(57)【要約】  【解決手段】  本発明は、配列ＩＤ番号１、２、３、または４のうちの１つまたはそれ以上に対応する治療有効量のポリペプチド、ペプチド、または類似体と、薬学的に許容される担体、薬学的に許容される希釈剤、および／または薬学的に許容される賦形剤のうちの１つまたはそれ以上とを有する組成物を提供する。本発明のポリペプチド治療薬は、経口製剤、非経口製剤、局所製剤、水性製剤、固体製剤、凍結乾燥製剤、または経皮製剤として治療を必要とする対象に投与するために製剤化することができる。対象における糖尿病、および／または高血糖、および／または高コレステロール血症、および／または高血圧、および／またはメタボリックシンドロームの少なくとも１つを治療する方法であって、本発明のポリペプチドまたは製剤を対象に投与する工程を有する方法も開示される。  【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４０ｓリボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）もしくはそのフラグメントを有し、またはそれからなる単離ポリペプチドであって、配列ＩＤ番号１、２、３、または４のアミノ酸配列と少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【請求項２】
請求項１に記載のポリペプチドにおいて、前記ＲＰＳ２またはそのフラグメントが、配列ＩＤ番号１、２、３、または４のアミノ酸配列と少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％の配列同一性を有する、ポリペプチド。
【請求項３】
請求項１または２に記載のポリペプチドにおいて、前記ＲＰＳ２またはそのフラグメントが、配列ＩＤ番号１、２、３、または４のアミノ酸配列を有する、ポリペプチド。
【請求項４】
上述の請求項のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、前記ＲＰＳ２またはそのフラグメントが、配列ＩＤ番号１、２、３、または４のアミノ酸配列からなる、ポリペプチド。
【請求項５】
上述の請求項のいずれかに記載の少なくとも１つのポリペプチドを有する製剤。
【請求項６】
前記製剤が経口医薬製剤である、請求項５に記載の製剤。
【請求項７】
前記製剤が非経口医薬製剤である、請求項５に記載の製剤。
【請求項８】
請求項５〜７のいずれかに記載のポリペプチドにおいて、前記製剤が、１またはそれ以上の医薬的に許容される担体、および／または１またはそれ以上の医薬的に許容される希釈剤、および／または１またはそれ以上の医薬的に許容される賦形剤を有する、製剤。
【請求項９】
前記製剤が水性医薬製剤である、請求項５〜８のいずれかに記載の製剤。
【請求項１０】
前記ペプチドが０．０５〜５μｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項９に記載の製剤。
【請求項１１】
前記ペプチドが、０．１〜１μｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項９に記載の製剤。
【請求項１２】
前記水性医薬製剤が緩衝剤、選択的に生理学的ｐＨを有する緩衝剤を有する、請求項９〜１１のいずれかに記載の製剤。
【請求項１３】
前記緩衝剤がリン酸緩衝生理食塩水である、請求項１２に記載の製剤。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項５〜１３のいずれかに記載の製剤を有する薬剤。
【請求項１５】
疾患を治療する方法に使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項５〜１３のいずれかに記載の製剤。
【請求項１６】
１型および／または２型糖尿病を治療する方法に使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項５〜１３のいずれかに記載の製剤。
【請求項１７】
請求項１６に記載のポリペプチドまたは製剤において、前記使用が、肝グルコース産生の減少、および／またはコレステロールレベルの減少、および／またはグルカゴンレベルの減少、および／またはインスリン抵抗性の減少、および／または血圧の低下を提供する、ポリペプチドまたは製剤。
【請求項１８】
高血糖症、および／または高コレステロール血症、および／または高血圧症、および／またはメタボリックシンドロームのうちの少なくとも１つの治療に使用するための、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチドまたは請求項５〜１３のいずれかに記載の製剤。
【請求項１９】
１型および／または２型糖尿病を治療するための薬剤を製造するための、請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも１つのポリペプチドの使用。
【請求項２０】
高血糖症、および／または高コレステロール血症、および／または高血圧症、および／またはメタボリックシンドロームのうちの少なくとも１つを治療するための薬剤を製造するための、請求項１〜４のいずれかに記載の少なくとも１つのポリペプチドの使用。
【請求項２１】
対象における糖尿病、および／または高血糖症、および／または高コレステロール血症、および／または高血圧症のうちの少なくとも１つを治療する方法であって、請求項５〜１３のいずれかに記載の製剤を前記対象に投与する工程を有する、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
真性糖尿病又は単に糖尿病は、制御せずにいると、高血糖をもたらし、又は血中の糖濃度が高くなる。時間がたつにつれ、高血糖症は、多くの身体のシステム、特に神経や血管に深刻な障害をもたらす。糖尿病には多くの種類がある。１型糖尿病は、膵臓がほとんどまたは全くインスリンを産生しない。１型糖尿病の治療にはインスリン注射が必要となる。糖尿病の中でも最も一般的な２型糖尿病は、膵臓が十分量のインスリンを産生できない、又は産生されたインスリンは、細胞耐性のためほとんど有効ではない、またはその両方である。世界保健機関は、世界中で糖尿病の症例の９０％が２型糖尿病であると規定している。２型糖尿病の治療には、薬物治療とインスリン療法だけでなく、健康的な食事と運動が含まれている。
【０００２】
糖尿病における慢性高血糖症の合併症には、内皮障害、増殖性網膜症、神経障害、腎症、高血圧、及び虚血性心疾患が含まれる。糖尿病は、心臓病、脳卒中、腎不全、失明及び四肢切断の主要な原因の１つであり、したがって、すべての先進国の経済に損害を与えている。
【０００３】
２型糖尿病の多くの症例において、薬理学的介入が治療に必要である。２型糖尿病に対して多くの薬剤が承認されており、スルホニルウレア、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）阻害剤、メグリチニド、ビグアナイド、チアゾリジンジオン、及びα−グルコシダーゼ阻害剤などがある。しかし、これらの薬剤は、胃のむかつき、低血糖、体重増加、肝臓障害、発疹、頭痛、及び呼吸器感染症などの望ましくない副作用を引き起こす。さらにこれらの薬剤は、より強い薬効を得るために併用療法として、一緒に使用されることが多い。しかし、複数の薬剤を併用すると、望ましくない副作用が発生する可能性が高くなる。２型糖尿病患者のほぼ５０％が最終的にインスリンの投与を必要とする。
【０００４】
インスリン投与は、１型糖尿病に対する唯一の治療選択肢であることに変わりはない。さらに、インスリンによる１型糖尿病の治療は、生理的状態の変化に必要とされる正確なインスリン投与量を決定することが困難であるため、高血糖及び低血糖の日々の周期によって引き起こされる長期合併症を避けられない。
【０００５】
