(57)【要約】  本発明は、等温核酸増幅を用いて、生体試料中の呼吸器合胞体ウイルス標的核酸の有無を検出するための方法及び組成物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）非構造ＮＳ２遺伝子のアンチセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を３’末端に含む第１のフォワードテンプレート；前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域；並びに
ｉｉ）ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を３’末端に含む第１のリバーステンプレート；前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域；又は
ｉｉｉ）ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのアンチセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を３’末端に含む第２のフォワードテンプレート；前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域；並びに
ｉｖ）ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を３’末端に含む第２のリバーステンプレート；前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域
を含む組成物。
【請求項２】
前記ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のアンチセンス鎖の３’末端に相補的である３’末端での認識領域は、長さが８〜３０ヌクレオチドであり、かつ／又は
前記ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのアンチセンス鎖の３’末端に相補的である３’末端での認識領域は、長さが８〜３０ヌクレオチドである、
請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のセンス鎖の３’末端に相補的である３’末端での認識領域は、長さが８〜３０ヌクレオチドであり、かつ／又は
前記ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのセンス鎖の３’末端に相補的である３’末端での認識領域は、長さが８〜３０ヌクレオチドである、
請求項１又は請求項２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
ｉ）及びｉｉ）を含む前記組成物が、ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ｉｉｉ）及びｉｖ）を含む組成物が、ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記第１のフォワードテンプレートの核酸配列が、配列番号１（ＣＧＡＣＴＣＡＣＡＣＧＡＧＴＣＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡ）に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；かつ
前記第１のリバーステンプレートの核酸配列が、配列番号２（ＡＧＡＣＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＴＣＴＡＧＴＴＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＧ）に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
ｉ）及びｉｉ）を含む前記組成物が、配列番号３（ＡＣＣＡＧＧＡＡＴＧＴＡＡＡＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴ）に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２〜４及び請求項６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記第２のフォワードテンプレートの核酸配列が、配列番号６（ＧＡＣＴＣＧＣＡＣＡＣＧＡＧＴＣＡＣＧＴＡＧＴＡＣＡＧＧＡＧＡＴＡＡ）に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；
前記第２のリバーステンプレートの核酸配列が、配列番号７（ＧＡＣＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＴＣＧＣＴＴＴＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＡＡ）に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項１〜３及び請求項５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
ｉｉｉ）及びｉｖ）を含む前記組成物が、配列番号８（ＴＧＡＣＡＣＡＴＣＡＴＡＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＴＣＡ）に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜３、請求項５及び請求項８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
ＤＮＡポリメラーゼ、１以上のニッキング酵素、ｄＮＴＰ又はｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物の１以上をさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ゲオバチルス・ボアジチ（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｇａｚｉｃｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ（巨大断片）、エクソＤＮＡポリメラーゼ、Ｍａｎｔａ  １．０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ（登録商標））からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記１以上のニッキング酵素が、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．ＢｐｕｌＯＩ、Ｎｔ．ＢｐｕｌＯＩ及びＮ．ＢｓｐＤ６１からなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、凍結乾燥される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記プローブが、検出可能な標識にコンジュゲートされる、請求項４、請求項５、請求項７又は請求項９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記検出可能な標識が、フルオロフォア、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対のメンバー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記第１のフォワードテンプレート、前記第１のリバーステンプレート、前記第２のフォワードテンプレート又は前記第２のリバーステンプレートの１以上が、１以上の修飾ヌクレオチド、スペーサー、又はブロッキング基を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’修飾を含む、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’−０−メチルを含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
生体試料中のＲＳＶの有無の検出のための方法であって、
ｉ）ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のアンチセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含むヌクレオチド配列を３’末端に含む第１のフォワードテンプレート；前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域；
ｉｉ）ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を３’末端に含む第１のリバーステンプレート；前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域；
ｉｉｉ）少なくとも１つのニッキング酵素；及び
ｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼ
を含む組成物と前記生体試料を接触させること；
核酸増幅反応で前記標的ヌクレオチド配列を増幅して増幅産物を提供すること；並びに
前記増幅産物の有無を検出すること
を含む、方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのニッキング酵素が、
前記第１のフォワードテンプレートの前記ニッキング部位でニッキング可能であり、かつＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のアンチセンス鎖内ではニッキングしない第１のニッキング酵素、並びに／又は
前記第１のリバーステンプレートの前記ニッキング部位でニッキング可能でありかつＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のセンス鎖内ではニッキングしない第２のニッキング酵素
を含み、前記第１のニッキング酵素及び前記第２のニッキング酵素が、同一であっても又は異なっていてもよい、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、前記ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項１９〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
生体試料中のＲＳＶの有無の検出のための方法であって、
ｉ）ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのアンチセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含むヌクレオチド配列を３’末端に含む第２のフォワードテンプレート；前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域；
ｉｉ）ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含むヌクレオチド配列を３’末端に含む第２のリバーステンプレート；前記認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及び前記ニッキング部位の上流の安定化領域；
ｉｉｉ）少なくとも１つのニッキング酵素；及び
ｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼ
を含む組成物と前記生体試料を接触させること；
核酸増幅反応で前記標的ヌクレオチド配列を増幅して増幅産物を提供すること；並びに
前記増幅産物の有無を検出すること
を含む、方法。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのニッキング酵素が、
前記第２のフォワードテンプレートの前記ニッキング部位でニッキング可能であり、かつＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのアンチセンス鎖内ではニッキングしない第１のニッキング酵素、並びに／又は
前記第２のリバーステンプレートの前記ニッキング部位でニッキング可能でありかつ前記ヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのセンス鎖内ではニッキングしない第２のニッキング酵素
を含み、前記第１のニッキング酵素及び前記第２のニッキング酵素が、同一であっても又は異なっていてもよい、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記組成物が、ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項２２〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
増幅が、基本的に等温条件下で行われる、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記第１のフォワードテンプレートの前記核酸配列が、配列番号１に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；かつ
前記第１のリバーステンプレートの前記核酸配列が、配列番号２に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項１９〜２１及び請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記プローブオリゴヌクレオチドが、配列番号３に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１９〜２１、請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２のフォワードテンプレートの前記核酸配列が、配列番号６に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；かつ
前記第２のリバーステンプレートの前記核酸配列が、配列番号７に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、
