(57)【要約】  本発明は、試料中の細菌プロテアーゼを検出するためのセンサー及び方法に関する。特に、本発明は、試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼ活性を検出するためのセンサー及び方法に関する。センサー及び方法は、乳製品の腐敗を検出または予測するために使用されてもよい。本発明はまた、プロテアーゼアッセイ用の試料を調製するための方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼセンサー分子であって、ＫＱ、ＳＦ、ＦＭ、ＫＫ、ＫＮ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、ＱＱ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼ切断部位、ならびに以下の特徴：
（ｉ）前記標的配列の長さが、約５０アミノ酸未満である、
（ｉｉ）検出可能な標識、及び／または
（ｉｉｉ）前記プロテアーゼ切断部位のうちの２つ以上、
のうちの１つ以上を有する標的配列を含み、
前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断が、検出可能な変化を生じる、前記Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼセンサー分子。
【請求項２】
前記標的配列が、３、４、５、６、または７つのプロテアーゼ切断部位を含む、請求項１に記載のセンサー。
【請求項３】
前記標的配列が、ＳＦＭ（配列番号３７）、ＳＫＭＸＸＰＰ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸（配列番号４０）である）、及び／またはＫＫＮＱ（配列番号２４）を少なくとも含む、請求項１または請求項２に記載のセンサー。
【請求項４】
前記標的配列が、
ＳＦＭＫＫＮＱＮＴＥＩ（配列番号４５）、
ＳＦＭＮＱＮＴＥＩ（配列番号５７）、
ＬＳＦＭＡＩＰ（配列番号７０）、
ＬＱＧＳＦＭＫＫＮＱＮＴＥＩＧＳＦＥ（配列番号７２）、
ＬＱＧＳＦＭＮＱＮＴＥＩＧＳＦＥ（配列番号７３）、
ＬＱＧＳＬＳＦＭＡＩＰＧＳＦＥ（配列番号７４）、及び
ＬＱＧＳＫＱＫＱＫＱＫＱＧＳＦＥ（配列番号１１２）、
から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１または請求項２に記載のセンサー。
【請求項５】
前記標的配列が、検出可能な標識に結合されているＮ末端及び／またはＣ末端にアミノ酸リンカーを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項６】
前記検出可能な変化が、共鳴エネルギー移動、音響、電気化学ポテンシャル、蛍光、化学発光、燐光、吸光度、抗体結合、ＢＲＥＴ比、ＦＲＥＴ効率、または質量の変化である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項７】
前記検出可能な標識が、発色団、ナノ粒子、量子ドット、ビオロゲン、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項８】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる前記標的配列の切断が、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）の検出可能な変化をもたらす、請求項１〜７のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項９】
前記検出可能な標識が、２つの以上の構成要素を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１０】
前記検出可能な標識が、
ｉ）前記標的配列に共有結合されている化学発光ドナードメイン及びアクセプタードメイン、または
ｉｉ）蛍光団ドメイン及びアクセプタードメイン、
含む、請求項９に記載のセンサー。
【請求項１１】
１つのドメインが、前記標的配列のＮ末端に共有結合しており、前記他のドメインが、前記標的配列のＣ末端に共有結合している、請求項１０に記載のセンサー。
【請求項１２】
前記アクセプタードメインが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、またはそれらのうちのいずれか１つの生物学的に活性な多様体もしくはフラグメントであり、
前記化学発光ドナードメインが、ルシフェラーゼまたは生物学的に活性な多様体もしくはフラグメントであり、
前記標的配列が、ＳＦＭＫＫＮＱＮＴＥＩ（配列番号４５）、ＳＦＭＮＱＮＴＥＩ（配列番号５７）、またはＬＳＦＭＡＩＰ（配列番号７０）を含む、請求項１０または請求項１１に記載のセンサー。
【請求項１３】
ｉ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼの場合、０．１〜１０ｎＭ、もしくは０．１〜１００ｎＭのＥＣ５０を有し、及び／または
ｉｉ）ウシプラスミンと比較して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼへの感度が、少なくとも２０倍、または少なくとも１００倍高い、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のセンサーもしくはその標的配列をコードする単離核酸、または請求項１〜１３のいずれか１項に記載のセンサーもしくはその標的配列をコードする核酸を含むベクター。
【請求項１５】
ｉ）試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出するための、
ｉｉ）乳製品の腐敗を検出するための、または
ｉｉｉ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．感染を検出するための、
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のセンサーの使用。
【請求項１６】
試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出する方法であって、前記方法が、
ｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載のセンサーと、試料を接触させること、及び
ｉｉ）前記センサーの変化を検出すること、
を含み、前記変化が、前記試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼの存在に対応する、前記方法。
【請求項１７】
乳製品の腐敗を検出する方法であって、前記方法が、
ｉ）請求項１〜１３のいずれか１項に記載のセンサーと、試料を接触させること、及び
ｉｉ）前記センサーの変化を検出すること、
を含み、前記変化が、前記乳製品が腐敗しているか、腐敗し始めているか、または腐敗する可能性があることを示す、前記方法。
【請求項１８】
ｉ）少なくとも１ｐＭ、もしくは少なくとも１０ｐＭ、もしくは少なくとも１００ｐｍのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出し、及び／または
ｉｉ）１時間未満、３０分未満、または１５分未満で実施される、
請求項１６または請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれか１項に記載のセンサー及び１つ以上の許容される担体（複数可）を含む組成物。
【請求項２０】
カゼインミセルからプロテアーゼを解離する方法であって、前記方法が、カゼインに結合している前記プロテアーゼと競合する化合物の存在下で、カゼインミセルと結合しているプロテアーゼを含む組成物を超音波処理することを含む、前記方法。
【請求項２１】
以下の特徴：
ｉ）前記組成物が、カゼインに結合しているプロテアーゼを含む乳製品またはその抽出物の試料である、
ｉｉ）前記プロテアーゼが、少なくとも部分的には乳汁腐敗を引き起こす、
ｉｉｉ）前記プロテアーゼが、プラスミンである、
ｉｖ）前記化合物が、アミノカプロン酸である、
ｖ）前記組成物が、カルシウムキレート剤を含む、
ｖｉ）前記超音波処理が、１５分未満、１０分未満、５分未満、または２分未満実施される、及び
ｖｉｉ）前記超音波処理が、約５０℃未満、または４０℃未満、または３０℃未満の温度で実施される、
のうちの１つ以上が、適用される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
乳製品中のプロテアーゼの濃度を決定する方法であって、前記方法が、
（ｉ）請求項２０または請求項２１のいずれか１項に記載の方法を使用して、前記乳製品の試料を処理すること、
（ｉｉ）前記加工乳製品中のプロテアーゼ活性を測定すること、及び
（ｉｉｉ）前記プロテアーゼ活性に基づいて前記乳製品のプロテアーゼの濃度を決定すること、
を含む、前記方法。
【請求項２３】
ステップ（ｉｉ）が、
少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位を有する標的配列及び任意に検出可能な標識を含むセンサー分子と、前記加工乳製品を混合すること、
を含み、前記プロテアーゼによる前記標的配列の切断が、検出可能な変化を生じ、さらに前記ステップ（ｉｉ）が、
前記検出可能な変化を測定すること、
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記センサー分子が、請求項１〜１３のいずれか１項に規定の通りである、請求項２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試料中の細菌プロテアーゼを検出するためのセンサー及び方法に関する。特に、本発明は、試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼ活性を検出するためのセンサー及び方法に関する。センサー及び方法は、乳製品の腐敗を検出または予測するために使用されてもよい。
【背景技術】
【０００２】
乳汁は、急速に腐敗する傾向がある。腐敗は、内因性因子、例えば、乳汁中に天然に存在する酵素（例えば、プラスミン）及び、外因性因子、例えば、乳汁中に存在する微生物により産生される酵素、の双方の結果として起こる可能性がある。適切に貯蔵された冷蔵乳汁中に存在する最も一般的で豊富な腐敗微生物は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種であり、これは、低温細菌として分類され、低温条件下で選択的利点を有する。低温細菌は、低い貯蔵温度、例えば、４℃、で比較的急速に増殖する能力を有する。細菌の成長は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの培養物の分布密度が約１０６ｃｆｕ／ｍｌを超える時、周囲の培地への、プロテアーゼを含む酵素の産生及び分泌を伴う。これらのプロテアーゼは、攻撃的で比較的熱安定性がある。それらは、カゼインなどの乳タンパク質を分解することができ、貯蔵中のＵＨＴ全乳及び脱脂乳中の粘度、ゲル化、及び苦味の増加をもたらし、それにより、貯蔵寿命の低下をもたらし得る。低温殺菌及び超高温（ＵＨＴ）処理などの技術が腐敗を防止するのに役立ち、且つ、乳汁の貯蔵寿命を延長することに役立ち得るが、いくつかの細菌酵素は、熱処理に耐性がある。十分な酵素が、熱処理前にバクテリアにより産生される場合、ＵＨＴ乳は、処理された後でさえも腐敗し得る。これらの酵素のうち、プロテアーゼは、非常に低い濃度で存在していても、乳汁腐敗を引き起こし得るので、特に重要なものである。さらに、乳汁中のプロテアーゼは、フレーバー乳、変性乳、及び強化乳を含む幅広い他の乳製品、ならびに特殊調製粉乳、チーズ、及び超長寿命低温殺菌乳を含む乳汁から作製された粉末製品の収率、品質、及び／または貯蔵寿命に悪影響を与える可能性もある。
【０００３】
乳汁などの乳製品中の細菌プロテアーゼを測定するために、幅広い方法が使用されている。フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）カゼインプロテアーゼアッセイなどの、乳汁試料中の細菌プロテアーゼを検出するために最も一般に使用される方法は、大規模な操作を必要とする。それらは、製造後６〜９ヶ月の間にＵＨＴミルクの腐敗をもたらし得る非常に低レベルのプロテアーゼを検出するのに十分敏感ではないか、またはそれらを全く検出することができないかのいずれかである（Ｂｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、（２０１１））。さらに、これらの方法は一般に、遅く、数日から数週間中で結果もたらす。それ故、それらは、製品破損の原因の事後決定に使用されてもよいが、それらは乳製品の製造、加工、及び流通のリアルタイム管理にはほとんど役に立たない。
【０００４】
プラスミン由来の乳汁中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを識別する２つの方法、すなわち、ＨＰＬＣ及び競合ＥＬＩＳＡアッセイが報告されている（Ｄａｔｔａ  ａｎｄ  Ｄｅｅｔｈ，２００１；Ｄｕｐｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００７；Ｍａｒｔｉｎｓ，２０１５）。これらの方法は双方ともに、数時間から数日の長時間のインキュベーションを必要とし、その間に、プロテアーゼは、上清中に特異的ペプチドを放出する内因性κ−カゼインを枯渇させる。ＨＰＬＣに基づく方法は、特有のκ−カゼイン由来ペプチドを同定するために、示差酸沈殿、続いて、逆相分離を使用する（Ｄａｔｔａ及びＤｅｅｔｈ、２００１）。ＥＬＩＳＡ法は、試料中の残留したインタクトなカッパカゼイン（κカゼイン）を測定するために、ＰｆｌｕプロテアーゼのインタクトなＭｅｔ１０５−Ｐｈｅ１０６標的に特異的なモノクローナル抗体に依存する（Ｄｕｐｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）。アッセイ中の未消化κカゼインは、ＥＬＩＳＡプレートの内壁上の一定量の精製κカゼインと競合する。これらの方法は、乳汁の腐敗前のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼ活性を測定するのに適していない。
【０００５】
それ故、試料中の細菌プロテアーゼを検出するために使用することができるセンサー及び方法、特に、迅速に及び／または感度を増加させて実施することができる方法、が必要とされている。プラスミンなどの内因性因子による腐敗と細菌プロテアーゼなどの外因性因子による腐敗とを区別する方法もまた必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、試料中の細菌プロテアーゼを検出するために使用することができるセンサーを特定している。本発明者らはまた、これらのセンサーを使用して試料中の細菌プロテアーゼの存在を検出する改良された方法を特定している。彼らはまた、これらのセンサーを使用して乳製品の腐敗を検出するための改良された方法も特定している。
【０００７】
一態様では、ＫＱ、ＳＦ、ＦＭ、ＫＫ、ＫＮ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、ＱＱ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼ切断部位、ならびに以下の特徴：
（ｉ）標的配列の長さが、約５０アミノ酸未満である、
（ｉｉ）検出可能な標識、及び／または
（ｉｉｉ）プロテアーゼ切断部位のうちの２つ以上、
のうちの１つ以上を有する標的配列を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼセンサー分子が提供される。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、検出可能な変化を生じる。
【０００８】
一部の実施形態では、ＫＱ、ＳＦ、ＦＭ、ＫＫ、ＫＮ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼ切断部位、ならびに以下の特徴：
（ｉ）標的配列の長さが、約５０アミノ酸未満である、
（ｉｉ）検出可能な標識、及び／または
（ｉｉｉ）プロテアーゼ切断部位のうちの２つ以上、
のうちの１つ以上を有する標的配列を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼセンサー分子が提供される。
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、検出可能な変化を生じる。
【０００９】
一部の実施形態では、標的配列は、２つ以上のプロテアーゼ切断部位を含む。一部の実施形態では、標的配列は、３、４、５、６、または７つのプロテアーゼ切断部位を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、標的配列は、ＫＱ、ＳＦＭ（配列番号３７）、ＫＫＮＱ（配列番号２４）、ＮＴ、及びＥＩ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択されるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼ切断部位を含む。一部の実施形態では、標的配列は、ＳＦＭ（配列番号３７）及び／またはＫＫＮＱ（配列番号２４）を少なくとも含む。さらなる実施形態では、標的配列は、ＳＫＭＸＸＰＰ（配列番号４０）を含み、Ｘは、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、標的配列は、ＳＦＭＫＫＮＱＮＴＥＩ（配列番号４５）；ＳＦＭＮＱＮＴＥＩ（配列番号５７）；及びＬＳＦＭＡＩＰ（配列番号７０）から選択されるアミノ酸配列を含む。さらなる実施形態では、標的配列は、ＬＱＧＳＦＭＫＫＮＱＮＴＥＩＧＳＦＥ（配列番号７２）、ＬＱＧＳＦＭＮＱＮＴＥＩＧＳＦＥ（配列番号７３）、ＬＱＧＳＬＳＦＭＡＩＰＧＳＦＥ（配列番号７４）、及びＬＱＧＳＫＱＫＱＫＱＫＱＧＳＦＥ（配列番号１１２）から選択されるアミノ酸配列を含む。他の例としては、ＬＱＧＳＰＰＬＫＱＰＰＰＧＳＦＥ（配列番号１１３）、ＬＱＧＳＰＰＬＱＱＰＱＰＧＳＦＥ（配列番号１１４）、及びＬＱＧＧＳＧＧＳＬＫＱＱＧＧＳＧＧＳＦＥ（配列番号１１５）が挙げられる。
【００１１】
一部の実施形態では、標的配列は、検出可能な標識に結合しているＮ末端及び／またはＣ末端にアミノ酸リンカーを含む。一部の実施形態では、リンカーは、１つ以上のグリシン、セリン、及び／またはプロリン残基を含む。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、ＬＱＧ（配列番号９５）、ＧＳＦＥ（配列番号９６）、ＧＳＳＧＧＳ（配列番号９７）、ＧＳＰＰＬ（配列番号９８）、ＰＰＰＧＳ（配列番号９９）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１００）、ＧＧＳＧＧＳＬ（配列番号１０１）、及びＰＰＶＫＱＰＰＰ（配列番号４４）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、検出可能な変化をもたらす。一部の実施形態では、検出可能な変化は、共鳴エネルギー移動、音響、電気化学ポテンシャル、蛍光、化学発光、燐光、吸光度、抗体結合、ＢＲＥＴ比、ＦＲＥＴ効率、または質量の変化である。一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）に検出可能な変化をもたらす。
【００１３】
一部の好ましい実施態様では、センサー分子は、検出可能な標識を含む。好ましくは、検出可能な標識は、発色団、ナノ粒子、量子ドット、ビオロゲン、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００１４】
一部の実施形態では、検出可能な標識は、発色団である。好ましい実施形態では、発色団は、蛍光団、発光団、有機染料、無機染料、ホスホフォア（ｐｈｏｓｐｈｏｐｈｏｒｅｓ）、光吸収ナノ粒子、それらの組み合わせ、及びそれらの金属化錯体からなる群より選択される。
【００１５】
一部の実施形態では、検出可能な標識は、２つ以上の構成要素を含む。例えば、検出可能な標識は、２つの構成要素を含んでもよい。一部の実施形態では、検出可能な標識は、ｉ）標的配列に共有結合している化学発光ドナードメイン及びアクセプタードメイン、または、ｉｉ）蛍光団ドメイン及びアクセプタードメインを含む。一部の実施形態では、１つのドメインは、標的配列のＮ末端に共有結合しており、他のドメインは、標的配列のＣ末端に共有結合している。例えば、化学発光ドナードメインは、標的配列のＮ末端に共有結合していてもよく、アクセプタードメインは、標的配列のＣ末端に共有結合していてもよい。あるいは、アクセプタードメインは、標的配列のＮ末端に共有結合していてもよく、化学発光ドナードメインは、標的配列のＣ末端に結合していてもよい。
【００１６】
一部の好ましい実施態様では、検出可能な標識は、標的配列に共有結合している化学発光ドナードメイン及びアクセプタードメインを含む。一部の実施形態では、アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間的位置及び／または双極子配向は、標的配列がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼにより切断される場合に変更される。アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間的位置及び／または双極子配向の変更は、検出可能な変化を生じ得る。
【００１７】
一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、ＢＲＥＴ比の変化をもたらす。一部の実施形態では、ＢＲＥＴ比の変化は、観察された最大ＢＲＥＴ比の約２％〜約９５％である。一部の実施形態では、ＢＲＥＴ比の変化は、観察された最大ＢＲＥＴ比の約５％〜約９０％である。
【００１８】
一部の実施形態では、化学発光ドナードメインは、生物発光タンパク質である。一部の実施形態では、生物発光タンパク質は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、またはβ−グルコシダーゼからなる群より選択される。
【００１９】
一部の実施形態では、生物発光タンパク質は、ルシフェラーゼである。一部の実施形態では、ルシフェラーゼは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｔｅルシフェラーゼ、北米グローワームシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、レールロードワームルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、エクオリン、Ａｒａｃｈｎｏｃａｍｐａルシフェラーゼ、もしくは生物学的に活性な多様体、またはそれらのうちのいずれか１つのフラグメント、もしくは２つ以上のキメラからなる群より選択される。
【００２０】
一部の実施形態では、生物発光タンパク質は、ルシフェリン、カルシウム、セレンテラジン、セレンテラジンの誘導体もしくはアナログ、またはルシフェリンの誘導体もしくはアナログから選択される基質を有する。
【００２１】
一部の実施形態では、生物発光タンパク質は、補因子を必要とする。例えば、補因子は、ＡＴＰ、マグネシウム、酸素、ＦＭＮＨ２、カルシウム、またはそれらのうちの任意の２つ以上の組み合わせとしてもよい。
【００２２】
一部の実施形態では、アクセプタードメインは、蛍光アクセプタードメインである。一部の実施形態では、蛍光アクセプタードメインは、タンパク質である。一部の実施形態では、蛍光アクセプタードメインは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの青色蛍光多様体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光多様体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光多様体（ＹＦＰ）、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、増強ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、増強ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、Ｔｏｐａｚ、ＧＦＰｕｖ、不安定化したＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化したＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化したＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｔダイマー２、ｔダイマー２（１２）、ｍＲＦＰ１、ポシロポリン（ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ）、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ、モンスターＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＴａｇＲＦＰ、ＴｕｒＢｏＦＢ、及びフィコビリンタンパク質、ならびにそれらのうちのいずれか１つの生物学的に活性な多様体またはフラグメントからなる群より選択される。
【００２３】
あるいは、蛍光アクセプタードメインは、非タンパク質である。一部の実施形態では、蛍光アクセプタードメインは、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素、Ｂｏｄｉｐｙ色素、Ｃｙ色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光マイクロスフェア、発光マイクロスフェア、蛍光ナノ結晶、マリーナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミン、テキサスレッド、及び希土類元素キレート、ならびにそれらの任意の組み合わせまたは誘導体からなる群より選択される。
【００２４】
一部の実施形態では、アクセプタードメインは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ及びｍＯｒａｎｇｅ、ならびにそれらの任意の１つの生物学的に活性な多様体またはフラグメントからなる群より選択され、化学発光ドナードメインは、ルシフェラーゼまたは生物学的に活性な多様体もしくはフラグメントであり、標的配列は、ＳＦＭＫＫＮＱＮＴＥＩ（配列番号４５）、ＳＦＭＮＱＮＴＥＩ（配列番号５７）、またはＬＳＦＭＡＩＰ（配列番号７０）を含む。
【００２５】
一部の実施形態では、ｉ）アクセプタードメインは、ＧＦＰ２であり、化学発光ドナードメインは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼであり、標的配列は、ＳＦＭＫＫＮＱＮＴＥＩ（配列番号４５）を含むか、ｉｉ）アクセプタードメインは、ＧＦＰ２であり、化学発光ドナードメインは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ２であり、標的配列は、ＳＦＭＫＫＮＱＮＴＥＩ（配列番号４５）を含むか、ｉｉｉ）アクセプタードメインは、ＧＦＰ２であり、化学発光ドナードメインは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ８であり、標的配列は、ＳＦＭＫＫＮＱＮＴＥＩ（配列番号４５）を含むか、または、ｉｖ）アクセプタードメインは、ｍＯｒａｎｇｅであり、化学発光ドナードメインは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ８．６−５３５であり、標的配列は、ＳＦＭＫＫＮＱＮＴＥＩ（配列番号４５）を含む。
【００２６】
一部の実施形態では、ｉ）アクセプタードメインは、ＧＦＰ２であり、化学発光ドナードメインは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼであり、標的配列は、ＳＦＭＮＱＮＴＥＩ（配列番号５７）を含むか、ｉｉ）アクセプタードメインは、ＧＦＰ２であり、化学発光ドナードメインは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ２であり、標的配列は、ＳＦＭＮＱＮＴＥＩ（配列番号５７）を含むか、ｉｉｉ）アクセプタードメインは、ＧＦＰ２であり、化学発光ドナードメインは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ８であり、標的配列は、ＳＦＭＮＱＮＴＥＩ（配列番号５７）を含むか、または、ｉｖ）アクセプタードメインは、ｍＯｒａｎｇｅであり、化学発光ドナードメインは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ８．６−５３５であり、標的配列は、ＳＦＭＮＱＮＴＥＩ（配列番号５７）を含む。
【００２７】
一部の実施形態では、ｉ）アクセプタードメインは、ＧＦＰ２であり、化学発光ドナードメインは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼであり、標的配列は、ＬＳＦＭＡＩＰ（配列番号７０）を含むか、ｉｉ）アクセプタードメインは、ＧＦＰ２であり、化学発光ドナードメインは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ２であり、標的配列は、ＬＳＦＭＡＩＰ（配列番号７０）を含むか、ｉｉｉ）アクセプタードメインは、ＧＦＰ２であり、化学発光ドナードメインは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ８であり、標的配列は、ＬＳＦＭＡＩＰ（配列番号７０）を含むか、または、ｉｖ）アクセプタードメインは、ｍＯｒａｎｇｅであり、化学発光ドナードメインは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ８．６−５３５であり、標的配列は、ＬＳＦＭＡＩＰ（配列番号７０）を含む。
【００２８】
当業者が理解するように、ＥＣ５０及びセンサーの感度は、使用される検出方法に応じて変動し得る。一実施形態では、センサー切断は、実施例２及び１０に規定されるような方法を使用して検出される。この実施形態では、一例では、センサーは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼに対して、０．１〜１０ｎＭのＥＣ５０を有し、及び／または、センサーは、ウシプラスミンと比較して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼへの感度が少なくとも１００倍高い。代替的実施形態では、センサー切断は、実施例１２に規定されているような方法を使用して検出される。この実施形態では、一例では、センサーは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼに対して、０．１〜１００ｎＭのＥＣ５０を有し、及び／または、センサーは、ウシプラスミンと比較して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼへの感度が少なくとも２０倍高い。
