(57)【要約】油糧種子及び穀物バイオマスからの付加価値のある産物を抽出する酵素ベースの方法を記載する。この方法は、アルカリ性前処理ステップ、続いて、タンパク質分解酵素での処理を含み、増大した産物の収率及び溶解度をもたらす。得られる産物は、可溶性タンパク質／ペプチド及び精製された食物繊維であり得る。食品、飲料、化粧品、飼料又は飼料添加剤製品の製造におけるそのような方法の使用も記載されている。【選択図】  図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
バイオマスからタンパク質及び／又はペプチドが富化されている画分と食物繊維が富化されている画分とを製造する方法であって、
ａ）  穏やかなアルカリ性条件下及び約８５℃以上の温度で、水溶液中でバイオマスをインキュベートし、水性スラリーを得るステップ；
ｂ）  前記水性スラリーをタンパク質分解酵素の活性に適した条件下でタンパク質分解酵素により処理するステップ；並びに
ｃ）  ｂ）のタンパク質分解酵素処理スラリーから液体画分及び固体画分を得るステップ；
を含み、前記液体画分が、タンパク質及び／又はペプチドが富化されており、前記固体画分が、食物繊維が富化されている、方法。
【請求項２】
前記バイオマスが湿潤形態にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記バイオマスが乾燥形態にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
乾燥バイオマスをステップａ）の前に粉砕するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記粉砕された乾燥バイオマスを、メッシュ、任意選択で５０〜２００μｍのメッシュ又は１００μｍのメッシュに通すステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオマスをステップａ）の前に脱脂するステップをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記穏やかなアルカリ性条件が、７超〜約１１以下のｐＨ、約９〜約１１のｐＨ、又は約１０のｐＨを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
ステップａ）が、約９０℃〜約１００℃の温度で実施される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ステップａ）が、約９０℃〜約９５℃の温度で実施される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ステップａ）が、約１５分〜約２時間、約３０〜約９０分、又は約１時間の時間にわたり実施される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップｂ）が、約７〜約１１のｐＨで実施される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップｂ）が、約５０℃〜約８０℃の温度で実施される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
ステップｂ）が、約５５℃の温度で実施される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップｂ）が、約１５分〜約２時間、約３０〜約９０分、又は約１時間の時間にわたり実施される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記水溶液中の前記バイオマスの量が約０．５％〜約２０％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記タンパク質分解酵素がサブチリシンを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記サブチリシンがバシラス・リケニフォルミス由来である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｃ）が、ｂ）の前記タンパク質分解酵素処理スラリーを遠心分離して、前記液体画分及び固体画分を得るステップを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記タンパク質分解酵素をステップｂ）の後に失活させるステップをさらに含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記失活させるステップが、熱失活することである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記熱失活することが、約８０℃〜約１００℃の温度で約５〜約３０分の時間にわたり実施される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
（ｉ）  ｂ）の前記タンパク質分解酵素処理スラリーを、二価カチオンを含む溶液で処理するステップ、及び／又は（ｉｉ）  ｃ）の前記液体画分を、二価カチオンを含む溶液で処理するステップをさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記溶液が、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２及びＦｅＣｌ２のうちの少なくとも１種を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ｃ）の前記液体画分を、二価カチオンを含む溶液で処理してフィテートを沈殿させるステップを含み、前記液体画分を前記フィテート沈殿物から単離するステップをさらに含む、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
二価カチオンを含む前記溶液を、約１．５〜約２０ｘ当量の量で使用する、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記液体画分をサイズ排除クロマトグラフィー又は濾過にかけるステップをさらに含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記液体画分を濃縮するステップをさらに含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記バイオマスが、穀物バイオマス、植物バイオマス、ジスチラーズドライドグレイン（ＤＤＧ）、ダイズバイオマス、アブラナミール又は亜麻種子ミールである、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記バイオマスがダイズバイオマスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ダイズバイオマスがおからである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記液体画分を乾燥させ、タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥産物を得るステップをさらに含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥産物が、市販のダイズタンパク質濃縮物（ＳＰＣ）より少なくとも５０％低い残留トリプシン阻害物質活性を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥産物が、市販のダイズタンパク質濃縮物（ＳＰＣ）より少なくとも６０％低い残留フィテート含量を有する、請求項３１又は３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記市販のＳＰＣがアルコン（登録商標）Ｆである、請求項３２又は３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記固体画分を乾燥させ、繊維が豊富な乾燥産物を得るステップをさらに含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記繊維が豊富な乾燥産物が、約７０％以上の炭水化物含量及び約１０％以下のタンパク質含量を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
以下の特徴：
ａ）  約３〜約１１のｐＨにわたり、８０％超の水溶解度；
ｂ）  約４０％以上のタンパク質及び／又はペプチド含量；
ｃ）  抽出物中の少なくとも７５％のタンパク質及び／又はペプチドが、２０ｋＤａ未満の分子量を有すること；
ｄ）  市販のダイズタンパク質濃縮物（ＳＰＣ）に比べて低減されたトリプシン阻害活性及びフィテート含量
を有する、タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥バイオマス抽出物。
【請求項３８】
炭水化物約２０％の炭水化物含量及び／又は約１０％の脂質含量を有する、請求項３７に記載のタンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥バイオマス抽出物。
【請求項３９】
請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法により得られる、請求項３７又は３８に記載のタンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥バイオマス抽出物。
【請求項４０】
請求項３５又は３６に記載の方法により得られる、繊維が豊富な乾燥バイオマス抽出物。
【請求項４１】
請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のタンパク質及び／若しくはペプチドが豊富な乾燥バイオマス抽出物、並びに／又は請求項４０に記載の繊維が豊富な乾燥バイオマス抽出物を含む、飲料、化粧品、食品又は飼料製品。
【請求項４２】
飲料、化粧品、食品又は飼料製品を製造する方法であって、（ｉ）  請求項３１〜３３のいずれか一項に記載の方法を実施して、タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥産物を得るステップ、並びに（ｉｉ）  前記タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥産物を飲料、化粧品、食品又は飼料組成物に組み入れるステップを含む、方法。
【請求項４３】
食品又は飼料製品を製造する方法であって、（ｉ）  請求項３５又は３６に記載の方法を実施して、繊維が豊富な乾燥産物を得るステップ、及び（ｉｉ）  前記繊維が豊富な乾燥産物を食品又は飼料組成物に組み入れるステップを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本願は、２０１７年４月２５日に出願された米国仮出願第６２／４８９，６４６号の優先権を主張し、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、油糧種子及び穀物からのバイオマスの加工、より詳細には、油糧種子及び他の穀物からの廃棄物又は副産物中のセルロース−ヘミセルロース繊維からのタンパク質の分離に関する。
【背景技術】
【０００３】
一般的に、油糧種子作物及び穀物供給原料を有用な食品及び飲料製品に加工すると、多量の繊維系の廃棄物又は副産物が生じる。これらの廃棄物は有益なタンパク質及び繊維成分を含有するが、濃度及び純度が低く、よって、しばしば廃棄物として処分され、加工業者が除去するにはコストがかかることが多い。通常、幾つかの油糧種子副産物は、低価値の動物飼料として使用される。
【０００４】
