(57)【要約】  本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、グルカゴンとインスリンを正常なバランスに戻らせる方法に関するとともに、グルカゴンとインスリンを正常なバランスに戻らせるための薬物にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者のグルカゴン分泌を低める方法。
【請求項２】
前記プラスミノーゲンはさらに糖尿病被験者のグルカゴンの発現を低める、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖尿病はＴ１ＤＭまたはＴ２ＤＭである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記プラスミノーゲンは、糖尿病被験者の食後のグルカゴン分泌を低める、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記プラスミノーゲンは、糖尿病被験者の禁食状態下のグルカゴン分泌を低める、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記プラスミノーゲンは、糖尿病被験者の血糖が上昇した状態下にグルカゴン分泌を低め、血糖を正常または正常に近いレベルに戻らせる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記プラスミノーゲンは、被験者のグルカゴンの発現及び／または分泌を低めるとともに、前記インスリンの発現及び／または分泌を促進する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記プラスミノーゲンは、被験者のグルカゴンの発現及び／または分泌を低めるとともに前記インスリンの発現及び／または分泌を促進することにより、被験者の血糖を正常または正常に近いレベルに戻らせる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記プラスミノーゲンはインスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者のインスリン分泌を促進する方法。
【請求項１１】
前記プラスミノーゲンはさらに糖尿病被験者のインスリンの発現を促進する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖尿病はＴ１ＤＭまたはＴ２ＤＭである、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プラスミノーゲンは糖尿病被験者の食後のインスリン分泌を促進する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記プラスミノーゲンは糖尿病被験者の禁食状態下のインスリン分泌を促進する、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記プラスミノーゲンは、糖尿病被験者の応答血糖の上昇により刺激されるインスリン分泌を促進し、血糖を正常または正常に近いレベルに戻らせる、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記プラスミノーゲンは、前記インスリンの発現及び／または分泌を促進するとともに被験者のグルカゴンの発現及び／または分泌を低める、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記プラスミノーゲンは、前記インスリンの発現及び／または分泌を促進するとともに被験者のグルカゴンの発現及び／または分泌を低めることにより、被験者の血糖を正常または正常に近いレベルに戻らせる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の血糖を降下する方法。
【請求項１９】
前記血糖は、血清ブドウ糖レベルと、血清フルクトサミンレベルと、血清糖化ヘモグロビンレベルとからなる群より選ばれる一つ以上のものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記血糖は血清ブドウ糖レベルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記糖尿病はＴ１ＤＭまたはＴ２ＤＭである、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の糖の耐量を高める方法。
【請求項２３】
前記糖尿病はＴ２ＤＭである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の食後の血糖降下を促進する方法。
【請求項２５】
前記プラスミノーゲンを被験者の食前３０分間から１．５時間までの間に投与する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プラスミノーゲンを被験者の食前３０分間から１時間までの間に投与する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者のブドウ糖利用を促進する方法。
【請求項２８】
前記プラスミノーゲンは一種以上のその他の薬物または治療方法と併用することができる、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記プラスミノーゲンは、抗糖尿病薬と、抗心脳血管疾患薬と、抗血栓薬と、抗高血圧薬と、抗血脂薬と、抗凝固薬と、抗感染薬とからなる群より選ばれる一つ以上の薬物と併用することができる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するものである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２において、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を添加、削除及び／または置換したものであり、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ−プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記プラスミノーゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記プラスミノーゲンは、ヒト由来の天然プラスミノーゲンである、請求項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記被験者はヒトである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン。
【請求項４２】
薬学的に許容される担体及び請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンを含む薬物組成物。
【請求項４３】
（ｉ）請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンと、（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための手段（ｍｅａｎｓ）とを含む、予防性または治療性キット。
【請求項４４】
前記手段はシリンジまたはバイアルである、請求項４３に記載のキット。
【請求項４５】
請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するラベルまたはプロトコルをさらに含む、請求項４３または４４に記載のキット。
【請求項４６】
ラベルを含む容器と、
（ｉ）請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン、またはプラスミノーゲンを含む薬物組成物とを含む製品であって、前記ラベルは、請求項１〜４０のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する、製品。
【請求項４７】
その他の薬物を含む、もう一つ以上の部材または容器をさらに含む、請求項４３〜４５のいずれか１項に記載のキット、または請求項４６に記載の製品。
【請求項４８】
前記その他の薬物は、抗糖尿病薬と、抗心脳血管疾患薬と、抗血栓薬と、抗高血圧薬と、抗血脂薬と、抗凝固薬と、抗感染薬とからなる群より選ばれる、請求項４７に記載のキットまたは製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、グルカゴンとインスリンを正常なバランスに戻らせる方法に関するとともに、グルカゴンとインスリンを正常なバランスに戻らせるための薬物にも関する。
【背景技術】
【０００２】
糖尿病（ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ、ＤＭ）はよく見られる、遺伝的傾向のあるブドウ糖の代謝異常と内分泌障害性疾患であり、絶対性または相対性インスリンの分泌不足によって引き起こされる。２０１５年に全世界では４．１５億の糖尿病患者があり、２０４０年までに、糖尿病患者数は６．４２億に達すると予想される［１］。糖尿病は人類の健康を深刻に害する重大な病気の一つである。
【０００３】
糖尿病は主に糖代謝異常及び脂肪、タンパク質などの物質の代謝障害として表され、長期的に高血糖状態にあると、微小血管合併症、糖尿病腎症、糖尿病心筋症、糖尿病神経系病変、糖尿病に伴う皮膚病変、糖尿病合併感染などを含む深刻な糖尿病合併症を招いてしまう。その中で、糖尿病腎症及び糖尿病神経系病変は患者の生活の質に対する影響は巨大であり、害も深刻である。
【０００４】
臨床的によく見られる糖尿病は、１型糖尿病（ｔｙｐｅ  １  ｄｉａｂｅｔｅｓ、Ｔ１ＤＭ）、２型糖尿病（ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ、Ｔ２ＤＭ）、妊娠糖尿病、特殊型糖尿病の４種類に分けられる。その中で、Ｔ１ＤＭとＴ２ＤＭの患者は最も多く、妊娠糖尿病と特殊型糖尿病の患者は比較的に少ない。
【０００５】
Ｔ１ＤＭは遺伝的要因、環境要因（例えば、ウイルス感染、糖尿病を引き起こす化学物質、飲食要因）、及び自己免疫要因に関係すると考えられる。研究によると、Ｔ１ＤＭ関連の遺伝子部位は少なくとも１７個あり、異なる染色体に位置している。環境要因については、Ｔ１ＤＭの発症に影響がある環境要素は、ウイルス感染、糖尿病を引き起こす化学物質、及び飲食要素を含み、中ではウイルス要素が最も重要である。耳下腺炎、風疹ウイルス、巨大細胞ウイルスなどがＴ１ＤＭの発症に関連していることは発見された。そのメカニズムは、ウイルスが膵島β細胞を直接に破壊し、ウイルスが膵島β細胞を損傷した後に自己免疫反応を刺激してさらに膵島β細胞を損傷することにある。糖尿病を引き起こす化学物質としては、アロキサン、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）、ペンタミジンが挙げられ、これらは膵島β細胞に作用して膵島β細胞の破壊を招く。自己免疫要素は体液性免疫と細胞性免疫とを含む。体液性免疫は、患者の血液循環中に多種の抗膵島β細胞の自己抗体が多く存在することとして表される。細胞性免疫は主に、ＨＬＡ−ＤＡ抗原の異常発現と、ＩＬ−２受容体と膵島細胞表面ＨＬＡ−１類抗原の過剰発現とを膵島炎症性浸潤細胞と膵島β細胞の表面に観察でき、外周血のＣＤ４＋／ＣＤ８＋の割合、及びＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＮＦ−γのレベルが上昇することとして表される。これらの要因による病理的変化は膵島β細胞の破壊に集中し、体内のインスリンのレベルが絶対的に低下し、Ｔ１ＤＭを引き起こすので、Ｔ１ＤＭは自己免疫性疾患であると考えられている。
【０００６】
Ｔ２ＤＭは多遺伝子遺伝性疾患であり、その発生は多源性であるとかんがえられ、その中では、環境要因と遺伝的要因が共に作用してインスリン抵抗を引き起こし、生体の抵抗機能によって同じレベル濃度のインスリンが正常レベルの機能を果たせなくなることとして表される。そして、生体は正常な血糖レベルに達するために、インスリンを「低い効率」で使用する状態を緩和するようにインスリンを過剰に分泌することになり、長期に亘って膵島β細胞に対する要求が高まり、最終的には膵島β細胞が「働きすぎ」て自己損傷になってしまい、インスリンの絶対的不足となる。
【０００７】
ＤＭの発症メカニズム
ＤＭの発症メカニズムは複雑であり、主に家族の遺伝傾向、種族異質性、インスリン受容体の欠陥、インスリン受容体の基質による損傷、タンパク質チロシンホスファターゼ関連遺伝子の発現上昇、過度の免疫炎症性反応、脂質毒性、酸化ストレス、及びミトコンドリア損傷などと関連している［２−３］。
【０００８】
１．遊離脂肪酸
遊離脂肪酸レベルの上昇は、インスリン抵抗の発症原因の一つでもあり、インスリン抵抗状態の重要な特徴の一つでもある。遺伝的要因または環境要因の作用下で、血液中の遊離脂肪酸レベルが高くなり、脂肪組織の貯蔵能力を超えるとインスリン抵抗がおこる。研究によると、長期的な高脂食は膵島β細胞の機能異常を引き起こすことになる。その原因として、高脂食は外周インスリン抵抗を引き起こす他、腹腔脂肪含有量を上昇させ、インスリンが脂肪分解を抑制する能力を低下させ、これによって遊離脂肪酸の含有量の上昇を促進し、さらにインスリン受容体及びその基質ＩＲＳ−１、ＩＲＳ−２のチロシンリン酸化を抑制し、Ｐ１３Ｋの活性を抑制し、インスリンシグナル伝達経路が阻害されてインスリン抵抗が形成する。
【０００９】
２．炎症性反応
１）炎症とインスリン抵抗
Ｔ２ＤＭは軽度の非特異性炎性疾患である。近年の研究で示されているように、炎症によるインスリン抵抗の主なメカニズムは、炎性因子とインスリン受容体基質のシグナル伝達が交差し、非特異性炎症による炎性因子がＩＲＳ／ＰＩ３Ｋシグナル経路に対して阻害作用を果たす一方、炎性因子によって活性化された一連のキナーゼがＩＲＳのセリン、スレオニン部位のリン酸化を誘導して正常なチロシンリン酸化を阻害し、最終的にインスリンのシグナル伝達能力が低下してインスリン抵抗が誘発される［２−３］。
【００１０】
ターゲット細胞において、インスリンとその受容体との結合は受容体を活性化させることができ、その後細胞内のシグナル伝達経路では一連の細胞内伝達分子が生じて酵素とカスケード反応してシグナルが細胞内に逐次伝達されて増幅され、シグナルが最後にターゲット器官に伝達されて一連の生物学的効果が生じる。シグナル伝達経路は主に二つあり、一つはＩＲＳ−１−ＰＩ３Ｋ−ＰＫＢ／ＡＫＴルートであり、もう一つはマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（Ｓｈｃ／Ｒａｆ／ＭＡＰＫ）ルートである。一つ目の経路では、まず外因性インスリン及び／ｍたはブドウ糖の刺激の下でインスリンとその受容体とが結合し、受容体の内因性チロシンキナーゼが活性化される。活性化されたチロシンキナーゼは自身のリン酸化を実現すると同時に、インスリン受容体基質ＩＲＳのチロシン部位のリン酸化を誘発する。活性化されたＩＲＳは細胞膜に移り、リン酸チロシン結合領域（ＰＴＢ）によりリン酸チロシンをＩＲＳチロシンキナーゼにアンカーし、チロシンリン酸化されたＩＲＳはそのＳＨ２構造領域を通してＰＩ３Ｋの調節サブユニットＰ８５に募集される。Ｐ８５は、ホスホイノシチドの３リン酸分子と結合し、ホスファチジルイノシトール１リン酸（ＰＩＰ）をホスファチジルイノシトール２リン酸（ＰＩＰ２）とホスファチジルイノシトール３リン酸（ＰＩＰ３）に変換し、これらはインスリンとその他の成長因子の第２のメッセンジャーであり、下流のシグナル分子ホスホイノシチドが頼るプロテインキナーゼー１（ＰＤＫ１）及び（または）プロテインキナーゼｃ（ＰＫＣ）のある亜型のアンカーポイントである。ＰＤＫ１はプロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ、Ａｋｔとも呼ばれる）とある非典型的なＰＫＣ亜型を活性化させることができる。活性化されたＰＫＢは、セリン／スレオニンリン酸化によってグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ＧＳＫ３）を不活性化させる一方、哺乳動物のレパーマイシンターゲットポイント（ｍＴＯＲ）プロテインキナーゼを活性化させ、下流の７０ｋｕ―Ｓ６キナーゼ（ｐ７０Ｓ６Ｋ）のリン酸化活性化を誘導する。ｍＴＯＲプロテインキナーゼは「ＡＴＰ感受器」として、Ｃａ２＋／ｃＡＭＰを通さずにｐ７０Ｓ６Ｋを活性化させ、タンパクの合成を制御し、遺伝子の転写を強化し、膵島β細胞肥大化及びその他の生物効果を促進することができる。ＰＫＢはある  転写因子のセリン／スレオニンリン酸化を直接に誘導して細胞の有糸分裂の発生を促進することができる［４−５］。二つ目の経路では、Ｒａｓの活性化は二つの通路を通じて実現できる。１）活性化されたインスリン受容体はＩＲＳ−２タンパク質を活性化させ、ＩＲＳ−２タンパク質はシグナルをアダプタータンパク質成長因子受容体結合タンパク質２（Ｇｒｂ２）に送り、シグナルタンパク質ＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ｍＳＯＳ）と相互作用し、不活性化させられたＲａｓ−ＧＤＰから変換されたＲａｓ−ＧＴを活性化させてＲａｓの活性化を実現することができる。インスリン受容体の直接な作用により、シグナルタンパク質Ｓｈｃのチロシンリン酸化がされ、そしてＳｈｃとＧｒｂ２とが結合してｍＳＯＳルート経由でＲａｓを活性化させる。活性化されたＲａｓ−ＧＴＰはＲａｆセリンキナーゼ��募集し、ＭＡＰＫキナーゼ、ＭＡＰＫをこの順でリン酸化する。活性化されたＭＡＰＫははその他のプロテインキナーゼを活性化させて遺伝子転写の誘導や細胞アポトーシスの調節制御などの過程に参加させることができる［６］。
【００１１】
ＩＲＳ−１のセリン残基は、ｃ−Ｊｕｎアミノ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、ＩｋＢキナーゼβ（ＩｋＫβ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）−θなどの多種の炎症キナーゼによりリン酸化されることができることは目前に実証されている。セリン３０７部位は、ＪＮＫによりＩＲＳ−１をリン酸化する主要な部位であり、その変異は、ＪＮＫにより誘導されるＩＲＳ−１リン酸化とＴＮＦがインスリンによるＩＲＳ−１チロシンリン酸化に対する抑制作用を消失させることは、ＩＲＳ−１放射免疫分析法により明らかになった。ＪＮＫは、リン酸かされたＩＲＳ−１のセリン３０７により、インスリン受容体基質のチロシンリン酸化を低減し、インスリンシグナルの伝達を抑制する［７］。食事性肥満マウスとоｂ／оｂマウスの肝臓、筋肉、脂肪組織の中のＪＮＫ活性が著しく上昇しているとＨｉｒｏｓｕｍｉらは発見した。遺伝子ノックアウト（ＪＮＫ１−／−）は、食事誘導性肥満マウスのインスリン抵抗現象を弱め、оｂ／оｂマウスの肥満、高血糖、及び高インスリン血症を緩和することができる。肥満マウスの肝臓組織ＩＲＳ−１のセリン３０７部位のリン酸化レベルは、リーンマウスより高いが、遺伝子ノックアウト（ＪＮＫ１−／−）の肥満マウスでは上昇することはないことから、ＩＲＳ−１のセリン３０７部位がＪＮＫの体内作用のターゲットであることが分かる［８］。ＴＮＦαにより肝臓細胞インスリン抵抗を刺激誘起するモデルにおいて、ＪＮＫ阻害剤はセリン３０７のリン酸化を完全に遮断できることは研究によって明らかである。ＩｋＫβは少なくとも二つのルートでインスリンシグナルの伝達を影響することができ、ＩＲＳ−１のＳｅｒ３０７部位のリン酸化を直接に誘導してもよく、ＩｋＢのリン酸化によってＮＦ−ｋＢをさらに活性化させ、多種の炎症因子の発現を刺激することによってインスリン抵抗を間接的に誘発してもよい。
【００１２】
炎症反応は、感染、組織損傷及びストレス反応後に人体免疫システムがこれらの損傷を対抗する防御反応であるとともに、糖尿病、心血管疾患及び腫瘍の病因または発症メカニズムでもある。
【００１３】
１９９３年には、Ｈｏｔｍａｍｉｓｌｉｇｉｌら［９］は動物実験により、インスリン抵抗の肥満ラットの脂肪組織の中で炎症性細胞因子、ＴＮＦ−αのレベルが高いことを証明した。その後、多くの研究者は炎症と肥満、インスリン抵抗との関係を検討し始め、分子の発症メカニズムを研究し始めた。２００６年にＨｏｔｍａｍｉｓｌｉｇｉｌら［１０］は代謝性炎症（ｍｅｔａｂоｌｉｃ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉоｎ）という新しい医学的定義を初めて提案し、この低度の慢性的な全身炎症が主に余分な栄養物質と代謝物質によるものであると強調した。代謝性炎症には、典型的な炎症と類似した分子とシグナルの伝達経路が存在する可能性があり、今まで認識している典型的な炎症とは違い、代謝性炎症には赤、腫れ、熱、痛み、機能障害の症状は存在しない。正常な状況では、生体内の環境は安定しており、炎症と代謝はそれぞれ及び相互に動的なバランスを保っている。生体に代謝障害が起こると、生体のバランス状態が破られ、免疫システムのバランスが崩れ、炎症シグナル伝達経路が刺激され、生体から一連の炎症因子の放出が促進される。一部の炎症因子はさらに自身の炎症反応を拡大し、炎症の滝効果が形成され、さらに生体からインスリン抵抗が発生し、代謝症候群を引き起こす。
【００１４】
ＴＮＦ−αは代謝症候群と密接な関係があることは研究によって証明された。ＴＮＦはカケクチンとも呼ばれ、主に活性化したマクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＴリンパ球から生じるものであり、マクロファージから分泌されるＴＮＦはＴＮＦ−αと呼ばれ、Ｔリンパ球から分泌されるリンパ毒素はＴＮＦ−βと呼ばれる。ＴＮＦ−αの生物学的活性はＴＮＦの全活性の７０％〜９５％を占めているので、よく係わっているＴＮＦは多くの場合ＴＮＦ−αを指す。長年の研究検討を経て、ＴＮＦ−αがインスリン抵抗、自己免疫性疾患、腫瘍、慢性Ｂ型肝炎など多くの病気と関係があることは明らかになっている。インスリン抵抗の発生発展過程においてＴＮＦ−αは極めて重要な役割を果たす。Ｓｗａｒｏｏｐら［１１］はＴ２ＤＭ患者の血清ＴＮＦ−αレベルを５０例検出することにより、Ｔ２ＤＭ患者のＴＮＦ−αレベルが上昇し、ＢＭＩ、空腹インスリンレベル及び定常状態モデルインスリン抵抗性指数（ＨＯＭＡ−ＩＲ）と著しく相関することに至り、ＴＮＦ−αがＴ２ＤＭ発症メカニズムにおいて重要な役割を果たしていることは示唆されている。また、ＴＮＦ−αはインスリン受容体のリン酸化を抑制させることができ、インスリン受容体のリン酸化が抑制されると、グルコース輸送タンパク質の遺伝子発現を減少させることができ、リポタンパク質リパーゼの活性を低下させ、最終的に脂肪分解を引き起こすことができると研究によって指摘されている［１２］。
【００１５】
２）炎症と膵島β細胞のアポトーシス
慢性低度炎症反応は膵島β細胞の機能障害と密接に関係している。β細胞数の減少による膵島β細胞の機能障害はＴ２ＤＭの発症のもう一つの重要な原因であり、β細胞アポトーシスはβ細胞数の減少の最も重要な原因である。遺伝または飲食の原因で、Ｔ２ＤＭ患者にはインスリン抵抗が発生し易く、患者の血糖が上昇し、高血糖の状態はまたＩＬ−６の発生を促進することができる。ＩＬ−６はＧＬＵＴ４発現を減少させ、脂肪細胞のブドウ糖に対する輸送を低下させ、グリコーゲンの合成を阻害し、インスリンの感度を低下させることができるだけではなく、同時に膵島細胞のＩＬ−６の分泌を促進し、悪循環を引き起こすこともできる。高血糖に誘導されるＩＬ−１βは大量に生成し、ＮＦ−ｋＢ、ＭＡＰＫ、Ｆａｓ、ＮＯなどの経路を活性化させることによって膵島細胞のアポトーシが発生し、多種の炎症経路は互いに交差して促進され、膵島細胞のアポトーシスを激化してついに膵島機能の低下を招く［１３］。また、ＩＬ−１βは、白細胞間の相互作用を介在し、しかもＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αなどのその他の細胞因子と互いに影響制約することができ、β細胞の損傷過程で重要な役割を果たしている。Ｔ２ＤＭの血中脂質異常はレプチンなどのホルモン類物質とＩＬ−６レベルを増加させる。レプチンはＩＬ−１βの放出を増加させてβ細胞アポトーシスを誘導することができ、インスリンの分泌をマイナスコントロールすることができる［１４］。ＲＯＳはインスリン抵抗を招く他、膵島β細胞の損傷に対しても作用があり、酸化ストレス状態下で、インスリン遺伝子転写因子の発現及びインスリン結合部位は顕著に減少してインスリンの生成及び分泌に影響を与える。ＴＮＦ−αのようなその他の脂肪細胞因子とレプチンもβ細胞の機能を低下させることができる［１５］。これらの細胞因子の連合作用は、膵島β細胞の機能に対してより顕著な損傷をもたらす。また、一部の炎症因子はインスリン受容体基質２の肝心な部位にも作用し、セリン／スレオニンをリン酸化させ、インスリン受容体基質２の分解を加速し、膵島β細胞のアポトーシスを促進する。
【００１６】
３．酸化ストレス
酸化ストレスはＴ２ＤＭの発生及び発展を引き起こす要素であることは研究によって示されている。酸化ストレスとは、活性酸素（ｒｅａｃｔｉｖｅ  оｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）と活性窒素（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｎｉｔｒоｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＮＳ）の発生と、生体内の抗酸化防御システムの除去との間のバランスが崩れ、ＲＯＳとＲＮＳが過剰に発生して生体組織細胞およびタンパクや核酸などの生体高分子に損傷を与えることをいう［１３］。高血糖は酸化ストレスを引き起こす主因であり、ミトコンドリア電子伝達鎖［１４］、ブドウ糖の自己酸化、多価アルコール経路などのルート［１５］を通して生体内のＲＯＳとＲＮＳ含有量を増加させ、その中で、ミトコンドリア電子伝達鎖はＲＯＳを発生させる主要なルートである。ミトコンドリア電子伝達鎖は主に酵素複合体Ｉ〜ＩＶ、細胞色素ｃおよび補酵素Ｑに係り、酵素複合体ＩとＩＩＩにおいて、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、ヒドロキシルラジカルを含む少量の超酸化物が持続的に生成し、超酸化物不均化酵素、過酸化水素酵素、及びグルタチオン過酸化物酵素は、超酸化物を酸素と水に変換する。しかし、肥満または高血糖の条件下で、超酸化物は大幅に増加し、超酸化物の生成速度がその除去速度を超えたときに酸化ストレスが発生する。
【００１７】
多くの研究［１６−１８］により示されているように、ＲＯＳは直接にβ細胞を損傷し、特に細胞ミトコンドリア構造を破壊し、β細胞のアポトーシスを促進することができる；ＲＯＳはインスリンシグナル伝達経路に影響を与えることでβ細胞の機能を間接的に抑制することができ、例えば、核転写因子ｋＢ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉоｎ  ｆａｃｔоｒ  ｋＢ、ＮＦ−ｋＢ）シグナル経路を活性化してβ細胞の炎症反応を引き起こすことができる；膵臓・十二指腸ホメオボックス因子１（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ａｎｄ  ｄｕоｄｅｎａｌ  ｈоｍｅоｂоｘ  １、ＰＤＸ−１）の核質の転位を抑制し、ミトコンドリアのエネルギー代謝を抑制し、インスリンの合成と分泌などを減少させる。酸化ストレスはＮＦ−ｋＢ経路を通じてβ細胞の損傷を引き起こしてＮＦ−ｋＢはｐ５０とＲｅｌＡとの二サブユニットからなる二量体になり、休止細胞において、抑制タンパクＩｋＢと結合して非活性の三量体として細胞質中に存在し、細胞がストレス、細胞因子、ラジカル、細菌ウイルスなどの刺激に対する応答および遺伝子発現の瞬時調節などに主に関与する［１９］。高血糖に誘発されるＲＯＳは細胞内シグナル伝達を攪乱することによりＮＦ−ｋＢを活性化させ、β細胞の損傷を誘起することは研究によって示されている［２０］。Ｍａｒｉａｐｐａｎら［２１］はピロリジンジチオカルバメート（ＰＤＴＣ）を用いて肥満ｄｂ／ｄｂマウスの体内ＮＦ−ｋＢ発現を抑制した結果、酸化ストレスがマウスのβ細胞ミトコンドリアに対する損傷程度が明らかに軽減されたことを発見した；Ｈоｆｍａｎｎら［２２］は抗酸化薬α−チオクト酸を利用して糖尿病患者を治療した結果、患者体内のＮＦ−ｋＢ活性が顕著に低下し、患者の病状も改善されたことを発見した；Ｅｌｄｏｒら［２３］は遺伝子組み換え技術によりマウスのＮＦ−ｋＢの発現を特異的に抑制し、ＳＴＺ誘導後のマウスの糖尿病発症率を顕著に低下させた。
【００１８】
ＮＦ−ｋＢは多方向核転写因子として、活性化された後、細胞増殖、細胞アポトーシス、炎症および免疫など多くの遺伝子の調節に寄与する［２４］。糖尿病の生体には、ＮＦ−ｋＢは、例えばＩＬ−１（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１）とＭＣＰ−１（ｍｏｎｏｃｙｔｅ／ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）因子などの細胞因子と走化性因子の遺伝子発現を調節することにより、膵島白細胞の増加を引き起こし、β細胞損傷を引き起こす［２５］。また、腫瘍壊死因子α（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  α、ＴＮＦ−α）などの、ＮＦ−ｋＢに調節制御される多くの遺伝子生成物はさらにＮＦ−ｋＢを活性化させ、β細胞損傷を重くする［２６］。
【００１９】
Ｍａｈａｄｅｖら［２７］の研究によると、ＲＯＳはインスリンシグナル伝達に対して調節制御の作用があり、しかもこのような作用は多面性である。インスリンの刺激の下で、生体はＮｏｘ（ＮＡＤＰＨ  ｏｘｉｄａｓｅ）依存メカニズムによって迅速に微量のＲＯＳを生成し、後者は第二のメッセンジャーとして、主に酸化作用によってＰＴＰ１Ｂの活性を抑制してインスリンカスケード反応を促進する［２８］。ＤＰＩ（ｄｉｐｈｅｎｙｌｅｎｅｉｏｄｏｎｉｕｍ）でＮｏｘを抑制した後、インスリンに刺激されるインスリン受容体（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，  ＩｎｓＲ）とインスリン受容体基質（ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ，  ＩＲＳ）のリン酸化が４８％低下した［２９］。Ｌоｈら［３０］の研究によると、生理的なＲＯＳは、インスリンに対する生体の感度を促進することができる。生理状態では、インスリンの刺激による微量のＲＯＳはインスリンの作用を促進するが、長期的に高血糖にあると、生体はミトコンドリア経由で大量のＲＯＳを生成し［３１］、インスリン抵抗を引き起こす。
