(57)【要約】本開示は、両親媒性コーティングを含むナノ粒子の制御された凝集を誘導する方法であって、多数の前記ナノ粒子を有機溶媒を含むイオン性溶液と接触させることを含む方法に関する。以下の実験条件のいずれか１つまたは複数を変更することによって、凝集プロセスのさらなる制御を提供することができる：イオン性溶液のモル濃度、有機溶媒の量、反応温度、ナノ粒子の表面電荷。ナノ粒子凝集体は、検出及び定量化アッセイを含めた様々な用途で有用である。例示的な一例では、ナノ粒子凝集体は医療診断用途で特に有用である。【選択図】図１
2020523430.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
両親媒性コーティングを含むナノ粒子の制御された凝集を誘導するための方法であって、多数の前記ナノ粒子を有機溶媒を含むイオン性溶液と接触させることを含む、前記方法。
【請求項２】
前記ナノ粒子の前記凝集を制御するために、ファンデルワールス力、平均場近似、ナノ粒子の表面電位、熱エネルギー、ナノ粒子の表面半径、流体誘電率、イオン濃度、ビエルム長及びデバイ−ヒュッケル長からなる群から選択されるＤＬＶＯ理論の１つまたは複数のパラメーターに影響を及ぼす、１つまたは複数の実験条件を変更することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ナノ粒子の凝集速度を制御するために前記イオン性溶液のモル濃度を変更することを含む、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ナノ粒子の凝集速度を高めるために前記イオン性溶液のモル濃度を高めることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ナノ粒子の凝集速度を制御するために前記有機溶媒の量を変更することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ナノ粒子の凝集速度を高めるために前記有機溶媒の量を増やすことを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ナノ粒子の凝集速度を制御するために温度を変更することを含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記ナノ粒子の凝集速度を高めるために温度を高めることを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
両親媒性コーティングを含む前記ナノ粒子が約−６０ｍＶ〜約＋４０ｍＶの範囲の初期表面電荷を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
両親媒性コーティングを含む前記ナノ粒子が約−３０ｍＶ〜約０ｍＶの範囲の初期表面電荷を有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ナノ粒子が１種または複数の量子ドットを含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が蛍光性ナノ粒子である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法によって形成されたナノ粒子凝集体を単離するステップをさらに含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記単離するステップが遠心分離を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法によって形成されたナノ粒子凝集体を機能的薬剤にコンジュゲートすることをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記機能的薬剤が捕獲試薬である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記捕獲試薬が抗体またはポリヌクレオチドを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法によって形成される、ナノ粒子凝集体。
【請求項１９】
請求項１８に記載のナノ粒子凝集体を含む、アッセイキット。
【請求項２０】
アッセイキットを生成する方法であって、請求項１８に記載のナノ粒子凝集体を前記アッセイキットの少なくとも一部の表面中または表面上に沈着させることを含む、前記方法。
【請求項２１】
前記アッセイキットがラテラルフローアッセイキットである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
試料中の分析物の存在を検出するための診断アッセイ装置の製造における、請求項１８に記載のナノ粒子凝集体の使用。
【請求項２３】
試料中の分析物を検出する方法であって、請求項１８に記載のナノ粒子凝集体と前記試料を接触させることを含み、前記ナノ粒子凝集体が、前記分析物に特異的に結合する捕獲試薬にコンジュゲートしており、前記分析物に結合している任意のナノ粒子凝集体を検出することを含む、前記方法。
【請求項２４】
ラテラルフロー装置を使用して行われる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
捕獲試薬にコンジュゲートした前記ナノ粒子凝集体が、前記試料中に存在する任意の分析物に結合して複合体を形成し、前記複合体が前記ラテラルフロー装置の試験ゾーンで検出される、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、ナノ粒子凝集体及び制御された様式でナノ粒子凝集体を調製するための方法に関する。ナノ粒子凝集体は、検出及び定量化アッセイを含めた様々な用途に有用である。一例では、ナノ粒子凝集体は、医療診断用途で特に有用である。
【背景技術】
【０００２】
ナノ粒子は、幅広い診断、予後及び治療用途における使用でますます普及している。そのような用途におけるナノ粒子の使用の利点の多くは、粒子の小さなサイズ（これは、流体環境においてナノ粒子の急速で一定した拡散を容易にする）、ナノ粒子を作製することができる様々な材料（これらは、特に電気化学的特性、例えば、蛍光、磁性、コロイド形成などをもたらす）、及びナノ粒子表面に安定してコンジュゲートされ得る（それによって、ナノ粒子にコンジュゲートされる標識化部分、標的化部分、治療的部分などを使用する多種多様の用途の可能性を広げる）多種多様の試薬に起因する。
【０００３】
量子ドットは、蛍光特性を有するナノ粒子のカテゴリーとして認識され、これは、視覚的検出の容易さの理由で標識用途で特に有用である。一般に、量子ドットは、高い量子収量、幅広い吸収スペクトル、サイズ依存的な狭い光ルミネセンス発光スペクトル、ならびにフォトブリーチング及び化学分解に対する高い耐性を示すナノサイズの半導体材料である。（例えば、Ｋｏｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００９）Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｅｐ−Ｏｃｔ；１（５）：４７５−９１を参照されたい）。個々の量子ドット単独よりも大きなシグナル強度を有する量子ドット凝集体が、複数の量子ドットを物理的に近接させて保持するために、スキャフォールド材料（例えば、シリカ、ポリスチレンなど）中に複数の量子ドットを包埋することによって、作出された。例えば、多色量子ドットが、ハイスループット遺伝子スクリーニング用途で使用するためにポリスチレンミクロビーズ中に組み込まれた（Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６３１−６３５）。別の例では、外部の磁場を使用して、正確な位置へのナノ粒子構築物の特異的標的化を可能にするために、Ｆｅ３Ｏ４などの磁性ナノ粒子が、量子ドットをさらに含むナノ粒子構築物中に組み込まれた（Ｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．１６：４０２２−４０２７）。例えば、磁性ナノ粒子、または抗体などの特異的結合薬剤へのナノ粒子のコンジュゲーションによって与えられる追加的な機能性によって、そのようなナノ粒子が標的薬物送達または標的医療イメージングに特に有用であり得ることが示唆された。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
多くのナノ粒子は安定なコロイドの形態で意図的に提供され、これらは、コロイド懸濁液全体にわたって個々のナノ粒子の一般的に均一な分散を保持する。そのような懸濁液中のナノ粒子の凝集は、コロイド懸濁液に対する特定の環境の影響の望ましくない結果であることが多い。その結果、環境が変化した場合でさえ、コロイド懸濁液全体にわたって個々のナノ粒子の一般的に均一な分散を保持する、ナノ粒子の安定なコロイド懸濁液を生成するために、多くの作業が行われてきた。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明者らは、特に好都合な物理化学的特性を有するナノ粒子凝集体を制御可能に生成する方法を今や発明した。これらの好都合な特性は、ナノ粒子凝集体を、（例えば）分析方法、例えば診断法を含めた様々な用途で有用にする。本明細書に開示される方法は、より大きなナノ粒子凝集体への個々のナノ粒子の制御された凝集につながる、ナノ粒子のコロイド懸濁液中の引力と反発力の間に存在する繊細な平衡状態の制御された不安定化に基づく。一般に、ナノ粒子のコロイド懸濁液は、個々のナノ粒子間の正味の反発力により、安定して分散した状態のままであり、これは、両親媒性材料でコーティングされていることが多い個々のナノ粒子の表面の周りの溶液における遊離イオンの局部的蓄積から生じることが多い。本明細書に開示される方法は、様々な用途で使用するための安定なナノ粒子凝集体を生成するために、コロイド懸濁液を支持する状態を微調整するのに使用することができる。本明細書に開示される方法の１つの特別な利点は、この方法が、狭いサイズ分布を有するナノ粒子凝集体の集団を正確に生成することができ、これが、分析的または診断的用途で使用するためのナノ粒子凝集体の適合性をさらに高めることである。
【０００６】
本明細書に開示される方法は、溶液中の荷電粒子間の引力と反発力の間の関係を説明するＤＬＶＯ（Ｄｅｒｊａｇｕｉｎ、Ｌａｎｄａｕ、Ｖｅｒｗｅｙ及びＯｖｅｒｂｅｅｋ）理論（Ｄｅｒｊａｇｕｉｎ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，（１９４１）Ａｃｔａ  Ｐｈｙｓｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｃａ  ＵＲＳＳ，１４：６３３）に基づく。静電力は、一般に、中距離から短距離でそのような粒子を互いに反発させるが、他の非共有結合力（例えば、ファンデルワールス力）は、非常に短距離でそのような粒子を互いに引きつける。個々の粒子が溶液中で互いに安定して会合するためには、引力が粒子を一緒に引っ張り、それらを安定な会合状態に保持するように粒子を互いに密接に会合させるために、反発力によって作出されるエネルギー障壁を克服する必要がある（図１は、関与する力の概略図を示す）。
【０００７】
要するに、粒子間の距離は、相互作用が引力的であるか反発的であるかを決定する。２つの粒子が遠い距離で離れている場合、これらは、互いに感知することができず、正味の相互作用エネルギーは、ゼロに近づく。粒子が中距離から短距離にある場合（例えば、安定なコロイドの場合）、静電反発力が優勢になる。非常に短距離では、一連の非共有結合性の引力的相互作用（例えば、ファンデルワールス力）が優勢になる。その結果、接近する粒子は、これらが凝集することになる場合、生成したエネルギー障壁を通過するのに十分なエネルギー（例えば、熱エネルギー）を有する必要がある。静電反発力が強いほど、粒子が衝突し、凝集することになる可能性が低い。安定なコロイドでは、熱エネルギーは粒子がエネルギー障壁を通過するには不十分であり、したがって、個々の粒子は互いに反発し続ける。
【０００８】
