(57)【要約】本開示は、ヒトプロテアーゼ活性化受容体４（ＰＡＲ４）結合タンパク質（例えば、抗体）を対象とする。詳細には、ヒトＰＡＲ４のアンタゴニストである抗ＰＡＲ４結合タンパク質、ならびにその方法及び使用を対象とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＰＡＲ４組換え抗体もしくは合成抗体もしくはモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であるプロテアーゼ活性化受容体４（ＰＡＲ４）結合タンパク質であって、トロンビンの存在下で、細胞表面発現ヒトＰＡＲ４の切断を５０％以上阻害する、前記プロテアーゼ活性化受容体４（ＰＡＲ４）結合タンパク質。
【請求項２】
前記トロンビンの存在下で、細胞表面発現ＰＡＲ４の（ｉ）６０％以上の切断、または（ｉｉ）７０％以上の切断、または（ｉｉｉ）８０％以上の切断を阻害する、請求項１に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項３】
前記トロンビンの存在下で、細胞表面発現ＰＡＲ４の９０％以上の切断を阻害する、請求項１または２に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項４】
ＰＡＲ４のトロンビン切断部位にまたがるエピトープに対し特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項５】
前記エピトープが配列ＡＰＲＧＹを含み、前記トロンビン切断部位がＲＧに対応する、請求項４に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項６】
前記エピトープがＩＬＰＡＰＲＧＹまたはＡＰＲＧＹＰＧＱＶから選択される配列を含むまたは前記配列からなる、請求項４または５に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項７】
前記抗体がヒトＰＡＲ４のＡｌａ１２０及び／またはＴｈｒ１２０バリアントに結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質が、ヒトＰＡＲ１、ＰＡＲ２、またはＰＡＲ３に結合しないかまたは実質的に結合しない、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項９】
以下に示される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
2020533022.tif 000025
（配列中、
Ｘ１はＶまたはＩであり、
Ｘ２はＡまたはＶであり、
Ｘ３はＴまたはＡであり、
Ｘ４はＬまたはＦであり、
Ｘ５はＮまたはＳであり、
Ｘ６はＹまたはＤであり、
Ｘ７はＳまたはＡであり、
Ｘ８はＹまたはＦであり、
Ｘ９はＳまたはＲであり、
Ｘ１０はＮまたはＳであり、
Ｘ１１はＫまたはＲであり、
Ｘ１２はＨまたはＹであり、
Ｘ１３はＡ、Ｌ、またはＴであり、
Ｘ１４はＫまたはＲであり、
Ｘ１５はＴまたはＤであり、
Ｘ１６はＮまたはＴであり、
Ｘ１７はＬまたはＱであり、
Ｘ１８はＹまたはＦであり、
Ｘ１９はＳまたはＩであり、
Ｘ２０はＳまたはＴであり、
Ｘ２１はＩ、Ｓ、またはＡであり、；
Ｘ２２はＶ、Ｉ、Ｍ、またはＬであり、
Ｘ２３はＥ、Ｓ、Ｖ、またはＩであり、
Ｘ２４はＶ、Ｔ、Ｒ、またはＧであり、
Ｘ２５はＬ、Ｒ、またはＧであり、
Ｘ２６はＰまたはＶである）
【請求項１０】
以下に示される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
2020533022.tif 000026
（配列中、
Ｘ１はＫまたはＥであり、
Ｘ２はＶまたはＡであり、
Ｘ３はＲまたはＧであり、
Ｘ４はＡまたはＴであり、
Ｘ５はＲまたはＳであり、
Ｘ６はＶまたはＩであり、
Ｘ７はＮまたはＳであり、
Ｘ８はＮまたはＳであり、
Ｘ９はＦまたはＹであり、
Ｘ１０はＦまたはＬであり、
Ｘ１１はＩまたはＴであり、
Ｘ１２はＩまたはＴであり、
Ｘ１３はＦまたはＬであり、
Ｘ１４はＳまたはＴであり、
Ｘ１５はＶまたはＬであり、
Ｘ１６はＮ、Ｒ、またはＳである）
【請求項１１】
前記ＶＨが以下からなる群より選択されるＣＤＲ１配列を含む、請求項９または１０に記載のＰＡＲ４結合タンパク質：
（ｉ）ＧＦＴＬＳＮＹＧ（配列番号１３）；
（ｉｉ）ＧＦＴＦＳＳＤＧ（配列番号５９）；
（ｉｉｉ）ＧＦＴＦＳＮＹＧ（配列番号６８）；
（ｉｖ）ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号５５）；
（ｖ）ＧＦＡＦＳＳＹＧ（配列番号７０）；及び
（ｖｉ）ＧＦＴＬＳＳＹＧ（配列番号７５）。
【請求項１２】
前記ＶＨが以下からなる群より選択されるＣＤＲ２配列を含む、請求項９〜１１のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質：
（ｉ）ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号１４）；
（ｉｉ）ＩＷＦＤＧＲＮＫ（配列番号６０）；
（ｉｉｉ）ＩＷＹＤＧＳＮＲ（配列番号７１）；及び
（ｉｖ）ＩＷＹＤＧＳＳＫ（配列番号７６）。
【請求項１３】
前記ＶＨが以下からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質：
（ｉ）ＡＲＥＳＩＶＥＶＬＰＰＦＤＹ（配列番号１５）；
（ｉｉ）ＡＲＥＳＳＩＳＴＲＰＰＦＤＹ（配列番号６１）；
（ｉｉｉ）ＡＲＥＴＩＭＶＲＧＶＰＦＤ（配列番号６９）；
（ｉｖ）ＡＲＥＴＡＬＶＲＧＶＰＦＤＹ（配列番号５６）；
（ｖ）ＡＲＥＴＡＭＶＲＧＶＰＦＤＹ（配列番号７２）；及び
（ｖｉ）ＡＲＥＴＩＬＩＧＧＶＰＦＤＹ（配列番号７７）。
【請求項１４】
前記ＶＬが以下からなる群より選択されるＣＤＲ１配列を含む、請求項１０に記載のＰＡＲ４結合タンパク質：
（ｉ）ＱＲＶＲＮＮＹ（配列番号１６）；
（ｉｉ）ＱＳＶＲＳＳＹ（配列番号５７）；及び
（ｉｉｉ）ＱＳＩＲＳＮＹ（配列番号７８）。
【請求項１５】
前記ＶＬがＣＤＲ２配列ＧＡＳ（配列番号２８）を含む、請求項１０または１４に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項１６】
前記ＶＬが以下からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む、請求項１０、１４、または１５に記載のＰＡＲ４結合タンパク質：
（ｉ）ＱＱＹＧＮＳＹＴ（配列番号１８）；
（ｉｉ）ＱＱＹＧＲＳＹＴ（配列番号６２）；及び
（ｉｉｉ）ＱＱＹＧＳＳＹＴ（配列番号５８）。
【請求項１７】
以下に示される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
2020533022.tif 000027
（配列中、
Ｘ１はＡまたはＳであり、
Ｘ２はＴまたはＡであり、
Ｘ３はＶまたはＩであり、
Ｘ４はＹまたはＳであり、
Ｘ５はＧまたはＳであり、
Ｘ６はＬまたはＦであり、
Ｘ７はＮ、Ｄ、またはＴであり、
Ｘ８はＹまたはＦであり、
Ｘ９はＳまたはＲであり、
Ｘ１０はＲまたはＨであり、
Ｘ１１はＮまたはＩであり、
Ｘ１２はＳまたはＴであり、
Ｘ１３はＴまたはＳであり、
Ｘ１４はＮまたはＴであり、
Ｘ１５はＫまたはＮであり、
Ｘ１６はＦまたはＬであり、
Ｘ１７はＫまたはＮであり、
Ｘ１８はＡまたはＫであり、
Ｘ１９はＩ、Ｆ、またはＶであり、
Ｘ２０はＹまたはＨであり、
Ｘ２１はＮまたはＳであり、
Ｘ２２はＲ、Ｇ、またはＳであり、
Ｘ２３はＶまたはＨである）
【請求項１８】
以下に示される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む、請求項１〜９または１７のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
2020533022.tif 000028
（配列中、
Ｘ１はＶまたはＡであり、
Ｘ２はＶまたはＩであり、
Ｘ３はＳまたはＴであり、
Ｘ４はＳ、Ｙ、またはＮであり、
Ｘ５はＫまたはＩであり、
Ｘ６はＮまたはＫであり、
Ｘ７はＲまたはＳであり、
Ｘ８はＲまたはＱであり、
Ｘ９はＴまたはＡであり、
Ｘ１０はＴまたはＳであり、
Ｘ１１はＱまたはＲであり、
Ｘ１２はＴ、Ｓ、またはＮであり、
Ｘ１３はＮまたはＮであり、
Ｘ１４はＥまたはＧである）
【請求項１９】
前記ＶＨが以下からなる群より選択されるＣＤＲ１配列を含む、請求項１８に記載のＰＡＲ４結合タンパク質：
（ｉ）ＧＧＳＬＳＤＹＹ（配列番号８６）；
（ｉｉｉ）ＳＧＳＦＳＴＹＦ（配列番号４７）；及び
（ｉｖ）ＧＧＳＦＳＮＹＹ（配列番号６６）。
【請求項２０】
前記ＶＨが以下からなる群より選択されるＣＤＲ２配列を含む、請求項１８または１９に記載のＰＡＲ４結合タンパク質：
（ｉ）ＩＮＨＳＧＴＴ（配列番号８７）；
（ｉｉ）ＩＩＨＴＧＳＴ（配列番号６４）；または
（ｉｉｉ）ＩＮＨＳＧＳＴ（配列番号４８）。
【請求項２１】
前記ＶＨが以下からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む、請求項１８、１９、または２０に記載のＰＡＲ４結合タンパク質：
（ｉ）ＡＩＥＹＳＮＳＲＧＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号８８）；
（ｉｉ）ＡＦＥＹＳＳＳＧＧＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号４９）；及び
（ｉｉｉ）ＫＶＥＨＳＳＳＳＧＨＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号６５）。
【請求項２２】
前記ＶＬが以下からなる群より選択されるＣＤＲ１配列を含む、請求項１８〜２１のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質：
（ｉ）ＱＴＩＳＮＹ（配列番号１０９）；
（ｉｉ）ＱＳＩＳＳＹ（配列番号５０）；及び
（ｉｉｉ）ＱＴＩＳＹＹ（配列番号６６）。
【請求項２３】
前記ＶＬがＣＤＲ２配列ＡＡＳ（配列番号５１）を含む、請求項１８〜２２のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項２４】
前記ＶＬが以下からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む、請求項１８〜２３のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質：
（ｉ）ＲＱＮＹＮＴＰＬＴ（配列番号８５）；
（ｉｉｉ）ＱＱＴＹＳＴＰＬＴ（配列番号５２）；または
（ｉｖ）ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号６７）。
【請求項２５】
以下の配列をそれぞれ含む、または以下の配列からそれぞれなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する可変重鎖（ＶＨ）を含む、いずれかの先行請求項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質：
（ｉ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５；
（ｉｉ）配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９；
（ｉｉｉ）配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６；
（ｉｖ）配列番号５５、配列番号１４、及び配列番号５６；
（ｖ）配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１；
（ｖｉ）配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５；
（ｖｉｉ）配列番号６８、配列番号１４、及び配列番号６９；
（ｖｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２；
（ｉｘ）配列番号５５、配列番号７３、及び配列番号７４；
（ｘ）配列番号７５、配列番号７６、及び配列番号７７；
（ｘｉ）配列番号７９、配列番号８０、及び配列番号８１；
（ｘｉｉ）配列番号８２、配列番号８０、及び配列番号８３；
（ｘｉｉｉ）配列番号５５、配列番号７３、及び配列番号７４；または
（ｘｉｖ）配列番号８６、配列番号８７、及び配列番号８８。
【請求項２６】
以下の配列をそれぞれ含む、または以下の配列からそれぞれなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）をさらに含む、請求項２５に記載のＰＡＲ４結合タンパク質：
（ｉ）配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８；
（ｉｉ）配列番号５０、配列番号５１、及び配列番号５２；
（ｉｉｉ）配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９；
（ｉｖ）配列番号５７、配列番号２８、及び配列番号５８；
（ｖ）配列番号５７、配列番号２８、及び配列番号６２；
（ｖｉ）配列番号６６、配列番号５１、及び配列番号６７；
（ｖｉｉ）配列番号５７、配列番号２８、及び配列番号５８；
（ｖｉｉｉ）配列番号５７、配列番号２８、及び配列番号５８；
（ｉｘ）配列番号７８、配列番号２８、及び配列番号６２；
（ｘ）配列番号８４、配列番号５１、及び配列番号８５；
（ｘｉ）配列番号５７、配列番号２８、及び配列番号５８；
（ｘｉｉ）配列番号５７、配列番号５１、及び配列番号５８；または
（ｘｉｉｉ）配列番号１０９、配列番号５１、及び配列番号８５。
【請求項２７】
配列番号１１、配列番号２２、配列番号４５、配列番号５３、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、もしくは配列番号１０７のうちのいずれか１つに示される配列に対し、少なくとも９５％同一であるＶＨ配列、またはそのヒト化、キメラ、もしくは脱免疫化バージョンを含む、いずれかの先行請求項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項２８】
配列番号１２、配列番号２３、配列番号４６、配列番号５４、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、もしくは配列番号１０８のうちのいずれか１つに示される配列に対し、少なくとも９５％同一であるＶＬ配列、またはそのヒト化、キメラ、もしくは脱免疫化バージョンをさらに含む、請求項２７に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項２９】
以下を含む、いずれかの先行請求項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質：
（ｉ）配列番号１１に示されるＶＨ及び配列番号１２に示されるＶＬ；
（ｉｉ）配列番号４５に示されるＶＨ及び配列番号４６に示されるＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２２に示されるＶＨ及び配列番号２３に示されるＶＬ；
（ｉｖ）配列番号５３に示されるＶＨ及び配列番号５４に示されるＶＬ；
（ｖ）配列番号８９に示されるＶＨ及び配列番号９０に示されるＶＬ；
（ｖｉ）配列番号９１に示されるＶＨ及び配列番号９２に示されるＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号９３に示されるＶＨ及び配列番号９４に示されるＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号９５に示されるＶＨ及び配列番号９６に示されるＶＬ；
（ｉｘ）配列番号９７に示されるＶＨ及び配列番号９８に示されるＶＬ；
（ｘ）配列番号９９に示されるＶＨ及び配列番号１００に示されるＶＬ；
（ｘｉ）配列番号１０１に示されるＶＨ及び配列番号１０２に示されるＶＬ；
（ｘｉｉ）配列番号１０３に示されるＶＨ及び配列番号１０４に示されるＶＬ；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０５に示されるＶＨ及び配列番号１０６に示されるＶＬ；または
（ｘｉｖ）配列番号１０７に示されるＶＨ及び配列番号１０８に示されるＶＬ。
【請求項３０】
前記抗原結合断片が、
（ｉ）１本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ）重鎖定常領域またはＦｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に連結している（ｉ）及び／または（ｉｉ）のうちの少なくとも１つ
である、いずれかの先行請求項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項３１】
前記抗原結合断片が、
（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；
（ｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ′）２；
（ｖｉ）Ｆｖ；または
（ｖｉｉ）重鎖定常領域またはＦｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に連結している（ｉ）〜（ｖｉ）のうちの少なくとも１つ
である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項３２】
ある部分と結合している、いずれかの先行請求項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項３３】
前記部分が、ラジオアイソトープ、検出可能な標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象におけるＰＡＲ４結合タンパク質の半減期を増加させる化合物、及びこれらの混合物からなる群より選択される、請求項３２に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項３４】
いずれかの先行請求項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質をコードする核酸。
【請求項３５】
配列番号２０に示されるＶＨ核酸配列を含む、及び／または配列番号２１に示されるＶＬ核酸配列を含む、請求項３４に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項３６】
配列番号３０に示されるＶＨ核酸配列を含む、及び／または配列番号３１に示されるＶＬ核酸配列を含む、請求項３４に記載のＰＡＲ４結合タンパク質。
【請求項３７】
請求項１〜３３のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質と好適な担体とを含む、組成物。
【請求項３８】
対象における血栓症または血栓塞栓性障害を治療または防止するための方法であって、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質もしくは抗体、または請求項３７に記載の組成物を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項３９】
血栓症または血栓塞栓性障害を治療、防止、または改善するための方法であって、それを必要とする対象に、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のＰＡＲ４結合タンパク質もしくは抗体の治療有効量、または請求項３７に記載の組成物の治療有効量を投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
参照による組込み
本明細書で引用または参照される全ての文書、及び本明細書で引用される文書内で引用または参照される全ての文書は、本明細書で言及される任意の製品に対するまたは本明細書での参照により組み込まれる任意の文書内での任意の製造業者の指示、記述、製品仕様、及び製品シートと共に、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、２０１７年９月１１日出願の豪州特許出願第２０１７９０３６８５号の優先権を主張するものであり、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
配列表の電子申請の全内容は、あらゆる目的においてその全体が参照により組み込まれる。
【０００４】
本開示の分野
本開示は、ヒトプロテアーゼ活性化受容体４（ＰＡＲ４）結合タンパク質（例えば、抗体）を対象とする。詳細には、ヒトＰＡＲ４のアンタゴニストである抗ＰＡＲ４結合タンパク質、ならびにその方法及び使用を対象とする。
【背景技術】
【０００５】
活性化血小板は動脈血栓症においてキーとなる細胞構成要素であり、世界中で最も一般的な死亡及び障害の原因となっており（Ｒｏｓｅｎｄａａｌ  ＦＲ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）３８４：１６５３−４）、多くの国における死亡のほぼ４０％を占め（Ｍｏｚａｆｆａｒｉａｎ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １３１  ｅ２９−３２２）、オーストラリアもこのような国に含まれる（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ  Ｂｕｒｅａｕ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｃａｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｄｅａｔｈ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ，２０１１  ３３０３  Ｃｈａｐｔｅｒ  ４２０１１（２０１３））。動脈血栓症は、心臓発作及び虚血性脳卒中を引き起こす。
【０００６】
血小板は、動脈血栓を形成する細胞である。血小板は、血小板凝集及び凝固促進を引き起こす内在的アゴニストの組合せにより活性化され、これらのアゴニストが一緒になって病的な血栓形成を推進する。そのため、抗血小板薬は動脈血栓症の防止のための主要な薬物療法を構成する。しかし、このような薬剤が多数あるにもかかわらず、安全性及び／または有効性の制約から新規薬物標的の合理化が求められている。広範囲の臨床現場で抗血小板薬の改良に対する重大な需要が存在し、新規薬剤の開発に大きな関心が寄せられている。
【０００７】
トロンビンは、既知のヒト血小板活性化物質としては最も強力であり、凝固カスケードにおいてキーとなるエフェクタープロテアーゼでもある。トロンビンは、主にプロテアーゼ活性化細胞表面受容体（ＰＡＲ）、ＰＡＲ１及びＰＡＲ４を介して血小板を活性化して、身体の最も強力な血小板活性化物質となる（Ｖｕ  Ｔ−ＫＨ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：１０５７−６８；Ｃｏｕｇｈｌｉｎ  ＳＲ（１９９２）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ８９：３５１−５；Ｃｏｕｇｈｌｉｎ  ＳＲ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：２５８−６４）。これらの受容体は、Ｎ末端のタンパク質分解により活性化される７回膜貫通受容体、Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のユニークなファミリーに属する。ひとたび切断されると、新たに露出したＮ末端は繋留リガンドとして働き、細胞外ループ２を結合することにより受容体を活性化する（Ｖｕ  Ｔ−ＫＨ  ｅｔ  ａｌ（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６４：１０５７−６８）。複数のプロテアーゼによって発現し活性化されるＰＡＲファミリーの４つのメンバー（ＰＡＲ１〜４）が存在する。
【０００８】
全ての血小板ＰＡＲ機能を欠損した（ＰＡＲ４−／−）マウスは、自発的出血を伴うことなく血栓症から保護される（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ２：１４２９−３５；Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ  ２３：６１−５）が、これは抗血栓療法向けにこのような受容体を標的化することにおける潜在可能性を示すものである。ヒト血小板上には２つの優勢なＰＡＲ、ＰＡＲ１及びＰＡＲ４が存在する。このうち、ＰＡＲ１はより高親和性のトロンビン受容体であり、抗血小板薬開発の的となっており、２つのＰＡＲ１アンタゴニスト、アトパキサル（Ｅ５５５５）（Ｇｏｔｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ  ３１：２６０１−１３）及びボラパキサル（Ｔｒｉｃｏｃｉ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６：２０−３３；Ｍｏｒｒｏｗ  ＤＡ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６：１４０４−１３）が臨床試験で評価されている。ボラパキサルは、２０１４年後半に米国ＦＤＡにより承認され、２０１６年半ばにＴＧＡにより心筋梗塞及び末梢動脈疾患の防止向けに予定された。しかし、一剤または二剤の抗血小板療法と組み合わせたボラパキサルは、特に脳卒中の病歴または他の素因を有する患者において、脳内出血率の顕著な増加を伴った（Ｔｒｉｃｏｃｉ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６：２０−３３；Ｍｏｒｒｏｗ  ＤＡ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６６：１４０４−１３）。
【０００９】
その結果、ＰＡＲ４アンタゴニストの開発に大きな関心が寄せられるようになった。ＰＡＲ４の機能的役割は、主に血小板に関して解明されている。ＰＡＲ４を特徴づけるキーとなる特色は、ＰＡＲ１及びＡＤＰ受容体Ｐ２Ｙ１２の両方と共にヘテロオリゴマーを形成する能力であり、これによりＰＡＲ４はトロンビン及びＡＤＰ開始シグナリングの両方に影響を及ぼすことが可能になる（Ｌｉ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８６：３８０５−１４）。２つの血小板ＰＡＲ間の１つの大きな差異は、細胞内シグナリングの動態である（Ｈｏｌｉｎｓｔａｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８１：２６６６５−７４；Ｖｏｓｓ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７１：１３９９−４０６；Ｈｏｌｉｎｓｔａｔ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ７１：６８６−９４）。ＰＡＲ１及びＰＡＲ４の両方がＧｑを介しシグナルを発して細胞内カルシウムを動員し、インテグリン活性化、顆粒分泌、及びホスファチジルセリン（ＰＳ）露出を含めた血小板機能を駆動する。しかし、ＰＡＲ４活性化は、ＰＡＲ１活性化よりも低速でより持続的な細胞内カルシウムシグナルを誘発する（Ｃｏｖｉｃ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＰＮＡＳ  ９９：６４３−８）。カルシウムシグナリングにおけるこの時間差は、部分的には、ＰＡＲ４切断部位に対するアニオン性配列Ｃ末端に起因する可能性がある（Ｊａｃｑｕｅｓ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３７６：７３３−４０）。ＰＡＲ４の下流におけるこのような持続的な血小板活性化がもたらす細胞的な結果はまだ完全には特徴づけられていないが、これらの現象が持続的な細胞内カルシウムレベルの上昇に依存することを考慮すると、持続的な血小板分泌動態（Ｊｏｎｎａｌａｇａｄｄａ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）１２０：５２０９−１６）及び血小板凝血促進機能が関係する可能性がある（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）３４：１０４４８−５５；Ｄａｃｈａｒｙ−Ｐｒｉｇｅｎｔ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１６２５−３４）。
【００１０】
ＰＡＲ４がヒト血栓形成セッティングにおける凝血促進活性に寄与することを検証する研究は存在しないが、これはおそらくは、このような研究に必要とされる適切なＰＡＲ４アンタゴニストの利用可能性が限定されていることに起因する。最も一般的に使用されるＰＡＲ４アンタゴニストは、小分子ＹＤ−３（Ｗｕ  ＣＣ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １３０：１２８９−９６）、ペプチド模倣体ｔｃ−ＹＰＧＫＦ−ＮＨ２（Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ  ＭＤ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）７９：４３９−４２）、ならびにペプデューシンＰ４ｐａｌ−１０及びＰ４ｐａｌ−ｉｌ（Ｌｅｇｅｒ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １１３：１２４４−５４；Ｃｏｖｉｃ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）ＰＮＡＳ  ９９：６４３−８；Ｓｔａｍｐｆｕｓｓ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：１４４７）である。しかし、これらの薬剤は、ヒト血小板を用いた研究では、広く利用可能でない（例えば、ＹＤ−３）か、あるいは特異性の欠如（例えば、ペプデューシン）及び／または有効性の欠如（例えば、ｔｃ−ＹＰＧＫＦ−ＮＨ２）が報告されている（Ｓｔａｍｐｆｕｓｓ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９：１４４７；Ｈｏｌｌｅｎｂｅｒｇ  ＭＤ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １４３：４４３−５４；Ｗｕ  ＣＣ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ８７：１０２６−３３）。ＰＡＲ４アンタゴニスト（ＢＭＳ−９８６１４１）は早期の臨床試験で血栓症の治療に関し検証されているが、一般的なＰＡＲ４バリアント（集団に応じて人口の１９〜８２％に存在）は、受容体を小分子阻害物質（例えば、ＢＭＳ−９８６１４１）に対し非感受性にする。
【００１１】
上記に基づけば、血栓症の医学的治療向けの改良されたヒトＰＡＲ４結合タンパク質の同定が有用であろうことは当業者には明らかであろう。さらに、有害な副作用を最小限にとどめた血栓症の治療は顕著なアンメットメディカルニーズである。したがって、既存の戦略にまさる利点をもたらし、血栓症の治療または防止においてＰＡＲ１の標的化における治療プロファイルの改良をもたらすＰＡＲ４アンタゴニストが当技術分野で必要とされている。
【発明の概要】
【００１２】
現在の臨床プログラムは、小分子オルソステリックＰＡＲ４阻害物質を開発している。しかし最近になり、このアプローチは高いパーセンテージの患者で完全に無効であることが明らかになった。具体的には、ＰＡＲ４における一塩基多型（ＳＮＰ；ｒｓ７７３９０２）は、受容体をオルソステリックＰＡＲ４アンタゴニズムに対し非感受性にする（Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ  ＬＣ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｂｌｏｏｄ  １２４：３４５０−３４５８）。この小ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）は、アミノ酸１２０がアラニン（Ａｌａ１２０）かスレオニン（Ｔｈｒ１２０）かを決定する。薬理学的研究からは、オルソステリックＰＡＲ４アンタゴニズムは、Ａｌａ１２０遺伝子型の患者におけるＰＡＲ４誘導血小板活性化を強力に阻害するが、Ｔｈｒ１２０遺伝子型の患者からの血小板には高濃度であっても全く影響をもたらさないことが示された。ヘテロ接合では部分的阻害のみがもたらされる（Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ  ＬＣ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｂｌｏｏｄ  １２４：３４５０−３４５８）。ＰＡＲ４における阻害物質抵抗性Ｔｈｒ１２０形態の出現率は著しく高く（いくつかの集団では８０％超）、これは、このアンタゴニズムが及ぼす影響が重大であることを示すものである。Ｔｈｒ１２０アレルは人種的に二形性であり、北米人１５４例のコホートでは、自分が黒人であると認識する者の６３％に生じており、これに対し白人では１９％に生じている。Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（ＨＧＤＰ）からのデータは、ＳＮＰ  ｒｓ７７３９０２が地域特異的ではなく、サハラ砂漠以南のアフリカに住む人々の最大８０％、パプア人及びメラネシア人の約３分の２がＴｈｒ１２０  ＰＡＲ４バリアントを有することを示している。
【００１３】
ＳＮＰ  ｒｓ７７３９０２は、ＰＡＲ４をオルソステリック阻害物質に対し抵抗性にすることに加え、ＰＡＲ４の受容体活性化に対する感受性を増加させ、Ｔｈｒ１２０バリアントを有する患者に過活性の血小板をもたらす（Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ  ＬＣ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １９：１６０９−１６１６）。このＰＡＲ４機能の増加は、標準治療の抗血小板薬（アスピリン及び／またはＰ２Ｙ１２阻害物質）で治療した患者において持続した。
【００１４】
発明者らは、ヒトＰＡＲ４に対し特異的に結合し、トロンビンによるＰＡＲ４活性化を阻害するモノクローナル抗体を開発した。したがって、この抗体は、トロンビンにより誘導されるＰＡＲ４切断のアンタゴニストである。発明者らにより同定された抗体は、ＰＡＲ４媒介事象（例えば血栓症）を弱めるまたは低減することができる。さらに、発明者らは、ＰＡＲ４の標的化は、その作用機序が異なることや全体的により幅広い安全プロファイルを有することにより、ＰＡＲ１の標的化に比べて出血合併症を引き起こしにくいことを見いだした。
【００１５】
詳細には、発明者らが同定した抗体は、ＰＡＲ４受容体バリアント、すなわちＡｌａ１２０及びＴｈｒ１２０の両方に対し有効であり、このことは、感受性のＰＡＲ４バリアントを有する対象だけでなく全ての対象における血栓塞栓性障害の治療に有効であることを意味する。さらに、当該抗体は、ＰＡＲ１との交差反応性を最小限にとどめてＰＡＲ４に対し特異的に結合するため、出血合併症を最小限に抑えるまたは回避することができる。したがって、本発明抗体は、従来技術のＰＡＲ１アンタゴニスト及びＰＡＲ４小分子阻害物質からはこのようにして区別される。
【００１６】
加えて、発明者らは、当該抗体がトロンビン誘導ＰＡＲ４切断及びヒト血小板の凝集を著しく阻害することを見いだした。さらに、これらの効果は、免疫化ペプチドで抗体を競合解除することにより元に戻すことができた。
【００１７】
したがって、本開示は、対象における血栓症を診断または予測するための様々な試薬を提供する。本開示は、対象における血栓症または血栓塞栓性障害を治療、防止、または改善するための方法も提供する。
【００１８】
本開示は、抗原結合ドメインを含むＰＡＲ４結合タンパク質であって、抗原結合ドメインがヒトＰＡＲ４に対し特異的に結合し、タンパク質が少なくとも１つのＰＡＲ４媒介事象（例えば、血栓症）を弱める、ＰＡＲ４結合タンパク質を提供する。１つの例において、タンパク質は、トロンビンの存在下で少なくとも１つのＰＡＲ４媒介事象（例えば、血栓症）を弱める。
【００１９】
１つの例において、抗原結合ドメインは、非抗体ＰＡＲ４結合タンパク質からのものである、またはこれに由来する。１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は小分子アンタゴニストではない（小分子アンタゴニストの例として、例えばＷＯ２０１３／１６３２４４に記載のイミダゾチアジアゾール誘導体、または例えばＵＳ７８７９７９２で説明されている合成ペプチドアナログ）。
【００２０】
本開示は、抗ＰＡＲ４抗体の抗原結合ドメインを含むヒトＰＡＲ４結合タンパク質であって、抗原結合ドメインがＰＡＲ４に対し特異的に結合し、タンパク質が、ＰＡＲ４を発現する細胞に接触したときに少なくとも１つのＰＡＲ４媒介事象（例えば、血栓症）を弱める、ヒトＰＡＲ４結合タンパク質も提供する。１つの例において、タンパク質は、トロンビンの存在下で少なくとも１つのＰＡＲ４媒介事象（例えば、血栓症）を弱める。
【００２１】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、ＰＡＲ４を発現する細胞（例えば、血小板）の細胞表面上にあるホスファチジルセリン（ＰＳ）の外在化を阻害する。１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、全血血栓症アッセイにより測定した場合の血栓体積を低減する。
【００２２】
本開示は、抗ＰＡＲ４組換えもしくは合成もしくはモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であるプロテアーゼ活性化受容体４（ＰＡＲ４）結合タンパク質であって、トロンビンによって誘導されるヒトＰＡＲ４切断を実質的に阻害する、プロテアーゼ活性化受容体４（ＰＡＲ４）結合タンパク質を提供する。
【００２３】
当業者は、適切なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いてＰＡＲ４切断を測定することができるであろう。非限定的な例として、ＰＡＲ４切断は、表面上で蛍光標識タグ付きＰＡＲ４タンパク質を発現する細胞株で評価することができる。トロンビンの存在下でＰＡＲ４切断が引き起こす細胞表面からのＦＬＡＧの喪失は、定量化することができる。特定の例において、ＰＡＲ４切断は、蛍光標識ＦＬＡＧタグを含むＰＡＲ４をコードする核酸を含む形質移入ＨＥＫ２９３細胞で測定することができる。トロンビンの存在下（例えば、０．１Ｕ／ｍｌ）でＰＡＲ４切断が引き起こす細胞表面からのＦＬＡＧの喪失は、フローサイトメトリーの使用により定量化することができる。
【００２４】
１つの例において、結合タンパク質は、細胞表面発現ヒトＰＡＲ４の切断を、トロンビンの存在下で５０％以上阻害する。
【００２５】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、ヒトＰＡＲ４のトロンビン切断部位にまたがるエピトープに対し、特異的に結合する。１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、ＧＤＤＳＴＰＳＩＬＰＡＰＲＧＹＰＧＱＶＣ（配列番号２）として示される配列内に含まれる残基を含むエピトープに対し、特異的に結合する。１つの例において、ペプチドは配列番号１または配列番号２からなる。例えば、ペプチドはファージの表面上に示される。
