(57)【要約】本発明は、ヒトにおけるＡＡＶに基づく遺伝子療法のための手段及び方法に関する。特に、本発明は、治療における使用を意図されるＡＡＶに対する抗体を有すると疑うことができるヒト患者の治療に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクターであって、前記ヒトは、抗ＡＡＶ５抗体を判定するアッセイを用いた事前スクリーニングに供されず、前記ヒトは、前記医学的治療の前にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療に供されていない、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクター。
【請求項２】
ヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクターであって、前記ヒトは、抗ＡＡＶ５抗体を判定するアッセイを用いた事前スクリーニングに供され、前記ヒトは、前記医学的治療の前にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療に供されておらず、前記ヒトは、ヒト集団において観察される抗ＡＡＶ５抗体レベルの多くても９５番目のパーセンタイルに相当する抗ＡＡＶ５抗体レベルを有する、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクター。
【請求項３】
前記ヒトが、抗ＡＡＶ５抗体（ｂｏｄｙ）に対して陽性の試験結果を示した、請求項３に記載のヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクター。
【請求項４】
少なくとも１０１２個カプシド／ｋｇに相当する投薬量で投与される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクター。
【請求項５】
少なくとも１０１２ｇｃ／ｋｇ体重に相当する投薬量で使用される、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクター。
【請求項６】
血友病Ａ又は血友病Ｂからなる群から選択される疾患の治療において使用される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクター。
【請求項７】
血友病の治療において使用され、ＦＩＸタンパク質又はそのバリアントをコードする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクター。
【請求項８】
前記使用は血流への投与を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクター。
【請求項９】
前記使用は肝臓への前記ベクターの送達を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ遺伝子療法ベクター。
【請求項１０】
昆虫細胞において産生される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクター。
【請求項１１】
ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療を受ける適格性があるヒト患者を判定するための方法であって、
ヒト患者由来の血清サンプルを用意するステップ、
抗ＡＡＶ５抗体力価を判定するステップ、
全抗ＡＡＶ５抗体力価が、実施例において記載される全抗ＡＡＶ５（ＴＡｂ）アッセイを用いて判定される０．０２〜５の範囲内の値を有する場合、患者は医学的治療を受ける適格性があると考えられ得るステップ
を含む方法。
【請求項１２】
ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療を受ける適格性があるヒト患者を判定するための方法であって、
ヒト患者由来の血清サンプルを用意するステップ、
抗ＡＡＶ５抗体力価を判定するステップ、
抗ＡＡＶ５抗体力価が、実施例において記載されるＮＡｂアッセイによって判定される中和抗ＡＡＶ５抗体アッセイを用いて判定される３〜５，０００の範囲内の値を有する場合、患者は医学的治療を受ける適格性があると考えられ得るステップ
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトにおけるＡＡＶに基づく遺伝子療法のための手段及び方法に関する。特に、本発明は、治療における使用を意図されるＡＡＶに対する抗体を有すると疑うことができるヒト患者の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、ヒト遺伝子療法のための最も有望なウイルスベクターの１つと考えられている。ＡＡＶは、分裂並びに非分裂ヒト細胞に効率的に感染する能力を有する。野生型ＡＡＶウイルスゲノムは、宿主細胞のゲノムにおける単一の染色体部位に組み込まれ、最も重要なことには、たとえＡＡＶが多くのヒトに存在しているとしても、ＡＡＶはいかなる疾患とも関連付けられていない。これらの利点を考慮して、組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、血友病Ｂ、悪性黒色腫、嚢胞性線維症、及び他の疾患に対する遺伝子療法臨床試験において評価されているところである。アリポジーンチパルボベック（Ａｌｉｐｏｇｅｎｅ  ｔｉｐａｒｖｏｖｅｃ）（グリベラ（Ｇｌｙｂｅｒａ）（登録商標）、ｕｎｉＱｕｒｅ）など、欧州における遺伝子療法医薬の数々の臨床試験及び認可は、ＡＡＶが臨床実践の主流（ｍａｉｎ  ｓｔａｙ）になる見込みを秘めている。
【０００３】
ＡＡＶベクターの投与の成功のための１つの大きな課題は、野生型ＡＡＶ又はＡＡＶに基づくベクターへの曝露後に発生している中和抗体（免疫グロブリン）（ＮＡｂ）の存在を克服することである。どちらの場合でも、ウイルスカプシドタンパク質に対する血清型特異的中和抗体は、同じ血清型のＡＡＶを用いた遺伝子移入の効率を低下させ得る。
【０００４】
他の血清型と比較して、ヒトにおけるＡＡＶ５血清型に対して、相対的に低いエンデミック（ｅｎｄｅｍｉｃ）ＮＡＢ力価が観察された（Ｂｏｕｔｉｎら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１０、２１：７０４〜７１２）。ＡＡＶを用いたヒトの治療において、そのような低いエンデミックＮＡＢ力価は、形質導入に影響を及ぼし、重度に低下した導入遺伝子発現をもたらすとすでに報告された（Ｍａｎｎｏら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００６、１２（３）、３４２〜３４７）。したがって、当分野における一般的合意は、ＮＡＢ力価を有する患者を治療することを完全に回避することである。故に、既存の免疫に対する臨床における現在の実践は、万一患者がＡＡＶカプシドに対する中和抗体を有するのであれば、除外のためのヒト患者のスクリーニングを伴う（Ｂｒｉｍｂｌｅら、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１６、１６（１）：７９〜９２、及びＢｏｕｔｉｎら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１０、２１：７０４〜７１２）。最初の投与があり次第のＮＡｂの形成を低下させて２回目の投与を可能にするために、免疫抑制レジメンが試行されている（Ｃｏｒｔｉら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ−Ｍｅｔｈ  Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖ（２０１４）１、１４０３３；Ｍｉｎｇｏｚｚｉら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、第２０巻、第７号、１４１０〜１４１６；ＭｃＩｎｔｏｓｈら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ２０１２、１９、７８〜８５））。さらに、血漿交換及び免疫抑制レジメンの使用を含むストラテジーは、既存の抗体を克服することが示唆されている（例えば、Ｃｈｉｃｏｉｎｅら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１４、第２２巻、第２号、３３８〜３４７；Ｈｕｒｌｂｕｔら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１０、第１８巻、第１１号、１９８３〜１９８４、及びＭｉｎｇｏｚｚｉら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、第２０巻、第７号、１４１０〜１４１６）。これらのストラテジーは動物モデルにおいて試験されており、限定された成功を収めている。
【０００５】
したがって、ＡＡＶ中和抗体を有する又は有すると疑うことができるヒト患者において、ｒＡＡＶ遺伝子療法ベクターの投与を可能にする必要性が当技術分野に存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、特にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターに関して、現況技術における示唆とは対照的に、エンデミックな既存の抗ＡＡＶ５抗体（すなわち、エンデミックな曝露により生じる既存の抗ＡＡＶ５抗体）を有するヒト患者が、治療を受ける適格性があると考えられ得ることを今回驚くべきことに見い出した。この知見は、中和抗体の存在が、例えば臨床試験に参加する患者に対する、除外基準として考えられるべきであるという先行技術における意見（ｂｅｌｉｅｖｅ）とは対照的である。言い換えれば、現況技術における意見とは、ＡＡＶ５に対する抗体、より特にＡＡＶ５に対するエンデミックな既存の抗体を有する患者は、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた治療を受ける適格性がないと考えられていることである。エンデミックな既存の抗ＡＡＶ５抗体を有するヒト患者が治療を受ける適格性があると考えられ得るという本明細書において開示される驚くべき知見は、例えば非常に低レベルの既存の抗ＡＡＶ５抗体を有することが見い出されているヒト患者の部分集団に関係するだけでなく、むしろ、既存の抗ＡＡＶ５抗体に対して陽性のスコアを取る、及びいかなるＡＡＶ５遺伝子療法にもこれまで供されたことがないヒト集団のすべてではないとしてもほとんどの患者に本質的に関係することが見い出された。