高血圧症、高コレステロール血症、及び高血糖症は、両型の糖尿病患者、特に２型糖尿病患者においてしばしば存在している。高血圧、高コレステロール、及び糖尿病の組み合わせは、心臓発作や脳卒中のリスクを著しく高める。現在、これらの３つの状態（高血圧症、高コレステロール、及び糖尿病）を治療するために使用される薬剤は、様々な程度の副作用を有する。したがって、現在使用されている薬物に見られる副作用なしに、血糖を下げる治療用組成物が、血圧及びコレステロールも調節することは有用であるだろう。そのような組成物は、糖尿病と共に高血圧症、コレステロールの治療において有用性を有するであろう。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、糖尿病、脳卒中、末梢血管疾患、肺高血圧症、メタボリックシンドローム、高コレステロール血症、及びアテローム性動脈硬化症などの高血圧及び血糖値の上昇（高血糖症）に関連するものを含む、臨床疾患を治療するための新規医薬組成物及び方法に関する。
【０００７】
意外なことに、４０ｓリボソームタンパク質Ｓ２活性領域（「ＲＰＳ２」）に配列相同性で対応するポリペプチドは、経口投与及び静脈内の治療薬として有効であることが見出されており、血糖値の低下、インスリン抵抗性の低下、肝グルコース産生の低下、グルカゴン値の低下、血圧の低下（収縮期及び拡張期のレベル）、及び血中コレステロール値の低下を促進することが示されている。
【０００８】
本明細書は、ＲＰＳ２ポリペプチド、ＲＰＳ２ペプチド類似体、及び／又はそれらの混合物を有する医薬組成物の方法及び組成物を提供する。一実施形態において、ＲＰＳ２ポリペプチドは配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ＲＰＳ２ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。さらに別の実施形態では、ＲＰＳ２ポリペプチドは、配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０００９】
一実施形態において、ＲＰＳ２ポリペプチドは、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ＲＰＳ２ポリペプチドは、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。さらに別の実施形態では、ＲＰＳ２ポリペプチドは、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１０】
一実施形態において、ＲＰＳ２ポリペプチドは、配列ＩＤ番号３に記載のアミノ酸配列を有する。別の実施形態では、ＲＰＳ２ポリペプチドは配列ＩＤ番号３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。さらに別の実施形態では、ＲＰＳ２ポリペプチドは、配列ＩＤ番号３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１１】
第１の態様において、本発明は、配列ＩＤ番号１、２、３、又は４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４０ｓリボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）、またはそのフラグメントもしくは類似体を有する単離ポリペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、配列ＩＤ番号１、２、３、又は４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４０ｓリボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）、又はそのフラグメントからなる単離ポリペプチドを提供する。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４０ｓリボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）を有し、又はそれからなる単離ポリペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４０ｓリボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）を有し、又はそれからなる単離ポリペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、配列ＩＤ番号３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４０ｓリボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）を有し、又はそれからなる単離ポリペプチドを提供する。一実施形態では、本発明は、配列ＩＤ番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する４０ｓリボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）を有し、又はそれからなる単離ポリペプチドを提供する。
【００１３】
一実施形態では、ＲＰＳ２又はそのフラグメントは、配列ＩＤ番号１、２、３、又は４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、ＲＰＳ２は、配列番号１に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、ＲＰＳ２のフラグメントは、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、ＲＰＳ２のフラグメントは、配列ＩＤ番号３に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。一実施形態では、ＲＰＳ２のフラグメントは、配列ＩＤ番号４に記載のアミノ酸配列に対して少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、又は９９％の配列同一性を有する。
【００１４】
一実施形態では、ＲＰＳ２又はそのフラグメントは、配列ＩＤ番号１、２、３、又は４に記載のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ＲＰＳ２は、配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ＲＰＳ２のフラグメントは、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ＲＰＳ２のフラグメントは、配列ＩＤ番号３に記載のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、ＲＰＳ２のフラグメントは、配列ＩＤ番号４に記載のアミノ酸配列を有する。
【００１５】
一実施形態では、ＲＰＳ２又はそのフラグメントは、配列ＩＤ番号１、２、３、又は４に記載のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、ＲＰＳ２は、配列ＩＤ番号１に記載のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、ＲＰＳ２のフラグメントは、配列ＩＤ番号２に記載のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、ＲＰＳ２のフラグメントは、配列ＩＤ番号３に記載のアミノ酸配列からなる。一実施形態では、ＲＰＳ２のフラグメントは、配列ＩＤ番号４に記載のアミノ酸配列からなる。
【００１６】
第２の態様において、本発明は、少なくとも１つの本発明によるポリペプチドを有する製剤を提供する。本発明による少なくとも１つのポリペプチドは、第１の態様による少なくとも１つのポリペプチドでもよい。
【００１７】
一実施形態では、前記製剤は、経口医薬製剤である。一実施形態では、前記製剤は、非経口医薬製剤である。一実施形態では、前記製剤は、局所医薬製剤である。
【００１８】