本明細書に開示される方法は、粒子間の引力的静電力がそうした粒子を一緒にまとめて凝集体を形成するのに十分なほど粒子をお互いに近づけるために、溶液中の粒子間のエネルギー障壁を制御可能に低減させることを含む。
【０００９】
したがって、一態様では、本開示は、両親媒性コーティングを含むナノ粒子の制御された凝集を誘導するための方法であって、多数の前記ナノ粒子を有機溶媒を含むイオン性溶液と接触させることを含む方法を提供する。
【００１０】
本明細書に開示される方法は、溶液中の同じ表面電荷を有する粒子間のエネルギー障壁を制御可能に低減させ、その結果、粒子間の静電反発力を克服することができることを含み得る。したがって、方法は、溶液中の２つの粒子が互いに接近する場合に得られる正味の引力的静電力の可能性を高めることを含み得る。したがって、方法は、溶液中の粒子を分離する反発力を制御された様式で積極的に変化させることを含み得る。（例えば、ＤＬＶＯ理論で説明されているように）溶液中の粒子の分散を左右する静電力のこの変化及び／または制御は、例えば、（例えば、有機溶媒の使用を介して）溶液中の個々のナノ粒子の両親媒性コーティングを少なくとも部分的に除去することによって、達成され得る。これは、個々のナノ粒子上の表面電荷を低下させることができ、したがって、個々のナノ粒子間の反発力を低下させることができる。両親媒性コーティングの部分的除去は、個々のナノ粒子の下層にある疎水性面を露出することもできる。露出した疎水性面は、水性環境で不安定であることが多く、ファンデルワールス引力とともに、衝突後に粒子を一緒に凝集体中に維持することに寄与する。
【００１１】
同様に、本明細書に開示される方法においてイオン性溶液を使用することも個々のナノ粒子上の表面電荷を減少させることができ、したがって、個々のナノ粒子間の反発力を低下させることができる。
【００１２】
両方の場合で、衝突の際に、個々のナノ粒子間に正味の引力が存在し、その結果、ナノ粒子凝集体の形成がもたらされるように、粒子間のエネルギー障壁を低減することができる。
【００１３】
ＤＬＶＯ理論の１つまたは複数のパラメーター（ファンデルワールス力、平均場近似、表面電位、熱エネルギー、粒子の表面半径、流体誘電率、イオン濃度、ビエルム長及びデバイ−ヒュッケル長を含める）に影響を及ぼし得る任意の実験変数は、ナノ粒子の凝集速度を制御するために、本明細書に開示される方法における任意の組み合わせで変更することができる。したがって、本明細書に開示される方法は、ナノ粒子の凝集を制御するために、ファンデルワールス力、平均場近似、ナノ粒子の表面電位、熱エネルギー、ナノ粒子の表面半径、流体誘電率、イオン濃度、ビエルム長及びデバイ−ヒュッケル長からなる群から選択されるＤＬＶＯ理論の１つまたは複数のパラメーターに影響を及ぼす任意の１つまたは複数の実験条件を変更することを含み得る。
【００１４】
溶液中の粒子間の引力及び／または反発力及び／またはエネルギー障壁を変化させることによってナノ粒子凝集体の形成を制御するために変えることができる変数の例は、本明細書に記載されている。
【００１５】
本方法によって生成されるナノ粒子凝集体の凝集速度及びサイズは、いくつかの実験条件のいずれか１つまたは複数を変更することによって、所望の通りに制御することができる。例えば、ナノ粒子の凝集速度を制御するために、イオン性溶液のモル濃度を変更することができる。例えば、ナノ粒子の凝集速度を高めるために、イオン性溶液のモル濃度を高めることができる。
【００１６】
代わりにまたはさらに、ナノ粒子の凝集速度を制御するために、有機溶媒の量を変更することができる。例えば、ナノ粒子の凝集速度を高めるために、有機溶媒の量を増やすことができる。
【００１７】
代わりにまたはさらに、ナノ粒子の凝集速度を制御するために、使用する有機溶媒を変更することができる。例えば、ナノ粒子の凝集速度を高めるために、より強い有機溶媒を使用することができる。
【００１８】
代わりにまたはさらに、ナノ粒子の凝集速度を制御するために、個々のナノ粒子上の表面電荷を変更することができる。例えば、ナノ粒子の凝集速度を高めるために、個々のナノ粒子上の表面電荷を低下させることができる。一例では、個々のナノ粒子の初期表面電荷は、約−６０ｍＶ〜約＋４０ｍＶの範囲であり得る。別の例では、個々のナノ粒子の初期表面電荷は、約−３０ｍＶ〜約０ｍＶの範囲であり得る。
【００１９】
代わりにまたはさらに、ナノ粒子の凝集速度を制御するために、凝集が行われる反応混合物の温度を変更することができる。例えば、ナノ粒子の凝集速度を高めるために、凝集が行われる反応混合物の温度を高めることができる。
【００２０】
上記の因子（イオン性溶液のモル濃度、有機溶媒の量、使用する特定の有機溶媒（すなわち、使用する有機溶媒の強度）、個々のナノ粒子上の表面電荷及び凝集が行われる温度を含める）のいずれか１つまたは複数を、本明細書に開示される方法のうちのいずれかにおいて、任意の組み合わせまたは順列で、変更することができることが理解されよう。所望の凝集速度を達成し、それによって、所望の物理化学的特性を有するナノ粒子凝集体を生成するために、これらの因子を変更することができる。これらの因子のいずれか１つまたは複数の変更は、凝集プロセスそれ自体の間で行うことができ、または本方法が行われる前に特定の実験条件もしくは成分を事前選択することによって達成することができる。したがって、本明細書に開示される方法のうちのいずれかは、所望の凝集体が生成されることを確実にするために、凝集プロセスをモニターすること、ならびに上記の因子（イオン性溶液のモル濃度、有機溶媒の量、使用する特定の有機溶媒（すなわち、使用する有機溶媒の強度）、個々のナノ粒子上の表面電荷及び凝集が行われる温度を含める）のいずれか１つまたは複数を凝集プロセスの間に変更することを含み得る。したがって、本明細書に開示される方法のうちのいずれかは、凝集体の成長のリアルタイムモニタリングを含み得る。変更は、これらの可変因子の１つまたは複数が異なる一連の実験を行うこと、各実験の結果を解析すること、及び本明細書に開示される方法で使用するための最適な値を選択することを含むこともできる。したがって、変更は、反復プロセスとして行い、それぞれの特に所望される結果のために可変因子の１つまたは複数を最適化することができる。
【００２１】
本明細書に開示される方法のうちのいずれかにおいて、ナノ粒子は蛍光性及び／または磁性ナノ粒子でもよい。好ましくは、ナノ粒子は蛍光性ナノ粒子である。
【００２２】
本明細書に開示される方法のうちのいずれかにおいて、ナノ粒子は、量子ドットを含んでもよいし、またはそれからなってもよい。
【００２３】
本明細書に開示される方法のうちのいずれかにおいて、ナノ粒子は、両親媒性コーティングの下に疎水性層を含み得る。
【００２４】
本明細書に開示される方法のうちのいずれかは、ナノ粒子凝集体を単離するステップをさらに含み得る。ナノ粒子凝集体を単離するための任意の適切な方法を使用することができる。一例では、単離ステップは遠心分離を含む。遠心分離は、所望のサイズのナノ粒子凝集体が遠心分離容器の底部にペレットを形成するが、凝集していない個々のナノ粒子、または小さすぎるナノ粒子凝集体は上清に残存するように、行うことができる。ナノ粒子凝集体を含むペレットを上清及びナノ粒子から分離し、任意の所望の溶液に再懸濁することができる。他の適切な単離方法は、例えば、濾過及び／または沈降を含む。
【００２５】
本明細書に開示される方法のうちのいずれかは、ナノ粒子凝集体をその所期の使用に適するようにするために、１つまたは複数の下流処理ステップをさらに含み得る。したがって、本明細書に開示される方法のうちのいずれかは、ナノ粒子凝集体を単離するステップ、（例えば、ナノ粒子凝集体の表面に安定化剤を施すことによって）ナノ粒子凝集体を安定化するステップ、（例えば、凝集体の表面に１種もしくは複数の反応種を施すことによって）さらなる機能化のためにナノ粒子凝集体をプライムするステップ、（例えば、ナノ粒子凝集体を１種もしくは複数の機能性部分とコンジュゲートすることによって）ナノ粒子凝集体を機能化するステップ、及び（例えば、安定な緩衝液、例えば医薬的に許容可能な緩衝液にナノ粒子凝集体を懸濁させることによって、もしくはアッセイ材料の表面中もしくは表面上にナノ粒子凝集体を沈着させることによって）その所期の使用のためにナノ粒子凝集体を製剤化するステップ、容器にナノ粒子凝集体を保存するステップ、または任意の他の下流処理ステップをさらに含み得る。本明細書に開示される方法は、任意の組み合わせまたは順列で、これらの下流処理ステップのいずれか１つまたは複数の実施を含み得ることが理解されよう。
【００２６】
本明細書に開示される方法の１つの利点は、ナノ粒子を凝集させるための、及びそれらを凝集形態で保持するための追加的なスキャフォールド材料の必要性を回避することである。以前に知られているナノ粒子凝集体は、複数のナノ粒子が包埋されるスキャフォールド材料（例えば、シリカ、ポリスチレンまたは他のもの）を含むことが多い。そうした包埋されたナノ粒子の効果は、スキャフォールド材料による妨害により縮小することが多い。対照的に、本開示は、スキャフォールド材料（例えば、シリカ、ポリスチレンまたは他のもの）の非存在下で安定なナノ粒子凝集体の形成を可能にする。したがって、スキャフォールド材料によって引き起こされる、ナノ粒子の特性への任意の潜在的な妨害が回避される。例えば、凝集体を調製するために使用されるナノ粒子が蛍光性である場合（例えば、ナノ粒子が量子ドットである場合）、凝集形態のナノ粒子が放射する蛍光シグナルはスキャフォールド材料の存在によって縮小されない。代わりに、本明細書に開示される方法によって生成される凝集した蛍光性ナノ粒子（例えば、凝集した量子ドット）が放射するシグナルは著しく増幅され（これは、全凝集体量の大部分がシグナル発生に寄与するからである）、検出用途において著しい利点をもたらす。したがって、本明細書に開示される方法のうちのいずれかは、スキャフォールド材料の使用を排除することができる。本明細書に開示される方法は、凝集した個々のナノ粒子から本質的になるナノ粒子凝集体の生成を可能にする。凝集したナノ粒子は、典型的には、非共有結合力によって結び付いている。
【００２７】
本明細書に開示される方法によって伝えられる別の利点は、ナノ粒子の自己凝集を誘導することであり、この自己凝集は、そうした凝集体が溶液に再懸濁された場合に安定して凝集したままである。ナノ粒子凝集体を生成するために、費用のかかる、または複雑なコンジュゲーションステップを行う必要がない。代わりに、反応成分を、単一容器中で、単一ステップで簡単に組み合わせることができ、自己集合により所望の凝集体の形成がもたらされる。凝集プロセスは、いくつかの簡単な方法によっていつでも停止することができ、これには、反応混合物に水を加えることによること、反応混合物から凝集体を物理的に分離することによる（例えば、遠心分離及び／または濾過及び／または沈降による）こと、反応混合物の温度を変化させることによる（例えば、２０℃未満、例えば１５℃未満、例えば１０℃未満、例えば５℃未満、例えば１℃未満に、例えば約１０℃に、例えば約５℃に、例えば約４℃に、などに反応混合物を冷却することによる）こと、または任意の他の適切な手段によることが含まれる。本明細書に開示されるナノ粒子凝集体の生成の容易さは、生成プロセスの費用及び複雑さを低減し、これは、スキャフォールド材料中で、または個々のナノ粒子を互いに化学的に連結するためのコンジュゲーション化学によって、ナノ粒子を凝集させる代替方法と比較して、著しい利点を提供する。したがって、本明細書に開示される方法は、ワンステップ凝集方法として行うことができる。本明細書に開示される方法は、凝集体を形成するために、個々のナノ粒子を互いに共有結合させるステップを排除することができる。
【００２８】
本開示は、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって形成されるナノ粒子凝集体も提供する。
【００２９】
本開示は、多数のナノ粒子を含む安定なナノ粒子凝集体も提供する。ナノ粒子凝集体は、本明細書に開示される方法に関して本明細書に記載される特色のうちのいずれかを含み得る。したがって、例えば、ナノ粒子凝集体は、多数のナノ粒子を含むことができ、ナノ粒子は蛍光性ナノ粒子である、及び／または量子ドットである。ナノ粒子凝集体を安定化することもできる（例えば、凝集体は、例えば、タンパク質または抗体の層などの安定化剤の外層を含むことができ、これらのどちらもナノ粒子凝集体の表面に共有結合的または非共有結合的に結合し得る）。
