(57)【要約】  本発明は、調節可能な主要後期プロモーターおよび外因性導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターに関する。また本発明は、そのようなアデノウイルスベクターを含む細胞、およびそのようなベクターを用いたプロセスも提供する。【選択図】図４
2020533956.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抑制可能な主要後期プロモーター（ＭＬＰ）を含むアデノウイルスベクターであって、前記ＭＰＬがアデノウイルス後期遺伝子の転写を調節または制御することのできる１つ以上のリプレッサーエレメントを含み、且つ前記のリプレッサーエレメントの１つ以上がＭＬＰ  ＴＡＴＡボックスの下流に挿入される前記アデノウイルスベクター。
【請求項２】
抑制可能な主要後期プロモーターおよび外因性導入遺伝子を含むアデノウイルスベクター。
【請求項３】
アデノウイルスベクターであって：
（ａ）複数のアデノウイルス初期遺伝子、および
（ｂ）主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の制御下にある複数のアデノウイルス後期遺伝子、および
（ｃ）導入遺伝子を含み、
前記ＭＬＰが前記のアデノウイルス後期遺伝子の転写を調節または制御することのできる１つ以上のリプレッサーエレメントを含む前記アデノウイルスベクター。
【請求項４】
前述の請求項のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記の１つ以上のリプレッサーエレメントが前記のＭＬＰ  ＴＡＴＡボックスと転写１位の間に挿入される前記アデノウイルスベクター。
【請求項５】
前述の請求項のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記リプレッサーエレメントがリプレッサータンパク質と結合することのできるものである前記アデノウイルスベクター。
【請求項６】
前述の請求項のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記リプレッサーエレメントと結合することのできるリプレッサータンパク質をコードする遺伝子がアデノウイルスゲノム内でコードされる前記アデノウイルスベクター。
【請求項７】
請求項５または６に記載のアデノウイルスベクターであって、前記リプレッサータンパク質が前記ＭＬＰの制御下で転写される前記アデノウイルスベクター。
【請求項８】
請求項５から７までのいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記リプレッサータンパク質がテトラサイクリンリプレッサー、ラクトースリプレッサーまたはエクジソンリプレッサー、好ましくはテトラサイクリンリプレッサー（ＴｅｔＲ）である前記アデノウイルスベクター。
【請求項９】
前述の請求項のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記リプレッサーエレメントが配列番号２に記載の配列を含むかまたはこれにより構成されるテトラサイクリンリプレッサー結合部位である前記アデノウイルスベクター。
【請求項１０】
前述の請求項のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記ＭＬＰのヌクレオチド配列が配列番号６または７に記載の配列を含むかまたはこれにより構成される前記アデノウイルスベクター。
【請求項１１】
前述の請求項のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記リプレッサーエレメントの存在がアデノウイルスＥ２Ｂタンパク質の産生に影響しない前記アデノウイルスベクター。
【請求項１２】
前述の請求項のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記アデノウイルスベクターがアデノウイルスＬ４  １００Ｋタンパク質をコードし且つ前記Ｌ４  １００Ｋタンパク質が前記ＭＬＰの制御下にない前記アデノウイルスベクター。
【請求項１３】
前述の請求項のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、
前記アデノウイルス初期領域の１つ、好ましくはアデノウイルスＥ１領域に導入遺伝子が挿入される前記アデノウイルスベクター。
【請求項１４】
前述の請求項のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記導入遺伝子がその５’−ＵＴＲに三分節系リーダー（ＴＰＬ）を含む前記アデノウイルスベクター。
【請求項１５】
前述の請求項のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記導入遺伝子が治療ポリペプチドをコードする前記アデノウイルスベクター。
【請求項１６】
請求項１から１４のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記導入遺伝子がウイルスタンパク質、好ましくは細胞内または細胞外で集合してウイルス様粒子を産生することのできるタンパク質をコードする前記アデノウイルスベクター。
【請求項１７】
請求項１６に記載のアデノウイルスベクターであって、前記導入遺伝子がノロウイルスＶＰ１またはＢ型肝炎ＨＢｓＡＧをコードする前記アデノウイルスベクター。
【請求項１８】
請求項１から１４のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記導入遺伝子がＡＡＶ  Ｒｅｐポリペプチド、ＡＡＶ  Ｃａｐポリペプチド、ＡＡＶ  Ｒｅｐ−Ｃａｐポリペプトドおよび／またはＡＡＶゲノムをコードする導入遺伝子をコードする前記アデノウイルスベクター。
【請求項１９】
請求項１から１８のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターを含むアデノウイルス粒子を、生理的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤のうち１つ以上と共に含む組成物。
【請求項２０】
請求項１から１８のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターを含むキットであって、前記キットが：
（ｉ）前記ウイルスベクターが細胞に感染して前記ウイルスのゲノムを複製することを可能とする細胞株であって、前記細胞株が前記ウイルスベクターのＭＬＰを抑制する細胞株および
（ｉｉ）前記ウイルスベクターの構築を補助する１つ以上のＤＮＡプラスミドからなる群から選択される１つ以上の追加的構成要素を追加的に含むキット。
【請求項２１】
配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列、またはこれと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むウイルスベクター（好ましくはアデノウイルスベクター）または核酸分子。
【請求項２２】
請求項１から１８のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターを含む哺乳類細胞。
【請求項２３】
請求項２２に記載の哺乳類細胞であって、前記細胞がアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質を発現するＨＥＫ２９３、ＰｅｒＣ６または９１１細胞である前記哺乳類細胞。
【請求項２４】
修飾された哺乳類細胞を生成するためのプロセスであって、前記プロセスが：
（ａ）請求項１から１８のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターを哺乳類細胞に感染させる段階であって、
これによりその後前記哺乳類細胞が前記アデノウイルスベクターを含む段階を含む前記プロセス。
【請求項２５】
請求項２４に記載の方法であって、前記細胞が前記細胞のゲノムに組み込まれたＡＡＶゲノムを含むもの、好ましくは前記ＡＡＶゲノムが左および右ＡＡＶ  ＩＴＲを含む前記方法。
【請求項２６】
請求項２５に記載の方法であって、前記アデノウイルスベクターがＡＡＶ  Ｒｅｐポリペプチド、ＡＡＶ  ＣａｐポリペプチドまたはＡＡＶ  Ｒｅｐ−Ｃａｐポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む前記方法。
【請求項２７】
導入遺伝子産物を産生するためのプロセスであって、前記プロセスが：
（ａ）請求項１から１８のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターを哺乳類細胞に感染させる段階、
（ｂ）前記の感染した哺乳類細胞を前記導入遺伝子が発現するような条件下にある培地で培養する段階；および
（ｃ）導入遺伝子産物を前記細胞または前記細胞培地より分離または精製する段階を含む前記プロセス。
【請求項２８】
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の産生における、請求項１から１８のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターの使用。
【請求項２９】
請求項２８に記載の使用であって、前記アデノウイルスベクターにおける１つ以上の導入遺伝子がＡＡＶ  Ｒｅｐ−Ｃａｐポリペプチドをコードする前記の使用。
【請求項３０】
請求項２８または請求項２９に記載の使用であって、前記導入遺伝子のうち１つ以上がＡＡＶゲノムをコードし、好ましくは前記ＡＡＶゲノムがＡＡＶに由来する５’および３’ＩＴＲ配列を介在配列と共に含むかまたはこれらで構成される前記の使用。
【請求項３１】
請求項２８から３０のうちいずれか１つに記載の使用であって、前記導入遺伝子のうち１つ以上がＡＡＶに由来するＲｅｐ−Ｃａｐポリペプチドおよび目的の配列に隣接するＩＴＲを有するＡＡＶゲノムをコードする前記の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、調節可能な主要後期プロモーターおよび外因性導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターに関する。また本発明は、そのようなアデノウイルスベクターを含む細胞、およびそのようなベクターを用いたプロセスも提供する。
【０００２】
アデノウイルスベクターは、遺伝学が十分に理解され、組織培養において高い収率となる増殖能を有する、バイオテクノロジーにおける魅力的且つ万能のツールである。アデノウイルスの複製周期は、初期と後期の双方を包含して高度に複雑である。初期から後期への転換は、ＤＮＡ複製およびウイルスゲノム中の主要後期プロモーター（ＭＰＬ）の活性化の後に発生すると考えられる。ＭＬＰは全てのウイルスの後期転写産物の発現を駆動し、細胞のタンパク質のうち最大３０％をウイルス構造タンパク質に変換することができる。ＭＬＰの原位置修飾により発現が誘導可能となることはこれまで立証されていないが、その主な原因はウイルスＤＮＡポリメラーゼコード配列が対向のＤＮＡ鎖にあることである。
【０００３】
アデノウイルスは数多くの用途に有用な実験室的ツールであるが、非常に生産性が高いことが製造ワークフローに用いる場合に大きな問題となり、すなわち相当量のウイルス粒子を産生し、これを下流プロセスで除去しなければならない。たとえば、アデノウイルスを先にタンパク質発現用途、またはその他のウイルス様粒子の産生、またはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の大スケール製造を目的として使用している場合、製造プロセス終了時に無傷のアデノウイルス粒子が存在することは非常に望ましくない。
【０００４】
哺乳類細胞内でタンパク質を産生する能力の魅力は高まっており、現在ではこの系で価値の高い組換えタンパク質が数多く産生され、最適なタンパク質プロセシング、フォールディングおよびグリコシル化を可能としている。これは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即時初期プロモーターなどの強力なプロモーターの制御の下で、必要な導入遺伝子をコードするプラスミドの一過性トランスフェクションを用いて達成されることが多い。しかし、他の生物におけるウイルス系（昆虫細胞内のバキュロウイルスなど）の一部と比較して、このプロセスは相対的に効率が低く、タンパク質収率はしばしば変動し、総細胞タンパク質質量の３％を上回ることはまれである。
【０００５】
アデノウイルスゲノムを詳細に特性解析すると、その遺伝子発現およびライフサイクルに関する豊富な知見に関連し、このウイルスは組換えタンパク質の収率を著しく改善する理想的なプラットフォームの候補となる。大きな利点の１つは、当該ウイルスが哺乳類細胞の機構を活発に奪う能力、および細胞タンパク質の産生を阻害する能力によって示される。
【０００６】
しかし、細胞タンパク質の産生を阻害することに加え、細胞リソースの相当部分が、ウイルスによってウイルス構造タンパク質の産生に利用される。たとえば、カプシドタンパク質の産生量は莫大で、最大で総タンパク質の３０％と算出されており、これらのタンパク質および産生後に構築されたウイルス粒子を取り除くのは極めて困難である。
【０００７】
組換えタンパク質と同様に、アデノ随伴ウイルス粒子に対する需要は、最近網膜障害および血友病の治療が臨床的に成功したことで著しく上昇している。従来、ＡＡＶの産生は異なる２つの経路から達成されている。当初、ＡＡＶは野生型（ＷＴ）アデノウイルス血清型５を用い、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子とＡＡＶゲノムをコードするプラスミドを細胞にトランスフェクトして産生された。これにより、ＷＴアデノウイルスがウイルス複製を促進する数多くの因子をトランスに提供することを可能とした。しかしこの手法には数多くの限界があり：たとえば、ＡＡＶの各バッチは純粋な生成物を提供するためにＡｄ５粒子から分離しなければならないが、全てのＡｄ５を確実に除去することは困難である。さらに、製造中の細胞が、ＡＡＶよりむしろアデノウイルス粒子の産生に膨大なリソースを充当していることも望ましくない。
【０００８】
さらに最近では、アデノウイルスに基づく系は、ＡＡＶ産生に必要なアデノウイルスゲノムの切片をコードするプラスミドに置き換えられた。これにより、最終ウイルス製剤に存在するアデノウイルス粒子に関する懸念の一部は解決したが、数多くの問題が残っている。これらは、製造細胞株のトランスフェクションに十分な製造前プラスミドが必要であること、およびトランスフェクションプロセスそれ自体に固有の低い効率を含む。これらの系の収率も、Ａｄ５を用いた手法と比べて低い。発明者らは、現在、後期アデノウイルス遺伝子の転写が、リプレッサーエレメントの主要後期プロモーターへの挿入により調節（阻害など）できることを発見している。後期遺伝子の発現の「スイッチを切る」ことにより、細胞のタンパク質製造能力を所望の組換えタンパク質の産生に転用することができる。重要なことに、本発明に従ってアデノウイルスゲノム内にある主要後期プロモーターを戦略的にサイレンシングすると、ウイルスが細胞内にあってもそのＤＮＡを複製し、幅広い用途を目的として転写できるウイルスゲノムＤＮＡを何千コピーも提供することを可能とする。
【０００９】
本発明は幅広い利点を提供する。たとえば、細胞のタンパク質産生能力を特定の組換えタンパク質の産生に振り向け、ウイルスの後期遺伝子が未だに発現している同等の系と比較して高収率とするために用いることができる。さらに、ウイルス構造タンパク質の産生の「スイッチを切る」能力は、タンパク質の産生プロセス中にウイルス粒子が産生されないか、またはほとんど産生されないことを意味する。その結果、精製タンパク質からウイルス粒子を除去する必要性が低減されるので、経済的節約効果が得られる。
【００１０】
本発明は、アデノウイルスゲノムの複製を維持することで、アデノウイルス内でＡＡＶのＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードし、ＡＡＶ粒子を産生するのに必要な高い発現レベルを提供しながら、最終ＡＡＶ製剤中のアデノウイルス粒子の産生を防止することのできる、単純で費用対効果の高いＡＡＶ粒子製造法を提供するという利点も有する。
【００１１】
ＭＰＬの修飾がこれまでにいくつか報告されている。これらには、ＭＰＬのコピーを作製し、他のプラスミドに配置して発現レベルを分析すること（Ｅｌ−Ｍｏｇｙ、２０１２年）、またはその発現を調節する部位を挿入されるアデノウイルスゲノムのＥ１領域内に配置すること（Ｍｏｌｉｎ，１９９８年）が含まれる。その他の研究には、基礎研究（Ｃｏｎｃｉｎｏ他、１９８３年；Ｃｏｎｃｉｎｏ他、１９８４年）、および細胞内にトランス相補性因子を有する細胞でのみ選択的にウイルスを増殖させることの双方を目的としたＭＬＰ  ＴＡＴＡボックスの変異が含まれた。重要なことに、後者の手法は、主要後期プロモーターの活性が細胞内に存在する相補的タンパク質因子に全面的に依存し、このためこの因子が存在しない細胞内ではＭＬＰが活性とならない系を備える。しかしながら、本発明はこれとは逆のものを提供し、リプレッサーが結合しない細胞内でＭＬＰが完全な発現活性レベルを維持し、最小限のウイルスライフサイクルの障害で高レベルウイルス複製を提供する。
【００１２】
従って、本願に記載する本発明のウイルスは、リプレッサーの有無に応じて、抑制されていないときには完全に活性がありながらも、抑制されることができる。これまで、アデノウイルスゲノムにおいて、リプレッサー結合部位をＭＬＰに原位置で挿入してその発現を調節することには成功していなかった。本発明者らは、この系をさらに改善して、リプレッサータンパク質コード配列を主要後期プロモーターそれ自体の制御の下に置いている。この手法においては、主要後期プロモーターがウイルスの構造タンパク質を転写しようとすると、それ自体の活性を抑制することのできるリプレッサーも転写するので、ＭＬＰ活性を阻害するネガティブフィードバックループが可能となり且つＭＰＬ発現が厳重に調節されるので、主要後期プロモーター自体で自己抑制する。
【００１３】
それゆえ、組換えタンパク質の収率の上昇を提供し、且つ非アデノウイルス粒子およびウイルス様粒子を提供するために用いることのできるアデノウイルスベクター系を提供することが、本発明の目的である。
【００１４】
また、タンパク質でも、あるいは非アデノウイルス粒子またはウイルス様粒子でもありうる精製された生成物からウイルス粒子を除去する必要性を低減する、アデノウイルス感染細胞において導入遺伝子産物を産生するプロセスを提供することも、本発明の目的である。
【００１５】
１つの実施形態においては、本発明は抑制可能な主要後期プロモーター（ＭＬＰ）を含むアデノウイルスベクターであって、ＭＰＬがアデノウイルス後期遺伝子の転写を調節または制御することのできる１つ以上のリプレッサーエレメントを含み、且つ１つ以上のリプレッサーエレメントがＭＬＰ  ＴＡＴＡボックスの下流に挿入されるアデノウイルスベクターを提供する。
【００１６】
他の実施形態において、本発明は、抑制可能な主要後期プロモーターおよび外因性導入遺伝子を含むアデノウイルスベクターを提供する。
