(57)【要約】  アッセイプロセス、特に多段階免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイで使用されるパラフィン除去、抗原賦活化、並びに一次染色試薬及び二次染色試薬の効率を決定するためのデバイス及び方法。デバイスは、２Ｄ又は３Ｄ配置でドットとして適用され、またパラフィンコーティング下で封止される複数の化合物を含有する、接着剤コーティング顕微鏡スライドを包含する。続いて、組織切片又は遊離細胞は、同じスライドに適用されて、全てが、組織捕捉からカバーガラスの適用に至るＩＨＣ処理工程を受ける。化合物は、一次ＩＨＣ染色試薬又は二次ＩＨＣ染色試薬のいずれかと反応して、共在する組織切片又は遊離細胞が受けた処理を記録する。
2020523614.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
検出領域と対照領域とを備えるスライドであって、
該検出領域は、免疫組織化学（ＩＨＣ）若しくは免疫化学（ＩＣＣ）検出及び／又は続く検査全体にわたる処理のために適用される、組織切片又は遊離細胞のためのスペースであり、
該対照領域は、免疫組織化学的若しくは免疫化学的検出プロセスの１個以上（例えば、
２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個）の中間工程に存在する考え得る誤差（存在する場合）を示し、及び／又は染色された組織若しくは細胞のカラー密度を定性的又は定量的に決定するための参照をもたらす対照標的を有し、
好ましくは、該中間工程は、パラフィン除去、抗原賦活化、一次染色及び二次染色からなる群から選択される１個以上の工程である、スライド。
【請求項２】
前記スライドは、ペプチド、タンパク質、糖、脂質、小無機分子等の部分と結合させる接着剤コーティングを有し、より好ましくは、該接着剤コーティングは、ガラスに共有結合して、−ＲＯＨ、−Ｒ（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ、−ＲＮＨ３、−Ｒ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２及び−ＲＮＨ２からなる群から選択される１個以上の末端基を提示し、更に好ましくは、該接着剤コーティングは、わずかに親水性である、請求項１に記載のスライド。
【請求項３】
前記対照領域は、１組以上（例えば、１組、２組、３組、４組、５組、６組、７組、８組、９組又は１０組）の一次標的アレイを含有し、該一次標的アレイは、１個以上（例えば、１個〜５０個、５個〜４５個、１０個〜４０個、１５個〜３５個、又は２０個〜３０個、特に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）の一次標的ローディングドット（該ドットは、円、楕円、正方形、菱形等の任意の規則的又は不規則的な形状を有し得る）を含み、ドットはそれぞれ、１個以上（例えば、１個〜５０個、５個〜４５個、１０個〜４０個、１５個〜３５個、又は２０個〜３０個、特に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）の一次標的を含み、該一次標的は、前記スライド上に固定化されて、かつ少なくとも１個（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）の抗原タンパク質又はその抗原特異性を変化させないその変異体の完全長又は一部に相当する抗原ペプチド断片であり、
好ましくは、該一次標的ローディングドットの１個における該一次標的（又は該抗原ペプチド断片）の少なくとも１個は、免疫組織化学的又は免疫化学的検出に使用される一次抗体によって認識することができる、請求項１又は２に記載のスライド。
【請求項４】
前記一次標的のペプチド鎖は、システイン残基を介して、好ましくはスルホ−ＳＭＣＣ架橋を経て、担体タンパク質にカップリングされ、任意選択で、コンジュゲートされた担体タンパク質は、ダミータンパク質とブレンドされて、濃度を調節し、
好ましくは、該担体タンパク質は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）及び他の場合では二次染色試薬と非反応性である他のタンパク質、例えば、ニワトリの卵白由来のオボアルブミン（ＯＶＡ）又はウマ、ロバ若しくはシマウマ等のウマ科ウマ属由来のいずれかから選択され、
更に好ましくは、前記一次標的は、パラホルムアルデヒド又はホルマリン等の固定液を用いて固定される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項５】
前記一次標的ローディングドットは、勾配標的密度対を形成し、標的対はそれぞれ、唯一の反応性抗原を組み込み、好ましくは、コンジュゲートされたペプチドは、中性ＫＬＨタンパク質及び４％ホルマリンと混合されて、２個〜１０個（好ましくは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）の希釈物の勾配密度シリーズを作製するか、又は、
標的ドットはそれぞれ、例えば、全て最大密度で、２個〜１０個の異なる抗原ペプチド断片で構成される、請求項４に記載のスライド。
【請求項６】
前記対照領域は、１組以上（例えば、１組、２組、３組、４組、５組、６組、７組、８組、９組又は１０組）の二次標的アレイを更に含み、該二次標的アレイは、１個以上（例えば、１個〜５０個、５個〜４５個、１０個〜４０個、１５個〜３５個又は２０個〜３０個、特に、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）の二次標的ローディングドット（該ドットは、円、楕円、正方形、菱形等の任意の規則的又は不規則的な形状を有し得る）を含み、二次標的ローディングドットはそれぞれ、或る特定の比率で前記スライドに固定される宿主タンパク質（例えば、ＩｇＧ）及びダミータンパク質（例えば、ＩｇＧ）の混合物であり、
同じか、又は異なる二次標的アレイにおける異なるドットに関して、宿主タンパク質は同じであり、該ダミータンパク質は、同じであり得るか、又は同じでない場合があり、好ましくは同じであり、
アレイの異なる組に関して、該宿主タンパク質は異なり、該ダミータンパク質は、同じであるか、又は同じではなく、
好ましくは、二次標的ドットアレイは、勾配希釈シリーズを形成し、好ましくは、勾配密度は１〜１０００：１の段階的な希釈増分を含み、より好ましくは、該勾配密度は、−ｄＢｄプロファイル、例えば、０ｄＢｄ〜−８０ｄＢｄ（１００％〜０．０１％）の宿主タンパク質濃度、又は０ｄＢｄ〜−１００ｄＢｄ内の等しいｄＢｄ増分の１つ以上の希釈物を含む任意のシリーズに従い、
更に好ましくは、該二次標的は、パラホルムアミド又はホルマリン等の固定液を用いて固定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項７】
前記宿主タンパク質は、前記免疫組織化学（ＩＨＣ）又は免疫化学検出で使用される一次抗体を産生する動物のタンパク質であり、好ましくは、前記宿主は、マウス、ラット、ウサギ及びヤギからなる群から選択される、請求項６に記載のスライド。
【請求項８】
前記ダミータンパク質は、場合によっては前記二次染色キットで見られる非特異的な染色をサポートしないタンパク質であり、好ましくは、前記ダミータンパク質は、ロバ又はウマタンパク質である、請求項６又は７に記載のスライド。
【請求項９】
前記対照領域は、１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個又は１０個）の３Ｄ二次標的ローディングドットを更に含み、該３Ｄ二次標的ローディングドットはそれぞれ、骨格としての多糖及び或る特定の濃度（例えば、１００％、１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％、１％又はその間の任意の値）の宿主タンパク質の混合物で形成され、前記スライド上にロードされる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項１０】
前記対照領域は、１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個又は５個）のイメージング参照ローディングドットを更に含み、好ましくは、該イメージング参照ローディングドットは、少なくとも黒色標的又は白色標的を含み、より好ましくは、黒色標的及び白色標的はともに含まれ、例えば、前記二次標的の片側に位置付けられる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項１１】
前記黒色参照標的は、カーボンダストから選択され、好ましくは、炭素化合物は、０．１ミクロン〜２ミクロンのサイズ範囲であり、及び／又は、
前記白色参照標的は、酸化チタン、酸化アルミニウム、硫酸アルミニウム、又は硫酸バリウム等の酸化物又は硫化塩状態のいずれかの元素周期表における「貧金属」から選択される、請求項１０に記載のスライド。
【請求項１２】
前記黒色標的及び前記白色標的はともに、メチルテトラヒドロフタル酸無水物及びジフェニルヨードニウムヘキサフルオロひ酸塩で構成されるＵＶによって反応開始する無水物触媒が好ましいが、これに限定されない公称３６５ｎｍでの直接ＵＶ光曝露によって触媒される無水物系エポキシ塗料基剤に基づいている、請求項１０又は１１に記載のスライド。
【請求項１３】
前記対照領域は、抗原賦活化プロセスの回収不足条件下での検出用の１個以上の抗原賦活化モニターローディングドットを更に含み、該抗原賦活化モニターローディングドットはそれぞれ、１個以上の宿主タンパク質の混合物、好ましくは、最小固定液（例えば、ホルムアルデヒド又はホルマリン）固定で処理した或る特定の比率、例えば（０〜１００）：（１００〜０）、例えば、約１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０又は９０：１０のマウス及びウサギタンパク質の混合物であり、より好ましくは、該ドットは、マウス及びウサギタンパク質の５０：５０混合物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項１４】
前記対照領域は、抗原賦活化プロセスの過剰回収条件の検出用の別の１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個又は５個）の抗原賦活化モニターローディングドットを更に含み、該抗原賦活化モニターローディングはそれぞれ、１個以上の宿主タンパク質の混合物、好ましくは、固定液（例えば、ホルムアルデヒド又はホルマリン）で過剰固定した３Ｄスカフォールド（例えば、多糖骨格）に付着させた或る特定の比率、例えば（０〜１００）：（１００〜０）、例えば、約１０：９０、２０：８０、３０：７０、４０：６０、５０：５０、６０：４０、７０：３０、８０：２０又は９０：１０のマウス及びウサギタンパク質の混合物であり、より好ましくは、該ドットは、マウス及びウサギタンパク質の５０：５０混合物である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項１５】
パラフィンコーティングは、前記スライド上の前記一次標的、二次標的、イメージング参照、抗原賦活化モニターローディングドットからなる群から選択される１個以上の生体材料に塗布されるか、又はパラフィンコーティングは、無機付着物（例えば、染色剤）に塗布され、好ましくは、塗布されたコーティングは、１ミクロン〜５ミクロン（例えば２ミクロン及び３ミクロン）厚であるが、５ミクロンよりも厚いべきではない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項１６】
前記パラフィンコーティングの塗布は、下記の工程：
（ａ）固形パラフィンが液体へと融解するまで、６０℃〜７０℃の範囲の温度で固形パラフィンを融解する工程であって、融点は、７５℃を超えるべきではない、工程と、
（ｂ）飽和混合物が得られるまで、脂肪族溶媒を、工程（ａ）で得られるパラフィンに添加する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）で得られる混合物を、３０℃〜３３℃の範囲の温度に冷却した後、ほぼ透明な液体が得られるまで、有機溶媒を徐々に添加する工程と、
（ｄ）工程（ｃ）で得られる透明な液体の薄層を、前記スライド上の前記生体材料又は無機付着物上に塗布して、保護コーティング用の前記スライド上に保護コーティングを形成する工程と、
（ｅ）付着されたパラフィン混合物を赤外線加熱に曝露して、融解させて、放出される溶媒を蒸発させて、それにより、前記パラフィンをその元の固体状態に戻す工程と、
を含み、
好ましくは、前記パラフィンは、Thermo Fisher社によるＴｉｓｓｕｅＰｒｅｐ及びＴｉｓｓｕｅＰｒｅｐ２（融点５６℃）、Leica社によるＰａｒａｐｌａｓｔ及びＰａｒａｐｌａｓｔ  ｐｌｕｓ（融点５６℃）、Leica社によるＰａｒａｐｌａｓｔ  Ｘ−ｔｒａ、融点（５０℃〜５４℃）から選択され、及び／又は、
該有機溶媒は、キシレン、脂肪族キシレン代替物（例えば、キシロール）、トルエン、塗料用シンナー、テレビン油、又はアセトン及びケロシンの５０：５０混合物から選択される、請求項１５に記載のスライド。
【請求項１７】
工程（ｃ）で得られるパラフィンの透明液体は、スプレー塗布法、インクジェット付着法、転写印刷法、スクリーン印刷法又は蒸着法により塗布することができる、請求項１５又は１６に記載のスライド。
【請求項１８】
前記スライドタイプを識別するマーク（好ましくは、スライドラベル領域の最上部に）及び前記一次標的によってサポートされる前記抗原を識別するコード、及び／又はロット番号（好ましくは、ラベルの直下に）を更に含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のスライド。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のスライドを用いた免疫組織化学的染色方法であって、下記工程：
ｂ．固定液（例えば、ホルムアルデヒド）固定を除去して、前記組織切片の抗原部位を露出させる工程と、