一実施形態では、前記製剤は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される担体及び／又は１つ又はそれ以上の薬学的に許容される希釈剤及び／又は１つ又はそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を有する。前記製剤は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される担体を有してもよい。前記製剤は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される希釈剤を有してもよい。前記製剤は、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される賦形剤を有してもよい。
【００１９】
一実施形態では、前記製剤は水性医薬製剤である。前記ペプチドは、前記水性医薬製剤中に０．０５〜５μｇ／Ｌの濃度で存在し得る。例えば、前記ペプチドが、０．０８〜３μｇ／Ｌの濃度で存在してもよく、または０．１〜１μｇ／Ｌの濃度で存在してもよい。前記ぺプチドは、少なくとも０．０５μｇ／Ｌ、例えば、少なくとも０．７、０．１、又は０．５μｇ／Ｌの濃度で存在し得る。前記ペプチドは、５μｇ／Ｌ以下、例えば４、３、又は２μｇ／Ｌ以下（例えば１μｇ／Ｌ以下）の濃度で存在してもよい。前記水性医薬製剤は、緩衝剤を含むことができる。前記緩衝剤は、約７〜８のｐＨを有してもよく、例えば前記緩衝剤は約７．２〜約７．６のｐＨを有することができる。前記緩衝剤は、生理学的ｐＨ（約７．４のｐＨ、例えば７．３〜７．４のｐＨ）を有してもよい。前記緩衝剤は、リン酸緩衝生理食塩水であってもよい。
【００２０】
第３の態様において、本発明は、本発明のポリペプチド又は本発明の製剤を有する薬剤を提供するものである。本発明のポリペプチドは、第１の態様に記載の少なくとも１つのポリペプチドであってもよい。本発明の製剤は、第２の態様に記載の製剤であってもよい。
【００２１】
第４の態様において、本発明は、疾患を治療する方法において使用するための本発明のポリペプチド又は本発明の製剤を提供するものである。本発明のポリペプチドは、第１の態様に記載の少なくとも１つのポリペプチドであってもよい。本発明の製剤は、第２の態様に記載の製剤であってもよい。前記疾患は、１型及び／又は２型糖尿病、高血糖症、高コレステロール血症、高血圧、及びメタボリックシンドロームのうちの少なくとも１つであってもよい。前記疾患は１型及び／又は２型糖尿病であってもよい。前記疾患は高血糖症であってもよい。前記疾患は高コレステロール血症であってもよい。前記疾患は高血圧であってもよい。前記疾患はメタボリックシンドロームであってもよい。
【００２２】
第５の態様において、本発明は、１型及び／又は２型糖尿病を治療する方法において使用するための本発明のポリペプチド又は本発明の製剤を提供するものである。本発明のポリペプチドは、第１の態様に記載の少なくとも１つのポリペプチドであってもよい。本発明の製剤は、第２の態様に記載の製剤であってもよい。前記使用は、肝グルコース産生の低下、及び／又はコレステロール値の低下、及び／又はグルカゴン値の低下、及び／又は血圧の低下をもたらすことができる。前記使用は、肝グルコース産生の低下をもたらすことができる。前記使用は、コレステロール値の低下をもたらすことができる。前記使用は、グルカゴン値の低下をもたらすことができる。前記使用は、血圧の低下をもたらすことができる。
【００２３】
第６の態様において、本発明は、１型及び／又は２型糖尿病を治療するための薬剤を製造するための、本発明による少なくとも１つのポリペプチドの使用を提供するものである。本発明のポリペプチドは、第１の態様に記載の少なくとも１つのポリペプチドであってもよい。
【００２４】
第７の態様において、本発明は、高血糖症、及び／又は高コレステロール血症、及び／又は高血圧、及び／又はメタボリックシンドロームのうちの少なくとも１つを治療するための薬剤を製造するための、本発明による少なくとも１つのポリペプチドの使用を提供するものである。本発明のポリペプチドは、第１の態様に記載の少なくとも１つのポリペプチドであってもよい。前記薬剤は高血糖症を治療することができる。前記薬剤は高コレステロール血症を治療することができる。前記薬剤は高血圧を治療することができる。前記薬剤はメタボリックシンドロームを治療することができる。
【００２５】
第８の態様において、本発明は、対象における糖尿病、及び／又は高血糖症、及び／又は高コレステロール血症、及び／又は高血圧のうちの少なくとも１つを治療するための方法であって、本発明のポリペプチドまたは本発明の製剤を前記対象に投与する工程を有する方法を提供する。本発明のポリペプチドは、第１の態様に記載の少なくとも１つのポリペプチドであってもよい。本発明の製剤は、第２の態様に記載の製剤であってもよい。前記方法には、有効量の前記ポリペプチドまたは前記製剤を投与する工程を有することができる。前記方法は糖尿病（例えば、１型及び／又は２型糖尿病）を治療することができる。前記方法は高血糖症を治療することができる。前記方法は高コレステロール血症を治療することができる。前記方法は高血圧症を治療することができる。
【００２６】
本発明は、配列ＩＤ番号１、２、３、又は４のうちの１つまたはそれ以上に対応する治療有効量のＲＰＳ２ポリペプチド又はペプチド類似体と、１つ又はそれ以上の薬学的に許容される担体、及び／又は１つ又はそれ以上の薬学的に許容される希釈剤、及び／又は１つ又はそれ以上の薬学的に許容される賦形剤とを有する医薬組成物を提供するものである。本発明のポリペプチド治療剤は、経口製剤、非経口製剤、局所製剤、水性製剤、固形製剤、凍結乾燥製剤、又は経皮製剤として治療を必要とする対象に投与するために製剤化することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、メトホルミンおよび／またはＩＭＧ−１を静脈内（１０μｇ）および経口（２００μｇ）投与した糖尿病動物（ズッカー糖尿病ラット動物モデル）の体重の関係と、動物間の体重の増加が一貫していることを示すグラフである。
【図２】図２は、コントロールおよびメトホルミンと比較して、ＩＭＧ−１製剤（経口およびＩＶ）による糖尿病動物の治療が、正常化された血糖値をもたらしたことを示すグラフである。
【図３】図３は、コントロールおよびメトホルミンと比較して、ＩＭＧ−１製剤（経口およびＩＶ）による糖尿病動物の治療が、正常化された血圧（収縮期および拡張期）レベルをもたらしたことを示すグラフである。
【図４】図４は、コントロールおよびメトホルミンと比較して、ＩＭＧ−１製剤（経口およびＩＶ）による糖尿病動物の治療が、ＨｂＡ１ｃレベルの低下をもたらしたことを示す棒グラフである。
【図５】図５は、ＩＭＧ−１製剤（経口およびＩＶ）による糖尿病動物の治療が、インスリン濃度（ｍｃＵ／ｍＬ）に影響を及ぼさないことを示す棒グラフである。
【図６】図６は、コントロールおよびメトホルミンと比較して、ＩＭＧ−１製剤（経口およびＩＶ）による糖尿病動物の治療が、グルカゴンレベルの低下をもたらしたことを示す棒グラフである。
【図７】図７は、ＩＭＧ−１を投与された（経口および静脈内）糖尿病動物から測定された平均コレステロールレベル（ｍｇ／ｄＬ）が未処理コントロールと比較して低かったことを示す棒グラフである。処理動物は平均<１７０ｍｇ／ｄＬであったが、コントロールは２２４ｍｇ／ｄＬであった。
【図８】図８は、ＩＭＧ−１製剤が１型糖尿病動物モデルにおいて血糖値を低下させるのに有効であり、その減少がコントロール（未処理）の糖尿病誘発動物と比較して有意であることを示す棒グラフである。
【図９】図９は、スプラーグドーリー動物モデルにおける２４時間にわたる血清からのＩＭＧ−１のクリアランス（ｐｇ／ｍＬとして測定）を示すグラフである。示された結果は、ＢＥＳ１７−０２−１、２、２として示される（３匹の動物を示す）。
【図１０】図１０は、ＩＭＧ−１製剤で処理したスプラーグドーリー動物における血糖値を示すグラフである。
【図１１】図１１は、１．０μｇ〜１０００．０μｇの用量で投与されたＩＭＧ−１製剤がスプラーグドーリーラットにおけるクレアチニンレベルに影響を及ぼさないことを示すグラフである。
