(57)【要約】  本発明は、脂質を製粉工程の潤滑剤として用いる活性物質のナノ粒子の製造方法に関し、さらに詳しくは、活性物質と潤滑剤としての脂質とを含む混合物及びガラス転移温度（glass transition temperature）が８０℃以上の生体適合性高分子をロールミルで粉砕した後、超臨界流体を用いて潤滑剤として使用された脂質を除去することによって、活性物質を医薬品、化粧品、機能性食品などに便利に使用できるナノ粒子で製造する方法に関する。
2020517578.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）活性物質、潤滑剤としての脂質、及びガラス転移温度（glass transition temperature）が８０℃以上の生体適合性高分子を含む混合物を提供する工程；
（２）製粉工程を介して前記工程（１）の生成物を粉砕する工程；及び
（３）超臨界流体を用いて前記工程（２）の生成物から脂質を除去する工程；
を含む、活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項２】
前記工程（１）が、活性物質、潤滑剤としての脂質、及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を物理的に均一に混合する工程である、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項３】
前記工程（１）が、活性物質と潤滑剤としての脂質とを混合し、この混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を脱塩水と共に添加した後、その生成物を物理的に均一に混合する工程である、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項４】
前記工程（１）が、活性物質、潤滑剤としての脂質、ガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子、並びにガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を物理的に均一に混合する工程である、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項５】
前記工程（１）が、活性物質と潤滑剤としての脂質とを混合し、この混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子並びにガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を脱塩水と共に添加した後、その生成物を物理的に均一に混合する工程である、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項６】
前記工程（１）が、活性物質及び潤滑剤としての脂質を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合粉末にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程である、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項７】
前記工程（１）が、活性物質及び潤滑剤としての脂質を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合粉末にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を脱塩水と共に添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程である、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項８】
前記工程（１）が、活性物質及び潤滑剤としての脂質を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合粉末にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子並びにガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程である、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項９】
前記工程（１）が、活性物質及び潤滑剤としての脂質を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合粉末にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子並びにガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を脱塩水と共に添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程である、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項１０】
前記工程（１）が、活性物質、潤滑剤としての脂質及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥する工程である、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項１１】
前記工程（１）が活性物質、潤滑剤としての脂質及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合粉末にガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程である、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項１２】
前記工程（１）が、活性物質、潤滑剤としての脂質及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合粉末にガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を脱塩水と共に添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程である、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項１３】
前記工程（２）における製粉工程が、逆方向に回転するロールを用いて連続的に行われる、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項１４】
前記工程（３）における脂質除去が、前記工程（２）の生成物を含有する反応器に超臨界流体を連続的に投入及び流出することによって行われる、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項１５】
前記工程（３）において、超臨界流体を用いた脂質除去が、５０気圧以上の圧力条件及び５〜６０℃の温度条件下で行われる、請求項１に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項１６】
前記活性物質が、有機化合物、有機金属化合物、天然抽出物、タンパク質及びこれらの組み合わせから選ばれる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項１７】
前記脂質が、炭素数１０〜２２の飽和脂肪酸、炭素数１０〜２２の飽和脂肪酸エステル、炭素数１０〜２２の飽和脂肪アルコール、炭素数１０〜２２の飽和脂肪酸性基を有するモノ−、ジ−又はトリ−グリセリド、炭素数１４以上の炭化水素及びこれらの組み合わせから選ばれる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【請求項１８】
前記ガラス転移温度（Ｔｇ）が８０℃以上の生体適合性高分子が、Ｔｇが８０℃以上のセルロース系の生体適合性高分子、Ｔｇが８０℃以上のポリビニルピロリドン、Ｔｇが８０℃以上のポリビニルアルコール及びＴｇが８０℃以上のオイドラギット系の生体適合性高分子から選ばれる１種以上である、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の活性物質のナノ粒子の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂質を製粉工程の潤滑剤として用いる活性物質のナノ粒子の製造方法に関し、さらに詳しくは、活性物質、潤滑剤としての脂質、及びガラス転移温度（glass transition temperature）が８０℃以上の生体適合性高分子を含む混合物を、製粉工程を介して粉砕した後、超臨界流体を用いて潤滑剤として使用された脂質を除去することによって、活性物質を医薬品、化粧品、機能性食品などに便利に使用できるナノ粒子で製造する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
様々な産業分野において、一定サイズの非常に微細な粒子を効果的、且つ迅速に製造する技術に対する要求が絶えず存在している。このような一定サイズの微粒子は多くの長所を有し、特に、流動性が良好であり粒子間相互作用の偏差が少ないことは産業的に非常に有利である。例えば、医薬産業では、治療剤の粒径は分解速度、生物学的能力、製剤（formulation）などに大きく影響し、治療剤の粒子間の相互作用の偏差が少なくなるにつれて、治療剤の全体的な安定性は良くなる。
