(57)【要約】  本明細書は、エリスロフェロンに特異的な抗体と、当該抗体を含むアッセイとを開示する。また、疾患の診断又は監視のために当該アッセイを用いる方法も開示する。【選択図】図１
2020510841.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）タンパク質の存在を検出するための及び／又はその量を測定するためのアッセイであって、
第１の抗体−ＥＲＦＥ複合体を形成するために前記サンプルを第１の抗体と接触させることと、
その後、前記第１の抗体と第２の抗体とが同一ではないとして、前記第１の抗体−ＥＲＦＥ複合体に結合した前記第２の抗体の存在を検出し及び／又はその量を測定し、これにより、前記サンプル中のＥＲＦＥタンパク質の存在及び／又は量を決定することと、
を含む、
アッセイ。
【請求項２】
前記アッセイはＥＬＩＳＡアッセイを含む、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記サンプルは血清サンプルである、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記第１の抗体及び前記第２の抗体は、配列番号１及び／又は３−１６の少なくとも１つの配列を含む、当該配列から実質的になる、又は当該配列からなるＥＲＦＥポリペプチドを、特異的に認識する、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記第１の抗体は、モノクローナル抗体である９Ｂ１２、１７Ａ５、１７Ｅ５、２Ｄ２、４Ｃ１、６Ｈ９、７Ｈ４、９Ｃ７、１４Ｂ２、及び１４Ｄ９、又は、これらのＥＲＦＥ結合断片から選択される、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記第１の抗体は４Ｃ１又はそのＥＲＦＥ結合断片である、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記第１の抗体は固体支持体上にコートされている、請求項１から６のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記固体支持体はＥＬＩＳＡプレートである、請求項７に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記検出工程は、第１の抗体−ＥＲＦＥポリペプチド複合体を標識化された第２の抗体と接触させることを含む、請求項１に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記第２の抗体は、９Ｂ１２、１７Ａ５、１７Ｅ５、２Ｄ２、４Ｃ１、６Ｈ９、７Ｈ４、９Ｃ７、１４Ｂ２、及び１４Ｄ９から選択された標識検出抗体である、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記第２の抗体は２Ｄ２である、請求項１０に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記標識はビオチンである、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１３】
前記標識はセイヨウワサビペルオキシダーゼである、請求項９に記載のアッセイ。
【請求項１４】
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片であって、
前記ＶＨは、
（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（ｖ）配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含み、
前記ＶＬは、
（ｖｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｘ）配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（ｘ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、
エリスロフェロン（ＥＲＦＥ）結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項１５】
ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片であって、
前記抗体が
（ｉ）配列番号１９−２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｉ）配列番号２４−２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｉｉ）配列番号２９−３１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｖ）配列番号３４−３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖ）配列番号３９−４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖｉ）配列番号４４−４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖｉｉ）配列番号４９−５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖｉｉｉ）配列番号５４−５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｘ）配列番号５９−６１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｘ）配列番号６４−６６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
を含む、
ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項１６】
配列番号１８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、請求項１４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項１７】
前記ＶＨは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４又は１６に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項１８】
前記ＶＬは配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４又は１６に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項１９】
前記抗体は、配列番号１９−２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号２４−２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、請求項１５に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項２０】
配列番号２８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号３３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、請求項１４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項２１】
前記ＶＨは配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４又は２０に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項２２】
前記ＶＬは配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４又は２０に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項２３】
前記抗体は、配列番号２９−３１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号３４−３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、請求項１５に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項２４】
配列番号３８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号４３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、請求項１４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項２５】
前記ＶＨは配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４又は２４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項２６】
前記ＶＬは配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４又は２４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項２７】
前記抗体は、配列番号３９−４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号４４−４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、請求項１５に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項２８】
配列番号４８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号５３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、請求項１４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項２９】
前記ＶＨは配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４又は２８に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項３０】
前記ＶＬは配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４又は２８に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項３１】
前記抗体は、配列番号４９−５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号５４−５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、請求項１５に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項３２】
配列番号５８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号６３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、請求項１４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項３３】
前記ＶＨは配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４又は３２に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項３４】
前記ＶＬは配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１４又は３２に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項３５】
前記抗体は、配列番号５９−６１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号６４−６６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、請求項１５に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項３６】
ＶＨ及びＶＬを含み、前記ＶＨは、配列番号１８、２８、３８、４８、又は５８のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬは、配列番号２３、３３、４３、５３、又は６３のアミノ酸配列を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項３７】
配列番号１８、２８、３８、４８、又は５８のＶＨ及び配列番号２３、３３、４３、５３、又は６３のＶＬを含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項３８】
配列番号１９、２９、３９、４９、又は５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項３９】
配列番号２０、３０、４０、５０、又は６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項４０】
配列番号２１、３１、４２、５２、又は６２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項４１】
配列番号２４、３４、４４、５４、又は６４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項４２】
配列番号２５、３５、４５、５５、又は６５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項４３】
配列番号２６、３６、４６、５６、又は６６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項４４】
前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は抗体断片である、請求項１４から４３のいずれか１項に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【請求項４５】
サンプル中のエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）タンパク質の存在を検出するための及び／又はその量を測定するためのアッセイであって、
第１の抗体−ＥＲＦＥ複合体を形成するために、前記サンプルを、請求項１４から４４のいずれか１項に記載の抗体を含む第１の抗体と接触させることと、
その後、第２の抗体は請求項１４から４４のいずれか１項に記載の抗体を含み、前記第１の抗体と前記第２の抗体とが同一ではないとして、前記第１の抗体−ＥＲＦＥ複合体に結合した前記第２の抗体の存在を検出し及び／又はその量を測定することと、
これにより、前記サンプル中のＥＲＦＥタンパク質の存在及び／又は量を決定することと、
を含む、
アッセイ。
【請求項４６】
前記アッセイはＥＬＩＳＡアッセイを含む、請求項４５に記載のアッセイ。
【請求項４７】
前記サンプルは血清サンプルである、請求項４５に記載のアッセイ。
【請求項４８】
前記第１の抗体は、配列番号１及び／又は３−１６の少なくとも１つの配列を含む、当該配列から実質的になる、又は当該配列からなるＥＲＦＥポリペプチドを、特異的に認識する、請求項４５に記載のアッセイ。
【請求項４９】
前記第１の抗体は固体支持体上にコートされている、請求項４５から４８のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項５０】
前記固体支持体はＥＬＩＳＡプレートである、請求項４９に記載のアッセイ。
【請求項５１】
前記検出工程は、第１の抗体−ＥＲＦＥポリペプチド複合体を標識化された第２の抗体と接触させることを含む、請求項４５に記載のアッセイ。
【請求項５２】
前記標識はビオチンである、請求項５１に記載のアッセイ。
【請求項５３】
前記標識はセイヨウワサビペルオキシダーゼである、請求項５１に記載のアッセイ。
【請求項５４】
ＥＲＦＥ又はマイオネクチンに関連する疾患のある対象での赤血球生成を評価する方法であって、前記対象由来のサンプルを請求項１から１３又は４５から５３のいずれか１項に記載のアッセイに掛けることを含む、方法。
【請求項５５】
前記疾患はサラセミアである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記疾患は心血管疾患である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
ＥＲＦＥ又はマイオネクチンに関連する疾患のある対象での赤血球生成を評価する方法であって、請求項１４から４４のいずれか１項に記載の抗体で前記対象由来のサンプル中のＥＲＦＥを検出することを含む、方法。
【請求項５８】
捕捉抗体及び検出抗体を含み、
（ｉ）前記捕捉抗体は１７Ａ５であり、前記検出抗体は、２Ｄ２、４Ｃ１、又は７Ｈ４である、
（ｉｉ）前記捕捉抗体は２Ｄ２であり、前記検出抗体は、４Ｃ１、７Ｈ４、１７Ａ５、又は９Ｂ１２である、
（ｉｉｉ）前記捕捉抗体は４Ｃ１であり、前記検出抗体は、２Ｄ２、７Ｈ４、１７Ａ５、又は９Ｂ１２である、
（ｉｖ）前記捕捉抗体は７Ｈ４であり、前記検出抗体は、２Ｄ２、４Ｃ１、１７Ａ５、又は９Ｂ１２である、
（ｖ）前記捕捉抗体は９Ｂ１２であり、前記検出抗体は、２Ｄ２、４Ｃ１、１７Ａ５、又は７Ｈ４である、又は、
（ｖｉｉ）前記捕捉抗体及び前記検出抗体は個別に請求項１４から４４のいずれか１項に記載の抗体であり、前記捕捉抗体及び前記検出抗体は同一ではない、
サンドイッチ免疫アッセイ用のキット。
【請求項５９】
前記捕捉抗体及び前記検出抗体は異なる抗体である、請求項５８に記載のキット。
【請求項６０】
前記捕捉抗体は固体支持体に結び付けられている、請求項５８又は５９に記載のキット。
【請求項６１】
前記検出抗体は標識に結び付けられている、請求項５８から６０のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６２】
前記標識はビオチンである、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
前記標識はセイヨウワサビペルオキシダーゼである、請求項６１に記載のキット。
【請求項６４】
ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼをさらに含む、請求項６２に記載のキット。
【請求項６５】
基質をさらに含む、請求項５８から６４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項６６】
前記アッセイを実行するための説明書をさらに含む、請求項５８から６５のいずれか１項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０１７年３月１３日出願の米国仮特許出願第６２／４７０，８５３号及び２０１７年３月１４日出願の米国仮特許出願第６２／４７１，１９５号の利益を主張し、両方の特許出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、鉄代謝を調節するポリペプチドへの抗体と当該抗体の使用法とに関する。
【背景技術】
【０００３】
赤血球産生は間違いなく体内での鉄の主な消費元である。赤血球産生の必要に応じて鉄を調節するホルモンの存在が５０年以上前から提唱されていた。
【０００４】
エリスロフェロン（ＥＲＦＥ）は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）に応答して骨髄で赤芽細胞により産生されるホルモンである。近年の動物実験により、ＥＲＦＥが、ベースラインの赤血球産生の調節に関与するよりも、むしろ、ヘプシジン発現のストレス赤血球生成特異的調節因子として働くことが示されてきている。高ヘプシジン発現は、食事性鉄の吸収の阻害とマクロファージ及び肝細胞での鉄の隔離とをもたらす。ＥＲＦＥは、肝臓でのヘプシジンの発現を抑制することで、増加した食事性鉄の吸収と、大出血後の血液質量の回復に必要な貯蔵鉄の回収とに寄与する。さらに、ＥＲＦＥがβサラセミアなどの遺伝性鉄付加性貧血でのヘプシジン調節に関与していることが明らかとなった。ＥＲＦＥは血液疾患のある患者での赤血球生成を評価するための臨床的指標としての潜在性を有する。
【０００５】
これまで、開発中の及び／又は検証中のヒトＥＲＦＥアッセイの報告はなかった。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書は、ヒトエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）に特異的な抗体と、サンプル内のＥＲＦＥポリペプチドの存在を検出し及び／又は当該ポリペプチドの量を測定するためのアッセイとを開示する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片であって、
ＶＨは、
（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（ｖ）配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含み、
ＶＬは、
（ｖｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｘ）配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（ｘ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む
エリスロフェロン（ＥＲＦＥ）結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片が提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、
抗体が
（ｉ）配列番号１９−２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｉ）配列番号２４−２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｉｉ）配列番号２９−３１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｖ）配列番号３４−３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖ）配列番号３９−４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖｉ）配列番号４４−４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖｉｉ）配列番号４９−５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖｉｉｉ）配列番号５４−５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｘ）配列番号５９−６１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｘ）配列番号６４−６６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