例えば、粉砕されたダイズから豆腐及び豆乳が世界中で生産されることにより、おからと呼ばれる固体副産物が、毎年数百万トン生じる。おからは、７５％の水分から構成される。乾物ベースで、おからは、約５０％の食物繊維、２５％のタンパク質、１０％の脂質、及び他の栄養素を含有する。しかしながら、その湿潤形態では、おからは発酵性であり、製造後、その高い栄養価及び高い含水量を原因として非常に短い時間で腐る。多量のおからの処分は、著しい環境的及び経済的な問題を有する。現在では、非常にわずかなおからだけが、乾燥後に、食品産業において、又は動物飼料として使用されている。大部分のおからは、肥料として田畑に放り込まれるか、又は廃棄物として焼却され、生産者及び環境の両方に損失がある。
【０００５】
同様に、トウモロコシ及びオオムギをエタノールのような有用な産物に加工する現在の方法では、ジスチラーズドライドグレイン（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ’  ｄｒｉｅｄ  ｇｒａｉｎ）（ＤＤＧ）と呼ばれる、繊維が豊富な副産物の産生をもたらす。現在、ＤＤＧはたいてい、低価値な製品として動物飼料に使用されている。その高価値な成分、例えばタンパク質及び食物繊維は、幾つかの健康上の利点、例えば心臓病のリスクの低減が報告されているものの、人による消費のための食料源としては利用されていない（Ｄａｎｉｅｌ  Ｄ．  Ｇａｌｌａｈｅｒ、１７ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｇｒａｉｎｓ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ、２０１３年、５月１５日〜１６日；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓｇｒａｉｎｓ．ｏｒｇ／ｆｉｌｅｓ／ｓｃｈｏｌａｒｓｈｉｐｓ／２０１３％２０Ｄａｎｉｅｌ％２０Ｇａｌｌａｈｅｒ．ｐｄｆ）。
【０００６】
同様に、油糧種子、例えばダイズ、綿、ヒマワリ、アブラナ及び亜麻からの幅広い種子ミールが、ほとんどの家畜用のタンパク質源として動物飼料に使用されている。歴史的には、幾つかの油糧種子、例えば、チア、亜麻及びヘンプが、油及び他の成分についてその主張される健康上の利点のために人間によっても消費されてきた。これらすべての作物の油糧種子ミールは、食物繊維及び他の成分と混ざった高価値なタンパク質を含有する。
【０００７】
しかしながら、タンパク質の飼料価値は、油糧種子ミールが様々な理由から直接消費される場合、十分には利用可能ではない。油抽出の間に用いられる高温プロセスにより、ミールのタンパク質溶解度が減少し、栄養価も低減する。動物、例えば、魚、ニワトリ及び若ブタについて、高水準の繊維は、ミールのタンパク質及びエネルギー含量を薄め、飼料価値がほとんどない。さらに、油糧種子バイオマスに含まれる抗栄養因子、例えばトリプシン阻害物質及びフィチン酸も不利な影響を与える。動物飼料中にトリプシン阻害物質活性が存在すると、成長速度及びタンパク質効率比（ＰＥＲ）が低減する（Ｗｉｌｓｏｎ及びＰｏｅ、１９８５、Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ、４６：１９〜２５ページ）。フィチン酸は、単胃種、例えば、ブタ、ニワトリ及び魚によりあまり消化されない。フィチン酸は、無機物、アミノ酸及びタンパク質と錯体を形成し、これにより栄養消化率を減少させることがある。さらに、フィチン酸分子中のリンは、主に動物には利用不可であり、糞便により排泄されて環境被害をもたらす。概して、油糧種子ミール又は廃棄物は、飼料成分として直接使用される場合、高繊維、高い抗栄養因子及び高いフィテートの含量を原因として、単胃動物、例えば、ブタ、ニワトリ及び魚のためのタンパク質源としての飼料価値が限られている。
【０００８】
これらのバイオマスから高価なタンパク質を分離するためのシンプルなグリーンテクノロジーの開発は、工業用途における大きな可能性を秘めている。
【０００９】
油糧種子、例えばダイズからの高価値のタンパク質濃縮物及びタンパク質単離物を製造するために、様々な水加工システム及び技術が、多くの場合で開発及び商業化されてきた。しかしながら、ほぼすべての既存の加工システム及び技術が、単一の高価値のタンパク質産物を生み出すことに注力しており、出発材料の繊維が豊富な非タンパク質成分の価値はほとんど考慮されていないか、又は考慮されていない。さらに、油糧種子から単一の高価値なタンパク質産物を製造するための現在の技術及び加工システムは、タンパク質の抽出及び単離効率を改善するために、しばしば多量の水及び薬品、例えば塩、酸又は塩基を消費する。水及び化学的なコストに加えて、低価値の副産物又は廃棄物流の処分にも、さらなるコストがかかる。
【００１０】
米国特許第５，６５８，７１４号には、まず抽出媒体のｐＨをアルカリ性条件に調整することにより野菜粉からタンパク質を抽出し、濃縮後に、抽出したタンパク質を、限外濾過透過液のｐＨを３．５〜６．０に調整することにより沈殿させる方法が記載されている。米国特許第４，４２０，４２５号には、アルカリ性条件を使用する脱脂ダイズの水抽出プロセスが記載されている。固体を濾過により除去した後に、可溶化タンパク質抽出物が、１００ｋＤ超の分画分子量での限外濾過により濃縮され、タンパク質濃縮物が生成される。米国特許第５，９８９，６００号には、酵素、例えばフィターゼ及び／又はタンパク質分解酵素により植物性タンパク質の溶解度を改善する方法が記載されている。米国特許第３，９６６，９７１号には、水性分散体中で酸性フィターゼを使用することによる植物性タンパク質の抽出方法が教示されている。
【００１１】
化学的又は酵素的方法のいずれかを使用しておからの食物繊維又はタンパク質成分のいずれかを単一の産物として単離するための様々な手順が報告されてきた。Ｍａ等（１９９７、Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、２９（８）：７９９〜８０５ページ）は、おからのタンパク質をアルカリ抽出及び等電沈殿により単離した。乾燥及び脱脂の後に、得られた産物は、８３％のタンパク質を含有している。しかしながら、単離されたタンパク質は、市販品に比べて溶解度が減少しており、これにより、食品産業におけるタンパク質の有用性が制限される。溶解度は、長時間の酸変性法（Ｃｈａｎ及びＭａｎ、１９９９、Ｆｏｏｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ３２：１１９〜１２７ページ）により改善することができるが、この二段階の手順（タンパク質の単離及びその後の化学的な変性）は、製造原価の増加をもたらし、したがって、商業化の可能性が低減する。さらに、この方法では、おから中の５３％のタンパク質しか回収されず、繊維が豊富な成分は使用されなかった。プロテアーゼ及びフィターゼの組合せが使用されてダイズタンパク質の溶解度が改善された（Ｂａｅ等、２０１３、Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３７：５１１〜５１９ページ）。しかしながら、報告された方法は、ダイズタンパク質の単離から始まり、酸性ｐＨ範囲における産物の溶解度を増加させるだけである。
【００１２】
おから繊維を製造するための様々な手順が報告されてきた。そのような研究の１つ（Ｔｉａｎ等、２００７、Ｃｈｉｎａ  Ｏｉｌｓ  ａｎｄ  Ｆａｔｓ、３２（９）：６４〜６６ページ）では、湿潤したおからを乾燥させ、粉状に砕き、アルカリ溶液に浸漬し、続いて、酵素的加水分解、漂白、エタノール沈殿及び乾燥を行う。Ｓｕｒｅｌ及びＣｏｕｐｌｅｔ（２００５、Ｊ  Ｓｃｉ  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ  ８５：１３４３〜１３４９ページ）は、おから繊維を精製するためのおからタンパク質のプロテアーゼ加水分解を報告した。この方法は、化学試薬又はリパーゼ加水分解のいずれかによるタンパク質の加水分解及び脱脂ステップの両方を含んでいた。これらのプロセスでは、タンパク質含量は回収されず、複雑なステップにより製造原価が増大する。
【００１３】
おからから繊維又はタンパク質のいずれかを抽出するために報告された手順は、他の成分の廃棄物をもたらし、たいてい強い化学試薬及び有機溶媒の適用も含む。さらに、得られた産物は、機能面における欠陥、例えば繊維の保水容量（ＷＨＣ）の減少又はタンパク質の溶解度の減少があると報告されている。これまでに、これらの産物のいずれのためにも商業的方法は開発されておらず、特に、このダイズ廃棄物を十分に活用して、統合された穏やかな方法で繊維が豊富な産物及びタンパク質が豊富な産物の両方を製造するための手順は報告されていない。
【００１４】
バイオマス（例えばおから）廃棄物の処分問題を解決するのみならず、バイオマス（例えばおから）における高価な成分、特にタンパク質及び繊維を最大限に利用することも可能な技術を開発する必要がある。
【００１５】
本明細書は幾つかの文書を参照しており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【００１６】
以下の項目１〜４３が提供される：
１．  バイオマスからタンパク質及び／又はペプチドが富化されている画分と食物繊維が富化されている画分とを製造する方法であって、
ａ）  穏やかなアルカリ性条件下及び約８５℃以上の温度で、水溶液中でバイオマスをインキュベートし、水性スラリーを得るステップ；
ｂ）  水性スラリーをタンパク質分解酵素の活性に適した条件下でタンパク質分解酵素により処理するステップ；並びに
ｃ）  ｂ）のタンパク質分解酵素処理スラリーから液体画分及び固体画分を得るステップ
を含み、液体画分が、タンパク質及び／又はペプチドが富化されており、固体画分が、食物繊維が富化されている、方法。
【００１７】
２．  バイオマスが湿潤形態にある、項目１に記載の方法。
【００１８】
３．  バイオマスが乾燥形態にある、項目１に記載の方法。
【００１９】
４．  乾燥バイオマスをステップａ）の前に粉砕するステップをさらに含む、項目３に記載の方法。
【００２０】
５．  粉砕された乾燥バイオマスを、メッシュ、任意選択で５０〜２００μｍのメッシュ又は１００μｍのメッシュに通すステップをさらに含む、項目４に記載の方法。
【００２１】
６．  バイオマスをステップａ）の前に脱脂するステップをさらに含む、項目１〜５のいずれか一つに記載の方法。
【００２２】
７．  穏やかなアルカリ性条件が、７超〜約１１以下のｐＨ、約９〜約１１のｐＨ、又は約１０のｐＨを含む、項目１〜６のいずれか一つに記載の方法。
【００２３】
８．  ステップａ）が、約９０℃〜約１００℃の温度で実施される、項目１〜７のいずれか一つに記載の方法。
【００２４】
９．  ステップａ）が、約９０°Ｃ〜約９５℃の温度で実施される、項目８に記載の方法。
【００２５】
１０．  ステップａ）が、約１５分〜約２時間、約３０〜約９０分、又は約１時間にわたり実施される、項目１〜９のいずれか一つに記載の方法。
【００２６】
１１．  ステップｂ）が、約７〜約１１のｐＨで実施される、項目１〜１０のいずれか一つに記載の方法。
【００２７】
１２．  ステップｂ）が、約５０℃〜約８０℃の温度で実施される、項目１〜１１のいずれか一つに記載の方法。
【００２８】
１３．  ステップｂ）が、約５５℃の温度で実施される、項目１２に記載の方法。
【００２９】
１４．  ステップｂ）が、約１５分〜約２時間、約３０〜約９０分、又は約１時間にわたり実施される、項目１〜１３のいずれか一つに記載の方法。
【００３０】
１５．  水溶液中のバイオマスの量が、約０．５％〜約２０％（ｗ／ｖ）である、項目１〜１４のいずれか一つに記載の方法。
【００３１】
１６．  タンパク質分解酵素が、サブチリシンを含む、項目１〜１５のいずれか一つに記載の方法。
【００３２】
１７．  サブチリシンがバシラス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）由来である、項目１６に記載の方法。
【００３３】
