(57)【要約】本発明において、抗体と複合体化した二置換マレインアミドリンカーならびにその調製方法および使用を提供する。特に、本発明は、強細胞毒性の活性物質をある種の新規なリンカーを通じて生体高分子と複合体化させる。この種のリンカーは、複合体の物質均質性を大幅に向上させるようにジスルフィド鎖と同時に選択的に作用することができる。本発明のリンカーによって調製される複合体は、対応する抗原を発現する細胞株に対して高い抑制活性を有する。上記の複合体を調製するための方法およびその使用も提供する。2020510677.tif 000173
2020510677.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Iaに示される置換マレアミドリンカー：
2020510677.tif 000144
式中、
RはXまたはArS-であり、
Xはハロゲンより選択され、
Arは置換または非置換C6〜C10アリールおよび置換または非置換5〜12員ヘテロアリールからなる群より選択され、
Ar'は置換または非置換C6〜C10アリーレンおよび置換または非置換5〜12員ヘテロアリーレンからなる群より選択され、
L1は、Ar'に連結した-O(CH2CH2O)n-であり、ここでnは1〜20の任意の整数である。
【請求項２】
Arがフェニル、ハロゲン置換フェニル、C1〜C4アルキルフェニル、C1〜C4アルコキシフェニル、4-メチルフェニル、4-メトキシフェニル、2-ピリジル、2-ピリミジニル、1-メチルイミダゾール-2-イル、および
2020510677.tif 000145
からなる群より選択され、ここでWは、カルボニルに結合したアミドR1であり、かつR1は-NH2、
2020510677.tif 000146
からなる群より選択される、請求項1記載の置換マレアミドリンカー。
【請求項３】
Ar'が置換フェニレンおよびピリジルより選択され、置換とは基上の水素原子がハロゲン、C1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、トリフルオロメチル、シアノ、およびアミド基からなる群より選択される1つまたは複数の置換基によって置換されることを意味する、請求項1記載の置換マレアミドリンカー。
【請求項４】
以下からなる群より選択される構造を有する、請求項1記載の置換マレアミドリンカー：
2020510677.tif 000147
2020510677.tif 000148
2020510677.tif 000149
2020510677.tif 000150
。
【請求項５】
下記式Ibに示される構造を有する置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物：
2020510677.tif 000151
式中、
R、Ar'、およびL1は請求項1に規定した通りであり、
L2は化学結合であるかまたはAA-PABの構造を有し、ここでAAはジペプチドまたはトリペプチド断片であり、かつPABはp-アミノベンジルカルバモイルであり、
CTDは、アミド結合を介してL2に結合した、細胞毒性小分子薬物ならびに/または自己免疫疾患および/もしくは炎症を治療するための薬物である。
【請求項６】
AAがVal-Cit、Val-Ala、Phe-Lys、Ala-Ala-Asn、およびD-Ala-Phe-Lysからなる群より選択される、請求項5記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項７】
CTDがチューブリンインヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、およびDNA結合剤からなる群より選択される、請求項5記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項８】
チューブリンインヒビターが、メイタンシンまたはその誘導体、モノメチルアウリスタチンE、モノメチルアウリスタチンF、モノメチルドラスタチン10、ツブリシン（Tubulysin）またはその誘導体、クリプトフィシンまたはその誘導体、およびタルトブリンからなる群より選択される、請求項7記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項９】
DNA結合剤が、PBDまたはその誘導体およびデュオカルマイシンまたはその誘導体からなる群より選択される、請求項7記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１０】
トポイソメラーゼインヒビターが、ドキソルビシンの代謝産物PNU-159682またはその誘導体、イリノテカンの代謝産物SN38またはその誘導体、およびエキサテカンからなる群より選択される、請求項7記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１１】
CTDが、下記D1〜D13'からなる群より選択される構造を有する、請求項5記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物：
2020510677.tif 000152
2020510677.tif 000153
。
【請求項１２】
式Ibに示される複合体が、以下からなる群より選択される、請求項5記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物：
2020510677.tif 000154
2020510677.tif 000155
2020510677.tif 000156
2020510677.tif 000157
2020510677.tif 000158
2020510677.tif 000159
2020510677.tif 000160
2020510677.tif 000161
2020510677.tif 000162
2020510677.tif 000163
2020510677.tif 000164
。
【請求項１３】
請求項5〜12のいずれか一項記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物と、抗体とをカップリングさせることによって形成される、抗体-薬物複合体。
【請求項１４】
下記式Icおよび/または式Idに示される構造を有する、請求項13記載の抗体-薬物複合体：
2020510677.tif 000165
式中、
Ar'、L1、L2、およびCTDは請求項5に規定した通りであり、
m＝1.0〜5.0であり、
Abはタンパク質、酵素、抗体、抗体断片、およびペプチドからなる群より選択される。
【請求項１５】
抗体がモノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項13記載の抗体-薬物複合体。
【請求項１６】
抗体が、HER2、HER3、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD79b、CD138、CD147、CD223、EpCAM、ムチン1、STEAP1、GPNMB、FGF2、FOLR1、EGFR、EGFRvIII、組織因子、c-MET、ネクチン4、AGS-16、グアニリルシクラーゼC、メソテリン、SLC44A4、PSMA、EphA2、AGS-5、GPC-3、c-KIT、RoR1、PD-L1、CD27L、5T4、ムチン16、NaPi2b、STEAP、SLITRK6、ETBR、BCMA、Trop-2、CEACAM5、SC-16、SLC39A6、デルタ様タンパク質3、およびクローディン18.2からなる群より選択される腫瘍関連抗原に結合できるものである、請求項13記載の抗体-薬物複合体。
【請求項１７】
HER2抗体がトラスツズマブまたはペルツズマブより選択されるか、またはEGFR抗体がErbituxまたはVectibixより選択される、請求項16記載の抗体-薬物複合体。
【請求項１８】
(a)請求項13〜17のいずれか一項記載の抗体-薬物複合体と、
(b)薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と
を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
腫瘍の治療のための薬剤を製造するための、請求項13〜17のいずれか一項記載の抗体-薬物複合体の使用。
【請求項２０】
以下の工程を含む、請求項12〜17のいずれか一項記載の抗体-薬物複合体を調製するための方法：
(1)緩衝液中で抗体を還元試薬と反応させて、還元抗体を得る工程、
(2)緩衝液と有機溶媒との混合液中でリンカー-薬物複合体を、工程(1)で得られた還元抗体と架橋して、抗体-薬物複合体を得る工程。
【請求項２１】
方法の合成スキームが以下の通りである、請求項20記載の抗体-薬物複合体を調製するための方法：
2020510677.tif 000166
式中、R、Ab、Ar'、L1、L2、CTD、およびmは請求項14に規定した通りである。
【請求項２２】
中間体Cと無水マレイン酸二ハロゲン化物との環化反応を実施して、中間体Dを生成する工程、および
アリールチオフェノールによる中間体Dの置換反応を実施して、式Eに示されるリンカーを生成する工程
を含み、合成スキームが以下の通りである、請求項1〜4のいずれか一項記載の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000167
式中、Rおよびnは請求項1に規定した通りであり、Xはハロゲン、好ましくはBrまたはClを表し、かつUおよびVは独立してNまたはCである。
【請求項２３】
中間体Bを還元することによって中間体Cが得られ、合成スキームが以下の通りである、請求項22記載の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000168
式中、R、n、U、およびVは請求項22に規定した通りである。
【請求項２４】
中間体Bが、フルオロニトロベンゼンによる化合物Aの置換反応によって得られ、合成スキームが以下の通りである、請求項23記載の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000169
式中、R、n、U、およびVは請求項22に規定した通りである。
【請求項２５】
中間体Bが以下の通りに調製される、請求項24記載の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000170
式中、R、n、U、およびVは請求項22に規定した通りである。
【請求項２６】
n-エチレングリコールをハロ酢酸tert-ブチルと反応させることによって化合物Aが得られ、合成スキームが以下の通りである、請求項25記載の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000171
式中、nおよびXは請求項22に規定した通りである。
【請求項２７】
置換マレイミドリンカーとジペプチド/トリペプチド-PABを含有するCTDとの縮合反応を実施してそれぞれF1またはF'1を生成する工程を含み、合成スキームが以下の通りである、請求項5〜12のいずれか一項記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体を調製するための方法：
2020510677.tif 000172
式中、Rは請求項1に規定した通りであり、Rxはハロゲン、C1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、トリフルオロメチル、シアノ、またはアミド基を表し、かつRyはHまたはアルキルを表す。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はある種の新規なジスルフィド結合ブリッジ用架橋剤、その高分子、治療用複合体および合成方法に関する。具体的には、本発明は、ジスルフィド結合ブリッジ用置換マレアミド系架橋剤を介して細胞毒性薬と高分子とを架橋することによって得られる複合体、その調製方法および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
最大の有効性および最小の毒性を達成するように細胞、組織または腫瘍を標的とするための薬物または他の剤の送達効率を向上させることは長年にわたって多くの研究の焦点となってきた。インビボおよびインビトロの両方で、生物学的に活性のある分子を細胞に移入させるための有効な方法を開発するために試みが多くなされてきたが、十分に満足のいくことが証明されたものはない。薬物の細胞内再分配、例えば隣接する細胞に対する再分配を最小限にしつつ薬物とその細胞内標的との会合を最適化することは困難であるかまたは非効率であることが多い。
【０００３】
現在、患者に非経口的に投与されるほとんどの薬剤は標的指向化されておらず、それらを必要としていない体細胞および組織への薬物の全身的な送達がもたらされる。これは有害な薬物副作用をもたらすことがあり、投与することができる薬物(例えば、化学療法(抗がん)、細胞毒性、酵素抑制、および抗ウイルスまたは抗微生物薬)の用量を制限することが多い。経口投与は簡便かつ経済的な投与様式であると考えられている一方で、薬物が一旦体循環へと吸収されると非罹患細胞に対して非特異的な毒性をもたらす懸念がある。さらに面倒なことには、経口バイオアベイラビリティおよび、薬物に対する内臓のさらなる曝露、ひいてはそこで毒性を生じる危険性につながる内臓での薬物の滞留に関する問題を伴う。したがって、(薬物送達)方法を開発する主な目的は、細胞および組織を薬剤の特異的な標的にすることである。そのような治療の利点は、感染していない細胞などの他の細胞および組織への薬剤の不適切な送達からもたらされる全身の生理学的な影響を回避することを含む。細胞内標的指向化は、生物学的に活性のある薬剤、すなわち活性のある代謝産物を細胞内に蓄積または保持させる方法、化合物および製剤によって達成され得る。
【０００４】
細胞毒性剤または細胞分裂阻害剤、すなわちがんの治療において腫瘍細胞を殺すかまたは抑制するための薬物の局所送達のための抗体-薬物複合体(ADC)、すなわちイムノコンジュゲートの使用は、腫瘍への薬物部分の標的送達およびその内部での細胞内蓄積を可能にする一方で、これらの非複合体化薬物の全身投与は、排除しようとする腫瘍細胞と共に正常細胞に対して許容できないレベルの毒性をもたらす場合がある。治療指数、すなわちADCの最大有効性および最小毒性を向上させるための取り組みは、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体(mAb)の選択性や薬物連結および薬物放出特性に焦点をあててきた。
【０００５】
新規の標的指向治療剤として、抗体薬物複合体(ADC)は腫瘍の治療のための新しい時代の幕開けとなる。基本的な設計思想は、1931年にパウル・エールリヒによって初めて提唱された「特効薬」および「薬物ターゲティング」、すなわち適切な担体を介して患部に薬物を送達するという概念に由来するものであった。しかしながら、抗体および高力価細胞毒性薬の技術は限定的であったため、2000年になって初めて最初のADC薬であるマイロターグ(Malotarg)(商標)(急性骨髄性白血病AMLの治療用)がFDAによって承認された。最近では、FDAは、ホジキンリンパ腫(HL)/未分化大細胞型リンパ腫(ALCL)の治療用にSeattle Geneticsによって開発されたAdcetris(商標)(2011)および乳がんの治療用にGenentechによって開発されたKadcyla(商標)(2013)という2種類のADC薬を承認しており、腫瘍治療向けに用いられるADCの急速な開発段階が来ていることを示している。
【０００６】
抗体薬物複合体は概して3つの部分、すなわち抗体または抗体様リガンド、小分子薬物、および薬物をリガンドと複合体化させるリンカーから構成されている。臨床試験段階に入った抗体薬物複合体の構造では、高力価細胞毒性薬は概して、リガンド表面のリジン残基または抗体のヒンジ領域におけるシステイン残基(鎖間ジスルフィド結合の部分的還元を通じて得られる)にリンカーを介して連結しており、最適な薬物対抗体比(DAR)は2〜4である。抗体表面上のリジン残基が多数(80個超)および複合体化様式が非選択的であると複合体化部位および数が一定にならず、翻ってこれは製造される抗体薬物複合体の不均質性につながる。例えば、T-DM1(平均DARは3.5)はDAR分布が0〜8の範囲である。同様に、抗体はそのヒンジ領域に鎖間ジスルフィド結合を4つしか含有していないが、これは2〜4の最適平均DARを達成するためには部分的に還元されなければならない。一般的な還元剤(DTT、TCEPなど)は鎖間ジスルフィド結合を選択的に還元することができないため、得られる複合体は均質な生成物ではなく、DARが0、2、4、6および8である異なる成分から構成されることになる。特定のDAR値を有する複合体であっても、複合体化部位が異なるために異性体で構成される場合がある。ADC生成物の不均質性は、最終的には、異なる複合体毎に異なるPK、有効性、および毒性特性につながる場合がある。例えば、より高いDARを有する複合体はより迅速に解かれ、体内でより大きな毒性をもたらす場合がある。
【０００７】
抗体薬物複合体に係る高不均質性の問題を克服するために、部位と数の両方で抗体と薬物との複合体化を制御する部位特異的複合体化技術が最近注目されている。この技術によって複合体化薬物の部位および数の制御を達成できるにもかかわらず、用いられる抗体またはタンパク質は全て遺伝子組換えによって得られる。遺伝子組換え技術に関しては、薬物複合体化またはペグ化のために好ましい部位を有する抗体またはタンパク質をスクリーニングするために相当な作業および厳密な設計が必要である。しかしながら、現在の遺伝子組換え技術を通じて得られる部位特異的修飾した抗体/タンパク質は発現レベルが低い。この点で、大規模な調製および製造は時間を要する場合があり、研究開発および最終的な工業化のコストは非常に高い。さらに、修飾された抗体/タンパク質のインビボでの有効性および安全性を検証するためにはそれらに対するさらなる作業が必要である。
【０００８】
複合体化技術における上記問題を考慮すると、簡便な化学的方法を介して現在の抗体に対して部位特異的複合体化を達成することは多くの人的、材料的および経済的資源を節約し得るので、より魅力的である。既存の関連する研究は、中国特許出願番号CN200480019814.4（特許文献1）においてPOLYTHERICS LIMITEDによって報告された複合体化技術、Igenica Biotherapeuticsによって出願された国際公開公報番号WO2014197871A2（特許文献2）において報告された技術的解決法、CONCORTIS BIOSYSTEMS CORPによって出願された中国特許出願番号CN201380025774.3（特許文献3）において報告された技術的解決法、NEWBIO THEREAPEUTICS, INC.によって出願された中国特許出願番号CN201310025021.4（特許文献4）において報告された技術的解決法などを含む。しかしながら、上に記載の技術は次のような多くの欠点を有する。カップリング試薬のための合成経路は長過ぎ、カップリング試薬の化学的安定性は悪く、得られる抗体複合体のエレクトロフェログラムは乱雑であってカップリングプロセス中に副反応が存在し得ることを示しており、体循環におけるスルフヒドリル基の交換(逆マイケル付加反応)はこれらの利用可能な解決法では避けられない。
【０００９】
したがって、部位特異的複合体化の目的を達成しかつ得られる抗体-薬物複合体の安定性、安全性および他の特性を同時に向上させることができる、効率性が高く簡便で実用的な化学的複合体化法が依然として必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】CN200480019814.4
【特許文献２】WO2014197871A2
【特許文献３】CN201380025774.3
【特許文献４】CN201310025021.4
【発明の概要】
【００１１】
本発明の1つの目的は、ほとんどの抗体と簡単にカップリングできるリンカーを提供することである。
【００１２】
第一の局面では、本発明は、式Iaに示される置換マレアミドリンカーを提供する：
2020510677.tif 000003
式中、
RはXまたはArS-であり、
Xはハロゲン、好ましくは臭素またはヨウ素より選択され、
Arは置換または非置換C6〜C10アリールおよび置換または非置換5〜12員ヘテロアリールからなる群より選択され、
好ましくは、Arはフェニル、ハロゲン置換フェニル、C1〜C4アルキルフェニル、C1〜C4アルコキシフェニル、2-ピリジル、2-ピリミジニル、1-メチルイミダゾール-2-イル、および
2020510677.tif 000004
からなる群より選択され、ここでWは、カルボニルに結合したアミドR1であり、かつR1は-NH2、
2020510677.tif 000005
などからなる群より選択され、C1〜C4アルキルフェニルは好ましくは4-メチルフェニルであり、かつC1〜C4アルコキシフェニルは好ましくは4-メトキシルフェニルである。
【００１３】
Ar'は置換または非置換C6〜C10アリーレンおよび置換または非置換5〜12員ヘテロアリーレンからなる群より選択され；好ましくは、Ar'は置換または非置換フェニレンおよび置換または非置換ピリジルからなる群より選択され；置換とは基上の水素原子がハロゲン、C1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、トリフルオロメチル、シアノ、アミド基などからなる群より選択される1つまたは複数の置換基によって置換されることを意味する。
【００１４】
L1は、Ar'に結合した-O(CH2CH2O)n-であり、ここでnは1〜20の任意の整数、好ましくは1〜10の任意の整数である。
【００１５】
別の好ましい態様では、リンカーは、以下からなる群より選択される構造を有する：
2020510677.tif 000006
2020510677.tif 000007
2020510677.tif 000008
2020510677.tif 000009
。
【００１６】
第2の局面では、本発明は、第1の局面に記載の式Iaに示されるリンカーを含有する置換マレアミドリンカー-薬物複合体またはその薬学的に許容される塩もしくは溶媒和物を提供し、該複合体は式Ibに示される構造を有する：
2020510677.tif 000010
式中、
R、Ar'、およびL1は上に規定した通りであり；
L2は化学結合であるかまたはAA-PABの構造を有し、ここでAAはジペプチドまたはトリペプチド断片(すなわち、ペプチド結合を通じて2〜3個のアミノ酸を連結することによって形成される断片)であり、好ましくはAAはVal-Cit(バリン-シトルリン)、Val-Ala(バリン-グリシン)、Phe-Lys(フェニルアラニン-リジン)、Ala-Ala-Asn(グリシン-グリシン-アスパラギン)、D-Ala-Phe-Lys(D-グリシン-フェニルアラニン-リジン)などからなる群より選択され；PABはp-アミノベンジルカルバモイルである。
【００１７】
CTDは、アミド結合を介してL2に結合した、細胞毒性小分子薬物ならびに/または自己免疫疾患および/もしくは炎症を治療するための薬物であり；好ましくは、CTDはチューブリンインヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、およびDNA結合剤からなる群より選択され；より好ましくは、チューブリンインヒビターはメイタンシンまたはその誘導体、モノメチルアウリスタチンE、モノメチルアウリスタチンF、モノメチルドラスタチン10、ツブリシン（Tubulysin）またはその誘導体、クリプトフィシンまたはその誘導体、およびタルトブリンからなる群より選択され；好ましくは、DNA結合剤はPBDまたはその誘導体およびデュオカルマイシンまたはその誘導体からなる群より選択され；好ましくは、トポイソメラーゼインヒビターはドキソルビシンの代謝産物PNU-159682またはその誘導体、イリノテカンの代謝産物SN38またはその誘導体、およびエキサテカンからなる群より選択される。
【００１８】
より具体的には、CTDは以下のD1〜D13およびD13'からなる群より選択される分子構造を有する：
2020510677.tif 000011
2020510677.tif 000012
。
【００１９】
別の好ましい態様では、式Ibに示される複合体は、以下からなる群より選択される：
2020510677.tif 000013
2020510677.tif 000014
2020510677.tif 000015
2020510677.tif 000016
2020510677.tif 000017
2020510677.tif 000018
2020510677.tif 000019
2020510677.tif 000020
2020510677.tif 000021
2020510677.tif 000022
2020510677.tif 000023
。
【００２０】
第3の局面では、本発明は、第2の局面で提供される式Ibに示される置換マレアミドリンカー-薬物複合体と抗体とをカップリングさせることによって形成される抗体薬物複合体を提供する。
【００２１】
別の好ましい態様では、複合体は、共有結合的に連結した1つまたは複数の薬物成分を有する。
【００２２】
別の好ましい態様では、複合体中の抗体および薬物は共有結合的に複合体化している(例えば、それらはそれぞれリンカーに共有結合的に連結している)。
【００２３】
別の局面では、本発明は式Icおよび/または式Idに示される構造を有する抗体薬物複合体を提供する：
2020510677.tif 000024
式中、
Ar'、L1、L2、およびCTDは上に規定した通りであり；
m＝1.0〜5.0、好ましくはm＝3.0〜4.2であり；
Abはタンパク質、酵素、抗体、抗体断片、およびペプチドからなる群より選択される。
【００２４】
別の好ましい態様では、式Idに示される複合体は式IcにおけるN-フェニルマレアミドの開環時の生成物である。
【００２５】
別の好ましい態様では、抗体またはAbはモノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および抗体断片(好ましくは抗体のFab断片)からなる群より選択される。
【００２６】
別の好ましい態様では、抗体-薬物複合体は次のようにして得られる。抗体または抗体断片のヒンジ領域におけるジスルフィド結合を一対のシステイン残基まで還元し、システイン残基中のスルフヒドリル基を置換を通じて式Ib中のアリールスルフィドと反応させ、これによって式Ibに示されるリンカー-薬物複合体を抗体または抗体断片に連結させる。
【００２７】
別の好ましい態様では、CTDは細胞毒性小分子薬物であり、好ましくはチューブリンインヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、およびDNA結合剤である。
【００２８】
別のさらに好ましい態様では、チューブリンインヒビターはメイタンシンまたはその誘導体、モノメチルアウリスタチンE(MMAE)、モノメチルアウリスタチンF(MMAF)、モノメチルドラスタチン10、ツブリシンまたはその誘導体、クリプトフィシンまたはその誘導体、およびタルトブリンからなる群より選択される。
【００２９】
別のさらなる好ましい態様では、DNA結合剤はPBDまたはその誘導体およびデュオカルマイシンまたはその誘導体からなる群より選択される。
【００３０】
別のさらに好ましい態様では、トポイソメラーゼインヒビターはドキソルビシンの代謝産物PNU-159682またはその誘導体、およびイリノテカン(CPT-11)の代謝産物SN38またはその誘導体からなる群より選択される。
【００３１】
別の好ましい態様では、抗体は以下からなる群より選択される腫瘍関連抗原に結合できるものである。
2020510677.tif 000025
【００３２】
別の好ましい態様では、抗体はHER2抗体、さらに好ましくはトラスツズマブまたはペルツズマブである。
【００３３】
別の好ましい態様では、抗体はEGFR抗体、さらに好ましくはErbituxまたはVectibixである。
【００３４】
別の好ましい態様では、抗体は組織因子(TF)抗体である。
【００３５】
第4の局面では、本発明は、(a)本発明の第3の局面に係る抗体-薬物複合体と(b)薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む薬学的組成物を提供する。
【００３６】
第5の局面では、本発明は、腫瘍の治療のための薬剤を製造するための本発明の第3の局面のいずれか1つに係る抗体-薬物複合体の使用を提供する。
【００３７】
別の好ましい態様では、腫瘍は乳がん、卵巣がん、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、未分化大細胞型リンパ腫、多発性骨髄腫、前立腺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、悪性メラノーマ、扁平上皮がん、膠芽腫、腎細胞がん、胃腸腫瘍、膵臓がん、前立腺がん、大腸がん、胃がん、ニューロスポンジオーマ(neurospongioma)、および中皮腫からなる群より選択される。
【００３８】
別の局面では、本発明は、腫瘍を治療するための方法であって、その必要がある対象に治療有効量の本発明の第3の局面に記載の抗体-薬物複合体を投与する工程を含む方法を提供する。
【００３９】
別の好ましい態様では、対象は哺乳類、好ましくはヒトである。
【００４０】
第6の局面では、本発明は
(1)緩衝液中で抗体を還元試薬と反応させて、還元抗体を得る工程；
