(57)【要約】ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路の成分を標的とする薬剤を用いた治療に対する増殖性疾患に罹患している患者の感受性を決定するための方法であって、前記方法は、前記患者からの腫瘍サンプルにおいて、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路ならびに他の発癌性バイオマーカーおよび腫瘍突然変異負荷に直接関連するものを含むリストから選択される少なくとも３つのバイオマーカーを決定することと、前記薬剤に対するインジケータ感受性として前記バイオマーカーの２つ以上の存在を関連付けることとを含む、方法。結果を処理するための決定およびアルゴリズムを行うための方法についても説明し、特許請求している。
2020523031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路の成分を標的とする薬剤を用いた治療に対する、増殖性疾患に罹患している患者の感受性を決定する方法であって、当該方法は、前記患者からの腫瘍サンプル中において第３Ａ表〜第３Ｄ表中に記載されたリストから選択された少なくとも３つのバイオマーカーを決定し、そして、当該バイオマーカーの複数の存在を前記薬剤に対する感受性の指標として関連付けることを含む増殖性疾患に罹患している患者の感受性を決定する方法。
【請求項２】
第３Ａ表〜第３Ｄ表中の少なくとも１０のバイオマーカーが決定される請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項３】
第３Ａ表〜第３Ｄ表中の全てのバイオマーカーが決定される請求項４に記載の方法。
を記載した請求項４に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルの腫瘍変異負担を決定することをさらに含む上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
増殖性疾患が癌である上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記癌が、副腎癌、肛門癌、基底および扁平細胞皮膚癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳および脊髄腫瘍、乳癌、未知の原発性癌、子宮頸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、眼癌、胆嚢癌、消化管癌、胃腸管癌、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、腎臓癌、喉頭および下咽頭癌、肝臓癌、肺癌、肺，カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、黒色腫、メルケル細胞皮膚癌、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、口腔および口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌，小細胞肺癌、小腸癌、軟部肉腫、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌から選択されたいずれかのものである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
バイオマーカーがＤＮＡまたはＲＮＡ分析またはこれらの組み合わせを用いて同定されるものである上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
腫瘍サンプルが患者から得られる診断ＰＷＥＴサンプルである上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーのコード領域全体をカバーするために、標的半導体配列決定を使用するものである上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも１つのバイオマーカーのＲＮＡのレベルが測定され、ここで野生型と比較して発現レベルの変化がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を示すものである、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオマーカーがＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）からなる群から選択されるものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１  ｍＲＮＡにわたる複数のエキソン−イントロン遺伝子座での遺伝子発現の分析が実施され、これは、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現レベルの測定値を定量するために、正規化された遺伝子発現に関連するものである請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
ＮＦＡＴＣ１（活性化Ｔ細胞１の核因子）、ＰＩＫ３ＣＡ（ホスファチジルイノシトール‐４，５‐ビスホスフェート３‐キナーゼ触媒サブユニットα）、ＰＩＫ３ＣＤ（ホスファチジルイノシトール‐４，５‐ビスホスフェート３‐キナーゼ触媒サブユニットδ）、ＰＲＤＭ１（ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１）、ＰＴＥＮ（ホスファターゼおよびテンシン相同体）、ＰＴＰＮ１１（チロシンタンパク質ホスファターゼ非受容体型１１）、ＭＴＯＲ（ラパマイシンの機械論的標的）、ＨＩＦ１ａ（低酸素誘導因子１‐α）およびＦＯＸＯ１ｍ（フォークヘッドボックスクラス０１突然変異体）のＲＮＡレベルの上昇が測定される請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ミスマッチ修復遺伝子ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６およびＭＬＨ２の遺伝子発現の喪失が決定される、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも１つのバイオマーカーが遺伝子における突然変異の検出を含み、前記突然変異が遺伝子または遺伝子産物の発現または機能に影響を及ぼすものである、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
突然変異が、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ遺伝子）、ＢＲＡＦ（Ｂ−Ｒａｆ遺伝子）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１遺伝子）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体遺伝子）、ＥＲＢＢ２（受容体チロシン−タンパク質キナーゼｅｒｂＢ−２またはヒト上皮成長因子受容体２遺伝子）、ＦＧＦＲ（線維芽細胞成長因子受容体遺伝子）、ＫＩＴ（ＫＩＴプロトオンコジーン受容体チロシンキナーゼ遺伝子）、ＫＲＡＳ（Ｋ−ｒａｓ  ｇｔｐａｓｅ遺伝子）、ＭＥＴ（ＭＥＴプロトオンコジーン、受容体チロシンキナーゼ）またはＮＲＡＳ（Ｎ−ｒａｓプロトオンコジーン、ＧＴＰａｓｅ遺伝子）からなる群より選択される遺伝子に存在するものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
異常な遺伝子融合をもたらす遺伝子再編成から生じるバイオマーカーが検出される、上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
遺伝子融合がＡＬＫ融合、ＭＥＴ遺伝子融合のＦＧＦＲ融合である請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
検出されたバイオマーカーが、遺伝子のコピー数変異体の存在を含むものである上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記遺伝子が、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＣＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２遺伝子）またはＣＤ２７３からなる群より選択されるものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
バイオマーカーが、ハイスループットアッセイプラットフォームを用いて決定されるものである上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
感受性のレベルを示すアルゴリズムが、得られた結果に適用されるものである上記請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
スコア「０」が種々のバイオマーカーの野生型または正常発現プロフィールに対して変化がないかことを示す結果に適用され、一方、少なくとも「１」のスコアは、記載される任意の変異または変異に適用されるものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
（ｉ）  「１」のスコアはバイオマーカー遺伝子における発癌性突然変異の存在の場合、またはバイオマーカー遺伝子の２〜３の追加コピーの存在、または発癌性遺伝子融合の存在、またはバイオマーカー遺伝子のＲＮＡ発現の小さな（すなわち、０〜５００  ｎＲＰＭ）変化に、または＜６突然変異／メガ塩基のＴＭＢに適用され；
（ｉｉ）  「２」のスコアはバイオマーカー遺伝子の４〜８コピーの追加コピーが存在する場合、またはバイオマーカー遺伝子のＲＮＡ発現の中間（５００〜１５００  ｎＲＰＭ）変化に、または６〜１９突然変異／メガ塩基のＴＭＢに適用され；
（ｉｉｉ）スコア「３」は、バイオマーカー遺伝子の８を超える追加コピーの存在の場合、またはバイオマーカー遺伝子のＲＮＡ発現の高い（＞１５００  ｎＲＰＭ）変化に、または２０を超える突然変異／メガ塩基のＴＭＢの場合に適用される；
物である請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記請求項のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項２６】
第３Ａ表〜第３Ｄ表に列挙される３つ以上のバイオマーカーを検出するために必要とされる増幅プライマーの組み合わせを含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法を実施するように構成された装置。
【請求項２８】
ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分析を実施するための手段と、請求項２４に記載の方法を実施するようにプログラムされたコンピュータとを含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
請求項２４に記載のアルゴリズムを実施するようにプログラムされたコンピュータまたは機械可読カセット。
【請求項３０】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を標的とする薬剤の有効量を、少なくとも中程度に感受性であることが見出された患者に投与することをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路の成分を標的とする薬剤を用いて治療に応答する増殖性疾患に罹患している患者を同定するためのシステムであって、以下を含む、システム：
プロセッサと、プロセッサによって実行されると、コンピュータシステムに以下のことを行わせるアルゴリズムのコードを記憶するメモリとを含む：
患者の腫瘍のサンプル中で同定された第３Ａ表〜第３Ｄ表に列挙されたものから選択された複数のバイオマーカーの入力レベルを受け取る；
前記サンプル中の核酸の腫瘍突然変異負荷に関するさらなる入力レベルを受け取る；
ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路の成分を標的とする薬剤を用いた治療に対する前記患者の感受性のレベルを示す出力を提供するために、アルゴリズムを介して入力レベルを分析し、変換する；
プロセッサのグラフィカルインタフェースに出力を表示する。
【請求項３２】
