(57)【要約】  本発明は、一般式（Ｉ）の化合物：2020517745.tif 000039        （Ｉ）であって、Ｒ1、ｎ、Ｒ2a、Ｒ2b及びＲ3がここに定義したとおりである、化合物に関連する。当該化合物は抗アポトーシス活性を有し、かつ癌、特に乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、結腸癌、前立腺癌又は膵臓癌の治療に有用である。
2020517745.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）の化合物：
2020517745.tif 000030
（Ｉ）
であって、Ｒ1のそれぞれが、独立してハロ、ＯＨ、シアノ、ニトロ、ＮＲ10Ｒ11、Ｃ（Ｏ）Ｒ10、Ｃ（Ｏ）ＯＲ10、Ｃ（Ｏ）ＮＲ10Ｒ11、−Ｓ（Ｏ）qＮＲ10Ｒ11、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6ハロアルキル、−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）、−Ｏ（Ｃ1-6ハロアルキル）、アリール、ヘテロアリール、−Ｏ−アリール、又は−Ｏ−ヘテロアリールであって、
Ｒ10及びＲ11のそれぞれが、Ｈ、又はＯＨ、ハロ、シアノ、ＮＨ2、アリール若しくはヘテロアリールから選択される１以上の置換基により任意で置換されるＣ1-6アルキルから独立して選択され、
アルキル及びハロアルキル基Ｒ1が、ＯＨ、シアノ、−Ｓ（Ｏ）pＮＲ4Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ4Ｒ5、アリール、ヘテロアリール、−Ｏ−アリール若しくは−Ｏ−ヘテロアリール、アリールで任意で置換された−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）、又は−Ｏ（Ｃ1-6ハロアルキル）から選択される１以上の置換基により任意で置換され、
アリール又はヘテロアリール基Ｒ1が、ハロ、ＯＨ、シアノ、ニトロ、−ＮＲ4Ｒ5、−Ｓ（Ｏ）pＮＲ4Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ4Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）Ｒ4、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ4、又はＯＨ、ハロ、アリール、ヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）、Ｏ（Ｃ1-6ハロアルキル）、−Ｏ−アリール若しくは−Ｏ−ヘテロアリールから選択される１以上の置換基により任意で置換される−Ｃ1-6アルキル若しくは−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）から選択される１以上の置換基により任意で置換され、
ｐが１又は２であり、
Ｒ4及びＲ5のそれぞれが、Ｈ若しくはＣ1-4アルキルから独立して選択され、又はＲ4及びＲ5が、それらが結合する窒素原子とともにＯ、Ｎ及びＳから選択される１以上の追加のヘテロ原子を任意で含有する３員若しくは８員の複素環を形成してもよく、
ｎが０、１、２、３、４、又は５であり、
Ｒ2a及びＲ2bが、各々独立してハロ、ＯＨ、アリール又はヘテロアリールから選択される１以上の置換基により任意で置換されるＣ1-6アルキルであり、又は、
Ｒ2a及びＲ2bが、それらが結合する窒素原子とともにＯ、Ｎ又はＳから選択される１以上のさらなるヘテロ原子を任意で含有する５員又は６員の複素環を形成し、及び１以上の置換基Ｒ6により任意で置換され、
Ｒ6のそれぞれが、アリール、ヘテロアリール、−Ｏ−アリール、−Ｏ−ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、−Ｏ−カルボシクリル、−Ｏ−ヘテロシクリル、Ｒ12、ＯＲ12、Ｃ（Ｏ）Ｒ12、Ｃ（Ｏ）ＯＲ11、Ｃ（Ｏ）ＮＲ11Ｒ12、ＣＮ、ＯＨから独立して選択され、
Ｒ11及びＲ12のそれぞれが、独立してＨ若しくはＣ1-4アルキルであり、１以上のアリール又はヘテロアリール基により置換されてもよく、アリール及びヘテロアリール基は、ハロ、ＯＨ、シアノ、ニトロ、−ＮＲ4Ｒ5、−Ｓ（Ｏ）pＮＲ4Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ4Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）Ｒ4、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ4又はＯＨ、ハロ、アリール、ヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）、Ｏ（Ｃ1-6ハロアルキル）、−Ｏ−アリール若しくは−Ｏ−ヘテロアリールから選択される１以上の置換基により任意で置換される−Ｃ1-6アルキル若しくは−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）から選択される１以上の置換基により置換され、
Ｒ4及びＲ5が、上記で定義したとおりであり、又はＲ11及びＲ12が、それらが結合する窒素原子に結合して、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１以上のさらなるヘテロ原子を任意で含有する３員から８員の複素環を形成し、及びＣ1-4アルキル、Ｃ1-4ハロアルキル若しくはハロにより任意で置換されてもよく、
Ｒ3が、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、又はヘテロシクリルであり、それらがハロ、任意でアリールにより置換されるＣ1-4アルキル、任意でアリールにより置換される−Ｏ（Ｃ1-4アルキル）、−Ｃ1-4ハロアルキル、−Ｏ（Ｃ1-4ハロアルキル）、又は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9から選択される１以上の置換基Ｒ7により任意で置換され、
Ｒ8及びＲ9のそれぞれが、独立してＨ、Ｃ1-4アルキル若しくはＣ3-6シクロアルキルから選択され、又はＲ8及びＲ9が、それらが結合する窒素原子とともにＯ、Ｎ及びＳから選択される１以上の追加のヘテロ原子を任意で含有する５員若しくは６員の複素環を形成してもよい、化合物、
又は薬学的に許容される塩、溶媒和化合物若しくはそれらの水和物又は全ての立体異性体を包含するその重水素化又はトリチウム化した変異体。
【請求項２】
一般式一般式（ＩＡ）の化合物：
2020517745.tif 000031
（ＩＡ）
であって、Ｒ1のそれぞれが、独立してハロ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6ハロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、アリール又はヘテロアリール基は、ハロ、ＯＨ、シアノ、ニトロ、−Ｓ（Ｏ）pＮＲ4Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ4Ｒ5、任意でアリールにより置換される−Ｃ1-6アルキル、−Ｃ1-6ハロアルキル、任意でアリールにより置換される−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）、又は−Ｏ（Ｃ1-6ハロアルキル）から選択される１以上の置換基により任意で置換され、
ｐが０、１又は２であり、
Ｒ4及びＲ5のそれぞれが、独立してＨ若しくはＣ1-4アルキルから選択され、又はＲ4及びＲ5が、それらが結合する窒素原子とともにＯ、Ｎ及びＳから選択される１以上の追加のヘテロ原子を任意で含有する５員若しくは６員の複素環を形成してもよく、
ｍが０、１、２、３又は４であり、
Ｒ2a及びＲ2bが、各々独立してハロ、ＯＨ、アリール又はヘテロアリールから選択される１以上の置換基により任意で置換されるＣ1-6アルキルであり、又は、
Ｒ2a及びＲ2bが、それらが結合する窒素原子とともにＯ、Ｎ又はＳから選択される１以上のさらなるヘテロ原子を任意で含有する５員又は６員の複素環を形成し、及び１以上の置換基Ｒ6により任意で置換され、
Ｒ6のそれぞれが、アリール、ヘテロアリール、−Ｏ−アリール、−Ｏ−ヘテロアリール、又は１以上のアリール若しくはヘテロアリール基により置換されるＣ1-4アルキルから独立して選択され、アリール及びヘテロアリール基が、ハロ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ハロアルキル、−Ｏ（Ｃ1-4アルキル）又は−Ｏ（Ｃ1-4ハロアルキル）から選択される１以上の置換基により置換され、
Ｒ3が、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリルであり、それらがハロ、任意でアリールにより置換されるＣ1-4アルキル、任意でアリールにより置換される−Ｏ（Ｃ1-4アルキル）、−Ｃ1-4ハロアルキル、−Ｏ（Ｃ1-4ハロアルキル）、又は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9から選択される１以上の置換基Ｒ7により任意で置換され、
Ｒ8及びＲ9のそれぞれが、独立してＨ、Ｃ1-4アルキル若しくはＣ3-6シクロアルキルから選択され、又はＲ8及びＲ9が、それらが結合する窒素原子とともに、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１以上の追加のヘテロ原子を任意で含有する５員若しくは６員の複素環を形成してもよい、化合物、
又は薬学的に許容される塩、溶媒和化合物若しくはそれらの水和物又は全ての立体異性体を包含するその重水素化又はトリチウム化した変異体。
【請求項３】
ｎが１若しくは２であり、及び少なくとも１つのＲ1基がＯＨである請求項１に記載の化合物、又はｍが０若しくは１である請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
ｍが０以外であり、及びＲ1がハロ又は請求項２で定義されるように任意で置換されるアリール若しくはヘテロアリール基である、請求項２又は３に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ1が、ハロ、ＯＨ、シアノ、ニトロ、−ＳＯ2ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ4Ｒ5、任意でアリールにより置換される−Ｃ1-4アルキル、−Ｃ1-4ハロアルキル、任意でアリール又は−Ｏ（Ｃ1-4ハロアルキル）により置換される−Ｏ（Ｃ1-4アルキル）により任意で置換されるアリール又はヘテロアリール基であり、Ｒ4及びＲ5が、それらが結合する窒素原子とともにピペリジン又はピロリジン環を形成する、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ1が、クロロ、フルオロ、メチル、エチル、トリフルオロメチル、ベンジル、メトキシ、エトキシ、ベンジルオキシ、トリフルオロメトキシ及びピペリジン−１−カルボニルにより任意で置換されるアリール又はヘテロアリール基である、請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ2a及びＲ2bが、それらが結合する窒素原子とともに、１以上の置換基Ｒ6により任意で置換される６員の複素環を形成する、請求項１から６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ2a及びＲ2bが、それらが結合する窒素原子とともに、ピペラジン４位で単一のＲ6置換基により置換されるピペラジン環を形成し、一般式（Ｉ）の前記化合物が一般式（ＩＢ）の化合物：
2020517745.tif 000032
（ＩＢ）
であり、
Ｒ1、ｎ、Ｒ3及びＲ6が、請求項２で定義されるとおりである、請求項７に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ6が、フェニル、ヘテロアリール、−Ｏ−フェニル、−Ｏ−ヘテロアリール、ベンジル、−ＣＨ（フェニル）2、−ＣＨ2−ヘテロアリール、及び−ＣＨ（ヘテロアリール）2であって、前記ヘテロアリール基が、ピリジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル、及びベンゾイソオキサゾリルから選択され、並びに上記のＲ6基が、請求項１に定義されるように置換されていてもよい、請求項１から８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ3が、１以上の置換基Ｒ7により任意で置換されるフェニルであり、一般式（Ｉ）の前記化合物が一般式（ＩＣ）の化合物：
2020517745.tif 000033
（ＩＣ）
であり、
Ｒ1、ｎ、Ｒ2a、Ｒ2b及びＲ7が、一般式（Ｉ）により定義されるとおりであり、及びｚが０から５である、請求項１から９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
ｚが０、１又は２であり、Ｒ7が存在せず（即ち、ｚが０である）、又はＲ7がハロ、−Ｃ1-4アルキル、ベンジル、−Ｏ（Ｃ1-4アルキル）ベンジルオキシ、−Ｃ1-4ハロアルキル、−Ｏ（Ｃ1-4ハロアルキル）若しくは−Ｃ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9であって、Ｒ8及びＲ9が、それらが結合する窒素原子とともにピペリジニル環を形成し、又はＲ8がＨであり、及びＲ9がＣ3-7シクロアルキルである、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
一般式（ＩＤ）の化合物：
2020517745.tif 000034
（ＩＤ）
であり、
Ｒ1、ｎ、Ｒ6、Ｒ7及びｚが、上記で定義したとおりである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
２−（（２−クロロフェニル）（４−（４−メトキシフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物１）、
２−（（４−クロロフェニル）（４−（４−メトキシフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物２）、
２−（（４−（ベンジルオキシ）−３−フルオロフェニル）（４−（４−メトキシフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物３）、
（４−（（２−ヒドロキシフェニル）（４−（４−メトキシフェニル）ピペラジニル）メチル）フェニル）（ピペリジン−１−イル）メタノン（化合物４）、
３−（（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）（４−（４−メトキシフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物５）、
２−（（４−（ベンジルオキシ）−３−フルオロフェニル）（４−（４−メトキシフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−４−クロロフェノール（化合物６）、
２−（（４−（ベンジルオキシ）−３−フルオロフェニル）（４−（６−フルオロベンゾ［ｄ］イソオキサゾール−３−イル）ピペリジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物７）、