(2)緩衝液と一定量の有機溶媒との混合液中でリンカー-薬物複合体を、工程(1)で得られた還元抗体と架橋して、抗体-薬物複合体を得る工程
を含む、本発明の第3の局面に記載の抗体-薬物複合体を調製するための方法を提供する。
【００４１】
工程(1)では、抗体中の鎖間ジスルフィド結合を還元試薬によって還元してスルフヒドリル基を生成する。
【００４２】
別の好ましい態様では、還元試薬はトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)、β-メルカプトエタノール、β-メルカプトエチルアミン塩酸塩、およびジチオスレイトール(DTT)からなる群より選択される。
【００４３】
別の好ましい態様では、緩衝液はリン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム(KH2PO4-NaOH)/塩化ナトリウム(NaCl)/ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)緩衝液；リン酸水素二ナトリウム-クエン酸/塩化ナトリウム(NaCl)/ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)緩衝液；ホウ酸-ホウ砂/塩化ナトリウム(NaCl)/ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)緩衝液；ヒスチジン-水酸化ナトリウム/塩化ナトリウム(NaCl)/ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)緩衝液；およびPBS/ジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)緩衝液からなる群より選択される。
【００４４】
別の好ましい態様では、工程(2)において反応液中の有機溶媒は15体積％以下である。
【００４５】
別の好ましい態様では、工程(2)における有機溶媒はアセトニトリル(ACN)、ジメチルホルムアミド(DMF)、ジメチルアセトアミド(DMA)、およびジメチルスルホキシド(DMSO)からなる群より選択される。
【００４６】
別の好ましい態様では、工程(2)において架橋は0〜37℃の温度で行われる。
【００４７】
別の好ましい態様では、工程(1)で用いられる還元試薬がβ-メルカプトエタノール、β-メルカプトエチルアミン塩酸塩、またはジチオスレイトール(DTT)より選択される場合には、還元反応が完了した後に生成物に脱塩カラムを通過させるかまたは生成物を限外ろ過に供して過剰の還元試薬を除去するさらなる工程が工程(1)の後であり工程(2)の前に含まれる。
【００４８】
別の好ましい態様では、方法の合成スキームは以下の通りである：
2020510677.tif 000026
式中、R、Ab、Ar'、L1、L2、CTD、およびmは上に規定した通りである。
【００４９】
別の好ましい態様では、方法は以下の工程を含む。
1)還元：緩衝液で抗体原液を2〜10mg/mLまで希釈し、これに140〜200倍過剰モル比のジチオスレイトール(DTT)または6.0〜20倍過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)を加え、得られた反応液を10〜35℃で2〜48時間撹拌する工程；
2)カップリング：工程1)から得られた反応液を0〜10℃まで冷却し、これに置換マレイミド化合物を加え、0〜37℃で2〜5時間攪拌する工程。
【００５０】
別のさらに好ましい態様では、方法は、工程1)の還元反応が完了した後に次の工程をさらに含む。工程1)においてDTTを還元試薬として用いた場合、生成物に脱塩カラムを通過させるかまたは生成物を限外ろ過に供して過剰のDTTを除去する工程。
【００５１】
別のさらに好ましい態様では、置換マレイミド化合物は有機溶媒に予め溶解することができ、有機溶媒はアセトニトリル(ACN)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)、およびジメチルアセトアミド(DMA)からなる群より選択され；さらに好ましくは置換マレイミド化合物は有機溶媒に10mg/mlまで溶解され、その際に反応液中の有機溶媒を確実に15体積％以下にする。
【００５２】
別のさらに好ましい態様では、方法は、工程2)のカップリングが完了した後に次の工程をさらに含む。コハク酸ナトリウム/NaCl緩衝液またはヒスチジン-酢酸/スクロースゲルを用いるろ過によって反応液を精製し、UV280紫外線吸収値にしたがって吸収ピークにおける試料を集める工程。
【００５３】
別のさらに好ましい態様では、方法は、工程2)のカップリングが完了した後に次の工程をさらに含む。得られた生成物を低温で保存する前に、反応液を限外ろ過に供し、ろ過によって滅菌する工程であって；さらに好ましくは保存温度は-100〜-60℃であり；よりさらに好ましくは限外ろ過に用いられる装置は0.15〜0.3μｍの細孔径を有する、工程。
【００５４】
別の好ましい態様では、工程1)は、過剰なTCEPを除去する必要なく還元のためにTCEPを用いることよって実施される。
【００５５】
別の好ましい態様では、工程1)における緩衝液は、50mMリン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム(KH2PO4-NaOH)/150mM塩化ナトリウム(NaCl)/1mMジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH6〜9；50mMリン酸水素二ナトリウム-クエン酸/150mM塩化ナトリウム(NaCl)/1mMジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH6〜9；50mMホウ酸-ホウ砂/150mM塩化ナトリウム(NaCl)/1mMジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH6〜9；50mMヒスチジン-水酸化ナトリウム/150mM塩化ナトリウム(NaCl)/1mMジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH6〜9；およびPBS/1mMジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH6〜9であり得る。
【００５６】
得られる抗体-薬物複合体は均質な薬物対抗体比(DAR)を有する。一方で、ある程度均質性が異なる抗体-薬物複合体もまた本発明の異なる置換マレイミドリンカーを用いて調製することによって得ることができる。より良好な均質性を有する複合体が所望される場合には、得られる抗体-薬物複合体を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、およびイオン交換クロマトグラフィー(IEC)より非限定的に選択される方法によってさらに単離し精製することができる。
【００５７】
第7の局面では、本発明は、中間体Cと無水マレイン酸二ハロゲン化物との環化反応を実施して、中間体Dを生成する工程、およびアリールチオフェノールによる中間体Dの置換反応を実施して、式Eに示されるリンカーを生成する工程を含む、第1の局面で提供される置換マレイミドリンカー(式Iaの好ましい例である式E)を調製するための方法を提供する。合成スキームは以下の通りである：
2020510677.tif 000027
式中、Rおよびnは上に規定した通りであり；Xはハロゲン、好ましくはBrまたはClを表し；UおよびVは独立してNまたはCである。
【００５８】
別の好ましい態様では、中間体Cは中間体Bを還元することによって得ることができ、合成スキームは以下の通りである：
2020510677.tif 000028
式中、R、n、U、およびVは上に規定した通りである。
【００５９】
別のさらに好ましい態様では、中間体Bはフルオロニトロベンゼンによる化合物Aの置換反応によって得ることができ、合成スキームは以下の通りである：
2020510677.tif 000029
式中、R、n、UおよびVは上に規定した通りである。
【００６０】
別のさらに好ましい態様では、中間体Bは以下の合成スキームによって調製することができる：
2020510677.tif 000030
式中、R、n、U、およびVは上に規定した通りである。
【００６１】
別のよりさらに好ましい態様では、化合物Aはn-エチレングリコールをハロ酢酸tert-ブチルと反応させることによって得られ、合成スキームは以下の通りである：
2020510677.tif 000031
式中、nおよびXは上に規定した通りである。
【００６２】
第8の局面では、本発明は、第2の局面で提供される置換マレイミドリンカー-薬物複合体(式Ibの好ましい例である式F1またはF'1)を調製するための方法であって、置換マレイミドリンカー(式Iaの好ましい例である式Ea)とジペプチドまたはトリペプチド-PABを含有するCTD(細胞毒性薬)との縮合反応を実施してそれぞれF1またはF'1を生成する工程を含み、合成スキームが以下の通りである方法を提供する：
2020510677.tif 000032
式中、Rは式Iaとして規定され、Rxはハロゲン、C1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、トリフルオロメチル、シアノまたはアミド基を表し、RyはHまたはアルキルを表す。
【００６３】
発明者らは、鋭意検討した後、全体的または部分的に抗体の軽鎖-重鎖および重鎖-重鎖とクロスカップリングすることができるある種のリンカーを見出した。さらに、従来の抗体-薬物複合体と比較して、上の複合体化方法によって得られる抗体-薬物複合体は狭い薬物対抗体比(DAR)分布を有する。上の知見に基づいて発明者らは本発明を完成した。
【００６４】
上に記載の本発明の技術的特徴および以下に(例えば実施例に)具体的に記載の技術的特徴を本発明の範囲内で互いに組み合わせて、紙面の都合上必ずしも1つずつ列挙されてはいない新規なまたは好ましい技術的解決法を形成することができると理解されたい。
【００６５】
定義
本明細書において用いるように、特に記載しない限り「C1〜C4アルキル」という用語はメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、sec-ブチル、tert-ブチルなどの炭素原子を1〜4個含有する直鎖または分岐鎖アルキルを指す。
【００６６】
「C1〜C4アルコキシ」という用語はメトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、tert-ブトキシなどの炭素原子を1〜4個含有する直鎖または分岐鎖アルコキシを指す。
【００６７】
「ハロゲン」という用語はF、Cl、BrまたはIを指す。
【００６８】
「C6〜C10アリール」という用語はフェニル、ナフチルなどの炭素原子を6〜10個含有するアリールを指し；アリールは置換されていても置換されていなくてもよい。
【００６９】
「5〜12員ヘテロアリール」または「5〜12員ヘテロアリーレン」という用語は5〜12個の炭素原子と、O、Sおよび/またはNからなる群より選択される1つまたは複数(好ましくは1〜3個)のヘテロ原子とを含有するヘテロアリールまたはヘテロアリーレンを指し、5〜8員のヘテロアリールまたはヘテロアリーレンが好ましい。ヘテロアリールまたはヘテロアリーレンは置換されていても置換されていなくてもよい。
【００７０】
発明において、「薬学的に許容される」成分という用語は過度の有害な副作用(毒性、刺激、およびアレルギー反応など)なくヒトおよび/または動物における使用に好適な物質、すなわち妥当なベネフィット・リスク比を有する物質を指す。
【００７１】
発明において、「有効量」という用語は標的とする疾患もしくは症状を治療する、改善する、もしくは予防するため、または検出可能な治療的もしくは予防的効果を呈するための治療剤の量を指す。対象にとっての正確な有効量は対象の大きさおよび健康状態、症状の特性および程度、ならびに投与のために選択した治療剤または治療剤の組み合わせに応じて異なると考えられる。よって、厳密な有効量を事前に特定することは有用ではない。しかしながら、所与の状況にとっての有効量は通常の実験によって決定することができ、臨床医の判断の範疇である。
【００７２】
特に記載しない限り、発明におけるすべての化合物は単一のキラル化合物、または様々なキラル化合物の混合物(すなわち、ラセミ体)などの可能性のあるすべての光学異性体を含むことを意図している。本発明の化合物において、各キラル炭素原子は任意でR配置もしくはS配置であっても、またはR配置とS配置の混合物であってもよい。
【００７３】
本明細書において用いるように、「発明の化合物」という用語は式Iに示される化合物を指す。該用語は式Iの化合物の様々な結晶形態、薬学的に許容される塩、水和物または溶媒和物も含む。
【００７４】
本明細書において用いるように、「薬学的に許容される塩」という用語は、酸または塩基と本発明の化合物とによって形成される医薬としての使用に好適な塩を指す。薬学的に許容される塩は無機および有機塩を含む。1つの好ましい種類の塩は、酸と本発明の化合物とによって形成される塩である。塩を形成するための好適な酸は塩酸、臭化水素酸、フッ化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸；ギ酸、酢酸、プロピオン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、ピクリン酸、メタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸などの有機酸；アスパラギン酸、グルタミン酸などの酸性アミノ酸を非限定的に含む。
【００７５】
特に記載しない限り、本明細書において用いる「アミノ酸」という用語はアスパラギン酸、グルタミン酸、システイン、アスパラギン、フェニルアラニン、グルタミン、チロシン、セリン、メチオニン、トリプトファン、グリシン、バリン、ロイシン、アラニン、イソロイシン、プロリン、スレオニン、ヒスチジン、リジン、およびアルギニンなどの任意の従来のアミノ酸を含むことを意図している。
【００７６】
本明細書において商品名が用いられている場合、これは該商品名の下での製品製剤、対応するジェネリック薬、および該商品名の下での製品の医薬有効成分を独立して含むことを意図している。
【００７７】
本明細書における「抗体」という用語はその最も広い意味で用いられ、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ダイマー、マルチマー、多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および抗体断片をそれらが所望の生物学的活性を呈する限り包含する(Miller et al (2003) Jour. of Immunology 170: 4854-4861)。抗体はマウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、または他の種に由来する抗体であってもよい。抗体は、特定の抗原を認識しそれに結合することが可能な、免疫系によって生成されるタンパク質である。(JaneWay, C., Travers, P., Walport, M., Shlomchik (2001) Immuno Biology, 5th Ed., Garland Publishing, NeW York)。標的抗原は、概して、複数の抗体上のCDRによって認識されるエピトープとも呼ばれる多数の結合部位を有する。異なるエピトープに特異的に結合する抗体は異なる構造を有する。よって、1つの抗原は1つより多い対応する抗体を有する場合がある。抗体は、完全長免疫グロブリン分子、または完全長免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分を含む場合があり、すなわち、がん細胞または自己免疫疾患に関連する自己免疫抗体を産生する細胞を非限定的に含む目的の標的の抗原またはその一部に、免疫特異的に結合する分子を含有する。本明細書において開示される免疫グロブリンは免疫グロブリン分子の任意のタイプ(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD、およびIgA)、クラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1およびIgA2)またはサブクラスであり得る。免疫グロブリンは任意の種に由来し得る。しかしながら、1つの局面では免疫グロブリンはヒト、マウス、またはウサギに由来する。
【００７８】
「抗体断片」は完全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例はFab、Fab'、F(ab')2、およびFv断片；ダイアボディ；線状抗体；ミニボディ(Olafsen et al (2004) Protein Eng. Design & Sel. 17(4):315-323)；Fab発現ライブラリによって産生される断片；抗イディオタイプ(抗Id)抗体；CDR(相補性決定領域)；およびがん細胞抗原、ウイルス抗原または微生物抗原に免疫特異的に結合する上記のいずれかのエピトープ結合断片；一本鎖抗体分子；および抗体断片によって形成される多重特異性抗体を含む。
【００７９】
発明の抗体薬物複合体を構成する抗体は、それが天然の野生型状態で有する抗原結合能を保持していることが好ましい。よって、本発明の抗体は抗原に、好ましくは特異的に、結合することができる。そのような抗原は、例えば、腫瘍関連抗原(TAA)、細胞表面受容体タンパク質および他の細胞表面分子、細胞生存調節因子、細胞増殖調節因子、組織の発達または分化に関連する分子(例えば機能性であることが公知であるかまたは疑われる分子)、リンホカイン、サイトカイン、細胞周期の調節に関与する分子、血管形成に関与する分子、および血管形成に関連する分子を含む。例えば、公知の抗体が結合することができる抗原は、上記のカテゴリのうちの1つまたはそのサブセットであってもよく、別のサブセットは(目的の抗原と比較して)明確な特徴を有する別の分子/抗原を含む。
【００８０】
抗体薬物複合体に用いられる抗体は、細胞表面受容体および腫瘍関連抗原に対する抗体を非限定的に含む。このような腫瘍関連抗原は当技術分野において周知であり、それらの抗体は当技術分野における抗体調製についての周知の方法および情報によって調製することができる。がんの診断および治療に有用な効果的な細胞標的を発見するために、研究者らは1つまたは複数のがん細胞の表面に特異的に発現されかつ1つまたは複数のタイプの非がん性細胞には発現が少ないかまたは発現されない膜貫通型またはそうでなければ腫瘍関連ポリペプチドの同定を試みた。多くの場合、そのような腫瘍関連ポリペプチドは非がん性細胞と比較してがん細胞の表面上で多量に発現される。そのような腫瘍関連因子の同定は、抗体に基づくがん療法の特異的標的指向化を大きく向上させることができる。
【００８１】
腫瘍関連抗原は下に列挙する腫瘍関連抗原(1)〜(53)を非限定的に含む。便宜上、すべて当技術分野では公知であるそれらの抗原に関連する情報が下に列挙されており、名称、代替名、およびGenbankアクセッション番号を含む。腫瘍関連抗原に対応する核酸およびタンパク質配列はGenBankなどの公的なデータベースで入手可能である。抗体によって対応して標的とされる腫瘍関連抗原は、引用文献において同定された配列に対して少なくとも70％、80％、85％、90％、または95％の配列同一性を有するすべてのアミノ酸配列変異体およびアイソフォームを含むか、または引用文献に見出される配列を有する腫瘍関連抗原と実質的に同じ生物学的特性および特徴を呈する。
【００８２】
(1)HER2(Gene ID：2064、ヒト上皮成長因子受容体2、HER2と略され、Neu、ErbB-2、CD340(分化群340)またはp185としても公知である)、ERBB2遺伝子によってコードされるタンパク質。HER2は上皮成長因子受容体(EGFR/ErbB)ファミリーのメンバーである；(2)HER3(Gene ID：2065、上皮因子受容体3(ErbB3/HER3)、上皮成長因子膜貫通受容体ファミリーのメンバー。近年ErbB3/HER3が乳がんの発症、再発および転移、化学療法および内分泌療法に密接に関わっていることが確認されており、治療のための有望な候補標的となっている；(3)CD19(Gene ID：930)；(4)CD20(Gene ID：931)；(5)CD22(Gene ID：933)；(6)CD30(Gene ID：943)；(7)CD33(Gene ID：945)；(8)CD37(Gene ID：951)；(9)CD45(Gene ID：5788)；(10)CD56(Gene ID：4684)；(11)CD66e(Gene ID：1048)；(12)CD70(Gene ID：970)；(13)CD74(Gene ID：972)；(14)CD79b(Gene ID：974)；(15)CD138(Gene ID：6382)；(16)CD147(Gene ID：682)；(17)CD223(Gene ID：3902)；(18)EpCAM(Gene ID：4072)；(19)ムチン1(Gene ID：4582)；(20)STEAP1(Gene ID：26872)；(21)GPNMB(Gene ID：10457)；(22)FGF2(Gene ID：2247)；(23)FOLR1(Gene ID：2348)；(24)EGFR(Gene ID：1956)；(25)EGFRvIII(GenBank：GM832119.1)；(26)組織因子(TF)(Gene ID：2152)；(27)c-MET(Gene ID：4233)；(28)ネクチン4(Gene ID：81607)；(29)AGS-16；(30)グアニリルシクラーゼC(Gene ID：2984)；(31)メソテリン(Gene ID：10232)；(32)SLC44A4(Gene ID：80736)；(33)PSMA(Gene ID：2346)；(34)EphA2(Gene ID：1969)；(35)AGS-5；(36)GPC-3(Gene ID：2719)；(37)c-KIT(Gene ID：3815)；(38)RoR1(Gene ID：4919)；(39)PD-L1(Gene ID：29126)；(40)CD27L(Gene ID：970)；(41)5T4(Gene ID：7162)；(42)ムチン16(Gene ID：94025)；(43)NaPi2b(Gene ID：10568)；(44)STEAP(Gene ID：26872)；(45)SLITRK6(Gene ID：84189)；(46)ETBR(Gene ID：1910)；(47)BCMA(Gene ID：608)；(48)Trop-2(Gene ID：4070)；(49)CEACAM5(Gene ID：1048)；(50)SC-16；(51)SLC39A6(Gene ID：25800)；(52)デルタ様タンパク質3(DLL3)(Gene ID：10683)；(53)クローディン18.2(Gene ID：51208)。
【００８３】
本明細書において用いるように、「薬物」という用語は所望の生物学的活性と、発明の複合体を調製するために利用可能な反応性官能基とを有する任意の化合物を指す。所望の生物学的活性はヒトまたは他の動物における疾患の診断、治癒、軽減、治療、または予防に有用な活性を含む。よって、必要な反応性官能基を有する限り、「薬物」という用語に伴う化合物は公式の中国薬局方や、例えば、公式の米国ホメオパシー薬局方(Homeopathic Pharmacopeia)、または公式の国民医薬品集(National Formulary)、またはそれらのあらゆる追補において同定された薬物を含む。例示的な薬物は、米国医師用卓上参考書(Physician's Desk Reference)(PDR)および米国食品医薬品局(FDA)によって管理されるオレンジブック(Orange Book)に記載されている。新薬は絶えず発見され開発されており、本発明ではそれらの新薬も本発明の薬物複合体の「薬物」に組み込まれることとする。
【００８４】
好ましくは、薬物は、がん治療用の細胞毒性薬；毒素、例えばアブリン、リシンA、緑膿菌外毒素、およびジフテリア毒素などの所望の生物学的活性を有するタンパク質またはポリペプチド；腫瘍壊死因子、α-インターフェロン、β-インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化因子、および生物学的応答調節剤、例えば、リンホカイン、インターロイキン-1(IL-1)、インターロイキン-2(IL-2)、インターロイキン-6(IL-6)、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子(GM-CSF)、顆粒球コロニー刺激因子、または任意の他の増殖因子を含む他の好適なタンパク質である。
【００８５】
本発明において用いることができる1つの好ましい薬物はメイタンシンまたはメイタンシノイドである。メイタンシンはチューブリンからの微小管の形成を抑制することによって細胞増殖を抑制する。メイタンシノイドはメイタンシンの誘導体である。メイタンシンおよびメイタンシノイドはどちらも細胞毒性は高いが、腫瘍に対する選択性が低いためにがん治療における臨床用途は非常に限定的である。しかしながら、高い細胞毒性がそれらをADCにおける魅力的な薬物部分とし得る。下に示される構造はデアセチル-メイタンシンである。
2020510677.tif 000033
【００８６】
本発明で用いることができる別の好ましい薬物はアウリスタチンである。アウリスタチンは、アメフラシ属の海洋軟体動物から単離され、生物学的活性を有することが見出されたポリペプチドであるドラスタチン10の合成類似体である。ドラスタチン10は抗がん剤であるビンクリスチンと同じドメインでチューブリンに結合することによってチューブリンの重合を抑制する。ドラスタチン10、アウリスタチンPE、およびアウリスタチンEはすべて、4個のアミノ酸（このうち3個がドラスタチンクラスの化合物に特有である）とC末端アミド基とを有する直鎖ペプチドである。2つの代表的なアウリスタチンであるモノメチルアウリスタチンE(MMAE)およびモノメチルアウリスタチンF(MMAF)がADC向けの好ましい薬物部分候補である。
2020510677.tif 000034
【００８７】
本発明で用いることができるさらに別の好ましい薬物はツブリシンである。研究者らによって粘液細菌培養物から最初に単離されたツブリシンはチューブリンの重合を抑制することによって作用し、これによってアポトーシスを誘導する非常に強力な細胞増殖インヒビターである。ツブリシンDはツブリシンの中で最も強力であり、エポチロン、ビンブラスチン、およびパクリタキセルを含むほとんどの他のチューブリン修飾剤よりも10〜1000倍高い活性を有する。パクリタキセルおよびビンブラスチンは様々ながんのための現在の治療剤であり、エポチロン誘導体は臨床試験において活性が評価されている。ツブリシンDの合成誘導体は抑制機構および重要な結合相互作用についての本質的な情報を提供すると考えられ、単離されたものとしてまたは標的指向抗体もしくはリガンドに対する化学弾頭(chemical Warhead)としてのいずれかで抗がん剤として優れた特性を有する場合がある。ツブリシンDは、式
2020510677.tif 000035
に示されるようにMep(D-N-メチルピペコリン酸)、Ile(イソロイシン)、Tuv(ツブバリン)、およびTup(ツブフェニルアラニン)という4つの領域に分けることができる複合テトラペプチドである。
【００８８】
本発明において用いることができるなお別の好ましい薬物は、チューブリンの重合を抑制する微生物由来クリプトフィシン誘導体である。クリプトフィシンはシアノバクテリアの培養物から単離された新規な抗腫瘍活性物質であり、これは微小管の形成を抑制することができかつ様々な腫瘍に対して活性がある。クリプトフィシンは2つのペプチド結合と、2つのエステル結合と、5つの光学活性中心と、エポキシ基とを含有する脂溶性化合物である。2つのペプチドおよび2つのエステル結合は1つの大環状構造中に存在する。クリプトフィシン誘導体CP1およびCP2の構造を以下に示す。
2020510677.tif 000036
【００８９】
本発明において用いることができる別の好ましい薬物は、新規な抗微小管剤タルトブリン(HTI-286、SPA-110)である。タルトブリンは精製された微小管の多量体化を抑制し、細胞内微小管組織と干渉し、有糸分裂の遮断および細胞のアポトーシスを誘導することができる。タルトブリンは細胞増殖の強力なインヒビターであり、18種類のヒト腫瘍細胞株について2.5nMの平均IC50を有する。タルトブリンは従来用いられている抗微小管剤と比較するとp-糖タンパク質に対する適切な基質ではない。タルトブリンの構造を以下に示す。
2020510677.tif 000037
【００９０】
1つの局面では、用いることができる薬物はカンプトテシンの誘導体であるSN-38である。SN-38はトポイソメラーゼに対するインヒビターに属するイリノテカン塩酸塩(CPT-11)の生物学的に活性な代謝産物である。SN-38はI型DNAトポイソメラーゼに対して最も強い抑制活性を示して、用量依存的および時間依存的にDNAの合成を抑制しかつ頻繁なDNA一本鎖切断を引き起こす。SN-38の構造を以下に示す。
2020510677.tif 000038
【００９１】
別の局面では、用いることができる薬物はカンプトテシンの誘導体であるエキサテカンである。エキサテカンは、I型DNAトポイソメラーゼインヒビターであるカンプトテシンの合成類似体であり、SN-38よりも活性が強い。エキサテカンはI型DNAトポイソメラーゼに対して最も強い抑制活性を示して、用量依存的および時間依存的にDNAの合成を抑制しかつ頻繁なDNA一本鎖切断を引き起こす。エキサテカンの構造を以下に示す。