【００２６】
別の例において、エピトープは配列ＡＰＲＧＹ（配列番号４２）を含み、このときトロンビン切断部位はＲＧに対応する。別の例において、エピトープは、ＩＬＰＡＰＲＧＹ（配列番号４３）またはＡＰＲＧＹＰＧＱＶ（配列番号４４）から選択される配列を含む、またはそれからなる。１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、ＰＲＧＹＰＧ（配列番号１）として示される配列を含むエピトープに対し特異的に結合する。
【００２７】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、ヒトＰＡＲ４のＡｌａ１２０バリアントまたはＴｈｒ１２０バリアントのいずれかに対し特異的に結合する。別の例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、ヒトＰＡＲ４のＡｌａ１２０バリアント及びＴｈｒ１２０バリアントのいずれにも結合する。
【００２８】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、配列番号１９に従うヒトＰＡＲ４配列内のトロンビン切断部位に結合する。１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、配列番号１９に示されるヒトＰＡＲ４配列の残基３５〜５４にマッチする配列に結合する。別の例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、任意選択でキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）または他の免疫刺激分子を追加的に含む、配列番号２として示される配列に結合する。さらなる例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、配列番号４に示される配列に結合する。
【００２９】
別の例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、任意選択でＣ末端ＧＧＧＧ及びストレプトアビジン−ｋ／ビオチン（ＳＫＢ）を追加的に含む、配列番号２として示される配列に結合する。１つの例において、ＰＡＲ４タンパク質は、配列番号７として示される配列に結合する。
【００３０】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、ヒトＰＡＲ３、ＰＡＲ２、またはＰＡＲ１に結合しないか、または実質的に結合しない。
【００３１】
さらなる例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、配列番号３（マウスＰＡＲ４）、配列番号８（ヒトＰＡＲ３）、配列番号９（ヒトＰＡＲ２）、または配列番号１０（ヒトＰＡＲ１）からなる群より選択されるＰＡＲ配列に対し、結合しないか、または実質的に結合しない。
【００３２】
１つの例において、結合のレベルは、ペプチド（例えば、配列番号２または配列番号７に従うペプチド）を固定し、ペプチドをＰＡＲ４結合タンパク質に接触させることによって評価される。
【００３３】
本明細書に記載されたこのような結合の特徴を有する例示的なＰＡＲ４結合タンパク質は、５ＡＲＣ３．Ｆ１０ｂ．Ｈ４ｂ（以下、５Ａ．ＲＣ３と呼ぶ）または５Ｆ．ＲＦ３．Ａ７ｂ．Ａ１（以下、５Ｆ．ＲＦ３と呼ぶ）という名称の抗体の可変領域及び／またはＣＤＲを含む。
【００３４】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、５Ａ．ＲＣ３、５１．ＲＧ１、５Ｆ．ＲＧ３、５Ｇ．ＲＡ１、５Ｄ．ＲＨ４、５Ｈ．ＲＨ４、５Ｇ．ＲＦ６、５Ｇ．ＲＤ６、５Ｈ．ＲＡ３、５Ｇ．ＲＧ１、５Ｈ．ＲＧ４、５Ｇ．ＲＣ５、５Ｆ．ＲＥ６、５Ｈ．ＲＦ２という名称の抗体と類似のレベルもしくは実質的に同じレベルで、または類似の親和性もしくは実質的に同じ親和性で、配列番号１、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７に示される配列からなるペプチドまたはヒトＰＡＲ４に結合する。
【００３５】
別の例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、５Ａ．ＲＣ３、５１．ＲＧ１、５Ｆ．ＲＧ３、５Ｇ．ＲＡ１、５Ｄ．ＲＨ４、５Ｈ．ＲＨ４、５Ｇ．ＲＦ６、５Ｇ．ＲＤ６、５Ｈ．ＲＡ３、５Ｇ．ＲＧ１、５Ｈ．ＲＧ４、５Ｇ．ＲＣ５、５Ｆ．ＲＥ６、５Ｈ．ＲＦ２という名称の抗体がヒトＰＡＲ４に結合するのを競合的に阻害する。さらなる例において、当該タンパク質は、５Ａ．ＲＣ３、５１．ＲＧ１、５Ｆ．ＲＧ３、５Ｇ．ＲＡ１、５Ｄ．ＲＨ４、５Ｈ．ＲＨ４、５Ｇ．ＲＦ６、５Ｇ．ＲＤ６、５Ｈ．ＲＡ３、５Ｇ．ＲＧ１、５Ｈ．ＲＧ４、５Ｇ．ＲＣ５、５Ｆ．ＲＥ６、５Ｈ．ＲＦ２という名称の抗体が、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示される配列からなるペプチドに結合するのを競合的に阻害する。
【００３６】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、配列番号２、配列番号４、または配列番号７に示される配列からなるペプチドに、配列番号１１、配列番号２２、配列番号４５、配列番号５３、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、または配列番号１０７に示される配列を含むＶＨと、配列番号１２、配列番号２３、配列番号４６、配列番号５４、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、または配列番号１０８に示される配列を含むＶＬとを含む抗体が結合する量の７５％以内の量で結合する。
【００３７】
１つの例において、結合しているタンパク質または抗体の量は、ＰＡＲ４結合タンパク質を、配列番号１、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７に示される配列からなるペプチドに接触させることにより、及びペプチドに接触したＰＡＲ４結合タンパク質の量（例えば、１０μｇ／ｍｌ）により評価される。次いで、ペプチドに結合しているＰＡＲ４結合タンパク質の量を測定し、それぞれがペプチドに結合している配列番号１１、配列番号２２、配列番号４５、配列番号５３、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、または配列番号１０７に示される配列を含むＶＨと、配列番号１２、配列番号２３、配列番号４６、配列番号５４、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、または配列番号１０８に示される配列を含むＶＨとを含む、抗体の量と比較する。１つの例において、ペプチドに結合しているＰＡＲ４結合タンパク質の量は、結合している抗体の量の約８０％、または７０％、または６０％、または４０％以内である。
【００３８】
本開示は、以下の名称の抗体の結合を競合的に阻害するＰＡＲ４結合タンパク質も提供する：
（ｉ）配列番号１１に示される配列を含むＶＨ及び配列番号１２に示される配列を含むＶＬを含む前述の５Ａ．ＲＣ３抗体；
（ｉｉ）配列番号４５に示される配列を含むＶＨ及び配列番号４６に示される配列を含むＶＬを含む５Ｉ．ＲＧ１；
（ｉｉｉ）配列番号２２に示される配列を含むＶＨ及び配列番号２３に示される配列を含むＶＬを含む５Ｆ．ＲＦ３；
（ｉｖ）配列番号５３に示される配列を含むＶＨ及び配列番号５４に示される配列を含むＶＬを含む５Ｇ．ＲＡ１；
（ｖ）配列番号８９に示される配列を含むＶＨ及び配列番号９０に示される配列を含むＶＬを含む５Ｄ．ＲＨ４；
（ｖｉ）配列番号９１に示される配列を含むＶＨ及び配列番号９２に示される配列を含むＶＬを含む５Ｈ．ＲＨ４；
（ｖｉｉ）配列番号９３に示される配列を含むＶＨ及び配列番号９４に示される配列を含むＶＬを含む５Ｇ．ＲＦ６；
（ｖｉｉｉ）配列番号９５に示される配列を含むＶＨ及び配列番号９６に示される配列を含むＶＬを含む５Ｇ．ＲＤ６；
（ｉｘ）配列番号９７に示される配列を含むＶＨ及び配列番号９８に示される配列を含むＶＬを含む５Ｈ．ＲＡ３；
（ｘ）配列番号９９に示される配列を含むＶＨ及び配列番号１００に示される配列を含むＶＬを含む５Ｇ．ＲＧ１；
（ｘｉ）配列番号１０３に示される配列を含むＶＨ及び配列番号１０４に示される配列を含むＶＬを含む５Ｈ．ＲＧ４；
（ｘｉｉ）配列番号１０３に示される配列を含むＶＨ及び配列番号１０４に示される配列を含むＶＬを含む５Ｇ．ＲＣ５；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０５に示される配列を含むＶＨ及び配列番号１０６に示される配列を含むＶＬを含む５Ｆ．ＲＥ６；または
（ｘｉｖ）配列番号１０７に示される配列を含むＶＨ及び配列番号１０８に示される配列を含むＶＬを含む５Ｈ．ＲＦ２が、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号７に示される配列を含むもしくはそれからなるペプチド、またはヒトＰＡＲ４（例えば、配列番号１９）。
【００３９】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、細胞表面（例えば、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを含むＰＡＲ４を形質移入したＨＥＫ２９３細胞）上に発現するヒトＰＡＲ４のトロンビン誘導切断を低減する（すなわち、ＰＡＲ４アンタゴニスト活性を有する）。１つの例において、（例えば、１０μｇ／ｍｌの濃度の）ＰＡＲ４結合タンパク質は、ＰＡＲ４発現ＨＥＫ２９３細胞（例えば、約５×１０４細胞）のトロンビン誘導切断を（例えば、０．１Ｕ／ｍｌ）低減する。このような活性を有する例示的な抗体は、抗体５Ａ．ＲＣ３、５Ｉ．ＲＧ１、５Ｆ．ＲＦ３、５Ｇ．ＲＡ１、５Ｄ．ＲＨ４、５Ｈ．ＲＨ４、５Ｇ．ＲＦ６、５Ｇ．ＲＤ６、５Ｈ．ＲＡ３、５Ｇ．ＲＧ１、５Ｈ．ＲＧ４、５Ｇ．ＲＣ５、５Ｆ．ＲＥ６、もしくは５Ｈ．ＲＦ２、またはこのような抗体のＣＤＲを含む抗体の可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
【００４０】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、本明細書に記載のヒトＰＡＲ４のトロンビン切断部位を含むペプチドに、またはヒトＰＡＲ４のＮ末端細胞外領域に、２ｎＭ以下（例えば１．５ｎＭ以下、例えば１ｎＭ以下）の親和性解離定数（ＫＤ）で結合する。１つの例において、ＫＤは、約０．０１ｎＭから約２ｎＭの間、例えば約０．０５ｎＭから約１ｎＭの間、例えば約０．１ｎＭから約１ｎＭの間、例えば約０．３ｎＭから約１ｎＭの間である。１つの例において、ＫＤは、約０．０１ｎＭから１ｎＭの間、例えば、約０．０５ｎＭから０．９ｎＭの間、例えば、約０．０９ｎＭから約０．７ｎＭの間、例えば、約０．１ｎＭから０．６ｎＭの間である。
【００４１】
１つの例において、ＫＤは、ストレプトアビジンチップを利用し、チップの表面上のビオチン結合ヒトＰＡＲ４ペプチド（例えば、配列番号７に従うペプチド）を捕捉し、それにＰＡＲ４結合タンパク質を通すことによって評価される。
【００４２】
１つの例において、ＫＤは、ストレプトアビジンチップを利用し、チップの表面上のビオチン結合ヒトＰＡＲ４ペプチド（例えば、配列番号７に従うペプチド）を捕捉し、それにＰＡＲ４結合タンパク質を通すことによって評価される。
【００４３】
本開示の例示的なＰＡＲ４結合タンパク質は、ＳＡチップビオチンペプチドＳＰＲにより評価した場合、約０．０１から０．６１の間のＫＤを有する。１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は０．４ｎＭ（例えば、＋／−０．１ｎＭ）のＫＤを有する。１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、本明細書におけるＰＡＲ４結合タンパク質のいずれか１つに対応する表４に示されるＫＤを有する。
【００４４】
１つの例において、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、ヒトＰＡＲ４に対し特異的に結合する。１つの例において、タンパク質の結合は、ＥＬＩＳＡ及び高スループット抗原マイクロアレイによって評価される。
【００４５】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、ヒトＰＡＲ４内の同じエピトープに、または以下の抗体が結合するエピトープと重複するヒトＰＡＲ４内のエピトープに結合する：
（ｉ）配列番号１１に示される配列を含むＶＨ及び配列番号１２に示される配列を含むＶＬを含む前述の５Ａ．ＲＣ３抗体；
（ｉｉ）配列番号４５に示される配列を含むＶＨ及び配列番号４６に示される配列を含むＶＬを含む５Ｉ．ＲＧ１；
（ｉｉｉ）配列番号２２に示される配列を含むＶＨ及び配列番号２３に示される配列を含むＶＬを含む５Ｆ．ＲＦ３；
（ｉｖ）配列番号５３に示される配列を含むＶＨ及び配列番号５４に示される配列を含むＶＬを含む５Ｇ．ＲＡ１；
（ｖ）配列番号８９に示される配列を含むＶＨ及び配列番号９０に示される配列を含むＶＬを含む５Ｄ．ＲＨ４；
（ｖｉ）配列番号９１に示される配列を含むＶＨ及び配列番号９２に示される配列を含むＶＬを含む５Ｈ．ＲＨ４；
（ｖｉｉ）配列番号９３に示される配列を含むＶＨ及び配列番号９４に示される配列を含むＶＬを含む５Ｇ．ＲＦ６；
（ｖｉｉｉ）配列番号９５に示される配列を含むＶＨ及び配列番号９６に示される配列を含むＶＬを含む５Ｇ．ＲＤ６；
（ｉｘ）配列番号９７に示される配列を含むＶＨ及び配列番号９８に示される配列を含むＶＬを含む５Ｈ．ＲＡ３；
（ｘ）配列番号９９に示される配列を含むＶＨ及び配列番号１００に示される配列を含むＶＬを含む５Ｇ．ＲＧ１；
（ｘｉ）配列番号１０３に示される配列を含むＶＨ及び配列番号１０４に示される配列を含むＶＬを含む５Ｈ．ＲＧ４；
（ｘｉｉ）配列番号１０３に示される配列を含むＶＨ及び配列番号１０４に示される配列を含むＶＬを含む５Ｇ．ＲＣ５；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０５に示される配列を含むＶＨ及び配列番号１０６に示される配列を含むＶＬを含む５Ｆ．ＲＥ６；または
（ｘｉｖ）配列番号１０７に示される配列を含むＶＨを含む５Ｈ．ＲＦ２。
【００４６】
本開示は、ヒトＰＡＲ４に対し特異的に結合し、かつ抗ＰＡＲ４組換えもしくは合成もしくはモノクローナル抗体またはその抗原結合断片であるＰＡＲ４結合タンパク質も提供する。
【００４７】
１つの例において、抗体は、トロンビンによるＰＡＲ４の切断を実質的に阻害する。
【００４８】
１つの例において、ＰＡＲ４はヒト血小板上で発現する。
【００４９】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、ヒト重鎖及び軽鎖の定常領域配列を含むキメラ抗体である。別の例において、ＰＡＲ４結合タンパク質はヒト化抗体または完全ヒト抗体である。
【００５０】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、細胞表面発現ＰＡＲ４の切断を、トロンビンまたはＰＡＲ１アンタゴニストの存在下で６０％以上阻害する。さらなる例において、当該タンパク質は、ＰＡＲ４の切断を少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８％、少なくとも８５％、少なくとも８７％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または１００％阻害する。
【００５１】
別の例において、トロンビンによるＰＡＲ４の切断は、ｆｌａｇタグ付ＰＡＲ４発現ＨＥＫ２９３細胞からのＦｌａｇタグの喪失によって測定される。別の例において、切断はフローサイトメトリーによって測定される。
【００５２】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、ヒトＰＡＲ１、ＰＡＲ２、またはＰＡＲ３に結合しない、または実質的に結合しない。
【００５３】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、以下に示される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む。
2020533022.tif 000002
（配列中、
Ｘ１はＶまたはＩであり、
Ｘ２はＡまたはＶであり、
Ｘ３はＴまたはＡであり、
Ｘ４はＬまたはＦであり、
Ｘ５はＮまたはＳであり、
Ｘ６はＹまたはＤであり、
Ｘ７はＳまたはＡであり、；
Ｘ８はＹまたはＦであり、
Ｘ９はＳまたはＲであり、
Ｘ１０はＮまたはＳであり、
Ｘ１１はＫまたはＲであり、
Ｘ１２はＨまたはＹであり、
Ｘ１３はＡ、Ｌ、またはＴであり、
Ｘ１４はＫまたはＲであり、
Ｘ１５はＴまたはＤであり、
Ｘ１６はＮまたはＴであり、
Ｘ１７はＬまたはＱであり、
Ｘ１８はＹまたはＦであり、
Ｘ１９はＳまたはＩであり、
Ｘ２０はＳまたはＴであり、
Ｘ２１はＩ、Ｓ、またはＡであり、
Ｘ２２はＶ、Ｉ、Ｍ、またはＬであり、
Ｘ２３はＥ、Ｓ、Ｖ、またはＩであり、
Ｘ２４はＶ、Ｔ、Ｒ、またはＧであり、
Ｘ２５はＬ、Ｒ、またはＧであり、
Ｘ２６はＰまたはＶである）
【００５４】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質はさらに、以下に示される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む。
2020533022.tif 000003
（配列中、
Ｘ１はＫまたはＥであり、
Ｘ２はＶまたはＡであり、
Ｘ３はＲまたはＧであり、
Ｘ４はＡまたはＴであり、
Ｘ５はＲまたはＳであり、
Ｘ６はＶまたはＩであり、
Ｘ７はＮまたはＳであり、
Ｘ８はＮまたはＳであり、
Ｘ９はＦまたはＹであり、
Ｘ１０はＦまたはＬであり、
Ｘ１１はＩまたはＴであり、
Ｘ１２はＩまたはＴであり、
Ｘ１３はＦまたはＬであり、
Ｘ１４はＳまたはＴであり、
Ｘ１５はＶまたはＬであり、
Ｘ１６はＮ、Ｒ、またはＳである）
【００５５】
１つの例において、ＶＨは、以下からなる群より選択されるＣＤＲ１配列を含む：
（ｉ）ＧＦＴＬＳＮＹＧ（配列番号１３）；
（ｉｉ）ＧＦＴＦＳＳＤＧ（配列番号５９）；
（ｉｉｉ）ＧＦＴＦＳＮＹＧ（配列番号６８）；
（ｉｖ）ＧＦＴＦＳＳＹＧ（配列番号５５）；
（ｖ）ＧＦＡＦＳＳＹＧ（配列番号７０）；及び
（ｖｉ）ＧＦＴＬＳＳＹＧ（配列番号７５）。
【００５６】
１つの例において、ＶＨは、以下からなる群より選択されるＣＤＲ２配列を含む：
（ｉ）ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号１４）；
（ｉｉ）ＩＷＦＤＧＲＮＫ（配列番号６０）；
（ｉｉｉ）ＩＷＹＤＧＳＮＲ（配列番号７１）；及び
（ｉｖ）ＩＷＹＤＧＳＳＫ（配列番号７６）。
【００５７】
１つの例において、ＶＨは、以下からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む：
（ｉ）ＡＲＥＳＩＶＥＶＬＰＰＦＤＹ（配列番号１５）；
（ｉｉ）ＡＲＥＳＳＩＳＴＲＰＰＦＤＹ（配列番号６１）；
（ｉｉｉ）ＡＲＥＴＩＭＶＲＧＶＰＦＤ（配列番号６９）；
（ｉｖ）ＡＲＥＴＡＬＶＲＧＶＰＦＤＹ（配列番号５６）；
（ｖ）ＡＲＥＴＡＭＶＲＧＶＰＦＤＹ（配列番号７２）；及び
（ｖｉ）ＡＲＥＴＩＬＩＧＧＶＰＦＤＹ（配列番号７７）。
【００５８】
１つの例において、ＶＬは、以下からなる群より選択されるＣＤＲ１配列を含む：
（ｉ）ＱＲＶＲＮＮＹ（配列番号１６）；
（ｉｉ）ＱＳＶＲＳＳＹ（配列番号５７）；及び
（ｉｉｉ）ＱＳＩＲＳＮＹ（配列番号７８）。
【００５９】
１つの例において、ＶＬは、ＣＤＲ２配列ＧＡＳ（配列番号２８）を含む。
【００６０】
１つの例において、ＶＬは、以下からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む：
（ｉ）ＱＱＹＧＮＳＹＴ（配列番号１８）；
（ｉｉ）ＱＱＹＧＲＳＹＴ（配列番号６２）；及び
（ｉｉｉ）ＱＱＹＧＳＳＹＴ（配列番号５８）。
【００６１】
別の例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、以下に示される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む。
【００６２】
別の例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、以下に示される可変重鎖（ＶＨ）配列を含む。
2020533022.tif 000004
（配列中、
Ｘ１はＡまたはＳであり、
Ｘ２はＴまたはＡであり、
Ｘ３はＶまたはＩであり、
Ｘ４はＹまたはＳであり、
Ｘ５はＧまたはＳであり、
Ｘ６はＬまたはＦであり、
Ｘ７はＮ、Ｄ、またはＴであり、
Ｘ８はＹまたはＦであり、
Ｘ９はＳまたはＲであり、
Ｘ１０はＲまたはＨであり、
Ｘ１１はＮまたはＩであり、
Ｘ１２はＳまたはＴであり、
Ｘ１３はＴまたはＳであり、
Ｘ１４はＮまたはＴであり、
Ｘ１５はＫまたはＮであり、
Ｘ１６はＦまたはＬであり、
Ｘ１７はＫまたはＮであり、
Ｘ１８はＡまたはＫであり、
Ｘ１９はＩ、Ｆ、またはＶであり、
Ｘ２０はＹまたはＨであり、
Ｘ２１はＮまたはＳであり、
Ｘ２２はＲ、Ｇ、またはＳであり、
Ｘ２３はＶまたはＨである）
【００６３】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質はさらに、以下に示される可変軽鎖（ＶＬ）配列を含む。
2020533022.tif 000005
（配列中、
Ｘ１はＶまたはＡであり、
Ｘ２はＶまたはＩであり、
Ｘ３はＳまたはＴであり、
Ｘ４はＳ、Ｙ、またはＮであり、
Ｘ５はＫまたはＩであり、
Ｘ６はＮまたはＫであり、
Ｘ７はＲまたはＳであり、
Ｘ８はＲまたはＱであり、
Ｘ９はＴまたはＡであり、
Ｘ１０はＴまたはＳであり、
Ｘ１１はＱまたはＲであり、
Ｘ１２はＴ、Ｓ、またはＮであり、
Ｘ１３はＮまたはＮであり、
Ｘ１４はＥまたはＧである）
【００６４】
１つの例において、ＶＨは、以下からなる群より選択されるＣＤＲ１配列を含む：
（ｉ）ＧＧＳＬＳＤＹＹ（配列番号８６）；
（ｉｉｉ）ＳＧＳＦＳＴＹＦ（配列番号４７）；及び
（ｉｖ）ＧＧＳＦＳＮＹＹ（配列番号６６）。
【００６５】
１つの例において、ＶＨは、以下からなる群より選択されるＣＤＲ２配列を含む：
（ｉ）ＩＮＨＳＧＴＴ（配列番号８７）；
（ｉｉ）ＩＩＨＴＧＳＴ（配列番号６４）；または
（ｉｉｉ）ＩＮＨＳＧＳＴ（配列番号４８）。
【００６６】
１つの例において、ＶＨは、以下からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む：
（ｉ）ＡＩＥＹＳＮＳＲＧＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号８８）；
（ｉｉ）ＡＦＥＹＳＳＳＧＧＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号４９）；及び
（ｉｉｉ）ＫＶＥＨＳＳＳＳＧＨＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号６５）。
【００６７】
１つの例において、ＶＬは、以下からなる群より選択されるＣＤＲ１配列を含む：
（ｉ）ＱＴＩＳＮＹ（配列番号１０９）；
（ｉｉ）ＱＳＩＳＳＹ（配列番号５０）；及び
（ｉｉｉ）ＱＴＩＳＹＹ（配列番号６６）。
【００６８】
１つの例において、ＶＬは、ＣＤＲ２配列ＡＡＳ（配列番号５１）を含む。
【００６９】
１つの例において、ＶＬは、以下からなる群より選択されるＣＤＲ３配列を含む：
（ｉ）ＲＱＮＹＮＴＰＬＴ（配列番号８５）；
（ｉｉｉ）ＱＱＴＹＳＴＰＬＴ（配列番号５２）；または
（ｉｖ）ＱＱＳＹＳＴＰＬＴ（配列番号６７）。
【００７０】
本開示は、以下の配列をそれぞれ含む、または以下の配列からそれぞれなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する可変重鎖（ＶＨ）を含むＰＡＲ４結合タンパク質も提供する：
（ｉ）配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５；
（ｉｉ）配列番号４７、配列番号４８、及び配列番号４９；
（ｉｉｉ）配列番号２４、配列番号２５、及び配列番号２６；
（ｉｖ）配列番号５５、配列番号１４、及び配列番号５６；
（ｖ）配列番号５９、配列番号６０、及び配列番号６１；
（ｖｉ）配列番号６３、配列番号６４、及び配列番号６５；
（ｖｉｉ）配列番号６８、配列番号１４、及び配列番号６９；
（ｖｉｉｉ）配列番号７０、配列番号７１、及び配列番号７２；
（ｉｘ）配列番号５５、配列番号７３、及び配列番号７４；
（ｘ）配列番号７５、配列番号７６、及び配列番号７７；
（ｘｉ）配列番号７９、配列番号８０、及び配列番号８１；
（ｘｉｉ）配列番号８２、配列番号８０、及び配列番号８３；
（ｘｉｉｉ）配列番号５５、配列番号７３、及び配列番号７４；または
（ｘｉｖ）配列番号８６、配列番号８７、及び配列番号８８。
【００７１】
本開示は、以下の配列をそれぞれ含む、または以下の配列からそれぞれなるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３配列を有する可変軽鎖（ＶＬ）を含むＰＡＲ４結合タンパク質も提供する：
（ｉ）配列番号１６、配列番号１７、及び配列番号１８；
（ｉｉ）配列番号５０、配列番号５１、及び配列番号５２；
（ｉｉｉ）配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９；
（ｉｖ）配列番号５７、配列番号２８、及び配列番号５８；
（ｖ）配列番号５７、配列番号２８、及び配列番号６２；
（ｖｉ）配列番号６６、配列番号５１、及び配列番号６７；
（ｖｉｉ）配列番号５７、配列番号２８、及び配列番号５８；
（ｖｉｉｉ）配列番号５７、配列番号２８、及び配列番号５８；
（ｉｘ）配列番号７８、配列番号２８、及び配列番号６２；
（ｘ）配列番号８４、配列番号５１、及び配列番号８５；
（ｘｉ）配列番号５７、配列番号２８、及び配列番号５８；
（ｘｉｉ）配列番号５７、配列番号５１、及び配列番号５８；または
（ｘｉｉｉ）配列番号１０９、配列番号５１、及び配列番号８５。
【００７２】
１つの例において、ＰＡＲ−４結合タンパク質は、以下を含む：
（ｉ）配列番号１１、配列番号２２、配列番号４５、配列番号５３、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、もしくは配列番号１０７のうちのいずれか１つに示される配列に対し、少なくとも５０％同一である配列を含むＶＨ、またはそのヒト化、キメラ、もしくは脱免疫化バージョン；及び／または
（ｉｉ）配列番号１２、配列番号２３、配列番号４６、配列番号５４、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、もしくは配列番号１０８に示される配列に対し、少なくとも８５％同一である配列を含むＶＬ、またはそのヒト化、キメラ、もしくは脱免疫化バージョン。
【００７３】
１つの例において、ＶＨは、配列番号１１、配列番号２２、配列番号４５、配列番号５３、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、または配列番号１０７のうちのいずれか１つに対し、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一である配列を含む。
【００７４】
１つの例において、ＶＬは、配列番号１２、配列番号２３、配列番号４６、配列番号５４、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、または配列番号１０４のうちのいずれか１つに対し、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一である配列を含む。
【００７５】
１つの例において、ＶＨは、配列番号１１、配列番号２２、配列番号４５、配列番号５３、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、または配列番号１０７（ＣＤＲ配列は除外）のうちのいずれか１つに対し、少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一である配列を含む。
【００７６】
１つの例において、ＶＬは、配列番号１２、配列番号２３、配列番号４６、配列番号５４、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、または配列番号１０８（ＣＤＲ配列は除外）に対し、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または９９．５％同一である配列を含む。
【００７７】
１つの例において、ＣＤＲは、ＩＭＧＴナンバリングシステムによって定義される。
【００７８】
本開示は、以下を含むＰＡＲ４結合タンパク質も提供する：
（ｉ）配列番号１１に示されるＶＨ及び配列番号１２に示されるＶＬ；
（ｉｉ）配列番号４５に示されるＶＨ及び配列番号４６に示されるＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２２に示されるＶＨ及び配列番号２３に示されるＶＬ；
（ｉｖ）配列番号５３に示されるＶＨ及び配列番号５４に示されるＶＬ；
（ｖ）配列番号８９に示されるＶＨ及び配列番号９０に示されるＶＬ；
（ｖｉ）配列番号９１に示されるＶＨ及び配列番号９２に示されるＶＬ；
（ｖｉｉ）配列番号９３に示されるＶＨ及び配列番号９４に示されるＶＬ；
（ｖｉｉｉ）配列番号９５に示されるＶＨ及び配列番号９６に示されるＶＬ；
（ｉｘ）配列番号９７に示されるＶＨ及び配列番号９８に示されるＶＬ；
（ｘ）配列番号９９に示されるＶＨ及び配列番号１００に示されるＶＬ；
（ｘｉ）配列番号１０１に示されるＶＨ及び配列番号１０２に示されるＶＬ；
（ｘｉｉ）配列番号１０３に示されるＶＨ及び配列番号１０４に示されるＶＬ；
（ｘｉｉｉ）配列番号１０５に示されるＶＨ及び配列番号１０６に示されるＶＬ；または
（ｘｉｖ）配列番号１０７に示されるＶＨ及び配列番号１０８に示されるＶＬ。
【００７９】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質抗原結合断片は、
（ｉ）１本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）；
（ｉｉ）二量体ｓｃＦｖ（ｄｉ−ｓｃＦｖ）；
（ｉｉｉ）重鎖定常領域またはＦｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に結合している（ｉ）及び／または（ｉｉ）のうちの少なくとも１つ；または
（ｉｖ）血小板に結合するタンパク質（例えば、フォン・ウィルブランド因子（ｖＷＦ））に連結している（ｉ）及び／または（ｉｉ）のうちの少なくとも１つ  である。
【００８０】
本開示の別の例において、ＶＬ及びＶＨは別々のポリペプチド鎖である。例えば、ＰＡＲ４結合タンパク質は、
（ｉ）ダイアボディ；
（ｉｉ）トリアボディ；
（ｉｉｉ）テトラボディ；
（ｉｖ）Ｆａｂ；
（ｖ）Ｆ（ａｂ′）２；
（ｖｉ）Ｆｖ；または
（ｖｉｉ）重鎖定常領域またはＦｃまたは重鎖定常ドメイン（ＣＨ）２及び／またはＣＨ３に連結している（ｉ）〜（ｖｉ）のうちの少なくとも１つ；または
（ｖｉｉｉ）血小板に結合するタンパク質（例えば、ｖＷＦ）に連結している（ｉ）〜（ｖｉ）のうちの少なくとも１つ  である。
【００８１】
本開示は、本明細書に記載のＶＨ及びＶＬを含むキメラ抗体であって、ＶＨがヒト重鎖定常領域に連結し、ＶＬがヒト軽鎖定常領域に連結している、キメラ抗体も提供する。
【００８２】
本開示に基づけば、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質がヒト、ヒト化、合成ヒト化（ｓｙｎｈｕｍａｎｉｚｅｄ）、キメラ、及び霊長類化タンパク質を包含することは当業者には明らかであろう。
【００８３】
本開示の抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、またはサブクラスを含めた任意のクラスに属することができる。ＩｇＧの例示的なサブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４である。
【００８４】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は組換え型である。１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は合成である。
【００８５】
１つの例において、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質または抗体は、ある部分と結合体化する。例えば、当該部分は、ラジオアイソトープ、検出可能な標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象におけるＰＡＲ４結合タンパク質の半減期を増加させる化合物、及びこれらの混合物からなる群より選択される。
【００８６】
本開示は、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質または抗体をコードする単離された核酸も提供する。１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質または抗体は、配列番号２０に示されるＶＨ核酸配列及び／または配列番号２１に示されるＶＬ核酸配列を含む。別の例において、ＰＡＲ４結合タンパク質または抗体は、配列番号３０に示されるＶＨ核酸配列及び／または配列番号３１に示されるＶＬ核酸配列を含む。
【００８７】
本開示は追加的に、プロモーターに対し作用可能に連結した本開示の核酸を含む発現コンストラクトを提供する。このような発現コンストラクトは、ベクター内、例えばプラスミド内のものであり得る。
【００８８】
単一のポリペプチドＰＡＲ４結合タンパク質を対象とする本開示の例において、発現コンストラクトは、そのポリペプチド鎖をコードする核酸に連結したプロモーターを含むことができる。
【００８９】
ＰＡＲ４結合タンパク質を形成する複数のポリペプチドを対象とする例において、本開示の発現コンストラクトは、プロモーターに対し作用可能に連結した（例えば、ＶＨを含む）ポリペプチドのうちの１つをコードする核酸と、別のプロモーターに対し作用可能に連結した（例えば、ＶＬを含む）ポリペプチドのうちの別の１つをコードする核酸とを含む。
【００９０】
別の例において、発現コンストラクトは、例えば、以下の５′から３′の順で作用可能に連結した構成要素を含む、バイシストロン性発現コンストラクトである：
（ｉ）プロモーター；
（ｉｉ）第１のポリペプチドをコードする核酸；
（ｉｉｉ）内部リボソーム進入部位；及び
（ｉｖ）第２のポリペプチドをコードする核酸。
【００９１】
例えば、第１のポリペプチドはＶＨを含み第２のポリペプチドはＶＬを含む、または第１のポリペプチドはＶＬを含み第２のポリペプチドはＶＨを含む。
【００９２】
本開示は、別々の発現コンストラクトであって、一方が（例えば、ＶＨと、任意選択で重鎖定常領域またはその一部とを含む）第１のポリペプチドをコードし、もう一方が（例えば、ＶＬと、任意選択で軽鎖定常領域とを含む）第２のポリペプチドをコードする、別々の発現コンストラクトも企図している。例えば、本開示は、
（ｉ）（例えば、プロモーターに対し作用可能に連結したＶＨを含む）ポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現コンストラクト、及び
（ｉｉ）（例えば、プロモーターに対し作用可能に連結したＶＬを含む）ポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現コンストラクト
を含む組成物であって、第１及び第２のポリペプチドが会合して本開示のＰＡＲ４結合タンパク質を形成する、組成物も提供する。
【００９３】
本開示は追加的に、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質もしくは抗体を発現する単離された細胞、または本開示のＰＡＲ４結合タンパク質もしくは抗体を発現するように遺伝子修飾された組換え細胞を提供する。１つの例において、細胞は単離されたハイブリドーマである。別の例において、細胞は、本開示の核酸もしくは発現コンストラクトを含むか、または：
（ｉ）プロモーターに対し作用可能に連結した（例えば、ＶＨを含む）ポリペプチドをコードする核酸を含む第１の発現コンストラクト、及び
（ｉｉ）プロモーターに対し作用可能に連結した（例えば、ＶＬを含む）ポリペプチドをコードする核酸を含む第２の発現コンストラクト
であって、第１及び第２のポリペプチドが会合して本開示のＰＡＲ４結合タンパク質を形成する、第１の発現コンストラクト及び第２の発現コンストラクトを含む。
【００９４】
本開示は追加的に、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質または核酸または発現コンストラクトまたは細胞と、好適な担体と含む組成物を提供する。１つの例において、組成物は本開示のＰＡＲ４結合タンパク質を含む。
【００９５】
１つの例において、担体は医薬的に許容される。
【００９６】
本開示の組成物は、単独で投与されても、他の治療、治療薬、または薬剤と組み合わせて、同時または順次のいずれかで投与されてもよい。
【００９７】
本開示は追加的に、対象における血栓症または血栓塞栓性障害を治療または防止するための方法であって、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質または核酸または発現コンストラクトまたは細胞または組成物を対象に投与することを含む、方法を提供する。１つの例において、対象は、血栓症のようなＰＡＲ４媒介事象のリスクがある者である。１つの例において、対象は、ＰＡＲ４媒介事象（例えば、血栓症）を有する、または過去に有していた者である。
【００９８】
１つの例において、本方法は、配列番号１１、配列番号２２、配列番号４５、配列番号５３、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、もしくは配列番号１０７のいずれか１つに示される配列を含むＶＨ、またはそのヒト化もしくは脱免疫化バージョンと、配列番号１２、配列番号２３、配列番号４６、配列番号５４、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号９８、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０６、もしくは配列番号１０８のいずれか１つに示される配列を含むＶＨ、またはそのヒト化もしくは脱免疫化バージョンとを含む抗体を、対象に投与することを含む。
【００９９】
本開示は追加的に、医学分野で使用するための、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質または核酸または発現コンストラクトまたは細胞または組成物を提供する。
【０１００】
本開示は追加的に、ＰＡＲ４媒介事象（例えば、血栓症）の治療または予防で使用するための、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質または核酸または発現コンストラクトまたは細胞または組成物を提供する。
【０１０１】
１つの例において、本開示は、血栓症または血栓塞栓性障害を治療、防止、または改善するための方法であって、それを必要とする対象に、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質または核酸または発現コンストラクトまたは細胞または組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【０１０２】
