(57)【要約】  本発明は、アミロイド沈着疾患を治療するためのキメラマウス−ヒト抗体、該抗体を含む医薬組成物、該抗体を産生するための方法および材料、ならびに該抗体および医薬組成物を使用してアミロイド沈着疾患を治療する方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号４７のＶＫ領域および配列番号４８のＶＨ領域を含む、キメラマウス−ヒト抗体。
【請求項２】
配列番号３６のＶＫ領域および配列番号３５のＶＨ領域を含むマウス抗体よりも高い親和性でアミロイド原線維のβプリーツシート構造によって発現されるエピトープに結合する、請求項１に記載のキメラマウス−ヒト抗体。
【請求項３】
請求項１に記載の抗体と、薬学的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。
【請求項４】
アミロイド沈着疾患の治療を必要とするヒト患者の前記アミロイド沈着疾患を治療する方法であって、前記アミロイド沈着疾患を治療するのに有効な量の請求項１に記載の抗体と薬学的に許容される担体とを、前記患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項５】
前記アミロイド沈着疾患が原発性アミロイドーシスである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ベクター構築物１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１−Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００の哺乳動物細胞へのコトランスフェクション、またはスーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００−１１−１Ｆ４の哺乳動物細胞へのトランスフェクションを含む、キメラ抗体を産生する方法。
【請求項７】
前記ベクター構築物１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１−Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００のコトランスフェクションまたはスーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００−１１−１Ｆ４のトランスフェクションが、ＣＯＳ細胞で起こる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ベクター構築物１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１−Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００のコトランスフェクションを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記スーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００−１１−１Ｆ４のトランスフェクションを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベクター構築物１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１−Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００のコトランスフェクションを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記スーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００−１１−１Ｆ４のトランスフェクションを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００、１１−１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００およびｐＧ１ＫＤ２００−１１−１Ｆ４からなる群から選択される、ベクター構築物。
【請求項１３】
１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００である、請求項１２に記載のベクター構築物。
【請求項１４】
１１−１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００である、請求項１２に記載のベクター構築物。
【請求項１５】
ｐＧ１ＫＤ２００−１１−１Ｆ４である、請求項１２に記載のベクター構築物。
【請求項１６】
アミロイド沈着物を有する疑いがある患者の前記アミロイド沈着物の存在を検出する方法であって、検出可能な標識が付着した請求項１に記載の抗体を前記患者に投与するステップを含み、投与される前記抗体の量は、前記アミロイド沈着物が存在する場合に前記アミロイド沈着物の検出に十分である、方法。
【請求項１７】
検出可能な標識が１２４Ｉである、
請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項６に記載の方法によって産生された、キメラマウス−ヒト抗体。
【請求項１９】
請求項８に記載の方法によって産生された、キメラマウス−ヒト抗体。
【請求項２０】
請求項９に記載の方法によって産生された、キメラマウス−ヒト抗体。
【請求項２１】
配列番号４７および配列番号４８から選択される、ポリペプチド。
【請求項２２】
配列番号４２および配列番号４５から選択される、ポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［ＥＦＳ−ＷＥＢを介して提出された配列表の参照］
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出された配列表を含み、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。「８４４１−０００４−１＿ＳＴ２５」と題するこの配列表のＡＳＣＩＩファイルは、２０１８年６月４日に作成され、その大きさは１５．６ｋｂである。
【０００２】
［優先権の主張］
本出願は、２０１７年６月２９日に出願された米国特許仮出願第６２／５２６，８３５号の優先権を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
［政府の権利］
本発明は、サイエンス・アプリケーションズ・インターナショナル−フレデリックによって授与されたＣｏｎｔａｃｔ  ２０ＸＳ０９４Ａの下、米国連邦政府の支援を受けてなされた。したがって、米国連邦政府は、本明細書および特許請求の範囲に開示される本発明において、一定の権利を有する。
【０００４】
本発明は、アミロイド沈着疾患、特に原発性（ＡＬ）アミロイドーシスを治療するのに有用なキメラマウス−ヒト抗体、該抗体を含む医薬組成物、該抗体を調製するための方法および材料、ならびに該抗体および医薬組成物を使用してアミロイド沈着疾患を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
天然抗体は、通常、２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つのジスルフィド結合によって重鎖に連結している。重鎖間の追加のジスルフィド結合の数は、様々な抗体アイソタイプによって異なる。最も単純なアイソタイプはＩｇＧであり、これは２つの軽鎖および２つの重鎖のみを含み、２つの重鎖が２つのジスルフィド結合によって連結されている。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有し、いくつかの隣接定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に定常ドメインを有する。抗体の軽鎖および重鎖の各可変ドメインは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントを含む。軽鎖の各ＣＤＲは、隣接重鎖の対応するＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位を形成する。軽鎖には、その定常領域に応じて、κとλの２つの主要なタイプがある。κとλの両方の軽鎖は、様々な重鎖タイプのいずれかと結合し得る。
