(57)【要約】  本発明は、被験体においてアレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）／喘息を処置するための、間葉系血管芽細胞由来−間葉系幹細胞（ＭＣＡ−ＭＳＣ）の使用に関連する。【選択図】  図１０
2020533373.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体においてアレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）／喘息を処置するための方法であって、該方法は間葉系血管芽細胞−間葉系幹細胞（ＭＣＡ−ＭＳＣ）を該被験体に投与することを含み、ここでＭＣＡ−ＭＳＣはｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ及びｍｉＲ−２１４−３ｐを発現するが、ｍｉＲ−１２７−３ｐ及びｍｉＲ−２９９−５ｐを発現しない、方法。
【請求項２】
被験体におけるアレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）／喘息を処置するための薬剤の製造における間葉系血管芽細胞−間葉系幹細胞（ＭＣＡ−ＭＳＣ）の使用であって、ここでＭＣＡ−ＭＳＣはｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ及びｍｉＲ−２１４−３ｐを発現するが、ｍｉＲ−１２７−３ｐ及びｍｉＲ−２９９−５ｐを発現しない、使用。
【請求項３】
ＭＣＡ−ＭＳＣは、ＣＤ７３+ＣＤ１０５+ＣＤ９０+ＣＤ１４６+ＣＤ４４+ＣＤ１０+ＣＤ３１-ＣＤ４５-の表現型を有する、請求項１の方法又は請求項２の使用。
【請求項４】
ＭＣＡ−ＭＳＣは、
（ａ）ＬｉＣｌ及びＦＧＦ２を含むが、ＰＤＧＦを除く間葉系コロニー形成培地（Ｍ−ＣＦＭ）の中で、間葉系コロニーを形成するのに十分な時間の間、酸素正常状態の下で原始中胚葉細胞を培養すること；及び
（ｂ）（ａ）の間葉系コロニーを付着させて培養し、ＭＣＡ−ＭＳＣを作製すること、
を含む方法により作られた、請求項１〜３の何れか１項の方法又は使用。
【請求項５】
ＭＣＡ−ＭＳＣは静脈内に又は鼻腔内に投与される、請求項１〜４の何れか１項の方法又は使用。
【請求項６】
ＭＣＡ−ＭＳＣは鼻腔内に投与される、請求項１〜５の何れか１項の方法又は使用。
【請求項７】
処置することが、約１×１０６個〜約１×１０９個のＭＣＡ−ＭＳＣを被験体に投与することを含む、請求項１〜６の何れか１項の方法又は使用。
【請求項８】
被験体は哺乳動物である、請求項１〜７の何れか１項の方法又は使用。
【請求項９】
被験体はヒトである、請求項１〜８の何れか１項の方法又は使用。
【請求項１０】
喘息を処置するために、被験体は過去にコルチコステロイド又はβアゴニストの投与を受けている、請求項１〜９の何れか１項の方法又は使用。
【請求項１１】
喘息を処置するために、被験体は過去にコルチコステロイド又はβアゴニストの投与を受けていない、請求項１〜９の何れか１項の方法又は使用。
【請求項１２】
被験体は重篤な喘息又は重篤な難治性喘息を有する、請求項１〜１１の何れか１項の方法又は使用。
【請求項１３】
ＡＡＤ／喘息を処置することは；
（ａ）ＡＩ、ＡＷＲ、気道線維症、肺線維症、杯細胞化生、上皮肥厚化、気道トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β１レベル、上皮下筋線維芽細胞密度、上皮下コラーゲン濃度、又は総肺コラーゲン濃度を減少させること、又は
（ｂ）肺ＭＭＰ活性を増加させること、又は
（ｃ）（ａ）の何れか１つ以上の特徴の任意の組み合わせ、又は（ａ）と（ｂ）の何れか１つ以上の特徴の任意の組み合わせ、
を含む、請求項１〜１２の何れか１項の方法又は使用。
【請求項１４】
被験体がコルチコステロイド又はβ−アゴニストの投与を受けない、請求項１〜１３の何れか１項の方法又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は被験体（subject）における、アレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）／喘息の処置に関連する。
【背景技術】
【０００２】
喘息は世界中でおよそ３億人の人々が罹患している慢性の呼吸器疾患であり、毎年２５００００人の死因となっている。その発症には３つの主たる要因：気道炎症（ＡＩ）；気道リモデリング（airway remodelling）（ＡＷＲ；気道／肺における構造変化を表し、最終的には気道の線維化及び閉塞に至る）；及び気道過敏性（ＡＨＲ；喘息の臨床的特徴である）がある。ＡＷＲは持続的な又は慢性のＡＩから生じ得るが、ＡＩとは独立にＡＨＲを発症に寄与し得る。
【０００３】
コルチコステロイドとβ−アゴニストを含む現在の喘息療法は、疾患の軽減よりも症状の管理に焦点が当てられており、そのために完全に有効ではない。β−アゴニストに基づいた療法による処置を受けた被験体は、彼らの喘息の症状については軽減できるが、基となる彼らのＡＩは持続している。そのために、β−アゴニストの慢性的な使用を必要とする被験体には、喘息が重篤に悪化し、入院と死亡に至る大きな危険性がある。
【０００４】
代表的な療法であるコルチコステロイドも、重篤な及び重篤難治性の喘息被験体の亜集団の処置には無効である。重篤な喘息被験体はしばしば高用量のコルチコステロイドによる処置を必要とし、それは全身的な副作用を伴うことがあり、肺機能又は生活の質を必ずしも改善するものでない。加えて、喘息被験体の重篤難治性の亜群では気道の制限が固定化されており、よってこの集団では彼らの喘息症状の一部としてＡＷＲが重要な役割を果たし、ＡＷＲを標的として低減することができる処置戦略が緊急に必要であることが強調される。
【０００５】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、多くの細胞系譜へ分かれる能力を有する多能性間質細胞である。これらの細胞はクラスＩ主要組織適合性複合体（ＭＨＣ−Ｉ）を発現するが、ＭＨＣ−ＩＩ及び共刺激分子ＣＤ８０，ＣＤ８６、及びＣＤ４０を欠いており、よって免疫特権を有する（immunoprivileged）。そのために、静脈内（ＩＶ）注入を介してＭＳＣを全身投与することができ、広い分布が可能となる。ＩＶ投与によりＭＳＣは肺の中に蓄積する。ケモカイン受容体４型の発現を介して、ＭＳＣも損傷された組織に戻り、その発現は喘息等の炎症誘発性環境において強調され、それらのホーミング能力を促進する。
【０００６】
ヒトの喘息の幾つかの特徴を模倣するアレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）のネズミモデルは、直接的な細胞−細胞接触とパラクリン因子の分泌の両方を通じて、ＭＳＣが免疫調節性及び抗炎症性の性質を見せることを示すために使用されてきた。外在性のＭＳＣの投与は、Ｔｈ２増殖を減少させ、Ｔｈ２バイアスを低下させることが示され、それはＡＡＤに寄与する。樹状細胞の活性化、移動及び抗原提示の抑制が観察されている。気管支肺胞洗浄液中で、好酸球関連の炎症誘発性サイトカインの減少が観察された。ＡＩを抑制するコルチコステロイドと比較して、これらのモデルの中でＭＳＣは、炎症を担っている細胞の存在と活性を能動的に減少させることが示されている。
【０００７】
更にＭＳＣ処置は、それらがコラーゲンを分解するゼラチナーゼレベルを促進する能力を介して、気道における上皮の厚み、平滑筋過形成及び杯細胞化生を減少させ、並びに上皮下及び総コラーゲン沈着（線維症）を多少減少させると示されており、ＭＳＣは抗リモデリング作用も有することを示している。
【０００８】
しかしながら、ＭＳＣは慢性疾患の状況に関連する有害症状の軽減を一貫して示している訳ではなく、ＭＳＣ処置の結果は、それらの組織の起源／由来、培養増殖の程度、ドナー依存性の生存能力及び有効性、並びにそれらの投与のタイミングによって変わり得る。
【０００９】
更に、ＭＳＣは第二の治療剤と組み合わせて投与されたときにのみ、ＭＳＣは有益な効果を示す。
【００１０】
加えて、各ドナー器官から単離できるのは比較的に少数のＭＳＣのみであるために、実験及び市販で使用するために十分な数を容易にするために、継続的なドナーの供給が必要とされるであろう。
【００１１】
もし何れかの先行文献が本明細書中で言及される場合に、そのような文献は、その文献がオーストラリア又は他の何れかの国における本技術分野の一般常識の一部を形成するという了解を構成するものではないと理解されるべきである。
【発明の概要】
【００１２】
第１の観点は、被験体（subject）においてアレルギー性気道疾患（ＡＡＤ）／喘息を処置するための方法を提供し、その方法は間葉系血管芽細胞−間葉系幹細胞（mesenchymoangioblast mesenchymal stem cell）（ＭＣＡ−ＭＳＣ）をその被験体に投与することを含み、ここでＭＣＡ−ＭＳＣはｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ及びｍｉＲ−２１４−３ｐを発現するが、ｍｉＲ−１２７−３ｐ及びｍｉＲ−２９９−５ｐを発現しない。
【００１３】
第１の観点の代わりの又は追加の態様は、被験体におけるＡＡＤ／喘息を処置するための薬剤の製造における間葉系血管芽細胞−間葉系幹細胞（ＭＣＡ−ＭＳＣ）の使用を提供し、ここでＭＣＡ−ＭＳＣはｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ及びｍｉＲ−２１４−３ｐを発現するが、ｍｉＲ−１２７−３ｐ及びｍｉＲ−２９９−５ｐを発現しない。
【００１４】
第１の観点の更なる代わりの又は追加の態様は、被験体においてＡＡＤ／喘息を処置する方法において使用するための間葉系血管芽細胞−間葉系幹細胞（ＭＣＡ−ＭＳＣ）を提供し、ここでＭＣＡ−ＭＳＣはｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ及びｍｉＲ−２１４−３ｐを発現するが、ｍｉＲ−１２７−３ｐ及びｍｉＲ−２９９−５ｐを発現しない。
【００１５】
１態様において、間葉系血管芽細胞−間葉系幹細胞（ＭＣＡ−ＭＳＣ）は、ＣＤ７３+ＣＤ１０５+ＣＤ９０+ＣＤ１４６+ＣＤ４４+ＣＤ１０+ＣＤ３１-ＣＤ４５-の表現型を有する。
【００１６】
１態様において、ＭＣＡ−ＭＳＣは、
（ａ）ＬｉＣｌとＦＧＦ２を含むが、ＰＤＧＦを除く間葉系コロニー形成培地（Ｍ−ＣＦＭ）の中で、間葉系コロニーが形成するのに十分な時間の間、酸素正常状態（normoxic conditions）の下で原始中胚葉細胞（primitive mesoderm cell）を培養すること；及び
（ｂ）（ａ）の間葉系コロニーを付着させて培養し、ＭＣＡ−ＭＳＣを作製すること、
を含む方法により作られる。
【００１７】
１態様において、ＭＣＡ−ＭＳＣは静脈内に又は鼻腔内に投与される。１態様において、ＭＣＡ−ＭＳＣは鼻腔内に投与される。
【００１８】
１態様において、処置することは、約１×１０６個〜約１×１０９個のＭＣＡ−ＭＳＣを被験体に投与することを含む。
【００１９】
１態様において、被験体は哺乳動物である。１態様において、被験体はヒトである。
【００２０】
