(57)【要約】本発明は、（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）；および（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内の細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドを含む細胞を提供する。本発明は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現する細胞；および特に、レシピエントにおけるこのような細胞の免疫拒絶を制御するアプローチに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）；および
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内の細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチド
を含む細胞。
【請求項２】
前記ＭＨＣクラスＩ分子の前記β２ミクログロブリン構成要素と前記細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在し得る前記ポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメインを含むエンドドメインをさらに含む操作されたβ２ミクログロブリンである、請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記操作されたβ２ミクログロブリンは、前記β２ミクログロブリンポリペプチドと前記細胞内シグナル伝達ドメインを含むエンドドメインとの間に膜貫通ドメインをさらに含む、請求項２に記載の細胞。
【請求項４】
前記ＭＨＣクラスＩ分子の前記β２ミクログロブリン構成要素と前記細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在し得る前記ポリペプチドは、ＴＣＲ複合体の構成要素に連結されたβ２ミクログロブリンポリペプチドである、請求項１に記載の細胞。
【請求項５】
前記ＴＣＲ複合体の前記構成要素は、ＣＤ３−ζ、ＣＤ３−ε、ＣＤ３−γまたはＣＤ３−δから選択されるＣＤ３複合体の構成要素である、請求項４に記載の細胞。
【請求項６】
前記β２ミクログロブリンポリペプチドは、リンカーペプチドによって前記ＣＤ３複合体の構成要素に融合される、請求項４または５に記載の細胞。
【請求項７】
前記β２ミクログロブリンポリペプチドは、前記ＣＤ３複合体の構成要素のエクトドメインに連結される、請求項４〜６のいずれかに記載の細胞。
【請求項８】
前記ＭＨＣクラスＩ分子の前記β２ミクログロブリン構成要素と前記細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得る前記ポリペプチドは、（ｉ）前記β２ミクログロブリンポリペプチドに結合し得る第１の結合ドメインおよび（ｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインまたはＣＤ３複合体の構成要素を含むポリペプチドに結合し得る第２の結合ドメインを含む二重特異的ポリペプチドである、請求項１に記載の細胞。
【請求項９】
前記二重特異的分子は、膜に繋留されている、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫レセプターチロシン活性化（ＩＴＡＭ）モチーフを含む、前述のいずれかの請求項に記載の細胞。
【請求項１１】
前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメイン、４−１ＢＢエンドドメイン、ＣＤ２エンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメイン、ＩＣＯＳエンドドメイン、ＣＤ４０エンドドメインのうちの１またはこれより多くを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインである、前述のいずれかの請求項に記載の細胞。
【請求項１２】
前記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、前記ＣＤ３−ζエンドドメインを含む、前述のいずれかの請求項に記載の細胞。
【請求項１３】
前記細胞は、α−βＴ細胞、ＮＫ細胞、γ−δＴ細胞、またはサイトカイン誘導キラー細胞である、前述のいずれかの請求項に記載の細胞。
【請求項１４】
（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴＣＲをコードする第１の核酸配列；および
（ｉｉ）前述のいずれかの請求項に規定されるＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドをコードする第２の核酸配列
を含む核酸構築物。
【請求項１５】
前記第１のおよび第２の核酸配列は、共発現部位によって分離される、請求項１４に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴＣＲをコードする第１の核酸配列；および
（ｉｉ）前述のいずれかの請求項に規定されるＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドをコードする第２の核酸配列、
を含む核酸配列のキット。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項１８】
（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列を含む第１のベクター；および
（ｉｉ）前述のいずれかの請求項に規定されるＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドをコードする核酸配列を含む第２のベクター、
を含むベクターのキット。
【請求項１９】
請求項１〜１３のいずれかに記載の複数の細胞、請求項１４もしくは１５に記載の核酸構築物、請求項１６に規定される第１の核酸配列および第２の核酸配列；請求項１７に記載のベクターまたは請求項１８に規定される第１のおよび第２のベクターを含む、薬学的組成物。
【請求項２０】
疾患を処置および／または防止することにおいて使用するための請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
疾患を処置および／または防止するための方法であって、該方法は、請求項１９に記載の薬学的組成物を、必要性のある被験体に投与する工程を包含する方法。
【請求項２２】
以下の工程：
（ｉ）細胞含有サンプルを単離する工程；
（ｉｉ）該細胞に、請求項１５もしくは１６に規定される核酸構築物、請求項１７に記載されるベクター、または請求項１８に規定される第１のおよび第２のベクターを形質導入またはトランスフェクトする工程；ならびに
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の該細胞を被験体に投与する工程、
を包含する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞は自家のものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞は同種異系のものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
疾患の処置および／または防止のための医薬の製造における、請求項１９に記載の薬学的組成物の使用。
【請求項２６】
前記疾患は、（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴＣＲ；および（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドを含む細胞の免疫拒絶である、請求項２０に記載の使用のための薬学的組成物、請求項２１〜２４のいずれかに記載の方法、または請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞を作製するための方法であって、該方法は、請求項１４もしくは１５に記載の核酸構築物、請求項１６に規定される第１の核酸配列および第２の核酸配列；請求項１７に記載のベクターまたは請求項１８に規定される第１のおよび第２のベクターを、該細胞に導入する工程を包含する方法。
【請求項２８】
前記細胞は、被験体から単離されたサンプルに由来する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ＣＤ３複合体の構成要素に連結された、ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素を含む、操作されたポリペプチド。
【請求項３０】
（ｉ）β２ミクログロブリンポリペプチドに結合し得る第１の結合ドメイン；および（ｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインまたはＣＤ３複合体の構成要素を含むポリペプチドに結合し得る第２の結合ドメインを含む二重特異的ポリペプチド。
【請求項３１】
請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドを認識するＴ細胞をインビボで削除するための方法であって、該方法は、請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞を被験体に投与する工程を包含し、その結果、このようなペプチド／ＭＨＣを認識する、該被験体におけるＴ細胞は、負の選択によって削除される、方法。
【請求項３２】
請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞によって発現される外因性タンパク質に由来するペプチドを認識するＴ細胞を削除するための、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞によって発現される、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）、トランスジェニックＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）、自殺遺伝子、キメラサイトカインレセプターまたはシグナル伝達改変タンパク質に由来するペプチドを認識するＴ細胞を削除するための、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に由来するペプチドを認識するＴ細胞を削除するための、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１〜１３のいずれかに記載の細胞の免疫拒絶を防止するための方法であって、該方法は、請求項３１〜３４のいずれかに記載の方法によって、該細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドを認識するＴ細胞をインビボで削除する工程を包含する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）を発現する細胞；および特に、レシピエントにおけるこのような細胞の免疫拒絶を制御するアプローチに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
注入後、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、レシピエント内に生着し、標的を有する細胞に遭遇した後に増殖する。ＣＡＲ  Ｔ細胞は、次いで生き残り、それらの集団は、時間を経てゆっくりと縮小する。ＣＡＲ  Ｔ細胞の生き残りは、血液サンプル中の導入遺伝子に関するリアルタイムＰＣＲによって、または血液サンプル中のＣＡＲに関するフローサイトメトリーによって臨床研究で決定され得、臨床研究者らは、生き残りと持続した応答との間の相関を見出した。この相関は、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）のＣＤ１９  ＣＡＲ療法において特に顕著である。この状況ではしばしば、ＣＡＲ  Ｔ細胞生着の喪失が、その白血病の再発の予告となる。
【０００３】
ＣＡＲ  Ｔ細胞は、ＣＡＲ  Ｔ細胞の拒絶を誘発し得る細胞媒介性免疫応答の活性化を生じ得る。これは、非自己タンパク質を通じて、またはレセプターを作製するために使用される自己タンパク質と他の操作構成要素との間の接合部から形成される非自己配列を通じて、いずれかで、細胞へと操作された構成要素の免疫原性に起因する。
【０００４】
ＣＡＲは、標的化ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよびシグナル伝達ドメインから代表的には構成される人工タンパク質である。その標的化ドメインは、代表的には、マウスであり得るｓｃＦｖに由来し得る。このｓｃＦｖがヒトであり得るかまたはヒト化され得かつ他の構成要素は、個々に自己タンパク質に由来する一方で、それらの間の接合部は、なお免疫原性であり得る。例えば、そのｓｃＦｖ内には、重鎖とリンカー、およびリンカーと軽鎖との間に接合部が存在する。次いで、ｓｃＦｖとスペーサードメインとの間には接合部が存在する。その膜貫通ドメインがそのスペーサーと連続していない場合には、そこにはさらなる接合部が存在する。同様に、その膜貫通ドメインがそのエンドドメインのアミノ末端部分と連続していない場合には、そこにはさらなる接合部が存在する。最後に、大部分のエンドドメインは、少なくとも２つの構成要素を、ときには、より多くの構成要素を有し、それに伴って、引き続いて各構成要素の間に接合部が存在する。
【０００５】
