(57)【要約】  ポリマー（たとえば、ＤＮＡ）内に記憶されているデータを読み取り、ナノポアに基づくチップ内に現場で合成されたポリマーの配列を検証する方法、システム、およびデバイスが、インダクタおよびセルを有する共振器を提供することであって、セルがナノポアおよびポリマーを有し、ポリマーがナノポアを横断することができ、共振器が、プローブ周波数におけるＡＣ入力電圧に応答して、プローブ周波数でＡＣ出力電圧周波数応答を有する、提供することと、少なくともプローブ周波数を有するＡＣ入力電圧を提供することと、少なくともプローブ周波数でＡＣ出力電圧を監視することであって、プローブ周波数におけるＡＣ出力電圧が、監視時にポリマー内に記憶されているデータを示す、監視することとを含み、ポリマーが、異なる共振周波数応答を引き起こす異なる特性を有する少なくとも２つのモノマーを含む。
2020502494.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリマー内に記憶されているデータを読み取る方法であって、
ｉ）インダクタおよびセルを有する共振器を提供することであって、前記セルがナノポアおよびポリマーを有し、前記ポリマーが前記ナノポアを横断することができ、前記共振器が、プローブ周波数におけるＡＣ入力電圧に応答して、プローブ周波数でＡＣ出力電圧周波数応答を有する、提供することと、
ｉｉ）少なくとも前記プローブ周波数を有する前記ＡＣ入力電圧を提供することと、
ｉｉｉ）少なくとも前記プローブ周波数で前記ＡＣ出力電圧を監視することであって、前記プローブ周波数における前記ＡＣ出力電圧が、監視時に前記ポリマー内に記憶されている前記データを示す、監視することと
を含む方法。
【請求項２】
前記ポリマーが、異なる共振周波数応答を引き起こす異なる特性を有する少なくとも２つのタイプのモノマーまたはオリゴマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも２つのタイプのモノマーまたはオリゴマーが、少なくとも、前記ナノポア内にあるときに第１の共振周波数応答を引き起こす第１の特性を有する第１のモノマーまたはオリゴマーと、前記ナノポア内にあるときに第２の共振周波数応答を引き起こす第２の特性を有する第２のモノマーまたはオリゴマーとを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記プローブ周波数における前記第１の周波数応答の特徴が、前記プローブ周波数における前記第２の周波数応答の同じ特徴とは異なる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第１および第２の周波数応答の前記特徴が、振幅および位相応答のうちの少なくとも１つを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記モノマーの前記第１の特性および前記第２の特性が、誘電体特性を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記セルが少なくとも頂部および底部電極を備え、前記ナノポアが前記電極間に配置され、前記セルが流体を有し、前記電極、前記ナノポア、および前記流体が、前記ポリマーが前記ナノポアを通過するときに変化する有効セルキャパシタンスを有する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記インダクタが、前記共振器を生じさせるように前記有効キャパシタンスに直列接続され、前記インダクタおよび有効キャパシタンスの組合せが、前記共振周波数応答に関係する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリマーが、前記電極に印加されるＤＣ操舵電圧を介して前記ナノポアに通される、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記セルが、少なくとも３つのチャンバと、少なくとも２つのナノポアと、前記ポリマーを前記ナノポアに通す少なくとも３つの電極とを有する、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ポリマーが、異なる共振周波数応答を引き起こす異なる特性を有する少なくとも２つのタイプのモノマーまたはオリゴマーを含み、前記ポリマー内の前記少なくとも２つのタイプのモノマーまたはオリゴマーの前記配列の少なくとも一部分が、コンピュータ可読コードの形態でデータを記憶する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ポリマーがＤＮＡを含み、前記ＤＮＡが、少なくとも２つのタイプのヌクレオチドを含み、各タイプのヌクレオチドが、前記プローブ周波数において固有の周波数応答を提供する、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記プローブ周波数が約１ＭＨｚ〜１ＧＨｚである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリマーが、少なくとも２つの異なるタイプのモノマーまたはオリゴマーを含み、各タイプが、前記プローブ周波数において少なくとも２つの異なる周波数応答を生じさせるように、前記共振器の前記周波数応答に影響を与える異なる誘電体特性を有する、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
ポリマー内に記憶されているデータを読み取るナノポアに基づくデバイスであって、
ｉ）インダクタおよびセルを有する共振器であって、前記セルがナノポアおよびポリマーを有し、前記ポリマーが前記ナノポアを横断することができ、前記共振器が、プローブ周波数におけるＡＣ入力電圧に応答して、プローブ周波数でＡＣ出力電圧周波数応答を有する、共振器と、
ｉｉ）少なくとも前記プローブ周波数でＡＣ入力電圧を提供するように構成されたＡＣ入力電圧源と、
ｉｉｉ）少なくとも前記プローブ周波数で前記ＡＣ出力電圧を監視するように構成された監視デバイスであって、前記プローブ周波数における前記ＡＣ出力電圧が、監視時に前記ポリマー内に記憶されている前記データを示す、監視デバイスと
を備えるデバイス。
【請求項１６】
前記ポリマーが、前記プローブ周波数で異なる共振周波数応答を引き起こす異なる特性を有する少なくとも２つのモノマーまたはオリゴマーを含み、前記応答が、少なくとも２つの異なるデータビットを示す、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
前記インダクタが、前記共振器を生じさせるように有効キャパシタンスに直列接続され、前記インダクタおよび有効キャパシタンスの組合せが、前記プローブ周波数における前記共振周波数応答に関係する、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１８】
ナノポアに基づくデバイス内で少なくとも２つの別個のモノマーまたはオリゴマーを含む荷電ポリマーを合成する方法であって、前記ナノポアに基づくデバイスが、
１つの反応周期において単一のモノマーまたはオリゴマーのみを付加することができるように、１つまたは複数のモノマーまたはオリゴマーを前記荷電ポリマーにブロック形態で付加するための緩衝溶液および試薬を収容する１つまたは複数の付加チャンバまたはチャネルと、
前記荷電ポリマーからブロッカ基を除去する緩衝溶液および試薬を収容する１つまたは複数のデブロックチャンバまたはチャネルとを備え、
前記付加チャンバまたはチャネルが、１つまたは複数のナノポアを含む１つまたは複数の膜によって前記デブロックチャンバまたはチャネルから分離され、
前記荷電ポリマーが、ナノポアを通過することができ、１つまたは複数のモノマーまたはオリゴマーの付加のための前記試薬のうちの少なくとも１つが、ナノポアを通過することができず、
前記方法が、
ａ）第１の末端および第２の末端を有する荷電ポリマーの前記第１の末端を、電気的引力によって付加チャンバまたはチャネル内へ動かし、それによって前記第１の末端にブロック形態でモノマーまたはオリゴマーが付加されることと、
ｂ）前記荷電ポリマーの前記第１の末端を前記付加されたモノマーまたはオリゴマーとともにブロック形態でデブロッカチャンバまたはチャネル内へ動かし、それによって前記付加されたモノマーまたはオリゴマーから保護基が除去されることと、
ｃ）前記所望のポリマー配列が得られるまで、工程ａ）およびｂ）を繰り返すことであって、工程ａ）で付加される前記モノマーまたはオリゴマーが同じまたは異なる、繰り返すことと、
ｄ）１つまたは複数のモノマーまたはオリゴマーが付加された後、前記ポリマー内のモノマーまたはオリゴマーの前記配列を検証することであって、前記配列が、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法を使用して検証される検証することと
を含む方法。
【請求項１９】
前記荷電ポリマーがＤＮＡである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリマーの第２の末端が、表面に結合される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記デバイスが、第１のタイプのモノマーまたはオリゴマーを付加するのに好適な試薬を収容する１つまたは複数の第１の付加チャンバまたはチャネルと、第２のタイプのモノマーまたはオリゴマーを付加するのに好適な試薬を収容する１つまたは複数の第２の付加チャンバとを備え、工程ａ）で、前記荷電ポリマーの前記第１の末端が、第１のタイプのモノマーまたはオリゴマーを付加することが所望されるか、それとも第２のタイプのモノマーまたはオリゴマーを付加することが所望されるかに応じて、前記第１の付加チャンバまたは前記第２の付加チャンバ内へ動かされる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
１つまたは複数のモノマーまたはオリゴマーを前記荷電ポリマーに付加するための前記試薬が、トポイソメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、またはこれらの組合せから選択された試薬を含む、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、内容が全体として参照により本明細書に組み込まれている、２０１７年８月２９日出願の米国特許出願第１５／６９０，１８９号、２０１７年２月２８日出願の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２００４４号、および２０１６年１０月３１日出願の米国仮特許出願第６２／４１５，４３０号に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、ナノポアデバイス（ｎａｎｏｐｏｒｅ  ｄｅｖｉｃｅ）を使用してポリマー、たとえば核酸を合成および配列決定する情報の記憶および検索に有用な新規な方法、組成物、およびデバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
記憶デバイスはさらに小さくなり、それらの容量はより大きくなっている状況で、物理媒体上または中にさらに多くのデータを記憶することが引き続き必要とされている。報告によると、記憶されるデータの量は、２年ごとにサイズが２倍になり、ある研究によると、２０２０年までに、我々が年間に作成および複写するデータの量は、４４ゼタバイト（ｚｅｔａｂｙｔｅｓ）、すなわち４４兆ギガバイトに到達する。さらに、ハードドライブ、光媒体、および磁気テープなどの既存のデータ記憶媒体は比較的不安定であり、長期間記憶すると損傷する。
【０００４】
長期間、たとえば数十年または数世紀にわたって、大量のデータを記憶する代替の手法が緊急に必要とされている。
【０００５】
一部では、ＤＮＡを使用してデータを記憶することが提案されている。ＤＮＡは極めて安定しており、理論的には莫大な量のデータを符号化し、データを非常に長い期間にわたって記憶する。たとえば、Bancroft, C., et al., Long-Term Storage of Information in DNA, Science (2001) 293: 1763-1765を参照されたい。加えて、記憶媒体としてのＤＮＡは、従来のデジタル記憶媒体のセキュリティ上のリスクを受けない。しかし、この概念を実施するための実用的な手法は存在しなかった。
【０００６】
ＷＯ２０１４／０１４９９１は、たとえば、ＤＮＡオリゴヌクレオチド上にデータを記憶する方法を記載しており、情報は、増幅および配列決定のために、９６ビット（９６ヌクレオチド）のデータブロック、１９ヌクレオチドのアドレス配列、およびフランキング配列によって、１つのヌクレオチドにつき１ビットがバイナリ形式で符号化される。このコードは次いで、ＰＣＲを使用して配列を増幅させ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑマシンのような高速シーケンサーを使用して配列決定することによって読み取られる。データブロック配列は次いで、アドレスタグを使用して正しい順序で配置され、アドレスおよびフランキング配列はフィルタ除去され、配列データはバイナリコードに翻訳される。そのような手法には、かなりの制限がある。たとえば、９６ビットのデータブロックは、１２文字しか符号化することができない（１文字または１スペースにつき従来の１バイトすなわち８ビットを使用）。記憶されている有用な情報と「ハウスキーピング」情報との比は低く、配列情報の約４０％がアドレスおよびフランキングＤＮＡによって占有される。同明細書は、５４，８９８オリゴヌクレオチドを使用して１冊の図書を符号化することを記載している。オリゴヌクレオチドを合成するために使用されるインクジェット印刷された忠実度の高いＤＮＡマイクロチップでは、オリゴのサイズが制限されていた（記載されている１５９ｍｅｒが上限であった）。さらに、オリゴヌクレオチドを読み取るには、増幅および隔離が必要であり、これにはさらなる誤りが起こる可能性がある。ＷＯ２００４／０８８５８５Ａ２、ＷＯ０３／０２５１２３Ａ２、C. BANCROFT: "Long-Term Storage of Information in DNA", Science (2001) 293 (5536): 1763c-1765、COX J P L: "Long-term data storage in DNA", Trends in Biotechnology (2001)19(7): 247-250も参照されたい。
【０００７】
ＤＮＡ配列決定デバイスは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ、Ｇｅｎｉａなどからのナノポアに基づくデバイスを含む。それらのデバイスの多くでは、典型的に、流体充填セル内でナノポアが使用され、ＤＮＡがナノポアを通過するときに電流の変化を測定することによって、ＤＮＡデータを読み取り、これは典型的にはナノアンプの範囲内である。キャパシタンスの変化に基づいた測定が提案されているが、商用化されていない。それらの変化は、ピコ／フェムト（ｆｅｍｐｔｏ）／アトファラドの範囲内である。したがって、典型的な背景雑音から区別するのが困難であるため、そのようなわずかな変化を確実かつ繰返し可能に検出することは非常に困難である。ＤＮＡは毎秒約百万塩基の速度でナノポアを進むことができ、これは既存の手段を使用して正確に読み取るには速すぎ、ＤＮＡのナノポア通過を遅らせるタンパク質ナノポアの使用を必要とし、大量のデータを読み取るには実用的でないことから、困難はさらに高まる。
【０００８】
既存のナノポアに基づくＤＮＡデータリーダは、これらの問題を克服しておらず、したがって高精度の繰返し可能で確実な自動化された強固なＤＮＡデータ読取り結果を提供しない。したがって、高品質で確実なＤＮＡデータ読取り結果を提供し、また同時に複数のＤＮＡ分子上に記憶されているデータを確実に読み取るスケーラブルな手法を提供するデバイスを有することが望ましいはずである。
【０００９】
ＤＮＡの潜在的な情報密度および安定性は、２５年以上にわたって認識されているように、データ記憶にとって魅力的な媒体である一方で、この形態で大量のデータを読み書きする実用的な手法は依然として存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明者らは、核酸配列を合成するためのナノ流体システムおよびそれらの配列を読み取るナノポアリーダを使用する核酸記憶に対する新しい手法を開発した。本発明者らの手法は、長さ数百、数千、またはさらには数百万塩基のＤＮＡ鎖の合成、記憶、および読取りを可能にする。これらの配列は長いため、配列のうち比較的小さい割合だけが識別情報によって占有され、したがって情報密度は上述した手法よりはるかに高くなる。さらに、いくつかの実施形態では、合成された核酸はナノチップ上に特有の位置を有しており、したがって識別情報がなくても配列を識別することができる。ナノチャンバ内で実施される配列決定は非常に急速であり、ナノポアによる配列の読取りは、最高毎秒百万塩基程度で極めて急速に行うことができる。２つの塩基タイプしか必要としないため、この配列決定は、４つのヌクレオチド塩基タイプ（アデニン、チミン、シトシン、グアニン）を区別しなければならない配列決定手順より速く正確に行うことができる。特定の実施形態では、２つの塩基は互いに対になって二次構造を形成するのではなく、異なるサイズである。たとえば、この目的では、ハイブリッド形成する傾向のあるアデニンおよびチミン、またはサイズが類似しているアデニンおよびグアニンより、アデニンおよびシトシンが良好なはずである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
いくつかの実施形態では、このシステムを使用して、データを符号化する長いポリマーを合成することができ、このデータを増幅および／または解放し、および次いで異なるシーケンサー上で配列決定することができる。他の実施形態では、このシステムを使用して、特注のＤＮＡ配列を提供することができる。さらに他の実施形態では、このシステムを使用して、ＤＮＡ配列を読み取ることができる。
【００１２】
一実施形態で使用されるナノチップは、少なくとも１つのナノポアによって接続された少なくとも２つの別個の反応区画を収容しており、ナノポアは、成分の少なくとも一部が混合するのを防止するが、ＤＮＡまたは他の荷電ポリマー、たとえばＲＮＡまたはペプチド核酸（ＰＮＡ）のわずか単一の分子が、１つの反応区画から別の反応区画へ制御可能に横断することを可能にする。１つの区画から別の区画へのポリマー（または少なくともモノマーが付加されたポリマーの末端）の移送により、たとえば大きすぎるため、または基質もしくは大型部分に係留されているため、ナノポアを横断することが防止された酵素を使用した塩基の付加などのポリマーへの順次操作／反応が可能になる。ナノポアセンサは、ポリマーの運動または位置およびその状態、たとえばその配列、および試行された反応が成功したかどうかに関して報告を返す。これにより、データを書き込み、記憶し、読み取ることが可能になり、たとえば塩基配列が、機械可読コード、たとえばバイナリコードに対応し、各塩基または塩基群が、１または０に対応する。
【００１３】
したがって、本発明はとりわけ、以下の実施形態を含む。
・  少なくとも２つの別個のモノマーを含む帯電ポリマー、たとえばＤＮＡの合成のためのナノチップであって、１つまたは複数のナノポアによって分離された２つ以上の反応チャンバを備え、各反応チャンバが、電解液と、帯電ポリマーをチャンバに引き込む１つまたは複数の電極と、ポリマーへのモノマーまたはオリゴマーの付加を容易にする１つまたは複数の試薬とを含む、ナノチップ。ナノチップは、ＤＮＡを案内、誘導、および／または制御するための機能要素を有するように構成してもよく、ＤＮＡの平滑な流れを可能にしまたはＤＮＡを取り付けるように選択された材料で被覆しても、またはそのような材料から形成してもよく、ナノポア近傍の電極を提供および制御するためのナノ回路要素を備えることができる。たとえば、１つまたは複数のナノポアはそれぞれ、ナノポアを通るポリマーの運動を制御しかつ／またはナノポアおよびポリマーのインターフェースにおける電位、電流、抵抗、もしくはキャパシタンスの変化を検出し、それによって１つまたは複数のナノポアを通過するポリマーの配列を検出することができる電極に関連付けてもよい。特定の実施形態では、オリゴマーは、ポリメラーゼまたは部位特異的リコンビナーゼを使用して合成される。いくつかの実施形態では、ポリマーは、間違いの検出および適宜補正を可能にするために合成中に配列決定される。いくつかの実施形態では、そのように得られたポリマーは、ナノチップ上に記憶され、ポリマー配列で符号化された情報にアクセスすることが所望されるときは配列決定することができる。
・  ＤＮＡがＤＣバイアスによってナノポアに引き込まれるときに共振ＲＦ回路内の容量分散（ｃａｐａｃｉｔｉｖｅ  ｖａｒｉａｎｃｅ）を測定することによって、ナノポアチップ内のポリマー、たとえばＤＮＡの配列を判定する方法およびデバイス。
・  記載のナノチップを使用してポリマー、たとえばＤＮＡを合成する方法。
・  配列が本質的に、非ハイブリッド形成ヌクレオチド、たとえばアデニンおよびシトシンヌクレオチド（ＡおよびＣ）のみからなり、これらがたとえばデータ記憶方法で使用するためのバイナリコードに対応するように配列内に配置されている一本鎖ＤＮＡ分子。
・  バイナリコードに対応する一連のヌクレオチド配列を含む二本鎖ＤＮＡであって、さらに含む二本鎖ＤＮＡ。
・  ナノポアシーケンサーを使用することを含む、ＤＮＡ内に符号化されたバイナリコードを読み取る方法。
・  上記のナノチップを使用して、少なくとも２つの別個のモノマーを含む帯電ポリマー、たとえばＤＮＡを作るデータ記憶方法およびデバイスであって、モノマーが、バイナリコードに対応する配列内に配置される、データ記憶方法およびデバイス。
・  ナノポアに基づくチップ内の現場でメモリ列（ＤＮＡまたはポリマーなど）上のデータの記憶および読取りを行う方法およびシステムであって、少なくとも３つのチャンバ、ポリマーに「１」ビットを付加するように配置されたＡｄｄ「１」チャンバ、およびポリマーに「０」ビットを付加するように配置されたＡｄｄ「０」チャンバ、ならびにポリマーがＡｄｄ「１」またはＡｄｄ「０」チャンバに入るとき、それぞれポリマーが「１」ビットおよび「０」ビットを受け取ることを可能にするように配置された「デブロック」チャンバを有するセルを提供することと、所定のデジタルデータパターンに基づいてポリマーを「デブロック」チャンバからナノポアを通ってＡｄｄ「１」チャンバまたはＡｄｄ「０」チャンバへ連続して操舵して、ポリマー上にデジタルデータパターンを作成することと、チップ上のナノポア−ポリマー共振器（ＮＰＲ）の共振周波応答を使用してナノポアを通過するときにポリマー上に記憶されているデジタルデータを読み取ることとを含む方法およびシステム。
・  ポリマー内に記憶されているデータを読み取る方法およびシステムは、インダクタおよびセルを有する共振器を提供することであり、セルがナノポアおよびポリマーを有し、ポリマーがナノポアを横断することができ、共振器が、プローブ周波数のＡＣ入力電圧に応答してプローブ周波数のＡＣ出力電圧周波数応答を有する、共振器を提供することと、少なくともプローブ周波数を有するＡＣ入力電圧を提供することと、少なくともプローブ周波数のＡＣ出力電圧を監視することであり、プローブ周波数のＡＣ出力電圧が、監視の時点でポリマー内に記憶されているデータを示す、ＡＣ入力電圧を提供することとを含み、ポリマーは、異なる共振周波数応答を引き起こす異なる特性を有する少なくとも２つのモノマーを含む。
【００１４】
本発明のさらなる態様および適用可能範囲は、以下に提供する詳細な説明から明らかになるであろう。本発明の好ましい実施形態を示している詳細な説明および特有の例は、例示のみを目的とすることを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。
【００１５】
本発明は、詳細な説明および添付の図面からより詳細に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】分割膜がナノポアによって穿孔されており、膜の両側に電極が位置する、簡単な２チャンバナノチップ設計の図を示す。
【図２−３】荷電ポリマー、たとえばＤＮＡがアノードの方へどのように引き込まれるかを示す。
【図４−５】電極の極性を反転させることによってポリマーを戻すことができることを示す。
【図６】ポリメラーゼ酵素が一方のチャンバ内に位置し、デブロック酵素が他方のチャンバ内に位置し、どちらもナノポアを通過することができない、ＤＮＡ合成のための２チャンバナノチップ設計を示す。
【図７】３’ブロックｄＡＴＰ（Ａ）が左チャンバを流れ、電流がＤＮＡをチャンバに入れるように「順方向」に設定されているときのアデニンヌクレオチドの付加を示す。
【図８】追加のヌクレオチドを付加することができる、オリゴヌクレオチドの脱保護を示す。たとえば、脱保護は、電流を「逆方向」に設定することによってＤＮＡをチャンバに入れた後に生じる。
【図９】３’ブロックｄＣＴＰ（Ｃ）の付加を示す。特定の実施形態では、このチャンバの内容物を交換するために流体流が使用され、たとえば図示のように、このチャンバ内には以前は「Ａ」が存在した。
【図１０】流れチャンバが試薬を提供するために単一のレーンになっているときに複数の別個の保持チャンバをどのように提供することができるかを示す。
【図１１】チャンバに取り付けることによって（図の上部ＤＮＡ断片）、またはナノポアを通過することができない大きいグループに結合することによって（図の下部ＤＮＡ断片）、そのチャンバに関連するＤＮＡを維持する手法を示す。このシステムでは、ＤＮＡの末端はそれでもなお、流れチャンバに入って、追加のヌクレオチドを受け取ることができるが、他方の末端は保持チャンバ内に留まる。
【図１２】ＤＮＡがチャンバの壁に取り付けられ、複数の電極によって制御される構成を示す。
【図１３】所望されるとき、電極の極性を簡単に制御することによって、ＤＮＡをチャンバ内にどのように保持するかを示す。
【図１４】自由に流れる試薬が両側を通り、ＤＮＡがチャンバの表面に結合されているアレイを示す。
【図１５】電極が分割膜に近接して両側に位置しており、より安価な製造を可能にする代替設計を示す。
【図１６】電極によってＤＮＡを区画から区画へ動かすことができる、３つの区画からなる配置を示す。このシステムは、合成中に著しい試薬の流れを必要としない。
【図１７】３つの区画からなる配置において試薬をどのように構成することができるかの一例を示す。
【図１８】ナノポアが膜の両側に電極要素を有し、ナノポアに近接して係留されているオリゴヌクレオチドを示す。
【図１９】ナノポアを含む膜に沿って取り付けられた一連のＤＮＡ分子を示し、それぞれナノポアに近接している電極の制御下にあり、膜の両側に流れレーンが位置している。たとえば、図示のように、左の流れレーンは、緩衝洗浄剤／３’ブロックｄＡＴＰ（Ａ）／緩衝洗浄剤／３’ブロックｄＣＴＰ（Ｃ）／緩衝洗浄剤の流れを提供し、ＤＮＡ分子は、所望のヌクレオチドが存在するときのみ流れチャンバに入る。右のレーンは、ヌクレオチドの３’末端を脱保護し、別のヌクレオチドの付加を可能にするために、デブロック剤（ｄｅｂｌｏｃｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を提供する。一実施形態では、デブロック剤は、左のレーンがバッファーで洗浄されているときに流れる。別の実施形態では、脱保護剤（ｄｅｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）は、ナノポアを介して左のレーンへ渡るには大きすぎる。
【図２０−２２】データを符号化するために使用されるビットが、トポイソメラーゼを使用して取り付けられた短いオリゴマーである、概念実証実験を概略的に示す。
【図２３】容量分散を使用してポリマー配列が読み取られるナノポアシーケンサーに対する形式を示す。このキャパシタンスによる読出し方式では、電極が、ナノポアを含む膜によって分離されたキャパシタの頂板および底板を形成する。キャパシタは、共振回路内に埋め込まれており、脈動直流電流が荷電ポリマーをナノポアに引き込むことができる。キャパシタンスの変化は、ポリマー、たとえばＤＮＡがナノポアを通過するとき、高周波インピーダンス分光法（ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）を使用して測定される。特にＤＮＡを用いたこの手法の主な利点は、測定周波数を非常に高くすることができ（実際上すべてのサイクルに対して１測定であり、したがって１００ＭＨｚの周波数は、毎秒１億回の測定に対応する）、ナノポアを通るモノマーの移送速度よりはるかに大きくすることができることである（たとえばＤＮＡは、何らかの抑制がない限り、毎秒百万ヌクレオチド程度の速度で電流に応答してナノポアを通過する）。
【図２４】たとえば２ビットまたはバイナリ符号化のために２つの異なるタイプのモノマーまたはオリゴマーを付加するのに好適な２重付加チャンバのレイアウトを示す。図の上部は上面図を示す。下部は側断面図を示す。この実施形態における完全なデバイスは、独立して製作された最大３つの層から組み立てて、ウェーハ接合によってつなぎ合わせることができ、または単一の基質のエッチングによって形成することができる。チップは、電気制御層（１）と、予備チャンバの上に２つの付加チャンバを収容し、第１および第２の付加チャンバへのナノポア入口間に荷電ポリマー（たとえば、ＤＮＡ）が繋がれている流体層（２）と、電気接地層（３）とを含む。
【図２５】図２４の２重付加チャンバのレイアウトの動作を示す。各付加チャンバの底面にナノポア（４）が存在することが観察されよう。ナノポアは、たとえば、ＦＩＢによる穿孔、ＴＥＭ、湿式もしくは乾式エッチング、または絶縁破壊によって作製される。ナノポアを含む膜（５）は、たとえば、１原子層から数１０ｎｍの厚さである。膜（５）は、たとえば、ＳｉＮ、ＢＮ、ＳｉＯｘ、グラフェン、遷移金属ダイカルコゲナイド（ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｍｅｔａｌ  ｄｉｃｈａｌｃｏｇｅｎｉｄｅ）、たとえばＷＳ２またはＭｏＳ２から作製される。ナノポア膜（５）の下には、予備またはデブロッカチャンバ（６）が存在し、付加チャンバのうちの１つにおけるモノマーまたはオリゴマーの付加後のポリマーの脱保護のための試薬を収容する（モノマーまたはオリゴマーは、末端が保護された形態で付加され、したがって一度に単一のモノマーまたはオリゴマー（ｏｌｉｇｉｍｅｒ）のみが付加されることを想起されたい）。ポリマー（７）は、電気制御層（１）内の電極の極性を変化させることによって付加チャンバの内外へ引っ張ることができる。
【図２６】は、図２４および図２５に類似のレイアウトの上面図を示すが、ここでは共通の予備またはデブロッカチャンバを共有する４つの付加チャンバが存在し、ポリマーは、４つのチャンバのそれぞれへのアクセスを有する位置（９）に係留されている。このレイアウトの横断面図は、図２４および図２５に示されているとおりであり、荷電ポリマーは、電気制御層（図２４の１）内の電極の動作によって、４つの付加チャンバのそれぞれに入れることができる。
【図２７】図２４および図２５に示す２重付加チャンバを複数組有し、複数のポリマーを並列して合成することを可能にするナノポアチップの上面図を示す。モノマー（ここではＡおよびＧとして表されているｄＡＴＰおよびｄＧＴＰヌクレオチド）が、直列流路を介して各チャンバ内へ投入される。１つまたは複数の共通のデブロッカフローセルにより、付加チャンバのうちの１つにおけるモノマーまたはオリゴマーの付加後、ポリマーを脱保護することが可能になる。またこれにより、要求に応じてポリマーを切り離す（ｄｅｔａｔｃｈｅｄ）ことが可能になる（たとえば、ＤＮＡの場合は制限酵素、またはナノポアに近接する表面からの化学的な切離し、および外部での収集を使用する。この特定の実施形態では、デブロッカフローセルは、付加チャンバを充填するために使用される流体工学的投入チャネルに直交している。
【図２８】２重付加チャンバのレイアウトに対する配線のさらなる詳細を示す。電気制御層（１）は、金属またはポリシリコンから形成された配線を含む。配線密度は、３Ｄスタッキングによって増大され、誘電体の堆積（たとえば、ＰＥＣＶＤ、スパッタリング、ＡＬＤなどを介して）によって電気的隔離が提供される。一実施形態では、付加チャンバ内の頂部電極へのコンタクト（１１）は、ディープ反応性イオンエッチング（Ｄｅｅｐ  Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｉｏｎ  Ｅｔｃｈ）（ＤＲＩＥ）（低温またはＢＯＳＣＨプロセス）によるシリコン貫通電極（Ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｖｉａ）（ＴＳＶ）を使用して作製される。個々の電圧制御（１２）により、各付加チャンバに個々に対処することが可能になり、並列して複数のポリマーの配列の微調整が可能になる。図の右側は、複数の付加セルへの配線を示す上面図を示す。電気接地層（３）は、共通とすることができ（図示のとおり）、またはセル間の交差結合を低減させるために分割することができる。
【図２９】付加チャンバに対する制御電極（１３）をチャンバの頂部ではなくチャンバの側面上に巻き付けて堆積させることができる代替構成を示す。
【図３０】実施例３に記載するトポイソメラーゼ付加プロトコルが機能することを立証するＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、予期されるＡ５およびＢ５生成物に対応する帯がはっきりと見える。
【図３１】実施例５のＰＣＲ生成物が正しいサイズであることを立証するアガロースゲルを示す。レーン０は２５塩基対ラダーであり、レーン１は実験の生成物であり、予期される分子量に対応するラインであり、レーン２は陰性対照＃１であり、レーン３は陰性対照＃２であり、レーン４は陰性対照＃４である。
【図３２】実施例５に記載されている制限酵素が予期される生成物を生成することを立証するアガロースゲルを示す。左のラダーは１００塩基対ラダーである。レーン１は不消化ＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃであり、レーン２は消化ＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃである。レーン３は不消化ＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃＩであり、レーン４は消化ＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃＩである。
【図３３】ナノポア付近のＤＮＡの不動化を示す。パネル（１）は、左チャンバ内の１つの末端上にオリガミ構造を有するＤＮＡを示す（実際のナノチップでは、最初に左チャンバ内に多数のそのようなオリガミ構造が存在する）。パネル（２）は、ＤＮＡをナノポアへ駆動するアノードを右に有するシステムを示す。ＤＮＡ鎖はナノポアを通行することが可能であるが、オリガミ構造は通過するには大きすぎ、したがってＤＮＡは「動けなくなる」。電流を遮断することで（パネル３）、ＤＮＡを放散させることが可能になる。好適な化学的性質によって、ＤＮＡ鎖の末端は、ナノポア付近で表面に接触したときに結合することが可能である。パネル（４）で、制限酵素が付加され、オリガミ構造をＤＮＡから切断する。チャンバは、酵素および残留ＤＮＡを除去するために洗浄される。最終結果は、ナノポア付近に取り付けられた単一のＤＮＡ分子であり、ナノポアを通って前後に動かすことが可能である。
【図３４】基本の機能的ナノポアを示す。各パネルにおいて、ｙ軸は電流（ｎＡ）であり、ｘ軸は時間（秒）である。「ＲＦ雑音のスクリーニング」という左のパネルは、ファラデーケージの有用性を示す。ナノポアをもたないチップがフローセル内に配置され、３００ｍＶが印加される。ファラデーケージの蓋を閉じたとき（第１の矢印）、雑音低減を見ることができる。ラッチを閉じたとき（第２の矢印）、わずかなスパイクが生じる。電流は約０ｎＡであることに留意されたい。孔の製造後（中央パネル）、３００ｍＶの印加（矢印）の結果、電流は約３．５ｎＡになる。ＤＮＡが接地チャンバに加えられ、＋３００ｍＶが印加されたとき、ＤＮＡ転座（右のパネル）を電流の過渡的な減少として観察することができる。（この場合、ＴＳバッファー：５０ｍＭのトリス、ｐＨ８、１ＭのＮａＣｌが使用されることに留意されたい）。このＤＮＡ転座実験には、Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡが使用される。
【図３５】大きい一本鎖領域、立方のオリガミ構造、ならびにオリガミ構造付近の２つの制限部位（ＳｗａＩおよびＡｌｗＮＩ）の存在というＤＮＡオリガミ構造の主な特徴を示す簡略化された図を示す。
【図３６】製造されたＤＮＡオリガミ構造の電子顕微鏡画像を示し、予期されるトポロジを実証する。５ｍＭのトリス塩基、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２で、オリガミが作製される。オリガミ構造を維持するために、約５ｍＭのＭｇ＋＋濃度または約１ＭのＮａ＋／Ｋ＋濃度を有することが好ましい。オリガミ構造は、４℃において５００ｎＭで貯蔵される。
【図３７】正しいアセンブリおよび機能を立証するためのＤＮＡオリガミの制限消化を示す。左端のレーンは、ＭＷ標準を提供する。制限部位は、ＡｌｗＮＩおよびＳｗａＩでオリガミを消化することによって試験される。４つの試験レーンは、以下の試薬を収容している（単位はマイクロリットル）。
【表１】
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試験レーン（１）は陰性対照であり、（２）はＳｗａＩによる消化であり、（３）はＡｌｗＮＩによる消化であり、（４）はＳｗａＩ／ＡｌｗＮＩによる二重消化（ｄｏｕｂｌｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）である。消化は、室温で６０分、続いて３７℃で９０分にわたって実行される。アガロースゲル１／２ｘ  ＴＢＥ−Ｍｇ（５ｍＭのＭｇＣｌ２を含む１／２ｘ  ＴＢＥ）が、臭化エチジウム染色によって可視化される。いずれかの酵素による個々の消化は、ゲル内で移動作用を示さないが、両方の酵素による消化（レーン４）の結果、予期されるように、異なる長さの２つの断片が得られる。
【図３８】ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖａｄｉｎ）被覆ビーズに対するビオチン標識オリゴヌクレオチドの結合と、ＢＳＡ被覆ビーズを制御するための結合との関係を示す。ｙ軸は、蛍光単位であり、「結合前」は、ビーズを結合する前の試験溶液からのオリゴ蛍光であり、（−）制御は、ＢＳＡコンジュゲートビーズの２つの異なるバッチに対する結合後に見られる蛍光であり、ＳＡ−１およびＳＡ−２は、ストレプトアビジンコンジュゲートビーズの２つの異なるバッチに対する結合後に見られる蛍光である。ＢＳＡコンジュゲートビーズによる小さく明らかな量の結合が観察されるが、ストレプトアビジンコンジュゲートビーズによるはるかに大きい結合が見られる。
【図３９】異なる緩衝システム、ＭＰＢＳおよびＨＫバッファーにおけるストレプトアビジン被覆ビーズに対するビオチン標識オリゴヌクレオチドの結合と、ＢＳＡ被覆ビーズを制御するための結合との関係を示す。左のバー「陰性対照」は、ビーズを結合する前の試験溶液からのオリゴ蛍光である。中央の列は、ＢＳＡに対する結合後の「ＢＳＡビーズ」の蛍光を示し、右の列は、ストレプトアビジンビーズに対する結合後の「ＳＡビーズ」の蛍光を示す。どちらの緩衝システムでも、蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｅｎｃｅ）は、制御に対してストレプトアビジンビーズによって低減され、これは、ビオチン標識オリゴヌクレオチドが、異なる緩衝システムにおいてストレプトアビジン被覆ビーズによく結合されることを意味する。
【図４０】機能性コンジュゲートＳｉＯ２ナノポアを示し、表面は、一方の側がストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐａｖｉｄｉｎ）で被覆され、他方の側がＢＳＡで被覆される。ｘ軸は時間であり、ｙ軸は電流である。ドットは、電流を反転させた点を示す。電流を反転させたとき、短時間のオーバーシュートが存在し、次いで電流は、ほぼ同じ絶対値に落ち着く。ナノポアは、２００ｍＶで約＋３ｎＡおよび−２００ｍＶで約−３ｎＡの電流を示す。
【図４１】ナノポアに挿入されたオリガミＤＮＡ構造の図を示す。
【図４２】ナノポアに近接してストレプトアビジン被覆面に一本鎖ＤＮＡを取り付ける図を示す。
【図４３】ナノポア付近で表面に取り付けられたオリガミＤＮＡの実験結果を示す。電流は両方向に＋または−約２．５ｎＡであり、これは＋／−約３ｎＡの元の電流より小さく、オリガミ構造による部分的な遮断を反映している。ｘ軸は時間（秒）であり、ｙ軸は電流（ｎＡ）であり、円は電圧切換え点を表す。
【図４４】オリガミＤＮＡの挿入を示し、その結果、電流のわずかな降下が生じる。電流が解放されると、オリガミはすぐにナノポアから出る。ｘ軸は時間（秒）であり、ｙ軸は電流（ｎＡ）であり、円は電圧切換え点を表す。
【図４５】電流の印加によってナノポアを前後に通るＤＮＡ鎖の制御された運動の図を示す。左側で、ＤＮＡは孔の中にあり、したがって観察される電流は、孔の中にＤＮＡがない場合より低い。電流を反転させたとき（右側）、孔の中にＤＮＡはなく、したがって電流は変化しない。
【図４６】この図を立証する実験結果を示す。正の電圧が印加されたとき、電流は約３ｎＡであり、これは孔が開いているときに典型的に観察される電流と同等である。電圧を反転させると、電流は約−２．５ｎＡになる。これは、孔が開いているときに典型的に見られる電流より低く、孔がＤＮＡの鎖によって閉塞されているときに典型的に観察される電流に対応する。いくつかの連続する電圧切換えは、一貫した結果を示し、ＤＮＡが図４５に示す構成を交互にとることを示唆している。
【図４７】ナノポアに近接してＤＮＡを表面につなぎ合わせる異なるコンジュゲーションケミストリーを示す。
【図４８】図４８Ａ、図４８Ｂ、および図４８Ｃは、本発明の実施形態によるポリマーおよびナノポアならびに等価回路の３つの図である。
【図４９Ａ】本発明の実施形態によるナノポアセルとともに作製された共振器に対する等価回路である。
【図４９Ｂ】本発明の実施形態による図４９Ａの共振器の出力応答の振幅および位相のグラフである。
【図５０】本発明の実施形態による図４９Ａの共振器の出力応答の振幅および位相の範囲を示す１群の曲線である。
【図５１】本発明の実施形態によるナノポアを通過するポリマー、ならびにその結果得られるプローブ周波数における共振器の出力応答の振幅および位相を示す時系列である。
【図５２】本発明の実施形態によるナノポアを通過するポリマー、ならびにその結果得られる第２のプローブ周波数における共振器の出力応答の振幅および位相を示す時系列である。
【図５３】本発明の実施形態による複数の並列のナノポア−ポリマー共振器からなる等価回路および信号処理である。
【図５４】本発明の実施形態によるいくつかの共振周波数帯域幅に対する周波数プロットである。
【図５５Ａ】本発明の実施形態によるＡＣ入力電圧Ｖｉｎに対する周波数プロットである。
【図５５Ｂ】本発明の実施形態による代替のＡＣ入力電圧Ｖｉｎに対する時間および周波数プロットである。
【図５６】本発明の実施形態による３つのプローブ周波数における振幅および位相の周波数プロットである。
【図５７】本発明の実施形態によるナノポア−ポリマー共振器の２Ｄアレイのブロック図である。
【図５８】本発明の実施形態によるナノポアメモリチップの側断面図である。
【図５９】本発明の実施形態による図５８のチップ内で使用されるインダクタの上面図である。
【図６０】本発明の実施形態によるＡＣ信号とＤＣ信号の両方を接続する「バイアスティ（ｂｉａｓ−ｔｅｅ）」構成の等価回路図である。
【図６１】本発明の実施形態による図６０の「バイアスティ」構成の一部分の図である。
【図６２】本発明の実施形態による頂部Ａｄｄチャンバのそれぞれに１つずつ２つのインダクタを有するナノポアメモリチップの別の実施形態の側断面図である。
【図６３】本発明の実施形態による頂部Ａｄｄチャンバのうちの１つに１つのインダクタを有するナノポアメモリチップの別の実施形態の側断面図である。