【０００３】
医薬品において、治療剤の粒子をナノスケールのサイズにすれば、以下の利点が得られる。まず、経口投与時の腸内吸収率が低い薬物では、吸収がより大きくなり、より大きなサイズのものに比べて治療剤の生物学的効率を高めることができる。さらに、薬剤の剤形を多様化できる。例えば、経口投与のみを介して投与されてきた薬物を、吸入による投与にすることができる。また、徐放性治療剤の製剤において、治療剤の放出速度は大変重要な要素である。治療剤の粒子サイズがナノスケールで形成される場合、粒子サイズは比較的より均一になり、その結果、放出速度がより予測可能となり、より有効な治療剤を提供することが可能となる。
【０００４】
均一なナノ粒子は、上記のような様々な利点を有するので、活性物質をナノ粒子として製造する試みが数多くなされてきた。従来、圧搾（crushing）、粉砕（grinding）、製粉（milling）等の機械的技術は、大きな粒子を比較的に小さくするために使用されてきた。近年、製薬業界では、大量の治療薬を医薬用途に適した大きさに粉砕するために、エアージェット粉砕機（air-jet mill）を用いた方法が一般的に用いられている。しかし、特許文献１及び非特許文献１によれば、このような従来の機械的方法は、一般に、可能な最小粒径が約数十マイクロメートルの限界を有するものとして認識されてきた。
【０００５】
Keiji Yamamotoらは、非特許文献２に、薬物のナノ粒子は、ロッドミルを用いて薬物をシクロデキストリンと共に粉砕することによって調製することができると記載した。彼らは、この方法で使用されるシクロデキストリンの量は、モル比で約２倍、即ち、重量比で約４倍であり、使用された全てのシクロデキストリンを水和させるための湿度が必要であり、その湿度が高過ぎても低過ぎても良くないと記載した。
【０００６】
特許文献２には、難水溶性薬物を界面活性剤の存在下で湿式製粉することにより、数百ナノメートルのサイズの粒子を調製する方法が開示されている。この技術は、従来の粉砕方法を用いて１００μｍ以下の粒径に薬物を調製した後に適用する必要がある。この方法では、目標サイズ範囲内の粒子を調製するための時間は、そのために使用される機械的装置に依存する。ボールミルを使用する場合、５日以上が必要である。一方、高剪断媒体ミルを使用する場合、１日以内に調製することができる。さらに、この方法で得られたナノ粒子は懸濁相であるため、粉末型にするためには、噴霧乾燥又は凍結乾燥の工程を行う必要がある。しかし、これら工程の間に粒子間の相互凝集が起こり、得られた粉末を液体中に再分散させたときに、実質的にナノメートルスケールの粒子に分散させることは困難である。このような問題を解決するために、特許文献３では、凍結乾燥時に使用される凝集防止剤を開示している。さらに、特許文献４では、噴霧乾燥工程中の安定剤、界面活性剤及び凝集防止剤の使用を開示している。また、特許文献５では、難溶性薬物に対する界面安定剤としてリゾチーム（lysozyme）を使用する湿式粉砕技術の適用が開示されている。しかし、この場合、界面安定剤はタンパク質であるため、乾燥には多くの制約があり、液相での調製のみが開示されている。
【０００７】
特許文献６では、ピストンギャップホモジナイゼーションを用いてナノ粒子を調製する方法が開示されている。しかし、ピストンギャップホモジナイゼーションを利用するためには、ジェットミル又はハンマーミルなどを用いて粒子を均一な大きさに粉砕する前処理工程が必要である。さらに、この工程は、高粘性溶液には利用できないので、活性物質の濃度が低い状態で実施されなければならない。
【０００８】
他の従来の方法では、活性物質を溶解した溶液の環境を変化させ、溶質の沈殿又は結晶化を生じさせて、活性物質の微粒子を得る再結晶方法がある。この再結晶方法には、大きく２種類の方式がある。その一つは、治療剤を適当な溶媒に溶解させ、温度を下げ、治療剤の溶解度を変化させて粒子を析出させる方式であり、他方は、治療剤を溶解した溶媒に貧溶媒を添加することにより、溶媒の溶解力を低下させて粒子を析出させる方式である。しかし、このような再結晶方法は、通常、ヒトに有害な有機溶媒の使用が必要である。また、湿潤状態での粒子の凝集又は凝固が、析出された粒子をろ過した後の乾燥工程中に生じ、その結果、最終的に得られた粒子のサイズが均一にならないことがある。
【０００９】
特許文献７では、高分子を有機溶媒に溶解し、その中にタンパク質である薬剤を溶解又は分散させ、急冷して超低温にして固化させ、凍結乾燥して微粒子を製造する方法が記載されている。しかし、この場合には、有機溶媒との接触によりタンパク質である薬物が変性し、また、急速冷却及び凍結乾燥の工程が必要となり、経済的ではない。
【００１０】
さらに、乳化を用いて粒径を小さくする方法もある。この方法は、化粧品分野で一般的に用いられており、難水溶性物質を熱で融解又は有機溶媒に溶解し、界面活性剤を溶解した水溶液に添加しながら高速撹拌するか、超音波を用いて分散することによって、微粒子を製造する方法である。しかし、この場合には、粉末状の微粒子を得るために水を除去する工程が必要となり、水分除去工程において多くの制約が生じる。また、難水溶性物質を溶解するために有機溶媒を用いると、ヒトに有害な有機溶媒の残留が常に懸念される。
【００１１】
特許文献８は、活性物質を有機溶媒に溶解し、界面活性剤を溶解した水溶液中に噴霧することによって微粒子を調製する方法が開示されている。この方法は有機溶媒を使用し、調製された粒子が水相に存在するので、溶媒として用いられる水を除去して、粉末状の粒子を得るために乾燥工程が必要となる。しかし、乾燥工程中に粒子の凝固が生じ、これにより、ナノスケールのサイズに粒子を再分散することは困難である。
【００１２】
近年、非結晶又はナノスケールの粒子を調製する際に超臨界流体を使用する試みが数多くなされている。一般的に使用される超臨界流体は二酸化炭素である。超臨界流体を用いてナノ粒子を調製する方法の一つとして、超臨界溶液急速膨張法（ＲＥＳＳ）が知られている（非特許文献３、特許文献９、１０）。この方法によれば、まず、対象溶質を超臨界流体に溶解させた後、その超臨界流体溶液をノズルを介して比較的低圧の状態に速やかに噴射する。そして、超臨界流体の密度が急激に低下する。その結果、超臨界流体が溶質を可溶化する能力も急速に低下し、溶質が非常に微細な粒子又は結晶に生成される。
【００１３】
超臨界流体を利用する他の方法には、気体−貧溶媒再結晶法（以下、‘ＧＡＳ’）（非特許文献４、特許文献１１）がある。この方法は、治療剤を通常の有機溶媒に溶解して溶液を調製し、この溶液をノズルを介して貧溶媒として作用する超臨界流体に噴射することを含む。そして、溶液と超臨界流体との接触により、急激な体積膨張が生じる。その結果、溶媒の密度及び溶解能力が低下し、極端な過飽和が生じ、溶質の核又は粒子が形成される。
【００１４】
上記のように、活性物質をナノ粒子に調製する多様な技術が開発されてきたが、その適用範囲に限界があった。また、経済面で多くの制約があった。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】米国特許第５，５３４，２７０号明細書
【特許文献２】米国特許第５，１４５，６８４号明細書
【特許文献３】米国特許第５，３０２，４０１号明細書
【特許文献４】米国特許第６，５９２，９０３号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／０１８５８６９号明細書
【特許文献６】米国特許出願公開第２００２／０１６８４０２号明細書
【特許文献７】米国特許出願公開第２００３／０１０４０６８号明細書
【特許文献８】米国特許出願公開第２００４／００６７２５１号明細書
【特許文献９】米国特許第６，３１６，０３０号明細書
【特許文献１０】米国特許第６，３５２，７３７号明細書
【特許文献１１】国際公開第２０００／３７１６９号
【非特許文献】
【００１６】
【非特許文献１】Lachman, et al. The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, Chapter 2, “Milling”, p.45, (1986)
【非特許文献２】Chem, Pharm, Bull. 55(3)359-363 (2007)
【非特許文献３】Tom et al. Biotechnol. Prog. 7(5):403-411. (1991)
【非特許文献４】Debenedetti et al. J. Control. Release 24:27-44. (1993)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
本発明は、上記の従来技術の問題点を解決するためのものである。本発明の目的は、従来技術のような適用限界及び低い経済性を克服しながら、製粉工程を介してナノ粒子サイズの活性物質を効率的に製造することができる方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明によれば、（１）活性物質、潤滑剤としての脂質、及びガラス転移温度（glass transition temperature）が８０℃以上の生体適合性高分子を含む混合物を提供する工程；（２）製粉工程を通じて前記工程（１）の生成物を粉砕する工程；及び（３）超臨界流体を用いて前記工程（２）の生成物から脂質を除去する工程；を含む活性物質のナノ粒子の製造方法が提供される。
