(57)【要約】  本発明は、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連タンパク質（ＧＩＴＲ）を結合する抗体、およびそれを使用する方法を提供する。抗ＧＩＴＲ抗体は、がんおよび他の疾患を治療するために単独で、または他の治療剤と組み合わせて治療的に使用することができる。【図１】
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連タンパク質）に特異的に結合し、
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、もしくは１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに／または
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む、単離抗体。
【請求項２】
配列番号２４、２５、２６、３２、３３、３４、３５、３９、４０、４１、１１５、１１６、１１７、６３、６４、もしくは６５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２７、２８、４４、４５、６６、もしくは６７のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号２９、４６、もしくは６８に示したアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに／または配列番号２１、３０、３６、４２、１１３、もしくは３１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２２、３７、４３、１１４、もしくは６１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２３、３８、もしくは６２に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項３】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、もしくは１１２に示したアミノ酸配列を含むＶＨ、または、ＣＤＲ内にない残基中に１つもしくはいくつかの保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項４】
配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１１１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ、またはＣＤＲ内にないアミノ酸中に１つもしくはいくつかのアミノ酸置換を有するその変異体を含む、請求項３に記載の単離抗体。
【請求項５】
配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１１２に示したアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１１１に示したアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１に記載の単離抗体。
【請求項６】
ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連タンパク質）に特異的に結合し、
配列番号１６、１８、２０、１２１、および１２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに／または
配列番号１５、１７、１９、１２０、および１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む、単離抗体。
【請求項７】
配列番号５０、５１、５２、５６、もしくは５７のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５３、５４、５８、もしくは５９のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号５５、６０、もしくは１２４に示したアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに／または配列番号４７に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号４８に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号４９に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項６に記載の単離抗体。
【請求項８】
ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連タンパク質）に特異的に結合し、
配列番号７０と７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ；ならびに／または
配列番号６９と７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む、単離抗体。
【請求項９】
配列番号３２、７６、７７、８４、８５、または８６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号７８または７９のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号８０または８７に示したアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、および／または配列番号７３または８１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７４または８２に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号７５または８３に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、請求項７に記載の単離抗体。
【請求項１０】
定常領域を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１１】
ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Δａ、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、ＩｇＧ４Δｃ、ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４Δｂ  Ｓ２２８Ｐ、およびＩｇＧ４Δｃ  Ｓ２２８Ｐからなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１２】
ＧＩＴＲに特異的に結合し、請求項１に記載の抗体とＧＩＴＲへの結合を競合し、かつ／または請求項１から２および６から９のいずれか一項に記載の抗体によって認識されるＧＩＴＲ上のエピトープと同じ、もしくはそれと重複するエピトープに結合する単離抗体。
【請求項１３】
配列番号３９、４０、または４１のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号４４または４５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、配列番号２９に示したアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、配列番号４２に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号４３に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号３８に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む、単離抗ＧＩＴＲ抗体。
【請求項１４】
ＣＴ２６細胞において同系腫瘍モデルを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで測定すると、Ｔｒｅｇの枯渇を促進し、Ｔエフェクター細胞を活性化する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１５】
Ｔ細胞からの炎症性サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαの放出を増大させる、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１６】
抗腫瘍免疫応答を増強する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１７】
ヒトＧＩＴＲに結合する、請求項１から７および１３のいずれか一項に記載の単離抗体。
【請求項１８】
請求項１から２および６から９のいずれか一項に記載の抗体を産生する単離細胞株。
【請求項１９】
請求項１から２および６から９のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離核酸。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項２２】
請求項１から２および６から９のいずれか一項に記載の抗体を産生することができるハイブリドーマ。
【請求項２３】
抗ＧＩＴＲ抗体を産生させる方法であって、抗体が産生される条件下で、請求項１から２および５から９のいずれか一項に記載の抗体を組換え産生する細胞株を培養するステップと、抗体を回収するステップとを含む、方法。
【請求項２４】
抗ＧＩＴＲ抗体を産生させる方法であって、抗体が産生される条件下で、配列番号１１０または１０９に示したアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号３９に示したアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体をコードする核酸を含む細胞株を培養するステップと、抗体を回収するステップとを含む、方法。
【請求項２５】
抗体の重鎖および軽鎖が、別個のベクターでコードされる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
抗体の重鎖および軽鎖が、同じベクターでコードされる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１から２および５から９のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物。
【請求項２８】
請求項２７に記載の医薬組成物を含む、がんを治療するためのキット。
【請求項２９】
それを必要とする対象におけるがんを治療するための方法であって、対象に、有効量の請求項１から２および５のいずれか一項に記載の抗ＧＩＴＲ抗体を投与するステップを含み、その結果、がんに関連した１つまたは複数の症状が、対象において緩和される、方法。
【請求項３０】
がんが、Ｂ細胞関連がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肉腫、頭頸部がん、胸腺がん、上皮がん、唾液腺がん、肝がん、胆管がん、神経内分泌腫瘍、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、肺がん、中皮腫、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、膵がん、神経膠腫、腎がん、膀胱がん、子宮頚がん、子宮がん、外陰がん、陰茎がん、精巣がん、肛門がん、絨毛癌、結腸直腸がん、口腔がん、皮膚がん、メルケル細胞癌、神経膠芽腫、脳腫瘍、骨がん、眼がん、および黒色腫からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
がんが、再発しているかまたは難治性である、請求項２９から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
がんが、局所進行性もしくは転移性黒色腫、扁平上皮細胞頭頸部がん（ＳＣＨＮＣ）、卵巣がん、腎がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、または肺がんである、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
有効量の第２の治療剤を投与するステップをさらに含む、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
第２の治療剤が、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗４−１ＢＢ抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、ＩＬ−８抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、抗ＣＳＦ１抗体、抗ＭＡＲＣＯ抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ＴＮＦＲ１抗体、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ８抗体、抗ＣＤ２００Ｒ抗体、抗ＶＩＳＧ４抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＬＩＬＲｂ２抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＤ２０６抗体、抗ＣＤ１６３抗体、抗ＫＬＲＧ１抗体、抗ＦＬＴ３抗体、抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、および第２の抗ＧＩＴＲ抗体からなる群から選択される抗体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
第２の治療剤が、サイトカイン、ＴＮＦα、ＰＡＰ阻害剤、腫瘍溶解性ウイルス、キナーゼ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＧＬＳ１阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＡＲＴ細胞療法もしくはＴ細胞療法、ＴＬＲアゴニスト、または腫瘍ワクチンである、請求項３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連タンパク質（ＧＩＴＲ）に結合する抗体、例えば、全長抗体に関する。本発明はさらに、ＧＩＴＲに対する抗体を含む組成物、および医薬として抗ＧＩＴＲ抗体を使用する方法に関する。ある特定の実施形態は、がんなどの過剰増殖性疾患を含めた様々な疾患を治療、予防、および／または診断するために抗ＧＩＴＲ抗体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連タンパク質（ＧＩＴＲ）は、ＣＤ８＋、ＣＤ４＋、または調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含むＮＫ細胞およびＴ細胞の表面上で発現する。Ｔｒｅｇは、他のタイプのＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞よりも高いレベルでＧＩＴＲを発現する。ＧＩＴＲの発現は末梢血では低く、マイナー集団のＴｒｅｇ上で起こるが、Ｔｒｅｇ浸潤固形腫瘍は、大部分のＴｒｅｇでＧＩＴＲの発現を増大させている。
【０００３】
ＧＩＴＲを介するシグナル伝達は、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を増大させ、また、Ｔ細胞を活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）から保護し、これが次に、記憶Ｔ細胞の頻度を増大させる。例えば、Ｒｏｎｃｈｅｔｔｉら、Ｅｕｒｏ．Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．３４（３）：６１３〜２２（２００４）、およびＳｎｅｌｌら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ．２４４（１）：１９７〜２１７（２０１１）を参照。これまでの研究は、アゴニストである抗ＧＩＴＲモノクローナル抗体（ｍＡｂ）が、Ｍｅｔｈ  Ａ線維肉腫、ＣＴ２６結腸癌、およびＭＢ４９膀胱癌を含む複数のマウス同系腫瘍モデルにおいて抗腫瘍の有効性を有することを示している。例えば、Ｊｏｓｈｉら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４３：１〜１２（２０１５）、およびＲｏｎｃｈｅｔｔｉら、Ｊ．ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７９：５９１６〜５９１６（２００７）を参照。この有効性は、エフェクターＴ細胞の増強した応答性と一致することが示されている。例えば、Ｋｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０２（７）：８８５〜８９１（２００５）；Ｃｏｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、５９（９）：１３６７〜７７（２０１０）；およびＣｏｈｅｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６６（９）：４９０４〜１２（２００６）を参照。ＧＩＴＲアゴニストはまた、抗ＣＴＬＡ−４抗体および抗ＰＤ−１抗体との相乗的な抗腫瘍効果を示している。例えば、Ｍｉｔｓｕｉら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ：ａｎ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１６（１０）：２７８１〜９１（２０１０）；およびＬｕら、Ｊ．ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１２：３６（２０１４）を参照。従って、ＧＩＴＲシグナル伝達を調節する抗体ベース治療剤の開発は、がんの治療において大きな価値がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本明細書において開示される発明は、ＧＩＴＲに選択的に結合する抗体を目的としている。本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は、Ｔｒｅｇの枯渇およびＴエフェクター細胞の活性化という二重の特性を有することが実証されており、これらの特性によって、腫瘍におけるＴｒｅｇに対するＴエフェクターの比が増強し、患者において腫瘍が退縮する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一態様では、本発明は、ＧＩＴＲに特異的に結合し、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４または１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）のＶＨ相補性決定領域１（ＣＤＲ１）、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに／または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３または１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗体を提供する。
一部の実施形態では、抗体は、配列番号３９に示した配列を含む軽鎖および／または配列番号２９もしくは３８に示した配列を含む重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３６３２を有する発現ベクターによって産生されるＶＨ領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３６３３を有する発現ベクターによって産生されるＶＬ領域を含む。
【０００６】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号２４、２５、２６、３２、３３、３４、３５、３９、４０、４１、１１５、１１６、１１７、６３、６４、６５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２７、２８、４４、４５、６６、もしくは６７のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号２９、４６、もしくは６８に示したアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに／または配列番号２１、３０、３６、４２、１１３、もしくは３１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２２、３７、４３、１１４、もしくは６１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２３、３８、もしくは６２に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、もしくは１１２に示したアミノ酸配列を含むＶＨ、または、ＣＤＲ内にない残基中に１つもしくはいくつかの保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１１１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ、またはＣＤＲ内にないアミノ酸中に１つもしくはいくつかのアミノ酸置換を有するその変異体を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、または１１２に示したアミノ酸配列を含むＶＨ、および配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、または１１１に示したアミノ酸配列を含むＶＬを含む。
【０００７】
別の態様では、本発明は、ＧＩＴＲに特異的に結合し、配列番号１６、１８、２０、１２１、および１２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨのＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに／または配列番号１５、１７、１９、１２０、および１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬのＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗体を提供する。一部の実施形態では、抗体は、配列番号５０、５１、５２、５６、もしくは５７のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５３、５４、５８、もしくは５９のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号５５、６０、もしくは１２４に示したアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに／または配列番号４７に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号４８に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号４９に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０００８】
別の態様では、本発明は、ＧＩＴＲに特異的に結合し、配列番号７０および７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨのＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに／または配列番号６９および７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬのＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗体を提供する。一部の実施形態では、抗体は、配列番号３２、７６、７７、８４、８５、もしくは８６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号７８もしくは７９のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号８０もしくは８７に示したアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに／または配列番号７３もしくは８１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７４もしくは８２に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号７５もしくは８３に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体であり得る。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。
【００１０】
一部の実施形態では、抗体は、定常領域を含む。一部の実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ２Δａ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、ＩｇＧ４Δｃ、ＩｇＧ４  Ｓ２２８Ｐ、ＩｇＧ４Δｂ  Ｓ２２８Ｐ、およびＩｇＧ４Δｃ  Ｓ２２８Ｐサブクラスのものである。一部の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１アイソタイプのものである。
【００１１】
別の態様では、本発明は、ＧＩＴＲに特異的に結合し、かつＧＩＴＲと競合し、かつ／もしくはＧＩＴＲに結合する、または本明細書において記載される抗ＧＩＴＲ抗体によって認識されるＧＩＴＲエピトープとオーバーラップする、単離抗体を提供する。
【００１２】
一部の実施形態では、本明細書において提供される抗ＧＩＴＲ抗体は、Ｔｒｅｇの枯渇を促進し、Ｔエフェクター細胞を活性化する（例えば、ＣＴ２６細胞において同系腫瘍モデルを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで測定すると）。
【００１３】
一部の実施形態では、本明細書において提供される抗ＧＩＴＲ抗体は、エフェクターＴ細胞からの炎症性サイトカインＩＦＮγおよびＴＮＦαの放出を増大させる（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで測定すると）。
【００１４】
一部の実施形態では、本明細書において提供される抗ＧＩＴＲ抗体は、抗腫瘍免疫応答を増強する（例えば、腫瘍の成長を阻害する、ＮＫおよび他の自然細胞などの非Ｔ細胞に対する影響を増強する）。
【００１５】
一部の実施形態では、本明細書に提供する抗ＧＩＴＲ抗体は、ヒトＧＩＴＲに結合する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、治療有効量の本明細書に記載の抗ＧＩＴＲ抗体および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ＧＩＴＲ抗体をコードするヌクレオチド配列を含む単離ポリヌクレオチドを提供する。別の態様では、本発明は、ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００１８】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載の抗ＧＩＴＲ抗体を組換え産生する単離宿主細胞を提供する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、抗ＧＩＴＲ抗体を産生させる方法であって、抗体が産生される条件下で本明細書に記載の抗体を組換え産生する細胞株を培養するステップと、抗体を回収するステップとを含む、方法を提供する。
【００２０】
別の態様では、本発明は、抗ＧＩＴＲ抗体を産生させる方法であって、抗体が産生される条件下で、配列番号１１０に示したアミノ酸配列を含む重鎖および配列番号１０９に示したアミノ酸配列を含む軽鎖を含む抗体をコードする核酸を含む細胞株を培養するステップと、抗体を回収するステップとを含む、方法を提供する。
【００２１】
一部の実施形態では、重鎖および軽鎖は、別個のベクター上でコードされる。他の実施形態では、重鎖および軽鎖は、同じベクター上でコードされる。
【００２２】
別の態様では、本発明は、対象における状態を治療するための方法であって、それを必要とする対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、状態は、がんである。一部の実施形態では、がんは、Ｂ細胞関連がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肉腫、頭頸部がん、胸腺がん、上皮がん、唾液腺がん、肝がん、胆管がん、神経内分泌腫瘍、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、肺がん、中皮腫、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、膵がん、神経膠腫、腎がん、膀胱がん、子宮頚がん、子宮がん、外陰がん、陰茎がん、精巣がん、肛門がん、絨毛癌、結腸直腸がん、口腔がん、皮膚がん、メルケル細胞癌、神経膠芽腫、脳腫瘍、骨がん、眼がん、および黒色腫からなる群から選択される。
【００２３】
一部の実施形態では、Ｂ細胞関連がんは、多発性骨髄腫、悪性形質細胞新生物、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、カーレル病および骨髄腫症、形質細胞白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞性前リンパ性白血病、有毛細胞白血病、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞型リンパ性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（下肢型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、炎症を伴うびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病で生じる大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫とバーキットリンパ腫との間の中間的特徴を有する未分類のＢ細胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫と古典型ホジキンリンパ腫との間の中間的特徴を有する未分類のＢ細胞性リンパ腫、および他のＢ細胞関連リンパ腫からなる群から選択される。
【００２４】
一部の実施形態では、がんは、再発しているかまたは難治性である。
【００２５】
一部の実施形態では、がんは、局所進行性もしくは転移性黒色腫、扁平上皮細胞頭頸部がん（ＳＣＨＮＣ）、卵巣がん、腎がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、または肺がんである。
【００２６】
別の態様では、本発明は、腫瘍を有する対象における腫瘍増殖または進行を阻害する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、対象におけるがん細胞の転移を阻害または防止する方法であって、それを必要とする対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、ＧＩＴＲ発現腫瘍を有する対象における腫瘍退縮を誘導する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、方法を提供する。
【００２９】
一部の実施形態では、本明細書の抗体は、対象において非経口的に投与することができる。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００３０】
一部の実施形態では、方法は、有効量の第２の治療剤を投与するステップをさらに含む。一部の実施形態では、第２の治療剤は、生物治療剤、例えば、それだけに限らないが、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗４−１ＢＢ抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、ＩＬ−８抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、抗ＣＳＦ１抗体、抗ＭＡＲＣＯ抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ＴＮＦＲ１抗体、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ８抗体、抗ＣＤ２００Ｒ抗体、抗ＶＩＳＧ４抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＬＩＬＲｂ２抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＤ２０６抗体、抗ＣＤ１６３抗体、抗ＫＬＲＧ１抗体、抗ＦＬＴ３抗体、抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、または第２の抗ＧＩＴＲ抗体を含む抗体である。
【００３１】
一部の実施形態では、第２の治療剤は、ＴＮＦα、ＰＡＰ阻害剤、腫瘍溶解性ウイルス、キナーゼ阻害剤、ＡＬＫ阻害剤（例えば、スニチニブまたはクリゾチニブ）、ＭＥＫ阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＧＬＳ１阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、アキシチニブまたはパルボシクリブ）、ＣＡＲ（キメラ抗原受容体）−Ｔ細胞療法もしくはＴ細胞療法、ＴＬＲ（Ｔｏｌｌ様受容体）アゴニスト（例えば、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９）、または腫瘍ワクチンである。
【００３２】
それを必要とする対象におけるがんを治療し、または腫瘍増殖もしくは進行を阻害するための医薬の製造における本明細書に提供する抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかの使用も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−通常Ｔ（Ｔｃｏｎｖ）細胞、およびＣＤ８＋Ｔ（ＣＤ８）細胞を含むヒト末梢血Ｔ細胞におけるＧＩＴＲの発現を要約するグラフを示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、Ｔｒｅｇ、ＣＤ８細胞、およびＴｃｏｎｖ細胞上でのＧＩＴＲ陽性細胞への抗ＧＩＴＲ抗体（ｍ３Ｇ７）の結合の密度（ＭＦＩ）を要約するグラフを示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヒト末梢血単核球におけるＴｒｅｇ、Ｔｃｏｎｖ、およびＣＤ８細胞の頻度を要約するグラフを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−通常Ｔ（Ｔｃｏｎｖ）細胞、およびＣＤ８＋Ｔ（ＣＤ８）細胞を含む腎細胞癌関連Ｔ細胞によるＧＩＴＲおよびＯＸ４０の発現を要約するグラフを示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＲＣＣ関連Ｔ細胞サブセット上でのＧＩＴＲおよびＯＸ４０抗体の結合密度（ＭＦＩ）を要約するグラフを示す。
【図２Ｃ】図２Ｃは、腎細胞癌組織における免疫浸潤（ＣＤ４５＋）内でのＴｒｅｇ、Ｔｃｏｎｖ、およびＣＤ８細胞の頻度を要約するグラフを示す。
【図３Ａ】図３Ａは、活性化Ｔ細胞への抗ＧＩＴＲ抗体ｍ３Ｇ７およびｍ１０Ｈ２の結合を要約するグラフを示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、活性型Ｔｒｅｇへの抗ＧＩＴＲ抗体Ｒ５（ｈ３Ｇ７  Ｒ５）、Ｒ９（ｈ３Ｇ７  Ｎ９）、Ｒ１３（１０Ｈ２  Ｎ１３）、およびＲ１４（１０Ｈ２  Ｎ１４）の結合を要約するグラフを示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ＧＩＴＲ抗体が、未分画のＰＢＭＣによって媒介される抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて細胞傷害を媒介することを示す。ｈＩｇＧ１  ＧＩＴＲ抗体（ｍ３Ｇ７およびｍ１０Ｈ２）は、マクロファージがＧＩＴＲ＋Ｔ細胞の用量依存性の殺傷を媒介することを可能にした。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＧＩＴＲ抗体が、マクロファージによって媒介される抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて細胞傷害を媒介することを示す。描写されるｈＩｇＧ１  ＧＩＴＲ抗体は、ｈ３Ｇ７  Ｒ５（「Ｒ５」）、ｈ３Ｇ７  Ｒ９（「Ｒ９」）、ｈ１０Ｈ２  Ｒ１３（「Ｒ１３」）、およびｈ１０Ｈ２  Ｒ１４（「Ｒ１４」）である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＧＩＴＲ抗体が、マクロファージによって媒介される抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて細胞傷害を媒介することを示す。
【図５Ａ】図５Ａは、本発明のＧＩＴＲ抗体（ｈ３Ｇ７  Ｒ５（「Ｒ５」）、ｈ３Ｇ７  Ｒ９（「Ｒ９」）、ｈ１０Ｈ２  Ｒ１３（「Ｒ１３」）、およびｈ１０Ｈ２  Ｒ１４（「Ｒ１４」））が、プレートに結合している場合に用量依存性の様式でＧＩＴＲ＋３Ａ９細胞からのＴＮＦαの分泌を増強したことを要約するグラフを示す。
【図５Ｂ】図５Ｂはまた、可溶性抗ＧＩＴＲ抗体Ｒ５、Ｒ９、Ｒ１３、およびＲ１４が、Ｂ細胞性リンパ腫系（ＬＫ３５．２）と共に共培養したＧＩＴＲ＋３Ａ９細胞の間で、ＴＮＦαの分泌を増強したことを要約するグラフを示す。
【図５Ｃ】図５Ｃは、プレートに結合した抗ＧＩＴＲ抗体Ｒ５、Ｒ９、Ｒ１３、およびＲ１４が、抗ＣＤ３抗体で活性化されたヒト血中ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞から分泌されるＩＦＮγを用量依存的に増大させたことを示す。
【図５Ｄ】図５Ｄは、プレートに結合した抗ＧＩＴＲ抗体であるＲ５、Ｒ９、Ｒ１３、およびＲ１４が、抗ＣＤ３抗体で活性化されたヒト血中ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞から分泌されたＴＮＦαの用量依存性の増大を生じさせたことを示す。
【図６Ａ】図６Ａは、抗ＧＩＴＲ抗体ｍ１０Ｈ２での、ヒトＧＩＴＲを発現しないＴ細胞系の染色の相関密度を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、抗ＧＩＴＲ抗体ｍ１０Ｈ２での、ヒトＧＩＴＲを低く発現するＴ細胞系の染色の相関密度を示す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、抗ＧＩＴＲ抗体ｍ１０Ｈ２での、ヒトＧＩＴＲを高く発現するＴ細胞系の染色の相関密度を示す。
【図６Ｄ】図６Ｄは、図６Ａにおいて記載されているＧＩＴＲを発現しない、低く発現する、および高く発現する細胞系の、抗ＧＩＴＲ  ｍ１０Ｈ２抗体でのフローサイトメトリー染色を示す。
【図６Ｅ】図６Ｅは、ヒトＧＩＴＲを発現しない、低く発現する、および高く発現するＴ細胞系の、定量ＰＣＲおよびアクチンＢ発現に対する正規化を示す。
【図６Ｆ】図６Ｆは、ｍ１０Ｈ２での、ＮＳＣＬＣ腫瘍から単離されたＦＦＰＥ（ホルマリン固定パラフィン包埋）組織の染色を示す。
【図６Ｇ】図６Ｇは、アイソタイプ対照マウス抗体での、ＮＳＣＬＣ腫瘍から単離されたＦＦＰＥ組織の染色を示す。
【図７Ａ】図７Ａは、５ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）のｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照で治療した個々のマウスの腫瘍成長を示す。