【００１７】
他の実施形態において、本発明は、アデノウイルスベクターであって：
（ａ）複数のアデノウイルス初期遺伝子、および
（ｂ）主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の制御下にある複数のアデノウイルス後期遺伝子、および
（ｃ）導入遺伝子を含み、
ＭＰＬがアデノウイルス後期遺伝子の転写を調節、または制御することのできる１つ以上のリプレッサーエレメントを含むアデノウイルスベクターを提供する。
【００１８】
好ましくは、リプレッサーエレメントと結合することのできるリプレッサータンパク質をコードする遺伝子がアデノウイルスゲノム内でコードされる。
【００１９】
好ましくは、導入遺伝子はその５‘−ＵＴＲに三分節系リーダー（ＴＰＬ）を含む。
【００２０】
好ましくは、リプレッサーエレメントの存在はアデノウイルスＥ２Ｂタンパク質の産生に影響しない。
【００２１】
好ましくは、リプレッサータンパク質はＭＰＬから転写される。
【００２２】
好ましくは、ＭＬＰ  ＴＡＴＡボックスと転写＋１位の間に１つ以上のリプレッサーエレメントが挿入される。
【００２３】
アデノウイルスは、現代の科学研究において最も多く研究および利用されているウイルスである。予防接種、遺伝子療法、ウイルス療法の分野において、また生体系を理解するための複合ツールとしても有用性が確認されている（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ他、２００４年）。
【００２４】
ウイルスのアデノウイルス科は二重鎖ＤＮＡウイルスであり、１９５３年に感染小児のアデノイドから初めて分離された（Ｒｏｗｅ他、１９５３年）。アデノウイルス科は、ヒト、鳥類および両生類を含む多様な宿主に感染する数多くの種からなり、その感染する多様な宿主を反映して４つの属に分類される。
【００２５】
マストアデノウイルス属は、哺乳類宿主に感染する２５種の固有アデノウイルス種からなる。現在、この属にはヒトに感染する異なる７種のアデノウイルスが存在する。それらは、ヒトアデノウイルスＡ〜Ｇのように文字で表示される。これらの種の中で複数の血清型が同定されて１〜５７まで付番され、いずれも国際ウイルス分類委員会より独立した株として認識されている。
種Ａ：１２、１８、３１
種Ｂ：３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、５０、５５
種Ｃ：１、２、５、６、５７
種Ｄ：８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３６、３７、３８、３９、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５１、５３、５４、５６
種Ｅ：４
種Ｆ：４０、４１
種Ｇ：５２
【００２６】
アデノウイルスは小型（直径約９０ｎｍ）の無エンベロープウイルスであり、正二十面体カプシドおよび正二十面体の頂点から突出する１２本の線維を有する。ウイルスは２４０個のヘキソン三量体、１２個のペントン五量体、６０個のＩＩＩａ単量体、１２個の線維三量体、６０個のＶＩＩ六量体、８０個のＩＸ三量体、さらには２個の末端反復タンパク質および複数のコアタンパク質からなる。後者の多くは細胞内輸送およびエンドサイトーシスで取り込まれたウイルスカプシドのタンパク質分解開裂に不可欠である。
【００２７】
アデノウイルスのＤＮＡゲノムの長さは血清型によって異なるが、典型的には長さ３４〜３６ｋ塩基である。アデノウイルス血清型５のゲノムは、通常３５９３８塩基対で、各末端に１０３塩基対の末端反復があり、ＧＣ含有率は５８％である。ゲノムは複製周期の大半においてカプシド構造内で直線型であるが、ゲノム複製時には核内でパンハンドル環状構造を形成することができる。
【００２８】
アデノウイルスの細胞接着プロセスは血清型によって異なる。アデノウイルスＣ種（血清型２および５を含む）は、細胞タイトジャンクションの構成要素である（Ｈｏｎｄａ他、２０００年）細胞表面のコクサッキーおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）と結合する（Ｔｏｍｋｏ他、１９９７年）その線維ドメインを介して、細胞に接着することが示されている。この開始時の相互作用は親和性が高く、その後はウイルスペントンベースと上皮細胞に多く存在する細胞表面インテグリン（αＶβ３とαＶβ５）の間の低親和性相互作用となる（Ｗｉｃｋｈａｍ他、１９９３年）。細胞表面への吸収後、ビリオンはエンドサイトーシスで取り込まれ、ウイルスカプシドがエンドソームから細胞基質に漏出するが、この段階は十分に解明されていない。アデノウイルスカプシドは、細胞基質内で微小管ネットワークと結合し、ダイニン依存性機構を経て核に運ばれ、そこでＤＮＡが核の内腔に送達された後、カプシドは核膜孔複合体と相互作用する（Ｔｒｏｔｍａｎ他、２００１年；Ｋｅｌｋａｒ他、２００４年）。
【００２９】
アデノウイルスの遺伝学、転写および翻訳に冠する我々の理解は、主としてアデノウイルスＣ種血清型５を用いたウイルス学的研究より導かれている。アデノウイルスゲノムからの連続的な遺伝子転写プロセスは、複製プロセスの各ステージにおけるウイルスのタンパク質要求量を反映している。したがって、アデノウイルスゲノムからの転写は、各ウイルスプロモーターから転写を開始する時期に応じて初期事象と後期事象に分類される（図１）。ウイルスゲノムから最初に産生されるタンパク質はＥ１Ａタンパク質である。Ｅ１Ａ転写単位はオルタナティブスプライシングを経て複数のｍＲＮＡ分子を産生し、これが６〜３６ｋＤａの範囲の複数のタンパク質を産生する。Ｅ１Ａタンパク質には感染細胞内で２つの主要な役割がある。第１に、細胞周期のＳ期に入ってウイルスゲノムの効率的な複製を可能とするよう、細胞を誘導する。第２に、トランス活性化によりウイルスゲノム内の他の初期プロモーターの転写を誘導する。これらのプロモーターはＥ１Ｂ、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４およびＥ５タンパク質の産生を制御する。Ｅ１Ａの発現の直後に、ＶＡ  ＲＮＡおよびＥ１ＢおよびＥ３タンパク質が産生される。これらのタンパク質およびＲＮＡ分子は、抗ウイルス反応の発生の防止に役立つ。ウイルス複製におけるこれらの初期事象は、パッケージング前のウイルスゲノムの複製を可能とするような細胞内環境の形成に役立つ。後期転写事象は、主として後期領域１〜５を転写する単一のプロモーター（主要後期プロモーター）に由来する、構造タンパク質および細胞溶解に不可欠なタンパク質の産生を包含する。細胞溶解は、初期遺伝子と表示されているにも関わらず感染時には後期にしか産生されず、主要後期プロモーターから産生するＥ３−１１．６Ｋタンパク質（アデノウイルス死タンパク質とも呼ばれる）に依存する（Ｔｏｌｌｅｆｓｏｎ他、１９９６年）。
【００３０】
アデノウイルス遺伝子は初期転写産物（Ｅ１〜４）および後期転写産物（Ｌ１〜５）に分類され、多様なスプライシング事象に由来する多数のタンパク質アイソフォームを伴う。初期領域はＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４に分けられる。Ｅ１は、ウイルス複製を促す細胞周期の相に細胞を移行させ、アポトーシスを阻害し、細胞分裂を促進するのに不可欠である。Ｅ２領域はＤＮＡゲノムの複製の大半を担い、ＤＮＡ結合タンパク質（Ｅ２Ａ）、末端タンパク質、およびＤＮＡポリメラーゼ（Ｅ２Ｂ）を含む。Ｅ３は宿主応答の免疫調節に関与する遺伝子を含み、Ｅ４は非相同末端結合（ＮＨＥＪ）などの細胞経路の調節およびｐ５３分解を媒介するＥ１Ｂ−５５Ｋとの複合体化に関与する幅広い遺伝子を含む。
【００３１】
アデノウイルス後期遺伝子は、全て同じプロモーターである主要後期プロモーターから転写され、集合して三分節系リーダー配列を形成する３つのエクソンを含む同一の５’ｍＲＮＡ末端を全てが共有する。後期遺伝子は、ウイルス粒子の一部（ヘキソンおよび線維など）を形成するか、またはその構築に関与する（１００Ｋタンパク質など）約１３種類のタンパク質の発現を可能とする、一連のスプライシング事象によって発現する。
【００３２】
アデノウイルスベクターは、アデノウイルス科のウイルスのゲノムに基づくか、またはこれに由来するベクターである。好ましくは、アデノウイルスはＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ群に由来するヒトアデノウイルスである。より好ましくは、アデノウイルスはＢまたはＣまたはＤ群に由来するヒトアデノウイルスである。さらにより好ましくは、アデノウイルスベクターはＢまたはＣ群に由来するヒトアデノウイルスである。
【００３３】
アデノウイルスベクターは、複数のアデノウイルス初期遺伝子を含む（図１）。
【００３４】
Ｅ１Ａタンパク質は、Ｅ１Ａ領域における核内アデノウイルスゲノムからの最初の遺伝子転写事象の翻訳産物である。この最初の転写は、Ｅ１Ａプロモーター内の強力な構成的活性エンハンサーエレメントによって駆動され、相当量のＥ１Ａ  ｍＲＮＡを産生することを可能とする。細胞周期の進行を誘導することもできるＥ１Ｂタンパク質による形質転換を誘導することのできる、アデノウイルスゲノム内の２組のタンパク質の一方である。Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子はウイルスの複製に不可欠である。
【００３５】
Ｅ２遺伝子はアデノウイルスゲノム内で２つの部分：Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ領域に分けられ、そのいずれもウイルス複製に必要とされる。Ｅ２Ｂは、基本的にウイルスゲノムＤＮＡの増幅に必要とされるＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含む。同様に、この領域はウイルスゲノム複製の開始に必要とされる末端タンパク質も含む。末端タンパク質はウイルスゲノムＤＮＡの端と共有結合する。Ｅ２Ａ領域はＤＮＡ複製に必要とされるＤＮＡ結合タンパク質を含む。全てのＥ２遺伝子は基本的にウイルス複製に必要とされる。
【００３６】
Ｅ３遺伝子は、主として細胞を調節することおよびウイルス感染に対する宿主免疫応答に関与するが、バイオテクノロジー用途に使用されるウイルスの大半はインビトロであるので、これらのウイルス遺伝子の全てではなくとも多くはウイルス複製効率を低減することなく除去することができる。Ｅ３遺伝子の大半はウイルスの複製に不可欠でない。しかし、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）などの一部の遺伝子は効率の高い複製およびウイルス産生に必要とされる。
【００３７】
アデノウイルスゲノムのＥ４領域は、ウイルスの制御を促進し、効率的なウイルス複製および産生を確保するよう細胞を調節するタンパク質の産生に主として関与する点で、Ｅ１領域に類似している。当該領域は、他の数多くの独立した機能のうち、非相同末端結合およびアポトーシスの防止に資することのできる６つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む。Ｅ４転写産物のウイルス複製に対する重要性にはそれぞればらつきがあり、あるものは不可欠である一方で、他のものはウイルスの増殖動態および産生にほとんど影響することなく削除または修飾することができる。
【００３８】
好ましくは、本発明のアデノウイルスベクターは、アデノウイルスが配置される細胞の核内のウイルスゲノムをアデノウイルスが複製することができるよう、十分なアデノウイルス初期遺伝子を含む。
【００３９】
アデノウイルスベクターは、複数のアデノウイルス後期遺伝子を含む（図１）。
【００４０】
ウイルス後期遺伝子は、Ｌ１〜Ｌ５と呼ばれる５つの主要な転写産物ファミリーに分けられる。これらの転写産物は、主としてウイルス構築に関与するタンパク質およびウイルスの構造タンパク質をコードする。ウイルス複製時には細胞タンパク質成分のうち３０〜４０％と多くを占めることがある（Ｇａｒｎｉｅｒ、１９９４年；Ｇｉｎｓｂｅｒｇ、１９８４年）。
【００４１】
Ｌ１系転写産物は１３．６Ｋ、５２Ｋ、およびＰＩＩＩａタンパク質をコードする。これらのタンパク質は全てウイルス構築および粒子産生に関与する。Ｌ１遺伝子はウイルス構築の成功に必要とされるが、ゲノムＤＮＡ複製には必要とされない。
【００４２】
Ｌ２系転写産物はペントンベース、ｐＶＩＩ、Ｖ、ｐＸタンパク質をコードする。これらはウイルスカプシドの構造的部分を形成し、粒子が正しく集合するために必要である。ペントンベースは、感染時にウイルスが細胞表面に接着するために重要なＲＧＤモチーフを含む。Ｌ２遺伝子はウイルス構築の成功に必要とされるが、ゲノムＤＮＡ複製には必要とされない。
【００４３】
Ｌ３系転写産物はｐＶＩ、ヘキソンおよびプロテアーゼタンパク質をコードする。ヘキソンタンパク質はウイルスカプシドの主要成分であり、血清型の間で抗原的に異なる。プロテアーゼタンパク質は細胞内への進入およびウイルスカプシドの成熟に関与する。Ｌ３遺伝子はウイルス構築の成功に必要とされるが、ゲノムＤＮＡ複製には必要とされない。
【００４４】
Ｌ４系転写産物は１００Ｋ、３３Ｋ、２２Ｋ、およびｐＶＩＩタンパク質をコードする。これらのタンパク質は幅広い機能に関与する。１００Ｋタンパク質はウイルスヘキソン構築の促進と核の移入に関与するが、細胞ｍＲＮＡの翻訳をｃａｐ依存性翻訳に切り替える際にも一定の役割を果たすこともある。１つの実施形態においては、１００Ｋタンパク質はウイルスゲノム内からではなく細胞内でトランスに提供されうる。２２Ｋタンパク質はウイルスのカプシド形成に関与する。Ｌ４遺伝子はウイルス構築の成功に必要とされるが、ゲノムＤＮＡ複製には必要とされない。しかし１００Ｋタンパク質は、細胞タンパク質の翻訳の三分節系リーダー（ＴＰＬ）配列を含む転写産物への切り替えに資することがある。
【００４５】
このように、本発明の実施形態の１つにおいては、１００Ｋタンパク質の発現はＭＬＰによって制御されないことがある。１つの実施形態における１００Ｋタンパク質は、ＭＬＰに制御されないウイルスゲノムの他の位置に導入されることがある。他の実施形態においては、１００Ｋタンパク質は別のウイルスに導入されることがある。他の実施形態においては、１００Ｋタンパク質は細胞の染色体に導入されるか、またはＤＮＡトランスフェクションまたはエレクトロポレーションによってトランスに提供されることもある。
【００４６】
Ｌ５は線維遺伝子をコードする。線維は、細胞表面への接着および細胞のウイルス感染を媒介することに関与するウイルス構造タンパク質である。線維タンパク質は、ウイルス粒子形成に必要な量を著しく上回って産生される。線維およびヘキソン（Ｌ３）はウイルス複製時に産生される最も豊富なタンパク質の一部であるので、本発明の実施形態の１つは少なくともこれらの一方をサイレンシングすることがある。Ｌ５遺伝子はウイルス構築の成功に必要とされるが、ゲノムＤＮＡ複製には必要とされない。
【００４７】
本発明のアデノウイルスベクターは、アデノウイルスが細胞内でパッケージングされて他の哺乳類細胞に感染することの可能なウイルス粒子を産生することができるよう、十分なアデノウイルス後期遺伝子を含む。ウイルスゲノムは、主要後期プロモーターから産生された少なくとも１つの後期転写産物を含むことになる。除去されてトランスに提供されるタンパク質もあれば、宿主細胞の染色体に導入されるタンパク質もある。
【００４８】
野生型アデノウイルスゲノムでは、単一の主要後期プロモーター（ＭＬＰ）がアデノウイルス後期転写産物Ｌ１〜Ｌ５の平行転写の促進を担う（図１）。本発明のアデノウイルスベクターはＭＬＰも含む。ＭＬＰはこれらの後期転写産物の５’末端に位置する。
【００４９】
複数のｍＲＮＡが、後期転写産物から３’−スプライシングおよびポリ（Ａ）部位の使い分けを経て産生される。これらの転写産物はいずれも三分節系リーダー（ＴＰＬ）配列を含む。
【００５０】
図２は主要後期プロモーターの注釈付き配列を示す。プロモーターの重要な機能には数多くの転写因子結合部位が含まれる。これはＣＡＡＴボックス、ＵＰＥボックス、ＴＡＴＡボックス、ＭＡＺ／ＳＰ１結合部位、転写＋１位、およびＩＮＲエレメントと、Ｒ１領域、ＤＥ１およびＤＥ２サブ領域を含むエンハンサー領域を含む。これらの機能は、主要後期プロモーターの活性に対して様々な度合いで重要であることが示されている。修飾または削除された場合にプロモーター活性を一時しく低下させることが知られている重要な機能はＴＡＴＡボックス、ＩＮＲエレメント、Ｒ領域と、ＤＥ１およびＤＥ２領域である。ＴＡＴＡボックスは、唯一の最も重要な機能が考えられ、ＴＡＴＡ配列自体の最終塩基より２８番目の塩基対から転写が開始される。
【００５１】
野生型Ａｄ５  ＭＬＰのヌクレオチド配列を以下に示す：
【００５２】
ｃｇｃｃｃｔｃｔｔｃｇｇｃａｔｃａａｇｇａａｇｇｔｇａｔｔｇｇｔｔｔｇｔａｇｇｔｇｔａｇｇｃｃａｃｇｔｇａｃｃｇｇｇｔｇｔｔｃｃｔｇａａｇｇｇｇｇｇｃｔａｔａａａａｇｇｇｇｇｔｇｇｇｇｇｃｇｃｇｔｔｃｇｔｃｃｔｃａ（配列番号１）
【００５３】
ＴＡＴＡボックスは上記の配列において下線を付し、最終塩基（太字）は転写開始位置（すなわち＋１位）を表示する。
【００５４】
本発明のアデノウイルスベクターにおいては、ＭＰＬは１つ以上のリプレッサーエレメントを含む。リプレッサーエレメントは、アデノウイルス後期遺伝子の転写を調節または制御することができる。好ましくは、リプレッサーエレメントは、下流のアデノウイルス後期遺伝子の転写を抑制することができる。
【００５５】
ＭＰＬには１つ以上のリプレッサーエレメントが存在しうる。好ましくは１、２、３または４個、より好ましくは１または２個のリプレッサーエレメントが存在する。
【００５６】
一部の実施形態においては、１個以上の（好ましくは１個の）リプレッサーエレメントがＭＬＰのＴＡＴＡボックスの下流に位置する。他の実施形態においては、１個以上の（好ましくは１個の）リプレッサーエレメントがＭＬＰのＴＡＴＡボックスの上流に位置する。他の実施形態においては、１個以上の（好ましくは１個の）リプレッサーエレメントがＭＬＰのＴＡＴＡボックスの上流に位置し、１個以上の（好ましくは１個の）リプレッサーエレメントがＭＬＰのＴＡＴＡボックスの下流に位置する。
【００５７】
好ましくは、１個以上のリプレッサーエレメントは全て＋１転写開始部位の上流に配置される。より好ましくは、ＭＬＰ  ＴＡＴＡボックスと転写＋１位の間に１つ以上のリプレッサーエレメントが挿入される。さらにより好ましくは、１つ以上のリプレッサーエレメントの開始はＴＡＴＡボックスから２７ヌクレオチド未満下流、より好ましくは２０ヌクレオチド未満下流、さらにより好ましくは１０ヌクレオチド未満下流に配置される。
【００５８】
リプレッサーはＤＮＡ結合タンパク質である。リプレッサーがＤＮＡに結合して転写開始に必要とされる転写因子の動員を直接阻害するか、またはリプレッサーがＤＮＡ上の重要なフットプリントを占拠して転写開始に必要とされる転写因子の結合を阻害し、転写の開始を立体的に阻害することになる。リプレッサーは、リプレッサータンパク質の立体構造を変化させて、そのＤＮＡとの結合を可能とするか、または抑止する低分子によって調節され得る。リプレッサーは活性化因子ではない。
【００５９】
リプレッサーによって調節されるプロモーターは、典型的には生物因子または非生物因子の有無によって誘導される。