【図１２】図１２は、１．０μｇ〜１０００．０μｇの用量で投与されたＩＭＧ−１製剤がスプラーグドーリーラットにおけるアラニンアミノトランスフェラーゼレベルに影響を及ぼさないことを示すグラフである。
【図１３】図１３は、グルコース注入速度（ｍｇ／ｋｇ／ｍ）に基づいて、２μｇ（静脈内）の用量で投与されたＩＭＧ−１製剤が、コントロールと比較して、糖尿病誘発性肥満（ＤＩＯ）マウスにおいてインスリン抵抗性を減少させることを示す棒グラフである。
【図１４】図１４は、２μｇ（静脈内）の用量で投与されたＩＭＧ−１製剤が、コントロールと比較して、ＤＩＯマウスにおいて肝グルコース産生（ＨＧＰ）を阻害することを示す棒グラフである。
【図１５】図１５は、２μｇ（静脈内）の用量でのＩＭＧ−１製剤がＤＩＯマウスにおける全身のグルコース代謝回転、解糖、またはグリコーゲン合成に影響を及ぼさず、コントロールと本質的に同等であることを示す棒グラフである。
【図１６】図１６は、２μｇの用量（静脈内）でのＩＭＧ−１製剤が骨格筋または白色脂肪グルコース取り込みに影響を及ぼさないことを示す棒グラフである。
【図１７】図１７は、全長ＲＰＳ２（ＩＭＧ−１）と比較して（ＩＭＧ−１ＬおよびＩＭＧ−１Ｓ）と命名された切断型ＲＰＳ２ペプチドの活性を未処理と比較して示す棒グラフである。内皮細胞を用いたＭＴＴアッセイからの光学密度によって測定されるように、全長タンパク質のＣ末端フラグメントに対応するＩＭＧ−１Ｌの製剤は、ＩＭＧ−１（全長）と比較してインビトロで同様の活性を示し、一方でＩＭＧ−１Ｓ（完全長タンパク質のＮ末端フラグメントに対応する）の製剤は活性を示さないようであった。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
以下の詳細な説明は、当業者が本発明を実施するのを助けるために提供されるが、本明細書に開示された実施形態における修正および変形が、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者によってなされることができるため、本発明を限定すると解釈されるべきではない。本出願において引用されたすべての刊行物および他の参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００２９】
定義
本明細書では、本発明の異なる態様を説明するために以下の用語が使用されている。これらの用語は説明の目的でのみ使用されており、本発明の任意の態様の範囲を限定することを意図していない。
【００３０】
本明細書中で使用される「有効成分」、「活性化合物」、「活性成分」、および／または「活性剤」は互換的に使用することができ、配列ＩＤ番号１、または配列ＩＤ番号２、または配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、またはそれらの組み合わせのアミノ酸配列を有するアミノ酸配列を有するポリペプチド、ペプチドフラグメント、またはその類似体を指す。前記活性成分／化合物を有する本発明の製剤は、活性化合物の特定の用量または濃度を意味することなく、「ＩＭＧ−１」製剤と総称される。
【００３１】
本明細書で使用される「有効量」は、対象に投与されたときに血糖値を２００ｍｇ／ｄｌ未満に低下させ、コレステロールを２００ｍｇ／ｄｌ未満に低下させ、および／または血圧を１４０／９０ｍｍＨｇ未満に低下させるのに有効である活性成分／化合物の量を指す。
【００３２】
本明細書で使用される「医薬製剤」、「医薬組成物」、「製剤」、または「組成物」は、液体（水性、ゲル、または軟膏）、またはある量の活性化合物を含む固体形態を（互換的に）指し、ヒトまたは他の動物などの哺乳動物への直接または再構成後の投与に適するように調製される。必要に応じて、前記製剤は薬学的に許容される担体および／または添加剤を含み得る。例えば、洗剤／界面活性剤（例えば、ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ（２０、８０など）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）、賦形剤、酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、メチオニン）、着色剤、香味剤、保存剤、安定剤、緩衝剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、潤滑剤、流動性促進剤、および矯味剤。本発明の医薬組成物は、本明細書に記載のＲＰＳ２ポリペプチドおよび／またはポリペプチド類似体と組み合わせて他の活性成分を含有してもよい。
【００３３】
本明細書で使用されるように、用語「治療する」、「治療すること」、または「治療」および本明細書で使用されるような他の文法上の同等のものは、疾患または症状の緩和、軽減、または改善、追加的症状の予防、症状の根本的な代謝的原因の改善または予防、疾患または状態の抑制、例えば疾患または状態の発症の阻止、疾患または状態の軽減、疾患または状態の軽減の原因、疾患または状態によって引き起こされる状態の軽減、または疾患または状態の症状の停止、および予防を含む。この用語はさらに、治療上の利益および／または予防的な利益を達成することを含む。治療上の利益とは、治療されている根本的な疾患の根絶または改善を意味する。また、患者が依然として基礎疾患に悩まされている可能性があるにもかかわらず、患者において改善が観察されるように、基礎疾患に関連する生理学的症状のうちの１つまたはそれ以上の根絶または改善によって治療上の利益が達成される。予防的な利益のために、この疾患の診断がなされていなくても、特定の疾患を発症する危険性がある患者、または疾患の１つまたはそれ以上の生理学的症状を報告する患者に前記組成物を投与することができる。
【００３４】
本明細書で使用されるように、糖尿病または高血圧症などの状態を治療するための「治療有効量」は、糖尿病における血糖値の低下、または高血圧における血圧の低下、または高トリグリセリド血症または高コレステロール血症におけるコレステロールの低下など、患者または患者集団において臨床的に関連する評価項目を達成することができる活性化合物の量である。限定されない例として、有効量のＩＭＧ−１組成物の投与は、（糖尿病動物モデルにおいて）血糖値を２００ｍｇ／ｄＬ未満に低下させ、血圧を１４０／９０ｍｍＨｇ未満に低下させ、総コレステロールを２００ｍｇ／ｄＬ未満に低下させることが動物実験において示されている。
【００３５】
本発明は、糖尿病（１型および／または２型）、高血圧症、高コレステロール血症、血管疾患、またはメタボリックシンドロームのうちの１つまたはそれ以上を有する、対象における１つまたはそれ以上の疾患を治療するための医薬組成物を提供する。前記医薬組成物は、１つまたはそれ以上の薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤との組み合わせた、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、配列ＩＤ番号４、またはそれらの活性領域のうちの１つまたはそれ以上に対応する精製または合成ＲＰＳ２ポリペプチドまたはペプチド類似体を有する。前記医薬組成物は、治療を必要とする対象への経口、非経口、または経皮／局所投与用に製剤化することができる。
【００３６】
別の実施形態において、本発明は、精製または合成ＲＰＳ２ペプチド、その類似体、または活性領域、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液を有する水性医薬製剤を提供し、前記製剤は通常の生理学的範囲内のｐＨ（約７．４）を有し、ＲＰＳ２ポリペプチドまたはペプチド類似体は、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、または配列ＩＤ番号４のうちの１つまたはそれ以上に記載のアミノ酸配列を有する。
【００３７】