【図７Ｂ】図７Ｂは、０．２ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）の抗ＧＩＴＲ  ２１Ｂ６マウス（ｍ）Ｆｃ  ＩｇＧ２ａで治療した個々のマウスの腫瘍成長を示す。
【図７Ｃ】図７Ｃは、１ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）の抗ＧＩＴＲ  ２１Ｂ６マウス（ｍ）Ｆｃ  ＩｇＧ２ａで治療した個々のマウスの腫瘍成長を示す。
【図７Ｄ】図７Ｄは、５ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）の抗ＧＩＴＲ  ２１Ｂ６マウス（ｍ）Ｆｃ  ＩｇＧ２ａで治療した個々のマウスの腫瘍成長を示す。
【図７Ｅ】図７Ｅは、５ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）のｍＩｇＧ２１アイソタイプ対照で治療した個々のマウスの腫瘍成長を示す。
【図７Ｆ】図７Ｆは、０．２ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）の抗ＧＩＴＲ  ２１Ｂ６マウス（ｍ）Ｆｃ  ＩｇＧ１で治療した個々のマウスの腫瘍成長を示す。
【図７Ｇ】図７Ｇは、１ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）の抗ＧＩＴＲ  ２１Ｂ６マウス（ｍ）Ｆｃ  ＩｇＧ１で治療した個々のマウスの腫瘍成長を示す。
【図７Ｈ】図７Ｈは、５ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）の抗ＧＩＴＲ  ２１Ｂ６マウス（ｍ）Ｆｃ  ＩｇＧ１で治療した個々のマウスの腫瘍成長を示す。
【図７Ｉ】図７Ｉは、ＩｇＧ１治療が、アイソタイプ対照で治療したマウスと比較して、腫瘍を有するマウスの生存を改善せず、その一方で、ＩｇＧ２ａ治療が、０．２ｍｐｋ、１ｍｐｋ、および５ｍｐｋでそれぞれ４０％、４４．４％、および８０％の生存をもたらしたことを示す。
【図７Ｊ】図７Ｊは、２１Ｂ６  ｍＩｇＧ２ａによって媒介される腫瘍成長の阻害が、１ｍｇ／ｋｇ用量で、ＣＤ８＋Ｔ細胞：Ｔｒｅｇの比の増大と相関したことを示す。
【図７Ｋ】図７Ｋは、２１Ｂ６  ｍＩｇＧ２ａによって媒介される腫瘍成長の阻害が、全ての用量で、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞：Ｔｒｅｇの比の増大と相関したことを示す。
【図７Ｌ】図７Ｌは、２１Ｂ６  ｍＩｇＧ２ａで治療したマウスが、腫瘍浸潤Ｔｒｅｇ数の有意ではない低減を有していたことを示す。
【図７Ｍ】図７Ｍは、ＣＤ８＋Ｔ細胞では影響がなかったことを示す。
【図７Ｎ】図７Ｎは、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆでは影響がなかったことを示す。
【図７Ｏ】図７Ｏは、全用量の２１Ｂ６  ｍＩｇＧ２ａが、腫瘍に浸潤するＣＤ４５＋免疫細胞内でＴｒｅｇの割合を低減させたこと、および、免疫浸潤におけるＴｒｅｇの割合が、２１Ｂ６  ｍＩｇＧ１治療による影響を受けなかったことを示す。
【図７Ｐ】図７Ｐは、腫瘍浸潤におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の変化が有意ではなかったことを示す。
【図７Ｑ】図７Ｑは、腫瘍浸潤におけるＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞の割合の変化が有意ではなかったことを示す。
【図７Ｒ】図７Ｒは、２１Ｂ６  ｍＩｇＧ２ａで治療したマウスが、０．２ｍｇ／ｋｇ用量で治療した場合に、脾臓におけるＴｒｅｇの割合の最も大きな低減を有していたこと、および、他の用量での変化が有意でなかったことを示す。
【図７Ｓ】図７Ｓは、脾臓ＣＤ８＋Ｔ細胞がいかなる用量でも影響を受けなったことを示す。
【図７Ｔ】図７Ｔは、２１Ｂ６  ｍＩｇＧ２ａで治療したマウスが、０．２ｍｇ／ｋｇ用量で治療した場合に、脾臓におけるＣＤ４＋Ｔｅｆｆの割合の最も大きな低減を有していたこと、および、他の用量での変化が有意でなかったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
ＧＩＴＲに結合する抗体が本明細書に開示される。抗ＧＩＴＲ抗体を作製する方法、これらの抗体を含む組成物、および医薬としてこれらの抗体を使用する方法が提供される。抗ＧＩＴＲ抗体は、腫瘍進行を阻害するのに使用することができ、がんおよび／または他の疾患の予防および／または治療において使用することができる。本発明の抗ＧＩＴＲ抗体が、抗腫瘍免疫を高める少なくとも２つのメカニズムを有し、これが次に腫瘍の退縮をもたらすことが実証されている。第１のメカニズムは、腫瘍に浸潤するＴｒｅｇを枯渇させることを目的としており、これが、特に増強したＴエフェクター細胞の活性化における、局所免疫の活性化をもたらす。第２のメカニズムは、Ｔエフェクター細胞のエフェクター機能の直接的な増強、および、ＧＩＴＲアゴニストとしてのＣＤ８＋細胞の生存である。Ｔｒｅｇの枯渇およびＴエフェクター細胞の活性化の組み合わせ効果は、冷たい腫瘍におけるＴｒｅｇに対するＴエフェクターの比を増強し、特に既存の適応抗腫瘍応答を有する患者において、腫瘍の退縮を誘発し得る。
【００３５】
一般的な技法
本発明の実施では、別段の指定のない限り、分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の慣例的な技法を使用し、これらは、当技術分野の技術内である。このような技法は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３〜１９９８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．  ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ、１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００）；Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９）；Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５）などで完全に説明されている。
【００３６】
定義
以下の用語は、別段に示されていない限り、以下の意味を有すると理解されるものとする。その起源または派生の源によって、（１）その天然の状態でそれに付随する天然に付随するコンポーネントと付随していない、（２）同じ源、例えば、種、それが発現される細胞、ライブラリーなどに由来する他の分子を実質的に含まない、（３）異なる種に由来する細胞によって発現される、または（４）自然において存在しない分子（分子が、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、または抗体である場合）を指すものとしての用語「単離分子」。したがって、化学合成される、またはそれが天然に端を発する系と異なる細胞系内で発現される分子は、その天然に付随するコンポーネントから「単離されている」ことになる。分子は、当技術分野で周知の精製技法を使用して、単離によって天然に付随するコンポーネントを実質的に含まないようにすることもできる。分子の純度または均質性は、当技術分野で周知のいくつかの手段によってアッセイすることができる。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、および当技術分野で周知の技法を使用するポリペプチドを可視化するためのゲルの染色を使用してアッセイすることができる。ある特定の目的に関して、より高い分解能を、ＨＰＬＣ、または精製のための当技術分野で周知の他の手段によってもたらすことができる。
【００３７】
「抗体」は、免疫グロブリン分子であって、免疫グロブリン分子の可変領域内に位置した少なくとも１つの抗原認識部位によって標的、例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどに特異的に結合することができる、免疫グロブリン分子である。本明細書では、この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、別段の指定のない限り、特異的結合についてインタクト抗体と競合するその任意の抗原結合部分、抗原結合部分を含む融合タンパク質、および抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成も包含する。抗原結合部分としては、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ、例えば、サメおよびラクダ抗体）、相補性決定領域（ＣＤＲ）、単鎖可変断片抗体（ｓｃＦｖ）、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ、およびビス−ｓｃＦｖを含めた断片、ならびにポリペプチドへの特異的抗原結合を付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドがある。抗体としては、任意のクラスの抗体、例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、もしくはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などがあり、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常領域の抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは、異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンの５つの主要クラス、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分類することができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および３次元構成は、周知である。
【００３８】
抗体の「可変領域」は、単独で、または組合せで抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。当技術分野で公知であるように、重鎖および軽鎖の可変領域は、それぞれ、３つの超可変領域としても公知の相補性決定領域（ＣＤＲ）によって接続された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなり、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。特に、ＣＤＲ領域の外側（すなわち、フレームワーク領域内）のアミノ酸残基において置換を有する、対象可変領域のバリアントが望まれる場合、適切なアミノ酸置換、好ましくは保存的アミノ酸置換は、対象可変領域を対象可変領域と同じカノニカルクラスにおいてＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列を含有する他の抗体の可変領域と比較することによって同定することができる（ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６（４）：９０１〜９１７、１９８７）。
【００３９】
ある特定の実施形態では、ＣＤＲ、および抗体の結合部位を含む残基の同定の最終的な描写は、抗体の構造を解明し、かつ／または抗体−リガンド複合体の構造を解明することによって達成される。ある特定の実施形態では、それは、Ｘ線結晶構造解析法などの当業者に公知の様々な技法のいずれかによって達成され得る。ある特定の実施形態では、分析の様々な方法を、ＣＤＲ領域を同定または近似するのに使用することができる。このような方法の例としては、それだけに限らないが、Ｋａｂａｔ定義、Ｃｈｏｔｈｉａ定義、ＡｂＭ定義、接触定義、およびコンホメーション定義がある。
【００４０】
Ｋａｂａｔ定義は、抗体における残基を番号付けるための標準であり、典型的にはＣＤＲ領域を同定するのに使用される。例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｗｕ、２０００、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２８：２１４〜８を参照。Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、Ｋａｂａｔ定義と同様であるが、Ｃｈｏｔｈｉａ定義は、ある特定の構造ループ領域の位置を考慮に入れる。例えば、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９０１〜１７；Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７〜８３を参照。ＡｂＭ定義は、抗体構造をモデル化するＯｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐによって作製された統合された一式のコンピュータープログラムを使用する。例えば、Ｍａｒｔｉｎら、１９８９、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）、８６：９２６８〜９２７２；「ＡｂＭ（商標），Ａ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｒｅｇｉｏｎｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫ；Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，Ｌｔｄ．を参照。ＡｂＭ定義は、ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌ．、３：１９４〜１９８におけるＳａｍｕｄｒａｌａら、１９９９、「Ａｂ  Ｉｎｉｔｉｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ」によって記載されたものなどの知識データベースおよびアブイニシオ法の組合せを使用して一次配列から抗体の三次構造をモデル化する。接触定義は、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づく。例えば、ＭａｃＣａｌｌｕｍら、１９９６、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、５：７３２〜４５を参照。ＣＤＲの「コンホメーション定義」と本明細書で呼ばれる別の手法では、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的寄与をする残基として同定することができる。例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照。さらに他のＣＤＲ境界定義は、上記手法の１つに厳密には従わないが、それにもかかわらず、これらは、特定の残基または残基の群が抗原結合に有意にインパクトを与えないという予測または実験的知見を踏まえると短くまたは長くされ得るが、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲの少なくとも一部と重なることになる。本明細書において、ＣＤＲは、手法の組合せを含めて、当技術分野で公知の任意の手法によって定義されるＣＤＲを指すことができる。本明細書で使用される方法は、これらの手法のいずれかに従って定義されるＣＤＲを利用することができる。１つを超えるＣＤＲを含有する任意の所与の実施形態について、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、接触、および／またはコンホメーション定義のいずれかに従って定義され得る。
【００４１】
当技術分野で公知であるように、抗体の「定常領域」は、単独で、または組合せで、抗体軽鎖の定常領域または抗体重鎖の定常領域を指す。
【００４２】
本明細書において、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、軽微な量で存在し得る可能な天然に存在する突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一抗原部位に向けられている。さらに、異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を一般に含むポリクローナル抗体配合物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一決定基に向けられている。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきでない。例えば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製することができ、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載されたものなどの組換えＤＮＡ法によって作製することができる。モノクローナル抗体は、例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５４に記載の技法を使用して生成されるファージライブラリーから単離することもできる。本明細書において、「ヒト化」抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはこれらの断片（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、もしくは抗体の他の抗原結合部分配列など）である、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を指す。好ましくは、ヒト化抗体は、ＣＤＲに由来する残基が、所望の特異性、親和性、および能力を有する、非ヒト種（ドナー抗体）、例えば、マウス、ラット、またはウサギなどのＣＤＲに由来する残基と置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されるＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見つからないが、抗体性能をさらに洗練および最適化するために含められる残基を含むことができる。
【００４３】
「ヒト抗体」は、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応し、かつ／または本明細書に開示のヒト抗体を作製するための技法のいずれかを使用して作製されたアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に除外する。
【００４４】
用語「キメラ抗体」は、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体、例えば、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体などを指す。
【００４５】
用語「エピトープ」は、抗体の抗原結合領域の１つまたは複数において抗体によって認識および結合され得る分子の部分を指す。エピトープは、アミノ酸または糖側鎖などの分子の表面基群（ｓｕｒｆａｃｅ  ｇｒｏｕｐｉｎｇ）からなることが多く、特定の３次元構造特性および特定の帯電特性を有する。一部の実施形態では、エピトープは、タンパク質エピトープであり得る。タンパク質エピトープは、線状または立体構造的であり得る。線状エピトープでは、タンパク質と相互作用分子（抗体など）との間の相互作用のポイントのすべては、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って直線的に存在する。「非線状エピトープ」または「立体構造エピトープ」は、エピトープに特異的な抗体が結合する抗原タンパク質内に非連続ポリペプチド（またはアミノ酸）を含む。用語「抗原エピトープ」は、本明細書において、当技術分野で周知の任意の方法によって、例えば、慣例的なイムノアッセイによって判定される場合、抗体が特異的に結合することができる抗原の部分として定義される。抗原上の所望のエピトープが決定された後、例えば、本明細書に記載の技法を使用してそのエピトープに対する抗体を生成することが可能である。代わりに、発見プロセス中に、抗体の生成および特徴付けにより、望ましいエピトープについての情報を解明することができる。この情報から、次いで同じエピトープへの結合について、抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを実現するための手法は、競合および交差競合試験を行って、ＧＩＴＲへの結合を互いに競合または交差競合する抗体、例えば、抗原への結合を競合する抗体を見つけることである。
【００４６】
本明細書において、用語「ＧＩＴＲ」は、任意の形態のＧＩＴＲ、およびＧＩＴＲの活性の少なくとも一部を保持するそのバリアントを指す。ヒトＧＩＴＲへの具体的な言及などによって異なって示されていない限り、ＧＩＴＲは、すべての哺乳動物種の天然配列ＧＩＴＲ、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシを含む。１つの例示的なヒトＧＩＴＲは、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｙ５Ｕ５（配列番号１０８）として見出される。
【００４７】
用語「アゴニスト」は、別の分子の生物活性または効果を促進する（すなわち、誘導し、引き起こし、増強し、または増大させる）物質を指す。用語アゴニストは、抗体などの受容体に結合する物質、および受容体に結合することなく（例えば、付随タンパク質を活性化することによって）受容体機能を促進する物質を包含する。
【００４８】
用語「アンタゴニスト抗体」は、標的に結合し、その標的の生物学的効果を防止または低減する抗体を指す。一部の実施形態では、この用語は、抗体であって、それが結合している標的が生物学的機能を実施するのを防止する抗体を表すことができる。
【００４９】
用語「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、任意の長さのアミノ酸の鎖を指すのに本明細書で互換的に使用される。鎖は、直鎖状であっても分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含むことができ、かつ／または非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語は、天然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識コンポーネントとのコンジュゲーションなどの任意の他の操作もしくは修飾によって修飾されたアミノ酸鎖も包含する。例えば、アミノ酸の１つまたは複数の類似体（例えば、非天然アミノ酸などを含む）、および当技術分野で公知の他の修飾を含有するポリペプチドもこの定義の中に含まれる。ポリペプチドは、単鎖または会合鎖として存在し得ることが理解される。
【００５０】
当技術分野で公知であるように、本明細書で互換的に使用する「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドの鎖を指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはこれらの類似体、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによって鎖中に組み込まれ得る任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド、およびこれらの類似体などを含むことができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、鎖をアセンブリーする前または後に付与することができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチドコンポーネントによって中断される場合がある。ポリヌクレオチドは、標識コンポーネントとのコンジュゲーションなどによって、重合後にさらに修飾することができる。他のタイプの修飾としては、例えば、「キャップ」、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つまたは複数の類似体との置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電連結（例えば、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏａｍｉｄａｔｅ）、カルバメートなど）を有するもの、および荷電した連結（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）を有するもの、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リシンなど）などを含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、キレーター（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含有するもの、アルキル化剤を含有するもの、修飾連結を有するもの（例えば、αアノマー核酸など）など、ならびにポリヌクレオチド（複数可）の無修飾形態がある。さらに、糖内に通常存在するヒドロキシル基のいずれも、例えば、ホスホネート基、リン酸基によって置き換え、標準的な保護基によって保護し、または活性化して追加のヌクレオチドへの追加の連結を準備することができ、または固体支持体にコンジュゲートすることができる。５’および３’末端ＯＨを、リン酸化し、またはアミンもしくは１〜２０炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルも、誘導体化して標準的な保護基にすることができる。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−、または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−またはβ−アノマー糖、エピマー糖、例えば、アラビノース、キシロース、またはリキソースなど、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、およびメチルリボシドなどの脱塩基ヌクレオシド類似体を含めた、当技術分野で一般に公知であるリボースまたはデオキシリボース糖の類似形態も含有し得る。１つまたは複数のホスホジエステル連結を、代替の連結基によって置き換えることができる。これらの代替の連結基としては、それだけに限らないが、ホスフェートが、Ｐ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）（式中、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈ、またはエーテル（−Ｏ−）連結、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、もしくはアラルジル（ａｒａｌｄｙｌ）を含有してもよい置換もしくは非置換のアルキルである（１〜２０Ｃ））によって置き換えられている実施形態がある。ポリヌクレオチド中のすべての連結が同一である必要はない。前述の説明は、ＲＮＡおよびＤＮＡを含めた、本明細書で参照されるすべてのポリヌクレオチドに当てはまる。
【００５１】
エピトープに「優先的に結合する」または「特異的に結合する」（本明細書で互換的に使用される）抗体は、当技術分野でよく理解されている用語であり、このような特異的または優先的結合を判定する方法も当技術分野で周知である。分子は、それが特定の細胞または物質と、それが代替の細胞または物質と反応または会合するより、頻繁に、急速に、長い継続時間で、かつ／または大きい親和性で反応または会合する場合、「特異的結合」または「優先的結合」を呈すると言われる。抗体は、それが他の物質に結合するより、大きい親和性、結合活性で、容易に、かつ／または長い継続時間で結合する場合、標的に「特異的に結合し」、または「優先的に結合する」。例えば、ＧＩＴＲエピトープに特異的または優先的に結合する抗体は、抗体であって、それが他のＧＩＴＲエピトープまたは非ＧＩＴＲエピトープに結合するより、大きい親和性、結合活性で、容易にかつ／または長い継続時間でこのエピトープに結合する、抗体である。例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的に特異的または優先的に結合することができ、または結合しない場合があることも、この定義を読むことによって理解される。したがって、「特異的結合」または「優先的結合」は、排他的結合を必ずしも要求しない（しかし、これは排他的結合を含み得る）。一般に、しかし必ずしもではないが、結合への言及は、優先的結合を意味する。
【００５２】
本明細書において、「実質的に純粋」は、少なくとも５０％純粋（すなわち、混入物を含まない）、より好ましくは、少なくとも９０％純粋、より好ましくは、少なくとも９５％純粋、なおより好ましくは、少なくとも９８％純粋、最も好ましくは、少なくとも９９％純粋である材料を指す。
【００５３】
「宿主細胞」には、ポリヌクレオチドインサートの組込みのためのベクター（複数可）のレシピエントであり得る、またはそれであった個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一宿主細胞の子孫が含まれ、子孫は、天然の、偶発的な、または意図的な突然変異に起因して、必ずしも元の親細胞と完全に同一（形態において、またはゲノムＤＮＡ補体において）でない場合がある。宿主細胞には、本発明のポリヌクレオチド（複数可）をｉｎ  ｖｉｖｏでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
【００５４】
当技術分野で公知であるように、用語「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するのに使用される。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域であっても、バリアントＦｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は、様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０からそのカルボキシル末端まで伸びるように定義される。Ｆｃ領域中の残基の番号付けは、ＫａｂａｔのＥＵインデックスのものである。Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．、１９９１。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。当技術分野で公知であるように、Ｆｃ領域は、二量体または単量体形態で存在し得る。
【００５５】
当技術分野で使用される場合、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記述する。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）に結合するものであり、好適なＲｃＲとして、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が挙げられ、これらの受容体の対立遺伝子バリアントおよび選択的にスプライスされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）があり、これらは、その細胞質ドメインにおいて主に異なる同様のアミノ酸配列を有する。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、９：４５７〜９２；Ｃａｐｅｌら、１９９４、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４：２５〜３４；ならびにｄｅ  Ｈａａｓら、１９９５、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、１２６：３３０〜４１に総説されている。「ＦｃＲ」には、新生仔受容体、ＦｃＲｎも含まれ、これは、母体ＩｇＧの胎仔への移動を担う（Ｇｕｙｅｒら、１９７６、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１１７：５８７；およびＫｉｍら、１９９４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：２４９）。
【００５６】
用語「競合する」は、抗体に関して本明細書で使用する場合、第１の抗体またはその抗原結合部分が、第２の抗体またはその抗原結合部分の結合と十分に同様の様式でエピトープに結合し、その結果、第１の抗体のその同族エピトープとの結合の結果が、第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下で検出可能な程度に減少することを意味する。第２の抗体のそのエピトープへの結合も第１の抗体の存在下で検出可能な程度に減少する残された選択も、当てはまり得るが、そうである必要はない。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体のそのエピトープへの結合を、その第２の抗体が第１の抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、阻害することができる。しかし、それぞれの抗体が、他の抗体のその同族エピトープまたはリガンドとの結合を、同じ程度であっても、より大きい程度であっても、またはより小さい程度であっても、検出可能な程度に阻害する場合、抗体は、これらのそれぞれのエピトープ（複数可）の結合を互いに「交差競合する」と言われる。競合および交差競合する抗体はともに、本発明によって包含されている。このような競合または交差競合が起こる機構（例えば、立体障害、コンホメーション変化、または共通エピトープもしくはその部分への結合）にかかわらず、当業者は、本明細書に提供する教示に基づいて、このような競合および／または交差競合する抗体が包含され、本明細書に開示の方法に有用であり得ることを理解するはずである。
【００５７】
「機能性Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を有する。例示的な「エフェクター機能」としては、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御などがある。このようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と結合されることを必要とし、このような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して評価することができる。
【００５８】
「天然配列Ｆｃ領域」は、自然において見つかるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾によって天然配列Ｆｃ領域のものと異なるが、それでも天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つのエフェクター機能を保持するアミノ酸配列を含む。好ましくは、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して少なくとも１個のアミノ酸置換、例えば、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域内に約１〜約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書のバリアントＦｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくは、これらと少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは、これらと少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の配列同一性を有することになる。
【００５９】
本明細書において、「治療」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るための手法である。本発明の目的に関して、有益なまたは所望の臨床結果としては、それだけに限らないが、以下のうちの１つまたは複数がある：新生物もしくはがん性細胞の増殖の低減（またはその破壊）、新生物細胞の転移の阻害、腫瘍のサイズの縮小もしくは減少、がんの寛解、がんから生じる症状の減少、がんに罹患している者の生活の質の増大、がんを治療するのに要求される他の薬物療法の用量の減少、がんの進行の遅延、がんの治癒、および／またはがんを有する患者の生存期間の延長。
【００６０】
「緩和」は、抗ＧＩＴＲアンタゴニスト抗体を投与しないことと比較して、１つまたは複数の症状の軽減または改善を意味する。「緩和」は、症状の継続時間の短縮または低減も含む。
【００６１】
本明細書において、薬剤、化合物、または医薬組成物の「有効投与量」または「有効量」は、任意の１つまたは複数の有益なまたは所望の結果をもたらすのに十分な量である。より具体的な態様では、有効量は、疾患の症状を予防し、和らげ、もしくは緩和し、かつ／または治療されている対象の生存期間を延長する。予防的使用に関して、有益なまたは所望の結果としては、疾患、疾患の発達中に呈する、その合併症、および中間の病理学的表現型の生化学的、組織学的、および／または行動的症状を含めた、疾患のリスクの排除もしくは低減、重症度の軽減、または発症の遅延がある。治療的使用では、有益なまたは所望の結果としては、例えば限定することなく、Ｂ細胞関連がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肉腫、頭頸部がん、胸腺がん、上皮がん、唾液腺がん、肝がん、胆管がん、神経内分泌腫瘍、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、肺がん、中皮腫、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、膵がん、神経膠腫、腎がん（例えば、腎細胞癌）、膀胱がん、子宮頚がん、子宮がん、外陰がん、陰茎がん、精巣がん、肛門がん、絨毛癌、結腸直腸がん、口腔がん、皮膚がん、メルケル細胞癌、神経膠芽腫、脳腫瘍、骨がん、眼がん、および黒色腫を含む例えばがんなどの疾患の１つもしくは複数の症状の低減、疾患を治療するために必要な他の薬物療法の用量の減少、別の薬物療法の効果の増強、ならびに／または患者におけるがんの進行の遅延などの臨床結果がある。有効投与量は、１回または複数の投与で投与することができる。本発明の目的に関して、薬剤、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、直接的にまたは間接的に予防的または治療的処置を達成するのに十分な量である。臨床状況において理解されているように、薬剤、化合物、または医薬組成物の有効投与量は、別の薬剤、化合物、または医薬組成物と併せて実現することができ、または実現されなくてもよい。したがって、「有効投与量」は、１種または複数の治療剤の投与という状況で考慮することができ、単剤は、１種または複数の他の作用物質と併せて、望ましい結果が実現され得る、または実現されている場合、有効量で与えられていると見なすことができる。
【００６２】
「個体」または「対象」は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、それだけに限らないが、家畜（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリなど）、競技動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、およびラットも含まれる。
【００６３】
本明細書において、「ベクター」は、宿主細胞内の対象とする１種または複数の遺伝子（複数可）または配列（複数可）を送達し、好ましくは発現させることができるコンストラクトを意味する。ベクターの例としては、それだけに限らないが、ウイルスベクター、裸のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン性縮合剤に付随したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中に被包されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、および産生細胞などのある特定の真核細胞がある。
