(57)【要約】  本明細書では、生細胞を選別および／または同定するための組成物および方法が提供される。組成物および方法は、生細胞の異種集団内で特定の細胞を同定したり、または生細胞の異種集団から特定の細胞を選別したりすることができ、その後、染色を反転させて、選別および／または同定された細胞を天然の状態で調製できるように、アプタマーにより生細胞を染色することを提供するものである。
2020514765.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生細胞を同定する方法であって、
（ａ）表面結合分子標的を有する細胞を含む生細胞の異種集団を提供する工程；
（ｂ）分子標的に結合親和性を有する選別アプタマーを、表面結合分子標的と接触させる工程であって、選別アプタマーは、オリゴヌクレオチドと選別標識とを含む、工程；
（ｃ）選別標識を使用して、細胞の異種集団の中から表面結合分子標的を有する細胞を同定する工程；および
（ｄ）表面結合分子標的から選別アプタマーを除去して、選別細胞を天然の状態で調製する工程
を含む、方法。
【請求項２】
選別標識を使用して、細胞の異種集団の少なくとも一部から表面結合分子標的を有する細胞を選別する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
生細胞を異種集団から天然の状態で選別する方法であって、
（ａ）表面結合分子標的を有する細胞を含む生細胞の異種集団を提供する工程；
（ｂ）分子標的に結合親和性を有する選別アプタマーを、表面結合分子標的と接触させる工程であって、選別アプタマーは、オリゴヌクレオチドと選別標識とを含む、工程；
（ｃ）選別標識を使用して、生細胞の異種集団の少なくとも一部から表面結合分子標的を有する細胞を選別する工程；および
（ｄ）表面結合分子標的からアプタマーを除去して、選別細胞を天然の状態で調製する工程
を含む、方法。
【請求項４】
選別標識を使用して、細胞の異種集団の中から表面結合分子標的を有する細胞を同定する工程をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
表面結合分子標的から選別アプタマーを除去することが、選別アプタマーを、オリゴヌクレオチドアンチドートと接触させることを含み、オリゴヌクレオチドアンチドートは、選別アプタマーの一部に少なくとも部分的に相補的な配列を含む、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
アプタマーが、複数の結合モチーフを含む多価アプタマーである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
複数の結合モチーフの各々が同じ結合モチーフである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
複数の結合モチーフの少なくとも１つが、他の結合モチーフと異なる、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
アプタマーがアプタマーコンジュゲートである、請求項１から８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
選別標識が、レポーター標識、磁気標識、結合標識、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項１から９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
レポーター標識がフルオロフォア部分を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、蛍光活性化細胞選別によって選別される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
磁気標識が磁気ビーズを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
細胞は、磁気活性化細胞選別によって選別される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
結合標識が、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびジゴキシゲニンからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
除去することが温度を調節することを含む、請求項１から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
除去することが、二価イオンの濃度を調節することを含む、請求項１から１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
外因性材料を除去することをさらに含む、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
外因性材料が染色アプタマーを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
外因性材料がアンチドートを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
天然の状態で選別された細胞が、
（ｉ）選別アプタマーの結合前の細胞機能に実質的に類似している細胞機能を有する生細胞；および／または
（ｉｉ）表面結合選別アプタマーを実質的に含まない生細胞
を含む、請求項１から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
選別された細胞が、別のものを実質的に含まない生細胞を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
選別された細胞が、最小限に操作されているか、または実質的な操作を受けていない生細胞を含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
表面結合分子標的が細胞表面受容体を含む、請求項１から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
アプタマーコンジュゲートが、レポーター標識および／または磁気標識を含むリンカーと複合体化した結合標識を含む選別アプタマーを含む、請求項１から２４のいずれか１項において使用するためのアプタマーコンジュゲート。
【請求項２６】
結合標識がビオチンを含み、リンカーがストレプトアビジンを含む、請求項２５に記載のアプタマー。
【請求項２７】
レポーター標識がフルオロフォア部分を含む、請求項２５または２６に記載のアプタマー。
【請求項２８】
アプタマーコンジュゲートが、結合標識を各々含む複数の選別アプタマーを含む、請求項２５から２７のいずれか１項に記載のアプタマー。
【請求項２９】
アプタマーコンジュゲートが、リンカーと複合体化した結合標識を各々含む２つの選別アプタマーを含む、請求項２８に記載のアプタマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この特許出願は、２０１７年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／４７５，３１５号の優先権の利益を主張し、その内容は全体として参照により本明細書に組み込まれる。
政府支援の陳述
本発明は、米国国立衛生研究所により授与されたＲ２１ＥＢ０１７８６８の下で政府支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
配列表への参照
この出願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されており、電子的に送信された．ｔｘｔ形式の配列表を含む。．ｔｘｔファイルには、２０１８年３月２３日に作成されたサイズが５，６５９バイトの「２０１８−０３−２３＿５６６７−００４２６＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」というタイトルの配列表が含まれている。この．ｔｘｔファイルに含まれる配列表は明細書の一部であり、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
発明の分野
本技術は、概して、細胞の同定および／または選別のための組成物および方法に関連する。より具体的には、本技術は、陽性細胞を同定し、および／または細胞を選別するためのアプタマーおよびアンチドート（ａｎｔｉｄｏｔｅ）の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の選択的精製が日常的に行われ、多数の臨床および基礎研究応用に不可欠である。臨床的に、毎年行われる４５，０００以上の造血幹細胞移植にはＣＤ３４＋細胞の濃縮が必要であり、急速に成長する養子Ｔ細胞療法の分野にはＣＤ８＋細胞の精製が必要とされる。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）および磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）などの一般的な基礎研究の精製スキームは、伝統的には、標的細胞集団の選択標識、および続く単離のために抗体に依存している。しかしながら、抗体標識は不可逆的であり、下流の応用における単離細胞の有用性が低下する。抗体の固有の免疫原性は、細胞治療の精製における抗体の使用を強く禁忌とし、受容体に拮抗的に結合する抗体は、天然のシグナル伝達経路を破壊し、潜在的に単離細胞の有用性を損なう。これらの十分に認識される問題を回避するための戦略には、望ましくない細胞が標識され、廃棄される負の枯渇、および免疫原性Ｆｃ領域を欠損するように操作された抗体の使用が含まれる。しかしながら、これらのアプローチのいずれも、基礎研究または臨床使用のために、機能的に阻害されていない細胞の純粋な集団を保証するものではない。
【発明の概要】
【０００３】
本明細書では、生細胞を選別および／または同定するための組成物および方法が提供される。組成物および方法は、特定の細胞を生細胞の異種集団内で同定したりまたは生細胞の異種集団から選別したりすることができ、その後、染色を反転させて、選別および／または同定された細胞を天然の状態（ｎａｔｉｖｅ  ｓｔａｔｅ）で調製できるように、アプタマーにより生細胞を染色することを提供するものである。
【０００４】
生細胞を同定する方法は、表面結合分子標的を有する細胞を含む生細胞の異種集団を提供する工程、分子標的に結合親和性を有する選別アプタマーを、表面結合分子標的と接触させる工程であって、選別アプタマーは、オリゴヌクレオチドと選別標識とを含む、工程、選別標識を使用して、細胞の異種集団の中から表面結合分子標的を有する細胞を同定する工程、および表面結合分子標的から選別アプタマーを除去して、選別細胞を天然の状態で調製する工程を含む。本方法は、選別標識を使用して、細胞の異種集団の少なくとも一部から表面結合分子標的を有する細胞を選別する工程をさらに含み得る。
【０００５】
生細胞を選別する方法は、表面結合分子標的を有する細胞を含む生細胞の異種集団を提供する工程、分子標的に結合親和性を有する選別アプタマーを、表面結合分子標的と接触させる工程であって、選別アプタマーは、オリゴヌクレオチドと選別標識とを含む、工程、選別標識を使用して、細胞の異種集団の中から表面結合分子標的を有する細胞を選別する工程、および表面結合分子標的から選別アプタマーを除去して、選別細胞を天然の状態で調製する工程を含む。本方法は、選別標識を使用して、細胞の異種集団の少なくとも一部から表面結合分子標的を有する細胞を同定する工程をさらに含み得る。
【０００６】
上記の方法のいずれかでは、表面結合分子標的から選別アプタマーを除去する工程は、選別アプタマーを、オリゴヌクレオチドアンチドートと接触させることを含んでいてもよく、オリゴヌクレオチドアンチドートは、選別アプタマーの一部に少なくとも部分的に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、アプタマーは、複数の結合モチーフを含む多価アプタマーである。結合モチーフは、同じであってもよく、または異なってもよい。一部の実施形態では、アプタマーはアプタマーコンジュゲートである。除去する工程は、二価イオンの温度および／もしくは濃度を単独でまたは選別アプタマーをオリゴヌクレオチドアンチドートと接触させることを組み合わせて調整することによっても達成され得る。
選別標識は、レポーター標識、磁気標識、結合標識、またはそれらの任意の組合せを含み得る。一部の実施形態では、レポーター標識はフルオロフォア部分を含む。別の実施形態では、磁気標識は磁気ビーズを含む。さらに別の実施形態では、結合標識は、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、およびジゴキシゲニンからなる群から選択される。
細胞の選別または同定は、生細胞に適した任意の方法によって達成され得る。生細胞の選別技術の例には、蛍光活性化細胞選別および磁気活性化細胞選別が含まれる。
上記の方法は、外因性材料を除去することをさらに含み得る。外因性材料は、染色アプタマー、アンチドート、および／または任意の他の外来材料を含み得る。
【０００７】
アプタマーコンジュゲートはまた、本明細書に提供される。アプタマーコンジュゲートは、リンカーと複合体化した結合標識を含む選別アプタマーを含み得、リンカーはレポーター標識および／または磁気標識を含む。一部の実施形態では、結合標識はビオチンを含み、リンカーはストレプトアビジンを含む。アプタマーコンジュゲートは、各々が結合標識を含む複数の選別アプタマーを含み得る。特定の実施形態では、アプタマーコンジュゲートは、各々が、リンカーに複合体化された結合標識を含む２つの選別アプタマーを含む。
本発明の非限定的な実施形態は、添付の図面を参照して例として説明されるが、添付の図面は概略であり、縮尺通りに描かれることを意図しない。図面では、図示されている同一またはほぼ同一の各構成要素は、典型的には、単一の数字で表される。明確にすることを目的として、すべての構成要素がすべての図面において標識付けされているわけではなく、当業者が本発明を理解できるようにするために例示が必要でない場合に、本発明の各実施形態のすべての構成要素が示されているわけではない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１Ａ】図１Ａおよび１Ｂは、末端修飾が異なるアプタマーの二次構造を示す：ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８で５’標識されたＥ０７（配列番号１；図１Ａ）。
【図１Ｂ】図１Ａおよび１Ｂは、末端修飾が異なるアプタマーの二次構造を示す：オリゴヌクレオチド伸長およびビオチンで５’標識されたｂＥ０７（配列番号５；図１Ｂ）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、蛍光標識された多価アプタマーＥ０７−ＳＡを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、アプタマー染色された標的細胞の選別、それに続く、アプタマーを除去し、天然の細胞機能を回復させるためのアンチドート処理の概要を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、アプタマー染色された標的細胞を選別し、続いて、蛍光標識されたストレプトアビジンリンカーと複合体化されたｂＥ０７を含む多価アプタマーコンジュゲートでアプタマーを除去し、天然の細胞機能を回復させるためのアンチドート処理の概要を示す。
【図３Ａ】図３Ａは、Ｅ０７単独で処理された細胞のＭＦＩによって標準化されたＥ０７結合を最もブロックすることができるアンチドートを同定するためのスクリーニングアッセイにおいて検出された平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。Ａ４３１細胞をＡＦ４８８−Ｅ０７（または対照アプタマーＡＦ４８８−Ｃ３６）＋／−１０００倍過剰の各ＤＮＡアンチドート候補で染色し、フローサイトメトリーで分析した。
【図３Ｂ−Ｃ】図３Ｂ−３Ｄは、ＤＮＡに基づくＡ９とその２’ＯＭｅ  ＲＮＡ類似体ｍＡ９の両方が、スクランブルされた配列対照アンチドート（ｓＡ９）ではなく、フローサイトメトリーで分析した場合、経時的に細胞結合Ｅ０７の経時的な除去を増大したことを示す。図３Ｂは、２分の時点にて３７℃での蛍光カウントを示し、図３Ｃは、１０分の時点にて３７℃での蛍光カウントを示し、図３Ｄは、時間経過の比較を示す。図３Ｂ−３Ｃの標識の色：細胞のみ（灰色）、Ｅ０７→アンチドートなし（緑色）、Ｅ０７→２５μＭのｓＡ９（橙色）、Ｅ０７→２５μＭのＡ９（紫色）、およびＥ０７→２５μＭのｍＡ９（赤色）。