【０００６】
原発性アミロイドーシスとも呼ばれるアミロイド軽鎖アミロイドーシス（ＡＬアミロイドーシス）は、米国で最も一般的な形の全身性アミロイドーシスである。「アミロイドーシス」という用語は、共通の特徴、すなわち臓器および組織における病的不溶性原線維タンパク質の細胞外沈着を共有する疾患のクラスターを指す（Ｒｏｄｎｅｙら、ＮＥＪＭ，２５：８９８）。アミロイドーシスは、人の抗体産生細胞の機能不全によって引き起こされ、異常なタンパク質線維の産生を引き起こし、これが凝集して臓器および組織に不溶性アミロイド沈着物を形成する。アミロイドーシスの種類は、原線維沈着物を形成する前駆体タンパク質の性質によって決定される。原発性アミロイドーシス（ＡＬ）では、原線維が免疫グロブリン軽鎖の断片を含み、続発性アミロイドーシスでは、原線維がアミロイドＡタンパク質を含む。アミロイドーシスの現代の分類は、原線維沈着物を形成する前駆体血漿タンパク質の性質に基づいている。
【０００７】
前駆体血漿タンパク質は多様であり、無関係である。それにもかかわらず、全ての前駆体沈着物が、原線維沈着物の典型的な染色特性を担う共通の典型的なβプリーツシート構造を共有するアミロイド沈着物を生成する。アミロイドーシスの発症の最終段階は、患者の臓器へのアミロイド原線維の沈着である。アミロイドーシスの死亡率は高く、現在の５年生存率は約２８％である。
【０００８】
これまで、ＡＬの治療は、従来のまたは高用量の細胞傷害性化学療法を通して機能不全細胞を攻撃することにより、アミロイド形成前駆体軽鎖の合成を減らすことに向けられてきた。しかしながらこの治療法には２つの欠点がある。第一に、原線維沈着物は通常、かなりの沈着が起こるまで無症候性である。したがって、既にかなりの沈着物が生じてしまう前に治療が行われる可能性が低い。第二に、この治療はせいぜい前駆体異常タンパク質の産生を停止するのに最も有効なだけであり、既存の沈着物を除去するのに有効ではなく、ＡＬ患者の予後は病的沈着物の持続（または進行）のために非常に悪いままである（Ｓｏｌｏｍｏｎら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２：２６９）。
【０００９】
近年の動物研究では、マウス１１−１Ｆ４抗体と、ＡＬ原線維に存在するβプリーツシート構造に共通のエピトープに対する他のマウス抗ヒト軽鎖特異的抗体とを投与すると、ヒトＡＬκおよびＡＬλアミロイド沈着物が完全に分解されることが示されている。これらのマウス抗体のいくつかは、全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８１０５５９４号明細書に記載されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
マウス抗体は一般に、受容種がマウス抗体を抗原性として認識し、それに対する抗体を産生するために、他の動物種（ヒトなど）への投与には不適切である。ある種に由来する抗体が別の種に注入された場合の抗原性は、通常、定常ドメインの一部によって引き起こされる。このような抗原性応答は、マウス抗体の所望の治療効果を妨害または防止するだろう。ヒトでは、この抗原性応答がヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）と呼ばれる。米国特許第８１０５５９４号明細書に記載されている抗体は、ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）応答を介して、ヒトで高度に免疫原性である可能性がある。ＨＡＭＡ応答は通常、ヒトのレシピエントからのマウス抗体の急速なクリアランスをもたらすので、ＨＡＭＡはマウス抗体が有し得る潜在的なヒト治療上の利益を厳しく制限するだろう。したがって、これらのマウス抗体は、患者のアミロイド原線維の沈着を停止または逆転させるための患者への投与に適さず、ヒトでの免疫原性が低いアミロイド沈着疾患のための抗体治療が必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一実施形態は、アミロイド沈着疾患、特に原発性（ＡＬ）アミロイドーシスの治療に有用なキメラマウス−ヒト抗体である。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、キメラ抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物である。
【００１３】
本発明の別の実施形態は、ポリヌクレオチド配列およびベクター構築物を含む、上記抗体を産生するための方法および材料である。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、原発性（ＡＬ）アミロイドーシスなどのアミロイド沈着疾患の症状の治療を必要とするヒトの該疾患を治療または改善する方法であって、アミロイド沈着疾患の症状の治療または改善に有効な上記抗体の少なくとも１つと薬学的に許容される担体とを有効な量だけ、上記治療または改善を必要とするヒト患者に投与するステップを含む。
【００１５】
本発明の別の実施形態は、本発明の標識抗体を投与し、患者における標識の存在を検出することによって、アミロイド沈着疾患を有する疑いがある患者のアミロイド沈着疾患を検出する方法である。標識は、１２４Ｉなどの放射標識であってもよいが、その他の種類の標識が当業者によって容易に想起され得る。本実施形態には、標識抗体自体が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】ハイブリドーマ細胞株からマウスＶＨおよびＶＫ遺伝子をクローニングするために使用される戦略を概説する図である。
【図２】マウス１１−１Ｆ４抗体ＶＨ領域遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号３９および配列番号３５）のリストである。
【図３】マウス１１−１Ｆ４抗体ＶＫ領域遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号４０および配列番号３６）のリストである。
【図４】免疫グロブリンκ軽鎖発現ベクターｐＫＮ１００のマップである。これはｐＳＶ２ベクター断片からなり、ＳＶ４０初期プロモーターおよび不完全ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０複製起点およびＣｏ１Ｅ１複製起点を有する。これはまた、アンピシリン耐性遺伝子およびｎｅｏ遺伝子を有する。不完全ＳＶ４０後期プロモーターがｎｅｏ遺伝子を駆動する。これはまた、ＨＣＭＶｉプロモーター、免疫グロブリン可変領域遺伝子を挿入するためのマルチクローニングサイト（ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含む）、およびκ軽鎖発現カセットと同じ配向にあるｓｐａＣ２終結シグナル配列（「Ａｒｎｉｅ」）によって終結するヒトκ定常領域遺伝子のｃＤＮＡを有する。
【図５】免疫グロブリンγ１重鎖発現ベクターｐＧ１Ｄ２００のマップである。これはｐＳＶ２ｄｈｆｒベクター断片からなり、ＳＶ４０初期プロモーターおよび不完全ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０複製起点およびＣｏ１Ｅ１複製起点を有する。これはまた、アンピシリン耐性遺伝子およびｄｈｆｒ遺伝子を有する。不完全ＳＶ４０後期プロモーターがｄｈｆｒ遺伝子を駆動する。結果として、発現が低い。これにより、比較的低レベルのメトトレキサートを使用して、多重遺伝子／高発現レベルのクローンを選択することができる。これはまた、ＨＣＭＶｉプロモーター断片、マルチクローニングサイト、ヒトγ１定常領域遺伝子（イントロン（−））のｃＤＮＡ、続いてｓｐａＣ２終結シグナル配列（「Ａｒｎｉｅ」）を有する。