請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記プローブオリゴヌクレオチドが、配列番号８に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項２２〜２４及び請求項２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物が、ｄＮＴＰ又はｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物をさらに含む、請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＤＮＡポリメラーゼが、ゲオバチルス・ボアジチのＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ（巨大断片）、エクソＤＮＡポリメラーゼ、Ｍａｎｔａ  １．０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ（登録商標））からなる群から選択される、請求項１９〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１のフォワードテンプレート及び第１のリバーステンプレート前記第２のフォワードテンプレート及び第２のリバーステンプレートが、前記同じ少なくとも１つのニッキング酵素によって認識されるニッキング酵素結合部位を含む、請求項１９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも１つのニッキング酵素が、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．ＢｐｕｌＯＩ、Ｎｔ．ＢｐｕｌＯＩ及びＮ．ＳＢｓｐＤ６１からなる群から選択される、請求項１９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記プローブが、検出可能な標識にコンジュゲートされる、請求項２１、請求項２４、請求項２７又は請求項２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記検出可能な標識が、フルオロフォア、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対のメンバー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つのニッキング酵素が、前記ニッキング酵素結合部位の下流でニッキングする、請求項１９〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
増幅前に前記生体試料から核酸を抽出／単離することを必要に応じて含む、請求項１９〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記生体試料が、糞便、口腔／咽喉の拭き取り検体、唾液、膿、痰、血液、及び尿から選択される、又は前記生体試料が、感染組織若しくは非感染組織からである、請求項１９〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１のフォワードテンプレート、前記第１のリバーステンプレート、前記第２のフォワードテンプレート又は前記第２のリバーステンプレートの１以上が、１以上の修飾ヌクレオチド、スペーサー、又はブロッキング基を含む、請求項１９〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’修飾を含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’− ０−メチルを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
（ａ）配列番号１に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１のフォワードテンプレート；及び配列番号２に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１のリバーステンプレート；又は
（ｂ）配列番号６に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する第２のフォワードテンプレート；及び配列番号７に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチドを含む第２のリバーステンプレート
からなる群から選択されるテンプレートオリゴヌクレオチド
を含むキット。
【請求項４３】
（ａ）が、配列番号３に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
（ｂ）が、配列番号８に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項４２に記載のキット。
【請求項４５】
拭き取り検体をさらに含む、請求項４２に記載のキット。
【請求項４６】
前記キットを使用するための取り扱い説明書をさらに含む、請求項４２に記載のキット。
【請求項４７】
ｄＮＴＰ又はｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物の１以上をさらに含む、請求項４２に記載のキット。
【請求項４８】
生体試料から核酸を抽出／単離するための試薬を必要に応じて含む、請求項４２に記載のキット。
【請求項４９】
前記テンプレートオリゴヌクレオチドが、１以上の修飾ヌクレオチド、スペーサー、又はブロッキング基を含む、請求項４２〜４８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５０】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’修飾を含む、請求項４９に記載のキット。
【請求項５１】
少なくとも１つの修飾ヌクレオチドが、２’− ０−メチルを含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
ポリメラーゼをさらに含む、請求項４２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、等温核酸増幅を用いて、生体試料中の標的核酸の有無を検出するための方法及び組成物に関する。より具体的には、本発明は、生体試料中の呼吸器合胞体ウイルス標的核酸を検出することに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
特定の等温増幅方法は、数分以内に、微量レベルから非常に高い検出可能なレベルまで標的核酸を増幅することができる。そのような等温法、例えば、ニッキング及び伸長増幅反応（ＮＥＡＲ）は、使用者が微量で特定のヌクレオチド配列を検出すること、ポイントオブケア検査を容易にすること、診断の利用可能性及び速度を上げることを可能にする。
【０００３】
呼吸器合胞体ウイルス（「ＲＳＶ」）は、少なくとも１０個のタンパク質及び３個の表面タンパク質を有する一本鎖エンベロープＲＮＡのパラミクソウイルスである。ＲＳＶは、最も一般的な小児呼吸器感染症（例えば、細気管支炎及び肺炎）の原因物質である。ＲＳＶ感染症の大半は１歳未満の乳児に影響を与え、米国では毎年、５歳未満の１７万人以上の子供たちがＲＳＶにより入院している（例えば、Ｓｔｏｃｋｍａｎら、（２０１２）  Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．３１（１）：５−９；Ｈａｌｌら、（２０１３）  Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １３２（２）：ｅ３４１−３４８；及びＬａｎｇｌｅｙら、（２０１１）  Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｊ．３０（６）：５１７−５１７参照）。ＲＳＶ感染はまた、高齢者及び高リスクの成人（すなわち、免疫不全患者）にも見られる。３〜５日の潜伏期間内で、ＲＳＶ感染症は典型的には、数日間検出されない状態である。ＲＳＶ感染に関連する症状は、典型的には、風邪の症状（例えば、鬱血、咳及び発熱）に関連するものを含む。これらの例示的な要因が、早期発見及び診断を非常に困難なものにする。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、少なくとも一部において、生体試料中のＲＳＶの有無を、ＮＥＡＲ又はリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を用いて正確かつ効率的に検出できるという発見に基づいている。この発見から、本明細書に提供されるのは、生体試料中のＲＳＶの有無を決定する（例えば、検出する）ためのＮＥＡＲの組成物及び方法である。より具体的には、本明細書に提供されるのは、生体試料中の、例えば、非構造遺伝子ＮＳ２又はＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子ＮなどのＲＳＶ標的核酸の有無を決定する（例えば、検出する）ためのＮＥＡＲの組成物及び方法である。本明細書に提供される組成物は、生体試料中のＲＳＶ核酸の検出に有用であり、少なくとも１対のテンプレート（すなわち、フォワード及びリバースのテンプレート対）、並びに必要に応じてＲＳＶに特異的なプローブ、を含む。
【０００５】
本明細書に提供されるのは、ｉ）呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）非構造ＮＳ２遺伝子のアンチセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を３’末端に含む第１のフォワードテンプレート；認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及びニッキング部位の上流の安定化領域；並びにｉｉ）ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を３’末端に含む第１のリバーステンプレート；認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及びニッキング部位の上流の安定化領域；又はｉｉｉ）ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのアンチセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を３’末端に含む第２のフォワードテンプレート；認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；ニッキング部位の上流の安定化領域；並びにｉｖ）ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含む核酸配列を３’末端に含む第２のリバーステンプレート；認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及びニッキング部位の上流の安定化領域、を含む組成物である。
【０００６】
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のアンチセンス鎖の３’末端に相補的である３’末端にある認識領域は、長さが８〜３０ヌクレオチドであり、かつ／又はＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのアンチセンス鎖の３’末端に相補的である３’末端にある認識領域は、長さが８〜３０ヌクレオチドである。
【０００７】
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のセンス鎖の３’末端に相補的である３’末端にある認識領域は、長さが８〜３０ヌクレオチドであり、かつ／又はＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのセンス鎖の３’末端に相補的である３’末端にある認識領域は、長さが８〜３０ヌクレオチドである。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ｉ）及びｉｉ）を含む組成物はさらに、ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、ｉｉｉ）及びｉｖ）を含む組成物はさらに、ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、第１のフォワードテンプレートの核酸配列は、配列番号１（ＣＧＡＣＴＣＡＣＡＣＧＡＧＴＣＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡ）に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；かつ
第１のリバーステンプレートの核酸配列は、配列番号２（ＡＧＡＣＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＴＣＴＡＧＴＴＧＡＣＣＡＧＧＡＡＴＧ）に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１０】
本明細書に記載の組成物のいずれかのいくつかの実施形態において、ｉ）及びｉｉ）を含む組成物はさらに、配列番号３（ＡＣＣＡＧＧＡＡＴＧＴＡＡＡＴＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴ）に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、第２のフォワードテンプレートの核酸配列は、配列番号６（ＧＡＣＴＣＧＣＡＣＡＣＧＡＧＴＣＡＣＧＴＡＧＴＡＣＡＧＧＡＧＡＴＡＡ）に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；第２のリバーステンプレートの核酸配列は、配列番号７（ＧＡＣＴＣＣＡＣＡＣＧＧＡＧＴＣＧＣＴＴＴＴＧＣＡＣＡＴＣＡＴＡＡ）に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ｉｉｉ）及びｉｖ）を含む組成物はさらに、配列番号８（ＴＧＡＣＡＣＡＴＣＡＴＡＡＴＴＧＧＧＡＧＴＧＴＣＡ）に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００１２】
本明細書に記載の組成物のいずれかのいくつかの実施形態において、さらに、ＤＮＡポリメラーゼ、１以上のニッキング酵素、ｄＮＴＰ又はｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物のうちの１以上を含む。いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、ゲオバチルス・ボアジチ（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｏｇａｚｉｃｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ（巨大断片）、エクソＤＮＡポリメラーゼ、Ｍａｎｔａ  １．０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ（登録商標））からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、１以上のニッキング酵素はＮｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．ＢｐｕｌＯＩ、Ｎｔ．ＢｐｕｌＯＩ及びＮ．ＢｓｐＤ６１からなる群から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態において、組成物は、凍結乾燥される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、プローブは、検出可能な標識にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、フルオロフォア、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対のメンバー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態において、第１のフォワードテンプレート、第１のリバーステンプレート、第２のフォワードテンプレート又は第２のリバーステンプレートの１以上は、１以上の修飾ヌクレオチド、スペーサー、又はブロッキング基を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’修飾を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’− ０−メチルを含む。
【００１６】