【００６０】
本発明の状況においてリプレッサーとして用いることが可能なタンパク質の例は、テトラサイクリンリプレッサー、ラクトースリプレッサー、エクジソンリプレッサー、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）、メタロチオネイン（金属イオンと結合してこれを隔離するタンパク質）、サリチル酸、エチレンおよびベンゾチアゾール（ＢＴＨ）を含む。
【００６１】
好ましくは、リプレッサーはテトラサイクリンリプレッサー、ラクトースリプレッサーまたはエクジソンリプレッサーである。最も好ましくは、リプレッサーはＴｅｔリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）である。
【００６２】
ＴｅｔＲ結合部位は野生型配列を有することがある。好ましくは、ＴｅｔＲ結合部位はわずかな配列変更を取り入れることによって１つ以上の改善を受けている。本発明の実施形態において用いることのできる好ましい変種は配列：
ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号２）を有する。
【００６３】
ＴｅｔＲリプレッサータンパク質が使用するＴｅｔＲ結合配列変種と結合するのであれば、ＴｅｔＲタンパク質またはＴｅｔＲタンパク質の誘導体と結合するリプレッサーエレメントの代替的な変種も、本発明の実施形態において使用しうる。一部のリプレッサー／結合部位変種は、互いに対する親和性が野生型よりも高くなり；これらは本発明の実施形態の１つにおいて好ましい。
【００６４】
本発明の１つの実施形態においては、ＴｅｔＲタンパク質のＤＮＡ配列は：
【００６５】
Ａｔｇｔｃｇｃｇｃｃｔｇｇａｃａａａａｇｃａａａｇｔｇａｔｔａａｃｔｃａｇｃｇｃｔｇｇａａｃｔｇｔｔｇａａｔｇａｇｇｔｇｇｇａａｔｔｇａａｇｇａｃｔｃａｃｔａｃｔｃｇｃａａｇｃｔｇｇｃａｃａｇａａｇｃｔｇｇｇｃｇｔｃｇａｇｃａｇｃｃａａｃｇｃｔｇｔａｃｔｇｇｃａｔｇｔｇａａｇａａｔａａａｃｇｇｇｃｇｃｔｃｃｔａｇａｃｇｃｇｃｔｔｇｃｃａｔｃｇａａａｔｇｃｔｇｇａｃｃｇｃｃａｔｃａｃａｃｃｃａｃｔｔｔｔｇｃｃｃｃｃｔｇｇａｇｇｇｃｇａａｔｃｃｔｇｇｃａａｇａｔｔｔｔｃｔｇｃｇｇａａｃａａｔｇｃａａａｇｔｃｇｔｔｃｃｇｇｔｇｃｇｃｔｃｔｇｃｔｇｔｃｃｃａｃｃｇｃｇａｔｇｇｃｇｃａａａａｇｔｇｃａｃｃｔｇｇｇｃａｃｔｃｇｇｃｃｃａｃｃｇａｇａａａｃａａｔａｃｇａａａｃｃｃｔｇｇａａａａｃｃａａｃｔｇｇｃｔｔｔｃｃｔｔｔｇｃｃａａｃａｇｇｇａｔｔｔｔｃａｃｔｇｇａｇａａｔｇｃｃｃｔｇｔａｃｇｃａｃｔａｔｃｃｇｃｇｇｔｃｇｇｃｃａｃｔｔｔａｃｃｃｔｇｇｇａｔｇｃｇｔｃｃｔｃｇａａｇａｔｃａｇｇａｇｃａｃｃａａｇｔｃｇｃｃａａｇｇａｇｇａａａｇａｇａａａｃｔｃｃｔａｃｃａｃｔｇａｃｔｃａａｔｇｃｃｔｃｃｇｃｔｃｃｔｇａｇａｃａａｇｃｃａｔｃｇａｇｃｔｇｔｔｃｇａｃｃａｃｃａｇｇｇｔｇｃｔｇａａｃｃｔｇｃａｔｔｔｃｔｇｔｔｃｇｇｇｃｔｔｇａａｃｔｇａｔｔａｔｃｔｇｃｇｇｃｃｔｇｇａｇａａａｃａｇｔｔｇａａｇｔｇｃｇａｇｔｃｇｇｇａｔｃｃｔａｇ（配列番号３）、
【００６６】
またはこれと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、かつＴｅｔＲタンパク質をコードする配列である。
【００６７】
本発明の１つの実施形態においては、ＴｅｔＲタンパク質のアミノ酸配列は：
【００６８】
ＭＳＲＬＤＫＳＫＶＩＮＳＡＬＥＬＬＮＥＶＧＩＥＧＬＴＴＲＫＬＡＱＫＬＧＶＥＱＰＴＬＹＷＨＶＫＮＫＲＡＬＬＤＡＬＡＩＥＭＬＤＲＨＨＴＨＦＣＰＬＥＧＥＳＷＱＤＦＬＲＮＮＡＫＳＦＲＣＡＬＬＳＨＲＤＧＡＫＶＨＬＧＴＲＰＴＥＫＱＹＥＴＬＥＮＱＬＡＦＬＣＱＱＧＦＳＬＥＮＡＬＹＡＬＳＡＶＧＨＦＴＬＧＣＶＬＥＤＱＥＨＱＶＡＫＥＥＲＥＴＰＴＴＤＳＭＰＰＬＬＲＱＡＩＥＬＦＤＨＱＧＡＥＰＡＦＬＦＧＬＥＬＩＩＣＧＬＥＫＱＬＫＣＥＳＧＳ（配列番号４）、
【００６９】
またはこれと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有し、かつＴｅｔＲタンパク質をコードする配列である。
【００７０】
ＴｅｔＲがリプレッサーエレメント（リプレッサー結合部位など）と結合するとき、転写の厳格な抑制が得られる。しかし、ドキシサイクリンの存在下では抑制が緩和されるので、関連プロモーターは完全な転写活性を回復する。ドキシサイクリンはテトラサイクリンよりも好ましい。
【００７１】
リプレッサーエレメントは、ＭＰＬ配列の修飾によりＭＰＬに導入しうる。リプレッサーエレメントは、リプレッサーエレメントのＭＬＰ配列への挿入；ＭＬＰ配列の１つ以上のヌクレオチドの置換によるリプレッサーエレメント配列の作製；または新規配列の挿入／削除の組み合わせによって導入しうる。
【００７２】
本発明の１つの実施形態においては、ＴＡＴＡボックスとＭＬＰのＤＮＡ転写＋１位の距離が維持されるが（±５％）、両者の間にリプレッサー結合部位が挿入される。この領域内にはＭＡＸ／ＳＰ１結合部位が存在する。この部位はＭＬＰ発現にとって根本的ではないので、本発明の１つの実施形態においては置換することができる。図３は、ＴＡＴＡボックスと転写＋１位の間の領域がテトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）との結合部位で置換されている、本発明の実施形態の１つを示す。
【００７３】
一部のアデノウイルスベクターでは、ＭＰＬ配列の対向ＤＮＡ鎖の切片が初期ウイルスタンパク質Ｅ２Ｂ（ウイルスＤＮＡポリメラーゼをコードする）をコードする。このようなアデノウイルスベクターがそのゲノムを複製する能力を維持するためには、ＭＬＰ配列に加えられた修飾がＥ２Ｂタンパク質の産生、安定性または有効性に対して著しく有害に影響しないことを保証する必要がある。
【００７４】
アデノウイルス血清型５においては、ＭＬＰはＥ２Ｂポリメラーゼエクソン２の中に位置する。このように、本発明の１つの実施形態においては、リプレッサーエレメント（リプレッサー結合部位など）のＭＰＬへの挿入は、対向ＤＮＡ鎖にあるＤＮＡポリメラーゼコード配列のコーディングフレームを維持するか、またはＭＬＰ配列に加えられた修飾がＥ２Ｂタンパク質の産生、安定性または有効性に対して著しく有害に影響しないことを保証しなければならない。
【００７５】
好ましくは、ＭＬＰ配列に加えられた変更の一部または全てはサイレントな変更であり、すなわちＥ２Ｂコドンを変化させない。他の実施形態においては、ＭＬＰに加えられた変更の一部または全ては保存的な変更、すなわち１つ以上のＥ２Ｂコドンが、同様の側鎖を有するアミノ酸をコードするよう変更される。
【００７６】
同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術において定義されている。これらのファミリーは、塩基性側鎖（リジン、アルギニン、ヒスチジンなど）、酸性側鎖（アスパラギン酸、グルタミン酸など）、非荷電極性側鎖（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファンなど）、非極性側鎖（アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニンなど）、β分枝側鎖（スレオニン、バリン、イソロイシンなど）および芳香族側鎖（チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンなど）を有するアミノ酸を含む。
【００７７】
したがって、Ｅ２Ｂタンパク質内の１つ以上のアミノ酸残基は同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換することが可能であり、変更されたＥ２Ｂタンパク質は機能または活性の著しい損失について試験することができる。
【００７８】
本発明の１つの実施形態においては、ＴｅｔＲ結合部位はＭＬＰ内のＴＡＴＡボックスと＋１位の間に位置する。図２はＤＮＡポリメラーゼのコード配列を示す。ＭＬＰ  ＴＡＴＡボックスと＋１位の間の領域においては、ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸コード配列はＥＮＥＲＡＰＴＰ（配列番号１８）である。図３は、この領域内へのＴｅｔＲ結合部位の戦略的配置によって配列ＥＳＬＳＬＩＧＴ（配列番号５）が作製されることを示す。この配列はＤＮＡポリメラーゼのリーディングフレームを維持するが、野生型アミノ酸の６０％超は類似の側鎖によって置換されている。重要なことは、ＴｅｔＲ結合部位の配列が正しくない位置にあると対向ＤＮＡ鎖内に停止コドンを含み、非機能性ＤＮＡポリメラーゼが作製される可能性が高いであろう。
【００７９】
したがって、本発明の１つの実施形態においては、ＴｅｔＲ結合部位の対向鎖上の配列は、ＥＳＬＳＬＩＧＴ（配列番号５）をコードする配列であるか、またはこれを含む。好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼは配列番号５の配列を含む。
【００８０】
Ｅ２Ｂ  ｍＲＮＡまたはタンパク質の産生量の若干の減少は、Ｅ２Ｂタンパク質のアミノ酸配列の若干の変更であり得るように、認容されうる。当業者は、修飾アデノウイルスベクターのウイルス力価を、標準的条件下で元の未修飾ウイルスと比較して単純に評価することにより、Ｅ２Ｂ遺伝子配列の変更がウイルスの複製能力に与える影響を容易に評価することができる。ウイルス力価を２５％未満、好ましくは１０％未満、より好ましくは１％未満減少させる変更は、Ｅ２Ｂタンパク質の産生、安定性または有効性に対して著しく有害に影響しないものであると見なしうる。
【００８１】
本発明の他のアデノウイルスベクターにおいては、Ｅ２Ｂ遺伝子は、ＭＬＰの修飾がＥ２Ｂタンパク質の産生に影響しないよう、アデノウイルスベクター内の他の位置にある。
【００８２】
ＴＡＴＡボックスと転写＋１位の間に１個のＴｅｔＲ結合部位を含む修飾ＭＬＰの例を以下に示す：
【００８３】
2020533956.tif 000003
【００８４】
ＴＡＴＡボックスには下線を付し、ＴｅｔＲ結合部位は太字で示す。
【００８５】
ＴＡＴＡボックスと転写＋１位の間に１個のＴｅｔＲ結合部位、およびＴＡＴＡボックスより上流のＵＰＥエレメントとＴＡＴＡボックスの間の第２の部位を含む修飾ＭＬＰの例を以下に示す：
【００８６】
2020533956.tif 000004
【００８７】
ＴＡＴＡボックスには下線を付し、ＴｅｔＲ結合部位は太字で示す。
【００８８】
リプレッサーエレメントと結合するリプレッサーは（細胞に）外因的に適用してもよく；細胞ゲノム内かまたはミトコンドリアゲノム内に（または細胞内のプラスミドまたはベクター）にコードされてもよく；あるいはアデノウイルスゲノム内にコードしてもよい。好ましくは、リプレッサーはアデノウイルスゲノム内の遺伝子によってコードされる。
【００８９】
より好ましくは、リプレッサー遺伝子は１つ以上のウイルス初期発現領域はまたは後期遺伝子発現領域に位置する。さらにより好ましくは、リプレッサー遺伝子はウイルスの後期領域に位置する。さらにより好ましくは、リプレッサーは、リプレッサーによって調節されるＭＬＰから転写される後期転写産物内に位置する。したがって系は自己抑制的である。
【００９０】
１つの実施形態においては、リプレッサータンパク質をコードする遺伝子は独立したプロモーター（すなわち、アデノウイルス主要初期プロモーターでも主要後期プロモーターでもないプロモーター）の制御下にある。好ましくは、リプレッサータンパク質をコードする遺伝子は強力なプロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターなど）の制御下にある。さらにより好ましくは、リプレッサータンパク質はその結合するＭＬＰの制御下にある。
【００９１】
好ましくは、リプレッサータンパク質をコードするｍＲＮＡはその５’−ＵＴＲに三分節系リーダー（ＴＰＬ）配列を含む。ＴＰＬは、全ての後期ウイルスｍＲＮＡに存在するが初期ウイルスｍＲＮＡのいずれにも存在しない５’−非翻訳配列である。ＴＰＬはｍＲＮＡの輸送および細胞質内への蓄積を促進し、細胞タンパク質より優先される後期ウイルスタンパク質の選択的翻訳を担う。
【００９２】
Ａｄ５リーダー配列は、翻訳後修飾時に３つのエクソンのスプライシングによって形成される２０１塩基対である。
【００９３】
本発明のアデノウイルスベクターは少なくとも１つの導入遺伝子を含む。本発明のアデノウイルスベクターの重要な機能は、導入遺伝子産物の産生を促進することである。
【００９４】
アデノウイルス感染時には、最高で９０％のｍＲＮＡがウイルスゲノムに由来し、またこれらは優先的に翻訳されてウイルスアウトプットを最大化することができる。ウイルス特異的ｍＲＮＡの選択的産生は、ウイルスＤＮＡポリメラーゼの増幅と、後期ｍＲＮＡ転写産物の産生への切り替えの組み合わせに依存する。ウイルスＤＮＡゲノムの複製は、数千コピー以上のＤＮＡテンプレートの転写の発生を可能とする。この活性は、後期転写産物の５’末端にある三分節系リーダーの存在と合わせて、後期ｍＲＮＡの選択的発現を可能とする。これは、三分節系リーダーの活性が正常な翻訳プロセスにおいて高い一方で、ｃａｐ−非依存性翻訳が細胞内で開始されると選択的翻訳も受けるからである。このプロセスには多数のウイルスタンパク質が関与する。
【００９５】
好ましくは、導入遺伝子はアデノウイルス初期領域の１つに挿入される。より好ましくは、導入遺伝子はアデノウイルスＥ１領域に挿入される。さらにより好ましくは、アデノウイルスゲノムよりＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子が削除され、導入遺伝子がこの領域に挿入される。好ましくは、導入遺伝子はその５’ＵＴＲにＴＰＬ配列を含む。これにより、導入遺伝子がｃａｐ非依存的に発現することが確保される。
【００９６】
導入遺伝子は任意の所望のＤＮＡ配列としてよい。導入遺伝子は２つ以上あってもよい（２、３、４または５つ以上の導入遺伝子など）。導入遺伝子のＤＮＡ配列はコード配列であっても、非コード配列であってもよい。ゲノムＤＮＡであってもｃＤＮＡであってもよい。好ましくは、ＤＮＡ配列はポリペプチド、より好ましくは治療ポリペプチドをコードする。一部の例においては、導入遺伝子は複数のタンパク質をコードすることとなる。好ましくは、導入遺伝子は１つ以上の転写および／または翻訳制御エレメント（エンハンサー、プロモーター、転写終結配列など）と機能的に関連する。
【００９７】
導入遺伝子でコードされたポリペプチドはヒト遺伝子であるか、またはその修飾型であるか、またはヒト細胞に感染するウイルスに由来するタンパク質をコードすることが可能である。
【００９８】
好ましい治療ポリペプチドの例は抗体、ＣＡＲ−Ｔ分子、ｓｃＦＶ、ＢｉＴＥ、ＤＡＲＰｉｎｓおよびＴ細胞受容体と、ヒトウイルス病原体に由来する抗原を含む。
【００９９】
一部の実施形態においては、治療ポリペプチドはＤＲＤ１などのＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）である。一部の実施形態においては、治療ポリペプチドはＣＤ１９、ＣＤ４０またはＣＤ３８などの免疫療法ターゲットである。一部の実施形態においては、治療ポリペプチドは、ＲＰＥ６５またはＲＥＰなどのヒトの視覚または網膜機能に関与する遺伝子の機能的コピーである。一部の実施形態においては、治療ポリペプチドはヒトの血液生成に関与する遺伝子の機能的コピーであるか、または第ＩＸ因子などの血液成分、またはβまたはαサラセミアまたは鎌形赤血球貧血に関与するものである。一部の実施形態においては、治療ポリペプチドは重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）またはアデノシンデアミナーゼ欠損症（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）におけるものなどの免疫機能に関与する遺伝子の機能的コピーである。一部の実施形態においては、治療ポリペプチドは成長因子受容体などの細胞の増殖を増加／減少させるタンパク質である。一部の実施形態においては、治療ポリペプチドはイオンチャネルポリペプチドである。一部の好ましい実施形態においては、治療ポリペプチドは免疫チェックポイント分子である。好ましくは、免疫チェックポイント分子は腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーメンバー（ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＧＩＴＲまたはＣＤ１３７など）またはＢ７−ＣＤ２８スーパーファミリーメンバー（ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４またはＩＣＯＳなど）である。一部の実施形態においては、コードされるポリペプチドはＰＤ１、ＰＤＬ１、ＣＴＬＡ４、Ｌａｇ１またはＧＩＴＲである免疫チェックポイント分子である。
【０１００】
一部の実施形態においては、導入遺伝子は抗原的に重要なＣＭＶ五量体などの１つまたは多数のウイルスポリペプチドをコードする。
【０１０１】
他の実施形態においては、１つまたは複数の導入遺伝子は、アデノウイルス以外のウイルスの複製または構造に関与するタンパク質をコードすることになる。
【０１０２】
ワクチンの大半はウイルスタンパク質の集合体：ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、不活化ウイルス粒子、または生弱毒化ウイルスのいずれかから構成される。ＶＬＰは典型的に全てタンパク質で構成されているという利点を有するため、元となるウイルスの潜在的病原性のいずれも有していない。また、その構造が元となるウイルスと同じであり、不活化プロセスで変化していないという、不活化ウイルス粒子を上回る利点を有する。数多くのＶＬＰが、ＨＰＶ、Ｂ型肝炎およびマラリアワクチンＲＴＳＳを含むワクチンとして成功していることが示されている。しかし、哺乳類系における産生は、ＶＬＰを商業的に実現可能な製品とするのに必要なものより低いことが多い。この例は、Ｂ型肝炎ワクチンＶＬＰが酵母で製造されるという知見である。したがって、正しいフォールディングとグリコシル化を確保するために、哺乳類細胞において大量のＶＬＰを産生する系が望ましい。
【０１０３】
一部の実施形態においては、本発明の導入遺伝子は細胞内でまたは細胞外で集合してＶＬＰを産生するタンパク質をコードすることになる。これらのＶＬＰは有用なワクチン製品となりうる。
【０１０４】
好ましい実施形態においては、導入遺伝子はパルボウイルス科（アデノ随伴ウイルスなど）、レトロウイルス科（ＨＩＶなど）、フラビウイルス科（Ｃ型肝炎ウイルスなど）およびオルトミクソウイルス科（インフルエンザウイルスなど）、および／またはカリシウイルス科（ノロウイルスなど）に由来するタンパク質をコードすることになる。好ましい実施形態においては、導入遺伝子はノロウイルスＶＰ１またはＢ型肝炎ＨＢｓＡＧをコードすることになる。