【００２０】
ＩｎｓＲとＩＲＳはインスリンシグナル伝達経路において重要なシグナル要素である。前者はインスリンシグナル伝達の開始要素であり、ＩＲＳは前者と経路下流要素との接続橋である。酸化ストレスは複数のルートでＩｎｓＲとＩＲＳのリン酸化反応を妨害してインスリンシグナル伝達を阻害することができることは大量の研究によって示されている。ＩＫＫはＮＦ−ｋＢの抑制サブユニットＩｋＢの活性化剤であり、ＲＯＳの刺激の下でＩＫＫはＩｎｓＲとＩＲＳのセリン／スレオニンリン酸化キナーゼとしてＩｎｓＲとＩＲＳにセリンリン酸化をさせることができ、正常なチロシン化が抑制され、インスリンシグナル伝達を阻害する［３２］。Ｂｒｏｗｎｌｅｅ［３３］の研究によると、ＩＫＫはＩＲＳ３０７部位のセリン残基を直接にリン酸化させることができ、ＩＲＳの正常なチロシンリン酸化が弱まり、ＩｎｓＲとＩＲＳとの結合を阻害し、インスリン抵抗を引き起こす。
【００２１】
ＩＫＫの他にも、ＭＡＰＫ家族の複数のメンバーはＩｎｓＲとＩＲＳに対して影響がある。ＪＮＫ、細胞外調整プロテインキナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ，  ＥＲＫ）およびｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ３８  ＭＡＰＫ）はＭＡＰＫ家族のメンバーであり、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性を持ち、酸化ストレス、細胞因子およびＧ−タンパク質共役型受容体作動剤などの作用下で活性化させられることができる。多くの研究によると、ＪＮＫ、ＥＲＫおよびｐ３８ＭＡＰＫの活性化は、ＩｎｓＲとＩＲＳのセリン／スレオニンのリン酸化程度を重くし、ＩｎｓＲとＩＲＳとの間のタンパク結合能力、およびＩＲＳ活性化下流にＳＨ−２構造領域を含むシグナル分子の能力を低下させることができる［３４−３６］。
【００２２】
糖尿病の高糖状態による酸化ストレスは、多種の慢性合併症が形成する重要な原因の一つであり、ＤＮＡ損傷を誘発する重要な要素でもある［３７］。糖尿病が発生すると、細胞外液に持続的な高糖が見える。この状態下で、ミトコンドリア電子伝達鎖によって発生する電子は明らかに増え、過剰なＲＯＳが生成し、細胞内環境と脂質、タンパク質とＤＮＡなどの生体高分子に損傷を与える。生体が有酸素代謝ルートで発生する活性酸素は突然変異誘導剤として、ＤＮＡ連鎖上のグアニンを８−ヒドロキシデオキシグアノシン（８−ｈｙｄｒоｘｙ−２’−ｄｅоｘｙｇｕａｎоｓｉｎｅ、８−ＯＨｄＧ）に酸化することができる。ＤＮＡ複製過程において、８−ＯＨｄＧはアデニンとミスマッチングしがちであり、Ｇ：ＣからＴ：Ａへの転換型突然変異を引き起こしてＤＮＡ損傷をもたらす。また、ＲＯＳは、ＤＮＡ鎖の破壊、ＤＮＡ部位の突然変異、ＤＮＡ二重鎖の歪み、がん原遺伝子と腫瘍抑制遺伝子の突然変異などを含むその他の形のＤＮＡ損傷を引き起こす。また、ＤＮＡ損傷はＲＯＳおよび酸化ストレス過程を激化させる可能性があり、例えば、ＤＮＡ損傷はＨ２ＡＸ−還元型補酵素ＩＩ酸化酵素１（Ｎｏｘ１）／Ｒａｃ１経路によってＲＯＳを誘発することができる。ＲＯＳはさらに大量のＣａ２＋をミトコンドリアに入らせ、細胞の壊死とアポトーシスを引き起こし、あるいはミトコンドリアを直接に損傷してミトコンドリアの機能障害を引き起こし、さらに膵島β細胞を損傷し、糖尿病の病理的過程を悪化させる［３８］。
【００２３】
ＲＯＳはインスリン抵抗を引き起こす他、膵島β細胞の損傷に対しても作用があり、酸化ストレスの状態下で、インスリン遺伝子転写因子の発現及びインスリン結合部位は明らかに減少してインスリンの発生及び分泌に影響を与える。ＴＮＦ−αのようなその他の脂肪細胞因子もβ細胞の機能を低下させることができる［１５］。これらの細胞因子の連合作用は、膵島β細胞の機能に対してより顕著な損傷をもたらす。また、一部の炎症因子はインスリン受容体基質２の肝心な部位にも作用し、セリン／スレオニンをリン酸化させ、インスリン受容体基質２の分解を加速し、膵島β細胞のアポトーシスを促進することができる。
【００２４】
以上から分かるように、糖尿病の発生と発展の過程における酸化ストレスの役割は非常に複雑である。ＲＯＳは膵島β細胞を直接に損傷する他、シグナル分子としてあるストレス感受性経路を活性化させ、相関因子の発現を調節し、β細胞のアポトーシスまたは壊死を引き起こし、インスリン分泌を抑制、インスリン抵抗を誘発し、最終的に糖尿病を誘発または激化し得る。
【００２５】
ＤＭの治療
糖尿病について通常は薬物治療は採用され、伝統的な薬物治療は、インスリン類の薬物と経口類の血糖降下薬を含む。
【００２６】
早期にはインスリンは主に豚や牛などの動物の膵臓から抽出され、人体に適用されると明らかなアレルギー反応が発生した。２０世紀９０年代になるとますます成熟してきて、インスリンの類似物は次第に応用されてきている。このようなインスリンは伝統的なインスリンの薬物動態学を顕著に変えることができ、低血糖の発生率が低く、効果が速く、作用が長持ちであるなどの利点を持っている。現在、インスリン製剤に対する探索が進むにつれて、一部の経口類インスリン製剤はすでに試験段階に入っているが、技術的には難点があるため、いまだに臨床に適用される効果的な経口製剤はない。
【００２７】
伝統的な経口類血糖降下薬は多く、一般的には下記のようなものが挙げられる。（１）メトホルミンのようなビグアナイド系。メトホルミンは心血管を保護する良好な作用があり、血糖降下効果も悪くない。現在、多くの国でＴ２ＤＭを治療する第一線の薬物として用いられている。（２）スルホニル尿素系：スルホニル尿素系はインスリン分泌促進剤の一種であり、膵島β細胞を刺激してインスリンを分泌させ、血糖レベルを改善する効果がある。現在、中国では市販が許可されているこの種類のインスリンは主にグリメピリド、グリベンクラミド、グリピジド、グリクラジド、グリキドンなどがあるが、このような薬物を長期的に服用すると血糖降下効果が失敗する可能性があり、低血糖と体質量の増加などの合併症が発生しやすいことはいくつかの研究より明らかになった。（３）チアゾリジンジオン（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ＴＺＤ）系。１９９９年にＦＤＡは、ロシグリタゾンとピオグリタゾンのＴ２ＤＭにおける使用を承認し、前者は心臓病のリスクを増やす可能性があるため、その後第二線治療薬物としてその使用が制限されるとともに、心不全症における使用は禁止された。２０１３年６月にＦＤＡはロシグリタゾンを新たに審査した結果、この薬物が引き続き臨床に使用できることを指摘し、さらにこの薬物およびその合成調合剤の使用を緩しまたは完全に禁止を解除した。（４）α−グリコシダーゼ阻害剤：このようなインスリンは腸の粘膜上皮細胞のグリコシダーゼを抑制し、さらに炭水化物の吸収作用を緩和し、食後の血糖レベルを低下させる。常用のこのような薬物として、ボグリボース、アカルボース、ミグリトールなどが挙げられる。
【００２８】
現段階で糖尿病を治療する薬物は主に伝統的な糖尿病薬物であり、スルホニル尿素系、グリニド系、ビグアナイド系、チアゾリジンジオン（ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，ＴＺＤ）系、α−グルコシダーゼ阻害剤およびインスリンなどを含む。これらの薬物はいずれも、低血糖、胃腸障害、肥満などの異なる程度の不良反応がある。糖尿病の基礎理論に対する研究が進むにつれて、伝統的な血糖降下薬の副作用を避けて膵島β細胞に保護作用をもたらすために、人々は積極的に糖尿病治療の新しいターゲットを探している。現在、糖尿病の発症メカニズムに関連するターゲットは主に、グルカゴン様ペプチド−１（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１，ＧＬＰ−１）、ジペプチドペプチダーゼ−４（ｄｉｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４，ＤＰＰ−４）、ナトリウム・グルコース共輸送体−２（ｓｏｄｉｕｍ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｃｏｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ−２，ＳＧＬＴ−２）、グリコーゲン合成酵素キナーゼ−３（ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ−３，ＧＳＫ−３）、タンパク質チロシンホスファターゼ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅｓ，ＰＴＰ）、グルコキナーゼ（ｇｌｕｃｏｋｉｎａｓｅ，ＧＫ）などを含む。その中で、グルカゴン様ペプチド−１（ｇｌｕｃａｇｏｎ−ｌｉｋｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ−１，ＧＬＰ−１）類似物、ＧＬＰ−１受容体作動剤およびジぺプチジルペプチダーゼ−４（ｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌ  ｐｅｐｔｉｄａｓｅ−４，ＤＰＰ−４）阻害剤のようなグルカゴンの調整に基づく薬物は、効果的に血糖の安定性を維持し、β細胞の機能を改善し、糖尿病の発展を遅らせ、さらに糖尿病の病症過程を逆転することができると考えられている。
【００２９】
いまだに糖尿病を完全に治癒できる効果的な薬物または手段はなく、現在の薬物による治療は主に、血糖を一定の範囲内にコントロールすることで合併症の発生を低くして遅らせることにある。糖尿病の発症メカニズムに対する理解がより深く、全面的になるにつれて、糖尿病の治療薬についての研究も、伝統的なメカニズムを有する薬物についての研究から新しいターゲットと新しい作用メカニズムを有する薬物についての研究へ移行している。例えば、ＧＬＰ−１受容体作動剤、ＤＰＰ−４阻害剤、及びＳＧＬＴ−２阻害剤など、一部はすでに市販されており、ＧＰＲ１１９受容体作動剤、１１β−ＨＳＤ１阻害剤、ＰＴＰ１Ｂ阻害剤およびＧＫ作動剤など、一部の薬物は臨床または臨床前研究段階にあり、その治療効果と安全性について臨床的に検証する必要がある。近年来、新しいターゲット抗糖尿病薬の登場はＤＭ治療により多くの選択を提供しているが、糖尿病の発症メカニズムが複雑であるため、係るホルモン、酵素および受容体は多く、新薬の研究分野では、シングルターゲット薬の作用範囲が狭く、血糖降下作用が弱く、全身システムに作用して不良反応を引き起こすなどの問題があり、更なる研究が必要である。そのため、糖尿病の発症メカニズムの多くの方面に作用でき、より効果的な治療薬を探す必要がある。
【００３０】
プラスミノーゲンは、糖尿病実験のマウスの膵臓組織の損傷を軽減し、炎症を抑制し、膵島β細胞のアポトーシスを減少させ、膵臓組織を修復し、膵島β細胞の分泌機能を回復し、血糖を降下することができ、糖尿病の発症メカニズムの多くの方面に全面的に対する新しい薬物となる見込みがあることは、本発明により発見された。
【発明の概要】
【００３１】
本発明は下記項に係る。
【００３２】
１．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者のグルカゴン分泌を低める方法。
【００３３】
２．前記プラスミノーゲンはさらに糖尿病被験者のグルカゴンの発現を低める、項１に記載の方法。
【００３４】
３．前記糖尿病はＴ１ＤＭまたはＴ２ＤＭである、項１または２に記載の方法。
【００３５】
４．前記プラスミノーゲンは、糖尿病被験者の食後のグルカゴン分泌を低める、項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【００３６】
５．前記プラスミノーゲンは、糖尿病被験者の禁食状態下のグルカゴン分泌を低める、項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【００３７】
６．前記プラスミノーゲンは、糖尿病被験者の血糖が上昇した状態下にグルカゴン分泌を低め、血糖を正常または正常に近いレベルに戻らせる、項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【００３８】
７．前記プラスミノーゲンは、被験者のグルカゴンの発現及び／または分泌を低めるとともに、前記インスリンの発現及び／または分泌を促進する、項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【００３９】
８．前記プラスミノーゲンは、被験者のグルカゴンの発現及び／または分泌を低めるとともに前記インスリンの発現及び／または分泌を促進することにより、被験者の血糖を正常または正常に近いレベルに戻らせる、項７に記載の方法。
【００４０】
９．前記プラスミノーゲンはインスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進する、項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【００４１】
１０．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者のインスリン分泌を促進する方法。
【００４２】
１１．前記プラスミノーゲンはさらに糖尿病被験者のインスリンの発現を促進する、項１０に記載の方法。
【００４３】
１２．前記糖尿病はＴ１ＤＭまたはＴ２ＤＭである、項１０または１１に記載の方法。
【００４４】
１３．前記プラスミノーゲンは糖尿病被験者の食後のインスリン分泌を促進する、項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【００４５】
１４．前記プラスミノーゲンは糖尿病被験者の禁食状態下のインスリン分泌を促進する、項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【００４６】
１５．前記プラスミノーゲンは、糖尿病被験者の応答血糖の上昇により刺激されるインスリン分泌を促進し、血糖を正常または正常に近いレベルに戻らせる、項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【００４７】
１６．前記プラスミノーゲンは、前記インスリンの発現及び／または分泌を促進するとともに被験者のグルカゴンの発現及び／または分泌を低める、項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【００４８】
１７．前記プラスミノーゲンは、前記インスリンの発現及び／または分泌を促進するとともに被験者のグルカゴンの発現及び／または分泌を低めることにより、被験者の血糖を正常または正常に近いレベルに戻らせる、項１６に記載の方法。
【００４９】
１８．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の血糖を降下する方法。
【００５０】
１９．前記血糖は、血清ブドウ糖レベルと、血清フルクトサミンレベルと、血清糖化ヘモグロビンレベルとからなる群より選ばれる一つ以上のものである、項１８に記載の方法。
【００５１】
２０．前記血糖は血清ブドウ糖レベルである、項１９に記載の方法。
【００５２】
２１．前記糖尿病はＴ１ＤＭまたはＴ２ＤＭである、項１８〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【００５３】
２２．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の糖の耐量を高める方法。
【００５４】
２３．前記糖尿病はＴ２ＤＭである、項２２に記載の方法。
【００５５】
２４．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の食後の血糖降下を促進する方法。
【００５６】
２５．前記プラスミノーゲンを被験者の食前３０分間から１．５時間までの間に投与する、項２４に記載の方法。
【００５７】
２６．前記プラスミノーゲンを被験者の食前３０分間から１時間までの間に投与する、項２５に記載の方法。
【００５８】
２７．被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者のブドウ糖利用を促進する方法。
【００５９】
２８．前記プラスミノーゲンは一種以上のその他の薬物または治療方法と併用することができる、項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【００６０】
２９．前記プラスミノーゲンは、抗糖尿病薬と、抗心脳血管疾患薬と、抗血栓薬と、抗高血圧薬と、抗血脂薬と、抗凝固薬と、抗感染薬とからなる群より選ばれる一つ以上の薬物と併用することができる、項２８に記載の方法。
【００６１】
３０．前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するものである、項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【００６２】
３１．前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２において、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を添加、削除及び／または置換したものであり、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【００６３】
３２．前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である、項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【００６４】
３３．前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ−プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である、項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【００６５】
３４．前記プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【００６６】
３５．前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである、項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【００６７】
３６．前記プラスミノーゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである、項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【００６８】
３７．前記プラスミノーゲンは、ヒト由来の天然プラスミノーゲンである、項１〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【００６９】
３８．前記被験者はヒトである、項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【００７０】
３９．前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している、項１〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【００７１】
４０．前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である、項１〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【００７２】
４１．項１〜４０のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン。
【００７３】
４２．薬学的に許容される担体及び項１〜４０のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンを含む薬物組成物。
【００７４】
４３．（ｉ）項１〜４０のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンと、（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための手段（ｍｅａｎｓ）とを含む、予防性または治療性キット。
【００７５】
４４．前記手段はシリンジまたはバイアルである、項４３に記載のキット。
【００７６】
４５．項１〜４０のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するラベルまたはプロトコルをさらに含む、項４３または４４に記載のキット。
【００７７】
４６．ラベルを含む容器と、
（ｉ）項１〜４０のいずれか１項に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン、またはプラスミノーゲンを含む薬物組成物とを含む製品であって、前記ラベルは、項１〜４０のいずれか１項に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する、製品。
【００７８】
４７．その他の薬物を含む、もう一つ以上の部材または容器をさらに含む、項４３〜４５のいずれか１項に記載のキット、または項４６に記載の製品。
【００７９】
４８．前記その他の薬物は、抗糖尿病薬と、抗心脳血管疾患薬と、抗血栓薬と、抗高血圧薬と、抗血脂薬と、抗凝固薬と、抗感染薬とからなる群より選ばれる、項４７に記載のキットまたは製品。
【００８０】
一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のフィブリンプラスミノーゲンまたはプラスミンを投与することを含む、糖尿病を予防及び治療する方法に係る。
【００８１】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の血糖を降下する方法に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の血糖降下におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の血糖を降下する薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明は、糖尿病被験者の血糖降下に用いられるプラスミノーゲンに係る。一部の実施形態において、前記血糖は、血清ブドウ糖レベルと、血清フルクトサミンレベルと、血清糖化ヘモグロビンレベルとからなる群より選ばれる一つ以上のものである。もう一部の実施形態において、前記血糖は血清ブドウ糖レベルである。上記実施形態において、前記糖尿病はＴ１ＤＭまたはＴ２ＤＭである。
【００８２】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の糖の耐量を高める方法に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の糖の耐量の向上におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の糖の耐量を高める薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、糖尿病被験者の糖の耐量の向上に用いられるプラスミノーゲンに係る。一部の実施形態において、前記糖尿病はＴ２ＤＭである。
【００８３】
一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の食後の血糖降下を促進する方法に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の食後の血糖降下の促進におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の食後の血糖を降下する薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、糖尿病被験者の食後の血糖低下の促進に用いられるプラスミノーゲンに係る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンを被験者の食前３０分間から１．５時間までの間に投与する。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンを被験者の食前３０分間から１時間までの間に投与する。
【００８４】
一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者のブドウ糖利用を促進する方法に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者のブドウ糖利用の促進におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者のブドウ糖利用を促進する薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、糖尿病被験者のブドウ糖利用を促進するために用いられるプラスミノーゲンに係る。もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者のインスリン分泌を促進する方法に係る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはさらに糖尿病被験者のインスリンの発現を促進する。上記実施形態において、前記糖尿病はＴ１ＤＭまたはＴ２ＤＭである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは糖尿病被験者の食後のインスリン分泌を促進する。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは糖尿病被験者の禁食状態下のインスリン分泌を促進する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、糖尿病被験者の応答血糖の上昇により刺激されるインスリン分泌を促進し、血糖を正常または正常に近いレベルに戻らせる。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、前記インスリンの発現及び／または分泌を促進するとともに被験者のグルカゴンの発現及び／または分泌を低め、具体的には、前記プラスミノーゲンは、前記インスリンの発現及び／または分泌を促進するとともに被験者のグルカゴンの発現及び／または分泌を低めることにより、被験者の血糖を正常または正常に近いレベルに戻らせる。
【００８５】
一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者のグルカゴン分泌を低める方法に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者のグルカゴン分泌を低めることにおけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者のグルカゴン分泌を低める薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、糖尿病被験者のグルカゴン分泌を低めるために用いられるプラスミノーゲンに係る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはさらに糖尿病被験者のグルカゴンの発現を低める。上記実施形態において、前記糖尿病はＴ１ＤＭまたはＴ２ＤＭである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、糖尿病被験者の食後のグルカゴン分泌を低める。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、糖尿病被験者の禁食状態下のグルカゴン分泌を低める。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、糖尿病被験者の血糖が上昇した状態下にグルカゴン分泌を低め、血糖を正常または正常に近いレベルに戻らせる。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、糖尿病被験者の血糖が上昇した状態下にグルカゴン分泌を低め、血糖を正常または正常に近いレベルに戻らせる。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、被験者のグルカゴンの発現及び／または分泌を低めるとともに、前記インスリンの発現及び／または分泌を促進し、具体的には、前記プラスミノーゲンは、被験者のグルカゴンの発現及び／または分泌を低めるとともに前記インスリンの発現及び／または分泌を促進することにより、被験者の血糖を正常または正常に近いレベルに戻らせる。上記実施形態において、前記プラスミノーゲンはインスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進する。
【００８６】