【図３Ｄ】図３Ｂ−３Ｄは、ＤＮＡに基づくＡ９とその２’ＯＭｅ  ＲＮＡ類似体ｍＡ９の両方が、スクランブルされた配列対照アンチドート（ｓＡ９）ではなく、フローサイトメトリーで分析した場合、経時的に細胞結合Ｅ０７の経時的な除去を増大したことを示す。図３Ｂは、２分の時点にて３７℃での蛍光カウントを示し、図３Ｃは、１０分の時点にて３７℃での蛍光カウントを示し、図３Ｄは、時間経過の比較を示す。図３Ｄの標識の色：Ｅ０７→アンチドートなし（緑色）、対照アプタマー（Ｃ３６）（灰色）、Ｅ０７→ＳＡ９（橙色）、Ｅ０７→Ａ９（紫色）、およびＥ０７→ｍＡ９（赤色）。
【図３Ｅ−Ｆ】図３Ｅ−３Ｇは、ＤＮＡと２’ＯＭｅ  ＲＮＡアンチドートの両方が５μＭ以上の濃度で同様に有効であり、２’ＯＭｅ  ＲＮＡバージョンは、フローサイトメトリーで分析した場合、低濃度でより強力であったことを示す。すべてのフローサイトメトリーデータは、１０4以上のゲート処理された事象を表す。図３Ｅは、異なる濃度でＡ９が提供された場合の蛍光カウントを示し、図３Ｆは、異なる濃度でｍＡ９が提供された場合の蛍光カウントを示し、図３Ｇは、異なる濃度でのＡ９とｍＡ９の相対比較を示す。図３Ｅ−３Ｆの標識の色：細胞のみ（灰色）、Ｅ０７→アンチドートなし（赤色）、Ｅ０７→５０ｎＭアンチドート（ピンク色）、Ｅ０７→１２５ｎＭアンチドート（紫色）、Ｅ０７→２５０ｎＭアンチドート（暗青緑色）、Ｅ０７→５００ｎＭアンチドート（マゼンタ色）、Ｅ０７→１μＭアンチドート（橙色）、Ｅ０７→１μＭアンチドート（明るい緑色）、およびＥ０７→１μＭアンチドート（暗い緑色）。
【図３Ｇ】図３Ｅ−３Ｇは、ＤＮＡと２’ＯＭｅ  ＲＮＡアンチドートの両方が５μＭ以上の濃度で同様に有効であり、２’ＯＭｅ  ＲＮＡバージョンは、フローサイトメトリーで分析した場合、低濃度でより強力であったことを示す。すべてのフローサイトメトリーデータは、１０4以上のゲート処理された事象を表す。図３Ｅは、異なる濃度でＡ９が提供された場合の蛍光カウントを示し、図３Ｆは、異なる濃度でｍＡ９が提供された場合の蛍光カウントを示し、図３Ｇは、異なる濃度でのＡ９とｍＡ９の相対比較を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、ｍＡ９が経時的に細胞からのＥ０７−ＳＡの除去を増強したが、染色Ａ４３１細胞のフローサイトメトリー分析によって証明されるように、ＥＧＦＲ結合抗体ＩＣＲ１０に影響を及ぼさなかった（ｎ＝３）。図４Ａの標識の色：ＥＧＦＲ  Ａｂ（橙色）、ＥＧＦＲ  Ａｂ＋２５μＭ  ｍＡ９（紫色）、Ｅ０７−ＳＡ（青色）、およびＥ０７−ＳＡ＋２５μＭ  ｍＡ９（緑色）。
【図４Ｂ−Ｃ】図４Ｂ−４Ｄは、Ｅ０７−ＳＡで選別し、アンチドートｍＡ９で脱染した後、細胞生存率が維持されたことを示す。生／死アッセイは、生存率が選別または細胞標識解除（ｒｅｖｅｒｓａｌ）によって影響されないことを示した。図４Ｂは、それぞれ未処理または熱処理（６５℃、１５分間）され、生および死の対照として機能する、未染色の選別された細胞を示す。図４Ｃ−４Ｄは、Ｅ０７−ＳＡ、ＥＧＦＲ拮抗抗体（Ｄ１Ｄ４Ｊ）またはｍＡ９処理のいずれも、生の対照と比較して生存率に有意な影響を及ぼさなかったことを示し（図４Ｃ）、すべての条件が、対照との比較に対して生存率＞９５％（ｎ≧４）を持続する（図４Ｄ）。フローサイトメトリーのデータは、１０4以上のゲート処理された事象を表す。図４Ｂの標識の色：生細胞（緑色）および死細胞（赤色）。
【図４Ｄ】図４Ｂ−４Ｄは、Ｅ０７−ＳＡで選別し、アンチドートｍＡ９で脱染した後、細胞生存率が維持されたことを示す。生／死アッセイは、生存率が選別または細胞標識解除（ｒｅｖｅｒｓａｌ）によって影響されないことを示した。図４Ｂは、それぞれ未処理または熱処理（６５℃、１５分間）され、生および死の対照として機能する、未染色の選別された細胞を示す。図４Ｃ−４Ｄは、Ｅ０７−ＳＡ、ＥＧＦＲ拮抗抗体（Ｄ１Ｄ４Ｊ）またはｍＡ９処理のいずれも、生の対照と比較して生存率に有意な影響を及ぼさなかったことを示し（図４Ｃ）、すべての条件が、対照との比較に対して生存率＞９５％（ｎ≧４）を持続する（図４Ｄ）。フローサイトメトリーのデータは、１０4以上のゲート処理された事象を表す。
【図４Ｅ】図４Ｅ−４Ｇは、Ａ４３１細胞からＥ０Ａ−ＳＡ−ＡＦ４８８染色を除去したｍＡ９での処理を示し、フローサイトメトリーで分析した場合、Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ６４７でのその後の再染色を可能にする（ｎ＝３；代表的な曲線を示す）。図４Ｅは、未処理細胞（灰色）およびＥ０７−ＳＡ−ＡＦ４８８処理細胞（青色）のＡＦ４８８（上段）およびＡＦ６４７（下段）の蛍光を示す。
【図４Ｆ】図４Ｅ−４Ｇは、Ａ４３１細胞からＥ０Ａ−ＳＡ−ＡＦ４８８染色を除去したｍＡ９での処理を示し、フローサイトメトリーで分析した場合、Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ６４７でのその後の再染色を可能にする（ｎ＝３；代表的な曲線を示す）。図４Ｆは、未処理細胞（灰色）、Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ４８８処理細胞（紫色）、およびＥ０７−ＳＡ−ＡＦ４８８＋ｍＡ９処理細胞（橙色）のＡＦ４８８（上段）およびＡＦ６４７（下段）の蛍光を示す。
【図４Ｇ】図４Ｅ−４Ｇは、Ａ４３１細胞からＥ０Ａ−ＳＡ−ＡＦ４８８染色を除去したｍＡ９での処理を示し、フローサイトメトリーで分析した場合、Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ６４７でのその後の再染色を可能にする（ｎ＝３；代表的な曲線を示す）。図４Ｇは、未処理細胞（灰色）、Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ４８８＋Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ６４７処理細胞（マゼンタ色）、およびＥ０７−ＳＡ−ＡＦ４８８＋ｍＡ９＋Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ６４７処理細胞（緑色）のＡＦ４８８（上段）およびＡＦ６４７（下段）の蛍光を示す。
【図４Ｈ】図４Ｈ−４Ｊは、フローサイトメトリーで分析した場合、抗体の不可逆性により、再染色用途での抗体の使用が禁止されることを示す（ｎ＝３；代表的な曲線を示す）。図４Ｈは、未処理細胞（灰色）およびＦＩＴＣ  ＥＧＦＲ  Ａｂ処理細胞（青色）のＦＩＴＣ（上段）およびＡＦ６４７（下段）の蛍光を示す。
【図４Ｉ】図４Ｈ−４Ｊは、フローサイトメトリーで分析した場合、抗体の不可逆性により、再染色用途での抗体の使用が禁止されることを示す（ｎ＝３；代表的な曲線を示す）。図４Ｉは、未処理細胞（灰色）、ＦＩＴＣ  ＥＧＦＲ  Ａｂ処理細胞（紫色）、およびＦＩＴＣ  ＥＧＲＦ  Ａｂ＋ｍＡ９処理細胞（橙色）のＦＩＴＣ（上段）およびＡＦ６４７（下段）の蛍光を示す。
【図４Ｊ】図４Ｈ−４Ｊは、フローサイトメトリーで分析した場合、抗体の不可逆性により、再染色用途での抗体の使用が禁止されることを示す（ｎ＝３；代表的な曲線を示す）。図４Ｊは、未処理細胞（灰色）、ＦＩＴＣ  ＥＧＲＦ  Ａｂ＋ＡＦ６４７  ２°Ａｂ処理細胞（マゼンタ色）、およびＦＩＴＣ  ＥＧＲＦ  Ａｂ＋ｍＡ９＋ＡＦ６４７  ２°Ａｂ処理細胞（緑色）のＦＩＴＣ（上段）およびＡＦ６４７（下段）の蛍光を示す。
【図４Ｋ】図４Ｋ−４Ｍは、ＥＧＦ刺激（「＋ＥＧＦ」で示される）後のリン酸化ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ；赤色；「Ｐ」）と総ＥＧＦＲ（緑色；「Ｔ」）の両方について調べたＡ４３１細胞の定量的ウエスタンブロットを示す。複合オーバーレイには「Ｃ」と表示される。Ｅ０７−ＳＡまたはＥＧＦＲ拮抗抗体（Ｄ１Ｄ４Ｊ）のいずれかで染色した後、細胞をＥＧＦＲ発現について選別した。ＥＧＦは未染色細胞と対照Ｃ３６アプタマーで染色された細胞の両方においてＥＧＦＲリン酸化を刺激し（図４Ｋ−４Ｍ）、一方、Ｅ０７−ＳＡまたはＥＧＦＲ−拮抗抗体のいずれかでの未選別細胞（図４Ｌ）と選別細胞（図４Ｍ）の両方の染色は、ＥＧＦによるＥＧＦＲの刺激を抑制し、受容体機能の低下を示した。５μＭのｍＡ９での５分間のその後の処理により、Ｅ０７−ＳＡが十分に除去され、ＥＧＦＲ刺激が天然のレベルに回復した。対照的に、不可逆的に結合した抗体は、ＥＧＦＲの刺激を永続的に阻害した（ｎ≧３）。一元配置分散分析、それに続くＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ事後検定を使用して、*（ｐ＝０．０１２）および****（ｐ＜０．０００１）で示される有意性を判定した。データは平均±ＳＥＭであり、フローサイトメトリーデータは１０4以上のゲート処理された事象を表す。
【図４Ｌ】図４Ｋ−４Ｍは、ＥＧＦ刺激（「＋ＥＧＦ」で示される）後のリン酸化ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ；赤色；「Ｐ」）と総ＥＧＦＲ（緑色；「Ｔ」）の両方について調べたＡ４３１細胞の定量的ウエスタンブロットを示す。複合オーバーレイには「Ｃ」と表示される。Ｅ０７−ＳＡまたはＥＧＦＲ拮抗抗体（Ｄ１Ｄ４Ｊ）のいずれかで染色した後、細胞をＥＧＦＲ発現について選別した。ＥＧＦは未染色細胞と対照Ｃ３６アプタマーで染色された細胞の両方においてＥＧＦＲリン酸化を刺激し（図４Ｋ−４Ｍ）、一方、Ｅ０７−ＳＡまたはＥＧＦＲ−拮抗抗体のいずれかでの未選別細胞（図４Ｌ）と選別細胞（図４Ｍ）の両方の染色は、ＥＧＦによるＥＧＦＲの刺激を抑制し、受容体機能の低下を示した。５μＭのｍＡ９での５分間のその後の処理により、Ｅ０７−ＳＡが十分に除去され、ＥＧＦＲ刺激が天然のレベルに回復した。対照的に、不可逆的に結合した抗体は、ＥＧＦＲの刺激を永続的に阻害した（ｎ≧３）。一元配置分散分析、それに続くＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ事後検定を使用して、*（ｐ＝０．０１２）および****（ｐ＜０．０００１）で示される有意性を判定した。データは平均±ＳＥＭであり、フローサイトメトリーデータは１０4以上のゲート処理された事象を表す。
【図４Ｍ】図４Ｋ−４Ｍは、ＥＧＦ刺激（「＋ＥＧＦ」で示される）後のリン酸化ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ；赤色；「Ｐ」）と総ＥＧＦＲ（緑色；「Ｔ」）の両方について調べたＡ４３１細胞の定量的ウエスタンブロットを示す。複合オーバーレイには「Ｃ」と表示される。Ｅ０７−ＳＡまたはＥＧＦＲ拮抗抗体（Ｄ１Ｄ４Ｊ）のいずれかで染色した後、細胞をＥＧＦＲ発現について選別した。ＥＧＦは未染色細胞と対照Ｃ３６アプタマーで染色された細胞の両方においてＥＧＦＲリン酸化を刺激し（図４Ｋ−４Ｍ）、一方、Ｅ０７−ＳＡまたはＥＧＦＲ−拮抗抗体のいずれかでの未選別細胞（図４Ｌ）と選別細胞（図４Ｍ）の両方の染色は、ＥＧＦによるＥＧＦＲの刺激を抑制し、受容体機能の低下を示した。５μＭのｍＡ９での５分間のその後の処理により、Ｅ０７−ＳＡが十分に除去され、ＥＧＦＲ刺激が天然のレベルに回復した。対照的に、不可逆的に結合した抗体は、ＥＧＦＲの刺激を永続的に阻害した（ｎ≧３）。一元配置分散分析、それに続くＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ事後検定を使用して、*（ｐ＝０．０１２）および****（ｐ＜０．０００１）で示される有意性を判定した。データは平均±ＳＥＭであり、フローサイトメトリーデータは１０4以上のゲート処理された事象を表す。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、アプタマー結合のアンチドートを媒介したブロック（図５Ａ）または結合アプタマーの除去（図５Ｂ）により指示されるＭＦＩの減少を示す。４℃でのアンチドートの存在下（図５Ａ）と非存在下（図５Ｂ）での染色は、結合Ｅ０７の量をわずかに減少させただけであり、予測されるループ領域を標的とするアンチドートが最も効果的であった。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、アプタマー結合のアンチドートを媒介したブロック（図５Ａ）または結合アプタマーの除去（図５Ｂ）により指示されるＭＦＩの減少を示す。４℃でのアンチドートの存在下（図５Ａ）と非存在下（図５Ｂ）での染色は、結合Ｅ０７の量をわずかに減少させただけであり、予測されるループ領域を標的とするアンチドートが最も効果的であった。
【図６】図６は、アンチドートＡ９が３７℃でのみ細胞からのＥ０７の除去を増強することを示す。Ｅ０７染色されたＡ４３１細胞は、３７℃でインキュベートした培地（明るい青色）またはアンチドート（１００μＭのＡ９）（濃い青色）に再懸濁され、結合Ｅ０７を除去した。
【図７Ａ】図７Ａ−７Ｄは、アプタマー対ストレプトアビジンのより高いモル比を使用して、より高い結合価のアプタマー−ストレプトアビジンコンジュゲートが生成されたことを示す。次に、ｂＥ０７（図７Ａ）とｂＣ３６（図７Ｂ）のＲＮＡはともに、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色し、画像化することで可視化された。最小（青色）、中間（緑色）、および最大（橙色）のＭＷコンジュゲートは、一価、二価、および三価であるとそれぞれみなされた。
【図７Ｂ】図７Ａ−７Ｄは、アプタマー対ストレプトアビジンのより高いモル比を使用して、より高い結合価のアプタマー−ストレプトアビジンコンジュゲートが生成されたことを示す。次に、ｂＥ０７（図７Ａ）とｂＣ３６（図７Ｂ）のＲＮＡはともに、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色し、画像化することで可視化された。最小（青色）、中間（緑色）、および最大（橙色）のＭＷコンジュゲートは、一価、二価、および三価であるとそれぞれみなされた。
【図７Ｃ】図７Ａ−７Ｄは、アプタマー対ストレプトアビジンのより高いモル比を使用して、より高い結合価のアプタマー−ストレプトアビジンコンジュゲートが生成されたことを示す。次に、ｂＥ０７（図７Ａ）とｂＣ３６（図７Ｂ）のＲＮＡはともに、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色し、画像化することで可視化された。最小（青色）、中間（緑色）、および最大（橙色）のＭＷコンジュゲートは、一価、二価、および三価であるとそれぞれみなされた。図７Ｃ（ｂＥ０７）および７Ｄ（ｂＣ３６）は、ソフトウェアで定量化され、次に、その試料のすべてのコンジュゲートの合わせた強度に標準化された各コンジュゲートサイズに対応するバンド強度を示す。
【図７Ｄ】図７Ａ−７Ｄは、アプタマー対ストレプトアビジンのより高いモル比を使用して、より高い結合価のアプタマー−ストレプトアビジンコンジュゲートが生成されたことを示す。次に、ｂＥ０７（図７Ａ）とｂＣ３６（図７Ｂ）のＲＮＡはともに、ゲルをＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色し、画像化することで可視化された。最小（青色）、中間（緑色）、および最大（橙色）のＭＷコンジュゲートは、一価、二価、および三価であるとそれぞれみなされた。図７Ｃ（ｂＥ０７）および７Ｄ（ｂＣ３６）は、ソフトウェアで定量化され、次に、その試料のすべてのコンジュゲートの合わせた強度に標準化された各コンジュゲートサイズに対応するバンド強度を示す。
【図８】図８は、高い比のＥ０７：ＳＡコンジュゲート混合物が見かけの親和性は高いが、見かけの飽和度が低いことを示す。図８の標識の色：Ｅ０７（黒色）、１：１  ＴｂＥ０７：ＳＡ（紫色）、２：１  ＴｂＥ０７：ＳＡ（青色）、３：１  ＴｂＥ０７：ＳＡ（緑色）。
【図９】図９は、フローサイトメトリーで分析した場合、Ｅ０７−ＳＡコンジュゲート混合物よりも有意に多くのモノマーＥ０７が選別中に失われたことを示す。各グループは他のすべてのグループと有意に相違する（*、**、***についてｐ＜０．０００１）。
【図１０Ａ】図１０Ａ−１０Ｃは、Ｅ０７モノマーと比較したＥ０７−ＳＡコンジュゲートの追加の安定性を強調した選別細胞の脱染を示す。次に、細胞をフローサイトメトリーで分析し、その除去に対応する各染色タイプの蛍光の減少をプロットした。ＥＧＦＲ抗体ＩＣＲ１０（明るい紫色と暗い紫色）およびＤ１Ｄ４Ｊ（明るい橙色と暗い橙色）は最も安定した染色であり、培地中、３７℃で３０分間にわたってわずかな喪失のみを経験した（図１０Ａ）。
