(57)【要約】  コンパニオン動物種に由来し、ＩＬ１３及び／又はＩＬ４に結合する、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドに関する、種々の実施態様が提供される。このような連続ポリペプチドは、コンパニオン動物、例えば、イヌ、ネコ、及びウマにおけるＩＬ１３及び／又はＩＬ４により誘導される状態を治療する方法に使用することができる。【選択図】図１
2020517262.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメイン及びＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインを含む連続ポリペプチドであって、ＩＬ１３Ｒ及びＩＬ４Ｒポリペプチドがコンパニオン動物種に由来する、連続ポリペプチド。
【請求項２】
式（Ｉ）ＩＬ１３Ｒ−Ｌ１−ＩＬ４Ｒ−Ｌ２−ＦＰ又は式（ＩＩ）ＩＬ４Ｒ−Ｌ１−ＩＬ１３Ｒ−Ｌ２−ＦＰ
（式中：
ａ．  ＩＬ１３Ｒは、コンパニオン動物種に由来するＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインであり、
ｂ．  ＩＬ４Ｒは、コンパニオン動物種に由来するＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインであり、
ｃ．  Ｌ１は、第１の任意選択のリンカーであり、
ｄ．  Ｌ２は、第２の任意選択のリンカーであり、及び
ｅ．  ＦＰは、融合パートナーである）を含む、請求項１に記載の連続ポリペプチド。
【請求項３】
コンパニオン動物種のＩＬ１３と、バイオレイヤー干渉測定によって測定した場合、５×１０−６Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１×１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１×１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１×１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、又は１×１０−１２Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する、請求項１又は請求項２に記載の連続ポリペプチド。
【請求項４】
コンパニオン動物種のＩＬ４と、バイオレイヤー干渉測定によって測定した場合、５×１０−６Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１×１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１×１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１×１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、又は１×１０−１２Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する、請求項１から３のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項５】
コンパニオン動物種においてＩＬ１３及び／又はＩＬ４シグナル伝達を低下させる、請求項１から４のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項６】
コンパニオン動物種が、イヌ、ネコ、又はウマである、請求項１から５のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項７】
ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３４、又は配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である、請求項１から６のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項８】
ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３４、又は配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項１から７のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項９】
ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３４、又は配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１から８のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１０】
ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３４、又は配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一である、請求項１から９のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１１】
ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号２２の１８位に対応するか、配列番号２４の１８位に対応するか、又は配列番号２６の１８位に対応する位置にシステインを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１２】
ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号２２の１８位、配列番号２４の１８位、配列番号２６の１８位、配列番号３２の１５位、配列番号３４の１５位、又は配列番号３６の１５位にシステインを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１３】
ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号３２、配列番号３４、及び配列番号３６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から１２のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１４】
ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１５】
ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１６】
ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１７】
ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１８】
ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項１９】
ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号３３、配列番号３５、及び配列番号３７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から１８のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項２０】
ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインが、配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項２１】
Ｌ１及びＬ２が、存在する場合、それぞれ独立して、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、Ｓ、ＳＳ、ＳＳＳ、ＧＳ、ＧＳＧＳ（配列番号３８）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号４０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４１）、ＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４３）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４４）、ＧＳＳ、ＧＳＳＧＳＳ（配列番号４５）、ＧＳＳＧＳＳＧＳＳ（配列番号４６）、ＧＧＳＳ（配列番号４７）、ＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号４８）、及びＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号４９）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２から２０のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項２２】
融合パートナーが、Ｆｃ、アルブミン、及びアルブミン結合断片から選択される、請求項２から２１のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項２３】
Ｆｃが（ａ）ＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−Ｃ、及びＩｇＧ−Ｄ定常領域から選択されるイヌ重鎖定常領域；（ｂ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂ定常領域から選択されるネコ重鎖定常領域；又は（ｃ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６及びＩｇＧ７定常領域から選択されるウマ重鎖定常領域である、請求項２２に記載の連続ポリペプチド。
【請求項２４】
配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、及び配列番号３１から選択される配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の連続ポリペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸を含む宿主細胞。
【請求項２７】
請求項２６に記載の宿主細胞を培養すること及び連続ポリペプチドを単離することを含む、連続ポリペプチドを生産する方法。
【請求項２８】
請求項１から２４のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項２９】
ＩＬ１３及び／又はＩＬ４により誘導される状態を有するコンパニオン動物種を治療する方法であって、コンパニオン動物種に、治療的有効量の請求項１から２４のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド又は請求項２８に記載の薬学的組成物を投与することを含む方法。
【請求項３０】
コンパニオン動物種が、イヌ、ネコ、又はウマである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
ＩＬ１３及び／又はＩＬ４により誘導される状態が、掻痒性又はアレルギー性状態、例えば、アトピー性皮膚炎、そう痒症、喘息、乾癬、強皮症、又は湿疹である、請求項２９又は３０に記載の方法。
【請求項３２】
連続ポリペプチド又は薬学的組成物が、非経口的に投与される、請求項２９から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
連続ポリペプチド又は薬学的組成物が、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑膜内経路、髄腔内経路、又は吸入経路によって投与される、請求項２９から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
Ｊａｋ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、又はＭＡＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項２９から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
抗ＩＬ１７抗体、抗ＩＬ３１抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ１３抗体、抗ＩＬ２３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１α抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗α４−インターグリン抗体、抗ＩＬ１２抗体、抗ＩＬ１β抗体、及び抗ＢｌｙＳ抗体から選択される１つ又は複数の抗体を投与することをさらに含む、請求項２９から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
細胞を、請求項１から２４のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド又は請求項２８に記載の薬学的組成物に、ＩＬ１３及び／又はＩＬ４に対する連続ポリペプチドの結合についての許容条件下で、曝露し、それによって、（ａ）天然ＩＬ１３受容体及び／又は天然ＩＬ−４受容体に対するＩＬ／４及び／又はＩＬ−１３の結合を低下させること並びにＩＬ１３−及び／又はＩＬ−４−媒介性シグナル伝達を低下させることを含む、細胞におけるＩＬ１３及び／又はＩＬ４シグナル伝達活性を低下させる方法。
【請求項３７】
細胞が、エクスビボで連続ポリペプチド又は薬学的組成物に曝露される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
細胞が、インビボで連続ポリペプチド又は薬学的組成物に曝露される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
細胞が、イヌ細胞、ネコ細胞、又はウマ細胞である、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
コンパニオン動物種からの試料中のＩＬ１３又はＩＬ４を検出するための方法であって、試料を、請求項１から２４のいずれか一項に記載の連続ポリペプチド又は請求項２８に記載の薬学的組成物と、ＩＬ１３及び／又はＩＬ４に対する連続ポリペプチドの結合についての許容条件下で接触させることと、試料中で連続ポリペプチドとＩＬ１３及び／又はＩＬ４との間に複合体が形成されるかどうかを検出することとを含む方法。