さらに、ＣＡＲ  Ｔ細胞はしばしば、さらなる構成要素で操作される。これらの構成要素は、自殺遺伝子を含む（例えば、ＨＳＶ−ＴＫ酵素）。この酵素は、高度に免疫原性であることが見出され、ハプロタイプ同一の（ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ）造血幹細胞移植の顕著な免疫抑制の状況外で、ＣＡＲ  Ｔ細胞の細胞免疫枯渇を引き起こした。他のより低い免疫原性自殺遺伝子は、いくらかの免疫原性をなお提供し得る。なぜなら２種のタンパク質の間の融合物が関わるほぼあらゆる種類の操作された構成要素または異種タンパク質の使用が、免疫原性であり得るからである。
【０００６】
多くの状況において、ＣＡＲ  Ｔ細胞は、自家のＴ細胞から生成される。この状況では、非自己応答（ａｌｌｏ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ）は起こらない。状況によっては、同種異系ドナーに由来するＴ細胞が使用される。これは、例えば、その患者が同種異系の造血幹細胞移植片を有したことがある場合に、起こり得る。この場合、採取したＴ細胞は同種異系である。さもなければ、患者は、化学療法誘導性リンパ球減少症に起因して、ＣＡＲ  Ｔ細胞生成物を生成するために不十分なＴ細胞を有し得る。
【０００７】
同種異系細胞の拒絶は、小さなミスマッチまたは主要なミスマッチに起因し得る。小さなミスマッチは、同種異系Ｔ細胞が、そのレシピエントにヒト白血球抗原（ＨＬＡ）マッチしている状況で起こる。この場合、拒絶は、非自己（ドナー）エピトープ／ＨＬＡ上の免疫原性ペプチドの提示を生じる個体間で非ＨＬＡ差異があるマイナー組織適合性抗原に起因して起こる。ドナーおよびレシピエントがミスマッチであるか。または部分的にのみマッチしている場合、レシピエントの内因性Ｔ細胞上のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、ミスマッチのＨＬＡと非特異的様式で相互作用し得、結論として拒絶を引き起こし得る。同種異系拒絶の小さな形態および主要な形態はともに、ＴＣＲと相互作用するＨＬＡによって引き起こされる。
【０００８】
細胞性免疫応答による拒絶を防止するための１つの方法は、操作されたジンクフィンガーンヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮｓ、ＣｒｉｓｐＲ／Ｃａｓｐ９、ＭｅｇａＴＡＬｓおよびメガヌクレアーゼのようなゲノム編集ツールによるものである。このようなツールを使用すると、ペプチド／ＨＬＡ提示の要素が破壊され得る。このことを行う最も直接的な方法は、ＨＬＡ発現を破壊させることによるものである。これは、ＨＬＡ遺伝子座の破壊によって、または代わりにβ２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子座の破壊（これは、次いで、ＭＨＣクラスＩ発現を停止させる）によって、達成され得る。他のアプローチとしては、ペプチド提示の構成要素の破壊が挙げられる。
【０００９】
細胞媒介性免疫拒絶を防止する別の方法は、ＨＬＡ発現を破壊させるために、タンパク質ベースのアプローチに依拠する。例えば、Ｂ２Ｍを認識しかつカルボキシ末端にゴルジ／ＥＲ保留シグナルを有する抗体単鎖可変フラグメントは、ＨＬＡのダウンレギュレーションを生じ得る。なぜならＢ２Ｍは、ＥＲ／ゴルジ複合体内で保持されるからである。他のアプローチとしては、ＨＬＡ発現および機能を破壊するように進化させたウイルスタンパク質を使用することが挙げられる。
【００１０】
全てのこれらアプローチの主要な制限は、それらが、ＮＫ細胞による拒絶を次に誘発するクラスＩの表面ダウンレギュレーションに依拠するまたはそのダウンレギュレーションを生じることである。よって、これらのアプローチは、α／βＴ細胞媒介性細胞拒絶の１つの問題を解決するが、細胞性免疫応答の別のタイプ（すなわち、ＮＫ細胞によるもの）を引き起こす。
【００１１】
１つのさらなる方法が記載された−その操作されたＴ細胞を強力な免疫抑制剤に対して耐性にし、操作されたＴ細胞の投与後に、上記免疫抑制剤を投与するものである。このアプローチは制限されている。なぜならそれは、その操作された細胞生成物を拒絶し得るものだけでなく、全ての正常なＴ細胞が抑制されることから、そのレシピエントにおいて顕著な免疫抑制を引き起こすからである。
【００１２】
従って、操作された細胞、特に、ＣＡＲまたは操作されたＴＣＲを発現する操作された免疫細胞の細胞媒介性免疫拒絶を低減する代替のアプローチが必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の局面の概要
本発明者らは、第１の細胞上のＭＨＣクラスＩの、第２の細胞上のＴＣＲへの結合を結びつけて、上記第１の細胞におけるシグナル伝達を−直接的にまたは間接的に−誘導することが可能であることを見出した。著しいことには、本発明のＭＨＣクラスＩシグナル伝達系は、相当する内因性ＭＨＣクラスＩ分子と、同じペプチド範囲を提示し得る。よって、ＭＨＣクラスＩによって天然に提示される任意のペプチドは、本発明のＭＨＣクラスＩによって提示される。これは、免疫原性であり得る任意の異種または接合部のペプチドを含む。同種異系の状況では、これはまた、マイナー組織適合性抗原を含み得る。従って、本明細書で規定されるＭＨＣクラスＩは、ペプチド／ＭＨＣ複合体の認識を通じて本発明の操作された細胞のレシピエントに存在する任意の内因性の反応性Ｔ細胞と相互作用する。上記反応性Ｔ細胞は従って、本発明の細胞による細胞傷害性媒介性細胞殺滅の活性化によって枯渇され得る。よって、本発明の細胞に対する細胞免疫応答は、低減され得る。
【００１４】
従って、第１の局面において、本発明は、
（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）；および
（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内の細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチド
を含む細胞を提供する。
【００１５】
上記ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と上記細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得る上記ポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメインを含むエンドドメインをさらに含む操作されたβ２ミクログロブリンであり得る。
【００１６】
上記操作されたβ２ミクログロブリンは、上記β２ミクログロブリンと上記細胞内シグナル伝達ドメインを含むエンドドメインとの間に膜貫通ドメインをさらに含み得る。
【００１７】
上記ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と上記細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得る上記ポリペプチドは、ＴＣＲ複合体の構成要素に連結されたβ２ミクログロブリンポリペプチドであり得、適切には、上記β２ミクログロブリンポリペプチドは、ＣＤ３複合体の構成要素に連結され得る。
【００１８】
上記ＣＤ３複合体の構成要素は、ＣＤ３−ζ、ＣＤ３−ε、ＣＤ３−γまたはＣＤ３−δから選択され得る。上記β２ミクログロブリンポリペプチドは、リンカーペプチドによって上記ＣＤ３複合体の構成要素に融合され得る。上記β２ミクログロブリンポリペプチドは、上記ＣＤ３複合体の構成要素のエクトドメインに連結され得る。
【００１９】
上記ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と上記細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得る上記ポリペプチドは、（ｉ）上記β２ミクログロブリンポリペプチドに結合し得る第１の結合ドメインおよび（ｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインまたは上記ＣＤ３複合体の構成要素を含むペプチドに結合し得る第２の結合ドメインを含む二重機能性ポリペプチドであり得る。
【００２０】
上記二重特異的分子は、膜に繋留されていてもよい。
【００２１】
上記細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫レセプターチロシン活性化（ＩＴＡＭ）モチーフを含み得る。
【００２２】
上記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζエンドドメイン、ＣＤ２８エンドドメイン、ＯＸ４０エンドドメイン、４−１ＢＢエンドドメイン、ＣＤ２エンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメイン、ＩＣＯＳエンドドメイン、ＣＤ４０エンドドメインのうちの１またはこれより多くを含む細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインであり得る。
【００２３】
上記細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインは、上記ＣＤ３−ζエンドドメインを含み得る。
【００２４】
上記細胞は、α−βＴ細胞、ＮＫ細胞、γ−δＴ細胞、またはサイトカイン誘導キラー細胞であり得る。
【００２５】
さらなる局面において、本発明は、
（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴＣＲをコードする第１の核酸配列；および
（ｉｉ）本発明に従うＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドをコードする第２の核酸配列、
を含む核酸構築物を提供する。
【００２６】
上記第１のおよび第２の核酸配列は、共発現部位によって分離され得る。
【００２７】
別の局面において、本発明は、
（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴＣＲをコードする第１の核酸配列；および
（ｉｉ）本発明に従うＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドをコードする第２の核酸配列、
を含む核酸配列のキットを提供する。
【００２８】
さらなる局面において、本発明は、本発明の核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００２９】
別の局面において、本発明は、
（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴＣＲをコードする核酸配列を含む第１のベクター；および
（ｉｉ）本発明に従うＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドをコードする核酸配列を含む第２のベクター、
を含むベクターのキットを提供する。
【００３０】
本発明は、本発明の複数の細胞；核酸構築物；第１の核酸配列および第２の核酸配列；ベクターまたは第１のおよび第２のベクターを含む薬学的組成物をさらに提供する。
【００３１】
本発明はまた、疾患を処置および／または防止するにあたって使用するための、本発明の細胞、核酸構築物；第１の核酸配列および第２の核酸配列；ベクター；第１のおよび第２のベクター；または薬学的組成物を提供する。
【００３２】
本発明は、必要性のある被験体に本発明の薬学的組成物を投与する工程を包含する、疾患を処置および／または防止するための方法をさらに提供する。
【００３３】
上記方法は、以下の工程を包含し得る：
（ｉ）細胞含有サンプルを単離する工程；
（ｉｉ）本発明の核酸構築物、ベクターまたは第１のおよび第２のベクターを上記細胞に形質導入またはトランスフェクトする工程；ならびに
（ｉｉｉ）上記（ｉｉ）の細胞を被験体に投与する工程。
【００３４】
上記方法のパート（ｉ）において単離された細胞は、自家のものであり得る。上記方法のパート（ｉ）において単離された細胞は、同種異系のものであり得る。
【００３５】
さらなる局面において、本発明は、疾患の処置および／または防止のための医薬の製造における、本発明の薬学的組成物の使用を提供する。
【００３６】
上記疾患は、（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴＣＲ；および（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドを含む細胞の免疫拒絶であり得る。
【００３７】
本発明は、本発明の第１の局面に従う細胞を作製するための方法を提供し、上記方法は、本発明の核酸構築物、第１の核酸配列および第２の核酸配列；ベクターまたは第１のおよび第２のベクターを、細胞に導入する工程を包含する。
【００３８】
上記細胞は、被験体から単離されたサンプルに由来し得る。
【００３９】
さらなる局面において、本発明は、上記ＣＤ３複合体の構成要素に連結されたＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素を含む操作されたポリペプチドを提供する。
【００４０】
別の局面において、本発明は、（ｉ）上記β２ミクログロブリンポリペプチドに結合し得る第１の結合ドメイン；および（ｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインまたは上記ＣＤ３複合体の構成要素を含むポリペプチドに結合し得る第２の結合ドメインを含む二重特異的ポリペプチドを提供する。
【００４１】
さらなる局面において、本発明は、本発明の第１の局面に従う細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドを認識するＴ細胞をインビボで枯渇または排除するための方法であって、上記方法は、本発明の第１の局面に従う細胞を被験体に投与し、その結果、上記被験体におけるこのようなペプチド／ＭＨＣを認識するＴ細胞が、負の選択によって削除される工程を包含する。
【００４２】
上記方法は、本発明の細胞によって発現される外因性タンパク質に由来するペプチドを認識するＴ細胞を削除し得る。「外因性」タンパク質は、タンパク質であって、例えば、組換え手段によって上記細胞が発現するように操作されているものである。それは、上記細胞によって通常は発現されない。