【０１０５】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、組換えタンパク質産生または遺伝子治療用途を目的として、導入遺伝子を細胞に送達するため多くの点で理想的なベクターである。幅広い宿主に感染し、堅牢且つ持続的な導入遺伝子発現プロフィールを誘発するが、宿主細胞に対して発揮する毒性は最小限である。ＡＡＶは，その自然ライフサイクルを完了するためにヘルパー機能を必要とする、ヘルパー依存性ＤＮＡパルボウイルスである。これらのヘルパー機能は、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルスまたはアデノウイルスの共感染を含む多くの媒介物によって提供されうる。ヘルパー媒介物および機能が不在であると、ＡＡＶ感染はＡＡＶウイルスゲノムが宿主細胞染色体に組み込まれる潜伏期に入る。続いて、ヘルパーウイルスの存在下で、組み込まれたＡＡＶプロウイルスはレスキューされ、ウイルスを複製し、事前に形成されたタンパク質カプシドにパッケージングし、感染性ビリオンを産生することが可能となる。
【０１０６】
ＡＡＶをＤＮＡ送達のためのバイオテクノロジーツールとしての使用することに対する現在の手法では、ＡＡＶを遺伝子操作してウイルスｒｅｐおよびｃａｐコード配列領域を目的の導入遺伝子で置換し、標的細胞に送達する。ウイルスカプシドの複製、組み込みおよび発現に必要とされるｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子配列は、これらの遺伝子を宿主細胞から安定して発現するよう遺伝子操作したＤＮＡ発現プラスミド、ウイルスベクターまたは細胞株によってトランスに提供される。
【０１０７】
従来のｒＡＡＶ産生方法は２種類のＤＮＡベクター：１）ｒＡＡＶ配列を含むプラスミド；および２）ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ配列を含むプラスミドの共トランスフェクションを包含する。続いて、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスの感染によってヘルパー機能をトランスに提供することができる。効率のよいｒＡＡＶ産生に必要とされるｒｅｐタンパク質の量は不明である。Ｒｅｐ７８／６８の翻訳開始コドンの減弱によって高レベルのｒＡＡＶ産生がもたらされると報告されているが（Ｌｉ他、１９９７年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：５２３６−５２４３）、他の報告では、ＡＡＶ  ｒｅｐの転写を担うｐ５プロモーターを、ヒト免疫不全ウイルスの長い末端反復（ＨＩＶ  ＬＴＲ）といった強力なウイルスプロモーターと交換すると、ｒＡＡＶが高レベルで産生されている（米国特許第５，６５８，７７６号を参照）。議論されている方法は、ｒＡＡＶを産生するために２種類のプラスミドの共トランスフェクションおよびアデノウイルスなどのヘルパーウイルスの共感染を必要とするため、再現性とバッチ変動が重大な問題となる。さらにｒＡＡＶは、下流および産業用途のためにヘルパー媒介物（アデノウイルスなど）から精製する必要がある。ヘルパーウイルスタンパク質、特にヘルパーウイルス由来の抗原であるものは、ＡＡＶ製剤などに対するヒトの反応に影響する可能性もあるので、最終製剤はこれを含むこともできない。
【０１０８】
ｒＡＡＶの産生に必要とされる第２の方法は、３つのＤＮＡプラスミドベクターの産生細胞株への共トランスフェクションを包含する。シスプラスミドは：１）ｒＡＡＶ  ＩＴＲおよび導入遺伝子；２）ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐをコードするトランスＤＮＡプラスミド；および３）ヘルパーウイルス（アデノウイルスなど）由来の配列をコードするトランスＤＮＡプラスミドを含む。この方法はヘルパーウイルス粒子の汚染がないという利点があるが、サイズが相当大きな３種類のＤＮＡプラスミドの共トランスフェクションにより、再現性が低下すると共にｒＡＡＶウイルス力価収率が相当低下する。
【０１０９】
第３の方法は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子配列が宿主細胞ゲノムに組み込まれるｒＡＡＶパッケージング細胞株の構築を包含する。典型的には、この方法により、ＡＡＶ  ＩＴＲおよび導入遺伝子をコードするＤＮＡシスプラスミドのトランスフェクションと、その後のヘルパー媒介物の導入（ヘルパーアデノウイルス感染など）によってｒＡＡＶが産生される。その代わりに、シスＤＮＡ  ＡＡＶ  ＩＴＲＳおよび導入遺伝子（ハイブリッドＡｄ／ＡＡＶ）を担持するヘルパーウイルスを、ｒＡＡＶの産生を目的とした産生細胞株に導入することができる（米国特許第５，８５６，１５２号を参照）。
【０１１０】
この方法の欠点は、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐが安定して組み込まれ、且つ十分な量発現する産生細胞株の複雑な遺伝子操作を必要とすることである。さらに、シスＤＮＡ配列（ＡＡＶ  ＩＴＲＳおよび導入遺伝子など）の送達を目的としてヘルパーウイルスを使用すると、ヘルパーウイルスで汚染され、下流での精製が必要となる。さらに、細胞株におけるＡＡＶ  ｒｅｐタンパク質の毒性が報告されており、また構成的発現によって抗増殖および細胞死がもたらされる（Ｙａｎｇ他、１９９４年Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８（８），４８４７−４８５６）。さらに、Ｒｅｐタンパク質はそれ自体の転写の抑制に対するネガティブフィードバックループを誘導することが報告された（Ｂｅａｔｏｎ他、１９８９年Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３，４５０−４４５４）。パッケージング細胞株の修飾によってＡＡＶ  ｒｅｐの発現されたＲｅｐに対する毒性を回避するその他の試みは、誘導可能な転写系を用いている（米国特許第５，８３７，４８４号およびＯｇａｓａｗａｒａ他、１９９９年Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８０，２４７７−２４８０を参照）。典型的には、これらの安定した系は、商業スケール化可能な系とするために必要とされるＡＡＶのレベルを得ることに失敗している。
【０１１１】
ｒＡＡＶを産生する第４の方法は、ＡＡＶ  ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の送達を目的としたヘルパー媒介物（ヘルパーアデノウイルスなど）の使用を包含する。この方法においては、組換えアデノウイルスはｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を含み、これらをヘルパーウイルスのゲノム（典型的には組換えアデノウイルスのＥ１領域）に挿入する。続いて、これらを用いてシスＡＡＶ  ＤＮＡ配列（ＡＡＶ  ＩＴＲおよび導入遺伝子）を含みうるパッケージング細胞株に感染させるか、またはトランスフェクション法によってシスＤＮＡプラスミドを導入することができる（Ｚｈａｎｇ他、２００１年Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．８（９），７０４−７１２）。この方法の著しい欠点は従来のｒＡＡＶ産生方法と同様であり、最終製品からヘルパーウイルスおよび何らかのタンパク質（特に構造的タンパク質）の汚染を除去するために、困難且つ費用のかかる精製段階を必要とする。
【０１１２】
本発明の１つの実施形態においては、本発明のアデノウイルスベクターにおける１つ以上の導入遺伝子はＡＡＶ  Ｒｅｐ−Ｃａｐポリペプチドをコードする。本発明の他の実施形態においては、１つ以上の導入遺伝子はＡＡＶゲノムをコードする。好ましくは、ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶに由来する５’および３’ＩＴＲ配列を介在配列と共に含むか、またはこれらから構成される。本発明の他の実施形態においては、１つ以上の導入遺伝子は、ＡＡＶに由来するＲｅｐ−Ｃａｐポリペプチド、およびＩＴＲが目的の配列に隣接するＡＡＶゲノムをコードする。ＲｅｐまたはＣａｐまたはそのサブ転写産物または領域は、本発明の実施形態において個別にコードされうる。
【０１１３】
アデノウイルスベクターは、レポーター遺伝子、制限酵素部位、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、非翻訳領域、エンハンサーおよびインシュレーターからなる群から選択される１つ以上の他のエレメントをさらに含みうるが、これに限定されない。
【０１１４】
一部の実施形態においては、アデノウイルスベクターは１つ以上の多重制限酵素部位をさらに含みうる。これらの部位は、最も好ましくはＩＩ型であり、長さが６または８塩基対のいずれかとなる。
【０１１５】
また本発明は、本発明のアデノウイルスベクターを含むアデノウイルス粒子を、生理的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤のうち１つ以上と共に含む組成物も提供する。ウイルス粒子と共に用いるのに適した生理的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤の例は技術上周知である。組成物は、好ましくは本発明のアデノウイルスベクターを含むアデノウイルス粒子を、水性バッファー溶液内に含む。好ましくは、水性バッファー溶液はＭｇＣｌ２および／またはグリセロールを含む。
【０１１６】
また本発明は、本発明のアデノウイルスベクターを含むキットであって、当該キットが（ｉ）ウイルスベクターが細胞に感染してそのゲノムを複製することを可能とする細胞株であって、当該細胞株がウイルスベクターのＭＬＰを抑制する細胞株および（ｉｉ）ウイルスベクターの構築を補助する１つ以上のＤＮＡプラスミドからなる群から選択される１つ以上の追加的構成要素をさらに含むキットも提供する。
【０１１７】
好ましくは、キットは導入遺伝子の挿入のための部位を含むウイルスベクターを含むプラスミドを含む。より好ましくは２つのプラスミド：ウイルスベクタープラスミドおよびウイルスベクターの容易な操作を可能とするシャトルプラスミドが存在する。シャトルプラスミドは、最終ウイルスベクターを作製するための相同組み換えを可能とするウイルスベクター相同領域か、ＤＮＡをシャトルプラスミドからウイルスベクタープラスミドにシャトリングすることを可能とするウイルスベクターと適合する制限部位のいずれかを含む。
【０１１８】
またキットは、１本以上の遠心管、ベンゾナーゼ、透析バッファー、透析カセットなどの、ウイルス粒子の密度バンディングおよび精製に関与するものなどの、ウイルス粒子の精製のための材料も含む。
【０１１９】
他の実施形態において本発明は、ウイルスベクター（好ましくはアデノウイルスベクター）または核酸分子であってヌクレオチド配列：
【０１２０】
2020533956.tif 000005
【０１２１】
またはこれと少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、９０％または９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むウイルスベクターまたは核酸分子を提供する。
【０１２２】
一部の実施形態においては、上記のヌクレオチド配列またはこれと同一性を有する配列は配列ｔｃｃｃｔａｔｃａｇｔｇａｔａｇａｇａ（配列番号２）を含む（すなわちリプレッサーエレメントは変化していない）。
【０１２３】
他の実施形態においては、上記のヌクレオチド配列またはこれと同一性を有する配列は上に太字で示したリプレッサーエレメントと異なるリプレッサーエレメントを含む。
【０１２４】
また本発明は、本発明のアデノウイルスベクターを含む哺乳類細胞も提供する。細胞は、たとえば生存動物内に存在しない、分離細胞でありうる。哺乳類細胞の例は、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、ウサギ、ロバ、ウマ、ヒツジ、ウシおよび類人猿に由来する任意の臓器または組織に由来するものを含む。好ましくは、細胞はヒト細胞である。細胞は初代細胞であっても不死化細胞であってもよい。好ましいヒト細胞はＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ａ、ＰｅｒＣ６、９１１、ＨｅＬａおよびＣＯＳ細胞を含む。
【０１２５】
ＨＥＫ−２９３細胞はＥ１ＡおよびＥ１Ｂタンパク質を含有するよう修飾されており、またこれにより、この細胞株で増殖させるＥ１ＡおよびＥ１Ｂ領域の欠失したウイルスの、トランス補完による作製を可能とする。同様に、ＰｅｒＣ６および９１１細胞はより小さな修飾を含み、これもまた使用することができる。最も好ましくは、ヒト細胞はＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３Ａ、ＰｅｒＣ６または９１１である。他の好ましい細胞はＣＨＯおよびＶＥＲＯ細胞を含む。
【０１２６】
アデノウイルスベクターはいくつかの方法によって産生可能であり、そのうち最も一般的なものは哺乳類細胞、または細菌および酵母を含む微生物のいずれかにおけるアデノウイルスプラスミドの相同組換えを包含する。シャトルプラスミドおよびアデノウイルス（骨格とも呼ばれる）プラスミドと呼ばれる２つのプラスミドを組換えて、双方のプラスミドに由来する配列を組み入れたＤＮＡ分子とする。その後、このＤＮＡ分子を哺乳類パッケージング細胞株にトランスフェクトして、アデノウイルス粒子を産生する。
【０１２７】
ＭＬＰがＴｅｔＲタンパク質によって調節される本発明の実施形態においては、ウイルスは、リプレッサータンパク質を阻害することによりＭＬＰプロモーター内のリプレッサーエレメント／部位との結合を防止するドキシサイクリンの存在下で回収される。これにより、アデノウイルスを高力価で産生することが可能となるはずである。
【０１２８】
タンパク質の産生またはウイルスタンパク質の発現を目的として、ドキシサイクリンの非存在下で、アデノウイルスが感染することが可能な任意の細胞株（ＨＥＫ−２９３細胞など）にウイルスを感染させることにより、発現したＴｅｔＲリプレッサータンパク質がＭＬＰリプレッサーエレメントに結合し、これによりウイルス後期遺伝子発現の生成を遮断し、ウイルス粒子の産生を防止することができる。
【０１２９】
ＴｅｔＲタンパク質は、感染細胞株の内部で一過性または安定的に提供するか、またはウイルス自体の内部にコードすることが可能である。ＭＬＰの制御下にある場合、各ゲノムの複製に伴ってＭＬＰの活性化がフィードバックルループを提供し、あらゆる潜在的新規ウイルス後期遺伝子発現をさらに遮断する。
【０１３０】
さらなる実施形態においては、本発明は修飾された哺乳類細胞を生成するためのプロセスであって、当該プロセスが：
（ａ）哺乳類細胞に本発明のアデノウイルスベクターを感染させ、
これにより哺乳類細胞がその後アデノウイルスベクターを含む段階を含むプロセスを提供する。
【０１３１】
さらなる実施形態においては、本発明は導入遺伝子産物を産生するためのプロセスであって、当該プロセスが：
（ａ）哺乳類細胞に本発明のアデノウイルスベクターを感染させる段階；
（ｂ）感染した哺乳類細胞を導入遺伝子が発現するような条件下にある培地で培養する段階；および
（ｃ）導入遺伝子産物を細胞または細胞培地より分離または精製する段階を含むプロセスを提供する。
【０１３２】
感染した哺乳類細胞を培養するのに適した方法は技術上周知である。
【０１３３】
導入遺伝子産物の発現レベルは、１００ｋＤａのＬ４／ｅＩＦ４８タンパク質の共発現によって改善しうる。さらに、リプレッサータンパク質はリプレッサーとして活性である必要がある（たとえばリプレッサータンパク質がＴｅｔＲの場合ドキシサイクリンは存在しない）。
【０１３４】
本発明のプロセスは、好ましくはインビトロまたはエクスビボで遂行される。
【０１３５】
本願に記載された各参照文献の開示は、参照文献として本願にその全文を個別に援用する。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】アデノウイルスゲノムの模式図を示し、且つ主要初期および後期発現領域を示す。ＭＬＰも示される。スプライシングパターンは点線で表示される。
【図２】野生型アデノウイルス血清型５の主要後期プロモーター領域の注釈付き配列（配列番号１２〜１４）を示す。
【図３】アデノウイルス血清型５の修飾された主要後期プロモーター領域の注釈付き配列（配列番号１５〜１７）を示す。
【図４】Ａｄ５リプレッサー変異主要後期プロモーターからのＧＦＰレポーターの発現を目的として構築されたプラスミドベクターの模式図を示す。
【図５】ＭＬＰプロモーターからＧＦＰレポーター遺伝子を発現するプラスミドベクターを示す。
【図６】ＴＥＴＲタンパク質によるリプレッサー変異ＭＬＰの転写抑制を示す。
【図７】ＴＥＴＲタンパク質を安定的に発現する細胞株ＨＥＫ２９３  Ｔ−Ｒｅｘ  Ｆｌｐ細胞において抑制されているＭＬＰリプレッサーＡｄ５の例を示す。
【図８】構成的ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターの制御下で、ＴＥＴＲ発現プラスミド（ｐＴＥＴＲ）をトランスフェクトした２９３Ａｄ細胞において抑制されているＭＬＰリプレッサーＡｄ５の例を示す。
【図９】ＴＥＴＲタンパク質を安定的に発現する細胞株２９３  Ｔ−Ｒｅｘ  Ｆｌｐ細胞において抑制されたＭＬＰ変異Ａｄ５のウイルスゲノム複製を示す。
【図１０Ａ】ＴＥＴ１ｂ修飾ＭＬＰ変種を有するＡｄ５によるＨＥＫ２９３細胞の低ＭＯＩ感染を示す。Ａ）ＣＭＶプロモーターの制御下およびドキシサイクリン０．２μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯの存在下で、Ｅ１／Ｅ３  Ａｄ５またはＥＧＦＰを発現するＡｄ５  ＴＥＴ１ｂ  ＭＬＰをＭＯＩ  ０．１でＨＥＫ２９３に形質導入した。感染６日後の蛍光顕微鏡像。
【図１０Ｂ】フローサイトメトリー分析用のＨＥＫ２９３細胞も回収して、ゲーティングされた集団内のＥＧＦＰ陽性細胞の割合を測定した（Ｂ）。データは３回の生物学的測定の平均±ＳＤである。
【図１１−１】ＴＥＴ０１ｂ修飾ＭＬＰを有するＡｄ５からのＥＧＦＰ発現を示す。Ａ）ＣＭＶプロモーターからのＡｄ５  ＴＰＬをコードするＥＧＦＰのプラスミド発現。プロモーターレスプラスミドから、またはＡｄ５  ＴＰＬを含むＣＭＶプロモーターおよび含まないＣＭＶプロモーターの制御下で、ＥＧＦＰを発現するプラスミドＤＮＡをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞。トランスフェクションより４８時間後にフローサイトメトリーで測定したＥＧＦＰ発現。Ｂ）ＤＭＳＯまたはドキシサイクリン０．２ｕｇ／ｍＬで処理したＴ−Ｒｅｘ  Ｆｌｐ細胞において、ＣＭＶプロモーターの制御下でＥＧＦＰを発現するＭＬＰ  ＴＥＴ０１ｂ修飾Ａｄ５（Ａｄ５  ＴＰＬを含むものおよび含まないもの）。感染の２４時間、４８時間および７２時間後のフローサイトメトリーによる細胞の分析。