【図１０Ｂ】図１０Ａ−１０Ｃは、Ｅ０７モノマーと比較したＥ０７−ＳＡコンジュゲートの追加の安定性を強調した選別細胞の脱染を示す。次に、細胞をフローサイトメトリーで分析し、その除去に対応する各染色タイプの蛍光の減少をプロットした。Ｅ０７−ＳＡは、培地のみとアンチドートの両方でＥ０７よりも実質的に安定であったが、高濃度のアンチドート（５μＭ；図１０Ｂ）対（５００ｎＭ；図１０Ｃ）は、結合したコンジュゲート混合物を３０分間にわたって効果的に除去した。図１０Ｂ−１０Ｃの標識の色：Ｅ０７、培地（明るい青色）、Ｅ０７、５００ｎＭ  ｍＡ９またはＥ０７、５μＭ  ｍＡ９（暗い青色）、Ｅ０７−ＳＡ培地（明るい緑色）、およびＥ０７−ＳＡ、５００ｎＭ  ｍＡ９またはＥ０７−ＳＡ、５μＭ  ｍＡ９（暗い緑色）。
【図１０Ｃ】図１０Ａ−１０Ｃは、Ｅ０７モノマーと比較したＥ０７−ＳＡコンジュゲートの追加の安定性を強調した選別細胞の脱染を示す。次に、細胞をフローサイトメトリーで分析し、その除去に対応する各染色タイプの蛍光の減少をプロットした。Ｅ０７−ＳＡは、培地のみとアンチドートの両方でＥ０７よりも実質的に安定であったが、高濃度のアンチドート（５μＭ；図１０Ｂ）対（５００ｎＭ；図１０Ｃ）は、結合したコンジュゲート混合物を３０分間にわたって効果的に除去した。図１０Ｂ−１０Ｃの標識の色：Ｅ０７、培地（明るい青色）、Ｅ０７、５００ｎＭ  ｍＡ９またはＥ０７、５μＭ  ｍＡ９（暗い青色）、Ｅ０７−ＳＡ培地（明るい緑色）、およびＥ０７−ＳＡ、５００ｎＭ  ｍＡ９またはＥ０７−ＳＡ、５μＭ  ｍＡ９（暗い緑色）。
【図１１Ａ】図１１Ａは、選別されていないアプタマーで染色された細胞がＥＧＦで刺激される能力をアンチドートで回復した場合の脱染のみを示す。定量的ウエスタンブロット法は、リン酸化（ｐＥＧＦＲ；赤色）および総ＥＧＦＲ（緑色）を調べることにより、ＥＧＦ誘導によるＡ４３１細胞の刺激の定量化を可能にした。*はＥＧＦによる刺激を示す；培地ＤＳ＝培地のみで脱染；ｍＡ９  ＤＳ＝５μＭのｍＡ９で脱染。抗体および未染色細胞は培地のみで脱染された。ＥＧＦの結合がＥＧＦＲの自己リン酸化をトリガーしてｐＥＧＦＲを生成するため、刺激の程度は、ｐＥＧＦＲおよび総ＥＧＦＲのバンド強度の比として採用された。
【図１１Ｂ】図１１Ｂ−１１Ｃは、Ｅ０７−ＳＡで染色されたが、Ｅ０７で染色されていない細胞のＥＧＦ刺激性の回復のために選別後にアンチドート処理が必要であることを示す。定量的ウエスタンブロットはまた、ＦＡＣＳを介して選別されたＡ４３１細胞について実施された。脱染、刺激、溶解、ならびにリン酸化ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ；赤色）および総ＥＧＦＲ（緑色）を調べるためのウエスタンブロット法は、未選別試料で使用したものと同一であった。*はＥＧＦによる刺激を示す；培地ＤＳ＝培地のみによる脱染；ｍＡ９  ＤＳ＝５μＭのｍＡ９による脱染。抗体および未染色細胞は培地のみで脱染された。脱染されたＣ３６およびＳＡ−Ｃ３６（２：１  Ｃ３６：ＳＡコンジュゲートミックス）試料（図１１Ｂ）は、脱染された陽性対照と比較して細胞刺激を阻害しなかったが、Ｃ３６およびＳＡ−Ｃ３６試料は細胞をわずかに異なる程度に刺激した（**対***についてｐ＝０．０１２）。
【図１１Ｃ】図１１Ｂ−１１Ｃは、Ｅ０７−ＳＡで染色されたが、Ｅ０７で染色されていない細胞のＥＧＦ刺激性の回復のために選別後にアンチドート処理が必要であることを示す。定量的ウエスタンブロットはまた、ＦＡＣＳを介して選別されたＡ４３１細胞について実施された。脱染、刺激、溶解、ならびにリン酸化ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ；赤色）および総ＥＧＦＲ（緑色）を調べるためのウエスタンブロット法は、未選別試料で使用したものと同一であった。*はＥＧＦによる刺激を示す；培地ＤＳ＝培地のみによる脱染；ｍＡ９  ＤＳ＝５μＭのｍＡ９による脱染。抗体および未染色細胞は培地のみで脱染された。未選別試料とは異なり、選択されたＥ０７試料の培地による脱染（図１１Ｃ）は、刺激を天然のレベルに戻すのに十分であった。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
細胞の生存率または機能を損なうことなく可逆的に細胞を標識する能力は、細胞の不均一な集団内の細胞を選別または同定するための貴重であり、多目的なツールである。この技術は、無数の研究および臨床応用に適合するように、アプタマー−アンチドート対を選択することによって調整され得る適応可能なプラットフォームとして機能する。ここでは、本発明者らは、アプタマーを用いて、アンチドートを媒介した可逆性のアプタマーの排他的な利点を保持しながらも、分子標的と結合することによって細胞を同定および／または選別し得ることを実証する。結果として、この技術は、不均一な集団内の細胞を陽性選別および／または同定し、その後、細胞を天然の状態に戻すことができる。
【００１０】
アプタマー
本明細書で使用するとき、用語「アプタマー」とは、高親和性で分子標的に特異的に結合する一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドを指す。アプタマーは、Ｋd＜１μＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．５ｎＭ、または０．１ｎＭで分子標的に結合し得る。分子標的には、限定されないが、タンパク質、脂質、炭水化物、他の種類の分子、またはそれらの任意の特定の結合部位が含まれ得る。分子標的は、膜に結合した表面であり得る。「表面結合分子標的」は、限定されないが、内在性または末梢膜タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質を含む、膜に関連付けられた任意の分子標的であり得る。以下の実施例に示されるように、本明細書で使用されるアプタマーは、細胞表面受容体である表面結合分子標的に結合する。
【００１１】
アプタマーは、ループおよび／またはステム領域によって特徴付けられる二次構造を有し得る。「ループ領域」は、この領域のヌクレオチドが、アプタマーの任意の他のヌクレオチドと塩基対を形成することは期待されないことを示す。「ステム領域」は、アプタマーのこの特定の領域のヌクレオチドが、逆相補体であるアプタマーの対応する領域のヌクレオチドと対を形成し、および整列され、アプタマーの二次構造を安定化すると予想されることを示す。当該技術分野において周知であるように、アデニンは、ウラシルまたはチミンと水素結合を形成し、シトシンおよびグアニンはまたＤＮＡとＲＮＡ分子の両方で互いに水素結合を形成する。塩基は、別々の核酸鎖上または同じ核酸鎖上のいずれかで逆相補体と整列する。
アプタマーは、少なくとも１つの結合モチーフを有する。「結合モチーフ」は、高親和性で分子標的に特異的に結合するオリゴヌクレオチド配列の一部であり、特定のループおよび／もしくはステム領域、またはアプタマーの特定のヌクレオチドもしくは塩基によって特徴付けられ得る。
【００１２】
本明細書に記載されるアプタマーは、一価または多価のアプタマーであり得る。「一価」アプタマーは、１つの結合モチーフを有する。「多価」アプタマーは、同じオリゴヌクレオチド鎖または異なるオリゴヌクレオチド鎖のいずれかに２つ以上の結合モチーフを有する。ある場合には、多価アプタマーは、２つの結合モチーフを有する「二価」アプタマー、３つの結合モチーフを有する「三価」アプタマー、または４つの結合モチーフを有する「四価」アプタマーである。いくつかの多価アプタマーについて、結合モチーフはすべて同じであり得る。換言すると、結合モチーフは各々、同じ分子標的に特異的に結合する同じオリゴヌクレオチド配列を含み得る。あるいは、結合モチーフの少なくとも１つは、他の結合モチーフと相違し得、特定の場合には、結合モチーフのすべてがいずれもの他の結合モチーフと相違する。換言すると、結合モチーフは、異なる分子標的に特異的に結合することができる異なるオリゴヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
標的への高親和性結合についてコンビナトリアルオリゴヌクレオチドライブラリーをスクリーニングすることにより、標的分子に対してアプタマーを生成させることができる（例えば、Ellington and Szostak, Nature 1990; 346: 8 18-22 (1990)、Tuerk and Gold, Science 249:505-10 (1990)を参照されたい）。本明細書に開示されるアプタマーは、当該技術分野において公知である方法を用いて合成され得る。例えば、開示されたアプタマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（ＩＤＴ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、またはＢｉｏ−Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｉｎｃ．などの様々な商業的供給業者によって使用される標準的なオリゴヌクレオチド合成技術を用いて合成され得る。
【００１４】
当業者はまた、本明細書で提供されるアプタマーはＲＮＡアプタマーであるが、アプタマーは修飾ヌクレオチドで作製され得、またはいくつかのデオキシリボヌクレオチド、２’−フルオロ（２’−Ｆ）、２’−Ｏ−メチル（２’−ＯＭｅ）、２’ヒドロキシル基（２’−ＯＨ）、または３’−反転デオキシチミジン（ｉｄＴ）残基もしくはＲＮＡの他の修飾を含み得ることを認識する。ヌクレアーゼ分解からの安定性を増加させるために、残基の修飾が追加され得る。アプタマーはまた、アプタマーへの３’もしくは５’修飾によって、またはロックされた核酸（ＬＮＡ）もしくはペプチド核酸（ＰＮＡ）などの修飾塩基の包含によって、ＲＮａｓｅ分解から保護することもできる。
「選別アプタマー」は、分子標的に関連付けられる細胞の選別および／または同定に有用である、高親和性で分子標的に特異的に結合するアプタマーを含む。染色アプタマーは、３Ｄ構造を有するオリゴヌクレオチドと選別標識とを含む。「選別標識」は、細胞の異種集団を細胞の亜集団に選別するために、または細胞の異種集団内の細胞の亜集団を同定するために使用され得る任意の適切な化学物質または物質を含み得る。選別標識は、レポーター標識、磁気標識、または結合標識であり得る。
【００１５】
本明細書で使用するとき、「細胞の不均一な集団」は、細胞に関連付けられる分子標的の存在もしくは不存在などの際立った特徴を有するか、または欠失している亜集団に細分され得る細胞の集団である。細胞の不均一な集団は、細胞または組織を含む生体液などの生体試料から調製され得るが、そうである必要はない。生体液は、流体内の細胞を本明細書に記載される選別アプタマーのいずれかと接触させる前に、処理の有無にかかわらず使用され得る。組織は、細胞を本明細書に記載される選別アプタマーのいずれかと接触させる前に、単一細胞懸濁液などの細胞懸濁液を調製するための処理とともに使用され得る。
【００１６】
「レポーター標識」は、画像化技術を使用してシグナルまたはコントラストとして検出され得る任意の適切な化学物質または物質を含み得る。レポーター部分は当該技術分野において周知であり、例えば、James and Gambhir, Physiol Rev 92: 897-965 (2012)に概説されている。一部の実施形態では、レポーター標識は、フルオロフォア部分、光学部分、磁気部分、放射標識部分、Ｘ線部分、超音波画像化部分、光音響画像化部分、ナノ粒子ベースの部分、または列挙された部分の２つ以上の組合せを含み得る。レポーター標識はまた、放射線療法で使用される放射性核種、または光線力学的療法において使用されるポルフィリンなどの治療用レポーターを含み得る。
【００１７】
「フルオロフォア部分」は、蛍光シグナルを生成することができる任意の分子を含み得る。様々なフルオロフォア部分が当該技術分野において周知であり、および／または市販されている。例示的なフルオロフォア部分には、限定されないが、フルオレセイン；ＦＩＴＣ；Ａｌｅｘａ色素、例えば、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＡＦ４８８）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０（ＡＦ６６０）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０（ＡＦ６８０）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７５０（ＡＦ７５０）、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７９０（ＡＦ７９０）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｃｙ色素、例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）；ＤｙＬｉｇｈｔ色素、ＤｙＬｉｇｈｔ  ３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ  ５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６５０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ  ７５５（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；ＩＲＤｙｅ色素、例えば、ＩＲＤｙｅ  ８００ＣＷ、ＩＲＤｙｅ  ８００ＲＳ、およびＩＲＤｙｅ  ７００ＤＸ（Ｌｉ−Ｃｏｒ）；ＶｉｖｏＴａｇ色素、例えば、ＶｉｖｏＴａｇ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ６８０、ＶｉｖｏＴａｇ−Ｓ７５０（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）が挙げられる。
「光学部分」には、限定されないが、発光または音響光学部分などの光学画像化を使用してコントラストまたはシグナルを生成するために使用することができる薬剤が含まれ得る。
「磁気部分」には、磁気共鳴剤用のキレート剤が含まれ得る。磁気共鳴剤用のキレート剤は、Ｇｄ（ＩＩＩ）、Ｄｙ（ＩＩＩ）、Ｆｅ（ＩＩＩ）、Ｍｎ（ＩＩ）などの常磁性金属イオンと安定した錯体を形成するように選択され得る。
【００１８】
他の例示的なレポーター部分には、「放射標識部分」が含まれる。例示的な放射標識部分には、限定されないが、99ｍＴｃ、64Ｃｕ、67Ｇａ、186Ｒｅ、188Ｒｅ、153Ｓｍ、177Ｌｕ、67Ｃｕ、123Ｉ、124Ｉ、125Ｉ、nＣ、X３Ｎ、15Ｏ、および18Ｆが含まれる。また、例示的なレポーター部分には、限定されないが、186Ｒｅ、188Ｒｅ、153Ｓｍ、67Ｃｕ、105Ｒｈ、mＡｇ、および192Ｉｒなどの治療用放射性医薬品も含まれ得る。
「Ｘ線部分」は、ヨウ素化有機分子または重金属イオンのキレートなど、Ｘ線画像化を使用してコントラストまたはシグナルを生成するために使用され得る任意の薬剤を含み得る。
「超音波画像化部分」は、レボビスト（Ｌｅｖｏｖｉｓｔ）、アルブネックス（Ａｌｂｕｎｅｘ）、またはエコビスト（Ｅｃｈｏｖｉｓｔ）などの超音波標的マイクロバブルを使用してコントラストまたはシグナルを生成するために使用することができる任意の薬剤を含み得る。
「光音響画像化部分」は、メチレンブルー、単層カーボンナノチューブ（ＳＷＮＴ）、および金ナノ粒子などの光音響画像化適合剤を含み得る。
【００１９】
レポーター標識はまた、ナノ粒子ベースの部分であり得る。「ナノ粒子ベースの部分」は、シグナルを生成することができるナノ粒子を含み得る。例えば、シリコン含有ナノ粒子を使用して、蛍光、発光、または他のタイプのシグナルを生成することができる。他の例示的なナノ粒子ベースの部分には、例えば、ナノスフェア、例えばコダックＸ−ＳＩＧＨＴ  ６５０、コダックＸ−ＳＩＧＨＴ  ６９１、コダックＸ−ＳＩＧＨＴ  ７５１（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；金属酸化物ナノ粒子；および量子ドット、例えばＥｖｉＴａｇｓ（Ｅｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＱｄｏｔプローブ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が含まれる。
【００２０】
「磁気標識」は、コロイド粒子、ミクロスフェア、ナノ粒子、またはビーズなどの強磁性、超常磁性、または常磁性固相を含み得る。磁気標識は、マグネタイトＦｅ3Ｏ4もしくはマグヘマイトγ−Ｆｅ2Ｏ3の酸化鉄；強磁性金属、例えば、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ；ＭｅＯ・Ｆｅ2Ｏ形態のフェライト酸化物、この場合、Ｍｅは、Ｍｇ、Ｚｎ、Ｍｎ、Ｎｉ、もしくはＣｏであり得る；ＣｏＰｔ３もしくはＦｅＰｔなどの白金化合物；またはその任意の組合せを含み得る。磁気標識は、１ｎｍから１００ミクロンの直径を有し得る。１ｎｍから１００ｎｍまたは１０ｎｍから５０ｎｍの直径を有する磁気標識を使用し得、この場合、複数の磁気標識を細胞に結合させることが意図されるが、一方、１ミクロンから１００ミクロンまたは１ミクロンから１０ミクロンの直径を有する磁気標識を使用し得、この場合、少数の磁気標識を細胞に結合されることが意図される。