【０００７】
したがって、一態様において、本発明は、ヒト患者の医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクターであって、前記ヒト患者は、抗ＡＡＶ５抗体を判定するアッセイを用いた事前スクリーニングに供されず、前記ヒトは、前記医学的治療の前にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療に供されていない、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを提供する。言い換えれば、ヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクターであって、抗ＡＡＶ５抗体状態は未知であり、前記ヒトは、前記医学的治療の前にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療に供されていない、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターが提供される。一態様によれば、本発明は、医学的治療、抗ＡＡＶ５抗体の存在についてのスクリーニングに先立って、それらなしで、それらの前に、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターで治療されていない患者を治療すること又は患者を臨床試験に含めることを可能にし得る。
【０００８】
さらなる態様において、ヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクターであって、前記ヒトは、抗ＡＡＶ５抗体を判定するアッセイを用いた事前スクリーニングに供され、前記ヒトは、前記医学的治療の前にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療に供されておらず、前記ヒトは、ヒト集団において観察される抗ＡＡＶ５抗体レベルの多くても１００番目のパーセンタイル、好ましくは多くても９５番目のパーセンタイルに相当する抗ＡＡＶ５抗体レベルを有する、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターが提供される。試験されるヒト患者は、抗ＡＡＶ５抗体に対して陽性であることが好ましい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】治療前サンプルのＮＡｂアッセイ結果である。Ａ：１０個の投薬前サンプル中和結果のグラフである。５０パーセントの印が点線として示されている。
【図１Ｂ】Ｂ：３つの陽性サンプル３、４、５の曲線フィッティング結果である。４パラメーター曲線を、非線形回帰によってフィットさせた。フィットした曲線が５０％の印を通過する理論的希釈として力価を算出した（横軸の上に示される）。
【図２Ａ】ＡＡＶ５中和抗体対全抗ＡＡＶ５抗体のグラフである。集団スクリーニング調査において報告された中和（ＮＡｂ）力価対全（ＴＡｂ）ＥＬＩＳＡ結果。各開いた記号は、１人の健常個体の対になったＮＡｂ及びＴＡｂ結果を表す。治療された患者のＮＡｂ及びＴＡｂ結果が重ね合わせて示されている（▲（黒三角）、指定される調査対象３、４、及び５を有する）。
【図２Ｂ】ＡＡＶ５  ＮＡｂ力価対ＦＩＸレベルのグラフである。投薬後のコホート１におけるＦＩＸ活性のパーセンテージが、投薬前のＮＡｂ力価に対してプロットされている。
【図３】ＡＡＶ  ＮＡｂ力価スケールの図である。ヒト集団（５０人の対象）のパーセンタイルが、ＡＡＶ５に対するＮＡｂ力価に関して描写されている。ヒト集団において観察されたＮＡｂ力価は、ＡＡＶ５で治療されたヒト患者において観察されたＮＡｂ力価からかなり離れていることに留意されたい。
【図４】野生型ＡＡＶ５のＶＰ１アミノ酸配列が描写されている。ＶＰ２（Ｔ、ＡＣＧ開始部位に起因して）及びＶＰ３（Ｍ）のアミノ酸スタート位置に下線が引かれている。
【図５】ＡＡＶ５由来ＶＰ２及びＶＰ３コード配列と連結したＮ末ＡＡＶ２由来ＶＰ１配列（下線が引かれている）からなる、ハイブリッドＶＰ１配列のＶＰ１アミノ酸配列が描写されている。故に、ＶＰ１タンパク質はハイブリッドＡＡＶ２／ＡＡＶ５カプシドタンパク質である。ハイブリッドＶＰ１をコードする、ＡＡＶカプシドに用いられた発現構築物は、ハイブリッドＶＰ２及びＶＰ３カプシドタンパク質ではなく野生型配列ＡＡＶ５  ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質であるＶＰ２及びＶＰ３配列もコードし得る。
【図６】野生型ＡＡＶ５配列の位置１と２の間にＡｌａの挿入を有する、野生型ＡＡＶ５のＶＰ１アミノ酸配列が示されている。したがって、ＶＰ１カプシドは、挿入されたアミノ酸を有するＡＡＶ５野生型配列からなり、コードされたＶＰ２及びＶＰ３タンパク質は、改変を有しない野生型ＡＡＶ５  ＶＰ２及びＶＰ３タンパク質である。
【００１０】
定義
「ＡＡＶベクター」とは、分子的方法を用いることによる野生型ＡＡＶに由来する組み換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを指す。ＡＡＶベクターは、ウイルスゲノムの少なくとも一部が、野生型ＡＡＶ核酸配列に対して非天然の核酸である導入遺伝子で置き換えられていることから、野生型（ｗｔ）ＡＡＶベクターとは区別される。
【００１１】
ＡＡＶカプシド及びＡＡＶゲノムＩＴＲの組み合わせを含むＡＡＶベクターは、参照により本明細書に組み入れられるＰａｎら（Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９９９）７３：３４１０〜３４１７）、Ｃｌａｒｋら（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９９）１０：１０３１〜１０３９）、Ｗａｎｇら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１１）８０７：３６１〜４０４）、及びＧｒｉｍｍ（Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００２）２８（２）：１４６〜１５７）に記載される、当技術分野において公知の方法を用いて産生され得る。代替的に、ＡＡＶベクターは、バキュロウイルス発現システム（ＢＥＶＳ）を用いて昆虫細胞において産生され得る。ｒＡＡＶの産生のための最初のバキュロウイルスシステムは、Ｕｒａｂｅら（Ｕｒａｂｅら［２００２］Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １３（１６）：１９３５〜１９４３）によって記載され、３種のバキュロウイルス、名前はＢａｃ−Ｒｅｐ、Ｂａｃ−ｃａｐ、及びＢａｃ−ｖｅｃからなり、昆虫細胞、例えばＳＦ９へのそれらバキュロウイルスの共感染はｒＡＡＶの作出をもたらした。そのような産生されたｒＡＡＶの特性、すなわち効力を含めた物理的及び分子的特徴は、哺乳類細胞において作出されるｒＡＡＶと大幅には異ならなかった（Ｕｒａｂｅ［２００２］、前出）。Ｕｒａｂｅ（２００２、前出）による最初のバキュロウイルスシステムは、さらに発展している（例えば、Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒら（２００５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２（６）：１２１７〜１２２５；Ｕｒａｂｅら（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ８０（４）：１８７４〜１８８５；国際公開第２００７／０４６７０３号；国際公開第２００７／１４８９７１号；国際公開第２００９／０１４４４５号、及び国際公開第２００９／１０４９６４号を参照されたい）。
【００１２】
「導入遺伝子」という用語は、ＡＡＶ核酸配列に対して非天然の核酸を指すために用いられる。前記用語は、細胞又は生物に導入され得るポリヌクレオチドを指すために用いられる。導入遺伝子には、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードする遺伝子、阻害性ポリヌクレオチドに転写されるポリヌクレオチド、又は転写されないポリヌクレオチド（例えば、転写を推進するプロモーターなどの発現制御要素を欠いている）など、任意のポリヌクレオチドが含まれる。導入遺伝子は、逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に挿入されることが好ましい。導入遺伝子は、コード配列及び３’終結配列に作動的に連結された、プロモーター又は転写調節配列などの発現調節要素を含む発現構築物でもよい。
【００１３】
「形質導入」とは、ウイルスベクターによる、レシピエント宿主細胞への導入遺伝子の移入を指す。本発明のｒＡＡＶベクターによる標的細胞の形質導入は、そのベクターに含有される導入遺伝子の、形質導入された細胞への移入につながる。「宿主細胞」又は「標的細胞」とは、例えば個体の滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）又は滑膜細胞（ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｃｅｌｌ）など、ＤＮＡ送達が生じる細胞を指す。ＡＡＶベクターは、分裂及び非分裂細胞の両方に形質導入し得る。
【００１４】