１８．  ステップｃ）が、ｂ）のタンパク質分解酵素処理スラリーを遠心分離して、液体画分及び固体画分を得るステップを含む、項目１〜１７のいずれか一つに記載の方法。
【００３４】
１９．  タンパク質分解酵素をステップｂ）の後に失活させるステップをさらに含む、項目１〜１８のいずれか一つに記載の方法。
【００３５】
２０．  失活させるステップが、熱失活することである、項目１９に記載の方法。
【００３６】
２１．  熱失活することが、約８０℃〜約１００℃の温度で約５〜約３０分間にわたり実施される、項目２０に記載の方法。
２２．  （ｉ）  ｂ）のタンパク質分解酵素処理スラリーを、二価カチオンを含む溶液で処理するステップ、及び／又は
（ｉｉ）  ｃ）の液体画分を、二価カチオンを含む溶液で処理するステップ
をさらに含む、項目１〜２１のいずれか一つに記載の方法。
【００３７】
２３．  溶液が、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２及びＦｅＣｌ２のうちの少なくとも１種を含む、項目２２に記載の方法。
【００３８】
２４．  ｃ）の液体画分を、二価カチオンを含む溶液で処理してフィテートを沈殿させるステップを含み、液体画分をフィテート沈殿物から単離するステップをさらに含む、項目２２又は２３に記載の方法。
【００３９】
２５．  二価カチオンを含む溶液が、約１．５〜約２０ｘ当量の量で使用される、項目２２〜２４のいずれか一つに記載の方法。
【００４０】
２６．  液体画分をサイズ排除クロマトグラフィー又は濾過にかけるステップをさらに含む、項目１〜２５のいずれか一つに記載の方法。
【００４１】
２７．  液体画分を濃縮するステップをさらに含む、項目１〜２６のいずれか一つに記載の方法。
【００４２】
２８．  バイオマスが、穀物バイオマス、植物バイオマス、ジスチラーズドライドグレイン（ＤＤＧ）、ダイズバイオマス、アブラナミール又は亜麻種子ミールである、項目１〜２７のいずれか一つに記載の方法。
【００４３】
２９．  バイオマスがダイズバイオマスである、項目２８に記載の方法。
【００４４】
３０．  ダイズバイオマスがおからである、項目２９に記載の方法。
【００４５】
３１．  液体画分を乾燥させ、タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥産物を得るステップをさらに含む、項目１〜３０のいずれか一つに記載の方法。
【００４６】
３２．  タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥産物が、市販のダイズタンパク質濃縮物（ＳＰＣ）より少なくとも５０％低い残留トリプシン阻害物質活性を有する、項目３１に記載の方法。
【００４７】
３３．  タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥産物が、市販のダイズタンパク質濃縮物（ＳＰＣ）より少なくとも６０％低い残留フィテート含量を有する、項目３１又は３２に記載の方法。
【００４８】
３４．  市販のＳＰＣがアルコン（Ａｒｃｏｎ）（登録商標）Ｆである、項目３２又は３３に記載の方法。
【００４９】
３５．  固体画分を乾燥させ、繊維が豊富な乾燥産物を得るステップをさらに含む、項目１〜３４のいずれか一つに記載の方法。
【００５０】
３６．  繊維が豊富な乾燥産物が、約７０％以上の炭水化物含量及び約１０％以下のタンパク質含量を有する、項目３５に記載の方法。
【００５１】
３７．  以下の特徴：
ａ）  約３〜約１１のｐＨにわたり、８０％超の水溶解度；
ｂ）  約４０％以上のタンパク質及び／又はペプチド含量；
ｃ）  抽出物中の少なくとも７５％のタンパク質及び／又はペプチドが、２０ｋＤａ未満の分子量を有すること；
ｄ）  市販のダイズタンパク質濃縮物（ＳＰＣ）に比べて低減されたトリプシン阻害活性及びフィテート含量
を有する、タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥バイオマス抽出物。
【００５２】
３８．  炭水化物約２０％の炭水化物含量及び／又は約１０％の脂質含量を有する、項目３７に記載のタンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥バイオマス抽出物。
【００５３】
３９．  項目３１〜３３のいずれか一つに記載の方法により得られる、項目３７又は３８に記載のタンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥バイオマス抽出物。
【００５４】
４０．  項目３５又は３６に記載の方法により得られる、繊維が豊富な乾燥バイオマス抽出物。
【００５５】
４１．  項目３７〜３９のいずれか一つに記載のタンパク質及び／若しくはペプチドが豊富な乾燥バイオマス抽出物、並びに／又は項目４０に記載の繊維が豊富な乾燥バイオマス抽出物を含む、飲料、化粧品、食品又は飼料製品。
【００５６】
４２．  飲料、化粧品、食品又は飼料製品を製造する方法であって、（ｉ）  項目３１〜３３のいずれか一つに記載の方法を実施して、タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥産物を得るステップ、並びに（ｉｉ）  前記タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥産物を飲料、化粧品、食品又は飼料組成物に組み入れるステップを含む、方法。
【００５７】
４３．  食品又は飼料製品を製造する方法であって、（ｉ）  項目３５又は３６に記載の方法を実施して、繊維が豊富な乾燥産物を得るステップ、及び（ｉｉ）  前記繊維が豊富な乾燥産物を食品又は飼料組成物に組み入れるステップを含む、方法。
【００５８】
さらなる特徴は、以下の詳細な説明の過程で説明されるか、又は明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】おからを用いた本明細書に記載の方法を示す概略図である。
【図２】ダイズミールの加水分解に対するプロテアーゼＥ１濃縮の効果を示す、クマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示すグラフである。
【図３】ダイズミール及びおから抽出物のタンパク質放出に対するプロテアーゼＥ１濃縮の効果を示すグラフである。
【図４】様々な抽出ステップの後の上澄み液及びペレットにおけるタンパク質含量を示すグラフである。
【図５】タンパク質抽出に対するｐＨ及び温度の影響を示すグラフである。
【図６】炭水化物抽出に対するｐＨ及び温度の影響を示すグラフである。
【図７Ａ】おから抽出物におけるトリプシン阻害物質活性に対する様々なプロテアーゼの影響を示すグラフである。ＮＥ＝酵素なし；酵素Ｅ１〜Ｅ１０は、以下の表４で説明される。
【図７Ｂ】ダイズミール（ＳＢＭ）におけるトリプシン阻害物質活性に対する様々なプロテアーゼの影響を示すグラフである。ＮＥ＝酵素なし；酵素Ｅ１〜Ｅ１０は、以下の表４で説明される。
【図８】おからペプチド抽出物のフィテート含量に対する様々な濃度のＣａＣｌ２の影響を示すグラフである。
【図９】プロテアーゼＥ１により製造されるおからペプチド抽出物及び市販品のアルコン（登録商標）Ｆの溶解度の比較を示すグラフである。
【図１０】おから及びダイズタンパク質抽出物のクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す画像である。
【図１１】様々なバイオマスからの加水分解上澄み液のクマシーブルー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す画像である。
【００６０】
発明の詳細な説明
本発明を説明する文脈（特に以下の請求項の範囲の文脈）における用語である「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」及び類似する指示語の使用は、本明細書において特に定めのない限り、又は文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈されるべきである。
【００６１】
「を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を有する」、「を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「を含有する」という用語は、特に記載のない限り、非限定的な用語として解釈されるべきである（すなわち、「を含むが、これらに限定されることはない」を意味する）。
【００６２】
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において特に定めのない限り、その範囲にあたる別個の値をそれぞれ個別に参照する短縮化された方法として用いられることを意図しているに過ぎず、別個の値はそれぞれ、本明細書において個別に挙げられたかのように本明細書に組み込まれる。その範囲内の値のすべてのサブセットも、本明細書において個別に挙げられたかのように本明細書に組み込まれる。
【００６３】
本明細書に記載の方法はすべて、本明細書において特に定めのない限り、そうでなければ文脈と明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施可能である。
【００６４】
本明細書で用いられる任意及びすべての例、又は例示語（例えば、「のような」）の使用は、本発明をより良好に説明することを意図しているだけであって、特に言及されていない限り、本発明の範囲を限定することはない。
【００６５】
本明細書において、「約」という用語は、その一般的な意味を有する。「約」という用語は、ある値が、値を求めるために用いられる装置又は方法についてのエラーの内在的変動を含むこと、又は挙げられた値に近い値を、例えば挙げられた値（又は値の範囲）の１０％又は５％以内で包含することを示すために使用される。
【００６６】
本明細書に開示されている実施形態及び特徴の任意及びあらゆる組合せ及び部分的組合せが、本発明に包含されている。例えば、本発明に記載の方法を実施可能な条件（温度、ｐＨ、時間など）の様々な実施形態のあらゆる組合せ及び部分的組合せが、本発明に包含されている。
【００６７】
本発明者等は、前処理ステップの後に未加工のバイオマスからタンパク質を直接加水分解する酵素的方法を開発した。高温での穏やかなアルカリ前処理（例えば、約６０分、約９０〜９５℃、ｐＨ約１０）を実施し、これにより原材料の殺菌が可能になり、したがって後の酵素的方法が汚染されるリスクが最小限に抑えられ、また可溶化が促進され、タンパク質及び繊維バイオマスの酵素アクセシビリティが増加し、それにより、良好なタンパク質回収率及び精製された繊維成分がもたらされた。前処理に続いて、温度及びｐＨをプロテアーゼ機能に適合するように調整する。酵素反応（例えば約６０分）の後に、大部分のタンパク質は、効率的に加水分解されて２０ＫＤａ未満のペプチド及び／又はアミノ酸になることが示され、固体画分を液体画分から分離することができた。選択された酵素での加水分解は、可溶性産物におけるトリプシン阻害活性が低減するという結果を示した。おからからの可溶性産物は、市販のダイズタンパク質濃縮物（ＳＰＣ）に比べてはるかに少ないフィテートを含有し、可溶性産物におけるフィテート含量をさらに低減し、必要に応じて、大部分の残留フィテートを沈殿させる二価カチオン溶液、例えばＣａＣｌ２を使用して得ることが可能であった。固体画分を乾燥させて、繊維が豊富な産物を得て、液体部分を濃縮し、乾燥させて、タンパク質／ペプチドが豊富な産物を得た。
【００６８】
したがって、本発明は、バイオマスからタンパク質及び／又はペプチドが富化されている画分と食物繊維が富化されている画分とを製造するであって、
ａ）  穏やかなアルカリ性条件下及び約８５℃以上の温度で、水溶液中でバイオマスをインキュベートし、水性スラリーを得るステップ；
ｂ）  水性スラリーをタンパク質分解酵素の活性に適した条件下でタンパク質分解酵素により処理するステップ；並びに
