(57)【要約】  本発明は、組織再生、特に腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織の再生または置換のための支持体またはマルチスケール階層骨格に関する。本発明はさらに、そのような支持体を得るための方法およびその使用に関する。
2020523178.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組織、特に腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織を置換、修復、再生、再構築またはシミュレートするためのマルチスケール階層骨格であって、
それぞれがナノ繊維からなる電界紡糸により得られた複数のクラスタであって、単一群を形成するように配置された複数のクラスタと、
ナノ繊維からなる電界紡糸により得られた多孔性シースであって、前記複数のクラスタを整列させた状態に維持しながらそれらを外部コーティングおよび圧縮するシースと
を備えるマルチスケール階層骨格。
【請求項２】
単一群を形成するように軸方向に整列および／またはねじれたナノ繊維からそれぞれ構成される、電界紡糸により得られた、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）の複数のクラスタと、
ナノ繊維からなる電界紡糸により得られた多孔性シースであって、前記複数のクラスタを整列させた状態に維持しながらそれらを外部コーティングおよび圧縮するシースと
を備える、請求項１に記載の骨格。
【請求項３】
それぞれ軸方向に整列および／もしくは軸方向にねじれたナノ繊維で構成される、ならびに／または単一群を形成するように無作為に配置された、電界紡糸により得られたナノ繊維の複数のリング状クラスタ（リング束）と、
ナノ繊維からなる電界紡糸により得られた多孔性シースであって、前記複数のクラスタを互いに整列させた状態に維持しながらそれらを外部コーティングおよび圧縮するシースと
を備える、請求項１または２に記載の骨格。
【請求項４】
２〜１００００Ｎ、特に１０〜５０００Ｎの機械的抵抗、および２０〜１０００００ＭＰａ、特に３０〜２００００ＭＰａの弾性率を有する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項５】
２００〜５００Ｎの機械的抵抗、および／または３０〜２００００ＭＰａの弾性率を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項６】
２〜１００００Ｎの機械的抵抗、および２０〜１０００００ＭＰａの弾性率を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項７】
１０〜１０００ｍｍ、特に１０〜５００ｍｍの長さ、および１〜１００ｍｍの平均直径を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項８】
２０〜２００ｍｍの長さ、および５〜５０ｍｍの平均直径を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項９】
前記クラスタおよび／または前記シースを構成する前記ナノ繊維が、１０〜１００００ｎｍの平均直径を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項１０】
前記クラスタおよび／または前記シースを構成する前記ナノ繊維が、２００〜１０００ｎｍ、特に３００〜１０００ｎｍの平均直径を有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項１１】
前記クラスタの平均直径が、１〜１００００μｍ、特に２０〜１００００μｍである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項１２】
前記クラスタの平均直径が、５００〜６５０μｍである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項１３】
ナノ繊維からなる電界紡糸により得られる第２の多孔性シースによって順に結合され、前記シースにより前記複数の骨格が外部コーティングおよび圧縮されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の複数の内側骨格を備える骨格。
【請求項１４】
前記多孔性シースが、無作為に配置されたナノ繊維からなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項１５】
前記多孔性シースが、骨格軸に対して軸方向に整列して配置されたナノ繊維からなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項１６】
前記多孔性シースが、骨格軸に対して円周方向に整列して配置されたナノ繊維からなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項１７】
前記多孔性シースが、請求項１４〜１６の組み合わせに従って配置されたナノ繊維からなる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項１８】
前記内側骨格が、軸方向に整列している、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項１９】
前記内側骨格が、互いにねじれた（ねじれている）、および／または無作為に配置されている、請求項１３〜１７のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項２０】
前記骨格内の前記クラスタの数が、４０〜１０００である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項２１】
前記骨格が、生体吸収性または生体安定性および／または不活性材料からできている、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項２２】
前記骨格が、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアミド、ポリオレフィン、ならびにそれらのフッ素化ポリマーおよびコポリマーから選択される合成材料、または多糖類、タンパク質、ポリエステル、ポリペプチドならびにそれらのコポリマーおよび／またはそれらの混合物から選択される天然材料からできている、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項２３】
前記ナノ繊維を作製するために、ポリ−（Ｌ）−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリアミドおよび／またはナイロン６，６が使用される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項２４】
前記骨格および／または前記ナノ繊維が、生物学的作用、ならびに／または前記組織の化学物理的および／もしくは機械的特性の変化をもたらしやすい有機および／または無機成分を付与および／または機能化されている、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項２５】
前記有機および／または無機成分が、薬物、成長因子、抗菌剤、ペプチド、ヒドロキシアパタイト、ホスフェート、バイオガラス、金属酸化物、グラフェン、カーボンナノチューブまたはそれらの混合物から選択される、請求項２４に記載の骨格。
【請求項２６】
ゲルまたはヒドロゲルが前記骨格に注入されている、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項２７】
前記ナノ繊維が単相性である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項２８】
前記ナノ繊維が、多相性である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項２９】
前記ナノ繊維が、コアシェル型および／または中空シェル型および／または多孔質および／またはそれらの組み合わせである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項３０】
前記ナノ繊維が、圧電型である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項３１】
前記束が、その内部に軸方向の空洞を有する、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項３２】
請求項１から３１のいずれか一項に記載の骨格を備える移植可能な人工装具。
【請求項３３】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の骨格を備える合成腱および／または靭帯。
【請求項３４】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の骨格を備える合成筋肉。
【請求項３５】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の骨格を備える合成神経。
【請求項３６】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のマルチスケール階層骨格を作製する方法であって、
ａ）軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）を電界紡糸することにより作製するステップと、
ｂ）外部コーティングを提供し、ステップａ）により作製された複数のクラスタを圧縮するために、前記クラスタをナノ繊維からなる多孔性シースでコーティングするようにナノ繊維を電界紡糸するステップと