【００２１】
「結合標識」は、別の薬剤を高親和性で結合することができる任意の標識を含む。いくつかの結合標識は当該技術分野において周知であり、限定されないが、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、ジゴキシゲニン、または抗ジゴキシゲニン抗体を含む。一部の実施形態では、選別アプタマーは、５’または３’末端のいずれかで修飾されてビオチンを含み得る。あるいは、アプタマーは、ストレプトアビジンまたはアビジンを含むように５’または３’末端のいずれかで修飾され得る。
【００２２】
アプタマーおよび選別標識は、共有結合または非共有結合のいずれかで「連結する」ことができる。さらに、リンカーまたはスペーサー部分を使用して、アプタマーおよび選別標識を連結させることができる。有用なリンカーまたはスペーサー部分には、ペプチド、アミノ酸、核酸、ならびにホモ機能性リンカーまたはヘテロ機能性リンカーが含まれる。アプタマーとレポーター標識間の共有結合の形成を促進させることができる、特に有用なコンジュゲーション試薬は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルおよび／もしくはマレイミドを含むか、またはクリック化学を使用し得る。アプタマーおよび選別標識は、アプタマーの５’末端もしくは３’末端で連結され得るか、またはヌクレオチドが、必要とされる官能基で最初に修飾されている場合は内部で任意のヌクレオチドで連結され得る。
アプタマーおよび選別標識は、タグシステムを使用して連結され得る。「タグシステム」は、高親和性で互いに結合することができる薬剤の任意のグループを含み得る。いくつかのタグシステムが当該技術分野において周知であり、限定されないが、ビオチン／アビジン、ビオチン／ストレプトアビジン、ビオチン／ニュートラアビジン、またはジゴキシゲニン（ＤＩＧ）システムが含まれる。一部の実施形態では、上記タグシステムは、ビオチン／アビジンまたはビオチン／ストレプトアビジンを含む。このような実施形態では、アプタマーはビオチンを含むように５’または３’末端のいずれかで修飾され得、一方、レポーター標識はストレプトアビジンまたはアビジンを含むように修飾され得る。あるいは、アプタマーはストレプトアビジンまたはアビジンを含むように５’または３’末端のいずれかで修飾され得、一方、選別標識はビオチンを含むように修飾され得る。
異なる結合モチーフは、アプタマーを選別標識に連結させるための上記の化学と類似した化学によって共有結合または非共有結合のいずれかで連結され得る。
【００２３】
様々なアプタマーが本明細書の実施例に記載され、使用されている。Ｅ０７は、アプタマーに拮抗する上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＲＦ）である。本明細書および実施例を通じて使用される「Ｅ０７」は、２’フルオロ（２’Ｆ）ピリミジンを含み得、３’末端で逆チミジン（ｉｄＴ）によって修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号１）を意味する。状況に応じて、「Ｅ０７」は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＡＦ４８８）またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＡＦ６４７）蛍光色素で５’末端にレポーター標識によって修飾され得る（図１Ａ）。「ｂＥ０７」は、５’末端にビオチン結合標識で修飾されたＲＮＡオリゴヌクレオチド（配列番号５）を意味する（図１Ｂ）。「Ｃ３６」（配列番号２）および「ｂＣ３６」（配列番号８）は、それぞれＥ０７およびｂＥ０７の無関係な非結合対照である。
【００２４】
一価または多価アプタマーコンジュゲートもまた調製され得る。「アプタマーコンジュゲート」は、１つ以上の結合標識を高親和性で結合することができるリンカーと非共有結合または共有結合された結合標識を含むアプタマーを含む。リンカーは、レポーター標識および／または磁気標識をさらに含み得る。図１Ｃは、それぞれ結合標識１３および１４を介してリンカー１５に連結された第１のアプタマー１１および第２のアプタマー１２を含む二価アプタマーコンジュゲート１０を示す。示されるように、リンカー１５は、レポーター標識１６などのレポーター標識を含む。示されるように、第１のアプタマー１１および第２のアプタマー１２は同じであるが、当業者はそれらがそうである必要はないことを認識する。一部の実施形態では、リンカー１５に連結されるアプタマーの数は、１とリンカー１５の結合部位の数との間の任意の数、例えば、１、２、３、または４であり得る。
【００２５】
本明細書で使用するとき、「Ｅ０７−ＳＡ」は、ｂＥ０７およびストレプトアビジンリンカーを含むアプタマーコンジュゲートであり、「Ｃ３６−ＳＡ」はｂＣ３６およびストレプトアビジンリンカーを含むアプタマーコンジュゲートである。「Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ４８８」および「Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ６４７」は、それぞれＡＦ４８８またはＡＦ６４７で蛍光標識されたストレプトアビジンを含むｂＥ０７アプタマー−ストレプトアビジンコンジュゲートである。
【００２６】
アプタマー配列およびプライマー配列のオリゴヌクレオチド配列を表１に示す。
【表１】
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【００２７】
アンチドート
アンチドートもまた本明細書で提供される。「アンチドート」は、アプタマーの二次構造変化をもたらし、したがって、アプタマーのその標的への結合を防止し、さらには解除（ｒｅｖｅｒｓｅ）させる、アプタマーとの塩基相補性を介してハイブリダイズできるＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドである。アンチドートは、アプタマーに存在する少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドに逆相補的であり、および／またはそれにハイブリダイズすることができる配列に対して５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。当業者は、ＤＮＡ形態である場合、ウラシルの代わりにチミンを含むように配列が変更されることを理解する。実施例に示されるように、アンチドートには、２’−Ｏ−メチルＲＮＡ修飾されたアンチドートが含まれていた。他の修飾核酸もまた、２’−フルオロ修飾された核酸、ＬＮＡまたはＰＮＡなどのアプタマーについて上記されたアンチドートに使用することができる。
【００２８】
一部の実施形態では、アンチドートは、アプタマーの二次構造変化をもたらし、したがって、アプタマーのその標的への結合を防止し、さらには解除させる、アプタマーに対する塩基相補性を介してハイブリダイズすることができる単一のオリゴヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、アンチドートは、アプタマーの二次構造変化をもたらし、したがって、アプタマーのその標的への結合を防止し、さらには解除させる、アプタマーの異なる部分に対して塩基相補性を介してハイブリダイズすることができる複数の異なるオリゴヌクレオチド配列を含む。ある場合には、複数の異なるオリゴヌクレオチド配列は、２、３、４、またはそれを超える異なるオリゴヌクレオチド配列を含む。複数の異なるオリゴヌクレオチド配列は、同じオリゴヌクレオチドまたは異なるオリゴヌクレオチドの一部であり得る。異なるオリゴヌクレオチドは、アプタマーを選別標識または他のアプタマーに連結させるための上記の化学によって共有結合または非共有結合され得る。
【００２９】
アンチドートは、実施例に記載される方法などの方法によって、相補的オリゴヌクレオチドをスクリーニングすることによりアプタマーに対して生成することができる。本明細書に開示されるアンチドートは、当該技術分野において公知である方法を用いて合成され得る。例えば、開示されたアンチドートは、Integrated DNA Technologies, Inc. (IDT)、Sigma-Aldrich、Life Technologies、またはBio-Synthesis, Inc.などの様々な商業的供給業者によって使用される標準的なオリゴヌクレオチド合成技術を用いて合成され得る。
【００３０】
スクリーニングされたアンチドートのオリゴヌクレオチド配列を表２に示す。
【表２】
2020514765.tif 000004
【００３１】
選別アプタマーを使用する方法
本明細書に記載されるアプタマーおよびアンチドートは、生細胞を可逆的に染色するために使用され得る。染色される細胞は、任意のタイプの細胞であり得る。染色される細胞は、生体液または組織などの生体試料から取得され得るが、そうである必要はない。本明細書で使用する場合、「染色」とは、細胞表面の分子標的との選別アプタマーの結合を介して選別標識を関連付けることを意味し、細胞の異種集団内の細胞を同定する能力、または細胞の異種集団から細胞を選別する能力を増強する。選別アプタマーが分子標的から除去されまたは非結合となった後、染色は「天然の状態で選別細胞を調製する」という点で「可逆的」である。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「天然の状態（ｎａｔｉｖｅ  ｓｔａｔｅ）」（自然の状態、本来の状態、未修飾の状態）とは、選別アプタマーを結合する前の細胞機能と実質的に類似した細胞機能を有する生細胞を意味し、および／または細胞は表面結合した染色アプタマーを実質的に含まない。実質的に類似した細胞機能を有する細胞は、選別アプタマーを結合する前の測定可能な細胞機能の±２０％、±１５％、±１０％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％以内、または統計的に関連する誤差の尺度（例えば、誤差の標準尺度（ＳＥＭ）または標準偏差）以内で測定可能な細胞機能を有することを意味し得る。表面結合選別アプタマーを実質的に含まない細胞とは、表面結合アプタマーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が除去されることを意味し得る。表面結合選別アプタマーを実質的に含まない細胞とは、表面結合アプタマーの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％が除去されることを意味し得る。天然の状態はまた、細胞が、水、晶質、殺菌剤、防腐剤、または保存剤を除いて、アンチドートなどの別のものとの組合せを実質的に含まないことを意味し得る。この文脈で実質的に含まないとは、薬剤に起因する細胞機能のいずれもの変調が、選別アプタマーを結合する前の測定可能な細胞機能の±２０％、±１５％、±１０％、±５％、±４％、±３％、±２％、±１％未満、または統計的に関連する誤差の尺度（例えば、誤差の標準尺度（ＳＥＭ）または標準偏差）以内であることを意味し得る。天然の状態はまた、細胞が最小限の操作を受けているか、または実質的な操作を受けていないことを意味し得る。「最小限の操作」とは、再構成、修復、もしくは置換のための組織の有用性に関連する組織の元の関連特性を変更しない処理、または細胞もしくは組織の関連生物学的特性を変更しない処理を意味する。切断、粉砕、成形、遠心分離、抗生物質または抗菌液への浸漬、滅菌、照射、細胞分離、細胞濃縮、細胞精製、ろ過、凍結乾燥（ｌｙｐｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、凍結、凍結保存（ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ）、またはガラス化などの操作は、実質的な操作ではない。
【００３３】
本明細書に記載される方法において使用後の細胞は、対象に、植え付け、移植、注入、または移入され得る。本明細書で使用される場合、「対象」は、「患者」または「個体」と交換可能であり得、治療を必要とするヒトまたは非ヒト動物であり得る動物を意味する。「治療を必要とする対象」は、本明細書に記載される方法および組成物によって選別または単離された細胞による細胞ベースの治療に反応する疾患、障害、または状態を有する対象を含み得る。
【００３４】
選別アプタマーを使用する方法２０は、一般的に、図２Ａに示されている。図２Ａに示されるように、本方法は、異種細胞集団内の細胞に関連付けられた分子標的を選別アプタマー２１と結合させ、異種細胞集団２２から細胞を選別し、分子標的２３から選別アプタマーを除去する工程を含む。あるいは、選別工程２３は、異種集団内で細胞が同定される同定工程であり得、または選別工程２３は、同定工程と選別工程の組合せであり得る。本方法は、外因性材料２４を除去することをさらに含んでもよい。
【００３５】
記載された代替手段は、異なる手段によって、および／または異なる目的のために実行され得る。本明細書で使用する場合、「選別する」とは、一般的に、不均一な集団内の細胞を、際立った特徴、例えば、細胞に関連付けられた分子標的に基づいて亜集団に物理的に分離することを意味する。本明細書で使用する場合、「同定する」とは、異種集団内の亜集団が保有する際立った特徴を検出することを意味する。一部の選別技術では、選別前に際立った特徴を同定する必要がある。選別技術が同定を必要としない場合でさえ、際立った特徴の存在または不存在を確認するために、オプションの同定工程が望ましい場合がある。
【００３６】
選別する方法は、任意の適切な細胞選別技術であり得る。多数の細胞選別技術が当該技術分野において公知であり、当業者は、適切な選別標識の選択に基づいて選別アプタマーを修飾して、選別技術を実施する方法を理解する。以下に説明する実施例で使用される選別技術の例は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）である。ＦＡＣＳは、散乱光および／または蛍光の同定に基づいて、細胞の異種集団内の細胞を２つ以上の容器に一度に一方の細胞に選別し、次に、細胞を適切な容器に選別することに応じて電界を変調する方法を提供する。フルオロフォア部分などのレポーター標識を含む選別アプタマーが細胞関連分子標的に結合する場合、ＦＡＣＳを使用して、レポーター標識からの散乱光および／または蛍光を同定し、それによって選別アプタマーとその関連細胞を選別し得る。
【００３７】
本明細書に記載される技術を用いて実施され得る選別技術の別の例は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）または他の磁石標識選別技術である。ＭＡＣＳは、磁性材料を隔離するために磁場を適用することによって、細胞の異種細胞集団内の細胞を選別する方法を提供する。磁気ビーズなどの磁気標識を含む選別アプタマーが細胞関連分子標的に結合する場合、選別アプタマーとその関連細胞を選別するためにＭＡＣＳが使用され得る。際立った特徴の同定は、選別前に必要ではないが、選別の前後で実行され得る。
【００３８】
本明細書に記載される技術を用いて実施され得る選別技術の別の例は、結合親和性に基づく細胞捕獲技術である。捕獲技術は、細胞を材料または基質に特異的に結合させることにより、または代替的に他の選別技術に使用することができる材料に特異的に結合することにより、細胞を物理的に隔離することによって細胞を選別する方法を提供する。後者のタイプの例として、結合標識を含む選別アプタマーは、レポータータイプの材料を含む材料、例えば、蛍光標識ストレプトアビジンに結合したビオチン化アプタマーに特異的に結合して、ＦＡＣＳによって分離され得る。別の例として、結合標識を含む選別アプタマーは、磁気材料を含む材料、例えば、ＭＡＣＳにより分離されるストレプトアビジン被覆磁気ビーズに結合したビオチン化アプタマーに特異的に結合され得る。
【００３９】