ｃ）  ｂ）のタンパク質分解酵素処理スラリーから液体画分及び固体画分を得るステップ；
を含み、液体画分が、タンパク質及び／又はペプチドが富化されており、固体画分は、食物繊維が富化されている、方法に関する。
【００６９】
バイオマス、例えばおから及びダイズミールから高価値な産物を抽出するための方法の開発
ダイズバイオマス
おからは、豆腐又は豆乳工場から、湿潤形態で廃棄物として幅広く入手可能であり、また乾燥産物としても入手可能で、現在では、大部分は飼料産業に使用されており、わずかだけ食品産業に使用されている。ダイズミールも、油を抽出した後に油糧種子の加工場から幅広く入手可能である。そのような油の抽出は、熱機械的抽出又は溶媒抽出のいずれかとして実施されてもよい。
【００７０】
他のバイオマス
本明細書において開発される方法は、植物バイオマスと、穀物バイオマスと、炭水化物と混合されたかなりの量（約１０％以上）のタンパク質を含有するその他のバイオマスと、水生植物、例えばウキクサ及び海藻と、微生物バイオマス、例えば、藻類、酵母、真菌及びバクテリアとを含む他の種類のバイオマスから、タンパク質／ペプチド及び／又は繊維を抽出するのに適切であり得る。以下の実施例に示されるように、この方法は、ダイズバイオマス（ＳＢＭ、おから）、並びにドライドジスチラーズグレイン（ＤＤＧ）、アブラナミール、亜麻種子ミール、ヘンプ種子全体及び皮をむいたヘンプ種子を含む他のバイオマスに成功裏に適用された。バイオマスに応じて、最適な反応条件（例えば、ｐＨ、温度及び時間）を調整する必要があるが、本明細書に定められた範囲内にあった。試験したすべてのバイオマスについて、タンパク質成分は、短時間で効果的に加水分解され、タンパク質回収率は、この方法での処理の後に著しく増大した。幾つかの試料について、抽出した産物におけるタンパク質含量も増加した。
【００７１】
一実施形態において、バイオマスは湿潤形態にある。別の実施形態において、バイオマスは乾燥形態にある。
【００７２】
水抽出プロセス（ＡＥＰ）についての条件：
従来の水抽出プロセスに基づき、中性又はアルカリ性条件の水懸濁液を用いて、おから及びダイズミールを主な開始バイオマスとして使用し、主成分としての可溶性画分含有タンパク質の抽出に対する様々な因子の影響を試験した。これらの因子としては以下のものが挙げられる：出発材料の粒径、抽出時間及び温度；抽出液体条件：ｐＨ調整及び緩衝液系。
【００７３】
出発材料の粒径に関して、本発明者等により、大きな破片を砕く粗い粉砕でさえ好ましいことがあり、微細な粉砕ステップが必要ないことが分かった。例えば、ダイズミールの場合、１μｍ超の粒径での最小限の粉砕は、０．１２５μｍまでの微細な粉砕と類似した効果をもたらし、同様に乾燥おからについても、約１μｍの粒径での単純な粉砕は、より微細な粉砕に比べて同じく良好に実施される。
【００７４】
特にダイズミールの場合、抽出効率を増大させるためには、粉砕により固体ダイズ粒子のサイズを小さくすることが好ましいことがある。ダイズミールは、粒子がＮｏ．１００のメッシュ（米国標準）スクリーンを通ることができるようなサイズに粉砕されることが一般的である。
【００７５】
したがって、一実施形態において、本明細書に定義されている方法は、バイオマス（乾燥バイオマス）をステップａ）の前に粉砕するステップをさらに含む。さらなる実施形態において、方法は、約２００、１５０、１００、５０、２５又は１０μｍ未満のサイズを有する粉砕された粒子を、例えば、粉砕された乾燥バイオマスをメッシュ、好ましくは５０〜２００μｍのメッシュ、より好ましくは１００μｍのメッシュに通すことにより単離するステップをさらに含む。
【００７６】
一実施形態において、本明細書に定義されている方法は、バイオマスをステップａ）の前に脱脂する（例えば油を除去する）ステップをさらに含む。バイオマス、例えばダイズバイオマス（おから）を脱脂する方法は、当技術分野において公知である。脱脂は、例えば、適切な溶媒を使用する化学的な抽出により、又はリパーゼ加水分解により達成されてもよい。
【００７７】
タンパク質の収率に対する抽出時間の影響に関して、室温の場合、時間が経つほど、タンパク質の放出が徐々に増加し、一般的に約６０分後には一定になることが分かった。したがって、実施形態において、前処理ステップは、約２時間未満、又は約９０分未満、又は約７５分未満の時間にわたり実施される。他の実施形態において、前処理ステップは、少なくとも１５分、少なくとも２０分、少なくとも２５分、少なくとも３０分、少なくとも３５分、少なくとも４０分又は少なくとも４５分の時間にわたり実施される。さらなる実施形態において、前処理ステップは、約１５分〜約９０分、約３０分〜約７５分、約４５分〜約７５分、約５０分〜約７０分、又は約６０分の時間にわたり実施される。
【００７８】
抽出温度を調べたところ、試験した９０℃までにおいて、温度がより高いほど、室温（例えば、約２０〜２５℃）よりも高い抽出率が得られることが一般的であり、ダイズミール及びおからの抽出の両方について一貫した結果が得られた。したがって、実施形態において、前処理ステップは、少なくとも約８５℃、少なくとも約８６℃、少なくとも約８７℃、少なくとも約８８℃、少なくとも約８９℃又は少なくとも約９０℃の温度で実施される。実施形態において、前処理ステップは、約８５℃〜約１００℃、約８５℃〜約９５℃、又は約８８℃〜約９２℃、例えば約９０℃の温度で実施される。
【００７９】
ダイズタンパク質の抽出に対するｐＨの影響を試験したところ、最も低い溶解度が酸性のｐＨ（約３．５〜４）で生じ、このｐＨ範囲から変動すると溶解度が増加し、穏やかなアルカリ性条件により最も高い溶解度がもたらされることが分かった。さらに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるように、異なるｐＨで抽出したタンパク質は、異なる組成プロファイルを示した。特に、ｐＨ２で抽出すると、総タンパク質が増加したが、高分子量の種が減少した。水又は緩衝液（ｐＨ８  ０．０３Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ）のいずれかで懸濁した場合のダイズミール及びおからの両方のタンパク質の抽出を調べ、緩衝液により、両方のバイオマスについてのタンパク質の抽出収率が著しく増大することが分かった。しかしながら、抽出前に（ＮａＯＨにより）異なるｐＨに調整した水懸濁液と緩衝液とを比較するさらなる分析により、タンパク質の抽出率の増大が主にｐＨの増加によるものであると示され、緩衝液処理したバイオマスは、同じｐＨに調整した水懸濁液と比べて同じ抽出効率を示した。
【００８０】
したがって、実施形態において、前処理ステップは、穏やかなアルカリ性のｐＨで、例えば、ｐＨ約７〜約１１、約８〜約１１、約９〜約１１、又は約１０で実施される。水溶液は、例えば、水、生理食塩水溶液又は緩衝液（例えばトリス緩衝液）であってもよい。
【００８１】
前処理ステップのための水溶液中のバイオマス濃度は、この方法を実施するのに適した任意の濃度であってもよく、例えば、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、又は少なくとも約１０％（ｗ／ｖ）の濃度であってもよい。実施形態において、水溶液中のバイオマスの濃度は、約０．１％〜約４０％であるか、又は水溶液中のバイオマスの濃度は、約０．５％、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、又は約１０％〜約４０％、約３０％、又は約２０％である。
【００８２】
組み合わされたｐＨ及び温度の両方の影響を試験したところ、温度を増大させると、試験したｐＨの全範囲にわたりタンパク質の抽出性が増加することが分かった。タンパク質の抽出は、反応条件を、ｐＨ約８〜１０及び約８０〜９０℃に設定した場合、非常に効率的である。高温及び高いｐＨ条件により、炭水化物の溶解度も増加させることができ、したがって、可溶性画分中の総タンパク質含量が減少する。炭水化物の総放出量に対する組み合わせた温度及びｐＨの影響を分析した。ｐＨ４〜１１の間では、炭水化物の放出は低く、ｐＨ又は温度のいずれによっても著しく影響を受けていなかった。ｐＨがより低い場合、糖の放出が、試験したすべての温度において著しく増加した。ｐＨが１１より高い場合、糖の放出の増加は、試験した最も高い温度においてしか測定されなかった。よって、ｐＨ約８〜１０及び約８０〜９０℃の反応条件が、良好な品質にとって、また炭水化物の放出の増加なしでの、おからからのタンパク質抽出の良好な収率にとって好ましい。したがって、実施形態において、前処理は、約８８℃〜約９２℃、例えば約９０℃の温度、及び約９〜約１１、例えば約１０のｐＨで実施される。
【００８３】
前処理（ｐＨ１０及び９０℃）なしでおからからどの程度タンパク質が直接放出され得るのかを調べるために、おからを水で３回直接抽出し、抽出したタンパク質を合わせた。出発材料中の総タンパク質に比べて、非常に少ない量が放出された（７〜８％）。別個の実験では、おから水懸濁液を１時間にわたり９０℃、ｐＨ１０で前処理（プレインキュベーション）し、その後、３回洗浄した。プレインキュベーションステップにより、可溶性タンパク質の回収率が増大した。しかしながら、おから中の総タンパク質の３３％しか可溶性形態で抽出されなかった。したがって、次に、酵素処理でタンパク質回収率をさらに改善することができるかを評価する。
【００８４】
ダイズバイオマスから産物を抽出するための酵素補助水抽出法（ＥＡＥＰ）
油糧種子バイオマスのタンパク質抽出効率に対するセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、セロビアーゼ、アミラーゼ及びリパーゼの影響を、ダイズミール（ＳＢＭ）及びおからを使用して試験した。セルラーゼ（スペザイム（Ｓｐｅｚｙｍｅ）（商標）ＣＰ）、ペクチナーゼ（ペクチネックス（Ｐｅｃｔｉｎｅｘ）（商標）Ｕ）及びキシラナーゼ（ＨＴＸ４）すべてにより、糖の放出が増加した。３種の酵素を組み合わせることにより、糖の放出がさらにより多くなった。アミラーゼ及びリパーゼでの処理によっては、糖の放出はもたらされなかった。しかしながら、これらの酵素での処理によっては、バイオマスからのタンパク質の放出が著しく増加することはなかった。
【００８５】
その後、総タンパク質回収率に対するプロテアーゼの影響を評価した。この方法を試験するために、市販で入手可能なプロテアーゼ（アルカリ性プロテアーゼ、ＣＡＳ番号：９０１４−０１−１、本明細書ではプロテアーゼＥ１として参照）を選択した。ダイズミール及びおからを、反応緩衝液（ｐＨ８、０．０３Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ）に懸濁させ、プロテアーゼＥ１（５５℃、１時間）で処理した場合、非常に少ない用量（０．０２５％ｖ／ｖ）の酵素でさえ、タンパク質を効果的に加水分解して、短時間で未加工のバイオマスから直接小さなペプチドにすることができた。意外なことに、プロテアーゼ処理により、同じ条件下でインキュベートした酵素なしの対照と比べて、抽出したタンパク質含量も著しく増加する。おからを用いてより詳細な分析を実施したところ、抽出したタンパク質は、酵素なしの対照に比べて６６％増加した。
【００８６】