「遺伝子」又は「コード配列」とは、特定のタンパク質を「コードする」ＤＮＡ又はＲＮＡ領域を指す。コード配列は、プロモーターなどの適当な調節領域の制御下に置かれた場合、転写され（ＤＮＡ）及びポリペプチドに翻訳される（ＲＮＡ）。遺伝子は、プロモーター、５’リーダー配列、イントロン、コード配列、及び３’非翻訳配列などのいくつかの作動的に連結されたフラグメントを含んでもよく、ポリアデニル化部位又はシグナル配列を含む。キメラ又は組み換え遺伝子とは、例えば転写されるＤＮＡ領域の一部又はすべてとプロモーターが天然には結び付いていない遺伝子など、天然において通常では見い出されない遺伝子である。「遺伝子の発現」とは、遺伝子がＲＮＡに転写される及び／又は活性タンパク質に翻訳される過程を指す。
【００１５】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じて、グローバルな又はローカルなアライメントアルゴリズムを用いた２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列のアライメントによって決定され得る。同程度の長さの配列は、配列を長さ全体にわたって最適にアラインするグローバルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ）を用いてアラインされることが好ましく、一方で実質的に異なる長さの配列は、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を用いてアラインされることが好ましい。その後、配列が配列同一性の少なくともある特定の最低限のパーセンテージ（下で規定される）を共有する場合（例えば、デフォルトパラメーターを用いたＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムによって最適にアラインされた場合）、配列は「実質的に同一の」又は「本質的に類似の」と称されてもよい。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを用いて２つの配列を２つの配列の長さ全体（全長）にわたってアラインし、合致の数を最大限に高め且つギャップの数を最小限に抑える。２つの配列が同程度の長さを有する場合、グローバルアライメントを適切に用いて配列同一性を決定する。一般的に、ギャップ創出ペナルティ＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップ伸長ペナルティ＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）を有するＧＡＰデフォルトパラメーターが用いられる。ヌクレオチドに関して、用いられるデフォルトスコア行列はｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質に関して、デフォルトスコア行列はＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ  ８９、９１５〜９１９）。Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３などのコンピュータープログラムを用いて、又は上記ＧＡＰに対してと同じパラメーターを用いた若しくはデフォルト設定（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方に関して、並びにタンパク質及びＤＮＡアライメントの両方に関して、デフォルトギャップ開始ペナルティは１０．０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティは０．５であり；デフォルトスコア行列は、タンパク質に関してＢｌｏｓｕｍ６２であり、ＤＮＡに関してＤＮＡＦｕｌｌである）を用いた、ＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０における「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いる）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いる）プログラムなどのオープンソースソフトウェアを用いて、配列同一性パーセンテージに対する配列アライメント及びスコアを決定することができる。配列が、実質的に異なる全体的長さを有する場合、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いるものなど、ローカルアライメントが好ましい。代替的に、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを用いた公共データベースに対して検索することによって、類似性又は同一性パーセ��テージを決定することができる。
【００１６】
本明細書において使用するとき、「遺伝子療法」とは、疾患を治療するための、個体の細胞及び／又は組織への核酸配列（例えば、本明細書において規定される導入遺伝子）の挿入である。導入遺伝子は、欠陥のあるアレルを置き換える又は補充する機能的変異アレルであり得る。遺伝子療法には、天然では阻害性である、すなわち、望ましくない又は異常な（例えば、病原性の）遺伝子又はタンパク質など、内因性の遺伝子又はタンパク質の発現、活性、又は機能を阻害する、減少させる、又は低下させる導入遺伝子の挿入も含まれる。そのような導入遺伝子は外因性であってもよい。外因性の分子又は配列は、治療される対象となる細胞、組織、及び／又は個体に通常では存在しない分子又は配列であると理解される。後天性及び先天性の疾患の両方とも、遺伝子療法に適している。故に、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターとは、遺伝子療法における使用のためのＡＡＶ５ベクターを指す。
【００１７】
この文書において及びこの文書の特許請求の範囲において、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という動詞及びその活用は、前記単語に続く項目は含まれるが、具体的に挙げられていない項目が除外されるわけではないことを意味する前記単語の非限定的な意味で用いられる。
【００１８】
加えて、「ａ」又は「ａｎ」という不定冠詞による要素への言及は、１つ及び１つのみの要素があることを文脈がはっきりと要していない限り、１つを上回る数の要素が存在する可能性を除外するわけではない。故に、「ａ」又は「ａｎ」という不定冠詞は、「少なくとも１つ」を通常では意味する。
【００１９】
「およそ」又は「約」という単語は、数値と関連して用いられる場合（およそ１０、約１０）、値が、所与の値１０からその値より１０％大きい又は小さい値であってもよいことを意味することが好ましい。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
述べられているように、特にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターに関して、エンデミックな既存の抗ＡＡＶ５抗体を有するヒト患者が、治療を受ける適格性があると考えられ得ることが驚くべきことに見い出された。この知見は、特定の血清型に対する既存の抗ＡＡＶ抗体の存在が、前記血清型を用いた遺伝子療法治療を不可能にするであろうという一般的意見とは対照的である。理論によって拘束されることなく、ＡＡＶ５は、エンデミックな既存の抗ＡＡＶ５抗体力価が、抗ＡＡＶ５抗体がヒト集団において見い出されるように、他の血清型と比較して相対的に低い血清型であることがある。この原因は、血清間で異なることがある及び／又はヘルパーウイルスの共感染があってもなくてもよい感染の経路であることがある。さらに、ＡＡＶ５は、他の霊長類ＡＡＶ血清型と最も相違しており且つそれと系統発生学的に分離しており、このことも相対的に低い力価に寄与していることがある。本発明の根源にあるものにかかわらず、他のＡＡＶ血清型と相違していることは、ヒト集団のすべてではないとしてもほとんどの人が、ＡＡＶ５血清型に基づく遺伝子療法又は同様のものを用いた治療を受ける適格性があることを可能にする。これらの人には、抗ＡＡＶ５抗体に対して陰性であるヒト集団の部分集合、及び抗ＡＡＶ５抗体に対して陽性であると見い出されたヒト集団の部分集合も含まれ、ＡＡＶ５遺伝子療法治療又は同様のものに供されているヒト集団の（現在のところ）非常に少数の部分集合は含まれない。ＡＡＶ５遺伝子療法治療に供されているヒト集団では、これらヒト集団がＡＡＶ５遺伝子療法ベクター又は同様のものを用いた治療を受ける適格性がないと思われるような高力価の抗ＡＡＶ５抗体が観察される（エンデミックにＡＡＶ５に感染したヒトと比較して約１０４又はそれを上回る）。
【００２１】
したがって、本発明の第１の態様において、ヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクターであって、前記ヒトは、抗ＡＡＶ５抗体を判定するアッセイを用いた事前スクリーニングに供されず、前記ヒトは、前記医学的治療の前にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療に供されていない、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターが提供される。
【００２２】
ＡＡＶ５及び他のＡＡＶ血清型の完全ゲノムはシークエンスされており（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、１９９９、Ｊ．ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第７３巻、第２号、１３０９〜１３１９ページ）、ヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋで入手可能である（アクセッション番号ＡＦ０８５７１６；２０１５年２月２３日）。野生型ＡＡＶ５に基づく遺伝子療法ベクターは、野生型ＡＡＶ５アミノ酸配列に相当する又は少なくとも実質的に同一であるＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３カプシドタンパク質を含む少なくともＡＡＶ５カプシドタンパク質を含むと理解される。野生型ＡＡＶ５と実質的に同一であることは、野生型ＡＡＶ５と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有することを含む。配列同一性が決定され得る対象となるＡＡＶ５カプシドＶＰ１タンパク質配列が、図４に示されている。そのような配列は、ＡＡＶ５クレードにおける系統発生学的視点から外れるＡＡＶウイルスの天然に存在する配列であり得る（例えば、図４に描写される）。