一つの局面において、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の膵島細胞損傷の修復を促進する方法に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の膵島細胞損傷の修復を促進することにおけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の膵島細胞損傷の修復を促進する薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、糖尿病被験者の膵島細胞損傷の修復を促進するために用いられるプラスミノーゲンに係る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンはインスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進する。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは細胞因子ＴＮＦ−αの発現を促進する。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは被験者の多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進する。一部の実施形態において、前記膵島細胞の損傷は、膵島β細胞の合成及びインスリン分泌の機能損傷、膵島組織構造の損傷、膵島コラーゲンの沈着、膵島の繊維化、膵島細胞のアポトーシス、膵島が分泌するグルカゴンとインスリンのバランス障害、膵島が分泌するグルカゴンとインスリンのレベルが被験者の血糖レベルに適応できないことからなる群より選ばれる一つ以上である。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、前記糖尿病被験者のグルカゴン分泌を減少させ、インスリン分泌を増加させ、具体的には、前記膵島グルカゴンとインスリン分泌の正常なバランスが修復される。
【００８７】
もう一つの局面において、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、被験者の膵島を保護する方法に係る。本発明はさらに、被験者の膵島の保護におけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、被験者の膵島を保護する薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、被験者の膵島を保護するために用いられるプラスミノーゲンに係る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは膵島コラーゲンの沈着を減少させる。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは膵島の繊維化を軽減する。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは膵島細胞のアポトーシスを抑制する。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは膵島インスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進する。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは膵島炎症の修復を促進する。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは細胞因子ＴＮＦ−αの発現を促進する。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは被験者の多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進する。上記実施形態において、前記被験者は糖尿病患者であり、具体的には、前記糖尿病患者はＴ１ＤＭまたはＴ２ＤＭである。一部の実施形態において、前記Ｔ１ＤＭ被験者はＰＬＧ活性が正常な被験者またはＰＬＧ活性が損傷された被験者である。
【００８８】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の膵島の炎症の修復を促進する方法に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の膵島の炎症の修復を促進することにおけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の膵島の炎症の修復を促進する薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、糖尿病被験者の膵島の炎症の修復を促進するプラスミノーゲンに係る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは細胞因子ＴＮＦ−αの発現を促進する。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは被験者の多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進する。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは膵島コラーゲンの沈着を減少させる。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは膵島の繊維化を軽減する。もう一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは膵島細胞のアポトーシスを抑制する。上記実施形態において、前記糖尿病患者はＴ１ＤＭまたはＴ２ＤＭであり、具体的には、前記Ｔ１ＤＭ被験者はＰＬＧ活性が正常な被験者またはＰＬＧ活性が損傷された被験者である。
【００８９】
一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の細胞因子ＴＮＦ−αの発現を促進する方法に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の細胞因子ＴＮＦ−αの発現を促進することにおけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の細胞因子ＴＮＦ−αの発現を促進する薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、糖尿病被験者の細胞因子ＴＮＦ−αの発現を促進するために用いられるプラスミノーゲンに係る。
【００９０】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進する方法に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することにおけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進する薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。
【００９１】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、膵島インスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進する方法に係る。本発明はさらに、膵島インスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進することにおけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、膵島インスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進する薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、膵島インスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進するために用いられるプラスミノーゲンに係る。
【００９２】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与してインスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進することを含む、糖尿病被験者のインスリン分泌を促進する方法に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者のインスリン分泌を促進することにおけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者のインスリン分泌を促進する薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、糖尿病被験者のインスリン分泌を促進するために用いられるプラスミノーゲンに係る。
【００９３】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、糖尿病被験者の膵島β細胞数の増加を促進する方法に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の膵島β細胞数の増加を促進することにおけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、糖尿病被験者の膵島β細胞数の増加を促進する薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、糖尿病被験者の膵島β細胞数の増加を促進するために用いられるプラスミノーゲンに係る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、インスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進する。
【００９４】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、膵島β細胞のアポトーシスを減少させる方法に係る。本発明はさらに、膵島β細胞のアポトーシスを減少させることにおけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、膵島β細胞のアポトーシスを減少させる薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、膵島β細胞のアポトーシスを減少させるために用いられるプラスミノーゲンに係る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、インスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進する。
【００９５】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、膵島β細胞の損傷の修復を促進する方法に係る。本発明はさらに、膵島β細胞の損傷の修復を促進することにおけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、膵島β細胞の損傷の修復を促進する薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、膵島β細胞の損傷の修復を促進するために用いられるプラスミノーゲンに係る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、インスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進する。
【００９６】
もう一つの局面において、本発明は、被験者に有効量のプラスミノーゲンを投与することを含む、膵島β細胞の機能の回復を促進する方法に係る。本発明はさらに、膵島β細胞の機能の回復を促進することにおけるプラスミノーゲンの用途に係る。本発明はさらに、膵島β細胞の機能の回復を促進する薬物の製造におけるプラスミノーゲンの用途に係る。また、本発明はさらに、膵島β細胞の機能の回復を促進するために用いられるプラスミノーゲンに係る。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、インスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進する。
【００９７】
上記実施形態において、前記プラスミノーゲンは一種以上のその他の薬物または治療方法と併用することができる。具体的には、前記プラスミノーゲンは、抗糖尿病薬と、抗心脳血管疾患薬と、抗血栓薬と、抗高血圧薬と、抗血脂薬と、抗凝固薬と、抗感染薬とからなる群より選ばれる一つ以上の薬物と併用することができる。
【００９８】
上記実施形態において、前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するものである。
【００９９】
上記実施形態において、前記プラスミノーゲンのアミノ酸は、例えば配列２、６、８、１０または１２に示される。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは配列２、６、８、１０または１２において、１−１００、１−９０、１−８０、１−７０、１−６０、１−５０、１−４５、１−４０、１−３５、１−３０、１−２５、１−２０、１−１５、１−１０、１−５、１−４、１−３、１−２、１個のアミノ酸を添加、削除及び／または置換したものであり、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である。
【０１００】
上記実施形態において、前記プラスミノーゲンはプラスミノーゲン活性フラグメントを含有し、且つ依然プラスミノーゲン活性を有するタンパク質である。具体的には、前記プラスミノーゲンは、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン、Ｌｙｓ−プラスミノーゲン、ミニプラスミノーゲン、マイクロプラスミノーゲン、δ−プラスミノーゲンまたはそれらのプラスミノーゲン活性を保持した変異体である。
【０１０１】
上記実施形態において、プラスミノーゲンは、天然または合成のヒトプラスミノーゲン、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントである。一部の実施形態において、前記プラスミノーゲンは、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するヒトプラスミノーゲンのオルソログ、またはその依然プラスミノーゲン活性を保持した変異体若しくはフラグメントであり、例えば、霊長類動物またはげっ歯類動物に由来するフィブリンプラスミノーゲンのオルソログであり、例えばゴリラ、アカゲザル、マウス、ウシ、ウマ、イヌに由来するフィブリンプラスミノーゲンのオルソログである。もっとも好ましくは、本発明のフィブリンプラスミノーゲンのアミノ酸配列は配列２、６、８、１０または１２に示される通りである。
【０１０２】
上記実施形態において、前記被験者はヒトである。一部の実施形態において、前記被験者はプラスミノーゲンが不足、または欠乏している。具体的には、前記不足または欠乏は、先天的、継発的及び／または局所的である。
【０１０３】
一つの実施形態において、前記フィブリンプラスミノーゲンは好ましくは、表面、静脈内、筋肉内、皮下、吸入、脊柱管内、局所注射、関節内注射または直腸投与によって全身または局所にて投与される。一つの実施形態において、前記局所投薬は、例えばドレッシング材やガイドチューブなどによって骨希薄化した領域に直接に行われる。
【０１０４】
一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは適切なポリペプチド担体または安定化剤と組み合わせて投与される。一つの実施形態において、前記プラスミノゲンは毎日０．０００１−２０００ｍｇ／ｋｇ、０．００１−８００ｍｇ／ｋｇ、０．０１−６００ｍｇ／ｋｇ、０．１−４００ｍｇ／ｋｇ、１−２００ｍｇ／ｋｇ、１−１００ｍｇ／ｋｇ、１０−１００ｍｇ／ｋｇ（体重一キロあたりで計算）または０．０００１−２０００ｍｇ／ｃｍ２、０．００１−８００ｍｇ／ｃｍ２、０．０１−６００ｍｇ／ｃｍ２、０．１−４００ｍｇ／ｃｍ２、１−２００ｍｇ／ｃｍ２、１−１００ｍｇ／ｃｍ２、１０−１００ｍｇ／ｃｍ２（体表面積平方センチメートルあたりで計算）の用量を投与し、好ましくは少なくとも一回繰り返し、好ましくは毎日投与する。局所投与の場合、前記用量はさらに状況に応じて調整することができる。一つの局面において、本発明は、薬学的に許容される担体及び本発明に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンを含む薬物組成物に係る。
【０１０５】
もう一つの局面において、本発明は、（ｉ）本発明に記載の方法に使用されるプラスミノーゲンと、（ｉｉ）前記プラスミノーゲンを前記被験者に送達するための手段（ｍｅａｎｓ）とを含む、予防性または治療性キットに係る。具体的には、前記手段はシリンジまたはバイアルである。一部の実施形態において、前記キットは、本発明に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンを前記被験者に投与することを指示するラベルまたはプロトコルをさらに含む。
【０１０６】
もう一つの局面において、本発明は、ラベルを含む容器と、（ｉ）本発明に記載の方法に使用されるプラスミノーゲン、またはプラスミノーゲンを含む薬物組成物とを含む製品であって、前記ラベルは、本発明に記載の方法を実施するように前記プラスミノーゲンまたは組成物を前記被験者に投与することを指示する、製品に係る。
【０１０７】
上記実施形態において、前記キットまたは製品は、その他の薬物を含む、もう一つ以上の部材または容器をさらに含む。一部の実施形態において、前記その他の薬物は、抗糖尿病薬と、抗心脳血管疾患薬と、抗血栓薬と、抗高血圧薬と、抗血脂薬と、抗凝固薬と、抗感染薬とからなる群より選ばれる。  
【０１０８】
［発明の詳細な説明］
「糖尿病」は遺伝的要素、免疫機能の乱れ、微生物感染及びその毒素、フリーラジカル毒素、精神要因などの各種病気誘発因子が生体に作用することによる、膵島機能不全、インスリン抵抗などによって引き起こされる糖、タンパク質、脂肪、水及び電解質等の一連の代謝に乱れが生じる症候群であり、臨床的には高血糖を主な特徴とする。
【０１０９】
「糖尿病合併症」は糖尿病プロセスにおける血糖の制御不良によって引き起こされる身体のその他の臓器または組織のダメージまたは機能障害であり、肝臓、腎臓、心臓、網膜、神経系のダメージまたは機能障害等を含む。世界保健機関（ＷＨＯ）の統計によれば、糖尿病合併症は１００種類以上あり、現在における合併症が最も多い疾患である。
【０１１０】
「インスリン抵抗」とは、様々な原因でインスリンがブドウ糖の摂取と利用を促進する効率が低下してしまい、血糖の安定性を維持するように生体が代償的に過剰のインスリンを分泌して高インスリン血症が生じることをいう。
【０１１１】
「プラスミン」は血液中に存在する非常に重要な酵素であり、フィブリン多量体を分解することができる。
【０１１２】
「プラスミノーゲン（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ，ｐｌｇ）」はプラスミンの酵素前駆体の形であり、ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列に基づいて、シグナルペプチドの天然ヒト由来プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列４）は計算によれば８１０個のアミノ酸からなり、分子量は約９０ｋＤであり、主に肝臓において合成され且つ血液中で循環できる糖タンパク質であり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列３に示される通りである。フルサイズのプラスミノーゲンは七つのドメインを含む：Ｃ末端に位置するセリンプロテアーゼドメイン、Ｎ末端に位置するＰａｎ  Ａｐｐｌｅ（ＰＡｐ）ドメイン及び５つのＫｒｉｎｇｌｅドメイン（Ｋｒｉｎｇｌｅ１−５）を含む。ｓｗｉｓｓ  ｐｒｏｔ中の配列を参照すれば、そのシグナルペプチドは残基Ｍｅｔ１−Ｇｌｙ１９を含み、Ｐａｐは残基Ｇｌｕ２０−Ｖａｌ９８を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ１は残基Ｃｙｓ１０３−Ｃｙｓ１８１を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ２は残基Ｇｌｕ１８４−Ｃｙｓ２６２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ３は残基Ｃｙｓ２７５−Ｃｙｓ３５２を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ４は残基Ｃｙｓ３７７−Ｃｙｓ４５４を含み、Ｋｒｉｎｇｌｅ５は残基Ｃｙｓ４８１−Ｃｙｓ５６０を含む。ＮＣＢＩデータによれば、セリンプロテアーゼドメインは残基Ｖａｌ５８１−Ａｒｇ８０４を含む。
【０１１３】
Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは天然のフルサイズのプラスミノーゲンであり、７９１個のアミノ酸からなる（１９個のアミノ酸からなるシグナルペプチドを含まない）。該配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１に示される通りであり、そのアミノ酸配列は配列２に示される通りである。体内において、さらにＧｌｕ−プラスミノーゲンの第７６−７７位のアミノ酸の位置で加水分解することにより形成されたＬｙｓ−プラスミノーゲンが存在し、例えば配列６に示されるものであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列５が示す通りである。δ−プラスミノーゲン（δ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はフルサイズのプラスミノーゲンにＫｒｉｎｇｌｅ２−Ｋｒｉｎｇｌｅ５構造の欠損が生じているフラグメントであり、Ｋｒｉｎｇｌｅ１及びセリンプロテアーゼドメインしか含有せず［３９、４０］、δ−プラスミノーゲンのアミノ酸配列（配列８）を報告している文献があり［４０］、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は例えば配列７である。ミニプラスミノーゲン（Ｍｉｎｉ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はＫｒｉｎｇｌｅ５及びセリンプロテアーゼドメインからなり、残基Ｖａｌ４４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドＧｌｕ−プラスミノーゲン配列を含まないＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）について文献が報告しており［４１］、そのアミノ酸配列は配列１０に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列９が示す通りである。しかしマイクロプラスミノーゲン（Ｍｉｃｒｏ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ）はセリンプロテアーゼドメインのみ含有し、そのアミノ酸配列は残基Ａｌａ５４３−Ａｓｎ７９１（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基は開始アミノ酸である）と文献が報告し［４２］、特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａはそれが残基Ｌｙｓ５３１−Ａｓｎ７９１を含むと開示し（シグナルペプチドを含まないＧｌｕ−プラスミノーゲン配列のＧｌｕ残基を開始アミノ酸とする）、本特許の配列は特許文献ＣＮ１０２１５４２５３Ａを参照でき、そのアミノ酸配列は配列１２に示される通りであり、該アミノ酸配列をコードするｃＤＮＡ配列は配列１１に示される通りである。
【０１１４】
本発明の「プラスミン」と「フィブリンプラスミン」、「繊維タンパクプラスミン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。「プラスミノーゲン」と「フィブリンプラスミノーゲン」、「繊維タンパクプラスミノーゲン」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
【０１１５】
本願において、プラスミノーゲンの「欠乏」とは、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より低く、被験者の正常な生理学的機能に影響を及ぼすのに十分に低いことをいう。プラスミノーゲンの「欠乏」の意味は、被験者体内のプラスミノーゲンの含有量または活性が正常な人より明らかに低く、活性または発現が極微量であり、外部供給によってのみ正常な生理学的機能を維持できることである。
【０１１６】
当業者は以下のように理解できる。本発明のプラスミノーゲンのすべての技術構成はプラスミンに適用でき、そのため、本発明に記載の技術構成はプラスミノーゲン及びプラスミンをカバーするものである。
【０１１７】
本発明の実施形態において、「老衰」と「早老」は互いに置き換えて使用でき、その意味は同じである。
【０１１８】
循環プロセスにおいて、プラスミノーゲンは閉鎖した非活性コンフォメーションであるが、血栓または細胞表面に結合した際、プラスミノーゲン（ＰＬＧ）活性化剤（ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＰＡ）の介在下において、開放性のコンフォメーションを有する活性プラスミン（ＰＬＭ）となる。活性を有するプラスミン（ＰＬＭ）はさらにフィブリン凝塊をフィブリン分解生成物及びＤ−二量体に加水分解させ、これにより血栓を溶解させる。そのうちプラスミノーゲンのＰＡｐドメインはプラスミノーゲンを非活性閉鎖コンフォメーションにする重要なエピトープであり、しかしＫＲドメインは受容体及び基質上のリジン残基と結合できるものである。プラスミノーゲン活性化剤としての酵素は、既に複数種類知られ、以下を含む：組織プラスミノーゲン活性化剤（ｔＰＡ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）、カリクレイン及び凝結因子ＸＩＩ（ハーゲマン因子）などである。
【０１１９】
「プラスミノーゲン活性フラグメント」とはプラスミノーゲンタンパク質において、基質中のターゲット配列と結合してタンパク質加水分解機能を発揮できる活性フラグメントである。本発明はプラスミノーゲンの技術構成に係り、プラスミノーゲン活性フラグメントでプラスミノーゲンの代替とする技術構成を含む。本発明に記載のプラスミノーゲン活性フラグメントはプラスミノーゲンのセリンプロテアーゼドメインを含むタンパク質であり、好ましくは、本発明に記載のプラスミノーゲン活性フラグメントは配列１４、配列１４と少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性のアミノ酸配列を含有するタンパク質を含むものである。そのため、本発明に記載のプラスミノーゲンは該プラスミノーゲン活性フラグメントを含み、且つ依然として該プラスミノーゲン活性を有するタンパク質を含む。
【０１２０】
現在、血液中のフィブリンプラスミノーゲン及びその活性測定方法は以下を含む：組織フィブリンプラスミノーゲン活性化剤の活性に対する測定（ｔ−ＰＡＡ）、血漿組織フィブリンプラスミノーゲン活性化剤抗原に対する測定（ｔ−ＰＡＡｇ）、血漿組織プラスミノーゲン活性に対する測定（ｐｌｇＡ）、血漿組織プラスミノーゲン抗原に対する測定（ｐｌｇＡｇ）、血漿組織フィブリンプラスミノーゲン活性化剤の阻害物活性に対する測定、血漿組織フィブリンプラスミノーゲン活性化剤の阻害物抗原に対する測定、血漿フィブリンプラスミン−抗プラスミン複合物に対する測定（ＰＡＰ）。最もよく見られる測定方法は発色基質法である：測定対象の血漿中にストレプトキナーゼ（ＳＫ）と発光基質を添加し、測定対象の血漿中のＰＬＧはＳＫの作用下においてプラスミンとなり、後者は発光基質に作用し、それから分光光度計で測定し、吸光度の増加はフィブリンプラスミノーゲンの活性と正比例関係となる。この他にも免疫化学法、ゲル電気泳動法、免疫比濁法、放射免疫拡散法などを用いて血液中のフィブリンプラスミノーゲン活性に対して測定を行うことができる。
【０１２１】
「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは異なる種どうしのホモログであり、タンパク質の相同物もＤＮＡの相同物も含む。それは具体的に異なる種どうしの同じ祖先の遺伝子から進化して得られるタンパク質または遺伝子を言う。本発明のプラスミノーゲンはヒト由来の天然プラスミノーゲンを含み、さらには異なる種に由来する、プラスミノーゲン活性を有するプラスミノーゲンホモログを含む。
【０１２２】
「保存的置換バリアント」とはそのうちの一つの指定されたアミノ酸残基が改変されたがタンパク質または酵素の全体のコンフォメーション及び機能を変えないものであり、これは類似の特性（例えば酸性、塩基性、疎水性など）のアミノ酸でペアレントタンパク質中のアミノ酸配列中のアミノ酸を置換するものを含むがこれらに限られない。類似の性質を有するアミノ酸は知られている通りである。例えば、アルギニン、ヒスチジン及びリジンは親水性の塩基性アミノ酸であり且つ互いに置き換えることができる。同じように、イソロイシンは疎水アミノ酸であり、ロイシン、メチオニンまたはバリンによって置換されることができる。そのため、機能の類似する二つのタンパク質またはアミノ酸配列の類似性は異なる可能性もある。例えば、ＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づいて７０％〜９９％の類似性（同一性）を有する。「保存的置換バリアント」はさらにＢＬＡＳＴまたはＦＡＳＴＡアルゴリズムに基づいて６０％以上のアミノ酸同一性を有するポリペプチドまたは酵素を含み、７５％以上に達すればさらによく、最も好ましくは８５％以上に達し、さらには９０％以上に達するのが最も好ましく、さらに天然またはペアレントタンパク質または酵素と比較して同じまたは基本的に類似する性質または機能を有する。
【０１２３】