を含む、方法。
【請求項３７】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載のマルチスケール階層骨格を作製する方法であって、
ａ）軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）を電界紡糸することにより作製するステップと、
ｂ）ステップａ）により作製された前記複数のクラスタを、単一群を形成するように位置付けるステップと、
ｃ）ステップｂ）により得られたクラスタの群を、クランプされたクラスタの群を電界紡糸シースでコーティングするプロセスに適した位置に維持することにより、一直線に剛体として軸回転できるグリップにクランプするステップと、
ｄ）特にクランプされたクラスタの群の回転パラメータ、構成の幾何学的パラメータ、およびプロセスパラメータを制御することによって電界紡糸することにより、ステップｃ）でクランプされたクラスタの群の外部のシースを作製するステップと
を含む、方法。
【請求項３８】
前記クラスタおよび／または前記シースのナノ繊維が、ジクロロメタン（ＤＣＭ）および／もしくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したＰＬＬＡまたはトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）および／もしくはアセトン（ＡＣ）に溶解に溶解したナイロン６，６の溶液を電界紡糸することにより作製される、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ナノ繊維を電界紡糸するステップ中に、１０ｋＶから３０ｋＶの間、好ましくは１８ｋＶの電圧を有する電界が少なくとも５分、特に少なくとも１５分の期間印加される、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ナノ繊維を電界紡糸するステップａ）の間に、前記ナノ繊維がその整列を可能にするようにコレクタ上に堆積される、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記シースを形成するステップ中に、前記ナノ繊維が、コーティングされるクラスタの群の近くに位置付けられたコレクタ上に堆積されるが、前記クラスタの群と接触しない、特にコーティングされるクラスタの群から約２〜５ｍｍ離して位置付けられる、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記シースを作製する前記ステップにおいて、以下のプロセスパラメータ、
５ｍｍ未満のクラスタの群と前記コレクタとの間の距離、
約２０〜２５ｒｐｍの間に含まれるクラスタの群の回転速度、
約３〜５分の間に含まれるクラスタの群の静止期間、
１〜２分の間に含まれるクラスタの群の回転期間
を使用する、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
グリップが、導電性金属材料、例えばステンレス鋼および／またはアルミニウムで作製され、骨格自体の端部に無作為に配置されたナノ繊維の前記シースの堆積を向上させるために接地電位で位置付けられる、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記シースを形成するステップの間、接地コレクタが平面形状を有する、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記シースを形成するステップの間、接地コレクタが、凹状、凸状またはプリズム状のプレートである、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記シースを形成するステップの間、接地コレクタが、２つの平行な金属ロッドおよび／またはプレートからなる、請求項３６〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
ａ）複数の電界紡糸ナノ繊維を回転ドラムコレクタ上で紡糸するステップと、
ｂ）電界紡糸ナノ繊維の膜のセクションをドラムの円周に巻き取り、リング状の束（リング束）を得るステップと、
ｃ）ドラムからナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）を取り出すステップと
を含む、請求項３６〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
複数の内側骨格を備えるマルチスケール階層骨格を作製する方法であって、
ａ）請求項１〜３１のいずれか一項に記載の複数の骨格を作製するステップと、
ｂ）ナノ繊維を電界紡糸して、前記複数の骨格をナノ繊維からなる多孔性シースでコーティングし、外部コーティングを提供し、ステップａ）により作製された複数の二重骨格を圧縮するステップと
を含む方法。
【請求項４９】
請求項３６〜４８のいずれか一項に記載の方法に従って得ることができる骨格。
【請求項５０】
機械的または生理学的信号を取得および／または伝送するためのセンサとして使用される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の骨格。
【請求項５１】
機械的または生理学的信号を取得および／または伝送するためのインビトロセンサとしての、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の骨格の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組織再生、特に腱および／または靭帯組織の再生または置換のための階層的でマルチスケールの三次元構造を特徴とする支持体（骨格）に関する。
【０００２】
本発明はまた、筋肉および／または神経組織の再生および／または置換および／またはシミュレーションにも適用することができる。
【０００３】
本発明はさらに、そのような支持体を得るための方法およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
組織工学の分野では、骨格は細胞の接着、増殖、移動に理想的な環境を提供する上で重要な役割を果たす。組織工学のための支持体の形態および構造は、再構築または置換される組織および臓器の形状および明確な構造のための基礎である。したがって、骨格の構造、形態、ならびに物理的および化学的特性の他の側面には、組織の再構築および／または置換に理想的とする特定の要件がある。
【０００５】
特に、靭帯または腱の再構築のための骨格は、生分解性、多孔質、生体適合性であるべきであり、十分な耐性および機械的剛性を有するべきであり、また靭帯または腱の組織の形成に有利となるべきである。
【０００６】
Ｄａｗｅｉらは、Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ  Ｂ  ２０１５、３、８８２３において、ナノ繊維ジポリ（Ｌ−ラクチド−コ−カプロラクトン）（Ｐ（ＬＬＡ−ＣＬ））およびポリ乳酸（ＰＬＬＡ）を電界紡糸することにより作製された末梢神経病変の再生のための支持体（骨格）を説明している。そのような骨格は、優先配向なしで電界紡糸されたナノ繊維によって形成された外側シースを有し、これは、以前に形成されたねじれたナノ繊維のある特定の数のクラスタ（糸）をコーティングする。腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織の組織工学の分野におけるこの構築物の適用可能性の限界は明らかなようである。
【０００７】
第一に、実際には、外側シースの紡糸にドラム接地コレクタが使用され、その周りに完全な骨格を構成するねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）が手動で固定されている場合、そのような技術的解決策では、その最終的な機械的特性を明らかに制限することにより、完全な骨格内にそのようなねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）を良好に圧縮することができず、さらに、このアプローチでは、最終的な構造物から接地コレクタを後に取り外す必要があり、これは、骨格自体の完全性を損ない得る手順である。最後に、Ｄａｗｅｉらにより採用された技術的解決策では、外側シースで電界紡糸された限られた数のねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）をコーティングすることができ、ねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）の数および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）の直径を増やすと、またはドラムコレクタの直径を小さくした場合、コレクタの接地効果が大幅に弱まり、外側シースを構成する電界紡糸繊維の堆積が不可能になるという大きなリスクがある。
【０００８】
さらに、既知の文献では、ねじれたナノ繊維のそのようなクラスタ（糸）および／または軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）を損傷組織および／もしくは筋肉との界面ならびに／または骨界面に効果的に縫合および／または固定できる有効な解決策は提供されていない。
【０００９】