前記メモリは、前記入力レベルに基づいて、前記患者の治療のためのカスタマイズされた推奨を提供するためのコードをさらに備える、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記カスタマイズされた推薦は、前記プロセッサのグラフィカルインターフェース上に表示される、請求項３２に記載のシステム。
【請求項３４】
プロセッサによって実行されると、コンピュータシステムに、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路を標的とする薬剤を用いた治療に応答する増殖性疾患に罹患している患者を、以下によって識別させる命令を記憶する非一時的なコンピュータ可読媒体：
患者の腫瘍サンプル中で同定された第３Ａ表〜第３Ｄ表に列挙されたものから選択された複数のバイオマーカーの入力レベルを受け取ること；
前記サンプル中の核酸の腫瘍突然変異負荷に関するさらなる入力レベルを受け取ること；
ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路の成分を標的とする薬剤を用いた治療に対する前記患者の感受性のレベルを示す出力を提供するために、アルゴリズムを介して入力レベルを分析し、変換すること；
プロセッサのグラフィカルインタフェースに出力を表示すること。
【請求項３５】
入力レベルに基づいて患者の治療のためのカスタマイズされた推奨を作成し、カスタマイズされた推奨をプロセッサのグラフィカルインターフェース上に表示するための命令をさらに記憶する、請求項３４に記載の非一時的なコンピュータ可読媒体。
【請求項３６】
増殖性疾患に罹患している患者を治療するための方法であって、当該方法は、前記患者からの腫瘍サンプルを使用して、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法を実施することと、前記バイオマーカーの分析に基づいて、治療または継続治療のためのカスタマイズされた推奨を開発することと、前記患者に適切な治療または治療を施すこととを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌などの増殖性疾患に罹患している患者の感受性を、特定の種類の薬剤を使用して治療するために、決定する方法に関する。それはさらに、当該決定に基づく、選択された患者に関して治療計画の開発、決定を実行するためのキット、および決定を実行するようにプログラムされたコンピューターを含む。
【背景技術】
【０００２】
抗−ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１指向免疫療法は、免疫療法に使用される薬剤群の最も重要なグループの１つとなっている。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路は、通常、慢性炎症の設定における耐性を促進し、組織損傷を防止することに包含される。プログラム死１（ＰＤ−１）およびそのリガンドである、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２は、Ｔ細胞活性化、耐性、および免疫病理学の間のバランスを調節する阻害シグナルを伝達する。ＰＤ−１プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）は、免疫系変調中にプログラム死１受容体（ＰＤ−１）に結合する膜貫通タンパク質である。このＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用は、Ｔ細胞の作用を阻害することにより正常細胞を免疫認識から保護し、それによって免疫媒介組織損傷を防止する。
【０００３】
癌と戦うことに免疫系を利用することは、関心の主要な話題となっている。癌の治療に関する免疫療法は、世界的かつ非特異的に免疫系をより標的化したアプローチに刺激する治療法から急速に進化している分野である。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路は、免疫療法の強力な標的として出現した。ある範囲の癌タイプが、免疫細胞によって発現されるＰＤ−１に結合するＰＤ−Ｌ１を発現することが示されており、これらの癌が腫瘍破壊を回避することを可能にする免疫抑制効果がもたらされることとなる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用はＴ細胞活性化を阻害し、腫瘍に対するエフェクター免疫応答をさらに抑制するＴ調節細胞（Ｔ−ｒｅｇｓ）の増殖を増強する。これは、免疫認識を避けるために正常な細胞によって使用されるアプローチを模倣する。従って、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１を標的とすることは、免疫療法指向治療のための新しい強力なアプローチとして登場した。
【０００４】
ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１を指向させた治療用抗体を用いてＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を標的とすることは、免疫回避の特徴を示すこれらの癌タイプにおける強力な治療法として浮上している。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかに指向させた治療用抗体（抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＰＤ−１剤）で破壊することは、腫瘍に対して指向されたＴ細胞の優先的活性化を伴うエフェクター免疫応答の回復をもたらすこととなる
【０００５】
黒色腫、腎細胞癌、頭頸部の肺癌、胃腸管悪性腫瘍、卵巣癌、血液悪性腫瘍を含む様々な種類の癌が、免疫回避をもたらすＰＤ−Ｌ１を発現することが知られている。抗ＰＤ−Ｌ１および抗ＰＤ−１療法は、これらの腫瘍タイプの多くにおいて、例えば、黒色腫で２０〜４０％、進行した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）で３３〜５０％の、強力な臨床応答を誘導することが示されている。これらの抗体のいくつか、例えば、抗ＰＤ−１指向化薬剤ニボルマブ（Nivolumab）およびペンブロリズマブ（Pembrolizumab）は、現在、転移性ＮＳＣＬＣおよび進行性黒色腫の治療に関してＦＤＡ承認を受けている。
【０００６】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を標的とする開発において９つの薬剤があり、現在の製薬会社の実施は、抗ＰＤ−１／抗ＰＤ−Ｌ１指向性療法に対する応答の予測因子として、抗ＰＤ−Ｌ１免疫不全化学（ＩＨＣ）診断アッセイを独自に開発することである。これらのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１指向性療法は、ペンブロリズマブ（Pembrolizumab）、アテゾリズマブ（atezolizumab）、アベルマブ（avelumab）、ニボルマブ（nivolumab）、デュルバルマブ（durvalumab）、ＰＤＲ−００１、ＢＧＢ−Ａ３１７、ＲＥＧ  Ｗ２８１０、ＳＨＲ−１２１０（以下の第１表）を含む。
【０００７】
大手バイオファーマ企業は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１指向性治療法のコンパニオン診断の開発のために、パラフィンワックス包埋ホルマリン固定診断生検および切除組織／サンプル（ＰＷＥＴ）に関する免疫組織化学的アプローチを選択した。これらの全ての試験は、酵素結合色素原検出システムを用いた標準的な免疫組織化学アッセイアプローチを用いて、組織切片に適用されるＰＤ−Ｌ１に対して産生されたモノクローナル抗体の適用を含む。次いで、ＰＤ−Ｌについての完全な表面膜染色のいずれかの部分的な細胞の免疫組織化学染色を、病理学者による顕微鏡検査によって手動で評価して、ＰＤ−Ｌ１を発現する細胞の割合を決定する。次いで、これを腫瘍割合スコアとして報告する。一部のアッセイはＰＤ−Ｌ１の腫瘍細胞発現のみを評価するものであり、その他のアッセイは、腫瘍細胞および関連する腫瘍内および腫瘍周囲の免疫細胞浸潤（ＩＣ）におけるＰＤ−Ｌ１の発現の両方を評価するものである。腫瘍比率スコアは、サンプル中に存在するすべての生存腫瘍細胞（陽性および陰性）に対して部分的または完全な膜染色（１＋）を示す生存腫瘍細胞の百分率として定義される。
【０００８】
ＰＤ−Ｌ１についての腫瘍比率スコアまたは腫瘍割合スコアおよび免疫細胞浸潤スコアを評価するコンパニオン診断アッセイの代表例を以下に示す（以下の第２表）。これらのテストは、ダコ（ＤＡＫＯ）とベンタナ（Ｖｅｎｔａｎａ）によって開発され、２種類のアプローチを強調している。
【０００９】
抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１指向性抗癌免疫療法のための現在のＩＨＣ  ＰＤ−Ｌ１ベースのコンパニオン診断に関連する主要な問題がある。
【００１０】
例えば、今日まで、各治療薬は、異なるＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−１抗体を使用する別々のコンパニオン診断試験と組み合わせて承認されている。抗体は、その感度および特異性が大きく変化し得る。従って、治療および診断のマトリックスは、臨床における試験および意思決定のための複雑な課題を提示する。また、各アッセイの目的は臨床経験によって形作られている。その結果、ペンブロリズマブを用いた事前ＮＳＣＬＣ試験における患者濃縮のための選択基準として使用されたＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣ  ２２０３  ｐｈａｒｍＤｘが、この指示における薬剤の臨床的使用には必要であるが、一方で、バイオマーカー陽性によって定義されるような異なる患者サブグループのリスク−利益評価に関する情報に、同じ患者集団において遡及的に評価されたＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣ  ２８−８  ｐｈａｒｍＤｘが使用される。
【００１１】
本アッセイは、ＰＤ−１経路にも関連するＰＤ−Ｌ２リガンドの分析を含まない。
【００１２】
現在のＰＤ−Ｌ１  ＩＨＣアッセイで問題を複雑化し、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ２分析の非存在下でＰＤ−Ｌ１を評価することは、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１指向性治療に反応する可能性のある患者を正確に同定する精度を低下させるものである、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２シグナル伝達ネットワークの統合評価に妥協するものである。同様に、それ自体でのＰＤ−１試験は、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２分析によって提供される予測情報を欠いている。
【００１３】
ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸は、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１に加えて、ＮＦＡＴＣ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＲＤＭ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＮ１１、ＭＴＯＲ、ＨＩＦ１Ａ、ＦＯＸＯ１の発現レベルの増加を含む、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法剤に対する応答の予測因子であることが示されている他の主要成分を含む。このような広いスペクトルの異常な遺伝子発現を、従来のＩＨＣを用いて分析することは不可能である。
【００１４】
特に、広範囲の発癌性突然変異も、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法に対する応答の主要な予測因子であることが示されている。これらには、癌遺伝子におけるホットスポット突然変異、および融合遺伝子につながる発癌性染色体再配列事象が含まれる。再び、ＩＨＣアプローチは、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法のための応答の予測バイオマーカーとして、このような広範な発癌性遺伝的事象を評価するために使用され得ない。