ｃ１．１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個）の一次抗体を適用して、前記組織切片／遊離細胞又は一次抗原標的のいずれかに見られる任意の適合性抗原部位に結合し、染色試薬の存在下で発色することができる部分とコンジュゲートされる１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個）の二次抗体を適用して、組織切片／遊離細胞、二次抗原標的又は抗原賦活化モニターのいずれかにおける工程ｃで使用される一次抗体に結合する工程、又は、
ｃ２．染色試薬の存在下で発色することができる部分とコンジュゲートされる１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個）の一次抗体を適用して、前記組織切片／遊離細胞又は一次抗原標的のいずれかに見られる任意の適合性抗原部位に結合する工程と、
ｅ．該染色試薬を適用して、標的とされる抗原の存在の可視的なカラー表示を生み出す工程と、
ｆ．任意選択で、十分な密度の色素を得る多段階増幅工程と、
ｇ．二次抗原密度勾配に基づいて、及び／又は可能な場合には、一次抗原密度勾配に支援されて、染色された組織又は細胞のカラー密度を定量的に決定する工程と、
ｈ．一次標的、二次標的及び抗原賦活化モニターの染色密度に基づいて、検出プロセスの品質に関して評価を行う工程と、
を含み、任意選択で、パラフィンコーティングは、前記スライド上の標的に選択的に塗布され、前記組織切片／遊離細胞もまた、パラフィン中に包埋される場合には、工程（ｂ）の前に下記の工程：
ａ．パラフィンを、パラフィンに包埋された切片又は遊離細胞及び標的上のパラフィン保護コーティングから除去する工程、
が実行される、方法。
【請求項２０】
工程（ａ）におけるパラフィンの除去は、６５℃〜７５℃の範囲の温度で、３分〜１０分間、前記パラフィンを加温して、半液化状態のパラフィンを得た後に、緩衝溶液中で再水和されるまで、一連の有機溶媒を用いて液化することによって実行される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記有機溶媒は、脂肪族溶媒を出発とする一連の溶媒、例えば、キシレン又はキシロール、無水エタノール、９５％エタノール、７０％エタノール、５０％エタノール、及び塩ベースの緩衝溶液から選択され、それぞれ、公称３分の曝露時間を有する、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
ホルムアルデヒドの前記固定は、熱処理エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）プロセス、又はより長い多重交換の温蒸留水抗原賦活化プロセスのいずれかによって除去することができる、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
工程（ｄ）で利用される二次染色試薬は、酵素標識された二次抗体、酵素標識された二次抗体と反応する酵素標識された三次抗体、二次抗体と反応するＡＰＡＡＰ免疫複合体、ビオチン化二次抗体と反応する酵素標識された（ストレプト）アビジン、ビオチン化二次抗体と反応するアビジン又はストレプトアビジン−ビオチン−酵素複合体、一次抗体上のビオチン化二次抗体上のストレプトアビジン−酵素複合体、及び二次抗体と一次抗体に結合された酵素部位とを含有するポリマーから選択することができる、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
利用される前記抗原賦活化緩衝液は、６〜９のｐＨ範囲から選択され得る、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
工程（ｃ）における前記一次抗体は、宿主タンパク質が、マウス又はウサギのいずれかである抗体から選択され、一般的な例として、ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ２、Ｋｉ６７が挙げられる、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
色素原は、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ＤＡＢ＋ニッケルエンハンサー、ファストレッド、ＴＭＢ、ステイイエロー、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ＢＣＩＰ／ＴＮＢＴ、ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸＋ファストブルーＢＢ、ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸＋ファストレッドＴＲ、ナフトールＡＳ−ＭＸリン酸＋ニューフクシン、ステイグリーン及びＮＢＴからなる群から選択することができる、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
コスト効率が良く、再現性があり、安定であり、誤診を招くＩＨＣ処理工程の識別を補助する、請求項１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
共在する組織切片又は遊離細胞上での抗原濃度に対するプロセス管理のための定量的な基準として利用される、請求項１９〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
抗原賦活化に関する評価の判定基準は、下記の通りである：
回収不足条件の標的の検出用の抗原賦活化モニターローディングドットが染色される場合、ＡＲプロセスが行われなかったことを意味し；
過剰回収条件の検出用の抗原賦活化モニターローディングドットが染色される場合、ＡＲプロセスが非常に活動的であり、前記スライドは、診断評価に使用されるべきではないことを意味し；
前記二次標的アレイの１０％〜３０％以下の標的が、可視的な染色を示さない場合、名目値の回収条件が行われ、続いて、ＡＲダメージの度合いは、染色していない低濃度の二次標的の量によって評価することができる、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のスライドを含むか、又は請求項１９〜２９のいずれか一項に記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１７年６月１５日に出願された、「Process Record Slide for  Immunohistochemical Staining」という表題の米国仮特許出願第６２／５２０，３１９号、２０１７年７月３１日に出願された、「Process Record Slide for  Immunohistochemical Staining」という表題の米国仮特許出願第６２／５３９，２８１号、２０１７年６月１５日に出願された、「Shield Coating for Protein  Deposits of a Microscope Slide」という表題の米国仮特許出願第６２／５２０，１６９号、２０１７年６月１５日に出願された、「IHC Imaging Baseline Reference」という表題の米国仮特許出願第６２／５２０，１７８号、及び２０１７年６月１５日に出願された、「IHC Antigen Imaging Scale Extrapolation」という表題の米国仮特許出願第６２／５２０，１８７号の優先権を主張し、それらの開示はそれぞれ、それらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０００２】
本発明は、新規のプロセス記録スライドに関する。特に、本発明は、免疫組織化学染色のためのプロセス記録スライド及び方法に関する。特に、本発明は、共在する患者試料と、染色プロセスを一緒に受ける対照標的とを提供するプロセス記録スライドを開示する。染色時に、染色された対照は、既知の標的ベースラインに対する逸脱として、存在する場合には考え得る誤差（複数の場合もある）を即座に示す。上述のプロセス記録スライドは、高い正確度及び精度で、コスト効率の良い値段で、容易に認められる閾値で、非常に有効なＱＣをもたらす。
【背景技術】
【０００３】
免疫組織化学方法、及び他の免疫化学的方法は全て、一連の試薬交換、インキュベーション、及び洗浄からなる多段階手順である。これらの手順の多くが、熟練者を必要とし、その結果は、研究室間で大きく変わり得る。コスト節約、スライド調製の一様性、及び手順上のヒューマンエラーの低減を導入するのに、自動システムが研究されている。
【０００４】
自動方法及び手動方法の両方に関して、考慮されるべき重要なポイントが多数存在する。スライドからの検体の損失を回避するために、注意を払わなくてならない。試薬の適用の間の検体の完全な洗浄は、残渣が増幅されるため、特に未結合抗体を除去するのに必須である。これまでの試薬のキャリーオーバー及び／又は続く試薬の望ましくない希釈を回避するために、過剰な液体を除去しなくてはならないが、検体は、乾燥させてはならない。検体が見られ得るスライド領域を完全に覆うのに十分な抗体試薬を適用しなくてはならいが、廃棄物は最小限に保たれる必要がある。
【０００５】
さらに、免疫組織化学的方法及び免疫化学的方法で使用される試薬の多く、例えば酵素溶液及びペルオキシダーゼ発色試薬は、作業温度で、更には室温で、安定性が限られている。このことにより、試薬の頻繁な調製が必要になる。さらに、誤った結果を招く非特異的な抗体結合は、いまだ問題である。
【０００６】
結果を改善して、試薬調製を最低限に抑える方法及び試薬は、手動及び自動の免疫組織化学的方法の両方を容易にする。改善の多くは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等の関連する免疫化学的方法に容易に適用させることができる。
【０００７】
「非特許文献１」を参照してもよく、そこでは、組織固定、処理、及び染色の変動は、エストロゲン受容体（ＥＲ）免疫組織化学アッセイの乏しい再現性に大いに関与していることが開示されている。既知のＥＲ含有量を有するＭＣＦ−７細胞の凍結させた寒天懸濁ペレットは、浸潤性乳癌（ＩＢＣ）の５５個の試料それぞれに添加されて、対照として役割を果たす。画像分析により、ＭＣＦ−７細胞及びＩＢＣの陽性面積（分析される総核当たりの陽性核）並びに陽性染色（陽性核面積の光学密度の合計を、研究した核全ての光学密度の合計で除算したもの）の割合を決定した。ＭＣＦ−７細胞は、デキストランでコーティングした活性炭分析によって、１５０ｆｍｏｌ／ｍｇのＥＲの平均値を有した。５５個の事例が含まれるＭＣＦ−７細胞の画像分析は、平均陽性面積７０．８１を示した。ＩＢＣ事例からの陽性染色は、０〜９８．５の範囲であった。ＭＣＦ−７細胞の既知のＥＲ含有量及び陽性面積を使用することによって、変換係数を使用して、臨床検体の陽性面積を、フェムトモル当量に変換し、それは、５５個のＩＢＣに関して、０〜１７９０の範囲であった（平均値、１８７）。既知のフェムトモル量のＥＲを有する対照を組み入れることにより、品質管理及びＥＲ定量化に関する内部標準が得られる。
【０００８】
特許文献１を参照してもよく、そこでは、免疫組織化学的プロセスにおいて検査及び品質管理のための陽性対照物質の調製方法が開示されている。上記方法は、下記の工程：抗体と特異的な反応を実行することができる種々の濃度を有するポリペプチド又はタンパク質を予めスライド上に吸着させる工程、又は種々の濃度を有するポリペプチド又はタンパク質を予めスライド上に配置させる工程を含み、ポリペプチド又はタンパク質及び病理学的組織切片は、同時に従来の免疫組織化学的工程を受け、ポリペプチド又はタンパク質の呈色の結果は、免疫組織化学手的プロセスに関する陽性対照として使用される。本発明は、スライド上に陽性対照タンパク質又はポリペプチドを配置させて、陽性対照及び品質管理基準を得る方法を採択し、上記方法は、既存の品質保証プログラムに対する重要な補足であり、免疫組織化学的アッセイの品質管理に関する新たな方法である。
【０００９】
上記発明によって下記の問題点が報告されており、それらを以下で列挙する。
【００１０】
ａ．ペプチドセグメントの、デキストランポリマーへの結合は、混合溶液の粘度、デキストランからの過剰ペプチドの洗浄に依存し、また沈殿するポリマーペレットの温度及びサイズは、浴の濃度、反応温度、及びＮａＯＨ注入の再現性に応じて変化するので、標的密度は、一貫性がない。
【００１１】
ｂ．ポリマーペレット上の利用可能なペプチドの濃度は未知であるので、既知の反応性（染色密度）の標的の構築は、限定される。その結果は、一次抗体検出のはい／いいえのみである。
【００１２】
ｃ．デキストランは、二次ＩｇＧ標的に関するタンパク質の捕捉をサポートし得る一方で、それは、はい／いいえの結果に限定される。したがって、ベースラインの検出ルーラーは、デジタルイメージングをサポートするように確立することができない。
【００１３】
ｄ．標的は、抗原賦活化中のタンパク質／ペプチドを、残存するスライド及び組織切片上に漏出させる。標的は、組織切片上に配置され、したがって、処理中には、バックグラウンド及び標的由来の組織汚染が存在する。
【００１４】
特許文献１に類似した対照スライドを作製するが、標的は、非常に異なって構築されるHorizon Diagnostics社を参照してもよい。標的は、所望の抗原ペプチドを元より細胞に配置させるように修飾されたＤＮＡを有する組織培養細胞系統から作製される。これらの細胞系統は、望ましい場合には複製させることができ、「再生可能供給源」と称される。細胞は、ホルマリン中に固定されて、遊離細胞スラリーとして組織ブロックへとパラフィン包埋される。使用時に、標的は、同じ切片内に陽性及び陰性の反応性標的の混合物を産生するように、非反応性細胞を含み得る。標的アレイを産生するために、細胞群はそれぞれ、他のコアと連携した円筒コアとして形成させることができ、アレイ全体は、スライドへの適用のために単一切片として切断される。
【００１５】
上記発明によって下記の問題点が報告されており、それらを以下で列挙する。
【００１６】
ａ．反応性標的部位密度について未知のことが多すぎるので、対照は、単にはい／いいえの結果に限定される。簡単に述べると、細胞全体にわたって、断面のスライスを変化させることによって、染色強度の結果が変化する。細胞ブロックは、抗原賦活化プロセスを経由しなくてはならないため、抗原の存在が何であれ、抗原賦活化プロセスを経ることで影響を受け、未知の変化を生ずる。