【図６３Ａ】本発明の実施形態による共振器の頂部電極に接続された単一の共通インダクタおよび各共振器セル内の固定のキャパシタンスを有する複数の並列のナノポア−ポリマー共振器からなる等価回路および信号処理である。
【図６３Ｂ】本発明の実施形態による図６３Ａの構成を有するナノポアメモリチップの別の実施形態の側断面図である。
【図６４】本発明の実施形態によるデブロックチャンバの底部にインダクタを有するナノポアメモリチップの別の実施形態の側断面図である。
【図６４Ａ】本発明の実施形態による図６４の構成に対するＡＣ信号とＤＣ信号の両方を接続する「バイアスティ」構成の等価回路図である。
【図６４Ｂ】本発明の実施形態による単一の共通インダクタおよび各共振器セル内の固定のキャパシタンスを有する複数の並列のナノポア−ポリマー共振器からなる等価回路および信号処理である。
【図６４Ｃ】本発明の実施形態による図６４Ｂの構成を有するナノポアメモリチップの別の実施形態の側断面図である。
【図６５】本発明の実施形態による透明な頂部および電極を有する１群の接続された３チャンバセルナノポアデバイスの部分斜視図である。
【図６６】本発明の実施形態による透明な頂部および電極を有する１群の接続された３チャンバセルナノポアデバイスの代替実施形態の部分斜視図である。
【図６７】本発明の実施形態による図６５のとおりに接続されたナノポアセルのアレイの回路ブロック図である。
【図６８】本発明の実施形態による読取り／書込みメモリコントローラおよびナノポアメモリチップのブロック図である。
【図６８Ａ】本発明の実施形態によるコンピュータシステムのブロック図である。
【図６９】本発明の実施形態によるメモリ付加周期、およびこれらの周期を実行するために必要とされる操舵電圧（ｓｔｅｅｒｉｎｇ  ｖｏｌｔａｇｅ）の表およびグラフである。
【図７０】本発明の実施形態による交互の書込みサイクルを使用してメモリが様々なデータ入力に対してどのようにポピュレートされるかを示すグラフおよびデータマップである。
【図７０Ａ】本発明の実施形態による図７０に示す書込みサイクルを実行するコントローラ論理の流れ図である。
【図７０Ｂ】本発明の実施形態による図６６に示すように構成されたナノポアチップに「１」および「０」を書き込む工程を示す表である。
【図７１】本発明の実施形態によるメモリ列上のビットの３つの異なるデータ形式リスティングを示す。
【図７２】本発明の実施形態による行内の各セルに対するメモリ列上のビットのデータ形式リスティングを示す。
【図７３】本発明の実施形態による行内の各セルに対するメモリ列上のビットの代替のデータ形式リスティングを示す。
【図７４】本発明の実施形態による行内のセルに対するメモリ列上のビットの代替の並列のデータ記憶形式リスティングを示す。
【図７５】本発明の実施形態による読取り／書込みメモリコントローラおよび流体／試薬に対する計器を示すナノポアメモリシステムを示すブロック図である。
【図７６】ＤＮＡ分子に対するオリゴヌクレオチドカセット（「ビット」）のトポイソメラーゼを媒介とする付加を示すゲル電気泳動の準備である。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
好ましい実施形態の以下の説明は、本質的に単なる例示であり、本発明、その応用例、または用途を限定することを何ら意図するものではない。
【００１８】
本明細書全体にわたって、簡略的に範囲を使用して、その範囲内のあらゆる値を記載する。範囲内の任意の値を、その範囲の境界として選択することができる。加えて、本明細書に引用するすべての参照文献は、全体として参照により本明細書に組み込まれている。本開示と引用された参照文献において定義が矛盾する場合、本開示が優先する。
【００１９】
別途指定しない限り、本明細書で表されるすべての百分比および量は、重量パーセントを指すと理解されたい。記載の量は、物質の有効重量に基づくものである。
【００２０】
本明細書では、「ナノチップ」は、流体を収容する複数のチャンバを備え、流体の流れを可能にするチャネルを適宜備えるナノ流体デバイスを指し、ナノチップの特徴の限界寸法、たとえばチャンバを互いから分割する要素の幅は、厚さ１原子〜１０ミクロンであり、たとえば１ミクロンより小さく、たとえば０．０１〜１ミクロンである。ナノチップ内の材料の流れは、電極によって調節することができる。たとえば、ＤＮＡおよびＲＮＡが負に帯電しているとき、これらのＤＮＡおよびＲＮＡは正に帯電している電極へ引き込まれる。たとえば、参照により本明細書に組み込まれている、Gershow, M, et al., Recapturing and Trapping Single Molecules with a Solid State Nanopore, Nat Nanotechnol. (2007) 2(12): 775-779を参照されたい。いくつかの場合、流体の流れはまた、ゲート要素によって、ナノチップとの間の流体の一掃、注入、および／または吸引によって調節することができる。システムは、核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）の精密な多重化された分析が可能である。特定の実施形態では、ナノチップは、シリコン材料、たとえば二酸化ケイ素または窒化ケイ素から作製することができる。窒化ケイ素（たとえば、Ｓｉ３Ｎ４）は、化学的に比較的不活性であり、厚さ数ｎｍしかないときでも水およびイオンの拡散に対して有効な障壁を提供するため、この目的にとって特に望ましい。二酸化ケイ素（本明細書の実施例で使用）もまた、化学的に修飾するのに良好な表面であるため、有用である。別法として、特定の実施形態では、ナノチップは、単分子と同じ薄さのシートを形成することができる材料（単層材料と呼ばれることがある）、たとえば、それぞれ内容が参照により本明細書に組み込まれている、たとえばHeerema, SJ, et al, Graphene nanodevices for DNA sequencing, Nature Nanotechnology (2016) 11: 127-136、Garaj S et al., Graphene as a subnanometre trans-electrode membrane, Nature (2010) 467 (7312), 190-193に記載されているグラフェン、または内容が参照により本明細書に組み込まれている、Feng, et al., Identification of single nucleotides in MoS2 nanopores, Nat Nanotechnol. (2015) 10(12):1070-1076に記載されている遷移金属ダイカルコゲナイド、たとえば二硫化モリブデン（ｍｏｌｙｂｅｎｄｕｍ）（ＭｏＳ２）、またはGilbert, et al. Fabrication of Atomically Precise Nanopores in Hexagonal Boron Nitride, eprint arXiv:1702.01220 (2017)に記載されている窒化ホウ素から、全体的または部分的に作製することができる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ナノチップは、たとえばＭｏＳ２などのグラフェンと少なくとも同じ不活性および堅さである、比較的堅く不活性のそのような単層材料を含む。単層材料は、たとえばナノポアを含む膜のすべてまたは一部として使用することができる。ナノチップは、部分的に金属で裏打ちすることができ、たとえば壁を層状にことができ（たとえば、金属−窒化ケイ素−金属）、金属は次いで、制御可能な１対の電極をナノポア付近に提供するように構成することができ、したがって核酸は、起電力によってナノポアを通って前後に動かすことができ、また核酸がナノポアを通過するときの電位の変化を測定することによって配列決定することができる。
【００２２】
ＤＮＡを配列決定するためのナノチップナノ流体デバイスは、それぞれ内容全体、たとえばナノポアを含むナノチップの設計および製造に関する教示が、参照により本明細書に組み込まれている、たとえばLi, J., et al, Solid-state nanopore for detecting individual biopolymers, Methods Mol Biol. (2009)544:81-93、Smeets RM, et al. Noise in solid-state nanopores, PNAS (2008)105(2):417-21、Venta K, et al., Differentiation of short, single-stranded DNA homopolymers in solid-state nanopores, ACS Nano. (2013)7(5):4629-36、Briggs K, et al. Automated fabrication of 2-nm solid-state nanopores for nucleic acid analysis, Small (2014)10(10):2077-86、およびChen Z, DNA translocation through an array of kinked nanopores, Nat Mater. (2010)9(8):667-75に記載されているように、概して知られている。
【００２３】
本明細書では、「ナノポア」は、直径１ミクロン未満、たとえば直径２〜２０ｎｍ、たとえば２〜５ｎｍ程度の孔である。一本鎖ＤＮＡは、２ｎｍのナノポアを通過することができ、一本または二本鎖ＤＮＡは、４ｎｍのナノポアを通過することができる。たとえば２〜５ｎｍの非常に小さいナノポアを有することで、ＤＮＡが通過することは可能になるが、より大きい酵素タンパク質が通過することは可能ではなく、それによってＤＮＡ（または他の荷電ポリマー）の制御された合成が可能になる。より大きいナノポア（またはより小さい酵素タンパク質）が使用される場合、酵素タンパク質は、ナノポアを通過することを防止する基質、たとえばより大きいタンパク質などのより大きい分子、ビーズ、またはチャンバ内の表面にコンジュゲートさせることができる。異なるタイプのナノポアが知られている。たとえば、生物学的なナノポアが、脂質二重層などの膜内の孔形成タンパク質（ｐｏｒｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のアセンブリによって形成される。たとえば、細胞膜内にはα溶血素および類似のタンパク質孔が自然に見られ、これらはイオンまたは分子が細胞の内外へ輸送されるチャネルとして作用し、そのようなタンパク質をナノチャネルとしての目的で使用することができる。たとえばフィードバック制御された低エネルギーのイオンビームスカルプティング（ＩＢＳ）または高エネルギーの電子ビーム照射を使用して、合成膜内に孔を構成することによって、たとえば窒化ケイ素またはグラフェンなどの合成材料内に固体ナノポアが形成される。合成材料内に孔形成タンパク質を埋め込むことによって、複合ナノポアを作製することができる。ナノポアのいずれかの末端またはいずれかの側に金属の表面または電極が存在する場合、電解液媒体を介してナノポアを通って、ナノポアを横切る電流の流れを確立することができる。電極は、任意の伝導性材料、たとえば銀、金、白金、銅、二酸化チタン、たとえば塩化銀で被覆された銀から作製することができる。
【００２４】
固体状態で、たとえば窒化ケイ素膜内にナノポアを構成する方法が知られている。１つの手法では、ケイ素の基質が、膜材料、たとえば窒化ケイ素で被覆され、膜の全体的な構成は、ナノチップに組み込むための所望のサイズ、たとえば約２５×２５ミクロンの窒化ケイ素膜を提供するために、フォトリソグラフィおよび湿式化学エッチングを使用して作製される。集束イオンビーム（ＦＩＢ）を使用して、窒化ケイ素膜内に、最初に直径０．１ミクロンの孔または空洞が開けられる。イオンビームスカルプティングにより、より大きい孔を収縮させることによって、たとえば膜表面におけるイオンビームに誘起された横方向の質量輸送によって、または両側から空洞を収容する膜の平坦側から層ごとのイオンビームスパッタリングによって膜材料を除去することによって、ナノポアを構成することができ、したがって最終的に空洞に到達したとき、鋭利なナノポアが得られる。イオンビーム露出が消滅し、次いで孔を通って伝送されるイオン電流は、所望の孔径に対して適当になる。たとえば、Li, J., et al., Solid-state nanopore for detecting individual biopolymers, Methods Mol Biol. (2009)544:81-93を参照されたい。別法として、ナノポアは、ＴＥＭにおいて高エネルギー（２００〜３００ｋｅＶ）の電子ビーム照射を使用して構成することができる。半導体処理技法、電子ビームリソグラフィ、ＳｉＯ２マスク層の反応性イオンエッチング、およびＳｉの異方性ＫＯＨエッチングを使用して、厚さ４０ｎｍの膜内に、ピラミッド形の２０×２０ｎｍ以上の孔が作製される。ＴＥＭ内の電子ビームは、より大きい２０ｎｍの孔をより小さい孔に収縮させるために使用される。ＴＥＭにより、収縮プロセスを実時間で観察することが可能になる。より薄い膜（たとえば、厚さ１０ｎｍ未満）を使用して、ＴＥＭにおける高エネルギー収束電子ビームによって、ナノポアを開けることができる。概して、内容がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれている、Storm AJ, et al. Fabrication of solid-state nanopores with single-nanometre precision. Nature Materials (2003) 2:537-540、Storm AJ, et al. Translocation of double-stranded DNA through a silicon oxide nanopore. Phys. Rev. E (2005)71:051903、Heng JB, et al. Sizing DNA Using a Nanometer-Diameter Pore. Biophys. J (2004) 87(4):2905-11を参照されたい。
【００２５】
他の実施形態では、たとえば、内容が参照により本明細書に組み込まれている、Kwok, et al., "Nanopore Fabrication by Controlled Dielectric Breakdown," PLOS ONE (2014) 9(3): e92880に記載されているように、ナノポアは、絶縁破壊を使用して、膜の両端間で比較的高電圧の電位を使用して作製され、電圧は、電流が検出されるまで引き上げられる。
【００２６】
これらの技法を使用して、当然ながら使用される厳密な技法ならびに膜の厚さおよび厳密な組成に応じて、窒化ケイ素などの固体材料内のナノポアの全体的な形状は、２つの漏斗に大まかに類似することができ、それらの頂点は、最も狭い点、すなわち実際のナノポアで交わる。そのような２重の円錐形状は、ナノポアを通ってポリマーを前後に操舵するのに役立つ。撮像技法、たとえば原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）または透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、特にＴＥＭを使用して、ナノ膜、ＦＩＢ孔または空洞、および最終的なナノポアのサイズ、位置、および構成を検証および測定することができる。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ポリマー、たとえばＤＮＡの一方の末端は、ナノポア付近またはナノポアにつながる漏斗の内壁に係留される。ポリマーは、最初は拡散によってナノポアに接近し、次いで電気勾配によって駆動されるため、ポリマーの一方の末端がナノポア付近に係留されている場合、勾配によって駆動される運動が最大になり、拡散運動が最小になり、それによって速度および効率が向上する。たとえば、Wanunu M, Electrostatic focusing of unlabelled DNA into nanoscale pores using a salt gradient, Nat Nanotechnol. (2010) 5(2):160-5、Gershow M., Recapturing and trapping single molecules with a solid-state nanopore. Nat Nanotechnol. (2007) 2(12):775-9、Gershow, M., Recapturing and Trapping Single Molecules with a Solid State Nanopore. Nat Nanotechnol. (2007) 2(12): 775-779を参照されたい。
【００２８】
一実施形態では、ポリマー、たとえばＤＮＡの一方の末端はビーズに取り付けられ、ポリマーは孔を通って駆動される。ビーズに取り付けることで、ポリマーがナノポアを完全に通って近接チャンバ内の分割膜の反対側へ動くことを停止する。次いで電流が遮断され、ポリマー、たとえばＤＮＡは、分割膜の他方の側においてチャンバ内でナノポアに近接して表面に取り付けられる。たとえば、一実施形態では、ｓｓＤＮＡの一方の末端は、５０ｎｍのビーズに共有結合によって取り付けられ、他方の末端はビオチン化される。分割膜の他方の側におけるチャンバ内の所望の取付け点の区域に、ストレプトアビジンが結合される。ＤＮＡは、電位によってナノポアを通って引っ張られ、ビオチンがストレプトアビジンに取り付けられる。ナノポアに近接したビーズおよび／または表面への取付けは、共有結合または強い非共有結合（ビオチン−ストレプトアビジン結合など）とすることができる。ビーズは次いで、酵素で切断され、洗い流される。いくつかの実施形態では、たとえば、参照により本明細書に組み込まれている、K. Nishigaki, Type II restriction endonucleases cleave single-stranded DNAs in general. Nucleic Acids Res. (1985) 13(16): 5747-5760に記載されているように、一本鎖ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡを開裂する制限酵素によって開裂される。他の実施形態では、相補形のオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｃｅｏｔｉｄｅ）を提供して二本鎖制限部位を作製し、次いで対応する制限酵素によって開裂することができる。
【００２９】
ポリマーがナノポアを通過するとき、異なるサイズおよび静電電位によって異なるモノマーを区別することができるため、ポリマーが通過するときにナノポアの部分的な閉塞によって引き起こされるナノポアにおける電位、キャパシタンス、または電流の変化を検出および使用して、ポリマー内のモノマーの配列を識別することができる。
【００３０】
本明細書に記載するＤＮＡ製作方法におけるナノポアを含むナノチップの使用は、当技術分野で開示されていないが、そのようなチップはよく知られており、ＤＮＡの急速配列決定のために市販されている。たとえば、ＭｉｎＩＯＮ（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、英国オックスフォード）は小さく、ラップトップコンピュータに取り付けることができる。ＤＮＡの一本鎖が毎秒３０塩基でタンパク質ナノポアを通過すると、ＭｉｎＩＯＮは電流を測定する。孔内のＤＮＡ鎖がイオンの流れを乱し、その結果、配列内のヌクレオチドに対応する電流に変化が生じる。Mikheyev, AS, et al. A first look at the Oxford Nanopore MinION sequencer, Mol. Ecol. Resour. (2014)14, 1097-1102。ＭｉｎＩＯＮの正確さは不十分であり、繰り返し再配列決定を必要とするが、読み取っているＤＮＡが２つの容易に区別可能な塩基、たとえばＡおよびＣだけを収容する場合、本発明のナノチップを使用する配列決定の速度および正確さを大きく改善することができる。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ナノポアを含む膜は、３層構成を有することができ、絶縁コア材料、たとえば窒化ケイ素膜の両側に金属表面を有する。この実施形態では、これらの金属表面は、たとえばリソグラフィ手段によって、各ナノポアの各末端の１つに、対になった電極を有するマイクロ回路を提供するように構成され、したがってたとえば、電解液媒体を介してナノポアを通って電極間に、ナノポアを横切る電流の流れを確立することができ、電流は、ナノポアを通ってポリマーを引き込むことができ、極性を反転させることによってポリマーを引き戻すことができる。ポリマーがナノポアを通過するとき、電極はナノポアの両端間の電位の変化を測定し、ポリマー内のモノマーの配列を識別することができる。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ポリマーの配列は、データを記憶するように設計される。いくつかの実施形態では、データは、バイナリコード（１および０）で記憶される。いくつかの実施形態では、各塩基が、１または０に対応する。他の実施形態では、２つ以上の塩基からなる容易に認識される配列が１に対応し、２つ以上の塩基からなる別の容易に認識される配列が０に対応する。他の実施形態では、データは、３進、４進、または他のコードで記憶することができる。特定の実施形態では、ポリマーはＤＮＡ、たとえば一本鎖ＤＮＡであり、ＤＮＡは、２つの塩基タイプのみを収容し、自己ハイブリッド形成（ｓｅｌｆ−ｈｙｂｒｉｄｉｚｉｎｇ）が可能ないかなる塩基も収容せず、たとえばＤＮＡは、アデニンおよびグアニン、アデニンおよびシトシン、チミジンおよびグアニン、またはチミジンおよびシトシンを含む。いくつかの実施形態では、これら２つの塩基に１つまたは複数の追加の塩基を点在させることができ、たとえばＡおよびＣは、たとえば顕著な自己ハイブリッド形成を招かない頻度でコーディング配列内の区切りを示すことによって、配列を「中断する」ためにＴを収容することができる。他の実施形態では、たとえば核酸が二本鎖である場合、いくつかまたはすべての利用可能な塩基を用いることができる。
【００３３】
ヌクレオチド塩基は天然のものとすることができ、またはいくつかの実施形態では、たとえば参照により本明細書に組み込まれている、Malyshev, D. et al. "A semi-synthetic organism with an expanded genetic alphabet", Nature (2014) 509: 385-388に記載されているように、非天然塩基からなるかもしくは非天然塩基を含むことができる。
【００３４】
一実施形態では、データは、ポリマーへの単一のモノマー、たとえばＤＮＡの場合、単一のヌクレオチドの付加によって記憶される。一実施形態では、ポリマーはＤＮＡであり、モノマーはアデニン（Ａ）およびシトシン（Ｃ）の残基である。ＡおよびＣ残基には、（ｉ）ＡおよびＣが大きいサイズ差を有し、したがってナノポアを通る区別が容易になるはずである、（ｉｉ）ＡおよびＣが互いに対をなさず、したがってナノポア信号の解釈を複雑にしうる大きな二次構造を形成しない、（ｉｉｉ）同じ理由のため、グアニンテトラッドを形成することが知られているので、Ｇもあまり好ましくないことから、利点がある。ターミナルトランスフェラーゼ（またはポリヌクレオチドホスホリラーゼ）によって、ヌクレオチドが付加されるが、これらのヌクレオチドは３’ブロックされており、したがって一度に単一のヌクレオチドが付加される。ブロックは、次のヌクレオチドの付加前に除去される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡはナノチップ内に残される。他の実施形態では、ＤＮＡは除去されており、たとえば長期安定性を向上させるために、二本鎖ＤＮＡに変換してもよく、かつ／または結晶形態に変換してもよい。さらに他の実施形態では、ＤＮＡを増幅させることができ、増幅されたＤＮＡは、長期貯蔵のために除去することができ、元の鋳型ＤＮＡ、たとえばナノチップ内のチャンバの壁に結合されたＤＮＡは、ナノチップ内に残すことができ、追加のＤＮＡを作製するための鋳型として読み取りかつ／または使用することができる。
【００３６】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡまたは他のポリマーは、合成中にナノポア近傍で表面に繋がれる。たとえば、一実施形態では、一本鎖ＤＮＡ分子はそれぞれ、ナノポア近傍の表面に５’末端で取り付けられ、各ナノポアの電流は、そのナノポアに対する電極によって独立して調節することができ、したがってＤＮＡ分子の３’末端は、３’保護ｄＮＴＰを付加するためにポリメラーゼまたはターミナルトランスフェラーゼ酵素とともに３’保護ｄＮＴＰの流れを収容する流れチャンバ内へ、ナノポアを通って保持チャンバから順方向に引っ張ることができ、またはナノポアが酵素を排除する保持チャンバ内に保持することができ、したがってｄＮＴＰは付加されない。たとえば、図１２〜１６ならびに図１８および図１９の表示を参照されたい。他の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｅｎｔｓ）では、以下でより詳細に記載するように、トポイソメラーゼ（ｔｏｐｉｓｏｍｅｒａｓｅ）を使用して、５’末端（３’末端が取り付けられている）への付加によって一本鎖ＤＮＡが構築される。各ＤＮＡ分子が各周期に関与するか否かを制御することによって、たとえば次のように、各ＤＮＡ分子の配列を精密に制御することができる。
【００３７】
【表２】
2020502494.tif 000004
流れA=3'保護dATP
流れC=3'保護dCTP
【００３８】
この概略図におけるナノポア１およびナノポア２は、異なるＤＮＡ鎖に関連しており、これらナノポアの位置（流れチャンバの中または外）は、別個に制御可能である。ＤＮＡは、保持チャンバ内の特有の酵素によって、または酵素、化学、光触媒、もしくは他の手段によって脱保護を提供するように流れチャンバ内の流れを変化させることによって、脱保護することができる。一実施形態では、デブロック剤は、流れＡおよび流れＣの周期間、たとえば流れチャンバがバッファーで一掃されるときに流れ、したがってデブロック剤は、ヌクレオチド構築ブロックを脱保護しない。他の実施形態では、脱保護剤は、ナノポアを介して流れチャンバへ渡るには大きすぎる。
【００３９】
上記の例の最終結果では、ナノポア１ではＡおよびＣがＤＮＡに付加され、ナノポア２ではＣおよびＣがＤＮＡに付加されるはずである。
【００４０】
別の実施形態では、チャンバ構成は類似しているが、二本鎖ＤＮＡがナノポア近傍で表面に繋がれており、たとえば部位特異的リコンビナーゼ、すなわち部位特異的再結合配列として知られている配列セグメント内で核酸の二本鎖の少なくとも１つの鎖を自発的に認識および開裂する酵素を使用して、たとえば後述するようにトポイソメラーゼが充填されたオリゴヌクレオチドを使用して、たとえばそれぞれバイナリコードに対応する２つ以上のタイプのオリゴヌクレオチド断片が順次付加される。
【００４１】
特定の実施形態では、合成後、帯電ポリマー、たとえばＤＮＡを凝集状態で保持することが望ましいことがある。これには次のようにいくつかの理由がある。
・  ポリマーは、この形態でより安定しているはずである。
・  ポリマーを凝集することで、密集を抑え、小さい体積内でより長いポリマーの使用を可能にする。
・  整然とした凝集により、ポリマーが結び目またはもつれを形成する可能性を低減させることができる。
・  チャンバのいずれかが相互接続されている場合、電流が印加されたときに通るはずの孔とは異なる孔を通るほどポリマーが長くならないようにするのに役立つ。
・  凝集は、電気化学がポリマーを損傷しうる電極からポリマーを離しておくのに役立つ。
人間の細胞は、約１０ミクロンであるが、ＤＮＡの８０億の塩基対を収容する。引き伸ばすと、長さ１メートルを超えるはずである。ＤＮＡは、ヒストンタンパク質の周りに巻き付けられているため、細胞の中に収まる。特定の実施形態では、ヒストンまたは類似のタンパク質が、本発明のナノチップ内に類似の機能を提供する。いくつかの実施形態では、ナノチップの内面はわずかに正に帯電しており、したがって帯電ポリマー、たとえばＤＮＡは、それらに弱く付着する傾向がある。
【００４２】
特定の実施形態では、荷電ポリマー、たとえば一本または二本鎖ＤＮＡは、ナノポア近傍で表面に結合される。これは、様々な形で実現することができる。概して、ポリマーは、ポリマーを比較的大型の構造［たとえば、ナノポアを通り抜けるには大きすぎる直径、たとえば１０ｎｍ超、たとえば約２０〜５０ｎｍを有するビーズ、タンパク質、またはＤＮＡオリガミ構造（後述）］に取り付け、電流を使用して荷電ポリマーをナノポアに通し、大型構造に対して遠位のポリマーの末端を、ナノポアに近接している表面、たとえばポリマー鎖の遠位末端に取り付けられたリンカー群を受け入れるように修正された表面に繋ぎ、それによってポリマー鎖を取り付け、大型構造を開裂することによって、ナノポアに局所化される。
【００４３】
大型構造に対して遠位のポリマーの末端をナノポアに近接している表面に繋ぐ工程は、様々な形で実現することができる。一実施形態では、ポリマーは一本鎖ＤＮＡであり、この一本鎖ＤＮＡの一部に対して相補形のＤＮＡ鎖（約５０ｂｐ）が事前に取り付けられており、したがって一本鎖ＤＮＡおよび事前に取り付けられたＤＮＡ鎖は、塩基対合を介してつなぎ合わせることができる。対合が十分に強い場合、操作された場合でもＤＮＡを繋いだままにするのに十分である。この取付け方法の利点は、所望される場合、ＤＮＡの長期貯蔵のために、ＤＮＡをナノポアチップから除去することが可能になることである。別法として、コンジュゲーションケミストリー、たとえば、以下の実施例１に記載するストレプトアビジン−ビオチンコンジュゲーション、もしくは「クリック」ケミストリー［参照により本明細書に組み込まれている、Kolb, et al. Angew. Chem. Int. Ed. (2001)40: 2004-2021参照］を使用し、かつ／または酵素的結合を使用して、たとえばオリゴを遠位面に共有結合によって事前に取り付け、次いでＤＮＡリガーゼを使用してこれらを接続することによって、鎖は表面に共有結合によって取り付けられる。
【００４４】
鎖の遠位末端がナノポアに近接して表面に取り付けられた後、たとえば大型構造付近の制限部位で開裂するエンドヌクレアーゼを使用して、大型構造が開裂される。
【００４５】
大型構造は、ビーズ、大型分子、たとえばＤＮＡ鎖に可逆的に結合されたタンパク質、またはＤＮＡオリガミ構造とすることができる。ＤＮＡオリガミは、３次元のＤＮＡ構造を作製するために、塩基対合の使用を伴う。ＤＮＡオリガミ技法は、概して、参照により本明細書に組み込まれている、Bell, et al, Nano Lett. (2012)12: 512-517に記載されている。たとえば、本発明では、ＤＮＡオリガミを使用して、単一のＤＮＡ分子をナノポアに近接して表面に取り付けることができる。一実施形態では、構造は、たとえば各辺が約２０ｎｍの「ハニカムキューブ」である。これにより、ＤＮＡのこの部分がナノポアを通るのを防止する（添付書類のとおり）。ＤＮＡの長い鎖（一本または二本鎖）が、オリガミ構造に取り付けられる。ＤＮＡ鎖は、オリガミキューブがナノポアに当たり、さらなる進行がブロックされるまで、ナノポアを通って進む。次いで電流が遮断され、鎖はナノポアに近接して表面に取り付けられる。
【００４６】
別の実施形態では、オリガミ構造を有する帯電ポリマー、たとえばＤＮＡは、３つのチャンバ構成の中央のチャンバ内にある。オリガミは、ＤＮＡが他の２つのチャンバ（または２チャンバの例では他の１つのチャンバ）に完全に入らないようにする。したがって、この例では、ポリマーを表面に繋ぐ必要はない。これにより、ポリマーが結び目をつくるリスクが低減され、ポリマーの一方の末端を表面に結合し、他方の末端で大型部分を開裂する工程の必要が回避される。オリガミを有するチャンバの体積は、ポリマーが比較的孔付近に留まるように、実用的に可能な限り小さく抑えるべきであり、それにより電流が印加されたときに迅速に転座することを確実にするのを助ける。ポリマーのオリガミ部分を収容している中央のチャンバは、他の中央のチャンバと相互接続することができないが（そうでなければ、異なるポリマーが混ざり合うことになる）、他のチャンバ（または３チャンバの例では数組のチャンバ）は相互接続することができることに留意されたい。ＤＮＡがそのチャンバへ動かされたとき、ポリマーは必然的に孔付近に位置する（実際にはその一部は孔の中に位置する）ため、これらの他のチャンバは、所望される場合、より大きい体積を有することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、デバイスは、３つの直列のチャンバを備えており、付加チャンバは、流れを可能にするように連続しており、共通の電極を有するが、「脱保護」チャンバは、ナノポアを通る流れを除いて流体的に隔離されており、固有の電極を有する。
【００４８】
他の実施形態では、ＤＮＡまたは他の荷電ポリマーは、繋がれておらず、チャンバ内の電極の制御下で合成チャンバと脱保護チャンバとの間で動かすことができ、ポリメラーゼおよび脱保護剤は、チャンバを接続しているナノポアを通過するには大きすぎ、かつ／またはチャンバ内の表面に繋がれるため、チャンバ間の運動から制限される。たとえば、図１〜９および図１６〜１７を参照されたい。
【００４９】
荷電ポリマーをナノポアに通すために必要とされる電流は、たとえば、ポリマーの性質、ナノポアのサイズ、ナノポアを収容している膜の材料、および塩濃度に依存し、したがって必要に応じて特定のシステムに最適化される。本明細書の実施例で使用されるＤＮＡの場合、電圧および電流の例は、たとえば５０〜５００ｍＶ、典型的には１００〜２００ｍＶ、および１〜１０ｎＡ、たとえば約４ｎＡであり、塩濃度は１００ｍＭ〜１Ｍ程度になるはずである。
【００５０】
ナノポアを通る荷電ポリマー、たとえばＤＮＡの運動は、通常は非常に急速であり、たとえば１塩基当たり１〜５μｓ、したがって毎秒百万塩基程度（周波数の命名法を採用した場合、１ＭＨｚ）であり、これはシステム内の雑音から分離した正確な読取りを得るのが難しい。現在の方法を使用すると、（ｉ）測定可能な特徴的な変化をもたらすために、配列内でヌクレオチドをたとえば約１００回連続して繰り返す必要があり、または（ｉｉ）アルファ溶血素（αＨＬ）もしくはマイコバクテリウム・スメグマチス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）ポリンＡ（ＭｓｐＡ）などのタンパク質孔を使用することで、塩基がポリマーを通るときに複数の読取りの可能性を伴う比較的長い孔が提供され、これらはいくつかの場合、一度に１塩基ずつ孔を通ってＤＮＡの制御された供給を提供するように適合させることができ、いくつかの場合、エキソヌクレアーゼを使用して通過するときに各塩基を開裂する。たとえば、様々な手法が可能である。
・  たとえば電圧が印加されると粘性がより大きくなる電気粘性流体を含む媒体を使用して、ポリマーの速度を約１ＭＨｚから約１００〜２００Ｈｚへ遅くし、それによってナノポアまたはプラズモン流体システムを通るポリマーの速度を遅くし、媒体の粘性は、光または分子モータもしくはラチェットによって制御することができる。
・  ポリマー、たとえば一本鎖ＤＮＡ内に配列を提供し、それにより大型二次構造、たとえば「ヘアピン」、「ハンマーヘッド」、または「ダンベル」構成を形成し、これはナノポアを通り抜けるには線形にしなければならず、それによって情報がより低密度になり、より長い持続時間を有する信号が提供される。
・  分子を次の配列枠へ引き込むための短時間の直流電流バーストと組み合わせて、たとえば急速に交番する電流を使用することによって、同じ配列の多くの読取りを提供し、配列全体を複数回読み取ることによって、または複数の同一の配列を並行して読み取ることによって、同じ配列枠の多くの読取りを可能にし、いずれの場合も、読取りを集めてコンセンサスリード（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｒｅａｄ）を提供し、信号を増幅する。
・  電流の流れまたは抵抗の変化を直接測定するのではなく、モノマー（たとえば、ヌクレオチド）がナノポアを通過するときにキャパシタンスの変化によって誘起される高周波信号におけるインピーダンス変化を測定する。
・  たとえば、サイズの差がより大きい、もしくは異なる信号を与えるようにその他の方法で修正された非天然塩基を使用することによって、または「ヘアピン」、「ハンマーヘッド」、もしくは「ダンベル」構成などのより大きい二次構造をＤＮＡ内に形成し、これらのサイズがより大きいために拡大された信号を提供することによって、異なる塩基間の電流、抵抗、またはキャパシタンスの差を拡大する。
・  たとえば内容が参照により本明細書に組み込まれている、Nam, et al., "Graphene Nanopore with a Self-Integrated Optical Antenna", Nano Lett. (2014)14: 5584-5589に記載されているように、光学読取りシステムを使用し、たとえば標準的なイオン電流測定を補完または交換するために光変換器（または光信号増強器）として作用する一体型の光アンテナをナノポアに近接して使用する。いくつかの実施形態では、モノマー、たとえばＤＮＡヌクレオチドは、蛍光性染料によって標識が付けられ、したがってそれぞれ異なるモノマーが、ナノポアおよびその光アンテナの接合部を通過するとき、署名強度で蛍光を発する。いくつかの実施形態では、たとえば内容がそれぞれ参照により本明細書に組み込まれている、McNally et al., "Optical recognition of converted DNA nucleotides for single molecule DNA sequencing using nanopore arrays", Nano Lett. (2010)10(6): 2237-2244、およびMeller A., "Towards Optical DNA Sequencing Using Nanopore Arrays", J Biomol Tech. (2011) 22(Suppl): S8-S9に記載されているように、ポリマーがナノポアを高速で通過するとき、固体ナノポアは蛍光性の標識を剥ぎ取り、一連の検出可能な光子バーストをもたらす。
【００５１】
一実施形態では、荷電ポリマーは核酸、たとえば一本鎖ＤＮＡであり、配列は二次構造を提供する。参照により本明細書に組み込まれている、Bell, et al., Nat Nanotechnol.(2016)11(7):645-51は、イムノアッセイにおいて抗原に標識を付けるために、固体ナノポア形式で検出可能なダンベル構成の比較的短い配列を使用することについて記載している。Bell, et alにおいて使用されるナノポアは比較的大きく、したがってダンベル構造全体が孔を通過することができたが、ダンベル構成の直径より小さいナノポアを使用すると、ＤＮＡは「アンジップ（ｕｎｚｉｐ）」され、線形になる。より複雑な構成を使用することもでき、たとえば各ビットが、ｔＲＮＡに類似の配列に対応する［たとえば、参照により本明細書に組み込まれている、Henley, et al. Nano Lett. (2016)16: 138-144を参照されたい］。したがって、本発明は、少なくとも２つのタイプの二次構造を有する荷電ポリマー、たとえば一本鎖ＤＮＡを提供し、二次構造は、データを符号化する（たとえば、バイナリデータ、１つの二次構造タイプが１であり、第２の二次構造タイプが０である）。他の実施形態では、二次構造を使用して、ＤＮＡのナノポア通過を遅くし、または配列内に区切りを提供して、配列の読取りを容易にする。
【００５２】
別の実施形態では、本発明は、一連の少なくとも２つの異なるＤＮＡモチーフを含むＤＮＡ分子を利用し、各モチーフは、特定のリガンド、たとえば二本鎖ＤＮＡの場合は遺伝子調節タンパク質に、または一本鎖ＤＮＡの場合はｔＲＮＡに、特に結合されており、少なくとも２つの異なるＤＮＡモチーフは、たとえばバイナリコードで情報を符号化し、たとえば１つのモチーフは１であり、第２のモチーフは０であり、リガンドは、ＤＮＡがナノポアを通過するときのナノポアの両端間の信号差（たとえば、電流またはキャパシタンスの変化）を拡大する。
【００５３】
上記で論じたように、異なるモノマーがナノポアを通過するとき、これらは主にナノポアを物理的に閉塞し、ナノポアのコンダクタンスを変化させることによって、ナノポアを通る電流の流れに影響を与える。既存のナノポアシステムでは、この電流の変化が直接測定される。現在の読取りシステムに伴う問題は、システム内にかなりの雑音が存在し、ＤＮＡの場合、たとえば異なるヌクレオチドユニットがナノポアを通過するときに電流の揺らぎを測定するとき、異なるモノマー間、たとえば異なる塩基間の差を正確に検出するには、百分の１秒程度の比較的長い統合時間が必要とされる。最近、細胞および生物学的システムを研究するために、インピーダンスおよびキャパシタンスの変化は、塩および生体分子との複雑な相互作用の可能性に関わらず有用となりうることが示されている。たとえば、Laborde, et al. Nat Nano. (2015)10(9):791-5（参照により本明細書に組み込まれている）は、高周波インピーダンス分光法を使用して、生理食塩条件下のキャパシタンスのわずかな変化を検出し、デバイ限界（Ｄｅｂｙｅ  ｌｉｍｉｔ）を越えて極微粒子および生細胞を撮像することができることを実証している。
【００５４】
したがって、本発明の一実施形態では、本発明者らは、たとえば電流分散を直接測定するのではなく、容量分散を測定し、モノマー（たとえば、ヌクレオチド）がナノポアを通過するときにキャパシタンスの変化によって誘起される無線周波信号の位相変化を測定することによって、荷電ポリマーの配列を識別する。
【００５５】
簡単に言うと、キャパシタンスは、１つの電気導体と別の電気導体との間に間隙があるあらゆる回路内に存在する。電流はキャパシタンスとともに直接変動するが、キャパシタンスと同時に変動しない。たとえば、交流電流を有する容量性回路における経時的な電流および電圧のプロットを作成する場合、電流および電圧がどちらもそれぞれ正弦波を形成するが、これらの波は位相がずれていることが見られるはずである。電流の変化があるとき、キャパシタンスの変化もあり、信号の位相の変化に反映される。無線周波交流電流は、信号に固定の周波数および振幅を提供するが、信号の位相は回路のキャパシタンスとともに変動する。本発明者らのシステムでは、交流電流ではなく脈動直流電流を使用し（すなわち、電圧が２つの値同士の間で交番するが、電圧は「０」の線を交差せず、したがって極性は維持され、一方の電極は正のままであり、他方の電極は負のままである）、したがってナノポアを通って（ＤＮＡの場合は正の電極の方へ）荷電ポリマーを引き込むことができる。ナノポア内に何もないとき、キャパシタンスは１つの値を有し、この値はポリマーの異なるモノマーがナノポアを通過すると変化する。好適な周波数範囲は、無線周波数範囲内であり、たとえば１ＭＨｚ〜１ＧＨｚ、たとえば５０〜２００ＭＨｚ、たとえば約１００ＭＨｚであり、たとえば媒体の著しい誘電体加熱を引き起こしうるより高いマイクロ波周波数を下回る。干渉の可能性を低減させるために、異なるナノポアに異なる周波数を印加することができ、その結果、単一の無線周波入力ラインによって、複数のナノポアを同時に測定することができる。
【００５６】
高い周波数におけるインピーダンス変化（たとえば、キャパシタンス変化による）を測定することで、電子測定回路内に固有の１／ｆ雑音または「ピンク」ノイズの影響が低減されるため、特定の時間内で利用可能な信号対雑音比が増大する。所与の時間内に多くの測定を行うとき、高周波信号を使用することで、信号対雑音比が高くなり、環境またはデバイスの変動および揺らぎによるインピーダンス変化から容易に区別されるより安定した信号が提供される。
【００５７】
これらの原理を本発明に適用することで、本発明は、一実施形態では、モノマー（たとえば、ヌクレオチド）がナノポアを通過するときにキャパシタンスの変化によって誘起される高周波信号におけるインピーダンス変化を測定する方法、たとえば少なくとも２つの異なるタイプのモノマーを含む荷電ポリマー、たとえばＤＮＡ分子のモノマー配列を読み取る方法を提供し、この方法は、たとえば１ＭＨｚ〜１ＧＨｚ、たとえば５０〜２００ＭＨｚ、たとえば約１００ＭＨｚの周波数で、無線周波脈動直流電流をナノポアの両端間に印加することを含み、脈動直流電流は、荷電ポリマーをナノポアに引き込み、モノマー配列は、荷電ポリマーがナノポアを通るときにナノポアにおける容量分散を測定することによって読み取られる。