【００２９】
一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｕｄｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ＬＢＳＡ１、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓである。
【００３０】
一部の実施形態では、センサーは、連続する一連のアミノ酸である。
【００３１】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のセンサーまたはその標的配列をコードする単離核酸を提供する。
【００３２】
さらに別の態様において、本発明は、本明細書に記載のセンサーまたはその標的配列をコードする単離核酸を含むベクターも提供する。
【００３３】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書に記載のセンサーをコードする核酸、もしくはその標的配列を含むベクター、または本明細書に記載のセンサーをコードする核酸、もしくはその標的配列を含む宿主細胞も提供し、核酸は、細胞内でセンサーまたはその標的配列を発現可能なプロモーターに作動可能に連結されている。
【００３４】
さらに別の態様では、本発明は、試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出する、本明細書に記載のセンサーの使用も提供する。
【００３５】
さらに別の態様では、本発明は、乳製品の腐敗を検出する、本明細書に記載のセンサーの使用も提供する。
【００３６】
さらに別の態様では、本発明は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．感染を検出する、本明細書に記載のセンサーの使用も提供する。
【００３７】
さらに別の態様では、本発明は、試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出する方法も提供し、方法は、
ｉ）本明細書に記載のセンサーと、試料を接触させること、及び
ｉｉ）センサーの変化を検出すること、
を含み、該変化は、試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼの存在に対応する。
【００３８】
一部の実施形態では、試料は、乳製品またはその抽出物、土またはその抽出物、臨床試料またはその抽出物、医療機器の試料、食品加工機器の試料、及び植物材料またはその抽出物からなる群より選択される。一部の実施形態では、臨床試料としては、血液、血清、痰、粘液、膿、腹腔液、及び他の体液が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、医療機器としては、カテーテル、静脈内ライン、人工呼吸器、透析機器などが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、食品加工機器としては、輸送用タンカー、保管タンク、加工機械、ライン、コネクタ、バルブなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３９】
さらに別の態様において、本発明は、乳製品の腐敗を検出する方法も提供し、この方法は、
ｉ）本明細書に記載のセンサーと、試料を接触させること、及び
ｉｉ）センサーの変化を検出すること、
を含み、該変化は、乳製品が腐敗するか、腐敗し始めるか、または腐敗する可能性があることを示す。
【００４０】
一部の実施形態では、乳製品は、未殺菌乳、低脂肪乳、無脂肪乳、低温殺菌乳、ＵＨＴ乳、ラクトース変性ＵＨＴ乳、強化ＵＨＴ乳、フレーバーＵＨＴ乳、及びこれらの製品の組み合わせ、ならびにＵＨＴ特殊調製粉乳、チーズ、ヨーグルト、乳清、バターミルク、クリーム、粉乳、乳児用調製粉乳、及びバターからなる群より選択される。
【００４１】
一部の実施形態では、検出可能な変化は、共鳴エネルギー移動、音響、電気化学ポテンシャル、蛍光、燐光、吸光度、抗体結合、ＢＲＥＴ比、ＦＲＥＴ効率、または質量の変化である。
【００４２】
一部の実施形態では、センサーは、化学発光ドナードメインを含み、方法は、化学発光ドナードメインのための基質を提供することをさらに含む。一部の実施形態では、基質は、ルシフェリン、カルシウム、セレンテラジン、セレンテラジンの誘導体もしくはアナログ、またはルシフェリンの誘導体もしくはアナログである。
【００４３】
一部の実施形態では、方法は、化学発光ドナードメインの補因子を提供することをさらに含む。一部の実施形態では、補因子は、ＡＴＰ、マグネシウム、酸素、ＦＭＮＨ２、カルシウム、またはそれらのうちの任意の２つ以上の組み合わせである。
【００４４】
一部の実施形態では、方法は、少なくとも１０ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出可能である。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出可能である。別の実施形態では、方法は、少なくとも１００ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出可能である。
【００４５】
一部の実施形態では、方法は、１時間未満、３０分未満、または１５分未満で実施される。
【００４６】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のセンサー及び１つ以上の許容される担体（複数可）を含む組成物を提供する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のセンサーを含むキットを提供する。
【００４８】
カゼインに結合しているプロテアーゼと競合する化合物の存在下で組成物を超音波処理すると、試料調製に必要な時間が低減することを、本発明者らは見出している。この方法を使用して調製された試料は、本出願の方法及び／または使用に使用することができる。
【００４９】
従って、別の態様において、本発明は、カゼインミセルからプロテアーゼを解離させる方法も提供し、方法は、カゼインミセルと結合しているプロテアーゼを含む組成物を、カゼインに結合しているプロテアーゼと競合する化合物の存在下で超音波処理することを含む。
【００５０】
一部の実施形態では、本発明は、カゼインミセルからプロテアーゼを解離させる方法も提供し、この方法は、カゼインミセルと結合しているプロテアーゼを含む組成物を、カゼインに結合しているプロテアーゼと競合する化合物及びカルシウムキレート剤の存在下で超音波処理することを含む。
【００５１】
一部の実施形態では、カゼインミセルと結合しているプロテアーゼを含む組成物は、カゼインに結合しているプロテアーゼを含む乳製品またはその抽出物の試料である。
【００５２】
好ましくは、プロテアーゼは、少なくとも部分的に乳汁腐敗を引き起こす。一部の実施形態では、プロテアーゼは、プラスミンである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、細菌プロテアーゼである。一部の実施形態では、細菌プロテアーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．により産生される。一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｕｄｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ＬＢＳＡ１、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓである。
【００５３】
一部の実施形態では、カゼインに結合しているプロテアーゼと競合する化合物は、リシンの誘導体またはアナログである。好ましい実施形態では、リシンの誘導体またはアナログは、アミノカプロン酸である。
【００５４】
一部の実施形態では、カルシウムキレート剤は、ヘキサメタリン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、フィチン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、及びエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸からなる群より選択される。好ましい実施態様では、カルシウムキレート剤は、クエン酸三ナトリウムである。
【００５５】
一部の実施形態では、超音波処理は、１５分間以下、１０分間以下、５分間以下、または２分間以下実施される。一部の実施形態では、超音波処理は、約１０μｍ〜約３００μｍ、または約１５μｍ〜約３００μｍ、好ましくは、約１５μｍ〜約２５μｍの超音波処理デバイス変位振幅で実施される。
【００５６】
一部の実施形態では、超音波処理は、約１１ｍｍ〜約２ｍｍのプローブ径で実施される。
【００５７】
一部の実施形態では、超音波処理は、約１０ｋＨｚ〜約６０ｋＨｚの、好ましくは、約２８ｋＨｚ〜約４０ｋＨｚ、の周波数で実施される。
【００５８】
一部の実施形態では、超音波処理は、約５５ワット未満、好ましくは、約２５ワット未満、最も好ましくは、約５ワット〜約８ワット、の電力で実施される。一部の実施形態では、試料が約１ｍｌ体積未満である場合、超音波処理は、約１ワット未満の音響出力レベルで実施される。
【００５９】
一部の実施形態では、超音波処理は、約５０℃未満、好ましくは、約４０℃未満、最も好ましくは、約３０℃未満、の温度で実施される。
【００６０】
さらに別の態様では、本発明は、乳製品中のプロテアーゼの濃度を決定する方法を提供し、方法は、
（ｉ）記載の超音波処理方法を使用して乳製品の試料を加工すること、
（ｉｉ）加工乳製品中のプロテアーゼ活性を測定すること、及び
（ｉｉｉ）プロテアーゼ活性に基づいて乳製品のプロテアーゼ濃度を決定すること、
を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、乳製品は、未殺菌乳、低脂肪乳、無脂肪乳、低温殺菌乳、ＵＨＴ乳、ラクトース修飾ＵＨＴ乳、強化ＵＨＴ乳、フレーバーＵＨＴ乳、ＵＨＴ特殊調製粉乳、チーズ、ヨーグルト、乳清、バターミルク、クリーム、粉乳、乳児用調製粉乳、及びバター、ならびにそれらの組み合わせ、及び／またはカゼインに結合しているプロテアーゼを含む、それらのうちの１つ以上の抽出物からなる群より選択される。
【００６２】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位を有する標的配列及び任意に検出可能な標識を含むセンサー分子と、加工乳製品を混合すること（プロテアーゼによる標的配列の切断は検出可能な変化を生じる）、ならびに、検出可能な変化を測定することを含む。
【００６３】
一実施形態では、センサー分子は、本発明のセンサー分子である。
【００６４】
一部の実施形態では、センサー分子は、本明細書に記載のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼセンサー分子である。一部の実施形態では、センサー分子は、検出可能な標識を含み、検出可能な標識は、化学発光ドナードメイン及び標的配列に共有結合しているアクセプタードメインを含む。
【００６５】
一部の実施形態では、プロテアーゼは、ＳＦ、ＦＭ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、ＱＱ、またはＫＺ（Ｚは、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｙ、ＶもしくはＥである）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される切断部位を有する。
【００６６】
一部の実施形態では、プロテアーゼは、ＳＦ、ＦＭ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、またはＫＺ（Ｚは、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｙ、Ｖ、もしくはＥである）、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される切断部位を有する。
【００６７】
本明細書の任意の実施形態は、別途具体的な記載のない限り、他の任意の実施形態に準用すると解釈されるべきである。
【００６８】
本発明は、本明細書に記載の具体的な実施形態により範囲が限定されるべきではなく、これは、例示のみを目的とするものである。機能的に等価な製品、組成物、及び方法は、本明細書に記載されるように、明らかに本発明の範囲内である。
【００６９】
本明細書を通して、別途具体的な記載のない限り、または、文脈が別途必要としない限り、単一のステップ、物質の組成物、ステップ群、または物質の組成物群への言及は、それらのステップ、物質の組成物、ステップ群、または物質の組成物群の１つ及び複数（すなわち、１つ以上）を包含すると解釈されるべきである。
【００７０】
本発明は、以下の非限定的により、且つ、添付に関して、以下に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】一実施形態による細菌プロテアーゼ活性を検出するためのＢＲＥＴ２センサー。センサーは、Ｐｈｅ−Ｍｅｔ切断部位を組み込む。
【図２】本開示の実施形態による未殺菌乳の前処理。（Ａ）４ｍｍのプローブ先端直径、４０ｋＨｚの周波数、１６μｍの振幅、ならびに０秒、３０秒、１分、及び２分の場合５Ｗの消費電力を有するように改良されたＨｏｎｄａ  ＺＯ４１超音波カッターを使用して、１．５ｍＬの試料を超音波処理し、（Ｂ）４ｍｍのプローブ先端直径、４０ｋＨｚの周波数、１９μｍの振幅、ならびに０秒、３０秒、１分、及び２分の場合８Ｗの消費電力を有するように改良されたＨｏｎｄａ  ＺＯ４１超音波カッターを使用して、１．５ｍＬの試料を超音波処理した。超音波処理後、試料を均質化する際に、超音波処理ステップがいかに有効であったかを判定するために、全ての試料を約１２，０００ｇで２分間遠心分離した。
【図３】Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株６５（レーン２）または対照（レーン１）と共にインキュベートした脱脂乳から調製した粗抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図４】種々の濃度のヒトプラスミン及びウシプラスミンと共にセンサーを１０分間インキュベートした後のプラスミンセンサーのＢＲＥＴ２応答。
【図５】０、１、１０、及び１００ｎＭのヒトプラスミン、ウシプラスミン、及び粗細菌プロテアーゼと共にセンサーを１０分間インキュベートした後のプラスミンセンサーのＢＲＥＴ２応答。
【図６】２８℃で１０分間インキュベーションした後の未殺菌乳中の、プラスミンのセンサーを使用した細菌プロテアーゼの較正。
【図７】５０％の全脂肪ＵＨＴ乳中の種々の濃度のウシプラスミン及び粗製細菌プロテアーゼと共にセンサーを１０分間インキュベートした後のＰｆｌｕセンサー１のＢＲＥＴ２応答。
【図８】５０％の全脂肪ＵＨＴ乳中の種々の濃度のヒトプラスミン及び粗製細菌プロテアーゼと共にセンサーを１０分間インキュベートした後のＰｆｌｕセンサー１のＢＲＥＴ２応答。
【図９】５０％の全脂肪ＵＨＴ乳中の種々の濃度のヒトプラスミン及び粗製細菌プロテアーゼと共にセンサーを１０分間インキュベートした後のＰｆｌｕセンサー２のＢＲＥＴ２応答。
【図１０】５０％の全脂肪ＵＨＴ乳中の種々の濃度のヒトプラスミン及び粗製細菌プロテアーゼと共にセンサーを１０分間インキュベートした後のＰｆｌｕセンサー３のＢＲＥＴ２応答。
【図１１】Ｒａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．の前処理プロトコール（２０１４）後に、熱処理した未殺菌乳に添加したヒトプラスミンを使用したＢＲＥＴ２プラスミンセンサーの較正。
【図１２】Ｒａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．の前処理プロトコール（２０１４）後に、熱処理した未殺菌乳試料に添加したヒトプラスミンを使用したＤ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩の較正。
【図１３】２ステップ前処理プロトコール後に、熱処理した未殺菌乳試料に添加したヒトプラスミンを使用したＢＲＥＴ２プラスミンセンサーの較正。
【図１４】２ステップ前処理プロトコール後に、熱処理した未殺菌乳試料に添加したヒトプラスミンを使用したＤ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩の較正。
【図１５】１ステップ前処理プロトコール後に、熱処理した未殺菌乳試料に添加したヒトプラスミンを使用したＢＲＥＴ２プラスミンセンサーの較正。
【図１６】１ステップ前処理プロトコール後に、熱処理した未殺菌乳試料に添加したヒトプラスミンを使用したＤ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩の較正。
【図１７】低出力超音波処理を含む１ステップ前処理プロトコール後に、熱処理した未殺菌乳試料に添加したヒトプラスミンを使用したＢＲＥＴ２プラスミンセンサーの較正。
【図１８】低出力超音波処理を含む１ステップ前処理プロトコール後に、未殺菌乳中のＰｆｌｕ１センサーを使用した細菌プロテアーゼの較正。
【図１９】低出力超音波処理を含む１ステップ前処理プロトコール後に、Ｐｆｌｕバイオセンサーを使用した未殺菌乳試料中で測定した細菌プロテアーゼレベル。試料１〜２０は、独立した未殺菌乳試料である。
【図２０】２８℃で１０分間インキュベーションした後の前処理なしの未殺菌乳中の、Ｐｆｌｕ１センサーを使用した細菌プロテアーゼの較正。
【図２１】２８℃で２時間インキュベーションした後の前処理なしの未殺菌乳中の、Ｐｆｌｕ１センサーを使用した細菌プロテアーゼの較正。
【図２２】２８℃で２時間インキュベートした後に低出力超音波処理を用いる１ステップの前処理プロトコールを用いた未殺菌乳中の、Ｐｆｌｕ１センサーを使用した細菌プロテアーゼの較正。
【図２３】Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株１１７（レーン２）または対照（レーン１）と共にインキュベートした脱脂乳から調製した粗抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。
【図２４】緩衝液及びＵＨＴミルク中で、０（対照）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株６５及び１１７由来の１ｎＭの粗細菌プロテアーゼと共に、センサーを１０分間インキュベートした後のＰｆｌｕ１センサーのＢＲＥＴ２応答。
【図２５】２８℃で２時間インキュベーションした後の未殺菌乳中の、Ｐｆｌｕ１センサーを使用した粗細菌プロテアーゼＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株１１７の較正。
【図２６】０（対照）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株６５由来の１ｎＭの粗細菌プロテアーゼと共に緩衝液中でセンサーを１０分間インキュベートした後のＰｆｌｕ−ＨセンサーシリーズのＢＲＥＴ２応答。
【図２７】０（対照）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株６５由来の１ｎＭの粗細菌プロテアーゼまたは１ｎＭのウシプラスミンを混ぜたＵＨＴ乳と共に、緩衝液中でセンサーを１０分間インキュベートした後のＰｆｌｕ−Ｈ１センサーのＢＲＥＴ２応答。
【図２８】０（対照）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株６５由来の１ｎＭの粗細菌プロテアーゼまたは１ｎＭのウシプラスミンを混ぜたＵＨＴ乳と共に、緩衝液中でセンサーを１０分間インキュベートした後のＰｆｌｕ−Ｈ２センサーのＢＲＥＴ２応答。
【図２９】０（対照）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株６５由来の１ｎＭの粗細菌プロテアーゼまたは１ｎＭのウシプラスミンを混ぜたＵＨＴ乳と共に、緩衝液中でセンサーを１０分間インキュベートした後のＰｆｌｕ−Ｈ３センサーのＢＲＥＴ２応答。
【図３０】０（対照）またはＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株６５由来の１ｎＭの粗細菌プロテアーゼまたは１ｎＭのウシプラスミンを混ぜたＵＨＴ乳と共に、緩衝液中でセンサーを１０分間インキュベートした後のＰｆｌｕ−Ｈ４センサーのＢＲＥＴ２応答。
【図３１】５０％の未殺菌乳中の種々の濃度のウシプラスミン及び粗細菌プロテアーゼと共に、センサーを１０分間インキュベートした後のＰｆｌｕ−Ｈ１センサーのＢＲＥＴ２応答。
【図３２】Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓとインキュベートした脱脂乳から調製した粗抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ。マーカー（レーン１）、株６５−１（レーン２）、６５−２（レーン３）、１１７（レーン４）、１００ｎｇのＢＳＡ（レーン５）、２００ｎｇのＢＳＡ（レーン６）、４００ｎｇのＢＳＡ（レーン７）、６００ｎｇのＢＳＡ（レーン８）、８００ｎｇのＢＳＡ（レーン９）、及び１０００ｎｇのＢＳＡ（レーン１０）。
【図３３】Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＴＬを使用したデンシトメトリー分析により決定したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の異なるＢＳＡ濃度（ｎｇ）の場合のバンドに対する、計算した体積。
【図３４】５０％の全脂肪ＵＨＴ乳中の種々の濃度のウシプラスミン及び粗製細菌プロテアーゼと共にセンサーを１０分間インキュベートした後のＰｆｌｕセンサー１のＢＲＥＴ２応答。ＢＳＡ標準との比較により決定した細菌プロテアーゼ。
【００７２】
配列表のキー
配列番号１〜９４及び１１２〜１１５  −  プロテアーゼセンサー分子の標的配列。
配列番号９５〜１０１  −  リンカー配列。
配列番号１０２  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ１−ＲＬｕｃ２をコードするヌクレオチド配列。
配列番号１０３  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ２−ＲＬｕｃ２をコードするヌクレオチド配列。
配列番号１０４  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ３−ＲＬｕｃ２をコードするヌクレオチド配列。
配列番号１０５  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ１−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号１０６  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ２−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号１０７  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ３−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号１０８  −  ＧＦＰ２−ｐｌａｓ１−ＲＬｕｃ２をコードするヌクレオチド配列。
配列番号１０９  −  ＧＦＰ２−ｐｌａｓ１−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号１１０  −  プラスミン標的配列。
配列番号１１１  −  Ｐｌａｓ１標的配列。
配列番号１１６  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ−Ｈ１−ＲＬｕｃ２をコードするヌクレオチド配列。
配列番号１１７  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ−Ｈ２−ＲＬｕｃ２をコードするヌクレオチド配列。
配列番号１１８  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ−Ｈ３−ＲＬｕｃ２をコードするヌクレオチド配列。
配列番号１１９  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ−Ｈ４−ＲＬｕｃ２をコードするヌクレオチド配列。
配列番号１２０  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ−Ｈ１−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号１２１  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ−Ｈ２−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号１２２  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ−Ｈ３−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
配列番号１２３  −  ＧＦＰ２−Ｐｆｌｕ−Ｈ４−ＲＬｕｃ２融合タンパク質。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
一般的な技術及び定義
別途具体的な明示のない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、（例えば、タンパク質化学、プロテアーゼ生物学、乳製品科学、乳製品技術、及び生化学などにおける）当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有すると解釈されるべきである。
【００７４】
別途指示のない限り、本発明に利用される組み換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技術は、当業者らに既知の標準的な手順である。このような技術は、Ｊ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９８４），Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｔ．Ａ．Ｂｒｏｗｎ（ｅｄｉｔｏｒ），Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １  ａｎｄ  ２，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｄ．Ｍ．Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ（ｅｄｉｔｏｒｓ），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  １−４，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９５  ａｎｄ  １９９６）、及びＦ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８、現在までの更新を全て含む）、Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，（１９８８）、ならびにＪ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｉｔｏｒｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（現在までの更新を全て含む）などの出典の文献を通して記載及び説明される。
【００７５】
「及び／または」、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」という用語は、「Ｘ及びＹ」または「ＸまたはＹ」のいずれかを意味すると理解されるべきであり、双方の意味またはいずれかの意味に明示的なサポートを提供すると解釈されるべきである。
【００７６】
文脈が別途示唆しない限り、センサー及び基質などの単数形の用語の言及は、明らかに複数形も意味する。例えば、単一分子ではなく論理的に多数の個々のセンサー分子は、デバイスを通って流れるか、またはウェル内に含有されるであろう。
【００７７】
本明細書で使用される場合、約という用語は、反対の記載がない限り、所定の値の±１０％、より好ましくは、±５％、さらにより好ましくは、±１％を指す。
【００７８】
本明細書を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形形態は、記載の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を含むが、他の任意の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を含まないことを意味すると理解されるであろう。
【００７９】
センサー
本明細書を通して、「センサー」、「細菌プロテアーゼセンサー」、及び「センサー分子」は、互換的に使用される。
【００８０】
一態様では、本出願は、ＫＱ、ＳＦ、ＦＭ、ＫＫ、ＫＮ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される少なくとも１つのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼ切断部位、ならびに以下の特徴：（ｉ）標的配列は、長さが約５０アミノ酸未満である；（ｉｉ）検出可能な標識；及び／または、（ｉｉｉ）プロテアーゼ切断部位のうちの２つ以上、のうちの１つ以上を有する標的配列を含むＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼセンサー分子を提供し、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、検出可能な変化を生じる。
【００８１】
一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｕｄｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ＬＢＳＡ１、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓである。好ましくは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓである。
【００８２】