を含む、
ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片が提供される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号１８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬは配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号１９−２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号２４−２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号２８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、配列番号３３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬは配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号２９−３１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号３４−３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号３８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号４３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬは配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号３９−４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号４４−４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号４８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号５３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬは配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号４９−５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号５４−５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む。
【００１７】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号５８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号６３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬは配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号５９−６１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号６４−６６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、配列番号１８、２８、３８、４８、又は５８のアミノ酸配列を含み、かつ、ＶＬは、配列番号２３、３３、４３、５３、又は６３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号１８、２８、３８、４８、又は５８のＶＨ及び配列番号２３、３３、４３、５３、又は６３のＶＬを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号１９、２９、３９、４９、又は５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号２０、３０、４０、５０、又は６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号２１、３１、４２、５２、又は６２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号２４、３４、４４、５４、又は６４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号２５、３５、４５、５５、又は６５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２を含む。いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、配列番号２６、３６、４６、５６、又は６６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は抗体断片である。
【００２３】
また、サンプル中のエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）タンパク質の存在を検出するための及び／又はその量を測定するためのアッセイであって、第１の抗体−ＥＲＦＥ複合体を形成するために前記サンプルを第１の抗体と接触させることと、その後、前記第１の抗体と第２の抗体とが同一ではないとして、前記第１の抗体−ＥＲＦＥ複合体に結合した前記第２の抗体の存在を検出し及び／又はその量を測定し、これにより、前記サンプル中のＥＲＦＥタンパク質の存在及び／又は量を決定することと、を含む、アッセイも、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、第１の抗体は捕捉抗体であり、第２の抗体は検出抗体である。いくつかの実施形態では、アッセイはＥＬＩＳＡアッセイを含む。いくつかの実施形態では、サンプルは血清サンプルである。いくつかの実施形態では、第１の抗体は、配列番号１及び／又は３−１６の少なくとも１つの配列を含む、当該配列から実質的になる、又は当該配列からなるＥＲＦＥポリペプチドを、特異的に認識する。
【００２４】
本明細書に開示のアッセイのいくつかの実施形態では、第１の抗体は、モノクローナル抗体である９Ｂ１２、１７Ａ５、１７Ｅ５、２Ｄ２、４Ｃ１、６Ｈ９、７Ｈ４、９Ｃ７、１４Ｂ２、及び１４Ｄ９、又は、これらのＥＲＦＥ結合断片から選択される。いくつかの実施形態では、第１の抗体は本明細書に開示の抗体から洗濯される。いくつかの実施形態では、第１の抗体は４Ｃ１又はそのＥＲＦＥ結合断片である。
【００２５】
本明細書に開示のアッセイのいくつかの実施形態では、第１の抗体は固体支持体上にコートされている。いくつかの実施形態では、固体支持体はＥＬＩＳＡプレートである。
【００２６】
本明細書に開示のアッセイのいくつかの実施形態では、検出工程は、第１の抗体−ＥＲＦＥポリペプチド複合体を標識化された第２の抗体と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗体は、９Ｂ１２、１７Ａ５、１７Ｅ５、２Ｄ２、４Ｃ１、６Ｈ９、７Ｈ４、９Ｃ７、１４Ｂ２、及び１４Ｄ９から選択された標識検出モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、第２の抗体は請求項１から３９のいずれか１項に記載の抗体から選択された標識検出抗体である。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、第２の抗体は２Ｄ２である。いくつかの実施形態では、標識はビオチンである。いくつかの実施形態では、標識はセイヨウワサビペルオキシダーゼである。
【００２７】
また、ＥＲＦＥ又はマイオネクチンに関連する疾患のある対象での赤血球生成を評価する方法であって、対象由来のサンプルを本明細書に開示のアッセイに掛けることを含む、方法も、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、疾患はサラセミアである。いくつかの実施形態では、疾患は心血管疾患である。
【００２８】
また、疾患のある対象での赤血球生成を評価する方法であって、本明細書に開示の抗体で対象由来のサンプル中のエリスロフェロンを検出することを含む、方法も、本明細書に開示される。
【００２９】
また、捕捉抗体及び検出抗体を含み、
（ｉ）捕捉抗体は１７Ａ５であり、検出抗体は、２Ｄ２、４Ｃ１、又は７Ｈ４である、
（ｉｉ）捕捉抗体は２Ｄ２であり、検出抗体は、４Ｃ１、７Ｈ４、１７Ａ５、又は９Ｂ１２である、
（ｉｉｉ）捕捉抗体は４Ｃ１であり、検出抗体は、２Ｄ２、７Ｈ４、１７Ａ５、又は９Ｂ１２である、
（ｉｖ）捕捉抗体は７Ｈ４であり、検出抗体は、２Ｄ２、４Ｃ１、１７Ａ５、又は９Ｂ１２である、
（ｖ）捕捉抗体は９Ｂ１２であり、検出抗体は、２Ｄ２、４Ｃ１、１７Ａ５、又は７Ｈ４である、
サンドイッチ免疫アッセイ用のキットも、本明細書に開示される。
【００３０】
キットのいくつかの実施形態では、捕捉抗体及び検出抗体は異なる抗体である。いくつかの実施形態では、捕捉抗体は固体支持体に結び付けられている。いくつかの実施形態では、検出抗体は標識に結び付けられている。いくつかの実施形態では、標識はビオチンである。いくつかの実施形態では、標識はセイヨウワサビペルオキシダーゼである。いくつかの実施形態では、キットはストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼをさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは基質をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットはアッセイを実行するための説明書をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】マウス（配列番号２）及びヒト（配列番号１）のエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）タンパク質のアラインメントを示す。強調配列が配列番号１６である。
【図２Ａ】図２Ａ及びＢは、還元ヒト組み換えＥＲＦＥ（レーン１）及び非還元ヒト組み換えＥＲＦＥ（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２Ａ）及びウェスタンン・ブロット（図２Ｂ）を示す。還元ＥＲＦＥの単一の顕著なバンドは特にウェスタンン・ブロットで明瞭な複数のバンドに匹敵するが、このことは多量体組成物を示唆している。レーンＰは陽性対照抗原を示す（ウェスタンン・ブロット）。
【図２Ｂ】図２Ａ及びＢは、還元ヒト組み換えＥＲＦＥ（レーン１）及び非還元ヒト組み換えＥＲＦＥ（レーン２）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２Ａ）及びウェスタンン・ブロット（図２Ｂ）を示す。還元ＥＲＦＥの単一の顕著なバンドは特にウェスタンン・ブロットで明瞭な複数のバンドに匹敵するが、このことは多量体組成物を示唆している。レーンＰは陽性対照抗原を示す（ウェスタンン・ブロット）。
【図３Ａ】図３Ａ−Ｆは、捕捉抗体としての６種のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェルでコート）（図３Ａでは１７Ｅ５、図３Ｂでは１７Ａ５、図３Ｃでは２Ｄ２、図３Ｄでは４Ｃ１、図３Ｅでは６Ｈ９、図３Ｆでは７Ｈ４）と、異なる濃度の組み換えヒトＥＲＦＥ（第１、第２、第３、及び第４の縦棒で、１５０、７５．００、３７．５０、１８．７５ｎｇ／ウェル）とを用いたペアワイズ・スクリーニングを示す。６種のモノクローナル抗体により補足された異なる濃度のＥＲＦＥの存在を識別するために８種のビオチン化検出抗体で試験を行った。
【図３Ｂ】図３Ａ−Ｆは、捕捉抗体としての６種のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェルでコート）（図３Ａでは１７Ｅ５、図３Ｂでは１７Ａ５、図３Ｃでは２Ｄ２、図３Ｄでは４Ｃ１、図３Ｅでは６Ｈ９、図３Ｆでは７Ｈ４）と、異なる濃度の組み換えヒトＥＲＦＥ（第１、第２、第３、及び第４の縦棒で、１５０、７５．００、３７．５０、１８．７５ｎｇ／ウェル）とを用いたペアワイズ・スクリーニングを示す。６種のモノクローナル抗体により補足された異なる濃度のＥＲＦＥの存在を識別するために８種のビオチン化検出抗体で試験を行った。
【図３Ｃ】図３Ａ−Ｆは、捕捉抗体としての６種のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェルでコート）（図３Ａでは１７Ｅ５、図３Ｂでは１７Ａ５、図３Ｃでは２Ｄ２、図３Ｄでは４Ｃ１、図３Ｅでは６Ｈ９、図３Ｆでは７Ｈ４）と、異なる濃度の組み換えヒトＥＲＦＥ（第１、第２、第３、及び第４の縦棒で、１５０、７５．００、３７．５０、１８．７５ｎｇ／ウェル）とを用いたペアワイズ・スクリーニングを示す。６種のモノクローナル抗体により補足された異なる濃度のＥＲＦＥの存在を識別するために８種のビオチン化検出抗体で試験を行った。
【図３Ｄ】図３Ａ−Ｆは、捕捉抗体としての６種のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェルでコート）（図３Ａでは１７Ｅ５、図３Ｂでは１７Ａ５、図３Ｃでは２Ｄ２、図３Ｄでは４Ｃ１、図３Ｅでは６Ｈ９、図３Ｆでは７Ｈ４）と、異なる濃度の組み換えヒトＥＲＦＥ（第１、第２、第３、及び第４の縦棒で、１５０、７５．００、３７．５０、１８．７５ｎｇ／ウェル）とを用いたペアワイズ・スクリーニングを示す。６種のモノクローナル抗体により補足された異なる濃度のＥＲＦＥの存在を識別するために８種のビオチン化検出抗体で試験を行った。
【図３Ｅ】図３Ａ−Ｆは、捕捉抗体としての６種のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェルでコート）（図３Ａでは１７Ｅ５、図３Ｂでは１７Ａ５、図３Ｃでは２Ｄ２、図３Ｄでは４Ｃ１、図３Ｅでは６Ｈ９、図３Ｆでは７Ｈ４）と、異なる濃度の組み換えヒトＥＲＦＥ（第１、第２、第３、及び第４の縦棒で、１５０、７５．００、３７．５０、１８．７５ｎｇ／ウェル）とを用いたペアワイズ・スクリーニングを示す。６種のモノクローナル抗体により補足された異なる濃度のＥＲＦＥの存在を識別するために８種のビオチン化検出抗体で試験を行った。
【図３Ｆ】図３Ａ−Ｆは、捕捉抗体としての６種のモノクローナル抗体（１００ｎｇ／ウェルでコート）（図３Ａでは１７Ｅ５、図３Ｂでは１７Ａ５、図３Ｃでは２Ｄ２、図３Ｄでは４Ｃ１、図３Ｅでは６Ｈ９、図３Ｆでは７Ｈ４）と、異なる濃度の組み換えヒトＥＲＦＥ（第１、第２、第３、及び第４の縦棒で、１５０、７５．００、３７．５０、１８．７５ｎｇ／ウェル）とを用いたペアワイズ・スクリーニングを示す。６種のモノクローナル抗体により補足された異なる濃度のＥＲＦＥの存在を識別するために８種のビオチン化検出抗体で試験を行った。
【図４Ａ】図４Ａ−Ｃは、３種の異なるコーティング抗体（７Ｈ４（図４Ａ）、１７Ａ５（図４Ｂ）、及び４Ｃ１（図４Ｃ））と４種の異なるビオチン化検出抗体（２Ｄ２、１７Ａ５、９Ｂ１２、及び４Ｃ１）を用いて行った抗ｈＥＲＦＥサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを示す。用いた捕捉抗体によらず、すべての検出抗体で良好な相関係数であったが、いくつかの検出抗体は試験したＥＲＦＥ濃度の範囲で他よりも大きな勾配を示した。
【図４Ｂ】図４Ａ−Ｃは、３種の異なるコーティング抗体（７Ｈ４（図４Ａ）、１７Ａ５（図４Ｂ）、及び４Ｃ１（図４Ｃ））と４種の異なるビオチン化検出抗体（２Ｄ２、１７Ａ５、９Ｂ１２、及び４Ｃ１）を用いて行った抗ｈＥＲＦＥサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを示す。用いた捕捉抗体によらず、すべての検出抗体で良好な相関係数であったが、いくつかの検出抗体は試験したＥＲＦＥ濃度の範囲で他よりも大きな勾配を示した。
【図４Ｃ】図４Ａ−Ｃは、３種の異なるコーティング抗体（７Ｈ４（図４Ａ）、１７Ａ５（図４Ｂ）、及び４Ｃ１（図４Ｃ））と４種の異なるビオチン化検出抗体（２Ｄ２、１７Ａ５、９Ｂ１２、及び４Ｃ１）を用いて行った抗ｈＥＲＦＥサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを示す。用いた捕捉抗体によらず、すべての検出抗体で良好な相関係数であったが、いくつかの検出抗体は試験したＥＲＦＥ濃度の範囲で他よりも大きな勾配を示した。
【図５Ａ】図５Ａ及びＢは、プロトタイプのモノクローナルサンドイッチＥＬＩＳＡ（捕捉抗体としてｍＡｂ  ４Ｃ１、検出抗体としてｍＡｂ  ２Ｄ２）を用いて作成した８点標準曲線を線形プロット（図５Ａ）及び対数プロット（図５Ｂ）でグラフに示す。標準曲線の低濃度部分の点同士を良好に区別でき（図５Ｂ）、これにより血清中で測定したＥＲＦＥ濃度の最適分解能が得られることに注意されたい。
【図５Ｂ】図５Ａ及びＢは、プロトタイプのモノクローナルサンドイッチＥＬＩＳＡ（捕捉抗体としてｍＡｂ  ４Ｃ１、検出抗体としてｍＡｂ  ２Ｄ２）を用いて作成した８点標準曲線を線形プロット（図５Ａ）及び対数プロット（図５Ｂ）でグラフに示す。標準曲線の低濃度部分の点同士を良好に区別でき（図５Ｂ）、これにより血清中で測定したＥＲＦＥ濃度の最適分解能が得られることに注意されたい。
【図６】ヒト血清ＥＲＦＥ発現における血漿アフェレーシス及び血小板アフェレーシスの効果を示す（ｎは患者３名で、実線、点線、又は破線で示す）。血清ＥＲＦＥは、２日目に上昇し、１４日間にわたってベースラインレベルを超えて維持されるが、すべての患者がアフェレーシス後１２０日までにベースラインＥＲＦＥレベルまで回復した。
【図７】Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血のある患者（ｎ＝１１、ＸＬＳＡ発端者）での血清ＥＲＦＥ濃度を当該患者の家族対照群（ｎ＝１５）と比較して示す。ＸＬＳＡ患者及び対照群でのメジアンＥＲＦＥ濃度は、それぞれ、１０．８及び０．１ｎｇ／ｍｌであった。図中、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示す。
【図８】鉄欠乏患者及びサラセミア患者でのＥＲＦＥを示す。対照ドナー（ｎ＝４７）、鉄欠乏ドナー（ＩＤ、ｎ＝２２）、α＋−サラセミア患者（ｎ＝１５）、β＋−サラセミア患者（ｎ＝２０）、及びβ０−サラセミア患者（ｎ＝２７）で、血清ＥＲＦＥを測定した。対照群でのメジアンＥＲＦＥは０．４ｎｇ／ｍｌであり、一方、ＩＤ患者、α＋−サラセミア患者、β＋−サラセミア患者、及びβ０サラセミア患者でのメジアンＥＲＦＥは、それぞれ、０．７、０．６、１．４、及び３４．８ｎｇ／ｍｌであった。図中、＊＊＊＊はｐ＜０．０００１を示し、＊＊はｐ＜０．００５を示す。
【図９】ＨＲＰ標識２Ｄ２検出抗体又はビオチン化２Ｄ２検出抗体のいずれかを用いてヒト血清サンプル（ｎ＝３８）で測定した内因性ＥＲＦＥ同士の関係を示す。これは、ＨＲＰによる検出抗体の直接標識がビオチン化検出抗体を用いた場合に匹敵する血清ＥＲＦＥ濃度をもたらすことを示している。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
エリスロフェロン（ＥＲＦＥ）に特異的な抗体、並びに、ＥＲＦＥを検出するための、ＥＲＦＥに関連する疾患を診断するための、及びＥＲＦＥに関連する疾患の進行を監視するための、当該抗体の使用法が、本明細書に開示される。
【００３３】
エリスロフェロンは、最初に同定された、赤血球細胞産生並びに対象での鉄の吸収及び分配を仲介する『ホルモン』である。エリスロフェロンは対象の骨髄で作られ、その産生は、例えば出血後や貧血からの回復中に、赤血球細胞産生が刺激されたときに、大幅に増加する。エリスロフェロンは、骨髄での赤血球産生の需要を満たすように鉄の供給を調節する。特に、エリスロフェロンは、肝臓で、主要な鉄調節タンパク質であるヘプシジンの産生を抑制する働きをすることが明らかとなっている。このため、エリスロフェロンの過剰産生はβ−サラセミアなどの疾患において鉄過負荷を引き起こすかもしれず、そのため、エリスロフェロンを無効にすることをβ−サラセミアの治療に用いることができると考えられる。
【００３４】
エリスロフェロンは、ヘプシジン発現を抑制する因子の探索過程で発見された。ヘプシジンは、肝臓で合成される２５アミノ酸のペプチドホルモンであり、鉄恒常性の中心的調節因子である。ヘプシジンは、唯一の鉄輸送因子であるフェロポーチンに結合することにより働き、そのユビキチン化、細胞内移行、及びリソソームでの分解をもたらす。フェロポーチンが細胞膜から消えると、食事性吸収が阻害され、回収された鉄がマクロファージ内に隔離され、赤血球生成に利用可能な鉄が減少する。対照的に、低ヘプシジンは、鉄を血漿に運び出す細胞でフェロポーチンが活性を維持することを可能とし、より多くの鉄をヘモグロビン合成に利用可能とする。鉄、炎症、又はＥＲストレスは、ヘプシジン産生を刺激し、一方、低酸素状態、鉄欠乏、及び増加した赤血球生成活性は、ヘプシジン産生を抑制する。
【００３５】
ヘプシジンは、大出血又はエリスロポエチン（ＥＰＯ）投与後に抑制される。ヘプシジンは、出血、溶血、又は鉄欠乏により引き起こされた貧血の際に、又は、無効赤血球産生をともなう遺伝性貧血の際に、減少する。ヘプシジンに対する赤血球生成の抑制的作用は、赤血球前駆体が大きく膨張するもののほとんどが赤血球へと成熟することなく赤芽細胞段階でアポトーシスをむかえるという無効赤血球生成をともなう疾患で特に顕著である。
【００３６】
エリスロフェロンは、骨格筋で主に発現・分泌され脂肪酸代謝過程及び輸送に関与するタンパク質であるマイオネクチン（ＣＴＲＰ１５）と同一である。マイオネクチンは、脂肪細胞及び肝細胞への脂質の取り込みを促進する。マイオネクチンは、グルコース又は脂肪酸のフラックスにより生じる細胞エネルギー状態の変化に応答して骨格筋により分泌される代謝調節因子であり、肥満個体では調節不全であるかもしれない。例えば、マイオネクチンの発現レベル及び循環レベルは肥満個体では減っているかもしれない。
【００３７】
エリスロフェロン・ホモログのアミノ酸配列は、脊椎動物の進化を通じてよく保存されており、マウスタンパク質とヒトタンパク質とは約７１％が同一であり（図１）、Ｃ末端側の半分はゼブラフィッシュのホモログと約４４％が同一である。ドメイン解析は、ＥＲＦＥが既知サイトカインとは中程度の類似性のみを有するＴＮＦαスーパーファミリーのメンバーであることを示した。ＴＮＦαとＲＡＮＫリガンド（ＲＡＮＫＬ）が最も近縁であった。Ｃ末端セグメントのＣＬＵＳＴＡＬアラインメントは、ＴＮＦファミリーのヒトのメンバーとＥＲＦＥのヒトバリアントとはシグナル配列が異なっていることを示した。
【００３８】
ＨＨＰｒｅｄｉｃｔＢを用いた全長タンパク質の構造モデリングは、本タンパク質のＮ末端部分がコラーゲン様セグメントを有するオープンリージョンが後に続くシグナル配列からなり、Ｃ末端部分がＴＮＦα／ＲＡＮＫＬと相同であることを示した。ＴＮＦαは、ＥＦＲＥと同様に、初代肝細胞培養物でヘプシジンｍＲＮＡを抑制することから、ＴＮＦαとの類似性は注目に値する。ＴＮＦαとの類似性からＥＲＦＥが多量体を形成する傾向があることが予測された。
【００３９】