いくつかの例において、本開示は、血栓症の治療、防止、または改善を必要とする対象における血栓症を治療、防止、または改善するための方法であって、それを必要とする対象に、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質または核酸または発現コンストラクトまたは細胞または組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【０１０３】
１つの例において、本開示は、手術手順に関連する血栓症のリスクを低減する方法であって、対象に、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質または核酸または発現コンストラクトまたは細胞または組成物を手術手順の前及び／または後のいずれかに投与することを含む、方法を提供する。１つの例において、手術手順は肝臓移植であり、血栓症は肝動脈血栓症である。
【０１０４】
いくつかの例において、本開示は、本開示に従うＰＡＲ４結合タンパク質または抗体の用量が適切かどうかを決定するための方法を提供する。このような方法は、（ｉ）本開示のＰＡＲ４結合タンパク質または抗体による処置を受けた対象からの血液試料を取得することと、（ｉｉ）血液試料からの血小板をｉｎ  ｖｉｔｒｏでＰＡＲ４アゴニストにより処置することと、（ｉｉｉ）血小板活性化を測定することと、（ｉｖ）ＰＡＲ４結合タンパク質または抗体により処置した後の血液試料における血小板活性化を、ＰＡＲ４結合タンパク質または抗体により処置する前に取得した血液試料における血小板活性化と比較することとを含む。
【０１０５】
好適なＰＡＲ４アゴニストの例は当業者によく知られていると考えられる。非限定的な例としては、ＡＹＰＧＫＦ−ＮＨ２（Ｔｏｃｒｉｓ）のようなアゴニストペプチドが挙げられる。
【０１０６】
１つの例において、血小板活性化は、本明細書の実施例で例示されている方法に従って測定される。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、本開示は、血小板凝集を阻害または防止する方法であって、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に、本開示に従うＰＡＲ４結合タンパク質の治療有効量を投与するステップを含む、方法を含む。
【０１０８】
いくつかの例において、本開示は、血栓症または血栓塞栓性障害の治療または予防の方法であって、それを必要とする対象（例えば、ヒト）に、本開示に従う、ＰＡＲ４切断及び／またはシグナリングを阻害するＰＡＲ４結合タンパク質の治療有効量を投与することを含み、当該対象が二重のＰＡＲ１／ＰＡＲ４血小板受容体レパートリーを有する、方法を提供する。
【０１０９】
好ましくは、対象はヒトである。
【０１１０】
本開示は追加的に、医学分野における、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質または核酸または発現コンストラクトまたは細胞または組成物の使用を提供する。
【０１１１】
本開示は追加的に、血栓症または血栓塞栓性障害を治療または予防するための医薬品製造における、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質または核酸または発現コンストラクトまたは細胞または組成物の使用を提供する。
【０１１２】
本開示は追加的に、試料中のＰＡＲ４を検出するための方法であって、試料を本開示のＰＡＲ４結合タンパク質または抗体に接触させて抗原−タンパク質複合体を形成することと、複合体を検出することとを含み、複合体を検出することが試料中のＰＡＲ４を示す、方法を提供する。
【０１１３】
本開示は、ヒトＰＡＲ４のアンタゴニスト抗体を生成するための、医薬的に許容される担体と共に配列番号４に従う配列を含むまたはそれからなるワクチン抗原も提供する。
【０１１４】
本開示は、トロンビンの存在下でＰＡＲ−４の切断を阻害しない、または部分的にのみ阻害するＰＡＲ−４結合タンパク質も提供する。
【０１１５】
したがって、１つの例において、本開示は、以下を含むＰＡＲ４結合タンパク質も提供する：
（ｉ）配列番号３２に示される配列に対し少なくとも５０％同一である配列を含むＶＨ、またはそのヒト化、キメラ、もしくは脱免疫化バージョン；及び／または
（ｉｉ）配列番号３３に示される配列に対し少なくとも８５％同一である配列を含むＶＬ、またはそのヒト化、キメラ、または脱免疫化バージョン。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ＰＡＲ４のトロンビン切断及び活性化部位の細胞外位置ならびに本明細書に記載の抗体の抗ＰＡＲ４標的領域の模式図を示している。
【図２】フローサイトメトリーによる定量化で、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを含むヒトＰＡＲ４を形質移入したＨＥＫ２９３細胞の細胞表面上に存在するインタクトＰＡＲ４のパーセンテージを示している。細胞は、第１のハイブリドーマスクリーンから取得した５つの異なるハイブリドーマ上清（ＭｏＢ５ＡＲＣ３、ＭｏＢ５ＢＲＢ４、ＭｏＢ５ＢＲＣ６、ＭｏＢ５ＢＢＲＨ３、及びＭｏＢ５ＣＲＣ４）で前処置してからトロンビンで処置した（２Ｕ／ｍｌで１０分間）。陽性対照はポリクローナル抗ＰＡＲ４抗体とした（Ｆｒｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  １４：１６４２−１６５４）。データは、３つの個別データポイントにおける平均＋平均の標準誤差である。
【図３】フローサイトメトリーによる定量化で、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを含むＰＡＲ４を形質移入したＨＥＫ２９３細胞の細胞表面上に存在するインタクトＰＡＲ４のパーセンテージ（ＦＬＡＧエピトープ％による測定）を示している。細胞を、５Ａ．ＲＣ３の２つのサブクローン（Ｂ６ｂ及びＨ４ｂと呼ばれる）からの上清で前処置してから、トロンビンで処置した（２Ｕ／ｍｌで１０分間）。データは、４つの個別データポイントにおける平均＋平均の標準誤差である。
【図４】フローサイトメトリーによる定量化で、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを含むヒトＰＡＲ４のＴｈｒ１２０またはＡｌａ１２０のいずれかを形質移入したＨＥＫ２９３細胞の細胞表面上に存在するインタクトＰＡＲ４のパーセンテージ（ＦＬＡＧエピトープ％による測定）を示している。細胞を、示されるような様々な濃度の５Ａ．ＲＣ３サブクローンで前処置し、次いでトロンビン（２Ｕ／ｍｌ）で処置した。
【図５】（Ａ）免疫原ＰＡＲ４ならびにＰＡＲ１、２、及び３の対応領域に対応する固定したタンパク質に対する５Ａ．ＲＣ３（濃色）及び５Ｂ．ＲＢ４（淡色）のハイブリドーマ上清の結合のＥＬＩＳＡベーススクリーニングと、（Ｂ）５Ａ．ＲＣ３サブクローンのＰＡＲ４抗体のヒトＰＡＲ４ペプチドに対する結合親和性のＢｉａｃｏｒｅ分析（異なる濃度で測定）とを示している。
【図６】５Ａ．ＲＣ３はＡｌａ１２０及びＴｈｒ１２０両方のＰＡＲ４バリアントのトロンビン切断を阻害する。ＰＡＲ４バリアントのトロンビン切断を評価するため、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、トロンビン切断部位の上流のＦＬＡＧエピトープを含むＰＡＲ４−１２０ＡｌａまたはＰＡＲ４−１２０Ｔｈｒいずれかのバリアントを一過的に形質移入した。（Ａ）細胞を漸増用量（０．１〜２Ｕ／ｍＬ）のトロンビンで刺激し、ＦＩＴＣ結合体化抗ＦＬＡＧ抗体を用いて、フローサイトメトリーによりトロンビン切断の量をＦＬＡＧエピトープの喪失として測定した。（Ｂ）トロンビン刺激の前に形質移入細胞を５Ａ．ＲＣ３と共にプレインキュベートすることで、ＰＡＲ４バリアントに関係なく、同じ程度でほぼ完全なトロンビン切断阻害がもたらされた。５Ａ．ＲＣ３の１、１０、１００μｇ／ｍｌの用量を比較した。
【図７】５Ａ．ＲＣ３サブクローンは、ＰＡＲ４  Ｔｈｒ１２０バリアントを有するドナーにおける上方制御されたトロンビン誘導血小板凝集応答を阻害する。異なるＰＡＲ４バリアントのヒト単離血小板において、ＰＡＲ４アゴニストに対する血小板凝集応答に対する応答を評価した。予測の通り、Ｔアレルの存在は、中用量範囲の（Ａ）ＰＡＲ４−ＡＰ及び（Ｂ）トロンビンに応答したより高い最大凝集に関連する。類似の傾向は、（Ｃ）ボラパキサル（９０ｎＭ）によるＰＡＲ１遮断の存在下でのトロンビン刺激の場合でも観察される。（Ｄ）ＰＡＲ１アンタゴニストの存在下におけるトロンビン誘導血小板凝集応答（すなわち、ＰＡＲ４依存的）に対する５Ａ．ＲＣ３阻害活性の濃度応答は、Ｔｈｒ１２０バリアントに対する有効性を示しており、これは抗体媒介のＰＡＲ４阻害が全ての遺伝子型に対し同様に有効であることを示すものである。（Ｅ）ＰＡＲ４依存的トロンビン誘導血小板凝集における５Ａ．ＲＣ３阻害活性のＩＣ５０。
【図８】フローサイトメトリーによってアイソタイプ対照に対し示されるように、５Ａ．ＲＣ３（１０ｕｇ／ｍＬ）が単離血小板中のヒトＰＡＲ４に結合することを示している。
【図９】ＰＡＲ４遺伝子型が凝固促進性血小板表現型の増加に関連し、抗体媒介阻害により標的化可能であることを示している。（Ａ）ＰＡＲ４活性化ペプチド（ＡＰ）刺激、及び（Ｂ）トロンビン刺激に応答したホスファチジルセリン露出を測定することにより、ヒト単離血小板の凝固促進活性を評価した。Ｔｈｒ１２０バリアントが、ＰＡＲ４−ＡＰ刺激血小板におけるＰＳ露出の増加をもたらすことに留意されたい。類似の傾向はトロンビン刺激血小板でも観察される。（Ｃ）５Ａ．ＲＣ３サブクローンによる前処置は、ドナー遺伝子型に関係なく、トロンビン誘導ホスファチジルセリン露出を用量依存的に阻害した。
【図１０−１】５Ａ．ＲＣ３サブクローンがドナー遺伝子型に関係なく血栓症を阻害することを示している。以下の血栓症パラメーターを、凝固条件下のヒト全血血栓症アッセイにおいて、１０分の期間にわたりリアルタイムで測定した：（Ａ）血小板沈着（ＰＥ結合体化抗ＣＤ９）、トロンビン活性（ＦＲＥＴベースのトロンビンプローブ）、フィブリン体積（Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０結合体化抗フィブリン抗体）、及び血栓当たりのフィブリンの比（示されているデータは１０分エンドポイント時のものである）。直接的なトロンビン阻害物質ヒルジン（８００Ｕ／ｍＬ）が、血小板沈着の継続にもかかわらず、トロンビン活性及びフィブリン体積を消失させたことに留意されたい。
【図１０−２】５Ａ．ＲＣ３サブクローンがドナー遺伝子型に関係なく血栓症を阻害することを示している。以下の血栓症パラメーターを、凝固条件下のヒト全血血栓症アッセイにおいて、１０分の期間にわたりリアルタイムで測定した：（Ｂ〜Ｅ）ＰＡＲ４遺伝子型全体においてこれらのパラメーターの有意差は観察されなかった。５Ａ．ＲＣ３（白抜きのバー、１００μｇ／ｍＬ）は、対照（黒色のバー）との比較で、（Ｆ）血小板沈着に対しては影響を及ぼさなかったが、（Ｇ）トロンビン活性、（Ｈ）フィブリン体積、及び（Ｉ）血栓体積当たりのフィブリンの比に対しては有意に阻害した。データは、遺伝子型当たりＮ＝４〜６の平均±ＳＥＭである（合計ｎ＝１５、色はＰＡＲ４遺伝子型を示す：黒色の丸＝ＡＡ、灰色の丸＝ＡＴ、白色の丸＝ＴＴ）。（Ｇ）及び（Ｈ）については、データをヒルジンベースラインに対し正規化し、未処置対照のパーセンテージとして表現した。統計的有意性は一元配置ＡＮＯＶＡ（Ｂ〜Ｅ）またはスチューデントＴ検定（Ｆ〜Ｇ）により決定した。＊はＰ＜０．０５を示す。
【図１１】血小板凝集に対する最初のハイブリドーマ上清の機能的スクリーニングを示す。
【図１２】ＩＭＧＴナンバリングに従って同定されたＣＤＲを伴うＭｏＢ５Ａ−ＲＣ３．Ｆ１０ｂ．Ｈ４ｂ（５Ａ．ＲＣ３）のＶＨ（Ａ）及びＶＬ（Ｂ）のアミノ酸配列を示している。ＶＨ＝重鎖可変領域、ＶＬ＝軽鎖可変領域、ＣＤＲ＝相補性決定領域、及びＦＷＲ＝フレームワーク領域。この抗体はＰＡＲ４阻害機能を示した。
【図１３】ＩＭＧＴナンバリングに従って同定されたＣＤＲを伴うＭｏＢ５Ｈ−ＲＤ２．Ａ７ｂ（５Ｈ．ＲＤ２）のＶＨ（Ａ）及びＶＬ（Ｂ）のアミノ酸配列を示している。ＶＨ＝重鎖可変領域、ＶＬ＝軽鎖可変領域、ＣＤＲ＝相補性決定領域、及びＦＷＲ＝フレームワーク領域。この抗体は、ＰＡＲ４に結合したものの、ＰＡＲ４に対する阻害機能を示さなかった。
【図１４】ＩＭＧＴナンバリングに従って同定されたＣＤＲを伴うＭｏＢ５Ｆ−ＲＦ３．Ａ７ｂ．Ｃ９（５Ｆ．ＲＦ３）のＶＨ（Ａ）及びＶＬ（Ｂ）のアミノ酸配列を示している。ＶＨ＝重鎖可変領域、ＶＬ＝軽鎖可変領域、ＣＤＲ＝相補性決定領域、及びＦＷＲ＝フレームワーク領域。この抗体はＰＡＲ４阻害機能を示した。
【図１５】ＥＬＩＳＡによる精製ｍＡｂのｈＰＡＲ４ペプチドとの反応性を示している。用量依存的方式でｈＰＡＲ４ペプチドに結合した精製ｍＡｂが、アルカリホスファターゼ（Ａｐ）と結合体化した抗マウスＦｃにより検出された。無関係の非ＰＡＲ４抗原に対し産生したＩＣ（アイソタイプ対照）ｍＡｂの場合には、結合が観察されなかった。
【図１６】ＥＬＩＳＡにより１０μｇ／ｍｌにおいて、精製抗ＨＰＡＲ４  ｍＡｂがｈＰＡＲ４ビオチン化ペプチドに対し特異的に結合し、ｈＰＡＲ１、ｈＰＡＲ２、及びｈＰＡＲ３（ビオチン化ペプチド）に対しては非特異的に反応しないことを示している。
【図１７】フローサイトメトリーによる精製抗ｈＰＡＲ４  ｍＡｂ  ｖｓアイソタイプ対照のヒト単離血小板に対する濃度依存的結合を示している。幾何平均蛍光強度として表現された生データが示されている。各ｍＡｂは濃度依存的に結合している。Ｎ＝３〜５。データポイントは平均±ＳＥＭである。
【図１８】３種の抗ｈＰＡＲ４  ｍＡｂクローンによる０．１Ｕ／ｍｌトロンビンにより誘導されるヒト血小板凝集の濃度依存的阻害を示している。試験した最高濃度において各クローンによるほぼ最大限の阻害が達成された。これらの濃度阻害曲線から測定されたＩＣ５０値（μｇ／ｍｌ）も図中に示されている。Ｎ＝４〜８。データポイントは平均±ＳＥＭである。
【図１９】モノクローナル抗体５Ａ．ＲＣ３及び５Ｄ．ＲＨ４によるヒト血栓形成の阻害を示している。５Ｄ．ＲＨ４または５Ａ．ＲＣ３（共に１００μｇ／ｍｌ）いずれかによる血液の前処置により、合計血栓体積が低減した。個別のデータポイントが示されている。バーは平均±ＳＥＭである。＊Ｐ＜０．０５（対応のないスチューデントｔ検定）。
【図２０】ＩＭＧＴナンバリングシステムに従う相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す抗ＰＡＲ４  ｍＡｂの可変重鎖の配列を示している。
【図２１】ＩＭＧＴナンバリングシステムに従う相補性決定領域（ＣＤＲ）を示す抗ＰＡＲ４  ｍＡｂの可変軽鎖の配列を示している。
【図２２】抗ｈＰＡＲ４  ｍＡｂのエピトープマッピングのための合成ペプチドを示している。元のヒトＰＡＲ４抗原にまたがる重複ペプチドを合成した。これらは、アミノ酸残基１〜９、アミノ酸残基８〜１５、及びアミノ酸置換１１〜２０からなった。トロンビン切断部位の配列は下線で示されている。多量体の形成を防止するためにＣ末端システイン残基を除去した。
【図２３】精製ｈＰＡＲ４  ｍＡｂとペプチド１〜９、ペプチド８〜１５、及びペプチド１１〜２０との反応性を示している。吸光度の値はバックグラウンドレベルから差し引いた。非ｈＰＡＲ４対照ｍＡｂは、３つのペプチドのいずれに対しても反応しなかった。
【０１１７】
配列表の解説
配列番号１：ＰＡＲ４のエピトープ配列
配列番号２：ｈＰＡＲ４の配列（裸）
配列番号３：ｍＰＡＲ４の配列（裸）
配列番号４：免疫原として使用したｈＰＡＲ４（ＫＬＨ）の配列
配列番号５：免疫原として使用したｍＰＡＲ４（ＫＬＨ）の配列
配列番号６：ｍＰＡＲ４（ビオチン）の配列
配列番号７：ｈＰＡＲ４（ビオチン）の配列
配列番号８：ｈＰＡＲ３（ビオチン）の配列
配列番号９：ｈＰＡＲ２（ビオチン）の配列
配列番号１０：ｈＰＡＲ１（ビオチン）の配列
配列番号１１：５Ａ．ＲＣ３  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１２：５Ａ．ＲＣ３  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号１３：５Ａ．ＲＣ３  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号１４：５Ａ．ＲＣ３  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号１５：５Ａ．ＲＣ３  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号１６：５Ａ．ＲＣ３  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号１７：５Ａ．ＲＣ３  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号１８：５Ａ．ＲＣ３  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号１９：ヒトＰＡＲ４の配列
配列番号２０：５Ａ．ＲＣ３  ＶＨの核酸配列
配列番号２１：５Ａ．ＲＣ３  ＶＬの核酸配列
配列番号２２：５Ａ．ＲＣ３  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号２３：５Ｆ．ＲＦ３  ＶＬのアミノ酸配列（５Ｆ．ＲＦ３）
配列番号２４：５Ｆ．ＲＦ３  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号２５：５Ｆ．ＲＦ３  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号２６：５Ｆ．ＲＦ３  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号２７：５Ｆ．ＲＦ３  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号２８：５Ｆ．ＲＦ３  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号２９：５Ｆ．ＲＦ３  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号３０：５Ｆ．ＲＦ３  ＶＨの核酸配列
配列番号３１：５Ｆ．ＲＦ３  ＶＬの核酸配列
配列番号３２：５Ｈ．ＲＤ２  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号３３：５Ｈ．ＲＤ２  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号３４：５Ｈ．ＲＤ２  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号３５：５Ｈ．ＲＤ２  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号３６：５Ｈ．ＲＤ２  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号３７：５Ｈ．ＲＤ２  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号３８：５Ｈ．ＲＤ２  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号３９：５Ｈ．ＲＤ２  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号４０：５Ｈ．ＲＤ２  ＶＨの核酸配列
配列番号４１：５Ｈ．ＲＤ２  ＶＬの核酸配列
配列番号４２：エピトープ配列
配列番号４３：エピトープ配列
配列番号４４：エピトープ配列
配列番号４５：５Ｉ．ＲＧ１  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号４６：５Ｉ．ＲＧ１  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号４７：５Ｉ．ＲＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号４８：５Ｉ．ＲＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号４９：５Ｉ．ＲＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号５０：５Ｉ．ＲＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号５１：５Ｉ．ＲＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号５２：５Ｉ．ＲＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号５３：５Ｇ．ＲＡ１  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号５４：５Ｇ．ＲＡ１  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号５５：５Ｇ．ＲＡ１  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号１４：５Ｇ．ＲＡ１  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号５６：５Ｇ．ＲＡ１  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号５７：５Ｇ．ＲＡ１  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号２８：５Ｇ．ＲＡ１  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号５８：５Ｇ．ＲＡ１  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号８９：５Ｄ．ＲＨ４  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号９０：５Ｄ．ＲＨ４  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号５９：５Ｄ．ＲＨ４  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号６０：５Ｄ．ＲＨ４  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号６１：５Ｄ．ＲＨ４  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号５７：５Ｄ．ＲＨ４  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号２８：５Ｄ．ＲＨ４  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号６２：５Ｄ．ＲＨ４  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号９１：５Ｈ．ＲＨ４  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号９２：５Ｈ．ＲＨ４  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号６３：５Ｈ．ＲＨ４  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号６４：５Ｈ．ＲＨ４  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号６５：５Ｈ．ＲＨ４  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号６６：５Ｈ．ＲＨ４  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号５１：５Ｈ．ＲＨ４  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号６７：５Ｈ．ＲＨ４  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号９３：５Ｇ．ＲＦ６  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号９４：５Ｇ．ＲＦ６  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号６８：５Ｇ．ＲＦ６  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号１４：５Ｇ．ＲＦ６  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号６９：５Ｇ．ＲＦ６  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号５７：５Ｇ．ＲＦ６  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号２８：５Ｇ．ＲＦ６  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号５８：５Ｇ．ＲＦ６  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号９５：５Ｇ．ＲＤ６  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号９５：５Ｇ．ＲＤ６  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号７０：５Ｇ．ＲＤ６  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号７１：５Ｇ．ＲＤ６  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号７２：５Ｇ．ＲＤ６  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号５７：５Ｇ．ＲＤ６  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号２８：５Ｇ．ＲＤ６  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号５８：５Ｇ．ＲＤ６  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号９７：５Ｈ．ＲＡ３  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号９８：５Ｈ．ＲＡ３  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号５５：５Ｈ．ＲＡ３  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号７３：５Ｈ．ＲＡ３  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号７４：５Ｈ．ＲＡ３  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号５７：５Ｈ．ＲＡ３  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号２８：５Ｈ．ＲＡ３  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号５８：５Ｈ．ＲＡ３  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号９９：５Ｇ．ＲＧ１  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１００：５Ｇ．ＲＧ１  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号７５：５Ｇ．ＲＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号７６：５Ｇ．ＲＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号７７：５Ｇ．ＲＧ１  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号７８：５Ｇ．ＲＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号２８：５Ｇ．ＲＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号６２：５Ｇ．ＲＧ１  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号１０１：５Ｈ．ＲＧ４  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１０２：５Ｈ．ＲＧ４  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号７９：５Ｈ．ＲＧ４  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号８０：５Ｈ．ＲＧ４  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号８１：５Ｈ．ＲＧ４  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号５７：５Ｈ．ＲＧ４  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号２８：５Ｈ．ＲＧ４  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号５８：５Ｈ．ＲＧ４  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号１０３：５Ｇ．ＲＣ５  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１０４：５Ｇ．ＲＣ５  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号８２：５Ｇ．ＲＣ５  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号８０：５Ｇ．ＲＣ５  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号８３：５Ｇ．ＲＣ５  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号５７：５Ｇ．ＲＣ５  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号５１：５Ｇ．ＲＣ５  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号５８：５Ｇ．ＲＣ５  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号１０５：５Ｆ．ＲＥ６  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１０６：５Ｆ．ＲＥ６  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号５５：５Ｆ．ＲＥ６  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号７３：５Ｆ．ＲＥ６  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号７４：５Ｆ．ＲＥ６  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号８４：５Ｆ．ＲＥ６  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号５１：５Ｆ．ＲＥ６  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号８５：５Ｆ．ＲＥ６  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列
配列番号１０７：５Ｈ．ＲＦ２  ＶＨのアミノ酸配列
配列番号１０８：５Ｈ．ＲＦ２  ＶＬのアミノ酸配列
配列番号８６：５Ｈ．ＲＦ２  ＶＨ  ＣＤＲ１の配列
配列番号８７：５Ｈ．ＲＦ２  ＶＨ  ＣＤＲ２の配列
配列番号８８：５Ｈ．ＲＦ２  ＶＨ  ＣＤＲ３の配列
配列番号１０９：５Ｈ．ＲＦ２  ＶＬ  ＣＤＲ１の配列
配列番号５１：５Ｈ．ＲＦ２  ＶＬ  ＣＤＲ２の配列
配列番号８５：５Ｈ．ＲＦ２  ＶＬ  ＣＤＲ３の配列。
【発明を実施するための形態】
【０１１８】
概要
本明細書全体において、別段の明記がない限り、または文脈上他の意味が要求されない限り、単一のステップ、物質の組成物、ステップの群、または物質の組成物の群への言及は、これらのステップ、物質の組成物、ステップの群、または物質の組成物の群のうちの１つ及び複数（すなわち１つ以上）を包含するように解釈するものとする。
【０１１９】
当業者は、本開示が、具体的に記載されているものの他にも変形形態及び変更形態が生じやすいことを理解するであろう。本開示が全てのこのような変形形態及び変更形態を含むことを理解されたい。本開示は、本明細書中で個別にまたは集合的に言及または示された全てのステップ、特色、組成物、及び化合物、ならびに当該ステップまたは特色のあらゆる組合せまたは任意の２つ以上も含む。
【０１２０】
本開示は、本明細書に記載の特定の例によって範囲を限定されないものとする。このような特定の例は、例示のために意図されているに過ぎない。機能的に等価の産物、組成物、及び方法は、明らかに本開示の範囲内にある。
【０１２１】
本開示の任意の例は、別段の明記がない限り、必要な変更を考慮しながら本開示の任意の他の例に適用されるように解釈するものとする。
【０１２２】
別段の具体的な定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当該技術分野の（例えば、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、及び生化学における）当業者が一般的に理解するものと同じ意味を有するように解釈するものとする。
【０１２３】
別段の指示がない限り、本開示で利用される組換えタンパク質、細胞培養、及び免疫学的技法は、当業者に周知された標準的な手順である。このような技法は文献全体において、例えば、Ｐｅｒｂａｌ（１９８４），Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）、Ｂｒｏｗｎ（１９９１）、Ｇｌｏｖｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ（１９９５及び１９９６）、ならびにＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８、現在に至るまでの全ての改訂を含む）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）、Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（現在までの全ての改訂を含む）、ならびにＺｏｌａ（１９８７）のような出典で記載及び説明されている。
【０１２４】
本明細書における可変領域及びその一部、免疫グロブリン、抗体及びその断片の記載及び定義は、Ｋａｂａｔ（１９８７及び／または１９９１）、Ｂｏｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、及び／またはＣｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ（１９８７及び／または１９８９）、またはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）、またはＬｅｆｒａｎｃ  Ｍ．−Ｐ．（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５  Ｔｏｄａｙ  １８，５０９のＩＭＧＴナンバリングにおける考察により、さらに明らかにされ得る。
【０１２５】
本明細書全体において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などのバリエーションは、述べられた要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を含み、ただし任意の他の要素、整数、もしくはステップ、または要素、整数、もしくはステップの群を除外しないように理解されたい。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「〜に由来する」という用語は、指定の完全体が、特定の供給源から取得することができること（ただし、必ずしもその供給源から直接取得されるとは限らない）を示すものと解釈されたい。
【０１２７】
本発明は、当業者の技能範囲の従来的な分子生物学、微生物学、及び組換えＤＮＡ技法を用いる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９）を参照。
【０１２８】
選択された定義
本明細書で使用される場合、文脈による明確な別段の定めがない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には複数の指示対象が含まれる。「ａ」（または「ａｎ」）、ならびに「１つ以上」及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では互換的に使用され得る。
【０１２９】
さらに、本明細書で使用される場合の「及び／または」は、他方を伴うまたは伴わない２つの指定された特色または構成要素を具体的に開示するものとして解釈するものとする。したがって、「Ａ及び／またはＢ」のような表現で使用される場合の「及び／または」という用語は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、ならびに「Ｂ」（単独）を含むように意図されている。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような表現で使用される場合の「及び／または」という用語は、以下の実施形態の各々を包含するように意図されている：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）。
【０１３０】
「約」という用語は、本明細書では、およそ、大まかに、〜前後、または〜の領域内を意味するように使用される。「約」という用語が数値範囲と共に使用される場合、「約」は、記載値の上方及び下方に境界を広げることにより、その範囲を変更する。概して、本明細書において「約」という用語は、ある数値を、記載値に対し１０パーセント（％）上または下（高いまたは低い）の変化量で上方及び下方に超えるように変更するために使用される。
【０１３１】