選別アプタマーの除去は、多数の異なる方法で達成され得る。本明細書で使用する場合、選別アプタマーを「除去する」とは、分子標的に結合した選別アプタマーの数を有意に減らすことを意味する。場合によっては、分子標的に結合する選別アプタマーの数が有意に減少するとは、分子標的に結合した選別アプタマーの数における少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の減少を意味する。選別アプタマーの除去は、本明細書に記載されるアンチドートのいずれかを選別アプタマーと接触させることによって達成され得る。適切なアンチドートが提供された場合、選別アプタマーおよびアンチドートは、塩基相補性を介して完全または部分的にハイブリダイズし得、その結果、アプタマーの二次構造が変化し、したがって、標的へのアプタマーの結合が防止され、さらには解除される。加えて、または可能性として、選別アプタマーをアンチドートと接触させることに代わるものとして、本方法は、温度を調節して、選別アプタマーを除去する有効性を高めることも含み得る。場合によっては、温度は、少なくとも１Ｋ、５Ｋ、１０Ｋ、１５Ｋ、２０Ｋ、２５Ｋ、または３０Ｋ上昇する。温度はまた、温度を少なくとも１Ｋ、５Ｋ、１０Ｋ、１５Ｋ、２０Ｋ、２５Ｋ、または３０Ｋ離れた平均最大値と最小値の間で循環させることによって調整することができる。本発明の目的が、本方法で使用した後、天然の状態で細胞を提供できることであるため、細胞機能が不可逆的に損なわれたり、または細胞の不活性化もしくは死滅が起こったりしないように温度調節を行う必要がある。加えて、または可能性として、選別アプタマーをアンチドートと接触させることに代わるものとして、本方法はまた、選別アプタマーを除去する有効性を高めるために、二価イオンの濃度を調節することを含み得る。二価イオンは、Ｍｇ2+、Ｃａ2+、またはＭｎ2+などの二価カチオンであり得る。加えて、または可能性として、選別アプタマーをアンチドートと接触させることに代わるものとして、本方法はまた、選別アプタマーを除去する有効性を高めるために、ポリカチオン性ポリマーを含む材料を提供することを含み得る。ポリカチオン性ポリマーを含む材料の例には、米国特許出願公開第２０１０／０１８４８２２号、米国特許出願公開第２０１２／０１８３５６４号、および米国特許出願公開第２０１７／００３７５４４号、ならびに国際公開第２０１４／１６９０４３号および国際公開第２０１７／０７９６３８号および国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６８２６２号に記載されているものが含まれる。
方法２０は、外因性材料２４を除去することをさらに含み得る。「外因性材料」は、選別アプタマーおよび／またはアンチドートなどの任意の外来材料を含み得る。除去工程は、選別細胞を溶液または細胞培養培地で洗浄することにより達成され得る。一部の実施形態では、除去工程は、選別アプタマーおよび／またはアンチドートの細胞からの解離を支援する。
【００４０】
図２Ｂは、アプタマー染色標的細胞の選別、続く、アプタマーを除去し、天然の細胞機能を回復させるためのアンチドート処理の概要を示す。最初は異種の集団の標的細胞をアプタマーで選択的に標識し、次に、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの従来の抗体ベースの精製スキームを使用して単離する。しかしながら、精製された細胞上の残留リガンドが天然の機能を妨げる可能性があるため、精製された標的細胞の有用性が損なわれる可能性がある。抗体ベースの染色とは異なり、アプタマー染色した細胞を合致したアンチドートで処理することにより、選別リガンドの除去が可能になり、下流の研究および臨床応用において細胞が正常に機能することが可能になる。実施例に示されるように、開示された技術は、ＥＧＦＲ拮抗アプタマーＥ０７（Ｅ０７−ＳＡ）および合致したアンチドート（ｍＡ９）の蛍光標識した多量体を使用して、標的受容体機能を調べる前に類表皮癌（Ａ４３１）細胞を染色、選別、および「脱染」する。
【００４１】
上記の方法は、複数の異なる選別アプタマーを含むように伸長され得る。一実施形態では、上述の方法の連続適用により、細胞の異種集団から下位亜集団を選別することができる。第１の選別アプタマーは、異種集団内の細胞に結合し得、第１の際立った特徴の存在または不存在について細胞を第２の異種集団に選別することができる。第２の選別アプタマーは、第２の異種集団内の細胞に結合し得、第２の際立った特徴の存在または不存在について細胞を選別することができる。採用される選別技術に応じて、第１のアプタマーは、第２のアプタマーの導入の前または後に除去され得る。当業者は、任意の数の選別アプタマーに対して連続用途を伸長することができることを容易に認識する。この実施形態で使用される選別アプタマーは、同じ選別標識または異なる選別標識を有し得る。
【００４２】
代替の実施形態では、複数の選別アプタマーの同時適用によって、または異なる結合モチーフを有する多価アプタマーおよび個々の選別アプタマーに特異的なアンチドートの連続適用によって、細胞の異種集団から下位亜集団を選別することができる。第１の選別アプタマーおよび第２の選別アプタマーまたは多価アプタマーは、異種集団内の細胞に結合され得、細胞が第２の異種集団に選別されることを可能にする。最初の選別アプタマーまたは最初の結合モチーフに特異的なアンチドートは、そのアプタマーまたは結合モチーフの染色を反転させ得、第２の不均一な集団の細胞を再び選別することができる。当業者は、本方法が任意の数の選別アプタマーまたは結合モチーフに伸長され得ることを容易に認識する。
【００４３】
結論
細胞の生存率および機能を損なうことなく可逆的に細胞を染色する能力は、研究室と病院の両方に重要な意味を持つ貴重な多目的ツールである。本明細書に示される実施例は、この技術の有用性を示す。さらに有望なのは、アンチドートを介した可逆性のアプタマーの排他的な利点を維持しながら、少なくともモノクローナル抗体と同様に行うことが予測される精製された多価アプタマー構築物を使用する見込みである。この方法論は、多数の研究および臨床応用に適合することができる他のアプタマー−アンチドート対の適応可能なプラットフォームとして機能する。
非破壊的で可逆的な細胞染色のためのアプタマーおよび対応するアンチドートは、比類のない細胞精製プラットフォームを提供する。この技術は、それを使用して精製された細胞の妥協のない有用性のため、インパクトがある。染色−選別−脱染のワークフローは、ほぼすべてのアプタマーを除去することに成功し、細胞の生存率または機能に悪影響はなかった。多価アプタマーは、モノマーの大部分を含む不均一な混合物の形態でさえ、抗体に近い安定性を提供したが、またアンチドート処理によって完全に可逆的であった。不完全な脱染は、抗体のような免疫原性ではないため、インビボでの治療に使用するアプタマー−選別細胞を禁忌とはしない。指数関数的濃縮（ＳＥＬＥＸ）によるリガンドの体系的進化を使用してアプタマーを様々な分子標的に対して発生させることができ、アプタマー配列に基づいて対応するアンチドートライブラリーを設計することができるため、本技術は事実上、任意の細胞タイプに伸長可能である。
【００４４】
この方法はまた、単一のフルオロフォアを使用して複数のバイオマーカーの細胞集団を連続的に選別するのに役立ち得る。供給源が限定されている研究環境では、シングルレーザー（カラー）ソーターしか使用できない場合があるが、表面マーカーのセットによって定義される細胞の特定の亜集団を精製する必要がある。抗体を使用すると、染色は永続的であるため、細胞を１つのマーカーのみで選別することができ、同じフルオロフォアを保有する別の抗体で集団を再度選別することは面倒であるかまたは不可能である。しかしながら、同じフルオロフォアで標識されたアプタマー−アンチドート対のセットは、各々の選別後に明確なスレートを提供し、同じチャネルでの連続選別を可能にし、最終的には目的とする集団を単離することができる。
【００４５】
可逆的な細胞染色技術はまた、標的化されたインビボ画像化の強化に有用である。標識アプタマーを静脈内投与すると、画像化のための標的組織への濃縮が可能になる。アプタマーを中和するアンチドート治療によるフォローアップ治療は、バックグラウンドシグナルに寄与する非特異的に結合したアプタマーをより容易に除去し、目的とする標的組織をよりよく視覚化するためにコントラストを改善する。
【００４６】
雑則
本開示は、本明細書に記載される構造、構成要素の配置、または方法工程の特定の詳細に限定されない。本明細書に開示される組成物および方法は、以下の開示に照らして当業者に明らかとなる様々な方法で作成、実施、使用、実行および／または形成することができる。本明細書で使用される表現および用語は、説明のみを目的とするものであり、特許請求の範囲を限定するものと見なされるべきではない。本明細書および特許請求の範囲で様々な構造または方法工程を参照するために使用される第１、第２、および第３などの順序指標は、任意の特定の構造もしくは工程、または任意の特定の順序または構成をこのような構造または工程に示すように解釈されることを意味しない。本明細書に記載されるすべての方法は、本明細書で別段指示がない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行することができる。本明細書で提供される任意のおよびすべての例または例示的な言葉（例えば、「など」）の使用は、単に開示を容易にすることを意図しており、特に請求されない限り、開示の範囲に対するいずれもの限定を意味しない。本明細書中の言語、および図面に示されている構造は、請求されていないいずれもの要素が開示された主題の実施に不可欠であることを示すものと解釈されるべきではない。本明細書における用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「有する」およびその変形の使用は、その後に列挙される要素およびその同等物、ならびに追加の要素を包含することを意味する。特定の要素を「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、または「有する」として列挙された実施形態はまた、それらの特定の要素「から本質的になる」および「からなる」として意図される。
【００４７】
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段指示がない限り、範囲内に含まれる各々個別の値を個別に参照する略記法として機能することを単に意図しており、各々個別の値は、本明細書で個別に列挙されているかのように本明細書に組み込まれている。例えば、濃度範囲が１％から５０％と記述されている場合、２％から４０％、１０％から３０％、または１％から３％などの値が本明細書において明示的に列挙されることが意図される。これらは具体的に意図されているものの例に過ぎず、列挙された最低値と最高値の間の数値のすべての可能な組合せ、およびその最低値および最高値は、本開示に明示的に記述されていると見なされる。特定の引用された量または量の範囲を記載するために「約」という用語の使用は、製造公差、測定の形成における機器および人的エラーなどにより考慮される可能性がある、または当然に考慮される値など、引用された量に非常に近い値がその量に含まれることを示すことを意味する。量を指すすべてのパーセンテージは、他に指示がない限り重量による。
【００４８】
本明細書で引用されている非特許文献または特許文献を含むいずれもの参考文献は、先行技術を構成することを認めるものではない。特に、別段断りがない限り、本明細書に記載されている文書への言及は、これらの文書のいずれかが米国またはその他の国の当該技術分野における共通した一般的な知識の一部を形成することを認めるものではないことを理解されたい。参照に関するいずれもの検討は、それらの著者が主張することを述べており、本出願人は、本明細書に引用されているいずれもの文書の正確性および適切性に挑戦する権利を留保する。本明細書に引用されているすべての参考文献は、特に別段指示がない限り、それらの全体が参照により完全に組み込まれる。本開示は、引用された参考文献に見られるいずれもの定義および／または説明の間に何らかの不一致がある場合に調整するものとする。
【００４９】
特に明記または文脈によって指示されない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は「１つ以上」を意味する。例えば、「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「ＲＮＡ（ａｎ  ＲＮＡ）」は、「１つ以上のタンパク質」または「１つ以上のＲＮＡ」を意味することが意図されるべきである。
以下の実施例は、例示することのみを意図しており、本発明の範囲または添付の特許請求の範囲を限定することを意味するものではない。
【実施例】
【００５０】
材料および方法
全般
緩衝液、試薬および実験試料は、他に記述がない限り、すべての手順の間、氷上または冷蔵遠心分離機のいずれかで４℃にて維持された。蛍光試料の周囲光への曝露を最小限にするように注意が払われた。１％ウシ血清アルブミンのみを補足した培地（「培地＋」）は、染色およびアンチドート溶液、洗浄、フローサイトメトリーバッファーとして広く使用された。他に明記しない限り、すべてのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ＋／＋）にはＣａ2+およびＭｇ2+が含まれた。
【００５１】
細胞培養
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）から供給されたＡ４３１類表皮癌細胞をＤｕｋｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙから入手した。Ａ４３１細胞は、ＡＴＣＣの推奨により１０％非加熱で不活性化されたＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンで補足された増殖培地（Ｓｉｇｍａ、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、および重炭酸ナトリウムを含有し、４．５ｇ／Ｌグルコースを含む高グルコースダルベッコ改変イーグル培地）中、３７℃および５％ＣＯ2で維持された。０．２５％トリプシン−ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）を使用して、細胞を７０−９０％のコンフルエントで継代し、１：２から１：４を新しい組織培養フラスコに分割した。実験では、継代数３２と３８の間のＡ４３１細胞を使用した。
【００５２】
アプタマーの化学合成
Ｅ０７および非特異的対照Ｃ３６  ＲＮＡアプタマー（表１の配列）は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９  ＤＮＡシンセサイザー（Ｂｉｏｌｙｔｉｃ  Ｌａｂ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）上での固相合成によって合成された。簡単には、すべてのアプタマーは、逆ｄＴ  ＣＰＧカラムで２’フルオロ（２’Ｆ）ピリミジン、２’ＯＨプリンおよび５’チオール（Ｃ６  Ｓ−Ｓホスホルアミダイトを使用）で合成された。アプタマー配列を表１に示す。合成試薬はＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓから購入した。アプタマーは、６５℃、１０×５０ｍｍ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）で０．１ＭのＴＥＡＡ、ｐＨ７．５のアセトニトリルの直線勾配を使用して逆相ＨＰＬＣ精製された。
【００５３】
色素コンジュゲーションを準備するために、７０℃で３分間加熱し、室温で５７分間インキュベートすることにより、５００ｍＭのＴＣＥＰを含む０．１ＭのＴＥＡＡで５’チオール−アプタマーを還元した。ＨＰＬＣでチオール還元を確認した後、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １０ｋＤスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して、ＰＢＳ（Ｃａ2+およびＭｇ2+なし）＋２ｍＭのＥＤＴＡに交換する緩衝液によってＴＣＥＰを除去した。次に、還元アプタマーは、チオール反応性ＡＦ４８８−Ｃ５−マレイミドまたはＡＦ６４７−Ｃ２−マレイミド色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＡＦ４８８）またはＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（ＡＦ６４７）で５’標識された。色素を２０ｍＭの濃度までＤＭＳＯに溶解し、還元アプタマーに５から１０倍モル過剰で添加した。標識効率は、分析ＨＰＬＣによって決定され、日常的に９９％まで進行した。Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １０ｋＤスピンカラムで、標識アプタマーを１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ  ｐＨ７．５（ＴＥ）で洗浄することにより遊離色素を除去した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、色素標識したアプタマーの濃度を定量した。
【００５４】
ビオチン化アプタマーの転写およびアプタマー−ストレプトアビジンコンジュゲートの調製