２−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（ｏ−トリル）メチル）フェノール（化合物８）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メチル）ベンズアミド（化合物９、ＮＰＢ）、
２−（（４−（ベンジルオキシ）−３−フルオロフェニル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物１０）、
２−（（４−（（４−クロロフェニル）（フェニル）メチル）ピペラジン−１−イル）（フェニル）メチル）フェノール（化合物１１）、
２−（（４−（（４−クロロフェニル）（フェニル）メチル）ピペラジン−１−イル）（ｐ−トリル）メチル）フェノール（化合物１２）、
２−（（４−クロロフェニル）（４−（（４−クロロフェニル）（フェニル）メチル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物１３）、
２−（（４−（（４−クロロフェニル）（フェニル）メチル）ピペラジン−１−イル）（４−エチルフェニル）メチル）フェノール（化合物１４）、
（４−（（４−（（４−クロロフェニル）（フェニル）メチル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メチル）フェニル）（ピペリジン−１−イル）メタノン（化合物１５）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物１６）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−２’−メチル−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物１７）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−３’−メチル−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物１８）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−４’−メチル−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物１９）、
３−（（２’−クロロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物２０）、
３−（（３’−クロロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物２１）、
３−（（４’−クロロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物２２）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４’−エチル−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２３）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−４’−（ピペリジン−１−カルボニル）−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２４）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−４’−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２５）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２’−エチル−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２６）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２’−フルオロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２７）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（３’−フルオロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２８）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４’−フルオロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２９）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−３’−ニトロ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物３０）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−３’−スルファモイル−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物３１）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−２’−（トリフルオロメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物３２）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−３’−（トリフルオロメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物３３）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−４’−（トリフルオロメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物３４）、
３−（（２’−シアノ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物３５）、
３−（（３’−シアノ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物３６）、
３−（（４’−シアノ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物３７）、
３−（（２’−クロロ−４−ヒドロキシ−４’−（トリフルオロメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物３８）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（２’，４’−ジクロロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）ベンズアミド（化合物３９）、
３−（（４’−クロロ−２’，４−ジヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物４０）、
３−（（４−（４−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物４１、ＮＣＫ１）、
２−（（４−クロロフェニル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物４２、ＮＣＫ２）、
２−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（３−メトキシフェニル）メチル）フェノール（化合物４３、ＮＣＫ３）、
１−（５−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メチル）チオフェン−２−イル）エタノン（化合物４４、ＮＣＫ４）、
２−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（ナフタレン−１−イル）メチル）フェノール（化合物４５、ＮＣＫ５）、
５−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メチル）フラン−２−カルバルデヒド（化合物４６、ＮＣＫ６）、
２−（（４−（５，６−ジクロロシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−イル）ピペラジン−１−イル）（２−フルオロ−３−メチルピリジン−４−イル）メチル）フェノール（化合物４７、ＮＣＫ７）、
２−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−（トリフルオロメチル）フェニル）メチル）フェノール（化合物４８、ＮＣＫ８）、
２−（（６−クロロ−５−メチルピリジン−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物４９、ＮＣＫ９）、
２−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（ピリジン−３−イル）メチル）フェノール（化合物５０、ＮＣＫ１０）、
１−（５−（（４−（４−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メチル）チオフェン−２−イル）エタノン（化合物５１、ＮＣＫ１４）、
３−（（４−（４−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−（ジエチルアミノ）−２−ヒドロキシフェニル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物５２、ＮＣＫ１６）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−（ジエチルアミノ）−２−ヒドロキシフェニル）メチル）ベンズアミド（化合物５３、ＮＣＫ１８）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシ−４，６−ジメトキシフェニル）メチル）ベンズアミド（化合物５４、ＮＣＫ１９）、
２−（（４−クロロフェニル）（４−（４−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物５５、ＮＣＫ２０）、
２−（（４−（４−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（６−メチルピリジン−３−イル）メチル）フェノール（化合物５６、ＮＣＫ２１）、
２−（ｏ−トリル（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物５７、ＳＧ１）、
２−（（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）（４−（トリフルオロメチル）フェニル）メチル）フェノール（化合物５８、ＳＧ２）、
Ｎ−シクロペンチル−４−（（２−ヒドロキシフェニル）（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）メチル）ベンズアミド（化合物５９、ＳＧ３）、
２−（（４−クロロフェニル）（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物６０、ＳＧ４）、
２−（（３−メトキシフェニル）（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物６１、ＳＧ５）、
５−（（２−ヒドロキシフェニル）（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）メチル）フラン−２−カルバルデヒド（化合物６２、ＳＧ６）、
２−（（６−メチルピリジン−３−イル）（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物６３、ＳＧ７）、から選択される、請求項１に記載の化合物、
又は薬学的に許容される塩、溶媒和化合物若しくはそれらの水和物又は全ての立体異性体を包含するその重水素化又はトリチウム化した変異体。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の化合物の調製方法であって、
ｉ．一般式（ＩＩ）のアルデヒド：
2020517745.tif 000035
（ＩＩ）
であって、Ｒ1及びｎが請求項１に定義したとおりであるアルデヒドを、
一般式（ＩＩＩ）の化合物：
2020517745.tif 000036
（ＩＩＩ）
であって、Ｒ2a及びＲ2bが請求項１に定義したとおりである化合物、
及び一般式（ＩＶ）のボロン酸：
2020517745.tif 000037
（ＩＶ）
であって、Ｒ3が請求項１に定義したとおりであるボロン酸と反応させる工程、又は
ｉｉ．Ｒ1がハロである一般式（Ｉ）の化合物を、一般式（Ｖ）の化合物：
2020517745.tif 000038
（Ｖ）
と反応させる工程であって、Ｒ1aが、請求項１においてＲ1について定義したとおりに任意で置換されるアリール又はヘテロアリールであり、
パラジウム触媒の存在下で鈴木カップリング反応を介して、Ｒ1がＲ1aである一般式（Ｉ）の化合物を得る工程、
のいずれかを含む調製方法。
【請求項１５】
医学における使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
癌の治療における使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
癌の治療のための薬の調製における、請求項１から１３のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項１８】
癌を治療するための方法であって、前記方法が、そのような治療を必要とする患者に有効量の請求項１から１３のいずれか一項に記載の化合物を投与する工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記癌が、ＢＡＤリン酸化が存在する癌、例えば、乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、結腸癌、前立腺癌、若しくは膵臓癌、又はＢＡＤがリン酸化されている任意の他の上皮由来の癌である、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の使用のための化合物、使用又は方法。
【請求項２０】
請求項１から１３のいずれか一項に記載の化合物及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２１】
腹腔内投与、肝門脈投与、静脈内投与、関節内投与、膵十二指腸動脈投与若しくは筋肉内投与、又はそれらの任意の組み合わせのために処方される、請求項２０に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な化合物、及び特に癌細胞におけるＢｃｌ−２関連死プロモーターの阻害剤である化合物、癌の治療又は予防における使用のための化合物、並びに当該化合物を含む医薬組成物に関連する。
【背景技術】
【０００２】