本明細書に記載のＰＡＲ４結合タンパク質及び抗体、核酸、細胞、ならびにベクターは単離された形態であることが理解されよう。「単離された」とは、天然に見いだされない形態のポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞を意味する。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞には、もはや天然に見いだされる形態ではない程度まで精製されたものが含まれる。いくつかの態様において、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞は実質的に純粋である。いくつかの態様において、単離された抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、または細胞は「組換え型」である。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「プロテアーゼ活性化受容体（ＰＡＲ４）」という用語は、トロンビンまたはトロンビンアゴニストにより特異的に活性化され、よってＰＡＲ４媒介シグナリング事象（例えば、ホスホイノシチド加水分解、Ｃａ流出、血小板凝集）を活性化する、脊椎動物細胞表面タンパク質の全てまたは一部を意味する。このポリペプチドは、本明細書に記載のリガンド活性化特性（アゴニスト活性化及びアンタゴニスト阻害の特性を含む）ならびに組織分布を有することを特徴とする。この用語は、トロンビンに結合可能なこれらのＰＡＲ４部分または配列番号２に示されるＰＡＲ４受容体部分を含む。
【０１３３】
「ＰＡＲ４アンタゴニスト」という用語は、ＰＡＲ４に結合し、ＰＡＲ４切断及び／またはシグナリングを阻害する血小板凝集の阻害物質を意味する。典型的には、ＰＡＲ４活性は、対照細胞におけるこのような活性に比べて少なくとも１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、または１００％、用量依存的に低減される。対照細胞とは、化合物で処置されていない細胞である。ＰＡＲ４活性は、本明細書に記載の方法（例えば、ＰＡＲ４発現細胞におけるカルシウム動員、血小板凝集、例えばカルシウム動員、ｐ−セレクチン、もしくはＣＤ４０Ｌ放出を測定する血小板活性化アッセイ、または血栓症及び止血モデル）を含めた、当技術分野における任意の標準的な方法によって測定される。
【０１３４】
「ｈＰＡＲ４」すなわち「ヒトＰＡＲ４」という用語は、完全ヒト抗体を指す。命名及び非限定の目的で、ｈＰＡＲ４のアミノ酸配列は配列番号１９に示されている。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「ｍＡｂ」という用語は、マウス定常領域配列及びヒト可変領域配列を含むモノクローナル抗体を指すように意図されている。
【０１３６】
「抗体」という用語は、天然の、または部分的もしくは完全に合成的に産生された、または組換えで産生された免疫グロブリンを説明する。この用語は、抗体結合ドメインである、または抗体結合ドメインに相同である結合ドメインを有する任意のポリペプチドまたはタンパク質も網羅する。ＣＤＲ移植抗体もこの用語で企図されている。「抗体」とは、特定のエピトープに結合する任意の免疫グロブリンであり、抗体及びその断片がこれに含まれる。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、多価抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及びヒト抗体を包含する。また、「抗体」という用語は、ジスルフィド結合によって相互接続される少なくとも２つの免疫グロブリン重（Ｈ）鎖及び２つの免疫グロブリン軽（Ｌ）鎖、またはこれらの抗原結合部分を含むタンパク質も指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略記される）及び重鎖定常領域（本明細書ではＣＨと略記される）から構成される。ＣＨは、通常、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３から構成される（例えば、ＩｇＭは追加の領域ドメインＣＨ４を有する）。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略記される）及び軽鎖定常領域（本明細書ではＣＬと略記される）から構成される。ＣＬは１つのドメインから構成され、ラムダまたはカッパタイプのものとすることができる。ＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができ、この領域は、フレームワーク領域（ＦＷＲ）と称されるより保存的な領域と共に散在する。各ＶＨ及びＶＬは３つのＣＤＲ及び４つのＦＷＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて以下の順：ＦＷＲ１、ＣＤＲ１、ＦＷＲ２、ＣＤＲ２、ＦＷＲ３、ＣＤＲ３、ＦＷＲ４に並んでいる。あるいくつかの実施形態において、ＶＨ及びＶＬは共に、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。他の実施形態において、単一のＶＨドメインまたは単一ＶＬドメインは、抗原と特異的に相互作用し得る。抗体のＣＨドメインは、免疫グロブリンが、免疫システムの様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）、血管壁を覆う細胞、免疫グロブリンのＣＨドメインのための他の細胞発現受容体、及び古典的相補システムの第１の構成要素（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子に結合するのを媒介することができる。抗体分子は、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、またはサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）のものとすることができる。本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、重鎖及び／または軽鎖の部分が、特定の種に由来する抗体内または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残部は別の種に由来する抗体内または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体も含み、加えて、所望の生物学的活性を示す限りでは、このような抗体の断片も含む（米国特許第４，８１６，５６７号及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．Ｕ��Ａ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４））。脊椎動物系における基本的な抗体構造は十分に理解されている。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）を参照。任意の「抗原結合断片」も「抗体」という用語の意味の中に含まれている。
【０１３７】
「抗原結合断片」という用語は、抗原（例えば、ＰＡＲ４）に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の断片を指す。全長抗体の断片は、抗体の抗原結合機能を実施することができる。抗体の「抗原結合断片」という用語内に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、すなわち、ＶＬ及びＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなる１価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ）２断片、すなわち、ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結する２つのＦａｂ断片を含む２価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＨ及びＣＬドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインまたはＶＬドメインのみからなる、単一ドメイン抗体断片またはｄＡｂ（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９））；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＨ及びＶＬは別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え法または合成法を用いて、例えば、単一タンパク質鎖としての作製を可能にする合成リンカーにより、結合することができ、このとき、ＶＨ及びＶＬ領域は対合して１価の分子（１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる）を形成する（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３）。ｓｃＦｖは、抗体の「抗原結合断片」という用語内にも包含される。これらの抗体断片は、当業者に知られている従来的な技法を用いて取得され、そしてこの断片は、インタクト抗体と同じ方式で有用性のスクリーニングが行われる。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「抗体可変領域」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）ならびにフレームワーク領域（ＦＷＲ）のアミノ酸配列を含めた抗体分子の軽鎖及び重鎖の部分を指す。ＶＨとは重鎖の可変領域を指す。ＶＬとは軽鎖の可変領域を指す。本発明で使用される方法によれば、ＣＤＲ及びＦＲに割り当てられたアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９８７及び１９９１））もしくはＣｈｏｔｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  １９８７  Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）に従って、またはＩＭＧＴナンバリングシステムに従って定義することができる。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「モノクローナル抗体」という用語は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体は、特定のエピトープに対する単一結合特異性及び親和性を示す。モノクローナル抗体は、任意の動物から、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタなどから生成することができ、または合成的に生成し、部分的または完全にヒト配列とすることができる。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「ポリクローナル抗体」という用語は、抗原に対する抗体を生成するために抗原を注射した哺乳類の血清から精製された抗体の混合物を指す。ポリクローナル抗体は、任意の哺乳類から、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ヒトなどから生成することができ、または、例えば、ＶＨ及びＶＬ遺伝子ファージディスプレイライブラリーとして、合成的に生成することができる。
【０１４１】
「キメラ抗体」という用語は、重鎖及び／または軽鎖の部分が、特定の種（例えば、ネズミ科動物）に由来する抗体内または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残部は別の種（例えば、霊長類）に由来する抗体内または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体内の対応する配列と同一または相同である抗体を指し、加えて、所望の生物学的活性を示す限りでは、このような抗体の断片も指す。
【０１４２】
「ヒト化抗体」という用語は、概して組換え技法を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンに由来するエピトープ結合部位を有し、分子の残りの免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造及び／または配列に基づく、キメラ分子を指すように理解するものとする。抗原結合部位は、好ましくは、ヒト抗体の可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域に移植した非ヒト抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト抗体からの残りの領域とを含む。
【０１４３】
「ヒト抗体」という用語は、本明細書で抗体分子及び結合タンパク質と共に使用される場合、可変抗体領域（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ、及びＦＲ領域）と、ヒトに（例えば、ヒトの生殖細胞または体細胞に）見いだされる配列に由来するまたは対応する定常抗体領域とを指す。
【０１４４】
「ＩＭＧＴナンバリング」とは、本明細書で使用される場合、抗体可変領域のＣＤＲ及びＦＷＲ配列を同定するために使用されるナンバリングシステムを指す。ＩＭＧＴユニークナンバリングは、任意の抗原受容体、鎖のタイプ、または種における可変ドメインを比較するために定義されている（Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ．−Ｐ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５  Ｔｏｄａｙ  １８，５０９（１９９７）／Ｌｅｆｒａｎｃ  Ｍ．−Ｐ．，Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｓｔ，７，１３２−１３６（１９９９）／Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｐｏｍｍｉｅ，Ｃ．，Ｒｕｉｚ，Ｍ．，Ｇｉｕｄｉｃｅｌｌｉ，Ｖ．，Ｆｏｕｌｑｕｉｅｒ，Ｅ．，Ｔｒｕｏｎｇ，Ｌ．，ＴｈｏｕｖｅｎｉｎＣｏｎｔｅｔ，Ｖ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｄｅｖ．  Ｃｏｍｐ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２７，５５−７７（２００３））。ＩＭＧＴユニークナンバリングにおいて、保存アミノ酸は常に同じ位置にあり、例えば、システイン２３（１ｓｔ  ＣＹＳ）、トリプトファン４１（ＣＯＮＳＥＲＶＥＤ−ＴＲＰ）、疎水アミノ酸８９、システイン１０４（２ｎｄ  ＣＹＳ）、フェニルアラニンまたはトリプトファン１１８（Ｊ−ＰＨＥまたはＪ−ＴＲＰ）となる。ＩＭＧＴユニークナンバリングは、フレームワーク領域（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：位置１〜２６、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：位置３９〜５５、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４、及びＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８）及び相補性決定領域（ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５、及びＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７）の標準化された境界を提供する。ギャップは占有されていない位置を表すことから、ＣＤＲ−ＩＭＧＴ長は決定的な情報となる。ＩＭＧＴユニークナンバリングは、ＩＭＧＴ  Ｃｏｌｌｉｅｒｓ  ｄｅ  Ｐｅｒｌｅｓという名称の２Ｄ図式表現（Ｒｕｉｚ，Ｍ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，５３，８５７−８８３（２００２）／Ｋａａｓ，Ｑ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，２，２１−３０（２００７））及びＩＭＧＴ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢにおける３Ｄ構造（Ｋａａｓ，Ｑ．，Ｒｕｉｚ，Ｍ．ａｎｄ  Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．，Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ＭＨＣ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｄａｔａ．  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，３２，Ｄ２０８−Ｄ２１０（２００４））で使用されている。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「特異的に結合する」という用語は、本開示のタンパク質が、代替的な細胞または物質よりも高頻度に、迅速に、長い持続期間で、及び／または高い親和性で、特定の細胞または物質と反応または会合することを意味するように解釈するものとする。また、この定義を読み取ることにより、例えば、第１の抗原に対し特異的に結合するタンパク質は、第２の抗原に対し特異的に結合する場合もあればそうでない場合もあることも理解される。そのため「特異的な結合」は、必ずしも排他的結合や別の抗原の非検出可能な結合を要件とせず、これは「選択的結合」という用語が意味するところである。
【０１４６】
「形質移入された」及び「形質移入細胞」などは、遺伝子操作を用いて、自らの中に（またはその祖先の中に）ＰＡＲ４をコードするＤＮＡ分子（またはその生物学的に活性の断片もしくはアナログをコードするＤＮＡ）が導入された細胞を意味する。このようなＤＮＡ分子は「発現向けに位置付けられて」いる。これは、ＤＮＡ分子が、配列の転写及び翻訳を指示する（すなわち、ＰＡＲ４タンパク質またはその断片もしくはアナログの産生を推進する）ＤＮＡ配列の隣に位置付けられていることを意味する。
【０１４７】
「同一性」という用語及びその文法上の変形形態は、言及された２つ以上の実体が同じであることを意味する。したがって、２つの抗体配列が同一である場合、これらは、少なくとも参照された領域または部分内で、同じアミノ酸配列を有する。２つの核酸配列が同一である場合、これらは、少なくとも参照された領域または部分内で、同じポリヌクレオチド配列を有する。同一性は、配列の定義されたエリア（領域またはドメイン）に対するものである場合もある。ポリヌクレオチドの同一性％は、ＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．４８：４４４−４５３．１９７０）分析（ＧＣＧプログラム）により測定され、ギャップ作成ペナルティー＝５及びギャップ延長ペナルティー＝０．３とする。別段の記載がない限り、クエリー配列は少なくとも４５ヌクレオチド長であり、ＧＡＰ分析は２つの配列を少なくとも４５ヌクレオチドの領域にわたってアラインメントする。好ましくは、クエリー配列は少なくとも１００ヌクレオチド長であり、ＧＡＰ分析は少なくとも１００ヌクレオチドの領域にわたって２つの配列をアラインメントする。最も好ましくは、２つの配列はその全長にわたってアラインメントされる。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの治療的または生物学的に活性の薬剤を含み、患者への投与に好適である任意の組成物を意味する。このような製剤のいずれも当技術分野で周知され容認されている方法によって調製することができる。例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．（２０００）を参照。
【０１４９】
「医薬的に許容される」という表現は、妥当な医学的評価の範囲内で、合理的な利益／リスク比に応じて、過度な毒性、刺激、アレルギー応答、及び／またはその他の問題もしくは合併症を伴うことなく、ヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適な化合物、材料、組成物、及び／または剤形を指すために本明細書で用いられる。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「治療する」または「治療」という用語は、療法的治療及び予防的または防止的な措置の両方を指し、その目的は、望ましくない生理学的変化または障害（例えば、血栓塞栓症（例えば、急性冠動脈症候群）の進行）を予防または緩徐化（軽減）することである。有益なまたは望ましい臨床的結果としては、以下に限定されないが、症状の軽減、疾患程度の減弱、疾患状態の安定化（すなわち、悪化していないこと）、疾患進行の遅延または緩徐化、疾患状態の改善または緩和、及び軽快（部分的または全体的）が挙げられ、検出可能なものも検出不可能なものも含まれる。「治療」は、治療を受けていない場合に予想される生存期間に比べて生存期間を延長することも意味する場合がある。治療が必要な者としては、状態もしくは障害を既に有する者、ならびに状態もしくは障害を有する傾向にある者、または状態もしくは障害を防止する必要がある者が挙げられる。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「予防」または「防止」とは、哺乳類、特にヒトにおける無症状の疾患状態に対する防止的治療を指し、臨床的疾患状態が発生する可能性を低減することを目的としている。患者は、一般集団に比べて臨床的疾患状態を患うリスクを増加させることが知られている因子に基づいて防止的療法が選択される。「予防」療法は、（ａ）一次防止及び（ｂ）二次防止に分類される。一次防止は、臨床的疾患状態をまだ提示していない対象における治療として定義され、他方二次防止は、同じまたは同様の臨床的疾患状態の二次発生を防止することとして定義される。
【０１５２】
「治療有効量」という用語は、ＰＡＲ４活性化の１つ以上の症状を、その障害において臨床的に特有なものとして観察及び容認されるレベル未満まで低減または阻害するためのＰＡＲ４結合タンパク質または抗体の十分な量を意味するように解釈するものとする。当業者は、このような量は特定の抗体、断片、及び／または特定の対象、及び／または重症度のタイプもしくは障害のレベルに応じて変動することを認識しているであろう。したがって、この用語は、本発明を特定の量に限定するように解釈されるべきではない。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「ＰＡＲ４アンタゴニスト療法」という用語は、ＰＡＲ４アンタゴニストによる対象の治療を意味する。
【０１５４】
「対象」とは、診断、予後判定、または療法が所望される任意の対象、特に哺乳類対象を意味する。本明細書に使用される場合、用語「対象」は任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳類及び非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、クマ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。本明細書で使用される場合、「ＰＡＲ４媒介状態または障害を有する対象」のような表現は、ＰＡＲ４アンタゴニストの投与から利益を受けるであろう対象、例えば、哺乳類対象を含む。
【０１５５】
本明細書で使用する場合、結合が「類似の」レベルであるという言及は、抗体が抗原に対し、別の抗原に結合するレベルの約３０％または２５％または２０％以内のレベルで結合することを意味するものと理解されたい。この用語は、ある抗体が抗原に対し、別の抗体が同じ抗原に結合するレベルの約３０％または２５％または２０％以内のレベルで結合することも意味する。
【０１５６】
本明細書で使用する場合、結合が「実質的に同じレベル」であるという言及は、抗体が抗原に対し、別の抗原に結合するレベルの約１５％または１０％または５％以内のレベルで結合することを意味するものと理解されたい。この用語は、ある抗体が抗原に対し、別の抗体が同じ抗原に結合するレベルの約５％または４％または３％以内のレベルで結合することも意味する。
【０１５７】
「競合的に阻害する」という用語は、本開示のタンパク質が、列挙された産生抗体（例えば、５Ａ．ＲＣ３）がＰＡＲ４またはその断片のトロンビン切断部位に結合するのを低減または防止することを意味するように理解するものとする。上記のことから、当該タンパク質は抗体の結合を完全に阻害する必要はなく、むしろ結合を統計的に有意な量で、例えば、少なくとも約１０％、または２０％、または３０％、または４０％、または５０％、または６０％、または７０％、または８０％、または９０％、または９５％低減すれば十分であることが明らかであろう。結合の競合的阻害を測定するための方法は当技術分野で知られており、及び／または本明細書に記載されている。例えば、抗体は、タンパク質の存在下または不在下のいずれかで、ＰＡＲ４またはその断片に対し露出される。抗体の結合が、タンパク質の不在下よりもタンパク質の存在下で少ない場合、そのタンパク質は抗体の結合を競合的に阻害するものと考えられる。１つの例において、タンパク質及び抗体は、実質的に同時にＰＡＲ４に対し露出される。結合の競合的阻害を測定するためのさらなる方法は、当業者には明らかであり、及び／または本明細書に記載されている。１つの例において、タンパク質の抗原結合ドメインは、抗体の結合を競合的に阻害する。
【０１５８】
２つのエピトープの文脈での「重複」とは、２つのエピトープが十分な数のアミノ酸残基を共有し、それにより一方のエピトープに結合する抗体が他方のエピトープに結合する抗体の結合を競合的に阻害することが可能になることを意味するように解釈するものとする。例えば、エピトープは、少なくとも１個、または２個、または３個、または４個、または５個、または６個、または７個、または８個、または９個、または１０個のアミノ酸を共有する。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、「検出可能に結合しない」という用語は、タンパク質（例えば、抗体）が候補抗原に対し、バックグラウンドの１０％未満、または８％未満、または６％未満、または５％未満上回るレベルで結合することを意味するように理解するものとする。バックグラウンドは、タンパク質の不在下及び／または陰性対照タンパク質（例えば、アイソタイプ対照抗体）の存在下で検出される結合シグナルのレベル、及び／または陰性対照抗原の存在下で検出される結合のレベルであり得る。結合のレベルは、バイオセンサー分析（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて、タンパク質を固定し抗原に接触させて検出される。
【０１６０】
抗体
誤解を避けるために言及するが、モノクローナル抗体ｍＡｂ  ＡＲＣ３は、実施例に示されるようなこの抗体の他の名称、例えばＭｏＢ５Ａ−ＲＣ３と同義である。この抗体をさらにサブクローニングして、派生モノクローナル抗体ＭｏＢ５−ＡＲＣ３．Ｆ１０ｂ．Ｈ４ｂとしている。このサブクローンもｍＡｂ  ＡＲＣ３．Ｈ４ｂと呼ばれる。この抗体に対応する配列は、配列番号１１〜１８に見いだされる。
【０１６１】
機能的に等価の抗体
本開示は、抗体ｍＡｂ  ＡＲＣ３．Ｈ４ｂの重鎖及び軽鎖可変領域配列における１つ以上のアミノ酸付加、欠失、または置換を伴い、ただしｍＡｂ  ＡＲＣ３．Ｈ４ｂの機能を依然として保持する抗ＰＡＲ４抗体またはその抗原結合断片も企図している。いくつかの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、１０以下の保存的アミノ酸置換、例えば、９、または８、または７、または６、または５、または４、または３、または２、または１個の保存的アミノ酸置換を含む。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖及び／または疎水性親水性及び／または親水性を有するアミノ酸残基で置き換えられた置換である。疎水性親水性指標は、例えばＫｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）に記載されており、親水性指標は、例えばＵＳ４５５４１０１に記載されている。
【０１６２】
このような修飾は、例えば、部位特異的変異誘発を通じて、計画的であってもよく、または、例えば、抗体を発現する宿主内の変異を通じて取得される修飾のように、偶発的であってもよい。
【０１６３】
変異（改変）ポリペプチドは、当技術分野で知られている任意の技法を用いて調製することができる。例えば、本開示のポリヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発に供してもよい。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ変異誘発技法は、ポリヌクレオチドを好適なベクター内でサブクローニングすることと、ベクターを「変異誘発」株、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ−１  ｒｅｄ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）内で形質転換することと、形質転換された細菌を好適な世代数増殖させることとを含む。変異／改変ＤＮＡに由来する産物は、本明細書に記載の技法を用いて容易にスクリーニングして、受容体結合及び／または阻害活性を有するかを決定することができる。
【０１６４】
アミノ酸配列変異体を設計する際、変異部位の位置及び変異の性質は、修飾される特徴（複数可）に依存する。変異のための部位は、例えば、（１）最初に保存的アミノ酸選択物で置換し、次いで達成される結果に応じてより根本的な選択物で置換する、（２）標的残基を欠失させる、または（３）配置された部位に隣接して他の残基を挿入することにより、個別にまたは連続して修飾することができる。
【０１６５】
アミノ酸配列欠失の範囲は、概して、残基約１〜１５個、より好ましくは残基約１〜１０個、典型的には連続した残基約１〜５個である。
【０１６６】
置換変異体は、可変領域を含めた抗体内及び／または免疫グロブリン鎖分子内の少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入される。置換変異誘発における最も関心対象となる部位は、抗原結合に重要であると同定された部位を含む。このような部位、特に、ヒト抗体及び／または免疫グロブリン鎖の少なくとも３つの他の等しく保存された部位の配列内に収まる部位は、好ましくは比較的保存的な方式で置換される。このような保存的置換は、「例示的な置換」という表題で表１に示される。
【０１６７】
保存的アミノ酸置換も本発明で企図されている。このような置換は、以下の表に示されるアミノ酸置換を意味するものと解釈される。
【０１６８】
【表１】
2020533022.tif 000006
【０１６９】
本明細書に記載のアミノ酸は、好ましくは「Ｌ」異性体形態をとる。ただし、免疫グロブリン結合の所望の機能的特性がポリペプチドによって保持される限り、Ｄ異性体内の残基が任意のＬ−アミノ酸残基に対し置換されてもよい。修飾には、構造的及び機能的アナログ、例えば、合成もしくは非天然アミノ酸またはアミノ酸アナログ及び誘導体化形態を有するペプチド模倣体も含まれる。
【０１７０】
本開示は、非保存的アミノ酸変化も企図している。例えば、特に関心対象となるのは、荷電アミノ酸を別の荷電アミノ酸及び中性または正に荷電したアミノ酸で置換することである。いくつかの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、１０個以下、例えば、９個、または８個、または７個、または６個、または５個、または４個、または３個、または２個、または１個の非保存的アミノ酸置換を含む。
【０１７１】
任意の例に従う本明細書に記載のＰＡＲ４結合タンパク質の変異形態は、ＰＡＲ４に対し特異的に結合する能力を保持する。ＰＡＲ４への特異的結合を測定するための方法は、本明細書に記載されている。例えば、標識ＰＡＲ４結合タンパク質を、固定化ＰＡＲ４、または（例えば、配列番号２に示されるような）ＰＡＲ４のトロンビン切断部位を含むペプチドに接触させる。洗浄後、結合した標識を検出する。また、標識ＰＡＲ４結合タンパク質を、固定したＰＡＲ４及び関連タンパク質または上記で論じられているようなＰＡＲ４の変異形態もしくはＰＡＲ４の断片にも接触させ、洗浄後、結合した標識を検出する。ＰＡＲ４に結合するが、ＰＡＲ４の関連（例えば、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、またはＰＡＲ３）もしくは変異タンパク質または断片には結合しない標識が検出された場合、これは、その変異ＰＡＲ４結合タンパク質がＰＡＲ４に対する特異的結合能力を保持することを示す。
【０１７２】
１つの例において、変異（複数可）は、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質のＦＷＲ内で生じる。別の例において、変異（複数可）は、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質のＣＤＲ内で生じる。
【０１７３】
抗体生成
抗体を生成するための方法は当技術分野で知られており、及び／またはＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）またはＺｏｌａ（１９８７）に記載されている。概して、このような方法では、任意選択で任意の好適なまたは所望の担体、アジュバント、または医薬的に許容される賦形剤と共に製剤化されたＦｎｌ４タンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープ含有、またはそれを発現し示す細胞（すなわち、免疫原）が、非ヒト動物に、例えば、マウス、ニワトリ、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ウマ、ウシ、ヤギ、またはブタに投与される。免疫原は、鼻腔内、筋肉内、皮下、静脈内、皮内、腹腔内、または他の既知の経路により投与することができる。
【０１７４】
ポリクローナル抗体の産生は、免疫動物の血液を免疫化後の様々な時点で試料採取することにより、モニターすることができる。所望の抗体力価を達成するために必要な場合は、１回以上さらに免疫化してもよい。追加免疫及び力価測定のプロセスは、好適な力価が達成されるまで繰り返される。所望のレベルの免疫原性が得られた場合は、免疫動物から採血し、血清を単離及び保管し、及び／または動物をモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の生成に使用する。
【０１７５】
モノクローナル抗体は、本開示が企図する例示的な抗体である。「モノクローナル抗体」または「ｍＡｂ」または「ＭＡｂ」という用語は、同じ抗原（複数可）に対し、例えば、抗原内の同じエピトープに対し結合可能である均質な抗体集団を指す。この用語は、抗体の供給源または抗体を作製する方式に対し限定されるようには意図されていない。
【０１７６】
ｍＡｂの産生については、複数の既知技法のいずれか１つを使用することができ、例えば、ＵＳ４，１９６，２６５、またはＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、またはＺｏｌａ（１９８７）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓで例示される手順を使用することができる。
【０１７７】
例えば、好適な動物は、抗体産生細胞を刺激するのに十分な条件下で、タンパク質またはその免疫原性断片もしくはエピトープまたはタンパク質を発現する細胞の有効量で免疫化される。ウサギ、マウス、及びラットのようなげっ歯類は例示的な動物であり、マウスが最も一般的に使用されている。ヒト免疫グロブリンタンパク質を発現し、ネズミ科動物免疫グロブリンタンパク質を発現しないように遺伝子操作されたマウスも、（例えば、ＷＯ２００２／０６６６３０に記載のようにして）本開示の抗体を生成するために使用することができる。
【０１７８】
免疫化後、抗体を産生する潜在能力を有する体細胞、特にＢリンパ球（Ｂ細胞）が、ｍＡｂ生成プロトコルで使用するために選択される。このような細胞は、脾臓、扁桃腺、もしくはリンパ節の生検から、または末梢血試料から取得することができる。免疫動物からのＢ細胞は、次いで、不死化骨髄腫細胞の細胞と融合させる。この骨髄腫細胞は、概して、免疫原で免疫化した動物と同じ種に由来する。Ｂ細胞及び不死化細胞は、細胞膜の融合を促進する１つまたは複数の薬剤（化学的または電気的）の存在下で複数の細胞タイプの混合物をインキュベートすることによって融合される。センダイウイルスを用いた融合方法は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７５）；及びＫｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，（１９７６）に記載されている。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（例えば、３７％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ）を用いた方法は、Ｇｅｆｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９７７）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．３（２）：２３１−６に記載されている。電気的誘導による融合方法を使用することも適切である。
【０１７９】
ハイブリッドは、組織培地中のヌクレオチドの新規合成をブロックする薬剤を含む選択培地中で培養することによって増幅される。例示的な薬剤は、アミノプテリン、メトトレキセート、及びアザセリンである。
【０１８０】
増幅したハイブリドーマは、例えば、フローサイトメトリー及び／または免疫組織化学検査及び／または免疫測定法（例えば、放射性免疫測定法、酵素免疫測定法、細胞毒性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫測定法など）により、抗体特異性及び／または力価についての機能的選択に供される。本開示は、例えば、本明細書で例示されるような、抗体産生細胞のサブクローニングも企図している。
【０１８１】
代替的に、ＡＢＬ−ＭＹＣ技術（ＮｅｏＣｌｏｎｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ  ５３７１３，ＵＳＡ）を使用して、（例えば、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ，（１９９９）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．６５（３）：１５３−９に記載のような）ｍＡｂを分泌する細胞株を産生する。
【０１８２】
また、抗体は、ディスプレイライブラリーにより、例えば、ファージディスプレイライブラリー、例えば、ＵＳ６３０００６４、ＥＰ０３６８６８４、及び／またはＵＳ５８８５７９３に記載のようなものにより、産生または単離することもできる。
【０１８３】
キメラ抗体及びタンパク質