【００４３】
上記方法は、本発明の細胞によって発現される、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）、トランスジェニックＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）、自殺遺伝子、キメラサイトカインレセプターまたはシグナル伝達改変タンパク質に由来するペプチドを認識するＴ細胞を削除し得る。
【００４４】
上記方法は、本発明の細胞によって発現されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）に由来するペプチドを認識するＴ細胞を削除し得る。
【００４５】
さらなる局面において、本発明の第１の局面の細胞の免疫拒絶を防止するための方法が提供され、上記方法は、上記で記載される方法によって、上記細胞のＭＨＣクラスＩ分子によって提示されるペプチドを認識するＴ細胞をインビボで削除する工程を包含する。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】（ａ）ＭＨＣおよびＢ２Ｍから構成されるＭＨＣクラスＩ分子複合体；（ｂ）ＣＤ３エレメントによって囲まれたＴＣＲα／β鎖から構成されるＴＣＲ複合体。
【図２】（ａ）Ｂ２Ｍ−Ｚ構築物：  上記Ｂ２Ｍ構築物は、膜貫通ドメインおよびＣＤ３−ζエンドドメインにインフレームで融合される；（ｂ）Ｂ２Ｍ−ＴＣＲ二重特異的構築物：Ｂ２Ｍを認識するｓｃＦｖは、上記ＣＤ３／ＴＣＲ複合体を認識する第２のｓｃＦｖへとリンカーで融合される。次いで、これは、膜貫通ドメインを介して膜に固定される；（ｃ）Ｂ２ＭとＣＤ３／ＴＣＲとの間の融合：例として、可撓性リンカーを介するＣＤ３−εへのＢ２Ｍの間の融合が示される。
【図３】ａ）古典的ＣＡＲを例証する模式図。（ｂ）〜（ｄ）：ＣＡＲエンドドメインの種々の生成および入れ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）：（ｂ）最初のデザインは、ＦｃεＲ１−γまたはＣＤ３ζエンドドメインを通じてＩＴＡＭシグナル単独を伝達したが、後のデザインは、同じ化合物エンドドメインにおいてさらなる（ｃ）１つのまたは（ｄ）２つの、共刺激シグナルを伝達した。
【図４】ＭＨＣクラスＩ  ＣＡＲを例証する模式図。主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩ  ＣＡＲは、２つの非共有結合的に連結されたポリペプチド鎖、αおよびβ２ミクログロブリン（β２ｍ）から構成されるヘテロダイマーである。負荷されたペプチドと一緒になったそのα１およびα２サブユニットは、Ｔ細胞の表面上で発現されるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に結合する。β２ミクログロブリンは、細胞膜の中に分子を固定する膜貫通ドメインに接続され、上記細胞へと細胞内シグナルを伝達するように作用するエンドドメインにさらに連結される。上記エンドドメインは、１またはこれより多くのシグナル伝達ドメインから構成され得る。
【図５】３種の考えられるβ２ｍベースのＣＡＲデザインを例証する模式図。  第１のＣＡＲにおいて、（Ａ）β２ミクログロブリンは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインへの架橋を介して連結され、これは次いで、ＣＤ３ζエンドドメインに連結される。他の２種のＣＡＲデザイン（ＢおよびＣ）は、それぞれ、付加された共刺激ドメイン４１ＢＢ、またはＣＤ２８を有する。
【図６】ＭＨＣ  Ｉ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＭＨＣ  Ｉ／ＴＣＲ相互作用を介して標的Ｔ細胞を殺滅し得る。３種のβ２ｍ構築物（β２ｍ−ＣＤ３ｚ、β２ｍ−４１ＢＢｚおよびβ２ｍ−ＣＤ２８ｚ）を使用して、ＨＬＡ−Ａ０２ハプロタイプの２名の健康なドナーに由来するＰＢＭＣを形質導入した。ＨＬＡ−Ａ０２に天然に結合する組換えＨＡ１Ｈペプチドを使用して、ある濃度範囲（最高濃度＝１０μＭ）でＣＡＲ−Ｔ細胞をパルスした。パルスしたＣＡＲ−Ｔ細胞を、２：１  エフェクター対  標的比において抗ＨＡ１Ｈ  ＴＣＲを発現するＳｕｐＴ１細胞と共培養した。４８時間のインキュベーション後、生きているＳｕｐＴ１標的細胞の数をフローサイトメトリーによって評価し、非形質導入（ＮＴ）コントロールに対して正規化した。全３種のβ２ｍ構築物は、標的細胞の殺滅において有効であった。ＨＡ１ＨペプチドのＥＣ５０は、約０．５μＭ（β２ｍ−ＣＤ３ｚ）〜約０．１μＭ（β２ｍ−４１ＢＢｚ）の範囲に及んだ。
【図７−１】ＭＨＣ  Ｉ  ＣＡＲ−Ｔ細胞と標的細胞との結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、サイトカインの生成を生じる。２：１  エフェクター対  標的比でのＭＨＣ  Ｉ  ＣＡＲ−Ｔ細胞（β２ｍ−ＣＤ３ｚ  ｎ＝１；β２ｍ−４１ＢＢｚおよびβ２ｍ−ＣＤ２８ｚ  ｎ＝２）およびＳｕｐＴ１．ＨＡ１Ｈ−ＴＣＲ標的細胞との４８時間共培養からの培地中の相対的サイトカイン濃度。ＣＡＲ−Ｔ細胞を、標的とともに播種する前に、ある濃度範囲において組換えＨＡ１Ｈペプチドでパルスした。ＮＴコントロールを使用して、サイトカイン濃度を正規化した。赤線は、ＮＴコントロールによって生成されるサイトカインのレベルを示す。
【図７−２】ＭＨＣ  Ｉ  ＣＡＲ−Ｔ細胞と標的細胞との結合（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）は、サイトカインの生成を生じる。２：１  エフェクター対  標的比でのＭＨＣ  Ｉ  ＣＡＲ−Ｔ細胞（β２ｍ−ＣＤ３ｚ  ｎ＝１；β２ｍ−４１ＢＢｚおよびβ２ｍ−ＣＤ２８ｚ  ｎ＝２）およびＳｕｐＴ１．ＨＡ１Ｈ−ＴＣＲ標的細胞との４８時間共培養からの培地中の相対的サイトカイン濃度。ＣＡＲ−Ｔ細胞を、標的とともに播種する前に、ある濃度範囲において組換えＨＡ１Ｈペプチドでパルスした。ＮＴコントロールを使用して、サイトカイン濃度を正規化した。赤線は、ＮＴコントロールによって生成されるサイトカインのレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
発明の詳細な説明
Ｂ２Ｍと細胞内シグナル伝達ドメインとの共局在化
本発明は、（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）；および（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内の細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドを含む細胞を提供する。
【００４８】
ネオエピトープまたは非自己抗原は、ＭＨＣクラスＩ分子上に提示される。ＭＨＣクラスＩは、β２ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）と、ペプチドを負荷されているＭＨＣクラスＩタンパク質とのアセンブリによって形成される。ＭＨＣクラスＩタンパク質は非常に多型である一方で、Ｂ２Ｍは保存されている。
【００４９】
そのＭＨＣクラスＩ分子は、４個の免疫グロブリン様ループから構成される。そのＭＨＣタンパク質は、３個のループ（α１、α２およびα３）を提供する。別個のタンパク質であるＢ２Ｍは、第４のループを提供する（図１（ａ）を参照のこと）。Ｂ２Ｍは、細胞表面上のＭＨＣクラスＩのα３鎖のそばにある。α３とは異なり、内因性Ｂ２Ｍは、膜貫通領域を有しない。Ｂ２Ｍの直ぐ上（すなわち、細胞からは遙かに離れている）に、α１鎖があり、これ自体は、α２の次にある。
【００５０】
例証的なＢ２Ｍアミノ酸配列は、配列番号１として示される。
【化１】
2020537521.tif 000002
【００５１】
本発明における使用のためのＢ２Ｍポリペプチド配列は、配列番号１として示される配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。その改変体は、ＭＨＣクラスＩタンパク質とアセンブリし、ＭＨＣクラスＩ複合体による生産的ペプチド提示を容易にする能力を維持する。
【００５２】
配列番号１の改変体は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得るが、ただしその改変体配列は、ＭＨＣクラスＩタンパク質とアセンブリし、ＭＨＣクラスＩ複合体による生産的ペプチド提示を容易にする能力を保持する。
【００５３】
２種のポリペプチド配列間のパーセンテージ同一性は、ＢＬＡＳＴのようなプログラム（これは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて無料で入手可能である）によって容易に決定され得る。適切なことには、そのパーセンテージ同一性は、参照配列および／または問い合わせ配列の全体にわたって決定される。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「ＭＨＣクラスＩ分子のＢ２Ｍ構成要素と細胞内の細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得る」とは、反応性Ｔ細胞上のＴＣＲが、本発明の細胞上のペプチド／ＭＨＣ複合体に結合する場合、その細胞内シグナル伝達ドメインが本発明の細胞において活性化シグナルを伝達するように、そのポリペプチドが、そのＢ２Ｍ構成要素とその細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化させることを意味する。
【００５５】
適切なことには、誘導されるその活性化シグナルは、本発明の細胞を刺激して、そのペプチド／ＭＨＣ複合体を認識する反応性Ｔ細胞を枯渇させる。このような枯渇は代表的には、細胞媒介性の細胞傷害性殺滅機構によって達成される。
【００５６】
細胞において細胞傷害性殺滅機構の活性化を決定するために適切な方法としては、クロム放出アッセイ、フローサイトメトリーベースの殺滅アッセイ、エフェクターおよび標的が（例えば、ＥＬＩＳＡまたはサイトカインビーズアレイによって）遭遇した後のサイトカイン放出の測定、フローサイトメトリーによるエフェクター−標的細胞遭遇後のエフェクター細胞に関する脱顆粒または活性化の実証が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５７】
操作されたＢ２Ｍ
いくつかの実施形態において、ＭＨＣクラスＩ分子のＢ２Ｍ構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメインを含むエンドドメインをさらに含む操作されたＢ２Ｍである。
【００５８】
このような操作されたＢ２Ｍ構成要素は、Ｂ２Ｍポリペプチドを含み、ＭＨＣクラスＩタンパク質とアセンブリして、ＭＨＣクラスＩ複合体による生産的ペプチド提示を容易にし得る。さらに、その操作されたＢ２Ｍは、その操作されたＢ２Ｍを含むペプチド／ＭＨＣ複合体へのＴＣＲの結合後に活性化シグナルを伝達し得る細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。その細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメインであり得る。
【００５９】
操作されたＢ２Ｍポリペプチドは、Ｍａｒｇａｌｉｔ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５，  １３７９-１３８７  （２００３））に記載される。これらの操作されたＭＨＣ／Ｂ２Ｍポリペプチドは、その操作されたＢ２Ｍに連結されたペプチドを含み、その結果、ＭＨＣクラスＩは、もっぱらその連結されたペプチドを提示する。このような構築物を発現するＴ細胞は、その選択されたペプチド／ＭＨＣ複合体を認識する任意の反応性Ｔ細胞を選択的に枯渇させる。このようにして、既知の抗原に対する選択的免疫抑制は、コグネートＴ細胞の枯渇によって実行され得る。
【００６０】
対照的に、ＭＨＣクラスＩによって天然に提示される任意のペプチドは、本発明のＭＨＣクラスＩ複合体によって提示される。これは、有利なことには、本発明のＭＨＣクラスＩ複合体を発現する細胞が、本発明の細胞によって提示される任意のペプチド／ＭＨＣ複合体を認識する内因性の反応性Ｔ細胞を枯渇させることを可能にする。
【００６１】
本発明のＭＨＣクラスＩ複合体は、細胞によって発現されるキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）に由来するペプチドを提示し得る。あるいは、それは、細胞が発現する様に操作されている別の非内因性タンパク質（例えば、自殺遺伝子、キメラサイトカインレセプター、またはシグナル伝達改変タンパク質）に由来するペプチドを提示し得る。
【００６２】
自殺遺伝子は、許容できない毒性に直面して、養子移入されたＴ細胞の選択的破壊を可能にする遺伝的にコードされた機構である。２つの自殺遺伝子が、臨床研究において試験されている：単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）および誘導性カスパーゼ９（ｉＣａｓｐ９）。本発明の細胞は、例えば、これらの自殺遺伝子のうちの一方、または代替のシステム（例えば、ＷＯ２０１３／１５３３９１、ＷＯ２０１６／１３５４７０またはＷＯ２０１６／１６６５２１に記載されるもののうちの１つ）を発現し得る。
【００６３】
キメラサイトカインレセプターは、細胞へのサイトカインシグナルを提供する。それらは、構成的に活性であり得るか、または腫瘍分泌因子、細胞膜タンパク質もしくはケモカインのような分子によって誘導され得る。キメラサイトカインレセプターの両方のタイプが、ＷＯ２０１７／０２９５１２においてより詳細に記載される。
【００６４】