【請求項４１】
試料が、イヌ、ネコ、又はウマから得られる生物学的試料である、請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、あらゆる目的で、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１８年４月２１日に提出された米国仮特許出願第６２／４８８，５０９号の優先権の利益を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、イヌＩＬ４及びイヌＩＬ１３などのコンパニオン動物種のＩＬ４及び／又はＩＬ１３に結合するコンパニオン動物種に由来するインターロイキン４受容体及びインターロイキン１３受容体断片を含む連続ポリペプチドに関する。本発明は、例えば、イヌ、ネコ、及びウマなどのコンパニオン動物における、ＩＬ４及び／若しくはＩＬ１３により誘導される状態を治療する又は細胞のＩＬ４及び／若しくはＩＬ１３シグナル伝達活性を低下させるための、連続ポリペプチドを使用する方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
インターロイキン４（ＩＬ４）は、ナイーブヘルパーＴ細胞のＴｈ２細胞への分化を促進するサイトカインである。インターロイキン１３（ＩＬ１３）は、免疫細胞において同様の作用を有する。ＩＬ４及びＩＬ１３の両方は、例えばアトピー性皮膚炎及び喘息のアレルギーと直接的に関連するＴ細胞媒介性免疫応答に重要な役割を果たしている。ＩＬ４は、ヘテロ二量体受容体ＩＬ４受容体サブユニットアルファ（ＩＬ４Ｒ）及びγｃ又はＩＬ４Ｒ及びＩＬ１３受容体サブユニットアルファ−１（ＩＬ１３Ｒ）のいずれかとシグナル伝達複合体を形成することができると一般的に理解されている。ＩＬ１３は、ヘテロ二量体受容体ＩＬ４Ｒａ及びＩＬ１３Ｒａ１とシグナル伝達複合体を形成することができる。ＩＬ４Ｒａ又はＩＬ１３Ｒａ１の細胞外ドメインは、ＩＬ４及び／又はＩＬ１３に結合し、サイトカインの遊離濃度を低下させ、したがって皮膚炎、喘息及び他の障害と関連する臨床的兆候及び症状を低減させ得る。
【０００４】
コンパニオン種動物、例えば、ネコ、イヌ、及びウマは、アトピー性皮膚炎及び喘息を含む、ヒトアレルギー性疾患と同様の多くのアレルギー性疾患に罹患する。したがって、ＩＬ４／ＩＬ１３により誘導される状態を治療するための及びＩＬ４／ＩＬ１３シグナル伝達活性を低下させるための、方法及びコンパニオン動物ＩＬ４及び／又はＩＬ１３に特異的に結合させるのに使用することができる化合物についての必要性が依然として残っている。
【発明の概要】
【０００５】
いくつかの実施形態において、コンパニオン動物種に由来する、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメイン及びＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインを含むＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドが提供される。
【０００６】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、式（Ｉ）ＩＬ１３Ｒ−Ｌ１−ＩＬ４Ｒ−Ｌ２−ＦＰ又は式（ＩＩ）ＩＬ４Ｒ−Ｌ１−ＩＬ１３Ｒ−Ｌ２−ＦＰを含み、式中：
ａ．  ＩＬ１３Ｒは、コンパニオン動物種に由来するＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインであり、
ｂ．  ＩＬ４Ｒは、コンパニオン動物種に由来するＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインであり、
ｃ．  Ｌ１は、第１の任意選択のリンカーであり、
ｄ．  Ｌ２は、第２の任意選択のリンカーであり、及び
ｅ．  ＦＰは、融合パートナーである。
【０００７】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、コンパニオン動物種のＩＬ１３と、バイオレイヤー干渉測定によって測定した場合、５×１０−６Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１×１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１×１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１×１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、又は１×１０−１２Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、コンパニオン動物種のＩＬ４と、バイオレイヤー干渉測定によって測定した場合、５×１０−６Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１×１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１×１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１×１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、又は１×１０−１２Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、コンパニオン動物種においてＩＬ１３及び／又はＩＬ４シグナル伝達を低下させる。
【００１０】
いくつかの実施形態において、コンパニオン動物種は、イヌ、ネコ、又はウマである。
【００１１】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３４、又は配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３４、又は配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３４、又は配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３４、又は配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一である。
【００１２】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２２の１８位に対応する、配列番号２４の１８位に対応するか、又は配列番号２６の１８位に対応する位置でシステインを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２２の１８位、配列番号２４の１８位、配列番号２６の１８位、配列番号３２の１５位、配列番号３４の１５位、又は配列番号３６の１５位にシステインを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号３２、配列番号３４、及び配列番号３６から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１３】