【００６４】
本明細書において、「発現制御配列」は、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的もしくは誘導プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーであり得る。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結されている。
【００６５】
本明細書において、「薬学的に許容できる担体」または「薬学的に許容できる賦形剤」として、活性成分と合わせたとき、成分に生物活性を保持させ、対象の免疫系と非反応性である任意の材料が挙げられる。例としては、それだけに限らないが、標準的な薬学的担体、例えば、リン酸緩衝溶液、水、油／水エマルジョンなどのエマルジョン、および様々なタイプの湿潤剤などのいずれかがある。エアロゾルまたは非経口投与用の好適な希釈剤は、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）または通常の（０．９％）生理食塩水である。このような担体を含む組成物は、周知の従来法によって製剤化される（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００を参照）。
【００６６】
用語「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因する生物学的活性を指す。抗体のエフェクター機能の例としては、それだけに限らないが、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、Ｆｃ受容体の結合、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、食作用、Ｃ１ｑの結合、および細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方調節がある。例えば、米国特許第６，７３７，０５６号を参照。このようなエフェクター機能は一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と結合されることを必要とし、このような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野で公知の様々なアッセイを使用して評価することができる。エフェクター機能の典型的な測定は、Ｆｃγ３および／またはＣ１ｑの結合を介する。
【００６７】
本明細書において使用する場合、「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合抗体を認識し、次いで標的細胞の溶解を生じさせる、細胞媒介性の反応を指す。目的の分子のＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号において記載されているものなどの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＤＣＣアッセイを使用して評価することができる。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびＮＫ細胞がある。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えば、Ｃｌｙｎｅｓら、１９９８、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、９５：６５２〜６５６において開示されているものなどの動物モデルにおいて、評価することができる。
【００６８】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的の溶解を指す。補体活性化経路は、同族抗原と複合体化した分子（例えば抗体）に対する補体系（Ｃ１ｑ）の第１のコンポーネントの結合によって開始される。補体活性化を評価するために、例えばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．、２０２：１６３（１９９６）において記載されているように、ＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００６９】
用語「ｋｏｎ」または「ｋａ」は、本明細書において、抗原への抗体の会合の速度定数を指す。具体的には、速度定数（ｋｏｎまたはｋａおよびｋｏｆｆまたはｋｄ）ならびに平衡解離定数は、全長抗体（すなわち二価抗体）および単量体ＧＩＴＲタンパク質を使用して測定される。
【００７０】
用語「ｋｏｆｆ」または「ｋｄ」は、本明細書において、抗体／抗原複合体からの抗体の解離の速度定数を指す。
【００７１】
用語「ＫＤ」は、本明細書において、抗原−抗体相互作用の平衡解離定数を指す。
【００７２】
本明細書で「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象としている実施形態を含む（かつ記述する）。例えば、「約Ｘ」に言及する記述は、「Ｘ」の記述を含む。数値範囲は、その範囲を画定する数値を含む。一般的に言うと、用語「約」は、示された変数値および示された値の実験誤差以内（例えば、平均の９５％信頼区間以内）または示された値の１０パーセント以内にある全ての変数値のどちらか大きい方を指す。用語「約」が時間間隔（年、カ月、週間、日など）の文脈内で使用される場合、用語「約」は、その時間間隔プラスまたはマイナス次の下位の時間間隔１つ分（例えば、約１年は１１〜１３カ月を意味し、６カ月は６カ月プラスまたはマイナス１週間を意味し、約１週間は６〜８日を意味するなど）または示された値の１０パーセント以内のいずれか大きい方を意味する。
【００７３】
用語「免疫効果細胞エンハンサー」または「ＩＥＣエンハンサー」は、哺乳動物の免疫エフェクター細胞の１つまたは複数のタイプの数、品質、または機能を増大させ、または増強することができる物質を指す。免疫エフェクター細胞の例としては、細胞溶解性ＣＤ８  Ｔ細胞、ＣＤ４  Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞がある。
【００７４】
用語「免疫モジュレーター」は、免疫応答（本明細書で定義される）、または宿主哺乳動物の自然、体液性、もしくは細胞免疫系の任意のコンポーネントの働きを変更する（例えば、阻害し、減少させ、増大させ、増強し、または刺激する）ことができる物質を指す。したがって、用語「免疫モジュレーター」は、本明細書で定義される「免疫効果細胞エンハンサー」および本明細書で定義される「免疫抑制細胞阻害剤」、ならびに哺乳動物の免疫系の他のコンポーネントに影響する物質を包含する。
【００７５】
用語「免疫応答」は、宿主哺乳動物の免疫系による特定の物質（抗原または免疫原など）に対する任意の検出可能な応答、例えば、自然免疫応答（例えば、トール受容体シグナル伝達カスケードの活性化）、細胞媒介免疫応答（例えば、抗原特異的Ｔ細胞などのＴ細胞、および免疫系の非特異的細胞によって媒介される応答）、ならびに体液性免疫応答（例えば、Ｂ細胞によって媒介される応答、例えば、血漿、リンパ、および／または組織流体中への抗体の生成および分泌など）などを指す。
【００７６】
用語「免疫原性」は、アジュバントの存在または非存在下で、単独であっても、担体に連結されているときであっても、特定の抗原に対して、免疫応答を引き起こし、誘発し、刺激し、もしくは誘導し、または既存の免疫応答を改善し、増強し、増大させ、もしくは延長する、物質の能力を指す。
【００７７】
用語「免疫抑制細胞阻害剤」または「ＩＳＣ阻害剤」は、哺乳動物の免疫抑制細胞の数または機能を低減または抑制することができる物質を指す。免疫抑制細胞の例としては、調節性Ｔ細胞（「Ｔｒｅｇ」）、骨髄由来抑制細胞、および腫瘍関連マクロファージがある。
【００７８】
用語「皮内投与」または「皮内に投与される」は、ヒトを含めた哺乳動物への物質の投与という状況で、哺乳動物の皮膚の真皮層中への物質の送達を指す。哺乳動物の皮膚は、表皮層、真皮層、および皮下層から構成される。表皮は、皮膚の外層である。真皮は、皮膚の中間層であり、神経終末、汗腺および油（皮脂線性）腺、毛嚢、ならびに血管を含有する。皮下層は、脂肪、ならびにより大きい血管および神経を収容する結合組織から構成される。皮内投与においてと対照的に、「皮下投与」は、皮下層内への物質の投与を指し、「局部投与」は、皮膚の表面上への物質の投与を指す。
【００７９】
用語「新生物障害」は、細胞が異常に高く制御されない速度、周囲の正常組織のものを超え、それと非協調的な速度で増殖する状態を指す。これは、通常、「腫瘍」として公知の固体病変部または塊をもたらす。この用語は、良性および悪性新生物障害を包含する。用語「悪性新生物障害」は、本開示では用語「がん」と互換的に使用され、腫瘍細胞の体内の他の場所に拡散する能力（「転移」として公知）によって特徴付けられる新生物障害を指す。用語「良性新生物障害」は、腫瘍細胞が転移する能力を欠く新生物障害を指す。
【００８０】
用語「予防すること」または「予防する」は、（ａ）障害が起こることを避けること、または（ｂ）障害の発症もしくは障害の症状の発症を遅延させることを指す。
【００８１】
用語「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」は、腫瘍細胞によって特異的に発現され、または同じ組織型の非腫瘍細胞によってより、腫瘍細胞によって高い頻度または密度で発現される抗原を指す。腫瘍関連抗原は、宿主によって通常発現されない抗原であり得、これらは、宿主によって通常発現される分子の突然変異された、トランケートされた、ミスフォールドされた、もしくは別段に異常な顕在化であり得、これらは、通常発現される分子と同一であり得るが、異常に高いレベルで発現され得、またはこれらは、異常である場面もしくは環境において発現され得る。腫瘍関連抗原は、例えば、タンパク質もしくはタンパク質断片、複合炭水化物、ガングリオシド、ハプテン、核酸、またはこれらもしくは他の生物学的分子の任意の組合せであり得る。
【００８２】
用語「ワクチン」は、哺乳動物内の特定の抗原に対する免疫応答を誘発するための哺乳動物への投与のための免疫原性組成物を指す。ワクチンは、典型的には、病原微生物または腫瘍細胞などの免疫応答の標的に類似または由来する作用物質（「抗原」または「免疫原」として公知）を含有する。がんなどの腫瘍の治療のために意図されたワクチンは、典型的には、標的腫瘍上に見つかるＴＡＡに由来する抗原を含有し、標的腫瘍上のＴＡＡに対して免疫原性を誘発することができる。
【００８３】
実施形態が言い回し「含む」を用いて本明細書で記載されている場合は必ず、「からなる」および／または「から本質的になる」の観点から記載される別段の類似の実施形態も提供されることが理解される。
【００８４】
本発明の態様または実施形態が選択肢のマーカッシュ群または他の分類の観点から記載される場合、本発明は、全体として列挙された群全体だけでなく、群の各メンバーを個々に、および主群のすべての可能な亜群、また群メンバーの１つまたは複数を欠く主群を包含する。本発明は、請求項に係る発明における群メンバーのいずれかの１つまたは複数を明確に除外することも想定する。
【００８５】
別段の定義のない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が支配する。本明細書および特許請求の範囲全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含むこと」などの変形は、述べた整数または整数の群を含めることを暗示するが、任意の他の整数または整数の群の除外を暗示しないことが理解されるであろう。脈絡による別段の要求のない限り、単数形の用語は、複数を含むものとし、複数形の用語は、単数形を含むものとする。用語「例えば（ｅ．ｇ．）」または「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」に続く任意の例（複数可）は、網羅的または限定的であるように意味しない。
【００８６】
例示的な方法および材料を本明細書に記載するが、本明細書に記載のものと同様または等価な方法および材料も、本発明の実施または試験において使用することができる。材料、方法、および例は、例示的であるだけであり、限定的であるように意図していない。
【００８７】
抗ＧＩＴＲ抗体
本明細書において提供されるものは、腫瘍の退縮をもたらす抗腫瘍免疫を高める特性を有する抗ＧＩＴＲ抗体である。本発明の抗ＧＩＴＲ抗体は以下の特徴を示す：（ａ）抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／もしくは抗体依存性食作用（ＡＤＣＰ）の機能を介して腫瘍浸潤Ｔｒｅｇを枯渇させる、（ｂ）Ｔエフェクター細胞上のＧＩＴＲに結合し、Ｔエフェクター細胞の活性化を直接的に増強する、かつ／または（ｃ）Ｔエフェクター細胞のエフェクター機能およびＣＤ８＋Ｔ細胞の生存を増強する。
【００８８】
本発明で有用な抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、二重特異性抗体、ヘテロコンジュゲート抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、これらの突然変異体、抗体部分（例えば、ドメイン抗体）を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、ならびに抗体のグリコシル化バリアント、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合的に修飾された抗体を含めた、要求された特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された構成を包含することができる。抗体は、マウス、ラット、ヒト、または任意の他の起源（キメラ抗体もしくはヒト化抗体を含む）であり得る。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化抗体である。
【００８９】
抗ＧＩＴＲ抗体は、当技術分野で公知の任意の方法によって作製することができる。ヒトおよびマウス抗体を生成するための一般的技法は、当技術分野で公知であり、かつ／または本明細書に記載されている。
【００９０】
抗ＧＩＴＲ抗体は、当技術分野で公知の方法を使用して同定し、または特徴付けることができ、それによってＧＩＴＲの結合活性が検出される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、候補剤をＧＩＴＲとともにインキュベートし、ＧＩＴＲの結合および／または生物活性の付随的低減もしくは中和を監視することによって同定される。結合アッセイは、例えば、精製ＧＩＴＲポリペプチド（複数可）を用いて、またはＧＩＴＲポリペプチド（複数可）を天然に発現し（例えば、様々な系統）、もしくはこれらを発現するようにトランスフェクトされた細胞を用いて実施することができる。一実施形態では、結合アッセイは、競合的結合アッセイであり、この場合、候補抗体がＧＩＴＲ結合を公知の抗ＧＩＴＲ抗体と競合する能力が評価される。アッセイは、ＥＬＩＳＡ形式を含めて様々な形式で実施することができる。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、候補抗体をＧＩＴＲとともにインキュベートし、結合を監視することによって同定される。
【００９１】
最初に同定した後、候補抗ＧＩＴＲ抗体の活性を、標的にされる生物活性を試験することが知られているバイオアッセイによってさらに確認および洗練することができる。一部の実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞アッセイが使用されて候補抗ＧＩＴＲ抗体がさらに特徴付けられる。
【００９２】
抗ＧＩＴＲ抗体は、当技術分野で周知の方法を使用して特徴付けることができる。例えば、１つの方法は、それが結合するエピトープを同定すること、または「エピトープマッピング」である。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９９の１１章に記載されている、抗体−抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドベースアッセイを含めて、タンパク質上のエピトープの位置をマッピングし、特徴付けるための多くの当技術分野で公知の方法がある。追加の例では、エピトープマッピングを使用して、抗ＧＩＴＲ抗体が結合する配列を求めることができる。エピトープマッピングは、様々な源、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ  １５、８２１９  ＰＨ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ、オランダ）から商業的に利用可能である。エピトープは、線状エピトープであり得、すなわち、アミノ酸の単一ストレッチ内に含有され得、または必ずしも単一ストレッチ内に含有されていない場合がある、アミノ酸の３次元相互作用によって形成される立体構造エピトープであり得る。様々な長さ（例えば、少なくとも４〜６アミノ酸の長さ）のペプチドを、単離または合成し（例えば、組換えで）、抗ＧＩＴＲ抗体を用いた結合アッセイに使用することができる。別の例では、抗ＧＩＴＲ抗体が結合するエピトープは、ＧＩＴＲ配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗ＧＩＴＲ抗体による結合を決定することによって、系統的なスクリーニングで決定することができる。遺伝子断片発現アッセイによれば、ＧＩＴＲをコードするオープンリーディングフレームがランダムに、または特定の遺伝子構築によって断片化され、ＧＩＴＲの発現断片の試験される抗体との反応性が決定される。遺伝子断片は、例えば、放射性アミノ酸の存在下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＰＣＲによって生成され、次いで転写され、およびタンパク質に翻訳され得る。次いで放射性標識ＧＩＴＲ断片への抗体の結合が、免疫沈降およびゲル電気泳動によって決定される。ある特定のエピトープは、ファージ粒子の表面上にディスプレイされたランダムペプチド配列の大きいライブラリー（ファージライブラリー）または酵母（酵母ディスプレイ）を使用することによっても同定することができる。代わりに重複ペプチド断片の定義されたライブラリーを、単純な結合アッセイで試験抗体への結合について試験することができる。追加の例では、抗原の突然変異誘発、ドメイン交換実験、およびアラニンスキャニング突然変異誘発を実施して、エピトープ結合に要求され、十分な、かつ／または必要な残基を同定することができる。例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発実験は、ＧＩＴＲポリペプチドの様々な残基がアラニンで置き換えられた突然変異体ＧＩＴＲを使用して実施することができる。突然変異体ＧＩＴＲへの抗体の結合を評価することによって、抗体結合に対する特定のＧＩＴＲ残基の重要性を評価することができる。
【００９３】
抗ＧＩＴＲ抗体を特徴付けるのに使用することができるさらに別の方法は、同じ抗原、すなわち、ＧＩＴＲの様々な断片に結合することが知られている他の抗体との競合アッセイを使用して、抗ＧＩＴＲ抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するか否かを決定することである。競合アッセイは、ＥＬＩＳＡ形式を含めて当業者に周知である。
【００９４】
ＧＩＴＲに対する抗ＧＩＴＲ抗体の結合親和性（ＫＤ）は、約０．００１〜約２００ｎＭであり得る。一部の実施形態では、結合親和性は、約２００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２０ｎＭ、約１９ｎＭ、約１８ｎＭ、約１７ｎＭ、約１６ｎＭ、約１５ｎＭ、約１４ｎＭ、約１３ｎＭ、約１２ｎＭ、約１１ｎＭ、約１０ｎＭ、約９ｎＭ、約８ｎＭ、約７ｎＭ、約６ｎＭ、約５ｎＭ、約４ｎＭ、約３ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約６０ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、約２ｐＭ、または約１ｐＭのいずれかである。一部の実施形態では、結合親和性は、約２５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２０ｐＭ、約１０ｐＭ、約５ｐＭ、または約２ｐＭのいずれか未満である。
【００９５】
したがって、本発明は、以下のいずれか、または表１に見つかる部分的な軽鎖配列および部分的な重鎖配列を有する抗体、もしくはそのバリアントを含む組成物（医薬組成物を含む）を提供する。表１において、下線を引かれた配列は、Ｋａｂａｔに従ったＣＤＲ配列であり、太字の配列は、Ｃｈｏｔｈｉａに従った配列である。
【００９６】
【表１−１】
2020510435.tif 000003
【００９７】
【表１−２】
2020510435.tif 000004
【００９８】
【表１−３】
2020510435.tif 000005
【００９９】
本発明は、ＧＩＴＲに対する抗体のＣＤＲ部分も提供する。ＣＤＲ領域の決定は、当技術分野の技術の十分範囲内である。一部の実施形態では、ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの組合せであり得る（「組合せＣＤＲ」または「拡張ＣＤＲ」とも呼ばれる）ことが理解される。ＣＤＲの「コンホメーション定義」と本明細書で呼ばれる別の手法では、ＣＤＲの位置は、抗原結合にエンタルピー的寄与をする残基として同定することができる。例えば、Ｍａｋａｂｅら、２００８、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８３：１１５６〜１１６６を参照。一般に、「立体構造ＣＤＲ」は、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、および抗体が特異的抗原に結合するための適切なループ構造を維持するために束縛されているバーニアゾーン内に残基位置を含む。立体構造ＣＤＲの決定は、当技術分野の技術の十分範囲内である。一部の実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲである。他の実施形態では、ＣＤＲは、拡張、ＡｂＭ、コンホメーション、または接触ＣＤＲである。言い換えれば、１つを超えるＣＤＲを有する実施形態では、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、拡張、ＡｂＭ、コンホメーション、接触ＣＤＲ、またはこれらの組合せのいずれかであり得る。
【０１００】
一部の実施形態では、抗体は、表１に示した重鎖可変領域のいずれか１つの３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体は、表１に示した軽鎖可変領域のいずれか１つの３つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体は、表１に示した重鎖可変領域のいずれか１つの３つのＣＤＲ、および表１に示した軽鎖可変領域のいずれか１つの３つのＣＤＲを含む。
【０１０１】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲに特異的に結合し、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、もしくは１１２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域（ＶＨ）のＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに／または配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域（ＶＬ）のＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗体が提供される。
【０１０２】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、もしくは１１２に示したアミノ酸配列を含むＶＨ、または、ＣＤＲ内にない残基中に１つもしくはいくつかの保存的アミノ酸置換を有するその変異体を含む。一部の実施形態では、抗体は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、もしくは１１１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ、またはＣＤＲ内にないアミノ酸中に１つもしくはいくつかのアミノ酸置換を有するその変異体を含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲに特異的に結合し、配列番号１６、１８、２０、１２１、および１２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨのＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに／または配列番号１５、１７、１９、１２０、および１２２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬのＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗体を提供する。
【０１０４】
一部の実施形態では、ＧＩＴＲに特異的に結合し、配列番号７０および７２からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＨのＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、およびＶＨ  ＣＤＲ３を含むＶＨ、ならびに／または配列番号６９および７１からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するＶＬのＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、およびＶＬ  ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗体を提供する。
【０１０５】
一部の実施形態では、抗体は、Ｃ末端リシンを有するもしくは有さない完全長重鎖、および／または抗ＧＩＴＲ抗体の完全長軽鎖を含む。例えば、抗ＧＩＴＲ抗体は、配列番号１１０に示したアミノ酸配列を含む重鎖、および配列番号１０９に示したアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１０６】
表２は、本明細書に提供する抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲ配列の例を提供する。
【０１０７】
【表２−１】
2020510435.tif 000006
【０１０８】
【表２−２】
2020510435.tif 000007
【０１０９】
【表２−３】
2020510435.tif 000008
【０１１０】
【表２−４】
2020510435.tif 000009
【０１１１】
一部の実施形態では、抗体は、表２からの３つの軽鎖ＣＤＲおよび３つの重鎖ＣＤＲを含む。
【０１１２】
抗ＧＩＴＲ抗体の選択番号に由来する軽鎖ＣＤＲのアラインメントを、表３に提供する。可変残基は、太字で示されている。コンセンサス軽鎖ＣＤＲ配列は、表３の最終行に提供されている。
【０１１３】
【表３】
2020510435.tif 000010
【０１１４】
抗ＧＩＴＲ抗体の選択番号に由来する重鎖ＣＤＲのアラインメントを表４に提供する。可変残基は、太字で示されている。コンセンサス重鎖ＣＤＲ配列は、表４の最終行に提供されている。
【０１１５】
【表４−１】
2020510435.tif 000011
【０１１６】
【表４−２】
2020510435.tif 000012
【０１１７】
【表４−３】
2020510435.tif 000013
【０１１８】
一部の実施形態では、抗体は、表３からの３つの軽鎖ＣＤＲおよび表４からの３つの重鎖ＣＤＲを含む。
【０１１９】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号２４、２５、２６、３２、３３、３４、３５、３９、４０、４１、１１５、１１６、１１７、６３、６４、もしくは６５のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号２７、２８、４４、４５、６６、もしくは６７のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号２９、４６、もしくは６８に示したアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに／または配列番号２１、３０、３６、４２、１１３、もしくは３１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号２２、３７、４３、１１４、もしくは６１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号２３、３８、もしくは６２に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１２０】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号５０、５１、５２、５６、もしくは５７のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号５３、５４、５８、もしくは５９のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号５５、６０、もしくは１２４に示したアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに／または配列番号４７に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号４８に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号４９に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１２１】
一部の実施形態では、抗体は、配列番号３２、７６、７７、８４、８５、もしくは８６のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ１、配列番号７８もしくは７９のアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ２、および配列番号８０もしくは８７に示したアミノ酸配列を含むＶＨ  ＣＤＲ３、ならびに／または配列番号７３もしくは８１に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ１、配列番号７４もしくは８２に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ２、および配列番号７５もしくは８３に示したアミノ酸配列を含むＶＬ  ＣＤＲ３を含む。
【０１２２】
本発明は、抗ＧＩＴＲ抗体を生成、選択、および作製する方法も提供する。本発明の抗体は、当技術分野で公知の手順によって作製することができる。一部の実施形態では、抗体は、組換えで作製し、当技術分野で公知の任意の方法を使用して発現させることができる。
【０１２３】
一部の実施形態では、抗体は、ファージディスプレイ技術によって調製および選択することができる。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；同第５，５８０，７１７号；同第５，７３３，７４３号；および同第６，２６５，１５０号；ならびにＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３〜４５５、１９９４を参照。代わりに、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ、３４８：５５２〜５５３、１９９０）を使用して、非免疫化ドナーに由来する免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト抗体および抗体断片を生成することができる。この技法によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子が、糸状バクテリオファージのメジャーまたはマイナーコートタンパク質遺伝子、例えば、Ｍ１３またはｆｄなどの中にインフレームでクローニングされ、ファージ粒子の表面上に機能的な抗体断片としてディスプレイされる。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するので、抗体を機能的性質に基づいて選択すると、これらの性質を呈する抗体をコードする遺伝子も選択される。したがって、ファージは、Ｂ細胞の性質の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々な形式で実施することができる。総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４〜５７１、１９９３を参照。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの源を、ファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４〜６２８、１９９１は、免疫化マウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小ランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離した。Ｍａｒｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１〜５９７、１９９１またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １２：７２５〜７３４、１９９３によって記載された技法に本質的に従って、ヒトドナーに由来するＶ遺伝子のレパートリーを構築することができ、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を単離することができる。天然の免疫応答では、抗体遺伝子は、高い割合で突然変異を蓄積する（体細胞超変異）。導入された変化のいくつかが、より高い親和性を付与することになり、高親和性表面免疫グロブリンをディスプレイするＢ細胞が、後続の抗原チャレンジの間に選択的に複製および分化される。この自然過程は、「鎖シャッフリング」として公知の技法を使用することによって模倣することができる。（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．  １０：７７９〜７８３、１９９２）。この方法では、ファージディスプレイによって得られる「一次」ヒト抗体の親和性は、非免疫化ドナーから得られるＶドメイン遺伝子の天然に存在するバリアントのレパートリー（レパートリー）で、重鎖および軽鎖Ｖ領域遺伝子を順次置き換えることによって改善することができる。この技法により、ｐＭ〜ｎＭ範囲内の親和性を有する抗体および抗体断片の生成が可能になる。非常に大きいファージ抗体レパートリー（「マザーオブオールライブラリー」としても公知���を作製するためのストラテジーが、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２１：２２６５〜２２６６、１９９３によって記載されている。げっ歯類抗体からヒト抗体を導出するのに遺伝子シャフリングも使用することができ、この場合、ヒト抗体は、出発げっ歯類抗体と同様の親和性および特異性を有する。「エピトープ刷り込み」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレイ技法によって得られるげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子がヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと置き換えられ、げっ歯類−ヒトキメラが作り出される。抗原の選択により、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変領域が単離され、すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配する（刷り込む）。残りのげっ歯類Ｖドメインを置き換えるためにこのプロセスが繰り返されると、ヒト抗体が得られる（ＰＣＴ公開第ＷＯ９３／０６２１３を参照）。ＣＤＲ移植によるげっ歯類抗体の伝統的なヒト化と異なり、この技法は、げっ歯類起源のフレームワークまたはＣＤＲ残基をまったく有さない完全ヒト抗体をもたらす。
【０１２４】
一部の実施形態では、抗体は、ハイブリドーマ技術を使用して作製することができる。ヒトを含めた任意の哺乳動物対象またはそれに由来する抗体産生細胞を、ヒトを含めた哺乳動物およびハイブリドーマ細胞株を生成するための基盤として機能を果たすように操作することができることが企図されている。宿主動物の免疫化の経路およびスケジュールは一般に、本明細書でさらに記載するように、抗体を刺激および生成するための確立された技法および慣例的な技法を踏まえている。一般に、宿主動物は、本明細書に記載するように、腹腔内、筋肉内、経口的、皮下、足底内、および／または皮内に、ある量の免疫原を接種される。
【０１２５】
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７の、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、１８：３７７〜３８１、１９８２によって改良された一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技法を使用して、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製することができる。それだけに限らないが、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、およびｔｈｅ  Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．、ＵＳＡからのものを含めた利用可能な骨髄腫株を、ハイブリダイゼーションで使用することができる。一般に、この技法では、ポリエチレングリコールなどの融合剤を使用して、または当業者に周知の電気的手段によって、骨髄腫細胞およびリンパ系細胞を融合する。融合後、細胞は、融合培地から分離され、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択的増殖培地内で増殖されて未ハイブリダイズ親細胞が排除される。血清の有無にかかわらず補充された、本明細書に記載の培地のいずれも、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するのに使用することができる。細胞融合技法の別の選択肢として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して、対象発明のＧＩＴＲモノクローナル抗体を生成することができる。ハイブリドーマまたは他の不死化Ｂ細胞は、必要に応じて、展開およびサブクローニングされ、慣例的なイムノアッセイ手順（例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光イムノアッセイ）によって抗免疫原活性について上清がアッセイされる。
【０１２６】
抗体源として使用され得るハイブリドーマは、ＧＩＴＲに特異的なモノクローナル抗体、またはこれらの一部を産生するすべての誘導体、親ハイブリドーマの子孫細胞を包含する。
【０１２７】