【図１１−２】Ｃ）ＨＥＫ２９３におけるＣＭＶプロモーター制御下でのプラスミドＤＮＡまたはＭＬＰ修飾Ａｄ５からのＥＧＦＰ発現。ＨＥＫ２９３細胞は、ＣＭＶプロモーターの制御の下、ドキシサイクリンまたはＤＭＳＯの存在下で、ＥＧＦＰを発現するＣＭＶプロモータープラスミドまたはＥＧＦＰを発現するＭＬＰ修飾Ａｄ５（Ａｄ５  ＴＰＬを含むものおよび含まないもの）による形質導入に先立ち、ＴＥＴＲを発現するプラスミドによりトランスフェクトした。形質導入の４８時間後に細胞をフローサイトメトリー用に回収した。Ｄ）ＤＭＳＯまたはドキシサイクリン０．２μｇ／ｍＬの存在下で、Ａｄ５  ＴＰＬをコードするＥＧＦＰを発現するＭＬＰ修飾Ａｄ５を形質導入したｐＴＥＴＲトランスフェクトＨＥＫ２９３細胞の蛍光顕微鏡画像。感染の４８時間後の画像。ＭＦＩ（蛍光強度中央値）データは平均±ＳＤ。
【図１２−１】ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＥＲＡ−ＣＭＶ−ＥＧＦＰまたはＥ１／Ｅ３  Ａｄ５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ感染に由来するアデノウイルス構造タンパク質のウエスタンブロット検出を示す。Ａ）ＴＥＲＡまたはＥ１／Ｅ３  Ａｄ５を用いてＨＥＫ２９３にＭＯＩ  １００または１０００で形質導入した。細胞ライセート（左側ブロット）または増殖培地（右ブロット）からウイルスを回収した。
【図１２−２】Ｂ）ドキシサイクリンの用量を漸増しながら培養し、ＴＥＲＡまたはＥ１／Ｅ３欠失Ａｄ５をＭＯＩ  １０またはＭＯＩ  １００で形質導入したＨＥＫ２９３細胞に由来する増殖培地のウエスタンブロット分析（Ｃ）。全てのウイルスサンプルは感染の７２時間後に回収し、抗Ａｄ５抗体を用いて自動ウェスタン機器（Ｗｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｗｅｓｔｅｒｎ）で検出した。
【図１３】ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＥＲＡのＤＮＡおよびウイルス複製を示す。Ａ）ＨＥＫ２９３細胞にＣＭＶ  ＥＧＦＰ発現カセットをコードするＴＥＲＡまたはＥ１／Ｅ３  Ａｄ５をＭＯＩ  １、１０または１００で感染させ、表示した感染後時点で総ＤＮＡを回収してＱＰＣＲ分析した。Ｂ）ＣＭＶ  ＥＧＦＰ発現カセットをコードするＴＥＲＡまたはＥ１／Ｅ３  Ａｄ５を用いて、ドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯの存在下でＨＥＫ２９３にＭＯＩ  １０または１００で感染させた。表示の感染後時点で総ＤＮＡを回収してＱＰＣＲ分析した。
【図１４】ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＥＲＡからのリポーターＥＧＦＰ発現を示す。Ａ）ＨＥＫ２９３細胞に、ＣＭＶプロモーター（Ａｄ５  ＴＰＬのあるもの、およびこれのないもの）からＥＧＦＰを発現するＴＥＲＡ（ＭＯＩ  １０）、およびこれもＣＭＶプロモーターの制御下でＥＧＦＰを発現するＥ１／Ｅ３  Ａｄ５（ＭＯＩ  １０）またはプラスミドＤＮＡ（Ｂｒａｎｃｈ  ＰＥＩを用いて細胞約７．０×１０４個につき０．７５ｕｇ）を形質導入した。形質導入の２４時間後および４８時間後にＨＥＫ２９３細胞をフローサイトメトリー分析用に回収した。Ｂ）ＤＭＳＯまたはドキシサイクリン０．５ｕｇ／ｍＬの存在下で、ＣＭＶプロモーターの元でＥＧＦＰを発現するＴＥＲＡをＭＯＩ  １００で感染させたＨＥＫ２９３細胞。形質導入の７２時間後に細胞ライセートから回収し、抗Ａｄ５および抗ＥＧＦＰ抗体を用いて自動ウエスタンブロット機器（Ｗｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）で検出したウイルス。
【図１５−１】ＨＥＫ２９３細胞におけるＢｉＴＥのＴＥＲＡ発現を示す。Ａ）ＣＭＶ（Ａｄ５  ＴＰＬのあるＣＭＶおよびＡｄ５  ＴＰＬのないＣＭＶ）の制御下で、ＥＧＦＰを発現するＥ１／Ｅ３  Ａｄ５またはＴＥＲＡをＨＥＫ２９３にＭＯＩ  １０で形質導入した。形質導入の４８時間後に回収し、さらに（５μＬ）自動ウェスタン（Ｗｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いて抗６ｘ  Ｈｉｓ抗体によりＢＩＴＥ発現を探索した培地。Ｂ）各サンプルからの化学発光シグナルをさらに定量し、プロットして検出されたピークおよび曲線下面積に基づく相対発現強度を得た。Ｃ）０時間、２４時間、４８時間および７２時間の時点でウイルス感染ＨＥＫ２９３細胞より総ＤＮＡを回収し、ゲノムをＱＰＣＲで定量した。
【図１５−２】Ｄ）ＢｉＴＥを発現するよう遺伝子操作したＥ１／Ｅ３  Ａｄ５またはＴＥＲＡを形質導入したＨＥＫ２９３細胞に由来するアデノウイルスタンパク質の検出。形質導入の４８時間後に回収し、さらに（５μＬ）自動ウェスタン（Ｗｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いて抗Ａｄ５抗体によりＡｄ５主要構造タンパク質を探索した培地。Ｅ）ＣＭＶプロモーターの制御下で、Ａｄ５  ＴＰＬをコードするＢｉＴＥを発現するプラスミドＤＮＡ（Ｂｒａｎｃｈ  ＰＥＩを用いて細胞約７．０×１０４個につき０．７５μｇ）またはＴＥＲＡをＭＯＩ  １０でＨＥＫ２９３細胞に形質導入した。形質導入した細胞に由来する増殖培地は規定の時点である形質導入の２４、４８および７２時間後に回収し、さらに（５μＬ）抗６ｘ  Ｈｉｓ抗体を用いてＢＩＴＥ発現を探索した。
【図１６−１】ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＥＲＡによるｒＡＡＶベクターの産生を示す。Ａ）ｒＡＡＶゲノム、ＡＡＶ  ＩＴＲに隣接するＣＭＶ−ＥＧＦＰ発現カセットをコードするＥ１／Ｅ３  Ａｄ５またはＴＥＲＡのＭＯＩ  １００または５００での形質導入、または三重プラスミドトランスフェクションを経たヘルパーフリー産生に先立ち、ＤＭＳＯまたはドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬの存在下でＡＡＶ  ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子を発現したプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。形質導入の７２時間後に細胞ライセートおよび増殖培地から総組換えウイルスを抽出し、アデノウイルスゲノムの線維配列またはｒＡＡＶとアデノウイルスが共有するＣＭＶプロモーター配列に対して向けられたＱＰＣＲプライマーおよびプローブセットによってＤＮアーゼＩ耐性ゲノムを定量した。１ウェル当たりのゲノム封入アデノウイルスの総数を、各サンプルからゲノム封入アデノウルスを減算して算出した１ウェル当たりの総ゲノム封入ｒＡＡＶと共にプロットした。Ｂ）各規定のｒＡＡＶ産生法に由来する培地（５μＬ）において、自動ウエスタンブロット機器（Ｗｅｓ  Ｓｉｍｐｌｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ）を用いて抗Ａｄ５抗体でアデノウイルスカプシドタンパク質を探索した。
【図１６−２】Ｃ）ヘルパーフリートランスフェクション法、またはＤＭＳＯ存在下、ＭＯＩ  ５００でのＴＥＲＡ−ＡＡＶ形質導入により産生されたｒＡＡＶカプシドまたはウイルス粒子（ＶＰ）をＥＬＩＳＡで測定した。
【図１６−３】データは、形質導入時点での細胞１個あたりの産生ウイルス粒子として提示し、ＱＰＣＲ分析によって測定した総封入ｒＡＡＶゲノムと共にプロットした。
【図１６−４】Ｅ）ｒＡＡＶカプシドから判定したゲノム封入ｒＡＡＶの割合を示す。Ｆ）ＤＭＳＯまたはドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬの存在下で、ＭＯＩ  ５００でのＨＥＫ２９３細胞のＴＥＲＡ−ＡＡＶ形質導入を用いたｒＡＡＶ産生より回収した感染培地を用い、ドキシサイクリン０．５μｇ／ｍＬ存在下で１：１００希釈して新鮮なＨＥＫ２９３に感染させた。感染の２４時間後および９６時間後に蛍光顕微鏡で撮像した細胞単層。
【図１６−５】Ｇ）ヘルパーフリートランスフェクション法、またはＤＭＳＯの存在下、ＭＯＩ  １００および５００でのＥ１／Ｅ３  Ａｄ５またはＴＥＲＡ形質導入によって産生したｒＡＡサンプルに由来する汚染性感染性アデノウイルスを、５０％培養細胞感染量（ＴＣＩＤ５０）測定法により測定した。ＡＡＶ産生におけるＴＥＲＡのＭＯＩ  １００または５００での使用に由来する汚染アデノウイルスは、Ｅ１／Ｅ３  Ａｄ５対照に対して算出した感染アデノウイルスの割合として提示する。
【実施例】
【０１３７】
本発明は以下の実施例によってさらに例示され、別段の言及がない限りその部および割合は重量によるものであり、温度は摂氏である。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方で、例示を目的としてのみ提示されることを理解すべきである。上記の考察およびこれらの実施例により、当業者は本発明の本質的特性を確認し、その主旨および範囲を逸脱することなく、本発明に多様な変更および変法を行って多様な用途および条件に適合させることができる。したがって、本願に提示および記載するものに加えて、本発明の多様な変法が、先行する記述により当業者に明らかになるであろう。そのような変法もまたは付属の請求項の範囲内となることを意図している。
【０１３８】
（材料と方法）
アデノウイルスベクターのクローン化および産生に用いた方法は以下の通りである。
【０１３９】
（原核系におけるプラスミド増幅）
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の形質転換によりプラスミドの増幅およびその後の所望の最終ＤＮＡクローンのスクリーニングを可能とした。ＤＮＡ形質転換は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を氷上で解凍した後、形質転換１回につき５〜１００ｎｇのＤＮＡを添加することによって実施した。細胞を氷中で２０分間インキュベートした後、３７℃で３分間熱ショックを行った。ＬＢ培地（各サンプル０．９ｍＬ）を各試験管に添加し、さらに３７℃で１５分間インキュベートした。サンプルを選択抗生物質含有する栄養寒天板に注ぐか、または各サンプル１００μＬを線条接種して個々のコロニーの分離を可能とした。
【０１４０】
形質転換に成功したクローンを増幅し、増殖培地内で適切な抗生物質を用いて抗生物質耐性により選択した。カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ、硫酸カナマイシン、インビトロジェン、英国）またはアンピシリン（５０μｇ／ｍＬ、アンピシリンナトリウム塩、シグマアルドリッチ）のいずれかを含有する細菌培養ブロスおよびプレートを、Ｌｅｎｎｏｘ  ＬＢ  Ｂｒｏｔｈ  Ｂａｓｅ（２０ｇ／Ｌ）およびＬｅｎｎｏｘ  ＬＢ  Ａｇａｒ寒天（３２ｇ／Ｌ）（インビトロジェン、英国）をそれぞれ用いて調整した。形質転換後に培養プレート上で得られた単一の細菌コロニーを選択し、三洋オービタルインキュベーター（三洋電機バイオメディカ株式会社、米国）を用いて３７℃で攪拌（２００ｒｐｍ）しながらブロス（少量調製５ｍＬまたは大量調製２５０ｍＬ）内で増殖させた。
【０１４１】
プラスミドは、ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ（キアゲン、英国）を用いた少量調製またはキアゲンＨｉｇｈ  Ｓｐｅｅｄ  Ｍａｘｉ−ｐｒｅｐ  ｋｉｔ（キアゲン、英国）を用いた大量調製により精製した。プラスミドクローンを選択し、診断的制限消化およびＤＮＡ配列決定により確認した。
【０１４２】
（細菌細胞）
大半の低分子（＜１０Ｋｂ）ＤＮＡ構築物では、ＤＨ５α  Ｅ．ｃｏｌｉ細菌（インビトロジェン）を用いてプラスミドを増幅した。より高分子量の（＞１０Ｋｂ）構築物では、ＸＬ１０  Ｇｏｌｄ  Ｕｌｔｒａｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  Ｅ．ｃｏｌｉ細菌（ストラタジーン）を用いてＤＮＡを増幅した。これらの細胞は、熱ショック処理による高分子ＤＮＡプラスミドの効率的送達を可能とし、低分子プラスミドライブラリー選択へのバイアスを低減するよう遺伝子操作されている。重要な制限部位におけるＤＡＭおよびＤＭＣメチル化のないＤＮＡ伸長には、ＪＭ１１０  Ｅ．ｃｏｌｉ（ストラタジーン）を用いた。これらの細胞はメチルトランスフェラーゼ酵素が欠損しているので、高純度のメチル欠損ＤＮＡを増殖することが可能である。ＤＮＡ分子の組換えにはＢＪ５１８３  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を用いた。これらの細胞は、エンドヌクレアーゼＩの変異と、相同領域における二重鎖の切断の効率的な修復を可能とするＲｅｃＥＴ相同体の発現の双方により、２つのＤＮＡ分子間の組換えを可能とする。全ての株はＬｅｎｎｏｘ  ＬＢ培地またはＬＢ寒天板において３７℃で培養した。
【０１４３】
（ＤＮＡ制限消化（調製および定量））
制限エンドヌクレアーゼを用いて、診断的消化バターンを作製するか、または付着（非平滑）末端または平滑末端を有するＤＮＡ分子を産生し、続いてＤＮＡフラグメントと、平滑末端または適合するオーバーハングを有する他のＤＮＡ分子を連結することを可能とした。全ての消化は、製造者の規定する条件に従って実施した（酵素はニューイングランドバイオラボ、英国またはプロメガ、英国から購入した）。分子操作を目的として消化を実施する場合、ゲル電気泳動により正しいサイズのＤＮＡフラグメントを可視化し、高分子フラグメントには（＞８  Ｋｂ）はＱＩＡＥＸ  ＩＩ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン、英国）および低分子フラグメントにはＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン、英国）を用いて切り取ったバンドから精製するか、あるいは、サイズの異なるフラグメントを分離する必要が無ければ、制限反応物から直接精製した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）。１〜１０Ｋｂ範囲のフラグメントの分子量マーカーとしてＨｙｐｅｒＬａｄｄｅｒ（登録商標）Ｉ（Ｂｉｏｌｉｎｅ  Ｌｔｄ、英国）を用いた。高分子ＤＮＡフラグメントには、Ｌａｍｂｄａ  Ｈｉｎｄ３消化ラダーを用いた（ニューイングランドバイオラボ、英国）。１Ｋｂ未満のフラグメントには１００塩基対ラダーを用いた（ニューイングランドバイオラボ、英国）。
【０１４４】
（ＤＮＡ連結）
ドナー（インサート）およびレシピエント（ベクター）ＤＮＡを単制限酵素または二重制限酵素（方向性クローニング用）で消化し、相補的塩基対形成に適合したオーバーハングを作製した。消化したインサートをゲル精製またはクリーンアップしながら、ベクターを仔ウシ腸アルカリホスファターゼ（インビトロジェン、英国）２μＬで処理して（３７℃、１時間）脱リン酸化し、ベクターの再連結により発生するバックグラウンド汚染を低減した。その後、ＭｉｎＥｌｕｔｅ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン、英国）またはＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（キアゲン、英国）を用い、製造者のプロトコルを用いてベクターを精製した。全ての精製ＤＮＡはヌクレアーゼフリー水に溶出させた。連結反応物は、Ｔ４  ＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（ニューイングランドバイオラボ、英国）を用い、製造者のプロトコルにしたがって調製した。
【０１４５】
（熱ショックコンピテント細胞）
熱ショックＤＮＡコンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞は、２ｘＹＴブロス培地５ｍＬ（１６ｇ／Ｌバクトトリプトン、１０ｇ／Ｌ酵母エキス、５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０に５Ｍ  ＮａＯＨを添加）にＥ．ｃｏｌｉの単一コロニーを播種し、３７℃で４時間震盪して生成した。これをあらかじめ加温した２ｘＹＴ培地２００ｍＬに移した。培養がＯＤ４８０に達したならば、細胞を３０００ｒｐｍ、４℃で１０分間スイングアウト遠心分離してペレット化した。細胞を冷ＴＦＢＩ１（３０ｍＭ  ＫＣ２Ｈ３Ｏ２（酢酸カリウム）、１００ｍＭ  ＲｂＣｌ、１０ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、１５％ｖ／ｖグリセロール、０．２Ｍ  ＣＨ３ＣＯＯＨを用いてｐＨ５．８に調節、ろ過滅菌）計８０ｍＬに再懸濁した。細胞を上述の方法で遠心分離し、ＴＦＢＩ２（１０ｍＭ  ＭＯＰＳ、１０ｍＭ  ＲｂＣｌ、７５ｍＭ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１５％ｖ／ｖグリセロール、５Ｍ  ＫＯＨを用いてｐＨ６．６に調節、ろ過滅菌）８ｍＬに再懸濁した。細胞１００μＬを、あらかじめ冷却した１．５ｍＬ微量遠心管に分取し、ドライアイス上で凍結した。その後、遠心管を−８０℃の長期保存に移した。
【０１４６】
（ポリメラーゼ連鎖反応（クローニング））
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、分子操作、配列決定またはスクリーニング手順の要件にしたがってデザインされたオリゴヌクレオチドプライマー（シグマジェノシス、英国より購入）を用いて実施した。ベクターの操作と分子の特性解析を目的として採用したプライマー配列を以下に示す。
【０１４７】
ＤＮＡテンプレートからのＰＣＲ増幅によって作製したＤＮＡフラグメントのサブクローニングには、忠実度の高いＡｃｃｕＰｒｉｍｅ（登録商標）Ｐｆｘ  ｐｒｏｏｆｒｅａｄｉｎｇ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン、英国）を用いた。ＰＣＲによる特定のＤＮＡ配列の有無についての常用的スクリーニングには、ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ（インビトロジェン、英国）を用いた。脱イオンヌクレアーゼフリー水にプライマーを１０μＭで溶解し；１回のＰＣＲ反応に対して順方向および逆方向プライマーを０．８〜１μＬずつ用いた。反応は酵素および試薬の供給者が提供する推奨プロトコルにしたがって実施した。必要な場合はプライマー濃度を変化させ、アニーリング温度のグラジエントを実施して至適反応条件を決定した。ＰＣＲは、ＰＴＣ−２２５  Ｐｅｌｔｉｅｒ  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＤＮＡ  Ｅｎｇｉｎｅ  Ｔｅｔｒａｄ（ＭＪリサーチ、米国）を用いて実施した。
【０１４８】
（アガロースゲル電気泳動）