一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼは、細胞外プロテアーゼである。好ましくは、プロテアーゼは、比較的熱安定性である。本明細書で使用される場合、「比較的熱安定性である」は、プロテアーゼが、９５℃に少なくとも８分間熱処理した後に、もしくは１４０℃に３秒間熱処理した後に、元の活性の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％もしくは８０％を、または類似した時間／温度曲線下面積をもたらす熱処理レジメンを保持することを意味する。好ましくは、プロテアーゼは、９５℃に少なくとも８分間の熱処理後の、もしくは１４０℃に３秒間熱処理後の元の活性の少なくとも２０％、または類似した時間／温度曲線下面積をもたらす熱処理レジメンを保持する。一部の実施形態では、プロテアーゼは、アルカリメタロプロテアーゼである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、セラリシンファミリーのプロテアーゼに属する。一部の実施形態では、プロテアーゼは、ＡｐｒＸプロテアーゼである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｎｏ  １１４（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＰｅｐｔ  ＩＤ  ＢＡＡ２８２６８）と少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する。
【００８３】
一部の実施形態では、センサーは、連続する一連のアミノ酸である。例えば、標的配列及び検出可能な標識は、限定されないが、標的配列のＮ末端に共有結合している化学発光ドナータンパク質ドメイン及び標的配列のＣ末端に共有結合しているアクセプタータンパク質ドメイン、または標的配列のＮ末端に共有結合しているアクセプタータンパク質ドメイン及び標的配列のＣ末端に共有結合している化学発光ドナータンパク質ドメイン、または標的配列のＮ末端に共有結合している蛍光団タンパク質ドメイン及び標的配列のＣ末端に結合しているアクセプタータンパク質ドメイン、または標的配列のＮ末端に共有結合しているアクセプタータンパク質ドメイン及び標的配列のＣ末端に共有結合している蛍光団タンパク質ドメインなどの単一の一連のアミノ酸配列である。
【００８４】
一部の実施形態では、本明細書で定義されるようなセンサーまたは標的配列をコードするポリヌクレオチド配列を含む単離核酸も提供される。例えば、一実施形態では、核酸分子は、配列番号８１、配列番号８２、または配列番号８３のポリペプチド配列をコードする配列を含む。本発明のセンサーをコードする配列に加えて、核酸分子は、プライマー部位、転写因子結合部位、ベクター挿入部位、及び核酸分解を阻止する配列（例えば、ポリアデノシンテール）などの他の配列を含有してもよい。核酸分子は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってよく、合成ヌクレオチドを含んでもよい。但し、ポリヌクレオチドは依然として、本発明のタンパク質を合成するために翻訳されることが可能である。
【００８５】
一部の実施形態では、核酸は、プラスミドなどのベクターの一部を形成する。上記の核酸配列に加えて、プラスミドは、原核生物の複製起点（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＯＲ１複製起点）、自律複製配列、セントロメア配列；核酸に作動可能に連結されている宿主細胞中で核酸を発現可能なプロモーター配列、核酸配列の下流に位置するターミネーター配列、抗生物質耐性遺伝子、及び／または分泌シグナル配列などの他の要素を含む。自律複製配列を含むベクターはまた、酵母人工染色体である。一部の代替実施形態では、ベクターは、バクテリオファージなどのウイルスであり、本発明の核酸配列に加えて、バクテリオファージの複製のための核酸配列、例えば、構造タンパク質、プロモーター、転写アクチベーターなど、を含む。
【００８６】
本発明のセンサーまたは標的配列を合成するために、本発明の核酸またはベクターを使用して、宿主細胞をトランスフェクトまたは形質転換してもよい。好適な宿主細胞としては、Ｅ．  ｃｏｌｉなどの原核細胞及び酵母細胞などの真核細胞、または哺乳動物もしくは植物細胞株が挙げられる。宿主細胞は、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムベースの方法、微粒子銃法などの当該技術分野において既知の技術を使用して、またはウイルスベクターの使用により、トランスフェクトまたは形質転換される。
【００８７】
トランスフェクション／形質転換の後、本発明の核酸またはベクターは、必要に応じて転写及び翻訳される。一部の実施形態では、合成タンパク質は、例えば、ベクター中の分泌シグナルの存在による細胞からの分泌、または宿主細胞の溶解及びそこからのタンパク質の精製のいずれかにより、宿主細胞から抽出される。
【００８８】
一部の実施形態では、センサーは、無細胞組成物として提供される。本明細書で使用される場合、「無細胞組成物」という用語は、もしあれば、極少ないインタクトな細胞を含有し、且つセンサーを含む単離組成物を指す。無細胞組成物の例としては、細胞（例えば、酵母細胞）抽出物、ならびに単離及び／または組み換えセンサー分子（例えば、タンパク質）を含有する組成物が挙げられる。細胞から無細胞組成物を調製する方法は、当該技術分野で周知である。
【００８９】
標的配列
本出願のセンサーは、少なくとも１つのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼ切断部位を有する標的配列を含む。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼ切断部位は、少なくとも、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼにより切断されるジペプチド配列である。通常は、ジペプチド配列中の最初のアミノ酸は、Ｐ１残基と呼ばれ、２番目のアミノ酸は、Ｐ１’残基と呼ばれる。プロテアーゼは、Ｐ１及びＰ１’残基間のペプチド結合を切断する。当業者により理解されるように、プロテアーゼ切断部位を囲む残基は、切断部位のプロテアーゼ認識、特異性、及び切断効率の認識を支援し得る。
【００９０】
一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＫＱ、ＳＦ、ＦＭ、ＫＫ、ＫＮ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、ＱＱ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＫＱ、ＳＦ、ＦＭ、ＫＫ、ＫＮ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＳＦ、ＦＭ、ＫＫ、ＫＮ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、ＱＱ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＳＦ、ＦＭ、ＫＫ、ＫＮ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＫＱである。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＳＦである。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＦＭである。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＫＫである。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＫＮである。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＮＱである。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＮＴである。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＥＩである。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＱＱである。
【００９１】
一部の実施形態では、標的配列は、少なくとも２つのプロテアーゼ切断部位を含む。一部の実施形態では、標的配列は、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、または少なくとも７つのプロテアーゼ切断部位を含む。一部の実施形態では、標的配列は、２、３、４、５、６、または７つのプロテアーゼ切断部位を含む。プロテアーゼ切断部位は、同じ切断部位の複数の反復、例えば、（ＫＱ）ｎ、（ＦＭ）ｎ、（ＦＭ）ｎ、（ＫＫ）ｎ、（ＫＮ）ｎ、（ＮＱ）ｎ、（ＮＴ）ｎ、（ＥＩ）ｎ、（ＱＱ）ｎ、及びそれらの組み合わせを含んでもよく、ｎは、２以上の整数、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、４０、５０、またはそれ以上である。プロテアーゼ切断部位は、任意の順序で標的配列に含まれ得る。例えば、標的配列は、ＫＱＫＱ（配列番号１）、ＫＱＳＦ（配列番号２）、ＫＱＦＭ（配列番号３）、ＫＱＫＫ（配列番号４）、ＫＱＫＮ（配列番号５）、ＫＱＮＱ（配列番号６）、ＫＱＮＴ（配列番号７）、ＫＱＥＩ（配列番号８）、ＫＱＱＱ（配列番号７５）、ＳＦＳＦ（配列番号９）、ＳＦＦＭ（配列番号１０）、ＳＦＫＫ（配列番号１１）、ＳＦＫＮ（配列番号１２）、ＳＦＮＱ（配列番号１３）、ＳＦＮＴ（配列番号１４）、ＳＦＥＩ（配列番号１５）、ＳＦＱＱ（配列番号７６）、ＦＭＦＭ（配列番号１６）、ＦＭＫＫ（配列番号１７）、ＦＭＫＮ（配列番号１８）、ＦＭＮＱ（配列番号１９）、ＦＭＮＴ（配列番号２０）、ＦＭＥＩ（配列番号２１）、ＦＭＱＱ（配列番号７７）、ＫＫＫＫ（配列番号２２）、ＫＫＫＮ（配列番号２３）、ＫＫＮＱ（配列番号２４）、ＫＫＮＴ（配列番号２５）、ＫＫＥＩ（配列番号２６）、ＫＫＱＱ（配列番号７８）、ＫＮＫＮ（配列番号２７）、ＫＮＮＱ（配列番号２８）、ＫＮＮＴ（配列番号２９）、ＫＮＥＩ（配列番号３０）、ＫＮＱＱ（配列番号７９）、ＫＮＦＭ（配列番号３１）、ＫＮＫＫ（配列番号３２）、ＮＱＮＱ（配列番号３３）、ＮＱＱＱ（配列番号８０）、ＮＴＮＴ（配列番号３４）、ＮＴＥＩ（配列番号３５）、ＮＴＱＱ（配列番号８１）、ＥＩＥＩ（配列番号３６）、ＥＩＱＱ（配列番号８２）、ＱＱＱＱ（配列番号８３）、ＱＱＫＱ（配列番号８４）、ＱＱＳＦ（配列番号８５）、ＱＱＦＭ（配列番号８６）、ＱＱＫＫ（配列番号８７）、ＱＱＫＮ（配列番号８８）、ＱＱＮＱ（配列番号８９）、ＱＱＮＴ（配列番号９０）、ＱＱＥＩ（配列番号９１）、ＫＱＱ（配列番号９２）、及びそれらの任意の組み合わせを含む。
【００９２】
一部の実施形態では、標的配列は、ＫＱ、ＳＦＭ（配列番号３７）、ＫＫＮＱ（配列番号２４）、ＮＴ、ＫＱＱ（配列番号９２）、及びＥＩ、ならびにそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、少なくとも、標的配列は、ＳＦＭ（配列番号３７）及び／またはＫＫＮＱ（配列番号２４）を含む。例えば、標的配列は、ＳＦＭＫＫＮＱ（配列番号３８）もしくはＫＫＮＱＳＦＭ（配列番号３９）またはその双方を含み得る。
【００９３】
一部の実施形態では、標的配列は、ＳＫＭＸＸＰＰ（配列番号４０）を含み、Ｘは、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、標的配列は、ＰＰＸＸＸＳＫＭＸＸＰＰ（配列番号４１）、ＰＰＸＸＳＫＭＸＸＰＰ（配列番号４２）、またはＰＰＸＳＫＭＸＸＰＰ（配列番号４３）を含み、Ｘは、任意のアミノ酸である。
【００９４】
一部の実施形態では、標的配列は、ＰＰＶＫＱＰＰＰ（配列番号４４）を含む。
【００９５】
一部の実施形態では、標的配列は、ウシプラスミンにより切断され得るジペプチド配列を含まない。ウシプラスミンがＫＺ間のペプチド結合を切断することが開示されており、Ｚは，Ｋ、Ｙ、Ｖ、またはＥからなる群より選択されるアミノ酸である。それ故、一部の実施形態では、標的配列は、ＫＫ、ＫＹ、ＫＶ、またはＫＥを含まない。好ましくは、プロテアーゼ切断部位は、ＫＱ、ＳＦ、ＦＭ、ＫＮ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＳＦ、ＦＭ、ＫＮ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００９６】
一部の実施形態では、標的配列は、ＳＦＭＫＫＮＱＮＴＥＩ（配列番号４５）、ＳＦＭＮＴＫＫＮＱＥＩ（配列番号４６）、ＳＦＭＱＮＴＥＩＫＫＮ（配列番号４７）、ＳＦＭＮＱＫＫＮＴＥＩ（配列番号４８）、ＳＦＭＮＱＮＴＫＫＥＩ（配列番号４９）、ＳＦＭＮＱＮＴＥＩＫＫ（配列番号５０）、ＫＫＮＱＳＦＭＮＴＥＩ（配列番号５１）、ＫＫＮＱＮＴＳＦＭＥＩ（配列番号５２）、ＫＫＮＱＮＴＥＩＳＦＭ（配列番号５３）、ＫＫＳＦＭＮＱＮＴＥＩ（配列番号５４）、ＫＫＮＱＳＦＭＥＩＮＴ（配列番号５５）、ＫＫＮＱＥＩＳＦＭＮＴ（配列番号５６）、ＳＦＭＮＱＮＴＥＩ（配列番号５７）、ＮＱＳＦＭＮＴＥＩ（配列番号５８）、ＮＱＮＴＳＦＭＥＩ（配列番号５９）、ＮＱＮＴＥＩＳＦＭ（配列番号６０）、ＳＦＭＮＴＮＱＥＩ（配列番号６１）、ＳＦＭＮＴＥＩＮＱ（配列番号６２）、ＳＦＭＮＱＥＩＮＴ（配列番号６３）、ＮＱＳＦＭＥＩＮＴ（配列番号６４）、ＮＱＥＩＳＦＭＮＴ（配列番号６５）、ＳＦＭＥＩＮＱＮＴ（配列番号６６）、ＥＩＳＦＭＮＴＮＱ（配列番号６７）、ＥＩＮＴＳＦＭＮＱ（配列番号６８）、ＥＩＮＴＮＱＳＦＭ（配列番号６９）、ＬＳＦＭＡＩＰ（配列番号７０）、またはＬＦＭＳＦＡＩＰ（配列番号７１）を含む。好ましくは、標的配列は、ＳＦＭＫＫＮＱＮＴＥＩ（配列番号４５）、ＳＦＭＮＱＮＴＥＩ（配列番号５７）、またはＬＳＦＭＡＩＰ（配列番号７０）を含む。
【００９７】
一部の実施形態では、標的配列は、ＬＱＧＳＦＭＫＫＮＱＮＴＥＩＧＳＦＥ（配列番号７２）、ＬＱＧＳＦＭＮＱＮＴＥＩＧＳＦＥ（配列番号７３）、ＬＱＧＳＬＳＦＭＡＩＰＧＳＦＥ（配列番号７４）、またはＬＱＧＳＫＱＫＱＫＱＫＱＧＳＦＥ（配列番号１１２）を含む。他の例としては、ＬＱＧＳＰＰＬＫＱＰＰＰＧＳＦＥ（配列番号１１３）、ＬＱＧＳＰＰＬＱＱＰＱＰＧＳＦＥ（配列番号１１４）、及びＬＱＧＧＳＧＧＳＬＫＱＱＧＧＳＧＧＳＦＥ（配列番号１１５）が挙げられる。
【００９８】
一部の実施形態では、標的配列は、ＧＳＰＰＬＱＱＰＰＰＧＳ（配列番号９３）またはＧＧＳＧＧＳＬＫＱＱＧＧＳＧＧＳ（配列番号９４）を含む。
【００９９】
標的配列は、検出可能な標識の一部を形成しないアミノ酸を含むか、またはそれからなる。それ故、標的配列は、検出可能な標識に結合しているアミノ酸リンカーを含んでもよい。一部の実施形態では、リンカーは、標的配列のＮ末端及び／またはＣ末端に位置し得る。一部の実施形態では、リンカーは、１つ以上のグリシン、セリン、及び／またはプロリン残基を含む。例えば、一部の実施形態では、リンカーは、ＬＱＧ（配列番号９５）、ＧＳＦＥ（配列番号９６）、ＧＳＳＧＧＳ（配列番号９７）、ＧＳＰＰＬ（配列番号９８）、ＰＰＰＧＳ（配列番号９９）、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号１００）、ＧＧＳＧＧＳＬ（配列番号１０１）、及びＰＰＶＫＱＰＰＰ（配列番号４４）から選択されるアミノ酸配列を含む。リンカー配列は、標的配列のＮ末端、標的配列のＣ末端、またはその双方に位置し得る。リンカーが標的配列のＮ末端及びＣ末端の双方に位置する場合、リンカー配列は、同じか、または異なっている可能性がある。理論に拘束されることを望むものではないが、リンカーは、以下の目的：（ｉ）プロテアーゼ切断部位が切断に好ましい立体配座にあることを確実にするのを助ける；（ｉｉ）プロテアーゼ切断部位の接近性を改善する；（ｉｉｉ）検出可能な変化の程度を増加させる（例えば、検出可能な標識がＢＲＥＴペアである場合、リンカー配列は、ＢＲＥＴ比を増加させるように機能し得る）；（ｉｖ）プロテアーゼによる標的配列の認識に寄与する；及び／または（ｖ）ウシプラスミンを超えるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼに対するセンサー（及び／または標的配列）の特異性に寄与する、のうちの１つ以上に役立ち得る。さらに理論に拘束されることを望むものではないが、標的配列中のプロリン残基は、ウシプラスミンを超えるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼに対するセンサーの特異性に寄与し得る。
【０１００】
一部の実施形態では、リンカーは、精製または検出可能な標識の結合に使用することができるアミノ酸または一連のアミノ酸を含む。例えば、リンカーは、精製のためのヒスチジンタグまたは検出可能な標識との自己組織化を含み得る。別の例では、リンカーは、検出可能な標識を付加するための反応基（例えば、システイン）を含み得る。
【０１０１】
好ましい実施態様では、標的配列は、約５０アミノ酸未満である。例えば、標的配列は、約２〜約５０のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、標的配列は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０アミノ酸を含む。標的配列の長さ（アミノ酸単位）は、センサーの感度を増加させるように変動させることができる。
【０１０２】
検出可能な標識（複数可）
好ましくは、センサーは、検出可能な標識を含む。本明細書で使用される場合、「標識」という用語は、共有結合または非共有相互作用により直接的または間接的のいずれかで、標的配列と特異的に結合する化合物または組成物を指す。好ましい実施態様では、標識は、共有結合、例えば、ペプチド、チオエーテル、またはエステル結合により標的に結合している。当業者は、標識を標的配列に共有結合させるために使用され得る技術を知っているだろう。視覚的にまたは装置デバイスにより検出可能であるシグナルを一般に生成可能な任意の物質を検出可能な標識として使用されてもよい。
【０１０３】
標識は、直接的に検出可能であっても、例えば、標識は、蛍光もしくは燐光分子（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）とし得る、または間接的に、例えば、酵素活性（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）により検出可能であってもよい。標識の組み込みは、例えば、２分子、例えば、酵素及びその基質（例えば、ＡＴＰアーゼ及びＡＴＰ）、ストレプトアビジン及びビオチン、または、抗原もしくはエピトープ及び抗体間の高い結合親和性の使用により、当該技術分野において既知の様々な手段により達成することができる。他の手段としては、実例として、組み換え発現もしくは合成手段を介するポリメラーゼ媒介プライマー伸長反応またはエピトープタグ付けにおける放射性標識またはビオチン化ヌクレオチドの使用が挙げられる。標識は、種々の長さのスペーサーアームまたはリンカーを介して直接的または間接的に結合させることができる。検出可能な標識は、タンパク質または非タンパク質とし得る。例えば、標的配列を用いる検出可能な標識、及び存在する場合、任意のリンカーは、一連のアミノ酸を形成し得る。
【０１０４】
好ましい実施態様では、検出可能な標識は、２つ以上の構成要素を含む。２つ以上の構成要素は、同じであっても、異なっていてもよい。例えば、２つ以上の構成要素は、同じ発色団であってよいか、または２つ以上の構成要素は、ｉ）標的配列に共有結合している化学発光ドナードメイン及びアクセプタードメイン、もしくは、ｉｉ）蛍光団ドメイン及びアクセプタードメイン、とし得る。
【０１０５】
一部の実施形態では、センサーは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼの場合、約０．０１〜約１００ｎＭ、または約０．１〜約１０ｎＭ、または約０．２〜約５ｎＭのＥＣ５０を有する。一部の実施形態では、センサーは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼは、約０．４〜約３ｎＭのＥＣ５０を有し、例えば、ＥＣ５０は、約０．１、０．２、１．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、または３．０ｎＭとし得る。
【０１０６】
プラスミンなどの内因性因子による腐敗と細菌プロテアーゼなどの外因性因子による腐敗とを区別するセンサーもまた必要とされている。一部の実施形態では、本発明のセンサーは、プラスミンと比較して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼへの感度が、少なくとも５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、または４００倍高い。好ましくは、センサーは、プラスミンと比較して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼへの感度が、少なくとも１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、または４００倍高い。本文脈中では、プラスミンと比較して、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼへの、センサーの感度は、プラスミン検量線から計算されたＥＣ５０の比をとり、それを細菌プロテアーゼ検量線から計算されたＥＣ５０で除することにより計算される。
【０１０７】
一部の実施形態では、検出可能な標識は、発色団、ナノ粒子、量子ドット、ビオロゲン、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１０８】
一部の実施形態では、検出可能な変化は、共鳴エネルギー移動、音響、電気化学ポテンシャル、蛍光、化学発光、燐光、吸光度、抗体結合、ＢＲＥＴ比、ＦＲＥＴ効率、または質量の変化である。一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）の検出可能な変化をもたらす。
【０１０９】
発色団
一部の実施形態では、検出可能な標識は、発色団を含む。本明細書を通して、発色団及び発光団は、互換的に使用される。本明細書で使用される場合、発色団は、任意の光活性化合物として広く定義され、任意の着色または非着色の光吸収種及び蛍光を発する任意の種を含む。任意の好適な発色団は、本出願のセンサーに使用することができる。好適な発色団としては、任意の有機もしくは無機染料、蛍光団、ホスホフォア、光吸収ナノ粒子、それらの組み合わせ、またはそれらの金属化錯体が挙げられるが、これらに限定されない。従って、一部の実施形態では、発色団は、有機染料、無機染料、ホスホフォア、光吸収ナノ粒子、それらの組み合わせ、及びそれらの金属化錯体からなる群より選択される。
【０１１０】
一部の実施形態では、有機染料は、クマリン、ピレン、シアニン、ベンゼン、Ｎ−メチルカルバゾール、エリトロシンＢ、Ｎ−アセチル−Ｌ−トリプトファンアミド、２，５−ジフェニルオキサゾール、ルブレン、及びＮ−（３−スルホプロピル）アクリジニウムからなる群より選択される。好ましいクマリンの例としては、７−アミノクマリン、７−ジアルキルアミノクマリン、及びクマリン１５３が挙げられる。好ましいベンゼンの例としては、１，４−ビス（５−フェニルオキサゾール−２−イル）ベンゼン及び１，４−ジフェニルベンゼンが挙げられる。好ましいシアニンの例としては、オキサシアニン、チアシアニン、インドシアニン、メロシアニン、及びカルボシアニンが挙げられる。他の例示的なシアニンとしては、ＥＣＬ  Ｐｌｕｓ、ＥＣＦ、Ｃ３−オキサシアニン、Ｃ３−チアシアニンＤｙｅ（ＥｔＯＨ）、Ｃ３−チアシアニンＤｙｅ（ＰｒＯＨ）、Ｃ５−インドシアニン、Ｃ５−オキサシアニン、Ｃ５−チアシアニン、Ｃ７−インドシアニン、Ｃ７−オキサシアニン、ＣｙｐＨｅｒ５、Ｄｙｅ−３３、Ｃｙ７、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５を、Ｃｙ３Ｃｙ５  ＥＴ、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ２、ＣＢＱＣＡ５ＮＩＲｌ、ＮＩＲ２、ＮＩＲ３、ＮＩＲ４、ＮＩＲ８２０、ＳＮＩＲｌ、ＳＮＩＲ２、ＳＮＩＲ４、メロシアニン５４０、ピナシアノールヨウ化物１，１−ジエチル−４，４−カルボシアニンヨージド、ステインズオール、Ｄｙｅ−１０４１、またはＤｙｅ−３０４が挙げられる。
【０１１１】
一部の実施形態では、無機染料は、金属化及び非金属化ポルフィリン、フタロシアニン、クロリン（例えば、クロロフィルＡ及びＢ）、ならびに金属化発色団からなる群より選択される。好ましいポルフィリンは、テトラカルボキシ−フェニル−ポルフィリン（ＴＣＰＰ）、及びＺｎ−ＴＣＰＰからなる群より選択される。好ましい金属化発色団は、イリジウム（ＩＩＩ）のルテニウムポリピリジル錯体、オスミウムポリピリジル錯体、ロジウムポリピリジル錯体、３−（１−メチルベンゾイミダゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−クマリン錯体、及びイリジウム（ＩＩＩ）との３−（ベンゾチアゾール−２−イル）−７−（ジエチルアミノ）−クマリン錯体からなる群より選択される。
【０１１２】
一部の実施形態では、検出可能な標識は、燐光染料、フルオレセイン、ローダミン（例えば、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ）、及びアントラセン（例えば、９−シアノアントラセン、９，１０−ジフェニルアントラセン、１−クロロ−９，１０−ビス（フェニルエチニル）アントラセン）からなる群より選択される蛍光団／ホスホフォアである。
【０１１３】
一部の実施形態では、光吸収ナノ粒子は、金、銀、白金、またはパラジウムを含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、ホスホフォアは、燐光染料である。一部の実施形態では、ホスホフォアは、ルテニウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチウム、銅、鉄、クロム、タングステン、亜鉛などの１つ以上の金属の金属錯体である。金属錯体は、水性または非水性環境における錯体の溶解性を促進する１つ以上のリガンドを含有してもよい。例えば、リガンドの一部の好適な例としては、ピリジン、ピラジン、イソニコチンアミド、イミダゾール、ビピリジン、テルピリジン、フェナントロリン、ジピリドフェナジン、ポルフィリン、ポルフィン、及びそれらの誘導体が挙げられる。このようなリガンドは、例えば、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、アラルキル、置換アラルキル、カルボキシラート、カルボキシアルデヒド、カルボキサミド、シアノ、アミノ、ヒドロキシ、イミノ、ヒドロキシカルボニル、アミノカルボニル、アミジン、グアニジニウム、ウレイド、硫黄含有基、リン含有基、及びＮ−ヒドロキシスクシンイミドのカルボン酸エステルで置換されていてもよい。
【０１１５】
当業者は、検出可能な標識として発色団を使用するプロテアーゼアッセイを知っているであろう。
【０１１６】
ナノ粒子
一部の実施形態では、検出可能な標識は、ナノ粒子を含む。本明細書で使用される場合、「ナノ粒子」という用語は、任意に金属または非金属のナノ層シェルにより囲まれ得る金属ナノ結晶粒子を指す。好適なナノ粒子は、約１ｎｍ〜約１００ｎｍの直径を有する。一部の実施形態では、直径は、好ましくは、約１０ｎｍ〜約５０ｎｍ、より好ましくは、約５ｎｍ〜約２０ｎｍである。ナノ粒子は、任意の種類の金属（元素金属を含む）または金属合金を含み得る。一部の実施形態では、金属または金属合金ナノ粒子は、金（Ａｕ）、銀（Ａｇ）、銅（Ｃｕ）、ニッケル（Ｎｉ）、パラジウム（Ｐｄ）、白金（Ｐｔ）、コバルト（Ｃｏ）、ロジウム（Ｒｈ）、イリジウム（Ｉｒ）、鉄（Ｆｅ）、ルテニウム（Ｒｕ）、オスミウム（Ｏｓ）、マンガン（Ｍｎ）、レニウム（Ｒｅ）、スカンジウム（Ｓｃ）、チタン（Ｔｉ）、バナジウム（Ｖ）、クロム（Ｃｒ）、亜鉛（Ｚｎ）、イットリウム（Ｙ）、ジルコニウム（Ｚｒ）、ニオブ（Ｎｂ）、モリブデン（Ｍｏ）、テクネチウム（Ｔｃ）、カドミウム（Ｃｄ）、ランタン（Ｌａ）、ルテチウム（Ｌｕ）、ハフニウム（Ｈｆ）、タンタル（Ｔａ）、タングステン（Ｗ）、アクチニウム（Ａｃ）、ローレンシウム（Ｌｒ）、ラウテルジウム（Ｒｆ）、ドブニウム（Ｄｂ）、シーボリウム（Ｓｇ）、ボリウム（Ｂｈ）、ハッシウム（Ｈｓ）、マイトネリウム（Ｍｔ）、ダームスタチウム（Ｄｓ）、レントゲニウム（Ｒｇ）、ウンウンビウム（Ｕｕｂ）、セレン（Ｓｅ）、及び酸化物（例えば、ＦｅＯ、Ｆｅ３Ｏ４、Ｆｅ２Ｏ３、ＦｅＸＯＹ（非化学量論的酸化鉄）、ＣｕＯ、ＮｉＯ、Ａｇ２Ｏ、Ｍｎ２Ｏ３）、上述の、水酸化物、硫化物、セレン化物、及びテルル化物、ならびにこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１１７】
一部の実施形態では、コア／シェルナノ粒子は、金属または金属合金コア及び金属シェルを含む。好ましい実施形態では、コアは、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、及びＰｔからなる群より選択される。好ましい実施形態では、言及されるシェルは、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｕ、Ｃｏ、Ｆｅ、Ｐｔ、それらの金属酸化物、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、金属コア／シェルの組み合わせは、Ｆｅ／Ａｕ、Ｆｅ／Ｆｅ３Ｏ４、及びＡｕ／Ｆｅ２Ｏ３からなる群より選択される。ナノ粒子のコアは、好ましくは、約１ｎｍ〜約２５ｎｍ、より好ましくは、約３ｎｍ〜約５ｎｍの直径を有する。コア／シェルナノ粒子の金属シェルは、好ましくは、約０．５〜約１０ｎｍ、より好ましくは、約０．５〜約２ｎｍの厚みを有する。
【０１１８】
一部の実施形態では、ナノ粒子は、安定化させることができる。本明細書で使用される場合、「安定化した」は、ナノ粒子をコーティングし、保護し、またはこれに特性を付与するためのリガンドシェルまたは単層の使用を意味する。例えば、リガンドシェルまたは単層は、生物腐食からナノ粒子を保護するために使用することができる。別の例では、リガンドシェルまたは単層は、ナノ粒子を、水などの溶媒に多少可溶であるようにするために使用することができる。単層は、同じリガンド（すなわち、ホモリガンド）のいくつか、または異なるリガンドの混合物から構成され得る。当業者は、リガンドをナノ粒子の表面に結合させて、リガンドシェルを形成するために使用することができる技術を知っているであろう。例えば、ナノ粒子は、ナノ粒子のコーティングを促進するリガンドを含有する溶液中で混合されてもよい。別の例では、ナノ粒子は、リガンド及び／またはコーティング材料が、ナノ粒子に付着または結合するように、リガンド及び／またはコーティング材料の蒸気相にナノ粒子を曝露することにより、リガンド及び／またはコーティング材料でコーティングすることができる。一部の実施形態では、リガンド及び／またはコーティング材料は、共有結合によりナノ粒子に付着する。リガンドは、ナノ粒子の金属表面に結合している官能基を含む。一部の実施形態では、リガンドは、チオール、アルコール、ニトロ化合物、ホスフィン、ホスフィンオキシド、レゾルシナレン、セレニド、ホスフィン酸、ホスホン酸、スルホン酸、スルホナート、カルボン酸、ジスルフィド、過酸化物、アミン、ニトリル、イソニトリル、チオニトリル、オキシニトリル、オキシシラン、アルカン、アルケン、アルキン、芳香族化合物、及びセレノ部分からなる群より選択される少なくとも１つの基を含む。単層を形成するのに必要とされるリガンドの数は、ナノ粒子のサイズに依存するであろう。