【図６】改変マウス１１−１Ｆ４抗体ＶＫ領域遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号４２および配列番号４７）、ならびにＶＫ遺伝子を改変するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーらの配列（それぞれ配列番号４１および配列番号４３）、ならびにリーダーを含むＤＮＡ配列（配列番号３７）のリストである。
【図７】改変マウス１１−１Ｆ４抗体ＶＨ領域遺伝子のＤＮＡおよびアミノ酸配列（それぞれ配列番号４５および配列番号４８）、ならびにＶＨ遺伝子を改変するために使用されるオリゴヌクレオチドプライマーらの配列（それぞれ配列番号４４および配列番号４６）、ならびにリーダーを含むＤＮＡ配列（配列番号３８）のリストである。
【図８】アミロイド原線維結合ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。キメラ１１−１Ｆ４抗体を含有するｃｏｓ細胞上清を、精製マウス１１−１Ｆ４抗体と共に同じＥＬＩＳＡプレートで別々に試験した。吸光度をＯＤ４０５で読み取った。
【００１７】
新ｓｖ＝ｐＧ１ＫＤ２００−１１−１Ｆ４。
【００１８】
新コトランスフェクション＝１１−１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００＋１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明によれば、アミロイド沈着疾患の症状を治療または改善するための該疾患を患っているヒトへの投与に有用なキメラマウス−ヒト抗体が提供される。本発明のキメラ抗体は、アミロイド沈着物に結合し、患者の免疫系を活性化して、結合した物質を除去しながら、ＨＡＭＡ反応をほとんどまたは全く生じさせない。また、本発明は、該キメラ抗体の少なくとも１つと、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物、該抗体を産生するための方法および材料、ならびにアミロイドーシスを患っている患者の症状を治療または改善する方法を提供する。該治療または改善方法において、患者の臓器からアミロイド沈着物を少なくとも一部除去するのに有効な量のキメラ抗体を患者に投与して、アミロイドーシスの症状を治療または改善する。
【００２０】
本発明では、少なくとも１つのキメラ抗体を、アミロイドーシスを患っているヒト患者に投与して、患者の臓器に沈着したアミロイド原線維の少なくとも一部の分解および除去を促進する。治療上有効な量の抗体を、薬学的に許容される担体と共に投与する。適切な薬学的に許容される担体は、当該技術分野で周知である。医学分野の当業者によく理解されているように、典型的な投与経路は非経口的（例えば静脈内）である。当然のことながら、他の投与経路も可能である。投与は単回投与であっても複数回投与であってもよい。投与される抗体の量および投与頻度は、特定の患者のために医師によって最適化されてもよい。
【００２１】
患者に投与される抗体の治療上有効な用量（単回投与で投与されるか複数回投与で投与されるかにかかわらず）は、患者の沈着アミロイド原線維の量を減らすのに十分である必要がある。このような治療上有効量は、患者の症候性変化を評価することによって、または沈着アミロイド原線維の量の変化を評価することによって（例えば、１２４Ｉタグ付き抗体を使用した沈着アミロイド沈着物の放射免疫検出によって）決定され得る。したがって、本発明の標識抗体を使用して、疾患を有する疑いがある患者のアミロイド沈着疾患の存在を検出することができ、また、治療の有効性を判定することができる。
【００２２】
本発明のキメラ抗体を産生するために、米国特許第８１０５５９４号明細書に記載されているマウス１１−１Ｆ４モノクローナル抗体重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子をＰＣＲ改変して、哺乳動物細胞におけるキメラ１１−１Ｆ４抗体の発現を促進した。改変された可変領域遺伝子の詳細な配列分析を実施した。改変された可変領域遺伝子を適切な哺乳動物発現ベクターにクローニングし、構築物１１−１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００および１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００を作製した。単一スーパーベクター構築物、ｐＧ１ＫＤ２００−１１−１Ｆ４を、ＥｃｏＲＩ制限酵素消化およびライゲーションによって、１１−１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００および１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００構築物から作製した。最後に、キメラ１１−１Ｆ４抗体を、コトランスフェクションと単一スーパーベクタートランスフェクションの両方によって、ＣＯＳ細胞で一過的に発現させた。便宜上、コトランスフェクションまたはトランスフェクションのためにＣＯＳ細胞を選択したが、当業者であれば他の哺乳動物細胞株を使用できることを認識するだろう。アミロイド原線維に対するキメラ１１−１Ｆ４抗体の結合能力の特性決定を、直接結合ＥＬＩＳＡによって決定した。予想外かつ有益なことに、キメラ１１−１Ｆ４抗体は、マウス１１−１Ｆ４抗体よりも高い親和性でアミロイド原線維に結合した。
【００２３】
本発明の抗体は、配列番号４７のＶＫ領域および配列番号４８のＶＨ領域を含むキメラマウス−ヒトモノクローナル抗体を含む。この抗体は、アミロイド原線維のβプリーツシート構造によって発現されるエピトープに結合する。さらに、驚くべきことに、この抗体は、配列番号３６のＶＫ領域および配列番号３５のＶＨ領域を含む、それが由来する１１−１Ｆ４マウス抗体よりも高い親和性でこのエピトープに結合する。本発明は、アミロイド沈着疾患の治療を必要とするヒト患者の該疾患を治療する方法を含む。該方法は、薬学的に許容される担体中の上記抗体を患者に投与するステップを含む。投与される抗体の量は、患者の組織に沈着したアミロイド原線維の量を減らすのに有効である必要がある。抗体組成物は、任意の従来の投与経路によって投与されてもよいが、非経口投与（静脈内など）が好ましい。薬学的に許容される担体は当該技術分野で周知であり、適切なものが医学分野の当業者によって選択され得る。好ましくは、アミロイド沈着疾患は、原発性（ＡＬ）アミロイドーシスである。
【００２４】
また、本発明は、本抗体を作製するための方法および材料を含む。本抗体を作製するのに有用な材料には、それぞれ図５および図６に示される１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１−Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００からなる群から選択されるベクター構築物、ならびに上記２つのベクター構築物から作製された超構築物（ｓｕｐｅｒｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）ｐＧ．１ＫＤ２００１１−１Ｆ４が含まれる。他の有用な材料には、改変マウス１１−１Ｆ４抗体ＶＫ領域遺伝子（配列番号４２）、改変１１−１Ｆ４抗体ＶＨ領域遺伝子（配列番号４５）、ならびにそれぞれのプライマーである配列番号４１、４３、４４および４６が含まれる。本抗体は、ベクター構築物１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１−Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００または超構築物ｐＧ．１ＫＤ２００１１−１Ｆ４のＣＯＳ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞などの適切な哺乳動物宿主細胞へのコトランスフェクションによって作製されてもよい。
【００２５】
［略語］
ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、分（ｍｉｎ）、秒（ｓｅｃ）、トリス−ホウ酸緩衝液（ＴＢＥ）。
【００２６】