【００１７】
ｂ．既知の細胞の混合物（抗原対ブランク）を形成することは、細胞上の静電的な電荷が異なるため、それらが分離し、類似のもの同士がまとまるため、切片を切断する場合には統計的に有効ではない。したがって、細胞ブロック全体にわたる切片間では、比が可変的であり、抗原密度スケールの発生を見込みがないものにする。
【００１８】
ｃ．細胞の再生は、複製寿命が限定されるため、一貫性がない細胞系統の性能が見られる。新たな細胞系統が、任意のこれまでの細胞系統と同じ抗原密度を有する保証はない可能性がある。
【００１９】
ｄ．組織ブロックを構築して、ブロックを切開して、切片をスライドに適用するための手動による大変な労力のため、コスト効率が良くない。
【００２０】
特許文献２を参照してもよく、そこでは、顕微鏡スライド上に載せた細胞及び組織に関して実施されるアッセイ用の対照及びキャリブレーターとして機能を果たす方法及び装置が開示されている。装置は、透明な球状ビーズ等の粒子状の物体に連結されたペプチドエピトープ等の品質管理部分を含み、ビーズは好ましくは、ほぼ細胞のサイズである。品質管理部分は、アッセイにおいて、分析物と類似した様式で挙動するように設計され、陽性アッセイ反応をもたらす。ビーズは、新規液体マトリックスによる染色の工程中、顕微鏡スライド上に保持され、それは、乾燥時に凝固して、ビーズを顕微鏡スライドに付着させる。
【００２１】
この対照及びキャリブレーターの解決法は、興味深いが、基板に対する標的の安定性が弱く、低密度で置かれるコーティングされたビーズ上に、標的材料が存在するため、標的データを抽出するのが困難であるので、実際の使用には非実用的である。単一ビーズをイメージングする場合、染色カラーは、ビーズの最上部の中心から、ビーズの縁へと変化し、したがって、ビーズの表面のどの点の画像データが正しいかを知ることは困難である。
【００２２】
特許文献３を参照してもよく、そこでは、アッセイプロセス、特に多段階免疫組織化学的アッセイで使用される試薬の品質を決定するためのデバイス及び方法が開示されている。特に、デバイスは、複数の化合物が付された基板を含み、該化合物はそれぞれ、アッセイで使用される試薬と反応性である。
【００２３】
上記特許文書に開示される免疫染色は、ＩＨＣ処理を経る組織切片をサポートするためではなく、二次染色キットの挙動を評価するための品質管理スライドと意図される。スライド基板は、標的のいずれかに関して抗原賦活化処理を経ることが可能な共有結合をサポートすることができないアミノ−シランであった。さらに、アルカリホスファターゼ標的は、抗原賦活化温度への曝露により機能停止する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２４】
【特許文献１】中国特許１０２４３５７２８号
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１６／０２７４００６号
【特許文献３】米国特許第７２７１００８号
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Use of cultured cells as a controlfor quantitative immunocytochemical analysis of estrogen receptor in breastcancer. The Quicgel method
【発明の概要】
【００２６】
概して、本発明の一態様は、免疫組織化学的染色用のプロセス記録スライドを提供する。
【００２７】
本発明の更なる別の態様は、パラフィン除去、抗原賦活化、並びにアッセイプロセス、特に多段階免疫組織化学的（ＩＨＣ）アッセイで使用される一次染色試薬及び二次染色試薬の効率を決定するためのデバイス及び方法を提供する。
【００２８】
更に別の態様において、本発明は、２Ｄ配置又は３Ｄ配置でドットとして適用され、またパラフィンコーティング下で封止される複数の化合物を含有する接着剤コーティングされた顕微鏡を包含するデバイスを提供する。
【００２９】
別の態様において、本発明は、組織切片又は遊離細胞が、続いて同じスライドに適用されて、全てが、組織捕捉からカバーガラスの適用までのＩＨＣ処理工程を受けるプロセス記録スライドを提供する。
【００３０】
更に別の態様において、本発明は、化合物が、一次ＩＨＣ染色試薬又は二次ＩＨＣ染色試薬のいずれかと反応して、共在する組織切片又は遊離細胞の受けた処理を記録するプロセス記録スライドを提供する。
【００３１】
更なる別の態様において、本発明は、一次標的が、担体タンパク質上のコンジュゲートされた抗原で構成されるプロセス記録スライドを提供する。
【００３２】
別の態様において、本発明は、一次標的が、異なる抗原とコンジュゲートされた他の担体タンパク質とブレンドされる担体タンパク質上のコンジュゲートされた抗原で構成されて、多重捕捉能力を有する標的を形成するプロセス記録スライドを提供する。一度に１個のみを使用することができるが、上記方法は、スライド上の一次標的の物理的な数を超えて、一次標的の数を拡げる。
【００３３】
更に別の態様において、本発明は、一次標的が、他の非反応性タンパク質とブレンドされる担体タンパク質上のコンジュゲートされた抗原で構成されて、同じ抗原の勾配密度アレイ全てを生じるプロセス記録スライドを提供する。
【００３４】
別の態様において、本発明は、二次標的の２つのアレイが使用されるプロセス記録スライドを提供し、ここで、一方のアレイはマウスであり、他方のアレイはウサギである。
【００３５】
更に別の態様において、本発明は、二次アレイが、２Ｄ／３Ｄ  １００％濃度の標的と併せて１０％〜１００％濃度の２Ｄ勾配密度アレイとして基板に適用されるプロセス記録スライドを提供する。
【００３６】
具体的には、本発明によれば、二次アレイの外挿が、利用可能な場合には、一次アレイに支援されて、共在する組織切片上での各抗原濃度を客観的に測定するためのスケール又はルーラーを作成するプロセス記録スライドが提供される。受けたＩＨＣ染色は、共在する組織切片又は遊離細胞で永続的にロックされるようになり、ＩＨＣプロセスのＱＣ及び抗原密度の客観的な測定をサポートする。
【００３７】
特に、本発明は、下記の実施の形態を含む。
【００３８】
１．免疫組織化学的染色用のプロセス記録スライドであって、
任意選択で、スライドタイプを識別するスライドラベル領域の最上部上のマーク及び一次標的によってサポートされる抗原を識別するコードと、
任意選択で、スライド上に印刷されたラベル直下のロット番号と、
組織切片が、ＩＨＣによる処理に、続いて検査に適用されるスペースと、
組織切片より下に位置するＩＨＣ標的と、
タンパク質アレイの片側に位置付けられるイメージング参照ドットと、
任意選択で、ガラス顕微鏡コーティングと、
を含む、免疫組織化学的染色用のプロセス記録スライド。
【００３９】
２．標的の組合せは、二次単独、二次＋抗原賦活化モニター、又は二次＋抗原賦活化モニター＋一次抗原であり得る、実施の形態１によるプロセス記録スライド。
【００４０】
３．組織切片は、任意の生物学的起源から選択される組織切片用の上記スペースに適用され得る、実施の形態１によるプロセス記録スライド。
【００４１】
４．二次ＩＨＣ  ２Ｄ標的は、ホルマリン及び（ａ）１００％から１０％のマウス濃度の勾配密度シリーズを形成するマウスタンパク質及びロバタンパク質及び（ｂ）１００％から１０％濃度のウサギの勾配密度シリーズを形成するウサギタンパク質及びロバタンパク質の４％混合物で構成される、実施の形態１によるプロセス記録スライド。
【００４２】
５．二次  ＩＨＣ  ３Ｄ  １００％標的は、骨格としての多糖及び実施の形態４Ａの（ａ）マウスタンパク質及び（ｂ）ウサギタンパク質の１００％混合物の混合物で形成される、実施の形態１に記載されるプロセス記録スライド。
【００４３】
６．広範な抗原賦活化モニター標的は、２つの配置：（ａ）２％ホルマリン固定を用いた２Ｄ及び（ｂ）６％ホルマリンで過剰固定される（over fixed）、多糖を用いて３Ｄで付着される１００％マウスタンパク質及びウサギタンパク質の５０：５０ブレンドである、実施の形態１に記載されるプロセス記録スライド。
【００４４】
７．一次ＩＨＣ  ２Ｄ標的は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）等の担体タンパク質に共有結合されて、これを中性ＫＬＨタンパク質及び４％ホルマリンと混合して３倍〜５倍希釈の勾配密度シリーズを作製することができる、又は異なる抗原に結合されたＫＬＨタンパク質と混合して多抗原標的を形成することができる、実施の形態１に記載されるプロセス記録スライド。
【００４５】
８．イメージング参照ドットは、白色イメージング参照及び黒色イメージング参照である、実施の形態１によるプロセス記録スライド。
【００４６】
９．ガラスに共有結合されて、アミン、アミド、カルボキシル、及びヒドロキシルからなる群から選択される反応性末端基に適合して、またわずかに親水性である生体接着剤でコーティングされたガラス顕微鏡スライド、例えば、Thermo-Fisher社のＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔ  Ｐｌｕｓ  ＃ＧＬ４９５１Ｐである、実施の形態１によるプロセス記録スライド。
【００４７】
１０．標的は、組織切片と共在する標的である、実施の形態１によるプロセス記録スライド。
【００４８】
１１．実施の形態１によるプロセス記録スライドを用いた免疫組織化学的染色方法であって、下記の工程：
ａ．パラフィンを、パラフィンに包埋された組織切片及びＰＲＳ標的上のパラフィン保護コーティングから除去する工程と、
ｂ．ホルムアルデヒド固定を除去して、抗原賦活化緩衝液によって組織切片の抗原部位を露出させる工程と、
ｃ．１個又は２個のコンジュゲートされた一次抗体を適用して、組織切片又は一次抗原標的部位のいずれかに見られる任意の適合性抗原部位に結合させる工程と、
ｄ．染色試薬を、工程（ｂ）で得られる露出された抗原部位に適用して、標的とされる抗原の存在の可視的なカラー表示を生み出す工程と、
ｅ．任意選択で、十分な密度の色素を得る多段階増幅工程と、
ｆ．ヘマトキシリンを使用して、対比カラー（青色）を提供し、物理的な形態を可視的にさせる工程と、
ｇ．スライドをカバーガラスで覆うことで、最終的な検査の準備をする工程と、
を含む、方法。
【００４９】
１２．工程（ａ）におけるパラフィンの除去は、６５℃〜７５℃の範囲の温度で、３分〜１０分間、前記パラフィンを加温して、半液化状態のパラフィンを得ること、続いて、緩衝溶液中で再水和されるまで、一連の有機溶媒を用いて液化することによって実行される、実施の形態１１による方法。
【００５０】
１３．前記有機溶媒は、脂肪族溶媒をはじめとする一連の溶媒、例えば、キシレン又はキシロール、無水エタノール、９５％エタノール、７０％エタノール、５０％エタノール、及び塩ベースの緩衝溶液から選択され、それぞれ、公称３分の曝露時間を有する、実施の形態１１及び１２による方法。
【００５１】
１４．ホルムアミドの固定は、熱処理エピトープ除去（ＨＩＥＲ）プロセス等の抗原賦活化プロセスによって、又は多くの水交換を用いたより長い温蒸留水による抗原賦活化プロセスによって除去され得る、実施の形態１１による方法。
【００５２】
１５．工程（ｄ）で利用される二次染色試薬は、酵素標識された二次抗体、酵素標識された二次抗体と反応する酵素標識された三次抗体、二次抗体と反応するＡＰＡＡＰ免疫複合体、ビオチン化二次抗体と反応する酵素標識された（ストレプト）アビジン、ビオチン化二次抗体と反応するアビジン又はストレプト−アビジン−ビオチン−酵素複合体、一次抗体上のビオチン化二次抗体上のストレプトアビジン−酵素複合体、並びに二次抗体及び一次抗体に結合された酵素部位を含有するポリマーから選択され得る、実施の形態１１による方法。
【００５３】
１６．利用される前記抗原賦活化緩衝液は、６〜９のｐＨ範囲から選択され得る、実施の形態１１による方法。
【００５４】
１７．工程（ｃ）における前記一次抗体は、宿主タンパク質が、マウス又はウサギのいずれかである抗体から選択され、一般的な例として、ＥＲ、ＰＲ、Ｈｅｒ２、Ｋｉ６７が挙げられる、実施の形態１１による方法。
【００５５】
１８．色素原は、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ＤＡＢ＋ニッケルエンハンサー、ファストレッド、ＴＭＢ、ステイイエロー、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ、ＢＣＩＰ／ＴＮＢＴ、ナフトールＡＳ−ＭＸホスフェート＋ファストブルーＢＢ、ナフトールＡＳ−ＭＸホスフェート＋ファストレッドＴＲ、ナフトールＡＳ−ＭＸホスフェート＋ニューフクシン、ステイグリーン及びＮＢＴから選択され得る、実施の形態１１による方法。
【００５６】
１９．コスト効率が良く、再現性があり、安定であり、誤診を招くＩＨＣ処理工程の識別を補助する、実施の形態１１に記載の方法。
【００５７】
２０．共在する組織切片又は遊離細胞上での抗原濃度に対するプロセス管理のための定量的な基準として利用される、実施の形態１１による方法。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】図１は、本発明の一実施形態により利用され得る様々な一次標的及び二次標的を表す図である。
【図２】図２Ａは、製造したままの本質的なスライドを示す図である。スライドは、彩色されたラベル領域におけるブランク領域とともにロットコード番号による最小ＩＤを有する。標的ドットの領域を超えて拡がる２つの太い彩色された長軸のバーが存在する。バーは、どのようにしてラベルプリンターが、スタックの最下からスライドを分配するかに対処するために最近追加したものである。バーは、上記スライドのスタックが、スライドコーティング、より重要なことには、パラフィン保護コーティング及びパラフィンより下の標的ドットに損傷を与えないことを保証する。図２Ｂは、スライドが、ラベル領域において印刷されたその受け入れ（accessioning）データ：日付及び２Ｄバーコードを有し、また組織切片が捕捉された後に見られるような本質的なスライドを示す図である。組織切片は、まさにパラフィンワックスの一部分として現れることに留意されたい。組織は、非常に透明であり、したがって、パラフィンのカラーが優位である。「患者の組織」、「対照標的」という文字列は、スライド上に印刷されず、読者に、パラフィンで覆われた領域がどれであるかを知らせるために存在する。図２Ｃは、ＩＨＣ処理後に見られる本質的なスライドを示す図である。標的及び組織切片はともに、ここでは可視的であり、解釈の準備が整っている。