【００３０】
さらにまたは代わりに、ナノ粒子凝集体を機能化することができる。例えば、ナノ粒子凝集体は、共有結合している機能性部分を含み得る。機能性部分は、本明細書に記載の任意の機能性部分でもよい。したがって、例えば、機能性部分は、本明細書に記載のように、捕獲試薬でもよい。一例では、捕獲試薬は抗体でもよい。
【００３１】
本開示は、本明細書で開示される多数のナノ粒子凝集体も提供する。凝集体は、均一なサイズ分布を有し得る。凝集体は、試験キット、例えば診断試験キットの製造で使用することができるように、容器中で提供することができる。凝集体は、任意の適切な形態で、例えば溶液で、例えば凍結乾燥形態で、例えば粉末で提供することができる。
【００３２】
さらに、本開示は、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって形成されるナノ粒子凝集体を含むアッセイキットを提供する。一例では、アッセイキットはラテラルフローアッセイキットを含み得る。
【００３３】
本開示は、アッセイキットを生成する方法であって、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって形成されるナノ粒子凝集体をアッセイキットの少なくとも一部の表面中または表面上に沈着させることを含む方法も提供する。一例では、方法は、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって形成されるナノ粒子凝集体をラテラルフロー材料の表面上に沈着させることを含む、ラテラルフローアッセイキットを生成することを含む。沈着したナノ粒子凝集体は可動性であり得、目的の分析物に特異的に結合する捕獲試薬とコンジュゲートすることができる。目的の分析物を含む可能性がある試料がラテラルフローアッセイキットに加えられると、ナノ粒子凝集体は、試料中に存在する任意の目的の分析物に特異的に結合することができ、それによって、ナノ粒子凝集体を検出することにより目的の分析物の検出及び／または定量化が可能になる。上記のように、蛍光性ナノ粒子凝集体（例えば、量子ドット凝集体）は、そうしたアッセイキットで使用するのに特に適している。
【００３４】
本開示は、試料中の分析物の存在を検出するための診断アッセイ装置の製造における、本明細書に開示される方法のうちのいずれかによって形成されるナノ粒子凝集体の使用も提供する。
【００３５】
本開示は、試料中の分析物を検出する方法であって、本明細書で開示されるナノ粒子凝集体（例えば、本明細書に開示される方法のうちのいずれかに従って生成される）と試料を接触させることを含み、ナノ粒子凝集体が、分析物に特異的に結合する捕獲試薬にコンジュゲートしており、分析物に結合している任意のナノ粒子凝集体を検出することを含む方法も提供する。
【００３６】
本開示の実施形態を、添付の図面を参照して例としてこれから記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】２つのコロイド粒子がお互いに近接する場合の優勢な相互作用の概略図である。
【図２】Ｑドットを溶媒混合物（４：１のメタノール：１，２プロパンジオール中の５％テトラヒドロフラン（ＴＨＦ））と接触させた後に形成されるナノ粒子の凝集の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像を示す図である。
【図３】ナノ粒子凝集に対する溶媒混合物のモル濃度の影響を示す図である。
【図４】３つの異なる反応混合物モル濃度（１０．７ｍＭ、１０．６ｍＭ及び１０．５ｍＭ）に対する、上清（第２のカラム）、最初のインキュベーション期間後のナノ粒子凝集体（最初のインキュベーション後の粒子；第３のカラム）及び全インキュベーション期間の終了後のナノ粒子凝集体（最終的な粒子；最後のカラム）と比較した、Ｑドットコロイド懸濁液（ＱＤストック；第１のカラム）の蛍光強度（Ｙ軸）を示す図である。
【図５】商業的に得たＱドットの異なるロットの蛍光強度（Ｙ軸）を示す図である。これは、インキュベーション期間後の上清（第２のカラム）及びナノ粒子凝集体（試料；最後のカラム）と比較して、初期のＱドットコロイド懸濁液（投入；第１のカラム）の強度を比較する。
【図６】ｉＺｏｎ解析を使用するリアルタイムでのナノ粒子凝集体の成長を示す図である。メインパネルは、ナノ粒子凝集体の集団が２４０分にわたって漸増することを示す。挿入図は、時間の関数として粒子濃度を示す。成長プロセスの間に臨界サイズに達した後、粒子濃度は、一緒に合体している大きな凝集体の結果として、低下し始める。
【図７】ナノ粒子凝集体あたりのＦＩＴＣコンジュゲート化ｍＡｂの数の推定を図示する図である。
【図８】機能化した被包化Ｑドットを用いて行われた同じ検出と比較した、２つの代表的なインフルエンザウイルス試料（インフルエンザＡ及びインフルエンザＢ）の検出における機能化したナノ粒子凝集体の使用からのデータを図示する図である。本明細書に開示されるナノ粒子凝集体で、より大きな振幅ピークが観察される。
【図９】凝集の間の４つの異なる時点での、量子ドットの３つの異なるロットにおける、遠心分離してナノ粒子凝集体を除去した後の上清の残留蛍光強度を示す図である（ＱＤストック＝第１のカラム；Ｔ０＝第２のカラム；Ｔ１時間＝第３のカラム；Ｔ１．５時間＝第４のカラム；Ｔ２時間＝第５のカラム；Ｔ２．５時間＝第６のカラム（ロット８１０７９４についてのみ表示））。より速いナノ粒子凝集体の成長（例えば、ロット１７３０９０７）は、上清の残留蛍光のより速い低下に対応する。
【図１０】動的光散乱法を使用して決定した場合の、凝集の間の４つの異なる時点での、量子ドットの３つの異なるロットの平均ナノ粒子凝集体サイズ（直径）を示す図である（Ｔ１時間＝第１のカラム；Ｔ１．５時間＝第２のカラム；Ｔ２時間＝第３のカラム；Ｔ２．５時間＝第４のカラム（ロット８１０７９４についてのみ表示））。
【図１１】凝集の間の６つの異なる時点における３つの異なる濃度での、塩化ナトリウムを含む反応混合物中のＯｃｅａｎカルボキシルＱドットに対する、遠心分離してナノ粒子凝集体を除去した後の上清の残留蛍光強度を示す図である。対照Ｑドット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＤＱ８００）との比較を示す（ストック＝第１のカラム；Ｔ０＝第２のカラム；Ｔ０．５＝第３のカラム；Ｔ１＝第４のカラム；Ｔ１．５＝第５のカラム；Ｔ２＝第６のカラム；Ｙ２．５＝第７のカラム（ＱＤ８００についてのみ表示））。
【図１２】ＴＨＦの異なる濃度での、ＰＥＧ−ＯＨ及び−ＮＨ２  Ｑドットに対する、遠心分離してナノ粒子凝集体を除去した後の上清の残留蛍光強度を示す図である（２．５％ＴＨＦ＝第１のカラム；３％ＴＨＦ＝第２のカラム；３．５％ＴＨＦ＝第３のカラム）。
【図１３】ＴＨＦ、ＤＭＦまたはピロリジンを含む反応混合物中におけるＱドットの凝集の間の４つの異なる時点での、遠心分離してナノ粒子凝集体を除去した後の上清の残留蛍光強度を示す図である（ＴＨＦ＝第１のカラム；ＤＭＦ＝第２のカラム；ピロリジン＝第３のカラム）。
【図１４】凝集プロセスの異なる時点でＤＬＳを使用して測定した場合の、平均ナノ粒子凝集体サイズを示す図である。
【図１５】それぞれ異なる濃度での、個々のｑドットナノ粒子（明るい灰色の右側のプロット）と比較した、機能化したナノ粒子凝集体（マルチｑドットマイクロ粒子；濃い灰色の左側のプロット）の相対輝度（蛍光強度）の比較を示す図である。
【図１６】ラテラルフローアッセイを使用するインフルエンザ抗原の検出における、ナノ粒子凝集体（マルチｑドットマイクロ粒子；明るい灰色の左側のプロット）と個々のｑドットナノ粒子（黒色の右側のプロット）の解析能力の比較を示す図である。抗原の様々な濃度で生成されたシグナルを示す。
【図１７】室温（第１のカラム）、３０℃（第２のカラム）または３７℃（第３のカラム）で行われる凝集プロセスにおけるＱドットの凝集の間の異なる時点での、遠心分離してナノ粒子凝集体を除去した後の上清の残留蛍光強度を示す図である。
【図１８】ＴＨＦ（第１のカラム）、ＤＭＦ（第２のカラム）またはピロリジン（第３のカラム）を含む反応混合物中で行われる凝集プロセスにおけるＱドットの凝集の間の異なる時点での、遠心分離してナノ粒子凝集体を除去した後の上清の残留蛍光強度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
一般原則
本明細書全体にわたって、特に記載のない限りまたは文脈上別段必要でない限り、単一ステップ、物質の組成物、一群のステップまたは一群の物質の組成物への言及は、そうしたステップ、物質の組成物、一群のステップまたは一群の物質の組成物の１つ及び多数（すなわち、１つまたは複数）を包含すると解釈されるものとする。
【００３９】
本明細書に記載の本開示が特に記載されるもの以外の変形及び修正を受けやすいことを当業者なら理解するであろう。本開示はすべてのそのような変形及び修正を含むことを理解されたい。本開示は、個々にまたは集団的に本明細書において言及されるか示される、ステップ、特色、組成物及び化合物のすべて、及び前記ステップまたは特色のありとあらゆる組み合わせまたは任意の２つ以上も含む。
【００４０】
本開示は、例証のみを目的とすることが意図される、本明細書に記載の特定例によって範囲が制限されるものではない。機能的に均等な生成物、組成物及び方法は、本明細書に記載のように、明らかに本開示の範囲内である。
【００４１】
用語「及び／または」、例えば、「Ｘ及び／またはＹ」は、「Ｘ及びＹ」か「ＸまたはＹ」のいずれか意味すると理解されるものとし、両方の意味またはいずれかの意味に対する明示的な支持を提供すると解釈されるものとする。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、特定の値の＋／−１０％の範囲を指す。誤解を避けるために、用語「約」はまた、後に続く正確な数に対して明確な支持を提供すると解釈されるべきである（例えば、用語「約１０」は、１０それ自体に対し
明確な支持を提供すると解釈されるべきである）。
【００４３】
本明細書全体にわたって、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または変形、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載した要素、整数もしくはステップ、または一群の要素、整数もしくはステップの包含を意味するが、任意の他の要素、整数もしくはステップ、または一群の要素、整数もしくはステップの排除を意味するものではないと理解される。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「コンジュゲートした」、「会合した」、「連結した」、「結合した」、「付着した」、「つながれた」、「吸着した」及びこれらの均等物は、２つのエンティティに関して使用される場合、構造物が使用される条件、例えば、アッセイ条件または生理的条件の下でエンティティが物理的に会合したままであるように十分に安定な構造物を形成するために、直接的か、連結剤として働く１つまたは複数のさらなるエンティティを介するかのいずれかで、エンティティが互いに物理的に会合または接続していることを意味する。いくつかの例では、エンティティは１つまたは複数の共有結合によって互いに付着し得る。いくつかの例では、エンティティは、特異的な（しかし非共有結合性ではない）結合（例えば、ストレプトアビジン／アビジン相互作用、抗体／抗原相互作用、ヌクレオチド／ヌクレオチド相互作用など）を含むメカニズムによって、互いに付着し得る。いくつかの例では、エンティティは、非共有結合性の非特異的結合（例えば、ファンデルワールス力）によって、互いに付着し得る。いくつかの例では、２つのエンティティは、他方の表面上への一方のエンティティの物理吸着（ｐｈｙｓａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ）により、または静電力により、一緒にコンジュゲートされ得る。いくつかの例では、十分な数の弱い相互作用が、物理的に会合したままであるために十分な安定性を２つのエンティティに与え得る。本明細書に開示されるナノ粒子凝集体は、典型的に、個々のナノ粒子間の非共有結合性力によって結び付いていることが理解されよう。比較すると、ナノ粒子凝集体にコンジュゲートしている機能性部分の本明細書に開示される多くの例は、１つまたは複数の共有結合相互作用を含む。