１態様において、喘息を処置するために、被験体は過去にコルチコステロイド又はβアゴニストの投与を受けている。他の態様において、喘息を処置するために、被験体は過去にコルチコステロイド又はβアゴニストの投与を受けていない。
【００２１】
１態様において、被験体はコルチコステロイド又はβアゴニストの投与を受けない。
【００２２】
１態様において、被験体は重篤な喘息又は重篤な難治性喘息を有する。
【００２３】
１態様において、ＡＡＤ／喘息を処置することは；
（ａ）ＡＩ、ＡＷＲ、気道線維症、肺線維症、杯細胞化生、上皮肥厚化、気道トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β１レベル、上皮下筋線維芽細胞密度、上皮下コラーゲン濃度、又は総肺コラーゲン濃度を低下させること；又は
（ｂ）肺マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）活性を増加させること；又は
（ｃ）（ａ）の何れか１つ以上の特徴の任意の組み合わせ、又は（ａ）と（ｂ）の何れか１つ以上の特徴の任意の組み合わせ、
を含む。
【００２４】
ＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴の処置のためのＭＣＡ−ＭＳＣの使用は、下記の非限定的な利点：
・異常な気道ＴＧＦ−β１レベル、気道／肺線維症、及びＡＨＲの、完全ではなくても実質的な好転
・コラーゲン分解ＭＭＰレベルの増加
・ＡＡＤ／喘息の安全且つ効果的な処置を示す、測定されたパラメーターの基礎発現に影響しないこと
の１つ以上を提供し得る。
【００２５】
過去の研究は、オボアルブミン（ＯＶＡ）誘導性の上皮下及び総コラーゲン沈着の促進は、幹細胞に基づいた処置が抗線維症剤と組み合わせて投与されたときのみに、十分に好転し得たことを示したので、本発明により提供される解決は予期されないものであった。よって本発明は、ＡＡＤ／喘息の処置における顕著な改善を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】図１は、実施例４による気管支周囲の炎症スコアに関するＭＣＡ−ＭＳＣの効果を示す。Ａ）研究された各群由来のヘマトキシリン及びエオジン（Ｈ＆Ｅ）染色された肺切片の代表的な顕微鏡写真は、気道上皮層の中及び周囲に存在する、気管支壁炎症性細胞の浸潤程度を示す。スケールバー＝５０μｍ。Ｂ）５つの気道／マウス（ｎ＝８匹マウス／群）由来の炎症スコアの平均±ＳＥＭも示し、ここで切片を、０（明確な炎症無し）〜４（重篤な炎症）のスケールで、炎症性凝集体の数と分布についてスコア付けした。生理食塩水（ＳＡＬ）群に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ群に対して＃＃＃Ｐ＜０．００１。
【図２】図２は、実施例４による杯細胞化生に関するＭＣＡ−ＭＳＣの効果を示す。Ａ）研究された各群由来のアルシアンブルー過ヨウ素酸シッフ（ＡＢＰＡＳ）染色された肺切片の代表的な顕微鏡写真は、気道上皮層中の杯細胞（ＯＶＡ損傷マウスにおいてのみ矢印により示される）の程度を示す。スケールバー＝２５μｍ。Ｂ）５つの気道／マウス（ｎ＝８匹マウス／群）由来の杯細胞カウントの平均±ＳＥＭも示す。生理食塩水（ＳＡＬ）群に対して＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ群に対して＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１。
【図３】図３は、実施例４による気道上皮厚み及び上皮下コラーゲン沈着（線維症）に関する、ＭＣＡ−ＭＳＣの効果を示す。Ａ）研究された各群由来のマッソントリクローム染色された肺切片の代表的な顕微鏡写真は、気道上皮厚みと上皮下コラーゲン厚み（青色染色）の程度を示す。スケールバー＝５０μｍ。５つの気道／マウス（ｎ＝８匹マウス／群）由来の基底膜（ＢＭ）長さに対する、Ｂ）上皮厚み（μｍ２）及びＣ）上皮下コラーゲン厚み（μｍ）の平均±ＳＥＭも示す。生理食塩水（ＳＡＬ）群に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ群に対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ  ＭＣＡ−ＭＳＣ  ＩＶ群に対してＰ¶＜０．０５。
【図４】図４は、実施例４による総肺コラーゲン濃度（線維症の別の指標）に関する、ＭＣＡ−ＭＳＣの効果を示す。研究された各群由来の総コラーゲン濃度（肺コラーゲン含有量／組織乾燥重量％）の平均±ＳＥＭを示す。マウス当たりの２番目に大きな肺葉から測定された、研究された各群由来の総肺コラーゲン濃度の平均±ＳＥＭ（肺コラーゲン含有量／組織乾燥重量％）も示し；ｎ＝８匹マウス／群から、マウスごとに２番目に大きな肺葉から測定された。生理食塩水（ＳＡＬ）群に対して＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ群に対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ  ＭＣＡ−ＭＳＣ  ＩＶ群に対してＰ¶¶＜０．０５。
【図５】図５は、実施例４による気道ＴＧＦ−β１（線維症促進性サイトカイン）発現に関する、ＭＣＡ−ＭＳＣの効果を示す。Ａ）研究された各群由来の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色された肺切片の代表的な顕微鏡写真は、気道上皮層の中及び周囲のＴＧＦ−β１染色／発現の程度を示す。スケールバー＝５０μｍ。Ｂ）５つの気道／マウス（ｎ＝７〜８匹マウス／群）由来のＴＧＦ−β１染色（％／領域として示される）の相対的な平均±ＳＥＭも示す。生理食塩水（ＳＡＬ）群に対して＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ群に対して＃＃＃Ｐ＜０．００１。
【図６】図６は、実施例４による上皮下筋線維芽細胞（鍵となる線維症作製細胞）密度に関する、ＭＣＡ−ＭＳＣの効果を示す。Ａ）研究された各群由来のＩＨＣ染色された肺切片の代表的な顕微鏡写真は、気道上皮下層中のα−ＳＭＡ染色された筋線維芽細胞密度（矢印で示す）の程度を示す。スケールバー＝２５μｍ。Ｂ）５つの気道／マウス（ｎ＝７〜８匹マウス／群）由来の筋線維芽細胞の平均±ＳＥＭ数（１００μｍＢＭ長さ当たり）も示す。生理食塩水（ＳＡＬ）群に対して＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ群に対して＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ  ＭＣＡ−ＭＳＣ  ＩＶ群に対してＰ¶＜０．０５。
【図７】図７は、実施例４によるＭＭＰ−９（コラーゲン分解酵素）レベルに関する、ＭＣＡ−ＭＳＣの効果を示す。Ａ）代表的なゼラチン・ザイモグラフ（倒立像）は、研究された各群における肺ＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ；９２ｋＤａ）及びＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ−３；〜５５ｋＤａ）の相対発現レベルを示す。各場合において、試料当たり１０μｇの総タンパク質を、解析のためにザイモグラフ上に搭載し；群当たり５〜６の追加試料を解析する別途のザイモグラフは類似した結果を作成した。Ｂ）ｎ＝７〜８匹マウス／群に由来する、ＭＭＰ−９（メスＢａｌｂ／ｃマウスの肺の中で最も豊富に発現しているゼラチナーゼである）の光学密度（ＯＤ）の相対的な平均±ＳＥＭも示す。生理食塩水（ＳＡＬ）群に対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ群に対して＃＃＃Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ  ＭＣＡ−ＭＳＣ  ＩＶ群に対してＰ¶＜０．０５。
【図８】図８は、実施例４によるＡＨＲに関する、ＭＣＡ−ＭＳＣの効果を示す。噴霧化メタコリン（気管収縮剤）の用量増加に応答した侵襲的プレチスモラフィーを介して、気道抵抗（ＡＨＲの変化を反映する）を評価した（ベースラインからの抵抗変化として表される）。試験したメタコリンの各用量に対する、ｎ＝７〜８匹マウス／群に由来する、気道抵抗の平均±ＳＥＭを示す。生理食塩水（ＳＡＬ）群に対する＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ群に対する＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ  ＭＣＡ−ＭＳＣ  ＩＶ群に対するＰ¶¶＜０．０１。
【図９】図９は、実施例５と６の慢性アレルギー性気道疾患モデルについての模式的なタイムラインである。処置は（肺病変が確立され進行しているときには）６４〜７８日目に投与された。
【図１０】図１０は、実施例５によるデキサメタゾン（ＤＥＸ）が添加されたＭＣＡ−ＭＳＣの、ＡＨＲに関する効果を示す。実施例４による噴霧化メタコリン（気管収縮剤；ベースラインからの抵抗変化として表される）の用量増加に応答した侵襲的プレチスモラフィーを介して、気道抵抗（ＡＨＲの変化を反映する）を評価した。試験したメタコリンの各用量に対する、ｎ＝６〜８匹マウス／群に由来する、気道抵抗の平均±ＳＥＭを示す。生理食塩水（ＳＡＬ）群に対する＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ群に対する＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ＋ＤＥＸ群に対するＰ¶¶＜０．０１。
【図１１】図１１は、実施例６による鼻腔内（ＩＮ）対静脈内（ＩＶ）対気管内（ＥＴ）投与されたＭＣＡ−ＭＳＣの、ＡＨＲに関する効果を示す。実施例４による噴霧化メタコリン（気管収縮剤；ベースラインからの抵抗変化として表される）の用量増加に応答した侵襲的プレチスモラフィーを介して、気道抵抗（ＡＨＲの変化を反映する）を評価した。ｎ＝６〜８匹マウス／群に由来する；試験したメタコリンの各用量に対する、気道抵抗の平均±ＳＥＭを示す。生理食塩水処置群に対する＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１；ＯＶＡ群に対する＃＃Ｐ＜０．０１。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
気道リモデリング（ＡＷＲ）として知られる構造変化は、慢性の／重篤な喘息の特徴であり、肺の機能不全に寄与する。一般的に、喘息はコルチコステロイド及び／又はβアゴニストにより管理される。
【００２８】
本発明は、コルチコステロイド及び／又はβアゴニストによる喘息処置を上回る改善であり、且つＭＳＣを他の薬剤と組み合わせた示唆された処置を上回る改善である、ＭＣＡ−ＭＳＣを使用した被験体における喘息の処置に関連する。
【００２９】