【００２３】
「血清型」とは、別のウイルスと比較して、１つのウイルスに対する抗体間での交差反応性の欠如に基づいて伝統的に定義される。そのような交差反応性の違いは、通常、カプシドタンパク質配列／抗原決定基の違いに起因する（例えば、ＡＡＶ血清型のＶＰ１、ＶＰ２、及び／又はＶＰ３配列の違いに起因する）。伝統的な定義の下で、血清型とは、すべての存在し、中和活性について特徴付けされた血清型に特異的な血清に対して関心対象のウイルスが試験されており、関心対象のウイルスを中和する抗体が見い出されていないことを意味する。より多くの天然に存在するウイルス分離株が発見され、カプシド変異体が作出されているように、現在存在する血清型のいずれかと血清学的な違いがあってもなくてもよい。便宜上、ＡＡＶ５血清型には、ＡＡＶ５血清型の部分群又はバリアントも構成することがある、はっきりと異なる血清型であるとは特徴付けされていないカプシド配列改変を有するＡＡＶが含まれる。そのようなバリアントは、実質的な配列同一性を一般的に有する。
【００２４】
非天然のカプシド配列も、本発明に従って企図することができ、例えば血清に曝露された（外界に曝露された）アミノ酸配列は１つの血清型に由来してもよく、一方でカプシド内の曝露されていないアミノ酸配列は他の血清型由来であってもよく及び／又はより多くの変形を許してもよい。ＡＡＶ５の結晶構造は公知であるように（例えば、Ｇｏｖｉｎｄａｓａｍｙら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２０１３年１０月、第８７巻、第２０号；１１１８７〜１１１９９）、曝露されていない、及び例えばＡＡＶ５カプシドの内部にある配列は、他の血清型由来の配列と交換されてもよく及び／又はより多くの配列変形を許してもよい。例えば、ＶＰ２及びＶＰ３に含有されないＶＰ１アミノ酸配列は内部に配置される。この配列は例えば血清型２由来であってもよく、一方でＶＰ２及びＶＰ３アミノ酸配列は全面的にＡＡＶ５に基づいてもよい（例えば、図５を参照されたい）。そのようなＡＡＶ５遺伝子療法ベクターカプシドは、完全な野生型カプシドと区別できない血清型像及び中和抗体像である（とりわけ、国際公開第２００００２８００４号、及びＵｒａｂｅら、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ、２００６年２月、第８０巻、第４号、１８７４〜１８８５ページを参照されたい）。そのような非天然のカプシド配列はハイブリッド配列であり、そのようなハイブリッドベクターは、本発明に従ったＡＡＶ５遺伝子療法ベクターであるとも理解される。さらに、ＡＡＶ５カプシド配列は、とりわけ国際公開第２０１５１３７８０２号に記載されるもの、及び例えば図６に示されるものなど、ベクターの製造及び／又は効力を増強するように挿入された又は置き換えられた１つ又は複数のアミノ酸も有することができる。そのようなわずかに改変されたＡＡＶ５カプシドも、ＡＡＶ５血清型のものであると考えられてもよい。
【００２５】
本発明に従ったＡＡＶ５ベクター又はＡＡＶ５遺伝子療法ベクターは、ＡＡＶ５  ＩＴＲであってもよいが必ずしもそうでなくてもよいＡＡＶ逆位反復の間に含まれる関心対象の遺伝子を有するベクターゲノムを包含するＡＡＶ５ベクターカプシドに関すると理解される。それ故、本発明に従ったＡＡＶ５ベクターは、ビヒクルの搭載物である、導入遺伝子、例えばヒトにとって有益であろう導入遺伝子を有するベクターゲノムを、ビヒクルの標的細胞に、例えば肝臓細胞又は心筋細胞に送達し得る送達ビヒクルである。したがって、ＡＡＶ５ベクターは、ヒト、例えば導入遺伝子の送達により改善されることがある疾患に罹患しているヒトの医学的治療において役立つと考えられ得る。実施例において示されるように、導入遺伝子はＦＩＸ、又はパドゥア（Ｐａｄｕａ）変異体など、そのバリアントであり得るが、導入遺伝子は決して限定的ではなく、本明細書において記載されるようにさらなる導入遺伝子を本発明において企図することができる。また、１つのさらなる実施形態において、ヒト患者は男性ヒト患者であってもよい。
【００２６】
別の実施形態において、ヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクターであって、抗ＡＡＶ５抗体状態は未知であり（例えば、判定されていない）、前記ヒトは、前記医学的治療の前にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療に供されていない、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターが提供される。述べられているように、そのような患者におけるＡＡＶ５に対する抗体の存在について試験する必要はなくてもよい。実施例の節において示されるように、ヒト集団の約３０％は、血清におけるＴＡｂ又はＮＡｂの存在に対して陽性であることが示されている。血清におけるＴＡｂ又はＮＡｂについて試験する必要はなくてもよいため、治療を受ける適格性がある集団サイズは大幅に増加し、さらには、治療が始まり得る前にＮＡｂ又はＴＡｂアッセイを実施する必要はないため、集団サイズの大幅な増加は、適格性がある患者の治療及び選択をより簡便にする。必要とされることがあるのは、ヒト患者が以前にＡＡＶ５遺伝子療法治療に供されたことがあるかどうかを知ることがすべてである。ＡＡＶ遺伝子療法治療による先行治療は、ＡＡＶ５だけに制限されなくてもよく、他の血清型、例えば血清型８を用いた治療も含んでもよいことを企図することができる。そのような対象に関しては、ＮＡｂ若しくはＴＡｂアッセイを含めて又は実施例の節に記載されるように試験して、血清におけるＮＡｂ又はＴＡｂ力価が、ナイーブの治療されていないヒト患者において観察される範囲内にとどまっていることを確認することが企図されてもよい。
【００２７】
別の実施形態において、ヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクターであって、前記ヒトは、抗ＡＡＶ５抗体を判定するアッセイを用いた事前スクリーニングに供され、前記ヒトは、前記医学的治療の前にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療に供されておらず、前記ヒトは、ヒト集団において観察される抗ＡＡＶ５抗体レベルの多くても９５番目のパーセンタイルに相当する抗ＡＡＶ５抗体レベルを有する、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターが提供される。この実施形態において、遺伝子療法治療から恩恵を受けることができるヒト患者は、抗ＡＡＶ５抗体アッセイを用いて事前スクリーニングされる。実施例の節において示されるように、ヒト集団において観察される抗ＡＡＶ５抗体のレベルの範囲、すなわち観察される抗ＡＡＶ５抗体レベルの範囲は、約０〜、又は約１〜約１０，０００である。
【００２８】
本明細書におけるｎ番目のパーセンタイルとは、例えば実施例において記載されるものなどのＮＡｂアッセイ又はＴＡｂアッセイを用いて判定される抗ＡＡＶ５抗体レベルを有する、０％〜ｎ％の分布の範囲内にあるヒト集団の割合ｎ％として典型的には定義される。例えば、集団におけるヒト患者（ＡＡＶ５ベクターを用いて以前に治療されていない）が、実施例において記載されるＮＡｂアッセイを用いて判定される抗ＡＡＶ５抗体レベルを有する場合、ヒト集団の最高で約１００％が含まれるであろうと概算されることから、集団全体において検出される抗ＡＡＶ５抗体レベルは多くても１０，０００であろう。多くても４，５００という実施例において記載されるアッセイを用いて判定されるＮＡｂレベルに相当する、最高で９５番目のパーセンタイルの抗ＡＡＶ５抗体レベルを有する場合、ヒト患者を治療することが好ましいことがある。多くても３，０００又は１，０００という実施例において記載されるアッセイを用いて判定されるＮＡｂレベルにそれぞれ相当する、最高で９３番目のパーセンタイル又は９０番目のパーセンタイルの抗ＡＡＶ５抗体レベルを有する場合、ヒト患者を治療することが好ましいことがある（図３を参照されたい）。別の実施形態に従って、最高で９９番目、９８番目、９７番目、９６番目、９５番目、９４番目、９３番目、９２番目、９１番目、９０番目、８０番目、又は７０番目のパーセンタイルの抗ＡＡＶ５抗体レベルを有する場合、ヒト患者を治療することが好ましいことがある。それにもかかわらず、すべてではないとしても集団のほとんどは、抗ＡＡＶ５抗体力価にかかわらず治療を受ける適格性があると期待することができる。実施例の節において示されるように、任意の抗ＡＡＶ５抗体アッセイで十分であり、すなわちＮＡｂアッセイ又はＴＡｂアッセイ又は同様のもののいずれかを利用して、ヒト集団の抗体力価を判定して、９５番目のパーセンタイル、９３番目のパーセンタイル、又は９０番目のパーセンタイルを判定することができる。選択されるヒト集団は同じままであるが、一方で力価の実際の値は様々に変わることがある（実施例のＮＡｂアッセイに対して最高で１０，０００、又はＴＡｂアッセイに対して最高で５）。この理由は、観察される力価の値が、集団において力価を大局的に見た場合に、単に関連性を有するだけ数であるためである。いずれの場合でも、集団において判定される抗ＡＡＶ５抗体力価レベルは、実施例の節において記載される少なくとも５０人のヒト集団に関すると理解される。
【００２９】