【００４５】
本明細書で使用する場合、用語「診断」及びその変異形、例えば、「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｅ）」、「診断した（ｄｉａｇｎｏｓｅｄ）」または「診断すること（ｄｉａｇｎｏｓｉｎｇ）」は、臨床状態の任意の一次診断または再発性疾患の診断を含む。
【００４６】
「試料」への本明細書での言及は、動物または環境供給源に由来する任意の試料への言及として理解されたい。試料は生物試料でもよい。生物試料は、例えば、対象から得られるか対象に由来する任意の材料、生体液、組織または細胞でもよく、限定されないが、血液（全血、白血球、末梢血単核球、血漿もしくは血清を含める）、痰、粘液、鼻吸引液、尿、精液、唾液、髄膜液、リンパ液、乳汁、気管支吸引液、細胞抽出物、脳組織または脳脊髄液が挙げられる。試料は、前述のうちのいずれかの実験的に分離した画分を含み得る。例えば、血液試料は、血清に、または特定のタイプの血液細胞、例えば、赤血球細胞または白血球細胞（白血球）を含む画分に分画することができる。必要に応じて、試料は、個体由来の試料の組み合わせ、例えば、組織及び流体試料の組み合わせでもよい。生物試料は、例えば、便試料、組織試料もしくは組織生検由来のホモジナイズした固体材料を含む材料、または組織培養もしくは細胞培養に由来する材料を含むこともできる。したがって、用語「試料」は、試料の抽出物及び／または誘導体及び／または画分を含む。
【００４７】
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒトを含めた任意の動物、例えば哺乳動物を意味すると解釈されるものとする。例示的対象としては、限定されないが、ヒト、霊長類、家畜（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、伴侶動物（例えば、イヌ、ネコ）、実験用試験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲野生動物（例えば、キツネ、シカ）が挙げられる。例えば、哺乳動物はヒトでもよく、または霊長類でもよい。特定例では、哺乳動物はヒトである。
【００４８】
選択された定義
本明細書で使用する場合、用語「ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）」、「ナノ粒子（ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）」またはそれらの変異形、例えば、「ナノコンジュゲート」は、ナノメートルスケールでサイズが測定される粒子を意味することが意図される。例えば、用語「ナノ粒子」は１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の直径を有する任意の粒子を指す。典型的には、ナノ粒子は、１００ｎｍ以下の最長直線寸法（例えば、直径）を有する。ナノ粒子は、５０ｎｍ以下の直径を有し得る。例えば、ナノ粒子は、４０ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、２０ｎｍ以下、１０ｎｍ以下または５ｎｍ以下の直径を有し得る。したがって、ナノ粒子は、１ｎｍ〜５０ｎｍ、５ｎｍ〜３０ｎｍ、１０ｎｍ〜２５ｎｍ、１０ｎｍ〜２０ｎｍまたは１５ｎｍ〜２０ｎｍの範囲の直径を有し得る。本明細書に開示されるナノ粒子は、約１００ｎｍ、約９０ｎｍ、約８０ｎｍ、約７０ｎｍ、約６０ｎｍ、約５０ｎｍ、約４０ｎｍ、約３０ｎｍ、約２０ｎｍ、約１５ｎｍ、約１０ｎｍまたは約５ｎｍの平均直径を有し得る。一例では、本明細書に開示されるナノ粒子は、約２５ｎｍまたは約１０ｎｍの平均直径を有する。
【００４９】
本明細書に開示されるナノ粒子は、既知の形状で形成することができる。例えば、ナノ粒子は、ナノスフェア、ナノロッド、ナノワイヤー、ナノキューブ、ナノプレートまたは任意の他の形状でもよい。例えば、ナノ粒子は、ピラミッド形、三角形、フラクタルの形状、または任意の他の形状を形成することができる。好ましくは、ナノ粒子はナノスフェアである。
【００５０】
ナノ粒子は、光学的にまたは磁気的に検出可能であり得る。例えば、本質的に蛍光性または発光性のナノ粒子、蛍光性または発光性部分を含むナノ粒子、プラズモン共鳴性ナノ粒子及び磁性ナノ粒子は、使用することができる検出可能なナノ粒子の中にある。
【００５１】
本明細書に開示されるナノ粒子は、中心コアを含み得る。コアは、本明細書に開示される任意のナノ粒子の寸法を有し得る。コア材料は、任意の適切な固体材料を含んでもよいし、またはそれからなってもよい。例えば、コア材料は、合成のまたは天然に存在するポリマーを含んでもよいし、またはそれからなってもよい。例えば、コアは、シリカ（二酸化ケイ素）を含み得る。あるいは、コア材料は、金属または金属の混合物を含んでもよいし、またはそれからなってもよい。金属は、例えば、金、銀、鉄、コバルト、亜鉛、カドミウム、ニッケル、ガドリニウム、クロム、銅、マンガン、パラジウム、スズ、アルミニウム、合金及び／またはこれらの酸化物、または任意の他の金属でもよい。金属は、任意のプラズモン的に活性な金属または金属の混合物でもよい。一例では、金属は、金、銀または二酸化チタンである。１つの特定例では、金属は銀である。ナノ粒子中の金属コアの存在は、（例えば、「金属増強蛍光」として知られる現象によって）ナノ粒子凝集体の発光強度を高め得る。
【００５２】
それぞれの個々のナノ粒子のコアは、１つまたは複数のシェルで取り囲まれ得る。例えば、コアは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のシェルで取り囲まれ得る。１つまたは複数のシェルは、金属または金属酸化物を含み得る。例えば、シェルは、Ｔｉ、Ｆｅ、Ｃｕ、Ｚｎ、Ｙ、Ｚｒ、Ｎｂ、Ｍｏ、Ｉｎ、Ｓｉ、Ｓｎ、Ｓｂ、Ｔａ、Ｗ、Ｐｂ、Ｂｉ及びＣｅからなる群から選択され、２〜６の原子価を有する少なくとも１種の金属を含む酸化物でもよい。そのような金属の酸化物の形態は、例えば、ＳｉＯ２、ＴｉＯ２、Ｆｅ２Ｏ３、ＣｕＯ、ＺｎＯ、Ｙ２Ｏ３、ＺｒＯ２、Ｎｂ２Ｏ５、ＭｏＯ３、Ｉｎ２Ｏ３、ＳｎＯ２、Ｓｂ２Ｏ５、Ｔａ２Ｏ５、ＷＯ３、ＰｂＯまたはＢｉ２Ｏ３でもよい。
【００５３】
本明細書に開示されるナノ粒子は、ナノ粒子のコロイド安定性に寄与する両親媒性材料でコーティングすることができる。例えば、ナノ粒子は、水性溶媒への溶解性を促進するために、それ自体が両親媒性層でコーティングされている有機層（例えば、オレイン酸）でコーティングすることができる。両親媒性コーティングの外層は、典型的には、コロイド安定性を増強し、親水性層と他のナノ粒子に静電気的に反発する水性環境中に広がる表面電荷との両方を導入し、それにより凝結を防止する。両親媒性コーティングの下に、ナノ粒子は疎水性面を含み得る。
【００５４】
任意の適切な両親媒性コーティングが、本明細書に開示される方法において使用されるナノ粒子上に存在可能である。両親媒性材料は、多数の個々のナノ粒子からなる懸濁液のコロイド安定性を増強する任意の材料を含み得る。例えば、両親媒性コーティングは、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１１）Ｓｅｎｓｏｒｓ  １１，１１０３６−１１０５５に記載されている任意の化合物または化合物の組み合わせを含み得る。したがって、親水性リガンドが疎水性リガンドと完全に置き換わる直接リガンド交換プロセスと異なり、両親媒性材料でナノ粒子を被包する方法は、結合中間体としてネイティブな非極性分子を使用することができる。両親媒性材料の疎水性セクションは、疎水性の安定化剤（例えば、ＴＯＰＯ）を挿入することができ、一方で、親水性部分は水溶解性を伝えることができる。
【００５５】
両親媒性材料は、１種または複数の界面活性剤を含み得る。リン脂質（Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．（２００６）８，３８９５−３９０３、Ｄｕｂｅｒｔｒｅｔ，Ｂ．Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００２）２９８，１７５９−１７６２、Ｆａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．（２００５）５，６４５−６４８）、α−シクロデキストリン（Ｌａｌａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ（２００１）１７，３７６６−３７６８、Ｗａｎｇ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．（２００３）３，１５５５−１５５９）、ｎ−アルカン酸（Ｓｈｅｎ，Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ（１９９９）１５，４４７−４５３）及びセチル−トリメチルアンモニウムブロミド（Ｓｗａｍｉ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ（２００３）１９，１１６８−１１７２）などの界面活性剤を使用することができる。界面活性剤のこれらの特定例はすべて、ナノ粒子を水中に移動させるために使用されている。しかし、比較的弱い疎水性相互作用のために、これらは、生物学的な条件にかけた場合に十分に安定でない可能性がある（Ｙｕ，Ｗ．Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（２００７）１２９，２８７１−２８７９）。両親媒性ポリマーの使用によって、この潜在的な課題を克服することができ、これは、単一ポリマー鎖が複数の疎水性サブユニットを有し得、これが、ナノ粒子表面上の疎水性リガンドとの挿入親和性を大きく増強するからである。したがって、両親媒性材料は、１種または複数の両親媒性ポリマーを含み得る。適切な両親媒性ポリマーの一例は、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）：ｔｈｅ  ａｍｐｈｉｐｈｉｌｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｐｏｌｙ（ｍａｌｅｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ−ａｌｔ−１−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｅ）（ＰＭＡＯ）−ＰＥＧに記載されている。したがって、両親媒性材料は、ポリ（無水マイレン酸−ａｌｔ−１−オクタデセン）（ＰＭＡＯ）−ＰＥＧを含み得る。ＰＭＡＯ−ＰＥＧを調製するための方法は、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）に記載されている。
【００５６】