アミノ酸は、ＩＵＰＡＣ略語によって次の通り表される：アラニン（Ａｌａ  Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）。ヌクレオチドについても、同様に次の通り表される：アデニン（ａ）、シトシン（ｃ）、グアニン（ｇ）、チミン（ｔ）、ウラシル（ｕ）、アデニンまたはグアニン（ｒ）、シトシンまたはチミン（ｙ）、グアニンまたはシトシン（ｓ）、アデニンまたはチミン（ｗ）、グアニンまたはチミン（ｋ）、アデニンまたはシトシン（ｍ）、シトシンまたはグアニンまたはチミン（ｂ）、アデニンまたはグアニンまたはチミン（ｄ）、アデニンまたはシトシンまたはチミン（ｈ）、アデニンまたはシトシンまたはグアニン（ｖ）、および任意の塩基（ｎ）。
【実施例１】
【００２７】
［マウス１１−１Ｆ４抗体のＰＣＲクローニングおよびＤＮＡ配列決定］
マウス１１−１Ｆ４モノクローナル抗体重鎖および軽鎖可変領域遺伝子をＰＣＲクローニングし、単離された全ての可変領域遺伝子（疑および機能性）の詳細な配列分析を実施した。マウス１１−１Ｆ４重鎖および軽鎖可変領域遺伝子の詳細なＤＮＡおよびアミノ酸配列を得た。
【００２８】
［材料］
培地成分および他の全ての組織培養材料は、ライフテクノロジーズ社（英国）から入手した。ＲＮＡ溶液キットはストラタジーン社（米国）から入手し、第１鎖ｃＤＮＡ合成キットはファルマシア社（英国）から購入した。ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを含むＲＣＲ反応のための全ての構成成分および機器は、パーキンエルマー社（米国）から購入した。ＴＯＰＯ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットは、インビトロジェン社（米国）から入手した。アガロース（ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（商標））は、ライフテクノロジーズ社（英国）から入手した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）Ｂｉｇ  Ｄｙｅ（商標）ターミネーターサイクルシーケンシング準備反応キットのプレミックスサイクルシーケンシングキットおよびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０シーケンシングマシンは、共にＰＥアプライド・バイオシステムズ社（米国）から購入した。他の全ての分子生物学的製品は、ニュー・イングランド・バイオラボ社（米国）およびプロメガ社（米国）から入手した。
【００２９】
［方法］
マウスモノクローナル抗体１１−１Ｆ４を産生するハイブリドーマ細胞株からマウスＶＨおよびＶＫ遺伝子をＰＣＲクローニングするために使用される戦略を図１に概説する。
【００３０】
α−ヒト軽鎖モノクローナル抗体１１−１Ｆ４を産生するＳＰ２／０ハイブリドーマ細胞株の２つのクローン（Ｂ２Ｃ４およびＢ２Ｄ６）は、親切にもアラン・ソロモン医学博士（米国テネシー州ノックスビル市のテネシー大学医療科学センター）によって提供された。ハイブリドーマ細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ寄託ＰＴＡ−１０５）から入手可能である。細胞株を、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびＬ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ培地を使用して培養した。１０８個の細胞の総生細胞数に達するまで細胞を培養した。
【００３１】
細胞を各クローンから別々に次の通り収穫した。マウスハイブリドーマ細胞株を、適切な培養培地で懸濁で、約１０８個の細胞の総生細胞数を提供するのに十分な量増殖させた。培養上清を収穫し、ハイブリドーマ細胞をベンチトップ遠心分離機（２５０ｇ、５分）でペレット化した。細胞を２０ｍｌのＰＢＳに穏やかに再懸濁し、生細胞計数のために１００μｌのアリコートを採取した。アリコートの細胞をもう一度ペレット化し、２００μｌのＰＢＳおよび２００μｌのトリパンブルーを１００μｌの細胞に添加し、穏やかに混合した。１０μｌのこの混合物を使い捨て細胞計数スライドにピペットで入れ、９つの小さな正方形中の白血球の数を顕微鏡下で数えた。青色細胞（すなわち、死細胞）は数えなかった。計数工程を繰り返し、結果を平均し、平均結果に９×１０５を掛けて、２０ｍｌのＰＢＳ中の細胞の生細胞数を得た。十分な細胞を収穫して、これらをＲＮＡ単離のために１０ｍｌの溶液Ｄに再懸濁した（ストラタジーン社のＲＮＡ単離キットを使用、下記参照）。
【００３２】
次いで、製造業者の指示書に従って、ストラタジーン社のＲＮＡ単離キットを使用して、各クローンの細胞から個別に総ＲＮＡを単離した。１ｍｌの２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）を試料に添加し、管を繰り返し反転させて、管の内容物を完全に混合した。管に１０．０ｍｌのフェノール（ｐＨ５．３〜５．７）を添加し、反転させて内容物を再び完全に混合した。混合物に２．０ｍｌのクロロホルム−イソアミルアルコール混合物を添加し、管に蓋をして１０秒間激しく振盪し、管を氷中で１５分間インキュベートした。試料を、氷上で予冷した５０ｍｌの厚肉丸底遠心管に移し、管を１００００×ｇの遠心分離機で４℃で２０分間回転させた。遠心分離後に、管に２つの相が見えた。上部水相はＲＮＡを含有し、下部フェノール相および中間相はＤＮＡおよびタンパク質を含有していた。ＲＮＡ含有上部水相を新しい遠心管に移し、下部フェノール相を捨てた。等量のイソプロパノールを水相に添加し、内容物を反転させて混合し、次いで、管を−２０℃で１時間インキュベートしてＲＮＡを沈殿させた。管を１００００×ｇの遠心分離機で４℃で２０分間回転させた。遠心分離後に、ＲＮＡを含有する管の底のペレットを取り出し、上清を捨てた。ペレットを３．０ｍｌの溶液Ｄに溶解し、３．０ｍｌのイソプロパノールを管に添加し、内容物をよく混合した。管を−２０℃で１時間インキュベートした後に、１００００×ｇの遠心分離機で４℃で１０分間再度回転させ、上清を管から除去し、捨てた。（注：この時点まで、ＲＮＡはイソチオシアン酸グアニジンの存在によってリボヌクレアーゼから保護されていたが、ここでもはや保護されなくなった。）ペレットを７５％（ｖ／ｖ）エタノール（ＤＥＰＣ処理水（２５％））で洗浄し、ペレットを真空下で２〜３分間乾燥させた。ＲＮＡペレットを０．５〜２ｍｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。
【００３３】
アマシャム・ファルマシア・バイオテク社の第１鎖ｃＤＮＡ合成キットに付属のＮｏｔ  Ｉ−ｄ（Ｔ）１８プライマーを使用して、製造業者の指示書に従って、１１−１Ｆ４ハイブリドーマｍＲＮＡの１本鎖ＤＮＡコピーを産生した。後述するように、単離された２つのＲＮＡ試料の各々に１つの反応を実施した。使用した成分は、バルク第１鎖ｃＤＮＡ反応ミックス、クローニングＦＰＬＣｐｕｒｅ（商標）マウス逆転写酵素、ＲＮＡｇｕａｒｄ（商標）、ＢＳＡ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ、２００ｍＭ  ＤＩＴ水溶液、Ｎｏｔ  Ｉ−ｄ（Ｔ）１８プライマー：５’−ｄ［ＡＡＣＴＧＧＡＡＧＡＡＴＴＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＧＡＡ１８］−３’、およびＤＥＰＣ処理水であった。
【００３４】
２０μｌのＤＥＰＣ水中の全ＲＮＡのうちの約５μｇを６５℃で１０分間加熱し、次いで、氷上で冷却した。バルク第１鎖ｃＤＮＡ反応ミックスを穏やかにピペットでピペッティングして均一な懸濁液を得て、０．５ｍｌのマイクロ遠心管に反応を次の通り設定した：総量３３μｌの２０μｌの変性ＲＮＡ溶液、１１μｌのバルク第１鎖ｃＤＮＡ反応ミックス、１μｌのＮｏｔ  Ｉ−ｄ（Ｔ）１８プライマーおよび１μｌのＤＴＴ溶液。反応物質をピペッティングして穏やかに混合し、３７℃で１時間インキュベートした。
【００３５】
次いで、マウス重鎖およびκ軽鎖可変領域遺伝子（それぞれＶＨ遺伝子およびＶＫ遺伝子）を、ＪｏｎｅｓおよびＢｅｎｄｉｇによって記載された方法（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，９：８８）を使用して、ｓｓＤＮＡ鋳型からＰＣＲ増幅した。