ＥＲＦＥの検出と解析とを促進するため、ヒト型の全長エリスロフェロン及びＥＲＦＥポリペプチド内の抗原に対する一連の抗体を生成した。さらに、ＥＲＦＥ及び／又はＥＲＦＥタンパク質の内部及びＮ末端エピトープに対する抗体を本開示に係る様々なアッセイ及び治療法に用いることができる。本明細書で、『タンパク質』という用語は全長配列を指し、『ポリペプチド』はタンパク質配列の断片を指す。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥタンパク質は、ヒトＥＲＦＥの全長配列（ＭＡＰＡＲＲＰＡＧＡＲＬＬＬＶＹＡＧＬＬＡＡＡＡＡＧＬＧＳＰＥＰＧＡＰＳＲＳＲＡＲＲＥＰＰＰＧＮＥＬＰＲＧＰＧＥＳＲＡＧＰＡＡＲＰＰＥＰＴＡＥＲＡＨＳＶＤＰＲＤＡＷＭＬＦＶＲＱＳＤＫＧＶＮＧＫＫＲＳＲＧＫＡＫＫＬＫＦＧＬＰＧＰＰＧＰＰＧＰＱＧＰＰＧＰＩＩＰＰＥＡＬＬＫＥＦＱＬＬＬＫＧＡＶＲＱＲＥＲＡＥＰＥＰＣＴＣＧＰＡＧＰＶＡＡＳＬＡＰＶＳＡＴＡＧＥＤＤＤＤＶＶＧＤＶＬＡＬＬＡＡＰＬＡＰＧＰＲＡＰＲＶＥＡＡＦＬＣＲＬＲＲＤＡＬＶＥＲＲＡＬＨＥＬＧＶＹＹＬＰＤＡＥＧＡＦＲＲＧＰＧＬＮＬＴＳＧＱＹＲＡＰＶＡＧＦＹＡＬＡＡＴＬＨＶＡＬＧＥＰＰＲＲＧＰＰＲＰＲＤＨＬＲＬＬＩＣＩＱＳＲＣＱＲＮＡＳＬＥＡＩＭＧＬＥＳＳＳＥＬＦＴＩＳＶＮＧＶＬＹＬＱＭＧＱＷＴＳＶＦＬＤＮＡＳＧＣＳＬＴＶＲＳＧＳＨＦＳＡＶＬＬＧＶ、配列番号１）と、約７０から約１００％の、約８０％の、約８５％の、約９０％の、約９５％の、約９６％の、約９７％の、約９８％の、約９９％の、又は約１００％の配列同一性を有する配列を含み、当該配列から実質的になり、又は当該配列からなる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＥＲＦＥポリペプチドは、ＧＬＰＧＰＰＧＰＰＧＰＱＧＰＰＧＰ（配列番号３）、ＡＨＳＶＤＰＲＤＡＷＭＬＦＶ（配列番号４）、ＡＨＳＶＤＰＲＤＡＷＭＬＦＶＸＱＳＤＫＧＸＮ（配列番号５）、ＬＬＫＥＦＱＬＬＬＫＧＡＶＲＱＲＥ（配列番号６）、ＧＰＲＡＰＲＶＥＡＡＦ（配列番号７）、ＶＸＲＲＡＬＨＥＬＧＸＹＹＬＰＸ（配列番号８）、ＧＬＮＬＴＳＧＱＹ（配列番号９）、ＡＰＶＡＧＦＹＡＬＡＡＴＬＨＶＡＬ（配列番号１０）、ＸＭＧＬＥＸＳＳＥＬＦＴＩＳＶＮＧＶＬＹＬＱ（配列番号１１）、ＳＳＥＬＦＴＩＳＶＮＧＶＬＹＬＱ（配列番号１２）、ＴＳＶＦＬＤＮＡＳＧ（配列番号１３）、ＳＬＴＶＲＳＧＳＨＦＳＡ（配列番号１４）、ＳＬＴＶＲＳＧＳＨＦＳＡＸＬＬＧＸ（配列番号１５）、又はＥＦＱＬＬＬＫＧＡＶＲＱＲＥＲＡＥＰＥＰＣＴＣＧＰＡＧＰＶＡＡＳＬＡＰＶＳＡＴＡＧＥＤＤＤＤＶＶＧＤＶＬＡＬＬＡＡＰＬＡＰＧＰＲＡＰＲＶＥＡＡＦＬＣＲＬＲＲＤＡＬＶＥＲＲＡＬＨＥＬＧＶＹＹＬＰＤＡＥＧＡＦＲＲＧＰＧＬＮＬＴＳＧＱＹＲＡＰＶＡＧＦＹＡＬＡＡＴＬＨＶＡＬＧＥＰＰＲＲＧＰＰＲＰＲＤＨＬＲＬＬＩＣＩＱＳＲＣＱＲＮＡＳＬＥＡＩＭＧＬＥＳＳＳＥＬＦＴＩＳＶＮＧＶＬＹＬＱＭＧＱＷＴＳＶＦＬＤＮＡＳＧＣＳＬＴＶＲＳＧＳＨＦＳＡＶＬＬＧＶ（配列番号１６）（ただし、Ｘは任意のアミノ酸）を含むＥＲＦＥ断片と、約７０から約１００％の、約８０％の、約８５％の、約９０％の、約９５％の、約９６％の、約９７％の、約９８％の、約９９％の、又は約１００％の配列同一性を有する配列を含み、当該配列から実質的になり、又は当該配列からなる。
【００４２】
本明細書に開示のいくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はこれらのＥＲＦＥ結合断片である。本明細書に開示の通り、抗ＥＲＦＥ抗体は全長ヒトＥＲＦＥタンパク質（配列番号１）及び／又は配列番号３−１６のうち１つのポリペプチドに結合する。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体はヒトＥＲＦＥよりもマウスＥＲＦＥ（配列番号２）に選択的に結合することはない。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示の抗ＥＲＦＥ抗体は、配列番号１及び３−１６の１つ以上に開示のエピトープを認識する。いくつかの実施形態では、エピトープは、タンパク質の三次元三次構造から生じる立体構造エピトープである。いくつかの実施形態では、エピトープは不連続アミノ酸から構成される。いくつかの実施形態では、エピトープは抗原のグリコシル化部位を含む。
【００４４】
本明細書では、『抗体』という用語は、最も広い意味で用いられ、さまざまな抗体構造を包含するものであり、これらに限定されるわけではないが、こうした抗体として、所望の抗原結合活性を示す限りにおいて、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体断片などが挙げられる。抗体は、広義には、重鎖（Ｈ）及び軽鎖（Ｌ）から構成された任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、又は、Ｉｇ分子の必須エピトープ結合特徴を保持する、任意のその機能性断片、変異体、バリアント、若しくは、誘導体を指す。こうした変異体、バリアント、又は誘導体の抗体形式は本分野において既知であり、その非限定的な実施形態を以下で議論する。抗体は、ある分子と特異的に反応する能力を有する場合、当該分子と『結合する能力がある』といえる。本明細書では、『断片』という用語は、抗体を指す場合、ＥＲＦＥ結合抗体断片などの抗原結合断片を意味すると理解されたい。
【００４５】
本明細書では、『モノクローナル抗体』という用語は、単一親細胞のクローンである同一免疫細胞から得られ、特定の単一のエンコード配列（発現系又は発現細胞内で生じ得るようなバリエーションは無視する）から発現された抗体を指す。典型的には、モノクローナル抗体は同じエピトープに結合するという点で多価性である。『モノクローナル』という修飾語は、１つのクローン供給源から得られるという抗体の性質を意味し、抗体をいずれかの特定の方法で生産する必要があると解釈されるべきではない。モノクローナル抗体は任意の哺乳類種に由来するものでよく、これらに限定されるわけではないが、こうした哺乳類種としては、ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、ウサギ、ラクダ科動物等が挙げられる。
【００４６】
ある抗体の『抗原結合部分』又は『抗原結合断片』（より簡略には『抗体部分』又は『抗体断片』）は、インタクト抗体が結合する抗原に結合する当該インタクト抗体の一部を含む、インタクト抗体以外の分子（例えば、抗原に特異的に結合する能力を保持している抗体の１つ以上の断片）を指す。抗体断片の例として、これらに限定されるわけではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性抗体、線状抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、重鎖のみ抗体（ＨＣＡｂ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。インタクト抗体のパパイン消化により、『Ｆａｂ』断片と呼ばれる、単一の抗原結合部位をそれぞれが有する２つの同一の抗原結合断片と、残部の『Ｆｃ』断片（この名称は容易に結晶化するその能力を反映するものである）とが作られる。ペプシン処理により、２箇所の抗原結合部位を有し依然として抗原と交差する能力があるＦ（ａｂ’）２断片が得られる。なお、これらの用語は、タンパク質分解消化により作られる前述の断片に加えて、同一又は類似の性質の遺伝的にコードされた断片にも適用され得る。ある抗体の抗原結合機能が全長抗体の断片により行われ得ることが示されている。こうした抗体の実施形態として、２種類又は複数種類の異なる抗原に特異的に結合する二重特異性又は多重特異性の様式を挙げることもできる。抗体の『抗原結合部分』とう用語に包含される結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により結合されている２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一腕部のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦＶ断片、（ｖ）単一の可変ドメインを含むｄＡｂ断片（国際出願公開第９０／０５１４４号、その内容を参照により本明細書で援用する）、及び、（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメインであるＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされているものの、ＶＬ及びＶＨ領域が組み合わさって一価分子を形成している単一タンパク質鎖（別名、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ））としてＶＬ及びＶＨを作成することを可能とする合成リンカーにより、組み換え法を用いて、結合することができる。また、こうした単鎖抗体も抗体の『抗原結合部分』という用語に包含されることが意図される。また、二重特異性抗体などの単鎖抗体の他の形態も包含される。
【００４７】
『キメラ』抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖のある部分があるソース又は種に由来し、その残部を含む重鎖及び／又は軽鎖の少なくとも１つの別の部分が異なるソース又は種に由来する抗体を指す。ある実施形態では、ＣＤＲはマウス配列に由来し、フレームワーク領域はヒト配列に由来する。
【００４８】
抗体の『クラス』は、その重鎖が占める定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。ヒトの抗体には５種類の主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのいくつかは、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２などの、サブクラス（アイソタイプ）にさらに分けられる。これら異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
【００４９】
『二重特異性抗体』という用語は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、２箇所の抗原結合部位を有する抗体断片を指す。同じ鎖上でのこれら２つのドメイン間の対合を許容するには短すぎるリンカーを用いることにより、これらのドメインを別の鎖の相補的なドメインと対合させて、２箇所の抗原結合部位を形成させる。二重特異性抗体は、二価及び／又は二重特異的である。二重特異性抗体は、例えば、欧州特許出願４０４０９７号、国際出願公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、９：１２９−１３４（２００３）、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、９０：６４４４−６４４８（１９９３）で、より詳細に記載されている。また、Ｈｕｄｓｏｎ等、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、９：１２９−１３４（２００３）には、三重特異性抗体及び四重特異性抗体も記載されている。
【００５０】
『エピトープ』又は『抗原決定基』という用語は、免疫グロブリン又はＴ細胞受容体と特異的に結合する能力を有する任意のタンパク質又はポリペプチド決定基を含む。エピトープ決定基は、ある実施形態では、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、又はスルホニルなどの分子の、化学活性表面基を含んでおり、また、ある実施形態では、特異的三次元構造特性及び／又は特異的電荷特性を有していてもよい。エピトープは、抗体が結合する抗原の領域である。ある実施形態では、抗体は、その標的抗原をタンパク質及び／又は巨大分子の複合混合物内で優先的に認識したときに、抗原に特異的に結合するといえる。
【００５１】
『Ｆａｂ』断片は、重鎖及び軽鎖可変ドメインを含み、また、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。Ｆａｂ’断片は、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインをはじめとする数個の残基が付加されている点で、Ｆａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインの（１つ又は複数の）システイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’を表す表記である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、ヒンジシステインを両者の間に有するＦａｂ’断片の組として本来は作られる。また、他の抗体断片の化学的結合も知られている。
【００５２】
本明細書では、『Ｆｃ領域』という用語は、定常領域の少なくとも一部を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を明示するために用いられる。当該用語は天然配列Ｆｃ領域及び変異Ｆｃ領域を含む。
【００５３】
『フレームワーク』又は『ＦＲ』は、相補性決定領域（ＣＤＲ）残基を除く可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメイン、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４からなる。従って、ＣＤＲ配列及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ配列又はＶＬ配列内で、ＦＲ１−ＣＤ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４という順番で出現する。
【００５４】
本明細書では、『全長抗体』、『インタクト抗体』、及び『全抗体』という用語は、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有する抗体又は本明細書で記載のＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指すものとして互換的に用いられる。
【００５５】
『Ｆｖ』は、完全な抗原結合部位を含む最小抗体断片を指す。一実施形態では、二重鎖Ｆｖ種は、緊密に非共有結合的に会合した１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインのダイマーからなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメイン及び１つの軽鎖可変ドメインは、軽鎖及び重鎖が二重鎖Ｆｖ種の構造と類似の『ダイマー』構造で会合できるような可撓性のペプチドリンカーにより共有結合的に結合され得る。この配置によれば、各可変ドメインの３つのＣＤＲがＶＨ−ＶＬダイマーの表面で抗原結合部位をなすように相互作用する。６つのＣＤＲは集合的に抗原結合特異性を抗体に付与する。しかし、結合部位全体よりも親和性は低いものの、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの片方）であっても抗原を認識し結合する能力を有する。
【００５６】
『ヒト抗体』は、ヒトゲノムによりコードされた又はヒトゲノムに由来するアミノ酸配列を有する抗体である。本開示のヒト抗体は、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によりコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発又は部位特異的変異誘発により、又は、インビボでの体細胞変異により、導入された変異）を、例えばＣＤＲ内に、含んでもよい。しかし、本明細書で用いる『ヒト抗体』という用語は、マウスなどの別の哺乳類種の生殖系列由来のＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体を含むことを意図するものではない。
【００５７】
『ヒト化』抗体は、非ヒト種（例えば、マウス）由来の重鎖及び軽鎖可変領域配列を含み、このＶＨ及び／又はＶＬ配列の少なくとも一部が、より『ヒトに似た状態』にあるように、すなわち、ヒト生殖系列可変配列に類似するように改変されている抗体を指す。ヒト化抗体の一種として、対応するヒトＣＤＲ配列を置換するために非ヒトＣＤＲ配列がフレームワークヒトＶＨ及びＶＬ配列に導入されているＣＤＲ移植抗体が挙げられる。そのため、ヒト化抗体は、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含んでもよい。ある実施形態では、ヒト化抗体は、ＣＤＲの全て又は実質的に全てが非ヒト抗体（すなわち、ドナー抗体）の該当部分に対応し且つＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列の該当部分に対応する可変ドメインを、少なくとも１つ、典型的には２つ、含むだろう。ヒト化抗体は、随意に、ヒト抗体由来の抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の、例えば、非ヒト抗体の、『ヒト化形態』とは、ヒト化された抗体を指す。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は重鎖の少なくとも可変ドメインと軽鎖との両方を含む。また、抗体は、重鎖の、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、ＣＨ３領域、及びＣＨ４領域を含んでもよい。いくつか実施形態では、ヒト化抗体はヒト化軽鎖のみを含む。いくつか実施形態では、ヒト化抗体はヒト化重鎖のみを含む。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ヒト化重鎖及び／又は軽鎖のヒト化可変ドメインのみを含む。ヒト化抗体は、ＩｇＹ、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥをはじめとする任意のクラスの免疫グロブリン、並びに、限定されるわけではないものの、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４をはじめとする任意のアイソトープから選択できる。ヒト化抗体は、２つ以上のクラス又はアイソタイプ由来の配列を含んでもよく、本技術分野でよく知られた手法を用いて所望のエフェクター機能を最適化するために、特定の定常ドメインが選択されてもよい。ヒト化抗体のフレームワーク領域及びＣＤＲ領域は必ずしも親配列と正確に一致せずともよく、例えば、ドナー抗体ＣＤＲ又はコンセンサスフレームワークが、少なくとも１つのアミノ酸残基の、置換、挿入、及び／又は欠失により、当該部位での当該ＣＤＲ又はフレームワークの残基がドナー抗体又はコンセンサスフレームワークのいずれかと一致しないように、変異誘発されてもよい。また、特定の実施形態では、こうした変異は広域には及ばないだろう。通常、ヒト化抗体残基の、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、又は８０％、具体的には、少なくとも８５％の、より具体的には、少なくとも９０％の、特に、少なくとも９５％が、親ＦＲ配列及び親ＣＤＲ配列の該当部分と一致するだろう。
【００５８】
『ＣＤＲ移植抗体』という用語は、ヒトの重鎖及び軽鎖可変領域を有し且つヒトＣＤＲの１つ以上がマウスＣＤＲ配列に置換されている抗体などの、１つの種に由来する重鎖及び軽鎖可変領域配列を含み且つＶＨ及び／又はＶＬのＣＤＲ領域の１つ以上の配列が別種のＣＤＲ配列と置換されている抗体を指す。
【００５９】
『可変領域』又は『可変ドメイン』という用語は、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれ、ＶＨ及びＶＬと略す）の可変ドメインは、一般的に、同様の構造を有しており、各ドメインは４つの保存フレームワーク領域（ＦＲ）と、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つの超可変領域とを含む（例えば、Ｋｉｎｄｔ等、Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６版、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、９１頁（２００７）を参照）。抗原結合特異性を付与するには、単一のＶＨ又はＶＬドメインで十分であるかもしれない。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、相補性ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングするための、当該抗原に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを用いて、単離してもよい。
【００６０】
ある実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体は、９Ｂ１２（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１２３８８２）、１７Ａ５（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１２３８８３）、２Ｄ２（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１２３８７９）、４Ｃ１（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１２３８８０）、及び７Ｈ４（ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１２３８８１）の１つ、又は、これらの抗体の１つに由来する１つ以上のＣＤＲを含む抗体若しくは抗体断片である。
【００６１】
本明細書に開示の抗ＥＲＦＥ抗体は２Ｄ２又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片はＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは配列番号１８のアミノ酸配列を含み、且つ、ＶＬは配列番号２３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は配列番号１８又は配列番号２３の一方を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号１９−２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲのうち１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号２４−２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲのうち１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、本明細書に開示の、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は抗体断片である。
【００６２】
本明細書に開示の抗ＥＲＦＥ抗体は４Ｃ１又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片はＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは配列番号２８のアミノ酸配列を含み、且つ、ＶＬは配列番号３３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は配列番号２８又は配列番号３３の一方を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号２９−３１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲのうち１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号３４−３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲのうち１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、本明細書に開示の、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は抗体断片である。