いくつかの実施形態において、ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一である。いくつかの実施形態において、ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態において、ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態において、ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも９８％同一である。いくつかの実施形態において、ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号３３、配列番号３５、及び配列番号３７から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態において、Ｌ１及びＬ２は、存在する場合、それぞれ独立して、Ｇ、ＧＧ、ＧＧＧ、Ｓ、ＳＳ、ＳＳＳ、ＧＳ、ＧＳＧＳ（配列番号３８）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号３９）、ＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号４０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４１）、ＧＧＧＳ（配列番号４２）、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４３）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４４）、ＧＳＳ、ＧＳＳＧＳＳ（配列番号４５）、ＧＳＳＧＳＳＧＳＳ（配列番号４６）、ＧＧＳＳ（配列番号４７）、ＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号４８）、及びＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号４９）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
いくつかの実施形態において、融合パートナーは、Ｆｃ、アルブミン、及びアルブミン結合断片から選択される。いくつかの実施形態において、Ｆｃは、（ａ）ＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−Ｃ、及びＩｇＧ−Ｄ定常領域から選択されるイヌ重鎖定常領域；（ｂ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、及びＩｇＧ２ｂ定常領域から選択されるネコ重鎖定常領域；又は（ｃ）ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６及びＩｇＧ７定常領域から選択されるウマ重鎖定常領域である。
【００１６】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、及び配列番号３１から選択される配列を含む。
【００１７】
いくつかの実施形態において、単離された核酸が提供され、これは本明細書において上で記載されるＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態において、宿主細胞が提供され、これは本明細書において上で記載されるＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドをコードする核酸を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドを生産する方法が提供され、これは本明細書において上で記載されるＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドをコードする核酸を含むこのような宿主細胞を培養すること及び連続ポリペプチドを単離することを含む。いくつかの実施形態において、薬学的組成物が提供され、これは本明細書に記載されるＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３及び／又はＩＬ４により誘導される状態を有するコンパニオン動物種を治療する方法が提供され、これはコンパニオン動物種に、治療的有効量の本明細書に記載されるＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又は本明細書に記載されるＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドを含む薬学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｒｉｓｉｔｉｏｎ）を投与することを含む。いくつかの実施形態において、コンパニオン動物種は、イヌ、ネコ、又はウマである。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３及び／又はＩＬ４により誘導される状態は、掻痒性又はアレルギー性状態、例えば、アトピー性皮膚炎、そう痒症、喘息、乾癬、強皮症、又は湿疹である。
【００１９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又は薬学的組成物は、非経口的に投与される。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又は薬学的組成物は、筋肉内経路、腹腔内経路、脳脊髄内経路、皮下経路、動脈内経路、滑膜内経路、髄腔内経路、又は吸入経路によって投与される。
【００２０】
いくつかの実施形態において、方法は、Ｊａｋ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、又はＭＡＰＫ阻害剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、抗ＩＬ１７抗体、抗ＩＬ３１抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＩＬ４抗体、抗ＩＬ１３抗体、抗ＩＬ２３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１α抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗α４−インターグリン（Ｉｎｔｅｒｇｒｉｎ）抗体、抗ＩＬ１２抗体、抗ＩＬ１β抗体、及び抗ＢｌｙＳ抗体から選択される１つ又は複数の抗体を投与することをさらに含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、細胞を、本明細書に記載されるＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又は薬学的組成物に、ＩＬ１３及び／又はＩＬ４に対する連続ポリペプチドの結合についての許容条件下で、曝露し、それによって、（ａ）天然ＩＬ１３受容体及び／又は天然ＩＬ−４受容体に対するＩＬ／４及び／又はＩＬ−１３の結合を低下させること並びにＩＬ１３−及び／又はＩＬ−４−媒介性シグナル伝達を低下させることを含む、細胞におけるＩＬ１３及び／又はＩＬ４シグナル伝達活性を低下させる方法が提供される。