(57)【要約】本発明は、小胞の溶解または透過処理なしで小胞上のバイオマーカーを検出および定量するための方法、組成物、およびキットならびに様々な疾病および障害の診断および予後予測の方法における小胞上で同定されたバイオマーカーの使用に関する。本発明の疾病および障害は、神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、および癌を含む。
2020523559.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）小胞を含む生体試料を提供する工程；
ｂ）小胞上に存在する場合には、捕捉剤が第一のバイオマーカーに選択的に結合する条件下で、固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を生体試料と接触させる工程、それによって固体支持体上で第一のバイオマーカーを有する小胞を捕捉する；
ｃ）生体試料から固体支持体を分ける工程；および
ｄ）第二のバイオマーカーに選択的に結合する検出剤を使用して固体支持体上で捕捉された小胞上の第二のバイオマーカーを検出する工程、ここで、小胞は溶解または透過処理されていない：
を含む、方法。
【請求項２】
小胞が、エキソソーム、微小粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、エクトソーム、およびアポトーシス小体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第一および第二のバイオマーカーが、小胞の膜結合型タンパク質または吸着タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第一または第二のバイオマーカーが、エキソソーム表面マーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
エキソソーム表面マーカーがＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＣＤ１１ｂ、ＤＡＴまたはＯＭＧである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
第一または第二のバイオマーカーが、神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質およびオリゴデンドロサイト特異的タンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
神経特異的タンパク質が、ＮＲＧＮ、タウ、リン酸化タウ、シナプトフィジン、αβ−４２、αシヌクレイン（ＳＮＣＡ）、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、およびＢＡＣＥからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
アストロサイト特異的タンパク質が、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
オリゴデンドロサイト特異的タンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）からなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
固体支持体上で捕捉された小胞が、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、オリゴデンドロサイト由来エキソソーム、およびミクログリア由来エキソソームからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
小胞の膜結合型タンパク質または吸着タンパク質が、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）またはチロシンヒドロキシゲナーゼ（ｈｙｄｒｏｘｙｇｅｎａｓｅ）（ＴＨ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
固体支持体上で捕捉された小胞上のサイトゾルタンパク質を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
サイトゾルタンパク質が、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＳＮＣＡ、αβ−４２、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、またはＰＳＧ１である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
サイトゾルタンパク質が、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＳＮＣＡ、αβ−４２、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、またはＰＳＧ１の凝集体および／または変異型を含む病的形態である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
固体支持体上で捕捉された小胞上の分泌タンパク質を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
分泌タンパク質が、サイトカイン、増殖因子、ケモカイン、インターロイキン、ノシセプチン（オピオイドペプチド）、およびＧｎＲＨからなる群から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
サイトカインがＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１６、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１３、ＩＬ１２Ｂ、およびＦａｓＬからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
固体支持体上で捕捉された小胞上の受容体タンパク質、トランスポータータンパク質、または膜タンパク質を検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
受容体タンパク質が、神経伝達物質受容体、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体、または神経ペプチド受容体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
膜タンパク質が、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、またはＮＣＡＭである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
トランスポータータンパク質が、神経伝達物質輸送体、ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）、セロトニントランスポーター、ＧＡＢＡトランスポーター、グルタミン酸トランスポーター、インスリントランスポーター、腫瘍壊死因子トランスポーター、または神経ペプチドトランスポーターである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
固体支持体上で捕捉された小胞上の１以上の付加的なバイオマーカーを検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
固体支持体が小胞上の異なるバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０の異なる固体支持体に結合した捕捉剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
検出することが、小胞上の異なるバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、または２０の異なる検出剤を使用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
固体支持体が、プレート、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、フィルター、スライド、ウェハー（ｗａｆｅｒ）、ロッド、粒子、ストランド（ｓｔｒａｎｄ）、ディスク、膜、またはチューブの表面、チャネル、カラム、フローセル装置、またはマイクロ流体デバイスである、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
固体支持体が、ガラス、石英、ケイ素、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、ハイドロゲル、またはレジンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
捕捉剤が、小胞上の第一のバイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体ミメティック、またはアプタマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、およびｓｃＦｖ断片からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
検出剤が、小胞上の第二のバイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体ミメティック、またはアプタマーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、およびｓｃＦｖ断片からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
検出剤が、検出可能標識をさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
検出可能標識が、蛍光性、化学発光性、電気化学発光性、生物発光性、同位体、または放射性のものである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
検出する工程が、イムノアッセイを行う工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
イムノアッセイが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）からなる群から選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
生体試料が対象または細胞培養上清からのものである、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
生体試料が、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、組織診、皮膚、および脳脊髄液からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
対象が疾病または障害を有すると診断された、または疑れたものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
対象が、神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、または癌を有すると診断された、または疑れたものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
神経障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムのパーキンソニズム−認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、抑うつ、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質疾患、脳萎縮症、精神遅滞、小脳失調、多系統萎縮症、脳震盪、脳震盪に至るか至らないかの（ｓｕｂｃｏｎｃｕｓｓｉｖｅ）衝撃、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
対象における疾病または障害を診断し、かつ治療する方法であって、以下：
ａ）対象からエキソソームを含む生体試料を得る工程；
ｂ）捕捉剤が神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質、およびオリゴデンドロサイト特異的タンパク質からなる群から選択されるエキソソームの第一のバイオマーカーに選択的に結合する条件下で、固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を生体試料と接触させる工程、ここで、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、オリゴデンドロサイト由来エキソソーム、またはミクログリア由来エキソソームは固体支持体上で捕捉される；
ｃ）生体試料から固体支持体を分ける工程；
ｄ）固体支持体上で捕捉されたエキソソームの神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質からなる群から選択される第二のバイオマーカーのレベルを測定すること、ここで、エキソソームは溶解または透過処理されていない；
ｅ）第二のバイオマーカーのレベルを第二のバイオマーカーのコントロールレベルと比較することにより疾病または障害を有する対象を診断する工程；および
ｆ）対象が疾病または障害を有すると診断される場合に疾病または障害について対象を治療する工程、
を含む方法。
【請求項４１】
疾病または障害が神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、または癌である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
神経障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムのパーキンソニズム−認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、抑うつ、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質疾患、脳萎縮症、精神遅滞、小脳失調、多系統萎縮症、脳震盪、脳震盪に至るか至らないかの（ｓｕｂｃｏｎｃｕｓｓｉｖｅ）衝撃、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
第一および第二のバイオマーカーが、小胞の膜結合型タンパク質または吸着タンパク質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
第二のバイオマーカーが、サイトゾルタンパク質または分泌タンパク質である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４５】
神経特異的タンパク質が、ＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ、シナプトフィジン、ＣＤ６３、αβ−４２、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、ＢＡＣＥ、ＳＮＣＡ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１６、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＣＸＣＬ１２、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１３、ＦａｓＬ、神経伝達物質受容体、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体、神経ペプチド受容体、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
アストロサイト特異的タンパク質が、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
オリゴデンドロサイト特異的タンパク質が、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
固体支持体上で捕捉された小胞が、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、オリゴデンドロサイト由来エキソソーム、およびミクログリア由来エキソソームからなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４９】
対象における疾病または障害を診断し、かつ治療する方法であって、以下：
ａ）対象からエキソソームを含む生体試料を得る工程；
ｂ）捕捉剤がエキソソームのＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＣＤ１１ｂまたはＯＭＧに選択的に結合する条件下で、固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を生体試料と接触させる工程、ここで、ＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＣＤ１１ｂまたはＯＭＧを有するエキソソームは固体支持体上で捕捉される；
ｃ）生体試料から固体支持体を分ける工程；
ｄ）固体支持体上で捕捉されたエキソソームのＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ、シナプトフィジン、ＣＤ６３、αβ−４２、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、ＢＡＣＥ、ＳＮＣＡ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１６、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＣＸＣＬ１２、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１３、ＦａｓＬ、神経伝達物質受容体、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体、神経ペプチド受容体、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭからなる群から選択される１以上のバイオマーカーのレベルを測定する工程、ここでエキソソームは溶解または透過処理されていない；
ｅ）１以上のバイオマーカーのレベルをコントロール試料におけるバイオマーカーのコントロールレベルと比較することにより疾病または障害を有する対象を診断する工程、ここで、コントロール試料における１以上のバイオマーカーのコントロールレベルと比較して１以上のバイオマーカーのレベルの増加および／または１以上のバイオマーカーのレベルの減少が、対象が疾病または障害を有することを示す；および
ｆ）対象が疾病または障害を有すると診断される場合に疾病または障害について対象を治療する工程、
を含む方法。
【請求項５０】
疾病または障害が神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、または癌である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
神経障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムのパーキンソニズム−認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、抑うつ、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質疾患、脳萎縮症、精神遅滞、小脳失調、多系統萎縮症、脳震盪、脳震盪に至るか至らないかの（ｓｕｂｃｏｎｃｕｓｓｉｖｅ）衝撃、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
対象における疾病または障害を診断するまたは予後判定する、疾病または障害のリスクのある対象を同定する、または疾病または障害を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想するためのキットであって、以下：
ａ）固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体、ここで、少なくとも１つの捕捉剤は、エキソソームの神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質、またはオリゴデンドロサイト特異的タンパク質に選択的に結合する；および
ｂ）１以上の検出剤、ここで、１以上の検出剤は、エキソソームの表面のサイトゾルタンパク質、分泌タンパク質、受容体、または膜タンパク質に選択的に結合する、
を含むキット。
【請求項５３】
疾病または障害が神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、または癌である、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
少なくとも１つの捕捉剤が、エキソソームのＣＤ１７１、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＣＤ１１ｂ、またはＯＭＧに選択的に結合する、請求項５２に記載のキット。
【請求項５５】
１以上の検出剤が、エキソソームの表面のＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ、シナプトフィジン、ＣＤ６３、αβ−４２、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、ＢＡＣＥ、ＳＮＣＡ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１６、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＣＸＣＬ１２、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１３、ＦａｓＬ、神経伝達物質受容体、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体、神経ペプチド受容体、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭに選択的に結合する、請求項５２に記載のキット。
【請求項５６】
少なくとも１つの捕捉剤または検出剤が、ＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ、シナプトフィジン、ＣＤ６３、αβ−４２、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、ＢＡＣＥ、ＳＮＣＡ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１６、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＣＸＣＬ１２、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＳＦ１０、ＴＮＦＳＦ１３、ＦａｓＬ、神経伝達物質受容体、ドーパミン受容体、セロトニン受容体、ＧＡＢＡ受容体、グルタミン酸受容体、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体、神経ペプチド受容体、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体ミメティック、またはアプタマーを含む、請求項５２に記載のキット。
【請求項５７】
抗体が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、およびｓｃＦｖ断片からなる群から選択される、請求項５２に記載のキット。
【請求項５８】
キットが、抗ＣＤ８１抗体、抗ＧＡＰＤＨ抗体、抗ＣＴＳＤ抗体、抗ＮＲＧＮ抗体、抗ＭＢＰ抗体、抗ＧＦＡＰ抗体、抗タウ抗体、抗リン酸化タウ抗体、抗ＣＤ６３抗体、抗αβ−４２抗体、抗ＣＸ３ＣＬ１抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、抗ＩＬ３４抗体、抗ＣＤ１７１抗体、抗ＳＮＡＰ２５抗体、抗ＥＡＡＴ１抗体、抗ＤＡＴ抗体、または抗ＯＭＧ抗体を含む、請求項５２に記載のキット。
【請求項５９】
検出剤が、検出可能標識をさらに含む、請求項５２に記載のキット。
【請求項６０】
検出可能標識が蛍光性、化学発光性、電気化学発光性、生物発光性、同位体、または放射性のものである、請求項５９に記載のキット。
【請求項６１】
イムノアッセイを行うための試薬をさらに含む、請求項５２に記載のキット。
【請求項６２】
イムノアッセイが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）からなる群から選択される、請求項６１に記載のキット。
【請求項６３】
神経障害が：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムのパーキンソニズム−認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、抑うつ、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質疾患、脳萎縮症、精神遅滞、小脳失調、多系統萎縮症、脳震盪、脳震盪に至るか至らないかの（ｓｕｂｃｏｎｃｕｓｓｉｖｅ）衝撃、およびパーキンソン病、
からなる群から選択される、請求項５３に記載のキット。
【請求項６４】
対象における疾病または障害の進行を予後判定するまたはモニタリングする方法であって、以下：
ａ）対象から小胞またはエキソソームを含む生体試料を得る工程；ｂ）捕捉剤が小胞またはエキソソームの第一のバイオマーカーに選択的に結合する条件下で、固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を生体試料と接触させる工程、ここで、小胞またはエキソソームは固体支持体上で捕捉される；ｃ）生体試料から固体支持体を分ける工程；ｄ）固体支持体上で捕捉された小胞またはエキソソームの第二のバイオマーカータンパク質のレベルを測定する工程、ここで、小胞またはエキソソームは溶解または透過処理されていない、を含み、それによって対象における疾病または障害の進行を予後判定するまたはモニタリングする、方法。
【請求項６５】
第二の生体試料で第二の時点で（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を繰り返すことをさらに含み、ここで、第一の時点でのそのレベルと比較した第二のバイオマーカーのレベルの増加が、疾病または障害が進行していることを示し、第一の時点でのそのレベルと比較した第二のバイオマーカーのレベルの減少が、疾病または障害が退行していることを示す、
請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
疾病または障害が進行している場合に疾病または障害について対象を治療する工程をさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
疾病または障害が退行している場合に疾病または障害の治療を減らすまたは治療を停止する工程をさらに含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
疾病または障害が神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、または癌である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
神経障害が、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムのパーキンソニズム−認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、抑うつ、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質疾患、脳萎縮症、精神遅滞、小脳失調、多系統萎縮症、脳震盪、脳震盪に至るか至らないかの（ｓｕｂｃｏｎｃｕｓｓｉｖｅ）衝撃、およびパーキンソン病からなる群から選択される、請求項６８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる２０１７年５月２４日提出の米国仮特許出願第６２／５１０，７２６号、および２０１７年８月１７日提出の米国仮特許出願第６２／５４７，０２４号の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、小胞の溶解または透過処理なしで小胞上のバイオマーカーを検出および定量するための方法、組成物、およびキットならびに様々な疾病および障害の診断および予後判定の方法における小胞上で同定されたバイオマーカーの使用に関する。本発明の疾病および障害は、神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、および癌を含む。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
