加速された安定性における改善が観察された。図１２（ＶＣＣ）および図２９（ＲＭ）を参照されたい。一般に、本試験で見られた崩壊の種類を引き起こすのに十分に高い一次乾燥棚温度におけるタンパク質の凍結乾燥は、凍結乾燥されたケーキにおける安定性低下をもたらす。しかし、この全細菌製剤の傾向は、反対であると思われる。
【０５９２】
結論。本試験は、増加させた一次乾燥棚温度が、凍結乾燥された製品の加速されたおよび長期の安定性における改善をもたらすことを示した。
２．９  増加させた一次乾燥温度（−１８℃）におけるプラス／マイナス温度シフトの比較
【０５９３】
Ｔｓ＝−１８℃の上昇された一次乾燥温度におけるマイナス［パートＡ］／プラス［パートＢ］温度シフトを比較するために、Ｌｙｏ１０安定性試験を行った。
２．９．１．ＷＰ７−Ｌｙｏ１０
【０５９４】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＰＶ薬物製品を本試験に使用した。−１８℃の棚温度を２群の材料に関して評価した：（１）パートＡ材料  −  収集の直後に加工（温度シフトなし）；および（２）パートＢ材料  −  温度シフトを行った。
【０５９５】
製剤は、リン酸塩に基づき、２．５％スクロースを有し、残留水分目標は、３．０％であり、ＯＤ６００＝１０であった。使用された安定性条件は、２〜８℃、−２０℃、ならびに３０℃で１、２および３日間の加速された条件であった。
【０５９６】
試験設計。生物反応器内の材料が、目標ＯＤ６００に達したら、パートＡおよびパートＢの両方に要求される体積を収集した。パートＡは、バイアル充填まで直ちに加工し、パートＢについては、氷／塩／水浴において温度シフトを行い、その後、材料を２〜８℃で３０分間保管した。次に、パートＡおよびパートＢ材料を、製剤化されたバルクが得られるまでさらに加工した。−１８℃の一次乾燥棚温度および２時間の二次乾燥時間により、凍結乾燥ランを行い、３．０％の残留水分を目標とした。凍結乾燥の前および後に、ならびに加速された条件で、ＶＣＣを解析した。ＶＣＣ力価を測定し、計数および凍結乾燥の前の計数のパーセントの両方として表現した。
【０５９７】
結果。増加させた棚温度により、結果は、温度シフトありおよびなしに匹敵した。図１３（ＶＣＣ）および図３０（ＲＭ）を参照されたい。結果は、増加させた棚温度に関して以前に観察された優れた安定性プロファイルを確認した。
２．１０．−１８℃の一次乾燥温度における温度シフトなしの安定性試験、および生物活性決定
【０５９８】
Ｌｙｏ１０の結果を確認するために、−１８℃の上昇された一次乾燥温度において温度シフトなしでＬｙｏ１１安定性試験を行った。次に、凍結乾燥された薬物製品の生物活性を、液体凍結された薬物製品と比較した。
２．１０．１．ＷＰ７−Ｌｙｏ１１
【０５９９】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＰＶ薬物製品を本試験に使用した。−１８℃の棚温度を温度シフトなしで評価した。製剤は、リン酸塩に基づき、２．５％スクロースを有し、残留水分目標は、２．５〜３．０％であり、ＯＤ６００＝１０であった。使用された安定性条件は、２〜８℃、−２０℃、ならびに３０℃で１、２および３日間の加速された条件であった。
【０６００】
試験設計。生物反応器内の材料が、目標ＯＤ６００に達したら、要求される体積を収集し、製剤化されたバルクが得られるまで直ちに加工した。−１８℃の一次乾燥棚温度により、凍結乾燥ランを行い、２．５〜３．０％の残留水分を目標とした。凍結乾燥の前および後に、ならびに加速された条件で、ＶＣＣを解析した。ＶＣＣ力価を測定し、計数および凍結乾燥の前の計数のパーセントの両方として表現した。
【０６０１】
結果。データは、棚温度を増加させた場合、許容される結果を達成するために温度シフトが必要とされないことを示す。図１４（ＶＣＣ）および図３１（ＲＭ）を参照されたい。凍結乾燥された試料は、２〜８℃および−２０℃保管の両方に関して、１２カ月間まで安定である。
【０６０２】
Ａｄｖｓ１１凍結された製剤（５２７１−１５−０１）、ｌｙｏ１１（５２７７  ＷＰ７  Ｌｙｏ１１）凍結乾燥された製剤、およびＸＦＬ７−ｔＬＬＯ−陰性対照株を使用して、２および２０のＭＯＩでＴＨＰ１細胞を感染させた。１０−ｍｅｒペプチド（ＹＭＬＤＬＱＰＥＴＴ、配列番号１００）を陽性対照として使用した。次に、感染させた細胞を２０〜２４時間発動させ（ｉｎｖｏｃａｔｅ）、捕集し、１０−ｍｅｒペプチドに特異的なＴ細胞と組み合わせた。１８〜２４時間後、Ｔ細胞ＩＦＮγ分泌を決定した。低いＭＯＩでは、凍結乾燥された製剤は、Ｔ細胞においてより高いＩＦＮγ産生を誘導した。より高いＭＯＩでは、凍結乾燥された製剤は、ＩＦＮγ産生の同様の誘導を示した。凍結乾燥された製剤のパーセント生細胞は、９５％であった。生物活性における損失は、凍結乾燥された製品に関して観察されず、低いＭＯＩに関して、生物活性は増加した。図３９を参照されたい。
２．１１．新鮮ｖｓ．異なる解凍による凍結材料の安定性試験
【０６０３】
Ｌｙｏ８、Ｌｙｏ１０およびＬｙｏ１１から得られた結果を確認するために、安定性試験Ｌｙｏ１２を行い、この試験において、新鮮および凍結材料の間で比較が為され、凍結材料は、異なる仕方で解凍される。
２．１１．１．ＷＰ７−Ｌｙｏ１２
【０６０４】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＰＶ薬物製品を本試験に使用し、温度シフトは行わなかった。製剤は、リン酸塩に基づき、２．５％スクロースを有し、残留水分目標は、２．５〜３．０％であり、ＯＤ６００＝１０であった。使用された安定性条件は、２〜８℃、−２０℃、ならびに３０℃で１、２および３日間の加速された条件であった。検査された群は、次の通りであった：（１）群Ａ：対照、即座に凍結乾燥；（２）群Ｂ：＜−７０℃で凍結、２〜８℃で解凍；および（３）群Ｃ：＜−７０℃で凍結、水浴において３７℃で解凍、次いで４時間３７℃でインキュベート。
【０６０５】
試験設計。生物反応器内の材料が、目標ＯＤ６００に達したら、材料を収集し、パートＡ、ＢおよびＣのために３個のアリコートに分割した。パートＡは、製剤化されたバルクが得られるまで直ちに加工し、凍結乾燥の前にＶＣＣ解析を行った。パートＢおよびパートＣ材料は、加工し、アリコート分配し、＜−７０℃で凍結した。パートＢ材料は、２〜８℃で一晩解凍し、パートＣ材料は、３７℃の水浴において完全に解凍し、次いで凍結乾燥の前に、３７℃の水浴において４時間インキュベートした。次に、材料をＯＤ６００＝１０に希釈し、凍結乾燥のために加工した。２．５〜３．０％の目標残留水分のために凍結乾燥ランを行った。凍結乾燥の前および後に、ならびに加速された条件で、ＶＣＣを解析した。ＶＣＣ力価を測定し、計数および凍結乾燥の前の計数のパーセントの両方として表現した。
【０６０６】
結果。データは、連続して加工された材料が、凍結および解凍された材料と比較して、より良い安定性プロファイルを有することを示す。データは、凍結乾燥前に原薬を保管することができることも実証する。図１５（ＶＣＣ）および図３２（ＲＭ）を参照されたい。
２．１１．２．ＷＰ７−Ｌｙｏ１３
【０６０７】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＰＶ薬物製品を本試験に使用した。製剤は、リン酸塩に基づき、２．５％スクロースを有し、残留水分目標は、２．５〜３．０％であり、ＯＤ６００＝１０であった。使用された安定性条件は、２〜８℃、−２０℃、ならびに３０℃で１、２および３日間の加速された条件であった。検査された群は、次の通りであった：（１）群Ａ：新鮮、即座に凍結乾燥；（２）群Ｂ：２〜８℃で３日間保管。
【０６０８】
試験設計。生物反応器内の材料が、目標ＯＤ６００に達したら、材料を収集し、パートＡおよびＢのために２個のアリコートに分割した。パートＡは、製剤化されたバルクが得られるまで直ちに加工し、凍結乾燥の前にＶＣＣ解析を行った。パートＢ材料は、加工し、アリコート分配し、＜−７０℃で凍結した。パートＢ材料は、凍結乾燥の前に２〜８℃で３日間保管した。次に、材料をＯＤ６００＝１０に希釈し、凍結乾燥のために加工した。２．５〜３．０％の目標残留水分のために凍結乾燥ランを行った。凍結乾燥の前および後に、ならびに加速された条件で、ＶＣＣを解析した。ＶＣＣ力価を測定し、計数および凍結乾燥の前の計数のパーセントの両方として表現した。
【０６０９】
結果。データは、連続して加工された材料（直行（ｓｔｒａｉｇｈｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ）加工）および２〜８℃で最大３日間保管された材料の両方に関して優れた結果を示す。図１６（ＶＣＣ）および図３３（ＲＭ）を参照されたい。データは、バルク原薬（ＢＤＳ）を、加工前に２〜８℃で３日間保管することができ、依然として、凍結乾燥後に許容される結果を達成できることを示す。
【０６１０】
結論。本試験は、２〜８℃における３日間の原薬保持が、依然として、凍結乾燥された薬物製品の許容される長期安定性をもたらすことができ、ルーチン製造における柔軟性を加えることを可能にすることを実証する。