シグナル伝達改変タンパク質は、例えば、両方のＳＨ２ドメインを含むが、ホスファターゼドメインを欠く短縮されたＳＨＰ−１またはＳＨＰ−２分子であり得る。このようなドミナントネガティブＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２分子は、阻害性免疫レセプター分子（例えば、ＰＤ１）上のｐＩＴＩＭへの結合に関して、内因性ＳＨＰ−１および／またはＳＨＰ−２と競合する。これは、ＳＨＰ−１／ＳＨＰ−２によるＩＴＡＭドメインの脱リン酸化を低減し、それによって、これらの分子によって媒介される免疫活性化の阻害を遮断または低減する。これらおよび他のシグナル伝達改変タンパク質は、ＷＯ２０１６／１９３６９６およびＷＯ２０１８／０９６３６１において記載される。
【００６５】
内因性Ｂ２Ｍポリペプチドは、膜貫通ドメインを含まない。適切なことには、本発明の操作されたＢ２Ｍは、Ｂ２Ｍポリペプチドと細胞内シグナル伝達ドメインを含むエンドドメインとの間に位置した膜貫通ドメインをさらに含む。
【００６６】
その膜貫通ドメインは、細胞膜の中へと挿入し得かつ細胞膜にまたがり得る任意のペプチドドメインであり得る。膜貫通ドメインは、膜の中で熱力学的に安定である任意のタンパク質構造であり得る。これは代表的には、いくつかの疎水性残基を含むαヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインは、本発明の膜貫通部分を供給するために使用され得る。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および全範囲（ｓｐａｎ）は、ＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ−２．０／）を使用して当業者によって決定され得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが比較的単純な構造、すなわち、その膜にまたがるために十分な長さの疎水性αヘリックスを形成すると予測されるポリペプチド配列であるとすると、人工的にデザインされたＴＭドメインがまた使用され得る（米国特許第７０５２９０６  Ｂ１号は、合成膜貫通構成要素を記載する）。例えば、その膜貫通ドメインは、疎水性αヘリックスを含み得る。その膜貫通ドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来し得る。
【００６７】
例示によれば、ＣＤ８αおよびＣＤ２８の膜貫通ドメインは、それぞれ、配列番号２８および配列番号２として示される。
【化２】
2020537521.tif 000003
【００６８】
本発明における使用のための例証的な操作されたＢ２Ｍは、配列番号３として示される。このポリペプチド配列は、Ｂ２Ｍドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ＣＤ３−ζエンドドメインを含む。
【化３】
2020537521.tif 000004
【００６９】
本発明における使用のための操作されたＢ２Ｍポリペプチド配列は、配列番号３として示される配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。その改変体は、ＭＨＣクラスＩタンパク質とアセンブリし、ＭＨＣクラスＩ複合体による生産的ペプチド提示を容易にし、その操作されたＢ２Ｍを含むペプチド／ＭＨＣ複合体へのＴＣＲの結合後に活性化シグナルを伝達する能力を維持する。
【００７０】
配列番号３の改変体は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得るが、ただしその改変体配列は、ＭＨＣクラスＩタンパク質とアセンブリし、ＭＨＣクラスＩ複合体による生産的ペプチド提示を容易にし、その操作されたＢ２Ｍを含むペプチド／ＭＨＣ複合体へのＴＣＲの結合後に活性化シグナルを伝達する能力を保持する。
【００７１】
Ｂ２Ｍ／ＣＤ３連結ポリペプチド
本発明の他の実施形態において、ＭＨＣクラスＩ分子のＢ２Ｍ構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドは、ＴＣＲ複合体の構成要素に連結されたＢ２Ｍポリペプチドである。
【００７２】
ＣＤ３は、細胞傷害性Ｔ細胞およびＴヘルパー細胞の両方の活性化に関与するＴ細胞共レセプターである。それは、４個の別個の鎖から構成されるタンパク質複合体から形成される。本明細書で使用される場合、用語「ＣＤ３複合体」とは、ＣＤ３ζ鎖も含む。哺乳動物では、その複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、および２個のＣＤ３ε鎖を含む。これらの鎖は、ＴＣＲと会合して、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成し得るＴＣＲ複合体を生成する。
【００７３】
そのＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、およびＣＤ３ε鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。多くのアスパラギン酸残基を含むそのＣＤ３鎖の膜貫通領域は、負に荷電しており、これらの鎖が正に荷電したＴＣＲ鎖と会合することを可能にするという特徴である。そのＣＤ３分子の細胞内テールは、免疫レセプターチロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として公知の単一の保存されたモチーフを含み、これは、ＴＣＲシグナル伝達に関与する。
【００７４】
そのＴＣＲ複合体の構成要素に連結されたＢ２Ｍポリペプチドは、ＭＨＣクラスＩ複合体とアセンブリし、ＭＨＣクラスＩ複合体による生産的ペプチド提示を容易にし得る。さらに、ＴＣＲ／ＣＤ３構成要素は、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体とアセンブリし得る。よって、そのＴＣＲ複合体の構成要素に連結されたＢ２Ｍを含むペプチド／ＭＨＣ複合体へのＴＣＲの結合は、そのＢ２Ｍに連結されているＣＤ３構成要素を含むＣＤ３／ＴＣＲ複合体を通じたシグナル伝達を誘発する（図２（ｃ）を参照のこと）。
【００７５】
そのＢ２Ｍポリペプチドは、ＴＣＲまたはＣＤ３複合体の構成要素に連結され得る。適切なことには、そのＢ２Ｍポリペプチドは、可変ドメインを欠く操作されたＴＣＲポリペプチドに連結され得る。例示によれば、そのＢ２Ｍポリペプチドは、操作されたｐｒｅ−Ｔ−α鎖に連結され得る。そのｐｒｅ−Ｔ−α鎖は、胸腺選択の間に発生中のＴ細胞上で発現されかつ可変ドメインを欠く。
【００７６】
操作されたｐｒｅ−Ｔ−α鎖の例示的配列は、配列番号３０として示される。
【化４】
2020537521.tif 000005
【００７７】
そのｐｒｅ−Ｔ−α鎖は、配列番号３０において示されるシグナル配列を欠いていてもよい。
【００７８】
そのｐｒｅ−Ｔ−α鎖の天然のＴＭドメインは、保持され得るか、または非シグナル伝達極性アンカーのうちのＴＭドメイン、ＣＤ３−Ｚのエンドドメインおよび／または共刺激シグナル（例えば、ＣＤ２８および／または４１ＢＢ）で置き換えられ得る。適切なシグナル伝達エンドドメインおよびこれらの組み合わせは、本明細書で記載される。
【００７９】
本発明における使用に適切なＴＣＲ鎖に連結された例示的なＢ２Ｍポリペプチドは、配列番号３１および３２として示される。これらのポリペプチド配列は、ｐｒｅ−Ｔ−α鎖のＮ末端に連結されたＢ２Ｍドメインを含み、それぞれ、天然のｐｒｅ−Ｔ−α膜貫通ドメインまたは４１ＢＢ−ＣＤ３ζシグナル伝達エンドドメインを含む。
【化５】
2020537521.tif 000006
【００８０】
ＴＣＲ複合体の構成要素に連結されかつ本発明における使用に適切なＢ２Ｍポリペプチドは、配列番号３１もしくは３２として示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体は、ＭＨＣクラスＩタンパク質とアセンブリし、ＭＨＣクラスＩ複合体による生産的ペプチド提示を容易にする能力を維持する。それはまた、活性化シグナルが、その操作されたＢ２Ｍを含むペプチド／ＭＨＣ複合体へのＴＣＲの結合後に伝達されることを可能にする。
【００８１】
配列番号３１または配列番号３２の改変体配列は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得るが、ただし、その改変体配列は、ＭＨＣクラスＩタンパク質とアセンブリし、ＭＨＣクラスＩ複合体による生産的ペプチド提示を容易にし、その操作されたＢ２Ｍを含むペプチド／ＭＨＣ複合体へのＴＣＲの結合後に活性化シグナルを伝達する能力を保持する。
【００８２】
適切なことには、そのＢ２Ｍポリペプチドは、ＣＤ３複合体の構成要素に連結される。Ｂ２Ｍポリペプチドが連結されるそのＣＤ３複合体の構成要素は、ＣＤ３−ζ、ＣＤ３−ε、ＣＤ３−γおよびＣＤ３−δから選択され得る。
【００８３】
適切なことには、Ｂ２Ｍポリペプチドが連結されるＣＤ３複合体の構成要素は、ＣＤ３−ζである。
【００８４】
適切なことには、Ｂ２Ｍポリペプチドが連結されるＣＤ３複合体の構成要素は、ＣＤ３−εである。
【００８５】
適切なことには、Ｂ２Ｍポリペプチドが連結されるＣＤ３複合体の構成要素は、ＣＤ３−γである。
【００８６】
適切なことには、Ｂ２Ｍポリペプチドが連結されるＣＤ３複合体の構成要素は、ＣＤ３−δである。
【００８７】
ヒトＣＤ３ζ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３εのアミノ酸配列の例は、それぞれ、配列番号４〜７として示される。本発明における使用のためのＣＤ３ポリペプチド配列は、配列番号４〜７のうちの１つとして示される配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。例えば、その改変体は、配列番号４〜７のうちの１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得る。
【化６】
2020537521.tif 000007
【００８８】
Ｂ２Ｍポリペプチドは、任意の適切な手段によってＣＤ３構成要素に連結され得る。例えば、そのＢ２Ｍポリペプチドは、リンカーペプチドによってＣＤ３複合体の構成要素に融合され得る。
【００８９】
適切なリンカーペプチドは、当該分野で公知である。例えば、適切なリンカーペプチドの範囲は、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  （Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．  ２０１３  Ｏｃｔｏｂｅｒ  １５；  ６５（１０）：  １３５７-１３６９  -  特に表３を参照のこと）によって記載される。
【００９０】
適切なリンカーは、（ＳＧＧＧＧ）ｎ（配列番号２９）であり、これは、配列番号２９の１またはこれより多くのコピーを含む。例えば、適切なリンカーペプチドは、配列番号８として示される。
配列番号８−SGGGGSGGGGSGGGGS
【００９１】
適切なことには、そのＢ２Ｍポリペプチドは、ＣＤ３複合体の構成要素のエクトドメインに連結される。適切なことには、そのＢ２Ｍポリペプチドは、ＣＤ３複合体の構成要素のＮ末端に連結される。
【００９２】
本発明における使用に適切なＣＤ３複合体の構成要素に連結された例示的なＢ２Ｍポリペプチドは、配列番号９および１０として示される。これらのポリペプチド配列は、それぞれ、ＣＤ３εポリペプチドまたはＣＤ３ζポリペプチドのＮ末端に連結されたＢ２Ｍドメインを含む。
【化７】
2020537521.tif 000008
【００９３】
ＣＤ３複合体の構成要素に連結されかつ本発明における使用に適切なＢ２Ｍポリペプチドは、配列番号９または１０として示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体は、ＭＨＣクラスＩタンパク質とアセンブリし、ＭＨＣクラスＩ複合体による生産的ペプチド提示を容易にする能力を維持する。それはまた、活性化シグナルが、その操作されたＢ２Ｍを含むペプチド／ＭＨＣ複合体へのＴＣＲの結合後に伝達されることを可能にする。
【００９４】
配列番号９または配列番号１０の改変体配列は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得るが、ただしその改変体配列は、ＭＨＣクラスＩタンパク質とアセンブリし、ＭＨＣクラスＩ複合体による生産的ペプチド提示を容易にし、その操作されたＢ２Ｍを含むペプチド／ＭＨＣ複合体へのＴＣＲの結合後に活性化シグナルを伝達する能力を保持する。
【００９５】
さらなる独立した局面において、本発明は、本明細書で記載されるＣＤ３複合体の構成要素に連結された操作されたＢ２Ｍポリペプチドを提供する。
【００９６】
本発明は、本明細書で記載されるＣＤ３複合体の構成要素に連結された操作されたＢ２Ｍポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。本発明はまた、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００９７】
さらに、本発明は、ＣＤ３複合体の構成要素に連結された操作されたＢ２Ｍポリペプチドまたは上記操作されたＢ２Ｍポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはベクターを含む細胞を提供する。
【００９８】
二重特異的Ｂ２Ｍ／ＴＣＲ結合分子
本発明のさらなる実施形態において、ＭＨＣクラスＩ分子のＢ２Ｍ構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドは、（ｉ）Ｂ２Ｍポリペプチドに結合し得る第１の結合ドメインおよび（ｉｉ）細胞内シグナル伝達ドメインまたはＣＤ３複合体の構成要素を含むポリペプチドに結合し得る第２の結合ドメインを含む二重特異的ポリペプチドであり得る。
【００９９】
細胞表面上で発現される場合、本発明の二重特異的分子は、ＭＨＣクラスＩおよびＴＣＲを共局在化し、本発明の二重特異的分子によって結合されたペプチド／ＭＨＣ複合体への異なるＴ細胞上のＴＣＲの結合後に、本発明の細胞におけるＴＣＲシグナル伝達を促進する。
【０１００】