ジャクソンら（国際公開第２０１０／０６２２９７号パンフレット）は、骨格自体に対して軸方向に整列した、同じく電界紡糸技術によって得られた単一ナノ繊維で構成された内部を含む無作為に配置されたナノ繊維（無作為）の多孔性シースで構成される、電界紡糸技術によって得られた神経等のいくつかの組織の再生のための支持体（骨格）について説明している。著者の説明によれば、骨格を電界紡糸するために、間にギャップ（ギャップ）を有する２つの同期回転シリンダが接地コレクタとして使用される。電界紡糸プロセスの初期段階の間、２つの接地コレクタに引き付けられたナノ繊維がローラの２つの対向する面に付着し、ローラ間のギャップを埋めて整列する。ローラの内面を整列したナノ繊維でコーティングすると、プロセスを継続することにより、整列したナノ繊維をコーティングするシースを構成することにより、ナノ繊維が無作為に配置される（２つのローラの軸方向領域によって引き付けられる）。プロセスの最後に、その内部に軸方向に整列した単一ナノ繊維で構成され、無作為に配置されたナノ繊維のシースでコーティングされた多孔質骨格が得られる。第１の制限は、骨格の最終的な長さを調整できないことである。事実、ローラ間の距離を大きくすると、骨格の生成および／またはナノ繊維の配列を不可能にすることによって、ナノ繊維を２つのローラ上のみに別々に堆積させることにより、２つのローラ間の接地効果が完全に消えるまで徐々に減少することが知られている。さらに、形態学的にそのような骨格は神経組織に関して極めて異なる構造を有し、完全な組織を形成するために異なるレベルで結合する下位構造で組織化された複雑でコンパクトな階層的でマルチスケールの繊維構造によって特徴付けられる。神経のマルチスケール階層構造では、そのような組織の基本的な要素は、ミエリン化された神経軸索にある。神経軸索は整列し、群として神経線維束に結合し、神経線維束の群は、神経上膜と呼ばれる線維性スリーブによって互いに結合し、圧縮されて、完全な神経が得られる。さらに、いくつかの神経では、神経線維束の単一下位群が神経周膜と呼ばれるスリーブによってそれらの間に結合し、これらの構造は神経上膜スリーブによって結び付けられる。今述べた構造は全て、著者が提案した骨格によって形態学的に再現されておらず、反対に、階層的またはマルチスケールの三次元構造を持たないようである。著者が提案した骨格における階層的組織化のそのような欠如は、骨格自体の機械的特性をさらに損なうが、これは、それがその中に整列したナノ繊維のみを含むが、下位構造内の組織化も圧縮レベルも有さないことは、そのような組織がインビボで供される生理的負荷を支える満足できる機械的抵抗を提供することができないためである。
【００１０】
Ｓｅｎｓｉｎｉら（Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ．２０１７  Ｍａｒ  ８；９（１）：０１５０２５）は、電界紡糸技術により、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）を生成するための方法を説明している。その形成のために、ポリマーナノ繊維は、高速で回転するドラムコレクタで電界紡糸される。電界紡糸プロセスの終わりに、ナノ繊維の膜の円周ストリップがドラム上で切断され、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）を形成することによって巻き上げられ（それぞれ約５００マイクロメートルの直径を有する）、次いでそれが切断されドラムから取り出される。しかしながら、著者は、これらの軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）を、コラーゲンの単一腱束の形態および機械的特性を模倣する骨格として示しているが、完全な腱を再現できるマルチスケール階層骨格を生成するための方法を提案してはない。
【００１１】
上記のことは、腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経の階層構造を各要素で再現することができるマルチスケール階層骨格の再現を目指した文献の大きな欠如を示している。
【００１２】
したがって、上記で要約した最新技術は、最新技術の欠点を有さない、その製造のための新しい支持体および方法を提供する必要性を示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】国際公開第２０１０／０６２２９７号
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ  Ｂ  ２０１５、３、８８２３
【非特許文献２】Ｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ．２０１７  Ｍａｒ  ８；９（１）：０１５０２５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明者らは、腱および靭帯および／または筋肉および／または神経の機械的、形態学的および生理学的特徴を再現することができる、階層的およびマルチスケールの三次元構造（マルチスケール階層骨格）を備えた構築物を介して、腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織を置換および／または再構築することを可能にする支持体（骨格）を得ることに成功した。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
本明細書の構築物および／またはマルチスケール階層骨格の下では、各デバイスまたは構造は、階層的順序で相互に結合する、異なる次元スケールの下位構造によって構成されることを意味する。この構成は、腱および／または靭帯等の結合組織、ならびに筋肉および神経に典型的なものである。実際、腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織は、異なる特徴（以下、分子レベルから始まって腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経全体まで列挙される）によって構成されるマルチスケール階層構造によって構成される。
【００１７】
腱および／または靭帯のマルチスケール階層構造では、そのような組織の基本要素は、コラーゲン原線維を生成することにより互いに結合しているトロポコラーゲン分子にあり、コラーゲン原線維は、線維束と呼ばれる異なる群で整列しており、線維束の群は、エピテノン／エピリガメント（ｅｐｉｌｉｇａｍｅｎｔ）と呼ばれるコラーゲン原線維のスリーブによって互いに結合および圧縮されて腱または靭帯全体を形成する。さらに、いくつかの腱および／または靭帯では、線維束の単一下位群が、エンドテノン／エンドリガメント（ｅｎｄｏｌｉｇａｍｅｎｔ）と呼ばれるスリーブによってそれらの間に結合し、これらの構造はエピテノン／エピリガメント（ｅｐｉｌｉｇａｍｅｎｔ）スリーブによって結び付けられる。
【００１８】
腱および／または靭帯の自然なマルチスケール階層構造は、本発明が関連するマルチスケール階層骨格によって完全に模倣され、電界紡糸ナノ繊維（腱および／または靭帯のコラーゲン原線維に匹敵するナノメートルの直径を有する繊維）は、ポリマー巨大分子（トロポコラーゲンに類似した次元スケールで）からなり、複数の電界紡糸ナノ繊維が整列して軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）を形成し、および／またはねじれてねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）を形成し（腱および／または靭帯の線維束に類似している）、軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）、および／またはねじれたナノ繊維の複数のクラスタ（糸）は、ナノ繊維の電界紡糸シース（腱および／または靭帯のエピテノン／エピリガメント（ｅｐｉｌｉｇａｍｅｎｔ）スリーブを模倣する）によって互いに結合および圧縮され、これが本発明が関連するマルチスケール階層骨格を形成する。さらに、本発明が関連するいくつかのマルチスケール階層骨格は、以前のものと同様に生成された追加の電界紡糸シースによって、追加の階層レベルでそれらの間で順番に結合することができる。この場合、単一マルチスケール階層骨格をコーティングするシースは、腱および／または靭帯のエンドテノン／エンドリガメント（ｅｎｄｏｌｉｇａｍｅｎｔ）スリーブをシミュレートするが、それに結合する外側シースは、腱および／または靭帯のエピテノン／エピリガメント（ｅｐｉｌｉｇａｍｅｎｔ）をシミュレートする。
【００１９】
筋肉の階層的でマルチスケールの構造では、そのような組織の基本的な要素は、アクチンとミオシンの分子にあり、筋肉繊維と呼ばれる繊維状の構造を生成することで互いに結合している。筋肉繊維は整列して、群として筋肉線維束に結合し、筋肉線維束の群は、完全な筋肉を形成することにより、エピミシウムと呼ばれる線維性スリーブによって互いに結合し、圧縮される。さらに、一部の筋肉では、筋肉線維束の下位群がペリミシウムと呼ばれるスリーブによってそれらの間に結合し、これらの構造はエピミシウムによって結び付けられる。
【００２０】
筋肉の自然なマルチスケール階層構造は、本発明が関連するマルチスケール階層骨格によって完全に模倣され、ポリマー巨大分子（筋肉のアクチンおよびミオシンに匹敵する次元スケールで）は、（筋原線維に匹敵する）電界紡糸ナノ繊維を形成し、複数の電界紡糸ナノ繊維が整列して軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）を形成し、および／またはねじれてねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）を形成し（筋肉線維束に類似している）、軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）、および／またはねじれたナノ繊維の複数のクラスタ（糸）は、ナノ繊維の電界紡糸シース（エピミシウムスリーブを模倣する）によって互いに結合および圧縮され、これが本発明が関連するマルチスケール階層骨格を形成する。さらに、本発明が関連するいくつかのマルチスケール階層骨格は、前のものと同様に生成された追加の電界紡糸シースによって追加の階層レベルで順番に結合することができる。この場合、単一マルチスケール階層骨格をコーティングするシースは、筋肉のペリミシウムスリーブをシミュレートするが、それらを結合する外側シースは筋肉組織のエピミシウムスリーブをシミュレートする。