【００５８】
たとえば、図４８Ａ、図４８Ｂ、図４８Ｃを参照すると、ナノポアに基づくセル４８００が示されており、セル４８００は、上部（または頂部）チャンバ４８０２および下部（または底部）チャンバ４８０４と、２つのチャンバ４８０２、４８０４を分離する膜４８０６とを有する。膜は、本明細書に上述した材料から作製される。またセル内には、膜を通ってナノポア４８０８（またはナノメートルサイズの孔）が存在し、ナノポア４８０８は、本明細書に記載するような形状および寸法を有しており、チャンバ４８０２、４８０４間の流体連通を可能にする。
【００５９】
セル４８００の内側には、本明細書に上述したようなポリマー分子、たとえば一本鎖ＤＮＡ分子４８１０（またはｓｓＤＮＡ）が位置する。この例では、ＤＮＡ４８１０は、３つのユニットまたは塩基、すなわち上部塩基４８１２、中央塩基４８１４、および下部塩基４８１６を有する。ＤＮＡ４８１０内の各塩基４８１２〜４８１６、または１群の塩基を、本明細書にやはり論じるようにデータを表現または記憶するために使用される情報の「ビット」と呼ぶことができる。所望される場合、本明細書に上記で論じたように、任意の他のポリマーまたはＤＮＡ分子（一本または二本鎖）を使用することもできる。
【００６０】
セル４８００のチャンバ４８０２、４８０４は、本明細書に記載するような流体で充填することができ、それによりＤＮＡ４８１０がチャンバ４８０２、４８０４間を浮遊して動くことを可能にする。セル４８００はまた、１対の電極４８１８、４８２０、すなわち入力電圧Ｖｉｎに接続された上部（または頂部）電極４８１８と、接地（またはＧＮＤもしくは０ボルト）に接続された下部（または底部）電極４８２０とを有する。いくつかの実施形態では、下部電極４８２０はまた、ゼロ以外のＤＣ電圧に接続することができるが、それでもなお、ＡＣ電圧（以下でさらに論じる）を通すキャパシタンス値を有する電極に接続されたＡＣ結合キャパシタの使用によって、ＡＣ（またはｒｆもしくは無線周波）「接地」とすることができる。電極４８１８、４８２０に印加される電圧が、セル４８００内のＤＮＡ４８１０の運動を決定する。特に、ＤＮＡ鎖４８１０が電界または電圧または電荷の差の存在下にあるとき、ＤＮＡ４８１０は、図１〜５に関連して前述したように、ＤＮＡ分子４８１０が正味の負の電荷を有するため、正の電荷または電圧に引き付けられる。
【００６１】
この場合、頂部電極４８１８が底部電極４８２０（ここでは接地または０ボルトで示されている）に対して正の電圧を有するとき、ＤＮＡ４８１０は、ナノポア４８０８（下部チャンバ４８０４内にあった場合）を通って頂部電極４８１８の方へ進み、上部チャンバ４８０２に入る。逆に、頂部電極４８１８が底部電極４８２０に対して負の電圧を有するとき、ＤＮＡ４８１０はナノポア４８０８を通って底部電極４８１８の方へ進み、下部チャンバ４８０４に入る。図４８Ａ、図４８Ｂ、および図４８Ｃは、ナノポア４８０８を通って上部チャンバ４８０２から下部チャンバ４８０４へ動いているＤＮＡ４８１０を示す。
【００６２】
図４８Ａ〜４８Ｃを参照すると、セル４８００（またはナノポアおよびＤＮＡシステム）は、並列接続されたキャパシタＣ１および抵抗器Ｒ１として示される等価回路図４８３０として電気的にモデル化することができる。特に、頂部電極４８１８は、その局所的な環境によって設定される接地へのキャパシタンスＣ１および抵抗Ｒ１を受け、キャパシタＣ１は、セル４８００のキャパシタンスを表し、２つの電極４８１８、４８２０（すなわち、キャパシタ板）の特性ならびに２つの電極４８１８、４８２０間の誘電体材料の特性によって決定され、これは少なくとも、セル４８００内の流体およびナノポア４８０８を有する膜４８０６によって画定される。抵抗器Ｒ１は、セル４８００に関連するＤＣ抵抗を表し、これは少なくとも、２つの電極間のＤＣ漏れ電流として見られる上述したセルの誘電体材料に関連する損失によって画定される。
【００６３】
ＤＮＡ４８１０がナノポア４８０８を通過するとき、セルのキャパシタンスおよび抵抗（またはセルのインピーダンス、Ｚｃｅｌｌ）はどちらも変化する。異なるＤＮＡ塩基は、異なるサイズを有し、したがってキャパシタンスおよび抵抗に対して異なる作用を有し、その結果、図４８Ａ〜４８Ｃに示すように異なる等価回路モデルが得られる。特に、図４８Ａで、ＤＮＡ４８１０はナノポア４８０８の外側にあり、その結果、１組の値Ｃ１、Ｒ１（またはＺｃｅｌｌ１）が得られる。図４８Ｂで、ＤＮＡ４８１０の塩基４８１４がナノポア内にあり、その結果、別の組の値Ｃ２、Ｒ２（またはＺｃｅｌｌ２）が得られる。同様に、図４８Ｃで、ＤＮＡ４８１０の塩基４８１２がナノポア内にあり、その結果、別の組の値Ｃ３、Ｒ３（またはＺｃｅｌｌ３）が得られる。
【００６４】
図４９Ａおよび図４９Ｂを参照すると、セル４８００（ナノポアおよびＤＮＡシステム）のキャパシタンスＣおよび抵抗Ｒを、インダクタＬと組み合わせて、回路４９００（図４９Ａ）によって示すように、グラフ４９５２によって示す振幅周波数応答およびグラフ４９５４によって示す位相周波数応答を有する「インダクタ−セル」または「セル−インダクタ」ＲＬＣ共振回路または共振器またはフィルタ（または帯域阻止、もしくはノッチ、もしくは帯域除去フィルタ）を作製することができる。回路４９００の中心または共振周波数ｆｒｅｓは、次の等式によって与えられる。
ωｒｅｓ＝２πｆｒｅｓ＝Ｓｑｒｔ（１／ＬＣ）×Ｓｑｒｔ（１−（Ｌ／Ｃ）／Ｒ２）  等式１
上式で、ＣおよびＲは、それぞれ所与の時間におけるセルのキャパシタンスおよび抵抗であり、Ｌは、インダクタ（セル内のＤＮＡの位置に対する定数）の値である。また、インダクタＬと直列に、インダクタコイル巻線のＤＣ抵抗を示す同等のコイル抵抗器（図示せず）が位置することもできる。しかし、コイル抵抗が無視できるほどである場合、回路図または共振周波数ｆｒｅｓの等式に示す必要はない。
【００６５】
セル抵抗Ｒの値が大きいとき、等式１は次のようになる。
ωｒｅｓ＝２πｆｒｅｓ＝Ｓｑｒｔ（１／ＬＣ）  等式２
【００６６】
図４９Ｂを参照すると、共振回路４９００の振幅応答４９５２（ＣおよびＲの所与の値に対する）は、共振周波数ｆｒｅｓで最大減衰（最小インピーダンス）を有し、共振周波数ｆｒｅｓ前後の狭い周波数帯域（または阻止帯域）Δｆｓｔｐにおいて急勾配の振幅減衰応答を有し、これは、振幅応答（Ｖｏｕｔ／Ｖｉｎ）が標準閾値、たとえば３ｄＢ（または２０Ｌｏｇ［ＳＱＲＴ（２）］）を下回る周波数範囲である。すべての他の周波数の場合、出力振幅は実質上一定であり、減衰しない。共振回路４９００の対応する位相シフト応答曲線４９５４は、共振周波数ｆｒｅｓで４５度の位相シフトを有し（リアクタンス、つまり複素インピーダンスの虚数部がゼロに等しいとき）、共振周波数ｆｒｅｓの両側の狭い阻止帯域Δｆｓｔｐにおいて急勾配の位相応答を有し、したがって、帯域Δｆｓｔｐの外側にあるｆｒｅｓを上回る周波数で、位相シフトは１８０度またはその付近にあり、帯域Δｆｓｔｐの外側にあるｆｒｅｓを下回る周波数で、位相シフトは０度またはその付近にある。それ以外の場合、すべての他の周波数において、位相応答出力は実質上一定であり、シフトしない。
【００６７】
図５０を参照すると、共振回路（またはフィルタ）の１群の共振周波数応答振幅曲線５００２および位相曲線５００３が示されており、これらの曲線は、振幅応答曲線５０１０〜５０１８および対応する位相応答曲線５０２０〜５０２８によって示すように、ＤＮＡ（またはその長さに沿って可変のサイズを有する他のポリマーもしくは分子）がナノポアを通過し、接地（たとえば、０ボルト）に対して測定されるキャパシタンス（またはインピーダンス）を変化させ、それによって共振周波数ｆｒｅｓを変化させることに応答している。特に、上記の等式２によって示すように、接地に対して測定されるキャパシタンスを増大させることで、共振周波数ｆｒｅｓが減少する。また、ＤＮＡ「塩基」サイズを増大させる（ナノポアをより閉塞する）ことで、セルのキャパシタンス（ＤＮＡの誘電率に依存）を増大させることができ、それにより共振周波数ｆｒｅｓが減少するはずである。逆に、ＤＮＡ塩基サイズを減少させる（ナノポアをそれほど閉塞しない）ことで、セルのキャパシタンス（ＤＮＡの誘電率に依存）を減少させることができ、それにより共振周波数ｆｒｅｓが増大するはずである。標準的なＤＮＡ塩基（Ｇ、Ｃ、Ａ、Ｔ）を使用すると、サイズ順序はＧ（最大）、Ａ、Ｔ、Ｃ（最小）になるはずである。したがって、ＤＮＡがナノポア内にあるとき、ＤＮＡの誘電率がＤＮＡ塩基とともに適当に変化すると考えると、ｆｒｅｓは、最大の塩基、たとえば塩基Ｇがナノポア内にあるときに最低になり、ｆｒｅｓは、最小の塩基、たとえば塩基Ｃがナノポア内にあるときに最高になるはずである。また、ナノポアが開いている（閉塞されていない）とき、すなわちＤＮＡまたはポリマーがナノポア内にないとき、ｆｒｅｓは最高の周波数になるはずである。この共振周波数の範囲または帯域は、図５０にΔｆｒｅｓとして示されている。また、図５０に示す振幅に対する共振器応答曲線５０１０〜５０１８および位相に対する共振器応答曲線５０２０〜５０２８に関して、共振器の全体的な帯域幅（振幅および位相が共振器による影響を実質的に受ける）は、図５０にΔｆＢＷとして示されている。
【００６８】
加えて、所与のセル−インダクタ共振回路（または共振器もしくはフィルタ）に対する全体的な共振周波数帯域Δｆｒｅｓは、インピーダンスに影響を与えるすべての他のセル条件が固定されたままであると考えると、ナノポアが開いている（またはポリマーによって閉塞されていない）ときに最大共振周波数ｆｒｅｓ−ｍａｘを有するはずであり、ナノポアが閉じている（またはポリマーによって閉塞されている）ときに最小共振周波数ｆｒｅｓ−ｍｉｎを有するはずであり、セルの共振周波数ｆｒｅｓは、所与の時間におけるナノポア内のポリマーのサイズによって変動（または調節または変更）され、したがってナノポア−ポリマー共振器（またはＮＰＲ）と呼ぶことができる。また、共振器の全体的な帯域幅ΔｆＢＷ（振幅および位相が共振器による影響を実質的に受ける）も、共振周波数帯域Δｆｒｅｓに基づいて同様に決定されるはずである。
【００６９】
共振器に印加されるＡＣ電圧が存在し、固定周波数ｆｐｒｏｂｅにおいて、たとえば中心（または共振）周波数ｆｒｅｓのうちの１つに必ずしも位置合わせされていない垂直の破線５００４として示されているＤＮＡ塩基に対する共振周波数範囲の中心付近において、共振器の出力電圧信号（Ｖｏｕｔ）が観察（または監視）されるとき、共振器は、ナノポアを通過する特有のＤＮＡ塩基（サイズ）に応じた、その周波数ｆｐｒｏｂｅにおける４つの異なる可能な出力信号（または振幅減衰もしくは位相シフトの量）およびＤＮＡがナノポア内にない（「開放孔」条件にある）ときの第５の出力電圧状態を提供する。これらの５つの出力信号は、１群の応答曲線５００２、５００３が監視周波数ｆｐｒｏｂｅに対応する線５００４と交差する場所、すなわち振幅Ｖ１〜Ｖ５および位相Ｐｈ１〜Ｐｈ５によって示される。
【００７０】
別法として、たとえばｆｐｒｏｂｅより低い周波数である、たとえば垂直の破線５００６として示されている最低の周波数応答曲線５０１０の共振周波数付近の、異なる周波数ｆｐｒｏｂｅ２において、出力電圧が監視される場合、周波数ｆｐｒｏｂｅ２における出力電圧は、５つの振幅出力電圧Ｖ６〜Ｖ１０（ｆｐｒｏｂｅで見られる出力電圧Ｖ１〜Ｖ５とは異なる）、および５つの出力位相シフトＰｈ６〜Ｐｈ１０（ｆｐｒｏｂｅで見られる出力電圧Ｐｈ１〜Ｐｈ５とは異なる）になるはずである。特に、これらの異なる５つの出力信号は、１群の応答曲線５００２、５００４が監視周波数ｆｐｒｏｂｅ２に対応する線５００６と交差する場所、すなわち振幅Ｖ６〜Ｖ１０および位相Ｐｈ６〜Ｐｈ１０によって示される。Ｖ１〜Ｖ１０およびＰｈ１〜Ｐｈ１０の値は任意の名称であり、識別または標識付けの目的のみで使用される。プローブまたは監視周波数ｆｐｒｏｂｅ、ｆｐｒｏｂｅ２に対する値または位置は、後述するように、所望の応答値に基づいて設定することができる。以下に示すように、ポリマーがナノポア内にあるときに見られる共振周波数の範囲内のプローブまたは監視周波数に対する値を使用することで、出力値の有用な範囲を提供することができる。所望される場合、所望される機能および性能上の要件を満たすことを条件として、他の測定またはプローブ周波数を使用することもできる。
【００７１】
特に、４つの塩基がサイズ順（すなわち、Ｇ、Ａ、Ｔ、Ｃ）にナノポアを順次通過する場合、最大の塩基（たとえば、塩基Ｇ）がナノポアを通過するとき、共振周波数ｆｒｅｓは最低になり（キャパシタンスは最高）、対応する応答が、それぞれ（左端の）振幅曲線５０１０および位相曲線５０２０によって示されている。その場合、曲線５０１０、５０２０が線５００４と交差する周波数ｆｐｒｏｂｅにおける出力電圧は、それぞれ出力電圧Ｖ２および出力位相Ｐｈ１に対応するはずである。別法として、出力電圧が監視周波数ｆｐｒｏｂｅ２で監視される場合、曲線５０１０、５０２０が線５００６と交差する周波数ｆｐｒｏｂｅ２における出力電圧は、それぞれ出力電圧Ｖ１０および出力位相Ｐｈ６に対応するはずである。
【００７２】
同様に、次に小さい塩基（たとえば、塩基Ａ）がナノポアを通過するとき、共振周波数ｆｒｅｓは前の塩基のものより少し高く、応答が、それぞれ振幅曲線５０１２および位相曲線５０２２によって示されている。その場合、曲線５０１２、５０２２が線５００４と交差する周波数ｆｐｒｏｂｅにおける出力電圧は、それぞれ出力電圧Ｖ５および出力位相Ｐｈ２に対応するはずである。別法として、出力電圧が監視周波数ｆｐｒｏｂｅ２で監視される場合、曲線５０１２、５０２２が線５００６と交差する周波数ｆｐｒｏｂｅ２における出力電圧は、それぞれ出力電圧Ｖ９および出力位相Ｐｈ７に対応するはずである。
【００７３】
同様に、次に小さい塩基（たとえば、塩基Ｔ）がナノポアを通過するとき、共振周波数ｆｒｅｓは前の塩基のものより少し高く、応答が、それぞれ振幅曲線５０１４および位相曲線５０２４によって示されている。その場合、曲線５０１４、５０２４が線５００４と交差する周波数ｆｐｒｏｂｅにおける出力電圧は、それぞれ出力電圧Ｖ４および出力位相Ｐｈ３に対応するはずである。別法として、出力電圧が監視周波数ｆｐｒｏｂｅ２で監視される場合、曲線５０１４、５０２４が線５００６と交差する周波数ｆｐｒｏｂｅ２における出力電圧は、それぞれ出力電圧Ｖ８および出力位相Ｐｈ８に対応するはずである。
【００７４】
最小の塩基（たとえば、塩基Ｃ）がナノポアを通過するとき、共振周波数ｆｒｅｓは前の塩基のものより少し高く、応答が、それぞれ振幅曲線５０１６および位相曲線５０２６によって示されている。その場合、曲線５０１６、５０２６が線５００４と交差する周波数ｆｐｒｏｂｅにおける出力電圧は、それぞれ出力電圧Ｖ３および出力位相Ｐｈ４に対応するはずである。別法として、出力電圧が監視周波数ｆｐｒｏｂｅ２で監視される場合、曲線５０１６、５０２６が線５００６と交差する周波数ｆｐｒｏｂｅ２における出力電圧は、それぞれ出力電圧Ｖ７および出力位相Ｐｈ９に対応するはずである。
【００７５】
最後に、ナノポア内にＤＮＡがないとき、共振周波数ｆｒｅｓは最高になり（キャパシタンスは最低）、応答が、それぞれ振幅および位相曲線５０１８、５０２８によって示されている。その場合、曲線５０１８、５０２８が線５００４と交差する周波数ｆｐｒｏｂｅにおける出力電圧は、それぞれ出力電圧Ｖ１および出力位相Ｐｈ５に対応するはずである。別法として、出力電圧が監視周波数ｆｐｒｏｂｅ２で監視される場合、曲線５０１８、５０２８が線５００６と交差する周波数ｆｐｒｏｂｅ２における出力電圧は、それぞれ出力電圧Ｖ６および出力位相Ｐｈ１０に対応するはずである。
【００７６】
図５１を参照すると、固定のプローブ（または監視）周波数ｆｐｒｏｂｅにおいて測定される本開示の「インダクタ−セル」共振器または「容量性共振」ＤＮＡデータ読取り技法を介して、ＤＮＡ鎖４８１０内の２ビット（たとえば、２つの塩基）を使用してＤＮＡ内に記憶されているデータを読み取る本開示の実施形態によるＤＮＡ読取り時間配列５１００の概略的な例が示されている。ＤＮＡ読取り時間配列は、５つの列５１０２〜５１１０として示されている５つの時間セグメントまたはステージＴ１〜Ｔ５を有し、時間セグメント間の進行が、破線５１１１によって示されている。時間ステージＴ１〜Ｔ５のそれぞれに対して、その時間ステージに対するＤＮＡ４８１０（図４８）およびナノポア４８０８に対するその位置を示す画像が存在し、またそれぞれ時間ステージＴ１〜Ｔ５に対する振幅および位相応答曲線５１１２〜５１２０が、監視周波数ｆｐｒｏｂｅにおける応答曲線（図５０に示す１群の曲線からの曲線に対応する）の交点を示し、２つの出力値グラフ５１３０、５１３２が、各時間ステージＴ１〜Ｔ５の監視周波数ｆｐｒｏｂｅにおけるそれぞれ振幅および位相応答に対する対応する出力信号（たとえば、電圧値）を示す。グラフ５１３０、５１３２に対する値Ｖ１〜Ｖ５およびＰｈ１〜ＰＨ５は、そのパラメータに対する出力値を示す任意の電圧値とすることができ、適当な範囲を有し、本明細書に記載する機能を提供するように比例する。
【００７７】
図５１の例の５つの時間状態Ｔ１〜Ｔ５のそれぞれにおけるＤＮＡ４８１０の位置および運動に関して、時間ステージＴ１（５１０２）＝ナノポア内にＤＮＡなし（開放孔）、時間ステージＴ２（５１０４）＝ナノポア内に塩基Ａ、時間ステージＴ３（５１０６）＝ナノポア内に塩基Ｇ、時間ステージＴ４（５１０８）＝ナノポア内に塩基Ａ、および時間ステージＴ５（５１１０）＝ナノポア内にＤＮＡなし（開放孔）である。
【００７８】
図５０および図５１を参照すると、時間ステージＴ１から始まり、ＤＮＡ４８１０は孔４８０８の外側にあり、接地へのキャパシタンスは低く（本明細書に論じる）、共振周波数ｆｒｅｓは高く、監視周波数ｆｐｒｏｂｅにおいて、測定された振幅出力信号は高く、位相値は非常に低く（たとえば、約０度）、これは図５０に示す応答曲線５０１８、５０２８に対応し、曲線５０１８、５０２８が線５００４と交差するｆｐｒｏｂｅにおける出力値が、それぞれ出力電圧Ｖ１および出力位相Ｐｈ５に対応する。時間Ｔ２で、ＤＮＡ塩基４８１６（この例では、塩基Ａ）が孔４８０８に入り、接地へのキャパシタンスは増大し、共振周波数ｆｒｅｓはより低い中心周波数へシフトし、ｆｐｒｏｂｅにおいて、測定された振幅出力信号は低く、位相値は中間（たとえば、約９０度）であり、これは図５０に示す応答曲線５０１２、５０２２に対応し、曲線５０１２、５０２２が線５００４と交差するｆｐｒｏｂｅにおける出力値が、それぞれ出力電圧Ｖ５および出力位相Ｐｈ２に対応する。時間Ｔ３で、ＤＮＡ塩基４８１４（この例では、塩基Ｇ、最大の塩基）が孔４８０８に入り、接地へのキャパシタンスは極めて高く、共振周波数ｆｒｅｓはより低くシフトするが、ｆｐｒｏｂｅにおいて、振幅出力信号は中間であり、出力値は中の上（たとえば、約１３５度）であり、これは図５０に示す応答曲線５０１０、５０２０に対応し、曲線５０１０、５０２０が線５００４と交差するｆｐｒｏｂｅにおける出力値が、それぞれ出力電圧Ｖ２および出力位相Ｐｈ１に対応する。
【００７９】
時間Ｔ４で、ＤＮＡ塩基４８１２（この例では、塩基Ａ）が孔４８０８に入り（再び）、接地へのキャパシタンスは減少し（Ｔ３の値から）、共振周波数ｆｒｅｓは中心周波数へシフトし、ｆｐｒｏｂｅにおいて、測定された振幅出力信号は低く、位相値は中間（たとえば、約９０度）であり、これは図５０に示す応答曲線５０１２、５０２２に対応し、曲線５０１２、５０２２が線５００４と交差するｆｐｒｏｂｅにおける出力値が、それぞれ出力電圧Ｖ５および出力位相Ｐｈ２に対応する。時間Ｔ５で、ＤＮＡ４８１０は孔４８０８の外側にあり（再び）、接地へのキャパシタンスは低く、共振周波数ｆｒｅｓは高い周波数へシフトし（再び）、ｆｐｒｏｂｅにおいて、測定された振幅出力信号は高く、これは図５０に示す応答曲線５０１８、５０２８に対応し、曲線５０１８、５０２８が線５００４と交差するｆｐｒｏｂｅにおける出力値が、それぞれ出力電圧Ｖ１および出力位相Ｐｈ５に対応する。
【００８０】
図５２を参照すると、異なる固定のプローブ（または監視）周波数ｆｐｒｏｂｅ２を使用して、本開示の容量性共振ＤＮＡデータ読取り技法を介して、ＤＮＡ鎖内の２ビット（たとえば、２つの塩基）を使用してＤＮＡ内に記憶されているデータを読み取る時間配列（Ｔ１〜Ｔ５）の別の概略的な例５２００が示されている。この配列は、５つの列５２０２〜５２１０として示されている５つの時間セグメントまたはステージＴ１〜Ｔ５を有し、時間セグメント間の進行が、破線５２１１によって示されている。時間ステージＴ１〜Ｔ５のそれぞれに対して、その時間ステージに対するＤＮＡ４８１０（図４８）およびナノポア４８０８に対するその位置を示す画像が存在し、またそれぞれ時間ステージＴ１〜Ｔ５に対する振幅および位相応答曲線５２１２〜５２２０が、監視周波数ｆｐｒｏｂｅ２における応答曲線（図５０に示す１群の曲線からの曲線に対応する）の交点を示し、２つの値グラフ５２３０、５２３２が、各時間ステージＴ１〜Ｔ５の監視周波数ｆｐｒｏｂｅ２におけるそれぞれ振幅および位相応答に対する対応する出力信号（たとえば、電圧値）を示す。グラフ５１３０、５１３２に対する値Ｖ１〜Ｖ５およびＰｈ１〜ＰＨ５は、そのパラメータに対する出力値を示す任意の電圧値とすることができ、適当な範囲を有し、本明細書に記載する機能を提供するように比例する。
【００８１】
図５２の例の５つの時間状態Ｔ１〜Ｔ５のそれぞれにおけるＤＮＡ４８１０の位置および運動に関して、より具体的には、時間ステージＴ１（５２０２）＝ナノポア内にＤＮＡなし（開放孔）、時間ステージＴ２（５２０４）＝ナノポア内に塩基Ａ、時間ステージＴ３（５２０６）＝ナノポア内に塩基Ｇ、時間ステージＴ４（５２０８）＝ナノポア内に塩基Ａ、および時間ステージＴ５（５２１０）＝ナノポア内にＤＮＡなし（開放孔）である。
【００８２】
図５０および図５２を参照すると、時間ステージＴ１から始まり、ＤＮＡ４８１０は孔４８０８の外側にあり、接地へのキャパシタンスは低く（本明細書に論じる）、共振周波数ｆｒｅｓは高く、測定された振幅出力信号は高く、位相シフト値は非常に低く（たとえば、約０度）、これは図５０に示す応答曲線５０１８、５０２８に対応し、曲線５０１８、５０２８が線５００６と交差するｆｐｒｏｂｅ２における出力値が、それぞれ出力電圧Ｖ６および出力位相Ｐｈ１０に対応する。時間Ｔ２で、ＤＮＡ塩基４８１６（この例では、塩基Ａ）が孔４８０８に入り、接地へのキャパシタンスは増大し、共振周波数ｆｒｅｓはより低い中心周波数へシフトし、ｆｐｒｏｂｅ２において、測定された振幅出力信号は中間であり、位相値は中の下の値（たとえば、約４５度）であり、これは図５０に示す応答曲線５０１２、５０２２に対応し、曲線５０１２、５０２２が線５００６と交差するｆｐｒｏｂｅ２における出力値が、それぞれ出力電圧Ｖ９および出力位相Ｐｈ７に対応する。
【００８３】
時間Ｔ３で、ＤＮＡ塩基４８１４（この例では、塩基Ｇ、最大の塩基）が孔４８０８に入り、接地へのキャパシタンスは極めて高く、共振周波数ｆｒｅｓはより低くシフトし、ｆｐｒｏｂｅ２における振幅出力信号は低い出力値であり、出力位相はほぼ中間または中央値（たとえば、約９０度）であり、これは図５０に示す応答曲線５０１０、５０２０に対応し、曲線５０１０、５０２０が線５００６と交差するｆｐｒｏｂｅ２における出力値が、それぞれ出力電圧Ｖ１０および出力位相Ｐｈ６に対応する。時間Ｔ４で、ＤＮＡ塩基４８１２（この例では、塩基Ａ）が孔４８０８に入り（再び）、接地へのキャパシタンスは減少し（Ｔ３の値から）、共振周波数ｆｒｅｓは中心周波数へシフトし、ｆｐｒｏｂｅ２において、測定された振幅出力信号は中間であり、位相は低く、これは図５０に示す応答曲線５０１２、５０２２に対応し、曲線５０１２、５０２２が線５００６と交差するｆｐｒｏｂｅ２における出力値が、それぞれ出力電圧Ｖ９および出力位相Ｐｈ７に対応する。時間Ｔ５で、ＤＮＡ４８１０は孔４８０８の外側にあり、接地へのキャパシタンスは低く、共振周波数ｆｒｅｓはより高い周波数へシフトし、ｆｐｒｏｂｅ２において、測定された振幅出力信号は高く、位相信号は非常に低く（たとえば、約０度）、これは図５０に示す応答曲線５０１８、５０２８に対応し、曲線５０１８、５０２８が線５００６と交差するｆｐｒｏｂｅ２における出力値が、それぞれ出力電圧Ｖ６および出力位相Ｐｈ１０に対応する。
【００８４】
図５１および図５２の２つの例を参照して、出力グラフ５１３０、５１３２、および５２３０、５２３２を比較すると、測定または監視周波数ｆｐｒｏｂｅ、ｆｐｒｏｂｅ２に基づいて、所望の出力値を選択することができることを見ることができる。
【００８５】
読み取るべきデータを表す２つおよび４つのビット（または塩基）を使用するＤＮＡについて上述したが、セルのキャパシタンスまたはインピーダンス（および対応する共振周波数または周波数応答）の変化が、他のビットのそれぞれから区別可能な各ビットに対する出力振幅および／または位相をもたらすのに十分であることを条件として、所望される場合、任意の数の「ビット」（またはモノマーもしくは塩基）をデータ記憶ポリマーに使用することができる。そのようなキャパシタンス変化は、塩基の物理的な分子サイズ（たとえば、直径）を変化させることによって実現することができるが、所望される場合、ナノポアを通過するときにセルの固有のキャパシタンス値をもたらす塩基の任意の特性を使用することができる。たとえば、所望の機能および性能上の要件を満たすことを条件として、異なる誘電体特性、異なるイオン（もしくは電荷）特性、および／または異なる量子力学／電気特性を有する塩基を使用することができる。
【００８６】
図５３を参照すると、本開示のＤＮＡデータ読取りネットワークアレイの等価回路およびブロック図５３００が示されており、共振回路またはナノポアポリマー共振器（ＮＰＲ）５３０２〜５３０６（ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３）からなる並列アレイを有し、各共振器は、個々の結合キャパシタＣＣＰＬ（以下に論じる）を通って共通のＡＣ入力電圧源５３０８に並列に接続されており、ＡＣ入力電圧源５３０８は、共振回路ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３のそれぞれに対する少なくとも所望の測定周波数（ｆｐｒｏｂｅ）を含む周波数を有するＡＣ電圧Ｖｉｎを提供する（以下でさらに論じる）。各共振器ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３は、それぞれ固有インダクタ値Ｌ１〜Ｌ３を有し、対応するセルの等価回路５３１２〜５３１６（図４８Ａ〜４８Ｃに記載したセル４８００および図４９Ａに記載した等価回路４９００に類似）と直列接続されており、セル４８００内のナノポア４８０８に対するセル４８００内のポリマー（またはＤＮＡ）４８１０（図４８Ａ）の位置（本明細書に上記で論じた）に基づいて変動する可変キャパシタＣおよび可変抵抗器Ｒを有する。各固有インダクタ値Ｌ１〜Ｌ３は、図５４に関して以下でさらに論じるように、固有の共振周波数帯域Δｆｒｅｓ（図５０）および対応する全体的な共振器帯域幅ΔｆＢＷ（図５０）を設定する。したがって、複数の共振器ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３は、共振器ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３のアレイを形成する周波数多重化（または周波数分割多重化）配置で並列接続されており、共振器はすべて単一のＡＣ入力電圧５３０８によって駆動されており、それぞれその独自のプローブ入力周波数に応答する。
【００８７】
図５３を参照すると、共振器ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３との分圧器もしくはインピーダンス整合を提供し、かつ／または当該動作周波数範囲にわたって共振器のインピーダンス値の範囲に基づいてＡＣ出力電圧Ｖｏｕｔ範囲を調整するために、共振器ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３の並列アレイに接続する前に、ＡＣ入力源５３０８と直列に適宜のＡＣ  ＲＦ減衰器５３１０を設けることができる。減衰器５３１０は、使用される周波数範囲、アレイおよび負荷のインピーダンス、ならびに／または所望の機能および性能特徴に応じて、一定または交換または可変タイプのＲＦ減衰器とすることができる。
【００８８】
図５３を参照すると、共振器ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３の並列アレイからのＡＣ出力電圧Ｖｏｕｔを、増幅器（または前置増幅器）５３２０へ提供することができ、増幅器５３２０は、雑音の除去、当該測定周波数周辺のフィルタリング、下流のデバイスもしくは構成要素からの共振器アレイのインピーダンスの隔離、測定感度の改善、Ｖｏｕｔ信号の増幅もしくは減衰、ならびに／または所望の機能および／もしくは性能を提供するために必要とされるＡＣ出力電圧信号Ｖｏｕｔの他の所望の増幅調節の実行など、出力信号Ｖｏｕｔに対する増幅調節を実行する。いくつかの実施形態では、増幅器はまた、プローブ周波数のうちの１つまたは複数周辺のＡＣ出力電圧信号をフィルタリングする能動フィルタとすることができる。増幅器５３２０は、線５３２２を介して、アナログＡＣ調節済み出力電圧Ｖｏｕｔ信号をＡ／Ｄ変換器５３２４（たとえば、集積回路またはチップ）に提供し、Ａ／Ｄ変換器５３２４は、調節済みＡＣ出力電圧Ｖｏｕｔをデジタルでサンプリングし、線５３２６を介して、サンプリングされた調節済みＡＣ出力電圧Ｖｏｕｔ信号を示すデジタル出力データを提供する。Ａ／Ｄ変換器のサンプルレートは、所望の測定周波数（たとえば、プローブ周波数）で周波数分析を実行する能力を維持するのに十分な出力信号のサンプリングを提供する任意のレートとすることができる。ＡＣ出力電圧はまた、たとえば、基本プローブ周波数がＡ／Ｄ変換器によって正確に直接サンプリングするには高すぎる（もしくは速すぎる）場合（または他の設計上もしくは性能上の理由のため）、所望のパラメータを正確に測定するために必要とされる振幅および／または位相成分を維持することを条件として、ＡＣ出力信号を同じ（または類似の）周波数と混合すること、たとえばホモダインもしくはヘテロダイン復調、または任意の他のタイプの復調もしくは周波数変換によって、より低い中間周波数またはＤＣにダウンコンバートすることができる。Ａ／Ｄ変換器５３２４は、サンプリングされた出力データを記憶するオンボードメモリを有することができ、かつ／またはサンプリングされた出力データのすべてもしくは一部分を記憶することができる別個の記憶デバイス（図示せず）に接続もしくは通信することができる。デジタルのサンプリングされた出力データは、線５３２６を介して、ＦＦＴ（または高速フーリエ変換）論理またはチップなどのデジタル信号処理周波数分析（または分解）論理５３２８に提供され、論理５３２８は、デジタルのサンプリングされたデータに対するデジタル信号処理（ＤＳＰ）を実行し、線５３３０を介して、サンプリングされたＡＣ出力信号Ｖｏｕｔ内に存在する周波数成分（または高調波）の振幅および／または位相を示すデジタルデータを提供する。所望される場合、本明細書に記載する機能および性能を提供し、当該の所望の周波数（たとえば、少なくとも所望のプローブまたは測定周波数）における出力信号の振幅および／または位相を十分に測定することを条件として、ＦＦＴ論理５３２８の代わりに、任意の他の周波数分析ハードウェア、ファームウェア、および／またはソフトウェアを使用することができる。
【００８９】
増幅器５３２０、Ａ／Ｄ変換器５３２４、およびＦＦＴ論理５３２９はすべて、Ｔｅｘａｓ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、Ａｎａｌｏｇ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐ．、Ｉｎｔｅｌ  Ｃｏｒｐ．、または他の類似の製造業者などの集積回路提供業者から得ることができる周知のハードウェアまたはファームウェア構成要素（コンピュータプログラマブル部分を有することができる）である。使用することができるデジタル化のための構成要素の一例には、Ｘｉｌｉｎｘ  ＦＦＴ  ＬｏｇｉＣＯＲＥ、部品番号４ＤＳＰ  ＦＭＣ１０３、１１２６、Ａｌａｚａｒｔｅｃ９３６０、９３７０が含まれる。所望される場合、本明細書に記載する機能および性能を提供することを条件として、他の構成要素を使用することができる。また、ＦＦＴ論理は、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）によって実行することもできる。
【００９０】
また、Ａ／Ｄ変換器によって出力電圧をサンプリングし、デジタル信号処理を実行して周波数成分を判定する代わりに、出力信号Ｖｏｕｔは、所望の周波数成分の振幅および／または位相を識別し、同じ内容を示すアナログ出力電圧信号を提供するように、所望の周波数に調整された１つまたは複数のアナログフィルタ（図示せず）に提供することができる。
【００９１】
図５４を参照すると、周波数プロット５４００が、本開示の図５３の複数の共振器ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３に対するサンプル周波数分離を示す。特に、図５３に関して上記で論じたように、各共振器ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３は、それぞれ固有インダクタ値Ｌ１〜Ｌ３によって設定または決定された固有の共振器帯域幅ΔｆＢＷ１、ΔｆＢＷ２、ΔｆＢＷ３を有する。それぞれ共振器ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３の帯域幅ΔｆＢＷ１、ΔｆＢＷ２、ΔｆＢＷ３は、近接共振器の共振器帯域幅ΔｆＢＷが重複して近接共振器間の干渉またはクロストークを引き起こさないように、周波数分離またはギャップΔｆｇａｐによって、近接共振器帯域幅から分離することができる。いくつかの実施形態では、これらの帯域幅は、各塩基の周波数応答が異なり、したがって各共振器の応答を識別する能力に影響を与えないことを条件として、重複することができる。
【００９２】
同様に、図５４に、それぞれ共振器ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３の帯域幅ΔｆＢＷ１、ΔｆＢＷ２、ΔｆＢＷ３に対応する１組のプローブまたは監視周波数ｆｐ１、ｆｐ２、ｆｐ３が示されており、これらは、各共振器帯域幅ΔｆＢＷ１、ΔｆＢＷ２、ΔｆＢＷ３内の周波数（または複数の周波数）とすることができ、ポリマーがナノポア内にあるとき（図５０〜５２に関して本明細書に上記で論じた）に見られる共振周波数の範囲内など、本明細書に論じる所望の出力信号を提供する。所望される場合、所望の機能および性能上の要件を満たすことを条件として、他の測定またはプローブ周波数を使用することができる。
【００９３】
ギャップ周波数は主に、インダクタＬ値の選択によって決定されるが、システム動作条件において生じうるシステムパラメータの変動によって引き起こされる動作中の望ましくない重複を回避するために必要とされる近接周波数帯域間の分離量はまた、それだけに限定されるものではないが、セル設計パラメータ許容差（たとえば、電極、インダクタ、キャパシタ、流体、セル壁、膜、材料、寸法、およびセルごとに変動することがある任意の他のセル設計パラメータ）、環境動作範囲、たとえば温度、圧力、湿度など、電磁干渉もしくは雑音パラメータ／作用、任意のセル間（もしくはチャンバ間）の相互作用、ならびに／あるいは所望の機能もしくは性能に影響を与えることがある任意の他の設計上の慣行、安全もしくは規制の要件もしくは許容差、または任意の他の要因を含む様々な要因によって決定することができる。そのような要因は、所与の共振器の帯域幅をその理想的な条件から変化させることがあり、したがって時間および環境にわたって周波数分離に対する全体的な設計許容差パラメータにおいて考えるべきである。
【００９４】
図５５Ａおよび図５５Ｂを参照すると、本開示のＡＣ入力電圧Ｖｉｎは、出力ＡＣ電圧Ｖｏｕｔが（たとえば、図５３のＦＦＴ論理５３３０によって）周波数分析される少なくとも所望の測定またはプローブ周波数を含む。図５５Ａを参照すると、ＡＣ入力電圧Ｖｉｎは、最小限の測定周波数ｆＭＩＮから最小限の測定周波数ｆＭＡＸまで、または第１のプローブ周波数ｆｐ１から最後のプローブ周波数ｆｐＮまで、すべての周波数を有する曲線５５０２によって示されている連続する広帯域ＡＣ周波数信号とすることができる。その場合、共振器ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３はすべて、広帯域周波数信号によって励起（ｅｘｃｉｄｅｄ）され、出力信号の周波数成分における応答を呈する。別法として、ＡＣ入力電圧Ｖｉｎは、それぞれ個々の周波数成分５５１２、５５１４、５５１６、５５１８によって示されている所望のプローブまたは監視周波数ｆｐ１、ｆｐ２、ｆｐ３、ｆｐＮのみを有する曲線５５１０によって示されている広帯域ＡＣ周波数信号とすることができる。また、アレイ内のすべての共振器に対するＡＣ入力電圧Ｖｉｎに対する全体的な周波数範囲は、約１．０ＭＨｚ〜１ＧＨｚとすることができる。所望される場合、本明細書に記載する機能および性能を満たすことを条件として、他の周波数を使用することができる。ＡＣ入力電圧Ｖｉｎは、ＦＭＣ２８５０、ＴＩＤＡＣ９００、またはＸｉｌｉｎｘ  ＤＳ５５８など、所望の設計構成および励起に対する所望のＡＣ周波数成分を提供する周知の発振器チップ（調整可能および／またはプログラマブルとすることができる）によって提供することができる。Ｖｉｎが複数の個々のプローブ周波数を含む場合、Ｖｉｎは、別個のＡＣ周波数をともに電子的に組み合わせることによって生成することができ、または数学的に直接合成し、発振器にプログラムすることができる（ハードワイヤードされ、もしくは接続されたマイクロプロセッサによってプログラムされる）。
【００９５】
図５５Ｂを参照すると、ＡＣ入力電圧Ｖｉｎは、曲線５５５０によって示されている時間掃引ＡＣ周波数信号とすることができ、最小限の測定周波数ｆＭＩＮから最小限の測定周波数ｆＭＡＸまで、または第１のプローブ周波数ｆｐ１から最後のプローブ周波数ｆｐＮまで、入力周波数を掃引し、次いで繰返し期間Ｔで繰り返される。その場合、入力電圧Ｖｉｎの周波数は、任意の所与の時間において１つの周波数のみであり、共振器ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３はすべて、その単一の入力周波数に応答し、出力信号においてその周波数に対する応答を呈する。またその場合、システムは一度に１つの周波数にのみ応答し、システムは入力電圧Ｖｉｎの周波数掃引タイミングが分かっていることから、システムが所望のプローブ周波数に関連する時間において振幅および／または位相をサンプリングし、値を直接決定することができるため、周波数分析の必要がない。
【００９６】
別法として、ＡＣ入力電圧Ｖｉｎは、曲線５５７０によって示されている時間ステップＡＣ周波数信号（ｔｉｍｅ−ｓｔｅｐｐｅｄ  ＡＣ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｓｉｇｎａｌ）とすることができ、入力周波数は、第１のプローブ周波数ｆｐ１から最後のプローブ周波数ｆｐＮまで階段状であり、各周波数において所定の滞留時間ＴＤにわたって待機し、次いで繰返し期間Ｔで繰り返される。その場合、掃引周波数曲線５５５０と同様に、入力電圧Ｖｉｎの周波数は、任意の所与の時間において１つの周波数のみであり、共振器ＮＰＲ１〜ＮＰＲ３はすべて、その単一の入力周波数に応答し、その時間に出力信号においてその周波数に対する応答を呈する。滞留時間ＴＤにより、システムが各プローブ周波数において出力信号をサンプリングためにより多くの時間が可能になる。またその場合、システムは一度に１つの周波数にのみ応答し、システムはタイミングが分かっていることから、システムが所望のプローブ周波数に関連する時間において振幅および／または位相をサンプリングし、値を直接決定することができるため、周波数分析（または分解）の必要がない。
【００９７】
また、アレイ内のすべての共振器（またプローブ測定周波数）に対するＡＣ入力電圧Ｖｉｎに対する全体的な周波数範囲は、約１．０ＭＨｚ〜１ＧＨｚとすることができる。所望される場合、本明細書に記載する機能および性能要件を満たすことを条件として、他の周波数を使用することができる。ＡＣ入力周波数は、セルのインピーダンスを十分にサンプリングすることを可能にするのに十分な数の周期（または期間）の入力周波数を可能にする値に設定するべきである。これは部分的に、ＤＮＡ（または他のポリマー）がナノポアに通される速度に基づいている。たとえば、ＤＮＡが約１ＭＨｚ（すなわち、毎秒百万塩基）の速度でナノポアを通っており、ＡＣ入力周波数が１００ＭＨｚである場合、セルインピーダンスは、各塩基に対して１００周期の入力周波数を受け（または経験する）、これは１００：１の「サンプル」レートに対応する。所望される場合、所望の機能および性能を提供することを条件として、他の入力周波数およびサンプルレートを使用することができる。たとえば、所与の入力周波数をデジタルで分解するために必要とされる最小サンプル周波数は、ナイキストサンプル周波数であり、これは入力周波数の２倍である。この場合、１ＭＨｚの入力信号（ＤＮＡのナノポア通過速度）に対して、最小（またはナイキスト）サンプルレートは２ＭＨｚになるはずである。
【００９８】
図５６を参照すると、本開示のいくつかの実施形態に対して、ＡＣ出力電圧Ｖｏｕｔの振幅周波数スペクトルグラフ５６００および位相周波数スペクトルグラフ５６２０の一例が示されている。特に、ＡＣ出力電圧信号Ｖｏｕｔに対して、それぞれＮＰＲ１、ＮＰＲ２、ＮＰＲ３の周波数応答に対応する３つの振幅線５６０２、５６０４、５６０６が示されている。この例では、図５２に示す例のように、使用されるプローブ周波数はｆｐｒｏｂｅ２であり、２つのビットのみが存在する。この例に対してこの出力が得られたとき、ＮＰＲ１は、時間Ｔ３の列５２０６（図５２）に示されているシナリオを有し、対応する周波数応答線５６０２は、Ｖ１０の振幅およびＰｈ６の位相を示す。同時に、ＮＰＲ２は、時間Ｔ２の列５２０４（図５２）に示されているシナリオを有し、対応する周波数応答線５６０４は、Ｖ９の振幅およびＰｈ７の位相を示す。また同時に、ＮＰＲ３は、時間Ｔ５の列５２１０（図５２）に示されているシナリオを有し、対応する周波数応答線５６０６（図５６）は、Ｖ６の振幅およびＰｈ１０の位相を示す。
【００９９】
いくつかの実施形態では、使用されるプローブまたは測定周波数は、共振器周波数応答、ポリマー特性、および出力信号の品質に影響を与える可能性があるシステム雑音などの他の要因に基づいて変動することができる。いくつかの実施形態では、システムは、最善の品質の出力信号が得られることを確実にするために、測定周波数をリアルタイムで切り換えることができ、または読み取ったデータの誤り検査もしくは検証を実行するために、複数の異なる測定周波数を使用することができる。その場合、ＶｉｎのＡＣ入力周波数は、たとえばそれに応じて（測定と同期して）測定周波数を変化させもしくは調整し、またはその測定周波数を提供される連続ＡＣ入力周波数成分の一部にすることによって、測定周波数を含むはずである。
【０１００】
図５７を参照すると、本開示の実施形態に対する最上位のブロック図５７００が示されている。特に、共振器（またはＮＰＲ）のアレイがチップ上にレイアウトされているとき、Ｍ×Ｎの共振器からなる二次元アレイで構成することができ、ここにはＭ行５７０２〜５７０８が存在し、各行は、すべて並列接続（線５７１６によって示す）されたＮ個の共振器を有しており、すべてのＮＰＲは、線５７１０を介して同じＡＣ入力電圧Ｖｉｎ５３０８（図５３）によって駆動され、すべてのＮＰＲは、線５７１２を介して共通の周波数分割多重化ＡＣ出力電圧Ｖｏｕｔに寄与し、これは増幅器（または前置増幅器）５３２０（図５３）へ供給することができる。その場合、行５７０２〜５７０８はそれぞれ、１００ＭＨｚ〜１９９Ｍｈｚ（行５７０２）、２００ＭＨｚ〜２９９ＭＨｚ（行５７０４）、３００Ｍｚ〜３９９ＭＨｚ（行５７０６）などの周波数帯域に対応することができ、他の行に対しても同様である。行５７０２〜５７０８のそれぞれにおいて、複数の共振器（またはＮＰＲ）が存在することができ、それぞれｆ行，列とした名称のボックス５７１４として示す。図５４に関して本明細書に上記で論じたように、所与の行におけるＮＰＲはそれぞれ、その行に関連する周波数帯域内の共振器帯域幅ΔｆＢＷを有しており、近接共振器間の干渉またはクロストークを回避するために、ギャップ周波数帯域Δｆｇａｐによって近接ＮＰＲから周波数が分離される。