二重特異的分子は、多くの異なる形式で開発されている。最も一般的なもののうちの１つは、異なる抗体の２つの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）からなる融合物である。
【０１０１】
本発明の二重特異的分子の第１のおよび／または第２の結合ドメインは、抗体または免疫グロブリンベースの結合ドメインであり得る。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「抗体」とは、少なくとも１つの相補性決定領域ＣＤＲを含む抗原結合部位を有するポリペプチドを意味する。その抗体は、３つのＣＤＲを含み得、ドメイン抗体（ｄＡｂ）のものに等価な抗原結合部位を有し得る。その抗体は、６つのＣＤＲを含み得、古典的な抗体分子のものに等価な抗原結合部位を有し得る。そのペプチドの残りは、その抗原結合部位のための適切な足場を提供しかつその抗原結合部位を、これがその抗原に結合するために適切な様式でディスプレイする任意の配列であり得る。その抗体は、完全免疫グロブリン分子またはその一部（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）フラグメント、ナノボディーまたは単鎖可変ドメイン（これは、３つのＣＤＲを有する、ＶＨ鎖またはＶＬ鎖であり得る））であり得る。その抗体は、二重機能性抗体であり得る。その抗体は、非ヒト、キメラ、ヒト化または完全ヒトであり得る。
【０１０３】
あるいは、本発明の二重特異的分子の第１のおよび／または第２の結合ドメインは、免疫グロブリンに由来しないかまたは免疫グロブリンに基づくドメインを含み得る。多くの「抗体模倣物」デザインの反復タンパク質（ＤＲＰ）は、非抗体ポリペプチドの結合能力を利用するために開発されてきた。このような分子としては、アンキリンまたはロイシンリッチ反復タンパク質、例えば、ＤＡＲＰｉｎｓ（Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ａｎｋｙｒｉｎ  Ｒｅｐｅａｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ、ＡｖｉｍｅｒｓおよびＶｅｒｓａｂｏｄｉｅｓが挙げられる。
【０１０４】
本発明の二重特異的分子の第１の結合ドメインは、Ｂ２Ｍポリペプチドに結合し得る。
【０１０５】
特に、その第１の結合ドメインは、Ｂ２Ｍｂに結合し得る。適切なＢ２Ｍｂ結合ドメインは、当該分野で公知であり、例えば、配列番号１１として示されるポリペプチド配列が挙げられる。
【化８】
2020537521.tif 000009
【０１０６】
このＢ２Ｍｂ結合ドメインは、Ｂｒｏｄｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ；  ９；  ５３６−５４５；  １９７９）およびＰａｒｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．；  ２５８；  ６１７９−６１８６；  １９８３）によって記載されるＢＢＭ１ハイブリドーマから生成され得る。
【０１０７】
その第１の結合ドメインは、配列番号１１として示されるｓｃＦｖ配列に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。
【０１０８】
その第１のドメインは、ｓｃＦｖ配列（例えば、配列番号１１として示されるもの）を含み得る。その第２のドメインは、配列番号１１と少なくとも８０％の配列同一性を有しかつＢ２Ｍ、特に、Ｂ２Ｍｂに結合する、このような配列の改変体を含み得る。
【０１０９】
その第１の結合ドメインは、配列番号１１として示される配列に由来する１またはこれより多くのＣＤＲを含み得る。その第２の結合ドメインは、配列番号１１の重鎖に由来するＣＤＲ３および／または配列番号１１の軽鎖に由来するＣＤＲ３を含み得る。その第２の結合ドメインは、配列番号１１に由来する全６個のＣＤＲを含み得る。配列番号１１に由来するＣＤＲの配列は、以下に示される。
【化９】
2020537521.tif 000010
【０１１０】
その第１の結合ドメインは、配列番号１１に由来するＣＤＲ配列を含むｓｃＦｖを含み得る（配列番号３３〜３８に示されるとおり）。
【０１１１】
単なる例示によれば、Ｂ２Ｍに対する抗体を提供するさらなるハイブリドーマは、Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．；  ９９５）；  ２０７−３１９；  ２００２）によって記載される。Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．によって記載されるＢＢ７．７ハイブリドーマは、可変重鎖配列および２つの可能な可変軽鎖配列で発現することが見出された。その第１の結合ドメインは、そのＢＢ７．７から生成されるｓｃＦＶを含み得る（配列番号３９〜４０として示される）。
【化１０】
2020537521.tif 000011
【０１１２】
その第１の結合ドメインは、配列番号１１、３９もしくは４０として示されるｓｃＦｖ配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有し、Ｂ２Ｍに結合する能力を保持するその改変体を含み得る。
【０１１３】
配列番号１１、３９または４０の改変体配列は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得、配列番号１１、３９または４０として示される配列と等価なまたは改善されたＢ２Ｍ結合能力を有し得る。
【０１１４】
本発明の二重特異的分子の第２のドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインまたはＣＤ３複合体の構成要素を含むポリペプチドに結合し得る。特に、その第２のドメインは、Ｔ細胞表面上のＣＤ３に結合する能力があり得る。この点では、その第２のドメインは、ＣＤ３もしくはＴＣＲ特異的抗体またはその一部を含み得る。
【０１１５】
その第２のドメインは、配列番号１２として示されるｓｃＦｖ配列に由来する相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。
【０１１６】
その第２のドメインは、ｓｃＦｖ配列（例えば、配列番号１２として示されるもの）を含み得る。その第２のドメインは、少なくとも８０％の配列同一性を有しかつＣＤ３に結合する、このような配列の改変体を含み得る。
【０１１７】
その第２のドメインは、ＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその一部（例えば、ＯＫＴ３、ＷＴ３２、抗ｌｅｕ−４、ＵＣＨＴ−１、ＳＰＶ−３ＴＡ、ＴＲ６６、ＳＰＶ−Ｔ３Ｂまたはこれらの親和性が調整された改変体）を含み得る。
【０１１８】
本発明の二重特異的分子の第２のドメインは、モノクローナル抗体ＯＫＴ３（これは、ＦＤＡによって承認された最初のモノクローナル抗体であった）の全てまたは一部を含み得る。ＯＫＴ３は、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  ８００１から入手可能である。その抗体配列は、米国特許第７，３８１，８０３号において公開されている。
【０１１９】
その第２のドメインは、ＯＫＴ３の１またはこれより多くのＣＤＲを含み得る。その第２の結合ドメインは、ＯＫＴ３の重鎖に由来するＣＤＲ３および／またはＯＫＴ３の軽鎖に由来するＣＤＲ３を含み得る。その第２の結合ドメインは、以下で示されるように、ＯＫＴ３の全６個のＣＤＲを含み得る。
【化１１】
2020537521.tif 000012
【０１２０】
その第２の結合ドメインは、ＯＫＴ３に由来するＣＤＲ配列を含むｓｃＦｖを含み得る。その第２の結合ドメインは、配列番号１２もしくは４１として以下で示されるｓｃＦｖ配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有し、ＣＤ３に結合する能力を保持するその改変体を含み得る。
【化１２】
2020537521.tif 000013
【０１２１】
配列番号１２および４１は、本発明における使用に適切なｓｃＦＶの代替の構成を提供する。配列番号１２は、ＶＬ−ＶＨ配置として提供される。配列番号４１は、ＶＨ−ＶＬ配置として提供される。
【０１２２】
配列番号１２または４１の改変体配列は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得、配列番号１２または４１として示される配列と等価なまたは改善されたＣＤ３結合能力を有し得る。
【０１２３】
本発明の二重特異的分子は、その第１のドメインをその第２のドメインと接続しかつその２つのドメインを空間的に分離するスペーサー配列を含み得る。
【０１２４】
例えば、その第１のおよび第２の結合ドメインは、短い５残基のペプチドリンカー（ＧＧＧＧＳ）を介して接続され得る。
【０１２５】
そのスペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークを含み得る。そのリンカーは、代わりに、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインの間隔を空ける特性を有する代替のリンカー配列を含み得る。
【０１２６】
そのスペーサーは、短いスペーサー、例えば、１００未満、８０未満、６０未満または４５未満のアミノ酸を含むスペーサーであってもよい。そのスペーサーは、ＩｇＧ１ヒンジもしくはＣＤ８ストーク、またはこれらの改変されたバージョンであってもよいし、これを含んでもよい。
【０１２７】
これらのリンカーのアミノ酸配列の例は、以下に示される：
【化１３】
2020537521.tif 000014
【０１２８】
そのＣＤ８ストークは、ホモダイマーの形成を誘導し得るようにする配列を有する。これが望ましくない場合、１またはこれより多くのシステイン残基が、ＣＤ８ストーク配列から置き換えられ得るかまたは除去され得る。本発明の二重特異的分子は、配列番号２０として示される配列または少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有するその改変体を含むかまたはこれからなるスペーサーを含み得るが、ただしその改変体配列は、その第１のおよび第２のドメインのほぼ等しい間隔をもたらす分子である、ならびに／またはその改変体配列がその二重特異的分子のホモダイマー化をもたらす。
【０１２９】
本発明の二重特異的分子は、一般式：
第１のドメイン−スペーサー−第２のドメイン
を有し得る。
【０１３０】
そのスペーサーはまた、鎖中断を導入するために、１またはこれより多くのリンカーモチーフを含み得る。鎖中断は、２つの別個のドメインを分離するが、異なる角度での配向を可能にする。このような配列としては、配列ＳＤＰ、および配列ＳＧＧＧＳＤＰ（配列番号２１）が挙げられる。
【０１３１】
そのリンカーは、セリン−グリシンリンカー（例えば、ＳＧＧＧＧＳ（配列番号２２））を含み得る。
【０１３２】
そのスペーサーは、その二重特異的分子が、例えば、そのスペーサー中の１またはこれより多くのシステイン残基の存在（これは、同じスペーサーを含む別の分子とのジスルフィド結合のためのものであり得る）に起因して、ホモダイマーを形成することを引き起こし得る。
【０１３３】
その二重特異的分子は、膜に繋留されていてもよい。言い換えると、その二重特異的分子は、本発明の細胞における発現後に細胞膜に位置されるようにされる、膜貫通ドメインを含み得る。
【０１３４】
例示によれば、その膜貫通ドメインは、本明細書で記載される膜貫通ドメインであり得る。例えば、その膜貫通ドメインは、疎水性αヘリックスを含み得る。その膜貫通ドメインは、ＣＤ８αまたはＣＤ２８に由来し得る。
【０１３５】
例示によれば、ＣＤ８αおよびＣＤ２８の膜貫通ドメインは、それぞれ、配列番号２８または配列番号２として本明細書で示される。
【０１３６】
本発明の二重特異的分子は、一般式：
第１のドメイン−スペーサー−第２のドメイン−膜貫通ドメイン；または
膜貫通ドメイン−第１のドメイン−スペーサー−第２のドメイン
を有し得る。
【０１３７】
本発明における使用に適切な例示的二重特異的分子は、配列番号２３として示される。このポリペプチド配列は、ＣＤ３結合およびドメインおよび膜貫通ドメインに連結されたＢ２Ｍ結合ドメインを含む。
【化１４】
2020537521.tif 000015
【０１３８】
本発明における使用に適切な二重特異的分子は、配列番号２３として示される配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体は、Ｂ２Ｍおよび細胞内シグナル伝達ドメインまたはＣＤ３複合体の構成要素に結合する能力を維持する。本発明の二重特異的分子はまた、活性化シグナルが、その二重特異的分子によって結合されるＢ２Ｍを含むペプチド／ＭＨＣ複合体へのＴＣＲの結合後に伝達されることを可能にする。
【０１３９】
配列番号２３の改変体配列は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得るが、ただしその改変体配列は、Ｂ２Ｍおよび細胞内シグナル伝達ドメインまたはＣＤ３複合体の構成要素に結合する能力を保持し；活性化シグナルが、その二重特異的分子によって結合されるＢ２Ｍを含むペプチド／ＭＨＣ複合体へのＴＣＲの結合後に伝達されることを可能にする。
【０１４０】
さらなる独立した局面において、本発明は、（ｉ）Ｂ２Ｍポリペプチドに結合し得る第１の結合ドメインおよび（ｉｉ）本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメインまたはＣＤ３複合体の構成要素を含むポリペプチドに結合し得る第２の結合ドメインを含む二重特異的分子を提供する。
【０１４１】
本発明は、（ｉ）Ｂ２Ｍポリペプチドに結合し得る第１の結合ドメインおよび（ｉｉ）本明細書で記載される細胞内シグナル伝達ドメインまたはＣＤ３複合体の構成要素を含むポリペプチドに結合し得る第２の結合ドメインを含む二重特異的分子をコードするポリヌクレオチドをさらに提供する。本発明はまた、上記ポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【０１４２】