臭化エチジウム（シグマアルドリッチ、英国）（０．５μｇ／ｍＬ）の０．５×ＴＡＥバッファー（１Ｌ中トリス塩基４．８４ｇ、氷酢酸１．０９ｇ、ＥＤＴＡ  ０．２９ｇ）溶液を含有する１％（ｗ／ｖ）アガロース（インビトロジェン、英国）上でのＤＮＡサイズ分画化により、ＤＮＡの視覚化と、上記の市販の分子量マーカーとの相対的比較によるサイズ推定が可能となる。ＰＣＲ反応または制限消化に由来する精製プラスミドまたはフラグメントに由来するＤＮＡ分子を、水平ＤＮＡゲル電気泳動ゲルタンク（バイオラドラボラトリーズ社、英国）内でゲル電気泳動（１０Ｖ／ｃｍゲル長、３０〜１２０分間）に付した。ゲルおよび蛍光撮影システム（ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒ、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国）を紫外線下で用いて、ＤＮＡを視覚化した。
【０１４９】
（二重鎖デオキシリボ核酸の定量）
ＤＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（サーモサイエンティフィック、英国）分光光度計を用いて定量した。分析前に、蒸留水を用いて機器をブランク測定し、その後ＤＮＡ溶媒溶液（ＴＥ、ＥＢまたはＨ２Ｏ）を用いてバックグラウンド測定を実施した。サンプルは３回測定し、ＮＤ−１０００ｖ３．１．０ソフトウェアを用いて製造者の指示に従いデータを解釈した。最終ＤＮＡ量はナノグラム／マイクロリットルで表示した。
【０１５０】
（アデノウイルスの回収を目的としたリン酸カルシウムトランスフェクション）
組換えアデノウイルスゲノムＤＮＡまたは野生型アデノウイルスゲノムのいずれかを含むＳｗａＩ−直線化アデノウイルスプラスミドを、リポフェクタミン２０００トランスフェクションを用いてＨＥＫ−２９３細胞にトランスフェクトした。ＨＥＫ−２９３細胞がトランスフェクション時に７０〜８０％コンフルエントとなるよう、トランスフェクションの２４時間前に６ウェルプレートのウェルに播種した。各ウェルについて、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉａ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）１００ｕＬに懸濁したリポフェクタミン２０００を、ＤＮＡ溶液（２．５μｇ／１００μＬ  Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｒｅｄｕｃｅｄ  Ｓｅｒｕｍ  Ｍｅｄｉａ）に、リポフェクタミン２０００に対する総ＤＮＡ質量の比率１：２で混合し、室温でインキュベートした後、Ｇｉｂｃｏ（登録商標）（サーモフィッシャーサイエンティフィック、英国）の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）添加ＤＭＥＭで増殖中の接着ＨＥＫ−２９３に一滴ずつ添加した。
【０１５１】
リポフェクタミン２０００トランスフェクション複合体を含む培地を、トランスフェクションの４時間後に除去した。ＦＣＳを２％含有する新鮮なＤＭＥＭ培地を各ウェルに加えた。トラスフェクションの１２日から１５日後に、トランスフェクションに成功した細胞を含むウェルで細胞変性効果（ＣＰＥ）が観察された。ウイルス保存液を９６ウェルプレートで連続１０倍希釈した。単一クローンを選別し、１０ｃｍディッシュで増幅し、これより感染上清を採取してさらなる増幅およびウイルス産生のためのシードストックとして保存した。
【０１５２】
（塩化セシウム勾配上のバンディングによるウイルス産生および精製）
精製１回につき、約１５〜２５コンフルエントの１７５ｃｍ２単層を用いて、５％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地で培養したＨＥＫ−２９３細胞で単一ウイルスクローンを増幅した。ウイルスの詰まった細胞を含むＨＥＫ−２９３単層を穏やかに攪拌して回収し（感染７２時間後、ＣＰＥが観察可能であるが感染細胞が溶解していない時点）、ペレット化した細胞を感染上清（１６ｍＬ、３本のバンディングカラムに収容できる容積）に再懸濁し、凍結−解凍サイクルを３回実施して溶解させ、ウイルス粒子を放出させた。溶解細胞と遊離ウイルス粒子を含む混合液を２４５ｇで遠心分離した（１０分間、４℃）。混合物を氷上で６０分間インキュベートした後、８００ｇで遠心分離した（１０分間、４℃）。ペレットを廃棄し、上清（ウイルス粒子を含む）は、塩化セシウム（ＣｓＣｌ）勾配を含む遠心管（Ｕｌｔｒａ−ｃｌｅａｒＴＭ  Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｔｕｂｅｓ、ベックマンコールターＵＫ社）に装填した。勾配を遠心分離した（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｌ８−７０Ｍ  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ｗｉｔｈ  ｒｏｔｏｒ  ｔｙｐｅ  ＳＷ４０  ＴＩを用いて減速せずに２５，０００ｒｐｍ、１０℃、１２０分間）（ベックマンコールター社、米国）。遠心分離後に２本の分離したバンド：「空の」ウイルス粒子を含むカラム上部の薄いバンド、および無傷の感染性ウイルス粒子を含むより濃く白濁した下部のバンドが得られた。１８ゲージの針を遠心管のウイルスバンド面の下まで刺入し、所望のバンドをシリンジに抜き取ることによりウイルスを回収した。
【０１５３】
続いて、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１×ＰＢＳ、０．１ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、０．２ｇ／Ｌ（初回透析）または０．１ｇ／Ｌ（最終透析）ＭｇＣｌ２および１０％グリセロールを含有するｐＨ７．８のバッファー（５００ｍＬ、４℃）で、初回透析に３〜１５ｍＬ透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ、ピアスバイオテクノロジー社、米国）を使用した連続透析によりＣｓＣｌを除去した後、ウイルスを回収してＢｅｎｚｏｎａｓｅ  ＤＮＡヌクレアーゼ（６μＬ／ｍＬ、ノバジェン、英国）により室温で３０分間処理した。続いて、ＣｓＣグラジエント遠心分離でウイルスを再度バンディングし、０．５〜３ｍＬカセット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ、ピアスバイオテクノロジー社、米国）を用いて最終透析バッファーで一晩透析した。各透析につき、１時間および２時間後にバッファーを交換して新鮮なバッファーと置換した後、一晩透析した。最終透析後に得られたウイルスを小分けし、速やかに−８０℃で保存した。
【０１５４】
（アデノウイルスの定量を目的とした二重鎖ＤＮＡ測定）
アデノウイルスＤＮＡ濃度は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，  インビトロジェン）を用いて測定した。アッセイには、アデノウイルスゲノム含有量の定量を可能とする二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）に対する蛍光核酸プローブが含まれた。ウイルス保存液を適切に希釈し（１０〜１００倍）、１×ＴＥバッファー（２５５μＬ）および０．５％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）１×ＴＥ溶液（３０μＬ）に移した（１５μＬ）。サンプルを５６℃でインキュベートし（３０分間）、ウイルス粒子を破壊した。Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）Ｋｉｔで提供される既知濃度のバクテリオファージλＤＮＡの４倍希釈（最高濃度１μｇ／ｍＬ）を６回連続実施し、そこから未知のサンプルのＤＮＡ含有量を算出する標準曲線の構築を可能とした（最終標準ブランク）。ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ試薬を１×ＴＥバッファーで２００倍希釈した。各標準または未知サンプルについて、希釈した試薬１００μＬを黒色９６ウェルプレート（コーニング、英国）のウェルに入れた。適切に希釈した標準液およびサンプル５０μＬをそれぞれ２ウェルに添加した。Ｗａｌｌａｃ  １４２０  Ｖｉｃｔｏｒ２マルチラベルカウンターで、「フルオレセイン４８５／５３５ｎｍ、１秒」分析プログラムを用いてプレートを読み取った。各サンプル中に存在するウイルス粒子の個数を、ＤＮＡ  １μｇが約２．７×１０１０個のアデノウイルス粒子に等しいことに基づき算出した。
【０１５５】
（５０％培養細胞感染量法を用いたアデノウイルス製剤のプラーク形成単位の算出）
５０％培養細胞感染量（ＴＣＩＤ５０）法（Ｋａｒｂｅｒ、１９３１年）は感染性ウイルス粒子の個数またはプラーク形成単位（ｐｆｕ）を概算するために用いられており、またウイルス製剤の１０倍連続希釈サンプルに感染後のＨＥＫ−２９３細胞における細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生に基づいている。この方法は、ＱＢｉｏｇｅｎｅ（フランス）が販売するＡｄＥａｓｙ非複製ウイルスプラットフォームのマニュアルに完全に記載されている。
【０１５６】
（アデノウイルス製剤）
全てのアデノウイルスはＨＥＫ−２９３細胞で培養し、上記の方法によりＣｓＣｌグラジエントで二重バンディングして精製した。ウイルス粒子（ｖｐ）数は、ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ（インビトロジェン、ペイズリー、英国）の変法（Ｍｉｔｔｅｒｅｄｅｒ他、１９９６年）を用いてＤＮＡ含有量を測定することにより判定した。感染力はＴＣＩＤ５０系を用いてＫＡＲＢＥＲ統計法（Ｋａｒｂｅｒ、１９３１年）により算出し、これを用いてアデノウイルス力価（ＴＣＩＤ５０単位／ｍＬ）を概算し、補正してプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍＬ）を判定した。
【０１５７】
（細胞株の維持）
ＨＥＫ２９３ヒト胚腎細胞は、欧州細胞培養保存機関（ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ、ポートンタウン、英国）から入手し、加湿インキュベーター内でペニシリン（２５Ｕ／ｍＬ）およびストレプトマイシン（１０ｍｇ／ｍＬ）を含む１０％ＦＣＳ（ＰＡＡラボラトリーズ、ヨービル、英国）含有ＤＭＥＭ培地において３７℃、５％ＣＯ２で維持した。
【０１５８】
（Ａｄ５のリアルタイム（定量）ＰＣＲ（Ｑ−ＰＣＲ））
アデノウイルス粒子測定のためのＱ−ＰＣＲの方法論は以前に報告されている（Ｇｒｅｅｎ他、２００４）。簡潔に述べると、哺乳類ゲノムＧｅｎｅｌｕｔｅ  ＤＮＡ抽出キット（シグマ）を用いて、感染細胞または組織サンプルに由来するウイルスＤＮＡを抽出した。反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓマスターミックスを用い、製造者のプロトコルにしたがって実施した。サイクルは以下の通りであった：９４℃で１０分間、その後９４℃３０秒間と６０℃で１分間を４０回。標的化Ａｄ５線維に対するプライマーの配列は：順方向プライマー−５’ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＴＴＡ  ＡＡＧ  ＧＣＡ  ＧＴＴ  ＴＧＧ  ３’（配列番号９）（Ａｄ５  ３２３５０−３２３７０ヌクレオチド）および逆方向プライマー５’ＧＣＡ  ＣＴＣ  ＣＡＴ  ＴＴＴ  ＣＧＴ  ＣＡＡ  ＡＴＣ  ＴＴ  ３’（配列番号１０）（Ａｄ５  ３２４３３−３２４１１  ｎｔ）およびＴａｑＭａｎプローブ５’ＴＣＣ  ＡＡＴ  ＡＴＣ  ＴＧＧ  ＡＡＣ  ＡＧＴ  ＴＣＡ  ＡＡＧ  ＴＧＣ  ＴＣＡ  ＴＣＴ  ３’（配列番号１１）（Ａｄ５  ３２３７２−３２４０４ｎｔ）、５’末端を６−カルボキシフルオレセインで、３’末端を６−カルボキシテトラメチルローダミンで二重標識。結果はＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍソフトウェア（アプライドバイオシステムズ）で分析した。組織および細胞の標準曲線は、細胞ライセートまたは組織ホモジネートサンプルに既知濃度のウイルス粒子の連続希釈を添加した後、各サンプルを上記の方法で個別に抽出し、Ｑ−ＰＣＲで分析した。
【０１５９】
（ウイルスゲノムＤＮＡ抽出）
アデノウイルスゲノム数の測定が必要である場合、培養上清か、または溶解溶液Ｃ（シグマ、英国）またはルシフェラーゼ測定システム（プロメガ、ＵＫ）の溶解溶液のいずれかで調製した細胞ライセートからウイルスＤＮＡを抽出した。サンプルをプロテインキナーゼＫ（１ｍｇ／ｍＬ）で処理し、５６℃で２０分間インキュベートしてウイルスカプシドタンパク質を分解した後、７０℃で２０分間インキュベートした。その後、Ｇｅｎｅｌｕｔｅ哺乳類ＤＮＡ抽出キット（シグマアルドリッチ、英国）を用い、製造者の指示に従って総細胞ＤＮＡの抽出を実施した。
【０１６０】
（ルミノメトリーによるＭＬＰ活性の測定）
１２ウェルプレートに細胞を３ウェルずつ播種した。２４時間後、ＨＢＳバッファー５０μＬにプラスミドＤＮＡ（０．５μｇ）を添加し、これも無菌ＨＢＳ  ５０μＬに加えたＤＯＴＡＰ試薬（ロシェ）２．５μＬと混合した。複合体を室温で３０分間インキュベートした。トランスフェクション混合液１００μＬを各ウェルに加え、３７℃で４時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（ＰＡＡラボラトリーズ、ヨービル、英国）を含有するＤＭＥＭでインキュベートした。トランスフェクション培地を除去してから２４時間後、さらにレポーター細胞溶解バッファー（プロメガ）１５０μＬを細胞に添加した。その後細胞を−８０℃で１時間凍結した後、解凍した。ルシフェリン（２５μＬ）（プロメガ、サウサンプトン、ＵＫ）を分取した細胞ライセート２５μＬに添加し、ルミノメトリー（Ｌｕｍａｔ  ＬＢ９５０７、ベルトールドテクノロジーズ、レッドボーン、英国）で相対発光を測定した。
【０１６１】
（ウイルス感染）
細胞を上記の条件、または本発明のウイルス内の導入遺伝子が発現される任意のそのような細胞株にとって好ましい条件を用いて培養する。ウイルスを、ＭＯＩ  １〜１０００、より好ましくはＭＯＩ  １〜１００、さらにより好ましくはＭＯＩ  １０〜１００で細胞培養上清に添加する。
【０１６２】
（タンパク質発現の測定）
細胞における導入遺伝子の発現レベルまたは後期タンパク質の発現レベルは、ウエスタンブロットまたは酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）により測定する。選択する方法は、測定する生成物が細胞内であるか、あるいは細胞外に分泌されているかによって異なる。前者では、タンパク質レベルは、細胞を溶解して細胞ライセートを作製した後、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより測定する。分泌された物質では、上清を速やかにウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡで測定する。
【０１６３】
ウエスタンブロットプロトコルを用いる場合は以下の手法を選択する。タンパク質３０μｇをＱｕａｎｔｉＰｒｏ  ＢＣＡアッセイ（シグマアルドリッチ、ｃａｔ：ＱＰＢＣＡ−１ＫＴ）を用いて定量した後、１０％ポリアクリルアミドゲル上に装填する。１６０Ｖでゲルの電気泳動を１時間実施した後、タンパク質をニトロセルロース膜に４℃、３０Ｖで一晩ブロッティングした。ニトロセルロース膜をポンソー溶液（以下に記載）で染色して装填量およびサンプルの移動が等しいことを確認した後、５％粉乳（Ｆｌｕｋａ、シグマアルドリッチ）で２時間（Ｅ１Ａ）または一晩（Ａｌｄｏｌａｓｅ  Ａ）ブロッキングした。その後、膜をＰＢＳ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した後、ＰＢＳで１回洗浄した。アデノウイルス後期タンパク質抑制レベルの検出には、抗Ｈｅｘｏｎウエスタンブロットを用いた。Ｈｅｘｏｎを認識する一次抗体（ＡｂＣａｍ、ケンブリッジ、英国、カタログ番号Ａｂ８２４９）を、２．５％粉乳ＰＢＳ溶液に１：５００希釈で１時間添加した。膜を上述の方法で洗浄した。抗ウサギＨＲＰ標識二次抗体を２．５％粉乳による１：１０００希釈で１時間添加した。膜は上記の方法で洗浄した後、０．１２５ｍＬ／ｃｍ２のＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（アマーシャム、ＧＥヘルスケア）に１分間浸漬した。Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈゲルドキュメンテーションシステムで、化学発光検出を用いてブロットを１、５および１０分間可視化した。デュアルカラー分子量ラダー（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に対して分子量を算出した。
【０１６４】
（ポンソー染色）
ポリアクリルアミドゲルからニトロセルロース膜へのタンパク質転写が成功したことを確認し、且つ装填および転写が等しいことを確かめるために、ポンソーＳ溶液（０．１％ｗ／ｖポンソーＳの脱イオン蒸留Ｈ２Ｏ調製５％ｖ／ｖ酢酸溶液）で膜を２分間染色した後にブロッキングした。その後染色液を捨て、膜をＰＢＳで短時間２回洗浄した後、撮影した。その後、膜をＰＢＳ０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で２回洗浄した後、ＰＢＳで１回洗浄して残留染料を除去した後、ブロッキングした。
【０１６５】
タンパク質レベルの評価にウエスタンブロットではなくＥＬＩＳＡを用いることがある。これを実施するためには、まず試験するサンプルをコーティングバッファー（カタログ番号２８３８２、サーモフィッシャー）で希釈する。典型的には、１：１０；１：１００；１：５００などの異なる濃度でサンプルをプレート上にコーティングし、至適検出範囲を決定する。検出しようとするタンパク質の事前に準備した一定量を用い、希釈によって最大標準点４μｇ／ｍＬでウェルをコーティングした後、隣のセルに２倍連続希釈して標準曲線を作成する。たとえば、標準タンパク質０．２ｍｇ／ｍＬは、４μＬおよび非トランスフェクト培地１９６μＬとコーティングバッファー１．８ｍＬを必要とする。これを用いて、再溶解標準液１ｍＬおよびコーティングバッファー１ｍＬを１．５ｍＬ試験管に添加する２倍連続希釈を実施し、８点標準曲線を作成する。その後、各標準液１００μＬをＥＬＩＳＡプレート２ウェルずつに添加する。各サンプル１００μＬをイムノマイクロプレート１ウェルずつに添加する。コーティングバッファー１００μＬを無抗原対照として１ウェルに添加する。ポジティブコントロールサンプルがある場合は、このサンプル１００μＬも含める。プレートを４℃で一晩インキュベートする。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄する。ブロッキングバッファー（元のコーティングバッファーに２％ＢＳＡを添加）を各ウェルに２００μＬ添加し、プレートを３７℃で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄する）。一次抗体（１＃）を必要な希釈度で希釈溶液に添加し、各ウェルに５０μＬ添加する。プレートを室温で１〜２時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄する。ＨＲＰ標識二次抗体を必要な希釈度で希釈溶液に添加する。各ウェルに５０μＬ添加する。プレートを室温で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ−Ｔ（０．１％Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄する。プレートをＰＢＳで１回洗浄する。３，３’５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）５０μＬを各ウェルに添加する。その後呈色するまで待ち、所要時間を記録する必要がある。停止溶液（１Ｍ  ＨＣｌ）５０μＬを添加する。プレートリーダーでプレートの吸光度を４５０ｎｍで読み取り、データ取得を達成する。