本開示の抗体またはＰＡＲ４結合タンパク質の１つの例はキメラ抗体である。すなわち、ＰＡＲ４結合タンパク質はキメラタンパク質である。「キメラタンパク質」という用語は、抗原結合ドメインＶＨまたはＶＬが、特定の種（例えば、マウスもしくはラットのようなネズミ科動物）に由来するタンパク質内、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属するタンパク質内の対応する配列と同一または相同である一方で、鎖（複数可）の残部が、別の種（例えば、ヒトのような霊長類）に由来するタンパク質内、または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属するタンパク質内の対応する配列と同一または相同である、タンパク質を指す。１つの例において、キメラタンパク質は、非ヒト抗体（例えば、ネズミ科動物抗体）からのＶＨ及びＶＬを含むキメラ抗体であり、抗体の残りの領域はヒト抗体からのものである。このようなキメラタンパク質の産生は当技術分野で知られており、標準的な手段（例えば、ＵＳ６３３１４１５；ＵＳ５８０７７１５；ＵＳ４８１６５６７；及びＵＳ４８１６３９７に記載のもの）によって達成することができる。このようなキメラ抗体の産生は当技術分野で知られており、標準的な手段（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２（１９８５）；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４（１９８６）；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ，（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １２５：１９１−２０２；米国特許第５，８０７，７１５号；第４，８１６，５６７号；及び第４，８１６，３９７号に記載のもの）によって達成することができる。さらに、本発明のキメラ抗体のヒト定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６、ＩｇＧ７、ＩｇＧ８、ＩｇＧ９、ＩｇＧｌ０、ＩｇＧ１１、ＩｇＧ１２、ＩｇＧ１３、ＩｇＧ１４、ＩｇＧ１５、ＩｇＧ１６、ＩｇＧ１７、ＩｇＧ１８、またはＩｇＧ１９定常領域から選択され得ることが企図されている。
【０１８４】
ヒト化及びヒト抗体／タンパク質
本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、ヒト化またはヒトであり得る。
【０１８５】
「ヒト化タンパク質」という用語は、非ヒト種からの抗体からのヒト類似可変領域（ＣＤＲを含む）がヒト抗体からのＦＲ内に移植または挿入されたものを含むタンパク質を指すように理解するものとする（このタイプの抗体は、「ＣＤＲ移植抗体」とも呼ばれる）。ヒト化タンパク質には、ヒトタンパク質の１つ以上の残基が１つ以上のアミノ酸置換によって修飾されている、及び／またはヒトタンパク質の１つ以上のＦＲ残基が対応する非ヒト残基によって置き換えられている、タンパク質も含まれる。また、ヒト化タンパク質は、ヒト抗体または非ヒト抗体のいずれにも見いだされない残基を含んでもよい。タンパク質の任意のさらなる領域（例えば、Ｆｃ領域）はヒトである。ヒト化は、当技術分野で知られている方法、例えば、ＵＳ５２２５５３９、ＵＳ６０５４２９７、ＵＳ７５６６７７１、またはＵＳ５５８５０８９を用いて実施することができる。「ヒト化タンパク質」という用語は、例えば、ＵＳ７７３２５７８に記載のスーパーヒト化タンパク質も包含する。
【０１８６】
１つの例において、ヒト化タンパク質は、本明細書で開示されている重鎖配列内の２６と３３との間、５１と５８との間、及び９７と１１０との間、ならびに２７と３３との間、５１と５３との間、及び９０と９７との間の領域を含む（ナンバリングはＩＭＧＴナンバリングシステムに従う）。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、「ヒトタンパク質」という用語は、可変抗体領域と、任意選択で、ヒトに（例えば、ヒトの生殖系細胞または体細胞に）見いだされる配列に由来するまたは対応する定常抗体領域とを有するタンパク質を指す。「ヒト」抗体は、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基、例えば、ランダムまたは部位特異的変異によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで導入される変異（詳細には、タンパク質の少数の残基、例えば、タンパク質の１、２、３、４、または５個の残基の保存的置換または変異を伴う変異）を含むことができる。このような「ヒト抗体」は、実際にはヒト免疫応答の結果として生成される必要はなく、そうではなく、組換え手段（例えば、ファージディスプレイライブラリーのスクリーニング）を用いて、及び／またはヒト抗体定常及び／または可変領域をコードする核酸を含むトランスジェニック動物（例えば、マウス）により、及び／または（例えば、ＵＳ５５６５３３２に記載のように）誘導性選択（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を用いて、生成することができる。この用語は、このような抗体の親和性成熟形態も包含する。また、ヒトタンパク質には、ヒト抗体からのＦＲを含むタンパク質、またはヒトＦＲのコンセンサス配列からの配列を含むＦＲであって、ＵＳ６３０００６４及び／またはＵＳ６２４８５１６に記載のように１つ以上のＣＤＲがランダムまたはセミランダムである、ＦＲを含むタンパク質が含まれることも考慮されるであろう。
【０１８８】
選択されたエピトープを認識するヒトタンパク質または抗体は、「誘導性選択」と呼ばれる技法を用いて生成することもできる。このアプローチでは、選択された非ヒトモノクローナル抗体（例えば、マウス抗体）を使用して、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を誘導する（Ｊｅｓｐｅｒｓ  ＬＳ  ｅｔ  ａｌ，（１９８８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２（９）：８９９−９０３）。
【０１８９】
本開示のヒトＰＡＲ４結合タンパク質は、ヒト抗体の可変領域を含む。
【０１９０】
合成ヒト化及び霊長類化タンパク質
本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、合成ヒト化タンパク質であってもよい。「合成ヒト化タンパク質」という用語は、ＷＯ２００７／０１９６２０に記載の方法により調製されるタンパク質を指す。合成ヒト化ＰＡＲ４結合タンパク質は、可変領域が新世界霊長類抗体可変領域からのＦＲと非新世界霊長類抗体可変領域からのＣＤＲとを含む、抗体の可変領域を含む。例えば、合成ヒト化ＰＡＲ４結合タンパク質は、可変領域が新世界霊長類抗体可変領域からのＦＷＲとマウス抗体からのＣＤＲ（例えば、本明細書に記載のもの）とを含む、抗体の可変領域を含む。１つの例において、合成ヒト化ＰＡＲ４結合タンパク質は、可変領域の一方または両方が合成ヒト化されているＰＡＲ４結合抗体である。
【０１９１】
本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、霊長類化タンパク質であってもよい。「霊長類化タンパク質」は、非ヒト霊長類（例えば、マカク属カニクイザル）の免疫化の後に生成された抗体からの可変領域（複数可）を含む。任意選択で、非ヒト霊長類抗体の可変領域は、ヒト定常領域と連結して霊長類化抗体を産生する。霊長類化抗体を産生するための例示的な方法は、ＵＳ６１１３８９８に記載されている。
【０１９２】
脱免疫化抗体及びタンパク質
本開示は、脱免疫化された抗体またはＰＡＲ４結合タンパク質も企図している。脱免疫化抗体は、１つ以上のエピトープ、例えば、Ｂ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを除去する（すなわち、変異させる）ことにより、対象が抗体またはタンパク質に対する免疫応答を引き起こす可能性を低減する。脱免疫化抗体及びタンパク質を産生するための方法は当技術分野で知られており、例えば、ＷＯＯＯ／３４３１７、ＷＯ２００４／１０８１５８、及びＷＯ２００４／０６４７２４に記載されている。
【０１９３】
好適な変異を導入し、得られたタンパク質を発現させアッセイするための方法は、本明細書の記載に基づけば当業者には明らかであろう。
【０１９４】
タンパク質を含む抗体可変領域。
単一ドメイン抗体
いくつかの例において、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は単一ドメイン抗体である（この名称は、「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」という用語と互換的に使用される）。単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変領域の全てまたは部分を含む、単一のポリペプチド鎖である。あるいくつかの例において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、ＵＳ６２４８５１６；ＷＯ９０／０５１４４；及び／またはＷＯ２００４／０５８８２０を参照）。
【０１９５】
ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ
抗体抗原結合ドメインを含む例示的なＰＡＲ４結合タンパク質は、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、及びより高次のタンパク質複合体、例えばＷＯ９８／０４４００１及びＷＯ９４／００７９２１に記載のものである。
【０１９６】
例えば、ダイアボディは、２つの会合したポリペプチド鎖を含むタンパク質であり、各ポリペプチド鎖は構造ＶＬ−Ｘ−ＶＨまたはＶＨ−Ｘ−ＶＬを含む（構造中、ＶＬは抗体軽鎖可変領域であり、ＶＨは抗体重鎖可変領域であり、Ｘは、単一ポリペプチド鎖内のＶＨ及びＶＬが会合する（もしくはＦｖを形成する）ことを可能にするために不完全な残基を含むリンカーであるか、または存在せず、一方のポリペプチド鎖のＶＨは他方のポリペプチド鎖のＶＬに結合して、抗原結合部位を形成する、すなわち、１つ以上の抗原に対し特異的に結合可能なＦｖ分子を形成する）。ＶＬ及びＶＨは、各ポリペプチド鎖内で同じであってもよく、またはＶＬ及びＶＨは、二重特異的なダイアボディを形成する（すなわち、異なる特異性を有する２つのＦｖを含む）ように各ポリペプチド鎖内で異なっていてもよい。
【０１９７】
１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片
当業者は、ｓｃＦｖが単一ポリペプチド鎖内にＶＨ領域及びＶＬ領域を含むことを認識しているであろう。ポリペプチド鎖はさらに、ＶＨとＶＬとの間に、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい（すなわち、単一ポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬが互いに会合してＦｖを形成するのに望ましい）構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを含む。例えば、リンカーは、ｓｃＦｖに対しより好ましいリンカーの１つである（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３と共に１２個超のアミノ酸残基を含む。
【０１９８】
本開示は、単一のシステイン残基がＶＨのＦＲまたはＶＬのＦＲに導入され、システイン残基がジスルフィド結合により連結して安定したＦｖをもたらす、ジスルフィド安定化Ｆｖ（またはｄｉＦｖもしくはｄｓＦｖ）も企図している（例えば、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ｅｔ  ａｔ，（１９９３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０：５４７−５５１を参照）。
【０１９９】
代替的または追加的に、本開示は、２量体ｓｃＦｖ、すなわち、非共有または共有結合により、例えばロイシンジッパードメイン（例えば、ＦｏｓまたはＪｕｎ由来）により連結した２つのｓｃＦｖ分子を含むタンパク質を提供する（例えば、Ｋｒｕｉｆ  ａｎｄ  Ｌｏｇｔｅｎｂｅｒｇ，１９９６を参照）。代替的に、２つのｓｃＦｖは、例えば、ＵＳ２００６０２６３３６７に記載のように、両方のｓｃＦｖの形成及び抗原への結合を可能にするのに十分な長さのペプチドリンカーによって連結している。
【０２００】
ｓｃＦｖの概説については、Ａｈｍａｄ  ＺＡ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１２／９８０２５０を参照。
【０２０１】
ミニボディ
当業者は、ミニボディが、抗体の（ＣＨ２ドメイン及び／または（ＣＨ３ドメインと融合した抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメインを含むことを認識しているであろう。任意選択で、ミニボディはＶＨとＶＬとの間にヒンジ領域を含み、この立体構造はＦｌｅｘミニボディと呼ばれることもある。ミニボディは、ＣＨ１もＣＬも含まない。１つの例において、ＶＨドメイン及びＶＬドメインは、抗体のヒンジ領域及びＣＨ３ドメインと融合している。当該ミニボディの可変領域の少なくとも１つが、本開示の方式でＰＡＲ４に結合する。例示的なミニボディ及びその生成方法は、例えば、ＷＯ９４／０９８１７に記載されている。
【０２０２】
タンパク質を含むその他の抗体可変領域
本開示はＰＡＲ４結合タンパク質を含む他の可変領域も企図しており、例えば以下のものが挙げられる：
（ｉ）ＵＳ５，７３１，１６８に記載の「キー・アンド・ホール（ｋｅｙ  ａｎｄ  ｈｏｌｅ）」二重特異性タンパク質；
（ｉｉ）ヘテロ結合体タンパク質（例えば、ＵＳ４，６７６，９８０に記載のもの）；
（ｉｉｉ）化学的クロスリンカーを用いて産生したヘテロ結合体タンパク質（例えば、ＵＳ４，６７６，に記載のもの）；
（ｉｖ）Ｆａｂ′−ＳＨ断片（例えば、Ｓｈａｌａｂｙ（１９９２）ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １；１７５（１）：２１７−２５に記載のもの）；
（ｖ）１本鎖Ｆａｂ；または
（ｖｉ）Ｆａｂ３（例えば、ＥＰ１９９３０３０２８９４に記載のもの）。
【０２０３】
非抗体ベース抗原結合ドメイン含有タンパク質
免疫グロブリン及び免疫グロブリン断片
本開示の化合物の１つの例は、免疫グロブリンの可変領域を含むタンパク質であり、例えば、Ｔ細胞受容体または重鎖免疫グロブリン（例えば、ＩｇＮＡ、ラクダ科動物抗体）である。
【０２０４】
「免疫グロブリン」という用語は、免疫グロブリンドメインを含む任意の抗原結合タンパク質を含むように理解される。例示的な免疫グロブリンは抗体である。「免疫グロブリン」という用語が包含する追加のタンパク質としては、ドメイン抗体、ラクダ科動物抗体、及び軟骨魚類からの抗体（すなわち、免疫グロブリン新規抗原受容体（ＩｇＮＡＲ））が挙げられる。概して、ラクダ科動物抗体及びＩｇＮＡＲはＶＨを含むがＶＬが欠如しており、しばしば重鎖免疫グロブリンと呼ばれる。その他の「免疫グロブリン」にはＴ細胞受容体が含まれる。
【０２０５】
重鎖免疫グロブリン
重鎖免疫グロブリンは、重鎖を含むが軽鎖を含まない限りにおいて、多くの他の免疫グロブリン形態（例えば、抗体）と構造的に異なる。したがって、このような免疫グロブリンは「重鎖のみの抗体」とも呼ばれる。重鎖免疫グロブリンは、例えば、ラクダ科動物及び軟骨魚類（ＩｇＮＡＲとも呼ばれる）に見いだされる。
【０２０６】
天然の重鎖免疫グロブリン内に存在する可変領域は、従来的な４鎖抗体内に存在する重鎖可変領域（「ＶＨドメイン」と呼ばれる）及び従来的な４鎖抗体内内に存在する軽鎖可変領域（「ＶＬドメイン」と呼ばれる）から区別するため、概してラクダ科動物Ｉｇにおける「ＶＨＨドメイン」及びＩｇＮＡＲにおけるＶ−ＮＡＲと呼ばれる。
【０２０７】
重鎖免疫グロブリンは、関連する抗原に高親和性及び高特異性で結合するのに軽鎖の存在を要件としない。このことは、単一ドメイン結合断片が、容易に発現し、かつ概して安定し可溶性である重鎖免疫グロブリンに由来し得ることを意味する。ラクダ科動物からの重鎖免疫グロブリン及びその可変領域についての全般的な説明ならびにその産生及び／または単離及び／または使用のための方法は、とりわけ、以下の参考文献：ＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９７／４９８０５、及びＷＯ９７／４９８０５に見いだされる。
【０２０８】
軟骨魚類科動物からの重鎖免疫グロブリン及びその可変領域についての全般的な説明ならびにその産生及び／または単離及び／または使用のための方法は、とりわけ、ＷＯ２００５／１１８６２９に見いだされる。
【０２０９】
Ｖ様タンパク質
本開示のＰＡＲ４結合タンパク質の１つの例は、Ｔ細胞受容体である。Ｔ細胞受容体は２つのＶドメインを有し、これらは化合して、抗体のＦｖモジュールに類似した構造となる。Ｎｏｖｏｔｎｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：８６４６−８６５０，１９９１は、Ｔ細胞受容体の２つのＶドメイン（アルファ及びベータと称される）がどのように融合し１本鎖ポリペプチドとして発現し得るか、さらに、どのように表面残基を改変して抗体ｓｃＦｖに直接的に類似する疎水性を低減するかについて記載している。２つのＶ−アルファ及びＶ−ベータドメインを含む１本鎖Ｔ細胞受容体または多量体Ｔ細胞受容体の産生について記載しているその他の刊行物としては、ＷＯ１９９９／０４５１１０またはＷＯ２０１１／１０７５９５が挙げられる。
【０２１０】
抗原結合ドメインを含むその他の非抗体タンパク質としては、Ｖ様ドメインを有するタンパク質が挙げられ、これらは概して単量体である。このようなＶ様ドメインを含むタンパク質の例としては、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、及びＩＣＯＳが挙げられる。このようなＶ様ドメインを含むタンパク質のさらなる開示は、ＷＯ１９９９／０４５１１０に含まれている。
【０２１１】
アドネクチン
１つの例において、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質はアドネクチンである。
【０２１２】
アドネクチンは、ループ領域が抗原結合を付与するように改変されているヒトフィブロネクチンの第１０フィブロネクチンＩＩＩ型（１０Ｆｎ３）ドメインに基づいている。例えば、１０Ｆｎ３のβサンドイッチの一方の端部における３つのループは、アドネクチンが抗原を特異的に認識できるように操作することができる。さらなる詳細については、ＵＳ２００８０１３９７９１またはＷＯ２００５／０５６７６４を参照。
【０２１３】
アンチカリン
さらなる例において、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質はアンチカリンである。アンチカリンは、疎水性小分子（例えば、ステロイド、ビリン、レチノイド、及び脂質）を輸送する細胞外タンパク質のファミリーであるリポカリンに由来する。リポカリンは、円錐状構造の開放端部に複数のループを有する剛性のβシート二次構造を有し、このループは、抗原に結合するように操作することができる。このような操作されたリポカリンはアンチカリンとして知られている。アンチカリンのさらなる説明については、ＵＳ７２５０２９７Ｂ１またはＵＳ２００７０２２４６３３を参照。
【０２１４】
アフィボディ
さらなる例において、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質はアフィボディである。アフィボディは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓのプロテインＡのＺドメイン（抗原結合ドメイン）に由来するスキャフォールドであり、このＺドメインは抗原に結合するように操作することができる。Ｚドメインは、およそ５８アミノ酸の３本ヘリックス束からなる。ライブラリーは、表面残基のランダム化によって生成されている。さらなる詳細については、ＥＰ１６４１８１８を参照。
【０２１５】
アビマー
さらなる例において、本開示のＰＡＲ結合タンパク質はアビマーである。アビマーは、Ａドメインスキャフォールドファミリーに由来するマルチドメインタンパク質である。およそ３５アミノ酸のネイティブドメインは、定義されたジスルフィド結合構造をとる。多様性は、Ａドメインのファミリーにより示される天然の変形形態をシャッフルすることにより生成される。さらなる詳細については、ＷＯ２００２０８８１７１を参照。
【０２１６】
ＤＡＲＰｉｎ
さらなる例において、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）である。ＤＡＲＰｉｎは、複合膜タンパク質が細胞骨格に付着するのを媒介するタンパク質のファミリーであるアンキリンに由来する。単一のアンキリンリピートは、２つのａヘリックス及び１つのβターンからなる３３残基のモチーフである。ＤＡＲＰｉｎは、各リピートの第１のａヘリックス及びβターン内の残基をランダム化することにより、異なる標的抗原に結合するように操作することができる。モジュールの数を増加させることにより、ＤＡＲＰｉｎの結合界面を増加させることができる（親和性成熟法）。さらなる詳細については、ＵＳ２００４０１３２０２８を参照。
【０２１７】
その他の非抗体ポリペプチド
結合ドメインを含むその他の非抗体タンパク質としては、ヒトγクリスタリン及びヒトユビキチン（アフィリン）、ヒトプロテアーゼ阻害物質のクニッツ型ドメイン、Ｒａｓ結合タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺドメイン、サソリ毒（カリブドトキシン）、Ｃ型レクチンドメイン（テトラネクチン）に基づくものが挙げられる。
【０２１８】
定常領域
本開示は、可変領域及び定常領域またはそのドメイン（複数可）（例えば、ＣＨ２及び／またはＣＨ３）を含むＰＡＲ４結合タンパク質を包含する。当業者は、本明細書の開示及び本明細書で論じられている参考文献に基づき、定常領域及び定常ドメインという用語の意味を認識しているであろう。
【０２１９】
本開示のＰＡＲ４結合タンパク質の産生に有用な定常領域配列は、複数の異なる供給源から取得することができる。いくつかの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質の定常領域またはその部分は、ヒト抗体に由来する。さらに、定常ドメインまたはその部分は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＥを含めた任意の抗体クラス、ならびにＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含めた任意の抗体アイソタイプに由来し得る。１つの例において、ヒトアイソタイプＩｇＧｌが使用される。
【０２２０】
様々な定常領域遺伝子配列は、公的にアクセス可能な寄託物の形態で利用可能であり、またはその配列は、公的に利用可能なデータベースから利用可能である。定常領域は、特定のエフェクター機能を有するもの（もしくは特定のエフェクター機能が欠如したもの）、または免疫原性を低減するための特定の修飾を伴うものが選択され得る。
【０２２１】
１つの例において、本開示のタンパク質は、ＰＡＲ４を発現する細胞の少なくとも部分的な枯渇、実質的な枯渇、または消失を推進するまたは可能にするエフェクター機能を有するまたは示す。このようなエフェクター機能は、Ｆｃ受容体に対する結合親和性の強化、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞媒介食作用（ＡＤＣＰ）、及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）であり得る。
【０２２２】
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、エフェクター機能のレベル強化を誘導可能である。
【０２２３】
１つの例において、定常領域によって誘導されるエフェクター機能のレベルは、ＩｇＧ１抗体の野生型Ｆｃ領域との対比で、またはＩｇＧ３抗体の野生型Ｆｃ領域との対比で強化されている。
【０２２４】
別の例において、定常領域は、自らが誘導可能なエフェクター機能のレベルを、修飾を伴わない定常領域に比べて増加させるように修飾される。このような修飾は、アミノ酸レベル及び／または二次構造レベル及び／または三次構造レベルにおけるもの、及び／またはＦｃ領域のグリコシル化に対するものであり得る。
【０２２５】
当業者は、より大きなエフェクター機能が、複数のやり方で、例えば、より大きなレベルの効果として、より持続的な効果として、またはより高速な効果として明らかにされ得ることを理解するであろう。例示的な定常領域修飾としては、アミノ酸置換、例えば、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）、またはＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）が挙げられる。
【０２２６】
Ｆｃ領域のエフェクター機能誘導能力を増加させるさらなるアミノ酸置換は、当技術分野で知られており、及び／または例えば、ＵＳ６７３７０５６もしくはＵＳ７３１７０９１に記載されている。
【０２２７】
１つの例において、定常領域のグリコシル化は、エフェクター機能強化の誘導能力を増加させるように改変される。いくつかの例において、本開示に従うＦｃ領域は、Ｆｃ領域に（直接的または間接的に）付着するフコースが欠如した、すなわち、Ｆｃ領域が「非フコシル化」されている炭水化物構造を含む。このようなバリアントは、ＡＤＣＣ誘導能力が改良されている可能性がある。非フコシル化抗体を産生するための方法は、ａ−ｌ，６−フコシルトランスフェラーゼ（ＦＵＴ８）を発現できない細胞株内でＦｎｌ４結合タンパク質を発現させることを含む（例えば、Ｙｕｍａｎｅ−  Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｈ，２００４に記載の通り）。他の方法は、エフェクター機能強化を誘導可能な抗体を生来的に産生する細胞株の使用を含む（例えば、ウイルスワクチン産生のためのアヒル胚由来幹細胞（ＷＯ２００８／１２９０５８）；トリＥＢＸ（登録商標）細胞内での組換えタンパク質の産生（ＷＯ２００８／１４２１２４））。
【０２２８】
ＰＡＲ４結合タンパク質は、ＣＤＣのレベル強化を誘導可能なＦｃ領域も含むことができる。例えば、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３のハイブリッドは、ＣＤＣ活性が強化された抗体を産生する（Ｎａｔｓｕｍｅ  ｅｔ  ａｔ，２００８）。
【０２２９】
抗体またはその抗原結合断片のエフェクター機能誘導能力を測定するための方法は当技術分野で知られており、及び／または本明細書に記載されている。
【０２３０】
別の例において、タンパク質は、ＰＡＲ４結合タンパク質の半減期を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。例えば、ＰＡＲ４結合タンパク質は、新生児Ｆｃ領域（ＦｃＲｎ）に対する定常領域の親和性を増加させる１つ以上のアミノ酸置換を含む定常領域を含む。例えば、定常領域は、より低いｐＨ（例えば、約ｐＨ６．０）におけるＦｃＲｎに対する親和性が増加しており、エンドソーム内のＦｃ／ＦｃＲｎ結合を推進する。１つの例において、定常領域は、約ｐＨ６におけるＦｃＲｎに対する親和性が約ｐＨ７．４における親和性に比べて増加しており、これにより、細胞再利用後の血中へのＦｃ再放出が推進される。このようなアミノ酸置換は、血液からのクリアランスを低減することにより、タンパク質の半減期を延長するのに有用である。
【０２３１】
例示的なアミノ酸置換としては、Ｔ２５０Ｑ及び／またはＭ４２８ＬまたはＴ２５２Ａ、Ｔ２５４Ｓ及びＴ２６６ＦまたはＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ及びＴ２５６ＥまたはＨ４３３Ｋ及びＮ４３４Ｆが挙げられる。追加的または代替的なアミノ酸置換は、例えば、ＵＳ２００７０１３５６２０またはＵＳ７０８３７８４に記載されている。本開示の中和ＰＡＲ４結合タンパク質は、ＩｇＧ４定常領域または安定化ＩｇＧ４定常領域を含むことができる。「安定化ＩｇＧ４定常領域」という用語は、Ｆａｂアーム交換、またはＦａｂアーム交換もしくは半抗体の形成を経る傾向、または半抗体を形成する傾向を低減するように修飾されたＩｇＧ４定常領域を意味するものと理解されたい。「Ｆａｂアーム交換」とは、１つのＩｇＧ４重鎖及び付着している軽鎖（半分の分子）が別のＩｇＧ４分子からの重軽鎖対と交換される、ヒトＩｇＧ４におけるタンパク質修飾の１つのタイプを指す。したがって、ＩｇＧ４分子は、２つの異なる抗原を認識する２つの異なるＦａｂアームを獲得することができる（その結果、二重特異性分子がもたらされる）。Ｆａｂアーム交換はｉｎ  ｖｉｖｏで天然に生じ、また、精製された血液細胞または還元型グルタチオンのような還元剤によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導することができる。「半抗体」形態は、ＩｇＧ４抗体が解離して各々が単一の重鎖と単一の軽鎖とを含む２つの分子を形成したときに、形成される。
【０２３２】
１つの例において、安定化ＩｇＧ４定常領域は、Ｋａｂａｔシステムに従うヒンジ領域の位置２４１にプロリンを含む。この位置は、ＥＵナンバリングシステムに従うヒンジ領域の位置２２８に対応する。ヒトＩｇＧ４において、この残基は概してセリンである。セリンのプロリンに対する置換後、ＩｇＧ４ヒンジ領域は配列ＣＰＰＣを含む。この点において、当業者は、「ヒンジ領域」が、抗体の２つのＦａｂアームに移動性を付与する、Ｆｃ及びＦａｂ領域に連結する抗体重鎖定常領域のプロリンリッチ部分であることを認識するであろう。ヒンジ領域は、重鎖間のジスルフィド結合に関与するシステイン残基を含む。ヒンジ領域は、Ｋａｂａｔナンバリングシステムに従うヒトＩｇＧｌ１のＧｌｕ２２６からＰｒｏ２４３に伸びるものとして定義される。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成する最初及び最後のシステイン残基を同じ位置に入れることにより、ＩｇＧｌ１配列でアラインメントすることができる（例えば、ＷＯ２０１０／０８０５３８を参照）。
【０２３３】
修飾タンパク質
本開示は、本開示の配列に対し少なくとも８０％の同一性を有し、かつ本明細書で記載または特許請求されている機能的特徴と同じＰＡＲ４結合タンパク質を提供する。
【０２３４】
１つの例において、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、本明細書で開示されているＶＬ配列（例えば、配列番号１１）に対し、少なくとも９０％、または９１％、または９２％、または９３％、または９４％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
【０２３５】
別の例において、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、本明細書で開示されているＶＨ（例えば、配列番号１２）に対し、少なくとも９０％、または９１％、または９２％、または９３％、または９４％、または９５％、または９６％、または９７％、または９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。
【０２３６】
本開示は、前述のタンパク質をコードする核酸、または中〜高ストリンジェンシー条件下でその核酸とハイブリダイズする核酸も提供する。
【０２３７】
本開示は、遺伝暗号の縮重の結果、本明細書で例示される配列とは異なる、配列番号１１及び配列番号１２に示される配列を含むタンパク質をコードする核酸も包含する。
【０２３８】
核酸またはポリペプチドの同一性％はＧＡＰ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ．１９７０）分析（ＧＣＧプログラム）により測定され、ギャップ作成ペナルティー＝５及びギャップ延長ペナルティー＝０．３とする。クエリー配列は少なくとも５０残基長であり、ＧＡＰ分析は少なくとも５０残基の領域にわたって２つの配列をアラインメントする。例えば、クエリー配列は少なくとも１００残基長であり、ＧＡＰ分析は少なくとも１００残基の領域にわたって２つの配列をアラインメントする。１つの例において、２つの配列はその全長にわたってアラインメントされる。
【０２３９】
抗体のグリコシル化パターンは、参照抗体の元のグリコシル化パターンから改変されてもよい。改変とは、抗体に見いだされる１つ以上の炭水化物部分の欠失、及び／または抗体中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位の付加を意味する。抗体のグリコシル化は、典型的にはＮ結合またはＯ結合のいずれかである。Ｎ結合型とは、炭水化物部分のアスパラギン残基の側鎖に対する結合を指す。トリペプチド配列アスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン（配列中、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、炭水化物部分のアスパラギン側鎖に対する酵素結合の認識配列である。したがって、ポリペプチド内にこれらのトリペプチド配列のうちのいずれかが存在することにより、潜在的グリコシル化部位が創出される。Ｏ結合型グリコシル化とは、糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、またはキシロースのうちの１つと、ヒドロキシアミノ酸（最も一般的にはセリンまたはスレオニンであるが、５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒドロキシリジンも使用され得る）との結合を指す。抗体へのグリコシル化部位の付加は、好都合には、（Ｎ結合型グリコシル化部位のための）上述のトリペプチド配列を含有するようにアミノ酸配列を変更することによって遂行される。改変は、（Ｏ結合型グリコシル化部位のための）元の抗体の配列に１つ以上のセリンまたはスレオニン残基を付加するか、またはそれにより置換することによって行うこともできる。
【０２４０】
本発明の抗体の修飾グリコフォームは、以下に限定されないが、エフェクター機能の強化もしくは低減、及び／または抗体の半減期の修飾（例えば、ＷＯ／２００７／０１０４０１を参照）を含めた様々な目的に有用であり得る。このような改変は、Ｃ１ｑ結合及びＣＤＣの減少もしくは増加、またはＦｃγＲ結合及びＡＤＣＣの減少もしくは増加をもたらし得る。置換は、例えば、重鎖定常領域のアミノ酸残基の１つ以上で行われ得、それによりエフェクター機能の変化が生じ、その一方で修飾抗体に比べて抗原への結合能力が保持される（ＵＳ５，６２４，８２１及びＵＳ５，６４８，２６０を参照）。操作されたグリコフォームは、当業者に知られている任意の方法によって生成することができ、例えば、操作されたもしくはバリアント発現株の使用、１つ以上の酵素（例えば、β（ｌ，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩ  １））との共発現、様々な生物内もしくは様々な生物からの細胞株内での抗体もしくはその断片の発現、または抗体もしくは断片の発現後の炭水化物（複数可）の修飾によって生成することができる。操作されたグリコフォームを精製するための方法は当技術分野で知られており、以下のものが挙げられるが、これに限定されない：Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３４６６−３４７３）  Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，６０２，６８４；米国特許出願第１０／２７７，３７０号；米国特許出願第１０／１１３，９２９号；ＰＣＴ第ＷＯ００／６１７３９Ａ１号；ＰＣＴ第ＷＯ０１／２９２２４６Ａ１号；ＰＣＴ第ＷＯ０２／３１１１４０Ａｌ号；ＰＣＴ第ＷＯ０２／３０９５４Ａ１号；Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂ（商標）グリコシル化操作技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）。例えば、ＷＯ０００６１７３９；ＥＡ０１２２９１２５；ＵＳ２００３０１１５６１４；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９−４９を参照。
【０２４１】
本明細書の抗体のエフェクター機能に関する修飾は、例えば、抗体の抗原依存性細胞媒介細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び／または補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）を強化するために、望ましいと考えられる。これは、１つ以上のアミノ酸置換を抗体のＦｃ領域内に導入することによって達成することができる。代替的または追加的に、システイン残基（複数可）をＦｃ領域内に導入し、それによりこの領域内で鎖間ジスルフィド結合を形成できるようにしてもよい。このように生成されたホモ２量体抗体は、内部移行能力が改良され、及び／または補体媒介性細胞殺滅や抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）が増加し得る。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７６：１  １９１−１  １９５（１９９２）及びＳｈｏｐｅｓ，Ｂ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：２９１８−２９２２（１９９２）を参照。抗腫瘍活性が強化されたホモ二量体抗体は、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載のようなヘテロ二官能性架橋剤を用いて調製することもできる。代替的に、二重Ｆｃ領域を有することにより補体溶解能力及びＡＤＣＣ能力が強化されていると考えられる抗体を操作してもよい。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ３：２１９−２３０（１９８９）を参照。
【０２４２】
抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載のようなサルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に、抗体断片）内に組み込んでもよい。本明細書で使用される場合、「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）のｉｎ  ｖｉｖｏ血清半減期を増加させる役割を担うＩｇＧ分子のＦｃ領域のエピトープを意味する。Ｄ．代替的に、抗体半減期はペグ化によって増加させることができる。
【０２４３】
親和性成熟
さらなる例において、本開示の既存のＰＡＲ４結合タンパク質は、増加した親和性でＰＡＲ４に結合可能な抗体を産生するように親和性が成熟している。例えば、ＶＬ及び／またはＶＨをコードする配列を単離し、ＣＤＲコード領域（例えば、ＶＬ及び／またはＶＨのＣＤＲ３をコードする領域）を１つ以上のアミノ酸置換が導入されるように変異させる。次いで、得られた変異ＰＡＲ４結合タンパク質において、例えば競合的アッセイで、ＰＡＲ４に対する結合をスクリーニングする。
【０２４４】
本開示に従うＰＡＲ４結合タンパク質は、可溶性の分泌タンパク質であってもよく、細胞の表面上の融合タンパク質、または粒子（例えば、ファージもしくはその他のウイルス、リボソーム、または胞子）として提示されてもよい。例示的なファージディスプレイ法は、例えば、ＵＳ５８２１０４７；ＵＳ６２４８５１６；及びＵＳ６１９０９０８に記載されている。次いで、これらの方法を用いて産生したファージ表示粒子をスクリーニングして、標的抗原（例えば、ＰＡＲ４）に結合するのに十分な立体構造を有する、表示されたＰＡＲ４結合タンパク質を同定する。
【０２４５】
タンパク質産生