２．１２．製品の提示
２．１２．１．ＷＰ７−Ｌｙｏ１４
【０６１１】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＰＶ薬物製品を本試験に使用した。製剤は、リン酸塩に基づき、２．５％スクロースを有し、残留水分目標は、２．５〜３．０％であり、ＯＤ６００＝１０であった。使用された安定性条件は、２〜８℃、−２０℃、ならびに３０℃で１、２および３日間の加速された条件であった。検査された因子は、２Ｒバイアル、１×１０９ＶＣＣおよび１．２ｍＬ充填であった。
【０６１２】
試験設計。生物反応器内の材料が、目標ＯＤ６００に達したら、凍結乾燥のために材料を収集および加工した。２．５〜３．０％の目標残留水分のために凍結乾燥ランを行った。凍結乾燥の前および後に、ならびに加速された条件で、ＶＣＣを解析した。ＶＣＣ力価を測定し、計数および凍結乾燥の前の計数のパーセントの両方として表現した。
【０６１３】
結果。データは、加速された条件下で生存率の減少を示すが、依然として、仕様の範囲内である。データは、２Ｒバイアル提示が、記載されている組成物および方法を使用した凍結乾燥における使用に適することも指し示す。図１７（ＶＣＣ）および図３４（ＲＭ）を参照されたい。残留水分は、約２％であり、３〜４％の目標を下回った。
２．１３  バッチ規模
【０６１４】
材料と方法。ＡＤＸＳ−ＨＰＶ薬物製品を本試験に使用した。製剤は、リン酸塩に基づき、２．５％スクロースを有し、残留水分目標は、２．５〜３．０％であり、１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬを目標としてＯＤ６００＝１０であった。２ｍＬ  ＡＤＸＳ−ＨＰＶ薬物製品を、約１５００個のＲ６バイアルのそれぞれに添加した。使用された安定性条件は、２〜８℃、−２０℃、ならびに３０℃で１、２および３日間の加速された条件であった。
【０６１５】
試験設計。生物反応器内の材料が、目標ＯＤ６００に達したら、凍結乾燥のために材料を収集および加工した。２．５〜３．０％の目標残留水分のために凍結乾燥ランを行った。凍結乾燥の前および後に、ならびに加速された条件で、ＶＣＣを解析した。ＶＣＣ力価を測定し、計数および凍結乾燥の前の計数のパーセントの両方として表現した。残留水分（ＲＭ）も決定した。
【０６１６】
結果。記載されている組成物および方法は、規模バッチ凍結乾燥での使用に適する。加速された安定性は、規模バッチの開発と両立する。バッチ規模は、６Ｒバイアル提示での原薬の臨床供給に対する適合性を実証した。図３５〜図３６（ＶＣＣ）、図３７〜図３８（ＲＭ）および表１２を参照されたい。図３７における「Ｈ」および「Ｃ」は、凍結乾燥器内のそれぞれホットおよびコールドスポットを指す。
【０６１７】
【表１２】
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２．１４．例示的な材料と方法
【０６１８】
ｐＨ緩衝液ストック溶液。ｐＨ緩衝液は、４倍ストック溶液として調製した。
【０６１９】
リン酸緩衝液ストック溶液。リン酸緩衝液ストック溶液は、現在の原薬製剤に可能な限り密接に似るように、ただし、ＮａＣｌおよびＫＣｌを含まないように調製した。この溶液は、４倍ストックとして調製した：０．８ｇのＫＨ２ＰＯ４（無水）および４．６ｇのＮａ２ＨＰＯ４（無水）を８００ｍＬのＷＦＩに溶解した。１０％ＨＣｌでｐＨを７．２に調整した。溶液を１０００ｍＬまでＷＦＩでフィルアップを行い、０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。最終的な製剤化された薬物製品は、０．２ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４（無水）および１．１５ｇ／ＬのＮａ２ＨＰＯ４（無水）を含有するであろう。
【０６２０】
クエン酸緩衝液ストック溶液。クエン酸の４０ｍＭ（＝４倍）ストック溶液は、０．８４ｇのクエン酸を１００ｍＬとなるようにＷＦＩに溶解することにより調製した。クエン酸Ｎａの４０ｍＭ（＝４倍）ストック溶液は、２．９４ｇのクエン酸Ｎａを２５０ｍＬとなるようにＷＦＩに溶解することにより調製した。クエン酸緩衝液の４０ｍＭ（＝４倍）ストック溶液は、４０ｍＭクエン酸溶液を使用して、４０ｍＭクエン酸Ｎａ溶液のｐＨをｐＨ＝７．２に調整することにより調製した。溶液を０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。
【０６２１】
ＭＯＰＳ緩衝液ストック溶液。ＭＯＰＳの４０ｍＭ（＝４倍）ストック溶液は、２．３１２５ｇ  ＭＯＰＳを２００ｍＬのＷＦＩに溶解することにより調製した。１０％ＨＣｌでｐＨをｐＨ＝７．２に調整した。溶液は、２５０ｍＬとなるようにＷＦＩでフィルアップを行い、０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。
【０６２２】
４０％ｗ／ｖスクロースストック溶液。２００ｇのスクロースを、５００ｍＬとなるようにＷＦＩに溶解した。溶液を０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。
【０６２３】
４０％ｗ／ｖトレハロースストック溶液。４０ｇのトレハロースを、１００ｍＬとなるようにＷＦＩに溶解した。溶液を０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。
【０６２４】
２０％ｗ／ｖ  ＭＳＧストック溶液。８ｇのＬ−グルタミン酸一ナトリウム塩水和物を、４０ｍＬとなるようにＷＦＩに溶解した。溶液を０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。
【０６２５】
２０％ｗ／ｖ  ｒＨＳＡストック溶液。１０ｇの凍結乾燥されたｒＨＳＡ（Ｋｅｒｒｙ、ｒＡｌｂｕｍｉｎ  ＥＧ）を、５０ｍＬとなるようにＷＦＩに溶解した。溶液を０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。
【０６２６】
細菌ペレットの再懸濁のための緩衝液。細菌ペレットの再懸濁のための１倍緩衝液は、１４０ｍＬ  ＷＦＩ、１０ｍＬの４０％スクロース、および５０ｍＬのそれぞれの４倍ｐＨ緩衝液ストックを混合し、１×ｐＨ緩衝液／２％スクロースをもたらすことにより調製した。
【０６２７】
ＡＡミックスストック溶液。１４４ｍＭアルギニン、２２８ｍＭグルタミンおよび２８ｍＭイソロイシンを含有する、２００ｍＬの４倍アミノ酸ストック溶液を調製した。例えば、Ｐａｉｋ  ｅｔ．ａｌ．（あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．  ２０１２  Ｎｏｖ−Ｄｅｃ；  ２８（６））を参照されたい。製剤化された原薬における最終アミノ酸濃度は、それぞれ３６ｍＭ、５７ｍＭおよび７ｍＭであった。これは、次の通りに調製した：５．１７ｇのアルギニン（Ｍｗ＝１７４．２ｇ／ｍｏｌ）を秤量し、５０ｍＬとなるようにＷＦＩに溶解した。４８．５２ｍＬ（５．０１７ｇを表す）のこの溶液を２５０ｍＬボトル内に移動させた。０．８ｇのイソロイシン（Ｍｗ＝１３１．１７ｇ／ｍｏｌ）を秤量し、５０ｍＬとなるようにＷＦＩに溶解した。４５．９１ｍＬのこの溶液（０．７３５ｇを表す）を、同じ２５０ｍＬボトル内に移動させた。６．７１ｇのグルタミン（Ｍｗ＝１４７．１３ｇ／ｍｏｌ）を秤量し、この２５０ｍＬボトル内に即座に移動させた。総体積を１６０ｍＬまでＷＦＩでフィルアップを行い、一定の撹拌下で２Ｎ  ＮａＯＨを添加することにより、ｐＨをｐＨ＝７．２に慎重に調整した。グルタミンが全て溶解し、ｐＨが安定したら、体積を２００ｍＬまでＷＦＩでフィルアップを行った。溶液を０．２μｍフィルターで滅菌濾過した。
【０６２８】
２倍賦形剤ストックの調製。２倍賦形剤ストックは、細菌ストック溶液と１：１混合して、ＯＤ６００約１０またはＯＤ６００約２．０を有する最終製剤を得るために使用した。これは、適切な体積の４倍ｐＨ緩衝液ストック溶液および賦形剤ストック溶液を混合して、所望の濃度を得ることにより調製した。
【０６２９】
Ｌｍの生育。１００ｍＬのＴＳＢ（３０ｇ  ＴＳＢ／１ｋｇ  ＷＦＩ、５ｇ酵母抽出物／１ｋｇ  ＷＦＩ、追加的な７．５ｇグルコース／１ｋｇ  ＷＦＩにより、１０ｇ／１ｋｇ  ＷＦＩのグルコースの最終濃度を生じる）を、５００ｍＬ整流（ｂａｆｆｌｅｄ）振盪フラスコ内で３７℃に予熱した。培地を一晩インキュベートした。翌日、培地は清澄であった。Ｌｍ  ＲＣＢ（５２７７−２０１５−０１．０１；ＶＣＣ＝２．４４×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）のうち１個のバイアルを室温で解凍した。培地に、９００μＬのバイアル内容物を接種した。Ｌｍを、３７℃、１１０ｒｐｍで、５時間１５分間インキュベートした（Ｐ１）。この時点で、ＯＤ６００は３．５９であった。Ｐ２のため、５００ｍＬのＴＳＢを含有する５×３Ｌ  Ｆｅｒｎｂａｃｈボトルに、それぞれ２．５ｍＬのＰ１を接種した。培養物を３７℃、１１０ｒｐｍで、１４時間５０分間インキュベートした。培養物をプールし、ＯＤ６００は５．９６であった。