また、本明細書に提供されるのは、生体試料中のＲＳＶの有無の検出のための方法であって、ｉ）ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のアンチセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含むヌクレオチド配列を３’末端に含む第１のフォワードテンプレート；認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及びニッキング部位の上流の安定化領域；ｉｉ）ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含むヌクレオチド配列を３’末端に含む第１のリバーステンプレート；認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及びニッキング部位の上流の安定化領域；ｉｉｉ）少なくとも１つのニッキング酵素；並びにｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼ、を含む組成物と生体試料を接触させること；核酸増幅反応で標的ヌクレオチド配列を増幅して増幅産物を提供すること；並びに増幅産物の有無を検出すること、を含む、方法である。
【００１７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのニッキング酵素は、第１のフォワードテンプレートのニッキング部位でニッキング可能であるが、ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のアンチセンス鎖内ではニッキングしない第１のニッキング酵素、並びに／又は第１のリバーステンプレートのニッキング部位でニッキング可能であるが、ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のセンス鎖内ではニッキングしない第２のニッキング酵素を含み、第１のニッキング酵素及び第２のニッキング酵素は、同一でも、又は異なっていてもよい。いくつかの実施形態において、組成物はさらに、ＲＳＶ非構造ＮＳ２遺伝子のヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００１８】
また、本明細書に提供されるのは、生体試料中のＲＳＶの有無の検出のための方法であって、ｉ）ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのアンチセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含むヌクレオチド配列を３’末端に含む第２のフォワードテンプレート；認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及びニッキング部位の上流の安定化領域；ｉｉ）ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのセンス鎖の３’末端に相補的である認識領域を含むヌクレオチド配列を３’末端に含む第２のリバーステンプレート；認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；及びニッキング部位の上流の安定化領域；ｉｉｉ）少なくとも１つのニッキング酵素；並びにｉｖ）ＤＮＡポリメラーゼ、を含む組成物と生体試料を接触させること；核酸増幅反応で標的ヌクレオチド配列を増幅して増幅産物を提供すること；並びに増幅産物の有無を検出すること、を含む、方法である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのニッキング酵素は、第２のフォワードテンプレートのニッキング部位でニッキング可能であるが、ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのアンチセンス鎖内ではニッキングしない第１のニッキング酵素、並びに／又は第２のリバーステンプレートのニッキング部位でニッキング可能であるが、ヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのセンス鎖内ではニッキングしない第２のニッキング酵素を含み、第１のニッキング酵素及び第２のニッキング酵素は、同一でも、又は異なっていてもよい。
【００２０】
いくつかの実施形態において、組成物はさらに、ＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎのヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、増幅は、基本的に等温の条件下で行われる。
【００２２】
いくつかの実施形態において、第１のフォワードテンプレートの核酸配列は、配列番号１に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；かつ第１のリバーステンプレートの核酸配列は、配列番号２に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号３に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、第２のフォワードテンプレートの核酸配列は、配列番号６に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み；第２のリバーステンプレートの核酸配列は、配列番号７に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態において、プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号８に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態において、組成物はさらに、ｄＮＴＰ又はｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、ゲオバチルス・ボアジチのＤＮＡポリメラーゼ、Ｂｓｔ（巨大断片）、エクソＤＮＡポリメラーゼ、Ｍａｎｔａ  １．０  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃｓ（登録商標））からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、第１のフォワードテンプレート及び第１のリバーステンプレート、第２のフォワードテンプレート及び第２のリバーステンプレートは、同じ少なくとも１つのニッキング酵素によって認識されるニッキング酵素結合部位を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのニッキング酵素は、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣｉ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、Ｎｂ．ＢｐｕｌＯＩ、Ｎｔ．ＢｐｕｌＯＩ及びＮ．ＳＢｓｐＤ６１からなる群から選択される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、プローブは、検出可能な標識にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、フルオロフォア、酵素、クエンチャー、酵素阻害剤、放射性標識、結合対のメンバー、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのニッキング酵素は、ニッキング酵素結合部位の下流でニッキングする。
【００２６】
本明細書に記載の方法のいずれかのいくつかの実施形態において、本方法は必要に応じて、増幅前に生体試料から核酸を抽出／単離することを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態において、生体試料は、糞便、口腔／咽喉の拭き取り検体、唾液、膿、痰、血液、及び尿から選択されるか、又は生体試料は感染組織若しくは非感染組織由来である。
【００２８】
いくつかの実施形態において、第１のフォワードテンプレート、第１のリバーステンプレート、第２のフォワードテンプレート又は第２のリバーステンプレートの１以上は、１以上の修飾ヌクレオチド、スペーサー、又はブロッキング基を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’修飾を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’− ０−メチルを含む。
【００２９】
また、本明細書に提供されるのは、（ａ）配列番号１に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１のフォワードテンプレート；及び配列番号２に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第１のリバーステンプレート；又は（ｂ）配列番号６に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む第２のフォワードテンプレート；及び配列番号７に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチドを含む第２のリバーステンプレート、からなる群から選択されるテンプレートオリゴヌクレオチドを含むキットである。
【００３０】
本明細書に記載のキットのいずれかのいくつかの実施形態において、（ａ）はさらに、配列番号３に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。本明細書に記載のキットのいずれかのいくつかの実施形態において、（ｂ）はさらに、配列番号８に少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むプローブオリゴヌクレオチドを含む。
【００３１】
本明細書に記載のキットのいずれかのいくつかの実施形態において、キットはさらに、拭き取り検体を含む。
【００３２】
本明細書に記載のキットのいずれかのいくつかの実施形態において、キットはさらに、キットを使用するための取り扱い説明書を含む。
【００３３】
本明細書に記載のキットのいずれかのいくつかの実施形態において、キットはさらに、ｄＮＴＰ又はｄＮＴＰとｄｄＮＴＰの混合物の１以上を含む。
【００３４】
本明細書に記載のキットのいずれかのいくつかの実施形態において、キットは必要に応じて、生体試料から核酸を抽出／単離するための試薬を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態において、テンプレートオリゴヌクレオチドは、１以上の修飾ヌクレオチド、スペーサー、又はブロッキング基を含む。
【００３６】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’修飾を含む。
【００３７】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドは、２’− ０−メチルを含む。
【００３８】
本明細書に記載のキットのいずれかのいくつかの実施形態において、キットはさらに、ポリメラーゼを含む。
【００３９】
本発明は、対象においてＲＳＶ感染症を検出及び診断するための高感度で迅速な定性的アッセイを提供する。
【００４０】
用語「テンプレート」又は「プライマー」は、核酸鎖に相補的なプライマー伸長生成物の５’から３’への合成の開始点として機能できるオリゴヌクレオチドを指す。プライマー伸長生成物は、適切な緩衝液中にて適切な温度で、適切なヌクレオチド、及びＤＮＡポリメラーゼなどのポリメライゼーション用の薬剤の存在下で合成される。
【００４１】
本明細書で使用する用語「プローブ」は、プローブ中の少なくとも１つの配列の標的配列との相補性により、分析を行っている試料中で、標的核酸配列の増幅によって作製される生成物とハイブリッド構造を形成するオリゴヌクレオチドを指す。任意の特定のプローブのヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、及び／又は合成のヌクレオチド類似体であり得る。
【００４２】
本発明の文脈内で、標的核酸配列は、ＲＳＶの核酸配列である。例えば、本発明の文脈内で、標的核酸配列は、ＲＳＶ非構造遺伝子ＮＳ２の核酸配列又はＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎの核酸配列であり得る。
【００４３】
本発明で使用される用語「１以上」又は「少なくとも１つの」は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個又はそれより多い化合物（複数可）を表す。
【００４４】
用語「第１」、「第２」、「第３」、及び「第４」などは、それらの関連のある意味でのみ、本開示で使用される。特に記載されない限り、それらの用語は単に、便宜上、実施形態の１以上の説明の中で使用されることを理解されたい。用語「第１」、「第２」、「第３」、及び「第４」などは、単に１つの要素と別の要素を区別するために使用され、本開示の技術の権利の範囲は、これらの用語によって制限されるべきではない。例えば、第１の要素は、第２の要素と指定される可能性があり、同様に、第２の要素は、第１の要素と指定される可能性がある。
【００４５】
用語「増加した」、「増加する」又は「上方制御される」は全て一般的に、統計的に有意な量での増加を意味するために本明細書で使用される。疑念を避けるために、用語「増加した」又は「増加する」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％又は１００％を含むが最大１００％の増加又は１０〜１００％のいずれかの増加、又は基準レベルと比較して少なくとも約０．５倍、又は少なくとも約１．０倍、又は少なくとも約１．２倍、又は少なくとも約１．５倍、又は少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍又は少なくとも約１０倍の増加、又は１．０倍〜１０倍のいずれかの増加又はそれを超える増加を意味する。
【００４６】
用語「減少する」、「減少した」、「低下した」、「低下」又は「下方制御される」は全て一般的に、統計的に有意な量の減少を意味するために本明細書で使用される。しかしながら、疑念を避けるために、「低下した」、「低下」、「減少した」又は「減少」は、基準レベルと比較して少なくとも１０％までの減少、例えば、基準レベルと比較して少なくとも約２０％、又は少なくとも約３０％、又は少なくとも約４０％、又は少なくとも約５０％、又は少なくとも約６０％、又は少なくとも約７０％、又は少なくとも約８０％、又は少なくとも約９０％又は１００％を含むが最大１００％の減少（すなわち、基準試料と比較してレベルなし）、又は１０〜１００％のいずれかの減少、又は基準レベルと比較して少なくとも約０．５倍、又は少なくとも約１．０倍、又は少なくとも約１．２倍、又は少なくとも約１．５倍、又は少なくとも約２倍、又は少なくとも約３倍、又は少なくとも約４倍、又は少なくとも約５倍又は少なくとも約１０倍の減少、又は１．０倍〜１０倍のいずれかの減少又はそれを超える
減少を意味する。
【００４７】