2020510677.tif 000039
【００９２】
本発明において用いることができるさらに別の好ましい薬物は、以下の構造を有するアマニチン(α-アマニチン)である。α-アマニチンはタマゴテングタケ(Amanita phalloides)からのマイコトキシンであり、これは8つのペプチドからなる2つのループによって形成され、真核生物のRNAポリメラーゼIIおよびRNAポリメラーゼIIIの転写を抑制することができる。
2020510677.tif 000040
【００９３】
本発明において用いることができるなお別の好ましい薬物は、ベンゾジピロール抗生物質(デュオカルマイシン、CC-1065など)および他のシクロプロパピロロインド-4-オン(CPI)誘導体であり、これらはいずれも強力なDNA副溝結合アルキル化剤である。シクロプロパベンゾインドール-4-オン(CBI)類似体は、天然のCPIアルキル化サブユニットを含有するそれらの親化合物よりも化学的に安定であり、生物学的に強力であり、合成が容易である。1つの代表的なCBI誘導体はフェノール性ヒドロキシル基保護CBI誘導体であり(下の式を参照されたい)、これは低下したプロドラッグ毒性および向上した水溶性を有する(下の式はseco-CBIの一般構造を示す)。
2020510677.tif 000041
【００９４】
本発明で用いることができるさらになお別の好ましい薬物はピロロ[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン(PBD)またはPBD二量体である。PBDはストレプトミセス属(Streptomyces)の種によって産生される天然物のファミリーであり、DNA副溝において、特にプリン-グアニン-プリン配列にて歪みのない共有結合付加物を形成するという独特の特徴を有する。DNA配列を標的としかつこれを固定するための小分子戦略の一部として、また新規な抗がんおよび抗菌剤としてのPBDの使用に対する関心が高まっている。フレキシブルなアルキレンリンカーを介して2つのPBD単位をそれらのC8/C8'-ヒドロキシル官能基を通じて一つに結合することによって得られる二量体は、増加した生物学的活性を有する。PBD二量体は、主にそれらの生物学的活性を担うパリンドローム5'-Pu-GATC-Py-3'鎖間架橋などの配列選択的DNA損傷につながると考えられている。これらの化合物は非常に有用な細胞毒性剤およびADC向けの良好な薬物候補になることが示されている。
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【００９５】
本発明において用いることができるなおさらに別の好ましい薬物はPNU-159682またはその誘導体である。PNU-159682はヒト肝臓ミクロソームにおけるネモルビシンの主な活性代謝産物であり、活性はMMDXおよびドキソルビシンと比較して3000倍大きい。
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【００９６】
別の局面では、薬物は上記のカテゴリに限定されず、ADCで用い得る全てのものを含む。特に、薬物は、上のD1〜D12に示される構造を有する細胞毒素のように、リンカーのアミド結合を通じて、例えば、有する塩基性アミン(一級または二級アミン)を通じてリンカーと配位することができる細胞毒素を含んでもよい。
【００９７】
細胞内での薬物放出メカニズムによれば、「リンカー」または「ADCリンカー」という用語は切断不可能なリンカーおよび切断可能なリンカーという2つのタイプに分類することができる。
【００９８】
切断不可能なリンカーを有するADCについては、薬物放出メカニズムは次の通りである。抗原と結合した後にADCが細胞内に取り込まれると、Abはリソソーム内で酵素的に消化され、小分子薬物、リンカー、および抗体のアミノ酸残基で構成される活性分子の放出をもたらす。薬物の分子構造におけるこの変化は薬物の細胞毒性を低下させるものではない。しかしながら、そのような活性分子は電荷を有しており(アミノ酸残基によって)、近接する細胞に拡散することができない。それ故、そのような活性薬物は標的抗原を発現していない近傍の腫瘍細胞、すなわち抗原陰性細胞を殺す(バイスタンダー効果)ことはできない。
【００９９】
切断可能なリンカーは、その名前が暗示するように、標的細胞内で切断され得、次いで活性薬物(小分子薬物自体)が放出される。切断可能なリンカーは、化学的に不安定なリンカーと酵素に不安定なリンカーという2つの主なグループに分類することができる。化学的に不安定なリンカーは血漿と細胞質との間の異なる特性に応じて選択的に切断され得る。そのような特性はpH値、グルタチオン濃度などが含まれる。pH感受性リンカーは一般に酸切断性リンカーと呼ばれる。それらは血液の中性環境(pH7.3〜7.5)中では比較的安定であるが、弱酸性エンドソーム(pH5.0〜6.5)およびリソソーム(pH4.5〜5.0)においては加水分解されると考えられる。第一世代のADCは、ヒドラゾン、カーボネート、アセタール、ケタールなどのようなこれらの種類のリンカーを主に用いていた。しかしながら、酸切断性リンカーの血漿安定性は限定的であるため、これらのリンカーに基づいたADCは半減期が比較的短い(2〜3日)。半減期がより短いことは、新世代のADCにおけるpH感受性リンカーの適用をある程度妨げる。
【０１００】
グルタチオン感受性リンカーはジスルフィド結合リンカーとも呼ばれる。そのようなリンカーに基づいたADCの薬物放出は、細胞内の高濃度のグルタチオン(ミリモル範囲)と血中の比較的低濃度のグルタチオン(マイクロモル範囲)との間の差に起因する。これは、低酸素状態が還元酵素の活性の増強、したがってさらに高いグルタチオン濃度をもたらす腫瘍細胞に特に当てはまる。ジスルフィド結合は熱力学的に安定しているので、血漿中で良好な安定性を呈する。
【０１０１】
ペプチドリンカーなどの酵素不安定リンカーは薬物放出のより良好な制御を達成することができる。ペプチドリンカーは、特定の腫瘍組織において高レベルで存在するカテプシンBまたはプラスミンのようなリソソームプロテアーゼによって効果的に切断することができる。好ましくないpHおよび血清プロテアーゼインヒビターによる抑制のために細胞外ではプロテアーゼは通常活性ではないため、この種類のペプチドリンカーは循環血漿中では非常に安定であると考えられている。高い血漿安定性ならびに良好な細胞内切断選択性および効率により、酵素不安定リンカーがADCにおける切断可能なリンカー候補として広く選択されている。典型的な酵素不安定リンカーはVal-Cit(vc)、Phe-Lysなどを含む。
【０１０２】
自壊性リンカーは、概して、切断可能なリンカーと活性薬物との間に挿入されるか、またはそれ自体が切断可能なリンカーの一部となる。自壊性リンカーの作用機構としては、切断可能なリンカーが適切な条件下で切断されると、自発的に構造の再編成を起こしてこれに結合した活性薬物を放出することができる。一般的な自壊性リンカーはp-アミノベンジルアルコール(PAB)およびβ-グルクロニドなどを含む。
【０１０３】
リンカー
本発明のリンカーまたはカップリング試薬はジアリールチオマレアミド単位およびカップリング基を含む。ジアリールチオマレアミド単位は抗体の鎖間でスルフヒドリルと架橋するために用いられる(還元時に)が、カップリング基は小分子薬物または薬物-リンカー単位とカップリングするために用いられる。単座リンカーを備えた従来のADCと比較して、本発明のADCは均質であり、ジアリールチオマレアミド単位と抗体中の開裂したシステイン-システインジスルフィド結合の2個の硫黄原子との間の二座結合のためにより高い安定性を有する。この点で、本発明のADCは増加したインビボ半減期を有し、全身に放出される細胞毒素の量が減少し、単座リンカーを備えたADCよりも安全な薬物特性を有すると考えられる。
【０１０４】
別の局面では、薬物-リンカー単位はリンカーを介して抗体に結合され得、部分的に鎖間架橋した複合体を生成する。従来のものと比較して、本発明の方法によって調製される抗体薬物複合体はDAR分布がはるかに狭いので、構造的および薬理学的な均質性が大幅に向上されている。
【０１０５】
このようにして作製されたADCは目的の細胞集団、例えば腫瘍細胞への薬物の標的指向送達に用いることができる。抗体薬物複合体は細胞表面タンパク質に特異的に結合し、結合した複合体は細胞内に迅速に取り込まれると考えられる。一旦取り込まれると、薬物は活性形態で放出され、効果を生じると考えられる。抗体はキメラ、ヒト化、またはヒト抗体；抗原に結合することができる抗体断片；またはFc融合タンパク質；またはタンパク質を含む。「薬物」は非常に強力な薬物であり(定義を参照されたい)、場合によってはポリエチレングリコールであり得る。
【０１０６】
抗体-薬物複合体
本発明において提供される抗体-薬物複合体は抗体、リンカー、および薬物によって構成される。リンカーは切断可能なリンカーまたは切断不可能なリンカーであり得る。
【０１０７】
抗体は、薬物-リンカーの複合体化に利用可能な一連のアミノ酸を有する球状タンパク質である。抗体の三次構造および四次構造により、溶媒露出アミノ酸のみが複合体化できると考えられる。実際に、抗体への高収率な複合体化はリジン残基のε-アミノ基においてかまたはシステイン残基のスルフヒドリル基において起こることが多い。
【０１０８】
抗体のタンパク質表面における多数のリジン側鎖は薬物複合体化のための複数の連結部位を与え、これは異なる量の複合体化薬物(薬物対抗体比、DAR)および複合体化部位を含有するADCの混合物をもたらす。
【０１０９】
依然として混合物ではあるが、発明によって提供される複合体生成物は、従来から生成される抗体薬物複合体と比較してDAR分布がはるかに狭い。得られる平均DARは、ADCの2〜4の最適DAR範囲内で4に近い。さらに、複合体化生成物は細胞の死滅には有効ではない裸抗体(DAR＝0)を含有しないかまたは最小限含有する。また、複合体化生成物は、DAR値が低いものよりも迅速に解かれることになる高度に複合体化した抗体(DAR＝8)を含有しない。その結果、本発明において提供されるADC生成物ははるかに向上した均質性を示す。
【０１１０】
抗体-薬物複合体を調製するための方法
抗体-薬物複合体の合成スキームを以下に示し、該合成スキームからは、抗体における鎖間ジスルフィド結合が還元されて8個のスルフヒドリル基が生じ、次いで置換マレアミドリンカー薬物複合体が還元抗体のスルフヒドリル基と架橋されて、対応する抗体薬物複合体を形成することが分かる。得られる抗体薬物複合体は以下に示される一方または両方の形態で存在する。
2020510677.tif 000044
【０１１１】
抗体原液を緩衝液で2〜10mg/mLまで希釈し、次いで140〜200倍過剰モル比のジチオスレイトール(DTT)または6.0〜20倍過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP)をそれに加え、得られた反応液を10〜35℃で2〜48時間撹拌する；本明細書において、用いられる緩衝液は以下の割合で調製される緩衝液であり得る：50mMリン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム(KH2PO4-NaOH)/150mM塩化ナトリウム(NaCl)/1mMジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH6〜9;50mMリン酸水素二ナトリウム-クエン酸/150mM塩化ナトリウム(NaCl)/1mMジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH6〜9;50mMホウ酸-ホウ砂/150mM塩化ナトリウム(NaCl)/1mMジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH6〜9;50mMヒスチジン-水酸化ナトリウム/150mM塩化ナトリウム(NaCl)/1mMジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH6〜9;およびPBS/1mMジエチレントリアミン五酢酸(DTPA)、pH6〜9。
【０１１２】
上から得られた反応液を0〜10℃まで冷却し；ジチオスレイトール(DTT)が還元試薬として用いられる場合には、生成物に脱塩カラムを通過させるかまたは生成物を限外ろ過に供することによって過剰の還元試薬を除去し、次いで置換マレアミド化合物(10mg/ml、アセトニトリル(ACN)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド(DMF)またはジメチルアセトアミド(DMA)に前もって溶解される)をそれに加える。反応液中の有機溶媒を確実に15体積％以下にする。得られる反応液をカップリングのために0〜37℃で2〜4時間撹拌する。さらに、TCEPが還元のために用いられる場合には、過剰のTCEPを除去する必要なく置換マレアミド化合物を直接加えることによってカップリング反応を行うことができる。
【０１１３】
カップリング反応後の反応液はコハク酸ナトリウム/NaCl緩衝液またはヒスチジン-酢酸/スクロースゲルを用いるろ過によって精製され、次いでUV280紫外線吸収値にしたがって、吸収ピークにおける試料を集める。あるいは、得られる生成物を低温で保存する前に、反応液を数回限外ろ過に供し、次いでろ過によって滅菌する。好ましくは、保存温度は-100〜-60℃であり；より好ましくはろ過に用いる装置の細孔径は0.15〜0.3μmである。
【０１１４】
得られる抗体薬物複合体は均質な薬物対抗体比(DAR)を有する。一方で、ある程度均質性が異なる抗体薬物複合体もまた本発明の異なる置換マレアミドリンカーを用いて調製することによって得ることができる。より良好な均質性を有する複合体が所望される場合には、得られる抗体薬物複合体を疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、およびイオン交換クロマトグラフィー(IEC)より非限定的に選択される方法によってさらに単離し精製することができる。
【０１１５】
薬学的組成物およびその投与方法
本発明によって提供される抗体-薬物複合体は特定の細胞集団を標的としかつ細胞表面の特定のタンパク質(抗原)に結合し得、これによって複合体のエンドサイトーシスまたは薬物浸潤を通じて薬物を活性形態で細胞内に放出する。よって、発明の抗体-薬物複合体は目的の疾患を治療するために用いることができ、上記の抗体-薬物複合体は治療有効量で適切な経路により対象(例えばヒト)に投与することができる。治療を必要とする対象は、特定の抗原の活性または発現量に関連する症状を有する危険性があるかまたはそれを有することが疑われる患者であり得る。そのような患者は定期健康診断によって特定することができる。
【０１１６】
医学の当業者には公知である従来の方法を用いて、治療すべき疾患のタイプまたは疾患が位置する場所に応じて、薬学的組成物を対象に投与することができる。そのような組成物は他の従来の経路を介して投与する、例えば、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、口腔内的に、経膣的に、または移植リザーバを介して投与することもできる。本明細書において用いる「非経口」という用語は皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内注射または注入技術を含む。さらに、1、3、または6ヶ月のデポー注射が可能なまたはその期間で生分解可能な材料および方法を用いるなどのデポー注射可能投与経路を介して対象に投与することができる。
【０１１７】
注射可能な組成物は植物油、ジメチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド、乳酸エチル、炭酸エチル、ミリスチン酸イソプロピル、エタノール、およびポリオール(グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)などの様々な担体を含有してもよい。静脈内注射には、水溶性抗体は滴下法によって投与することができ、滴下法によって抗体および生理学的に許容される賦形剤を含有する薬学的製剤が注入される。生理学的に許容される賦形剤は、例えば、5％デキストロース、0.9％食塩水、リンゲル液または他の適切な賦形剤を含んでもよい。筋肉内調製物、例えば、抗体の適切な可溶性塩形態の滅菌製剤は、注射用水、0.9％食塩水、または5％グルコース溶液などの薬学的賦形剤に溶解して投与することができる。
【０１１８】
本明細書に記載の抗体薬物複合体が治療剤として用いられる場合、当技術分野における通常の方法によって送達することができる。例えば、リポソーム、ヒドロゲル、シクロデキストリン、生分解性ナノカプセル、または生体接着性ミクロスフェアを用いて細胞に導入することができる。あるいは、直接的な注射によってまたは注入ポンプの使用によって核酸またはベクターを局所的に送達することができる。他のアプローチは複合体および生分解性ポリマーの使用を通じた様々な輸送および担体システムを採用することを含む。
【０１１９】
本発明の薬学的組成物は、安全かつ有効な量の本発明の抗体-薬物複合体と薬学的に許容される担体とを含有する。そのような担体は食塩水、緩衝液、グルコース、水、グリセロール、エタノール、およびこれらの組み合わせを非限定的に含む。概して、薬学的調製物は投与方法と適合しているべきであり、本発明の薬学的組成物は注射剤として調製することができ、例えば、グルコースと他のアジュバントとを含有する生理食塩水または水溶液を用いて通常の方法によって調製することができる。薬学的組成物は好ましくは無菌条件下で製造される。活性成分の投与用量は治療有効量である。
【０１２０】
本発明の抗体-薬物複合体の有効量は投与の様式および治療すべき疾患の重症度に応じて異なる場合がある。好ましい有効量の選択は様々な要因に基づいて当業者によって決定することができる(例えば、臨床試験によって)。そのような要因は、バイオアベイラビリティ、代謝、半減期などの本発明の二官能性抗体複合体の薬物動態学的パラメータ；患者において治療すべき疾患の重症度、患者の体重、および患者の免疫状態、投与の経路などを非限定的に含む。概して、本発明の抗体-薬物複合体を1日に動物の体重1kgあたり約0.0001mg〜50mg(好ましくは動物の体重1kgあたり0.001mg〜10mg)の用量で投与すると、満足のいく結果を得ることができる。例えば、治療状況によっては緊急性に応じて、いくつかの別々の用量を毎日投与してもよいし、または用量を比例的に減少させてもよい。
【０１２１】
局所投与には本発明の化合物の剤形は軟膏、粉末、パッチ、エアゾール、および吸入剤を含む。活性成分は、無菌条件下で、生理学的に許容される担体および、必要に応じて任意の防腐剤、緩衝剤、または噴射剤と混合される。
【０１２２】
発明の化合物は、単独で、または他の薬学的に許容される治療薬と組み合わせて投与することができる。
【０１２３】
薬学的組成物を用いる場合、安全かつ有効な量の本発明の化合物を、それを必要とする哺乳類(ヒトなど)に適用し、ここで、適用される量は薬学的に有効な量である。体重60kgの人には、1日量は通常1〜2000mg、好ましくは5〜500mgである。もちろん、具体的な用量は投与の経路、患者の健康状態などの他の要因に応じても異なるべきであり、これは熟練した医師が有する技能の範疇である。
【０１２４】
実験は本発明の主な利点が以下の通りであることを示した：
1.本発明によって提供される新規なリンカーは簡単な化学的方法を通じて抗体とカップリングでき、リンカーを用いることによって得られる複合体のDAR分布は従来のものと比較して非常に狭い。この点で、本発明によって得られる複合体は、分布が一様(DARが4)な複合体が80％超を占める高い均質性を有する。
【０１２５】
2.本発明によって提供される複合体のうち、裸抗体または架橋度が低いADCはほぼ0パーセントを占める(DARが0または1の成分は質量分析では検出されない)。
【０１２６】
3.出願人は、本発明によって提供される抗体-薬物複合体が腫瘍を治療する際に安全かつ効果的であることを多数の実験で実証した。複合体化したエチレングリコールによって付与される親水性は生体分子特性を調節するために用いることができ；従来のmcVC-PAB複合体と比較して、本発明の複合体は、インビトロでの腫瘍細胞増殖に対する抑制活性、生物学的活性、薬物代謝安定性、安全性、および他のドラッガビリティが向上または維持されている。
【０１２７】
4.部位特異的複合体化部位を導入する目的での各抗体に対する面倒な組換えおよび修飾を行うことを回避することができる本発明によって提供される複合体化方法はほとんどの抗体に適しているので、広範な適用可能性を有する。
【０１２８】
5.先行技術における複合体化方法と比較して、本発明のジスルフィド結合ブリッジのためのマレアミド系架橋剤を用いる複合体化方法は架橋速度が速く、架橋反応が2〜4時間以内に完了し得るという利点を有する。
【０１２９】
6.マレアミド系ジスルフィド結合ブリッジはよりよい安定性を有し、骨格内でスルフヒドリル-エーテル交換しにくい傾向がある。さらに、非置換フェニルと比較して、Ar'への置換基の導入は、マレイミド環の開裂の後に起きる第二の加水分解反応を大きく減速させることができ、これによってインビトロおよびインビボにおける抗体-薬物複合体の安定性がさらに増強される。
【０１３０】
本発明を特定の実施例を参照して下にさらに説明する。これらの実施例は単に発明を説明するためのものであり、発明の範囲を限定しないことを理解されたい。以下の実施例における任意の実験方法が詳細な実験条件によって特定されていない場合には、通常の条件または製造業者によって推奨される条件に適合されたい。特に明記しない限り、部およびパーセントは重量基準で計算される。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１】図1は比較のためのペルツズマブおよびペルツズマブ薬物複合体の疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)のクロマトグラムを示す。
【図２】図2は比較のためのペルツズマブおよびペルツズマブ薬物複合体のマススペクトルのクロマトグラムを示す。
【図３】図3はNCI-N87細胞表面の抗原Her2に対するADC-2、P-mcVC-MMAE、およびペルツズマブの結合の実験結果を示す。
【図４】図4はヒト乳がん細胞SK-BR-3に対するADC-2、P-mcVC-MMAE、Kadcyla、およびペルツズマブの増殖抑制の実験結果を示す。
【図５】図5はヒト乳がん細胞BT-474に対するADC-2、P-mcVC-MMAE、Kadcyla、およびペルツズマブの増殖抑制の実験結果を示す。
【図６】図6はヒト胃がん細胞N87に対するADC-2、P-mcVC-MMAE、Kadcyla、およびペルツズマブの増殖抑制の実験結果を示す。
【図７】図7はSKOV-3ヒト卵巣がん細胞、Du-145ヒト前立腺がん細胞、およびPanc-1ヒト膵臓がん細胞に対するADC-2の増殖抑制の実験結果を示す。
【図８】図8はヒト乳がん細胞MCF-7、MDA-MB-231、およびMDA-MB-468に対するADC-2の増殖抑制の実験結果を示す。
【図９−１】図9-1はヒト胃がん細胞N87に対するADC-4の増殖抑制の実験結果を示す。
【図９−２】図9-2はCalu-3ヒト肺がん細胞に対するADC-2、ADC-3、およびADC-4の増殖抑制の実験結果を示す。
【図１０】図10はヌードマウスにおけるヒト胃がんNCI-N87皮下異種移植腫瘍に対するADC-2、ADC-3、P-mcVC-MMAE、およびKadcylaの抑制活性に関する研究結果を示す。
【図１１−１】図11-1はペルツズマブの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)のクロマトグラムを示す。
【図１１−２】図11-2はペルツズマブ-薬物複合体ADC-Iの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)のクロマトグラムを示す。
【図１１−３】図11-3はペルツズマブ-薬物複合体ADC-IIの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)のクロマトグラムを示す。
【図１１−４】図11-4はペルツズマブ-薬物複合体ADC-IIIの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)のクロマトグラムを示す。
【図１１−５】図11-5はペルツズマブ-薬物複合体ADC-IVの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)のクロマトグラムを示す。
【図１１−６】図11-6はペルツズマブ-薬物複合体ADC-Vの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)のクロマトグラムを示す。
【図１１−７】図11-7はペルツズマブ-薬物複合体ADC-VIの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)のクロマトグラムを示す。
【図１１−８】図11-8はペルツズマブ-薬物複合体ADC-VIIの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)のクロマトグラムを示す。
【図１２−１】図12-1はトラスツズマブの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)のクロマトグラムを示す。
【図１２−２】図12-2はトラスツズマブ-薬物複合体ADC-VIIIの疎水性相互作用クロマトグラフィー(HIC)のクロマトグラムを示す。
【図１３−１】図13-1はペルツズマブのマススペクトルのクロマトグラムを示す。
【図１３−２】図13-2はペルツズマブ-薬物複合体ADC-Iのマススペクトルのクロマトグラムを示す。
【図１３−３】図13-3はペルツズマブ-薬物複合体ADC-IIのマススペクトルのクロマトグラムを示す。
【図１３−４】図13-4はペルツズマブ-薬物複合体ADC-IIIのマススペクトルのクロマトグラムを示す。
【図１３−５】図13-5はペルツズマブ-薬物複合体ADC-IVのマススペクトルのクロマトグラムを示す。
【図１３−６】図13-6はペルツズマブ-薬物複合体ADC-Vのマススペクトルのクロマトグラムを示す。
【図１３−７】図13-7はペルツズマブ-薬物複合体ADC-VIのマススペクトルのクロマトグラムを示す。
【図１３−８】図13-8はペルツズマブ-薬物複合体ADC-VIIのマススペクトルのクロマトグラムを示す。
【図１４−１】図14-1はトラスツズマブのマススペクトルのクロマトグラムを示す。
【図１４−２】図14-2はトラスツズマブ-薬物複合体ADC-VIIIのマススペクトルのクロマトグラムを示す。
【図１５】図15は室温で0〜7日目にLC-MS(Q-TOF)を用いて検出されたADC対照、ADC-I、ADC-II、およびADC-VIIによって生成された第二加水分解物の傾向チャートを示す。
【図１６−１】図16-1は室温で0日目のADC対照のHICクロマトグラムを示す。
【図１６−２】図16-2は室温で2日目のADC対照のHICクロマトグラムを示す。
【図１６−３】図16-3は室温で4日目のADC対照のHICクロマトグラムを示す。
【図１６−４】図16-4は室温で7日目のADC対照のHICクロマトグラムを示す。
【図１７−１】図17-1は室温で0日目のADC-IのHICクロマトグラムを示す。
【図１７−２】図17-2は室温で2日目のADC-IのHICクロマトグラムを示す。
【図１７−３】図17-3は室温で4日目のADC-IのHICクロマトグラムを示す。
【図１７−４】図17-4は室温で7日目のADC-IのHICクロマトグラムを示す。
【図１８−１】図18-1は室温で0日目のADC-IIのHICクロマトグラムを示す。
【図１８−２】図18-2は室温で2日目のADC-IIのHICクロマトグラムを示す。
【図１８−３】図18-3は室温で4日目のADC-IIのHICクロマトグラムを示す。
【図１８−４】図18-4は室温で7日目のADC-IIのHICクロマトグラムを示す。
【図１９−１】図19-1は室温で0日目のADC-VIIのHICクロマトグラムを示す。
【図１９−２】図19-2は室温で2日目のADC-VIIのHICクロマトグラムを示す。
【図１９−３】図19-3は室温で4日目のADC-VIIのHICクロマトグラムを示す。
【図１９−４】図19-4は室温で7日目のADC-VIIのHICクロマトグラムを示す。
【図２０】図20はヒト胃がん細胞NIC-N87に対するADC-I、ADC-II、ADC-III、ADC-IV、ADC-V、ADC-VI、ADC-VII、およびペルツズマブ(Perjeta)の増殖抑制の実験結果を示す。
【図２１】図21はヒト乳がん細胞BT-474に対するADC-I、ADC-II、ADC-III、ADC-IV、ADC-V、ADC-VI、ADC-VII、およびペルツズマブ(Perjeta)の増殖抑制の実験結果を示す。
【図２２】図22はヒト胃がん細胞NIC-N87に対するADC-VIIIおよびトラスツズマブ(Herceptin)の増殖抑制の実験結果を示す。
【図２３】図23はヒト乳がん細胞BT-474に対するADC-VIIIおよびトラスツズマブ(Herceptin)の増殖抑制の実験結果を示す。
【図２４】図24はヌードマウスにおけるヒト胃がんNCI-N87皮下異種移植腫瘍に対するP-mcVC-MMAE(1.0mg/kg)、ADC対照(0.5、1.0mg/kg)、ADC-I(1.0mg/kg)、ADC-IV(1.0mg/kg)、ADC-V(1.0mg/kg)、ADC-VI(1.0mg/kg)、およびADC-VII(0.5、1.0mg/kg)の抑制活性に関する研究結果示す。