エキソソームは、それらが由来する母細胞およびその母細胞の近くの微小環境の生理学的および病理学的物質（タンパク質、代謝物、ＲＮＡ、低分子など）を保有するため、生物学的液体中のエキソソームは、様々な疾病につき診断上潜在的に有用である。しかしながら、エキソソームが診断に有用な資源であると認識されているとしても、エキソソームを解析する現在の解析方法は、診断検査で日常的に使用するには複雑すぎて高価である。
【０００４】
５４０万人以上のアメリカ人および世界では３５００万人が、認知症の最も一般的な形態であるアルツハイマー病を有する。現在、アルツハイマー病を診断する唯一の確実な方法は、患者の死亡後の脳組織の直接検査によるものである。医師は、アルツハイマー病を有する疑いのある患者における疾患を診断するために、脳イメージング、行動評価、精神医学的検査および他の手段を使用するが、いずれも高い正確性を示さず、かつ多くはコストがかかるか、実用的ではない。
【０００５】
２０１７年には、米国で推定１，６８８，７８０の新しい癌症例が診断され、６００，９２０の癌死が予想される。最も一般的な癌は、乳癌、肺および気管支癌、前立腺癌、結腸および直腸癌、膀胱癌、皮膚のメラノーマ、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、腎臓および腎盂腎癌、白血病、子宮内膜癌、および膵癌である。同様に、数百万人のアメリカ人が免疫系の機能障害によって引き起こされる免疫障害や病気に苦しんでいる。
【０００６】
従って、例えば、神経障害、癌、免疫学的障害、および胎盤疾患などの疾病および他の障害を診断するためのバイオマーカーおよび方法が当技術分野で必要とされている。さらに、当該技術分野では、バイオマーカーを検出するための組成物、ならびに疾病および他の障害の治療に有用な組成物および方法が必要である。本発明は、疾病および他の障害を診断するための正確で非侵襲的な方法を提供することにより、この必要性を満たす。本発明は様々な疾病および障害を診断する、予後判定する、予想する、および治療するための新規な方法、アッセイ、バイオマーカー、キット、および組成物をさらに提供する。
【発明の概要】
【０００７】
発明の概要
本発明は、小胞上のバイオマーカーを検出および定量するための方法、組成物、およびキットに関する。特に、本発明は、固体支持体の目的の表面マーカーを保有する小胞を選択的に捕捉する、ならびに小胞の溶解または透過処理の必要なしで捕捉された小胞の膜結合型のおよび吸着バイオマーカーを検出するための方法を提供する。小胞上のバイオマーカーの測定は、様々な疾病のための診断および予後判定の方法において有用である。特に、本発明は、対象における疾病または障害を診断するまたは予後判定する、疾病または障害のリスクのある対象を同定する、または疾病または障害を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、対象における神経障害を診断するまたは予後判定する、神経障害のリスクのある対象を同定する、または神経障害を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、対象における免疫学的障害を診断するまたは予後判定する、免疫学的障害のリスクのある対象を同定する、または免疫学的障害を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、対象における癌を診断するまたは予後判定する、癌のリスクのある対象を同定する、または癌を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想する方法を提供する。他の実施形態では、本発明は、対象における胎盤疾患を診断するまたは予後判定する、胎盤疾患のリスクのある対象を同定する、または胎盤疾患を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想する方法を提供する。
【０００８】
一態様では、本発明は、ａ）小胞を含む生体試料を提供する工程；ｂ）小胞上に存在する場合には、捕捉剤が第一のバイオマーカーに選択的に結合する条件下で、固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を生体試料と接触させる工程、それによって固体支持体上で第一のバイオマーカーを有する小胞を捕捉する；ｃ）生体試料から固体支持体を分ける工程；およびｄ）第二のバイオマーカーに選択的に結合する検出剤を使用して固体支持体上で捕捉された小胞上の第二のバイオマーカーを検出する工程、ここで、小胞は溶解または透過処理されていない：を含む方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、固体支持体上で捕捉された小胞上の分泌タンパク質を検出することをさらに含む。或る態様では、分泌タンパク質は、サイトカイン、増殖因子、ケモカイン、およびインターロイキンからなる群から選択される。他の態様では、サイトカインは、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１６、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＳＦ１０、ＩＬ１２Ｂ、ノシセプチン、ＧｎＲＨ、ＦａｓＬ、およびＴＮＦＳＦ１３からなる群から選択される。
【００１０】
特定の実施形態では、小胞が、エキソソーム、微小粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、エクトソーム、およびアポトーシス小体からなる群から選択される。
【００１１】
特定の実施形態では、第一および第二のバイオマーカーは、小胞の膜結合型タンパク質または吸着タンパク質である。例えば、第一または第二のバイオマーカーは、エキソソーム表面マーカー（例えば、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ１７１）、神経特異的タンパク質（例えば、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、タウ（Ｔａｕ）、リン酸化タウ、αβ−４２、およびシナプトフィジン）、アストロサイト特異的タンパク質（例えば、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１））、ミクログリア特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、ドーパミントランスポータータンパク質（例えば、ＤＡＴ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、またはケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）またはサイトカイン（ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＦａｓＬ、またはＩＬ１２Ｂ）であってもよい。別の実施形態では、第一または第二のバイオマーカーは、代謝物である。別の実施形態では、該方法は、固体支持体上で捕捉された小胞上のサイトゾルタンパク質（例えば、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、αシヌクレイン（ＳＮＣＡ）、チロシンヒドロキシゲナーゼ（ｈｙｄｒｏｘｙｇｅｎａｓｅ）（ＴＨ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、またはＦａｓＬ）を検出することをさらに含む。別の実施形態では、該方法は、固体支持体上で捕捉された小胞上の１以上の付加的なバイオマーカーを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＣＤ８１、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、ＣＴＳＤ、ＲＥ１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、シナプトタグミン（ＳＹＴ）、シナプトフィジン（ＳＹＰ）、シナプトポディン（ＳＹＮＰＯ）、シナプス後膜肥厚タンパク質９５（ＰＳＤ９５）、シナプス小胞糖タンパク質２Ａ（ＳＶ２Ａ）、ＮＧＲＮ、単球走化性タンパク質−１（ＣＣＬ２）、ＩＬ３４、グリコーゲン合成酵素（ＧＹＳ）、（ＯＲ）、細胞死受容体６（ＤＲ６）、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）、ＩＬ１２ベータ、アルファ−ベータ（Ａβ）、βセクレターゼ（ＢＡＣＥ）、ドーパミン受容体（Ｄ１およびＤ２）、セロトニン受容体（２Ａ、２Ｃ、および３Ｂ）、ＧＡＢＡ受容体（１−６、５．Ｂ１、Ｂ２）、グルタミン酸受容体（１および２）、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＲＡＬ、ＴＮＦ受容体、細胞死受容体５および６）、神経ペプチド受容体（オレキシン受容体、オピオイド受容体ＫＯＲ）、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第一のバイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５であり、かつ第二のバイオマー��ーは、ＣＤ８１、タウ、ＮＥＦＬ、ＴＮＦａ、およびＩＬ８からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第一のバイオマーカーは、ＥＡＡＴ１であり、かつ第二のバイオマーカーは、ＣＤ８１またはＧＦＡＰである。いくつかの実施形態では、第一のバイオマーカーは、ＯＭＧであり、かつ第二のバイオマーカーは、ＣＤ８１またはＭＢＰである。いくつかの実施形態では、第一のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂであり、かつ第二のバイオマーカーは、ＳＹＰである。いくつかの実施形態では、第一のバイオマーカーは、ＤＡＴであり、かつ第二のバイオマーカーは、ＣＤ８１、ＳＮＣＡ、またはＴＨである。いくつかの実施形態では、第一のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂであり、かつ第二のバイオマーカーは、ＳＹＰである。
【００１２】
別の実施形態では、固体支持体上で捕捉された小胞が、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、オリゴデンドロサイト由来エキソソーム、およびミクログリア由来エキソソームからなる群から選択される。
【００１３】
特定の実施形態では、固体支持体は、プレート、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、フィルター、スライド、ウェハー（ｗａｆｅｒ）、ロッド、粒子、ストランド（ｓｔｒａｎｄ）、ディスク、膜、またはチューブの表面、チャネル、カラム、フローセル装置、またはマイクロ流体デバイスである。固体支持体は、例えば、ガラス、石英、ケイ素、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、ハイドロゲル、またはレジンを含むことができる。
【００１４】
特定の実施形態では、固体支持体は、１種以上の固体支持体に結合した捕捉剤、例えば、小胞上の異なるバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれ以上の異なる捕捉剤を含む。
【００１５】
特定の実施形態では、固体支持体上で捕捉された小胞上のバイオマーカーの検出は、１種以上の検出剤、例えば、小胞上の異なるバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれ以上の異なる検出剤を使用することを含む。
【００１６】
特定の実施形態では、捕捉剤は、小胞上の第一のバイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体ミメティック、またはアプタマーを含む。他の実施形態では、検出剤は、小胞上の第二のバイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体ミメティック、またはアプタマーを含む。捕捉剤および検出剤は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、またはｓｃＦｖ断片を含んでもよい。
【００１７】
特定の実施形態では、検出剤は、検出可能標識、例えば、蛍光性、化学発光性、電気化学発光性、生物発光性、同位体、または放射性の標識をさらに含む。
【００１８】
特定の実施形態では、小胞上のバイオマーカーを検出することは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイを行うことを含む。
【００１９】
小胞を含む生体試料は対象または細胞培養上清からのものであってもよい。特定の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。
【００２０】
特定の実施形態では、生体試料は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムのパーキンソニズム−認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、抑うつ、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質疾患、脳萎縮症、精神遅滞、小脳失調、多系統萎縮症、脳震盪、脳震盪に至るか至らないかの（ｓｕｂｃｏｎｃｕｓｓｉｖｅ）衝撃、またはパーキンソン病などの神経障害を有すると診断されたまたは疑われている対象から得られる。
【００２１】
いくつかの実施形態では、生体試料は、乳癌、膵癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝癌、卵巣癌、脳癌、腟癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌（ｐｅｎｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、食道癌、皮膚癌、ファロピウス管癌、頭頚部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼球内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺の癌、副腎癌、尿道癌、腎盂の癌、尿管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、脳下垂体癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍などの癌を有すると診断されたまたは疑われている対象から得られる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、生体試料は、免疫学的障害を有すると診断されたまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態では、生体試料は、胎盤疾患を有すると診断されたまたは疑われている対象から得られる。
【００２３】
一態様では、本発明は、以下：ａ）対象からエキソソームを含む生体試料を得る工程；ｂ）捕捉剤がエキソソームの第一のバイオマーカーに選択的に結合する条件下で、固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を生体試料と接触させる工程、ここでエキソソームが固体支持体上で捕捉されている；ｃ）生体試料から固体支持体を分ける工程；ｄ）固体支持体上で捕捉されたエキソソームの第二のバイオマーカーのレベルを測定する工程、ここで、エキソソームは溶解または透過処理されていない；ｅ）第二のバイオマーカーのレベルを第二のバイオマーカーのコントロールレベルと比較することにより疾病または障害を有する対象を診断する工程；およびｆ）対象が疾病または障害を有すると診断される場合、疾病または障害について対象を治療する工程、を含む、対象における疾病または障害を診断し、かつ治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、第一のバイオマーカーは、神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質、またはオリゴデンドロサイト特異的タンパク質である。他の実施形態では、第二のバイオマーカーは、サイトゾルタンパク質、分泌タンパク質、受容体タンパク質、トランスポータータンパク質、または膜タンパク質である。いくつかの実施形態では、サイトゾルタンパク質は、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＳＮＣＡ、αβ−４２、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、またはＦａｓＬからなる群から選択される。他の実施形態では、分泌タンパク質は、サイトカイン、増殖因子、ケモカイン、およびインターロイキンからなる群から選択される。或る態様では、サイトカインは、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１６、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＳＦ１０、ＩＬ１２Ｂ、ノシセプチン、ＧｎＲＨ、ＦａｓＬおよびＴＮＦＳＦ１３からなる群から選択される。他の実施形態では、神経伝達物質受容体は、ドーパミン受容体（Ｄ１およびＤ２）、セロトニン受容体（２Ａ、２Ｃ、および３Ｂ）、ＧＡＢＡ受容体（１−６、５．Ｂ１、Ｂ２）、グルタミン酸受容体（１および２）、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＲＡＬ、ＴＮＦ受容体、細胞死受容体５および６）、および神経ペプチド受容体（オレキシン受容体、オピオイド受容体ＫＯＲ）からなる群から選択される。他の実施形態では、膜タンパク質は、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、トランスポータータンパク質は、神経伝達物質輸送体、ドーパミントランスポーター（例えば、ＤＡＴ）、セロトニントランスポーター、ＧＡＢＡトランスポーター、グルタミン酸トランスポーター、インスリントランスポーター、腫瘍壊死因子トランス��ーター、または神経ペプチドトランスポーターである。いくつかの実施形態では、疾病または障害が神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、または癌である。
【００２４】
別の態様では、本発明は、以下：ａ）対象からエキソソームを含む生体試料を得る工程；ｂ）捕捉剤が神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質、およびオリゴデンドロサイト特異的タンパク質からなる群から選択されるエキソソームの第一のバイオマーカーに選択的に結合する条件下で固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を生体試料と接触させる工程、ここで、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、オリゴデンドロサイト由来エキソソーム、またはミクログリア由来エキソソームは固体支持体上で捕捉される；ｃ）生体試料から固体支持体を分ける工程；ｄ）固体支持体上で捕捉されたエキソソームの神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質からなる群から選択される第二のバイオマーカーのレベルを測定する工程、ここで、エキソソームは溶解または透過処理されていない；ｅ）第二のバイオマーカーのレベルを第二のバイオマーカーのコントロールレベルと比較することにより神経障害を有する対象を診断する工程；およびｆ）対象が神経障害を有すると診断される場合に、神経障害について対象を治療する工程、を含む、対象における神経障害を診断し、かつ治療する方法を提供する。
【００２５】
他の実施形態では、本発明は、以下：ａ）対象からエキソソームを含む生体試料を得る工程；ｂ）捕捉剤がエキソソームの第一のバイオマーカーに選択的に結合する条件下で、固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を生体試料と接触させる工程、ここでエキソソームが固体支持体上で捕捉されている；ｃ）生体試料から固体支持体を分ける工程；ｄ）固体支持体上で捕捉されたエキソソームの第二のバイオマーカータンパク質のレベルを測定する工程、ここで、エキソソームは溶解または透過処理されていない、を含む対象における疾病または障害の進行を予後判定するまたはモニタリングする方法を提供し、それにより対象における疾病または障害の進行を予後判定するまたはモニタリングする。いくつかの実施形態では、該方法は、対象からエキソソームを含む第二の生体試料を得る工程および本発明のバイオマーカーのレベルを測定する工程および第二の生体試料におけるバイオマーカーのレベルを第一の生体試料におけるバイオマーカーのレベルと比較する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、第一のバイオマーカーは、神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質、またはオリゴデンドロサイト特異的タンパク質である。他の実施形態では、第二のバイオマーカーは、サイトゾルタンパク質、分泌タンパク質、受容体タンパク質、トランスポータータンパク質、または膜タンパク質である。いくつかの実施形態では、サイトゾルタンパク質は、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＳＮＣＡ、αβ−４２、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ−９５、ＳＶ２Ａ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、またはＦａｓＬからなる群から選択される。他の実施形態では、分泌タンパク質は、サイトカイン、増殖因子、ケモカイン、およびインターロイキンからなる群から選択される。或る態様では、サイトカインは、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１６、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＳＦ１０、ＩＬ１２Ｂ、ノシセプチン、ＧｎＲＨ、ＦａｓＬおよびＴＮＦＳＦ１３からなる群から選択される。他の実施形態では、神経伝達物質受容体は、ドーパミン受容体（Ｄ１およびＤ２）、セロトニン受容体（２Ａ、２Ｃ、および３Ｂ）、ＧＡＢＡ受容体（１−６、５．Ｂ１、Ｂ２）、グルタミン酸受容体（１および２）、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＲＡＬ、ＴＮＦ受容体、細胞死受容体５および６）、および神経ペプチド受容体（オレキシン受容体、オピオイド受容体ＫＯＲ）からなる群から選択される。他の実施形態では、膜タンパク質は、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、トランスポータータンパク質は、神経伝達物質輸送体、ドーパミントランスポーター、��ロトニントランスポーター、ＧＡＢＡトランスポーター、グルタミン酸トランスポーター、インスリントランスポーター、腫瘍壊死因子トランスポーター、または神経ペプチドトランスポーターである。いくつかの実施形態では、疾病または障害が神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、または癌である。
【００２６】
他の実施形態では、本発明は、以下：ａ）対象からエキソソームを含む生体試料を得る工程；ｂ）捕捉剤が神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質、およびオリゴデンドロサイト特異的タンパク質からなる群から選択されるエキソソームの第一のバイオマーカーに選択的に結合する条件下で固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を生体試料と接触させる工程、ここで、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、オリゴデンドロサイト由来エキソソーム、またはミクログリア由来エキソソームは固体支持体上で捕捉される；ｃ）生体試料から固体支持体を分ける工程；ｄ）固体支持体上で捕捉されたエキソソームの神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質からなる群から選択される第二のバイオマーカーのレベルを測定する工程、ここで、エキソソームは溶解または透過処理されていないを含む、対象における神経障害の進行を予後判定するまたはモニタリングする方法を提供し、それによって対象における神経疾患の進行を予後判定するまたはモニタリングする。いくつかの実施形態では、該方法は、対象からエキソソームを含む第二の生体試料を得る工程および本発明のバイオマーカーのレベルを測定する工程および第二の生体試料におけるバイオマーカーのレベルを第一の生体試料におけるバイオマーカーのレベルと比較する工程をさらに含む。
【００２７】
さらに別の態様では、本発明は、以下：ａ）対象からエキソソームを含む生体試料を得る工程；ｂ）捕捉剤がエキソソームの第一のバイオマーカーに選択的に結合する条件下で、固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を生体試料と接触させる工程、ここでエキソソームが固体支持体上で捕捉されている；ｃ）生体試料から固体支持体を分ける工程；ｄ）固体支持体上で捕捉されたエキソソームの第二のバイオマーカーを検出する工程、ここで、エキソソームは溶解または透過処理されていない；ｅ）第二のバイオマーカーのレベルを第二のバイオマーカーのコントロールレベルと比較することにより疾病または障害を有する対象を診断する工程；およびｆ）対象が疾病または障害を有すると診断される場合に疾病または障害について対象を治療する工程、を含む対象における疾病または障害を診断し、かつ治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、第一のバイオマーカーは、神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質、またはオリゴデンドロサイト特異的タンパク質である。他の実施形態では、第二のバイオマーカーは、サイトゾルタンパク質、分泌タンパク質、受容体タンパク質、トランスポータータンパク質、または膜タンパク質である。いくつかの実施形態では、サイトゾルタンパク質は、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＳＮＣＡ、αβ−４２、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、またはＦａｓＬからなる群から選択される。他の実施形態では、分泌タンパク質は、サイトカイン、増殖因子、ケモカイン、およびインターロイキンからなる群から選択される。或る態様では、サイトカインは、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１６、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＳＦ１０、ＩＬ１２Ｂ、ノシセプチン、ＧｎＲＨ、ＦａｓＬおよびＴＮＦＳＦ１３からなる群から選択される。他の実施形態では、神経伝達物質受容体は、ドーパミン受容体（Ｄ１およびＤ２）、セロトニン受容体（２Ａ、２Ｃ、および３Ｂ）、ＧＡＢＡ受容体（１−６、５．Ｂ１、Ｂ２）、グルタミン酸受容体（１および２）、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＲＡＬ、ＴＮＦ受容体、細胞死受容体５および６）、および神経ペプチド受容体（オレキシン受容体、オピオイド受容体ＫＯＲ）からなる群から選択される。他の実施形態では、膜タンパク質は、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、トランスポータータンパク質は、神経伝達物質輸送体、ドーパミントランスポーター、セロトニントランスポーター、ＧＡＢＡトランスポーター、グルタミン酸トランスポーター、インスリントランスポーター、腫瘍壊死因子トランスポーター��または神経ペプチドトランスポーターである。いくつかの実施形態では、疾病または障害が神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、または癌である。