両親媒性ポリマーでコーティングされたナノ粒子の安定性は、最も外側の層を共有結合的に架橋することによって、さらに向上し得る（Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．（２００４）４，７０３−７０７、Ｗｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（２００３）２１，４１−４６）。したがって、本明細書に開示される両親媒性材料は架橋された外層を含み得る。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「ナノ粒子凝集体」または任意のその変異形は、互いに近接した多数の個々のナノ粒子の安定な集合体を意味することが意図される。一般に、個々のナノ粒子は、非共有結合相互作用によって（例えば、共有結合以外の引力によって）結び付いている。ナノ粒子凝集体は、凝集体の所望の特性（例えば、サイズ、蛍光強度など）に応じて、１個を超える任意の数の個々のナノ粒子を含み得る。典型的には、ナノ粒子凝集体は、約１０個を超える個々のナノ粒子、例えば、約２０個を超える個々のナノ粒子、例えば、約３０個を超える個々のナノ粒子、例えば、約４０個を超える個々のナノ粒子、例えば、約５０個を超える個々のナノ粒子、例えば、約１００個を超える個々のナノ粒子、例えば、約１５０個を超える個々のナノ粒子、例えば、約２００個を超える個々のナノ粒子、例えば、約２５０個を超える個々のナノ粒子、例えば、約３００個を超える個々のナノ粒子、例えば、約４００個を超える個々のナノ粒子、例えば、約５００個を超える個々のナノ粒子、例えば、約６００個を超える個々のナノ粒子、例えば、約７００個を超える個々のナノ粒子、例えば、約８００個を超える個々のナノ粒子、例えば、約９００個を超える個々のナノ粒子、例えば、約１，０００個を超える個々のナノ粒子、例えば、約１，２００個を超える個々のナノ粒子を含む。好ましくは、ナノ粒子凝集体は、約５０個を超える個々のナノ粒子を含む。凝集体内のナノ粒子の数は、凝集体の所期の使用に従って、適合させることができる。例えば、凝集体は、約５０個または約１００個または約１５０個または約２００個または約２５０個または約３００個または約３５０個または約４００個のナノ粒子を含み得る。凝集体がラテラルフロー診断アッセイで使用されることが意図される場合の好ましい一実施形態では、凝集体は約２００個のナノ粒子を含む。
【００５８】
ナノ粒子凝集体は、個々のナノ粒子のサイズを超えるいかなるサイズでもよい。典型的には、ナノ粒子凝集体は、約５０ｎｍまたは約５５ｎｍまたは約６０ｎｍまたは約６５ｎｍまたは約７０ｎｍまたは約７５ｎｍまたは約８０ｎｍまたは約８５ｎｍまたは約９０ｎｍまたは約９５ｎｍまたは約１００ｎｍまたは約１５０ｎｍまたは約２００ｎｍまたは約２５０ｎｍまたは約３００ｎｍまたは約３５０ｎｍまたは約４００ｎｍの平均直径を有する。例えば、ナノ粒子凝集体は、約５０ｎｍ〜約４００ｎｍ、例えば、約７５ｎｍ〜約３００ｎｍ、例えば、約１００ｎｍ〜約２５０ｎｍ、例えば、約１５０ｎｍ〜約２００ｎｍに及ぶ直径を有し得る。あるいは、ナノ粒子凝集体は、約５０ｎｍ〜約１５０ｎｍ、例えば、約６０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、または例えば約７５ｎｍ〜約１５０ｎｍ、または例えば約７５ｎｍ〜約１００ｎｍ、または例えば約６０ｎｍ〜約９０ｎｍに及ぶ直径を有し得る。
【００５９】
ナノ粒子は量子ドットでもよい。本明細書で使用する場合、用語「量子ドット」及びその変異形、例えば、「Ｑドット」、「ＱＤ」などは、サイズ依存的光ルミネセンス特性を有する半導体ナノ結晶を指す。量子ドットはナノ粒子サイズのものである。したがって、量子ドットは、本明細書で定義されるナノ粒子のものと同じサイズを有し得る。典型的には、量子ドットは２ｎｍ〜２０ｎｍに及ぶ平均直径を有し得る。例えば、量子ドットは、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０ｎｍの平均直径を有し得る。
【００６０】
本明細書に開示される方法において、当技術分野で既知の任意の量子ドットを使用することができる。例えば、量子ドットは、限定されないが、第ＩＩ族〜第ＶＩ族金属のものを含めた、任意の半導体材料を含み得る。したがって、量子ドットは、第ＩＩ族〜第ＶＩ族金属または合金またはそれらの混合物を含み得る。例えば、量子ドットは、ＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＨｇＳ、ＨｇＳｅ、ＨｇＴｅ、ＭｇＳ、ＭｇＳｅ、ＭｇＴｅ、ＣａＳ、ＣａＳｅ、ＣａＴｅ、ＳｒＳ、ＳｒＳｅ、ＳｒＴｅ、ＢａＳ、ＢａＳｅ、ＢａＴｅなどのいずれか１つまたは複数を含み得る。さらに、量子ドットは、第ＩＩＩ族〜第Ｖ族金属または合金またはそれらの混合物を含み得る。例えば、量子ドットは、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＮ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂなどのいずれか１つまたは複数を含み得る。さらに、量子ドットは、第ＩＶ族金属または合金またはそれらの混合物を含み得る。例えば、量子ドットは、Ｇｅ、Ｓｉなどのいずれか１つまたは複数を含み得る。一例では、量子ドットは、二元合金、例えば、テルル化カドミウム、セレン化カドミウム、硫化カドミウム、ヒ化インジウム及びリン化インジウムを含む。別の例では、量子ドットは、三元合金、例えばセレン化硫化カドミウムを含む。１つの特定例では、量子ドットはテルル化カドミウムを含む。別の特定例では、量子ドットはセレン化カドミウムを含む。当業者に理解されるように、量子ドットの組成の選択、及び量子ドットのサイズは、量子ドットの特有のスペクトル発光波長に影響を及ぼす。本明細書で使用される量子ドットの材料組成及びサイズは、所望の通りに選択することができる。
【００６１】
制御された凝集
本明細書に開示される方法は、安定なコロイド懸濁液を維持する静電力の制御された破壊に基づく。ナノ粒子（例えば、量子ドットを含む）は、懸濁液中に分散される場合に、個々のナノ粒子間の正味の反発力により、安定なコロイドを形成することが多い。以下の２つのタイプの相互作用がナノスケールで主に関与する：エントロピー力（例えば、静電力）及びファンデルワールス力（図１に例示する）。ファンデルワールス力は、永続的／誘導性双極子間の分子間非共有結合性非静電力であり、粒子が近接する場合に引力的である。対照的に、エントロピー力は、一般に、水溶液中に個々のナノ粒子を分散させる。優勢な相互作用に応じて、システムは、コロイド安定性または制御されない凝集（凝結）を示し得る。
【００６２】
ナノ粒子の表面上の分子構造は、ナノ粒子が水溶液中に分散される場合に表面電荷を規定する。例えば、カルボキシル基は、中性ｐＨで脱プロトン化され、正味の負電荷が生じ、溶液からのイオンは荷電したナノ粒子表面に引っぱられ、静電拡散層を形成して、電荷を遮蔽する。したがって、２つの同一の粒子が近接する場合、粒子周辺のイオン層の間の相互作用は、凝集を防止する反発力をもたらす。ファンデルワールス力はこの反発力に対抗する。累積位置エネルギーは、ファンデルワールス力が優勢である近距離の一次極小、及びエネルギー極大で分離した、より遠い距離の二次極小を特徴とする。エネルギー極大が利用可能な熱エネルギーよりもはるかに大きい場合、凝結の速度は非常に遅く、粒子は長期間溶液中で安定なままであり得る（コロイド安定性）。
【００６３】
本明細書に開示される方法は、個々のナノ粒子の凝集を誘発するために、こうした引力及び反発力の微操作を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、有機溶媒の存在が個々のナノ粒子の表面上の両親媒性コーティングを分解し、ナノ粒子間の正味の反発力を低減させ、凝集を誘発すると考える。したがって、ナノ粒子の初期表面電荷（すなわち、有機溶媒を含むイオン性溶液と接触する前の表面電荷）は低減する。
【００６４】
本明細書に開示される方法において、任意の有機溶媒を使用することができる。有機溶媒は、例えば、極性プロトン性溶媒または非プロトン性溶媒または極性プロトン性溶媒と非プロトン性溶媒の混合物を含み得る。一実施形態では、プロトン性溶媒は、１つまたは複数のヒドロキシル（−ＯＨ）官能基を含み、水を含み得る。プロトン性溶媒はアルコールでもよい。アルコールは、脂肪族、脂環式、芳香族または複素環式のものでもよい。一実施形態では、アルコールは脂肪族のものである。
【００６５】
プロトン性溶媒の例としては、以下が挙げられる：酢酸、ギ酸、メタノール、エタノール、プロパン−１−オール、プロパン−２−オール（イソプロパノール）、ブタン−１−オール、ブタン−２−オール（ｓｅｃ−ブタノール）、２−メチルプロパン−１−オール（イソブタノール）、２−メチルプロパン−２−オール（ｔｅｒｔ−ブタノール）、エタン−１，２−ジオール、プロパン−１，２−ジオール、プロパン−１，２，３−トリオール、水またはこれらの混合物。
【００６６】
非プロトン性溶媒は、炭化水素、ハロゲン化炭化水素、複素環式化合物、エーテルまたはこれらの混合物でもよい。
【００６７】
非プロトン性溶媒の例としては、以下が挙げられる：塩化メチレン（ジクロロメタン）、１，２−ジクロロエタン（塩化エチレン）、トリクロロメタン（クロロホルム）、ペンタン、シクロペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、Ｎ−メチルピロリジノン、ジエチルエーテル、ビス−メトキシメチルエーテル、酢酸エチル、アセトン、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、アセトニトリル（ＭｅＣＮ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、１，４−ジオキサンまたはこれらの混合物。
【００６８】
有機溶媒は、例えば、メタノール、エタノール、プロパン−２−オール、ブタン−２−オール、エタン−１，２−ジオール、プロパン−１，２−ジオール、プロパン−１，２，３−トリオール、トリクロロメタン（クロロホルム）、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミドまたは１，２−ジクロロエタンのいずれか１つまたは複数を含み得る。１つの特定例では、有機溶媒はテトラヒドロフランを含む。
【００６９】
一例では、有機溶媒は、極性プロトン性（好ましくは、メタノール、プロパン−１，２−ジオール）溶媒と非プロトン性（好ましくは、テトラヒドロフラン）溶媒の混合物を含むか、それからなる。より好ましくは、有機溶媒はテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）をさらに含む。溶媒混合物中に含まれるＴＨＦの正確な量は、変更することができるが、好ましくは、１〜２０％、例えば１〜１０％、例えば１〜５％、または例えば３〜２０％、例えば３〜１０％、例えば３〜５％、または例えば５〜２０％、例えば５〜１０％の範囲で存在する。好ましい一実施形態では、ＴＨＦは溶媒混合物の３〜５％の範囲で存在する。
【００７０】
重要なことに、本発明者らは、ナノ粒子の制御された凝集を依然として可能にしながら、本明細書に開示される方法で使用される特定の溶媒成分を変更することができることを示した。特に、ナノ粒子凝集の速度を高めるために、より強い有機溶媒を使用することができる。逆に、ナノ粒子凝集の速度を低下させるために、より弱い有機溶媒を使用することができる。
【００７１】
ナノ粒子凝集の速度を制御するために変更することができる別の因子は、本明細書に開示される方法において使用されるナノ粒子の表面電荷である。したがって、本明細書に開示される方法は、−６０ｍＶ〜＋６０ｍＶの範囲の初期表面電荷を有するナノ粒子を選択することを含み得る。好ましくは、負の初期表面電荷を有するナノ粒子が使用される。例えば、−３０ｍＶ〜０ｍＶの範囲の負の初期表面電荷を有するナノ粒子を使用することができる。一般に、ナノ粒子の初期表面電荷が強いほど、凝集が急速に生じる。したがって、本明細書に開示される方法は、凝集体形成の速度を高めるために、より強い初期表面電荷を有するナノ粒子を選択することを含み得る。逆に、本明細書に開示される方法は、凝集体形成の速度を低下させるために、より弱い初期表面電荷を有するナノ粒子を選択することを含み得る。所望の初期表面電荷は、本明細書に開示される方法で使用するのに適したナノ粒子を選択することによって、または所望の表面電荷を達成するために、有機溶媒を含むイオン性溶液と接触する前にナノ粒子を化学修飾することによって、作出することができることが理解されよう。
【００７２】
ナノ粒子凝集の速度を制御するために変更することができる別の因子は、使用する水溶液のモル濃度である。モル濃度は、例えば、１種または複数の塩を水溶液に加えることによって、変更することができる。適切な塩としては、例えば、以下が挙げられる：炭酸塩、塩化物塩、硫酸塩、クエン酸塩、乳酸塩、酢酸塩、ホウ酸塩またはリン酸塩。したがって、加えることができる適切な塩としては、例えば、塩化物塩、リン酸塩またはホウ酸塩が挙げられる。Ｔｒｉｚｍａ（登録商標）塩基緩衝液（ＣＡＳ番号７７−８６−１；ＮＨ２Ｃ（ＣＨ２ＯＨ）３）などの市販の緩衝液も使用することができる。好ましい一実施形態では、塩溶液のモル濃度は約１０〜１１ｍＭ、例えば約１０．５〜１０．７ｍＭである。任意の塩溶液をこれらの好ましいモル濃度範囲で提供することができるが、好ましい一実施形態では、塩は、約１０〜１１ｍＭ、例えば約１０．５〜１０．７ｍＭのモル濃度を有するホウ酸塩溶液である。