本明細書で使用する節の見出しは、単なる構成上の目的のためのものであり、決して説明される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。組み込まれる参考文献中の用語の定義が、本教示に提供される定義と異なるように思われる場合には、本教示に提供される定義が優先する。僅かで、実質的でない逸脱が本明細書の本教示の範囲内にあるように、本教示で論じられる温度、濃度、及び時間などの指標の前に、暗黙の「約」があるとことを理解されたい。本出願において、単数形の使用は、特に具体的に述べられない限り、複数形を含む。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。前述の一般的説明と以下の詳細な説明の両方は、単なる例示及び説明であり、本発明を限定するものではないことを理解すべきである。冠詞「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、冠詞の文法上の目的語の１つ又は２以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。一例として、「１つの要素」は、１つの要素又は２以上の要素を意味する。
【００４８】
特に定義しない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明での使用のための方法及び材料が本明細書に記載されている。当技術分野で公知の他の適切な方法及び材料を使用することもできる。材料、方法、及び実施例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。
【００４９】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかになる。
【００５０】
本特許又は本出願ファイルは、少なくとも１枚のカラー図面を含む。カラー図面（複数可）を有するこの特許又は特許出願の公表物のコピーは、要求し、必要な料金を支払うと、特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５１】
【図１】本明細書に記載のＲＳＶ非構造遺伝子ＮＳ２を検出するための例示的なアッセイ（「ＲＳＶ  Ａアッセイ」）を用いた検出限界（ＬＯＤ）試験の結果を示すグラフである。
【図２】本明細書に記載のＲＳＶヌクレオキャプシド遺伝子Ｎを検出するための例示的なアッセイ（「ＲＳＶ  Ｂアッセイ」）を用いて行ったＬＯＤ試験の結果を示すグラフである。
【図３Ａ−Ｄ】０コピー（標的コピーなし「ＮＴＣ」）（図３Ａ）、５０コピー（図３Ｂ）、２５０コピー（図３Ｃ）、又は５００コピー（図３Ｄ）の標的核酸及び漸増量のバックグラウンドヒトゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ、１００ｎｇ、１０００ｎｇ）の存在下で行った例示的なＲＳＶ  Ａアッセイの結果を示すグラフである。
【図４Ａ−Ｄ】０コピー（「ＮＴＣ」）（図４Ａ）、５０コピー（図４Ｂ）、２５０コピー（図４Ｃ）又は５００コピー（図４Ｄ）の標的核酸及び漸増量のバックグラウンドヒトゲノムＤＮＡ（１０ｎｇ、１００ｎｇ、及び１０００ｎｇ）の存在下で行った例示的なＲＳＶ  Ｂアッセイの結果を示すグラフである。
【図５】漸増量のバックグラウンドヒトｇＤＮＡ（０、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１０００ｎｇ）の存在下で、０コピーの標的核酸を用いて行った例示的なＲＳＶ  Ｂアッセイの結果を示すグラフである。
【図６−７】精製ＲＮＡ（図６）及び精製ウイルス（図７）とのアッセイの反応性を決定するための例示的なＲＳＶ  Ａアッセイの結果を示すグラフである。Ｘ軸−サイクル（１サイクル＝１０秒）；Ｙ軸−ｍＶ。
【図８】精製ウイルスでの検出限界（ＬＯＤ）を決定するために行った例示的なＲＳＶ  Ａを示すグラフである。
【図９−１０】精製ＲＮＡ（図９）及び精製ウイルス（図１０）とのアッセイの反応性を示す例示的なＲＳＶ  Ｂアッセイを示すグラフである。Ｘ軸−サイクル（１サイクル＝１０秒）；Ｙ軸−ｍＶ。
【図１１−１２】精製ＲＮＡ（図１１）及び精製ウイルス（図１２）とのアッセイの反応性を決定するために行った例示的なＲＳＶ  Ｂ＋ＩＣアッセイの結果を示すグラフである。
【図１３−１４】精製ウイルスでの検出限界（ＬＯＤ）を決定するために行った例示的なアッセイの、ＲＳＶ  Ｂ性能（図１３）及びＲＳＶ  Ｂ＋ＩＣ性能（図１４）の結果を示すグラフである。
【図１５−１７】標的が反応中に存在しなかった場合に、アッセイが偽陽性の結果をもたらすかどうかを決定するための、ＲＳＶ  Ａアッセイ（図１５）、ＲＳＶ  Ｂアッセイ（図１６）、及びＲＳＶ  Ｂ＋ＩＣアッセイ（図１７）の「標的コピーなし」（ＮＴＣ）反復試験の結果を示すグラフである。Ｘ軸−サイクル（１サイクル＝１０秒）；Ｙ軸−ｍＶ。
【図１８−１９】アッセイが複数の株全体で同レベルの性能を提供するかどうかを決定するためのＲＳＶ  Ａアッセイ（図１８）及びＲＳＶ  Ｂアッセイ（図１９）の例示的な包括試験の結果を示すグラフである（Ａ２を開発株として使用し、Ａロングでの結果が示される）。株Ａロングを、３つ組で、反応あたり５コピー（開発株Ａ２のＬＯＤであると決定された）の精製ＲＮＡ又は１０コピーの精製ＲＮＡのいずれかでスクリーニングした（Ｒｏｘ−標的の検出；Ｆａｍ−内部対照の検出）。
【図２０Ａ−Ｂ】ＲＳＶ  Ａアッセイ（図２０Ａ）及びＲＳＶ  Ｂ（図２０Ｂ）が、非ＲＳＶ種に対する特異性を提供するかどうかを決定するための例示的な交差反応性試験の結果を示すグラフである。
【図２１Ａ−Ｂ】アッセイが、反対のＲＳＶサブタイプに対する特異性を提供するかどうかを決定するための例示的な交差反応性試験の結果を示すグラフである。ＲＳＶ  ＡアッセイをＲＳＶ  Ｂ標的に対してスクリーニングし（図２１Ａ）、ＲＳＶ  ＢアッセイをＲＳＶ  Ａ標的に対してスクリーニングした（図２１Ｂ）。
【図２２−２３】ＲＳＶ  Ｂ配列に対するＲＳＶ  Ａの生成物１の配列（図２２）及びＲＳＶ  Ａ配列に対するＲＳＶ  Ｂの生成物１の配列（図２３）を用いて行ったＢＬＡＳＴ分析を示すグラフである。代表的な「トップヒット」を、代表的なＲＳＶ  Ａ株配列と共に、ＲＳＶ  Ａテンプレート、分子ビーコン及び生成物の配列とそれぞれ整列させて示し、代表的な「トップヒット」を、代表的なＲＳＶ  Ｂ株配列と共に、ＲＳＶ  Ｂテンプレート、分子ビーコン及び生成物の配列とそれぞれ整列させて示す。ＢＬＡＳＴ分析を、短いインプット配列を検索するように調整された標準的なＢＬＡＳＴパラメータを用いて、それぞれ、ＲＳＶタイプＢ（ｔａｘｉｄ：２０８８９５）、及びＲＳＶタイプＡ（ｔａｘｉｄ：２０８８９３＆１４３９７０７）を特異的に標的として、基本的なＢＬＡＳＴ「ヌクレオチドブラスト」プログラム（ＢＬＡＳＴＮ  ２．２．３０＋）、ヌクレオチドコレクション（ｎｒ／ｎｔ）データベースを使用して、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで行った。
【図２４−２５】臨床マトリックスの存在下で、ＲＳＶ  Ａの凍結乾燥試薬（図２４）及びＲＳＶ  Ｂの凍結乾燥試薬（図２５）の性能を評価するために行った例示的な実験の結果を示すグラフである。両アッセイを、匿名のドナーの拭き取り検体プールＣを用いてスクリーニングした。
【図２６−２８】５０個の臨床拭き取り検体試料のＲＳＶ  Ａ  ＮＥＡＲアッセイ（図２６）、ＲＳＶ  Ｂ  ＮＥＡＲアッセイ（図２７）、及びＲＳＶ  Ｂ＋ＩＣ  ＮＥＡＲアッセイ（図２８）のまとめの結果を示すグラフである。
【図２９】ＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  ＢのＮＥＡＲアッセイを用いた、陽性と呼ばれる臨床拭き取り検体試料のサブセットのリアルタイム蛍光曲線を示す例示的な結果を示す。
【図３０−３２】ＲＳＶ  Ａ  ＮＥＡＲアッセイ（図３０）、ＲＳＶ  Ｂ  ＮＥＡＲアッセイ（図３１）及びＲＳＶ  Ｂ＋ＩＣ  ＮＥＡＲアッセイ（図３２）を用いてスクリーニングした、５０個の臨床ＵＴＭ試料のリアルタイム蛍光曲線を示す例示的な結果を示す。
【図３３】ＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  ＢのＮＥＡＲアッセイを用いた、陽性と呼ばれる臨床ＵＴＭ試料のサブセットのリアルタイム蛍光曲線を示す例示的な結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本明細書に提供されるのは、ポイント・オブ・ケア（ＰＯＣ）での使用のための、超高速で、超高感度で、特異的な、かつ堅牢なアプローチである。ＤＮＡ若しくはＲＮＡ標的のいずれかを用いる、ニッキング酵素増幅反応、又はＮＥＡＲの等温性質、低分子生成物、及び幾何学的増幅機構が、超高速増幅方法を提供する。長い又は面倒な試料調製／核酸精製の必要がないので、臨床マトリクスの存在下で堅牢な性能を提供する能力がＮＥＡＲを多くの他の分子検査から際立たせる。これらの重要な属性は、ＮＥＡＲを、迅速かつ信頼性の高い結果が不可欠であるＰＯＣ統合のための理想的な技術にする。これらの原理に基づいて、ＮＥＡＲ検査が、試料中のＲＳＶの有無を検出するために開発された。例示的な実施形態において、検査は、臨床患者試料、例えば、鼻の拭き取り検体試料を用いて、非構造遺伝子ＮＳ２及び／又はヌクレオキャプシド遺伝子Ｎを検出するための、２つのアッセイからなる。
【００５３】
本開示は、等温増幅を用いて生体試料中のＲＳＶの有無を検出することが可能であるという発見に一部基づいている。そのために、本出願は、ＮＥＡＲを用いて、標的ヌクレオチド配列を増幅及び検出することによって、生体試料中のＲＳＶの有無を検出するための組成物を開示する。いくつかの実施形態において、標的ヌクレオチド配列は、リアルタイム又はエンドポイント検出アプローチを用いて、例えば、蛍光標識プローブを利用して検出できる。
【００５４】
用語「標的配列」の使用は、配列のセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれかを指してよく、また、それらが元の標的配列の標的核酸、増幅されたコピー、又は増幅産物上に存在するような配列を指す。増幅産物は、標的配列、及び少なくとも１つの他の配列、又は他のヌクレオチドを含む、より大きな分子であり得る。
【００５５】
この発明の方法は、ＲＳＶ感染症の診断のための検体から核酸を特定するために使用できる。これらの方法において使用される本発明の特定のプライマー及びプローブは、特異的増幅産物の増幅及び発達の監視を可能にする。ＲＳＶ（例えば、非構造遺伝子ＮＳ２、ヌクレオキャプシド遺伝子Ｎ）の検出のためのＮＥＡＲの増加された感度は、臨床検査室での及びポイントオブケアでのＲＳＶ感染症の定期診断のためのこの技術の遂行を実現可能にする。
【００５６】
特定の等温増幅方法は、数分以内に、微量レベルから非常に高い検出可能なレベルまで標的核酸を増幅できる。このような等温法、例えば、ＮＥＡＲ及びＲＰＡは、ユーザーが微量で特定の配列を検出することを可能にし、ポイントオブケア検査を容易にしかつ診断の利用可能性及び速度を上昇させる。
【００５７】
増幅反応が実行される時間は、例えば、約１分以内、又は約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０分以内で変化し得る。より長い反応時間は、速度が問題とならない許容可能な結果をもたらし得る。いくつかの実施形態において、反応は、１〜２０分、１〜１５分又は１〜１０、１〜８、１〜５、１〜２．５、２．５〜５、２．５〜８、２．５〜１０、又は２．５〜２０分である。本明細書に記載の増幅プロセスは、効率的であり、いくつかの実施形態において、反応の時間枠内で、例えば、５、１０又は１２分で、約１×１０６倍以上の増幅、約１×約１０７倍以上の増幅、約１×１０８倍以上の増幅、約１×１０９倍以上の増幅、又は約１×１０１０倍以上の増幅がある。反応は非常に敏感であり、例えば、試料中で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００若しくはそれ以上ほどの低いコピー数を検出できるか、試料中で２００、５００、１，０００、５，０００、若しくは１０，０００若しくはそれ以上ものコピー数を検出できるか、又は、例えば、約３．３２Ｅ−１３マイクロモル〜約３．３２Ｅ−８マイクロモル、約１．６６Ｅ−１２マイクロモル〜約３．３２Ｅ−８マイクロモル、約３．３２Ｅ−１３マイクロモル〜約３．３２Ｅ−７マイクロモル、若しくは約３．３２Ｅ−１３マイクロモル〜約３．３２Ｅ−６マイクロモルの濃度で存在する標的を検出できる。
【００５８】
ＮＥＡＲ法は、例えば、米国特許第９，６１７，５８６号及び同第９，６８９，０３１号に開示されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００５９】
本発明の方法に関連して増幅するのに適する核酸（例えば、ポリヌクレオチド）は、ＤＮＡ及びＲＮＡ分子などの二本鎖及び一本鎖の核酸分子を含む。ポリヌクレオチドは、ゲノム、染色体、プラスミド、ミトコンドリア、細胞、及びウイルス核酸由来のものであり得る。二本鎖ポリヌクレオチドについては、増幅は、一方又は両方の鎖のいずれかであり得る。
【００６０】
本明細書に開示される方法に適する別のそのような等温増幅法は、ＲＰＡである。ＲＰＡは、ユーザーが微量で特定の配列を検出することを可能にし、ポイントオブケア検査を容易にしかつ診断の利用可能性及び速度を上昇させる。本明細書に記載するように、ＲＰＡは、テンプレート二本鎖核酸中の相同な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマーをペアリングできる、リコンビナーゼとして知られている酵素を使用する。このように、ＤＮＡ合成は、テンプレート二本鎖核酸中の定義される点に向けられる。テンプレート核酸が存在する場合、２以上の配列特異的（例えば、遺伝子特異的）プライマーを用いて、指数関数的な増幅反応が開始される。反応は急速に進行し、数分以内に、ほんの数コピーのテンプレート核酸から検出可能なレベルの増幅産物まで、テンプレートの二本鎖核酸内に存在する配列の特異的増幅をもたらす。ＲＰＡ法は、例えば、米国特許第７，２７０，９８１号、同第７，３９９，５９０号、同第７，６６６，５９８号、同第７，４３５，５６１号、同第８，０７１，３０８号、及びＷＯ  ２０１０／１４１９４０で開示されており、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
用語「テンプレート」及び「プライマー」は、交換可能に使用され、一般的に、ポリメラーゼを用いる標的配列のヌクレオチド増幅のための出発点として機能するオリゴヌクレオチド配列を指す。テンプレートは、標的配列の認識領域に結合し、かつ認識領域の上流にニッキング酵素結合領域及びニッキング酵素結合領域の上流に安定化領域を含有する、オリゴヌクレオチドとして定義される。本明細書に開示される組成物は、標的核酸配列を増幅するテンプレートのセットを含有してよい。テンプレートは、標的核酸配列に相補的であるか又は１以上の位置で標的核酸配列とは異なる、配列を含んでよい。本明細書に開示されるＮＥＡＲ増幅法に適するテンプレートの設計は、例えば、米国特許第９，６１７，５８６号及び同第９，６８９，０３１号に提供されており、これらの各々は参照により本明細書に組み込まれる。
【００６２】