【００３６】
適切な定常領域プライマー（ＶＨについてＭＨＣ１−ＭＨＣ３およびＶＫについてＭＫＣの等モル混合物）を使用して、変性リーダー配列特異的プライマー（ＶＨについてＭＨＶ１−ＭＨＶ１２およびＶＫについてＭＫＶ１−ＭＫＶ１１）の各々に対して別々のＰＣＲ反応を準備した。表１および表２は、それぞれＶＨおよびＶＫ領域遺伝子を増幅するために使用されるプライマーを詳述している。合計で、１２の重鎖反応および１１のκ軽鎖反応を実施した。後述するように全ての場合において、ＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを使用して鋳型ｃＤＮＡを増幅した。
【００３７】
完成したｃＤＮＡの第１鎖合成反応物を９０℃で５分間加熱して、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ二本鎖を変性させ且つ逆転写酵素を不活性化し、氷上で冷却した。１１本のＧｅｎｅＡｍｐ（商標）ＰＣＲ反応管をＭＫＶ１−１１で標識した。各管について、各反応混合物が６９．３μｌの滅菌水、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液ＩＩ、６μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、それぞれ２μｌのｄＮＴＰの１０ｍＭストック溶液、２．５μｌの１０ｍＭ  ＭＫＣプライマー、２．５μｌの１０ｍＭ  ＭＫＶプライマーのうちの１つ、および１μｌのＲＮＡ−ｃＤＮＡ鋳型ミックスを含有する１００μｌの反応混合物を調製した。次いで、管の各々に０．７μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼを添加し、完成した反応ミックスに５０μｌの鉱油を重ねた。
【００３８】
同様の一連の反応混合物を上記のように調製して、マウス重鎖可変領域遺伝子をＰＣＲクローニングした。ただし、今回は１２本の反応管を標識し、１２のＭＨＶプライマーのうちの１つと適切なＭＨＣプライマーを各々に添加した。すなわち、例えば、マウスγ１重鎖の可変ドメイン遺伝子をＰＣＲ増幅するために、ＭＨＣ  Ｇ１プライマーを使用した。
【００３９】
反応管をＤＮＡサーマルサイクラーに装填し、（９４℃で１．５分間の初期融解後）９４℃で１分間、５０℃で１分間および７２℃で１分間、２５サイクルにわたって処理した。最後のサイクルに続いて、７２℃で１０分間の最終伸長ステップを行った後に、４℃に冷却した。２．５分の延長したランプ時間を使用したアニーリング（５０℃）ステップと伸長（７２℃）ステップとの間を除いて、サイクルの各ステップの間で３０秒間のランプ時間を使用した。各ＰＣＲ反応からの１０μｌのアリコートを、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１％（ｗ／ｖ）アガロース／１×ＴＢＥ緩衝液ゲルで泳動して、どのリーダープライマーがＰＣＲ産物を産生するかを決定した。陽性ＰＣＲクローンのサイズは約４２０〜５００ｂｐであった。
【００４０】
上記ＰＣＲ増幅プロセスをさらに２回繰り返し、完全長可変ドメイン遺伝子を増幅すると思われるＰＣＲ反応を選択した。各潜在的ＰＣＲ産物の６μｌのアリコートを、製造業者の指示書に記載されるように、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットによって提供されるｐＣＲ（商標）ＩＩベクターに直接クローニングした。形質転換大腸菌細胞の１０．０％（ｖ／ｖ）、１．０％（ｖ／ｖ）および０．１％（ｖ／ｖ）のアリコートを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有する個々の直径９０ｍｍのＬＢ寒天プレートにピペットで移し、２５μｌのＸ−Ｇａｌストック溶液および４０μｌのＩＰＴＧストック溶液を重ね、３７℃で一晩インキュベートした。陽性コロニーをＰＣＲスクリーニングによって同定した。
【００４１】
【表１】
2020526191.tif 000003
【００４２】
【表２】
2020526191.tif 000004
【００４３】
各ＰＣＲ反応からの５μｌのアリコートを１％アガロース／ＴＢＥ（ｐＨ８．８）ゲルに泳動して、正しいサイズ（約４５０ｂｐ）のＰＣＲ産物を産生したものを決定した。このように同定されたこれらの推定陽性ＰＣＲ産物を、ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットによって提供されるｐＣＲ２．１ベクターに直接クローニングし、製造業者のプロトコルに記載されるようにＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換した。正しいサイズのインサートを有するプラスミドを含有するコロニーを、ＧｕｓｓｏｗおよびＣｌａｃｋｓｏｎの方法（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１７：４０００）に従って、１２１２および１２３３オリゴヌクレオチドプライマー（表３）を使用してコロニーをＰＣＲスクリーニングすることによって同定した。このように同定されたこれらの推定陽性クローンを、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターを使用し、二本鎖プラスミドＤＮＡ配列決定した。Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株クローンからのＶＨおよびＶＫ遺伝子のそれぞれ３つの陽性クローンを配列決定し、Ｂ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株クローンからのＶＫ遺伝子の４つの陽性クローンおよびＶＨ遺伝子の６つも同様に配列決定した。
【００４４】
【表３】
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【００４５】
マウス１１−１Ｆ４重鎖可変領域遺伝子を増幅するために各ハイブリドーマクローン（Ｂ２Ｃ４およびＢＣＤ６）に対して実施した１２のＰＣＲ反応の結果を表４（ａ）に示す。
【００４６】
変性リーダー配列プライマーＭＨＶ７は、ＭＨＣＧＩ−３定常領域プライマーのミックス（表１）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株とＢ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株の両方に由来する鋳型ｃＤＮＡから約６００ｂｐのＰＣＲ産物を産生した。このバンドは、平均ＶＨ遺伝子についての予想サイズ（４５０ｂｐ）よりも大きかったので、さらには調査しなかった。逆に、変性リーダー配列プライマーＭＨＶ６は、ＭＨＣＧＩ−３定常領域プライマーのミックス（表１）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株とＢ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株の両方に由来する鋳型ｃＤＮＡからＶＨ遺伝子について予想サイズ（４５０ｂｐ）のＰＣＲ産物を産生した。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
Ｂ２Ｃ４由来ＰＣＲ産物からの３つのクローンおよびＢ２Ｄ６由来ＰＣＲ産物からの５つのクローンの配列分析によって、単一重鎖可変領域配列が明らかになった（図２）。
【００４９】
使用したクローニング戦略（この領域に隣接するプライマー、すなわちリーダー配列および定常領域配列特異的プライマーを使用することによる可変領域遺伝子全体の増幅）によって、完全なＦＲ１配列を同定することができた。配列決定された８つのクローンは全て、この領域で同一の配列を有していた（図２）。
【００５０】
マウス１１−１Ｆ４κ軽鎖可変領域遺伝子を増幅するために各ハイブリドーマクローン（Ｂ２Ｃ４およびＢＣＤ６）に対して実施した１１のＰＣＲ反応の結果を表４（ｂ）に示す。
【００５１】