【０１１９】
好ましい実施形態では、安定化したナノ粒子は、ナノ粒子コアを囲む有機単層を含む。当業者に既知の任意の有機単層が使用されてもよい。例えば、好適な有機単層は、アルカンチオラート単層、アミノアルキルチオラート単層、アルキルチオールサルファート単層、ならびに有機フェノール（例えば、ドーパミン及びその誘導体）からなる群より選択することができる。一部の実施形態では、有機単分子層の厚さは、約１０ｎｍ未満、好ましくは、約５ｎｍ未満である。
【０１２０】
好ましい安定化したナノ粒子は、トリオクチルホスフィノオキシドで安定化したナノ粒子、アミンで安定化したナノ粒子、カルボン酸で安定化したナノ粒子、ホスフィンで安定化したナノ粒子、チオールで安定化したナノ粒子、アミノアルキルチオールで安定化したナノ粒子、及び有機フェノールで安定化したナノ粒子からなる群より選択される。
【０１２１】
非限定例として、検出可能な標識は、金ナノ粒子を含む。プロテアーゼアッセイへの金ナノ粒子の適用は、Ｇｕａｒｉｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）で考察されている。
【０１２２】
量子ドット
一部の実施形態では、検出可能な標識は、量子ドットを含む。本明細書を通して、量子ドット及びナノ結晶は、互換的に使用される。本明細書で使用される場合、「量子ドット」は、周期表のＩＩ−ＶＩ族またはＩＩＩ−Ｖ族元素からの原子（例えば、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、及びＩｎＰ）からなる半導体である。同じ材料であるがサイズが異なる量子ドットは、異なる色の光を放出し得る。それらの明るさは、３つ空間次元全てにおける電子の閉じ込めによるエネルギー準位の量子化に起因する。バルク半導体では、電子−正孔ペアは、Ｂｏｈｒ励起子半径内に束縛され、これは、各タイプの半導体に特徴的である。量子ドットは、Ｂｏｈｒ励起子半径よりも小さく、これは、離散的なエネルギー準位の出現を引き起こす。半導体の価電子帯及び伝導帯間のバンドギャップΔＥは、ナノ結晶のサイズ及び形状の関数である。従来の有機蛍光団と比較して、量子ドットは、わずかに低い発光量子収量を有するが、はるかに大きい吸収断面積及び非常に小さい光退色速度を有する。量子ドットのモル吸光係数は、約１０５〜１０６Ｍ−１ｃｍ−１であり、これは、染料よりも１０〜１００倍大きい。本明細書で使用される場合、「量子収量」は、元のエネルギー提供の最終放出の尺度を指す。
【０１２３】
目的に適する任意の量子ドットを使用することができる。一部の実施形態では、量子ドットの光学特性は、シェルを合成することにより操作することができる。通常は、シェルは、安定化シェルである。このような量子ドットは、コア−シェル量子ドットとして既知であり、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＺｎＳ、ＩｎＰ／ＣｄＳｅを含むが、これらに限定されない。コア／シェル量子ドットは、低いバンドギャップコアの周りに、高いバンドギャップシェルを有し、これは、シェルによる吸収なしに光を放出する。シェルは、コアからの表面非放射放出を不動態化し、それにより、光発光量子収量を高め、自然分解を防止する。Ｉ型量子ドット（例えば、ＣｄＳｅ／ＺｎＳ）のシェルは、コアよりも高いエネルギー伝導帯及び低いエネルギー価電子帯を有し、その結果、コア内に電子及び正孔の双方が閉じ込められる。ＩＩ型量子ドット（例えば、ＣｄＴｅ／ＣｄＳｅ及びＣｄＳｅ／ＺｎＴｅ）のシェルの伝導帯及び価電子帯は、コアのものよりも、双方ともエネルギーが低いかまたは双方ともエネルギーが高いかのいずれかである。従って、電子及び正孔の運動は、１次元に制限される。コア−シェル界面での励起子の放射再結合は、ＩＩ型放出を引き起こす。ＩＩ型量子ドットは、バンドエッジ付近では間接半導体として振る舞い、それ故、赤外及び近赤外に吸収テールを持っている。Ｉ型及びＩＩ型が好ましいが、合金化半導体量子ドット（ＣｄＳｅＴｅ）を使用することもできる。変動させることができる合金組成及び内部構造は、粒子のサイズを変えることなく光学特性を調整することを可能にする。
【０１２４】
一部の実施形態では、量子ドットは、ＣｄＳｅ／ＺｎＳコア／シェル量子ドット、ＣｄＴｅ／ＣｄＳｅコア／シェル量子ドット、ＣｄＳｅ／ＺｎＴｅコア／シェル量子ドット、及び合金化半導体量子ドット（例えば、ＣｄＳｅＴｅ）からなる群より選択される。
【０１２５】
複数のセンサーを作成するために異なる色の放出が必要な場合（多重検出）、これは、異なる放出波長を生じる量子ドットコアのサイズを変えることにより達成することができる。量子ドットは、ナノ粒子に関して上述したように安定化または不安定化させることができる。量子ドットを安定化させるための好ましいリガンドは、レゾルシナレンである。
【０１２６】
非限定例として、検出可能な標識が共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）に基づく場合、量子ドットを使用することができる。プロテアーゼアッセイにおける量子ドットの使用の概説については、Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｋｉｍ（２０１２）を参照のこと。
【０１２７】
ビオロゲン
一部の実施形態では、検出可能な標識は、ビオロゲンを含む。本明細書で使用される場合、「ビオロゲン」は、有機レドックス化合物である。好ましいビオロゲンは、酸化及び還元の際に何度も可逆的に色を変えることができる。一部の実施形態では、ビオロゲンは、ビオロゲンメチル、プロピルビオロゲン−スルホナートまたはアミノプロピルビオロゲンである。一部の実施形態では、ビオロゲンは、ポルフィリンなどの発色団の励起状態を消光することができるので、消光剤として使用することができる。
【０１２８】
共鳴エネルギー移動
一部の実施形態では、検出可能な標識は、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動などの、且つ限定されないが、生物発光共鳴エネルギー移動（「ＢＲＥＴ」）及び蛍光共鳴エネルギー移動（「ＦＲＥＴ」）を含む共鳴エネルギー移動（ＲＥＴ）に基づく。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、「ＢＲＥＴ」は、生物発光タンパク質ドナー及びアクセプター分子間の非放射性エネルギー移動に基づく近接アッセイである。「生物発光共鳴エネルギー移動」及び「ＢＲＥＴ」は、互換的に使用される。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「ＦＲＥＴ」は、２つの発色団または発色団と消光剤との間の非放射性エネルギー移動に基づく近接アッセイである。「ＦＲＥＴ」及び「蛍光共鳴エネルギー移動」は、互換的に使用される。
【０１３１】
一部の実施形態では、検出可能な標識は、ｉ）標的配列に共有結合している化学発光ドナードメイン及びアクセプタードメイン、または、ｉｉ）ドナードメイン及びアクセプタードメインを含む。ｉｉ）の一部の実施形態では、ドナードメインは、蛍光団ドナーであり、及び／またはアクセプタードメインは、消光剤ドメインである。一部の実施形態では、１つのドメインは、標的配列のＮ末端に共有結合しており、他のドメインは、標的配列のＣ末端に共有結合している。好ましい実施形態では、検出可能な標識は、化学発光ドナードメイン及び標的配列に共有結合しているアクセプタードメインを含む。一例が図１に提示される。
【０１３２】
Ａ．化学発光ドナードメイン
化学発光は、化学反応の結果として、熱の放出が制限されたエネルギーの放出（発光）である。「化学発光」という用語は、本明細書では、酵素の活性に依存する生物発光を包含するため使用される。非酵素化学発光は、触媒の存在下での有機染料及び酸化剤間の化学反応の結果である。化学発光放出は、化学的に誘起される有機色素の励起状態からのエネルギーが基底状態に崩壊するにつれて発生する。化学発光放出の持続時間及び強度は、反応溶液中に存在する化学試薬の程度にほぼ依存している。
【０１３３】
好ましい実施態様では、化学発光ドナードメインは、生物発光タンパク質である。本明細書で使用される場合、「生物発光タンパク質」という用語は、発光を生じるために、好適な基質に作用することが可能な任意のタンパク質を指す。
【０１３４】
生物発光タンパク質は、活性化された生成物に基質を変換する酵素であり、次に、活性化された生成物は、緩和するにつれてエネルギーを放出すると当該技術分野で理解されている。活性化された生成物（基質上の生物発光タンパク質の活性により生成される）は、アクセプター分子に移動する、生物発光タンパク質により生じた発光の供給源である。
【０１３５】
本発明に用いることができる多数の異なる生物発光タンパク質がある（例えば、表１を参照のこと）。光放出系は、知られており、細菌、原生動物、セレンテラート、軟体動物、魚、ヤスデ、ハエ、真菌、虫、Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｔｅ、及び甲虫、特に、Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ属のコメツキムシ、ならびにＰｈｏｔｉｎｕｓ属、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ属、及びＬｕｃｉｏｌａ属のホタル、を含む多くの発光生物から単離されている。生物発光を示す、さらなる生物は、ＷＯ００／０２４８７８、ＷＯ９９／０４９０１９、及びＶｉｖｉａｎｉ（２００２）に記載されている。
【０１３６】
任意の好適な生物発光タンパク質は、本出願のセンサーに使用することができる。１つの非常によく知られている例は、特定の生化学物質ルシフェリン（天然に存在する蛍光団）がルシフェラーゼ活性を有する酵素により酸化されるエネルギー生成化学反応を触媒するルシフェラーゼとして知られるタンパク質のクラスである（Ｈａｓｔｉｎｇｓ、１９９６）。細菌、藻類、真菌、昆虫、魚、及び他の海洋生物の形態の種を含む、原核生物及び真核生物の双方の生物の多様性は、このように光エネルギーを放出することができ、それぞれは、他の生物のものとは化学的に区別される特定のルシフェラーゼ活性及びルシフェリンを有する。ルシフェリン／ルシフェラーゼ系は、形態、化学、及び機能において非常に多様である。従って、ルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質は、様々な供給源からまたは様々な手段により入手可能である。ルシフェラーゼ活性を有する生物発光タンパク質の例は、米国特許第５，２２９，２８５号、第５，２１９，７３７号、第５，８４３，７４６号、第５，１９６，５２４号、及び第５，６７０，３５６号に見出され得る。最も広く使用されているルシフェラーゼのうちの２つは：（ｉ）基質としてセレンテラジンを使用し、且つ４８０ｎｍの光を放出する３５ｋＤａのタンパク質であるＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ（Ｒ．ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来）（Ｌｏｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１）；及び、（ｉｉ）基質としてルシフェリン使用し、且つ５６０ｎｍの光を放出する６１ｋＤａのタンパク質であるホタルルシフェラーゼ（ｄｅ  Ｗｅｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７）である。
【０１３７】
Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ（Ｇａｕｓｓｉａ  ｐｒｉｎｃｅｐｓ由来）は、生化学的アッセイに使用されている（Ｖｅｒｈａｅｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼは、迅速な反応でセレンテラジンを酸化する２０ｋＤａのタンパク質であり、４７０ｎｍの明るい光の放出をもたらす。
【０１３８】
Ａｎａｃｈｎｏｃａｍｐａ  ｓｐ由来の本発明に有用なルシフェラーゼは、特徴付けられている（ＷＯ２００７／０１９６３４）。これらの酵素は、サイズが約５９ｋＤａであり、スペクトルの青色部分内の放出スペクトルを有する発光反応を触媒するＡＴＰ依存性ルシフェラーゼである。
【０１３９】
天然に存在する生物発光タンパク質の生物学的に活性な多様体またはフラグメントは、当業者らが容易に製造することができる。本発明に有用なこのような多様体の３つの例は、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの各多様体であるＲｌｕｃ２（Ｌｏｅｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）、Ｒｌｕｃ８（Ｌｏｅｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００６）、及びＲｌｕｃ８．６−５３５（Ｌｏｅｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）である。さらに好ましい実施形態では、ＢＲＥＴ化学発光ドナーの配列は、天然のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼセンサーを組み込むセンサー分子よりも高い熱安定性を有するように選択される。ＲＬｕｃ２またはＲＬｕｃ８は、好適な選択の便利な例であり、従って、これは、天然Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ配列を組み込むセンサーよりも５倍以上または１０倍以上高い輝度を示す。このような輝度の向上は、所与のあらゆる時間分解能に対して試薬を経済的に使用することが可能になるので、大きな利点を有する。
表１．例示的な生物発光タンパク質
【表１−１】
2020510406.tif 000002
【表１−２】
2020510406.tif 000003
【０１４０】
本発明に用いることができる代替の非ルシフェラーゼ生物発光タンパク質は、発光シグナルを生成するために好適な基質に作用し得る任意の酵素である。このような酵素の具体例は、β−ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、及びβ−グルコシダーゼである。これらの酵素のための合成発光基質は、当該技術分野で周知であり、Ｔｒｏｐｉｘ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｄｆｏｒｄ、米国マサチューセッツ州）などの企業から市販されている。
【０１４１】
本発明に有用なペルオキシダーゼの例は、Ｈｕｓｈｐｕｌｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）により記載されている。
【０１４２】
一部の実施形態では、生物発光タンパク質は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ラクタマーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−グルクロニダーゼ、またはβ−グルコシダーゼである。一部の実施形態では、生物発光タンパク質は、ルシフェラーゼである。好適なルシフェラーゼとしては、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ（例えば、ＰｐｙＲＥ８、ＰｐｙＲＥ１０）、Ｃｏｅｌｅｎｔｅｒａｔｅルシフェラーゼ、北米グローワームルシフェラーゼ、コメツキムシルシフェラーゼ、レールロードワームルシフェラーゼ、バクテリアルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、エクオリン、Ａｒａｃｈｎｏｃａｍｐａルシフェラーゼ、あるいは、それらのうちのいずれか１つの生物学的に活性な多様体もしくはフラグメント、またはそれらのうちの２つ以上のキメラが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「生物学的に活性なフラグメント」は、全長ポリペプチドの規定の活性を維持する、本明細書に記載のポリペプチドの一部である。本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な多様体」は、１つ以上のアミノ酸により天然に存在する分子及び／または規定の分子とは異なるが、生物学的に活性なフラグメントについて上で規定されるような規定の活性を維持する分子である。生物学的に活性な多様体は、天然に存在する分子及び／または規定の分子と、通常は、少なくとも５０％、より好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９７％、さらにより好ましくは、少なくとも９９％同一である。
【０１４４】
好ましい実施形態では、立体障害による相互作用の阻害を防ぐために、低分子量の生物発光タンパク質が使用される。生物発光タンパク質は、単一のポリペプチド鎖からなることが好ましい。また、生物発光タンパク質は、オリゴマーまたはアグリゲートを形成しないことが好ましい。生物発光タンパク質のＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、及びホタルルシフェラーゼは、これらの基準の全てまたはほとんどを満たしている。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「基質」という用語は、発光を生じるか、または吸収するために、化学発光ドナーと併せて使用することができる任意の分子を指す。基質の選択は、化学発光ドナーにより生じる光の波長及び強度に影響を及ぼし得る。一部の実施形態では、生物発光タンパク質は、ルシフェリン、カルシウム、セレンテラジン、セレンテラジンの誘導体もしくはアナログ、またはルシフェリンの誘導体もしくはアナログから選択される基質を有する。
【０１４６】
セレンテラジンは、刺胞動物、カイアシ類、ヤムシ、クシクラゲ、十脚類のエビ、アミエビ、放散虫、及び一部の魚類分類群に発生する広く知られている基質である（Ｇｒｅｅｒ  ａｎｄ  Ｓｚａｌａｙ、２００２）。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼでは、例えば、４１８〜５４７ｎｍの光放出をもたらすセレンテラジンアナログ／誘導体が入手可能である（Ｉｎｏｕｙｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７、Ｌｏｅｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００７）。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼを用いて４００ｎｍの光を放出するセレンテラジンアナログ／誘導体（４００Ａ、ＤｅｅｐＢｌｕｅＣ）が記載されている（ＷＯ０１／４６６９１）。セレンテラジンアナログ／誘導体の他の例は、ＥｎｄｕＲｅｎ、Ｐｒｏｌｕｍｅ  ｐｕｒｐｌｅ、Ｐｒｏｌｕｍｅ  ｐｕｒｐｌｅ  ＩＩ、Ｐｒｏｌｕｍｅ  ｐｕｒｐｌｅ  ＩＩＩ、ＶｉｖｉＲｅｎ、及びフリマジンである。セレンテラジンアナログ／誘導体の他の例としては、ＰＣＴ／ＵＳ２０１３０５７６６０及びＵＳ２０１４０３０２５３９に開示の化合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「ルシフェリン」という用語は、広く定義され、生物発光が可能な生物に見出される光放出生物学的色素のクラス、及び合成アナログまたは機能的に等価な化学物質を指し、これは、オキシルシフェリンを産生する酵素ルシフェラーゼ及び光の形態のエネルギーの存在下で酸化される。Ｄ−ルシフェリン、または２−（６−ヒドロキシベンゾチアゾール−２−イル）−２−チアゾリン−４−カルボン酸は、ホタルであるＰｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓから最初に単離された。それ以来、種々の異なる生物由来の、主に、海洋、例えば、魚及びイカ、由来のルシフェリンの種々の化学的に異なる形態が発見及び研究されているが、種々の異なる生物由来の、多くは、陸生成物、例えば、虫、甲虫、及び種々の他の昆虫、で確認されている（Ｄａｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００４；Ｖｉｖｉａｎｉ、２００２）。本明細書で使用される場合、ルシフェリンは、ルシフェリンの誘導体またはアナログも含む。
【０１４８】
環状アルキルアミノルシフェリン（ＣｙｃＬｕｃ１）などの完全な合成ルシフェリンに加えて、少なくとも５つの一般的な種類の生物学的に進化したルシフェリンがあり、これはそれぞれ、化学的に異なり、広範囲の異なる補因子を用いる化学的及び構造的に異なるルシフェラーゼにより触媒される。１つ目は、ホタルルシフェラーゼの基質であるホタルルシフェリンであり、これは、触媒反応のためにＡＴＰを必要とする（ＥＣ  １．１３．１２．７）。２つ目は、長鎖アルデヒド及び還元型のリボフラビンリン酸からなるイカ及び魚でも見られるバクテリアルシフェリンである。バクテリアルシフェラーゼは、ＦＭＮＨ依存性である。３つ目は、夜間の海洋燐光の原因となる生物であるＤｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅ（海洋プランクトン）に見られるテトラピロールクロロフィル誘導体であるＤｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅｓルシフェリンである。Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅルシフェラーゼは、Ｄｉｎｏｆｌａｇｅｌｌａｔｅルシフェリンの酸化を触媒し、３つの同一の触媒活性ドメインからなる。４つ目は、特定のオストラコッド及び深海魚、例えば、Ｐｏｒｉｃｈｔｈｙｓに見られるイミダゾロピラジンバルグリンである。最後は、放散虫、クシクラゲ、刺胞動物、イカ、カイアシ類、ヤムシ、魚、及びエビに見出されるタンパク質エクオリンの光放出があるコエレンテラジン（イミダゾールピラジン）である。
【０１４９】
一部の実施形態では、生物発光タンパク質は、補因子を必要とする。補因子の例としては、ＡＴＰ、マグネシウム、酸素、ＦＭＮＨ２、カルシウム、またはそれらの任意の２つ以上の組み合わせが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。
【０１５０】
Ｂ．アクセプタードメイン
本明細書で使用される場合、「アクセプタードメイン」は、化学発光ドナードメインの活性の結果として放出されるエネルギーを受容することが可能な任意の分子である。一部の実施形態では、アクセプタードメイン（本明細書では「アクセプター分子」とも呼ばれる）は、蛍光アクセプタードメインである。本明細書で使用される場合、「蛍光アクセプタードメイン」という用語（本明細書では「蛍光アクセプター分子」とも呼ばれる）は、化学発光ドナーの活性の結果として放出されるエネルギーを受け入れて、光エネルギーとしてそれを再放出することができる任意の化合物を指す。
【０１５１】
本発明に用いることができる多数の異なるアクセプタードメインがある。好適なアクセプタードメインは、タンパク質または非タンパク質性であってよい。
【０１５２】
一部の実施形態では、蛍光アクセプタードメインは、タンパク質である。例としては、蛍光アクセプタードメインは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの青色蛍光多様体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光多様体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光多様体（ＹＦＰ）、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、増強ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、増強ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、Ｔｏｐａｚ、ＧＦＰｕｖ、不安定化したＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化したＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化したＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｔダイマー２、ｔダイマー２（１２）、ｍＲＦＰ１、ポシロポリン、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ、モンスターＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、ＴｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｋａｅｄｅタンパク質、ＴａｇＲＦＰ、ＴｕｒＢｏＦＢ、もしくはフィコビリンタンパク質、またはそれらのうちのいずれか１つの生物学的に活性な多様体もしくはフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５３】
一部の実施形態では、蛍光アクセプタードメインは、非タンパク質である。タンパク質ではないアクセプター分子の例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素（例えば、ＡＦ６８０、ＡＦ７５０）、Ｂｏｄｉｐｙ色素、Ｃｙ色素、フルオレセイン、ダンシル、ウンベリフェロン、蛍光マイクロスフェア、発光マイクロスフェア、蛍光ナノ結晶、マリーナブルー、カスケードブルー、カスケードイエロー、パシフィックブルー、オレゴングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミン、テキサスレッド、希土類元素キレート、またはそれらのうちの任意の組み合わせ、もしくは誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
１つの非常によく知られている例は、クラゲのＡｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ由来の緑色蛍光タンパク質及び分子生物学の適用、例えば、変異導入及びキメラタンパク質技術（Ｔｓｉｅｎ、１９９８）、から生じる多数の他の多様体（ＧＦＰ）を含む蛍光団の群である。ＧＦＰは、それらの発色団の特有の構成要素に基づいて分類され、各クラスは、異なる励起波長及び放出波長：クラス１、中性フェノール及びアニオン性フェノラートの野生型混合物：クラス２、フェノラートアニオン：クラス３、中性フェノール：クラス４、積層Ｓ電子系フェノラートアニオン：クラス５、インドール：クラス６、イミダゾール：及びクラス７、フェニルを有する。
【０１５５】
変異している天然に存在するアクセプター分子（多様体）は、本発明に有用であり得る。ＢＲＥＴに適する操作系の一例は、媒介タンパク質（複数可）の非存在下で、単独で互いに有意な程度に直接相互作用しないＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びＧＦＰの増強された黄色変異体（ＥＹＦＰ）のペアリングである（この場合、Ｇタンパク質結合受容体）（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）。
【０１５６】
別の実施形態では、アクセプタードメインは、蛍光ナノ結晶である。ナノ結晶、または「量子ドット」は、光分解への耐性、輝度の改善、非毒性、及びいくつかのプロセスの同時監視を可能にするサイズ依存性の狭い放出スペクトルを含む、蛍光標識として有機分子を超えるいくつかの利点を有する。さらに、ナノ結晶の吸収スペクトルは通常、非常に広く、全てのサイズ、従って、全ての色が単一の励起波長で励起されることを可能にする。この性質は、それらが多重化に適していることを意味する。ナノ結晶は、紫外及び可視領域の波長において非常に大きいモル吸光係数も有する。結果として、それらは、同じ励起光束で有機色素よりも１０〜５０倍多い光子を吸収することができる。
【０１５７】
蛍光ナノ結晶は、様々な方法でタンパク質（例えば、本出願のセンサーまたは標的配列）に付着しても、または「バイオコンジュゲート」されてもよい。例えば、「量子ドット」の表面キャップは、ジヒドロリポ酸（ＤＨＬＡ）または両親媒性ポリマーのカルボキシラート基で負荷電であってよい。タンパク質は、直接的に、または組み換えタンパク質に融合している正荷電ロイシンジッパーペプチドからなるブリッジを介して、静電的にＤＨＬＡナノ結晶にコンジュゲートすることができる。後者は、意図する標的への特異性で、１次抗体に結合する。あるいは、抗体、ストレプトアビジン、または他のタンパク質は、従来のカルボジイミド化学を用いてナノ結晶のポリアクリラートキャップに共有結合により結合されている。
【０１５８】
セレン化カドミウム、硫化カドミウム、ヒ化インジウム、及びリン化インジウムを含む、ナノ結晶を製造するためのコロイド法がある。これらの量子ドットは、１０〜５０原子の直径を有する、量子ドット体積内にわずか１００〜１００，０００原子を含み得る。一部の量子ドットは、より大きいバンドギャップを有する別の材料に埋め込まれている１つの材料の小さな領域である。これらは、例えば、コア内にＣｄＳｅ及びシェル内にＺｎＳを有するか、またはオルモシルと呼ばれるシリカの特別な形態に由来する、いわゆる、コア−シェル構造とし得る。ドットが大きいほど、蛍光スペクトルは、より赤く（エネルギーがより低く）なる。逆に、ドットが小さいほど、より青い（より高いエネルギー）光を放出する。呈色は、量子ドットのエネルギー準位と相関関係にある。定量的に言えば、蛍光を光のエネルギー（従って、色）を決定するバンドギャップエネルギーは、量子ドットのサイズの２乗に反比例する。量子ドットが大きいほど、より狭い間隙を介したより大きいエネルギー準位を有する。これにより、量子ドットが、より少ないエネルギーを含有する光子、すなわち、スペクトルの赤端により近い光子、を吸収可能になる。
【０１５９】
前述のようなナノ結晶は、有機分子及び／または巨大分子でコーティングすることができる。これらのコーティングは、ナノ結晶の特性を変更するために使用することができる。例えば、コーティングは、水性溶媒中のナノ結晶の溶解度を改善することができる。
【０１６０】
ナノ結晶または量子ドットのＦＲＥＴ及びＢＲＥＴへの適用は、Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｋｉｍ（２０１２）に概説されている。
【０１６１】