【００１９】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質、潤滑剤としての脂質、及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００２０】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質と潤滑剤としての脂質を混合し、この混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を脱塩水と共に添加した後、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００２１】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質、潤滑剤としての脂質、ガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子、並びに、ガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００２２】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質と潤滑剤としての脂質を混合し、この混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子並びにガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を脱塩水と共に添加した後、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００２３】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質及び潤滑剤としての脂質を水混和性（水と混合する性質）有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００２４】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質及び潤滑剤としての脂質を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を脱塩水と共に添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００２５】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質及び潤滑剤としての脂質を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子並びにガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００２６】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質及び潤滑剤としての脂質を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子並びにガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を脱塩水と共に添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００２７】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質、潤滑剤としての脂質及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過して乾燥する工程であってもよい。
【００２８】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質、潤滑剤としての脂質及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合物にガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００２９】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質、潤滑剤としての脂質及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合物にガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を脱塩水と共に添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００３０】
前記工程（１）において、物理的混合は、ｖ−ミキサー（v-mixer）、縦型ミキサー（vertical mixer）、リボンミキサー（ribbon mixer）、プラネタリーミキサー（planetary mixer）、ロールミル（roll mill）等の従来公知のミキサーを用いて行うことができる。
【００３１】
前記工程（１）において、各成分の混合時の温度は特に限定されず、例えば、４０℃以下（例えば、１０〜４０℃）、好ましくは３０℃以下（例えば、１０〜３０℃）であってもよい。
【００３２】
本発明の一態様において、前記工程（２）における製粉工程は、逆方向に回転するロール（例えば、二本ロールミル又は三本ロールミル）を用いて連続的に行うことができる。
【００３３】
本発明の一態様において、前記工程（３）における脂質除去は、前記工程（２）の生成物を含有する反応器に超臨界流体を連続的に投入及び流出させることによって行うことができる。
【００３４】
本発明の一態様において、前記工程（３）において、超臨界流体を用いた脂質除去は、５０気圧以上の圧力条件及び５〜６０℃の温度条件下で行うことができる。
【発明の効果】
【００３５】
本発明に係る活性物質ナノ粒子製造方法は、活性物質と生体適合性高分子、及び必要に応じて界面活性剤及び／又は凝集防止剤を含む混合物をロールミル（例えば、三本ロールミル又は二本ロールミル）を用いて製粉するときに、潤滑剤として脂質を用いてスムーズに製粉工程を行い、ロールミルを用いて活性成分のナノ粒子を工業的規模で製造することができる。本発明により製造された活性物質ナノ粒子は、分散性、吸水性、生理的活性などが非常に優れており、医薬品、機能性食品、一般食品、化粧品などに好適に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１Ａ〜図１Ｅは、実施例１〜５で製造されたナノ粒子の粒度分布図である。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、実施例６及び７で製造されたナノ粒子の粒度分布図である。
【図３】図３は、実施例８で製造されたナノ粒子の粒度分布図である。
【図４】図４は、実施例１０で製造されたナノ粒子のｐＸＲＤ分析結果である。
【図５】図５は、実施例１０と比較例でそれぞれ製造されたナノ粒子のｐＸＲＤ分析結果を対比して示した図である。
【図６】図６は、実施例１１で製造されたナノ粒子の粒度分布図である。
【図７】図７Ａ〜図７Ｂは、実施例１２及び１３で製造されたナノ粒子の粒度分布図である。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、実施例１５及び１６で製造されたナノ粒子の粒度分布図である。
【図９】図９Ａ〜図９Ｃは、実施例１７〜１９で製造されたナノ粒子の粒度分布図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３８】
本発明において、上記の活性物質としては、例えば、医薬品、機能性食品、化粧品などにおいて生理活性を示す有機化合物、有機金属化合物、天然抽出物、タンパク質、及びこれらの組み合わせから選ばれたものを使用できるが、これらに限定されない。上記の活性物質において、固相又は液相などの室温における性状及び中性又はイオン性などの電気的形態に特に制限はない。
【００３９】
本発明の特定の態様によれば、前記活性物質は、生理的活性物質、その塩、異性体、エステル、エーテル又は他の誘導体として、例えば、抗癌剤（anticancer agents）、抗真菌剤（antifungal agents）、鎮痛剤（analgesics）、抗精神剤（psychiatric agents）、麻酔剤（anesthetic agents）又は催眠剤（hypnotics）等の意識レベル調節剤（consciousness level-altering agents）、非ステロイド抗炎症剤（nonsteroidal antiinflammatory agents）、駆虫剤（anthelminthics）、抗ニキビ剤（antiacne agents）、抗狭心症剤（antianginal agents）、抗不整脈剤（antiarrhythmic agents）、抗喘息剤（anti-asthma agents）、抗菌剤（antibacterial agents）、前立腺肥大症治療剤（anti-benign prostatic hypertrophy agents）、抗凝血剤（anticoagulants）、抗うつ剤（antidepressants）、糖尿病治療剤（antidiabetics）、鎮吐剤（antiemetics）、抗てんかん剤（antiepileptics）、抗痛風剤（antigout agents）、抗高血圧剤（antihypertensive agents）、抗炎症剤（antiinflammatory agents）、抗マラリア剤（antimalarials）、抗片頭痛剤（antimigraine