【図３】図３は、ＡＲ損傷の影響に関する精密な表示である。
【図４】図４は、明るさレベルが暗すぎるもの（最適から−５％）、最適なもの（＋０）、及び（＋１０％又は＋１５％）のように明るすぎるものである場合の画像への影響を示す図である。
【図５】図５は、パラフィン保護が、どのようにしてその付着物の縁でシールを保証するかを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、本開示の一部をなす本発明の以下の詳細な説明を参照することにより、より容易に理解され得る。本発明は、本明細書で記載されるか、及び／又は、示される特定の装置、方法、条件、又はパラメータに限定されるものではなく、本明細書で使用される専門用語は単なる例であり、特許請求する発明の限定を意図するものではないと理解されるべきである。また、添付の特許請求の範囲を含む明細書で使用される数量を特定していない単数形（'a', 'an', and 'the'）は、複数形を含み、特定の数値に対する言及は、内容により明確に異なることが指示されない場合は、少なくともその特定の数値を含むものである。本明細書中、他の実施形態において表現されている場合は、範囲は、「約（about）」又は「およそ（approximately）」他の特定値からと表現してもよい。また、特段の指示がない限り、本明細書で言及する寸法及び材料特性は、限定的なものではなく例示であり、好適に実用できるサンプル実施形態をより理解するためのものであり、言及した値を外れる変形形態も、特定の用途によって本発明の範囲に含まれ得ると理解されるべきである。
【００６０】
本発明は、その適用において、以下の記載において明示する、又は以下の記載において説明される、又は図面において説明される構造の詳細及び構成要素の配列に限定されるものではない。本発明においては、他の実施形態が可能であり、種々の方法で実施又は実行することができる。また、本明細書で使用の用語及び専門用語は、説明を目的として使用されており、限定的に解釈されるべきではない。「含む（including）」、「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」、「伴う（involving）」、及びこれらの変化形の使用は、追加の項目を含む。
【００６１】
ここで、本発明の好ましい実施形態に対して詳細に言及する。好ましい実施形態の例が添付の図面で図示される。可能な限り、図面及び明細書で使用する同じ参照符号は、同じ部品か、又は同様の部品を指す。
【００６２】
定義
本明細書中で使用する場合、「顕微鏡スライド」とも称される「スライド」という用語は、顕微鏡下での検査用に物体を保持するのに使用される、通常７５ｍｍ×２６ｍｍ（３インチ×１インチ）及び約１ｍｍ厚の薄く平坦なシート片（通常、ガラスで作製される、したがって、場合によっては「スライドガラス」とも称される）を意味する。
【００６３】
本開示におけるスライドは、「プロセス記録スライド（ＰＲＳ）」とも称され、それは、区別なく、ＰＲＳ−ＩＨＣスライドと称されてもよい。
【００６４】
「検出領域」という用語は、本明細書中で使用する場合、任意の生物学的起源の組織及び遊離細胞等の検体が、続く免疫組織化学的又は免疫化学的検出のために配置されるスライドにおけるスペースを指す。
【００６５】
「対照領域」という用語は、本明細書中で使用する場合、一次標的アレイ及び二次標的アレイ、イメージング参照及び抗原賦活化モニターから選択される１個以上を含む、抗体賦活化状態、一次抗体試薬効率、及び二次試薬効率を評価するための既知の反応性挙動を有する標的を保持するスペースを指す。
【００６６】
「検出領域」及び「対照領域」は、スライド上で明確な境界を有する場合があり、又はそうでない場合もあり、好ましくは、「検出領域」及び「対照領域」は、それらの機能に基づいてのみ分類されることに留意されるべきである。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、「一次標的」という用語は、ＩＨＣアッセイ用の一次抗体が結合することができる標的を意味する。また、この用語は、抗体によって認識され得る任意の特に指定しない抗原ペプチド断片を指し得る。抗原ペプチド断片のタイプは、ＩＨＣプロセスで使用される一次抗体によって決定され、続いて所望の一次標的アレイ（複数の場合もある）を得るために担体タンパク質とコンジュゲートされ得る。或いは、一次抗体は、続く使用のために、共通の抗原ペプチド断片を用いて前もって調製される。
【００６８】
「抗原ペプチド断片」という用語は、本明細書中で使用する場合、抗原タンパク質と同じか、又はほぼ同じ抗原特異性を有する抗原タンパク質の完全長又は一部、及びハロゲンを指す。
【００６９】
本明細書中で使用する場合、「二次標的」という用語は、ＩＨＣプロセスで使用される二次抗体が結合する標的を意味する。通常は、二次抗体は、ＩＨＣにおいて一次抗体に結合し、したがって、二次抗体は通常、マウス及びウサギ等の異なる起源のＩｇＧを含む。
【００７０】
「宿主タンパク質」という用語は、マウス、ラット、ウサギ及びヤギタンパク質（ＩｇＧ）等の一次抗体と同じ起源を有するタンパク質（特に、ＩｇＧ）を意味する。
【００７１】
「ダミータンパク質」という用語は、二次抗体と非反応性であり、勾配希釈物を得るために宿主タンパク質と混合するのに使用されるタンパク質を意味する。好ましいダミータンパク質は、ロバタンパク質（ＩｇＧ）又はウマタンパク質（ＩｇＧ）である。
【００７２】
本明細書中で使用する場合、「ローディングドット」という用語は、区別なく「ドット」とも称され、この用語は、所望のペプチド又はタンパク質をスライド上に固定することによって形成される実体を意味する。「ドット」は、円、楕円、正方形、菱形等の任意の形状であり得るが、それらに限定されない。
【００７３】
スライド
免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色は概して、患者の組織切片における特定の抗原部位の存在を評価するために用いられる。異常状態又は癌性状態の診断レベルを割り当てるために、主観的解釈が組織切片上での染色密度に対して適用される。概して、ＩＨＣ処理が常に正確に機能し、組織切片が異常状態又は癌性状態を存在する場合にそれらを特定する可視色素原マーカーで標識されると仮定される。しかしながら、抗原賦活化が失敗する又は染色試薬に欠陥があると、アーチファクトを特定するシグネチャは残らない。このため、有効な診断判定を実験助手又は病理学者に委ねることができない可能性が大きい。言い換えると、物理的形態が異常状態を示すのに十分ではなく、抗原部位が標識されず、スライドによりヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）スライド上で見られる以上のものが提供されない可能性がある。
【００７４】
本発明の一実施形態は、区別なく「プロセス記録スライド」と称され得る新規の接着剤コーティングされたスライドを開示する（これ以降、接着剤コーティングスライドは、同じ範囲及び意味を提供するプロセス記録スライドと称され得る）。上述の「プロセス記録スライド−免疫組織化学的」（ＰＲＣ−ＩＨＣ）スライドは、抗原賦活化状態、一次抗体試薬効率、及び二次試薬効率を評価するための既知の反応性挙動を有する標的を組み込む。本発明の別の実施形態において、一次抗原標的部位は、脱パラフィン、抗原賦活化プロセス、一次抗体性能、沈殿した色素原に対する二次増幅、及びカバースリッピングの累積結果であるが、これらに限定されない。本発明の更なる別の実施形態において、二次標的部位は、一次抗体試薬の性能よりも一次抗原標的の累積結果であるが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明の別の実施形態において、上述の染色された二次標的群の部位は、一次部位の抗原密度が客観的に確立され得るベースラインを提供する。二次タンパク質アレイそれぞれの１個の成員もまた、３Ｄスカフォールドとして多糖を使用して、３Ｄ標的として印刷され得ることに留意することは妥当である。さらに、同濃度の２Ｄ標的と３Ｄ標的との間の色素原沈殿の比は、一次抗原アレイに適用されて、３Ｄ材料上の抗原濃度の客観的な測定を可能にし得るスケール要素を確立する。色素原沈殿の測定として３Ｄ抗原密度を同定することで、スケール又はルーラーを共在する組織切片に適用して、組織切片において抗原の存在を客観的に定量化し得る。二次反応性標的及び一次反応性標的の両方の存在は、染色試薬の生存度の同定及び抗原賦活化プロセスによるアンマスキングにおいて、極めて重要な役割を果たす。上述の工程又は試薬のいずれかにおける欠陥は、ＰＲＳ標的において容易に同定可能な場合があり、そのため誤診を知らせる可能性が高いことが強調されるべきである。
【００７６】
免疫組織化学的実験プロセスで用いられる考え得る標的を示す図１について言及し得る。
【００７７】
接着剤コーティングされたスライド又はプロセス記録スライドの構造を示す図２について言及してもよく、ここで、ＩＨＣ標的は、タンパク質が、標的材料から放出されて組織切片まで掃引され、捕捉され得る可能性を低減させるため、組織切片より下に位置付けられる。標的の最上行は、マウス勾配密度アレイであり、中央行は、ウサギ勾配密度アレイである。最下行は、１２個の標的をサポートし、１２個の標的は、一次抗原又は一次抗原の混合物若しくは組合せであり得る。黒色イメージング参照ドット及び白色イメージング参照ドットは、二次タンパク質アレイの左側に存在する。顔料標的のちょうど右に、３Ｄマウス標的及びウサギ標的が存在する。二次、及び全ての一次標的の残余は、２Ｄ配置である。本発明の別の実施形態において、使用可能なガラス顕微鏡スライド接着剤コーティングは、Thermo-Fisher社のＳｕｐｅｒＦｒｏｓｔスライド、ＧＬ４９５１Ｐ上に見出される。更に別の実施形態において、最適な接着剤コーティングされたスライドは、ガラスに共有結合すること、及び２個以上（−ＲＯＨ、−Ｒ（Ｃ＝Ｏ）ＯＨ、−ＲＮＨ３、−Ｒ（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２、及び−ＲＮＨ２）の末端基（しかし、これらに限定されない）を、生体材料に提示し、製造時に表面の濡れ性に関して調節可能であるという特性を有する。
【００７８】
本発明の一実施形態において、上述の「プロセス記録スライド−免疫組織化学的」（ＰＲＳ−ＩＨＣ）スライドは、抗原賦活化状態、一次抗体試薬効率、及び二次試薬効率を評価するための既知の反応性挙動を有する標的を組み込んでもよい。一次抗原標的部位は、脱パラフィン、抗原賦活化プロセス、一次抗体性能、沈殿した色素原の二次増幅、及びカバースリッピングの累積結果である。二次標的部位は、一次抗体試薬の性能よりも一次抗原標的の累積結果である。
【００７９】
本発明の別の実施形態において、上述の接着剤コーティングされたスライド又はプロセス記録スライドの構造に適合して、上述のＰＲＳ−ＩＨＣスライドは、黒色イメージング参照標的及び白色イメージング参照標的を含む勾配密度アレイにおいて、生物学的物質ベースの標的を組み込む。標的が、生物学的起源である場合、パラフィンの薄いフィルムは、酸化及び微生物攻撃を防御するために塗布されてもよい。パラフィンフィルムは、組織切片の包埋用パラフィンが除去される工程と同じＩＨＣ処理工程で除去されてもよい。ＰＲＳ−ＩＨＣは、組織捕捉からカバースリッピングまでの同じ過程を経て、ＩＨＣプロセスを記録して、永久に組織切片とともに存在することが、強く強調される。受けた処理が既知であり、記録され、利用可能である場合には、セカンドオピニオン及び遠隔診断（tele-diagnostic）が実行可能となる。
【００８０】
本発明の一実施形態において、接着剤コーティングされたスライド又はプロセス記録スライドは、対照が患者の材料と共在する一助となり、その結果、接着剤コーティングされたスライド又はプロセス記録スライドは、ラボ情報システム（ＬＩＳ）で起こり得るように、入れ替わる及び損失する可能性はない。したがって、対照は、生物学的材料の捕捉から、カバースリッピングの完了までの全ての過程を必ず経る。
【００８１】
本発明の別の実施形態において、接着剤コーティングされたスライド又はプロセス記録スライドは、再現性があり、経時的に安定であり、それぞれ勾配密度アレイとして１個以上の抗原をサポートし、ＩＨＣスライドの現在の処理に対して安定であり、コスト効率が良い。プロセス記録スライドは、プロセス管理及び共在する組織切片又は遊離細胞上の抗原濃度に関する客観的測定のための定量的な基準を提供し、ここでマウスタンパク質及びウサギタンパク質が、勾配密度アレイに役立つ。
【００８２】
本発明の一実施形態において、ＩＨＣ染色プロセスの工程は、接着剤コーティングされたスライド又はプロセス記録スライドにおいて実行される免疫組織化学的染色の洞察に関して記載され得る。固定された組織切片は、パラフィンに包埋され、まずパラフィンを半液体状態に加温することと、続いてキシレン（又はキシロール）、続いて徐々に希釈したエタノール洗浄液、最終的には緩衝溶液により液化することによって、パラフィンは除去されて、切片の細胞構造を露出させなくてはならない。次に、ホルムアミド固定は、抗原部位を露出させるのに除去されなければならない。最も一般的には、固定は、熱処理エピトープ賦活化（ＨＩＥＲ）プロセス又は遥かに長い温水抗原賦活化プロセスのいずれかによって除去される。ＨＩＥＲプロセスは、熱（最適には、８９℃、かつ９５℃以下）を加えることにより、ホルムアルデヒドと組織との間のシッフ塩基結合を破壊する一方で、組織は、緩衝液試薬（組織タイプに応じて、ｐＨ６〜ｐＨ１０）に曝露される。この時点で、抗原部位は露出されて、染色試薬が適用されて、標的とされる抗原の存在の可視的なカラー表示を生み出すことができる。水ベースの抗原賦活化プロセスは、包埋用パラフィンの融点よりも約１０℃高い温度、すなわち約６０℃〜６５℃で作用する。石鹸及び多くの連続的な洗浄により、パラフィンは徐々に溶解されて、除去される。パラフィン除去及び固定回収におけるオペレーター又は処理の欠陥は、染色プロセスを阻止して、偽陰性の結果をもたらす。