変性リーダー配列プライマーＭＫＶ６は、ＭＫＣ定常領域プライマー（表２）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株のみに由来する鋳型ｃＤＮＡから約２００ｂｐのＰＣＲ産物を産生した。このバンドは、ＶＫ遺伝子についての予想サイズ（４５０ｂｐ）よりもずっと小さかったので、さらには調査しなかった。
【００５２】
変性リーダー配列プライマーＭＫＶ２は、ＭＫＣ定常領域プライマー（表２）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株とＢ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株の両方に由来する鋳型ｃＤＮＡからバンドの予想サイズ４５０ｂｐよりも小さいＰＣＲ産物を産生した（アガロースゲル上で見た場合）。さらに、以前のＶＫクローニングでは、ＭＫＶ２プライマーが周知のκ軽鎖偽遺伝子を増幅することが分かった。したがって、この産物がマウス１１−１Ｆ４のＶＫ遺伝子ではなく偽遺伝子であることを確認するために、各ＰＣＲ産物の１つのクローンの配列分析を実施した。この配列分析によって、当該ＰＣＲクローンが実際に偽遺伝子であることが明らかになった。
【００５３】
最後に、変性リーダー配列プライマーＭＫＶ１は、ＭＫＣ定常領域プライマー（表１）と組み合わせると、Ｂ２Ｃ４ハイブリドーマ細胞株とＢ２Ｄ６ハイブリドーマ細胞株の両方に由来する鋳型ｃＤＮＡから、ＶＫ遺伝子についてほぼ予想サイズ（４５０ｂｐ）のＰＣＲ産物を産生した。
【００５４】
Ｂ２Ｃ４由来ＰＣＲ産物の３つのクローンおよびＢ２Ｄ６由来ＰＣＲ産物の４つのクローンの配列分析によって、偽遺伝子として同定できなかった単一κ軽鎖可変領域配列が明らかになった。
【００５５】
したがって、１１−１Ｆ４重鎖可変領域遺伝子を、ハイブリドーマｍＲＮＡから（定常領域特異的およびリーダー配列特異的プライマーを使用して）クローニングし、配列決定した。
【００５６】
翻訳されると、配列はＴＶＳＳペプチド配列を示した。Ｋａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）に記録された１２２個の再配列されたヒトＶＨ遺伝子の分析によって、これらの配列の８４％がＴＶＳＳペプチド配列有することが明らかになった。したがって、単離されたＶＨ遺伝子が正しい１１−１Ｆ４遺伝子配列であると結論付けられた。
【００５７】
マウス１１−１Ｆ４可変領域κ軽鎖遺伝子も、非機能的ＶＫ偽遺伝子と同様に、クローニングおよび配列決定に成功した。この偽遺伝子は、Ｃａｒｒｏｌｌら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９８８）２５：９９１）によって最初に同定された。この配列は、元のＭＯＰＣ−２１腫瘍（ＳＰ２／０を含む）に由来する全ての標準的な融合パートナーに存在する異常なｍＲＮＡ転写産物から生じる。異常なｍＲＮＡの結果として、２３位の不変システインがチロシン残基によって置き換えられ、ＶＪジョイントがフレーム外になり、１０５位に停止コドンが生じる。
【００５８】
リンパ系細胞またはハイブリドーマ細胞が、２つ以上の再配列された軽免疫グロブリンｍＲＮＡを合成することが一般的である。これらのｍＲＮＡは通常、機能的ＶＫ遺伝子では通常見られない終止コドンまたはフレームシフトの存在のために非生産的である。これらの偽メッセンジャーは、機能的ポリペプチドをコードしていないという事実にもかかわらず、Ｖ領域ＰＣＲの非常に優れた基質であるため、ハイブリドーマから免疫グロブリン遺伝子をクローニングする際にしばしば大きな問題を引き起こす。
【００５９】
１１−１Ｆ４のＶＫ遺伝子配列は、２つの異なるＰＣＲ産物から単離された７つ別個のＰＣＲクローンの詳細な配列分析後に同定され、配列番号３６が得られた。全ての配列が同一であったので、これが正しい１１−１Ｆ４κ軽鎖可変領域配列として受け入れられた。
【００６０】
クローニングＶＨおよびＶＫ領域遺伝子を使用して、キメラマウス−ヒト１１−１Ｆ４モノクローナル抗体を作製し、次いで、これを分析してＡＬ原線維への特異的結合を確認した。
【実施例２】
【００６１】
［キメラマウス−ヒト１１−１Ｆ４（ｃ１１−１Ｆ４）抗体の構築］
キメラマウス−ヒト抗体の一部として哺乳動物細胞で上記の１１−１Ｆ４のＶＨおよびＶＫ可変領域遺伝子の一過的発現を可能にするためには、特異的に設計されたＰＣＲプライマーを使用して５’末端および３’末端を改変することが必要であった（表５）。オリゴヌクレオチドプライマーＦ３９８３６およびＦ３９８３７を使用して１１−１Ｆ４のＶＫ遺伝子をＰＣＲ改変し、プライマーＦ３９８３５およびＦ５８９３３を使用して１１−１Ｆ４のＶＨ遺伝子をＰＣＲ改変した。逆方向（ＢＡＫ）プライマーＦ３９８３６およびＦ３９８３５は、ＶＫおよびＶＨ遺伝子のそれぞれの５’末端に、ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位、コザック翻訳開始部位および免疫グロブリンリーダー配列を導入した。順方向（ＦＯＲ）オリゴヌクレオチドプライマーＦ３９８３７は、ＶＫ遺伝子の３’末端に、スプライスドナー部位およびＢａｍＨＩ制限部位を導入した。順方向（ＦＯＲ）オリゴヌクレオチドプライマーＦ５８９３３は、ＶＨ遺伝子の３’末端に、ＡｐａＩ制限部位を含むγ−１ＣＨ１遺伝子の最初の２２塩基対を付加した。
【００６２】
【表５】
2020526191.tif 000007
【００６３】
コザックコンセンサス配列は、可変領域配列の効率的な翻訳に不可欠である（Ｋｏｚａｋ、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏ，１９６：９４７）。これは、リボソームが翻訳を開始する正しいＡＵＧコドンを定義し、単一の最も重要な塩基は、ＡＵＧ開始の上流−３位のアデニン（またはわずかに好ましくはグアニン）である。
【００６４】
免疫グロブリンリーダー配列は、発現された抗体が培地に分泌され、したがって容易に収穫および精製されることを保証する。この例に使用されるリーダー配列は、ＶＨおよびＶＫクローニングプロセス中にハイブリドーマｃＤＮＡからクローニングされたマウス１１−１Ｆ４のＶＫおよびＶＨリーダー配列であった。
【００６５】
スプライスドナー配列は、適切な定常領域への軽鎖可変領域の正しいインフレーム付着、したがって１３０ｂｐのＶＫ：ＣＫイントロンをスプライシングで切り出すのに重要である。重鎖可変領域を、Ａｐａｌ部位を介してその適切な定常領域遺伝子に直接付着させたので、スプライスドナー部位の必要性が排除された。
【００６６】
サブクローニング制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ、ならびにＨｉｎｄＩｌｌおよびＡｐａｌは、それぞれ改変ＶＫおよびＶＨ可変領域遺伝子を挟む。様々なユニークな制限部位の使用によって、適切な哺乳動物発現ベクターへの方向性サブクローニングが保証された。
【００６７】
１１−１Ｆ４軽鎖可変領域遺伝子を最初に慎重に分析して、望ましくないスプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位およびコザック配列を同定した（表６参照）。重鎖可変領域遺伝子と軽鎖可変領域遺伝子の両方を、機能的全抗体のサブクローニングおよび／または発現を後で妨害する余分なサブクローニング制限部位の存在について分析した。何も見つからなかった。
【００６８】
【表６】
2020526191.tif 000008
【００６９】