高血糖症、高血圧症、および／または高コレステロール血症を有する１つまたはそれ以上の状態を予防し、その発症を遅らせ、またはその重症度を軽減する方法も提供される。本発明はまた、タンパク質発現用の細胞を増殖させるための培地およびタンパク質発現に最適化された細胞培養産生培地を含む、細胞培養、特に酵母、細菌、および哺乳動物細胞培養におけるタンパク質発現を改善するための方法および組成物を提供する。
【００３８】
本発明はまた、例として意図され、網羅的ではないと意図され、それらに限定されないと理解されるべきである実施例および実験結果を通して記載される。
【００３９】
４０ｓ  ＲＰＳ２ペプチドおよびアミノ酸配列
驚くべきことに、切断型フラグメントを含む精製された単離４０ｓリボソームタンパク質Ｓ２（ＲＰＳ２）は、被験体に投与された場合に、血糖値を低下させ、血糖値を正常化し、血中コレステロール値を低下させ、血圧レベルを低下させかつ正常化し、ヘモグロビンＡ１ｃレベルを低下させ、グルカゴンレベルを低下させ、インスリン抵抗性を減少させる能力を含む治療上の利点を示すことが発見された。参考として、４０ｓ  ＲＰＳ２は、リボソームタンパク質のＳ５Ｐファミリーに属するタンパク質である。ヒトに関しては、ＲＰＳ２遺伝子は、４０Ｓサブユニットの構成要素であり、かつ細胞質に位置するリボソームタンパク質をコードする。
【００４０】
ＲＰＳ２アミノ酸配列は典型的な核局在化シグナルを含まない。欠失変異体分析およびｒｐＳ２−β−ガラクトシダーゼキメラタンパク質を用いて、ＲＰＳ２中の核標的ドメインの推定上の同定を決定した。７２〜７５アミノ酸を有する中央ドメインは、キメラβ−ガラクトシダーゼを核に標的化するために必要かつ十分である。この核標的ドメインは、リボソームタンパク質または他の核タンパク質中の既に特徴付けられている核局在化シグナルと有意な類似性を共有しない。
【００４１】
全長ＲＰＳ２アミノ酸配列は、配列ＩＤ番号１と命名された２９３アミノ酸配列である。配列ＩＤ番号１の切断型Ｃ末端フラグメントは１５９アミノ酸フラグメントであり、配列ＩＤ番号２と命名される。非従来型の核局在化シグナルは、配列ＩＤ番号１のアミノ酸１６１〜２３５に位置する７５アミノ酸フラグメントであり、配列ＩＤ番号３と命名される。配列ＩＤ番号１のアミノ酸１３５〜２２１に位置する８７アミノ酸フラグメントは配列ＩＤ番号４と命名される。配列ＩＤ番号１の切断型Ｎ末端フラグメントは１３４アミノ酸フラグメントであり、配列ＩＤ番号５と命名される。
【００４２】
配列ＩＤ番号１のＲＰＳ２ポリペプチドは、ＢＬＡＳＴデータベース（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov）を利用して行われた配列分析によって比較した場合、すべての動物間で９４％〜１００％相同である。配列ＩＤ番号２の１５９アミノ酸からなるＣ末端領域は、動物界の門に対して９９〜１００％相同である。配列ＩＤ番号３に対応する７５アミノ酸の核局在化配列は、すべての動物と細菌との間で９９〜１００％の相同性を共有する。動物／細菌タンパク質配列は平均して９８〜１００％の相同性であるのに対して、植物に対する相同性は７７％程度の低い相同性であり得る。
【００４３】
本発明のＲＰＳ２アミノ酸配列（２９３アミノ酸）を以下に示し、配列ＩＤ番号１と命名する。
MADDAGAAGGPGGPGGPGMGNRGGFRGGFGSGIRGRGRGRGRGRGRGRGARGGKAEDKEWMPVTKLGRLVKDMKIKSLEEIYLFSLPIKESEIIDFFLGASLKDEVLKIMPVQKQTRAGQRTRFKAFVAIGDYNGHVGLGVKCSKEVATAIRGAIILAKLSIVPVRRGYWGNKIGKPHTVPCKVTGRCGSVLVRLIPAPRGTGIVSAPVPKKLLMMAGIDDCYTSARGCTATLGNFAKATFDAISKTYSYLTPDLWKETVFTKSPYQEFTDHLVKTHTRVSVQRTQAPAVATT
【００４４】
本発明のＲＰＳ２  Ｃ末端フラグメントは、約１８ｋＤａの１５９アミノ酸フラグメントである。このＣ末端フラグメントを以下に示し、配列ＩＤ番号２と命名する。
GHVGLGVKCSKEVATAIRGAIILAKLIVPVRRGYWGNKIGKPHTVPCKVTGRCGSVLVRLIPAPRGTGIVSAPVPKKLLMMAGIDDCYTSARGCTATLGNFAKATFDAISKTYSYLTPDLWKETVFTKSPYQEFTDHLVKTHTRVSVQRTQAPAVATT
【００４５】
本発明の７５アミノ酸の核局在化シグナル（配列ＩＤ番号１のアミノ酸１６１〜２３５の配列に対応する）を以下に示し、配列ＩＤ番号３と命名する。
SIVPVRRGYWGNKIGKPHTVPCKVTGRCGSVLVRLIPAPRGTGIVSAPVPKKLLMMAGIDDCYTSARGCTATLGN
【００４６】
配列ＩＤ番号１のアミノ酸１３５〜２２１のＮ末端付近の核局在化シグナルの一部に対応する８７アミノ酸配列を以下に示し、配列ＩＤ番号４と命名する。
GHVGLGVKCSKEVATAIRGAIILAKLSIVPVRRGYWGNKIGKPHTVPCKVTGRCGSVLVRLIPAPRGTGIVSAPVPKKLLMMAGIDD
【００４７】
本発明のＲＰＳ２  Ｎ末端フラグメントは、約１３ｋＤａのフラグメントであり、配列ＩＤ番号５と命名される。
MADDAGAAGGPGGPGGPGMGNRGGFRGGFGSGIRGRGRGRGRGRGRGRGARGGKAEDKEWMPVTKLGRLVKDMKIKSLEEIYLFSLPIKESEIIDFFLGASLKDEVLKIMPVQK QTRAGQRTRFKAFVAIGDYN
【００４８】
本発明におけるアミノ酸配列に含まれるアミノ酸は、本分野において周知の方法に従って翻訳後修飾することができる。例えば、ピログルタミル化によるＮ末端グルタミン（Ｇｌｎ）残基のピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）残基への修飾は当業者に周知である。当然、そのような翻訳後修飾アミノ酸は前記アミノ酸配列に含まれ、本発明の範囲内である。
【００４９】
インビトロでのＲＰＳ２の精製およびＲＰＳ２発現
ヒト４０Ｓリボソームタンパク質Ｓ２をコードするＲＰＳ２遺伝子、および種々のペプチド部分をｐＭＡＬ−５ベクター（New England Biolabs）にサブクローニングした。フォワードプライマー（配列：atggcggatgacgccggtgc）およびリバースプライマー（配列：ctatgttgtagccacagctgg）を用いてＲＰＳ２遺伝子を増幅し、得られたＰＣＲ断片をリン酸化し、低融点アガロースから精製した。得られた配列をｐＭＡＬ−５ベクターにライゲーションし、ライゲーションおよびインキュベーションの後、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有するＬＢプレート上に広げ、３７℃で一晩インキュベートしてインビボタンパク質産生用の形質転換体を作製した。
【００５０】
インビボでのＲＰＳ２タンパク質の生成
ＲＰＳ２形質転換体を５ｍｌのブロスに接種し、２×１０８細胞／ｍｌまで増殖させた。この培養物を使用して、２００ｍＬのＬＢ  ａｍｐ  ０．２％グルコースを約０．５のＡ６００に接種した。次いで、この培養物を、ＩＴＰＧ（イソプロピルチオ−β−ガラクトシド）を終濃度が０．３ｍＭになるように添加することによって誘導し、３０℃でさらに４時間増殖させた。次に細胞を遠心分離し、培養液１リットル当たり２５ｍｌのカラム緩衝液に再懸濁した。この細胞を凍結融解によって溶解し、続いて２０ゲージの針を通して継代した。溶解した細胞を遠心分離し、２５ｍｌのクルード抽出物ごとに１２５ｍｌの冷ＣＢを添加することによって上清を希釈した。希釈したクルード抽出物を１５ｍｌのアミロースカラムに加え、１２カラム容量のＣＢで洗浄した。タンパク質をＣＢおよびマルトース（１０ｍＭ）で溶出した。得られた溶出液を、２００μｇ／ｍｌに希釈した１μｌの第Ｘａ因子と共に室温で４時間インキュベートした。融合タンパク質切断混合物をｐＨ８．０で透析し、アミラーゼカラムを緩衝液で洗浄し、融合タンパク質切断混合物をカラムにロードした。フロースルーを回収し、単離タンパク質の量をビシンコニン酸アッセイ（ＢＳＡ）アッセイによって決定し、タンパク質の量をＥＬＩＳＡによって評価した。