【００８３】
抗原部位が、ホルムアミド固定からアンマスキングされると、１個又は２個のコンジュゲートされた一次抗体試薬が適用される。これらは、組織切片又はＰＲＳ一次抗原標的部位のいずれかにおいて見出される任意の適合性抗原部位に結合する。一次抗体は、マウスタンパク質又はウサギタンパク質上にコンジュゲートされ、続いて、二次染色試薬からの作用を受ける。
【００８４】
本発明の別の実施形態において、人による目視検出用の色素の十分な密度を達成するために、多段階増幅プロセスを実行してもよい。１工程から３工程増幅に及ぶ様々な二次検出キットが存在する。全て、色素原沈殿の同じ最終状態に達する。通常、３個の一般的に使用される二次染色群のうちの１個又は２個、及び幾つかの対染色剤の１個が使用される：ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼ及び核対比染色剤。利用することができる考え得る沈殿した色素原のカラーは、下記のリストから選択することができるが、これらに限定されない。
【００８５】
ＨＲＰ
ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベンジン）＞＞褐色から赤褐色
ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカルバゾール）＞＞赤色
ＤＡＢ＋ニッケルエンハンサー＞＞黒色
ＴＮＢ（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン）＞＞青色
ステイイエロー＞＞黄色
【００８６】
ＡＰ
ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ホスフェート）／
（ニトロブルーテトラゾリウム）＞＞青色
ナフトールＡＳ−ＭＸホスフェート＋ファストブルー＞＞青色
ナフトールＡＳ−ＭＸホスフェート＋ファストレッド＞＞赤色
ナフトールＡＳ−ＭＸホスフェート＋ニューフクシン＞＞赤色
ステイグリーン＞＞緑色
グルコースオキシダーゼ＞＞青色
【００８７】
核染色
ヘマトキシリン（最も一般的に使用される）＞＞青色
【００８８】
ＤＡＢは、既知であり、米国で広く使用されている。世界の多くの他の地域は、代わりにＡＥＣを使用している。ＡＥＣの赤色の彩度が、ＤＡＢの茶褐色のカラーと比較すると低すぎることが、ＤＡＢを使用する人々がＡＥＣを拒絶する理由である。実験により、元のＤＡＢが短期間で著しく劣化して、その結果、彩度が４時間以内で著しく下がることが示されている。より新しい型のＤＡＢには、ＤＡＢの安定性を数時間から数日間延ばす安定剤が組み込まれている。ＤＡＢはまた、続く緩衝液洗浄サイクル中に洗い流される傾向を有する。他方で、ＡＥＣは、数週間から数ヶ月間、安定なままである。
【００８９】
世界中の規制基準は、確証された対照が、かかる技術が実行可能及び利用可能になってから、組織切片及び遊離細胞の処理の試薬、方法、及び器具類を検査するのに使用されることを求めているか、又は要求している。かかる規制管理は、結果を検証するために、また品質保証のために、血液学及び臨床化学に関して、長い間整備されてきた。対照実験の結果は、Levey-Jenningsのチャートの形態でプロットされる（Westgard et al. 1981）。Westgard J, Barry P, Hunt M, Groth T (1981) "A multi-rule Shewhart chart forquality control in clinical chemistry". Clin Chem27: 493-501。
【００９０】
本発明の別の実施形態において、上記で利用される対照は、前処理段階：脱パラフィン及び抗原賦活化によって著しく影響されてはならない。結果から、ＩＨＣ染色試薬の有効性が測定され、組織上の抗原濃度に関して組織切片に対して適用するためのスケール又はルーラーが作成される。幾つかの工程又は試薬の失敗が発生したことの同定の洞察を得ることは極めて重要であり、それは、誤診を防止するのを助ける。
【００９１】
本発明の別の実施形態において、上述の２Ｄ二次染色標的は全て、ホルムアルデヒドで固定される。二次標的を以下に列挙する：
１０％〜１００％のマウス２Ｄアレイ、３Ｄ＠１００％、
１０％〜１００％のウサギ２Ｄアレイ、３Ｄ＠１００％。
【００９２】
２Ｄ二次染色標的は、一方はマウス＋ロバ及び他方はウサギ＋ロバであるタンパク質勾配密度アレイを組み込む。勾配スケールは、１０％密度〜１００％密度の既知のプロファイル曲線に従う。ロバは、二次染色キットにおいて場合によっては発生する非特異的な染色をサポートしないため、より一般的に使用されるウシを上回って使用されている。ＡＢＣ二次染色キットは、第２の染色試薬（抗ヤギを含有する）とともに、第１の工程試薬としてヤギ−抗−（マウス又はウサギ）を使用する。ヤギは、第２の工程二次染色試薬の捕捉をサポートするウシと種が非常に近い。ロバ又はウマ科内の他のものは、この意図的ではない反応を回避する。
【００９３】
本発明の別の実施形態において、異なる二次染色及び沈殿した色素原は、タイプ及び供給業者間で、カラー密度が大幅に異なる。この変動を説明するために、２Ｄ勾配密度アレイは、色素原密度と、マウスタンパク質濃度及びウサギタンパク質濃度との関連性を形成する。二次勾配アレイ混合物が、絶対濃度スケールを生成できる一方で、それは、スライドコーティングの物理的な構造を説明することができない。ＨＩＥＲ処理全体にわたって親水性の挙動及び組織保持の両方を示すＩＨＣスライドは全て、多孔度要素を有する。組織切片に関して、これは、切片の表面上の切開用の刃及びスライド表面にわたって拡がる試薬によって引き起こされる物理的な不規則性に一致し準拠したスライドコーティング以外は重要ではない。しかしながら、タンパク質に関して、多孔度及び濡れ性の変数は、空隙を充填するのにどれくらい多くの付着物が必要とされるか、またどれくらい有効な表面積が、表面最上部に存在するかに影響をもたらす。多孔度は、スライド間で可変的であるが、任意の１個のスライド上では非常に均質である。個々のタンパク質一次希釈は、２８０ｎｍでその吸光度によって評価される。続いて、データを使用して、付着されたタンパク質アレイ標的混合物を配合して、異なるＩｇＧロット間で一貫した性能を保証する。全ての二次標的は、ホルムアルデヒドで固定される。
【００９４】
本発明の別の実施形態において、２Ｄ一次抗原染色対照は、システイン残基及びスルホ−ＳＭＣＣ架橋を用いて担体タンパク質にカップリングされた所望の抗原のペプチド鎖を使用する。ここで、コンジュケートされた担体タンパク質は、ダミータンパク質とブレンドされて、濃度を調節する。一次抗原標的は全て、ホルムアルデヒドで固定される。一次標的は、２つの形態で産生され得る。
【００９５】
ａ．最大密度が、抗体が、５０％濃度で第２を結合する能力を超える勾配密度対。標的対はそれぞれ、唯一の反応性抗原を組み込む。
【００９６】
ｂ．全てが最大密度の、各標的が最大１０個の異なる抗原で構成される抗原標的のアレイ。各標的における抗原タイプの混合物は、唯一の抗原が、使用中に反応性であるようものである。
【００９７】
抗原は、システイン残基を有するペプチド鎖で構成され、スルホ−ＳＭＣＣで予め活性化された担体タンパク質に共有結合される。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は、あらゆるヒト抗体とのその非反応性及びスルホ−ＳＭＣＣをサポートすることが可能な部位の範囲が既知のため使用される。等価な性能を有する他の類似したタンパク質を使用することができる。
【００９８】
ペプチド鎖は抗原のほんの短いセグメントであるため、ペプチド鎖を使用することに関して潜在的な懸念事項が存在する。抗体が、マッチとして構成されない場合は、抗体が、組織切片又は遊離細胞上の抗原に正確に結合するとしても検出されない。したがって、幾つかの抗体に関して、一次標的は、最大１０個の異なる抗原セグメントをサポートしなくてはならない。ほとんどのラボが、７５個〜１００個の異なる抗原を使用している。多くのラボが、使用する着色剤とまとめて、一次抗体及び二次染色を使用することを選択している。完全抗体の断片である抗体に関して、接合（mating）抗原は、非常に特異的である。着色剤供給業者は、業者自体の抗体を大規模に開発するため、ＰＲＳは、上記のオプションＢを使用して、各着色剤試薬一式をサポートするため、より良好に市場に貢献する。
【００９９】
しかしながら、新たな抗体を開発する場合、多重抗原配合物を試験して、最適な検出条件に達することが、非常に重要である。これは、最適な抗体濃度及び感度がどれほどであるかが未知であるので、上記オプションＡによってより良好に貢献される。
【０１００】
本発明の別の実施形態において、３Ｄ標的が、２Ｄ標的を変換する必要性は、組織切片に適用され得る測定につながる。組織切片及び細胞は全て、それらに対して４ミクロン〜１０ミクロンの高さを有する。抗原部位は、細胞構造上及び細胞構造内の至るところに存在することができる。垂直構造上に存在する抗原部位は、切片の最上部に位置付けられる酵素によって色素原が沈殿され得る相当な深さを有し得る。したがって、２Ｄタンパク質付着物上で起こり得るよりも、遥かに多い色素原が沈殿され得る。これが、２Ｄタンパク質及びペプチドベースの標的が、遊離細胞及び組織切片ほど暗くなり得ないことの理由である。
【０１０１】
ＤＡＢ試薬の劣化の影響は、染色結果を、短期間で相当量分シフトさせる。しかしながら、単純に３Ｄ抗原濃度スケールはＤＡＢ性能の変化に非依存性であるので、ＰＲＳ−ＩＨＣの解決法は、色素原沈殿のシフトの減少を補正することができる。タンパク質及び抗原標的アレイは、既知の濃度で構成されているため、染色の結果は、圧縮されているが、単に同じ関連性を伴ったままである。したがって、観察した強度（暗さ）が弱くなる一方で、スケールは、組織切片又は遊離細胞上の同じ抗原密度測定を提供し続ける。
【０１０２】
イメージング参照標的
２Ｄ二次タンパク質標的アレイ及び３Ｄ二次タンパク質標的アレイの他に、黒色イメージング参照標的及び白色イメージング参照標的が印刷される。
【０１０３】
染色された生体材料を含有する顕微鏡スライドのデジタルイメージングは、染色された材料に対するプレスクリーニング及び潜在的には完全な診断決定を実施するように発展しつつある。概して、デジタル画像が、白色境界又は黒色境界のいずれかで圧縮状態にないように、イメージングシステムは、照明光レベルを調節しなくてはならない。従来の解決法は、標識が位置すると予測される場所に位置付けられる黒色標的及び白色標的を有することである。白色標的及び黒色標的が、スライドが存在し得る極値を表すことが、基礎を成す前提である。しかしながら、黒色標的及び白色標的を有する場合、組織切片の染色によって実現され得るよりも、黒色は遥かに黒く、白色は遥かに白くなるため、デジタルスケールで圧縮状態になる。
【０１０４】
本発明の１つの好ましい実施形態において、患者の組織切片又は遊離細胞付着物と共在する対照及び参照標的標準物質を組み込んだ顕微鏡スライドが開示される。参照標的及び組織切片は、組織捕捉と染色されたスライドのカバースリッピングとの間に受けた処理を記録する。
【０１０５】
本発明の別の実施形態において、顕微鏡スライド標的アレイの中に、共在する黒色参照標的及び白色参照標的が存在する。黒色参照標的及び白色参照標的は、他の標的及び組織切片と同じ、試薬への曝露及び処理を受けた。
【０１０６】
本発明の別の実施形態において、参照標的の両方、即ち、黒色標的及び白色標的は、スライドを処理するのに使用される試薬のいずれにも非反応性である印刷された塗料付着物である。理想的な状況における白色標的は、完全な白色である。しかしながら、黒色から白色までの中間を過ぎるようになる染色された生体材料の有用性は、限りなく低い。したがって、白色は、完全な白色から５％〜１０％外れる場合があるが、依然として有用な値であり得る。好ましい実施形態において、白色は、太陽光に曝露されない場合、時間の経過に伴って安定である金属酸化物又は硫酸塩組成物の白色である。より好ましい実施形態において、白色は、酸化アルミニウム及び酸化チタンである。
【０１０７】
別の実施形態において、黒色標的及び白色標的はともに、公称３６５ｎｍでの直接ＵＶ光曝露によって触媒される無水物系エポキシ塗料基剤に基づいている。上記無水物触媒は、メチルテトラヒドロフタル酸無水物及びジフェニルヨードニウムヘキサフルオロひ酸塩で構成される。ＵＶによって反応開始することに加えて、無水物は、エポキシの架橋の触媒機能のために、熱の添加を必要とする。ＵＶによって反応開始する好ましい無水物及びその仲間を列挙するが、無水物製造業者を探せば他の可能な解決法を見つけることができる。かかる塗料／インクは、必要に応じて構築することができるが、通常は使用される印刷方法に関して最適化された市販成分である。塗料／インクの製造は、顔料粒子とエポキシバインダーとの間で良好な濡れを達成することの難しさに対処しなくてはならない。無水物系塗料（低粘度を有する場合にはインクとも呼ばれる）は、可使時間が持続期間数ヶ月であり得る場合、エポキシと無水物とを混合する場合が多い。粘度を下げることは、印刷産業に関わるものの既知の知識であり、配合物は、エポキシ混合物が適用される表面及び使用される印刷方法に応じて様々である。熱誘発性の無水物−エポキシ塗料／インクが一般的に使用される一方で、反応を開始させるのに必要な熱は、塗料／インクと共在し得る生体材料（タンパク質、ペプチド及び化学的標的）に潜在的に損傷を与え得る。
【０１０８】
別の実施形態において、無水物触媒は、アミノ−シランベースの触媒で見られる未反応アミンを排除する。排除されない場合、未反応アミンは非特異的な染色をサポートする。遊離アミン末端基は、生体材料及び特殊染色の幾つかの両方を捕捉することができ、また捕捉するであろう。具体的には、これは、スライド処理試薬、特に染色試薬による白色標的の望ましくない染色の問題に対処する。塗料／インクの表面上の遊離アミン末端基として、それは、一次抗体及び二次染色試薬の両方を捕捉することができ、染色されるようになる。したがって、スライド上に白色標的が組み込まれた価値を無効にする。
【０１０９】