agents）、抗ムスカリン剤（antimuscarinic agents）、抗腫瘍剤（antineoplastic agents）、抗肥満剤（antiobesity agents）、抗骨粗鬆症剤（antiosteoporosis agents）、抗パーキンソン病剤（antiparkinsonian agents）、抗増殖剤（antiproliferative agents）、抗原虫剤（antiprotozoal agents）、抗甲状腺剤（antithyroid agents）、鎮咳剤（antitussive agent）、抗尿失禁剤（anti-urinary incontinence agents）、抗ウイルス剤（antiviral agents）、抗不安剤（anxiolytic agents）、食欲抑制剤（appetite suppressants）、β遮断剤（beta-blockers）、心臓収縮促進剤（cardiacinotropic agents）、化学療法剤（chemotherapeutic drugs）、認知向上剤（cognition enhancers）、避妊剤（contraceptives）、コルチコステロイド剤（corticosteroids）、Ｃｏｘ−２抑制剤（Cox-2 inhibitors）、利尿剤（diuretics）、勃起不全治療剤（erectile dysfunction improvement agents）、去痰剤（expectorants）、胃腸薬（gastrointestinal agents）、ヒスタミン受容体拮抗剤（histamine receptor antagonists）、免疫抑制剤（immunosuppressants）、ケラチノサイト溶解剤（keratolytics）、脂質調節剤（lipid regulating agents）、ロイコトリエン抑制剤（leukotriene inhibitors）、マクロライド（macrolides）、筋肉弛緩剤（muscle relaxants）、神経弛緩剤（neuroleptics）、栄養剤（nutritional agents）、オピオイド鎮痛剤（opioid analgesics）、タンパク質加水分解酵素抑制剤（protease inhibitors）、又は鎮静剤（sedatives）等を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
本明細書で使用する用語「ナノ粒子」とは、その９０％以上の粒子が５μｍ以下、好ましくは２μｍ以下、より好ましくは１μｍ以下（例えば、０．９μｍ以下、０．８μｍ以下、０．７μｍ以下、又は０．６μｍ以下）、さらに好ましくは０．５μｍ以下、さらに好ましくは０．４μｍ以下、さらに好ましくは０．３μｍ以下、さらに好ましくは０．２μｍ以下の平均粒径を有する粒子である。前記ナノ粒子の平均粒径の下限は、１ｎｍ以上、５ｎｍ以上、１０ｎｍ以上、５０ｎｍ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４１】
本発明において、潤滑剤として用いられる前記脂質の性状には特に制限がなく、室温で液相又は固相のいずれも使用することができる。一態様において、好ましくは、超臨界流体に対する良好な溶解度を有する脂質を用いることができ、このような脂質の例は、炭素数１０〜２２の飽和脂肪酸、炭素数１０〜２２の飽和脂肪酸エステル、炭素数１０〜２２の飽和脂肪アルコール、炭素数１０〜２２の飽和脂肪酸性基を有するモノ−、ジ−又はトリ−グリセリド、炭素数１４以上（例えば、１４〜２４）の炭化水素、及びこれらの組み合わせから選ばれたものが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４２】
本発明の特定の態様によれば、前記脂質は、例えば、ミリスチルアルコール（Myristyl alcohol）、セチルアルコール（Cetyl alcohol）、ステアリルアルコール（Stearyl alcohol）及びラウリルアルコール（Lauryl Alcohol）などの脂肪アルコール（fatty alcohol）、ステアリン酸（stearic acid）、パルミチン酸（palmitic acid）、ミリスチン酸（myristic acid）、ラウリン酸（lauric acid）、及びこれらのメチル、エチル、プロピル及びブチルアルコールなどのエステル、ステアリルモノグリセリド、パルミチルモノグリセリド、ミリスチルモノグリセリド、ラウリルモノグリセリドなどの脂肪酸モノグリセリド、ジステアリルグリセリド、ジパルミチルグリセリド、ジミリスチルグリセリド、ジラウリルグリセリドなどの脂肪酸ジグリセリド、テトラデカン（tetradecane）、ペンタデカン（pentadecane）、ヘキサデカン（hexadecane）、ヘプタデカン（heptadecane）、オクタデカン（octadecane）、ノナデカン（nonadecane）、イコサン（icosane）、ヘンエイコサン（heneicosane）、ドコサン（docosane）、トリコサン（tricosane）、テトラコサン（tetracosane）などの炭化水素、及びこれらの組み合わせから選ばれてもよいが、これらに限定されるものではない。本発明の方法によると、製粉工程において潤滑剤として働き、超臨界流体によって除去することができる限り、いかなる脂質も使用可能である。
【００４３】
本発明において、前記脂質は、前記活性物質１重量部に対して、０．１重量部以上、又は０．３重量部以上、又は０．５重量部以上の量で使用することができる。また、前記脂質は、前記活性物質１重量部に対して、１０重量部以下、５重量部以下、又は３重量部以下、又は２重量部以下、又は１．５重量部以下の量で使用することができる。脂質の使用量が活性物質に比べて少な過ぎると、次の製粉工程で重い負荷がかかるため、円滑な製粉が困難であり、活性物質が非晶形又は他の結晶形に変形され、製造されたナノ粒子の安定性が低下することがある。逆に、脂質の使用量が活性物質に比べて多すぎると、次の脂質除去工程の経済性が顕著に低下することがある。また、使用する脂質が室温で液相である場合、その使用量は、活性物質１重量部に対して１．５重量部以下であってもよく、使用量が多すぎると、混合物の性状がスラリーとなり、製粉が適切に行われないことがある。
【００４４】
活性物質がナノ粒子のような微粒子として製造される場合、表面エネルギーが増加し、経過時間に従って、より大きな粒子への凝集又は結晶成長のケースが頻繁に発生する。このような凝集又は結晶成長を防止するために、ナノ粒子化工程で使用される生体適合性高分子のガラス転移温度が非常に重要な因子となる。ナノ粒子製造工程で用いられる生体適合性高分子のガラス転移温度が８０℃未満であると、製造されたナノ粒子の凝集及び／又は結晶成長を十分に防止することができず、経過時間に従って製造された粒径が大きくなることがある。このような製造されたナノ粒子の凝集及び／又は結晶成長を防止するために、本発明では、必ずガラス転移温度が８０℃以上（好ましくは９０℃以上）の生体適合性高分子を使用する。
【００４５】
本発明で使用可能な、ガラス転移温度（Ｔｇ）が８０℃以上（好ましくは９０℃以上）の生体適合性高分子は、例えば、メチルセルロース（ＭＣ）（例えば、Ｔｇが約１８４〜１９７℃のＭＣ）、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）（例えば、Ｔｇが約１２７℃のＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）（例えば、Ｔｇが約１０５℃のＨＰＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、（例えば、Ｔｇが約１８０℃のＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネート（ＨＰＭＣ−ＡＳ）（例えば、Ｔｇが約１１７℃のＨＰＭＣ−ＡＳ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート（ＨＰＭＣ−Ｐ）（例えば、Ｔｇが約１４５℃のＨＰＭＣ−Ｐ）、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）（例えば、Ｔｇが約１３５℃のＣＭＣ）、セルロースアセテート（ＣＡ）（例えば、Ｔｇが約１８０℃のＣＡ）、デキストラン（例えば、Ｔｇが約２００℃のデキストラン）等のような、Ｔｇが８０℃以上のセルロース系の生体適合性高分子、Ｔｇが８０℃以上のポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）（例えば、Ｔｇが約１３８〜１５６℃のＰＶＰ  ｋ１７、ｋ３０、ｋ９０）、Ｔｇが８０℃以上のポリビニルアルコール、及びＴｇが８０℃以上のオイドラギット（Eudragit）系の生体適合性高分子から選ばれる１種以上であってもよい。
【００４６】
本発明で必須に用いられる前記Ｔｇが８０℃以上の生体適合性高分子は、単独で用いてもよく、２種以上を混合して用いてもよい。その使用量は、活性物質１重量部に対して０．０１重量部以上が好ましい。より具体的に、前記Ｔｇが８０℃以上の生体適合性高分子を、活性物質１重量部に対して、０．０５重量部以上、０．１重量部以上、０．１５重量部以上、０．２重量部以上、０．２５重量部以上、又は０．３重量部以上の量であり、また、活性物質１重量部に対して、５重量部以下、３重量部以下、２重量部以下、１重量部以下、又は０．５重量部以下の量で使用することができる。
【００４７】