したがって、さらなる実施形態において、ヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクターであって、前記ヒトは、抗ＡＡＶ５抗体を判定するアッセイを用いた事前スクリーニングに供され、前記ヒトは、前記医学的治療の前にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療に供されておらず、前記ヒトは、ヒト集団において観察される抗ＡＡＶ５抗体レベルの多くても９５番目のパーセンタイルに相当する、実施例において記載されるＮＡｂ  ＥＬＩＳＡアッセイで判定される抗ＡＡＶ５抗体レベルを有する、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターが提供される。別の実施形態に従って、最高で９９番目、９８番目、９７番目、９６番目、９５番目、９４番目、９３番目、９２番目、９１番目、９０番目、８０番目、又は７０番目のパーセンタイルの抗ＡＡＶ５抗体レベルを有する場合、ヒト患者を治療することが好ましいことがある。
【００３０】
本発明に従って、ＡＡＶ５を用いた治療を受ける適格性がないと以前は考えられてきたであろうヒト集団の部分集団は、今では、抗ＡＡＶ５抗体アッセイにおいて陽性の試験結果を示すにもかかわらず、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた治療を受ける適格性があると今では考えられると理解される。したがって、さらなる実施形態において、ヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクターであって、前記ヒトは、抗ＡＡＶ５抗体に対して陽性の試験結果を示し、前記ヒトは、ＡＡＶ５又は同様のものを用いて以前に治療されていない、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターが提供される。
【００３１】
異なる実施形態において、エンデミックな治療されていないヒト集団におけるＡＡＶ５抗体レベルは効率的なＡＡＶ５遺伝子療法治療を可能にすることが本実施形態において示されているように、本発明は、ＡＡＶ遺伝子療法治療、すなわちＡＡＶ５に供されているヒト患者の治療も可能にすることがある。例えば、血中の抗体のレベルを低下させ得、それによって抗ＡＡＶ５抗体のレベルも低下させる手段及び方法は、当技術分野において公知である。抗体を血液から除去する、血液のそのような体外処理を採用して、血中の抗ＡＡＶ５抗体力価を低下させて、エンデミックな曝露により観察される、すなわちエンデミックな治療されていないヒト集団において観察されるのと同じレベルを達成し得る。そのような方法は当技術分野において公知であり、例えばプラズマフェレーシス（Ｃｈｉｃｏｉｎｅら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１４、第２２巻、第２号、３３８〜３４７）を含み得る。したがって、抗ＡＡＶ５抗体を含めた、血中の抗体を下げるために採用され得る任意の方法を本発明において利用して、ヒト患者がＡＡＶ５に基づく遺伝子療法治療に以前に供されたために治療を受ける適格性が以前はなかったヒト患者が、エンデミックなヒト集団において観察される抗ＡＡＶ５抗体力価を獲得し、ＡＡＶ５に基づく遺伝子療法に供され得るような程度まで、抗ＡＡＶ５抗体力価を低下させることができる。
【００３２】
本発明の別の態様において、上で記載されるＡＡＶ５遺伝子療法ベクターは、少なくとも１０１１個カプシド／ｋｇ体重に相当する投薬量で投与される。本発明者らが抗ＡＡＶ５抗体の存在に関して行った観察結果は用量依存的であることがあると理解される。言い換えれば、用いられる投薬量で、抗ＡＡＶ５抗体の濃度及び／又は量は形質導入を損なうわけではない。例えば導入遺伝子発現の意味のあるレベルを獲得するために、治療においてヒト患者に投与されるＡＡＶ５遺伝子療法ベクターの量は、血中に存在する抗ＡＡＶ５抗体をはるかに超えている。この視点から、上限はないと考えてもよい。それにもかかわらず、考えることができる上限は、多くても１０１６個カプシド／ｋｇ体重に相当する投薬量にある。投薬量は、患者あたりの投薬量、又は血液容積あたりの投薬量で設定されてもよいと理解される。少なくとも１０１２個カプシド／ｋｇ体重の投薬量は、約８５ｋｇの平均体重及び５Ｌの平均血液容積に基づき、患者あたり約１０１４個カプシド又は約１０１３個カプシド／患者の血液容積Ｌに変換される。したがって、どんな用量域が企図されたとしても、これらの用量域を、これらのパラメーターに基づいて容易に再計算することができる。投薬量は、少なくとも１×１０１２個カプシド／ｋｇ体重、少なくとも５×１０１２個カプシド／ｋｇ体重、又は少なくとも１×１０１３個カプシド／ｋｇ体重に相当することが好ましい。実施例の節において用いられる投薬量は、約５×１０１３個カプシド／ｋｇ体重及び約２×１０１４個カプシド／ｋｇ体重のものである。ＡＡＶカプシド粒子力価のＡＡＶ定量は容易に判定され、当技術分野において周知である（とりわけ、Ｋｏｈｌｂｒｅｎｎｅｒら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈ．２０１２年６月、第２３巻、第３号：１９８〜２０３；Ｇｒｉｍｍら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、第６巻、第７号、１３２２〜１３３０ページ、１９９９）。
【００３３】
選択される投薬量は、ゲノムコピーにも基づいてもよい。ゲノムコピーとは、ＡＡＶ５調製物に含有されるベクターゲノムの量を意味する。ＡＡＶ５ベクター調製物のｇｃ力価は、ベクターゲノム配列を定量するｑＰＣＲを用いることによって容易に判定され得る。ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターは、少なくとも５×１０１１ｇｃ／ｋｇ体重に相当する投薬量で使用されることが好ましい。少なくとも５×１０１１個カプシド／ｋｇ体重の投薬量は、約８５ｋｇの平均体重及び５Ｌの平均血液容積に基づき、患者あたり約５×１０１２ｇｃ又は約１０１２ｇｃ／患者の血液容積Ｌに変換される。したがって、どんな用量域が企図されたとしても、これらの用量域を、これらのパラメーターに基づいて容易に再計算することができる。選択される投薬量は、少なくとも１×１０１２ｇｃ／ｋｇ体重、少なくとも２×１０１２ｇｃ／ｋｇ体重、又は４×１０１２ｇｃ／ｋｇ体重であってもよい。実施例の節において用いられる投薬量は、約５×１０１２ｇｃ／ｋｇ体重及び約２×１０１３ｇｃ／ｋｇ体重のものである。上限はなくてもよいが、上限は、多くても１０１５ｇｃ／ｋｇ体重に相当する投薬量に相当するように設定されてもよい。
【００３４】
述べられているように、本発明に従ったＡＡＶ５遺伝子療法ベクターは、医学的治療における使用のためのものである。本発明に従ったＡＡＶウイルスベクターに含有される導入遺伝子は、本発明の限定でなくてもよい。それにもかかわらず、好ましくは及び実施例に従って、治療用遺伝子は、Ｎａｔｈｗａｎｉら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１１；３６５（２５）：２３５７〜６５、及びＮａｔｈｗａｎｉら、Ｂ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１４；３７１（２１）：１９９４〜２００に記載されるように、ヒト第ＩＸ因子をコードし、参照により文献全体として本明細書に組み入れられる国際公開第２０１００２９１７８号、国際公開第１９９９００３４９６号、国際公開第２０１５０８６４０６号、及び国際公開第２０１００１２４５１号に記載されるものなど、ヒト第ＩＸ因子のバリアントを含んでもよい。特に、治療上意味のある量のタンパク質は、ヒト患者においてＦＩＸコードＡＡＶ５ベクターを用いて獲得され得ることが実施例の節において示されている。そのようなタンパク質は、例えば血友病Ａ又は血友病Ｂの治療において、有用であることがある。
【００３５】
したがって、本発明に従ったヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクターであって、前記ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターは血友病Ｂの治療において用いられ、血漿において獲得されるトランスジェニックＦＩＸタンパク質の量は、約０．０２マイクログラム／ｍｌ〜最高で約５ｕｇ／ｍｌの範囲内にあり得る。代替的に、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターは、重度の表現型を有する血友病Ｂ患者の治療において用いられる場合、治療後に、中程度若しくは軽度の表現型、又は健常個体において観察される表現型さえ獲得する。血友病Ｂは３つのクラスに分類され得、クラスのそれぞれは、異なる血漿濃度のＦＩＸの存在によって特徴付けされている。重度の血友病Ｂにおいて、ＦＩＸ活性の血漿レベルは正常の１％を下回り；中程度の形態において、レベルは１％〜５％であり；軽度の形態において、正常レベルの５〜２５％である。正常の２５％〜５０％という中間のＦＩＸ活性レベルを有する健常なキャリア個体が存在するが、多くのキャリアは５０％をさらに超えるレベルを有し得る。
【００３６】