別の実施形態において、黒色顔料は、直径２ミクロン未満のカーボンダストを使用する一方で、白色は、酸化アルミニウム、酸化チタン、又は硫酸バリウムビーズを使用し、好ましくは、白色は、硫酸バリウムを使用する。
【０１１０】
別の実施形態において、好ましいエポキシインク／塗料配合物は、完全に界面活性剤を回避して、これらのスライドが受け得る範囲の染色及び試薬に反応性であるインク／塗料を残すのを防ぐ。
【０１１１】
別の実施形態において、標的の印刷は、スタンプ台及びシリンジによって行われ得る。更に別の実施形態において、シリンジは、それが標的付着のより良好な形状及び大きさ（feature size）の管理をサポートするため好ましい。
【０１１２】
別の実施形態において、上述の白色標的は、無水物で触媒されるエポキシ内の金属酸化物又は硫酸塩色素で構成される。別の実施形態において、上述の黒色標的は、ＵＶによって反応開始する無水物で触媒されるエポキシ内の炭素色素で構成される。別の実施形態において、無水物触媒は、直接的なＵＶ光曝露によってＵＶによって反応開始される。ＵＶによって反応開始する無水物触媒を使用する主な利点は、無水物−エポキシ反応を開始させるのに必要な熱が、生体材料（タンパク質、ペプチド、及び化学的標的）が損傷なく許容し得るものを超えることである。染色試薬と反応し得る任意の遊離アミンの排除は、より重要である。
【０１１３】
保護コーティング
パラフィンワックスは概して、石油、石炭又はオイルシェールに由来する白色又は無色の軟質固体であり、２０個〜４０個の炭素原子を含有する炭化水素分子の混合物からなる。パラフィンワックスは、室温で固体であり、およそ３７℃（９９°Ｆ）を超えると融解し始め、その沸点は、３７０℃（６９８°Ｆ）を超える。パラフィンワックスの一般的な用途として、潤滑、電気絶縁、及びろうそくが挙げられ、染色されたパラフィンワックスは、クレヨンにすることができる。パラフィンワックスは、場合によってはパラフィンと呼ばれるケロシン及び他の石油製品と異なる。
【０１１４】
病理学研究室では、パラフィンワックスは、組織の薄い試料を切り分ける前に組織を含浸させるのに使用される。水は、濃度を上昇させるアルコール（７５％〜無水）により組織から除去されて、組織は、キシレン、又は脂肪族代替物の１つ、例えばキシロール等の有機溶媒中で透徹する。次に、組織は、パラフィンワックス中に数時間配置させた後、ワックスとともに型にはめられて、冷却されて、凝固されて、続いて、切片は、ミクロトームで切断される。
【０１１５】
組織切片をパラフィンに包埋することは、組織切片を長期間保存するために日常的に実施されている。しかしながら、顕微鏡スライドの選択領域上に薄いコーティング層としてパラフィンを塗布することは報告されていない。本発明において、顕微鏡スライド、ガラス又はプラスチック上に付着させた標的タンパク質は、細菌又は真菌という害をなすもの（antagonist）に対して豊富な食料源を提供する。さらに、タンパク質の抗原部位（例えば、エピトープ）は、検出抗体をタンパク質に結合させる能力を効果的に中和する酸化の影響を受けやすい。続く反応結合部位の多くは、ヒドロキシルであり、ヒドロキシルは、大気中の酸及び塩基との反応により損傷を受けるようになり得る。通常、タンパク質付着物を含有するスライドは、微生物の成長をサポートする温度未満の温度で保管される。しかしながら、かかる制約は、付着物の有効な利用を制限する。さらに、タンパク質が付着されたスライドは、真空封止した容器中にパッケージングされて、酸化の損傷を防ぐ。無保護のタンパク質が付着されたスライドは、外気温及び大気中の混入物質レベルに応じて、２日〜５日のオープンエアでの有効期限を有する。
【０１１６】
パラフィンは、抗原部位の酸化及び露出部位の大気中の酸／塩基分解を防止する抗真菌剤及び抗細菌剤を含有すると本質的に知られている。パラフィン保護コーティングは、３日〜５日から１年〜２年にまで、生体材料の生存寿命を変化させて、最終使用者にとって有用な製品寿命を可能にする。
【０１１７】
包埋用パラフィンの除去もまた、組織切片を、続く免疫組織化学的（ＩＨＣ）染色に曝露させるために日常的に実施されている。同じか、又は類似したパラフィン配合物を利用して、同じ顕微鏡スライド上で他の付着材料を保護することで、ＩＨＣ染色を開始する前に、更なるスライド処理が行われてはならないことが保証される。
【０１１８】
本発明の一実施形態において、パラフィンは、溶媒とブレンドされて、材料状態を、室温で固体から液体に変化させる。ブレンドは、Ｐｒａｐｌａｓｔ  Ｘ−ｔｒａ又は同等品を、キシレン又は脂肪族溶媒、例えばキシロールとともに使用して、粘度を低減し、付着後の凝固を減速させる。
【０１１９】
別の実施形態において、溶媒は、トルエン、塗料用シンナー、テレビン油、又はアセトン及びケロシンの５０：５０混合物から選択され得るが、これらに限定されない。具体的には、Ｐａｒａｐｌａｓｔ  Ｘ−ｔｒａは、ブチル化ヒドロキシトルエン、フェノール性酸化防止剤を組み込み、タンパク質、ペプチド、及び無機標的の酸化分解を低減させる。
【０１２０】
別の実施形態において、固形パラフィンは、液体になるまで、パラフィン融点より高い７５℃以下で融解させた後、飽和点が観察される（固体が形成される）まで、脂肪族溶媒を徐々に添加する。混合物を４５℃に冷却させて、完全に透明になるまで、より多くの脂肪族溶媒を徐々に添加する。
【０１２１】
別の実施形態において、上述のパラフィンコーティングは、生体材料及び顕微鏡スライドに予め適用される特殊染色反応性付着物及び適用される抗体及び二次染色試薬と反応する、特殊染色材料を特有に捕捉する特殊染色反応性末端基上に塗布され、生体材料として、タンパク質、ペプチド、コンジュゲートされたタンパク質、タンパク質でコーティングされたビーズ、ペプチドでコーティングされたビーズ、又はコンジュゲートされたコーティングされたビーズが挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１２２】
別の実施形態において、パラフィン層は、スライド上の標的に選択的に塗布される。更なる別の実施形態において、パラフィン層は、顕微鏡スライド上に付着されてもよく、その方法としては、スプレー、インクジェット付着、転写印刷（例えば、パッド印刷）、スクリーン印刷、及び蒸着が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、パラフィンは、好ましくは、ほぼ５ミクロン以下の厚さの薄層であり、別の好ましい実施形態において、パラフィンは、６０℃未満、好ましくは５６℃未満の融点を有し、キシレン又はキシロール（脂肪族置換）溶媒に対する曝露により溶解する。更に別の好ましい実施形態において、パラフィンは、包埋パラフィンの硬度に類似した外気温硬度を有する。
【０１２３】
別の実施形態において、組織ブロック包埋用パラフィン材料として、Thermo Fisher社によるＴｉｓｓｕｅＰｒｅｐ及びＴｉｓｓｕｅＰｒｅｐ  ２（融点５６℃）、Leica社によるＰａｒａｐｌａｓｔ及びＰａｒａｐｌａｓｔ  ｐｌｕｓ（融点５６℃）、Leica社によるＰａｒａｐｌａｓｔ  Ｘ−ｔｒａ（融点５０℃〜５４℃）が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１２４】
別の実施形態において、それぞれが、融点、硬度、及び粘度を確立させるための精製パラフィン、合成ポリマー、及び他の材料のブレンドである。微生物成長をサポートしないことは、パラフィンに固有である。
【０１２５】
別の実施形態において、特殊染色には、アルシアンブルー、アニリンブルー−オレンジＧ溶液、アザン染色、ビルショウスキー銀染色、Ｂｒｏｗ＆Ｂｅｎｎグラム染色、クレシルバイオレット、ＤＡＢ、フォンタナマッソン、ゴードンスイート銀染色、グロコットメセナミン銀染色法、ホールビリルビン染色、ジョーンズメセナミン銀染色法、ルクソールファストブルー、ルクソールファストブルー−クレシルバイオレット、ムチカルミン（メイヤー法）、ミューラー−モーリーコロイド鉄、オレンジＧ、ヌクレアファストレッド、ジアスターゼ消化したＰＡＳ、過ヨウ素酸Ｓｃｈｉｆｆ（ＰＡＳ）、リンタングステン酸、ヘマトキシリン、ピクロシリウスレッド、酸性化トルイジンブルー、トリクロム−ゴモリ一段法、トリクロム−マッソン、ビクトリアブルー、ボンコッサ、ワイゲルトレゾルシンフクシン、ワイゲルト鉄ヘマトキシリン、ゼル−ニールセン法が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【０１２６】
別の実施形態において、標的は、黒色及び白色等の顔料で着色された付着物から選択され得るが、これらに限定されず、任意の顔料カラーを含むことができる。
【０１２７】
別の実施形態において、上述のパラフィンコートが塗布され得る顕微鏡スライドは、ガラス、プラスチック又は任意のポリマー材料から選択され得るが、これらに限定されない。別の実施形態において、パラフィンは、精製され、無水でもよい。
【０１２８】
別の実施形態において、得られた顕微鏡スライドは、後に熱せられて、パラフィン粒子を、一様な表面コーティングへと融解及び／又はブレンドしてもよく、付着物及び付着物の周囲のスライド表面の両方を封止する。
【０１２９】
更に別の実施形態において、得られた顕微鏡スライドは、後に熱せられて、パラフィンから溶媒を追い出して、確実にパラフィンは硬化状態に戻る。これは、好ましくは赤外光を使用して、スライドのパラフィン側から行われなくてはならない。パラフィンを最上部から下へ融解させることにより、確実に溶媒は上昇して、妨げなくパラフィンから蒸発する。結果を図５に示し、図５は、パラフィンがどのようにして、その付着物の縁でのシールを保証するかを示している。
【０１３０】
抗原賦活化モニター
本発明の別の実施形態において、抗原賦活化モニターは、抗原賦活化（これ以降、ＡＲと称する）プロセスによって実行され、使用されるプロセス及びその実行に応じて、スライド間、及び着色剤間で非常に可変性である。ＡＲ緩衝液及び緩衝液の温度の直接的な測定は、実際には知られておらず、推定されるに過ぎないものであるので、ＡＲは、オープンループプロセスである。ＡＲプロセスは、ヒーターが所望の温度で機能を果たすとされているので、ＡＲ緩衝液の温度は、一様に同じであると想定する。また、ＡＲプロセスは、使用されるＡＲ緩衝液が、正確な試薬構成要素を使用した正確な混合物であると想定する。ともに、研究室に対して如何なる具体的なフィードバックも伴わずに、ＡＲを実施することはないという結果になる前提である。
【０１３１】
本発明の別の実施形態において、ＰＲＳは、２個のＡＲ標的：ＡＲＭ３Ｄ及びＡＲＭ２Ｄ＋２Ｄ二次アレイを組み込む。３個のＡＲ状態：回収不足（under recovered）、名目値回収（nominal）及び過剰回収（over recovered）が存在する。
【０１３２】
回収不足条件は、低すぎるＡＲ温度、不十分な曝露時間、又は全く実行されないことによって生じる。ＡＲＭ２Ｄ標的は、最小ホルムアルデヒド固定で１００％濃度の、例えば、マウスタンパク質及びウサギタンパク質（又は、他の種由来のタンパク質、マウスタンパク質及びウサギタンパク質に限定されない）の５０：５０混合物である。この標的が染色されると、ＡＲプロセスは、行うことができなかった。好ましくは、タンパク質は、ＩｇＧである。
【０１３３】
回収過剰条件は、高すぎるＡＲ温度、過剰な曝露時間、又はＡＲ緩衝液がｐＨ９．５を超えるか、若しくはｐＨ５．５未満であることによって生じる。ＡＲＭ３Ｄ標的は、ホルムアルデヒドで過剰固定された３Ｄスカフォールド中に付着された１００％濃度のマウスタンパク質及びウサギタンパク質（又は他の種由来のタンパク質、マウスタンパク質及びウサギタンパク質に限定されない）の５０：５０混合物である。この標的が染色されると、ＡＲプロセスは非常に活動的であり、スライドは、診断評価に使用されるべきではない。
【０１３４】
名目値回収条件は、マウス勾配密度アレイ及びウサギ勾配密度アレイの１０％〜３０％以下の標的が、可視的な染色を示さない場合に生じる。続いて、ＡＲ損傷の度合いは、染色されていない低濃度二次標的の量によって評価することができる。この損傷は、同様に、組織切片でも観察される。
【０１３５】
抗原イメージングスケールの外挿
一次抗体は、所望の抗原画分によって接種された宿主動物（例えば、マウス又はウサギ）から得られる処理された宿主血液血清で構成されることが知られている。続いて、宿主は、血清タンパク質を産生して、そこで、抗原部位はこの段階では、抗原アンタゴニストに対する抗体反応物を含有する。続いて、抗体が、標的抗原を含有するタンパク質と接触すると、抗原及び抗体は、ともに結合する。その結果、宿主種（マウス又はウサギ）の抗体は、遊離の状態であり、二次染色キットと反応する。
【０１３６】
一次標的及び二次標的は、既知の分注量の標的物質が適用される、明確に画定された規則的な（例えば円形の）付着域を有する。タンパク質付着物は、架橋カプラーを含むため、スライドコーティングの孔内にタンパク質の深さを超えて沈むことができない。タンパク質が、互いに更に緩く架橋される場合、それらの有効サイズは、接着剤コーティングの多孔度へと浸透する、タンパク質の能力を阻害する。多孔度は、互いに架橋されるタンパク質対よりも極めて大きいわけではない。したがって、タンパク質は、多くのタンパク質の厚さであるコーティングとして残ることが多い。タンパク質ドットがスライド上に付着した後の焼成工程まで、架橋は完全に行われない。タンパク質付着物が、コーティングによって吸収されるようにならないことを知ることは、増幅化学が利用可能な空間に存在するための余地が単に十分でなく、タンパク質付着物は、コーティングに吸収されると、後に染色試薬と反応することができないため重要である。イメージングの観点から、タンパク質によっては、抗原賦活化中に損失されるものもあるが、新しいタンパク質が露出される。したがって、標的ドットは、付着物の最上部にあるもののみが、染色と反応することができるため、タンパク質の単層として出現する。
【０１３７】
このため、タンパク質の原子質量、付着物中の各タンパク質型のタンパク質の数、標的の面積、及び標的の有効表面タンパク質密度を知ることで、標的の活性表面タンパク質密度を計算することができる。
【０１３８】