【００２８】
さらに別の態様では、本発明は、以下：ａ）対象からエキソソームを含む生体試料を得る工程；ｂ）捕捉剤が神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質、およびオリゴデンドロサイト特異的タンパク質からなる群から選択されるエキソソームの第一のバイオマーカーに選択的に結合する条件下で固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を生体試料と接触させる工程、ここで、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、オリゴデンドロサイト由来エキソソーム、またはミクログリア由来エキソソームは固体支持体上で捕捉される；ｃ）生体試料から固体支持体を分ける工程；ｄ）固体支持体上で捕捉されたエキソソームの神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質からなる群から選択される第二のバイオマーカーを検出する工程、ここで、エキソソームは溶解または透過処理されていない；ｅ）第二のバイオマーカーのレベルを第二のバイオマーカーのコントロールレベルと比較することにより神経障害を有する対象を診断する工程；およびｆ）対象が神経障害を有すると診断される場合に神経障害について対象を治療する工程を含む、対象における神経障害を診断し、かつ治療する方法を提供する。
【００２９】
特定の実施形態では、神経障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムのパーキンソニズム−認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、抑うつ、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質疾患、脳萎縮症、精神遅滞、小脳失調、多系統萎縮症、脳震盪、脳震盪に至るか至らないかの（ｓｕｂｃｏｎｃｕｓｓｉｖｅ）衝撃、およびパーキンソン病からなる群から選択される。
【００３０】
特定の実施形態では、第一および第二のバイオマーカーは、以下を含むがこれらに限定されない小胞の膜結合型タンパク質または吸着タンパク質である；シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、タウ、リン酸化タウ、およびシナプトフィジンからなる群から選択される神経特異的タンパク質、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）からなる群から選択されるアストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＦａｓＬ、またはＩＬ１２Ｂからなる群から選択されるサイトカイン、ケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）、ＣＤ８１、ＣＤ１７１、ＣＴＳＤ、ＣＤ６３、αβ−４２、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）からなる群から選択されるオリゴデンドロサイト特異的タンパク質。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＣＤ８１、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、ＣＴＳＤ、ＲＥ１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、シナプトタグミン（ＳＹＴ）、ＮＧＲＮ、単球走化性タンパク質-１（ＣＣＬ２）、ＩＬ３４、グリコーゲン合成酵素（ＧＹＳ）、嗅覚受容体（ＯＲ）、細胞死受容体６（ＤＲ６）、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）、ＩＬ１２ベータ、アルファ−ベータ（Ａβ）、βセクレターゼ（ＢＡＣＥ）、ドーパミン受容体（Ｄ１およびＤ２）、セロトニン受容体（２Ａ、２Ｃ、および３Ｂ）、ＧＡＢＡ受容体（１−６、５、Ｂ１、Ｂ２）、グルタミン酸受容体（１および２）、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＲＡＬ、ＴＮＦ受容体、細胞死受容体５および６）、神経ペプチド受容体（オレキシン受容体、オピオイド受容体ＫＯＲ）、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第一のバイオマーカーは、ＳＮＡＰ２５であり、かつ第二のバイオマーカーは、ＣＤ８１、タウ、ＮＥＦＬ、ＴＮＦａ、およびＩＬ８からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、第一のバイオマーカーは、ＥＡＡＴ１であり、かつ第二のバイオマーカーは、ＣＤ８１またはＧＦＡＰである。いくつかの実施形態では、第一のバイオマーカーは、ＯＭＧであり、かつ第二のバイオマーカーは、ＣＤ８１またはＭＢＰである。いくつかの実施形態では、第一のバイオマーカーは、ＣＤ１１ｂであり、かつ第二のバイオマーカーは、ＳＹＰである。
【００３１】
いくつかの実施形態では、生体試料におけるエキソソームの１以上のバイオマーカーのレベルは、コントロール試料における１以上のバイオマーカーのレベルと比較され、ここで生体試料の１以上のバイオマーカーのレベルはコントロール試料と比較して上昇している。いくつかの実施形態では、生体試料における１以上のバイオマーカーのレベルはコントロール試料における１以上のバイオマーカーのレベルと比較され、ここで、生体試料の１以上のバイオマーカーのレベルはコントロール試料と比較して減少している。いくつかの実施形態では、バイオマーカーレベルは少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％特異度で対象の疾病または障害状態決定する。いくつかの実施形態では、疾病または障害が神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、または癌である。いくつかの実施形態では、神経障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムのパーキンソニズム−認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、抑うつ、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質疾患、脳萎縮症、精神遅滞、小脳失調、多系統萎縮症、脳震盪、脳震盪に至るか至らないかの（ｓｕｂｃｏｎｃｕｓｓｉｖｅ）衝撃、およびパーキンソン病からなる群から選択される。他の実施形態では、生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、癌は、乳癌、膵癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝癌、卵巣癌、脳癌、腟癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌（ｐｅｎｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、食道癌、皮膚癌、ファロピウス管癌、頭頚部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼球内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺の癌、副腎癌、尿道癌、腎盂の癌、尿管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、脳下垂体癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍である。
【００３２】
別の実施形態では、本発明は、以下：ａ）対象からエキソソームを含む生体試料を得る工程；ｂ）捕捉剤がエキソソームの膜マーカーに選択的に結合する条件下で固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を生体試料と接触させる工程、ここで、膜マーカーは、ＳＮＡＰ２５、ＯＭＧ、ＣＤ１１ｂ、ＥＡＡＴ１およびＣＤ１７１からなる群から選択され、ここで、エキソソームは固体支持体上で捕捉された膜マーカーを有する；ｃ）生体試料から固体支持体を分ける工程；ｄ）固体支持体上で捕捉されたエキソソームのＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ、ＣＤ６３、αβ−４２、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、およびＩＬ３４からなる群から選択される１以上のバイオマーカーのレベルを測定する工程、ここで、エキソソームは溶解または透過処理されていない；ｅ）１以上のバイオマーカーのレベルをコントロール試料におけるバイオマーカーのコントロールレベルと比較することにより疾病または障害を有する対象を診断する工程、ここで、コントロール試料における１以上のバイオマーカーのコントロールレベルと比較して増加した１以上のバイオマーカーのレベルおよび／または減少した１以上のバイオマーカーのレベルが、対象が疾病または障害を有すると示す；およびｆ）対象が疾病または障害を有すると診断される場合に疾病または障害について対象を治療する工程、を含む、対象における疾病または障害を診断し、かつ治療する方法を含む。いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、ＣＤ８１、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、ＣＴＳＤ、ＲＥ１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、シナプトタグミン（ＳＹＴ）、ＮＧＲＮ、単球走化性タンパク質-１（ＣＣＬ２）、ＩＬ３４、グリコーゲン合成酵素（ＧＹＳ）、嗅覚受容体（ＯＲ）、細胞死受容体６（ＤＲ６）、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）、ＩＬ１２ベータ、アルファ−ベータ（Ａβ）、βセクレターゼ（ＢＡＣＥ）、ドーパミン受容体（Ｄ１およびＤ２）、セロトニン受容体（２Ａ、２Ｃ、および３Ｂ）、ＧＡＢＡ受容体（１−６、５．Ｂ１、Ｂ２）、グルタミン酸受容体（１および２）、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＲＡＬ、ＴＮＦ受容体、細胞死受容体５および６）、神経ペプチド受容体（オレキシン受容体、オピオイド受容体ＫＯＲ）、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、疾病または障害が神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、または癌である。
【００３３】
別の態様では、本発明は、以下：ａ）固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体、ここで捕捉剤が小胞の表面の第一のバイオマーカーに選択的に結合する；およびｂ）小胞の表面の第二のバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも１つの検出剤、を含む小胞上のバイオマーカーを検出するためのキットを含む。特定の実施形態では、小胞は、エキソソーム、微小粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソームからなる群から選択される。さらに他の態様では、本発明は、以下：ａ）固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体、ここで、少なくとも１つの捕捉剤は、エキソソームの神経特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質、またはオリゴデンドロサイト特異的タンパク質に選択的に結合する；およびｂ）１以上の検出剤、ここで、１以上の検出剤は、エキソソームの表面のサイトゾルタンパク質、分泌タンパク質、神経伝達物質受容体または膜タンパク質に選択的に結合する、を含む、小胞上のバイオマーカーを検出するためのキットを提供する。いくつかの実施形態では、サイトゾルタンパク質は、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＳＮＣＡ、αβ−４２、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、またはＦａｓＬからなる群から選択される。他の実施形態では、分泌タンパク質は、サイトカイン、増殖因子、ケモカイン、およびインターロイキンからなる群から選択される。或る態様では、サイトカインは、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１６、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＳＦ１０、ＩＬ１２Ｂ、ノシセプチン、ＧｎＲＨ、ＦａｓＬおよびＴＮＦＳＦ１３からなる群から選択される。他の実施形態では、神経伝達物質受容体は、ドーパミン受容体（Ｄ１およびＤ２）、セロトニン受容体（２Ａ、２Ｃ、および３Ｂ）、ＧＡＢＡ受容体（１−６、５．Ｂ１、Ｂ２）、グルタミン酸受容体（１および２）、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＲＡＬ、ＴＮＦ受容体、細胞死受容体５および６）、および神経ペプチド受容体（オレキシン受容体、オピオイド受容体ＫＯＲ）からなる群から選択される。他の実施形態では、膜タンパク質は、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭからなる群から選択される。
【００３４】
特定の実施形態では、キットにおける捕捉剤および検出剤は、小胞上の第一のバイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体ミメティック、またはアプタマーを含む。該抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、およびｓｃＦｖ断片を含んでもよい。別の実施形態では、捕捉剤または検出剤は、抗ＣＤ１７１抗体、抗シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）抗体、抗ニューログラニン（ＮＲＧＮ）抗体、抗タウ抗体、抗シナプトフィジン抗体、および抗ＣＤ６３抗体、抗αβ−４２抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＴＤ抗体、抗ＧＡＰＤＨ抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、抗ＩＬ３４抗体、抗ＣＸ３ＣＬ１抗体、抗グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体、抗興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）抗体、抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）抗体、抗ＳＮＣＡ抗体、抗ＴＨ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、および抗オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）抗体からなる群から選択される抗体を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの捕捉剤は、エキソソームのＣＤ１７１、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＣＤ１１ｂ、またはＯＭＧに選択的に結合する。他の実施形態では、１以上の検出剤は、エキソソームの表面のＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、ＣＤ６３、αβ−４２、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、またはＩＬ３４に選択的に結合する。いくつかの実施形態では、少なくとも１以上の検出剤は、ＣＤ８１、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、ＣＴＳＤ、ＲＥ１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、シナプトタグミン（ＳＹＴ）、ＮＧＲＮ、単球走化性タンパク質−１（ＣＣＬ２）、ＩＬ３４、グリコーゲン合成酵素（ＧＹＳ）、嗅覚受容体（ＯＲ）、細胞死受容体６（ＤＲ６）、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）、ＩＬ１２ベータ、アルファ−ベータ（Ａβ）、βセクレターゼ（ＢＡＣＥ）、ドーパミン受容体（Ｄ１およびＤ２）、セロトニン受容体（２Ａ、２Ｃ、および３Ｂ）、ＧＡＢＡ受容体（１−６、５．Ｂ１、Ｂ２）、グルタミン酸受容体（１および２）、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＲＡＬ、ＴＮＦ受容体、細胞死受容体５および６）、神経ペプチド受容体（オレキシン受容体、オピオイド受容体ＫＯＲ）、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、またはＮＣＡＭに選択的に結合する。
【００３５】
特定の実施形態では、キットにおける検出剤は、検出可能標識、例えば、蛍光性、化学発光性、電気化学発光性、生物発光性、同位体、または放射性の標識をさらに含む。
【００３６】
別の実施形態では、キットは、イムノアッセイを行うための試薬をさらに含む。例示的なイムノアッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）を含む。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、対象における疾病または障害を診断するまたは予後判定する、疾病または障害のリスクのある対象を同定する、または疾病または障害を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想するためのキットであって、以下を含むキット：ａ）固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体、ここで、少なくとも１つの捕捉剤は、エキソソームのＣＤ１７１膜マーカーに選択的に結合する；およびｂ）少なくとも２つの検出剤、ここで、少なくとも１つの検出剤は、リン酸化タウＴ１８１に選択的に結合し、かつ少なくとも１つの検出剤は、エキソソームの表面のニューログラニンに選択的に結合する、を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの捕捉剤または検出剤は、ＣＤ１７１、リン酸化タウＴ１８１、またはニューログラニンに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体ミメティック、またはアプタマーを含む。特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、およびｓｃＦｖ断片からなる群から選択される。別の実施形態では、キットは、抗ニューログラニン抗体、抗リン酸化タウＴ１８１抗体、および抗ＣＤ１７１抗体を含む。一実施形態では、疾病または障害が神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、または癌である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、本発明は、以下：ａ）対象から小胞またはエキソソームを含む生体試料を得る工程；ｂ）捕捉剤が小胞またはエキソソームの第一のバイオマーカーに選択的に結合する条件下で固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を生体試料と接触させる工程、ここで小胞またはエキソソームは固体支持体上で捕捉される；ｃ）生体試料から固体支持体を分ける工程；ｄ）固体支持体上で捕捉された小胞またはエキソソームの第二のバイオマーカータンパク質のレベルを測定する工程、ここで、小胞またはエキソソームは溶解または透過処理されていない、を含む、対象における疾病または障害の進行を予後判定するまたはモニタリングする方法を提供し、それにより、対象における疾病または障害の進行を予後判定するまたはモニタリングする。他の実施形態では、該方法は、第二の生体試料で第二の時点で（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、および（ｄ）を繰り返すことをさらに含み、ここで、第一の時点でのそのレベルと比較した第二のバイオマーカーのレベルの増加が、疾病または障害が進行していることを示し、第一の時点でのそのレベルと比較した第二のバイオマーカーのレベルの減少が、疾病または障害が退行していることを示す。他の実施形態では、該方法は、疾病または障害が進行している場合に疾病または障害について対象を治療する工程をさらに含む。さらに他の実施形態では、該方法は、疾病または障害が退行している場合に疾病または障害についての治療を減らすまたは治療を停止する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、疾病または障害が神経障害、免疫学的障害、胎盤疾患、または癌である。他の実施形態では、神経障害は、以下からなる群から選択される：アルツハイマー病（ＡＤ）、血管性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムのパーキンソニズム−認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、抑うつ、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質疾患、脳萎縮症、精神遅滞、小脳失調、多系統萎縮症、脳震盪、脳震盪に至るか至らないかの（ｓｕｂｃｏｎｃｕｓｓｉｖｅ）衝撃、およびパーキンソン病。
【００３９】
本発明のこれらの、および他の実施形態は、容易に、本明細書の開示に照らして当業者に想起され、全てのそのような実施形態が具体的に企図されている。
【００４０】
本発明の各々の限定は、本発明の様々な実施形態を包含し得る。従って、任意の１つの要素または要素の組み合わせを伴う本発明の各々の限定は、本発明の各態様に含まれ得ると考えられる。本発明は、その適用にあたり、以下詳述される構造の詳細および構成要素の配置に限られない。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な方法で実施または具体化することができる。また、本明細書で使用される表現および用語は説明の目的のためであり、限定とみなされるべきではない。本明細書における「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「伴う（ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ）」、およびそれらの活用形の使用は、その後に列挙される項目およびその同等物ならびに追加項目を包含することを意味する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに指示しない限り、複数の言及を含むことに注意しなければならない。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】図１Ａおよび１Ｂはエキソソームの細胞特異的バイオマーカーを定量するための方法を示す。図１Ａはそれらが由来する細胞（母細胞）のタンパク質を含有するエキソソームの生成を示す概略図を示す。図１Ｂは膜マーカーおよび吸着マーカーについてエキソソームをスクリーニングする方法を示す。
【００４２】
【図２】図２Ａ−２Ｆはエキソソームの表面のサイトゾル（非膜）タンパク質の例示的な検出を示す。神経特異的な抗ＳＮＡＰ２５（図２Ａ−２Ｃ）またはコントロールマウスＩｇＧ（図２Ｄ−２Ｆ）を白色ＥＬＩＳＡプレートに固定化した。様々な容積（１０、２．５、および０ｕＬ）の血漿を最終容積４０ｕＬでＰＢＳ（▲）、０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０  ＰＢＳ（○）、または０．１％トリトン−Ｘ１００  ＰＢＳ（□）において懸濁し、ＥＬＩＳＡプレートにアプライした。４℃で一晩インキュベーションした後、未結合の材料を除去した。そして、エキソソーム表面マーカーＣＤ８１（図２Ａおよび２Ｄ）、および２つの異なる可溶性サイトゾルタンパク質ＧＡＰＤＨ（図２Ｂおよび２Ｅ））およびＣＴＳＤ（図２Ｃおよび２Ｆ）に対するビオチンラベル化抗体をＥＬＩＳＡプレートにアプライした。ＰＢＳ試料（▲）について、抗体をｔｗｅｅｎ−２０なしでＰＢＳにおいて懸濁した。ｔｗｅｅｎ−２０（○）およびトリトン−Ｘ１００（□）の試料について、ラベル化抗体を０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０  ＰＢＳにおいて懸濁した。従来の化学発光ＥＬＩＳＡ手順を実施し、相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ）（ＲＬＵ）を決定した。
【００４３】
【図３】図３Ａ−３Ｄは本発明のマーカータンパク質の特異度を示す。（図３Ａ）エキソソーム表面マーカーＣＤ８１、（図３Ｂ）ニューロン表面マーカーＳＮＡＰ２５、（図３Ｃ）アストロサイト表面マーカー（ＥＡＡＴ１）、または（図３Ｄ）オリゴデンドロサイト表面マーカー（ＯＭＧ）に対する抗体を白色ＥＬＩＳＡプレートに固定化した。４０μＬのＰＢＳで懸濁した１０μＬの血漿をＥＬＩＳＡプレートにアプライした。４℃で一晩インキュベーションした後、未結合の材料を除去した。エキソソーム表面マーカーＣＤ８１、一般的なサイトゾルマーカーＧＡＰＤＨ、ニューロンにおけるサイトゾルタンパク質（ＮＲＧＮ）、オリゴデンドロサイト（ＭＢＰ）、およびアストロサイト（ＧＦＡＰ）に対するビオチンラベル化抗体をＥＬＩＳＡプレートにアプライした。抗体のないコントロール（ｔＰＢＳ）も含んだ。従来の化学発光ＥＬＩＳＡを実施し、相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ）（ＲＬＵ）を決定した。
【００４４】
【図４】図４Ａ−４Ｄは本発明のエキソソームバイオマーカーの検出および定量を示す。抗ＳＮＡＰ２５（図４Ａおよび図４Ｂ）、抗ＥＡＡＴ１（図４Ｃ）、または抗ＯＭＧ（図４Ｄ）をＥＬＩＳＡプレートに固定化した。様々な容積の標準血漿をＰＢＳにおいて懸濁し、最終容積４０ｍＬでＥＬＩＳＡウェルにアプライした。ＮＲＧＮ（図４Ａ）、タウ（図４Ｂ）、ＧＦＡＰ（図４Ｃ）、およびＭＢＰ（図４Ｄ）に対する抗体を検出抗体として使用した。
【００４５】
【図５】図５Ａ−５Ｃはエキソソーム吸着マーカーのスクリーニングを示す。コントロールマウスＩｇＧ（白抜きカラム）、マウス抗ヒトＣＤ８１（明るいグレーのカラム）、またはマウス抗ヒトシナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）（暗いグレーのカラム）をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、そしてプールしたヒト血漿をすべてのＥＬＩＳＡウェルにアプライした。列挙した様々な検出抗体を使用してＥＬＩＳＡを実行した。検出抗体（すべてビオチン化された）はエキソソーム膜タンパク質（ＣＤ８１、ＣＤ１７１、ＣＤ６３、およびＳＮＡＰ２５）だけでなく、様々な非膜タンパク質（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、タウ、微小管関連タンパク質タウ（タウ）およびリン酸化タウＴ１８１、およびアミロイドｂ１−４２ペプチド（Ａベータ４２）に対するものであった。陰性コントロールとして、ビオチン化抗体を何も含まないＰＢＳを使用した。図５Ａは膜タンパク質、ＣＤ８１およびＣＤ１７１、および非膜タンパク質、ＧＡＰＤＨおよびＣＴＳＤの検出を示す。図５Ｂは膜タンパク質、ＣＤ６３、およびＳＮＡＰ２５の検出を示す。図５Ｃは非膜タンパク質、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、Ｔ１８１、およびＡベータ４２の検出を示す。
【００４６】
【図６】図６Ａ−６Ｅはアルツハイマー病の診断についての臨床応用を示す。図６Ａにおけるアッセイ概略図で示されるように抗ＣＤ１７１抗体をＥＬＩＳＡプレートに固定化した。アルツハイマー病を有する対象からの１２のＥＤＴＡ血漿試料および年齢、性別を一致させたコントロールをＥＬＩＳＡウェルにアプライし、および（図６Ｂ）ＣＤ８１、（図６Ｃ）ＣＴＳＤ（図６Ｄ）ＮＲＧＮ、および（図６Ｅ）ｐ−タウＴ１８１に対する抗体を検出抗体として使用した。