「分離された」プラスミノーゲンとは天然環境から分離及び／または回収されたプラスミノーゲンタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記プラスミノーゲンは（１）９０％を超える、９５％を超える、または９８％を超える純度（重量で計算した場合）になるまで精製し、例えばＬｏｗｒｙ法によって決まるもので、例えば９９％（重量で計算した場合）を超えるまで精製する、（２）少なくともスピニングカップ配列分析装置によりＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基が得られる程度になる精製する、または（３）同質性になるまで精製する。該同質性はクマシーブリリアントブルーまたは銀染色により還元性または非還元性条件下のドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミノゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって決まるものである。分離されたプラスミノーゲンはバイオエンジニアリング技術により組み換え細胞から製造することができ、さらに少なくとも一つの精製ステップで分離されたプラスミノーゲンを含む。
【０１２４】
用語の「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」は本明細書において互いに置き換えて使用でき、いかなる長さのアミノ酸の重合体を指し、遺伝的にコードされた及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的または生化学的に修飾されまたは派生したアミノ酸、及び修飾されたペプチド主鎖を有するポリペプチドを含む。該用語は融合タンパク質を含み、異種性アミノ酸配列を有する融合タンパク質を含むがこれに限られず、異種性と同種性由来のリーダー配列（Ｎ端メチオニン残基を有するか有しない）を含む融合物；等々である。
【０１２５】
参照ペプチド配列の「アミノ酸配列同一性パーセンテージ（％）」の定義は、必要な時にギャップを導入することで最大のパーセンテージ配列の同一性を実現した後、如何なる保存的な置換も配列同一性の一部として見なさない場合、候補配列中における参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基のパーセンテージである。パーセンテージのアミノ酸配列の同一性を測定することを目的とした比較は本分野の技術範囲における複数種類の方式によって実現でき、例えば公衆が入手できるコンピュータソフトウエア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアによって実現できる。当業者は配列をアライメントするための適切なパラメータを決めることができ、該パラメータが比較対象の配列のフルサイズに対して最大比較の要求を実現するための如何なるアルゴリズムも含む。しかし、本発明の目的のために、アミノ酸配列の同一性パーセンテージは配列比較コンピュータソフトウエアＡＬＩＧＮ−２により得られるものである。
【０１２６】
ＡＬＩＧＮ−２を用いることによりアミノ酸配列を比較する場合、所定のアミノ酸配列Ａと所定のアミノ酸配列Ｂに対するアミノ酸配列同一性％（または所定のアミノ酸配列Ｂに対して、及び、またはについてのあるアミノ酸配列と同一性を有する又は含む所定のアミノ酸配列Ａともいう）は以下のように計算される：  
分数Ｘ／Ｙ×１００
【０１２７】
そのうちＸは配列アライメントプログラムＡＬＩＧＮ−２において該プログラムのＡ及びＢのアライメントにおいて同一でマッチングすると評価したアミノ酸残基の数であり、且つそのうちＹはＢにおけるアミノ酸残基の総数である。以下のように理解するべきである：アミノ酸配列Ａの長さとアミノ酸配列Ｂの長さが等しくない場合、ＡのＢに対するアミノ酸配列の同一性％は、ＢのＡに対するアミノ酸配列同一性％とは異なる。特に断りのない限り、本文中において使用するすべてのアミノ酸配列同一性値％は前記の段落に記載の通りであり、ＡＬＩＧＮ−２コンピュータプログラムによって得られるものである。
【０１２８】
本文において使用されているように、用語の「治療」及び「処理」は期待される薬理及び／または生理的効果が得られることを言う。前記効果は疾患またはその症状を完全または一部予防すること、及び／または疾患及び／またはその症状を一部または完全に治癒するものとすることができる。さらに以下を含む：（ａ）疾患が被験者の体内で発生することを予防し、前記被験者は疾患の要因を持っているが、該疾患を有すると診断されていない状況であること；（ｂ）疾患を抑制し、その形成を阻害すること；及び（ｃ）疾患及び／またはその症状を減軽し、即ち疾患及び／またはその症状を減退させること。
【０１２９】
用語の「個体」、「被験者」及び「患者」は本明細書中において互いに置き換えて使用でき、哺乳動物を指し、ネズミ（ラット、マウス）、ヒト以外の霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えばウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）などを含むがこれらに限られない。
【０１３０】
「治療上有効量」または「有効量」とは、哺乳動物またはその他の被験者に投与して疾患の治療に用いられる際に疾患の前記予防及び／または治療を実現できるプラスミノーゲンの量である。「治療上有効量」は使用するプラスミノーゲン、治療しようとする被験者の疾患及び／または症状の重症度及び年齢、体重などに従って変化するものである。
【０１３１】
２．本発明のプラスミノーゲンの調製
プラスミノーゲンは治療の用途に用いられるために、自然界から分離及び精製されるものでもよく、標準的な化学ペプチド合成技術によって合成することでもよい。化学的手法によりポリペプチドを合成する際、液相または固相で合成を行うことができる。固相ポリペプチド合成（ＳＰＰＳ）（配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に附着させ、順番に配列中の残りのアミノ酸を添加する）はプラスミノーゲンの化学的合成に適したものである。各種形式のＳＰＰＳ、例えばＦｍｏｃ及びＢｏｃは、プラスミノーゲンの合成に用いることができる。固相合成に用いられる技術は以下に記載されている：Ｂａｒａｎｙ及びＳｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；３−２８４ページ、Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．第二巻：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ．，Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，ｔら  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６（１９６３）；Ｓｔｅｗａｒｔら，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．（１９８４）；及びＧａｎｅｓａｎ  Ａ．２００６Ｍｉｎｉ  Ｒｅｖ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．６：３−１０及びＣａｍａｒｅｒｏ  ＪＡら  ２００５Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｌｅｔｔ．１２：７２３−８。簡単に言えば、その上にペプチド鎖が構築されている機能性ユニットにより不溶性の多孔ビーズを処理する。カップリング／脱保護の繰り返し循環後に、附着した固相の遊離Ｎ末端アミンと単一のＮ保護を受けているアミノ酸ユニットをカップリングさせる。それから、該ユニットを脱保護し、他のアミノ酸と接続する新しいＮ末端アミンを露出させる。ペプチドを固相上に固定したままにし、それからそれを切除する。
【０１３２】
標準的な組み換え方法により本発明のプラスミノーゲンを生産する。例えば、プラスミノーゲンをコードする核酸を発現ベクター中に挿入し、それと発現ベクター中の制御配列を操作可能に接続させる。発現制御配列はプロモーター（例えば天然に関連されているプロモーター、または異種由来のプロモーター）、シグナル配列、エンハンサーエレメント及び転写終了配列を含むが、これらに限られない。発現の制御はベクター中の真核プロモーターシステムとすることができ、前記ベクターは真核宿主細胞（例えばＣＯＳまたはＣＨＯ細胞）を形質転換またはトランスフェクションさせる。一旦ベクターを適切な宿主に導入すれば、ヌクレオチド配列の高レベル発現及びプラスミノーゲンの収集及び精製に適した条件下において宿主を維持する。
【０１３３】
適切な発現ベクターは通常宿主体内において附加体または宿主染色体ＤＮＡの整合部分として複製される。通常、発現ベクターは選択マーカー（例えばアンピシリン耐性、ハイグロマイシン耐性、テトラサイクリン耐性、カナマイシン耐性またはネオマイシン耐性）を含み、インビトロで所望のＤＮＡ配列によって形質転換されたそれらの細胞に対して測定を行うことに有用である。
【０１３４】
大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）は目的抗体をコードするポリヌクレオチドをクローンする原核宿主細胞の例である。その他の使用に適した微生物宿主は桿菌を含み、例えばバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）及びその他の腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばサルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、及び各種シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）種である。これらの原核宿主において、発現ベクターを生成でき、通常は宿主細胞と相容する発現制御配列（例えば複製開始点）を含むものである。また、多くの公知のプロモーターが存在し、例えば乳糖プロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、β−ラクタマーゼプロモーターシステム、またはファージλ由来のプロモーターシステムである。プロモーターは一般的に発現を制御し、必要に応じて遺伝子配列を制御する場合に、転写及び翻訳を起動するために、、さらにリボソームの結合位置配列を有してもよい。
【０１３５】
その他の微生物、例えば酵母も発現に用いることができる。酵母（例えばサッカロミセス（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））及びピキア（Ｐｉｃｈｉａ）が適した酵母宿主細胞の例であり、そのうちの適切な担体は必要に応じて発現制御配列（例えばプロモーター）、複製開始点、終止配列など含む。典型的なプロモーターは３−ホスホグリセリン酸キナーゼ及びその他の糖分解酵素を含む。誘導型酵母プロモーターはアルコール脱水素酵素、イソチトクロムＣ、及び麦芽糖とガラクトースの利用のための酵素のプロモーターを含む。
【０１３６】
微生物以外に、哺乳動物細胞（例えば体外細胞培養物中において培養された哺乳動物細胞）も本発明のプラスミノーゲンの発現に用いることができる（例えば目的抗−Ｔａｕ抗体をコードするポリヌクレオチド）。例えばＷｉｎｎａｃｋｅｒ，Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）参照。適した哺乳動物宿主細胞はＣＨＯ細胞系、各種Ｃｏｓ細胞系、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞系、及び形質転換されたＢ細胞またはハイブリドーマを含む。これらの細胞に用いられる発現ベクターは発現制御配列、例えば複製開始点、プロモーター、及びエンハンサー（Ｑｕｅｅｎら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．８９：４９（１９８６））、及び必要とされる加工情報位置、例えばリボソームの結合サイト、ＲＮＡの切断サイト、ポリアデノシン酸化サイト、及び転写ターミネーター配列を含むことができる。適切な発現制御配列の例はウサギ免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシ乳頭腫ウィルス、サイトメガロウイルスなどの派生のプロモーターである。Ｃｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１１４９（１９９２）を参照すること。
【０１３７】
一旦合成（化学または組み換え的に）されれば、本分野の標準的な手順、例えば硫酸アンモニウム沈殿、アフィニテイカラム、カラムクロマトグラフィー、高速液相クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、ゲル電気泳動などにより本発明に記載のプラスミノーゲンを精製することができる。該プラスミノーゲンは基本的に純粋なものであり、例えば少なくとも約８０％から８５％の純度で、少なくとも約８５％〜９０％の純度で、少なくとも約９０％〜９５％の純度で、または９８％〜９９％の純度またはさらに純度が高いものであり、例えば汚染物を含まず、前記汚染物は例えば細胞砕片、目的抗体以外の大分子などである。
【０１３８】
３．薬物配合剤
所望の純度のプラスミノーゲンと必要に応じて薬用担体、賦形剤、または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１６版，Ｏｓｏｌ，Ａ．ｅｄ．（１９８０））を混合して凍結乾燥製剤または水溶液を形成して治療用の配合剤を得る。許容可能な担体、賦形剤、安定化剤は所要の用量及び濃度下において被験者に対して毒性がなく、さらに例えばリン酸塩、クエン酸塩及びその他の有機酸などの緩衝剤を含む。抗酸化剤はアスコルビン酸和メチオニンを含む；防腐剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメチレンジアミン；塩化ベンザルコニウム（ｂｅｎｚａｌｋｏｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブタノールまたはベンジルアルコール；アルキルパラヒドロキシ安息香酸エステル、例えばメチルまたはプロピルパラヒドロキシ安息香酸エステル；ピロカテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；ｍ−クレゾール）；低分子量ポリペプチド（少なくとも約１０個の残基を有するもの）；タンパク質例えば血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン；親水性重合体、例えばポビニルピロリドン；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンである；単糖、二糖及びその他の炭水化物はグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む；キレート剤は例えばＥＤＴＡである；糖類は例えばショ糖、マンニトール、フコースまたはソルビトールである；塩形成イオン、例えばナトリウム；金属複合体（例えば亜鉛−タンパク複合体）；及び／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。好ましくは凍結乾燥された抗−ＶＥＧＦ抗体配合剤であり、ＷＯ  ９７／０４８０１に記載されているとおりであり、本明細書において参考とされるものである。
【０１３９】
本発明の配合剤は治療を必要とする具体的な症状の必要とする一種類以上の活性化合物を含有してもよく、好ましくは活性が相補的で互いに副作用を有しないものである。例えば、血圧降下薬、抗不整脈薬、糖尿病治療薬等である。
【０１４０】
本発明のプラスミノーゲンは例えば凝集技術または界面重合によって作られるマイクロカプセル中に内包ことができ、例えば、膠質薬物輸送系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン剤、ナノ粒子及びナノカプセル）中に入れまたは粗エマルジョン状液中のヒドロキシメチルセルロースまたはゲルーマイクロカプセル及びポリ―（メタアクリル酸メチル）マイクロカプセル中に入れることができる。これらの技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ′ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０１４１】
体内に投与することに用いられる本発明のプラスミノーゲンは必ず無菌である必要がある。これは凍結乾燥及び再度配合する前または後に除菌濾過膜で濾過することで容易に実現できる。
【０１４２】
本発明のプラスミノーゲンは緩衝製剤を調製できる。緩衝製剤の適切な実例は一定の形状を有し且つ糖タンパクを含む固体の疎水性重合体の半透過マトリックスを含み、例えば膜またはマイクロカプセルである。緩衝基質の実例はポリエステル、水性ゲル（例えばポリ（２−ヒドロキシエチル−メタアクリル酸エステル）（Ｌａｎｇｅｒら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２））またはポリ（ビニールアルコール）、ポリラクチド（米国特許３７７３９１９，ＥＰ  ５８，４８１）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Ｓｉｄｍａｎ，ら，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７（１９８３）），分解できないエチレン−ビニルアセテート（ｅｔｈｙｌｅｎｅ−ｖｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｔｅ）（Ｌａｎｇｅｒ，ら，出所は前記と同じ）、または分解可能な乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体、例えばＬｕｐｒｏｎ  ＤｅｐｏｔＴＭ（乳酸−ヒドロキシ酢酸共重合体及びリュープロレリン（ｌｅｕｐｒｏｌｉｄｅ）酢酸エステルからなる注射可能なミクロスフェア体）、及びポリＤ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。重合体、例えばエチレン−酢酸エチル及び乳酸−ヒドロキシ酢酸は、持続的に分子を１００日間以上放出することができ、しかしいくつかの水性ゲルがタンパク質を放出する時間は比較的短い。関連のメカニズムに応じてタンパク質を安定化させる合理的なストラテジーにより設計できる。例えば、凝集のメカニズムが硫化ジスルフィド結合の交換によって分子間Ｓ−Ｓ結合を形成するであれば、メルカプト基残基を修飾することにより、酸性溶液中から凍結乾燥させ、湿度を制御し、適切な添加剤を用いて、及び特定の重合体基質組成物を開発することで安定化を実現できる。
【０１４３】
４．投与及び使用量
異なる方式、例えば静脈内、腹膜内、皮下、頭蓋骨内、髄腔内、動脈内（例えば頸動脈）、筋肉内、鼻内、体表または皮内投与または脊髄または脳内輸送により本発明の薬物組成物の投与を実現できる。エアロゾル製剤例えば鼻噴霧製剤は活性化剤を含有する精製した水性またはその他の溶液及び防腐剤と等張剤を含有する。このような製剤を鼻粘膜と相容し得るｐＨ及び等張状態に調整する。
【０１４４】
一部の場合において、以下の方式により本発明のプラスミノーゲン薬物組成物を修飾または配合することができ、これにより血液脳関門を通過できる能力を提供する。
【０１４５】
胃腸外での投与に用いられる製造物は無菌水性または非水性溶液、懸濁液及び乳剤を含む。非水性溶媒の例はプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブオイルのような植物油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は水、アルコール性／水性溶液、乳剤または懸濁液を含み、食塩水及び緩衝媒介を含む。胃腸外媒介物は塩化ナトリウム溶液、リンガ―デキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、または固定油である。静脈内媒介物は液体及び栄養補充物、電気分解補充物などを含む。されには防腐剤及びその他の添加剤、例えば抗微生物製剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなども存在してもよい。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本発明のプラスミノーゲンは血液脳関門の通過を促進する薬剤と配合されている。いくつかの場合において、本発明のプラスミノーゲンは直接またはリンカにより血液脳関門の通過を促進する担体分子、ペプチドまたはタンパク質と融合する。一部の実施形態において、本発明のプラスミノーゲンは内在性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するポリペプチドと融合する。プラスミノーゲンと内在性血液脳関門受容体に結合するポリペプチドは、ＢＢＢの通過を促進する。内在性血液脳関門（ＢＢＢ）受容体に結合するポリペプチドは抗体、例えばモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントを含み、それは特異的に内在性ＢＢＢ受容体に結合する。適切な内在性ＢＢＢ受容体はインスリン受容体を含むがこれに限られず、抗体はリポソームに内包されたものである。例えば米国特許公開書類Ｎｏ．２００９／０１５６４９８を参照すること。
【０１４７】
医療関係者は各種臨床的要素により用量案を決めることができる。例えば医学分野で公知のように、任意の患者の用量は複数の要素によって決められ、これらの要素は患者の体型、体表面積、年齢、投与される具体的な化合物、性別、投与回数及び経路、全体の健康度、及び同時に投与するその他の薬物を含む。本発明が含有するプラスミノーゲンの薬物組成物の用量の範囲は例えば被験者体重に対して毎日約０．０００１〜２０００ｍｇ／ｋｇであり、または約０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ（例えば０．０２ｍｇ／ｋｇ，０．２５ｍｇ／ｋｇ，０．５ｍｇ／ｋｇ，０．７５ｍｇ／ｋｇ，１０ｍｇ／ｋｇ，５０ｍｇ／ｋｇなど）とすることができる。例えば、用量は１ｍｇ／ｋｇ体重または５０ｍｇ／ｋｇ体重または１−５０ｍｇ／ｋｇの範囲とすることができ、または少なくとも１ｍｇ／ｋｇである。この例示性の範囲より高いまたは低い用量もカバーされ、特に前記の要素を考慮した場合である。前記範囲中の中間用量も本発明の範囲内に含まれるものである。被験者は毎日、隔日、毎週または経験分析によって決められた任意のスケジュール表に従ってに従ってこのような用量を投与できる。例示的な用量のスケジュール表は連続数日１−１０ｍｇ／ｋｇ投与することである。本発明の薬物の投与過程において血栓及びその関連疾患の治療効果及び安全性はリアルタイムに評価、定期的に評価すべきである。
【０１４８】
５．治療の効力と治療安全性
本発明の一つの実施形態はプラスミノーゲンを用いて被験者を治療した後、治療効力及び治療安全性に対して判断を行うことに係る。よく用いられる骨の希薄化症の治療効果のモニタリングと評価内容は、定着フォロー（不良反応、規則正しい服薬、基礎措置および骨折リスク因子再評価など）、新発骨折評価（臨床的骨折、身長低下、映像学検査）、骨密度（ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ，ＢＭＤ）測定と骨代謝回転マーカー（ｂｏｎｅ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｍａｒｋｅｒｓ，ＢＴＭ）測定、及びこれらのデータに基づく総合的再評価などを含む。その中で、ＢＭＤは現在最も広範に応用されている治療効果のモニタリングと評価方法である。例えば、二重エネルギーＸ線吸収測定器（ｄｕａｌ  ｅｎｅｒｇｙ  Ｘ−ｒａｙ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｍｅｔｒｙ，ＤＸＡ）、定量ＣＴ（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｄ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ，ＱＣＴ）、単一光子吸収法（ＳＰＡ）、または超音波測定法によりＢＭＤを測定することができる。治療開始後、毎年ＢＭＤを１回測定し、ＢＭＤが安定してから間隔を適切に延長することができ、例えば、２年に１回モニタリングすることができる。ＢＴＭについて、現在、血清学指標においてよく使用されている骨形成指標は、血清１型プロコラゲンＮ末端プロペプチド（ｐｒｏｃｏｌｌａｇｅｎ  ｔｙｐｅ  １  ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ，ＰＩＮＰ）であり、骨吸収指標は血清１型プロコラゲンＣ末端テロペプチド（ｓｅｒｕｍ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｅｌｏｐｅｐｔｉｄｅ，Ｓ−ＣＴＸ）である。研究の進展により、より合理的な測定指標を適時に調整することができる。治療開始前にベースライン値を測定し、形成を促進する薬物を用いて治療してから３ヶ月、吸収を抑制する薬物を用いて治療してから３〜６ヶ月に測定すべきである。ＢＴＭは骨格の動態情報を提供することができ、作用と機能ではＢＭＤから独立しているとともに、ＢＭＤと相互補完のモニタリング手段となり、両者を結合するとより高い臨床的価値を有する。一般的には、治療後ＢＭＤが上昇したり安定したりし、ＢＴＭには予想される変化があり、しかも治療中に骨折がない場合、治療反応が良好であると考えられる。また、本発明はさらに、プラスミノーゲン及びその変体を用いて被験者を治療する過程中および治療後に該治療案の安全性に対する判断に係り、これは、被験者体内での薬物の血清半減期、治療半減期、半数中毒量（ＴＤ５０）、半数致死量（ＬＤ５０）を統計し、または治療過程においてまたは治療後に発生する、アレルギー反応のような様々な不良事件を観察することを含むが、これらに限定されていない。
【０１４９】
６．製品または薬物キット
本発明の一つの実施形態は製品または薬物キットに係るものであり、本発明のプラスミノーゲンを含有する。前記製品は好ましくは一つの容器、ラベルまたはプロトコルを含む。適切な容器はボトル、バイアル、注射器などである。容器は各種材料例えばガラスまたはプラスチックから作られることができる。前記容器は組成物を含有し、前記組成物は本発明の疾患または症状を有効に治療し且つ無菌の入口を有する（例えば前記容器は静脈輸液用パックまたはバイアルであり、皮下注射針によって貫通される栓を含む）。前記組成物中の少なくとも一種類の活性化剤がプラスミノーゲンである。前記容器上にあるまたは添付されているラベルは前記組成物を本発明の前記老衰または老衰の関連疾患の治療に用いられると説明するものである。前記製品はさらに薬用緩衝液を含有する第二容器を含み、前記薬用緩衝液は例えばリン酸塩緩衝の食塩水、リンガー溶液及びグルコース溶液を含む。さらには商業及び使用者の角度から見ると必要とされるその他の物質、即ちその他の緩衝液、希釈剤、濾過物、針及び注射器を含むことができる。また、前記製品は使用説明を有するプロトコルを含み、これは例えば前記組成物の使用者にプラスミノーゲン組成物及び疾患の治療に伴うその他の薬物を患者に投与することを指示するものである。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】図１は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島グルカゴン免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、グルカゴンは正常対照群マウスにおいて膵島周辺のα細胞の領域に発現されている。プラスミノーゲン投与群と比べ、溶媒ＰＢＳ投与対照群のグルカゴンの陽性細胞（矢印に表記される）は明らかに増え、陽性細胞は膵島の中央に浸潤している；プラスミノーゲン投与群のグルカゴンの陽性細胞は膵島周辺に散在的に分布し、ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の膵島形態は正常マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島α細胞の増殖およびグルカゴンの分泌を顕著に抑制でき、膵島α細胞の分布の乱れを修正でき、膵島損傷の修復を促進できることを示している。
【図２】図２は２６週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島グルカゴン免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析結果である。その結果、グルカゴンは正常対照群マウスにおいて膵島周辺のα細胞の領域に発現されている。プラスミノーゲン投与群と比べ、溶媒ＰＢＳ投与対照群のグルカゴンの陽性細胞（矢印に表記される）は明らか増え、陽性細胞は膵島の中央に浸潤し、しかも平均光学密度の定量分析結果の差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）；プラスミノーゲン投与群のグルカゴンの陽性細胞は膵島周辺い散在的に分布し、ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の膵島形態は正常マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島α細胞の増殖およびグルカゴンの分泌を顕著に抑制でき、膵島α細胞の分布の乱れを修正でき、膵島損傷の修復を促進できることを示している。
【図３】図３はプラスミノーゲンを２８日投与した後のＰＬＧ活性が正常であるマウスがＴ１ＤＭモデルにおける膵島グルカゴン免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群のグルカゴンの陽性発現はプラスミノーゲン投与群より明らかに多く、しかも平均光学密度の定量分析結果の差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島α細胞のグルカゴン分泌を顕著に減少させることができ、膵島損傷の修復を促進できることを示している。