【００７３】
ナノ粒子凝集の速度を制御するために変更することができる別の因子は、凝集が行われる温度である。一般に、温度が高いほど、凝集が急速に生じる。逆に、温度が低いほど、凝集がゆっくりと生じる。任意の適切な温度を選択することができる。一例では、本明細書に開示される方法は、１０℃〜５０℃、例えば１５℃〜４５℃、例えば２０℃〜４０℃、例えば２５℃〜３５℃に及ぶ温度で行われる。本明細書に開示される方法は、約室温の温度で、または約３０℃で、または約３７℃で行うことができる。凝集プロセス全体にわたって一定の温度を維持することができることが理解されよう。あるいは、凝集プロセス全体にわたって、温度を連続的に変えることができる。あるいは、凝集プロセスの過程中に、第１の温度から第２の温度へ（及び場合により、１つまたは複数のさらなる温度へ）温度を変えることができる。この柔軟性は、所望のナノ粒子凝集体の生成を達成するために、凝集プロセスに適用することができる制御のレベルを増す。
【００７４】
ナノ粒子凝集の速度を制御するために変更することができる別の因子は、反応時間である。したがって、反応混合物（凝集を誘導するために必要とされる成分のすべてを含む）を、所望のサイズを有するナノ粒子凝集体の生成を可能にするのに十分な期間にわたってインキュベートすることができる。さらにまた、所望の特性を有するナノ粒子凝集体の生成を確実にするために、反応時間を変更することができる。例えば、凝集プロセスは、ナノ粒子凝集体が閾値サイズを上回って成長しないことを確実にするために、所与の時点で停止することができる。
【００７５】
下流の処理
所望のナノ粒子凝集体の生成後、いくつかの随意の下流処理ステップを行うことができる。例えば、任意の適切な手段によって（例えば、遠心分離によって）、ナノ粒子凝集体を単離することができる。
【００７６】
代わりにまたはさらに、この目的のために当技術分野において使用される任意の適切な安定化手段を使用して、ナノ粒子凝集体をさらに安定化することができる。例えば、安定化剤（例えば、ポリマーブラシ層）を凝集体の表面に施すことができる。
【００７７】
代わりにまたはさらに、機能的薬剤へのさらなるコンジュゲーションのために、ナノ粒子凝集体をプライムすることができる。このプライムは、さらなるコーティングを凝集体表面に加えることを含むことができ、コーティングは、機能的薬剤へのコンジュゲーションを促進する１種または複数の化学部分を含む。
【００７８】
代わりにまたはさらに、ナノ粒子凝集体を機能的薬剤にコンジュゲートすることができる。任意の既知のコンジュゲーション技法を使用して、本明細書に開示される凝集体に機能的薬剤をコンジュゲートすることができる。例えば、適切なコンジュゲーション技法は、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ−３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ａｕｔｈｏｒｓ：Ｇｒｅｇ  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ；Ｉｍｐｒｉｎｔ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔｅ：１９ｔｈ  Ａｕｇｕｓｔ  ２０１３に記載されている。他の適切なコンジュゲーション技法は当業者に知られているであろう。
【００７９】
個々のナノ粒子と比較して大きなサイズのナノ粒子凝集体は、官能基を凝集体表面にコンジュゲートするプロセスを向上させる。例えば、個々のナノ粒子に対するよりも多くの官能基をナノ粒子凝集体に対してコンジュゲートすることができることが多い。さらに、凝集体−官能基コンジュゲートを作出する効率は、個々のナノ粒子−官能基コンジュゲートの生成に対するものよりも大きいことが多い。
【００８０】
本明細書に開示されるナノ粒子凝集体にコンジュゲートすることができる機能的薬剤は、凝集体の所期の使用に応じて選択することができる。例えば、機能的薬剤は、特異的にまたは非特異的に別の分子に結合する捕獲試薬でもよい。したがって、一例では、機能的薬剤は、目的の分析物に特異的に結合する捕獲試薬でもよい。所期の標的エンティティまたは標的分子に応じて、任意の適切な捕獲試薬を使用することができる。捕獲試薬は、標的分子と結合対を形成することができる任意の薬剤でもよい。例示的結合対としては、対応する抗体もしくは結合部分またはそれらの断片と組み合わせた任意のハプテン性または抗原性化合物が挙げられる。したがって、ハプテン性もしくは抗原性化合物または抗体のいずれかを、本明細書に開示されるナノ粒子凝集体にコンジュゲートすることができる。好ましい一例では、本明細書に開示されるナノ粒子凝集体は抗体にコンジュゲートしている。
【００８１】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１つの抗原結合部位を介して、その標的タンパク質及び／またはエピトープに結合することができる、免疫グロブリン分子及び／またはその免疫原性断片及び／またはその修飾形態（例えば、グリコシル化されたものなど）を指す。この用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、キメラ抗体ならびにそれらの断片または変異体、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖抗体（遺伝子的に融合した単鎖分子として、適切なポリペプチドリンカーによって連結された軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子操作分子と定義され、そのような単鎖抗体は、多特異性でもよいし、そうでなくてもよい、多量体の形態、例えば、ダイアボディ、トリアボディ及びテトラボディでもよい）及び単一ドメイン抗体を含む融合ポリペプチドも包含する。この用語は、抗体を含む誘導体、例えば、さらなる成分、例えば、毒素及び／または抗体の安定性を高める化合物を含むコンジュゲートも包含する。
【００８２】
例示的結合対としては、非免疫学的結合対（例えば、ビオチン−アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン）、ホルモン（例えば、チロキシン／コルチゾール）−ホルモン結合タンパク質、受容体−受容体アゴニストまたはアンタゴニスト（例えば、アセチルコリン受容体−アセチルコリンまたはそれらの類似体）、ＩｇＧ−プロテインＡ、レクチン−炭水化物、酵素−酵素補因子、酵素−酵素阻害剤、アプタマー−抗原及び核酸二重鎖を形成することができる相補的ポリヌクレオチド対なども挙げられる。本明細書で使用する場合、用語「ポリヌクレオチド」は、一本鎖もしくは二本鎖の、センス方向もしくはアンチセンス方向もしくは両方の組み合わせのＤＮＡ、ＲＮＡもしくはこれらの組み合わせ、ｄｓＲＮＡ、または他のものを含む。ポリヌクレオチドは、その安定性を増強するために任意の修飾を含むことができ、標的ポリヌクレオチドに結合するのに十分であるいかなる長さでもよい。
【００８３】
捕獲試薬は、標的分子に特異的に結合することができ得る。「特異的に結合する」は、捕獲試薬が、標的分子を含む試料中に存在する他の分子よりも大きな親和性で標的分子に結合することを意味する。したがって、一例では、本明細書に開示されるナノ粒子凝集体は、対象から得られた試料中の特異的な標的タンパク質またはポリヌクレオチドに結合するように使用することができる。
【００８４】
捕獲試薬は、当技術分野で既知の任意の適切な手段によって、ナノ粒子凝集体にコンジュゲートされ得る。捕獲試薬は、１つまたは複数のリンカーを介して、直接的または間接的にナノ粒子凝集体にコンジュゲートされ得る。捕獲試薬の直接連結は、凝集体の外表面上の官能基及び結合薬剤それ自体が化学的付着点として働くことを意味する。そのような例では、外表面を、反応基、例えば、チオール、アミン、カルボキシル、ヒドロキシル基などを有する機能性有機分子によって修飾することができる。適切な表面活性反応物としては、限定されないが、そのような直接連結に対応するための、脂肪族及び芳香族アミン、メルカプトカルボン酸、カルボン酸、アルデヒド、アミド、クロロメチル基、ヒドラジド、ヒドロキシル基、スルホネート、スルフェートなどが挙げられる。
【００８５】
１つまたは複数のリンカー（または「スペーサー」）を介して、ナノ粒子凝集体の外表面への捕獲試薬の付着が生じる場合、適切なリンカーは、（限定はされないが）、脂質、ポリペプチド、オリゴヌクレオチド、ポリマーなどを含み得る。
【００８６】
ナノ粒子凝集体の機能化で使用することができる他の化学物質としては、ポリマー、シラン、界面活性剤、生物試薬及び金属酸化物コーティングが挙げられる。
【００８７】
さらに、凝集体の表面上に沈着する化学蒸気に凝集体をさらすことによって、乾燥ナノ粒子凝集体を機能化することができる。沈着し得るコーティングの例としては、シラン、他の金属酸化物前駆体及びポリマーが挙げられる。疎水性、親水性及び非多孔性コーティングを施すこともできる。一般に、（乾燥状態かどうかを問わず）、ナノ粒子凝集体は、流動床、ｖ−ブレンダー、スラントコーンブレンダー、ミル、アコースティックミキサー（例えば、ＬａｂＲＡＭ）、振盪機及び振盪機中でコーティングすることができる。コーティング後、ナノ粒子を乾燥状態で保持することができ、または溶媒中に分散させ、粉砕、超音波処理、顕微溶液化または均質化などの方法によって解凝集することができる。
【００８８】
代わりにまたはさらに、ナノ粒子凝集体をその所期の使用のために製剤化することができる。これは、適切な保存緩衝液中でナノ粒子凝集体を製剤化することを含み得る。したがって、本明細書に開示される方法は、ナノ粒子凝集体を保存緩衝液中に再懸濁することを含み得る。あるいは、ナノ粒子凝集体を乾燥させることができる。乾燥は、熱乾燥、蒸発性乾燥、ロトバップ乾燥、スピードバック乾燥、凍結乾燥、超臨界乾燥及び噴霧凍結乾燥を含めた多くの方法によって、達成することができる。したがって、本明細書に開示される方法は、さらに、ナノ粒子凝集体を乾燥することを含み得る。
【００８９】
さらに、本明細書に開示されるナノ粒子凝集体は、医薬としてまたは化粧品として許容されるいかなる種類の組成物中にも組み込むことができる。例えば、凝集体を溶液、コロイド分散体、乳濁液（水中油型または油中水型）、懸濁液、粉末、ファンデーション、クリーム、リップクリーム、ローション、ゲル、フォーム、ムース、スプレーなどに加えることができる。様々なビヒクルタイプの製剤のための方法は当技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ  ＩＩで見出すことができる。
【００９０】
アッセイ形式
本開示は、任意の形態のアッセイにおける本明細書に開示されるナノ粒子凝集体の使用も提供する。例えば、アッセイはイムノアッセイでもよい。例示的イムノアッセイとしては、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、競合アッセイ、ラジオイムノアッセイ、ラテラルフローイムノアッセイ、フロースルーイムノアッセイ、比濁ベースのアッセイ、濁度ベースのアッセイ、蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）ベースのアッセイ、免疫組織学検査、免疫化学検査、マイクロアレイなどが挙げられる。好ましい一例では、本開示は、ラテラルフローアッセイ、例えば、ラテラルフローイムノアッセイにおける開示される、ナノ粒子凝集体の使用を提供する。本明細書に開示されるナノ粒子凝集体は、生物試料中の標的タンパク質または核酸などの任意の分析物の存在を決定するために、本明細書に記載のアッセイのうちのいずれかで使用することができる。
【００９１】
キット
本開示は、本明細書で開示されるナノ粒子凝集体を含むキットをさらに提供する。ナノ粒子は、溶液で、または乾燥形態で提供することができる。
【００９２】