【発明を実施するための形態】
【０１３２】
態様の詳細な説明
発明者らは、鋭意検討した後に、全体的または部分的に抗体の軽鎖-重鎖および重鎖-重鎖とクロスカップリングすることができるある種のリンカーを見出した。さらに、従来の抗体薬物複合体と比較して、上の複合体化方法によって得られる抗体薬物複合体はより狭い薬物対抗体比(DAR)分布を有する。上の知見に基づいて発明者らは本発明を完成した。
【実施例】
【０１３３】
一具体的設計：式Iaに示される置換マレアミドリンカーの調製および使用、式中、Ar'は、非置換C6〜C10アリーレンおよび非置換5〜12員ヘテロアリーレンからなる群より選択される。
2020510677.tif 000045
【０１３４】
セクション1：リンカーの合成および調製方法
解決法1：
本発明の第1の局面において提供される、式Iaに示される置換マレアミドリンカーは、解決法1に列挙される方法によって合成することができる。すなわち、中間体Bを、n-エチレングリコールとフルオロニトロベンゼン（ここでは、続いてニトロが還元されてアミノ化合物Cが生成される）との置換反応によって得ることができる。中間体Dを、2,3-ジブロモマレイミドとアリールチオフェノールとの間の置換反応によって得ることができ、次いでクロロギ酸メチルと反応させて中間体Eを生成する。あるいは、2,3-ジブロモマレイミドを、クロロギ酸メチルと直接反応させて中間体E'を生成することができる。中間体Cを中間体Eまたは中間体E'と反応させてリンカーFを生成する。合成スキームおよび特定の例は以下の通りである：
2020510677.tif 000046
【０１３５】
実施例1：式1〜12で示される化合物の合成および調製
1.1  化合物F-1（式1）の合成
1.1.1  中間体B-1の合成（工程a）
2020510677.tif 000047
【０１３６】
4-フルオロニトロベンゼン（10.0 g、0.071 mol）、ジエチレングリコール（75.2 g、0.71 mol）、および炭酸カリウム（14.7 g、0.11 mol）を計量し、250 mLの丸底フラスコに入れ、窒素雰囲気下、80℃で22時間攪拌した。次に、得られた混合物を、室温までゆっくりと冷却し、ジクロロメタンで抽出し、1mol/Lの希塩酸、水、および飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。残留物をカラムクロマトグラフィーにかけ（シリカゲル、200〜300メッシュ、PE/EtOAc 10：1）、淡黄色の透明な液体の生成物を得た（15.1g、収率94%）。LC-MS（M+）の理論値：227.08、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：228.12。
【０１３７】
1.1.2  中間体C-1の合成（工程b）
2020510677.tif 000048
【０１３８】
中間体B-1（3.0 g、9.52mmol）をアセトン（30 mL）に溶解し、氷水で冷却し、次に、新しく調製したジョーンズ試薬（15 mL）をこれにゆっくりと滴下した。得られた反応混合物を室温で3時間攪拌し、氷水で冷却し、次に、これにイソプロパノールをゆっくりと滴下し、その後、氷水浴中で15分間攪拌した。続いて、有機溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。水相をジエチルエーテルで3回抽出し、次に、有機相を混合し、飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、残っている溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。得られた黄色油状粗生成物は精製せずに、次の工程に直接使用した。
【０１３９】
得られた粗生成物をテトラヒドロフラン（30mL）に溶解し、次に、これに10%パラジウム炭素（300mg）を加え、30℃で6時間水素添加した。吸引ろ過により触媒を除去した後、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させ、黄褐色の油状の粗生成物を得た。粗生成物は精製せずに、次の工程に直接使用した。LC-MS（M+）の理論値：211.08、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：212.05。
【０１４０】
1.1.3  中間体D-1の合成（工程c）
2020510677.tif 000049
【０１４１】
2,3-ジブロモマレイミド（7.0 g、27.69 mmol）をメタノール（80 mL）に溶解し、これに、酢酸ナトリウム（4.5 g、55.4 mmol）およびチオフェノール（11.3 mL、110.7 mmol）を加えた。得られた反応混合物を、室温で30分攪拌し、次に有機溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。残留物を、ジクロロメタンで抽出し、水および飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次に、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。得られた粗生成物を石油エーテル/酢酸エチルで共結晶化させ、吸引ろ過し、乾燥して、鮮黄色の固体D-1を得た（6.5g、収率75%）。
【０１４２】
1.1.4  中間体E-1の合成（工程d）
2020510677.tif 000050
【０１４３】
中間体D-1（3.0 g、9.6 mmol）およびN-メチルモルホリン（1.37 mL、12.5 mmol）を酢酸エチル（40 mL）に溶解し、氷水中で冷却し、次に、クロロギ酸メチル（1.11 mL、14.4 mmol）をこれにゆっくりと滴下した。反応混合物を室温で30分間攪拌した後、酢酸エチルで希釈し、水を加えて抽出し、水および飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。得られた粗生成物を石油エーテル/酢酸エチルで共結晶化させ、吸引ろ過し、乾燥して、鮮黄色の固体E-1を得た（3.5 g、収率98%）。
【０１４４】
1.1.5  中間体F-1の合成（工程e）
2020510677.tif 000051
【０１４５】
中間体C-1（2.0 g、9.5 mmol）を無水ジクロロメタン（40 ml）に溶解し、次に、中間体E-1（3.5 g、9.5 mmol）をこれに加えた。窒素雰囲気下、得られた反応混合物を室温で24時間攪拌した。反応混合物にシリカゲル（12 g、200-300 メッシュ）を添加した後、室温で一晩攪拌した。次に、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させ、残留物を乾燥カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、200〜300メッシュ、ジクロロメタン/メタノール 10:1）にかけ、オレンジ色の油状生成物であるF-1を得た（4.1 g、収率85%）。LC-MS（M+）の理論値：507.08、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：508.11。
【０１４６】
1.2  化合物F-2（式2）の合成
2020510677.tif 000052
【０１４７】
工程aにおいてジエチレングリコールをトリエチレングリコールに変えた以外は、実施例1.1の化合物F-1の合成と同様の工程で、化合物F-2を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-2は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：551.11、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：552.13。
【０１４８】
1.3  化合物F-3（式3）の合成
2020510677.tif 000053
【０１４９】
工程aにおいてジエチレングリコールをテトラエチレングリコールに変えた以外は、実施例1.1の化合物F-1の合成と同様の工程で、化合物F-3を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-3は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：595.13、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：596.14。
【０１５０】
1.4  化合物F-4（式4）の合成
2020510677.tif 000054
【０１５１】
工程aにおいてジエチレングリコールをペンタエチレングリコールに変えた以外は、実施例1.1の化合物F-1の合成と同様の工程で、化合物F-4を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-4は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：639.16、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：640.18。
【０１５２】
1.5  化合物F-5（式5）の合成
2020510677.tif 000055
【０１５３】
工程aにおいてジエチレングリコールをヘキサエチレングリコールに変えた以外は、実施例1.1の化合物F-1の合成と同様の工程で、化合物F-5を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-5は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：683.19、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：684.21。
【０１５４】
1.6  化合物F-6（式6）の合成
2020510677.tif 000056
【０１５５】
工程aにおいてジエチレングリコールをオクタエチレングリコールに変えた以外は、実施例1.1の化合物F-1の合成と同様の工程で、化合物F-6を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-6は、橙黄色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：771.24、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：772.26。
【０１５６】
1.7  化合物F-7（式7）の合成
2020510677.tif 000057
【０１５７】
工程aにおいてジエチレングリコールをデカエチレングリコールに変えた以外は、実施例1.1の化合物F-1の合成と同様の工程で、化合物F-7を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-7は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：895.29、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：896.31。
【０１５８】
1.8  化合物F-8（式8）の合成
2020510677.tif 000058
【０１５９】
工程cにおいてチオフェノールをp-メチルチオフェノールに変えた以外は、実施例1.3の化合物F-3の合成と同様の工程で、化合物F-8を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-8は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：623.16、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：624.18。
【０１６０】
1.9  化合物F-9（式9）の合成
2020510677.tif 000059
【０１６１】
工程cにおいてチオフェノールをp-メトキシチオフェノールに変えた以外は、実施例1.3の化合物F-3の合成と同様の工程で、化合物F-9を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-9は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：655.15、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：656.17。
【０１６２】
1.10  化合物F-10（式10）の合成
2020510677.tif 000060
【０１６３】
工程cにおいてチオフェノールを4-(N-メチルホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.3の化合物F-3の合成と同様の工程で、化合物F-10を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-10は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：709.18、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：710.23。
【０１６４】
1.11  化合物F-11（式11）の合成
2020510677.tif 000061
【０１６５】
工程cにおいてチオフェノールを2-メルカプトピリジンに変えた以外は、実施例1.3の化合物F-3の合成と同様の工程で、化合物F-11を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-11は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：597.12、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：598.13。
【０１６６】
1.12  化合物F-12（式12）の合成
2020510677.tif 000062
【０１６７】
工程cにおいてチオフェノールを2-メルカプトピリミジンに変えた以外は、実施例1.3の化合物F-3の合成と同様の工程で、化合物F-12を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-12は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：599.11、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：600.13。
【０１６８】
1.13  化合物F-13（式13）の合成
2020510677.tif 000063
【０１６９】
工程aにおいて4-フルオロニトロベンゼンを3-フルオロニトロベンゼンに変えた以外は、実施例1.3の化合物F-3の合成と同様の工程で、化合物F-13を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-13は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：595.13、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：596.15。
【０１７０】
1.14  化合物F-14（式14）の合成
2020510677.tif 000064
【０１７１】
工程eにおいて中間体E-1を中間体E’（臭素で置換）に変えた以外は、実施例1.3の化合物F-3の合成と同様の工程で、化合物F-14を合成した。4工程の反応後に得られた生成物F-14は、無色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：534.95、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：536.01。
【０１７２】
1.15  化合物F-15（式15）の合成
2020510677.tif 000065
【０１７３】
工程cにおいてチオフェノールを2-メルカプト-1-メチルイミダゾールに変えた以外は、実施例1.3の化合物F-3の合成と同様の工程で、化合物F-15を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-15は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：603.15、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：604.14。
【０１７４】
1.16  化合物F-16（式16）の合成
2020510677.tif 000066
【０１７５】
工程cにおいてチオフェノールを4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.3の化合物F-3の合成と同様の工程で、化合物F-16を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-16は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：821.23、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：822.21。
【０１７６】
1.17  化合物F-17（式17）の合成
2020510677.tif 000067
【０１７７】
工程cにおいてチオフェノールを4-(N-2-メトキシエチルホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.3の化合物F-3の合成と同様の工程で、化合物F-17を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-17は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：797.23、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：798.31。
【０１７８】
1.18  化合物F-18（式18）の合成
2020510677.tif 000068
【０１７９】
工程cにおいてチオフェノールを4-(N-メトキシ-N-メチルホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.3の化合物F-3の合成と同様の工程で、化合物F-18を合成した。5工程の反応後に得られた生成物F-18は、オレンジ色の油状生成物であった。LC-MS（M+）の理論値：769.20、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：770.28。
【０１８０】
式Iaで表される置換マレアミドリンカーは、下記スキームに示される方法によっても合成し得る。すなわち、n-エチレングリコールとフルオロニトロベンゼンとの間の置換反応により中間体Bを得て、次にtert-ブチルブロモ酢酸と反応させて中間体Zを生成させるか、あるいは、n-エチレングリコールをtert-ブチルブロモ酢酸と反応させ、次にフルオロニトロベンゼンとの別の置換反応を行うことによっても中間体Zを得ることができ、次に、中間体Zを還元して中間体Yを生成させる；2,3-ジブロモマレイミドとアリールチオフェノールとの置換反応により中間体Dを得て、次にクロロギ酸メチルと反応させて、中間体Eを生成させる；中間体Eを中間体Yと反応させて、中間体Xを得て、さらに、酸条件下で中間体Xのtert-ブチルエステルを除去してリンカーWを得ることができる。合成スキーム例は以下の通りである：
【０１８１】
2020510677.tif 000069
【０１８２】
解決法2：
本発明の第2の局面において提供される、式Ibに示される置換マレアミドリンカー−薬物複合体（式19〜式25）は、解決法2に列挙される合成スキームによって合成することができる。すなわち、化合物Fを、細胞毒性薬物CTD（市販のD1〜D11）と縮合および結合させて、式Gで表される一連の分子を得る。合成スキームおよび特定の実施例は以下の通りである：
2020510677.tif 000070
【０１８３】
実施例2：式19〜25に示される化合物の合成および調製
2.1  化合物G-1（式19）の合成
2020510677.tif 000071
【０１８４】
化合物F-3（200 mg、0.34 mmol）および化合物D1（220 mg、0.34 mmol）をN,N-ジメチルホルムアミド（10mL）に溶解し、次に、これに、1-エチル-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（EDCl）（77 mg、0.40 mmol）および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール（HOBT）（54 mg、0.40 mmol）を加えた。反応混合物を室温で一晩攪拌し、次に酢酸エチルで希釈し、水を添加して抽出した。水および飽和食塩水で順次洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、次に、ロータリーエバポレーターで溶媒を蒸発させた。得られた粗生成物をシリカゲルクロマトグラフィーカラム（ジクロロメタン/メタノール）を用いて単離、精製し、吸引ろ過して乾燥し、黄色無定形固体G-1を得た（3.5 g、収率98%）。LC-MS（M+）の理論値：1226.40、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1227.42。
【０１８５】
2.2  化合物G-2（式20）の合成
2020510677.tif 000072
【０１８６】
化合物D1を化合物D2に変えた以外は、実施例2.1の化合物G-1の合成と同様の工程で、化合物G-2を合成した。得られた生成物G-2は、黄色無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1294.63、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1295.64。
【０１８７】
2.3  化合物G-3（式21）の合成
2020510677.tif 000073
【０１８８】
化合物D1を化合物D3に変えた以外は、実施例2.1の化合物G-1の合成と同様の工程で、化合物G-3を合成した。得られた生成物G-3は、黄色非結晶固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1308.61、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1309.63。
【０１８９】
2.4  化合物G-4（式22）の合成
2020510677.tif 000074
【０１９０】
化合物D1を化合物D9に変えた以外は、実施例2.1の化合物G-1の合成と同様の工程で、化合物G-4を合成した。得られた生成物G-4は、黄色無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1302.41、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1303.43。
【０１９１】
2.5  化合物G-5（式23）の合成
2020510677.tif 000075
【０１９２】
化合物D1を化合物D6に変えた以外は、実施例2.1の化合物G-1の合成と同様の工程で、化合物G-5を合成した。得られた生成物G-5は、黄色無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1290.51、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1291.53。
【０１９３】
2.6  化合物G-6（式24）の合成
2020510677.tif 000076
【０１９４】
化合物D1を化合物D7に変えた以外は、実施例2.1の化合物G-1の合成と同様の工程で、化合物G-6を合成した。得られた生成物G-6は、黄色非結晶固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1274.44、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1275.45。
【０１９５】
2.7  化合物G-7（式25）の合成
2020510677.tif 000077
【０１９６】
化合物D1を化合物D11に変えた以外は、実施例2.1の化合物G-1の合成と同様の工程で、化合物G-7を合成した。得られた生成物G-7は、黄色無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1291.38、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1292.40。
【０１９７】
解決法3：
本発明の第2の局面において提供される、式Ibに示される置換マレアミドリンカー−薬物複合体（式26〜式49）は、解決法3に列挙される合成スキームによって合成することができる。すなわち、化合物Fを、ジペプチド/トリペプチド-PABリンカー（市販品）のアミノと縮合し、次に、ビス(p-ニトロフェニル)カーボネートで活性化した後、PAB基を細胞毒性薬物CTD（D1〜D11）と縮合および結合させて、式Kで表される一連の分子を得る。合成スキームおよび特定の例は以下の通りである：
2020510677.tif 000078
【０１９８】
3.1  化合物K-1（式26）の合成
3.1.1  中間体I-1の合成（工程f）
2020510677.tif 000079
【０１９９】
化合物F-3（2.0 g、3.36 mmol）を無水N,N-ジメチルホルムアミド（25 mL）に溶解し、次に、これに、窒素雰囲気下、EDCI(963 mg、5.04 mmol)、HOBt(681 mg、5.04 mmol)およびN-メチルモルホリン(1.11 ml、10.08 mmol)を順次加えた。反応混合物を窒素雰囲気下、室温で、20分間攪拌し、次に、これに化合物H-1(Val-Cit-PAB、1.91 g、5.04 mmol)を加えた。反応混合物を、窒素雰囲気下、室温で一晩攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させ、残留物を乾燥カラムクロマトグラフィーに通し（シリカゲル、200〜300メッシュ、DCM/MeOH 10:1）、オレンジ色の油状生成物であるI-1を得た（2.0g、収率62.2%）。LC-MS（M+）の理論値：956.34、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：957.37。
【０２００】
3.1.2  中間体J-1の合成（工程g）
2020510677.tif 000080
【０２０１】
化合物I-1（1.5 g、1.57 mmol）を無水N,N-ジメチルホルムアミド（10mL）に溶解し、次に、これに、窒素雰囲気下、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（0.52 mL、3.14 mmol）およびビス(p-ニトロフェニル)カーボネート（717 mg、2.335 mmol）を順次加えた。反応混合物を、室温で、15時間攪拌し、次に、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。残留物を乾燥カラムクロマトグラフィーに通し（シリカゲル、200〜300メッシュ、DCM/MeOH 10:1）、オレンジ色の油状生成物であるJ-1を得た（1.4 g、収率79.9%）。LC-MS（M+）の理論値：1121.35、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1122.37。
【０２０２】
3.1.3  中間体K-1の合成（工程h）
2020510677.tif 000081
【０２０３】
化合物J-1（0.5 g、0.52 mmol）を無水N,N-ジメチルホルムアミド（5mL）に溶解し、次に、これに、窒素雰囲気下、N,N-ジイソプロピルエチルアミン（0.172 mL、1.04）、HOBt (70 mg、0.52 mmol)および化合物D1 (340 mg、0.52 mmol)を順次加えた。反応混合物を、窒素雰囲気下、室温で、一晩攪拌し、次に、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。残留物を乾燥カラムクロマトグラフィーに通し（シリカゲル、200〜300メッシュ、DCM/MeOH 10:1）、黄色無定形固体であるK-1を得た（310 mg、収率36.33%）。LC-MS（M+）の理論値：1631.60、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1632.62。
【０２０４】
3.2  化合物K-2の合成（式27）
2020510677.tif 000082
【０２０５】