【０１０１】
たとえば、本明細書に上記および図５４に関して論じたように、頂部５７０２における第１の行に周波数帯域１００ＭＨｚ〜１９９Ｍｈｚが指定されている場合、その行５７０２内のＮＰＲｆ１，１〜ｆ１，Ｎは、この帯域内にあり、ギャップ周波数帯域によって互いから分離されるはずである。したがって、この形式では、読取りシステムは、単一の入力および出力線によって個々に可読のデータ要素からなる２Ｄアレイであると見ることができる。所望される場合、他の周波数帯域および範囲を使用することができる。
【０１０２】
図５８を参照すると、多層チップ構造５８００の横断面図が示されており、セル４８００（図４８Ａ）、インダクタＬ（図４９Ａ、図５３）、および結合キャパシタＣＣＰＬ、ならびに頂部コンタクト５８０２を含み、頂部コンタクト５８０２には入力（および出力）Ｉ／Ｏ電圧線を接続することができ、本明細書では、これらを集合的にナノポア−ポリマー共振器（ＮＰＲ）と呼ぶことができる。セル４８００（図４８Ａ）の整合構成要素は、図５８でも同様に示されている。上部電極４８１８の上には、チップインダクタ５８０８（図５９参照）Ｌの中心への垂直接続５８０６が位置しており、チップインダクタ５８０８の他方の末端は、結合チップキャパシタ５８１２に接続される。チップキャパシタ５８１２の上側は、Ｉ／Ｏコンタクト５８０２に接続される。複数の層の３Ｄスタッキングにより、セル４８００および回路構成要素を多数詰め込むことが可能になり、それによりセル５８０４の密接な詰め込みが可能になる。特に、図４８Ａおよび図５８を参照すると、セル４８００である。また、機能的回路要素をそれぞれ分離する誘電体層５８０４が存在することができる。共振器またはＮＰＲ構造５８００の複数のコピーを、一次元または二次元のアレイでともに接続して、たとえば図５３および図５７に関して本明細書に上記で論じたＮＰＲアレイを有する「チップ」を作製することができる。また、増幅器５３２０（図５３）、たとえばＣＭＯＳ増幅器または前置増幅器は、出力線コンタクト層５８０２において適当な位置で、たとえばアレイ内の最後のＮＰＲ５８００の後に、「フリップチップ」接合または所望の機能および性能を提供する任意の他の技法を介して、チップ構造内に一体化することができる。また、図５９を参照すると、チップ５８００内で使用することができるインダクタＬの上面図が示されており、これはリソグラフィ製作または他の製作技法などの周知のチップインダクタ製作技法を使用して製作することができる。本明細書に論じるように、チャンバ内に浮遊しているＤＮＡまたはポリマーを特定の所望のチャンバへ動かしまたは操舵するために、電極にＤＣ電圧を印加することもできる。本明細書に論じるように、ＡＣ電圧は、Ｉ／Ｏコンタクトを介してすべてのＮＰＲ５８００に印加され、Ｉ／ＯコンタクトはすべてのＮＰＲに共通とすることができ、線５８１２を介してＡＣ入力電圧によって供給され、ＤＣ電圧は、線５８１０を介して各電極に個々に印加することができ、各ＮＰＲは、電極４８１８を固有に制御するために、その独自の別個のＤＣ電圧入力線５８１０を有する。
【０１０３】
図６０および図６１を参照すると、ＡＣ電圧およびＤＣ電圧の両方が同じセルを駆動することを可能にするために、「バイアスティ」接続を使用してＡＣ線およびＤＣ線を構造５８００に接続することができ、「バイアスティ」接続は、図６０に示す回路６０００と、図６１に示すサンプル物理的チップ実装６１００とを有する。図６０を参照すると、ＡＣ  ＲＦ（高周波）入力信号Ｖｉｎは、結合キャパシタＣＣＰＬ（本明細書にすでに論じた）を通ってインダクタＬに結合されており、ＤＣ入力は、高抵抗ワイアＲｗを通って、インダクタＬの同じ側に接続することができ、ワイアＲｗは、高周波ＡＣ信号がＤＣ入力源経路を介して回路から出ていくのを「ブロック」するのに十分な自己インダクタンスを有する。別法として、所望される場合、抵抗ワイアＲｗをインダクタＬの他方の側（電極側）に接続することもできる。しかしその場合、抵抗ワイアＲｗの値は、共振を減衰させるように（ＡＣ接地へのセルキャパシタンスと並列の別の抵抗器として）作用するはずである。
【０１０４】
図６１を参照すると、「バイアスティ」接続の物理的実装６１００の一例が示されており、「バイアスティ」接続の拡大図を示す。高周波ＡＣ入力信号Ｖｉｎは、伝送線（たとえば、図５８の頂部Ｉ／Ｏコンタクト５８０２）を介してインダクタＬに容量結合されており、ＡＣを結合してＤＣ電圧をブロックする結合キャパシタＣＣＰＬを生じさせるように、第２の板６１０２に対して間隙があけられる。また、図６０に関して上記でやはり論じたように、ＤＣ入力電圧（またはＤＣ「操舵」電圧）は、高抵抗ワイアＲｗを通って、インダクタＬの同じ側に接続することができ、ワイアＲｗは、高周波ＡＣ信号がＤＣ入力源経路を介して回路から出ていくのを「ブロック」するのに十分な自己インダクタンスを有する。「バイアスティ」接続の結果、インダクタＬに印加される電圧が、ＤＣ入力電圧によって決定されるＤＣバイアスを有するＡＣ入力電圧になる。
【０１０５】
図６２を参照すると、多層チップ構造６２００の横断面図が示されており、図２４、図２５、図２８、および図２９に示したものに類似の本明細書に記載する３つのチャンバを有するセルを含み、２つの一体化されたインダクタＬ１Ａ、Ｌ１Ｂを有する。その場合、頂部左電極６２１０（ビット、たとえば「０」を付加する）を有する上部（または頂部）左チャンバ６２０２と、頂部右電極６２１２（ビット、たとえば「１」を付加する）を有する頂部右チャンバ６２０４と、接地（たとえば、０ボルト）に接続することができる対応する電極６２１４を有する頂部左チャンバ６００２および頂部右チャンバ６００４の両方に共通している下部「デブロック」チャンバ６２０６とが存在する。３チャンバセルの場合、２つのキャパシタを並列に有し、それぞれ時間とともに変化する独自のインピーダンスを有すると見ることができる。この場合、左インダクタＬ１Ａは左頂部電極６２１０に接続され、右インダクタＬ１Ｂは右頂部電極６２１２に接続される。残りの構成要素および要素は、２チャンバセル設計に関して上記で論じたものと同じとすることができる。ＡＣ  ＲＦ  Ｉ／Ｏ入力線は、インダクタに容量結合することができ、各ＤＣ入力線６２２０、６２２２は、本明細書に上記で論じた「バイアスティ」接続を使用して、抵抗器または抵抗ワイアによって結合される。インダクタＬ１Ａ、Ｌ１Ｂが異なる値を有する場合、左および右チャンバは、異なる共振周波数および異なる共振帯域幅を有する。その場合、各３チャンバセルは、２つの共振帯域幅を有する２つの共振器を有するはずであり、これらの共振器は、本明細書に上記で論じたようにポリマー（またはＤＮＡ）上のデータを読み取るために呼掛けまたは監視されるように周波数空間内に位置決めすることができる。インダクタＬ１Ａ、Ｌ１Ｂが同じ値を有する場合、１つのセルにつき１つのポリマー（またはＤＮＡ）鎖しかないため、システムが一度に１つのチャンバのみを読み取ることができることから、それでもなお各チャンバに対してＤＮＡを読み取ることができる。したがってこれは本質的に時間配列または時間依存であり、したがってデータの読取りを実現するために周波数を分離する必要がない。しかし、正しいチャンバが実際に読み取られていることを確実にする（または認証する）ために、これらを分離することが望ましいことがある。
【０１０６】
図６３を参照すると、多層チップ構造６３００の横断面図が示されており、図６２に示すものに類似のものを有する３チャンバセルを含み、単一の一体化されたインダクタＬ１Ａを有する。いくつかの実施形態では、データ読取りおよび書込みプロトコルに応じて、１つのセル、たとえば頂部左セル６００２のみを使用してポリマーデータを読み取ることが望ましいことがあり、他のセル、たとえば６００４は、読取りのために構成しなくてもよく、したがってインダクタを有しておらず、共振器を形成しない。その場合、他の実施形態に関して本明細書に上述したように、ＡＣ入力電圧ＶｉｎおよびＤＣ操舵電圧は、左頂部電極６２１０を駆動するように、「バイアスティ」接続を使用してインダクタＬ１Ａに結合することができ、このＤＣ操舵電圧は線６３０２を介して入り、右頂部電極６２１２に対してはＤＣ操舵入力電圧は、線６３０４によって示すように、直接接続することができる。残りの構成要素および要素は、３チャンバセル設計に対して図６２に関して上記で論じたものと同じとすることができる。
【０１０７】
図６４および図６４Ａを参照すると、頂部電極のうちの１つまたは２つに取り付けられたインダクタを有する代わりに、単一の一体化されたインダクタＬ１を底部電極６２１４に接続することができ、頂部電極６２１０、６２１２は、それぞれ線６４１０、６４１２を介してその電極に対するそれぞれのＤＣ操舵電圧に個々に接続される。その場合、回路の頂部および底部に「バイアスティ」タイプの接続が得られるはずである（図６４Ａ参照）。その場合、底部電極にＡＣ  ＲＦ入力電圧を提供することができ、底部電極は、結合キャパシタＣＣＰＬを介してインダクタＬ１にＡＣ結合することができ、頂部の結合キャパシタは、ＡＣをＡＣ  ＲＦ接地に結合する。ＤＣ線６４１０、６４１２（図６４）はそれぞれ、Ｒｗ（図６４Ａ）を通ってそれぞれの電極に結合され、ＤＣはセルおよびインダクタを通過し、底部Ｒｗを通ってＤＣ接地へ進む。底部コンタクトは、ＡＣ  ｒｆ  Ｉ／Ｏ線として作用することができ、頂部コンタクト４６１０は、ＤＣ  Ｉ／Ｏ線として作用することができる。また、ＤＣ接地はＤＣ入力線とすることができ、唯一の要件は、頂部電極と底部電極との間にＤＣ電位差を画定することである。共通インダクタＬ１によって、１つのセルにつき１つのポリマー（またはＤＮＡ）鎖（または本明細書に論じるメモリ列）しかない（上記で論じたように）ため、システムが一度に１つのチャンバのみを読み取ることができることから、それでもなお各チャンバに対してＤＮＡを読み取ることができる。したがって、これは本質的に時間配列または時間依存である。図６３、図６３Ａ、および図６３Ｂを参照すると、いくつかの実施形態では、固有の共振周波数および周波数帯域幅を設定するために、各共振器に対して固有インダクタＬ（図６３に示す）を使用する代わりに、アレイ内のすべての共振器に対して単一の共通インダクタＬｃｏｍｍｏｎを使用することができ、各共振器の共振周波数を設定する値を有する各セルに並列に、固有のキャパシタＣＲを設けることができる。その場合、メモリチップは、各チャンバに対して頂部電極から底部電極への内蔵の固定チップ共振器キャパシタＣＲを有することができ、これは各セルに対して共通インダクタによって共振周波数を設定するような値である。ポリマーがナノポアを通り、セルのキャパシタンスが変化すると、このキャパシタンス変化により、全体的な並列キャパシタンスの組合せが調整され、それに応じて共振周波数が調整されるはずである。固有インダクタＬを有する場合のように、固定の共振キャパシタＣＲの値は、共振器アレイ内の各共振器に対して固有の共振周波応答を提供するように設定されるはずである。本明細書に上記でインダクタの実施形態に対して論じるように、測定を実行する１つのキャパシタ（１つの共振器）が存在するだけでよく、または２つが使用される場合、これらは同じ値であっても（上記で論じたように固有の時間配列決定のため）、所望される場合、認証、冗長、または他の目的で、異なる値であってもよい。図６３Ａは、固定の共振キャパシタＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、および共通インダクタＬｃｏｍｍｏｎを有するいくつかのセルに対する等価回路図の一例を示す。
【０１０８】
図６４、図６４Ｂ、図６４Ｃを参照すると、いくつかの実施形態では、固有の共振周波数および周波数帯域幅を設定するために、各共振器の底部で固有インダクタＬ（図６４に示す）を使用する代わりに、アレイ内のすべての共振器に対して単一の共通底部インダクタＬｃｏｍｍｏｎを使用することができ、各共振器の共振周波数を設定する値を有する各セルに並列に、固有のキャパシタＣＲを設けることができる。固定の共振キャパシタを使用する類似の変形形態は、底部のインダクタに対して行うこともでき、共振キャパシタＣＲ１、ＣＲ２、ＣＲ３、および共通インダクタＬｃｏｍｍｏｎを使用することができる。その場合、メモリチップは、各チャンバに対して頂部電極から底部電極への内蔵の固定チップ共振器キャパシタＣＲ（図６４Ｃ）を有することができ、これは各セルに対して共通インダクタＬｃｏｍｍｏｎによって共振周波数を設定するような値である。
【０１０９】
本開示は、各セル内のデータを読み取るためにセルが個々にアドレス可能であることを必要としない。また、本開示は、周波数分割多重化を使用して、単一源の入力線および単一の出力線を使用することによって、各セル内に位置するポリマー上に記憶されているデータの読取りを可能にする。さらに、本発明のデータ読取り技法は、任意のタイプのナノポア、たとえば固体、タンパク質ベース、または任意の他のタイプのナノポアとともに機能する。加えて、本開示のシステムおよび方法は、メモリ列（またはＤＮＡもしくはポリマー）を読み取るために、たとえば約１ＭＨ〜１ＧＨｚの高ｒｆ周波数を使用し、それにより実質上１／ｆ雑音をなくし、したがってシステムは、そのような高周波測定手法を使用しないシステムより高い感度（または粒度もしくは忠実度）を有する可能性が高い。加えて、そのような高周波手法を使用することで、ナノポアを通過するときにメモリ列を読み取る（またはサンプリングする）ために速い時間スケールが提供され、それによってサンプリングまたは測定の目的で列を意図的に遅くする必要がなくなる。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本発明は、少なくとも２つの別個のモノマーを含む帯電ポリマー、たとえばＤＮＡを配列決定するナノチップを提供し、このナノチップは、少なくとも第１および第２の反応チャンバを備え、各反応チャンバは電解質媒体を含み、１つまたは複数のナノポアを含む膜によって分離されており、回路内に接続された１対の電極（たとえば、対向する板の形態）が、１つまたは複数のナノポアを含む膜の両側に配置され、これらの電極は、１〜３０ミクロン、たとえば約１０ミクロンの距離だけ分離され、したがって無線周波脈動直流電流、たとえば１ＭＨｚ〜１ＧＨｚが電極に印加されると、これらの電極間の間隙はキャパシタンスを有し、帯電ポリマーをナノポアに、たとえば一方のチャンバから次のチャンバへ引き込み、したがって帯電ポリマーがナノポアを通過すると、キャパシタンスの変化とともに脈動直流無線周波電流の位相が変化し、それによって帯電ポリマーのモノマー配列の検出が可能になる。特定の実施形態では、ナノチップは、複数組の反応チャンバを備え、１組の中の反応チャンバは、１つまたは複数のナノポアを有する膜によって分離され、数組の反応チャンバは、数組の反応チャンバ間の電気干渉を最小にし、かつ／または複数の線形ポリマーを分離し、並行して配列決定することを可能にするために、遮蔽層によって分離される。
【０１１１】
たとえば、一実施形態では、電極は、共振回路内に埋め込まれたキャパシタの頂板および底板を形成しており、ＤＮＡが板同士の間の孔を通過するとき、キャパシタンスの変化が測定される。
【０１１２】
特定の実施形態では、ナノチップは、たとえば以下に参照するナノチップ１のいずれかに応じて、ポリマー、たとえばＤＮＡを合成する試薬をさらに含む。
【０１１３】
したがって、一実施形態では、本発明は、ナノチップ、たとえばナノポアに基づくデバイス、たとえば以下に参照するナノチップ１のいずれかの中に少なくとも２つの別個のモノマーを含む荷電ポリマー［たとえば、核酸（たとえば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）］を合成する方法（方法１）を提供し、ナノチップは、
１つの反応周期において単一のモノマーまたはオリゴマーのみを付加することができるように、ターミナル保護形態で緩衝溶液内の荷電ポリマーに１つまたは複数のモノマー［たとえば、ヌクレオチド］またはオリゴマー［たとえば、オリゴヌクレオチド］を付加するための試薬を収容する１つまたは複数の付加チャンバと、
緩衝溶液を収容するが、１つまたは複数のモノマーまたはオリゴマーの付加に必要なすべての試薬を収容するとは限らない１つまたは複数の予備チャンバとを備え、
チャンバは、１つまたは複数のナノポアを含む１つまたは複数の膜によって分離され、
荷電ポリマーはナノポアを通過することができるが、１つまたは複数のモノマーまたはオリゴマーの付加のための試薬のうちの少なくとも１つはナノポアを通過することができず、
この方法は、
ａ）第１の末端および第２の末端を有する荷電ポリマーの第１の末端を、電気的引力によって付加チャンバ内へ動かし、それによってモノマーまたはオリゴマーが前記第１の末端にブロック形態で付加されることと、
ｂ）荷電ポリマーの第１の末端を付加されたモノマーまたはオリゴマーとともにブロック形態で予備チャンバ内へ動かすことと、
ｃ）付加されたモノマーまたはオリゴマーをデブロックすることと、
ｄ）所望のポリマー配列が得られるまで、工程ａ〜ｃを繰り返すことであって、工程ａ）で付加されるモノマーまたはオリゴマーは同じでありまたは異なる、繰り返すこととを含む。
【０１１４】
たとえば、本発明は、以下を提供する。
１．１．ポリマーが核酸であり、たとえばポリマーがＤＮＡまたはＲＮＡであり、たとえばポリマーがＤＮＡ、たとえばｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡである、方法１。
１．２．ポリマー、たとえば核酸の第２の末端が、ナノポアに近接して基質に保護または結合される、上記いずれかの方法。
１．３．電気的引力が、各チャンバ内の電極間に電位を印加することによって提供され、電極間の極性および電流の流れを制御することができ、たとえばそれにより核酸が正の電極に引き付けられる、上記いずれかの方法。
１．４．ポリマーが核酸であり、
（ｉ）核酸の前記第１の末端が３’末端であり、ヌクレオチドの付加が、５’から３’の方向に行われ、ポリメラーゼによる触媒作用を受け、たとえばポリメラーゼは、ナノポアを通過することが妨げられ（たとえば、そのサイズのため、もしくは第１のチャンバ内の基質に係留されているため）、ヌクレオチドは、付加されるときに３’保護されており、３’保護ヌクレオチドを核酸の３’末端に付加した後、たとえば予備チャンバ内で、核酸上の３’保護基が除去され、または
（ｉｉ）核酸の前記第１の末端が５’末端であり、ヌクレオチドの付加が、３’から５’の方向に行われ、ヌクレオチドは、付加されるときに５’保護されており、５’保護されたヌクレオチドを核酸の５’末端に付加した後、たとえば第２のチャンバ内で、５’保護基が除去され（たとえば、５’保護ヌクレオチド上のリン酸が、５’保護基を介してナノポアを通過することのできない大きい基に結合されたヌクレオシドホスホラミダイトであり、したがって核酸への結合後、未反応のヌクレオチドが一掃され、大きい５’保護基が核酸から開裂されて一掃され、核酸の５’末端を予備チャンバ内へ動かすことができる）、
核酸へのヌクレオチドの付加は、１つまたは複数の付加チャンバの内外への核酸の第１の末端の運動によって制御され、その周期は、所望の配列が得られるまで継続される、上記いずれかの方法。
１．５．そのように合成されたポリマー内のモノマーまたはオリゴマーの配列［たとえば、核酸内のヌクレオチドの配列］が、バイナリコードに対応する、上記いずれかの方法。
１．６．そのように合成されたポリマーが、一本鎖ＤＮＡである、上記いずれかの方法。
１．７．配列決定内の誤りを識別するために、ナノポアを通過するときにモノマーまたはオリゴマー［たとえば、ヌクレオチド塩基］を配列決定することによって、ポリマー［たとえば、核酸］の配列がプロセスまたは合成中に検査される、上記いずれかの方法。
１．８．そのように合成されたポリマーが一本鎖ＤＮＡであり、配列内の塩基の少なくとも９５％、たとえば少なくとも９９％、たとえば実質上すべてが、鎖内の他の塩基とハイブリッド形成しない２つの塩基から選択され、たとえば塩基はアデニンおよびシトシンから選択される、上記いずれかの方法。
１．９．多数のポリマー［たとえば、オリゴヌクレオチド］が独立して並行して合成され、したがって１つまたは複数の付加チャンバ内に存在するか、それとも１つまたは複数の予備チャンバ内に存在するかを別個に制御することによって、異なる配列を有するポリマー［オリゴヌクレオチド］が得られる、上記いずれかの方法。
１．１０．異なるモノマーまたはオリゴマー（ｏｌｉｇｍｅｒｓ）、たとえば異なるヌクレオチドを付加するのに好適な試薬を収容する少なくとも２つの付加チャンバが存在し、たとえば、第１のモノマーまたはオリゴマーを付加するのに好適な試薬を収容する１つまたは複数の付加チャンバ、および第２の異なるモノマーまたはオリゴマーを付加するのに好適な試薬を収容する１つまたは複数の付加チャンバが存在し、たとえばアデニンヌクレオチドを付加するのに好適な試薬を収容する１つまたは複数の付加チャンバ、およびシトシンヌクレオチドを付加するのに好適な試薬を収容する１つまたは複数の付加チャンバが存在する、上記いずれかの方法。
１．１１．少なくとも１つの付加チャンバが流れチャンバであり、（ｉ）第１のモノマーまたはオリゴマーを付加するのに好適な試薬を流れチャンバに提供することと、（ｉｉ）一掃することと、（ｉｉｉ）第２の異なるモノマーまたはオリゴマーを付加するのに好適な試薬を流れチャンバに提供することと、（ｉｖ）一掃することとを含む流れ周期を提供し、合成が完了するまでこの周期を繰り返し、ポリマー内のモノマーまたはオリゴマーの配列が、各周期の工程（ｉ）または（ｉｉｉ）中に流れチャンバからポリマーの第１の末端を導入または排除することによって制御される、上記いずれかの方法。
１．１２．ポリマーがＤＮＡであり、少なくとも１つの付加チャンバが流れチャンバであり、（ｉ）第１のタイプのヌクレオチドを付加するのに好適な試薬を流れチャンバに提供することと、（ｉｉ）一掃することと、（ｉｉｉ）第２のタイプのヌクレオチドを付加するのに好適な試薬を流れチャンバに提供することと、（ｉｖ）一掃することとを含む流れ周期を提供し、合成が完了するまでこの周期を繰り返し、配列が、流れチャンバ内のＤＮＡの第１の末端（たとえば、３’末端）の有無を制御することによって制御される、上記いずれかの方法。
１．１３．ポリマーがＤＮＡであり、少なくとも１つの付加チャンバが流れチャンバであり、（ｉ）第１のタイプのヌクレオチドを付加するのに好適な試薬を流れチャンバに提供することと、（ｉｉ）一掃することと、（ｉｉｉ）第２のタイプのヌクレオチドを付加するのに好適な試薬を流れチャンバに提供することと、（ｉｖ）一掃することと、（ｉ）第３のタイプのヌクレオチドを付加するのに好適な試薬を流れチャンバに提供することと、（ｉｉ）一掃することと、（ｉｉｉ）第４のタイプのヌクレオチドを付加するのに好適な試薬を流れチャンバに提供することと、（ｉｖ）一掃することとを含む流れ周期を提供し、合成が完了するまでこの周期を繰り返し、配列が、異なるタイプのヌクレオチドを付加するのに好適な試薬が存在するときに流れチャンバ内のＤＮＡの第１の末端（たとえば、３’末端）の有無を制御することによって制御される、上記いずれかの方法。
１．１４．ポリマーがＤＮＡであり、ナノチップが、流れチャンバである２つの付加チャンバを備えており、（ａ）第１の流れチャンバが、（ｉ）第１のタイプのヌクレオチドを付加するのに好適な試薬を第１の流れチャンバに提供することと、（ｉｉ）一掃することと、（ｉｉｉ）第２の異なるタイプのヌクレオチドを付加するのに好適な試薬を第１の流れチャンバに提供することと、（ｉｖ）一掃することとを含む流れ周期を提供し、合成が完了するまでこの周期を繰り返し、（ｂ）第２の流れチャンバが、（ｉ）第３のタイプのヌクレオチドを付加するのに好適な試薬を第２の流れチャンバに提供することと、（ｉｉ）一掃することと、（ｉｉｉ）第４の異なるタイプのヌクレオチドを付加するのに好適な試薬を第２の流れチャンバに提供することと、（ｉｖ）一掃することとを含む流れ周期を提供し、合成が完了するまでこの周期を繰り返し、ヌクレオチドが、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＧＴＰから選択され、配列が、次の所望のヌクレオチドが提供されている流れチャンバ内へＤＮＡの第１の末端（たとえば、３’末端）を誘導することによって制御される、上記いずれかの方法。
１．１５．ポリマーがＤＮＡであり、ナノポアチップが、ｄＡＴＰを付加するための１つまたは複数の付加チャンバと、ｄＴＴＰを付加するための１つまたは複数の付加チャンバと、ｄＣＴＰを付加するための１つまたは複数の付加チャンバと、ｄＧＴＰを付加するための１つまたは複数の付加チャンバとを備える、上記いずれかの方法。
１．１６．合成されたポリマー［たとえば、核酸］がそれぞれ、第２の末端を介してナノポア近傍の表面に結合される、上記いずれかの方法。
１．１７．ポリマー［たとえば、核酸］の配列が、ポリマーがナノポアを通過するときに電位、電流、抵抗、キャパシタンス、および／またはインピーダンスの変化を検出することによって、各周期後に判定される、上記いずれかの方法。
１．１８．ポリマーが核酸であり、核酸の合成が、緩衝溶液、たとえばｐＨ７〜８．５、たとえば約ｐＨ８に対するバッファー、たとえばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、好適な酸、ならびに適宜、キレート化剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むバッファー、たとえばトリス塩基、酢酸、およびＥＤＴＡの混合物を含有するＴＡＥバッファー、またはトリス塩基、ホウ酸、およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＢＥバッファーを含む溶液、たとえばｐＨ７．９＠２５℃で１０ｍＭのトリスｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＫＣｌ、またはたとえば、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウムを含む溶液中で行われる、上記いずれかの方法。
１．１９．ポリマーが一本鎖ＤＮＡであり、合成された一本鎖ＤＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換することをさらに含む、上記いずれかの方法。
１．２０．ポリマーの合成が完了した後、ポリマー［たとえば、核酸］をナノチップから除去することをさらに含む、上記いずれかの方法。
１．２１．ポリマーが核酸であり、適当なプライマーおよびポリメラーゼ（たとえば、Ｐｈｉ２９）を使用して、合成された核酸のコピーを増幅して回収することをさらに含む、上記いずれかの方法。
１．２２．ポリマーが核酸であり、合成された核酸を制限酵素によって開裂し、核酸をナノチップから除去することをさらに含む、上記いずれかの方法。
１．２３．ポリマーが核酸であり、そのように合成された核酸を増幅することをさらに含む、上記いずれかの方法。
１．２４．ポリマー［たとえば、核酸］をナノチップから除去し、ポリマーを結晶化することをさらに含む、上記いずれかの方法。
１．２５．ポリマーが核酸であり、たとえば参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第８２８３１６５（Ｂ２）号に記載されているように、たとえばバッファー（たとえば、ホウ酸塩バッファー）、抗酸化剤、湿潤剤、たとえばポリオール、および適宜、キレート化剤のうちの１つもしくは複数とともに核酸を含む溶液を乾燥させることによって、または核酸とポリ（エチレングリコール）−ポリ（ｌ−リシン）（ＰＥＧ−ＰＬＬ）ＡＢ型ブロック共重合体などのポリマーとの間にマトリックスを形成することによって、または相補形の核酸鎖またはＤＮＡに結合するタンパク質の付加によって、核酸を安定化させることをさらに含む、上記いずれかの方法。
１．２６．
（ｉ）核酸の３’末端への３’保護ヌクレオチドの付加に触媒作用を与えるポリメラーゼの存在下において、付加チャンバ内で３’保護ヌクレオチドと核酸を反応させることと、
（ｉｉ）少なくともこのように得られた３’保護核酸の３’末端を付加チャンバから、少なくとも１つのナノポアを通って、予備チャンバに引き込むことであって、ポリメラーゼがナノポアを通過することが妨げられる（たとえば、そのサイズのため、または第１のチャンバ内で基質に係留されているため）、引き込むことと、
（ｉｉｉ）３’保護核酸を、たとえば化学的または酵素学的に脱保護することと、
（ｉｖ）追加の３’保護ｄＮＴＰがオリゴヌクレオチドに付加されることが所望される場合、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）が繰り返されるように、オリゴヌクレオチドの３’末端を同じまたは異なる付加チャンバに引き込み、またはそのように所望されない場合、所望の３’保護ｄＮＴＰが付加チャンバに提供されるさらなる周期まで、核酸の３’末端が予備チャンバ内に留まることを可能にすることと、
（ｖ）所望の核酸配列が得られるまで、工程（ｉ）〜（ｉｖ）の周期を繰り返すこととを含む、上記いずれかの方法。
１．２７．ポリマーが核酸一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であり、１つまたは複数のナノポアが、ｓｓＤＮＡが通過することを可能にするが二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）が通過することは可能にしない直径、たとえば約２ｎｍの直径を有する、上記いずれかの方法。
１．２８．モノマーが、３’保護ヌクレオチド、たとえばデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）であり、たとえばデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）から選択され、たとえばｄＡＴＰまたはｄＣＴＰである、上記いずれかの方法。
１．２９．ポリマーが核酸であり、核酸へのヌクレオチドの付加が、ポリメラーゼ、たとえば鋳型非依存ポリメラーゼ、たとえばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、またはポリヌクレオチドホスホリラーゼによる触媒作用を受け、たとえばポリメラーゼが、ＤＮＡの３’ヒドロキシル終端におけるデオキシヌクレオチドの組込みに触媒作用を与える、上記いずれかの方法。
１．３０．膜が、多数のナノポアと、それぞれナノポア近傍で表面に結合された多数のポリマー、たとえばそれぞれ５’末端を介してナノポアの近傍で表面に結合された多数の核酸とを含む、上記いずれかの方法。
１．３１．それぞれナノポア近傍で表面に結合された多数のポリマー、たとえばそれぞれ５’末端においてナノポア近傍で表面に結合された多数の核酸が、独立して合成され、各ナノポアが、関連する１対の電極を有し、この対の一方の電極が、ナノポアの一方の末端の近傍に位置し、他方の電極が、ナノポアの他方の末端の近傍に位置し、したがって１対の電極によって提供される電流によって、各ポリマーを第１のチャンバと第２のチャンバとの間で独立して動かすことができる、上記いずれかの方法。
１．３２．ポリマーが、５’末端においてナノポア近傍で表面に結合された３’保護核酸であり、電気力を使用することによって、たとえば近接するチャンバ内の電極から印加される電気力を使用することによって、３’保護核酸の３’末端がナノポアに引き込まれる、上記いずれかの方法。
１．３３．新しい３’保護ｄＮＴＰが、第１の３’保護ｄＮＴＰと同じまたは異なる、方法１．２０。
１．３４．この周期の工程（ｉ）で使用される３’保護ｄＮＴＰが、各周期によって、３’保護ｄＡＴＰと３’保護ｄＣＴＰとの間で交互になる、方法１．２０。
１．３５．ポリマーが核酸（ｎｕｃｅｉｃ  ａｃｉｄ）であり、核酸の脱保護が、ｓｓＤＮＡ上の３’保護基を除去するが３’保護ｄＮＴＰ上では除去しない酵素によって実施される、上記いずれかの方法。
１．３６．ナノポアを通過するときにポリマーの配列を検出して所望の配列が合成されたことを立証する工程をさらに含む、上記いずれかの方法。
１．３７．ＤＮＡがナノポアに引き込まれるときに共振ＲＦ回路内の容量分散を測定することによって、ナノポアを通過するときにポリマーの配列を検出して所望の配列が合成されたことを立証する工程を含む、上記いずれかの方法。
１．３８．１つまたは複数のモノマーまたはオリゴマーを荷電ポリマーに付加するための試薬が、トポイソメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、またはこれらの組合せから選択された試薬を含む、上記いずれかの方法。
１．３９．荷電ポリマーへの１つまたは複数のモノマーまたはオリゴマーの付加が、以下に参照する方法２または以下に参照する方法Ａのいずれかによって実施される、上記いずれかの方法。
【０１１５】
たとえば、本発明は、少なくとも１つのナノポアを含む膜によって分離された少なくとも第１のチャンバおよび第２のチャンバを備えるナノチップ内で核酸を合成する方法を提供し、合成は、第１の末端および第２の末端を有する核酸の第１の末端へのヌクレオチドの付加周期によって、緩衝溶液内で実施され、核酸の第１の末端が、１つまたは複数の付加チャンバ（ヌクレオチドを付加することが可能な試薬を収容する）と、１つまたは複数の予備チャンバ（ヌクレオチドを付加するために必要な試薬を収容しない）との間で電気的引力によって動かされ、これらのチャンバが、それぞれ１つまたは複数のナノポアを含む１つまたは複数の膜によって分離され、ナノポアが、核酸の通過を可能にするのに十分に大きいが、本質的にヌクレオチドを付加するための少なくとも１つの試薬の通過を可能にするには小さすぎ、たとえばこの方法は、以下に参照する方法１のいずれかに対応する。
【０１１６】
たとえば、ナノポアに基づくデバイス内で少なくとも２つの別個のモノマーまたはオリゴマーを含む荷電ポリマーを合成するたとえば以下に参照する方法１のいずれかによる方法である方法１Ａであって、ナノポアに基づくデバイスは、
１つの反応周期において単一のモノマーまたはオリゴマーのみを付加することができるように、１つまたは複数のモノマーまたはオリゴマーを荷電ポリマーにブロック形態で付加するための緩衝溶液および試薬を収容する１つまたは複数の付加チャンバまたはチャネルと、
荷電ポリマーにブロック形態で付加された１つまたは複数のモノマーまたはオリゴマーからブロッカ基（ｂｌｏｃｋｅｒ  ｇｒｏｕｐ）を除去する緩衝溶液およびデブロック試薬を収容する１つまたは複数のデブロックチャンバまたはチャネルとを備え、
付加チャンバまたはチャネルが、１つまたは複数のナノポアを含む１つまたは複数の膜によってデブロックチャンバから分離され、
荷電ポリマーはナノポアを通過することができ、１つまたは複数のモノマーまたはオリゴマーの付加のための試薬のうちの少なくとも１つはナノポアを通過することができず、デブロック試薬の少なくとも１つが、ナノポアを通過することができず、
この方法は、
ａ．第１の末端および第２の末端を有する荷電ポリマーの第１の末端を、電気的引力によって付加チャンバまたはチャネル内へ動かし、それによってモノマーまたはオリゴマーが前記第１の末端にブロック形態で付加されることと、
ｂ．荷電ポリマーの第１の末端を付加されたモノマーまたはオリゴマーとともにブロック形態で予備チャンバ内へ動かし、それによって付加されたモノマーまたはオリゴマー上の保護基が除去されることと、
ｃ．所望のポリマー配列が得られるまで、工程ａおよびｂを繰り返すことであって、工程ａ）で付加されるモノマーまたはオリゴマーは同じまたは異なる、繰り返すこととを含み、
たとえば、デバイスが、第１のタイプのモノマーまたはオリゴマーを付加するのに好適な試薬を収容する１つまたは複数の第１の付加チャンバまたはチャネルと、第２の異なるタイプのモノマーまたはオリゴマーを付加するのに好適な試薬を収容する１つまたは複数の第２の付加チャンバとを備え、工程ａで、荷電ポリマーの第１の末端が、第１のタイプのモノマーまたはオリゴマーを付加することが所望されるか、それとも第２の異なるタイプのモノマーまたはオリゴマーを付加することが所望されるかに応じて、第１の付加チャンバまたは第２の付加チャンバ内へ動かされる。
【０１１７】
特定の実施形態では、ポリマーの配列は、バイナリコードに対応し、たとえばポリマーは核酸であり、配列はバイナリコードに対応し、各ビット（０または１）が、塩基、たとえばＡまたはＣによって表される。
【０１１８】
特定の実施形態では、ポリマーはＤＮＡである。
【０１１９】
特定の他の実施形態では、各ビットは、単一のモノマーではなく短い配列のモノマーによって表される。たとえば、１つのそのような実施形態では、ＤＮＡの基が合成され、各基は、ナノポアを介して固有の信号を生成し、０または１に対応する。この実施形態には、単一のヌクレオチドはナノポア、特に固体ナノポア内で検出するのがより困難であり、したがってブロックを使用すると、それに対応してポリマー内の情報密度が低減されるが、読取り誤差を受けにくいという特定の利点がある。
【０１２０】
たとえば、部位特異的リコンビナーゼ、すなわち部位特異的再結合配列として知られている配列セグメント内で核酸の二本鎖のうちの少なくとも１つの鎖を自発的に認識および開裂する酵素を使用して、（二本鎖）ヌクレオチドのブロックを付加することができる。１つのそのような実施形態では、部位特異的リコンビナーゼは、トポコンジュゲートｄｓＤＮＡオリゴヌクレオチド基（ｔｏｐｏ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｄｓＤＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｂｌｏｃｋ）を配列にライゲーションするために使用されるトポイソメラーゼである。これらのオリゴヌクレオチド自体は、制限酵素によって開裂されるまで、さらなるライゲーションに適合している構造を有していない。ワクシニアウイルストポイソメラーゼＩは特に、ＤＮＡ配列５’−（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴ−３’を認識する。トポイソメラーゼは、二本鎖ＤＮＡに結合し、５’−（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴ−３’開裂部位でそれを開裂する。トポイソメラーゼは一方の鎖上のＤＮＡのみを開裂する（ただし、他方の鎖上に近くの切れ目を有することで、ある種の二本鎖切断を引き起こす）ため、開裂は完全でなく、開裂するとき、トポイソメラーゼは、３’ヌクレオチドの３’リン酸に共有結合によって取り付けられることに留意されたい。このとき酵素は、ＤＮＡの３’末端に共有結合されたままであり、最初に開裂（ＤＮＡ弛緩中）されたのと同じ結合において共有結合によって保持された鎖に再度ライゲーションすることができ、または適合しているオーバーハングを有する非相同のアクセプタＤＮＡに再度ライゲーションして組換え分子を生成することができる。この実施形態では、本発明者らは、トポイソメラーゼ再結合部位と、トポイソメラーゼライゲーション部位を生成する制限部位とによって挟まれたｄｓＤＮＡドナーオリゴヌクレオチド（たとえば、一方が「０」、他方が「１」に対する少なくとも２つの異なる配列のうちの１つを含む）を生成した。カセットはトポ充填（Ｔｏｐｏ−ｃｈａｒｇｅｄ）されており、すなわちトポイソメラーゼに共有結合されており、それによりレシーバ（ｒｅｃｅｉｖｅｒ）オリゴヌクレオチド上のトポイソメラーゼライゲーション部位に結合される。レシーバの成長しているＤＮＡ鎖は、制限酵素によって開裂されたとき、トポ充填カセットにライゲーションすることが可能になる。したがって、成長しているＤＮＡを制限酵素からトポ充填カセットへ連続して循環させるだけでよく、各周期が別のドナーオリゴヌクレオチドを付加する。クローニングに対する関連手法が記載されている。たとえば内容が参照により組み込まれている、Shuman S., Novel approach to molecular cloning and polynucleotide synthesis using vaccinia DNA topoisomerase. J Biol Chem. (1994); 269(51):32678-84を参照されたい。
【０１２１】
類似の方策を使用して、単一の塩基を付加することができる。好適な一本鎖「脱保護」「アクセプタ」ＤＮＡの存在下で、トポ充填ＤＮＡがトポイソメラーゼによってアクセプタに酵素によってかつ共有結合によってライゲート（「付加」）され、このプロセスにおいて、ＤＮＡから除去される。このときＩＩＳ型制限酵素が、単一の塩基（「付加」されている塩基）を除いて、付加されたＤＮＡのすべてを開裂することができる。脱保護−付加のこのプロセスを繰り返して、追加の塩基（ビット）を付加することができる。本明細書に実施例で実証するように、トポ／ＩＩＳ型制限酵素の組合せを使用して、単一のヌクレオチドを標的一本鎖ＤＮＡの５’末端に付加することが実行可能である。ＩＩＳ型制限酵素の使用により、認識配列とは異なる位置におけるＤＮＡの開裂が可能になる（他のＩＩＳ型制限酵素は、https://www.neb.com/tools-and-resources/selectioncharts/type-iis-restriction-enzymesに見ることができる）。このシステムにおけるイノシン（「ユニバーサル塩基」として作用し、任意の他の塩基と対をなす）の使用により、標的ＤＮＡ内でいかなる特有の配列要件もなしでこの反応を生じさせることが可能になる。一本鎖標的ＤＮＡに付加されるヌクレオチドの同一性は、ワクシニアトポイソメラーゼが３’リン酸を介してコンジュゲートする３’ヌクレオチドである。ワクシニアトポイソメラーゼの認識配列は（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴであるため、本発明者らは、このシステムを使用して標的ＤＮＡに「Ｔ」を付加した。関連するトポイソメラーゼ、ＳＶＦが、認識配列ＣＣＣＴＧを使用することができる（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8661446）。したがってＳＶＦを使用して、「Ｔ」の代わりに「Ｇ」を付加することができる。ワクシニアトポと対にすることで、バイナリデータをＴおよびＧで符号化することができる。
【０１２２】
単一塩基の付加に対する別の手法では、５’リン酸が保護基を提供して、３’から５’の方向において単一塩基の付加を提供する。充填反応により、５’リン酸基を有する単一のＴ（もしくはＧ、または所望される場合は他のヌクレオチド）をトポイソメラーゼに充填する。充填されたトポイソメラーゼは、遊離５’非ブロック（非リン酸化）一本鎖ＤＮＡ鎖を「見る」と、その鎖にＴを付加し、５’にＴが付加されたＤＮＡを提供する。この付加は、トポイソメラーゼおよび一本鎖アクセプタＤＮＡが結合することができる配列を有するアダプタＤＮＡの存在によって容易になる（アダプタＤＮＡは触媒作用的であり、反応の繰返しにおいて鋳型として再び使用することができることに留意されたい）。付加されたヌクレオチドは、５’リン酸を有し、したがって５’リン酸を除去するホスファターゼに露出されるまで、さらなる付加に対する基質にはならない。このプロセスは、ワクシニアトポイソメラーゼを使用して単一の「Ｔ」を標的一本鎖ＤＮＡの５’末端に付加し、ＳＶＦトポイソメラーゼを使用して単一の「Ｇ」を付加することによって繰り返され、したがってＴおよびＧによりバイナリ情報を符号化する配列の構造が可能になる。ＡまたはＣを付加するために他のトポイソメラーゼを使用することもできるが、この反応はそれほど効率的でない。
【０１２３】
トポイソメラーゼが充填されたとき、充填された生成物と充填されていない生成物との混合が生じ、これは２つの種の間の平衡状態を表す。トポイソメラーゼが離れる「オーバーハング」は、反応の効率を最適化するように、多くの方法で設計することができる。ＧＣを多量に含むオーバーハングは、より速い充填反応を有する傾向があるが、充填の平衡状態を有し、これはより低い生成収率をもたらす傾向がある。本発明者らは、「適切な」対ではなく、ある程度の塩基の不整合を有すること（またはイノシンを使用すること）で、「逆方向」の反応が減少し、収率が改善されることを見出した。また、ポリヌクレオチドキナーゼ（ＡＴＰを添加）の存在下で反応を実行することで、逆方向の反応率を減少させる反応「副生成物」のリン酸化によって、収率が改善される。特定の実施形態では、ナノポアを通過することができないように十分に大きいことを確実にするために、機能を損なわない追加のアミノ酸配列を付加することによって、トポイソメラーゼ酵素を「大型化」することができる。