１つの例において、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、細胞株（例えば、本明細書に記載されている及び／または当技術分野で知られているように、例えば、当該タンパク質の産生に十分な条件下でのハイブリドーマ）を培養することにより産生される。
【０２４６】
組換え発現
組換えタンパク質の場合には、組換えタンパク質をコードする核酸を１つ以上の発現コンストラクト（例えば、発現ベクター（複数可））内に入れて、次いで宿主細胞（例えば、ジスルフィド架橋または結合をもたらし得る細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳類細胞）に形質移入する。例示的な哺乳類細胞としては、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または別の形で免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞が挙げられる。このような目的を達成するための分子クローニング技法は当技術分野で知られており、例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＳａｍｂｒｏｏｋに記載されている。幅広い種類のクローニング及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅の方法が組換え核酸の構築に好適である。組換え抗体を産生する方法も当技術分野で知られている。ＵＳ４８１６５６７、ＵＳ７９２３２２１、及びＵＳ７０２２５００を参照。
【０２４７】
本開示のタンパク質をコードする核酸は、単離した後、さらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のため、または無細胞系もしくは細胞内で発現させるために、発現コンストラクトまたは複製可能なベクター内に挿入する。例えば、核酸は、プロモーターに対し作用可能に連結している。本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、最も広い文脈で解釈するものとし、ゲノム遺伝子の転写制御配列（的確な転写開始に必要とされるＴＡＴＡボックスまたは開始エレメントを含む）を含み、例えば、発生及び／または外部刺激に応答してあるいは組織特異的方式で核酸の発現を改変する、追加の制御エレメント（例えば、上流活性化配列、転写因子結合部位、エンハンサー、及びサイレンサー）を伴う場合も伴わない場合もある。また、本発明の文脈において「プロモーター」という用語は、作用可能に連結した核酸の発現を付与、活性化、または強化する組換え、合成、もしくは融合の核酸、または誘導体を説明するためにも使用される。例示的なプロモーターは、当該核酸の発現をさらに強化するため及び／または空間的発現及び／または時間的発現を改変するための、１つ以上の特定の制御エレメントのさらなるコピーを含むことができる。
【０２４８】
本明細書で使用される場合、「〜に対し作用可能に連結した」という用語は、核酸の発現がプロモーターによってコントロールされるように、核酸に対するプロモーターの位置を定めることを意味する。
【０２４９】
無細胞発現系も本開示で企図されている。例えば、本開示のＦｎｌ４結合タンパク質をコードする核酸は、好適なプロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）に対し作用可能に連結しており、得られた発現コンストラクトは転写及び翻訳に十分な条件に曝露される。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現または無細胞発現のための典型的な発現ベクターが説明されており、このような発現ベクターとしては、以下に限定されないが、ＴＮＴ  Ｔ７及びＴ３  ＴＮＴシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｐＥＸＰｌ−ＤＥＳＴ及びｐＥＸＰ２−ＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が挙げられる。
【０２５０】
細胞内での発現向けには多くのベクターが利用可能である。概して、ベクター構成要素としては、以下のうちの１つ以上が挙げられるが、これに限定されない：シグナル配列、（例えば、本明細書で提供される情報に由来する）本開示のＦｎｌ４結合タンパク質をコードする配列、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列。当業者は、タンパク質の発現に好適な配列を認識しているであろう。例えば、例示的なシグナル配列としては、原核生物分泌シグナル（例えば、ｐｅｌＢ、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、もしくは熱安定性エンテロトキシンＩＩ）、酵母分泌シグナル（例えば、インベルターゼリーダー、因子リーダー、もしくは酸性ホスファターゼリーダー）、または哺乳類分泌シグナル（例えば、単純ヘルペスｇＤシグナル）が挙げられる。
【０２５１】
例示的なプロモーターとしては、原核生物内で活性のプロモーター（例えば、ｐｈｏＡプロモーター、β−ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系、ならびにハイブリッドプロモーター、例えば、ｔａｃプロモーター）が挙げられる。
【０２５２】
哺乳類細胞内で活性の例示的なプロモーターとしては、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（ＣＭＶ−ＩＥ）、ヒト伸長因子１−ｏｃプロモーター（ＥＦ１）、小核ＲＮＡプロモーター（Ｕｌａ及びＵｌｂ）、ｏｃ−ミオシン重鎖プロモーター、サルウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、ラウス肉腫ウイルスプロモーター（ＲＳＶ）、アデノウイルス主後期プロモーター、βアクチンプロモーター；ＣＭＶエンハンサー／βアクチンプロモーターもしくは免疫グロブリンプロモーターまたはその活性断片を含むハイブリッド制御エレメントが挙げられる。有用な哺乳類宿主細胞株の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＵＳＴＲＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞または懸濁培養下での成長のためにサブクローニングされた２９３細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＵＳＴＲＡＬＩＡＮ  ＣＥＬＬ  ＢＡＮＫ  ＣＣＬ  １０）；またはチャイニーズハムスター（ＣＨＯ）である。
【０２５３】
酵母細胞（例えば、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、及びＳ．ｐｏｍｂｅからなる群より選択される酵母細胞）内での発現に適した典型的なプロモーターとしては、以下に限定されないが、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ４プロモーター、ＣＵＰｌプロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ｎｍｔプロモーター、ＲＰＲ１プロモーター、またはＴＥＦ１プロモーターが挙げられる。
【０２５４】
単離された核酸分子またはこのような核酸分子を含む遺伝子コンストラクトを細胞内に導入するための手段は、当業者に知られている。所与の細胞に使用する技法は、好結果を収めている既知の技法に依存する。組換えＤＮＡを細胞内に導入するための手段としては、マイクロインジェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介の形質移入、例えば、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）及び／またはセルフェクチン（Ｇｉｂｃｏ，ＭＤ，ＵＳＡ）の使用によるリポソーム媒介の形質移入、ＰＥＧ媒介のＤＮＡ取込み、エレクトロポレーション、ウイルス形質導入（例えば、レンチウイルスを用いた形質導入）、ならびに微粒子衝撃（例えば、中でも、ＤＮＡコーティングされたタングステンまたは金の粒子（Ａｇｒａｃｅｔｕｓ  Ｉｎｃ．，ＷＩ，ＵＳＡ）の使用による微粒子衝撃）が挙げられる。
【０２５５】
本開示のＰＡＲ４結合タンパク質の産生に使用される宿主細胞は、使用する細胞タイプに応じて様々な培地で培養され得る。Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭ１−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ修飾イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）のような市販の培地は、哺乳類細胞の培養に好適である。本明細書で論じられる他の細胞タイプを培養するための培地は、当技術分野で知られている。
【０２５６】
タンパク質の単離
本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、単離することも精製することもできる。
【０２５７】
本開示のＰＡＲ４結合タンパク質を精製するための方法は、当技術分野で知られている、及び／または本明細書に記載されている。
【０２５８】
組換え技法を使用する場合、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、細胞内、ペリプラズム間隙内で産生させても、培地中に直接分泌させてもよい。タンパク質を細胞内で産生させる場合、第１のステップとして、微粒子状デブリである宿主細胞または溶解断片は、例えば、遠心分離または限外濾過により除去される。タンパク質を培地中に分泌させる場合、最初に、このような発現系からの上清を市販のタンパク質濃縮フィルター（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニット）を使用して濃縮する。タンパク質分解を阻害するためにＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害物質が前述のステップのうちのいずれかに含まれてもよく、外来性夾雑物の成長を防止するために抗生物質が含まれてもよい。
【０２５９】
細胞から調製されるタンパク質は、例えば、イオン交換、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、親和性クロマトグラフィー（例えば、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーもしくはプロテインＧクロマトグラフィー）、または前述のものの任意の組合せを用いて精製することができる。これらの方法は当技術分野で知られており、例えば、Ｗ０９９／５７１３４またはＺｏｌａ（１９９７）に記載されている。
【０２６０】
また、当業者は、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質が、精製または検出を推進するためのタグ、例えば、ポリヒスチジンタグ、例えば、ヘキサヒスチジンタグ、またはインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、またはサルウイルス５型（Ｖ５）タグ、またはＦＬＡＧタグ、またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグを含むように修飾され得ることも認識しているであろう。例えば、このタグはヘキサ−ｈｉｓタグである。得られたタンパク質は、次に当技術分野で知られている方法、例えば、親和性精製を用いて精製される。例えば、ヘキサ−ｈｉｓタグを含むタンパク質は、当該タンパク質を含む試料を、固体または半固体支持体上に固定したヘキサ−ｈｉｓタグと特異的に結合するニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）に接触させ、試料を洗浄して非結合タンパク質を除去し、次に結合タンパク質を溶離することにより、精製される。代替的または追加的に、タグに結合するリガンドまたは抗体は、親和性精製法で使用される。
【０２６１】
結合体
本開示は、任意の例に従う本明細書に記載のＰＡＲ４結合タンパク質の結合体も提供する。タンパク質が結合体化し得る化合物の例は、ラジオアイソトープ、検出可能な標識、治療化合物、コロイド、毒素、核酸、ペプチド、タンパク質、対象におけるタンパク質の半減期を増加させる化合物、及びこれらの混合物からなる群より選択される。例示的な治療剤としては、以下に限定されないが、抗血管新生剤、抗新血管形成剤及び／またはその他の血管形成剤、抗増殖剤、アポトーシス促進剤、化学療法剤、または治療核酸が挙げられる。毒素には、細胞に対し有害な（例えば、細胞を殺滅する）任意の薬剤が含まれる。当技術分野で知られている薬物のクラスについての記載、及びそれらの作用機序についてはＧｏｏｄｍａｎ  ｅｔ  ａｈ，（１９９０）を参照。免疫グロブリン−免疫毒素結合体の調製に適切なさらなる技法は、例えば、ＵＳ５１９４５９４に示されている。例示的な毒素としては、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉタンパク質、ジアンシンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害物質、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害物質、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンが挙げられる。例えば、Ｗ０９３／２１２３２を参照。
【０２６２】
１つの例において、任意の例に従う本明細書に記載のＰＡＲ４結合タンパク質は、別のタンパク質に、例えば、免疫修飾物質、または半減期延長タンパク質もしくはペプチド、または特に血清アルブミンに結合する他のタンパク質に結合または連結している。例示的な血清アルブミン結合ペプチドまたはタンパク質は、ＵＳ２００６０２２８３６４またはＵＳ２００８０２６０７５７に記載されている。
【０２６３】
別の例において、タンパク質は、細胞事前標的化で利用するために「受容体」（例えば、ストレプトアビジン）と結合体化させてもよく、この場合、結合体を患者に投与し、次いで除去剤を用いて非結合の結合体を血液循環から除去し、次いで治療剤（例えば、放射性ヌクレオチド）と複合体化した「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。
【０２６４】
本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、当技術分野で知られており容易に入手可能なさらなる非タンパク質部分を含むように修飾することができる。例えば、タンパク質の誘導体化に好適な部分は、生理学的に許容されるポリマー、例えば、水溶性ポリマーである。このようなポリマーは、安定性の増加及び／または（例えば、腎臓による）クリアランスの低減及び／または本開示のＦｎｌ４結合タンパク質の免疫原性の低減に有用である。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、以下に限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、またはプロプロピレン（ｐｒｏｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）グリコール（ＰＰＧ）が挙げられる。
【０２６５】
１つの例において、任意の例に従う本明細書に記載のＰＡＲ４結合タンパク質は、検出及び／または単離を推進するための１つ以上の検出可能なマーカーを含む。例えば、化合物は蛍光標識、例えば、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、５，６−カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾール−４−イル（ＮＢＤ）、クマリン、塩化ダンシル、ローダミン、４′−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ならびにシアニン色素Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、及びＣｙ７、フルオレセイン（５−カルボキシフルオセイン−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル）、ローダミン（５，６−テトラメチルローダミン）を含む。これらの蛍光物質における吸収及び発光の最大値は、それぞれ以下の通り：ＦＩＴＣ（４９０ｎｍ；５２０ｎｍ）、Ｃｙ３（５５４ｎｍ；５６８ｎｍ）、Ｃｙ３．５（５８１ｎｍ；５８８ｎｍ）、Ｃｙ５（６５２ｎｍ；６７２ｎｍ）、Ｃｙ５．５（６８２ｎｍ；７０３ｎｍ）、及びＣｙ７（７５５ｎｍ；７７８ｎｍ）。代替的または追加的に、任意の例に従う本明細書に記載のＦｎｌ４結合タンパク質は、例えば、蛍光半導体ナノ結晶（例えば、ＵＳ６，３０６，６１０に記載のようなもの）で標識される。
【０２６６】
代替的または追加的に、ＰＡＲ４結合タンパク質は、例えば、鉄、鋼、ニッケル、コバルト、希土類材料、ネオジム−鉄−ホウ素、二価鉄−クロム−コバルト、ニッケル−二価鉄、コバルト−白金、またはストロンチウムフェライトのような磁性または常磁性化合物で標識される。
【０２６７】
タンパク質の固定
１つの例において、ＰＡＲ４結合タンパク質は、固体マトリックスまたは半固体マトリックス上に固定される。「固定」という用語は、例えば、Ｗ０９９／５６１２６またはＷＯ０２／２６２９２に記載のような、タンパク質を特定のマトリックスに固定するための様々な方法及び技法を伴うものと理解されたい。例えば、固定は、タンパク質を安定化して、特に保管中または単一バッチ使用において、生物学的、化学的、または物理的な露出によってタンパク質の活性が低減または有害に修飾されないようにするのに役立ち得る。マトリックス上にタンパク質を固定するための様々な方法が当技術分野で知られており、このような方法としては、架橋、担体との結合、半透性マトリックス内での保持が挙げられる。例示的なマトリックスとしては、多孔質ゲル、酸化アルミニウム、ベントナイト、アガロース、デンプン、ナイロン、またはポリアクリルアミドが挙げられる。
【０２６８】
本開示の結合タンパク質の活性のアッセイ
結合アッセイ
このようなアッセイの１つの形態は、例えば、Ｓｃｏｐｅｓ（１９９４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇに記載のような抗原結合アッセイである。このような方法は、概して、ＰＡＲ４結合タンパク質を標識することと、当該タンパク質を固定した抗原またはその断片に、例えば、（例えば、配列番号６に示されるような）ビオチンと融合したＰＡＲ４の細胞外部分を含むタンパク質に接触させることとを伴う。洗浄して非特異的結合タンパク質を除去した後、標識の量、そして結果として結合タンパク質が検出される。当然ながら、ＰＡＲ４結合タンパク質を固定し抗原を標識することができる。パニング型アッセイも使用することができる。本明細書における実施例は、ＨＥＫ細胞の表面上に発現させることができるｆｌａｇタグ付きＰＡＲ４に基づいた結合アッセイを記載している。トロンビンの存在下でのＰＡＲ４結合タンパク質によるＰＡＲ４切断の阻害は、フローサイトメトリーによって測定することができる。
【０２６９】
本発明の、ＰＡＲ４抗体のエピトープに対する結合を競合的に阻害するＰＡＲ４結合タンパク質は、当技術分野で知られている従来的な競合結合アッセイ、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いてスクリーニング及び同定することができる。
【０２７０】
競合結合アッセイ
本開示の抗体（例えば、ｍＡｂ  ＡＲＣ３．Ｈ４ｂ）の結合を競合的に阻害するＰＡＲ４結合タンパク質を測定するためのアッセイは、当業者には明らかであろう。例えば、本開示の抗体を、検出可能な標識、例えば、蛍光標識または放射性標識と複合体化させる。次いで、標識抗体及び試験ＰＡＲ４結合タンパク質を混合し、抗体またはそのエピトープを含むペプチドのＦｃ領域と融合したＰＡＲ４またはその細胞外ドメインに接触させる。次いで、標識抗体のレベルを測定し、ＰＡＲ４結合タンパク質の不在下で標識抗体をＰＡＲ４またはＰＡＲ４−Ｆｃ領域またはそのエピトープを含むペプチドと接触させたときに測定したレベルと比較する。試験ＰＡＲ４結合タンパク質の存在下での標識抗体のレベルが、ＰＡＲ４結合タンパク質の不在下の場合に比べて低減する場合、そのＰＡＲ４結合タンパク質は抗体の結合を競合的に阻害する。
【０２７１】
任意選択で、試験ＰＡＲ４結合タンパク質を抗体とは異なる標識と複合体化させる。これにより、試験ＰＡＲ４結合タンパク質のタンパク質またはエピトープに対する結合のレベルを検出できるようになる。
【０２７２】
別の例において、試験ＰＡＲ４結合タンパク質をＰＡＲ４またはＰＡＲ４−Ｆｃ領域またはそのエピトープを含むペプチドに結合させ、その後にＰＡＲ４またはＰＡＲ４−Ｆｃ領域またはそのエピトープを含むペプチドを本明細書に記載の抗体に接触させる。ＰＡＲ４結合タンパク質の存在下での結合抗体の量が、ＰＡＲ４結合タンパク質の不在下の場合に比べて低減した場合、そのＰＡＲ４結合タンパク質が抗体のＰＡＲ４に対する結合を競合的に阻害することを示す。また、標識ＰＡＲ４結合タンパク質を用いて相互アッセイを実施することもでき、最初に抗体をＰＡＲ４またはＰＡＲ４−Ｆｃ領域またはそのエピトープを含むペプチドに結合させる。この場合には、抗体の存在下でのＰＡＲ４またはＰＡＲ４−Ｆｃ領域またはそのエピトープを含むペプチドに結合した標識ＰＡＲ４結合タンパク質の量が、抗体の非存在下の場合に比べて低減した場合、そのＰＡＲ４結合タンパク質が抗体のＰＡＲ４に対する結合を競合的に阻害することを示す。
【０２７３】
エピトープマッピングアッセイ
別の例において、本明細書に記載のＰＡＲ４結合タンパク質が結合するエピトープがマッピングされている。エピトープマッピングの方法は、当業者には明らかであろう。例えば、目的エピトープを含むＰＡＲ４配列またはその領域にまたがる一連の重複ペプチド、例えば１０〜１５アミノ酸を含むペプチドが産生される。次いで、ＰＡＲ４結合タンパク質を各ペプチドまたはその組合せに接触させ、当該タンパク質が結合するペプチド（複数可）を決定する。これにより、ＰＡＲ４結合タンパク質が結合するエピトープを含むペプチド（複数可）を決定することができる。ＰＡＲ４結合タンパク質が複数の非連続ペプチドに結合する場合、ＰＡＲ４結合タンパク質は立体構造的エピトープに結合する可能性がある。
【０２７４】
１つの例において、ＰＡＲ４のランダムな断片をファージの表面に発現させ、ファージをＰＡＲ４結合タンパク質に接触させる。次いで抗体が結合したファージを単離し、ファージ内に含まれるコード核酸により、発現したペプチドのアミノ酸配列を推定することができる。重複ペプチドを有する一連のファージを単離することにより、エピトープに含まれる残基を含むＰＡＲ４の領域を含むペプチドが同定される。
【０２７５】
代替的または追加的に、ＰＡＲ４内のアミノ酸残基を、例えば、アラニンスキャニング変異誘発によって変異させ、ＰＡＲ４結合タンパク質の結合を低減または防止する変異を決定する。ＰＡＲ４結合タンパク質の結合を低減または防止する任意の変異は、ＰＡＲ４結合タンパク質が結合するエピトープ内に存在する可能性がある。
【０２７６】
さらなる方法は、ＰＡＲ４またはその領域を、固定した本開示のＰＡＲ４結合タンパク質に結合させることと、得られた複合体をプロテアーゼで消化させることとを伴う。次いで、固定したＰＡＲ４結合タンパク質に結合したままのペプチドを単離し、例えば質量分析を用いて分析してペプチドの配列を決定する。
【０２７７】
さらなる方法は、ＰＡＲ４またはその領域内の水素を重水素核（ｄｅｕｔｒｏｎ）に変換し、得られたタンパク質を、固定した本開示のＰＡＲ４結合タンパク質に結合させる。次いで、重水素核を変換して水素に戻し、ＰＡＲ４またはその領域を単離し、酵素で消化させ、例えば質量分析を用いて分析して、重水素核を含む領域を同定する。このような領域は、本明細書に記載のＰＡＲ４結合タンパク質の結合により、水素への変換から保護されているものと考えられる。
【０２７８】
上記段落では、ＰＡＲ４に対する言及は、組換えＰＡＲ４及びその細胞外ドメインを包含する。
【０２７９】
親和性アッセイ
任意選択で、ＰＡＲ４またはそのエピトープ含有ペプチドに対するＰＡＲ４結合タンパク質の解離定数（Ｋｄ）または会合定数（Ｋａ）または結合定数（ＫＤ、すなわち、Ｋａ／Ｋｄ）が測定される。ＰＡＲ４結合タンパク質に対するこれらの定数は、放射標識または蛍光標識ＰＡＲ４結合アッセイにより測定される１つの例である。このアッセイは、滴定系列の非標識ＰＡＲ４の存在下、最小濃度の標識ＰＡＲ４でＰＡＲ４結合タンパク質を平衡化する。結合していないＰＡＲ４を除去するために洗浄した後、標識の量を測定する。別の例に従えば、係数は、表面プラズモン共鳴アッセイを使用することにより、例えば、固定したＰＡＲ４またはその領域と共にＢＩＡｃｏｒｅ表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を使用することにより、測定される。
【０２８０】
タンパク質検出アッセイ
本開示の１つの例は、ＰＡＲ４またはＰＡＲ４を発現する細胞（例えば、血小板）の存在を検出する。タンパク質または細胞の量、レベル、または存在は、当業者に知られている様々な技法のいずれかを用いて、例えば、フローサイトメトリー、免疫組織化学検査、免疫蛍光法、免疫ブロット、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、タンデム質量分析（質量分析、ＬＣ  ＭＳ／ＭＳを含む）、バイオセンサー技術、エバネッセント光ファイバー技術、またはプロテインチップ技術からなる群より選択される技法を用いて測定される。
【０２８１】
１つの例において、タンパク質の量またはレベルの測定に使用されるアッセイは半定量的アッセイである。別の例において、タンパク質の量またはレベルの測定に使用されるアッセイは定量的アッセイである。
【０２８２】
例えば、タンパク質は、免疫測定法により、例えば、免疫組織化学検査、免疫蛍光法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、、蛍光結合免疫吸着測定法（ＦＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、放射性免疫測定法（ＲＩＡ）、バイオセンサーアッセイ、プロテインチップアッセイ、免疫染色アッセイ（例えば、免疫蛍光法）からなる群より選択されるアッセイを用いて検出される。
【０２８３】
標準的な固相ＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡ形式は、様々な試料からタンパク質の濃度を測定する上で特に有用である。
【０２８４】
１つの形態において、ＥＬＩＳＡまたはＦＬＩＳＡは、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質またはＰＡＲ４の異なるエピトープに結合するタンパク質を固体マトリックス上に、例えば、膜、ポリスチレンもしくはポリカーボネートマイクロウェル、ポリスチレンもしくはポリカーボネートディップスティック、またはガラス支持体上に固定することを含む。次いで、試料を固定したタンパク質との物理的関係に供し、ＰＡＲ４は結合または「捕捉」される。次いで、結合したＰＡＲ４は、ＰＡＲ４の異なるエピトープに結合する第２の標識化合物を用いて検出される。代替的に、第２の（検出）抗体に結合する第３の標識抗体を使用してもよい。本明細書に記載のアッセイ形式が高スループット形式、例えば、スクリーニングプロセスの自動化またはマイクロアレイ形式を適用可能であることは、当業者には明らかであろう。さらに、上述のアッセイのバリエーション、例えば、競合的ＥＬＩＳＡなども当業者には明らかであろう。
【０２８５】
代替的な例において、ポリペプチドは、当技術分野で知られている方法、例えば、免疫組織化学検査または免疫蛍光法を用いて、細胞内または細胞上で検出される。免疫蛍光法を用いた方法は、定量的または少なくとも半定量的であるため、例示的である。染色された細胞の蛍光の程度を定量化する方法は当技術分野で知られており、例えば、Ｃｕｅｌｌｏ（１９８４）に記載されている。
【０２８６】
バイオセンサーデバイスは、概して、電流またはインピーダンス測定要素と組み合わせた電極表面を用いて、（例えば、ＵＳ５５６７３０１に記載のような）アッセイ基質と組み合わせてデバイスに一体化される。本開示のＰＡＲ４結合タンパク質はバイオセンサーデバイスの表面上に組み込まれ、生物学的試料は当該デバイスに接触される。バイオセンサーデバイスに検出された電流またはインピーダンスの変化は、当該ＰＡＲ４結合タンパク質に対するタンパク質結合を示す。当技術分野で知られているバイオセンサーのいくつかの形態は、タンパク質相互作用を検出するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）にも依存しており、表面プラズモン共鳴表面における反射の変化は、リガンドまたは抗体に結合するタンパク質を示す（ＵＳ５４８５２７７及びＵＳ５４９２８４０）。
【０２８７】
バイオセンサーは、このようなシステムをマイクロまたはナノスケールに適合させることが容易であるため、高スループット分析で特に使用される。さらに、このようなシステムはいくつかの検出試薬を組み込むように好都合に適合され、単一バイオセンサーユニットにおける診断試薬の多重化が可能になる。これにより、少量の体液中でいくつかのタンパク質またはペプチドを同時に検出することが可能になる。
【０２８８】
タンパク質のＰＡＲ４に対する結合は、本明細書の実施例に記載されているようにフローサイトメトリーを用いて検出することもできる。
【０２８９】
抗ＰＡＲ４抗体の生成及び選択
本明細書において有用な抗体の生成及び選択のための代替的な技法としては、リンパ球の（例えば、本明細書に記載の）ＰＡＲ４タンパク質またはＰＡＲ４ペプチドに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ曝露、及び（例えば、固定または標識されたＰＡＲ４タンパク質またはペプチドの使用による）ファージまたは同様のベクターにおける抗体ディスプレイライブラリーの選択が挙げられる。有望なＰＡＲ４ポリペプチド結合ドメインを有するポリペプチドをコードする遺伝子は、ファージ（ファージディスプレイ）上またはＥ．ｃｏｌｉのような細菌上に示されるランダムペプチドライブラリーをスクリーニングすることにより取得することができる。ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、複数の方法で、例えば、ランダム変異誘発及びランダムポリヌクレオチド合成により取得することができる。このようなランダムペプチドディスプレイライブラリーは、既知の標的と相互作用するペプチドのスクリーニングに使用することができ、既知の標的は、タンパク質またはポリペプチド（例えば、リガンドもしくは受容体）、生物もしくは合成の巨大分子、または有機もしくは無機の物質であり得る。そのようなランダムペプチドディスプレイライブラリーを創出及びスクリーニングするための技法は当該分野で知られており（Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，２２３，４０９号；Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，９４６，７７８号；Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，４０３，４８４号、及びＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５７１，６９８号）、ランダムペプチドディスプレイライブラリー及びこのようなライブラリーをスクリーニングするためのキットは、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びＰｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）から市販されている。ランダムペプチドディスプレイライブラリーは、ＰＡＲ４に結合するタンパク質を同定するために、本明細書で開示されているＰＡＲ４配列を用いてスクリーニングすることができる。ＰＡＲ４ポリペプチドと相互作用するこのような「結合タンパク質」は、細胞のタグ付け、親和性精製によるホモログポリペプチドの単離に使用することができ、また薬物、毒素、放射性ヌクレオチドなどと直接的または間接的に複合体化させることができる。このような結合タンパク質は、例えば発現ライブラリー及び中和活性をスクリーニングするための分析方法で使用することもできる。また、結合タンパク質は、ポリペプチドの循環レベルを測定するための診断アッセイや、基礎病態または基礎疾患のマーカーとしての可溶性ポリペプチドを検出または定量化するための診断アッセイ向けに使用することもできる。このような結合タンパク質は、ＰＡＲ４結合及びシグナル伝達をｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでブロックするためのＰＡＲ４「アンタゴニスト」として作用することもできる。このような抗ＰＡＲ４結合タンパク質は、プロテアーゼ活性化ＰＡＲ４に���する細胞応答の阻害に有用であると考えられる。
【０２９０】
当業者に知られている様々なアッセイを利用して、ＰＡＲ４タンパク質またはペプチドに特異的に結合する抗体を検出することができる。例示的なアッセイは、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（Ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８に詳細が記載されている。このようなアッセイの代表例としては、同時免疫電気泳動法、放射性免疫測定法、放射性免疫沈降法、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ブロットまたはウェスタンブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、及びサンドイッチアッセイが挙げられる。加えて、抗体は、野生型ｖｓ変異型のＰＡＲ４タンパク質、ポリペプチド、または断片に対する結合をスクリーニングすることができる。
【０２９１】
ＰＡＲ４結合タンパク質の機能的特徴のアッセイ
全てのＰＡＲ４バリアントに対するＰＡＲ４結合タンパク質の抗血栓活性は、全バリアントの有効性を確証するため、遺伝子型がホモ接合型Ａｌａ１２０もしくはＴｈｒ１２０またはヘテロ接合型であると同定された人々からの血液を用いて、ｅｘ  ｖｉｖｏ血小板凝集アッセイで検証することができる。
【０２９２】
ＰＡＲ４結合タンパク質の抗血栓薬としての有用性は、既存抗血小板薬経路の阻害物質（アスピリン（５０μＭ）、Ｐ２Ｙ１２阻害物質２−ＭｅＳＡＭＰ（５０μＭまたは１００μＭ））の不在下及び存在下での抗血栓効果を測定することによって検証することができ、またＰＡＲ１阻害物質ボラパキサル（１００ｍＭ）も、ＰＡＲ４結合タンパク質との抗血栓効果の比較研究のためにｅｘ  ｖｉｖｏ血小板凝集アッセイで使用される。発明者らが、血栓症がこれらの機構とは無関係に生じることを示している場合、高剪断条件（３０００ｓ−１）が含まれる（Ｎｅｅｖｅｓ  ＫＢ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ６：２１９３−２２０１）。
【０２９３】
追加的または代替的に、マウスｉｎ  ｖｉｖｏ血栓症実験（Ｌｅｅ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １６６：２１８８−２１９７；Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ６：６５３５）がＰＡＲ４結合タンパク質の機能性の検証に使用されてもよい。このようなマウス実験で抗ＰＡＲ４活性に対する陽性対照を確実に含めるには、マウスまたはヒト受容体配列（表２）のいずれかに対応する抗原を使用し上記の概説のようにスクリーニングして、生成される抗体の抗血栓効果を検証することができる。霊長類が、ＰＡＲ１及びＰＡＲ４の組合せのみを発現する血小板を有することが知られている唯一の種であることに留意されたい。マウス血小板はＰＡＲ３及びＰＡＲ４を発現し、ＰＡＲ４のみが機能する。そのため、このような研究はｉｎ  ｖｉｖｏの機構実証に限定されているが、ヒト対象の試験及び非ヒト霊長類の前臨床研究以外においては、ＰＡＲ４結合タンパク質の抗血栓活性における最も適切なｉｎ  ｖｉｖｏ検証である。麻酔マウスの頚動脈の電解質損傷は、ＰＡＲ４結合タンパク質のｉｎ  ｖｉｖｏ血栓形成及び安定性に及ぼす効果を検証するために使用することができる（Ｌｅｅ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｒｉｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  １６６：２１８８−２１９７；Ｌｅｅ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １０７）。血流はドップラーフロープローブを用いて記録する。エンドポイントは、血栓形成（動脈閉塞までの時間）及び安定性（閉塞後の再疎通事象の回数及び程度）、ならびに損傷動脈を通る全血流、及びパラフィン包埋動脈断面のＣａｒｓｔａｉｒ染色による血栓組織像の徹底的な検証を評価することができる。
【０２９４】
ＰＡＲ４活性化は、プロテアーゼ刺激後にホスホイノシチド加水分解を測定することによって研究することができる。本明細書に記載のエピトープタグ付きＰＡＲ４アッセイは、ＰＡＲ４結合タンパク質によるＰＡＲ４の切断及び活性化を検証するために使用することもできる。
【０２９５】
ＰＡＲ４コンストラクトまたはＰＡＲ４多型バリアントを形質移入した哺乳類細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）は、ＰＡＲ４のアンタゴニストの研究に有用なシステムである。ＰＡＲ４形質移入細胞は受容体に対するリガンドのスクリーニングに使用され、また天然リガンドのアンタゴニストのスクリーニングにも使用される。このアプローチを要約すると、ｃＤＮＡまたは受容体をコードする遺伝子はその発現に必要な他の遺伝子要素（例えば、転写プロモーター）と組み合わされ、得られた発現ベクターは宿主細胞に挿入される。ＤＮＡを発現し機能的受容体を産生する細胞が選択され、様々なスクリーニングシステム内で使用される。
【０２９６】