代替的実施形態では、アクセプター分子は、蛍光マイクロスフェアである。これらは通常は、ポリマーから作製され、ポリマーマトリックス中に組み込まれている蛍光分子（例えば、フルオレセインＧＦＰまたはＹＦＰ）を含有し、これは、様々な試薬にコンジュゲートすることができる。蛍光ミクロスフェアは、内部または表面上に標識されていてもよい。内部標識は通常、狭い蛍光放出スペクトルを有する非常に明るく安定した粒子を生成する。内部標識を用いて、表面基は依然として、リガンド（例えば、タンパク質）をビーズの表面にコンジュゲートするために利用可能である。内部標識ビーズは、光退色に対してより高い耐性を示すので、イメージング用途に広く使用される。
【０１６２】
カルボキシラート修飾蛍光マイクロスフェアは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＡＣ）などの水溶性カルボジイミド試薬を使用したタンパク質の共有結合に適する。硫酸蛍光マイクロスフェアは、比較的疎水性であり、受動的且つほぼ不可逆的にいかなるタンパク質も吸着するであろう。アルデヒド−硫酸蛍光マイクロスフェアは、表面アルデヒド基を付加して、タンパク質と反応するように修飾されている硫酸マイクロスフェアである。
【０１６３】
別の実施形態では、アクセプター分子は、発光マイクロスフェアである。これらは通常、ポリマーマトリックスに組み込まれている発光分子（例えば、ユーロピウムまたは白金の錯体）を含有するポリマーから作製され、これは、様々な試薬にコンジュゲートすることができる。
【０１６４】
本発明に有用な非蛍光アクセプタードメインの例としては、ＤＡＢＣＹＬ［４−（（４−（ジメチルアミノ）フェニル）アゾ）安息香酸］、ＤＡＢＳＹＬ（ジメチルアミノアゾスルホン酸）、金及び銀などの金属ナノ粒子、ブラックホール消光剤（ＢＨＱ）、ならびにＱＸＬ消光剤などの消光剤が挙げられる。
【０１６５】
Ｃ．化学発光ドナードメイン及びアクセプタードメインペア
任意の数のドナー−アクセプターの組み合わせは、本発明のセンサーに使用することができる。当業者は、効率的なエネルギー移動を許容するドナー及びアクセプターのペアを選択することができるであろう。好ましい実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼの不存在下での化学発光ドナードメイン及びアクセプタードメインの分離及び相対的配向は、Ｆｏｒｓｔｅｒ距離の±５０％以内である。本明細書で使用される場合、「分析物の存在下及び／または不存在下での化学発光ドナードメイン及びアクセプタードメインの分離及び相対的配向は、Ｆｏｒｓｔｅｒ距離の±５０％以内である」という用語は、Ｒ０の±５０％の範囲内で実施することができる定常状態のＲＥＴ測定値を指す。この語句は、化学発光ドナードメインからアクセプタードメインへの１０〜９０％の範囲の発光エネルギー移動の効率を包含する。一部の実施形態では、化学発光ドナードメイン及びアクセプタードメインのＦｏｒｓｔｅｒ距離は、少なくとも４ｎｍである。一実施形態では、化学発光ドナードメイン及びアクセプタードメインのＦｏｒｓｔｅｒ距離は、約４ｎｍ〜約１０ｎｍ、または約６ｎｍ〜約１０ｎｍである。
【０１６６】
好適なペアリングを決定する際に考慮されるべき基準は、ドナーのものと比較したアクセプター分子の相対放出／蛍光スペクトルである。ドナーの放出スペクトルは、ドナー発光放出の光エネルギーが、アクセプター分子を励起し、それにより、２つの分子が互いに関して適切な近接性及び配向性で存在する場合に、アクセプター分子の蛍光を促進することができる波長にあるように、アクセプターの吸収スペクトルと重なり合うはずである。例えば、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ／ＥＧＦＰペアリングは、観察可能な放出スペクトルピークに基づくＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ／ＥＹＥＦペアリング程良好ではないことが実証されている（Ｘｕ、１９９９年；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７年）。可能なペアリングを研究するために、選択された生物発光タンパク質及びアクセプター分子を含有するタンパク質融合（例えば）が調製され、適切な基質の存在下で、試験される。
【０１６７】
ドナー及びアクセプター分子が誤って互いに結合していないことも確認されるべきである。これは、例えば、同じ細胞内で生物発光タンパク質及びアクセプター分子を別々に同時発現させて、次に、ＢＲＥＴが起こるかどうかを決定するために発光スペクトルを監視することにより達成することができる。これは、例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）の方法を使用して達成されてもよい。選択された生物発光タンパク質及びアクセプター分子は、ＢＲＥＴベアがほとんどまたは全く観察されない場合、好適なＢＲＥＴペアを形成する。
【０１６８】
ドナー放出は、基質に対する修飾により操作することができる。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼの場合、基質は、セレンテラジンである。ドナー放出を変更することの背後にある理論的根拠は、ドナー放出及びアクセプター放出間の分解能を改善することである。オリジナルのＢＲＥＴシステムは、ドナーとしてＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、アクセプターとしてＥＹＦＰ（またはＴｏｐａｚ）、及び基質としてセレンテラジンｈ誘導体を使用する。これらの構成要素は、ＢＲＥＴアッセイで組み合わせた場合、４５〜５５ｎｍのスペクトル分解能を与える、生物発光タンパク質の場合４７５〜４８０ｎｍの範囲の光及びアクセプター分子の場合５２５〜５３０ｎｍの範囲の光を生じる。
【０１６９】
残念ながら、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、ＧＦＰ放出と実質的に重なり合う広い放出ピークを生じ、それにより、これは、システムのノイズに対するシグナルを減少させるのに寄与する。本発明に使用される１つのＢＲＥＴシステムは、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ基質としてｃｏｅｌ４００ａを有し、ドナー及びアクセプター放出波長間の広いスペクトル分解能（約１０５ｎｍ）を提供する。ｃｏｅｌ４００ａを有するＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼは、３９０〜４００ｎｍの光を生じ、この範囲の光を吸収して、５０５〜５０８ｎｍの光を再放出するＧＦＰ誘導体（ＧＦＰ２）を調製した。Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ及びＧＦＰ放出間のスペクトル分解能のこの増加のために、このＢＲＥＴシステムは、細菌プロテアーゼである標的配列の切断を監視する優れた生物学的ツールを提供する。しかし、より小さいストークスシフトＢＲＥＴシステムもまた、プロテアーゼ活性の高感度測定を可能にするであろう。
【０１７０】
Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ活性の結果として（野生型セレンテラジンにより生成されるものとは異なる）種々の波長の光を生成する、ｃｏｅｌ４００ａを含む種々のセレンテラジン誘導体が当該分野で既知である。当業者は、ドナーの光放出ピークが変化しているので、この波長の光を吸収し、それにより、効率的なエネルギー移動を許容するアクセプター分子を選択することが必要であることを理解するであろう。これは、例えば、クラス３または１のＧＦＰになるように、ＧＦＰクラス４を変更することにより行うことができる。ドナーの光放出及びアクセプターの光吸収ピーク間のスペクトルの重なりは、とりわけ、効率的なエネルギー移動のための１つの条件である。クラス３及び１のＧＦＰは、４００ｎｍの光を吸収して、５０５〜５１１ｎｍで再放出することが知られている。これにより、約１１１ｎｍのドナー及びアクセプター放出間の波長差が生じる。
【０１７１】
さらなる生物発光タンパク質及びアクセプター分子のペアの例は、表２に提示される。
表２．例示的なＢＲＥＴ生物発光タンパク質及びアクセプター分子ペア
【表２−１】
2020510406.tif 000004
【表２−２】
2020510406.tif 000005
【表２−３】
2020510406.tif 000006
【表２−４】
2020510406.tif 000007
【表２−５】
2020510406.tif 000008
【表２−６】
2020510406.tif 000009
【表２−７】
2020510406.tif 000010
【０１７２】
Ｄ．蛍光団ドメイン及びアクセプタードメイン
一部の実施形態では、検出可能な標識は、蛍光団ドナードメイン及びアクセプタードメインを含む。本明細書で使用される場合、「ドナー」という用語は、特定の波長の光を照射された場合に、光を放出する分子を意味する。本明細書で使用される「アクセプター」という用語は、ドナーから、ドナーの励起時にエネルギーを吸収することができる分子を指す。ドナー及びアクセプターの双方が光エネルギーを吸収することができるが、ドナーのみが光エネルギーを放出することが必要とされ、すなわち、ドナーは、蛍光性であり得、アクセプターは、非蛍光性であり得る。アクセプターが光エネルギーを放出しない場合、それは、消光剤または消光剤ドメインと呼ばれる。本発明に有用なアクセプターは一般に、ドナーの励起に適する波長のかなり低い吸収も有する。好ましい実施態様では、検出可能な標識は、蛍光ドナー及び消光剤ドメインを含む。
【０１７３】
ドナーの放出スペクトルがアクセプターの励起スペクトルと重複する場合、任意の適切に選択された発色団をドナー及び／またはアクセプターとして使用することができる。本明細書で使用される場合、アクセプターの吸光度スペクトル及びドナーの放出スペクトルに関して、「重なり合うこと」という用語は、部分的または完全に共有されている吸収スペクトル及び放出スペクトルを意味する。従って、このような重なり合うスペクトルでは、ドナーの放出スペクトルの範囲の上限は、アクセプターの吸光度スペクトルの範囲の下限よりも高い。
【０１７４】
ドナー及び／またはアクセプターとしての使用に適している蛍光団の非限定例としては、フルオレセイン、ローダミン、４−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（ＮＢＤ）；カスケードブルー、４，４−ジフルオロ−５，７−ジフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸；４，４−ジフルオロ−５，ｐ−メトキシフェニル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−プロピオン酸、４，４−ジフルオロ−５−スチリル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−プロピオン酸；６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′−テトラメチル−６−カルボキシローダミン；５−（（（（２−ヨードアセチル）アミノ）エチル）アミノ）ナフタレン−１−スルホン酸などのヨードアセチル指向プローブ（ＩＡＥＤＡＮＳ、ＡＥＤＡＮＳと互換的に使用される）；５−カルボキシフルオレセイン；６−カルボキシフルオレセイン；６−（フルオレセイン−５−カルボキサミド）ヘキサン酸；フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）；テトラメチルローダミンイソチオシアナート（ＴＲＩＴＣ）；テキサスレッド（ＴＲ）；エオシン；フィコビリタンパク質；シアニン色素；クマリン；Ｒ−フィコエリスリン；アロフィコエリトリン（ＡＰＣ）；Ｒ−フィコエリスリン（Ｒ−ＰＥ）コンジュゲート；Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素；量子ドット色素；４−ジメチルアミノアゾベンゼン−４’−マレイミド（ＤＡＢｍａｌ）、及びフルオレセイン−５−マレイミド（Ｆｍａｌ）などのマレイミド指向プローブ；またはそれらの組み合わせ（例えば、タンデムコンジュゲート）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
他の非限定例としては、ＡＴＰ−、ＡＤＰ−、またはＡＭＰ−アナログなどのヌクレオチドアナログが挙げられる（例えば、Ｂａｇｓｈａｗ、２００１を参照のこと）。特定の実施形態では、ヌクレオチドアナログは、蛍光性である。蛍光ヌクレオチドアナログの例としては、実例として、２’−（または−３’）−Ｏ−（トリニトロフェニル）アデノシン５’−三リン酸（ＴＮＰ−ＡＴＰ）、２’−（または−３’）−Ｏ−（トリニトロフェニル）アデノシン５’−二リン酸（ＴＮＰ−ＡＤＰ）、ｅ−ＡＴＰ、ｅ−アザ−ＡＴＰ、ＦＴＰ、２ＡＰ−ＴＰ、ａｎｔ−ＡＴＰ、Ｍａｎｔ−ＡＴＰ、ＤＥＤＡ−ＡＴＰ、ＦＥＤＡ−ＡＴＰ、ＲＥＤＡ−ＡＴＰ、及びＣｙｓ３−ＥＤＡ−ＡＴＰが挙げられる。
【０１７６】
他の非限定例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＧＦＰの青色蛍光多様体（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光多様体（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光多様体（ＹＦＰ）、増強ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、増強ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、増強ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド、Ｖｅｎｕｓ、ｍＯｒａｎｇｅ、Ｔｏｐａｚ、ＧＦＰｕｖ、不安定化したＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化したＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化したＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ｔダイマー２、ｔダイマー２（１２）、ｍＲＦＰ１、ポシロポリン、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ、モンスターＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、ＴｄＴｏｍａｔｏ、ｍＣｈｅｒｒｙ、Ｋａｅｄｅタンパク質、ＴａｇＲＦＰ、ＴｕｒＢｏＦＢ、もしくはフィコビリンタンパク質、またはそれらのうちのいずれか１つの生物学的に活性な多様体もしくはフラグメントなどのタンパク質が挙げられる。
【０１７７】
一部の実施形態では、ドナー蛍光団ドメインは、上で規定されたようなナノ結晶または量子ドットとし得る。
【０１７８】
一部の実施形態では、アクセプタードメインは、消光剤とし得る。本明細書で使用される場合、「消光」という用語は、機序にかかわらず、エネルギー移動による消光ドメインにより引き起こされる蛍光ドナーの蛍光の減少を指す。それ故、消光剤の存在下での蛍光ドナーの照度は、予想されるよりも強度が弱い、またはさらには完全に存在しない放出シグナルをもたらす。適切に選択された任意の分子は、蛍光団ドナードメインとして使用されている蛍光団の蛍光強度を減少させる場合、消光剤として使用することができる。消光剤の例としては、Ｄｅｅｐ  Ｄａｒｋ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  ＤＤＱ−Ｉ、ＤＡＢＣＹＬ、Ｅｃｌｉｐｓｅ（登録商標）Ｄａｒｋ  ｑｕｅｎｃｈｅｒ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＦＱ、ＢＨＱ−１、ＱＳＹ−７、ＢＨＱ−２、ＤＤＱ−ＩＩ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ（登録商標）ＲＱ、ＱＳＹ−２１、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）ＢＨＱ−３、及び金ナノ粒子が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７９】
任意の数のドナー−アクセプターの組み合わせは、本発明のセンサーに使用することができる。当業者は、効率的なエネルギー移動を許容するドナー及びアクセプターのペアを選択することができるであろう。例えば、Ｂｒｙｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）及びＳａｐｓｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）を参照のこと。
【０１８０】
検出可能な変化
プロテアーゼ、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる本発明のセンサーの切断は、検出可能な変化を生じる。当業者が認識するように、本発明のセンサーはまた、センサーが他のプロテアーゼにより認識及び切断された切断部位を含有する場合、他のプロテアーゼにより切断され得る。
【０１８１】
当業者が理解するように、本明細書で使用される「検出可能な変化」は、センサーにおける任意の測定可能な変化である。例えば、検出可能な変化は、センサーの物理的または化学的特性の変化とし得る。一部の実施形態では、検出可能な変化は、音響、電気化学ポテンシャル、蛍光、化学発光、燐光、吸光度、抗体結合、ＢＲＥＴ比、ＦＲＥＴ効率、または質量の変化である。一部の実施形態では、検出可能な変化は、蛍光、化学発光、燐光、吸光度、抗体結合、または質量の変化である。本発明の利点は、センサーが、利用可能な検出技術に適するように適合させることができることである。検出可能な変化は、当業者に既知の任意の技術を使用して測定することができる。
【０１８２】
好ましい実施形態では、検出可能な変化は、ＢＲＥＴ比の変化である。一例としてＢＲＥＴ測定を使用して、一実施形態では、生物発光タンパク質及びアクセプター分子間に生じるエネルギー移動は、特定の波長を選択する光学フィルタを使用して測定された放出から計算された比（１つは、アクセプター分子放出用、もう１つは、生物発光タンパク質放出用）として提示される（等式１を参照のこと）。
Ｅａ／Ｅｄ＝ＢＲＥＴ比（１）
Ｅａは、アクセプター分子放出強度として定義され（放出光は、アクセプターの放出に適合した特定のフィルタを使用して選択され）、Ｅｄは、生物発光タンパク質放出強度として定義される（放出光は、生物発光タンパク質の放出に適合する特定のフィルタを使用して選択される）。
【０１８３】
光学フィルタは、ＢＲＥＴに適する波長識別を可能にする任意の種類のフィルタであり得ることが当業者により容易に理解されるべきである。例えば、本発明に従って使用される光学フィルタは、干渉フィルタ、ロングパスフィルタ、ショートパスフィルタなどとし得る。フィルタを通過する波長の強度（通常は、１秒当たりのカウント数（ＣＰＳ）または相対発光単位（ＲＬＵ））は、固相マイクロ光電子増倍管（マイクロＰＭＴ）、光電子増倍管（ＰＭＴ）、カスケードフォトダイオード、フォトダイオードアレイ、または電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラなどの高感度カメラを含むフォトダイオードのいずれかを使用して定量することができる。続いて、定量化されたシグナルは、ＢＲＥＴ比を計算するために使用され、エネルギー移動効率を表す。ＢＲＥＴ比は、アクセプター放出の強度の増加に伴って増加する。
【０１８４】
一般に、ドナー放出強度に対するアクセプター放出強度の比が決定され（等式１を参照のこと）、これは、エネルギー移動効率を反映する任意の単位で表される数である。比率は、エネルギー伝達効率の増加に伴って増加する（Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９を参照のこと）。
【０１８５】
エネルギー移動効率は、アクセプター放出強度に対するドナー放出強度の逆比を使用して表すこともできる（等式２を参照のこと）。この場合、比率は、エネルギー移動効率の増加に伴って減少する。この計算を実施する前に、放出強度は、バックグラウンド光の存在及び基質の自己発光について補正される。この補正は一般に、基質を含有するが、本発明の生物発光タンパク質、アクセプター分子、またはポリペプチドを含有しない対照試料から、適切な波長で測定された放出強度を差し引くことにより行われる。
Ｅｄ／Ｅａ＝ＢＲＥＴ比（２）
Ｅａ及びＥｄは、上で規定された通りである。
【０１８６】
生物発光タンパク質及びアクセプター分子放出の光強度は、分光蛍光光度計、電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ、またはダイオードアレイ検出器などのモノクロメーターベースの装置を使用して定量することもできる。分光蛍光光度計を使用して、基質の添加時に生物発光タンパク質及びアクセプター分子放出ピークの双方が検出されるように、放出スキャンが実施される。λｍａｘまたは最大強度に対するいずれかの任意の強度により規定される波長でのピーク下面積または強度は、相対的な光強度を表すために使用することができ、上で概説したように、比を計算するために使用されてもよい。同じ試料からの生物発光タンパク質及びアクセプター分子についての光を測定することが可能な任意の装置が、本発明のＢＲＥＴシステムを監視するために使用することができる。
【０１８７】
代替的実施形態では、アクセプター分子放出のみが、ＢＲＥＴの効果的な検出及び／または定量化に適している。この場合、エネルギー移動効率は、アクセプター放出強度のみを使用して表される。エネルギー移動を測定するために、いかなる比率計算も行うことなくアクセプター放出強度を使用され得ることが、当業者には容易に明らかであろう。これは、理想的には、アクセプター分子が、生物発光タンパク質から移動した光を吸収する場合にのみ、光を放出するであろうという事実に起因するものである。この場合、１つの光フィルタのみが必要とされる。
【０１８８】
関連する実施形態では、生物発光タンパク質放出単独が、ＢＲＥＴの効果的な検出及び／または定量化に適する。この場合、エネルギー移動効率は、生物発光タンパク質放出強度のみを使用して計算される。エネルギー移動を測定するために、いかなる比率計算も行うことなくドナー放出強度を使用され得ることが、当業者には容易に明らかであろう。これは、アクセプター分子が生物発光タンパク質から移動した光を吸収するので、生物発光タンパク質からの検出可能な放出の対応する減少があるという事実に起因するものである。この場合、１つの光フィルタのみが必要とされる。
【０１８９】
代替的実施形態では、エネルギー伝達効率は、測定用の光学フィルタを１つのみ必要とするレシオメトリック測定を使用して表される。この場合、ドナーまたはアクセプターの光強度は、適切な光学フィルタを使用して決定され、試料の別の測定は、いかなるフィルタも使用せずに行われる（オープンスペクトルの強度）。この後者の測定では、全光出力（全波長に対する）が定量される。次に、比率計算は、式３または４のいずれかを使用して行われる。等式３では、アクセプター用の光学フィルタのみが必要とされる。等式４では、ドナー用の光学フィルタのみが必要とされる。
Ｅａ／Ｅｏ−Ｅａ＝ＢＲＥＴ比または＝Ｅｏ−Ｅａ／Ｅａ（３）
Ｅｏ−Ｅｄ／Ｅｄ＝ＢＲＥＴ比または＝Ｅｄ／Ｅｏ−Ｅｄ（４）
Ｅａ及びＥｄは、上で規定された通りであり、Ｅｏは、結合された全ての波長の放出強度として規定されている（オープンスペクトル）。
【０１９０】
さらなる等式は、等式１〜４から導き出すことができることが、当業者には、容易に明らかでなければならない。例えば、このような１つの誘導体は、生物発光タンパク質及び／またはアクセプター分子の放出波長で存在するバックグラウンド光について補正することを含む。
【０１９１】
ＢＲＥＴアッセイを実施する際には、光放出は、ＢＲＥＴＣｏｕｎｔを使用して各ウェルから決定することができる。ＢＲＥＴＣｏｕｎｔ装置は、改良型ＴｏｐＣｏｕｎｔであり、ＴｏｐＣｏｕｎｔは、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｍｅｒｉｄｅｎ、コネチカット州）により販売されているマイクロタイタープレートシンチレーション及びルミネセンスカウンターである。バックグラウンドノイズを排除するために２つの光電子増倍管（ＰＭＴ）を利用する従来のカウンターとは異なり、ＴｏｐＣｏｕｎｔは、標準の不透明なマイクロタイタープレートでのカウントを可能にするノイズ低減用のシングルＰＭＴテクノロジー及び時間分解パルスカウントを用いる。不透明なマイクロタイタープレートを使用すると、光学的クロストークを無視できるレベルまで低減させ得る。ＴｏｐＣｏｕｎｔは、それぞれ、１、２、６、または１２の試料の同時読み出しを可能にする１、２、６及び１２の検出器（ＰＭＴ）を含む種々のフォーマットで提供される。ＢＲＥＴＣｏｕｎｔに加えて、他の市販の装置：Ｖｉｃｔｏｒ２（Ｗａｌｌａｃ、フィンランド（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））及びＦｕｓｉｏｎ（Ｐａｃｋａｒｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、メリデン）は、ＢＲＥＴを実施可能である。ＢＲＥＴは、少なくともアクセプター分子放出、好ましくは、２つの波長（アクセプター分子用及び生物発光タンパク質用）、またはそれ以上を検出し得るリーダーを使用して実施することができる。
【０１９２】
当業者が理解するように、ＢＲＥＴは、センサーがアクセプタードメインに対して化学発光ドナードメインを有する検出可能な標識を含むことを必要とする。これらの実施形態では、標的配列がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼにより切断される場合に、アクセプタードメインに対する化学発光ドナードメインの空間的位置及び／または双極子配向を変更して、ＢＲＥＴ比の変化をもたらす。
【０１９３】
本明細書で使用される場合、「空間的位置」という用語は、ドナードメインが標的配列を介してアクセプタードメインに連結されないよう、プロテアーゼがセンサー分子を切断した結果として変化するアクセプター分子に対するドナーの３次元配置を指す。
【０１９４】
本明細書で使用される場合、「双極子配向」という用語は、３次元空間におけるドナー及び／またはアクセプター分子の配向に対する、ドナー及び／またはアクセプター分子のいずれかと関連する双極子モーメントの３次元空間における方向を指す。双極子モーメントは、分子上の電荷の変動の結果である。
【０１９５】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、ＢＲＥＴ比の変化をもたらし、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、観察された最大ＢＲＥＴ比の約２％〜約９５％のＢＲＥＴ比の変化をもたらし得る。一部の実施形態では、ＢＲＥＴ比の変化は、観察された最大ＢＲＥＴ比の約５％〜約９０％、約１５％〜約５０％、または約１５％〜約４０％である。一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、観察された最大ＢＲＥＴ比の２％以上であるＢＲＥＴ比の変化をもたらす。一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、観察された最大ＢＲＥＴ比の５％以上、１０％以上、２０％以上、３０％以上、３５％以上であるＢＲＥＴ比の変化をもたらす。１５％以上のＢＲＥＴ比の変化は、プロテアーゼ検出のシグナル対ノイズ比を増加させる。これは、所与のあらゆるサンプリング時間に対する優れた検出限界及びプロテアーゼ濃度のレベルのより正確なコーディングをもたらす。あるいは、一定の検出限界では、ＢＲＥＴ比のより大きな変化は、より短いシグナル積分時間を容易にし、それ故、より迅速な検出を容易にする。
【０１９６】
本明細書で使用される場合、「ストークスシフト」は、同じ電子遷移の吸収スペクトルのバンド最大値の位置及び放出スペクトルのバンド最大値の位置間の波長の差である。好ましくは、アクセプタードメインは、大きなストークスシフトを有する。吸収スペクトルの最大バンドの位置及び放出スペクトルの最大バンドの位置間の差が大きいと、放出された信号から反射励起放射を除去するのが容易になるので、大きなストークスシフトが望ましい。
【０１９７】
一部の実施形態では、アクセプタードメインは、約５０ｎｍを超えるストークスシフトを有する。一部の実施形態では、アクセプタードメインは、約５０ｎｍ〜約３５０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍのストークスシフトを有する。一部の実施形態では、アクセプタードメインは、約９０ｎｍより大きい、例えば、１００ｎｍ、１１０ｎｍ、１２０ｎｍ、１３０ｎｍ、１４０ｎｍ、または１５０ｎｍのストークスシフトを有する。
【０１９８】
ＢＲＥＴは、外部光源を用いるドナーの励起を必要としないので、蛍光に基づく技術に優るいくつかの利点を有する。ＢＲＥＴは、ドナー部分の自己蛍光、光散乱、光退色、及び／または光異性化、または細胞への光損傷を受けない。ＢＲＥＴアッセイに外部光源が存在しないと、バックグラウンドが非常に低くなり、その結果、検出感度が向上する。例えば、ＢＲＥＴは、トロンビン触媒によるタンパク質分解的な切断の監視に関して、ＦＲＥＴよりも感度が５０倍高い（Ｄａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）。
【０１９９】
一部の実施形態では、検出可能な変化は、ＦＲＥＴ効率の変化であり、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、ＦＲＥＴ効率の変化をもたらす。本明細書で使用される場合、ＦＲＥＴは、１つの蛍光団（ドナー）からアクセプターへのエネルギーの非放射移動に基づく近接アッセイである。アクセプターは通常、異なる色の蛍光を放出する別の蛍光団とし得る。アクセプターはまた、光を放出しない消光剤とし得る。Ｆｏｒｓｔｅｒの等式（Ｆｏｒｓｔｅｒ（１９４８）及びＦｏｒｓｔｅｒ（１９６０））によると、ＦＲＥＴ効率は、５つのパラメータ：（ｉ）第２の蛍光団の吸収スペクトル及び第１の蛍光団の放出スペクトル間の重なり、（ｉｉ）ドナーの放出双極子及びアクセプターの吸収双極子間の相対的配向、（ｉｉｉ）蛍光団間の距離、（ｉｖ）ドナーの量子収量、及び（ｖ）アクセプターの吸光係数、に依存する。
【０２００】
通常は、ドナー及びアクセプターは、本発明のセンサーを形成する標的配列のＮ末端及びＣ末端に結合している。ドナー及びアクセプターがインタクトな標的配列に結合している場合、アクセプターからの放出が、ドナー粒子の励起時に観察される。プロテアーゼが標的配列を切断すると、ドナー及びアクセプター間のエネルギー移動が中断される。ドナー及びアクセプターの双方が蛍光団である場合、切断は、ドナー対アクセプターの蛍光放出の比を変える。ドナーが蛍光団であり、且つアクセプターが消光剤である場合、切断は、蛍光強度を増加させる。これは、ドナー及びアクセプター間の距離が、センサーの切断時に、大幅に増大するためである。