【図４】図４は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを１０日、３１日投与した後の血糖測定結果を示したものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの血糖は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）ことは示されている。また、投与時間が長くなるにつれて、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖は上昇する傾向があるに対して、プラスミノーゲン投与群の血糖は徐々に低下する。これは、プラスミノーゲンが血糖を降下する作用があることを示している。
【図５】図５はプラスミノーゲンが糖尿病マウスの血清フルクトサミンの濃度に対する影響を示したものである。測定した結果、プラスミノーゲン投与後の血清フルクトサミンの濃度は明らかに低下し、投与前と比べ、その差が統計学的に極めて有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの血糖を顕著に降下することができることを示している。
【図６】図６は２６週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の血清フルクトサミンの測定結果を示すものである。測定結果によると、プラスミノーゲン投与群の血清フルクトサミンの濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、その差が統計学的に有意に近い（Ｐ＝０．０６）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの血糖レベルを顕著に低下させることができることを示している。
【図７】図７は２６週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の血漿糖化ヘモグロビンの測定結果を示したものである。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの糖化ヘモグロビンのＯＤ値は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの血糖を降下する作用があることを示している。
【図８】図８は２６週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを１０日投与した後のＩＰＧＴＴ測定結果を示したものである。その結果、ブドウ糖を腹腔に注射した後、プラスミノーゲン投与群マウスの血糖レベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より低く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べてプラスミノーゲン投与群の糖耐性曲線は正常なマウスにより近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの耐糖能を明らかに改善できることを示している。
【図９】図９はＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が正常であるマウスにプラスミノーゲンを１０日投与してから禁食後の血糖測定結果を示したものである。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖はプラスミノーゲン投与群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊＊＊は、Ｐ＜０．００１を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が正常なマウスの血糖レベルを顕著に低下させることができることを示している。
【図１０】図１０はＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が正常なマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後のＩＰＧＴＴ測定結果を示したものである。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスのブドウ糖注射後の血糖濃度はプラスミノーゲン投与群より明らかに高く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の糖耐性曲線は正常なマウスにより近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が正常なマウスの耐糖能を高めることができることを示している。
【図１１】図１１はＴ１ＤＭモデルマウスにプラスミノーゲンを２０日投与した後の血糖測定結果を示すものである。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖はプラスミノーゲン投与群マウスより明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（Ｐ＝０．０４）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭマウスのブドウ糖分解能力を促進でき、血糖を降下することができることを示している。
【図１２】図１２は２６週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の血清インスリンの測定結果を示したものである。その結果、プラスミノーゲン投与群の血清インスリンレベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンがインスリンの分泌を効果的に促進できることを示している。
【図１３】図１３は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵臓のＨＥ染色の写真および膵島面積比を示したものである。Ａ、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、ＣとＤはプラスミノーゲン投与群であり、Ｅは膵島面積の定量分析結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群の大部分の膵島が委縮し、委縮した膵島細胞は腺房（↓により示される）に置き換えられ、膵島のヘリの腺房が増殖して膵島と腺房との境目があいまいになっている；プラスミノーゲン投与群の大部分の膵島は対照群より面積が大きく、しかも膵島内には腺房増殖がなく、ただ僅かの膵島内に僅かの腺房が残存しており、膵島と腺房との境目がはっきりしていることは示されている。プラスミノーゲン投与群と対照群の、膵島と膵臓との面積比を比較すると、プラスミノーゲン投与群は対照群の倍近くになっていることが分かる。これは、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島損傷の修復を促進でき、損傷した膵島を修復することにより糖尿病を治療することができることを示している。
【図１４】図１４は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵島シリウスレッド染色の観察結果を示したものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの膵島コラーゲン沈着（矢印に標記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病動物の膵島の繊維化を改善できることを示している。
【図１５】図１５は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵島Ｃａｓｐａｓｅ−３免疫組織化学的染色の観察結果を示したものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群のＣａｓｐａｓｅ−３の発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島細胞のアポトーシスを減少させ、糖尿病マウスの膵臓組織を保護できることを示している。
【図１６】図１６は１８週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島インスリン免疫組織化学的染色結果を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群のインスリンの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的な有意の差に近い（Ｐ＝０．１５を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島の機能修復を促進でき、インスリンの生成と分泌Ｔを促進できることを示している。
【図１７】図１７は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後のインスリン免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群のインスリンの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島の機能修復を促進でき、インスリンの生成と分泌Ｔを促進できることを示している。
【図１８】図１８は２６週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後のインスリン免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群であり、Ｃは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群のインスリンの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島の機能修復を効果的に促進でき、インスリンの生成と分泌Ｔを促進できることを示している。
【図１９】図１９は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵臓組織ＮＦ−ｋＢ免疫組織化学的染色の観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析結果である。その結果、プラスミノーゲン投与群のＮＦ−ｋＢの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進でき、２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島炎症の修復を促進できることを示している。
【図２０】図２０は１８週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島グルカゴン免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析結果である。その結果、グルカゴンは正常対照群マウスにおいて膵島周辺のα細胞の領域に発現されている。プラスミノーゲン投与群と比べ、溶媒ＰＢＳ投与対照群のグルカゴンの陽性細胞（矢印に表記される）は明らかに増え、グルカゴンの陽性細胞は膵島の中央に浸潤し、しかも平均光学密度の定量分析結果の差が統計学的に極めて有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）；プラスミノーゲン投与群のグルカゴンの陽性細胞は膵島周辺に散在的に分布し、ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の膵島形態は正常マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島α細胞の増殖およびグルカゴンの分泌を顕著に抑制でき、膵島α細胞の分布の乱れを修正でき、膵島損傷の修復を促進できることを示している。
【図２１】図２１は１８週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島ＩＲＳ−２免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの膵島ＩＲＳ−２陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に極めて有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）；プラスミノーゲン投与群のＩＲＳ−２発現レベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させ、インスリンシグナル伝達を改善し、糖尿病マウスの膵島β細胞損傷を減少させることができることを示している。
【図２２】図２２は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵島ＩＲＳ−２免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの膵島ＩＲＳ−２陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表す）；プラスミノーゲン投与群のＩＲＳ−２発現レベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させ、インスリンシグナル伝達を改善し、糖尿病マウスの膵島β細胞損傷を減少させることができることを示している。
【図２３】図２３は２６週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島ＩＲＳ−２免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群であり、Ｄは定量分析結果である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの膵島ＩＲＳ−２陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群より明らかに少ない；プラスミノーゲン投与群のＩＲＳ−２発現レベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させ、インスリンシグナル伝達を改善し、糖尿病マウスの膵島β細胞損傷を減少させることができることを示している。
【図２４】図２４はプラスミノーゲンを２８日投与した後のＰＬＧ活性が正常であるＴ１ＤＭマウスの膵島ＩＲＳ−２免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの膵島ＩＲＳ−２陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群より明らかに少ない；プラスミノーゲン投与群のＩＲＳ−２発現レベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群マウスにより近い。これは、プラスミノーゲンが膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させ、インスリンシグナル伝達を改善し、ＰＬＧ活性が正常であるＴ１ＤＭマウスの膵島β細胞損傷を減少させることができることを示している。
【図２５】図２５は２６週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島好中球の免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群の陽性発現の細胞（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より少なく、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群により近い。これは、プラスミノーゲンが好中球の浸潤を減少させることができることを示している。
【図２６】図２６はＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が損傷したマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島好中球の免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群の陽性発現の細胞（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より少なく、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群よりブランク対照群により近い。これは、プラスミノーゲンがＰＬＧ活性が損傷したマウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島好中球の浸潤を減少させることができることを示している。
【図２７】図２７はＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が正常であるマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島好中球の免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群の陽性発現の細胞（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より少なく、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群よりブランク対照群により近い。これは、プラスミノーゲンがＰＬＧ活性が正常であるマウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島好中球の浸潤を促進できることを示している。
【図２８】図２８はＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が損傷したマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島インスリンの免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。免疫組織化学的結果によると、プラスミノーゲン投与群のインスリン陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群よりブランク対照群により近い。これは、プラスミノーゲンがＰＬＧ活性が損傷したマウスのＴ１ＤＭモデルにおけるインスリンの合成と分泌を促進できることを示している。
【図２９】図２９はＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が正常であるマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島インスリンの免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。免疫組織化学的結果によると、プラスミノーゲン投与群のインスリン陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多く、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群よりブランク対照群により近い。これは、プラスミノーゲンがＰＬＧ活性が正常であるマウスのＴ１ＤＭモデルにおけるインスリンの合成と発現を促進できることを示している。
【図３０】図３０はＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が損傷したマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島ＮＦ−ｋＢの免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群のＮＦ−ｋＢ発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが炎症修復因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することができ、膵島炎症の修復を促進することができることを示している。
【図３１】図３１は１８週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島ＮＦ−ｋＢの免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。その結果、プラスミノーゲン投与群のＮＦ−ｋＢ発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに多いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することができ、比較的に若い（１８週齢）糖尿病マウスの膵島炎症の修復を促進することができることを示している。
【図３２】図３２は２６週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３５日投与した後の膵島ＮＦ−ｋＢの免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。本発明の実験結果によると、プラスミノーゲン投与群のＮＦ−ｋＢ発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することができ、比較的に老齢（２６週齢）の糖尿病マウスの膵島炎症の修復を促進することができることを示している。
【図３３】図３３は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵島ＴＮＦ−αの免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。研究結果によると、プラスミノーゲン投与群のＴＮＦ−αの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンがＴＮＦ−αの発現を促進することができ、２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島損傷の修復を促進することができることを示している。
【図３４】図３４は２６週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵島ＴＮＦ−αの免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。研究結果によると、プラスミノーゲン投与群のＴＮＦ−αの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンがＴＮＦ−αの発現を促進することができ、２６週齢の糖尿病マウスの膵島損傷の修復を促進することができることを示している。
【図３５】図３５はＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が損傷したマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島ＴＮＦ−αの免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｂはプラスミノーゲン投与群である。研究結果によると、プラスミノーゲン投与群のＴＮＦ−αの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高い。これは、プラスミノーゲンがＴＮＦ−αの発現を促進することができ、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が損傷したマウスの膵島損傷の修復を促進することができることを示している。
【図３６】図３６はＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が損傷したマウスにプラスミノーゲンを２８日投与した後の膵島ＩｇＭの免疫組織化学的観察結果を示すものである。Ａはブランク対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。本実験研究の結果によると、プラスミノーゲン投与群のＩｇＭの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもプラスミノーゲン投与群は溶媒ＰＢＳ投与対照群より正常対照群により近い。これは、プラスミノーゲンがＩｇＭの発現を低下させることができ、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が損傷したマウスの膵島損傷を減少させることができることを示している。
【図３７】図３７は２４〜２５週齢の糖尿病マウスにプラスミノーゲンを３１日投与した後の膵島ＴＵＮＥＬ染色の観察結果を示すものである。Ａは正常対照群であり、Ｂは溶媒ＰＢＳ投与対照群であり、Ｃはプラスミノーゲン投与群である。本実験研究の結果によると、プラスミノーゲン投与群の陽性細胞数（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに少ない。正常対照群のＴＵＮＥＬ陽性染色は極めて低い。正常対照群のアポトーシス率は約８％であり、溶媒ＰＢＳ投与対照群のアポトーシス率は約９３％であり、プラスミノーゲン投与群のアポトーシス率は約１６％である。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島細胞のアポトーシスを顕著に減少させることができることを示している。
【図３８】図３８はＴ１ＤＭモデルマウスにプラスミノーゲンを２０日投与した後の血清インスリンの測定結果を示すものである。その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血清インスリン濃度はプラスミノーゲン投与群マウスより明らかに低く、しかもその差が統計学的な有意の差に近い（Ｐ＝０．０８）。これは、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭマウスのインスリン分泌を促進することができることを示している。
【実施例１】
【０１５１】
実施例１は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島α細胞の増殖を減少させ、膵島α細胞の正常な分布を回復し、グルカゴン分泌を低下させることに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１１匹、ｄｂ／ｍオスマウスを５匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に５匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に６匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与するか何ら液体も注射せずに、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスグルカゴン抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
膵島α細胞はグルカゴンを合成分泌し、主に膵島の周辺領域に分布されている。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図１Ｃ）と比べ、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１Ｂ）のグルカゴンの陽性細胞（矢印に表記される）は明らかに増え、陽性細胞は膵島の中央に浸潤する；プラスミノーゲン投与群のグルカゴンの陽性細胞は膵島周辺に散在的に分布し、ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の膵島形態は正常対照群（１Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島α細胞の増殖およびグルカゴンの分泌を顕著に抑制でき、膵島α細胞の分布の乱れを修正できることを示し、プラスミノーゲンが膵島損傷の修復を促進できることを示唆している。
【実施例２】
【０１５２】
実施例２は、プラスミノーゲンが２６週齢の糖尿病マウスの膵島α細胞の増殖を減少させ、膵島α細胞の正常な分布を回復し、グルカゴン分泌を低下させることに関するものである。
２６週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスグルカゴン抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
膵島α細胞はグルカゴンを合成分泌し、主に膵島の周辺領域に分布されている。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図２Ｃ）と比べ、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１７Ｂ）のグルカゴンの陽性細胞（矢印に表記される）は明らかに増え、陽性細胞は膵島の中央領域に浸潤し、しかも平均光学密度定量分析結果の差が統計学的に有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）（図２Ｄ）；プラスミノーゲン投与群のグルカゴンの陽性細胞は膵島周辺に散在的に分布し、ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の膵島形態は正常対照群（２Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが２６週齢の糖尿病マウスの膵島α細胞の増殖およびグルカゴンの分泌を顕著に抑制でき、膵島α細胞の分布の乱れを修正できることを示し、プラスミノーゲンが膵島損傷の修復を促進できることを示唆している。
【実施例３】
【０１５３】
実施例３は、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が正常であるマウスのグルカゴン分泌を減少させることに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ活性が正常であるオスマウスを１５匹取り、ランダムに三つの群に分け、ブランク対照群、溶媒ＰＢＳ投与対照群、及びプラスミノーゲン投与群で５匹ずつである。溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ，ロット番号Ｓ０１３０）を注射してＴ１ＤＭモデルを誘導し［４３］、ブランク対照群に対して処置しなかった。注射して１２日後から投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスグルカゴン抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