【００４７】
【図７】図７Ａ−７Ｌは本発明の様々なエキソソームバイオマーカーの血漿レベルの安定性を示す。抗ＣＤ８１、抗ＣＤ１７１、抗ＳＮＡＰ２５、抗ＥＡＡＴ１、および抗ＯＭＧをＥＬＩＳＡプレートに固定化した。ＥＤＴＡ血漿を２−３週間毎週７コントロール対象から得て、ＥＬＩＳＡウェルにアプライした。図７Ａはエキソソーム膜標的を検出するためのアッセイ概略図を示す。図７Ｂ−７Ｆは（図７Ｂ）総エキソソーム（ＴＥ）についてのＣＤ８１プレートの抗ＣＤ８１プローブ、（図７Ｃ）ＣＤ１７１−ベースのＮＤＥ（ｃＮＤＥ）についてのＣＤ８１プレートの抗ＣＤ１７１プローブ、（図７Ｄ）ＳＮＡＰ２５−ベースのＮＤＥ（ｓＮＤＥ）についてのＣＤ８１プレートの抗ＳＮＡＰ２５プローブ、（図７Ｅ）ＥＡＡＴ１プレート（ＡＤＥ）の抗ＣＤ８１プローブ、および（図７Ｆ）ＯＤＥについてのＯＭＧプレートの抗ＣＤ８１プローブでの検出を示す。図７Ｇはエキソソーム表面タンパク質標的についてのアッセイ概略図を示す。図７Ｈ−７Ｌはそれぞれ（図７Ｈ）ＥＡＡＴ１プレートのＧＦＡＰプローブ、（図７Ｉ）ＯＭＧプレートのＭＢＰプローブ、（図７Ｊ）ＳＮＡＰ２５プレートのＮＲＧＮプローブ、（図７Ｋ）ＳＮＡＰ２５プレートのタウプローブ、および（図７Ｌ）ＣＤ１７１プレートのＮＲＧＮプローブでの検出を示す。
【００４８】
【図８】図８Ａおよび８Ｂは抗ＮＲＧＮ−固定化ＥＬＩＳＡプレートを使用する血漿における本発明のエキソソームバイオマーカーの検出および定量を示す。図８Ａは例示的なアッセイ概略図を示す。図８Ｂはアッセイ結果を示す。抗ＮＲＧＮ（中程度のグレーおよび暗いグレーのカラム）またはコントロールマウスＩｇＧ（黒および明るいグレーのカラム）をＥＬＩＳＡプレートに固定化した。ＥＤＴＡ血漿（明るいグレーおよび暗いグレーのカラム）またはＰＢＳ単独（黒および中程度のグレーのカラム）をＥＬＩＳＡウェルにアプライした。ＮＲＧＮ、ＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＣＤ８１、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧおよびＰＢＳコントロールに対する抗体を検出抗体として使用した。
【００４９】
【図９】図９Ａ−９Ｄは本発明のエキソソームバイオマーカーのミクログリアターゲティングを示す。図９Ａはアッセイ概略図を示す。図９Ｂ−９Ｄはアッセイ結果を示す。抗ＣＤ１１ｂ（中程度のグレーおよび暗いグレーのカラム）またはコントロールマウスＩｇＧ（黒および明るいグレーのカラム）をＥＬＩＳＡプレートに固定化した。７つの異なるドナーからのＥＤＴＡ血漿（ＩＲ１−ＩＲ７）（明るいグレーおよび暗いグレーのカラム）またはＰＢＳ単独（黒および中程度のグレーのカラム）をＥＬＩＳＡウェルにアプライした。ＧＦＡＰ（図９Ｂ）、ＭＢＰ（図９Ｃ）、またはＮＲＧＮ（図９Ｄ）に対する抗体を検出抗体として使用した。
【００５０】
【図１０】図１０Ａ−１０Ｆは、脳由来エキソソームの表面の分泌タンパク質（サイトカイン（ＩＬ１ｂおよびＩＬ３４）およびケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１））の検出を示すデータを示す。
【００５１】
【図１１】図１１は、ＥＬＩＳＡ定量標準として標準血漿の希釈を示すデータを示す。
【００５２】
【図１２】図１２は、本発明の１６エキソソームバイオマーカーの血漿レベルについての二重変動（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）を示すデータを示す。
【００５３】
【図１３】図１３は、本発明の１６エキソソームバイオマーカーの血漿レベルについての標準曲線を示すデータを示す。
【００５４】
【図１４】図１４は、血漿における標的エキソソーム表面タンパク質バイオマーカーの定量を示すデータを示す。
【００５５】
【図１５】図１５は、ＣＤ８１に標準化された血漿エキソソームバイオマーカーレベルを示すデータを示す。
【００５６】
【図１６】図１６は、ＳＹＴに標準化された血漿エキソソームバイオマーカーレベルを示すデータを示す。
【００５７】
【図１７】図１７は、本発明の例示的なアッセイの原理を示すデータを示す。ＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥは抗ＳＮＡＰ２５（ニューロンマーカー）、抗ＥＡＡＴ１（アストロサイトマーカー）、および抗ＯＭＧ（オリゴデンドロサイト（ｏｌｉｇｏｄｅｄｒｏｃｙｔｅ）マーカー）が固定化されているＥＬＩＳＡプレートで特異的に捕捉される。捕捉されたエキソソームをビオチン化抗ＣＤ８１（エキソソームの一般的なマーカー）でさらに調査した。
【００５８】
【図１８】図１８Ａ−１８Ｃは、本発明の例示的なアッセイの特異度を示すデータを示す。抗ＳＮＡＰ２５（５００ｎｇ／ｍＬ）（Ａ●）、抗ＥＡＡＴ１（８３０ｎｇ／ｍＬ）（Ｂ●）、抗ＯＭＧ（８３０ｎｇ／ｍＬ）（Ｃ●）、およびコントロールマウスＩｇＧ（５００ｎｇ／ｍＬ）（△）を方法の項で記載されるようにＥＬＩＳＡプレートに固定化した。単一ドナー血漿試料の連続的な希釈を調製し、ＥＬＩＳＡプレートにアプライし、そしてビオチン化抗ＣＤ８１で調べた。ＥＬＩＳＡ結果は相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ）（ＲＬＵ）として表される。
【００５９】
【図１９】図１９Ａ−１９Ｃは、本発明の例示的なアッセイのアッセイ間精度を示すデータを示す。ＮＤＥ（Ａ）、ＡＤＥ（Ｂ）、およびＯＤＥ（Ｃ）を５２試料（コントロール、ＰＤ、ＭＳＡ、およびＰＳＰの各１５）を重複して列挙し、および各重複をｘ−ｙプロットで解析しアッセイ間変動を示した。点線は４５°線および実線は回帰直線である。
【００６０】
【図２０】図２０Ａ−２０Ｃは、本発明の例示的なアッセイについてのアッセイ間精度を示すデータを示す。ＮＤＥ（Ａ）、ＡＤＥ（Ｂ）、およびＯＤＥ（Ｃ）が３つの異なるコントロール血漿試料で９回別々に列挙された。各実験では、標準血漿の７つの希釈（任意に割り当てられた１００ユニット／ｍＬ）および緩衝液コントロールを同時に解析した、そしてＥＬＩＳＡ測定値（ＲＬＵ）をユニット／ｍＬに変換した。コントロール血漿１（△）、２（□）、および３（●）の平均±標準偏差（ＣＶ％）は、それぞれＮＤＥについて６４．６±９．２ユニット／ｍＬ（１４．２％）、１．６±０．８ユニット／ｍＬ（５２．９％）、および４４．４±５．５ユニット／ｍＬ（１２．４％）、ＡＤＥについて７．５±１．３ユニット／ｍＬ（１６．８％）、２．６±０．５ユニット／ｍＬ（２０．３％）、および０．２±０．１ユニット／ｍＬ（６３．３３％）、およびＯＤＥについて１２．６±１．３ユニット／ｍＬ（１０．１％）、２．６±０．３ユニット／ｍＬ（１１．４５％）、および０．２±０．１ユニット／ｍＬ（３４．５％）であった。
【００６１】
【図２１】図２１Ａ−２１Ｃは、本発明の例示的なアッセイについての希釈直線性を示すデータを示す。様々なコントロール血漿試料のスクリーニング後に、我々は、広範囲なＮＤＥ（Ａ）、ＡＤＥ（Ｂ）、およびＯＤＥ（Ｃ）を示す３つの血漿試料（□、●、▲）を見つけた。次に、３つの血漿試料間の直線性と勾配を解析するために、血漿希釈研究を実施した。
【００６２】
【図２２】図２２Ａ−２２Ｃは、パーキンソン病を有するヒト対象における脳由来エキソソームの列挙を示すデータを示す。ＮＤＥ（Ａ）、ＡＤＥ（Ｂ）、およびＯＤＥ（Ｃ）をコントロール、ＰＤ、ＭＳＡの各１５、および７ＰＳＰ患者において列挙した。各ドットは１人の個人を表し、およびｐ値はコントロールに対するものである。
【００６３】
【図２３】図２３Ａ−２３Ｃは、パーキンソン病およびコントロールの鑑別診断についてＮＤＥおよびＯＤＥの受信者動作特性（ＲＯＣ）を示すデータを示す。ＲＯＣをパーキンソン病およびコントロールのＮＤＥ（Ａ）およびＯＤＥ（Ｂ）データを使用して算出した。曲線下面積（ＡＵＣ）はそれぞれＮＤＥおよびＯＤＥについて８８．９％および８８％であった。
【００６４】
【図２４】図２４Ａ−２４Ｆは、パーキンソン病を有する対象からの血漿試料における血漿ＢＤＥのレベルおよび疾患重症度間相関を示すデータを示す。ＰＤ患者のＮＤＥ（Ａ、Ｄ）、ＡＤＥ（Ｂ、Ｅ）、およびＯＤＥ（Ｃ、Ｆ）はｍＲＳ（Ａ−Ｃ）およびＨｏｅｈｎ−Ｙａｈｒ（Ｄ−Ｆ）の重症度スコアで分類され、コントロールのスコアとともに示される。各ドットは１人の個人を表し、および統計学的なｐ−値は各重症度群およびコントロール間のものであった。
【００６５】
【図２５】図２５Ａ−２５Ｄは、脳由来エキソソーム、およびパーキンソン病重症度の相関を示すデータを示す。Ａ：ＡＤＥ／ＮＤＥ比および罹病期間。Ｂ：ＡＤＥ／ＮＤＥ比およびｍＲＳスコア。Ｃ：ＡＤＥ／ＮＤＥ比およびＵＰＤＲＳパート３（運動（ｍｏｔｏｒ））。Ｄ：ＯＤＥ／ＮＤＥ比およびＵＰＤＲＳパート３（運動）。
【００６６】
【図２６】図２６Ａ−２６Ｄは、ＭＳＡにおける血漿ＢＤＥのレベルおよび疾患重症度間の相関を示すデータを示す。Ａ：ＭＳＡ患者のＯＤＥ（Ａ）はｍＲＳの重症度スコアで分類され、コントロールのスコアとともに示された。各ドットは１人の個人を表す。Ｂ：図３Ｃに示されるのと同じデータ。Ｃ−Ｅ：各ＭＳＡ患者のＯＤＥは、数か月における罹病期間（Ｃ）、および運動失調の国際評価尺度（ＩＣＡＲＳ）のスコア（Ｄ）および統一パーキンソン病評価尺度（ＵＰＤＲＳ）３（運動）（Ｅ）と比較した。ｒ２およびｐ値はＥで示した。
【００６７】
【図２７】図２７Ａ−２７Ｆは、ニューロン−、アストロサイト−、およびオリゴデンドロサイト由来エキソソームの表面のα−シヌクレインの病的形態の検出を示すデータを示す。
【００６８】
【図２８】図２８Ａ−２８Ｂは、ニューロン由来エキソソーム（ＮＤＥ）の表面のドーパミン受容体Ｄ２（ＤＲＤ２）の検出を示すデータを示す。
【００６９】
【図２９】図２９Ａ−２９Ｃは、ＤＲＤ２について血漿希釈研究結果を示すデータを示す。
【００７０】
【図３０】図３０Ａ−３０Ｇは、神経疾患を有するヒトからの血漿試料におけるニューロン由来エキソソームにおけるＤＲＤ２検出を示すデータを示す。
【００７１】
【図３１】図３１は、ＰＤおよびコントロール試料間のＤＲＤ２レベルについてのＲＯＣ曲線および曲線下面積（ＡＵＣ）を示すデータを示す。
【００７２】
【図３２】図３２Ａ−３２Ｄは、ＤＡＴ＋小胞の表面のＣＤ８１、ＳＮＣＡ、ＳＮＣＡオリゴマーＦ１、およびＴＨの検出を示すデータを示す。
【００７３】
【図３３】図３３は、血漿における小胞の表面のＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、およびＯＭＧの検出を示すデータを示す。
【００７４】
【図３４】図３４は、血漿における捕捉されたＤＡＴ＋ＣＤ８１＋小胞についての粒子径を示すデータを示す。
【００７５】
【図３５】図３５は、血漿における小胞の表面の様々なバイオマーカーの検出を示すデータを示す。
【発明を実施するための形態】
【００７６】
発明の詳細な説明
本発明は、本明細書中に記載された、変化し得るような特定の方法論、プロトコール、細胞株、アッセイ、および薬剤に限られないということが理解されるべきである。また、本明細書で使用される用語は、本発明の特定の実施形態を説明することを意図し、添付の特許請求の範囲に記載の本発明の範囲を限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。
【００７７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに指示しない限り、複数への言及を含むことに注意しなければならない。従って、例えば「断片」への言及は、そのような断片の複数を含み、「抗体」への言及は、１つ以上の抗体および当業者に知られたその同等物などへの言及である。
【００７８】
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと、類似もしくは同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法、装置、および材料が以下に記載されている。本明細書に引用される全ての刊行物は、本発明に関連して使用されてもよい、刊行物で報告された方法論、薬剤、およびツールを説明および開示する目的で、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる。本明細書において、本発明が、先行発明により上述の開示に先行する権利がないと認めるものとして解釈されるべきものはない。
【００７９】
特に指示しない限り、本発明の実施は、当技術分野の技術の範囲内で、化学、生化学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学および薬理学の従来の方法を採用するだろう。このような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，ｅｄ．  （１９９０）Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．；  Ｃｏｌｏｗｉｃｋ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．  Ｉ−ＩＶ  （Ｄ．Ｍ．  Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ）；  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．  （１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｓ．  Ｉ−ＩＩＩ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；  Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．  Ｍ．  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．  （１９９９）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；  Ｒｅａｍ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．  （１９９８）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：  Ａｎ  Ｉｎｔｅｎｓｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）；  ＰＣＲ  （Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｓｅｒｉｅｓ）、２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｎｅｗｔｏｎ  ＆  Ｇｒａｈａｍ  ｅｄｓ．，１９９７，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ）を参照のこと。
【００８０】
本発明は、部分的に、小胞上のバイオマーカーを検出および定量するための効率的な方法の開発に関する。特に、小胞は固体支持体上で選択的に捕捉され、捕捉された小胞の膜結合型のおよび吸着バイオマーカーは小胞の溶解または透過処理なしで検出される。本発明は、様々な疾病のための診断および予後判定の方法における小胞上で同定されたかかるバイオマーカーの使用にさらに関する。
【００８１】
その上、本発明は、本明細書に記載の方法で使用するための組成物を提供する。かかる組成物は、固体支持体、小胞の表面マーカー（すなわち、膜タンパク質または吸着タンパク質）に特異的に結合して固体支持体の小胞を捕捉する捕捉剤、小胞上のバイオマーカーに特異的に結合する検出剤、イムノアッセイを行うための試薬、および本明細書に記載の方法を行うための他の試薬を含んでもよい。
【００８２】
本発明は、小胞上のバイオマーカーを検出するためのキットをさらに提供する。当該キットは、固体支持体、固体支持体の小胞に特異的に結合しかつ捕捉する１以上の捕捉剤、小胞上のバイオマーカーに特異的に結合する１以上の検出剤、および所望により、イムノアッセイ試薬および本明細書に記載の方法を行うための他の試薬、生体試料を収集する、および／または保持するための１以上の容器、およびキットの使用説明書を含んでもよい。
【００８３】
本発明は、エキソソームバイオマーカーが例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を含む神経障害を有するまたは発症する可能性のある対象を有するを同定するためにアッセイされ得るという発見にさらに関する。
【００８４】
本発明は、部分的には、神経疾患（例えば、アルツハイマー病）を有する対象の血液循環中に存在するニューロン由来エキソソーム中の特定のバイオマーカーの予想外の減少または増加の、発見に基づく。本発明は、これらのバイオマーカーのエキソソームレベルが神経疾患を有する対象における神経障害を診断するためにアッセイされることがあることを実証する。本発明は、対象からのニューロン由来のエキソソーム中の特定のバイオマーカーの測定が神経疾患のその後の発症を予想する（例えば、神経障害を発症するリスクのある対象を同定する）ために使用されることがあることをさらに示す。
【００８５】
セクションの見出しは、構成上の目的のためのみに本明細書中で使用され、本明細書に記載の主題を限定するものとして決して解釈されるべきではない。
【００８６】
生体試料
小胞（例えば、エキソソーム）を含む生体試料は、対象から得られてもよい。対象から得られた生体試料は典型的には血液であるが、解析される小胞を含む体液、組織または細胞からの任意の試料であり得る。生体試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹水、脳脊髄液、子宮頸部スワブ、涙、唾液、頬スワブ、皮膚、臓器、および生検を含んでもよいが、これらに限られない。あるいは、エキソソームは、周囲の培地から分泌されたエキソソームを収集することにより培養細胞から得られ得る。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本発明の生体試料は、血液から得られる。いくつかの実施形態では、約１−１０ｍｌの血液が対象から採血される。他の実施形態では、約１０−５０ｍｌの血液が対象から採血される。血液は、腕、脚、または中心静脈カテーテルを介してアクセス可能な血液を含む、身体の任意の適切な領域から採血できる。いくつかの実施形態では、血液は、処置または活動の後に収集される。例えば、血液は、健康診断の後に収集できる。また、収集のタイミングは、試料中に存在する小胞（例えば、エキソソーム）の数および／または組成を増加するように調整することができる。例えば、血液は、血管拡張を誘導する運動または処置の後に収集できる。
【００８８】
血液は、その後の技術のために、試料を保存または調製するための収集の後に、様々な成分と組み合わせることができる。例えば、いくつかの実施形態では、血液は、収集後に、抗凝固剤、細胞固定剤、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、タンパク質、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ保存剤で処理される。いくつかの実施形態では、血液は、ＥＤＴＡまたはヘパリンなどの抗凝固剤を含有する真空採取チューブを用いて静脈穿刺によって収集される。また、血液は、ヘパリンコーティングされた注射器および皮下注射針を用いて収集できる。血液はまた、細胞培養のために有用であろう成分と組み合わせることができる。例えば、いくつかの実施形態では、血液は、細胞培養培地または補充した細胞培養培地（例えば、サイトカイン）と組み合わせられる。
【００８９】
小胞（エキソソーム、微小粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、およびエクトソーム）の濃縮または単離
試料は、ポジティブセレクション、ネガティブセレクション、またはポジティブセレクションおよびネガティブセレクションの組み合わせを通して、小胞について濃縮され得る。いくつかの実施形態では、小胞は直接捕捉される。他の実施形態では、血液細胞が捕捉され、小胞は残りの生体試料から収集される。いくつかの実施形態では、生体試料で濃縮された小胞はエキソソーム、微小粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、またはエクトソームである。いくつかの実施形態では、生体試料で濃縮された小胞はニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、オリゴデンドロサイト由来エキソソーム、またはミクログリア由来エキソソームである。
【００９０】
試料はまた、小胞の生化学的特性の差異に基づいて、小胞について濃縮され得る。例えば、試料は、抗原、核酸、代謝、遺伝子発現、またはエピジェネティックな差異に基づいて、小胞について濃縮され得る。抗原の差異に基づくいくつかの実施形態では、磁場勾配における抗体結合性の磁性もしくは常磁性ビーズまたは蛍光標識された抗体がフローサイトメトリーと使用される。核酸の差異に基づくいくつかの実施形態では、フローサイトメトリーが使用される。代謝の差異に基づくいくつかの実施形態では、フローサイトメトリーまたは他のソーティング技術により測定される色素の取り込み／排出が使用される。遺伝子発現に基づく実施形態のいくつかでは、サイトカインとの細胞培養が使用される。試料はまた、当技術分野で知られた他の生化学的特性に基づいて、小胞について濃縮され得る。例えば、試料は、ｐＨおよび運動性に基づいて、小胞について濃縮され得る。さらに、いくつかの実施形態では、１より多くの方法が小胞についての濃縮のために使用される。他の実施形態では、試料は、抗体、リガンド、または可溶性受容体を使用して小胞について濃縮される。
【００９１】
他の実施形態では、表面マーカーは、試料中の小胞を正に濃縮するために使用される。いくつかの実施形態では、小胞はエキソソーム、微小粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、またはエクトソームである。他の実施形態では、ＮＣＡＭ、ＣＤ１７１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧ、ニューロン特異的エノラーゼ、様々なニューロンまたはアストロサイト接着性タンパク質、ミクログリアＣＤ１８／１１、またはＣＤ３Ｔ細胞膜細胞表面マーカーは、エキソソームについての濃縮に使用される。いくつかの実施形態では、小胞集団で見られない細胞表面マーカーは、細胞集団を枯渇させることにより、小胞を負に濃縮するために使用される。フローサイトメトリー選別は蛍光標識にコンジュゲートした細胞表面マーカーまたは細胞内もしくは細胞外マーカーを用いて、エキソソームについてさらに濃縮するために使用されてもよい。細胞内および細胞外マーカーは、核染色、または小胞で優先的に発現する細胞内または細胞外タンパク質に対する抗体を含んでもよい。細胞表面マーカーは、エキソソームで優先的に発現する細胞表面抗原（例えば、ＮＣＡＭ）に対する抗体を含んでもよい。いくつかの実施形態では、細胞表面マーカーは、例えば、ＮＣＡＭまたはＣＤ１７１を含むニューロン由来エキソソーム表面マーカーである。いくつかの実施形態では、モノクローナルＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ニューロン特異的エノラーゼまたはＣＤ１７１抗体は、試料からエキソソームを濃縮するまたは単離するために使用される。或る態様では、ＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ニューロン特異的エノラーゼまたはＣＤ１７１抗体はビオチン化される。この実施形態では、ビオチン化ＮＣＡＭまたはＣＤ１７１抗体はストレプトアビジンアガロースレジンまたはビーズを使用して後で単離できる抗体−エキソソーム複合体を形成できる。他の実施形態では、ＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ニューロン特異的エノラーゼまたはＣＤ１７１抗体は、モノクローナル抗ヒトＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ニューロン特異的エノラーゼまたはＣＤ１７１抗体である。他の実施形態では、細胞表面マーカーは、神経特異的タンパク質（例えば、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、タウ、リン酸化タウ、αβ−４２、およびシナプトフィジン）、アストロサイト特異的タンパク質（例えば、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１））、ミクログリア特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイトゾルタンパク質（例えば、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、αシヌクレイン（ＳＮＣＡ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、またはＦａｓＬ）、またはケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）またはサイトカイン（ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＦａｓＬ、またはＩＬ１２Ｂ）である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、生体試料から濃縮した小胞は、その後、特定のタイプの小胞について濃縮される。例えば、生体試料はエキソソームについて濃縮され、次いで濃縮されたエキソソームはその後神経由来のエキソソームについて濃縮される。いくつかの実施形態では、生体試料は小胞の個々の神経細胞源について濃縮される。或る態様では、小胞の神経細胞源はミクログリア、ニューロン、またはアストロサイトである。
【００９３】
他の実施形態では、小胞は以下を含む方法により生体試料から単離されまたは濃縮される；生体試料中に存在する小胞が薬剤に結合して小胞−薬剤複合体を形成する条件下で、生体試料を薬剤と接触させること、および小胞−薬剤複合体から小胞を単離して小胞を含有する試料を得ることを含み、ここで、試料中に存在する小胞の純度は生体試料中に存在する小胞の純度より高い。特定の実施形態では、薬剤は、抗体またはレクチンである。小胞−レクチン複合体を形成するのに有用なレクチンは米国公開特許公報第２０１２／００７７２６３号に記載される。いくつかの実施形態では、小胞は、エキソソーム、微小粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、またはエクトソームである。いくつかの実施形態では、エキソソームはニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、オリゴデンドロサイト由来エキソソーム、またはミクログリア由来エキソソームである。いくつかの実施形態では、複数の単離または濃縮工程が行われる。本願実施形態のある特定の態様では、第一の単離工程は血液試料からエキソソームを単離するために行われ、第二の単離工程は他のエキソソームから神経の由来エキソソームを単離するために行われる。
【００９４】
さらに他の実施形態では、該方法は、小胞−薬剤複合体から小胞を放出することをさらに含む。他の実施形態では、小胞は、小胞−薬剤複合体を３．５−１．５間の低ｐＨに曝露することにより放出される。他の実施形態では、小胞は、本発明の方法において使用される選択抗体の結合について競合する競合ペプチドを使用して放出される。さらに他の実施形態では、放出された小胞は高ｐＨ溶液を加えることにより中和される。他の実施形態では、放出された小胞は、放出された小胞を溶解溶液とインキュベートすることにより溶解される。さらに他の実施形態では、溶解溶液はプロテアーゼおよびホスファターゼについての阻害剤を含有する。
【００９５】
固体支持体の小胞の捕捉および検出
他の実施形態では、小胞のサブセットは、固体支持体上で固定化された捕捉剤を使用して生体試料における他の小胞から分離される。かかる捕捉剤は小胞の表面マーカー（例えば、膜タンパク質または吸着タンパク質）に選択的に結合するため、捕捉剤が表面マーカーを有する小胞を「捕捉」できる。「捕捉する」とは、捕捉剤が小胞の表面マーカーに結合することにより試料中の他の小胞から標的小胞が分離できることを意味する。
【００９６】
捕捉剤の特異性が固体支持体上で捕捉された生体試料から小胞のサブセットを決定する。１以上の捕捉剤が異なる表面マーカーを有する小胞を捕捉するために組み合わせて使用され得る。例えば、固体支持体は、１種以上の固体支持体に結合した捕捉剤、例えば、小胞上の異なるバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれ以上の異なる捕捉剤を含んでもよい。いくつかの実施形態では、捕捉剤により標的化された小胞はエキソソーム、微小粒子、微小胞、ナノソーム、細胞外小胞、またはエクトソームである。