本発明において、任意に使用可能な、ガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分は、医薬品、食品及び化粧品に使用されるものであり、その電気的性質（例えば、イオン性、非イオン性など）に特に制限がなく、また、室温でのその性状（例えば、液相、ワックス又は固相など）にも特に制限がなく、単独で又は２種以上を混合して用いることができる。
【００４８】
本発明において、任意に使用可能な追加成分は、活性物質のナノ粒子化のために有用なガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤、凝集防止剤、又は活性物質のナノ粒子化のために使用することができる新規のものを用いることができる。このような任意の追加成分は、例えば、ゼラチン（gelatin）、カゼイン（casein）、アラビアゴム（gumacacia）、トラガカントゴム（tragacanth）、ポリエチレングリコール（polyethylene glycols）、ポロキサマー（poloxamers）、ガラス転移温度が８０℃未満のオイドラギット（登録商標）、リゾチーム（lysozyme）、アルブミン（albumin）等のガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、塩化アセチルピリジニウム（acetyl pyridinium chloride）、リン脂質（phospholipids）、脂肪酸（fatty acid）、塩化ベンザルコニウム（benzalkonium chloride）、ステアリン酸カルシウム（calcium stearate）、グリセリン脂肪酸エステル（glycerin esters of fatty acid）、脂肪酸アルコール（fatty alcohol）、セトマクロゴール（cetomacrogol）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（polyoxyethylene alkyl ethers）、ソルビタンエステル（sorbitan esters）、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体（polyoxyethylene castor oil derivatives）、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters）、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド（dodecyl trimethyl ammonium bromide）、ステアリン酸ポリオキシエチレン（polyoxyethylene stearate）、ナトリウムラウリル硫酸塩（sodium lauryl sulfate）、ショ糖脂肪酸エステル（sucrose fatty acid ester）、ＰＥＧ−コレステロール（PEG-cholesterol）、ＰＥＧ−ビタミンＥ等の界面活性剤、糖類などの凝集防止剤が挙げられる。本発明において、糖類は、単糖類化合物、二糖類化合物、多糖類化合物及び糖アルコールなどを含み、特にグルコース、ラクトース、マンニトール、スクロース、キシリトール、キトサン、デンプン繊維質などを含む概念であり、単独で又は混合物の形態で使用することができる。これら任意の追加成分は、単独で又は２種以上を混合して使用することができる。しかし、上記の態様には何ら限定されない。
【００４９】
本発明において、前記任意の追加成分を１種又は２種以上を用いる場合には、それぞれは、例えば、活性物質１重量部に対して、０．００１重量部以上、又は０．００５重量部以上、又は０．０１重量部以上の量で使用することができ、また、活性物質１重量部に対して、５重量部以下、又は３重量部以下、又は２重量部以下、又は１重量部以下、又は０．５重量部以下の量で使用することができる。
【００５０】
本発明に用いることができる水混和性有機溶媒としては、活性物質、及び潤滑剤として用いられた脂質を溶解可能な溶媒であり、水と混合することができ、水中で活性物質と潤滑剤として用いられた脂質が均一に混合された混合物を製造することができる溶媒であれば特に限定されない。
【００５１】
具体的には、前記水混和性有機溶媒は、炭素数８以下（例えば、１〜８）の一価又は多価アルコール、アミン、アセトンなどのケトン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ピリジン、及びこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００５２】
本発明において、前記水混和性有機溶媒を用いる場合、前記活性物質１重量部に対して、０．１重量部以上、又は０．５重量部以上、又は１重量部以上の量で用いてもよい。また、前記水混和性有機溶媒は、前記活性物質１重量部に対して、１０重量部以下、又は６重量部以下、又は３重量部以下の量で用いてもよい。前記水混和性有機溶媒の使用量が活性物質に比べて少な過ぎると、低温（例えば、１００℃以下）で活性物質及び潤滑剤である脂質を溶解させることが困難になる場合がある。逆に、前記水混和性有機溶媒の使用量が活性物質に比べて多すぎると、水で固化する時、活性物質のかなりの量が固化することができず、生産収率が低下する恐れがある。
【００５３】
本発明のナノ粒子製造方法において、前記工程（１）では、活性物質、潤滑剤としての脂質及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を含む混合物が提供される。
【００５４】
一態様において、前記工程（１）は、活性物質、潤滑剤としての脂質、及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子、並びに、任意でガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００５５】
一態様において、前記工程（１）は、活性物質と潤滑剤としての脂質を混合し、この混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を脱塩水と共に添加した後、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００５６】
一態様において、前記工程（１）は、活性物質と潤滑剤としての脂質を混合し、この混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子、並びにガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を脱塩水と共に添加した後、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００５７】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質及び潤滑剤としての脂質を水混和性（水と混合する性質）有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００５８】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質及び潤滑剤としての脂質を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を脱塩水と共に添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００５９】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質及び潤滑剤としての脂質を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子、並びに任意でガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００６０】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質及び潤滑剤としての脂質を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合物にガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子、並びに任意でガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を脱塩水と共に添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００６１】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質、潤滑剤としての脂質及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過して乾燥する工程であってもよい。
【００６２】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質、潤滑剤としての脂質及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合物にガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００６３】
本発明の一態様において、前記工程（１）は、活性物質、潤滑剤としての脂質及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子を水混和性有機溶媒に溶解し、得られた溶液を水に投入して固化した後、これをろ過し、乾燥し、得られた混合物にガラス転移温度が８０℃未満の生体適合性高分子、界面活性剤及び凝集防止剤から選ばれる一つ以上の追加成分を脱塩水と共に添加し、その生成物を物理的に均一に混合する工程であってもよい。