【００１５】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の異常な過剰発現がまた、遺伝子増幅の結果として生じ得る。ＩＨＣに基づくアプローチは、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２リガンドの遺伝子増幅を検出することができない。抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法に対する応答を予測する多くの癌遺伝子が増幅を受けることができるので、これらはＩＨＣアプローチを用いて検出できない。
【００１６】
さらに、ＰＤ−Ｌ１のコード配列における突然変異は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法に対する応答の予測因子であるが、ＩＨＣでは検出できない。
【００１７】
ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、およびＰＤ−１発現の細胞、空間、および時間の不均一性は上記で議論された問題と組み合わされ、すべて、臨床におけるこれらのバイオマーカーの予測精度の低下（すなわち、陽性および陰性予測値の両方の欠如）に寄与する。さらに、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＰＤ−１についてＩＨＣによって陽性とスコア付けされた腫瘍の割合は抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法に応答せず、同様に、腫瘍生検がＰＤ−Ｌ１タンパク質発現に関してＰＤ−Ｌ１陽性である患者のサブセットは、実際にはほとんど臨床的利益を達成しないことが示されている。これはまた、ＩＨＣベースのアッセイが不十分であり、偽陽性および偽陰性の結果を生じることを示唆している。
【００１８】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２免疫調節経路の包括的な分析は、抗腫瘍免疫応答に関与する腫瘍中の全ての細胞成分の分析を必要とする。これには腫瘍細胞、Ｔ免疫細胞および抗原提示細胞（ＡＰＳ）が含まれ、後者はマクロファージまたは樹状細胞とも呼ばれる。しかしながら、利用可能なアッセイのほとんどは、腫瘍細胞のみを評価する。
【００１９】
ＰＤ−Ｌ１免疫染色の個々の病理学者による顕微鏡検査は、その訓練および経験によって異なる。従って、ＰＤ−Ｌ１の腫瘍比率スコアの生成には大きな観測者間の変動がある。さらに、標識指数の評価は単一の病理学者による高いレベルの変動において強調されるように、極めて困難である。
【００２０】
現在のＩＨＣベースのアッセイは感度と特異性が異な抗体クローンを用い、そして腫瘍比率スコアおよび染色強度における個々の解釈が異なる異なった病理学者によって、解釈が実行される。これはまた、ＰＤ−Ｌ１発現についての免疫細胞の評価にも当てはまる。これは、異なる腫瘍タイプに関連する異なる組織構造によってさらに混乱する。総合すると、これらの問題は、実験室間の標準化を非常に困難にする。
【００２１】
ＩＨＣバイオマーカーの正確な標識指数を生成する病理学者のための問題は、Ｋｉ６７の標識インデックスプロトコルを開発しようとする初期の研究で強調されている。特に、自動画像解析もこの問題に対処することができなかった。
【００２２】
さらに、抗体クローンの選択、ＰＤ−Ｌ１染色の最適なカットオフ点標準化が問題であり、まだ確立されていない。最後に、ＩＨＣ  ＰＤ−Ｌ１に基づく試験は本質的に半定量的であり、したがって、定量的アッセイによって提供される精度に欠ける。
【００２３】
次世代配列決定技術およびＴ細胞またはＢ細胞レパートリーの多様性分析（ｉｍｍｕｎｏｍｅ）を用いるゲノム全体の突然変異分析（ｍｕｔａｎｏｍｅ）は、予測バイオマーカーを同定するための潜在的な戦略として注目を集めていると報告されている（ワイ．イワイら、ジャーナル  オブ  バイオメディカル  サイエンス  （２０１７年）２４：２６  ＤＯＩ  １０．１１８６／ｓ１２９２９−０１７−０３２９−９（Ｙ．Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１７）  ２４：２６  ＤＯＩ  １０．１１８６／ｓ１２９２９−０１７−０３２９−９））。しかしながら、バイオマーカーの選択は重要であり、個々のバイオマーカーは、癌の種類に応じて高い応答に必ずしも対応しないことが認識されている。
【発明の概要】
【００２４】
本発明によれば、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路の成分を標的とする薬剤を用いて、増殖性疾患に罹患している患者の治療に対する感受性を決定するための方法が提供され、当該方法は、前記患者からの腫瘍サンプル中において以下の第３Ａ表〜第３Ｄ表中に記載された群から選択された少なくとも３つのバイオマーカーを決定し、そして、当該バイオマーカーのうちの２つ以上の存在を前記薬剤に対する感受性の指標として関連付けることを含むものである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は結果を解釈し、患者の感受性の指標を提供するために使用されるアルゴリズムを含む、本発明を実施する方法を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「バイオマーカー」は、ＰＤ１／ＰＤＬ１経路における異常を示す、増加または減少した遺伝子発現などのような、任意の分子、遺伝子、配列突然変異または特徴をいう。これらは、遺伝子配列における突然変異、特に腫瘍学的結果を生じることが知られている「ホットスポット」変異、遺伝子のコピー数変動、異常な遺伝子融合またはＲＮＡ発現の増加または減少が含まれる。
【００２７】
ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路の成分を標的とする薬剤は、好ましくはＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１またはＰＤ−Ｌ２タンパク質を標的とするまたは結合する薬剤であるが、そのようなタンパク質の発現を標的とする薬剤、例えば、それらのタンパク質をコードするＤＮＡまたはＲＮＡもまた想定され得る。
【００２８】
特に本発明の方法で使用するバイオマーカーとして用いることができる遺伝子、および癌リスクに関連する変化は、以下の第３Ａ表〜第３Ｄ表および図１に記載される。
【００２９】
特定の実施形態においては、本発明の方法が第１表のバイオマーカーの少なくとも５個、例えば少なくとも８個、例えば少なくとも１０個、好ましくは第１表のバイオマーカーの全ての決定を含む。特に、検出されるバイオマーカーの数が多ければ多いほど、調節不全遺伝子が同定される確率が高くなり、その結果、偽陰性（すなわち、感受性患者が見逃される場合）が回避される。
【００３０】
特定の実施形態において、検出されるバイオマーカーの少なくとも１つは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路に直接関連し、したがって、ＣＤ２７９（ＰＤ１）、ＣＤ２７４（ＰＤ１）またはＣＤ２７３（ＰＤ２）から選択される遺伝子のバイオマーカーである。特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１の両方が一緒に評価され、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸のより強力な評価を提供する。
【００３１】
別の特定の実施形態において、この方法はｍＲＮＡ過剰発現に連結されたＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２遺伝子増幅（コピー数多型；  ＣＮＶ）の両方を測定し、そしてＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１インヒビターに対する応答を予測するためのはるかに信頼性の高いパラメータを示し得る。
【００３２】
特定の実施形態において、本発明の方法は、腫瘍細胞、免疫細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む腫瘍−免疫細胞相互作用に関与するすべての細胞集団においてＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１発現を分析し、組み込む。
【００３３】
特定の実施形態において、検出された少なくとも１つの遺伝子は、ＰＤ１／ＰＤＬ−１経路に直接関連していないが、ＣＤ２７９（ＰＤ１）、ＣＤ２７４（ＰＤ１）またはＣＤ２７３（ＰＤ２）以外の第３Ａ表〜第３Ｄ表にリストされているバイオマーカーである。異なる機能に関連するバイオマーカーの範囲を選択することにより、本出願人は、免疫経路、特にＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、を標的とする治療に対する感受性のより良好な指標であることを認識した。他の遺伝子における突然変異、特に発癌性突然変異は、いわゆる「ネオ抗原」を生じさせる可能性が高い。ネオ抗原は突然変異型であり、特に癌特異的抗原であり、免疫系が有効であり、抑制を受けない場合、癌細胞に対するＴ細胞活性化をもたらすことができる。したがって、ネオ抗原が存在する場合、患者は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路などの免疫経路に作用する薬剤に対して、より効率的かつ持続的な応答を示すことができる。
【００３４】
別の実施形態では、本発明の方法に従って測定されるさらなるバイオマーカーは、腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）である。タンパク質ベースのバイオマーカーとは異なり、ＴＭＢは腫瘍ゲノムのコード領域あたりの突然変異の総数の定量的尺度である。
【００３５】
体細胞突然変異の一部のみがネオ抗原を生じるので、特定のコード領域内の体細胞突然変異（ＴＭＢ）の総数を測定することは、ネオ抗原負荷の代理として作用する。ＴＭＢは、エキソーム配列決定を使用して、特に１．７Ｍｂコード領域をカバーする４１１遺伝子の次世代配列決定を使用して測定することができる。挿入欠失、置換などを含む検出された全ての変異体から、全ての可能性のある生殖系列多型および予測される発癌性ドライバーを分析から除去する。後者は、既知の癌遺伝子の配列決定の確認偏りを防ぐために行われる。次いで、腫瘍突然変異負荷を、配列決定されたＤＮＡのＭｂ当たりの突然変異（ｍｕｔ／Ｍｂ）として計算する。ＴＭＢの分析は定量的および定性的の両方であり、メトリック（ｍｕｔ／Ｍｂ）ならびに状態として報告される。高い（Ｈｉｇｈ）の状態は、＞２０  ｍｕｔ／Ｍｂ、中間の状態は、６〜１９ｍｕｔ／Ｍｂ、および低い（Ｌｏｗ）状態は、＜６  ｍｕｔ／Ｍｂに分類される。
【００３６】
ＴＭＢは抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２チェックポイント阻害剤に対する応答の予測因子であり、従って、本発明の方法において有用なさらなるバイオマーカーを提供することが認識されている。このような薬剤によって処置され得る増殖性疾患としては、癌、特に、副腎癌、肛門癌、基底および扁平細胞皮膚癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳および脊髄腫瘍、乳癌、未知の原発性癌、子宮頸癌、大腸癌、子宮内膜癌、食道癌、ユーイング肉腫、眼癌、胆嚢癌、消化管癌、胃腸管癌、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、腎臓癌、喉頭および下咽頭癌、肝臓癌、肺癌、肺，カルチノイド腫瘍、悪性中皮腫、黒色腫、メルケル細胞皮膚癌、鼻腔および副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非小細胞肺癌、口腔および口腔咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、陰茎癌、下垂体腫瘍、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、皮膚癌，小細胞肺癌、小腸癌、軟部肉腫、胃癌、精巣癌、胸腺癌、甲状腺癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌などの固形癌が挙げられる。