【０６３０】
あるいは、５０ｍＬのＴＳＢを、２５０ｍＬ整流振盪フラスコ内で３７℃に予熱した。培地を一晩インキュベートした。翌日、培地は清澄であった。Ｌｍ  ＲＣＢ（５２７７−２０１５−０１．０１；ＶＣＣ＝２．４４×１０９ＣＦＵ／ｍＬ）のうち１個のバイアルを室温で解凍した。培地に、６００μＬのバイアル内容物を接種した。Ｌｍを、３７℃、１１０ｒｐｍで、７時間５５分間インキュベートした（Ｐ１）。この時点で、ＯＤ６００は４．７８であった。Ｐ２のため、５００ｍＬのＴＳＢを含有する３×３Ｌ  Ｆｅｒｎｂａｃｈボトルに、それぞれ５．０ｍＬのＰ１を接種した。培養物を、３７℃、１１０ｒｐｍで、１４時間３０分間インキュベートした。この時点で、ＯＤ６００は５．９６であった。
【０６３１】
Ｌｍの濃縮および製剤化。ｐＨ緩衝液（リン酸塩、クエン酸塩＆ＭＯＰＳ）毎に、５２０ｍＬのＰ２を、２，０００ｇで１０分間、ＲＴにて遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、それぞれ、１５５ｍＬの１×ｐＨ緩衝液２％スクロースにそれぞれ再懸濁し、ＯＤ６００値をチェックした。濃縮後に目標ＯＤ６００は２０であった：ＯＤ６００リン酸緩衝液＝１９．２。ＯＤ６００クエン酸緩衝液＝１８．６。ＯＤ６００ＭＯＰＳ緩衝液＝１８．８。等しい体積の濃縮された細菌を２×濃縮された賦形剤ストックと混合し、ＯＤ６００約１０を有する製剤をもたらすことにより、最終製剤を得た。賦形剤濃度は、本明細書の他の箇所に記載されている。製剤化の後に、ＶＣＣ解析のために試料を採取した（Ｌｙｏ前）。
【０６３２】
あるいは、１，０００ｍＬのＰ２を、２，０００ｇで１０分間、ＲＴにて遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、それぞれ、３００ｍＬの１×リン酸緩衝液２％スクロースに再懸濁した。再懸濁後にＯＤ６００は１８．３であった。このストックは、ＯＤ６００約１０の試料の作製に使用した。ＯＤ６００約２の試料の作製のため、このストックを１×リン酸緩衝液２％スクロースで４．５８倍希釈した。希釈後にＯＤ６００は４．１２であった。等しい体積の濃縮された細菌を２×濃縮された賦形剤ストックと混合し、ＯＤ６００約１０またはＯＤ６００約２を有する製剤をもたらすことにより、最終製剤を得た。
２．１５．要約
【０６３３】
要約すると、データは、加速された条件が、長期安定性の優れた予測因子であると思われることと、２〜８℃および−２０℃における凍結乾燥された薬物製品の保管が、可能であることを示す。ＡＤＶＸ−ＨＰＶのデータは、ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２のデータに匹敵し、データが、異なるＬｍ薬物製品にわたって一致すると予測されることを指し示す。データは、より高いＲＭがより望ましいことも指し示す。例えば、約１％を下回る水分は、安定したＬｍ製品を提供しない場合があるが、６〜７％もの高さの水分は、３〜４％前後の水分と同じ程度に安定すると思われる。データは、温度シフトが、安定性を改善することと、より高い棚温度（一次乾燥ステップ）が、安定性を改善することも指し示す。２Ｒおよび６Ｒバイアル提示は、記載されている組成物および方法を使用した凍結乾燥における使用に適する。バイオアッセイは、凍結された液体製剤と比較して、凍結乾燥された材料の優れた活性を示す。バッチ規模は、６Ｒ提示における臨床供給に適する。一部の実施形態では、薬物製品は、１×１０１０ＣＦＵ／ｍＬで、６Ｒバイアルにおいて提示される。一部の実施形態では、薬物製品は、１×１０９ＣＦＵ／ｍＬで、２Ｒバイアルにおいて提示される。
【０６３４】
温度シフトによるストレス応答の誘導は、凍結乾燥の後の生存率を有意に改善する。加えて、一般に、リン酸緩衝液は凍結乾燥製品にとって理想的な緩衝液ではないにもかかわらず、リン酸塩に基づく製剤は、クエン酸塩およびＭＯＰＳに基づく緩衝液と比較してより良い性能を有し、現在の原薬製剤に最も近いことから、最小のプロセス変化を要求した。最良の安定性は、スクロースを含むが、トレハロース、ＭＳＧまたはｒＨＳＡを含まない製剤において見られた。スクロースのみまたはスクロース＋ＡＡの混合物を含有する製剤は、より乾燥していたｒＨＳＡ製剤と比較してより良い残留水分を有していた。最高の回収（および最低の可変性）は、最低スクロース濃度（約２．５％ｗ／ｖ）で観察された。安定性における改善は、一次乾燥ステップにおける棚温度増加（例えば、約１８℃）および残留水分レベル増加（例えば、約３．５％）に伴い観察された。３．５％（これは、凍結乾燥された製品のための典型的な残留水分レベルよりも高い）など、残留水分レベル増加のため、５℃もの低さの二次乾燥温度が実現可能であり得る（例えば、約５℃〜約２０℃の間）。
（実施例３）
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓのための凍結乾燥パラメーターの再現およびさらなる最適化
【０６３５】
異なる検査パラメーターにより一連の実験を行って、実施例２の凍結乾燥サイクルを再現し、製剤、細胞のプレコンディショニング、および凍結乾燥サイクルをさらに最適化した。
３．１．比較の基盤として以前の凍結乾燥サイクルを再現する
【０６３６】
Ｌｙｏ９〜Ｌｙｏ１３と同じ凍結乾燥サイクルパラメーターを使用して、６Ｒバイアルおよび２ｍＬ充填により一連の実験（ＷＰ２Ａ）を行った。
【０６３７】
試験設計。生物反応器内の材料が、目標ＯＤ６００に達したら、凍結乾燥のために材料を収集および加工した。２．５〜３．０％の目標残留水分のために凍結乾燥ランを行った。凍結乾燥の前および後に、ならびに加速された条件（３０℃で１、２および３日間）で、ＶＣＣを解析した。残留水分も、凍結乾燥の後、および３日間の加速された条件で測定した。マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）および共振式質量測定（ＲＭＭ）も、凍結乾燥の前、凍結乾燥の後、ならびに１、２および３日間の加速された条件（３０℃）において行った。ＶＣＣ力価を測定し、計数および凍結乾燥の前の計数のパーセントの両方として表現した。水分およびＶＣＣデータを、同じ凍結乾燥サイクル条件による以前のデータと比較した。
【０６３８】
結果。８０％へのＶＣＣ（ＣＦＵ／ｍＬ）の減少が、凍結乾燥の後に観察された。図１８を参照されたい。ＶＣＣは、３０℃で最大７２時間の保管を通じて一定であった。初期残留水分（直接的試料注射）は平均して２．４％であり、増加は、３０℃で７２時間にわたって観察されなかった。凍結乾燥の前および後の試料の肉眼では見えない粒子の数は、ＭＦＩおよびＲＭＭによって測定された場合に匹敵した。粒径分布は、一定を維持した。以前の凍結乾燥サイクルの再現に成功した。
３．２．二次乾燥棚温度の関数として残留水分含量を試験する
【０６３９】
一連の実験（ＷＰ２Ｂ）を行って、二次乾燥棚温度の関数として残留水分（ＲＭ）含量を試験して、目標である３．５％ＲＭをもたらすであろう二次乾燥棚温度を予測した。
【０６４０】
試験設計。２ｍＬ充填による６Ｒバイアル、ならびにＷＰ２Ａ実験と同じ凍結および一次乾燥。次のステージにおいて二次乾燥を行った：（１）一次乾燥の終わり、ストッパー棚（ＲＭ情報のみのため）；（２）０℃へとランプ、６時間保持、ストッパー棚；（３）５℃へとランプ、６時間保持、ストッパー棚；（４）１５℃へとランプ、６時間保持、ストッパー棚。凍結乾燥の前および後に、ならびに加速された条件（３０℃で１、２および３日間）で、ＶＣＣを解析した。残留水分も、凍結乾燥の後、および３日間の加速された条件で測定した。ＭＦＩおよびＲＭＭも、凍結乾燥の前、凍結乾燥の後、ならびに１、２および３日間の加速された条件（３０℃）において行った。
【０６４１】
結果。５℃〜１５℃の間（例えば、１２℃）の二次乾燥温度を使用することにより、３．５％の目標ＲＭを得ることができる。図１９を参照されたい。異なるサンプリング点における試料の肉眼では見えない粒子の数は、ＭＦＩおよびＲＭＭによって測定された場合に匹敵した。異なるＳＤ温度は、肉眼では見えない粒子レベルに影響がなかった。匹敵する粒子レベルが、ＷＰ２Ａ試料に関して観察された。凍結乾燥前から凍結乾燥後へと、ＶＣＣの有意な変化は観察されなかった。３０℃で７２時間後に、凍結乾燥前の７８％〜８５％へのＶＣＣの減少が観察された。ＳＤ温度によるＶＣＣの識別可能な傾向はなかった。
３．３．改変された凍結ステップを評価する
【０６４２】
一連の実験（ＷＰ３）を行って、全バイアルを凍結温度のすぐ上で平衡化させるための、−４℃におけるバイアルの延長された保持時間により改変された凍結ステップを調査した。
【０６４３】
試験設計。２ｍＬ充填による６Ｒバイアル、および次の変化を加えたＷＰ２Ａ実験由来のサイクル条件を使用した：（１）３０分間からおよそ１時間２０分間へと−４℃における保持を延長する；および（２）３．５％ＲＭを目標とするために１２℃で二次乾燥を行う。凍結乾燥の前および後に、ならびに加速された条件（３０℃で１、２および３日間）で、ＶＣＣを解析した。残留水分も、凍結乾燥の後、および３日間の加速された条件で測定した。ＭＦＩおよびＲＭＭも、凍結乾燥の前、凍結乾燥の後、ならびに１、２および３日間の加速された条件（３０℃）において行った。