【００６４】
活性物質の結晶性を維持するか、又は活性物質が熱に敏感な場合、各成分を粉末状態のミキサーに供給し、均一に混合してもよい。活性物質と脂質をより均一に混合する必要がある場合には、活性物質と脂質をミキサーに投入し、水混和性有機溶媒を添加し、加熱して混合物を透明に溶解させた後、この溶液を潤滑剤として用いられた脂質の融点よりも低い温度の水、例えば、４０℃以下、好ましくは３０℃以下、より好ましくは２５℃、さらに好ましくは２０℃以下の脱塩された蒸溜水に投入して固化し、得られた固形物をろ過し、減圧乾燥し、成分が均一に混合された混合粉末を加えてもよい。
【００６５】
前記生体適合性高分子、界面活性剤及び／又は凝集防止剤は、場合に応じて、脱塩水と一緒に粉末形態で、又は水溶液形態で添加してもよい。
【００６６】
前記工程（１）において、ガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子、及び／又は任意の追加成分を脱塩水と共に添加して物理的に均一に混合する場合には、水の使用量は、特に限定されないが、工程の円滑性と経済性の観点から、水を含む混合物の全重量に対して、４０％（ｗ／ｗ）以下（より具体的には、３５％（ｗ／ｗ）以下、３０％（ｗ／ｗ）以下、２５％（ｗ／ｗ）以下、２０％（ｗ／ｗ）以下又は１５％（ｗ／ｗ）以下）の量の水を使用することが好ましい。工程（２）の製粉工程において、効果的な粉砕を達成するためには、強い剪断力を混合物に伝達しなければならず、この剪断力は混合物内の含水率と密接に関連する。含水率が高いと、剪断力が非常に低くなり、効果的な粉砕が行われず、効果的な粉砕が可能な剪断力になるまで水分量を減らすのに時間がかかるため、経済性が低下することがある。
【００６７】
本発明のナノ粒子製造方法において、前記工程（２）では、前記工程（１）で得られた生成物（即ち、活性物質、潤滑剤としての脂質及びガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子、必要に応じて、任意の追加成分を含む混合物）を製粉工程により粉砕する。前記製粉工程は、例えば、二本ロールミル又は三本ロールミルを用いて連続的に行うことができる。
【００６８】
ロールミルは、２つ以上のロール（例えば、二本ロールミル又は三本ロールミルなど）が逆方向に回転し、投入された混合物に圧着及び剪断力を加えて粉砕する装置である。本発明では、前記工程（１）で得られた生成物に圧縮及び剪断力を加えて粉砕できるロールミルであればどのようなものでも使用することができる。
【００６９】
製粉工程中、ローラー間隙は、１ｍｍ以下、例えば、５００μｍ以下、２００μｍ以下、好ましくは１００μｍ以下、より一層好ましくは５０μｍ以下、さらに好ましくは３０μｍ以下であってもよい。ローラー間隙が広すぎると、圧縮及び剪断力が低くなり十分な粉砕効果が得られなく、ロール間隙が狭すぎると、投入速度が遅くなるという問題がある。この技術分野の当業者であれば、製造現場において、容易且つ適切に間隙を調整することができる。
【００７０】
製粉工程におけるロールの温度は、用いる潤滑剤、即ち、脂質の融点と使用量、及び生体適合性高分子などの添加時に用いられる水の量等に応じて適宜調整すればよい。一態様において、使用される脂質の量が活性物質１重量部に対して１重量部以上の場合には、ロールの温度を使用する脂質の融点よりも低く維持することが好ましい場合がある。他の態様において、使用される脂質の量が活性物質１重量部に対して１重量部未満の場合には、ロールの温度を使用する脂質の融点付近（融点±５℃）又はそれ以上にすることができる。他の場合、例えば、ラウリルアルコール（融点：２２℃）のような室温で液相の脂質を使用する場合には、ロールの温度よりは添加される脂質の量を調整（例えば、活性物質１重量部に対して、０．１〜１重量部、又は０．２〜０．８重量部、又は０．３〜０．５重量部に調整）するほうが製粉工程に有利である。
【００７１】
ガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子及び／又は任意の追加成分を単に添加するか、或いは、脱塩水と共に添加しても製粉工程中に水分の蒸発を促進して１％（ｗ／ｗ）以下の水分条件にして、製粉を行う場合には、潤滑剤として使用される脂質の融点又はそれより低い温度範囲（例えば、脂質の融点よりも０〜２０℃低い温度範囲）で活性物質が十分にナノ粒子になるまで行う。このとき、脂質が存在しなければ、活性物質と生体適合性高分子の混合物に高すぎる剪断力が作用し、製粉工程が困難になり、商業的生産が不可能である。
【００７２】
ガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子及び／又は任意の追加成分を、脱塩水と共に、活性物質と脂質との混合物に添加し、水分の減少による剪断力増加を利用して粉砕を行う場合には、ロールは３５℃以下、好ましくは２５℃以下、より好ましくは２０℃以下、さらに好ましくは１７℃以下で行うことがナノ粒子の製造に有利である。製粉工程を繰り返し行うと、混合物内の水分の含量は低くなり、水分の含量が２０％（ｗ／ｗ）以下、好ましくは１５％（ｗ／ｗ）以下、より好ましくは１２％（ｗ／ｗ）以下、さらに好ましくは１０％（ｗ／ｗ）以下になれば、製粉工程における剪断力が急激に増加し、活性物質のナノ粒子の調製が容易になる。一方、混合水内に存在するガラス転移温度が８０℃以上の生体適合性高分子のガラス転移温度は、混合物内の水分の含量が低くなるほど急激に上昇し、潤滑剤として使用される脂質がないと、製粉工程中にロールに重い負荷が発生し、経済的な生産が非常に困難になる。
【００７３】
本発明のナノ粒子の製造方法において、前記工程（３）では、超臨界流体を用いて前記工程（２）の生成物から潤滑剤として使用された脂質を除去する。一態様において、前記の脂質除去は、前記工程（２）の生成物含有の反応器に超臨界流体を連続的に投入し、そこから流出させることによって行うことができる。これは、例えば、５０気圧以上の圧力条件及び５〜６０℃の温度条件下で行うことができる。
【００７４】
本明細書で使用される用語「超臨界流体」は、二酸化炭素又は窒素のような反応性のない不活性な気体又は液体であり、特定温度と特定圧力、即ち、超臨界温度と超臨界圧力の下で、超臨界流体（supercritical fluid）であり得る気体又は液体を意味する。
【００７５】
また、本明細書で使用される用語「超臨界圧力」は、その圧力以上の圧力下では超臨界流体のガスが超臨界流体になり得る特定圧力を意味する。
【００７６】
一態様において、前記工程（２）で得られた固形混合物を高圧反応器に入れ、潤滑剤として使用する脂質が流れ落ちない温度、例えば、５〜６０℃、より具体的には１０〜４０℃で反応器内部を維持しながら、反応器に超臨界流体ガス（例えば、二酸化炭素）を投入し、例えば、５０〜４００気圧、好ましくは６０〜２００気圧で反応器内部を加圧した後、超臨界流体投入バルブと排出バルブを調節して、超臨界流体を連続的に反応器内部に投入及び反応器外部に流出させることにより、潤滑剤として使用された脂質を超臨界流体とともに反応器の外部に排出し、除去することになる。このとき、高圧反応器内部の温度が高すぎると、潤滑剤として使用された脂質が活性物質の溶媒として作用し、その結果、ナノ粒子サイズで製造された活性物質の結晶が成長する可能性がある。従って、反応器の温度は、工程（２）で得られた固形混合物内に存在する脂質の流動性をできるだけ低くすることができる範囲、好ましくは、脂質の融点以下の温度を維持することが好ましく、作業性を考慮する場合、１０〜４０℃に維持することが好ましい。
【００７７】
また、脂質を超臨界流体によって除去する時間は、使用された脂質の種類及び量に依存するが、より高純度の活性物質粒子を得るためには、できるだけ十分な時間、脂質を除去して残存脂質の量を最小限に抑えることが好ましい。本発明で好ましく用いられる脂質は、人体に無害であるので、その残存量を特定範囲に限定する必要はないが、得られる活性物質の純度を考慮すると、好ましくは、全重量の１重量％未満である。界面活性剤として用いられるモノ−、ジ−又はトリ−グリセリド系の化合物のなどの脂質を使用する場合には、その残存量が１０重量％を越えても問題ない。
【００７８】
前記のような固形混合物粉末から除去された脂質は、別の反応器に回収され、次の製造工程で使用することができる。
【００７９】
以下、実施例及び比較例により本発明を詳細に説明する。しかし、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００８０】
実施例１〜５
【００８１】
活性物質としてニロチニブ（Nilotinib；遊離塩基）１ｇを、潤滑剤として下記の表１に示された脂質２ｇと共にビーカーに入れ、へら（spatula）でよく混合した後、そこに、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ  ｋ３０）０．３ｇ及びラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）０．０５ｇを添加し、再びよく混合した後、その生成物に対して、三本ロールミル（ＴＲＸ−３１００Ｓ；Intec system社製）を利用して下記の表１に示された条件で連続製粉を行い、ニロチニブと潤滑剤の脂質、ＰＶＰ  ｋ３０及びＳＬＳが均一に混合された固体分散体型混合物を得た。