さらに、本発明は、本明細書で記載される二重特異的分子；または上記操作されたＢ２Ｍポリペプチドをコードするポリヌクレオチドもしくはベクターを含む細胞を提供する。
【０１４３】
細胞内シグナル伝達ドメイン
本発明は、ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内の細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドを提供することを含む。
【０１４４】
細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書で使用される場合、エンドドメインのシグナル伝達部分をいう。
【０１４５】
その細胞内シグナル伝達ドメインは、本発明の細胞において操作されたＢ２Ｍを含むＭＨＣ／ペプチド複合体への反応性Ｔ細胞上に存在するＴＣＲの結合後に本発明の細胞内でシグナル伝達をもたらし得る。
【０１４６】
その細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインであってもよいし、これを含んでもよい。
【０１４７】
その細胞内シグナル伝達ドメインは、１またはこれより多くの免疫レセプターチロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含み得る。ＩＴＡＭは、免疫系のある種の細胞表面タンパク質の細胞質テールにおいて２回反復される４個のアミノ酸の保存された配列である。そのモチーフは、任意の２個の他のアミノ酸によってロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンを含み、記号ＹｘｘＬ／Ｉを与える。２つのこれらの記号は、代表的には、分子（ＹｘｘＬ／Ｉｘ（６−８）ＹｘｘＬ／Ｉ）のテール中の６〜８アミノ酸の間で分離される。
【０１４８】
ＩＴＡＭは、免疫細胞におけるシグナル伝達にとって重要である。よって、それらは、重要な細胞シグナル伝達分子（例えば、ＣＤ３およびＴ細胞レセプター複合体のζ鎖、Ｂ細胞レセプター複合体のＣＤ７９  α鎖およびβ鎖、ならびにある種のＦｃレセプター）のテールにおいて見出される。これらのモチーフ内のチロシン残基は、レセプター分子とそれらのリガンドとの相互作用後にリン酸化され、細胞のシグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のためのドッキング部位を形成する。
【０１４９】
好ましくは、その細胞内シグナル伝達ドメイン構成要素は、ＣＤ３−ζエンドドメイン（これは、３個のＩＴＡＭを含む）を含むか、これから本質的になるか、またはこれからなる。古典的には、そのＣＤ３−ζエンドドメインは、抗原が結合された後に、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達する。しかし、本発明の状況において、そのＣＤ３−ζエンドドメインは、操作されたＢ２Ｍを含むＭＨＣ／ペプチド複合体が、異なるＴ細胞上のＴＣＲに結合した後に、Ｔ細胞へと活性化シグナルを伝達する。
【０１５０】
その細胞内シグナル伝達ドメインは、さらなる共刺激シグナル伝達を含み得る。例えば、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７としても公知）は、ＣＤ３−ζとともに使用され得るか、またはＣＤ２８およびＯＸ４０は、ＣＤ３−ζとともに使用されて、増殖／生存シグナルを伝達し得る。
【０１５１】
よって、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３−ζエンドドメイン単独で、４−１ＢＢ、ＣＤ２８もしくはＯＸ４０エンドドメインから選択される１もしくはこれより多くの共刺激ドメインとの組み合わせで、および／または４−１ＢＢ、ＣＤ２８もしくはＯＸ４０のうちのいくつかもしくは全てとの組み合わせでＣＤ３−ζエンドドメインを含み得る。
【０１５２】
そのエンドドメインは、ＩＣＯＳエンドドメイン、ＣＤ２エンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメイン、またはＣＤ４０エンドドメインのうちの１またはこれより多くを含み得る。
【０１５３】
そのエンドドメインは、配列番号２４〜２７として示される配列または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。少なくとも配列同一性を有するその改変体は、配列番号２４〜２７のうちの１つのシグナル伝達機能を維持する。
【０１５４】
配列番号２４〜２７として示される配列のうちの１つの改変体は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の配列同一性を有し得るが、ただしその改変体配列は、細胞に活性化シグナルを伝達する能力を保持する。
【０１５５】
２つのポリペプチド配列の間のパーセンテージ同一性は、ＢＬＡＳＴ（これは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいて無料で入手可能である）のようなプログラムによって容易に決定され得る。適切なことには、そのパーセンテージ同一性は、その参照配列および／または問い合わせ配列の全体にわたって決定される。
【化１５】
2020537521.tif 000016
【０１５６】
シグナルペプチド
ＭＨＣクラスＩ分子のＢ２Ｍ構成要素と細胞内の細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得る本発明のポリペプチドは、シグナルペプチドを含み得、その結果、そのシグナルペプチドが細胞（例えば、Ｔ細胞）で発現される場合に、その新生タンパク質は、小胞体に、そしてその後、細胞表面（ここでそのタンパク質が発現される）に指向される。
【０１５７】
そのシグナルペプチドのコアは、単一のαヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含み得る。そのシグナルペプチドは、アミノ酸の短い正に荷電したストレッチとともに始まり得、これは、移行の間にそのポリペプチドの適切なトポロジーを強める助けになる。そのシグナルペプチドの末端に、シグナルペプチダーゼによって認識されかつ切断されるアミノ酸のストレッチが代表的には存在する。シグナルペプチダーゼは、移行を完了させる間または移行の完了後のいずれかに切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。その遊離シグナルペプチドは、次いで、特異的プロテアーゼによって消化される。
【０１５８】
細胞
本発明の細胞は、免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞またはサイトカイン誘導キラー細胞）であり得る。
【０１５９】
そのＴ細胞は、α−βＴ細胞またはγ−δＴ細胞であり得る。
【０１６０】
その細胞は、患者自身の末梢血（当事者）に由来してもよいし、ドナー末梢血（提供者）からの造血幹細胞移植の状況にあってもよいし、または関係のないドナー（第三者）からの末梢血であってもよい。例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処置によって、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子で形質導入される前に、活性化および／または拡大され得る。
【０１６１】
あるいは、その細胞は、Ｔ細胞への、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のエキソビボ分化に由来し得る。あるいは、その溶解機能を保持する不死化Ｔ細胞株が使用され得る。
【０１６２】
その細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）であり得る。ＨＳＣは、適切にマッチしたドナーの骨髄から、薬理学的用量のサイトカイン（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）の投与による動員後の末梢血の白血球フェレーシス［末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）］によって、または出産後の胎盤から集められた臍帯血（ＵＣＢ）から、移植のために得られ得る。骨髄、ＰＢＳＣ、またはＵＣＢは、処理することなく移植されてもよいし、そのＨＳＣは、ＣＤ３４表面抗原に対するモノクローナル抗体での免疫選択によって富化されてもよい。
【０１６３】
キメラ抗原レセプター
古典的ＣＡＲ（これは図３に模式的に示される）は、細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）へと細胞該抗原認識（結合因子）を接続するキメラＩ型膜貫通タンパク質である。その結合因子は、代表的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であるが、それは、抗体様抗原結合部位を含む他の形式に、または標的抗原に対するリガンドに基づき得る。スペーサードメインは、その結合因子を膜から離し、適切な配向を可能にするために必要であり得る。使用される一般的スペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサーは、十分であり得る（例えば、抗原に依存して、ＣＤ８α由来のストークおよびさらにはＩｇＧ１ヒンジ単独）。膜貫通ドメインは、細胞膜の中にタンパク質を固定し、スペーサーをエンドドメインへと接続する。
【０１６４】
初期のＣＡＲデザインは、ＦｃεＲ１のγ鎖またはＣＤ３ζのいずれかの細胞内部分に由来するエンドドメインを有した。結論として、これらの第１世代レセプターは、免疫学的シグナル１を伝達し、これはコグネート標的細胞のＴ細胞殺滅を誘発するために十分であったが、Ｔ細胞を十分に活性化して、増殖および生存させなかった。この制限を克服するために、化合物エンドドメインが構築された：  Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部分を、ＣＤ３ζの細胞内部分へと融合すると、抗原認識後に活性化および共刺激シグナルを同時に伝達し得る第２世代のレセプターが生じる。最も一般的に使用される共刺激ドメインは、ＣＤ２８のものである。これは、最も強力な共刺激シグナル−すなわち、免疫学的シグナル２を供給し、これは、Ｔ細胞増殖を誘発する。いくつかのレセプターも記載されており、これらレセプターとしては、ＴＮＦレセプターファミリーエンドドメイン（例えば、生存シグナルを伝達する、最も近く関連するＯＸ４０および４１ＢＢ）が挙げられる。さらにより強力な第３世代ＣＡＲが今や記載されており、これらは、活性化、増殖および生存を伝達し得るエンドドメインを有する。
【０１６５】
ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを使用して、Ｔ細胞に移入され得る。このようにして、多数の抗原特異的Ｔ細胞が、養子細胞移入のために生成され得る。そのＣＡＲが標的抗原に結合する場合、これは、そのＣＡＲが発現されるＴ細胞への活性化シグナルの伝達を生じる。従って、そのＣＡＲは、標的化された抗原を発現する細胞に対してＴ細胞の特異性および細胞傷害性を指向する。
【０１６６】
抗原結合ドメイン
その抗原結合ドメインは、抗原を認識する古典的ＣＡＲの一部である。
【０１６７】
多くの抗原結合ドメインは当該分野で公知であり、これらとしては、抗体、抗体模倣物、およびＴ細胞レセプターの抗原結合部位に基づくものが挙げられる。例えば、その抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体に由来する単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）；標的抗原の天然のリガンド；その標的に対して十分な親和性を有するペプチド；単一ドメイン結合因子（例えば、ｃａｍｅｌｉｄ）；Ｄａｒｐｉｎとして単一の人工結合因子；またはＴ細胞レセプターに由来する１本鎖を含み得る。
【０１６８】
種々の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は、以下の表２に示されるように公知である。本発明において使用される抗原結合ドメインは、その中で示されるＴＡＡに結合し得るドメインであり得る。
【表１】
2020537521.tif 000017
【０１６９】
その抗原結合ドメインは、Ｂ細胞膜抗原（ＢＣＭＡ）および膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド相互作用因子（ＴＡＣＩ）に結合する増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）を含み得る。ＡＰＲＩＬベースの抗原結合ドメインを含むＣＡＲは、ＷＯ２０１５／０５２５３８において記載される。
【０１７０】
膜貫通ドメイン
その膜貫通ドメインは、膜にまたがる古典的ＣＡＲの配列である。それは、疎水性αヘリックスを含み得る。その膜貫通ドメインは、ＣＤ２８に由来し得、これは良好なレセプター安定性を与える。
【０１７１】
シグナルペプチド
そのＣＡＲは、本明細書で記載されるシグナルペプチドをさらに含み得る。
【０１７２】
スペーサードメイン
そのＣＡＲは、その抗原結合ドメインをその膜貫通ドメインと接続するスペーサー配列を含み得る。可撓性のスペーサーは、その抗原結合ドメインが、異なる方向性に配向して、結合を容易にすることを可能にする。
【０１７３】
そのスペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８ストークまたはマウスＣＤ８ストークを含み得る。そのスペーサーは、代わりに、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークと類似の長さおよび／またはドメインの間隔を空ける特性を有する代替のリンカー配列を含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するために質変化され得る。