アポトーシス又はプログラム細胞死は、自己反応性免疫細胞、加齢細胞及び修復できないＤＮＡ損傷を有する細胞の排除に中心的に関与する制御機構である［１］。アポトーシスは、脊椎動物における２つの別個の機構―外因性及び内因性の経路により実行される［２］。内因性の経路は、低酸素条件下で、深刻なゲノム損傷、酸化ストレス又は成長因子の枯渇後に活性化される［３］。ＢＣＬ−２ファミリータンパク質は、内因性アポトーシス経路の制御における中心的な役割を有する［４］。２０を超えるＢＣＬ−２ファミリーメンバーが同定され、かつ抗アポトーシス性の、アポトーシス促進性の、及びＢＨ３−ｏｎｌｙのタンパク質に大まかに分類されている。ＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ｘＬ及びＢＣＬ−ｗは抗アポトーシス性であり、ＢＡＫ及びＢＡＸはアポトーシス促進性であり、並びにＢＡＤ、ＢＩＭ、ＰＵＭＡ、ＮＯＸＡは優勢なアポトーシス促進性のＢＨ３  ｏｎｌｙタンパク質である［５−７］。ゆえに、ＢＣＬ−２ファミリーは、その間に維持される平衡を有するアポトーシス促進性及び抗アポトーシス性の機能の両方を供給し、かつアポトーシス促進性ＢＨ３  ｏｎｌｙタンパク質は、通常はホメオスタシスを確保するために抑制されている［８］。
【０００３】
アポトーシスの抑制は、不適当な細胞の生存並びに癌の発達及び／又は進行に貢献する［９−１１］。ほとんどの悪性腫瘍において、抗アポトーシス性タンパク質の発現が増加し、アポトーシスに対する耐性の発達をもたらす。Ｂｃｌ−２関連死プロモーター（ＢＡＤ）は、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ及びＢｃｌ−ｗとの相互作用によるアポトーシスの制御における、重大な役割を果たす［１２］。ヒトＢＡＤは、ｐ４４／４２ＭＡＰキナーゼによりＳｅｒ７５（同等のマウス残基はＳｅｒ１１２である）で、及びＡＫＴ／ｐ７０Ｓ６ＫによりＳｅｒ９９（同等のマウス残基はＳｅｒ１３６である）で、リン酸化される［１３］。両方のセリン残基は、アポトーシスを防ぐためにＰｉｍファミリーキナーゼによってもリン酸化される［１４］。これらの両方の残基におけるＢＡＤのリン酸化は、ｈＢＡＤをＢＣＬ−ｘＬ又はＢＣＬ−２とヘテロ二量体化する能力の損失をもたらす［１５］。リン酸化されたＢＡＤタンパク質は、１４−３−３タンパク質とヘテロ二量体化され、かつ細胞質中に隔離される［１６］。アポトーシスの開始に際して、ＢＡＤは脱リン酸化を受け、かつＢＣＬ−２、ＢＣＬ−ｘＬ又はＢＣＬ−ｗとヘテロ二量体化し、これによりＢＡＫ及びＢＡＸにシトクロムＣを細胞質に放出させ、これには後続の内因性アポトーシス経路の促進が伴う［１７］。ＢＡＤは、他のタンパク質及び細胞内での機能的相互作用を有することも報告されている。例えば、ＢＡＤ発現はｐ５３により制御され、かつｐ５３とのＢＡＤ複合体はアポトーシスを促進する［１８］。Ｂａｄはｐ５３により転写的に上方制御され、かつミトコンドリアでＢａｄ／ｐ５３複合体を形成してアポトーシスを誘発する［１８］。臨床的には、ＢＡＤの高発現は前立腺癌におけるグリソンスコアの高さと関連し［１５］、かつＢＡＤのリン酸化は卵巣癌における低い全生存率を予報し［１９］、シスプラチンに対する耐性と関連する［１９］と報告されている。さらに、乳癌におけるＣＤ４４陽性の癌幹細胞（ＣＳＣ）集団の８０％を超えるリン酸化されたＢＡＤが観察され、かつＢＡＤのリン酸化がＣＳＣの生存に不可欠であることが報告されている［２０］。
【０００４】
プログラム細胞死の多数の小分子モジュレーターが発達し、これらは種々のヒトの悪性腫瘍に対する治療上の使用のためにＢＣＬ−２ファミリータンパク質を標的としている［２１−２３］。現在まで、ＢＡＤなどのＢＨ３−ｏｎｌｙタンパク質の小分子モジュレーターは報告されていない。したがって、上流の事象に影響を与えることなくＢＡＤリン酸化を阻害することにより癌を管理するための、より優れた有効な化合物／治療法を開発する必要性がある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明においては、一般式（Ｉ）の化合物：
2020517745.tif 000003
（Ｉ）
であって、Ｒ1のそれぞれが、独立してハロ、ＯＨ、シアノ、ニトロ、ＮＲ10Ｒ11、Ｃ（Ｏ）Ｒ10、Ｃ（Ｏ）ＯＲ10、Ｃ（Ｏ）ＮＲ10Ｒ11、−Ｓ（Ｏ）qＮＲ10Ｒ11、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6ハロアルキル、−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）、−Ｏ（Ｃ1-6ハロアルキル）、アリール、ヘテロアリール、−Ｏ−アリール、又は−Ｏ−ヘテロアリールであって、
Ｒ10及びＲ11のそれぞれが、Ｈ又はＯＨ、ハロ、シアノ、ＮＨ2、アリール若しくはヘテロアリールから選択される１以上の置換基により任意で置換されるＣ1-6アルキルから独立して選択され、
アルキル及びハロアルキル基Ｒ1が、ＯＨ、シアノ、−Ｓ（Ｏ）pＮＲ4Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ4Ｒ5、アリール、ヘテロアリール、−Ｏ−アリール若しくは−Ｏ−ヘテロアリール、アリールで任意で置換された−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）、又は−Ｏ（Ｃ1-6ハロアルキル）から選択される１以上の置換基により任意で置換され、
アリール又はヘテロアリール基Ｒ1が、ハロ、ＯＨ、シアノ、ニトロ、−ＮＲ4Ｒ5、−Ｓ（Ｏ）pＮＲ4Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ4Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）Ｒ4、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ4、又はＯＨ、ハロ、アリール、ヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）、Ｏ（Ｃ1-6ハロアルキル）、−Ｏ−アリール若しくは−Ｏ−ヘテロアリールから選択される１以上の置換基により任意で置換される−Ｃ1-6アルキル若しくは−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）から選択される１以上の置換基により任意で置換され、
ｐが１又は２であり、
Ｒ4及びＲ5のそれぞれが、Ｈ若しくはＣ1-4アルキルから独立して選択され、又はＲ4及びＲ5が、それらが結合する窒素原子とともにＯ、Ｎ及びＳから選択される１以上の追加のヘテロ原子を任意で含有する３員若しくは８員の複素環を形成してもよく、
ｎが０、１、２、３、４、又は５であり、
Ｒ2a及びＲ2bが、各々独立してハロ、ＯＨ、アリール又はヘテロアリールから選択される１以上の置換基により任意で置換されるＣ1-6アルキルであり、又は、
Ｒ2a及びＲ2bが、それらが結合する窒素原子とともにＯ、Ｎ又はＳから選択される１以上のさらなるヘテロ原子を任意で含有する５員又は６員の複素環を形成し、及び１以上の置換基Ｒ6により任意で置換され、
Ｒ6のそれぞれが、アリール、ヘテロアリール、−Ｏ−アリール、−Ｏ−ヘテロアリール、カルボシクリル、ヘテロシクリル、−Ｏ−カルボシクリル、−Ｏ−ヘテロシクリル、Ｒ12、ＯＲ12、Ｃ（Ｏ）Ｒ12、Ｃ（Ｏ）ＯＲ11、Ｃ（Ｏ）ＮＲ11Ｒ12、ＣＮ、ＯＨから独立して選択され、
Ｒ11及びＲ12のそれぞれが、独立してＨ若しくはＣ1-4アルキルであり、１以上のアリール又はヘテロアリール基により置換されてもよく、アリール及びヘテロアリール基は、ハロ、ＯＨ、シアノ、ニトロ、−ＮＲ4Ｒ5、−Ｓ（Ｏ）pＮＲ4Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ4Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）Ｒ4、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ4又はＯＨ、ハロ、アリール、ヘテロアリール、−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）、Ｏ（Ｃ1-6ハロアルキル）、−Ｏ−アリール若しくは−Ｏ−ヘテロアリールから選択される１以上の置換基により任意で置換される−Ｃ1-6アルキル若しくは−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）から選択される１以上の置換基により置換され、
Ｒ4及びＲ5が、上記で定義したとおりであり、又はＲ11及びＲ12が、それらが結合する窒素原子に結合して、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１以上のさらなるヘテロ原子を任意で含有する３員から８員の複素環を形成し、及びＣ1-4アルキル、Ｃ1-4ハロアルキル若しくはハロにより任意で置換されてもよく、
Ｒ3が、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル、又はヘテロシクリルであり、それらがハロ、任意でアリールにより置換されるＣ1-4アルキル、任意でアリールにより置換される−Ｏ（Ｃ1-4アルキル）、−Ｃ1-4ハロアルキル、−Ｏ（Ｃ1-4ハロアルキル）、又は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9から選択される１以上の置換基Ｒ7により任意で置換され、
Ｒ8及びＲ9のそれぞれが、独立してＨ、Ｃ1-4アルキル若しくはＣ3-6シクロアルキルから選択され、又はＲ8及びＲ9が、それらが結合する窒素原子とともにＯ、Ｎ及びＳから選択される１以上の追加のヘテロ原子を任意で含有する５員若しくは６員の複素環を形成してもよい、化合物、
又は薬学的に許容される塩、溶媒和化合物若しくはそれらの水和物又は全ての立体異性体を包含するその重水素化又はトリチウム化した変異体が提供される。
【０００６】
一般式（Ｉ）の化合物は、その上流キナーゼに影響を与えることなく部位特異的ＢＡＤリン酸化を阻害し、したがって多数の癌由来細胞のアポトーシスの促進に有用である。
本明細書においては、表現言語又必要な含意のために文脈が別途要求する場合を除き、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」若しくは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形が包括的な意味で使用され、即ち、述べられた特性の存在を明示するが、本発明の種々の実施形態におけるさらなる特性の存在又は追加を排除しない。
本明細書においては、用語「Ｃ1-6アルキル」は、１個から６個の炭素原子を有する完全に飽和した直鎖又は分岐鎖の炭化水素鎖を指す。例には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｔ−ブチル、ｎ−ヘキシルを包含される。
用語「Ｃ1-4アルキル」は、同様の意味を有するが、１個から４個の炭素原子を有するアルキル基を指す。
用語「Ｃ1-6ハロアルキル」は、上記で定義したとおりのＣ1-6アルキル基であり、１以上の水素原子がハロ原子により置き換えられている。ハロアルキル基は、１からペルハロ置換までの任意の数のハロ置換基を有し得る。例には、クロロメチル、トリフルオロメチル、１−ブロモエチル、１，１，２，２−テトラフルオロエチルなどが包含される。
【０００７】
用語「カルボシクリル」は、３個から７個の炭素原子を有し、かつ任意で１以上の炭素−炭素二重結合を含有する、非芳香族炭化水素環を指す。例には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルなどのＣ3-7シクロアルキル基、並びにシクロヘキセニルなどのシクロアルケニル基が包含される。
用語「ヘテロシクリル」は、５個から７個の炭素原子並びにＮ、Ｏ、及びＳから選択される少なくとも１つの環ヘテロ原子を有する非芳香環を指す。例には、ピペラジニル、ピペリジニル、モルホリニル、ピロリジニル及びイミダゾリニルが包含される。
本明細書においては、「ハロ」はフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨードを指す。
本明細書の文脈における用語「アリール」は、別途明示しない限り、５個から１４個の環炭素原子を有し、かつ最大で３つの環を含有する芳香族特性を有する環系を指す。アリール基が１以上の環を含有する場合、すべての環が完全に芳香族特性である必要はない。芳香族部分の例は、ベンゼン、ナフタレン、インダン及びインデンである。
本明細書の文脈における用語「ヘテロアリール」は、（別途明示しない限り）５個から１４個の環原子を有し、その少なくとも１つがＮ、Ｏ及びＳから選択されるヘテロ原子であり、かつ最大で３つの環を含有する、芳香族特性を有する環系を指す。ヘテロアリール基が１以上の環を含有する場合、すべての環が完全に芳香族特性である必要はない。ヘテロアリール基の例には、ピリジン、ピリミジン、インドール、イソインドール、ベンゾフラン、ベンゾイミダゾール、ベンゾオキサゾール、ベンゾイソオキサゾール及びインドレンが包含される。
一般式（Ｉ）の化合物においては、ｎが好適には２又は３、例えば２である。少なくとも１つのＲ1基は、ＯＨであり得る。この場合、ＯＨ基は好適には−ＣＨ（Ｒ3）ＮＲ2aＲ2b基に近接する位置である。
【０００８】
好適には、一般式（Ｉ）の化合物は、一般式（ＩＡ）の化合物：
2020517745.tif 000004
（ＩＡ）
であって、Ｒ1、Ｒ2a、Ｒ2b、及びＲ3が上記で定義したとおりであり、及びｍが０、１、２、３又は４である。
好適には、一般式（Ｉ）及び（ＩＡ）の化合物において、
Ｒ1のそれぞれが、独立してハロ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6ハロアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、アリール又はヘテロアリール基は、ハロ、ＯＨ、シアノ、ニトロ、−Ｓ（Ｏ）pＮＲ4Ｒ5、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ4Ｒ5、任意でアリールにより置換される−Ｃ1-6アルキル、−Ｃ1-6ハロアルキル、任意でアリールにより置換される−Ｏ（Ｃ1-6アルキル）、又は−Ｏ（Ｃ1-6ハロアルキル）から選択される１以上の置換基により任意で置換され、
ｐが０、１又は２であり、
Ｒ4及びＲ5のそれぞれが、独立してＨ若しくはＣ1-4アルキルから選択され、又はＲ4及びＲ5が、それらが結合する窒素原子とともにＯ、Ｎ及びＳから選択される１以上の追加のヘテロ原子を任意で含有する５員若しくは６員の複素環を形成してもよく、
Ｒ2a及びＲ2bが、各々独立してハロ、ＯＨ、アリール又はヘテロアリールから選択される１以上の置換基により任意で置換されるＣ1-6アルキルであり、又は、
Ｒ2a及びＲ2bが、それらが結合する窒素原子とともにＯ、Ｎ又はＳから選択される１以上のさらなるヘテロ原子を任意で含有する５員又は６員の複素環を形成し、及び１以上の置換基Ｒ6により任意で置換され、
Ｒ6のそれぞれが、アリール、ヘテロアリール、−Ｏ−アリール、−Ｏ−ヘテロアリール、又は１以上のアリール若しくはヘテロアリール基により置換されるＣ1-4アルキルから独立して選択され、アリール及びヘテロアリール基が、ハロ、Ｃ1-4アルキル、Ｃ1-4ハロアルキル、−Ｏ（Ｃ1-4アルキル）又は−Ｏ（Ｃ1-4ハロアルキル）から選択される１以上の置換基により置換され、
Ｒ3が、アリール、ヘテロアリール、カルボシクリル又はヘテロシクリルであり、それらがハロ、任意でアリールにより置換されるＣ1-4アルキル、任意でアリールにより置換される−Ｏ（Ｃ1-4アルキル）、−Ｃ1-4ハロアルキル、−Ｏ（Ｃ1-4ハロアルキル）、又は−Ｃ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9から選択される１以上の置換基Ｒ7により任意で置換され、
Ｒ8及びＲ9のそれぞれが、独立してＨ、Ｃ1-4アルキル若しくはＣ3-6シクロアルキルから選択され、又はＲ8及びＲ9が、それらが結合する窒素原子とともに、Ｏ、Ｎ及びＳから選択される１以上の追加のヘテロ原子を任意で含有する５員若しくは６員の複素環を形成してもよい、化合物、