【０２０１】
一部の実施形態では、検出可能な変化は、燐光の変化であり、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、燐光の変化をもたらす。燐光の変化は、当業者に既知の技術を使用して測定することができる。本明細書で使用される場合、「燐光」は、物質により吸収されたエネルギーが光の形態で比較的ゆっくり放出されるプロセスである。
【０２０２】
一部の実施形態では、検出可能な変化は、時間分解蛍光の変化である。蛍光の変化は、当業者に既知の技術を使用して測定することができる。
【０２０３】
一部の実施形態では、検出可能な変化は、吸光度の変化であり、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、吸光度の変化をもたらす。一部の実施形態では、センサーは、発色団（例えば、ｐ−ニトロアニリン）を含む。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、発色団の化学的環境を変え、分光光度計を使用して測定することができる吸光度の変化をもたらすであろう。一部の実施形態では、センサーの標的配列は、Ｎ末端またはＣ末端で、発色団、好ましくは高イプシロン発色団で標識され、非標識末端は、固体支持体（例えば、ビーズまたは表面）に付着する。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、発色団を固体支持体から分離し、発色団を反応培地中に放出する。培地中に放出される発色団の量は、当業者に既知の技術を使用して決定することができる。さらなる実施形態では、センサーは、発色基質または化学発光基質を使用して吸光度変化を生じさせ得る酵素（例えば、アルカリホスファターゼ／西洋ワサビペルオキシダーゼなど）を含む。センサーは、固体基質（例えば、ビーズまたは表面）にも結合している。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、当業者に既知の技術を使用した酵素アッセイを使用して検出することができる反応培地中に、色または光生成部分を放出するであろう。
【０２０４】
一部の実施形態では、検出可能な変化は、抗体結合の変化であり、例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、抗体を使用して検出することができるエピトープを放出する。一部の実施形態では、センサーは、エピトープ（例えば、ｍｙｃ、Ｆｌａｇ、ヘキサヒスチジンなど）を含む。任意に、センサーは、固体支持体に結合している。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、当業者に既知の方法を使用して検出することができる反応培地中にエピトープを放出する。未放出エピトープは、関連する抗体（例えば、抗ｍｙｃ、抗６ＸＨｉｓタグ、または抗ＦＬＡＧ）及び当業者に既知の方法を使用して検出することもできる。
【０２０５】
一部の実施形態では、検出可能な変化は、質量の変化である。当業者に理解されるように、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、センサーの質量を変化させる。質量の変化は、当業者に既知の任意の好適な技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）または水晶振動子マイクロバランス（ＱＣＭ）などの任意のマイクロ計量技術を使用して検出することができる。一部の実施形態では、センサーは、当業者に既知の任意の技術（例えば、チオール結合）を介してＳＰＲチップまたはＱＣＭ上に固定化することができる。ＳＰＲの場合、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、局所的な屈折率の変化をもたらし、測定することができるＳＰＲの変化をもたらす。ＱＣＭの場合、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼによる標的配列の切断は、共振器の質量を変化させ、ＱＣＭの共振周波数の変化を検出することができる。一部の実施形態では、センサーは、標的配列が切断された時に、質量の変化がより大きくなるように、大きな分子、ビーズなどを含む。
【０２０６】
組成物、方法、及び使用
本発明のセンサーは、細菌プロテアーゼを検出するのに使用される組成物に含まれていてもよい。一部の実施形態では、本発明によるセンサー及び許容される担体を含む組成物が提供される。本明細書で使用される場合、「許容される担体」という用語は、本発明の方法及び使用に適合する任意の及び全ての固体または溶媒（例えば、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液、水、生理食塩水）、分散媒、コーティングなどを含む。許容される担体は、組成物の他の成分と適合性があり、且つ試験されているプロテアーゼを阻害または損傷しないという意味において「許容される」はずである。一般に、好適な許容される担体は、当該分野で既知であり、最終用途に基づいて選択される。
【０２０７】
当業者が理解するように、本出願のセンサーは、試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼの有無を検出するために使用することができ、存在する場合、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼの活性を決定するためにも使用されてもよい。それ故、一部の実施形態では、試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出する方法が提供され、方法は、ｉ）試料を本発明のセンサーと接触させること、及び、ｉｉ）センサーの変化を検出すること、を含み、該変化は、試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼの存在に対応する。
【０２０８】
乳製品中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．及び他の細菌由来のκ−カゼイン分解性プロテアーゼを検出及び定量するために、貯蔵寿命及び品質を予測するために、且つ細菌プロテアーゼ駆動型腐敗を低減させるか、遅延させるか、または排除するように設計された管理及び加工処理を最適化するために、センサーを使用することができる。
【０２０９】
本明細書で使用される場合、乳製品及び他の食品に関して「腐敗」という用語は、それが、もはや食欲をそそらないか、またはヒトの摂取用に適していない時点までの、製品の質感、色、匂い、及び／または風味の変質を記載するために使用される用語である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．などの微生物により引き起こされる腐敗の場合、腐敗は多くの場合、微生物またはそれらの酵素によるタンパク質（例えば、カゼイン及び乳清）、炭水化物、ならびに脂肪の分解を伴う。本発明者らは、３７℃において、細菌プロテアーゼが、１ｐＭを超える濃度で存在する場合、乳汁腐敗を引き起こし得ることを観察している。この場合、腐敗は、（得られた外観が「凝乳及び乳清」である）ミルクの相分離により明示される。
【０２１０】
本明細書で使用される場合、「乳製品」という用語は、ミルク、及びミルクから部分的にまたは完全に取り出された製品を含む。乳汁は、任意の哺乳動物、例えば、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラクダ、バッファロー、ヒトなどから得られ得る。乳製品は、未殺菌乳、低脂肪乳、無脂肪乳、低温殺菌乳、ＵＨＴ乳、ラクトース変性ＵＨＴ乳、強化ＵＨＴ乳、フレーバーＵＨＴ乳、及びこれらの製品の組み合わせ、ならびにＵＨＴ特殊調製粉乳、チーズ、ヨーグルト、乳清、バターミルク、クリーム、粉乳、乳児用調製粉乳、及びバターなどを含むが、これらに限定されない。一部の実施形態では、乳製品の腐敗を検出する方法が提供され、方法は、ｉ）試料を本発明のセンサーと接触させること；及び、ｉｉ）センサーの変化を検出することを含み、該変化は、乳製品が、腐敗しているか、腐敗し始めているか、または腐敗する可能性を有することを示す。この例では、標的配列は、少なくとも部分的に乳汁腐敗を引き起こすＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．細菌プロテアーゼにより切断され得る切断部位を含む。製品はまた、プロテアーゼを含むか、または含むと疑われる乳製品の部分精製部分などの抽出物であってよい。
【０２１１】
本発明のセンサーは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．を含むバイオフィルムを検出または推定するために使用することもできる。例えば、本発明のセンサーは、牛乳加工プラント及び機器の一部の手が届かないか、または届きにくい場所に存在し得るＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．を含むバイオフィルムを検出または推定するために使用することができる。別の例では、本発明のセンサーは、食品及び／または飲料加工プラント及び機器の一部の手が届かないか、または届きにくい場所のバイオフィルムを検出または推定するために使用することもできる。さらなる例では、本発明のセンサーは、医療機器及びデバイスにおけるバイオフィルムを検出または推定するために使用することもできる。機器などを分解することなく、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．を含むバイオフィルムを検出または推定する能力は、所定の「所定位置の清掃」及び「所定位置以外の清掃」手順のスケジューリング及び評価に役立つであろう。
【０２１２】
本発明のセンサーは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．感染を検出するために使用することもできる。少なくとも１回の重篤なカテーテル感染の発生が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓに関連している。他のシュードモナスは、重要な日和見病原体である。感染を検出するためのこれらのセンサーの使用は、臨床状況における感染管理及び処置を助けることができる。
【０２１３】
当業者が知っているように、本発明のセンサーは、多重化することもできる。この系では、異なるプロテアーゼにより切断されている２つ以上の異なるセンサー分子が提供される。例えば、本発明のセンサーは、ウシプラスミンにより切断されるセンサーと多重化することができる（例えば、ＰＣＴ／ＡＵ２０１３／０００３７８を参照のこと）。一部の実施形態では、それぞれ異なるセンサー分子は、異なる標的化合物の検出及び定量化を可能にするために異なる波長で放出するように、異なるドナー及び／またはアクセプター分子を含み得る。一部の実施形態では、それぞれ異なるセンサー分子は、同じドナー及び／またはアクセプター分子であってよい。一部の実施形態では、単一の流体検出チャンバが使用される。一部の実施形態では、マルチチャンネル検出デバイスが使用されてもよい。
【０２１４】
「試料」は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．及び／またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを含有する可能性を有する任意の物質または組成物とし得る。通常は、試料は、細菌及び／またはプロテアーゼを含むことが知られているか、または含むと疑われる任意の物質である。試料の例としては、液体、生物学的材料、及び装置が挙げられる。一部の実施形態では、試料は、乳製品またはその抽出物、土壌またはその抽出物、臨床試料またはその抽出物、医療機器の試料（例えば、綿棒、リンスなど）、機械の試料（例えば、綿棒、リンスなど）、食品加工機器の試料（例えば、綿棒、リンスなど）、植物材料またはその抽出物などからなる群より選択される。一部の実施形態では、臨床試料としては、血液、血清、痰、粘液、膿、腹腔液、及び他の体液が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、食品加工機器としては、輸送用タンカー、保管タンク、加工機械、ライン、管、コネクタ、バルブなどが挙げられるが、これらに限定されない。試料は、機械から取り出されてもよい（例えば、綿棒、リンスなど）。機械は、細菌及び／またはプロテアーゼを保有することが疑われるか、または保有することが知られている任意の機械、例えば、乳製品の製造、貯蔵、及び加工に関与する任意の機械を含む。一部の実施形態では、機械としては、緩衝剤及び保管サイロ、溶接継手、バッファタンク出口、コンベヤーベルト、限外濾過膜、バルブ、空気分離器、タンカートラック、タンカートラック貯蔵タンク、貯蔵タンク、バルブ、ガスケット、接続パイプなどが挙げられるが、これらに限定されない。試料は、医療機器から取り出されてもよく、例えば、試料は、限定されないが、カテーテル、静脈内ライン、人工呼吸器、創傷被覆材、コンタクトレンズ、透析機器、医療デバイスなどを含む医療機器の綿棒またはリンスであってよい。
【０２１５】
乳製品は、未殺菌乳、低脂肪乳、無脂肪乳、低温殺菌乳、ＵＨＴ乳、ラクトース修飾ＵＨＴ乳、強化ＵＨＴ乳、フレーバーＵＨＴ乳、及びこれらの製品の組み合わせ、ならびにＵＨＴ特殊調製粉乳、チーズ、ヨーグルト、乳清、バターミルク、クリーム、粉乳、乳児用調製粉乳、及びバターなどとし得るが、これらに限定されない。試料は、環境または供給源から直接入手しても、本発明の方法が実施される前に好適な手順により抽出及び／または少なくとも部分的に精製されてもよい。
【０２１６】
一部の実施形態では、試料は、水性液体である。例えば、試料は、乳汁、フルーツジュース、他の飲料、及び血清を含む体液を含むがこれらに限定されない。
【０２１７】
本発明の方法は、検出可能な変化を測定するのに適する任意のシステムで実施することができる。
【０２１８】
当業者が理解するように、本発明の方法は、バッチ（例えば、プレートリーダーを使用するバッチフォーマット）またはフローフォーマットで実施することができる。例えば、本発明の方法は、適切なフィルタを備えたマイクロプレートリーダーを使用したマイクロプレートフォーマットで実施することができる。本発明の方法は、ＰＣＴ／ＡＵ２０１３／０００３７８に記載されているようなマイクロ流体デバイスで実施することもできる。
【０２１９】
前述の方法とは対照的に、本発明は、乳汁中、且つピコモルレベルで、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを測定する直接的な選択的アッセイに使用することができる。例えば、一部の実施形態では、少なくとも１ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出することができる。一部の実施形態では、少なくとも５ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出することができる。一部の実施形態では、少なくとも１０ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出することができる。一部の実施形態では、少なくとも２０ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出することができる。一部の実施形態では、少なくとも３０ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出することができる。一部の実施形態では、少なくとも４０ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出することができる。一部の実施形態では、少なくとも５０ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出することができる。一部の実施形態では、少なくとも６０ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出することができる。一部の実施形態では、少なくとも７０ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出することができる。一部の実施形態では、少なくとも８０ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出することができる。一部の実施形態では、少なくとも９０ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出することができる。一部の実施形態では、少なくとも１００ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出することができる。一部の実施形態では、少なくとも１５０ｐＭのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出することができる。
【０２２０】
乳汁中の細菌プロテアーゼを検出する、以前に報告された方法は、非常に長いインキュベーション時間（最大１４日以上）を必要とする（Ｂｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２０１１）。対照的に、本発明の方法は、３時間未満、２時間、１時間未満、３０分未満、または１５分未満で実施することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、２時間未満で実施することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、１時間未満で実施することができる。一部の実施形態では、本発明の方法は、３０分未満で実施することができる。好ましくは、本発明の方法は、１５分未満で、所望の感度を得ることができる。
【０２２１】
本出願の方法及びセンサーは、ウシプラスミンよりも、細菌プロテアーゼへの感度が高い可能性がある。実施形態では、本発明は、ウシプラスミンよりも、細菌プロテアーゼへの選択性が、少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または５倍〜１，０００倍、または５倍〜１００倍、または５倍〜５０倍、または５倍〜２０倍、及び／または一部の場合では、最大１００〜１，０００倍高い。
【０２２２】
試料調製
プラスミン、そのチモーゲンプラスミノーゲン、及び細菌プロテアーゼなどのプロテアーゼは、乳製品中でカゼインミセル及び乳脂肪球と結合し得る。これは、これらの試料中に存在するプロテアーゼの量を測定することを困難にし得る。理論に拘束されることを望むものではないが、これらのプロテアーゼに対する天然基質であるカゼインは、プロテアーゼアッセイに使用される基質に対する競合的阻害剤として作用し得ると考えられる。乳製品中のプロテアーゼの量を測定する種々の方法が記載されている（例えば、プラスミンの場合、Ｓａｉｎｔ−Ｄｅｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）及びＲａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）を参照のこと）。これらのアッセイにより測定されたプロテアーゼの量は、試料がアッセイのために調製されている仕方に応じて変動し得る。カゼインミセルからプロテアーゼを解離させ、プロテアーゼアッセイのための試料を調製するために使用することができる改良された方法が必要とされている。
【０２２３】
本発明者らは、カゼインミセルからプロテアーゼを解離させるための改良された方法を見出している。一態様では、本発明は、カゼインミセルからプロテアーゼを解離させる方法を提供し、方法は、カゼインミセルと結合しているプロテアーゼを含む組成物を、カゼインに結合しているプロテアーゼと競合する化合物の存在下で超音波処理することを含む。一部の実施形態では、カゼインミセルからプロテアーゼを解離させる方法が提供され、方法は、カゼインミセルと結合しているプロテアーゼを含む組成物を、カゼインに結合しているプロテアーゼと競合する化合物及びカルシウムキレート剤の存在下で超音波処理することを含む。改良された方法は、遊離プロテアーゼの量を増加させ、上記のプロテアーゼセンサー分子を使用するようなプロテアーゼアッセイのための試料を調製するために使用することができる。本明細書で使用される場合、「遊離プロテアーゼ」という用語は、カゼインミセルから解離されているプロテアーゼを指す。
【０２２４】
一部の実施形態では、組成物は、乳製品の試料である。組成物は、乳製品の部分的に精製された部分などの抽出物でもあり得る。
【０２２５】
カゼインに結合しているプロテアーゼと競合する化合物は、当業者に既知の任意の好適な化合物とし得る。一部の実施形態では、化合物は、リシンの誘導体またはアナログである。リシンの好適な誘導体またはアナログとしては、アミノカプロン酸、トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸、トランス−４−アミノ−エチルシクロヘキサンカルボン酸、及びそれらのエステルが挙げられるが、これらに限定されない。アミノカプロン酸は、ε−アミノカプロン酸、ε−Ａｈｘ、または６−アミノヘキサン酸としても知られている。アミノカプロン酸及びそのエステルの例としては、アミノカプロン酸、ヘキシルε−アミノカプロン酸などのアルキルエステル、及びベンジルε−アミノカプロン酸などのアラルキルエステルが挙げられる。トランス−４−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸及びそのエステルの例としては、トランス−４−アミノ−メチルシクロヘキサンカルボン酸、ベンジルトランス−アミノメチルシクロヘキサンカルボン酸などのアラルキルエステル、ならびにフェニルトランス−アミノメチルシクロヘキサンカルボキシラート及び４−（２−カルボキシエチル）フェニルトランス−アミノメチルシクロヘキサンカルボキシラートなどのアリールエステルが挙げられる。本発明に使用されるトランス−４−アミノエチルシクロヘキサンカルボン酸及びそのエステルの例としては、トランス−４−アミノ−エチルシクロヘキサンカルボン酸、ベンジルトランス−アミノエチルシクロヘキサンカルボキシラートなどのアラルキルエステル、ならびにフェニルトランス−アミノエチルシクロヘキサンカルボキシラート及び４−（２−カルボキシエチル）フェニルトランス−アミノエチルシクロヘキサンカルボキシラートなどのアリールエステルが挙げられる。好ましい実施形態では、リシンの誘導体またはアナログは、ε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡとも呼ばれる）である。
【０２２６】
カゼインに結合しているプロテアーゼと競合する化合物は、遊離プロテアーゼの量を増加させるのに十分な量で存在する。一部の実施形態では、組成物は、約０．１ｍＭ〜約２０ｍＭの化合物、約０．３ｍＭ〜約１０ｍＭの化合物、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭの化合物、約０．６ｍＭ〜約４ｍＭ、または０．７ｍＭ〜約２ｍＭの化合物を含む。例えば、組成物は、約０．７ｍＭ、約０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約１．１ｍＭ、約１．２ｍＭ、約１．３ｍＭ、約１．４ｍＭ、約１．５ｍＭ、約１．６ｍＭ、約１．７ｍＭ、約１．８ｍＭ、約１．９ｍＭ、または約２．０ｍＭの化合物を含有し得る。好ましい実施形態では、組成物は、０．８ｍＭ、約０．９ｍＭ、約１ｍＭ、約１．１ｍＭ、または約１．２ｍＭの化合物を含む。より好ましい実施形態では、組成物は、約１ｍＭの化合物を含む。
【０２２７】
組成物は、カルシウムキレート剤を含み得る。当業者に既知の任意の好適なカルシウムキレート剤を使用することができる。理論に拘束されることを望むものではないが、カルシウムキレート剤は、遊離カルシウムイオン及びコロイド状リン酸カルシウムの量を減少させて、カゼインミセルの少なくとも部分的な解離をもたらすと考えられる。一部の実施形態では、カルシウムキレート剤は、クエン酸イオン、リン酸イオン、ピロリン酸イオン、ポリリン酸イオン、及びポリカルボキシラート、ならびにその塩からなる群より選択される。一部の実施形態では、カルシウムキレート剤は、ヘキサメタリン酸ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、クエン酸三ナトリウム、フィチン酸ナトリウム、エチレンジアミン四酢酸、及びエチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸からなる群より選択される。カルシウムキレート剤の濃度は、キレート化されるべき金属イオンの予測量及び／または使用されるカルシウムキレート剤の種類に応じて変動し得る。一部の実施形態では、カルシウムキレート剤の濃度は、約０．０１Ｍ〜約０．５Ｍ、または約０．０５Ｍ〜約０．４Ｍ、または約０．０５Ｍ〜約０．１Ｍである。一部の実施形態では、カルシウムキレート剤は、クエン酸イオンまたはその塩である。一部の実施形態では、カルシウムキレート剤は、クエン酸三ナトリウムである。一部の実施形態では、クエン酸三ナトリウムの濃度は、約０．０１Ｍ〜約０．５Ｍ、または約０．０５Ｍ〜約０．４Ｍ、または約０．０５Ｍ〜約０．１Ｍである。
【０２２８】
一部の実施形態では、組成物のｐＨは、使用されるカルシウムキレート剤に基づいて、当業者が選択することができる。ｐＨは、キレート剤の安定性及び有効性に影響を及ぼし得る。一部の実施形態では、組成物のｐＨは、６．０を超える。一部の実施形態では、ｐＨは、７．０を超える。一部の実施形態では、ｐＨは、約８．０〜約１０．０、約８．３〜９．５、約８．５〜約９．３、約８．７〜約９．１、約８．８〜約９．０、または約８．９である。ｐＨを維持するために、緩衝剤を組成物に添加することができる。任意の好適な緩衝液を使用することができる。
【０２２９】
組成物は、許容される担体及び／または添加剤も含み得る。一般に、好適な許容される担体及び／または添加剤は、当該技術分野で既知であり、最終用途に基づいて選択される。例えば、一部の実施形態では、組成物は、塩化ナトリウムを含む。一部の実施形態では、塩化ナトリウムの濃度は、約０．０１Ｍ〜約０．３Ｍ、または約０．０２５Ｍ〜約０．２５Ｍ、または約０．０４Ｍ〜約０．１Ｍ、または約０．０５Ｍである。一部の実施形態では、塩化ナトリウムの濃度は、０．０５Ｍの塩化ナトリウムである。
【０２３０】
好ましい実施形態では、プロテアーゼは、少なくとも部分的に乳汁腐敗を引き起こす。一部の実施形態では、プロテアーゼは、比較的熱安定性である。一部の実施形態ではプロテアーゼは、プラスミンまたはそのチモーゲン、プラスミノーゲンである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、プラスミンである。一部の実施形態では、方法は、当業者に既知の方法を使用してプラスミノーゲンをプラスミンに変換することをさらに含む。一部の実施形態では、プロテアーゼは、細菌プロテアーゼである。一部の実施形態では、細菌プロテアーゼは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．により産生される。一部の実施形態では、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｒａｇｉ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｌｕｄｅｎｓｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ＬＢＳＡ１、またはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、細菌性細胞外プロテアーゼである。一部の実施形態では、細菌性細胞外プロテアーゼは、アルカリ金属のメタロプロテアーゼである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、セラリシンファミリーのプロテアーゼに属する。一部の実施形態では、プロテアーゼは、ＡｐｒＸプロテアーゼである。一部の実施形態では、プロテアーゼは、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  ｎｏ  １１４（ＮＣＢＩ  ＧｅｎＰｅｐｔ  ＩＤ  ＢＡＡ２８２６８）のＡｐｒＸと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性、または１００％の配列同一性を有する。
【０２３１】
本方法の利点の１つは、当該技術分野に記載の他の方法よりも、実施が速いことである。例えば、Ｒａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）に記載の方法は、１５分のインキュベーションを２回必要とする。最初のインキュベーションは、カゼインミセルを解離させると考えられる。第２のインキュベーションは、カゼインからプロテアーゼを解離させると考えられる。本発明者らは、本明細書に記載の方法が試料調製に必要な時間を低減することを見出している。一部の実施形態では、超音波処理は、１５分間以下、１０分間以下、５分間以下、または２分間以下実施される。好ましくは、超音波処理は、５分間以下実施される。より好ましくは、超音波処理は、２分間以下で実施される。本明細書で使用される場合、「以下」は、少なくとも１秒間の超音波処理を必要とする。
【０２３２】
一部の実施形態では、超音波処理は、連続的である。代替の実施形態では、超音波処理は、パルス化される。
【０２３３】
当業者に既知の任意の好適な超音波処理装置またはホモジナイザーが使用されてもよい。好適な超音波処理装置またはホモジナイザーとしては、Ｈｏｎｄａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｓｏｎａｃ−２００コントローラー、改良型Ｈｏｎｄａ  ＺＯ４１超音波カッター、Ｈｅｉｌｓｃｈｅｒ  ＧＤｍｉｎｉ２などのインライン超音波マイクロリアクター、Ｍｉｓｏｎｉｘ超音波処理装置３０００、またはＱ５５超音波処理装置が挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、超音波処理器は、Ｓｏｎｏ  ＴｅｋのＳｏｎｉｃＳｙｒｉｎｇｅ（商標）システムなどの音波注射器を用いて実施されてもよい。
【０２３４】
好ましくは、超音波処理装置は、１０ｍＬ以下、５ｍＬ以下、２．５ｍＬ以下、１．２５ｍＬ以下、または０．１ｍＬ以下の試料体積を超音波処理するために使用することができる。一部の実施形態では、超音波処理装置は、約２．５ｍＬの試料体積を超音波処理するために使用することができる。一部の実施形態では、超音波処理装置は、約１．２５ｍＬの試料体積を超音波処理するために使用することができる。一部の実施形態では、超音波処理装置は、約０．１ｍＬの試料体積を超音波処理するために使用することができる。
【０２３５】