【００３７】
特定のバイオマーカーを決定するために使用される方法論は、バイオマーカーの性質に応じて変化し、当該分野で一般的に理解されるであろう。バイオマーカー遺伝子がタンパク質またはペプチド、特に変異体タンパク質またはペプチドを発現する場合、これらは、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイ技術を用いて同定することができる。
【００３８】
しかしながら、特定の実施形態において、バイオマーカーは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分析またはこれらの組み合わせを用いて同定される。特定の実施形態では、腫瘍生検サンプルは、例えば、日常的な診断用ＰＷＥＴサンプルのような、癌に罹患している患者から得られ、そこから核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）が抽出される。次いで、これを用いて、例えば以下に概説するような従来の方法を用いてライブラリーを構築する。ライブラリーは、必要に応じて濃縮され、次いで、再び以下に示されるような従来の方法を使用して、濃縮のためのテンプレートとして使用される。次いで、この分析を、オンコロジカ  ゆーけいリミテッド（Ｏｎｃｏｌｏｇｉｃａ  ＵＫ  Ｌｔｄ．）から入手可能なような半導体次世代配列決定技術を使用して実施する。
【００３９】
特定の実施形態では、本発明の方法は、目的のバイオマーカーのコード領域全体をカバーするために、標的半導体配列決定を使用する。アンプリコンはシーケンスカバレッジの冗長性のために重複し、定期的な診断ＰＷＥＴサンプルから得られた断片化ＤＮＡ鋳型を増幅することができるように設計されている。従って、この方法は、点突然変異、欠失、重複、および挿入を含む多種多様な作用可能な遺伝子変異体を同定することができる。
【００４０】
従って、特定の実施形態において、本発明の方法は次世代配列決定技術を利用して、例えば、定期的なホルマリン固定パラフィン包埋腫瘍サンプルから採取された単一の１０μｍ切片のような、サンプルからのＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現レベルを定量的に測定する。従って、本発明の方法は少量（＜１０ｎｇ）のＰＷＥＴ材料のみを使用して実施することができ、分解されたＤＮＡ／ＲＮＡの分析のために最適化することができる
【００４１】
この方法は抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１指向性療法に最も応答しそうな患者を決定するために、はるかに正確なノヒストケミストリー（ＩＨＣ）を与える定量的試験を提供するために使用され得る。抗体の使用を回避することによって、異なる抗体クローンの感度および特異性に関連する問題が回避される。
【００４２】
いくつかのバイオマーカーは、例えば、ＲＮＡ転写物の定量的測定を使用する遺伝子発現の分析によって最も容易に同定され得る。従って、特定の実施形態において、この方法はＲＮＡのレベルを分析する工程を包含し、ここで、野生型と比較した発現レベルの変化は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を示す。このようにして同定され得るバイオマーカーは以下の第３Ａ表および図１に列挙され、特に、このような経路が関与する腫瘍では、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）から上昇したレベルのＲＮＡが検出され得る。．
【００４３】
特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１  ｍＲＮＡにわたる複数のエキソンイントロン遺伝子座における遺伝子発現が行われ、それが遺伝子全体の遺伝子発現を正規化する生物情報学プログラムと結びつけられて、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現レベルの非常に正確な定量的測定が可能となる。
【００４４】
さらに、ＮＦＡＴＣ１（活性化Ｔ細胞１の核因子）、ＰＩＫ３ＣＡ（ホスファチジルイノシトール‐４，５‐ビスホスフェート３‐キナーゼ触媒サブユニットα）、ＰＩＫ３ＣＤ（ホスファチジルイノシトール‐４，５‐ビスホスフェート３‐キナーゼ触媒サブユニットδ）、ＰＲＤＭ１（ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１）、ＰＴＥＮ（ホスファターゼおよびテンシン相同体）、ＰＴＰＮ１１（チロシンタンパク質ホスファターゼ非受容体型１１）、ＭＴＯＲ（ラパマイシンの機械論的標的）、ＨＩＦ１ａ（低酸素誘導因子１‐α）およびＦＯＸＯ１ｍ（フォークヘッドボックスクラス０１突然変異体）のＲＮＡレベルの上昇を定量することができる。さらに、本発明の方法は、ミスマッチ修復遺伝子ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６およびＭＬＨ２の遺伝子発現の喪失を検出し得る。これらの遺伝子のうちの１つの機能の喪失は、腫瘍表面ネオ抗原の発現の増加につながるゲノム不安定性をもたらし、それによって、抗癌指向免疫療法に対する応答速度を増加させる。
【００４５】
正常と比較して上昇していると考えられ、従って陽性バイオマーカーを示す任意の特異的ＲＮＡのレベルを第３Ａ表に示す。
【００４６】
別の実施形態では、前記サンプルからのＤＮＡが分析され、遺伝子または遺伝子産物の発現または機能に影響を及ぼすバイオマーカーをコードする遺伝子における突然変異が検出される。突然変異が生じる、例えばＳＮＶホットスポット突然変異を介して生じる特定の例は、以下の第３Ｂ表に列挙されたバイオマーカーを見出される。特に、このようなバイオマーカーは、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ遺伝子）、ＢＲＡＦ（Ｂ−Ｒａｆ遺伝子）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１遺伝子）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体遺伝子）、ＥＲＢＢ２（受容体チロシン−タンパク質キナーゼｅｒｂＢ−２またはヒト上皮成長因子受容体２遺伝子）、ＦＧＦＲ（線維芽細胞成長因子受容体遺伝子）、ＫＩＴ（ＫＩＴプロトオンコジーン受容体チロシンキナーゼ遺伝子）、ＫＲＡＳ（Ｋ−ｒａｓ  ｇｔｐａｓｅ遺伝子）、ＭＥＴ（ＭＥＴプロトオンコジーン、受容体チロシンキナーゼ）またはＮＲＡＳ（Ｎ−ｒａｓプロトオンコジーン、ＧＴＰａｓｅ遺伝子）からなる群より選択される遺伝子において見出され得る。発癌性突然変異を示すこれらの遺伝子の特異的突然変異を以下の第３Ｂ表に示す。これらの突然変異は以下に説明するように、従来の技術を用いて検出することができる。
【００４７】
特定の実施形態において、異常な遺伝子融合をもたらす遺伝子再配列に起因するバイオマーカーが検出され得、これらは以下の第３Ｃ表に列挙される。例えば、ＡＬＫ遺伝子が一部の癌においてエキノドルフ微小管関連タンパク質様４（ＥＭＬ４）遺伝子の一部と融合され得ること、ＦＧＦＲ遺伝子が例えば他の癌のキナーゼと融合し得ること、およびＭＥＴ遺伝子は例えば、ＴＦＧ、ＣＬＩＰ２またはＰＴＲＺ１を含む他の遺伝子と融合され得ることが認識される。任意のそのような融合遺伝子／タンパク質の検出は、陽性バイオマーカー指標を提供する。
【００４８】
別の実施形態では、分析は、発現の増加をもたらし得るコピー数多型の存在を特定する。特に、前記サンプルからのＤＮＡを分析し、バイオマーカーをコード化する遺伝子のコピー数の変動の存在を検出する。この場合の適切なバイオマーカーは第３Ｄ表に列挙されるように、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＣＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２遺伝子）またはＣＤ２７３からなる群より選択される。このような場合、増幅または発現の増加をもたらし得るコピー数の増加が認められる。このような場合、コピー数の増加が大きいほど、示される感受性は高くなる。
【００４９】
これらの場合において、正常コピー数を第３Ｄ表に要約される。従って、これらの図からの逸脱は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を標的とする薬剤に対する感受性を示されるであろう。
【００５０】
バイオマーカーの決定のための種々の分析方法および技術は、可能な限りハイスループットアッセイプラットフォームにおいて適切に実施される。
【００５１】
特定の実施形態では、感受性のレベルを示すアルゴリズムが上述のようにして得られた結果に適用される。特に、「０」のスコアは種々のバイオマーカーの野生型または正常発現プロフィールに対して変化がないかまたは最小であること（例えば、ＲＮＡ発現の場合、１００万回読み取りあたり０〜５００正規化読み取り（ｎＲＰＭ））を示す結果に適用され、一方、「１」のスコアは、記載される任意の突然変異または変異に適用される。特定の遺伝子の複数のコピーが検出される場合、検出されるコピーの数に応じて、より高いスコアを割り当てることができ、非常に高いＲＮＡ発現レベル変化（例えば、＞１５００  ｎＲＰＭ）の場合には、より高いスコアを適用することもできる。上述のＴＭＢスコアは、このようなアルゴリズムに含まれてもよい。この場合、＜６ｍｕｔ／Ｍｂの「低」ＴＭＢに対して１のスコアを割り当てることができ、６〜１９ｍｕｔ／Ｍｂの中間ＴＭＢに対して２のスコアを割り当てることができ、＞２０ｍｕｔ／Ｍｂの「高」ＴＭＢに対して３のスコアを割り当てることができる。
【００５２】
このようなアルゴリズムの特定の例を図１に示す。この場合、１〜２のスコアはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を標的とする薬剤に対する最小感受性を示し、３〜５のスコアはＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を標的とする薬剤に対する中程度の感受性を示し、６を超えるスコアは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を標的とする薬剤に対する感受性を示す。
【００５３】
好ましくは、アルゴリズムが、バイオマーカーデータを導出するために使用されるハイスループットシステムに統合され、結果が生成されるる。このようなシステムは、本発明の方法を用いて得られたデータを受信し、分析し、変換して、上述のアルゴリズムを用いてＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の成分を標的とする薬剤を用いた治療に対する患者の感受性を示す「スコア」を生成するための命令を記憶するプロセッサおよびメモリを含む。次いで、これらの結果をグラフィックインターフェース上に適切に表示することができる。場合によっては、メモリは一時的でないコンピュータ読取り可能な媒体を備える。このようなシステムおよび媒体は、本発明のさらなる態様を形成する。
【００５４】
本発明の方法を用いて検出された遺伝的変異体は、適切なバイオインフォマティクスプラットフォームを介して、臨床試験中のものからＦＤＡ／ＥＭＡ承認治療までのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を標的とする広範囲の潜在的薬剤に連結され得る。
【００５５】
この方法で同定されると、有する腫瘍がこのような阻害剤に感受性である患者は、適切な薬剤を使用して、それに応じて処置され得る。従って、さらなる局面において、本発明は増殖性疾患に罹患している患者を処置するための方法を提供し、該方法は、該患者由来の腫瘍サンプルを使用して上記のような方法を実施すること、該患者の処置または継続処置のためのカスタマイズされた推奨を開発すること、バイオマーカーの分析に基づいて、該患者に適切な治療または処置を施すことを含む。特に、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の成分を標的とする薬剤を用いた治療に対して感受性であるか、または非常に感受性であると同定された患者はそのような薬剤で治療することができ、一方、アルゴリズムを用いて感受性がほとんどないと同定された患者は、代替の薬剤タイプで治療することができる。これらは、通常の臨床実践に従って投与される。
【００５６】