５’−ビオチン化８ヌクレオチド伸長（５’−ビオチン−ＧＧＡ  ＧＡＡ  ＵＡ−Ｅ０７またはＣ３６−３’）を含むＥ０７およびＣ３６（表１の配列）を転写して、ＡＦ４８８またはＡＦ６４７標識したストレプトアビジン（ＡＦ４８８−ＳＡまたはＡＦ６４７−ＳＡ；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）へのコンジュゲーションを可能にした。ヌクレオチド伸長は、Ｅ０７（ｍｆｏｌｄソフトウェア）の予測される二次構造が影響を受けないように設計された（図１Ｂ）。Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ（ＲＮＡＰ）プロモーターを含む伸長されたビオチン化Ｅ０７（ｂＥ０７）とＣ３６（ｂＣ３６）の両方の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）鋳型は、購入したプライマーのアニーリング（表１；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤＴ）およびＫｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ）を使用して生成され、一本鎖突出部を埋めた。その後、ｂＥ０７およびｂＣ３６のｄｓＤＮＡ鋳型は、１０倍モル過剰の５’−ビオチン−Ｇ−モノホスフェート（ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でドープした２’Ｆピリミジンおよび２’ＯＨプリンヌクレオチドとともにＹ６３９Ｆ突然変異体Ｔ７  ＲＮＡＰを使用して転写された。アプタマーを変性１２％ポリアクリルアミドゲルで精製し、一晩、４℃でＴＥ、ｐＨ７．５に抽出し、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ  １０ｋＤスピンカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で脱塩し、分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で２６０ｎｍの吸光度で定量した。
【００５５】
アプタマーは、６５℃で５分間の変性、続く周囲温度への３分間の受動冷却によって、ＰＢＳ＋／＋中で折り畳まれた。次に、アプタマー−ストレプトアビジンコンジュゲート（Ｅ０７−ＳＡまたはＣ３６−ＳＡ）は、ＰＢＳ＋／＋中、２０分間、室温で２：１のモル比（ＲＮＡ：ＳＡ）でＡＦ４８８−ＳＡまたはＡＦ６４７−ＳＡとともに、折り畳まれたｂＥ０７またはｂＣ３６をインキュベートすることによって調製された。コンジュゲートをさらに精製することなく直接使用した。
【００５６】
アプタマーまたは抗体で細胞を染色する
すべてのアプタマーは、６５℃で５分間の変性、続く周囲温度への３分間の受動冷却により、ＰＢＳ＋／＋中で折り畳まれた。一般的に、染色には５００ｎＭアプタマー溶液を使用したが、この濃度はいくつかのアッセイで述べたように変更された。アプタマー−ＳＡ染色液について、１μＭアプタマーおよび５００ｎＭのＡＦ４８８−ＳＡまたはＡＦ６４７−ＳＡで２：１のアプタマーコンジュゲートを調製した。すべての染色溶液は培地＋中で調製され、非特異的結合を軽減するために１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡを含んだ。すべての抗体は、１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡを含む培地＋で１：５０希釈として使用された。ＦＩＴＣコンジュゲートしたＩＣＲ１０（Ａｂｃａｍ）とＰＥコンジュゲートしたＤ１Ｄ４Ｊ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）モノクローナルＥＧＦＲ抗体の両方を染色に使用した。
【００５７】
フローサイトメトリー
実験では、４８から７２時間前に播種された７５から９０％のコンフルエントな細胞を使用した。トリプシンを使用して細胞を採取し、細胞が剥離するとすぐに増殖培地で中和した。細胞を培地＋で１回洗浄し、血球計でカウントし、試料ごとに５×１０5個の細胞を、冷やした１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに分配した。染色は、適切な抗体またはアプタマー染色溶液（１ｍＬあたり５００万細胞）の１００μＬ中に細胞を再懸濁し、３０分間、氷上でインキュベートすることにより行った。染色した細胞を５００μＬの培地＋で１回洗浄し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒまたはＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。
見かけの結合親和性の決定
Ｅ０７およびＥ０７−ＳＡの見かけの結合親和性は、飽和細胞結合曲線から算出された。細胞を２５、５０、１２５、２５０または５００ｎＭのＥ０７またはＥ０７−ＳＡで染色し、洗浄し、フローサイトメトリーで分析して平均蛍光強度（ＭＦＩ）を得た。見かけの解離定数（ＫD）および飽和結合強度（Ｂmax）は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアで非線形回帰を実行し、フローデータをシングルサイト飽和結合方程式ＭＦＩ＝（Ｂmax［アプタマー］）／（ＫD＋［アプタマー］）に適合させて決定された。
【００５８】
蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）
染色した試料を４０μｍの細胞ストレーナーでろ過し、１ｍＬあたり１０００万個の細胞に再懸濁し、選別前に氷上で保持した。試料は、処理された細胞の別個の純粋な集団であった。試料と回収チューブの両方を４℃に維持するために、冷却を利用してＢＤ  ＤｉＶａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で３０ｐｓｉおよび毎秒５ｘ１０3細胞の速度で選別を行った。回収チューブには３ｍＬの培地＋が含まれており、約１ｍＬのシース液（Ｃａ2+またはＭｇ2+を含まないＰＢＳ）が、選別された５０万個の細胞ごとに追加された。選別関連の喪失は、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒまたはＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で選別の直前と直後に試料を個別に分析することにより評価された。
【００５９】
アンチドートスクリーニング実験
長さが１５塩基である一本鎖ＤＮＡアンチドートは、Ｅ０７（配列番号１）の様々な領域を標的とするように設計され、ＩＤＴから購入した。標的化領域は、２つの塩基で相殺され、アンチドートが一緒になってＥ０７配列全体を調べた。アンチドート配列は、これらの標的化領域に相補的であり、表２に示される。２’Ｏメチル（２’ＯＭｅ）ＲＮＡアンチドートは、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ｉｎｃ．から購入した。
【００６０】
相対的なアンチドートの性能は、フローサイトメトリーブロッキングアッセイを使用して評価された。実験では、４８から７２時間前に播種された７５から９０％のコンフルエントな細胞を使用した。トリプシンを使用して細胞を採取し、細胞が剥離するとすぐに増殖培地で中和した。細胞を培地＋で１回洗浄し、血球計でカウントし、試料ごとに５×１０5個の細胞を、冷やした１．５ｍＬマイクロ遠心チューブに分配した。染色は、１００μＭアンチドートの非存在下または存在下のいずれかで３０分間、３７℃で１００μＬの１００ｎＭ  Ｅ０７に細胞を再懸濁することにより行った。染色した細胞を５００μＬの培地＋で１回洗浄し、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒまたはＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でフローサイトメトリーにより分析した。未処理のＥ０７染色対照と比較したアンチドート処理された細胞の平均蛍光強度の減少は、アンチドートの有効性の指標として役立った。
【００６１】
細胞の脱染
氷上で維持された染色細胞を、アンチドートＡ９  ＤＮＡ、２’ＯメチルＲＮＡ  Ａ９（ｍＡ９）またはスクランブルされた対照アンチドートｓＡ９  ＤＮＡを含むかまたは含まない１００μＬ培地＋に再懸濁し、３７℃の水浴で最大３０分間インキュベートした。脱染後すぐに、試料を氷上に戻した。次に、細胞を培地＋で１回洗浄し、フローサイトメトリーで分析するか、またはその後、ＥＧＦ刺激アッセイで使用した。
細胞生存率アッセイ
製造業者の指示に従って、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ｎｅａｒ−ＩＲ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、染色、選別、次に脱染された細胞の生存率を評価した。その後、処理された試料をＢＤ  ＦＡＣＳＣａｎｔｏ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のフローサイトメトリーで分析した。６５℃で２０分間加熱した未染色の選別細胞は、ゲート処理のための陽性（死細胞）対照として機能した。
【００６２】
ＥＧＦ刺激アッセイおよびウエスタンブロット
細胞は、未染色のままであるか、あるいはＡＦ４８８標識されたＣ３６−ＳＡもしくはＥ０７−ＳＡ、またはＥＧＦＲに対するＰＥ標識されたＤ１Ｄ４Ｊ中和モノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色された。続いて細胞を選別し、５μＭのｍＡ９の有無にかかわらず、５分間、３７℃で脱染した。脱染後、細胞を培地＋中で５ｎＭのＥＧＦとともに氷上で１５分間刺激し、次に、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含む放射免疫沈降（ＲＩＰＡ）緩衝液に再懸濁することによって溶解した。溶解物はすぐに使用されるか、または使用するまで−８０℃で凍結された。
【００６３】
粗溶解物中のタンパク質の量は、製造業者の指示に従って、バイシンクロン酸（ＢＣＡ）アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して定量化された。等量のタンパク質を含む粗溶解物試料を、１０％β−メルカプトエタノールを含むＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液中で調製し、９５℃で５分間煮沸し、次に、Ｔｒｉｓ／グリシン／ＳＤＳ緩衝液中、３００Ｖでの４−１５％変性ポリアクリルアミドゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で泳動した。電気泳動された試料は、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ＳｙｓｔｅｍおよびＴｒａｎｓｆｅｒ  Ｐａｃｋｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、高分子量タンパク質の転写のデフォルト設定を用いて、低蛍光ポリビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレンにブロットされた。０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０（ＰＢＳＴ）および５％ウシ血清アルブミン（ブロッキング緩衝液）を含むＰＢＳ中で室温にて１時間メンブレンをブロックした。ブロッキングされたメンブレンは、総ＥＧＦＲ（マウス抗ヒト；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ２２３９Ｓ）およびｐＥＧＦＲ（ウサギ抗ヒト；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ４４０７Ｓ）に対する一次モノクローナル抗体の１：１０００希釈液を含むブロッキング緩衝液で一晩、４℃でインキュベートされた。次に、メンブレンをロッカー上でＰＢＳＴを用いて５分間、３回洗浄し、次に、スペクトルの重複のない別々の蛍光チャネルで、総ＥＧＦＲ（ヤギ抗マウスＡＦ５４６コンジュゲートの１：１０，０００希釈液；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１１０３０）およびｐＥＧＦＲ（ヤギの抗ウサギＡＦ６４７コンジュゲートの１：２０，０００希釈；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ  １１１−６０５−１４４）の検出のためにフルオロフォアコンジュゲートした二次抗体を含むブロッキング緩衝液とともにインキュベートした。ブロットを同じ方法で洗浄し、次に、蛍光多重化を可能にする緑色および赤色ＬＥＤを備えたＣｈｅｍｉｄｏｃ  ＭＰ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で画像化した。総ＥＧＦＲおよびｐＥＧＦＲに対応するバンドは、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の矩形体積を使用して手動で同定され、各タンパク質の量を各特定の体積のバックグラウンド調整強度として採用した。各試料のｐＥＧＦＲ／総ＥＧＦＲ比は、刺激された未染色細胞の平均比に標準化され、これは、天然の阻害されていない刺激の陽性対照として機能した。
統計
データは、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）およびＪＭＰソフトウェアのＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ事後検定によって分析され、必要に応じて実験条件間の有意差を確立した。ｐ＜０．０５で有意性が想定された。
【００６４】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
アプタマー−ＳＡコンジュゲートの価数は、以前に説明されたようにＥＭＳＡによって特徴付けられた（Maier, Jangra et al. 2016）。一定量のＳＡに対してアプタマーの量を変えることにより、上記のようにコンジュゲート試料を調製した。対照として機能するアプタマーのみの試料には、１：１コンジュゲート試料と同量のアプタマーが含まれた。試料を、１％ＳＤＳを補足した２×ホルムアミド試料緩衝液と組み合わせ、１２０Ｖで０．１％ＳＤＳを含む８％変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動した。アプタマーは、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）でゲルを染色し、続いてＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で画像化することにより視覚化された。Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の矩形体積（ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ  ｖｏｌｕｍｅ）を使用して、３つの異なる分子量（最小、中位および最大）のコンジュゲートに対応するバンドを手動で同定し、各アプタマーの量を各特定の体積のバックグラウンド調整強度として採用した。各サイズのコンジュゲートの量は、比較のために１：１コンジュゲートミックスの量に標準化された。
【００６５】
（例１）
天然の状態で細胞を調製するための可逆的選別リガンドとしてのアプタマー
この新規なアプローチを評価するために、十分に特徴付けられたＥＧＦＲ拮抗アプタマーＥ０７（Ｅ０７−ＳＡ）の蛍光性多量体を、合致したアンチドート（ｍＡ９）と組み合わせて使用して、蛍光標識し、ＦＡＣＳを介して精製し、ＥＧＦＲを高度に発現する類表皮癌細胞株（Ａ４３１）を脱染する（図２Ｂ）。次に、Ｅ０７−ＳＡを除去し、アプタマー阻害されたＥＧＦＲシグナル伝達を天然のレベルに戻すｍＡ９の有効性を評価した。
【００６６】
５’Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（ＡＦ４８８）色素でタグ付けされた単量体Ｅ０７に対する有効なアンチドートを同定するために、最初のスクリーニングを行った。細胞をＥ０７（表１）およびアプタマー配列の異なる領域に相補的な過剰な１５ヌクレオチド長の一本鎖ＤＮＡアンチドート候補（表２）とともにインキュベートし、洗浄し、次にフローサイトメトリーで分析した。最も効果的なアンチドートは、Ｅ０７の細胞への結合を中和することによって、細胞の蛍光を大幅に減少させ（図３Ａ）、アンチドートＡ９が最も効果的なアンチドートとして明らかになった。