懸濁したバイオマスに酵素を直接添加することにより、上記のタンパク質の抽出が増加をもたらした。酵素添加前に前処理を組み合わせることにより、タンパク質の抽出をさらに改善することができるかをさらに調べた。バイオマスを酵素反応緩衝液（ｐＨ８）中に酵素反応（５５℃）と同じ温度で懸濁することにより、前処理を実施した。固液分離の後に、上澄み液中の放出されたタンパク質を、酵素処理なしで基線タンパク質放出として処理する。ペレットをさらに再懸濁させ、酵素で処理し、酵素なしで処理された試料と比べてより多くのタンパク質が放出され得るかを観察した。前処理ステップを導入し、続いて、ペレットを酵素で処理したところ、前処理ステップにより、Ｏ．Ｄ．２８０を単純に測定することにより容易に検出可能な有意な量のタンパク質が放出された。引き続くプロテアーゼ処理により、タンパク質回収率がさらに改善された。酵素なしで処理された試料に比べて、抽出したタンパク質の８９％の増加が達成された。しかしながら、総タンパク質回収率は、約３０％だけであり、大多数のタンパク質は、ペレット不溶性画分中に残留していた。前処理をより高い温度（９０℃）及びｐＨ８で１時間にわたり実施し、続いて、酵素で処理したところ、３８％の酵素処理なしでの回収率に比べて、５９％の総タンパク質回収率が達成された。前処理を９０℃及びｐＨ１０で実施し、続いて、酵素で処理したところ、おからバイオマスから８５％までの総タンパク質回収率が達成された。繊維が豊富な不溶性画分中のタンパク質含量が著しく低減した。これらの結果は、穏やかなアルカリ性条件下（ｐＨ１０）及び高温での前処理の組合せ、続いて、プロテアーゼ酵素での処理ステップが、タンパク質抽出にとって効率的であることを示す。さらに、そのような酵素補助水抽出法は、タンパク質の総抽出効率を増大させることのみならず、より良好な機能、例えば全長タンパク質／ペプチド混合物に比べて増加した栄養消化率を有し得るペプチド産物を産生することにより、２倍の利益を有し得る。
【００８７】
標準基質に対する１０種の異なるプロテアーゼ（以下の表４中の酵素Ｅ１〜Ｅ１０参照）の活性を特徴付けし、ダイズタンパク質の加水分解プロファイルについて、標準化された酵素用量を用いて、ダイズミール及びおからの両方を使用して分析した。本発明者等は、バシラス・リケニフォルミス（セリン型プロテアーゼ、サブチリシン、シグマ（Ｓｉｇｍａ）（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ５４５９及びＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃａｔ．Ｎｏ．１２６７４１）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）（セリン型プロテアーゼ、サブチリシン、シグマ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ１２３６）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（エンドプロテアーゼ及びエキソペプチダーゼ、シグマ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏ．Ｐ６１１０）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）種（セリン型プロテアーゼ、サブチリシン、シグマ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏｓ．Ｐ３１１１、Ｐ５９８５、Ｐ５８６０）及びシステインプロテアーゼ（パパイン、シグマ（登録商標）Ｃａｔ．Ｎｏｓ．Ｐ３３７５及びＰ７６２２０）からのプロテアーゼを含む様々なプロテアーゼを使用して、類似した加水分解パターンが生じることを発見した。ほとんどの加水分解プロセスでは、短いペプチドの幾分早い段階の蓄積により、すべてのサイズのタンパク質及びペプチドが徐々に減少した。試験したすべての酵素について、大多数の加水分解されたペプチドは、３０ｋＤａ未満の分子質量を有していた。
【００８８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析に基づいて、これらの酵素の大部分が、類似した分子サイズの範囲にあるペプチドを放出していると思われるものの、これらのペプチドの収率及び同一性は、同じではないことがある。例えば、異なるプロテアーゼ加水分解からのペプチドの物理的及び栄養補助的な機能は、組成が異なるために、同じではないことがある。当業者であれば、この方法で使用すべきプロテアーゼ（又はその組合せ）が、所望の基準、例えばある特定の条件下でのより良好な加水分解効率、所望の活性などに基づいて選択可能であると理解するだろう。
【００８９】
１０種のプロテアーゼについて、トリプシン阻害活性が低減した産物を生成するそれらの能力を試験した。酵素なしで処理された材料に比べて、異なる酵素での処理により、トリプシン阻害が様々な度合いで減少し、その差は、得られた加水分解された産物の組成が異なることから生じていると思われる。
【００９０】
したがって、実施形態において、本明細書に記載の方法は、エンドプロテアーゼ、エキソペプチダーゼ、セリン型プロテアーゼ（例えばサブチリシン）、システイン型プロテアーゼ（例えばパパイン）、トレオニン型プロテアーゼ、アスパラギン型プロテアーゼ、グルタミン型プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ及びアスパラギンペプチドリアーゼを含む、任意のタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）又はこれらの組合せを使用して実施することができる。これらのプロテアーゼは、一般的に使用されている技術を用いて、任意の適切な生物（バクテリア、真菌、植物、動物など）から単離することができる、又は組換えで産生することができる。一実施形態において、本明細書に定義されている方法は、１種又は複数種のセリン型プロテアーゼ、例えばサブチリシンの使用を含む。別の実施形態において、本明細書に定義されている方法は、１種又は複数種のシステイン型プロテアーゼ、例えばパパインの使用を含む。別の実施形態において、本明細書に定義されている方法は、表４に記載の酵素Ｅ１〜Ｅ１０のうちの１種又は複数種の使用を含む。一実施形態において、開始バイオマスはおからであり、本明細書に定義されている方法は、表４に記載の酵素Ｅ１、Ｅ３、Ｅ８及びＥ１０のうちの１種又は複数種の使用を含む。一実施形態において、開始バイオマスはＳＢＭであり、本明細書に定義されている方法は、表４に記載の酵素Ｅ３、Ｅ４及びＥ９のうちの１種又は複数種の使用を含む。
【００９１】
タンパク質分解ステップについての条件（例えば、温度、ｐＨ、時間）を、使用するプロテアーゼ（複数可）に基づいて適合させてもよい。一実施形態において、タンパク質分解ステップの温度は、約２０℃〜約８０℃、約３０℃〜約７０℃、約４０℃〜約６０℃、又は約５０℃〜約６０℃である。実施形態において、タンパク質分解ステップは、約４〜約１２、約７〜約１１、約８〜約１１、約９〜約１１又は約１０のｐＨで行われる。タンパク質分解ステップは、前処理ステップと同じ水溶液中で、又は異なる溶液中で実施されてもよい。ｐＨ及び温度は、前処理ステップとタンパク質分解ステップとの間で再調整されてもよい。
【００９２】
実施形態において、タンパク質分解ステップは、約２時間未満、又は約９０分未満、又は約７５分未満の時間にわたり実施される。他の実施形態において、タンパク質分解ステップは、少なくとも１５分、少なくとも２０分、少なくとも２５分、少なくとも３０分、少なくとも３５分、少なくとも４０分又は少なくとも４５分の時間にわたり実施される。さらなる実施形態において、タンパク質分解ステップは、約１５分〜約９０分、約３０分〜約７５分、約４５分〜約７５分、約５０分〜約７０分、又は約６０分の時間にわたり実施される。
【００９３】
一実施形態において、本明細書に定義されている方法は、タンパク質分解酵素を失活させるステップをタンパク質分解ステップの後にさらに含む。プロテアーゼを失活させる方法は、当技術分野において周知であり、例えば、化学的な失活（例えばプロテアーゼ阻害物質を使用する）、ｐＨ失活（例えば、混合物／スラリーのｐＨがタンパク質分解活性と不適合になるように酸又は塩基を添加することによる）、又は熱失活が挙げられる。一実施形態において、タンパク質分解酵素を失活させるステップは、熱失活、例えば、スラリーを少なくとも７０℃又は８０℃の温度に少なくとも５分又は１０分にわたり加熱することによる熱失活を含む。一実施形態において、熱失活は、スラリーを８０℃〜約１００℃（例えば、８０℃、８５℃、９０℃又は９５℃）の温度に約５分〜約３０分、好ましくは約１０分〜２０分又は約１５分の時間にわたり加熱することを含む。
【００９４】
産物中のフィテート（フィチン酸）含量の低減
本明細書に記載の方法を使用して得られる産物中のフィテート含量を低減することが望ましいことがある。フィテートが、ある特定の栄養素、例えば、無機物（カルシウム、マグネシウム、鉄、銅及び亜鉛）の吸収に対するその干渉を理由に栄養阻害物質であるとしばしば称されるのは明らかである。この課題を達成すべく、（沈殿により）ペプチド産物中の非栄養性フィテートの濃度を低減するために選択した二価カチオン（ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２及びＦｅＣｌ２）を試験した。製造条件下で試験（ｐＨ１０）したところ、ＭｎＣｌ２が、フィテートの沈殿を、特により低い濃度で誘発するのに最も効果的であると思われた。１．５ｘ当量（１当量、１ｘは、フィテートの分子１個あたりに二価カチオン、例えばカルシウムの分子が６個あることと定義される）及びより高い濃度の場合、ＣａＣｌ２及びＦｅＣｌ２も非常に良好に実施される。ＣａＣｌ２は、最適化された条件及びより高い濃度で使用されると、ベンチスケール実験で試験した場合に、最終産物において９５％のフィテート濃度を低減することができた。
【００９５】
よって、一実施形態において、本明細書に定義されている方法は、フィテート含量を低減するステップをさらに含む。組成物中のフィテート含量を低減する方法は、当技術分野において周知であり、例えば、フィテート分解酵素（例えばフィターゼ）又は二価カチオンでの処理が挙げられる。フィターゼは、任意の供給源／発生源、例えば、真菌、バクテリア、酵母又は植物由来であってもよい。さらなる実施形態において、方法は、ステップｂ）のタンパク質分解酵素処理スラリーを、１種又は複数種の二価カチオンを含む溶液、例えば、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＭｎＣｌ２及びＦｅＣｌ２のうちの１種又は複数種を含む溶液で処理するステップを含む。さらなる実施形態において、溶液はＣａＣｌ２を含む。実施形態において、スラリー中の二価カチオンの量は、約０．５ｘ〜約５０ｘ当量、又は約１ｘ〜約４０ｘ当量、又は約１．５ｘ〜約２５ｘ当量である。
【００９６】
産物の回収率及び品質のために開発された最終的な方法
二段階のプロテアーゼ法と、タンパク質分解及び低減されたトリプシン阻害活性に適した酵素の候補と、フィテート沈殿のための二価カチオンを添加する条件とを特定して、最適な産物の回収率及び品質のために方法を仕上げた。本明細書に記載の実施形態によると、特定した最適なパラメーターは以下の通りである：約９０℃、ｐＨ１０で約１時間にわたる前処理、続いて、選択した用量の酵素で約１時間にわたる処理、及びＣａＣｌ２を特定した用量で添加した。その後、上澄み液（液体画分）を、（例えば、遠心分離、濾過、又は液体画分と固体画分との分離に適した任意の他の方法を使用して）固体画分から分離し、濃縮し、乾燥させて、タンパク質／ペプチドが豊富な可溶性産物を得ることができる。繊維が富化されている固体画分を、食品又は飼料用の繊維産物として使用するために乾燥させてもよい。
【００９７】
したがって、本発明は、バイオマスからタンパク質及び／又はペプチドが富化されている画分と食物繊維が富化されている画分とを製造する方法であって、
ａ）  バイオマスを乾燥形態又は湿潤形態のいずれかで得るステップ；
ｂ）  任意選択でバイオマスを粉砕するステップ；
ｃ）  バイオマス又は粉砕されたバイオマスを、アルカリ性条件に調整したｐＨ及び９０℃以上に調整した温度を有する水溶液で可溶化する及び抽出するステップ；
ｄ）  水性スラリーの温度及びｐＨを再調整し、水性スラリーをタンパク質分解酵素で処理するステップ；
ｅ）  任意選択で、フィテート含量を、例えば、二価カチオン溶液（例えばＣａＣｌ２）をスラリーに添加してフィテート含量を沈殿させることにより低減するステップ；