このような抗体を産生するハイブリドーマは、公知の手順を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、必要に応じて、慣例的な免疫グロブリン精製手順、例えば、硫安分画、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などによって、培地または体液から単離することができる。望まれない活性は、存在する場合、例えば、固相に付着した免疫原でできた吸着剤上に配合物を流し、免疫原から所望の抗体を溶出または放出することによって除去することができる。ＧＩＴＲポリペプチド、または免疫される種内で免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシニアン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、もしくはダイズトリプシン阻害剤にコンジュゲートした標的アミノ酸配列を含有する断片を用いて、二機能性剤または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基によるコンジュゲーション）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基による）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、ＲおよびＲ１は、異なるアルキル基である）を使用して、宿主動物を免疫化すると、抗体（例えば、モノクローナル抗体）の集団を生じさせることができる。
【０１２８】
必要に応じて、対象とする抗ＧＩＴＲ抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）を配列決定し、次いで、ポリヌクレオチド配列をベクター中にクローン化し、発現または増殖させることができる。対象とする抗体をコードする配列を、宿主細胞内のベクター中に維持することができ、次いで宿主細胞を展開し、将来使用するために凍結することができる。細胞培養物内での組換えモノクローナル抗体の生成は、当技術分野で公知の手段によって、Ｂ細胞から抗体遺伝子をクローニングすることによって実施することができる。例えば、Ｔｉｌｌｅｒら、２００８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、３２９、１１２、米国特許第７，３１４，６２２号を参照。
【０１２９】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチド配列を遺伝子操作に使用して、抗体を「ヒト化」し、または抗体の親和性もしくは他の特性を改善することができる。抗体は、例えば、イヌ、ネコ、霊長類、ウマ、およびウシにおいて使用するためにカスタマイズすることもできる。
【０１３０】
一部の実施形態では、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように遺伝子工学的に改変された市販のマウスを使用することによって、完全ヒト抗体を得ることができる。より望ましい（例えば、完全ヒト抗体）、またはよりロバストな免疫応答を生じるように設計されたトランスジェニック動物も、ヒト化抗体またはヒト抗体を生成するのに使用することができる。このような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）製のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）、ならびにＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）製のＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＴＣ  Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
【０１３１】
抗体は、宿主動物から抗体および抗体産生細胞を最初に単離し、遺伝子配列を得、遺伝子配列を使用して、宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）内で抗体を組換えで発現させることによって組換えで作製することができる。使用することができる別の方法は、植物（例えば、タバコ）またはトランスジェニック乳内で抗体配列を発現させることである。植物または乳内で、組換えで抗体を発現させるための方法は、開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓら、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：２７５６、２００１、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ  Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３：６５、１９９５ならびにＰｏｌｌｏｃｋら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１４７、１９９９を参照。抗体の誘導体、例えば、ドメイン、単鎖などを作製するための方法は、当技術分野で公知である。
【０１３２】
イムノアッセイ、および蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリーソーティング技法も、ＧＩＴＲに対して特異的な抗体を単離するのに使用することができる。
【０１３３】
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、慣例的な手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離および配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡなどの好適な源として機能を果たす。単離した後、発現ベクター（ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示された発現ベクターなど）内にＤＮＡを配置することができ、次いでこれらは、宿主細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または免疫グロブリンタンパク質を他の方法で産生しない骨髄腫細胞などの中にトランスフェクトされて、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成が得られる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号を参照。ＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常領域のコード配列を置換することによって、Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８１：６８５１、１９８４、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてもしくは一部を共有結合的に接合することによって、修飾することもできる。その様式で、本明細書のＧＩＴＲモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。
【０１３４】
抗体断片は、抗体のタンパク質分解もしくは他の分解によって、上述した組換え法（すなわち、単一もしくは融合ポリペプチド）によって、または化学合成によって生成することができる。抗体のポリペプチド、特に最大約５０アミノ酸のより短いポリペプチドは、化学合成によって好都合に作製される。化学合成の方法は、当技術分野で公知であり、商業的に利用可能である。例えば、抗体は、固相法を使用する自動ポリペプチドシンセサイザーによって生成することができる。米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、および同第６，３３１，４１５号も参照。
【０１３５】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、抗体ｍ３Ｇ７、ｈ３Ｇ７ＶＬ１．１，ｈ３Ｇ７Ｈ１，ｈ３Ｇ７Ｈ２，ｈ３Ｇ７ＡＭ，ｈ３Ｇ７Ｒ５，ｈ３Ｇ７ＬＦ，ｈ３Ｇ７Ｎ９，ｍ１０Ｈ２、ｈ１０Ｈ２ＨＵ、ｈ１０Ｈ２ＡＭ、ｈ１０Ｈ２Ｎ１３、ｈ１０Ｈ２Ｎ１４、ｒ１８Ｈ１２、およびｒ２１Ｂ６の重鎖および／または軽鎖可変領域をコードする配列を含む。対象とする抗体をコードする配列は、宿主細胞内のベクター中に維持することができ、次いで宿主細胞を展開し、将来使用するために凍結させることができる。ベクター（発現ベクターを含む）および宿主細胞は、本明細書でさらに記載されている。
【０１３６】
本発明は、親和性成熟した実施形態を含む。例えば、親和性成熟抗体は、当技術分野で公知の手順によって生成することができる（Ｍａｒｋｓら、１９９２、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０：７７９〜７８３、Ｂａｒｂａｓら、１９９４、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ，ＵＳＡ  ９１：３８０９〜３８１３、Ｓｃｈｉｅｒら、１９９５、Ｇｅｎｅ、１６９：１４７〜１５５、Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５５：１９９４〜２００４、Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４（７）：３３１０〜９、Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２６：８８９〜８９６、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２００４／０５８１８４）。
【０１３７】
以下の方法は、抗体の親和性を調整し、ＣＤＲを特徴付けるのに使用することができる。抗体のＣＤＲを特徴付け、かつ／または抗体などのポリペプチドの結合親和性を変更する（改善するなど）一方法は、「ライブラリースキャンニング突然変異誘発」と呼ばれた。一般に、ライブラリースキャンニング突然変異誘発は、以下のように働く。ＣＤＲ内の１つまたは複数のアミノ酸位置が、当技術分野で承認されている方法を使用して、２つ以上（３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個など）のアミノ酸と置き換えられる。これにより、クローンの小ライブラリーが生成され（一部の実施形態では、分析されるアミノ酸位置毎に１つ）、それぞれは、２つ以上のメンバーの複雑性を有する（位置毎に２つ以上のアミノ酸が置換される場合）。一般に、ライブラリーは、天然（非置換）アミノ酸を含むクローンも含む。各ライブラリーから少数のクローン、例えば、約２０〜８０クローン（ライブラリーの複雑性に応じて）が、標的ポリペプチド（または他の結合標的）に対する結合親和性についてスクリーニングされ、結合性が増大した、同じ、減少した、またはまったくない候補が同定される。結合親和性を決定するための方法は、当技術分野で周知である。結合親和性は、例えば、約２倍以上の結合親和性の差異を検出するＢｉａｃｏｒｅ（商標）表面プラズモン共鳴分析、Ｋｉｎｅｘａ（登録商標）バイオセンサー、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＯＲＩＧＥＮ（登録商標）イムノアッセイ、蛍光消光、蛍光移動、および／または酵母ディスプレイを使用して求めることができる。結合親和性は、適当なバイオアッセイを使用してスクリーニングすることもできる。Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）は、出発抗体が比較的高い親和性、例えば、約１０ｎＭ以下のＫＤで既に結合する場合、特に有用である。
【０１３８】
一部の実施形態では、ＣＤＲ内のすべてのアミノ酸位置が、当技術分野で承認されている突然変異誘発法（これらのいくつかを本明細書に記載する）を使用して、２０すべての天然アミノ酸で置き換えられる（一部の実施形態では、一つずつ）。これにより、クローンの小ライブラリーが生成され（一部の実施形態では、分析されるアミノ酸位置毎に１つ）、それぞれは、２０のメンバーの複雑性を有する（位置毎に２０個すべてのアミノ酸が置換される場合）。
【０１３９】
一部の実施形態では、スクリーニングされるライブラリーは、２つ以上の位置に置換を含み、これらは、同じＣＤＲ内にあっても、２つ以上のＣＤＲ内にあってもよい。したがって、ライブラリーは、１つのＣＤＲ内の２つ以上の位置に置換を含み得る。ライブラリーは、２つ以上のＣＤＲ内の２つ以上の位置に置換を含み得る。ライブラリーは、２、３、４、５、または６つのＣＤＲ内に見つかる、３、４、５、またはそれ以上の位置に置換を含み得る。置換は、低冗長性コドンを使用して調製することができる。例えば、Ｂａｌｉｎｔら１９９３、Ｇｅｎｅ  １３７（１）：１０９〜１８の表２を参照。
【０１４０】
ＣＤＲは、重鎖可変領域（ＶＨ）ＣＤＲ３および／または軽鎖可変領域（ＶＬ）ＣＤＲ３であり得る。ＣＤＲは、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＶＨ  ＣＤＲ２、ＶＨ  ＣＤＲ３、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＶＬ  ＣＤＲ２、および／またはＶＬ  ＣＤＲ３の１つまたは複数であり得る。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ  ＣＤＲ、Ｃｈｏｔｈｉａ  ＣＤＲ、拡張ＣＤＲ、ＡｂＭ  ＣＤＲ、接触ＣＤＲ、またはコンホメーションＣＤＲであってもよい。
【０１４１】
結合性が改善された候補を配列決定し、それによって、親和性を改善するＣＤＲ置換突然変異体（「改善された」置換とも呼ばれる）を同定することができる。結合する候補を配列決定し、それによって、結合性を保持するＣＤＲ置換を同定することもできる。
【０１４２】
複数ラウンドのスクリーニングを行うことができる。例えば、結合性が改善された候補（それぞれは、１つまたは複数のＣＤＲの１つまたは複数の位置でアミノ酸置換を含む）は、それぞれの改善されたＣＤＲ位置（すなわち、置換突然変異体が結合性の改善を示したＣＤＲ内のアミノ酸位置）で少なくとも元のアミノ酸および置換されたアミノ酸を含有する第２ライブラリーの設計にも有用である。このライブラリーの調製、およびスクリーニングまたは選択を以下でさらに論じる。
【０１４３】
改善された結合性、同じ結合性、減少した結合性を有し、または結合性をまったく有さないクローンの頻度も、抗体−抗原複合体の安定性について各アミノ酸位置の重要性に関する情報を提供する限り、ライブラリースキャンニング突然変異誘発も、ＣＤＲを特徴付けるための手段を提供する。例えば、ＣＤＲの位置が、２０個すべてのアミノ酸に変更されたとき結合性を保持する場合、その位置は、抗原結合に必要とされそうにない位置として同定される。反対に、ＣＤＲの位置が、置換の小パーセンテージのみにおいて結合性を保持する場合、その位置は、ＣＤＲ機能に重要である位置として同定される。したがって、ライブラリースキャンニング突然変異誘発法により、多くの異なるアミノ酸（２０個すべてのアミノ酸を含む）に変更することができるＣＤＲ内の位置、および変更することができないか、または数種のアミノ酸に変更することができるだけであるＣＤＲ内の位置に関する情報が生成される。
【０１４４】
親和性が改善された候補は、第２ライブラリー内で組み合わせることができ、このライブラリーは、改善されたアミノ酸、その位置における元のアミノ酸を含み、望まれる、または所望のスクリーニングもしくは選択法を使用して許容されるライブラリーの複雑性に応じて、その位置で追加の置換をさらに含むことができる。さらに、必要に応じて、隣接するアミノ酸位置は、少なくとも２つ以上のアミノ酸に対してランダム化することができる。隣接するアミノ酸をランダム化すると、突然変異体ＣＤＲ内の追加の立体構造的柔軟性を可能にすることができ、それはさらには、より多数の改善突然変異の導入を可能にし、または促進することができる。このライブラリーはまた、スクリーニングの第１ラウンドで親和性の改善を示さなかった位置で置換を含むことができる。
【０１４５】
第２ライブラリーは、Ｋｉｎｅｘａ（商標）バイオセンサー分析を使用するスクリーニング、ならびにファージディスプレイ、酵母ディスプレイ、およびリボソームディスプレイを含む、選択のための当技術分野で公知の任意の方法を使用する選択を含めて、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、結合親和性が改善および／または変更されたライブラリーメンバーについてスクリーニングまたは選択される。
【０１４６】
本発明の抗ＧＩＴＲ抗体を発現させるために、ＶＨおよびＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片を、上述した方法のいずれかを使用して最初に得ることができる。様々な修飾、例えば、突然変異、欠失、および／または付加も、当業者に公知の標準方法を使用して、ＤＮＡ配列中に導入することができる。例えば、突然変異誘発は、ＰＣＲ媒介突然変異誘発などの標準方法を使用して実施することができ、ＰＣＲ媒介突然変異誘発では、突然変異したヌクレオチドがＰＣＲプライマー中に組み込まれ、その結果、ＰＣＲ産物が所望の突然変異または部位特異的突然変異誘発を含有する。
【０１４７】
本発明は、表１に示した可変領域、および表２、３、または４に示したＣＤＲに対する修飾を包含する。例えば、本発明は、これらの性質に有意に影響しない機能的に等価な可変領域およびＣＤＲを含む抗体、ならびに活性および／または親和性が増強され、もしくは減少したバリアントを含む。例えば、アミノ酸配列を突然変異させて、ＧＩＴＲに対する所望の結合親和性を有する抗体を得ることができる。ポリペプチドの修飾は、当技術分野で日常の行為であり、本明細書で詳細に説明する必要はない。修飾ポリペプチドの例としては、アミノ酸残基の保存的置換、機能活性を有意に有害に変更しない、もしくはポリペプチドのそのリガンドに対する親和性を成熟させる（増強する）アミノ酸の１つもしくは複数の欠失もしくは付加、または化学的類似体の使用を有するポリペプチドがある。
【０１４８】
アミノ酸配列挿入としては、１つの残基から、１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入がある。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体、またはエピトープタグに融合した抗体がある。抗体分子の他の挿入バリアントには、血液循環中で抗体の半減期を増大させる酵素またはポリペプチドの、抗体のＮ末端またはＣ末端への融合が含まれる。
【０１４９】
置換バリアントは、除去された抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基、およびその場所内に挿入された異なる残基を有する。置換突然変異誘発の最も大きな関心のある部位には超可変領域が含まれるが、フレームワーク変化も企図されている。保存的置換を、「保存的置換」の表題で表５に示す。このような置換が生物活性を変化させる場合、表５で「例示的な置換」と命名した、またはアミノ酸クラスを参照して以下にさらに記載する、より実質的な変化を導入することができ、生成物をスクリーニングすることができる。
【０１５０】
【表５】
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【０１５１】
抗体の生物学的性質の実質的な修飾は、（ａ）例えば、βシートもしくはヘリックスコンホメーションとしての置換範囲内のポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクを維持することに対する置換の効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖の性質に基づいて群に分類される：
（１）非極性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）電荷を有さない極性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性（負に荷電した）：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性（正に荷電した）：Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、および
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ。
【０１５２】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのクラスのメンバーを別のクラスと交換することによって行われる。
【０１５３】
例えば、行うことができる１つのタイプの置換は、別の残基、例えば、限定することなく、アラニンまたはセリンなどに化学反応性であり得る、抗体中の１つまたは複数のシステインを変更することである。例えば、非カノニカルシステインの置換が存在し得る。置換は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域内、または抗体の定常領域内で行うことができる。一部の実施形態では、システインは、カノニカルである。抗体の適切なコンホメーションの維持に関与していない任意のシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防止するために、一般にセリンと置換することができる。反対に、システイン結合（複数可）を、特に抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合、抗体の安定性を改善するために抗体に付加することができる。
【０１５４】
抗体は、例えば、抗体の結合性を変更するために、例えば、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン内で修飾することもできる。可変領域内の変化は、結合親和性および／または特異性を変更し得る。一部の実施形態では、１〜５個以下の保存的アミノ酸置換がＣＤＲドメイン内で行われる。他の実施形態では、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換がＣＤＲドメイン内で行われる。例えば、ＧＩＴＲに対する抗体のＫＤを増減し、ｋｏｆｆを増減し、または抗体の結合特異性を変更するために、ＣＤＲ領域の１つまたは複数内で突然変異を行うことができる。部位特異的突然変異誘発における技法は、当技術分野で周知である。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらおよびＡｕｓｕｂｅｌら、上記を参照。
【０１５５】
修飾または突然変異をフレームワーク領域または定常領域内で行って、抗ＧＩＴＲ抗体の半減期を延ばすこともできる。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０９５６０号を参照。フレームワーク領域または定常領域内での突然変異を行って、抗体の免疫原性を変更し、別の分子への共有結合性もしくは非共有結合性結合のための部位を提供し、または補体結合、ＦｃＲ結合、および抗体依存性細胞媒介性細胞傷害などの性質を変更することもできる。一部の実施形態では、１〜５個以下の保存的アミノ酸置換がフレームワーク領域または定常領域内で行われる。他の実施形態では、１〜３個以下の保存的アミノ酸置換がフレームワーク領域または定常領域内で行われる。本発明によれば、単一抗体は、可変ドメインのＣＤＲまたはフレームワーク領域の任意の１つまたは複数内、または定常領域内に突然変異を有することができる。
【０１５６】
修飾には、グリコシル化および非グリコシル化ポリペプチド、ならびに他の翻訳後修飾、例えば、異なる糖でのグリコシル化、アセチル化、およびリン酸化などを有するポリペプチドも含まれる。抗体は、これらの定常領域内の保存位置でグリコシル化される（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、１９９７、Ｃｈｅｍ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６５：１１１〜１２８；ＷｒｉｇｈｔおよびＭｏｒｒｉｓｏｎ、１９９７、ＴｉｂＴＥＣＨ、１５：２６〜３２）。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能（Ｂｏｙｄら、１９９６、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３２：１３１１〜１３１８；ＷｉｔｔｗｅおよびＨｏｗａｒｄ、１９９０、Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２９：４１７５〜４１８０）、ならびにコンホメーションに影響し得る糖タンパク質の部分と、糖タンパク質の提示された三次元表面との分子内相互作用（ＪｅｆｆｅｒｉｓおよびＬｕｎｄ、上記；ＷｙｓｓおよびＷａｇｎｅｒ、１９９６、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、７：４０９〜４１６）に影響する。オリゴ糖は、特異的な認識構造に基づいて、ある特定の分子に所与の糖タンパク質を向ける機能を果たすこともできる。抗体のグリコシル化は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に影響することも報告されている。特に、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼであるβ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）がテトラサイクリンにより発現制御されるＣＨＯ細胞によって産生される抗体は、改善されたＡＤＣＣ活性を有することが報告された（Ｕｍａｎａら、１９９９、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１７：１７６〜１８０）。
【０１５７】
抗体のグリコシル化は、一般に、Ｎ結合型またはＯ結合型である。Ｎ結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン、アスパラギン−Ｘ−トレオニン、およびアスパラギン−Ｘ−システイン（式中、Ｘは、プロリンを除く任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分がアスパラギン側鎖に酵素的結合するための認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列のいずれかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作り出される。Ｏ結合型グリコシル化は、糖Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１種の、ヒドロキシアミノ酸、最も一般にはセリンまたはトレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリシンも使用することができる。
【０１５８】
グリコシル化部位の抗体への付加は、アミノ酸配列を、これが上述したトリペプチド配列の１つまたは複数を含有するように変更することによって好都合には達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位に関して）。変更は、元の抗体の配列への、１つまたは複数のセリンまたはトレオニン残基の付加、またはこれらによる置換によっても行うことができる（Ｏ結合型グリコシル化部位に関して）。
【０１５９】
抗体のグリコシル化パターンも、基本的なヌクレオチド配列を変更することなく変更することができる。グリコシル化は、抗体を発現させるのに使用される宿主細胞に大部分は依存する。潜在的な治療剤としての組換え糖タンパク質、例えば、抗体の発現に使用される細胞型は、まれにネイティブ細胞であるので、抗体のグリコシル化パターンのバリエーションが予期され得る（例えば、Ｈｓｅら、１９９７、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７２：９０６２〜９０７０を参照）。
【０１６０】
宿主細胞の選択に加えて、抗体を組換え生産する間にグリコシル化に影響する要因としては、増殖モード、培地配合、培養密度、酸素供給、ｐＨ、精製スキームなどがある。オリゴ糖生成に関与するある特定の酵素の導入または過剰発現を含めて、特定の宿主生物体内で実現されるグリコシル化パターンを変更するための様々な方法が提案されている（米国特許第５，０４７，３３５号、同第５，５１０，２６１号、および同第５，２７８，２９９号）。グリコシル化、またはある特定のタイプのグリコシル化は、例えば、エンドグリコシダーゼＨ（Ｅｎｄｏ  Ｈ）、Ｎ−グリコシダーゼＦ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３を使用して、糖タンパク質から酵素的に除去することができる。さらに、組換え宿主細胞は、ある特定のタイプの多糖のプロセシングにおいて欠陥のあるように遺伝子工学的に改変することができる。これらの技法および同様の技法は、当技術分野で周知である。
【０１６１】
修飾の他の方法には、それだけに限らないが、酵素的手段、酸化的置換、およびキレート化を含めた、当技術分野で公知のカップリング技法の使用が含まれる。修飾は、例えば、イムノアッセイ用標識の結合に使用することができる。修飾ポリペプチドは、当技術分野で確立した手順を使用して作製され、当技術分野で公知の標準アッセイを使用してスクリーニングすることができる。これらのアッセイのいくつかを以下および実施例で記載する。
【０１６２】
一部の実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ１であり得る。一部の実施形態では、定常領域は、配列番号１２９に示した配列を有する。
【０１６３】
一部の実施形態では、Ｆｃは、ヒトＩｇＧ２またはヒトＩｇＧ４であり得る。一部の実施形態では、抗体は、以下の突然変異を含むＩｇＧ４の定常領域を含む（Ａｒｍｏｕｒら、２００３、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ４０、５８５〜５９３）：番号付けが野生型ＩｇＧ４を参照している、Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５（ＩｇＧ４Δｃ）。さらに別の実施形態では、Ｆｃは、欠失Ｇ２３６を伴ったヒトＩｇＧ４  Ｅ２３３Ｆ２３４Ｌ２３５からＰ２３３Ｖ２３４Ａ２３５である。一部の実施形態では、Ｆｃは、Ｓ２２８からＰ２２８へのヒンジ安定化突然変異を含有する任意のヒトＩｇＧ４  Ｆｃ（ＩｇＧ４、ＩｇＧ４Δｂ、またはＩｇＧ４Δｃ）である（Ａａｌｂｅｒｓｅら、２００２、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０５、９〜１９）。他の実施形態では、Ｆｃは、アミノ酸残基が野生型ＩｇＧ２配列を参照して番号付けされる、Ａ３３０Ｐ３３１からＳ３３０Ｓ３３１への突然変異（ＩｇＧ２Δａ）を含有するヒトＩｇＧ２であり得る。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４。
【０１６４】
一部の実施形態では、抗体は、ヒトＦｃγ受容体に対する結合親和性が増大もしくは減少した修飾定常領域を含み、免疫学的に不活性もしくは部分的に不活性であり、例えば、補体媒介溶解を誘発せず、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激せず、もしくはミクログリアを活性化せず、または以下、すなわち、補体媒介溶解の誘発、ＡＤＣＣの刺激、もしくはミクログリアの活性化のうちの任意の１つもしくは複数において活性が低減している（無修飾抗体と比較して）。エフェクター機能の最適レベルおよび／または組合せを実現するために、定常領域の異なる修飾を使用することができる。例えば、Ｍｏｒｇａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８６：３１９〜３２４、１９９５；Ｌｕｎｄら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５７：４９６３〜９  １５７：４９６３〜４９６９、１９９６；Ｉｄｕｓｏｇｉｅら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１６４：４１７８〜４１８４、２０００；Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：２５９５〜２６０１、１９８９；およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６、１９９８を参照。一部の実施形態では、定常領域は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９９、２９：２６１３〜２６２４、ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９９／０５８５７２に記載されているように修飾される。
【０１６５】
一部の実施形態では、抗体定常領域を修飾して、Ｆｃγ受容体と補体および免疫系との相互作用を回避することができる。このような抗体を調製するための技法は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されている。例えば、抗体がヒトにおける臨床試験および治療で使用される場合、定常領域をヒト定常領域により類似しているように遺伝子工学的に改変して、免疫応答を回避することができる。例えば、米国特許第５，９９７，８６７号および同第５，８６６，６９２号を参照。
【０１６６】
さらに他の実施形態では、定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化の代わりに非グリコシル化されている。一部の実施形態では、定常領域は、オリゴ糖付着残基および／または定常領域中のＮ−グリコシル化認識配列の一部であるフランキング残基を突然変異させることによって、Ｎ結合型グリコシル化の代わりに非グリコシル化されている。例えば、Ｎ−グリコシル化部位Ｎ２９７は、例えば、Ａ、Ｑ、Ｋ、またはＨに突然変異され得る。Ｔａｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４３：２５９５〜２６０１、１９８９、およびＪｅｆｆｅｒｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、１６３：５９〜７６、１９９８を参照。一部の実施形態では、定常領域は、Ｎ結合型グリコシル化について非グリコシル化されている。定常領域は、酵素的に（酵素ＰＮＧａｓｅによって炭水化物を除去するなど）、またはグリコシル化欠損宿主細胞内の発現によって、Ｎ結合型グリコシル化について非グリコシル化されていてもよい。
【０１６７】
他の抗体修飾には、ＰＣＴ公開第ＷＯ９９／５８５７２号に記載されたように修飾された抗体が含まれる。これらの抗体は、標的分子に向けられた結合ドメインに加えて、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常領域のすべてまたは一部に実質的に相同のアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、標的の著しい補体依存性溶解または細胞媒介性破壊を誘発することなく、標的分子に結合することができる。一部の実施形態では、エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂに特異的に結合することができる。これらは一般に、２つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインに由来するキメラドメインに基づく。このようにして修飾された抗体は、慣例的な抗体療法に対する炎症反応および他の拒絶反応を回避するための長期抗体療法で使用するのに特に適している。
【０１６８】
一部の実施形態では、抗体は、無修飾抗体と比較してＦｃＲｎに対する結合親和性の増大および／または血清半減期の増大を有する修飾定常領域を含む。
【０１６９】
「生殖系列化（ｇｅｒｍｌｉｎｉｎｇ）」として公知のプロセスでは、ＶＨおよびＶＬ配列中のある特定のアミノ酸を突然変異させて、生殖系列ＶＨおよびＶＬ配列中に天然に見つかるものとマッチさせることができる。特に、抗体が投与されるときの免疫原性のリスクを低減するために、ＶＨおよびＶＬ配列中のフレームワーク領域のアミノ酸配列を突然変異させて、生殖系列配列とマッチさせることができる。ヒトＶＨおよびＶＬ遺伝子についての生殖系列ＤＮＡ配列は、当技術分野で公知である（例えば、「Ｖｂａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースを参照；Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎら、１９９２、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：７７６〜７９８；およびＣｏｘら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４：８２７〜８３６も参照）。
【０１７０】
行うことができる別のタイプのアミノ酸置換は、抗体中の潜在的なタンパク質分解部位を除去することである。このような部位は、可変ドメインのＣＤＲもしくはフレームワーク領域内または抗体の定常領域内に存在し得る。システイン残基を置換し、タンパク質分解部位を除去すると、抗体生成物中の不均質性のリスクを減少させ、したがってその均質性を増大させることができる。別のタイプのアミノ酸置換は、潜在的なアミド分解部位を形成するアスパラギン−グリシン対を、これらの残基の一方または両方を変更することによって排除することである。別の例では、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖のＣ末端リシンを切断することができる。本発明の様々な実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体の重鎖および軽鎖は、シグナル配列を任意選択により含む場合がある。
【０１７１】
本発明のＶＨおよびＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られた後、これらのＤＮＡ断片を、標準的な組換えＤＮＡ技法によってさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子、またはｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作では、ＶＬまたはＶＨコードＤＮＡ断片は、抗体定常領域などの別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片、または可動性リンカーに作動可能に連結される。用語「作動可能に連結した」は、本脈絡において使用する場合、２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片が接合されていることを意味するように意図されている。
【０１７２】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨコードＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、またはＩｇＤ定常領域とすることができるが、最も好ましくはＩｇＧ１またはＩｇＧ２定常領域である。ＩｇＧ定常領域配列は、異なる個体の中で存在することが知られている様々な対立遺伝子またはアロタイプ、例えば、Ｇｍ（１）、Ｇｍ（２）、Ｇｍ（３）、およびＧｍ（１７）などのいずれかであり得る。これらのアロタイプは、ＩｇＧ１定常領域中の天然に存在するアミノ酸置換を代表する。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子に関して、ＶＨコードＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。ＣＨ１重鎖定常領域は、重鎖遺伝子のいずれかに由来し得る。
【０１７３】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬコードＤＮＡを軽鎖定常領域、ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（およびＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、１９９１、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５版、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ刊行物番号９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、κまたはλ定常領域とすることができる。κ定常領域は、異なる個体の中で存在することが知られている様々な対立遺伝子、例えば、Ｉｎｖ（１）、Ｉｎｖ（２）、およびＩｎｖ（３）のいずれかであり得る。λ定常領域は、３種のλ遺伝子のいずれかに由来し得る。
【０１７４】