【００５１】
インビボ動物実験のために、カラム精製後の溶液中の配列ＩＤ番号１に対応する精製ＲＰＳ２タンパク質をＰＢＳで所望の濃度（経口または静脈内投与に応じて）に希釈した。その後の溶液を、実施例に記載されているように、動物被検体への投与のために製剤を濾過滅菌するために０．２２μｍフィルターを通して濾過した。
【００５２】
細菌ＲＰＳ２の遺伝子を用いて同様の研究を実施し、ヒトＲＰＳ２と比較してインビボで同様の結果をもたらした。糖尿病動物モデルにおけるＩＭＧ製剤の試験、並びにコントロール動物モデルにおける毒性試験を含む、治療薬としての単離ＲＰＳ２ポリペプチドおよびペプチドフラグメントの安全性および有効性を試験するための様々な試験を実施した。実施された研究および得られた結果は、添付の図面と共に、実施例として本明細書に提示される。
【実施例１】
【００５３】
２型糖尿病動物モデル
ラットのズッカー糖尿病脂肪（ＺＤＦ）株は広く知られており、肥満、ならびに高血圧および高コレステロールに関連する２型糖尿病を研究するために一般的に使用されている。ＺＤＦ株は早発性糖尿病の近交系ラットモデルであり、すべてのｆａ／ｆａ雄ラットが、Ｐｕｒｉｎａ５００８（Charles River Laboratories International, Inc., MA, USA）の特別食を与えられると、１０〜１２週齢で糖尿病を発症する。表現型は同質であり、主にその株が遺伝的に近交系であるという事実と特別な食事療法が提供されるという事実とに起因する。
【００５４】
ズッカー糖尿病脂肪（ＺＤＦ）ラットに、体重を増加させるためにＰｕｒｉｎａ  ５００８（Charles River Laboratories International, Inc.）の特別食を与えた。試験前にその動物の血糖値を評価し、血糖値が２００ｍｇ／ｄｌ以上のラットのみを試験に使用した。動物を未処理（ｎ＝７）、１日１回のメトホルミン（２００ｍｇ／ｋｇ、ｎ＝７）、１日１回の１０μｇのＩＭＧ−１の静脈内投与（ＩＶ、ｎ＝８）、および１日１回の２００μｇのＩＭＧ−１の経口投与（ＰＯ、ｎ＝９）の４群に無作為に分けた。動物をこの飼料で３５日間飼育し、体重を週に２回測定した。３５日後、動物を屠殺した。図１は、３０日間にわたって測定された、１群あたりの体重（グラム）の分布を示す。
【００５５】
空腹時血糖（ＦＢＧ）レベルは、Ａｃｃｕｔｒｅｎｄ  Ｐｌｕｓシステムを使用して実験を通してＺＤＦにおいて評価した。ＩＭＧ−１で処理したＺＤＦラットは、投与した様式に関係なく処理後３日という早い時期に血糖値の著しい減少を示し（ＩＭＧ−１のＩＶ投与で１７９ｍｇ／ｄｌおよびＩＭＧ−１のＰＯ投与で１３５ｍｇ／ｄｌの平均ＦＢＧレベルに対して、未処理群およびメトホルミン処理群におけるＦＢＧレベルはそれぞれ２８１ｍｇ／ｄｌおよび２５８ｍｇ／ｄｌ）、７日目までにすべてのＩＭＧ−１処理動物は正常なＦＢＧレベル（２００ｍｇ／ｄｌ未満のレベル）を有した。未処理コントロールおよびメトホルミン処理動物は、試験を通して有意に上昇したＦＢＧレベルを有し、試験の終わりでは平均レベルは４００ｍｇ／ｄｌ（それぞれ４８１ｍｇ／ｄｌおよび４６８ｍｇ／ｄｌ）を超えた。図２は、ＩＭＧ−１が糖尿病動物モデルにおいて血糖値を正常化することを示し、血糖値はコントロールおよびメトホルミンに対してＩＭＧ−１で処理した動物において低下した。
【００５６】
ＺＤＦラットの血圧を、テールカフ血圧モニター（ＣＯＤＡ、Kent Scientificからのモニター）を用いて週２回モニターした。処理３日以内にＩＭＧ−１で処理したラットはより低い血圧を示し始め、ＩＭＧ−１を経口投与したＺＤＦラットは７日目までに正常ＢＰを示したが、ＩＭＧ−１を静脈内投与したラットは１０日目までに正常ＢＰを示した（ＩＭＧ−１のＩＶ投与およびＰＯ投与についてそれぞれ１２０／８２ｍｍＨｇおよび１１５／８０ｍｍＨｇ）。未処理ＺＤＦラットおよびメトホルミン処理ＺＤＦラットは高血圧を有した（>１４０／９０ｍｍＨｇ、未処理で１４１／９５ｍｍＨｇおよびメトホルミン処理で１４２／９９ｍｍＨｇ）。図３はコントロールおよびメトホルミンと対比したＩＭＧ−１で処理した動物における収縮期および拡張期の血圧レベルを示し、ＩＭＧ−１による処理は、糖尿病動物モデルにおいて血圧を正常化することを示す。
【００５７】
ＨｂＡ１ｃレベルを評価するために、０日目、１５日目、および３５日目の屠殺時にすべての動物で採血を実施した。採取した血液および血清に対してバイオアッセイを実施した。ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）レベルを３つすべての時点ですべての動物において測定した。図４に示されるように、平均Ｈｂ１Ａｃレベルは、０日目（９．７〜１０．８）では有意差はなく、１５日目にＨｂｌＡｃレベルは未処理群およびメトホルミン群の両方と比較して、ＩＭＧ−１処理群において有意に低く（ＩＶで１０．２、ＰＯで９．５に対して、未処理で１２．１、メトホルミン処理で１１．０）、３５日目までにＩＭＧ−１処理動物は、未処理およびメトホルミン処理動物（未処理で１２．３、メトホルミン処理で１１．８）の両方、並びにそれらの初期開始レベル（ＩＶで１０．４、ＰＯで１０．５）よりも有意に低レベルであった（ＩＶで７．４、ＰＯで７．５）。
【００５８】
Ｈｂ１Ａｃレベルと共に、３つの時点で全ての動物のインスリンレベルを測定した。図５に示されるように、図４のＨｂｌＡｃレベルとは異なり、３つの時点のいずれにおいても未処理群とＩＭＧ−１処理群との間でインスリンレベルに有意差はなかった。さらに、コントロールにおいて見られた結果は文献と一致した。
【００５９】
ＩＭＧ−１、メトホルミン、およびコントロール動物のインスリンレベルに変化はなかったが、ＩＶでのＩＭＧ−１処理動物およびＰＯでのＩＭＧ−１処理動物の両方のグルカゴンレベルについて、１５日目（それぞれ１１５ｐｇ／ｍｌおよび１１９ｐｇ／ｍｌから９０ｐｇ／ｍｌおよび９２ｐｇ／ｍｌ）および３５日目（８９ｐｇ／ｍｌおよび９２ｐｇ／ｍｌ）で有意な減少があった。コントロールおよびメトホルミン処理動物は、研究全体を通してグルカゴンレベルに有意差はなかった。図６はＩＭＧ−１が糖尿病動物モデルにおいてグルカゴンレベルを低下させることを示す。コントロールと比較した場合のグルカゴンレベルの減少は、ＩＭＧ−１の経口投与とＩＶ投与との間で一致していた。
【００６０】
ＺＤＦラットのコレステロールレベルを、２０μｇのＩＭＧ−１の単回投与注射の４８時間後、飲料水中のＩＭＧ−１への持続的なアクセスの後、または未処理（ｎ＝４）で評価した。ＩＭＧ−１処理動物は、未処理コホートと比較してコレステロールレベルが有意に低下していた。図７は、ＩＭＧ−１が糖尿病動物モデルにおいてコレステロールを減少させることを示す。未処理動物はコレステロールレベルが２２４ｍｇ／ｄＬであり、一方ＩＭＧ−１処理動物はコレステロールレベルがそれぞれ１７１ｍｇ／ｄＬ（ＩＶ）および１５６ｍｇ／ｄＬ（経口）であった。
【実施例２】
【００６１】
１型糖尿病動物モデル
ＩＭＧ−１が２型糖尿病動物モデルにおいて血糖値を正常化し、ＨＡ１Ｃを減少させることが示されたので、ＩＭＧ−１が１型糖尿病動物モデルにおいて血糖値に影響を及ぼし得るかどうかを確かめた。糖尿病はストレプトゾトシン（ＳＴＺ）を使用することによってマウスで誘発することができ、ＳＴＺは膵臓β細胞に対する選択的な毒性を有し、げっ歯類における実験的糖尿病の誘発のために広く使用されている化学物質である化合物である。ＳＴＺは、ストレプトマイセスアクロモジェンス細菌によって産生される抗生物質であり、膵臓β細胞に細胞毒性作用を及ぼす高反応性メチルニトロソ尿素部分に結合するグルコース分子（デオキシ形態）を含む。
【００６２】