工程hにおいて化合物D1を化合物D2（モノメチルアウリスタチンE）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-2を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-2は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1699.83、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1610.85。
【０２０６】
3.3  化合物K-3の合成（式28）
2020510677.tif 000083
【０２０７】
工程fにおいて化合物F-3をF-5に変え、工程hにおいて化合物D1をD2（モノメチルアウリスタチンE）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-3を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-3は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1787.88、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1788.90。
【０２０８】
3.4  化合物K-4の合成（式29）
2020510677.tif 000084
【０２０９】
工程fにおいて化合物F-3をF-6に変え、工程hにおいて化合物D1をD2（モノメチルアウリスタチンE）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-4を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-4は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1875.93、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1876.95。
【０２１０】
3.5  化合物K-5の合成（式30）
2020510677.tif 000085
【０２１１】
工程fにおいて化合物F-3をF-7に変え、工程hにおいて化合物D1をD2（モノメチルアウリスタチンE）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-5を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-5は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1963.99、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1965.01。
【０２１２】
3.6  化合物K-6の合成（式31）
2020510677.tif 000086
【０２１３】
工程fにおいて化合物H-1をH-2（Val-Ala-PAB）に変え、工程hにおいて化合物D1をD2（モノメチルアウリスタチンE）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-6を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-6は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1613.78、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1614.80。
【０２１４】
3.7  化合物K-7の合成（式32）
2020510677.tif 000087
【０２１５】
工程fにおいて化合物H-1をH-3（Phe-Lys-PAB）に変え、工程hにおいて化合物D1をD2（モノメチルアウリスタチンE）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-7を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-7は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1718.84、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1719.86。
【０２１６】
3.8  化合物K-8の合成（式33）
2020510677.tif 000088
【０２１７】
工程fにおいて化合物H-1をH-4（Ala-Ala-Asn-PAB）に変え、工程hにおいて化合物D1をD2（モノメチルアウリスタチンE）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-8を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-8は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1699.79、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1700.80。
【０２１８】
3.9  化合物K-9の合成（式34）
2020510677.tif 000089
【０２１９】
工程fにおいて化合物H-1をH-5（D-Ala-Phe-Lys-PAB）に変え、工程hにおいて化合物D1をD2（モノメチルアウリスタチンE）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-9を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-9は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1789.88、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1790.90。
【０２２０】
3.10  化合物K-10の合成（式35）
2020510677.tif 000090
【０２２１】
工程hにおいて化合物D1をD3（モノメチルアウリスタチンF）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-10を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-10は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1713.81、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1714.83。
【０２２２】
3.11  化合物K-11の合成（式36）
2020510677.tif 000091
【０２２３】
工程hにおいて化合物D1をD4（モノメチルドラスタチン10、MMAD）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-11を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-11は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1752.80、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1753.82。
【０２２４】
3.12  化合物K-12の合成（式37）
2020510677.tif 000092
【０２２５】
工程hにおいて化合物D1をD5（ツブリシン誘導体1）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-12を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-12は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1506.59、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1507.61。
【０２２６】
3.13  化合物K-13の合成（式38）
2020510677.tif 000093
【０２２７】
工程hにおいて化合物D1をD6（ツブリシン誘導体2）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-13を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-13は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1695.71、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1696.73。
【０２２８】
3.14  化合物K-14の合成（式39）
2020510677.tif 000094
【０２２９】
工程hにおいて化合物D1をD6（クリプトフィシン誘導体）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-14を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-14は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1679.64、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1680.66。
【０２３０】
3.15  化合物K-15の合成（式40）
2020510677.tif 000095
【０２３１】
工程hにおいて化合物D1をD8（タルトブリン）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-15を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-15は、黄褐色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1455.65、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1456.67。
【０２３２】
3.16  化合物K-16の合成（式41）
2020510677.tif 000096
【０２３３】
工程hにおいて化合物D1をD9（PBDダイマー）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-16を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-16は、黄褐色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1707.61、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1708.63。
【０２３４】
3.17  化合物K-17の合成（式42）
2020510677.tif 000097
【０２３５】
工程hにおいて化合物D1をD10（デュオカルマイシン誘導体1）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-17を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-17は、黄褐色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1618.55、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1619.57。
【０２３６】
3.18  化合物K-18の合成（式43）
2020510677.tif 000098
【０２３７】
工程hにおいて化合物D1をD11（デュオカルマイシン誘導体2）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-18を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-18は、黄褐色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1696.58、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1697.60。
【０２３８】
3.19  化合物K-19の合成（式44）
2020510677.tif 000099
【０２３９】
工程hにおいて化合物D1をD12（PNU-159682誘導体）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-19を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-19は、黄褐色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1737.61、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1738.68。
【０２４０】
3.20  化合物K-20の合成（式45）
2020510677.tif 000100
【０２４１】
工程fにおいて中間体F-3を中間体F-14に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-20を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-20は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1639.64、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1640.61。
【０２４２】
3.21  化合物K-21の合成（式46）
2020510677.tif 000101
【０２４３】
工程fにおいて中間体F-3を中間体F-11に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-21を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-21は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1701.82、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1702.86。
【０２４４】
3.22  化合物K-22の合成（式47）
2020510677.tif 000102
【０２４５】
工程fにおいて中間体F-3を中間体F-16に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-22を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-22は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1925.92、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1926.88。
【０２４６】
3.23  化合物K-23の合成（式48）
2020510677.tif 000103
【０２４７】
工程fにおいて中間体F-3を中間体F-16に変え、工程hにおいて化合物D1を化合物D11（デュオカルマイシン誘導体2）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-23を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-23は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1848.64、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1849.58。
【０２４８】
3.24  化合物K-24の合成（式49）
2020510677.tif 000104
【０２４９】
工程fにおいて中間体F-3を中間体F-16に変え、工程hにおいて化合物D1を化合物D13（SN38誘導体）に変えた以外は、実施例3.1の化合物K-1の合成と同様の工程で、化合物K-24を合成した。3工程の反応後に得られた生成物K-24は、黄色の無定形固体であった。LC-MS（M+）の理論値：1714.64、LC-MS（ESI、M+H+）の実測値：1715.61。
【０２５０】
セクション2：抗体薬物複合体の調製および検出
実施例1：ADC-1の調製
pH7.4を有する、50mMのリン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム（KH2PO4-NaOH）／150mMの塩化ナトリウム（NaCl）／1mMのジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）反応緩衝液で、ペルツズマブ原液を5mg/mLに希釈し、次に、これに、6.0倍の過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を加えた。得られた反応液を35℃で10時間攪拌した。
【０２５１】
引き続いて、精製せずに、反応液を8℃まで冷却し、これに、適量のジメチルスルホキシド（DMSO）および6倍の過剰モル比の化合物G-2（10 mg/ml、DMSOに事前溶解）を加え、反応系のDMSOは15％以下の体積となるようにした。カップリングのため、得られた反応液を37℃で3時間攪拌した。
【０２５２】
カップリング反応の後、ヒスチジン-酢酸/スクロースゲル（pH6.0）を用いる脱塩カラムによるろ過により反応液を精製し、次に、UV280紫外線吸収値にしたがって、吸収ピークにおける試料を集めた。集めた試料を、細孔径0.15μmのろ過装置を通して滅菌し、得られた生成物を-60℃で保存した。
【０２５３】
実施例2：ADC-2の調製
pH7.4を有する、50mMのリン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム（KH2PO4-NaOH）／150mMの塩化ナトリウム（NaCl）／1mMのジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）反応緩衝液で、ペルツズマブ原液を5mg/mLに希釈し、次に、これに、10倍の過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を加えた。得られた反応液を10℃で4時間攪拌した。
【０２５４】
引き続いて、精製せずに、反応液を5℃まで冷却し、これに、適量のジメチルアセトアミド（DMA）および6倍の過剰モル比の化合物K-2（10 mg/ml、DMAに事前溶解）を加え、反応系のDMAは10％以下の体積となるようにした。カップリングのため、得られた反応液を25℃で2.5時間攪拌した。
【０２５５】
カップリング反応の後、ヒスチジン-酢酸/スクロースゲル（pH6.0）を用いる脱塩カラムによるろ過により反応液を精製し、次に、UV280紫外線吸収値にしたがって、吸収ピークにおける試料を集めた。集めた試料を、細孔径0.22μmのろ過装置を通して滅菌し、得られた生成物を-80℃で保存した。
【０２５６】
実施例3：ADC-3の調製
pH7.4を有する、50mMのリン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム（KH2PO4-NaOH）／150mMの塩化ナトリウム（NaCl）／1mMのジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）反応緩衝液で、ペルツズマブ原液を5mg/mLに希釈し、次に、これに、20倍の過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を加えた。得られた反応液を15℃で2時間攪拌した。
【０２５７】
引き続いて、精製せずに、反応液を10℃まで冷却し、これに、適量のアセトニトリル（ACN）および6倍の過剰モル比の化合物K-3（10 mg/ml、ACNに事前溶解）を加え、反応系のACNは10％以下の体積となるようにした。カップリングのため、得られた反応液を10℃で4時間攪拌した。
【０２５８】
カップリング反応の後、ヒスチジン-酢酸/スクロースゲル（pH6.0）を用いる脱塩カラムによるろ過により反応液を精製し、次に、UV280紫外線吸収値にしたがって、吸収ピークにおける試料を集めた。集めた試料を、ろ過により滅菌し、得られた生成物を低温で保存した。例えば、集めた試料を細孔径0.20μmのろ過装置を通して滅菌し、得られた生成物を-90℃で保存した。
【０２５９】
実施例4：ADC-4の調製
pH7.4を有する、50mMのリン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム（KH2PO4-NaOH）／150mMの塩化ナトリウム（NaCl）／1mMのジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）反応緩衝液で、ペルツズマブ原液を5mg/mLに希釈し、次に、これに、8倍の過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を加えた。得られた反応液を25℃で48時間攪拌した。
【０２６０】
引き続いて、精製せずに、反応液を0℃まで冷却し、これに、適量のジメチルホルムアミド（DMF）および6倍の過剰モル比の化合物K-4（10 mg/ml、DMFに事前溶解）を加え、反応系のDMFは8％以下の体積となるようにした。カップリングのため、得られた反応液を0℃で2時間攪拌した。
【０２６１】
カップリング反応の後、ヒスチジン-酢酸/スクロースゲル（pH6.0）を用いる脱塩カラムによるろ過により反応液を精製し、次に、UV280紫外線吸収値にしたがって、吸収ピークにおける試料を集めた。集めた試料を、細孔径0.3μmのろ過装置を通して滅菌し、得られた生成物を-100℃で保存した。
【０２６２】
実施例1で得られた生成物およびペルツズマブを、疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）（図1）および質量分析（図2）で比較した。その結果、本発明により提供されるリンカーを用いて得られた複合体は、極めて狭いDAR 値分布を有し、平均値は4に近かったことが示された。この点に関し、本発明により得られた複合体は、高い均質性を有し、単一分布（DARが4）を有する複合体が、80%を超える割合を占めている。mの値は、3.0〜4.2と特定された。実施例2〜4で得られた生成物を同じ方法で分析したところ、同じ結果が得られ、mは1.0〜5.0であった。
【０２６３】
セクション3：抗体薬物複合体の生物学的検出
1.  分子結合アッセイ
タンパク質の分子間親和性を検出するBiacore機器の原理は、表面プラズモン共鳴（SPR）技術に基づく。SPRは、光学的物理的現象である。P-偏光ビームが特定の角度範囲でプリズムの1つの面上に入射するときに、表面プラズマ波がプリズムと金属膜（Au）の間の界面に生成する。入射ビームの伝搬定数が表面プラズマ波の伝搬定数と一致したときに、金属膜における自由電子の共鳴が引き起こされる。したがって、分析のため、まず初めに、生体分子認識膜がセンサーチップの表面上に固定され、次に、試験する試料がセンサーチップの表面を通して流される。センサーチップの表面上の生体分子認識膜と相互作用し得る分子が試料中にある場合、それに応じてAu膜の表面の屈折率が変化し、それによって、最終的にSPR角の変化がもたらされる。例えば、濃度、親和性、動力学定数、および検体の特異性などの情報が、SPR角の変化を検出することによって得られ得る。
【０２６４】
ペルツズマブ、ADC-2およびADC-4を含む3つのモノクローナル抗体試料の、ヒトErbB2に対する結合親和性を、Biacoreを用いる結合実験を通して検出した。
【０２６５】
（表１）3つのモノクローナル抗体試料の、ヒトErbB2との親和性および動力学パラメータ
2020510677.tif 000105
【０２６６】
本実験において、ヒトErbB2に対する、ペルツズマブ、ADC-2およびADC-4の3つのモノクローナル抗体試料の結合活性を、表面プラズモン共鳴技術を用いて特徴付けたところ、3つの全ての試料がヒトErbB2への結合を示した。実験結果によれば、上記3つのモノクローナル抗体試料はヒトErbB2に対して類似の親和性を有し、全て0.5〜0.7nMの範囲にあることが示された。
【０２６７】
2.  Her2に対するADC-2の細胞結合アッセイ
下記実験で使用した実験材料：RPMI1640 培地、0.25% トリプシン-EDTA、ウシ胎仔血清、100×ピルビン酸ナトリウムおよび100×ペニシリン-ストレプトマイシンは、Gibcoより購入した；フルオレセインイソチオシアネート（FITC）で標識した二次抗体は、Invitrogenより購入した；ならびに、NCI-N87胃がん細胞は、Kunming Cell Bank of Chinese Academy of Sciencesより得た。使用した他の全ての試薬は、分析グレードであった。FACSCaliburフローサイトメーター（BD）を使用した。
【０２６８】
この実施例では、Her2を高度に発現している細胞に対する、ADC-2、P-mcVC-MMAEおよびペルツズマブの結合親和性を調べた。
【０２６９】
Her2を高度に発現しているヒト胃がんNCI-N87細胞を本実施例で使用した。37℃、5%CO2インキュベーター中、10%ウシ胎仔血清を含有するRPMI1640培地でNCI-N87細胞を培養した。4〜5日間継代培養した細胞を計数し、次に、15mLの遠心分離管に集め、冷PBSで2回洗浄し、4℃で5分間1000 rpmで遠心分離にかけた。得られた細胞を5%ウシ胎仔血清を含むPBS中に再懸濁し、37℃で30分間培養し、次に4℃で5分間1000 rpmで遠心分離にかけ、上清を取り除いた。得られた細胞を冷PBS中に再懸濁し、1×106細胞/1.5mLでEPチューブ中に分注し、4℃で5分間1000 rpmで遠心分離にかけ、上清を取り除いた。引き続き、0.5mLのADC-2、P-mcVC-MMAE、ペルツズマブおよびヒトIgGを異なる濃度でEPチューブに加え、次にこれを、40分間氷上に置いた後、4℃で5分間1000 rpmで遠心分離にかけた。得られた残留物を1mlの冷PBSで2回洗浄し、次に、200μLのFITC標識二次抗体を各チューブに加えた。EPチューブを暗室で40分間氷上に置き、4℃で5分間1000 rpmで遠心分離にかけ、上清を取り除いた。得られた細胞を1mlの冷PBSで2回洗浄し、次に、0.5mlの冷PBSを添加して再懸濁し、暗室で氷上に置いた。FACSCaliburフローサイトメーターを用いて、異なる濃度の各ADC-2、P-mcVC-MMAEおよびペルツズマブの、細胞に対する結合を、平均蛍光強度（MFI）として検出した。ヒトIgG結合の蛍光強度は、非特異的結合であった。
【０２７０】
図3に示すように、ADC-2、P-mcVC-MMAEおよびペルツズマブは、NCI-N87細胞の表面上の抗原Her2に全て結合し、濃度の増加に伴って、ADC-2、P-mcVC-MMAEおよびペルツズマブの、Her2に対する結合が増加した。さらに重要なことに、NCI-N87細胞のHer2に対する、モノクローナル抗体の結合親和性は同等であり、顕著な相違は観察されなかった。
【０２７１】
3.  インビトロにおける細胞増殖の生物活性アッセイ
下記実験で使用した実験材料：DMEM、RPMI1640培地、DMEM/F12K、0.25% トリプシン-EDTA、ウシ胎仔血清、100×ピルビン酸ナトリウムおよび100×ペニシリン-ストレプトマイシンは、Gibcoより購入した；スルホローダミンB（SRB）はSigmaより購入した；BT-474 ヒト乳がん細胞、SK-RB-3ヒト乳がん細胞、MDA-MB-231ヒト乳がん細胞、およびNCI-N87ヒト胃がん細胞は、Kunming Cell Bank of Chinese Academy of Sciencesより得た；Panc-1ヒト膵臓がん細胞、MDA-MB-468ヒト乳がん細胞、およびMCF-7ヒト乳がん細胞は、Cell Bank in Shanghai Institutes for Biological Sciencesより得た；ならびに、SKOV-3ヒト卵巣がん細胞、およびDu-145ヒト前立腺がん細胞はAmerican Type Culture Collection（ATCC）より得た。使用した他の全ての試薬は、分析グレードであった。96ウェル平底ポリスチレン（Flat Bottom Polystyrene）（Corning, catalog No.3599）およびSynergy 2マイクロプレートリーダー（Bio-Tek）を使用した。
【０２７２】
本実験では、腫瘍細胞株の増殖におけるADC-2、ADC-4、P-mcVC-MMAE、Kadcyla、およびペルツズマブの効果を調べた。
【０２７３】
薬物の抗増殖効果を評価するため、本実施例では、スルホローダミンB（SRB）ベースの比色法を使用した。SRBは、水に容易に溶解し、細胞中のタンパク質を構成している塩基性アミノ酸と酸性条件下で特に結合し得る、ピンク色の陰イオン染料である。510nmで吸収ピークを与え、吸光度と細胞の量との間には、直線的かつ正の相関が認められる。この点で、当該方法は、細胞数の定量的検出に使用し得る。