【０１２４】
トポイソメラーゼ媒介方策を使用する１つの利点は、モノマーがトポイソメラーゼに共有結合によって取り付けられており、したがって「逃亡」して他の反応に干渉することができないことである。ポリメラーゼが使用されるとき、モノマーが放散する可能性があり、したがってポリメラーゼおよび／もしくはデブロック剤は特有（たとえば、Ａ対Ｃに対して選択的）であるべきであり、または別法として、モノマーは流れによって提供され、したがってモノマーが混合する機会がない。
【０１２５】
一態様では、本発明は、単一のヌクレオチドが充填されたトポイソメラーゼ、すなわち単一のヌクレオチドにコンジュゲートされたトポイソメラーゼを提供し、たとえばトポイソメラーゼは、ヌクレオチドの３’リン酸を介してコンジュゲートされ、ヌクレオチドは、５’位置で保護、たとえばリン酸化される。
【０１２６】
別の態様では、本発明は、３’から５’の方向で単一のヌクレオチドまたはオリゴマーをＤＮＡ鎖に付加することによって、トポイソメラーゼ媒介ライゲーションを使用してＤＮＡ分子を合成する方法（方法Ａ）であって、（ｉ）所望のヌクレオチドまたはオリゴマーが充填されたトポイソメラーゼとＤＮＡ分子を反応させることであって、ヌクレオチドまたはオリゴマーを５’末端におけるさらなる付加からブロックすることと、次いで（ｉｉ）そのように形成されたＤＮＡの５’末端をデブロックすることと、所望のヌクレオチド配列が得られるまで工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すこととを含む方法、たとえば以下を提供する。
Ａ１．１．３’から５’の方向に単一のヌクレオチドを付加することによってＤＮＡ分子を合成する方法であって、（ｉ）５’保護形態、たとえば５’リン酸化形態において、所望のヌクレオチドが充填されたトポイソメラーゼとＤＮＡ分子を反応させ、それによって５’保護形態の所望のヌクレオチドがＤＮＡの５’末端に付加されることと、次いで（ｉｉ）ホスファターゼ酵素の使用によって、そのように形成されたＤＮＡの５’末端を脱保護することと、所望のヌクレオチド配列が得られるまで工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すこととを含む方法Ａ、または
Ａ１．２．３’から５’の方向にオリゴマーを付加することによってＤＮＡ分子を合成する方法であって、（ｉ）所望のオリゴマーが充填されたトポイソメラーゼとＤＮＡ分子を反応させ、それによってオリゴマーをＤＮＡ分子にライゲーションすることと、次いで（ｉｉ）制限酵素を使用して、別のオリゴマーに対するトポイソメラーゼ媒介ライゲーションのための５’部位を提供することと、所望のオリゴマー配列が得られるまで工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すこととを含む方法Ａ。
Ａ１．３．リガーゼおよびＡＴＰを提供して、ＤＮＡ内の切れ目を封止することを含む［注：トポイソメラーゼライゲーションは１つの鎖のみをライゲーションする］、上記いずれかの方法。
Ａ１．４．トポイソメラーゼ充填ドナーオリゴヌクレオチドが、トポイソメラーゼを有する鎖に相補形の鎖上に５’オーバーハングを含み、ポリイノシン配列を構成する［注：イノシンが「ユニバーサル塩基」として作用し、任意の他の塩基と対をなす］、上記いずれかの方法。
Ａ１．５．制限酵素が、単一の塩基（「付加」されている塩基）を除いて、すべての付加されたＤＮＡを開裂することができるＩＩＳ型制限酵素である、上記いずれかの方法。
Ａ１．６．トポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｓｉｏｍｅｒａｓｅ）が、ワクシニアトポイソメラーゼおよびＳＶＦトポイソメラーゼＩから選択される、上記いずれかの方法。
Ａ１．７．たとえばバイナリコードを提供するために、ワクシニアトポイソメラーゼ（（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴを認識する）を使用して、ｄＴＴＰヌクレオチドを付加し、ＳＶＦトポイソメラーゼＩ（ＣＣＣＴＧを認識する）を使用して、ｄＧＴＰヌクレオチドを付加する、上記いずれかの方法。
Ａ１．８．ＤＮＡが二本鎖であり、予備チャンバが、トポイソメラーゼによってつながれていないＤＮＡ鎖を修復するために、リガーゼおよびＡＴＰをさらに含む、上記いずれかの方法。
Ａ１．９．トポイソメラーゼ阻害剤を使用して、ＤＮＡオリゴマーに対する自由なトポイソメラーゼの結合および活動を抑制することを含み、たとえば阻害剤は、ノボビオシンおよびクーママイシンから選択される、上記いずれかの方法。
Ａ１．１０．そのように提供されたＤＮＡ鎖が、チミジン（Ｔ）ヌクレオシドおよびデオキシグアノシン（ｄｅｏｘｙｇｕａｎｉｓｉｎｅ）（Ｇ）ヌクレオシドを含む配列を有する、上記いずれかの方法。
Ａ１．１１．トポイソメラーゼは、単一の塩基を付加するが、制限酵素は、トポイソメラーゼによって付加された塩基から５’方向に１ヌクレオチドの位置で開裂する、上記いずれかの方法。
Ａ１．１２．そのように提供されたＤＮＡ鎖が、「ＴＴ」および「ＴＧ」ジヌクレオチドの配列を含む配列を有する、上記いずれかの方法。
Ａ１．１３．ＤＮＡが一本鎖である、上記いずれかの方法。
Ａ１．１４．ＤＮＡが二本鎖である、上記いずれかの方法。
Ａ１．１５．ＤＮＡが基質または磁気ビーズ上にあり、所望の配列を提供するために必要とされる場合、選択的に試薬に露出しまたは試薬から除去することができる、上記いずれかの方法。
Ａ１．１６．ＤＮＡを付加またはデブロックする試薬の一部またはすべてが、流れによって供給され、フラッシングによって除去される、上記いずれかの方法。
Ａ１．１７．一本鎖ＤＮＡへの単一のヌクレオチドまたはオリゴマーの取付けは、トポイソメラーゼおよび一本鎖アクセプタＤＮＡを結合することができる配列を有するアダプタＤＮＡの存在によって容易にされる、上記いずれかの方法。
Ａ１．１８．たとえば以下に参照する方法２のいずれかに記載されているように、ナノポアが、トポイソメラーゼを含むチャンバを、ホスファターゼまたは制限酵素を含むチャンバから分離し、ナノポアが、酵素ではなく、電気的引力によるＤＮＡの運動を可能にする、システム内で実施される上記いずれかの方法。
【０１２７】
１つの起こりうる問題は、ポリＧ配列がＧカルテット二次構造を形成する可能性があることである。制限酵素を１塩基分（トポ配列の５’へ）戻し、類似のトポ／ＩＩＳ方策に従うことによって、「ＴＴ」または「ＴＧ」を付加することができ、それぞれ異なるビットを表すことができる。これには１ビットを符号化するために２つの塩基が必要とされるはずであるが、ポリＧ配列を回避するという利点がある。他の実施形態では、（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴほど効率的ではないが、トポ認識配列の３’末端における他の塩基により、（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＡ、（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＣ、および（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＧを有するポックスウイルストポイソメラーゼを使用して、コンジュゲーションを可能にすることができる（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17462694）。タンパク質工学／選択技法を使用して、これらの反応の効率を改善することができ、類似の手法を使用して、非正規の塩基を付加することができる。
【０１２８】
特定の実施形態では、この方法によってＤＮＡを合成する方法は、リガーゼおよびＡＴＰによってＤＮＡを処理することを含む。トポイソメラーゼは、ＤＮＡの一方の側だけをともにつなぎ合わせる（他方は本質的に切れ目が入っている）。リガーゼは、切れ目を修復し、トポイソメラーゼ自体が反応生成物を再切断して開裂しないことを確実にするはずである。
【０１２９】
特定の実施形態では、この方法は、トポイソメラーゼ阻害剤を使用して、ＤＮＡオリゴマーに対する自由なトポイソメラーゼの結合および活動を抑制することを含む。好適な阻害剤には、ノボビオシンおよびクーママイシンが含まれる。完全な阻害は望ましくなく、低レベルのトポイソメラーゼ活動は、コイルＤＮＡを「弛緩」させるのを助けることができ、これは長いＤＮＡ鎖を合成するときに特に有用であることに留意されたい。
【０１３０】
したがって、別の実施形態では、本開示は、ナノチップ内でＤＮＡを合成する方法（方法２）を提供し、ナノチップは、トポイソメラーゼ充填オリゴヌクレオチド（すなわち、３’末端でトポイソメラーゼに結合されたオリゴヌクレオチド）を収容する１つまたは複数の付加チャンバと、制限酵素またはデブロッカ、たとえばホスファターゼを含む１つまたは複数の予備チャンバとを備え、前記チャンバはまた、適合している緩衝溶液を収容し、少なくとも１つのナノポアを含む膜によって分離され、トポイソメラーゼおよび制限酵素は、ナノポアを通過することが防止され（たとえば、大きすぎるため、かつ／またはそれぞれ第１および第２のチャンバ内で基質に係留されているため）、この合成は、第１の末端および第２の末端を有する核酸の第１の末端に単一のヌクレオチドまたは短いオリゴヌクレオチドブロックを付加する周期によって実施され、核酸の第１の末端は、たとえば一実施形態では次のように、電気的引力によって付加チャンバと予備チャンバとの間を動かされ、この方法は、
（ｉ）電気力によって、レシーバＤＮＡ（たとえば、二本鎖ＤＮＡ）の５’末端を第１の付加チャンバ内へ動かすことと、
（ｉｉ）トポイソメラーゼ結合部位、情報配列（たとえば、少なくとも２つの異なるヌクレオチドまたは配列から選択され、たとえば一方の配列がバイナリコード内の「０」に対応し、他方が「１」に対応する）、および制限酵素によって開裂されるとトポイソメラーゼライゲーション部位をもたらす制限部位を含むトポイソメラーゼ充填ドナーオリゴヌクレオチドを、第１の付加チャンバ内に提供することと、
（ｉｉｉ）ドナーオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）がレシーバＤＮＡにライゲーションし、それによってレシーバＤＮＡを延ばすのに十分な時間を可能にすることと、
（ｉｖ）電気力によって、そのように延ばされたレシーバＤＮＡの５’末端を予備チャンバ内へ動かし、たとえばしたがって、制限酵素がレシーバＤＮＡを開裂して、トポイソメラーゼライゲーション部位を提供し、または単一のヌクレオチドの付加の場合、デブロッカ、たとえばホスファターゼが、一本鎖ＤＮＡ上に５’非ブロックヌクレオチドを生成することと、
（ｖ）１つまたは複数の所望のＤＮＡ配列が得られるまで、工程（ｉ）〜（ｉｖ）の周期を繰り返し、同じまたは異なる情報配列を有するオリゴヌクレオチドを付加することとを含む。
【０１３１】
たとえば、本発明は以下を提供する。
２．１．レシーバＤＮＡの３’末端が、ナノポア近傍に取り付けられ、レシーバオリゴヌクレオチドの５’末端が、トポイソメラーゼライゲーション部位を含んでおり、工程（ｉｖ）の後、第１の付加チャンバを一掃し、前のドナーオリゴヌクレオチドとは異なる情報配列を有する新しいトポイソメラーゼ充填ドナーオリゴヌクレオチドを、第１の付加チャンバに提供することによって、レシーバＤＮＡの５’末端に追加のオリゴヌクレオチドを付加することと、新しいドナーオリゴヌクレオチドがレシーバＤＮＡに付加されることが所望される場合、レシーバ核酸の５’末端を第１のチャンバ内へ引き戻すことと、所望のドナーオリゴヌクレオチドが第１のチャンバに提供されるまで、工程（ｉ）〜（ｉｉｉ）を繰り返し、またはそのように所望されない場合、レシーバＤＮＡが第２のチャンバ内に留まることを可能にすることとを含む、方法２。
２．２．多数のレシーバＤＮＡ分子が独立して並行して合成され、したがって第１のチャンバ内に存在するかどうかを別個に制御することによって、異なる配列を有するＤＮＡ分子が得られる、上記いずれかの方法。
２．３．それぞれ３’末端においてナノポア近傍で表面に結合された多数のレシーバＤＮＡ分子が独立して合成され、各ナノポアが、関連する１対の電極を有し、この対の一方の電極が、ナノポアの一方の末端の近傍に位置し、他方の電極が、ナノポアの他方の末端の近傍に位置し、したがって１対の電極によって提供される電流によって、各レシーバＤＮＡ分子を第１のチャンバと第２のチャンバとの間で独立して動かすことができる、上記いずれかの方法。
２．４．この周期の工程（ｉ）で使用されるドナーオリゴヌクレオチドが、第１の情報配列を含むドナーオリゴヌクレオチドと、第２の情報配列を含むドナーオリゴヌクレオチドとの間で周期ごとに交互になる、上記いずれかの方法。
２．５．レシーバＤＮＡの５’末端を第１の付加チャンバに戻して、同じ情報配列を有するオリゴヌクレオチドを付加することによって、または３’末端でトポイソメラーゼに結合されたドナーオリゴヌクレオチドを有する第２の付加チャンバへレシーバＤＮＡの５’末端を動かすことによって、レシーバＤＮＡの５’末端に追加のオリゴヌクレオチドを付加する工程を含み、第２の付加チャンバ内のドナーオリゴヌクレオチドは、第１の付加チャンバ内のドナーオリゴヌクレオチドとは異なる情報配列を有する、方法２。
２．６．ドナーオリゴヌクレオチドは、以下のような構造を含み、
【化１】
2020502494.tif 000005
ここで、Ｎは任意のヌクレオチドを指し、制限酵素はＡｃｃ１であり、適当なオーバーハングを提供するためにＤＮＡ（たとえば、上記の配列でＧＴＣＧＡＣ）を切断することができる、上記いずれかの方法。
２．７．ドナーオリゴヌクレオチドが、ヘアピン構造、たとえば２．６を有し、上鎖および下鎖上のＮＮＮＮＮ基がつながれている、上記いずれかの方法。
２．８．トポイソメラーゼ充填オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、次のような構造を有する、
【化２】
2020502494.tif 000006
上記いずれかの方法。
２．９．トポイソメラーゼ充填オリゴヌクレオチドの少なくとも１つが、次のような構造を有する、
【化３】
2020502494.tif 000007
上記いずれかの方法。
２．１０．トポイソメラーゼ充填オリゴヌクレオチド、前述した方法。
２．１１．合成されたＤＮＡの配列が、オリゴヌクレオチドがナノポアを通過するときに電位、電流、抵抗、キャパシタンス、および／またはインピーダンスの変化を検出することによって、各周期後に判定される、上記いずれかの方法。
２．１２．ＤＮＡの合成が、緩衝溶液、たとえばｐＨ７〜８．５、たとえば約ｐＨ８に対するバッファー、たとえばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、好適な酸、ならびに適宜、キレート化剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むバッファー、たとえばトリス塩基、酢酸、およびＥＤＴＡの混合物を含有するＴＡＥバッファー、またはトリス塩基、ホウ酸、およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＢＥバッファーを含む溶液、たとえばｐＨ７．９＠２５℃で１０ｍＭのトリスｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＫＣｌ、またはたとえば、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウムを含む溶液中で行われる、上記いずれかの方法。
２．１３．ＤＮＡをナノチップから除去することをさらに含む、上記いずれかの方法。
２．１４．そのように合成されたＤＮＡを増幅することをさらに含む、上記いずれかの方法。
２．１５．ＤＮＡをナノチップから除去し、ＤＮＡを結晶化することをさらに含む、上記いずれかの方法。
２．１６．たとえば参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第８２８３１６５（Ｂ２）号に記載されているように、たとえばバッファー（たとえば、ホウ酸塩バッファー）、抗酸化剤、湿潤剤、たとえばポリオール、および適宜、キレート化剤のうちの１つもしくは複数とともにＤＮＡを含む溶液を乾燥させることによって、または核酸とポリ（エチレングリコール）−ポリ（ｌ−リシン）（ＰＥＧ−ＰＬＬ）ＡＢ型ブロック共重合体などのポリマーとの間にマトリックスを形成することによって、ＤＮＡを安定化させることをさらに含む、上記いずれかの方法。
２．１７．リガーゼおよびＡＴＰを提供して、ＤＮＡ内の切れ目を封止することを含む［注：トポイソメラーゼライゲーションは１つの鎖のみをライゲーションする］、上記いずれかの方法。
２．１８．トポイソメラーゼ充填ドナーオリゴヌクレオチドが、トポイソメラーゼを有する鎖に相補形の鎖上に５’オーバーハングを含み、ポリイノシン配列を構成する［注：イノシンが「ユニバーサル塩基」として作用し、任意の他の塩基と対をなす］、上記いずれかの方法。
２．１９．制限酵素が、単一の塩基（「付加」されている塩基）を除いて、すべての付加されたＤＮＡを開裂することができるＩＩＳ型制限酵素である、上記いずれかの方法。
２．２０．トポイソメラーゼが、ワクシニアトポイソメラーゼおよびＳＶＦトポイソメラーゼＩから選択される、上記いずれかの方法。
２．２１．たとえばバイナリコード情報を提供するために、ワクシニアトポイソメラーゼ（（Ｃ／Ｔ）ＣＣＴＴを認識する）を使用して、ｄＴＴＰヌクレオチドを付加し、ＳＶＦトポイソメラーゼＩ（ＣＣＣＴＧを認識する）を使用して、ｄＧＴＰヌクレオチドを付加する、上記いずれかの方法。
２．２２．予備チャンバが、トポイソメラーゼによってつながれていないＤＮＡ鎖を修復するために、リガーゼおよびＡＴＰをさらに含む、上記いずれかの方法。
２．２３．トポイソメラーゼ阻害剤を使用して、ＤＮＡオリゴマーに対する自由なトポイソメラーゼの結合および活動を抑制することを含み、たとえば阻害剤は、ノボビオシンおよびクーママイシンから選択される、上記いずれかの方法。
２．２４．そのように提供されたＤＮＡ鎖が、チミジン（Ｔ）ヌクレオシドおよびデオキシグアノシン（Ｇ）ヌクレオシドを含む配列を有する、上記いずれかの方法。
２．２５．トポイソメラーゼは、単一の塩基を付加するが、制限酵素は、トポイソメラーゼによって付加された塩基から５’方向に１ヌクレオチドの位置で開裂する、上記いずれかの方法。
２．２６．そのように提供されたＤＮＡ鎖が、「ＴＴ」および「ＴＧ」ジヌクレオチドの配列を含む配列を有する、上記いずれかの方法。
２．２７．３’から５’の方向に単一のヌクレオチドを付加することによってＤＮＡ分子を合成する方法であって、（ｉ）５’保護形態、たとえば５’リン酸化形態において、所望のヌクレオチドが充填されたトポイソメラーゼとＤＮＡ分子を反応させ、それによって５’保護形態の所望のヌクレオチドがＤＮＡの５’末端に付加されることと、次いで（ｉｉ）ホスファターゼ酵素の使用によって、そのように形成されたＤＮＡの５’末端を脱保護することと、所望のヌクレオチド配列が得られるまで工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すこととを含む、上記いずれかの方法。
２．２８．３’から５’の方向にオリゴマーを付加することによってＤＮＡ分子を合成する方法であって、（ｉ）所望のオリゴマーが充填されたトポイソメラーゼとＤＮＡ分子を反応させ、それによってオリゴマーをＤＮＡ分子にライゲーションすることと、次いで（ｉｉ）制限酵素を使用して、別のオリゴマーに対するトポイソメラーゼ媒介ライゲーションのための５’部位を提供することと、所望のヌクレオチド配列が得られるまで工程（ｉ）および（ｉｉ）を繰り返すこととを含む、上記いずれかの方法。
２．２９．以下に参照する方法Ａのいずれかによる方法である、上記いずれかの方法。
【０１３２】
合成反応の生成物は、検出し、品質管理の目的で再調査し、ポリマー上に符号化されたデータを抽出するために読み取ることができる。たとえば、ＤＮＡは、ナノポア配列決定が強固であることを立証する従来の手段によって、増幅および配列決定することができる。
【０１３３】
別の実施形態では、本発明は、トポイソメラーゼ結合部位、情報配列（たとえば、少なくとも２つの異なる配列から選択され、たとえば一方の配列がバイナリコード内の「０」に対応し、他方が「１」に対応する）、および制限酵素によって開裂されるとトポイソメラーゼライゲーション部位をもたらす制限部位を含むオリゴヌクレオチド（ｏｌｉｇｏｎｕｌｃｅｏｔｉｄｅ）を提供し、たとえば、以下の配列を含む。
【化４】
2020502494.tif 000008
ここで、情報配列ＡまたはＢは、３〜１２、たとえば約８つのヌクレオチドからなる配列である。
【０１３４】
別の実施形態では、本発明は、トポイソメラーゼ充填オリゴヌクレオチドを提供し、オリゴヌクレオチドは、トポイソメラーゼ結合部位、情報配列（たとえば、少なくとも２つの異なる配列から選択され、たとえば一方の配列がバイナリコード内の「０」に対応し、他方が「１」に対応する）、および制限酵素によって開裂されるとトポイソメラーゼライゲーション部位をもたらす制限部位を含み、たとえばトポイソメラーゼ充填オリゴヌクレオチドは、以下の構造を有する。
【化５】
2020502494.tif 000009
ここで、情報配列ＡまたはＢは、３〜１２、たとえば約８つのヌクレオチドからなる配列であり、＊は、オリゴヌクレオチドに共有結合されたトポイソメラーゼであり、たとえばトポイソメラーゼは、ワクシニアウイルストポイソメラーゼＩである。
【０１３５】
特定の実施形態では、ナノポアチップは、たとえば、コンピュータ化されたチップコントローラを使用して、以下に参照する方法１、以下に参照する方法Ａ、または以下に参照する方法２のいずれかによる、ポリマーを合成しかつ／または読み取る方法を実施するように制御される。
【０１３６】
たとえば、図６５を参照すると、本開示のいくつかの実施形態に対するナノポアメモリチップの３チャンバのナノポアに基づくセル６５００（各セルは本明細書に上記で論じたものに類似している）からなる群の選択的な透明表面を有する部分斜視図が示されている。特に、４つの３チャンバセル６５０６、６５０８、６５１０、６５１２からなる群がともに接続されており、したがって接続されたセル６５０６〜６５１２のそれぞれの上部（または頂部）左チャンバ６５０２（Ａｄｄ「０」チャンバ）は、ともに流体的に接続されて、Ａｄｄ「０」流れチャネルまたはＡｄｄ「０」チャンバ６５０２を形成する。加えて、接続されたセル６５０６〜６５１２のそれぞれの上部（または頂部）右チャンバ６５０４（Ａｄｄ「１」チャンバ）もまた、ともに流体的に接続されて、別個のＡｄｄ「１」流れチャネルまたはＡｄｄ「１」チャンバ６５０４を形成する。加えて、Ａｄｄ「０」チャンバ（またはチャネル）６５０２は、共通の電極６５２０を有し、Ａｄｄ「１」チャンバ（またはチャネル）６５０４は、異なる共通の電極６５２２を有する。いくつかの実施形態では、各付加チャネルに対する共通の電極を提供する単一の金属性または伝導性ストリップが存在することができ、いくつかの実施形態では、チップ内の配線によって接続された別個の電極が存在することができる。
【０１３７】
集合的なＡｄｄチャネル６５０２、６５０４の下に、本明細書に上記で論じたものに類似の個々の「デブロック」チャンバ６５３０〜６５３６が存在し、これらはどちらも他のチャンバから流体的かつ電気的に隔離される。デブロックチャンバ６５３０〜６５３６のそれぞれの底部には、対応する個々に制御可能な「デブロック」電極が存在し、たとえば図６５に見られるデブロック電極６５１４、６５１６が、それぞれデブロックチャンバ６５３４、６５３６に対応する。また、セル６５０６〜６５１２に対する上部チャンバはそれぞれ、膜６５２９を通る対応するナノポア６５２８を有する。またこの例では、流体セル６５１２は、左頂部Ａｄｄ「０」チャンバ６５３７および右頂部Ａｄｄ「１」チャンバ６５３９を有する。流体セル６５０２〜６５１２に対するＡｄｄ「０」チャンバは、流体チャネル６５０２を介して流体的に接続され、流体セル６５０２〜６５１２に対するＡｄｄ「１」チャンバは、流体チャネル６５０４を介して流体的に接続され、流体セル６５０６〜６５１２はそれぞれ、独立したメモリ記憶列（たとえば、ＤＮＡまたはポリマー）６５５０を有し、その一方の末端は、ナノポア６５５０を横断してＡｄｄ「１」またはＡｄｄ「０」チャンバに入り、（この例では）他のチャンバから流体的かつ電気的に隔離されているその対応するデブロックチャンバ６５３０〜６５３６に戻る。したがって、３チャンバの流体セル６５０６〜６５１２はそれぞれ、独立したメモリ記憶セルまたはメモリセルを表す（以下でさらに論じる）。
【０１３８】
図６５の構成では、すべてのＡｄｄ「０」電極がともに接続され、別個にすべてのＡｄｄ「１」電極がともに接続され、デブロック電極が個々に制御されているとき、書込み（または付加）は、「０」を書き込む必要のあるすべてのセルに同時に書き込むことができるＡｄｄ「０」周期、それに続いて「１」を書き込む必要のあるすべてのセルにすべて同時に書き込むことができるＡｄｄ「１」周期など、書込み（または付加）「周期」において行うことができる。所望される場合、他のデータ書込み周期または手法を使用することもできる。
【０１３９】
加えて、Ａｄｄ「０」チャネル６５０２およびＡｄｄ「１」チャネル６５０４は、それぞれ矢印６５０３〜６５０５によって示されているように、前後から流体で充填する（または一掃し、もしくは洗い流し、もしくは空にする）ことができ、デブロックチャンバ６５３０〜６５３６は、それぞれ矢印６５４０〜６５４６によって示されているように、側面から流体で充填する（または一掃し、もしくは洗い流し、もしくは空にする）ことができる。すべてのＡｄｄ「１」チャンバを流体的かつ電気的に接続すること、またはすべてのＡｄｄ「０」チャンバを流体的かつ電気的に接続することは必要とされない。多数のチャンバがそのように接続された場合、効率が提供され、概して、接続されるセルが多ければ多いほど、さらなる効率を実現することができる。
【０１４０】
また、たとえばデブロックチャンバ６５３６内の点６５５２として示すように、ポリマー６５５０の一方の末端を中央のデブロックチャンバ６５３６の表面に結合（または係留もしくは取付け）することによって、ポリマー（もしくはＤＮＡ）または「列」もしくはメモリ列６５５０全体が中央のデブロックチャンバから完全に出ることを防止することができる。所望の機能および性能上の要件を満たすことを条件として、ポリマーを係留するために、デブロックチャンバ６５３６内の他の位置を使用することもできる。いくつかの実施形態では、構造６５５４、たとえばビーズ、粒子、もしくはオリガミ、または他の構造は、ポリマー６５５０の一方の末端に取り付けることができ、ポリマーがナノポア６５５０を通ってデブロックチャンバ６５３６を離れるのを防止することができる。類似の基準が、他のデブロックチャンバ６５３０〜６５３４内のポリマーメモリ列６５５０にも当てはまる。
【０１４１】
データを記憶するために使用されるポリマー６５５０は、本明細書に論じるように、ＤＮＡとすることができ、または本明細書に記載する特性を有する任意の他のポリマーもしくは他の材料とすることができる。本明細書では、データを記憶するために使用されるポリマー６５５０はまた、「メモリポリマー」または「メモリ列」と呼ぶこともできる（その列状の外観のため）。
【０１４２】
図６６を参照すると、本開示のいくつかの実施形態に対するナノポアメモリチップの３チャンバのナノポアに基づくセル６６００（各セルは本明細書に上記で論じたものに類似している）からなる群の選択的な透明表面を有する部分斜視図が示されている。特に、図６５と同様に、４つの３チャンバセル６６０６、６６０８、６６１０、６６１２からなる群がともに接続されており、したがって接続されたセル６６０６〜６６１２のそれぞれの上部（または頂部）左チャンバ６６０２（Ａｄｄ「０」チャンバ）は、ともに流体的に接続されて、Ａｄｄ「０」流れチャネル６６０２を形成する。加えて、接続されたセル６６０６〜６６１２のそれぞれの上部（または頂部）右チャンバ６６０４（Ａｄｄ「１」チャンバ）もまた、ともに流体的に接続されて、別個のＡｄｄ「１」流れチャネル６６０４を形成する。しかし、この実施形態では、セル６６０６〜６６１２に関連するＡｄｄ「０」チャンバは、別個の電極６６２０〜６６２６を有し、セル６６０６〜６６１２に関連するＡｄｄ「１」チャンバはまた、別個の電極６６３０〜６６３６を有する。この流体的な電極配置は、図２７に関して本明細書に上述および図示したものに類似している。いくつかの実施形態では、上部チャンバ（Ａｄｄ「０」およびＡｄｄ「１」）は、ＤＮＡの経路を制御しようとするときに近接するＡｄｄチャンバ間で起こりうる電気的クロストークを回避するために、互いから流体的に分離または隔離することができる。
【０１４３】
また、図６５に関して、電極は別個に制御されているが、デブロックチャンバは流体的に接続することができる。その場合、チャネル間にクロストークが生じる可能性があり、たとえば近くのＤＮＡが電界によって引き付けられ、かつ／または近接するセルによって電流の流れが見られる可能性がある。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、電極は、セルの底部から立ち上がりまたはセル内へ下に突出する三角形または三角錐などの３Ｄ形状を有することができる。その場合、電極は、そのセルに対するナノポアにより標的を絞った、集束された、またはより密な電界を生じさせるように構築することができ、それにより流体的に接続されているが電気的に分離されている近接するセル間のクロストークを低減させることができる
【０１４５】
メモリ列（またはＤＮＡもしくはポリマー）がそのように長くなった場合、１つの付加チャンバから別のチャンバの頂部を通って巻き付く可能性がある。その問題を回避するために、流れチャネルに沿って近接するセル間に部分的な壁を配置して、近接するナノポア間の距離を長いＤＮＡに対してはるかに長くすることができる。
【０１４６】
Ａｄｄチャンバの下には共通の「デブロック」チャンバ６６４０が位置し、デブロックチャンバ６６４０は、本明細書に上記で論じたものと同様に、すべての上部Ａｄｄチャンバに共通している。共通のデブロックチャンバ６５４０の底部には、共通のデブロック電極６６４２が位置する。また、セル６６０６〜６６１２に対する上部チャンバはそれぞれ、膜６５２９を通って、本明細書に上記で論じたものに類似のナノポア６５２８を有することができる。
【０１４７】
加えて、デブロックチャンバ６５４０は、側面から流体で充填することができる（セルの構造上の構成に応じる）。いくつかの実施形態では、デブロックチャンバ６５４０は、矢印６６５０によって示されているように、左（または右側）から充填することができる。他の実施形態では、デブロックチャンバ６５４０は、矢印６６５２によって示されているように、前（または後）側から充填することができる。
【０１４８】
また、たとえばセル６６１２に対する点６５５２として示すように、ポリマー６５５０の一方の末端を中央のデブロックチャンバ６６４０の表面に結合（または係留）することによって、ＤＮＡまたはポリマー「列」（またはメモリ列）６５５０全体が中央のデブロックチャンバから完全に出ないようにすることができる。類似の配置は、他のセル６６０６〜６６１０にも当てはまるはずである。所望の機能および性能上の要件を満たすことを条件として、ポリマーを係留するために、他の位置を使用することもできる。
【０１４９】
図６７を参照すると、本開示の実施形態に対するナノポアに基づく「メモリチップ」６７００の概略回路ブロック図が示されている。特に、メモリチップ６７００は、複数のナノポアに基づく「メモリセル」６７０２（または「記憶セル」もしくは「データ記憶セル」）を有することができ、それぞれデータを記憶する能力を有する。「メモリセル」６７０２はそれぞれ、多チャンバのナノポアに基づく流体セル６７０４を有し、そのセル構造は、本明細書に上記で論じたものに類似している（たとえば、ナノポアを備えた膜と、「メモリ列」６５５０（たとえば、本明細書に論じるＤＮＡまたは他のポリマー）とを有する）。「メモリセル」６７０２はまた、任意の固体または半導体の受動または能動の回路またはチップ層または構成要素を含むことができ、これらは流体セル６７０４に接続されて、本明細書に記載するデータ記憶（もしくは書込みもしくは付加）および／またはデータ検索（もしくは読取りもしくは配列決定）の機能を提供する。
【０１５０】
メモリセル６７０２は、図６５に関して図示および説明するように、共通の流体「Ａｄｄ」チャネルおよび共通の「Ａｄｄ」電極、ならびに独立した「デブロック」チャンバを有する３チャンバセルのように、ともに（電気的かつ流体的に）接続することができる。所望される場合、本明細書に記載する任意の数のチャンバおよび任意のセル構成を使用することができる。
【０１５１】
「メモリセル」６７０２は、Ｍ行およびＮ列を有するＭ×Ｎのアレイとして構成することができ、セル６７０２はそれぞれ、ＣＭ，Ｎで示されている。より具体的には、第１の行内のセル６７０２は、Ｃ１，１〜Ｃ１，Ｎで示されており、最後の行内のセル６７０２は、ＣＭ，１〜ＣＭ，Ｎで示されている。ＭおよびＮは、所望の機能および性能を提供する任意の値とすることができ、Ｍ、Ｎはそれぞれ、メモリチップの所望の接地面積サイズおよび各メモリセルのサイズに応じて、わずか１から百万、１千万、１億、十億、または１兆、またはそれ以上の大きさとすることができる。
【０１５２】
メモリチップ６７００は、線６７１０を介してＡｄｄ「０」入力ＤＣ電圧を有し、これはＡｄｄ「０」電極のそれぞれに電気的に接続される（直接、または本明細書に記載するように、オンチップ回路もしくは構成要素を介して）。Ａｄｄ「０」入力ＤＣ電圧は、線６７１０を介して、Ａｄｄ「０」電極を所望の電圧状態（本明細書に論じる）に駆動して、メモリ列６５５０（本明細書に論じるＤＮＡまたは他のポリマー）を流体セル６７０４の所望のチャンバに位置決めする（または動かすもしくは操舵する）のを助ける。この構成では、図６５に示すように、各メモリセルに対するＡｄｄ「０」電極はすべて、共有されもしくは共通であり、または電気的に接続される。
【０１５３】
メモリチップ６７００はまた、線６７１２を介してＡｄｄ「１」入力ＤＣ電圧を有し、これはＡｄｄ「１」電極のそれぞれに電気的に接続される（直接、または本明細書に記載するように、オンチップ回路もしくは構成要素を介して）。Ａｄｄ「１」入力ＤＣ電圧は、線６７１０を介して、Ａｄｄ「１」電極を所望の電圧状態（本明細書に論じる）に駆動して、メモリ列６５５０（本明細書に論じるＤＮＡまたは他のポリマー）を流体セル６７０４の所望のチャンバに位置決めする（または動かすもしくは操舵する）のを助ける。この構成では、図６５に示すように、各メモリセルに対するＡｄｄ「１」電極６５２２はすべて、共有されまたは共通である。
【０１５４】
メモリチップ６７００はまた、複数の線（またはバス）６７１４を介して「Ｄｅｂｌｏｃｋ」入力ＤＣ電圧を有し、これらはそれぞれ、各セル６７０２内の対応する「デブロック」電極に電気的に接続される（直接、または本明細書に記載するように、オンチップ回路もしくは構成要素を介して）。デブロック入力ＤＣ電圧は、所与のセルに対する対応するデブロック電極を所望の電圧状態（本明細書に論じる）に駆動して、メモリ列６５５０（本明細書に論じるように、ＤＮＡまたは他のポリマー）を流体セル６７０４の所望のチャンバに位置決めする（または動かすもしくは操舵する）のを助ける。この構成では、図６５に示すように、デブロック電極はそれぞれ独立して駆動されており、したがって複数の電気的接続またはバス（またはデブロックバス）６７１４が必要とされる。メモリセル６７０２の各行には、対応する数のデブロック入力ＤＣ電圧線が提供されている。たとえば、第１の行では、１組のＮ本のデブロック線６７１６が、その行内のＮ個のセル６７０２に供給し、最後の行Ｍでは、別個の組のＮ本のデブロック線６７１８が、行Ｍ内のＮ個のセル６７０２に供給する
【０１５５】
本明細書では、ＤＣ入力電圧Ａｄｄ「０」、Ａｄｄ「１」、およびデブロックは、それぞれ線６７１０、６７１２、６７１４を介して、所望の結果を実現するために適当な時間にポリマーメモリ列を流体セル６７０４の適当なチャンバへ「操舵」するために、たとえばメモリ列上へ「０」もしくは「１」を書き込みまたは付加するため、または何もしないため、またはメモリ列を特定のチャンバへ動かして、データの書込みもしくは読取りを可能にするため、または認証試験を実行するためなどに使用されることから、ＤＣ「操舵」電圧ＶＳＴ（またはポリマーもしくはＤＮＡ操舵電圧またはメモリ列操舵電圧）と呼ぶことができる。ＤＣ入力電圧Ａｄｄ「０」、Ａｄｄ「１」、およびデブロックは、それぞれ線６７１０、６７１２、６７１４を介して、本明細書に記載するように、本明細書に記載する機能を実行するのに適当な論理を有するコンピュータに基づくコントローラ回路または論理またはデバイスから提供することができる。
【０１５６】
メモリチップ６７００はまた、それぞれ線６７２０、６７２２を介してＡＣ入力電圧ＶｉｎおよびＡＣ出力電圧Ｖｏｕｔを有する。本明細書に記載するように、ＡＣ入力電圧Ｖｉｎは、線６７２０を介して、メモリセル６７０２のそれぞれに電気的に並列接続される。ＡＣ  Ｖｉｎは、線６７２０を介して、ＡＣ信号、たとえばｒｆまたは無線周波数信号をメモリセル６７０２のそれぞれに提供し、メモリセルは、本明細書に論じるように、それぞれ入力ＡＣ  Ｖｉｎに対して異なる周波数応答を有する共振器またはナノポアポリマー共振器（ＮＰＲ）になるように構成される。線６７２０は、本明細書に記載するように、ナノポアポリマー共振器（ＮＰＲ）に使用される回路構成、流体セル構成、電極構成、または他の要因に応じて、図６７に示すものとは異なる形で、チップ上のメモリセル６７０２および／または電子構成要素、電極、ならびにその中の流体セル６７０４を接続することができる。ＡＣ入力電圧Ｖｉｎは、線６７２０を介して、本明細書に記載するように、適当なＡＣ入力電圧Ｖｉｎを提供して本明細書に記載する機能を実行するのに適当な論理を有するコンピュータに基づくコントローラ回路または論理またはデバイスから提供することができる。
【０１５７】
各メモリセル６７０２からの組み合わせた周波数応答は、オンチップ増幅器（または前置増幅器）５３２０（図５３）に提供することができ、増幅器５３２０は、線６７２２を介して、組み合わせた周波数応答を示すＡＣ出力電圧Ｖｏｕｔを提供する。ＡＣ出力電圧Ｖｏｕｔは、線６７２２を介して、コンピュータに基づく処理回路または論理またはデバイスに提供することができ、処理回路は、本明細書に記載するように、適当な論理、たとえばアナログ−デジタル（Ａ／Ｄ）変換およびデジタル信号処理（ＤＳＰ）論理を有しており、メモリ列６５５０上に記憶されているデータを読み取り、本明細書に記載する他の機能を実行することができる。
【０１５８】
図６８を参照すると、本開示の実施形態によるナノポアに基づくメモリチップ６７００（図６７）と、メモリ読取り／書込みコントローラ６８０２とを有する読取り／書込みメモリ記憶システム６８００の最上位のハードウェアブロック図が示されている。特に、メモリ読取り／書込みコントローラ６８０２は、書込みコントローラ論理６８０４を有することができ、書込みコントローラ論理６８０４は、線を介して、メモリチップ６７００に書き込むべき入力データを受け取り、線６８０８を介して、このデータを記憶するためのアドレス（またはラベルもしくはポインタなど）を受け取り、それぞれ線６７１０、６７１２、６７１４を介して、ＤＣ操舵電圧Ａｄｄ「０」、Ａｄｄ「１」、およびデブロックをナノポアメモリチップ６７００に提供する。書込みコントローラ６８０４は、ボックス６８１０によって示すように、本明細書に記載する機能を提供するために必要とされる適当なハードウェア、ソフトウェア、およびファームウェア（任意のマイクロプロセッサまたはマイクロコンピュータに基づくプロセッサチップもしくはデバイスおよび／またはメモリ記憶を含む）を有する。
【０１５９】
加えて、書込みコントローラ６８０４はまた、書込み（または付加）周期クロック６８１２（または発振器）を提供することができ、クロック６８１２は、メモリチップ６７００が「０」または「１」ビットをいつ書き込む（または付加もしくは記憶する）かを判定する。特に、書込みコントローラチップ６８０４は、書込み周期クロック６８１２に基づいて、ＤＣ操舵電圧（Ａｄｄ「０」、Ａｄｄ「１」、Ｄｅｂｌｏｃｋ）を提供し、メモリチップ６７００に「１」または「０」をメモリセルに書き込ませる。図６５に関して本明細書に上記で論じたように、すべてのＡｄｄ「０」電極がともに接続され、別個にすべてのＡｄｄ「１」電極がともに接続され、デブロック電極が個々に制御されているときなどの特定のセル構成（図６５など）では、データビットの書込み（または付加）は、「０」を書き込む必要のあるすべてのセルに同時に書き込むことができるＡｄｄ「０」周期、それに続いて「１」を書き込む必要のあるすべてのセルにすべて同時に書き込むことができるＡｄｄ「１」周期など、書込み（または付加）「周期」において行うことができる。書込み周期クロックは、線６８１４を介して書込み周期信号を提供し、書込み要求デバイスまたはプラットホームまたはコンピュータバスがメモリチップの書込み状態を判定することを可能にする。所望される場合、他のデータ書込み周期、タイミング、または手法を使用することもできる。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、書込みコントローラ６８０２はまた、線６８２０を介して、特定のデータをメモリチップ６７００に書き込むことを要求するＷｒｉｔｅ  Ｒｅｑｕｅｓｔ（Ｗ−ＲＥＱ）信号などの制御信号をシステムまたはコンピュータバスから受け取ることができ、書込みコントローラ６８０２はまた、線６８２２を介して、要求されたデータがメモリチップ６７００にいつ書き込まれたかを示すＷｒｉｔｅ（またはＡｄｄ）Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（Ｗ−ＣＯＭ）信号を提供することができる。
【０１６１】
メモリ読取り／書込みコントローラ６８０２はまた、メモリ読取りコントローラ論理６８５０を有することができ、メモリ読取りコントローラ論理６８５０は、線６８５２を介して、メモリチップ６７００から読み取ることが所望されるデータの記憶位置に対応する読取りアドレス（またはラベルもしくはポインタなど）を受け取ることができ、線６８５４を介して、メモリチップ６７００から読み取った要求データを提供する。読取りコントローラ６８５０はまた、線６７２０を介して、ＡＣ入力電圧信号Ｖｉｎをメモリチップ６７００に提供するために、必要な論理および構成要素を有することができる。本明細書に記載するように、ＡＣ入力電圧Ｖｉｎは、メモリチップ６７００内のナノポア共振器（ＮＰＲ）の帯域幅に対応する周波数成分を有するＡＣ  ｒｆ（無線周波数）信号である。Ｖｉｎ信号を提供するために、読取りコントローラ６８５０は、周波数発振器論理６８５８（プログラマブルまたは非プログラマブル）を有することができ、周波数発振器論理６８５８は、要求されたデータを読取りコントローラ論理がナノポアメモリチップ６７００から読み取ることを可能にするために、必要な周波数成分（本明細書に論じる）を提供する。本明細書に論じるように、ＡＣ  Ｖｉｎ信号は、直接合成し、複数のプローブ周波数を組み合わせることができ、単一の広帯域信号、または時間掃引もしくはステップ周波数信号、または本明細書に記載する機能を提供する任意の他のＡＣ信号とすることができる。
【０１６２】
読取りコントローラ６８５０はまた、線６７２２を介して、メモリチップ６７００から出力ＡＣ  Ｖｏｕｔ電圧を受け取り、本明細書に論じるように、Ｖｏｕｔ信号上でＡ／Ｄ変換およびデジタル信号処理を実行し（たとえば、オンボードＡ／Ｄ変換論理６８６２およびＦＦＴ論理６８６４を使用）、指定の読取りアドレスにおける所望のデータの値を判定し、Ｒｅａｄ  Ｄａｔａ  Ｏｕｔ線６８５４を介して出力データを提供する。
【０１６３】
読取りコントローラ６８５０は、ボックス６８５６によって示すように、本明細書に記載する機能を提供するために必要とされる適当なハードウェア、ソフトウェア、およびファームウェア（任意のマイクロプロセッサまたはマイクロコンピュータに基づくプロセッサチップもしくはデバイスおよび／またはメモリ記憶を含む）を有する。
【０１６４】