いくつかの実施形態において、細胞は、エクスビボでＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又は薬学的組成物に曝露される。いくつかの実施形態において、細胞は、インビボで連続ポリペプチド又は薬学的組成物に曝露される。いくつかの実施形態において、細胞は、イヌ細胞、ネコ細胞、又はウマ細胞である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、試料を、本明細書に記載されるＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又は薬学的組成物と、ＩＬ１３及び／又はＩＬ４に対する連続ポリペプチドの結合についての許容条件下で、接触させること、及び複合体が、試料中で、連続ポリペプチドとＩＬ１３及び／又はＩＬ４との間に形成されるかどうかを検出することを含む、コンパニオン動物種からの試料中のＩＬ１３又はＩＬ４を検出するための方法が提供される。いくつかの実施形態において、試料は、イヌ、ネコ、又はウマから得られる生物学的試料である。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図１は、ＰＢＳ中３０μｇ／ｍＬの濃度のＩＬ４及びＩＬ１３を使用する、イヌＩＬ４及びＩＬ１３又はイヌＩＬ１３及びＩＬ４へのイヌＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｆｃの連続的な結合のグラフである。
【図２】図２は、ＰＢＳ中３０μｇ／ｍＬの濃度のＩＬ４及びＩＬ１３を使用する、イヌＩＬ４及びＩＬ１３又はイヌＩＬ１３及びＩＬ４へのイヌＩＬ１３Ｒ−ＩＬ４Ｒ−Ｆｃの連続的な結合のグラフである。
【図３】図３は、ＴＦ１細胞増殖アッセイにおける、イヌＩＬ４活性を中和するイヌＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｆｃのグラフである。イヌＩＬ４（５０ｎｇ／ｍＬ又は３．８５ｎＭ）を、アッセイに使用した。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
配列の説明
表1は、本明細書で参照される特定の配列の配列表を提供する。
2020517262.tif 000003
2020517262.tif 000004
2020517262.tif 000005
2020517262.tif 000006
2020517262.tif 000007
2020517262.tif 000008
2020517262.tif 000009
2020517262.tif 000010
2020517262.tif 000011
2020517262.tif 000012
2020517262.tif 000013
2020517262.tif 000014
2020517262.tif 000015
【００２５】
実施態様の説明
イヌＩＬ１３及び／若しくはＩＬ４、ネコＩＬ１３及び／若しくはＩＬ４、並びに／又はウマＩＬ１３及び／若しくはＩＬ４を結合する連続ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、連続ポリペプチドは、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメイン及びＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインを含む。連続ポリペプチドを生産する又は精製する方法も提供される。ＩＬ１３及び／又はＩＬ４に結合し、ＩＬ１３−及び／又はＩＬ−４−媒介性シグナル伝達を阻害する、連続ポリペプチドを使用する治療の方法が提供される。このような方法には、コンパニオン動物種におけるＩＬ１３−及び／又はＩＬ４により誘導される状態を治療する方法が含まれるが、これに限定されない。コンパニオン動物種からの試料中のＩＬ１３及び／又はＩＬ４を検出する方法も提供される。
【００２６】
読者の利便性のために、本明細書において使用される用語の以下の定義が提供される。
【００２７】
本明細書において使用される、数的な用語、例えば、Ｋｄは、科学的な測定に基づいて計算され、したがって、適切な測定誤差の対象である。いくつかの場合において、数的な用語は、最も近い有意な数字に四捨五入される数的な値を含み得る。
【００２８】
本明細書において使用される、「１つ（ａ）」又は「１つ（ａｎ）」は、別途指定のない限り、「少なくとも１つ（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ）」又は「１つ又は複数（ｏｎｅ  ｏｒ  ｍｏｒｅ）」を意味する。本明細書において使用される、用語「又は（ｏｒ）」は、別途指定のない限り、「及び／又は（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。複数従属請求項の文脈において、他の請求項に戻って参照する場合には「又は」の使用は、これらの請求項のいずれか１つのみを指す。
【００２９】
ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド
例えば、イヌＩＬ１３及び／若しくはＩＬ４、ネコＩＬ１３及び／若しくはＩＬ４、並びに／又はウマＩＬ１３及び／若しくはＩＬ４に結合する、連続ポリペプチドの新規ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドが提供される。
【００３０】
「アミノ酸配列」は、ペプチド又はタンパク質におけるアミノ酸残基の配列を意味する。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すために、交換可能に使用され、最小の長さに限定されない。そのようなアミノ酸残基のポリマーは、天然又は非天然アミノ酸残基を含有し、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、及び多量体を含み得るが、これらに限定されない。完全長タンパク質及びその断片の両方が、その定義によって包含される。その用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアル酸付加、アセチル化、リン酸化、及び同種のものも含む。さらに、本開示の目的に関して、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列に対する修飾、例えば、欠失、付加、及び置換（一般に自然界で保存される）を含むタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発によるような意図的なものであってもよく又はタンパク質を生産する宿主の変異若しくはＰＣＲ増幅に起因するエラーによるなどの偶発的なものであってもよい。
【００３１】
本明細書における用語「連続ポリペプチド」は、アミノ酸の中断されていない配列を意味するように使用される。連続ポリペプチドは、典型的には単一の連続したＤＮＡ配列から翻訳される。連続ポリペプチドは、例えば、第１のタンパク質のＤＮＡ配列から終止コドンを除去すること、次いで、第２のタンパク質のＤＮＡ配列をインフレームで追加して、ＤＮＡ配列を単一タンパク質として発現させることによる遺伝的なエンジニアリングによって作製することができる。典型的は、これは、ｃＤＮＡを存在する遺伝子とインフレームで発現ベクターにクローニングすることによって達成される。
【００３２】