実施例１と２は、ヒト人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）の、早期クローン性の中内胚葉前駆体細胞（mesoendodermal precursor cell）のクラスである、間葉系血管芽細胞（ＭＣＡ）として知られる前駆体細胞への、及び引き続いての間葉系幹細胞（ＭＣＡ−ＭＳＣ）への分化を示す。ｉＰＳＣは無限に増殖することができ、且つそれら自体は極めて大量のＭＳＣに増えることができるので、単一の健康な血液ドナー由来のｉＰＳＣの単一のマスターセルバンクから、十分なＭＣＡ−ＭＳＣを獲得することができ、それにより、一旦ＭＳＣが形成されたならば過度の培養増殖をする必要性が無く、ドナー依存性及び増殖依存性の変動と非標的細胞からの混入を制限する。
【００３０】
本開示のＭＣＡ−ＭＳＣは、本質的に制限が無い供給の利点と、先行技術のＭＳＣと比較して改善された免疫調節効果の更なる利点を提供する。
【００３１】
本開示において、特に実施例４と５において、良好に確立された慢性ＡＡＤのネズミモデルに運ばれたときの、これらＭＣＡ−ＭＳＣの治療潜在力を検討した。このＡＡＤのネズミモデルはヒト喘息の３つの中心となる特徴であるＡＩ、ＡＷＲ、及びＡＨＲを伴って示し、本技術分野において喘息の前臨床モデルとして受け入れられている。特にＭＣＡ−ＭＳＣの抗リモデリング効果を、静脈内（ＩＶ）投与対鼻腔内（ＩＮ）投与で比較した。
【００３２】
重要なことに、幾つかのＭＳＣは喘息又はその症状の処置において幾らかの効果を示し得るが、そのような効果は、それらのＭＳＣが他の治療剤と組み合わせて使用されているときのみに得られる。有利なことに、本発明は組み合わせ療法の必要性が防がれる。
【００３３】
喘息
喘息及び／又はＡＡＤは下記の特徴の何れかの組み合わせの何れか１つ以上により特徴付けることができる：ＡＩ、ＡＷＲ、ＡＨＲ、気道／肺線維症、杯細胞化生、上皮肥厚化、気道トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β１レベルの増加、肺ＭＭＰ−９が無いか又はレベルが低いこと、上皮下筋線維芽細胞密度の増加、上皮下コラーゲン蓄積、及び総肺コラーゲン蓄積。
【００３４】
従って本開示のＭＣＡ−ＭＳＣによる喘息及び／又はＡＡＤの処置は、下記の特徴の何れかの組み合わせの何れか１つ以上を処置することにより特徴付けることができる：ＡＩの減少、ＡＷＲの減少、気道／肺線維症の減少、杯細胞化生の減少、上皮肥厚化の減少、気道トランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）−β１レベルの減少、上皮下筋線維芽細胞及び上皮下コラーゲンの低下、及び総肺コラーゲン濃度の減少。
【００３５】
本開示のＭＣＡ−ＭＳＣによるＡＡＤ／喘息の処置は、ＭＭＰ（例えばゼラチナーゼ及び／又はコラゲナーゼ）の発現／活性を増加させてもよい。１態様においてＭＭＰはＭＭＰ−９である。他の態様においてＭＭＰはＭＭＰ１３である。他の態様においてＭＭＰはＭＭＰ１、ＭＭＰ２、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、又はＭＭＰ１２である。
【００３６】
間葉系血管芽細胞−間葉系幹細胞（ＭＣＡ−ＭＳＣ）
従って本発明は、ＭＣＡ−ＭＳＣを投与することによる、ＡＤＤ／喘息、又はその特有の特徴の１つ以上のための改良された療法を提供する。ＭＣＡ−ＭＳＣはそれらの免疫調節の性質を介してそれらの効果を発揮し、ＡＡＤ／喘息の特有の特徴を産生する部位において直接的に作用することができる。
【００３７】
ＭＣＡ−ＭＳＣはサイトカイン、ケモカイン、及び成長因子等の生物活性分子を分泌し、免疫系を調節する能力を有する。ＭＣＡ−ＭＳＣは生着に頼らずに再生を促進し、免疫系に影響を及ぼすと示されている。言い換えればＭＣＡ−ＭＳＣは、それら自体が宿主被験体中に導入されている必要性は無く、むしろ、それらは短い時間の間にそれらの影響を及ぼしてその後に除かれる。しかしながら、ＭＣＡ−ＭＳＣは生着してもよい。
【００３８】
本明細書中で使用する「間葉系幹細胞（mesenchymal stem sell）」又は「ＭＳＣ」とは、骨髄、脂肪組織（脂肪）、胎盤、及び臍帯血を含む、広範囲の組織から単離され得る特定の型の幹細胞を言う。あるいはＭＳＣを、多能性幹細胞（ＰＳＣ）から作製してもよい。ＭＳＣは「間葉系間質細胞（mesenchymal stromal sell）」としても知られている。
【００３９】
本明細書中で使用する「ＭＣＡ−ＭＳＣ」とは、間葉系血管芽細胞（mesenchymoangioblast）表現型を介してｉＰＳＣから作製される特定の型のＭＳＣを言う。ＰＳＣからのＭＣＡ−ＭＳＣの作製は２０１７年３月１４日に出願された国際特許公開番号ＰＣＴ／ＡＵ２０１７／０５０２２８の中に述べられており、それ全体としてこの相互参照により組み込まれ、実施例１と２の中に述べられている。例えば実施例３に示されているように、ＭＣＡ−ＭＳＣは先行技術のＭＳＣとは異なる。
【００４０】
ＭＳＣは、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、及びナチュラルキラー細胞に対して免疫調節活性を奏すると示されている。理論により縛られることを望むものではないが、基となるメカニズムは、一酸化窒素、インドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ、プロスタグランジンＥ２、腫瘍壊死因子−誘導性遺伝子６タンパク質、ＣＣＬ−２、及びプログラム細胞死リガンド１等の、免疫調節性メディエーターを含んでもよい。これらのメディエーターは、例えば炎症性サイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＩＬ−１７等）により刺激されるまでは、発現レベルが低い。
【００４１】
本願明細書で使用される「多能性幹細胞」又は「ＰＳＣ」とは、それ自体を無制限に再生産し、且つ任意の他の型の細胞に分化する能力を有する細胞を言う。２つの主要な型のＰＳＣ：胚性幹細胞（ＥＳＣ）；及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）がある。
【００４２】
本願明細書で使用される「胚性幹細胞」又は「ＥＳＣ」とは、体外受精療法（in vitro fertilisation therapy）が完了し、余剰の胚を有する被験体から、同意の上で提供された５日目〜７日目の胚から単離された細胞を言う。ヒト胚からの細胞の抽出についての倫理的な懸念により、ＥＳＣの使用はある程度妨げられている。
【００４３】
適切なヒトＰＳＣには、Ｈ１及びＨ９ヒト胚性幹細胞が挙げられる。
【００４４】
本明細書で使用される「人工多能性幹細胞」又は「ｉＰＳＣ」とは、成熟細胞に由来するＥＳＣ様の細胞を言う。ｉＰＳＣはＥＳＣと非常に類似した特性を有するが、ｉＰＳＣは胚に由来するものではないので、ＥＳＣに関する倫理的な懸念が回避される。その代わりにｉＰＳＣは、「再プログラム化」されて多能性の状態に戻っている、典型的には十分に分化した成熟細胞に由来する。
【００４５】
適切なヒトｉＰＳＣには、限定されるものではないが、線維芽細胞に由来するｉＰＳＣ  １９−９−７Ｔ、ＭＩＲＪＴ６ｉ−ｍＮＤ１−４及びＭＩＲＪＴ７ｉ−ｍＮＤ２−０、並びに骨髄単核細胞に由来するｉＰＳＣ  ＢＭ１１９−９が挙げられる。他の適切なｉＰＳＣは、マディソン、ウィスコンシン州、米国のセルラー・ダイナミクス・インターナショナル（ＣＤＩ）から得られる。
【００４６】
１態様において、本発明において使用されるＭＣＡ−ＭＳＣは、原始中胚葉細胞から形成される。原始中胚葉細胞は、間葉系血管芽細胞（ＭＣＡ）の潜在能力を有してもよい。原始中胚葉細胞は、ＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋の表現型を有してもよい。１態様において、本発明で使用されるＭＣＡ−ＭＳＣは、ＭＣＡの潜在能力を有するＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞から形成される。
【００４７】
本明細書で使用される「ＭＣＡの潜在能力を有するＥＭＨｌｉｎ−ＫＤＲ＋ＡＰＬＮＲ＋ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ＋原始中胚葉細胞」とは、典型的には原始線条（primitive streak）及び側板（lateral plate）／胚外中胚葉（extraembryonic mesoderm）遺伝子を発現している細胞を言う。これらの細胞は、血清無しの培地中で線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）に応答して、ＭＣＡと血管芽細胞のコロニーを形成する潜在能力を有する。実施例２に従って培養されたときには、これらの細胞はＭＣＡ−ＭＳＣとなる。
【００４８】
用語ＥＭＨｌｉｎ−は、ＣＤ３１、ＶＥ−カドヘリン内皮マーカー、ＣＤ７３及びＣＤ１０５間葉系／内皮マーカー、並びにＣＤ４３及びＣＤ４５造血マーカーの発現を欠いていることを意味する。
【００４９】
１態様において、本発明において使用されるＭＣＡ−ＭＳＣは、ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＣＤ９０＋ＣＤ１４６＋ＣＤ４４＋ＣＤ１０＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−の表現型を示す。
【００５０】
１態様において、本発明において使用されるＭＣＡ−ＭＳＣは、マイクロＲＮＡであるｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ及びｍｉＲ−２１４−３ｐのそれぞれを発現するが、ｍｉＲ−１２７−３ｐ及びｍｉＲ−２９９−５ｐを発現しない。
【００５１】
本明細書中で示されたＡＡＤ／喘息の処置におけるそれらの効果に加えて、ＭＣＡ−ＭＳＣは、ＭＣＡ−ＭＳＣがＴヘルパー（ＣＤ４＋）リンパ球の増殖を抑制する能力としてインビトロで評価され得る、「免疫調節活性」を有する。免疫調節活性は、例えば免疫能アッセイ（ImmunoPotency Assay）を使用して測定されるように、基準に対してインビトロで定量化されてもよい。
【００５２】
適切な免疫能アッセイは、健康なドナーの末梢血から精製された、カルボキシフルオレセイン・スクシンイミジル・エステル標識を有する白血球を種々の濃度で別個にプレートした、本明細書中で開示された方法によって作製された照射試験ＭＣＡ−ＭＳＣ及び照射基準試料ＭＳＣを使用する。基準試料のサブセットを表すＴヘルパー（ＣＤ４＋）リンパ球を、ＣＤ３及びＣＤ２８抗体を添加することにより刺激する。Ｔ細胞増殖を評価するために、ＣＤ４標識されたＴ細胞を、フローサイトメトリーを使用して数え上げる。ＩＣ５０値は基準試料の関数として報告される。より高いＩＣ５０値は、Ｔヘルパー（ＣＤ４＋）リンパ球の増殖の抑制の程度がより大きいことを示唆し、よって、Ｔ細胞免疫調節の性質が優れていることを示唆する。このアッセイに使用される前にＭＳＣ試料を照射し、それらの増殖潜在能の交絡因子を除く。
【００５３】
ＭＣＡ−ＭＳＣによるＡＡＤ／喘息の処置
被験体においてＡＡＤ／喘息を処置するために、ＭＣＡ−ＭＳＣの治療有効量を被験体に投与する正確な方法は、医師の裁量によるであろうことは、本技術分野の当業者により理解されるであろう。用量、他の薬剤との組み合わせ、投与のタイミングと頻度等を含む投与のやり方は、被験体の状態と病歴により影響され得る。
【００５４】
ＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴を処置するのに、ＭＣＡ−ＭＳＣを単独でも使用し得ることは本発明の利点であるが、ＭＣＡ−ＭＳＣを他の喘息療法と組み合わせることができることは理解されるであろう。喘息の被験体が（例えばコルチコステロイド又はβ−アゴニスト療法を含む）既存の喘息の処置計画を有するときには、例えば医師は、喘息の被験体を他の喘息療法で処置してもなお、ＭＣＡ−ＭＳＣによる処置を引き続いて行ってもよい。
【００５５】
ＭＣＡ−ＭＳＣを治療組成物として投与してもよい。本明細書で使用する用語「治療組成物」とは、被験体に投与するために調合されている、本明細書中で述べられるＭＣＡ−ＭＳＣ又はＭＣＡ−ＭＳＣの集団を含む組成物を言う。好ましくは、治療組成物は無菌である。１態様において、治療組成物は発熱物質（pyrogen）を含まない。
【００５６】
１態様において、ＭＣＡ−ＭＳＣ又は治療組成物は、容器内に、好ましくは滅菌容器内に、好ましくは発熱物質を含まない容器内に提供される。１態様において容器は、例えばボーラス投与のために適したシリンジである。他の態様において、容器は注入のために適している注入バッグである。他の態様において、容器はＩＮ投与のために適合している。
【００５７】
ＭＣＡ−ＭＳＣは良い医療行為（good medical practice）に適うやり方で製剤化され、投薬され（dosed）、及び投与されるであろう。この文脈において考慮される因子には、処置される障害（disorder）及び予測される副作用又は症状の特定の型、処置される特定の被験体、被験体の臨床状態、投与部位、投与方法、投与のスケジュール調整、並びに医師に知られている他の因子が挙げられる。投与されるＭＣＡ−ＭＳＣの治療有効量は、そのような検討事項により支配されるであろう。
【００５８】
ＭＣＡ−ＭＳＣの用量は、約１０３細胞／ｍ２〜約１０１１細胞／ｍ２、例えば約１０６細胞／ｍ２〜約２×１０８細胞／ｍ２、若しくは約１０３細胞／ｍ２、約５×１０３細胞／ｍ２、約１０４細胞／ｍ２、約５×１０４細胞／ｍ２、約１０５細胞／ｍ２、約５×１０５細胞／ｍ２、約１０６細胞／ｍ２、約５×１０６細胞／ｍ２、約１０７細胞／ｍ２、約５×１０７細胞／ｍ２、約１０８細胞／ｍ２、約５×１０８細胞／ｍ２、約１０９細胞／ｍ２、約５×１０９細胞／ｍ２、約１０１０細胞／ｍ２、約５×１０１０細胞／ｍ２、又は約１０１1細胞／ｍ２に及び得る。
【００５９】
ＭＣＡ−ＭＳＣの用量は、約１０３細胞／ｋｇ〜約１０１１細胞／ｋｇ、例えば約１０６細胞／ｋｇ〜約２×１０８細胞／ｋｇ、若しくは約１０３細胞／ｋｇ、約５×１０３細胞／ｋｇ、約１０４細胞／ｋｇ、約５×１０４細胞／ｋｇ、約１０５細胞／ｋｇ、約５×１０５細胞／ｋｇ、約１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約１０７細胞／ｋｇ、約５×１０７細胞／ｋｇ、約１０８細胞／ｋｇ、約５×１０８細胞／ｋｇ、約１０９細胞／ｋｇ、約５×１０９細胞／ｋｇ、約１０１０細胞／ｋｇ、約５×１０１０細胞／ｋｇ、又は約１０１１細胞／ｋｇに及び得る。
【００６０】
ＭＣＡ−ＭＳＣの用量は、約１０３細胞〜約１０１１細胞、例えば約１０６細胞〜約２×１０８細胞、若しくは約１０３細胞、約５×１０３細胞、約１０４細胞、約５×１０４細胞、約１０５細胞、約５×１０５細胞、約１０６細胞、約５×１０６細胞、約１０７細胞、約５×１０７細胞、約１０８細胞、約５×１０８細胞、約１０９細胞、約５×１０９細胞、約１０１０細胞、約５×１０１０細胞、又は約１０１1細胞に及び得る。
【００６１】
用語「治療有効量」とは、被験体の処置に有効なＭＣＡ−ＭＳＣの量を言う。
【００６２】
ＭＣＡ−ＭＳＣを単回投与で、分割投与で、又は複数回投与で投与してもよい。例えば、被験体の鼻孔（複数）の間で分割投与をしてもよく、例えば鼻孔（単数）当たり用量のおよそ半分を投与してもよい。
【００６３】
被験体にＭＣＡ−ＭＳＣを、１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回投与してもよい。
【００６４】
１週間、２週間、１か月、又は２か月の間隔をあけて、被験体にＭＣＡ−ＭＳＣを２回以上投与してもよい。例えば、もしＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴が、既にＭＣＡ−ＭＳＣで処置された被験体で再発するならば、再発の時に又は再発の後に、３か月毎に、半年毎に、１年毎に、２年毎に、又はより大きな間隔をあけて、被験体に２回以上投与してもよい。
【００６５】
任意の適切な経路により、例えば、静脈内（ＩＶ）、鼻腔内（ＩＮ）、気管内、肺内、及び動脈内を含む経路により、ＭＣＡ−ＭＳＣを全身投与又は末梢投与してもよい。１態様において、ＩＶ、ＩＮ、気管内、又は肺内の経路により、ＭＣＡ−ＭＳＣを投与する。１態様においてＭＣＡ−ＭＳＣをＩＮ投与する。
【００６６】
１態様において、ＭＣＡ−ＭＳＣは投与に先立って前処理される。前処理を成長因子により行っても、又は遺伝子編集により行ってもよく、例えば、成長因子がＭＣＡ−ＭＳＣをプライムしてもよく、遺伝子編集がＭＣＡ−ＭＳＣに新たな治療特性を付与してもよい。
【００６７】
被験体がＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴を発症する前に、発症の間に、又は発症の後に、被験体にＭＣＡ−ＭＳＣを投与してもよい。
【００６８】
従って用語「処置する（treat）」、「処置する（treating）」、又は「処置（treatment）」とは、治療的な処置と、予防的な（prophylatic）又は防御的な（preventive）手段の両方を言うものであり、ここで目的は被験体においてＡＡＤ／喘息若しくはその特有の特徴を防ぎ、低減し、若しくは改善すること、又は被験体においてＡＡＤ／喘息若しくはその特有の特徴の進行を遅らせる（減少させる）ことである。処置の必要がある被験体には、ＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴を既に有する者のみならず、ＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴を防ぐべき若しくは改善するべき者も含まれる。
【００６９】
用語「予防する（preventing）」、「予防（prevention）」、「予防的（preventative）」、又は「予防的（prophylactic）」とは、ＡＡＤ／喘息若しくはその特有の特徴の発症から守る（keeping）こと、又はＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴の発症を妨げる（to hinder）こと、発症から防御する（defend from）こと、若しくは発症から保護する（protect from）ことを言う。ＡＡＤ／喘息若しくはその特有の特徴を予防する必要がある被験体は、例えば家族歴のために、ＡＡＤ／喘息若しくはその特有の特徴を発症する傾向がある。
【００７０】
用語「改善する（ameliorate）」又は「改善（amelioration）」とは、ＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴が減少すること、低減すること又は除去されることを言う。
【００７１】
ＭＣＡ−ＭＳＣの投与によるＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴の処置は、ＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴の約１％の減少、約２％の減少、約３％の減少、約４％の減少、約５％の減少、約６％の減少、約７％の減少、約８％の減少、約９％の減少、約１０％の減少、約１５％の減少、約２０％の減少、約２５％の減少、約３０％の減少、約３５％の減少、約４０％の減少、約４５％の減少、約５０％の減少、約５５％の減少、約６０％の減少、約６５％の減少、約７０％の減少、約７５％の減少、約８０％の減少、約８５％の減少、約９０％の減少、約９５％の減少、約９９％の減少、又は約１００％の減少をもたらすことができる。
【００７２】
１態様において、ＭＣＡ−ＭＳＣの投与によるＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴の処置は、ＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴を、ＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴を有さない被験体と同等の程度まで減少させることができる。
【００７３】
本技術分野の当業者は、ＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴を評価して定量化する方法を容易に理解し、例えば本実施例中に述べられた方法を使用して、困難又は過度の負担なくにそれを行うことが可能であろう。例えば、以下を定量化することができる：１）ＡＩの指標としての炎症スコア；２）ＡＩに誘導されたＡＷＲの指標としての杯細胞化生；ｉｉｉ）ＡＷＲの指標としての上皮厚み；ｉｖ）ＡＷＲ／線維化の指標としての上皮下コラーゲン厚み；ｖ）ＡＷＲ／線維化の指標としての総肺コラーゲン濃度；ｖｉ）ＡＷＲの指標としての上皮ＴＧＦ−β１染色；ｖｉｉ）ＡＷＲの指標としての上皮下筋線維芽細胞密度；ｖｉｉｉ）ＡＷＲの指標としてのゼラチナーゼ（例えばＭＭＰ−２及び／又はＭＭＰ−９）及び／又はコラゲナーゼ（例えばＭＭＰ−１及び／又はＭＭＰ−１３）の発現及び／又は活性；ｉｘ）肺機能及びＡＨＲの指標としての気道過敏性／反応性、並びにＡＨＲ。
【００７４】
任意のＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴を定量化して、コントロール（例えばＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴を有さない健康なコントロール被験体、又はコントロール被験体の健康な集団）と比較してもよい。あるいはコントロールは、ＡＡＤ／喘息又はその特有の特徴を有し、且つＭＣＡ−ＭＳＣで処置されて反応した、コントロール被験体又はコントロール被験体の集団であってもよい。
【００７５】
本明細書で使用される用語「被験体」とは、哺乳動物を言ってもよい。その哺乳動物は霊長類、特にヒトであってもよく、又は家畜、動物園の動物、又は伴侶動物であってもよい。本明細書中で開示される方法はヒトの医学的処置に適することは特に期待されるところであるが、それは、ウマ、ウシ、及びヒツジ等の家畜、イヌ及びネコ等の伴侶動物、又はネコ科動物（felids）、イヌ科動物（canids）、ウシ科動物（bovids）、及び有蹄動物（ungulates）等の動物園の動物の処置を含む、獣医処置にも適用可能である。
【００７６】
本明細書中に特に規定されない限り、本明細書中で使用される技術用語と科学用語は、本発明が属する技術分野に当業者により、及び出版された教科書を参照することにより、一般的に理解されるのと同じ意味を有するものである。
【００７７】