【００９７】
いくつかの実施形態では、捕捉剤はニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、オリゴデンドロサイト由来エキソソーム、またはミクログリア由来エキソソームに選択的に結合する。例えば、捕捉剤は、エキソソームを捕捉するためにエキソソーム表面マーカー（例えば、ＣＤ８１）、一般に、ニューロン由来エキソソームを捕捉するために神経特異的タンパク質（例えば、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、タウ、リン酸化タウ、αβ−４２、およびシナプトフィジン）、アストロサイト由来エキソソームを捕捉するためにアストロサイト特異的タンパク質（例えば、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）、ミクログリア由来エキソソームを捕捉するためにミクログリア特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、オリゴデンドロサイト由来エキソソームを捕捉するためにオリゴデンドロサイト特異的タンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）またはオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ））、脳由来エキソソームを捕捉するためにサイトゾルタンパク質（例えば、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、αシヌクレイン（ＳＮＣＡ）またはカテプシンＤ（ＣＴＳＤ））、またはケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）またはサイトカイン（ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＦａｓＬ、またはＩＬ１２Ｂ）タンパク質に選択的に結合するものが選択され得る。いくつかの実施形態では、捕捉剤は一般に細胞外小胞を捕捉するために細胞外小胞（ＥＶ）表面マーカー（例えば、ＤＡＴ）に選択的に結合するものが選択され得る。
【００９８】
典型的には、捕捉剤は直接的にまたは間接的に固体支持体に結合している。捕捉剤はプレート、スライド、ウェハー（ｗａｆｅｒ）、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、ロッド、粒子、ストランド（ｓｔｒａｎｄ）、ディスク、膜、フィルム、またはチューブの内面、チャネル、カラム、フローセル装置、またはマイクロ流体デバイスなどの固体支持体の表面に固定化されていてもよいが、これらに限定されない。固体支持体は、ガラス、石英、ケイ素、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、アガロース、レジン、多孔質ポリマーモノリス、ハイドロゲル、およびそれらの複合材を含む様々な材料を含んでもよいが、これらに限定されない。さらに、捕捉剤の付着を促進するために固体支持体の表面に基質を追加してもよい。
【００９９】
いったん固体支持体上で捕捉されると、小胞の溶解または透過処理の必要なしで検出剤を使用して１以上の膜結合型のおよび吸着バイオマーカーについて小胞を、スクリーニングできる。かかる検出剤は小胞の膜結合型のまたは吸着バイオマーカーに選択的に結合する。特定の実施形態では、検出剤は神経特異的タンパク質（例えば、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、αβ−４２、タウ、リン酸化タウ、およびシナプトフィジン）、アストロサイト特異的タンパク質（例えば、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１））、ミクログリア特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、サイトゾルタンパク質（例えば、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、αシヌクレイン（ＳＮＣＡ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、またはＦａｓＬ）、ケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）またはサイトカイン（ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＦａｓＬ、またはＩＬ１２Ｂ）、ＣＴＳＤ、ＧＡＰＤＨ、ＣＤ８１、ＣＤ６３、またはＣＤ１７１、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ベータ、Ａβ、またはＢＡＣＥに選択的に結合する。特定の実施形態では、固体支持体上で捕捉された小胞上のバイオマーカーの検出は、１種以上の検出剤、例えば、小胞上の異なるバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれ以上の異なる検出剤を使用することを含む。
【０１００】
捕捉剤および検出剤は、小胞の表面マーカー（例えば、膜結合型のまたは吸着タンパク質）に特異的に結合する例えば、抗体、抗体断片、抗体ミメティック、またはアプタマーを含んでもよい。「特異的に（または選択的に）結合する」とは、タンパク質および他の生物製剤の不均一な集団における小胞の表面マーカーの存在を決定できる結合反応を指す。したがって、指定されたアッセイ条件下で、特定の捕捉剤または検出剤は、バックグラウンドの少なくとも２倍、小胞の特定の表面マーカーに結合し、試料に存在する他のタンパク質に実質的に有意な量では結合しない。
【０１０１】
特定の実施形態では、捕捉剤または検出剤は、小胞の表面マーカー（例えば、膜タンパク質または吸着タンパク質）に特異的に結合する抗体を含む。以下を含む任意のタイプの抗体が使用されてもよい：ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、ハイブリッド抗体、改変抗体、キメラ抗体および、ヒト化抗体並びに：ハイブリッド（キメラ）抗体分子（例えばＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３４９：２９３−２９９；および米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）；Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ａｂ）断片；Ｆｖ分子（非共有結合ヘテロ二量体、例えば以下を参照されたい、Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９７２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；およびＥｈｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６）；一本鎖Ｆｖ分子（ｓＦｖ）（例えば以下を参照されたい、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）；ナノボディまたはシングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（例えば以下を参照されたい、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  １１：３２８７−３３０３、Ｖｉｎｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ９１１：１５−２６；二量体および三量体抗体断片コンストラクト；ミニボディ（例えば以下を参照されたい、Ｐａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３１：１５７９−１５８４；Ｃｕｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １４９Ｂ：１２０−１２６）；ヒト化抗体分子（例えば以下を参照されたい、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；および１９９４年９月２１日発行英国特許公報ＧＢ２，２７６，１６９号）；およびかかる分子から得られる任意の機能的断片、ここでかかる断片は親抗体分子の特異的結合特性を維持している（すなわち、小胞の標的表面マーカーに特異的に結合する）。
【０１０２】
他の実施形態では、捕捉剤または検出剤は、小胞の標的表面マーカーに特異的に結合するアプタマーを含む。任意のタイプのアプタマーが使用されてもよく、標的抗体アイソタイプに特異的に結合するＤＮＡ、ＲＮＡ、ゼノ核酸（ＸＮＡ）、またはペプチドアプタマーを含む。かかるアプタマーは例えば、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより同定できる。標的抗体アイソタイプに選択的に結合する核酸アプタマー（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー）は、指数関数的濃縮によるリガンドの試験管内の選択または系統的進化を繰り返し行うことにより（ＳＥＬＥＸ）生産され得る。標的抗体アイソタイプに結合するペプチドアプタマーはコンビナトリアルライブラリーから単離されてもよく、および定方向突然変異または頻回回数の突然変異誘発および選択により改善されてもよい。アプタマーの生産方法の説明については、例えばその全体が出典明示により本明細書に組み込まれる以下を参照されたい；Ａｐｔａｍｅｒｓ：  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ  （Ｒ．Ｎ．  Ｖｅｅｄｕ  ｅｄ．，  Ｐａｎ  Ｓｔａｎｆｏｒｄ，  ２０１６），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｐｔａｍｅｒｓ：  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇ．  Ｍａｙｅｒ  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２００９），  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｐｔａｍｅｒｓ：  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  （Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇ．  Ｍａｙｅｒ  ｅｄ．，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  ２０１６），  Ａｐｔａｍｅｒｓ  Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｂｙ  Ｃｅｌｌ−ＳＥＬＥＸ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  （Ｗ．  Ｔａｎ，  Ｘ．  Ｆａｎｇ  ｅｄｓ．，  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  ２０１５），  Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ９（１０）：２５２５−２５３１；  Ｃｏｘ  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０（２０）：  ｅ１０８，  Ｋｅｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．  １１８：２１７−２３１；  Ｐｌａｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ  Ｎｏｖ  １６  ｐｉｉ：  Ｓ０３０４−４１６５（１６）３０４４７−０、およびＬｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１６）  Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ６（９）：１４４０−１４５２。
【０１０３】
さらに他の実施形態では、捕捉剤または検出剤は、抗体ミメティックを含む。任意のタイプの抗体ミメティックが使用されてもよく、以下を含むが、これらに限定されない；アフィボディ分子、（Ｎｙｇｒｅｎ  （２００８）ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７５（１１）：２６６８−２６７６）、ａｆｆｉｌｉｎｓ  （Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３７２（１）：１７２−１８５）、ａｆｆｉｍｅｒｓ  （Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）Ａｎａｌ．  Ｃｈｅｍ．  ８４（１５）：６５５３−６５６０）、ａｆｆｉｔｉｎｓ  （Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３８３（５）：１０５８−１０６８）、ａｌｐｈａｂｏｄｉｅｓ  （Ｄｅｓｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ５：５２３７）、ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ  （Ｓｋｅｒｒａ  （２００８）ＦＥＢＳ  Ｊ．  ２７５（１１）：２６７７−２６８３）、ａｖｉｍｅｒｓ  （Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２３（１２）：１５５６−１５６１）、ｄａｒｐｉｎｓ  （Ｓｔｕｍｐｐ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．  Ｔｏｄａｙ  １３（１５−１６）：６９５−７０１）、ｆｙｎｏｍｅｒｓ  （Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２８２（５）：３１９６−３２０４）、およびｍｏｎｏｂｏｄｉｅｓ  （Ｋｏｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３５２：９５−１０９）。
【０１０４】
検出剤は、小胞上のバイオマーカーの検出および／または定量を促進する検出可能標識をさらに含んでもよい。検出可能標識は、特定の結合剤（例えば、小胞の膜結合型のまたは吸着バイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体ミメティック、またはアプタマー）に付着する蛍光性、化学発光性、電気化学発光性、または生物発光性タグ、金属、色素、放射性核種などを含む。
【０１０５】
神経障害
本発明は、対象における神経障害を診断するまたは予後判定する、神経障害のリスクのある対象を同定する、または神経障害を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想するための方法を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、対象における神経障害の鑑別診断のための方法を提供する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、神経障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管性認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、大脳皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原線維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、嗜銀顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他の運動ニューロン疾患、グアムのパーキンソニズム−認知症複合、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、抑うつ、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質疾患、脳萎縮症、精神遅滞、小脳失調、脳震盪、脳震盪に至るか至らないかの（ｓｕｂｃｏｎｃｕｓｓｉｖｅ）衝撃、およびパーキンソン病からなる群から選択される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本発明は医療従事者が、対象における１以上の神経障害を診断するまたは予後判定することを可能にする。他の実施形態では、本発明は医療従事者が、診断上の可能性として１以上の神経疾患を除外するまたは除去することを可能にする。他の実施形態では、本発明の方法は、医療従事者がＦＴＤのいくつかの形態とアルツハイマー病を区別することを可能にする。さらに他の実施形態では、本発明は医療従事者が、神経障害を発症するリスクのある対象を同定することを可能にする。他の実施形態では、本発明は医療従事者が、対象が後に神経障害を発生するかどうかを予想することを可能にする。さらなる実施形態では、本発明は医療従事者が、神経障害を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想することを可能にする。
【０１０８】
癌
本発明は、対象における癌を診断するまたは予後判定する、癌を発症するリスクのある対象を同定する、または癌を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想するための方法を提供する。一般に、癌は体のあらゆる場所での異常な細胞の制御不能な増殖に特徴づけられる。異常な細胞は癌細胞、悪性細胞、または腫瘍細胞と呼ばれてもよい。癌はヒトに限定されず；動物および他の生物が癌になり得る。
【０１０９】
いくつかの例では、癌は悪性であってもよい。あるいは、癌は良性であってもよい。癌は、再発性および／または難治性の癌であってもよい。ほとんどの癌は、細胞腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、または中枢神経系の癌として分類できる。
【０１１０】
癌は、肉腫であってもよい。肉腫は骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合組織または支持組織の癌である。肉腫は、以下を含むがこれらに限られない；骨癌、線維肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性シュワン細胞腫、両側性前庭神経鞘腫、骨肉腫、軟部肉腫（例えば、胞状軟部肉腫、血管肉腫、葉状嚢胞肉腫、皮膚線維肉腫、類腱腫、類上皮肉腫、骨外性骨肉腫、線維肉腫、血管外皮腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫）。
【０１１１】
あるいは、癌は、細胞腫であってもよい。細胞腫は、上皮細胞から始まり、体の表面を覆い、ホルモンを産生し、腺を構成する細胞である。非限定的な例として、細胞腫は、乳癌、膵癌、肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝癌、卵巣癌、脳癌、腟癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌（ｐｅｎｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、食道癌、皮膚癌、ファロピウス管癌、頭頚部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼球内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺の癌、副腎癌、尿道癌、腎盂の癌、尿管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、脳下垂体癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、および脊髄腫瘍を含む。いくつかの例では、癌は、基底細胞癌、扁平上皮癌、メラノーマ、非黒色腫性の、または光線性（日光）角化症などの皮膚癌である。好ましくは、癌は、前立腺癌である。あるいは、癌は、甲状腺癌、膀胱癌、または膵癌であってもよい。
【０１１２】
いくつかの例では、癌は、肺癌である。肺癌は気管から分岐した気道から始まり、肺（気管支）または肺の小さな気嚢（肺胞）に供給される。肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、および中皮腫を含む。ＮＳＣＬＣの例は、扁平上皮癌、腺癌、および大細胞癌を含む。中皮腫は、肺および胸腔の内膜（胸膜）または腹部の内膜（腹膜）の癌性腫瘍であってもよい。中皮腫はアスベスト曝露に起因してもよい。癌は、膠芽腫などの脳癌であってもよい。
【０１１３】
あるいは、癌は中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍であってもよい。ＣＮＳ腫瘍は神経膠腫または非神経膠腫に分類されてもよい。神経膠腫は悪性神経膠腫、ハイグレード神経膠腫、びまん性内在性橋グリオーマであってもよい。神経膠腫の例は、星状細胞腫、乏突起神経膠腫（または乏突起神経膠腫および星状細胞腫（ａｓｔｏｃｙｔｏｍａ）要素の混合物）、および上衣腫を含む。星状細胞腫は、ローグレード星状細胞腫、未分化星状細胞腫、多形神経膠芽腫、毛様細胞性星状細胞腫、多形黄色星細胞腫、および上衣下巨細胞性星細胞腫を含むがこれらに限られない。乏突起神経膠腫は、ローグレード乏突起神経膠腫（または乏突起星細胞腫（ｏｌｉｇｏａｓｔｒｏｃｙｔｏｍａｓ））および未分化の乏突起神経膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｄｒｉｏｇｌｉｏｍａｓ）を含む。非神経膠腫は、髄膜腫、下垂体腺腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、および髄芽腫を含む。いくつかの例では、癌は、髄膜腫である。
【０１１４】
癌は、白血病であってもよい。白血病は、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、または慢性骨髄性白血病であってもよい。さらなるタイプの白血病は、有毛細胞白血病、慢性骨髄単球性白血病、および若年性骨髄単球性白血病を含む。
【０１１５】
いくつかの例では、癌は、リンパ腫である。リンパ腫はリンパ球の癌であり、かつＢまたはＴリンパ球のいずれかから発生してもよい。リンパ腫の２つの主要なタイプは以前にホジキン病として知られたホジキンリンパ腫、および非ホジキンリンパ腫である。ホジキンリンパ腫はリードスターンバーグ細胞の存在により特徴づけられる。非ホジキンリンパ腫はホジキンリンパ腫ではないすべてのリンパ腫である。非ホジキンリンパ腫は低悪性度リンパ腫および中悪性度リンパ腫であってもよい。非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾臓周辺帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、節外性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性体液性リンパ腫、およびリンパ腫様肉芽腫症を含むがこれらに限られない。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、本発明は医療従事者が、対象における１以上の癌を診断するまたは予後判定することを可能にする。他の実施形態では、本発明は医療従事者が、診断上の可能性として１以上の癌を除外するまたは除去することを可能にする。他の実施形態では、本発明の方法は医療従事者が癌の起源を同定することを可能にする。さらに他の実施形態では、本発明は医療従事者が、癌を発症するリスクのある対象を同定することを可能にする。他の実施形態では、本発明は医療従事者が、対象が後に癌を発生するかどうかを予想することを可能にする。さらなる実施形態では、本発明は医療従事者が、癌を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想することを可能にする。癌診断および予後判定において有用である本発明の例示的なバイオマーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９を含むがこれらに限られない。
【０１１７】
免疫学的障害
本発明は、対象における免疫学的障害を診断するまたは予後判定する、免疫学的障害を発症するリスクのある対象を同定する、または免疫学的障害を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想するための方法を提供する。免疫学的障害は免疫系の機能障害により引き起こされる疾病または状態であり、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、自己炎症性症候群および免疫不全症候群を含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、本発明は医療従事者が、対象における１以上の免疫学的障害を診断するまたは予後判定することを可能にする。他の実施形態では、本発明は医療従事者が、診断上の可能性として１以上の免疫学的障害を除外するまたは除去することを可能にする。さらに他の実施形態では、本発明は医療従事者が、免疫学的障害を発症するリスクのある対象を同定することを可能にする。他の実施形態では、本発明は医療従事者が、対象が後に免疫学的障害を発生するかどうかを予想することを可能にする。さらなる実施形態では、本発明は医療従事者が、免疫学的障害を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想することを可能にする。免疫学的障害の診断および予後判定において有用である本発明の例示的なバイオマーカーは、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、およびＴＲＥＭ２を含むがこれらに限られない。
【０１１９】
胎盤疾患および胎児評価
本発明は、対象における胎盤疾患を診断するまたは予後判定する、胎盤疾患を発症するリスクのある対象を同定する、または胎盤疾患を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想するための方法を提供する。一般に、胎盤疾患は、胎盤の任意の疾病、障害、または病態である。本発明の方法およびバイオマーカーはまた、例えば、胎児性アルコール症候群または胎児遺伝的異常などの胎児障害の胎児評価または診断に使用されてもよい。胎盤疾患または胎児評価の診断および予後判定において有用である本発明の例示的なバイオマーカーは、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、およびＰＳＧ１を含むがこれらに限られない。
【０１２０】
バイオマーカー