従って、特定の実施形態において、本発明の方法が得られた結果に基づいて、治療のためのカスタマイズされた推奨を作成することをさらに含む。このような突然変異に由来する情報を統合することにより、例えば、上記のシステムおよび媒体を使用して、治療のためのカスタマイズされた推奨を調製することが可能になり、このような場合、これらはまた、グラフィカルなインターファクトに表示され得る。
【００５７】
本発明の方法は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法のための現在のＩＨＣベースのコンパニオン診断の問題および厳しい制限に対処する。特に、この方法は、完全自動化に適している。これは、特に上述のアルゴリズムを使用する場合に定量的であり得、病理学者による主観的な人間の解釈を必要としない。特定の実施形態において、本発明の方法は、ＰＤ−Ｌ１発現の手動評価のための病理学者の入力を必要としない。試験全体は完全に自動化されており、従って、観察者間または観察者内の変動を受けない。
【００５８】
特定の実施形態において、本発明の方法は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２免疫療法に対する応答に関連する全てのバイオマーカーの包括的かつ統合された読み出しを提供する。上記のように、アルゴリズムを使用して、これらの予測バイオマーカーの全てを多遺伝子予測スコア（ＰＰＳ）に組み込むことができる（図１）。上記のように、０のＰＰＳスコアは、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２免疫療法に対する応答がないことを示す。１〜２のスコアは最小の応答を示し、３〜５のスコアは中程度の応答を示し、６〜８のスコアは主要な応答を示す。
【００５９】
このアッセイの定量的性質は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法に対する反応を予測する正確な切り分け点を同定することができる。明確な定量的結果を提供することによって、ＩＨＣベースのアッセイの解釈に関連する任意の主観性および観察者間変動が回避される。
【００６０】
本発明の方法は、単一のＩＨＣバイオマーカーを用いて達成することができない、統合アプローチにおいて、完全なＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸を評価することができる。本発明の方法を用いて、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＮＦＡＴＣ１、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＲＤＭ１、ＰＴＥＮ、ＰＴＰＮ１１、ＭＴＯＲ、ＨＩＦ１Ａ、ＩＦＮ−γおよびＦＯＸ０１を含むＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸における多くのエレメントの活性化／増加した発現を評価することができる。
【００６１】
重要なことには、本発明の方法は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１指向免疫療法に対する応答に関連する発癌性突然変異の評価を含み得る。広範な発癌遺伝子が、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１指向免疫療法に関連する遺伝子異常、突然変異、融合および増幅（第３表および図１Ａ）に関して評価される。これらの遺伝子の多くは、成長シグナル伝達ネットワークの構成要素である。これらの増殖シグナル伝達ネットワークの発癌性活性化は、ＰＤ−１リガンドＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２の誘導をもたらす。
【００６２】
従って、本発明の方法は、腫瘍細胞、Ｔ免疫細胞および抗原提示細胞（ＡＰＳ）を含む、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１免疫調節抗癌応答に関与するすべての成分を分析するように設計された、完全に自動化された試験を提供することができる。これは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２免疫調節癌応答に関与する全ての成分の、全ての細胞型（腫瘍細胞および免疫細胞）に関して、およびＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の全てのレベルでの定量的な統合画像を提供する。
【００６３】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２シグナル伝達軸の包括的な分析に加えて、本発明の方法は、上記のような抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１指向免疫療法に対する応答に影響を及ぼすすべての発癌性突然変異を検出するように設計されている。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２シグナル伝達軸に由来する情報を発癌予測因子と統合することは、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法に対する応答の最も強力な予測因子を提供する。例えば、（ｉ）変異ＰＤ−Ｌ１および（ｉｉ）増幅ＰＤ−Ｌ１の検出はまた、（ｉｉｉ）ＰＤ−Ｌ１の増加した発現に関連する。これは、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法に対する応答の３つの独立しているが、関連した予測因子を提供する。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２シグナル伝達軸からの情報を増殖シグナル伝達ネットワークの発癌性活性化と統合することにより、本明細書に記載のアルゴリズムは、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法に最も応答しやすい患者を正確に同定することができる（第３Ａ表〜第３Ｄ表および図１）。
【００６４】
本発明の方法はＦＤＡ／ＥＭＡ承認ＥＳＭＯ／ＮＣＣＮガイドライン参考文献から、および世界中の臨床試験のすべてのフェーズにおいて、患者の腫瘍を特定の標的治療に適合させるために、高スループット分析プラットフォームを使用することができる。
【００６５】
本出願人は、サーモ  フィッシャー  イオント  レント（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ）プラットフォームを利用して、本発明のアッセイを開発した。目的は上記で説明した理由のために、上記で概説したように、この経路の多くの成分を分析することによって、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸の包括的な図を提供することであった。本明細書中に記載されるような単一の統合試験の使用、および両方の遺伝子を横切る複数の遺伝子座における両方の免疫調節遺伝子のエキソン／イントロン境界にわたるプライマーのセットの使用は、それらが、日常的なホルマリン固定ワックス包埋臨床腫瘍材料／生検／切除標本から抽出される分解されたＲＮＡ材料を増幅し得るように設計された。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２シグナル伝達軸のこれらの複数の成分の正確かつ精密な測定は、この免疫調節経路の定量的な統合プロフィールの提供を可能にする。次いで、このアッセイプラットフォームからのアウトプットを使用して、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向療法に対する治療応答を予測するこれらの免疫調節バイオマーカーについての正確なカットオフを提供し得る。アンプリコンはまた、日常的な診断用ＰＷＥＴサンプルから得られる断片化ＤＮＡ鋳型の増幅を最適化するために、シーケンスカバレッジの冗長性のために重複するように設計されている。ＤＮＡ分析は、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法に対する応答の予測因子として同定されている発癌性突然変異および遺伝子コピー異常を検出するように設計される。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２シグナル伝達分子のＲＮＡ発現分析に加えて、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法に対する応答の予測因子として同定された発癌性融合転写産物を検出するためにＲＮＡ発現分析が行われる。
【００６６】
本発明の方法を実施するのに適したキットは、新規であり、かつ本発明のさらなる態様を形成する。これらは、第３表に列挙された３つ以上のバイオマーカーを検出するために必要な増幅プライマーの組み合わせを含み得る。
【００６７】
さらに、上述の方法を実行するように構成された装置も新規であり、本発明のさらなる態様を形成する。特に、機器は上記のように、該アルゴリズムを実施するようにプログラムされたコンピュータに連結された、上記のようなＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分析を実施するための手段を含む。このようにプログラムされたコンピュータまたは機械可読カセットは本明細書に記載された方法を搬送することを可能にするシステムおよび非一時的なコンピュータ可読媒体と同様に、本発明のさらに別の態様を形成する。
【実施例】
【００６８】
ここで、本発明を、添付の概略図を参照して、実施例として特に説明する：
図１は結果を解釈し、患者の感受性の指標を提供するために使用されるアルゴリズムを含む、本発明を実施する方法を示す概略図である。
【００６９】
実施例１
材料及び方法
プライマー設計の概要：
【００７０】
第３Ａ表〜第３Ｄ表に列挙されるバイオマーカーの各々を検出するためのプライマーを、従来の実施に従って設計した。一般に、長さ１８〜３０ヌクレオチドのプライマーは、６５℃〜７５℃の融解温度（Ｔｍ）で最適である。プライマーのＧＣ含量は４０〜６０％の間であるべきであり、プライマーの３’末端は、結合を促進するためにＣまたはＧで終わる。プライマー自体の中での二次構造の形成は、ＧＣに富むドメインとＡＴに富むドメインのバランスのとれた分布を保証することによって最小化される。プライマー内／プライマー間相同性は、最適なプライマー性能のために避けるべきである。
【００７１】
コピー数検出用のプライマー：
プライマーは、遺伝子当たりいくつかのアンプリコンを有する第３Ｄ表に列挙された遺伝子中の正確な領域に及ぶように設計された。カバレッジの深さは、これらのアンプリコンの各々について測定される。コピー数増幅および欠失アルゴリズムは、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づく。コピー数の決定に先立って、読み取りカバレッジはＧＣバイアスについて補正され、予め設定されたベースラインと比較される。
【００７２】
ホットスポット検出用プライマー：
プライマーは第３Ｂ表に列挙されるように、および上記の一般的な点を考慮して、発癌性体細胞突然変異を起こしやすい特定の領域を標的とするように設計された。
【００７３】
ＲＮＡ発現分析用プライマー：
抽出されたＲＮＡはＲＴ−ＰＣＲを介して処理され、特定のプライマーを使用して増幅される相補的なＤＮＡ（Ｃｄｎａ）を作製する。複数のプライマーセットは、第３Ａ表に列挙されているように発現分析の対象となる全ての遺伝子にわたってエキソン／イントロン境界にまたがるように設計された。
【００７４】
ＲＮＡ融合検出用プライマー：
一対の標的化エキソン−エキソン切断点アッセイプライマーは、第３Ｃ表に列挙される各融合について設計される。融合切断点に隣接するプライマーは、融合遺伝子の同定を可能にする参照配列に整列される特異的融合アンプリコンを生成する。発現不均衡アッセイは、サンプルが融合切断点を有することを示す５‘アッセイと３’アッセイとの間の不均衡を伴って、同等の発現レベルが正常サンプルにおいてモニターされることを可能にする。
【００７５】
アルゴリズムは図１に示すように、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２指向免疫療法に対する応答を予測するために、日常的なパラフィンワックス包埋組織生検標本のこの標的化ゲノム分析から得られた情報を統合するために開発された。
【００７６】
ＤＮＡおよびＲＮＡ抽出