用語「a」又は「an」とは１つ以上を言うことに留意するべきであり、例えば、「a MCA-MSC」は、１つ以上のＭＣＡ−ＭＳＣ（複数可）を表すと理解される。従って用語「a」又は「an」、「一つ以上（one or more）」、及び「少なくとも一つ（at least one）」は、本明細書中で互いに交換可能であるように使用され得る。
【００７８】
本明細書に続く特許請求の範囲の中において及び発明の記載の中において、言語表現又は必要な含意のために、そうではないことを文脈が必要とする場合を除いて、用語「含む（comprise）」、又は「含む（comprises）」若しくは「含んでいる（comprising）」等のバリエーションは、包含的な意味で、即ち、述べられた特徴の存在を特定するものとして使用されるが、本発明の種々の態様において更なる特徴が存在すること又は付加することを除外するものではない。
【００７９】
本明細書中で使用される用語「約」は、所定の数について、その数の大きさの±２５％の値の範囲を予定するものである。他の態様において用語「約」は、所定の数について、その数の大きさの±２０％、±１５％、±１０％、又は±５％の値の範囲を予定するものである。例えば１態様において「約３グラム」は、２．７グラム〜３．３グラム（すなわち３グラム±１０％）等の値を示す。
【００８０】
同様に、イベントのタイミング又は期間は、少なくとも２５％で変動し得る。例えば、特定のイベントが１態様において１日続き得ると開示されているときには、そのイベントはおおよそ１日続き得る。例えば「１日」は、約１８時間〜約３０時間の期間を含み得る。他の態様において、時間の期間は、その時間の期間の±２０％、±１５％、±１０％、又は±５％で変動し得る。
【００８１】
下記の実施例は本発明の記述を助けるものであり、そのような実施例により限定されるものではない。
【実施例】
【００８２】
実施例１  ＭＣＡ−ＭＳＣ作製のための試薬
【表１−１】
2020533373.tif 000003
【００８３】
【表１−２】
2020533373.tif 000004
【００８４】
表１に列挙された試薬は当業者に知られており、ＩＭＤＭとＨＡＭ’ｓＦ１２等、容認された組成を有する。ＧＬＵＴＡＭＡＸはＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンジペプチドを含み、通常は０．８５％のＮａＣｌ中に２００ｍＭで供給される。ＧＬＵＴＡＭＡＸは培養されるべき細胞により、ジペプチド結合の開裂に際してＬ−グルタミンを放出する。化学的に規定された脂質濃縮物（Chemically defined lipid concentrate）は、アラキドン酸を２ｍｇ／Ｌ、コレステロールを２２０ｍｇ／Ｌ、ＤＬ−アルファ−トコフェロールアセテートを７０ｍｇ／Ｌ、リノール酸を１０ｍｇ／Ｌ、リノレン酸を１０ｍｇ／Ｌ、ミリスチン酸を１０ｍｇ／Ｌ、オレイン酸を１０ｍｇ／Ｌ、パルミチン酸を１０ｍｇ／Ｌ、パルミトレイン酸を１０ｍｇ／Ｌ、プルロニックＦ−６８を９０ｇ／Ｌ、ステアリン酸を１０ｍｇ／Ｌ、ＴＷＥＥＮ８０（登録商標）を２．２ｇ／Ｌ、及びエチルアルコールを含む。Ｈ−１１５２とＹ２７６３２は高度に強力な、細胞浸透性である、選択的なロック（ＲＯＣＫ）（Rho-associated coiled coil forming protein serine/threonine kinase）阻害剤である。
【００８５】
【表２】
2020533373.tif 000005
【００８６】
【表３】
2020533373.tif 000006
【００８７】
【表４】
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【００８８】
【表５】
2020533373.tif 000008
【００８９】
【表６】
2020533373.tif 000009
【００９０】
実施例２  ヒトｉＰＳＣのＭＣＡ−ＭＳＣへの分化
１．ビトロネクチンで被覆された（０．５μｇ／ｃｍ２）プラスチック製品上で、Ｅ８完全培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２基礎培地＋Ｅ８サプリメント）＋１μＭ  Ｈ１１５２の中でｉＰＳＣを解凍した。プレートしたｉＰＳＣを３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）でインキュベートした。
【００９１】
２．ビトロネクチンで被覆された（０．５μｇ／ｃｍ２）プラスチック製品上で、Ｅ８完全培地（ロック阻害剤無し）の中でｉＰＳＣを３継代増殖し、分化プロセスが開始する前に３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）でインキュベートした。
【００９２】
３．回収し、コラーゲンＩＶで被覆された（０．５μｇ／ｃｍ２）プラスチック製品上で、Ｅ８完全培地＋１０μＭのＹ２７６３２の中で単一細胞／小さなコロニーとして５×１０３細胞／ｃｍ２でｉＰＳＣを播種し、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で２４時間インキュベートした。
【００９３】
４．Ｅ８完全培地＋１０μＭのＹ２７６３２を分化培地と置き換え、３７℃、５％ＣＯ２、５％Ｏ２（低酸素圧）で４８時間インキュベートし、原始中胚葉細胞（primitive mesoderm cell）を作製した。
【００９４】
５．単一細胞の懸濁液として、分化培地接着培養液からコロニー形成原始中胚葉細胞を回収し、Ｍ-ＣＦＭ懸濁液培養液に移し、間葉系コロニーが形成するまで、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で１２日間インキュベートした。
【００９５】
６．回収し、フィブロネクチン／コラーゲンＩで被覆された（０．６７μｇ／ｃｍ２フィブロネクチン、１．２μｇ／ｃｍ２コラーゲンＩ）プラスチック製品上で、Ｍ−ＳＦＥＭの中に間葉系コロニーを播種し、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートしてＭＳＣを作製した（継代０）。
【００９６】
７．コロニーを回収し、フィブロネクチン／コラーゲンＩで被覆されたプラスチック製品上で、Ｍ−ＳＦＥＭの中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単一細胞として播種し（継代１）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
【００９７】
８．回収し、フィブロネクチン／コラーゲンＩで被覆されたプラスチック製品上で、Ｍ−ＳＦＥＭの中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単一細胞として播種し（継代２）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
【００９８】
９．回収し、フィブロネクチン／コラーゲンＩで被覆されたプラスチック製品上で、Ｍ−ＳＦＥＭの中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単一細胞として播種し（継代３）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
【００９９】
１０．回収し、フィブロネクチン／コラーゲンＩで被覆されたプラスチック製品上で、Ｍ−ＳＦＥＭの中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単一細胞として播種し（継代４）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
【０１００】
１１．回収し、フィブロネクチン／コラーゲンＩで被覆されたプラスチック製品上で、Ｍ−ＳＦＥＭの中に１．３×１０４細胞／ｃｍ２で単一細胞として播種し（継代５）、３７℃、５％ＣＯ２、２０％Ｏ２（正常酸素圧）で３日間インキュベートした。
【０１０１】
１２．単一細胞として回収し、最終産物を凍結した。
【０１０２】
２つの実験（ＴＣ−Ａ−９６及びＤＡＤ−Ｖ−９０）を実施し、Ｍ−ＣＦＭにＰＤＧＦ−ＢＢ（１０ｎｇ／ｍＬ）及び／又はＬｉＣｌ（１ｍＭ）を補足することが、ｉＰＳＣ由来のＭＣＡ−ＭＳＣのＴ細胞抑制に及ぼす影響を検討した。Ｔ細胞抑制を、ワイズマン・バイオマニファクチャリングの免疫能アッセイ（ＩＰＡ）を使用して評価した。
【０１０３】
表７で概説するように、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）とＬｉＣｌの下記の組み合わせ：ＰＤＧＦ＋／ＬｉＣｌ＋、ＰＤＧＦ−／ＬｉＣｌ−、ＰＤＧＦ＋／ＬｉＣｌ−、及びＰＤＧＦ−／ＬｉＣｌ＋、を評価した。２つの異なるＤｎｅｇ１播種密度（５×１０３細胞／ｃｍ２と１×１０４細胞／ｃｍ２）、及び分化培地中のアクチビンＡ（ＡＡ）の２つの異なる濃度（１倍のＡＡ＝１５ｎｇ／ｍＬ及び０．１倍のＡＡ＝１．５ｎｇ／ｍＬ）を、ＴＣ−Ａ−９６実験で比較したことに留意されたい。単一のＤｎｅｇ１播種密度（５×１０ｅ３細胞／ｃｍ２）とアクチビンＡ濃度（１．５ｎｇ／ｍＬ）を、ＤＡＤ−Ｖ−９０実験において使用した。第１のＩＰＡ（ＩＰＡ１）においては単一のｌｅｕｋｏｐａｋ（ＬＰＫ７）が使用され、第２のＩＰＡ（ＩＰＡ２）においては２つのｌｅｕｋｏｐａｋ（ＬＰＫ７とＬＰＫ８）が使用されたことにも留意されたい。
【０１０４】
このアッセイは、各ＭＳＣ株がＴヘルパー（ＣＤ４＋）リンパ球の増殖を抑制できる程度を評価するために設計された。健康な個体の末梢血から精製された凍結保存された白血球（Ｌｅｕｃｏｐａｋ（ＬＰＫ）に由来する末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ））を使用して、凍結保存されたＭＳＣを試験した。従って、ドナーとドナーの間でＬＰＫ細胞集団の変動が予測される。研究グレード材料のための単一のＰＭＢＣ試料に対する試験に限定するというオプションを伴い、各ＭＣＡ−ＭＳＣ試験試料を、臨床グレード材料のための２つの異なる個体に由来するＰＭＢＣに対して試験した。アッセイの完全性（integrity）／再現性を保証し、試験試料を標準化するために、各ＭＣＡ−ＭＳＣ試験試料のためのアッセイは、参照標準ＭＳＣ株と共に行われた。そのアッセイはBloomら Cytotherapy, 2015, 17(2):140-51に述べられている。
【０１０５】
要するに、試験ＭＣＡ−ＭＳＣを２１Ｇｙのガンマ照射に曝した。４８ウェルの組織培養プレート中に、４×１０ｅ５、２×１０ｅ５、４×１０ｅ４、及び２×１０ｅ４個の照射されたＭＣＡ−ＭＳＣを、個々のウェル中にプレートした。ＰＢＭＣを別個に、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルにより標識した。上記のＭＣＡ−ＭＳＣを含んでいるウェル当たり４×１０５細胞で、標識されたＰＭＢＣ細胞をプレートした。これは、１：１、１：０．５、１：０．１、及び１：０．０５に設定されたＰＢＭＣ：ＭＣＡ−ＭＳＣ比（titrated PBMC:MCA-MSC ratio）をもたらした。追加のウェルに刺激されたＰＢＭＣ単独、他にＭＣＡ−ＭＳＣ単独、及び他に１：０．０５の比で刺激無しをプレートし、それらは全てコントロールとして働いた。その後、Ｔ細胞刺激性のモノクローナル抗体、抗ヒトＣＤ３イプシロン（epilson）及び抗ヒトＣＤ２８（Ｒ＆Ｄシステムズ社、ミネアポリス、ミネソタ州）を各ウェルに添加した。