【００２１】
神経のマルチスケール構造では、そのような組織の基本的な要素は全て、ミエリン化された神経軸索にある。神経軸索は整列し、群として神経線維束に結合し、神経線維束の群は、完全な神経を得るために神経上膜と呼ばれる線維性スリーブによって互いに結合し、圧縮される。さらに、いくつかの神経では、神経線維束の単一下位群が神経周膜と呼ばれるスリーブによってそれらの間に結合し、これらの構造は神経上膜スリーブによって結び付けられる。
【００２２】
神経の自然なマルチスケール階層構造は、本発明が関連するマルチスケール階層骨格によって完全に模倣され、複数の電界紡糸ナノ繊維（神経の芽およびシュワンの細胞の成長を誘導するため）は、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）として整列および群化する、および／またはナノ繊維のクラスタとしてねじれ（糸）（神経線維束に類似している）、軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）、および／またはねじれたナノ繊維の複数のクラスタ（糸）は、ナノ繊維の電界紡糸シース（神経の神経上膜スリーブを模倣する）によって互いに結合および圧縮され、これが本発明が関連するマルチスケール階層骨格を形成する。さらに、本発明が関連するいくつかのマルチスケール階層骨格は、前のものと同様に生成された追加の電界紡糸シースによって追加の階層レベルでそれらの間で順番に結合することができる。この場合、単一マルチスケール階層骨格をコーティングするシースは、神経の神経周鞘をシミュレートするが、それらを結合する外側シースは神経組織の神経上膜スリーブをシミュレートする。
【００２３】
そのようなマルチスケール階層骨格の生成に使用される方法により、外側の電界紡糸シースを生成することができ、これは、マルチスケール階層骨格の本体内で接地コレクタを使用せずに、マルチスケール内の軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）の下位群を圧縮するためにも使用され得る。さらに、そのようなシースは、同時に細胞の通過を可能にすることにより、その内部の軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）の保護および機械的圧縮を提供する。
【００２４】
本発明者らによって得られたマルチスケール階層骨格は、完全な腱／靭帯に到達するまで、コラーゲン原線維から腱／靭帯線維束までの腱／靭帯組織の様々な凝集レベルを繰り返すことに成功する。さらに、本発明者らは、腱／靭帯（エピテノン）をコーティングするスリーブに形態学的に類似した、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）の表面にナノ繊維のシースを電界紡糸できるようにするための方法を開発することに成功し、その下位群（エンドテノン）のコーティングにも成功した場合、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）の圧縮を可能にし、またその片側の機械的抵抗に有利であるが、さらにはシースを通る細胞の通過、ならびに軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）のコロニー形成を可能にする。
【００２５】
本明細書に記載のマルチスケール階層骨格の追加の利点は、片側ではその内部の軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）に対する保護を、反対側では軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）上に堆積でき、また腱／靭帯および／または筋肉および／または神経細胞外マトリックスを再構築できることを目的として細胞の通過を保証することができる多孔質電界紡糸シースを介して圧縮および結合された、任意の直径を有する任意の数の軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）をその内部に含む可能性にある。電界紡糸シースは、マルチスケール階層骨格の内部にコレクタを使用せずに生成され、その内部の軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）を圧縮し、場合によってはねじる（ねじる）ことができる。そのようなシースはまた、機械的特性および凝集階層レベルをさらに高めることにより、マルチスケール階層骨格内の軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）の下位群をコーティングするためにも使用され得る。
【００２６】
したがって、第１に、本発明は、組織、特に腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織の置換および／または修復および／または再生および／または再構築および／またはシミュレーションのためのマルチスケール階層骨格であって、
−それぞれがナノ繊維からなる電界紡糸により得られた複数のクラスタであって、単一群を形成するように配置された複数のクラスタと、
−ナノ繊維からなる電界紡糸により得られた多孔性シースであって、前記複数のクラスタを整列させた状態に維持することによりそれらを外部コーティングおよび圧縮するシースと
を備えるマルチスケール階層骨格に関する。
【００２７】
そのようなシースはまた、凝集階層レベルを上げることにより、マルチスケール階層骨格の群を互いに結合することができる。
【００２８】
すると、前記シースは、以前に開発された構築物の場合とは異なり、それらを織り交ぜる必要なく、撚り合わせる必要なく、また同じ効果を得るために充填剤の圧縮の使用の可能性なく、同時に互いに整列した状態を維持することにより、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）を圧縮することに成功し、その結果、腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経体組織に典型的なものと同様の機械的特性を保証することにより、同時に腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織自体の階層組織を完全にフィデリック（ｆｉｄｅｌｉｃ）に模倣することを可能にする。
【００２９】
その結果、そのような特徴は、腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織の再生のために考案された骨格に実質的に重要となり、実際、骨格の形態学的構造を自然組織の形態学的構造から変えることにより、瘢痕組織が生じるリスクは非常に強く、その結果、再生組織の最終的な機械的および形態学的特性が消失する。前記シースはさらに、マルチスケール階層構造全体にコロニー形成すべき細胞の通過を可能にし、さらに、細胞成分の正しい血管新生と、対象組織の再構築中に細胞によって生成された廃棄成分の除去を可能にする。結果として生じる骨格は、腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経のヒト組織と同程度の高い機械的特徴（抵抗および剛性）を有する。
【００３０】
第２に、本発明は、組織、特に腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織の置換、修復または再構築のためのマルチスケール階層骨格を作製する方法であって、
ａ）軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）を電界紡糸することにより作製するステップと、
ｂ）外部コーティングを提供し、ステップａ）に従って作製された軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維の複数のクラスタ（糸）を圧縮するために、軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維の複数のクラスタ（糸）をナノ繊維からなる多孔性シースでコーティングするようにナノ繊維を電界紡糸するステップと
を含む方法に関する。
【００３１】
特に、一実施形態によれば、その方法は、
ａ）各々が軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）からなる複数のクラスタを電界紡糸することにより作製するステップと、
ｂ）ステップａ）に従って作製された軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）の前記複数のクラスタを、単一群を形成するように位置付けるステップと、  ｃ）ステップｂ）で得られた軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）のクランプされた群を、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）のクランプされた群を電界紡糸シースでのコーティングプロセスに適した位置に維持することにより、剛体として一直線に軸回転できるグリップにクランプするステップと、
ｄ）特に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）のクランプされた群の回転パラメータ、構成の幾何学的パラメータ、およびプロセスパラメータを制御することによって電界紡糸することにより、ステップｃ）でクランプされた軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）の群の外側シースを形成するステップと
を提供する。