本方法のテンプレートは、例えば、スペーサー、ブロッキング基、及び修飾ヌクレオチドを含んでよい。修飾ヌクレオチドは、組成及び／若しくは構造において天然のヌクレオチド並びにヌクレオチド三リン酸とは異なるヌクレオチド又はヌクレオチド三リン酸である。修飾は、天然に生じるもの、又はメチルトランスフェラーゼなどのヌクレオチドを修飾する酵素による修飾から生じるものを含む。修飾ヌクレオチドはまた、合成又は非天然のヌクレオチドを含む。例えば、修飾ヌクレオチドは、２’−０−メチル及び２’−フルオロなどの２’修飾を有するものを含む。他の２’修飾ヌクレオチドは、当技術分野で知られており、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，０９６，８９７号に記載されている。本明細書で使用する修飾ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド三リン酸は、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識部位が存在する二本鎖核酸の一方の鎖上に修飾が存在する場合に、修飾ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド三リン酸が、制限酵素による切断から修飾鎖を保護するように修飾されてよい。そのため、修飾ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチド三リン酸の存在は、二本鎖核酸の切断よりもむしろ、ニッキングを促進する。ブロッキング基は、ポリメラーゼによる標的配列に依存しない核酸ポリメライゼーションを阻害するためにテンプレートに付加できる化学部分である。ブロッキング基は通常、テンプレートの３’末端に位置している。ブロッキング基の例は、例えば、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、ホスホロチオエート、アルカンジオール残基、ペプチド核酸、及び例えば、コルジセピンを含む３’−ＯＨを欠くヌクレオチド誘導体を含む。スペーサーの例は、例えば、Ｃ３スペーサーを含む。スペーサーは、例えば、テンプレート内で使用でき、また、例えば、標識などの他の基を結合させるために、例えば、５’末端で使用され得る。
【００６３】
本発明の別の態様において、試料中のＲＳＶを検出する方法であって、対象から試料を取得する工程；試料から核酸を抽出する工程；及び核酸を増幅する工程、を含み、上記核酸が、本明細書に記載のテンプレート及びプローブを用いて増幅及び検出される、方法が提供される。
【００６４】
本発明は、例えば、ゲル電気泳動、質量分析、ＳＹＢＲ  Ｉ蛍光、ＳＹＢＲ  ＩＩ蛍光、ＳＹＢＲゴールド、ピコグリーン、ＴＯＴＯ−３、インターカレート色素の検出、ＦＲＥＴ、分子ビーコン検出、表面捕捉、キャピラリー電気泳動、標識ヌクレオチドの取り込みからなる群から選択される方法により増幅産物を検出することをさらに含んで捕捉、蛍光偏光、及び側方流動捕捉による検出を可能にする。増幅産物は、例えば、二本鎖ＤＮＡ中にインターカレートする化学部分によって検出できる。例えば、ＳＹＢＲグリーン（登録商標）は、二本鎖ＤＮＡを結合し、励起時に光を放つ。そのため、産物が蓄積するにつれて、蛍光が増加する。増幅産物は、例えば、少なくとも１つの捕捉プローブが、増幅配列に結合する固体表面上に固定化される、例えば、固体表面法を用いて検出できる。全ての態様のいくつかの実施形態において、増幅産物を検出することは、「リアルタイム蛍光」を用いて実行される。
【００６５】
用語「リアルタイム蛍光」は、同一又は異なるオリゴヌクレオチド基質への蛍光色素分子及びクエンチャー部分の結合によって生成される蛍光シグナルを介する核酸増幅産物の検出を指す。一般的に使用されるプローブの例は、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ、分子ビーコンプローブ、及びＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プローブである。簡単に説明すると、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ、分子ビーコン、及びＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プローブは各々、互いに近接して取り付けられた蛍光レポーター色素（「フルオロ（ｆｌｕｏｒ）」とも呼ばれる）及びクエンチャー部分を有する。ハイブリダイズしていない状態では、フルオロとクエンチャー分子の近接が、プローブからの蛍光シグナルの検出を妨げ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブの場合には、増幅中、ポリメラーゼが、その上にプローブが結合されたテンプレートを複製するときに、ポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼ活性がプローブを切断し、そのため、フルオロ及びクエンチャーが互いに分離するので、各複製サイクルで蛍光が増加する。この事象がビーコンの構造に立体構造変化を誘導し、それによりフルオロとクエンチャーを分離するので、分子ビーコンプローブは、相同な産物のアニーリングに続き蛍光を発する。簡単に説明すると、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）プローブ及びＳＣＯＲＰＩＯＮ（登録商標）プローブは、分子ビーコンと同様に、特定の産物がプローブにアニーリングし伸長されたときに、これがフルオロとクエンチャーの分離をもたらし、蛍光シグナルを放出する。
【００６６】
標的核酸及び核酸配列の生成又は存在は、側方流動装置によっても検出及び監視され得る。側方流動装置はよく知られている。これらの装置は一般に、毛管力によりそれを通って流体が流れる、固相流体透過性流路を含む。例は、様々な適切なコーティングが施されたディップスティックアッセイ及び薄層クロマトグラフィープレートを含むが、これらに限定されない。流路上に固定化されるのは、試料のための様々な結合試薬、結合パートナー又は試料のための結合パートナーを含むコンジュゲート及びシグナル生成システムである。試料の検出は、いくつかの方法；例えば、酵素的検出、ナノ粒子検出、比色検出、及び蛍光検出で達成できる。酵素的検出は、側方流動装置の表面上で相補的又は実質的に相補的な核酸標的にハイブリダイズされる酵素標識プローブを含み得る。生じた複合体は、適切なマーカーで処理されて、読み取り可能なシグナルを発し得る。ナノ粒子の検出は、金コロイド、ラテックス及び常磁性ナノ粒子を使用できるビーズ技術を伴う。一例では、ビーズは、抗ビオチン抗体にコンジュゲートされてよい。標的配列を直接ビオチン化するか、又は標的配列を配列特異的なビオチン化プローブにハイブリダイズさせてもよい。金及びラテックスは、肉眼で見える比色シグナルを生じ、常磁性粒子は、磁場中で励起されると見えないシグナルを生じ、特殊な読取装置によって解釈することができる。
【００６７】
核酸はまた、側方流動装置上で捕捉されてよい。捕捉の手段は、抗体に依存する方法及び抗体に依存しない方法を含み得る。抗体依存性捕捉は一般に、抗体捕捉ライン及び標的に相補的な又は実質的に相補的な配列である標識プローブを含む。
【００６８】
抗体非依存性捕捉は一般に、２つの結合パートナーの間の非共有結合性相互作用、例えば、ビオチン化プローブとストレプトアビジンラインの間の高親和性で不可逆的な結合を使用する。捕捉プローブは、側方流動膜上に直接固定化されてよい。抗体依存性と抗体非依存性の両方の方法が、マルチプレックスに使用され得る。
【００６９】
標的核酸及び核酸配列の生成又は存在はまた、マルチプレックスＤＮＡ配列決定によって検出及び監視され得る。マルチプレックスＤＮＡ配列決定は、ＤＮＡのプールから標的ＤＮＡ配列を特定する手段である。この技術は、多くの配列決定テンプレートの同時処理を可能にする。プールされた複数のテンプレートは、プロセスの完了時に個々の配列に分割できる。
【００７０】
用語「相補的な」及び「実質的に相補的な」は、配列決定又は増幅される一本鎖核酸上のヌクレオチド間又は核酸間、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の２つの鎖間又はオリゴヌクレオチドプライマーとプライマー結合部位の間の塩基対形成を指す。相補的なヌクレオチドは、一般に、ＡとＴ（又はＡとＵ）、及びＧとＣである。本発明の文脈内で、列挙された特定の配列の長さは例示的であり限定されるものではないということ、及びそれらが列挙された配列と同じ標的上の位置にハイブリダイズするという条件で、同一のマップ位置をカバーするが、塩基の数がわずかに少ない又は多い配列は、その配列の等価物であると考えられ本発明の範囲内であることを理解されたい。核酸は、ハイブリダイズするために完全な相補性を必要としないことが理解されているので、本明細書に開示されるプローブ及びプライマー配列は、特異的なプライマー及びプローブとしての有用性を失うことなく、ある程度まで修飾されてよい。一般的に、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％の相同性を有する配列は、本発明の範囲内に入る。当技術分野で知られているように、相補的な核酸配列及び部分的に相補的な核酸配列のハイブリダイゼーションは、ストリンジェンシーを増減するためのハイブリダイゼーション条件の調整によって、すなわち、ハイブリダイゼーション温度又は緩衝液の塩含有量の調整によって取得され得る。
【００７１】
全ての態様のいくつかの実施形態において、テンプレート及びプローブは、検出可能な標識で標識されて（例えば、それにコンジュゲートされる）よい。本明細書で使用する用語「検出可能な標識」及び「標識」は、検出可能な（好ましくは、定量可能な）シグナルを提供するために使用でき、かつ共有結合又は非共有相互作用を介して（例えば、イオン結合若しくは水素結合を介して、若しくは固定化、若しくは吸着などにより）核酸又はタンパク質に結合され得る任意の化学部分を指す。標識は一般的に、蛍光、化学発光、放射能、比色分析、質量分析、Ｘ線回折又は吸着、磁性、又は酵素活性などによって検出可能なシグナルを提供する。標識の例は、ハプテン、酵素、酵素基質、補酵素、酵素阻害剤、フルオロフォア、クエンチャー、発色団、磁性粒子又は磁性ビーズ、レドックス感受性部分（例えば、電気化学的に活性な部分）、発光マーカー、放射性同位体（放射性ヌクレオチドを含む）、及び結合対のメンバーを含む。より具体的な例は、フルオレセイン、フィコビリタンパク質、テトラエチルローダミン、及びβ−ガラクトシダーゼを含む。結合対は、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／アビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、ビオチン／カプタビジン、エピトープ／抗体、プロテインＡ／免疫グロブリン、プロテインＧ／免疫グロブリン、プロテインＬ／免疫グロブリン、ＧＳＴ／グルタチオン、Ｈｉｓタグ／金属イオン（例えば、ニッケル、コバルト又は銅）、抗原／抗体、ＦＬＡＧ／ＭＩ抗体、マルトース結合タンパク質／マルトース、カルモジュリン結合タンパク質／カルモジュリン、酵素−酵素基質、受容体−リガンド結合対、並びに結合対の類似体及び変異体を含み得る。
【００７２】
本明細書で使用する用語「蛍光標識」及び「フルオロフォア」は、交換可能に使用され、物質が異なる波長（励起波長）の放射によって照射された時に特定の波長（発光波長）で電磁エネルギーを放つ任意の物質を指し、かつ試料中の目的の分析物と特異的に相互作用又は反応して１以上の光シグナルを提供できる化学的若しくは生化学的分子又はその断片を包含することが意図される。
【００７３】
本明細書に提供される方法で使用するための代表的なフルオロフォアは、例えば、ＦＡＭ、（テトラメチルローダミン）テキサスレッド（商標）、緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、フルオレセイン、フルオレセイン５−イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、シアニン色素（Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、ボディピ（Ｂｏｄｉｐｙ）色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及び／又はアレクサフルオロ色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ダンシル、塩化ダンシル（ＤＮＳ−Ｃｌ）、５−（ヨードアセトアミド）フルオレセイン（５−ＩＡＦ、６−アクリロイル−２−ジメチルアミノナフタレン（アクリロダン）、７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イルクロリド（ＮＢＤ−Ｃｌ）、臭化エチジウム、ルシファーイエロー、ローダミン色素（５−カルボキシローダミン６Ｇ塩酸塩、リサミンローダミンＢスルホニルクロリド、ローダミン−Ｂ−イソチオシアネート（ＲＩＴＣ（ローダミン−Ｂ−イソチオシアネート）、ローダミン８００）；テトラメチルローダミン５−（及び６−）イソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ））、テキサスレッド（商標）、塩化スルホニル、１−アニリノナフタレン−８−スルホン酸（ＡＮＳ）及び６−（ｐ−トルイジニル）ナフタレン−ｅ−２−スルホン酸（ＴＮＳ）を含むが、これらに限定されないナフタルアミン（ｎａｐｈｔｈａｌａｍｉｎｅ）スルホン酸、アンスロイル脂肪酸、ＤＰＨ、パリナリン酸、ＴＭＡ−ＤＰＨ、フルオレニル脂肪酸、フルオレセインホスファチジルエタノールアミン、テキサスレッドホスファチジルエタノールアミン、ピレニルホスファチジルコリン、フルオレニルホスファチジルコリン、メロシアニン５４０、ナフチルスチリル、３，３’ジプロピルチアジカルボシアニン（ｄｉＳ−Ｃ３−（５））、４−（ｐ−ジペンチルアミノスチリル）−１−メチルピリジニウム（ｄｉ−５−ＡＳＰ）、Ｃｙ−３ヨードアセトアミド、Ｃｙ−５−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｃｙ−７−イソチオシアネート、ＩＲ−１２５、チアゾールオレンジ、アズールＢ、ナイルブルー、Ａｌフタロシアニン、オキサキシン（Ｏｘａｘｉｎｅ）１，４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヘキスト３３３４２、ＴＯＴＯ、アクリジンオレンジ、エチジウムホモ二量体、Ｎ（エトキシカルボニルメチル）−６−メトキシキノリニウム（ＭＱＡＥ）、Ｆｕｒａ−２、カルシウムグリーン、カルボキシＳＮＡＲＦ−６、ＢＡＰＴＡ、クマリン、フィトフルオロ、コロネン、及び金属−リガンド複合体を含む。
【００７４】
蛍光クエンチャーはまた、検出可能な標識と見なされることに留意すべきである。例えば、蛍光クエンチャーは蛍光色素に接触されてよく、クエンチングの量が検出され得る。
【００７５】
本明細書に提供される方法で使用するためのハプテンは、例えば、ジゴキシゲニン、グルタチオン及びビオチンを含む。
【００７６】
本明細書に提供される方法で使用するための酵素は、例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ、西洋ワサビオキシダーゼ（ＨＲＰ）、大豆ペルオキシダーゼ（ＳＢＰ）、ウレアーゼ、β−ラクタマーゼ及びグルコースオキシダーゼを含む。
【００７７】