ｆ）  任意選択でタンパク質分解酵素を失活させるステップ；
ｇ）  液体画分と固体画分とを分離するステップ；
ｈ）  任意選択で液体画分を濃縮して、液体濃縮物を得るステップ；
ｉ）  任意選択で液体濃縮物を乾燥させて、可溶性のタンパク質及びペプチドが豊富な産物を得るステップ；並びに
ｊ）  任意選択で固体画分を乾燥させて、繊維が豊富な非水溶性の産物を得るステップ
を含む、方法に関する。
【００９８】
実施形態において、ステップｅ）をステップｇ）の後に行い、続いて、別途、固体／液体分離を実施して、沈殿したフィテート含量を除去してもよい。液体画分をさらに濃縮して、最終産物として乾燥させてもよい。
【００９９】
実施形態において、ステップｈ）の前に、液体画分を、１回又は複数回の精製ステップ（複数可）、例えば、目標とする産物の特徴に基づいた膜濾過システムを使用した、分子質量又はサイズ差に基づく精製にかけてもよい。
【０１００】
一実施形態において、本明細書に定義されている方法は、有機溶媒の使用を含まない。
【０１０１】
産物の特徴
表１は、アルコン（登録商標）Ｆ（Ａｒｃｈｅｒ  Ｄａｎｉｅｌｓ  Ｍｉｄｌａｎｄ、ＡＤＭ製）と、本明細書に記載の方法により得られた２種のペプチド産物との組成比較を示す。おからから抽出したタンパク質／ペプチド試料のアミノ酸プロファイル分析は、ＡＤＭからの市販のダイズタンパク質濃縮物（ＳＰＣ）であるアルコン（登録商標）Ｆに比べた場合、必須アミノ酸及び非必須アミノ酸の両方の比が類似していることを示し、他の特徴が同じである場合、同等の栄養価を期待できることを示唆している。しかしながら、溶解度分析は、市販のＳＰＣアルコン（登録商標）Ｆが、ｐＨ３〜９の間で約１０％の溶解度しか示さず、ｐＨ１１でしか２５％まで上昇しない一方で、本明細書に記載の方法により得られた抽出したタンパク質／ペプチド産物が、広範囲のｐＨ（３〜１１）にわたり一貫して高い溶解度（８０％超）を示すことを表した。アルコン（登録商標）Ｆに比べて、おから由来の本明細書に記載の方法により得られるペプチド産物は、主に出発材料中のより低いタンパク質含量（おから、ダイズミールに対して２５％、通常５０％超）と、おから及びペプチド産物中の余分な脂質に起因して、より少ない量のタンパク質を含有していた。しかしながら、アルコン（登録商標）Ｆに比べて、より低い濃度の抗栄養因子が、本明細書に記載の方法により得られるおから抽出物中で検出された。酵素的方法により、２０％超の加水分解度を有し、大部分が２０ｋＤａ未満であるタンパク質／ペプチド産物ももたらされた。この方法により、トリプシン阻害活性及びフィチン酸含量もより低くなった。よって、本明細書に記載の方法により得られる抽出したタンパク質／ペプチド産物は、食品、飼料、飲料、化粧品を含む幅広い範囲の用途に使用することができ、良好な機能及び栄養価を有する。
【０１０２】
【表１】
2020517257.tif 000003
【０１０３】
したがって、別の態様において、本発明は、本明細書に記載の特徴のうちの１つ又は複数を含む、タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥バイオマス抽出物、好ましくはダイズバイオマス抽出物に関する。一実施形態において、タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥バイオマス抽出物は、本明細書に記載の特徴のうちの少なくとも２つ、３つ、４つ又は５つを含む。さらなる実施形態において、抽出物は、以下の特徴：
ａ）  約３〜約１１のｐＨにわたり、８０％超の水溶解度；
ｂ）  約４０％以上のタンパク質及び／又はペプチド含量；
ｃ）  抽出物中の少なくとも７５％のタンパク質及び／又はペプチドが、２０ｋＤａ未満の分子量を有すること；
ｄ）  市販のダイズタンパク質濃縮物（ＳＰＣ）に比べて低減されたトリプシン阻害活性及びフィテート含量
のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ又はすべてを含む。
【０１０４】
さらなる実施形態において、抽出物中の少なくとも８０％、少なくとも８５％、又は少なくとも９０％のタンパク質及び／又はペプチドが、約２０ｋＤａの分子量を有する。
【０１０５】
一実施形態において、抽出物は、以下の実施例に記載の方法を使用して測定して、約３、２．５又は２ＴＵＩ／ｍｇ未満のトリプシン阻害活性を有する。
【０１０６】
一実施形態において、抽出物は、以下の実施例に記載の方法を使用して測定して、約２５又は２０ｍｇ／ｇ未満のフィテート含量を有する。
【０１０７】
一実施形態において、タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥バイオマス抽出物は、本明細書に記載の方法により得られる。
【０１０８】
別の態様において、本発明は、本明細書に記載の特徴のうちの１つ又は複数を含む、繊維が豊富な乾燥バイオマス抽出物、好ましくはダイズバイオマス抽出物をもたらす。一実施形態において、繊維が豊富な乾燥バイオマス抽出物は、本明細書に記載の方法により得られる。
【０１０９】
実施形態において、本明細書に記載の抽出物は、様々な食品、例えば、飲料（例えばソフトドリンク）、乳製品、ソース、焼き菓子、栄養バー、シリアル、キャンディー、ガム、ゼリーなどのような菓子、タブレット、パン、調理米、ベジタリアン用食品（ハンバーガー、ソーセージ、グラノーラ製品、パテ）などに組み入れることが可能である。一実施形態において、本明細書に記載の抽出物は、動物飼料（家畜、ペット）に組み入れられる。
【０１１０】
実施形態において、本明細書に記載の抽出物は、化粧製品／組成物に組み入れることが可能である。そのような化粧製品／組成物は、例えば、クリーム、エマルション、フォーム、ゲル、ローション、ミルク、ムース、軟膏、ペースト、粉末、スプレー又は懸濁液の形態にあり得る。化粧製品／組成物は、化粧品にとって許容可能な助剤を少なくとも１種任意選択で含む。化粧品として許容される助剤としては、担体、賦形剤、乳化剤、界面活性剤、保存剤、香料、香油、増粘剤、ポリマー、ゲル形成剤、染料、吸収顔料、光保護剤、粘度調整剤、酸化防止剤、泡消剤、耐電防止剤、樹脂、溶媒、溶解促進剤、中和剤、安定剤、殺菌剤、噴霧剤、乾燥剤、乳白剤、化粧品有効成分、毛髪用ポリマー、ヘアコンディショナー剤及びスキンコンディショナー剤、グラフトポリマー剤、水溶性又は分散性シリコーン含有ポリマー剤、漂白剤、ケア剤、着色剤、色味剤、日焼け剤、保水剤、再脂肪化剤、コラーゲン、タンパク質加水分解物、脂質、皮膚軟化剤及び軟化剤、色味剤、日焼け剤、漂白剤、ケラチン硬化物質、抗菌作用有効成分、光フィルタ有効成分、忌避性有効成分、充血性物質、角質溶解剤及び角質形成物質（ｋｅｒａｔｏｐｌａｓｔｉｃ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、ふけ防止有効成分、抗炎症剤、角質化物質、酸化防止剤として作用する有効成分及び／又はフリーラジカル捕捉剤として作用する有効成分、皮膚保湿物質又は皮膚保水物質、再脂肪化有効成分、脱臭有効成分、皮脂抑制（ｓｅｂｏｓｔａｔｉｃ）有効成分、植物抽出物、抗紅斑性（ａｎｔｉｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｕｓ）又は抗アレルギー性有効成分並びにこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１１】
本発明はまた、本明細書に記載のタンパク質及び／若しくはペプチドが豊富な乾燥バイオマス抽出物、又は繊維が豊富な乾燥バイオマス抽出物含む、飲料、化粧品、食品又は飼料製品に関する。
【０１１２】
本発明はまた、（ｉ）本明細書に記載の方法を実施して、タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥産物を得るステップ、並びに前記タンパク質及び／又はペプチドが豊富な乾燥産物を飲料、化粧品、食品又は飼料組成物に組み入れるステップを含む、飲料、化粧品、食品又は飼料製品を製造する方法に関する。
【０１１３】
本発明はまた、（ｉ）本明細書に記載の方法を実施して、繊維が豊富な乾燥産物を得るステップ、及び前記繊維が豊富な乾燥産物を飲料、化粧品、食品又は飼料組成物に組み入れるステップを含む、飲料、化粧品、食品又は飼料製品を製造する方法に関する。
【実施例】
【０１１４】
本発明をより明瞭に理解できるようにするために、その実施形態について、添付図面を参照して、非限定的な実施例を用いてより詳細に説明する。
【０１１５】
実施例１：おから及びダイズミール加水分解についてのプロテアーゼＥ１の用量分析
プロテアーゼが、最初のタンパク質の精製なしで未加工のバイオマスから直接ダイズタンパク質を効率的に加水分解することができるかを分析するために、フリーズドライした脱脂ダイズミール試料を、０．０３ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中に２．８％の固体：液体比（Ｗ／Ｖ）で懸濁させ、酵素を添加して１時間にわたり５５℃でインキュベートした。一般的な市販で入手可能なプロテアーゼのうちの１つ（シグマ  Ｐ５４５９；本明細書ではプロテアーゼＥ１として定義されている）を使用して、ダイズタンパク質加水分解に対する量的効果を試験した。ブランクについて、反応を、別個のチューブ内で、酵素を添加せずに実施した。試験した酵素用量は、０．００２５％、０．００５％、０．０１％、０．０２％、０．０４％、０．０８％（ｖ／ｖ）であった。１時間後、反応チューブを９５℃で１５分にわたりインキュベートすることにより反応を停止した。反応チューブを２０，０００ｘｇで２０分にわたり遠心分離して、液体画分と固体画分とを分離した。上澄み液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分析した。各反応からの等しい体積（１５μｌ）の液体を１２％のアクリルアミドゲルにロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを１３０ボルトで１時間にわたり実行し、その後、クマシーブルーで染色した。これらの結果を図２に提示する。酵素なしの対照に比べて、より高い分子量のタンパク質を加水分解して大部分を４０ｋＤａ未満にするには、非常に少ない用量の酵素で十分であった。用量を増加すると、より高い分子量のタンパク質の密度がさらに低下し、同様に、およそ３０〜４０ｋＤａのより低い分子量のタンパク質の密度も低下し、このことは、より多くのタンパク質が加水分解されて、３０ｋＤａ未満のより小さなペプチドになったことを示唆している。０．０４％の用量で、大多数のタンパク質が加水分解されて、およそ３０〜４０ｋＤａの非常に弱いペプチドの画分を除いて、短いペプチドになった。用量をさらに増加させて０．０８％にすると、およそ３０ｋＤａのペプチドは、ほぼ目視ができなくなった。これらの結果は、ダイズタンパク質が、少ない用量のプロテアーゼＥ１により多く加水分解されて、１時間以内に短いペプチド又はアミノ酸になったことを示唆している。
【０１１６】
ダイズ及びおからのタンパク質抽出に対するプロテアーゼＥ１の量的効果を分析するために、ダイズミール及びおからの試料の両方をフリーズドライし、０．０３ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中に２．８％の固体：液体比（Ｗ／Ｖ）で懸濁させた。反応混合物のインキュベーション、プロテアーゼＥ１用量、及び固液分離は、前述と同じであった。Ｏ．Ｄ．２８０ｎｍでの吸収率を測定することにより、放出されたタンパク質含量について上澄み液を試験した。Ｏ．Ｄ．２８０値を酵素用量に対してプロットした（図３）。おから及びダイズミールのどちらについても、酵素は、非常に少ない用量でタンパク質の放出に影響を与える。用量が増加すると、タンパク質の放出が増加し、これは約０．０５％の用量で一定になった。プロテアーゼの加水分解によるダイズミール又はおからのいずれかのタンパク質の放出におけるこの著しい増加は、予期せぬことだった。この影響のさらなる詳細な特徴は、以下の実施例で報告される。