場合により、本開示のキットは、使用のための指示書とともにパッケージ化される。例えば、指示書は、本明細書に記載のアッセイ方法においてナノ粒子凝集体を正しく使用する方法を使用者に伝えることができる。したがって、一例では、指示書は対象から得られた試料中の分析物と関係がある疾患、障害または生理的状態を診断する方法においてナノ粒子凝集体を正しく使用する方法を、使用者に伝えることができる。
【実施例】
【００９３】
本開示を以下の非限定例に関してさらに説明する。
【００９４】
実施例１：ナノ粒子凝集体の自己集合
量子ドットナノ結晶（「Ｑドット」と本明細書で称される）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｑ２１３７１ＭＰ）を解析のために選択した。これらのＱドットは、合成中に安定化疎水性薬剤でキャップされるコアシェル構造から構成されるナノ結晶である。表面は、両親媒性コーティングの生成によって、合成後に修飾される。両親媒性コーティングは、安定化疎水性薬剤と相互作用する疎水性基、及び水溶性をもたらし、非特異的相互作用を軽減する親水性基を有する。これは、下流の生物機能化に使用される機能性部分（例えば、従来のカルボジイミド化学のためのカルボキシル基）も導入する。その結果、Ｑドットは、高い単分散度を特徴とする非常に安定なコロイドを形成する。本研究で使用されるＱドットのＺ電位はおよそ−３０ｍＶであった。
【００９５】
Ｑドットは、４：１のメタノール：１，２プロパンジオール中の５％テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）から構成される溶媒混合物へ（保存緩衝液とともに）直接移す前に、保存緩衝液（５０ｍＭホウ酸緩衝液）中に保持した。Ｑドットを溶媒混合物へ移すと、凝集プロセスが直ちに誘発された。凝集は比較的長い期間（１〜３時間）にわたって生じ、Ｑドットの高密度コアを生成した（図２）。凝集フェーズの終わりに、１０，０００ＲＣＦで８分間の遠心分離によってナノ粒子凝集体を単離し、これを水に再懸濁し、ここで、これは良好なコロイド安定性を示した（明白な凝結は観察されなかった）。
【００９６】
実施例２：モル濃度はナノ粒子の凝集速度に影響する
実施例１で観察された自己集合を導く物理的メカニズムをより良く理解するために、溶液のモル濃度がどのように凝集に影響を及ぼすかについて検討した。保存緩衝液（５０ｍＭホウ酸緩衝液）に懸濁させたＱドットに漸増量の脱イオン水を加えることによって、反応混合物のモル濃度を変化させた。これは、Ｑドット保存緩衝液のモル濃度を５０ｍＭから１０〜１１ｍＭへ効果的に低下させた。異なる濃度の保存緩衝液に懸濁させたＱドットを溶媒混合物（４：１のメタノール：１，２プロパンジオール中の５％テトラヒドロフラン（ＴＨＦ））に直接移し、それによって、反応混合物を形成した。これは、反応混合物のモル濃度を効果的に変化させた。反応混合物中で１時間インキュベートした後、１０，０００ＲＣＦで８分間の遠心分離によって、形成したナノ粒子凝集体を個々のＱドットから分離した。ペレットを水に再懸濁し、次いで、緩衝液のモル濃度の関数として、（各凝集体中の個々のＱドットの数によって決定される）凝集効率を推定するために使用した。
【００９７】
図３に示すように、モル濃度と凝集収率（ナノ粒子凝集体中に存在する個々のＱドットの数）の間に直線関係が観察され、最適なモル濃度は１０．５〜１０．７ｍＭの範囲内であった。
【００９８】
実施例３：ナノ粒子凝集体の蛍光強度に対するモル濃度の影響
上清及び凝集体の蛍光強度を測定することによって、実施例２でより高い凝集体収率（１０．５〜１０．７ｍＭ）をもたらすことが示されたモル濃度の範囲について、凝集プロセスをさらに解析した。手短に言えば、５０ｍＭホウ酸緩衝液中で提供される、ストックＱドットの２５μＬの一定分量を、脱イオン水を加えることによって所望のモル濃度に希釈した。９２μＬの凝集緩衝液（４：１のメタノール：１，２プロパンジオール中の５％テトラヒドロフラン（ＴＨＦ））をその混合物に加えて、凝集を誘発し、室温で６０分間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、１μＬの溶液を９９μＬのＨ２Ｏを含む９６ウェルプレートのウェルに移した。１０，０００ＲＣＦで８分間試料を遠心分離し、蛍光強度（＝「最初のインキュベーション後の粒子」）の決定のために、１μＬの上清を９６ウェルプレートに移した。脱イオン水中でさらに３回ストックを洗浄し、９９μＬの脱イオン水を含む９６ウェルプレートのウェル中に１μＬを移した（＝「最終測定」）。最終測定は、粒子が洗浄中に失われないこと、及び凝集後に凝集体が安定なままであることを検証するために行った。蛍光強度は、蛍光強度の任意単位（相対蛍光強度またはＲＦＵ）で表す。
【００９９】
図４に示すように、上清の蛍光強度は、モル濃度の低下とともに漸増した。これは、凝集収率がモル濃度とともに増大するという本発明者らの以前の観察と相関する。
【０１００】
凝集体の蛍光は、モル濃度と無関係であるように思われた。所与の凝集時間に対する収率の増大がより速い凝集キネティクスと同等であることを考慮すると、より高いモル濃度でのサイズ分布は、より大きな凝集体に偏っている可能性がある。理論に拘束されることを望むものではないが、蛍光の低減は、近接している場合のＱドットの潜在的なクエンチングによるか（しかし、小さな／大きな凝集体に対して凝集体間の同じ距離期待されることを考えれば、これは可能性が低い）、凝集体のコアに位置するＱドットが、励起放射するには深く埋められすぎていることが理由であるかのいずれかで、説明され得る。
【０１０１】
別途、上記の段落［０１１２］に記載されている同じプロトコールによって、Ｑドットの複数のロットを蛍光強度について解析して、商業的に得た製品ロット間の変動性を検討した。
【０１０２】
図５に例示するように、状態（例えば、Ｑドットの保存状態または表面化学）のわずかなロット間変動が、凝集キネティクスに影響を及ぼすことが示された。その結果、本明細書に開示される方法によって生成されるナノ粒子凝集体の蛍光特性のより大きな均一性を確実にするために、ナノ粒子凝集体の成長のリアルタイムモニタリングが推奨される。凝集体の成長のリアルタイムモニタリングと凝集間の実験条件の制御された変更（例えば、反応混合物のモル濃度）とを組み合わせることによって、非常に再現性のあるナノ粒子凝集体の生成が達成される。
【０１０３】
実施例４：ナノ粒子凝集体の安定化及び機能化
実施例１に記載されている凝集条件下で、ｉＺｏｎアナライザー（ｉＺｏｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、ナノ粒子（Ｑドット）凝集体の成長のリアルタイムモニタリングを行った。凝集プロセスの開始時は、反応混合物中に凝集体は存在せず、すべてのＱドットはｉＺｏｎアナライザーのサイズ解像度未満である。粒子数及び平均サイズは経時的に漸増し、試料のサイズ分布が所定の値に達した時に、１０，０００ＲＣＦで８分間の遠心分離及び脱イオン水へのペレットの再懸濁によって反応を止めた。
【０１０４】
凝集体の成長のリアルタイムモニタリングの結果を図６に図示する。興味深いことに、成長プロセスは、単一のＱドットが溶液から枯渇した後でも進行し、結果として粒子濃度が低下し（例えば、挿入図中のｔ＝２５０分のデータ点を参照されたい）、長いインキュベーション時間の間により大きな凝集体が出現する（メインパネル、Ｔ２４０を参照されたい）ことが観察された。
【０１０５】
凝集プロセス後に、市販のＱドット安定化方法を使用してＱドット凝集体をさらに安定化させ、既知の「クリック」化学を使用してさらに機能化して、抗インフルエンザモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を凝集体にコンジュゲートした。
【０１０６】
コンジュゲーションの成功を２つの試験で評価した：
ａ）ＦＩＴＣ−ＧＡＭ（ヤギ抗マウス）
蛍光色素（ＦＩＴＣ）で標識された抗マウス抗体を「クリック化学を使用した（ｃｌｉｃｋｅｄ）」ナノ粒子凝集体とともにインキュベートした。インキュベーション後、未結合のＦＩＴＣ−ｍＡｂを洗浄ステップで除去し、ＦＩＴＣ由来の蛍光強度をナノ粒子凝集体の蛍光強度と相関させた。図７に結果を図示する。この方法によって、ナノ粒子凝集体あたりの抗体の数の推定を行うことが可能になった。
ｂ）機能性試験
ナノ粒子凝集体の機能性試験を行い、参照校正物を使用して得られたシグナル振幅をあらかじめ決定された範囲内で比較した。本試験の結果を図８に図示する。本対照試験の許容可能なレベル内でシグナル振幅を示すナノ粒子凝集体試料を診断アッセイでの使用に適するとみなした。
【０１０７】
要約すると、既知のコンジュゲーション化学を首尾よく使用して、抗インフルエンザモノクローナル抗体をナノ粒子凝集体にコンジュゲートし、試料中のインフルエンザを検出するためのアッセイでそれらを引き続き使用することが可能になった。
【０１０８】
実施例５：凝集に対するナノ粒子の表面電荷の影響
様々な表面化学（及び、したがって、様々な表面電荷）を有するいくつかの異なる市販の量子ドットＨ２Ｏ中に入った状態で得た。Ｑドットを含む溶液のモル濃度を、漸増量の２Ｍ  ＮａＣｌを添加することによって所望のレベルに調整した。使用した量子ドットを表１に記載する。
【表１】
2020523430.tif 000003
【０１０９】
表１に列挙される量子ドットを実施例１に記載される凝集条件にかけた。反応混合物のインキュベーションは室温で行った。凝集体のサイズを推定するための間接的な方法として、試料をその蛍光強度について定期的にモニターした。サイズの推定は、より大きな凝集体は、遠心分離によって個々のＱドット（または、小さな凝集体）から分離することができ、したがって、凝集プロセスが発生するとともに、凝集していない個々のＱドットから放射される上清の残留蛍光は経時的に減少するという原理に基づいた。したがって、サイズの推定は、試料を定期的に遠心分離し、上清の蛍光強度を測定することによって行った。凝集の間の４つの異なる時点で測定した、Ｑドットの３つの異なるロットについて行ったこれらの測定の例を図９に図示する。
【０１１０】
上記の蛍光強度シグナルによるサイズの推定に加えて、動的光散乱法（ＤＬＳ）によって、残留蛍光とナノ粒子凝集体集団の平均サイズの間の相関関係を決定した。ＤＬＳを使用して生成された、形成されたナノ粒子凝集体の平均サイズを示す代表的なデータを図１０に示す。
【０１１１】
ＤＬＳによって、遅い成長（これは、個々のＱドットが、続いてさらなる成長に進行する初期の「種」を形成する、核形成フェーズに起因する）を特徴とする初期フェーズが明らかになった。初期の核形成が一旦生じると、成長は急速に、線形傾向を有して進行する。しかし、このプロセスは、環境条件の小さな変化（例えば、図５に示すような、凝集混合物のモル濃度または化学量のゆらぎ）に感受性である。
【０１１２】
感受性であるが、このプロセスは、凝集フェーズの動的な（バッチ特異的な）持続時間を有することによって、非常に再現性のあるナノ粒子凝集体バッチをもたらすように、正確に制御することができ、十分な柔軟性を有する。ナノ粒子凝集体集団の平均サイズの直線的な増大は、（図９に示すように）遠心分離後の上清の残留蛍光の漸減を伴う。したがって、ナノ粒子凝集体の形成は、上清の残留蛍光強度をモニターすることによって検証することができる。凝集が制御されず、より大きな凝集体をもたらす場合、残留蛍光は漸減を示さないが、より突然の急速な低下を示すであろう。
【０１１３】
表１に列挙される量子ドットを実施例１に記載される凝集条件にかけた結果を表２にまとめる。
【表２】
2020523430.tif 000004
【０１１４】
表２に示す結果から分かるように、本実施例で使用した特定の凝集混合物は、高度に負の表面電荷（例えば、カルボン酸基によって生じる）を有するＱドットの凝集を誘導するには穏やかすぎる環境か、軽度に負の表面または正に荷電した表面（例えば、ヒドロキシル基またはアミン基によって生じる）を有するＱドットの凝集を誘導するには過激すぎる環境のいずれかをもたらした。
【０１１５】