小胞上のバイオマーカーレベルは、疾病を有するまたは有するリスクのある対象から得られた生体試料においてアッセイされる。いくつかの実施形態では、小胞上のバイオマーカーレベルは、神経障害（例えば、アルツハイマー病）を有するまたは有するリスクのある対象から得られた生体試料においてアッセイされる。他の実施形態では、小胞上のバイオマーカーレベルは、癌を有するまたは有するリスクのある対象から得られた生体試料においてアッセイされる。さらに他の実施形態では、小胞上のバイオマーカーレベルは、免疫学的障害を有するまたは有するリスクのある対象から得られた生体試料においてアッセイされる。さらに他の実施形態では、小胞上のバイオマーカーレベルは、胎盤障害を有するまたは有するリスクのある対象から得られた生体試料においてアッセイされる。いくつかの実施形態では、１以上のバイオマーカーは、神経特異的タンパク質（例えば、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、タウ、およびシナプトフィジン）、アストロサイト特異的タンパク質（例えば、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１））、ミクログリア特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、オリゴデンドロサイト特異的タンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ））、および細胞外小胞特異的タンパク質（ドーパミントランスポーター、ＤＡＴ）からなる群から選択される。別の実施形態では、バイオマーカーはＣＤ１７１、リン酸化タウＴ１８１、ＳＮＣＡ、およびＮＲＧＮである。他の実施形態では、バイオマーカーはアセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、ＣＴＳＤ、ＲＥ１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、シナプトタグミン（ＳＹＴ）、単球走化性タンパク質-１（ＣＣＬ２）、ＩＬ３４、グリコーゲン合成酵素（ＧＹＳ）、（ＯＲ）、細胞死受容体６（ＤＲ６）、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）、ＩＬ１２ベータ、アルファ−ベータ（Ａβ）、およびβセクレターゼ（ＢＡＣＥ）である。いくつかの実施形態では、１以上のバイオマーカーは、サイトゾルタンパク質、分泌タンパク質、膜タンパク質および受容体ならびに凝集体および変異体を含むそれらの病的形態からなる群から選択される。本発明のバイオマーカーは、例えば、ドーパミン受容体（Ｄ１およびＤ２）、セロトニン受容体（２Ａ、２Ｃ、および３Ｂ）、ＧＡＢＡ受容体（１−６、５．Ｂ１、Ｂ２）、およびグルタミン酸受容体（１および２）などの神経伝達物質受容体を含む。本発明の他の受容体バイオマーカーは、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＲＡＬ、ＴＮＦ受容体、細胞死受容体５および６）、および神経ペプチド受容体（オレキシン受容体、オピオイド受容体ＫＯＲ）を含む。本発明のバイオマーカーは、例えば、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭなどの膜タンパク質を含む。他の既知の神経障害バイオマーカーは本発明のバイオマーカーと組み合わせて使用さ���てもよい。かかるバイオマーカーの例は、出典明示により組み込まれる米国特許出願公報第２０１５／０１１９２７８号で提供される。
【０１２１】
当業者は、本発明のマーカーの検出および解析のために利用可能ないくつかの方法および装置を有する。患者試験試料中の小胞上のポリペプチドまたはタンパク質に関して、多くの場合イムノアッセイ装置および方法が利用される。これらの装置および方法は、目的の解析物の存在または量に関するシグナルを生成するために、様々なサンドイッチ（ｓａｎｄｗｉｃｈ）、競合、または非競合アッセイ形式で標識分子を利用することができる。さらに、バイオセンサーおよび光学的イムノアッセイなどの特定の方法および装置が、標識分子を必要とすることなく、解析物の存在および量を決定するために使用されてもよい。
【０１２２】
他の方法（例えば、マーカーＲＮＡレベルの測定）は当業者に良く知られているが、好ましくは、マーカーはイムノアッセイを使用して解析される。マーカーの存在または量は、一般的に、各マーカーに特異的な抗体を使用して、かつ特異的な結合を検出して、決定される。任意の適切なイムノアッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合的結合アッセイプレーナーウェイブガイド技術などが利用されてもよい。マーカーに対する特異的な抗体の免疫学的結合は、直接的にまたは間接的に決定され得る。直接標識は、抗体に結合した蛍光もしくは発光タグ、金属、色素または放射性核種などを含む。間接標識は、アルカリホスファターゼ、西洋わさびペルオキシダーゼなどの当技術分野でよく知られた種々の酵素を含む。
【０１２３】
小胞の表面マーカーに特異的な固定化抗体の使用も、本発明によって企図される。抗体は、磁気もしくはクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイ場所（マイクロタイターウェルなど）の表面、固体基板材料片（プラスチック、ナイロン、紙など）等などの、種々の固体支持体に固定化され得る。アッセイストリップは固体支持体のアレイに抗体または複数の抗体をコーティングすることによって調製できる。このストリップを、試験試料中に浸漬して表面マーカーへの結合を通じて小胞を捕捉し、次いで、洗浄および上述のように検出試薬での検出段階を経て迅速に処理して、着色されたスポットなどの測定可能なシグナルを生成できる。
【０１２４】
複数のマーカーの解析は１つの試験試料と別々にまたは同時に行ってもよい。いくつかの小胞上のマーカーは、複数の試料の効率的な処理のために１つの試験に複数の捕捉剤および／または検出剤の組み合わせを使用して、捕捉されおよび／または検出されてもよい。さらに、当業者は、同じ個体からの複数の試料（例えば、連続した時点）を試験する価値を認識するだろう。そのような連続した試料を試験することは、経時的なマーカーレベルの変化の同定を可能にするだろう。マーカーレベルの増加または減少だけでなく、マーカーレベルの変化の非存在は、事象の開始からのおおよその時間を同定すること、救助可能な組織（ｓａｌｖａｇｅａｂｌｅ  ｔｉｓｓｕｅ）の存在および量、薬物療法の妥当性、様々な治療法の有効性、事象の重症度の同定、疾患の重症度の同定、ならびに将来の事象のリスクを含む患者の治療結果（アウトカム）の同定に限定されるものではないが、これらを含む、疾患状態についての有用な情報を提供するだろう。
【０１２５】
本発明で参照されるマーカーの組み合わせからなるアッセイを構築し、鑑別診断に関する関連情報を提供してもよい。そのようなパネルは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０もしくはそれ以上、または個別のマーカーを使用して構築されてもよい。単一のマーカー、またはより大きなマーカーのパネルを含むマーカーのサブセットの解析を本発明内に記載された方法において実施し、種々の臨床状況における臨床的感度または特異度を最適化することができる。
【０１２６】
マーカーの解析は、同様に種々の物理的形式において実施され得る。例えば、マイクロタイタープレートの使用または自動化を用いて、多数の試験試料の処理を容易にすることができる。あるいは、単一試料形式を開発し、例えば、外来輸送（ａｍｂｕｌａｔｏｒｙ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）または緊急治療室の状況において、時機を逸せずに迅速な処置および診断を容易にすることができる。特に、有用な物理形式は、複数の異なる検体の検出のための、複数の不連続な、アドレス可能な位置を有する表面を含む。かかる形式はプロテインマイクロアレイもしくは「プロテインチップ」およびキャピラリー装置を含む。
【０１２７】
本発明のバイオマーカーは、神経障害（例えばアルツハイマー病）の早期検出およびモニタリングにおいて、重要な役割を果たす。かかる障害のマーカーは典型的に、測定することができる身体試料中に見られる物質である。測定された量は、基礎障害もしくは疾患の病態生理、神経障害の存在もしくは非存在、または将来の神経障害の可能性に相関し得る。患者の状態について治療を患者が受ける際に、測定された量はまた、治療の反応性に相関するだろう。いくつかの実施形態では、本発明の１以上のバイオマーカーのレベルにおける減少または増加は神経障害を示す。例えば、ＣＤ１７１膜マーカーを有するエキソソームのリン酸化タウＴ１８１レベルの増加および／またはＮＲＧＮレベルの減少は、アルツハイマー病を示す。従って、本発明の方法はアルツハイマー病の鑑別診断に有用である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーは、免疫組織化学、免疫細胞化学、免疫蛍光法、免疫沈降、電気化学発光イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫ポリメラーゼ連鎖反応、ウエスタンブロット法、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される方法により測定される。
【０１２９】
臨床アッセイ性能
本発明の方法は、対象における神経障害を診断もしくは予後判定する、神経障害のリスクのある対象を同定する、および／または、神経障害を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想するために、臨床アッセイにおいて用いられてもよい。臨床アッセイ性能は、アッセイの感度、特異度、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）、精度、陽性適中率（ＰＰＶ）、および陰性適中率（ＮＰＶ）を決定することによって評価できる。本明細書中に開示されているものは、対象における神経障害を診断もしくは予後判定する、神経障害のリスクのある対象を同定する、または、神経障害を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想するためのアッセイである。
【０１３０】
アッセイの臨床性能は感度に基づいてもよい。本発明のアッセイの感度は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％であってもよい。アッセイの臨床性能は特異度に基づいてもよい。本発明のアッセイの特異度は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％であってもよい。アッセイの臨床性能はＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいてもよい。本発明のアッセイのＡＵＣは、少なくとも約０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９または０．９５であってもよい。アッセイの臨床性能は精度に基づいてもよい。本発明のアッセイの精度は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％であってもよい。
【０１３１】
組成物
本発明の方法において有用な組成物は、神経障害に関連するバイオマーカーを特異的に認識する組成物を含む。かかる組成物は、例えば、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、αβ−４２、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、タウ、リン酸化タウ、およびシナプトフィジンなどの神経特異的タンパク質バイオマーカー、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）などのアストロサイト特異的タンパク質バイオマーカー、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）などのオリゴデンドロサイト特異的タンパク質バイオマーカー、ミクログリア特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、サイトゾルタンパク質（例えば、グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、αシヌクレイン（ＳＮＣＡ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、またはＦａｓＬ）、またはケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）またはサイトカイン（ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＦａｓＬ、またはＩＬ１２Ｂ）を認識する捕捉剤および／または検出剤を含んでもよい。
【０１３２】
さらに他の実施形態では、組成物は、ペプチド、核酸、抗体、および低分子からなる群から選択される。
【０１３３】
特定の実施形態では、本発明は、神経障害に関連するバイオマーカーを特異的に検出する組成物に関する。本明細書の他の場所で詳述されるように、本発明は、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ、シナプトフィジン、αβ−４２、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＳＮＣＡ、ＣＤ１１ｂ、ＯＭＧ、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、およびＢＡＣＥは、ＡＤおよび他の神経障害についてのバイオマーカーとして使用され得るという発見に基づく。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、かかるバイオマーカーに特異的に結合し、検出する。例えば、組成物は、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＣＤ１１ｂ、またはＯＭＧに選択的に結合する、固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体を含んでもよい。別の例では、組成物は、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ、シナプトフィジン、αβ−４２、ＳＮＣＡ、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＯＭＧ、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、および／またはＢＡＣＥに選択的に結合する検出剤を含んでもよい。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、組成物は抗体を含み、前記抗体は本発明のバイオマーカーまたは小胞と特異的に結合する。本明細書中で使用され、さらに以下に説明される「抗体」なる用語は、バイオマーカーまたは小胞（例えばエキソソーム）とも特異的に反応する、それらの断片を含むことを意図している。抗体は従来の技術を用いて断片化することができ、全長抗体（ｗｈｏｌｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）に関して上記に記載したものと同じ方法で、断片は有用性についてスクリーニングできる。例えば、Ｆ（ａｂ）２断片は、ペプシンで抗体を処理することによって生成され得る。得られたＦ（ａｂ）２断片をジスルフィド架橋を還元するように処理して、Ｆａｂ断片を産生することができる。抗原結合部分はまた、組換えＤＮＡ技術により、または無傷の（ｉｎｔａｃｔ）抗体の酵素的もしくは化学的切断により、産生されてもよい。抗原結合部分は、とりわけ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ダイアボディ、および、ポリペプチドに特異的抗原結合を付与するために十分な、少なくとも免疫グロブリンの部分を含有するポリペプチドを含む。特定の実施形態では、抗体は、抗体に結合し、かつ検出され得る、標識をさらに含む（例えば、標識は放射性同位体、蛍光物質、酵素または酵素の補酵素であり得る）。
【０１３５】
特定の実施形態では、本発明の抗体はモノクローナル抗体であり、かつ特定の実施形態では、本発明は、本発明のバイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合する新規抗体を生成するための方法を利用可能にする。例えば、バイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するための方法は、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効な、バイオマーカーもしくはエキソソーム、またはそれらのフラグメントを含む免疫原性組成物の量をマウスへ投与すること、マウスから抗体産生細胞（例えば、脾臓由来の細胞）を得て、抗体産生ハイブリドーマを得るために、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を融合すること、および、バイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するために抗体産生ハイブリドーマを試験することを含んでもよい。いったん得られると、ハイブリドーマは細胞培養で、任意に、ハイブリドーマ由来の細胞がバイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する培養条件で、増殖され得る。モノクローナル抗体は、細胞培養物から精製されてもよい。
【０１３６】
抗体に関して使用される「と特異的に反応する」という用語は、当技術分野において一般に理解されるように、抗体が目的の抗原（例えばバイオマーカーまたはエキソソーム）と目的でない他の抗原の間で、十分に選択的であることを意味することを意図している。治療応用などの抗体を使用する特定の方法では、結合におけるより高い程度の特異性が望まれてもよい。モノクローナル抗体は、一般に、所望の抗原と、交差反応するポリペプチドとの間で効果的に識別する、より大きな傾向（ポリクローナル抗体と比較して）を有する。抗体：抗原相互作用の特異性に影響する１つの特徴は、抗原に対する抗体のアフィニティーである。所望の特異性は異なるアフィニティーの範囲に到達してもよいが、一般に、好ましい抗体は、約１０−６、１０−７、１０−８、１０−９またはそれ以下のアフィニティー（解離定数）を有するだろう。
【０１３７】
抗体は、例えば、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、オリゴデンドロサイト由来エキソソーム、およびミクログリア由来エキソソーム、またはシナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、タウ、リン酸化タウ（ｔａｒ）、およびシナプトフィジンからなる群から選択される神経特異的タンパク質、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）からなる群から選択されるアストロサイト特異的タンパク質、およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）およびオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）からなる群から選択されるオリゴデンドロサイト特異的タンパク質、ミクログリア特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、およびケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）またはサイトカイン（ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＦａｓＬ、またはＩＬ１２Ｂ）を含む、本発明のエキソソームまたはバイオマーカーのエピトープに特異的に結合するよう生成できる。別の実施形態では、生産された抗体は、抗ＣＤ１７１抗体、抗シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）抗体、抗ニューログラニン（ＮＲＧＮ）抗体、抗タウ抗体、抗シナプトフィジン抗体、および抗ＣＤ６３抗体、抗αβ−４２抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＴＤ抗体、抗ＧＡＰＤＨ抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、抗ＩＬ３４抗体、抗ＣＸ３ＣＬ１抗体、抗グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体、抗興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）抗体、抗ＳＮＣＡ抗体、抗ＴＨ抗体、および抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）抗体、抗オリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）抗体、抗ドーパミントランスポーター（ＤＡＴ）抗体、抗ＡｃｈＥ抗体ＡｃｈＥ、抗ＬＡＭＰ１抗体ＬＡＭＰ１、抗ＲＥＳＴ抗体ＲＥＳＴ、抗ＳＹＴ抗体ＳＹＴ、抗ＳＹＰ抗体、抗ＳＹＮＰＯ抗体、抗ＰＳＤ９５抗体、抗ＳＶ２Ａ抗体、抗ＣＣＬ２抗体ＣＣＬ２、抗ＩＬ３４抗体ＩＬ３４、抗ＧＹＳ抗体ＧＹＳ、抗ＯＲ抗体ＯＲ、抗ＤＲ６抗体ＤＲ６、抗ＨＳＰ抗体ＨＳＰ、抗ＩＬ１２ｂ抗体ＩＬ１２ｂ、抗Ａβ抗体Ａβ、または抗ＢＡＣＥ抗体ＢＡＣＥである。
【０１３８】
また、所望の抗体を同定する目的で抗体をスクリーニングするために用いられる技術は、得られる抗体の性質に影響してもよい。種々の異なる技術は、特に望ましい抗体を同定するために、抗体抗原間の相互作用を試験するために利用できる。このような技術は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、ビアコア結合アッセイ、ビアコアＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、常磁性ビーズシステム、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．）、ウェスタンブロット、免疫沈降アッセイ、免疫細胞化学、および免疫組織化学を含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明は、神経障害を治療するまたは防ぐために使用される組成物に関する。本明細書の他の場所で詳述されるように、本発明は、ＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＣＤ６３、αβ−４２、ＳＮＣＡ、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、および／またはＢＡＣＥのレベルが例えば、アルツハイマー病などの種々の神経障害の病理と関係するという知見に基づく。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、表面バイオマーカーに加えて、小胞内のバイオマーカーが解析される。特定の実施形態では、本発明は、対象から得られた生体試料中の小胞（例えば、エキソソーム）を溶解するための組成物に関する。本発明の方法に有用な溶解剤は、ＲＩＰＡ緩衝液；Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）；グリセリン；ＳＤＳ；２−メルカプトエタノール；トリトン−Ｘ  １００；Ｍ−ＰＥＲ試薬；Ｔ−ＰＥＲ溶液；およびＣＨＡＰＳを含む。本発明の小胞の膜を破壊し、その後の解析のために小胞カーゴ（ｃａｒｇｏ）（例えば、エキソソームタンパク質）を放出させるために溶解剤を生体試料とインキュベートしてもよい。
【０１４１】
治療方法
本発明は、対象に有効量の組成物を投与することを含む、対象における神経障害を治療する方法を提供し、ここで、該組成物は対象におけるＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＣＤ６３、αβ−４２、ＳＮＣＡ、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、またはＩＬ３４のレベルを増加させ、減少させ、または維持する。さらに他の実施形態では、該組成物はＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＣＤ６３、αβ−４２、ＳＮＣＡ、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、またはＢＡＣＥレベルにおける増加または減少を防ぐ。他の実施形態では、本発明は、対象に有効量の組成物を投与することを含む対象における神経障害を治療する方法を提供し、ここで、該組成物はＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＣＤ６３、αβ−４２、ＳＮＣＡ、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＴＨ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、および／またはＢＡＣＥのレベルを参照レベルに正常化する。
【０１４２】
キット
捕捉剤が結合した固体支持体、検出剤、および所望によりＥＬＩＳＡ、ＩＦＡ、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、ＥＣＬＩＡ、またはＲＩＡなどのイムノアッセイを行うための試薬を含む上述のアッセイ試薬は、上記のように、小胞上のバイオマーカーを検出するためのアッセイを実施するために適切な指示書および他の必要な試薬とともにキットで提供され得る。キットは通常、捕捉剤が結合した固体支持体、検出剤、コントロール製剤（陽性および／または陰性）、およびアッセイ型式が必要とする他の試薬を別々の容器に含有するであろう。アッセイを実行するための指示書（例えば、書面、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、Ｂｌｕ−ｒａｙ、フラッシュドライブ、デジタルダウンロードなど）は、通常キットに含まれる。キットはまた、使用される特定のアッセイに応じて、他のパッケージ化された試薬および材料（すなわち、洗浄バッファーなど）を含有できる。上記のようなアッセイは、これらのキットを使用して実施できる。
【０１４３】
別の実施形態では、本発明は、対象における神経障害を検出またはモニタリングするためのキットを包含する。様々な構成要素を有する種々のキットが、本発明により企図されている。一般的に言うと、キットは対象における１以上のバイオマーカーを定量するための手段を含むだろう。別の実施形態では、キットは生体試料を収集するための手段、生体試料中の１つ以上のバイオマーカーを定量する手段、およびキットの内容物の使用のための説明書を含むだろう。特定の実施形態では、キットは生体試料中のエキソソームを濃縮または単離するための手段を含むだろう。さらなる態様では、キットは、生体試料からのエキソソームを単離するための結合捕捉剤を有する固体支持体を含む。或る態様では、キットは、バイオマーカーの量を定量するための手段を含む。さらなる態様では、バイオマーカーの量を定量するための手段は、バイオマーカーの量を検出するために必要な試薬を含む。
【０１４４】
別の実施形態では、本発明は、対象における神経障害を診断するまたは予後判定する、神経障害のリスクのある対象を同定する、または神経障害を有する対象における治療レジメンを処方するまたは治療の利益を予想するための、以下：ａ）固体支持体に結合した捕捉剤を含む固体支持体、ここで少なくとも１つの捕捉剤は、ＣＤ１７１、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、またはＯＭＧに選択的に結合する；およびｂ）１以上の検出剤、ここで、１以上の検出剤は、エキソソームの表面のＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、ＣＤ６３、αβ−４２、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＳＹＰ、ＳＹＮＰＯ、ＰＳＤ９５、ＳＶ２Ａ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、またはＢＡＣＥに選択的に結合する、を含むキットを含む。特定の実施形態では、少なくとも１つの捕捉剤または検出剤は、ＣＤ１７１、リン酸化タウＴ１８１、またはニューログラニンに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体ミメティック、またはアプタマーを含む。特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、およびｓｃＦｖ断片からなる群から選択される。別の実施形態では、キットは、抗ニューログラニン抗体、抗リン酸化タウＴ１８１抗体、および抗ＣＤ１７１抗体を含む。
【０１４５】
本発明のこれら、および他の実施形態は、容易に、本明細書の開示に鑑みて当業者に想起されるだろう。
【実施例】
【０１４６】
本発明は、本発明の単なる例示であるよう意図された、以下の実施例を参照することによってさらに理解されるだろう。これらの実施例は、本発明を例示するためにのみ提供される。本発明は、本発明の単一の態様の例示としてのみ意図されている例示の実施形態によって範囲は限定されない。機能的に同等である任意の方法は、本発明の範囲内である。本明細書に記載したものに加えて、本発明の種々の改変は、前述の説明から当業者に明らかになるだろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【０１４７】
実施例１：エキソソームの細胞特異的バイオマーカーを定量する方法
体液中のエキソソームは、それらが由来する母細胞および母細胞の近くの微小環境の生理学的および病理学的材料（タンパク質、代謝産物、ＲＮＡ、小分子など）を運ぶため、様々な疾病の診断の新しいリソースである（図１Ａ）。したがって、エキソソームにおけるそのような病理学的材料の定量は、次世代の診断の基盤となる。
【０１４８】
しかしながら、エキソソームの解析のための現在の方法は複雑で高価であり、日常的な診断テストでの使用が制限されている。エキソソーム内物質の定量には、標的エキソソームの単離、エキソソームカーゴ（ｃａｒｇｏ）の放出のためのエキソソームの溶解または透過処理、および解析のための適切なアッセイ容器への移送が典型的に含まれる。エキソソーム解析の現在の手順に含まれる複数の工程は、労働集約的であり、大きな試料間およびアッセイ間変動を生み出す。