【０１１７】
実施例２：おからからのタンパク質抽出収率に対するプロテアーゼの影響
おからからのタンパク質抽出に対するプロテアーゼ処理の効果をさらに判定するために、フリーズドライしたおからを、０．０３ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液中に２．８％の固体：液体比で懸濁させ、１時間にわたり５５℃でインキュベートした。固体及び液体を、ベンチトップ遠心分離機で、１０分にわたる２０，０００ｇの遠心分離により分離し、上澄み液を保持した。０．０１％ｖ／ｖの比でプロテアーゼＥ１を添加し、反応混合物を５５℃で１時間にわたりインキュベートした。その後、９５℃で１５分にわたりインキュベートすることにより反応を停止した。酵素なしの対照に関して、酵素添加なしの別個の反応を並行して行った。９５℃での１５分のステップの後に、上澄み液を遠心分離の後に回収し、ペレットを、同じ緩衝液で１時間にわたり５５℃でもう一度抽出した。液体及び固体分離の後に、別個に保持及びフリーズドライしたすべての液体のタンパク質含量を、クマシープラスアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）でのブラッドフォードタンパク質アッセイ（ＢＰＡ）法を製造会社の手順に従って使用することにより分析した。あるいは、おから試料をトリス緩衝液中に懸濁させ、プロテアーゼで直接処理し、先に記載のような洗浄ステップが続いた。並行する酵素なしの対照実験を別個の反応において行った。各ステップからの上澄み液中で放出されたタンパク質を、同じキットを使用して分析した。これらの結果を表２に要約した。
【０１１８】
プロテアーゼをおから懸濁液に直接添加する場合、酵素ステップで抽出したタンパク質の量は、酵素なしの対照中で抽出したものの２倍であった。後処理ステップを含む場合、抽出した総タンパク質は、酵素なしの対照に比べて６６％増加した。前処理ステップを導入する場合、酵素処理ステップだけで、タンパク質の抽出が、酵素なしの対照に比べて４．５倍増加した。３つのステップすべての総タンパク質を合わせた場合、抽出した総タンパク質の８９％の増加が達成された。
【０１１９】
【表２】
2020517257.tif 000004
【０１２０】
実施例３：可溶形態及び繊維ペレットのおからのタンパク質含量に対するプロテアーゼの影響
固体バイオマス、おから、繊維ペレット及び抽出した可溶性画分についてのタンパク質含量をすべて、ゲルハルトケルダーム（Ｇｅｒｈａｒｄｔ  Ｋｊｅｌｄａｔｈｅｒｍ）分解器、ゲルハルトベーパデス（Ｇｅｒｈａｒｄｔ  Ｖａｐｏｄｅｓｔ）（商標）２０ｓ蒸留装置を用いるケルダール方法（ＡＯＡＣ  Ｏｆｆｉｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２００１．１１；Ｊ  ＡＯＡＣ  Ｉｎｔ．１９９９、８２：１３８９〜１３９８ページ）により決定し、ＳＩ分析タイトロライン（Ｔｉｔｒｏｌｉｎｅ）（商標）６０００により滴定した。
【０１２１】
水を放出したタンパク質を決定するために、フリーズドライしたおから（２５０ｍｇ）を、室温で水中に２．８％の固体：液体比で懸濁させた。固体及び液体を、アレグラ（Ａｌｌｅｇｒａ）（商標）Ｘ−１２Ｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）遠心分離機で、１５分にわたる２８００ｇの遠心分離により分離し、上澄み液を保管した。ペレットを再懸濁させ、この方法をさらに２回繰り返した。３回の繰り返しからの上澄み液を合わせた。プールした上澄み液及びペレットの両方をフリーズドライし、タンパク質含量をケルダール法により決定した。
【０１２２】
おからのプレインキュベーション及び洗浄のために、フリーズドライしたおからを先のステップのように懸濁させ、ｐＨ８．０（４ＮのＮａＯＨで調整）及び９０℃で１時間にわたりインキュベートした。インキュベーションの上澄み液と３つの洗浄液とを合わせた。上澄み液及びペレットのタンパク質含量を、先のステップに記載のように決定した。
【０１２３】
酵素ブランクについて、おからを３回洗浄し、９０℃でｐＨ８．０において１時間にわたりインキュベートした。液体を固体から分離し、ペレットを上記のように３回洗浄した。その後、ペレットを水中に元々の体積へと再懸濁させ、ｐＨを８．０に調整し、５５℃で１時間にわたり酵素なしでインキュベートした。液体を上記のように固体から分離し、ペレットを３回洗浄した。すべての液体上澄み液を合わせた。プールした液体及び洗浄したペレットの両方をフリーズドライし、タンパク質含量をケルダール法により決定した。酵素補助抽出について、操作は、０．００５％（Ｖ／Ｖ）のプロテアーゼＥ１の５５℃で１時間にわたる添加を除いて、酵素ブランクとすべて同じであった。
【０１２４】
様々な操作後の上澄み液中のタンパク質回収率及びペレット中の残留タンパク質含量は、表３及び図４に示される。室温の３つの洗浄液により１０％のタンパク質放出がもたらされた；高温のｐＨ８のプレインキュベーション、続いて３回の洗浄により３３％のタンパク質回収率がもたらされた；別のステップ（５５℃で１時間）の酵素なしの処理を追加して、続いて３回の洗浄を行う場合、３８％のタンパク質回収率が達成された；酵素を１時間ステップの間５５℃で添加することにより５９％のタンパク質回収率が上澄み液中でもたらされた。相応して、ペレット中に残ったタンパク質含量は、８７％から３６％に減少した。
【０１２５】
【表３】
2020517257.tif 000005
実施例４：タンパク質抽出に対するｐＨ及び温度の効果
フリーズドライしたおからを、水中に２．５％（Ｗ／Ｖ）比で懸濁させ、ｐＨを４ＮのＨＣｌ（ｐＨ１．５→７）又は４ＮのＮａＯＨ（ｐＨ７→１２）で調整した。異なるｐＨのおから懸濁液を、異なる温度で１時間にわたりインキュベートした。固体及び液体分離を、１０分にわたる２８００ｇの遠心分離により行った。上澄み液中のタンパク質含量を、タンパク質ＤＣキット（バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）（登録商標））を用いて、製造会社の手順に従って分析した。
【０１２６】
組み合わせたｐＨ及び温度の影響は、図５に描かれるグラフに示されている。温度が増大、試験したｐＨの全範囲にわたりタンパク質抽出性が増加した。タンパク質溶解度は、ｐＨ３〜５の間で最も低く、ｐＨを調整して、より高く又はより低くした場合、両方の方向に向かって増加した。９０℃で、ｐＨ１及びｐＨ１０が、同様な高いタンパク質放出をもたらした。ｐＨ１０及び９０℃で、タンパク質回収率が高く、これらの条件は、実際の製造方法と適合しているだろう。
【０１２７】
実施例５：炭水化物抽出に対するｐＨ及び温度の効果
炭水化物の合計を、変更を加えたフェノール／硫酸法により分析した（Ｎｉｅｌｓｅｎ、２００３、Ｆｏｏｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｈａｐｔｅｒ６；ＤｕＢｏｉｓ等、１９５６、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、２８：３５０〜３５６ページ；Ｍｅｃｏｚｚｉ、２００５、Ｃｈｅｍｏｍｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、７９：８４〜９０ページ）。おから試料を懸濁させ、異なる温度及びｐＨでインキュベートし、１時間にわたり上記のように抽出した。異なる抽出からの上澄み液（１０μＬ）を１５ｍＬのファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）（商標）チューブ内に置いた。水及び８０％のフェノールの添加後に、原料Ｈ２ＳＯ４をチューブに直接添加した。試料をボルテックスし、１０分にわたり室温で静置させ、その後、２５℃の水浴中で１０分にわたり冷却し、続いて、ＵＶ分光計によるＯ．Ｄ．４９０読み取りを行った。Ｏ．Ｄ．値対ｐＨを図６に示されるようにプロットした。
【０１２８】
方法の開発についての１つの主な目標は、抽出した産物中のタンパク質回収率及びタンパク質含量を増加させることであった。タンパク質含量は、抽出した産物中の放出された炭水化物によっても影響を受ける。糖の放出に対する組み合わせたｐＨ及び温度両方の影響を試験した。ｐＨ４〜１１の間で、炭水化物の放出は低く、ｐＨ又は温度のいずれによっても著しい影響を受けなかった。より低いｐＨでは、糖の放出は、試験したすべての温度下で著しく増加した。１１より高いｐＨでは、糖の放出は、試験した最高温度においてのみ増加が測定された。よって、タンパク質の放出が高くても、酸性条件は好ましくないだろう。より高いｐＨ及び温度では、炭水化物の放出は増加せず、その一方で、タンパク質の放出は増加し、したがって、抽出した産物中でのタンパク質回収率の増加及びより高いタンパク質含量が可能である。
【０１２９】
実施例６：ダイズ試料のトリプシン阻害物質活性に対する酵素処理の効果
表４に一覧にされている１０種の市販で入手可能なプロテアーゼ（Ｅ１〜Ｅ１０）を、おから及び脱脂ダイズミールを用いて、確立されたＥＡＥＰ法に従って試験した。プロテアーゼの相対活性を、非特異的基質であるカゼイン（シグマ（登録商標））を用いて、一般的なプロテアーゼ活性アッセイ手順（シグマ（登録商標））に基づいて試験した。予め処理したおから及びダイズミール（ＳＢＭ）を、標準化された量の各酵素で加水分解した。
【０１３０】
トリプシン阻害物質活性アッセイを、わずかに変更を加えた公開されている方法に従って実施した（Ｋａｋａｄｅ等、１９６９  Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ  ４６：５１８〜５２６ページ；Ｋａｋａｄｅ等、１９７４、Ｃｅｒｅａｌ  Ｃｈｅｍ  ５１：３７６〜３８１ページ）。乾燥させた試料（０．５ｇ）を粉砕して、６０メッシュ篩に通し、室温にて１５０ｒｐｍで振とうさせながら、２５ｍｌの０．０１ＮのＮａＯＨで３時間にわたり抽出した（懸濁液のｐＨ約９．５〜９．８）。４０〜６０％のトリプシン阻害が達成されるように懸濁液を希釈した。トリプシン溶液と混合した後に、反応混合物を、３７℃の水浴中で１０分にわたりインキュベートし、続いて、ベンゾイル−ＤＬ−アルギニン−ｐ−ニトロアニリド塩酸塩（ＢＡＰＡ）溶液を添加し、さらに１０分にわたりインキュベートした。反応を酢酸で停止した後に、Ｏ．Ｄ．４１０を試薬ブランク及び試料ブランクに対して測定した。
【０１３１】
トリプシン単位（ＴＵ）を、使用した条件下での反応混合物１０ｍｌあたり０．０１の４１０ｎｍでの吸光度単位の増加と任意で定義する。トリプシン単位阻害（ＴＵＩ）は、ダイズ試料あり及びなしでアッセイしたトリプシン単位の差である。
【０１３２】
対照試料に比べて、すべての酵素での処理で、図７Ａ及び７Ｂに示されるように、トリプシン阻害活性の減少が様々な程度で生じた。酵素１、３、８及び１０は、おからに対して最も著しい効果を実証し、酵素３、４及び９は、ダイズミールに対して最も効果的であった。
【０１３３】
【表４】
2020517257.tif 000006
実施例７：おからから抽出したタンパク質のフィテート含量
フィテート含量アッセイを、わずかに変更を加えた公開されている方法に従って実施した（Ｄｒａｇｉｃｅｖｉｃ等、２０１１、Ａｃｔａ  ｐｅｒｉｏｄｉｃａ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａ  ４２：１１〜２１ページ；Ｇａｏ等、２００７、Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ４７：１７９７〜１８０３ページ）。
【０１３４】
乾燥したおからの試料（０．５ｇ）を、６０メッシュ篩に通し、２５０ｒｐｍで振とうさせながら、室温にてＨＣｌ及びＴＣＡで２時間にわたりインキュベートした。２０分にわたり１０℃で１０，０００ｇで遠心分離した後に、上澄み液を０．２２μＭのシリンジフィルターユニットで濾過し、その後、脱イオン化したＨ２Ｏで２５回希釈した。