機能的ＰＡＲ４を発現する細胞は、スクリーニングアッセイ内で使用される。様々な好適なアッセイが当技術分野で知られている。このようなアッセイは、標的細胞における生物学的応答の検出に基づいている。対照値を上回る代謝の増加は、ＰＡＲ４の活性または応答を調節する試験化合物を示す。１つのこのようなアッセイは細胞増殖アッセイである。細胞を試験化合物の存在下または非存在下で培養し、細胞増殖の検出を、例えば、トリチウム標識チミジンの取込みを測定することにより、または３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）の代謝分解に基づく比色分析アッセイにより行う（Ｍｏｓｍａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈ．６５：５５−６３，１９８３）。追加のアッセイ方法は、試験化合物が細胞表面上に目的受容体を含む受容体（＋）細胞と目的受容体を発現しない受容体（−）細胞とに及ぼす効果を測定することを含む。このような細胞はレポーター遺伝子を発現するように操作することができる。レポーター遺伝子は、受容体連結経路に応答性であるプロモーターエレメントまたは応答エレメントに連結しており、当該アッセイはレポーター遺伝子の転写の活性を検出する。好適な応答エレメントとしては、サイクリックＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）、ホルモン応答エレメント（ＨＲＥ）、インスリン応答要素（ＩＲＥ）（Ｎａｓｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：５２７３−７７，１９９０）、及び血清応答エレメント（ＳＲＥ）（Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５６：５６３−７２，１９８９）が挙げられる。サイクリックＡＭＰ応答エレメントは、Ｒｏｅｓｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１９）：９０６３−６６；１９８８；及びＨａｂｅｎｅｒ，Ｍｏｌｅｃ．  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．４（８）：１０８７−９４；１９９０で概説されている。ホルモン応答エレメントは、Ｂｅａｔｏ，Ｃｅｌｌ  ５６：３３５−４４；１９８９で概説されている。この点において好ましいプロモーターエレメントは、血清応答エレメント、すなわちＳＲＥである（例えば、Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５６：５６３−７２，１９８９を参照）。好ましいこのようなレポーター遺伝子はルシフェラーゼ遺伝子である（ｄｅ  Ｗｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．７：７２５，１９８７）。ルシフェラーゼ遺伝子の発現は、当技術分野で知られている方法を用いて発光により検出される（例えば、Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２９０９４−１０１，１９９４；Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ  ａｎｄ  Ｇｏｉｆｆｉｎ，Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  ４１：１１，１９９３）。ルシフェラーゼ活性アッセイキットは、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ）から市販されている。このタイプの標的細胞株は、化学物質、細胞条件培地、真菌ブロス、土壌試料、水試料などのライブラリーのスクリーニングに使用することができる。このタイプのアッセイは、ＰＡＲ４リガンド結合を直接的にブロックする化合物と、さらに受容体−リガンド結合の後に続く細胞経路のプロセスを��ロックする化合物とを検出する。代替形態において、化合物または他の試料は、検出可能な標識（例えば、１２５  Ｉ、ビオチン、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ＦＩＴＣなど）でタグ付けされた部分を用いてＰＡＲ４結合の直接的ブロックについて試験することができる。このタイプのアッセイ内では、試験試料の活性化ＰＡＲ４阻害能力は阻害活性の指標であり、これは二次アッセイにより確証することができる。試験試料のＰＡＲ４活性刺激能力も、二次アッセイにより測定及び確認することができる。
【０２９７】
リガンド結合受容体もしくは抗体またはこれらの結合断片を使用するアッセイシステム及び市販のバイオセンサー装置（ＢＩＡｃｏｒｅ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が有利に用いられ得る。このような受容体、抗体、または断片は受容体チップの表面上に固定する。この装置の使用は、Ｋａｒｌｓｓｏｎ，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４５：２２９−４０，１９９１；及びＣｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２３４：５５４−６３，１９９３で開示されている。受容体、抗体、または断片は、アミンまたはスルフヒドリル化学を用いて、フローセル内の金フィルムに付着するデキストラン繊維に対し共有結合的に付着させる。試験試料を細胞に通す。リガンドまたはエピトープが試料中に存在する場合、リガンドまたはエピトープはそれぞれ固定した受容体または抗体に結合して媒体の屈折率の変化を引き起こし、これが金フィルムの表面プラズモン共鳴の変化として検出される。このシステムは、オン速度及びオフ速度（これらから結合親和性を計算することができる）の測定と、結合の化学量論の評価とを可能にする。
【０２９８】
リガンド結合受容体ポリペプチドは、当技術分野で知られている他のアッセイシステムでも使用することができる。このようなシステムとしては、結合親和性の測定のためのＳｔａｔｃｈａｒｄ分析（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ，Ａｎｎ．ＮＹ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．５１：６６０−７２，１９４９を参照）及び比色分析アッセイ（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５４５−４８，１９９１；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４５：８２１−２５，１９９１）が挙げられる。
【０２９９】
ＦＬＩＰＲアッセイは、本発明のＰＡＲ４アンタゴニストの活性を測定するための例示的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイである。このアッセイでは、ＰＡＲ４アゴニストによってＰＡＲ４発現細胞の細胞内カルシウム動員が誘導され、カルシウム動員がモニターされる。
【０３００】
本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、ガンマトロンビンにより誘導される血小板凝集阻害能力についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで試験することができる。ガンマトロンビンは、ＰＡＲ１ともはや相互作用しないアルファトロンビンのタンパク質分解産物であり、ＰＡＲ４を選択的に切断及び活性化する（Ｓｏｓｌａｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ，“Ｕｎｉｑｕｅ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｂ”，Ｊ．  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：２１１７３−２１１８３（２００１））。血小板凝集は、９６ウェルマイクロプレート凝集アッセイ形式で、または標準的な血小板凝集計を用いてモニターすることができる。凝集アッセイは、ＰＡＲ４アゴニストペプチド、ＡＤＰ、またはトロンボキサンアナログＵ４６６１９によって誘導される血小板凝集を阻害するための化合物の選択性を試験するために使用することができる。
【０３０１】
もう１つの例は、本明細書の実施例に示されているようなアルファトロンビン誘導血小板凝集アッセイである。アルファトロンビンはＰＡＲ１及びＰＡＲ４の両方を活性化させる。選択的ＰＡＲ４アンタゴニストの血小板凝集阻害能力は、標準的な光学的凝集計を用いて測定することができる。
【０３０２】
もう１つの例は、組織因子誘導血小板凝集アッセイである。このアッセイにおける条件は、血栓形成中の生理的事象を模倣している。このアッセイにおいて、ヒトＰＲＰにおける血小板凝集は、組織因子及びＣａＣｌ２を加えることで開始する。外因性凝固カスケードのイニシエーターである組織因子は、ヒト動脈硬化性プラークの場合に非常に高くなる。血液をアテローム性動脈硬化部位の組織因子に曝露することで、トロンビンのロバストな生成が作動し、閉塞性血栓の形成が誘導される。
【０３０３】
本発明のＰＡＲ４結合タンパク質の血栓症防止における有効性は、様々なｉｎ  ｖｉｖｏアッセイでも測定することができる。本発明のＰＡＲ４アンタゴニストの抗血栓剤としての有効性を試験するための血栓症及び止血のモデルを提供し得る例示的な哺乳類としては、以下に限定されないが、モルモット及び霊長類が挙げられる。該当する有効性モデルとしては、以下に限定されないが、電解質損傷頸動脈血栓症、ＦｅＣｌ３誘導頸動脈血栓症、及び動静脈短絡血栓症が挙げられる。腎臓（ｋｉｄｎｅｙ）出血時間、腎（ｒｅｎａｌ）出血時間、及びその他の出血時間の測定モデルは、出血リスクを評価するために使用することができる。
【０３０４】
ＰＡＲ４結合タンパク質は、カニクイザルにおける動脈血栓症のｉｎ  ｖｉｖｏモデルで試験することができる。ＰＡＲ４結合タンパク質は、頚動脈の電解質損傷により誘導される血栓形成阻害能力をこのモデルで試験することができる。
【０３０５】
血小板凝集アッセイ
マイクロプレートベース血小板光透過凝集測定法を使用して、血小板凝集を測定することができる（Ｆｒｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  １４：１６４２−１６５４）。
【０３０６】
この試験（Ｂｏｒｎ  ＧＶ（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ  １９４：９２７−９２９）は、糖タンパク質（ＧＰ）ＩＩｂ／ＩＩＩａ依存的方式でのｉｎ  ｖｉｔｒｏ血小板間クランプ形成、すなわち、血小板の最も重要な機能である凝集を評価するものである。当該アッセイは、外因性血小板アゴニストを加えた後の、多血小板血漿（ＰＲＰ）または洗浄血小板の光学的に高密度な試料を通る光透過率の増加を測定することに基づく。アッセイ中、アゴニスト追加後のＰＲＰまたは洗浄血小板調製物は、血小板凝集物が沈殿するためより清澄になる。これは、血漿試料を通る光透過率の増加を決定する。デバイスは、光度計により、この増加の割合及び最大パーセンテージを０％（ＰＲＰまたは洗浄血小板の最大光学密度）から１００％（自己由来の乏血小板血漿またはタイロードバッファーそれぞれの光学密度なし）まで記録する。このシグナルは、血小板凝集中の光透過率増加に対応するグラフ曲線で自動的に変換される。利用可能な凝集計は、自動設定（１００％及び０％）、結果を格納するためのソフトウェア、及び撹拌棒付きの使い捨てキュベットを備えた使用しやすいデバイスである。曲線の傾き、凝集の最大程度（％）、及び潜伏時間（誘導期）は自動測定パラメーターであり、形状の変化ならびに一次及び二次凝集を図式的に見ることができる。ＰＲＰまたは洗浄血小板の試料に異なるアゴニストを加えて異なる血小板活性化経路を刺激し、血小板機能のいくつかの特色についての情報を取得する。Ｂｏｒｎの血小板凝集測定法は、血小板機能障害の検出及び抗血小板療法のモニターに最も広く用いられている方法論である。
【０３０７】
ＰＡＲ４結合タンパク質を投与した後の血小板機能のｉｎ  ｖｉｖｏ分析は、出血時間（ＢＴ）を用いて測定することができる（Ｄｕｋｅ  ＷＷ  ｅｔ  ａｌ（１９１０）ＪＡＭＡ  ５５：１１８５−１１９２）。ＢＴは、血小板が出血を止めるためにｉｎ  ｖｉｖｏ皮膚創傷を閉塞するのに要する時間を記録することにより、血小板の止血栓発生能力を評価する。
【０３０８】
インピーダンス全血凝集測定法（ＷＢＡ）は、抗凝固処置した全血（ＷＢ）を環境として使用することにより、いかなる試料処理も伴わない血小板機能の評価を可能にする（Ｍａｃｋｉｅ  ＩＪ，ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ．３７：８７４−８７８）。当該測定法は、活性化血小板が、ＷＢ試料内で互いの間に所定の距離を置いて位置決めされた２つの電極の人工的な表面に、表面受容体を介して付着するという原理に基づいている。血小板凝集は、電極に固定された血小板上での他の血小板の凝集によって生成される電気インピーダンスの増加を検出することにより評価される。したがって、電流強度を弱めることにより電気インピーダンスが増加する。インピーダンスの増加の程度はオーム単位で記録される。
【０３０９】
光凝集測定法（ｌｕｍｉａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｒｙ）は、血小板顆粒からのアデニンヌクレオチド放出及び血小板凝集の同時測定を可能にする（Ｈｏｌｍｓｅｎ  Ｈ，ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７：４５６−４７）。この方法は、ＰＲＰ、洗浄血小板（ＷＰ）、またはＷＢにおける発光技法を使用することによる、異なるアゴニストによって活性化血小板から放出されるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）の評価に基づいている。当該アッセイは、血小板高密度顆粒から放出されたＡＤＰがルシフェリン−ルシフェラーゼ試薬と反応するＡＴＰに変換されることに基づいている。放出される光はＡＴＰ濃度に比例しており、光凝集計によって定量化される。
【０３１０】
さらなる血小板機能試験は、Ｐａｎｉｃｃｉａ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｖａｓｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｉｓｋ  Ｍａｎａｇ．１１：１３３−１４８で概説されている。
【０３１１】
カルシウムシグナル伝達アッセイ
カルシウム流動は、二重色素レシオメトリックマイクロイメージングアッセイにより単離血小板で測定することができる（Ｎｅｓｂｉｔｔ  ＷＳ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７８８：７３−８９）。
【０３１２】
動物モデル
血栓症のｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルは、ＰＡＲ４活性化または抗血栓効果をｉｎ  ｖｉｖｏでさらに評価することを含めて、本開示の抗体またはその断片をさらにまたは追加的にスクリーニング、評価、及び／または確認するために、当業者が利用することができる。このような動物モデルとしては、以下に限定されないが、頚動脈の電解質損傷に供するモデルが挙げられ、それにより、血栓形成（動脈閉塞までの時間）と、安定性（閉塞後の再疎通事象の回数及び程度）と、損傷した動脈を通る総血流とが検証される。
【０３１３】
例示的または好適なマウスモデルはＰＡＲ４−／−マウスである（Ｓａｍｂｒａｎｏ  ＧＲ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ２０００  ４０７：２５８−６４；Ｍａｏ  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｊ  Ｃｅｒｅｂ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  Ｍｅｔａｂ．３０（５）：１０４４−１０５２）。
【０３１４】
医薬組成物
本開示のＰＡＲ４結合タンパク質（活性成分と同義）は、予防的治療または療法的治療のために、非経口、局所、経口、もしくは局在的投与、エアロゾル投与、または経皮投与用の医薬組成物に製剤化するのに有用である。医薬組成物は、投与方法に応じて様々な単位剤形で投与され得る。例えば、経口投与に好適な単位剤形としては、粉末、錠剤、ピル、カプセル、及びロゼンジが挙げられる。
【０３１５】
本開示の医薬組成物は、静脈内投与または皮下投与のような非経口投与に有用である。
【０３１６】
投与のための組成物は、一般的には、医薬的に許容される担体、例えば、水性担体に溶解した本開示のＰＡＲ４結合タンパク質の溶液を含むことになる。様々な水性担体、例えば、緩衝食塩水などを使用することができる。組成物は、必要に応じて生理的条件に近づけるための医薬的に許容される担体、例えば、ｐＨ調整剤及び緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含んでもよい。このような製剤における本開示のＰＡＲ４結合タンパク質の濃度は広く変動し得、選択する特定の投与様式及び患者のニーズに応じて、主に液体体積、粘度、体重などに基づいて選択される。例示的な担体としては、水、食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。混合油及びオレイン酸エチルのような非水性溶媒も使用することができる。リポソームも担体として使用することができる。溶媒は、等張性及び化学的安定性を強化する少量の添加剤、例えば、バッファー及び保存料を含んでもよい。
【０３１７】
本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、非経口投与向けに製剤化することができ、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、またはその他のこのような経路を介した注入（腫瘍もしくは疾患部位内への蠕動投与及び直接的点滴注入（腔内投与）を含む）向けに製剤化することができる。活性成分としての本開示の化合物を含む水性組成物の調製は、当業者に知られているであろう。
【０３１８】
本開示に従う好適な医薬組成物は、概して、意図される使用に応じて一連の最終濃度をもたらすように、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質のある量が許容される医薬担体（例えば、無菌水性溶液）と混合されたものを含む。調製の技法は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８０により例示されるように、当技術分野で広く知られている。
【０３１９】
製剤化の際、本開示の化合物は、薬用量の製剤化に適合した方法で、かつ治療的／予防的に有効であるような量で投与される。本開示の化合物の好適な薬用量は、特定の化合物、治療を行う状態、及び／または治療を行う対象に応じて変動する。例えば、最適または有用な薬用量を決定するために最適以下の薬用量で始めて増加方向に薬用量を変更することにより好適な薬用量を決定することは、当業者の技量の範囲内である。
【０３２０】
例示的な薬用量及び投与のタイミングは、本明細書の開示に基づけば当業者には明らかであろう。ＰＡＲ４アンタゴニストの好ましい用量は、生物学的活性用量である。生物学的活性用量とは、ＰＡＲ４の切断及び／またはシグナリングを阻害し、抗血栓効果を有する用量である。望ましくは、ＰＡＲ４アンタゴニストは、ＰＡＲ４の活性を未処置対照のレベルより少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、または１００％超低減する能力を有する。血小板におけるＰＡＲ４のレベルは、例えば、受容体結合アッセイ、血小板凝集、血小板活性化アッセイ（例えば、ＦＡＣＳによるｐ−セレクチン発現）、ウェスタンブロット、またはＥＬＩＳＡ分析を含めた当技術分野で知られている任意の方法によって測定される。代替的に、ＰＡＲ４の生物学的活性は、ＰＡＲ４により誘発される細胞内シグナリング（例えば、カルシウム動員または他の二次メッセンジャーアッセイ）を評価することによって測定される。
【０３２１】
いくつかの例において、ＰＡＲ４化合物の治療有効量は、好ましくは約１００ｍｇ／ｋｇ未満、５０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇ未満である。より好ましい実施形態において、ＰＡＲ４化合物の治療有効量は５ｍｇ／ｋｇ未満である。最も好ましい実施形態において、ＰＡＲ４化合物の治療有効量は１ｍｇ／ｋｇ未満である。有効用量は、当業者が認識するように、投与経路及び賦形剤の用法に応じて変動する。
【０３２２】
いくつかの例において、リポソーム及び／またはナノ粒子もＰＡＲ４結合タンパク質と共に用いられ得る。リポソームの形成及び使用は当業者に広く知られている。リポソームは水性媒体中に分散したリン脂質から形成することができ、自発的に多重膜同心円状二分子層ベシクル（多重膜ベシクル（ＭＬＶ）とも称される）を形成する。ＭＬＶは、概して２５ｎｍ〜４μｍの直径を有し得る。ＭＬＶの超音波処理は、２００〜５００オングストロームの範囲の直径を有し中心部に水性溶液を含む小さな一重膜ベシクル（ＳＵＶ）の形成をもたらす。リン脂質は、水に分散させると、水に対する脂質のモル比に応じてリポソーム以外の様々な構造を形成し得る。低い比におけるリポソームが好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、及び２価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性及び極性の物質に対し低い透過性を示し得るが、高温においては相転移を経て透過性が顕著に変化する。相転移は、ゲル状態として知られる密に充填された秩序構造から、流体状態として知られる疎に充填された低秩序構造への変化を伴う。
【０３２３】
組成物は、単独で投与されてもよく、他の治療、治療薬、または薬剤と組み合わせて、同時または順次のいずれかで投与されてもよい。他の治療、治療薬、または薬剤としては、以下のものが挙げられるがこれに限定されない：
（ｉ）抗凝固剤、例えば、Ｆｘａ阻害物質、アピキサバンもしくはリバーロキサバンのようなＦＸＩａ阻害物質、またはダビガトランのようなトロンビン阻害物質；
（ｉｉ）抗血小板剤、例えば、アスピリンまたはＰ２Ｙ１２アンタゴニスト（例えば、クロピドグレル、チカグレロール、もしくはプラスグレル）；
（ｉｉｉ）血管形成剤、例えば、血管新生阻害剤。
【０３２４】
治療方法
本明細書で論じられているように、本開示のＰＡＲ４結合タンパク質は、対象における血栓症または血栓塞栓性障害の治療、防止、または改善に使用することができる。
【０３２５】
血栓症とは、血管が供給する組織の虚血または梗塞を引き起こし得る、血管内の血栓（ｔｈｒｏｍｂｕｓ：複数形はｔｈｒｏｍｂｉ）の形成または存在を指す。
【０３２６】
血栓塞栓性障害は、血流によって堆積部位に運ばれた血餅（例えば、塞栓形成）または異物により、動脈が突然ブロックされることを特徴とする。「血栓塞栓症」とは、別の血管を塞ぐ起点部位から血流によって運搬された血栓性物質による血管の閉塞を指す。「血栓塞栓性障害」という用語は、「血栓性」及び「塞栓性」障害（上記で定義）の両方を伴う。
【０３２７】
血栓塞栓性障害には、動脈心血管血栓塞栓性障害、静脈心血管または脳血管血栓塞栓性障害、及び心室または末梢循環における血栓塞栓性障害が含まれる。本明細書で使用される場合、「血栓塞栓性障害」という用語はさらに、以下に限定されないが、不安定狭心症または他の急性冠動脈症候群、心房細動、初回または再発性心筋梗塞、虚血性突然死、一過性脳虚血発作、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、末梢閉塞性動脈疾患、静脈血栓症、深部静脈血栓症、血栓性静脈炎、動脈塞栓症、冠動脈血栓症、脳動脈血栓症、脳塞栓症、腎塞栓症、肺塞栓症、及び血栓症を促進する人工表面に血液が曝露される医療用インプラント、デバイス、または手順に起因する血栓症から選択される、特定の障害も含む。医療用インプラントまたはデバイスとしては、以下に限定されないが、人工弁（ｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ  ｖａｌｖｅ）、人工弁（ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ｖａｌｖｅ）、留置カテーテル、ステント、血液酸素供給器、シャント、血管アクセスポート、心室補助デバイス及び人工心臓または心室、ならびに血管グラフトが挙げられる。手順としては、以下に限定されないが、心肺バイパス、経皮的冠動脈インターベンション、及び血液透析が挙げられる。別の実施形態において、「血栓塞栓性障害」という用語は、急性冠動脈症候群、脳卒中、深部静脈血栓症、及び肺塞栓症を含む。
【０３２８】
本明細書で使用される場合、「脳卒中」という用語は、総頚動脈（ｃａｒｏｔｉｄ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、内頚動脈（ｃａｒｏｔｉｄ  ｉｎｔｅｒｎａ）、または脳内動脈における閉塞性血栓症から生じる塞栓性脳卒中またはアテローム血栓性脳卒中を指す。
【０３２９】
キット
本開示は、本発明の検出／診断／予後判定／治療／予防の方法で使用するための、本開示の化合物を含む治療／予防／診断キットも提供する。このようなキットは概して、好適な収容手段で本開示のＰＡＲ４結合タンパク質を収容する。キットは、例えば、検出／単離／診断／イメージングまたは併用療法のための、他の化合物も収容することができる。例えば、このようなキットは、一連の抗凝固剤または抗血小板剤のうちのいずれか１つ以上を収容することができる。
【０３３０】
１つの例において、キットは、状態の治療または防止のためのものである。このようなキットにおいて、ＰＡＲ４結合タンパク質は、溶液または凍結乾燥形態で、任意選択で再懸濁用の溶液と共に提供され得る。ＰＡＲ４結合タンパク質は治療化合物と結合体化していてもよく、またはキットは結合体化のための治療化合物を含んでもよい。
【０３３１】
当業者は、多数の変形形態及び／または変更形態が、広範に記載される本発明の範囲から逸脱することなく、具体的な実施形態に示されるような本発明に対し施され得ることを理解するであろう。そのため、本発明の実施形態はあらゆる点において、例示的であり、制約的ではないとみなすべきである。
【０３３２】
以下の具体的な実施例は、単に例示として解釈すべきであり、いかなる方法においても本開示の残りの部分を限定するものではないと解釈すべきである。当業者は、さらなる詳細を伴わずに、上記の説明に基づいて本発明を最大限に利用できると考えられる。
【０３３３】
本発明は、以下の非限定的な実施例でさらに説明される。
【実施例】
【０３３４】
方法
抗体の生成
ＨｕｍＡｂマウス（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を、以下の表２に記載のＣ末端ＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）結合体化ペプチドで免疫化することにより、抗ＰＡＲ４モノクローナル抗体を産生した。免疫化ペプチドは、ｈＰＡＲ４（配列番号２）のＮ末端トロンビン切断及び活性化部位に対応する。切断部位はＲＧによって示され、以下のヒトＰＡＲ４配列において下線付きで示される通りである。
2020533022.tif 000007
裸ペプチド（配列番号３）に対しスクリーニングを実施した。
【０３３５】
マウスの腹腔内に、２週間の間隔を置いて３回、１６μｇの抗原及びメチル化ＣｐＧと合わせた免疫アジュバント（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号Ｓ６３２２）の組合せで免疫化した。免疫化マウスから血清試料を収集し、抗原に対する反応性をＥＬＩＳＡにより１：２５０及び１：１２５０の希釈において試験し、免疫化前の試料と比較した。１：２５０及び１：１２５０における免疫前と免疫後との血清力価の差は３倍超の増加が求められた。
【０３３６】
最も高い力価を有するマウスを融合に選択した。
【０３３７】
免疫化ペプチド
免疫化ペプチド及びＳＫＢ標識ペプチド（表２に示される）を、固相合成を用いてＡｕｓｐｅｐ（Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により合成した。
【０３３８】
セリン（Ｓ）及びリジン（Ｋ）のリンカー（ＳＫ）を用いて、ビオチンをＣ末端でペプチドに付着させた（表２参照）。化学的結合体化によってビオチンをＣ末端リジン残基に加えることで、表２に示されるようなＳＫＢを生成した。
【０３３９】
配列ＧＤＤＳＴＰＳＩＬＰＡＰＲＧＹＰＧＱＶＣ−ＫＬＨを有するヒトＰＡＲ４キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）ペプチドでマウスを免疫化した。
【０３４０】
ハイブリドーマの増殖
ハイブリドーマ細胞を生成するため、マウスの脾臓を摘出し、分離して単一細胞懸濁液にし、ポリエチレングリコールを用いてＳｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞と融合させた。得られたハイブリドーマ細胞を、２０×９６ウェル組織培養プレート内のアザセリンヒポキサンチン含有培地で成長させた。
【０３４１】
ハイブリドーマコロニーを１０日間成長させ、その時点でのハイブリドーマコロニーの数（融合効率として表される）を測定し、さらに３日のインキュベート後、抗体上清のアリコートをスクリーニング用に採取した。上清における抗原及び任意のスクリーニング試料に対する反応性を、最初はマイクロアレイにより、次いで任意のＩｇＧ陽性クローンのＥＬＩＳＡによりアッセイした。
【０３４２】
次いで、最も応答性の高いＥＬＩＳＡ陽性クローンを２４ウェル組織培養プレート内で３〜４日間増殖させ、その時点でそれらを６ウェル組織培養プレートに増殖させた。細胞を１：５（上清ウェル）及び１：２５（細胞ウェル）の比で播種した。ひとたび細胞ウェルが８０％コンフルエンスに到達したら、細胞を抽出し、１０％  ＤＭＳＯ中液体窒素で凍結し、上清ウェルからの上清はプールし、−２０℃で凍結した。
【０３４３】
サブクローニング用に選択したクローンを少なくとも２ラウンドの系列希釈に供した。各希釈段階後、細胞を４〜５日間成長させ、抗原に対し陽性の抗体を産生する単一コロニーを上清ＥＬＩＳＡにより測定し、最上位のクローンをさらなるラウンドのために増殖させた。最終モノクローナル細胞株を６ウェル組織培養プレート内で４〜５日間増殖させ、上清を抽出し、細胞と共に凍結した。
【０３４４】
サブクローン細胞株の上清を市販のアッセイキットで試験して、産生されているモノクローナル抗体のアイソタイプを決定した。
【０３４５】
マイクロアレイアッセイ
マイクロアレイによるハイブリドーマ上清のスクリーニングを、標準的な技法に従って実施した。
【０３４６】
モノクローナル抗体のＥＬＩＳＡスクリーニング
９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを、５０μｌの抗原をコーティングバッファー（０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）（Ｍｅｒｃｋ，＃１．０６３２９．０５００））中４μｇ／ｍｌの濃度まで希釈したものでコーティングした。プレートを４℃で一晩インキュベートした。
【０３４７】
次いで、ウェルを自動プレート洗浄器で洗浄した（３００μｌ、１×ＰＢＳ、３回）。ウェルを２００μｌのブロッキングバッファー（３％  ＢＳＡ／１×ＰＢＳ（ＢＳＡ：（Ｓｉｇｍａ，＃１００１６４７７４２））で室温で１時間ブロックし、次いで上記のように洗浄した。
【０３４８】
５０μｌの未希釈ハイブリドーマ細胞培養上清を適切なウェルに加え、室温で１時間インキュベートし、次いで上記のように洗浄した。二次抗体（アルカリホスファターゼ結合体化ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ））（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．＃１１５−０５５−００３））を１×ＰＢＳ（８％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、Ｍｅｒｃｋ  ＃１．０６４０４．５０００）、０．２％塩化カリウム（ＫＣｌ、Ｍｅｒｃｋ  ＃１．０４９３６．０５００）、１．４４％リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４、Ｍｅｒｃｋ  ＃１．０６５８６．０５００）、０．２４％オルトリン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４、Ｍｅｒｃｋ  ＃１．０４８７３．０５００））中で１：１０００希釈し、５０μｌの希釈抗体を各ウェルに加え、室温で１時間インキュベートした。ウェルを上記のように洗浄した。基質錠剤一式（１×銀、１×金）を２０ｍｌのｄｄＨ２Ｏ中に、室温で６分間サーモミキサー上で激しく振とうすることにより入れた。５０μｌの基質（ＳＩＧＭＡＦＡＳＴＴＭリン酸ｐ−ニトロフェニル（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｎ２７７０−５０ＳＥＴ）錠）を各ウェルに加え、室温で２０〜２５分間インキュベートした。５０μｌの停止溶液（２Ｍ水酸化ナトリウム、固体（ＮａＯＨ）（Ｍｅｒｃｋ、Ｃａｓ＃１３１０−７３−２））を各ウェルに加えて反応を停止させた。吸光度は、停止溶液を加えた直後、ＥＬＩＳＡリーダーで「ＲｄｒＯｌｅ４」を用いて４０５ｎｍにて読み取った。
【０３４９】
ヒト血液試料
過去１０年間抗血小板薬物を服用していない健康な成人（２１〜５０歳の男女）からインフォームドコンセントを取得した後、血液を収集した。血液は、肘前静脈から１９ゲージ蝶型針を用いて、血小板単離については７分の１体積の酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）（７：１ｖ／ｖ最終濃度）を含むシリンジに、または過去に記載のような全血流実験（Ｍｏｕｎｔｆｏｒｄ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ（２０１５）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ６：６５３５）については１０分の１体積のクエン酸三ナトリウム（０．３２％ｗ／ｖ最終濃度）を含むシリンジに採取した。
【０３５０】
マウス
ＨｕｍＡｂマウス（Ｍｕｒｐｈｙ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１１：５１５３−５１５８）をＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓから入手した。ＨｕｍＡｂマウスは、マウス重可変Ｉｇ座位及びκ軽可変Ｉｇ座位の３Ｍｂセグメントをヒトの対応物で置き換えることにより、ヒト抗体応答の生成が可能になるように遺伝子操作されている（Ｍｕｒｐｈｙ  ＡＪ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１１：５１５３−５１５８）。ＨｕｍＡｂマウスは、正常な可変セグメント再配置と、体細胞超変異と、クラススイッチングとを示し、モノクローナル抗体の大きな多様性をもたらすロバストな液性応答を示し、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎが使用する、一連の標的に対する完全ヒトモノクローナル抗体を産生するためのプラットフォームである。
【０３５１】
フローサイトメトリーによるＰＡＲ４の検出
ヒトまたはマウスの洗浄済み血小板（５×１０７／ｍＬ）を抗ＰＡＲ４抗体（０．１ｍｇ／ｍｌ）と共に３７℃で３０分間インキュベートし、次いでパラホルムアルデヒド（１％ｖ／ｖ最終濃度）で固定した。次いで、懸濁液を１０００×ｇで２分間遠心分離して血小板ペレットを取得し、次いでこれを、ＦＩＴＣ結合体化抗ウサギＩｇＧの１：５０希釈物を含む修飾タイロードバッファー（１２ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、５．５ｍＭ  Ｄ−グルコース、１ｍＭ  ＣａＣｌ２）に再懸濁した。室温で３０分後、試料を再び遠心分離し、血小板ペレットを修飾タイロードバッファーに再懸濁し、フローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用することにより分析した。
【０３５２】
ＰＡＲ４トロンビン切断アッセイ
１ｘ１０６  ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ダルベッコ修飾イーグル培地＋１０％ウシ胎仔血清中）を、形質移入の２４時間前に１２ウェルプレートに播種した。コンフルエントになったら、ＰＡＲ４バリアント（ｐＢＪ−ＦＬＡＧ−ＰＡＲ４−１２０Ａ−２９６ＦまたはｐＢＪ−ＦＬＡＧ−ＰＡＲ４−１２０Ｔ−２９６Ｆ；Ｅｄｅｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ（２０１４）Ｂｌｏｏｄ  １２４（２３）：３４５０−８）のうちの１つからの１μｇのＤＮＡに加えて４μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を製造業者の指示に従って形質移入した。形質移入から４８時間後、細胞を採取し、ＰＢＳで２回洗浄し、次いで再懸濁して１×１０６／ｍＬのカウントにした。次いで細胞（５０μＬアッセイ／０．５ｘ１０５細胞／条件）を１、１０、もしくは１００μｇ／ｍｌの５ＲＣ３もしくはサブクローン５Ａ．ＲＣ３．Ｆ１０ｂ．Ｈ４ｂ、または１００μｇ／ｍｌのマッチしたアイソタイプ対照（マウスＩｇＧ１）のいずれかを用いて３７℃で１５分間前処置した。次いで細胞を２Ｕ／ｍＬのトロンビンで１０分間刺激した。４Ｕ／ｍＬのヒルジンを加えることにより反応を停止した。次いで、細胞を１回洗浄し、ＦＩＴＣ抗ＦＬＡＧ抗体（Ｓｉｇｍａ、クローンＭ２）の１：２００希釈物を含むＰＢＳで再懸濁し、暗中室温で１時間インキュベートした。次いで、細胞を１％パラホルムアルデヒド（最終濃度）で固定し、ＦＣ１／ＦＩＴＣ陽性事象の％を測定するためにＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーターで読み取った。データを静止試料（１００％トロンビン処置なし）に対し正規化した。
【０３５３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイ
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）は、標識なしでリアルタイムのタンパク質間相互作用の測定を可能にするバイオセンサー技術である。標準的な技法によりＢｉｏ−Ｒａｄ  ＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６アレイシステムまたはＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００（ＧＥ  ｓｙｓｔｅｍ）を用いてタンパク質及び抗体のＳＰＲ結合分析を実施した。
【０３５４】
５Ａ．ＲＣ３の動態を測定する方法
ＰｒｏｔｅＯｎは、単回の注入ステップで最大３６のタンパク質相互作用を分析するためのマルチチャネルモジュールと相互作用アレイセンサーチップとを備えたＳＰＲバイオセンサーである。分析は、ビオチン化タンパク質及びペプチドの捕捉のためのアルギン酸ポリマーに結合したＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎからなる表面を含む、ＰｒｏｔｅＯｎ  ＮＬＣバイオセンサーチップを用いて実施した。
【０３５５】
ＮＬＣチップを５０ｍＭ  ＮａＯＨで調整し、次いで１Ｍ  ＮａＣｌで調整した。いずれも３０μｌ／分の流速で行った。調整は、水平及び垂直の両方向（チャネル）で実施した。２５μｇ／ｍｌの濃度のビオチン化ペプチド（リガンド試料）を垂直チャネルにおいて３０μｌ／分の流速でチップ上に捕捉した（バイオセンサーチップ上にセットアップしたリガンド試料については表１を参照）。分析対象物の注入前にペプチドリガンドの安定な捕捉を確実にするために、ランニングバッファー（１×ＰＢＳ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）、ｐＨ７．４）を垂直チャネル全体に注入した。次いでチップを水平に回転させ、ｍＡｂ５ＡＲＣ３．Ｆ１０ｂ．Ｈ４ｂ（検体）の希釈系列を、１００μｌ／分の流速でチャネルＡ１〜Ａ６全体に注入した（試験した分析対象物の濃度については表１を参照）。注：６．２５ｎＭのｍＡｂ濃度は、通常の読取り値より高い値を示したため、最終分析から除外した。
【０３５６】