又は薬学的に許容される塩、溶媒和化合物若しくはそれらの水和物又は全ての立体異性体を包含するその重水素化又はトリチウム化した変異体である。
【０００９】
一部の好適な一般式（１Ａ）の化合物においては、ｍは０であるため、Ｒ1は存在しない。
他の好適な化合物においては、ｍは１又は２であるが、より一般的には１である。
そのような場合には、Ｒ1は好適にはハロ、特にクロロ又はフルオロであり、あるいはＲ1は任意で上記したように置換されるアリール又はヘテロアリール基である。より一般的には、Ｒ1は、クロロ、フルオロ又は任意で上記したように置換されるアリールである。
Ｒ1がアリール又はヘテロアリール基である場合、それは好適にはフェニル環の４位である（炭素がＯＨ基で置換されている場所が１位として指定される）。
アリール又はヘテロアリール基Ｒ1のための好適な置換基は、ハロ、ＯＨ、シアノ、ニトロ、−ＳＯ2ＮＨ2、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ4Ｒ5、任意でアリールにより置換される−Ｃ1-4アルキル、−Ｃ1-4ハロアルキル、任意でアリールにより置換される−Ｏ（Ｃ1-4アルキル）又は−Ｏ（Ｃ1-4ハロアルキル）を包含し、Ｒ4及びＲ5が、それらが結合する窒素原子とともにピペリジン又はピロリジン環を形成する。
アリール又はヘテロアリール基Ｒ1のためのより好適な置換基は、クロロ、フルオロ、メチル、エチル、トリフルオロメチル、ベンジル、メトキシ、エトキシ、ベンジルオキシ、トリフルオロメトキシ及びピペリジン−１−カルボニルを包含する。
本発明の一部の好適な化合物においては、Ｒ2a及びＲ2bが、それらが結合する窒素原子とともに、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１以上のさらなるヘテロ原子を任意で含有し、かつ１以上の置換基Ｒ6により任意で置換され、Ｒ6が上記で定義したとおりである、５員若しくは６員の複素環を形成する。
より好適には、Ｒ2a及びＲ2bが、それらが結合する窒素原子とともに、１以上の置換基Ｒ6により任意で置換される６員の複素環を形成する。
【００１０】
さらにより好適には、Ｒ2a及びＲ2bにより形成される６員環はピペリジン環又はピペラジン環であり、最も好適にはピペラジン環である。Ｒ2a及びＲ2bがピペラジン環を形成する場合、それは１以上の上記で定義したとおりの置換基Ｒ6により任意で置換され得るが、好適には単一のＲ6置換基によりピペラジン４位で置換され、一般式（Ｉ）の化合物が一般式（ＩＢ）の化合物：
2020517745.tif 000005
（ＩＢ）
であって、Ｒ1、ｎ、Ｒ3及びＲ6が一般式（Ｉ）及び（ＩＡ）で定義したとおりである。
【００１１】
特に好適な置換基Ｒ6は、アリール、ヘテロアリール、−Ｏ−アリール、−Ｏ−ヘテロアリール又は１又は２つのアリール若しくはヘテロアリール基により置換されるメチルを包含し、アリール及びヘテロアリール基は、ハロ、メチル、エチル、トリフルオロメチル、メトキシ、エトキシ若しくはトリフルオロメトキシから選択される１以上の置換基により置換される。
さらにより好適な置換基Ｒ6は、フェニル、ヘテロアリール、−Ｏ−フェニル、−Ｏ−ヘテロアリール、ベンジル、−ＣＨ（フェニル）2、−ＣＨ2−ヘテロアリール及びーＣＨ（ヘテロアリール）2を包含し、ヘテロアリール基がピリジニル、インドリル、イソインドリル、ベンゾオキサゾリル及びベンゾイソオキサゾリルから選択され、かつ上記のＲ6基のいずれもが上記したように置換されてもよいが、より好適にはハロ、メチル、エチル、及びトリフルオロメチルから選択される１以上の置換基により置換される。
【００１２】
一般式（Ｉ）及び（ＩＡ）のより好適な化合物においては、Ｒ3は、上記で定義したとおりの１以上の置換基Ｒ7により任意で置換されるアリール又はヘテロアリールである。最も好適には、Ｒ3は、１以上の置換基Ｒ7により任意で置換されるフェニルであり、一般式（Ｉ）の化合物は一般式（ＩＣ）の化合物：
2020517745.tif 000006
（ＩＣ）
であって、Ｒ1、ｎ、Ｒ2a、Ｒ2b及びＲ7が上記で定義したとおりであり、及びｚが０から５である。
【００１３】
より好適には、ｚは０、１、２又は３であり、最も好適には０、１又は２である。
Ｒ7は上記で定義したとおりであるが、一部の好適な化合物においては、Ｒ7は存在せず（即ち、ｚは０である）、又はＲ7はハロ、−Ｃ1-4アルキル、ベンジル、−Ｏ（Ｃ1-4アルキル）ベンジルオキシ、−Ｃ1-4ハロアルキル、−Ｏ（Ｃ1-4ハロアルキル）若しくはＣ（Ｏ）ＮＲ8Ｒ9であり、Ｒ8及びＲ9が、それらが結合する窒素原子とともにピペリジニル環を形成し、又はＲ8がＨでありかつＲ9がＣ3-7シクロアルキルである。
より好適には、Ｒ7は存在せず、又はＲ7のそれぞれは独立してハロ、特にクロロ若しくはフルオロ、メチル、エチル、ベンジル、メトキシ、エトキシ、ベンジルオキシ、−Ｃ（Ｏ）−ピペリジニル又は−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ3-7シクロアルキルである。
【００１４】
一部の特に好適な本発明の化合物は、一般式（ＩＤ）の化合物：
2020517745.tif 000007
（ＩＤ）
であって、Ｒ1、ｎ、Ｒ6、Ｒ7及びｚが、一般式（Ｉ）、（ＩＡ）、（ＩＢ）及び（ＩＣ）について上記で定義したとおりである。
【００１５】
一般式（Ｉ）の化合物の例は、
２−（（２−クロロフェニル）（４−（４−メトキシフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物１）、
２−（（４−クロロフェニル）（４−（４−メトキシフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物２）、
２−（（４−（ベンジルオキシ）−３−フルオロフェニル）（４−（４−メトキシフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物３）、
（４−（（２−ヒドロキシフェニル）（４−（４−メトキシフェニル）ピペラジニル）メチル）フェニル）（ピペリジン−１−イル）メタノン（化合物４）、
３−（（５−クロロ−２−ヒドロキシフェニル）（４−（４−メトキシフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物５）、
２−（（４−（ベンジルオキシ）−３−フルオロフェニル）（４−（４−メトキシフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−４−クロロフェノール（化合物６）、
２−（（４−（ベンジルオキシ）−３−フルオロフェニル）（４−（６−フルオロベンゾ［ｄ］イソオキサゾール−３−イル）ピペリジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物７）、
２−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（ｏ−トリル）メチル）フェノール（化合物８）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メチル）ベンズアミド（化合物９、ＮＰＢ）、
２−（（４−（ベンジルオキシ）−３−フルオロフェニル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物１０）、
２−（（４−（（４−クロロフェニル）（フェニル）メチル）ピペラジン−１−イル）（フェニル）メチル）フェノール（化合物１１）、
２−（（４−（（４−クロロフェニル）（フェニル）メチル）ピペラジン−１−イル）（ｐ−トリル）メチル）フェノール（化合物１２）、
２−（（４−クロロフェニル）（４−（（４−クロロフェニル）（フェニル）メチル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物１３）、
２−（（４−（（４−クロロフェニル）（フェニル）メチル）ピペラジン−１−イル）（４−エチルフェニル）メチル）フェノール（化合物１４）、
（４−（（４−（（４−クロロフェニル）（フェニル）メチル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メチル）フェニル）（ピペリジン−１−イル）メタノン（化合物１５）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物１６）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−２’−メチル−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物１７）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−３’−メチル−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物１８）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−４’−メチル−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物１９）、
３−（（２’−クロロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物２０）、
３−（（３’−クロロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物２１）、
３−（（４’−クロロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物２２）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４’−エチル−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２３）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−４’−（ピペリジン−１−カルボニル）−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２４）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−４’−メトキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２５）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２’−エチル−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２６）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２’−フルオロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２７）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（３’−フルオロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２８）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４’−フルオロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物２９）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−３’−ニトロ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物３０）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−３’−スルファモイル−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物３１）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−２’−（トリフルオロメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物３２）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−３’−（トリフルオロメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物３３）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−ヒドロキシ−４’−（トリフルオロメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）メチル）ベンズアミド（化合物３４）、
３−（（２’−シアノ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物３５）、
３−（（３’−シアノ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物３６）、
３−（（４’−シアノ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物３７）、
３−（（２’−クロロ−４−ヒドロキシ−４’−（トリフルオロメチル）−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物３８）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（２’，４’−ジクロロ−４−ヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）ベンズアミド（化合物３９）、
３−（（４’−クロロ−２’，４−ジヒドロキシ−［１，１’−ビフェニル］−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物４０）、
３−（（４−（４−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物４１、ＮＣＫ１）、
２−（（４−クロロフェニル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物４２、ＮＣＫ２）、
２−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（３−メトキシフェニル）メチル）フェノール（化合物４３、ＮＣＫ３）、
１−（５−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メチル）チオフェン−２−イル）エタノン（化合物４４、ＮＣＫ４）、
２−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（ナフタレン−１−イル）メチル）フェノール（化合物４５、ＮＣＫ５）、
５−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メチル）フラン−２−カルバルデヒド（化合物４６、ＮＣＫ６）、
２−（（４−（５，６−ジクロロシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−イル）ピペラジン−１−イル）（２−フルオロ−３−メチルピリジン−４−イル）メチル）フェノール（化合物４７、ＮＣＫ７）、
２−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−（トリフルオロメチル）フェニル）メチル）フェノール（化合物４８、ＮＣＫ８）、