【００６３】
本明細書に開示の抗ＥＲＦＥ抗体は７Ｈ４又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片はＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは配列番号３８のアミノ酸配列を含み、且つ、ＶＬは配列番号４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は配列番号３８又は配列番号４３の一方を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号３９−４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲのうち１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号４４−４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲのうち１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、本明細書に開示の、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は抗体断片である。
【００６４】
本明細書に開示の抗ＥＲＦＥ抗体は９Ｂ１２又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片はＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは配列番号４８のアミノ酸配列を含み、且つ、ＶＬは配列番号５３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は配列番号４８又は配列番号５３の一方を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号４９−５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲのうち１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号５４−５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲのうち１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、本明細書に開示の、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は抗体断片である。
【００６５】
本明細書に開示の抗ＥＲＦＥ抗体は１７Ａ５又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片はＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは配列番号５８のアミノ酸配列を含み、且つ、ＶＬは配列番号６３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は配列番号５８又は配列番号６３の一方を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号５９−６１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲのうち１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号６４−６６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲのうち１つ、２つ、又は３つ全てを含む。いくつかの実施形態では、本抗体は、本明細書に開示の、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は抗体断片である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号１９、２９、３９、４９、又は５９の１つを含むＣＤＲＨ１を有する。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号２０、３０、４０、５０、又は６０の１つを含むＣＤＲＨ２を有する。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号２１、３１、４２、５２、又は６２の１つを含むＣＤＲＨ３を有する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号２４、３４、４４、５４、又は６４の１つを含むＣＤＲＬ１を有する。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号２５、３５、４５、５５、又は６５の１つを含むＣＤＲＬ２を有する。いくつかの実施形態では、抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、配列番号２６、３６、４６、５６、又は６６の１つを含むＣＤＲＬ３を有する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、改善された性質を有する抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片が提供される。例えば、ＥＲＦＥについて改善された親和性を有する抗ＥＲＦＥ抗体又はその断片は、本明細書に開示の抗体又はその断片の親和性成熟により調製される。
【００６９】
ＣＤＲはエピトープ認識に重要だが、これらは本明細書に開示の抗体又はその断片に必須というわけではない。従って、例えば本明細書に開示の抗体の親和性成熟などにより得られる改善された性質を有する抗体又は断片が提供される。
【００７０】
ＣＤＲの特定のセットを挟む可変領域配列及び定常領域配列内の変異、欠失、及び／又は挿入により、多様な抗体又は抗体断片並びに抗体模倣体が容易に作られ得る。このため、例えば、ＣＤＲのあるセットについて異なる重鎖の置換により異なる種類の抗体が可能であり、これにより、例えば、ＩｇＧ１−４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１−２、ＩｇＤ、ＩｇＥといった抗体タイプ及びアイソタイプが作られ得る。同様に、全長合成フレームワーク内にＣＤＲのあるセットを埋め込むことにより本開示の範囲内に収まる人工抗体も作られ得る。
【００７１】
リサーフェシング及びＣＤＲ移植などのいくつかの手法を用いてヒト化抗体又は他の哺乳類により拒絶されないよう適合された抗体が作られ得る。リサーフェシング手法では、分子モデリング、統計解析、及び変異誘発を組み合わせて、標的宿主の既知の抗体の表面と似るように可変領域の非ＣＤＲ表面を調節する。抗体のリサーフェシングのための戦略及び方法並びに異種宿主内での抗体の免疫原性を減らすための他の方法が、米国特許第５６３９６４１号に開示されている。この文献の内容の全体を参照により本願明細書で援用する。ＣＤＲ移植手法では、マウス重鎖及び軽鎖ＣＤＲが全長ヒトフレームワーク配列内に移植される。
【００７２】
また、本開示は本明細書に開示の抗体の機能的等価物も包含する。機能的等価物は、抗体の結合特性に匹敵する結合特性を有し、例えば、キメラ化抗体、ヒト化抗体、及び単鎖抗体、並びにこれらの断片を含む。こうした機能的等価物の製造方法が、国際公開第９３／２１３１９号、欧州特許出願第２３９４００号、国際公開第８９／０９６２２号、欧州特許出願第３３８７４５号、及び欧州特許出願第３３２４２４号に開示されている。これらの文献の内容の全体を参照により本願明細書で援用する。機能的等価物として、本発明の抗体の可変又は超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドが挙げられる。本明細書で、アミノ酸配列について適用される『実質的に同じ』は、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、ＵＳＡ、８５、２４４４−２４４８（１９８８）に従ってＦＡＳＴＡ検索法により求めたときに、別のアミノ酸配列に対して、少なくとも約９０％の、より好ましくは、少なくとも約９５％の、配列同一性を有する配列として定義される。機能的等価物として、ＥＲＦＥへの結合親和性を維持している、キメラ抗体、単鎖抗体断片、及び他の抗体断片が挙げられる。
【００７３】
また、適切なヌクレオチド変化の抗体ＤＮＡへの導入により又はペプチド合成により調製された抗ＥＲＦＥ抗体のアミノ酸配列バリアントも本開示の範囲内である。こうしたバリアントとして、例えば、本明細書の実施例の抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は、当該残基への挿入、及び／又は、当該残基の置換が挙げられる。最終的なコンストラクトが所望の性質を有するという条件で、当該最終的なコンストラクトを得るために欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせがなされる。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置を変化させるなど、ヒト化抗体又はバリアント抗体の翻訳後プロセスを変更し得る。
【００７４】
変異誘発に好適な位置である抗体の特定の残基又は領域の同定のための有用な方法として、『アラニンスキャニング変異誘発』と呼ばれるものがある。標的残基のある残基又は基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、及びＧｌｕなどの荷電残基）を同定し、これを中性の又は負に帯電したアミノ酸（最も好適にはアラニン又はポリアラニン）で置換し、当該アミノ酸と抗原との相互作用に影響を与える。次に、これらのアミノ酸位置のうち置換に対する機能的感受性を示すものを、さらなるバリアント又は別のバリアントを置換部位に導入する又は置換部位について導入することにより洗練する。そのため、アミノ酸配列変異を導入するための部位は所定の部位であっても、変異の性質自体は必ずしも所定の性質ではない。例えば、ある部位での変異の性能を分析するためには、標的コドン又は標的領域でアラニンスキャニング又はランダム変異誘発を行い、発現抗体バリアントを所望の活性についてスクリーニングを行う。
【００７５】
アミノ酸配列挿入として、１つ又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入のみならず、１残基から百以上の残基を含むポリペプチドにわたる長さのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合が挙げられる。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗ＥＲＦＥ抗体又はエピトープタグに融合された当該抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントとして、抗体の血清半減期を増加させる酵素又はポリペプチドの抗体のＮ末端又はＣ末端への融合が挙げられる。
【００７６】
バリアントの別種として、アミノ酸置換バリアントが挙げられる。これらのバリアントは、抗体分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基が取り除かれ、その場所に別の残基が挿入されている。置換変異誘発への関心が最も高い部位として、超可変領域が挙げられるが、ＦＲ変化も考えられる。保存的置換を表１で『好適な置換』の見出しの下に示す。前述の置換が生物学的活性の変化をもたらす場合、表１で『例示的置換』と呼称するような又はアミノ酸の種類を参照して以下でさらに記載するような、より実質的な変化が導入され得、そして、産物がスクリーニングされ得る。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
（ａ）置換区域のポリペプチド骨格の構造を、例えば、シート又はヘリカル立体構造として維持する効果、（ｂ）標的部位での分子の電荷又は疎水性を維持する効果、又は（ｃ）側鎖のかさ高さを維持する効果が著しく異なる置換を選択することにより、抗体の生物学的性質の実質的な修飾が実現される。天然残基は共通する側鎖性質に基づき以下のように分類される。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ
（２）中性、親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ
（４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｉｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ
（５）鎖配向に影響する残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ
（６）芳香性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ
【００７９】
非保存置換はこれらの種類のうち１つのメンバーを別の種類に交換することを伴うものである。
【００８０】
また、抗ＥＲＦＥ抗体の適切な立体構造の維持に関与していない何れのシステイン残基も置換されてよく、通常は、セリンと置換され、分子の酸化安定性を改善し、異常交差を防止する。反対に、抗体の安定性を改善するために（特に、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）システイン結合が抗体に追加されてもよい。
【００８１】
置換バリアントの別種として、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の超可変領域残基の１つ以上の置換が挙げられる。一般的に、結果として生じたバリアントのうちさらなる開発のために選択されるものは、それらを作る元となった親抗体に対して改善された生物学的性質を有するはずである。こうした置換バリアントを作る簡便なやり方として、ファージディスプレイを用いた親和性成熟が挙げられる。簡潔に説明すれば、いくつかの超可変領域部位（例えば、６−７部位）を変異させて、各部位で可能な全てのアミノ酸置換物を作る。こうして作られた抗体バリアントを繊維状ファージ粒子から各粒子内にパッケージされたＭ１３のｇｅｎｅ  ＩＩＩＩ  産物との融合物として一価の様式でディスプレイさせる。次に、ファージにディスプレイさせたバリアントを本明細書で開示したそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、抗原結合に顕著に寄与する同定済み超可変領域残基への、アラニンスキャニング変異誘発を行ってもよい。この代わりに又はこれに加えて、抗体とヒトＥＲＦＥとの間の接触点を同定するために抗原抗体複合体の結晶構造を解析することも有益かもしれない。こうした接触残基及び隣接残基は本明細書で詳述の手法に従い置換するための候補である。いったんこうしたバリアントが作られると、バリアントのパネルを本明細書に開示のようなスクリーニングに掛け、１種以上の関連アッセイでの優れた性質を有する抗体をさらなる開発のために選択してもよい。
【００８２】
抗体のアミノ酸バリアントの別種は抗体の本来のグリコシル化パターンを改変させる。改変させるとは、抗体でみられる炭水化物部分の１つ以上を削除すること、及び／又は、抗体に存在しないグリコシル化部位の１つ以上を付加することを意味する。
【００８３】
抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ−結合型又はＯ−結合型である。Ｎ−結合型は、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の連結を指す。アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（ただし、Ｘはプロリンを除く任意のアミノ酸）というトリペプチド配列が、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的連結のための認識配列である。そのため、あるポリペプチド中でのこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位をなす。Ｏ−結合型グリコシル化は、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリシンも用いられ得るものの、ヒドロキシアミノ酸、より一般的には、セリン又はスレオニンへの、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースといった糖類の１つの連結を指す。
【００８４】
抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列が上述のトリペプチド配列の１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変することにより、適宜に実現できる（Ｎ−結合型グリコシル化部位の場合）。また、改変は、本来の抗体の配列への１つ以上のセリン又はスレオニン残基の付加又は当該残基での置換により行ってもよい（Ｏ−結合型グリコシル化部位の場合）。
【００８５】
抗ＥＲＦＥ抗体のアミノ酸配列バリアントをコードする核酸分子は、本技術分野で既知のさまざまな方法により調製される。こうした方法として、これらに限定されるわけではないものの、天然ソース（天然アミノ酸配列バリアントの場合）からの又はオリゴヌクレオチド介在（又は部位指向性）変異誘発による調製物からの単離、ＰＣＲ変異誘発、及び先に調製した、抗ＥＲＦＥ抗体のバリアント又は当該抗体の非バリアント型のカセット変異誘発が挙げられる。
【００８６】
抗ＥＲＦＥ抗体の他の修飾も考えられる。例えば、疾患の治療の際の抗体の効率を増強するなどのために、エフェクター機能に関して抗体を修飾することも望ましいかもしれない。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入することにより、当該領域での鎖間ジスルフィド結合形成を可能としてもよい。
【００８７】
本明細書に開示の抗体は、組み換え手段により生産されてもよい。そのため、抗体をコードする核酸、抗体をコードする核酸を含む発現ベクター、及び抗体をコードする核酸を含む細胞が、本明細書に開示される。組み換え生産法は、本技術水準で広く知られており、原核細胞及び真核細胞でのタンパク質発現と、その後の抗体単離と、通常では、薬学的に許容可能な純度までの精製とを含む。宿主細胞での上述の抗体の発現については、抗体配列をコードする核酸が標準法により発現ベクターに挿入される。発現は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＰＥＲ  Ｃ６細胞、イースト、又は大腸菌細胞などの適切な原核又は真核の宿主細胞内で行われ、抗体は当該細胞（上清又は溶解後細胞）から回収される。
【００８８】
従って、本明細書に開示のある実施形態は、抗ＥＲＦＥ抗体を調整する方法であって、ａ）当該抗体をコードする核酸分子を含む少なくとも１つの発現ベクターで宿主細胞を形質転換する工程、ｂ）抗体分子の合成を可能とする条件下で宿主細胞を培養する工程、及びｃ）培養物から当該抗体分子を回収する工程を含む、方法を含む。
【００８９】
抗体は、例えば、プロテインＡ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、アフィニティークロマトグラフィーなどの、従来の免疫グロブリン精製手法により、培養培地から好適には分離される。
【００９０】
本明細書では、『細胞』、『細胞株』、及び『細胞培養物』という用語は、互換的に用いられ、これらの表記のすべてが子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）を含む。そのため、『形質転換体』及び『形質転換細胞』という語は、初代対象細胞及び継代数によらずそれに由来する培養物を含む。また、意図的な又は非意図的な変異により、すべての子孫がＤＮＡコンテントについて正確に同じというわけでなくともよいことを理解されたい。最初に形質転換した細胞でスクリーニングされたのと同じ機能又は生物化学的活性を有するバリアント子孫が含まれる。異なる表記同士が意図的に用いられる箇所については文脈から明らかだろう。
【００９１】
本明細書では、『形質転換』という用語は、宿主細胞内にベクター／核酸を導入する工程のことを指す。厄介な細胞壁障壁のない細胞が宿主細胞として用いられる場合、トランスフェクションは、例えば、リン酸カルシウム沈殿法により、実行できる。しかし、ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法（核注入又は原形質融合など）を用いてもよい。原核細胞又は実質的な細胞壁構築物を含む細胞が用いられる場合、例えば、トランスフェクションの方法のひとつとして、塩化カルシウムを用いたカルシウム処理が挙げられる。
【００９２】
本明細書では、『発現』とは、核酸がｍＲＮＡに転写される工程、及び／又は、転写されたｍＲＮＡ（転写産物ともいう）が、次に、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳される工程を指す。転写産物及びコードされたポリペプチドは集合的に遺伝子産物と呼ばれる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞での発現はｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【００９３】
『ベクター』は、挿入核酸分子を宿主細胞内に導入する及び／又は当該宿主細胞間で移送する核酸分子、特に、自己複製性核酸分子である。この用語は、細胞へのＤＮＡ又はＲＮＡの挿入（例えば、染色体への組み込み）に主に機能するベクター、ＤＮＡ又はＲＮＡの複製に主に機能するベクター複製、及び、ＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳に機能する発現ベクターを含む。また、前述の機能の２つ以上をもたらすベクターも含まれる。
【００９４】
『発現ベクター』は、適切な宿主細胞に導入された際にあるポリペプチドに転写及び翻訳され得るポリヌクレオチドである。『発現系』は、通常、所望の発現産物を生産するために機能し得る発現ベクターを含んでなる適切な宿主細胞を指す。
【００９５】
本明細書では、『宿主細胞』という用語は、本明細書に開示の抗体を生成するように改変できる任意の種類の細胞系を意味する。一実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞及びＣＨＯ細胞が宿主細胞として用いられる。
【００９６】
原核生物に適した制御配列は、例えば、プロモーターと、随意にオペレーター配列と、リボソーム結合部位とを含む。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、及びポリアデニル化シグナルを用いることが知られている。
【００９７】