加えて、読取りコントローラ６８５０はまた、線６８１４を介して、書込み周期クロック６８１２（または発振器）から書込み（または付加）周期クロック信号を受け取ることができ、クロック６８１２は、上記で論じたように、メモリチップ６７００が「０」または「１」ビットをいつ書き込む（または付加もしくは記憶する）かを判定する。特に、コントローラチップ６８０４は、書込み周期クロック６８１２に基づいて、ＤＣ操舵電圧（Ａｄｄ「０」、Ａｄｄ「１」、Ｄｅｂｌｏｃｋ）を提供し、メモリチップ６７００に「１」または「０」をメモリセルに書き込ませる。本開示による書込み動作は、ＤＮＡ（またはポリマーもしくはメモリ列）がＡｄｄビットへの所望のチャンバに入るためにナノポアを通過すること、またデブロックチャンバへ戻るときにナノポアを通過することを必要とするため、書込み周期クロック信号はまた、図６９に関して以下でさらに論じるように、データを読み取るための最善の時間がいつであるかを判定するために、読取りコントローラ６８５０によって使用することができる。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、読取りコントローラは、書込みコントローラ６８０４へ読取り信号６８６０を提供し、コントローラ６８０４が、線６７１０〜６７１４を介して、メモリ列をナノポアに通してメモリ列の読取りを可能にするための必要な操舵電圧（Ａｄｄ「０」、Ａｄｄ「１」、Ｄｅｂｌｏｃｋ）を提供することを要求することができる。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、読取りコントローラ６８５０はまた、線６８７０を介して、特定のデータをメモリチップ６７００から読み取ることを要求するＲｅａｄ  Ｒｅｑｕｅｓｔ（ＲＤ−ＲＥＱ）信号を受け取ることができ、読取りコントローラ６８５０はまた、線６８２２を介して、要求されたデータがメモリチップ６７００からいつ読み取られたかを示すＲｅａｄ  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（ＲＤ−ＣＯＭ）信号を提供することができる。メモリコントローラ６８０２は、１つの機能のみ、たとえば所望される場合、ナノポアチップに対する読取りもしくは書込みを実行することができ、または所望される場合、これらの機能（読取りおよび書込み）の両方を実行することができる。
【０１６７】
図６８Ａを参照すると、ナノポアメモリシステム６８００は、より大きいコンピュータシステムの一部とすることができ、アドレス／データ／制御バス６８７０と相互作用することができ、また別個のメモリコントローラ６８７６と相互作用することもでき、これらはすべて、１つまたは複数のＣＰＵ／プロセッサ６８７４と相互作用する。たとえば、図６８に示す番号６８２０、６８２２、６８０６、６８０８、６８１４、６８５２、６８５４、６８７２、６８７０など、読取り／書込みアドレスおよび／またはデータの入力、出力、および／または制御線のうちの１つまたは複数は、バス６８７２またはメモリコントローラ６８７６から受け取ることができ、またはバス６８７２またはメモリコントローラ６８７６へ提供することができる。コンピュータシステム８６７０は、ユーザ６８７８および表示画面６８８０とインターフェース接続することができる。
【０１６８】
図６９を参照すると、本開示の実施形態による図６５に示す構成に対するサンプルＤＣ操舵電圧（ＶＳＴ）の表６９００、ならびに操舵電圧ＶＳＴおよびメモリチップ６７００上の関連結果に対する対応する時間グラフ６９０２が示されている。特に、表６９００は、「０」を書き込む必要のあるすべてのセルに同時に書き込むことができるＡｄｄ「０」周期、それに続いて「１」を書き込む必要のあるすべてのセルにすべて同時に書き込むことができるＡｄｄ「１」周期など、メモリチップ６７００に「１」または「０」をメモリセルに書き込ませる書込み周期タイミングに基づいて、メモリセルのそれぞれの電極に提供すべきＤＣ操舵電圧ＶＳＴ（たとえば、Ａｄｄ「０」、Ａｄｄ「１」、Ｄｅｂｌｏｃｋ、またはそれぞれＶＳＴ０、ＶＳＴ１、ＶＳＴＤＢ）６９０４を示す。
【０１６９】
図６９および図６５を参照すると、Ａｄｄ「１」周期に対するサンプル操舵電圧が、列６９０６に示されており（図６９）、Ａｄｄ「０」周期に対する操舵電圧が、列６９０８に示されている。より具体的には、Ａｄｄ「１」周期中、メモリ列（ＤＮＡまたはポリマー）６５５０がナノポア６５２８を横断して流体セル６５１２のＡｄｄ「１」チャンバ６５３９（図６５）へ進むことが所望される。これは、「１」ビットが列６５５０に書き込まれる（または付加される）まで、Ａｄｄ「１」電極電圧ＶＳＴ１を接地（ＧＮＤ）または０ボルトにし、Ａｄｄ「０」電極電圧ＶＳＴ０を負の電圧（Ａｄｄ「１」電圧に対して）にし、デブロック電極電圧ＶＳＴＤＢを負の電圧（Ａｄｄ「１」電圧に対して）にすることによって行うことができる。「１」ビットが書き込まれた後、デブロック電圧を正の電圧（Ａｄｄ「１」電圧およびＡｄｄ「０」電圧に対して）に変化させ、それによって列が正味の負の電荷を有する場合、ＤＮＡなどのメモリ列を引き付けることによって、列６５５０をデブロックチャンバ６５３６内へ引き戻すことができる（次の書込みコマンドに対する準備のため）。
【０１７０】
時間プロット６９０２は、Ａｄｄ「１」およびＡｄｄ「０」書込み周期に対する操舵電圧の値を示す。この場合、Ａｄｄ「１」周期に対するプロット６９１０は、Ａｄｄ「１」電圧値がＡｄｄ「１」周期全体に対してＧＮＤ（０ボルト）の一定の値で保持されることを示し、プロット６９１２は、Ａｄｄ「０」電圧の値がＡｄｄ「１」周期全体に対して負の電圧（たとえば、−１．０ボルト）の一定の値で保持されることを示す。「デブロック」電圧に対するプロット６９１４は、２つの部分６９１６および６９２０を有する方形波を示し、負の電圧値（本明細書に上記で論じた）で開始して、メモリ列をデブロックチャンバ６５３６（図６５）から解放し、メモリ列６５５０の一方の末端がデブロックチャンバ６５３６からナノポア６５２８を通ってＡｄｄ「１」チャンバ６５３９へ横断することを可能にし、そこでグラフ６９１４に示すように、「１」ビットの書込みのために「Ｗ１」によって示すように、Ａｄｄ「１」ビット反応が生じる。グラフ区間６９１８の第１の部分（「Ｔ１」で示す）は、メモリ列（ＤＮＡまたはポリマー）がナノポア６５２８を横断してＡｄｄ「１」チャンバ６５３９内へ進むのにかかる時間であり、その後、時間「Ｗ１」中に「付加」の化学反応が生じる。時間Ｗ１の量は、「１」ビット付加反応が完了するのに十分な長さに設定されるべきであり、たとえば約０．０１〜１００Ｈｚまたは約１０秒〜１００ミリ秒の反応時間を有することができる。本明細書に論じるように、所望される場合、使用される化学的性質に応じて、付加反応に対する他の付加反応時間を使用することができる。
【０１７１】
次に、Ｄｅｂｌｏｃｋ時間のグラフ区間６９２０において、Ｄｅｂｌｏｃｋ電圧は、Ａｄｄ「１」電圧に対して正になり、それによりナノポア６５２８を通ってＤｅｂｌｏｃｋチャンバ内へメモリ列６５５０を引き戻し、その後、本明細書に論じるように（Ａｄｄ反応時間に類似）、Ｄｅｂｌｏｃｋ電圧は、デブロック反応が生じるのに十分な長さのＨＯＬＤ時間期間ＴＨ１にわたって保持される。番号６９２２によって示されている時間「Ｔ２」は、メモリ列６５５０がナノポア６５２８を横断するのにかかる時間である。周期のこの部分１９２０における時間（Ｈｏｌｄ時間ＴＨ１）の残りにわたって、列はＤｅｂｌｏｃｋチャンバ内で保持され、次のＷｒｉｔｅ  Ｒｅｑｕｅｓｔに対して待機する。したがって、デブロック反応を除いて、このＨｏｌｄ時間中にこの列において活動なし（ＮＡ）の状態が生じる。
【０１７２】
次に、書込み周期が、今回はＡｄｄ「０」周期、列６９０８に対して繰り返す。図６９および図６５を参照すると、Ａｄｄ「０」周期に対するサンプル操舵電圧が、列６９０８に示されている。より具体的には、Ａｄｄ「０」周期中、メモリ列（ＤＮＡまたはポリマー）６５５０がナノポア６５２８を横断して流体セル６５１２のＡｄｄ「０」チャンバ６５３７（図６５）へ進むことが所望される。これは、「０」ビットが列６５５０に書き込まれる（または付加される）まで、Ａｄｄ「０」電極電圧ＶＳＴ０を接地（ＧＮＤ）または０ボルトにし、Ａｄｄ「１」電極電圧ＶＳＴ１を負の電圧（Ａｄｄ「０」電圧に対して）にし、デブロック電極電圧ＶＳＴＤＢを負の電圧（Ａｄｄ「０」電圧に対して）にすることによって行うことができる。「０」ビットが書き込まれた後、デブロック電圧を正の電圧（Ａｄｄ「１」電圧およびＡｄｄ「０」電圧の両方に対して）に変化させ、それによって列が正味の負の電荷を有する場合、ＤＮＡなどのメモリ列を引き付けることによって、列６５５０をデブロックチャンバ６５３６内へ引き戻すことができる（次の書込みコマンドに対する準備のため）。
【０１７３】
同様に、Ａｄｄ「０」周期に関して、Ａｄｄ「０」周期に対するプロット６９１２は、Ａｄｄ「０」電圧値がＡｄｄ「０」周期全体に対してＧＮＤ（０ボルト）の一定の値で保持されることを示し、プロット６９１０は、Ａｄｄ「０」電圧の値がＡｄｄ「０」周期全体に対して負の電圧（たとえば、−１．０ボルト）の一定の値で保持されることを示す。Ａｄｄ「０」周期に関して「デブロック」電圧に対するプロット６９１４は、２つの部分６９２６および６９３０を有する方形波を示し、負の電圧値（本明細書に上記で論じた）で開始して、メモリ列をデブロックチャンバ６５３６（図６５）から解放し、メモリ列６５５０の一方の末端がデブロックチャンバ６５３６からナノポア６５２８を通ってＡｄｄ「０」チャンバ６５３７へ横断することを可能にし、そこでグラフ６９１４に示すように、書込みビット「０」のために「Ｗ０」によって示すように、Ａｄｄ「０」ビット反応が生じる。グラフ区間６９２４の第１の部分（「Ｔ３」で示す）は、メモリ列（ＤＮＡまたはポリマー）がナノポア６５２８を横断してＡｄｄ「０」チャンバ６５３７内へ進むのにかかる時間であり、その後、時間「Ｗ０」中にビット「０」の「付加」の化学反応が生じる。時間Ｗ０の量は、付加反応が完了するのに十分な長さに設定されるべきであり、たとえば約１０〜１００Ｈｚまたは約１０〜１００ミリ秒の反応時間を有することができる。本明細書に論じるように、所望される場合、使用される化学的性質に応じて、付加に対する他の付加反応時間を使用することができる。
【０１７４】
次に、Ｄｅｂｌｏｃｋ時間のグラフ区間６９３０において、Ｄｅｂｌｏｃｋ電圧は、Ａｄｄ「０」電圧に対して正になり、それによりナノポア６５２８を通ってＤｅｂｌｏｃｋチャンバ６５３６内へメモリ列６５５０を引き戻し、その後、本明細書に論じるように（Ａｄｄ反応時間に類似）、Ｄｅｂｌｏｃｋ電圧は、デブロック反応が生じるのに十分な長さのＨＯＬＤ時間期間ＴＨ２にわたって保持される。番号６９２８によって示されている時間「Ｔ４」は、メモリ列６５５０がナノポア６５２８を横断して再びＤｅｂｌｏｃｋチャンバに入るのにかかる時間である。書込み周期のこの部分１９３０における時間（Ｈｏｌｄ時間ＴＨ２）の残りにわたって、この列においてデブロック反応が生じ（本明細書に論じる）、列はＤｅｂｌｏｃｋチャンバ内で保持され、次のＷｒｉｔｅ  Ｒｅｑｕｅｓｔに対して待機する。したがって、デブロック反応を除いて、このＨｏｌｄ時間中にこの列において活動なし（ＮＡ）の状態が生じる。
【０１７５】
したがって、記載する実施形態に対して、デブロック電圧は、「１」または「０」の書込み、対応するＡｄｄチャンバに入るためのメモリ列の解除、ならびに書込み後のチャンバからのメモリ列の除去、およびデブロックチャンバにおける列の保持を制御することができる。したがって、デブロック電圧は、所望される場合、所与の書込み周期またはその一部分にわたって、周期中に「Ｈｏｌｄ」時間を調整することによって、Ｎｏ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ（ＮＡ）状態または何もしない状態を生じさせることができる。周期中に書込み時間Ｗ１、Ｗ０を調整することによって、書込み（または付加）時間が開始および終了するタイミングを決定することもできる。また、メモリ列がナノポアを完全に横断するのにかかる横断時間Ｔ１〜Ｔ４に応じて、Ａｄｄチャンバ内で所望の書込み（または付加）反応を実行するのに十分な時間があることを確実にするために、書込み時間Ｗ１（Ａｄｄ「１」）、Ｗ０（Ａｄｄ「０」）を調整することが必要になることがある。したがって、本明細書に上記で論じた読取り／書込みコントローラ６８０２（図６８）は、本明細書に記載する流体、電極、または他の構成などの構成および実施形態のいずれかに対して、これらの条件をリアルタイムで測定および調整する論理を有することができる。また、横断時間は塩基の数に依存し、塩基が多ければ多いほど時間はより長くなる。たとえば、１００Ｋ塩基の場合、毎秒百万塩基（ナノポアを通るＤＮＡに対する典型的な平均速度）でナノポアを進むことで、ナノポアを横断するのに約１００ミリ秒かかるはずである。また、孔に入るのに、たとえば約１００ミリ秒の遅延が存在することができるが、他の値を使用することもできる。
【０１７６】
加えて、本明細書に論じるように、グラフ６９１４に示す横断時間Ｔ１〜Ｔ４中、メモリ列（またはＤＮＡもしくはポリマー）がナノポアを横断している間に、読取り／書込みコントローラ６８０２は、ナノポアを通過するビットの値を読み取る（または配列決定する）ことができる。したがって、各書込み周期（Ａｄｄ「１」周期またはＡｄｄ「０」周期）に対して、システムがメモリ列上に記憶されているデータを読み取ることができるそれぞれ２つの時間期間Ｔ１、Ｔ２またはＴ３、Ｔ４が存在する。データを連続して読み取ることは、データを検証するため、データの複数の読取りを提供するため、データ内の誤りにフラグを立てるため、また他の理由のため、有用となりうる。
【０１７７】
本開示に対するメモリ列からデータを読み取ることに関して考慮するために、タイミング（たとえば、いつどのくらいの頻度で読み取るか）、流体および電極その他の関連する構成（たとえば、読取りを実行するための操舵信号をどのように提供するか）、ならびに本明細書の開示ならびに全体的なメモリシステムの設計、機能、および性能要件に基づいて判定することができる他の要因を含めて、多数の可能な手法および要因が存在する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、メモリ列（またはＤＮＡもしくはポリマー）は、書込みが行われておらず、Ａｄｄチャンバが洗い流されて化学的な「Ａｄｄ」能力（たとえば、付加酵素など）が除去されているときのみ読み取ることができる。その場合、メモリ列は、読取りコントローラによって所望のナノポアの内外へ操舵することができ、情報は、読取りコントローラによって後の使用のために記憶することができる。その場合、読取りコントローラは、検索したデータを後の使用のために保持する別のメモリ記憶デバイスと通信することができる。
【０１７９】
メモリ列（またはＤＮＡもしくはポリマー）がナノポアを横断する（Ａｄｄチャンバの内外へ）のにかかる横断（または輸送）時間Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４は、メモリ列の長さ（列上のビットが多ければ多いほどより長くかかる）およびナノポアを通る列の輸送速度（ナノポアを通る列が遅ければ遅いほどより長くかかる）に基づいて変動することがある。輸送速度は、列がナノポアに接近する角度、ナノポアの幾何形状（円錐、円筒など）、列の直径（その長さに沿って変動することがある）と比較したナノポアの直径、列内の絡みまたは折畳みまたは巻付きの量、列の長さに沿って速度がどのように変動するか、流体の動的作用、チャンバの壁との摩擦／引力／結合、粘性作用、流体内の音波、および他の要因を含む複数の要因に基づいて変動することがある。
【０１８０】
速度が正確に分からない場合、システムは、００００００または１１１１１１１などの同じビット状態の長い列を有するワード内のビットの数を正確に判定することができない可能性がある。しかし、速度は、本開示のシステムまたは方法によって、セルに対するメモリ列（またはＤＮＡもしくはポリマー）上に、交互の１および０、すなわち１０１０１０１０１０１０など、所定の「速度較正配列」のデータを書き込み、以下でさらに論じるように、列の先頭付近、または特定の数のワードが書き込まれた後、または特大であるなどの特殊な特性を有する「特殊」なビットを検出した後など、その列の記憶データにおいて周知のまたは判定可能な位置にこのデータを配置することによって、判定または較正することができる。システムは、交互の「１０１０」パターンを読み取ったとき、そのパターンが分かっているため、列の速度を判定することができる。そのような速度較正配列は、所望される場合、速度の複数のリアルタイム較正を可能にするように、メモリ列に沿って多数の位置に配置することができる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ビット間に「ベースライン分解能」が存在する場合、すなわち次のビットの前にビット信号がベースライン値に戻る場合、速度を較正する必要がないことがある。しかし、１ビット以上の長さを有するナノポアが存在する場合、ベースライン分解能は予期されないはずである。その場合、システムは、数ビットを同時に読み取り、たとえば配列１１０１１１０に対して１１００１１から１００１１１から００１１１０など、それが時間とともにどのように変化するかを評価しているはずである。このシナリオを実際上解釈するために、単位時間あたり可能な限り多くの測定を有することが望ましい。また、システムは、ほとんどがランダムである時間領域の少なくともある程度の変動性を平均化するために、同じＤＮＡの複数の読取りを実行することができる。
【０１８２】
図６９に示す操舵電圧ＶＳＴに対するサンプル電圧値は、負に帯電したＤＮＡなどのポリマー、または他の負に帯電したポリマーなど、正味の（または全体的もしくは平均的な）負の電荷を有するメモリ列に対するものである。メモリ列が正味の正の電荷を有する場合、ここで示した値が逆になるはずである。所望される場合、相対的な電圧差が所望の結果を実現するのに十分であることを条件として、電子回路構成要素および他の要因に基づいて、本明細書に示すメモリ列（またはＤＮＡもしくはポリマー）の操舵電圧に対する他の値［および極性（±）］を使用することができる。また、操舵電圧ＶＳＴが負および正の値を有する必要はない。操舵電圧によって生じる相対的な電圧差は、ナノポア６５２８を通って所望のチャンバへメモリ列を動かすのに必要な電界力を生じさせることだけが必要である。
【０１８３】
図７０を参照すると、一連の時間グラフ７０００が示されており、書込み周期グラフ７００２と、対応する５つの異なるビットパターンに対して５ビットワードがどのようにポピュレートされるはずであるかを示す対応する１組のビット時間グラフ７００４〜７００１２とを有する。特に、書込み（または付加）周期グラフは、Ａｄｄ「０」周期、Ａｄｄ「１」周期、Ａｄｄ「０」周期、以下同様を交互に繰り返す書込み周期を示す方形波７００２を示す。時間グラフ７００４〜７０１２は、左に５つの５ビットバイナリデータワード７０２０の一例（１１１００、０００１１、０１０１０、１１１１、００００）を示し、対応する時間グラフ７００４〜７０１２は、交互の書込み周期７００２（Ａｄｄ「１」、Ａｄｄ「０」）の手法を使用して、５ビットデータワード７０２０の各ビットが単一のセル内でいつ書き込まれるはずであるかを示す。「Ｘ」を有するセルは、書込み周期７００２のその部分中にデータが書き込まれていないことを示す。グラフはまた、各データワード７０２０がセル内へいつ完全に書き込まれるはずであるかを示し、これは矢印７０１４によって示されている。データ１１１００の場合、書き込むのに９周期かかり、データ０００１１は書き込むのに８周期かかり、データ０１０１０は書き込むのに５周期かかり、１１１１は書き込むのに１０周期かかり、データ００００は書き込むのに９周期かかった。したがって、各ワードを所与のセルに書き込む場合、同じ数のビットを書き込むための書込み周期の数（または時間）は、ワード内の１および０のパターンに基づいて変動することができる。この例では、書込み周期の数は、５周期から１０周期まで（すなわち、ビットの数からビットの数の２倍まで）変動した。
【０１８４】
しかし、セルが並列に書き込まれた（または付加された）場合、すなわち各ビットが同時に異なるセルに割り当てられて書き込まれた場合、ビットの数またはビットのパターンから独立して、書込み周期の最大数は２になり、最小数は１になるはずである。したがって、書込み速度が重要であり、交互の書込み周期を有する実施形態が使用される場合、データワードを単一のセルに直列に書き込むのではなく、データを並列にセルに書き込むようにフォーマットすることが有利になりうる。したがって、いくつかの実施形態の場合、書込み周期の管理とデータメモリセルの形式との間にトレードオフが存在することがある。
【０１８５】
図７０Ａを参照すると、本開示の実施形態によるビットに書き込むための読取り／書込みメモリコントローラ６８０２のＷｒｉｔｅ／Ｖｓｔ  ＣＮＴＲＬ論理６８０４（図６８）に対する流れ図７０３０が示されている。プロセス／論理７０３０は、書込み周期がＡｄｄ「０」周期であるかどうかを確認するブロック７０３２で始まる。書込み周期がＡｄｄ「０」周期でない場合、プロセスはブロック７０３４へ進み、書込み周期がＡｄｄ「０」周期であるかどうかを確認する。書込み周期がＡｄｄ「０」周期でない場合、プロセスは終了する。ブロック７０３４の結果がＹＥＳであった場合、ブロック７０３６は、操舵電圧ＶＳＴを図６９に示す値、たとえばＶＳＴ１＝ＧＮＤ；ＶＳＴ０＝負に設定する。次に、ブロック７０３８は、次の書き込むべきデータビットが「１」であるかどうかを確認する。ＮＯの場合、プロセスは終了する。ＹＥＳの場合、ブロック７０４０は、図６９に示すように、時間ｔ＝Ｔ１＋Ｗ１において、ＶＳＴＤＢ＝負を設定し、メモリ列（またはＤＮＡもしくはポリマー）をＡｄｄ「１」チャンバ内へ解放する。次いで、この時間が経過した後、論理は、ＶＳＴＤＢ＝正を設定し、メモリ列をＡｄｄチャンバからＤｅｂｌｏｃｋチャンバ内へ引き込み、プロセスは終了する。
【０１８６】
ブロック７０３２の結果がＹＥＳであった場合、書込み周期はＡｄｄ「０」周期内にあり、ブロック７０４２は、ＶＳＴを図６９に示す値、たとえばＶＳＴ１＝負；ＶＳＴ０＝ＧＮＤに設定する。次に、ブロック７０４４は、次の書き込むべきデータビットが「０」であるかどうかを確認する。ＮＯの場合、プロセスは終了する。ＹＥＳの場合、ブロック７０４６は、図６９に示すように、時間ｔ＝Ｔ３＋Ｗ０において、ＶＳＴＤＢ＝負を設定し、メモリ列（またはＤＮＡもしくはポリマー）をＡｄｄ「０」チャンバ内へ解放する。次いで、この時間が経過した後、論理は、ＶＳＴＤＢ＝正を設定し、メモリ列をＡｄｄチャンバからＤｅｂｌｏｃｋチャンバ内へ引き込み、プロセスは終了する。プロセス７０３０は、次の書込み周期を探し、それに応じて応答するように、連続して繰り返される。
【０１８７】
図７０Ｂを参照すると、図６６に示すナノポア記憶デバイスのセル構成、特にデブロックチャンバに対して底部に共通の電極を有し、頂部の付加チャンバ上に個々に制御可能な電極を有するセルに関して、「１」および「０」を書き込む工程を示す表が示されている。列７０８２内には、各タイプの書込みに対して４つの工程が示されており、対応するコントローラ動作が、書込みコントローラに対する列７０８４に示されており、対応する結果が、その特定の工程に対してチップの内側で何が起こるかを説明する列７０７６に示されている。
【０１８８】
図７１を参照すると、データがどのように記憶されるかという形式は、様々な要因および設計基準に基づいて変動することがある。特に、メモリ列（またはＤＮＡもしくはポリマー）６５５０は、線７１０２として示すことができ、線７１０２上には、所与のメモリセル内のメモリ列６５５０上に書き込まれた（または付加された）個々の「ビット」を示す一連の楕円形が存在する。いくつかの実施形態では、ビット７１０４は、次々に書き込まれて、「記憶ワード」を構築することができる。第１の例のデータ形式７１１０は、記憶ワード７１１２に対する３つの構成要素、すなわちアドレス区間７１０６、データ区間７１０８、および誤り検査区間７１１０を示す。アドレス区間７１０６は、所望のデータを位置付けるためにメモリシステムによって使用されるラベルまたはポインタである。コンピュータメモリバス上のハードウェアアドレス線が固有のメモリ位置をアドレス指定するはずの従来の半導体メモリ記憶とは異なり、本開示のメモリチップおよびシステムでは、アドレス（またはラベル）が、記憶されているデータの一部であり、検索することが所望されるデータがどこに位置するかを示す必要がある。図７１に示す例では、アドレスは、データ近傍に、または連続して位置し、ならびにパリティ、チェックサム、誤り補正コード（ＥＣＣ）、巡回冗長検査（ＣＲＣ）、または暗号化情報を含む任意の他の形態の誤り検査および／もしくはセキュリティ情報などの誤り検査データが位置する。記憶ワード７１１２では、アドレス７１０６、データ７１０８、誤り検査７１１０の各構成要素は、メモリ列内に互いに連続して位置する。各構成要素が周知の長さ（ビット数）、たとえばアドレス＝３２ビット、データ＝１６ビット、誤り検査＝８ビットを有するため、各記憶ワード７１１２およびその構成要素は、ビットの数を計数することによって判定することができる。
【０１８９】
別の例のデータ形式７１２０は、同じ３つの構成要素、すなわちアドレス区間７１０６、データ区間７１０８、および誤り検査区間７１１０を示す。しかし、各区間の間には、「特殊ビットまたは配列」区間Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３が存在し、それぞれ番号７１２２、７１２４、７１２６として示されている。これらの特殊ビットＳ１、Ｓ２、Ｓ３は、どの区間が次にくるかを示す所定の一連のビットまたはコードとすることができ、たとえば１００１００１００１は、アドレスが次にくることを示すことができ、１０１０１０１０は、データが次にくることを示すことができ、１１００１１００１１は、誤り検査区間が次にくることを示すことができる。いくつかの実施形態では、特殊ビットは、ナノポアを通過するときに容易に画定可能なダンベル型、フラワー型、または他の「大きい」分子構造など、異なる分子ビットまたはビット構造を列に取り付けることができる。特殊ビットは、大きい代わりに、本明細書に上記で論じたように、１ビットおよび０ビットとは異なるキャパシタンスまたは共振の固有の変化を提供する他の分子特性を有することもできる。
【０１９０】
別の例のデータ形式７１３０は、データ構成要素７１４０のみを示し、アドレス構成要素および誤り検査構成要素７１１０はない。この構造では、列は、「データ」構成要素のみを保持し、アドレス構成要素はなく、アドレス構成要素は、以下に論じるように、他の列に記憶することができる。この例ではまた、特殊ビットＳ１、Ｓ２、Ｓ３が存在し、それぞれ番号７１３２、７１３４、７１３６で示されている。例７１２０と同様に、これらの特殊ビットＳ１、Ｓ２、Ｓ３は、データ区間同士の間の分離を示し、誤り検査区間がいつ次にくるかを示す所定の一連のビットもしくはコードとすることができ、または本明細書に上記で論じたように、ナノポアを通過するときに容易に画定可能な異なる分子ビットもしくはビット構造を列に取り付けることができる。
【０１９１】
図７２を参照すると、単一の行のメモリセル７２０２〜７２０８が示されており、各セルにはそれぞれサンプルメモリ列７２１０〜７２１６が関連付けられている。本開示のメモリシステムは、各メモリセルが単一ビットの情報（１または０）を記憶するのではなく、本開示の各メモリセルは相当な量のデータを記憶することができるため、従来の半導体メモリとは大幅に異なる。したがって、従来の半導体メモリが２Ｄアレイと見なされる場合、本メモリシステムは３Ｄアレイであり、アレイ内の各メモリセル位置は、相当な記憶深さを有する。これにより、どのようにデータを記憶および検索するかに関して広範囲の選択肢が提供される。
【０１９２】
図７２に示す例では、図７１の例７１１０に論じたものと同様に、各セルは、線形の自己完結型の情報列（記憶ワード）を記憶することができる。その場合、各記憶ワードは、他の記憶ワード上に連続して記憶される。また行内の各セル７２０２〜７２０８は、この構造を複製し、これが複数の行（図示せず）に対して繰り返される。
【０１９３】
図７３を参照すると、いくつかの実施形態では、いくつかのセルがアドレス情報のみを記憶し、いくつかのセルがデータ情報のみを記憶することができる。その場合、各行は、アドレスまたはポインタからなるメモリ列７３０２を有するセル、たとえばセル１、７３１０を有することができ、行の残り、たとえばセル２〜セルＮ、それぞれ７３１０〜７３１６は、それぞれ対応する列のデータ７３０４〜７３０８を有する。その場合、アドレスまたはポインタは、行、列、およびエントリ番号、たとえば行３、列８、エントリ５０など、データがメモリチップ上のどこに記憶されているかを示す値を有するはずであり、これはこのアドレスに対応するデータが行３および列８内の５０番目のデータブロックに存在することを意味する。これによりアドレスは、物理的にデータの隣の位置から実際上切り離され、記憶の柔軟性を提供することができる。また、各列は、列上に記憶されている情報を認証するために、１つまたは複数の誤り検査またはセキュリティ構成要素を有することができる。これは、アレイ内の各行に対して繰り返すことができる。
【０１９４】
図７４を参照すると、所与のメモリ列上に情報を連続して（または直列に）記憶する代わりに、データをメモリセルアレイ内に並列に記憶することができる。たとえば、記憶ワードが記憶されるとき、半導体メモリが機能する従来の方法と同様に、アレイにわたって記憶することで、単一の記憶動作でより迅速に記憶することが可能であるが、３Ｄ深さにより何度も繰り返し行うことが可能になり、毎回別の記憶ワードを列に「押し込む」（記憶する）ことができる。またそのような形式により、所与の記憶ワードの迅速な並列検索が可能になる（位置付け後）。その場合、特定のセル７４０２は、アドレス／ポインタを記憶することに割り当てることができ、特定のセル７２０４は、並列データを記憶することに割り当てることができ、特定のセル７４０６は、誤り検査およびセキュリティデータを記憶することに割り当てることができる。たとえば、図７２に示す記憶ワード７２１０（１つの列上に直列に記憶されている）は、アドレス１、データ１、および誤り検査１を有する記憶ワード７４１０として示すように記憶することができ、複数のセル（１〜Ｎ、Ｎ＋１〜Ｍ、およびＭ＋１〜Ｐ）にわたって並列に記憶される。同じ列にわたって記憶ワード７４１０に並列に（列の記憶方向に応じて下または上に）積み重ねられている記憶ワード７４１２の場合も同様である。いくつかの実施形態では、データは、二次元で並列に記憶することができ、それによって記憶情報の積層２Ｄアレイを生じさせることができ、たとえば多層２Ｄ画像捕捉データなどを記憶することができるが、２Ｄ画像をリアルタイムで記憶することが可能であり、各２Ｄスナップショットは、前のスナップショット上に積層される。
【０１９５】
ビットは、バイナリビットとすることができるが、本明細書に記載するように、本開示はメモリスティックが３つ以上の異なる値を書き込む（または付加する）ことを可能にするため、いかなる基底の数体系にも限定されるものではない。その場合、セル設計は、それに応じて調整されるはずである。たとえば４進法（たとえば、ＤＮＡに基づくシステムの場合、ＧＣＡＴ）の場合、本明細書に記載するように、４つの付加チャンバおよび単一のデブロックチャンバが存在する。これは、３、４、５、６、７、８、９、１０（１０進法）、またはそれ以上、最大Ｎなど、２より大きい任意の基底の数体系に対して拡張することができる。ここでは、Ｎ個の付加チャンバおよび１つのデブロックチャンバが存在するはずである。唯一の制限は、メモリ列（またはＤＮＡもしくはポリマー）がすべての付加チャンバに到達することができるようにチャンバが向けられることになるはずである。
【０１９６】
本明細書では、「データ」という用語は、アドレス（または物理的もしくは仮想的なものを含むラベルもしくはポインタ）を表すデータ、任意のタイプの機械コード（それだけに限定されるものではないが、オブジェクトコード、実行可能コードなどを含む）、メモリ内に記憶することができる誤り検査、暗号化、ライブラリ、データベース、スタックなどを含むすべての形態のデータを含む。図７１〜７４（または文脈上示唆される別の場所）などの特定の例では、「データ」という用語は、「アドレス」または「誤り検査」とは別個のものとして図示または説明することができる。それらの場合、これらの用語は、例示のみを目的として、異なる形態のデータを示すために使用することができる。
【０１９７】
チップ流体計器および制御：図７５を参照すると、ナノポアチップ６７００（図６７）は、図６８に関して本明細書に上記で論じたように、読取り／書込みメモリコントローラ６８０２と相互作用することができ、読取り／書込みメモリコントローラ６８０２は、線７５０４によって集合的に示されているように、電圧（ＡＣおよびＤＣ）を制御して、ポリマーをＡｄｄビットへ操舵もしくは制御し、かつ／またはメモリ列上のビットを読み取ることができる。メモリチップはまた、線７５０６を介して計器７５０２とインターフェース接続することができ、計器７５０２は、本明細書に論じるように、チップをバッファー、酵素、および／またはポリマーもしくはＤＮＡ（もしくは他のメモリ列）で充填するなど、メモリチップに流体を提供することができる。計器７５０２およびメモリコントローラ６８０２は、図６８Ａに記載および図示されているように、ユーザ６８７８と相互作用することができ、ディスプレイ６８８０を有することができるように制御することができ、またはコンピュータシステム６８７０からコマンドを受け取ることができる。コンピュータシステム６８７０は、コンピュータバス６８７２（図６８）を介して、読取り／書込みメモリコントローラ６８０２および計器７５０２と相互作用することができる。計器７５０２は、本明細書に記載する機能を提供しまたは結果を実現するのに十分な流体および／または気体の制御、供給、および測定能力を含む、必要な電子機器、コンピュータ処理電源、インターフェース、メモリ、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、論理／状態機械、データベース、マイクロプロセッサ、通信リンク、ディスプレイ、または他の視覚もしくは音声ユーザインターフェース、印刷デバイス、および任意の他の入出力インターフェースを有する。
【０１９８】
特に、計器は、毛管作用および／またはマイクロポンピングによってチップを必要な流体、酵素、試薬、ＤＮＡなどで最初に充填するという流体動作をメモリチップとともに実行することができる。Ａｄｄ１およびＡｄｄ０が流動チャネルを有し、デブロックが隔離されたチャンバを有する実施形態の場合、デブロックチャンバをまずまとめて充填し（毛管作用を介して）、次いで封止することができ、水およびバッファーは付加チャンバ内へ進むはずであり、次いで付加チャンバを酵素／バッファーで充填することができ、または標的を絞った付加（たとえば、インクジェット）を介してデブロックチャンバを個々に充填し、乾燥および封止することもできる。その場合、Ａｄｄチャンバは、デブロックチャンバ内に気泡が閉じ込められないことを確実にするために、真空下で充填することができ、またはデブロックチャンバは、気体は通すが水は通さない材料（ＰＤＭＳなど）で封止することができる。また、デブロックチャンバは、組立て中にセルの底部を開いたままにし、セルの底部を所望の流体に入れることによって充填することができ、流体は毛管作用によってデブロックチャンバに入る。
【０１９９】
流体の充填および一掃に対する所望の結果を実現する様々な流体設計が存在する。たとえば、Ａｄｄ「０」チャネルおよびＡｄｄ「１」チャネルはそれぞれ、連続する蛇行（前後）パターンでともに接続することができ（ともに合わせたチャネルのように）、チャネルの上の層からビアを通って流体を供給することができる。ビアは、所望の流体をチャネルに供給するのに十分な標準的な流体インターフェースを介して計器に接続することができる。いくつかの実施形態では、Ａｄｄチャネルはそれぞれ、Ａｄｄ「０」チャネルに対する共通のリザーバおよびチャネルの上の層に位置するＡｄｄ「１」チャネルに対する別個の共通のリザーバから、別個のビアを通って供給することができる。所望される場合、任意の他の流体設計を使用することもできる。Ａｄｄチャネルに対するサンプル寸法は、幅が約１００ｎｍ〜約１０ミクロンであり、高さが約１ミクロン〜約５０ミクロンであり、チップの一方の辺から他方の辺までの長さが約１００ｍｍ（１ｃｍまたは１０００ミクロン）である。蛇行接続チャネルは、どれだけ多くのチャネルが直列接続されるかに応じて、この倍数になるはずである。
【０２００】
計器７５０２はまた、所望される場合、初期化およびセル試験中に使用することができる。たとえば、セルの初期化およびセルの試験に対して、予期の電流（孔径に比例する電流）が観察されることを確実にするために、ナノポア品質に対する品質管理（ＱＣ）を使用することができる。また、ＤＮＡの存在に対するＱＣは、予期の電流（または本明細書に論じるように、キャパシタンスもしくはインピーダンス、または共振の振幅もしくは位相のシフト）が、ナノポアを通るＤＮＡ（またはポリマーなど）の特徴を変化させること（たとえば、本明細書に論じるように、予期される電流の低減、または共振の振幅もしくは位相のシフト）を確実にする。加えて、ナノポア品質のために実行されたものに類似しているはずの回路形成のためのＱＣに使用することができる。
【０２０１】
計器７５０２はまた、本明細書に前述したように、ＤＮＡの付加に使用することができ、オリガミを有するＤＮＡが、付加チャンバ（またはチャネル）のうちの１つを介して導入され、挿入が検出されるまで、セルに電流を印加することができ、デブロックチャンバ内の修飾ＤＮＡ末端が放散し、次いで表面に取り付けられ、制限酵素が付加チャンバに導入されてオリガミを開裂し、次いでオリガミはバッファーの流れを介して除去される。
【０２０２】
別の実施形態では、本発明は、上述した一本または二本鎖ＤＮＡ分子を提供し、一本の鎖またはコード配列は、たとえばデータ記憶方法で使用するためのバイナリコードに対応するように順に配置された非ハイブリッド形成基、たとえばアデニンおよびシトシン（ＡおよびＣ）から本質的になる。たとえば、本発明は、ＤＮＡ（ＤＮＡ１）を提供し、ＤＮＡは一本または二本鎖であり、少なくとも長さ１０００ヌクレオチド、たとえば、１０００〜１，０００，０００ヌクレオチド、またはたとえば長さ５，０００〜２０，０００ヌクレオチドであり、ヌクレオチドの配列は、バイナリコードに対応する。たとえば以下のとおりである。
１．１．ＤＮＡが一本鎖である、ＤＮＡ１。
１．２．ＤＮＡが二本鎖である、ＤＮＡ１。
１．３．一本鎖またはコード鎖内のヌクレオチドは、アデニン、チミン、およびシトシンのヌクレオチドから選択され、たとえばアデニンおよびシトシンのヌクレオチド、またはチミンおよびシトシンのヌクレオチドから選択される、上記いずれかのＤＮＡ。
１．４．主に非ハイブリッド形成ヌクレオチドからなり、したがって一本鎖の形態にあるときは大きい二次構造を形成しない、上記いずれかのＤＮＡ。
１．５．ヌクレオチドは、少なくとも９５％、たとえば９９％、たとえば１００％のアデニンおよびシトシンのヌクレオチドである、上記いずれかのＤＮＡ。
１．６．バイナリコードを含むヌクレオチドを分離または中断するため、たとえば１および０または１および０からなる群を分離するために付加された１つのヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含み、したがって連続する１または０をより容易に読み取ることができる、上記いずれかのＤＮＡ。
１．７．（ａ）バイナリコード内の各ビットが、単一のヌクレオチドに対応し、たとえば１および０がそれぞれ、ＡもしくはＣに対応し、または（ｂ）バイナリコード内の各ビットが、一連の２つ以上のヌクレオチド、たとえば２、３、もしくは４つのヌクレオチド、たとえばＡＡＡまたはＣＣＣに対応する、上記いずれかのＤＮＡ。
１．８．結晶化された、上記いずれかのＤＮＡ。
１．９．たとえば参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第８２８３１６５（Ｂ２）号に記載されているように、緩衝塩（たとえば、ホウ酸塩バッファー）、抗酸化剤、湿潤剤、たとえばポリオール、および適宜、キレート化剤のうちの１つもしくは複数とともに乾燥した形態で、ならびに／またはポリ（エチレングリコール）−ポリ（ｌ−リシン）（ＰＥＧ−ＰＬＬ）ＡＢ型ブロック共重合体などの核酸とポリマーとの間のマトリックスで、ならびに／またはＤＮＡを結合する相補形の核酸鎖もしくはタンパク質とともに提供される、上記いずれかのＤＮＡ。
１．１０．識別配列を含む、上記いずれかのＤＮＡ。
１．１１．ＰＣＲ増幅配列を含む、上記いずれかのＤＮＡ。
１．１２．１つまたは複数の較正配列、たとえばナノポアに基づく配列決定デバイスを較正するために、たとえばＤＮＡのナノポア通過速度、または異なるヌクレオチドがナノポアを通過することに起因するキャパシタンスもしくは電流に対する相対作用を測定するために使用することができるヌクレオチドの周知の配列を含む、上記いずれかのＤＮＡ。
１．１３．以下に参照するナノチップ１などのナノポアに基づくデバイスにおいてナノポア付近で表面に繋ぐことが可能なターミナルリンカ基、表面に繋がれているときにＤＮＡ鎖がナノポアに到達することを可能にする十分な長さのスペーサ配列、データ、コドン、または他の情報を符号化するデータ記憶配列、ならびに適宜、合成された後にＤＮＡを開裂および検索することを可能にする制限配列を含む、上記いずれかのＤＮＡ。
１．１４．以下に参照する方法１、または以下に参照する方法２、または以下に参照する方法Ａのいずれによって作製される、上記いずれかのＤＮＡ。
【０２０３】
さらに別の実施形態では、本発明は、情報を記憶する方法における以下に参照するＤＮＡ１のいずれかの使用を提供する。
【０２０４】
別の実施形態では、本発明は、情報を記憶する方法における一本鎖ＤＮＡの使用を提供し、たとえば配列は、実質上非自己ハイブリッド形成である。
【０２０５】
ナノチップは、たとえば図２３〜２９に示すように製作することができる。たとえば、１つの形式では、各ポリマー鎖は、２つまたは４つの付加チャンバに関連付けられ、ポリマー内でバイナリコードを符号化するには２つの付加チャンバ形式が有用であり、特注のＤＮＡ配列を作製するには４つの付加チャンバ形式が特に有用である。各付加チャンバは、別個に制御可能な電極を収容する。付加チャンバは、バッファー内でポリマーにモノマーを付加するための試薬を収容する。付加チャンバは、１つまたは複数のナノポアを含む膜によって予備チャンバから分離され、予備チャンバは、複数の付加チャンバに共通とすることができ、付加チャンバ内に付加された保護モノマーまたはオリゴマーを脱保護するために、脱保護試薬およびバッファーを収容する。ナノチップは、多数のポリマーの並列合成を可能にするために、多数の付加チャンバ設定を備える。
【０２０６】
たとえば、いくつかの実施形態では、本開示のナノポアに基づく記憶デバイスは、たとえば厚さ約４００ミクロンの研磨された単結晶シリコンウェーハ上で製作することができる。たとえば低圧化学気相成長または他の類似の技法を介して、厚さ約２００ｎｍの窒化ケイ素層が、シリコンウェーハの両側に堆積させられる。次に、たとえば厚さ約５ミクロンの二酸化ケイ素層が、単結晶シリコンウェーハの頂面上に堆積させられ、次いで研磨される。次に、二酸化ケイ素層の上に、薄い（たとえば、約５ｎｍの）窒化ケイ素層が堆積させられる。次いで、二酸化ケイ素層（たとえば、約５ミクロン）が堆積させられる。二酸化ケイ素層の上に、たとえば厚さ約２００ｎｍの窒化ケイ素層が堆積させられる。次に、頂部の窒化ケイ素層二酸化ケイ素のエッチングによって、流体「Ａｄｄ」チャネルが形成され、チャネルの底部に薄い窒化ケイ素層を露出させる。これらのチャネルが、「Ａｄｄ１」および「Ａｄｄ０」チャネルになる。別のシリコンウェーハ［厚さ約３００ミクロン、配線として働くように伝導性金属で充填された絶縁（たとえば二酸化ケイ素を使用）ビアを有する］が、元のシリコンウェーハに位置合わせされ、これらのウェーハがともに接合される。接合されたウェーハは次いで、デバイスの底部から窒化ケイ素、次いでケイ素層を通ってエッチングされる。この後、個々のデブロックチャンバが二酸化ケイ素内にエッチングされ、薄い窒化ケイ素層を露出させる。次いで、電子ビームまたは他の適当な技法を使用して、薄い窒化ケイ素層内の適当な位置にナノポアが形成される。追加のシリコンウェーハ［厚さ約３００ミクロン、配線として働くように伝導性金属で充填された絶縁（たとえば二酸化ケイ素による）ビアを有する］が、接合されたウェーハの底部に位置合わせされて接合される。流体チャネルを通ってデバイスの頂層内へエッチングまたは穿孔することによって、流体の入口および出口が導入される。デバイスの頂面および底面において、デバイス内に埋め込まれた電極への接続（流体チャネルおよびデブロックチャンバへ内部に接続する）にアクセスすることができる。