ＤＮＡおよびＲＮＡを、リカバーオール（ＲｅｃｏｖｅｒＡｌｌ）（商標名）  アンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）抽出キット（カタログ番号：Ａ２６０６９）を使用して、１０μｍで切断されたＦＦＰＥカールから、または５μｍで染色されていないスライド上の切片から抽出した。）。キシレン１ｍｌをサンプルと混合することにより、２回のキシレン洗浄を行った。サンプルを遠心分離し、キシレンを除去した。これに続いて、純粋なエチルアルコール１ｍｌで２回洗浄した。サンプルを風乾した後、２５μｌの消化緩衝液、７５μｌのヌクレアーゼを含まない水および４μｌのプロテアーゼを各サンプルに添加した。次いで、サンプルを５５℃で３時間消化し、続いて９０℃で１時間消化した。
【００７７】
１２０μｌの単離添加剤を各サンプルと混合し、サンプルを収集チューブ中のフィルターカートリッジに添加し、遠心分離した。フィルターを新しい収集チューブに移動させ、後の段階でのＤＮＡ抽出のために冷蔵庫に保持した。フロースルーをＲＮＡ抽出のために維持し、２７５μｌの純粋なエチルアルコールを添加し、そしてサンプルを収集チューブ中の新しいフィルターに移動させ、そして遠心分離した。７００μｌの洗浄１緩衝液での１回洗浄後、ＲＮＡを以下のようにＤＮａｓｅで処理した；各サンプル毎に、６μｌの１０×ＤＮａｓｅ緩衝液、５０μｌのヌクレアーゼを含まない水、および４μｌのＤＮａｓｅを使用して、ＤＮａｓｅマスターミックスを調製した。これを各フィルターの中心に添加し、室温で３０分間インキュベートした。
【００７８】
インキュベーション後、洗浄１を用いて３回の洗浄を行い、次いで、各遠心分離の後、洗浄緩衝液を収集チューブから除去して２／３回洗浄した。フィルターを新しい収集チューブに移し、溶出溶液（９５℃に加熱）を各フィルターに添加し、１分間インキュベートした。サンプルを遠心分離した後、フィルターを廃棄し、フロースルー中に収集されたＲＮＡを新しい低結合チューブに移動させた。
【００７９】
フィルター中のＤＮＡを洗浄１緩衝液で洗浄し、遠心分離し、フロースルーを廃棄した。ＤＮＡをＲＮａｓｅ（５０μｌのヌクレアーゼ水および１０μｌのＲＮａｓｅ）で処理し、室温で３０分間インキュベートした。ＲＮＡについての上記のように、３回の洗浄を完了し、そしてサンプルを９５℃に加熱した溶出溶液中に溶出した。
【００８０】
ＤＮＡおよびＲＮＡ測定
Ｑｕｂｉｔ（登録商標）３．０蛍光光度計並びにＱｕｂｉｔ（登録商標）ＲＮＡ高感度アッセイキット（カタログ番号：Ｑ３２８５５）およびＱｕｂｉｔ（登録商標）ｄｓＤＮＡ高感度アッセイキット（カタログ番号：Ｑ３２８５４）を使用して、抽出されたサンプルからのＤＮＡおよびＲＮＡの量を測定した。１９９μｌのＨＳ緩衝液と試薬を合わせた１μｌのＲＮＡ／ＤＮＡを、測定のためにｑｕｂｉｔアッセイ管中で使用した。対照として、１０μｌの標準１または２を１９０μｌの緩衝液および試薬溶液と合わせた。
【００８１】
ライブラリー作成
ＲＮＡサンプルを必要に応じて５ｎｇ／μｌに希釈し、スーパースクリプト  ヴィロ（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｖｉｌｏ）  ｃＤＮＡ合成キット（カタログ番号：１１７５４２５０）を用いて９６ウェルプレート中でｃＤＮＡに逆転写した。２μｌのヴィロ（ｖｉｌｏ）、１μｌの１０×スーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）  ＩＩＩ酵素ミックスおよび５μｌのヌクレアーゼを含まない水からなるマスターミックスを、全てのサンプルについて作製した。８μｌのマスターミックスを、２μｌのＲＮＡと共に、９６ウェルプレートの各ウェルにおいて使用した。
以下のプログラムを実行した：
：
【００８２】
【表１】
2020523031.tif 000003
【００８３】
次いで、ｃｄｎａの増幅を、遺伝子を横切る多数のエキソン−イントロン遺伝子座をカバーする６つのＲＮＡプライマーの４μｌ、アンプリセック（Ａｍｐｌｉｓｅｑ）Ｈｉ−Ｆｉ＊１の４μｌおよび２μｌのヌクレアーゼを含まない水を用いて、各々のサンプルウェルに実施した。プレートを、以下のプログラムを用いて３０サイクル、サーマルサイクラー上で運転した：
【００８４】
【表２】
2020523031.tif 000004
【００８５】
ＤＮＡサンプルを５ｎｇ／μｌに希釈し、アンプリセック（Ａｍｐｌｉｓｅｑ）Ｈｉ−Ｆｉ＊１に添加し、ヌクレアーゼを含まない水を加え、９６ウェルプレートに２つのＤＮＡプライマープール（プール１の５μｌとプール２の５μｌ）を使用してセットアップした。以下のプログラムをサーマルサイクラーで実行した：
【００８６】
【表３】
2020523031.tif 000005
【００８７】
増幅後、アンプリコンはリブ  フパ（ＬＩＢ  Ｆｕｐａ）＊１の２μｌを使用して部分的に消化し、十分に混合し、以下のプログラムでサーマルサイクラー上に置いた：
【００８８】
【表４】
2020523031.tif 000006
【００８９】
４μｌの切替え溶液＊１、希釈イオン  エクスプレス  バーコード（ＩＯＮ  ＸＰＲＥＳＳ  Ｂａｒｃｏｄｅ）１−１６（カタログ番号：４４７１２５０）の２μｌおよびＬＩＢ  ＤＮＡリガーゼ＊１の２μｌを各サンプルに添加し、各成分の添加間で十分に混合した。以下のプログラムをサーマルサイクラーで実行した：
【００９０】
【表５】
2020523031.tif 000007
【００９１】
次いで、３０μｌのエーゲンコート  エーエムピュア（Ａｇｅｎｃｏｒｔ  ＡＭＰｕｒｅ）  ＸＰ（バイオメック  コールター（Ｂｉｏｍｅｃｋ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）  カタログ番号：  Ａ６３８８１）を用いてライブラリーを精製し、５分間インキュベートした。プレート磁石を用いて、７０％エタノールを用いた２回の洗浄を行った。次いで、サンプルを５０μｌのＴＥで溶出した。
【００９２】
ｑＰＣＲ
ライブラリーの量は、イオン  ライブラリー  タクマン（Ｉｏｎ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｔａｑｍａｎ）定量キット（カタログ番号：４４６８８０２）を用いて測定した。標準曲線を作成するために、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）  ＤＨ１０Ｂ  Ｉｏｎ対照ライブラリーの４つの１０倍連続希釈液（６．８ｐｍｏｌ、０．６８ｐｍｏｌ、０．０６８ｐｍｏｌおよび０．００６８ｐｍｏｌ）を使用した。各サンプルを１／２０００に希釈し、各サンプル、標準および陰性対照を二重に試験した。１０μｌの２Ｘ  タクマン（Ｔａｑｍａｎ）マスターミックスおよび１μｌの２０Ｘ  タクマン  アッセイを、各サンプルについて９６ウェル高速熱サイクルプレートのウェル中で合わせた。１／２０００希釈サンプル、標準またはヌクレアーゼを含まない水（陰性対照）の合計をプレートに添加し、以下のプログラムを用いてエイビーアイ  ストップワンプラス（ＡＢＩ  ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ）（商標名）機（カタログ番号４３７６６００）でｑＰＣＲを行った：
【００９３】
【表６】
2020523031.tif 000008
【００９４】
サンプルをＴＥを用いて１００ｐｍｏｌに希釈し、各サンプルの１０μｌをＤＮＡチューブまたはＲＮＡチューブのいずれかにプールした。ＤＮＡとＲＮＡサンプルを組み合わせるために、８０：２０のＤＮＡ：ＲＮＡの比率を用いた。
【００９５】
イオンワンタッチ（ＩＯＮ  Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ）（商標名）２は、イオンＳ５  ＯＴ２溶液および供給物（Ｉｏｎ  Ｓ５  ＯＴ２  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｌｉｅｓ）＊２を用いて初期化され、各々の回収チューブにブレーキング溶液＊２１５０μｌを供給した。プールしたＲＮＡサンプルをヌクレアーゼを含まない水（プールサンプル８μｌに水９２μｌ）でさらに希釈し、クレアーゼを含まない水、Ｉｏｎ  Ｓ５酵素ミックス＊２、イオン球状粒子（ＩＳＰ）＊２及び希釈ライブラリーとともにＩＯＮ  Ｓ５試薬ミックス＊２を用いて増幅マスターミックスを作成した。マスターミックスを反応油＊２と共にアダプターに装填した。装置に、増幅プレート、回収チューブ、ルーター、並びに、サンプルおよび増幅マスターミックスを装填した増幅アダプターを装填した。
【００９６】
濃縮
濃縮工程では、ツウィーン（Ｔｗｅｅｎ）＊２２８０ｍｌと１Ｍ水酸化ナトリウム４０μｌを用いて溶解を行った。ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標）マイワン（ＭｙＯｎｅ）（商標名）ストレプトアビジンＣ１（カタログ番号：６５００１）を、マグネットを用いてワンタッチ洗浄液＊２で洗浄した。ビーズを１３０μｌのマイワンビーズ捕捉溶液＊に懸濁した。上澄みを除去し、新しい低結合チューブに移し、続いてヌクレアーゼを含まない水８００μｌで洗浄することによって、ＩＳＰを回収した。サンプルを遠心分離し、水の上澄みを除去した後、テンプレート陽性のＩＳＰの２０μｌが残った。ＩＳＰ再懸濁液＊２８０μｌを添加し、最終容量を１００μｌとした。
【００９７】
新しいチップ、０．２ｍｌの管および８ウェルの細片を、以下のようにしてワンタッチ（Ｏｎｅ  Ｔｏｕｃｈ）（商標名）ＥＳ装置に装填した：
ウェル１：テンプレート陽性ＩＳＰの１００μｌ
ウェル２：マイワンビーズ捕捉溶液＊に再懸濁した、１３０μｌの洗浄ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標）マイワン（ＭｙＯｎｅ）（商標名）ストレプトアビジンＣ１ビーズ
ウェル３：イオンワンタッチＥＳ洗浄溶液＊２の３００μｌ
ウェル４：イオンワンタッチＥＳ洗浄溶液の３００μｌ
ウェル５：イオンワンタッチＥＳ洗浄溶液の３００μｌ
ウェル  ６：  空
ウェル７：３００μｌのメルトオフ
ウェル  ８：  空
【００９８】
約３５分を要する実験に続いて、濃縮されたＩＳＰを遠心分離し、上清を除去し、２００μｌのヌクレアーゼを含まない水で洗浄した。さらなる遠心分離工程および上澄み除去の後、１０μｌのＩＳＰが残った。ヌクレアーゼを含まない水９０μｌを添加し、ビーズを再懸濁した。
【００９９】
シーケンシング
イオンＳ５システム（ＩＯＮ  Ｓ５  ｓｙｓｔｅｍ）（商標名）（カタログ番号：Ａ２７２１２）は、イオンＳ５試薬カートリッジ、イオン５５洗浄液及びイオンＳ５洗浄液＊２を用いて初期化された。
【０１００】
５μｌの対照ＩＳＰ＊２を濃縮サンプルに添加し、十分に混合した。チューブを遠心分離し、上澄みを除去して、サンプルおよび対照ＩＳＰを残した。１５μｌのイオンＳ５アニーリング緩衝液＊２および２０μｌの配列決定プライマー＊２をサンプルに加えた。サンプルを、９５℃で２分間、３７℃で２分間、プライマーアニーリングのためにサーマルサイクラーにロードした。熱サイクルに続いて、１０μｌのイオンＳ５負荷緩衝液＊を添加し、サンプルを混合した。
【０１０１】
５００μｌのイオンＳ５アニーリング緩衝液＊２と５００μｌのヌクレアーゼを含まない水＊２を用いて５０％アニーリング緩衝液を作製した。
【０１０２】
次に、サンプル全体をイオン５４０（商標名）チップ（カタログ番号：Ａ２７７６６）の装填口に装填し、チップ遠心分離機で１０分間遠心分離した。
【０１０３】
その後、１００μｌの泡沫（５０％アニーリング緩衝液４９μｌ及び泡沫液１μｌ＊２を用いて調製）をポートに注入した後、５０％アニーリング緩衝液５５μｌをチップウェルに注入し、出口ウェルから余分な液体を除去した。チップノッチを外に向けてチップを３０秒間遠心分離した。この発泡工程を繰り返した。これに続いて、１００μｌの発泡体（５０％アニーリング緩衝液４９μｌと発泡溶液＊２の１μｌを使用して調製）をポートに注入し、続いて５５μｌの５０％アニーリング緩衝液をチップウェルに注入し、出口ウェルから余分な液体を除去した。チップは、チップノッチを外に向けて３０秒間遠心分離した。この発泡工程を繰り返した。
【０１０４】
チップを１００μｌのフラッシング溶液（イソプロパノール２５０μｌおよびイオンＳ５アニーリング緩衝液２５０μｌを用いて調製）をローディングポートに２回フラッシュし、そして過剰の液体を出口ウェルから除去した。次いで、装填ポートへの５０％アニーリング緩衝液での３回の洗浄を行った。６０μｌの５０％アニーリング緩衝液を６μｌのイオンＳ５配列決定ポリメラーゼ＊２と組み合わせた。次に、６５μｌのポリメラーゼ混合物をポートに装填し、５分間インキュベートし、配列決定のために約３時間、データ転送に１６時間かかるＳ５機器に装填した。