膵島α細胞はグルカゴンを合成分泌し、主に膵島の周辺領域に分布されている。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３Ｂ）のグルカゴンの陽性発現はプラスミノーゲン投与群（図３Ｃ）より明らかに多く、しかも平均光学密度定量分析結果の差が統計学的に有意であり（図３Ｄ）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の膵島形態は正常対照群（３Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが、ＳＴＺに誘導された糖尿病マウスの膵島α細胞のグルカゴンの分泌を顕著に減少させることができることを示している。
【実施例４】
【０１５４】
実施例４は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの血糖を降下することに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを８匹取り、ランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に５匹と溶媒ＰＢＳ投与対照群に３匹である。実験開始当日を０日目として体重を測ってから群分けし、一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。１０、３１日目に１６時間禁食した後、血糖試験紙（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で血糖検出をした。
その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの血糖は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（＊は、Ｐ＜０．０５を表し、＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）。また、投与時間が長くなるにつれて、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖は上昇する傾向があるに対して、プラスミノーゲン投与群の血糖は徐々に低下する（図４）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病動物の血糖を降下する作用があることを示している。
【実施例５】
【０１５５】
実施例５は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスのフルクトサミンレベルを低下させることに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを５匹取り、血清フルクトサミン濃度の測定のために投薬する前日にマウス１匹ずつ眼球静脈叢から５０μｌ採血し、採血当日を０日目として、１日目にプラスミノーゲンを投与し始め、連続して３１日投与した。３２日目に眼球を摘出して採血し、血清フルクトサミンの濃度を測定した。フルクトサミン濃度について、フルクトサミン測定キット（南京建成、Ａ０３７−２）で測定した。
フルクトサミン濃度は１〜３週間以内の血糖の平均レベルを反映する。その結果、プラスミノーゲン投与後の血清フルクトサミンの濃度は明らかに低下し、投薬前と比べてその差が統計学的に極めて有意である（図５）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病動物の血糖を効果的に降下できることを示している。
【実施例６】
【０１５６】
実施例６は、プラスミノーゲンが２６週齢の糖尿病マウスの血清フルクトサミンレベルを低下させることに関するものである。
２６週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹取り、実験開始当日を０日目として体重を測ってから体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹と溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹である。プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与した。一日目からプラスミノーゲンまたはＰＢＳを投与し、連続して３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分し、血清フルクトサミンの濃度を測定した。フルクトサミンの濃度をフルクトサミン測定キット（南京建成、Ａ０３７−２）で測定した。
測定の結果、プラスミノーゲン投与群の血清フルクトサミンの濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、その差が統計学的な有意の差に近いことは示されている（Ｐ＝０．０６）（図６）。これは、プラスミノーゲンが２６週齢の糖尿病マウスの血糖フルクトサミンを降下できることを示している。
【実施例７】
【０１５７】
実施例７は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの糖化ヘモグロビンレベルを低下させることに関するものである。
２６週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹取り、実験開始当日に体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹である。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３５日目にマウスを１６時間禁食し、３６日目に眼球を摘出して採血し、血漿糖化ヘモグロビンの濃度を測定した。
糖化ヘモグロビンの含有量は通常患者の最近８〜１２週間内の血糖コントロール状況を反映することができる。その結果、プラスミノーゲン投与群マウスの糖化ヘモグロビンの濃度は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（図７）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病動物の血糖レベルを効果的に降下できることを示している。
【実施例８】
【０１５８】
実施例８は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの耐糖能を改善することに関するものである。
２６週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹、及びｄｂ／ｍマウスを３匹取った。実験開始当日にｄｂ／ｄｂマウスの体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹とし、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１０日投与した。１１日目にマウスを１６時間禁食した後、マウス１匹ずつ５ｇ／ｋｇ体重で５％ブドウ糖溶液を腹腔注射により投与し、０、３０、６０、９０、１２０、１８０分に血糖試験紙（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で血糖濃度を測定した。
腹腔糖耐性テスト（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｅｓｔ，ＩＰＧＴＴ）は、生体がブドウ糖に対する耐性能力をテストすることができる。従来技術では、糖尿病患者の糖耐量が低下することが知られている。
実験の結果、ブドウ糖を腹腔に注射した後、プラスミノーゲン投与群マウスの血糖レベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より低く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べてプラスミノーゲン投与群の糖耐性曲線は正常マウス群により近いことは示されている（図８）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの耐糖能を明らかに改善できることを示している。
【実施例９】
【０１５９】
実施例９は、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が正常であるマウスの血糖レベルを低下させることに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ活性が正常であるオスマウスを１０匹取り、ランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で５匹ずつである。二つの群のマウスを４時間禁食した後、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）２００ｍｇ／ｋｇを腹腔注射により一回投与してＴ１ＤＭを誘導した［４３］。ＳＴＺ注射して１２日後に投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１０日投与した。１１日目にマウスを６時間禁食した後、血糖試験紙（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で血糖を測定した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖はプラスミノーゲン投与群マウスより明らかに高く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（図９）。これは、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が正常であるマウスの血糖レベルを顕著に低下させることができることを示している。
【実施例１０】
【０１６０】
実施例１０は、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルマウスの糖耐性レベルを改善することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ活性が正常であるオスマウスを１５匹取り、ランダムに三つの群に分け、ブランク対照群、溶媒ＰＢＳ投与対照群、及びプラスミノーゲン投与群で５匹ずつである。溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群マウスを４時間禁食した後、ＳＴＺ（ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）２００ｍｇ／ｋｇを腹腔注射により一回投与してＴ１ＤＭを誘導し［４３］、ブランク対照群に対して処置しなかった。ＳＴＺ注射して１２日後に投薬し始め、投薬し始めた日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２８日目にマウスを６時間禁食した後、５ｇ／ｋｇ体重で５％ブドウ糖溶液を腹腔注射により投与し、注射後０、１５、３０、６０、９０分に血糖試験紙（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で血糖濃度を測定した。
腹腔糖耐性テスト（Ｉｎｔｒａｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｅｓｔ，ＩＰＧＴＴ）は、生体がブドウ糖に対する耐性能力をテストすることができる。従来技術では、糖尿病患者の糖耐量が低下することが知られている。
その結果、ブドウ糖注射後、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖濃度はプラスミノーゲン投与群より明らかに高く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べてプラスミノーゲン投与群の糖耐性曲線は正常マウス群により近いことは示されている（図１０）。これは、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ活性が正常であるマウスのＴ１ＤＭモデルにおける耐糖能を向上させることができることを示している。
【実施例１１】
【０１６１】
実施例１１は、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるマウスのブドウ糖分解能力を向上させることに関するものである。
９〜１０週齢のＣ５７オスマウスを８匹取り、ランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で４匹ずつである。溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群マウスを４時間禁食した後、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）２００ｍｇ／ｋｇを腹腔注射により一回投与してＴ１ＤＭを誘導した［４３］。ＳＴＺ注射して１２日後に投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して１９日投与した。２０日目にマウスを６時間禁食した後、２ｇ／ｋｇ体重で２０％のブドウ糖を胃管栄養法により投与し、６０分間後、眼窩静脈叢から採血して遠心分離して上澄み液を取り、ブドウ糖測定キット（上海栄盛３６１５００）により血糖を測定した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスの血糖はプラスミノーゲン投与群マウスの血糖より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（Ｐ＝０．０４）（図１１）。これは、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるマウスのブドウ糖分解能力を向上させることができ、血糖を低下させることができることを示している。
【実施例１２】
【０１６２】
実施例１２は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスのインスリン分泌機能を促進することに関するものである。
２６週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹である。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３５日目にマウスを１６時間禁食し、３６日目に眼球を摘出して採血し、遠心分離して上澄み液を取り、インスリン測定キット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  ＡＢ）で取扱説明書に従って血清インスリンレベルを測定した。
測定した結果、プラスミノーゲン投与群の血清インスリンレベルは溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（図１２）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスのインスリン分泌を顕著に向上させることができることを示している。
【実施例１３】
【０１６３】
実施例１３は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵臓に対する保護作用に関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを７匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に３匹である。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にした後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせさらに浸水してヘマトキシリン及びエオシンで染色（ＨＥ染色）させ、１％塩酸アルコールで分別させ、アンモニア水でブルーイングさせ、さらにアルコールで段階的に脱水させて封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍と４００倍にて観察した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１３Ａ、１３Ｂ）の大部分の膵島が委縮し、委縮した膵島細胞は腺房（矢印に表記される）に置き換えられ、膵島のヘリの腺房が増殖して膵島と腺房との境目があいまいになっている；プラスミノーゲン投与群（図１３Ｃ、１３Ｄ）の大部分の膵島は対照群より面積が大きく、しかも膵島内には腺房増殖がなく、ただ僅かの膵島内に僅かの腺房が残存しており、膵島と腺房との境目がはっきりしていることは示されている。プラスミノーゲン投与群と対照群の、膵島と膵臓との面積比を比較すると、プラスミノーゲン投与群は対照群の倍近くになっていることが分かる（図１３Ｅ）。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島損傷の修復を促進できることを示し、プラスミノーゲンが膵島損傷の修復を促進することにより根本的に糖尿病を完治することができることを示唆している。
【実施例１４】
【０１６４】
実施例１４は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島コラーゲンの沈着を減少させることに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１６匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に１０匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に６匹である。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗い、０．１％シリウスレッドで６０分間染色した後、流水で流し、ヘマトキシリンで１分間染色してから流水で流し、１％塩酸アルコールとアンモニア水で分別させてブルーイングさせ、流水で流した。乾燥した後に封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
シリウスレッド染色はコラーゲンを持続的に染色することができ、病理学的切片の特殊の染色方法として、シリウスレッド染色はコラーゲン組織を特異的に示すことができる。
染色の結果、プラスミノーゲン投与群マウス（図１４Ｂ）の膵島コラーゲンの沈着（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１４Ａ）より明らかに低く、しかもその差が統計学的に有意である（図１４Ｃ）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病動物の膵島の繊維化を低下させることができることを示している。
【実施例１５】
【０１６５】
実施例１５は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島細胞のアポトーシスを減少させることに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを６匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に２匹である。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、ウサギ抗マウスＣａｓｐａｓｅ−３（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。段階的に脱水させて透徹にし、封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
Ｃａｓｐａｓｅ−３は細胞アポトーシス過程において最も主要な端末制限酵素であり、その発現は多ければ多いほど、アポトーシス状態にある細胞が多いことは示される［４４］。
本発明の実験の結果、プラスミノーゲン投与群（図１５Ｂ）のＣａｓｐａｓｅ−３の発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１５Ａ）より明らかに低いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島細胞のアポトーシスを減少させることができることを示している。
【実施例１６】
【０１６６】
実施例１６は、プラスミノーゲンが１８週齢の糖尿病マウスのインスリンの発現と分泌を促進することに関するものである。
１８週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを８匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で４匹ずつである。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、ウサギ抗マウスインスリン抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。段階的に脱水させて透徹にし、封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図１６Ｂ）のインスリンの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図１６Ａ）より明らかに高く、しかもその差が統計学的な有意の差に近い（Ｐ＝０．１５）（図１６Ｃ）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島の機能修復を促進でき、インスリンの発現と分泌を促進できることを示している。
【実施例１７】
【０１６７】
実施例１７は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスのインスリンの発現と分泌を促進することに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを８匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に５匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に３匹である。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、ウサギ抗マウスインスリン抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。段階的に脱水させて透徹にし、封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群のインスリンの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（Ｐ＝０．０２）（図１７）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが膵島の機能を効果的に修復でき、インスリンの発現と分泌を促進できることを示している。
【実施例１８】
【０１６８】
実施例１８は、プラスミノーゲンが糖尿病マウスのインスリン合成分泌機能の修復を促進することに関するものである。
２６週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹である。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３５日目にマウスを１６時間禁食した後、３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、ウサギ抗マウスインスリン抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。段階的に脱水させて透徹にし、封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
その結果、プラスミノーゲン投与群のインスリンの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に極めて有意である（Ｐ＝０．００５）（図１８）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島の機能を効果的に修復でき、インスリンの発現と分泌を促進できることを示している。
【実施例１９】
【０１６９】
実施例１９は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１０匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に６匹である。また、ｄｂ／ｍを４匹取って正常対照群とし、正常対照群に対して処置しなかった。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、水で２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で１時間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、ウサギ抗マウスＮＦ−ｋＢ（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。段階的に脱水させて透徹にし、封入させた後、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ＮＦ−ｋＢは転写因子タンパクの家族メンバーであり、炎症修復の過程において重要な役割を果たしている［４５］。
本発明の実験の結果、プラスミノーゲン投与群のＮＦ−ｋＢの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群より明らかに高く、しかもその差が統計学的に有意である（図１９）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンが多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進できることを示している。
【実施例２０】
【０１７０】
実施例２０は、プラスミノーゲンが１８週齢の糖尿病マウスの膵島α細胞の増殖を減少させ、膵島α細胞の正常な分布を回復し、グルカゴン分泌を低下させることに関するものである。
１８週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを８匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群と溶媒ＰＢＳ投与対照群で４匹ずつであり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスグルカゴン抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
膵島α細胞はグルカゴンを合成分泌し、主に膵島の周辺領域に分布されている。
その結果、プラスミノーゲン投与群（図２０Ｃ）と比べ、溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２０Ｂ）のグルカゴンの陽性細胞（矢印に表記される）は明らかに増え、陽性細胞は膵島の中央に浸潤し、しかも平均光学密度の定量分析結果の差が統計学的に有意である（＊＊は、Ｐ＜０．０１を表す）（図２０Ｄ）；プラスミノーゲン投与群のグルカゴンの陽性細胞は膵島周辺に散在的に分布し、ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群の膵島形態は正常対照群（２０Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが１８週齢の糖尿病マウスの膵島α細胞の増殖およびグルカゴンの分泌を顕著に抑制でき、膵島α細胞の分布の乱れを修正できることを示し、プラスミノーゲンが膵島損傷の修復を促進できることを示唆している。
【実施例２１】
【０１７１】
実施例２１は、プラスミノーゲンが１８週齢の糖尿病マウスの膵島インスリン受容体基質２（ＩＲＳ−２）の発現を促進することに関するものである。
１８週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを７匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に３匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に４匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＩＲＳ−２抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
インスリン受容体基質２（Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ−２，ＩＲＳ−２）は活性化され得るインスリン受容体チロシンキナーゼに作用される基質であり、インスリンシグナル伝達経路における重要な分子であり、しかも膵島β細胞の生存に対して極めて重要である。ＩＲＳ−２は膵島β細胞の発現の増加時に保護作用があり、機能性膵島β細胞の維持に対して極めて重要である［４６，４７］。
ＩＲＳ−２免疫組織化学的結果によると、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウス（図２１Ｂ）の膵島ＩＲＳ−２の陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群（図２１Ｃ）より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に極めて有意であり（図２１Ｄ）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図２１Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが、１８週齢の糖尿病マウスの膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させることができることを示している。