【０６４４】
結果。約２３時間のプロセス時間の後に、試料の一次乾燥（ＰＤ）を完結した。前バイアルに関して、ＰＤは、１８時間後に既に完了していた。後バイアルに関して、ＰＤは、２０時間後に完了した。ＰＤ後に、バイアルを−４℃で８３分間平衡化した。凍結乾燥の後、試料を直ちに解析した（Ｔｌｙｏ）または３０℃で保管した（Ｔｘｘｈ）。８０％へのＶＣＣの減少が凍結乾燥の後に観察され、３０℃で最大７２時間の保管（Ｔ３０時間）後に７０％への減少が観察された。予想された３．５％の代わりに、中央バイアルに関して凍結乾燥の後に２．３％のＲＭが測定された。凍結乾燥の前および後の試料の肉眼では見えない粒子の数は、ＭＦＩによって測定された場合に匹敵した。粒径分布は、一定を維持した。増強された凍結ステップは、氷晶形成を変化させ、これにより、凍結乾燥ケーキの乾燥挙動を変化させた可能性があり、これが、細胞生存率および残留水分に影響を与えた可能性がある。図４０Ａ〜図４０Ｂを参照されたい。
３．４．改変された凍結ステップおよび一次乾燥温度を評価する
【０６４５】
２因子（ｔｗｏ−ｆａｃｔｏｒｉａｌ）設計試験（ＷＰ４）を行う（凍結ステップおよび一次乾燥温度）。
【０６４６】
試験設計。凍結ステップにおける５℃から−４５℃への速い棚冷却を検査する。調整された一次乾燥条件を検査して、ケーキ縮小／崩壊を低下させる。凍結乾燥の前および後に、ならびに加速された条件（３０℃で１、２および３日間）で、ＶＣＣを解析する。残留水分も、凍結乾燥の後、および３日間の加速された条件で測定する。ＭＦＩおよびＲＭＭも、凍結乾燥の前、凍結乾燥の後、ならびに１、２および３日間の加速された条件（３０℃）において行う。
３．５．解凍手順（３７℃解凍）を評価する
【０６４７】
一連の実験（ＷＰ６）を行って、ＡＤＸＳ−ＨＥＲ２のための新たな解凍手順を評価した。以前の解凍手順は、製剤化されたバルク材料を２〜８℃で一晩解凍するというものであった。
【０６４８】
試験設計。２ｍＬ充填による６Ｒバイアル、およびＷＰ２Ｂ実験由来のサイクル条件を使用した。１０のＯＤ６００における製剤化されたバルク材料を３７℃で解凍した。細胞ペレットを３７℃で解凍し、次いで、１０のＯＤ６００となるように製剤緩衝液で希釈した。凍結乾燥の前および後に、ならびに加速された条件（３０℃で１、２および３日間）で、ＶＣＣを解析した。残留水分も、凍結乾燥の後、および加速された条件の３日目に測定した。ＭＦＩおよびＲＭＭも、凍結乾燥の前、凍結乾燥の後、ならびに１、２および３日間の加速された条件（３０℃）において行った。図４１Ａ〜図４１Ｂを参照されたい。
【０６４９】
結果。５℃のＳＤ温度まで、ＷＰ２Ｂのプロセスを再現した。約２５時間のプロセス時間の後に、試料の一次乾燥（ＰＤ）を完結した。Ｌｙｏプロセスは、ＷＰ２Ｂに匹敵した。凍結乾燥の後、試料を直ちに解析した（Ｔｌｙｏ）または３０℃で保管した（Ｔｘｘｈ）。ＴｌｉｑにおけるＣＦＵ／ｍＬは、Ａ（製剤化されたバルク材料（すなわち、原薬））およびＢ（細胞ペレット（すなわち、高度に濃縮して、全ての製剤緩衝液を基本的に除去した原薬））の間に匹敵した。凍結乾燥の後、７０％および８０％ＶＣＣへの減少が観察された。約５０％ＶＣＣへのさらなる減少が、３０℃で２４時間の保管後に観察され、これは、３０℃で７２時間後に変化しなかった。
３．６．異なる細菌目標濃度を評価する（ＷＰ７）
【０６５０】
３種の異なる細菌目標濃度を検査して、アニーリングステップありの凍結乾燥サイクルが使用された場合のケーキ外観における細菌濃度の影響を決定した。
【０６５１】
試験設計。異なるＯＤ６００値を有する３種の異なる製剤を調製した：
（ａ）ＯＤ１０：Ｆ１０００：規定通りの、届けられたＢＤＳの使用、
（ｂ）ＯＤ２：Ｆ０２００：３１．３７ｍｌ  ＢＤＳ  ＋  １１８．６３ｍｌ製剤緩衝液、および
（ｃ）ＯＤ０．６５：Ｆ００６５：１０．２０ｍｌ  ＢＤＳ  ＋  １３９．８０ｍｌ製剤緩衝液。
ＡＤＸＳプラットフォーム製造プロセスを使用して、ＨＥＲ２材料を提供した（実施例７を参照）。
パラメーター                  細胞ペレット
量                            ８００ｍＬ（体積による
ＯＤ６００（未加工の材料）    １０．０５
細胞／ｍＬ                    １．６９×１０１０
生存率                        ９８．４５％
凍結乾燥の前、凍結乾燥の後、ならびに１、２および３日間の加速された条件（３０℃）で、ＶＣＣを解析した。凍結乾燥の後、および３日間の加速された条件で、残留水分を解析した。凍結乾燥の前、凍結乾燥の後、ならびに１、２および３日間の加速された条件（３０℃）において、ＭＦＩおよびＲＭＭを解析した。
【０６５２】
結果：約４０時間のプロセス時間の後に、試料の一次乾燥（ＰＤ）を完結した（Ｐｔ１００センサーおよび圧力センサー読み取りの両方によって指し示される）。プロセスは、ＷＰ７サイクル１に匹敵した；約３．５％の残留水分含量を目標とするために、ＳＤ温度のみが、５℃から０℃へと変化された。凍結乾燥の後に、試料を直ちに解析した（Ｔｌｙｏ）またはそれぞれ３０℃もしくは２〜８℃で保管した。最終製品の細菌濃度および光学的外観の間の相関が観察された。細菌濃度が低いほど、さらなるケーキ縮小が観察された。凍結乾燥されたケーキの復元は、Ｆ００６５およびＦ０２００（約２０秒間）が、Ｆ１０００（約１００秒間）よりも速かった。図４２Ａ〜図４２Ｂを参照されたい。
【０６５３】
凍結乾燥の後に、細菌濃度とは独立して、約６０％へのＶＣＣの減少が観察された。また、凍結乾燥の後に、前および中央バイアルにＶＣＣの差は観察されなかった。僅かにより高いＶＣＣが、前バイアルにさらに検出された。３０℃で２４時間後に、低い方の細菌濃度２種に、ＶＣＣのさらに１０％減少が観察された。結果は、３０℃で７２時間後に変化しなかった。２〜８℃で７日後に、約２０％のＶＣＣの減少が観察された。図４３を参照されたい。
【０６５４】
生存細胞計数（ＶＣＣ）および生存率は、加速された条件下で安定しているように思われた。図４４Ａ〜図４４Ｂを参照されたい。
３．７．２Ｒバイアル提示を評価する（ＷＰ８）
【０６５５】
１×１０９の目標ＶＣＣにおける２Ｒバイアル提示を評価した。加えて、凍結および非凍結ＢＤＳの安定性を比較した。
【０６５６】
試験設計。製造損失を説明するための、１×１０９および１×１０１０プラス約３０％の目標ＶＣＣにおける製剤化されたバルク材料が提供された。凍結乾燥の前、凍結乾燥の後、ならびに１、２および３日間の加速された条件（３０℃）で、ＶＣＣを解析した。凍結乾燥の後、および３日間の加速された条件で、残留水分を解析した。凍結乾燥の前、凍結乾燥の後、ならびに１、２および３日間の加速された条件（３０℃）において、ＭＦＩおよびＲＭＭを解析した。
【０６５７】
結果。凍結乾燥による最小の損失が観察された。加速された安定性におけるＶＣＣまたは生／死において観察される有意な変化は観察されなかった。初期の％生細胞は、液体凍結された製剤と比べてより高かった。図４５Ａ〜図４５Ｂを参照されたい。
３．８  大規模生産（ＷＰ７）
【０６５８】
大規模生産において、凍結乾燥ランを開始する前のＢＤＳの保持時間は、パイロット規模フリーズドライヤーでの開発における凍結乾燥ランと比較してより長い。本試験の目的は、このことが、製品に影響を与え得るか評価することである。
【０６５９】
試験設計。フリーズドライサイクルの開始１日前に、ＡＰＣによって非凍結液体バルク原薬（ＢＤＳ）が提供された。届けられた製剤緩衝液を使用することにより、液体ＢＤＳを、０．８５のＯＤ６００値（１．３×１０９ＣＦＵ／ｍｌの目標ＶＣＣ）に希釈した。保持時間試験を行う間、希釈された材料を２〜８℃で保管した。４つの棚にＢＤＳを充填し、４つの異なる時点：フリーズドライプロセス開始の２０時間（Ｈ２０時間）、８時間（Ｈ８時間）、５時間（Ｈ５時間）および０時間（Ｈ０時間）前でフリーズドライヤー内にローディングした。
【０６６０】
結果。凍結乾燥の後に、ＶＣＣの減少が観察された（Ｔｌｉｑと比べて）：Ｈ０時間で７８％、Ｈ５時間で７４％：Ｈ８時間で７４％、７３％、およびＨ２０時間で６５％。３０℃で最大７２時間の保管後に、Ｈ２０時間、Ｈ８時間およびＨ５時間に関して１０％前後のさらなる減少が観察された。２〜８℃で保管後のＴ７日間におけるＶＣＣは、凍結乾燥の後のＶＣＣに匹敵した。図４６Ａ、図４６Ｂ、図４７Ａおよび図４７Ｂを参照されたい。
（実施例４）
薬物製品の凍結乾燥、および凍結乾燥された薬物製品の長期室温安定性
４．１  ＡＤＸＳ１１−００１パイロットバッチ
４．１．１  材料と方法
【０６６１】