【０１４９】
ここでは、元の母細胞に由来するエキソソーム材料をエキソソームの表面で測定する方法、したがって、溶解または透過処理工程の必要性を取り除く方法を説明する。エキソソームの単離と解析は、試料を他のアッセイ容器に移すことなく同じ固体支持体上で行われ、材料の損失を防ぐ。
【０１５０】
図１Ｂに示されるように、当該方法は、エキソソーム膜タンパク質および／または吸着マーカーを含んでもよいエキソソームの表面の少なくとも２つの異なるマーカーに対する抗体を使用して行われる。例えば、膜マーカー（ＣＤ８１、ＳＮＡＰ２５、ＣＤ１７１、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧなど）または吸着マーカー（タウ、ＮＲＧＮ、ＧＦＡＰ、ＭＢＰなど）などのエキソソームマーカーに対する一次抗体はＥＬＩＳＡプレートに固定化され、そのマーカーを有するエキソソームの捕捉を可能にする。膜マーカー（ＣＤ８１、ＳＮＡＰ２５、ＣＤ１７１、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧなど）または吸着マーカー（タウ、ＮＲＧＮ、ＧＦＡＰ、ＭＢＰなど）でもあり得る目的の別のエキソソームマーカーに対する二次抗体が続いて一次抗体によって捕捉されたエキソソームをスクリーニングするために使用される。
【０１５１】
実施例２：エキソソームの表面のサイトゾル非膜タンパク質の検出
サイトゾル非膜タンパク質を以下のようにエキソソームの表面上で検出した。神経特異的な抗ＳＮＡＰ２５（図２Ａ−２Ｃ）またはコントロールマウスＩｇＧ（図２Ｄ−２Ｆ）を白色ＥＬＩＳＡプレートに固定化した。様々な容積（１０、２．５、および０μＬ）の血漿を最終容積４０μＬでＰＢＳ、０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０、または０．１％トリトン−Ｘ１００ＰＢＳにおいて懸濁し、ＥＬＩＳＡプレートにアプライした。４℃で一晩インキュベーションした後、未結合の材料を除去し、次いでエキソソーム表面マーカーＣＤ８１、および２つの異なる可溶性サイトゾルタンパク質（ＧＡＰＤＨおよびＣＴＳＤに対するビオチンラベル化抗体）をＥＬＩＳＡプレートにアプライした。ＰＢＳ試料について、抗体をｔｗｅｅｎ−２０なしでＰＢＳにおいて懸濁した。ｔｗｅｅｎ−２０およびトリトン−Ｘ１００の試料について、ラベル化抗体を０．１％  ｔｗｅｅｎ−２０  ＰＢＳにおいて懸濁した。その後、従来の化学発光ＥＬＩＳＡ手順を実施し、相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ）（ＲＬＵ）を決定した。
【０１５２】
ＧＡＰＤＨおよびＣＴＳＤはサイトゾルタンパク質であるため、ｔｗｅｅｎ−２０またはトリトン−Ｘ１００によるエキソソームの透過処理後にのみこれらが検出され、膜タンパク質ＣＤ８１は両方の場合に現れると仮定した。しかしながら、図２Ａ−２Ｃに示されるように、全３マーカーが血漿量依存的に検出され、他方でマウスＩｇＧ−固定化コントロールＥＬＩＳＡプレートではシグナルは検出されなかった。これらの結果は、ＧＡＰＤＨおよびＣＴＳＤなどの可溶性サイトゾルタンパク質がエキソソームの表面で検出される場合があることを明確に示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物は、バイオマーカーに選択的に結合する検出剤を使用して固体支持体上で捕捉された小胞上のバイオマーカー、ここで、小胞は溶解または透過処理されていない、を検出するのに有用であることをさらに示した。
【０１５３】
実施例３：エキソソームの表面のサイトゾル非膜タンパク質の起源
エキソソームの表面のサイトゾル非膜タンパク質の起源を以下のように決定した。エキソソーム表面マーカーＣＤ８１、ニューロン表面マーカーＳＮＡＰ２５、アストロサイト表面マーカー（ＥＡＡＴ１）、またはオリゴデンドロサイト表面マーカー（ＯＭＧ）に対する抗体を白色ＥＬＩＳＡプレートに固定化した。４０μＬのＰＢＳで懸濁した１０μＬの血漿をＥＬＩＳＡプレートにアプライした。４℃で一晩インキュベーションした後、未結合の材料を除去し、次いで、エキソソーム表面マーカーＣＤ８１、一般的なサイトゾルマーカーＧＡＰＤＨ、ニューロンにおけるサイトゾルタンパク質（ＮＲＧＮ）、オリゴデンドロサイト（ＭＢＰ）、およびアストロサイト（ＧＦＡＰ）に対するビオチンラベル化抗体をＥＬＩＳＡプレートにアプライした。抗体のないコントロールも含んだ（ｔＰＢＳ）。そして。従来の化学発光ＥＬＩＳＡ手順を実施し、相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ）（ＲＬＵ）を決定した（図３Ａ−３Ｄ）。
【０１５４】
ＣＤ８１およびＧＡＰＤＨの両方がすべてのＥＬＩＳＡプレートで検出され（左）、各ＥＬＩＳＡプレートがＧＡＰＤＨが表面に付着したエキソソームを捕捉したことを示す。エキソソーム全体を捕捉したＣＤ８１プレート（図３Ａ）では、ＭＢＰおよびＧＦＡＰは検出されなかった。ＮＲＧＮは検出されたが、値は非常に低かった。ニューロン由来エキソソームが捕捉されたＳＮＡＰ２５プレート（図３Ｂ）では、神経特異的ＮＲＧＮが検出されたが、ＭＢＰおよびＧＦＡＰは非常に低かった。アストロサイト由来エキソソームが捕捉されたＥＡＡＴ１プレート（図３Ｃ）では、アストロサイト特異的ＧＦＡＰが検出されたがＮＲＧＮおよびＭＢＰも検出された。オリゴデンドロサイト由来エキソソームが捕捉されたＯＭＧプレートでは（図３Ｄ）、オリゴデンドロサイト特異的ＭＢＰが検出されたが、ＮＲＧＮおよびＧＦＡＰも検出された。
【０１５５】
これらの結果は、エキソソームの表面の可溶性マーカーが、外部に放出される前の母細胞または母細胞から放出された直後の微小環境に由来することを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていない小胞上のバイオマーカーを検出するのに有用であることをさらに示した。
【０１５６】
実施例４：マーカータンパク質の定量
本発明のマーカータンパク質を以下のように定量した。固定化した抗体およびビオチンラベル化検出抗体は２つの異なる標的分子（ＣＤ８１およびＳＮＡＰ２５など）に結合するため、検出可能な標的標準は単一分子に両方の抗原が含まれている必要がある。したがって、従来のＥＬＩＳＡとはことなり精製タンパク質または組換えタンパク質は定量標準として適用できない。したがって、最初に様々な血漿試料をスクリーニングし、大量の標的エキソソームを含む適切な試料を見つけた。この血漿に１００ユニット／ｍＬ割り当てることにより、希釈研究をＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、およびＯＭＧプレート上で実施した（図４Ａ−４Ｄ）。
【０１５７】
図４Ａおよび４Ｂに示されるように、抗ＳＮＡＰ２５固定化ＥＬＩＳＡ（ニューロン由来エキソソーム、ＮＤＥ）プレートのＮＲＧＮ（図４Ａ）およびタウタンパク質（図４Ｂ）のＥＬＩＳＡ測定値ＲＬＵ（ｘ軸）は、線形変化を示した。同様に、抗ＥＡＡＴ１（アストロサイト由来エキソソーム、ＡＤＥ）および抗ＯＭＧ（オリゴデンドロサイト由来エキソソーム、ＯＤＥ）固定化プレートのＧＦＡＰ（図４Ｃ）およびＭＢＰ（図４Ｄ）はそれぞれ線形変化を示した。したがって、ＲＬＵはユニット／ｍＬを変換できる。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていない小胞上のバイオマーカーを検出し、かつ測定することに有用であることを示した。
【０１５８】
実施例５：エキソソーム吸着バイオマーカーのスクリーニング
エキソソーム吸着バイオマーカーを以下のように同定した。コントロールマウスＩｇＧ、マウス抗ヒトＣＤ８１、またはマウス抗ヒトシナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、そしてプールしたヒト血漿をすべてのＥＬＩＳＡウェルにアプライした（図５Ａ−５Ｃ）。様々な検出抗体（すべてビオチン化された）を使用してＥＬＩＳＡを実行し、エキソソーム膜タンパク質（ＣＤ８１、ＣＤ１７１、ＣＤ６３、およびＳＮＡＰ２５）に対する抗体だけでなく、様々な非膜タンパク質（グリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、タウ、微小管関連タンパク質タウ（タウ）およびリン酸化タウＴ１８１、およびアミロイドｂ１−４２ペプチド）に対する抗体を含んでいた。陰性コントロールとして、ビオチン化抗体を何も含まないＰＢＳを使用した。
【０１５９】
図５Ａに示されるように、ＥＬＩＳＡシグナル（ＲＬＵ）は抗ＣＤ８１および抗ＳＮＡＰ２５−固定化プレートの両方で明らかに陽性であったが、他方でコントロールマウスＩｇＧ−固定化プレートではほとんどシグナルが検出されず、当該システムがＣＤ８１またはＳＮＡＰ２５特異的であることを示した。ＰＢＳに示されているように、検出抗体のない非特異的シグナルは非常に低く、アッセイが検出抗体特異的であることを示す。膜タンパク質（ＣＤ８１、ＣＤ１７１、ＣＤ６３、およびＳＮＡＰ２５）の検出により当該アッセイがエキソソームを捕捉したことが確認された（図５Ａおよび５Ｂ）。驚いたことに、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰおよびＧＦＡＰなどの非膜タンパク質も検出された（図５Ｃ）。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていない小胞上のバイオマーカーを同定し、検出し、かつ測定するのに有用であることを示した。
【０１６０】
実施例６：ヒトにおけるアルツハイマー病の診断
本発明の方法および組成物は以下のようにヒトからの生体試料におけるアルツハイマー病を診断するために使用した。抗ＣＤ１７１をＥＬＩＳＡプレートに固定化した。アルツハイマー病（ＡＤ）を有する対象からのＥＤＴＡ血漿の１２試料および年齢、性別を一致させたコントロールをＥＬＩＳＡウェルにアプライし、およびＣＤ８１、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ｐ−タウＴ１８１に対する抗体を検出抗体として使用した（図６Ａ−６Ｅ）。
【０１６１】
以下の表１に示すように、ＮＲＧＮ値はＡＤ試料でコントロールよりも低く、Ｔ１８１値はＡＤ試料でコントロールよりも高かった。カイ二乗検定は、表１に示すように、これら２つのグループが有意に異なることを示した（ＮＲＧＮではｐ＝０．００２、Ｔ１８１ではｐ＝０．０００１）。これらの結果は、本発明の方法および組成物がアルツハイマー病を診断するために使用できることを示した。
【表１】
2020523559.tif 000003
【０１６２】
実施例７：血漿エキソソームバイオマーカーレベルの安定性
血漿エキソソームバイオマーカーレベルの安定性を以下のように決定した。抗ＣＤ８１、抗ＣＤ１７１、抗ＳＮＡＰ２５、抗ＥＡＡＴ１、および抗ＯＭＧを別々のＥＬＩＳＡプレートに固定化した。ＥＤＴＡ血漿を２−３週間毎週７コントロール対象から得て、ＥＬＩＳＡウェルにアプライした。エキソソーム膜標的の検出について（図７Ａ−７Ｆ）、抗ＣＤ８１プローブは、ＣＤ８１プレートで使用し（総エキソソーム、ＴＥ）；抗ＣＤ１７１プローブは、ＣＤ８１プレートで使用し（ＣＤ１７１−ベースのＮＤＥ、ｃＮＤＥ）；抗ＳＮＡＰ２５プローブは、ＣＤ８１プレートで使用し（ＳＮＡＰ２５−ベースのＮＤＥ、ｓＮＤＥ）；抗ＣＤ８１プローブは、ＥＡＡＴ１プレートで使用し（ＡＤＥ）；および抗ＣＤ８１プローブは、ＯＭＧプレートで使用した（ＯＤＥ）。エキソソーム表面タンパク質標的の検出について（図７Ｇ−７Ｌ）、それぞれＥＡＡＴ１プレートのＧＦＡＰプローブ、ＯＭＧプレートのＭＢＰプローブ、ＳＮＡＰ２５プレートのＮＲＧＮプローブ、ＳＮＡＰ２５プレートのタウプローブ、およびＣＤ１７１プレートのＮＲＧＮプローブ。
【０１６３】
各値は試験対象者の間で大きく分散していた（ＳＮＡＰ２５プレートのタウ以外）が、値はＳＡＮＰ２５プレートのＮＲＧＮを除いて同じ個体内で非常に一定であった。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていない小胞上のバイオマーカーを同定し、検出し、かつ測定するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が対象における神経障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が疾病または障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。
【０１６４】
実施例８：抗ＮＲＧＮ固定化ＥＬＩＳＡプレートの血漿
血漿エキソソームバイオマーカーを以下のように同定した。抗ＮＲＧＮまたはコントロールマウスＩｇＧをＥＬＩＳＡプレートに固定化した。ＥＤＴＡ血漿またはＰＢＳ単独をＥＬＩＳＡウェルにアプライした。ＮＲＧＮ、ＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＣＤ８１、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧに対する抗体を検出のために使用し、ＰＢＳコントロールを比較のために使用した。
【０１６５】
図８Ｂに示されるように、抗ＮＲＧＮ固定化ＥＬＩＳＡプレートにアプライされた血漿はＥＡＡＴ１およびＯＭＧではなくＮＲＧＮ、ＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、およびＣＤ８１に陽性であることを試験し、ＳアストロサイトまたはオリゴデンドロサイトではなくＮＡＰ２５プレートのＮＲＧＮのニューロンに特異的であることを示す（図８Ｂ）。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていない小胞上のバイオマーカーを同定し、検出し、かつ測定するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が対象における神経障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が疾病または障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。
【０１６６】
実施例９：エキソソームバイオマーカーのミクログリアターゲティング
エキソソームバイオマーカーのミクログリアターゲティングを以下のように行った。抗ＣＤ１１ｂ抗体またはコントロールマウスＩｇＧをＥＬＩＳＡプレートに固定化した。７つの異なるドナーからのＥＤＴＡ血漿（ＩＲ１−ＩＲ７）またはＰＢＳ単独をＥＬＩＳＡウェルにアプライした。ＧＦＡＰ（図９Ｂ）、ＭＢＰ（図９Ｃ）、またはＮＲＧＮ（図９Ｄ）に対する抗体を検出抗体として使用した。
【０１６７】
図９Ｂ−９Ｄに示されるように、ミクログリア特異的な抗体は利用できず、抗ＣＤ１１ｂがミクログリアおよび末梢性マクロファージの両方に結合するにもかかわらず、ミクログリア解析はＣＤ１１ｂ＋エキソソームの表面の脳由来タンパク質を評価することにより行うことができる。４（ＧＦＡＰ）から５（ＭＢＰ）のドナーは、３つのコントロール（ＩｇＧプレートのＰＢＳ、ＩｇＧプレートの血漿およびＣＤ１ｂプレートのＰＢＳ）より高い陽性シグナルを示し、これらのドナーにおけるミクログリアと、アストロサイトおよびオリゴデンドロサイトの相互作用を示した。しかしながら、７の対象のいずれもＮＲＧＮを示さなかった（図９Ｄ）。
【０１６８】
これらの結果は、本発明の方法がミクログリア由来エキソソームのバイオマーカー（ＧＦＡＰ、ＭＢＰ、ＮＧＲＮ）を検出するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていない小胞上のバイオマーカーを同定し、検出し、かつ測定するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が対象における神経疾患を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が疾病または障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。
【０１６９】
実施例１０：脳由来エキソソームの表面の分泌タンパク質（サイトカインＩＬ１ｂおよびＩＬ３４およびケモカインＣＸ３ＣＬ１）の検出
脳由来エキソソームの表面の分泌タンパク質（サイトカインおよびケモカイン）を以下のように検出した。様々な濃度の標準血漿（図１０Ａ、１０Ｃ、および１０Ｅ）および７のコントロール血漿試料の固定希釈（ＩＬ１ｂおよびＩＬ３４について１／８希釈およびＣＸ３ＣＬ１について１／４希釈）およびＰＢＳコントロールをそれぞれＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥを捕捉するために固定化した抗体（抗ＳＮＡＰ２５、抗ＥＡＡＴ１、抗ＯＭＧ、およびコントロールマウスＩｇＧ）を含有するＥＬＩＳＡプレートにアプライした。コントロールマウスＩｇＧは非特異的結合を評価するために使用した。
【０１７０】
図１０Ａ、１０Ｃ、よび１０Ｅに示されるように、標準血漿は、コントロールＩｇＧ−固定化プレートと比較してＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、およびＯＭＧ  ＥＬＩＳＡプレートのＩＬ１ｂ、ＩＬ３４およびＣＸ３ＣＬ１レベルにおいて容積依存性増加を示した。抗ＯＭＧ−固定化プレートのＩＬ１ｂおよびＩＬ３４は２．５％血漿で飽和した（図１０Ａおよび１０Ｃ参照）。
【０１７１】
陰性コントロールＰＢＳ単独のものと同様に、血漿試料（ＩＲ１、ＩＲ４、ＩＲ６）はＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、およびＣＸ３ＣＬ１について陰性であった。しかしながら、ＩＲ２はＳＮＡＰ２５  ＥＬＩＳＡプレートでＩＬ１ｂ陽性であり、ＩＲ３はＥＡＡＴ１およびＯＭＧ  ＥＬＩＳＡプレートでＣＸ３ＣＬ１陽性であった。ＩＲ５は、ＳＮＡＰ２５プレートのＩＬ１ｂレベルおよびＩＬ３４で陽性であり、ならびにＥＡＡＴ１およびＯＭＧ  ＥＬＩＳＡプレートのＣＸ３ＣＬ１の検出可能レベルを示した。ＩＲ７は、全ＥＬＩＳＡプレートのＩＬ１ｂ、ＳＮＡＰ２５  ＥＬＩＳＡプレートのＩＬ３４で陽性であり、ならびにＥＡＡＴ１およびＯＭＧ  ＥＬＩＳＡプレートの両方でＣＸ３ＣＬ１の検出可能レベルを示した。
【０１７２】
これらの結果は、本発明の方法がエキソソームの表面のサイトカイン（ＩＬ１ｂおよびＩＬ３４）およびケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）を検出するのに有用であることを示した（ＳＮＡＰ２５＋ＮＤＥ、ＥＡＡＴ１＋ＡＤＥ、およびＯＭＧ＋ＯＤＥ）。これらの結果はまた、サイトカインおよびケモカイン特性が脳由来エキソソームの各サブセット（ＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥ）に固有であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていない小胞上のバイオマーカーを同定し、検出し、かつ測定するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が対象における神経疾患を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が疾病または障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。
【０１７３】
実施例１１：エキソソームの表面の膜タンパク質および受容体の検出
エキソソームの表面の複数の膜タンパク質および受容体を以下のように検出した。様々な抗体をコーティング緩衝液において懸濁し、ＥＬＩＳＡプレートにアプライした。１時間のインキュベーション後、各ウェルを１回洗浄し、その後、ブロッキング溶液（ブロッカーカゼイン中０．５％ＢＳＡ）を添加し、インキュベーションをさらに１時間続けた。各ウェルを２回洗浄した後、血漿または緩衝液コントロール（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）を追加したその後、冷蔵庫で一晩インキュベーションを続けた。各ウェルを２回洗浄した後、ビオチン化抗ＣＤ８１または抗ＳＮＡＰ２５を加えて１時間インキュベーションを続けた。各ウェルを２回洗浄した後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼを加え、さらに３０分インキュベーションを続けた。各ウェルを３回洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ基質を添加し、化学発光シグナルをルミノメーターで測定した。
【０１７４】
以下の表２に示されるように、複数のサイトゾルタンパク質、分泌タンパク質、および膜タンパク質および受容体がエキソソームの表面で検出された。
表２．ＣＤ８１／ＳＮＡＰ２５でプローブした抗体固定化。
【表２−１】
2020523559.tif 000004
【表２−２】
2020523559.tif 000005
【表２−３】
2020523559.tif 000006
【０１７５】
上記表２で検出されたタンパク質を確認するために、次のように２回の一連の実験を行った。陽性の抗体をビオチン化し、ＰＢＳまたは血漿を抗ＳＮＡＰ２５−、またはコントロールＩｇＧ−固定化プレートにアプライしたＥＬＩＳＡ上で使用した。以下の表３に示すように、表２の陽性抗体はすべて、この一連の実験でも陽性であった。
表３．様々なビオチン化抗体で調べた抗ＳＮＡＰ２５またはコントロールＩｇＧ−固定化プレート。
【表３−１】
2020523559.tif 000007
【表３−２】
2020523559.tif 000008
【表３−３】
2020523559.tif 000009
【０１７６】
これらの結果は、本発明の方法がエキソソームの表面のサイトゾルタンパク質、分泌タンパク質、および膜タンパク質および受容体を検出するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていないエキソソームのバイオマーカーを同定し、検出し、かつ測定するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が対象における神経疾患を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が疾病または障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。
【０１７７】
実施例１２：マルチ標的ＥＬＩＳＡの定量標準。
ＥＬＩＳＡアッセイは試験試料の標的分子のレベルを決定するための定量標準を必要とする。本発明の例示的なアッセイは、異なる標的分子に対する２つの抗体を利用する。従って、精製または組換えタンパク質は、このようなＥＬＩＳＡアッセイの標準として適用できない。したがって、ＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥ陽性のエキソソームを含むエキソソームの高い値を有することについて、様々な血漿試料がスクリーニングされ、１つの特定の血漿試料が選択した。その後、この血漿試料を定量標準として使用した。図１１に示すように、この血漿試料は、本発明の複数のＥＬＩＳＡの標準として良好に機能した。４つのパラメーターロジスティック回帰解析を使用して、各ターゲットの標準曲線を生成した。
【０１７８】
実施例１３：ヒトにおけるアルツハイマー病および軽度認知障害の鑑別診断
本発明の方法および組成物は、以下のようにヒトからの生体試料におけるアルツハイマー病および軽度認知障害の鑑別診断のために使用された。抗ＳＮＡＰ２５抗体をＥＬＩＳＡプレートに固定化した。アルツハイマー病（ＡＤ、ｎ＝４）または軽度認知障害（ＭＣＩ、ｎ＝４）を有する対象からのＥＤＴＡ血漿の８の試料および年齢および性別を一致させた８のコントロールをＥＬＩＳＡウェルにアプライし、１６のサイトゾルタンパク質、分泌タンパク質、および膜タンパク質および受容体に対する抗体を検出抗体として使用した（図１２）。
【０１７９】
図１２に示されるように、すべての１６バイオマーカーの二重変動（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）は小さかった。図１３は全１６バイオマーカーの標準曲線を示す。標的表面タンパク質バイオマーカーの定量は図１４に示される。図１４に示されるように、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、およびＣＣＬ２レベルはコントロール試料レベルと比較してＭＣＩにおいて有意に高かった。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、ＭＣＩを診断するために、アルツハイマー病およびＭＣＩの鑑別診断のために、使用できることを示した。
【０１８０】
血漿試料におけるＣＤ８１レベルの変動を説明するために、残りの１５エキソソームバイオマーカーレベルをＣＤ８１レベルで標準化した。図１５に示されるように、ＡｃｈＥおよびＬＡＭＰ１レベルはコントロール試料と比較してＭＣＩおよびＡＤ＋ＭＣＩを有する対象からの血漿試料において有意に大きかった。さらにＮＧＲＮ、ＧＹＳ、およびＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、およびＢＡＣＥレベルは、ＡＤ、ＭＣＩ、ＡＤ＋ＭＣＩおよびコントロール試料間で有意に異なった。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、ＡＤ、ＭＣＩを診断するため、およびＡＤおよびＭＣＩの鑑別診断のために使用できることを示した。
【０１８１】
別の一連の実験では、上記でアッセイした血漿試料の標的バイオマーカーレベルをＳＹＴレベルに標準化した。神経の由来エキソソームはＳＮＡＰ２５−固定化プレートにより捕捉されたため、ＳＹＴ規準化はニューロンマーカーの第二の規準化をもたらす。図１６に示されるように、ＡｃｈＥ／ＳＹＴ、ＬＡＭＰ１／ＳＹＴ、ＲＥＳＴ／ＳＹＴ、ＣＣＬ２／ＳＹＴ、ＨＳＰ／ＳＹＴ、およびＩＬ１２ｂ／ＳＹＴレベルはＡＤ、ＭＣＩ、ＡＤ＋ＭＣＩ、およびコントロール試料間で有意に異なった。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、ＡＤ、ＭＣＩを診断するため、およびＡＤおよびＭＣＩの鑑別診断のために使用できることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が疾病または障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。
【０１８２】
実施例１４：パーキンソニズム−プラス症候群を有するヒト対象における脳由来エキソソームの列挙
本発明の方法および組成物は、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）を有する患者およびコントロール対象から得られたニューロン−由来の、アストロサイト−由来の、およびオリゴデンドロサイト由来エキソソーム（それぞれＮＤＥ、ＡＤＥおよびＯＤＥ）の血漿レベルを列挙するために以下のように使用した。ＰＤを有する１５の患者（年齢４６−７９、平均±ＳＤ  ６４．７±１０．８、男性９および女性６）、ＭＳＡを有する１５の患者（年齢４４−７４、平均±ＳＤ  ６３．３±８．１６、男性１０および女性５）、ＰＳＰを有する７の患者（年齢５８−８１、平均±ＳＤ  ７１．６±９．８、男性２および女性５）、および１５の疾病コントロール（年齢４７−７７、平均±ＳＤ  ６４．７±８．５、男性１０および女性５）を含む合計５２の対象がこの研究に含まれ、これらのグループは年齢が一致した。
【０１８３】
静脈穿刺により血漿試料を採取し、合計８ｍＬの血液をＥＤＴＡ含有チューブに収集した。収集後、２，０００ｇで１５分間の遠心分離により血漿を分離し、ポリプロピレンバイアルに入れ、解析まで−８０℃で保存した。
【０１８４】
様々な濃度の抗体を１ｘコーティング緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）において懸濁し、５０μＬを白の平底ストリップマイクロプレート（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓｅ，  ＭＯ）の各ウェルにアプライした。室温で１時間インキュベートした後、各ウェルを１ｘ洗浄緩衝液（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）で洗浄し、その後１％ブロッカーウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を添加した７５μＬのブロッカーカゼイン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）を加え、およびインキュベーションをさらに１時間続けた。各ウェル洗浄後、各プレートをすぐに酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）に使用した。