【実施例２２】
【０１７２】
実施例２２は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島ＩＲＳ−２の発現を促進することに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１１匹、ｄｂ／ｍオスマウスを５匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に５匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に６匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与するか何らの液体も注射せずに、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＩＲＳ−２抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ＩＲＳ−２免疫組織化学的結果によると、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウス（図２２Ｂ）の膵島ＩＲＳ−２の陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群（図２２Ｃ）より明らかに少なく、しかもその差が統計学的に有意であり（図２２Ｄ）、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群は正常対照群（図２２Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが、２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させることができることを示している。
【実施例２３】
【０１７３】
実施例２３は、プラスミノーゲンが２６週齢の糖尿病マウスの膵島ＩＲＳ−２の発現を促進することに関するものである。
２６週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＩＲＳ−２抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ＩＲＳ−２免疫組織化学的結果によると、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウス（図２３Ｂ）の膵島ＩＲＳ−２の陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群（図２３Ｃ）より明らかに少ない；プラスミノーゲン投与群のＩＲＳ−２発現レベルは正常対照群マウス（図２３Ａ）に近い。これは、プラスミノーゲンが、２６週齢の糖尿病マウスの膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させることができることを示している。
【実施例２４】
【０１７４】
実施例２４は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ活性が正常であるＴ１ＤＭマウスの膵島ＩＲＳ−２の発現を促進することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ活性が正常であるオスマウスを１５匹取り、ランダムに三つの群に分け、ブランク対照群、溶媒ＰＢＳ投与対照群、及びプラスミノーゲン投与群で５匹ずつである。溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ，ロット番号Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［４３］、ブランク対照群に対して処置しなかった。注射して１２日後から投薬し始め、投薬開始当日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＩＲＳ−２抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ＩＲＳ−２免疫組織化学的結果によると、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウス（図２４Ｂ）の膵島ＩＲＳ−２の陽性発現（矢印に表記される）はプラスミノーゲン投与群（図２４Ｃ）より明らかに少なく、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図２４Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが、９〜１０週齢のＰＬＧ活性が正常であるマウスの膵島細胞ＩＲＳ−２の発現を効果的に増加させることができることを示している。
【実施例２５】
【０１７５】
実施例２５は、プラスミノーゲンが２４〜２６週齢の糖尿病マウスの膵島好中球の浸潤を減少させることに関するものである。
２４〜２６週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、ｄｂ／ｄｂオスマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。実験開始当日を０日目とし、体重を計って群分けをし、実験の２日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、その日を１日目とした。プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウス好中球抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
好中球は非特異性細胞の免疫システムにおける重要なメンバーであり、炎症が発生する時、好中球は走化性物質により炎症部位に吸引される。
好中球の免疫組織化学的結果によると、プラスミノーゲン投与群（図２５Ｃ）の陽性発現細胞は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２５Ｂ）より少なく、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群は正常対照群（図２５Ａ）により近い。
【実施例２６】
【０１７６】
実施例２６は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ活性が損傷したマウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島好中球の浸潤を減少させることに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ活性が損傷したオスマウスを１０匹取り、ランダムに三つの群に分け、ブランク対照群に３匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に３匹、及びプラスミノーゲン投与群に４匹である。溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［４３］、ブランク対照群に対して処置しなかった。注射して１２日後から投薬し始め、投薬開始当日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウス好中球抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
好中球の免疫組織化学的結果によると、プラスミノーゲン投与群（図２６Ｃ）の陽性発現細胞（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２６Ｂ）より少なく、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図２６Ａ）により近い。
【実施例２７】
【０１７７】
実施例２７は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ活性が正常であるマウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島好中球の浸潤を減少させることに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ活性が正常であるオスマウスを１１匹取り、ランダムに三つの群に分け、ブランク対照群に３匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に４匹、及びプラスミノーゲン投与群に４匹である。溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［４３］、ブランク対照群に対して処置しなかった。注射して１２日後から投薬し始め、投薬開始当日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウス好中球抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で４００倍にて観察した。
好中球の免疫組織化学的結果によると、プラスミノーゲン投与群（図２７Ｃ）の陽性発現細胞（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２７Ｂ）より少なく、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図２７Ａ）により近い。
【実施例２８】
【０１７８】
実施例２８は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ活性が損傷したマウスのＴ１ＤＭモデルにおけるインスリンの合成と分泌を促進することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ活性が損傷したオスマウスを１０匹取り、ランダムに三つの群に分け、ブランク対照群に３匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に３匹、及びプラスミノーゲン投与群に４匹である。溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［４３］、ブランク対照群に対して処置しなかった。注射して１２日後から投薬し始め、投薬開始当日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスインスリン抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
免疫組織化学的結果によると、プラスミノーゲン投与群（図２８Ｃ）のインスリンの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２８Ｂ）より明らかに多く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図２８Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が損傷したマウスのインスリンの合成と分泌を促進できることを示している。
【実施例２９】
【０１７９】
実施例２９は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ活性が正常であるマウスのＴ１ＤＭモデルにおけるインスリンの合成と発現を促進することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ活性が正常であるオスマウスを１１匹取り、ランダムに三つの群に分け、ブランク対照群に３匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に４匹、及びプラスミノーゲン投与群に４匹である。溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［４３］、ブランク対照群に対して処置しなかった。注射して１２日後から投薬し始め、投薬開始当日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスインスリン抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
免疫組織化学的結果によると、プラスミノーゲン投与群（図２９Ｃ）のインスリンの陽性発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図２９Ｂ）より明らかに多く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図２９Ａ）により近い。これは、プラスミノーゲンが、Ｔ１ＤＭモデルにおけるＰＬＧ活性が正常であるマウスのインスリンの合成と発現を促進できることを示している。
【実施例３０】
【０１８０】
実施例３０は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ活性が損傷したマウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ活性が損傷したオスマウスを１０匹取り、ランダムに三つの群に分け、ブランク対照群に３匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に３匹、及びプラスミノーゲン投与群に４匹である。溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［４３］、ブランク対照群に対して処置しなかった。注射して１２日後から投薬し始め、投薬開始当日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＮＦ−ｋＢ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ＮＦ−ｋＢは多方向核転写因子として、活性化された後に細胞の増殖、細胞のアポトーシス、及び炎症と免疫など多くの遺伝子の調節に寄与する［２４］。
実験の結果、プラスミノーゲン投与群（図３０Ｃ）のＮＦ−ｋＢの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３０Ｂ）より明らかに高いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進できることを示している。
【実施例３１】
【０１８１】
実施例３１は、プラスミノーゲンが１８週齢の糖尿病マウスの膵島多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することに関するものである。
１８週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを７匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に３匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に４匹である。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＮＦ−ｋＢ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
本発明の実験の結果、プラスミノーゲン投与群（図３１Ｂ）のＮＦ−ｋＢの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３１Ａ）より明らかに高いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進できることを示している。
【実施例３２】
【０１８２】
実施例３２は、プラスミノーゲンが２６週齢の糖尿病マウスの多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進することに関するものである。
２６週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＮＦ−ｋＢ抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
実験の結果、プラスミノーゲン投与群（図３２Ｃ）のＮＦ−ｋＢの発現（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３２Ｂ）より明らかに高く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群は正常対照群（図３２Ａ）により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが比較的に老齢（２６週齢）の糖尿病マウスの多方向核転写因子ＮＦ−ｋＢの発現を促進できることを示している。
【実施例３３】
【０１８３】
実施例３３は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島ＴＮＦ−αの発現を促進することに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１１匹、ｄｂ／ｍオスマウスを５匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に５匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に６匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与するか何ら液体も注射せずに、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＴＮＦ−α抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
腫瘍壊死因子α（Ｔｕｍｏｒ  Ｎｅｃｒｏｓｉｓ  Ｆａｃｔｏｒ−α、ＴＮＦ−α）は主に活性化した単核／マクロファージにより発生し、炎症を促進する重要な因子である［４８］。
本実験研究の結果、プラスミノーゲン投与群（図３３Ｃ）のＴＮＦ−αの陽性発現は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３３Ｂ）より明らかに高く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群は正常対照群（図３３Ａ）により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスのＴＮＦ−αの発現を促進できることを示している。
【実施例３４】
【０１８４】
実施例３４は、プラスミノーゲンが２６週齢の糖尿病マウスの膵島ＴＮＦ−αの発現を促進することに関するものである。
２６週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを９匹、ｄｂ／ｍオスマウスを３匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に４匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に５匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与するか何ら液体も注射せずに、連続して３５日投与した。３６日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＴＮＦ−α抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
研究の結果、プラスミノーゲン投与群（図３４Ｃ）のＴＮＦ−αの陽性発現は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３４Ｂ）より明らかに高く、しかも溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群は正常対照群（図３４Ａ）により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが２６週齢の糖尿病マウスのＴＮＦ−αの発現を促進できることを示している。
【実施例３５】
【０１８５】
実施例３５は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ活性が損傷したマウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島ＴＮＦ−αの発現を促進することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ活性が損傷したオスマウスを７匹取り、ランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群に３匹、プラスミノーゲン投与群に４匹である。二つの群のマウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導した［４３］。注射して１２日後から投薬し始め、投薬開始当日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ウサギ抗マウスＴＮＦ−α抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して４℃で終夜インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）二次抗体を室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
本実験研究の結果、プラスミノーゲン投与群（図３５Ｂ）のＴＮＦ−αの陽性発現は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３５Ａ）より明らかに高いことは示されている。これは、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ活性が損傷したマウスのＴ１ＤＭモデルにおけるＴＮＦ−αの発現を促進できることを示している。
【実施例３６】
【０１８６】
実施例３６は、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ活性が損傷したマウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島の損傷を軽減することに関するものである。
９〜１０週齢のＰＬＧ活性が損傷したオスマウスを１０匹取り、ランダムに三つの群に分け、ブランク対照群に３匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に３匹、プラスミノーゲン投与群に４匹である。溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群マウスを４時間禁食した後、一回経腹腔で２００ｍｇ／ｋｇのＳＴＺ（Ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）を注射してＩ型糖尿病を誘導し［４３］、ブランク対照群に対して処置しなかった。注射して１２日後から投薬し始め、投薬開始当日を１日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２８日投与した。２９日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、３％過酸化水素水で１５分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。５％の健常ヒツジ血清液（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で３０分間ブロッキングした；時間になった後、ヒツジ血清液を廃棄し、ヤギ抗マウスＩｇＭ（ＨＲＰ）抗体（Ａｂｃａｍ）を滴加して室温で１時間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで２回洗い、毎回５分間であった。ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ＩｇＭ抗体はアポトーシスと壊死細胞の除去過程において重要な役割を果たし、組織器官の損傷局所のＩｇＭ抗体のレベルは、損傷程度と正相関している［４９，５０］。よって、組織器官局所のＩｇＭ抗体のレベルは、該組織器官の損傷状況を反映できる。
研究の結果、プラスミノーゲン投与群（図３６Ｃ）のＩｇＭの陽性発現は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３６Ｂ）より明らかに低く、溶媒ＰＢＳ投与対照群と比べ、プラスミノーゲン投与群はブランク対照群（図３６Ａ）により近いことは示されている。これは、プラスミノーゲンがＩｇＭの発現を低下させることができることを示し、プラスミノーゲンが、ＰＬＧ活性が損傷したマウスのＴ１ＤＭモデルにおける膵島の損傷を軽減できることを示唆している。
【実施例３７】
【０１８７】
実施例３７は、プラスミノーゲンが２４〜２５週齢の糖尿病マウスの膵島細胞のアポトーシスを減少させることに関するものである。
２４〜２５週齢のｄｂ／ｄｂオスマウスを１１匹、ｄｂ／ｍオスマウスを５匹取り、実験開始当日を０日目とし、体重を計って体重によってｄｂ／ｄｂマウスをランダムに二つの群に分け、プラスミノーゲン投与群に５匹、溶媒ＰＢＳ投与対照群に６匹であり、ｄｂ／ｍマウスを正常対照群とした。一日目からプラスミノーゲンまたは溶媒ＰＢＳを投与し、プラスミノーゲン投与群に２ｍｇ／０．２ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与するか何ら液体も注射せずに、連続して３１日投与した。３２日目にマウスを殺処分して膵臓を取り、４％パラホルムアルデヒド固定液において固定を行った。固定後の膵臓組織をアルコールで段階的に脱水させ及びキシレンで透徹化処理した後にパラフィンで包埋処理を行った。組織切片の厚みは３μｍであり、切片を脱パラフィンさせて浸水して１回水で洗った。ＰＡＰマーカーで組織を丸で囲み、プロテアーゼＫ使用液を滴加して組織を覆い、室温で７分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで３回洗い、毎回３分間であった。ＴＵＮＥＬキット（Ｒｏｃｈｅ）試薬１と試薬２との混合液体（５：４５）を滴加し、３７℃恒温で４０分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで３回洗い、毎回３分間であった。メタノールで調製した３％過酸化水素水（過酸化水素：メタノール＝１：９）を滴加して室温で遮光して２０分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで３回洗い、毎回３分間であった。ＴＵＮＥＬキット試薬３を滴加し、３７℃恒温で３０分間インキュベーションし、０．０１Ｍ  ＰＢＳで３回洗い、ＤＡＢキット（Ｖｅｃｔｏｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＵＳＡ）で呈色させ、３回水洗いした後にヘマトキシリンで３０秒複染色して、流水で５分間流した。アルコールで段階的に脱水させてキシレンで透徹にし、中性ゴムに封入させ、切片を光学顕微鏡下で２００倍にて観察した。
ＴＵＮＥＬ染色は、組織細胞がアポトーシスの末期における細胞核ＤＮＡの破断状況を検出するために用いることができる。
本実験研究の結果、プラスミノーゲン投与群（図３７Ｃ）の陽性細胞数（矢印に表記される）は溶媒ＰＢＳ投与対照群（図３７Ｂ）より明らかに少ない。正常対照群のＴＵＮＥＬ陽性染色は極めて低い（図３７Ａ）。正常対照群のアポトーシス率は約８％であり、溶媒ＰＢＳ投与対照群のアポトーシス率は約９３％であり、プラスミノーゲン投与群のアポトーシス率は約１６％である。これは、プラスミノーゲンが糖尿病マウスの膵島細胞のアポトーシスを顕著に減少させることができることを示している。
【実施例３８】
【０１８８】
実施例３８は、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるマウスのインスリン分泌を改善できることに関するものである。
９〜１０週齢のＣ５７オスマウスを６匹取り、ランダムに二つの群に分け、溶媒ＰＢＳ投与対照群とプラスミノーゲン投与群で３匹ずつである。二つの群のマウスを４時間禁食した後、ストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（ｓｉｇｍａ  Ｓ０１３０）２００ｍｇ／ｋｇを腹腔注射により一回投与してＴ１ＤＭを誘導した［４３］。ＳＴＺ注射して１２日後に投薬し始め、投薬開始当日を一日目とし、プラスミノーゲン投与群に１ｍｇ／０．１ｍＬ／匹／日でヒト由来のプラスミノーゲンを尾静脈注射により投与し、溶媒ＰＢＳ投与対照群にも同じ体積のＰＢＳを尾静脈注射により投与し、連続して２０日投与した。２１日目にマウスを６時間禁食した後、眼球静脈叢から採血して遠心分離して上澄み液を取り、インスリン測定キット（Ｍｅｒｃｏｄｉａ  ＡＢ）を用いて取扱説明書に従って血清インスリン濃度を測定した。
その結果、溶媒ＰＢＳ投与対照群マウスのインスリン濃度はプラスミノーゲン投与群マウスより明らかに低く、しかもその差が統計学的な有意の差に近い（Ｐ＝０．０８）（図３８）ことは示されている。これは、プラスミノーゲンがＴ１ＤＭモデルにおけるマウスのインスリン分泌を促進できることを示している。
【０１８９】
参考文献：
[1]International Diabetes Federation. IDF diabetes atlas [M]. 7th ed. Brussels: Karakas Print, 2015: 13.[2]Lopez AP, de Dios A, Chiesa I, et al. Analysis of mutations in the glucokinase gene in people clinically characterized as MODY2 without a family history of diabetes. Diabetes Res Clin Pract, 2016, 118: 38-43.