ｓｃＦｖ遺伝子を作り出すために、ＶＨおよびＶＬコードＤＮＡ断片は、可動性リンカーをコードする別の断片に、ＶＨおよびＶＬ配列が、ＶＬおよびＶＨ領域が可動性リンカーによって接合された連続した単鎖タンパク質として発現され得るように作動可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３〜４２６；Ｈｕｓｔｏｎら、１９８８、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９〜５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４を参照）。連結ペプチドの例は、（ＧＧＧＧＳ）３（配列番号１３０）であり、これは、一方の可変領域のカルボキシ末端と他方の可変領域のアミノ末端との間のおよそ３．５ｎｍを架橋する。他の配列のリンカーも設計および使用されている（Ｂｉｒｄら、１９８８、上記）。リンカーは、次に、追加の機能、例えば、薬剤の結合または固体支持体への結合などのために修飾することができる。単鎖抗体は、単一のＶＨおよびＶＬのみが使用される場合、一価であり得、２つのＶＨおよびＶＬが使用される場合、二価であり得、または２つを超えるＶＨおよびＶＬが使用される場合、多価であり得る。ＧＩＴＲおよび別の分子に特異的に結合する二重特異性抗体または多価抗体を生成することができる。単鎖バリアントは、組換えで、または合成的に生成することができる。ｓｃＦｖの合成生成のために、自動シンセサイザーを使用することができる。ｓｃＦｖの組換え産生のために、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドを含有する適当なプラスミドを、酵母、植物、昆虫、もしくは哺乳動物細胞などの真核生物、または大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの原核生物の適当な宿主細胞内に導入することができる。対象とするｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのライゲーションなどの慣例的な操作によって作製することができる。結果として生じるｓｃＦｖは、当技術分野で公知の標準的なタンパク質精製技法を使用して単離することができる。
【０１７５】
ダイアボディなどの単鎖抗体の他の形態も包含される。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬが、単一ポリペプチド鎖上であるが、短すぎて同じ鎖上の２つのドメイン間で対形成させることができず、それによってドメインを別の鎖の相補的ドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を作り出すリンカーを使用して発現される、二価の二重特異性抗体である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、１９９３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４〜６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．ら、１９９４、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、２：１１２１〜１１２３を参照）。
【０１７６】
２つの共有結合的に接合された抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内である。このような抗体は、免疫系細胞を望まれない細胞に向けるのに（米国特許第４，６７６，９８０号）、およびＨＩＶ感染を治療するために（ＰＣＴ公開第ＷＯ１９９１／０００３６０および同第９２／２００３７３号；ＥＰ０３０８９）使用されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋法を使用して作製することができる。適当な架橋剤および架橋技法は、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されている。
【０１７７】
キメラまたはハイブリッド抗体も、架橋剤を伴うものを含めて、合成タンパク質化学の公知の方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することができる。例えば、免疫毒素は、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成することによって構築することができる。この目的用の適当な試薬の例としては、イミノチオレートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミデート（ｍｅｒｃａｐｔｏｂｕｔｙｒｉｍｉｄａｔｅ）がある。
【０１７８】
本発明は、本明細書に開示の抗体に由来する１つまたは複数の断片または領域を含む融合タンパク質も包含する。一部の実施形態では、別のポリペプチドに連結された本発明の抗ＧＩＴＲ抗体のすべてまたは一部を含む融合抗体を作製することができる。別の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体の可変ドメインのみがポリペプチドに連結される。別の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体のＶＨドメインは、第１ポリペプチドに連結され、一方、抗ＧＩＴＲ抗体のＶＬドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用して抗原結合部位を形成することができる様式で第１ポリペプチドと会合する第２ポリペプチドに連結される。別の好適な実施形態では、ＶＨドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに相互作用することができるように、リンカーによってＶＬドメインから分離される。次いで、ＶＨ−リンカー−ＶＬ抗体は、対象とするポリペプチドに連結される。さらに、２つ（またはそれ以上）の単鎖抗体が互いに連結された融合抗体を作り出すことができる。これは、単一ポリペプチド鎖上に二価もしくは多価抗体を作り出したい場合、または二重特異性抗体を作り出したい場合、有用である。
【０１７９】
一部の実施形態では、配列番号１，３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、１１１、１２０、１２２、６９もしくは７１に示した可変軽鎖領域の少なくとも１０の連続したアミノ酸、および／または配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、７０、７２、１１２、１２１、もしくは１２３に示した可変重鎖領域の少なくとも１０個のアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。他の実施形態では、可変軽鎖領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約３０個の連続したアミノ酸および／または可変重鎖領域の少なくとも約１０個、少なくとも約１５個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、もしくは少なくとも約３０個の連続したアミノ酸を含む融合ポリペプチドが提供される。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号１と２、３と４、５と６、７と８、９と1０、１１と1２、１３と１４、１１１と１１２、１５と１６、１７と１８、１９と２０、１２０と１２１、１２２と１２３、６９と７０、もしくは７１と７２の中から選択される配列対のいずれかに示された軽鎖可変領域および／または重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、融合ポリペプチドは、１つまたは複数のＣＤＲ（複数可）を含む。さらに他の実施形態では、融合ポリペプチドは、ＶＨ  ＣＤＲ３および／またはＶＬ  ＣＤＲ３を含む。本発明の目的に関して、融合タンパク質は、１種または複数の抗体、および天然分子内に結合されていない別のアミノ酸配列、例えば、異種配列、または別の領域からの相同配列を含有する。例示的な異種配列としては、それだけに限らないが、ＦＬＡＧタグまたは６Ｈｉｓタグなどの「タグ」がある。タグは、当技術分野で周知である。
【０１８０】
融合ポリペプチドは、当技術分野で公知の方法によって、例えば、合成的に、または組換えで作り出すことができる。一般に、本発明の融合タンパク質は、本明細書に記載の組換え法を使用して、これらをコードするポリヌクレオチドを調製し、発現させることによって作製されるが、これらは、例えば、化学合成を含めた当技術分野で公知の他の手段によっても調製することができる。
【０１８１】
他の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体コード核酸分子を使用して他の修飾抗体を調製することができる。例えば、「カッパボディ」（Ｉｌｌら、１９９７、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．、１０：９４９〜５７）、「ミニボディ」（Ｍａｒｔｉｎら、１９９４、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １３：５３０３〜９）、「ダイアボディ」（Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、上記）、または「ジャヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）」（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９１、ＥＭＢＯ  Ｊ．  １０：３６５５〜３６５９およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒら、１９９２、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（補遺）、７：５１〜５２）を、本明細書の教示に従って、標準的な分子生物学的技法を使用して調製することができる。
【０１８２】
例えば、二重特異性抗体、すなわち、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体を、本明細書に開示の抗体を使用して調製することができる。二重特異性抗体を作製するための方法は、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １２１：２１０を参照）。例えば、二重特異性抗体または抗原結合断片は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の連結によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ、１９９０、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ７９：３１５〜３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙら、１９９２、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １４８：１５４７〜１５５３を参照。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生産は、２本の重鎖が異なる特異性を有する、２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づいていた（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３、Ｎａｔｕｒｅ  ３０５、５３７〜５３９）。さらに、二重特異性抗体を「ダイアボディ」または「ジャヌシン」として形成することができる。一部の実施形態では、二重特異性抗体は、ＧＩＴＲの２つの異なるエピトープに結合する。一部の実施形態では、上述した修飾抗体は、本明細書に提供する抗ＧＩＴＲ抗体に由来する可変ドメインまたはＣＤＲ領域の１つまたは複数を使用して調製される。
【０１８３】
二重特異性抗体を作製するための一手法によれば、所望の結合特異性（抗体−抗原結合部位）を有する抗体可変ドメインが、免疫グロブリン定常領域配列に融合される。融合は、好ましくは、ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常領域とのものである。融合物の少なくとも１つの中に存在する、軽鎖結合に必要な部位を含有する第１重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好適である。免疫グロブリン重鎖融合物および必要に応じて、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別個の発現ベクター内に挿入され、適当な宿主生物体内にコトランスフェクトされる。これは、構築物内で不等比の３本のポリペプチド鎖が使用されると収率が最適になる実施形態において、３つのポリペプチド断片の相互の比率の調整に大きな柔軟性をもたらす。しかし、少なくとも２本のポリペプチド鎖が等比で発現されると収率が高くなる場合、または比が特に重要でない場合、２本、または３本すべてのポリペプチド鎖のコード配列を１つの発現ベクター内に挿入することが可能である。
【０１８４】
一手法では、二重特異性抗体は、一方のアーム内の第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖、および他方のアーム内のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）から構成される。二重特異性分子の半分のみに免疫グロブリン軽鎖を有する非対称構造は、望まれない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を促進する。この手法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０４６９０に記載されている。
【０１８５】
別の手法では、二重特異性抗体は、一方のアーム内の第１のヒンジ領域におけるアミノ酸修飾から構成され、第１のヒンジ領域における置換された／置き換えられたアミノ酸は、他方のアーム内の第２のヒンジ領域における対応するアミノ酸と逆の電荷を有する。この手法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６４１９（ＷＯ２０１１／１４３５４５）において記載されている。一部の実施形態では、二重特異性抗体の形成は、第１のＦｃ領域と第２のＦｃ領域との間（例えば、ヒンジ領域とＣＨ３領域との間）の界面を変更または遺伝子工学的に操作することによって増強される。この手法では、二重特異性抗体は、第１のＣＨ３ポリペプチドおよび第２のＣＨ３ポリペプチドを含むＣＨ３領域から構成され得、これらのポリペプチドは共に相互作用してＣＨ３界面を形成し、ＣＨ３界面内の１つまたは複数のアミノ酸は、ホモ二量体（例えば、単一特異的抗体）の形成を不安定化する。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１１／０３６４１９（ＷＯ２０１１／１４３５４５）を参照。
【０１８６】
別の手法では、二重特異性抗体は、一方のアーム内のエピトープ（例えば、ＧＩＴＲ）に向けられた抗体に対する遺伝子工学的に操作されたグルタミン含有ペプチドタグ、および別のアーム内の第２のエピトープに向けられた第２の抗体に対する遺伝子工学的に操作された別のペプチドタグ（例えば、Ｌｙｓ含有ペプチドタグまたは反応性内因性Ｌｙｓ）を、トランスグルタミナーゼの存在下で使用して生成することができる。この手法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５４８９９（ＷＯ２０１２／０５９８８２）において記載されている。
【０１８７】
本発明は、固体支持体へのカップリングを促進する作用物質（ビオチンまたはアビジンなど）にコンジュゲートした（例えば、連結した）抗体を含む組成物も提供する。単純性のために、これらの方法が本明細書に記載のＧＩＴＲ結合の実施形態のいずれかに適用されるという理解で、一般に、抗体に言及する。コンジュゲーションは一般に、本明細書に記載のこれらのコンポーネントを連結することを指す。連結（これは一般に、少なくとも投与のために、近接会合でこれらのコンポーネントを固定することである）は、任意の数の方法で実現され得る。例えば、作用物質と抗体との直接反応は、それぞれが他方の置換基と反応することができる置換基を有する場合、可能である。例えば、一方上の求核基、例えば、アミノ基またはスルフヒドリル基などは、他方上のカルボニル含有基、例えば、無水物もしくは酸ハロゲン化物など、または良好な脱離基（例えば、ハロゲン化物）を含有するアルキル基と反応することができる。
【０１８８】
抗体は、多くの異なる担体に結合することができる。担体は、活性および／または不活性であり得る。周知の担体の例としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースならびに磁鉄鉱がある。担体の性質は、本発明の目的に関して可溶性または不溶性であり得る。当業者は、結合抗体用の他の適当な担体が分かり、または日常の実験を使用してこのようなものを確認することができるであろう。一部の実施形態では、担体は、肺、心臓、または心臓弁を標的にする部分を含む。
【０１８９】
本発明の抗体またはポリペプチドは、標識化剤、例えば、蛍光性分子、放射性分子、または当技術分野で公知の任意の他の標識などに連結され得る。一般にシグナルをもたらす（直接的にまたは間接的に）標識は、当技術分野で公知である。
【０１９０】
ポリヌクレオチド、ベクター、および宿主細胞
本発明は、本明細書に記載の抗体断片および修飾抗体を含めた抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドも提供する。別の態様では、本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを作製する方法を提供する。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の手順によって作製し、発現させることができる。従って、一部の実施形態では、本発明は、以下：ｍ３Ｇ７、ｈ３Ｇ７ＶＬ１．１、ｈ３Ｇ７Ｈ１、ｈ３Ｇ７Ｈ２、ｈ３Ｇ７ＡＭ、ｈ３Ｇ７Ｒ５、ｈ３Ｇ７ＬＦ、ｈ３Ｇ７Ｎ９、ｍ１０Ｈ２、ｈ１０Ｈ２ＨＵ、ｈ１０Ｈ２ＡＭ、ｈ１０Ｈ２Ｎ１３、ｈ１０Ｈ２Ｎ１４、ｒ１８Ｈ１２、ｒ２１Ｂ６、または、ＧＩＴＲを結合する能力を有するその任意の断片もしくは部分のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド（または医薬組成物を含む組成物）を提供する。
【０１９１】
別の態様では、本発明は、発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む組成物（医薬組成物など）を提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書において記載される抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。さらに他の実施形態において、組成物は、配列番号８８および８９、配列番号９０および９１、配列番号９２および９３、配列番号９４および９５、配列番号９６および９７、配列番号９８および９９、配列番号１００および１０１、配列番号１０２および１０３、配列番号１０４および１０５、配列番号１０６および１０７、配列番号１１８および１１９、配列番号１２５および１２６、配列番号１２７および１２８に示したポリヌクレオチドのいずれかまたは両方を含む。
【０１９２】
任意のこのような配列に相補的なポリヌクレオチドも本発明によって包含される。ポリヌクレオチドは、一本鎖（コードまたはアンチセンス）であっても、二本鎖であってもよく、ＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成）であっても、ＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子には、イントロンを含有し、１対１の様式でＤＮＡ分子に対応するＨｎＲＮＡ分子、およびイントロンを含有しないｍＲＮＡ分子が含まれる。追加のコード配列または非コード配列が本発明のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、その必要はなく、ポリヌクレオチドは、他の分子および／または支持材に連結されていてもよいが、その必要はない。
【０１９３】
ポリヌクレオチドは、天然配列（すなわち、抗体またはその断片をコードする内因性配列）を含むことができ、またはこのような配列のバリアントを含むことができる。ポリヌクレオチドバリアントは、コードされるポリペプチドの免疫反応性が天然の免疫反応性分子と比べて減少しないように、１つまたは複数の置換、付加、欠失、および／または挿入を含有する。コードされるポリペプチドの免疫反応性に対する効果は、一般に、本明細書に記載するように評価することができる。バリアントは、好ましくは、自然抗体またはその断片をコードするポリヌクレオチド配列と、少なくとも約７０％の同一性、より好ましくは、少なくとも約８０％の同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％の同一性、最も好ましくは、少なくとも約９５％の同一性を呈する。
【０１９４】
２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列は、２つの配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載するように、最大対応に関してアラインメントされたとき同じである場合、「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には、比較ウィンドウにわたって配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することによって実施される。「比較ウィンドウ」は、本明細書において、少なくとも約２０の連続した位置、通常３０〜約７５、または４０〜約５０のセグメントを指し、この中で１つの配列を同じ数の連続した位置の参照配列と、２つの配列を最適にアラインメントさせた後に比較することができる。
【０１９５】
比較するための配列の最適なアラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウェアのＬａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）一式内のＭｅｇＡｌｉｇｎ（登録商標）プログラム（ＤＮＡＳＴＡＲ（登録商標），Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、デフォルトのパラメータを使用して行うことができる。このプログラムは、以下の参考文献に記載されたいくつかのアラインメントスキームを具現する：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．、１９７８、Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  −  Ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｔ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ  Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編）、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、５巻、補遺３、３４５〜３５８頁；Ｈｅｉｎ  Ｊ．、１９９０、Ｕｎｉｆｉｅｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ、６２６〜６４５頁、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１８３巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．およびＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．、１９８９、ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１〜１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．およびＭｕｌｌｅｒ  Ｗ．、１９８８、ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１〜１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．、１９７１、Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ．  １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．、Ｎｅｓ，Ｍ．、１９８７、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．  ４：４０６〜４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．およびＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．、１９７３、Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｔｈｅ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ、Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．、１９８３、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：７２６〜７３０。
【０１９６】
好ましくは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較のウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することによって求められ、ここで、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（これは、付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセント以下、通常５〜１５パーセント、または１０〜１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両配列内で起こる位置の数を求めてマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を参照配列（すなわち、ウィンドウサイズ）内の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。
【０１９７】
バリアントは、加えて、または代わりに、天然遺伝子またはその部分もしくは相補鎖に実質的に相同である。このようなポリヌクレオチドバリアントは、自然抗体（または相補配列）をコードする天然に存在するＤＮＡ配列に、中程度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。
【０１９８】
適当な「中程度にストリンジェントな条件」は、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳ、１．０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中での予洗、５０℃〜６５℃、５×ＳＳＣで一晩のハイブリダイゼーション、その後の０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×、および０．２×ＳＳＣのそれぞれを用いた６５℃で２０分間の２回の洗浄を含む。
【０１９９】
本明細書において、「高度にストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、（１）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば、５０℃で、０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを使用し、（２）ハイブリダイゼーションの間に、４２℃で、ホルムアミド、例えば、０．１％のウシ血清アルブミンを含む５０％（ｖ／ｖ）のホルムアミド／０．１％のフィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭのクエン酸ナトリウムを含むｐＨ６．５の５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液などの変性剤を使用し、または（３）４２℃で０．２×ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）および５５℃で５０％のホルムアミド中での洗浄、その後の５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を伴った、４２℃で、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％のデキストラン硫酸を使用するものである。当業者は、プローブ長などの要因に対応するために、必要に応じてどのように温度、イオン強度などを調整するかを認識するであろう。
【０２００】
遺伝コードの縮退の結果として、本明細書に記載のポリペプチドをコードする多くのヌクレオチド配列が存在することを当業者が理解することになる。これらのポリヌクレオチドのいくつかは、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列と最小の相同性を持つ。それにもかかわらず、コドン使用頻度の差異に起因して変化するポリヌクレオチドは、本発明によって具体的に企図されている。さらに、本明細書に提供するポリヌクレオチド配列を含む遺伝子の対立遺伝子は、本発明の範囲内である。対立遺伝子は、ヌクレオチドの１つまたは複数の突然変異、例えば、欠失、付加、および／または置換などの結果として変更されている内因性遺伝子である。得られるｍＲＮＡおよびタンパク質は、変更された構造または機能を有し得るが、その必要はない。対立遺伝子は、標準技法（ハイブリダイゼーション、増幅、および／またはデータベース配列比較など）を使用して同定することができる。
【０２０１】
本発明のポリヌクレオチドは、化学合成、組換え法、またはＰＣＲを使用して得ることができる。化学的なポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野で周知であり、本明細書で詳細に記載する必要はない。当業者は、所望のＤＮＡ配列を生成するために、本明細書に提供する配列、および市販のＤＮＡシンセサイザーを使用することができる。
【０２０２】
組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、本明細書でさらに論じるように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを適当なベクター中に挿入することができ、ベクターを次に、複製および増幅のために適当な宿主細胞内に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の手段によって宿主細胞内に挿入することができる。細胞は、直接取込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ−接合、または電気穿孔により、外因性ポリヌクレオチドを導入することによって形質転換される。導入された後、外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター（プラスミドなど）として細胞内で維持し、または宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる。このように増幅されたポリヌクレオチドは、当技術分野で周知の方法によって宿主細胞から単離することができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９を参照。
【０２０３】
代わりに、ＰＣＲにより、ＤＮＡ配列の複製が可能になる。ＰＣＲ技術は、当技術分野で周知であり、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，８００，１５９号、同第４，７５４，０６５号、および同第４，６８３，２０２号、ならびにＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、Ｍｕｌｌｉｓら編、Ｂｉｒｋａｕｓｗｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、１９９４に記載されている。
【０２０４】
ＲＮＡは、適切なベクター中で単離ＤＮＡを使用し、適当な宿主細胞内にこれを挿入することによって得ることができる。細胞が複製し、ＤＮＡがＲＮＡに転写される場合、次いで、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、上記に示されているように、当業者に周知の方法を使用してＲＮＡを単離することができる。
【０２０５】
適当なクローニングベクターを標準技法によって構築することができ、または当技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択することができる。選択されるクローニングベクターは、使用されるように意図された宿主細胞によって変更することができるが、有用なクローニングベクターは一般に、自己複製する能力を有することになり、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一標的を有することができ、かつ／またはベクターを含有するクローンの選択に使用することができるマーカー用遺伝子を担持することができる。適当な例としては、プラスミドならびに細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（例えば、ｐＢＳ  ＳＫ＋）およびその誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡ、ならびにｐＳＡ３およびｐＡＴ２８などのシャトルベクターがある。これらの、および多くの他のクローニングベクターは、市販供給業者、例えば、ＢｉｏＲａｄ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、およびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である。
【０２０６】
発現ベクターがさらに提供される。発現ベクターは一般に、本発明によるポリヌクレオチドを含有する複製可能ポリヌクレオチドコンストラクトである。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの一体部分として宿主細胞内で複製可能でなければならないことが暗示されている。適当な発現ベクターとしては、それだけに限らないが、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスを含めたウイルスベクター、コスミド、およびＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号に開示された発現ベクター（複数可）がある。ベクターコンポーネントとして一般に、それだけに限らないが、以下、すなわちシグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、適当な転写制御エレメント（プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなど）の１つまたは複数を挙げることができる。発現（すなわち、翻訳）のために、１つまたは複数の翻訳制御エレメント、例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドンなども通常必要とされる。
【０２０７】
対象とするポリヌクレオチドを含有するベクターは、電気穿孔、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ−デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；微粒子銃；リポフェクション；および感染（例えば、この場合、ベクターは、ワクシニアウイルスなどの感染性病原体である）を含めたいくつかの適切な手段のいずれかによって宿主細胞内に導入することができる。ベクターまたはポリヌクレオチドを導入する選択は、宿主細胞の特徴に依存することになることが多い。
【０２０８】
本発明は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞も提供する。異種ＤＮＡを過剰発現することができる任意の宿主細胞を、対象とする抗体、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする遺伝子を単離する目的に使用することができる。哺乳動物宿主細胞の非限定例としては、それだけに限らないが、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、およびＣＨＯ細胞がある。ＰＣＴ公開第ＷＯ８７／０４４６２号も参照。適当な非哺乳動物宿主細胞としては、原核生物（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＢ．スブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ）など）、および酵母（Ｓ．セレビサエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓａｅ）、Ｓ．ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）、またはＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）など）がある。好ましくは、宿主細胞は、存在する場合、宿主細胞中の対象とする、対応する内因性抗体またはタンパク質のレベルより、約５倍高い、より好ましくは１０倍高い、さらにより好ましくは２０倍高いレベルでｃＤＮＡを発現する。ＧＩＴＲまたはＧＩＴＲドメインへの特異的結合のための宿主細胞のスクリーニングは、イムノアッセイまたはＦＡＣＳによって行われる。対象とする抗体またはタンパク質を過剰発現する細胞を同定することができる。
【０２０９】
発現ベクターを抗ＧＩＴＲ抗体の直接発現に使用することができる。当業者は、ｉｎ  ｖｉｖｏで外因性タンパク質の発現を得るための発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第６，４３６，９０８号、同第６，４１３，９４２号、および同第６，３７６，４７１号を参照。発現ベクターの投与としては、注入、経口投与、粒子銃もしくはカテーテル挿入投与、および局部投与を含めた局所投与または全身投与がある。別の実施形態では、発現ベクターは、交感神経幹もしくは神経節に、または冠動脈、心房、心室、もしくは心膜内に直接投与される。
【０２１０】