以前の開発実験は全て、小規模開発用凍結乾燥器を使用して行った。スケールアップは、研究室規模におけるものと同じ製品温度動力学および氷含量を保証しないため、より大規模の生産のために凍結乾燥サイクルに対する改変が必要な場合がある。潜在的なスケールアップ問題を評価するために、概念実証および安定性試験のためのパイロットバッチを製造した。原薬プロセスは、揺動波動型生物反応器技術によって提供される使い捨ての閉鎖系内で実行する。原薬製造が、ＡＤＸＳプラットフォーム製造プロセスに続いた。プラットフォームは、発酵のための製品２０Ｌ培養バッグ、濃縮および緩衝液交換のための接線流濾過（ＴＦＦ）マニフォールド、およびＤＳ充填のための容器マニフォールドの、使い捨ての閉鎖系からなる。原薬は、２〜８℃で一晩保持し、目標ＯＤ６００となるように製剤緩衝液で希釈し、ＤＩＮ  ６Ｒバイアル（２．０ｍＬ）内に充填し、凍結乾燥した。おおよそのバッチサイズは、１５００個のバイアルであった。
【０６６２】
【表１３】
2020533997.tif 000019
４．１．２  試験設計
【０６６３】
Ｍａｒｔｉｎ  Ｃｈｒｉｓｔ  Ｅｐｓｉｌｏｎ  ２−１２Ｄパイロット規模凍結乾燥器において凍結乾燥プロセスを行った。この凍結乾燥器は、研究室規模凍結乾燥器で使用されるＭＫＳセンサーの代わりに制御圧力センサーとしてピラニ計量器を使用するため、ピラニ計量器のための圧力セットポイントを選択する必要があった。ピラニ計量器圧力が測定された（ただし、制御に使用されてはいない）以前の凍結乾燥サイクルの見直しに基づき、０．１６３ｍｂａｒのピラニ圧力が、一次乾燥の主要部分における０．０９０ｍｂａｒのＭＫＳ圧力と等価であることが判明した。ピラニ計量器圧力は、気相の組成に依存するため、一次乾燥の終わりに向かって水の分圧が減少するにつれて、ピラニ圧力読み取りデータは、ＭＫＳ圧力読み取りデータに近づく。
【０６６４】
【表１４】
2020533997.tif 000020
４．１．３  結果と考察
【０６６５】
【表１５】
2020533997.tif 000021
【０６６６】
凍結乾燥器内の棚毎のホット（Ｈ）およびコールド（Ｃ）スポットのＶＣＣを決定する（プレート方法）ことにより、凍結乾燥器の予備的マッピングを行った。データを図４８および表１６に提示する。
【０６６７】
【表１６】
2020533997.tif 000022
【０６６８】
凍結乾燥器内のホットおよびコールドスポット由来のＶＣＣデータの要約統計は、ホットスポットの平均ＶＣＣが、７．０８Ｅ＋０９ＣＦＵ／ｍＬであり、コールドスポットの平均が、１．０３２Ｅ＋１０ＣＦＵ／ｍＬであることを実証する。凍結乾燥器におけるホットスポットおよびコールドスポットは、凍結乾燥器内のプローブ由来の温度に基づき決定される。ホットスポットは、凍結乾燥器の周縁に存在する傾向があり、コールドスポットは、凍結乾燥器の中央に存在する傾向がある。試料番号は、凍結乾燥器内の棚に対応し、ＨまたはＣ場所による変動をほとんど示さない。表１７中のＣＶ欄を参照されたい。
【０６６９】
【表１７】
2020533997.tif 000023
【０６７０】
データは、凍結乾燥器内のホットおよびコールドスポットの間のＶＣＣおよびＲＭにおける差異を示す。ＶＣＣにおける差が、必然的に、ＲＭにおける差によるものであるか、または両者共に、凍結乾燥ケーキの他のいくつかの特徴の関数であるか否かについては公知ではない。
【０６７１】
検証された方法を使用して、Ｅｕｒｏｆｉｎｓによって発売および安定性解析が行われた。バイアルは、解析に先立ち２ｍＬの生理食塩水により復元される。発売および安定性データを表１８に提供する。
【０６７２】
【表１８−１】
2020533997.tif 000024
【表１８−２】
2020533997.tif 000025
４．２．１  加速された安定性
【０６７３】
初期開発データは、３０℃における加速された安定性が、長期安定性傾向を予測することができることを実証した。バッチを３０℃で保管し、最大６３日間評価して、加速された条件下で製品が安定する時間の長さを決定した（図４９〜図５３および表１９）。
【０６７４】
【表１９】
2020533997.tif 000026
４．２．２  ｉｎ  ｖｉｖｏ検査
【０６７５】
ＡＤＸＳ１１−００１（ＡＸＡＬ）は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連がんの処置のために臨床開発中の、生きた弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ−リステリオリシンＯ（Ｌｍ−ＬＬＯ）免疫療法である。ＡＤＸＳ１１−００１は、ＨＰＶ１６の全長Ｅ７タンパク質に融合されたリステリオリシンＯのトランケートされた断片（ｔＬＬＯ）（ｔＬＬＯ−Ｅ７）からなる、抗原−アジュバント融合タンパク質を分泌するように生物工学的に操作されている。Ｌｍに基づく免疫療法の提案された作用機序は、協調された抗腫瘍応答を惹起するために自然および獲得免疫系の両方を刺激し、その結果、腫瘍に浸潤しこれを破壊することができる腫瘍抗原特異的Ｔ細胞のｄｅ  ｎｏｖｏ作製をもたらすことである。製品の生物活性が、凍結乾燥によって有害に影響されないことを確認するために、ＡＤＸＳ１１−００１で免疫化された腫瘍を有するマウスは、ＨＰＶ１６−Ｅ７およびＨＰＶ１６−Ｅ６に特異的なＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を作製する。
【０６７６】
腫瘍を制御し、動物生存を延長する、凍結乾燥されたＡＸＡＬおよび臨床ＡＸＡＬの能力を、ＴＣ−１腫瘍を有するマウスにおいて評価および比較した。成体雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右側腹部に、１×１０５個のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射し、次いで、ＰＢＳによるまたは様々な用量（５×１０７ＣＦＵ、１×１０８ＣＦＵ、２×１０８ＣＦＵ）の凍結乾燥されたＡＸＡＬもしくは臨床ＡＸＡＬによるＩＰ注射により、腫瘍移植後８、１５および２２日目に免疫化した（図５４を参照）。マウスの腫瘍成長および総体的な健康を、腫瘍移植後６２日間モニターした。腫瘍体積が、２０００ｍｍ３を超えた場合、マウスを安楽死させた。
【０６７７】
ＰＢＳで処置されたマウスにおいて、腫瘍体積は、増加し続け、３０日目を越えて生存した動物はいなかった（図５５〜図５６）。比較すると、凍結乾燥されたＡＸＡＬおよび臨床ＡＸＡＬの全用量は、有意に腫瘍成長を阻害し、動物生存を延長した（図５５〜図５６）。注目すべきことに、用量毎に、凍結乾燥されたＡＸＡＬおよび臨床ＡＸＡＬの腫瘍成長曲線および生存曲線は同様であった。
【０６７８】
図５５に示す通り、腫瘍を有するマウスを、腫瘍移植後８日目に、ＰＢＳで、または３種の異なる用量の凍結乾燥されたＡＸＡＬもしくは臨床ＡＸＡＬで、また、その後７日間の間隔で、総計３用量処置した。腫瘍体積を１週間に２回測定した。用量群毎の腫瘍成長曲線を示す。＊＊＊＊Ｐ＜．０００１。ＮＳ、有意でない。
【０６７９】
図５６に示す通り、腫瘍を有するマウスを、腫瘍移植後８日目に、ＰＢＳで、または３種の異なる用量の凍結乾燥されたＡＸＡＬもしくは臨床ＡＸＡＬで、また、その後７日間の間隔で、総計３用量処置した。マウスの腫瘍成長および総体的な健康を、腫瘍移植後６２日間モニターした。腫瘍体積が、２０００ｍｍ３を超えた場合、マウスを安楽死させた。用量群毎の生存曲線を示す。＊＊Ｐ＜．０１。ＮＳ、有意でない。
【０６８０】
ＴＣ−１腫瘍を有するマウスにおける腫瘍成長を制御し、動物生存を延長する、それらの能力に関して、凍結乾燥されたＡＸＡＬおよび臨床ＡＸＡＬの間に有意差は観察されなかった。これらのデータは、凍結乾燥プロセスが、ＡＸＡＬの抗腫瘍活性に影響しないことを指し示す。
４．３  結論
【０６８１】
パイロットバッチは、凍結乾燥された薬物製品を支持するための、ＡＤＸＳ  ＤＳプラットフォーム製造プロセスの応用の実証に成功した。加速された安定性における％生細胞およびＶＣＣは、以前の開発試験と一致する。
（実施例５）
原薬を凍結／解凍し、連続的に加工された材料に匹敵する結果を得る能力
５．１  ＷＰ７、サイクル３
【０６８２】
原薬の異なる保管条件（凍結ｖｓ．非凍結２〜８℃）を評価して、凍結乾燥サイクルにおける改善が、単一の凍結解凍を経たＤＳの凍結乾燥後生存率改善をもたらすかどうか確かめた。
５．２  材料と方法
【０６８３】
凍結（Ａ）および非凍結液体（Ｂ）ＢＤＳは、フリーズドライサイクルの１日間前にＡＰＣ（Ｄｕｂｌｉｎ、Ｉｒｅｌａｎｄ）によって提供された。およそ８００ｍＬの２〜８℃および凍結両方のＤＳを、１Ｌ  ＬＤＰＥバッグ内でおよそ１４のＯＤ６００へと製剤化した。材料が氷晶を含有しなくなるまで、凍結材料を３７℃の水浴において解凍した（解凍時間：２．５時間）。製剤緩衝液（コリオリで調製）を使用することにより、２種の原薬（ＡおよびＢ）を２種の異なるＯＤ６００値に希釈した。表２０は、調製された製剤および目標ＯＤ６００値の概要を挙げる。
【０６８４】
【表２０】
2020533997.tif 000027
【０６８５】
原薬と共に希釈物の測定されたＯＤ６００値を表２１に示す。調製された製剤の希釈スキームを表２２に挙げる。
【０６８６】
【表２１】
2020533997.tif 000028
【０６８７】
【表２２】
2020533997.tif 000029
５．３  試験設計
【０６８８】