一次抗体の試薬に曝露されるスライド上での適用濃度、分注量及び表面積は、既知である。試薬の曝露時間中に浮遊抗体の大部分が落下し、受容抗原部位によって捕捉されると合理的に仮定することができる。抗原部位上に直接落下するもののみが、捕捉されるようになり、その残余は、緩衝液洗浄工程によって洗い流される。したがって、付着された抗体濃度は、適正な条件下で、例えば、濃度が、カットオフの２５％を超える場合に、また飽和から２５％未満である場合に確立させることができ、ここで、カットオフは、適用されるタンパク質濃度を捕捉するのに不十分な標的密度として定義され、飽和は、適用されるタンパク質全てを捕捉することができない濃度として定義される。
【０１３９】
一次希釈率（ration）を知ることで、正確な一次標的の密度標的を選ぶことができ、一次濃度を実証することができる。
【０１４０】
本発明の一実施形態において、各々の二次標的及び一次標的は、（（マウス又はウサギ）＋（ロバ＋架橋剤＋真菌阻害剤））又は（（抗原Ａを有するＫＬＨ又は抗原Ｂを有するＫＬＨ）＋（非コンジュゲートＫＬＨ＋架橋剤＋真菌阻害剤））の混合ブレンドである。各ドットは、同じ量の総タンパク質を有するが、特定の標的を構成するタンパク質間で原子質量が異なり得ることから、混合比を僅かに調整しなくてはならない。
マウスＩｇＧ＝１５５ｋＤａ
ウサギＩｇＧ＝１５０ｋＤａ
ロバＩｇＧ＝１６０ｋＤａ
抗原ペプチド鎖とコンジュゲートしたＫＬＨサブユニット（ここで、サブユニットは、ＫＬＨ１及びＫＬＨ２である）＝３５０ｋＤａ＆３９０ｋＤａ
【０１４１】
本発明の別の実施形態において、２Ｄ二次標的勾配は、好ましくは−２０ｌｏｇ（希釈率）プロファイルに従う、１〜１０００：１の段階的な希釈増分であり、ここで、希釈増分は、−３ｄＢｄ工程である。−２０ｌｏｇ（希釈率）＝ｄＢｄという用語はともに、データを線形化するために、半対数ベースで希釈について記載することを指し、その結果、修飾用語は、容易に適用され得る。（希釈率）という用語は、希釈［Ｘ］を指し、ここで、Ｘは、１：１〜１０００：１に等しい［１．．１０００］である。ｄＢｄという用語は、希釈のデシベル又は希釈強度として定義される。修飾用語は、抗原賦活化損傷、抗原獲得、一次抗体試薬希釈を含む。単一２Ｄ／３Ｄ標的を用いて、２Ｄベースと３Ｄ粒子との間の染色密度Δを測定する。Δを２Ｄアレイの残りに適用して、組織切片内又は組織切片上で見られる３Ｄ挙動に良好に適合したカラー密度スケールを作成することができる。
【０１４２】
二次１００％２Ｄ／３Ｄ及び２Ｄ標的により、２つの付着物が２Ｄ染色密度に関して適合していることが確認される。これにより、３Ｄ粒子成分が１００％タンパク質物質を２Ｄ成分のシフトを引き起こすほどに十分に消費しないことが確認される。
【０１４３】
二次染色は、染色試薬の構築の関数である１倍〜２０倍の酵素利得関数を採用する。したがって、利得が上昇するにつれて、より低濃度の二次標的が飽和へとシフトする一方で、利得が１まで低下すると、高濃度の二次標的のみが視認可能に染色される。
【０１４４】
二次標的タンパク質と一次標的タンパク質との間の相当な大きさの違いのために、タンパク質濃度の密度は、一次タンパク質によって確立される。
【０１４５】
１５０ｋＤａの平均一次抗体原子質量を用いると、単一抗体の重量は１５０ｋＤａ（１．６６０５×１０１２）であり、これは２４９×１０−１２ｎｇの重量に相当する。スライドの単一領域を曝露される唯一の部分とした場合に、適用される一次試薬の量を解明することができる。したがって、内寸が２０．３ｍｍ平方×高さ０．１４ｍｍ以内の密閉毛細管ギャップを用いると、容量は５７．２μＬである。１ミクロンの標的領域に関する比は、適用される一次抗体試薬２．８３２ｎｌをもたらす。
【０１４６】
一次抗体試薬は、その濃縮物から１０μｇ／ｍｌの中間希釈まで希釈される。続いて、中間希釈は、スライド上への塗布のために、１：１〜１０００：１まで希釈される。これは、それぞれ、１：１〜２５．１：１の希釈に関して、面積１ミクロン２上への３１．５個〜７．０８個の抗体の付着をもたらす。
【０１４７】
１００％の捕捉能を確実にするには、一次標的が１００倍〜１０００倍の安全係数を有するべきである。１０００倍の選択肢を選んだ場合、一次標的は、４×１０６個の抗原部位を含有する必要がある。ＫＨＬサブユニットは適用抗体よりも大きいが、増分は捕捉抗体の数が１：１を超えて変化するには十分でない。各ＫＬＨサブユニットは、３７０ｋＤａの平均原子質量を有し、これは６１４．４×１０−１２ｎｇの重量に相当する。
【０１４８】
タンパク質分子の体積は、タンパク質の分子量及び平均タンパク質部分比容から極めて単純かつ確実に概算することができる（部分比容＝体積／分子量）。可溶性の球状タンパク質について実験的に決定される部分比容の平均は、約０．７３ｃｍ３／ｇである。この値はタンパク質によって異なるが、範囲は幾分狭い。等式を約（１．２１２×１０３×ＭＷ）ｎｍ３のタンパク質体積へと換算する。これにより、ＫＬＨサブユニットでは、個々の体積は４４８．４４ｎｍ３である。タンパク質を球体としてモデル化すると、球体の直径は０．１３２×ＭＷ１／３（ｎｍ）となる。ＫＬＨサブユニットでは、これは９．４３６ｎｍである。
【０１４９】
１ｍｍの標的直径では、ＫＬＨサブユニットの単分子層は、１１．２３７×１０２７個のタンパク質を必要とする。４×１０６個のタンパク質の活性標的密度では、最小希釈率は１：２．８×１０２１となる。実際的には、１：１０００に近い任意の希釈率が、その活性タンパク質濃度によって一次抗体の評価が支配されることから、有効である。このため、標的密度は、その低濃度下限値によってのみ制限される。
【０１５０】
一実施形態において、二次標的アレイは、１〜１０００：１の段階希釈増分である。希釈の線形勾配は、ｄＢｄ＝−２０ｌｏｇ（希釈率）として生じる。１〜１０００：１の記載の希釈範囲については、片対数範囲は０ｄＢ〜−６０ｄＢｄである。−３ｄＢの希釈段階を選ぶと、二次標的希釈は−０ｄＢｄ、−３ｄＢｄ、−６ｄＢｄ、−９ｄＢｄ、−１２ｄＢｄ、−１５ｄＢｄ、−１８ｄＢｄ、−２１ｄＢｄとなる。
【０１５１】
二次標的アレイ及び一次標的アレイは全て、不可逆的に固定されて、ＡＲプロセス中に組織又はＡＲ標的よりも遥かに低い程度の分解を受ける。分解は、完全タンパク質ではなく、解放されたタンパク質セグメントに由来する。ＡＲプロセスは、タンパク質標的及び組織切片に作用し続けるため、ＡＲ損傷は、勾配スケールパターンの１００％の位置に向かってのシフトとして観察される。他方で、二次酵素利得は、勾配アレイを、１０％位置に向かってシフトさせる。酵素利得は、１、２、４、５、８、１０、１５、及び２０である。これらは、１０％標的側への二次アレイのシフトとして言い換えられる：
１．  ２０倍  全標的が−２６ｄＢｄにシフトする；
２．  １５倍  全標的が−２３．５２にシフトする；
３．  １０倍  全標的が−２０にシフトする；
４．  ５倍  全標的が−１３．９８にシフトする；
５．  ４倍  全標的が−１２．０４にシフトする；
６．  ２倍  全標的が−６．０２にシフトする；
７．  １倍  ２Ｄの１００％ドットのみが黒色に近い。
【０１５２】
通常、二次アレイを、１００％の位置に向かって、３個以上のドット分シフトさせるＡＲ損傷は、過剰であるとみなされ、スライドは、より高い酵素利得二次染色キット、又はより高濃度の抗体を使用してやり直されるべきである。
【０１５３】
したがって、一次抗原標的カラー密度は、二次染色キットの抗体濃度×酵素利得の集計的合計である。その一方で、二次標的密度は、酵素利得×二次標的タンパク質濃度の単なる合計に過ぎない。
【０１５４】
デジタルイメージングシステムに応じて、明るさの変化は、飽和（より暗くなる）又はカットオフ（より明るくなる）へ画像のダイナミックレンジをシフトさせる。これらの変化は、抗原のカラースケールをシフトさせる一方で、抗原密度の数字スケールはシフトさせない。したがって、数字スケールは、明るさに非依存性であり、カラースケールは依存性である。
【０１５５】
本発明の一実施形態において、上述の二次タンパク質標的アレイは、２つの系統：ダミーＩｇＧ血清タンパク質と混合された、一方がマウスＩｇＧとして、他方がウサギＩｇＧとして形成され、最大密度から最小密度まで、−２０ｌｏｇ（希釈率）線形勾配で進行する５個以上の成員の勾配密度シリーズを形成し、ここで、希釈は、初期の１０００：１の希釈後に、１：１〜１０００：１の範囲であり得る。
【０１５６】
別の実施形態において、最終プロセス工程において、同定される抗原部位は、色素原沈殿によって着色されるようになる。したがって、マウス標的アレイ及びウサギ標的アレイは、二次染色キット色素原沈殿の−２０ｌｏｇ（希釈率）線形勾配を反映する。
【０１５７】
別の実施形態において、一次抗原密度スケールを形成する方法に関する好ましい解決法は、標的混合物を首尾よく構成することと、それらを接着剤コーティングされたスライド上に付着させることと、接着剤と標的材料との間で共有結合させることとに基礎を置いている。
【０１５８】
別の実施形態において、標的アレイが首尾よく適用されて、一次染色試薬及び二次染色試薬がともに、合理的に機能すると推定し、続いて、データ組間の曲線適合が、コンピューターアルゴリズムによって容易に行うことができる。別の実施形態において、一次染色剤は、蛍光マーカーにもコンジュゲートされないか、又は酵素部位（例えば、ＨＲＰ又はＡＰ）に組み込まれないマウス宿主タンパク質又はウサギ宿主タンパク質を使用する任意のＩＨＣ認可抗体から選択され得る。別の実施形態において、二次染色剤は、それぞれ異なるカラー色素原を使用するマウスとウサギとの間でそれぞれが特有に非依存的である１倍〜２５倍の酵素利得を伴う二次染色剤から選択され得るが、これらに限定されない。
【０１５９】
本発明の別の実施形態において、絶対的な基準における或るスライド上での性能の結果は、別の時間に行われる別のスライドとは同一ではあり得ないことに留意することは妥当である。これは、一次のコンジュゲートされた一次抗体がそうであるように、二次染色キットが、ロット間で性能の点で異なるという事実に由来する。しかしながら、任意の１個のプロセス記録スライドに関する性能の抗原スケールは、有効であり、異なる染色試薬を使用して行われる別のものとほぼ等価である。
【０１６０】
続いて、別の実施形態において、一次抗原濃度スケールは、癌等の検出される細胞の異常の組織切片を利用するために共在する組織切片に適用される。
【０１６１】
様々な実施形態が、実施例として本明細書中で記載される。様々な変更が成されてもよく、他の実施形態が、本明細書中で提示する本発明のより広い範囲から逸脱することなく使用することができることは、当業者に明らかである。例示的な実施形態に関するこれらの変形及び他の変形は、本発明によって網羅されると意図される。
【実施例】
【０１６２】
下記の実施例は、本発明を説明するように提示され、如何なる場合でも本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【０１６３】
実施例１  パラフィン保護コーティングに関するスプレー塗布法
低い気流を用いて、表面上に噴霧する。空気混合物に対して少量の液体が好ましい。混合物を、スライド上にマスクを通じて噴霧して、ＰＲＳ標的を覆う。通常、１回〜２回行って、５ミクロン未満の厚さの層を形成させて、パラフィンシールを流すために再加熱する必要はない。パラフィン混合物容器及びスプレーヘッドをともに、５６℃よりもわずかに高く加熱して、確実にパラフィンは流体となり、スプレーヘッドからスライドまで進む間も流体として存在する。ヘッドからのスプレー被覆範囲は、公称０．３７５インチの幅である。１回行う場合、１００％の封止を保証するために、再加熱が必要である。
【０１６４】
実施例２  パラフィン保護コーティングに関するスクリーン印刷法
２個の平行な側面間のスクリーンのワイヤに電流を通すことによって、ステンレス鋼スクリーンを加熱する。スクリーンの温度は、パラフィンがスクリーンの底部側にまで流れ込まないように、パラフィンの融点のわずかに下である必要がある。基本的には、パラフィンは、液体よりもペーストとして挙動する。ＰＲＳは、１００％の封止を保証するために、再加熱サイクルが必要である。
【０１６５】
実施例３  パラフィン保護コーティングに関するインクジェット法
インクジェットヘッドは、パラフィンを液体状態で維持するために、プリントヘッド内に組み込まれたヒーターを有する必要がある。スライド上での後再加熱サイクルは、１００％の封止を保証する。
【０１６６】
実施例４  パラフィン保護コーティングに関するローラー転写法
加熱したローラーにより、パラフィンのフィルムを、加熱した容器からローラー上へ引っ張りあげる。続いて、ローラーは、ナップローラーを用いた壁の塗装とほぼ同じ様式でスライド上にパラフィンのフィルムをに転写する。スライド上での後再加熱サイクルは、１００％の封止を保証する。
【０１６７】
実施例５  ＰＲＳ標的に対する抗原賦活化露出対分解
実験研究により、ＡＲ露出の変化が、２Ｄ二次標的及びＡＲ標的において見られることを検証しようとした。
【０１６８】
予測される結果は、露出時間及びタンパク質分解の線形勾配であった。しかしながら、結果は、その通りではなかった。これは、ＡＲ緩衝液が、予熱された加熱状態でスライド上に適用されず、それどころか、ＡＲ緩衝液は、９２℃〜９５℃の使用温度に加熱されなくてはならないためであった。したがって、ひいては、８９℃を超えるＡＲ緩衝液を得るのにかかる時間は度外視すると、勾配は線形である。ホワイトバランス及びコントラストを最適に設定するためにＰＲＳ黒色／白色標的を用いて８ビットのデジタル化を使用すると、勾配は、１．３ｌｓｂ／分、＋／−０．２ｌｓｂであった。タイムマークが８９℃を超えて２０分を過ぎると、標的の５０％が、重度のストレス下となり、二次標的シリーズの有用性が損なわれた。
【０１６９】
実施例６  二次標的の一貫性
試験研究は、研究される２つの要素を有していた：
Ｉ．二次タンパク質の単一混合バッチ内のスライド間のドット間、
ＩＩ．二次タンパク質アレイの異なるビルドのスライド間のドット間。
【０１７０】
単一混合バッチ実験は、１００％標的配合物及び４０％標的配合物を使用した。１００個のスライドに印刷をして、全て、Scytek社からのアビジン−ビオチン複合体（ＡＢＣ）タイプマウス＆ウサギ二次染色キットで処理した。抗原賦活化は、更なる変数を加えるに過ぎないため実施しなかった。両方の分布は、１．５％以内であった。
【０１７１】
実施例７  ダミータンパク質の選択