発現ベクターまたはサブゲノムポリヌクレオチドを含有する治療用組成物の標的化送達も使用することができる。受容体媒介ＤＮＡ送達技法は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１９９３、１１：２０２、Ｃｈｉｏｕら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ、Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編、１９９４、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８８、２６３：６２１、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９４、２６９：５４２、Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９９０、８７：３６５５、Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９１、２６６：３３８に記載されている。ポリヌクレオチドを含有する治療用組成物は、遺伝子療法プロトコールの局所投与に関して、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇのＤＮＡの範囲内で投与される。約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇのＤＮＡの濃度範囲も、遺伝子療法プロトコールの間に使用することができる。治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源であっても、非ウイルス起源であってもよい（一般に、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、１：５１、Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９４、５：８４５、Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１９９５、１：１８５、およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、１９９４、６：１４８を参照）。このようなコード配列の発現は、内因性哺乳動物プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘導され得る。コード配列の発現は、構成的であってもよく、または制御されてもよい。
【０２１１】
所望のポリヌクレオチドを送達し、所望の細胞内で発現させるためのウイルス系ベクターは、当技術分野で周知である。例示的なウイルス系ビヒクルとしては、それだけに限らないが、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／０７９３６号、同第ＷＯ９４／０３６２２号、同第ＷＯ９３／２５６９８号、同第ＷＯ９３／２５２３４号、同第ＷＯ９３／１１２３０号、同第ＷＯ９３／１０２１８号、同第ＷＯ９１／０２８０５号、米国特許第５，２１９，７４０号および同第４，７７７，１２７号、英国特許第２，２００，６５１号、ならびに欧州特許第０３４５２４２号を参照）、アルファウイルス系ベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、ならびにベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ  ＶＲ１２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／１２６４９号、同第ＷＯ９３／０３７６９号、同第ＷＯ９３／１９１９１号、同第ＷＯ９４／２８９３８号、同第ＷＯ９５／１１９８４号、および同第ＷＯ９５／００６５５を参照）がある。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７に記載された死滅アデノウイルスに連結したＤＮＡの投与も使用することができる。
【０２１２】
それだけに限らないが、死滅アデノウイルス単独に連結した、または連結していないポリカチオン凝縮ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１９９２、３：１４７を参照）、リガンド連結ＤＮＡ（例えば、Ｗｕ、Ｊ．、Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、１９８９、２６４：１６９８５を参照）、真核細胞送達ビヒクル細胞（例えば、米国特許第５，８１４，４８２号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０７９９４号、同第ＷＯ９６／１７０７２号、同第ＷＯ９５／３０７６３号、および同第ＷＯ９７／４２３３８号を参照）、ならびに核電荷中和または細胞膜との融合を含めた、非ウイルス送達ビヒクルならびに方法も使用することができる。裸のＤＮＡも使用することができる。例示的な裸のＤＮＡ導入方法は、ＰＣＴ公開第ＷＯ９０／１１０９２号、および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用することができるリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／１３７９６号、同第ＷＯ９４／２３６９７号、同第ＷＯ９１／１４４４５号、およびＥＰ０５２４９６８に記載されている。追加の手法は、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．、１９９４、１４：２４１１、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、１９９４、９１：１５８１に記載されている。
【０２１３】
組成物
本発明は、有効量の本明細書に記載の抗ＧＩＴＲ抗体を含む医薬組成物も提供する。このような組成物の例および製剤化方法も、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、組成物は、１種または複数の抗ＧＩＴＲ抗体を含む。他の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＧＩＴＲを認識する。他の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ヒト抗体である。他の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、所望の免疫応答、例えば、抗体媒介溶解、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰなどを誘発することができる定常領域を含む。他の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、望まれない、または望ましくない免疫応答、例えば、抗体媒介溶解、ＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰなどを誘発しない定常領域を含む。他の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、抗体の１つまたは複数のＣＤＲ（１、２、３、４、５、または一部の実施形態では、６つすべてのＣＤＲなど）を含む。
【０２１４】
組成物は、１種を超える抗ＧＩＴＲ抗体（例えば、ＧＩＴＲの異なるエピトープを認識するＧＩＴＲ抗体の混合物）を含み得ることが理解される。他の例示的な組成物は、同じエピトープ（複数可）を認識する１種を超える抗ＧＩＴＲ抗体、またはＧＩＴＲの異なるエピトープに結合する抗ＧＩＴＲ抗体の異なる種を含む。一部の実施形態では、組成物は、ＧＩＴＲの異なるバリアントを認識する抗ＧＩＴＲ抗体の混合物を含む。
【０２１５】
本発明で使用される組成物は、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２０版、２０００、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ）をさらに含むことができる。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、投与量および濃度でレシピエントに無毒性であり、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸など；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベンなど；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなど；グルコース、マンノース、もしくはデキストランを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含むことができる。薬学的に許容できる賦形剤は、本明細書でさらに記載されている。
【０２１６】
抗ＧＩＴＲ抗体およびその組成物はまた、作用物質の有効性を増強および／または補完するように機能を果たす他の作用物質と併せて使用し、または別個に、同時に、もしくは順次投与することができる。
【０２１７】
本発明は、本発明のポリヌクレオチドのいずれかを含む、医薬組成物を含めた組成物も提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。他の実施形態では、組成物は、本明細書に記載の抗体のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む。
【０２１８】
ＧＩＴＲによって媒介される状態を予防または治療するための方法
本発明の抗体および抗体コンジュゲートは、それだけに限らないが、治療的処置方法および診断的処置方法を含めた、様々な用途で有用である。
【０２１９】
一態様では、本発明は、がんを治療するための方法を提供する。一部の実施形態では、対象におけるがんを治療する方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載のＧＩＴＲ抗体のいずれかを含む有効量の組成物（例えば、医薬組成物）を投与するステップを含む。本明細書において使用する場合、がんとしては、それだけに限らないが、Ｂ細胞関連がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、小腸がん、肉腫、頭頸部がん（例えば、扁平上皮細胞頭頸部がん）、胸腺がん、上皮がん、唾液腺がん、肝がん、胆管がん、神経内分泌腫瘍、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、甲状腺がん、肺がん、中皮腫、卵巣がん、乳がん、前立腺がん、食道がん、膵がん、神経膠腫、腎がん（例えば、腎細胞癌）、膀胱がん、子宮頚がん、子宮がん、外陰がん、陰茎がん、精巣がん、肛門がん、絨毛癌、結腸直腸がん、口腔がん、皮膚がん、メルケル細胞癌、神経膠芽腫、脳腫瘍、骨がん、眼がん、および黒色腫がある。
【０２２０】
一部の実施形態では、Ｂ細胞関連がんとしては、それだけに限らないが、多発性骨髄腫、悪性形質細胞新生物、ホジキンリンパ腫、結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫、カーレル病および骨髄腫症、形質細胞白血病、形質細胞腫、Ｂ細胞性前リンパ性白血病、有毛細胞白血病、Ｂ細胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、濾胞性リンパ腫、バーキットリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、前駆Ｂリンパ芽球性リンパ腫、骨髄性白血病、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、濾胞性リンパ腫、辺縁帯リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫、小細胞型リンパ性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、原発性縦隔（胸腺）大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、リンパ形質細胞性リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞性リンパ腫、脾辺縁帯リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性滲出性リンパ腫、リンパ腫様肉芽腫症、Ｔ細胞／組織球豊富型大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性皮膚びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（下肢型）、高齢者のＥＢＶ陽性びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、炎症を伴うびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、ＡＬＫ陽性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、形質芽球性リンパ腫、ＨＨＶ８関連多中心性キャッスルマン病で生じる大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫とバーキットリンパ腫との間の中間的特徴を有する未分類のＢ細胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫と古典型ホジキンリンパ腫との間の中間的特徴を有する未分類のＢ細胞性リンパ腫、および他のＢ細胞関連リンパ腫である。
【０２２１】
一部の実施形態では、がんは、再発しているかまたは難治性である。
【０２２２】
一部の実施形態では、がんは、局所進行性もしくは転移性黒色腫、扁平上皮細胞頭頸部がん（ＳＣＨＮＣ）、卵巣がん、腎がん、胃がん（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、または肺がん（例えば、ＮＳＣＬＣ（非小細胞肺がん））である。
【０２２３】
一部の実施形態では、対象における腫瘍増殖または進行を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のＧＩＴＲ抗体を含む有効量の組成物を投与するステップを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、対象におけるがん細胞の転移を阻害する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載のＧＩＴＲ抗体のいずれかを含む有効量の組成物を投与するステップを含む、方法が提供される。他の実施形態では、対象における腫瘍の退縮を誘導する方法であって、それを必要とする対象に、本明細書に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のいずれかを含む有効量の組成物を投与するステップを含む、方法が提供される。
【０２２４】
別の態様では、がんを検出、診断、および／または監視する方法が提供される。例えば、本明細書に記載の抗ＧＩＴＲ抗体は、造影剤および酵素−基質標識などの検出可能部分で標識することができる。本明細書に記載の抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏイメージング（例えば、ＰＥＴもしくはＳＰＥＣＴ）などのｉｎ  ｖｉｖｏ診断アッセイ、または染色試薬に使用することもできる。
【０２２５】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、追加の形態の療法で対象を治療するステップをさらに含む。一部の実施形態では、追加の形態の療法は、それだけに限らないが、化学療法、放射線、手術、ホルモン療法、および／または追加の免疫療法を含めた追加の抗がん療法である。
【０２２６】
本明細書に記載のすべての方法に関して、抗ＧＩＴＲアンタゴニスト抗体への言及は、１種または複数の追加の作用物質を含む組成物も含む。これらの組成物は、当技術分野で周知である、緩衝剤を含めた薬学的に許容できる賦形剤などの適当な賦形剤をさらに含み得る。本発明は、単独で、または治療の他の方法と組み合わせて使用することができる。
【０２２７】
抗ＧＩＴＲアンタゴニスト抗体は、任意の適当な経路を介して対象に投与することができる。本明細書に記載の例は、利用可能な技法を限定するように意図されておらず、例示するものであるように意図されていることが当業者に明らかであるはずである。したがって、一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲアンタゴニスト抗体は、公知の方法、例えば、ボーラスのような静脈内投与、またはある時間にわたる持続注入によるもの、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、経皮、皮下、関節内、舌下、滑液包内や、ガス注入を介した、クモ膜下、経口、吸入、または局部的の経路によるものなどに合わせて対象に投与される。投与は、全身的、例えば、静脈内投与であっても、局在的であってもよい。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含めた液体製剤用市販噴霧器は、投与に有用である。液体製剤を直接噴霧することができ、凍結乾燥粉末を再構成後に噴霧することができる。代わりに、抗ＧＩＴＲアンタゴニスト抗体は、フルオロカーボン製剤および定量吸入器を使用してエアロゾル化することができ、凍結乾燥し、粉砕した粉末として吸入することができる。
【０２２８】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、部位特異的、または標的化局所的送達技法を介して投与される。部位特異的、または標的化局所的送達技法の例としては、抗ＧＩＴＲ抗体の様々な移植可能なデポー源、または局所的送達カテーテル、例えば、注入カテーテル、留置カテーテル、もしくはニードルカテーテルなど、合成移植片、外膜ラップ、シャントおよびステントもしくは他の埋め込み型デバイス、部位特異的担体、直接注入、または直接塗布がある。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／５３２１１号および米国特許第５，９８１，５６８号を参照。
【０２２９】
抗ＧＩＴＲ抗体の様々な製剤が投与のために使用され得る。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、そのまま投与することができる。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体および薬学的に許容できる賦形剤は、様々な製剤中に存在し得る。薬学的に許容できる賦形剤は、当技術分野で公知であり、薬理学的に有効な物質の投与を促進する相対的に不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形態もしくは粘稠度を与え、または希釈剤として作用することができる。適当な賦形剤としては、それだけに限らないが、安定化剤、湿潤剤および乳化剤、モル浸透圧濃度を変更するための塩、封入剤、緩衝剤、および皮膚浸透エンハンサーがある。非経口および非腸管外の（ｎｏｎｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）薬物送達用賦形剤および製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００に示されている。
【０２３０】
一部の実施形態では、これらの作用物質は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）による投与のために製剤化される。したがって、これらの作用物質は、薬学的に許容できるビヒクル、例えば、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液などと組み合わせることができる。特定の投薬レジメン、すなわち、用量、タイミング、および繰り返しは、特定の個体およびその個体の医療歴に依存することになる。
【０２３１】
抗ＧＩＴＲ抗体は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）によってを含めて、任意の適当な方法を使用して投与することができる。抗ＧＩＴＲ抗体は、本明細書に記載するように、局部的に、または吸入を介して投与することもできる。一般に、抗ＧＩＴＲ抗体の投与では、候補投与量は、毎日、毎週、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、６週間毎、７週間毎、８週間毎、１０週間毎、１２週間毎、または１２週間超毎に投与することができる。状態に応じて数日間またはそれ以上にわたって投与を繰り返すことに関して、治療は、症状の所望の抑制が起こるまで、または例えば、がんに関連した症状を低減するのに十分な治療レベルが実現されるまで持続される。この療法の進行は、慣例的な技法およびアッセイによって容易に監視される。投薬レジメン（使用される抗ＧＩＴＲ抗体を含む）は、経時的に変更することができる。
【０２３２】
一部の実施形態では、候補投与量は、上述した要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上のいずれかの範囲の投与量を毎日投与される。例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、および約２５ｍｇ／ｋｇの１日投与量を使用することができる。
【０２３３】
一部の実施形態では、候補投与量は、上述した要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上のいずれかの範囲の投与量を毎週投与される。例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、および約３０ｍｇ／ｋｇの毎週投与量を使用することができる。
【０２３４】
一部の実施形態では、候補投与量は、上述した要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上のいずれかの範囲の投与量を２週間毎に投与される。例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、および約３０ｍｇ／ｋｇの２週間毎の投与量を使用することができる。
【０２３５】
一部の実施形態では、候補投与量は、上述した要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上のいずれかの範囲の投与量を３週間毎に投与される。例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、および約５０ｍｇ／ｋｇの３週間毎の投与量を使用することができる。
【０２３６】
一部の実施形態では、候補投与量は、上述した要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約３０μｇ／ｋｇ〜約３００μｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ〜約３０ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、またはそれ以上のいずれかの範囲の投与量を毎月または４週間毎に投与される。例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２．５ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、および約５０ｍｇ／ｋｇの毎月投与量を使用することができる。
【０２３７】
他の実施形態では、候補投与量は、上述した要因に応じて、約０．０１ｍｇ〜約１２００ｍｇまたはそれ以上の範囲の投与量を毎日投与される。例えば、約０．０１ｍｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約１０ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、または約１２００ｍｇの１日投与量を使用することができる。
【０２３８】
他の実施形態では、候補投与量は、上述した要因に応じて、約０．０１ｍｇ〜約２０００ｍｇまたはそれ以上の範囲の投与量を毎週投与される。例えば、約０．０１ｍｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約１０ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１９００ｍｇ、または約２０００ｍｇの毎週投与量を使用することができる。
【０２３９】
他の実施形態では、候補投与量は、上述した要因に応じて、約０．０１ｍｇ〜約２０００ｍｇまたはそれ以上の範囲の投与量を２週間毎に投与される。例えば、約０．０１ｍｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約１０ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１９００ｍｇ、または約２０００ｍｇの２週間毎の投与量を使用することができる。
【０２４０】
他の実施形態では、候補投与量は、上述した要因に応じて、約０．０１ｍｇ〜約２５００ｍｇまたはそれ以上の範囲の投与量を３週間毎に投与される。例えば、約０．０１ｍｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約１０ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１９００ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２１００ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２３００ｍｇ、約２４００ｍｇ、または約２５００ｍｇの３週間毎の投与量を使用することができる。
【０２４１】
他の実施形態では、候補投与量は、上述した要因に応じて、約０．０１ｍｇ〜約３０００ｍｇまたはそれ以上の範囲の投与量を４週間毎または毎月投与される。例えば、約０．０１ｍｇ、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、約１０ｍｇ、約５０ｍｇ、約１００ｍｇ、約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１０００ｍｇ、約１１００ｍｇ、約１２００ｍｇ、約１３００ｍｇ、約１４００ｍｇ、約１５００ｍｇ、約１６００ｍｇ、約１７００ｍｇ、約１８００ｍｇ、約１９００ｍｇ、約２０００ｍｇ、約２１００ｍｇ、約２２００ｍｇ、約２３００ｍｇ、約２４００ｍｇ、約２５００ｍｇ、約２６００ｍｇ、約２７００ｍｇ、約２８００ｍｇ、約２９００ｍｇ、または約３０００ｍｇの毎月投与量を使用することができる。
【０２４２】
本発明の目的に関して、抗ＧＩＴＲ抗体の適切な投与量は、使用される抗ＧＩＴＲ抗体（またはその組成物）、治療される症状のタイプおよび重症度、作用物質が予防目的または治療目的に投与されるか否か、以前の療法、患者の病歴および作用物質に対する応答、投与される作用物質の患者のクリアランス速度、ならびに主治医の自由裁量に依存する。一般に、臨床医は、抗ＧＩＴＲ抗体を、投与量が所望の結果を実現するものに到達するまで投与する。用量および／または頻度は、治療の過程にわたって変更することができる。半減期などの経験的な考慮事項は一般に、投与量の決定に寄与する。例えば、ヒト免疫系と適合した抗体、例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体などを、抗体の半減期を延ばし、抗体が宿主の免疫系によって攻撃されるのを防止するために使用することができる。投与の頻度は、療法の過程にわたって決定および調整することができ、症状の治療および／または抑制および／または緩和および／または遅延に必ずではないが一般に基づく。代わりに、抗ＧＩＴＲ抗体の持続的連続的放出製剤が適切となり得る。徐放を実現するための様々な製剤およびデバイスが当技術分野で公知である。
【０２４３】
一実施形態では、抗体の投与量は、抗体の１つまたは複数の投与を与えられた個体において経験的に決定され得る。例えば、個体は、抗ＧＩＴＲ抗体の漸増投与量を与えられる。有効性を評価するために、疾患の指標をフォローすることができる。
【０２４４】
本発明の方法による本明細書記載の抗ＧＩＴＲ抗体の投与は、例えば、レシピエントの生理的条件、投与の目的が治療的であるか、または予防的であるか、および熟練した開業医に公知の他の要因に応じて、連続的であっても、断続的であってもよい。抗ＧＩＴＲ抗体の投与は、予め選択された時間にわたって本質的に連続的であってもよく、または間隔を置いた一連の投薬におけるものであってもよい。
【０２４５】
一部の実施形態では、１種を超える抗ＧＩＴＲ抗体が存在する場合がある。少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なる、またはそれ超の抗体が存在し得る。一般に、これらの抗ＧＩＴＲ抗体は、互いに悪影響しない相補的な活性を有し得る。
【０２４６】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、１種または複数の追加の治療剤の投与と組み合わせて投与することができる。これらとしては、それだけに限らないが、生物治療剤、化学療法剤、ワクチン、ＣＡＲ−Ｔ細胞ベース療法、放射線療法、サイトカイン療法（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＦＮγ、ＩＦＮα、ＩＬ−８）、ワクチン、他の免疫抑制経路の阻害剤、血管新生の阻害剤、Ｔ細胞活性化因子、代謝経路の阻害剤、ｍＴＯＲ（ラパマイシンの機械論的標的）阻害剤（例えば、ラパマイシン、ラパマイシン誘導体、シロリムス、テムシロリムス、エベロリムス、およびデフォロリムス）、アデノシン経路の阻害剤、それだけに限らないが、インライタ、ＡＬＫ（退形成性リンパ腫キナーゼ）阻害剤（例えば、クリゾチニブ、セリチニブ、アレクチニブ、およびスニチニブ）を含むチロシンキナーゼ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤（例えば、ベムラフェニブおよびダブラフェニブ）、エピジェネティック調節剤、Ｔｒｅｇ細胞および／または骨髄由来抑制細胞の阻害剤または枯渇薬、ＪＡＫ（ヤーヌスキナーゼ）阻害剤（例えば、ルキソリチニブおよびトファシチニブ、バリシチニブ、フィルゴチニブ、ガンドチニブ、レスタウルチニブ、モメロチニブ、パクリチニブ、ならびにウパダシチニブ）、ＳＴＡＴ（シグナル伝達物質および転写活性化因子）阻害剤（例えば、フルダラビンなどのＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、およびＳＴＡＴ５阻害剤）、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤、免疫原性剤（例えば、減弱がん性細胞、腫瘍抗原、腫瘍由来抗原または核酸をパルスした樹状細胞などの抗原提示細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮα２、ＧＭ−ＣＳＦ）、ＭＥＫ阻害剤（例えば、トラメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、およびセルメチニブ）、ＧＬＳ１阻害剤、ＰＡＰ阻害剤、腫瘍溶解性ウイルス、ＩＤＯ（インドールアミン−ピロール２，３−ジオキシゲナーゼ）阻害剤、ならびに、それだけに限らないがＧＭ−ＣＳＦなどの免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞の投与がある。
【０２４７】
一部の実施形態では、生物治療剤は、それだけに限らないが、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗４−１ＢＢ抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、ＩＬ−８抗体、抗ＨＶＥＭ抗体、抗ＢＴＬＡ抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＣＤ４０Ｌ抗体、抗ＣＤ４７抗体、抗ＣＳＦ１Ｒ抗体、抗ＣＳＦ１抗体、抗ＭＡＲＣＯ抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＶＥＧＦＲ１抗体、抗ＶＥＧＦＲ２抗体、抗ＴＮＦＲ１抗体、抗ＴＮＦＲ２抗体、抗ＣＤ３二重特異性抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗Ｈｅｒ２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ５２抗体、抗ＣＣＲ４抗体、抗ＣＣＲ８抗体、抗ＣＤ２００Ｒ抗体、抗ＶＩＳＧ４抗体、抗ＣＣＲ２抗体、抗ＬＩＬＲｂ２抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＤ２０６抗体、抗ＣＤ１６３抗体、抗ＫＬＲＧ１抗体、抗ＦＬＴ３抗体、抗Ｂ７−Ｈ４抗体、抗Ｂ７−Ｈ３抗体、または第２の抗ＧＩＴＲ抗体を含む、抗体である。
【０２４８】
従って、一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えばＢＭＳ−９３６５５９（ＭＤＸ−１１０５）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、およびアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）などの抗ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト抗体；例えばニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、およびピジリズマブなどの抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体；例えばイピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標））などの抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体；ＢＭＳ−９８６０１６およびＩＭＰ７０１などの抗ＬＡＧ−３アンタゴニスト抗体；抗ＴＩＭ−３アンタゴニスト抗体；例えばＭＧＡ２７１などの抗Ｂ７−Ｈ３アンタゴニスト抗体；抗ＶＩＳＴＡアンタゴニスト抗体；抗ＴＩＧＩＴアンタゴニスト抗体；抗ＣＤ２８アンタゴニスト抗体；抗ＣＤ８０抗体；抗ＣＤ８６抗体；抗Ｂ７−Ｈ４アンタゴニスト抗体；抗ＩＣＯＳアゴニスト抗体；抗ＣＤ２８アゴニスト抗体；自然免疫応答モジュレーター（例えば、ＴＬＲ、ＫＩＲ、ＮＫＧ２Ａ）、およびＩＤＯ阻害剤と併せて使用される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えばＰＦ−０５０８２５６６またはウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）などの４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストと併せて使用される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば抗ＯＸ−４０アゴニスト抗体などのＯＸ４０アゴニストと併せて使用される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えばＴＲＸ５１８などの別のＧＩＴＲアゴニストと併せて使用される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、ＩＤＯ阻害剤と併せて使用される。一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、例えば限定することなく、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−３３、ＣＳＦ−１、ＭＣＳＦ−１などのサイトカイン療法と併せて使用される。
【０２４９】
化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミドなど；スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファンなど；アジリジン、例えば、ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、およびウレドパなど；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロールオメラミン（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ）を含めたエチレンイミンおよびメチルアメラミン；アセトゲニン（特にブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９、およびＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロランブシル、クロルナファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなど；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマ１およびカリケアマイシンファイＩ１、例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３：１８３〜１８６（１９９４）を参照；ジネマイシンＡを含めたジネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシンを含む）、ＰＥＧ化リポソームドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシンなど；抗代謝産物、例えば、メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセートなど；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなど；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；抗副腎剤（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デホファミン；デメコルシン；ジアジクォン；エルフォルミチン；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシウレア；レンチナン；ロニダミン；マイタンシノイド、例えば、マイタンシンおよびアンサミトシンなど；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２、２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドキセタキセル；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチンなど；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸、または誘導体がある。例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（ファレストン）を含めた抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）などの腫瘍に対するホルモン作用を制御または阻害するように作用する抗ホルモン剤；副腎におけるエストロゲン生成を制御する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール、エキセメスタン、フォルメスタン、ファドロゾール、ボロゾール、レトロゾール、およびアナストロゾールなど；ならびに抗アンドロゲン、例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリンなど；ならびに上記のいずれかの薬学的に許容できる塩、酸、または誘導体も含まれる。
【０２５０】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、免疫チェックポイントモジュレーターを標的にする１種または複数の他の治療剤、例えば、限定することなく、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−ＤＣ（ＰＤ−Ｌ２）、Ｂ７−Ｈ５、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ８、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳ−Ｌ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２、ＣＤ４７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４８、ＣＤ５８、ＣＤ２２６、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２、ＬＡＩＲ１、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＭ１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ４、ＶＩＳＴＡ（ＰＤ−Ｈ１）、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、４−ＢＢＬ、ＤＲ３、ＴＬ１Ａ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０）、ＳＬＡＭＦ２（ＣＤ４８）、ＳＬＡＭＦ３（ＣＤ２２９）、ＳＬＡＭＦ４（２Ｂ４、ＣＤ２４４）、ＳＬＡＭＦ５（ＣＤ８４）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ）、ＳＬＡＭＣＦ７（ＣＳ１）、ＳＬＡＭＦ８（ＢＬＡＭＥ）、ＳＬＡＭＦ９（ＣＤ２Ｆ）、ＣＤ２８、ＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６ａ）、ＣＥＡＣＡＭ３、ＣＥＡＣＡＭ４、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＥＡＣＡＭ６、ＣＥＡＣＡＭ７、ＣＥＡＣＡＭ８、ＣＥＡＣＡＭ１−３ＡＳ、ＣＥＡＣＡＭ３Ｃ２、ＣＥＡＣＡＭ１−１５、ＰＳＧ１−１１、ＣＥＡＣＡＭ１−４Ｃ１、ＣＥＡＣＡＭ１−４Ｓ、ＣＥＡＣＡＭ１−４Ｌ、ＩＤＯ、ＴＤＯ、ＣＣＲ２、ＣＤ３９−ＣＤ７３−アデノシン経路（Ａ２ＡＲ）、ＢＴＫ、ＴＩＫ、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＣＲ５、ＶＥＧＦ経路、ＣＳＦ−１、または自然免疫応答モジュレーターを標的にする作用物質などと併せて使用される。