ＳＴＺ誘発糖尿病モデルにおけるＩＭＧ−１の有効性を調べるために、高血糖症の発症を促進するために３〜４ヶ月目の２０匹のオスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスに５日間ＩＰ注射によってＳＴＺを投与した。ＳＴＺ注射後、治療前（ベースライン）の血糖値を４時間の絶食後に測定し、マウスを２つの研究群（コントロール群（プラセボ、ｎ＝７）およびＩＭＧ−１群（ｎ＝８／群））に選択するために使用した。この動物を、コントロールまたは３３μｇのＩＭＧ−１（ＰＯ）の１日１回の経口強制投与で３週間処理した。治療期間中、空腹時血糖値を２〜３日間隔で測定し、インスリンおよびグルカゴンレベルも同様に測定した。ＳＴＺ治療後１８日目に、コントロール群の動物の空腹時血糖値は２１６ｍｇ／ｄｌから３１９ｍｇ／ｄｌに上昇し、コントロール群の動物の１匹（１４％以下）は発育の失敗のため安楽死させなければならなかった。しかしながら、ＩＭＧ−１群の血糖値は、２０９ｍｇ／ｄｌから２３７ｍｇ／ｄｌへのわずかなグルコース値の増加を見ただけであり、図８に示すように、１８日目までにＩＭＧ−１群はコントロール動物よりも有意に低い血糖を有することが示された。
【実施例３】
【００６３】
毒性およびＰＫ研究
スプラーグドーリーモデルを用いて、ＩＭＧ−１製剤のクリアランスおよび毒性にアクセスした。３匹のオスのスプラーグドーリーラットに静脈内投与によって２０μｇの活性化合物（配列番号１に対応）を処理し、続いて間隔を置いて採血した。具体的には、０、ＩＭＧ−１投与後５分、１５分、３０分、６０分、９０分、２時間、４時間、６時間、２４時間、および４８時間である。図９に示すように、６時間にわたって測定したＩＭＧ−１活性化合物の血清レベル（ｐｇ／ｍＬ）によって、活性化合物は、投与後２時間までに３匹すべての動物の血液中で検出され、３匹目の動物では処置後４時間まで検出可能なレベルを示した。活性化合物のレベルと共に、血糖値をスプラーグドーリーモデルで評価した。ＩＭＧ−１投与はＺＤＦラットの血糖値を劇的に低下させたが、スプラーグドーリーラットに投与された単回投与のＩＭＧ−１製剤（２０μｇ）は、スプラーグドーリー動物における４８時間にわたる血糖値によってみられるように、４８時間以内に低血糖を促進することはなかった（図９を参照）。
【００６４】
ＩＭＧ−１製剤の毒性を評価するために、スプラーグドーリーラットを用いてパイロット用量発見毒性アッセイを実施した。試験は５群からなり、１群あたり３匹のメスおよび３匹のオスの動物を用いた。処理群には、以下のＩＭＧ−１濃度のうちの１つの単回用量を与えた。１．０μｇ、１０μｇ、１００μｇ、または１０００μｇ。コントロール群には処理をしなかった。臨床観察は、投与後４時間は１時間毎に行い、５つの群すべてについて合計１４日間毎日行った。投与後７日目および１４日目に、５つの群（処理および未処理）のそれぞれについて採血した。いずれの動物においても有害な臨床観察は見られなかった。５つの群のそれぞれにおいて、クレアチニンレベルを測定して腎機能を評価し、アラニンアミノトランスフェラーゼレベルを測定して肝機能を評価した。それぞれ図１０および１１に示すように、クレアチニンおよびアラニンアミノトランスフェラーゼの両方のレベルにおいて、ＩＭＧ−１製剤で処理した動物と未処理の動物との間に識別可能な差は見られなかった。
【実施例４】
【００６５】
インスリンクランプ研究
インスリン分泌および抵抗性を定量化するための最も広く受け入れられている試験方法は、正常血糖インスリンクランプ法であり、これは動物がどの程度グルコースを代謝するか、または動物がインスリンに対してどのくらい敏感であるかを測定する。この手順では、絶食時より高い一定の血漿インスリンレベルを維持するように外因性インスリンを注入しながら、グルコースを様々な速度で注入することによってグルコースを基礎レベル（１００〜１５０ｍｇ／ｄｌ）に固定する。
【００６６】
コントロール（ｎ＝８）に対するＩＭＧ−１処理動物（ｎ＝８）におけるインスリン作用およびグルコース代謝を評価するために、食餌誘発性肥満（ＤＩＯ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに２時間の高インスリン正常血糖クランプ処理を施した。クランプ処理の前に、ＰＢＳ処理動物と比較して、クランプ試験の４８時間前および２４時間前に、２μｇのＩＭＧ−１製剤を尾静脈を介して（動物ごとに）静脈内投与した。ＩＭＧ−１処理動物は、ＰＢＳ処理動物（３０ｍｇ／ｋｇ／ｍＬ）よりもクランピング中に有意に高い定常状態グルコース注入速度（３８．８ｍｇ／ｋｇ／ｍＬ）を有した。図１２に示されるように、ＩＭＧ−１による処理はＤＩＯマウスにおけるインスリン抵抗性を減少させる。図１３に示されるように、肝臓グルコース産生（ＨＧＰ）もまた、ＩＭＧ−１で処理されたすべての動物において劇的に抑制された。さらに、肝臓インスリン作用（ＨＧＰの抑制率）は、高インスリン正常血糖クランプ処理の間にすべてのＩＭＧ−１処理動物において増加した。しかしながら、グルコース代謝回転、解糖、及びグリコーゲン合成のレベルがコントロール動物と処理動物との間でほぼ等しいことを示す図１４から明らかなように、処理動物のいずれにおいても、ＩＭＧ−１は全身のグルコース代謝回転、解糖、またはグリコーゲン合成に影響を与えなかった。骨格筋グルコース取り込み及び白色脂肪組織グルコース取り込みが、未処理動物と処理動物との間でほぼ同一であったことを示す図１５でも明らかなように、クランピング手順の結果はまた、骨格筋および脂肪組織におけるグルコース代謝が、クランプアッセイの間、ＩＭＧ−１またはＰＢＳ処理動物のいずれにおいても有意に異ならないことを示した。
【実施例５】
【００６７】
ＲＰＳ２活性領域の同定
全長精製ＲＰＳ２タンパク質を、２つの位置（Ｐ１位のＡｓｎ及びＰ１位のＧｌｙのアミノ酸１３４）でＲＰＳ２を切断し、２つのサブユニットを得るヒドロキシルアミン（ＮＨ２ＯＨ）で消化し、約１３ｋＤａのＲＰＳ２−ｓｈｏｒｔ（ＩＭＧ−１Ｓ）および約１８ｋＤａのＲＰＳ２−ｌｏｎｇ（ＩＭＧ−１Ｌ）と命名した。得られたフラグメントを非変性ポリアクリルアミドゲルで分離し、可視化した後、ゲルから電気溶出した。このフラグメントを使用して細胞培養で試験するための製剤を調製した。
【００６８】
ヒト皮膚微小血管内皮細胞（ＣＡＤＭＥＣ／ＨＭＶＥＣ）は、内皮機能および疾患、特に微小血管系に関連するものの多くの側面を研究するための優れたモデルシステムを提供する。ＭＴＴアッセイは、細胞代謝活性を評価するための比色分析である。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ依存性細胞オキシドレダクターゼ酵素は、規定の条件下で、存在する生存細胞の数を反映し得る。これらの酵素はテトラゾリウム染料ＭＴＴ３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミドをその不溶性ホルマザンに還元することができ、これは紫色を有する。細胞活性に対するＩＭＧ製剤の効果を評価するために、Cell Applications, Inc.から入手可能なものなどのＣＡＤＭＥＣ培養物を種々の製剤の１つ（０μｇ／ｍＬ全長タンパク質（ＩＭＧ−１と呼ぶ）、０．５μｇ／ｍＬのＣ末端フラグメント（ＩＭＧ−１Ｌと呼ぶ）、または０．５μｇ／ｍＬのＮ末端フラグメント（ＩＭＧ−１Ｓと呼ぶ））で処理した。処理した培養物を７２時間増殖させた。７２時間の細胞増殖の後、１００μＬの細胞培養物を１０μＬの１２ｍＭのＭＴＴで処理し、３７℃で４時間インキュベートした。ＭＴＴで４時間インキュベートした後、結晶を可溶化するために１００μＬのＳＤＳ−ＨＣｌ溶液をＭＴＴ処理細胞培養物に加え、さらに４時間インキュベートした。次いで、マイクロプレート吸光分光光度計（ＢｉｏＲａｄのｘＭａｒｋ（商標）と同様）を用いて５７０ｎｍで吸光度を読み取った。図１７に示されるように、７２時間で、ＩＭＧ−１およびＩＭＧ−１Ｌの製剤で処理した細胞において相対光学ＯＤの有意な増加があったが（それぞれ１６４％および１５７％）、ＩＭＧ−１Ｓは細胞増殖および未処理レベルに影響を与えるようには見えなかった。ＩＭＧ−１Ｌは全長タンパク質のＣ末端フラグメントに対応し、一方でＩＭＧ−１Ｓ製剤は全長タンパク質のＮ末端フラグメントに対応する。したがって、ＲＰＳ２のＣ末端、並びにそのフラグメント及び／または類似体は、全長ＲＰＳ２タンパク質と共に治療的価値がある。