【０１０６】
培養の４日目に個々のウェルから細胞を回収した。各ウェル由来の細胞を、アロフィコシアニン標識された抗ヒトＣＤ４と共にインキュベートした。その後、フロ−サイトメーターを使用したカルボキシフルオレセイン強度を介して、ＣＤ４＋細胞の増殖について解析した。ＭＣＡ−ＭＳＣ単独のコントロールは、共培養されたウェルからＭＣＡ−ＭＳＣを取り除く（gate out）ために働いた。ＰＭＢＣ単独のコントロールは、ＭＣＡ−ＭＳＣに仲介された抑制の測定された程度に対する、最大のＴ細胞増殖のための陽性コントロールとして働いた。刺激されない１：０．０５の比のウェルは、測定された増殖に対する陰性コントロールゲ−ト（negative control gate）を作製するために使用された。
【０１０７】
試験試料比から、最良にフィトする曲線を使用してＩＣ５０値を作成した。ＩＣ５０値は基準標準に対して正規化された（ＩＣ５０基準標準／ＩＣ５０試験試料）。この正規化されたＩＣ５０は、より効力が強い（より抑制的である）試料に対しては大きな値、及び効力がより低い試料に対してはより小さな値をもたらす。
【０１０８】
結果
表７の中に表されたＩＣ５０データは、ＬｉＣｌが補足されているが、ＰＤＧＦが除かれている（すなわちＰＤＧＦ−／ＬｉＣｌ＋）Ｍ−ＣＦＭは、ｉＰＳＣを分化させて、免疫調節性であるｉＰＳＣ−ＭＳＣを作製するために最適であることを示している。さらに、アクチビンＡのより低い濃度も、ｉＰＳＣ由来のＭＣＡ−ＭＳＣの免疫抑制を改善した。
【０１０９】
【表７】
2020533373.tif 000010
【０１１０】
この実施例により作製されたＭＣＡ−ＭＳＣは、ＣＤ７３＋ＣＤ１０５＋ＣＤ９０＋ＣＤ１４６＋ＣＤ４４＋ＣＤ１０＋ＣＤ３１−ＣＤ４５−の表現型を示した。
【０１１１】
実施例３  ＭＣＡ−ＭＳＣマイクロＲＮＡ解析
実施例２において作製されたＭＣＡ−ＭＳＣは、１１９４のｍｉＲＮＡ、及び、（７１のＭＳＣ試料と９４の非ＭＳＣ試料に対して検証された）ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−２１４−３ｐ、ｍｉＲ−２９９−５ｐからなる独自のｍｉＲＮＡパネルを含む、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）マイクロアレイに対する解析を受けた。
【０１１２】
実施例２において作製されたＭＣＡ−ＭＳＣは、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１８１ｂ−５ｐ、及びｍｉＲ−２１４−３ｐをそれぞれ発現したが、ｍｉＲ−２１４−３ｐ及びｍｉＲ−２９９−５ｐは発現しなかった。
【０１１３】
試験された全ての試料について作成された正規化された（少なくとも１つの試験された試料の中に存在する）データの中で信頼性を有して検出されたマイクロアレイの２３３のｍｉＲＮＡの主要成分解析は、実施例２において作製されたＭＣＡ−ＭＳＣは他の７１のＭＳＣ試料のそれぞれとは異なることを示した。
【０１１４】
実施例４  インビボにおけるＡＡＤ／喘息の処置
方法及び材料
動物
６〜８週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスを、モナッシュ・アニマル・サービス（モナッシュ大学、クレイトン、ビクトリア、オーストラリア）から得、水と飼料（バラストック・ストックフィード、パケナム、ビクトリア、アーストラリア）を自由に摂取できる、１２時間明るく／１２時間暗い照明サイクルの、制御された環境下で飼育した。如何なる実験の前にも４〜５日の順応期間が全てのマウスに与えられ、行われた全ての手順は、モナッシュ大学動物倫理委員会（エシックス番号：ＭＡＲＰ／２０１６／０７８）により承認され、科学的な目的のための実験動物のケアと使用のためのオーストラリアのガイダンスに従ったものである。
【０１１５】
慢性ＡＡＤの誘導
慢性ＡＡＤにおけるＭＳＣの効果を評価するために、オボアルブミン（ＯＶＡ）誘導性の慢性ＡＡＤのモデルを、マウスにおいて確立した（ｎ＝２４）。１０μｇのグレードＶの鶏卵ＯＶＡ（シグマ−アルドリッチ、ミズーリ州、米国）及び４００μｇ硫酸アルミニウムカリウムアジュバント（ａｌｕｍ：ＡＪＡＸケミカルズ、ＮＳＷ、オーストラリア）を、０日目と１４日目に、腹腔内（ＩＰ）注射を２回することによりマウスを感作した。その後それらを、２１日目と６３日目の間に、週に３回、超音波ネブライザー（オムロン  ＮＥ−Ｕ０７；オムロン、京都、日本）を使用して、３０分間、エアロゾル化したＯＶＡ（０．９％の通常の生理食塩水中に２．５％ｗ／ｖ）を、全身吸入で暴露（噴霧）することにより接種した。しかしながらコントロールマウス（ｎ＝２４）については、ＯＶＡの代わりに、５００μＬの０．９％生理食塩水のＩＰ注射を行い、０．９％の生理食塩水により噴霧した。
【０１１６】
ＭＣＡ−ＭＳＣ処置
慢性ＡＡＤの確立の２４時間後（６４日目）、ＯＶＡ又は生理食塩水で感作された／接種を受けたマウスの亜群（ｎ＝８匹マウス／群）は、ＭＣＡ−ＭＳＣのＩＶ又はＩＮ投与を受けた。ＯＶＡに誘導されたＡＡＤの慢性モデルにおいて、ヒト骨髄由来の（間質の）ＭＳＣとヒト羊膜上皮細胞等の、他の幹細胞のＩＮがもたらす効果を評価するのに使用された時間枠を再現するために、全ての場合において１４日間の処置期間（６４〜６７日目）が選ばれた。
【０１１７】
実施例１と２に従ってＭＣＡ−ＭＳＣを作製した。ＭＳＣを規定する特徴はＣＤ７３、ＣＤ９０、及びＣＤ１０５の発現であり、ＭＣＡ−ＭＳＣ細胞の９９％超はそれらのマーカーの３つ全てについて陽性であるが、ＣＤ４３／４５とＣＤ３１については陰性であり、造血及び内皮系列細胞の不在が確かめられた。処置期間に亘って１週間当たり１回（６４日目と７１日目）、全ての処置が施された。各々のスケジュールされた処置の朝に、凍結されたＭＣＡ−ＭＳＣを３７℃の水浴中で解凍し、その後に下記のように再懸濁した：ＭＣＡ−ＭＳＣのＩＶ投与のために、１×１０７個の細胞を２ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の中で再懸濁した。マウスをパースペックス拘束器により拘束し、１×１０６細胞／２００μｌのＰＢＳを、生理食塩水又はＯＶＡで感作された／接種を受けたマウスの尾静脈中に注射した。ＭＣＡ−ＭＳＣのＩＮ投与においては、１×１０７個の細胞を０．５ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁した。マウスをイソフルラン（バクスターヘルスケア、ＮＳＷ、オーストラリア）により軽く麻酔し、鼻腔内滴下を行っている間は半仰臥位に保った。ＰＢＳの１×１０６細胞／５０μＬを（自動ピペットを使用して各鼻腔内に２５μＬ）、その後マウスにＩＮ投与した。 
【０１１８】
侵襲的プレチスモグラフィー
７８日目（ＭＣＡ−ＭＳＣの最後の処置に続く７日目）にマウスを、０．９％生理食塩水中のケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ体重）及びキシラジン（２ｍｇ／ｋｇ体重）により麻酔した。その後、１８ゲージの気管切開チューブを用いて全てのマウスについて気管切開を行った。その後、Ｂｕｘｃｏ  ＦｉｎｅＰｏｉｎｔｅ  ｐｌｅｔｈｙｓｍｏｇｒａｐｈ（ブクスコ、リサーチシステムズ、ウィルミントン、ノースカロライナ州、米国）のチャンバーにマウスを置き、通気した。その後ＰＢＳ中に溶解され、噴霧されたメタコリン（メタコリン；シグマ−アルドリッチ、ミズ−リ州、米国）の増加する用量に応答した各マウスの気道抵抗を測定し、６．２５〜５０ｍｇ／ｍＬを気管内に４回送達して気管支収縮を引き起こし、ＡＨＲを評価した。気道抵抗の変化（各投与後の最大気道抵抗からＰＢＳのみのベースライン抵抗を引く）を対応するメタコリンの用量に対してプロットした。
【０１１９】
組織採取
侵襲的プレチスモグラフィーに続いて、各動物から肺組織を単離し、４つの別個の小葉（lobe）に分ける前に冷たいＰＢＳ内で洗浄した。最大の小葉を１０％の中性緩衝ホルムアルデヒド中で一晩固定し、切断加工し、（種々のエンドポイントの組織学的及び免疫組織化学的な解析のために）パラフィンワックス中に包埋した。残る３つの小葉は、様々な他のアッセイのために液体窒素中で急速凍結した。
【０１２０】
肺の組織病理学
各マウス由来の最大の小葉が一旦パラフィンに包埋されたら、各組織ブロックを連続切片とし（厚さ３μｍ）、荷電した（charged）ミクロガラススライド（グレイル・サイエンティフィック、リングウッド、ヴィクトリア、オーストラリア）上に戴置し、様々な組織学的染色又は免疫組織化学に供した。炎症スコアを評価するために、上皮の厚みと上皮下細胞外マトリックス（ＥＣＭ）沈着、各マウス由来の１つの切片（スライド当たり）はマッソンのトリクローム染色を受けた。杯細胞化生の評価のために、スライドの第二のセットは、アルシアンブルー過ヨウ素酸シッフ（ＡＢＰＡＳ）染色を受けた。マッソンのトリクローム染色及びＡＢＰＡＳ染色された切片を、以下に詳細に述べるように形態計測的に解析した。
【０１２１】
免疫組織化学（ＩＨＣ）
ＴＧＦ−β１（ポリクローナル抗体；ｓｃ−１４６；サンタクルス・バイオテクノロジー、サンタクルス、カリフォルニア州、米国；１：１０００希釈）又はα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ；筋線維芽細胞分化のマーカー；モノクローナル抗体使用；Ｍ０８５１；ダコ、グロストロップ、デンマーク；１：２００希釈）を検出するために、ＩＨＣを使用した。ＤＡＫＯ  ＥｎＶｉｓｉｏｎ抗ウサギ又は抗マウスキットと３、３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）色素原を使用して一次抗体染色を検出し、一方、如何なる一次抗体も無しでＥｎＶｉｓｉｏｎキットに曝したネガティブコントロ−ルも含めた。全てのスライドをその後ヘマトキシリンにより対比染色し、形態計測分析的解析のために、ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＡＴ  Ｔｕｒｂｏ（アペリオ、カリフォルニア州、米国）を用いてモナッシュ・ヒストロジー・サービスによりスキャンした。
【０１２２】
形態計測分析的解析
マッソンのトリクローム、ＡＢＰＡＳ、及びＩＨＣ染色したスライドを、下記のようにして形態計測分析的解析をかけた。切片当たり（直径１５０〜３００μｍの）５つの気道を無作為に選択し、Ａｐｅｒｉｏ  ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅ（アペリオ、カリフォルニア州、米国）を用いて解析した。マッソンのトリクローム染色したスライドに、半定量的細気管支周囲炎症スコア付けを行い、ここで実験を盲検とし、個々の気道に０（気道の周囲に検出可能な炎症無し）から４（広範囲に及び、且つ大きな炎症性細胞凝集物、プールされた大きさ〜０．６ｍｍ２）のスコアを付けた。マッソンのトリクローム染色したスライドの、上皮及び上皮下のＥＣＭ層（青色に染色）の厚みを測定することにより（基底膜（ＥＭ）の長さのμｍ２／μｍとして表した）、上皮の厚みと上皮下ＥＣＭ沈着の解析も行った。