【０２５１】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体は、生物治療剤および化学療法剤と併せて使用される。例えば、有効量の本明細書において記載される抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト抗体（例えば、アベルマブ）、および化学療法剤（例えば、ゲムシタビン、メトトレキサート、または白金類似体）を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象におけるがんを治療するための方法が提供される。一部の実施形態では、有効量の本明細書において記載される抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＰＤ−１アンタゴニスト抗体（例えば、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））またはペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標））、および化学療法剤（例えば、ゲムシタビン、メトトレキサート、または白金類似体）を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象におけるがんを治療するための方法が提供される。一部の実施形態では、有効量の本明細書において記載される抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト抗体（例えば、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ（登録商標）））、および化学療法剤（例えば、ゲムシタビン、メトトレキサート、または白金類似体）を対象に投与するステップを含む、それを必要とする対象におけるがんを治療するための方法が提供される。
【０２５２】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体療法は、数分〜数週間の範囲の間隔によって他の作用物質治療に先行し、またはそれに続く場合がある。他の作用物質および／またはタンパク質もしくはポリヌクレオチドが別個に投与される実施形態では、一般に、著しい時間がそれぞれの送達間で経過せず、その結果本発明の作用物質および組成物が依然として対象に有利に組み合わされた効果を発揮することができることを保証するはずである。このような場合では、両モダリティーを互いに約１２〜２４時間以内に、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に投与することができることが企図される。いくつかの状況では、投与の時間を大きく延長することが望ましい場合があるが、この場合、数日（２、３、４、５、６、または７）〜数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）がそれぞれの投与間で経過する。
【０２５３】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体組成物は、クリゾチニブ、パルボシクリブ、ゲムシタビン、シクロホスファミド、フルオロウラシル、フォルフォックス、ホリン酸、オキサリプラチン、アキシチニブ、スニチニブリンゴ酸塩、トファシチニブ、ベバシズマブ、リツキシマブ、およびトラスツズマブから選択される第２の作用物質を含む。
【０２５４】
一部の実施形態では、抗ＧＩＴＲ抗体組成物は、手術、放射線療法、化学療法、標的療法、免疫療法、ホルモン療法、血管新生阻害、および緩和ケアからなる群から選択される伝統的な療法をさらに含む治療レジメンと組み合わされる。
【０２５５】
製剤
本発明によって使用される抗ＧＩＴＲ抗体の治療製剤は、凍結乾燥製剤または水性液剤の形態で、所望の程度の純度を有する抗体を、任意選択の薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００）と混合することによって、貯蔵用に調製することができる。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに無毒性であり、緩衝剤、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸など；塩化ナトリウムなどの塩；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベンなど；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなど；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；糖、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなど；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤、例えば、ＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などを含むことができる。
【０２５６】
抗ＧＩＴＲ抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４０３０（１９８０）；ならびに米国特許第４，４８５，０４５号、および同第４，５４４，５４５号に記載されたものなどの、当技術分野で公知の方法によって調製される。循環時間が増強されたリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール、およびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いて、逆相蒸発法によって生成することができる。リポソームは、所望の直径を有するリポソームを生じるように、規定孔サイズのフィルターを通して押し出される。
【０２５７】
活性成分は、コロイド薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル）内で、またはマクロエマルジョン内で、例えば、コアセルベーション技法によって、または界面重合によって調製されるマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセル、およびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセル中に封入することもできる。このような技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）に開示されている。
【０２５８】
徐放配合物を調製することができる。徐放配合物の適当な例には、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、これらのマトリックスは、造形品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態にある。徐放マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸と７エチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射用ミクロスフェア）など、スクロースアセテートイソブチレート、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸がある。
【０２５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用される製剤は、滅菌されていなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を通す濾過によって容易に達成される。治療用抗ＧＩＴＲ抗体組成物は一般に、滅菌したアクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針で穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアル内に入れられる。
【０２６０】
本発明による組成物は、経口、非経口もしくは直腸投与、または吸入もしくはガス注入による投与のための単位剤形、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、液剤もしくは懸濁剤、または坐剤などであり得る。
【０２６１】
錠剤などの固体組成物を調製するために、主な活性成分は、薬学的担体、例えば、慣例的な錠剤化成分、例えば、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウム、またはガムなど、および他の薬学的希釈剤、例えば、水と混合されて、本発明の化合物、または無毒性の薬学的に許容できるその塩の均質な混合物を含有する固体予備製剤組成物が形成される。これらの予備製剤組成物が均質であるという場合、活性成分が組成物全体にわたって均等に分散されており、その結果、組成物が同様に有効な単位剤形、例えば、錠剤、丸剤、およびカプセル剤などに容易にさらに分割され得ることを意味する。次いで、この固体予備製剤組成物は、約０．１〜約５００ｍｇの本発明の活性成分を含有する上述したタイプの単位剤形にさらに分割される。新規組成物の錠剤または丸剤は、持続性作用の利点をもたらす剤形を提供するために、被覆または他の方法で調合することができる。例えば、錠剤または丸剤は、内側投与および外側投与コンポーネントを含むことができ、後者は、前者の上の外被の形態である。２つのコンポーネントは、胃内での崩壊に耐える機能を果たし、内側コンポーネントがインタクトで十二指腸内に入り、または放出が遅延されることを可能にする腸溶性層によって分離することができる。様々な材料を、このような腸溶性層または被覆に使用することができ、このような材料には、多数のポリマー酸ならびにシェラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースのような材料とのポリマー酸の混合物が含まれる。
【０２６２】
適当な表面活性剤としては、特に、非イオン性剤、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン（例えば、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０、または８５）、および他のソルビタン（例えば、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０、または８５）などがある。表面活性剤を含む組成物は、好都合には、０．０５〜５％の間の表面活性剤を含むことになり、０．１〜２．５％の間であり得る。必要であれば、他の成分、例えば、マンニトールまたは他の薬学的に許容できるビヒクルを添加することができることが理解されるであろう。
【０２６３】
適当なエマルジョンは、市販の脂肪エマルジョン、例えば、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）、およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などを使用して調製することができる。活性成分を、予備混合エマルジョン組成物中に溶解させることができ、または代わりに、活性成分を、油（例えば、ダイズ油、サフラワー油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油、または扁桃油）、ならびにリン脂質（例えば、卵リン脂質、ダイズリン脂質、またはダイズレシチン）および水と混合して形成されたエマルジョン中に溶解させることができる。エマルジョンの張性を調整するために、他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースを添加してもよいことが理解されるであろう。適当なエマルジョンは一般に、最大２０％の油、例えば、５〜２０％の間の油を含有することになる。脂肪エマルジョンは、０．１〜１．０μｍ、特に０．１〜０．５μｍの間の脂肪滴を含み、５．５〜８．０の範囲内のｐＨを有することができる。
【０２６４】
エマルジョン組成物は、抗ＧＩＴＲ抗体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはそのコンポーネント（ダイズ油、卵リン脂質、グリセロール、および水）と混合することによって調製されるものであり得る。
【０２６５】
吸入またはガス注入用組成物は、薬学的に許容できる水性溶媒もしくは有機溶媒、またはこれらの混合物中の溶液および懸濁液、ならびに粉末を含む。液体または固体組成物は、上記に示した適当な薬学的に許容できる賦形剤を含有し得る。一部の実施形態では、組成物は、局所的または全身的効果のために、経口呼吸経路または鼻呼吸経路によって投与される。好ましくは滅菌した薬学的に許容できる溶媒中の組成物は、ガスを使用して霧状化することができる。霧状化溶液は、噴霧器から直接吸い込むことができ、または噴霧器をフェイスマスク、テント、もしくは間欠的陽圧呼吸機に取り付けてもよい。溶液、懸濁液、または粉末組成物は、適切な様式で製剤を送達するデバイスから、好ましくは経口的または経鼻的に投与することができる。
【０２６６】
キット
本発明は、本明細書に記載の抗体のいずれかまたはすべてを含むキットも提供する。本発明のキットは、本明細書に記載の抗ＧＩＴＲ抗体を含む１つまたは複数の容器、および本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従って使用するための指示書を含む。一般に、これらの指示書は、上述した治療的処置のための抗ＧＩＴＲ抗体の投与の記述を含む。一部の実施形態では、キットは、単回用量投与ユニットを生成するために提供される。ある特定の実施形態では、キットは、乾燥タンパク質を有する第１の容器および水性製剤を有する第２の容器の両方を含有し得る。ある特定の実施形態では、シングルおよびマルチチャンバー型プレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ）を含有するキットが含まれる。
【０２６７】
一部の実施形態では、抗体は、ヒト抗体である。一部の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。一部の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。抗ＧＩＴＲ抗体の使用に関する指示書は、一般に、意図された治療のための投与量、投薬スケジュール、および投与経路に関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、マルチドーズパッケージ）、またはサブユニット用量のものであり得る。本発明のキット内に供給される指示書は、一般に、ラベルまたは添付文書（例えば、キット内に含まれる紙シート）での書面による指示書であるが、機械可読な指示書（例えば、磁気または光記憶ディスクで携帯される指示書）も許容できる。
【０２６８】
本発明のキットは、適当な包装内にある。適当な包装としては、それだけに限らないが、バイアル、ボトル、広口瓶、フレキシブル包装（例えば、密封されたマイラーバッグまたはビニール袋）などがある。特定のデバイス、例えば、吸入器、経鼻投与デバイス（例えば、アトマイザ）、またはミニポンプなどの注入デバイスなどと組み合わせて使用するためのパッケージも企図されている。キットは、滅菌したアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。容器も、滅菌したアクセスポートを有することができる（例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１種の活性剤は、抗ＧＩＴＲ抗体である。容器は、第２医薬活性剤をさらに含むことができる。
【０２６９】
キットは、追加のコンポーネント、例えば、緩衝液および解釈情報などを任意選択により提供することができる。通常、キットは、容器、および容器上の、またはこれに付随したラベルまたは添付文書（複数可）を含む。
【０２７０】
生物学的寄託
本発明の代表的な材料は、２０１６年１１月１０日にアメリカンタイプカルチャーコレクション、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．  ２０１１０−２２０９、ＵＳＡに寄託した。ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３６３２を有するベクターｈ３Ｇ７Ｒ５−ＶＨは、ｈ３Ｇ７Ｒ５重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドであり、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−１２３６３３を有するベクターは、ｈ３Ｇ７Ｒ５軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドである。寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約およびその下の規定（ブダペスト条約）の条項下で行った。これにより、寄託日から３０年間、寄託物の生存培養が保証される。寄託物は、ブダペスト条約の条項、ならびにＰｆｉｚｅｒ，Ｉｎｃ．とＡＴＣＣとの契約の対象であって、関係する米国特許の発行の後、または米国もしくは外国特許出願の公共への公開の後のいずれか早い方に、公共に寄託物の培養の子孫の永続的および非制限的利用可能性を保証し、米国特許法第１２２条およびこれに準じた長官規則（８８６ＯＧ６３８を特に参照して連邦規則法典第３７巻第１．１４条を含む）によって、米国特許商標庁長官が権利を有すると決定したものへの子孫の利用可能性を保証する、契約の対象の下でＡＴＣＣによって利用可能にされることになる。
【０２７１】
本願の代理人は、寄託した材料の培養物が、適当な条件下で培養されたとき、死滅し、または失われ、もしくは破壊された場合、通知された後、材料を別の同じものに即座に置き換えることに同意している。寄託した材料の利用可能性は、任意の政府の権限下でその特許法に従って付与された権利に違反した本発明の実施のライセンスと解釈されるべきでない。
【０２７２】
以下の実施例は、例示的な目的だけのために提供されており、本発明の範囲を決して限定するように意図されていない。実際に、本明細書に示し、記載したものに加えて、本発明の様々な修正形態が、前述の説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲内に入る。
【実施例】
【０２７３】
（実施例１）
ヒト末梢血Ｔ細胞におけるＧＩＴＲの発現。
この実施例は、ヒトの末梢血におけるわずかな画分のＴ細胞サブセットによるＧＩＴＲの発現を記載する。
【０２７４】
健康なドナーの末梢血におけるＴ細胞上でのＧＩＴＲの発現を評価した。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−通常Ｔ（Ｔｃｏｎｖ）細胞（４．７５＋／−１．３％のＧＩＴＲ陽性細胞）、またはＣＤ８＋Ｔ細胞（１．６８＋／−０．４％のＧＩＴＲ陽性細胞）と比較して、有意に多い画分のＧＩＴＲ発現細胞（１４．３５＋／−１．９％）を含有していた（図１Ａ）。ＧＩＴＲ陽性細胞に結合する抗ＧＩＴＲ抗体の密度は、ＴｒｅｇまたはＣＤ８＋Ｔ細胞と比較して、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞で有意に低かった（図１Ｂ）。Ｔｒｅｇ細胞は、末梢血単核球の１．７２３＋／−０．６１％を含む小さい画分であり、その一方で、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖは３３．８８＋／−３％を含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞は２０．９５＋／−５．４％を含む（図１Ｃ）。
【０２７５】
（実施例２）
ヒトにおける腎細胞癌の免疫細胞浸潤におけるＧＩＴＲおよびＯＸ４０の発現
この実施例は、腎細胞癌（ＲＣＣ）関連ＴｒｅｇにおけるＧＩＴＲおよびＯＸ４０の発現レベルを記載する。
【０２７６】
Ｔ細胞浸潤腎細胞癌上でのＧＩＴＲおよびＯＸ４０の発現を評価した。ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｔｒｅｇ浸潤ＲＣＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも多くのＧＩＴＲおよびＯＸ４０発現細胞を含有し、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりも多くのＯＸ４０発現ＴｒｅｇおよびＴｃｏｎｖ細胞を含有していた（図２Ａ）。Ｔｒｅｇのうち、６７．８＋／−１２．２％がＧＩＴＲを発現し、７６．５＋／−６．５％がＯＸ４０を発現した。その一方で、ＲＣＣ関連ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖのうち、２２．８＋／−７．５％がＧＩＴＲを発現し、３２．９７＋／−３．９％がＯＸ４０を発現し、ＣＤ８＋Ｔ細胞では、１２．３＋／−５％がＧＩＴＲを発現し、９．７＋／−３．４％がＯＸ４０を発現した（図２Ａ）。ＲＣＣ関連Ｔ細胞上でのＧＩＴＲおよびＯＸ４０抗体結合密度もまた評価した。ＧＩＴＲおよびＯＸ４０を結合している抗体の密度は、ＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖ細胞よりもＴｒｅｇ上で有意に高かった（図２Ｂ）。従って、ＯＸ４０およびＧＩＴＲは、腫瘍関連Ｔ細胞によって同程度に発現され、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞と比較してＴｒｅｇ上で差別的に高い。
【０２７７】
Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ４５＋免疫細胞浸潤腎細胞癌組織の小さい画分で、３．２９＋／−０．８２％を含み、その一方で、ＣＤ４＋Ｔｃｏｎｖは１５．３＋／−３％を含み、ＣＤ８＋Ｔ細胞は４１．２９＋／−５．６％を含む（図２Ｃ）。
【０２７８】
方法
濃縮全血のＰＢＭＣの強化
一次ヒトリンパ球を、血液をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない）中に１：４でまず希釈することによって、スタンフォード血液銀行によって提供された濃縮全血から単離した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、フィコール勾配下層（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して単離した。回収されたバフィー層をＰＢＳで２回洗浄し、計数した。細胞を５０×１０ｅ６細胞／ｍＬでＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中に再懸濁し、製造者の指示に従って、ＣＤ３陰性強化キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈ  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）で処理した。
【０２７９】
腫瘍関連リンパ球の単離および分析：
ヒト腫瘍試料の消化
原発性腫瘍組織を完全体で入手し、社内で処理した。組織をメスまたはレーザーブレードで小さなピースに切断して≦０．５ｃｍ３とした。酵素解離を、ヒト腫瘍解離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を使用して行った。細胞懸濁液を７０ｕｍのストレーナーを通すことによって、腫瘍のモノサスペンションを確実に行った。ＲＢＣの溶解を、ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を５分、室温で使用して（適切であれば）行った。処理した腫瘍試料を凍結し、今後の分析のために−８０℃で９０％ヒト血清＋１０％ＤＭＳＯ中で保管した。分析のために、凍結された解離腫瘍細胞を、１０％ＨＩ  ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ中に解凍し、ＦＡＣＳ分析の前に一晩置いた。細胞を培地から洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。
【０２８０】
抗体の染色およびフローサイトメトリー分析
対照パネルを使用し、抗体のバックグラウンドを、細胞内抗体もＡｌｅｘａ  ６４７（Ａ６４７）抗体も含まないフルオレッセンス・マイナス・ワン（ＦＭＯ）で補正することを可能にした。細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液中に１：５０で希釈した、全てＢＤ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）から入手した、ヒト表面受容体ＣＤ４５、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８に特異的な抗体を伴う１μｇ／ｍｌのＡ６４７コンジュゲートｍ３Ｇ７抗体、およびＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で染色した。Ｆｏｘｐ３  ｆｉｘ  ｐｅｒｍキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ．）を使用して、製造者の指示によって、細胞内マーカーＨｅｌｉｏｓ（２２Ｆ６、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）およびＦｏｘｐ３（２５９Ｄ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で細胞を染色した。
【０２８１】
フローサイトメトリー分析のための分析およびゲーティング。
試料を購入後に、Ｆｌｏｗ  Ｊｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ、ＣＡ）を使用して分析した。生存免疫細胞を同定し、ｌｉｖｅ／ｄｅａｄ染料陰性、ＣＤ４５ｈｉ、ＣＤ４＋通常細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−）、ＣＤ８＋細胞（ＣＤ３＋）、およびＴｒｅｇ（ＣＤ３＋ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋／−）としてゲーティングした。Ａ６４７の平均蛍光強度を使用して、ゲーティングを設定するためのＦＭＯ試料および補償を設定するための単色対照を使用して試料の相対蛍光シグナルおよび発現パーセントを調べた。データの値を、グラフ表示および統計分析のために、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアにエクスポートした。示すように、データセットを、Ｇｅｉｓｓｅｒ  Ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ補正およびＤｕｎｎｅｔｓ多重比較補正を伴う対応のある一元配置ＡＮＯＶＡ、または対応のないスチューデントＴ検定を使用して分析した。Ｐ値の有意性は、＜０．０５＊有意、＜０．０１＊＊さらに有意、＜０．００１＊＊＊非常に有意、として特徴付けされる。
【０２８２】
（実施例３）
異なる種におけるＧＩＴＲ／ＩｇＧ相互作用の動態および親和性の決定
この実施例は、ヒトＧＩＴＲ／ＩｇＧ、カニクイザルＧＩＴＲ／ＩｇＧ、およびマウスＧＩＴＲ／ＩｇＧの、３７℃での、異なる抗ＧＩＴＲ抗体との相互作用の動態および親和性を示す。表６および７を参照。
【０２８３】
【表６】
2020510435.tif 000015
【０２８４】
【表７】
2020510435.tif 000016
【０２８５】
全ての実験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００表面プラズモン共鳴バイオセンサー（ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）で行った。
【０２８６】
ａ．ヒトＧＩＴＲ／ＩｇＧおよびカニクイザルＧＩＴＲ／ＩｇＧの相互作用
センサーチップの準備
センサーチップの準備を、２５℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４からなるランニング緩衝液で行った。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ４センサーチップの全てのフローセルを、４００ｍＭのＥＤＣおよび１００ｍＭのＮＨＳの１：１（ｖ／ｖ）混合物で７分、１０μＬ／分の流速で活性化することによって、抗ヒトＦｃセンサーチップを作製した。抗ヒトＦｃ試薬（ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈカタログ番号２０８１−０１）を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５中に３０μｇ／ｍＬまで希釈し、全てのフローセル上に７分、２０μＬ／分で注入した。全てのフローセルを、１５０ｍＭのホウ酸緩衝液、ｐＨ８．５中の１００ｍＭのエチレンジアミンで７分、１０μＬ／分でブロックした。
【０２８７】
動態および親和性アッセイ
実験は、３７℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなるランニング緩衝液を使用して行った。
【０２８８】
抗体を、希釈していない上清から下流のフローセル（フローセル２、３、および４）に、１０μＬ／分の流速で２分、補足した。異なる抗体を各フローセルに捕捉した。フローセル１は、参照表面として使用した。抗体を捕捉した後、分析物（緩衝液、ｈＧＩＴＲ、またはｃｙＧＩＴＲ）を、３０μＬ／分で全てのフローセルに２分、注入した。分析物を注入した後、解離を１０分間モニタリングし、その後、７５ｍＭのリン酸の１分間の注入を３回行って、全てのフローセルを再生した。各捕捉した抗体について、以下の分析物の注入を行った：緩衝液、２０ｎＭのｈＧＩＴＲ、２００ｎＭのｈＧＩＴＲ、２０ｎＭのｃｙＧＩＴＲ、および２００ｎＭのｃｙＧＩＴＲ。二重参照の目的のために、緩衝液サイクルを、捕捉した各抗体について回収した（Ｍｙｓｚｋａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２：２７９〜２８４（１９９９）において記載されている二重参照）。二重参照したセンサーグラムは、単純な１：１ラングミュア物質輸送結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ  １：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）に全体的に適合していた。
【０２８９】
ｂ．マウスＧＩＴＲ／ＩｇＧの相互作用
センサーチップの準備
センサーチップの準備を、２５℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４からなるランニング緩衝液で行った。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ４センサーチップの全てのフローセルを、４００ｍＭのＥＤＣおよび１００ｍＭのＮＨＳの１：１（ｖ／ｖ）混合物で７分、１０μＬ／分の流速で活性化することによって、抗マウスＦｃセンサーチップを作製した。抗マウス免疫グロブリン試薬（Ｂｉａｃｏｒｅマウス抗体捕捉キットのウサギ抗マウス免疫グロブリン抗体、ＧＥ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号ＢＲ−１００８−３８）を、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中に６０μｇ／ｍＬまで希釈し、全てのフローセル上に７分、２０μＬ／分で注入した。全てのフローセルを、１５０ｍＭのホウ酸緩衝液、ｐＨ８．５中の１００ｍＭのエチレンジアミンで７分、１０μＬ／分でブロックした。
【０２９０】
動態および親和性アッセイ
実験は、３７℃で、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４、１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡからなるランニング緩衝液を使用して行った。
【０２９１】
精製した抗体を、下流のフローセル（フローセル２、３、および４）に、１０μＬ／分の流速で２分、１０μｇ／ｍＬで補足した。異なる抗体を各フローセルに捕捉した。フローセル１は、参照表面として使用した。抗体を捕捉した後、分析物（緩衝液またはｍＧＩＴＲ）を、３０μＬ／分で全てのフローセルに２分、注入した。分析物を注入した後、解離を１０分間モニタリングし、その後、１０ｍＭのグリシン、ｐＨ１．７の３分間の注入を１回行って、全てのフローセルを再生した。５つのメンバーからなるｍＧＩＴＲの希釈シリーズを、この方法を使用して分析し、ここで、最高濃度は３００ｎＭであり、希釈係数は３倍であった。３３ｎＭの希釈を２セット行った。二重参照の目的のために、緩衝液サイクルを、捕捉した各抗体について回収した（Ｍｙｓｚｋａ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２：２７９〜２８４（１９９９）において記載されている二重参照）。二重参照したセンサーグラムは、単純な１：１ラングミュア物質輸送結合モデル（ｓｉｍｐｌｅ  １：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｗｉｔｈ  ｍａｓｓ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ）に全体的に適合していた。
【０２９２】
（実施例４）
活性化Ｔ細胞およびＴｒｅｇへのＧＩＴＲ抗体の結合
この実施例は、異なる抗ＧＩＴＲ抗体が、用量応答を伴って、活性化ＴエフェクターおよびＴｒｅｇを同様に結合することを記載する。
【０２９３】
抗ＧＩＴＲ抗体を、Ｔ細胞およびＴｒｅｇに対するそれらの結合特徴について評価した。新たに単離した末梢血Ｔ細胞上でのＧＩＴＲの発現を増大させるために、精製したＴ細胞およびＴｒｅｇをｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化した。ＧＩＴＲ抗体ｍ３Ｇ７およびｍ１０Ｈ２は、抗ヒトＧＩＴＲ抗体への二次抗体の結合の平均蛍光強度において評価したところ、活性化Ｔ細胞に対して類似の結合を示した（図３Ａ）。ＧＩＴＲ抗体Ｒ５（ｈ３Ｇ７Ｒ５）、Ｒ９（ｈ３Ｇ７Ｎ９）、およびＲ１３（１０Ｈ２Ｎ１３）は、活性型Ｔｒｅｇに対して類似の結合パターンを有し、および抗体Ｒ１４（１０Ｈ２  Ｎ１４）は、他の抗体と比較して低密度の結合を有していた（図３Ｂ）。
【０２９４】
方法
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞の強化および活性化。
一次ヒトリンパ球を、血液をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない）中に１：４でまず希釈することによって、スタンフォード血液銀行によって提供された濃縮全血から単離した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、フィコール勾配下層（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して単離した。回収されたバフィー層をＰＢＳで２回洗浄し、計数した。細胞を５０×１０ｅ６細胞／ｍＬでＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中に再懸濁し、製造者の指示に従って、ＣＤ３陰性強化キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈ  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）で処理した。強化した後、細胞を計数し、今後の使用のために、９０％ＦＢＳ  １０％ＤＭＳＯ凍結培地内に１０〜２０×１０ｅ６のアリコートで凍結した。活性化のために、ドナーＴ細胞から得た細胞のバイアルを解凍し、Ｔ７５フラスコ中のＲ１０ｃ（ＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ＦＢＳ＋１×ＮＥＡＡ＋１×ピルビン酸ナトリウム＋１×Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ）中で、１×１０ｅ６細胞／ｍＬで一晩置いた。細胞を計数し、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｈｕｍａｎ  ＣＤ３／２８  Ｔ細胞活性化ビーズで、１：１のビーズ対細胞比で、４８時間刺激した（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）。４８時間後、細胞を培地から取り出し、１×ＰＢＳで洗浄した。細胞を９６ウェルプレート内に滴定し、プレート内で、ＰＢＳ中の未標識マウス抗ヒトＧＩＴＲ抗体（１００〜０．００１ｕｇ／ｍＬ）で細胞を染色し、３０分、３７℃でインキュベートした。未結合抗体を細胞から洗浄し、ＡＰＣ標識したＦｃガンマ（Ｆｃγ）断片特異的ヤギ抗マウスａｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２ＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）を使用して、一次結合抗体を検出した。２回目の染色の後、プレートを１×ＰＢＳで洗浄し、３３５×ｇ（１２００ｒｐｍ）で回転させた。ウェルをＰＢＳ＋２％ＰＢＳ中に再懸濁し、ＨＴＳで得た。
【０２９５】
一次Ｔｒｅｇのソーティングおよび展開
Ｔｒｅｇの単離および展開は、Ｐｕｔｎａｍら（Ｄｉａｂｅｔｅｓ、５８（３）：６５２〜６２（２００９））によるプロトコールに基づくものであった。具体的には、一次ヒトリンパ球を、血液をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない）中に１：４でまず希釈することによって、スタンフォード血液銀行によって提供された濃縮全血から単離した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、フィコール勾配下層（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して単離した。回収されたバフィー層をＰＢＳで２回洗浄し、計数した。細胞を５０×１０ｅ６細胞／ｍＬでＰＢＳ＋２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中に再懸濁し、製造者の指示に従って、ＣＤ４陰性強化キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈ  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）で処理した。強化した後、細胞を計数し、ＦＡＣＳソーティングのために準備した。
【０２９６】