【００６７】
次に、アンチドートＡ９、その２’Ｏ−メチルＲＮＡ類似体（ｍＡ９）、および配列がスクランブルされたＤＮＡベースの対照（ｓＡ９）のＥ０７染色を経時的に解除させる能力を評価した。細胞をＥ０７で染色し、洗浄し、その後、フローサイトメトリーで分析する前に、３７℃でモル過剰のＡ９、ｍＡ９またはｓＡ９で様々な期間処理した。Ｅ０７特異的なアンチドートＡ９およびｍＡ９はともに、類似した量の結合Ｅ０７を経時的に細胞から除去し、Ｅ０７染色を対照の非標的化アプタマー（Ｃ３６）で見られるバックグラウンドレベルに減少された。スクランブルされた対照ｓＡ９は、アンチドートなしの処理対照と比較してＥ０７の除去を増大しなかった（図３Ｂ−３Ｄ）。Ａ９およびｍＡ９は２５μＭの比較的高濃度で同様に機能したが、２’Ｏ−メチルＲＮＡ対ＤＮＡの親和性が高いため、ｍＡ９は低濃度（＜５μＭ）でより強力であった。結果として、ｍＡ９は、その後のすべての実験で使用された（図３Ｅ−３Ｇ）。
【００６８】
次に、単量体Ｅ０７を多価Ｅ０７（Ｅ０７−ＳＡ）に代えて、通常は二価である抗体との良好な比較を与えた。Ｅ０７−ＳＡは、５’−ビオチン化Ｅ０７（ｂＥ０７）をＡＦ４８８標識したストレプトアビジン（ＡＦ４８８−ＳＡ）で標識し、ＳＡ色素あたり最大４個のアプタマーを含む多価Ｅ０７を作成することにより形成された。ＳＡへのコンジュゲーション時にアプタマー機能に影響を与える可能性のある立体効果を制限するために、Ｅ０７の５’末端を８ヌクレオチド延長した。
【００６９】
Ｅ０７−ＳＡが抗体の可逆的な代替物であることを検証するために、細胞をＥ０７−ＳＡまたはＥＧＦＲ結合抗体（ＩＣＲ１０）のいずれかで染色し、次に、ｍＡ９の有無で処理して脱染した。Ｅ０７−ＳＡおよびＩＣＲ１０は各々、アンチドートの非存在下で３７℃にて堅牢な細胞染色および安定性を示した。対照的に、２５μＭのｍＡ９による処理は、結合したＥ０７−ＳＡを容易に除去したが、抗体はアンチドート処理に感受性ではないため、結合したＩＣＲ１０を除去しなかった（図４Ａ）。重要なことに、この連続法の穏やかな性質が細胞の生存率を維持した（図４Ｂ−４Ｄ）。
【００７０】
Ｅ０７−ＳＡ染色のアンチドート反転の成功は、細胞を天然の状態に回復し、細胞を再染色する選択肢が提示された。このような方法は、単一のフルオロフォアまたはスペクトルプロファイルが重複するフルオロフォアを使用して、複数のバイオマーカーの細胞集団を連続的に選別する柔軟性を可能にする。加えて、可逆的な細胞染色リガンドは、オンとオフを切り替えることができる分子スイッチとして機能し得る。この概念を実証するために、本発明者らは、細胞をＥ０７−ＳＡ−ＡＦ４８８で染色し、Ｅ０７／ＡＦ４８８＋シグナルで選別し、次にｍＡ９を使用してまたは使用せずに脱染色し、フルオロフォアＡＦ６４７で標識したＥ０７−ＳＡ（Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ６４７）を用いて再染色した。Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ４８８染色の成功したアンチドートの解除により、細胞表面のＥＧＦＲからＥ０７が剥がれ、Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ６４７で再染色することにより、分子スイッチが「オフ」になり、受容体が再び「オン」にして、利用可能な状態にする。Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ４８８染色は、すべてのＥＧＦＲ結合部位を飽和させず、Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ４８８シグナルを喪失させることなく、その後のＥ０７−ＳＡ−ＡＦ６４７による細胞染色を可能にした（図４Ｅ−４Ｇ）。逆に、アンチドートｍＡ９処理は、初期のアプタマーＡＦ４８８染色の約９０％を除去することにより、ＥＧＦＲ染色を「オフ」に切り替えた。Ｅ０７−ＳＡ−ＡＦ６４７を使用したその後の標識化は、ＥＧＦＲスイッチを「オン」に戻し、アンチドート処理した細胞を、対照のアンチドート処理していない細胞と比較して約８０％多いＡＦ６４７で染色した。
【００７１】
この方法は、不可逆的であるため、抗体標識には適用することができない（図４Ｈ−４Ｉ）。アプタマーベースの細胞標識とは対照的に、抗体はアンチドート処理時に細胞から除去することができなかった。これは、ここでは、アンチドートｍＡ９処理の前と後の両方で、一次ＥＧＦＲ結合抗体（ＩＣＲ１０）の一貫した蛍光レベルによって、およびアンチドート処理の前と後の両方で、同レベルでＥＧＦＲ抗体に結合する対応する二次抗体の能力によって示される。
【００７２】
次に、Ｅ０７−ＳＡまたは中和ＥＧＦＲ抗体（Ｄ１Ｄ４Ｊ）のいずれかで染色された細胞のＥＧＦＲ機能を救出するｍＡ９を使用することによって、細胞を天然の機能状態に戻す可逆的細胞リガンドの能力を調べた。このアプローチは、結合時に受容体の細胞内ドメインのリン酸化を促進し、結果として細胞機能を調節する下流シグナル伝達を開始するＥＧＦＲの天然アゴニストであるＥＧＦで細胞を刺激することによって評価された。Ｅ０７およびＤ１Ｄ４Ｊはともに、ＥＧＦ誘発による刺激をブロックし、リン酸化を減少させるＥＧＦＲ拮抗剤である。したがって、染色された細胞からのＥ０７−ＳＡのアンチドート除去により、ＥＧＦＲリン酸化が天然のレベルに回復するべきであり、これは、ＥＧＦＲ標的化リガンドの存在により以前に不能にされた細胞の機能回復を示す。この回復は、総合のおよびリン酸化されたＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ）について調べ、異なる処置群の細胞の相対的リン酸化レベル（ｐＥＧＦＲ／総ＥＧＦＲ）を決定することができる定量的ウエスタンブロットを使用して評価された。未選別および選別試料について、Ｅ０７−ＳＡとＤ１Ｄ４Ｊ染色された細胞の両方が、ＥＧＦで刺激された天然細胞の陽性対照と比較して、刺激の有意な低下を示した（図４Ｋ−４Ｍ）。しかしながら、Ｅ０７−ＳＡ染色細胞を５μＭのｍＡ９で処理すると、ＥＧＦ刺激が天然のレベルに救出され、標的化受容体の完全な機能回復が示された。対照的に、Ｄ１Ｄ４Ｊ結合は不可逆的であり、ＥＧＦＲシグナル伝達に永続的な不能をもたらした（図４Ｌおよび４Ｍ）。
【００７３】
細胞の生存率または機能を損なうことなく可逆的に細胞を標識する能力は、研究室と病院の両方に重要な意味を持つ貴重で多用途のツールである。ここでは、本発明者らは、アンチドートを介した可逆性のアプタマーの排他的な利点も維持しながら、多価アプタマーを使用して抗体の代わりに細胞を選別することができることを実証する。この方法論は、多数の研究および臨床応用に適合することができる他のアプタマー−アンチドート対の適応可能なプラットフォームとして機能する。
【００７４】
（例２）
Ｅ０７の予測されるループを標的とした最良のアンチドート
４℃で実施した場合、アンチドートの存在下（図５Ａ）とアンチドート処理前（図５Ｂ）の両方でＥ０７で染色すると、過度に高いアンチドート濃度（１００μＭ）にもかかわらず、単に染色された細胞に比べて結合アプタマーの量がわずかに減少した。これらのスクリーニングをより低いアンチドート濃度（１および１０μＭ；データを示さず）で実施すると、さらに多くの押さえた効果が観察された。劇的に改善されたアンチドートの性能は３７℃で達成され、蛍光は有意に減少した（図３Ａ）。
【００７５】
Ａ４３１細胞は、４℃または３７℃で、非存在下または１０００倍モル過剰（１００μＭ）のアンチドートの存在下で、Ｃ３６（無作為対照ＲＮＡ）またはＥ０７とともに３０分間染色された。続いて、アンチドートの非存在下で染色された試料は洗浄され、染色と同じ条件下でアンチドートに再懸濁された。未染色、Ｃ３６染色および非アンチドート処理されたＥ０７染色細胞を対照として使用した。次に、洗浄した試料をフローサイトメトリーで分析し、アンチドートで処理していないＥ０７試料に対する平均蛍光強度（ＭＦＩ）の割合をプロットした。ＭＦＩの減少は、アンチドートを介したアプタマー結合のブロックまたは結合アプタマーの除去を示した。４℃でのアンチドートの存在下（図５Ａ）および非存在下（図５Ｂ）での染色は、結合したＥ０７の量をわずかに減少させただけであり、予測されたループ領域を標的とするアンチドートが最も効果的であった。しかしながら、３７℃でのアンチドートの存在下での染色（図３Ａ）は、予測されたループ領域を標的化したアンチドートを使用して、結合したＥ０７の量を劇的に減少させた。Ｅ０７の予測されたループ領域を標的化とするアンチドートは、常に最も効果的であった。すべてのアッセイで最も優れたアンチドートの１つであるＡ９が、さらなる実験で使用するために選択された。
【００７６】
（例３）
アンチドートは結合Ｅ０７の除去を増大した
Ｅ０７は、染色および試料処理中に維持された４℃の温度で染色された細胞に対して比較的安定であったが、３７℃の処理はアンチドートスクリーニング中のように結合Ｅ０７を容易に遊離させた。３０分間にわたって最初のＥ０７に起因する蛍光強度の２１％に細胞を脱染することは、培地＋単独で達成された（図６）。しかしながら、Ｅ０７除去の速度と程度は、１００μＭのＡ９の存在下で大幅に増大された。このＡ９濃度により、１０分までに最大の脱染（初期値の６．８％）が可能になった。これらの結果は、同様に高いアンチドートレベルで実施された他のいくつかの脱染実験の代表である。当初に選択された全長Ｅ０７アプタマー（９３塩基）は、培地＋のみで同じ速度で喪失することが観察され、これはＥ０７の不安定性が切断によってもたらされなかったことを示す（データを示さず）。
【００７７】
（例４）
より高い結合価のコンジュゲートの形成はＳＡ比に対するアプタマーの増加により促進された
多価アプタマー−ＳＡコンジュゲートは、５’ビオチン化尾部を有するＥ０７およびＣ３６（ｂＥ０７およびｂＣ３６）とＡＦ４８８標識した四量体ＳＡを反応させることにより形成された。ＥＭＳＡは、より高いアプタマー：ＳＡモル比がより高い割合の高分子量コンジュゲートをもたらすことを明らかにした（図７Ａ−７Ｄ）。これはおそらく、結合に利用可能な４つのＳＡ部位のより大きな飽和を介したより高い結合価のコンジュゲートに対応した。
【００７８】
アプタマー−ストレプトアビジン（ＳＡ）に対するビオチン化アプタマーの異なるモル比で調製されたＳＡコンジュゲートの結合価は、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって特徴付けられた。５’ビオチン化尾部を有するＣ３６またはＥ０７（ｂＣ３６およびｂＥ０７）は、アプタマーとテトラマーのモル比が１：１、２：１、３：１、または４：１の４つのビオチン結合部位を有する四量体ＳＡと反応した。次に、遊離ＲＮＡ（１：０）および等量のＳＡを含むコンジュゲート試料を、ＲＮＡを変性させたが、ＳＡ四量体の完全性を保持したポリアクリルアミドゲル上での電気泳動により分離した。
【００７９】
１：１および２：１のｂＥ０７：ＳＡから調製したｂＥ０７−ＳＡ試料は事実上同じであり、２価のコンジュゲートよりも１価のコンジュゲートであり、３価のコンジュゲートはほとんどなかった。３：１と４：１の高い比率のｂＥ０７−ＳＡ試料もまた同様であり、各々が低い比率の調製物よりも少ない一価のコンジュゲートと、より多くの二価および三価のコンジュゲートであった。ｂＣ３６−ＳＡ試料は同様の傾向を示したが、より高い結合価のコンジュゲートの収率は、ビオチン化アプタマーの比率が低いほど良好であり、比率が高いとあまり劇的ではなかった。最小、中位、および最大のコンジュゲートは、それぞれ一価、二価、三価と考えられた。１：１および２：１のｂＥ０７：ＳＡから調製されたＥ０７−ＳＡコンジュゲート混合物は、事実上同一であり、約６０％の一価および約３５％の二価のコンジュゲートからなった（図７Ｃ）。３：１および４：１  ｂＥ０７：ＳＡの比率では、より高い割合のより高い結合価の多量体が得られ、両方の反応混合物は、約３２％の一価、約４９％二価、および約１８％三価のコンジュゲートで構成されていた。ｂＣ３６−ＳＡコンジュゲートはこのパターンと類似していたが、より低い比率でより高い収率のより高い結合価のコンジュゲートが得られた（図７Ｄ）。また、すべてのコンジュゲート混合物には、組み込まれていない単量体尾部アプタマーも含まれていたことに留意すべきである。後続の脱染およびＥＧＦ刺激実験では、Ｅ０７モノマーとの比較のために、未精製の２：１アプタマー：ＳＡコンジュゲート混合物を使用した。
【００８０】
（例５）
より高い比のＥ０７：ＳＡコンジュゲート混合物はより高い見かけの親和性を示した
Ｅ０７−ＳＡコンジュゲート混合物の見かけの親和性は、ｂＥ０７：ＳＡの比率が高くなるにつれて増加したが、親和性の増加には、見かけの飽和に付随する減少が伴った（図８）。比較のために、Ｅ０７（直接的に標識されたモノマー；６２．７ｎＭ）の見かけの親和性は、２：１混合物（１４．７ｎＭ）よりも１：１コンジュゲート混合物（８５．１ｎＭ）の親和性に近かった。
Ａ４３１細胞は、様々な濃度（２５、５０、１２５、２５０または５００ｎＭ）のＥ０７のみ、または１：１、２：１もしくは３：１のビオチン化Ｅ０７を四量体ストレプトアビジンと反応させることにより調製されたＥ０７−ＳＡコンジュゲート混合物で染色された。染色した細胞を洗浄し、フローサイトメトリーで分析し、結合したＥ０７またはＥ０７−ＳＡの量に対応するそれらの蛍光をプロットして、見かけの結合親和性（解離定数；ＫD）および細胞表面飽和度（受容体の総数；Ｂｍａｘ）を決定した。より高いＥ０７：ＳＡ比から調製されたコンジュゲート混合物は、見かけの親和性が高くなったが、見かけの飽和度は低くなった。コンジュゲートしていないＥ０７は、１：１コンジュゲート混合物よりも高い親和性を有したが、２：１および３：１混合物よりも低い親和性を示した。
【００８１】
（例６）
Ｅ０７−ＳＡコンジュゲート混合物は選別および脱染中にＥ０７よりも安定していた
細胞選別用の可逆染色としてのＥ０７およびＥ０７−ＳＡコンジュゲート混合物の使用を検証し、様々なＥＧＦＲ結合モノクローナル抗体（ＩＣＲ１０およびＤ１Ｄ４Ｊ）と比較した。すべての染色タイプでは、４℃で選別された試料を維持するためにチラーを使用して、未染色細胞とは区別される安定した蛍光細胞集団が得られた。選別されている試料の蛍光を各選別の最初と最後で比較し、どの染色タイプについてもドリフトは検出されなかった（データを示さず）。
【００８２】
しかしながら、最初は冷えた試料収集チューブを積極的に冷やしたにもかかわらず、選別中に喪失が発生した（図９）。染色したＡ４３１細胞をＦＡＣＳの直前と直後にフローサイトメトリーで分析し、選別中に発生した喪失を調べた。Ｅ０７は、４６％の喪失で最も安定性が低く、次に２５％の喪失のＥ０７−ＳＡ（２：１  Ｅ０７：ＳＡコンジュゲートミックス）、および各々約１１％の喪失のＥＧＦＲ抗体が続いた。選別に起因する喪失は、ＦＡＣＳの直前と直後の試料を分析するためにフローサイトメトリーを使用して決定された。Ｅ０７喪失（４６％）は、Ｅ０７−ＳＡコンジュゲート混合物のほぼ２倍（２５％）であったが、両方の抗体は、各々約１１％の喪失でコンジュゲートの２倍超で安定であった。
【００８３】
（例７）
脱染はアプタマー染色細胞の自然刺激性を救出した
脱染処置は、アプタマー誘導性のＥＧＦＲ刺激阻害を解除させたが、抗体誘導性阻害は不可逆的であった。ＥＧＦＲへのＥＧＦ結合は、結果として、その細胞内ドメインがリン酸化されてｐＥＧＦＲが生成され、この刺激事象は、細胞機能を調節する一連の下流シグナルが核となる。ＥＧＦによって引き起こされる刺激の程度は、様々な処置における細胞の相対的なリン酸化レベル（ｐＥＧＦＲ／総ＥＧＦＲ）を決定することによって評価された。
次に、安定性および可逆性をさらに評価するために、選別細胞を培地＋またはアンチドートｍＡ９中で脱染した（図１０Ａ−１０Ｃ）。ＩＣＲ１０またはＤ１Ｄ４Ｊで標識された細胞は培地＋中での脱染中に最小限の喪失を示したため、抗体染色は非常に安定したままであり、不可逆的に見えるようである（図１０Ａ）。Ｅ０７−ＳＡコンジュゲート混合物は、Ｅ０７モノマーよりも培地＋と５００ｎＭのｍＡ９の両方で脱染中に顕著に安定であった（図１０Ｂ−１０Ｃ）。５μＭのより高いｍＡ９濃度は、Ｅ０７およびＥ０７−ＳＡコンジュゲート混合物の除去のギャップを埋め、３０分間の脱染後に各々の小分画のみが残った（図１０Ｃ）。全体として、これらのデータは、選別に起因する染色喪失から得られた安定性データを反映し、裏付ける。
【００８４】
（例８）
総ＥＧＦＲおよびｐＥＧＦＲについての定量的ウエスタンブロットプロービングを使用してタンパク質レベルを評価した。