２−（（６−クロロ−５−メチルピリジン−３−イル）（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物４９、ＮＣＫ９）、
２−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（ピリジン−３−イル）メチル）フェノール（化合物５０、ＮＣＫ１０）、
１−（５−（（４−（４−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メチル）チオフェン−２−イル）エタノン（化合物５１、ＮＣＫ１４）、
３−（（４−（４−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−（ジエチルアミノ）−２−ヒドロキシフェニル）メチル）−Ｎ−シクロペンチルベンズアミド（化合物５２、ＮＣＫ１６）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（４−（ジエチルアミノ）−２−ヒドロキシフェニル）メチル）ベンズアミド（化合物５３、ＮＣＫ１８）、
Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシ−４，６−ジメトキシフェニル）メチル）ベンズアミド（化合物５４、ＮＣＫ１９）、
２−（（４−クロロフェニル）（４−（４−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物５５、ＮＣＫ２０）、
２−（（４−（４−クロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（６−メチルピリジン−３−イル）メチル）フェノール（化合物５６、ＮＣＫ２１）、
２−（ｏ−トリル（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物５７、ＳＧ１）、
２−（（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）（４−（トリフルオロメチル）フェニル）メチル）フェノール（化合物５８、ＳＧ２）、
Ｎ−シクロペンチル−４−（（２−ヒドロキシフェニル）（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）メチル）ベンズアミド（化合物５９、ＳＧ３）、
２−（（４−クロロフェニル）（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物６０、ＳＧ４）、
２−（（３−メトキシフェニル）（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物６１、ＳＧ５）、
５−（（２−ヒドロキシフェニル）（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）メチル）フラン−２−カルバルデヒド（化合物６２、ＳＧ６）、及び
２−（（６−メチルピリジン−３−イル）（４−（ｐ−トリル）ピペラジン−１−イル）メチル）フェノール（化合物６３、ＳＧ７）を包含する。
【００１６】
一般式（Ｉ）の化合物は、一般式（ＩＩ）のアルデヒド：
2020517745.tif 000008
（ＩＩ）
であって、Ｒ1及びｎが一般式（Ｉ）について定義したとおりであるアルデヒドを、
一般式（ＩＩＩ）の化合物：
2020517745.tif 000009
（ＩＩＩ）
であって、Ｒ2a及びＲ2bが一般式（Ｉ）について定義したとおりである化合物、
及び一般式（ＩＶ）のボロン酸：
2020517745.tif 000010
（ＩＶ）
であって、Ｒ3が一般式（Ｉ）について定義したとおりであるボロン酸と反応させる工程により調製することができる。
【００１７】
当該反応はペタシス反応であり、これは一般式（ＩＶ）のボロン酸を潜在的な求核種として使用して、一般式（ＩＩ）のサリチルアルデヒド誘導体と一般式（ＩＩＩ）のアミンと反応して新たな炭素−炭素結合を形成する、３成分ボロン酸マンニッヒ型反応である。ペタシス反応はイミニウム種の形成を介して進行し、イミニウム種はボロン酸と反応して第３級アミンを生成する。
好適な反応溶媒は、有機溶媒、例えばジオキサンなどの環状エーテルを包含する。
好適には、当該方法は：
ｉ．一般式（ＩＩ）の化合物を一般式（ＩＩＩ）の化合物と反応させて、中間体イミニウム種を含む混合物を形成する工程、
ｉｉ．工程（ｉ）の生成物を一般式（ＩＶ）の化合物と反応させる工程、を包含する。
好適な工程（ｉｉ）は、高温、例えば５０℃から１００℃、例えば溶媒の還流温度で実行される。溶媒がジオキサンの場合、これは約８５℃から９５℃であり、典型的には約９０℃である。
生成物を、酢酸エチルなどの第２の溶媒に抽出し、乾燥し、かつ以下の実施例に記載されるような標準的方法を用いて精製することができる。
一般式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）及び（Ｖ）の化合物は公知であり、かつ市販され又は公知の方法を用いて調製することができる。
【００１８】
一般式（Ｉ）の化合物を、一般式（Ｉ）の他の化合物から調製することも可能である。例えば、Ｒ1がアリール又はヘテロアリールにより任意で置換される一般式（Ｉ）の化合物を、Ｒ1がハロである一般式（Ｉ）の化合物から、一般式（Ｖ）の化合物：
2020517745.tif 000011
（Ｖ）
との反応であって、Ｒ1aが一般式（Ｉ）について定義したとおりに任意で置換されるアリール又はヘテロアリールである、反応により調製することができる。
当該反応は、パラジウム触媒による鈴木カップリング反応を使用して実行することができる。
一般式（ＩＶ）の化合物は公知であり、かつ市販され又は公知の方法を用いて調製することができる。
【００１９】
一般式（Ｉ）の化合物の調製方法は、本発明のさらなる態様を示す。
一般式（Ｉ）の化合物は、Ｂｃｌ−２関連死プロモーター（ＢＡＤ）タンパク質を阻害し／下方制御し／抑制することができ、特に癌細胞におけるＢｃｌ−２関連死プロモーター（ＢＡＤ）タンパク質のリン酸化を阻害し／下方制御し／抑制することができる。ＢＡＤの阻害／下方制御／抑制は、Ａｋｔ／タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ）と呼ばれる上流のＳｅｒ／Ｔｈｒキナーゼに影響を与えることなく生じる。したがって、一般式（Ｉ）の化合物は、ＢＡＤのリン酸化を優先的に阻害し／下方制御し／抑制する。
ＢＡＤの阻害／下方制御は、Ｂｃｌ−２／ＢＡＤのタンパク質−タンパク質界面内の疎水性溝を占める一般式（Ｉ）の化合物によって実行される。さらに、一般式（Ｉ）の化合物は、ジクロロフェニル部分とともにヒトタンパク質のＬｅｕ−９７、Ｔｒｐ−１４４、及びＰｈｅ−１９８の側鎖により形成される界面内の、追加の疎水性サイドポケットを占める。
式（Ｉ）の化合物は、ＢＡＤ癌細胞、特に乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、結腸癌、前立腺癌、又は膵臓癌細胞の、潜在性のある阻害剤／下方制御剤であり、かつＢＡＤのリン酸化の下方制御／阻害によりアポトーシスを誘発する。前記化合物は、癌細胞の細胞障害性を高め、かつ上流のキナーゼに影響を与えることなくＢＡＤのリン酸化の標的特異的な下方制御／阻害を実行する。
【００２０】
一般式（Ｉ）の化合物は、ＭＣＦ７細胞に対する抗癌活性によりスクリーニングされ、かつＮＰＢ（化合物９）が最も潜在性のある化合物であることが発見された。続いてＮＰＢを、正常な不死化乳腺上皮細胞（ＭＣＦ１０Ａ及びＭＣＦ１２Ａ）、正常な肝細胞（ＬＯ２）、乳癌（ＢＴ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＢＴ４７４）、子宮内膜癌（Ｉｓｈｉｋａｗａ、Ｅｃｃ−１、ＲＬ９５−２、ＡＮ３）、卵巣癌（ＳＫ−ＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ−２、Ｃａｏｖ−３、ＨＥＹ  Ｃ２、Ｏｖｃａ４３３）、肝臓癌（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈ２Ｐ，Ｈ２Ｍ）、結腸癌（ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１、Ｃａｃｏ−２）、前立腺癌（ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５）、及び膵臓癌（ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３）のパネルに対して評価した。ＮＰＢは試験した癌細胞株のすべてにおいてアポトーシスを有意に高め、かつＮＰＢは正常な肝細胞及び不死化乳腺上皮細胞に対する実質的な活性を示さなかった。ラプラシアン修正（Ｌａｐｌａｃｉａｎ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ）単純ベイズ分類器を使用して、ＮＰＢを、ＮＰＢのヒトターゲットをＢＡＤタンパク質として予測するｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ解析にかける。
ＮＰＢは癌腫細胞の範囲におけるアポトーシス性細胞死を誘発するが、正常な（不死化された）上皮細胞には細胞障害性効果を有しないことが発見された。
アポトーシスを受けている細胞の特徴的な特性（ｈａｌｌｍａｒｋ  ｆｅａｔｕｒｅｓ）は、ホスファチジルセリンの外在化、カスパーゼの活性化、及びゲノムＤＮＡの断片化である。ある実施形態においては、ＮＰＢは、ＦＩＴＣ−アネキシン−Ｖ及びヨウ化プロピジウムの染色を使用して、ＭＣＦ７細胞に対するアポトーシスを示す。ＦＩＴＣ−アネキシン−Ｖ染色は膜の完全性の損失を確認し、ＰＩ染色は後期アポトーシスイベントを示し、かつこれらの結果はカスパーゼ３／７活性に相関する。
【００２１】
したがって、本発明のさらなる態様においては、医学における使用のための一般式（Ｉ）の化合物が提供される。
一般式（Ｉ）の化合物は、癌、好適には、ＢＡＤリン酸化が存在する癌の治療に特に有用である。
したがって、さらなる態様においては、一般式（Ｉ）の化合物の癌の治療における使用が提供される。
さらに、癌の治療のための薬の調製における一般式（Ｉ）の化合物の使用が提供される。
癌を治療するための方法であって、当該方法が、そのような治療を必要とする患者に有効量の一般式（Ｉ）の化合物を投与する工程を含む方法もまた提供される。
当該化合物はＢＡＤリン酸化が存在する癌の治療に特に有用であり、例えば、癌は乳癌、子宮内膜癌、卵巣癌、肝臓癌、結腸癌、前立腺癌、若しくは膵臓癌、又はＢＡＤがリン酸化されている任意の他の上皮由来の癌であり得る。
一般式（Ｉ）の化合物は、好適には医薬組成物として投与され、したがって本発明のさらなる態様においては、一般式（Ｉ）の化合物及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提供される。
薬学的に許容される賦形剤は、アジュバント、希釈剤、担体、造粒剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、甘味剤、流動化剤、抗付着剤、帯電防止剤、界面活性剤、抗酸化剤、ゴム、コーティング剤、着色剤、香味剤、コーティング剤、可塑剤、防腐剤、懸濁剤、乳化剤、植物セルロース材料、球状化剤、他の従来公知の薬学的に許容される賦形剤、又はそれらの賦形剤の任意の組み合わせであり得る。
他の実施形態においては、本発明の医薬組成物は、腹腔内投与、肝門脈投与、静脈内投与、関節内投与、膵十二指腸動脈投与若しくは筋肉内投与、又はそれらの任意の組み合わせのために処方される。
ここで、実施例及び図面を参照して、本発明をより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１Ａ】図１Ａ及び図１Ｂは、化合物１の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図１Ｂ】図１Ａ及び図１Ｂは、化合物１の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図２】図２は、化合物２の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、化合物３の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、化合物３の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図４Ａ】図４Ａ及び図４Ｂは、化合物４の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図４Ｂ】図４Ａ及び図４Ｂは、化合物４の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図５Ａ】図５Ａ及び図５Ｂは、化合物５の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図５Ｂ】図５Ａ及び図５Ｂは、化合物５の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図６】図６は、化合物６の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図７Ａ】図７Ａ及び図７Ｂは、化合物７の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図７Ｂ】図７Ａ及び図７Ｂは、化合物７の1Ｈ−ＮＭＲ及び13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図８】図８は、化合物８の13Ｃ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図９Ａ】図９Ａ及び図９Ｂは、化合物９の1Ｈ−ＮＭＲ及びＬＣＭＳスペクトルを表す。
【図９Ｂ】図９Ａ及び図９Ｂは、化合物９の1Ｈ−ＮＭＲ及びＬＣＭＳスペクトルを表す。
【図１０】図１０は、化合物１０の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図１１】一連の癌腫細胞株におけるＮＰＢのＩＣ５０値である。
【図１２】ＮＰＢは癌腫細胞株の細胞生存率を抑え、かつアポトーシスを促進する。乳腺、子宮内膜、卵巣、肝臓、結腸、前立腺、及び膵臓の癌腫細胞株を包含する癌腫細胞の生存率に対する、ＮＰＢ（５μＭ）の効果。（Ａ）細胞生存率、（Ｂ）カスパーゼ３／７活性、及び（Ｃ）細胞障害性を、方法論に記載されているようにＡｐｏＴｏｘ−ＧｌｏTM  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用して評価した。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５を使用して、独立両側スチューデントｔ検定により評価した。列は、３回の測定の平均を示す；バー、±ＳＤ。**Ｐ＜０．００１、*Ｐ＜０．０５。注：ＲＦＵ、相対蛍光単位；ＲＬＵ、相対発光単位；＃、非形質転換の不死化上皮細胞；ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１。