一部の実施形態では、超音波処理装置は、２０ｍｍ以下、１５ｍｍ以下、１１ｍｍ以下、９ｍｍ以下、７ｍｍ以下、５ｍｍ以下、４ｍｍ以下、３ｍｍ以下、または２ｍｍ以下のプローブの先端直径を有する。一部の実施形態では、超音波処理装置は、好適な４ｍｍのプローブ先端直径を備えたマイクロ超音波処理装置（例えば、Ｈｏｎｄａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ＺＯ４１またはＺＯ−４０Ｗ超音波カッター）を用いて実施されてもよい。さらに別の実施形態では、超音波処理装置は、１１ｍｍのプローブ先端直径を備えたＨｅｉｌｓｃｈｅｒ  ＧＤｍｉｎｉ２（またはこの機器の低出力バージョン）などのインライン超音波マイクロリアクターである。
【０２３６】
任意の好適な超音波処理デバイスの変位振幅を使用することができる。一部の実施形態では、超音波処理は、約１５μｍ〜３００μｍ、または約４０μｍ〜３００μｍ、または約１２０μｍ〜３００μｍの超音波処理デバイスの変位振幅で実施される。一部の実施形態では、超音波処理は、約１５μｍ〜３００μｍ、または約１５μｍ〜１２０μｍ、約１５μｍ〜２５μｍの超音波処理デバイスの変位振幅で実施される。一部の実施形態では、超音波処理は、約４０μｍの超音波処理デバイスの変位振幅で実施される。
【０２３７】
任意の好適な周波数を使用することができる。一部の実施形態では、超音波処理は、約１０ｋＨｚ〜約６０ｋＨｚの周波数、例えば、約１０ｋＨｚ、約２０ｋＨｚ、約３０ｋＨｚ、約４０ｋＨｚ、約５０ｋＨｚ、または約６０ｋＨｚで実施される。一部の実施形態では、超音波処理は、約１５ｋＨｚ〜約３０ｋＨｚの周波数で実施される。一部の実施形態では、超音波処理は、約２８ｋＨｚ〜約４０ｋＨｚの周波数で実施される。
【０２３８】
任意の好適な電力消費量を使用することができる。一部の実施形態では、超音波処理は、約５５ワット未満、約５０ワット未満、約４５ワット未満、約４０ワット未満、約３５ワット未満、約３０ワット未満、約２５ワット未満、約２０ワット未満、または約１５ワット未満の消費電力で実施される。好ましい実施形態では、超音波処理は、約２５ワット未満の電力で実施される。
【０２３９】
一部の実施形態では、超音波処理は、約０．０５ｍＬ〜約１０ｍＬ、０．０８ｍＬ〜２ｍＬ、または０．１ｍＬ〜約２．５ｍＬの試料体積で実施される。例えば、超音波処理は、約０．１ｍＬ、約０．２ｍＬ、約０．３ｍＬ、約０．４ｍＬ、約０．５ｍＬ、約０．６ｍＬ、約０．７ｍＬ、約０．８ｍＬ、約０．９ｍＬ、約１．０ｍＬ、約１．１ｍＬ、約１．２ｍＬ、約１．３ｍＬ、約１．４ｍＬ、約１．５ｍＬ、約１．６ｍＬ、約１．７ｍＬ、約１．８ｍＬ、約１．９ｍＬ、約２．０ｍＬ、約２．１ｍＬ、約２．２ｍＬ、約２．３ｍＬ、約２．４ｍＬ、または約２．５ｍＬの試料体積で実施される。一部の実施形態では、超音波処理は、約０．１ｍＬの試料体積で実施される。一部の実施形態では、超音波処理は、約１．２５ｍＬの試料体積で実施される。一部の実施形態では、超音波処理は、約２．５ｍＬの試料体積で実施される。
【０２４０】
当業者には理解されるように、超音波処理パラメータ（上述のものを含む）は、試料体積、超音波処理装置、超音波処理装置プローブ、先端深さ、試料容器などに応じて変動し得る。当業者は、超音波処理後に、約１２，０００×ｇで２分間の遠心分離で乳汁が別の層を形成しないように、乳汁を均質化するのに必要な超音波処理パラメータを選択することができるであろう（図２）。好ましくは、超音波処理後に、１２，０００×ｇで２分間の遠心分離で乳汁が別の層を形成しないように、乳汁を均質化するのに必要な最短時間で低出力超音波処理を提供する超音波処理パラメータが選択される。
【０２４１】
例えば、一部の実施形態では、超音波処理装置は、１１ｍｍのプローブ先端直径を有するＨｏｎｄａ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  Ｓｏｎａｃ−２００コントローラーであり、試料体積は、２．５ｍＬ（０．５ｍＬの添加ＥＡＣＡ緩衝液を含む２ｍＬの未殺菌乳）であり、試料は、内径２３ｍｍのガラスバイアル中にあり、超音波処理は、以下のパラメータ：周波数＝２８ｋＨｚ、振幅＝１７〜２１μｍ、及び消費電力：２５Ｗで約２分間実施される。
【０２４２】
他の実施形態では、超音波処理装置は、４ｍｍのプローブ先端直径を有するように改良されたＨｏｎｄａ  ＺＯ４１超音波カッターであり、試料体積は、２．５ｍＬ（２ｍＬの未殺菌乳及び０．５ｍＬの添加ＥＡＣＡ緩衝液）であり、試料は、内径２３ｍｍのガラスバイアル中にあり、超音波処理は、以下のパラメータ：周波数＝４０ｋＨｚ、振幅＝１６〜１９μｍ、及び消費電力：５〜８Ｗで約２〜６分間実施される。
【０２４３】
さらに他の実施形態では、超音波処理装置は、４ｍｍのプローブ先端直径を有するように改良されたＨｏｎｄａ  ＺＯ４１超音波カッターであり、試料体積は、約１．２５ｍＬ（１ｍＬの未殺菌乳及び０．２５ｍＬの添加ＥＡＣＡ緩衝液を含む）であり、試料は、内径約１０ｍｍの１．５〜２ｍＬのプラスチックエッペンドルフチューブ中にあり、超音波処理は、以下のパラメータ：周波数＝４０ｋＨｚ、振幅＝１６〜１９μｍ、消費電力：５〜８Ｗで約１〜６分間実施される。
【０２４４】
別の実施形態では、超音波処理装置は、４ｍｍのプローブ先端直径を有するように改良されたＨｏｎｄａ  ＺＯ４１超音波カッターであり、試料体積は、約０．１５０ｍＬ（０．１２０ｍＬの未殺菌乳及び０．０３０ｍＬのＥＡＣＡ緩衝液を含む）であり、試料は、内径６ｍｍの９６ウェルプレートの０．３ｍＬウェル中にあり、超音波処理は、以下のパラメータ：周波数＝３５ｋＨｚ、振幅＝１０μｍ、及び音響パワーレベル０．２５Ｗで約１〜２分間実施される。
【０２４５】
当業者に理解されるように、超音波処理は、プロテアーゼの変性及び／または不活化を引き起こさない温度で実施される。一部の実施形態では、超音波処理は、約５０℃未満、好ましくは、４０℃未満、最も好ましくは、３０℃未満の温度で実施される。例えば、試料は、超音波処理中に氷上または氷浴中でインキュベートされてもよい。超音波処理する場合、試料は、（例えば、冷凍または他の好適な技術により）１０℃以下に、１０℃以下、または４℃以下に維持されてもよい。
【０２４６】
上述したように、カゼインミセルからプロテアーゼを解離する方法は、プロテアーゼアッセイのための試料を調製するために使用することができる。この方法は、プロテアーゼアッセイ用の乳製品の試料を調製するために、且つ乳製品中のプロテアーゼの濃度を決定するために使用することもできる。従って、別の態様では、乳製品中のプロテアーゼの濃度を決定する方法が提供され、方法は、
（ｉ）本明細書に記載の方法を使用して、乳製品の試料を処理すること。
（ｉｉ）加工された乳製品中のプロテアーゼ活性を測定すること、及び
（ｉｉｉ）プロテアーゼ活性に基づいて乳製品のプロテアーゼ濃度を決定すること、
を含む。一部の実施形態では、乳製品の試料はまた、乳製品の部分的に精製された部分などの抽出物とし得る。一部の実施形態では、未殺菌乳、低脂肪乳、無脂肪乳、低温殺菌乳、ＵＨＴ乳、ラクトース変性ＵＨＴ乳、強化ＵＨＴ乳、フレーバーＵＨＴ乳、ＵＨＴ特殊調製粉乳、チーズ、ヨーグルト、乳清、バターミルク、クリーム、粉乳、乳児用調製粉乳、及びバター、ならびにそれらの組み合わせ、及び／またはカゼインに結合しているプロテアーゼを含むそれらのうちの１つ以上の抽出物からなる群より選択される乳製品。
【０２４７】
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉ）は、少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位を有する標的配列及び任意に検出可能な標識を含むセンサー分子と、加工乳製品を混合すること（プロテアーゼによる標的配列の切断が検出可能な変化を生じる）、ならびに、検出可能な変化を測定することを含む。
【０２４８】
一部の実施形態では、センサー分子は、本発明のセンサー分子である。一部の実施形態では、センサー分子は、本明細書に記載のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼセンサー分子である。一部の実施形態では、センサー分子は、配列番号１０５、１０６、及び１０７から選択されるポリペプチド配列を有する。一部の実施形態では、センサー分子は、ＰＣＴ／ＡＵ２０１３／０００３７８に規定のセンサー分子である。一部の実施形態では、センサー分子は、ポリペプチド配列、配列番号１０９を有する。一部の実施形態では、センサーは、プラスミンにより切断される（例えば、ＰＣＴ／ＡＵ２０１３／０００３７８を参照のこと）。一部の実施形態では、センサーは、細菌プロテアーゼ、例えば、本明細書で定義されるようなＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼにより切断される。
【０２４９】
一部の実施形態では、センサー分子は、検出可能な標識を含み、検出可能な標識は、化学発光ドナードメイン及び標的配列に共有結合しているアクセプタードメインを含む。一部の実施形態では、アクセプタードメインは、本明細書に規定の通りである。一部の実施形態では、化学発光ドナードメインは、本明細書に規定の通りである。
【０２５０】
センサー分子は、少なくとも１つのプロテアーゼ切断部位を有する標的配列を含む。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＳＦ、ＦＭ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、ＱＱ、及びＫＺ（Ｚは、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｙ、Ｖ、またはＥである）、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＳＦ、ＦＭ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、及びＫＺ（Ｚは、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｙ、Ｖ、またはＥである）、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＳＦ、ＦＭ、ＮＱ、ＮＴ、ＥＩ、ＫＫ、ＫＱ、及びＫＮ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。一部の実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、ＫＫ、ＫＹ、ＫＶ、及びＫＥ、ならびにそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０２５１】
一部の実施形態では、標的配列は、プラスミン切断部位を含む。一部の実施形態では、標的配列は、アミノ酸配列ＫＺを含み、Ｚは、Ｋ、Ｙ、Ｖ、またはＥである。一部の実施形態では、標的配列は、アミノ酸配列ＬＱＸＸＸＸＫＺＫＬＱ（配列番号１１０）を含み、Ｚは、Ｋ、Ｙ、Ｖ、またはＥであり、Ｘは、任意のアミノ酸である。一部の実施形態では、標的配列は、ＬＱＧＳＫＫＹＫＶＫＥＧＳＬＱ（配列番号１１１）を含む。
【０２５２】
一部の実施形態では、標的配列は、細菌プロテアーゼ切断部位を含む。一部の実施形態では、標的配列は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．切断部位を含む。一部の実施形態では、標的配列は、配列番号１〜９４を含む。
【実施例】
【０２５３】
以下の実施例は、本発明による好ましいセンサー及び方法について記載している。しかし、これは、これらの実施例は、実例として提供され、その中には、本発明の全体的な範囲に限定されるものとして解釈されるべきものはないと理解されるべきである。
【０２５４】
実施例１
センサーの構築
ＢＲＥＴ２−プラスミンセンサー及びＢＲＥＴ２−細菌プロテアーゼＰｆｌｕセンサー１、２、及び３をコードするＤＮＡ構築物を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ＵＳＡ）で合成した。センサーは、化学発光ドナーとしてのＲｌｕｃ２、及びアクセプターとしての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ２）の多様体を含んでいた。ＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ制限部位を使用して、ｐＲＳＥＴベクター（ＢｉｏＬａｂｓ、オーストラリア）に構築物をクローニングして、プロテアーゼセンサーをコードするｐＲＳＥＴ−Ｐｆｌｕベクターを作製した。プロテアーゼセンサーをコードするポリヌクレオチド配列を、配列番号１０２〜１０４に示す。プロテアーゼセンサーのポリペプチド配列を、配列番号１０５〜１０７に示す。プラスミンセンサーをコードするポリヌクレオチド配列を、配列番号１０８に示す。プラスミンセンサーのポリペプチド配列を、配列番号１０９に示す。
【０２５５】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）の細胞を、プロテアーゼセンサーをコードするｐＲＳＥＴ−Ｐｆｌｕベクターで形質転換した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）で、センサーを発現させた。３７℃、２００ｒｐｍで、１００μｇ／ｍＬのアンピシリン及び２％のグルコースを含有するＬＢ（１０ｇのトリプトン、５ｇの酵母エキス、５ｇのＮａＣｌ（ｐＨ７．４））中で、単一コロニーから一晩培養物を成長させた。０．１のＯＤ６００まで、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢを２５０ｍＬ接種すること、及び、３７℃（２００ｒｐｍ）で４．５時間インキュベートし、続いて、２２℃（２００ｒｐｍ）で一晩インキュベートすることにより、発現を誘導した。接種の２４時間後に、細胞を採取した。
【０２５６】
４３３５×ｇ（４℃）で１５分間の遠心分離により細胞を採取し、平衡緩衝液（５７．７ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、４２．３ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中に再懸濁させた。約２１，０００ｐｓｉの圧力で、ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｍ−１００Ｐ（Ｎｅｗｔｏｎ、米国マサチューセッツ州））に、細胞懸濁液を通過させ、１５，０００×ｇ（４℃）で１５分間の遠心分離により可溶性タンパク質画分を単離した。製造者の使用説明書に従って、コバルトアフィニティークロマトグラフィー（ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｌ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｒｅｓｉｎ（Ｔａｋａｒａ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、オーストラリア））を使用して、タンパク質を精製した。１５０ｍＭのイミダゾールで精製タンパク質を溶出した後、セルロース透析膜（１２，０００分子量カットオフ（Ｓｉｇｍａ））を使用して、プラスミン切断緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１０ｍＭのＮａＣｌ、及び２５ｍＭのリシン）に対し、試料を透析した。ドライアイス上で、精製タンパク質の５００μＬのアリコートをスナップ凍結し、−８０℃で保存した。
【０２５７】
実施例２
材料及び方法
粗細菌プロテアーゼ
ＯＸＯＩＤ寒天プレート上に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（株６５）の分離株をプレーティングし、２８℃で２日間インキュベートした。プレートからの３つのコロニーを、滅菌栄養ブロス（ＮＢ）１００ｍｌに接種し、２８℃で４８時間インキュベートした。１０ｍＬの培養物を、６０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを滅菌等張生理食塩水（０．８５％ｗ／ｖ）１ｍＬに再懸濁し、脱脂ＵＨＴ乳（ＣＯＬＥＳオーストラリア脱脂乳、９９％脂肪不含）９９ｍＬに添加した。培養物を、１５０ｒｐｍで円形撹拌しながら、４℃で８日間インキュベートした。０．８５％ｗ／ｖの生理食塩水１ｍＬを脱脂ＵＨＴ乳９９ｍＬに添加すること、及び同一条件下で８日間インキュベートすることにより、対照培養物を調製した。この後、培養物を、４℃、３，０００×ｇで１０分間遠心分離した。上清を収集し、０．２２μｍフィルタで濾過滅菌し、粗プロテアーゼの供給源として使用した。これを、１ｍｌのアリコートに等分し、−８０℃で保存した。
【０２５８】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを接種した脱脂乳から調製された粗抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図３）分析により、乳汁中の多数の異なるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株により産生される亜鉛依存性メタロプロテアーゼのクラス（ＡｐｒＸプロテアーゼ）を特徴付ける５０ｋＤａの分子量と一致する４６〜５８ｋＤａの主要バンドの存在が実証された（Ｄａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｂｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上の染色されたバンドの濃度分析により、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株６５により分泌されたプロテアーゼの濃度を０．３４μＭと推定した。
【０２５９】
プロテアーゼアッセイ
最終体積１００μＬを含む９６ウェルプレート中で、プロテアーゼアッセイを実施した。切断緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのリシン、ｐＨ８）中の、または５０μＬの全脂肪または脱脂ＵＨＴ乳（Ｃｏｌｅｓ）が追加された様々な量の粗細菌プロテアーゼまたはプラスミン（ヒトもしくはウシ、Ｓｉｇｍａ）と共に、精製プラスミンセンサー（１０ｎｍ）を、２８℃で１０分間インキュベートした。１ｐＭ〜１０ｎＭのプロテアーゼ濃度をアッセイすることにより、較正グラフを生成した。１０分間インキュベーションした後に、ＢＲＥＴ２シグナルを測定した。ＢＲＥＴ２測定では、１０分間のインキュベーション期間の後に、５μＬのＣｌｚ４００ａ基質（１００μＭ）を加えた。
【０２６０】
ＲＬｕｃ２／Ｃｌｚ４００ａ放出フィルタ（４１０ｎｍ、バンドパス８０ｎｍ）及びＧＦＰ２放出フィルタ（５１５ｎｍ、バンドパス３０ｎｍ）を含む、ＢＲＥＴ２放出フィルタセットを使用したＰＯＬＡＲｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬａｂＴｅｃｈ、オーストラリア）を用いて、同時二重放出ＢＲＥＴ測定を実施した。０．５秒の積分時間を使用した。
【０２６１】
データ分析
マイクロプレート分光計を使用して、５００ｎｍ及び４７０ｎｍで測定された生物発光放出の比としてＢＲＥＴ比を計算した。ＧＦＰ２強度（平均０〜５秒）をＲＬｕｃ２強度（平均０〜５秒）で除することにより、ＢＲＥＴ比を計算した。Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ７の正規化関数を使用して、ＢＲＥＴ比を正規化して、Ｌｏｇ［プロテアーゼ］値に対してプロットし、Ｌｏｇ［アゴニスト］対正規化応答−可変勾配モデルに適合させた。
【０２６２】
結果
ウシプラスミン及びヒトプラスミン（図４）または細菌プロテアーゼに対する全脂肪ＵＨＴ乳中のプラスミンセンサーの検量線を作成した。プラスミンセンサーは、ヒトプラスミンの場合に５．６ｎＭのＥＣ５０、ウシプラスミンの場合に１０８ｎＭのＥＣ５０を有していた（表３）。ヒトプラスミン、ウシプラスミン、及び細菌プロテアーゼへのプラスミンセンサーの応答を比較する予備研究（図５）は、細菌プロテアーゼの場合のＥＣ５０が全脂肪ＵＨＴ乳中で約５０ｎＭであることを推測する。
【０２６３】
これに加えて、未殺菌乳中の細菌プロテアーゼ（図６）を用いて、プラスミンセンサーを較正した。プラスミンセンサーは、未殺菌乳中の細菌プロテアーゼの場合、１．４ｎＭのＥＣ５０を有していた（表３）。
【０２６４】
実施例３
本出願のセンサーは、乳製品などの試料中のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．プロテアーゼを検出するために使用することができる。実施例１に記載されるように、Ｐｆｌｕセンサー１、２、及び３を調製した。実施例２に記載されるように、粗細菌プロテアーゼを調製した。１０ｎＭの精製センサーを使用した実施例２に記載されるように、プロテアーゼアッセイを実施した。
【０２６５】
結果
細菌プロテアーゼ、ウシプラスミン、及び／またはヒトプラスミンへの全脂肪ＵＨＴ乳中のＰｆｌｕセンサー１、２、及び３の検量線を作成した。図７（Ｐｆｌｕセンサー１）、図８（Ｐｆｌｕセンサー１）、図９（Ｐｆｌｕセンサー２）、及び図１０（Ｐｆｌｕセンサー３）に検量線を示す。
【０２６６】
Ｐｆｌｕセンサー１は、細菌プロテアーゼの場合、０．７ｎＭのＥＣ５０、ウシプラスミンの場合、１６９ｎＭ、ヒトプラスミンの場合、１２４ｎＭのＥＣ５０を有していた（表３）。それ故、Ｐｆｌｕセンサー１は、ヒトプラスミンよりも、細菌プロテアーゼへの感度が約１７４倍高く、ウシプラスミンよりも細菌プロテアーゼへの感度が２３８倍高い。プラスミンを使用して生成された検量線から計算されたＥＣ５０を、細菌プロテアーゼを使用して生成された検量線から計算されたＥＣ５０で除することにより、センサーの感度を決定する。
【０２６７】
Ｐｆｌｕセンサー２は、細菌プロテアーゼ画分の場合、２．６ｎＭのＥＣ５０、ヒトプラスミンの場合、９２６ｎＭのＥＣ５０を有していた（表３）。ウシプラスミンを試験しなかった。それ故、Ｐｆｌｕセンサー２は、ヒトプラスミンよりも、細菌プロテアーゼへの感度が約３５３倍高い。
【０２６８】
Ｐｆｌｕセンサー３は、細菌プロテアーゼの場合、２．３ｎＭのＥＣ５０、ヒトプラスミンの場合、１２８０ｎＭのＥＣ５０を有していた（表３）。ウシプラスミンを試験しなかった。それ故、Ｐｆｌｕセンサー３は、プラスミンよりも、細菌プロテアーゼへの感度が約５６３倍高い。
【０２６９】
結言
センサーの標的配列を変えることにより、０．１〜９０ｎＭの細菌プロテアーゼの線形範囲の組み合わせを与える細菌プロテアーゼへの細菌プロテアーゼセンサーの感度は、３２〜５３７ｎＭの範囲のウシプラスミンレベル及び０．７〜３６８０ｎＭの範囲のヒトプラスミンレベルを測定し得る。プラスミンの濃度は、比色測定を使用した未殺菌乳中の１〜５ｎＭの濃度範囲で（Ｂｅｎｓｌｉｍａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００９）、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して０．６〜２２ｎＭの範囲で（Ｄｕｐｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）測定されている。本発明によるセンサーは、細菌プロテアーゼにより切断され、細菌プロテアーゼへの選択性があり、乳汁中のプラスミンの生理学的レベルに対して大部分または比較的感度が鈍いことを、これらのデータが実証する。
【０２７０】
実施例４
材料及び方法
未殺菌乳試料
オーストラリアの乳製品加工業者から、６つの未殺菌乳試料を入手した。これらの試料を得た雌ウシは、貯蔵寿命が長い生乳を一貫して生産することができる高品質の生産者であると認識されていたことを、加工業者は示していた。
【０２７１】
Ｒａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）の前処理プロトコール。
未殺菌乳試料を１２分間超音波処理した（Ｍｉｓｏｎｉｘ超音波処理装置３０００；試料パルサーオン、０．５秒；パルサーオフ、２．５秒；パワー５．５）。未殺菌乳試料を超音波処理して、均質な分散液を作製する。超音波処理後、Ｒａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）に記載の前処理方法を使用して、乳汁試料を前処理した。要約すると、０．４Ｍのクエン酸三ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．９）２５０μＬと、超音波処理した未殺菌乳１ｍＬを混合し、振盪しながら室温で１５分間インキュベートして、カゼインミセルを解離させた。８ｍＭのε−アミノカプロン酸（ＥＡＣＡ）及び０．４ＭのＮａＣｌを含有する０．１Ｍのトリス緩衝液（ｐＨ８）と、クエン酸処理乳を混合（１：１）し、振盪しながら室温でさらに１５分間インキュベートした。
【０２７２】
表３．粗プロテアーゼを含む５０％の全脂肪乳で計算されたＥＣ５０及び線形範囲。１０％〜９０％のＢＲＥＴ２応答の範囲として定義された線形範囲。細菌プロテアーゼセンサーＰｆｌｕ１、Ｐｆｌｕ２、Ｐｆｌｕ３、Ｐｆｌｕ−Ｈ３、及びプラスミンセンサーに対する選択率（細菌プロテアーゼ：プラスミン）。Ｎ．Ｄ．＝測定なし、＊は、未殺菌乳試料中で計算された値を示し、１は、株１１７由来の細菌プロテアーゼへの応答を示し、他の全ての応答は、株６５由来の細菌プロテアーゼに対するものである。
【表３】
2020510406.tif 000011
【０２７３】
ＢＲＥＴ２プラスミンセンサーを使用した検量線
検量線を作成するために、前処理された乳汁試料のアリコートを３０秒間９０℃に加熱して、任意の内因性プラスミンを不活化した。１０μＬのプラスミン溶液を５０μＬの加熱した乳汁試料に添加することにより、加熱した前処理した試料にヒトプラスミン（Ｓｉｇｍａ）を混ぜた。添加されたプラスミンの最終濃度は、０．００１〜５００ｎＭに及んでいた。５μＬのＢＲＥＴ２プラスミンセンサー（１０ｎＭ）及び３０μＬのプラスミン切断緩衝液を混ぜた試料に加え、試料を、ピペッティングすることによりよく混合した。試料を、２８℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後に、５μＬのＣｌｚ４００ａ基質（１００μＭ）をウェルに添加し、ＢＲＥＴ比を上記のように記録した。
【０２７４】
ＢＲＥＴ２プラスミンセンサーを使用した内因性プラスミン濃度の測定
未殺菌乳試料中に存在するプラスミンの量を決定するために、５０μＬの前処理された未殺菌乳試料をマイクロプレートウェル中で５μＬのＢＲＥＴ２プラスミンセンサー（１０ｎＭ）及び４０μＬのプラスミン切断緩衝液と混合した。混合物を、２８℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、５μＬのＣｌｚ４００ａ基質（１００μＭ）をウェルに添加し、ＢＲＥＴ比を記録した。検量線から計算した濃度に２．５の希釈係数を掛けた。
【０２７５】
比色基質を使用した検証
比色基質としてＤ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩（Ｖ０８８２、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用したＲａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．の方法（２０１４）を使用して、ＢＲＥＴ２プラスミンセンサーに基づく測定を検証した。
【０２７６】
５ｍｇの基質に、０．１ＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）１．８１ｍＬを添加することにより、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩の５ｍＭのストック溶液を調製した。
【０２７７】
プラスミン切断緩衝液中のヒトプラスミン５μｌ及び比色基質４５μＬと、前処理された未殺菌乳５０μＬを混合して、３７℃で２時間インキュベートすることにより、検量線を生成した。添加されたプラスミンの最終濃度は、０〜１５ｎＭに及んでいた。プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）を使用して、吸光度を、２分毎に４０５及び４９０ｎｍで測定した。４９０ｎｍでの吸光度を、４０５ｎｍでの吸光度から差し引き、時間に対してプロットした。２０〜１２０分の吸光度の変化率（４１０ｎｍ〜４９０ｎｍ）を、各添加プラスミン濃度について計算した。
【０２７８】
市販のアッセイを使用して、内因性プラスミンの濃度を決定した。５μＬのプラスミン切断緩衝液（１０ｎｍ）及び比色基質４５μＬと、前処理された未殺菌乳５０μＬを混合し、３７℃で２時間インキュベートした。プレートリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  Ｍ２、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）を使用して、吸光度を、２分毎に４０５及び４９０ｎｍで測定した。４９０ｎｍでの吸光度を、４０５ｎｍでの吸光度から差し引き、時間に対してプロットした。２０〜１２０分の吸光度の変化率（４１０ｎｍ〜４９０ｎｍ）を、各試料について計算した。検量線から計算された濃度に２．５の希釈係数を掛けた。
【０２７９】
結果
ＢＲＥＴ２プラスミンセンサー
前処理ステップなしで未殺菌乳中のプラスミン濃度を決定する最初の試みは成功しなかった。
【０２８０】
Ｒａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）の前処理プロトコール後に調製され、ヒトプラスミンを混ぜた試料についてＢＲＥＴ２プラスミンセンサーの検量線を作成した（図１１）。ＥＣ５０は、１９．４８ｎＭである。前処理された未殺菌乳試料中で測定された内因性プラスミン濃度は、２．１ｎＭ〜４．４ｎＭの範囲であり（表４）、内因性プラスミン濃度は、試料の３つにおいて検出可能でなかった。
【０２８１】
比色基質
Ｒａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）の前処理プロトコール後に、ヒトプラスミンを混ぜた未殺菌乳試料の場合の、比色基質Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩の検量線を作成した（図１２）。元のＲａｕｈ前処理プロトコール後の未殺菌乳試料中で測定された内因性プラスミン濃度は、２．１ｎＭ〜２．９ｎＭの範囲であった（表４）。
【０２８２】
実施例５
材料及び方法
２ステップ前処理プロトコール
クエン酸三ナトリウム緩衝液にＥＡＣＡ及びＮａＣｌを添加して、２回の１５分間のインキュベーションのステップを組み合わせることにより、実施例４に記載の前処理プロトコールを修正した。要約すると、５ｍＭのＥＡＣＡ及び０．２５ＭのＮａＣｌを含有するクエン酸三ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．９）２５０μＬと、１ｍＬの超音波処理未殺菌乳を混合した。次に、試料を室温で１５分間インキュベートした。
表４．Ｒａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）の前処理プロトコール後の未殺菌乳試料中の遊離の内因性プラスミンの測定。ＢＲＥＴ２プラスミンセンサーを使用する場合、前処理された試料を１０分間、または発色基質（Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩）と共に１２０分間インキュベートした。ＮＤ＝検出不能