Ｔｒｅｇ染色緩衝液を、２％正常マウス血清（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）および２％ヒトＡＢ血清（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ＣｅｌｌＧｒｏ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）を含むＰＢＳとして調製した。ＣＤ４陰性強化細胞を、３０分、室温で、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７を含むＴｒｅｇ染色緩衝液で染色したが、ＣＤ２５以外は１：５０で希釈し、ＣＤ２５は１：１２．５で希釈した。全ての抗体は、ＢＤによって提供された。（ＣＤ３−ＡＰＣ（ＵＣＨＴ１）、ＣＤ４：ＰａｃＢｌｕｅ（ＲＦＰ−Ｔ４、ＢＤ２６９８６）、ＣＤ８：ＢＶ７８６（ＨＩＴ８ａ、ＢＤ５５５６３５）、ＣＤ１２７：ＰＥＣｙ７（Ｍ２１、ＢＤ６５０８２２）、ＣＤ２５：ＰＥ（２Ａ３、ＢＤ３４０９３８）。染色した後、細胞を洗浄し、５０×１０ｅ６細胞／ｍＬで、Ｔｒｅｇ緩衝液中に再懸濁した。ＦＡＣＳソーティングを、Ａｒｉａプラットフォーム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で行った。そのＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５高ＣＤ１２７低の表現型の識別特性によって同定されるＴｒｅｇをＦＡＣＳソーティングし、ソーティングされた試料の小画分を得ることによって、９８％＋の純度を確認した。適切であれば、純度を最大にするために、第２のソーティングで細胞を調べた。
【０２９７】
ＦＡＣＳソーティングで得られた細胞を計数し、５％ヒトＡＢ血清および１×ＭＥＭ−ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、およびペニシリン−ストレプトマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加したＲｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）−１６４０と、１：１Ｔｒｅｇ展開剤ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）とからなる、Ｔｒｅｇ展開培地中に、０．２５×１０ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁した。２日後、培地の容積を倍にし、組換えヒトＩＬ−２を３００ＩＵ／ｍＬで添加した。５日目、７日目、および９日目に細胞を計数し、３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ２と共に０．２５×１０ｅ６細胞／ｍＬまで継代培養した。９日目の継代培養に加えて、Ｔｒｅｇの「再刺激」のために、１：１のＴｒｅｇ展開剤ビーズを培養物に添加した。１３日目に、結合および機能のアッセイのために細胞を回収した。
【０２９８】
一次展開Ｔｒｅｇの表現型
培養したＴｒｅｇは、純度を確認するために、展開の間を通して追跡される。細胞を、分析のために、フルオロフォアコンジュゲートＣＤマーカーを使用して、２％ＦＢＳを含むＰＢＳであるＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。ＧＩＴＲおよび他のＣＤリンパ球マーカーに対するＦＡＣＳ抗体を、適切な濃度で、ＦＡＣＳ緩衝液中で調製し、３０分、室温でインキュベートした。Ｔｒｅｇ純度染色は細胞内標的を利用するものであり、Ｆｏｘｐ３  固定／透過処理キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ／ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｓｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で処理した。染色された細胞を新たなＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁し、ＦＡＣＳ分析器ＬＳＲＩＩまたはＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で分析した。動態および結合のデータを得るために、コンジュゲートしていない抗体を１０〜０．００１ｕｇ／ｍＬ（１：１０の連続希釈、濃度毎に３つのウェル）で滴定し、４℃で６０分、ウェル当たり１×１０ｅ５の展開された１２日目のＴｒｅｇとインキュベートした。未結合の抗体を細胞から洗浄し、Ａ６４７標識Ｆｃガンマ（Ｆｃγ）断片特異的ヤギ抗ヒトａｆｆｉｎｉＰｕｒｅ  Ｆ（ａｂ’）２  ＩｇＧを使用して、結合抗体を検出した（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ）。染色した細胞の分析は、ＦｌｏｗＪｏ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で完了した。ＡＰＣの幾何学的平均を使用して、モル濃度を対数変換することによってＥＣ５０を計算し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍで非線形当てはめ曲線を作成した。
【０２９９】
（実施例５）
ＧＩＴＲ抗体は細胞傷害を媒介する
この実施例は、以下の２つのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ＧＩＴＲ抗体が細胞傷害を媒介することを示す：１）未分画ＰＢＭＣによって媒介される抗体媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、および２）マクロファージによって媒介される抗体媒介性細胞食作用（ＡＤＣＰ）。
【０３００】
ｈＩｇＧ１抗ＧＩＴＲ抗体ｍ３Ｇ７およびｍ１０Ｈ２は、アイソタイプ対照と比較して類似のレベルのＧＩＴＲ＋Ｔ細胞系のＡＤＣＣを示し、０．０１ｕｇ／ｍｌでの最大の標的細胞殺傷は、ｍ３Ｇ７では７８．５％、ｍ１０Ｈ２では８３．４％であった（図４Ａ）。
【０３０１】
腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、マウスにおけるＴｒｅｇの抗体に向けられた細胞傷害を媒介する細胞集団として関与しているとされている（Ｓｉｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１０（９）：１６９５〜１７１０（２０１３）；Ｂｕｌｌｉａｒｄら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１０（９）：１６８５〜９３（２０１３））。本発明者らは、ヒト単球由来マクロファージによるＧＩＴＲ＋Ｔ細胞系のＧＩＴＲ抗体媒介性細胞傷害を評価した。ｈＩｇＧ１  ＧＩＴＲ抗体は、マクロファージがＧＩＴＲ＋Ｔ細胞の用量依存性の殺傷を媒介することを可能にした（図４Ｂ）。ＧＩＴＲ抗体は等価ではなく、抗体ｈ３Ｇ７  Ｒ５（「Ｒ５」）、ｈ３Ｇ７  Ｒ９（「Ｒ９」）、ｈ１０Ｈ２  Ｒ１３（「Ｒ１３」）、およびｈ１０Ｈ２  Ｒ１４（「Ｒ１４」）はそれぞれ、９１９．７、６９２．２、４４５０、２０１３ｐＭのＥＣ５０を有していた。マクロファージ媒介性の細胞傷害は、ＧＩＴＲ抗体のＦｃに依存していた。細胞傷害活性は、ＦｃＲへの結合を低減させるＮ２９７Ａ突然変異で喪失した（Ｃｈａｏら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．３８（１）：７６〜９２（２００９））（図４Ｃ）。
【０３０２】
方法
エフェクターＰＢＭＣおよびＧＩＴＲ＋標的でのＡＤＣＣアッセイ
一次ヒトリンパ球を、血液をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まない）中に１：４でまず希釈することによって、スタンフォード血液銀行によって提供された濃縮全血から単離した。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、フィコール勾配下層（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して単離した。回収されたバフィー層をＰＢＳで２回洗浄し、計数した。ＰＢＭＣを、１０％ＦＢＳおよび１×ＭＥＭ−ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、およびペニシリン−ストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を添加したＲＰＭＩ中に３×１０ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁した。ＧＩＴＲ＋Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞系を、ＰＢＳ中で、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で染色した。標識した後、Ｊｕｒｋａｔを３×１０ｅ５細胞／ｍＬで再懸濁した。抗ＧＩＴＲ抗体の希釈シリーズを、４０ｕｇ／ｍＬの溶液を０．０００４ｕｇ／ｍＬまで１：１０で滴定することによって作製した（６つの濃度）。５０ｕＬの滴定された抗体を、９６ウェルＵ底プレートのウェル毎に、５０ｕＬの標識されたＪｕｒｋａｔおよび１００ｕＬのＰＢＭＣと共に蒔き、２０：１のエフェクター対標的比とし、最終抗体濃度を［１０〜０．０００１ｕｇ／ｍＬ］とした。プレートを一晩（≒１８時間）インキュベートし、翌日、プレートを分析のために回収した。
【０３０３】
Ｕ−ウェルプレートを１２００ｒｐｍで回転させて、細胞から培地を除去し、プレートをＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳ中に１：５００のＰＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を、ウェル当たり３０ｕＬで１０分間、室温で添加した。ＰＩに、２％ＦＢＳ（ＰＩを消すため）を添加したおよそ１００ｕＬのＰＢＳを添加して、ＨＴＳ分析前の容積をウェル当たり１００〜１５０ｕＬとした。得る直前に、１×１０ｅ４のＣｏｕｎｔ  Ｂｒｉｇｈｔカウントビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を各ウェルに添加した。ビーズ数に対する、生存Ｔｒｅｇ標的数の比は、プレートを正規化するために使用され、細胞傷害パーセントを得るために、対照ＩｇＧ１の比と比較される。
【０３０４】
ＡＤＣＰアッセイ：単球由来マクロファージエフェクターおよび展開されたＴｒｅｇ標的
ＰＢＭＣを上記のように調製した。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）ＣＤ１４＋陰性強化キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈ  Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ）を使用して、単球を正に強化し、２０ｎｇ／ｍＬのＭＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を添加したＲ１０ｃ中に１×１０ｅ６細胞／ｍＬで再懸濁し、Ｔ１７５中に、フラスコ当たり５５〜６５ｍＬの細胞懸濁液で蒔いた。単球は組織培養フラスコに強力に接着し、２０ｎｇ／ｍＬのＭＣＳＦを添加した新たなＲ１０ｃで培養の２日目および５日目に培地を交換しても除去されなかった。５日目の培地にも、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ１０（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）を添加した。１週間培養した後、細胞を回収し、１×１０ｅ５細胞／ウェルで、９６ウェル平底プレート中の、１ｍｇ／ｍＬのＰＧＥ２（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、それぞれ１０ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ、ＩＬ１Ｂ、およびＩＬ６（全て、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）からなる活性化培地中に蒔いた。翌日、蒔いた単球を活性化培地から洗い出し、５×１０ｅ４のＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識Ｊｕｒｋａｔ  ｂｕｌｋ  ＧＩＴＲ＋細胞を、対照ＩｇＧ１抗体または滴定されたＧＩＴＲ抗体のいずれかと共に、ウェル毎に添加した（標的に対するエフェクターの最終的な比を２：１にするため）。プレートを一晩インキュベートし（≒１８時間）、翌日、プレートを分析のために回収した。９６ウェル平底プレートの細胞を完全に粉末にし、９６ウェルＵ−ウェルプレートに移した。プレートを１２００ｒｐｍで回転させて細胞から培地を除去し、プレートをＰＢＳで洗浄した。残りの手順は、ＰＩ染色で開始される、ＡＤＣＣの取得および分析の節に従う。
【０３０５】
（実施例６）
ＧＩＴＲ抗体によって増強されるＴ細胞サイトカインの生産
この実施例は、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体がｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＴ細胞サイトカインの生産を増強することを示す。
【０３０６】
ＧＩＴＲは、Ｔ細胞上の共刺激受容体である。ＧＩＴＲとそのリガンドとのライゲーションによって、分化したＴヘルパー細胞の増殖が増強する（Ｔｏｎｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００（２５）：１５０５９〜１５０６４（２００３））。高められたＴ細胞活性化およびＩＦＮγなどの炎症誘発性サイトカイン生産は、マウスモデルにおける腫瘍の退縮に繋がる（Ｋｏら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２００５．２０２（７）：８８５〜８９１（２００５））。この実施例では、ＩＦＮγおよびＴＦＮαの分泌によるＴ細胞活性化について、ＧＩＴＲ抗体を評価した。ヒトＧＩＴＲを発現するＴ細胞ハイブリドーマ（３Ａ９、Ｄｕｓｔｉｎら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７（５）：２０１４〜２０２１（１９９６））を、抗ＣＤ３抗体（クローン２Ｃ１１、Ｅｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で活性化し、プレートに固定化された抗ＧＩＴＲ抗体（ｈ３Ｇ７  Ｒ５（「Ｒ５」）、ｈ３Ｇ７  Ｒ９（「Ｒ９」）、ｈ１０Ｈ２  Ｒ１３（「Ｒ１３」）、およびｈ１０Ｈ２  Ｒ１４（「Ｒ１４」））の濃度を上昇させた。４つのＧＩＴＲ抗体が、０．０１〜０．１μｇ／ｍｌまでの用量依存性の様式でＴＦＮαの分泌を増強した。より高いＧＩＴＲ抗体濃度では、ＴＮＦαの分泌は低下した（図５Ａ）。類似の実験を、Ｂ細胞性リンパ腫系（ＬＫ３５．２）の存在下で、ＧＩＴＲ発現３Ａ９細胞およびＣＤ３抗体２Ｃ１１で行って、ＧＩＴＲのクラスター化およびシグナル伝達に必要なＦｃＲを得た（Ｚｈｏｕら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１０５（１４）：５４６５〜５４７０（２００８））。ＧＩＴＲ抗体Ｒ５、Ｒ９、Ｒ１３、およびＲ１４を溶液状で添加し、４つ全てが、０．０１から１０μｇ／ｍｌの間の濃度でＴＮＦαの分泌を増強した（図５Ｂ）。
【０３０７】
活性化一次Ｔ細胞のサイトカイン分泌に対するＧＩＴＲ抗体の効果を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで評価した。ＧＩＴＲ抗体Ｒ５、Ｒ９、Ｒ１３、およびＲ１４は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞から分泌されるＩＦＮγおよびＴＮＦαを用量依存的に増大させ、ピークは０．０１から０．１μｇ／ｍｌの間であり、その後、より高い濃度では低下させた（図５Ｃおよび図５Ｄ）。従って、この実施例は、ＧＩＴＲ抗体が用量依存性のＴ細胞活性化特性を有することを示す。
【０３０８】
方法
ＧＩＴＲ抗体のＴ細胞アゴニストアッセイ
固定ＧＩＴＲ抗体培養プレートを準備するために、無菌のＮｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６平底ウェルプレートを一晩、４℃で、ＰＢＳ中に希釈した２ｕｇ／ｍＬの抗マウスおよび抗ヒトＦｃ断片特異的タンパク質１００ｕＬで被覆した。１×ＰＢＳで２回洗浄した後、１０ｎｇ／ｍＬのマウスＣＤ３（２Ｃ１１）１００ｕＬを、３７℃で６０〜９０分インキュベートした。ＧＩＴＲ抗体Ｒ５、Ｒ９、Ｒ１３、およびＲ１２を、ＰＢＳ中に１０〜０．０００１ｕｇ／ｍＬで滴定し、１００ｕＬを各ウェルに添加し、これを各濃度について３セット行った。プレートを３７℃で６０〜９０分インキュベートし、洗浄し、その後、細胞を添加した。
【０３０９】
準備した固定ＧＩＴＲプレートを使用して、５００００のヒトＧＩＴＲ＋３Ａ９細胞をウェル毎に、２００ｕＬのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地中に蒔いた。４８時間培養した後、上清を、サイトカイン分析のために、マウス可溶性タンパク質アッセイ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｎｋｉｎｓｏｎ）を使用して回収した。
【０３１０】
ヒトＧＩＴＲ＋３Ａ９細胞もまた、マウスＢ細胞性リンパ腫系であるＬＫ３５．２を利用して、可溶性ＧＩＴＲ抗体アッセイで試験した。このアッセイでは、２：１比の３Ａ９とＬＫ３５．２とを、０．１ｕｇ／ｍＬのマウス抗ＣＤ３抗体（２Ｃ１１）および１０〜０．０００１ｕｇ／ｍＬで滴定したＧＩＴＲ抗体と共に蒔いた。
【０３１１】
ヒトサイトカイン分泌もまた、新たに単離したヒトｐａｎ  Ｔ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ８＋）を使用してアッセイし、これを、上記のように準備した固定プレート上に蒔いた。１０万個の細胞をウェル毎にＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ中に蒔き、４日間インキュベーションした後、上清を回収した。
【０３１２】
（実施例７）
ＧＩＴＲの免疫組織化学的染色
この実施例は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を特異的に染色する免疫組織化学（IＨＣ）試薬としての抗ＧＩＴＲ抗体の最適化を記載する。
【０３１３】
抗ヒトＧＩＴＲ抗体ｍ１０Ｈ２を評価し、これは、ヒトＧＩＴＲを発現しない、低く発現する、および高く発現するＴ細胞系の染色の相関密度を示した（図６Ａ、図６Ｂ、および図６Ｃ）。最小の、低い、および高いＧＩＴＲ発現の確認が、ｍ１０Ｈ２クローンでの表面タンパク質のフローサイトメトリー染色（図６Ｄ）、ならびに、定量ＰＣＲおよびアクチンＢ発現に対する正規化（図６Ｅ）によって示される。さらに、ＮＳＣＬＣ腫瘍から単離されたＦＦＰＥ組織を、ｍ１０Ｈ２（図６Ｆ）またはアイソタイプ対照抗体（図６Ｇ）で染色した。ｍ１０Ｈ２染色は、腫瘍組織における単核浸潤内の細胞の膜に制限された（図６Ｆ）。従って、この実施例は、ｍ１０Ｈ２が、ＧＩＴＲの発現を定量するためにＦＦＰＥ組織で使用することができる有効な抗ＧＩＴＲ抗体であることを実証する。
【０３１４】
方法
ＧＩＴＲを過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞系での表面染色：
ＩＨＣ分析の前に、３つのＪｕｒｋａｔ系を、Ａ６４７標識ｍ１０Ｈ２抗体を使用するＦＡＣＳによって、表面ＧＩＴＲの発現について分析した。これらの系としては、親Ｊｕｒｋａｔ細胞系と、Ｊｕｒｋａｔ親細胞へのＧＩＴＲプラスミドのトランスフェクションによって生じる２つの系とがあった。各系のおよそ５×１０ｅ６細胞を、１ｕｇ／ｍＬの濃度の標識抗体で染色した。染色した後、細胞を、１×ＰＢＳを使用して未結合抗体から洗浄し、ＦＡＣＳによって分析した。
【０３１５】
結果
ＦＡＣＳによると、Ｊｕｒｋａｔ親細胞は、検出可能なＧＩＴＲ発現を有しておらず、一方、２つの形質導入された系は、陽性の染色を有していた。２つ系でのＧＩＴＲ発現の中央値の間で、およそ１．５ｌｏｇ倍の差があり、このことによって、本発明者らは、これらを、ＧＩＴＲ＋低発現系およびＧＩＴＲ＋高発現系として区別した。
【０３１６】
ｑＰＣＲによる定量的なＧＩＴＲ発現分析：
Ｊｕｒｋａｔ親、ＧＩＴＲ＋低、およびＧＩＴＲ＋高でのＧＩＴＲの発現の定量分析を、ｑＰＣＲによって行った。ＲＮＡを、各系の５〜１０×１０ｅ６細胞から、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｕｉａｇｅｎ）を使用して単離した。ｃＤＮＡ鋳型を、２００ｎｇの単離ＲＮＡを使用して、高性能ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して作製した。ＴａｑＭａｎ  ＦＡＳＴ試薬を使用して、ｃＤＮＡ鋳型と共にｑＰＣＲを行った。ハウスキーピング遺伝子Ａｃｔｉｎ  Ｂ（Ｈｓ９９９９９９０３＿ｍ１）とカスタム特異的ＧＩＴＲプライマーとの両方のためのプライマーを、各反応で使用した。カスタムＧＩＴＲプライマーは、ＧＩＴＲトランスフェクト型プラスミド（配列はＡＢＩによって開示されていない）のベクター配列を使用して、ＡＢＩによって作製された。ｑＰＣＲを、製造者の指示およびＴａｑＭａｎ  ＦＡＳＴ熱サイクリングの説明書に従って、Ｖｉｉａ７系で行った。デルタＣｔを、式：２＾（−［Ｃｔ（ＧＩＴＲ）−Ｃｔ（ＡｃｔＢ｝）を使用して計算した。
【０３１７】
結果
ｑＰＣＲ分析によって、３つの系の発現ランクが確認され、ＧＩＴＲ＋低は親よりも２．７ｌｏｇ高い発現を有し、ＧＩＴＲ＋高系はＧＩＴＲ＋低系よりも２ｌｏｇ高いＧＩＴＲ発現を有していた。
【０３１８】
ＩＨＣ細胞の処理：
ＦＡＣＳおよびｑＰＣＲによってアッセイされたＧＩＴＲ発現レベルを用いて、Ｊｕｒｋａｔ親（ＧＩＴＲ陰性）、ＧＩＴＲ＋低、およびＧＩＴＲ＋高系の細胞を、切片化のために以下のように調製および処理した。２０×１０ｅ６から３０×１０ｅ６の間の細胞を５０ｍＬのコニカルビーカー内に回収し、≒７５０×ｇで１０分間回転させた。上清を除去した後、ペレットを１５ｍＬのコニカルビーカーの１０％中性緩衝ホルマリン中に移し、≒７５０×ｇで１０分間回転させた。５０℃で調製したＨｉｓｔｏＧｅｌを細胞ペレットと混合し、冷凍によって４℃に冷やした。ＨｉｓｔｏＧｅｌ細胞ペレットを次いで、固定のために＞１２時間、１０％中性緩衝ホルマリン中に移し、パラフィン包埋のためにカセットに移した。スライドの切片化を行って、４ｕＭの厚さのペレットのスライスを得た。ＩＨＣ染色では、Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ  Ｏｎｅ検出系を使用した。簡潔に述べると、スライドを、６０℃で１時間焼き、それぞれ３分の３ラウンドのキシレン洗浄で脱パラフィン化を行うことによって準備した。切片化されたペレットを、１００％ＥＴＯＨ（２×）、９５％ＥＴＯＨ（１×）、７０％ＥＴＯＨ（１×）、およびＰＢＳ（１×）中で連続的なインキュベーションをそれぞれ２分行うことによって、再水和した。スライドを５分、ＤＩＶＡ緩衝液中および１１０℃に加熱され５ＰＳＩに加圧されたクローキング解除チャンバ中（共にＢｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌから入手した）中で処理することによって、抗原賦活化を行い、その後、ＰＢＳ中で２回洗浄した。スライドを３％Ｈ２Ｏ２（ペルオキシダーゼ）中で１０分間ブロックし、ＰＢＳ中で洗浄した。一次抗体ｍ１０Ｈ２をブロック溶液中で１ｕｇ／ｍＬに希釈し、スライドを一晩、４℃でインキュベートした。ＰＢＳ（３×）中で３分洗浄した後、スライドをＨＲＰポリマー中で３０分、室温でインキュベートし、ＰＢＳ（３×）中で洗浄した。ＤＡＢ試薬を調製し、スライドを５分晒した。対比染色をヘマトキシリンで行い、脱水した後、スライドのマウントを完了した。スライドをＧＩＴＲレベルについて分析した。
【０３１９】
ＮＳＣＬＣ試料の染色
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）試料の調製したスライドを、社内のバンクから受け取った。Ｔｈｅｒｍｏ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃのＵｌｔｒａＶｉｓｉｏｎ  Ｏｎｅ検出系を、上記のように使用した。細胞ペレットの染色のように、１ｕｇ／ｍＬのｍ１０Ｈ２抗ＧＩＴＲ抗体を、５ｕｇ／ｍＬのマウスＩｇＧ１対照抗体と共にアッセイした。
【０３２０】
（実施例８）
ＧＩＴＲ抗体の抗腫瘍活性
この実施例は、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプを伴う抗マウスＧＩＴＲ抗体が、ＣＴ２６結腸癌の治療的処置モデルにおいて腫瘍成長低減活性を有することを示す。
【０３２１】
ｍＩｇＧ２ａは、ＡＤＣＣ活性を媒介し得るヒトＩｇＧ１アイソタイプを最も緊密に反映し、その一方で、ｍＩｇＧ１アイソタイプは、最小のＡＤＣＣ活性を有するｈＩｇＧ２ａに最も緊密に類似している（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、３１０：１５１０〜１５１２（２００５））。
【０３２２】
抗ＧＩＴＲ  ２１Ｂ６  ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ抗体は抗腫瘍活性を有し、その一方で、ｍＩｇＧ２ａアイソタイプ対照抗体はそれを有していなかった（図７Ａ〜図７Ｄ）。２１Ｂ６  ｍＩｇＧ２ａは、０．２、１、および５ｍｐｋ（ｍｇ／ｋｇ）でそれぞれ９５％、９４％、１０２％の腫瘍成長阻害を示した（表８、図７Ａ〜図７Ｄ）。ｍＩｇＧ１アイソタイプは、０．２、１、および５ｍｇ／ｋｇでそれぞれ３３％、９％、および２２％の腫瘍成長阻害を誘発した（表９、図７Ｅ〜図７Ｈ）。研究の最後には（初回投与から４３日後）、５ｍｐｋ  ｍＩｇＧ２ａ群ではマウスの８０％（８／１０）が生存し、その一方で、１ｍｇ／ｋｇ  ｍＩｇＧ２ａ群では４４．４％（４／９）が生存し、０．２ｍｇ／ｋｇ  ｍＩｇＧ２ａ群では４０％（４／１０）が生存していた（表８および表９、図７Ｉ）。ｍＩｇＧ１治療では、生存はなかった。屠殺する必要のあった全てのケースは、研究（４３日間）終了前の腫瘍組織量が理由であった（表８および表９、図７Ｉ）。
【０３２３】
【表８】
2020510435.tif 000017
【０３２４】
【表９】
2020510435.tif 000018
【０３２５】
２１Ｂ６  ＩｇＧ２ａによって媒介される腫瘍成長の阻害は、ＣＤ８：腫瘍に浸潤するＴｒｅｇの比の増大と相関した（図７Ｊ）。１ｍｇ／ｋｇ用量の２１Ｂ６  ＩｇＧ２ａは、最も高いＣＤ８：Ｔｒｅｇ比をもたらした（１０．９×ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、ｐ＝０．０４９）。２１Ｂ６  ＩｇＧ２ａでの治療もまた、全ての用量で、ＣＤ４  Ｔｅｆｆ：腫瘍に浸潤するＴｒｅｇの比を増大させ（図７Ｋ）、０．２ｍｇ／ｋｇの２１Ｂ６  ＩｇＧ２ａ用量で、最も高い平均比となった（ＩｇＧ２ａアイソタイプ対照よりも４．７倍高い）。アイソタイプＩｇＧ２ａ対照と比較して、５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、および０．２ｍｇ／ｋｇの間で統計的有意性が見られ、ｐ値はそれぞれ０．０４３、０．００３、および＜０．０００１であった。これらの変化は、２１Ｂ６  ＩｇＧ１で治療したマウスでは観察されず、このマウスでは、ＣＤ８  Ｔ細胞：ＴｒｅｇおよびＣＤ４  Ｔｅｆｆ細胞：Ｔｒｅｇは、ＩｇＧ１アイソタイプ対照と比較して統計的有意性を示さなかった（図７Ｊおよび図７Ｋ）。
【０３２６】
腫瘍成長の阻害は、２１Ｂ６  ＩｇＧ２ａ治療マウスにおける腫瘍内Ｔｒｅｇの喪失と対応していた（図７Ｌ）。全ての用量レベルの２１Ｂ６  ＩｇＧ２ａが、原発性腫瘍に関連するグラム当たりのＴｒｅｇ細胞の数を低減させたが、これらの変化は統計的に有意ではなかった。５ｍｇ／ｋｇでＣＤ８＋Ｔ細胞が低減し（図７Ｍ）、５ｍｇ／ｋｇおよび１ｍｇ／ｋｇでＣＤ４＋Ｔエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞が低減したが（図７Ｎ）、これらの変化は、統計的に有意ではなかった。同様に、全ての用量の２１Ｂ６  ｍＩｇＧ２ａが、ＣＤ４５＋腫瘍に浸潤する免疫細胞内でのＴｒｅｇの割合を、２．５６％から、０．２ｍｇ／ｋｇ用量では０．６９％まで（ｐ＝０．００１８）、１ｍｇ／ｋｇ用量では０．４２％まで（ｐ＝０．０００５）、そして５ｍｇ／ｋｇ用量では１．２９％（ｐ＝０．０２８７）まで低減させた（図７Ｏ）。免疫浸潤内でのＴｒｅｇの割合は、２１Ｂ６  ｍＩｇＧ１治療の影響を受けなかった（図７Ｏ）。腫瘍浸潤内でのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔｅｆｆ細胞の割合の変化は、有意ではなかった（図７Ｐおよび図７Ｑ）。総合すると、これらの分析は、腫瘍Ｔｒｅｇの低減が、Ｔエフェクター細胞：Ｔｒｅｇ比の増加、抗腫瘍有効性、およびＧＩＴＲ抗体投与後のマウスの生存を説明することを示唆し、これは、ｍＩｇＧ２ａに依存し、ｍＩｇＧ１  Ｆｃアイソタイプには依存しなかった。
【０３２７】
Ｔ細胞サブセットの頻度を、末梢免疫区画、すなわち、腫瘍を有する２１Ｂ６治療マウスの脾臓において評価した。０．２ｍｇ／ｋｇ用量は最も大きな効果を有しており、Ｔｒｅｇを、対照抗体治療マウスにおけるＣＤ４５＋細胞に対する２．４６％からｍＩｇＧ２ａ治療マウスにおける１．１１％まで低減させ（ｐ＝０．０００６）、ＣＤ４＋Ｔｅｆｆを対照抗体治療マウスにおけるＣＤ４５＋細胞に対する１５．０６％からｍＩｇＧ２ａ治療マウスにおける１１．２２％まで低減させた（ｐ＝０．０１２１）（図７Ｒおよび７Ｔ）。他の用量での変化は、有意ではなかった。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、いかなる用量の影響も受けなかった（図７Ｓ）。
【０３２８】
方法
ｍ２１Ｂ６  ＩｇＧ２ａのクローニングおよび発現
抗ｍＧＩＴＲ  ２１Ｂ６重鎖および軽鎖可変ドメインのＤＮＡ配列を、Ｌｅｗｉｓ  Ｒａｔハイブリドーマ融合体からＲＴ−ＰＣＲを使用して生成したｃＤＮＡから得た。得られた翻訳されたアミノ酸配列を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｇｅｎｅａｒｔのプロプライエタリアルゴリズムを使用して、ヒト上皮腎細胞２９３の発現のためにコドン最適化した。合成されたコドン最適化可変ドメインを次いで、それぞれＢｓｓＨＩＩ／ＢｓｔＥＩＩおよびＡｐａＬＩ／ＰａｃＩを使用して、哺乳動物発現ベクターｐＡＲＣ  ｍＩｇ２ａおよびｐＡＲＣ  ｍＫａｐｐａにクローニングした。軽鎖および重鎖構築物の正確なクローンの配列を確認し、それに応じてｈ３Ｇ７Ｒ５−ＶＬおよびｈ３Ｇ７Ｒ５−ＶＨと名付けた。
【０３２９】
抗体の発現および精製
１：１の質量比のプラスミドｈ３Ｇ７Ｒ５−ＶＬおよびｈ３Ｇ７Ｒ５−ＶＨを、ＰＥＩベースのトランスフェクションプロトコール（２００万細胞当たり０．５ｍｇの各プラスミド）を使用して、Ｅｘｐｉ２９３細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクションの５日後、トランスフェクトされた細胞培養物を回収し、遠心分離し、０．２ｕＭの膜を使用して濾過した。濾過した上清を次いで、タンパク質Ａアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）を使用して精製し、次いで、凝集タンパク質を除去するためにサイジングした（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  ２６／６０  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）。Ｂｉａｃｏｒｅ分析と組み合わせたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、単量体活性タンパク質画分を同定した。
【０３３０】
同系腫瘍モデル：ＣＴ２６
動物
７週齢のメスＢＡＬＢ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌ）のマウスコホートを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＭＥ）から入手し、Ｐｆｉｚｅｒ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ）の無病原体施設で、動物実験委員会（ＩＡＣＵＣ）のプロトコールに従って飼育した。実験を開始する際、動物は８週齢であった。
【０３３１】
細胞培養物
マウス結腸癌細胞系ＣＴ２６（ＣＲＬ−２６３８）を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手した。細胞を、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液（全て、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を含有する推奨の塩基性培地中で増殖させた。細胞をＴｒｙｐＬＥ  Ｓｅｌｅｃｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で回収し、２倍容積の血清含有培地で洗浄し、その後、細胞をペレット化した。ペレットを、血清を含まない塩基性培地中に再懸濁し、細胞数および生存能力のチェックを行った。ＣＴ２６細胞は、注射のために、塩基性培地中に１ｍＬ当たり２×１０６細胞の濃度とした。
【０３３２】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験プロトコール
腫瘍を確立するために、１００ｕＬの細胞懸濁液を、マウスの右脇腹に皮下注射した。移植を、腫瘍がおよそ８０ｍｍ３の平均容積に達するまでモニタリングし、平均腫瘍容積およびＳＥＭにほぼ等しい容積を有するマウスの群にランダム化した。２１Ｂ６抗体を、５ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照ＩｇＧ１（クローンＭＯＰＣ−２１）およびＩｇＧ２アイソタイプ対照（Ｃ１．１８．４、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ、Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ）と共に５、１、および０．２ｍｇ／ｋｇで投与するために調製した。治療は、ランダム化の日（０日目）に開始した。マウスを秤量し、２〜３日毎に全部で３用量、腹腔内投与した。
【０３３３】
腫瘍成長の評価
週に２回、腫瘍の長さおよび幅（ミリメートル単位）をデジタルカリパス（Ｍｉｔｕｔｏｙｏ、Ａｕｒｏｒａ、ＩＬ）で計測する。腫瘍容積は、式：Ｖ＝１／２Ｌ×Ｗ２（式中、Ｌ（長さ）は腫瘍の最長直径であり、Ｗ（幅）はＬに対して垂直である）で、長さおよび幅の値を使用して計算した。有効性の測定を２０日目まで継続し、生存分析のために最大４０日間、マウスのモニタリングを継続した。
【０３３４】
腫瘍のＴＩＬおよび脾細胞の分析
最後の投与の翌日、群当たり４〜５頭のマウスから腫瘍および脾臓を解剖した。腫瘍は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＯｃｔｅｔのプログラムＩＭＰ−００２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で、製造者の指示に従って解離した。脾臓は７０ｕＭメッシュのフィルター上で、手で解離し、赤血球をＡＣＫ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）で溶解した。両細胞集団をＰＢＳで洗浄し、ＦＡＣＳ分析のために、以下の蛍光標識抗体で染色した：全てＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、ＣＤ９０．２、ＣＤ４、およびＣＤ８、ならびに、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅから入手したＧＩＴＲおよびＣＤ４５。３０分、４℃で細胞外染色を行った後、細胞をＰＢＳ＋２％ＦＢＳで洗浄し、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｘｐ３  Ｆｉｘ／Ｐｅｒキット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）で、製造者の指示によって処理した。細胞を、細胞内マーカーＦｏｘｐ３−ｅＦｌｏｕｒ４５０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）およびＫｉ−６７−ＢＶ６０５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）で染色した。Ｔ細胞サブセットの分析をＦｌｏｗＪｏ（ＦｌｏｗＪｏ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）で行い、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用してプロットした。
【０３３５】
（実施例９）
抗ＧＩＴＲ抗体および他の治療剤を使用する組み合わせ療法
この実施例は、腫瘍の治療的処置のための、他の免疫標的化抗体と組み合わせた抗ＧＩＴＲの代替手段抗体である２１Ｂ６  ｍＩｇＧ２ａの評価を記載する。
【０３３６】
ＣＴ２６結腸癌モデルは、単剤２１Ｂ６  ＩｇＧ２ａで腫瘍が完全に退縮し（実施例８）、したがって、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルが単剤免疫標的化療法に対してあまり応答性ではないため、このモデルを評価する（例えば、Ｍｏｓｌｅｙら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、５（１）２９〜４１（２０１７）を参照）。治療プロトコールは、実施例８で記載した研究に類似している：Ｂ１６Ｆ１０腫瘍を移植し、平均サイズが８０ｍｍ３に達するとランダム化し、３用量の１ｍｇ／ｋｇの２１Ｂ６  ＩｇＧ２ａで治療し、確立された有効用量の組み合わせパートナーを、２〜３日毎に全部で３用量、腹腔内投与する。抗ＧＩＴＲ抗体２１Ｂ６  ＩｇＧ２ａと抗ＰＤ−Ｌ１、抗４−１ＢＢ、抗ＯＸ４０、および抗ＰＤ−１抗体との１対の組み合わせは全て、いずれかの単剤治療単独と比較して、腫瘍成長阻害の改善を示した。
【０３３７】
これらのデータは、本発明の抗ＧＩＴＲ抗体を、腫瘍成長阻害効果の改善のために、免疫チェックポイント阻害剤またはＴ細胞刺激抗体と組み合わせることができることを示す。
【０３３８】
開示される教示を、様々な用途、方法、キット、および組成物を参照して記載してきたが、様々な変更および改変を、本明細書の教示および以下の請求項に係る発明から逸脱することなく行うことができることが理解されるであろう。上記の実施例は、開示される教示をより良好に例示するために提供されており、本明細書に提示した教示の範囲を限定するように意図されていない。本教示をこれらの例示的な実施形態の観点から記載してきたが、当業者は、これらの例示的な実施形態の多数のバリエーションおよび改変が、過度の実験を伴うことなく可能であることを容易に理解するであろう。すべてのこのようなバリエーションおよび改変は、本教示の範囲内である。
【０３３９】
特許、特許出願、論文、教科書などを含む本明細書に引用したすべての参考文献、ならびにこれらに引用された参考文献は、これらが既に組み込まれていない程度に、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。組み込まれた文献および同様の資料の１つまたは複数が、それだけに限らないが、定義された用語、用語の使用法、記載した技法などを含めて、本願と異なる、または矛盾する場合には、本願が支配する。
【０３４０】
上記の記載および実施例は、本発明のある特定の具体的な実施形態を詳述し、本発明者らが企図するベストモードを記述する。しかし、どんなに詳細に上記のことが本文中に現れる場合があっても、本発明を多くの方法で実践することができ、本発明は、添付の特許請求の範囲およびその任意の均等物に従って解釈されるべきであることが理解されるであろう。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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