[3]Fan M, Li W, Wang L, et al. Association of SLC30A8 gene polymorphism with type 2 diabetes, evidence from 46 studies: a meta-analysis. Endocrine, 2016, 53: 381-94.
[4]L iang J, S lingerland JM1Mu ltiple ro les of the P I3K /PKB ( Akt) pathway in cell cycle progress ion[J].Cell Cycle, 2003,2(4):339-451.
[5]Dhand R, H iles I, Panayotou G, e t a l. PI 3-k inase is a dual specif icity enzyme: autoregulation by an intrinsic p rotein-serin e k inase activity[J]. Em bo J, 1994,13(3):522-331.
[6] Perrin AJ, Gunda M, Yu B, Yen K, Ito S, Forster S, Tissenbaum HA, Derry WB. Noncanonical control of C. elegans germline apoptosis by the insulin/IGF-1 and Ras/MAPK signaling pathways. Cell Death Differ. 2013 Jan;20(1):97-107.
[7]AguirreV ,UchidaT ,Y enushL ,etal .Thec -JunN H (2)-terminlk inasep romotes insulin resistanced uringa ssociationw ithi nsuline rceptor substrate-1 and phosphorylation of ser(307)[J].J BiolChem,2000, 275:9047-9054.
[8]HirosumiJ ,TunemanG ,Ch angL ,et al .A central or lefor JNKi no besity and insulin resistance.Natuer[J].2002,420:333-336.
[9]Hotamisligil GS, Shargill NS, Spiegelman BM. Adipose expression of tumor necrosis factor-alpha: direct role in obesity-linked insulinresistance[J]. Science, 1993, 259(5091): 87-91.
[10]Hotamisligil GS. Inflammation and metabolic disorders[J]. Nature, 2006, 444(7121): 860- 867.
[11]Swaroop JJ, Rajarajeswari D, NaiduJN. Association of TNF-α with insulin resistance in type 2 diabetes mellitus[J]. Indian J Med Res, 2012, 135: 127-130.
[12]Kentish SJ, O'Donnell TA, Isaacs NJ, et al. Gastricvagal afferent modulation by leptin is influenced by food intake status[J]. J Physiol,2013, 591(7): 1921-1934.
[13]Keane KN, Cruzat VF, Carlessi R, de Bittencourt PI Jr, Newsholme P. Molecular Events Linking Oxidative Stress and Inflammation to Insulin Resistance and β-Cell Dysfunction. Oxid Med Cell Longev. 2015;2015:181643
[14]LUOTOLA K，PIETIL A，ZELLEＲ T，et al．Associa-tions between interleukin-1(IL-1) gene variations or IL-1 receptor antagonist levels and the development of type 2 diabetes［J］．J Intern Med，2011，269(3):322-332．
[15]DONATH M Y，SHOELSON S E．Type 2 diabetes as an inflammatory disease［J］．Nature Ｒeviews Immunology，2011，11(2):98-107．
[16]Reddy VP, Zhu X, Perry G, Smith MA. Oxidative stress in diabetes and Alzheimer’s disease. J Alzheimers Dis 2009;16(4): 763-774.
[17]Nishikawa T, Araki E. Impact of mitochondrial ROS production in the pathogenesis of diabetes mellitus and its complications. Antioxid Redox Signal 2007; 9(3): 343-353.
[18]Ceretta LB, Reus GZ, Abelaira HM, Ribeiro KF, Zappellini G, Felisbino FF, Steckert AV, Dal-Pizzol F, Quevedo J.Increased oxidative stress and imbalance in antioxidant enzymes in the brains of alloxan-induced diabetic rats. Exp Diabetes Res 2012; 2012: 302682.
[19]Kajimoto Y, Kaneto H. Role of oxidative stress in pancreatic 17 beta-cell dysfunction. Ann N Y Acad Sci 2004; 1011: 168-176.
[20]Valko M, Leibfritz D, Moncol J, Cronin MT, Mazur M,  18 Telser J. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease. Int J Biochem Cell Biol 2007; 39(1): 44-84.
[21]Drews G, Krippeit-Drews P, Dufer M. Oxidative stress and 19 beta-cell dysfunction. Pflugers Arch 2010; 460(4): 703-718.
[22]Patel S, Santani D. Role of NF-κB in the pathogenesis of diabetes and its associated complications. Pharmacol Rep 2009; 61: 595-603.
[23]Hayden MR, Sowers JR. Isletopathy in type 2 diabetes mellitus: implications of islet RAS, islet fibrosis, islet amyloid, remodeling, and oxidative stress. Antioxid Redox Signal 2007; 9(7): 891-910.
[24]Mariappan N, Elks CM, Sriramula S, Guggilam A, Liu Z, Borkhsenious O, Francis J. NF-kappaB-induced oxidative stress contributes to mitochondrial and cardiac dysfunction in type II diabetes. Cardiovasc Res 2010; 85(3): 473-483.
[25]Hofmann MA, Schiekofer S, Isermann B, Kanitz M, Henkels M, Joswig M, Treusch A, Morcos M, Weiss T, Borcea V, Khalek A, Amiral J, Tritschler H, Ritz E, Wahl P, Ziegler R, Bierhaus A, Nawroth PP. Peripheral blood mononuclear cells isolated from patients with diabetic nephropathy show increased activation of the oxidative-stress sensitive transcription factor NF-κB. Diabetologia 1999; 42(2): 222-232.
[26]Eldor R, Yeffet A, Baum K, Doviner V, Amar D, Ben-Neriah Y, Christofori G, Peled A, Carel JC, Boitard C, Klein T, Serup P, Eizirik DL, Melloul D. Conditional and specific NF-kappaB blockade protects pancreatic beta cells from diabetogenic agents. Proc Natl Acad Sci U S A 2006; 103(13): 5072-5077.
[27]Caamano J, Hunter CA. NF-kappaB family of transcription factors: central regulators of innate and adaptive immune functions. Clin Microbiol Rev 2002; 15(3): 414-429.
[28]Lacraz G, Giroix MH, Kassis N, Coulaud J, Galinier A, Noll C, Cornut M, Schmidlin F, Paul JL, Janel N, Irminger JC, Kergoat M, Portha B, Donath MY, Ehses JA, Homo-Delarche F. Islet endothelial activation and oxidative stress gene expression is reduced by IL-1Ra treatment in the type 2 diabetic GK rat. PLoS One 2009; 4(9): e6963.
[29]Cheng CY, Hsieh HL, Sun CC, Lin CC, Luo SF, Yang CM. IL-1 beta induces urokinase-plasminogen activator expression and cell migration through PKC alpha, JNK1/2, and NF-kappaB in A549 cells. J Cell Physiol 2009; 219(1):183-193.
[30]Mahadev K, Motoshima H, Wu X, Ruddy JM, Arnold RS, Cheng G, Lambeth JD, Goldstein BJ. The NAD(P)H oxidase homolog Nox4 modulates insulin-stimulated generation of H2O2 and plays an integral role in insulin signal transduction. Mol Cell Biol 2004; 24(5): 1844-1854.
[31]Goldstein BJ, Mahadev K, Wu X. Insulin action is facilitated by insulin-stimulated reactive oxygen species with multiple potential signaling targets. Diabetes 2005; 54(2): 311-321.
[32]Mahadev K, Wu X, Zilbering A, Zhu L, Lawrence JTR, Goldstein BJ. Hydrogen peroxide generated during cellular insulin stimulation is integral to activation of the distal insulin signaling cascade in 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem 2001; 276: 48662-48669.
[33]Loh K, et al., Reactive oxygen species enhance insulin sensitivity. Cell Metab 2009; 10(4): 260-272.
[34]Nishikawa T, Araki E. Impact of mitochondrial ROS production in the pathogenesis of diabetes mellitus and its complications. Antioxid Redox Signal 2007; 9(3): 343-353.
[35]Evans JL, Goldfine ID, Maddux BA, Grodsky GM. Are oxidative stress-activated signaling pathways mediators of insulin resistance and beta-cell dysfunction? Dibetes 2003; 52(1): 1-8.
[36]Brownlee M. The pathobiology of diabetic complications: a unifying mechanism. Diabetes 2005; 54(6): 1615-1625.
[37]Henriksen EJ, Diamond-Stanic MK, Marchionne EM. Oxidative stress and the etiology of insulin resistance and type 2 diabetes. Free Radic Biol Med 2011; 51(5): 993-999.
[38]Wang J, Ma H, Tong C, Zhang H, Lawlis GB, Li Y, Zang M, Ren J, Nijland MJ, Ford SP, Nathanielsz PW, Li J. Overnutrition and maternal obesity in sheep pregnancy alter the JNK-IRS-1 signaling cascades and cardiac function in the fetal heart. FASEB J 2010; 24(6): 2066-2076.
[39]Marder V J, Novokhatny V. Direct fibrinolytic agents: biochemical attributes, preclinical foundation and clinical potential [J]. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2010, 8(3): 433-444.
[40]Hunt J A, Petteway Jr S R, Scuderi P, et al. Simplified recombinant plasmin: production and fu-nctional comparison of a novel thrombolytic molecule with plasma-derived plasmin [J]. Thromb Haemost, 2008, 100(3): 413-419.
[41]Sottrup-Jensen L, Claeys H, Zajdel M, et al. The primary structure of human plasminogen: Isolation of two lysine-binding fragments and one “mini”-plasminogen (MW, 38, 000) by elastase-catalyzed-specific limited proteolysis [J]. Progress in chemical fibrinolysis and thrombolysis, 1978, 3: 191-209.
[42]Nagai N, Demarsin E, Van Hoef B, et al. Recombinant human microplasmin: production and potential therapeutic properties [J]. Journal of Thrombosis and Haemostasis, 2003, 1(2): 307-313.
[43] Brian L. Furman . Streptozotocin-Induced Diabetic Models UNIT 5.47 in Mice and Rats. Curr. Protoc. Pharmacol. 70:5.47.1-5.47.20.
[44] Parvesh Chaudhry, Mohan Singh, Sophie Parent et al. Prostate Apoptosis Response 4 (Par-4), a Novel Substrate of Caspase-3 during Apoptosis Activation. Mol Cell Biol. 2012 Feb; 32(4): 826-839.
[45] Patrick Viatour, Marie-Paule Merville, Vincent Bours et al. Phosphorylation of NF-kB and IkBproteins: implications in cancer and inflammation..TRENDS in Biochemical Sciences  , 2005 , 30 (1) :43-52.
[46]Withers DJ,Gutierrez JS, Towery H, et al. Disruption of IRS-2 causes type 2diabetes in mice. Nature 1998;391:900-904.
[47]Withers DJ, Burks DJ, Towery HH et al. White MF. Irs-2 coordinates Igf-1 receptor-mediated beta-cell development and peripheral insulin signalling. Nat Genet 1999;23:32-40.
[48]Jacob CO1, Aiso S, Michie SA, McDevitt HO et al. Prevention of diabetes in nonobese diabetic mice by tumor necrosis factor (TNF): similarities between TNF-alpha and interleukin 1. Proc Natl Acad Sci U S A. 1990 Feb;87(3):968-72.
[49]Zhang M, Takahashi K, Alicot EM, Vorup-Jensen T, Kessler B, et al. Activation of the lectin pathway by natural IgM in a model of ischemia/reperfusion injury. J Immunol.2006. 177: 4727-4734.
[50] Kim SJ, Gershov D, Ma X, Brot N, Elkon KB (2002) I-PLA2 Activation during Apoptosis Promotes the Exposure of Membrane Lysophosphatidylcholine Leading to Binding by Natural Immunoglobulin M Antibodies and Complement Activation. The Journal of Experimental Medicine 196: 655-665.
[51]Ghinwa Barakat, Mohamed E Moustafa, Ibrahim Khalifeh ea al. Effects of exendin-4 and selenium on the expression of GLP-1R,IRS-1, and preproinsulin in the pancreas of diabetic rats. J Physiol Biochem. 2017 Jun 7.
【図１】
2020502150.tif 000002
【図２】
2020502150.tif 000003
【図３】
2020502150.tif 000004
【図４】
2020502150.tif 000005
【図５】
2020502150.tif 000006
【図６】
2020502150.tif 000007
【図７】
2020502150.tif 000008
【図８】
2020502150.tif 000009
【図９】
2020502150.tif 000010
【図１０】
2020502150.tif 000011
【図１１】
2020502150.tif 000012
【図１２】
2020502150.tif 000013
【図１３】
2020502150.tif 000014
【図１４】
2020502150.tif 000015
【図１５】
2020502150.tif 000016
【図１６】
2020502150.tif 000017
【図１７】
2020502150.tif 000018
【図１８】
2020502150.tif 000019
【図１９】
2020502150.tif 000020
【図２０】
2020502150.tif 000021
【図２１】
2020502150.tif 000022
【図２２】
2020502150.tif 000023
【図２３】
2020502150.tif 000024
【図２４】
2020502150.tif 000025
【図２５】
2020502150.tif 000026
【図２６】
2020502150.tif 000027
【図２７】
2020502150.tif 000028
【図２８】
2020502150.tif 000029
【図２９】
2020502150.tif 000030
【図３０】
2020502150.tif 000031
【図３１】
2020502150.tif 000032
【図３２】
2020502150.tif 000033
【図３３】
2020502150.tif 000034
【図３４】
2020502150.tif 000035
【図３５】
2020502150.tif 000036
【図３６】
2020502150.tif 000037
【図３７】
2020502150.tif 000038
【図３８】
2020502150.tif 000039
【配列表】
2020502150000001.app
【国際調査報告】
2020502150.tif 000040
2020502150.tif 000041
2020502150.tif 000042
2020502150.tif 000043
2020502150.tif 000044
2020502150.tif 000045
2020502150.tif 000046
2020502150.tif 000047
2020502150.tif 000048
2020502150.tif 000049
2020502150.tif 000050
2020502150.tif 000051