【表２】
2020533022.tif 000008
【０３５７】
精製ｈＰＡＲ４  ｍＡｂのｈＰＡＲ４に対する動態を測定する方法
２つの異なる方法、抗マウスＦｃ捕捉アプローチ、またはＰｒｏｔｅｏＯｎシステムを用いた上述と類似の方法のいずれかを用いて、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００でＢｉａｃｏｒｅ分析を実施した。
【０３５８】
抗体捕捉方法
ヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃを伴った製造業者推奨のプロトコルを用いて、標準的なＥＤＣ／ＮＨＳアミンカップリング化学によりｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  ＣＭ５センサーチップを活性化した。抗ｈＰＡＲ４  ｍＡｂを１〜２ｕｇ／ｍｌで２分間、フローセル２（ＦＣ２）上で１０ｕｌ／ｍ分にて捕捉し、フローセル１（ＦＣ１）を参照チャネルとして使用した。ｈＰＡＲ４ペプチドの希釈物をランニングバッファー（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．００５％  Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０及び０．１％  ＢＳＡ）で、典型的には１０００、５００、２５０、１２５、６２．５ｎＭで調製し、ＦＣ１及び２の両方に３０ｕｌ／分で６０〜１００秒間流し、解離を８０〜１２０秒間モニターした。バッファー単独のブランク注入も実施した。全ての注入を２連及びランダムな順序で実施した。各捕捉／注入／解離サイクル後、０．１ＭグリシンｐＨ２．０の３０秒注入によりチップを再生した。
【０３５９】
ストレプトアビジン捕捉方法
製造業者推奨のプロトコルを用いてｓｅｒｉｅｓ  ＳセンサーチップＳＡを調整し、ＦＣ２上の１ｕｇ／ｍｌ  ｈＰＡＲ４−ビオチン化ペプチド及びＦＣ１上のｈＰＡＲ１−ビオチン化ペプチド（対照）で固定した。抗ｈＰＡＲ４の希釈物をランニングバッファーで、典型的には１０、５、２．５、１．２５、６．２５、及び０ｎＭで調製し、ＦＣ１及び２の両方に１００ｕｌ／分の流速で６０秒間流し、解離を２００秒間モニターした。バッファー単独のブランク注入も実施した。全ての注入を２連及びランダムな順序で実施した。各捕捉／注入／解離サイクル後、０．１ＭグリシンｐＨ２．０の３０秒注入によりチップを再生した。
【０３６０】
血小板凝集アッセイ
血小板凝集は、９６ウェルプレート形式において光透過凝集測定法により測定した。ヒト単離血小板（２×１０８／ｍｌ）を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）（１％ｖ／ｖ）、ＰＡＲ１アンタゴニストボラパキサル（９０ｎＭ）、抗ＰＡＲ４抗体５ＲＣ３（２０〜１００μｇ／ｍｌ）、またはボラパキサルと５ＲＣ３との組合せにより、３７℃で１０分間前処置した。血小板をトロンビン（０．１Ｕ／ｍｌ）で処置し、凝集を３７℃で、ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡプレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）内で５９５ｎｍ励起フィルターを用いて５０分間の期間分析した（各読取り間に５分の二重軌道振とう期間を伴う１０回の読み取りサイクル）。光学密度をブランク（最大値）及び非刺激血小板（最小値）に対し正規化し、最大値％として表現した。
【０３６１】
全血血栓症アッセイ
クエン酸（３．２％）中に収集したヒト全血を、ＰＥ結合体化抗ＣＤ９抗体（４μｇ／ｍＬ）及び抗フィブリン抗体（５μｇ／ｍｌ）、ならびにヒルジン（８００Ｕ／ｍｌ）、ＤＭＳＯ（１％ｖ／ｖ）、ＰＡＲ−１アンタゴニストＥ５５５５（１μＭ）、抗ＰＡＲ４抗体（０．２ｍｇ／ｍｌ）、または両方のＰＡＲ阻害物質の組合せのうちの１つと共に、３７℃で１５分間プレインキュベートした。全血を５〜７．５ｍＭ  ＣａＣｌ２（最終濃度）で再石灰化して凝固を開始し、ウシ１型コラーゲン（２５０μｇ／ｍｌ）でコーティングしたガラスマイクロスライド（１×０．１ｍｍ内径）に０．０６ｍｌ／分の固定流速で取り出し、６００ｓ−１の壁剪断速度を得た。２色共焦点蛍光画像を４８８及び５６１ｎｍの励起で記録し、４０×水浸対物レンズを通じて収集した。共焦点ｚ−スタックを修正前の２分間継続的に記録し、カルシウム非含有タイロードバッファーを血栓に流し、血栓野全体を包含するｚ−スタックを１０分の期間にわたり記録した。抗ＣＤ９−ＰＥを用いて血小板血栓を定義し、血栓野の平均蛍光を用いてフィブリン体積を定量化した。データをヒルジンベースラインに対し正規化し、対照のパーセンテージとして表現した。
【０３６２】
ＰＡＲ４  ＳＮＰに対するＰＣＲベースＳＮＰ遺伝子型判定アッセイ
ＱＩＡａｍｐ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ−Ｍｉｎｉを製造業者の指示に従って用いて、ヒト全血のバフィーコートからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。Ｔａｑｍａｎ  ＳＮＰ遺伝子型判定アッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を製造業者の指示に従って用いて、１０ｎｇ  ＤＮＡを用いて、ＤＮＡ試料に対しｒｓ７７３９０２の遺伝子型判定を行った。Ｒｏｃｈｅ  ９６ウェルプレートｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒで、以下の熱サイクル条件を用いてＰＣＲを実施した：９５℃で１５秒、６０℃で６０秒を４０サイクル反復。（Ｍｙｇｏ  Ｐｒｏ）ソフトウェアを用いたエンドポイント遺伝子型判定分析をアレル間の識別に使用した。４６５〜５１０ｎｍ（「Ａ」アレル）／５３３〜５８０ｎｍ（「Ｔ」アレル）に蓄積した相対蛍光シグナルのレシオメトリック分析を使用した。
【０３６３】
統計的分析
ＧＲＡＰＨＰＡＤ  ＰＲＩＳＭ（ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．０，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて統計的分析を実施した。有意性は、対応のない両側スチューデントｔ検定、または多重比較のためのフィッシャーのＬＳＤ検定を伴った一元配置ＡＮＯＶＡのいずれかにより決定されるＰ＜０．０５で定義した。
【０３６４】
抗体の命名法
反対のことが示されない限り、以下の命名法は、下記の表２に示されるように、本明細書で言及されている抗体を指すために使用される。例えば、５Ａ．ＲＣ３に対する簡略な言及は、反対のことが示されない限り、モノクローナル抗体サブクローン５Ａ．ＲＣ３．Ｆ１０ｂ．Ｈ４ｂを指す。
【０３６５】
【表３】
2020533022.tif 000009
【０３６６】
［実施例１  ヒトＰＡＲ４に対するアンタゴニストモノクローナル抗体の開発］
発明者らは、ヒトＰＡＲ４を標的化するモノクローナル抗体の開発に努めた。Ｍｏｎａｓｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（ＭＡＴＦ）で、当該施設の指導教官Ｐｒｏｆ  Ｍａｒｋ  Ｓｌｅｅｍａｎは、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ独自のＨｕＭａｂマウス（ＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅ（登録商標））を用いて抗体産生及びスクリーニングを実施し、後にさらなる詳細が記載されるようにＰＡＲ４に対する高親和性抗体を産生した。
【０３６７】
（ｉ）免疫化
ヒトＰＡＲ４（ｈＰＡＲ４）のＮ末端トロンビン切断及び活性化部位のＫＬＨ結合体化ペプチドを生成してＨｕｍＡｂマウスの免疫化に使用し、次いで標準的なプロトコルに従って３回の追加免疫を行った。裸ｈＰＡＲ４ペプチド（表３）を用いてＥＬＩＳＡにより血清力価を測定した。
【０３６８】
当該ペプチドを用いて、合計１２匹のＨｕｍＡｂマウスに３回の別々の免疫化プログラムを行った。免疫化に使用したペプチドの配列を表３に示す。これらの配列は、いくつかの場合には追加のＣ末端システインを含んだ（下線で示される通り）。ペプチドを、Ｃ末端でキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と、またはシステイン−リジンを介しビオチン（ＳＫＢ）と結合体化させた。
【０３６９】
【表４】
2020533022.tif 000010
【０３７０】
（ｉｉ）ハイブリドーマの生成
融合は、融合パートナーとしてのＳＰ２／Ｏ  Ａｇ１４と共に、標準的な融合プロトコルを用いて実施し（Ｙｏｋｏｙａｍａ，Ｗ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．  Ｉｎ：Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ，Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ  Ａ，Ｍａｒｇｕｉｌｅｓ  Ｄ，Ｓｈｅｖａｃｈ  Ｅ  Ｍ，Ｓｔｒｏｂｅｒ  Ｗ．，  ｅｄｉｔｏｒｓ．  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ．１．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；１９９４．ｐｐ．２．５．２−２．５．１７．）、２０個の９６ウェルプレートで平板培養した。細胞を、選択マーカーとしてのＨＡＴを含有する培地中で成長させた。
【０３７１】
ハイブリドーマを、１０％ウシ胎児血清と、５０μＭベータメルカプトエタノールと、１ｍＭピルビン酸ナトリウムとを追加したＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。
【０３７２】
（ｉｉｉ）ハイブリドーマクローンのスクリーニング
発明者らは、数千種のハイブリドーマ上清において、高親和性特異的抗原陽性株をスクリーニングした。モノクローナル抗体は、マウス定常領域に連結したヒトＩｇ可変領域を含む（そのため、このようなキメラ抗体を指すために本明細書では「ｍＡｂ」と称する）。
【０３７３】
最初に、ハイブリドーマ上清において、免疫化ＰＡＲ４ペプチド配列（ＧＤＤＳＴＰＳＩＬＰＡＰＲＧＹＰＧＱＶＣ−ＫＬＨ）に対する結合を抗原マイクロアレイによりスクリーニングした。結合は、バックグラウンド（培地単独からのシグナル）を上回る蛍光強度により測定した。脾臓融合当たり上位４６種のクローンを、さらなるＥＬＩＳＡベースのＰＡＲ４抗原に対する結合（ネイティブ及びＫＬＨ連結の両方；ネイティブｖｓ  ＫＬＨ連結ＰＡＲ４ペプチドの結合倍数）のスクリーニングに選択した。ＫＬＨ連結ＰＡＲ４ペプチドの３倍超のネイティブＰＡＲ４ペプチドに対する結合を示したクローンを、類似したＥＬＩＳＡベースの特異性スクリーニング（ネイティブＰＡＲ４ペプチドに対する結合ｖｓ同等の領域に対応するＰＡＲ１のペプチド（ＳＫＡＴＮＡＴＬＤＰＲＳＦＬＬＲＮＰ）、ＰＡＲ２のペプチド（ＳＣＳＧＴＩＱＧＴＮＲＳＳＫＧＲＳＬ）、及びＰＡＲ３のペプチド（ＳＣＳＧＴＩＱＧＴＮＲＳＳＫＧＲＳＬ）に対する結合；ＰＡＲ４ペプチドｖｓ  ＰＡＲ１、２、または３ペプチドの結合倍数）に選択した。他のＰＡＲペプチドの３倍超のＰＡＲ４ペプチドに対する結合を示したクローンを増殖させ、機能的バイオアッセイ（ＰＡＲ４切断の阻害及びＰＡＲ４誘導血小板活性化／凝集の阻害）で試験した（図２及び１２）。
【０３７４】
結合及び機能の両方を示したクローンをサブクローニング及び再試験のために選択した。サブクローニングの各ラウンド後、クローン内の結合抗体の維持を確証するため、再び、クローンのネイティブＰＡＲ４ペプチドに対する結合（培地単独と比較）をＥＬＩＳＡにより試験した。
【０３７５】
【表５】
2020533022.tif 000011
2020533022.tif 000012
2020533022.tif 000013
【０３７６】
【表６】
2020533022.tif 000014
2020533022.tif 000015
【０３７７】
［実施例２  抗ＰＡＲ４ハイブリドーマクローンはＰＡＲ４のトロンビン誘導切断をブロックする］
モノクローナル抗体ハイブリドーマ上清（ＭｏＢ５ＡＲＣ３、ＭｏＢ５ＢＲＢ４、ＭｏＢ５ＢＲＣ６、ＭｏＢ５ＢＲＨ３、及びＭｏＢ５ＣＲＣ４）において、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを含むヒトＰＡＲ４を形質移入したＨＥＫ２９３細胞の表面上に存在するインタクトＰＡＲ４を切断する能力についてスクリーニングした。切断をフローサイトメトリーにより定量化し、図２に示した。
【０３７８】
形質移入したＨＥＫ２９３細胞を、抗ＰＡＲ４ポリクローナル抗体（Ｆｒｅｎｃｈ  ＳＬ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  １４，１６４２−１６５４に記載、陽性対照として使用）またはモノクローナル抗体クローンＭｏＢ５ＡＲＣ３、ＭｏＢ５ＢＲＢ４、ＭｏＢ５ＢＲＣ６、ＭｏＢ５ＢＲＨ３、もしくはＭｏＢ５ＣＲＣ４、及び未処置の陰性対照のいずれかと共に、トロンビン（０．１Ｕ／ｍｌ）の存在下、室温で１０分間インキュベートした。トロンビンによるＰＡＲ４の切断は、フローサイトメトリーを用いて、ＰＡＲ４発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのＦＬＡＧタグの喪失により測定した。
【０３７９】
トロンビンによる細胞の処置（２Ｕ／ｍｌを１０分間）は、総ＰＡＲ４のうちのおよそ５０％の切断をもたらした（陰性対照）。ポリクローナル抗ＰＡＲ４抗体による前処置は、ほぼ完全にトロンビン誘導切断をブロックすることが見いだされた（陽性対照）（図２）。５種のハイブリドーマ上清の最初のスクリーニングにより、ＭｏＢ５ＡＲＣ３はほぼ完全にＰＡＲ４のトロンビン誘導切断をブロックし、他の４種のハイブリドーマ（Ｂ５Ａ．ＲＣ３、Ｂ５．ＢＲＢ４、Ｂ５．ＢＲＣ６、Ｂ５．ＢＲＨ３、及びＢ５．ＣＲＣ４）からの上清に対しては限定的でばらつきのある応答が示された。
【０３８０】
クローンＢ５Ａ．ＲＣ３は、ＰＡＲ４のトロンビン誘導切断を少なくとも９０％ブロックした。クローンＢ５．ＢＲＢ４はトロンビン誘導切断を約６０％ブロックし、Ｂ５ＢＲＣ６はトロンビン誘導切断を約５０％ブロックし、Ｂ５ＢＲＨ３はトロンビン誘導切断を約６５％ブロックし、Ｂ５ＣＲＣ４はトロンビン誘導切断を約５０％ブロックした。
【０３８１】
クローン５Ａ．ＲＣ３を標準的プロトコルに従った限界希釈によってさらにサブクローニングし、図３に示すように、フローサイトメトリーによる測定においてＰＡＲ４のトロンビン誘導切断をブロックする能力について試験した。５Ａ．ＲＣ３（サブクローンＨ４ｂ）及び５Ａ．ＲＣ３（サブクローンＢ６ｂ）からの両方のハイブリドーマ上清は、１００μｌ上清において、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１００μｌ細胞懸濁液）上のＰＡＲ４のトロンビン誘導切断を、９０％超という顕著な程度までブロックした。
【０３８２】
図４は、５Ａ．ＲＣ３．Ｈ４ｂサブクローンが、ＨＥＫ２９３細胞の表面上に発現したＰＡＲ４の切断を用量依存的方式で有効に阻害し、その切断がヒトＰＡＲ４受容体のＡｌａ１２０及びＴｈｒ１２０バリアントの両方に有効であったことを示している。
【０３８３】
［実施例３  ｍＡｂ−５ＲＣ３のＨ４ｂ及びＢ６ｂサブクローンの結合特異性］
抗ｈＰＡＲクローンのＰＡＲ４に対する特異性を測定するため、上述のようにＥＬＩＳＡスクリーニングを実施した。図５Ａは、クローンｍＡｂ−５ＡＲＣ３（５Ａ．ＲＣ３）及びｍＡｂ−５ＢＲＢ４（５Ｂ．ＲＢ４）のｈＰＡＲ１、ｈＰＡＲ２、ｈＰＡＲ３、及びｈＰＡＲ４に対する結合特異性の結果を示している。
【０３８４】
５Ａ．ＲＣ３は、ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、及びＰＡＲ３の１６倍のヒトＰＡＲ４ペプチドに対する選択性を示した。ｍＡｂ  ５Ｂ．ＲＢ４は４種全てのヒトＰＡＲペプチドに同様に結合し、５Ａ．ＲＣ３に比べるとＰＡＲ４に対する親和性は低かった。
【０３８５】
発明者らは、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｐｒｏｔｅｏｎ  ＸＰＲ３６を利用して表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析を実施し、５Ａ．ＲＣ３．Ｆ１０ｂ．Ｈ４ｂの結合親和性（会合及び解離の速度）ならびに特異性への洞察を得た。ストレプトアビジンチップを利用して全てのビオチン結合ヒトＰＡＲペプチド（表１）を表面上に捕捉し、異なる濃度の精製５Ａ．ＲＣ３を通した。クローン５Ａ．ＲＣ３．Ｆ１０ｂ．Ｈ４ｂは、ＳＡチップＳＰＲにより、約０．４ｎＭの解離定数（ＫＤ）を有することが観察された（図５Ｂ）。
【０３８６】
［実施例４  抗ＰＡＲ４ハイブリドーマｍＡｂ−５ＲＣ３．Ｆ１０ｂ．Ｈ４ｂ（以下５Ａ．ＲＣ３）は両方のヒトＰＡＲ４バリアントのトロンビン誘導切断をブロックする］
先行技術のＰＡＲ４阻害物質の制約の１つは、ＰＡＲ４の特定のバリアントに特異的であり、したがって首尾よく阻害できるのは、該当ＰＡＲ４受容体バリアントを有する者の血小板凝集に過ぎないということである。
【０３８７】
抗ＰＡＲ４クローンがトロンビンのＰＡＲ４切断に及ぼす効果を阻害し得るかどうかを決定するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ阻害アッセイを実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対し、トロンビン切断部位の上流のＦＬＡＧエピトープを含むＰＡＲ４−１２０Ａｌａ（Ａ）またはＰＡＲ４−１２０Ｔｈｒ（Ｔ）バリアントを一過的に形質移入した。トロンビンによるＰＡＲ４の切断は、フローサイトメトリーを用いて、ＰＡＲ４発現ＨＥＫ２９３細胞からのＦｌａｇタグの喪失により測定した。
【０３８８】
細胞を漸増用量のトロンビン（０．１〜２Ｕ／ｍｌ）で刺激し、ＦＩＴＣ結合体化抗ＦＬＡＧ抗体を用いてフローサイトメトリーによりトロンビン切断の量をＦＬＡＧエピトープの喪失として測定した。図６Ａに示すように、阻害は用量依存的であった。
【０３８９】
図６Ｂは、トロンビン刺激の前に形質移入細胞を５Ａ．ＲＣ３（１００μｇ／ｍｌ）と共にプレインキュベートしたことで、ＰＡＲ４バリアントに関係なく、同じ程度でほぼ完全なトロンビン切断阻害がもたらされたことを示している。
【０３９０】
図６Ｂは、５Ａ．ＲＣ３（１０μｇ／ｍｌ）のＨＥＫ２９３細胞ＰＡＲ４切断に対する結果をビヒクル、アイソタイプ対照のいずれかと比較して示しており、トロンビン（０．１Ｕ／ｍｌ）と共に１０分間共インキュベートしている。
【０３９１】
モノクローナル抗体５Ａ．ＲＣ３は、ＰＡＲ４のＡｌａ１２０及びＴｈｒ１２０バリアント両方のトロンビン誘導ＰＡＲ４切断ならびにヒトＰＡＲ４の活性化を顕著に阻害した。この抗ｈＰＡＲ４抗体５Ａ．ＲＣ３の機能性は、免疫化ペプチドの添加で元に戻った。
【０３９２】
［実施例５  血小板凝集の阻害］
抗ｈＰＡＲ４抗体ＭｏＢ５ＡＲＣ３．Ｈ４ｂ（５Ａ．ＲＣ３）が、血小板凝集により観察されるトロンビンのＰＡＲ４に及ぼす効果を阻害し得るかどうかを決定するため、ヒト血小板に対するｅｘ  ｖｉｖｏ血小板凝集アッセイを実施した。異なるＰＡＲ４バリアントのヒト単離血小板において、ＰＡＲ４アゴニストに対する応答を評価した。図７に示すように、３つの異なる遺伝子型（ＴＴ、ＡＴ、及びＡＡ）を試験した。
【０３９３】
図７Ａ及びＢに示すように、Ｔアレルの存在は、中用量範囲のＰＡＲ４活性化ペプチド（ＡＰ）及びトロンビンに応答してのより高い最大凝集に関連していた。ＰＡＲ４−ＡＰは、Ｃ末端アミド化ペプチド配列ＡＹＰＧＫＦ−ＮＨ２を有する選択的ＰＡＲ４アゴニストである。
【０３９４】
図７Ｃは、ボラパキサル（９０ｎｍ）によるＰＡＲ１遮断の存在下でのトロンビン刺激を示している。
【０３９５】
図７Ｄは、血小板凝集が５Ａ．ＲＣ３により用量依存的方式で阻害されたことを示している。この用量依存的阻害は、全ての遺伝子型にわたり同様に有効であった。
【０３９６】
図７Ｅは、５Ａ．ＲＣ３サブクローンにおける阻害濃度（ＩＣ５０）を示している。
【０３９７】
［実施例６  ＭｏＢ５ＡＲＣ３．Ｆ１０ｂ．Ｈ４ｂ（以下、５Ａ．ＲＣ３）はヒト血小板上のＰＡＲ４に結合する］
クローン５Ａ．ＲＣ３において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの単離ヒト血小板に対する結合を試験した。フローサイトメトリーを用いて結合の分析を決定した。単離血小板をマウスＩｇＧ１（アイソタイプ対照）または５Ａ．ＲＣ３のいずれかと共にインキュベートし、ＰＡＲ４に対する結合について試験した。血小板上に発現するマーカーであるＣＤ４１ａを陽性対照として使用した。図８に示すように、５Ａ．ＲＣ３（１０μｇ／ｍｌ）は単離血小板中のヒトＰＡＲ４に結合する。
【０３９８】
［実施例７  ＭｏＢ５ＡＲＣ３．Ｆ１０ｂ．Ｈ４ｂ（以下、５Ａ．ＲＣ３）によって示される単離血小板における凝固促進活性の阻害］
血小板表面ホスファチジルセリン（ＰＳ）露出を、アネキシンＶ結合を測定することにより決定した。ヒト単離血小板（５×１０７／ｍｌ）を指示濃度の５Ａ．ＲＣ３で前処置（５分）し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合体化アネキシンＶ（１：１００）と共にインキュベートしてからトロンビンで刺激した。刺激後、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）向けに修飾タイロードバッファーに再懸濁した。
【０３９９】
単離ヒト血小板の凝固促進活性を、ＰＡＲ４−ＡＰまたはトロンビン（１Ｕ／ｍｌ）による刺激に応答してのホスファチジルセリン（ＰＳ）露出を測定することにより検証した。アネキシンＶ陽性細胞のパーセンテージを測定した。血小板を５Ａ．ＲＣ３と共に５分間プレインキュベートした。血液を１０分間流し、データをリアルタイムで収集した。１０分（最終データ点）は簡略性のために示されている。
【０４００】
図９は、ＰＡＲ４−ＡＰ刺激（Ａ）またはトロンビン刺激（Ｂ）のいずれかに応答してのアネキシンＶ陽性細胞のパーセンテージを示している。ｔｈｒ１２０バリアントはＰＡＲ４−ＡＰ刺激血小板におけるＰＳ露出の増加をもたらした。類似の傾向はトロンビン刺激血小板でも観察された。
【０４０１】
図９Ｃは、５Ａ．ＲＣ３による前処置（５分）が、ドナー遺伝子型に関係なく、用量依存的方式でトロンビン誘導ホスファチジルセリン露出を阻害したことを示している。
【０４０２】
［実施例８  ＭｏＢ５ＡＲＣ３．Ｆ１０ｂ．Ｈ４ｂ（以下５Ａ．  ＲＣ３）の抗血栓性効果］
血小板沈着、トロンビン活性、フィブリン体積、及び血栓当たりのフィブリンの比を含めた血栓症パラメーターを、凝固条件下の本明細書に記載のような全血血栓症アッセイにおいて、１０分の期間にわたりリアルタイムで測定した。
【０４０３】
１０分エンドポイントにおける血小板沈着（ＰＥ結合体化抗ＣＤ９）、トロンビン活性（ＦＲＥＴベースのトロンビンプローブ）、フィブリン体積（Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０結合体化抗フィブリン抗体）、及びトロンビン当たりのフィブリンの比を、２５×レンズ及び２×デジタル倍率を備えたＮｉｋｏｎ  Ａ１ｒを用いて（体積測定を行えるようにするための）共焦点顕微鏡により図１０Ａに示す。
【０４０４】
直接的なトロンビン阻害物質ヒルジン（８００Ｕ／ｍＬ）は、血小板沈着の継続にもかかわらず、トロンビン活性及びフィブリン体積を消失させた。図１０Ｂ〜Ｅは、ＰＡＲ４遺伝子型全体において上記パラメーターの有意差が観察されなかったことを示している。白抜きのバーで示される５Ａ．ＲＣ３（１００μｇ／ｍｌ）による前処置は、対照（黒色のバー）に比べて、血小板沈着（Ｆ）には影響を及ぼさなかったが、トロンビン活性（Ｇ）、トロンビン活性（Ｈ）、フィブリン体積（Ｈ）、及びトロンビン体積当たりのフィブリンの比（Ｉ）に対しては有意に阻害した。
【０４０５】
［実施例９  追加クローンのさらなるスクリーニング］
結合スクリーニングからヒトＰＡＲ４に対する合理的な親和性及び特異性を有すると同定されたクローンを、機能的血小板凝集アッセイによりさらに検証した。
【０４０６】
ＰＡＲ１アンタゴニストの存在下のトロンビン誘導血小板凝集（すなわち、ＰＡＲ４依存的凝集）は、ヒト血小板に結合する３０種のモノクローナル抗体上清について示されている。抗体上清をヒト血小板（２×１０８細胞）と１：１の比で混合した。図１１は５０分時に達成された最大凝集を示しており、対照のパーセンテージとして表現されている（個別ドナーｎ＝３）。
【０４０７】
［実施例１０  ２つの阻害物質クローン及び１つの非阻害物質クローンの配列］
全てＩｇＧ１カッパアイソタイプであるモノクローナル抗体のシークエンシングを、Ｍｏｎａｓｈ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｏｎａｓｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで行った。
【０４０８】
（ｉ）５Ａ．ＲＣ３サブクローン
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を決定した。これを本開示の一部を形成する配列表に示し、また図１２にも示す。この抗体はアンタゴニストであり、ＩｇＧ２ａアイソタイプに属する。
【０４０９】
相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を以下に示す。
５Ａ．ＲＣ３重鎖ＣＤＲ：
ＣＤＲ１：ＧＦＴＬＳＮＹＧ（配列番号１３）
ＣＤＲ２：ＩＷＹＤＧＳＮＫ（配列番号１４）
ＣＤＲ３：ＡＲＥＳＩＶＥＶＬＰＰＦＤＹ（配列番号１５）
５Ａ．ＲＣ３軽鎖ＣＤＲ：
ＣＤＲ１：ＱＲＶＲＮＮＹ（配列番号１６）
ＣＤＲ２：ＧＡＳ（配列番号１７）
ＣＤＲ３：ＱＱＹＧＮＳＹＴ（配列番号１８）
【０４１０】
（ｉｉ）５Ｆ．ＲＦ３サブクローン
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を決定した。これを本開示の一部を形成する配列表に示し、また図１４にも示す。この抗体はアンタゴニストである。抗体アイソタイプはＩｇＧ２ｂカッパである。
【０４１１】
相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を以下に示す。
５Ｆ．ＲＦ３重鎖ＣＤＲ：
ＣＤＲ１：ＡＹＴＦＴＮＹＧ（配列番号２４）
ＣＤＲ２：ＩＳＰＹＮＧＮＴ（配列番号２５）
ＣＤＲ３：ＡＲＥＹＮＲＳＳＲＧＲＹＹＹＹＧＭＤＶ（配列番号２６）
５Ｆ．ＲＦ３軽鎖ＣＤＲ：
ＣＤＲ１：ＱＳＶＳＳＮＹ（配列番号２７）
ＣＤＲ２：ＧＡＳ（配列番号２８）
ＣＤＲ３：ＱＱＹＧＳＳＰＷＴ（配列番号２９）
【０４１２】
（ｉｉｉ）５Ｈ．ＲＤ２サブクローン
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域のヌクレオチド及びアミノ酸配列を決定した。これを本開示の一部を形成する配列表に示し、また図１３にも示す。この抗体はＰＡＲ４に結合するが、アンタゴニストとしては機能しなかった。この抗体のアイソタイプはＩｇＧ１カッパである。
【０４１３】
相補性決定領域（ＣＤＲ）の配列を以下に示す。
５Ｈ．ＲＤ２重鎖ＣＤＲ：
ＣＤＲ１：  ＧＦＴＦＦＮＴＷ（配列番号３４）
ＣＤＲ２：ＶＫＳＫＮＤＧＧＴＫ（配列番号３５）
ＣＤＲ３：ＴＴＤＰＨＹＤＦＷＳＡＹ（配列番号３６）
５Ｈ．ＲＤ２軽鎖ＣＤＲ：
ＣＤＲ１：ＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴ（配列番号３７）
ＣＤＲ２：ＶＫＳＫＮＤＧＧＴＫ（配列番号３８）
ＣＤＲ３：ＬＱＡＴＱＦＭＹＴ（配列番号３９）
【０４１４】
ＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔプログラムを用いてＣＤＲ及びフレームワーク領域の指定を決定した。
【０４１５】
［実施例１１  ２つの異なる表面プラズモン共鳴アッセイ（ＳＰＲ）による７種の精製モノクローナル抗体クローンの結合動態の測定］
２つの異なる方法を使用して、下の表４に記載されている７種の精製抗ｈＰＡＲ４  ｍＡｂの結合動態を測定した。
【０４１６】
ｍＡｂ捕捉方法については、１：１結合相互作用をもたらす試みとして低レベルのリガンドｍＡｂ及び分析対象物ｈＰＡＲ４を使用した。この方法は、全ＩｇＧを用いたにもかかわらず、動態及び親和性ＫＤの測定（Ｋａｍａｔ  Ｖ  ａｎｄ  Ｒａｆｉｑｕｅ  Ａ（２０１７）Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５３０：７５−８６）で首尾よく使用された。ストレプトアビジン捕捉方法については、非常に低レベルの分析対象物（ｍＡｂ）を用いるにもかかわらず、全抗体をこの分析で使用することにより、１：１超の相互作用が生じ得る。
【０４１７】
精製ｍＡｂにおいて、ＥＬＩＳＡによりｈＰＡＲ４に対する結合を分析し（図１５）、データをＥＬＩＳＡ陽性：陰性比として表現した。ｍＡｂとｈＰＡＲ４との間の結合相互作用の動態を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いて２つの異なる方法：１．抗マウスＦｃ  ｍＡｂ捕捉方法、及び２．ビオチン化ペプチドを捕捉するためのストレプトアビジン（ＳＡ）チップにより測定した。Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアを用いて、ｋａ（オン）速度及びｋｄ（オフ）速度ならびにＫＤを測定しラングミュアモデルに適合させた。
【０４１８】
【表７】
2020533022.tif 000016
【０４１９】
［実施例１２  抗ｈＰＡＲ４モノクローナル抗体のｈＰＡＲ４ペプチドに対する結合］
実施例１１に記載のＥＬＩＳＡスクリーニング方法に類似する方法を使用して、ｈＰＡＲ４ペプチドに結合する精製ｍＡｂの反応性を同定した。実験は、ハイブリドーマ上清の代わりにＰＢＳに希釈した精製ｍＡｂを用いて完了した。
【０４２０】
７種の精製ｈＰＡＲ４モノクローナル抗体の反応性をＥＬＩＳＡにより分析した（表４参照）。ｍＡｂの希釈物をｈＰＡＲ４ペプチドコーティングウェルと反応させた。結合曲線を図１５に示す。最も強い結合はｍＡｂ  ５Ｆ  ＲＦ３．Ａ７ｂ．Ｃ９（５Ｆ．ＲＦ３）で観察され、この後に非常に類似する結合曲線を有する３つのｍＡｂ、５Ｈ  ＲＡ３．Ｄ３ｂ．Ａ２ｂ（５Ｈ．  ＲＡ３）、５Ａ  ＲＣ３．Ｆ１０ｂ．Ｈ４ｂ（５Ａ．ＲＣ３）、５Ｄ  ＲＨ４．Ｇ７．Ｅ６．Ｃ７ｂ．Ｇ７（５Ｄ．ＲＨ４）の結合曲線が続いた。
【０４２１】
５Ｇ  ＲＡ１．Ｅ１０．Ｇ３（５Ｇ．ＲＡ１）ｍＡｂの反応性はこれよりわずかに低く、ｍＡｂのうちｈＰＡＲ４ペプチドとの反応性が最も小さかったのは５Ｈ  ＲＦ２．Ａ５ｂ．Ｄ３．Ｃ２（５Ｈ．ＲＦ２）及び５Ｉ  ＲＧ１．Ｄ６．Ｃ１ｂ（５Ｉ．ＲＧ１）であった。このデータは、表４に示されるＥＬＩＳＡ陽性：陰性比としても表現される。
【０４２２】
［実施例１３  抗ｈＰＡＲ４モノクローナル抗体のヒトＰＡＲ４ペプチドに対する特異性］
ストレプトアビジンコーティングプレートのウェル（ＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋでブロックされたＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｉｅｒｃｅストレプトアビジン高結合能コーティングプレート、コード＃１５５００）を洗浄バッファー（０．０５％  ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０及び０．１％ウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）で３回洗浄した。ビオチン化ペプチド（ｈＰＡＲ１〜４）を洗浄バッファーで希釈し、ブロックしたストレプトアビジンコーティングウェルに１０ｕｇ／ｍｌ（ウェル当たり１００ｕｌ）で室温で１時間、穏やかに混合しながら結合させた。ウェルを上記のように３回洗浄し、洗浄バッファー中１０ｕｇ／ｍｌで調製した精製抗ｈＰＡＲ４  ｍＡｂを室温で１時間穏やかに混合しながら結合させた（１００ｕｌ／ウェル）。プレートを上記のように３回洗浄し、０．３ｕｇ／ｍｌ（１００ｕｌ）でアルカリホスファターゼ（ＡＰ）と結合体化した抗マウスＦｃコンジュゲートを上記のように１時間かけてウェルに加えた。ウェルを上記のように３回洗浄し、上清スクリーニングＥＬＩＳＡにおいて記載のようにアルカリホスファターゼ基質で発色させた。
【０４２３】
精製抗ｈＰＡＲ４  ｍＡｂをさらに特徴づけるため、ｍＡｂのｈＰＡＲ１、ｈＰＡＲ２、ｈＰＡＲ３、及びｈＰＡＲ４ビオチン化ペプチドに対する特異性を実施した。結合データは明らかに、７種全ての精製モノクローナル抗体が非常に特異的であり、ｈＰＡＲ４にのみ結合し、ｈＰＡＲ１、ｈＰＡＲ２、及びｈＰＡＲ３ペプチドとは反応しないことを示している。
【０４２４】
［実施例１４  ５種の精製抗ｈＰＡＲ４モノクローナル抗体における結合及び阻害の特徴］
５種の抗ＰＡＲ４モノクローナル抗体のヒト血小板に対する結合をフローサイトメトリーによって検証した。表５は、１）フローサイトメトリーによるヒト血小板に対する結合（１０μｇ／ｍｌで観察された、アイソタイプ対照の同濃度のものに対する幾何平均蛍光強度［ＧＭＦＩ］として表現される）と、２）０．１Ｕ／ｍｌトロンビンに応答したヒト血小板凝集の阻害におけるＩＣ５０値とに関する各クローンの結果を示している。
【０４２５】
【表８】
2020533022.tif 000017
【０４２６】
精製抗ｈＰＡＲ４  ｍＡｂのヒト単離血小板に対する濃度依存的結合を図１７に示す。各抗体は、関係するアイソタイプ対照との対比で濃度依存的結合を示した。
【０４２７】
０．１Ｕ／ｍｌトロンビンにより誘導されるヒト血小板凝集の濃度依存的結合を、３種の抗ｈＰＡＲ４  ｍＡｂクローン（５Ａ．ＲＣ３、５Ｄ．ＲＨ４、及び５Ｇ．ＲＡ１）について図１８に示す。試験した最高濃度において各クローンでほぼ最大限の阻害が観察された。
【０４２８】
［実施例１５  ２つの抗ＰＡＲ４クローン（５Ｄ．ＲＨ４及び５Ａ．ＲＣ３）の抗トロンビン効果］
ｍＡｂ  ５Ａ．ＲＣ３及びｍＡｂ  ５Ｄ．ＲＨ４によるヒト血栓形成の阻害を共焦点顕微鏡によって検証した。ｅｘ  ｖｉｖｏヒト全血血栓症アッセイにおいて、３分後に形成されたヒト血栓の体積を共焦点顕微鏡により定量化した。血液を１００μｇ／ｍｌのいずれかのｍＡｂで前処置したところ、図１９に示すように合計血栓体積が低減した。
【０４２９】
［実施例１６  精製抗ｈＰＡＲ４  ｍＡｂクローンの配列］
全てＩｇＧ１カッパアイソタイプであるモノクローナル抗体のシークエンシングを、Ｍｏｎａｓｈ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＭｏｎａｓｈ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで行った。ＩＭＧＴ／Ｖ−Ｑｕｅｓｔプログラムを用いてＣＤＲ及びフレームワーク領域の指定を決定した。
【０４３０】
ヒトＰＡＲ４に対する精製ｍＡｂの可変重鎖の配列を図２０に示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って図に示されている。
【０４３１】
ヒトＰＡＲ４に対する精製ｍＡｂの可変軽鎖の配列を図２１に示す。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＩＭＧＴナンバリングシステムに従って図に示されている。
【０４３２】
抗体の相補性決定領域配列を表６に示す。
【０４３３】
【表９】
2020533022.tif 000018
2020533022.tif 000019
【０４３４】
【表１０】
2020533022.tif 000020
2020533022.tif 000021
2020533022.tif 000022
2020533022.tif 000023
【０４３５】
［実施例１７  エピトープマッピング］
抗ｈＰＡＲ４モノクローナル抗体が結合する最小エピトープを決定するため、ｈＰＡＲ４ペプチドに対応する３つの重複ペプチドを下記及び図２２に示すように合成した。
2020533022.tif 000024
【０４３６】
トロンビン切断部位の配列ＲＧは下線で示されている。多量体の形成を防止するためにＣ末端システインを除去した。元のｈＰＡＲ４ペプチドについては表２を参照（ＫＬＨ及び裸のペプチド）。
【０４３７】
実施例１１に記載のようなＥＬＩＳＡアッセイを用いたスクリーニングを実施して、ｍＡｂが、元のペプチド抗原にまたがるより短い重複ペプチドのいずれかにより大きな反応性を示すかを同定した。簡潔に述べると、Ｎｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート上でペプチドを１０ｕｇ／ｍｌでコーティングバッファー（０．１Ｍ炭酸ナトリウムｐＨ８．０）中で一晩コーティングした。ＰＢＳで希釈した精製ｍＡｂを上清の代わりに使用した。
【０４３８】
図２３に示すように、精製ｍＡｂ５Ａ．ＲＣ３、５Ｇ．ＲＡ１、５Ｄ．ＲＨ４、及び５Ｆ．ＲＦ３は、トロンビン切断部位を含むコアペプチドアミノ酸残基８〜１５と優先的に反応した。そのため、このことからエピトープが元のｈＰＡＲ４ペプチドのこの領域内にあることが示される。
【０４３９】
図２３に示すように、精製ｍＡｂ  ５Ｇ．ＲＡ３はペプチドアミノ酸残基１１〜２０に反応した。この残基もトロンビン切断部位を含むが、このことは、他のｍＡｂと比較して、５Ｇ．ＲＡ３がわずかに異なるｈＰＡＲ４のエピトープを認識することを示すものである。
【０４４０】
当業者は、多数の変形形態及び／または変更形態が、広範に記載される本発明の範囲から逸脱することなく、上述の実施形態に示されるような本発明に対し施され得ることを理解するであろう。そのため、本発明の実施形態はあらゆる点において、例示的であり、制約的ではないとみなすべきである。
【図１】
2020533022.tif 000029
【図２】
2020533022.tif 000030
【図３】
2020533022.tif 000031
【図４】
2020533022.tif 000032
【図５】
2020533022.tif 000033
【図６】
2020533022.tif 000034
【図７】
2020533022.tif 000035
【図８】
2020533022.tif 000036
【図９】
2020533022.tif 000037
【図１０−１】
2020533022.tif 000038
【図１０−２】
2020533022.tif 000039
【図１１】
2020533022.tif 000040
【図１２】
2020533022.tif 000041
【図１３】
2020533022.tif 000042
【図１４】
2020533022.tif 000043
【図１５】
2020533022.tif 000044
【図１６】
2020533022.tif 000045
【図１７】
2020533022.tif 000046
【図１８】
2020533022.tif 000047
【図１９】
2020533022.tif 000048
【図２０】
2020533022.tif 000049
【図２１】
2020533022.tif 000050
【図２２】
2020533022.tif 000051
【図２３】
2020533022.tif 000052
【配列表】
2020533022000001.app
【国際調査報告】
2020533022.tif 000053
2020533022.tif 000054
2020533022.tif 000055
2020533022.tif 000056