可変領域遺伝子ごとに、別個のＰＣＲ反応を次の通り準備した。上述したプラスミド１１−１Ｆ４のＶＨ．ｐＣＲ２．１および１１−１Ｆ４のＶＫ．ｐＣＲ２．１を鋳型として使用した。１００μｌの反応混合物を各ＰＣＲ管で調製した。各混合物は、最大４１μｌの滅菌水、１０μｌの１０×ＰＣＲ緩衝液Ｉ、８μｌのｄＮＴＰの１０ｍＭストック溶液、１μｌの１０ｍＭ  ５’順方向プライマー、１μｌの１０ｍＭ  ３’逆方向プライマーおよび１μｌの１／１０希釈の鋳型ＤＮＡを含有した。最後に、０．５μｌのＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ（２．５ユニット）を添加した後に、完成した反応混合物に５０μｌの鉱油を重ねた。反応管をＤＮＡサーマルサイクラーに装填し、（９４℃で１分間の初期融解後）９４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間および７２℃で５０秒間、２５サイクルにわたって処理した。最後のサイクルに続いて、７２℃で７分間の最終伸長ステップを行って、４℃に冷却した。各ＰＣＲ反応管からの１０μｌのアリコートを、０．５μｇ／ｍｌの臭化エチジウムを含有する１．２％（ｗ／ｖ）アガロース／１×ＴＢＥ緩衝液ゲルで泳動して、ＰＣＲ産物のサイズおよび存在を決定した。陽性ＰＣＲクローンのサイズは約４２０ｂｐであった。このように同定されたこれらの推定陽性ＰＣＲ産物を、Ｔｏｐｏ  ＴＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）キットによって提供されるｐＣＲ２．１ベクターに直接クローニングし、製造業者のプロトコルに記載されるようにＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換した。ＧｕｓｓｏｗおよびＣｌａｃｋｓｏｎの方法に従って、１２１２および１２３３オリゴヌクレオチドプライマー（表３）を使用してコロニーをＰＣＲスクリーニングして、正しいサイズのインサートを有するプラスミドを含有するコロニーを同定した。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＡｎａｌｙｚｅｒおよびＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ＢｉｇＤｙｅ（商標）ターミネーターを使用して、上記推定陽性クローンを二本鎖プラスミドＤＮＡ配列決定した。それぞれＴｏｐｏ  ＴＡクローニングＶＨおよびＶＫ遺伝子の２つの陽性クローンを配列決定した。
【００７０】
正しく改変された１１−１Ｆ４のＶＨおよび１１−１Ｆ４のＶＫ遺伝子を含むクローンを同定し、これらのクローンからの改変Ｖ遺伝子をそれぞれの発現ベクターにサブクローニングして、哺乳動物細胞におけるキメラ重鎖およびκ軽鎖の発現を促進した。改変された１１−１Ｆ４のＶＫ遺伝子を、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片として発現ベクターｐＫＮ１００（図４）にサブクローニングした。このベクターは、ヒトκ定常領域遺伝子（アロタイプ：Ｋｍ（３  Ａｌａ１５３、Ｓｅｒ１９１））を含んでいる。改変された１１−１Ｆ４のＶＨ遺伝子も、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＡｐａＩ断片として発現ベクターｐＧ１Ｄ２００（図５）にサブクローニングした。このベクターは、ヒトγ１定常領域遺伝子（アロタイプ：Ｇ１ｍ（−１  Ｇｌｕ３７７、Ｍｅｔ３８Ｉ、−２  Ａｌａ４６２、３  Ａｒｇ２２２、Ｓｅｒ２２９））を含んでいる。使用されるκ定常領域アロタイプとγ１定常領域アロタイプの両方は、白人集団で一般的に見られる。次いで、ライゲーションした発現構築物、１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１−１Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００を使用してＤＨ５αコンピテント細胞を形質転換し、元のＰＣＲ改変プライマー（表４）を使用して上述したＰＣＲスクリーニング法を使用して陽性クローンを同定した。発現ベクターは容易に入手可能である。
【実施例３】
【００７１】
［ＣＯＳ細胞におけるキメラ１１−１Ｆ４の一過的発現のための単一スーパーベクターの構築］
キメラ１１−１Ｆ４抗体の両方の免疫グロブリン鎖を発現する単一スーパーベクターを次の通り構築した。１１−１Ｆ４κ軽鎖発現カセット（ＨＣＭＶｉプロモーター、１１−１Ｆ４κ軽鎖可変領域遺伝子およびκ軽鎖定常領域遺伝子を含んでいた）を、１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００構築物（図４）から制限酵素消化（１位および２４９０位のＥｃｏＲＩ）し、次いで、ユニークなＥｃｏＲＩ（４２９７位、図５）を介して１１−１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００構築物にライゲートした。このライゲーションによって、１１−１Ｆ４キメラ抗体の重鎖とκ軽鎖の両方を含むスーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００−１１−１Ｆ４が構築された。
【実施例４】
【００７２】
［ＣＯＳ細胞におけるキメラγ１／κ．１１−１Ｆ４全抗体の一過的発現］
キメラ１１−１Ｆ４抗体を、次の２つの方法で欧州細胞培養コレクション（ＥＣＡＣＣ）のＣＯＳ細胞で一過的に発現させた：
（ｉ）それぞれ１０μｇのベクター構築物１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１−１Ｆ４ＶＨ．ｐＧ１Ｄ２００のコトランスフェクションによる。コトランスフェクションは２連で行った。
（ｉｉ）１３μｇの単一スーパーベクター構築物ｐＧ１ＫＤ２００−１１−１Ｆ４のトランスフェクションによる。スーパーベクターのトランスフェクションは５回行った。
【００７３】
次の通りトランスフェクション法を使用した。ＣＯＳ細胞株を、１５０ｃｍ２フラスコ中１０％（ｖ／ｖ）ＦＣＳ、５８０μｇ／ｍｌのＬ−グルタミン、および５０ユニット／ｍｌのペニシリン／５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ（「培地」）でコンフルエントになるまで増殖した。細胞をトリプシン処理し、ベンチトップ遠心分離機で遠心沈殿させ（２５０ｇ、５分間）、次いで、６ｍｌの培地に再懸濁した後に、これを２５ｍｌの新鮮な予熱培地をそれぞれ含む３つの１５０ｃｍ２フラスコに均等に分けた。細胞を５％ＣＯ２中３７℃で一晩インキュベートし、翌日、指数関数的に増殖している間に収穫した。各フラスコは約１×１０７個の細胞を含有していた。細胞を再度トリプシン処理し、前のようにペレット化し、２０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで、細胞濃度が１×１０７細胞／ｍｌになるように十分なＰＢＳに再懸濁した。７００μｌのこれらの洗浄したＣＯＳ細胞をＧｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）キュベットにピペットで入れ、次いで、そこに１μｌの重鎖発現ベクターＤＮＡとκ軽鎖発現ベクターＤＮＡ（それぞれ１０μｇ）の両方または１３μｇのスーパーベクター構築物を添加した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）装置を使用して、１９００Ｖ、２５μＦの静電容量パルスを混合物に供給した。各実験トランスフェクションおよび（ＣＯＳ細胞をＤＮＡの非存在下で電気穿孔した）「ＤＮＡなし」対照についてパルスを繰り返した。ＣＯＳ細胞の効率を試験するために、以前に発現した抗体の陽性対照も実施した。
【００７４】
ＣＯＳ細胞を室温で１０分間回復させ、次いで、１０％（ｖ／ｖ）γ−グロブリンを含まないＦＢＳ、５８０μｇ／ｍｌのＬグルタミンおよび５０ユニット／ｍｌのペニシリン／５０μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した予熱ＤＭＥＭ８ｍｌを含む直径１０ｃｍの組織培養皿に穏やかにピペットで移し、５％ＣＯ２中３７℃で７２時間インキュベートした後に、分析のためにＣＯＳ細胞上清を収穫した。７２時間のインキュベーション後に、培地を回収し、回転させて細胞片を除去し、キメラ抗体産生およびｃ１１−１Ｆ４抗体の抗原結合についてＥＬＩＳＡによって分析した。
【実施例５】
【００７５】
［捕捉ＥＬＩＳＡを介したキメラγ１／κ１１−１Ｆ４抗体の定量化］