【表４】
2020510406.tif 000012
【０２８３】
検量線
ＢＲＥＴ２プラスミンセンサー及び比色基質についての検量線を、実施例４に記載のように決定した。
【０２８４】
内因性プラスミン濃度の決定
実施例４に記載されるように、未殺菌乳試料中に存在するプラスミンの量を決定した。実施例４に記載されているように、比色基質、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩を使用して、未殺菌乳試料中に存在するプラスミンの量を検証した。
【０２８５】
結果
ＢＲＥＴ２プラスミンセンサー
ヒトプラスミンを混ぜた未殺菌乳試料を使用して、２ステップ前処理プロトコール後に、ＢＲＥＴ２プラスミンセンサーの検量線を作成した。ＥＣ５０は、１６．０４ｎＭである（図１３）。未殺菌乳試料中で測定された内因性プラスミン濃度は、５．８ｎＭ〜９．０ｎＭの範囲であった（表５）。
【０２８６】
比色基質
２ステップ前処理プロトコールにより処理し、ヒトプラスミンを混ぜた未殺菌乳試料を使用して比色基質の検量線を作成した（図１４）。２ステップ前処理プロトコール後の未殺菌乳試料中で測定された内因性プラスミン濃度は、９．７ｎｍ〜１０．９ｎＭの範囲であった（表５）。
表５：ＢＲＥＴ２プラスミンセンサー及び比色基質、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩を使用した２ステップ前処理後の未殺菌乳試料中の遊離内因性プラスミンの測定（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。ＢＲＥＴ２プラスミンセンサーを使用する場合、前処理された試料を１０分間、または発色基質（Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩）と共に１２０分間インキュベートした。
【表５】
2020510406.tif 000013
【０２８７】
実施例６
材料及び方法
１ステップ前処理プロトコール
遊離プラスミンの放出を促進するために超音波処理及びインキュベーションステップを組み合わせることにより、実施例５に記載の前処理プロトコールを修正した。要約すると、未殺菌乳１ｍＬに、０．４Ｍのクエン酸三ナトリウム緩衝液（５ｍＭのＥＡＣＡ及び０．２５ＭのＮａＣｌを含有するｐＨ８．９）２５０μＬを混ぜ、試料を１２分間超音波処理した（Ｍｉｓｏｎｉｘ超音波処理装置３０００；試料パルサーオン、０．５秒；パルサーオフ、２．５秒、パワー５．５）。
【０２８８】
検量線
ＢＲＥＴ２プラスミンセンサー及び比色基質についての検量線を、実施例４に記載のように決定した。
【０２８９】
内因性プラスミン濃度の決定
実施例４に記載されるように、未殺菌乳試料中に存在するプラスミンの量を決定した。実施例４に記載されているように、比色基質、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩を使用して、未殺菌乳試料中に存在するプラスミンの量を検証した。
【０２９０】
結果
ＢＲＥＴ２プラスミンセンサー
１ステップ前処理プロトコール後に、ヒトプラスミンを混ぜた未殺菌乳試料の場合の、ＢＲＥＴ２プラスミンセンサーの検量線を作成した。検量線を図１５に示す。ＥＣ５０は、２４．２ｎＭであり、線形応答が１．６ｎＭ（９０％）〜１２８ｎＭ（１０％）のプラスミンで観察される。
【０２９１】
未殺菌乳試料中で測定された内因性プラスミン濃度は、２０．９ｎＭ〜２３．１ｎＭの範囲であった（表６）。乳汁試料中で測定された最低プラスミン濃度は、１８．２ｎＭであり、７７．１％のＢＲＥＴ２応答であり、最高は、２５．７ｎＭであり、６６．７％のＢＲＥＴ２応答であり、双方のウェルは、アッセイの直線範囲内であった。
【０２９２】
比色基質
１ステップ前処理プロトコール後に、ヒトプラスミンを混ぜた未殺菌乳試料の場合の、比色基質、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩の検量線を作成した。検量線を図１６に示す。
【０２９３】
比色アッセイのＥＣ５０は、１１．０６ｎＭであり、５．７０ｎＭ（１０％）〜１３．７０ｎＭ（９０％）の線形応答であった。これは、ＢＲＥＴ２プラスミンセンサーのキャリブレーション結果で観察されるよりもはるかに狭い範囲である。
【０２９４】
未殺菌乳試料中で測定された内因性プラスミン濃度は、１７．２ｎＭ〜１８．０ｎＭの範囲であった（表６）。
表６：ＢＲＥＴ２プラスミンセンサー及び比色基質、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を使用した１ステップ前処理後の未殺菌乳試料中の遊離内因性プラスミンの測定。ＢＲＥＴ２プラスミンセンサーを使用する場合、前処理された試料を１０分間、または発色基質（Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−４−ニトロアニリド二塩酸塩）と共に１２０分間インキュベートした。
【表６】
2020510406.tif 000014
【０２９５】
実施例７
材料及び方法
低出力超音波処理を含む１ステップ前処理プロトコール
超音波処理装置（Ｍｉｓｏｎｉｘ超音波処理装置３０００）を、連続的に使用することができる低出力超音波処理装置（Ｑ５５超音波処理装置、Ｄａｉｎｔｒｅｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と交換することにより、実施例６に記載の前処理プロトコールをさらに修正した。要約すると、０．４Ｍのクエン酸三ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．９、５ｍＭのＥＡＣＡ及び０．２５ＭのＮａＣｌを含有する）２５０μＬと、未殺菌乳１ｍＬを混合した。試料を氷上で２分間連続して超音波処理した（Ｑ５５超音波処理装置、振幅を４０に設定）。
【０２９６】
検量線
実施例４に記載されたように、検量線を決定した。
【０２９７】
内因性プラスミン濃度の決定
実施例４に記載されるように、未殺菌乳試料中に存在するプラスミンの量を決定した。
【０２９８】
結果
低出力超音波処理を含む１ステップ前処理プロトコール後に、ヒトプラスミンを混ぜた未殺菌乳試料の場合の、ＢＲＥＴ２プラスミンセンサーの検量線を作成した。検量線を図１７に示す。計算されたＥＣ５０は、２９．３ｎＭであり、応答は、５．５ｎＭ（９０％）〜１０７ｎＭ（１０％）で線形である。
【０２９９】
低出力超音波処理を含む１ステップ前処理後の未殺菌乳試料中で測定された内因性プラスミン濃度は、１２．０ｎＭ〜１７．２ｎＭの範囲であり、ＢＲＥＴ２応答は、６つの試料について８７．１％〜９１．４％の範囲であった（表７）。
【０３００】
考察
実施例４〜７のデータは、前処理プロトコールへの超音波処理の組み込みが、アッセイの感度及び乳汁試料中で測定された遊離内因性プラスミンの量に大きな好ましい効果を有することを示す（表８）。例えば、１ステップ前処理プロトコールを使用すると、Ｒａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）の前処理方法と比較して、測定された遊離内因性プラスミンのレベルが５〜１０倍増加した。比色基質アッセイを使用して、これを検証した。ＢＲＥＴアッセイ及び比色アッセイの双方について、未殺菌乳中で測定された内因性遊離プラスミンレベルは、２ステップ前処理の代わりに１ステッププロトコールを使用した場合に２〜３倍高かった。低出力超音波処理を組み込むと、同時に、元の方法の場合の５０分のアッセイ時間から低出力超音波処理の前処理場合の１２分のアッセイ時間に総アッセイ時間を低減しながら、Ｒａｕｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）の前処理方法と比較して、未殺菌乳中で測定された内因性遊離プラスミンレベルが４〜６倍増加した。データは、ＥＡＣＡの存在下で試料を超音波処理することが、カゼインからの内因性プラスミンの解離の効率を有意に増加させることを示している。
表７：ＢＲＥＴ２プラスミンセンサーを備えた低出力超音波処理を含む１ステップ前処理後の未殺菌乳試料中の遊離内因性プラスミンの測定（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【表７】
2020510406.tif 000015
表８．元のＲａｕｈ前処理プロトコール、２ステップ前処理、１ステップ前処理、及び低出力超音波処理（迅速な１ステップ）を含む１ステップ前処理後の６つの「高品質」未殺菌乳試料で測定された遊離の内因性プラスミン濃度範囲（ｎＭ）の比較。総アッセイ時間は、均質化時間（２ステップ及び１ステップの場合の１２分ならびに迅速な１ステップの場合の２分間）、前処理インキュベーション時間、及び１０分のインキュベーションアッセイ時間を含む。
【表８】
2020510406.tif 000016
【０３０１】
実施例８
材料及び方法
未殺菌乳中の細菌プロテアーゼを測定するために、Ｐｆｌｕ１センサーを本明細書で使用した。試料を４分間超音波処理したことを除いて、実施例７に記載されたように、前処理された未殺菌乳試料を調製した。
【０３０２】
検量線
検量線を生成するために、前処理された未殺菌乳試料のアリコートを、１時間５５℃、続いて、３０秒間９０℃に加熱して、任意の内因性細菌プロテアーゼ及び内因性プラスミンを不活化した。５０μＬの加熱された乳汁試料に、１０μＬの細菌プロテアーゼを添加することにより、加熱前処理された試料に、種々の量の粗製細菌プロテアーゼ画分を混ぜた（調製については実施例２を参照のこと）。添加された細菌プロテアーゼの最終濃度は、１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲であった。５μＬのＢＲＥＴ２  Ｐｆｌｕ１センサー（１０ｎＭ）及び３０μＬのプラスミン切断緩衝液を、混ぜた試料に添加して、試料をピペッティングにより十分に混合した。試料を、２８℃で１０分間インキュベートした。インキュベーション後に、５μＬのＣｌｚ４００ａ基質（１００μＭ）をウェルに添加し、ＢＲＥＴ比を上記のように記録した。
【０３０３】
細菌プロテアーゼ濃度の決定
未殺菌乳試料中に存在する細菌プロテアーゼの量を決定するために、マイクロプレートウェル中の５μＬのＰｆｌｕ１センサー（１０ｎＭ）及び４０μＬのプラスミン切断緩衝液と、前処理未殺菌乳試料５０μＬを混合した。混合物を、２８℃で２時間インキュベートした。インキュベーション後、５μＬのＣｌｚ４００ａ基質（１００μＭ）をウェルに添加し、ＢＲＥＴ比を記録した。検量線から計算した濃度に２．５の希釈係数を掛けた。
【０３０４】
結果
前処理及びＰｆｌｕ１センサー後の未殺菌乳試料の検量線を作成した。検量線を図１８に示す。ＥＣ５０は、０．４ｎＭであり、応答は、４８．２ｐＭ（９０％）〜２．６ｎＭ（１０％）の線形である。迅速な１ステップ前処理プロトコール後の未殺菌乳試料中で測定された細菌プロテアーゼのレベルは、主に、ＣＹＢＥＲＴＯＮＧＵＥ（登録商標）細菌プロテアーゼセンサーの本発明者らの現在の生成の検出の限界以下のサブピコモル濃度で存在していた（検出限界は現時点では、１ｐＭ以上と推定される）。未殺菌乳試料のうち２つを除く全ては、検出可能な細菌プロテアーゼを含まなかった（図１９）。内因性細菌プロテアーゼを測定することができた試料では、濃度は、１．４ｐＭ〜３．４ｐＭの範囲であった（図１９）。
【０３０５】
実施例９
材料及び方法
本明細書では、未殺菌乳試料の任意の前処理なしに、未殺菌乳中の細菌プロテアーゼを測定するために、Ｐｆｌｕ１センサーを使用した。
【０３０６】
検量線
検量線を生成するために、前処理された未殺菌乳試料のアリコートを、５５℃に１時間加熱して、任意の内因性細菌プロテアーゼを不活化した。５０μＬの加熱された乳汁試料に、１０μＬの細菌プロテアーゼを添加することにより、加熱前処理された試料に、種々の量の粗製細菌プロテアーゼ画分を混ぜた（調製については実施例２を参照のこと）。添加された細菌プロテアーゼの最終濃度は、１ｐＭ〜１０ｎＭの範囲であった。５μＬのＢＲＥＴ２  Ｐｆｌｕ１センサー（１０ｎＭ）及び３０μＬのプラスミン切断緩衝液を、混ぜた試料に添加して、試料をピペッティングにより十分に混合した。試料を、前処理（低出力超音波処理を含む１ステップ前処理プロトコール）有り及びなしで、２８℃で１０分間または２時間インキュベートした。インキュベーション後に、５μＬのＣｌｚ４００ａ基質（１００μＭ）をウェルに添加し、ＢＲＥＴ比を上記のように記録した。
【０３０７】
結果
細菌プロテアーゼセンサーは、２時間のインキュベーション期間の後に（４分間の低出力超音波処理を含む１ステップ前処理プロトコールを使用して）前処理されている未殺菌乳中で検量された同じセンサーと比較して、細菌プロテアーゼを含むセンサーの１０分間のインキュベーション後の未殺菌乳のいかなる前処理もなしに、細菌プロテアーゼへの類似の応答及び感度を有することが明らかである（図２０〜２２、表９）。
【０３０８】
２時間のインキュベーション時間後に前処理なしで、細菌プロテアーゼの最低検出率（３．９４ｐＭ）を達成した。これは、より長いインキュベーション時間が、より低い検出限界をもたらすことを実証する。インキュベーション時間をさらに増加させると、より低い濃度（ｐＭ未満）の細菌プロテアーゼの検出が可能になることが予測される。未殺菌乳中で細菌プロテアーゼへのプラスミンセンサーの応答と、結果を比較すると（図６及び表３）、Ｐｆｌｕ１センサーは、未殺菌乳中でインキュベーション時間が１０分間のプラスミンセンサーよりも、細菌プロテアーゼへの感度が１０倍高い。
表９．４分間の低出力超音波処理を含む１ステップ前処理プロトコールの有無にかかわらず、異なるインキュベーション時間のために粗プロテアーゼを混ぜた５０％の未殺菌乳中で計算されたＥＣ５０及び線形範囲。１０％〜９０％のＢＲＥＴ２応答の範囲として定義された線形範囲。
【表９】
2020510406.tif 000017
【０３０９】
実施例１０
Ｐｆｌｕ１センサーが複数のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株に応答することができるかどうかを決定するために、本発明者らは、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株１１７由来の細菌プロテアーゼの粗抽出物を生成した。
【０３１０】
材料及び方法
実施例２に記載の方法を使用して、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株１１７を接種した脱脂乳から粗抽出物を調製した。
【０３１１】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（株１１７）を接種した脱脂乳から調製された粗抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２３）分析により、株６５（図３）を含む、乳汁中の多数の異なるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株により産生された亜鉛依存性メタロプロテアーゼのクラス（ＡｐｒＸプロテアーゼ）を特徴付ける５０ｋＤａの分子量と一致する４６〜５８ｋＤａの主要バンドの存在が実証された（Ｄａｃｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４；Ｂｕｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１）。染色されたバンドの比色分析により、マーカー４６ＫＤａ（カラータンパク質標準、Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ  ＃Ｐ７７１２Ｓ  Ｌｏｔ：００２１４１０、ＢｉｏＬａｂａｎ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルと比較した場合、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株１１７により分泌されるプロテアーゼの濃度を０．３２μＭであると推定した。
【０３１２】
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（株１１７）由来の細菌プロテアーゼの検出
切断緩衝液及びＵＨＴ乳に、株６５または１１７いずれかから産生された１ｎＭの細菌プロテアーゼを混ぜ、応答を、いかなる細菌プロテアーゼも添加しない対照と比較した。実施例２に記載したように、粗細菌プロテアーゼを調製した。１０ｎＭの精製センサーを使用して、実施例２に記載されるように、プロテアーゼアッセイを実施した。
【０３１３】
結果
Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株６５及び１１７から産生された細菌プロテアーゼは、緩衝液中で１０分のインキュベーション時間内にＰｌｕ１センサーを完全に切断して（図２４）、ＢＲＥＴ比の９５％の減少をもたらした。１ｎＭの細菌プロテアーゼを混ぜたＵＨＴ乳中で、アッセイを実施した場合、株１１７由来の細菌プロテアーゼにおける７１．２％の低減と比較して、株６５の細菌プロテアーゼにおけるＢＲＥＴ比の８０．６％の低減があった。これにより、Ｐｆｌｕ１センサーが異なるＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株から産生された細菌プロテアーゼに応答することができることが実証される。
【０３１４】
実施例１１
Ｐｆｌｕ１〜３センサーシリーズは、κ−カゼインに見られる切断部位及びポリペプチド配列を組み込む、中央のＦ−Ｍ開裂部位を有するリンカー配列（図１）で隔てられているＢＲＥＴ構成要素を含んでいた。全てのカゼインに見出される全ての切断部位に対するＰ４〜Ｐ４’位に見出される最も主要なアミノ酸を組み込むように、プロテアーゼセンサーの第２のセットを設計した（Ｐｆｌｕ−Ｈ１〜４）。
【０３１５】
材料及び方法
新しい細菌プロテアーゼセンサーの構築
ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（米国）により、ＢＲＥＴ２細菌プロテアーゼＰｆｌｕセンサーＨ１、Ｈ２、Ｈ３、及びＨ４をコードするＤＮＡ構築物を合成した。センサーは、リンカーで隔てられている化学発光ドナーとしてのＲｌｕｃ２及びアクセプターとしての緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ２）の多様体を含んでいた（表１０）。ｐＲＳＥＴベクター（ＢｉｏＬａｂｓ、オーストラリア）に構築物をクローニングして、プロテアーゼセンサーをコードするｐＲＳＥＴ−Ｐｆｌｕ−Ｈベクターを作製した。プロテアーゼセンサーをコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号１１６〜１１９に示される。プロテアーゼセンサーのポリペプチド配列は、配列番号１２０〜１２３に示される。実施例１に記載の方法を使用して、精製センサーを製造した。
【０３１６】
検量線及びプロテアーゼアッセイ
検量線の方法及び新規細菌プロテアーゼセンサー（Ｐｆｌｕ−Ｈ１〜Ｈ４）のプロテアーゼアッセイは、実施例２に記載されている。
表１０．Ｈ１〜Ｈ４センサーのＢＲＥＴ構成要素を隔てるリンカー配列。
【表１０】
2020510406.tif 000018
【０３１７】
結果
４つ新しい細菌プロテアーゼセンサー（Ｐｆｌｕ−Ｈ１〜Ｈ４）全ては、緩衝液中の１ｎＭの細菌プロテアーゼに対して有意に応答した（Ｐ＝０．０５）（図２６）。センサーの相対感度は、Ｈ３＞Ｈ４＞Ｈ１＞Ｈ２であり、応答は、それぞれ８９．７％、６４．５％、４９．５％、及び３１．９％であった。これにより、Ｐｆｌｕ−Ｈ３センサーが、最も感度が高く、Ｐｆｌｕ−Ｈ４、Ｐｆｌｕ−Ｈ１、及びＰｆｌｕ−Ｈ２センサーのそれぞれの応答と比較して、１ｎＭの細菌プロテアーゼへの応答が３９％、８２％、及び１８２％高いことが実証される。
【０３１８】
乳汁中のプラスミンと比較した細菌プロテアーゼへのＰｆｌｕ−Ｈ１〜Ｈ４センサーの選択性を評価するために、１ｎＭのプラスミンまたは細菌プロテアーゼのいずれかを混ぜたＵＨＴ乳へのＰｆｌｕ−Ｈ１〜Ｈ４センサーの応答を比較した（図２７〜３０及び表１１）。
表１１．ＵＨＴ乳中のＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株６５由来の１ｎＭの粗細菌プロテアーゼまたは１ｎＭのウシプラスミンへのＰｆｌｕ−Ｈ１〜Ｈ４センサーシリーズのＢＲＥＴ２応答（％）。細菌プロテアーゼ応答対プラスミン応答の比として、選択性を計算する。
【表１１】
2020510406.tif 000019
【０３１９】
Ｐｆｌｕ−Ｈ３センサーは、プラスミンを超える細菌プロテアーゼを検出することに対して最も選択性があり、ＵＨＴ乳では４０の選択率を示した。これの後に、プラスミンよりも、細菌プロテアーゼへの選択性が２．７倍高いＰｆｌｕ−Ｈ４センサーが続いた。Ｐｆｌｕ−Ｈ１は、プラスミンよりも細菌プロテアーゼへの選択性が１．３倍高い。Ｐｆｌｕ−Ｈ２は、細菌プロテアーゼへの選択性が最も低く、プラスミンへの選択性が高く、選択率は０．８であった。
【０３２０】
Ｐｆｌｕ−Ｈ３は、乳汁中の細菌プロテアーゼを検出する選択性及び感度が最も高かったので、未殺菌乳中でこのセンサーを使用して、さらなる分析を実施した。図３１に示されるように、細菌プロテアーゼ（株６５）及びウシプラスミンについて検量線をプロットした。Ｐｆｌｕ−Ｈ３センサーは、細菌プロテアーゼの場合の０．５ｎＭのＥＣ５０及びウシプラスミンの場合の１７３．９ｎＭのＥＣ５０を有していた（表３）。それ故、Ｐｆｌｕ−Ｈ３センサーは、未殺菌乳中でウシプラスミンよりも、細菌プロテアーゼへの感度が約３７６倍高い。
【０３２１】
実施例１２
実施例２及び１０では、デンシトメトリーを使用して、且つＳＤＳ−ＰＡＧＥの細菌プロテアーゼバンドの相対密度を４６ｋＤａバンドのマーカーバンドと比較して、細菌プロテアーゼ濃度を推定した（カラータンパク質標準、Ｂｒｏａｄ  Ｒａｎｇｅ  ＃Ｐ７７１２Ｓ  Ｌｏｔ：００２１４１０、ＢｉｏＬａｂａｎ）。本発明者らは、細菌プロテアーゼの相対密度を既知の濃度のＢＳＡと比較することにより、細菌プロテアーゼ濃度を決定する異なるアプローチを調査した。
【０３２２】
材料及び方法
実施例２及び１０に記載の方法を使用して、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ株６５及び１１７を接種した脱脂乳から粗抽出物を調製した。株６５（６５−１及び６５−２）ならびに株１１７及び異なる濃度のＢＳＡの２つの抽出物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を実施した（図３２）。株６５−１は、株６５由来の細菌プロテアーゼを使用している本明細書中の全ての実施例に使用される抽出物である。株１１７は、実施例１０に使用される抽出物である。Ｎｏｖｅｘ  ＃ＬＣ５６２５  ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｒｅ−ｓｔａｉｎｅｄ  Ｓｔａｎｄａｒｄは、使用された市販のマーカーであった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでのタンパク質のデンシトメトリー分析を、Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ  ＴＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及びＢＳＡ検量線から推定された細菌プロテアーゼ濃度を使用して実施した（図３３）。線形回帰分析を当てはめることにより、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ（バージョン７）を使用して、検量線グラフをプロットした。
【０３２３】
結果
ＢＳＡ較正グラフに最適な直線は、ｙ＝１０７２３５＋７９．６６ｘ、Ｒ２＝．９６７９であると決定された（図３２）。抽出物６５−１、６５−２、及び１１７のための細菌プロテアーゼ濃度はそれぞれ、それぞれ３．９４、２．３７、及び３．３７μＭであると決定された。実施例２及び１０において株６５−１及び株１１７の同じバッチの濃度を決定するために使用された以前の方法により、それぞれ、０．３４μＭ及び０．３２μＭの濃度が推定された。濃度決定のための今日のアプローチを使用すると、細菌プロテアーゼの濃度が、株６５（６５−１）の場合１１．６倍高く、株１１７の場合１０．５倍高くなる。Ｐｆｌｕ１センサーの感度に対するこれの効果の一例としては、補正率１１．６を使用して、図７をプロットするために使用される全ての細菌プロテアーゼ濃度を補正し、結果として、表３に提示されているものよりも１１．６高い８．２ｎＭのＥＣ５０及び１．４〜４５ｎＭの線形範囲（図３４及び表１２）になる。細菌プロテアーゼ濃度に関する補正率を、細菌プロテアーゼ測定ために、表３に最初に提示された全ての値に適用した（表１２）。
【０３２４】
細菌プロテアーゼ濃度を推定するための、このアプローチの使用は、ヒトまたはウシプラスミンと比較して、細菌プロテアーゼへの細菌プロテアーゼセンサーの選択性を低減させるという影響を有する。例えば、（ヒトプラスミンと比較した）細菌プロテアーゼへの最低の選択性は、１７４よりも低減した、Ｐｆｌｕ１センサーの場合の１５であり、最高は、５６３の元の選択率と比較して、Ｐｆｌｕ３センサーの場合の４８．５である。細菌プロテアーゼへのプラスミンセンサー応答に対し補正率を適用すると、細菌プロテアーゼと比較して、プラスミンを検出するプラスミンセンサーへの選択率が増加する（表１２）。
【０３２５】
ＵＨＴ乳中の細菌プロテアーゼ濃度を測定するための標準としてＢＳＡを使用して、異なる標的配列を有するセンサーは全て、初期の濃度決定方法を使用して、ＵＨＴ乳中の０．１〜９０ｎＭの細菌プロテアーゼと比較して、１．５〜１０４４ｎＭの組み合わされた線形範囲を与える。未殺菌乳では、バクテリアプロテアーゼ測定のための組み合わされた線形範囲は、２つの異なる濃度決定方法の場合の０．０１〜９ｎＭ（表３）と比較して、０．２〜１１０ｎＭ（表１２）の範囲である。
【０３２６】
未殺菌乳中の内因性細菌プロテアーゼレベルを決定するために、実施例８で使用されたＢＳＡ法により決定した細菌プロテアーゼ濃度の検量線を補正する場合、ここで測定された濃度は、（図１９）を使用して、１６．２ｐＭ〜３９．４ｐＭの範囲である。
表１２．粗プロテアーゼを含む５０％の全脂肪乳で計算されたＥＣ５０及び線形範囲。１０％〜９０％のＢＲＥＴ２応答の範囲として定義された線形範囲。細菌プロテアーゼセンサーＰｆｌｕ１、Ｐｆｌｕ２、Ｐｆｌｕ３、Ｐｆｌｕ−Ｈ３、及びプラスミンセンサーに対する選択率（細菌プロテアーゼ：プラスミン）。ＢＳＡ標準との比較により決定した細菌プロテアーゼ。Ｎ．Ｄ．＝測定なし、＊は、未殺菌乳試料中で計算された値を示し、１は、株１１７由来の細菌プロテアーゼへの応答を示し、他の全ての応答は、株６５由来の細菌プロテアーゼに対するものである。
【表１２】
2020510406.tif 000020
【０３２７】
本開示の一般的な広い範囲から逸脱することなく、上述の実施形態に対して、多数の変形及び／または修正が行われ得ることが当業者に理解されるであろう。それ故、本実施形態は、全ての点で、例示的であり限定的ではないと見なされるべきである。
【０３２８】
本出願は、２０１６年１１月１４日に出願されたＡＵ２０１６９０４６３９及び２０１７年１月１９日に出願されたＡＵ２０１７９００１６１からの優先権を主張し、その双方の内容全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０３２９】
本明細書で考察及び／または参照されている全ての刊行物は、全体が本明細書に組み込まれている。
【０３３０】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、デバイス、物品などのあらゆる考察は、単に本発明の文脈を提供する目的のためのものである。これらの事項のいずれかまたはその全てが、本出願の各請求項の優先日より前に存在していたので、先行技術の基礎の一部を形成するか、または本発明に関連する分野における一般的な知識であったことを認めたものと解釈すべきではない。
【０３３１】
参考文献
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Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｌｖ（２０１４）Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．５１：１１８５−１１９．
【図１】
2020510406.tif 000021
【図２】
2020510406.tif 000022
【図３】
2020510406.tif 000023
【図４】
2020510406.tif 000024
【図５】
2020510406.tif 000025
【図６】
2020510406.tif 000026
【図７】
2020510406.tif 000027
【図８】
2020510406.tif 000028
【図９】
2020510406.tif 000029
【図１０】
2020510406.tif 000030
【図１１】
2020510406.tif 000031
【図１２】
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【図１３】
2020510406.tif 000033
【図１４】
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【図１５】
2020510406.tif 000035
【図１６】
2020510406.tif 000036
【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
2020510406.tif 000040
【図２１】
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【図２２】
2020510406.tif 000042
【図２３】
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【図２４】
2020510406.tif 000044
【図２５】
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【図２６】
2020510406.tif 000046
【図２７】
2020510406.tif 000047
【図２８】
2020510406.tif 000048
【図２９】
2020510406.tif 000049
【図３０】
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【図３１】
2020510406.tif 000051
【図３２】
2020510406.tif 000052
【図３３】
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【図３４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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