【０２０７】
単一ＤＮＡに基づく解決策を実現するには、高帯域幅および低雑音のナノポアセンサおよび検出電子機器が重要である。特定の実施形態では、ナノチップは、相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）チップに電気的にリンクされる。たとえば、内容が参照により本明細書に組み込まれている、Uddin, et al., "Integration of solid-state nanopores in a 0.5 μm cmos foundry process", Nanotechnology (2013) 24(15): 155501に記載されているように、ＣＭＯＳプラットホームにおいて、バイアス電極および特注設計の増幅器電子機器に密接して、固体ナノポアを組み込むことができる。
【０２０８】
別の実施形態では、本開示は、少なくとも２つの別個のモノマーを含む帯電ポリマー、たとえばＤＮＡの合成および／または配列決定のためのナノチップ（ナノチップ１）を提供し、ナノチップは、１つまたは複数のナノポアを含む膜によって分離された少なくとも第１および第２の反応チャンバを備え、各反応チャンバは、帯電ポリマーをチャンバ内へ引き込むための１つまたは複数の電極を備え、ポリマーにモノマーを付加するための電解媒体、および適宜、試薬をさらに含む。たとえば、次のとおりである。
１．１．ナノポアの直径が２〜２０ｎｍ、たとえば２〜１０ｎｍ、たとえば２〜５ｎｍである、ナノチップ１。
１．２．ナノチップの反応チャンバの壁のいくつかまたはすべてが、ケイ素材料、たとえばシリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、またはこれらの組合せ、たとえば窒化ケイ素を含む、上記いずれかのナノチップ。
１．３．ナノチップの反応チャンバの壁のいくつかまたはすべてが、ケイ素材料、たとえばシリコン、二酸化ケイ素、窒化ケイ素、またはこれらの組合せ、たとえば窒化ケイ素を含み、ナノポアのいくつかまたはすべてが、イオン衝撃によって作製される、上記いずれかのナノチップ。
１．４．ナノポアのいくつかまたはすべてが、膜内に孔形成タンパク質、α溶血素から構成され、たとえば脂質二重層である、上記いずれかのナノチップ。
１．５．反応チャンバの壁のいくつかまたはすべてが、試薬との相互作用を最小にするように被覆され、たとえばポリエチレングリコールなどのポリマーまたはウシ血清アルブミンなどのタンパク質で被覆される、上記いずれかのナノチップ。
１．６．電解液媒体を含む、上記いずれかのナノチップ。
１．７．バッファー、たとえばｐＨ７〜８．５、たとえば約ｐＨ８に対するバッファー、たとえばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、好適な酸、ならびに適宜、キレート化剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むバッファー、たとえばトリス塩基、酢酸、およびＥＤＴＡの混合物を含有するＴＡＥバッファー、またはトリス塩基、ホウ酸、およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＢＥバッファー、たとえばｐＨ７．９＠２５℃で１０ｍＭのトリスｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＫＣｌ、またはたとえば、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウムを含む溶液を含む電解液媒体を含む、上記いずれかのナノチップ。
１．８．ポリマーにモノマーを付加するための試薬を含む、上記いずれかのナノチップ。
１．９．ポリマーの合成（「書込み」、たとえばポリマーにモノマーまたはモノマー群を順次付加することによる）と、配列決定（「読取り」、たとえばモノマーがナノポアを通過するときの電流および／またはインダクタンスの変化を測定することによる）との両方が可能である、上記いずれかのナノチップ。
１．１０．１つまたは複数のナノポアを含む膜が、両側に金属表面を含み、金属表面は、絶縁体、たとえば窒化ケイ素膜によって分離され、金属表面は、たとえばリソグラフィ手段によって、各ナノポアの両端に電極を提供するように構成され、たとえばそれにより電解液媒体を介してナノポアを通って、ナノポアを横切る電流の流れを確立することができ、たとえばそれにより電流（ｃｕｒｒａｎｔ）は、ポリマーをナノポアに引き込むことができ、ポリマーがナノポアを通過すると、ナノポアの両端間の電位の変化を測定することができ、それを使用してポリマー内のモノマーの配列を識別することができる、上記いずれかのナノチップ。
１．１１．ＤＮＡである帯電ポリマーを含む、上記いずれかのナノチップ。
１．１２．一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）である帯電ポリマーを含む、上記いずれかのナノチップ。
１．１３．所定の制限部位を含むＤＮＡである帯電ポリマーを含む、上記いずれかのナノチップ。
１．１４．ＤＮＡである帯電ポリマーを含み、ＤＮＡは、上記のように、以下に参照するＤＮＡ１のいずれかに記載のＤＮＡである、上記いずれかのナノチップ。
１．１５．ＤＮＡである帯電ポリマーを含み、ＤＮＡは、少なくとも９５％、たとえば９９％、たとえば１００％のアデニンおよびシトシンを含む、上記いずれかのナノチップ。
１．１６．ＤＮＡである帯電ポリマーを含み、ＤＮＡは、アデニンおよびシトシンのみを含む、上記いずれかのナノチップ。
１．１７．バッファーおよび試薬の導入および一掃を可能にするための１つまたは複数のポートを含む、上記いずれかのナノチップ。
１．１８．緩衝溶液、たとえばｐＨ７〜８．５、たとえば約ｐＨ８に対するバッファー、たとえばトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）、好適な酸、ならびに適宜、キレート化剤、たとえばエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を含むバッファー、たとえばトリス塩基、酢酸、およびＥＤＴＡの混合物を含有するＴＡＥバッファー、またはトリス塩基、ホウ酸、およびＥＤＴＡの混合物を含むＴＢＥバッファーを含む溶液、たとえばｐＨ７．９＠２５℃で１０ｍＭのトリスｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＫＣｌ、またはたとえば、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウムを含む溶液を含む、上記いずれかのナノチップ。
１．１９．貯蔵のために凍結乾燥され、後に再水和されており、またはそれが可能であり、たとえばナノチップの構造が、水和可能または透水性のポリマーを含む、上記いずれかのナノチップ。
１．２０．乾燥した形態で合成され、たとえばナノチップの構造が、水和可能または透水性のポリマーを含み、それに続いて使用前に水和され、適宜それに続いて、書込みプロセスが完了した後、長期貯蔵のために凍結乾燥される、上記いずれかのナノチップ。
１．２１．帯電ポリマー、たとえばＤＮＡが、ヒストンによって安定化される、上記いずれかのナノチップ。
１．２２．内面が正に帯電している、上記いずれかのナノチップ。
１．２３．電極が、たとえば１ＭＨｚ〜１ＧＨｚ、たとえば５０〜２００ＭＨｚ、たとえば約１００ＭＨｚの周波数で、ナノポアの両端間に無線周波脈動直流電流を提供することが可能な容量回路内に動作可能に接続され、たとえば脈動直流電流は、荷電ポリマーをナノポアに引き込むことができ、荷電ポリマーがナノポアを通るときにナノポアにおける容量分散を測定することによって、モノマー配列を判定することができる、上記いずれかのナノチップ。
１．２４．付加チャンバのうちの１つにおけるモノマーまたはオリゴマーの付加後のポリマーの脱保護のための試薬を収容する予備またはデブロッカチャンバを含む、上記いずれかのナノチップ。
１．２５．多数の対の付加チャンバを備える、上記いずれかのナノチップ。
１．２６．たとえば図２４に示されているように、ウェーハ接合によってつながれている電気制御層、流体層、および電気接地層を備える、上記いずれかのナノチップ。
１．２７．ナノポアが、ＦＩＢによる穿孔、ＴＥＭ、湿式または乾式エッチングによって作製される、上記いずれかのナノチップ。
１．２８．ナノポアを含む膜が、厚さ１原子層〜３０ｎｍである、上記いずれかのナノチップ。
１．２９．ナノポアを含む膜が、ＳｉＮ、ＢＮ、ＳｉＯｘ、グラフェン、遷移金属ダイカルコゲナイド、たとえばＷＳ２またはＭｏＳ２から作製される上記いずれかのナノチップ。
１．３０．金属またはポリシリコンから作製された配線を含む、上記いずれかのナノチップ。
１．３１．配線密度が、３Ｄスタッキングによって増大され、誘電体の堆積（たとえば、ＰＥＣＶＤ、スパッタリング、ＡＬＤなどを介して）によって電気的隔離が提供される、上記いずれかのナノチップ。
１．３２．付加チャンバ内の電極へのコンタクトが、ディープ反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）によるシリコン貫通電極（ＴＳＶ）を使用して、たとえば低温もしくはＢＯＳＣＨプロセスを使用して、または湿式シリコンエッチングを介して作製される、上記いずれかのナノチップ。
１．３３．各付加チャンバ内の電極に対する個々の電圧制御により、各付加チャンバ内の電極を個々に制御および監視することが可能になる、上記いずれかのナノチップ。
１．３４．各ポリマーが、第１の付加チャンバ、第２の付加チャンバ、およびデブロックチャンバに関連付けられる、上記いずれかのナノチップ。
１．３５．１つまたは複数のチャンバが、流体流を有する、上記いずれかのナノチップ。
１．３６．１つまたは複数のチャンバが、流体的に隔離される、上記いずれかのナノチップ。
１．３７．デブロックチャンバが、流体流を有する、上記いずれかのナノチップ。
１．３８．付加チャンバが、共通の流体流を有する、上記いずれかのナノチップ。
１．３９．チャンバ間の配線が、類似のタイプのチャンバ間（たとえば、第１の付加チャンバ間、第２の付加チャンバ間、およびデブロックチャンバ間）で共通である、上記いずれかのナノチップ。
１．４０．付加チャンバが、個々の電圧制御を有し、デブロックチャンバが、共通の電気接地を有する、上記いずれかのナノチップ。
１．４１．デブロックチャンバが、個々の電圧制御を有し、第１の付加チャンバが、共通の電気接地を有し、第２の付加チャンバが、共通の電気接地を有する、上記いずれかのナノチップ。
１．４２．ナノチップが、ウェーハ接合によって製作され、チャンバが、接合前に所望の試薬で事前に充填される、上記いずれかのナノチップ。
１．４３．１つまたは複数の内面がシラン化されている、上記いずれかのナノチップ。
１．４４．流体の導入または除去のための１つまたは複数のポートを有する、上記いずれかのナノチップ。
１．４５．チャンバ内の電極が、荷電ポリマーとの直接接触から制限され、たとえば電極は、ナノポアに近接して表面に結合された荷電ポリマーが到達できないほどナノポアから遠くに配置され、または電極は、水および単原子イオン（たとえば、Ｎａ＋、Ｋ＋、およびＣｌ−イオン）は通すがポリマーまたはポリマーにつながれたモノマーもしくはオリゴマー試薬は通さない材料によって保護される、上記いずれかのナノチップ。
１．４６．相補型金属酸化膜半導体（ＣＭＯＳ）チップに電気的にリンクされる、上記いずれかのナノチップ。
１．４７．前述したように、チップコントローラに動作可能にリンクされる、上記いずれかのナノチップ。
【０２０９】
たとえば、一実施形態では、本発明は、少なくとも２つの別個のモノマーを含む帯電ポリマー、たとえばＤＮＡを配列決定するたとえば以下に参照するナノチップ１のいずれかによるナノチップを提供し、ナノチップは、少なくとも第１および第２の反応チャンバを備え、これらの反応チャンバは電解液媒体を含み、１つまたは複数のナノポアを含む膜によって分離されており、各反応チャンバは、膜の両側に配置された少なくとも１対の電極を備え、電極は、たとえば１ＭＨｚ〜１ＧＨｚ、たとえば５０〜２００ＭＨｚ、たとえば約１００ＭＨｚの周波数で、無線周波脈動直流電流をナノポアの両端間に提供することが可能な容量回路内に動作可能に接続され、たとえば脈動直流電流は、荷電ポリマーをナノポアに引き込むことができ、荷電ポリマーがナノポアを通るときにナノポアにおける容量分散を測定することによって、モノマー配列を判定することができる。
別の実施形態では、本発明は、少なくとも２つの異なるタイプのモノマー、たとえばＤＮＡ分子を含む荷電ポリマーのモノマー配列を読み取る方法を提供し、この方法は、たとえば１ＭＨｚ〜１ＧＨｚ、たとえば５０〜２００ＭＨｚ、たとえば約１００ＭＨｚの周波数で、無線周波脈動直流電流をナノポアの両端間に印加することを含み、脈動直流電流は、荷電ポリマーをナノポアに引き込み、荷電ポリマーがナノポアを通るときにナノポアにおける容量分散を測定することによって、モノマー配列が読み取られ、たとえば回路は共振回路であり、容量分散は、共振周波数の変化を検出することによって検出される。
【０２１０】
たとえば、特定の実施形態では、本発明は、ポリマー内に記憶されているデータを読み取ることが可能である、たとえば以下に参照するナノチップ１のいずれかによる、ナノポアに基づくデバイス（デバイス１）、たとえばナノチップを提供し、このデバイスは、
ａ．インダクタおよびセルを有する共振器であって、セルがナノポアおよびポリマーを有し、ポリマーがナノポアを横断することができ、共振器が、プローブ周波数におけるＡＣ入力電圧に応答して、プローブ周波数でＡＣ出力電圧周波数応答を有する共振器と、
ｂ．少なくともプローブ周波数でＡＣ入力電圧を提供するように構成されたＡＣ入力電圧源と、
ｃ．少なくともプローブ周波数でＡＣ出力電圧を監視するように構成された監視デバイスであって、プローブ周波数におけるＡＣ出力電圧が、監視時にポリマー内に記憶されているデータを示す、監視デバイスとを備える。
【０２１１】
たとえば、デバイス１の特定の実施形態では、ポリマーは、プローブ周波数で異なる共振周波数応答を引き起こす異なる特性を有する少なくとも２つのモノマーを含み、応答は、少なくとも２つの異なるデータビット、たとえば２つの異なるＤＮＡヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドを示し、かつ／またはインダクタは、共振器を生じさせるように有効キャパシタンスに直列接続され、インダクタおよび有効キャパシタンスの組合せが、プローブ周波数における共振周波数応答に関係する。
【０２１２】
たとえば、特定の実施形態では、本発明は、たとえば以下に参照する方法１、以下に参照する方法Ａ、または以下に参照する方法２のいずれかとともに、たとえば以下に参照するナノポア１または以下に参照するデバイス１のいずれかによるデバイスを使用して、ポリマー内に記憶されているデータを読み取る方法（方法３）を提供し、この方法は、
ａ．インダクタおよびセルを有する共振器を提供することであって、セルがナノポアおよびポリマーを有し、ポリマーがナノポアを横断することができ、共振器が、プローブ周波数におけるＡＣ入力電圧に応答して、プローブ周波数でＡＣ出力電圧周波数応答を有する、提供することと、
ｂ．少なくともプローブ周波数を有するＡＣ入力電圧を提供することと、
ｃ．少なくともプローブ周波数でＡＣ出力電圧を監視することであって、プローブ周波数におけるＡＣ出力電圧が、監視時にポリマー内に記憶されているデータを示す、監視することとを含む。たとえば次のとおりである。
３．１．ポリマーが、異なる共振周波数応答を引き起こす異なる特性を有する少なくとも２つの異なるタイプのモノマーまたはオリゴマーを含む、方法３。
３．２．少なくとも２つの異なるタイプのモノマーまたはオリゴマーが、少なくとも、ナノポア内にあるときに第１の共振周波数応答を引き起こす第１の特性を有する第１のモノマーまたはオリゴマーと、ナノポア内にあるときに第２の共振周波数応答を引き起こす第２の特性を有する第２のモノマーまたはオリゴマーとを含む、方法３．１。
３．３．プローブ周波数における第１の周波数応答の特徴が、プローブ周波数における第２の周波数応答の同じ特徴とは異なる、方法３．２。
３．４．第１および第２の周波数応答の特徴が、振幅および位相応答のうちの少なくとも１つを含む、方法３．３。
３．５．モノマーの第１の特性および第２の特性が、誘電体特性を含む、方法３．４。
３．６．第１および第２のモノマーまたはオリゴマーがそれぞれ、複数のモノマーまたはオリゴマーを含む、上記いずれかの方法。
３．７．セルが少なくとも頂部および底部電極を備え、ナノポアが電極間に配置され、セルが流体を有し、電極、ナノポア、および流体が、ポリマーがナノポアを通過するときに変化する有効セルキャパシタンスを有する、上記いずれかの方法。
３．８．インダクタが、共振器を生じさせるように有効キャパシタンスに直列接続され、インダクタおよび有効キャパシタンスの組合せが、共振周波数応答に関係する、上記いずれかの方法。
３．９．ポリマーが、電極に印加されるＤＣ操舵電圧を介して、ナノポアに通される、上記いずれかの方法。
３．１０．セルが、少なくとも３つのチャンバと、少なくとも２つのナノポアと、ポリマーをナノポアに通す少なくとも３つの電極とを有する、上記いずれかの方法。
３．１１．モノマーのうちの少なくとも２つが、少なくとも２つの異なるデータビットを示す、上記いずれかの方法。
３．１２．複数のモノマーが、１つのデータビットを示す、上記いずれかの方法。
３．１３．ポリマーがＤＮＡを含み、ＤＮＡが塩基を含み、塩基のうちの少なくとも２つが、プローブ周波数において固有の周波数応答を提供する、上記いずれかの方法。
３．１４．プローブ周波数が約１ＭＨｚ〜１ＧＨｚである、上記いずれかの方法。
３．１５．モノマーのうちの少なくとも２つが、プローブ周波数において少なくとも２つの異なる周波数応答を生じさせるように共振器の周波数応答に影響を与える誘電体特性を有する、上記いずれかの方法。
３．１６．ポリマーがＤＮＡを含み、配列が、タンパク質または生物学的に機能的なＲＮＡ、たとえばｍＲＮＡを符号化する、上記いずれかの方法。
３．１７．配列が、コンピュータ可読データを、たとえば２進法、３進法、または４進法コードで符号化する、上記いずれかの方法。
３．１８．以下に参照する方法１、以下に参照する方法Ａ、または以下に参照する方法２のいずれかによって配列決定されたポリマーの配列を読み取りまたは立証する方法である、上記いずれかの方法。
【０２１３】
別の実施形態では、本発明は、ナノポアに基づくチップ内の現場でポリマー上のデータの記憶および読取りを行う方法を提供し、この方法は、
ａ．ポリマーに「１」ビットを付加するように配置されたＡｄｄ「１」チャンバ、およびポリマーに「０」ビットを付加するように配置されたＡｄｄ「０」チャンバ、ならびにポリマーがＡｄｄ「１」またはＡｄｄ「０」チャンバに入るとき、ポリマーがそれぞれ「１」ビットおよび「０」ビットを受け取ることを可能にするように配置された「デブロック」チャンバを含む、少なくとも３つのチャンバを有するセルを提供することと、
ｂ．所定のデジタルデータパターンに基づいてポリマーを「デブロック」チャンバからナノポアを通ってＡｄｄ「１」チャンバまたはＡｄｄ「０」チャンバへ連続して操舵して、ポリマー上にデジタルデータパターンを作成することと、
ｃ．チップ上のナノポア−ポリマー共振器（ＮＰＲ）の共振周波応答を使用して、たとえば以下に参照する方法３による方法を使用して、ナノポアを通過するときにポリマー上に記憶されているデジタルデータを読み取ることとを含む。
【０２１４】
別の実施形態では、本発明は、ナノチップ、たとえば以下に参照するナノチップ１のいずれかを使用して、少なくとも２つの別個のモノマーまたはオリゴマーを含む帯電ポリマー、たとえばＤＮＡを作るデータ記憶方法およびデバイスを提供し、モノマーまたはオリゴマーは、たとえば以下に参照する上記の方法１および／または２のいずれかによって、バイナリコードに対応する配列内に配置される。
【０２１５】
たとえば、一実施形態では、そのように合成されたポリマーを含むナノチップは、データ記憶デバイスを提供し、任意の時間にナノポア（ｎｏｎｏｐｏｒｅ）を通過させることによって、ナノチップを起動し、ポリマーの配列を検出することができる。他の実施形態では、ポリマーはナノチップから除去され、または増幅され、増幅されたポリマーがナノチップから除去され、必要とされるまで貯蔵され、次いで従来のシーケンサー、たとえば従来のナノポア配列決定デバイスを使用して読み取られる。
【０２１６】
別の実施形態では、本発明は、情報を記憶する方法を提供し、この方法は、たとえば以下に参照する方法１または以下に参照する方法２のいずれかによって、以下に参照するＤＮＡ１のいずれかを合成することを含む。
【０２１７】
別の実施形態では、本発明は、ナノポアシーケンサーを使用して、たとえば本明細書に記載するように以下に参照するナノチップ１を使用して、たとえば以下に参照するＤＮＡ１のいずれかにおいて符号化されているバイナリコードを読み取る方法を提供する。
【０２１８】
別の実施形態では、本発明は、荷電ポリマーを溶解させる酵素、たとえばＤＮＡを加水分解するデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）を使用して、ナノチップが消去される、上記いずれかの方法を提供する。
【０２１９】
本明細書に記載するすべての寸法は、本開示の例示的な実施形態に対して示されており、所望される場合、本明細書に記載する機能を提供することを条件として、他の寸法、形状寸法、レイアウト、および向きを使用することもできる。
【０２２０】
また、本開示は、ＤＮＡに基づくデータ記憶における使用に限定されるものではなく、本明細書に記載する機能または性能を実現するのに必要な特性を有する任意のポリマーまたは他の材料などの任意のタイプの分子データ記憶で使用することができる。
【０２２１】
本明細書に記載する任意の自動化または半自動化されたデバイスまたは構成要素は、本明細書に記載する機能を提供しまたは結果を実現するのに十分な流体および気体の制御、供給、および測定能力を含む、必要な電子機器、コンピュータ処理電源、インターフェース、メモリ、ハードウェア、ソフトウェア、ファームウェア、論理／状態機械、データベース、マイクロプロセッサ、通信リンク、ディスプレイ、または他の視覚もしくは音声ユーザインターフェース、印刷デバイス、および任意の他の入出力インターフェースを有するコンピュータ制御式のデバイスとすることができる。本明細書に別途明示的または暗示的に示すものを除いて、本明細書に記載するプロセスまたは方法工程は、１つまたは複数の汎用コンピュータ上で実行されるソフトウェアモジュール（またはコンピュータプログラム）内で実施することができる。別法として、特定の動作を実行するために、特別に設計されたハードウェアを使用することもできる。加えて、本明細書に記載するコンピュータまたはコンピュータに基づくデバイスは、それだけに限定されるものではないが、タブレット、ラップトップコンピュータ、デスクトップコンピュータなどを含む、本明細書に記載する機能を実行することが可能な任意の数の計算デバイスを含むことができる。
【０２２２】
本開示について、本開示を実施する例示的な技法、アルゴリズム、またはプロセスを使用して本明細書に説明したが、本明細書に記載する同じ機能および結果を実現する他の技法、アルゴリズム、およびプロセス、または本明細書に記載する技法、アルゴリズム、およびプロセスの他の組合せおよび順序も使用または実行することができ、これらは本開示の範囲内に包含されることを、当業者には理解されたい。
【０２２３】
本明細書に提供するプロセス流れ図におけるあらゆるプロセス説明、工程、またはブロックは、１つの可能な実装形態を示すものであり、本明細書に記載するシステムおよび方法の好ましい実施形態の範囲内には、代替実装形態も包含され、当業者には理解されるように、必要な機能性に応じて、機能または工程は削除することができ、または実質上同時もしくは逆の順序を含む、図示もしくは議論する順序以外で実行することができる。
【０２２４】
本明細書に別途明示的または暗示的に示されない限り、本明細書に特定の実施形態に関して記載する特徴、特性、代替手段、または修正手段はいずれも、本明細書に記載する任意の他の実施形態に適用、使用、または統合することができることを理解されたい。また本明細書の図面は、別途示されない限り、原寸に比例して描かれていない。
【実施例】
【０２２５】
実施例１
ナノポアに近接するＤＮＡの一方の末端の不動化および電流を介したＤＮＡの前後運動の制御
実験手順は、関係するタンパク質がチャンバ間で動かないという条件下で、ＤＮＡが電流を介してナノポアによって分離された２つのチャンバ間で前後に動かされることを実証するために開発されたものである。
【０２２６】
２つのチャンバを備えるナノチップが、窒化ケイ素から製作される。Briggs K, et al. Automated fabrication of 2-nm solid-state nanopores for nucleic acid analysis, Small (2014)10(10):2077-86に記載されているように、４ｎｍ（ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡの場合）および２ｎｍ（ｓｓＤＮＡのみの場合）より小さいナノポアが準備される。２つのチャンバを「近傍」および「遠方」チャンバと呼び、遠方チャンバは、ＤＮＡの３’末端がコンジュゲートされるチャンバである。
【０２２７】
ｓｓＤＮＡ（２ｎｍ孔）およびｓｓＤＮＡ＋ｄｓＤＮＡ（４ｎｍ孔）がナノポアを通過するが、タンパク質は通過しないことが示されている。ナノポアの通過は、電流の乱れによって検出される。
【０２２８】
孔の表面に対するＤＮＡのコンジュゲーション：カルボジイミド媒介による取付けを介して、５’アミノ修飾ＤＮＡをカルボキシ被覆ポリスチレンビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．からのＦｌｕｏｒｅｓｂｒｉｔｅ（登録商標）ＢＢ  Ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  Ｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ  ０．０５μｍ）に取り付ける。ＤＮＡの３’はビオチンで標識付けされる。ＤＮＡは、事前に指定された長さである。
【０２２９】
ストレプトアビジン（Ｓｔｒｅｐａｔｉｖｉｄｉｎ）コンジュゲーション：Arafat, A. Covalent Biofunctionalization of Silicon Nitride Surfaces. Langmuir (2007) 23 (11): 6233-6244に記載されているように、表面に対して窒化ケイ素ナノポアコンジュゲートストレプトアビジンの「遠方」側で、コンジュゲーションが実行される。
【０２３０】
ナノポア付近のＤＮＡの不動化：バッファー内のＤＮＡコンジュゲートポリスチレンビーズが、「近傍」チャンバに付加され、バッファーが「遠方」チャンバに付加される（標準的なバッファー：１０ｍＭのトリスｐＨ８、１ｍＭのＥＤＴＡ、１５０ｍＭのＫＣｌ）。電流の乱れが観察されるまで、電圧（約１００ｍＶ）が印加される（Ａｘｏｎ  Ｎａｎｏｐａｔｃｈ２００Ｂパッチクランプ増幅器を使用）。５０ｎｍのビーズはナノポアを通過することができず、したがってＤＮＡ鎖が通過し、ビーズがナノポアの末端に押し付けられたとき、電流は大きく乱れる。ＤＮＡがビオチンの結合を介して遠方側で不動化ストレプトアビジンに不可逆的に結合されるまで、電流が１〜２分間維持される。ＤＮＡが不動化されたことを立証するために、電流が逆にされる。ＤＮＡが孔に出入りしている場合、異なる電流が観察される。ＤＮＡが不動化されていないと考えられる場合、プロセスが繰り返される。
【０２３１】
エンドヌクレアーゼを介してビーズを解放する：ＤＮＡが取り付けられたチャンバに、制限酵素バッファー内の制限酵素が付加される。一実施形態では、ＤＮＡは一本鎖であり、一本鎖ＤＮＡを開裂する酵素によって開裂可能な制限部位を含む。たとえば、Nishigaki, K., Type II restriction endonucleases cleave single-stranded DNAs in general. Nucleic Acids Res. (1985) 13(16): 5747-5760を参照されたい。代替実施形態では、ＤＮＡが取り付けられたチャンバに、相補形のオリゴヌクレオチドが付加され、３０分間ハイブリッド形成させてｄｓＤＮＡを生じさせ、次いで制限酵素が付加される。ビーズを解放した後、洗い流される。ＤＮＡが孔を通って出入りすることを立証するために、電流が順方向と逆方向との間で切り換えられる。
【０２３２】
制御された前後運動を実証する：標準的なバッファーを使用して、信号の乱れが観察されるまで、電流が順方向に印加され、次いでＤＮＡが通過した後、逆にして「正常」にする。信号の乱れが観察されるまで、逆方向の電流が印加される。ＤＮＡが孔の中に留まっているため、信号が正常に戻らないことが観察される。順方向および逆方向の電流の印加を数周期分繰り返し、ＤＮＡがナノポアを通って前後に動くことを立証する。
【０２３３】
実施例１ａ
二酸化ケイ素チップ内のナノポアに近接するＤＮＡ鎖の不動化
ナノチップ内壁が、二酸化ケイ素から製作される。両側がシラン化されるが、オリゴヌクレオチドはチップ壁の一方の側のみにコンジュゲートされ、次いでナノポアが作製される。
【０２３４】
シラン化：チップ壁の表面は、３０℃でピラニア溶液（様々なブランドが市販されており、概して硫酸（Ｈ２ＳＯ４）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）の混合物を含み、表面から有機残渣を除去する）によって清浄にされ、再蒸留水によって洗われる。５０％のメタノール（ＭｅＯＨ）、４７．５％のＡＰＴＥＳ、２．５％のナノ純Ｈ２Ｏによって、４℃で１時間超エージングされ、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）の原液が準備される。次いでＡＰＴＥＳ原液は、ＭｅＯＨ内で１：５００に希釈され、室温でチップ壁に塗布されてインキュベートされる。次いでチップ壁はＭｅＯＨで洗い流され、３０分間１１０℃で乾燥させられる。
【０２３５】
コンジュゲーション：次いでチップ壁は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）内の１，４−フェニレンジイソチオシアナート（ＰＤＣ）の０．５％ｗ／ｖ溶液中で、５時間室温でインキュベートされる。チップ壁は、ＤＭＳＯで簡単に２度、再蒸留水で簡単に２度洗われる。次いでチップ壁は、再蒸留水（ｐＨ８）内の１００ｎＭのアミン修飾一本鎖ＤＮＡオリゴマー（約５０ｍｅｒ）とともに一晩３７℃でインキュベートされる。次いでチップ壁は、２８％のアンモニア溶液で２度洗われてあらゆる未反応の材料を不活性化し、再蒸留水で２度洗われる。次いで１つまたは複数のナノポアが、壁に作製される。
【０２３６】
ナノチップの製作が完了した後、内壁は、長さ約５０ｂｐのＤＮＡオリゴマーで被覆される。これにより、ｓｓＤＮＡを比較的大きい構造（たとえば、ナノポアを通るには大きすぎる直径を有するビーズ、タンパク質、またはＤＮＡオリガミ構造）に取り付けることによって、表面結合ＤＮＡに相補形の末端ターミナル配列を有する一本鎖ＤＮＡをナノポアに局所化することが可能になり、表面結合ＤＮＡに相補形の配列は、大型構造に対して遠位にあり、電流を使用して荷電ポリマーをナノポアに引き込み、ｓｓＤＮＡがナノポアに近接して相補形表面結合ＤＮＡオリゴマーに結合することを可能にし、大型構造を開裂する。
【０２３７】
実施例２
ＤＮＡ合成−単一のヌクレオチドの付加
ＤＮＡは、適当な電流を印加し、ＤＮＡ運動を検出することによって、「逆方向」チャンバへ動かされる。
【０２３８】
適当なバッファー（ｐＨ７．９＠２５℃で５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス酢酸、１０ｍＭの酢酸マグネシウム）内のターミナルトランスフェラーゼ酵素（ＴｄＴ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に、可逆的にブロックされたｄＡＴＰ＊を加えて、「付加」チャンバに付加する。バッファーはまた、「逆方向」チャンバにも付加される。
【０２３９】
３’−ＯＨに可逆性のブロックを有するｄＮＴＰを使用して、ＤＮＡにヌクレオチドを付加する。ＤＮＡ鎖に付加されたとき、ブロックｄＮＴＰが非ブロック化されるまで、次のｄＮＴＰを付加することはできない。
【０２４０】
デブロックは、化学的または酵素学的に行うことができる。様々な手法が利用される。
【０２４１】
ａ．３’Ｏ−アリル：Ju J, Four-color DNA sequencing by synthesis using cleavable fluorescent nucleotide reversible terminators. Proc Natl Acad Sci U S A. (2006);103(52):19635-40に記載されているように、水性緩衝溶液におけるＰｄ触媒の非アリル化によって、またはShankaraiah G., et al., Rapid and selective deallylation of allyl ethers and esters using iodine in polyethylene glycol-400. Green Chem. (2011)13: 2354-2358に記載されているように、ポリエチレングリコール４００内でヨウ素（１０モル％）を使用することによって、アリルが除去される。
【０２４２】
ｂ．３’Ｏ−ＮＨ２：米国特許第８０３４９２３号に記載されているように、緩衝ＮａＮＯ２内でアミンが除去される。
【０２４３】
ｃ．３’リン酸。リン酸は、エンドヌクレアーゼＩＶ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）によって加水分解される。やはりエンドヌクレアーゼＩＶによって除去することができる他の可能な３’修飾には、ホスホグリコアルデヒドおよびデオキシリボース−５−リン酸が含まれる。
【０２４４】
ｄ．３’−Ｏ−Ａｃ：Ud-Dean, A theoretical model for template-free synthesis of long DNA sequence. Syst Synth Biol (2008) 2:67-73に記載されているように、酵素加水分解によって酢酸が除去される。
【０２４５】
次いでＤＮＡは、適当な電流を印加し、ＤＮＡ運動を検出することによって、「遠方」チャンバへ動かされる。ＤＮＡは、バッファーを除去し、上記のａ．〜ｄ．に記載するようにデブロックバッファー／溶液を付加することによって脱保護される。
【０２４６】
所望される場合、当該配列を作製するために、プロセスが繰り返される。
【０２４７】
実施例３
ＤＮＡ合成：ブロックオリゴヌクレオチドの付加
二本鎖ＤＮＡの３’末端が、４ｎｍのアパーチャを有するナノポアに近接して取り付けられる。ＤＮＡの５’末端は、ＣＧのオーバーハングを有する（５’から３’へ読取り）。
【０２４８】
オリゴカセットＡおよびＢが、次のように作製される。
【化６】
2020502494.tif 000010
【０２４９】
コードＡおよびコードＢはそれぞれ、情報配列を表す。Ｎは任意のヌクレオチドを指す。５’配列は、トポイソメラーゼ認識部位を含み、３’配列は、Ａｃｃ１制限部位を含む。オリゴは、トポイソメラーゼに露出され、トポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｓｉｓｏｍｅｒａｓｅ）は３’チミジンに結合する。
【化７】
2020502494.tif 000011
【０２５０】
ＤＮＡは、適当な電流を印加し、ＤＮＡ運動を検出することによって、「近傍」チャンバへ動かされる。トポイソメラーゼ充填「コードＡ」オリゴが、「付加」チャンバ内に提供される。ＤＮＡは、適当な電流を印加し、ＤＮＡ運動を検出することによって、付加チャンバ内へ動かされ、その際、コードＡオリゴがＤＮＡに結合され、Ａｃｃ１が「逆方向」チャンバに付加され、Ａｃｃ１は制限部位で開裂し、トポイソメラーゼ（ｔｏｐｏｉｓｉｍｅｒａｓｅ）ライゲーション部位を提供する。
【０２５１】
プロセスは、所望の配列に到達するまで繰り返され、他の「コードＡ」または「コードＢ」を付加する。新しいＡｃｃ１を「逆方向」チャンバに絶えず付加する必要はなく、コードＡまたはコードＢから切り替えるとき、「付加」チャンバ内のコードＡまたはコードＢのオリゴを一掃するだけでよいことに留意されたい。
【０２５２】
ｓｓＤＮＡのみが通過することを可能にする孔を配列決定するために、上記のプロトコルに対するいくつかの修正が必要とされる。ｄｓＤＮＡが小さい孔（２ｎｍ）に遭遇したとき、ｓｓＤＮＡのみが通過し、相補配列は「剥離」されることがすでに知られている。したがって、２ｎｍの孔によってこの合成を行う場合、適切なｄｓＤＮＡが他方の側で「再形成」することが可能であることを確実にしなければならない。これを行うため、近傍チャンバに「ＣＧＡＡＧＧＧ＜コードＡまたはＢ＞ＧＴＣＧＡＣＮＮＮＮＮ」を付加し（制限部位が作製されることを確実にするため）、「ＣＧＡＡＧＧＧ＜コードＡまたはＢ＞ＧＴ」を遠方チャンバに付加する（トポ適合部位が生成されることを確実にするため）はずである。
【０２５３】
上記の方法について詳述することで、本発明者らは、それぞれ「付加」および「脱保護」工程を含む２以上の順次付加（２データビットを表す）による成長しているＤＮＡ鎖へのＤＮＡ符号化情報の順次「付加」を実証する。最適化および概念実証のための最初の実験は、マイクロチューブ内で実行される。
【０２５４】
この例に記載する手法において、１列のヌクレオチド内に１ビットの情報が符号化される。「付加」すべきＤＮＡビットは、ワクシニアトポイソメラーゼＩ（トポ）にコンジュゲートされた短いｄｓＤＮＡ配列である。好適な「脱保護」「アクセプタ」ＤＮＡの存在下で、トポ充填ＤＮＡ「ビット」は、トポイソメラーゼによってアクセプタに酵素学的および共有結合によって連結（「付加」）され、これはプロセスにおいてＤＮＡから除去される。次いで制限酵素が、付加されたビットを開裂して「脱保護」し、次のビットの付加のために好適な「アクセプタ」配列を作製することができる。
【０２５５】
トポ充填：一般的な充填方式は次のとおりであり、図２２および以下に概略的に示されており、ここでＮは、任意のヌクレオチドを示し、Ａ、Ｔ、Ｇ、およびＣは、それぞれアデニン、チミン、グアニン、およびシトシン塩基を有するヌクレオチドを表す。互いに重なっているＮは相補形である。この例では、制限酵素ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩを使用するが、基本的な方策は、たとえば実施例４に実証するように、他の制限酵素でも機能する。
【化８】
2020502494.tif 000012
【化９】
2020502494.tif 000013
【０２５６】
以下のオリゴヌクレオチドは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）から得たものである。オリゴヌクレオチドのいくつかの末端にある「ｂ」はビオチンを示す）。
【化１０】
2020502494.tif 000014
【０２５７】
オリゴヌクレオチドが、ＴＥバッファーで１００ｕＭに可溶化され、−２０Ｃで貯蔵される。
【０２５８】
後述するようにオリゴヌクレオチドを混合し、５分間９５℃まで加熱し、次いで温度が２０℃に到達するまで、この温度を３分ごとに５℃ずつ降下させることによって、ハイブリッドオリゴヌクレオチドが作製される。ハイブリッドオリゴヌクレオチドは、４℃または−２０℃で貯蔵される。オリゴヌクレオチドの組合せは、次のとおりである。
【化１１】
2020502494.tif 000015
【０２５９】
この例では、以下のバッファーおよび酵素が使用される。
ＴＥ：１０ＭのトリスｐＨ８．０．１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．０
ＷＢ：１ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．０
１×トポ：２０ｍＭのトリスｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＤＴＴ、５ｍＭのＭｇＣｌ２
１×ＲＥ：ｐＨ７．９＠２５Ｃで５０ｍＭの酢酸Ｋ、２０ｍＭのトリス酢酸、１０ｍＭの酢酸Ｍｇ、１００ｕｇ／ｍｌのＢＳＡ
ワクシニアＤＮＡトポイソメラーゼＩ（トポ）は、Ｍｏｎｓｅｒａｔｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入されたものである（１０，０００Ｕ／ｍＬ）。
ＨｙｐＣＨ４ＩＩＩは、ＮＥＢから購入したものである。
ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（ｓ−ＭａｇＢｅａｄｓ）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入したものである。
【０２６０】
アクセプタは、次のように準備される。５ｕＬのｓ磁気ビーズが、２００ｕＬのＷＢ内で１度洗われる（結合時間は１分）。５ｕＬのＢ１／２＋１９５ｕＬのＷＢがビーズに付加され、１５分間室温でインキュベートされ、次いで２００ｕＬのＷＢで１度洗われ、次いで２００ｕＬの１×トポで１度洗われ、１５０ｕＬの１×トポ内に再懸濁される。
【０２６１】
トポ充填Ａ５（図２０参照）は、次のように調製される。４ｕＬの１０×トポバッファー＋２３ｕＬの水＋８ｕＬのＡ５＋５ｕＬのトポが、３０分間３７℃でインキュベートされ、５ｕＬのｓ磁気ビーズに付加され（２００ｕＬのＷＢで１度、２００ｕＬの１×トポで１度洗われ、１５０ｕＬの１×トポ内に再懸濁される）、１５分間室温で結合させられる。
【０２６２】
アクセプタへの充填Ａ５の「付加」：ｓ磁気ビーズがトポ充填Ａ５から除去され、アクセプタに付加され、６０分間３７℃でインキュベートされる。アリコートは除去され、ＴＥ内で１／２００で希釈され、−２０Ｃで貯蔵される。
【０２６３】
脱保護：材料は、２００ｕＬのＷＢで１度洗われ、２００ｕＬの１×ＲＥで１度洗われ、１５ｕＬの１０×ＲＥおよび１２０ｕＬの水に再懸濁される）。１５ｕＬのＨｙｐＣＨ４ＩＩＩが付加される。混合物は、６０分間３７℃でインキュベートされ、次いで２００ｕＬのＷＢで１度洗われ、２００ｕＬの１×トポで１度洗われて、本発明者らが「アクセプタＡ５」と呼ぶ生成物を生じさせる。
【０２６４】
トポ充填Ｂ５（図２１参照）は、次のように調製される。４ｕＬの１０×トポバッファー、２３ｕＬの水、および８ｕＬのＢ５＋５ｕＬのトポが組み合わされ、３０分間３７℃でインキュベートされ、生成物は、５ｕＬのｓ磁気ビーズに付加され（２００ｕＬのＷＢで１度、２００ｕＬの１×トポで１度洗われ、１５０ｕＬの１×トポ内に再懸濁される）、１５分間室温で結合させられる。
【０２６５】
アクセプタＡ５への充填Ｂ５の「付加」：ｓ磁気ビーズがトポ充填Ｂ５から除去され、アクセプタＡ５に付加され、６０分間３７℃でインキュベートされる。次いでアリコートは除去され、ＴＥ内で１／２００で希釈され、−２０℃で貯蔵される。
【０２６６】
脱保護：材料は、２００ｕＬのＷＢで１度洗われ、次いで２００ｕＬの１×ＲＥで１度洗われ、１５ｕＬの１０×ＲＥおよび１２０ｕＬの水に再懸濁される。１５ｕＬのＨｙｐＣＨ４ＩＩＩが付加され、混合物は６０分間３７℃でインキュベート（ｎｃｕｂａｔｅｄ）される。
【０２６７】
上記の反応が機能したという立証は、Ａ５（Ａ５が付加されたアクセプタ、概略図の工程ｉｉｉ「Ａ５付加」）およびＢ５（Ｂ５が付加されたアクセプタＡ５、概略図の工程ｖｉ「Ｂ５付加」）からのアリコートのＰＣＲ増幅によって提供される。「鋳型なし」は、Ａ５に対する陰性対照として使用され、Ａ５は、Ｂ５に対する陰性対照として使用され、オリゴＢＡＢは、Ｂ５に対する陽性対照として使用される。Ａ５  ＰＣＲに対する予期の生成物サイズは６８ｂｐであり、Ｂ５  ＰＣＲに対する予期の生成物サイズは５７ｂｐである。（Ｂ１／２は、ゲルの上も流れ、予期されるサイズは約４７ｂｐであるが、これは、オーバーハングが存在し、ビオチン化されるため、近似とすることができる）。ＰＣＲ反応［９５／５５／６８（各１分）の３０周期が、次にように実施される。
【０２６８】
【表３】
2020502494.tif 000016
【０２６９】