【０１６６】
（ＶＬＰ産生の測定）
細胞からのＶＬＰ産生レベル、導入遺伝子の発現レベルまたは後期タンパク質の発現レベルは、上記の方法でＶＬＰ表面上のエピトープを認識する抗体を用いてウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより測定する。
【実施例１】
【０１６７】
（Ａｄ５リプレッサー変異主要後期プロモーターからのＧＦＰレポーターの発現を目的としたプラスミドベクターの構築）
ＧＦＰレポーター遺伝子が、野生型Ａｄ５  ＭＬＰ（ｐＭＬＰｗｔ−ＧＦＰ）、リプレッサー変異ＭＬＰ（ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０１ａ−ＧＦＰ；ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０１ｂ−ＧＦＰ；ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０２−ＧＦＰ）、または低レベルベースライン転写測定用の内部プロモーターのない対照構築物（ｐＭＣＳ−ＧＦＰ）によって転写される５種類の発現構築物を作製した。ベクターは図４に示す。
【実施例２】
【０１６８】
（ＭＬＰプロモーターからのＧＦＰレポーター遺伝子の発現）
ＧＦＰレポーター遺伝子が野生型Ａｄ５  ＭＬＰ（ｐＭＬＰｗｔ−ＧＦＰ）、リプレッサー変異ＭＬＰ（ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０１ａ−ＧＦＰ；ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０１ｂ−ＧＦＰ；ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０２−ＧＦＰ）、または低レベルベースライン転写測定用の内部プロモーターのない対象構築物（ｐＭＣＳ−ＧＦＰ）によって転写される５種類の発現構築物を作製した。ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、組織培養処理した４８ウェルプレートに密度３ｅ４細胞／ウェルで播種した。分枝ＰＥＩ（２５ｋＤＡ）をＰＥＩに対するＤＮＡ質量の比率１：３で用いて、プラスミドｐＭＬＰｗｔ−ＧＦＰ；ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０１ａ−ＧＦＰ；ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０１ｂ−ＧＦＰ；ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０２−ＧＦＰ；ｐＭＣＳ−ＧＦＰをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションは３回実施し、トランスフェクションの２４時間、４８時間、および７２時間後に細胞を回収し、フローサイトメトリーで分析した。データは図５にＧＦＰ陽性細胞のＭＦＩ（平均蛍光強度）として示す。誤差棒は３回の生物学的測定の標準偏差を示す。Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定によりデータは有意性無し（ｐ＞０．０５）。
【実施例３】
【０１６９】
（ＴＥＴＲタンパク質によるリプレッサー変異ＭＬＰの転写抑制）
ＧＦＰレポーター遺伝子が野生型Ａｄ５  ＭＬＰ（ｐＭＬＰｗｔ−ＧＦＰ）、リプレッサー変異ＭＬＰ（ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０１ａ−ＧＦＰ；ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０１ｂ−ＧＦＰ；ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０２−ＧＦＰ）、または低レベルベースライン転写測定用の内部プロモーターのない対照構築物（ｐＭＣＳ−ＧＦＰ）によって転写される５種類の発現構築物を作製した。ＧＦＰレポーターを発現する野生型Ａｄ５  ＭＬＰ（ｐＭＬＰｗｔ−ＧＦＰ）、リプレッサー変異ＭＬＰ（ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０１ａ−ＧＦＰ；ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０１ｂ−ＧＦＰ；ｐＭＬＰ−ＴＥＴ０２−ＧＦＰ）または対照構築物を、構成的ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターの制御下で、ドキシサイクリン０．２μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯで処理したＨＥＫ２９３細胞に、ＴＥＴＲ発現プラスミド（ｐＴＥＴＲ）と総ＤＮＡ質量比１：１で共トランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞を、トランスフェクションの２４時間前に、組織培養処理した４８ウェルプレートに密度３ｅ４細胞／ウェルで播種した。トランスフェクションは、分枝ＰＥＩ（２５ｋＤＡ）をＰＥＩに対する総ＤＮＡ質量比１：３で用いて３回実施し、トランスフェクションの２４時間、４８時間、および７２時間後に細胞をフローサイトメトリーで分析した。データは、Ａｄ５  ＭＬＰ野生型（ｐＭＬＰｗｔ−ＧＦＰ）と比較し、且つプロモーターレス対照構築物と比較してバックグラウンド発現シグナルを正規化した、ＧＦＰ陽性細胞におけるＭＦＩ（平均蛍光強度）の抑制百分率として図６に示す。データは平均±ＳＤ、有意差なしｐ＞０．０５；＊ｐ≦０．０５；＊＊ｐ≦０．０１；＊＊＊ｐ≦０．００１；＊＊＊＊Ｐ≦０．０００１；対応のない両側Ｓｔｕｄｅｎｔ検定。
【実施例４】
【０１７０】
（ＨＥＫ２９３  Ｔ−Ｒｅｘ  Ｆｌｐ細胞において抑制されているＡｄ５  ＭＬＰリプレッサー）
分子的クローニング法で操作してリプレッサー配列を組み入れたアデノウイルスをＨＥＫ２９３で回収した。ＭＬＰリプレッサー配列ＭＬＰ−ＴＥＴ０１ａ、ＭＬＰ−ＴＥＴ０１ｂ、ＴＥＴ０２または野生型ＭＬＰを有するＡｄ５ゲノムを、ＳｗａＩ制限酵素による制限消化で細菌プラスミドＤＮＡから切り取り、Ａｄ５  ＩＴＲ配列に隣接する５’および３’を遊離させた。ＨＥＫ２９３細胞を１０ｃｍ組織培養プレートに密度１ｅ５細胞／プレートで２４時間播種し、リポフェクタミン２０００をリポフェクタミン２０００に対する総ＤＮＡ質量の比率１：２で用いて、ＭＬＰリプレッサーＡｄ５またはＡｄ５  ＭＬＰｗｔゲノムを含むＤＮＡ１０μｇをトランスフェクトした。ウイルスの感染および細胞質効果（cytoplasmic effect, cytopathic effect 細胞変性効果）を観察した後、典型的にはトランスフェクションの１０〜１５日後にウイルスを回収した。２９３  Ｔ−Ｒｅｘ  Ｆｌｐ細胞を、４８ウェル組織培養処理プレートに密度４ｅ４細胞／ウェルで２４時間播種し、ドキシサイクリン０．２μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯの存在下で、アデノウイルスＡｄ５−ＭＬＰ−ＴＥＴ０１ａ、Ａｄ５−ＭＬＰ−ＴＥＴ０１ｂ、Ａｄ５−ＭＬＰ−ＴＥＴ０２または標準Ｅ１−Ｅ３欠失Ａｄ５（Ａｄ５−ＭＬＰｗｔ）により形質導入し、感染の１０日後に光学顕微鏡（light miscopy）で撮影した。図７に示すデータは、３回の生物学的測定の代表的なものである。棒の長さ＝２５０μｍ。
【実施例５】
【０１７１】
（構成的ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーターの制御下で、ＴＥＴＲ発現プラスミド（ｐＴＥＴＲ）によりトランスフェクトした２９３Ａｄ細胞における抑制されたＡｄ５  ＭＬＰリプレッサー）
分子的クローニング法で操作してリプレッサー配列ＭＬＰ−ＴＥＴ０１ｂを組み入れたアデノウイルスをＨＥＫ２９３で回収した。ＭＬＰリプレッサー配列ＭＬＰ−ＴＥＴ０１ｂを有するＡｄ５ゲノムを、ＳｗａＩ制限酵素による制限消化で細菌プラスミドＤＮＡから切り取り、Ａｄ５  ＩＴＲ配列に隣接する５’および３’を遊離させた。ＨＥＫ２９３細胞を１０ｃｍ組織培養プレートに密度１ｅ５細胞／プレートで２４時間播種し、リポフェクタミン２０００をリポフェクタミン２０００に対する総ＤＮＡ質量の比率１：２で用いて、ＭＬＰリプレッサーＡｄ５を含むＤＮＡ１０ｕｇをトランスフェクトした。ウイルスの感染および細胞質効果を観察した後、典型的にはトランスフェクションの１０〜１５日後にウイルスを回収した。ＨＥＫ２９３細胞を１０ｃｍ組織培養プレートに播種し、リポフェクタミン２０００をリポフェクタミン２０００に対する総ＤＮＡ質量の比率１：２で用い、ｐＴＥＴＲ（５μｇ）またはスタッファーＤＮＡをトランスフェクトした後、アデノウイルスＡｄ５−ＭＬＰ−ＴＥＴ０１ｂを感染させた。結果を図８に示す。感染の２４，４８、７２および９６時間後に光学顕微鏡で撮影したデータ。
【実施例６】
【０１７２】
（２９３  Ｔ−Ｒｅｘ  Ｆｌｐ細胞における抑制されたＭＬＰ変異Ａｄ５のウイルスゲノム複製）
分子的クローニング法で操作してリプレッサー配列を組み入れたアデノウイルスをＨＥＫ２９３で回収した。ＭＬＰリプレッサー配列ＭＬＰ−ＴＥＴ０１ａ、ＭＬＰ−ＴＥＴ０１ｂ、ＴＥＴ０２または野生型ＭＬＰを有するＡｄ５ゲノムを、ＳｗａＩ制限酵素による制限消化で細菌プラスミドＤＮＡから切り取り、Ａｄ５  ＩＴＲ配列に隣接する５’および３’を遊離させる。２９３  Ｔ−Ｒｅｘ  Ｆｌｐ細胞を１０ｃｍ組織培養プレートに密度１ｅ５細胞／プレートで２４時間播種し、リポフェクタミン２０００をリポフェクタミン２０００に対する総ＤＮＡ質量の比率１：２で用い、ＭＬＰリプレッサーＡｄ５またはＡｄ５  ＭＬＰｗｔゲノムを含むＤＮＡ１０μｇをトランスフェクトした。ウイルスの感染および細胞質効果を観察した後、典型的にはトランスフェクションの１０〜１５日後にウイルスを回収した。２９３  Ｔ−Ｒｅｘ  Ｆｌｐ細胞を、４８ウェル組織培養処理プレートに密度４ｅ４細胞／ウェルで２４時間播種し、ドキシサイクリン０．２μｇ／ｍＬまたはＤＭＳＯの存在下で、アデノウイルスＡｄ５−ＭＬＰ−ＴＥＴ０１ａ、Ａｄ５−ＭＬＰ−ＴＥＴ０１ｂ、Ａｄ５−ＭＬＰ−ＴＥＴ０２または標準Ｅ１−Ｅ３欠失Ａｄ５（Ａｄ５−ＭＬＰｗｔ）を形質導入した。ドキシサイクリンまたはＤＭＳＯの存在下でＭＬＰ変異またはＭＬＰ−ｗｔ  Ａｄ５を２９３  Ｔ−Ｒｅｘ  Ｆｌｐ細胞に感染させた。感染の１０日後に総ウイルスおよび細胞ＤＮＡを回収した。ウイルスゲノムコピーは、ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブを用いてＱＰＣＲで定量した。既知の力価のＡｄ５を用いて標準曲線を生成し、データは感染に用いた初期ウイルス装填量を上回るゲノムコピーの増加として示した（図９）。データは３回実施した生物学的試験の代表的値であり、平均±ＳＥＭとして示す。＊＊Ｐ≦０．０１；対応のない両側Ｓｔｕｄｅｎｔ検定。
【実施例７】
【０１７３】
（ＭＬＰ抑制によりＨＥＫ２９３細胞単層におけるアデノウイルスの拡散が阻害される）
アデノウイルス産生およびウイルス拡散を阻害する際のＭＬＰ抑制の効果を判定するため、ＥＧＦＰ開始コドンと融合したＡｄ５  ＴＰＬのあるＥＧＦＰ受容体およびこれのないＥＧＦＰ受容体を発現するよう、野生型ＭＬＰまたはＴＥＴ０１ｂ修飾を有するアデノウイルスを操作した。ＣＭＶプロモーターの制御の元でウイルスＥ１欠失領域よりＥＧＦＰレポーターを発現させた。ＥＧＦＰを発現するアデノウイルスを用いて、ドキシサイクリンまたはＤＭＳＯで処理したＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞の単層にＭＯＩ  １で感染させ、第６日にＥＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡およびフローサイトメトリーでモニタリングした。ウイルス拡散、すなわち細胞単層全体のＥＧＦＰ発現は野生型ＭＬＰを有する対照アデノウイルスにおいて阻害されないが、ドキシサイクリンを用いないＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞においてはＭＬＰ  ＴＥＴ０１ｂを有するアデノウイルスのウイルス拡散は阻害され、ビリオン複製の抑制を示した（図１０Ａ）。
【０１７４】
感染の６日後、細胞をフローサイトメトリー用に回収し、ゲート化された集団内のＥＧＦＰ発現細胞の相対割合を測定した。蛍光顕微鏡検査の結果と一致して、ＥＧＦＰを発現する細胞の割合は、対照アデノウイルスに感染した後ドキシサイクリンまたはＤＭＳＯで処理したＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３細胞において同等であった（図１０Ｂ）。しかし、ＥＧＦＰ陽性細胞の集団は、対照ウイルスと比較して、ドキシサイクリン処理細胞におけるＭＬＰ  ＴＥＴ０１ｂ修飾アデノウイルスによる感染から低下し、おそらくこれは感染性および複製の変動によるものであり、その一方でＤＭＳＯ処理した細胞はＥＧＦＰ発現の一般性が有意に低く、ＥＧＦＰは初回感染に由来するウイルスで形質導入された細胞からのみ発現することを示している。
【実施例８】
【０１７５】
（ＭＬＰ抑制によりＡｄ５  ＴＰＬエクソン１−２−３を含むＥＧＦＰの発現が促進された）
Ａｄ５  ＴＰＬエクソンのＥＧＦＰ開始コドンへの融合が遺伝子発現に影響したか否か判定するため、ＣＭＶプロモーターの制御下で、ラダー配列を含むＥＧＦＰ発現およびラダー配列を含まないＥＧＦＰ発現に操作されたプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、またトランスフェクションの４８時間後にフローサイトメトリーでＥＧＦＰ発現を判定した。結果を図１１Ａに示す。プロモーターレス対照プラスミドがＥＧＦＰのバックグラウンドレベルを示す一方で、ＴＰＬ配列を含むプラスミドからのＥＧＦＰ発現のレベルには有意差がなかった。
【０１７６】
ＭＬＰの抑制後にタンパク質発現が増加するか否か評価するため、Ａｄ５  ＴＰＬを含む、およびＡｄ５  ＴＰＬを含まない、ＣＭＶプロモーターからＥＧＦＰを発現するＭＬＰ  ＴＥＴ０１ｂ修飾アデノウイルスを、ドキシサイクリンまたはＤＭＳＯ処理したＦｌｐ−Ｉｎ  Ｔ−ＲＥｘ  ２９３にＭＯＩ  １０で感染させ、また感染の２４，４８および７２時間後にＥＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで測定した。結果を図１１Ｂに示す。ＴＰＬを含むＥＧＦＰを発現するＭＬＰ  ＴＥＴ０１ｂアデノウイルスは、ＴＰＬ配列のないＥＧＦＰと比較して蛍光強度中央値（ＭＦＩ）の上昇を示すが、ＤＭＳＯ処理細胞の感染に由来するアデノウイルスＭＬＰの抑制により、ＥＧＦＰ発現は、ビリオン産生が可能なドキシサイクリン処理細胞のウイルス感染と比較してさらに約２倍上昇した。
【０１７７】
同様に、アデノウイルスＭＬＰがリプレッサーＴＥＴＲの一過性発現により抑制される場合、ＨＥＫ２９３細胞においてＥＧＦＰ発現の約３倍の増加が観察された（図１１Ｃ〜１１Ｄを参照）。ＣＭＶプロモーターからＴＥＴＲを発現するプラスミドを、ドキシサイクリンまたはＤＭＳＯで処理したＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。続いて、ＭＬＰ  ＴＥＴ０１ｂ修飾を含み、ＣＭＶプロモーターからＥＧＦＰ（ＴＰＬエクソンを含むものと含まないもの）を発現するアデノウイルスを細胞に感染させるか、またはリポフェクタミンを用いてＥＧＦＰを転写したＣＭＶ発現プラスミドをトランスフェクトした。ウイルスとプラスミドによる形質導入の４８時間後に、フローサイトメトリーでＥＧＦＰ発現を測定した。結果より、アデノウイルスまたはプラスミドＤＮＡで形質導入したＨＥＫ２９３細胞からの、ＭＦＩで測定したＥＧＦＰ発現が同等のレベルにあることが示された。しかし、ＥＧＦＰ発現の約３倍の増加は、ＴＥＴＲによるＡｄ  ＭＬＰ  ＴＥＴ０１ｂの抑制が可能となった、ＤＭＳＯ処理細胞のＴＰＬエクソンを有するＭＬＰ  ＴＥＴ０１ｂ修飾アデノウイルス発現ＥＧＦＰによる感染からのみ観察され、この効果がＴＰＬエクソンのないＥＧＦＰコード配列で観察されないことから、ｃａｐ−非依存性翻訳によるタンパク質産生の促進であることが示される。
【実施例９】
【０１７８】
（テトラサイクリン有効化抑制アデノウイルス（ＴＥＲＡ）によるＭＬＰ自己抑制によりアデノウイルス構造タンパク質の産生が抑制される）
ＭＬＰ  ＴＥＴ０１ｂ修飾を有するアデノウイルスをさらに操作し、ウイルス内部ＭＬＰの直接制御の下で、ウイルスのＥ３欠失領域に位置するスプライシングアクセプター配列に由来するリプレッサーＴＥＴＲを発現させ、ＴＥＲＡを構築した。結果を図１２に示す。
【０１７９】
ＴＥＲＡに由来するウイルス構造タンパク質の抑制を評価するため、対照Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスまたはＴＥＲＡを用いて、ドキシサイクリンまたはＤＭＳＯの存在下で、ＭＯＩ  １００または１０００でＨＥＫ２９３細胞に感染させた。感染の７２時間後に、細胞ライセートおよび増殖培地に由来するアデノウイルスカプシドタンパク質を、抗Ａｄ５抗体を用いてウエスタンブロットで探索した。増殖培地にドキシサイクリンが存在する場合、細胞ライセートおよび培地の双方から、ＴＥＲＡおよび対照ウイルスから同等レベルのアデノウイルス構造タンパク質が検出された。しかしＤＭＳＯ処理群では、ＴＥＲＡに由来する構造タンパク質はブロットから検出されなかった。おそらく、ドキシサイクリンが存在しない場合、ＨＥＫ２９３細胞がＴＥＲＡに感染すると、ウイルスＭＬＰ転写ＴＥＴＲの産生によりＭＬＰ自体の自己抑制およびカプシドタンパク質の遮断が可能となる。
【０１８０】
ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＥＲＡ産生を評価するドキシサイクリン用量漸増試験では、野生型ＭＬＰを有する対照アデノウイルスまたはＴＥＲＡを用いて、ＤＭＳＯまたはドキシサイクリン用量０．１、０．２、０．５および１．０μｇ／ｍＬで処理したＨＥＫ２９３細胞にＭＯＩ  １０および１００で感染させた。結果を図１２Ｂ〜１２Ｃに示す。ＤＭＳＯまたはドキシサイクリンで処理した細胞における対照アデノウイルス感染では、同等レベルのＡｄ５主要構造タンパク質が検出されたが、ＴＥＲＡから発現されるカプシドタンパク質は、ドキシサイクリン用量が最大０．５μｇ／ｍＬまで増加すると、評価したＭＯＩのいずれでも一貫して増加した。