【００３２】
生成されるシースは、異なるクラスタ間のギャップを最小限に抑え、したがってマルチスケール階層骨格のグローバルセクションを最小限に抑えることにより、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）を圧縮する効果を有する。そのような効果により、模倣しなければならない自然組織の機械的特性に匹敵し、そのセクション全体で均質な機械的特性を発現できる構築物を得ることができる。
【００３３】
ステップｂ）に従って、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）の群を、マルチスケール階層骨格の群に置き換え、ステップｃ）およびｄ）を繰り返すことにより、複数のマルチスケール階層骨格で構成されるように、凝集階層レベルがさらに増加したマルチスケール階層骨格を得ることがさらに可能になる。
【００３４】
第３に、本発明は、ナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）と呼ばれる新しい電界紡糸構築物に関する。そのような構築物は、無作為に配置されたナノ繊維（無作為）からなる閉じたリング状に形態学的に構成され、および／またはリングの軸方向に沿った整列度を有する。そのようなナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）は、必ずしも元の円形で使用されるわけではないが、閉じた細長い形状を得るような方向に従って引き伸ばすことができる。特に、そのようなナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）は、単独で使用される場合、および／またはこれに類似するナノ繊維の複数のリング状クラスタに並べて配置される場合、腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経と同様のマルチスケール階層電界紡糸骨格を構築するために使用され得る。特に、ステップａ）で、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）を、ナノ繊維の単一リング状クラスタ（リング束）および／または複数のナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）と交換した場合、およびステップｂ）からステップｄ）のシースの生成手順を繰り返すことによって、電界紡糸シースは、電界紡糸ナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の中央領域を、それに細長い形状を提供することにより、およびマルチスケール階層骨格の終わりにループを生成することにより圧縮する。そのようなループは、例えば、そのようにして得られたマルチスケール階層骨格を、対象となる腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経および／または骨とのインターフェースに縫合および／または固定するのに有用となる。さらに、そのようなナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）は、互いに軸方向に整列した、および／もしくは互いにねじれた（ねじれ）、および／もしくは単独でねじれ、かつ互いに軸方向に並んで配置された、および／もしくは単独でねじれ（ねじれ）、かつ互いにねじれた（ねじれ）状態でマルチスケール階層骨格内に配置されてもよく、ならびに／または軸方向に整列したナノ繊維の１つまたは複数のクラスタ（束）および／もしくはねじれたナノ繊維の１つまたは複数のクラスタ（糸）と共に同じ骨格内に配置されてもよい。
【００３５】
そのような電界紡糸ナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）は、無作為に配置された（無作為）および／または軸方向に整列したおよび／またはねじれたナノ繊維からなることができる。
【００３６】
本発明の他の利点、特徴および使用形態は、限定ではなく例示を目的として示されるいくつかの実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】本発明の好ましい実施形態によるマルチスケール階層骨格の軸方向に整列したナノ繊維の単一クラスタ（束）の写真である。
【図２】本発明の好ましい実施形態による無作為に配置された繊維の外側シースによって一緒に保持された軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）（図１）からなるマルチスケール階層骨格を完全に示す写真である。
【図３】本発明の好ましい実施形態によるシースの紡糸の前の段階で並んで配置された、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）を互いに平行に固定できる実験構成の写真である。
【図４】本発明の好ましい実施形態による、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）をナノ繊維の外側シースでコーティングすることを可能にする実験構成の写真である。
【図５】ポリ（Ｌ）乳酸（ＰＬＬＡ）中の軸方向に整列したナノ繊維の単一クラスタ（束）のナノ繊維の断層画像である。
【図６】軸方向に整列したナノ繊維の１００個のクラスタ（束）および電界紡糸された外側シースで構成されるＰＬＬＡ中のマルチスケール階層骨格のセクションのＳＥＭ画像である。
【図７】本発明の好ましい実施形態によるナノ繊維の単一リング状クラスタ（リング束）の写真である。
【図８】それ自体の端部で縫合および／または固定するためのループを示すことよる、本発明の好ましい実施形態による無作為に配置されたナノ繊維の外側シースにより一緒に保持されたナノ繊維の複数のリング状クラスタ（リング束）（図７）からなるマルチスケール階層骨格を完全に示す写真である。
【図９】本発明が関連するマルチスケール階層骨格の階層構造と比較した、腱および／または靭帯、筋肉および神経組織のマルチスケール階層レベルの凝集の概略図である。特に、ａ）腱および／または靭帯のマルチスケール階層構造、ｂ）筋肉のマルチスケール階層構造、ｃ）神経のマルチスケール階層構造、ｄ）マルチスケール階層骨格構造である。
【図１０】同じ組織のマルチスケール階層レベルを増加させることにより、同じ組織のさらに下位階層ユニットが結合する腱および／または靭帯、筋肉および神経組織のマルチスケール階層レベルの凝集の概略図である。そのようなレベルは、マルチスケール階層骨格の階層構造と比較され、本発明は、より高い階層組織化レベルのマルチスケール階層骨格を形成することにより、マルチスケール階層骨格の群が電界紡糸ナノ繊維の追加のシースによって一緒に結合される実施形態に関する。特に、ａ）腱および／または靭帯のマルチスケール階層構造、ｂ）筋肉のマルチスケール階層構造、ｃ）神経のマルチスケール階層構造、ｄ）マルチスケール階層骨格の群によって構成されるマルチスケール階層骨格構造である。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、マルチスケール階層骨格、その製造方法およびその使用に関する。
【００３９】
本明細書における階層的およびマルチスケールとは、階層的順序で結合する異なる次元スケールを有する下位構造によって構成される各デバイスまたは構造を意味する。
【００４０】
本明細書における「支持体またはマルチスケール階層骨格」という表現は、本来の状態で再構築したい組織の細胞外マトリックスを可能な限り正確に模倣するために、（以前に定義された）マルチスケール構造で階層的に組織化された、異なるレベルの次元スケール（ナノメートルからマイクロメートルおよびミリメートル）で形態学的レベルで組み立てられた生体材料で構成される多孔質異方性三次元構築物を意味する。骨格は、典型的には次の機能を実行するように設計されている：（ｉ）細胞と生体材料との相互作用、細胞接着および細胞増殖を促進すること、（ｉｉ）酸素、二酸化炭素、栄養素の輸送を可能にすること、（ｉｉｉ）生体吸収性である場合には、対象となる培養条件下で組織再生速度に近い速度で生分解すること、（ｉｖ）ｉｎ  ｖｉｖｏ（生体内）の炎症または毒性を引き起こさないこと、ならびに（ｖ）再構築したい組織に類似した機械的特性を有すること。
【００４１】
非生体吸収性材料でも選択可能であるが、この場合、ｉｎ  ｖｉｖｏで炎症および毒性を引き起こすべきではなく、再構築および／またはシミュレートおよび／または交換したい組織に類似した機械的および形態学的特性を有するべきである。
【００４２】
本明細書における「軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）」とは、クラスタ自体の軸に従う、すなわちこれらの構築物のより大きな発達方向に沿った整列レベルで配列するナノ繊維からなる、可変の伸長および／または断面を有する電界紡糸構造を意味する。
【００４３】
本明細書における「ねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）」とは、電界紡糸構造は、糸自体の軸に従う、すなわちこれらの構築物の長さ方向に沿ったねじれのレベルで配列するナノ繊維からなる可変の伸長および／または断面を有する電界紡糸構造を意味する。
【００４４】
本明細書における「ナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）」とは、ナノ繊維からなり、リング状クラスタまたはリング束自体の軸に沿った整列レベルの可変の伸長および断面を有するリング状電界紡糸構造を意味する。
【００４５】
本明細書における「単一群を形成する」という表現は、単一クラスタを形成するという事実を意味する。
【００４６】