【０１７４】
細胞内シグナル伝達ドメイン
その細胞内シグナル伝達ドメインは、古典的ＣＡＲのシグナル伝達部分である。
【０１７５】
最も一般的に使用されるシグナル伝達ドメイン構成要素は、ＣＤ３−ζエンドドメインのものであり、これは、３つのＩＴＡＭを含む。これは、抗原が結合した後にそのＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３−ζは、十分に能力のある活性化シグナルを提供しないこともあり、さらなる共刺激シグナル伝達が必要とされ得る。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、増殖／生存シグナルを伝達するために、ＣＤ３−ζとともに使用され得るか、または全３個が一緒に使用され得る（図３Ｂに図示される）。
【０１７６】
トランスジェニックＴ細胞レセプター
そのＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとして抗原のフラグメントを認識することを担うＴ細胞の表面に見出される分子である。
【０１７７】
そのＴＣＲは、２種の異なるタンパク質鎖から構成されるヘテロダイマーである。ヒトでは、Ｔ細胞のうちの９５％において、そのＴＣＲは、アルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖からなる（それぞれ、ＴＲＡおよびＴＲＢによってコードされる）のに対して、Ｔ細胞のうちの５％では、そのＴＣＲは、ガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖からなる（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）。
【０１７８】
そのＴＣＲは、抗原性ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と結合する場合、そのＴリンパ球は、シグナル伝達を通じて活性化される。
【０１７９】
従来の抗体で指向される標的抗原とは対照的に、ＴＣＲによって認識される抗原は、潜在的細胞内タンパク質のアレイ全体を含み得る。これは、そのタンパク質は、処理され、ペプチド／ＭＨＣ複合体として細胞表面に送達される。
【０１８０】
ＴＲＡおよびＴＲＢ遺伝子；またはＴＲＧおよびＴＲＤ遺伝子を、ベクターを使用してその細胞へと人工的に導入することによって、細胞を操作して、異種（すなわち、非天然の）ＴＣＲ分子を発現させることは、可能である。例えば、操作されたＴＣＲのための遺伝子は、自家のＴ細胞へと再導入され得、Ｔ細胞養子療法のために患者へと戻され得る。このような「異種」ＴＣＲはまた、「トランスジェニックＴＣＲ」と本明細書でいわれ得る。
【０１８１】
核酸構築物／核酸配列のキット
本発明は、（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴＣＲをコードする第１の核酸配列；および（ｉｉ）本明細書で規定されるＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含む核酸配列を提供する。
【０１８２】
本発明は、本発明に従う核酸配列を含むキットをさらに提供する。例えば、そのキットは、（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴＣＲをコードする第１の核酸配列；および（ｉｉ）本明細書で規定されるＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含み得る。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」は、互いに同義語であることが意図される。
【０１８４】
多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝コードの縮重の結果として同じポリペプチドをコードし得ることは、当業者によって理解される。さらに、当業者が、慣用的技術を使用して、本明細書で記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行って、そのポリペプチドが発現されるべき任意の特定の宿主性物のコドン使用法を反映させ得ることは、理解されるべきである。
【０１８５】
本発明に従う核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは、１本鎖であっても２本鎖であってもよい。それらはまた、その中に合成ヌクレオチドまたは改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対する改変の多くの異なるタイプが、当該分野で公知である。これらとしては、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３末端’および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が挙げられる。本明細書で記載される使用の目的のために、ポリヌクレオチドは、当該分野で利用可能な任意の方法によって改変され得ることは理解されるべきである。このような改変は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を増強するために行われ得る。
【０１８６】
ヌクレオチド配列に関連する用語「改変体」、「ホモログ」、または「誘導体」とは、その配列からまたはその配列への、１（またはこれより多くの）核酸の、任意の置換、バリエーション、改変、置き換え、欠失または付加を含む。
【０１８７】
共発現部位
共発現部位は、（ｉ）ＣＡＲまたはＴＣＲ；および（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内の細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドの両方の共発現を可能にする核酸配列をいうために、本明細書で使用される。その共発現部位は、切断部位をコードする配列であり得、その結果、その核酸構築物は、切断部位によって繋がれたその２つのポリペプチドを生じる。その切断部位は、自己切断であり得、その結果、そのポリペプチドが生成される場合に、いかなる外部の切断活性の必要性もなしに、そのポリペプチドは、個々のペプチドへと直ぐに切断される。
【０１８８】
その切断部位は、その２つのポリペプチドが分離されることを可能にする任意の配列であり得る。
【０１８９】
用語「切断」とは、本明細書で便宜上使用されるが、その切断部位は、そのペプチドが、古典的な切断以外の機構によって、個々の実体へと分離することを引き起こし得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（以下を参照のこと）については、その「切断」活性：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解または翻訳効果を説明するために種々のモデルが提唱されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２：１０２７−１０４１）。このような「切断」の正確な機構は、その切断部位が、タンパク質をコードする核酸配列の間に配置される場合に、そのタンパク質が別個の実体として発現されることを引き起こす限りにおいて、本発明の目的にとって重要ではない。その切断部位は、フリン切断部位であってもよい。
【０１９０】
フリンは、ズブチリシン様プロプロテインコンベルターゼファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在性の前駆タンパク質を、それらの生物学的に活性な生成物へと処理するプロプロテインコンベルターゼである。フリンは、それらの対形成した塩基性アミノ酸プロセシング部位において前駆タンパク質を効率的に切断し得るカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フリン基質の例としては、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング増殖因子β１前駆体、プロアルブミン、プロ−β−セクレターゼ、膜タイプ−１マトリクスメタロプロテイナーゼ、プロ神経増殖因子およびフォンビレブラント因子のβサブユニットが挙げられる。フリンは、塩基性アミノ酸標的配列（標準的には、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’）の直ぐ下流のタンパク質を切断し、ゴルジ装置において富化される。
【０１９１】
その切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得る。
【０１９２】
ＴＥＶプロテアーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼである、高度に配列特異的なシステインプロテアーゼである。そのプロテアーゼは、その標的切断部位に対して非常に特異的であり、従って、インビトロおよびインビボの両方で融合タンパク質の制御された切断のために頻繁に使用される。そのコンセンサスＴＥＶ切断部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓ（ここで「＼」は、切断されたペプチド結合を示す）である。哺乳動物細胞（例えば、ヒト細胞）は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。従って、本発明の核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含みかつ哺乳動物細胞において発現される実施形態において、外因性ＴＥＶプロテアーゼは、その哺乳動物細胞においても発現されなければならない。
【０１９３】
その切断部位は、自己切断ペプチドをコードし得る。
【０１９４】
「自己切断ペプチド」とは、そのタンパク質および自己切断ペプチドを含むポリペプチドが生成される場合に、その自己切断ペプチドが、いかなる外部の切断活性の必要性もなしに、別個のかつ不連続の第１のおよび第２のポリペプチドへと直ぐに「切断される」かまたは分離されるように機能するペプチドをいう。
【０１９５】
その自己切断ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルスに由来する２Ａ様自己切断ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの主要な２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端での２Ａ「切断」によって媒介される。アフトウイルス（例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルス）では、その２Ａ領域は、約１８アミノ酸の短いセクションであり、これは、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存されたプロリン残基）と一緒になって、それ自体のＣ末端での「切断」を媒介し得る自立因子を表す（Ｄｏｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ  （２００１）（上記のとおり））。
【０１９６】
「２Ａ様」配列は、上記のように、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルスおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｓｐｐ内の反復配列ならびに細菌配列（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）において見出されている。
【０１９７】
共発現する配列は、内部リボソーム進入配列（ＩＲＥＳ）であり得る。その共発現する配列は、内部プロモーターであり得る。
【０１９８】
ベクター
本発明はまた、本発明の１またはこれより多くの核酸配列または核酸構築物を含むベクターまたはベクターのキットを提供する。このようなベクターは、宿主細胞が、ＣＡＲまたはＣＡＲ構成要素、および必要に応じてＣＡＲ活性を調節する因子を発現するように、その宿主細胞へとその核酸配列または構築物を導入するために使用され得る。
【０１９９】
そのベクターは、例えば、プラスミドもしくはウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）、またはトランスポゾンベースのベクターもしくは合成ｍＲＮＡであり得る。
【０２００】
そのベクターは、細胞にトランスフェクトまたは形質導入し得る。
【０２０１】
薬学的組成物
本発明はまた、本発明の複数の細胞、核酸構築物、第１の核酸配列および第２の核酸配列；ベクターまたは第１のおよび第２のベクターを含む薬学的組成物に関する。特に、本発明は、本発明に従う複数の細胞を含む薬学的組成物に関する。
【０２０２】
その薬学的組成物は、薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤または賦形剤をさらに含み得る。その薬学的組成物は、１またはこれより多くのさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を必用に応じて含み得る。このような製剤は、例えば、静脈内注入に適切な形態にあり得る。
【０２０３】
処置方法
本発明は、本発明の細胞を（例えば、上記の薬学的組成物において）被験体に投与する工程を包含する、疾患を処置および／または防止するための方法を提供する。
【０２０４】
疾患を処置するための方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。この点において、その細胞は、既存の疾患または状態を有する被験体に、その疾患と関連する少なくとも１つの症状を少なくする、低減する、もしくは改善する、および／またはその疾患の進行を遅くする、低減するもしくは遮断するために投与され得る。