【０１８５】
各４０μＬの標準、コントロール、および血漿試料をＥＬＩＳＡプレートの各ウェルにアプライし、冷蔵庫で一晩インキュベートした。翌日、各ウェルを洗浄した後、０．１％ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ブロッカーＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、８μｇ／ｍＬマウスＩｇＧ（Ｅｑｕｉｔｅｃｈ−Ｂｉｏ，  Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ，  ＴＸ）を加えたリン酸緩衝液生理食塩水、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）に懸濁した４０μＬのビオチン化検出抗体を加え、室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、各ウェルを洗浄し、その後、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、１％ブロッカーＢＳＡ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）、および５％ブロッカーカゼインを添加したＰＢＳで懸濁した４０μＬのストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＳＡ−ＨＲＰ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）をアプライした。３０分間のインキュベーション後、各ウェルを洗浄し、次に５０μＬの基質（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ、Ｔｈｅｒｍｏ）をアプライした。４分間のインキュベーション後、化学発光シグナル（相対発光量（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  Ｌｉｇｈｔ  Ｕｎｉｔ）、ＲＬＵ）をルミノメーター（ＡＮＳＨ  Ｌａｂｓ，  Ｗｅｂｓｔｅｒ，  ＴＸ）で決定した。
【０１８６】
我々のサンドイッチＥＬＩＳＡは、抗ＣＤ８１および抗ＳＮＡＰ２５（シナプトソーム関連タンパク質２５）などの２つの異なる標的抗体の組み合わせを使用したため、精製または組換えタンパク質は定量標準として適用できなかった。したがって我々は商用ソース（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｎｏｖｉ，  ＭＩ，  ａｎｄ  ＥｑｕｉＴｅｃｈ  Ｅｎｔｅｒｐｒｉｓｅ，  Ｋｅｒｒｖｉｌｌｅ，  ＴＸ）から得られた様々な血漿試料を最初にスクリーニングし、ＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥのすべての高濃度の血漿試料を見つけた。この血漿に１００ユニット／ｍＬを割り当てることにより、各ＥＬＩＳＡで希釈試験を実施し、各希釈でＲＬＵを得た。次に、４パラメーターロジスティック解析を使用して、各試料のＲＬＵをユニット／ｍＬに変換した。
【０１８７】
血漿におけるＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥに対する抗体を見つけるために、血漿の様々な希釈を、全エキソソームを捕捉するための抗ＣＤ８１モノクローナル抗体（ｃｌｏｎｅ  ＪＳ−８１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｓｐａｒｋｓ，  ＭＤ）固定化ＥＬＩＳＡプレート並びに陰性コントロールとして使用されるコントロールマウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｄａｌｌａｓ，  Ｔｅｘａｓ）固定化ＥＬＩＳＡプレートにアプライした。各ウェルから非結合物質を除去するための広範な洗浄工程の後、様々な標的に対するビオチン化抗体をアプライし、上記のようにＥＬＩＳＡを実施した。ビオチン標識について、我々はＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（Ｔｈｅｒｍｏ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＵＳＡ）を使用した。このことから、ＳＮＡＰ２５（ｃｌｏｎｅ  Ｂ−８、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対するモノクローナル抗体、興奮性アミノ酸トランスポーター１（ＥＡＡＴ１）（＝グルタミン酸アスパラギン酸トランスポーター（ＧＬＡＳＴ））およびオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）（Ｂｉｏｓｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）に対するポリクローナル抗体が、コントロールマウスＩｇＧ−固定化プレートではなくＣＤ８１−固定化プレート上で非常に強いシグナルを示すことがわかった。適切な抗体の発見後、抗ＳＮＡＰ２５、抗ＥＡＡＴ１、および抗ＯＭＧをＥＬＩＳＡプレートに固定し、ビオチン化抗ＣＤ８１（Ｃｌｏｎｅ  １．３．３．２２、ＬＳ  Ｂｉｏ，  Ｓｅａｔｔｌｅ，  ＷＡ）で調べた。我々はそれぞれＳＮＡＰ２５＋、ＣＤ８１＋ＥＬＩＳＡ結果についてＮＤＥ、ＥＡＡＴ１＋、ＣＤ８１＋ＥＬＩＳＡ結果についてＡＤＥ、およびＯＭＧ＋、ＣＤ８１＋ＥＬＩＳＡ結果についてＯＤＥとした（図１７）。
【０１８８】
ＢＤＥの測定値の対数変換を特定の解析に適切に使用して、グループの違いやパラメーター間の回帰の解析における過度のゆがみや外れ値の影響を減らした。診断グループ間のＢＤＥの平均差、およびＢＤＥレベルと臨床パラメーター間の回帰は、ｔ検定（Ｅｘｃｅｌ）によって評価した。試料の数が限られていたため、追加のノンパラメトリックマン・ホイットニーのＵ検定を行った（Ｐｒｉｓｍ，  ＧｒａｐｈＰａｄ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）。我々ははまた、予測因子としてＢＤＥのレベルを使用して、ＰＤの診断のための受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を導出し、曲線下面積（ＡＵＣ；ＡＵＣ＝０．５は違いがないことを示し、ＡＵＣ＝１は診断検査を示すであろう）を推定して、各予測因子（ＮＤＥ、ＡＤＥおよびＯＤＥの血漿レベル）の診断上の能力を評価した。有意水準はｐ＜０．０５に設定した。
【０１８９】
ＥＬＩＳＡ特異性を以下のように決定した。ＥＬＩＳＡプレートを標的抗体（抗ＳＮＡＰ２５、抗ＥＡＡＴ１、および抗ＯＭＧ）またはコントロールＩｇＧのいずれかで固定化し、血漿の連続希釈をアプライした。図１８Ａ−１８Ｃに示されるように、ＥＬＩＳＡ測定値（ＲＬＵ）は、コントロールＩｇＧ−固定化プレート（白抜き三角；△）ではなく標的抗体固定化ＥＬＩＳＡプレート（黒丸；●）の血漿の容積に比例して増加した。我々はまた、ビオチン抗体なしでＥＬＩＳＡを試験して、ＳＡ−ＨＲＰの非特異的結合を評価したが、シグナルは検出されなかった。ビオチン抗体を１０倍の容積のコントロールマウスＩｇＧと混合したため、非特異的なＩｇＧ結合は当該アッセイで除去された。
【０１９０】
次に、ＥＬＩＳＡアッセイの性能を決定した。アッセイ内の精度は、５２の異なる対象を使用して２回実行されたＥＬＩＳＡによって決定した。図１９Ａ−１９Ｃに示されるように、二重変動（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）はすべての３つのＥＬＩＳＡにおいて非常に小さかった（それぞれＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥについてｒ２＝０．９６４４、０．９５４１、および０．９７９１および傾き＝１．０８、０．９９、および１．０１）。アッセイ間精度を９回実行された３つのコントロール血漿試料を使用して決定した。図２０Ａ−２０Ｃに示されるように、高および中範囲の血漿のＣＶ％は＜＝２０％以下でったが、非常に低範囲の血漿（ＮＤＥについて＜１０ユニット／ｍＬ、ＡＤＥおよびＯＤＥについて＜１ユニット／ｍＬ）は３５−６３％であった。各実験でＥＬＩＳＡプレートを構築したため、ＣＶ％は許容範囲であった。
【０１９１】
このＥＬＩＳＡでは、標的血漿試料の定量は、標準血漿の希釈曲線に基づく。この計算は、試料と標準間の希釈曲線が同じ場合に適用できる。この仮説を検証するために、希釈直線性は、高、中、低範囲の血漿試料によって決定した。図２１Ａ−２１Ｃに示されるように、これらの３つの血漿の量は約１，０００倍で大きく変動するが、すべての３つの血漿は、ほとんど同一の傾きでＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥ線形希釈を示した。図２１Ａ−２１Ｃに示されるように、線形検出範囲はそれぞれ０．１−５ｕＬ血漿（ＮＤＥ）、０．０１−５ｕＬ血漿（ＡＤＥおよびＯＤＥ）であった。
【０１９２】
ＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥの検出限界（ＬＯＤ）はそれぞれ０．５１９、０、および０．０６２ユニット／ｍＬであった。
【０１９３】
血漿ＢＤＥの列挙および患者とコントロール間の比較を以下のように決定した。それぞれＮＤＥ、ＡＤＥおよびＯＤＥの血漿レベルはコントロール試料におけるものよりもＰＤ試料で有意に高かった（図２２Ａ−２２Ｃ；ＮＤＥについてｐ＝０．００３（ｔ検定）、ｐ＝０．００３（Ｕ検定）、ＡＤＥについてｐ＝０．０２８（ｔ検定）、ｐ＝０．０２１（Ｕ検定）、およびＯＤＥについてｐ＝０．０１６（ｔ検定）、ｐ＝０．００８（Ｕ検定））。ＰＤおよびＭＳＡグループ間を比較すると、ＮＤＥの血漿レベルはＭＳＡのものよりもＰＤを有する患者で有意に高かった（図２２Ａ−２２Ｃ；ｐ＝０．０２８（ｔ検定）、ｐ＝０．０２３（Ｕ検定））、他方でＡＤＥおよびＯＤＥにおいて有意差はみられなかった。ＰＳＰを有する患者はまた、コントロールのものと比較して血漿ＮＤＥ、およびＡＤＥの有意な高レベルを示した（図２２Ａ−２２Ｂ；ＮＤＥについてｐ＝０．０３８（ｔ検定）、ｐ＝０．０４１（Ｕ検定）、およびＡＤＥについてｐ＝０．０１２（ｔ検定）、ｐ＝０．０２５（Ｕ検定））。
【０１９４】
図２３Ａ−２３Ｃは、血漿ＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥのレベルに基づく、ＰＤを有する患者およびコントロールの分類のＲＯＣ曲線を示す。血漿ＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥについてのＲＯＣ曲線のＡＵＣはそれぞれ０．８９、０．８３、および０．８８であり、ＮＤＥ、ＡＤＥ、およびＯＤＥの血漿レベルが実質的な精度でＰＤの診断検査に適用可能であるだろうことを示す。
【０１９５】
ＰＤおよびＭＳＡを有する対象の、ＢＤＥおよび臨床重症度間の相関を以下のように決定した。我々はＰＤを有する患者における、血漿ＢＤＥのレベルおよび臨床重症度のスコア間の相関を研究した。図２４Ａ−２４Ｆに示されるように、すべてのＢＤＥ（ＮＤＥ、ＡＤＥおよびＯＤＥ）の血漿レベルはコントロールグループと比較して、進行したＰＤを有する患者、すなわちｍＲＳグレード４のグループ（ｎ＝４）（ＮＤＥについてｐ＝０．００３（ｔ検定）、ｐ＝０．００８（Ｕ検定）、ＡＤＥについてｐ＝０．００１（ｔ検定）、ｐ＝０．００６（Ｕ検定）、およびＯＤＥについてｐ＜０．００１（ｔ検定）、ｐ＝０．００６（Ｕ検定）と、ホーン・ヤール（ＨＹ）ステージ４のもの（ｎ＝５）（ＮＤＥについてｐ＝０．００１（ｔ検定）、ｐ＝０．００３（Ｕ検定）、ＡＤＥについてｐ＝０．００１（ｔ検定）、ｐ＝０．００３（Ｕ検定）、およびＯＤＥについてｐ＜０．００１（ｔ検定）、ｐ＝０．００３（Ｕ検定）の両方において、有意に高かった。さらに、ＮＤＥの血漿レベルはコントロールと比較して、ｍＲＳグレード１−２（ｎ＝５）（ｐ＝０．００１（ｔ検定）、ｐ＝０．００２（Ｕ検定））またはＨＹステージ１−２（ｎ＝４）（ｐ＝０．００３（ｔ検定）、ｐ＝０．００４（Ｕ検定））の軽度ＰＤ患者においてでさえも有意に高かった。それほど顕著ではないが、それでもＯＤＥの血漿レベルもコントロールと比較して、ｍＲＳグレード１−２（ｐ＝０．００２（ｔ検定）、ｐ＝０．００５（Ｕ検定））またはＨＹステージ１−２（ｐ＝０．０１１（Ｕ検定））を有する軽度ＰＤ患者においてでさえも有意に高かった。さらに、ＡＤＥの血漿レベルもコントロールと比較して、ｍＲＳグレード１−２（ｐ＝０．０２３（Ｕ検定））を有する軽度ＰＤ患者においてでさえも高かった。これらの結果は、ＮＤＥおよびＯＤＥの血漿レベルが、特に初期の疾患段階のＰＤ患者の診断バイオマーカーとして有用であり得ることを示す。ｍＲＳおよびＹａｈｒスコア１−３の初期疾患コースにおいてＯＤＥのレベルは変動したが、ＯＤＥのレベルはスコア１−３よりｍＲＳおよびＹａｈｒスコア４で有意に高かった（ｍＲＳについてｐ＝０．００２（ｔ検定）、ｐ＝０．０１１（Ｕ検定）、およびＹａｈｒにおけるｐ＝０．００４（ｔ検定）、ｐ＝０．００２４（Ｕ検定））。これは、ＯＤＥがＰＤの疾患進行のモニタリングの潜在的な代替バイオマーカーである可能性があることを示唆する。
【０１９６】
我々はＢＤＥのレベルまたはそれらの間の比率（ＡＤＥ／ＮＤＥ、ＯＤＥ／ＮＤＥ、およびＯＤＥ／ＡＤＥ）およびＰＤグループにおける様々な臨床パラメータ間の相関をさらに研究した（表４参照）。ＵＰＤＲＳパートＩＩＩスコアについてのＯＤＥ／ＮＤＥ（ｒ２＝０．５１、ｎ＝１４、ｐ＝０．００４１）と同様、ＡＤＥ／ＮＤＥの比は、患者の罹病期間（ｒ２＝０．５１、ｎ＝１５、ｐ＝０．００２８）、ｍＲＳのグレード（ｒ２＝０．４７、ｎ＝１５、ｐ＝０．００４８）、およびＵＰＤＲＳパートＩＩＩスコア（ｒ２＝０．５２、ｎ＝１４、ｐ＝０．００３６）について統計学的に有意な高いｒ２値を示した（図２５Ａ−２５Ｄ）。これらの結果はまた、ＢＤＥの血漿レベルがＰＤを有する患者の重症度のモニタリングにおそらく有用であることを示唆する。
表４．  ＢＤＥおよびＰＤ重症度間の相関。＊＝ｒ２値。
【表４】
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【０１９７】
次に、ＢＤＥのレベルとＭＳＡグループの様々な臨床パラメーター間の相関を調査した。図２６Ａ−２６Ｄに示されるように、ＯＤＥの血漿レベルは全体としてｍＲＳのグレードまたはＭＳＡを有する患者における罹病期間と相関せず、またはＭＳＡ−ＣにおけるＩＣＡＲＳスコアと相関しなかったが、ＵＰＤＲＳパートＩＩＩスコアと有意な相関を示した（ｒ２＝０．５７、ｎ＝６、ｐ＝０．０４８）。
【０１９８】
これらの結果は、ＮＤＥおよびＯＤＥの両方の血漿レベルが、ＰＤの初期であってもコントロールと比較して有意にしたこと、およびＯＤＥのレベルがＰＤにおける疾患重症度の進行に従って増加することを示した。これらの結果は、ＢＤＥの血漿レベルがＰＤおよび関連疾患についての診断上および重症度レベルのバイオマーカーであり得ることをさらに示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていないエキソソームのバイオマーカーを同定し、検出し、かつ測定するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が対象における神経疾患を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が疾病または障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。
【０１９９】
実施例１５：ニューロン−、アストロサイト−、およびオリゴデンドロサイト由来エキソソームの表面のα−シヌクレインの病的形態の検出。
ニューロン−、アストロサイト−、およびオリゴデンドロサイト由来エキソソームの表面のα−シヌクレインの病的形態の検出を以下のように行った。４０ｕＬのＥＤＴＡ血漿試料（ＰＢＳで１／４希釈）を、ニューロン−（ＮＤＥ）、アストロサイト−（ＡＤＥ）、およびオリゴデンドロサイト−（ＯＤＥ）由来のエキソソームを捕捉する抗ＳＮＡＰ２５−、ＥＡＡＴ１−およびＯＭＧ−固定化ＥＬＩＳＡプレートに加えた。各ウェルを洗浄した後、α−シヌクレインの凝集形態（病的形態）に対するビオチン化抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄからＳｙｎ−Ｆ１、Ｓｙｎ−Ｏ２）をアプライし、さらに１時間のインキュベーションを続け、その後通常のＥＬＩＳＡ手順を行った（ＨＲＰ反応、Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ、化学発光シグナルの測定）。図２７Ａ−２７Ｆに示されるように、病的なα−シヌクレインをＰＤ、ＭＳＡ、およびＰＳＰを有する患者において検出した。統計学的有意性はマン・ホイットニーのＵ検定に基づいた。
【０２００】
これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていないエキソソームのバイオマーカーを同定し、検出し、かつ測定するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が対象における神経疾患を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が疾病または障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。
【０２０１】
実施例１６：ニューロン由来エキソソームの表面のドーパミン受容体Ｄ２（ＤＲＤ２）の検出。
ニューロン由来エキソソームの表面のドーパミン受容体Ｄ２（ＤＲＤ２）の検出を以下のように行った。抗ＳＮＡＰ２５（ニューロンマーカー）、抗ＤＲＤ２、およびコントロールマウスＩｇＧをＥＬＩＳＡプレートに固定化した。次に、ヒトＥＤＴＡ血漿または緩衝液コントロール（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）をＥＬＩＳＡプレートにアプライした、その後、ビオチン化抗ＳＮＡＰ２５と反応させた。図２８Ａに示されるように、血漿は抗ＳＮＡＰ２５および抗ＤＲＤ２抗体ＥＬＩＳＡプレートの両方で陽性であったが、他方でＰＢＳは違った。
【０２０２】
別の一連の実験では、抗ＳＮＡＰ２５およびコントロールマウスＩｇＧをＥＬＩＳＡプレートに固定化し、ヒトＥＤＴＡ血漿またはＰＢＳ  ＥＬＩＳＡプレートにアプライし、その後、ＳＮＡＰ２５、ＣＤ８１（エキソソームの一般的なマーカー）、ＤＲＤ２に対するビオチン化抗体、並びにＰＢＳコントロールと反応させた。図２８Ｂに示されるように、血漿は抗ＳＮＡＰ２５抗体ＥＬＩＳＡプレートの抗ＳＮＡＰ２５、ＣＤ８１、およびＤＲＤ２プローブで陽性であった。
【０２０３】
血漿希釈研究を以下のように行った。抗ＳＮＡＰ２５をＥＬＩＳＡプレートに固定化し、ヒトＥＤＴＡ血漿試料（３つの異なるドナー）の連続希釈をＥＬＩＳＡプレートにアプライし、その後、ビオチン化抗ＤＲＤ２および抗ＣＤ８１と反応させた。図２９Ａおよび２９Ｂに示されるように、血漿希釈の傾きは３つのドナー間でほとんど同じであった。従って、ＤＲＤ２／ＣＤ８１の比は一定だった（図２９Ｃ参照）。
【０２０４】
別の一連の実験では、神経疾患を有するヒトからの血漿試料におけるニューロン由来エキソソームにおいてＤＲＤ２を検出した。標準血漿１００ユニット／ｍＬに割り当て、次いで希釈曲線を使用して、各試料のＥＬＩＳＡ測定値（ＳＮＡＰ２５プレートのＤＲＤ２プローブ、およびＳＮＡＰ２５プレートのＣＤ８１プローブ（ＮＤＥ））をユニット／ｍＬ（Ｕ／ｍＬ）に変換した。コントロール、パーキンソン病（ＰＤ）、多系統萎縮症（ＭＳＡ）の各１５、および進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）を有する７の患者からの血漿試料を解析した。ＰＤおよびＭＳＡ患者を疾患の重症度（ｍＲＳスコア）によりさらに分類した。図３０Ａ−３０Ｇに示されるように、ＰＤにおけるＤＲＤ２のレベルはコントロールより有意に低かったが、ＮＤＥのレベルはコントロールよりＰＤにおいて有意に高かった。したがって、当該比（ＤＲＤ２／ＮＤＥ）は、ＰＤ試料およびコントロール試料間でより優有意な差を示した。さらに、ＤＲＤ２における減少はＰＤの軽症例（ｍＲＳスコア１＋２）で示され、ＰＤ患者の早期スクリーニング並びにＰＤ進行のモニタリングのマーカーとして使用されてもよいことを示す。ＰＤおよびコントロール試料間のＤＲＤ２レベルについてのＲＯＣ曲線および曲線下面積（ＡＵＣ）は図３１に示される。
【０２０５】
これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていない小胞上のバイオマーカーを同定し、検出し、かつ測定するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、対象における神経障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が疾病または障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。
【０２０６】
実施例１７：ＤＡＴ陽性細胞外小胞の検出
ＤＡＴ陽性細胞外小胞は以下のようにＥＬＩＳＡプレートで捕捉され、解析した。３つの異なるヒトコントロールドナーから得られた血漿試料をＰＢＳで希釈した。試料を１対の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）ウェルにアプライし、１つのウェルを抗ＤＡＴマウスモノクローナル抗体と固定化し（図３２、●▲■）、かつ他方のウェルをコントロールマウスＩｇＧと固定化した（図３２、○△□）。ＤＡＴ＋細胞外小胞（ＥＶ）をＥＬＩＳＡウェルで捕捉した後、未結合の材料を広範な洗浄により除去し、次いで、ラベル化抗ＣＤ８１で調べてＤＡＴ＋−ＣＤ８１＋二重陽性シグナル（＝ＤＡＴ＋  ＥＶ）を定量し（図３２Ａ）、並びに単量体（図３２Ｂ）、オリゴマーα−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）（図３２Ｃ）、およびチロシンヒドロキシラーゼ（ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）（ＴＨ）（図３２Ｄ）に対する抗体でＤＡＴ＋  ＥＶの表面のＳＮＣＡおよびＴＨを定量した。
【０２０７】
図３２に示されるように、ＤＡＴ＋  ＥＬＩＳＡウェルの血漿試料のすべては、用量依存的なシグナル変化を示し、他方でコントロールＩｇＧ  ＥＬＩＳＡウェルのものはＤＡＴ＋  ＥＬＩＳＡウェルのものよりも非常に低く、１／１０−１／１００低かった。より重要なことには、３つの血漿試料の傾きは非常に類似しており、１つの特定の血漿の希釈曲線を普遍的な定量標準として使用できることを示す。
【０２０８】
これらの結果は、本発明の方法および組成物が、ＤＡＴ陽性細胞外小胞を捕捉し、検出するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていない小胞上のバイオマーカーを同定し、検出し、かつ測定するのに有用であることをさらに示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が対象における神経疾患または障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。
【０２０９】
実施例１８：ＳＮＡＰ２５−陽性、ＥＡＡＴ１−陽性、およびＯＭＧ陽性細胞外小胞の検出
ＳＮＡＰ２５−陽性、ＥＡＡＴ１−陽性、およびＯＭＧ陽性細胞外小胞を以下のようにＥＬＩＳＡプレートで捕捉し、解析した。コントロールドナーから得られた血漿試料をＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、およびＯＭＧに対する抗体が以前に固定化されたＥＬＩＳＡプレートにアプライした。捕捉された細胞外小胞（ＥＶ）を広範に洗浄した後、ＥＶをｐＨ１２．５溶出緩衝液で５分間インキュベーションすることにより溶出し、すぐに中和した。これらの試料をナノ粒子トラッキング解析（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ）にアプライした。
【０２１０】
図３３に示されるように、ＥＶをサイズ範囲が１００−４００ｎｍのすべての試料において検出した。さらに、ＳＮＡＰ２５のＥＶサイズはＥＡＡＴ１およびＯＭＧのものよりも小さかった。
【０２１１】
これらの結果は、本発明の方法および組成物がＳＮＡＰ２５−陽性、ＥＡＡＴ１−陽性、およびＯＭＧ陽性細胞外小胞を捕捉し、検出するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていない小胞上のバイオマーカーを同定し、検出し、かつ測定するのに有用であることをさらに示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が対象における神経疾患または障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。
【０２１２】
実施例１９：エキソソームの表面のバイオマーカーの検出
複数の膜バイオマーカーをエキソソームの表面で以下のように検出した。様々な抗体をコーティング緩衝液において懸濁し、ＥＬＩＳＡプレートにアプライした。１時間のインキュベーション後、各ウェルを１回洗浄し、その後、ブロッキング溶液（ブロッカーカゼイン中０．５％ＢＳＡ）を添加し、インキュベーションをさらに１時間続けた。各ウェルを２回洗浄した後、血漿または緩衝液コントロール（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ）を追加したその後、冷蔵庫で一晩インキュベーションを続けた。各ウェルを２回洗浄した後、ビオチン化抗ＥＡＡＴ１、抗ＳＮＡＰ２５、抗ＯＭＧ、または抗ＣＤ１１ｂを加えて１時間インキュベーションを続けた。各ウェルを２回洗浄した後、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼを加え、さらに３０分インキュベーションを続けた。各ウェルを３回洗浄した後、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ基質を添加し、化学発光シグナルをルミノメーターで測定した。
【０２１３】
図３５に示されるように、複数のバイオマーカーをＳＮＡＰ２５＋、ＥＡＡＴ１＋、ＯＭＧ＋、およびＣＤ１１ｂ＋エキソソームの表面で検出した。
【０２１４】
図３４に示されるように、すべての３つのコントロール血漿は、サイズが５０−４００ｎｍの範囲の粒子を示した。これらの結果は、上記の実施例１７で記載された方法により捕捉された粒子が細胞外小胞であることを実証した。
【０２１５】
これらの結果は、本発明の方法がエキソソームの表面のバイオマーカーを検出するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が、溶解または透過処理されていないエキソソームのバイオマーカーを同定し、検出し、かつ測定するのに有用であることを示した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が対象における神経疾患を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。これらの結果は、本発明の方法および組成物が疾病または障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。
【０２１６】
本明細書に示され記載されたものに加え、本発明の種々の改変が、前述の説明から当業者に明らかになるであろう。このような改変は、添付の特許請求の範囲内に入ることが意図される。
【０２１７】
本明細書中で引用されるすべての参考文献は、その全体が出典明示により本明細書に組み込まれる。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図６−５】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１１−４】
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【図１１−５】
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【図１１−６】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１２−４】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１４−３】
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【図１４−４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【国際調査報告】
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