４℃でのアニーリングステップまたは保持なしで凍結乾燥における凍結を行ったが、その理由として、以前の実験において、これらのステップによるケーキ外観におけるプラスの効果が観察されなかったことが挙げられる。保持またはアニーリングステップなしで、バイアルを直ちに−４５℃に凍結した。二次乾燥時間を５時間に延長して、より均一なバッチを得て、３．５％の目標残留水分含量（ＲＭ）に達した。凍結乾燥された製品のＲＭ、ＶＣＣ、ＭＦＩ、ＲＭＭ、復元時間、外観分類、および秤量による水損失決定を凍結乾燥の後に行った。ＶＣＣ、ＭＦＩ、ＲＭＭは、３０℃で２４および７２時間解析した。その上、ＶＣＣは、試料に関して２〜８℃で７日間解析した。
【０６８９】
【表２３】
2020533997.tif 000030
５．４  結果と考察
【０６９０】
Ｅｐｓｉｌｏｎ  ２−１２Ｄパイロット規模フリーズドライヤー（Ｍａｒｔｉｎ  Ｃｈｒｉｓｔ、Ｏｓｔｅｒｏｄｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して凍結乾燥を行った。フリーズドライプロセスにおいて、圧力（ピラニおよびＭＫＳによる）、製品温度、棚温度および氷コンデンサー温度をモニターした。ＰＴ１００センサーによって中央および前バイアルをモニターした。
【０６９１】
凍結においてアニーリングステップは含まれず、０℃での二次乾燥ステップは、５時間に設定された。ＰＴ１００センサーおよび圧力センサー読み取りによって指し示される通り、約３４時間のプロセス時間後に全試料の一次乾燥を完結した。前バイアルに関して、ＰＴ１００センサーによって指し示される通り、一次乾燥は、１８時間のプロセス時間の後に既に完了していた。試料の乾燥は、細菌濃度とは独立していた。
【０６９２】
凍結ステップのため、保持またはアニーリングステップなしで、試料を直ちに−４５℃に凍結した。ＰＴ１００センサーによると、前バイアルは、ＰＤ温度へのランプ前に−４５℃に達しなかった。
【０６９３】
凍結乾燥プロセスからビデオを記録して、縮小が起こるときを決定した。ビデオにおいて、全４種の製剤（Ａ００８５、Ａ１３００、Ｂ００８５およびＢ１３００）由来の試料は目に見え、縮小は、一次乾燥の間に発生すると思われる。前バイアルで、中央バイアルよりも早く一次乾燥が完了したため、中央バイアルの乾燥挙動は、僅かに異なる可能性がある。
５．５  フリーズドライされた製品の光学的評価
【０６９４】
凍結乾燥されたケーキの光学的外観は、凍結乾燥の後の各製剤の１０個の中央バイアルに関して考証された。４種の製剤の凍結乾燥ケーキの全体的光学的外観は、優れていた。全ケーキはコンパクトであり、ガラスバイアルにフルコンタクトしていなかった。より高く濃縮された製剤（Ａ１３００およびＢ１３００）に関して、ケーキの高さにおけるならびにバイアル壁および底からの縮小は、同様のＯＤ６００値を有する以前のサイクルの試料（Ｆ１０００）に匹敵した。より低く濃縮された試料（Ａ００８５およびＢ００８５）も同じである。サイクル２のより低く濃縮された製剤（Ｆ００６５）に関して、同様の凍結乾燥ケーキが観察された。凍結乾燥ケーキは、凍結乾燥されたプラセボと同様の光学的外観を有した。サイクル２と同様に、最終製品の細菌濃度および光学的外観の間の相関が観察された。
５．６  ケーキ重量の決定
【０６９５】
サイクル３におけるケーキ重量および水損失を決定した。製剤１種当たり５個のバイアルの重量を重量測定的に決定した。空バイアル、充填後および凍結乾燥の後のバイアルの重量に基づき、ケーキ重量および水損失を計算した（表２４）。より低く濃縮された製剤の凍結乾燥ケーキは、３０ｍｇの重さであり、より高く濃縮された製剤の場合は、４０ｍｇの重さであった。凍結乾燥の後、１．１７〜１．１８ｇの水損失が決定された。したがって、１．２ｍＬの復元体積が、凍結乾燥前と同じ細菌濃度を得るために適する。
【０６９６】
【表２４】
2020533997.tif 000031
５．７  復元時間
【０６９７】
製剤１種当たり２種の試料の復元時間を測定し、サイクル１およびサイクル２の結果と比較した（図５７および表２５）。より高く濃縮された製剤（Ａ１３００およびＢ１３００）の復元時間は、より低く濃縮された製剤（Ａ００８５およびＢ００８５）よりも長かった。復元時間は、一般に、ＷＰ７の以前のサイクルよりも短かった。アニーリングステップを含まない試料の直接的凍結は、復元時間を短縮すると思われる。
【０６９８】
【表２５】
2020533997.tif 000032
５．８  マイクロフローイメージング（ＭＦＩ）
【０６９９】
肉眼では見えない粒子の数をＭＦＩによって解析して、未加工の材料（凍結または非凍結）または細菌濃度が、粒子形成や、粒子のサイズ分布に影響を有するか決定した。肉眼では見えない粒子は、裸眼では観察不可能な粒子状物質である。注射および非経口的注入における粒子状物質は、溶液中に意図せず存在する、ガスの泡以外の、可動性の溶解していない粒子からなる。非経口的注入に許される肉眼では見えない粒子の数には規制限度が存在する。凍結乾燥の前（Ｔｌｉｑ）、凍結乾燥の後（Ｔｌｙｏ）、ならびに３０℃で２４時間および７２時間の保管後（Ｔ２４時間およびＴ７２時間）に、試料を解析した。結果を図５８Ａ〜図５８Ｄに示す。肉眼では見えない粒子の数は、凍結乾燥の前および後の、ならびに３０℃で最大７２時間の保管後の凍結材料（Ａ００８５およびＡ１３００）で変化しなかった。非凍結材料に関して、より多くの粒子が凍結乾燥の前に検出された。非凍結材料も使用された他の実験において、同様の結果が得られた。凍結乾燥の後の肉眼では見えない粒子の数は、凍結材料の結果に匹敵した。
５．９  共振式質量測定（アルキメデス）
【０７００】
その負および正の浮力がある粒子含量に関するＡＤＸＳ−ＨＥＲ２試料のＲＭＭ解析の結果を図５９Ａ〜図５９Ｄに提示する。
【０７０１】
凍結および非凍結材料の結果は、同様であった。ビンサイズ≧０．３μｍに関する、全時点および全保管条件に関する累積的な負の浮力がある粒子計数の比較。１ｍＬ当たり３００，０００個の粒子（ＬｏＱ）を下回る粒子計数は、情報のためだけに挙げていることに留意されたい（データは希釈補正されていない、Ａ００８５およびＢ００８５：２００倍希釈、Ａ１３００およびＢ１３００：５，０００倍希釈）。
【０７０２】
凍結乾燥の後に、より小さい第２の粒子集団が、３００ｎｍ前後に出現した。粒子分布は、全製剤で、全解析時点にわたって匹敵した。負の浮力がある粒子の微分粒子計数の比較。０．３μｍサイズビンを下回る値は、情報のためだけに挙げている（データは希釈補正されていない、Ａ００８５およびＢ００８５：２００倍希釈、Ａ１３００およびＢ１３００：５，０００倍希釈）。
【０７０３】
製剤の異なる細菌濃度が原因で、異なる希釈物を調製する必要があった。Ａ００８５およびＢ００８５は、２００倍希釈し、Ａ１３００およびＢ１３００は、５，０００倍に希釈した。測定に固有の乗算誤差を過大評価しないために、累積的計数は、個々の希釈に対して補正されない。さらに、本方法の定量化限界（ＬｏＱ）は、１ｍＬ当たりおよそ３００，０００個の粒子であるため、希釈補正は、ＬｏＱを上回る一部の測定値に関する低い粒子計数を上昇させ、これは、他の仕方では考慮されず、したがって、実際の実験条件を反映しない可能性がある。
【０７０４】
サブミクロン粒子の数は、凍結乾燥の前および後の全４種の製剤で変化しなかった（図５９Ａ〜図５９Ｄ）。凍結および非凍結材料の結果は、同様であった。凍結乾燥の前に、１つの主要な粒子集団が、６００〜７００ｎｍのサイズ範囲内で検出された（図６０Ａ〜図６０Ｄ）。凍結乾燥の後に、より小さい第２の粒子集団が、３００ｎｍ前後に出現した。粒子分布は、全製剤で、全解析時点にわたって匹敵した。
５．１０  カール・フィッシャー滴定
【０７０５】
直接的な注射により、ＴｌｙｏにおけるＲＭを解析した（図６１および表２６）。より高く濃縮された試料（Ａ１３００およびＢ１３００）に関して、約３％のＲＭに達し、より低く濃縮された試料（Ａ００８５およびＢ００８５）に関して、約３．５％のＲＭに達した。製剤１種当たり５個の解析バイアルの相対的標準偏差は、サイクル２よりも低く、これは、延長されたＳＤ時間が原因である可能性が最も高い。凍結および非凍結材料の結果は、匹敵した。
【０７０６】
【表２６】
2020533997.tif 000033
５．１１  ＶＣＣアッセイ
【０７０７】
Ｔｌｉｑにおいて、Ｔｌｙｏにおける凍結乾燥の後に、３０℃で２４時間および７２時間保管後（Ｔ２４時間およびＴ７２時間）に、ならびに２〜８℃で７日間保管後（Ｔ７日間）に、生存細菌の濃度（ＶＣＣ、ＣＦＵ／ｍＬとして表現）を解析した（図６２および表２７）。凍結乾燥の後に、より低い細菌濃度に関する約６０％へのＶＣＣの減少（Ｔｌｉｑと比べて）、およびより高い細菌濃度に関する７０〜７８％への減少が観察された。３０℃で７２時間のインキュベーション時間の後に、約１０％のさらなる減少が、より低い細菌濃度に観察され、２０％のさらなる減少が、より高い細菌濃度に観察された。２〜８℃で７日間の保管後のＶＣＣ結果は、凍結乾燥の後の値に匹敵した。ＣＦＵ／ｍＬの結果は、ＷＰ２と同様に、凍結乾燥後の目標値を下回った：
・  Ａ１３００（１３の目標ＯＤ６００）：１Ｅ＋１０ＣＦＵ／ｍＬ
・  Ａ００８５（０．８５の目標ＯＤ６００）：１Ｅ＋０９ＣＦＵ／ｍＬ