さらなる実施形態において、リング状クラスタを構成するナノ繊維は、無作為に（無作為）、および／またはねじれた形で（ねじれ）、および／またはリング状クラスタもしくはリング束自体の本体内部の軸方向の整列レベルで配置され得る。
【００４７】
本発明によるマルチスケール階層骨格は、電界紡糸により得られた軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）を外部コーティングする、電界紡糸により得られた多孔性シースをさらに含む。前記外側シース（ケーシング）も、ナノ繊維で構成される。シースの多孔性は、組織−非組織構造のような三次元構造を形成することにより、同じ平面上にプロセス期間中に堆積する連続ナノ繊維の層の重ね合わせによって生成される。次いで、シースの多孔性は、細孔が繊維のシースの外層を最内層と連通させ、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）および／またはマルチスケール階層骨格の下位群と接触するという意味で相互接続される。細孔間の相互接続により、細胞は外側シースを介してろ過され、マルチスケール階層骨格の内層に到達し得る。
【００４８】
シースのナノ繊維は、無作為に、および／または軸方向の整列レベルで、および／または周囲の整列レベルで配置され得る。
【００４９】
マルチスケール階層骨格を構成するナノ繊維の平均直径は、１０〜１０００００ｎｍの間に含まれ得る。
【００５０】
マルチスケール階層骨格の長さは、１０〜１０００ｍｍの間、特に１０〜５００ｍｍ、好ましくは２０〜２００ｍｍの間に含まれてもよく、１〜１００ｍｍの間に含まれる、好ましくは２〜５０ｍｍの間に含まれる平均直径を有する。一実施形態によれば、マルチスケール階層骨格は、生体吸収性または生体安定性および／または不活性材料で作製される。
【００５１】
合成起源の生体吸収性または生体安定性材料の例は、ポリエステル、ポリウレタン、ポリアミド、ポリオレフィン、それらのフッ素化ポリマーおよびコポリマーである。天然起源の生体吸収性または生体安定性材料の例は、多糖類、タンパク質、ポリエステル、ポリペプチド、およびそれらのコポリマーである。ナノ繊維を作製するための材料の好ましい例は、ポリ−（Ｌ）−乳酸（ＰＬＬＡ）および／またはコラーゲンおよび／またはナイロン６，６であり、当業者に知られている他の生体適合性ポリアミドもまた使用され得る。
【００５２】
一実施形態によれば、マルチスケール階層骨格および／またはそれが構成されるナノ繊維は、マルチスケール階層骨格を使用できる組織の生物学的作用ならびに／または化学物理的および／もしくは機械的特性の変化を担う有機および／または無機的性質の成分で負荷および／または機能化され得る。例えば、使用され得る有機および／または無機的性質の成分は、薬物、成長因子、抗菌剤、ペプチド、ヒドロキシアパタイト、ホスフェート、バイオガラス、金属酸化物、グラフェン、カーボンナノチューブである。
【００５３】
マルチスケール階層骨格および／またはシースおよび／または軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）を構成するナノ繊維の一実施形態において、それらは、形態の観点から、単一相（単一材料ならびに／または材料の混合物ならびに／または負荷および／もしくは機能化材料で作製される）および／もしくは２つ以上の相（例えば、コアシェルナノ繊維であり、コアシェルナノ繊維とは、ナノ繊維自体の中央部分と外側部分との間で異なる材料で作製されたものを意味する）で構成された古典的ナノ繊維、ならびに／または中空シェルナノ繊維（中空シェルとは、ナノ繊維がナノ繊維自体の軸に沿った内部中央空洞によって構成されることを意味する）、ならびに／または多孔性ナノ繊維（多孔性ナノ繊維とは、その表面および／もしくは内部容積に沿って細孔を有することを意味する）であってもよい。
【００５４】
異なる形態を有するナノ繊維を負荷および／または機能化および／または製造する手順は、当業者に知られている。
【００５５】
軸方向に整列したナノ繊維の単一クラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）および／またはシースおよび／または複数のシースを構成するナノ繊維は、１０〜１００００ｎｍの間に含まれる、好ましくは２００〜１０００ｎｍの間、特に３００〜１０００ｎｍの間に含まれる平均直径を有し、一方、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の平均直径は、１０〜１００００μｍの間に含まれる、特に２０〜１００００μｍの間、好ましくは５００〜６５０μｍの間に含まれ得る。軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の数は、例えば２〜１０００の間、好ましくは４０〜２００の間に含まれ、例えば１００である。
【００５６】
本発明によるマルチスケール階層骨格は、有利には、１０〜５０００Ｎの間、好ましくは２００〜５００Ｎの間の機械的抵抗値、および／または２０〜１０００００ＭＰａの間に含まれる、好ましくは約３０〜２００００ＭＰａの弾性率を有する。そのような機械的特徴は、キャプスタングリップ（キャプスタングリップ）による単軸引張試験、および例に記載されているような端部の接合によって測定された。
【００５７】
本発明は、さらに、組織、特に腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織の置換および／または修復および／または再生および／または再構成および／またはシミュレーションのためのマルチスケール階層骨格を作製する方法であって、
ａ）軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）を電界紡糸することにより作製するステップと、
ｂ）外部コーティングを提供し、ステップａ）に従って作製された軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）を圧縮するために、軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）をナノ繊維からなる多孔性シースでコーティングするようにナノ繊維を電界紡糸するステップと、
ｃ）外部コーティングを提供し、ステップｂ）による軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはマルチスケール階層骨格を圧縮するために、ステップｂ）に従って複数の前記支持体またはマルチスケール階層骨格をナノ繊維からなる追加の多孔性シースでコーティングするようにナノ繊維を電解防止するステップと
を含む方法に関する。
【００５８】
本発明の一実施形態は、ナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）を作製するための方法であって、
ａ）所望の整列レベルに応じて異なる速度で回転するドラムのような形状の接地コレクタ上に、複数のナノ繊維を電界紡糸するステップと、
ｂ）ステップａ）に従う電界紡糸により得られたナノ繊維の膜の周囲ストリップを切断するステップと、
ｃ）ステップｂ）に従って得られたナノ繊維の膜の周囲ストリップを、ドラム軸に従って巻き上げるステップと、
ｄ）ステップｃ）に従って得られたナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）をドラムから引き出すステップと
を含む方法である。
【００５９】
特に、ナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）を用いてマルチスケール階層骨格を作製する方法は、
ａ）軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）を電界紡糸することにより作製するステップと、
ｂ）ステップａ）に従って作製された軸方向に整列したナノ繊維の複数のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはリング状ナノ繊維のクラスタ（リング束）を、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の単一群を形成するように配置するステップと、
ｃ）ステップｂ）に従って得られた群を、しっかりと一直線に軸回転できるグリップにクランプし、そのようにしてナノ繊維のクラスタおよび／または軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の群を、電界紡糸シースによるコーティングプロセスに適した位置にクランプして維持するステップと、
ｄ）特に軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）のクランプされた群の回転パラメータ、構成の幾何学的パラメータ、およびプロセスパラメータを制御することによって電界紡糸することにより、マルチスケール階層構造または骨格を得ることにより、ステップｃ）でクランプされた軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の群に外側シースを形成するステップと、
ｅ）特にクランプされた構造の群またはマルチスケール階層骨格の回転パラメータ、構成の幾何学的パラメータ、およびプロセスパラメータを制御することによって電界紡糸することにより、ステップｄ）に従って得られ、ステップ（ｃ）に従ってクランプされた構造の群またはマルチスケール階層骨格上に追加の外側シースを形成するステップと
を提供する。
【００６０】
一実施形態によれば、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）および／またはシースのナノ繊維は、適切な溶媒、例えばジクロロメタン（ＤＣＭ）およびＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解したＰＬＬＡの溶液を電界紡糸することにより作製され得る。溶液は、例えば、６５／３５（体積／体積）（ＤＣＭ／ＤＭＦ）中の１０〜３０％（重量／体積）のＰＬＬＡ等で作製され得る。