核酸が他の核酸配列と機能的関連をもって配置される場合に、当該核酸は『動作可能に結合』されている。例えば、前駆配列又は分泌リーダー用のＤＮＡがあるポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、当該ＤＮＡは当該ポリペプチド用のＤＮＡに動作可能に結合されているといえ、プロモーター又はエンハンサーがコード配列の転写に影響する場合、当該プロモーター又はエンハンサーは当該配列に動作可能に結合されているといえ、また、リボソーム結合部位が翻訳を促進するように配置されている場合、当該リボソーム結合部位はコード配列に動作可能に結合されているといえる。一般的に、『動作可能に結合』とは、結合されるＤＮＡ配列同士が、連続していること、特に、分泌リーダーの場合、連続しており且つ読み枠内にあることを意味する。ただし、複数のエンハンサーは必ずしも連続している必要はない。同様に、いくつかの場合、動作可能に結合される核酸配列の間にイントロンが存在してもよい。結合は、都合の良い制限酵素認識部位でのライゲーションにより実行される。こうした部位が存在しない場合は、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが従来のやり方で用いられる。
【００９８】
また、抗ＥＲＦＥ抗体をコードする単離核酸、当該核酸を含むベクター及び宿主細胞、並びに、当該抗体の産生のための組み換え手法も、本明細書に開示される。
【００９９】
抗体の組み換え産生のため、当該抗体をコードする核酸を単離してさらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現のための複製可能ベクターに挿入してもよい。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、米国特許第５，２０４，２４４号に開示のような、相同組み換えにより産生されてもよい。特に、抗体産生について当該文献のすべての内容を参照により本明細書で援用する。抗体をコードするＤＮＡは、従来手法を用いて（例えば、当該抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）、容易に単離・配列同定される。さまざまなベクターが利用可能である。ベクター成分として、これらに限定されるわけではないが、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終了配列、の１つ以上、例えば、米国特許第５，５３４，６１５号に記載のもの、が挙げられる。タンパク質発現について当該文献のすべての内容を参照により本明細書で援用する。
【０１００】
本明細書に開示のベクター内のＤＮＡをクローニング又は発現させるために適した宿主細胞として、上述の、原核生物、イースト、又は、より高度な真核細胞が挙げられる。当該目的に適した原核生物として、グラム陰性菌又はグラム陽性菌などの真正細菌、例えば、腸内細菌科（大腸菌属（例えば、大腸菌）、エンテロバクター属、エルウィニア属、クレブシエラ属、プロテウス属、サルモネラ属（例えば、ネズミチフス菌）、セラチア属（例えば、セラチア菌）、及び、赤痢菌属など）、並びに、バシラス綱（枯草菌及びバシラス・リケニフォルミスなど）、シュードモナス属（緑膿菌など）、及び、ストレプトマイセス属が挙げられる。大腸菌クローン宿主の一例として、Ｅ．ｃｏｌｉ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）が挙げられるが、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）、及びＥ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ２７，３２５）等の他の菌株も適している。ただし、これらは例示を目的とするものであり、これらに限定することを意図するわけではない。
【０１０１】
原核生物に加えて、糸状菌又はイーストなどの真核微生物も、抗ＥＲＦＥ抗体コードベクターの適切なクローニング又は発現ベクターである。低級真核宿主微生物のなかで、サッカロマイセス・セレビシエ又は一般的なパン酵母が、最も一般的に用いられている。しかし、数々の他の属、種、及び株が、一般的に利用可能であり、本明細書でも役に立つ。例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ、クルイウェロマイセス属宿主（例えば、Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ｗｉｃｋｅｒａｍｉｉ（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ｗａｌｔｉｉ（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｒｕｍ（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、及びＫ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなど）、ヤロウィア属（ＥＰ４０２，２２６）、ピキア・パストリス（ＥＰ１８３，０７０）、カンジダ属、トリコデルマ・リーシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）（ＥＰ２４４，２３４）、ニューロスポラ・クラッサ、シュワンニオマイセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）（Ｓ．ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓなど）、並びに、糸状菌（例えば、アカパンカビ属、ペニシリウム属、トリポクラジウム属など）、アスペルギルス属宿主（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ及びＡ．ｎｉｇｅｒなど）が挙げられる。
【０１０２】
グリコシル化抗ＥＲＦＥ抗体の発現に適した宿主細胞として、多細胞生物由来のものがあり、植物細胞及び昆虫細胞などの非脊椎動物細胞が挙げられる。数多くのバキュロウイルス株及び変異株、並びに、宿主（ツマジロクサヨトウ（芋虫）、ネッタイシマカ（蚊）、ヒトスジシマカ（蚊）、キイロショウジョウバエ（フルーツフライ）、及びカイコなど）由来の対応する許容可能な昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクション用のさまざまなウイルス株が公知であり、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ−１変異株、及び、カイコＮＰＶのＢｍ−５株が挙げられ、こうしたウイルスは、本発明に係る本明細書に開示のウイルスとして、特に、ツマジロクサヨトウ細胞のトランスフェクションのために、用いることができる。綿、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマト、及びタバコの植物細胞培養物も宿主として利用できる。
【０１０３】
しかし、脊椎動物細胞が最も注目されてきており、培養中での脊椎動物細胞の増殖（組織培養）はルーチンの手法となっている。有用な哺乳類宿主細胞株の例として、ＳＶ４０で形質転換されているモンキー腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）、ヒト胚性腎臓細胞株（２９３、又は、懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ）、マウスセルトリ細胞（ＴＭ４）、モンキー腎臓細胞（ＣＶ１、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸がん細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）、マウス乳腺腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲＩ細胞、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝臓がん株（Ｈｅｐ  Ｇ２）が挙げられる。
【０１０４】
宿主細胞は、抗ＥＲＦＥ抗体産生用の上述の発現ベクターで形質転換され、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適宜に修正された従来の栄養培地で培養される。
【０１０５】
抗ＥＲＦＥ抗体の産生に用いられる宿主細胞は様々な培地で培養され得る。当該宿主細胞の培養には、ハムＦ１０、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ−１６４０、及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）などの市販の培地が適している。さらに、当該宿主細胞用の培養培地として、米国特許第４，７６７，７０４号明細書、米国特許第４，６５７，８６６号明細書、米国特許第４，９２７，７６２号明細書、米国特許第４，５６０，６５５号明細書、米国特許第５，１２２，４６９号明細書、国際出願公開第９０／０３４３０号明細書、国際出願公開第８７／００１９５号明細書、又は米国再発行特許第３０，９８５号明細書を用いてもよい。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩類（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びフォスフェートなど）、緩衝剤（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）など）、微量元素（通常マイクロモーラー範囲の終濃度で存在する無機化合物として定義される）、及び、グルコース又は等価なエネルギー源を補ってもよい。また、他の任意の必要な補充物を当業者に既知の適切な濃度で含有させてもよい。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞でこれまでに用いられていた条件なので、当業者には明らかだろう。
【０１０６】
組み換え手法を用いる場合、抗体は、細胞内で、ペリプラズム内で、又は、直接培地に分泌される形で、産生され得る。抗体が細胞内で産生される場合、最初の工程として、粒子状残渣である宿主細胞又は溶解断片のいずれかが、例えば、遠心分離又は限外濾過により、除去される。
【０１０７】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製でき、アフィニティークロマトグラフィーが好適な精製手法である。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種類及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体を精製するために用いることができる。マウスアイソタイプのすべて及びヒトγ３については、プロテインＧが推奨される。アフィニティーリガンドが付着させられるマトリックスは、殆どの場合、アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。細孔制御ガラス又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるよりも、速い流速及び短い処理時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂が精製に役立つ。また、回収対象の抗体に応じて、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、ヘパリン−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）上でのクロマトグラフィー、アニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのクロマトグラフィー、クロマト分画、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び、硫酸アンモニウム沈殿などの、他のタンパク質精製手法も、利用可能である。
【０１０８】
いずれの予備的精製工程の後も、興味のある抗体と混入物質とを含む混合物を、約２．５−４．５の間のｐＨで溶出緩衝液を用いた、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０−０．２５Ｍ塩）で行われる、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに掛けてもよい。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、サンプル中のＥＲＦＥタンパク質又はポリペプチドの存在を検出するための、及び／又は、その量を測定するためのアッセイであって、本開示のＥＲＦＥタンパク質又はポリペプチドに対する抗体にサンプルを接触させ、その後、結合抗体の存在を検出し、及び／又は、その量を測定することを含むアッセイが、本明細書に開示される。
【０１１０】
本明細書では、『サンプル』という用語は、ＥＲＦＥアッセイが望まれるＥＲＦＥを含有する可能性のある任意のものを指す。サンプルは、体液又は生物組織などの生物学的サンプルであってもよい。体液の例としては、血液、血清、血漿、唾液、痰、眼の水晶体液、汗、尿、乳、腹水、粘液、滑液、腹腔液、経皮滲出液、咽頭浸出液、気管支肺胞洗浄、気管吸引、脳脊髄液、精液、頸管粘液、膣又は子宮分泌物、羊水などが挙げられる。生体組織は、細胞の凝集物、通常は、ヒト又は動物の構造的材料の１つを形成する特定の種類の細胞とそれらの細胞間質とを含む凝集物であり、結合組織、上皮組織、筋肉組織、及び神経組織などが挙げられる。サンプルは、ソースから直接に得て用いてもよいし、その特性を修飾するための前処理の後に得て用いてもよい。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、アッセイは免疫アッセイである。例示的且つ非限定的な免疫アッセイとして、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。別の実施形態では、免疫アッセイは免疫組織化学的アッセイである。免疫アッセイは、検体、タンパク質などの基質を、当該基質への抗体の特異性を用いて、測定する。
【０１１２】
一実施形態では、ＥＬＩＳＡはサンドイッチＥＬＩＳＡである。こうしたアッセイでは、基質に特異的な捕捉抗体はマイクロタイタープレートなどの固体支持体に結び付けられている。基質を含有する液体（若しくは基質を含有すると疑われる液体、又は、基質を含まないことを決定する必要があるサンプル）は、捕捉抗体に結合するに任される。その後、捕捉抗体に結合した基質の検出を可能とするために、当該基質にやはり特異的な検出抗体が添加される。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、アッセイは免疫組織化学的アッセイである。免疫組織化学は、生物組織において抗体が抗原に特異的に結合するという原理を利用した組織切片で抗原（タンパク質）を選択的に画像化する処理を含む。抗体抗原相互作用の可視化は種々の方法で実現できる。最も一般的なやり方では、抗体が結合する基質の検出を可能とする検出抗体が用いられる。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、検出抗体は標識抗体である。標識として、放射性標識、酵素標識、比色標識（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ  ｌａｂｅｌ）、蛍光標識、化学発光標識、又は、当業者に既知の他の標識を挙げることができる。いくつかの実施形態では、標識はビオチンである。標識がビオチンである場合、アビジン又はストレプトアビジンを含む二次検出剤が、酵素、放射性同位体、比色剤、又は他の剤にコンジュゲートされる必要がある。一実施形態では、二次検出剤はストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼである。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、標識は、ペルオキシダーゼ（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）、ガラクトシダーゼ（例えば、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ）、又はホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）などの、酵素標識である。酵素標識の場合、分光光度法で測定される、色、蛍光、又は発光を生じさせるために、当該酵素により切断される基質が必要とされる。ペルオキシダーゼ用の比色基質の例として、これらに限定されるわけではないが、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、３，３’，４，４’  ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、４−クロロ−１−ナフトール（４ＣＮ）、２，２’−アジノ−ジ［３−エチルベンズチアゾリン］スルホネート（ＡＢＴＳ）、及びｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、アッセイがＥＬＩＳＡである場合、基質は、６５０ｎｍの波長で測定される青色を生じさせるＴＭＢである。反応を、酸又は他の停止試薬の添加で止めることができる。硫酸停止試薬を用いることでＴＭＢを黄色にでき、そして、この色は４５０ｎｍで読み取ることができる。ホスファターゼ用の比色基質の例として、これらに限定されるわけではないが、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）及びｐ−ニトロフェニルホスフェート（ｐ−ＮＰＰ）が挙げられる。ガラクトシダーゼ用の比色基質の例として、これらに限定されるわけではないが、５−ドデカノイルアミノフルオレセイン  ジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｃ１２ＦＤＧ）、９Ｈ−（１，３−ジクロロ−９，９−ジメチルアクリジン−２−オン−７−イル）、及びβ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＤＤＡＯガラクトシド）が挙げられる。蛍光基質の例として、これらに限定されるわけではないが、４−メチルウンベリフェリルホスフェート（４−ＭＵＰ、ホスファターゼ用）及び４−メチルウンベリフェリルガラクトシド（ＭＵＧ、ガラクトシダーゼ用）、フルオレセイン  ジ−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＦＤＧ、ガラクトシダーゼ用）、ヒドロキシフェニル酢酸（ＨＰＡ、ペルオキシダーゼ用）、及び３−ｐ−ヒドロキシフェニルプロピオン酸（ＨＰＰＡ、ペルオキシダーゼ用）が挙げられる。発光基質の例として、これらに限定されるわけではないが、ペルオキシダーゼ用には、ルミノール、ポリフェノール（例えば、ピロガロール、ププロガリン（ｐｕｐｕｒｏｇａｌｌｉｎ）、没食子酸、及びウンベリフェロン）、及びアクリジンエステルが、ホスファターゼ用には、３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メチル−４−（３’−ホスホリルオキシフェニル−１，  ２−ジオキセタン（ＡＭＰＰＤ）二ナトリウム塩が、ガラクトシダーゼ用には、（３−（２’−スピロアダマンタン）−４−メトキシ−４−（３’−β−Ｄ−ガラクトピラノシルオキシフェニル−１，２−ジオキセタン（ＡＭＰＧＤ）が挙げられる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、標識はセイヨウワサビペルオキシダーゼであり、基質はＴＭＢである。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、標識は、比色標識、蛍光標識、又は発光標識である。比色標識の例として、これに限定されるわけではないが、ナノ粒子状金が挙げられる。蛍光標識の例として、これらに限定されるわけではないが、エチジウムブロマイド、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、緑色蛍光タンパク質、テキサスレッド、カスケードブルー、オレゴングリーン、マリーナブルー、ＡＴＴＯ標識、ＣＦ（商標）染料、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ、及びシアニン染料が挙げられる。発光標識の例として、これらに限定されるわけではないが、ルシフェリン及びホタルルシフェラーゼが挙げられる。
【０１１８】
捕捉抗体及び検出抗体として用いるのに適した抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、多くの種に由来し得る。抗体の種の例として、ヒト、ウサギ、マウス、ラット、ラクダ科動物、リャマ、ニワトリなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、捕捉抗体及び検出抗体は、ともに、マウスモノクローナル抗体である。別の実施形態では、捕捉抗体及び検出抗体は、ウサギのモノクローナル又はポリクローナル抗体である。また、捕捉抗体及び検出抗体が異なる種のものである又は一方がポリクローナル抗体であり他方がモノクローナル抗体であるアッセイも、本開示の範囲内である。
【０１１９】
ポリペプチド配列についての『アミノ酸配列同一性百分率（％）』は、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せずに、基準ポリペプチド配列と候補配列とをアラインし、ギャップを、必要であれば、最大の配列同一性百分率をもたらすように、導入した後での、基準ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列内のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性百分率を求めるためのアラインメントは、本技術分野内にあるさまざまな方法で実現でき、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを用いて実現できる。当業者であれば、比較する配列の全長にわたり最大アラインメントをもたらすのに必要とされる任意のアルゴリズムをはじめとする、配列をアラインするための適切なパラメータを求めることができる。
【０１２０】
また、ヘプシジン関連障害、鉄恒常性疾患、ＥＲＦＥに関連する障害、及び／又は、マイオネクチンに関連する障害を診断又は監視するために抗体を用いる方法も開示する。
【０１２１】
本明細書では、『ヘプシジンに関連する障害』という言葉は、鉄恒常性（ホメオスタシス）を破綻させる異常レベルのヘプシジン（例えば、貯蔵鉄分又は貧血の程度に関連するヘプシジン過剰又はヘプシジン欠乏）により引き起こされる又はそれと関連する症状を指す。鉄恒常性の破綻は次いで貧血などの二次疾患を招き得る。急性又は慢性の炎症症状はヘプシジン発現の上方調節を招き得、これは減少された循環鉄レベルを招き得、これは貧血を引き起こしたり発症済みの貧血の悪化を引き起こしたりし得る。ヘプシジンに関連する疾患の例として、がんに伴う貧血、慢性疾患に伴う貧血、炎症に伴う貧血、化学療法誘発貧血、慢性腎臓病（ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、又はＶ）、末期腎臓病、慢性腎不全鬱血性心不全、がん、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、クローン病、ピロリ菌感染症又は他の細菌の感染症、Ｃ型肝炎、ＨＩＶ、及び他のウィルス性疾患、動脈硬化、アテローム性動脈硬化、肝硬変、膵炎、敗血症、血管炎、鉄欠乏、低色素性小球性貧血、鎌状赤血球病、及びヘプシジン過剰を伴う症状が挙げられる。