選別されていない細胞の刺激は、図４Ｌおよび１１Ａに示される。Ｅ０７（図１１Ａ）、Ｅ０７−ＳＡコンジュゲートミックスまたは中和抗体Ｄ１Ｄ４Ｊ（図４Ｌ）で染色し、培地＋で５分間脱染した細胞のＥＧＦ刺激は、未染色対照と比較して有意に減少した。代わりに５μＭのｍＡ９での脱染により、ＥＧＦＲブロッキングアプタマーが十分に除去され、未染色細胞のレベルまで刺激が回復した。特に、培地＋で脱染した後の氷上での２時間のインキュベーションはまた、Ｅ０７で染色された細胞の刺激性のみを救出し、Ｅ０７−ＳＡコンジュゲート混合物ではなく、さらに、コンジュゲート混合物に対するモノマーの安定性の低下を示唆した（データを示さず）。対照的に、抗体の結合、したがってＥＧＦＲ機能の低下は不可逆的であった。
【００８５】
また、同じアッセイを実施することによって、選別細胞について回復可能な刺激性が示された（図４Ｍおよび１１Ｂ−１１Ｃ）。非特異的アプタマー染色およびストレプトアビジンの存在が未染色細胞からの刺激レベルを変更しなかったことを示すために、陰性対照Ｃ３６およびＣ３６−ＳＡコンジュゲートミックスが含まれた（図１１Ｂ）。選別後、十分なＥ０７は、未染色細胞およびｍＡ９脱染細胞に沿った刺激を与える培地＋でのみ脱染した後、除去された（図１１Ｃ）。しかしながら、比較的安定したＥ０７−ＳＡコンジュゲートミックスで染色された試料では、刺激を救出するためにｍＡ９で脱染する必要があった（図４Ｍ）。
【００８６】
定量的ウエスタンブロット法により、リン酸化（ｐＥＧＦＲ；赤色）および総ＥＧＦＲ（緑色）を調べることにより、ＥＧＦによって誘導したＡ４３１細胞の刺激の定量化が可能になった。*はＥＧＦによる刺激を示す；培地ＤＳ＝培地のみで脱染。ｍＡ９  ＤＳ＝５μＭのｍＡ９で脱染。抗体および未染色細胞は培地のみで脱染した。ＥＧＦの結合はＥＧＦＲの自己リン酸化をトリガーしてｐＥＧＦＲを生成するため、刺激の程度はｐＥＧＦＲと総ＥＧＦＲのバンド強度の比として採用された。染色または未染色の細胞は、培地または５μＭのｍＡ９で３７℃にて５分間脱染され、氷上で１５分間、５ｎＭのＥＧＦで刺激され、次に、ホスファターゼおよびプロテアーゼ阻害剤の存在下で溶解された。等量のタンパク質を含む粗溶解物試料を調製し、変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分離し、メンブレンにブロットした。メンブレンをアルブミンでブロックし、総ＥＧＦＲおよびｐＥＧＦＲに対する一次抗体とともに４℃で一晩インキュベートした。二次抗体を検出に使用し、ブロットを画像化した。総ＥＧＦＲおよびｐＥＧＦＲに対応するバンド強度をソフトウェアにより定量化し、各試料のｐＥＧＦＲ／総ＥＧＦＲ比を、刺激された未染色細胞の平均比に標準化した。これは、天然の抑制されていない刺激に対する陽性対照として機能した。培地での脱染（図１１Ａ）Ｅ０７および（図４Ｌ）Ｅ０７−ＳＡ（２：１  Ｅ０７：ＳＡコンジュゲートミックス）は、非染色細胞と比較して刺激が有意に減少した。しかしながら、ｍＡ９による脱染は十分に除去され、（図１１Ａ）Ｅ０７および（図４Ｌ）Ｅ０７−ＳＡは未染色細胞のレベルに沿った自然刺激レベルを可能にする。中和ＥＧＦＲ抗体Ｄ１Ｄ４Ｊは、他のいずれの治療よりも刺激を不可逆的に大きな程度で抑制した（図４Ｌ）。各グループは、他のすべてのグループとは有意に異なる（*、**、***、****についてはｐ＜０．０００１）。
【００８７】
また、ＦＡＣＳを介して選別されたＡ４３１細胞に対して、定量的ウエスタンブロットを実施した。脱染、刺激、溶解、ならびにリン酸化ＥＧＦＲ（ｐＥＧＦＲ；赤色）および総ＥＧＦＲ（緑色）を調べるためのウエスタンブロット法は、未選別試料で使用したものと同一であった。*はＥＧＦによる刺激を示す；培地ＤＳ＝培地のみで脱染；ｍＡ９  ＤＳ＝５μＭのｍＡ９で脱染。抗体および未染色細胞は培地のみで脱染した。脱染Ｃ３６およびＳＡ−Ｃ３６（２：１  Ｃ３６：ＳＡコンジュゲートミックス）試料（図１１Ｂ）は、未染色陽性対照と比較して細胞刺激を阻害しなかったが、Ｃ３６およびＳＡ−Ｃ３６試料は細胞をわずかに異なる程度に刺激した（**対***についてｐ＝０．０１２）。未選別試料とは異なり、培地で選別されたＥ０７試料（図１１Ｃ）の脱染は、刺激を天然のレベルに戻すのに十分であった。対照的に、選別されたＥ０７−ＳＡ試料（２：１  Ｅ０７：ＳＡコンジュゲートミックス）（図４Ｍ）は、細胞刺激性を救出するためにアンチドートをなおも必要とした。
【００８８】
検討
本明細書で提供される実施例は、アプタマーおよび合致したアンチドートを使用して、細胞を可逆的に染色および選別し、選別細胞を天然の状態に戻すことができることを実証する。したがって、この技術は、臨床および治療用途のための細胞の陽性選択に新しい用途を開くものである。
アンチドートは特に脱染の速度を高め、２’ＯＭｅ  ＲＮＡアンチドートは、ＤＮＡ対応物よりも強力であった。精製されていないアプタマー−ストレプトアビジンコンジュゲート混合物は、単量体アプタマーよりも高い価数、アビディティー、および安定性を示したが、細胞からのコンジュゲートはより高いアンチドート濃度で容易に脱染された。細胞は様々なストレスにさらされ、長期間冷却して保持されたにもかかわらず、すべての実験条件で高い細胞生存率が維持された。重要なことに、アプタマーによって標的化された受容体の阻害された刺激は、アンチドートを介した脱染により無効にされ、機能を損なう染色で選別細胞の天然の挙動を回復した。同じ受容体を標的とする抗体はまた、選別のための良好な安定性を提供したが、抗体の永続性は、単離細胞が刺激される能力を不可逆的に不能にした。
【００８９】
Ｅ０７染色は低温でのみ安定であることが研究の初期に発見された。これは実際に除去するための利点であったが、目的の細胞集団を明確に同定する強力な蛍光シグナルを保持するために、選別が完了するまでＥ０７染色した試料を低温に保つことが重要であった。この研究において使用された最小化されたＥ０７アプタマーの３７℃での喪失はまた、その全長の親配列と実質的に同じであることが判明した（データを示さず）。これは、その不安定性が、切断によって与えられなかったことを意味する。さらに、他の研究では、細胞精製および治療薬の標的送達など、いくつかの用途の有用性を低下させるアプタマーの高いオフレートが報告されている。
４℃でのＥ０７染色試料の維持はまた、結合アプタマーのエンドサイトーシスを阻害するのに重要であった。これは、生理的温度で容易に生じるプロセスである。Ｅ０７とその標的ＥＧＦＲとの複合体は、結合に応じて容易に相互作用し、脱染中のその除去を防ぐ。結合したＥ０７の安定性の向上に加えて、細胞膜の流動性が実質的に低下するため、低温でもエンドサイトーシスが妨げられる。したがって、試料を４℃で維持すると、細胞外表面上でＥ０７が安定に保たれ、（１）選別中に堅牢なシグナルを提供し、（２）下流のアプタマー除去を最大化する。
【００９０】
この理論的根拠に沿って、結合したＥ０７を中和または除去するアンチドートスクリーニング実験を最初に４℃で行った。特に最終的に使用される非常に高い濃度（１００μＭ）を考慮すると、商業的に生成されたＤＮＡ（対修飾ＲＮＡ）の低コストは、最初のスクリーニング実験に非常に適していた。その過剰な濃度でさえ、Ｅ０７配列の全体を一緒にサンプリングした１５マーのアンチドートは、結合を実質的にブロックすることも、すでに結合したアプタマーを４℃で脱染することもできなかった。より低い濃度は、さらに抑制された効果があった（データを示さず）。アンチドートスクリーニングの目的にはアプタマーの内在化を回避することが最優先事項ではなかったため、ブロッキングを３７℃で行ってより良い結果を得た。これらのデータ、およびコールドスクリーニング中に取得されたデータは、Ｅ０７の予測されたループ構造を標的とするアンチドートが最も効果的であり、アンチドートＡ９が最も効果的であり、今後、リードアンチドートとして選択されるものの一つである。ループ標的アンチドートが非常に効果的であるというこの所見は、以前の研究で開発され、成功したアンチドートと一致していた。
【００９１】
次に、アンチドートは構造化されているため、コールドアッセイにおいて機能していなかった可能性があることが判明した。１５から２０塩基のアンチドートは、生理学的温度でアプタマーを急速に中和するため、過去に成功裏に使用されていたが、４℃ではこれらのアンチドートは構造化されると予測される。実際、Ｅ０７に対する潜在的なアンチドートの大まかな調査では、平均にして長さが１０塩基超のアンチドートは、その温度で構造を有することが明らかになった（データを示さず）。
【００９２】
この所見は、４℃で細胞を脱染するための代替戦略の試みを促進した。冷たいときに折り畳まれる単一のより大きなアンチドートを使用する代わりに、より小さなアンチドートの組合せを試験して、一緒に大きな領域を標的化したが、個々の小さなサイズは冷たいときに構造化を避けた。長さが７または８塩基である２つまたは３つのアンチドートのグループをスクリーニングした。これは、この長さのＤＮＡは、二次構造を形成せずにその標的にアニーリングすることができると予測されたためである（データを示さず）。理論的には、このシステムは、より大きなアンチドートを苦しませる落とし穴を回避することにより、４℃で細胞を脱染することができたはずであった。短いアンチドートの組合せは冷たい場合にＥ０７結合をブロックすることができるため、実際には部分的な成功のみが観察されたが、すでに結合したアプタマーを細胞から除去する実際の試験で最も優良な長いアンチドートとほぼ同程度に実施した（データを示さず）。
【００９３】
これと生理的温度でのアンチドートＡ９の確立された有効性に照らして、エンドサイトーシスの前に結合したアプタマーを除去するために、短期の３７℃脱染処理が採用された。熱だけで細胞からＥ０７が除去されたが（３０分後、７９％）、アンチドート（１００μＭ）の存在により除去が大いに促進された（１０分後、９７％）。無作為にスクランブルされたＡ９配列を保有する対照アンチドートの濃度がまだ過度に高く、培地＋のみと比較して、脱染の速度または程度に影響を与えなかったため、この増大は特異的であることが判明した。エンドサイトーシスはまた評価され、培地＋で１０分後に約４％、ｓＡ９で３％と非常に軽度であることが判明した。Ａ９およびｍＡ９の存在下でのＥ０７除去の比較的迅速な速度は、内在化の速度と有利に競合し、エンドサイトーシスを約１．５％にさらに減少させた（データを示さず）。
【００９４】
低濃度のアンチドートＡ９およびその２’ＯＭｅ  ＲＮＡ類似体ｍＡ９はまた、試薬を保存するが、脱染速度をなおも最大化する条件を探すために試験された。最良の観察された脱染力を保存したＡ９の最小濃度は５μＭであり、ｍＡ９はこの濃度で同様に有効であった。しかしながら、そのより高い効力は、ｍＡ９を最大１０倍低い濃度でこの最大の効果を維持させることができた。このより大きな効力は、インビボでアプタマー治療薬を制御するアンチドートの開発において日常的に利用されており、ＤＮＡと比較して、２’ＯＭｅの相補的塩基に対する結合親和性がより高いためである（ヌクレオチドあたり０．５−０．７℃高いＴm）。非標準的な塩基（例えば、２’Ｆ、２’ＯＭｅ）で修飾されたＲＮＡアンチドートの使用は、これらの塩基が与える、血漿中の有意に高い安定性によって動機付けられる不可欠なものである。ヌクレアーゼが問題にならない、ここで示されたようなインビトロでの用途について、ＤＮＡアンチドートは、所望の効果を達成するために有意に多くのものが必要である場合でさえ、財政的に魅力的な代替手段を提供する。
【００９５】
アプタマーの不安定性はまた、試料を冷たく保持することに加えて、多量体Ｅ０７−ストレプトアビジンコンジュゲート混合物を利用することによって対処された。コンジュゲートは、ビオチン化Ｅ０７および対照Ｃ３６を、４つのアプタマーによる装飾を理論的にサポートするＡＦ４８８標識された四量体ストレプトアビジンと反応させることによって生成された。コンジュゲーション時のアプタマー結合に影響を与え得る立体効果を回避するために、ビオチン化５’伸長を有する「テール」アプタマー（ｂＥ０７およびｂＣ３６）を使用した。追加のクッションは、ビオチンと尾部の最初のヌクレオチドとの間の６炭素スペーサーによって提供された。
【００９６】
ビオチン化アプタマーとＳＡの反応により、未反応のアプタマーと、ある範囲の価数を有するコンジュゲートとの混合物が得られ、３：１のｂＥ０７：ＳＡモル比が、実質的により多価のコンジュゲートの生成に対して閾値として現れた。これは、３：１が最適であることが判明したアプタマー−ＳＡコンストラクトを使用した他の研究と一致している（Maier, Jangra et al. 2016）。ビオチン−ＳＡは公知の最強の非共有結合であり、利用可能なアプタマー結合部位が過剰であるにもかかわらず、（１）立体混雑、および（２）アプタマーが追加されたため、ＳＡ上の静電反発に起因して、最大２から３の結合価しか可能ではないという理論がある（Maier, Jangra et al. 2016）。この理論は、１：１の混合物でさえ組み込まれていない大量のアプタマー、得られるコンジュゲート種のスペクトル、および多価構築物の収率を高めるための過剰なアプタマーの要件を説明している。
【００９７】
未精製のコンジュゲート混合物の組成は、細胞を染色するために使用した場合に観察される見かけの結合親和性および飽和を説明する。コンジュゲート混合物を調製するために一定量のＳＡと比較してｂＥ０７の量が増加したため、ＥＭＳＡにより良好な取り込みが観察されたにもかかわらず、より高い比率の混合物により多くの未反応ｂＥ０７が存在した。より高い比率での非蛍光未反応ｂＥ０７のより大きな分率は、結合に関してより良く競合し、結果として、結合した蛍光コンジュゲートの量を減らし、見かけの飽和を低下させた。未標識の競合物は見かけの結合親和性に影響を与えるべきではないため、より高い比率のコンジュゲート混合物のより大きな見かけの親和性は、より高いアビディティーの構築物の増加した内容を正確に反映した。平均的な結合価が高いと、３：１対２：１の混合物の親和性のより大きな差が予想されたが、２価を超えるコンジュゲートではアビディティー（ａｖｉｄｉｔｙ）のリターンが減少する。未精製のコンジュゲート混合物の染色を後続の実験でＥ０７と比較したため、類似した見かけの親和性のために２：１の比率が選択されたが、ＥＧＦ刺激アッセイに大きな影響を与える未標識の低親和性競合物ｂＥ０７との競合が減少した。
その組成にもかかわらず、単量体Ｅ０７に比べて未精製のコンジュゲート反応混合物を使用して、モノクローナルＥＧＦＲ抗体の安定性に近い有意に改善された安定性が達成された。脱染実験は、３７℃で経時的なアプタマー喪失における実質的な減少としてこれを反映し、機能アッセイは、アゴニストＥＧＦによる刺激を防止するＥＧＦＲの非常に強力な中和を明らかにした。コンジュゲート混合物によって付与されたこの改善された平均的な安定性は、細胞選別後にさらにより明らかになった。これを考慮すると、観察された結果は非常に印象的である。
【００９８】
しかし、コンジュゲート混合物によって付与される培地＋のより大きな平均的な安定性は、より高いアンチドート濃度（５μＭ）で完全に無効になった。興味深いことに、アンチドート濃度の低下は、コンジュゲートの脱染に効果が小さいという観察から、細胞表面上でＥＧＦＲが架橋していることが示唆される。ＳＡにコンジュゲートしているが、アンチドート治療時にＥＧＦＲに関連付けられていないｂＥ０７は中和される必要があり、結果として、再結合に利用できるアプタマーの局所濃度を下げる必要がある。したがって、アンチドート処理の前に１を超えるＥＧＦＲ受容体に同時に結合した多価コンジュゲートのみが、モノマーに対して追加の安定性を提供するべきである。このような多価が可能な架橋は、抗体で日常的に観察されており、ＥＧＦＲの二量体化は十分に特徴付けられている。
【００９９】
また、処理タイプに関わらず、選別および脱染後に、非常に高い細胞生存率が維持されることが期待された。脱着、染色、選別、および脱染の手順には、複数の遠心分離工程、および試料を数時間冷却するなど、多数のストレスが伴う。Ａ４３１細胞は比較的堅牢であり得、生存率データはアポトーシスではなく壊死のみに関するものであるが、結果は依然として非常に良好であり、可逆的なアプタマーベースの細胞染色の穏やかな性質を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ−Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
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【図４Ｉ】
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【図４Ｊ】
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【図４Ｋ】
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【図４Ｌ】
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【図４Ｍ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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