【０２０５】
疾患を防止するための方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。この点において、その細胞は、その疾患に未だ罹ったことがない被験体および／またはその疾患のいかなる症状も示していない被験体に投与されて、その疾患の原因を防止もしくは減らし得るか、またはその疾患と関連する少なくとも１つの症状の発生を低減もしくは防止し得る。その被験体は、その疾患の素因を有し得るか、またはその疾患を発生させるリスクにあると考えられ得る。
【０２０６】
その方法は、以下の工程を包含し得る：
（ｉ）細胞含有サンプルを単離する工程；
（ｉｉ）このような細胞に、本発明によって提供される核酸配列またはベクターを形質導入またはトランスフェクトする工程；
（ｉｉｉ）  （ｉｉ）の細胞を被験体に投与する工程。
【０２０７】
本発明は、疾患を処置するおよび／または防止するにあたって使用するための本発明の細胞、核酸構築物、第１の核酸配列および第２の核酸配列、ベクター、または第１のおよび第２のベクターを提供する。特に、本発明は、疾患を処置するおよび／または防止するにあたって使用するための本発明の細胞を提供する。
【０２０８】
本発明はまた、疾患の処置および／または防止のための医薬の製造における本発明の細胞、核酸構築物、第１の核酸配列および第２の核酸配列、ベクター、または第１のおよび第２のベクターの使用に関する。特に、本発明は、疾患の処置および／または防止のための医薬の製造における細胞の使用に関する。
【０２０９】
本発明の方法によって処置および／または防止されるべき疾患は、（ｉ）キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）またはトランスジェニックＴＣＲ；および（ｉｉ）ＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドを含む細胞の免疫拒絶であり得る。
【０２１０】
その疾患は、自家の細胞の免疫拒絶または本明細書で記載されるＣＡＲもしくはトランスジェニックＴＣＲをコードする同種異系細胞の免疫拒絶であり得る。
【０２１１】
本発明の方法によって処置および／または防止されるべき疾患は、感染（例えば、ウイルス感染）であり得る。
【０２１２】
本発明の方法はまた、例えば、自己免疫疾患、アレルギー、および移植片対宿主拒絶において、病原性の免疫応答の制御のためのものであり得る。
【０２１３】
その方法は、がん疾患（例えば、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がんおよび甲状腺がん）の処置のためのものであり得る。
【０２１４】
本発明のＣＡＲ細胞は、標的細胞（例えば、がん細胞）を殺滅し得る。その標的細胞は、ＴＡＡの発現、例えば、表１において上記で提供されるＴＡＡの発現によって認識可能であり得る。
【０２１５】
細胞を作製する方法
本発明のＣＡＲまたはトランスジェニックＴＣＲを発現する細胞は、そのＣＡＲまたはＴＣＲ、およびＭＨＣクラスＩ分子のβ２ミクログロブリン構成要素と細胞内の細胞内シグナル伝達ドメインとを共局在化し得るポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡでのトランスフェクションを含む多くの手段のうちの１つによって導入することによって生成され得る。
【０２１６】
本発明の細胞は、
（ｉ）細胞含有サンプルを、被験体または上記で列挙された他の供給源のうちの１つから単離する工程；および
（ｉｉ）その細胞に、インビボまたはエキソビボで、上記で規定される１またはこれより多くの核酸配列または核酸構築物を形質導入またはトランスフェクトする工程
によって作製され得る。
【０２１７】
その細胞は、次いで、精製され得、例えば、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択され得る。
【０２１８】
本開示は、本明細書で開示される例示的な方法および材料によって限定されず、本明細書で介されるものに類似または等価な任意の方法および材料が、本開示の実施形態の実施または試験において使用され得る。数値範囲は、その範囲を規定する数字を含む。別段示されなければ、ぞれぞれ、任意の核酸配列は、左から右へと、５’から３’配向で書かれる；アミノ酸配列は、左から右へと、アミノからカルボキシの配向へと書かれる。
【０２１９】
値の範囲が提供される場合、状況が別段明らかに規定しなければ、その範囲の上限と下限との間の各々の間にある値はまた、その下限の単位の１／１０まで、具体的に開示されることが理解される。任意の述べられた値または述べられた範囲の間にある値と、任意の他の述べられた値またはその述べられた範囲の間にある値との間の各々のより小さな範囲は、本開示内に包含される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して、その範囲の中に包含されてもよいし、排除されてもよく、そのより小さな範囲の中でいずれか一方の境界が含まれる、いずれの境界もそこに含まれない、または両方の境界がそこに含まれる各範囲はまた、その述べられた範囲における任意の具体的に排除される境界に従って、本開示内に包含される。その述べられた範囲がその境界のうちの一方または両方を包含する場合、それらの包含された境界のうちのいずれかまたは両方を排除する範囲はまた、本開示に包含される。
【０２２０】
本明細書および添付の請求項で使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「上記、その、この（ｔｈｅ）」は、状況が別段明らかに規定しなければ、複数形への言及を包含することは注記されなければならない。
【０２２１】
用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」は、本明細書で使用される場合、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、または「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」と同義語であり、包括的または制限のない、かつ追加の記載されていないメンバー、要素または方法の工程を排除しない。用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「から構成される（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ）」はまた、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を包含する。
【０２２２】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に関してのみ提供される。このような刊行物が、ここに添付される請求項に対する先行技術を構成するという認定として解釈されるべきものは本明細書には存在しない。
【０２２３】
本発明は、ここで実施例によってさらに記載される。この実施例は、本発明を実施するにあたって当業者の一助となるように働くことが意味され、本発明の範囲を限定することは如何様にしても意図されない。
【実施例】
【０２２４】
実施例１−混合リンパ球応答アッセイにおいて低減された非自己反応性（ａｌｌｏ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）の実証
混合リンパ球応答（ＭＬＲ）アッセイは、非自己反応性を決定するために使用される古典的アッセイである。正常なドナーＴ細胞に、Ｂ２Ｍ−ＣＤ３−ζエンドドメイン（Ｂ２Ｍ−Ｚ）構築物と共発現されるＣＤ１９  ＣＡＲを発現するレトロウイルスベクターを形質導入する。同じドナーのＴ細胞にまた、ＣＤ１９  ＣＡＲのみを発現したレトロウイルスベクターを形質導入する。これらのＣＡＲ  Ｔ細胞またはＣＡＲ／Ｂ２Ｍ−Ｚ  Ｔ細胞を照射し、ＭＨＣミスマッチの別の正常なドナーのＴ細胞とともに反復して共培養する。そのミスマッチのＴ細胞にトリチウムを負荷する。これは、非自己抗原に応じた計数を可能にする。反復した共培養の後に、そのＣＡＲ  Ｔ細胞は、そのＣＡＲ／Ｂ２Ｍ−Ｚ  Ｔ細胞と比較して、より大きな非自己応答を有する。
【０２２５】
実施例２−免疫適格動物モデルにおける低減した免疫原性の実証
ＣＡＲ  Ｔ細胞カセットを生成する。これは、免疫原性因子（例えば、ＯＶＡタンパク質またはＨＳＶ−ＴＫ）の共発現によって、特に免疫原性である。第２のＣＡＲ  Ｔ細胞カセットでは、同一のＣＡＲおよび免疫原性タンパク質を、Ｂ２Ｍ−Ｚとともに共発現する。マウス脾細胞に、上記の構築物を形質導入する。同系マウスを、低線量全身照射に馴化し、形質導入した脾細胞を注入する。ＣＡＲ  Ｔ細胞の生着および生き残りを、フローサイトメトリーによって決定する。その免疫原性因子に対する免疫応答を、ＥＬＩＳＰＯＴによって決定する。そのＢ２Ｍ−Ｚ構成要素の包含を、生着を増強し、免疫応答を低減するために予測する。
【０２２６】
実施例３−ハプロタイプ同一移入モデルにおける低減した同種異系応答の実証
ＢＡＬＢ／Ｃ  ＢＬＡＣＫ６マウスを交配して、Ｆ１ハイブリッドを生じさせる。Ｆ１ハイブリッドマウスのＴ細胞の生着は通常、ＢａｌＢ／Ｃ  ＭＨＣ分子の認識に起因して、ＢａｌＢ／Ｃマウスへの投与後に、それらの拒絶を生じる。抗マウスＣＤ１９を発現するＦ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞、ならびに抗マウスＣＤ１９  ＣＡＲおよびＢ２ＭＺの両方を発現するＦ１  ＣＡＲ  Ｔ細胞を、低線量全身照射後のＢａｌＢ／Ｃマウスに投与する。生着を、生体発光画像化によって連続的に、およびフローサイトメトリーによる終了後に研究する。
【０２２７】
実施例４−Ｔ細胞におけるβ２ｍキメラ構築物の発現は、ＭＨＣ  Ｉを機能的ＣＡＲへと変える
ＭＨＣクラスＩ分子は、α鎖およびβ２ミクログロブリンから構成されるヘテロダイマーである。内因性ＭＨＣ  Ｉ複合体では、α鎖のみが、細胞膜の中に固定されるが、β２ミクログロブリンは、そのパートナーに非共有結合的に結合される。そのα鎖の膜遠位ドメイン（α１およびα２）は、Ｔ細胞上のペプチド特異的Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）によって認識され得る短いペプチドに結合する溝を形成する。内因性分子とは対照的に、ＭＨＣ  Ｉ  ＣＡＲは、膜貫通ドメインを介して細胞膜へと固定され、シグナル伝達エンドドメインに連結したβ２ミクログロブリンから構成される（図４）。これらの考えられるＭＨＣ  Ｉ  ＣＡＲデザインは、β２ｍキメラ構築物のデザインに依存して可能である（図５）。これらの構築物は、ＣＤ３ζエンドドメインのみを含んでいてもよいし（第１世代）、さらに共刺激ドメイン、４１ＢＢまたはＣＤ２８を含んでいてもよい（第２世代）。
【０２２８】
その３種のβ２ｍキメラ構築物の機能性を試験するために、レトロウイルスを、そのＣＡＲ、ｇａｇ／ｐｏｌおよびエンベロープタンパク質ＲＤ１１４をコードするプラスミドで２９３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトすることによって生成した。３日後に、その上清を採取し、これを使用して、２名の健康な被験体のＰＢＭＣを、レトロネクチン被覆プレートを使用して形質導入した。形質導入の５日後に、ＣＡＲ発現をフローサイトメトリーによって確認した。
【０２２９】
使用したそのＰＢＭＣドナーの両方を、ＤＮＡ配列決定法によって、ＨＬＡ−Ａ０２＋として以前にハプロタイプ決定した。以前に刊行されたように、ＨＬＡ−Ａ０２＋ドナーは、ＨＡ１Ｈペプチドを、ＭＨＣ  Ｉ複合体のそれらのペプチド結合溝へと結合させ得る。従って、組換えＨＡ１Ｈペプチドを用いてこれらのドナーから得たそのＣＡＲ−Ｔ細胞または非形質導入コントロール細胞（ＮＴ）の短時間のインキュベーションは、Ｔ細胞へのそのペプチドの提示を生じる。あるＨＡ１Ｈペプチド濃度範囲（０．０１〜１０μＭ）でパルスしたＣＡＲ−Ｔを、２：１比において、ＨＡ１Ｈ特異的ＴＣＲを発現するように操作されたＳｕｐＴ１細胞とともに共培養した。標的細胞殺滅を、フローサイトメトリーによって２日後にアッセイし、そのＨＡ１Ｈペプチド  ＥＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して各ＣＡＲＴに関して計算した（図６）。同時に、その上清を除去し、サイトカインレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘアッセイによってアッセイした（図７）。
【０２３０】
上記明細書で言及された全ての刊行物は、本明細書に参考として援用される。本発明の記載された方法およびシステムの種々の改変およびバリエーションは、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は、具体的な好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、請求項に記載される本発明が、このような具体的実施形態に過度に限定されるべきではないことは、理解されるべきである。実際に、分子生物学または関連分野の当業者に明らかである、本発明を実行するための記載される態様の種々の改変は、以下の請求項の範囲内にあることは意図される。
【図１】
2020537521.tif 000018
【図２（ａ）】
2020537521.tif 000019
【図２（ｂ）】
2020537521.tif 000020
【図２（ｃ）】
2020537521.tif 000021
【図３】
2020537521.tif 000022
【図４】
2020537521.tif 000023
【図５】
2020537521.tif 000024
【図６】
2020537521.tif 000025
【図７−１】
2020537521.tif 000026
【図７−２】
2020537521.tif 000027
【配列表】
2020537521000001.app
【国際調査報告】
2020537521.tif 000028
2020537521.tif 000029