本明細書に記載の生体試料中のＲＳＶの有無を検出するための組成物、例えば、試薬混合物は、ＤＮＡポリメラーゼを含み得る。本明細書に開示されるＤＮＡポリメラーゼは、真核生物又は原核生物のポリメラーゼであり得る。ポリメラーゼは、例えば、ゲオバチルス・ボアジチＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ、ＢｓｔＤＮＡポリメラーゼ（巨大断片）、９ＮｍＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（大腸菌）、ＤＮＡポリメラーゼＩ、巨大（クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ））断片、クレノウ断片、（３’，５’エクソ−）、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）（エクソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｄｅｅｐ  ＶｅｎｔＲ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＥＸＴ  ＤＮＡ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ（商標）ＩＩホットスタートＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（商標）高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｈｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）ＩＩ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、ＶｅｎｔＲ（登録商標）（エクソ−）ＤＮＡポリメラーゼ、ＲｅｐｌｉＰＨＩ（商標）Ｐｈｉ２９  ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ｒＢｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、巨大断片（ＩｓｏＴｈｅｒｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ）、ＭａｓｔｅｒＡｍｐ（商標）ＡｍｐｌｉＴｈｅｒｍ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｆｌ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｂｒ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ  Ｂｅｔａ、ＴｈｅｒｍｏＰｈｉ  ＤＮＡポリメラーゼ及びＰｙｒｏｐｈａｇｅ  ３１７３（Ｌｕｃｉｇｅｎ）、又はそれらの組み合わせから選択されてよい。
【００７８】
試薬混合物及び緩衝溶液などの、本明細書に記載の生体試料中のＲＳＶの有無を検出するための組成物は、抗菌剤又は防腐剤を含んでよい。抗菌剤は、微生物の増殖を阻害し、試薬混合物又は緩衝溶液の貯蔵寿命を高めることができる。抗菌剤は、塩化ベンザルコニウム、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン、プロクリン（ＰｒｏＣｌｉｎ）（登録商標）（例えば、プロクリン３００（登録商標）、プロクリン（登録商標）９５０など）、アジド、メルチオレート、及び／又は抗生物質を含み得る。いくつかの実施形態において、抗菌剤は、５−クロロ−２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オン及び２−メチル−４−イソチアゾリン−３−オンを含む。
【００７９】
「一定温度」、「等温条件」、「本質的に等温」又は「等温」は、増幅反応の過程の間、その反応の温度が、本質的に又は実質的に一定に維持される反応条件のセットを意味する。本方法の増幅方法の利点は、温度が上限温度と下限温度の間で循環される必要がないことである。ニッキング及び伸長反応は、同じ温度で又は同じ狭い温度範囲内で動作する。しかしながら、温度が正確に１つの温度で維持される必要はない。高温を維持するために使用される機器が、反応混合物の温度を、例えば、１度、０．８度、０．６度、０．４度、若しくは０．２度未満など、数度、又は数十分の一だけ変化させ得る場合、これは、増幅反応に有害でなく、なおも等温反応であると考えられ得る。
【００８０】
本発明は、マルチプレックス増幅のために使用できる。そのため、例えば、本発明の特定の実施形態において、少なくとも２つの標的配列が増幅され得る。用語「マルチプレックス増幅」は、目的の２以上の核酸の増幅を指す。「増幅され得る」とは、増幅反応が、少なくとも２つの標的配列を増幅するのに適切なテンプレート及び酵素を含むことを意味する。そのため、例えば、増幅反応は少なくとも２つの標的配列を検出するために調製されるが、標的配列の一方のみが実際に検査される試料中に存在し、したがって一方の配列のみが実際には増幅され得るが、両方の配列が増幅され得る。或いは、２つの標的配列が存在する場合には、増幅反応は、標的配列の両方の増幅をもたらし得る。マルチプレックス増幅反応は、それに対する適切なテンプレート及び酵素をこの反応が含む標的配列の、１つ、いくつか、又は全ての増幅をもたらし得る。
【００８１】
本明細書で使用する用語「生体試料」又は「試料」は、対象（すなわち、患者）から得られる又は由来する試料を指す。一例として、生体試料は、血液、血漿、血清、リンパ液、滑液、脳脊髄液、羊水、羊膜臍帯血、涙、唾液、粘液分泌物、尿及び鼻咽頭洗浄液からなる群から選択され得る、対象から得られる組織液であり得る。気道からの代表的な生体試料は、傷及び喉の拭き取り検体、咽頭洗浄液、鼻腔拭き取り検体、及び下気道からの検体を含む。
【００８２】
本明細書で使用する「取得する」又は「取得すること」は、「直接的」又は「間接的」手段によって試料を所有することになる任意の手段であり得る。試料を直接取得することは、試料を取得するためのプロセスを行うこと（例えば、抽出などの物理的方法を行うこと）を意味する。試料を間接的に取得することは、別の当事者又は供給源（例えば、試料を直接獲得した第三者の研究室）から試料を受け取ることを指す。試料を直接取得することは、身体の物質、例えば、血液、例えば、以前に患者から単離された血液などの出発物質における物理的変化を含むプロセスを行うことを含む。そのため、取得は、対象からの試料の採取及び／又は除去を意味するために使用される。さらに、「取得」はまた、以前に試料を所有していた別の人から試料を受け取ることを意味するために使用される。
【００８３】
試料中の標的核酸内に存在する標的配列は、試料が取得された後に、最初に標的核酸を精製することなく、本発明の方法を用いて増幅できる。用語「精製する」は、例えば、標的核酸を試料中に存在する阻害物質及びバックグラウンド材料から実質的に分離することを意味し得る。本発明によれば、取得された試料は、標的核酸を濃縮することなく、又は試料中に存在する阻害物質及びバックグラウンド材料を実質的に除去することなく、例えば、試料中の細胞を溶解するのに適する緩衝液で希釈されてよい。
【００８４】
「対象」という用語は、動物若しくはヒト、又は動物若しくはヒト由来の１以上の細胞を指す。好ましくは、対象はヒトである。対象はまた、ヒト以外の霊長類を含んでよい。細胞は、組織中に保持された細胞、細胞クラスター、不死化細胞、トランスフェクト細胞又は形質転換細胞、及び物理的又は表現型的に改変された動物に由来する細胞を含む、任意の形態であり得る。ヒト対象は患者として知られ得る。
【００８５】
さらに他の実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼ；標的配列のアンチセンス鎖の３’末端に相補的又は実質的に相補的である認識領域を３’末端に含む核酸増幅のための第１のテンプレート；認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；並びにニッキング酵素結合部位及びニッキング部位の上流の安定化領域；標的配列のセンス鎖の３’末端に相補的又は実質的に相補的である認識領域を３’末端に含む核酸増幅のための第２のテンプレート；認識領域の上流のニッキング酵素結合部位及びニッキング部位；並びにニッキング酵素結合部位及びニッキング部位の上流の安定化領域；１つの酵素が第１及び該第２のテンプレートのニッキング部位でニッキング可能であるか、又は第１の酵素が第１のテンプレートのニッキング部位でニッキング可能でありかつ第２の酵素が第２のテンプレートの酵素部位でニッキング可能である、１以上のニッキング酵素、を含む、核酸増幅のための本発明の方法に従うキットが提供される。
【００８６】
本方法に使用されるキットはまた、別々の容器、パケット、チューブ、バイアル、及びマイクロタイタープレートなどの任意の数の構成要素の１以上を含み得るか、又は構成要素は、そのような容器中で様々な組み合わせで組み合わされ得る。
【００８７】
キットの構成要素は、例えば、１以上の容器中に存在し得、例えば、構成要素の全てが１つの容器中に存在し得るか、又は、例えば、酵素は、テンプレートとは別の容器中に存在してもよい。構成要素は、例えば、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）されるか、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｉｅｄ）されるか、又は安定な緩衝液中に存在し得る。一例では、ポリメラーゼ及びニッキング酵素は単一の容器中で凍結乾燥形態にあり、テンプレートは異なる容器中で凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）されるか、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ  ｄｒｉｅｄ）されるか、又は緩衝液中に存在する。或いは、別の例において、ポリメラーゼ、ニッキング酵素、及びテンプレートは、単一の容器中で凍結乾燥形態にある。或いは、ポリメラーゼ及びニッキング酵素は、異なる容器中に分けられてよい。
【００８８】
キットはさらに、例えば、反応に使用されるｄＮＴＰ、又は修飾ヌクレオチド、キュベット又は反応に使用される他の容器、又は凍結乾燥成分の再水和のための水若しくは緩衝液のバイアルを含み得る。使用される緩衝液は、例えば、ポリメラーゼとニッキング酵素活性の両方に適切であり得る。
【００８９】
本発明の方法に使用されるキットはまた、本明細書に記載の１以上の方法を実行するための指示書及び／又は本明細書に記載の１以上の組成物若しくは試薬の説明書を含み得る。指示書及び／又は説明書は、印刷されたフォームであってよく、キット挿入物に含まれていてもよい。キットはまた、そのような指示書又は説明書を提供するインターネット上の記述を含み得る。
【００９０】
キットはさらに、例えば、ＦＲＥＴに使用される試薬、側方流動装置、ディップスティック、蛍光色素、金コロイド粒子、ラテックス粒子、分子ビーコン、又はポリスチレンビーズなどの、検出方法に使用される試薬を含み得る。
【００９１】
本方法及び本キットの利点は、サーモサイクラー、インキュベーションオーブン、水浴、及びヒートブロックを含む、一定の温度を提供する任意の装置で使用できることである。
【００９２】
検出のための捕捉プローブを用いる方法は、例えば、捕捉プローブが増幅核酸に結合するように、増幅産物鎖に相補的な又は実質的に相補的な配列を含む核酸分子（捕捉プローブ）の使用を含む。プローブは、特定の実施形態において、検出可能な標識に連結され得、増幅産物は、増幅産物に特異的にハイブリダイズするプローブの検出可能な標識に基づいて検出され得る。反応は、例えば、さらに、捕捉プローブに組み込まれるか又は結合される分子に対する抗体を含んでよい。或いは、例えば、捕捉プローブ、又は捕捉プローブに結合する分子は、例えば、酵素標識、例えば、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、若しくはベータガラクトシダーゼ、例えば、フルオレセイン若しくはローダミンなどの蛍光標識、又は、例えば、化学発光活性若しくは生物発光活性を有する他の分子を組み込むことができる。いくつかの実施形態において、プローブは、固体支持体に連結され、増幅産物鎖は、当業者によって知られ選択された条件下で、固体支持体に連結された捕捉プローブに特異的に固定化できる。後者の実施形態において、固体支持体に固定化された増幅産物は、洗浄、イオン交換、固体支持体からの放出、又は他の処理工程などの処理工程に供されてよい。増幅産物は、いくつかの実施形態において、固体支持体に固定化された時に、検出され得る。本発明の実施形態はまた、これらの検出方法と分析方法の組み合わせを含む。
【００９３】
さらに別の実施形態において、本方法はさらに、ＲＳＶ感染を有すると診断されている対象を特定するために、対象の臨床記録を修正することを含む。好ましくは、臨床記録は、コンピュータ読み取り可能な媒体に保存される。
【００９４】
実施例
本発明をさらに以下の実施例に記載するが、これは、特許請求の範囲に記載される発明の範囲を限定するものではない。当業者なら、例示的なアッセイのために、反応の体積及びフォーマット、アッセイが行われる時間の長さ、及び各反応物の量に多くの変更を施すことができることを理解する。
【００９５】
実施例１．ＲＳＶゲノムＤＮＡのＮＥＡＲ
標的の選択
複数のＲＳＶ株にわたって強い保存を示す一方でＲＳＶに固有である、非構造遺伝子ＮＳ２及び遺伝子Ｎを標的にするＮＥＡＲアッセイを開発した。最初のバイオインフォマティクス分析を、ＮＣＢＦのヌクレオチドデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｔｎ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｕｃｃｏｒｅ）及びゲノムデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｏｍｅ？ｄｂ＝ｇｅｎｏｍｅ）から利用可能な配列データを用いて行った。多重配列アラインメントを行って保存領域を特定した。相同性を示す全ての配列セグメントをＢＬＡＳＴ分析に供してこれらの配列がＲＳＶに固有であったかどうかを決定した。ＢＬＡＳＴ分析に続いて、ＲＳＶに固有と特定された全ての配列をテンプレートセットの生成に使用した（ヌクレオチドコレクション（ｎｒ／ｎｔ）データベースを用いて実行するＢＬＡＳＴ分析）。テンプレートセットを、研究室内の自動化ソフトウェアツールを用いることによって、部分的に作製した。インシリコでのフィルタリングを次いで適用して、実験室でスクリーニングするためのテンプレートセットの選択を確定した。一般に、これらのフィルタリング基準は、ＮＥＡＲの性能並びにほとんどの核酸増幅技術に共通するパラメータに特異的に影響を与える可能性がある、研究室で特定したいくつかのパラメータを含む、アッセイ性能を低下させる可能性のある潜在的な相互作用についてテンプレートセットを分析することを含んだ。これらのフィルタリング基準を用いて、「ＲＳＶ  Ａ」及び「ＲＳＶ  Ｂ」テンプレートのセットをスクリーニングのために選択した。
【００９６】
スクリーニングプロセスは、ＲＳＶを検出するための以下のアッセイの開発をもたらした。アッセイは、少なくとも１つのＲＳＶ標的核酸、参照株ＮＣ＿００１８０３．１のヌクレオチド位置７８０〜８１７に位置する非構造遺伝子ＮＳ２、及び／又は参照株Ｎ２  ＫＦ８９３２６０．１の位置１２２０〜１２６１に位置するヌクレオキャプシド遺伝子Ｎを増幅する。ＮＳ２遺伝子は、ホストＩ型インターフェロン活性を阻害するのに関与する（免疫系を回避するのに役立つ）、非構造２タンパク質（ＮＳ２）をコードする。Ｎ遺伝子は、ウイルスの複製及び転写を助ける、ヌクレオキャプシドタンパク質をコードする。
【００９７】
「ＲＳＶ  Ａ」アッセイは、ＲＳＶ参照株ＮＣ＿００１８０３．１のヌクレオチド位置７８０〜８１７（ＮＳ２遺伝子内）を標的とし、「ＲＳＶ  Ｂ」アッセイは、ＲＳＶ参照株Ｎ２  ＫＦ８９３２６０．１のヌクレオチド位置１２２０〜１２６１を標的とする。アッセイのテンプレート、プローブ（分子ビーコン）及び生成物の配列を以下の表１及び２に提供する。
【００９８】
【表１】
2020533974.tif 000002
【００９９】
【表２】
2020533974.tif 000003
【０１００】
アッセイ標的配列が、パブリックドメインに見出され、かつＲＳＶに固有の全てのそれぞれのＲＳＶ  ＡとＲＳＶＢの配列間で保存されていることを確認するために、多重配列のアラインメント及びＢＬＡＳＴ分析を行った。これらの配列の多重アラインメント分析は、ＲＳＶ  ＡとＲＳＶ  Ｂの両方のアッセイについて、パブリックドメインに見出される全ての配列にわたって良好な相同性を明らかにした。ＢＬＡＳＴ分析の際に、ＲＳＶ  Ａ＆Ｂの標的配列に顕著な相同性を含む種は他にないことが確認された。注意すべきことに、ＲＳＶ  Ａ標的は、ＲＳＶ  Ｂゲノムに顕著な相同性を示し、ＲＳＶ  Ｂ標的配列は、ＲＳＶ  Ａゲノムに顕著な相同性を示した。