【実施例１０】
【０１８１】
（ＴＥＲＡウイルス複製はＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスと同等であり、またＭＬＰ抑制はＤＮＡ複製を促進した）
ＴＥＲＡのウイルス複製を評価するため、対照Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスまたはＴＥＲＡを用いて、ドキシサイクリンの存在下で、ＨＥＫ２９３細胞の単層にＭＯＩ  １、１０および１００で感染させ、ウイルス感染の０、２４、４８および７２時間後の時点で、増殖培地および細胞ライセートから総ゲノムＤＮＡを抽出した。アデノウイルスゲノムＤＮＡの存在量をＱＰＣＲで測定した。結果を図１３に示す。
【０１８２】
評価した３つのＭＯＩ全てにおいて、ＴＥＲＡのウイルス複製は対照アデノウイルスと同等であり、この場合２４時間後にウイルスゲノムの相対存在量が急激に上昇し、感染の７２時間後には総ウイルスゲノムが＞４−ｌｏｇ上昇した。
【０１８３】
ＭＬＰ抑制時のＴＥＲＡのゲノム複製をＱＰＣＲでさらに評価した。ウイルスＴＥＲＡまたは対照Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスを用いて、ドキシサイクリンまたはＤＭＳＯの存在下でＭＯＩ  １０および１００でＨＥＫ２９３細胞に感染させ、ウイルス感染の０、２４、４８、７２および９６時間後のＱＰＣＲによるウイルスゲノム定量の時点で総ゲノムＤＮＡを回収した。同様に、ＴＥＲＡのウイルス複製は対照ウイルスと同等であったが、ＤＭＳＯ処理したＨＥＫ２９３細胞対照群における感染２４時間後のＴＥＲＡからのＤＮＡ複製は、ドキシサイクリンを添加して培養した細胞への感染と比較して有意に増加した。おそらく、ウイルスＭＬＰの抑制によりＴＥＲＡの複製ライフサイクルの完遂が阻害されるので、ウイルスゲノムの指数関数的増幅が可能となる。
【実施例１１】
【０１８４】
（ＴＥＲＡはＥＧＦＰレポーターの発現を促進した）
ＣＭＶプロモーターに制御されたＴＥＲＡからのＥＧＦＰレポーター発現を評価するために、Ａｄ５  ＴＰＬエクソンを含む、およびこれを含まない、ＥＧＦＰを発現するよう操作されたＴＥＲＡを用いてＨＥＫ２９３細胞に感染させ、ＥＧＦＰ発現をＥ１／Ｅ３対照アデノウイルスからの発現、およびＣＭＶ発現プラスミドによる一過性トランスフェクションと比較した。結果を図１４に示す。
【０１８５】
Ｅ１／Ｅ３アデノウイルスおよびＴＥＲＡは、ＣＭＶプラスミドベクターからの発現と比較してＥＧＦＰ発現の増加を示すが、Ａｄ５  ＴＰＬエクソンを含むＥＧＦＰを発現するＴＥＲＡは、Ｅ１／Ｅ３対照ベクターおよびＴＰＬエクソンを含まないＴＥＲＡの双方で観察されたレベルを上回るレベルに産生を促進した。おそらくは、ウイルスコードＴＥＴＲによるＴＥＲＡ  ＭＬＰの自己抑制がＡｄ５後期ｍＲＮＡ転写産物の抑制を引き起こし、さらに支配的ＴＰＬ  ＥＧＦＰ  ｍＲＮＡの非ｃａｐ依存性翻訳を可能とした。
【０１８６】
さらに、ドキシサイクリンの存在下で対照Ｅ１／Ｅ３アデノウイルスおよびＴＥＲＡを用いたＥＧＦＰ発現が、汚染アデノウイルスタンパク質を伴うことが、ウエスタンブロットにより確認された。対照的に、ドキシサイクリンが存在しないことで、ＴＥＲＡにおいてＥＧＦＰ発現を維持しながらＡｄ５構造タンパク質を抑制することを可能とした。
【実施例１２】
【０１８７】
（ＴＥＲＡはＢｉ−特異的Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）の産生を促進した）
ＴＥＲＡを用いたモデル分泌タンパク質の産生をプラスミドＤＮＡからの一過性発現法と比較するため、ＴＥＲＡおよびプラスミドベクター（ｐＣＭＶ−ＢｉＴＥ）を操作し、ＣＭＶプロモーターの制御下で、腫瘍特異抗原ＥｐＣＡＭに対する二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）を発現させた。結果を図１５に示す。
【０１８８】
Ａｄ５  ＴＰＬエクソンまたはプラスミドｐＣＭＶ−ＢｉＴＥを含むＢｉＴＥを発現するウイルスＴＥＲＡを用いて、それぞれＭＯＩ  １０または０．７５μｇＤＮＡ／ウェルでＨＥＫ２９３細胞に形質導入し、形質導入の２４、４８および７２時間後の時点でタンパク質を増殖培地から回収し、抗６ｘ  Ｈｉｓ抗体を用いて探索した。ウエスタンブロットより、３つの回収時点全てにおいて、ＴＥＲＡから発現したＢｉＴＥに、ＣＭＶ発現プラスミドの使用からの産生と比較して有意な上昇が示された。
【０１８９】
図１５ＤはＥ１／Ｅ３欠失アデノウイルスと比較した、ＴＥＲＡから発現したＢｉＴＥタンパク質のウエスタンブロット検出を示す。ドキシサイクリンの非存在下で培養したＨＥＫ２９３細胞に、ＣＭＶプロモーター（Ａｄ５  ＴＰＬエクソンのあるもの、およびこれのないもの）の制御下で、Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスまたはＢｉＴＥを発現するＴＥＲＡをＭＯＩ  １０で感染させ、感染の４８時間後に増殖培地からのＢｉＴＥタンパク質発現を測定した。ＴＥＲＡは、対照アデノウイルスと比較してＢｉＴＥ産生の増加を示した；しかし、Ａｄ５  ＴＰＬエクソンを含むＢｉＴＥを発現するＴＥＲＡの感染からは、ＢｉＴＥ産生の約２倍の増加が観察された。さらに、Ｅ１／Ｅ３欠失ウイルス対照の感染からはウイルス構造タンパク質が検出されたが、ＴＥＲＡの感染後にウイルスカプシドタンパク質は検出されなかった。ウイルスゲノムＤＮＡの増幅は維持され、対照ウイルスと同等であることがＱＰＣＲ分析により確認された。
【実施例１３】
【０１９０】
（ＴＥＲＡはＡｄ５粒子汚染物質のないｒＡＡＶの産生を促進する）
ｒＡＡＶウイルスベクター産生を目的としたヘルパー機能およびｒＡＡＶ  ＤＮＡの送達を目的としたＴＥＲＡの使用を評価するため、Ｅ１／Ｅ３欠失対照アデノウイルスおよびＴＥＲＡを、ウイルスＥ１欠失領域において操作し、ＣＭＶプロモーターの制御の下でｒＡＡＶゲノムであるＥＧＦＰ発現カセットに隣接するＡＡＶ２  ＩＴＲをコードさせた。結果を図１６に示す。
【０１９１】
確立されたヘルパーフリー三重トランスフェクション法、または対照Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスまたはＴＥＲＡの感染により、ＥＧＦＰ導入遺伝子をコードするｒＡＡＶを産生した。ドキシサイクリンまたはＤＭＳＯの存在下で、ＨＥＫ２９３細胞に、１）ＥＧＦＰをコードするｒＡＡＶゲノム、２）ＡＡＶ２  ＲｅｐおよびＣａｐ、および３）Ａｄ５ヘルパーをコードするプラスミドを三重トランスフェクトするか、またはＡＡＶ２  ＲｅｐおよびＣａｐをコードするプラスミドおよび対照Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスまたはＴＥＲＡを形質導入した。形質導入の７２時間後に細胞ライセートおよび増殖培地から組換えウイルスを回収し、さらに、カプセル化アデノウイルスおよびｒＡＡＶに由来するウイルスゲノムを、線維をコードするアデノウイルスＤＮＡに向けられたプライマーおよびプローブセット、またはｒＡＡＶおよびアデノウイルスの双方にコードされたＣＭＶプロモーターを用いて、ＱＰＣＲにより定量した。
【０１９２】
図１６Ｃは、細胞ライセートおよび増殖培地に由来するカプセル化アデノウイルスゲノムの定量を示す。ＤＭＳＯおよびドキシサイクリンで処理したＨＥＫ２９３細胞に、対照アデノウイルスおよびＴＥＲＡをそれぞれ感染させると、その後に著しいレベルのアデノウイルスが検出されたが、ドキシサイクリンを用いずにＴＥＲＡまたはヘルパーフリー生成法で形質導入したところ、アデノウイルスの存在は、ＨＥＫ２９３細胞からの測定の最低標準および検出範囲の最低値未満であった。対照的に、アデノウイルスとｒＡＡＶの双方にあるコードされたＣＭＶプロモーターに向けられたプライマーおよびプローブセットを用いると、全てのサンプルより著しいレベルの組換えウイルスがＱＰＣＲ測定法で検出された（図１６Ｄ）。
【０１９３】
ウイルス定量ではＱＰＣＲプライマーを用い、コード化されたＣＭＶプロモーターに向けられたプローブがｒＡＡＶおよびアデノウイルス送達ベクターの双方を検出したので、各産生方法および条件による総ｒＡＡＶは、検出された全体的アデノウイルス粒子汚染を減算して算出した（図１６Ａ）。Ｅ１／Ｅ３欠失アデノウイルスは、三重トランスフェクションによるヘルパーフリー産生系と同等かまたはこれを上回るｒＡＡＶを産生したが、著しいレベルのアデノウイルス汚染も伴った。対照的に、ドキシサイクリンを用いずにＴＥＲＡ−ＡＡＶに感染したＨＥＫ２９３細胞は、ヘルパーフリープラスミドトランスフェクションと比較してｒＡＡＶの約５倍の増加をもたらし、アデノウイルス汚染はＱＰＣＲ検出限界を外れた。（図１６Ｂ）増殖培地のアデノウイルス粒子汚染は、Ａｄ５カプシドタンパク質に対する抗体を用いたウエスタンブロットによってさらに確認された。ＱＰＣＲ分析結果と一致して、ヘルパーフリー産生法またはドキシサイクリンを用いないＴＥＲＡによるＨＥＫ２９３細胞の感染（ＭＯＩ  １００および５００）では、アデノウイルス構造タンパク質は検出されなかったが、ＭＬＰを活性化するドキシサイクリン存在下でのＴＥＲＡ感染およびＥ１／Ｅ３対照ウイルスからは、アデノウイルスタンパク質が容易に検出された。
【０１９４】
カプセル化ｒＡＡＶゲノムを有するｒＡＡＶ粒子を測定するために、ヘルパーフリープラスミドトランスフェクション法で、またはプラスミドＲｅｐおよびＣａｐをトランスフェクトしたＨＥＫ２９３細胞にＴＥＲＡを感染させて産生したｒＡＡＶカプシドを定量した。図１６Ｅは、形成されたＡＡＶ２ウイルスカプシドに向けられたＥＬＩＳＡ、およびＱＰＣＲによるｒＡＡＶゲノムの定量によってそれぞれ測定された、総ｒＡＡＶ２カプシドおよびＤＮアーゼＩ型耐性ゲノム封入粒子を示す。図１６Ｆは、細胞１個について、ＭＯＩ  ５００でのＴＥＲＡ感染により産生されるｒＡＡＶ２カプシドおよびＤＮアーゼＩ型耐性ゲノム封入ｒＡＡＶの量が、ヘルパーフリー産生法と比較して有意に高いことを示す。全体的に、ヘルパーフリーｒＡＡＶ２産生およびＴＥＲＡは、それぞれ総ｒＡＡＶ２カプシド粒子の約３０％および約５０％を占めるゲノム封入粒子を産生した。
【０１９５】
ドキシサイクリンを加えずに培養したＨＥＫ２９３細胞においてｒＡＡＶを産生する際の、ＴＥＲＡの使用に由来する汚染アデノウイルス粒子は、ウエスタンブロットおよびＱＰＣＲで検出不可能であった。図１６Ｈは、ヘルパーフリー法、および対照Ｅ１／Ｅ３アデノウイルスまたはＴＥＲＡの感染によるｒＡＡＶの産生後に、５０％培養細胞感染量測定（ＩＣＩＤ５０）によってＨＥＫ２９３細胞の汚染感染性アデノウイルスを測定したことを示す。図１６Ｇに示すように、ドキシサイクリン存在下でＴＥＲＡ感染法により産生した粗ｒＡＡＶを、ＨＥＫ２９３細胞に形質導入すると、初期ＥＧＦＰ発現とアデノウイルスＣＰＥ細胞の形態が得られる。ドキシサイクリンが存在しないと、これとは明らかに異なり、ＥＧＦＰレポーターの遅延発現および無傷の細胞単層から、おそらくはｒＡＡＶから発現され、ｒＡＡＶゲノムの第２のＤＮＡ鎖の合成に要する時間としてみられる、ＭＬＰおよびアデノウイルスの自己抑制が可能となる。さらに、アデノウイルスを用いないｒＡＡＶ２ヘルパーフリー産生法で感染性アデノウイルスが検出されない一方で、ＭＯＩ  １００および５００でのＴＥＲＡ感染によるｒＡＡＶ産生は、対照Ｅ１／Ｅ３アデノウイルスを用いたｒＡＡＶ２産生と比較するとき、それぞれ０．０００３％（＞２ｅ６分の１倍抑制）および０．００７％レベルの汚染感染性アデノウイルスを示す。全般的に、ドキシサイクリンがなくＭＬＰ自己抑制が可能である場合、ＭＯＩ  １００および５００でのＨＥＫ２９３細胞のＴＥＲＡ感染により、汚染アデノウイルスはＥ１／Ｅ３欠失対照アデノウイルスと比較してそれぞれ約３×１０６および約１．５×１０４分の１に減少する。
【０１９６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１６−４】
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【図１６−５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月15日(2020.6.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抑制可能な主要後期プロモーター（ＭＬＰ）及び複数のアデノウイルス後期遺伝子を含むアデノウイルスベクターであって、前記ＭＰＬがアデノウイルス後期遺伝子の転写を調節または制御することのできる１つ以上のリプレッサーエレメントを含み、且つ前記のリプレッサーエレメントの１つ以上がＭＬＰ  ＴＡＴＡボックスの下流に挿入される前記アデノウイルスベクター。
【請求項２】
アデノウイルスベクターであって：
（ａ）複数のアデノウイルス初期遺伝子、および
（ｂ）主要後期プロモーター（ＭＬＰ）の制御下にある複数のアデノウイルス後期遺伝子、および
（ｃ）導入遺伝子を含み、
前記ＭＬＰが前記のアデノウイルス後期遺伝子の転写を調節または制御することのできる１つ以上のリプレッサーエレメントを含み、且つ前記リプレッサーエレメントの１つ以上がＭＬＰ  ＴＡＴＡボックスの下流に挿入される、前記アデノウイルスベクター。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のアデノウイルスベクターであって、前記の１つ以上のリプレッサーエレメントが前記のＭＬＰ  ＴＡＴＡボックスと転写＋１位の間に挿入される前記アデノウイルスベクター。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記リプレッサーエレメントがリプレッサータンパク質と結合することのできるものである前記アデノウイルスベクター。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記リプレッサーエレメントと結合することのできるリプレッサータンパク質をコードする遺伝子がアデノウイルスゲノム内でコードされる前記アデノウイルスベクター。
【請求項６】
請求項４または５に記載のアデノウイルスベクターであって、前記リプレッサータンパク質が前記ＭＬＰの制御下で転写される前記アデノウイルスベクター。
【請求項７】
請求項４から６までのいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、前記リプレッサータンパク質がテトラサイクリンリプレッサー、ラクトースリプレッサーまたはエクジソンリプレッサーである前記アデノウイルスベクター。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、
（Ａ）前記リプレッサーエレメントが配列番号２に記載の配列を含むかまたはこれにより構成されるテトラサイクリンリプレッサー結合部位であるか；及び／又は、
（Ｂ）前記ＭＬＰのヌクレオチド配列が配列番号６または７に記載の配列を含むかまたはこれにより構成されるか；及び／又は、
（Ｃ）前記リプレッサーエレメントの存在がアデノウイルスＥ２Ｂタンパク質の産生に影響しないか；及び／又は、
（Ｄ）前記アデノウイルスベクターがアデノウイルスＬ４  １００Ｋタンパク質をコードし且つ前記Ｌ４  １００Ｋタンパク質が前記ＭＬＰの制御下にないか；及び／又は、
（Ｅ）前記アデノウイルス初期領域の１つに導入遺伝子が挿入される、前記アデノウイルスベクター。
【請求項９】
請求項２から８のいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターであって、
（Ａ）前記導入遺伝子がその５’−ＵＴＲに三分節系リーダー（ＴＰＬ）を含むか；及び／又は、
（Ｂ）前記導入遺伝子が細胞内または細胞外で集合してウイルス様粒子を産生することのできるウイルスタンパク質をコードするか；及び／又は、
（Ｃ）前記導入遺伝子がＡＡＶ  Ｒｅｐポリペプチド、ＡＡＶ  Ｃａｐポリペプチド、またはＡＡＶ  Ｒｅｐ−Ｃａｐポリペプチドをコードするおよび／または前記導入遺伝子がＡＡＶゲノムをコードする、前記アデノウイルスベクター。
【請求項１０】
請求項１から９のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターを含むアデノウイルス粒子を、生理的に許容できる担体、賦形剤または希釈剤のうち１つ以上と共に含む組成物。
【請求項１１】
請求項１から９のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターを含むキットであって、
（ｉ）前記ウイルスベクターが細胞に感染して前記ウイルスのゲノムを複製することを可能とする細胞株であって、前記細胞株が前記ウイルスベクターのＭＬＰを抑制する細胞株および
（ｉｉ）前記ウイルスベクターの構築を補助する１つ以上のＤＮＡプラスミドからなる群から選択される１つ以上の追加的構成要素を追加的に含む、前記キット。
【請求項１２】
配列番号６または配列番号７のヌクレオチド配列、またはこれと少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含むウイルスベクターまたは核酸分子。
【請求項１３】
請求項１から９のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターを含む哺乳類細胞。
【請求項１４】
修飾された哺乳類細胞を生成するためのプロセスであって、
（ａ）請求項１から９のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターを哺乳類細胞に感染させる段階を含み、
これによりその後前記哺乳類細胞が前記アデノウイルスベクターを含む、前記プロセス。
【請求項１５】
請求項１４に記載のプロセスであって、前記細胞が前記細胞のゲノムに組み込まれたＡＡＶゲノムを含む、前記プロセス。
【請求項１６】
請求項１５に記載のプロセスであって、前記アデノウイルスベクターがＡＡＶ  Ｒｅｐポリペプチド、ＡＡＶ  ＣａｐポリペプチドまたはＡＡＶ  Ｒｅｐ−Ｃａｐポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む前記プロセス。
【請求項１７】
導入遺伝子産物を産生するためのプロセスであって、
（ａ）請求項１から９のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターを哺乳類細胞に感染させる段階；
（ｂ）前記の感染した哺乳類細胞を前記導入遺伝子が発現するような条件下にある培地で培養する段階；および
（ｃ）導入遺伝子産物を前記細胞または前記細胞培地より分離または精製する段階、を含む前記プロセス。
【請求項１８】
組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の産生における、請求項１から９のうちいずれか１つに記載のアデノウイルスベクターの使用。
【国際調査報告】
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