同様に、関心対象の他の遺伝子の治療上有効量は、当業者の十分に手の届く範囲内にあると予想され得る。したがって、本発明は、任意の導入遺伝子に関して有用であると期待される。遺伝子療法のためのウイルスベクターにおける、患者への送達のためのさらなる適切な導入遺伝子は、当業者によって選択されてもよい。これらの治療用核酸配列は、患者におけるインビボ又はエクスビボでの投与及び発現のための産物（例えば、タンパク質又はＲＮＡ）を典型的にはコードして、例えば欠損を置き換える若しくは補正することによって遺伝性若しくは非遺伝性の遺伝子欠陥を治療する、エピジェネティック障害若しくは疾患を治療する、又は遺伝子産物の調節異常に伴う病状を治療する。遺伝子療法の遂行に望ましいそのような治療用遺伝子には、限定されることなく、家族性高コレステロール血症又は家族性複合型高脂血症の治療のための超低密度リポタンパク質受容体遺伝子（ＶＬＤＬ−Ｒ）、嚢胞性線維症の治療のための嚢胞性線維症膜貫通調節因子遺伝子（ＣＦＴＲ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療のためのＤＭＤベッカーアレル、及び特定の障害又は疾患を治療するために当業者が容易に選択することができるいくつかの他の遺伝子が含まれる。好ましい実施形態において、ｒＡＡＶベクターは、治療用タンパク質、又はｍｉＲＮＡなどのＲＮＡをコードする導入遺伝子を含む。治療用タンパク質は、第ＩＸ因子（好ましくはヒト第ＩＸ因子）、第ＶＩＩＩ因子（好ましくはヒト第ＶＩＩＩ因子）、リポタンパク質リパーゼ（ＬＰＬ；例えばＬＰＬＳ４４７Ｘなどの変異体を含む；国際公開第０１／００２２０  Ａ２号を参照されたい）、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ（ＰＢＧＤ）、超低密度リポタンパク質受容体（ＶＬＤＬ−Ｒ）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）ベッカーアレル、高シュウ酸尿症（ｈｙｐｏｘｙｌｕｒｉａ）（ＡＧＸＴ）、Ｎ−アセチル−α−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮａＧｌｕ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、Ｓ１００Ａ１（Ｓ１００カルシウム結合タンパク質Ａ１としても知られる、ヒトではＳ１００Ａ１遺伝子によってコードされる）からなる群から選択されることが好ましい。好ましい実施形態において、治療用タンパク質は第ＩＸ因子であり、ヒト第ＩＸ因子であることがより好ましい。
【００３７】
代替的に、又は前述の実施形態のいずれか１つと組み合わせて、好ましい実施形態において、遺伝子療法は、生命を脅かす、慢性的に消耗性である、及び／又は治療が不十分である、集団のわずかな割合、例えば集団の１，５００人中１人よりも少ない割合に影響を及ぼす希少疾患であると本明細書において理解される、病状又は疾患、好ましくはいわゆる奇病を治療する、予防する、治癒する、及び／又は元に戻すためのものである。一般的に、奇病は遺伝子疾患であり、したがって、たとえ症状が直ちに現れないとしても、生涯にわたる疾患である。好ましい実施形態において、そのような病状又は疾患は、リポタンパク質リパーゼ欠損症（ＬＰＬＤ）、血友病Ｂ、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、サンフィリポＢ症候群、パーキンソン病（ＰＤ）、鬱血性心不全（ＣＨＦ）、血友病Ａ、ハンチントン病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、レーバー先天性黒内障、Ｘ連鎖重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、アデノシンデアミナーゼ欠損重症複合免疫不全症（ＡＤＡ−ＳＣＩＤ）、副腎白質ジストロフィー、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、多発性骨髄腫、嚢胞性線維症、鎌状赤血球症、高リポタンパク血症Ｉ型、サラセミア、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、てんかん、フリードライヒ運動失調症、ファンコーニ貧血、バッテン病、ウェット型ＡＭＤ、α−アンチトリプシン−１、ポンペ病、ＳＭＡ−１、薬剤耐性非小細胞肺癌、ＧＭ１ガングリオシド−シス、網膜色素変性症、ホモ接合性家族性高コレステロール血症、リソソーム蓄積症、銅又は鉄蓄積障害（例えば、ウィルソン病又はメンケス病）、リソソーム酸性リパーゼ欠損症、高シュウ酸尿症、ゴーシェ病、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、グリコーゲン蓄積症、及び網膜変性疾患（ＲＰＥ６５欠損症、コロイデレミアなど）からなる群から選択される。
【００３８】
さらなる実施形態において、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターは、本発明に従ったヒトの医学的治療における使用のためのものであり、前記使用は、血流への投与、例えば血流へのＡＡＶ５遺伝子療法ベクターの投与を含む。血液は抗ＡＡＶ５抗体を含有し得、特に血流を介した、例えば血管内注入又は注射を介した送達経路が企図される。血流を介した送達は、標的組織へのＡＡＶ５ベクターの送達を可能にする。標的組織へのそのような送達は、全身送達によって生じてもよい。本発明は、血流への投与に限定されるわけではない。実際、企図することができる従来的で薬学的に許容できる投与の経路には、標的臓器、組織、又は部位（例えば、肝臓又はＣＮＳ）への直接送達、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、経口、及び他の非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）の投与の経路が含まれる。しかしながら、企図することができる好ましい標的組織は肝臓である。したがって、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターは、血流を介した投与経路によりベクターの導入遺伝子を肝臓に送達することが最も好ましい。述べられているように、ＡＡＶ５ウイルスベクターを十分な量で投与して、所望の細胞にトランスフェクトし且つ選択された導入遺伝子の十分なレベルの形質導入及び発現を提供して、医学の技術分野における当業者によって判定され得る過度の逆効果なしに又は医学的に許容できる生理学的効果を有して、治療的有益性を提供する。必要に応じて、投与の経路も組み合わされてもよい。ｒＡＡＶベクター（すなわち、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクター）の投薬量は、治療されている病状、選択された遺伝子、患者の年齢、重量、及び健康状態などの因子に主に依存すると考えられ、故に、患者間で様々に変わることがある。
【００３９】
本発明に従ったヒトの医学的治療における使用のためのＡＡＶ５遺伝子療法ベクターは、昆虫細胞において産生されたＡＡＶ５遺伝子療法ベクターであることが好ましい。理論によって拘束されることなく、ＡＡＶカプシドは、昆虫細胞において産生される場合、哺乳類細胞において産生されるＡＡＶカプシドとは異なることがあるため、産生の方法は、ＡＡＶベクターと関連した免疫プロファイルにおいて役割を果たすことがある。この違いは、グリコシル化又は他の翻訳後修飾に関するものであることがある。さらに、哺乳類細胞に基づく製造は、ｒｅｐ及びｃａｐ発現構築物が、患者に投与されるＡＡＶカプシドに含有されており、ｒｅｐ及びｃａｐ発現構築物の、ごく少量ではあるがヒト対象への移入をもたらすというマイナス面を有することがある。ヒト患者におけるＡＡＶ  ｒｅｐ及びｃａｐの発現は、特に抗ＡＡＶ５抗体に対して陽性の試験結果を示すであろうヒト患者の場合に、免疫の視点から有害であることがある。したがって、ヒト患者に投与されるべきＡＡＶ５ウイルスベクターは昆虫細胞において産生されることが好ましいことがある。昆虫細胞に基づく製造は十分に確立されており、参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２００７０４６７０３号、国際公開第２００７１４８９７１号、国際公開第２００９０１４４４５号、国際公開第２００９１０４９６４号、国際公開第０３０４２３６１号、国際公開第２００８０２４９９８号、国際公開第２０１０１１４９４８号に記載される手段及び方法を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００４０】
別の実施形態において、
ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療を受ける適格性があるヒト患者を判定するための方法であって、
ヒト患者由来の血清サンプルを用意するステップ、
抗ＡＡＶ５抗体力価を判定するステップ、
全抗ＡＡＶ５抗体力価が、実施例において記載される全抗ＡＡＶ５抗体（ＴＡｂ）アッセイを用いて判定される０．０２〜５の範囲内の値を有する場合、患者は医学的治療を受ける適格性があると考えられ得るステップ
を含む方法が提供される。
【００４１】
任意選択で、この方法は、続いて
適格性があるヒト患者にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを投与するステップ
を含む。
【００４２】
ＡＡＶ５遺伝子療法因子の医学的使用に関連した実施形態に関して上で記載される境界（ｍｅｅｔ）及び限界のいずれかは、例えばＡＡＶ５遺伝子療法ベクターの送達の方法のための又は適格性の判定のための、本明細書において記載される方法のいずれかにも適用されると理解される。全抗ＡＡＶ５抗体力価は、実施例において記載される全抗ＡＡＶ５抗体（ＴＡｂ）を用いて判定される０．０２〜４、０．０２〜３、又は０．０２〜２の範囲内の値を有することが好ましい。
【００４３】
別の実施形態において、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療を受ける適格性があるヒト患者を判定するための方法は、
ヒト患者由来の血清サンプルを用意するステップ、
抗ＡＡＶ５抗体力価を判定するステップ、
中和抗ＡＡＶ５抗体力価が、実施例において記載される中和抗ＡＡＶ５抗体（ＮＡｂ）アッセイを用いて判定される３〜１０，０００の範囲内の値を有する場合、患者は医学的治療を受ける適格性があると考えられ得るステップ
を含む。
【００４４】
任意選択で、この方法は、続いて
適格性があるヒト患者にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを投与するステップ
を含む。
【００４５】