【００６１】
一実施形態によれば、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）および／またはシースのナノ繊維は、適切な溶媒、例えばトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびアセトン（ＡＣ）に溶解したナイロン６，６の溶液を電界紡糸することにより作製され得る。溶液は、例えば、５０／５０（体積／体積）（ＴＦＡ／ＡＣ）中の１０〜３０％（重量／体積）のナイロン６，６で作製され得る。
【００６２】
一実施形態によれば、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の紡糸条件は、高速で回転するコレクタに繊維を堆積させてナノ繊維の整列度を与えることにより、少なくとも５分間、特に少なくとも１５分間、好ましくは１時間の電界紡糸時間の間、１０〜３０ｋＶの間に含まれる、好ましくは１８ｋＶの電圧を有する電場の印加を提供する。コレクタに堆積したナノ繊維は、その後一緒に収集されて、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）を形成して整列度を有する。
【００６３】
一実施形態によれば、ナノ繊維の外側シースを製造するための回転機の電界紡糸条件は、少なくとも２時間、好ましくは３の電界紡糸時間の間、１０〜３０ｋＶの間に含まれる電圧を有する電場の印加を提供する。
【００６４】
有利には、シースを作製するために、以下のプロセスパラメータが適用される。
−クラスタの群とフラットコレクタとの間の距離が５ｍｍ未満
−約２０〜２５ｒｐｍのクラスタの群の回転速度
−約３〜５分のクラスタの群の静止期間
−１〜２分のクラスタの群の回転期間。
【００６５】
本発明によるマルチスケール階層骨格を作製するための方法は、重要な利点、特に、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の周りのシースの発達を有し、これは繊維の堆積を誘導するためにマルチスケール階層骨格の本体に何も挿入することなく生成される。
【００６６】
そのような結果は、コーティングされる軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の群の近くに配置されるが接触しないコレクタの形状、サイズ、および位置を調整することによって、ならびにその回転および静止期間を調整することによって得られ、例えば、それは、１〜５０ｍｍの間に含まれる距離で位置付けられてもよい。
【００６７】
このようにして、静止期間中、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）は、コレクタ上に配置された独自の端部を有するナノ繊維の層に囲まれる。クラスタの群を回転させることによって、ナノ繊維のクラスタの群を包み込み、圧縮およびプレテンションを促進することにより、ナノ繊維の層の一端がフラットコレクタから分離される。ナノ繊維の層全体がナノ繊維のクラスタの群の周りに巻き上げられると、フラットコレクタにまだ取り付けられている端が順番に分離される。分離が完了すると、回転および静電場の複合作用により、ナノ繊維の層の残りの部分さえも、ナノ繊維のクラスタの表面上に堆積する。このプロセスの繰り返しによって、ナノ繊維のクラスタの群のセクションの最終的な低減による圧縮、および完全なマルチスケール階層骨格を得るためのシースの完全な形成が徐々にもたらされる。
【００６８】
同様に、前述のように生成され、単一群を形成するように一緒に結合された複数のマルチスケール階層骨格上にナノ繊維のシースを生成するプロセスを繰り返すことにより、全てナノ繊維の電界紡糸シースでコーティングおよび圧縮された複数のマルチスケール階層骨格で構成されるマルチスケール階層骨格を得ることが可能になる。
【００６９】
一実施形態によれば、しっかりと一直線に回転し、したがってナノ繊維のクラスタの群を電界紡糸シースでのコーティングプロセスに適した位置にクランプした状態で維持することができる、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）を固定するためのグリップは、金属材料、好ましくはステンレス鋼および／またはアルミニウムで作製され得る。一実施形態によれば、そのようなグリップは、異なる直径および／または等しい直径、好ましくは０．５〜３０ｍｍの間の直径を有する、１〜１００個、好ましくは６個のシリンダアームを有する構造等、ナノ繊維のクラスタの固定を容易にする形状を有することができる。そのようなグリップを接地電位に電気的に接続して、紡糸プロセス中に、本明細書に記載のプロセスの任意の実施形態によるナノ繊維のシースによってマルチスケール階層骨格の端部のコーティングを容易にすることができる。
【００７０】
実際、最新技術では、そのような均一性レベルで、１）回転したドラムの周りに固定されたねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）に電界紡糸されたシース、または２）軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／もしくはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）が挿入された第２の瞬間にその内側に別個に生成されたシース、または３）樹脂等の充填剤により互いに固定された軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／もしくはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）の群に生成されたシースが形成された。これらの手順では、最終的な骨格を高レベルで圧縮することはできず、これは、構築物の機械的特性を高めるための基本であり、軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）のクラスタ数に重大な設計上の制約を課す。
【００７１】
本発明はまた、本明細書に記載の方法の実施形態のいずれか１つに従って得ることができるナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）およびその製造方法に関する。
【００７２】
本発明はまた、本明細書に記載の方法の実施形態のいずれかに従って得ることができるマルチスケール階層骨格に関する。
【００７３】
本明細書に記載のマルチスケール階層骨格は、特に生体安定性材料、または細胞増殖および組織再生用の材料で作製される場合、特に生体吸収性材料で作製される場合、例えば、移植可能な人工装具として整形外科または獣医分野の生物医学部門における異なる用途で使用され得る。
【００７４】
これはまた、生体安定性合成材料で作製される場合、ロボット工学において、ならびにアクチュエータおよびガイドの製造において、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの外科手術をシミュレートするための腱および／もしくは靭帯および／もしくは筋肉および／もしくは合成神経の製造において適用され得る。
【００７５】
本明細書に記載の実施形態のいずれかによるマルチスケール階層骨格を必要とする対象に移植するステップを含む、組織、特に腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織の再生または置換のための方法も本明細書に記載される。
【００７６】
本明細書に記載のマルチスケール階層骨格は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経の生成のためのｅｘ  ｖｉｖｏ方法、例えば、細胞がマルチスケール階層骨格とともにｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される方法で使用され得る。
【００７７】
一実施形態によれば、本発明はまた、組織、特に腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織の置換、修復、再構築またはシミュレーションのためのマルチスケール骨格であって、
−軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）および／またはねじれたナノ繊維のクラスタ（糸）および／またはナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）からなる電界紡糸により得られた複数のクラスタであって、単一群を形成するように配置された複数のクラスタと、
−無作為に配置された、および／または整列したナノ繊維からなる電界紡糸により得られた多孔性シースであって、前記複数のクラスタを互いに整列させた状態に維持しながらそれらを外部コーティングおよび圧縮するシースと
を備えるマルチスケール骨格に関する。
【００７８】
本明細書に記載の実施形態のいずれかによる骨格は、有利には、例えば機械的または生理学的信号を取得および／または送信するために、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで埋め込み可能なセンサとしても使用され得る。
【実施例】
【００７９】
［実施例１］
軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）自体の方向に整列したナノ繊維からなる軸方向に整列したナノ繊維の１００個のクラスタ（束）により構成される長さ１００ｍｍ（平均直径５〜６ｍｍ）のポリ−（Ｌ）−乳酸（ＰＬＬＡ）で作製されたマルチスケール階層骨格の８つのプロトタイプを開発した。（軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）の平均直径５５０〜６５０μｍ、ナノ繊維の平均直径５００〜６００ｎｍ）。