＊１  イオンアンプリセク（ＩＯＮ  Ａｍｐｌｉｓｅｑ）（商標名）ライブラリ２．０から（カタログ番号：４４８０４４１）
＊２  イオン５４０（商標名）  ＯＴ２キットから  （カタログ番号：Ａ２７７５３）
【０１０５】
データ分析
ＤＮＡ  ＣＮＶ  分析：
コピー数変異（ＣＮＶＳ）は、ゲノムのセグメントが複製されている（ゲイン）か、または欠失している（損失）変異のクラスを表す。大きなゲノムコピー数の不均衡は、染色体下領域から染色体全体に及ぶことができる。
【０１０６】
生データをイオンＳ５システムで処理し、オンカミン  コンプレヘンシブ  アッセイ  ベースライン（Ｏｎｃｏｍｉｎｅ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ａｓｓａｙ  Ｂａｓｅｌｉｎｅ）  ｖ２．０を用いて実施した一次データ分析のためにトレント  サーバー（Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｅｒｖｅｒ）に移した。このプラグインは、各イオン  トレント（商標名）  シーケンサ（ＩＯＮ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ）に付属のトレント  スイート（Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｕｉｔｅ）ソフトウェアに含まれている。コピー数増幅および欠失検出は、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）に基づくアルゴリズムを用いて行った。このアルゴリズムはコピー数を予測するために、ゲノム全体にわたる読み取りカバレッジを使用する。コピー数の決定に先立って、読み取りカバレージはＧＣバイアスについて補正され、予め設定されたベースラインと比較される。
【０１０７】
全てのペアワイズ差（ＭＡＰＤ）スコアの絶対値の中央値はサンプルごとに報告され、サンプル変動性を評価し、データがコピー数分析に有用であるかどうかを定義するために使用される。ＭＡＰＤは、標準偏差（ＳＤ）のようなコピー数変動性の配列決定ごとのラン推定値である。ｌｏｇ２比が、標準ＳＤに対して平均０で正規分布していると仮定すると、ＭＡＰＤ／０．６７はＳＤに等しい。しかしながら、ＳＤとは異なり、ＭＡＰＤを使用することは、癌のような既知の状態によって誘導されるｌｏｇ２比における高い生物学的変動性に対して力強いもの（ｒｏｂｕｓｔ）である。ＭＡＰＤスコアが０．５を超えるサンプルは、ＣＮＶコールを確認する前に慎重に検討すべきである。
【０１０８】
正規化後のコピー数分析からの結果は、生データから視覚化することができる。
【０１０９】
体細胞ＣＮＶ検出は、各コピー番号セグメントについての信頼限界を提供する。信頼度は、コピー番号が所与のコピー番号限界未満であると推定される確率パーセントである。下側および上側パーセントならびにそれぞれのコピー数値の限界は、各ＣＮＶについて与えられる。各ＣＮＶについての信頼区間も記載し、正規化および９５％  ＣＩ≦１での欠失後の、５％信頼値が２４である６を超えるコピー数の増幅を、存在するものとして分類する。
【０１１０】
ＤＮＡホットスポット分析：
生データは、イオンＳ５システム上で処理され、カスタムワークフローを使用して実行される一次データ分析のためにトレント  サーバーに転送された。生データの参照ゲノムへのマッピングおよびアラインメントを行い、次いでホットスポット変異体にＢＥＤファイルに従って注釈を付ける。カバレッジ統計および他の関連するＱＣ基準は、公開ソースの豊富なセットを使用する注釈を含むｖｃｆファイルにおいて定義される。フィルタリングパラメータを適用して、ＱＣ閾値を通過するこれらの変異体を識別することができ、これらの変異体をＩＧＶ上で可視化することができる。一般に、＞１０％の交互対立遺伝子読み取りを有する変異体を分類する規則、および＞１０の固有読み取りは、「検出された」として分類される。
【０１１１】
同定された改変体の病原性を評価するために、いくつかのインシリコ（ｉｎ−ｓｉｌｉｃｏ）ツールが利用され、これらには、ＰｈｙｌｏＰ、ＳＩＦＴ、Ｇｒａｎｔｈａｍ、ＣＯＳＭＩＣおよびＰｏｌｙｐｈｅｎ−２が含まれる。
【０１１２】
ＲＮＡ発現分析：
生データをイオンＳ５システムで処理し、アンプリセックＲＮＡ（ＡｍｐｌｉＳｅｑＲＮＡ）プラグインを用いて実施した一次データ分析のためにトレント  サーバーに移した。このプラグインは、それぞれのイオントレント（商標名）シーケンサに付属しているトレントスイートソフトウェアに含まれている。アンプリセックＲＮＡプラグインは、トレント  マッピング  アラインメント  プログラム（Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）（ＴＭＡＰ）を使用する。ＴＭＡＰはアンプリシークキットによって標的化された全ての転写物を含むカスタムリファレンス配列セットに対して、生の配列決定読み取りを整列させるために、イオントレント（商標名）配列決定データについて最適化される。アッセイ固有の情報は、特注のＢＥＤファイル内に含まれる。特異性および感度を維持するために、ＴＭＡＰは、２段階マッピングアプローチを実施する。最初に、候補マッピング位置（ＣＭＬ）のリストを識別するために、４つのアラインメントアルゴリズム、ＢＷＡ短（ＢＷＡ−ｓｈｏｒｔ）、ＢＷＡ長（ＢＷＡ−ｌｏｎｇ）、ＳＳＡＨＡ、および超最大精密マッチング（Ｓｕｐｅｒ−ｍａｘｉｍａｌ  Ｅｘａｃｔ  Ｍａｔｃｈｉｎｇ）を用いた。スミス  ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムを使用して、さらなる整列プロセスを実行して、最終的な最良のマッピングを見つける。アンプリセックＲＮＡプラグインの一部として、サムツールズ（ｓａｍｔｏｏｌｓ）（ｓａｍｔｏｏｌｓ  ｖｉｅｗ  −ｃ−Ｆ４−Ｌ  ｂｅｄ＿ｆｉｌｅ  ｂａｍ＿ｆｉｌｅ）を使用して、標的遺伝子の生の読み取りカウントを行う。所与のサンプルについてのイオン  アンプリセックＲＮＡ正規化は、プラグインによって、マッピングされた１００万リードまたはＲＰＭあたりの遺伝子あたりのマッピングされたリードの数として自動的に計算される。次いで、この数字は、１００万当たりのｌｏｇ２変換正規化読み取り（ｎＲＰＭ）である。
【０１１３】
特注ＢＥＤファイルは、マッピング参照中の転写物当たりの各アンプリコンのヌクレオチド位置を含むようにフォーマットされている。予想されるアンプリコン位置に整列し、最小整列長などのフィルタリング基準を満たす読取りを、百分率「有効」読取りとして報告する。「検出された標的」は、標的の総数の百分率として検出されたアンプリコンの数（≧１０読取りカウント）として定義される。
【０１１４】
マッピング、アラインメントおよび正規化の後、アンプリセックＲＮＡプラグインはＱＣメトリック、可視化プロット、および遺伝子当たりの正規化カウントに関するデータを提供し、これは、タブ区切りテキストファイル中の遺伝子当たりの読み取りカウントを詳述するダウンロード可能ファイルへのリンクを含む遺伝子発現情報に対応する。所与の遺伝子標的に整列する読取りの数は、「カウント」と呼ばれる発現値を表す。この追加のプラグイン分析はサンプル当たりのダイナミックレンジおよび感度の決定を可能にするために、少なくとも１、１０、１００、１，０００、および１０，０００カウントを有する遺伝子（アンプリコン）の数の各バーコードについての出力を含む。
【０１１５】
マッピングされた全読み取り値のバーコード当たりのマッピング統計、標的に対する百分率、および検出されたパネル遺伝子の百分率（「標的検出」）を含む上記情報の要約表はトレント  スィート  ソフトウェア（Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｕｉｔｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）において見ることができ、実行およびライブラリー性能を迅速に評価する。
【０１１６】
ＰＤ−１およびＰＤ−１発現のカットオフ点の定義：
ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現値は各組織器官系（例えば、脳、肺、乳房、結腸、卵巣、前立腺、膀胱）を表す正常組織サンプルの範囲を用いて決定し、ウサギモノクローナル抗体（Ｅ１Ｌ３、細胞シグナル伝達）を用いる免疫組織化学アッセイを利用するイムノフォーカス（Ｉｍｍｕｎｏｆｏｃｕｓ）試験を用いてＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１タンパク質発現レベルと相関させた。これらのデータは、０〜５００  ｎＲＰＭの範囲の正常組織についてのベースラインＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現レベルを提供した。次いで、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現を、ある範囲の腫瘍型について決定し、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１  イムノフォーカスタンパク質発現レベルと相関させた。正常組織で観察されたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現の非存在または低レベルを示す腫瘍（すなわち、０〜５００  ｎＲＰＭ）はイムノフォーカスによって決定されたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１腫瘍比率スコア＜１％と相関し、イムノフォーカスによって評価された腫瘍比率スコア＞５０％を示す腫瘍は、１５００〜２０００  ｎＲＰＭの範囲の高ＲＮＡ発現と相関した。１％から５０％の間のがん比率の点数については、対応するＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ表現の増加が５００〜１５００  ｎＲＰＭの範囲で観察された。これらのデータは臨床的に関連するレベルのＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現を定量アッセイによって測定することができ、従って、抗ＰＤ−１および抗ＰＤ−Ｌ１指向性治療のためのコンパニオン診断として現在使用されている半定量的および主観的ＩＨＣベースのアッセイに取って代わることができることを決定的に示す。これは、免疫療法剤から利益を得ることができる患者を正確に同定するための強力で革新的な新しいアプローチを提供する。
【０１１７】
【表７】
2020523031.tif 000009
【０１１８】
【表８】
2020523031.tif 000010
【０１１９】
【表９】
2020523031.tif 000011
【０１２０】
【表１０】
2020523031.tif 000012
【０１２１】
【表１１】
2020523031.tif 000013
【０１２２】
【表１２】
2020523031.tif 000014
【０１２３】
【表１３】
2020523031.tif 000015
【０１２４】
【表１４】
2020523031.tif 000016
【０１２５】
【表１５】
2020523031.tif 000017
【０１２６】
【表１６】
2020523031.tif 000018
【０１２７】
【表１７】
2020523031.tif 000019
【０１２８】
【表１８】
2020523031.tif 000020
【０１２９】
【表１９】
2020523031.tif 000021
【０１３０】
【表２０】
2020523031.tif 000022
【図１】
2020523031.tif 000023
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月19日(2020.6.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路の成分を標的とする薬剤を用いた治療に対する、増殖性疾患に罹患している患者の感受性を決定する方法であって、当該方法は、
ａ)  ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−Ｌ２コピー変異多型の両方を測定し、