・  Ｂ１３００（１３の目標ＯＤ６００）：１Ｅ＋１０ＣＦＵ／ｍＬ
・  Ｂ００８５（０．８５の目標ＯＤ６００）：１Ｅ＋０９ＣＦＵ／ｍＬ
ＡＰＣ（Ｉｒｅｌａｎｄ、Ｄｕｂｌｉｎ）は、各製剤の試料によりフローサイトメトリーを再度行った。ＶＣＣおよび％生細胞結果を図６２および表２７に提示する。
【０７０８】
【表２７】
2020533997.tif 000034
【０７０９】
図６３Ａ〜図６３Ｂは、サイクル３後および加速された安定性におけるＶＣＣおよび％生細胞を示す。凍結乾燥による最小の損失が観察された。加速された安定性におけるＶＣＣまたは％生細胞の変化は観察されなかった。初期の％生細胞は、液体凍結された製剤と比べてより高く、この結果は、凍結乾燥された製剤のさらなる開発を支持する。凍結／解凍を経たＤＳは、優れた加速された安定性を実証し、ＶＣＣまたは％生細胞のいずれの減少も観察されなかった。より低いＶＣＣレベルにおいて新鮮および凍結材料の間で観察された％生細胞に僅かなオフセットが存在し、これは、ＶＣＣ増加が、凍結乾燥後のより良い回収に関連するという先の観察と一致する。
【０７１０】
【表２８】
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５．１２  結論
【０７１１】
非凍結および凍結ＤＳによる凍結乾燥ランを行った。２種の目標細菌濃度を検査した。以前のサイクルにおいて利点がなかったため、凍結におけるアニーリングステップまたは保持は含まれなかった。
【０７１２】
全製剤（２種の異なる細菌濃度、凍結および未凍結の未加工の材料）の凍結乾燥ケーキの光学的外観は、優れていた。凍結乾燥ケーキの縮小は、細菌濃度に依存するものと思われた。より少ない縮小が、より高い細菌濃度で観察された。
【０７１３】
復元時間は、細菌濃度および凍結ステップに依存した。より長い復元時間が、より高い細菌濃度に観察された。より短い復元時間が、凍結におけるアニーリングステップがある実験と比較して、凍結におけるアニーリングステップがない実験において観察された（データ図示せず）。
【０７１４】
肉眼では見えないサブミクロン粒子の数は、凍結乾燥および３０℃での保管の後で主に変化しなかった（ＲＭＭおよびＭＦＩによって解析）。非凍結材料の粒子の数は、凍結乾燥の前でより多かった。凍結乾燥の後に、約３００ｎｍサイズの小さい粒子集団が検出された（ＲＭＭによって解析）。
【０７１５】
約６０〜７０％へのプレートに基づくＶＣＣの減少（Ｔｌｉｑと比べて）が、最低細菌濃度に関して凍結乾燥の後に観察された。より高いＶＣＣ（Ｔｌｉｑと比べて７０〜７８％）が、２種の高い方の細菌濃度に観察された。１０〜２０％のさらなる減少が、３０℃で最大７２時間の保管後に観察された。３７℃での解凍による１Ｌ  ＬＤＰＥバッグにおけるＤＳの保管は、連続的に加工されたＤＳに対する、加速された安定性における匹敵するＶＣＣおよび％生細胞結果を実証した。
【０７１６】
ＶＣＣおよび％生細胞のためのフローサイトメトリー解析は、凍結および新鮮ＤＳの両方で優れた安定性を実証した。新鮮および凍結ＤＳの間でより低いＶＣＣレベルの僅かなオフセットが存在した。
【０７１７】
約３％（より高い細菌濃度）および３．５％（より低い細菌濃度）のＲＭが、凍結乾燥（６時間、０℃のＳＤ温度）の後に得られた。
【０７１８】
一般に、適用された方法により、凍結および非凍結材料の間に差は観察されず、−８０℃におけるＤＳの長期保管が可能であり得、これにより、連続的製造の必要がなくなることを指し示す。
（実施例６）
凍結乾燥前の凍結原薬の解凍における温度および時間の効果
【０７１９】
解凍のための温度および時間は、安定性に影響し得る。凍結原薬を解凍するための適切な条件を同定することにより、凍結乾燥前の原薬の凍結および保持が可能になる。解凍から得られる高品質の健康な細胞であることを確実にすることにより、結果として得られる凍結乾燥された薬物製品も、十分な品質のものであることが確実になる。
６．１  バルク原薬の凍結解凍（ＦＴ）
【０７２０】
開発を通じて、様々な試験が、−８０℃で原薬（ＤＳ）を保管し、後日、凍結乾燥された薬物製品（ＤＰ）バッチを解凍および配合製造する能力を評価した。これは、ＤＳの凍結解凍を含む。凍結／解凍サイクルは、氷晶が残らなくなるまでの、ＤＳの完全解凍に続く、最低２４時間の−８０℃での保管として定義された。凍結解凍によるストレスは、凍結乾燥された製品の製品品質（例えば、ＶＣＣ、％生細胞）に有害に影響し得る。したがって、一連の実験を行って、ＤＳに最適な保管条件および解凍手順を決定した。
６．２  ＤＳ容器（バッグｖｓ．ボトル）の評価
【０７２１】
初期試験は、ボトル内に保管されたＤＳを評価した（Ｖｉｂａｌｏｇｉｃｓ実験Ｌｙｏ８、Ｌｙｏ１２およびＬｙｏ１６、ならびにコリオリＷＰ２Ａ、ＷＰ２ＢおよびＷＰ３）。他の試験は、一晩２〜８℃（Ｖｉｂａｌｏｇｉｃｓ  Ｌｙｏ８およびＬｙｏ１２、ならびにコリオリＷＰ２ＢおよびＷＰ３）またはより短いスパンの時間で３７℃（Ｖｉｂａｌｏｇｉｃｓ  Ｌｙｏ１６、ならびにコリオリＷＰ２Ａ、ＷＰ６およびＷＰ７−サイクル１）のいずれかでＤＳを解凍した。後の試験は、１Ｌ  ＬＤＰＥバッグ内で保管され、３７℃で解凍されたＤＳを評価した（ＷＰ７−サイクル３）。
６．３  ＤＳ解凍温度およびＤＳ濃度の評価
【０７２２】
ＬＤＰＥバッグ内でのＤＳの保管は、ＧＭＰ製造のために、ボトル内での保管よりも好まれるため、開発努力は、バッグ内で保管した場合に、より高いＶＣＣおよび％生細胞プロファイルをもたらす条件に焦点を合わせた。凍結／解凍サイクルは、ＤＳの完全解凍に続く、最低２４時間の−８０℃での保管として定義された。凍結／解凍試験が完結して、ある範囲のＤＳ  ＶＣＣレベル（濃度）および解凍温度に関する、３回のＦＴサイクルにわたる原薬ＶＣＣおよび％生細胞を評価した。
【０７２３】
ＦＴ試験は、３．５および６．５のＯＤ６００におけるＤＳを評価した。およそ１ＬのＤＳを、１Ｌ  ＬＤＰＥバッグ内に充填し、−８０℃で凍結し、２〜８℃、室温（ＲＴ）または３７℃のいずれかで３回のＦＴサイクルに付した。ＤＳバッグを、６．５のＯＤ６００または３．５のＯＤ６００で、４℃の冷蔵庫内で３６時間、研究室の実験台の上の室温でおよそ１２時間、またはインキュベーター内の３７℃で≦８時間解凍した。完全に解凍した後に、解析のために試料を採取し、バッグを最低２４時間−８０℃に置き、その後、それぞれの条件で解凍し、次のサイクルのために再凍結した。
【０７２４】
図６４および図６５に示す通り、試験された解凍条件に関して、６．５のＯＤ６００におけるＢＤＳのＶＣＣおよび生存率の値は、３．５のＯＤ６００におけるＢＤＳと比べて、３回の凍結解凍サイクルにわたるより高いＶＣＣおよび生存率を実証した。
【０７２５】
３．５のＯＤ６００におけるＢＤＳの生存率は、３７℃解凍を除いた全解凍温度で、複数の凍結解凍サイクルに伴い減少した。３７℃解凍は、６．５および３．０の両方のＯＤ６００で凍結解凍安定性を実証した。
【０７２６】
データは、３７℃でのＤＳの解凍が、評価されたＶＣＣ値の範囲にわたって改善された製品品質をもたらすことを実証する。データは、許容される加速された安定性プロファイルをもたらさなかった、ボトル内に濃縮ペレットとして保管され２〜８℃で解凍されたＤＳを評価したコリオリ実験によってさらに支持される。知見に基づき、ＷＰ７サイクル３を行って、ＤＳの目標保管条件および目標解凍条件が、ＦＴサイクルを経ていないＤＳと比べて、改善されたＬｙｏにおけるＤＰ安定性をもたらすか評価した。３７℃で解凍された１Ｌ  ＬＤＰＥバッグ内の１Ｌ充填による２〜８℃および−８０℃保管されたＤＳを比較したＷＰ７−サイクル３の結果は、匹敵する結果を実証し、凍結乾燥前にＤＳを凍結および解凍することが実現可能であることを実証する。
（実施例７）
例示的な凍結乾燥条件
７．１  製剤
【０７２７】
【表２９】
2020533997.tif 000036
７．２  原薬製造および解凍
【０７２８】
ＤＳ製造は、発酵のための２０Ｌ培養バッグ、濃縮および緩衝液交換のための接線流濾過（ＴＦＦ）マニフォールド、ならびにＤＳ充填のための容器マニフォールドの、使い捨ての閉鎖系からなる。ＤＳは、配合、充填および凍結乾燥前に、２〜８℃で最大３日間保持することができる、または−８０℃で凍結することができる。ＤＳ目標濃度３．５〜６．５ＯＤ６００。ＤＳの解凍は、３７℃で≦８時間に行われる。
７．３  凍結乾燥サイクル
【０７２９】
【表３０】
2020533997.tif 000037
７．４  残留水分目標
【０７３０】
残留水分目標は、＞３．０％発売時である。
７．４  ＡＤＸＳ  ＤＳプラットフォームプロセス説明
【０７３１】
発酵は、揺動波動型生物反応器技術によって提供される使い捨ての閉鎖系内で実行される。使い捨ての閉鎖系は、発酵のための製品培養バッグ、濃縮および緩衝液交換のための接線流濾過（ＴＦＦ）システム、ならびに原薬容器充填のための製品マニフォールドからなる。これらの構成成分のそれぞれは、ガンマ線照射によって滅菌され、現場の（ｓｉｔｅ）品質システムに従って受け取られる。
【０７３２】
プラットフォームは、発酵のために揺動波動型技術を使用する。この技術は、閉鎖系における加工操作全体を制御する能力を提供する。バルクＤＳは、使い捨てのホローファイバーモジュールおよび使い捨てのディスポーザブル濾過通路を使用したＴＦＦによって収集される。