【図１３】ＮＰＢはＭＣＦ７細胞におけるアポトーシス性細胞死を刺激する。（Ａ）１０μＭのＮＰＢによる処理後にフローサイトメトリー解析を使用して測定した、ＭＣＦ７細胞のアポトーシス性細胞死。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ染色をＸ軸に示し、ＰＩ染色をＹ軸に示す。左下の象限は生存細胞を示し、右下の象限は初期アポトーシス細胞を示し、左上の象限は壊死細胞を示し、右上の象限は後期アポトーシス細胞を表す。取得したアネキシンＶ及びＰＩデータを、各象限において百分率（％）で示す。（Ｂ）１０μＭのＮＰＢによる処理後にフローサイトメトリー解析を使用して測定した、ＭＣＦ７細胞の細胞周期解析。（Ｃ）ＮＰＢ又はＤＭＳＯへの暴露の後、３Ｄマトリゲル中で１４日間培養した、ＭＣＦ７細胞により生成された、施された（ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ）コロニーのＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）生存率アッセイを使用した細胞生存率。ＮＰＢ又はＤＭＳＯへの暴露の後、３Ｄマトリゲル中で培養した、ＭＣＦ７細胞により生成されたカルセインＡＭ染色コロニーの顕微鏡可視化（下）。（Ｄ）ＮＰＢ又はＤＭＳＯへの暴露の後、軟寒天中で培養した、ＭＣＦ７細胞により生成されたコロニーの、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）生存率アッセイを使用した細胞生存率。（Ｅ）ＮＰＢ又はＤＭＳＯへの暴露の後の、ＭＣＦ７細胞により生成されたｆｏｃｉコロニーのクリスタルバイオレット染色。すべてのアッセイを、方法論に記載されているように実行した。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５を使用して、独立両側スチューデントｔ検定により評価した。列は、３回の測定の平均を示す；バー、±ＳＤ。**Ｐ＜０．００１、*Ｐ＜０．０５。
【図１４】ケモインフォマティクス及び表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析は、ＮＰＢのＢＡＤタンパク質に対する相互作用を予測する。（Ａ）ＮＰＢのＢＡＤタンパク質サブユニットを伴うＳＰＲ解析により得られたセンサーグラム。ＢＡＤタンパク質サブユニットを、ＣＭ５センサーチップの表面に固定した。様々な濃度（２０〜１００μＭ）のＮＰＢの溶液を注入して、時間（秒）の関数として記録された結果の結合応答（ｒｅｓｕｌｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ）（ＲＵ）を生成した。結果を、ＢＩＡ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．１を使用して解析した。（Ｂ）ウエスタンブロット（ＷＢ）解析を使用して、ＮＰＢによる処理後のＭＣＦ７細胞におけるＢＡＤのＳｅｒ９９リン酸化のレベルを評価した。（下）米国のＮＩＨのＩｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ／）を使用して、上記のＢＡＤリン酸化、ＢＡＤ及びβ−アクチンの用量応答からの、ＮＰＢの計算されたＩＣ50。（Ｃ）ＷＢ解析を使用して、ＮＰＢによる処理後のＭＣＦ７細胞中のＢＡＤの上流に関与する、多数のタンパク質のレベルを評価した。（Ｄ）ＷＢ解析を使用して、ＮＰＢによる処理後のＭＣＦ７細胞中の細胞生存及び細胞増殖に関与する、多数のタンパク質のレベルを評価した。ＷＢ解析については、方法論に記載されているように、可溶性全細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、かつ免疫ブロットした。β−アクチン（ＡＣＴＢ）を、細胞ライセートの入力コントロールとして使用した。検出されたタンパク質バンドのｋＤａでのサイズを、左側に示す。
【図１５】ＮＰＢは、ＡＫＴのシグナル伝達から独立して、癌腫細胞株中のＢＡＤの（Ｓｅｒ９９での）リン酸化を特異的に阻害する。（Ａ）ＷＢ解析を使用して、乳腺、卵巣、膵臓、子宮内膜、肝細胞、結腸及び前立腺を包含する一連の癌腫細胞株における、（Ｓｅｒ７５及びＳｅｒ９９で）リン酸化されたヒトＢＡＤ及びＢＡＤタンパク質のレベルを評価した。総ＢＡＤを、細胞ライセートの入力コントロールとして使用した。（Ｂ）ＷＢ解析を使用して、ＭＣＦ７、Ｃａｏｖ−３、Ｉｓｈｉｋａｗａ、及びＡｓＰＣ−１細胞におけるｐＢＡＤ（Ｓｅｒ９９）及びｐＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）、ＡＫＴ及びＢＡＤのレベルを評価した。それぞれ５μＭのＡＫＴ阻害剤（ＩＶ）及びＮＰＢを使用して、細胞を処理した。ＡＫＴ発現の枯渇を、方法論に記載されているように、ＡＫＴ転写産物に向けられた小ヘアピン（ｓｈ）−ＲＮＡ（１及び２）の一過的な遺伝子導入を使用して達成した。β−アクチンを、細胞ライセートの入力コントロールとして使用した。ＷＢ解析については、方法論に記載されているように、可溶性全細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、かつ免疫ブロットした。検出されたタンパク質バンドのｋＤａでのサイズを、左側に示す。注：＃；非形質転換不死化細胞株。
【図１６】ｓｉＲＮＡを介したＢＡＤ発現の枯渇は、癌腫細胞株におけるＮＰＢの効果を妨げる。（Ａ）ＷＢ解析を使用して、５μＭのＮＰＢで処理した後に、ＭＣＦ７、ＢＴ４７４、Ｃａｏｖ−３、Ｉｓｈｉｋａｗａ、ＡｓＰＣ−１、及びＤＬＤ−１細胞におけるｐＢＡＤ（Ｓｅｒ９９）活性及びＢＡＤタンパク質のレベルを評価した。ＢＡＤ発現の枯渇を、ＢＡＤ転写産物に向けられた低分子干渉（ｓｉ）−ＲＮＡの一過的な遺伝子導入を使用して達成した。材料及び方法に記載されて医療に、可溶性全細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、かつ免疫ブロットした。β−アクチンを、入力コントロールとして使用した。ＭＣＦ７、ＢＴ４７４、Ｃａｏｖ−３、Ｉｓｈｉｋａｗａ、ＡｓＰＣ−１、及びＤＬＤ−１細胞におけるＮＰＢ（５μＭ）の効果。（Ｂ）細胞生存率及び（Ｃ）カスパーゼ３／７活性を、ＡｐｏＴｏｘ−ＧｌｏTMＴｒｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔを使用して評価した。すべてのアッセイを、方法論に記載されているように実行した。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５を使用して、独立両側スチューデントｔ検定により評価した（Ｐ＜０．０５を有意であるとみなした）。列は、３回の測定の平均を示す；バー、±ＳＤ。**Ｐ＜０．００１、*Ｐ＜０．０５。注：ＲＦＵ、相対蛍光単位；ＲＬＵ、相対発光単位。
【図１７】ＮＰＢは、乳癌のＢＡＤ  Ｓｅｒ９９のリン酸化を阻害し、かつ腫瘍の成長を阻害する。（Ａ）材料及び方法に記載した、ＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ雌マウスの腫瘍体積の測定。動物（各グループｎ＝５）をビヒクル、５ｍｇ／ｋｇのＮＰＢ、又は２０ｍｇ／ｋｇのＮＰＢにより処理し、かつ相対腫瘍量を記録した。実験期間中、動物質量を毎日測定した。（Ｂ）ＮＰＢ治療レジメンの後に腫瘍を切除し、質量を測定した。代表的な切除腫瘍を、右側に示す。（Ｃ）ｐ−ＢＡＤ（Ｓｅｒ９９）及びＢＡＤのレベルを決定するための腫瘍組織のＷＢ。方法論に記載されているように、可溶性全細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、かつ免疫ブロットした。β−アクチンを、入力コントロールとして使用した。検出されたタンパク質バンドのｋＤａでのサイズを、左側に示す。（Ｄ）リン酸化ＢＡＤ、ＢＡＤ、Ｋｉ６７及びタネル染色の組織学的解析。腫瘍組織切片を、ヤギ抗ｐＢＡＤ（Ｓｅｒ１３６）ポリクローナル抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、マウス抗ＢＡＤモノクロールナル（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び抗Ｋｉ６７抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１５５８０）で免疫標識し、かつヘマトキシリンで染色した。方法論に記載されているように、ＴＵＮＥＬ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｇｅｎ  Ｓｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．）を使用して、アポトーシスＤＮＡ断片化を検出した。統計的有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５を使用して、独立両側スチューデントｔ検定により評価した（Ｐ＜０．０５を有意であるとみなした）。点は、３回の測定の平均を示す；バー、±ＳＤ。**Ｐ＜０．００１、*Ｐ＜０．０５。
【図１８】（Ａ）ウエスタンブロット解析を使用して、ＮＰＢ（１０μＭ）による処理期間を長くした後、ＭＣＦ７細胞のｐＢＡＤ、ＢＡＤ、ｐＡＫＴ、及びＡＫＴのＢＡＤ  Ｓｅｒ９９リン酸化のレベルを評価した。方法論に記載されているように、可溶性全細胞抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動し、かつ免疫ブロットした。検出されたタンパク質バンドのｋＤａでのサイズを、左側に示す。（Ｂ）ウエスタンブロットアレイ（Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｐｒｏｆｉｌｅｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｋｉｎａｓｅ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔ）を使用して、キナーゼ及びリン酸化基質を検出した。細胞ライセートの調製の前に、ＭＣＦ７細胞をＮＰＢ（１０μＭ）又はＤＭＳＯで、３７℃で１２時間処理した。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェアを用いて平均ピクセル密度を解析し、これを以下に示す。
【図１９】図１９は、ＮＣＫ５の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図２０】図２０は、ＮＣＫ１６の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図２１】図２１は、ＮＣＫ１８の1Ｈ−ＮＭＲスペクトルを表す。
【図２２Ａ】図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃ、図２２Ｄ、及び図２２Ｅは、癌腫細胞株におけるＮＰＢ構造ベースの類似体のＩＣ50値である。注：ＮＶ、値なし。
【図２２Ｂ】図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃ、図２２Ｄ、及び図２２Ｅは、癌腫細胞株におけるＮＰＢ構造ベースの類似体のＩＣ50値である。注：ＮＶ、値なし。
【図２２Ｃ】図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃ、図２２Ｄ、及び図２２Ｅは、癌腫細胞株におけるＮＰＢ構造ベースの類似体のＩＣ50値である。注：ＮＶ、値なし。
【図２２Ｄ】図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃ、図２２Ｄ、及び図２２Ｅは、癌腫細胞株におけるＮＰＢ構造ベースの類似体のＩＣ50値である。注：ＮＶ、値なし。
【図２２Ｅ】図２２Ａ、図２２Ｂ、図２２Ｃ、図２２Ｄ、及び図２２Ｅは、癌腫細胞株におけるＮＰＢ構造ベースの類似体のＩＣ50値である。注：ＮＶ、値なし。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示の実施例に到達するために利用した材料
細胞培養及び試薬―
ヒトの不死化乳腺上皮細胞株であるＭＣＦ１０Ａ及びＭＣＦ１２Ａ、並びに不死化肝細胞表皮細胞株であるＬＯ２を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、メリーランド州、ロックビル）から取得し、かつＡＴＣＣの増殖指示（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）の通りに培養した。ＭＣ細胞株であるＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、ＢＴ４７４、ＢＴ５４９、及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＭＢ−２３１と示す）、子宮内膜癌腫細胞株であるＩｓｈｉｋａｗａ、ＥＣＣ１、ＲＬ９５−２、及びＡＮ３、肝細胞癌腫細胞株であるＨｅｐ３Ｂ、Ｈ２Ｐ、及びＨ２Ｍ、結腸癌腫細胞株であるＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１、及びＣａｃｏ−２、並びに前立腺癌腫細胞株であるＰＣ３、ＬＮＣａＰ、ＤＵ１４５を、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、メリーランド州、ロックビル）から取得した。卵巣癌腫細胞株であるＳＫ−ＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ−２、Ｃａｏｖ−３、ＨＥＹ  Ｃ２、及びＯｖｃａ４３３を、シンガポール国立大学（ＮＵＳ）のＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＳｉｎｇａｐｏｒｅのＲｕｂｙ  Ｈｕａｎｇ博士の研究室から取得した。膵臓癌腫細胞株を、シンガポール国立大学（ＮＵＳ）のＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  ＳｉｎｇａｐｏｒｅのＨ．Ｐｈｉｌｌｉｐ  Ｋｏｅｆｆｅｌｅｒ教授の研究室から取得した。すべての癌腫細胞株を、ＡＴＣＣの増殖指示の通りに培養した。ＡＫＴ阻害剤ＩＶを、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（米国、カリフォルニア州、サンディエゴ）から購入した。ＢＡＤに向けられたｓｔｅａｌｔｈ（ｓｈ）−ＲＮＡ−ＢＡＤ（ｓｈＲＮＡ−ＢＡＤ１、５’−ＧＣＵＣＣＧＣＡＣＣＡＵＧＡＧＵＧＡＣＧＡＧＵＵＵ−３’及びｓｈＲＮＡ−ＢＡＤ２、５’ＡＡＡＣＵＣＧＵＣＡＣＵＣＡＵＣＣＵＣＣＧＧＡＧＣ３’）を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（シンガポール）から購入した。ＡＫＴに向けられたｓｈＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ−ＡＫＴ１、５’−ＣＣＧＧＣＧＣＧＴＧＡＣＣＡＴＧＡＡＣＧＡＧＴＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＡＣＴＣＧＴＴＣＡＴＧＧＴＣＡＣＧＣＧＴＴＴＴＴＧ−３’及びｓｈＲＮＡ２−ＡＫＴ、５’−ＣＣＧＧＧＧＡＣＴＡＣＣＴＧＣＡＣＴＣＧＧＡＧＡＡＣＴＣＧＡＧＴＴＣＴＣＣＧＡＧＴＧＣＡＧＧＴＡＧＴＣＣＴＴＴＴＴＧ−３’）を、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（シンガポール）から購入し、ＰＬＫＯ．１ベクター（Ｓｉｇｍａ、シンガポール）にクローニングした。細胞を、２０ｎＭのｓｈＲＮＡ（ＡＫＴ若しくはＢＡＤ）又は汎用ネガティブコントロール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国、カリフォルニア州、カールスバッド）とともに、２４時間のＦｕＧＥＮＥ  ＨＤ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて一過的に遺伝子導入し、かつさらなるアッセイを実行した。アラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、クレアチンキナーゼ（ＣＫ）、血中尿素窒素（ＢＵＮ）の市販キットを、インドのケーララ州のＡＧＡＰＰＥ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから購入した。