【０２７４】
本実験で使用した細胞株は以下である：BT-474ヒト乳がん細胞、SK-RB-3ヒト乳がん細胞、MDA-MB-231ヒト乳がん細胞、MDA-MB-468ヒト乳がん細胞、MCF-7ヒト乳がん細胞、NCI-N87ヒト胃がん細胞、SKOV-3ヒト卵巣がん細胞、Du-145ヒト前立腺がん細胞、およびPanc-1ヒト膵臓がん細胞。
【０２７５】
10％ウシ胎仔血清を含むRPMI 1640 培地でBT-474細胞、SK-BR-3細胞およびNCI-N87細胞を、10％ウシ胎仔血清を含むDMEMでSKOV-3細胞、Du-145細胞、Panc-1細胞、MCF-7細胞およびMDA-MB-231細胞を、ならびに、10％ウシ胎仔血清を含むDMEM/F12でMDA-MB-468細胞を、37℃、5％CO2インキュベーター中で対数増殖期まで培養した。対数増殖期にある上記細胞を、ウェルあたり2×103〜9×103個の細胞密度、ウェルあたり100μLで、96ウェルプレート中に播種して、24時間培養し、次に、これに、異なる濃度の薬物を5日間加えた。すなわち、各薬物を3倍、4倍または5倍に希釈して9つの濃度に調製し、かつ各濃度は2つ組みでウェルに設定し、またビヒクル対照ウェルおよび細胞の入っていない培地対照ウェルも、対応する濃度で設定した。薬物作用の終わりに、培養液をデカントで移し、事前に4℃に冷却したトリクロロ酢酸溶液（30%、w/v）100μlを各ウェルに加え、細胞を4℃で1時間固定した。引き続いて、細胞を非イオン水で5回洗浄し、室温で乾燥し、次に100μLの0.4%（w/v）SRB色素（Sigma、1%氷酢酸で調製）を各ウェルに加えた。室温で30分間培養および染色した後、細胞を1%氷酢酸で4回洗浄して、結合していない染料を取り除き、次に室温で乾燥させた。その後、10 mMのトリス溶液100μLを各ウェルに加えた。室温で15分間培養および染色した後、細胞を1%氷酢酸で5回洗浄して、結合していないSRBを取り除き、次に室温で乾燥させた。各ウェルに10mMのトリス緩衝液（pH＝10.5）を加えて、細胞中のタンパク質に結合した染料を溶解し、Synergy 2マイクロプレートリーダー（Bio-Tek）を用いて510nmおよび690nmの波長で吸光度（OD値）を測定した。A＝OD510−OD690。
【０２７６】
抑制率（%）＝（A対照−A薬物）／A対照×100%
【０２７７】
本実験では、インビトロで培養されたHer2を高発現する様々な腫瘍細胞株の増殖に対する、ADC-2、ADC-4、P-mcVC-MMAE、Kadcyla、およびペルツズマブの効果を調べた。また、インビトロで培養されたHer2を高発現しない様々な腫瘍細胞株の増殖に対するADC-2の効果も調査した。図4〜6に示されるように、ADC-2、P-mcVC-MMAEおよびKadcylaで処置した、Her2高発現SK-BR-3ヒト乳がん細胞、BT-474ヒト乳がん細胞、およびNCI-N87ヒト胃がん細胞において、腫瘍細胞増殖の顕著な抑制が観察された。すなわち、腫瘍細胞増殖に対するADC-2およびP-mcVC-MMAEの抑制活性は、Kadcylaの抑制活性よりも顕著に高く、腫瘍細胞増殖に対するADC-2の抑制活性は、P-mcVC-MMAEの抑制活性と本質的に同等であった。しかしながら、ADC-2は、BT-474腫瘍細胞の増殖に対して、P-mcVC-MMAEよりも若干高い抑制活性を有していた。さらに、裸であるペルツズマブと比べて、ADC-2、P-mcVC-MMAおよびKadcylaを含む抗体薬物複合体は、腫瘍細胞の増殖に対して顕著に高い抑制活性を有していた。図7に示すように、ADC-2は、Her2を高発現していない、SKOV-3ヒト卵巣がん細胞、Du-145ヒト前立腺がん細胞、およびPanc-1ヒト膵臓がん細胞の増殖に対して良好な抑制効果も示した。これに対し、ADC-2の抑制活性は、Her2を発現していない、ヒト乳がんMCF-7細胞、ヒト乳がんMDA-MB-231細胞、およびヒト乳がんMDA-MB-468細胞の増殖に対して顕著に低かった（図8）。上記の結果は、抗体薬物複合体ADC-2が、標的抗原を発現していない細胞に対する効果を本質的に有しておらず、したがって、ADC-2の毒性および副作用が顕著に小さいことを示している。図9-1に示すように、ADC-4は、Her2が高発現したNCI-N87ヒト胃がん細胞に対して強力な増殖抑制効果を示した。さらに、図9-1に示すように、ADC-2、ADC-3、およびADC-4は、Her2が適度に発現したCalu-3ヒト肺がん細胞に対して強力な増殖抑制効果を示した。
【０２７８】
4.  インビボ抗腫瘍有効性アッセイ
本発明の複合体の有効性は、インビボで検出し得る。すなわち、がん細胞の同種移植片または異種移植片を齧歯動物に移植し、次に、移植した腫瘍を複合体で処置する。試験するマウスに、薬物処置または対照処置を施し、数週間またはそれ以上の間モニターし、腫瘍倍加時間、対数的死滅、および腫瘍抑制を観察し得る。
【０２７９】
1)実験動物
6〜7週齢のBALB/cA-ヌードマウス（♀）をShanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd. から購入した。製品ライセンス番号：SCXK (Shanghai) 2013-0018；動物証明書番号：2013001815683；および摂食環境：SPFレベル。
【０２８０】
2)実験工程
それらのヌードマウスに、ヒト胃がんNCI-N87細胞を皮下接種し、次に、腫瘍が100〜250 mm3に成長した段階で、無作為にグループ分けした（D0）。投与の用量およびレジメンを図10に示す。腫瘍体積を1週間に2〜3回測定し、マウスの体重を測定し、対応するデータを記録した。腫瘍体積（V）を下記の通り計算した。
V＝1/2×a×b2; 式中、aおよびbは、それぞれ長さおよび幅を表す。
T/C（%）＝（T-T0）/（C-C0）×100；式中、TおよびCは、実験終了時の腫瘍体積を表し；T0およびC0は、実験開始時の腫瘍体積を表す。
【０２８１】
3)実験結果
図10は、ADC-2（0.5、1、2 mg/kg、IV、週1回、合計2回）が、用量依存的かつ顕著に、ヌードマウスにおけるヒト胃がんNCI-N87皮下異種移植片の成長を抑制し得、腫瘍抑制率が、それぞれ、59%、94%、および200%であることを示す。具体的には、1 mg/kgで処置したグループにおいては、3/6のマウスの腫瘍が部分的に消失し；2 mg/kgで処置したグループにおいては、6/6のマウスの腫瘍が完全に消失した。NCI-N87に対するADC3（0.5、1、2 mg/kg、IV、週1回、合計2回）の抑制率は、それぞれ、65%、69%、および185%である。具体的には、2 mg/kgで処置したグループにおいては、1/6のマウスの腫瘍が部分的に消失し、5/6のマウスの腫瘍が完全に消失した。NCI-N87に対するP-vcMMAE（1mg/kg、IV、週1回、合計2回）の抑制率は、94％である。具体的には、2/6のマウスの腫瘍が部分的に消失した。参考薬物のKadcyla（2mg/kg、IV、週1回、合計2回）の抑制率は、77％である。さらに重要なことに、これらの担腫瘍マウスは、薬物に対して良好な耐容性を有し、体重減少といった症状は起こらなかった。
【０２８２】
別の一具体的設計：式Iaに示される置換マレアミドリンカーの調製および使用、式中、Ar’は、置換C6〜C10アリーレンおよび置換5〜12員ヘテロアリーレン
からなる群より選択される。
【０２８３】
実施例の第一グループ：化合物の合成および調製方法
1.1  化合物E-1（式Ia-1）の合成
1.1.1  中間体A-1の合成（工程a）
2020510677.tif 000106
【０２８４】
トリエチレングリコール（92 g、613 mmol）をtBuOH（200 ml）に溶解した。得られた溶液を氷浴に置き、これにKOtBu (22.91 g、204 mmol)を加え、30分間攪拌した。引き続いて、tBuOH（40 ml）に溶解させたtert-ブチルブロモ酢酸（39.8 g、204 mmol）を、アルゴン雰囲気下、滴下して加え、得られた混合物を室温で一晩攪拌した。次の日、TLCにより、反応が完了したことを確認した。t-ブタノールをロータリーエバポレーターで蒸発させた。残留物を、400mlのジクロロメタンに加え、有機相を400mlの水で洗浄した。得られた水相を300mlのジクロロメタンで1回抽出した。有機相を合わせ、飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、次に、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィーにかけ（石油エーテル：酢酸エチル＝3:1-＞1:1）、黄色油状生成物である中間体A-1を得た（24 g、収率44.5%）。
【０２８５】
1.1.2  中間体B-1の合成（工程b）
2020510677.tif 000107
【０２８６】
中間体A-1（7.8 g、29.5 mmol）、5-フルオロ-2-ニトロベンゾトリフルオリド（9.26 g、44.3 mmol）、およびK2CO3粉末（6.12 g、44.3 mmol）を250mLの丸底反応フラスコに入れた。窒素雰囲気下、得られた混合物を80℃に加熱し、48時間攪拌した。TLCにより、出発物質は、ほんの少しの量だけしか残っていないことを確認した。
【０２８７】
次に、室温にまで冷却し、500mlのジクロロメタンで抽出した。有機相を400mlの1N希塩酸で1回、400mlの水で1回、400mlの飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。残留物をカラムクロマトグラフィーで精製し（シリカゲル、200〜300メッシュ）、石油エーテル：酢酸30:1〜10:1ですすぎ、黄色油状生成物である中間体B-1を得た（7.5 g、収率56.1%）。
【０２８８】
1.1.3  中間体C-1
2020510677.tif 000108
【０２８９】
中間体B-1（6 g、13.23 mmol）を100mLの無水エタノールに溶解し、次に、得られた溶液を1.2gの10%Pd-Cを含む反応フラスコに加えた。水素添加反応を6時間（1atm、38℃）行い、TLCで反応が完了したことを確認した。反応混合物を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキをエタノールですすぎ、ろ液をロータリーエバポレーターで蒸発させて、黄色油状生成物である中間体C-1を得た（5 g、収率89%）。
【０２９０】
1.1.4  化合物E-1
2020510677.tif 000109
【０２９１】
中間体C-1（0.8 g、1.889 mmol）を計量し、平行反応管に入れ、次に、窒素雰囲気下、これにAcOH（3ml）を加え、攪拌して溶解させた。次に、3,4-ジブロモマレイン酸無水物（0.483 g、1.889 mmol）を前記管に加え、得られた反応混合物を110℃まで加熱し、窒素雰囲気下で一晩攪拌した。反応をTLCで検出した。その後、反応混合物を室温まで冷却し、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。残留物にトルエンを加えて、さらに2回ロータリーエバポレーターで蒸発させ、それによって化合物E-1を得た。化合物E-1は茶色油状生成物であり、精製せずに次の工程で直接使用した。
【０２９２】
1.2  化合物E-2（式Ia-2）の合成（工程e）
2020510677.tif 000110
【０２９３】
化合物E-1（2.0 g、1.35 mmol）を計量し、100mlの丸底フラスコに入れ、次に、窒素雰囲気下、これに30mlの無水ジクロロメタンを加え、攪拌して溶解させた。次に、チオフェノール297mgを計量し、窒素雰囲気下、これに加えた。チオフェノールが溶解した後、DIPEA（0.44 ml、2.70 mmol）を、氷浴中のフラスコにゆっくり滴下して加えた。その後、反応混合物を5分間攪拌し、次に氷浴を取り除いた。窒素雰囲気下、室温で2時間攪拌した後、TLCにより反応が完了したことを確認した。
【０２９４】
溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物をカラムクロマトグラフィー（200〜300メッシュ  シリカゲル）で単離、精製した。カラムにジクロロメタンを充填してすすぎ、次に、極性を2％から10%へゆっくり増加させたメタノールですすいだ。溶出液を集め、溶媒を蒸発させて、オレンジ色の油状生成物であるE-2を得た（0.92 g、収率79%）。LC-MS（M+）の理論値：595.13、実測値：596.15（ESI、M+H+）。
【０２９５】
1.3  化合物E-3（式Ia-3）の合成
工程eにおいてチオフェノールを2-メルカプトピリジンに変えた以外は、実施例1.2の化合物E-2の合成と同様の工程で、化合物E-3を合成した。得られた生成物E-3は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０２９６】
1.4  化合物E-4（式Ia-4）の合成
工程bにおいて5-フルオロ-2-ニトロベンゾトリフルオリドを4-フルオロ-2-メトキシ-1-ニトロベンゼンに変え、工程eにおいてチオフェノールを4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.2の化合物E-2の合成と同様の工程で、化合物E-4を合成した。得られた生成物E-4は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０２９７】
1.5  化合物E-5（式Ia-5）の合成
工程bにおいて5-フルオロ-2-ニトロベンゾトリフルオリドを1-フルオロ-2-メトキシ-4-ニトロベンゼンに変え、工程eにおいてチオフェノールを4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.2の化合物E-2の合成と同様の工程で、化合物E-5を合成した。得られた生成物E-5は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０２９８】
1.6  化合物E-6（式Ia-6）の合成
工程bにおいて5-フルオロ-2-ニトロベンゾトリフルオリドを5-フルオロ-2-ニトロベンゾニトリルに変え、工程eにおいてチオフェノールを4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.2の化合物E-2の合成と同様の工程で、化合物E-6を合成した。得られた生成物E-6は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０２９９】
1.7  化合物E-7（式Ia-7）の合成
工程bにおいて5-フルオロ-2-ニトロベンゾトリフルオリドを2-フルオロ-5-ニトロベンゾニトリルに変え、工程eにおいてチオフェノールを4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.2の化合物E-2の合成と同様の工程で、化合物E-7を合成した。得られた生成物E-7は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３００】
1.8  化合物E-8（式Ia-8）の合成
工程bにおいて5-フルオロ-2-ニトロベンゾトリフルオリドを5-フルオロ-2-ニトロベンズアミドに変え、工程eにおいてチオフェノールを4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.2の化合物E-2の合成と同様の工程で、化合物E-8を合成した。得られた生成物E-8は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３０１】
1.9  化合物E-9（式Ia-9）の合成
工程bにおいて5-フルオロ-2-ニトロベンゾトリフルオリドを4-フルオロ-1-ニトロ-2-(トリフルオロメチル)ベンゼンに変え、工程eにおいてチオフェノールを4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.2の化合物E-2の合成と同様の工程で、化合物E-9を合成した。得られた生成物E-9は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３０２】
1.10  化合物E-10（式Ia-10）の合成
工程bにおいて5-フルオロ-2-ニトロベンゾトリフルオリドを1-フルオロ-4-ニトロ-2-(トリフルオロメチル)ベンゼンに変え、工程eにおいてチオフェノールを4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.2の化合物E-2の合成と同様の工程で、化合物E-10を合成した。得られた生成物E-10は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３０３】
1.11  化合物E-11（式Ia-11）の合成
1.11.1  中間体F-11（工程f）
2020510677.tif 000111
【０３０４】
250mlの丸底フラスコに、中間体A-1（4 g、15.13 mmol）、トリエチルアミン（2.53 ml、18.16 mmol）およびジメチルアミノピリジン（0.370 g、3.03 mmol）を、モレキュラーシーブで乾燥させた100mlのジクロロメタンに溶解し、次に攪拌した。引き続いて、氷浴下、数回に分けて、塩化4-トルエンスルホニル（3.17 g、16.65 mmol）を加え、アルゴン雰囲気下、得られた反応系を室温で一晩攪拌した。
【０３０５】
抽出のため、100mlのジクロロメタンを反応系へ加え、次に、有機相を200mlの1N希塩酸で1回、200mlの水で2回、200mlの飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。200〜300メッシュシリカゲルが充填されたカラムを用い、PE：EA＝5：1〜2：1の溶出条件下、カラムクロマトグラフィーで残留物を単離した。集めた溶出液をロータリーエバポレーターで蒸発させて中間体F-11を得た（2.8 g、収率44.2%）。
【０３０６】
1.11.2  中間体B-11（工程g）
2020510677.tif 000112
【０３０７】
中間体F-11（1 g、2.389 mmol）および2,6-ジフルオロ-4-ニトロフェノール(0.315 g、1.797 mmol)を20mlのDMFに溶解し、次に、これにK2CO3(0.497 g、3.59 mmol)を加えた。得られた混合物を100℃まで加熱し、5時間攪拌した。溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させ、次に抽出のため、残留物を200mlジクロロメタンに溶解した。次に、有機相を200mlの1N希塩酸で1回、200mlの水で1回、200mlの飽和食塩水で1回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥し、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。200〜300メッシュシリカゲルが充填されたカラムを用い、PE：EA＝5：1〜3：1の溶出条件下、カラムクロマトグラフィーで残留物を精製した。集めた溶出液をロータリーエバポレーターで蒸発させて中間体B-11を得た（600 mg、収率79%）。
【０３０８】
1.11.3  中間体C-11
2020510677.tif 000113
【０３０９】
中間体B-11（600 mg、1.42 mmol）を100mLの無水エタノールに溶解し、次に、得られた溶液を120mgの10%Pd-Cを含む反応フラスコに加えた。水素添加反応を6時間（1atm、38℃）行い、TLCで反応が完了したことを確認した。反応混合物を珪藻土でろ過し、ろ過ケーキをエタノールですすぎ、ろ液をロータリーエバポレーターで蒸発させて、黄色油状生成物である中間体C-11を得た（450mg、収率81%）。
【０３１０】
1.11.4  中間体D-11
2020510677.tif 000114
【０３１１】
中間体C-11（0.40 g, 1.02 mmol）を計量し、平行反応管に入れ、次に、窒素雰囲気下、これにAcOH（3ml）を加え、攪拌して溶解させた。次に、3,4-ジブロモマレイン酸無水物（0.261 g、1.02 mmol）を前記管に加え、得られた反応混合物を110℃まで加熱し、窒素雰囲気下で一晩攪拌した。反応をTLCで検出した。その後、反応混合物を室温まで冷却し、溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。残留物にトルエンを加え、さらに2回ロータリーエバポレーターで蒸発させ、それによって中間体D-11を得た。中間体D-11は茶色油状生成物であり、精製せずに次の工程で直接使用した。
【０３１２】
1.11.5  中間体E-11
2020510677.tif 000115
【０３１３】
化合物D-11（600 mg、0.95 mmol）を計量し、100mlの丸底フラスコに入れ、次に、窒素雰囲気下、これに30mlの無水ジクロロメタンを加え、攪拌して溶解させた。次に、これに、窒素雰囲気下、425 mg (1.91 mmol)の重さの4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールを加えた。4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールが溶解した後、DIPEA（0.36 ml、1.91 mmol）を、氷浴中のフラスコにゆっくり滴下して加えた。その後、反応混合物を5分間攪拌し、次に氷浴を取り除いた。窒素雰囲気下、室温で2時間攪拌した後、TLCにより反応が完了したことを確認した。
【０３１４】
溶媒を減圧下で蒸発させ、残留物をカラムクロマトグラフィー（200〜300メッシュ  シリカゲル）で単離、精製した。カラムにジクロロメタンを充填してすすぎ、次に、極性を2％から10%へゆっくり増加させたメタノールですすいだ。溶出液を集め、溶媒を蒸発させて、オレンジ色の油状生成物であるE-11を得た（0.62 g、収率76%）。LC-MS（M+）の理論値：857.21、実測値：858.23（ESI、M+H+）。
【０３１５】
1.12  化合物E-12（式Ia-12）の合成
工程gにおいて2,6-ジフルオロ-4-ニトロフェノールを3-フルオロ-4-ニトロフェノールに変えた以外は、実施例1.11の化合物E-11の合成と同様の工程で、化合物E-12を合成した。得られた生成物E-12は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３１６】
1.13  化合物E-13（式Ia-13）の合成
工程gにおいて2,6-ジフルオロ-4-ニトロフェノールを2,5-ジフルオロ-4-ニトロフェノールに変えた以外は、実施例1.11の化合物E-11の合成と同様の工程で、化合物E-13を合成した。得られた生成物E-13は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３１７】
1.14  化合物E-14（式Ia-14）の合成
工程aにおいてトリエチレングリコールをジエチレングリコールに変えた以外は、実施例1.11の化合物E-11の合成と同様の工程で、化合物E-14を合成した。得られた生成物E-14は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３１８】
1.15  化合物E-15（式Ia-15）の合成
工程aにおいてトリエチレングリコールをテトラエチレングリコールに変えた以外は、実施例1.11の化合物E-11の合成と同様の工程で、化合物E-15を合成した。得られた生成物E-15は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３１９】
1.16  化合物E-16（式Ia-16）の合成
工程aにおいてトリエチレングリコールをペンタエチレングリコールに変えた以外は、実施例1.11の化合物E-11の合成と同様の工程で、化合物E-16を合成した。得られた生成物E-16は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３２０】
1.17  化合物E-17（式Ia-17）の合成
工程aにおいてトリエチレングリコールをヘキサエチレングリコールに変えた以外は、実施例1.11の化合物E-11の合成と同様の工程で、化合物E-17を合成した。得られた生成物E-17は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３２１】
1.18  化合物E-18（式Ia-18）の合成
工程aにおいてトリエチレングリコールをドデカエチレングリコールに変えた以外は、実施例1.11の化合物E-11の合成と同様の工程で、化合物E-18を合成した。得られた生成物E-18は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３２２】
1.19  化合物E-19（式Ia-19）の合成
工程eにおいて4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールをチオモルホリン-1,1-ジオキシドに変えた以外は、実施例1.11の化合物E-11の合成と同様の工程で、化合物E-19を合成した。得られた生成物E-19は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３２３】
1.20  化合物E-20（式Ia-20）の合成
工程eにおいて4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールを4-(N-メチルホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.11の化合物E-11の合成と同様の工程で、化合物E-20を合成した。得られた生成物E-20は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３２４】
1.21  化合物E-21（式Ia-21）の合成
工程bにおいて5-フルオロ-2-ニトロベンゾトリフルオリドを5-フルオロ-2-ニトロピリジンに変え、工程eにおいてチオフェノールを4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.2の化合物E-2の合成と同様の工程で、化合物E-21を合成した。得られた生成物E-21は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３２５】
1.22  化合物E-22（式Ia-22）の合成
工程bにおいて5-フルオロ-2-ニトロベンゾトリフルオリドを2-フルオロ-5-ニトロピリジンに変え、工程eにおいてチオフェノールを4-(N-モルホリンホルムアミド)チオフェノールに変えた以外は、実施例1.2の化合物E-2の合成と同様の工程で、化合物E-22を合成した。得られた生成物E-21は、オレンジ色の油状生成物であった。
【０３２６】
実施例の第二グループ：式Ib-1〜Ib-24に示される化合物の合成および調製
2.1  化合物F1-1（式Ib-1）の合成
2020510677.tif 000116
【０３２７】
化合物E1-9（300 mg、0.337 mmol）を計量し、100mlの丸底フラスコに入れ、窒素雰囲気下、無水DMF（20 mL）を添加し、攪拌して溶解した。その後、HATU（154 mg、0.404 mmol）およびDIEA（0.11 ml、0.674 mmol）を計量し、順次フラスコに加えた。得られた混合物を室温で15分間攪拌し、次に、これに化合物D1-1（219 mg、0.337 mmol）を加えた。得られた反応混合物を、窒素雰囲気下、室温で一晩攪拌した。TLCおよびHPLCにより、一晩の反応で出発原料のE9がなくなったことを確認した。減圧下、溶媒を蒸発させ、残留物を定量分析し、次に逆相HPLCにより単離、精製して、黄色無定形粉末生成物F1-1を得た（0.350 g、0.230 mmol、収率68.2 %）。LC-MS（M+）の理論値：1520.48、実測値：1521.51（ESI、M+H+）。
【０３２８】
2.2  化合物F1-2（式Ib-2）の合成
2020510677.tif 000117
【０３２９】
化合物D1-1を化合物D1-2に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-2を合成した。得られた生成物F1-2は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1993.91、実測値：1994.93（ESI、M+H+）。
【０３３０】
2.3  化合物F1-3（式Ib-3）の合成
2020510677.tif 000118
【０３３１】
化合物D1-1を化合物D1-3に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-3を合成した。得られた生成物F1-3は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：2007.89、実測値：2008.91（ESI、M+H+）。
【０３３２】
2.4  化合物F1-4（式Ib-4）の合成
2020510677.tif 000119
【０３３３】
化合物D1-1を化合物D1-4に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-4を合成した。得られた生成物F1-4は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：2046.88、実測値：2047.86（ESI、M+H+）。