４〜２０％のトリス−グリシンゲルを使用するＳＤＳ−ＰＡＧＥが、予期されるサイズのオリゴヌクレオチドが作製されたことを立証するために使用される。充填は、上述したように実行されるが、充填（３７℃のインキュベーション工程）の直後に、ローディングバッファーが混合され、サンプルが２分間で７０℃に加熱され、ゲルを流す前に冷却させられる。ゲルはクーマシーによって染色される。陰性対照の場合、トポの代わりに水が反応に付加される。図３０は、これらの結果を示し、Ａ５  ＰＣＲおよびＢ５  ＰＣＲに対して予期される生成物サイズに対応する帯をはっきりと示している。
【０２７０】
したがって、トポイソメラーゼ充填ＤＮＡカセットを介したＤＮＡビット付加および制限酵素を介して実行される脱保護が実行可能であることが示されている。これらの概念実証実験において、ＤＮＡは、ストレプトアビジンコンジュゲート磁気ビーズを介して不動化され、異なる反応混合物内へ順次動かされるが、ナノポアチップ形式では、本発明者らは、別個の反応チャンバを作製し、電流を使用して、ＤＮＡをそれらの異なる反応チャンバ内へ動かす。
【０２７１】
最後に、ＰＣＲは、情報の「ビット」に対応するＤＮＡ配列の順次付加を実行するとき、予期されるＤＮＡ配列が作製されることを実証する。これらの反応は、最小の最適化でも設計どおり機能した。
【０２７２】
実施例２および３に記載したように作製されたＤＮＡは、市販のナノポアシーケンサー（Ｏｘｆｏｒｄ  ＮａｎｏｐｏｒｅからのＭｉｎＩＯＮ）を使用して検索および配列決定され、所望の配列が得られたことを立証する。
【０２７３】
実施例４
ＤＮＡ合成：異なる制限酵素を使用するブロックオリゴヌクレオチドの付加
以下の合成は、実施例３と同様に実施されるが、制限酵素ＭｌｕＩを使用する。制限酵素ＭｌｕＩは、「ＡＣＧＣＧＴ」で切断して、
【化１２】
2020502494.tif 000017
を形成する。この例では、トポは、充填トポがＭｌｕＩによって切断されたＤＮＡにＤＮＡを伝達することを可能にする配列相補性を有する複合体を形成するように充填される。
【化１３】
2020502494.tif 000018
【０２７４】
前述の例に類似しているプロセスによって、次いで充填トポを使用して、相補形のアクセプタ配列を有する合成中の鎖の５’末端にオリゴマーを付加し、それによってトポを解除し、次いで鎖は、ＭｌｕＩを使用して「脱保護」され、所望の配列のオリゴマーが得られるまで、この周期が繰り返される。
【０２７５】
実施例５
トポイソメラーゼ方策を使用する単一の塩基の付加
本発明者らは、トポイソメラーゼシステムは、一本鎖ＤＮＡ鎖に単一の塩基を付加するように設計することもできることを見出した（「カセット」の付加について記載した実施例３と比較）。「付加」すべきＤＮＡビットは、ワクシニアトポイソメラーゼＩ（トポ）にコンジュゲートされる短いＤＮＡ配列内に収容される。好適な一本鎖「脱保護」「アクセプタ」ＤＮＡの存在下で、トポ充填ＤＮＡは、トポイソメラーゼによってアクセプタに酵素学的および共有結合によってライゲーション（「付加」）され、これはプロセスにおいてＤＮＡから除去される。次いでＩＩＳ型制限酵素が、単一の塩基（「付加」されている塩基）を除いて、すべての付加されたＤＮＡを開裂することができる。この脱保護−付加のプロセスを繰り返して、追加の塩基（ビット）を付加する。
【０２７６】
トポ充填：実施例３と同様に、一般的な充填プロトコルは次のとおりである。
【化１４】
2020502494.tif 000019
実施例３と同様に、互いに重なっているＮは相補形である。Ｉはイノシンである。ビオチンが、未反応の生成物および副生成物を除去するために使用される。単一の塩基の付加は、次のように実施される。
【化１５】
2020502494.tif 000020
脱保護は、ＢｃｉＶＩ制限酵素（太字部位）を使用して、次のように示す。
【化１６】
2020502494.tif 000021
【０２７７】
以下のオリゴヌクレオチドは、商用に合成されたものである（Ｂ＝ビオチン、Ｐ＝リン酸、Ｉ＝イノシン）。
【化１７】
2020502494.tif 000022
【０２７８】
オリゴヌクレオチドは、ＴＥバッファーで１００μＭに可溶化され、−２０℃で貯蔵される。
【０２７９】
ハイブリッド形成：以下のハイブリッドオリゴヌクレオチドは、記載のオリゴヌクレオチドを混合し、５分間９５℃まで加熱し、次いで温度が２０℃に到達するまで、この温度を３分ごとに５℃ずつ降下させることによって作製される。ハイブリッドオリゴヌクレオチドは、４℃または−２０℃で貯蔵される。
NAT1b/NAT9cI/NAT9x
8 μL NAT1B
10 μL NAT9cI
10 μL NAT9x
48 μL TE
4 μL 5M NaCl
NAT1/NAT9cI
10 μL NAT1
10 μL NAT9cI
80 uL PBS
NAT1/NAT9
10 μL NAT1
10 μL NAT9
80 uL PBS
【０２８０】
バッファーおよび酵素：以下のバッファーが使用される。
ＴＥ：１０ＭのトリスｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡｐＨ８．０
ＰＢＳ：リン酸緩衝食塩水（１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１．８ｍＭのＫＨ２ＰＯ４）（ｐＨ７．４）
１０×Ｃｕｔｓｍａｒｔ：５００ｍＭのＫＡｃ、２００ｍＭのトリス−Ａｃ、１００ｍＭのＭｇ−Ａｃ、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡｐＨ７．９
ＢｃｉＶＩは、ＮＥＢから購入したものであり、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（ｓ−ＭａｇＢｅａｄｓ）は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒから購入したものである。
【０２８１】
付加反応は、次のように実施される。
【０２８２】
１．トポ充填：試薬が表のように集められる。
【０２８３】
【表４】
2020502494.tif 000023
【０２８４】
次いで試薬は、３０分間３７℃でインキュベートされる。副生成物は、結合を可能にするために室温で１０分後、１×トポバッファー内でストレプトアビジン磁気ビーズ（５ｕＬ）を使用して除去される。
【０２８５】
２．反応：試薬は表のように集められる。
【０２８６】
【表５】
2020502494.tif 000024
【０２８７】
次いで試薬は、３０分間３７℃でインキュベートされる。付加反応は、次のように進行することが予期される。
【化１８】
2020502494.tif 000025
【０２８８】
アスタリスク（＊）は、トポイソメラーゼを表す。ＮＡＴ９ｃＩはリン酸化されているが、これは例示の目的で示されているものではないことに留意されたい。
【０２８９】
充填トポは、アクセプタ配列の存在下にあるとき、以下のように反応する。
【化１９】
2020502494.tif 000026
【０２９０】
アガロースゲル上の生成物の分子量のＰＣＲ増幅および測定により、予期される生成物が作製されたことが立証される。レーン１（実験）内に正しいサイズの帯があり、陰性対照内に帯がないことを示す図３０を参照されたい。
【０２９１】
Ｂ．脱保護反応：試薬が表のように集められる。
【０２９２】
【表６】
2020502494.tif 000027
【０２９３】
試薬は、９０分間３７℃でインキュベートされる。脱保護反応の場合、付加反応の代表的な生成物は、購入されたオリゴヌクレオチドを使用して作製され、ＢｃｉＶＩ制限酵素による消化が試験される。
【化２０】
2020502494.tif 000028
「正常」な塩基とは異なり、切断部位の３’が一連のイノシンであると仮定して、制限酵素が意図されるＤＮＡを切断するかどうかは分からなかった。陽性対照として、ＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃＩの「適当」な塩基対の均等物が作製される（ＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃ）。
【化２１】
2020502494.tif 000029
生成物のＰＣＲ増幅、それに続いてアガロースゲル上の分子量の測定（図３１）により、酵素が意図どおり機能したことが示される。陽性対照の場合、不消化のときはより大きい帯が観察されるが（レーン１）、消化によってより小さい帯が観察される。ＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃＩによって同じパターンが観察され、これはイノシンの存在が消化を否定または干渉しないことを示す。ＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃＩによって、わずかな量の不消化生成物が残ると考えられ、これは少なくともこれらの条件下で、開裂がＮＡＴ１／ＮＡＴ９ｃの場合ほど有効でないことを示唆する。開裂効率は、バッファー条件の変更および／またはＮＡＴ９ｃＩの５’末端におけるより多くのイノシン付加によって改善することができる。
【０２９４】
上記の例は、トポ／ＩＩＳ型制限酵素の組合せを使用して、単一のヌクレオチドを標的一本鎖ＤＮＡの５’末端に付加することが実行可能であることを実証する。配列ＣＣＣＴＧを認識する関連するトポイソメラーゼ、ＳＶＦは（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8661446）、類似したプロセスを使用して「Ｔ」の代わりに「Ｇ」を付加するために使用され、したがってＴおよびＧによってバイナリ情報を符号化する配列の構造が可能になる。
【０２９５】
上述したように、トポイソメラーゼ方策を使用してｄｓＤＮＡが生成される場合、ＡＴＰとともにリガーゼを使用して、反対側の鎖のＤＮＡ内の切れ目を修復することができる。しかし、この例のように、単一のヌクレオチドの付加を行うとき、本発明者らは一本鎖ＤＮＡを構築しており、したがって修復する必要のある切れ目はなく、リガーゼを使用する必要はない。
【０２９６】
実施例６
５’リン酸結合によるトポイソメラーゼ方策の結合を使用する単一の塩基の付加
単一の塩基の付加に対する別の手法では、本発明者らは、５’リン酸を保護基として使用して、３’から５’の方向に単一の塩基対の付加を提供する。充填反応は、５’リン酸基を有する単一のＴ（もしくはＧ、または所望される場合は他のヌクレオチド）をトポイソメラーゼに充填する。充填トポイソメラーゼは、遊離５’非ブロック（非リン酸化）一本鎖ＤＮＡ鎖を「見る」と、その鎖にＴを付加して、５’にＴが付加されたＤＮＡを提供する。この付加は、トポイソメラーゼおよび一本鎖アクセプタＤＮＡを結合することができる配列を有するアダプタＤＮＡの存在によって容易になる（アダプタＤＮＡには触媒作用があり、反応の繰返しにおいて鋳型として再利用することができることに留意されたい）。付加されたヌクレオチドは、５’リン酸を有し、したがって５’リン酸を除去するホスファターゼに露出されるまで、さらなる付加のための基質にはならない。このプロセスは、トポを使用して単一の「Ｔ」を標的一本鎖ＤＮＡの５’末端に付加し、ＳＶＦトポイソメラーゼを使用して単一の「Ｇ」を付加することで繰り返され、したがってＴおよびＧによってバイナリ情報を符号化する配列の構造が可能になる。このプロセスは、次のように概略的に示されている。
【０２９７】
【化２２】
2020502494.tif 000030
【化２３】
2020502494.tif 000031
【０２９８】
実施例７
ＤＮＡオリガミを使用してナノポアに近接してＤＮＡを取り付けることを支援する
一方の末端に大きいオリガミ構造を有するＤＮＡ鎖が、ナノポア内で捕捉され、ＤＮＡ上のターミナルビオチン部分を通って表面コンジュゲートストレプトアビジンに不動化される。制限酵素によるオリガミ構造の開裂後、電流の乱れによって立証されるように、不動化ＤＮＡは孔を通って前後に動かすことができる。不動化により、孔を通る単一のＤＮＡ分子の制御された運動が可能になり、それによりＤＮＡに対する情報の「読取り」と「書込み」の両方が可能になる。
【０２９９】
図３５に示すように、ナノポアを通るには大きすぎる大型の二本鎖ＤＮＡユニットが形成され、一本鎖領域が、合成体内に付加すべきＤＮＡを繋ぐ働きをする２つの短い二本鎖領域によって大型部分に連結される。次いで一本鎖領域を切り離し、ナノポアに近接して表面に繋ぎ、オリガミ構造を解放することができる。図３３を参照されたい。
【０３００】
２０ｎｍのＳｉＯ２を有する３ｍｍのチップ内に、５０＊５０μｍの窓によってナノポアが形成される。チップは、Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓによって提供される。ナノポアカセットホルダおよびフローセルがＮａｎｏｐｏｒｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓによって提供される。増幅器は、Ｔｅｃｅｌｌａ  Ｐｉｃｏ２増幅器である。これは、制御のためにｕｓｂコンピュータインターフェースを使用するｕｓｂ給電式増幅器である。Ｔｅｃｅｌｌａは、増幅器を制御するために（Ｗｉｎｄｏｗｓ）ソフトウェアを供給する。マルチメータは、ＦＬＵＫＥ１７Ｂ＋デジタルマルチメータであり、わずか０．１ｕＡの電流を検出することが可能である。無線周波雑音のスクリーニングの場合、本発明者らは、ＵＳＢインターフェースを有するＣｏｎｃｅｎｔｒｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ＴＣ−５９１６Ａ  Ｓｈｉｅｌｄ  Ｂｏｘ（Ｆａｒａｄａｙ  Ｃａｇｅ）を使用する。ＩＤＴ．ｃｏｍからオリゴヌクレオチドが得られる。「ＰＳ」は、http://www.gelest.com/product/o-propargyl-n-triethoxysilylpropylcarbamate-90/からのプロパギル（Ｐｒｏｐａｒｙｌ）シラン−Ｏ−（ＰＲＯＰＡＲＧＹＬ）−Ｎ−（ＴＲＩＥＴＨＯＸＹＳＩＬＹＬＰＲＯＰＹＬ）ＣＡＲＢＡＭＡＴＥである。
【０３０１】
オリガミ構造は、一辺が約２０ｎｍの「ハニカム」立方体オリガミ構造を有する一本鎖ｍ１３に基づいている。ハニカムに近接して二本鎖領域が存在し、それぞれ固有の制限部位を含む。それらの部位のうちの一方は、ナノポア付近の取付けを可能にするように修飾ＤＮＡを取り付けるために使用され、他方は、ＤＮＡが取り付けられた後にオリガミ構造を開裂するために使用される。
【０３０２】
ナノポア形成：ナノポアは、次のように、絶縁破壊を使用してチップ内に形成される。
１．チップがカセット内に慎重に取り付けられる。
２．湿潤化：１００％のエタノールがチップ上に慎重に分注される。気泡は除去しなければならない。しかし、チップ上での溶液の直接分注は回避するべきであり、そうでなければチップが割れる可能性がある（ＳｉＯ２はわずか２０ｎｍである）。
３．表面処理：エタノールが除去され、新しく準備されたピラニア（Ｐｉｒａｎａｈ）溶液［７５％の硫酸、２５％の過酸化水素（３０％）］がチップ上へ分注される（ピラニア溶液は室温にしておく）。３０分間放置する。
４．蒸留水によって４度洗い流す。
５．ＨＫバッファー（１０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ８、１ＭのＫＣｌ）によって２度洗い流す。
６．カセットをフローセル内へ組み立てる。
７．７００μＬのＨＫバッファーをフローセルの各チャンバに付加する。
８．増幅器に取り付けられた銀電極を挿入し、ファラデーケージを閉じる。
９．３００ｍＶで抵抗を試験する。電流は検出されないはずである。電流が検出された場合、チップが割れている可能性が高く、もう１度やり直さなければならない。
１０．電極を６ＶのＤＣ電流に接続し、マルチメータで電流を試験する。電流は低いはずであり、変化しないはずである。電圧を１．５Ｖ上昇させ、その電圧を抵抗が増大するまで保持する。抵抗が５〜１０分後に増大しない場合、電圧をさらに１．５Ｖ上昇させ、再試行する。抵抗が増大するまで繰り返し、抵抗が増大した時点で印加電圧をすぐに停止するべきである（十分な電圧があれば、絶縁破壊が生じ、ＳｉＯ２膜に「孔」が作製される。最初に作製したとき、孔は小さいが、電圧が維持されるとサイズが増大する）。
１１．増幅器を使用して孔を試験する。３００ｍＶで、２〜３ｎＡから数ｎＡの電流が見られるはずである。電流が大きければ大きいほど、孔もより大きくなる。
【０３０３】
図３４は、基本の機能的ナノポアを示す。各パネルにおいて、ｙ軸は電流（ｎＡ）であり、ｘ軸は時間（秒）である。「ＲＦ雑音のスクリーニング」という左のパネルは、ファラデーケージの有用性を示す。ナノポアをもたないチップがフローセル内に配置され、３００ｍＶが印加される。ファラデーケージの蓋を閉じたとき（第１の矢印）、雑音低減を見ることができる。ラッチを閉じたとき（第２の矢印）、わずかなスパイクが生じる。電流は約０ｎＡであることに留意されたい。孔の製造後（中央パネル）、３００ｍＶの印加（矢印）の結果、電流は約３．５ｎＡになる。ＤＮＡが接地チャンバに加えられ、＋３００ｍＶが印加されたとき、ＤＮＡ転座（右のパネル）を電流の過渡的な減少として観察することができる。（この場合、ＴＳバッファー：５０ｍＭのトリス、ｐＨ８、１ＭのＮａＣｌが使用されることに留意されたい）。このＤＮＡ転座実験には、Ｌａｍｂｄａ  ＤＮＡが使用される。
【０３０４】
塩化銀電極：
１．銀ワイアが、絶縁された銅ワイアにはんだ付けされる。
２．銅ワイアが接地され、銀は新しい３０％の次亜塩素酸ナトリウムに３０分間浸漬される。
３．銀は暗灰色の被覆（塩化銀）を得るはずである。
４．銀ワイアを蒸留水で広範に洗い流して乾燥させる。
５．これで使用の準備ができる。
【０３０５】
ビーズのシラン化：シラン化方法は、ＳｉＯ２で被覆された磁気ビーズ上で最初に開発／試験されたものである（ＧＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）。以下のプロトコルが採用される。
１．ビーズを新しいピラニア（ｐｉｒａｎｎａｈ）溶液内で３０分間前処理する。
２．蒸留水で３度洗う。
３．メタノール内で２度洗う。
４．ＡＰＴＥＳ原液をメタノールで１：５００に希釈する。
５．希釈されたＡＰＴＥＳをビーズに付加し、４５分間ＲＴでインキュベートする。
６．メタノールで洗い流す。
７．３０分間１００℃にする。
８．真空下で貯蔵する。
【０３０６】
シリコンチップのシラン化
１．ナノポアを有するチップをカセット内に取り付ける。
２．メタノールで洗い流し、あらゆる気泡を慎重に除去する。
３．新しいピラニア溶液（室温と平衡にしておく）を付加し、３０分間インキュベートする。
４．蒸留水で４度洗う。
５．メタノールで３度洗う。
６．ＡＰＴＥＳ原液をメタノールで１：５００に希釈し、これを使用してチップを２度洗う。４５分間ＲＴでインキュベートする。
７．メタノールで２度洗い流す。
８．空気流下で乾燥させる。
９．真空下で一晩貯蔵する。
【０３０７】
ビーズのストレプトアビジンコンジュゲーション：ストレプトアビジンコンジュゲーションは、上記で準備したシラン化ビーズ上で最初に開発／試験されたものである。
１．改変リン酸緩衝食塩水（ＭＰＢＳ）でシラン化ビーズを洗う。
２．ＭＰＢＳ内で１．２５％のグルタルアルデヒドの新しい溶液を作る（凍結貯蔵された５０％のグルタルアルデヒド原液を使用）。
３．１．２５％のグルタルアルデヒドをビーズに付加し、１５分ごとに上下に静かに分注して６０分間放置する。
４．ＭＰＢＳで２度洗う。
５．水で２度洗う。
６．真空下で乾燥させる。
７．ストレプトアビジン（ＭＰＢＳ内に５００μｇ／ｍＬ）をビーズに付加し、６０分間インキュベートする［陰性対照ビーズの場合、ストレプトアビジンの代わりにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（ＭＰＢＳ内に２ｍｇ／ｍＬ）を使用する］。
８．ストレプトアビジンを除去し、ＢＳＡ（ＭＰＢＳ内に２ｍｇ／ｍＬ）を付加する。６０分間インキュベートする。
９．ＭＰＢＳ内で２度洗う。
１０．４℃で貯蔵する。
【０３０８】
シリコンチップのストレプトアビジンコンジュゲーション
１．シラン化チップをエタノールで２度洗い流す。
２．シラン化チップをＭＰＢＳで２度洗い流す。
３．ＭＰＢＳ内で１．２５％のグルタルアルデヒドの新しい溶液を作る（冷凍貯蔵された５０％のグルタルアルデヒド原液を使用）。
４．チップを１．２５％のグルタルアルデヒドで２度洗い流し、１５分ごとに静かに上下に分注して６０分間放置する。
５．ＭＰＢＳで２度洗う。
６．水で２度洗う。
７．空気流下で乾燥させる。
８．チップの半分にＢＳＡ（ＭＰＢＳ内に２ｍｇ／ｍＬ）を付加し、残り半分にストレプトアビジン（ＭＰＢＳ内に５００μｇ／ｍＬ）を付加する。６０分間インキュベートする。カセット上にマークを作製し、チップのどちらの半分がストレプトアビジン改変されたかを示す。
９．チップの両方の部分をＢＳＡ（ＭＰＢＳ内に２ｍｇ／ｍＬ）で洗い流す。６０分間インキュベートする。
１０．ＭＰＢＳ内で洗う。
【０３０９】
本明細書で使用されるバッファーは、次のように作製される。
ＭＰＢＳ：８ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．２ｇ／ＬのＫＣｌ、１．４４ｇ／Ｌのリン酸二ナトリウム、０．２４０ｇ／Ｌのリン酸カリウム、０．２ｇ／Ｌのポリソルベート２０（ｐＨ７．２）
ＰＢＳ：８ｇ／ＬのＮａＣｌ、０．２ｇ／ＬのＫＣｌ、１．４４ｇ／Ｌのリン酸二ナトリウム、０．２４０ｇ／Ｌのリン酸カリウム
ＴＳ：５０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１ＭのＮａＣｌ
ＨＫ：１０ｍＭのＨＥＰＥＳｐＨ８．０、１ＭのＫＣｌ
ＴＥ：１０ｍＭのトリス、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０
ピラニア溶液：７５％の過酸化水素（３０％）＋２５％の硫酸
ＡＰＴＥＳ原液：５０％のメタノール、４７．５％のＡＰＴＥＳ、２．５％のナノ純水。少なくとも１時間４℃でエージングする。４℃で貯蔵する。
ＰＤＣ原液：ＤＭＳＯ内の０．５％ｗ／ｖの１，４−フェニレンジイソチオシアナート
【０３１０】
オリゴヌクレオチド（５’から３’）を順序付ける。
【化２４】
2020502494.tif 000032
【０３１１】
オリゴヌクレオチド対のハイブリッド形成が、次のように実施される。
１．ＴＥバッファー内に濃度１００ｕＭでオリゴの原液を作る。
２．オリゴをＰＢＳ内に１０μＭまで希釈する
３．サーマルサイクラにおいて５分間に８５℃まで加熱する
４．２５℃まで３分ごとに５℃ずつ熱を下げる。
５．４℃または−２０℃で貯蔵する。
【０３１２】
ストレプトアビジンコンジュゲーション：ＳｉＯ２に対するストレプトアビジンコンジュゲーションは、ＳｉＯ２被覆磁気ビーズを使用して開発および試験されたものであり、次いでプロトコルはＳｉＯ２チップに適合された。ストレプトアビジンとＢＳＡコンジュゲートビーズの両方に対するビオチン化オリゴの結合が試験される。予期されるように、ＢＳＡコンジュゲートビーズの場合、無視できるほどの結合しか観察されないが、ストレプトアビジンコンジュゲートビーズの場合、強い結合が観察される。図３８を参照されたい。高塩濃度でコンジュゲーションを実行する（ＤＮＡ運動が高塩濃度で実行される）とより好都合なはずであるため、ＨＫバッファー内でビーズが結合する能力も試験される。ＨＫバッファー内の結合は、ＭＰＢＳバッファー内の結合（図３９）と同等である。
【０３１３】
オリガミ構造は、図３５〜３７に関して上述したように作製され、動作可能であることが立証される。オリゴヌクレオチドを使用して、オリガミ構造のビオチン化が試験される。本発明者らには、図３７に関して上述した「オリガミ」の結果から、ＡｌｗＮＩ部位が活性であることがすでに分かっている。オリガミＤＮＡ内の厳密な配列のセグメントを再現するオリゴヌクレオチド対が、以下で使用される（ｏ１／ｏ３）。オリガミ分子は次のように示される。
【０３１４】
【化２５】
2020502494.tif 000033
【０３１５】
オリゴ対ｏ１／ｏ３は、次のとおりである。
【化２６】
2020502494.tif 000034
【０３１６】
以下の反応により、ＤＮＡは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼの存在下でＡｌｗＮＩによって消化され、オーバーハングに対して相補形のビオチン化オリゴがオリガミ配列の３’側に位置する（それ自体が長いｓｓＤＮＡ配列に取り付けられており、長いｓｓＤＮＡ配列自体はオリガミの他方の側に取り付けられている）。
【０３１７】
【化２７】
2020502494.tif 000035
【０３１８】
この方策では、ＡｌｗＮＩが標的ＤＮＡを開裂する。リガーゼが付加されるとき、このＤＮＡを再度ライゲーションすることが可能になるが、制限酵素はＤＮＡを再び切断する。しかし、（右）断片（ｏ１／ｏ３のうち）がＢＮ１／Ｎ２に結合する場合、制限部位は再現されず、したがってこの生成物は切断されない。制限酵素の有無によって試験することによって、特有の取付けが立証される。
【０３１９】
【表７】
2020502494.tif 000036
【０３２０】
リガーゼを除くすべての試薬が付加され、溶液が６０分間３７℃でインキュベートされる。リガーゼが付加され、溶液が１６℃で一晩インキュベートされる。１０×リガーゼバッファーは、ＮＥＢ１０×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼバッファーを指す。リガーゼはＮＥＢ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ内にある。ｏ１／ｏ３およびｎ１／ｎ２は、上述したように、アニール化オリゴ対を指す。単位はマイクロリットルである。アガロースゲル分析により、ＡｌｗＮＩの存在下で、オリガミ構造に取り付けられた長いｓｓＤＮＡアームに取り付けられるビオチン化オリゴヌクレオチドに対応して、より大きい生成物が形成されることが立証された。所望される場合、３’ビオチン化に対して類似の方策が使用される。
【０３２１】
上記で、本発明者らは、ナノポアを形成および使用して電圧に誘起されたＤＮＡによる孔の通行、その遠方末端でビオチンに取り付けられた長いｓｓ領域によるオリガミ分子の作製、ならびに二酸化ケイ素に対するストレプトアビジンのコンジュゲーションを検出し、それを使用してビオチン化ＤＮＡを捕捉する能力を実証している。これらのツールを使用して、単一のＤＮＡ分子をナノポア付近に取り付け、その運動を制御する。
【０３２２】
第１の工程は、ストレプトアビジンをＳｉＯ２ナノポアの１つの表面に（またＢＳＡを他方の側に）コンジュゲートさせることである。これは、上記のプロトコルによって実現される。その結果得られる孔は、最初に有するものより低い電流を有する傾向がある。いくつかの短い６ｖパルス後、電流は元の電流付近に戻る。この時点の機能的ナノポアが、図４０に示されている。
【０３２３】
次に、オリガミＤＮＡが挿入される。オリガミＤＮＡが適当なチャンバに付加され、電流が投入されたとき、オリガミはチャンバに入る。この表現が、図４１に示されている。オリガミが５０ｐＭの最後の濃度で導入されたときの実験結果は、オリガミを有するＤＮＡが比較的すぐに（典型的には数秒で）孔に入ることを立証しており、これはその結果生じるナノポアにおける電流の流れの低減によって検出可能である（たとえば、これらの実験では、オリガミ挿入前の電流が約３ｎＡであり、挿入後は約２．５ｎＡである）。電流がより長い時間流された場合、２回の挿入を観察することができる。より高い濃度が使用される場合、挿入がより迅速に行われることが観察される。
【０３２４】
挿入されたＤＮＡのチップへの結合。オリガミがナノポア内へ挿入された後、１５分経過してから、再び電圧が印加される。オリガミのｓｓＤＮＡ領域の末端はビオチンを含み、ストレプトアビジンがナノポアの表面にコンジュゲートされる。ストレプトアビジンは、共有結合に近い親和定数でアビジンに結合する。１５分の時間により、ＤＮＡが放散され、ビオチン末端がストレプトアビジンを見つけて結合することが可能になる。ＤＮＡが表面に実際に取り付けられた場合、電圧が逆にされると、観察される電流は、以前に見られたものよりわずかに小さくなるはずである。また、電流を前後に切り換える結果、電流はどちらの方向でも、孔に何もないときに見られたものより小さくなるはずである。ここに示す例では、何もない孔は、約３ｎＡの電流を示す。図４２は、取り付けられたＤＮＡの図を示し、図４３は、取り付けられたオリガミＤＮＡを電圧によって切り換える実験結果を示す。どちらの方向に見られる電流も、約±２．５ｎＡであり、これは孔に何もないときに観察される約±３ｎＡより低いことに留意されたい。ＤＮＡが表面に結合していない場合、電圧が切り換えられたとき、元の電流が検索される（図４４）。
【０３２５】
オリガミ構造を除去するために、オリガミ構造を収容するフローセルチャンバ内のバッファーが除去され、１ｕＬのＳｗａＩ／２０°Ｌを有する１×ＳｗａＩバッファーに交換された。他のフローセルチャンバ内のバッファーは、ＳｗａＩのない１×ＳｗａＩバッファーに交換される。これは、６０分間室温でインキュベートされ、次いでＨＫバッファーで洗われ、電圧が印加される。図４５に表されるＤＮＡの前後運動は、ＳｉＯ２ナノポアを通る不動化ＤＮＡの制御された運動を示す図４６の実験データによって立証される。
【０３２６】
実施例８
ナノポアに近接して表面にポリマーを取り付ける代替手段
上記の例は、ＤＮＡをビオチン化し、取付け面をストレプトアビジンで被覆することによって、ＤＮＡをナノポアに近接して表面に取り付けることを記載している。ポリマーを取り付けるいくつかの代替手段が、図４７に示されている。
【０３２７】
ａ）ＤＮＡハイブリッド形成：１つの方法では、本発明の方法で延ばされたＤＮＡが、ナノポア付近の取り付けられた短いオリゴヌクレオチドにハイブリッド形成される。合成が完了した後、合成されたＤＮＡは、制限酵素の必要なく容易に除去することができ、または別法として、二本鎖は、結合されたオリゴヌクレオチドによって形成することができ、合成されたＤＮＡは、制限酵素に対する基質を提供することができる。この例では、短いオリゴマーが、ビオチン−ストレプトアビジンを使用して表面にコンジュゲートされ、または次のように、１，４−フェニレンジイソチオシアナートを使用してライゲーションされる。
ＳｉＯ２へのビオチン化ＤＮＡのコンジュゲーション
Ａ．シラン化
１．前処理：３０分間ｎｈａ溶液に入れ、再蒸留Ｈ２Ｏ（ｄｄＨ２Ｏ）で洗う。
２．ＡＰＴＥＳ原液：５０％のＭｅＯＨ、４７．５％のＡＰＴＥＳ、２．５％のナノ純Ｈ２Ｏを準備し、４℃で１時間超エージングする。
３．ＡＰＴＥＳ原液をＭｅＯＨ内で１：５００に希釈する。
４．チップを室温でインキュベートする。
５．ＭｅＯＨを洗い流す。
６．乾燥させる。
７．１１０℃で３０分間加熱する。
コンジュゲーション：
１．チップをＰＤＣ原液で５時間（室温）処理する（ＰＤＣ原液：ＤＭＳＯ内に０．５％ｗ／ｖの１，４−フェニレンジイソチオシアナート）。
２．ＤＭＳＯ内で２度洗う（短時間で！）。
３．ｄｄＨ２Ｏ内で２度洗う（短時間で！）。
４．１００ｎＭのアミノ修飾ＤＮＡをｄｄＨ２Ｏ（ｐＨ８）に３７℃で一晩入れる。
５．２８％のアンモニア溶液で２度洗う（不活性化）。
６．ｄｄＨ２Ｏで２度洗う。
【０３２８】
上述したように、取り付けられたオリゴヌクレオチドに相補形のターミナル配列を有する一本鎖ＤＮＡが導入され、取り付けられたオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成される。
【０３２９】
ｂ）クリックケミストリー（Ｃｌｉｃｋ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）：クリックケミストリーとは、簡単で熱力学的に効率的であり、有毒または高反応性の副生成物をもたらさず、水または生体適合溶媒内で動作し、多くの場合、選択された基質を特有の生体分子に結び付けるために使用される反応に対する一般的な用語である。この場合、クリックコンジュゲーション（ｃｌｉｃｋ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）は、ａ）で使用されるものに類似の化学的性質を使用して、オリゴヌクレオチドを取り付けるが、ここでは本発明の方法における合成中に延ばされたポリマーを取り付けるためだけに使用される。この例では、ＤＮＡはポリマーであるが、この化学的性質は、適合しているアジド基の付加によって機能化された他のポリマーにも取り付けられるように機能するはずである。
シラン化：
１．前処理：３０分間ピラニア溶液に入れ、ｄｄＨ２Ｏで洗う。
２．ＰＳ（プロパルギルシラン）原液：５０％のＭｅＯＨ、４７．５％のＰＳ、２．５％のナノ純Ｈ２Ｏを準備し、４Ｃで１時間超エージングする。
３．ＡＰＴＥＳ原液をＭｅＯＨ内で１：５００に希釈する。
４．チップを室温でインキュベートする。
５．ＭｅＯＨを洗い流す。
６．乾燥させる。
７．１１０℃で３０分間加熱する。
【０３３０】
アジド官能基で終端されたＤＮＡは、この表面に共有結合する（図４７に示す）。ＤＮＡへのビオチン付加に関して前述したように、アジド終端オリゴが順序付けられ、より長いオリガミＤＮＡに取り付けられる。
【０３３１】
実施例９
最適化されたトポイソメラーゼ媒介ＤＮＡ合成
オリゴヌクレオチドカセットが、二本鎖ＤＮＡカセットを形成するようにハイブリッド形成された３つのオリゴヌクレオチドから構成される。カセットは、プラスＤＮＡ鎖上にワクシニアウイルストポイソメラーゼ認識配列（ＣＣＣＴＴ）を有し、それに続いてマイナス鎖上にＧＣＣＧ配列を有するように設計される。その標的配列のトポイソメラーゼ認識後、トポイソメラーゼはオリゴヌクレオチドを開裂し、オリゴヌクレオチドの５’区間との共有結合を形成し、その結果、「充填」トポイソメラーゼを形成する。プラス鎖上でＣＣＣＴＴの３’に整合されていない塩基対を（マイナス鎖上でＧＣＣＧに整合したＣＧＡＡを）付加する結果、より効率的なトポイソメラーゼ充填が得られる。ストレプトアビジン被覆ビーズが混合物に付加され、プラスＤＮＡ鎖の３’末端に取り付けられたビオチンに結合するとき、オリゴヌクレオチドカセットの開裂された３’部分（副生成物と呼ばれる）は、充填トポイソメラーゼから除去することができる。この反応は、次のように示される。
オリゴヌクレオチドの初期充填：
【化２８】
2020502494.tif 000037
斜体のオリゴヌクレオチドは５’リン酸化されている。
トポイソメラーゼ充填後は次のとおりである。
【化２９】
2020502494.tif 000038
トポイソメラーゼは、ＣＣＣＴＴ認識配列（図示せず）の３’Ｔに共有結合によって連結される。
オリゴヌクレオチド副生成物は、ストレプトアビジンビーズに結合されたビオチンによって除去される。
【化３０】
2020502494.tif 000039
充填トポイソメラーゼは、オリゴヌクレオチドの５’区間を、相補形のオーバーハングを有するＤＮＡアクセプタ鎖に付加する固有の能力を有する。
【化３１】
2020502494.tif 000040
１つのカセット（またはビット）によって延ばされたＤＮＡアクセプタ鎖
【化３２】
2020502494.tif 000041
トポイソメラーゼは、この反応によって解放される。次いでオリゴヌクレオチドカセットまたはビットは、ヌクレオチドＧＧＴＣＴＣを認識する制限酵素ＢｓａＩによる消化によって「脱保護」される。ＢｓａＩは、非対称ＤＮＡ配列（ＧＧＴＣＴＣ配列）を認識し、それらの認識配列の外側を開裂するＩＩＳ型制限酵素である。カセットは、ＢｓａＩによる開裂の結果、ＣＧＧＣオーバーハングが得られるように設計されたものである。このオーバーハングは、ＤＮＡアクセプタ鎖に見られるものと同じであり、別の充填トポイソメラーゼによって別のカセットまたはビットを付加することが可能になる。
１つの保護カセットを有するＤＮＡアクセプタ（太字はＢｓａＩ制限部位）
【化３３】
2020502494.tif 000042
ＢｓａＩ消化後に１つのカセットを有するＤＮＡアクセプタ
【化３４】
2020502494.tif 000043
充填トポイソメラーゼによるインキュベーションの結果、別のカセット（ビット）が付加され、ＤＮＡ鎖を延ばしてより多くの情報を符号化する。
【化３５】
2020502494.tif 000044
２つのカセット（またはビット）によって延ばされたＤＮＡアクセプタ鎖
【化３６】
2020502494.tif 000045
このプロセスは、データを符号化する「ビット」によってＤＮＡ鎖を延ばすために、何度も繰り返すことができる。
【０３３２】
実験の詳細
トポイソメラーゼ充填反応：４０マイクロリットルのストレプトアビジン被覆磁気ダイナビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）が、Ｂ＆Ｗバッファー（１０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌ）で５度洗われる。２．７ピコモルのビオチン化充填オリゴヌクレオチドが、ビーズに付加され、混合物が、静かな振動を加えながら１０分間室温でインキュベートされる。浮遊物はビーズから除かれて廃棄され、結合された充填オリゴヌクレオチドだけが残る。次いでビーズは、ワクシニアウイルストポイソメラーゼ（６ｕｇ）、１０単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（３’ホスファターゼマイナス、ＮＥＢ）、０．１ｕＭのＡＴＰ（ＮＥＢ）、および５ｍＭのＤＴＴを含有する１×Ｃｕｔｓｍａｒｔバッファー（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、ＮＥＢ）内で、３０分間３７Ｃでインキュベートされ、トポイソメラーゼを充填する。トポイソメラーゼが充填オリゴヌクレオチドを開裂した後、ポリヌクレオチドキナーゼが、新しく形成された副生成物オリゴヌクレオチドの５’末端をリン酸化し、それによってトポイソメラーゼが充填オリゴヌクレオチドに再度ライゲーションするのを防止し、充填反応の効率を増大させる。未充填トポイソメラーゼは、静電力を介してストレプトアビジン被覆Ｄｙｎａｂｅａｄｓに結合する。充填トポイソメラーゼには、ストレプトアビジン被覆ビーズがない。ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）は、ＰＮＫの活動を逆にする組換えシュリンプアルカリ性ホスファターゼ（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｈｒｉｍｐ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）によって中和され、または好ましくは、充填トポイソメラーゼは、イオン交換クロマトグラフィーもしくはニッケルＮＴＡビーズによって精製される（トポイソメラーゼはＨｉｓ６タグを有する）。
【０３３３】
ビーズへのアクセプタＤＮＡの初期結合：２０マイクロリットルのストレプトアビジン被覆磁気ダイナビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）がＢ＆Ｗバッファー（１０ｍＭのトリスｐＨ８．０、１ｍＭのＥＤＴＡ、２ＭのＮａＣｌ）で５度洗われる。０．０３ピコモルのビオチン化ＤＮＡアクセプタオリゴヌクレオチドが、洗われたビーズに付加され、振動を加えながら１０分間室温でインキュベートされる。浮遊物はストレプトアビジン被覆ビーズから除かれて廃棄され、ビーズに結合されたＤＮＡアクセプタ鎖だけが残る。
【０３３４】
付加反応：付加混合物を準備するために、Ｅ  ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ＋１ｍＭのＮＡＤを充填トポイソメラーゼに付加する。適宜：１００ｕＭのクーママイシンまたは１ｍＭのノボビオシンを付加する。［根拠：Ｅ  ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼ（ＮＡＤを必要とする）は、充填トポイソメラーゼがＤＮＡをアクセプタに付加するときに残った切れ目を「修復」する。これにより、未充填トポイソメラーゼがこのＤＮＡに遭遇した場合、ＤＮＡを開裂しないことが確実になる。また、クーママイシンおよびノボビオシンはトポイソメラーゼを抑制し、優先的に「充填」を抑制し、「付加」反応は抑制しない。したがって阻害剤もまた、反応中に形成される未充填トポイソメラーゼが活性でないことを確実にするのに役立つ］。５０マイクロリットルの付加混合物が、ビーズに付加され、１５分間３７℃でインキュベートされ、ＤＮＡアクセプタ分子へのＤＮＡカセットの付加を可能にする。図７６は、４％のアガロースゲルを示し、カセットが予測どおり付加されたことを証明している。ＤＮＡを磁気ビーズから解放してこのゲルを準備するために、サンプルはＥｃｏ（ＥｃｏＲＩ）によって消化される）。
【０３３５】
次いでビーズは、磁石の隣に配置され、トポイソメラーゼ溶液が除去され、保留される。次いでビーズは、トポイソメラーゼのあらゆる残渣を除去するために、５０マイクロリットルの１×Ｃｕｔｓｍａｒｔバッファー（ＮＥＢ）によって３度洗われる。
【０３３６】
デブロック反応：次いでビーズは、４０単位のＢｓａＩおよび１単位のシュリンプアルカリ性ホスファターゼを含有する５０マイクロリットルのＣｕｔｓｍａｒｔバッファー（ＮＡＤおよび適宜クーママイシン／ノボビオシンを有する）によってインキュベートされる。制限酵素がＤＮＡを切断するとき、５’リン酸が残り、これにより充填トポイソメラーゼが別のカセットを付加することが抑制される。シュリンプアルカリ性ホスファターゼの付加により、５’リン酸が除去され、それによってカセットを実際上脱保護する。シュリンプアルカリ性ホスファターゼまたはウシ腸由来ホスファターゼ（ｃａｌｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）などのホスファターゼの使用により、反応の効率が高まり、ホスファターゼがなければ、５’リン酸は阻害作用がある。
【０３３７】
ＢｓａＩおよびＳＡＰはビーズから除去され、ビーズはＣｕｔｓｍａｒｔバッファー内で３度洗われる。これで充填トポイソメラーゼによる別のカセットの付加のための準備ができる。
【０３３８】
充填トポイソメラーゼ（／リガーゼ）でＤＮＡアクセプタ鎖をインキュベートし、それに続いてＢｓａＩ／ｒＳＡＰによって消化することによってカセットを付加するこの順序は、付加すべきカセットの数だけ繰り返される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2020502494.tif 000052
【図８】
2020502494.tif 000053
【図９】
2020502494.tif 000054
【図１０】
2020502494.tif 000055
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５Ａ】
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【図５５Ｂ】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６３Ａ】
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【図６３Ｂ】
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【図６４】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ】
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【図６４Ｃ】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６８Ａ】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７０Ａ】
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【図７０Ｂ】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
2020502494.tif 000128
【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【国際調査報告】
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2020502494.tif 000133