【０１２２】
本明細書では、『鉄恒常性疾患（又は障害』という言葉は、対象の鉄レベルが調節を必要とする症状を指す。これは、ヘプシジン関連障害や、ヘプシジンレベルの上昇を伴わないものの、ヘプシジンにより引き起こされたのではない鉄恒常性の破綻などのヘプシジン活性の阻害から恩恵を受けるだろう症状や、鉄の異常な吸収、回収、代謝、又は分泌が、鉄の正常な血液レベル又は組織分布の破綻を引き起こす疾患や、鉄異常調節が、炎症、がん、又は化学療法などの他の疾患又は症状の結果である疾患や、鉄の異常な血液レベル又は組織分布から生じる疾患又は障害や、鉄レベル又は分布を調節することで治療できる疾患又は障害を含む。こうした、鉄恒常性疾患又は障害、ヘプシジン関連障害、及びヘプシジン過剰をもたらし得る炎症症状の非限定的な例として、アフリカ鉄過負荷、鉄難治性鉄欠乏性貧血（ＩＲＩＤＡ）、アルファサラセミア、アルツハイマー病、貧血、がんに伴う貧血、慢性疾患に伴う貧血、炎症に伴う貧血、動脈硬化又はアテローム性動脈硬化症（冠動脈疾患、脳血管疾患、又は末梢閉塞性動脈疾患等）、運動失調、鉄に関連した運動失調、無トランスフェリン血症、がん、セルロプラスミン欠乏症、化学療法誘発貧血、末期腎疾患又は慢性腎不全を含む慢性腎疾患（ステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、又はＶ）、急性腎障害（ＡＫＩ）、心肺バイパス関連ＡＫＩ、薬物又は毒素に関連するＡＫＩ、肝硬変、古典的なヘモクロマトーシス、コラーゲン誘発性関節炎（ＣＩＡ）、ヘプシジン過剰（ヘプシジン上昇）を伴う症状、先天性赤血球生成貧血、うっ血性心不全、クローン病、セリアック病、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、糖尿病、鉄の体内分布の障害、鉄恒常性障害、鉄代謝障害、フェロポーチン病、フェロポーチン変異ヘモクロマトーシス、葉酸欠乏症、フリードリヒ運動失調、索状骨髄症、グラシル症候群、ピロリ菌感染症又は他の細菌感染症、遺伝性ヘモクロマトーシス、後天性ヘモクロマトーシス、トランスフェリン受容体２の変異に起因するヘモクロマトーシス、ヘモグロビン症、肝炎、肝炎（ブロック）、Ｃ型肝炎、肝細胞癌、ＨＩＶ又は他のウイルス性疾患、ハンチントン病、高フェリチン血症、低色素性小球性貧血、低鉄血症、インスリン抵抗性、鉄欠乏性貧血、鉄欠乏、鉄過剰、ヘプシジン過剰を伴う鉄欠乏症状、若年性ヘモクロマトーシス（ＨＦＥ２）、多発性硬化症、トランスフェリン受容体２、ＨＦＥ、ヘモジュベリン、フェロポーチン、又は他の鉄代謝遺伝子の変異、新生児ヘモクロマトーシス、鉄に関連する神経変性疾患、骨減少症、骨粗鬆症膵炎、パントテン酸キナーゼ関連神経変性、パーキンソン病、ペラグラ、異食症、ポルフィリン症、晩発性皮膚ポルフィリン症、偽脳炎、肺ヘモジデローシス、赤血球障害、関節リウマチ、敗血症、鉄芽球性貧血、全身性エリテマトーデス、サラセミア、サラセミアインターメディア、輸血鉄過負荷、腫瘍、血管炎、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症、及び／又は、ウィルソン病が挙げられる。
【０１２３】
鉄調節の破綻にかかる非炎症性症状として、これらに限定されるわけではないが、ビタミンＢ６欠乏症、ビタミンＢ１２欠乏症、葉酸欠乏症、ペラグラ、索状脊髄症、偽脳炎、パーキンソン病、アルツハイマー病、冠状動脈性心臓病、骨減少症、骨粗鬆症、異常血色素症、及び赤血球代謝障害、並びに、末梢動脈閉塞性疾患が挙げられる。
【０１２４】
本明細書では、『ＥＲＦＥに関連する疾患（又は障害）』という言葉は、異常レベルのＥＲＦＥ（例えば、ＥＲＦＥ過剰又はＥＲＦＥ欠乏）により引き起こされる又はそれと関連する症状を指す。ＥＲＦＥに関連する疾患の例として、これらに限定されるわけではないものの、サラセミア、鎌状赤血球病、鉄ヘモスタシス疾患又は障害、及びヘプシジン関連障害が挙げられる。
【０１２５】
サラセミアは、異常ヘモグロビン産生を特徴とする遺伝性血液障害である。症状は、種類に依存し、無症状から重篤症状まで異なり得る。αサラセミアとβサラセミアの２つの主要な種類が存在する。α及びβサラセミアの重篤度は、αグロビンについての４種類の遺伝子又はβグロビンについての２種類の遺伝子のうちいくつが欠けているかに依存する。変異アレルは、部分的な機能が保存されている場合（そのタンパク質が、減弱された機能を有するか、正常に機能するものの減少した量で産生されるかする場合）、β＋と呼ばれ、機能的タンパク質が産生されない場合、β０と呼ばれる。
【０１２６】
本明細書では、『マイオネクチンに関連する疾患（又は障害）』という言葉は、異常レベルのマイオネクチン（例えば、マイオネクチン過剰又はマイオネクチン欠乏）により引き起こされる又はそれと関連する症状を指す。マイオネクチンに関連する疾患の例として、これらに限定されるわけではないものの、鉄ヘモスタシス疾患又は障害、ヘプシジン関連障害、心血管疾患又は障害、糖尿病、肥満、及びインスリン抵抗性が挙げられる。
【０１２７】
本明細書では、『対象』又は『患者』又は『個体』という用語は、哺乳類を指し、限定されるわけではないが、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマなど）、霊長類（例えば、ヒト、モンキーなどの非ヒト科霊長類）、ウサギ、及び、齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。ある実施形態では、対象はヒトである。
【０１２８】
（実施形態）
・実施形態１
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片であって、
前記ＶＨは、
（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（ｖ）配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含み、
前記ＶＬは、
（ｖｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｘ）配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（ｘ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、
エリスロフェロン（ＥＲＦＥ）結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態２
ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片であって、
前記抗体が
（ｉ）配列番号１９−２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｉ）配列番号２４−２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｉｉ）配列番号２９−３１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｖ）配列番号３４−３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖ）配列番号３９−４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖｉ）配列番号４４−４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖｉｉ）配列番号４９−５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖｉｉｉ）配列番号５４−５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｘ）配列番号５９−６１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｘ）配列番号６４−６６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
を含む、
ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態３
配列番号１８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、実施形態１のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態４
前記ＶＨは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１又は３のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態５
前記ＶＬは配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１又は３のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態６
前記抗体は、配列番号１９−２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号２４−２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、実施形態２のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態７
配列番号２８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、配列番号３３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態８
前記ＶＨは配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１又は７のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態９
前記ＶＬは配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１又は７のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態１０
前記抗体は、配列番号２９−３１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号３４−３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、実施形態２のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態１１
配列番号３８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号４３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、実施形態１のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態１２
前記ＶＨは配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１又は１１のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態１３
前記ＶＬは配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１又は１１のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態１４
前記抗体は、配列番号３９−４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号４４−４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、実施形態２のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態１５
配列番号４８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号５３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、実施形態１のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態１６
前記ＶＨは配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１又は１５のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態１７
前記ＶＬは配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１又は１５のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態１８
前記抗体は、配列番号４９−５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号５４−５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、実施形態２のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態１９
配列番号５８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、配列番号６３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態２０
前記ＶＨは配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１又は１９のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態２１
前記ＶＬは配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、実施形態１又は１９のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態２２
前記抗体は、配列番号５９−６１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号６４−６６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、実施形態２のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態２３
ＶＨ及びＶＬを含み、前記ＶＨは、配列番号１８、２８、３８、４８、又は５８のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬは、配列番号２３、３３、４３、５３、又は６３のアミノ酸配列を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態２４
配列番号１８、２８、３８、４８、又は５８のＶＨ及び配列番号２３、３３、４３、５３、又は６３のＶＬを含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態２５
配列番号１９、２９、３９、４９、又は５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態２６
配列番号２０、３０、４０、５０、又は６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態２７
配列番号２１、３１、４２、５２、又は６２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態２８
配列番号２４、３４、４４、５４、又は６４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態２９
配列番号２５、３５、４５、５５、又は６５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態３０
配列番号２６、３６、４６、５６、又は６６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態３１
前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は抗体断片である、実施形態１から３０のいずれか１つのＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
・実施形態３２
サンプル中のエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）タンパク質の存在を検出するための及び／又はその量を測定するためのアッセイであって、第１の抗体−ＥＲＦＥ複合体を形成するために、前記サンプルを、第１の抗体と接触させることと、その後、前記第１の抗体と第２の抗体とが同一ではないとして、前記第１の抗体−ＥＲＦＥ複合体に結合した前記第２の抗体の存在を検出し及び／又はその量を測定し、これにより、前記サンプル中のＥＲＦＥタンパク質の存在及び／又は量を決定することと、を含む、アッセイ。
・実施形態３３
前記アッセイはＥＬＩＳＡアッセイを含む、実施形態３２のアッセイ。
・実施形態３４
前記サンプルは血清サンプルである、実施形態３２のアッセイ。
・実施形態３５
前記第１の抗体及び前記第２の抗体は、配列番号１及び／又は３−１６の少なくとも１つの配列を含む、当該配列から実質的になる、又は当該配列からなるＥＲＦＥポリペプチドを、特異的に認識する、実施形態３２のアッセイ。
・実施形態３６
前記第１の抗体は、モノクローナル抗体である９Ｂ１２、１７Ａ５、１７Ｅ５、２Ｄ２、４Ｃ１、６Ｈ９、７Ｈ４、９Ｃ７、１４Ｂ２、及び１４Ｄ９、又は、これらのＥＲＦＥ結合断片から選択される、実施形態３２のアッセイ。
・実施形態３７
前記第１の抗体は実施形態１から３１のいずれか１つの抗体から選択される、実施形態３２のアッセイ。
・実施形態３８
前記第１の抗体は４Ｃ１又はそのＥＲＦＥ結合断片である、実施形態３２のアッセイ。
・実施形態３９
前記第１の抗体は固体支持体上にコートされている、実施形態３２から３８のいずれか１つのアッセイ。
・実施形態４０
前記固体支持体はＥＬＩＳＡプレートである、実施形態３９のアッセイ。
・実施形態４１
前記検出工程は、第１の抗体−ＥＲＦＥポリペプチド複合体を標識化された第２の抗体と接触させることを含む、実施形態３２のアッセイ。
・実施形態４２
前記第２の抗体は、９Ｂ１２、１７Ａ５、１７Ｅ５、２Ｄ２、４Ｃ１、６Ｈ９、７Ｈ４、９Ｃ７、１４Ｂ２、及び１４Ｄ９から選択される標識化された検出モノクローナル抗体である、実施形態４１のアッセイ。
・実施形態４３
前記第２の抗体は請求項１から３９のいずれか１項に記載の抗体から選択される標識化された検出抗体である、実施形態４１のアッセイ。
・実施形態４４
前記第２の抗体は２Ｄ２である、実施形態４１のアッセイ。
・実施形態４５
前記標識はビオチンである、実施形態４１のアッセイ。
・実施形態４６
前記標識はセイヨウワサビペルオキシダーゼである、実施形態４１のアッセイ。
・実施形態４７
ＥＲＦＥ又はマイオネクチンに関連する疾患のある対象での赤血球生成を評価する方法であって、前記対象由来のサンプルを実施形態３２から４６のいずれか１つのアッセイに掛けることを含む、方法。
・実施形態４８
前記疾患はサラセミアである、実施形態４７の方法。
・実施形態４９
前記疾患は心血管疾患である、実施形態４７の方法。
・実施形態５０
疾患のある対象での赤血球生成を評価する方法であって、実施形態１から３１のいずれか１つの抗体で前記対象由来のサンプル中のエリスロフェロンを検出することを含む、方法。
・実施形態５１
捕捉抗体及び検出抗体を含み、
ｉ）前記捕捉抗体は１７Ａ５であり、前記検出抗体は、２Ｄ２、４Ｃ１、又は７Ｈ４である、
ｉｉ）前記捕捉抗体は２Ｄ２であり、前記検出抗体は、４Ｃ１、７Ｈ４、１７Ａ５、又は９Ｂ１２である、
ｉｉｉ）前記捕捉抗体は４Ｃ１であり、前記検出抗体は、２Ｄ２、７Ｈ４、１７Ａ５、又は９Ｂ１２である、
ｉｖ）前記捕捉抗体は７Ｈ４であり、前記検出抗体は、２Ｄ２、４Ｃ１、１７Ａ５、又は９Ｂ１２である、
ｖ）前記捕捉抗体は９Ｂ１２であり、前記検出抗体は、２Ｄ２、４Ｃ１、１７Ａ５、又は７Ｈ４である、又は、
ｖｉｉ）前記捕捉抗体及び前記検出抗体は個別に請求項１４から４４のいずれか１項に記載の抗体であり、前記捕捉抗体及び前記検出抗体は同一ではない、
サンドイッチ免疫アッセイ用のキット。
・実施形態５２
前記捕捉抗体及び前記検出抗体は異なる抗体である、実施形態５１のキット。
・実施形態５３
前記捕捉抗体は固体支持体に結び付けられている、実施形態５１又は５２のキット。
・実施形態５４
前記検出抗体は標識に結び付けられている、実施形態５１から５３のいずれか１つのキット。
・実施形態５５
前記標識はビオチンである、実施形態５４のキット。
・実施形態５６
前記標識はセイヨウワサビペルオキシダーゼである、実施形態５４のキット。
・実施形態５７
ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼをさらに含む、実施形態５５のキット。
・実施形態５８
基質をさらに含む、実施形態５１から５７のいずれか１つのキット。
・実施形態５９
前記アッセイを実行するための説明書をさらに含む、実施形態５１から５８のいずれか１つのキット。
【０１２９】
（実施例）
（実施例１：無効赤血球生成の臨床評価のための血清エリスロフェロンに関するモノクローナルサンドイッチＥＬＩＳＡ法）
β−サラセミア並びに他の一般的な遺伝性及び後天性の鉄負荷性貧血の顕著な特徴は、鉄過負荷の存在下で衰弱性貧血をまねく無効赤血球生成（Ｉｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｅｓｉｓ：ＩＥ、血液産生不良）である。最近に発見されたエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）は、赤血球細胞（Ｒｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ：ＲＢＣ）の発生中に産生されるホルモンであり、血漿鉄レベルを調節するマスターホルモンであるヘプシジンの負調節因子であること及びβ−サラセミア患者で大きく上昇することが示されている。
【０１３０】
［ＥＲＦＥ抗原産生及び精製］
培養したＨＥＫ細胞をＦＬＡＧタグ含有クローン化ＥＲＦＥで一過的にトランスフェクトした。トランスフェクト済みＨＥＫ細胞をＥＲＦＥ発現を可能とする条件下で増殖させ、培地上清を集め、抗ＦＬＡＧカラムでの精製に備え溜めた。抗原は抗ＥＲＦＥ  ｍＡｂで認識されたが、収率は低かった。ＥＲＦＥの生産効率を向上させるための高効率ＨＥＫ細胞株及びＧｅｎＳｃｒｉｐｔの独占的なクローニング・ベクター（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）では約５ｍｇ／Ｌの精製ＥＲＦＥが得られた。
【０１３１】
［ＥＲＦＥ  ｍＡｂのプラズモン共鳴評価］