【０１３５】
フィテート含量の比色定量を、ウェイド試薬（Ｗａｄｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）（０．０３％のＦｅＣｌ３  ６Ｈ２Ｏ及び０．３％のスルホサリチル酸）を反応チューブに添加することにより行った。遠心分離後に、吸光度を５００ｎｍで測定した。
【０１３６】
計算：Ｏ．Ｄ．５００における減少した値は、試薬ブランク吸光度から試料の吸光度を減算することにより得られる、試料中のフィテート含量を反映している。フィテート量は、フィチン酸ナトリウム標準曲線により計算した。
【０１３７】
おからからの抽出したペプチド産物中のフィテート濃度に対するＣａＣｌ２添加の効果を調べた。別個の実験において、異なる量のＣａＣｌ２を抽出プロセスの間に添加し、試料を異なる時点で採取した。図８に示されるように、加水分解プロセスにおけるＣａＣｌ２の当量が増加するほど、抽出した可溶性産物中のフィテートの量は、用量依存的に減少した。１５当量以上の場合、フィテート含量は、ＣａＣｌ２の添加後３０分で最小値に低下した。このプロセスの最後に、おからの対照スラリー（ＣａＣｌ２は添加されていない）は、約２４０μｇ／ｍＬのフィテートを有し、その一方で、より高い濃度でＣａＣｌ２を添加することにより、図８に示されるように、最終産物中で９５％までのフィテートが減少した。
【０１３８】
実施例８：おからペプチドの加水分解度（％ＤＨ）
おからバイオマスを、水中に１０％の固体：液体比で懸濁させ、ｐＨを４ＮのＮａＯＨで１０に調整し、９０℃で１時間にわたり抽出した。その後、温度を５５℃に調整し、ｐＨを、４ＮのＨＣｌを使用して８に再調整した。プロテアーゼ１を０．００５％の用量で添加し、加水分解試料を異なる時点で採取した。実験を繰り返し、酵素なしの対照実験を比較として並行して実行した。加水分解プロセスを、加水分解度（％ＤＨ）を測定することによりモニタリングした。
【０１３９】
％ＤＨを、ｏ−フタルジアルデヒド（ＯＰＡ）を用いて、わずかに変更を加えた公開されている手順に従って実施した（Ｎｉｅｌｓｅｎ等、２００１、Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．６６：６４２〜６４６ページ；Ｖｉｇｏ等、１９９２、Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．４４：３６３〜３６５ページ）。１ｍＬあたり１〜１０ｍｇのタンパク質を含有するように試料を希釈し、希釈係数を記録した。すべての反応試薬を添加した後に、Ａ３４０を測定する前に、混合物をちょうど２分にわたり静置させた。
ＤＨを以下のように計算した：％ＤＨ＝ｈ／ｈｔｏｔ＊１００；
ｈ＝（セリン−ＮＨ２−β）／α；
ダイズタンパク質についてのパラメーター：β＝０．３４２；α＝０．９７０；ｈｔｏｔ＝７．８。
ＯＤ読み取りからの等価のセリン−ＮＨ２を以下の通りに得た：
【０１４０】
【数１】
2020517257.tif 000007
【０１４１】
反応体積（Ｌ）、試料重量（ｇ）及びタンパク質濃度を反応条件に基づいて得た。試料の％タンパク質を、分数としてではなく、パーセンテージとして入力する。
【０１４２】
表５に示される結果は、反応の５分以内は加水分解の低下が増し、ＤＨが最後の時点に向かって増え続けることを示す。６０分で、２４〜２７％の％ＤＨに達し、対照試料は、７〜１０％の間で一定にとどまった。
【０１４３】
【表５】
2020517257.tif 000008
【０１４４】
実施例９：市販品のアルコン（登録商標）Ｆを用いたおからからの産物の溶解度の比較
タンパク質の溶解度を、わずかに変更を加えた、Ｌｅｅ及びＭｏｒｒの方法を使用することにより測定した（Ｌｅｅ等、２００３、ＪＡＯＣＳ  ８０、８５〜９０ページ；Ｍｏｒｒ等、１９８５、Ｊ．  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．５０：１７１５〜１７１８ページ）。プロテアーゼＥ１及び市販品のアルコン（登録商標）Ｆ（ＡＤＭ）により製造したおからペプチド産物の１つのバッチを、０．１ＭのＮａＣｌ溶液中に２％（Ｗ／Ｖ）の濃度で懸濁させた。ｐＨを１ＮのＮａＯＨ又は１ＮのＨＣｌ溶液で調整した後に、懸濁液をエアシェーカーにより、室温、１００ｒｐｍで３０分にわたり完全に混合した。その後、懸濁液を、２０，０００ｇで１５分にわたり遠心分離した。上澄み液及び元々の固体粉末のタンパク質含量を、ケルダール法及び６．２５の転化係数を使用して測定した。タンパク質の溶解度を、元々の試料中の総タンパク質に対する、上澄み液中のタンパク質のパーセンテージとして計算した。
【０１４５】
ｐＨ３〜９で約１０％の溶解度及びｐＨ１１で２５％の溶解度しか示さなかった市販のダイズタンパク質濃縮物アルコン（登録商標）Ｆに比べて、本明細書に記載の方法により得られる抽出されたタンパク質／ペプチド産物は、試験したｐＨ範囲（３〜１１）全体にわたり一貫して高い溶解度（８０％超）を示した（図９）。
【０１４６】
実施例１０：おから可溶性抽出物中のタンパク質及び抗栄養因子の濃度に対する酵素及びＣａＣｌ２処理の効果
前処理ステップと、続く酵素処理とを含む確立された手順を、酵素ステップの間にＣａＣｌ２を５当量で添加することにより実施し、抗栄養素であるフィテートの濃度を低減した。抽出を１Ｌスケールで３回実施した。酵素なし及び／又はＣａＣｌ２なしの対照抽出も３回実施した。最終抽出物の試料を凍結乾燥し、収率及び抗栄養素因子（トリプシン阻害活性及びフィチン酸）について分析した。酵素及びＣａＣｌ２ありの抽出手順により５３％のタンパク質回収率が得られ、これは、ＣａＣｌ２なしの抽出（６０％）よりもわずかに低く、このことは、ＣａＣｌ２が、酵素加水分解の間にバイオマス懸濁液に添加される際に、溶解度を低減するか、又は幾つかの可溶性タンパク質を沈殿させることができることを示唆している。しかしながら、ＣａＣｌ２あり又はなしの酵素プロセスは、酵素なしの抽出（４７％）よりも大きなタンパク質収率を生じた。さらに、加水分解物中のタンパク質含量も増加した。再現性の観点で、３つの抽出手順すべてが、８．５％（標準偏差）以下で変動するタンパク質収率を生じた。ＣａＣｌ２及びプロテアーゼをこの手順において使用した場合、抽出した産物において抗栄養因子が低減した。表６に示されるように、ＣａＣｌ２を添加することにより、フィチン酸が４０％低減し、酵素を添加することにより、トリプシン阻害活性が６０％減少した。最終産物の必要性に応じて、必要であれば、ＣａＣｌ２濃度を増大させることによりフィテート含量をさらに低減してもよい。
【０１４７】
【表６】
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【０１４８】
実施例１１：おから及び丸ダイズから抽出したタンパク質の比較
おからタンパク質を、乾燥させたおからをｐＨ８のＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液中に、又は上記のように様々なｐＨ（ｐＨ６、７、８、９及び１０）に調整した水中に懸濁させることにより抽出した。まず乾燥したダイズを水に２時間にわたり室温で浸漬し、続いて、１０分にわたり粉砕し、その後、粉砕物の懸濁液を３０分にわたり沸騰させることにより、おからと同じ種類のダイズから豆乳を調製した。豆乳を、３層のチーズクロスに通して濾過することで得た。抽出した試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、続いてクマシーブルーでの染色を実行することにより比較した。おからから抽出したタンパク質のペプチドプロファイルは、貯蔵ダイズ１１Ｓ／７Ｓタンパク質及び他の微量成分の両方を含む非常に類似したパターンを示した（図１０）。これは、おから抽出タンパク質と丸ダイズ抽出タンパク質との間で、タンパク質／ペプチド組成において有意な差がないことを示唆している。
【０１４９】
さらに、おからペプチド抽出物の４つの異なるバッチのアミノ酸プロファイルを、市販のダイズタンパク質濃縮物アルコン（登録商標）Ｆのアミノ酸プロファイルと比較した。アルコン（登録商標）Ｆ及びおからペプチド抽出物の両方とも、従来の方法に従ってＨＣｌで加水分解した。アミノ酸プロファイル分析を、ゾルバックス（Ｚｏｒｂａｘ）（商標）Ｅｘｔｅｎｄ  Ｃ１８カラム（Ａｇｉｌｅｎｔ  ｐ／ｎ７６３９５４−３０２）を用いたＡｇｉｌｅｎｔ  ＺＯＲＢＡＸ（商標）Ｅｃｌｉｐｓｅ  Ｐｌｕｓ  Ｃ１８ＡＡ法を使用して、製造会社の指示書に従って実施した（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏｔｅ  ５９９０−４５４、ｆｏｒ  ｆｏｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）。アミノ酸内部標準の調製、移動相及び勾配を、製造会社の指示書に従って０．４２ｍＬ／分の流速で選択した。ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）による検出、及び定量化（内部標準及び較正溶液）も、製造会社の指示書に従って実施した。各試料について、アッセイを２回繰り返し、繰り返しの平均を表７に記載した。
【０１５０】
【表７】
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【０１５１】
実施例１２：開発された方法を他のバイオマスにおいて適用
おからの抽出に基づいて確立された方法を、他のバイオマスについて１００ｍＬスケールで試験した；各バイオマスについて、抽出した産物におけるタンパク質回収率及び含量を決定した。タンパク質回収率を、抽出したタンパク質の量を、未加工のバイオマス中の総タンパク質と比較することにより決定した。タンパク質含量を、乾物ベースでの抽出した産物の総重量に対する抽出したタンパク質の量を比較することにより決定した。タンパク質収率を増加させるために、ジスチラーズドライドグレイン（ＤＤＧ）及びアブラナミールの抽出について、前処理ｐＨをｐＨ１１に上昇させた。他のステップ及び他の試料については、上記の手順に従った。表８に示されるように、試験したすべての材料について、酵素プロセスによりタンパク質回収率が著しく増加した。酵素なしの対照に比べて、タンパク質回収率における最も大きな増加は、ＤＤＧ（４０％〜７４％）に見られ、続いてアブラナミール（６５％〜８７％）に見られた。抽出した産物中のタンパク質含量の観点で、ＤＤＧ及びアブラナミールが、最大の増加を示した一方で、亜麻及びダイズについては、わずかな増加が得られた。
【０１５２】
【表８】
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【０１５３】
たいていおからに基づく先に記載の方法を他のバイオマスを加水分解するために使用できるかを判定するために、小規模な抽出を、プロテアーゼＥ１を用いて、おから、ダイズミール、ＤＤＧ及びアブラナミールについて実施した。各バイオマスについて、酵素あり及びなしの上澄み液を、並べて１５％のアクリルアミドゲルで分析した。図１１に見られるように、様々な材料を酵素でインキュベートした場合、より大きな分子量からより小さな分子量の材料への転化が明らかであった。おからについて、大部分のタンパク質は、加水分解されて１５ｋＤａ未満のペプチドになり、ダイズミールについては大部分が２５ｋＤａ未満になり、ＤＤＧについては大部分が１０ｋＤａ未満になり、アブラナミールについては大部分が１０ｋＤａ未満になった。
【０１５４】
請求項の範囲は、実施例に記載の好ましい実施形態に限定されるべきではなく、全体として明細書に一致する最も広い解釈が与えられるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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