興味深いことに、水性合成で生成された（したがって、両親媒性コーティングを有さない）量子ドットについて凝集が観察された。しかし、凝集は可逆的であった。凝集体は、遠心分離してからチューブを穏やかに撹拌することによって容易に再懸濁することが可能であった。そのような可逆的凝集は実用価値がほとんどなく、これは、形成される凝集体が非常に不安定であるからである。それにもかかわらず、本明細書に記載のものを含めた既知の安定化技法を使用して、生成された不安定な凝集体を安定化することができる。
【０１１６】
実施例６：様々な表面電荷を有するナノ粒子の凝集に対するモル濃度の影響
凝集プロセスを制御するために反応混合物のモル濃度を変更できるという本明細書における実証を考えて、実施例５で用いられる特定の反応条件下で制御された凝集を受けない、実施例５に示されるＱドットを、凝集の制御を救うためにモル濃度を変更することができるかどうかを判断するために、様々なモル濃度を有する異なる反応混合物にかけた。
【０１１７】
（Ｚ電位が約−３０ｍＶである対照バッチと比較して）−５０ｍＶ〜−３０ｍＶに及ぶＺ電位を有する、その表面にカルボン酸基を有する表２のＱドットを、実施例１に記載される凝集緩衝液（４：１のメタノール：１，２プロパンジオール中の５％テトラヒドロフラン（ＴＨＦ））とともに４ｍＭ〜７ｍＭに及ぶモル濃度の塩化ナトリウム溶液中に入れることにより、凝集体に誘導した。凝集体形成は、実施例５に記載されているように、所与のインキュベーション時間後に上清の残留蛍光強度を測定することによって決定した。そのようなナノ粒子凝集体の制御された形成を示す一例の結果を図１１に示す。
【０１１８】
次いで、中性に近い電荷を有する表面基を有するナノ粒子（例えば、ＰＥＧ−ＯＨ、ＮＨ２  Ｑドット）の制御された凝集を誘導するために、反応混合物のモル濃度を変更した。凝集環境を調節するために、幅広い緩衝液モル濃度（０ｍＭ〜２０ｍＭ）を様々な含有パーセンテージのＴＨＦと組み合わせて試験した。これらの実験の結果を図１２に図示する。図１２に示すように、有機溶媒のセンテージの増大は、残留蛍光強度を低減させ、これは、ナノ粒子凝集体の形成を示す。
【０１１９】
これらの発見は、反応混合物（すなわち、凝集緩衝液）の組成または緩衝溶液（すなわち、保存緩衝液及び／または反応混合物）のモル濃度を調整することによって、−３０ｍＶ〜０ｍＶの範囲の表面電荷を有するＱドットの凝集を達成することができることを示す。凝集プロセスは、非常に急速になるように制御することができる。さらに、凝集プロセスは環境条件に感受性であり得る。例えば、中性の表面を有するナノ粒子は、３％未満のＴＨＦが反応混合物中に存在する場合はコロイド的に安定であり得るが、ＴＨＦ含量を３．７５％に単に増大させることにより、非常に急速な凝集をもたらすことができる。
【０１２０】
これらの発見は、本システムが、環境条件の比較的軽微な変化の際にコロイド的な安定から凝集に移行する準安定状態を有することも示す。中性の表面電荷を有するナノ粒子の凝集を制御するために条件を調整できることが本明細書で示されているが、プロセスの頑強性及び全体的なバッチ間再現性のために、ナノ粒子の強く負の表面電荷が好ましい。
【０１２１】
実施例７：ナノ粒子凝集に対する有機溶媒の影響
次いで、本発明者らは、所望の制御されたナノ粒子凝集を依然として達成しながら、本明細書に開示される方法において様々な有機溶媒成分を使用することができると判断した。表３に列挙される化合物のそれぞれ（及び、それらの組み合わせ）は、本発明者らによって、本明細書で開示されるナノ粒子の制御された凝集での使用に適することが示された。
【表３】
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高分子量の使用化合物ほど、凝集を妨げないが遠心分離による分離の容易さに影響を及ぼす粘性環境をもたらした。最も長い炭素鎖を有するアルコール（例えば、ブタノール）は最も好ましくなく、これは、量子ドットの非常に急速な凝集を誘導するわずかな傾向を示し、凝集体の最も大きなサイズを制御することを少し難しくした高い疎水性の尾部が理由である。それにもかかわらず、これらの化合物のすべては、制御されたＱドットの凝集のための方法における使用に適することが分かった。本明細書で示すように、他の凝集条件（例えば、使用されるナノ粒子の表面電荷、凝集混合物のモル濃度など）を変更することによって、表３に列挙される成分のうちのいずれか、または成分の任意の組み合わせを使用して、特に所望される凝集動態を最適化することができることも認識されるであろう。
【０１２２】
実施例８：ナノ粒子凝集に対する有機溶媒の影響
ナノ粒子凝集体の制御された形成を依然として達成しながら、使用する特定の有機溶媒を変更することができるさらなる実証では、代替の有機溶媒（ＴＨＦの代わりにピロリジン及びジメチルホルムアミド（ＤＭＦ））を使用して、実施例１に記載されている凝集プロセスを繰り返した。
【０１２３】
本実験の結果を図１３に示す。図１３は、凝集ステップで利用した有機溶媒の関数として、上清の蛍光強度の時間発展を図示する。データは、凝集プロセスは、異なるキネティクスを有するにもかかわらず、溶媒に関係なく非常に類似して生じることを示す。ＤＭＦは穏やかで遅い凝集をもたらしたが、ピロリジンは、ＤＭＦまたはＴＨＦよりもはるかに速くＱドット凝集を誘導した。凝集プロセスの特定のキネティクスは、他のパラメーター、例えば、有機溶媒、または本明細書に記載の他の変数の濃度（例えば、Ｑドット表面電荷、緩衝液のモル濃度など）のうちのいずれかを調整することによって、さらに制御することができる。
【０１２４】
実施例９：ナノ粒子凝集体サイズに対する凝集時間の影響
ＤＬＳを使用して、形成されるナノ粒子凝集体のサイズに対する凝集時間の影響をモニターした。実施例１に記載されている凝集プロセスを繰り返し、凝集プロセスの開始後の様々な時点でＤＬＳ測定を行った。本実験の結果を図１４に図示する。
【０１２５】
ＤＬＳデータは、凝集プロセスが延びることにより、より大きな凝集体（凝集体の平均流体力学半径は３０ｎｍ〜１００ｎｍに及んだ）が進行的にもたらされることを明らかに示す。個々の量子ドットは、およそ１５ｎｍの流体力学半径を有する。さらに表面ブロッキング及び抗体機能化を行った後、粒径は２００〜２２０ｎｍまで増加した。
【０１２６】
次いで、本発明者らは、本明細書に開示される方法が均一サイズのナノ粒子凝集体を生成することをさらに示した。表４は、個々のナノ粒子の３つの異なるバッチを使用して形成されたナノ粒子凝集体の平均粒径及び多分散指数の概要を示し、これは、バッチ間の高い再現性を示した。上記のように、さらに表面ブロッキング及び抗インフルエンザ抗体へのコンジュゲーションを行った後、ＤＬＳを使用してサイズ測定を行った。用語「多分散指数」は、分布の「不均一性」の程度を説明するのに使用される。完全に単分散した分布はＰＤＩ＝０を特徴とすると思われ、ＰＤＩ＞０．４は、通常、広く多分散したナノ粒子集団の指標である。表４に示すように、調製されたナノ粒子凝集体の各バッチに対するＰＤＩは低く、これは、各バッチにおいて生成されたナノ粒子凝集体のサイズの高度な均一性を示す。
【表４】
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【０１２７】
実施例１０：ナノ粒子凝集体の蛍光の増強
本明細書に開示される蛍光性ナノ粒子凝集体は、高い輝度を特徴とする。この高い輝度は、各凝集体中の多数の個々のナノ粒子から生じると考えられる。その結果、同じ捕獲試薬にコンジュゲートした個々のナノ粒子を使用して生成されるシグナルよりも強いシグナルが凝集体によって生成されるので、捕獲試薬にコンジュゲートしたナノ粒子凝集体と分析物の間の結合イベントをより正確に検出することができる。
【０１２８】
この利点を実証するために、本発明者らは、個々の量子ドットをストレプトアビジンで機能化し、続いて、インフルエンザに対するビオチン化抗体で個々の量子ドットをコーティングした。機能化した個々の量子ドットによって生成されるシグナルと本明細書で開示される機能化したナノ粒子凝集体によって生成されるシグナルを直接比較するために、ナノ粒子凝集体の同じ機能化を行った。対照インフルエンザ抗原への結合の際に、個々の量子ドットによって、及びナノ粒子凝集体によって生成される蛍光強度シグナルを測定した。図１５に結果を示す。
【０１２９】
図１５に示すように、ナノ粒子凝集体によって生成される蛍光シグナルは、個々のナノ粒子によって与えられるものよりも有意に強い。はるかに低い濃度のナノ粒子凝集体に与えられるものと同じレベルのシグナルを生成するためには、はるかに高い濃度の個々のナノ粒子が必要とされる。
【０１３０】
次いで、本発明者らは、ナノ粒子凝集体と比較して、個々のナノ粒子の相対的アッセイ性能を比較した。ラテラルフロー試験ストリップ上に２つのタイプの構築物を配置し、様々な濃度のインフルエンザ抗原（インフルエンザ核タンパク質）への結合の際に生成されるシグナルを測定した。試験あたり等しいモル濃度または等しい粒子ロード量でサンドイッチイムノアッセイを使用して、ナノ粒子凝集体と比較した、単一ナノ粒子構築物から得られる検出の相対下限を決定した。個々のナノ粒子の濃度は原材料の供給業者によって提供された。凝集体構築物の濃度は、元素分析、すなわち、ＩＣＰ−ＭＳによって推定した。イムノクロマトグラフィーの試験ストリップは、ニトロセルロース膜のセクション内の別々の位置に、インフルエンザＡ核タンパク質に対して特異的な捕獲抗体を固定化することによって、固相として調製した。個々のナノ粒子または凝集体構築物は、固相の上流のリリースパッド中に固定化した。分析物の希釈系列を模擬マトリックス中に調製し、次いで試験ストリップ上にロードして、クロマトグラフィーを開始した。各分析物濃度に応じてイムノクロマトグラフィーの試験ストリップから放射される蛍光強度の測定は、薄層クロマトグラフィースキャナーを使用して行った。図１６に結果を示す。
【０１３１】
図１６に示すように、機能化したナノ粒子凝集体は、個々の機能化したナノ粒子と比較して、１００倍低い濃度で存在するインフルエンザ抗原を検出することができた。これはアッセイの感度を著しく向上させる。したがって、本明細書に開示されるナノ粒子凝集体は、診断、例えば医療診断の分野で使用される場合に特に有利である。１つの特定例では、本明細書に開示されるナノ粒子凝集体は、ラテラルフローアッセイ、例えばラテラルフローイムノアッセイで使用される場合に特に有利である。
【０１３２】
実施例１１：ナノ粒子凝集に対する温度の影響
本明細書に開示されるナノ粒子凝集プロセスにおける温度の影響を理解するために、異なる温度（室温、３０℃及び３７℃）で実施例１に記載されている凝集プロセスを行った。本実験の結果を図１７に示す。
【０１３３】
図１７に示すように、凝集プロセスの動態の有意な変化はなかったが、温度の上昇は、凝集のより速いキネティクスをもたらした。したがって、凝集速度は、凝集プロセスの間に温度を変更することによって制御することができる。例えば、凝集プロセスが行われる温度を高めることによって、凝集速度を高めることができる。
【０１３４】
実施例１２：異なる表面電荷を有するナノ粒子凝集に対する有機溶媒の影響
異なる表面電荷を有するナノ粒子が使用される場合に、有機溶媒の特定の選択が凝集プロセスに対する影響を保持することを実証するために、本発明者らは、−ＮＨ２及びポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド（ＰＤＤＡ）基でキャップされた、正に荷電した量子ドットを使用して、実施例８に記載されている実験を繰り返した。これら２つの表面化学は、正に荷電したポリマーブラシでナノ粒子をキャップする。−ＮＨ２量子ドットは、ＰＥＧポリマーの薄層及び低密度の正に荷電した官能基（約０ｍＶのＺ電位）を有するが、ＰＤＤＡ基は、厚いポリマーブラシ（約＋４０ｍＶのＺ電位）上に高密度に詰められている。本実験の結果を図１８に示す。
【０１３５】
図１８に示すように、ピロリドン（より急速なキネティクスを有する溶媒であり、したがって、より効力のある溶媒である）は、正の表面電荷を有する、ＰＤＤＡでコーティングされたナノ粒子を凝集することができる。軽度に荷電したナノ粒子（−ＮＨ２）は、効力の弱い有機溶媒（ＴＨＦ、図１２を参照されたい）で凝集することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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