【００６９】
例示的なＩＭＧ−１製剤
本発明は、配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、および／または配列ＩＤ番号４のうちの１つまたは以上に対応する１つまたは以上のポリペプチド、ペプチド、および／または類似体を有する医薬組成物を提供する。
【００７０】
配列ＩＤ番号１、配列ＩＤ番号２、配列ＩＤ番号３、および／または配列ＩＤ番号４に対応する精製または合成ペプチドまたはペプチド類似体を有する本発明の製剤は、当業者に利用可能な方法に従って製剤化することができる。一実施形態において、医薬製剤は、配列ＩＤ番号１〜４のうちの１つに対応するＲＰＳ２ポリペプチドもしくは類似体、またはその活性ペプチド領域を、２０μｇ未満から１５０μｇまでの範囲で、固形剤形または溶液として有する。一実施形態において、製剤は、０．０５〜５μｇ／Ｌの濃度で存在するペプチドを有する。別の実施形態において、製剤は０．１〜１μｇ／Ｌの濃度で存在するペプチドを有する。さらに別の実施形態において、製剤は、経口製剤では５０〜１５０μｇ／ｋｇ、静脈内製剤では５〜１５μｇ／ｋｇの濃度で存在するペプチドを有する。活性成分の濃度および対応する用量は、部分的には、対象の体重、投与経路、治療されるべき症状／障害、および症状の重症度に依存するであろう。
【００７１】
一実施形態において、本発明の医薬製剤は、１種以上の洗剤、界面活性剤、胆汁酸塩、Ｃａ２＋キレート剤、脂肪酸、中鎖グリセリド、アシルカルニチン、アルカノイルコリン、Ｎ−アセチル化α−アミノ酸、Ｎ−アセチル化非α−アミノ酸、キトサン、粘膜付着性ポリマー、およびリン脂質を含む１種以上の吸収促進剤をさらに有する。
【００７２】
一実施形態において、本発明に有用な例示的な賦形剤には、緩衝剤、塩、界面活性剤、ポリオール／二糖類／多糖類、アミノ酸、および抗酸化剤が含まれる。４．７〜７．４のｐＨレベルを維持する例示的な緩衝剤としては、酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、コハク酸塩、リン酸塩、およびヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）が挙げられる。例示的な界面活性剤には、ポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）、およびポロキサマー１８８が含まれる。凍結乾燥製剤は、ポリオール／二糖類／多糖類（例えば、マンニトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、およびデキストラン４０）のうちの１つまたは混合物を使用することができる。糖は凍結乾燥製剤の大部分を成し、治療用タンパク質のための安定化剤として役立つことが知られている。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）は、タンパク質製剤と共に一般的に使用されている。抗酸化剤の例としては、アスコルビン酸、メチオニン、およびエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）が挙げられる。
【００７３】
他の実施形態において、本発明の医薬製剤は、１つまたはそれ以上の親油性部分による表面修飾をさらに有する。さらに別の実施形態において、医薬製剤は、選択的に１つまたはそれ以上の担体分子の濃縮溶液と同時投与される活性剤を有する。
【００７４】
さらに別の実施形態において、医薬製剤は、ポリアクリル酸またはセルロース誘導体を有する１つまたはそれ以上の合成生体接着性ポリマーをさらに有する。ポリアクリル酸系ポリマーの例としては、カルボポール、ポリカルボフィル、ポリアクリル酸（ＰＡＡｃ）、ポリアクリレート、ポリ（メチルビニルエーテル−コ−メタクリル酸）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メタクリレート）、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、およびポリ（イソブチルシアノアクリレート）が挙げられるが、これらに限定されるものではない。セルロース誘導体としては、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、およびメチルヒドロキシエチルセルロースが挙げられるが、これらに限定されるものではない。さらに、半天然生体接着性ポリマーとしては、キトサン、並びにグアー、キサンタン、ポリ（ビニルピロリドン）、およびポリビニルアルコールなどの様々なガムが挙げられる。
【００７５】
さらに別の実施形態において、本発明の医薬製剤は、腸溶性カプセルに含まれる層状フィルムを伴う活性剤を有する胃腸粘膜接着性パッチシステム（ＧＩ−ＭＡＰＳ）をさらに有し、これは水不溶性ポリマーであるエチルセルロース（ＥＣ）を有するバッキング層と、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、Ｅｕｄｒａｇｉｔ  Ｌ１００、またはＳ１００などの腸溶性ｐＨ感受性ポリマーを有する表面層と、接着剤層を有するコーティング層と、前記バッキング層に付着したセルロース膜からなるペプチド含有層である中間層とを有する。経口投与後、前記表面層は標的の腸部位で溶解し、小腸壁に付着し、そこで粘膜に付着することによって胃腸粘膜の標的部位上に閉鎖空間が形成される。その結果、活性物質と吸収促進剤の両方が前記閉鎖空間内に共存し、前記システム内と腸細胞との間に高濃度の勾配が形成され、これがペプチドの吸収促進に寄与する。
【００７６】
上述の実施形態のいずれかに関して説明した特徴は、異なる実施形態間でも交換可能に適用可能であり得ることは当業者には明らかであろう。上述の実施形態は、本発明の様々な特徴を説明するための例である。
【００７７】
本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、「有する」および「含む」という用語、およびそれらの変形は「含むがこれらに限定されない」ことを意味し、それらは他の部分、添加剤、成分、または工程を排除することを意図せず、また排除しない。本明細書の説明および特許請求の範囲を通して、文脈上そうでないと要求されない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用されている場合、文脈上別段の要求がない限り、本明細書は単数形だけでなく複数形も企図するものとして理解されるべきである。
【００７８】
本発明の特定の態様、実施形態、または実施例に関連して記載された特徴、特性、化合物、化学的部分、または基は、適合しない場合を除き、本明細書に記載の他の態様、実施形態、または実施例に適用可能である。本明細書（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に開示されたすべての特徴、および／またはそのように開示された任意の方法またはプロセスのすべての工程は、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本発明は、上述の実施形態の詳細に限定されない。本発明は、本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規のもの、もしくは任意の新規の組み合せ、またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスの工程の任意の新規のもの、もしくは任意の新規の組み合せに及ぶ。
【００７９】
読者の注意は、本出願に関連して本明細書と同時にまたはそれ以前に提出され、本明細書を用いて公衆の閲覧に供されるすべての論文および文書に向けられ、そのような論文および文書のすべての内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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