【００２４】
実施例１
式Ｉの化合物の合成及び特徴づけ
式Ｉの化合物の一般合成
ピペラジン（０．８ｍｍｏｌ）及びサリチルアルデヒド（０．８ｍｍｏｌ）をＲＢＦに取り、ジオキサンを溶媒として使用して約１０分間攪拌する。約１０分間の後、アリールボロン酸（０．８ｍｍｏｌ）を混合物に追加し、ジオキサンを溶媒として用いて、約９０℃に維持したホットプレート上で約８時間の連続的な攪拌により還流させる。約８時間の後、酢酸エチル及び水を反応混合物に追加し、酢酸エチル層を、分液漏斗を用いて分離し、無水硫酸ナトリウム上で乾燥させる。酢酸エチルを蒸発させて生成物を得る。所望のフェノール化合物生成物を、カラムクロマトグラフィーを用いた分離により得る。
【００２５】
化合物１から１５及び４１から６３を得るために使用する特定の試薬が、以下の表１に提供される。
【表１−１】
2020517745.tif 000012
【表１−２】
2020517745.tif 000013
【表１−３】
2020517745.tif 000014
【表１−４】
2020517745.tif 000015
【表１−５】
2020517745.tif 000016
【表１−６】
2020517745.tif 000017
【表１−７】
2020517745.tif 000018
【００２６】
表２に示す化合物を、ＮＰＢ臭化物（表２の第１欄を参照）をボロン酸とともに、概略図１に示すパラジウム触媒鈴木カップリング反応を用いて反応させることにより得た。
概略図
2020517745.tif 000019
【００２７】
【表２−１】
2020517745.tif 000020
【表２−２】
2020517745.tif 000021
【表２−３】
2020517745.tif 000022
【表２−４】
2020517745.tif 000023
【表２−５】
2020517745.tif 000024
【表２−６】
2020517745.tif 000025
【表２−７】
2020517745.tif 000026
【００２８】
化合物１の特徴づけ
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ：３．６９１（ｓ、３Ｈ）、５．３０３（ｓ、１Ｈ、Ｃ−Ｈ）、１．１８４−３．６９１（ｍ、８Ｈ−ピペラジンプロトン）、７．５９７−７．６１５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．３４１−７．３２３（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、７．０６０−７．１８９（ｍ、４Ｈ−ＡｒＨ）、６．５５５−６．８１５（ｍ、５Ｈ−ＡｒＨ）、６．９５６−６．９７４、（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）１１．８５（ｓ、１Ｈ−ＯＨｂｒｄピーク）；13ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：５０．８５４、５５．５２１、６９．５０、１１４．４５、１１７．１７、１１８．４４、１１９．５４７、１２２．０５、１２７．７８、１２８．８３、１２９．０１、１２９．１９、１２９．８４、１２９．９３、１３３．８９、１４５．１１、１５６．６０；融解点１２０−１２４℃。（図１）
化合物２の特徴づけ
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ：２．５３９−３．０６５（ｍ、８Ｈ）、３．６７４（ｓ、３Ｈ）、４．３５９（ｓ、１Ｈ）、６．６５１（ｍ、１Ｈ）、６．７４０−６．８０４（ｍ、５Ｈ）、６．８５５−６．８７２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６．８Ｈｚ）、７．０８６（ｍ、１Ｈ）、７．１６５（ｍ、２Ｈ）、７．２８０（ｍ、１Ｈ）、７．３６１（ｍ、１Ｈ）；13ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：５０．７４、５１．７６、５５．５２、７５．８６、１１４．４９、１１７．２４、１１８．４３、１１９．６２、１２４．４１、１２６．５８、１２８．２８、１２８．５４、１２８．９２、１２９．２０、１３０．２８、１３４．６６、１４１．６３、１４５．０７、１５４、１５６．１８；融解点８５−８９℃。（図２）
【００２９】
化合物３の特徴づけ
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ：１．１９４−３．０７９（ｍ，８Ｈ）、３．６８９（ｓ、３Ｈ）、４．３３６（ｓ、１Ｈ）、５．０４１（ｓ、２Ｈ）、６．６７２−６．７０２（ｍ、１Ｈ）、６．７８１−６．８１９（ｍ、５Ｈ）、６．８６３−６．８６７（ｍ、２Ｈ）、７．０２６−７．０８２（ｍ、２Ｈ）、７．１９６（ｍ、１Ｈ）、７．２７９−７．３４８（ｍ、５Ｈ）；13ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：５０．７７０、５５．５２、７１．２６、７５．３６、１１４．４６、１１５．４６、１１７．１６、１１８．４２、１１９．５４、１２４．８２、１２７．３４、１２８．１４、１２８．６２、１２８．７６、１２９．１４、１４５．０４、１５６．１４；融解点７２−７６℃。（図３）
化合物４の特徴づけ
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ：１．１８３−２．４６９（ｍ、１０Ｈ）、２．５５７−３．６８４（ｍ、８Ｈ）、３．６８４（ｓ、３Ｈ）、４．４１２（ｓ、１Ｈ）、６．６３１（ｍ、２Ｈ）、６．７４５−６．８１３（ｍ、４Ｈ）、７．０５９−７．０９５（ｍ、１Ｈ）、７．１９１−７．２１６（ｍ、１Ｈ）、７．２６１−７．２６９（ｍ、２Ｈ）、７．３５１−７．４０９（ｍ、２Ｈ）；13ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：２４．５１、２６．５２５、２９．６８、４３．６０、４８．７３、５０．７１、５１．８０、５５．５１、７６．０４、１１４．４５、１１７．１３４、１１８．３６６、１１９．１９８、１１９．５２、１２４．７５、１２６．７４、１２７．５０、１２８．０４、１２８．５０、１２８．７９、１２９．２９、１３６．１８、１４１．０２、１４５、１５４、１５６．２、１６９．７９（Ｃ＝Ｏ）；融解点７８−８２℃。（図４）
【００３０】
化合物５の特徴づけ
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ：１．１８６−１．６５０（ｍ、８Ｈ）、１．９７８−３．６３３（ｍ、８Ｈ）、３．６８９（ｓ、３Ｈ）、４．２９８−４．３４５（ｍ、１Ｈ）、４．４２１（ｓ、１Ｈ）、５．９７９−５．９９２（ｓ、１Ｈ）６．７３６−６．８０３（ｍ、５Ｈ）、６．８６０（ｍ、１Ｈ）、７．１９２（ｓ、１Ｈ）、７．７３７（ｓ、１Ｈ）、７．３０４−７．３３９（ｍ、１Ｈ）、７．５４０−７．５５７（ｍ、２Ｈ）；13ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：２３．７９、３３．１８、５０．６７、５１．８３、５５．５１、６７．０６、７５．０６、１１４．４６、１１８．４５、１１８．５８、１２４．０２、１２６．１１、１２６．４２、１２８．７２、１２８．８７、１２９．３９、１３９．３９、１４４．８９、１５４．１９、１５４．９５、１６６．６８；融解点１０２−１０６℃。（図５）
化合物６の特徴づけ
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ：１．１７９−３．６２０（ｍ、８Ｈ）、３．６７６（ｓ、３Ｈ）、４．２６１（ｓ、１Ｈ）、５．０２９（ｓ、２Ｈ）、６．７１６−６．７９１（ｍ、５Ｈ）、６．８２３（ｍ、１Ｈ）、６．８６２−６．８８２（ｍ、１Ｈ）、６．９７３−７．０１５（ｍ、２Ｈ）、７．１１０−７．１３９（ｍ、１Ｈ）、７．２４３−７．２５８（ｍ、２Ｈ）、７．２８０−７．３１７（ｍ、１Ｈ）、７．３３１−７．３５０（ｍ、２Ｈ）；13ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：５０．７０、５１．５９、５５．５２、７１．２７、７４．９３、１１４．４８、１１５．５２、１１８．５８、１２３．９７、１２４．３９、１２６．３、１２７．３、１２８．２、１２８．８、１３２．１、１３６．２７、１４４．９６、１４６．７４、１５４．１９、１５４．９３；融解点６０−６４℃。（図６）
【００３１】
化合物７の特徴づけ
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ：２．６４８−３．８２０（ｍ、８Ｈ）  ４．２４５（ｓ、１Ｈ）、５．００９（ｓ、１Ｈ）、５．６５１（ｓ、２Ｈ）、７．２７６（ｓ、１Ｈ）、７．４３６−７．４８５（ｍ、３Ｈ）、７．６０６−７．６８２（ｍ、３Ｈ）、７．７９７（ｍ、２Ｈ）、７．８７６−７．９５４（ｍ、５Ｈ）、８．１８５（ｓ、１Ｈ）；13ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：３０．９７２、５０．７６、６７．６０、７１．７９、７５．８５、９８．１６、１００．９、１０４．９、１１３．１６、１１５．９７、１１７．６５、１１９．９６、１２２．８４、１２５．４、１２７．８、１２８．６、１２９．１、１２９．６、１３３．２、１３６．８、１５７．０６、１６０．８７、１６４．５１、１６５．８６；融解点５８−６２℃。（図７）
化合物８の特徴づけ
1Ｈ  ＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ：２．４７９（ｓ、３Ｈ）、４．９２７（ｓ、１Ｈ）、２．２６０−３．０６３（ｍ、８Ｈ）、６．５３３−６．５５１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．２Ｈｚ）、６．６３１−６．６９２（ｍ、２Ｈ）、６．７３９−６．７５８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、６．７８９−６．８０９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝８Ｈｚ）、６．８６４（ｍ、３Ｈ）、７．０９２−７．１８３（ｍ、１Ｈ）、７．２８１−７．２９７（ｍ、１Ｈ）、７．５３７−７．５５２（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝６Ｈｚ）；13ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：２０．９２、５１．１６、５１．４２、７３．４４、１１６．０７、１１６．９６、１１７．１４、１１８．７１６、１１９．２７、１１９．８３、１２４．９６５、１２５．２４、１２６．４４５、１２７．１２、１２７．５４５、１２８．２６６、１２８．７２９、１２９．２６０、１３０．８６９、１３４．０７２、１３８．１７１、１５０．６００、１５６．４４３；融解点１０８−１１２℃。（図８）
【００３２】
化合物９（ＮＰＢ）の特徴づけ
1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ：１．１８３−１．６４７（ｍ、８Ｈ）、２．０１９−３．０６７（ｍ、８Ｈ）、４．５０９（ｓ、１Ｈ）、４．３１２−４．３２７（ｍ、１Ｈ、ＮＨ）、５．９６５（ｓ、１Ｈ）、６．６６８（ｍ、１Ｈ）、６．８０１−６．８９６（ｍ、３Ｈ）、７．０７３−７．１９０（ｍ、３Ｈ）、７．３０５（ｍ、１Ｈ）、７．５２７−７．５４２（ｍ、２Ｈ）、７．７７０（ｓ、１Ｈ）；13ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：２３．７８、３３．１８、５１．２２、５１．７８、７６．１０、１１７．１４、１１８．５９、１１９．６７、１２４．６９、１２４．９８、１２６．２２、１２７．５３、１２８．８５、１２９．２９、１３１．０８、１３４．０８、１３５．５３、１４０．２８、１５０．５、１５６．１、１６６．７３；ｍ／ｚ（Ｍ＋２、５２６．２，５２７．２）；融解点１７４−１７８℃。（図９）
化合物１０の特徴づけ
1ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ3、４００ＭＨｚ）δ：１．１８３−３．０７４（ｍ、８Ｈ）、４．３６１（ｓ、１Ｈ）、５．０３４（ｓ、２Ｈ）、６．６５８−６．６９４（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝７，２Ｈｚ）、６．７６８（ｍ、１Ｈ）、６．８５６−６．８７３（ｍ、３Ｈ）、７．０２３（ｍ、１Ｈ）、７．０５５−７．０９４（ｍ、３Ｈ）、７．１６４（ｍ、１Ｈ）、７．２３１（ｍ、１Ｈ）、７．２６６（ｍ、１Ｈ）、７．３０４（ｍ、１Ｈ）、７．３２２−７．３５５（ｍ、２Ｈ）；13ＣＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）δ：５１．２６４、７１．２６０、７５．４３４、１１７．１５、１１８．６、１１９．６、１２４．８、１２４．９、１２７．３、１２７．５、１２８．１、１２８．６、１２８．８、１２９．１８、１５０．５、１５６．０９；融解点７５−８０℃。（図１０）
【００３３】
実施例２
式Ｉの化合物は、一連の癌腫細胞の細胞生存率を低下させる
発癌性アッセイ
まず、ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ（登録商標）細胞生存率アッセイを用いて、新規に合成した小分子化合物のＭＣＦ７細胞（ＥＲ＋ＭＣ細胞）に対する効果を調査した。一連の新規の小分子化合物の中で、ＮＰＢを、ビヒクル（ＤＭＳＯ）処理細胞と比較してＭＣＦ７細胞の生存率を低下させる有効な小分子化合物として同定した。化合物の中で、化合物９  Ｎ−シクロペンチル−３−（（４−（２，３−ジクロロフェニル）ピペラジン−１−イル）（２−ヒドロキシフェニル）メチル）ベンズアミド（ＮＰＢ）を、６．５μＭのＩＣ50で最も潜在性のある抗増殖性の化合物として同定した。次いで、ＥＲ−乳腺（ＢＴ５４９、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）、ＥＲ＋乳腺（ＭＣＦ７、Ｔ４７Ｄ、及びＢＴ４７４）、子宮内膜（Ｉｓｈｉｋａｗａ、ＥＣＣ−１、ＲＬ９５−２、及びＡＮ３）、卵巣（ＳＫ−ＯＶ−３、ＯＶＣＡＲ−２、Ｃａｏｖ−３、ＨＥＹ  Ｃ２、及びＯＶＣＡ４３３）、肝細胞（Ｈｅｐ３Ｂ、Ｈ２Ｐ、及びＨ２Ｍ）、結腸（ＨＣＴ１１６、ＤＬＤ−１、及びＣａｃｏ−２）、前立腺（ＰＣ３、ＬＮＣａＰ、及びＤＵ１４５）並びに膵臓（ＡｓＰＣ−１、ＢｘＰＣ−３）癌腫に由来するものを包含する広範囲の癌腫細胞株におけるＮＰＢの阻害濃度５０％（ＩＣ50）を決定した。正常細胞のコントロールとして、不死化乳腺上皮細胞（ＭＣＦ１０Ａ及びＭＣＦ１２Ａ）、並びに不死化肝細胞（ＬＯ２）もまた細胞株のパネルに包含した。癌腫細胞株におけるＮＰＢのＩＣ50値を、図１１に表にする。
【００３４】
実施例３
ＮＰＢは、一連の癌腫細胞株におけるアポトーシス性細胞死を誘発する