【０１２３】
ＡＢＰＡＳ、α−ＳＭＡ染色されたスライドを、ポシティブに染色された杯細胞又はＢＭ長さ１００μｍ当たりのα−ＳＭＡポシティブ細胞の数を数えることにより、杯細胞化生及び上皮下の筋線維芽細胞数のそれぞれについて解析した。ＴＧＦ−β１染色されたスライドを、気道中の強いポシティブに染色されたピクセルを評価するアルゴリズムを実行することにより、ＴＧＦ−β１タンパク質発現について解析した。気道の総面積（ｍｍ２）当たりの強いポシティブのピクセルの数として；及びその後（１として表される）生理食塩水で処置されたコントロール群と比較して、結果を表した。
【０１２４】
ヒドロキシプロリンアッセイ
各マウスに由来する二番目に大きな肺葉を、ヒドロキシプロリン含有量の測定について既に述べられたようにして加工し（Royce, S. G.ら, (2013) Clin. Sci. 124, 41-51）、それを精製されたトランス−４−ヒドロキシ−Ｌ−プロリン（シグマ−アルドリッチ）の標準曲線から測定した。総コラーゲン含有量を推定するために、ヒドロキシプロリンの値を６．９４の係数（多くの哺乳動物組織中のコラーゲンのアミノ酸組成の〜１４．４％を表しているヒドロキシプロリンに基づく）により掛け算を行い、次に各対応組織の乾燥重量により割り算を行いコラーゲン濃度パーセンテージを得た。
【０１２５】
ゼラチンザイモグラフィー
各マウスに由来する三番目に大きな肺葉を、総タンパク質（試料当たり１０μｇ）の等量アリコートを１ｍｇ／ｍｌのゼラチンを含む７．５％アクリルアミドゲル上で評価する前に、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を含むタンパク質の抽出のために既に詳細に述べたようにして加工した（Woessner, J. F., (1995) Methods Enzymol. 248, 510-528）。ゼラチン分解活性を明らかなバンドとして可視化した。ＭＭＰ−９（メスＢａｌｂ／ｃマウスの肺内の主たるゼラチナーゼ）の濃度測定を、ＧＳ７１０濃度計（バイオラッド・ラボラトリ−ズ、グレイズヴィル、ニューサウスウェールズ、オーストラリア）及びＱｕａｎｔｉｔｙ−Ｏｎｅソフトウェア（バイオラッド）を用いて行った。ＭＭＰ−９の光学密度（ＯＤ）の相対平均±ＳＥＭをその後グラフ化した。
【０１２６】
統計解析
全ての統計解析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６．０（グラフパッド・ソフトウェア社、ラホヤ、カリフォルニア州、米国）を用いて行われ、平均±ＳＥＭで表した。ＡＨＲの結果を、ボンフェローニ事後解析（Bonferroni post-hoc test）を伴う二元配置分散分析（two-way ANOVA）により解析した。残りのデータを、群間の多重比較のために、ニューマン・コイルス事後解析（Newman-Keuls post-hoc test）を伴う一元配置分散分析（one-way ANOVA）により解析した。各場合において、データはｐ＜０．０５で有意であると見做された。
【０１２７】
結果
ＡＩに対するＭＣＡ−ＭＳＣの効果
炎症スコア付けシステム（０〜４）を使用して、Ｈ＆Ｅ染色した肺切片からＡＩを半定量した。ＯＶＡで損傷されたマウスの気管支周囲の炎症スコア（２．７５±０．０９）は、生理食塩水（ＳＡＬ）で感作された／接種を受けたコントロールのスコア付け（０．２５±０．０９；ＳＡＬ群に対してＰ＜０．００１）よりも有意に高かった（図１）。ＯＶＡ群における炎症レベルの上昇により、これらのマウスのＯＶＡによる感作と接種が成功していることが確認された。
【０１２８】
ＳＡＬ−コントロールマウスに投与されたときの基礎炎症スコアに影響することなく、ＭＣＡ−ＭＳＣの投与は、ＯＶＡ誘導性の気管支周囲の炎症細胞の浸潤を有意に減少させた（１．２５±０．２３；ＯＶＡ群に対してＰ＜０．００１）（図１Ａ、図１Ｂ）。しかしながらＭＣＡ−ＭＳＣによる処置は、ＳＡＬコントト−ルマウスにおいて測定されたＡＩに戻る程には、ＡＩを十分に減少させることができなかった（ＯＶＡ損傷マウスにＭＣＡ−ＭＳＣを投与した処置につき、ＳＡＬ群に対してＰ＜０．０５）。
【０１２９】
ＡＷＲに対するＭＣＡ−ＭＳＣの効果
杯細胞化生
杯細胞化生をＡＢＰＡＳ染色された肺切片から形態計測的に評価し、ＢＭ長さ１００μｍ当たりの杯細胞の数として表した（図２）。ＯＶＡ処置されたマウスは、それらのＳＡＬコントロールの対応物（０．００１±０．００）と比較して、杯細胞数（６．０８±０．５２）が有意に増加した（ＳＡＬ群に対してＰ＜０．００１；図２Ａ、図２Ｂ）。ＭＣＡ−ＭＳＣの投与は、ＯＶＡ誘導性の杯細胞数の促進を、完全にではないが、有意に減少させることができた（３．９７±０．６４から２．８９±０．４８、ＯＶＡ群に対してＰ＜０．０１；図２Ａ、図２Ｂ）。しかしながら、ＭＣＡ−ＭＳＣの送達は、ＯＶＡ誘導性の杯細胞化生を、ＳＡＬコントロールで測定されたところまで好転させることはなかった（両方はＳＡＬ群に対してＰ＜０．００１）が、ＳＡＬ処置されたマウスにおける杯細胞数には影響しなかった。
【０１３０】
気道上皮厚み
気道上皮厚みを、マッソンのトリクロームで染色された肺切片から形態計測的に評価し、μｍ２／μｍＢＭ長さとして表した（図３）。ＯＶＡ処置されたマウスの上皮厚み（１９．１６±０．６３）は、ＳＡＬコントロールにおいて測定されたもの（１４．２８±０．４５）よりも有意に高かった（ＳＡＬ群に対してＰ＜０．００１；図３Ａ、図３Ｂ）。ＭＣＡ−ＭＳＣの送達は上皮の厚みを、ＯＶＡ群において測定されたもの（１８．５９±０．７７から１６．６７±０．８７）から、完全にではないが有意に減少させた（ＯＶＡ群に対してＰ＜０．０５；ＳＡＬ群に対してＰ＜０．０５；図３Ａ，図３Ｂ）。重要なことに、ＭＣＡ−ＭＳＣ処置はＳＡＬコントロールマウスにおける基礎上皮厚みには影響しなかった。
【０１３１】
上皮下コラーゲン沈着
マッソントリクロームで染色された肺切片から、上皮下コラーゲン沈着を形態計測的に評価し、μｍ２／μｍＢＭ長さとして表し（図３）；ＳＡＬコントロ−ルにおける値（１４．３１±１．８７）と比較して、ＯＶＡ損傷マウス（２７．６３±０．６６）においては有意に上昇した（ＳＡＬ群に対してＰ＜０．００１；図３Ａ，図３Ｃ）。ＭＣＡ−ＭＳＣの送達は、ＯＶＡ誘導性の上皮下コラーゲン沈着の異常な促進を低下させた（２２．３９±１．７８から１６．９８±０．９８、ＯＶＡ群に対してＰ＜０．０５；図３Ａ、図３Ｃ）。
【０１３２】
総肺コラーゲン濃度（線維症）
総肺コラーゲン濃度（コラーゲン濃度％／肺組織乾燥重量）を、各マウスの二番目に大きな肺葉中に存在するヒドロキシプロリンレベルから推定し、線維症の指標として使用した（図４）；ＯＶＡ損傷マウス（３．９４±０．０９％）においては、ＳＡＬコントロールマウスにおいて測定されたものと比較して有意に増加していた（２．８９±０．１８％；ＳＡＬ群に対してＰ＜０．００１）。ＯＶＡ損傷マウスへのＭＣＡ−ＭＳＣの投与は、肺における線維症を低下させた（３．２６±０．１７％から３．６２±０．０７％；ＯＶＡ群に対してＰ＜０．０５；図４）。
【０１３３】
気道ＴＧＦ−β１発現
ＭＣＡ−ＭＳＣがＯＶＡ誘導性の上皮下及び総コラーゲン沈着（線維症）を好転させることができる機構を決定するために、気道ＴＧＦ−β１（線維症促進性サイトカイン）発現レベルにおける相対的な変化を、ＩＨＣ−染色した肺切片から形態計測的に評価し、解析された気道当たりの染色％として表した（図５）。気道ＴＧＦ−β１発現はＯＶＡ損傷マウス（１．８５±０．１３）において、ＳＡＬコントロールで測定されたもの（１．００±０．０８％）と比較して有意に増加した（ＳＡＬ群に対してＰ＜０．００１；図５Ａ、図５Ｂ）。ＯＶＡ損傷マウスへのＭＣＡ−ＭＳＣの送達は、異常な気道ＴＧＦ−β１発現レベルを、ＳＡＬコントロールにおいて測定されたレベルに戻るまで好転させ（１．０６±０．０５から１．２２±０．０５、ＯＶＡ群に対してＰ＜０．００１；ＳＡＬ群と差がない）、ＳＡＬコントロールマウスに投与したときに基礎気道ＴＧＦ−β１発現レベルに影響することはなかった（図５Ａ、図５Ｂ）。
【０１３４】
上皮下筋線維芽細胞密度
α−ＳＭＡ染色された上皮下筋線維芽細胞密度も、ＩＨＣ染色された肺切片から形態計測的に評価し、ＢＭ長さの筋線維芽細胞／１００μｍの数として表した（図６）。ＳＡＬコントロールマウスにおいて、微量の上皮下のα−ＳＭＡポシティブな筋線維芽細胞が検出された（０．１４±０．０５）一方で、ＯＶＡ損傷マウスでは筋線維芽細胞密度が〜３０倍増加した（４．３７±０．３７；ＳＡＬ群に対してＰ＜０．００１；図６Ａ、図６Ｂ）。ＭＣＡ−ＭＳＣの投与は、ＯＶＡ誘導性の上皮下筋線維芽細胞密度の増加を減少させ（２．８６±０．２７から３．４２±０．０９；ＯＶＡ群に対してＰ＜０．０５）、ＳＡＬコントロールマウスに投与されたときの基礎筋線維芽細胞数に何ら影響することはなかった（図６Ａ、図６Ｂ）。しかしながら、ＭＣＡ−ＭＳＣの投与が、異常な上皮下筋線維芽細胞負荷を、ＳＡＬコントロールマウスにおいて測定されたところに戻るまで十分に回復させることはなかった（両方ともＳＡＬ群に対してＰ＜０．００１；図６Ａ、図６Ｂ）。
【０１３５】
肺ゼラチナーゼ発現
我々はＭＣＡ−ＭＳＣに仲介された、ＯＶＡ誘導性の気道／肺線維症の回復が、コラーゲン分解性のＭＭＰレベルに影響するそれらの能力に関連しているどうかかも決定した。ゼラチンザイモグラフィーは、メスＢａｌｂ／ｃマウスの肺は主としてＭＭＰ−９（ゼラチナーゼＢ）を発現し、ＭＭＰ−１３（コラゲナーゼ−３）の程度は低いことを明らかにした（図７）。ＯＶＡ損傷マウスにおける相対的ＭＭＰ−９発現レベル（１．６２±０．２２）は、ＳＡＬコントロール動物において測定されたものと有意差はなかった（１．００±０．０９）（図７Ａ；図７Ｂ）。それと比較して、ＯＶＡ損傷マウスへのＭＣＡ−ＭＳＣの投与は、ＭＭＰ−９レベルを顕著に増加させ（３．７７±０．１８から４．５６±０．２０；ＯＶＡ  ＭＣＡ−ＭＳＣ群に対してＰ＜０．０５）、ＯＶＡ処置されたマウス単独において測定されたものに対して〜１．３倍と〜１．８倍であった（ＯＶＡ群に対してＰ＜０．００１；ＳＡＬ群に対してＰ＜０．００１；図７Ａ；図７Ｂ）。興味深いことに、ＳＡＬ処置マウスへのＭＣＡ−ＭＳＣの送達も、ＭＭＰ−９レベルを有意に増加させた（１．９５±０．３８から２．６５±０．３０；ＳＡＬ群に対してＰ＜０．０５）。
【０１３６】
ＡＨＲへのＭＣＡ−ＭＳＣの効果
ＡＨＲを、噴霧されたメタコリン（気管支収縮剤）の濃度増加に応答した侵襲的なプレチスモグラフフィーにより評価した（図８）。予期された様に、ＯＶＡ処置されたマウスはＳＡＬコントロールにおいて測定されたものと比較して、ＡＨＲが有意に上昇した（Ｐ＜０．００１対ＳＡＬ群；図８）。ＭＣＡ−ＭＳＣの送達は、ＯＶＡ誘導性のＡＨＲの増加を好転させた（Ｐ＜０．０５対ＯＶＡ群；図８）。測定された多くの他のエンドポイントと同様に、ＳＡＬコントロ−ルマウスに投与されたときには、ＭＣＡ−ＭＳＣの送達は基礎ＡＨＲ測定には影響しなかった（図８）。
【０１３７】
考察
この研究は、確立された疾患病理に対する治療として与えられたときに、慢性ＡＡＤ／喘息の病因の３つの中心要素：ＡＩ、ＡＷＲ、及びＡＨＲに対する、新規なｉＰＳＣ由来のＭＣＡ−ＭＳＣの治療潜在能力を評価することを目的としている。
【０１３８】