次に、ＥＲＦＥ抗原に結合する抗体の特異性、親和性、及び速度論を求める。このアプローチにより、ＥＲＦＥとの高親和性ｍＡｂを選択すること及びＥＲＦＥサンドイッチＥＬＩＳＡのための捕捉用及び検出用ｍＡｂの最適な組み合わせを選択することが可能となる。すべてのモノクローナル抗体候補の最初のスクリーニングは、ＥＲＦＥをコートした９６ウェルプレートでのＥＬＩＳＡを用いて行われる。プラスチック上への固定化の際にエピトープへの近づきやすさ又はＥＲＦＥ抗原の立体構造が変わることがあるので、ＥＲＦＥ抗原はＥＬＩＳＡプレート上に異なる濃度で固定化される。いずれかのプレートで高力価を有するハイブリドーマ上清を本アッセイに基づいて選択する。表面プラズモン共鳴解析のために、高純度抗体をＢｉａｃｏｒｅセンサーチップ上にコートする。指向性をもった抗体の捕捉を保証するために、Ｆｃ特異的チップ（プロテインＡ／ＧセンサーチップＣＭ５）を用いる。発現させ精製したＥＲＦＥ抗原をある濃度範囲（ｎＭからｍＭ）で注入し、結合相互作用をある緩衝条件範囲で調べた。装置及び緩衝剤によるアーチファクトを補正するために、対照として、ＢＳＡ又は非特異的抗原を同じ条件下で基準表面上に固定化した。解離速度定数（ｋｏｆｆ）及び結合速度定数（ｋｏｎ）並びに他の結合パラメータを製造元が提供するＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン３．２ソフトウェアを用いて求めた。
【０１３２】
また、本実験をチップにＥＲＦＥ抗原をコートしｍＡｂ溶液を注入するという逆の構成でも行う。ＥＲＦＥ抗原は−ＮＨ２基又は−ＣＯＯＨ基を介してチップ上に固定化され、対照として関連タンパク質が用いられる。最後に、抗体の組がＥＲＦＥと相互作用する能力を同定したもののうち有望な候補を用いて試験する。一方の抗体をＦｃチップ上にアンカリングし、ＥＲＦＥを添加し、他方の抗体を当該チップ上方に浮遊させた。最も高い親和性相互作用が得られた抗体の組を選択する。対照は、ＥＲＦＥを他の関連タンパク質又は非関連タンパク質と置換した実験を含む。
【０１３３】
［モノクローナル抗体産生］
９種類のＥＲＦＥ特異的マウスモノクローナルハイブリドーマを限界希釈により同定した。これらは適切な量のＥＲＦＥ特異的ＩｇＧ抗体（約１μｇ  ＩｇＧ／ｍｌ  ＴＣ培地）を分泌する確認済みの能力を有する。各抗体の複数のアリコートを増加させ液体窒素で保存した。
【０１３４】
抗ＥＲＦＥ抗体のサブセットをサンドイッチＥＬＩＳＡによる適切なｍＡｂの組のスクリーニングに続いて同定した。選択したハイブリドーマを、ｍＡｂ産生効率について組織培養フラスコ及び１０−１００ｍｌの中空糸バイオリアクター内で評価し、これらの産生条件がアッセイ性能に影響するかを求めた。
【０１３５】
インビトロ増殖研究のために、ｍＡｂである２Ｄ２及び４Ｃ１を湿潤温度調節ＣＯ２組織培養インキュベーター内に収容した２つのＦｉｂｅｒＣｅｌｌシステム中空糸バイオリアクター（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、メリーランド州）を用いて無血清培地で増殖させた。３０日後に多くのミリグラム量の抗体を得るために、流速を２５−５０ｍｌ／分に調節した。毎日採取したバイオリアクター培地内のｍＡｂを溜め、５ｍｌプロテインＧカラムでアフィニティー精製し、ＨｉＰｒｅｐ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）を用いてＰＢＳに対して脱塩した。９６ウェルのＥＩＡプレートを精製捕捉抗体でオーバーナイトにわたりコートした。これらの捕捉用ｍＡｂのそれぞれをＥＬＩＳＡによる同時結合活性についてビオチンで標識化した各検出用ｍＡｂを用い少量で試験した。
【０１３６】
また、ハイブリドーマ培地組成及び産生方法条件が抗ＥＲＦＥ  ｍＡｂの抗原抗体相互作用に影響するかを確かめるために、拡縮した規模のバイオリアクター産生を評価した。異なる方法又は規模で産生されたｍＡｂの技術的利点を比較した。抗体産生条件はアッセイ性能への僅かな影響を有するかもしれない。
【０１３７】
［ＥＲＦＥ  ｍＡｂコート済みマイクロタイタープレートの生産のための方法及び材料の開発］
９６ウェルマイクロタイタープレートへのｍＡｂの受動的吸収について最適の抗体濃度及び条件を求めるために、最良の性能の抗体のすべてをアフィニティー精製し、チェッカーボード最適化にかけた。温度及び湿度を調節したインキュベーターを用いてマイクロタイタープレートをオーバーナイトにわたり乾燥させ、個別のプレートを１グラムの分子篩乾燥剤を含むメイラーポーチ内に加熱密封し４℃で保存した。
【０１３８】
独占的試薬を用いたＥＲＦＥについての研究的サンドイッチＥＬＩＳＡが開発されてきている。高ｐＨカーボネートコーティングバッファーを用いてｍＡｂの受動的吸収によりプレートをコート及びブロックした。抗体結合についてウェル間のばらつきが最小（ＣＶ５％未満）で信号対雑音比が最大であったＥＲＦＥ捕捉用ｍＡｂの最適の濃度及び希釈を求めるために、異なる製造元から得たいくつかの追加の９６ウェルマイクロタイタープレート形式を試験した。
【０１３９】
［ＥＲＦＥの臨床アッセイの自動化及び検証］
既存のＥＲＦＥ  ｍＡｂに基づくサンドイッチＥＬＩＳＡはベースラインＥＲＦＥ  ＥＬＩＳＡであり、このＥＬＩＳＡにより臨床アッセイを検証する。完全統合型Ｂｅｃｋｍａｎ  ＦＸプラットフォーム上でのアッセイを開発するために、臨床検査室改善法（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ  Ａｍｅｎｄｍｅｎｔｓ：ＣＬＩＡ）及び米国臨床病理医協会（Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ：ＣＡＰ）ガイドラインを用いる。Ｂｅｃｋｍａｎプラットフォームには、ＤＴＸ−８８０検出器、ＢｉｏＴｅｋプレートウォッシャー、及びＣｙｔｏｍａｔ２Ｃ１５インキュベーター、並びに、プレート／チップホテルを取り付ける。現在のところ、サンドイッチＥＬＩＳＡは、それぞれ０．１及び０．１５ｎｇ／ｍｌという優れた検出下限（Ｌｏｗｅｒ  Ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ：ＬＬＯＤ）及び定量下限（Ｌｏｗｅｒ  Ｌｉｍｉｔ  ｏｆ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ：ＬＬＯＱ）を有している。自動化は、研究的ＥＲＦＥサンドイッチＥＬＩＳＡのダイナミックレンジを増加させ、低ｐｇ／ｍｌ又は低ｎｇ／ｍｌ範囲でのＥＲＦＥの一貫性のある測定を可能とするだろう。信号対雑音比のみならずアッセイ間／アッセイ内の変動係数（ＣＶ）も改善される。ＥＲＦＥ試験の感度の変化は自動化Ｂｅｃｋｍａｎ  ＦＸ  ＥＲＦＥ試験におけるより低いＬＬＯＤ／ＬＬＯＱから自ずと明白であった。
【０１４０】
アッセイの開発は、終濃度が０−５０ｎｇ／ｍｌ、０−４０ｎｇ／ｍｌ、０−３０ｎｇ／ｍｌ、０−２０ｎｇ／ｍｌ、又は０−１０ｎｇ／ｍｌの範囲であるＥＲＦＥ抗原から作成した標準曲線から始めた。ｍＡｂに基づく診断装置の所望の特徴の１つは検出下限を改善することであったため、検出線形範囲内に収まる程度にサンプルが希釈されることを保証するように実験は行われた。アッセイの選択性は、無効赤血球生成の疾患がある患者のパネルから得た既知濃度の血清内ＥＲＦＥの添加により調べた。
【０１４１】
健康ヒトボランティア群（ヘモグロビン、フェリチン、血清トランスフェリン受容体、及びＣ反応性タンパク質が正常実験室レベルであり、男女分布は均等）からの２９２名の初回血液ドナーの血清サンプルのパネルを用い、自動化ＦＸ  ＥＲＦＥ試験の基準範囲を定めた。アッセイ内の精度を、血清サンプルを同日に反復して（ｎ＝６）測定し変動係数（ＣＶ）を求めることにより試験した。アッセイ間の再現性を、少なくとも２名の技師が異なる３日にアッセイを行いＣＶのミーン及びメジアンを計算することにより求めた。アッセイ検証研究で必要とされる厳密な品質管理基準の厳守を保証するために、バッチ内及びバッチ間のアッセイのばらつきを、同じバッチ又は異なるバッチの試薬から製造したプレートで実験を繰り返すことにより調べた。
【０１４２】
（実施例２：組み換えヒトエリスロフェロン抗原の作成）
ヒトＥＲＦＥの発見に続き、プロトタイプのサンドイッチＥＬＩＳＡに必要なモノクローナル抗体の開発を進めた。ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、ヒトＥＲＦＥ又はＦＬＡＧタグ付加ＥＲＦＥのいずれかでトランスフェクトし、５％ＣＯ２雰囲気、３７℃で、７２時間にわたり培養し、上清を採取し、プロテインＧアガロースビーズに固定化された抗ヒトＥＲＦＥポリクローナル抗体（ヒトＥＲＦＥの場合）又は抗ＦＬＡＧ  Ｍ２  アフィニティークロマトグラフィー（ＦＬＡＧタグ付加ＥＲＦＥの場合）により抗原を精製した。抗原の活性及び純度をＥＬＩＳＡ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動、及びウェスタンン・ブロットで確かめ、タンパク質濃度をビシンコニン酸タンパク質アッセイ（ＢＣＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォール、イリノイ州）を用いて求め、アリコートを−８０℃で凍結させた。予備的研究では、収率が悪く、組織培養上清１リットル当たり０．２−０．３ｍｇの範囲の組み換えＥＲＦＥ抗原しか得られないことが示された。この抗原は抗ＥＲＦＥ  ｍＡｂで認識されたものの、収率は低かった。ＥＲＦＥ作成のために、高効率ＨＥＫ細胞株とヒトＥＲＦＥ又はＦＬＡＧタグ付加ＥＲＦＥを含むＧｅｎＳｃｒｉｐｔの独占的なクローニング・ベクター（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）とを用いた。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの発現試薬及び方法では、約５ｍｇ／Ｌの精製ＥＲＦＥが得られた。この発現の取り組みにより、約７０％の純度で１ｍｇの総タンパク質量が得られた。
【０１４３】
（実施例３：モノクローナル抗体及びハイブリドーマの作成）
メスのＢＡＬＢ／ｃマウス（ｎ＝５匹、６−８週齢）を、複数の皮下部位での組み換えヒトエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）の繰り返し注射により免疫化した。血清力価を４週間隔で監視し、免疫化に強い応答を示したマウスをそれぞれ選択し、リンパ節及び脾臓のプールを用いて融合を行った。合計で４回の融合を行い、各融合につき１２枚の９６ウェルプレートに播種し、プレートを、５％ＣＯ２雰囲気、３７℃で、４日間にわたりインキュベートして、スクリーニングに利用可能なおよそ４６００個の生きたハイブリドーマコロニーを得た。
【０１４４】
９６ウェルマイクロプレートに組み換え抗体をコートし、ハイブリドーマ組織培養上清１００μｌを各ウェルに加えることにより、ヒトＥＲＦＥ特異的抗体を分泌するハイブリドーマを同定し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ鎖抗体の添加によりＥＲＦＥ特異的抗体の存在を検出した。ＴＭＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）の添加後、反応を１５分間にわたり進め０．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４で止めてから、吸光度（４５０ｎｍ）を測定した。合計で１０種類のヒトＥＲＦＥ特異的ＩｇＧハイブリドーマを同定した（ヒット率０．０２２％、９Ｂ１２、１７Ａ５、１７Ｅ５、２Ｄ２、４Ｃ１、６Ｈ９、７Ｈ４、９Ｃ７、１４Ｂ２、及び１４Ｄ９）。アイソタイプ分析から、これらのＥＲＦＥ特異的ハイブリドーマの９種類（９Ｂ１２、１７Ａ５、１７Ｅ５、４Ｃ１、６Ｈ９、７Ｈ４、９Ｃ７、１４Ｂ２、及び１４Ｄ９）がＩｇＧ１であり、１種類（２Ｄ２）がＩｇＧ２ａであることが明らかとなった。すべてのハイブリドーマを限界希釈によりサブクローン化し、それらのアイソタイプを再確認し、それぞれの複数のアリコートを液体窒素中で凍結させた。
【０１４５】
同定したハイブリドーマは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションの特許用寄託に以下のアクセッション番号で寄託された。
９Ｂ１２：ＰＴＡ−１２３８８２
１７Ａ５：ＰＴＡ−１２３８８３
２Ｄ２  ：ＰＴＡ−１２３８７９
４Ｃ１  ：ＰＴＡ−１２３８８０
７Ｈ４  ：ＰＴＡ−１２３８８１
【０１４６】
そして、ハイブリドーマ９Ｂ１２、１７Ａ５、２Ｄ２、４Ｃ１、及び７Ｈ４由来の抗体を、配列同定した。ＴＲＩｚｏｌ（登録商標）試薬を製造元の指示通りに用いてハイブリドーマ細胞から全ＲＮＡを単離した。その後、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（商標）  １ｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キットとアイソタイプ特異的アンチセンスプライマー又はユニバーサルプライマーとを用いて全ＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡを作成した。ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ、及びＣＬの抗体断片を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔを用いてＲＡＣＥ法（ｒａｐｉｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｅｎｄｓ）により増幅した。増幅抗体断片を標準クローニング・ベクターに個別にクローン化した。コロニーＰＣＲを行い、正しいサイズのインサートを含むクローンをスクリーニングした。各断片について、正しいサイズのインサートを含むコロニーを５つ以上配列同定した。異なるクローンの配列をアラインして、保存配列を表２に示した。
【０１４７】
【表２−１】
2020510841.tif 000004
【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【０１４８】
研究では、まず、ヒトＥＲＦＥに特異的なモノクローナル抗体サンドイッチＥＬＩＳＡの開発のための最良の性能の抗体の組を同定した。捕捉したＥＲＦＥへのビオチン化ｍＡｂの結合特性に基づき、９種類のクローンを液体窒素から蘇生し、６ウェル組織培養プレートに播種し、１０％ウシ胎児血清含有ＤＭＥＭを用いコンフルエントになるまで増殖させ、複数回の増殖を経つつ徐々に無血清培地に慣らした。慣らしの後、各マウスハイブリドーマを、まず、Ｔ７５組織培養フラスコで、次に、Ｔ１５０組織培養フラスコで、増殖し、およそ１リットルの培養上清を生産した。この上清から１ｍｌのＨｉＴｒａｐ（商標）プロテインＧカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スウェーデン）を用いてモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を精製し、アリコートを−２０℃で保存した。各ｍＡｂをＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ロックフォード、イリノイ州）を用いてビオチンで標識化した。ＥＬＩＳＡプレートを１００ｎｇ／ウェルの未標識の捕捉用ｍＡｂでオーバーナイトにわたりコートし、組み換えヒトＦＬＡＧ−ＥＲＦＥ（１５０、７５、３７．５、１８．７５ｎｇ／ウェル）を６０分インキュベートし、未結合の抗原を除去するために洗い、そして、ビオチン化ｍＡｂ（１５０ｎｇ／ウェル）を各ウェルに加え、さらに１時間インキュベートした。抗体結合をストレプトアビジンＨＲＰの添加後にＴＭＢを添加することにより検出し、反応を１５分にわたり進め、シグナルを止め、そして、吸光度を４５０ｎｍで測定した。捕捉抗体として９種類の異なる抗体を試験し、検出抗体として８種類のビオチン化抗体を試験した。７２通りの異なる組み合わせを試験した。予備分析から、複数の抗体の組が一対比較のために選ばれた９種類のｍＡｂ由来の組み換えヒトＥＲＦＥを捕捉・検出できることが明らかとなった。
【０１４９】
さらなる抗ＥＲＦＥサンドイッチアッセイ実験を３種類の異なるコーティング抗体７Ｈ４、１７Ａ５、及び４Ｃ１と４種類の異なるビオチン化検出抗体２Ｄ２、１７Ａ５、９Ｂ１２、及び４Ｃ１とを用いて行った（図４Ａ−Ｃ）。図４に示すように、試験した捕捉抗体によらず、各検出抗体で作成した回帰方程式は区別できる傾きを示したが、これは各検出抗体がコーティング抗体により捕捉されたＥＲＦＥに対して異なる結合親和性を有することを示す。この特性は、結合親和性が高いほどアッセイの感度が高くなるため、サンドイッチＥＬＩＳＡ開発にとって重要である。さらに、各回帰方程式についての相関係数が優れていると考えられるものの（０．９９４４から０．９９９９の範囲のＲ２値）、抗原検出が試験したＥＲＦＥ濃度にわたって最適であることから、傾きは大きいほど望ましい。まとめると、本アプローチにより、さらなるアッセイ開発のために検討すべき候補の抗体の組が実験的に同定された。
【０１５０】
（実施例４：モノクローナルサンドイッチＥＬＩＳＡ）
結合活性について捕捉抗体と検出抗体とのすべての可能な組み合わせを照会した後、さらなるアッセイの最適化のために捕捉抗体及び検出抗体としてそれぞれｍＡｂ４Ｃ１及び２Ｄ２を選んだ。９６ウェルＥＬＩＳＡプレート上で乾燥させたｍＡｂ４Ｃ１を用いた予備的『チェッカーボード』研究では、捕捉抗体と、８点標準曲線のためのＥＲＦＥ抗原と、血清中のＥＲＦＥの結合及び検出を定量化するためのストレプトアビジンＨＲＰとの、最適濃度を同定した。標準曲線は、８点のＥＲＦＥ濃度（１０．０、５．０、２．５、１．２５、０．６３、０．３１、０．１６、０．００ｎｇ／ｍｌ）で構築され、２．０−２．２の範囲の最大吸光度及び０．０５吸光度単位未満のバックグラウンドシグナルであった（図５）。このプロトタイプのサンドイッチＥＬＩＳＡは検出下限（ＬＬＯＤ）及び定量下限（ＬＬＯＱ）がそれぞれ０．１５及び０．１７ｎｇ／ｍｌであった。
【０１５１】
さらに、捕捉抗体として７Ｈ４を検出抗体としてビオチン化２Ｄ２を用いたサンドイッチアッセイで２種類のｆｌａｇ−ｈＥＲＦＥを使い本アッセイを評価したところ、同様の結果が得られ、本アッセイの有効性がさらに証明された。
【０１５２】
このプロトタイプのアッセイを用いて、正常な（フェリチン、血漿鉄、及びトランスフェリン飽和度の評価により決定される）鉄状態である１１０名の健康な初回血液ドナー由来の血清を試験することにより、ヒトＥＲＦＥの基準範囲を求めるための研究を行った。健康な個人で期待されるとおり、血清ＥＲＦＥは、低く（ミーン０．８３ｎｇ／ｍｌ）、また、０．１５から３．９４ｎｇ／ｍｌの範囲であった（信頼区間５％及び９５％、表３）。
【０１５３】
【表３】
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【０１５４】
４Ｃ１捕捉抗体と、ビオチン又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識化した２Ｄ２検出抗体とを用いて、さらなるアッセイを行った。２Ｄ２ビオチンウェルは、ストレプトアビジンＨＲＰを用いてさらにインキュベートし、その後、すべてのウェルを、ＴＭＢと反応させた。図９に示すように、ビオチンで標識化した検出抗体とＨＲＰで標識化した検出抗体とは血清サンプル中のＥＲＦＥを検出する能力について実質的に等価であった。
【０１５５】
（実施例５：無効赤血球生成の理解のためのＥＲＦＥの臨床評価）
ヒト血清ＥＲＦＥ濃度への献血の効果を求めた。３名のドナーがベースラインで血小板及び血漿アファレーシスを経験し、血清を、ベースラインで採取し、アファレーシス後１２０日目で採取し、さらに、アファレーシス後２−１４日目後から少なくとも５回採取した。各患者はアファレーシス治療中に約３０ｍｌの赤血球を失うと推定された。期待されたとおり、血清ＥＲＦＥは、各患者でアファレーシス後の最初の２日間にベースラインから上昇し、アファレーシス後１４日間にわたり上昇を続けるが、アファレーシス後の１２０日目までに血清ＥＲＦＥはベースラインレベルに戻った（図６）。
【０１５６】
次に、血清ＥＲＦＥ濃度が無効赤血球生成に関連する血液疾患で上昇するという仮説を検証した。血清サンプルを、Ｘ連鎖性鉄芽球性貧血患者（ＸＬＳＡ発端者）及びその家族１５名（家族対象）から採取した。９名のＸＬＳＡ発端患者はＡＬＡＳ２遺伝子に点変異を有し、２名はα−グロビン重複を有していた。血清ＥＲＦＥをＸＬＳＡ発端者及び対照群で測定したところ、ＥＲＦＥが家族対照群と比べＸＬＳＡ発端者群で有意に上昇していることがわかった（図７）。興味深いことに、家族群（対照）での血清ＥＲＦＥは初回健康血液ドナーと同様の濃度であった。
【０１５７】
α−又はβ−グロブリン遺伝子での変異のため無効赤血球生成を呈し異常血色素症及び重篤な鉄過負荷がもたらされることが知られているサラセミア患者での血清ＥＲＦＥ濃度の定量のためにさらなる研究を行った。血清を、α＋−サラセミア患者並びにβ＋−サラセミア患者及びβ０サラセミア患者の両方から採取し、鉄欠乏（ＩＤ）患者及び対照患者から採取した血清由来のＥＲＦＥレベルと比較した。β＋−サラセミア患者及びβ０サラセミア患者の両方がα＋−サラセミア群、ＩＤ群、及び対照群の患者よりも有意に高いＥＲＦＥ濃度を有することがわかった（図８）。さらにめざましい発見として、β０サラセミアの患者がβ＋−サラセミア患者よりも有意に高い血清ＥＲＦＥ濃度を有していた。この発見は、血清ＥＲＦＥ測定が、β＋−又はα＋−サラセミア形質のいずれかを示す患者とより重篤なβ０−サラセミア形質を有する患者とを弁別する助けとなるかもしれないことを示唆している。
【０１５８】
特記のない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の、成分の量、分子量などの性質、反応条件などを表す全ての数値は、いかなる場合も、『約』という用語で修飾されているものとして解釈されるべきである。本明細書では、『約』及び『およそ』という用語は、１０から１５％の範囲内にあること、好ましくは、５から１０％の範囲内にあることを意味する。従って、反対のことが記載されていない限り、本明細書及び特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、本発明で得ようとする所望の性質に応じて変動し得る近似値である。均等論の適用を請求項の範囲に限定することを意図するわけではないが、最低限、各数値パラメータは記載の有効数字の数を鑑み通常の丸め手法を適用して少なくとも解釈されるべきである。本発明の広い範囲を規定する数値範囲及びパラメータは近似値であるものの、特定の実施例に記載の数値は可能な限り正確に記載されている。ただし、いかなる数値も対応する試験測定値でみられる標準偏差から不可避的に生じるいくらかの誤差を本質的に含む。
【０１５９】
本発明を記載する文脈で（特に、特許請求の範囲の文脈で）用いられる単数への言及は、本明細書に特記がなく且つ文脈上で明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含すると解釈されるべきである。本明細書の数値範囲の記載は、当該範囲内に収まる独立した数値のそれぞれを個別に参照する簡潔明瞭な方法としての役割を果たすにすぎない。本明細書に特記のない限り、個別の数値のそれぞれが本明細書で個別に記載したかのように本明細書に取り込まれる。本明細書に開示のすべての方法は、本明細書に特記がなく且つ文脈上で明確に矛盾しない限り、任意の適切な順番で行うことができる。あらゆる例示の使用又は本明細書に開示の例示表記（例えば、『〜などの』）は、本発明の理解をより容易にするためのものにすぎず、請求項に記載された以上の限定を本発明の範囲にもたらすものではない。本明細書の記載は、請求項に記載されていないものの本発明を実施するために必須の要素を示すものと解釈されるべきではない。
【０１６０】
本明細書に開示の発明の代替的要素又は実施形態のグループは限定事項と解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、又は、当該グループの他のメンバー若しくは本明細書に開示の他のグループの他のメンバーとの任意の組み合わせで、参照され、また、請求項に記載され得る。あるグループの１つ以上のメンバーが、便宜上及び／又は特許上の理由で、あるグループに追加されたり、あるいは、あるグループから削除されたりすることも考えられる。こうした追加又は削除が起きた場合、本明細書は、変更後のグループを含んでいたものとみなされるので、特許請求の範囲で用いられるマーカッシュグループのすべてが記載要件を満たす。