【００８０】
軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）を生成するために使用されるＰＬＬＡの同じ溶液を電界紡糸することにより、その上シースを生成した。ジクロロメタン（ＤＣＭ）およびジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）の６５／３５（体積／体積）の割合の溶媒系に溶解した１３％（重量／体積）のＰＬＬＡで組成物を作製する。シースは、３時間の電界紡糸、および軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）の群の静止期間と回転期間とを交互に繰り返すことによって生成した。
【００８１】
軸方向に整列したナノ繊維の単一クラスタ（束）を生成するための紡糸条件は、
−２本の金属針ゲージ２０で紡糸
−シリンジポンプ送達１．２ｍｌ／時
−電場電圧１８ｋＶ
−回転コレクタ回転速度２９００ｒｐｍ
−針−コレクタ距離２００ｍｍ
−生成された軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）の有効厚さ５５０〜６５０μｍ。
【００８２】
軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）をそれぞれ１００ｍｍの長さを有する試料に切断したら、以下の条件を適用することにより、無作為ナノ繊維の外側シースの生成のためにそれらを回転機械で整列および固定した。
−針ゲージ２０で紡糸
−シリンジポンプ送達１．２ｍｌ／時
−電場電圧１８ｋＶ
−金属コレクタ
−コレクタ−針距離２００ｍｍ
−軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）の群とフラットコレクタ間の距離が５ｍｍ未満
−軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）の群の回転速度約２０〜２５ｒｐｍ
−軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）の群の静止期間２〜５分
−軸方向に整列したナノ繊維のクラスタ（束）の群の回転期間１〜２分
−シースの有効厚さ：５〜１０μｍ。
【００８３】
［実施例２］
実施例１で得られた、軸方向に整列したナノ繊維の生成されたクラスタ（束）の機械的試験
次いで、軸方向に整列したナノ繊維の単一クラスタ（束）を引張試験で機械的に試験した。
【００８４】
合成的には、腱組織の破壊に相当するひずみ速度の生理学的条件をシミュレートするために、１００％／秒のひずみ速度で引張破壊試験を使用して試験を行った。
−試験された試料：１０
−ゲージ長１６ｍｍ
−クロスヘッド速度１６ｍｍ／秒（ひずみ速度：１／秒）
−破壊までの単調な傾斜
−変位制御
−０．９％ＮａＣｌ食塩水中で２分間の試験の前の試料の水和。
軸方向に整列したナノ繊維の単一クラスタ（束）は、延性挙動および９０％程度の変形を伴い、約８０ＭＰａの弾性率で４〜５Ｎまで破壊に耐えた。
【００８５】
［実施例３］
実施例１で得られた生成されたマルチスケール階層骨格の機械的試験
完全なマルチスケール階層骨格もまた機械的に試験したが、この場合でも、腱組織の生理学的破壊条件をシミュレートするために、１００％／秒のひずみ速度で引張試験を行った。
−５つの試験された試料に対して５０ｍｍの有効路
−より良いクランプのために、試験前の試料の端部はポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）で接着されていた。このようなキャストは、応力集中を最小限に抑えるためにテーパー形状であった。
−クロスヘッド速度５０ｍｍ／秒（ひずみ速度：１／秒）
−破壊までの単調な傾斜
−変位制御
−０．９％ＮａＣｌ食塩水中で２分間の試験の前の試料の水和
５つのマルチスケール階層骨格は、２３０〜３８０Ｎの間の力値に達し、変形は約３０％、弾性率は約１３０ＭＰａであった。
【００８６】
試料の破壊は、マルチスケール階層骨格とセメントとの界面で生じたが、これは、マルチスケール階層骨格の破壊力値のかなりの過小評価を伴うグリップにより、応力集中が生じることを伴う。
【００８７】
［実施例４］
リング状クラスタ（リング束）の軸の方向に整列したナノ繊維からなる２５個のリング状クラスタ（リング束）で構成される、長さ２３０ｍｍ（平均直径４〜５ｍｍ）のナイロン６，６で作製されたマルチスケール階層骨格の３つのプロトタイプを開発した（束の平均直径５５０〜６５０μｍ、ナノ繊維の平均直径２００〜３００ｎｍ）。
【００８８】
リング状クラスタ（リング束）は、直径８ｍｍの６本の対称円筒形アームで構成されるステンレス鋼製の２つのグリップを介して、シース生成用の回転システムの端部に固定した。
【００８９】
マルチスケール階層骨格上で、リング状クラスタ（リング束）を生成するために使用されるナイロン６，６の同じ溶液を電界紡糸することによってシースを生成した。トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）およびアセトン（ＡＣ）の５０／５０（体積／体積）の割合の溶媒系に溶解した１５％（重量／体積）のナイロン６，６で組成物を作製する。シースは、１２時間の電界紡糸、およびリング状束の群（リング束）の静止期間と回転期間とを交互に繰り返すことによって生成した。
【００９０】
単一リング状クラスタ（リング束）を生成するための紡糸条件は
−２本の金属針ゲージ２０で紡糸
−シリンジポンプ送達０．５ｍｌ／時
−電場電圧２０ｋＶ
−回転コレクタ回転速度２９００ｒｐｍ
−針−コレクタ距離１６０ｍｍ
−生成されたリング状束（リング束）の有効厚さ５５０〜６５０μｍ
−リング状束（リング束）の長さ：約４７０ｍｍ（直径１５０ｍｍのドラムへの堆積に由来）。
【００９１】
リング状クラスタ（リング束）が得られたら、その２５個を、無作為繊維の外側シースを生成するための回転機で、以下の条件を適用することにより上記の金属グリップのアームの端部に整列および固定した。
−２つの針ゲージ２０で紡糸
−シリンジポンプ送達０．５ｍｌ／時
−電場電圧１８ｋＶ
−接地フラット金属コレクタ
−コレクタ−針距離１６０ｍｍ；
−ナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の群とフラットコレクタとの間の距離５ｍｍ未満
−ナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の群の回転速度約２０〜２５ｒｐｍ
−ナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の群の静止期間２〜５分
−ナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の群の回転期間１〜２分
−シースの有効厚さ：５〜１０μｍ
−前述のように接地に電気的に接続されたフラットコレクタで１０時間シースを紡糸した後、ナノ繊維のリング状クラスタ（リング束）の群の端部に配置された２つの金属グリップも、接地電位に配置し、無作為に配置されたナノ繊維（無作為）のシースで端部自体もコーティングした。紡糸パラメータは上記と同じである。
【００９２】
［実施例５］
実施例４で得られた生成されたリング状クラスタ（リング束）の機械的試験
次いで、ナノ繊維の単一リング状クラスタ（リング束）を引張試験で機械的に試験した。
【００９３】
合成的には、腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織の破壊に相当するひずみ速度の生理学的条件をシミュレートするために、１００％／秒のひずみ速度で引張破壊試験を使用して試験を行った。
−試験された試料：５
−ゲージ長２３０ｍｍ
クロスヘッド速度２３０ｍｍ／秒（ひずみ速度：１／秒）
−破壊までの単調な傾斜
−変位制御
−０．９％ＮａＣｌ食塩水中で２分間の試験の前の試料の水和
ナノ繊維の単一リング状クラスタ（リング束）は、延性挙動および９〜１２％程度の変形を伴い、約６００〜９００ＭＰａの弾性率で２０〜２４Ｎまで破壊に耐えた。
【００９４】
［実施例６］
実施例４で得られた生成されたマルチスケール階層骨格の機械的試験
完全なマルチスケール階層骨格もまた機械的に試験したが、この場合でも、腱および／または靭帯および／または筋肉および／または神経組織の生理学的な破壊条件をシミュレートするために、１００％／秒のひずみ速度で引張試験で機械的に試験した。
−３つの試験試料につきゲージ長２３０ｍｍ
−機械的試験用の試料のグリップとして、同じ金属グリップを使用し、シース生成用に試料を機械に固定した。そのようなグリップは、張力を緩和するために適切に設計されていた。
−クロスヘッド速度２３０ｍｍ／秒（ひずみ速度：１／秒）
−破壊までの単調な傾斜
−変位制御
−０．９％ＮａＣｌ食塩水中で２分間の試験の前の試料の水和
３つのマルチスケール階層骨格は、３００〜３５０Ｎの間の力値に達し、変形は約９％、弾性率は約３００〜４００ＭＰａであった。
【００９５】
試料の破壊は、マルチスケール階層骨格とグリップとの界面およびゲージ長の両方で生じたが、これは、マルチスケール階層骨格の破壊力値の過小評価を伴うグリップにより、部分的応力集中が生じることを伴う。
【００９６】
これまで、いくつかの好ましい実施形態を参照して本発明を説明してきた。以下に報告される特許請求の範囲の保護範囲によって定義されるように、同じ発明のコアに属する他の実施形態が存在し得ることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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