【０３３４】
2.5  化合物F1-5（式Ib-5）の合成
2020510677.tif 000120
【０３３５】
化合物D1-1を化合物D1-5に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-5を合成した。得られた生成物F1-5は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1800.67、実測値：1801.65（ESI、M+H+）。
【０３３６】
2.6  化合物F1-6（式Ib-6）の合成
2020510677.tif 000121
【０３３７】
化合物D1-1を化合物D1-6に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-6を合成した。得られた生成物F1-6は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1989.79、実測値：1990.80（ESI、M+H+）。
【０３３８】
2.7  化合物F1-7（式Ib-7）の合成
2020510677.tif 000122
【０３３９】
化合物D1-1を化合物D1-7に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-7を合成した。得られた生成物F1-7は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1973.72、実測値：1974.72（ESI、M+H+）。
【０３４０】
2.8  化合物F1-8（式Ib-8）の合成
2020510677.tif 000123
【０３４１】
化合物D1-1を化合物D1-8に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-8を合成した。得られた生成物F1-8は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1749.73、実測値：1750.75（ESI、M+H+）。
【０３４２】
2.9  化合物F1-9（式Ib-9）の合成
2020510677.tif 000124
【０３４３】
化合物E1-9およびD1-1をそれぞれ化合物E1-17およびD1-9に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-9を合成した。得られた生成物F1-9は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：2015.72、実測値：2016.73（ESI、M+H+）。
【０３４４】
2.10  化合物F1-10（式Ib-10）の合成
2020510677.tif 000125
【０３４５】
化合物D1-1を化合物D1-10に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-10を合成した。得られた生成物F1-10は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1912.63、実測値：1913.65（ESI、M+H+）。
【０３４６】
2.11  化合物F1-11（式Ib-11）の合成
2020510677.tif 000126
【０３４７】
化合物D1-1を化合物D1-11に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-11を合成した。得られた生成物F1-11は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1916.63、実測値：1917.61（ESI、M+H+）。
【０３４８】
2.12  化合物F1-12（式Ib-12）の合成
2020510677.tif 000127
【０３４９】
化合物D1-1を化合物D1-12に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-12を合成した。得られた生成物F1-12は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：2031.70、実測値：2032.71（ESI、M+H+）。
【０３５０】
2.13  化合物F1-13（式Ib-13）の合成
2020510677.tif 000128
【０３５１】
化合物D1-1を化合物D1-13に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-13を合成した。得られた生成物F1-13は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1711.57、実測値：1712.55（ESI、M+H+）。
【０３５２】
2.14  化合物F1-14（式Ib-14）の合成
2020510677.tif 000129
【０３５３】
化合物E1-9およびD1-1をそれぞれ化合物E1-2およびD1-2に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-14を合成した。得られた生成物F1-14は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1767.82、実測値：1768.83（ESI、M+H+）。
【０３５４】
2.15  化合物F1-15（式Ib-15）の合成
2020510677.tif 000130
【０３５５】
化合物E1-9およびD1-1をそれぞれ化合物E1-19およびD1-2に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-15を合成した。得られた生成物F1-15は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：2057.84、実測値：2058.87（ESI、M+H+）。
【０３５６】
2.16  化合物F1-16（式Ib-16）の合成
2020510677.tif 000131
【０３５７】
化合物E1-9およびD1-1をそれぞれ化合物E1-20およびD1-2に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-16を合成した。得られた生成物F1-16は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1849.85、実測値：1850.83（ESI、M+H+）。
【０３５８】
2.17  化合物F1-17（式Ib-17）の合成
2020510677.tif 000132
【０３５９】
化合物E1-9およびD1-1をそれぞれ化合物E1-10およびD1-2に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-17を合成した。得られた生成物F1-17は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1993.91、実測値：1994.90（ESI、M+H+）。
【０３６０】
2.18  化合物F1-18（式Ib-18）の合成
2020510677.tif 000133
【０３６１】
化合物E1-9およびD1-1をそれぞれ化合物E1-11およびD1-2に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-18を合成した。得られた生成物F1-18は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1961.90、実測値：1962.91（ESI、M+H+）。
【０３６２】
2.19  化合物F1-19（式Ib-19）の合成
2020510677.tif 000134
【０３６３】
化合物E1-9およびD1-1をそれぞれ化合物E1-5およびD1-2に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-19を合成した。得られた生成物F1-19は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1955.93、実測値：1956.95（ESI、M+H+）。
【０３６４】
2.20  化合物F1-20（式Ib-20）の合成
2020510677.tif 000135
【０３６５】
化合物E1-9およびD1-1をそれぞれ化合物E1-4およびD1-2に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-20を合成した。得られた生成物F1-20は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1955.93、実測値：1956.95（ESI、M+H+）。
【０３６６】
2.21  化合物F1-21（式Ib-21）の合成
2020510677.tif 000136
【０３６７】
化合物E1-9およびD1-1をそれぞれ化合物E1-12およびD1-2に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-21を合成した。得られた生成物F1-21は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1943.91、実測値：1944.90（ESI、M+H+）。
【０３６８】
2.22  化合物F1-22（式Ib-22）の合成
2020510677.tif 000137
【０３６９】
化合物E1-9およびD1-1をそれぞれ化合物E1-6およびD1-2に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-22を合成した。得られた生成物F1-22は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1950.92、実測値：1951.93（ESI、M+H+）。
【０３７０】
2.23  化合物F1-23（式Ib-23）の合成
2020510677.tif 000138
【０３７１】
化合物E1-9およびD1-1をそれぞれ化合物E1-21およびD1-2に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-23を合成した。得られた生成物F1-23は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1926.92、実測値：1927.93（ESI、M+H+）。
【０３７２】
2.24  化合物F1-24（式Ib-24）の合成
2020510677.tif 000139
【０３７３】
化合物E1-9およびD1-1をそれぞれ化合物E1-22およびD1-2に変えた以外は、実施例2.1の化合物F1-1の合成と同様の工程で、化合物F1-24を合成した。得られた生成物F1-24は、黄色無定形粉末であった。LC-MS（M+）の理論値：1926.92、実測値：1927.93（ESI、M+H+）。
【０３７４】
実施例の第三グループ：抗体薬物複合体の調製
1. ADC-Iの調製
pH7を有する、50mMのリン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム（KH2PO4-NaOH）／150mMの塩化ナトリウム（NaCl）／1mMのジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）反応緩衝液で、ペルツズマブ原液を2mg/mLに希釈し、次に、これに、6.0倍の過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を加えた。得られた反応液を35℃で2.5時間攪拌した。
【０３７５】
引き続いて、精製せずに、反応液を8℃まで冷却し、これに、適量のジメチルスルホキシド（DMSO）および6倍の過剰モル比の化合物F1-17（10 mg/ml、DMSOに事前溶解）を加え、反応系のDMSOは15％以下の体積となるようにした。カップリングのため、得られた反応液を37℃で3時間攪拌した。
【０３７６】
カップリング反応の後、ヒスチジン-酢酸/スクロースゲル（pH6.0）を用いる脱塩カラムによるろ過により反応液を精製し、次に、UV280紫外線吸収値にしたがって、吸収ピークにおける試料を集めた。集めた試料を、細孔径0.15μmのろ過装置を通して滅菌し、得られた生成物を-60℃で保存した。
【０３７７】
2. ADC-IIの調製
pH6を有する、50mMのリン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム（KH2PO4-NaOH）／150mMの塩化ナトリウム（NaCl）／1mMのジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）反応緩衝液で、ペルツズマブ原液を5mg/mLに希釈し、次に、これに、10倍の過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を加えた。得られた反応液を10℃で40時間攪拌した。
【０３７８】
引き続いて、精製せずに、反応液を5℃まで冷却し、これに、適量のジメチルアセトアミド（DMA）および6倍の過剰モル比の化合物F1-2（10 mg/ml、DMAに事前溶解）を加え、反応系のDMAは10％以下の体積となるようにした。カップリングのため、得られた反応液を25℃で2.5時間攪拌した。
【０３７９】
カップリング反応の後、ヒスチジン-酢酸/スクロースゲル（pH6.0）を用いる脱塩カラムによるろ過により反応液を精製し、次に、UV280紫外線吸収値にしたがって、吸収ピークにおける試料を集めた。集めた試料を、細孔径0.22μmのろ過装置を通して滅菌し、得られた生成物を-80℃で保存した。
【０３８０】
3. ADC-IIIの調製
pH7.4を有する、PBS//1mMのジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）反応緩衝液で、ペルツズマブ原液を5mg/mLに希釈し、次に、これに、20倍の過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を加えた。得られた反応液を15℃で2時間攪拌した。
【０３８１】
引き続いて、精製せずに、反応液を10℃まで冷却し、これに、適量のアセトニトリル（ACN）および6倍の過剰モル比の化合物F1-20（10 mg/ml、ACNに事前溶解）を加え、反応系のACNは10％以下の体積となるようにした。カップリングのため、得られた反応液を10℃で4時間攪拌した。
【０３８２】
カップリング反応の後、ヒスチジン-酢酸/スクロースゲル（pH8.0）を用いる脱塩カラムによるろ過により反応液を精製し、次に、UV280紫外線吸収値にしたがって、吸収ピークにおける試料を集めた。集めた試料を、細孔径0.20μmのろ過装置を通して滅菌し、得られた生成物を-90℃で保存した。
【０３８３】
4. ADC-IVの調製
pH7を有する、50mMのリン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム（KH2PO4-NaOH）／150mMの塩化ナトリウム（NaCl）／1mMのジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）反応緩衝液で、ペルツズマブ原液を8mg/mLに希釈し、次に、これに、8倍の過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を加えた。得られた反応液を25℃で25時間攪拌した。
【０３８４】
引き続いて、精製せずに、反応液を5℃まで冷却し、これに、適量のジメチルホルムアミド（DMF）および6倍の過剰モル比の化合物F1-19（10 mg/ml、DMFに事前溶解）を加え、反応系のDMFは8％以下の体積となるようにした。カップリングのため、得られた反応液を0℃で2時間攪拌した。
【０３８５】
カップリング反応の後、ヒスチジン-酢酸/スクロースゲル（pH6.0）を用いる脱塩カラムによるろ過により反応液を精製し、次に、UV280紫外線吸収値にしたがって、吸収ピークにおける試料を集めた。集めた試料を、細孔径0.3μmのろ過装置を通して滅菌し、得られた生成物を-80℃で保存した。
【０３８６】
5. ADC-Vの調製
pH7.4を有する、50mMのヒスチジン-水酸化ナトリウム／150mMの塩化ナトリウム（NaCl）／1mMのジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）反応緩衝液で、ペルツズマブ原液を6mg/mLに希釈し、次に、これに、8倍の過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を加えた。得られた反応液を35℃で15時間攪拌した。
【０３８７】
引き続いて、精製せずに、反応液を10℃まで冷却し、これに、適量のジメチルホルムアミド（DMF）および6倍の過剰モル比の化合物F1-22（10 mg/ml、DMFに事前溶解）を加え、反応系のDMFは8％以下の体積となるようにした。カップリングのため、得られた反応液を0℃で5時間攪拌した。
【０３８８】
カップリング反応の後、ヒスチジン-酢酸/スクロースゲル（pH6.0）を用いる脱塩カラムによるろ過により反応液を精製し、次に、UV280紫外線吸収値にしたがって、吸収ピークにおける試料を集めた。集めた試料を、細孔径0.15μmのろ過装置を通して滅菌し、得られた生成物を-100℃で保存した。
【０３８９】
6. ADC-VIの調製
pH9を有する、50mMのホウ酸-ホウ砂／150mMの塩化ナトリウム（NaCl）／1mMのジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）反応緩衝液で、ペルツズマブ原液を10mg/mLに希釈し、次に、これに、8倍の過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を加えた。得られた反応液を25℃で10時間攪拌した。
【０３９０】
引き続いて、精製せずに、反応液を10℃まで冷却し、これに、適量のジメチルホルムアミド（DMF）および6倍の過剰モル比の化合物F1-21（10 mg/ml、DMFに事前溶解）を加え、反応系のDMFは8％以下の体積となるようにした。カップリングのため、得られた反応液を0℃で4時間攪拌した。
【０３９１】
カップリング反応の後、ヒスチジン-酢酸/スクロースゲル（pH6.0）を用いる脱塩カラムによるろ過により反応液を精製し、次に、UV280紫外線吸収値にしたがって、吸収ピークにおける試料を集めた。集めた試料を、細孔径0.2μmのろ過装置を通して滅菌し、得られた生成物を-60℃で保存した。
【０３９２】
7. ADC-VIIの調製
pH8を有する、50mMのリン酸二水素カリウム-水酸化ナトリウム（KH2PO4-NaOH）／150mMの塩化ナトリウム（NaCl）／1mMのジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）反応緩衝液で、ペルツズマブ原液を3mg/mLに希釈し、次に、これに、8倍の過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を加えた。得られた反応液を15℃で48時間攪拌した。
【０３９３】
引き続いて、精製せずに、反応液を0℃まで冷却し、これに、適量のジメチルホルムアミド（DMF）および6倍の過剰モル比の化合物F1-18（10 mg/ml、DMFに事前溶解）を加え、反応系のDMFは8％以下の体積となるようにした。カップリングのため、得られた反応液を0℃で3時間攪拌した。
【０３９４】
カップリング反応の後、ヒスチジン-酢酸/スクロースゲル（pH6.0）を用いる脱塩カラムによるろ過により反応液を精製し、次に、UV280紫外線吸収値にしたがって、吸収ピークにおける試料を集めた。集めた試料を、細孔径0.3μmのろ過装置を通して滅菌し、得られた生成物を-70℃で保存した。
【０３９５】
8. ADC-VIIIの調製
pH7.4を有する、50mMのリン酸水素二ナトリウム-クエン酸／150mMの塩化ナトリウム（NaCl）／1mMのジエチレントリアミン五酢酸（DTPA）反応緩衝液で、トラツズマブ原液を5mg/mLに希釈し、次に、これに、8倍の過剰モル比のトリス(2-カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩（TCEP）を加えた。得られた反応液を25℃で5時間攪拌した。
【０３９６】
引き続いて、精製せずに、反応液を0℃まで冷却し、これに、適量のジメチルホルムアミド（DMF）および6倍の過剰モル比の化合物F1-2（10 mg/ml、DMFに事前溶解）を加え、反応系のDMFは8％以下の体積となるようにした。カップリングのため、得られた反応液を0℃で2時間攪拌した。
【０３９７】
カップリング反応の後、ヒスチジン-酢酸/スクロースゲル（pH6.0）を用いる脱塩カラムによるろ過により反応液を精製し、次に、UV280紫外線吸収値にしたがって、吸収ピークにおける試料を集めた。集めた試料を、細孔径0.3μmのろ過装置を通して滅菌し、得られた生成物を-80℃で保存した。
【０３９８】
実施例の第四グループ：抗体薬物複合体の検出および安定性研究
抗体複合薬物の疎水性相互作用クロマトグラフィー（HIC）分析により、例えば、結合部位の数および位置、および抗体に対する薬物の割合（DAR）などの重要な情報を得ることができる。この関連で、本発明者らは、下記の条件に基づいて、上記ADC生成物のHIC分析を実施した。得られたクロマトグラムを図11-1〜図11-8および図12-1〜図12-2に示した。
【０３９９】
Agilent 1290 Infinity
クロマトグラフィーカラム：Waters Protein-Pak Hi Res HIC (4.6*100 mm、2.5 μm)
移動相：2.5M硫酸アンモニウム（125mMのリン酸緩衝液を含有）：125mMリン酸緩衝液：イソプロパノール；
流速：0.7mL/min、カラム温度：25℃。
【０４００】
さらに、ADCの構造および組成を分析し、ADC中のリンカーの安定性を評価し、異なるDARを有する成分の間の相対的な割合を分析および決定するために、LC-MS技術を使用した。この関連で、本発明者らは、下記の条件に基づいて、上記ADC生成物のLC-MS分析を実施した。得られたクロマトグラムを図13-1〜図13-8および図14-1〜図14-2に示した。
【０４０１】
機器：Agilent 6520 Q-TOF
クロマトグラフィーカラム：Polyhydroxyethyl-A （PHEA）（PolyLC、Columbia、MD）2.1 mm*200 mm；300Åの孔を有する5μm粒子
移動相：200mM酢酸アンモニウム
流速：0.1mL/min；
カラム温度：25℃。
【０４０２】
マレアミド系ジスルフィド結合ブリッジはよりよい安定性を有し、骨格内でスルフヒドリル-エーテル交換しにくい傾向がある。Ar’への置換基の導入により、マレアミド環の開裂の後に起こる第二の加水分解反応が大きく減速し得ること、および、非置換フェニルと比較した場合の抗体薬物複合体の安定性も増強され得ることをさらに証明するため、本発明者は、本実験における対照ADCを調製した。ADC-Iを調製するための結合方法と同様の結合方法により、ペルツズマブと、Ar’がちょうど1,4-置換フェニルである化合物（下記式に示される通り）とを結合させることによって、対照ADCを得た。
【０４０３】
2020510677.tif 000140
【０４０４】
対照ADCと比較するため、抗体薬物複合体ADC-I、ADC-IIおよびADC-VIIを選択した。すなわち、同じ抗体濃度を有し、緩衝液に保存しておいたADC試料を、25℃に置き、0日、2日、4日、および7日目にそれぞれサンプリングした。
【０４０５】
各抗体薬物複合体（ADC）試料において形成された第二加水分解生成物の対応量をLC-MS（Q-TOF）で求め、第二加水分解生成物の質量スペクトルにおける特徴的なピークを抽出し、ピーク面積を計算した。0日〜7日の間のピーク面積の変化を比較することによって、各ADC試料における第二加水分解生成物の量の変化傾向を得た。詳細を下記データおよび図15に示す。下記のデータから、対照ADC試料で形成された第二加水分解生成物の量は、ADC-I試料、ADC-II試料およびADC-VII試料で形成された第二加水分解生成物と比べて著しく高いことが判る。
【０４０６】
2020510677.tif 000141
【０４０７】
さらに、0日、2日、4日、および7日目の各ADC試料の変化をHICによっても求めた。図16-1〜図16-4から分かるように、7日目の対照ADC試料のクロマトグラフィーにおいては、保持時間が6.904である位置に不純物のピークが現れた。しかしながら、図17-1〜図17-4、図18-1〜図18-4および図19-1〜図19-4に示されるように、0日〜7日の間でサンプリングしたADC-I試料、ADC-II試料およびADC-VII試料のクロマトグラムにおいては、実質的に変化がなかった。
【０４０８】
実施例の第五グループ：抗体薬物複合体の生物学的検出
1.  インビトロにおける細胞増殖の生物活性アッセイ
下記実験で使用した実験材料：DMEM、DMEM/F12K、RPMI 1640 培地、 0.25% トリプシン-EDTA、ウシ胎仔血清、100×ピルビン酸ナトリウム、および100×ペニシリン-ストレプトマイシンは、Gibcoから購入した；スルホローダミンB（SRB）は、Sigmaから購入した；NCI-N87ヒト胃がん細胞およびBT-474ヒト乳がん細胞は、Kunming Cell Bank of Chinese Academy of Sciencesから購入した。使用した他の全ての試薬は、分析グレードであった。96ウェル平底ポリスチレン（Corning, catalog No.3599）およびSynergy 2マイクロプレートリーダー（Bio-Tek）を使用した。
【０４０９】
本実験では、腫瘍細胞株の増殖におけるADC-I、ADC-II、ADC-III、ADC-IV、ADC-V、ADC-VI、ADC-VIIおよびADC-VIIIの効果を調べた。
【０４１０】
薬物の抗増殖効果を評価するため、本実施例では、スルホローダミンB（SRB）ベースの比色法を使用した。SRBは、水に容易に溶解し、細胞中のタンパク質の塩基性アミノ酸と酸性条件下で特に結合し得る、ピンク色の陰イオン染料である。510nmで吸収ピークを与え、吸光度と細胞の量との間には、直線的かつ正の相関が認められる。この点で、当該方法は、細胞数の定量的検出に使用し得る。
【０４１１】
本実験で使用した細胞株は以下である：BT-474ヒト乳がん細胞およびNCI-N87ヒト胃がん細胞。
【０４１２】
10％ウシ胎仔血清を含むRPMI 1640 培地でBT-474細胞およびNCI-N87細胞を、37℃、5％CO2インキュベーター中で対数増殖期まで培養した。対数増殖期にある上記細胞を、ウェルあたり2×103〜9×103個の細胞密度、ウェルあたり100μLで、96ウェルプレート中に播種し、24時間培養し、次に、これに、異なる濃度の薬物を5日間加えた。すなわち、各薬物を3倍、4倍および5倍に希釈して9つの濃度に調製し、各濃度は2つ組みでウェルに設定し、ビヒクル対照ウェルおよび細胞の入っていない培地対照ウェルも、対応する濃度で設定した。薬物作用の終わりに、培養液をデカントで移し、事前に4℃に冷却したトリクロロ酢酸溶液（30%、w/v）100μlを各ウェルに加え、細胞を4℃で1時間固定した。引き続いて、細胞を非イオン水で5回洗浄し、室温で乾燥し、次に100μLの0.4%（w/v）SRB色素（Sigma、1%氷酢酸で調製）を各ウェルに加えた。室温で30分間培養および染色した後、細胞を1%氷酢酸で4回洗浄して、結合していない染料を取り除き、次に室温で乾燥させた。その後、10 mMのトリス溶液100μLを各ウェルに加えた。室温で15分間培養および染色した後、細胞を1%氷酢酸で5回洗浄して、結合していないSRBを取り除き、次に室温で乾燥させた。各ウェルに10mMのトリス緩衝液（pH＝10.5）を加えて、細胞中のタンパク質に結合した染料を溶解し、Synergy 2マイクロプレートリーダー（Bio-Tek）を用いて510nmおよび690nmの波長で吸光度（OD値）を測定した。A＝OD510−OD690。
【０４１３】
抑制率（%）＝（A対照−A薬物）／A対照×100%
【０４１４】
本実験では、インビトロで培養されたHer2を高発現する様々な腫瘍細胞株の増殖に対する、ADC-I、ADC-II、ADC-III、ADC-IV、ADC-V、ADC-VI、ADC-VIIおよびADC-VIIIの効果を調べた。下記の表に示すように、裸抗体のPerjetaおよびHerceptinで処置した場合と比較して、ADC-I、ADC-II、ADC-III、ADC-IV、ADC-V、ADC-VI、ADC-VIIおよびADC-VIIIで処置した後は、Her2を高発現するNCI-N87ヒト胃がん細胞およびBT-474ヒト乳がん細胞の増殖が、顕著に抑制された。対応する増殖抑制曲線を図20〜図23に示す。
【０４１５】
2020510677.tif 000142
【０４１６】
2.  インビボ抗腫瘍有効性アッセイ
本発明の複合体の有効性は、インビボで検出し得る。すなわち、がん細胞の同種移植片または異種移植片を齧歯動物に移植し、次に、移植した腫瘍を複合体で処置する。試験するマウスに、薬物処置または対照処置を施し、数週間またはそれ以上の間モニターし、腫瘍倍加時間、対数的死滅、および腫瘍抑制を観察し得る。
【０４１７】
1)実験動物