ＭＣＡ−ＭＳＣの投与により、マウスに対する繰り返されたＯＶＡ感作と接種により誘導された、確立されたＡＩ、ＡＷＲ（杯細胞化生、異常な気道ＴＧＦ−β１レベル、上皮下筋線維芽細胞とコラーゲンの蓄積、総肺コラーゲン濃度）、及びＡＨＲに対して保護がなされた（表８）。これは２週間（週に１回）の処置期間に亘り、異常な気道ＴＧＦ−β１レベル、気道／肺線維化及びＡＨＲの好転と、ＭＣＡ−ＭＳＣの送達によるコラーゲン分解性ＭＭＰ−９レベルの有意な増加をもたらした（表８）。重要なことにＭＣＡ−ＭＳＣの投与は、測定されたパラメーターの基礎発現に影響しないことが見出され、ＭＣＡ−ＭＳＣの送達は、ＡＡＤ／喘息の中心要素を処置する安全であり且つ最も有効な手段を提供することを示唆している。
【０１３９】
【表８】
2020533373.tif 000011
【０１４０】
喘息の炎症性要素は気道閉塞に寄与する。Ｔｈ２が歪めた（skewed）炎症は、インターロイキン（ＩＬ）−１３を含むサイトカインの特定のサブセットの上昇と、杯細胞化生の誘導をもたらした。
【０１４１】
これらの発見と整合して、過去の研究は、ｉＰＳＣ由来のＭＳＣ（本明細書で開示されるＭＣＡ−ＭＳＣではない）のＩＶ注射は、急性ＯＶＡモデルにおいて、Ｔｈ２サイトカイン、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１３のレベルを抑制することにより、気道の炎症スコアを部分的に低下させることができたと示している。ＭＣＡ−ＭＳＣの全身的な効果は、直接的な細胞−細胞接触を介して制御性Ｔ細胞を活性化するそれらの能力とすら関連しているかもしれない。しかしながらＭＣＡ−ＭＳＣが、ＡＩを〜７５％、杯細胞化生を〜５０％顕著に抑制するという本発見は、ヒト骨髄又は脂肪組織に由来するＭＳＣと比較して、ＭＣＡ−ＭＳＣが免疫調節的性質をより大きく仲介することを示唆している。
【０１４２】
気道／肺へＭＣＡ−ＭＳＣを直接的に投与すると、それらが分泌する防御因子が、肺環境中に残存することが許容される。さらに直接的に投与されたＭＣＡ−ＭＳＣは、炎症を起こした肺の中で残存する可能性がより高く、肺胞マクロファージと樹状細胞を含む抗原提示細胞の抑制を介して、仲介されたアレルゲン暴露に対する、より大きな保護効果を有する。
【０１４３】
杯細胞化生と共に上皮増殖は、喘息における上皮リモデリングにおいて大きな貢献をする。上皮のバリア機能の減少と剥離は、上皮増殖としての最高点（culminate）である。この増殖は重篤な喘息において特に広範囲であり、ここで上皮の拡張は気道閉塞をもたらす。このリプログラミングが喘息の発症において早期に起こるならば、喘息療法は上皮を標的にするべきである。ＭＣＡ−ＭＳＣの送達は上皮厚みの減少をもたらすが、ＡＩにおいても類似の減少を提供する。これは骨髄由来のＭＳＣに関連した、骨髄−ＭＳＣ単独でのＩＮ送達は上皮厚みに影響しないという過去の知見と対照的である。その研究において、ＡＩにおける減少により上皮厚みは影響を受けなかった。よってＭＣＡ−ＭＳＣと骨髄−ＭＳＣの間で観察された差は、それらがＡＩを弱める能力により作成された受動的な効果というよりも、ＭＣＡ−ＭＳＣ自身の能動的な性質によるものでありそうである。
【０１４４】
更に他の研究において、上皮因子修復ペプチド（トレフォイル因子−２）の投与は、抗線維症とコルチコステロイドによる組み合わせ処置と同程度まで上皮の厚みを減少させたが、その組み合わせ処置によりＡＩのより大きな減少が提供された。そのために、炎症の減少によって上皮増殖の減少が仲介されることはなかった。
【０１４５】
この追加の証拠と共に本知見は、ＭＣＡ−ＭＳＣの送達は、ｉ）上皮厚みを減少させるパラクリン因子を十分に蓄積すること、及び／又は、ｉｉ）これらの細胞は損傷された上皮と直接的に接触するようになり、その増殖における好転を仲介すること、を許容することを示唆する。ＭＣＡ−ＭＳＣにより作製される上皮厚みと杯細胞化生の減少は、ＡＷＲの好転の最初の証拠である。
【０１４６】
機械的傷害とアレルゲンを含む多数の因子が最高点になる（culmination）ことは、肺構造と気道機能の破壊に貢献し得、ＡＩに加えてＡＷＲをもたらす。アレルゲンによる又は遺伝性の感受性に由来する損傷は、構造と気道機能を自己修復しようとするリモデリングの内因性の工程を、肺が受けることの原因となり、これらの修復過程は異常な創傷治癒をもたらし、最終的には線維症に至る。線維症はＯＶＡ感作された気道においては明らかであり、上皮下と総コラーゲンレベルの異常な上昇を示す。ＭＣＡ−ＭＳＣの送達は、異常な上皮下と総コラーゲン沈着の両方を有意に減少させ、場合によっては、損傷を受けていない生理食塩水処置群において見られるレベルに戻るまで、この異常なコラーゲン沈着を完全に好転させた。過去の研究はＯＶＡ誘導性の上皮下及び総コラーゲン沈着の促進は、幹細胞に基づいた処置が抗線維症剤と共に投与されたときにのみ十分に好転させることができると示したので、これらの結果は予期されないものであった。これらの組み合わせ処置の研究において、抗線維症剤は、幹細胞に基づいた療法を導入し得る、より好ましい環境を作り出すであろうと提案され、よって幹細胞の生き残りを助け且つそれらの増殖及び移動能力を増加させ、それらの予防／治療効果を誘導する。よってＭＣＡ−ＭＳＣの送達は、抗線維症剤と類似した効果を有し、線維症の非存在下において創傷治癒を促進することができる、胎児線維芽細胞に類似した抗線維症特性を有するかもしれない。
【０１４７】
これらの結果は、観察された上皮厚みのＭＣＡ−ＭＳＣ誘導性の減少にも相当する。線維形成性成長因子は、上皮障害に応答して、上皮細胞により一般的に放出される。喘息においてこの応答は促進され、上皮下線維症は、防御性の上皮から気道壁のより深部への信号の伝達に起因することを示唆している。従ってＭＣＡ−ＭＳＣは、ＩＶ投与されたときには上皮下コラーゲンと総コラーゲンの減少を前提として、免疫調節性の性質と、抗線維性メディエーターの可能な分泌を介して、それらの抗線維症効果を発揮し得る。
【０１４８】
この研究の鍵となる発見は、ＭＣＡ−ＭＳＣは線維症を好転させ、ＡＨＲを、損傷を受けていないマウスにおいて測定されたレベルまで戻すということである。ＡＨＲは杯細胞化生と上皮肥厚に由来する粘液栓により引き起こされ得る、気道閉塞により決定される。加えて気道壁のＡＩと線維症の間の相互作用も、ＡＨＲを上昇させる環境をもたらす。線維症が、喘息を有する被験体における気道コンプライアンス（compliance）を減少させるのみならず、ＥＣＭにおけるこの拡張も可溶性炎症性メディエーターの保持と、確立されたＡＨＲの慢性的な持続をもたらす。従ってＡＨＲは、主として上皮下線維症の減少とＡＩの減退により、及び／又は、ＭＣＡ−ＭＳＣにより提供される杯細胞のカウントの減少により仲介される気道閉塞の低減と上皮肥厚化のレベルの低下により、正常な損傷されていないレベルまで戻り得た。本明細書中で開示されるようにＭＣＡ−ＭＳＣは、それらの抗炎症性効果に加えて、多くのレベルでＡＷＲを標的とすることによりＡＨＲを修正した。
【０１４９】
結論として本研究は、慢性ＡＡＤ／喘息の処置にＭＣＡ−ＭＳＣを初めて使用し、ＭＣＡ−ＭＳＣがＡＩを効果的に減少させ、ＡＨＲのみならずＡＷＲのマーカーを好転させることを見出した。よってＭＣＡ−ＭＳＣはＡＡＤ／喘息のための単独の療法を提供する。ＭＣＡ−ＭＳＣを、ＡＡＤ／喘息のための補助療法としても使用できる。ＭＣＡ−ＭＳＣは、コルチコステロイド又はβ−アゴニスト療法等の既存の療法に応答しないＡＡＤ／喘息を有する被験体の亜集団に、特に治療利益を提供し得る。
【０１５０】
ＭＣＡ−ＭＳＣを過去に研究された他の幹細胞から分ける顕著な発見は、他のＭＳＣ／幹細胞は、他の治療剤と組み合わせて投与されたときのみに治療効果を生み出すということである。
【０１５１】
実施例５
実施例４における６週間の代わりに、週に３回８週間（２１〜７７日目、図９）、オボアルブミンの噴霧エアロゾル溶液で３０分間マウスに接種した以外は、実施例４と同様にして６〜８匹のマウスの群にＡＡＤ／喘息を誘発した。５つの群：１非処置群（喘息なし）；２非処置感作動物（喘息）；３ＭＣＡ−ＭＳＣのＩＮ注入により処置された感作動物（喘息）；４デキサメタゾン（ＤＥＸ）のＩＮ注入により処置された感作動物（喘息）；５ＭＣＡ−ＭＳＣ＋ＤＥＸのＩＮ注入により処置された感作動物（喘息）、の１つにマウスを無作為に割り当てた。全てのＭＣＡ−ＭＳＣ処置されたマウスは、１０６個の細胞の用量でＩＮ投与を２回（９週と１０週に週１回）受けた。９〜１１週にＤＥＸ（１ｍｇ／ｋｇ／日）を毎日１回投与した。ＤＥＸはＡＨＲを改善したが、ＭＣＡ−ＭＳＣは有意に顕著な効果を有し、ＤＥＸはＭＣＡ−ＭＳＣ単独を超える追加効果を有さなかった（図１０）。
【０１５２】
実施例６
この実施例において使用されたモデルは実施例５と同じであり、メスのＢａｌｂ／ｃマウスを使用して９週にアレルゲンで誘発された慢性気道疾患モデルは、このモデルにおいて反応性が最も高かった。
【０１５３】
７〜８週齢のメスのＢａｌｂ／ｃマウスの下記の群（ｎ〜８匹マウス／群）を比較し、その中でＭＣＡ−ＭＳＣを、９〜１１週に週に１回、鼻腔内（ＩＮ）、静脈内（ＩＶ）、又は気管内（ＥＴ）を介して投与した：
ｉ）生理食塩水で感作された／接種を受けたコントロール；
ｉｉ）ＯＶＡで感作された／接種を受けた（ＡＡＤ）；
ｉｉｉ）ＯＶＡで感作された／接種を受けた＋ＩＮ投与による１×１０６個のＭＣＡ−ＭＳＣ／マウス；
ｉｖ）ＯＶＡで感作された／接種を受けた＋ＩＶ投与による１×１０６個のＭＣＡ−ＭＳＣ／マウス；
ｖｉ）ＯＶＡで感作された／接種を受けた＋ＥＴ投与による１×１０６個のＭＣＡ−ＭＳＣ／マウス。
【０１５４】
２０％のＳＤを伴うこの設計は、ｎ＝８匹マウス／群で２５％の効果を検出する９０％の力を提供した。
【０１５５】
気道過敏性（肺機能の指標）が解析され、図１１中に報告されている。
【０１５６】
ＯＶＡ誘導性の慢性ＡＡＤを有するマウスは、気道収縮剤の用量の増加に反応して、それらの生理食塩水処置された対応物と比較して、ＡＨＲを有意に悪化させた。このＯＶＡ誘導性のＡＨＲは、ＭＣＡ−ＭＳＣのＩＮ又はＩＶ投与（継続中のＯＶＡ誘導性の損傷の存在下で９〜１１週に週１回の投与）により、７９〜８０％で有意に減少した。ＭＣＡ−ＭＳＣでＩＮ又はＩＶ処置されたマウスと生理食塩水で処置されたコント−ルの間で、ＡＨＲの有意差は無かった。
【０１５７】
ＭＣＡ−ＭＳＣのＥＴ投与はＡＨＲを６１％減少させ、それはなおＯＶＡ群単独から測定されたものよりも有意に低かったが、生理食塩水群から測定されたものよりも有意に高かった。
【０１５８】
ＩＮ対ＩＶ対ＥＴで処置された群の間のＡＨＲに有意さはなく、３つのＭＣＡ−ＭＳＣの送達様式は全て、慢性ＡＡＤ／喘息を処置する実現可能なアプローチを提供することを示している。
【０１５９】
解析されるべき追加のエンドポイントは：
ｉ）炎症スコア；
ｉｉ）杯細胞化生；
ｉｉｉ）上皮厚み；
ｉｖ）上皮損傷；
ｖ）上皮下コラーゲン厚み；
ｖｉ）総肺コラーゲン濃度；
ｖｉｉ）上皮ＴＧＦ−ベータ１（betal）染色；
ｖｉｉｉ）上皮下筋線維芽細胞密度；及び
ｉｘ）ゼラチナーゼ（ＭＭＰ−２及びＭＭＰ−９）発現／活性
を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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