１０個の異なる二次希釈群を、マウス、ウサギ、及びウシのＩｇＧタンパク質の２つの異なるロットから作製した。希釈物は、マウス＆ウシ及びウサギ＆ウシの１００％、４０％並びに２０％であった。分布は、１００％希釈群及び４０％希釈群に関して、１．５％以内であった。２０％希釈群は、染色密度において予期せぬ増加を示した。このデータから、ＡＢＣ染色キットのウシ試薬とビオチン化ヤギ−抗多価試薬との間の相互作用を、本発明者らは発見した。問題は、ウシをロバに置き換えることによって解決された。試験を繰り返して、ここで群の２０％が、１．５％以内に留まった。
【０１７２】
実施例８  ＰＲＳ−ＩＨＣの品質管理の使用
ＱＣモードでは、図３に示されるように、共在する標的がＩＨＣプロセスのフィードバックを与える。二次アレイの４つの列を公称値内の場合、公称値を超える場合、公称値を大幅に超える場合及び公称値を過度に超える場合（それぞれ５％、１０％、３０％及び４０％）の行われる抗原賦活化の程度の差で示した。抗原賦活化プロセスでは、ホルムアルデヒドとタンパク質との間のシッフ塩基結合を逆転することによって抗原部位のアンマスキングを図る。抗原が露出する速度は、反応温度によって大きく左右される。温度が上昇するにつれ、核沸騰（nucleated boiling）の可能性が生じる。核沸騰は、組織及びタンパク質付着物の両方に対する物理的損傷を引き起こす。理想的には、抗原賦活化活性はスライド全体で一様であるが、実際には、そうはならず、用いられる方法及び環境に依存して、より高い又はより低い抗原賦活化活性を有する領域が生じる。一様の抗原賦活化活性を仮定すると、以下の事項を用いてスライドが診断判定に使用可能であると示すことができる。
【０１７３】
ＡＲが最低又は過度である場合、二次アレイが失敗を反映することができない可能性がある。しかしながら、２つのＡＲ標的が過度の失敗条件を示唆する。
ａ．低ＡＲは一定未満の２Ｄ／３Ｄ及び一定を超える２Ｄとして見られ、標的はどちらも黒色である。二次アレイは、標的のＡＲシフトが残らずに完全に見える。
低ＡＲ活性がＩＨＣ染色装置における以下の状況から生じ得る：
ｉ．ＡＲ加熱装置が動作しないか、又は８０℃よりはるかに低温に設定される；
ｉｉ．ＡＲバッファーがｐＨ６又は９ではなく、中性ｐＨ７を有する；
ｉｉｉ．曝露時間が過度に短い。
ｂ．高ＡＲは一定未満の２Ｄ／３Ｄとして見られ、大幅に白化し、一定を超える２Ｄ標的は５０％未満が黒色である。二次アレイの大半も白化する。高ＡＲ活性がＩＨＣ染色装置における以下の状況から生じ得る：
ｉ．加熱装置が９５℃超の温度で動作する；
ｉｉ．曝露時間が過度に長い。
ｃ．色素原沈殿の誤りは、２つの状況下で起こり得る。
ｉ．高濃度の二次標的では、染色強度が最大暗さとはならずに下がる。二次アレイでは、部位密度に対して常に増大させる必要がある。そうでない場合、色素原沈殿により二次試薬キットのキャパシティが枯渇した。その解決策は、一次抗体の希釈率を増大すること（抗体濃度を低下させることと同じ）である。
ｉｉ．色素原試薬は、活性化（ＤＡＢによって生じることが多い）のために劣化している。その解決策は、新たなＤＡＢ混合物を使用することである。
【０１７４】
染色は、一次抗体の濃度及び二次染色キットの酵素利得に応じて、飽和又はカットオフを受けることができる。飽和は、酵素部位の密度が、色素原から色素を沈殿させる容量を超える場合である。換言すると、染色カラーは、実現することができる程度で暗い。カットオフは、一次抗体の濃度及び二次染色キットの酵素利得が非常に低い場合に起こり、観察されるのに不十分な色素沈殿を生じる。２つの要素は、二次系統の暗さを飽和（１００％）又はカットオフ（０％）にシフトさせる。図３に基づいて、この移動は、可視的な標的の数として観察される。二次酵素利得が増加すると、１００％ドット密度は、０％の位置へとシフトする。一般的な酵素利得は、１、２、４、５、８、１０、１５、及び２０である。これらは、０％位置側への二次アレイのシフトとして言い換えられる：
１．  ２０倍  全標的が−２６ｄＢｄにシフトする；
２．  １５倍  全標的が−２３．５２にシフトする；
３．  １０倍  全標的が−２０にシフトする；
４．  ５倍  全標的が−１３．９８にシフトする；
５．  ４倍  全標的が−１２．０４にシフトする；
６．  ２倍  全標的が−６．０２にシフトする；
７．  １倍  ２Ｄの１００％ドットのみが黒色に近い。
【０１７５】
一次標的アレイが存在する場合、二次酵素利得の増加は、染色密度を、低い一次濃度ドットにシフトさせる。同じことが、一次抗体濃度が増加される場合にも当てはまる。抗原賦活化プロセスは、一次標的及び二次標的の両方を、幾らかのレベルにまで分解させて、シフトをカットオフへと反転させる。ＩＨＣ染色の終わりに、３個以上のドットが消失した場合、スライドは、過剰な抗原賦活化持続時間、温度、又はその両方を有するとみなされ、多すぎる抗原の存在が、組織上で損失されて、診断解釈を最低限にさせる。この決定は、二次染色が損なわれているとすでに示されているため、一次抗体の効率と非依存性である。抗体工程に関して、この損失レベルは克服できるものはない。
【０１７６】
実施例９  ＰＲＳは、その抗原密度スケールを用いて明るさを追跡する
顕微鏡スライドを従来の顕微鏡で見ることは、照明レベルに関して主観的である。ホールスライドイメージング（whole slide imaging；ＷＳＩ）では、ホワイトバランス及びコントラストを確立するために、スキャナーに完全な白色及び黒色のホールを用いる。このことは、手動顕微鏡には当てはまらない。図４に、照明レベルが過度に暗い場合（最適より−５％）、最適の場合（＋０）及び過度に明るい場合（＋１０％又は＋１５％等）の画像に対する影響を示す。光レベルが最適を下回る場合、染色密度の圧縮が見られる。癌の病期に関しては、これにより診断が本来あるべきよりも１段階高くなる可能性がある。光レベルが最適を上回る場合、画像の白化が見られる。癌の病期に関しては、これにより診断が本来あるべきよりも１段階低くなる可能性がある。抗原のカラー密度及び数値のルーラーを一次標的及び二次標的から作成し、ＷＳＩ画像に重ね合わせることができる。数値スケールが独立事項である一方、カラー密度は従属事項である。抗原密度のカラー及び数値のルーラーをＷＳＩに適用する場合、使用者が照明レベルを上下しても数値スケールは固定されたままである。一方、カラー密度スケールは照明レベルの変化に応じてシフトする。その利点は、組織像上の特徴が最も良好に「見える」ように、使用者がカラー密度との数値関係を失うことなく見かけの照明を上下する選択肢を有することである。このことは、倍率を変化させる際にも実用的である。
【０１７７】
実施例１０  抗原密度ルーラーの構築
抗原密度ルーラーを作成することができる形式は２つある。
１．タイプＡは、一次抗体が常に組織抗原部位に対して１０％未満過剰な抗体で適用されるという仮定に基づく。
２．タイプＢでは、一次抗原の勾配密度アレイを用いる。
【０１７８】
タイプＡ：二次のみに基づく抗原ルーラー
この形式では、二次標的アレイのみを用いる。２Ｄバーコードに組み込まれる確認済みの情報は、（ａ）一次抗体データ：抗体の宿主種及び−ｄＢｄでの希釈率、並びに（ｂ）二次酵素利得を含む。
【０１７９】
二次勾配密度標的アレイは、標的間の−３ｄＢｄの減分に従う既知濃度のタンパク質から構成される。最大濃度は、一次抗体に用いられる最低希釈率によって選ばれる。殆どの使用者は、抗体試薬の製造業者によって提供される濃度基準値を用い、１μｇ／ｍｌの一定中間濃度まで希釈する。それから、異なる組織型に対応するように他の全ての希釈を必要に応じて行う。概して、第２の一次抗体希釈のセットは、１：１〜１０００：１の範囲である。
【０１８０】
二次酵素利得の範囲に対応するためには、二次アレイをより広範囲の希釈から構成しなくてはならない。このため、−３ｄＢｄ刻みでは、二次アレイの最低希釈を１０００：１又は−６０ｄＢｄから始める（ＳｄＢｄによって表される）。この場合、８ドット系列の最大値は−０ｄＢｄ又は１：１となる。抗原賦活化の作用により二次タンパク質が分解される（ＡＲｄＢｄによって表される）。二次アレイ中の８つのうち１つの各ドットは、−３ｄＢｄの増分を表す。２つの標的の消失についての抗原賦活化による消失（もはや視認可能でない）は、＋６ｄＢｄとなる。このことは、二次アレイが２Ｄ標的の（−Ｓ＋ＡＲ）ｄＢｄ又は（＋６ｄＢｄ〜−５４ｄＢｄ）であることを意味する。ここで、抗体濃度及び二次酵素利得を考慮に入れる必要がある。抗体濃度はＡｄＢｄであるが、酵素利得はＥｄＢｄである。これにより、二次アレイは（−Ｓ＋ＡＲ−Ｅ）ｄＢｄとなり、組織は（＋ＡＲ−Ｅ＋Ａ）ｄＢｄとなる。適用すべき次の因子は、１００％２Ｄ対３Ｄ差分である。１００％２Ｄ／３Ｄ標的及び１００％２Ｄにおける３Ｄ物体間の染色差は、二次染色の色素原沈殿定数を表し、これはカラー密度を数値スケールに割り当てるために用いられ、ＤｄＢｄに割り当てられる。色密度の差は、アレイ中の２Ｄ標的の各々に適用される。このため、２Ｄアレイは（＋ＡＲ−Ｅ＋Ａ＋Ｄ）ｄＢｄの染色カラー密度で存在する。
【０１８１】
酵素利得が１０倍である場合、Ｅは−２０ｄＢｄとなる。この場合、２Ｄ二次アレイは−１４、−１７、−２０、−２３、−２６、−２９、ブランク、ブランク（ｄＢｄ）となる。０％近くの２つのドットは、染色により回復することができないほど抗原賦活化プロセスによって損傷を受けているため、ブランクとされる。例えば、２Ｄ／３Ｄカラー密度差が１０倍である場合、Ｄは＋２０ｄＢｄとなり、３Ｄ二次アレイは−３４、−３７、−４０、−４３、−４６、−４９、ブランク、ブランク（ｄＢｄ）となる。一次抗体試薬により一次標的中の好適な抗原部位が見出され、１００％の収率が得られると仮定する。ＫＬＨタンパク質１つ当たり２つよりはるかに多くの抗原ペプチド鎖が存在するが、ＫＬＨタンパク質１つ当たり１つの抗体のみが効果的に結合し、染色することができるとも仮定する。同じＫＬＨタンパク質上に好適な抗原を見出す任意の付加的な抗体は、重複占有のために二次染色の完了が妨げられる。したがって、検出することができる一次抗原保有タンパク質１つ当たりの抗原部位の数は１である。一次標的が１ミクロン当たり二次と同じ数のタンパク質を含有することから、二次カラー密度を数値抗原密度に対して調整するために、５００μｇ／ｍｌ抗体マスターからの一次希釈を二次アレイデータに適用する。二次標的をモニタリングすることで、中間のカラー密度を有する標的を選ぶ。中間のカラー密度は、最大限の黒色と最大限の白色との間の５０％の点として規定される。この点は、３ｄＢｄ範囲内では１．５ｄＢｄに相当する。この場合、この点は抗原密度ルーラーを確立する固定点（anchor）として機能する。上記の最終標的範囲を用いると、中間点は−４１．５ｄＢｄとなる。
【０１８２】
二次タンパク質を１０μｇ／ｍＬのマスター希釈液へと希釈する。各アレイは、ロバＩｇＧタンパク質と混合されたマウス又はウサギのブレンドである。タンパク質は全て異なる原子質量を有するが、以下では全て１５０ｋＤａであり、標的ドット１つ当たりのタンパク質の総数は一定であり、混合比は一定でないと想定される。差し当たり、反応性タンパク質濃度のみを考慮する。１５０ｋＤａでは、個々のタンパク質の分子量ＭＷは２４９．０７×１０−１２ｎｇである。標準標的ドットは直径１ｍｍである。印刷される付着物が１μｍ厚である場合、付着物の濃度は１０μｇ／ｍＬであり、３１．５×１０６個のタンパク質が付着する。この場合、直径１μｍの領域は３１．５個のタンパク質を有する。１個のタンパク質が１つの抗原部位に相当するとみなすことで、抗原密度を確立することができる。二次アレイでは付着物１つ当たり同数のタンパク質を用いるが、マウス又はウサギとロバとの比率は、マウス又はウサギの濃度を低下させるにつれて変化する。１００％標的は全てマウス又はウサギであり、ルーラー上の０ｄＢｄの点に一致する。
【０１８３】
二次では、一次抗体が組織上の抗原部位に結合する場合にのみ組織が染色される。このことは、十分な抗体濃度を利用可能な抗原部位に結合するように与える必要がある点を除いて、適用される抗体の濃度に特に左右されない。このため、組織上での抗原密度の測定値は一定のままであるが、数値を抗原賦活化による損傷及び二次酵素利得に対して補正しなければならない。この場合、数値測定値に対するカラー密度を調整する必要がある。
【０１８４】
先の例では、酵素利得は１０倍であり、抗原賦活化が二次アレイからの２つのドットの消失を引き起こしている。酵素利得は−２０ｄＢｄであり、抗原賦活化による消失は＋６ｄＢｄである。結果として−１４ｄＢｄとなる。この場合、希釈は以下のように変換される。
【０１８５】
【表１】
2020523614.tif 000003
【０１８６】
タイプＢ：一次抗原に基づくルーラー
この形式では、一次及び二次標的アレイの両方を用いる。２Ｄバーコードに組み込まれる確認済みの情報は、（ａ）一次抗体データ：抗体の宿主種及びｄＢｄでの希釈率、並びに（ｂ）二次酵素利得を含む。ロットのコードデータは、用いられる一次標的の組合せに関する情報を含む。
【０１８７】
一次標的系列が存在する場合、３ドットとなり、ここで最も濃厚なドットは二次アレイと同じ１００％濃度となるが、ドットは−６ｄＢｄの間隔で配置される。実際には、一次アレイ及び二次アレイが同じ希釈勾配を有する。一次標的は−０ｄＢｄ、−６ｄＢｄ、−１２ｄＢｄとなり、ＰｄＢｄで表される。抗原賦活化が損傷を生じ、二次アレイとほぼ同一であると予想することは妥当である。一次アレイは二次染色の作用を受けるため、同じ酵素利得関数を受ける。このため、一次アレイは（−Ａ＋ＡＲ−Ｅ）ｄＢｄとなり、ここで一次標的密度は、一次抗体の希釈率によって制御される。唯一の要件は、Ｐが常にＡよりも大きくなることである。１０倍の酵素利得＝−２０ｄＢｄ及び＋６ｄＢｄの抗原賦活化による消失では、一次アレイは−２０ｄＢｄ、−２６ｄＢｄ、−３２ｄＢｄである。抗原賦活化による消失は、二次アレイに対する影響に基づくと、一次標的にそれらをブランクにするほど作用しない。二次アレイは抗原密度ルーラーを作成するのに十分であるが、一次希釈が正確に適用されたことを確認するのが重要である。このため、一次標的は、そのキャパシティにおいて機能する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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