6〜7週齢のBALB/cA-ヌードマウス（♀）をShanghai Lingchang Biotechnology Co., Ltd. から購入した。製品ライセンス番号：SCXK (Shanghai) 2013-0018；動物証明書番号：2013001815683；および摂取環境：SPFレベル。
【０４１８】
2)実験工程
これらのヌードマウスに、6×106ヒト胃がんNCI-N87細胞を皮下接種し、次に、腫瘍が100〜250 mm3に成長した後、マウスを腫瘍の体積に応じてグループ分けした（D0）。マウスに、それぞれ10 mL/kgの投与量で静脈注射し（IV）；ビヒクル対照グループのマウスは、同じ量の「ビヒクル」（0.1%のBSAを含む生理食塩水）を投与した。投与の用量およびレジメンを図24に示す。腫瘍体積を1週間に2回測定し、マウスの体重を測定し、対応するデータを記録した。
【０４１９】
本実験の目的は、特定の指標T/C%または腫瘍成長抑制値（TGI）（%）を用いて腫瘍成長における薬物の効果を調べることであった。
【０４２０】
ノギスで1週間に2回腫瘍の直径を測定した。腫瘍体積（V）を下記の通り計算した。
V＝1/2×a×b2; 式中、aおよびbは、それぞれ長さおよび幅を表す。
T/C（%）＝（T-T0）/（C-C0）×100；式中、TおよびCは、実験終了時の腫瘍体積を表し；T0およびC0は、実験開始時の腫瘍体積を表す。
【０４２１】
腫瘍成長抑制値（TGI）（%）＝100-T/C(%)
【０４２２】
腫瘍が退縮したとき、腫瘍成長抑制値（TGI）（%）＝100-(T-T0)/T0×100
【０４２３】
当初より腫瘍の体積が小さくなった場合、すなわち、T＜T0またはC＜C0である場合、部分的に退縮したと定義し（PR）；一方、腫瘍が完全に消失した場合、完全に退縮したと定義した（CR）。
【０４２４】
実験が終了したとき（D21）、実験の終わりに達したとき、または腫瘍体積が15000mm3に達したとき、対応するマウスを二酸化炭素ナルコーシスで屠殺し、解剖し、腫瘍を取り除き、撮影した。
【０４２５】
3)実験結果
ヌードマウスにおけるヒト胃がんNCI-N87皮下異種移植に対する薬物の効果を下記の表および図24に示した。さらに、これらの担腫瘍マウスは、薬物に対して良好な耐容性を有し、体重減少などの症状は起こらなかった。
【０４２６】
2020510677.tif 000143
【０４２７】
本発明で言及した全ての文献は、各文献が単独で参照により組み入れられているように、参照により本出願に組み入れられる。さらに、当業者は、本発明の上述の教示に接した後は、本発明に対して様々な修正または補正をすることができ、これら等価物も同様に、本出願の添付の特許請求の範囲に定義される範囲に含まれると理解されるべきである。
【図１】
2020510677.tif 000174
【図２】
2020510677.tif 000175
【図３】
2020510677.tif 000176
【図４】
2020510677.tif 000177
【図５】
2020510677.tif 000178
【図６】
2020510677.tif 000179
【図７】
2020510677.tif 000180
【図８】
2020510677.tif 000181
【図９−１】
2020510677.tif 000182
【図９−２】
2020510677.tif 000183
【図１０】
2020510677.tif 000184
【図１１−１】
2020510677.tif 000185
【図１１−２】
2020510677.tif 000186
【図１１−３】
2020510677.tif 000187
【図１１−４】
2020510677.tif 000188
【図１１−５】
2020510677.tif 000189
【図１１−６】
2020510677.tif 000190
【図１１−７】
2020510677.tif 000191
【図１１−８】
2020510677.tif 000192
【図１２−１】
2020510677.tif 000193
【図１２−２】
2020510677.tif 000194
【図１３−１】
2020510677.tif 000195
【図１３−２】
2020510677.tif 000196
【図１３−３】
2020510677.tif 000197
【図１３−４】
2020510677.tif 000198
【図１３−５】
2020510677.tif 000199
【図１３−６】
2020510677.tif 000200
【図１３−７】
2020510677.tif 000201
【図１３−８】
2020510677.tif 000202
【図１４−１】
2020510677.tif 000203
【図１４−２】
2020510677.tif 000204
【図１５】
2020510677.tif 000205
【図１６−１】
2020510677.tif 000206
【図１６−２】
2020510677.tif 000207
【図１６−３】
2020510677.tif 000208
【図１６−４】
2020510677.tif 000209
【図１７−１】
2020510677.tif 000210
【図１７−２】
2020510677.tif 000211
【図１７−３】
2020510677.tif 000212
【図１７−４】
2020510677.tif 000213
【図１８−１】
2020510677.tif 000214
【図１８−２】
2020510677.tif 000215
【図１８−３】
2020510677.tif 000216
【図１８−４】
2020510677.tif 000217
【図１９−１】
2020510677.tif 000218
【図１９−２】
2020510677.tif 000219
【図１９−３】
2020510677.tif 000220
【図１９−４】
2020510677.tif 000221
【図２０】
2020510677.tif 000222
【図２１】
2020510677.tif 000223
【図２２】
2020510677.tif 000224
【図２３】
2020510677.tif 000225
【図２４】
2020510677.tif 000226
【手続補正書】
【提出日】令和1年8月6日(2019.8.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記式Iaに示される置換マレアミドリンカー：
2020510677.tif 000227
式中、
RはXまたはArS-であり、
Xはハロゲンより選択され、
Arは置換または非置換C6〜C10アリールおよび置換または非置換5〜12員ヘテロアリールからなる群より選択され、
Ar'は置換または非置換C6〜C10アリーレンおよび置換または非置換5〜12員ヘテロアリーレンからなる群より選択され、
L1は、Ar'に連結した-O(CH2CH2O)n-であり、ここでnは1〜20の任意の整数である。
【請求項２】
Arがフェニル、ハロゲン置換フェニル、C1〜C4アルキルフェニル、C1〜C4アルコキシフェニル、4-メチルフェニル、4-メトキシフェニル、2-ピリジル、2-ピリミジニル、1-メチルイミダゾール-2-イル、および
2020510677.tif 000228
からなる群より選択され、ここでWは、カルボニルに結合したアミドR1であり、かつR1は-NH2、
2020510677.tif 000229
からなる群より選択される、請求項1記載の置換マレアミドリンカー。
【請求項３】
Ar'が置換フェニレンおよびピリジルより選択され、置換とは基上の水素原子がハロゲン、C1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、トリフルオロメチル、シアノ、およびアミド基からなる群より選択される1つまたは複数の置換基によって置換されることを意味する、請求項1記載の置換マレアミドリンカー。
【請求項４】
以下からなる群より選択される構造を有する、請求項1記載の置換マレアミドリンカー：
2020510677.tif 000230
2020510677.tif 000231
2020510677.tif 000232
2020510677.tif 000233
。
【請求項５】
下記式Ibに示される構造を有する置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物：
2020510677.tif 000234
式中、
R、Ar'、およびL1は請求項1に規定した通りであり、
L2は化学結合であるかまたはAA-PABの構造を有し、ここでAAはジペプチドまたはトリペプチド断片であり、かつPABはp-アミノベンジルカルバモイルであり、
CTDは、アミド結合を介してL2に結合した、細胞毒性小分子薬物ならびに/または自己免疫疾患および/もしくは炎症を治療するための薬物である。
【請求項６】
AAがVal-Cit、Val-Ala、Phe-Lys、Ala-Ala-Asn、およびD-Ala-Phe-Lysからなる群より選択される、請求項5記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項７】
CTDがチューブリンインヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、およびDNA結合剤からなる群より選択される、請求項5記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項８】
チューブリンインヒビターが、メイタンシンまたはその誘導体、モノメチルアウリスタチンE、モノメチルアウリスタチンF、モノメチルドラスタチン10、ツブリシン（Tubulysin）またはその誘導体、クリプトフィシンまたはその誘導体、およびタルトブリンからなる群より選択される、請求項7記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項９】
DNA結合剤が、PBDまたはその誘導体およびデュオカルマイシンまたはその誘導体からなる群より選択される、請求項7記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１０】
トポイソメラーゼインヒビターが、ドキソルビシンの代謝産物PNU-159682またはその誘導体、イリノテカンの代謝産物SN38またはその誘導体、およびエキサテカンからなる群より選択される、請求項7記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
【請求項１１】
CTDが、下記D1〜D13'からなる群より選択される構造を有する、請求項5記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物：
2020510677.tif 000235
2020510677.tif 000236
。
【請求項１２】
式Ibに示される複合体が、以下からなる群より選択される、請求項5記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物：
2020510677.tif 000237
2020510677.tif 000238
2020510677.tif 000239
2020510677.tif 000240
2020510677.tif 000241
2020510677.tif 000242
2020510677.tif 000243
2020510677.tif 000244
2020510677.tif 000245
2020510677.tif 000246
2020510677.tif 000247
。
【請求項１３】
請求項5〜12のいずれか一項記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物と、抗体とをカップリングさせることによって形成される、抗体-薬物複合体。
【請求項１４】
下記式Icおよび/または式Idに示される構造を有する、請求項13記載の抗体-薬物複合体：
2020510677.tif 000248
式中、
Ar'、L1、L2、およびCTDは請求項5に規定した通りであり、
m＝1.0〜5.0であり、
Abはタンパク質、酵素、抗体、抗体断片、およびペプチドからなる群より選択される。
【請求項１５】
抗体がモノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および抗体断片からなる群より選択される、請求項13記載の抗体-薬物複合体。
【請求項１６】
抗体が、HER2、HER3、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD79b、CD138、CD147、CD223、EpCAM、ムチン1、STEAP1、GPNMB、FGF2、FOLR1、EGFR、EGFRvIII、組織因子、c-MET、ネクチン4、AGS-16、グアニリルシクラーゼC、メソテリン、SLC44A4、PSMA、EphA2、AGS-5、GPC-3、c-KIT、RoR1、PD-L1、CD27L、5T4、ムチン16、NaPi2b、STEAP、SLITRK6、ETBR、BCMA、Trop-2、CEACAM5、SC-16、SLC39A6、デルタ様タンパク質3、およびクローディン18.2からなる群より選択される腫瘍関連抗原に結合できるものである、請求項13記載の抗体-薬物複合体。
【請求項１７】
HER2抗体がトラスツズマブまたはペルツズマブより選択されるか、またはEGFR抗体がErbituxまたはVectibixより選択される、請求項16記載の抗体-薬物複合体。
【請求項１８】
(a)請求項13〜17のいずれか一項記載の抗体-薬物複合体と、
(b)薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と
を含む、薬学的組成物。
【請求項１９】
腫瘍の治療のための薬剤を製造するための、請求項13〜17のいずれか一項記載の抗体-薬物複合体の使用。
【請求項２０】
以下の工程を含む、請求項12〜17のいずれか一項記載の抗体-薬物複合体を調製するための方法：
(1)緩衝液中で抗体を還元試薬と反応させて、還元抗体を得る工程、
(2)緩衝液と有機溶媒との混合液中でリンカー-薬物複合体を、工程(1)で得られた還元抗体と架橋して、抗体-薬物複合体を得る工程。
【請求項２１】
方法の合成スキームが以下の通りである、請求項20記載の抗体-薬物複合体を調製するための方法：
2020510677.tif 000249
式中、R、Ab、Ar'、L1、L2、CTD、およびmは請求項14に規定した通りである。
【請求項２２】
中間体Cと無水マレイン酸二ハロゲン化物との環化反応を実施して、中間体Dを生成する工程、および
アリールチオフェノールによる中間体Dの置換反応を実施して、式Eに示されるリンカーを生成する工程
を含み、合成スキームが以下の通りである、請求項1〜4のいずれか一項記載の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000250
式中、Rおよびnは請求項1に規定した通りであり、Xはハロゲン、好ましくはBrまたはClを表し、かつUおよびVは独立してNまたはCである。
【請求項２３】
中間体Bを還元することによって中間体Cが得られ、合成スキームが以下の通りである、請求項22記載の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000251
式中、R、n、U、およびVは請求項22に規定した通りである。
【請求項２４】
中間体Bが、フルオロニトロベンゼンによる化合物Aの置換反応によって得られ、合成スキームが以下の通りである、請求項23記載の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000252
式中、R、n、U、およびVは請求項22に規定した通りである。
【請求項２５】
中間体Bが以下の通りに調製される、請求項24記載の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000253
式中、R、n、U、およびVは請求項22に規定した通りである。
【請求項２６】
n-エチレングリコールをハロ酢酸tert-ブチルと反応させることによって化合物Aが得られ、合成スキームが以下の通りである、請求項25記載の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000254
式中、nおよびXは請求項22に規定した通りである。
【請求項２７】
置換マレイミドリンカーとジペプチド/トリペプチド-PABを含有するCTDとの縮合反応を実施してそれぞれF1またはF'1を生成する工程を含み、合成スキームが以下の通りである、請求項5〜12のいずれか一項記載の置換マレアミドリンカー-薬物複合体を調製するための方法：
2020510677.tif 000255
式中、Rは請求項1に規定した通りであり、Rxはハロゲン、C1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、トリフルオロメチル、シアノ、またはアミド基を表し、かつRyはHまたはアルキルを表す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１９】
別の好ましい態様では、式Ibに示される複合体は、以下からなる群より選択される：
2020510677.tif 000256
2020510677.tif 000257
2020510677.tif 000258
2020510677.tif 000259
2020510677.tif 000260
2020510677.tif 000261
2020510677.tif 000262
2020510677.tif 000263
2020510677.tif 000264
2020510677.tif 000265
2020510677.tif 000266
。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３０】
[本発明1001]
下記式Iaに示される置換マレアミドリンカー：
2020510677.tif 000267
式中、
RはXまたはArS-であり、
Xはハロゲンより選択され、
Arは置換または非置換C6〜C10アリールおよび置換または非置換5〜12員ヘテロアリールからなる群より選択され、
Ar'は置換または非置換C6〜C10アリーレンおよび置換または非置換5〜12員ヘテロアリーレンからなる群より選択され、
L1は、Ar'に連結した-O(CH2CH2O)n-であり、ここでnは1〜20の任意の整数である。
[本発明1002]
Arがフェニル、ハロゲン置換フェニル、C1〜C4アルキルフェニル、C1〜C4アルコキシフェニル、4-メチルフェニル、4-メトキシフェニル、2-ピリジル、2-ピリミジニル、1-メチルイミダゾール-2-イル、および
2020510677.tif 000268
からなる群より選択され、ここでWは、カルボニルに結合したアミドR1であり、かつR1は-NH2、
2020510677.tif 000269
からなる群より選択される、本発明1001の置換マレアミドリンカー。
[本発明1003]
Ar'が置換フェニレンおよびピリジルより選択され、置換とは基上の水素原子がハロゲン、C1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、トリフルオロメチル、シアノ、およびアミド基からなる群より選択される1つまたは複数の置換基によって置換されることを意味する、本発明1001の置換マレアミドリンカー。
[本発明1004]
以下からなる群より選択される構造を有する、本発明1001の置換マレアミドリンカー：
2020510677.tif 000270
2020510677.tif 000271
2020510677.tif 000272
2020510677.tif 000273
。
[本発明1005]
下記式Ibに示される構造を有する置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物：
2020510677.tif 000274
式中、
R、Ar'、およびL1は本発明1001に規定した通りであり、
L2は化学結合であるかまたはAA-PABの構造を有し、ここでAAはジペプチドまたはトリペプチド断片であり、かつPABはp-アミノベンジルカルバモイルであり、
CTDは、アミド結合を介してL2に結合した、細胞毒性小分子薬物ならびに/または自己免疫疾患および/もしくは炎症を治療するための薬物である。
[本発明1006]
AAがVal-Cit、Val-Ala、Phe-Lys、Ala-Ala-Asn、およびD-Ala-Phe-Lysからなる群より選択される、本発明1005の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
[本発明1007]
CTDがチューブリンインヒビター、トポイソメラーゼインヒビター、およびDNA結合剤からなる群より選択される、本発明1005の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
[本発明1008]
チューブリンインヒビターが、メイタンシンまたはその誘導体、モノメチルアウリスタチンE、モノメチルアウリスタチンF、モノメチルドラスタチン10、ツブリシン（Tubulysin）またはその誘導体、クリプトフィシンまたはその誘導体、およびタルトブリンからなる群より選択される、本発明1007の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
[本発明1009]
DNA結合剤が、PBDまたはその誘導体およびデュオカルマイシンまたはその誘導体からなる群より選択される、本発明1007の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
[本発明1010]
トポイソメラーゼインヒビターが、ドキソルビシンの代謝産物PNU-159682またはその誘導体、イリノテカンの代謝産物SN38またはその誘導体、およびエキサテカンからなる群より選択される、本発明1007の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物。
[本発明1011]
CTDが、下記D1〜D13'からなる群より選択される構造を有する、本発明1005の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物：
2020510677.tif 000275
2020510677.tif 000276
。
[本発明1012]
式Ibに示される複合体が、以下からなる群より選択される、本発明1005の置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物：
2020510677.tif 000277
2020510677.tif 000278
2020510677.tif 000279
2020510677.tif 000280
2020510677.tif 000281
2020510677.tif 000282
2020510677.tif 000283
2020510677.tif 000284
2020510677.tif 000285
2020510677.tif 000286
2020510677.tif 000287
。
[本発明1013]
本発明1005〜1012のいずれかの置換マレアミドリンカー-薬物複合体、その薬学的に許容される塩または溶媒和物と、抗体とをカップリングさせることによって形成される、抗体-薬物複合体。
[本発明1014]
下記式Icおよび/または式Idに示される構造を有する、本発明1013の抗体-薬物複合体：
2020510677.tif 000288
式中、
Ar'、L1、L2、およびCTDは本発明1005に規定した通りであり、
m＝1.0〜5.0であり、
Abはタンパク質、酵素、抗体、抗体断片、およびペプチドからなる群より選択される。
[本発明1015]
抗体がモノクローナル抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および抗体断片からなる群より選択される、本発明1013の抗体-薬物複合体。
[本発明1016]
抗体が、HER2、HER3、CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD37、CD45、CD56、CD66e、CD70、CD74、CD79b、CD138、CD147、CD223、EpCAM、ムチン1、STEAP1、GPNMB、FGF2、FOLR1、EGFR、EGFRvIII、組織因子、c-MET、ネクチン4、AGS-16、グアニリルシクラーゼC、メソテリン、SLC44A4、PSMA、EphA2、AGS-5、GPC-3、c-KIT、RoR1、PD-L1、CD27L、5T4、ムチン16、NaPi2b、STEAP、SLITRK6、ETBR、BCMA、Trop-2、CEACAM5、SC-16、SLC39A6、デルタ様タンパク質3、およびクローディン18.2からなる群より選択される腫瘍関連抗原に結合できるものである、本発明1013の抗体-薬物複合体。
[本発明1017]
HER2抗体がトラスツズマブまたはペルツズマブより選択されるか、またはEGFR抗体がErbituxまたはVectibixより選択される、本発明1016の抗体-薬物複合体。
[本発明1018]
(a)本発明1013〜1017のいずれかの抗体-薬物複合体と、
(b)薬学的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤と
を含む、薬学的組成物。
[本発明1019]
腫瘍の治療のための薬剤を製造するための、本発明1013〜1017のいずれかの抗体-薬物複合体の使用。
[本発明1020]
以下の工程を含む、本発明1012〜1017のいずれかの抗体-薬物複合体を調製するための方法：
(1)緩衝液中で抗体を還元試薬と反応させて、還元抗体を得る工程、
(2)緩衝液と有機溶媒との混合液中でリンカー-薬物複合体を、工程(1)で得られた還元抗体と架橋して、抗体-薬物複合体を得る工程。
[本発明1021]
方法の合成スキームが以下の通りである、本発明1020の抗体-薬物複合体を調製するための方法：
2020510677.tif 000289
式中、R、Ab、Ar'、L1、L2、CTD、およびmは本発明1014に規定した通りである。
[本発明1022]
中間体Cと無水マレイン酸二ハロゲン化物との環化反応を実施して、中間体Dを生成する工程、および
アリールチオフェノールによる中間体Dの置換反応を実施して、式Eに示されるリンカーを生成する工程
を含み、合成スキームが以下の通りである、本発明1001〜1004のいずれかの置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000290
式中、Rおよびnは本発明1001に規定した通りであり、Xはハロゲン、好ましくはBrまたはClを表し、かつUおよびVは独立してNまたはCである。
[本発明1023]
中間体Bを還元することによって中間体Cが得られ、合成スキームが以下の通りである、本発明1022の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000291
式中、R、n、U、およびVは本発明1022に規定した通りである。
[本発明1024]
中間体Bが、フルオロニトロベンゼンによる化合物Aの置換反応によって得られ、合成スキームが以下の通りである、本発明1023の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000292
式中、R、n、U、およびVは本発明1022に規定した通りである。
[本発明1025]
中間体Bが以下の通りに調製される、本発明1024の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000293
式中、R、n、U、およびVは本発明1022に規定した通りである。
[本発明1026]
n-エチレングリコールをハロ酢酸tert-ブチルと反応させることによって化合物Aが得られ、合成スキームが以下の通りである、本発明1025の置換マレアミドリンカーを調製するための方法：
2020510677.tif 000294
式中、nおよびXは本発明1022に規定した通りである。
[本発明1027]
置換マレイミドリンカーとジペプチド/トリペプチド-PABを含有するCTDとの縮合反応を実施してそれぞれF1またはF'1を生成する工程を含み、合成スキームが以下の通りである、本発明1005〜1012のいずれかの置換マレアミドリンカー-薬物複合体を調製するための方法：
2020510677.tif 000295
式中、Rは本発明1001に規定した通りであり、Rxはハロゲン、C1〜C4アルキル、C1〜C4アルコキシ、トリフルオロメチル、シアノ、またはアミド基を表し、かつRyはHまたはアルキルを表す。
本発明を特定の実施例を参照して下にさらに説明する。これらの実施例は単に発明を説明するためのものであり、発明の範囲を限定しないことを理解されたい。以下の実施例における任意の実験方法が詳細な実験条件によって特定されていない場合には、通常の条件または製造業者によって推奨される条件に適合されたい。特に明記しない限り、部およびパーセントは重量基準で計算される。
【国際調査報告】
2020510677.tif 000296
2020510677.tif 000297
2020510677.tif 000298
2020510677.tif 000299
2020510677.tif 000300
2020510677.tif 000301