【０１０１】
ＲＳＶ検査フォーマット
ＲＳＶ  ＮＥＡＲアッセイを、Ａｌｅｒｅ（商標）ｉ  プラットフォーム上で実行するために開発した。Ａｌｅｒｅ（商標）ｉ  プラットフォームは、加熱、混合及び自動化された結果出力での蛍光検出を提供するＡｌｅｒｅ（商標）ｉ機器、並びに試料受器（そこに溶出／溶解緩衝液が保存される）、検査基材（凍結乾燥ＮＥＡＲ試薬の２本のチューブを含む）及びトランスファーカセット（検査基材中にある試料受器から凍結乾燥ＮＥＡＲ試薬を含む２本のチューブの各々に溶出試料の１００μｌアリコートを移すように設計される）からなる、使い捨てのセットからなる。
【０１０２】
ＲＳＶアッセイは、２本のチューブ−１本のチューブにＲＳＶ  Ａ標的特異的アッセイ、及び第２のチューブにＲＳＶ  Ｂ／内部対照（ＩＣ）二重アッセイ（検査基材中のＡｌｅｒｅ（商標）ｉ機器上で並んで検査される）のアッセイである。
【０１０３】
溶出／溶解緩衝液（試料受器中で保存される）は、臨床試料の鼻／鼻咽頭拭き取り検体からのＲＳＶ生物の迅速な放出を可能にしかつ、迅速かつ効率的な溶解（強酸）を提供するように設計され、ＮＥＡＲアッセイを促進するのに必要な塩（ＭｇＳ０４と（ＮＨ４）２Ｓ０４の両方）も含んだ。
【０１０４】
アッセイ進行中に、２Ｘ対３Ｘ対４Ｘの凍結乾燥ボリューム混合物を比較するための試験を行った。これらの試験から、３Ｘ混合物ボリュームが、性能及び安定性の最適な組み合わせを提供したことが決定され、及びその結果、３Ｘ混合物を選択して、実現可能性に向けて進めた。また、アッセイ進行中に、溶出／溶解緩衝液を予熱するのに必要とされる時間の長さを分析した。１分、２分及び３分の予熱時間を比較し、これらのデータから、最良の実行条件は３分の予熱工程であると結論付けられた。
【０１０５】
図１及び図２は、それぞれ、精製ウイルスＲＮＡを用いるＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  Ｂアッセイを用いて行ったＬＯＤ試験の結果を示す。精製ＲＮＡストックを、再水和緩衝液１００μｌに添加される５μｌボリュームが標的の適切なコピー数を提供するように、適切な濃度に希釈した。反応を、標準的な「ホットスタート」アプローチを用いてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｍｘ３００５Ｐサーマルサイクラーにて行った。ＬＯＤ試験を、試料及び凍結乾燥混合物を両方とも３分間、５６℃で予熱し次いで組み合わせる標準的なＮＥＡＲ「ホットスタート」アプローチを用いて行った。図１から、標準的な「ホットスタート」アプローチを使用した場合に、ＬＯＤは５コピーのＲＳＶ  Ａの精製ウイルスＲＮＡであると結論付けられた。図２から、標準的な「ホットスタート」アプローチを使用した場合に、ＬＯＤは５０コピーのＲＳＶ  Ｂの精製ウイルスＲＮＡであると結論付けられた。
【０１０６】
内部対照
内部対照（ＩＣ）の存在は、ＰＯＣ診断装置の必須構成要素である。ＮＥＡＲについては、内部対照は、アッセイ試薬が適切に機能しており検査中に不活性化又は阻害されていないことの確証を提供する。これは、臨床試料が「陰性」と呼ばれていた場合に、特に重要である。「陰性」コールがアッセイの失敗によるものではなく、むしろ、標的生物が存在しないという事実に起因していることを確認するために、ＩＣは不可欠である。ＲＳＶ検査は２本のチューブの検査であり、ＲＳＶ  Ａ検出が１本のチューブの中で生じ、ＲＳＶ  Ｂ検出が第２のチューブの中で生じる。各チューブ中に対照を組み込む代わりに、単一ＩＣを、ＲＳＶ  Ｂアッセイを含むチューブに組み込んだ。ＩＣシステムは、ＲＳＶ  Ｂアッセイによって共有されるテンプレート、固有の短いＲＮＡオリゴヌクレオチド標的及びＩＣ産物特異的分子ビーコンのセットからなる（表２）。ＲＮＡオリゴヌクレオチドは、標的テンプレートセットの認識領域に相補的であるが標的スペーサー領域と異なるスペーサー領域を有する、５’及び３’末端を含有する。簡単に説明すると、同じテンプレートセットが、標的とＩＣの両方を増幅するために使用される。
【０１０７】
凍結乾燥
実行可能なＰＯＣ技術を提供するために、ＲＳＶ検出に使用する試薬は、周囲温度（最大３０℃）で長期間（例えば、６ヶ月〜３６ヶ月）、又は２〜８℃で保存される場合には、最小時間、安定であることが必要である。このレベルの安定性を提供するために、ＮＥＡＲアッセイ試薬は、凍結乾燥された後にパッケージ化されて水分と酸素の両方への試薬の曝露を最小限にする必要がある。
【０１０８】
これを達成するために、ＮＥＡＲアッセイ試薬を、賦形剤のデキストロース及びトレハロースを含有する混合物中で合わせ、凍結乾燥に供した。
【０１０９】
混合組成物と凍結乾燥法の両方の最適化を行って、長期安定性を提供しながら活性を保持する適切な凍結乾燥混合物を得た。共に進めるために選択した最終の凍結乾燥混合組成物及び凍結乾燥法を、それぞれ、以下の表３及び表４に示す。ＲＳＶ検査フォーマットは２本のチューブを提供し、１本のチューブはＲＳＶ  Ａ標的アッセイを提供し、第２のチューブはＲＳＶ  ＢとＩＣアッセイの両方を提供する。これらの試薬は、同じ凍結乾燥法を用いて凍結乾燥され、本質的に同じ試薬のセットを含有する（各チューブが、標的のための、並びに／又はＩＣ特異的増幅及び検出のためのオリゴヌクレオチドの固有のセットを含有するという事実を除く）。
【０１１０】
【表３】
2020533974.tif 000004
【０１１１】
【表４】
2020533974.tif 000005
【０１１２】
両方の混合物を３Ｘ（３３．３μｌ）で凍結乾燥させることは、混合物を３倍の濃度に乾燥させ、続いて、１００μｌの体積になるように再懸濁して、最終ＩＸ濃度の各試薬を提供することを意味する。このアプローチは、ＩＸ混合物を凍結乾燥に使用した場合と比較して、各混合物に添加される２種類の賦形剤（デキストラン及びトレハロース）の濃度を３倍効果的に減少させる。凍結乾燥ＮＥＡＲ材料の安定性を最大化するプロセスでの最終工程は、パッケージングである。凍結乾燥プロセスが完了すると、乾燥試薬を１０％未満の相対湿度の雰囲気に供した後すぐに、乾燥剤を含有する耐湿及び酸素耐性ホイルポーチに入れる。すると、試薬は、明らかな性能の損失なく、長期間保存できる。
【０１１３】
ＲＳＶ溶出／溶解
ＲＳＶの存在を検出するために、臨床試料を収集するために使用された拭き取り検体からのウイルスの溶出と、汎用輸送培地（ＵＴＭ）中の溶出又は貯蔵後のそのウイルスの溶解、の２つの工程が標的の増幅及び検出に先行して、標的ウイルスＲＮＡゲノムへのアクセスを可能にする。ＰＯＣ産物については、溶出及び溶解は、効率的で迅速かつ単純でなければならない。本発明者らは、拭き取り検体からＲＳＶウイルスを効果的に取り出しウイルスシェルを迅速かつ効率的に溶解してＮＥＡＲ増幅のためにウイルスゲノムＲＮＡを暴露させる、酸系の溶出及び溶解緩衝液を開発した。緩衝液の組成を表５に示す。これらの試薬は、この文書の後の節に示されるように、感度の高いＮＥＡＲ性能に十分な溶出及び溶解を提供する。
【０１１４】
【表５】
2020533974.tif 000006
【０１１５】
溶出／溶解緩衝液をＡｌｅｒｅ（商標）ｉ機器で３分間予熱し、約４２℃〜４５℃の温度に到達させた。この時点で、ＵＴＭの２００μｌアリコートを溶出／溶解緩衝液に添加して混合するか、又は拭き取り検体を素早く（１０秒）旋回し、溶出／溶解緩衝液に入れる。この文書の後の節で説明するように、溶出／溶解緩衝液は、拭き取り検体からのＲＳＶを効果的に溶出／溶解し、かつＵＴＭから移されたＲＳＶを溶解し、ＮＥＡＲ凍結乾燥材料の再懸濁後の高感度のＮＥＡＲ増幅及び検出を可能にすることが示された。
【０１１６】
実施例２．ＲＳＶ  Ａ／ＢのＮＥＡＲアッセイ性能に対するヒトゲノムＤＮＡの影響
ＮＥＡＲ技術の１つの潜在的阻害物質はヒトｇＤＮＡである。鼻の拭き取り検体試料をＲＳＶ感染の症候を示す患者から採取する場合、ヒトｇＤＮＡも拭き取り検体中に採取される可能性がある（白血球などの免疫細胞から又は局所上皮細胞から）。ヒトｇＤＮＡがＲＳＶ  Ａ、ＲＳＶ  Ｂ及びＲＳＶ  Ｂ＋ＩＣアッセイ性能に与える影響を評価するために、漸増量の精製ヒトｇＤＮＡを各アッセイに添加し標的とＩＣの両方の検出を監視する、試験を行った（図３Ａ〜Ｄ；図４Ａ〜Ｄ、及び図５）。
【０１１７】
図３Ａ〜Ｄに示すように、ヒトｇＤＮＡの存在は、ＮＴＣ反応を検査したときに、ヒトｇＤＮＡインプット（反応あたり０〜１０００ｎｇ）にかかわらず、蛍光シグナルがベースラインレベルにとどまったので偽陽性を生じなかった。ＲＳＶ  ＡアッセイのＬＯＤ（５コピー）では、ヒトｇＤＮＡの影響が強かった。５コピーの標的が１０ｎｇのヒトｇＤＮＡでなおも検出可能であったが、この量を超えるヒトｇＤＮＡの全てのインプットレベルは、実質的に完全な阻害をもたらした（図３Ｂ）。標的のコピー数が増加するにつれて、アッセイ性能は、より高いレベルのヒトｇＤＮＡの存在下で大幅に改善した（図３Ｃ〜Ｄ）ことから、標的増幅と臨床試薬の非特異的な消費との間に競争が生じていることが示唆される。標的コピー数が増加するにつれて、臨床試薬は、標的特異的増幅及び検出のためにより多く消費され、ヒトｇＤＮＡでの非特異的活性には使用されていない可能性が高い。
【０１１８】
図４Ａ〜Ｄにおいて、ヒトｇＤＮＡの存在は、ＮＴＣ反応を検査したときに、ヒトｇＤＮＡインプット（反応あたり０〜１０００ｎｇ）にかかわらず、蛍光シグナルがベースラインレベルにとどまったので偽陽性を生じなかった。ＲＳＶ  ＢアッセイのＬＯＤ（５０コピー）では、ヒトｇＤＮＡの影響が強く、ヒトｇＤＮＡの全てのインプットレベルは、実質的に完全な阻害をもたらした（図４Ｂ）。標的のコピー数が増加するにつれて、アッセイ性能は、より高いレベルのヒトｇＤＮＡの存在下で大幅に改善した（図４Ｃ〜Ｄ）ことから、標的増幅と臨床試薬の非特異的な消費との間に競争が生じていることが示唆される（上記のように）。
【０１１９】
図５において、ＲＳＶ  Ｂ＋ＩＣアッセイを０コピーの標的の存在下で（ＮＴＣ反応）、ヒトｇＤＮＡの量を増加させて実施した。ＩＣアッセイは、１００ｎｇのヒトｇＤＮＡの存在によってストレスを受けたときに、非常に優れた性能を示した。
【０１２０】
実施例３．Ａｌｅｒｅ（商標）ｉでの反応性分析（精製ＲＮＡ）−ＲＳＶ  Ａ
ＲＳＶ  Ａ反応性分析試験を、精製ウイルスＲＮＡを用いてＡｌｅｒｅ（商標）ｉ機器にて行ってアッセイの感度を評価した。精製ウイルスＲＮＡを予熱した溶出／溶解緩衝液（３分の予熱工程を模倣するために、４５℃に予熱した）に添加し、１００μｌアリコートを凍結乾燥反応に直ちに移して、増幅及び検出を開始した。各標的コピー数で、３つ組反応を行った。蛍光をリアルタイムで監視した。ＲＳＶ  Ａについては、アッセイは、５コピーの精製ＲＮＡを検出できたが、２コピーの精製ＲＮＡで、ベースラインを上回る十分な蛍光シグナルを示した（図６）。これらのデータは、ＲＳＶ  Ａアッセイについて５コピーの精製ＲＮＡの感度を示唆する。アッセイは、０．００５ｐｆｕの精製ウイルスを検出できる一方で、０．００２ｐｆｕでは、ほとんどの複製物は、バックグラウンド蛍光レベルを上回って検出された（図７）。これらのデータは、ＲＳＶ  Ａアッセイについて０．００５ｐｆｕの精製ウイルスの感度を示唆する。
【０１２１】
検出限界（精製ウイルス）−ＲＳＶ  Ａ
ＲＳＶ  Ａアッセイの感度を確認するために、検出限界（ＬＯＤ）試験を行った。試験を、反応あたり０．００５ｐｆｕ（反応性分析検査中に決定される感度の限界、節ｈを参照されたい）で開始した。ＬＯＤは、複製物の９５％が検出され得る最小標的濃度として定義される。ＲＳＶ  Ａ試験を、反応あたり０．００５ｐｆｕで始めたが、２０の複製物試験中、２つの複製物は陽性として検出されなかったので、標的濃度を０．０１ｐｆｕに増加した（２倍増加）。０．０１ｐｆｕでは、全ての複製物が陽性として検出され（図８）、したがってＬＯＤは、０．０１ｐｆｕ／反応の精製ウイルスＲＮＡ（株Ａ２）である。
【０１２２】
実施例４．Ａｌｅｒｅ（商標）ｉでの反応性分析（精製ＲＮＡ）−ＲＳＶ  Ｂ
ＲＳＶ  Ｂ反応性分析試験を、精製ウイルスＲＮＡを用いてＡｌｅｒｅ（商標）ｉ機器にて行ってアッセイの感度を評価した。精製ウイルスＲＮＡを予熱した溶出／溶解緩衝液（３分の予熱工程を模倣するために、４５℃に予熱した）に添加し、１００μｌアリコートを凍結乾燥反応に直ちに移して、増幅及び検出を開始した。各標的コピー数で、３つ組反応を行った。蛍光をリアルタイムで監視した。
【０１２３】
ＲＳＶ  Ｂについては、アッセイは、１０〜２５コピーの精製ＲＮＡを検出できたが、５コピーの精製ＲＮＡで、ベースラインを上回る十分な蛍光シグナルを示す複製物は無かった（図９）。これらのデータは、ＲＳＶ  Ｂアッセイについて１０〜２５コピーの精製ＲＮＡの感度を示唆する。図１０で、アッセイは、０．０２〜０．０５ｐｆｕの精製ウイルスを検出でき、０．０２ｐｆｕで全３つの複製物は弱い蛍光シグナルを示し、０．０１ｐｆｕでは、ほとんどの複製物は、ベースライン蛍光レベルを上回って検出された。これらのデータは、ＲＳＶ  Ｂアッセイについて０．０２〜０．０５ｐｆｕの精製ウイルスの感度を示唆する。ＩＣの性能もこの試験中に評価し、全ての場合において、堅牢な増幅／検出が提供され、全ての複製物についてシグナルは飽和していた（図１１〜１２）。
【０１２４】
Ａｌｅｒｅ（商標）ｉでの検出限界（精製ウイルス）−ＲＳＶ  Ｂ
ＲＳＶ  Ｂアッセイの感度を確認するために、検出限界（ＬＯＤ）試験を行った。試験を、反応あたり０．０５ｐｆｕ（反応性分析検査中に決定される感度の限界、節ｈを参照されたい）で開始した。ＬＯＤは、１９／２０の複製物（９５％）が検出され得る最小標的濃度として定義される。反応あたり０．０５ｐｆｕで、２０／２０の複製物が陽性として検出され（図１３）、したがって、ＬＯＤは０．０５ｐｆｕ／反応の精製ウイルスＲＮＡ（株Ｂ１）である。ＩＣ性能もこの試験中に評価し、全ての場合において、堅牢な増幅／検出が提供され、全ての複製物についてシグナルは飽和していた（図１４）。
【０１２５】
実施例５．ＮＴＣの再現性
ＲＳＶの標的がそれぞれの反応物中に存在しない場合にＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  Ｂアッセイが偽陽性の結果をもたらさないことを確認するために、ＮＴＣ反復試験を行った。各アッセイについて、２０のＮＴＣ反応を、蛍光をリアルタイムで監視してバックグラウンド蛍光レベルを超える増加が観察されたかどうかを決定しながら、Ａｌｅｒｅ（商標）ｉ機器にてスクリーニングした。図１５にＲＳＶ  Ａの結果を示し、図１６及び図１７に、ＲＳＶ  Ｂ及びＩＣアッセイの結果をそれぞれ示す。ＲＳＶ  ＡとＲＳＶ  Ｂの両方のアッセイは、偽陽性を示すことができなかったことから、アッセイは安定であること、及び偽陽性は今後の予想される問題ではないことを示す。データはまた、全ての複製物が強い（飽和）ＩＣ増幅及び検出を示したので、ＩＣシステムの再現性を示す。
【０１２６】
包括
ＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  Ｂアッセイをそれぞれ、ＲＳＶ株Ａ２及びＢ１を用いて開発した。これらの株は、精製ウイルス又は精製ＲＮＡとして市販されており、開発作業に適し、かつ便利である。ＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  Ｂアッセイが開発株以外の株で機能することを保証するために、追加のＲＳＶ株を購入し、検査した。ＲＳＶ  Ａについては、ＬＯＤは、開発株Ａ２を使用した場合に５コピーの精製ＲＮＡであると決定された。株Ａロングも５コピーの精製ＲＮＡで検査し、この標的コピー数での検出が堅牢であることが確認し、ＲＳＶ  ＡアッセイがＲＳＶ  Ａ株全体で機能できることを示唆する（図１８）。ＲＳＶ  Ｂについては、ＬＯＤは、開発株Ｂ１を使用した場合に０．５ｐｆｕの精製ウイルスであると決定された。菌株Ｂ  ９３２０及びＢ  １８５３７も０．５ｐｆｕの精製ウイルスでスクリーニングし、データはこの標的コピー数での検出が堅牢であることを確認し、ＲＳＶ  Ｂアッセイが複数のＲＳＶ  Ｂ株全体で機能できることを示唆する（図１９）。
【０１２７】
実施例６．交差反応性
ＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  ＢアッセイがＲＳＶに対する特異性を各々提供することを保証するために、一般的な呼吸器感染性病原体を用いて、一連の交差反応性実験を行った。インフルエンザＡウイルス、インフルエンザＢウイルス及び連鎖球菌Ａ細菌（一般的な呼吸器疾患感染性病原体）を、高い標的濃度でスクリーニングした。使用した各標的の濃度は、最悪な場合のシナリオを模倣するために意図的に高くし、反応あたりの最終濃度を、各反応に２μｌのストック材料を添加することに基づいて決定した。ＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  Ｂアッセイを、６ｅ５ｐｆｕ／反応でインフルエンザＡウイルスを、１ｅ６ｐｆｕ／反応でインフルエンザＢウイルスを、及び８ｅ６ｐｆｕ／反応で連鎖球菌Ａを用いてスクリーニングした。使用した各標的の濃度は、最悪な場合のシナリオを模倣するために意図的に高くし、反応あたりの最終濃度を、各反応に２μｌのストック材料を添加することに基づいて決定した。各標的を、３つ組反応で検査し、結果を図２０Ａ〜Ｂに示す。ＲＳＶ  Ａ又はＲＳＶ  Ｂアッセイは、インフルエンザＡ、インフルエンザＢ又は連鎖球菌Ａを検出せず、これらのアッセイは非ＲＳＶ種に対して良好な特異性を提供することを示した。ＲＳＶ  Ａについては、連鎖球菌Ａの１つの複製物が飽和蛍光シグナルを示した。この試料をその後、ＥＳＩ−ＭＳによって分析し、それは、生じた生成物が、ＲＳＶゲノム（この配列は連鎖球菌Ａゲノムに存在しない）の外れた増幅から生じる予想される生成物であったので、この反応にＲＳＶ標的／増幅物が混入していたことを確認した。
【０１２８】
特異性の確認のための非ＲＳＶ種に対するＲＳＶアッセイを検査することに加えて、ＲＳＶ  ＡアッセイをＲＳＶ  Ｂ標的に対してスクリーニングし、ＲＳＶ  Ｂアッセイを、ＲＳＶ  Ａ標的に対してスクリーニングした。ＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  Ｂの標的配列は、互いに類似しており、ある程度のレベルの交差反応性が予想された。図２１Ａに示すように、ＲＳＶ  ＡアッセイにＲＳＶ  Ｂウイルスを負荷した場合に、アッセイはそれを検出するが、ＲＳＶ  Ａウイルスの検出と比較して、感度が大幅に減少される。ＲＳＶ  Ａアッセイでは、ＬＯＤはＲＳＶ  Ａ標的に対し０．０１ｐｆｕ／反応であるが、この試験では、ＲＳＶ  Ａアッセイは、４００〜４，０００ｐｆｕ／反応のＲＳＶ  Ｂ標的までしか検出できなかった。同様に、ＲＳＶ  ＢアッセイにＲＳＶ  Ａウイルスを負荷した場合、アッセイはそれを検出するが、再び、ＲＳＶ  Ｂウイルスと比較して感度が減少した（図２１Ｂ）。ＲＳＶ  Ｂアッセイでは、ＬＯＤはＲＳＶ  Ｂ標的に対し０．５ｐｆｕ／反応であるが、１０〜１００ｐｆｕ／反応のＲＳＶ  Ａ標的しか検出できなかった。
【０１２９】
図２２及び２３に示されるのは、ＲＳＶ  Ａアッセイのテンプレートと分子ビーコン成分とＲＳＶ  Ａ標的とＲＳＶ  Ｂ標的のアラインメント（図２２）、並びにＲＳＶ  Ｂ標的及びＲＳＶ  Ａ標的に対するＲＳＶ  Ｂアッセイ成分（図２３）である。アラインメントから分かるように、ＲＳＶ  Ａ標的配列とＲＳＶ  Ｂ株のサブセットからのゲノム配列との間に有意な相同性がある。示されているのは、ＲＳＶ  Ａ標的配列に対して有意な相同性を有するいくつかの株である（Ｅ値＜１ｅ−０４、トップ２００リストからのトップ２４ヒットを表す）。ＢＬＡＳＴ分析から、他のＲＳＶ  Ｂ株は、ＲＳＶ  Ａ標的配列に有意な相同性を示さなかった（残りのトップ２００ヒット（２００中２５）全てＥ値＞１をもたらした）。トップＲＳＶ  Ｂヒットは確実に、ＲＳＶ  Ａ試薬を用いた場合に、ある程度のレベルのＲＳＶ  Ｂの増幅及び検出をもたらすのに十分な相同性を提供する。
【０１３０】
ＲＳＶ  Ａアッセイ及びＲＳＶ  Ｂ標的と同様に、ＲＳＶ  ＢアッセイとＲＳＶ  Ａのゲノム配列との間に有意な相同性がある。図２３に示すのは、ＲＳＶ  Ｂアッセイテンプレート、分子ビーコン及び生成物配列と整列させた代表的なＲＳＶ  Ａ株である。このＲＳＶ  Ａ株はトップ２００のＲＳＶ  Ａ  ＢＬＡＳＴヒットと同一であり（全てのヒットは３ｅ−０８のＥ値を有し）、ＲＳＶ  Ａゲノム配列はＲＳＶ  Ｂアッセイ標的配列に対して非常に高い相同性を有することを示唆し、ＲＳＶ  Ｂゲノムの外れた増幅がある程度生じることを示唆する。
【０１３１】
実施例７．臨床マトリックスの存在下でのアッセイ性能
臨床マトリックスの存在下で検査した場合のＲＳＶ  Ａ及びＢアッセイの性能に関する指標を提供するために、一連の匿名のドナーの拭き取り検体を、プールした試料として検査した。Ａ、Ｂ＆Ｃの３つのプールを作製し、各々はそれぞれ４人の個々の匿名ドナーの拭き取り検体からなる。各拭き取り検体を、拭き取り検体を１０秒間旋回し搾り出した後に緩衝液から取り出すことにより、２．５ｍｌの予熱した（３分）溶出緩衝液／溶解緩衝液中に溶出した。拭き取り検体溶出液をその後、組み合わせて、各１０ｍｌのプールを作製した。ＲＳＶ  Ａ及びＲＳＶ  Ｂアッセイを最初に、ＬＯＤウイルス濃度を用いてスクリーニングし、３／３の複製物が「陽性」結果をもたらすまで、ウイルス濃度を増加させた。データは、臨床マトリックスがアッセイ性能に影響を与えることができ、影響は大きく変化することを示す。ＲＳＶ  Ａアッセイは、プールＡを負荷した場合に、０．０１ｐｆｕ／反応（臨床マトリックスが存在しないアッセイのＬＯＤ）を検出できなかったが、０．０２にｐｆｕ／反応を倍増させると、再現可能な様式で良好な増幅及び検出が生じた。マトリックスプールＢは、ＲＳＶ  Ａアッセイが０．０１ｐｆｕ／反応で全複製物を容易に検出したので、最小限の阻害を提供した。図２４に示すように、匿名ドナーの拭き取り検体プールＣでスクリーニングしたＲＳＶ  Ａアッセイは、最も抑制性のプールであり、一貫性のある陽性の結果をもたらすためには、０．０５ｐｆｕ／反応（アッセイのＬＯＤを５倍上回る）の添加を必要とした。
【０１３２】
ＲＳＶ  Ｂアッセイは、プールＡ、Ｂ＆Ｃを負荷した場合に、０．５ｐｆｕ／反応（臨床マトリックスが存在しないアッセイのＬＯＤ）を検出できたが、増幅及び検出は強くなかった（図２５）。マトリックスプールＡは最も抑制性のプールであり、ごく一部の複製物がバックグラウンドを超える蛍光シグナルを示し、他の複製物は弱いシグナルを示した。検査した３つのマトリックスプールの各々について、１ｐｆｕ／反応に標的濃度を増加させると、強い増幅及び検出をもたらし、全複製物は飽和した蛍光シグナルは（アッセイのＬＯＤを２倍上回る）を生じた。
【０１３３】
ＲＮアーゼＰのｑＰＣＲアッセイを用いて、各マトリックスプール中に存在するヒトｇＤＮＡの量を定量した。ｑＰＣＲデータは、マトリックスＡ、Ｂ＆Ｃの試料が１００μｌあたりヒトｇＤＮＡをそれぞれ４．６ｎｇ、５．０ｎｇ及び４．９ｎｇ含有することを示唆する。これらの濃度は、実施例２のプール中のそれらと同様の濃度で負荷した場合に、アッセイが十分に機能することが示されたので、ＲＳＶ  Ａ、Ｂ又はＩＣアッセイに対して阻害性でないはずである。各プールのＲＮアーゼ及びＤＮアーゼのレベルも、ＩＤＴのＲＮアーゼＡｌｅｒｔキット及びＤＮアーゼＡｌｅｒｔキットを用いて定性的に決定した。３つのプールは非常に低いＤＮアーゼレベルを示したが、全３つのプールは顕著なＲＮアーゼ活性を保持し、プールＢは最大活性を示した（データは示さず）。各プールに見出されるＲＮアーゼ活性の顕著なレベルは、良好な増幅及び検出を提供するために各アッセイのＬＯＤを上回って標的インプットを増加させる必要があった図２２及び２３に示されるように、アッセイ性能の低下の主要原因であると考えられる。
【０１３４】
実施例８．臨床試料試験
ＲＳＶ  Ａ、ＲＳＶ  Ｂ及びＩＣアッセイが、臨床試料に対してどれくらい十分に機能するかを決定するために、−８０℃で凍結保存した５０種の直接臨床拭き取り検体試料及び−８０℃で凍結保存した５０種のＵＴＭ試料を使用した。試料は特徴付けられず、それは、たとえあったとしても、試料はＲＳＶ陽性であることが知られていなかったことを意味する。この試験の一環として、ＲＳＶ  Ａ＆Ｂ検査を臨床試料に対して行い、ＲＳＶ  ｑＰＣＲ（適切な場合に、ＲＳＶ＋／−状態及びコピー数を決定するために、「ゴールドスタンダード」として使用される）、ＲＮアーゼＰ  ｑＰＣＲ（ヒトｇＤＮＡ含量を決定するため）及びＲＮアーゼ／ＤＮアーゼヌクレアーゼ検査（ＲＮアーゼ及びＤＮアーゼ活性のレベルを決定するため）を実行することによってさらに特徴付けた。
【０１３５】
簡単に説明すると、緩衝液中に拭き取り検体を浸漬し、約１０秒間旋回し、拭き取り検体を搾り出し、その後拭き取り検体を取り出すことにより、２．５ｍｌの予熱した溶出緩衝液／溶解緩衝液に各々の拭き取り検体試料を最初に溶出させることによって、ＲＳＶ  Ａ＆Ｂ  ＮＥＡＲアッセイをスクリーニングした。溶出液をその後、増幅及び検出を開始するための機器に既に存在する凍結乾燥反応に直ちに移した。ＵＴＭ中の試料を、２．５ｍｌの予熱した溶出緩衝液／溶解緩衝液に２００μｌのＵＴＭを添加し、素早く混合することによって（上下にピペッティングすることにより）、スクリーニングした。溶出液を次いで、増幅及び検出を開始するための機器に既に存在する凍結乾燥反応に直ちに移した。全ての臨床試料を解凍し、使用前に周囲温度に到達させた。
【０１３６】
各試料における補助的な検査を以下のように実施した：溶出／溶解した各拭き取り検体の溶出液からそれぞれ１４０μｌを、ＲＮＡ及びＤＮＡを精製するために使用した。これらの精製試料をその後、ＲＳＶ  Ａ／ＢのｑＰＣＲ及びヒトｇＤＮＡの分析に使用した。各ＵＴＭ試料からそれぞれ１４０μｌを、ＲＮＡ及びＤＮＡを精製するために直接使用した（溶出／溶解前に）。Ｑｉａｇｅｎ  ＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡミニキット（カタログ＃５２９０４）を、核酸精製のために使用した。ＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ検査を、ＩＤＴ  ＲＮアーゼＡｌｅｒｔ（カタログ番号１１−０２−０１−０２）及びＤＮアーゼＡｌｅｒｔ（カタログ＃１１−０２−０１−０４）キットを用いて実行した。溶出／溶解した各拭き取り検体溶出液から１μｌ及び１μｌの１：１０希釈を、各ヌクレアーゼ検査でスクリーニングした。各ＵＴＭ試料からの１μｌ及び１μｌの１：１０希釈を、溶出／溶解前に、各ヌクレアーゼ検査でスクリーニングした。臨床試料使用後に、アリコートを−８０℃で凍結した。
【０１３７】
上記の全ての検査の結果を、以下の表（表６〜７）にまとめ、それは、各試料についてのＲＳＶ  ＮＥＡＲ  ｃａｌｌ（ＲＳＶ  Ａ及び／又はＲＳＶ  Ｂについての＋／−）、ＲＳＶ  Ａ／ＢのｑＰＣＲｃａｌｌ（＋／−）並びにＲＳＶのコピー数、ヒトｇＤＮＡ濃度（ナノグラム）並びにＲＮアーゼ／ＤＮアーゼ活性の相対レベルを含む。定義されたカットオフ閾値を有するアルゴリズム、臨床試料検査の時に開発されていなかったので、ＲＳＶ  Ａ／Ｂ  ＮＥＡＲ  ｃａｌｌを主観的に作製した（蛍光シグナル≧２×バックグラウンドを＋とみなした）。図２６〜３３は、スクリーニングした全臨床試料についてのリアルタイム蛍光曲線のまとめを示す。
【０１３８】
【表６】
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【表７】
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【０１３９】
より詳細に説明すると、これまでにスクリーニングした１００種の臨床試料のうち、３８種を、広い範囲の力価でｑＰＣＲによって陽性と判定し（９種のＲＳＶ  Ａ、２９種のＲＳＶ  Ｂ）、３８％の有病率を得た。ＲＳＶ  Ａの力価は、４９７コピー／反応〜１，８８１，６００コピー／反応の範囲であった。ＲＳＶ  Ｂの力価は、２６コピー／反応〜５，３８８，００９コピー／反応の範囲であった。ＲＳＶ  Ａ／Ｂ  ＮＥＡＲアッセイを実行した。ＲＳＶ  Ａ＆Ｂアッセイは、アッセイのＬＯＤ未満である最低のＲＳＶ  Ｂ試料（２６コピー／反応）を除いて、ＮＥＡＲ陽性として全ｑＰＣＲ陽性試料を検出できた。これらの結果は、全体の９７．４％の感度及び１００％の特異性を提供した。さらに、無効なｃａｌｌは無く、０％の無効率が得られた。実施例６で述べたように、ＲＳＶ  Ａ＆Ｂ  ＮＥＡＲアッセイは、互いに交差反応性があり、これは、臨床試料検査で見られ得る。９個のｑＰＣＲの確認されたＲＳＶ  Ａ陽性試料のうち、１個は、ＲＳＶ  Ｂ  ＮＥＡＲアッセイにより陽性として検出された。２９個のｑＰＣＲの確認されたＲＳＶ  Ｂ陽性試料のうち、１２個は、ＲＳＶ  Ａ  ＮＥＡＲアッセイにより陽性として検出された。
【０１４０】
スクリーニングした臨床試料の潜在的阻害特性に関して、各試料中に存在するヒトｇＤＮＡの量は、検出可能でないほどのわずかな量から、１００μｌのＮＥＡＲ反応あたり１．６μｇのｇＤＮＡまで大きく変化した（表８）。
【０１４１】
【表８】
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【０１４２】
定性的ＲＮアーゼＡｌｅｒｔアッセイを用いて測定した場合、ＲＮアーゼ活性も大幅に変化した。ＲＮアーゼ活性のレベルを、高（４つ星）、中程度（３つ星）、低い（２つ星）及び非常に低い（１つ星）の４つのレベルに主観的に分離した。高いＲＮアーゼ活性のｃａｌｌは、ＲＮアーゼＡｌｅｒｔアッセイにおける飽和シグナルの結果であった。非常に低いレベルは、ＲＮアーゼＡｌｅｒｔアッセイにおけるＲＮアーゼ活性のベースラインレベル（陰性対照）をわずかに上回るシグナルの結果であった（表９）。全体として、臨床試料の大部分は大量のＲＮアーゼ活性を保有し、これは、ＲＳＶ検査においてなど、標的がＲＮＡ種である場合に、潜在的にアッセイ阻害をもたらし得る。最後に、検査した１００種の臨床試料のうち、７種だけが測定可能なＤＮアーゼ活性を有し、全７試料は非常に低いレベルのＤＮアーゼを保有したことから、この潜在的な阻害物質は、ＲＳＶ検査の鼻拭き取り検体の阻害に重要な役割を担っていないことを示唆する。
【０１４３】
【表９】
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【０１４４】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と併せて説明してきたが、前述の説明は、例示であり、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図するものではないことを理解されたい。他の態様、利点、及び改変は、以下の特許請求の範囲内である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月6日(2020.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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