さらに、ＮＰＢをいくつかの癌由来細胞株に対して評価し、製造元の指示に従ってＡｐｏＴｏｘ−ＧｌｏTM  Ｔｒｉｐｌｅｘ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ（シンガポール）を使用して全ての細胞生存率、アポトーシス、及び細胞障害性に対する効果を決定する（図１２）。手短に言えば、細胞を黒色の不透明な９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）、シンガポール）に播種する。細胞の一晩のインキュベーションの後、培地を指定のＮＰＢ濃度に変更する。約４８時間のインキュベーションの後、ＧＦ−ＡＦＣ基質及びｂｉｓ−ＡＡＦ−Ｒ１１０基質の両方を含有する生存率／細胞障害性試薬を、供給元の提案に従って細胞に加える。約３７℃での約４５分間のインキュベーション後、蛍光用Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、シンガポール）を用いて、生存率については４００ｎｍ励起／５０５ｎｍ放射、細胞障害性については４８５ｎｍ励起／５２０ｎｍ放射で蛍光を記録する。Ｃａｓｐａｓｅ−Ｇｌｏ  ３／７  Ｒｅａｇｅｎｔをさらに細胞に加え、室温での約２５分間のインキュベーション後、Ｔｅｃａｎマイクロプレートリーダーを使用して発光を記録する。生存細胞、細胞障害性細胞、及びアポトーシス性細胞の数を３回測定する。
【００３５】
アネキシンＶ及びヨウ化プロビジウム（アネキシンＶ−ＰＩ）アポトーシスアッセイ
ホスファチジルセリン暴露及び細胞死を、Ａｎｎｅｘｉｎ−Ｖ−ＦＬＵＯＳ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、シンガポール）及びＰＩ染色細胞を用いてＦＡＣＳ解析により評価する。手短に言えば、１×１０5ＭＣＦ細胞／ウェル（１９０μＬ／ウェル）を６ウェルプレートに播種して異なる濃度のＮＰＢとともに約２４時間インキュベートし、ＤＭＳＯ処理した試料をコントロールとして使用する。続いて細胞をアネキシンＶ結合バッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ、ｐＨ７．４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ2）で洗浄し、アネキシンＶ  ＦＩＴＣとともに暗所にて室温で約３０分間染色し、次いで再度洗浄し、ＰＩを含有するアネキシンＶ結合バッファー中に再懸濁する。試料を、直ちにＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、サンロゼ）上で解析する。
膜統合性の損失及び原形質膜の外側の小葉へのホスファチジルセリンの移行は、アポトーシスの初期段階のイベントであり、これはＦＩＴＣ結合アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウム染色を使用して検出することができる。ＦＩＴＣ−アネキシンＶ及びヨウ化プロピジウムを使用して、ＮＰＢがＭＣＦ７細胞におけるアポトーシスを誘発することが観察される。ＮＰＢを用いた処理により、初期（ＰＩ陰性、ＦＩＴＣ−アネキシンＶ陽性）及び後期アポトーシス細胞（ＰＩ陽性、ＦＩＴＣ−アネキシンＶ陽性）の両方の増加が、図１３Ａに示すように、用量に依存した挙動で観察される。
【００３６】
実施例４
ＮＰＢの組み換えＢＡＤタンパク質との分子相互作用
最も有望な候補である、ＮＰＢのＢＡＤに対する結合親和性の分子相互作用を提供するため、ＮＰＢを分析物として使用して、固定化ＢＡＤサブユニットとともに表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を実行した。本発明者らは、ＢＡＤがｉｎ  ｖｉｔｒｏでＢＡＤサブユニットに結合し得ることを了知している。ゆえに、ＢＩＡコアシステムを使用して相互作用を解析した。組み換えＢＡＤをＣＭ５センサーチップ上に固定した。結合曲線及び解離曲線を決定するため、様々な濃度のＮＰＢをＢＡＤでコーティングされたセンサーチップの表面に、個別に注入した。図１４に示すオーバーレイしたセンサーグラムを、まとめて解析した。ＢＡＤのＮＰＢに対する直接的な結合が証明された（図１４Ａ）。ＮＰＢとＢＡＤの相互作用の動態パラメーターの計算により、結合親和性の（１．４±．４）×１０3Ｍ-1Ｓ-1の結合速度定数及び（５．４±０．３８）×１０3Ｓ-1の解離速度定数が明らかになり、これは３７．１２μＭの解離平衡定数（Ｋｄ）をもたらした。これらの動態パラメーターは、ＢＡＤとＮＰＢ構造の相互作用に対する親和性のサポートを示す。
【００３７】
表面プラズモン共鳴解析
分子相互作用を、ＢＩＡｃｏｒｅ−２０００  ｓｙｓｔｅｍ（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ、  スウェーデン、ウプサラ）を使用して、表面プラズモン共鳴に基づいて解析した。ヒト組み換えＢＡＤタンパク質（カタログＮｏ．ＭＢＳ１４３０１２、ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ、米国）を、製造元のプロトコルに記載されているようにセンサーチップ上に固定した。ＢＡＤとＮＰＢの相互作用を調査するため、泳動バッファー（ＨＢＳ−ＥＰ、ｐＨ７．４、ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ）中の様々な濃度のＮＰＢ（２０から１００μＭ）を、ＢＡＤ固定化センサーチップの表面に、製造元の指示に従って１５μｌ／分の流量で注入した。ＮＰＢをそれぞれ結合及び解離のために２分間ＢＡＤサブユニットと相互作用させ、その後、次の注入の前に２分間１Ｍ  ＮａＣｌを注入することにより、センサーチップを再生した。ＢＩＡ評価ソフトウェア（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ）を使用すると、動態パラメーターは、物質移動を伴う１：１結合モデルを使用した、結合及び解離速度定数（ｋａ及びｋｄ）、解離平衡定数（Ｋｄ）などであった。得られたセンサーグラムを、ＢＩＡ評価ソフトウェアを使用してオーバーレイした。
【００３８】
実施例５
ＮＰＢのＢＡＤリン酸化に対する効果は、Ｓｅｒ９９（ヒト）に特異的である
Ｓｅｒ−７５（マウスＢＡＤセリン残基１１２）及びＳｅｒ−９９（マウスＢＡＤセリン残基１３６）の残基におけるｈＢＡＤのリン酸化は、抗アポトーシスタンパク質のＢＣＬ−２ファミリーの活性化の制御に重要である［１５］。Ｓｅｒ−７５又はＳｅｒ−９９（又はマウスｂａｄの対応する残基）のいずれかにおけるｈＢＡＤのリン酸化は、ｈＢＡＤのＢＣＬ−ｘＬ又はＢＣＬ−２とのヘテロ二量体化する能力の損失をもたらす［１５］。予想される標的をさらに確認するため、まずウエスタンブロット解析により、Ｓｅｒ９９におけるｈＢＡＤのリン酸化に対するＮＰＢの効果を解析した。ＮＰＢによるＭＣＦ細胞の処理により、総ｈＢＡＤタンパク質の有意な変化を伴うことなく、ｈＢＡＤ  Ｓｅｒ９９のリン酸化の用量依存的減少がもたらされた（図１４Ｂ）。ＮＰＢによるＢＡＤ  Ｓｅｒ９９リン酸化の阻害について計算されたＥＣ50は、０．４１±０．２１μＭであった。
次に、Ｓｅｒ７５及びＳｅｒ９９の両方におけるｈＢＡＤのリン酸化に対するＮＰＢの効果を、ウエスタンブロット解析により、７つの異なる癌タイプに由来する２５の癌腫細胞株において解析した。ＮＰＢが、すべての試験した癌腫細胞株においてＳｅｒ９９サイトでのＢＡＤのリン酸化を概ね阻害することが観察されたが、ＮＰＢは同一の細胞においてＳｅｒ７５でのｈＢＡＤのリン酸化への影響を表さず、これはＮＰＢがｈＢＡＤのＳｅｒ９９でのリン酸化を特異的に阻害したことを示している（図１５）。
【００３９】
ｓｉ−ＲＮＡを介したＢＡＤ発現の枯渇は、癌腫細胞株におけるＮＰＢの効果を逆戻りさせる。
ＢＡＤタンパク質に向けられたＮＰＢの機能的特異性を確認するために、６つの癌腫細胞株（ＭＣＦ７、ＢＴ４７４、Ｃａｏｖ−３、Ｉｓｈｉｋａｗａ、ＡｓＰＣ−１及びＤＬＤ１）におけるｓｉ−ＲＮＡを介したＢＡＤの発現の枯渇の後の、ＮＰＢ暴露の効果をさらに調査した。ＢＡＤ転写産物に向けられたｓｉＲＮＡによる異なる癌腫細胞の一過的な遺伝子導入は、ウエスタンブロット解析により観察されるように、コントロール細胞（スクランブルオリゴを遺伝子導入した）と比較して、ＢＡＤ発現を減少させ、かつリン酸−Ｓｅｒ９９  ＢＡＤのレベルもまた減少させた（図１６Ａ）。細胞生存率もアポトーシスも、以前に報告されたように［２６］、ｓｉＲＮＡを介したＢＡＤの枯渇によって有意に変化した。上記したように、コントロール遺伝子導入癌腫細胞株のＮＰＢ処理は、ビヒクル処理細胞と比較してＢＡＤリン酸化（Ｓｅｒ９９）を減少させた。同時に、同一の癌腫細胞のＮＰＢへの曝露は、ビヒクル暴露細胞と比較して細胞生存率を低下させ、かつカスパーゼ３／７活性を増加させた。対照的に、ＮＰＢは、ＢＡＤの枯渇した発現を伴う癌腫細胞株における、細胞生存率にもカスパーゼ３／７活性にも影響しなかった（図１６Ｂ及びＣ）。
【００４０】
実施例６
ＮＰＢは、癌腫細胞株におけるＡＫＴシグナル伝達から独立して、ＢＡＤリン酸化を阻害する
上流のＡＫＴ  Ｓｅｒ／Ｔｈｒキナーゼは、Ｓｅｒ９９におけるｈＢＡＤのリン酸化を調節する［１３］。したがって、ウエスタンブロット解析を使用して、ＮＰＢがＡＫＴの活性の調節（Ｓｅｒ４７３のリン酸化によって示唆される）を介してｈＢＡＤ（Ｓｅｒ９９）のリン酸化を阻害しているか否かを決定した。４つの異なる癌腫細胞株（ＭＣＦ７、Ｃａｏｖ−３、Ｉｓｈｉｋａｗａ、及びＡｓＰＣ−１）の１０μＭ  ＮＰＢへの暴露の後の、ｐＡＫＴのレベル又は総ＡＫＴタンパク質のレベルの変化は観察されなかった。しかしながら、すべてのＮＰＢ処理癌腫細胞株（ＭＣＦ７、Ｃａｏｖ−３、Ｉｓｈｉｋａｗａ、及びＡｓＰＣ−１）は、Ｓｅｒ９９サイトでＢＡＤリン酸化の阻害を示し、かつ全体のＢＡＤタンパク質のレベルの変化を示さなかった（図１５Ｂ）。さらに、ＡＫＴ発現を標的とする２つの独立したｓｈＲＮＡを使用したＡＫＴの枯渇後のＢＡＤリン酸化、又は異なる癌腫細胞株におけるポジティブコントロールとしてのＡＫＴ阻害剤ＩＶによるＡＫＴ活性の阻害を調査した。癌腫細胞株におけるＡＫＴの枯渇した発現は、コントロール細胞と比較してｐＡＫＴ（Ｓｅｒ４７４）及びｐＢＡＤ（Ｓｅｒ９９）レベルの付随的な減少と関連していることが観察され、これはＢＡＤ  Ｓｅｒ９９リン酸化が試験したすべての癌由来細胞株に依存し、かつ他者により以前に公開された［１３、１５、２７−２９］とおりであることを示している。したがって、ＮＰＢは上流のキナーゼ（ＡＫＴ）の活性に影響を与えることなく、Ｓｅｒ９９におけるＢＡＤのリン酸化を特異的に阻害する［２９］。これらの結果は、ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ標的予測及びＳＰＲにより観察されたＢＡＤへのＮＰＢの結合と合致している。ゆえに、ＮＰＢは、上流の（ＡＫＴ）キナーゼから独立して、Ｓｅｒ９９におけるＢＡＤのリン酸化を特異的に阻害する。
【００４１】
実施例７
５から６週齢のＢＡＬＢ／ｃ−ｎｕ雌マウスに１７β−エストラジオールペレット（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ）を０．７２ｍｇ／ペレットで皮下移植し、首の首筋に６０日間放出し、３日後にマウスに、１００μｌの細胞懸濁液（１×１０7細胞）で右わき腹に皮下注射した。カリパスを用いて腫瘍サイズを測定することにより、腫瘍の成長を監視した。移植の約１２日後、毎日７日間、腹腔内注射により２００μｌのＮＰＢ（５％ＤＭＳＯ、５０％ＰＥＧ４００及び４５％水  ｐＨ５．０に溶解）を投与した治療により、マウスを無作為化し、かつ３つのグループ（各グループ、ｎ＝８）に分けた。マウスの最初のグループをビヒクルで処理し、２番目を５ｍｇ／ｋｇ用量のＮＰＢで、３番目を２０ｍｇ／ｋｇのＮＰＢで処理した。動物の体重と腫瘍体積を毎日測定した。完了後、腫瘍を切除し、写真を撮り、質量を測定し、かつ後の分析のために液体窒素で固定又は保存した。組織学的解析を、以前に説明されたように実行した［３０−３２］。
【００４２】
ＭＣの異種移植片（ＭＣＦ７）におけるＮＰＢのｉｎ  ｖｉｖｏでの効能を調査した。腫瘍が施された無作為にグループ化されたマウス（体積〜１５０ｃｍ3）に、５ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇのビヒクル又はＮＰＢを腹腔内注射した。ＮＰＢで処理したマウスでは、ビヒクルで処理したそれらの対応物と比較して、腫瘍体積の有意な減少が観察された（図１７Ａ）。この期間中、動物の体重にはグループ間で有意差がなかった（図１７Ａ、下）。しかしながら、ＮＰＢ処理した動物の腫瘍質量は、ビヒクル処理したマウスと比較して用量依存的な挙動で減少した（図１７Ｂ）。ＷＢ解析を使用して、腫瘍組織におけるｈＢＡＤ  Ｓｅｒ９９リン酸化レベルに対するＮＰＢの効能をさらに解析した（図１７Ｃ）。ＮＰＢ処理は、コントロール標本と比較して、腫瘍内のＢＡＤ（Ｓｅｒ９９）のリン酸化を有意に抑制した。ＮＰＢで処理した腫瘍とコントロール処理した腫瘍の間で、ＢＡＤタンパク質の合計レベルの変化は観察されなかった。
ＮＰＢで処理した動物から切除された腫瘍標本の組織学的分析は、ビヒクル処理した腫瘍と比較して有意に減少したｐ−ＢＡＤ（Ｓｅｒ９９）を示す一方で（図１７Ｄ）、ＢＡＤタンパク質はグループ間で有意に異ならなかった。ＮＰＢで処理した動物は、ビヒクル処理した動物と比較して、腫瘍でＫｉ６７陽性細胞の有意に減少した割合と、有意に増加したＴＵＮＥＬ陽性を示した（図１７Ｄ）。
【００４３】
実施例８
ＮＰＢがキナーゼ活性の調節によりｈＢＡＤ  Ｓｅｒ９９リン酸化を減少させる可能性を解明するために、Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＨｕｍａｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｋｉｎａｓｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｒｒａｙ  Ｋｉｔを使用して、様々なキナーゼに対するＮＰＢの効果を評価した。同じ抽出物におけるｈＢＡＤ  Ｓｅｒ９９リン酸化のＮＰＢ阻害にもかかわらず、ＤＭＳＯ暴露細胞と比較して、ＮＰＢに暴露したＭＣＦ７細胞においては、キナーゼ活性又はリン酸化基質の有意な変化は観察されなかった（図１８）。
実施例９
また、クレームした化学テンプレートに従ってＮＰＢの類似体をさらに生成し（図１９、２０、２１）、これはＮＰＢよりも優れた薬物動態プロファイルを示し得る。ＩＣ５０によって決定されるそれらの構造及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの有効性を、図２２に示す。
【００４４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ−Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ−Ｃ】
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【図１３Ａ−Ｅ】
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【図１４Ａ−Ｄ】
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【図１５Ａ−Ｂ】
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【図１６Ａ−Ｃ】
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【図１７Ａ−Ｄ】
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【図１８Ａ−Ｂ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【国際調査報告】
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