発現後に、ＣＯＳ細胞上清中に存在するＩｇＧ分子全体を、捕捉ＥＬＩＳＡアッセイを使用して定量化した。ＩｇＧ分子を、固定化ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的抗体を介してＮｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ＭａｘｉＳｏｒｂ（商標）プレート上に捕捉し、抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲート抗体を介して検出した。以下と同じ方法で、同じプレート上の既知の濃度の標準ＩｇＧ抗体を捕捉および検出して、標準曲線を作成した。９６ウェル（穴）イムノプレートの各ウェルを、ＰＢＳで希釈した０．４μｇ／ｍｌヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体の１００μｌのアリコートでコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。過剰なコーティング溶液を除去し、プレートを２００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液（１ｘＰＢＳ、０．１％ＴＷＥＥＮ）で３回洗浄した。第２列のＢ行〜Ｇ行のウェルを除く全てのウェルに、１００μｌのＳＥＣ緩衝液を分注した。ヒトＩｇＧ１／κ抗体のＳＥＣ緩衝液中１μｇ／ｍｌ溶液を標準として調製し、２００μｌ／ウェルを第２列のＢ行およびＣ行のウェルにピペットで入れた。トランスフェクトしたｃｏｓ細胞の培地を遠心分離し（２５０ｇ、５分）、上清を保存した。（ＣＯＳ細胞をＤＮＡの非存在下でトランスフェクトした）「ＤＮＡなし」対照からの上清２００μｌのアリコートを、第２列のＤ行のウェルにピペットで入れ、実験上清の２００μｌ／ウェルのアリコートを第２列、Ｅ行、Ｆ行およびＧ行のウェルにピペットで入れた。第２列のＢ行〜Ｇ行のウェルの２００μｌのアリコートを混合し、次いで、１００μｌを各ウェルから第３列の隣接ウェルに移した。このプロセスを、標準試料、対照試料および実験試料の一連の２倍希釈液で第１１列まで続け、次いで、全てを３７℃で１時間インキュベートし、全てのウェルを洗浄緩衝液の２００μｌのアリコートで６回すすいだ。ヤギ抗ヒトκ軽鎖ペルオキシダーゼコンジュゲートをＳＥＣ緩衝液で５０００倍希釈し、１００μｌの希釈コンジュゲートを各ウェルに添加し、インキュベーションとすすぎステップを繰り返した。各ウェルに１５０μｌのＫ−ＢＬＵＥ基質を添加し、暗所中２５℃で１０分間インキュベートした。５０μｌのＲＥＤ  ＳＴＯＰ溶液を各ウェルに添加して反応を停止し、６５５ｎｍで光学濃度を読み取った。
【実施例６】
【００７６】
［キメラ１１−１Ｆ４抗体の結合分析］
キメラ１１−１Ｆ４抗体を、直接結合ＥＬＩＳＡアッセイを使用して、アミロイド原線維への結合について試験した。合成原線維を免疫グロブリン軽鎖タンパク質から形成し、「低結合」ポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ、番号３４７４）を使用した固相ＥＬＩＳＡベースアッセイで抗体の反応性を監視するために使用した。プレートをコーティングする直前に、２５０μｇの原線維の塊をコーティング緩衝液（ｐＨ７．５のリン酸緩衝生理食塩水中０．１％ウシ血清アルブミン）で１ｍｌに希釈した。次いで、最大値の４０％に設定した出力でＴｅｋｍａｒ  Ｓｏｎｉｃ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ超音波プローブを使用して、試料を２０秒間超音波処理して、それぞれ最大２〜５個のプロトフィラメントで構成される短い原線維の溶液を得た。次いで、この溶液を５ｍｌに希釈し、ボルテックスで十分に混合し、プレートのウェルに等分した。このプロセスにより、各ウェルで５０μｇ／ｍｌの濃度の原線維溶液５０μｌが得られた。次いで、プレートを３７℃のインキュベーターに蓋をせずに入れて、一晩乾燥させた。
【００７７】
次いで、プレートを調製してから４８時間以内にＥＬＩＳＡアッセイを次の通り実施した。ＰＢＳ中１％ＢＳＡ１００μｌの添加によってウェルをブロッキングし、シェーカー上で室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ｖ／ｖ）で３回洗浄した。プレートの各ウェルに、５０μｌのｃ１１−１Ｆ４の溶液（０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中３μｇ／ｍｌ抗体）を添加し、プレートをシェーカー上で室温で１時間インキュベートした。プレートを再度（前回同様）３回洗浄し、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ｓｉｇｍａ番号Ｂ−８７７４、抗重鎖および軽鎖）を使用して、結合抗体の検出を達成した。
【００７８】
［結果］
改変に成功したＶＨおよびＶＫ遺伝子の配列分析によって、正しい配列が存在することが明らかになった。改変された１１−１Ｆ４のＶＫおよびＶＨ遺伝子の詳細なＤＮＡおよびアミノ酸配列を図３および図４に示す。改変されたＶＫおよびＶＨ遺伝子の、哺乳動物発現ベクターｐＧ１Ｄ２００およびｐＫＮ１００へのクローニングにそれぞれ成功し、得られた１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１−１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００構築物を、哺乳動物細胞のコトランスフェクションに使用した。
【００７９】
次いで、１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１−１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００構築物を使用して、哺乳動物細胞でキメラ１１−１Ｆ４抗体を発現する単一スーパーベクター（ｐＧ１ＫＤ２００−１１−１Ｆ４）も構築した。ＥＣＡＣＣのＣＯＳ細胞のコトランスフェクションとスーパーベクタートランスフェクションの両方からのキメラ１１−１Ｆ４抗体発現レベルを分析した。ｐＧ１ＫＤ２００−１１−１Ｆ４スーパーベクターのトランスフェクションから観察された発現レベル（１０３２６ｎｇ／ｍｌ）は、１１−１Ｆ４ＶＫ．ｐＫＮ１００および１１−１Ｆ４ＶＨｐＧ１Ｄ２００構築物の対応するコトランスフェクションから観察されたレベル（２８２０ｎｇ／ｍｌ）よりも３．７倍高かった。
【００８０】
発現および定量化の後に、キメラ１１−１Ｆ４抗体を直接結合ＥＬＩＳＡによって標的抗原（親切にもＮＣＩによって提供されたアミロイド原線維）への結合について試験した。結合ＥＬＩＳＡの結果を図８に示す。２つの最良の個々のｐＧ１ＫＤ２００−１１−１Ｆ４スーパーベクタートランスフェクションからの上清を、対応するコトランスフェクションからの１つの上清と並行して分析した。
【００８１】
結果は、キメラ１１−１Ｆ４抗体がそのマウス同等物よりも高い親和性でアミロイド原線維に結合することを示した。通常、キメラ抗体は元のマウス抗体に匹敵する結合親和性を有すると予想されるため、この結果は驚くべきものであり、予想外であった。特定の機構によって拘束されることを意図するものではないが、本発明者らは、１１−１Ｆ４マウスＶ領域とキメラ１１−１Ｆ４抗体の作製に使用されるヒトγ１／κＣ領域とを組み合わせることで得られた正味の効果によって、より高い親和性を有する抗体が得られた可能性があると考えている。
【００８２】
本明細書の説明および特許請求の範囲において使用される「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などを含む当該単語の変形は、特に明示されていない限り、他の特徴、添加剤、成分、整数またはステップを排除することを意図していない。これらの単語の範囲は、排他的な意味ではなく包括的な意味を有するように広く解釈されるものである。
【００８３】
本発明の組成物および方法は、一例として本明細書に記載しているにすぎない。本発明はこれらに限定されず、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の教示から逸脱することなく、当業者によって知られるように変形を行うことができることが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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