【０７３３】
発酵培地およびｐＨ制御溶液（１Ｍ水酸化ナトリウム）の組成を表３１に提供する。接種のための培地は、順次に２個の０．２μｍフィルターに通して濾過滅菌して、無菌１Ｌガラスボトルに入れる。発酵培地は、順次に２個の０．２μｍフィルターに通して濾過滅菌して、無菌１０Ｌガラスボトルに入れる。
【０７３４】
【表３１】
2020533997.tif 000038
【０７３５】
培養バッグは、溶存酸素（ＤＯ）およびｐＨモニタリングのためのプローブと予め接続されている。次にこれに、５Ｌの発酵培地を無菌的に充填する。培養バッグは、０．２μｍ濾過された圧縮Ｏ２および空気で膨張される。
【０７３６】
濾過された（０．２μｍ）圧縮空気／Ｏ２は、繁殖の間、１．０Ｌ／分の速度で連続的に供給され、Ｏ２流動セットポイントは、５０％であり、ベントポートを通して除去される。揺動角度は、１０°に設定される。ＤＯ制御は、１８〜３６ｒｐｍの間の揺動速度によりスピードに対して設定される。ｐＨ制御ボトルは、培養バッグに無菌的に接続される。繁殖の間、プロセスは、統合された制御システムにより、温度、ｐＨおよび溶存酸素に関して自動的にモニターおよび制御される。
【０７３７】
１ｍＬのＷＣＢをピペッティングして、１７０ｍＬの発酵培地に入れることにより、前培養を、ワーキングセルバンクから開始し、≧３．５のＯＤ６００に達するまでおよそ１０時間増殖させる。前培養物を培養バッグに無菌的に移動することにより、前培養物を生産培養への接種に使用する。増殖は、ＯＤ６００≧７．５まで進められる。ＯＤ６００が、目標値に達したら、Ｒｅａｄｙ  Ｍａｔｅコネクタを使用して、培養バッグを、製剤緩衝液に対する濃縮および透析濾過のための無菌ＴＦＦマニフォールドに接続する。ＴＦＦモジュールは、細胞分離適用の低剪断要件を満たす、０．２μｍポアサイズホローファイバーフィルターを使用する。蠕動ポンプを使用して、ＴＦＦシステム内に発酵培養物を供給する。再循環ループにおけるバルク培養は、およそ７５ｒｐｍ（およそ４．５Ｌ／分）の流速に初期に設定される。発酵ブロスは、およそ１０００ｇの質量に対して５倍濃縮される。透過ポンプが使用され、２０％（およそ２７５ｍＬ／分）で初期に設定される。
【０７３８】
収集濃縮物の透析濾過／洗浄は、≧７透析体積により行われる。残余分原薬は、インプロセスサンプリングマニフォールドを使用して、ＴＦＦアセンブリからサンプリングされる。試料のＯＤ６００を測定し、≦６．５の目標ＯＤ６００に達するのに必要とされる希釈体積の計算に使用する。要求される量の製剤緩衝液をポンピングして、残余分バッグに入れて、残余分を要求される濃度に希釈する。全ての体積移動は、体積移動を制御するための完全ＴＦＦアセンブリに加えて、それぞれのバッグにおける重量変化によって制御される。残余分を、サンプリングし、測定して、ＯＤ６００が≦６．５であることを確認する。ＯＤ６００が十分に希釈されていない場合、これをさらに希釈することができる。次に、ＤＳは、製品バッグ内でおよそ１Ｌアリコートに分配される。
【０７３９】
各バッグは、アセンブリから除去するためにヒートシールされる。各バッグに、適切な情報について個々にラベルを付け、次いで−７０±１５℃で保管する。
７．６  原薬プロセスフロー図
【０７４０】
図２０を参照されたい。
７．７  薬物製品プロセスフロー図
【０７４１】
図２１を参照されたい。
【図１】
2020533997.tif 000039
【図２Ａ】
2020533997.tif 000040
【図２Ｂ】
2020533997.tif 000041
【図３】
2020533997.tif 000042
【図４】
2020533997.tif 000043
【図５】
2020533997.tif 000044
【図６】
2020533997.tif 000045
【図７Ａ】
2020533997.tif 000046
【図７Ｂ】
2020533997.tif 000047
【図８】
2020533997.tif 000048
【図９】
2020533997.tif 000049
【図１０】
2020533997.tif 000050
【図１１】
2020533997.tif 000051
【図１２】
2020533997.tif 000052
【図１３】
2020533997.tif 000053
【図１４】
2020533997.tif 000054
【図１５】
2020533997.tif 000055
【図１６】
2020533997.tif 000056
【図１７】
2020533997.tif 000057
【図１８】
2020533997.tif 000058
【図１９】
2020533997.tif 000059
【図２０】
2020533997.tif 000060
【図２１】
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【図２２Ａ】
2020533997.tif 000062
【図２２Ｂ】
2020533997.tif 000063
【図２３Ａ】
2020533997.tif 000064
【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
2020533997.tif 000066
【図２４Ｂ】
2020533997.tif 000067
【図２５】
2020533997.tif 000068
【図２６】
2020533997.tif 000069
【図２７】
2020533997.tif 000070
【図２８】
2020533997.tif 000071
【図２９】
2020533997.tif 000072
【図３０】
2020533997.tif 000073
【図３１】
2020533997.tif 000074
【図３２】
2020533997.tif 000075
【図３３】
2020533997.tif 000076
【図３４】
2020533997.tif 000077
【図３５】
2020533997.tif 000078
【図３６】
2020533997.tif 000079
【図３７】
2020533997.tif 000080
【図３８】
2020533997.tif 000081
【図３９】
2020533997.tif 000082
【図４０】
2020533997.tif 000083
【図４１Ａ】
2020533997.tif 000084
【図４１Ｂ】
2020533997.tif 000085
【図４２】
2020533997.tif 000086
【図４３】
2020533997.tif 000087
【図４４Ａ】
2020533997.tif 000088
【図４４Ｂ】
2020533997.tif 000089
【図４５Ａ】
2020533997.tif 000090
【図４５Ｂ】
2020533997.tif 000091
【図４６】
2020533997.tif 000092
【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
2020533997.tif 000097
【図５２】
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【図５３】
2020533997.tif 000099
【図５４】
2020533997.tif 000100
【図５５】
2020533997.tif 000101
【図５６】
2020533997.tif 000102
【図５７】
2020533997.tif 000103
【図５８Ａ】
2020533997.tif 000104
【図５８Ｂ】
2020533997.tif 000105
【図５８Ｃ】
2020533997.tif 000106
【図５８Ｄ】
2020533997.tif 000107
【図５９Ａ】
2020533997.tif 000108
【図５９Ｂ】
2020533997.tif 000109
【図５９Ｃ】
2020533997.tif 000110
【図５９Ｄ】
2020533997.tif 000111
【図６０Ａ】
2020533997.tif 000112
【図６０Ｂ】
2020533997.tif 000113
【図６０Ｃ】
2020533997.tif 000114
【図６０Ｄ】
2020533997.tif 000115
【図６１】
2020533997.tif 000116
【図６２】
2020533997.tif 000117
【図６３Ａ】
2020533997.tif 000118
【図６３Ｂ】
2020533997.tif 000119
【図６４】
2020533997.tif 000120
【図６５】
2020533997.tif 000121
【配列表】
2020533997000001.app
【国際調査報告】
2020533997.tif 000122
2020533997.tif 000123
2020533997.tif 000124
2020533997.tif 000125
2020533997.tif 000126