抗ＡＡＶ５抗体力価は、実施例において記載される中和抗ＡＡＶ５抗体（ＮＡｂ）を用いて判定される３〜５，０００、３〜３，０００、又は３〜１，０００の範囲内の値を有することが好ましい。
【００４６】
上で記載される適格性尺度（ｃｒｉｔｅｒｉｕｍ）は、ＡＡＶ５遺伝子療法治療を選択するために用いられ得る唯一の尺度ではないと理解される。したがって、ヒト患者が他のすべての基準を満たす場合、抗ＡＡＶ５抗体尺度によりヒト患者の適格性が判定される。
別の実施形態において、有効量のＡＡＶ５遺伝子療法ベクターをそれを必要とするヒトに投与するステップを含む、ヒトを治療する方法であって、
前記ヒトは、抗ＡＡＶ５抗体を判定するアッセイを用いた事前スクリーニングに供されず、
前記ヒトは、前記医学的治療の前にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療に供されていない、方法が提供される。
【００４７】
なおさらなる実施形態において、有効量のＡＡＶ５遺伝子療法ベクターをそれを必要とするヒトに投与するステップを含む、ヒトを治療する方法であって、
前記ヒトは、抗ＡＡＶ５抗体を判定するアッセイを用いた事前スクリーニングに供され、
前記ヒトは、前記医学的治療の前にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療に供されておらず、
前記ヒトは、ヒト集団において観察される抗ＡＡＶ５抗体レベルの多くても９５番目のパーセンタイルに相当する抗ＡＡＶ５抗体レベルを有する、方法が提供される。
【００４８】
別のさらなる実施形態において、有効量のＡＡＶ５遺伝子療法ベクターをそれを必要とするヒトに投与するステップを含む、ヒトに遺伝子を送達する方法であって、
前記ヒトは、抗ＡＡＶ５抗体を判定するアッセイを用いた事前スクリーニングに供され、
前記ヒトは、前記医学的治療の前にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療に供されておらず、
前記ヒトは、ヒト集団において観察される抗ＡＡＶ５抗体レベルの多くても９５番目のパーセンタイルに相当する抗ＡＡＶ５抗体レベルを有する、方法が提供される。
【００４９】
別の実施形態において、有効量のＡＡＶ５遺伝子療法ベクターをそれを必要とするヒトに投与するステップを含む、ヒトに遺伝子を送達する方法であって、
前記ヒトは、抗ＡＡＶ５抗体を判定するアッセイを用いた事前スクリーニングに供されず、
前記ヒトは、前記医学的治療の前にＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた医学的治療に供されていない、方法が提供される。
【００５０】
代替的に、又は前述の実施形態のいずれか１つと組み合わせて、好ましい実施形態において、ＡＡＶ５ベクター組成物は、薬学的に許容できる担体、希釈剤、可溶化剤、充填剤、防腐剤、及び／又は賦形剤をさらに含む。好ましくは生物学的に適合する溶液又は薬学的に許容できる送達ビヒクルに懸濁された、治療用遺伝子を持するｒＡＡＶベクターを患者に投与することができる。適切なビヒクルには無菌生理食塩水が含まれる。薬学的に許容できる担体であることが公知の及び当業者に周知の、他の水性及び非水性の等張無菌注射液並びに水性及び非水性の無菌懸濁液を、この目的のために採用してもよい。ウイルスベクターを、上で記載される十分な量でヒト患者に投与して、所望の細胞にトランスフェクトし且つ選択された導入遺伝子の十分なレベルの形質導入及び発現を提供して、医学の技術分野における当業者によって判定され得る過度の逆効果なしに又は医学的に許容できる生理学的効果を有して、治療的有益性を提供する。
【実施例】
【００５１】
調査設計及び参加者
１）連続的なＦＩＸ予防、又は２）要求に応じたＦＩＸ、のいずれかを要し、１年あたり≧４回の出血又は血友病性関節症を有する、重度（ＦＩＸ＜１ＩＵ／ｄＬ）又は中程度〜重度（ＦＩＸ≦２ＩＵ／ｄＬ）の血友病Ｂを有する成人男性を含む、多国籍の非盲検の用量漸増第１／２相調査を行った。試験のさらなる詳細を、ＮＩＨ  ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ（ＮＣＴ０２３９６３４２）のウェブサイトで見い出すことができる。調査は、各センターにおいて施設内審査委員会／施設内倫理委員会によって認可された。すべての参加者は、書面でのインフォームドコンセントを提供した。ヘルシンキ宣言及び医薬品臨床試験の実施基準（Ｇｏｏｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ）の原則に従って、試験を実施した。
【００５２】
肝臓特異的プロモーターＬＰ１の制御下に、コドン最適化された野生型ｈＦＩＸ遺伝子を組み入れたＡＡＶ５ベクター（Ｎａｔｈｗａｎｉら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１１；３６５（２５）：２３５７〜６５、及びＮａｔｈｗａｎｉら、Ｂ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１４；３７１（２１）：１９９４〜２００４）を調査において用いた。ベクターを、医薬品及び医薬部外品の製造管理及び品質管理規則（Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）に従って、バキュロウイルス発現システムを用いて製造した。ベクターゲノムコピー力価（ｇｃ）を、ｑＰＣＲを用いて判定した。カプシド：ｇｃ比は約１０であり、すなわちカプシドの量は、ゲノムコピーの量の約１０倍であった。カプシド力価は、ＵＶ吸収検出を有する高速液体サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬ−ＳＥＣ）によって判定され得る。方法はＳＥＣカラムに基づき、カラムは、ＡＡＶ粒子をより小さなマトリックス構成要素から分離するカラムの能力に対して選定される。方法において、検量線を、既知の総粒子濃度を有するＡＡＶベクター調製物を用いて作出する。検量線では、注射された総粒子の量が応答データに対してプロットされている。回復したＡＡＶピーク面積及び検量線を用いて、注射されるサンプル粒子の量は補間によって算出される。ＡＡＶ５ベクターを、単回の３０分間の末梢静脈注入として投与した。参加者を、２つの連続した漸増用量コホートにおいて治療した：コホート１（ｎ＝５、参加者１〜５）は５×１０１２ｇｃ／ｋｇを受け、コホート２（ｎ＝５、参加者６〜１０）は２×１０１３ｇｃ／ｋｇを受けた。コホート１は、６９歳の平均年齢（３５〜７２）及び８４．５ｋｇの平均体重（７１．２〜８９．１）を有する成人男性からなり、コホート２は、３５歳の平均年齢（３３〜４６）及び８４．０ｋｇの平均体重（７１．４〜９６．０）を有する成人男性からなった。効力成果測定法は、ＦＩＸ血漿活性測定を含んだ。さらに、中和ＡＡＶ５抗体力価（ＮＡｂ力価）及び全ＡＡＶ５抗体力価（ＴＡｂ）解析のために、対象由来の血清を獲得した。
【００５３】
健常ドナー由来の対照血清を、ＳｅｒａＬａｂ（Ｗｅｓｔ  Ｓｕｓｓｅｘ、ＵＫ）から商業的に獲得した。これらの血清に関連する提供されたすべての情報が、下に列挙されている。
【００５４】
【表１】
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【００５５】
中和ＡＡＶ５抗体（ＮＡｂ）力価
ヒト血清におけるＮＡｂの測定を、導入遺伝子ルシフェラーゼを保持するＡＡＶ５（ＡＡＶ５−ｌｕｃ）及びヒト胎児腎臓細胞株ＨＥＫ２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  １１．２６８）を用いた高感度インビトロアッセイに基づいて査定した。導入遺伝子発現は、ルシフェリン類似体の添加によって明らかになる。
【００５６】
用いた材料：
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＨＥＫ２９３Ｔ／ＡＴＣＣ  １１．２６８）
フェノールレッドを含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、参照＃３１９６６）／１０％ＦＢＳ（Ｇｒｅｉｎｅｒ、参照＃７５８０９３）／１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、参照＃１５１４０）
フェノールレッドを含まないＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、参照＃２１０６３）／１％Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（Ｇｉｂｃｏ、参照＃１５１４０）
１×ＰＢＳ−／−（Ｇｉｂｃｏ、参照＃１４１９０）
１×トリプシンＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、参照＃２５２００）
ポリ−Ｌ−リジン（ＰＬＬ）溶液（２．５％）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、参照＃８９２０−１００）
９６ウェル平底黒色培養プレート（ｃｏｓｔａｒ、参照＃３９１６）
透明の９６ウェル平底プレート（ｃｏｒｎｉｎｇ、参照＃３５９６）
ＯＮＥ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、参照＃Ｅ６１２０）
Ｇｌｏ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ、１×（Ｐｒｏｍｅｇａ、参照＃Ｅ２６６１）
ＡＡＶ５−ＣＭＶ−ｌｕｃ（例えば、ＰＫＯからのＡＡＶ５−ＣＭＶ−７３ＱｌｕｃＨｔｔを用いた、力価：４ｅ１３ｇｃ／ｍｌ）
【００５７】
基本的には、０．５×１０５個細胞／ウェルの濃度でＤＭＥＭ（フェノールレッド／１０％ＦＢＳ及び１％Ｐ／Ｓ（ペニシリン／ストレプトマイシン）を含む）に１００μｌ／ウェルのＨＥＫ２９３Ｔ細胞を添加することによって、細胞を黒色の９６ウェルプレート及び透明の９６ウェルプレートに播種した。細胞を一晩インキュベートした。
【００５８】