【０１６１】
発明者等が知る限り本発明を実施するために最良の形態をはじめとする本発明のいくつかの形態が本明細書に記載されている。当然ながら、前述の記載に触れた当業者にとってこうした記載済みの実施形態の変形例は明白だろう。本発明者等は、当業者がこうした変形例を適切に採用することを期待し、本発明が本明細書に具体的に記載された以外のやり方で実施されることを意図している。従って、本発明は、適用法が許す限り、本願に添付の請求項で記載される主題の修整例及び等価例のすべてを包含する。さらに、上記の要素のすべての可能な変形例での当該要素の任意の組み合わせが、本明細書に特記がなく且つ文脈上で明確に矛盾しない限り、本発明に包含される。
【０１６２】
本明細書に開示の特定の実施形態は、請求項において、「からなる」又は「から実質的になる」という表現を用いて、さらに限定されることもある。請求項において用いられる場合、出願当初からであったか補正により追加されたかを問わず、「からなる」という移行句は、請求項で特定されていない要素、工程、及び成分のすべてを除外する。「から実質的になる」という移行句は、請求項の範囲を当該請求項で特定された材料又は工程及びその基礎的且つ新規な特徴に大きく影響しないものに限定する。このように請求項に記載された本発明の実施形態は、本明細書に内在的に又は明示的に記載され且つ実施可能である。
【０１６３】
さらに、本明細書では、数々の特許文献又は刊行物を引用している。上で引用した参考文献及び刊行物のそれぞれについて、その全体を参照により本明細書で援用する。
【０１６４】
最後に、本明細書に開示の本発明の実施形態は本発明の原理を例示するものと理解されたい。採用可能な他の修整例も本発明の権利範囲に含まれる。そのため、例えば、これに限定されるわけではないが、本発明の代替的な構成を本明細書に開示の教示に従って採用することもできる。従って、本発明は例示及び記載されたものに厳密に限定されるわけではない。
【０１６５】
［付記］
［付記１］
サンプル中のエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）タンパク質の存在を検出するための及び／又はその量を測定するためのアッセイであって、
第１の抗体−ＥＲＦＥ複合体を形成するために前記サンプルを第１の抗体と接触させることと、
その後、前記第１の抗体と第２の抗体とが同一ではないとして、前記第１の抗体−ＥＲＦＥ複合体に結合した前記第２の抗体の存在を検出し及び／又はその量を測定し、これにより、前記サンプル中のＥＲＦＥタンパク質の存在及び／又は量を決定することと、
を含む、
アッセイ。
【０１６６】
［付記２］
前記アッセイはＥＬＩＳＡアッセイを含む、付記１に記載のアッセイ。
【０１６７】
［付記３］
前記サンプルは血清サンプルである、付記１に記載のアッセイ。
【０１６８】
［付記４］
前記第１の抗体及び前記第２の抗体は、配列番号１及び／又は３−１６の少なくとも１つの配列を含む、当該配列から実質的になる、又は当該配列からなるＥＲＦＥポリペプチドを、特異的に認識する、付記１に記載のアッセイ。
【０１６９】
［付記５］
前記第１の抗体は、モノクローナル抗体である９Ｂ１２、１７Ａ５、１７Ｅ５、２Ｄ２、４Ｃ１、６Ｈ９、７Ｈ４、９Ｃ７、１４Ｂ２、及び１４Ｄ９、又は、これらのＥＲＦＥ結合断片から選択される、付記１に記載のアッセイ。
【０１７０】
［付記６］
前記第１の抗体は４Ｃ１又はそのＥＲＦＥ結合断片である、付記１に記載のアッセイ。
【０１７１】
［付記７］
前記第１の抗体は固体支持体上にコートされている、付記１から６のいずれか１つに記載のアッセイ。
【０１７２】
［付記８］
前記固体支持体はＥＬＩＳＡプレートである、付記７に記載のアッセイ。
【０１７３】
［付記９］
前記検出工程は、第１の抗体−ＥＲＦＥポリペプチド複合体を標識化された第２の抗体と接触させることを含む、付記１に記載のアッセイ。
【０１７４】
［付記１０］
前記第２の抗体は、９Ｂ１２、１７Ａ５、１７Ｅ５、２Ｄ２、４Ｃ１、６Ｈ９、７Ｈ４、９Ｃ７、１４Ｂ２、及び１４Ｄ９から選択された標識検出抗体である、付記９に記載のアッセイ。
【０１７５】
［付記１１］
前記第２の抗体は２Ｄ２である、付記１０に記載のアッセイ。
【０１７６】
［付記１２］
前記標識はビオチンである、付記９に記載のアッセイ。
【０１７７】
［付記１３］
前記標識はセイヨウワサビペルオキシダーゼである、付記９に記載のアッセイ。
【０１７８】
［付記１４］
重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含むエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片であって、
前記ＶＨは、
（ｉ）配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｉ）配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｉｉ）配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｖ）配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（ｖ）配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含み、
前記ＶＬは、
（ｖｉ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｖｉｉ）配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｖｉｉｉ）配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
（ｉｘ）配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、又は、
（ｘ）配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列、
を含む、
エリスロフェロン（ＥＲＦＥ）結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１７９】
［付記１５］
ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片であって、
前記抗体が
（ｉ）配列番号１９−２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｉ）配列番号２４−２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｉｉ）配列番号２９−３１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｖ）配列番号３４−３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖ）配列番号３９−４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖｉ）配列番号４４−４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖｉｉ）配列番号４９−５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｖｉｉｉ）配列番号５４−５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｉｘ）配列番号５９−６１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
（ｘ）配列番号６４−６６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全て、
を含む、
ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１８０】
［付記１６］
配列番号１８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号２３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、付記１４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１８１】
［付記１７］
前記ＶＨは配列番号１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、付記１４又は１６に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１８２】
［付記１８］
前記ＶＬは配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、付記１４又は１６に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１８３】
［付記１９］
前記抗体は、配列番号１９−２１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号２４−２６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、付記１５に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１８４】
［付記２０］
配列番号２８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号３３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、付記１４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１８５】
［付記２１］
前記ＶＨは配列番号２８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、付記１４又は２０に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１８６】
［付記２２］
前記ＶＬは配列番号３３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、付記１４又は２０に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１８７】
［付記２３］
前記抗体は、配列番号２９−３１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号３４−３６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、付記１５に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１８８】
［付記２４］
配列番号３８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号４３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、付記１４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１８９】
［付記２５］
前記ＶＨは配列番号３８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、付記１４又は２４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１９０】
［付記２６］
前記ＶＬは配列番号４３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、付記１４又は２４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１９１】
［付記２７］
前記抗体は、配列番号３９−４１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号４４−４６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、付記１５に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１９２】
［付記２８］
配列番号４８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号５３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、付記１４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１９３】
［付記２９］
前記ＶＨは配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、付記１４又は２８に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１９４】
［付記３０］
前記ＶＬは配列番号５３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、付記１４又は２８に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１９５】
［付記３１］
前記抗体は、配列番号４９−５１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号５４−５６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、付記１５に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１９６】
［付記３２］
配列番号５８のＶＨと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列と、配列番号６３のＶＬと少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列とを含む、付記１４に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１９７】
［付記３３］
前記ＶＨは配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、付記１４又は３２に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１９８】
［付記３４］
前記ＶＬは配列番号６３のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する、付記１４又は３２に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０１９９】
［付記３５］
前記抗体は、配列番号５９−６１のアミノ酸配列を有する重鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てと、配列番号６４−６６のアミノ酸配列を有する軽鎖ＣＤＲの１つ、２つ、又は３つ全てとを含む、付記１５に記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０２００】
［付記３６］
ＶＨ及びＶＬを含み、前記ＶＨは、配列番号１８、２８、３８、４８、又は５８のアミノ酸配列を含み、かつ、前記ＶＬは、配列番号２３、３３、４３、５３、又は６３のアミノ酸配列を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０２０１】
［付記３７］
配列番号１８、２８、３８、４８、又は５８のＶＨ及び配列番号２３、３３、４３、５３、又は６３のＶＬを含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０２０２】
［付記３８］
配列番号１９、２９、３９、４９、又は５９のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ１を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０２０３】
［付記３９］
配列番号２０、３０、４０、５０、又は６０のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ２を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０２０４】
［付記４０］
配列番号２１、３１、４２、５２、又は６２のアミノ酸配列を有するＣＤＲＨ３を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０２０５】
［付記４１］
配列番号２４、３４、４４、５４、又は６４のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ１を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０２０６】
［付記４２］
配列番号２５、３５、４５、５５、又は６５のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ２を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０２０７】
［付記４３］
配列番号２６、３６、４６、５６、又は６６のアミノ酸配列を有するＣＤＲＬ３を含む、ＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０２０８】
［付記４４］
前記抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又は抗体断片である、付記１４から４３のいずれか１つに記載のＥＲＦＥ結合抗体又はそのＥＲＦＥ結合断片。
【０２０９】
［付記４５］
サンプル中のエリスロフェロン（ＥＲＦＥ）タンパク質の存在を検出するための及び／又はその量を測定するためのアッセイであって、
第１の抗体−ＥＲＦＥ複合体を形成するために、前記サンプルを、付記１４から４４のいずれか１つに記載の抗体を含む第１の抗体と接触させることと、
その後、第２の抗体は付記１４から４４のいずれか１つに記載の抗体を含み、前記第１の抗体と前記第２の抗体とが同一ではないとして、前記第１の抗体−ＥＲＦＥ複合体に結合した前記第２の抗体の存在を検出し及び／又はその量を測定することと、
これにより、前記サンプル中のＥＲＦＥタンパク質の存在及び／又は量を決定することと、
を含む、
アッセイ。
【０２１０】
［付記４６］
前記アッセイはＥＬＩＳＡアッセイを含む、付記４５に記載のアッセイ。
【０２１１】
［付記４７］
前記サンプルは血清サンプルである、付記４５に記載のアッセイ。
【０２１２】
［付記４８］
前記第１の抗体は、配列番号１及び／又は３−１６の少なくとも１つの配列を含む、当該配列から実質的になる、又は当該配列からなるＥＲＦＥポリペプチドを、特異的に認識する、付記４５に記載のアッセイ。
【０２１３】
［付記４９］
前記第１の抗体は固体支持体上にコートされている、付記４５から４８のいずれか１つに記載のアッセイ。
【０２１４】
［付記５０］
前記固体支持体はＥＬＩＳＡプレートである、付記４９に記載のアッセイ。
【０２１５】
［付記５１］
前記検出工程は、第１の抗体−ＥＲＦＥポリペプチド複合体を標識化された第２の抗体と接触させることを含む、付記４５に記載のアッセイ。
【０２１６】
［付記５２］
前記標識はビオチンである、付記５１に記載のアッセイ。
【０２１７】
［付記５３］
前記標識はセイヨウワサビペルオキシダーゼである、付記５１に記載のアッセイ。
【０２１８】
［付記５４］
ＥＲＦＥ又はマイオネクチンに関連する疾患のある対象での赤血球生成を評価する方法であって、前記対象由来のサンプルを付記１から１３又は４５から５３のいずれか１つに記載のアッセイに掛けることを含む、方法。
【０２１９】
［付記５５］
前記疾患はサラセミアである、付記５４に記載の方法。
【０２２０】
［付記５６］
前記疾患は心血管疾患である、付記５４に記載の方法。
【０２２１】
［付記５７］
ＥＲＦＥ又はマイオネクチンに関連する疾患のある対象での赤血球生成を評価する方法であって、付記１４から４４のいずれか１つに記載の抗体で前記対象由来のサンプル中のＥＲＦＥを検出することを含む、方法。
【０２２２】
［付記５８］
捕捉抗体及び検出抗体を含み、
（ｉ）前記捕捉抗体は１７Ａ５であり、前記検出抗体は、２Ｄ２、４Ｃ１、又は７Ｈ４である、
（ｉｉ）前記捕捉抗体は２Ｄ２であり、前記検出抗体は、４Ｃ１、７Ｈ４、１７Ａ５、又は９Ｂ１２である、
（ｉｉｉ）前記捕捉抗体は４Ｃ１であり、前記検出抗体は、２Ｄ２、７Ｈ４、１７Ａ５、又は９Ｂ１２である、
（ｉｖ）前記捕捉抗体は７Ｈ４であり、前記検出抗体は、２Ｄ２、４Ｃ１、１７Ａ５、又は９Ｂ１２である、
（ｖ）前記捕捉抗体は９Ｂ１２であり、前記検出抗体は、２Ｄ２、４Ｃ１、１７Ａ５、又は７Ｈ４である、又は、
（ｖｉｉ）前記捕捉抗体及び前記検出抗体は個別に付記１４から４４のいずれか１つに記載の抗体であり、前記捕捉抗体及び前記検出抗体は同一ではない、
サンドイッチ免疫アッセイ用のキット。
【０２２３】
［付記５９］
前記捕捉抗体及び前記検出抗体は異なる抗体である、付記５８に記載のキット。
【０２２４】
［付記６０］
前記捕捉抗体は固体支持体に結び付けられている、付記５８又は５９に記載のキット。
【０２２５】
［付記６１］
前記検出抗体は標識に結び付けられている、付記５８から６０のいずれか１つに記載のキット。
【０２２６】
［付記６２］
前記標識はビオチンである、付記６１に記載のキット。
【０２２７】
［付記６３］
前記標識はセイヨウワサビペルオキシダーゼである、付記６１に記載のキット。
【０２２８】
［付記６４］
ストレプトアビジン−セイヨウワサビペルオキシダーゼをさらに含む、付記６２に記載のキット。
【０２２９】
［付記６５］
基質をさらに含む、付記５８から６４のいずれか１つに記載のキット。
【０２３０】
［付記６６］
前記アッセイを実行するための説明書をさらに含む、付記５８から６５のいずれか１つに記載のキット。
【図１】
2020510841.tif 000009
【図２Ａ】
2020510841.tif 000010
【図２Ｂ】
2020510841.tif 000011
【図３Ａ】
2020510841.tif 000012
【図３Ｂ】
2020510841.tif 000013
【図３Ｃ】
2020510841.tif 000014
【図３Ｄ】
2020510841.tif 000015
【図３Ｅ】
2020510841.tif 000016
【図３Ｆ】
2020510841.tif 000017
【図４Ａ】
2020510841.tif 000018
【図４Ｂ】
2020510841.tif 000019
【図４Ｃ】
2020510841.tif 000020
【図５Ａ】
2020510841.tif 000021
【図５Ｂ】
2020510841.tif 000022
【図６】
2020510841.tif 000023
【図７】
2020510841.tif 000024
【図８】
2020510841.tif 000025
【図９】
2020510841.tif 000026
【配列表】
2020510841000001.app
【国際調査報告】
2020510841.tif 000027
2020510841.tif 000028
2020510841.tif 000029
2020510841.tif 000030