【００８２】
前記得られた固体分散体型混合物を高圧反応器に入れ、１５〜２５℃、７０〜１００気圧で超臨界流体の二酸化炭素を連続的に添加し、潤滑剤として使用された脂質を除去し、ニロチニブ、ＰＶＰ  ｋ３０及びＳＬＳが混合された粉末を得た。
【００８３】
得られた粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度（ニロチニブ基準）の脱塩蒸溜水に分散した後、大塚電子株式会社製のＥＬＳＺ−１０００を使用してＤＬＳ（Dynamic light scattering）法により粒度を測定した。実施例１〜５で製造されたナノ粒子の粒度分布図を図１に示した。
【００８４】
【表１】
2020517578.tif 000003
【００８５】
実施例１〜３の場合、各脂質の融点よりも１０℃（±５℃）ほどの低いローラー温度（Ｒ．Ｔ）を維持し、製粉が円滑に行われ、製粉中のロールに重い負荷がかからなかった。実施例４及び５の場合、脂質の融点と比較してローラー温度が実施例１〜３よりも低い条件で製粉を行い、ロールに若干の負荷がかかったが、ナノ粒子はよく製造された。
【００８６】
実施例６〜７
【００８７】
活性物質としてニロチニブ（遊離塩基）１ｇを、潤滑剤としてラウリルアルコール（ＬＡ）０．３ｇ、及び０．５ｇとそれぞれよく混合し、そこに、ＰＶＰ  ｋ３０  ０．３ｇ、ＳＬＳ  ０．０５ｇを添加し、再びよく混合した後、その生成物に対して、三本ロールミル（ＴＲＸ−３１００Ｓ；Intec system社製）を利用して下記の表２に示された条件で連続製粉を行い、ニロチニブ、潤滑剤の脂質、ＰＶＰｋ３０及びＳＬＳが均一に混合された固体分散体型混合物を得た。
【００８８】
前記得られた固体分散体型混合物を高圧反応器に入れ、１５〜２５℃、７０〜１００気圧で超臨界流体である二酸化炭素を連続的に添加し、潤滑剤として使用された脂質を除去し、ニロチニブ、ＰＶＰ  ｋ３０及びＳＬＳが混合された粉末を得た。
【００８９】
得られた粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度（ニロチニブ基準）の脱塩蒸溜水に分散した後、大塚電子株式会社製のＥＬＳＺ−１０００を使用してＤＬＳ（Dynamic light scattering）法により粒度を測定した。実施例６及び７で製造されたナノ粒子の粒度分布図を図２に示した。
【００９０】
【表２】
2020517578.tif 000004
【００９１】
実施例８
【００９２】
活性物質としてエルロチニブ（遊離塩基）１０ｇと潤滑剤としてＭＡ  ２０ｇ、水混和性溶媒としてＤＭＳＯ  ２０ｇをビーカーに入れ、４０℃に加熱して完全に溶解した後、１０℃の水５００ｍＬに投入し、エルロチニブとＭＡとがよく混合された固体分散体を製造し、これをろ過した後、減圧乾燥した。この乾燥された固形混合物３０ｇに、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ：ｓｓＬ）３ｇとステアリン酸スクロース（ｓ−１６７０）１ｇを脱塩蒸溜水１５ｍＬと共に添加し、ロールミルを数回行ってよく混合した後、この混合物を、三本ロールミルを利用して、ローラー速度（Ｒ．Ｓ）６０ｒｐｍ、ローラー温度（Ｒ．Ｔ）２５〜３０℃で４０回連続製粉を行った。混合に使用した水は製粉工程中に全て蒸発し、残存水分の含量は１％（ｗ／ｗ）以下であった。
【００９３】
前記得られた固体分散体型混合物を高圧反応器に入れ、１５〜２５℃、７０〜１００気圧で超臨界流体の二酸化炭素を連続的に添加し、潤滑剤として使用された脂質を除去し、エルロチニブ、ＨＰＣ  ｓｓＬ及びステアリン酸スクロースが混合された粉末を得た。
【００９４】
得られた粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度（エルロチニブ基準）の脱塩蒸溜水に分散した後、大塚電子株式会社製のＥＬＳＺ−１０００を使用してＤＬＳ（Dynamic light scattering）法により粒度を測定し、平均粒径が３４１．７ｎｍであることを確認した。実施例８で製造されたナノ粒子の粒度分布図を図３に示した。
【００９５】
実施例９
【００９６】
ソラフェニブトシレートＩＩＩ（Sorafenib tosylate III）を溶媒に溶解して再結晶化した場合、結晶形の変化及びトシル酸塩の喪失により遊離塩基化合物が一部で生成される恐れがあることを確認した。
【００９７】
従って、ソラフェニブトシレートＩＩＩ粉末３ｇを潤滑剤のＭＡ粉末９ｇとよく混合した後、そこに、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ；５ｃｐ）０．７５ｇ、ＰＶＰ（ｋ３０）０．３ｇ及びポロキサマー（Poloxamer、４０７）０．０９ｇを脱塩蒸溜水２．２５ｍＬと共に添加し、ロールミルを数回行い、よく混合した。この混合物に、ローラー速度（Ｒ．Ｓ）６０ｒｐｍ、ローラー温度（Ｒ．Ｔ）１５〜１９℃で三本ロールミルを用いて８回連続製粉を行った。この時、残存水分の含量は９％（ｗ／ｗ）（カール・フィッシャー法で測定）であり、室温（２５℃）で減圧乾燥した。得られた固体分散体型混合物を高圧反応器に入れ、１５〜２５℃、７０〜１００気圧で超臨界流体の二酸化炭素を連続的に添加し、潤滑剤として使用された脂質を除去し、ソラフェニブ、ＨＰＭＣ、ＰＶＰ及びポロキサマーが混合された粉末を得た。
【００９８】
得られた粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度（ソラフェニブ基準）の脱塩蒸溜水に分散した後、大塚電子株式会社製のＥＬＳＺ−１０００を使用してＤＬＳ（Dynamic light scattering）法により粒度を測定し、平均粒径が４９６．８ｎｍであることを確認した。
【００９９】
実施例１０
【０１００】
ソラフェニブトシレートＩＩＩ粉末３ｇを潤滑剤のＭＡ粉末４．５ｇとよく混合した後、そこに、ＨＰＣ（ｓｓＬ）０．３g、ポリオキシエチレン４０ステアレート（ＰＳ）０．３ｇ、ＰＶＰ（ｋ３０）０．３ｇ、ステアリン酸スクロース（ＳＳ；ｓ−１６７０）０．３ｇ及びポロキサマー（４０７）０．９ｇを脱塩蒸溜水４．５ｍＬと共に添加し、よく混合した後、この混合物をローラー速度（Ｒ．Ｓ）６０ｒｐｍ、ローラー温度（Ｒ．Ｔ）１５〜１９℃で三本ロールミルを用いて４０回連続製粉を行った。このとき、残存水分の含量は５％（ｗ／ｗ）（カール・フィッシャー法で測定）であり、室温（２５℃）で減圧乾燥した。得られた固体分散体型混合物を高圧反応器に入れ、１５〜２５℃、７０〜１００気圧で超臨界流体の二酸化炭素を連続的に添加し、潤滑剤として使用された脂質を除去し、ソラフェニブ、ＨＰＣ、ＰＶＰ、ＰＳ、ＳＳ及びポロキサマーが混合された粉末を得た。
【０１０１】
得られた粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度（ソラフェニブ基準）の脱塩蒸溜水に分散した後、大塚電子株式会社製のＥＬＳＺ−１０００を使用してＤＬＳ（Dynamic light scattering）法により粒度を測定し、平均粒径が４４６．０ｎｍであることを確認した。また、ｐＸＲＤ分析によりソラフェニブトシレートＩＩＩの結晶形が維持されることが確認された。実施例１０で製造されたナノ粒子のｐＸＲＤ分析結果を図４に示した。
【０１０２】
比較例
【０１０３】
潤滑剤であるＭＡを添加しなかったことを除いて、全ての賦形剤の添加率及び製粉の工程条件は実施例１０と同様にした。潤滑剤である脂質が添加されていなく、非常に重い負荷がかかっていたので、製粉工程に多大な時間が要された。また、潤滑剤を添加していないため、二酸化炭素を用いて潤滑剤を除去する工程は行わなかった。製粉のみを行った後、混合物を減圧乾燥した。得られたソラフェニブ、ＨＰＣ、ＰＶＰ、ＰＳ、ＳＳ及びポロキサマーが混合された粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度（ソラフェニブ基準）の脱塩蒸溜水に分散した後、大塚電子株式会社製のＥＬＳＺ−１０００を使用してＤＬＳ（Dynamic light scattering）法により粒度を測定し、平均粒径が７８６．０ｎｍであることを確認した。ｐＸＲＤ分析によりソラフェニブトシレートの結晶形を分析した結果、結晶形がＩ型に変化することが確認された。実施例１０と比較例でそれぞれ製造されたナノ粒子のｐＸＲＤ分析結果を図５に示した。
【０１０４】
実施例１１
【０１０５】
ソラフェニブ（遊離塩基）５０ｇと潤滑剤としてＭＡ  １００ｇをＤＭＦ  １００ｍＬに入れ、４０℃に加熱して、完全に溶解させた後、この溶液を２０℃の冷たい水に投入して固化し、その生成物を室温で３時間撹拌した後、ろ過及び減圧乾燥して、ソラフェニブとＭＡの混合物を得た。この混合物９ｇに、ＨＰＣ  ０．３ｇ、ＰＶＰ（ｋ３０）０．４５g及びポロキサマー（４０７）０．４５ｇを脱塩水３ｍＬと共に添加し、ロールミルを数回行い、よく混合した後、この混合物を三本ロールミルを利用して、ローラー速度（Ｒ．Ｓ）６０ｒｐｍ、ローラー温度（Ｒ．Ｔ）２７〜３０℃で５０回連続製粉を行った。混合に使用された水は製粉工程中に全て蒸発し、残存水分の含量は１％（ｗ／ｗ）以下であった。得られた固体分散体型混合物を高圧反応器に入れ、１５〜２５℃、７０〜１００気圧で超臨界流体である二酸化炭素を連続的に添加し、潤滑剤として使用された脂質を除去し、ソラフェニブ、ＨＰＣ、ＰＶＰ（ｋ３０）及びポロキサマー（４０７）が混合された粉末を得た。
【０１０６】