翌日、透明の９６ウェルプレートにて培地（ＤＭＥＭ／１％ＰＳ、フェノールレッドを含まない／１０％ＦＢＳ）中に血漿の連続希釈物を調製した。ウイルスの添加後（下記を参照されたい）、得られた最終的な血漿希釈は、２、４、８、１６、３２、６４、１２８、２５６、５１２、及び１０２４であった。
【００５９】
Ａ２〜Ａ１１と指定されたウェル（陰性対照ウェル）に１４０μｌの培地を添加することによって希釈物を調製し、７０μｌの培地をプレートの列３、４、５、６、７、８、９、１０、及び１１における残りの行に、並びに行Ｈ２〜Ｈ１１（陽性対照）に添加する。
【００６０】
血漿サンプルをウェルＢ２、Ｃ２、Ｄ２、Ｅ２、Ｆ２、Ｇ２に添加し（１４０μｌ／ウェル）、第１の希釈：１をもたらした。その結果として、列２から列３へ（希釈２）、３から４へ（４）、４から５へ（８）、５から６へ（１６）、６から７へ（３２）、７から８へ（６４）、８から９へ（１２８）、９から１０へ（２５６）、１０から１１へ（５１２）、７０μｌを移動させることによって、血漿の連続希釈をプレートにわたって実施し、次いで列１１から７０μｌを捨てる。ＡＡＶ５−ＣＭＶ−７３ＱｌｕｃＨｔｔを培地（ＤＭＥＭ／１％ＰＳ、フェノールレッドを含まない／１０％ＦＢＳ）に６×１０９ｇｃ／ｍｌで調製する。次に、７０μｌ／ウェルの６×１０９ｇｃ／ｍｌのＡＡＶ５（１６０）−ＣＭＶ−７３ＱｌｕｃＨｔｔウイルス希釈物を、ウェルＡ２〜Ａ１１（陰性対照）を除く血漿希釈プレートに添加する。プレートをプレート振とう器に３００ｒｐｍで２分間慎重に置く。次いで、プレートをセ氏４度で１時間インキュベートする。
【００６１】
培養培地を、前日に調製された黒色の９６ウェルプレート（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を有する）から除去し、Ｈｅｋ２９３Ｔ細胞を有する黒色プレートに、透明のプレートからピペットで移すことによって、１００μｌ／ウェルの容積の調製された血漿希釈物で置き換える。これらのプレートを３７℃で１６〜２０時間インキュベートした。翌日、細胞を室温で平衡化し、培地を除去した。細胞を１×ＰＢＳ−／−（１００μｌ／ウェル）で１回リンスし、その後１００μｌ／ウェルのＧｌｏ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒをプレートに添加し、室温で５分間インキュベートして、溶解を生じさせた。この後、ＯＮＥ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍからの１００μｌ／ウェルの試薬を添加する（試薬はメーカーの指示書に従って調製される）。少なくとも３分後、ＧｌｏＭａｘ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒ機器でのＯＮＥ−Ｇｌｏプロトコールの使用によりプレートを測定する。バックグラウンド活性の引き算後、各血清希釈に対する中和のパーセントを算出し、次いで曲線を中和プロファイルにフィットさせるＬａｂＫｅｙソフトウェア解析の使用により、抗ＡＡＶ５中和抗体力価を判定する。次いで、ＬａｂＫｅｙはこの曲線を用いて、選定されたベンチマーク、曲線下面積（ＡＵＣ）、及び誤差概算に対して中和抗体力価を算出する。４パラメーター法を用いて曲線フィットを算出した。ＬａｂＫｅｙは、抗体が形質導入を５０％阻害する希釈であるＩＣ５０を算出する。ＬａｂＫｅｙは、Ｊｏｈｎｓｏｎ及びＢｙｉｎｇｔｏｎ、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ＨＩＶ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．：Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、１９９０：７１〜７６に従った「点に基づく」力価も算出する。この算出は、標的中和パーセンテージの両側で２回の反復間を直線的に補間することによって行われる。各ランは、陽性対照（サンプル血清を有しないが、ＡＡＶ５−ＬＵＣを有するウェル）、陰性対照（サンプル血清を有さず、ＡＡＶ５−ＬＵＣを有さず、培地のみを有するウェル）、及び陰性対照サンプル血清（熱不活性化ＦＢＳ）を含んで、ＡＡＶ５−ＬＵＣ中和の特異性を査定した。ＦＢＳは、サンプルとして測定される場合、抗ＡＡＶ５中和特性を有するべきではない。
【００６２】
抗ＡＡＶ５抗体力価
ＡＡＶ５に対する全ヒトＡｂの定量は、特異的カプシドを用いてプレートをコーティングしたＥＬＩＳＡアッセイに基づいた。ＡＡＶ５カプシドに特異的な全ヒトＡｂの存在は、プロテインＡペルオキシダーゼを用いて明らかになる。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ  ＭａｘｉＳｏｒｐプレート、参照：４５６５３７、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を炭酸塩バッファー中１００ｎｇ／ウェルの抗原（ＡＡＶ５  ｃａｐ）で４℃に一晩コーティングした。翌日、プレートをＰＢＳ  ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳｔ）で３回洗浄して抗原の残りを排除し、ブロッキング溶液（ＰＢＳ＋３％ＦＢＳ）でブロッキングして非特異的結合を防いだ。２００μＬ  ＰＢＳｔで３回洗浄した後、１００μＬの最終容積で、１：９で始まり１：３の希釈系列が後に続く、ＰＢＳｔ中ヒト血清希釈物を添加した。すべてのサンプルを二つ組で試験した。ヒト血清を有しない陰性対照が各プレートに含まれた。血清希釈物を３７°で２時間インキュベートした。この後、血清を除去し、プレートをＰＢＳｔで３回洗浄し、ブロッキング溶液に１：１０，０００で希釈された１００μＬのプロテインＡペルオキシダーゼを１時間添加した。プレートをＰＢＳｔで３回洗浄し、反応をＴＭＢ基質で明らかにし、３０分後にＨ２ＳＯ４  ２Ｎで停止させた。吸光度をマイクロプレートリーダーにて４５０ｎｍで読み取った。全抗体力価を血清希釈として算出し、全抗体力価は陰性対照よりも５倍高い吸光度を有した。
【００６３】
結果及び考察
両コホートにおけるヒト患者すべてが、ＦＩＸ活性の意味のある向上を呈示し、ほとんどのヒト患者は重度から軽度への表現型の変化によって向上し（表２）、ＦＩＸタンパク質の予防的投与の使用の実質的低下又は欠如さえもたらした。患者間及びコホート間で観察されたＦＩＸ活性レベルの間に変動が観察された。ＦＩＸ活性レベルの変動は、ヒト患者のＮＡｂ又はＴＡｂ状態とは相関しなかった。
【００６４】
ＡＡＶ５に対するＴＡｂについての以前に報告された普及率（４０％、Ｂｏｕｔｉｎら、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１０年６月、２１（６）：７０４〜７１２）は、本解析の結果（３０％）とおおむね合致した。ルシフェラーゼに基づくＮＡｂアッセイを用いて獲得された結果（図１及び２を参照されたい）は、５０個のスクリーニングされた対照血清のうちの１４個（２８％）に対して陽性シグナルが回復したことから、ＡＡＶ５（中和）抗体の普及率は同程度であることを示唆し、その割合は最近の調査と一致している（Ｌｉ  Ｃら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１２年３月；１９（３）：２８８〜９４）。遺伝子療法治療の前にヒト患者から獲得された血清からの結果は、同様に最近の調査と一致しており、１０個の血清のうちの３つがＮＡｂアッセイ及びＴａｂアッセイの両方において陽性であることが見い出された（３０％）。ＥＬＩＳＡによって査定される全抗体、及びルシフェラーゼに基づくアッセイによって査定される中和抗体は密接に相関し、両アッセイが同じ実体を検出することを示唆する（図２Ａを参照されたい）。
【００６５】
さらに、治療後の中和抗体力価の存在も試験し、約１０６及びそれを上回る範囲内にあることが見い出された。したがって、エンデミックに得られた、治療されていないヒトにおいて見い出された抗体力価は、ＡＡＶ５に基づく遺伝子療法に供されたヒト患者において観察された力価の範囲からかなり離れている。さらに、既存のＡＡＶ５  ＮＡｂを有する患者は、抗原への最初の曝露に典型的な、ＩｇＭの急速で且つ一過性の増加それに続くＩｇＧの増大を示す、ＮＡｂを有しない患者とは対照的に、ＡＡＶ−ＦＩＸの投与があると、免疫ブーストに特徴的なＩｇＧの急速な増加を示した。さらに、既存のＮＡｂを有する治療された患者において、ＡＬＴ（アラニンアミノトランスフェラーゼ）上昇又はカプシド特異的なＴ細胞活性化の証拠はなかった。したがって、エンデミックに得られた既存のＮＡｂを有する患者におけるＡＡＶ５に基づく遺伝子療法の施しは、ＡＬＴ上昇又はＴ細胞活性化なく、良好な忍容性を示した。
【００６６】
結論付けると、ＮＡｂアッセイ又はＴＡＢアッセイのいずれかによってインビトロで検出された抗ＡＡＶ５抗体の存在は、インビボでの形質導入を損なうことを予測するわけでも指し示すわけでもなかった。療法前のＮａｂの存在と、ＡＡＶ５  ＦＩＸ遺伝子移入により生じる療法後のＦＩＸレベルとの間に明らかな相関はなかった。より低用量のＡＡＶ５ベクターを受けたコホート１における最も高い応答者が、検出された最も高いレベルのＮＡｂ及びＴＡｂ抗体も有したことは顕著である。健常集団において観察された抗ＡＡＶ５力価の範囲は、ＡＡＶ５遺伝子療法治療に供されていない健常集団における抗体のレベルが、インビボでのＡＡＶ５による形質導入を損なわないことを示す。この理由は、健常集団において観察された最も高い力価が、コホート１の患者５において観察された最も高い力価に範囲内で近いためである。したがって、ＡＡＶ５遺伝子療法ベクターを用いた治療の前に、治療されていない集団における抗ＡＡＶ５抗体の有無について試験することを要しないことは実現可能だと考えられる。
【００６７】
【表２】
2020526203.tif 000003
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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