ｂ）  前記患者からの腫瘍サンプル中において、検知されたバイオマーカーの少なくとも１つはＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路に直接関連するものであり、バイオマーカーの少なくとも１つはＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路に直接関連するものではないが第３Ａ表〜第３Ｄ表中に列挙されたものであり、そして少なくとも１つが腫瘍突然変異負荷である、少なくとも３つのバイオマーカーを当該患者からの腫瘍サンプルにおいて測定すること、および
ｃ）ｍＲＭＡの過剰発現および前記薬剤に対する感受性の指標として、当該バイオマーカーの複数の存在を関連付けることを含む
増殖性疾患に罹患している患者の感受性を決定する方法。
【表１】
2020523031.tif 000024
【表２】
2020523031.tif 000025
【表３】
2020523031.tif 000026
【表４】
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【表５】
2020523031.tif 000028
【表６】
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【表７】
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【表８】
2020523031.tif 000031
【表９】
2020523031.tif 000032
【表１０】
2020523031.tif 000033
【表１１】
2020523031.tif 000034
【請求項２】
第３Ａ表〜第３Ｄ表中の少なくとも１０のバイオマーカーが決定される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第３Ａ表〜第３Ｄ表中の全てのバイオマーカーが決定される請求項２に記載の方法。
【請求項４】
増殖性疾患が癌である上記請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
バイオマーカーがＤＮＡまたはＲＮＡ分析またはこれらの組み合わせを用いて同定されるものである上記請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
腫瘍サンプルが患者から得られる診断ＰＷＥＴサンプルである上記請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオマーカーのコード領域全体をカバーするために、標的半導体配列決定を使用するものである上記請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも１つのバイオマーカーのＲＮＡのレベルが測定され、ここで野生型と比較して発現レベルの変化がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を示すものである、上記請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオマーカーがＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）およびＣＤ２７９（ＰＤ−１）からなる群から選択されるものである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１  ｍＲＮＡにわたる複数のエキソン−イントロン遺伝子座での遺伝子発現の分析が実施され、これは、ＰＤ−１およびＰＤ−Ｌ１  ＲＮＡ発現レベルの測定値を定量するために、正規化された遺伝子発現に関連するものである請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＮＦＡＴＣ１（活性化Ｔ細胞１の核因子）、ＰＩＫ３ＣＡ（ホスファチジルイノシトール‐４，５‐ビスホスフェート３‐キナーゼ触媒サブユニットα）、ＰＩＫ３ＣＤ（ホスファチジルイノシトール‐４，５‐ビスホスフェート３‐キナーゼ触媒サブユニットδ）、ＰＲＤＭ１（ＰＲドメインジンクフィンガータンパク質１）、ＰＴＥＮ（ホスファターゼおよびテンシン相同体）、ＰＴＰＮ１１（チロシンタンパク質ホスファターゼ非受容体型１１）、ＭＴＯＲ（ラパマイシンの機械論的標的）、ＨＩＦ１ａ（低酸素誘導因子１‐α）およびＦＯＸＯ１ｍ（フォークヘッドボックスクラス０１突然変異体）のＲＮＡレベルの上昇が測定される請求項８〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
ミスマッチ修復遺伝子ＭＬＨ１、ＰＭＳ２、ＭＳＨ６およびＭＬＨ２の遺伝子発現の喪失が決定される、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
少なくとも１つのバイオマーカーが遺伝子における突然変異の検出を含み、前記突然変異が遺伝子または遺伝子産物の発現または機能に影響を及ぼすものである、上記請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
突然変異が、ＡＬＫ（未分化リンパ腫キナーゼ遺伝子）、ＢＲＡＦ（Ｂ−Ｒａｆ遺伝子）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１遺伝子）、ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体遺伝子）、ＥＲＢＢ２（受容体チロシン−タンパク質キナーゼｅｒｂＢ−２またはヒト上皮成長因子受容体２遺伝子）、ＦＧＦＲ（線維芽細胞成長因子受容体遺伝子）、ＫＩＴ（ＫＩＴプロトオンコジーン受容体チロシンキナーゼ遺伝子）、ＫＲＡＳ（Ｋ−ｒａｓ  ｇｔｐａｓｅ遺伝子）、ＭＥＴ（ＭＥＴプロトオンコジーン、受容体チロシンキナーゼ）またはＮＲＡＳ（Ｎ−ｒａｓプロトオンコジーン、ＧＴＰａｓｅ遺伝子）からなる群より選択される遺伝子に存在するものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
異常な遺伝子融合をもたらす遺伝子再編成から生じるバイオマーカーが検出される、上記請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
遺伝子融合がＡＬＫ融合、ＭＥＴ遺伝子融合のＦＧＦＲ融合である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
検出されたバイオマーカーが、遺伝子のコピー数変異体の存在を含むものである上記請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記遺伝子が、ＥＲＢＢ２、ＦＧＦＲ、ＦＧＦＲ１、ＦＣＦＲ２、ＦＧＦＲ３、ＦＧＦＲ４、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２遺伝子）またはＣＤ２７３からなる群より選択されるものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
バイオマーカーが、ハイスループットアッセイプラットフォームを用いて決定されるものである上記請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
感受性のレベルを示すアルゴリズムが、得られた結果に適用されるものである上記請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
スコア「０」が種々のバイオマーカーの野生型または正常発現プロフィールに対して変化がないかことを示す結果に適用され、一方、少なくとも「１」のスコアは、記載される任意の変異または変異に適用されるものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ｉ）  「１」のスコアはバイオマーカー遺伝子における発癌性突然変異の存在の場合、またはバイオマーカー遺伝子の２〜３の追加コピーの存在、または発癌性遺伝子融合の存在、またはバイオマーカー遺伝子のＲＮＡ発現の小さな（すなわち、０〜５００  ｎＲＰＭ）変化に、または＜６突然変異／メガ塩基のＴＭＢに適用され；
（ｉｉ）  「２」のスコアはバイオマーカー遺伝子の４〜８コピーの追加コピーが存在する場合、またはバイオマーカー遺伝子のＲＮＡ発現の中間（５００〜１５００  ｎＲＰＭ）変化に、または６〜１９突然変異／メガ塩基のＴＭＢに適用され；
（ｉｉｉ）スコア「３」は、バイオマーカー遺伝子の８を超える追加コピーの存在の場合、またはバイオマーカー遺伝子のＲＮＡ発現の高い（＞１５００  ｎＲＰＭ）変化に、または２０を超える突然変異／メガ塩基のＴＭＢの場合に適用される；
物である請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
第３Ａ表〜第３Ｄ表に列挙される３つ以上のバイオマーカーを検出するために必要とされる増幅プライマーの組み合わせを含む前記請求項のいずれか１項に記載の方法を実施するためのキット。
【請求項２４】
ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ分析を実施するための手段と、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のアルゴリズムを実施するようにプログラムされたコンピュータとを含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法を実施するように構成された装置。
【請求項２５】
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のアルゴリズムを実施するようにプログラムされたコンピュータまたは機械可読カセット。
【請求項２６】
ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路の成分を標的とする薬剤を用いて治療に応答する増殖性疾患に罹患している患者を同定するためのシステムであって、以下を含む、システム：
プロセッサと、
プロセッサによって実行されると、コンピュータシステムに以下のことを行わせるアルゴリズムのコードを記憶するメモリとを含む：
患者の腫瘍のサンプル中で同定された第３Ａ表〜第３Ｄ表に列挙されたものから選択された複数のバイオマーカーの入力レベルを受け取る；
前記サンプル中の核酸の腫瘍突然変異負荷に関するさらなる入力レベルを受け取る；
ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路の成分を標的とする薬剤を用いた治療に対する前記患者の感受性のレベルを示す出力を提供するために、アルゴリズムを介して入力レベルを分析し、変換する；
プロセッサのグラフィカルインタフェースに出力を表示する。
【請求項２７】
前記メモリは、前記入力レベルに基づいて、前記患者の治療のためのカスタマイズされた推奨を提供するためのコードをさらに備える、請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記カスタマイズされた推薦は、前記プロセッサのグラフィカルインターフェース上に表示される、請求項２７に記載のシステム。
【請求項２９】
プロセッサによって実行されると、コンピュータシステムに、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路を標的とする薬剤を用いた治療に応答する増殖性疾患に罹患している患者を、以下によって識別させる命令を記憶する非一時的なコンピュータ可読媒体：
患者の腫瘍サンプル中で同定された第３Ａ表〜第３Ｄ表に列挙されたものから選択された複数のバイオマーカーの入力レベルを受け取ること；
前記サンプル中の核酸の腫瘍突然変異負荷に関するさらなる入力レベルを受け取ること；
ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１経路の成分を標的とする薬剤を用いた治療に対する前記患者の感受性のレベルを示す出力を提供するために、アルゴリズムを介して入力レベルを分析し、変換すること；
プロセッサのグラフィカルインタフェースに出力を表示すること。
【請求項３０】
入力レベルに基づいて患者の治療のためのカスタマイズされた推奨を作成し、カスタマイズされた推奨をプロセッサのグラフィカルインターフェース上に表示するための命令をさらに記憶する、請求項２９に記載の非一時的なコンピュータ可読媒体。           
【国際調査報告】
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