得られた粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度（ソラフェニブ基準）の脱塩蒸溜水に分散した後、大塚電子株式会社製のＥＬＳＺ−１０００を使用してＤＬＳ（Dynamic light scattering）法により粒度を測定し、平均粒径が１９６．５ｎｍであることを確認した。実施例１１で製造されたナノ粒子の粒度分布図を図６に示した。
【０１０７】
実施例１２
【０１０８】
活性物質として抗真菌剤であるポサコナゾール（Posaconazole）４０ｇと潤滑剤としてのＭＡ  ８０ｇをＤＭＳＯ  １２０ｍＬに入れ、４０℃で完全に溶解し、この溶液を３０℃の水に投入して固化した後、その生成物を３時間撹拌した後、ろ過及び減圧乾燥して、ポサコナゾールと脂質との混合物を得た。この混合物１５ｇにＨＰＣ  １．５ｇ、ポロキサマー（４０７）０．５ｇ及びＰＶＰ（ｋ３０）０．５ｇを脱塩水５ｍＬと共に添加し、２０℃以下の温度でロールミルを数回行い、均一に混合した。このとき、残存水分の含量は２１％（ｗ／ｗ）（カール・フィッシャー法で測定）であり、室温（２５℃）で減圧乾燥した。得られた固体分散体型混合物を高圧反応器に入れ、１５〜２５℃、７０〜１００気圧で超臨界流体である二酸化炭素を連続的に添加し、潤滑剤として使用された脂質を除去し、ポサコナゾール、ＨＰＣ、ＰＶＰ（ｋ３０）及びポロキサマー（４０７）が混合された粉末を得た。
【０１０９】
得られた粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度（ポサコナゾール基準）の脱塩蒸溜水に分散した後、大塚電子株式会社製のＥＬＳＺ−１０００を使用してＤＬＳ（Dynamic light scattering）法により粒度を測定し、平均粒径が２８６．５ｎｍであることを確認した。実施例１２で製造されたナノ粒子の粒度分布図を図７に示した。
【０１１０】
実施例１３
【０１１１】
実施例１２で製造されたポサコナゾールと潤滑剤であるＭＡとの混合物１５ｇにＨＰＣ（ｓｓＬ）１．５ｇ、ポロキサマー（４０７）０．５ｇ及びＰＶＰ（ｋ３０）０．５ｇを脱塩水５ｍＬと共に添加し、２０℃以下の温度でロールミルを数回行い、均一に混合した。この混合物に対して、三本ロールミルを利用してロール速度（Ｒ．Ｓ）６０ｒｐｍ、ローラー温度（Ｒ．Ｔ）１３〜１７℃で２０回連続製粉を行った。このとき、残存水分の含量は８.９％（ｗ／ｗ）（カール・フィッシャー法で測定）であり、室温（２５℃）で減圧乾燥した。得られた固体分散体型混合物を高圧反応器に入れ、１５〜２５℃、７０〜１００気圧で超臨界流体である二酸化炭素を連続的に添加し、潤滑剤として使用された脂質を除去し、ポサコナゾール、ＨＰＣ、ＰＶＰ（ｋ３０）及びポロキサマー（４０７）が混合された粉末を得た。
【０１１２】
得られた粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度（ポサコナゾール基準）の脱塩蒸溜水に分散した後、大塚電子株式会社製のＥＬＳＺ−１０００を使用してＤＬＳ（Dynamic light scattering）法により粒度を測定し、平均粒径が１８５.９ｎｍであることを確認した。実施例１３で製造されたナノ粒子の粒度分布図を図７に示した。
【０１１３】
実施例１４
【０１１４】
二本ロールミルを利用したことを除いて、実施例１３の方法が、活性物質に対する全ての賦形剤の割合が同じで、同じ製粉工程温度条件及び同じ製粉回数をもちいて実施され、ポサコナゾール、ＨＰＣ、ＰＶＰ（ｋ３０）及びポロキサマー（４０７）が混合された粉末を得た。実施例１３と同じ方法で潤滑剤である脂質を除去して平均粒径が１９９．２ｎｍであるナノ粒子を製造した。
【０１１５】
実施例１５〜１６
【０１１６】
活性物質としてポサコナゾール１重量部と潤滑剤としてＭＡ  ０．５重量部又は１重量部をＤＭＳＯ  ２重量部に入れ、４５℃で加熱して完全に溶解し、この溶液を２５℃の脱塩水に投入して固化した。３時間撹拌後、ろ過及び減圧乾燥して、ポサコナゾール：ＭＡがそれぞれ１：０．５及び１：１の固形混合物を得た。
【０１１７】
この混合物それぞれに、ポサコナゾール１重量部に対してＨＰＣ  ０．３重量部、ポロキサマー（４０７）０．１重量部及びＰＶＰ（ｋ９０）０．１重量部を脱塩水１重量部と共に添加し、２０℃以下の温度でロールミルを数回行い、均一に混合した。この混合物に対して、三本ロールミルを利用して、ロール速度（Ｒ．Ｓ）６０ｒｐｍ、ローラー温度（Ｒ．Ｔ）１５〜１７℃でそれぞれ４５回及び６０回連続製粉を行った。このとき、残存水分の含量はそれぞれ８.０４及び７.６１％（ｗ／ｗ）（カール・フィッシャー法で測定）であり、室温（２５℃）で減圧乾燥した。得られた固体分散体型混合物を高圧反応器に入れ、１５〜２５℃、７０〜１００気圧で超臨界流体である二酸化炭素を連続的に添加し、潤滑剤として使用された脂質を除去し、ポサコナゾール、ＨＰＣ、ＰＶＰ（ｋ９０）及びポロキサマー（４０７）が混合された粉末を得た。
【０１１８】
得られた粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度（ポサコナゾール基準）の脱塩蒸溜水に分散した後、大塚電子株式会社製のＥＬＳＺ−１０００を使用してＤＬＳ（Dynamic light scattering）法により粒度を測定し、その平均粒径を下記の表３に示した。実施例１５及び１６で製造されたナノ粒子の粒度分布図を図８に示した。
【０１１９】
【表３】
2020517578.tif 000005
【０１２０】
実施例１７〜１９
【０１２１】
活性物質としてポサコナゾール６ｇと潤滑剤としてＭＡ  １２ｇ及びＨＰＣ（ｓｓＬ）１．８ｇを脱塩水６ｍＬと共に混合し、この混合物に対して、三本ロールミルを利用して、ロール速度（Ｒ．Ｓ）６０ｒｐｍ、ローラー温度（Ｒ．Ｔ）２７〜３０℃でそれぞれ３０回、５０回及び７０回連続製粉を行った。混合に使用された水は製粉工程中に全部蒸発し、残存水分の含量は１％（ｗ／ｗ）以下であった。得られた固体分散体型混合物を高圧反応器に入れ、１５〜２５℃、７０〜１００気圧で超臨界流体である二酸化炭素を連続的に添加し、潤滑剤として使用された脂質を除去し、ポサコナゾール及びＨＰＣ（ｓｓＬ）が混合された粉末を得た。
【０１２２】
得られた粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度（ポサコナゾール基準）の脱塩蒸溜水に分散した後、大塚電子株式会社製のＥＬＳＺ−１０００を使用してＤＬＳ（Dynamic light scattering）法により粒度を測定し、その平均粒径を下記の表４に示した。実施例１７〜１９で製造されたナノ粒子の粒度分布図を図９に示した。
【０１２３】
【表４】
2020517578.tif 000006
【０１２４】
実施例２０
【０１２５】
活性物質としてポサコナゾール６ｇと潤滑剤としてＭＡ  １２ｇ及びＨＰＣ（ｓｓＬ）１．８ｇを脱塩水６ｍＬと共に混合し、この混合物に対して、三本ロールミルを利用して、ロール速度（Ｒ．Ｓ）６０ｒｐｍ、ローラー温度（Ｒ．Ｔ）２７〜３０℃で６０回連続製粉を行った。混合に使用された水は製粉工程中に全て蒸発し、残存水分の含量は１％（ｗ／ｗ）以下であった。得られた固体分散体にポロキサマー（４０７）０．６ｇ及びＰＶＰ（ｋ３０）０．６ｇを脱塩水６ｍＬと共に添加し、２０℃以下の温度でロールミルを数回行い、均一に混合した。この混合物に対して、三本ロールミルを利用して、ロール速度（Ｒ．Ｓ）６０ｒｐｍ、ローラー温度（Ｒ．Ｔ）１３〜１５℃で２４回連続製粉を行った。このとき、残存水分の含量は８.４８％（ｗ／ｗ）（カール・フィッシャー法で測定）であり、室温（２５℃）で減圧乾燥した。得られた固体分散体型混合物を高圧反応器に入れ、１５〜２５℃、７０〜１００気圧で超臨界流体である二酸化炭素を連続的に添加し、潤滑剤として使用された脂質を除去し、ポサコナゾール、ＨＰＣ、ＰＶＰ（ｋ３０）及びポロキサマー（４０７）が混合された粉末を得た。
【０１２６】
得られた粉末を１ｍｇ／ｍＬの濃度（ポサコナゾール基準）で脱塩された蒸溜水に分散した後、大塚電子株式会社製のＥＬＳＺ−１０００を使用してＤＬＳ（Dynamic light scattering）法により粒度を測定し、その平均粒径が２５４．４ｎｍであることを確認した。
【図１Ａ】
2020517578.tif 000007
【図１Ｂ】
2020517578.tif 000008
【図１Ｃ】
2020517578.tif 000009
【図１Ｄ】
2020517578.tif 000010
【図１Ｅ】
2020517578.tif 000011
【図２Ａ】
2020517578.tif 000012
【図２Ｂ】
2020517578.tif 000013
【図３】
2020517578.tif 000014
【図４】
2020517578.tif 000015
【図５】
2020517578.tif 000016
【図６】
2020517578.tif 000017
【図７Ａ】
2020517578.tif 000018
【図７Ｂ】
2020517578.tif 000019
【図８Ａ】
2020517578.tif 000020
【図８Ｂ】
2020517578.tif 000021
【図９Ａ】
2020517578.tif 000022
【図９Ｂ】
2020517578.tif 000023
【図９Ｃ】
2020517578.tif 000024
【国際調査報告】
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2020517578.tif 000026
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