本明細書において使用される、「ＩＬ４Ｒ」は、ＩＬ−４に結合する、ＩＬ４受容体サブユニットアルファの全体又は断片を含むポリペプチドである。
【００３３】
例えば、「ＩＬ４Ｒ」は、別途指示がない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザルサル）、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）、及びコンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ、及びウマ）を含む、任意の脊椎動物源からのＩＬ４Ｒポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、ＩＬ４Ｒは、ＩＬ４に結合する細胞外ドメイン断片である。いくつかのこのような実施形態において、ＩＬ４Ｒは、ＩＬ４Ｒ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と称されてもよい。いくつかの実施形態において、ＩＬ４Ｒは、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、又は配列番号３７のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本明細書において使用される、「ＩＬ１３Ｒ」は、ＩＬ−１３に結合する、ＩＬ１３受容体サブユニットアルファ−１の全体又は一部を含むポリペプチドである。
【００３５】
例えば、「ＩＬ１３Ｒ」は、別途指示がない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザルサル）、げっ歯類（例えば、マウス及びラット）、及びコンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ、及びウマ）を含む、任意の脊椎動物源からのＩＬ１３Ｒポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒは、ＩＬ１３に結合する細胞外ドメイン断片である。いくつかのこのような実施形態において、ＩＬ１３Ｒは、ＩＬ１３Ｒ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）と称されてもよい。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒポリペプチドは、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３４、又は配列番号３６のアミノ酸配列を含む。
【００３６】
用語「コンパニオン動物種」は、ヒトに対するコンパニオンであることが適切な動物を指す。いくつかの実施形態において、コンパニオン動物種は、小さな哺乳動物、例えば、イヌ（ｃａｎｉｎｅ）、ネコ（ｆｅｌｉｎｅ）、イヌ（ｄｏｇ）、ネコ（ｃａｔ）、ウマ、ウサギ、フェレット、モルモット、げっ歯類などである。いくつかの実施形態において、コンパニオン動物種は、家畜、例えば、ウマ、雌ウシ、ブタなどである。
【００３７】
「細胞外ドメイン」（「ＥＣＤ」）は、膜貫通ドメインを越えて細胞外間隙に拡張するポリペプチドの一部である。本明細書において使用される、用語「細胞外ドメイン」は、完全な細胞外ドメインを含んでいてもよい、又はそのリガンドに結合する、１つ又は複数のアミノ酸を欠いている、切断型細胞外ドメインを含んでいてもよい。細胞外ドメインの組成は、どのアミノ酸が膜にあるかを決定するのに使用されるアルゴリズムに依存し得る。異なるアルゴリズムが所与のタンパク質に対する異なる細胞外ドメインを予想し得、また異なるシステムが所与のタンパク質に対する異なる細胞外ドメインを発現し得る。
【００３８】
ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、完全な細胞外ドメイン又はＩＬ４に結合するＩＬ４Ｒの切断型細胞外ドメインを含んでいてもよい。本明細書において使用される、用語「ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメイン」、「ＩＬ４Ｒ  ＥＣＤ」、及び同様の用語は、その用語が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び同種の用語などのオープンな移行句が続く場合であっても、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインを含まない、ＩＬ４Ｒポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、コンパニオン種動物に由来する、ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインである。例えば、いくつかの実施形態において、ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、イヌＩＬ４Ｒ、ネコＩＬ４Ｒ又はウマＩＬ４Ｒに由来する。いくつかの実施形態において、ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２３、配列番号２５、若しくは配列番号２７、又はその任意の断片のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号３３、配列番号３５、若しくは配列番号３７、又はその任意の断片のアミノ酸配列を含む。
【００３９】
ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、完全な細胞外ドメイン又はＩＬ１３に結合するＩＬ１３Ｒの切断型細胞外ドメインを含んでいてもよい。本明細書において使用される、用語「ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメイン）」、「ＩＬ１３Ｒ  ＥＣＤ」、及び同様の用語は、その用語が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び同種の用語などのオープンな移行句が続く場合であっても、膜貫通ドメイン又は細胞質ドメインを含まない、ＩＬ１３Ｒポリペプチドを指す。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、コンパニオン種動物に由来するＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインである。例えば、いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、イヌＩＬ１３Ｒ、ネコＩＬ１３Ｒ又はウマＩＬ１３Ｒに由来する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号２２、配列番号２４、若しくは配列番号２６、又はその任意の断片のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインは、配列番号３２、配列番号３４、若しくは配列番号３６、又はその任意の断片のアミノ酸配列を含む。
【００４０】
用語「ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド」及び「ＩＬ４Ｒ／ＩＬ１３Ｒ連続ポリペプチド」は、交換可能に使用され、ＩＬ１３Ｒポリペプチド及びＩＬ４Ｒポリペプチドを含む連続ポリペプチドを指し、その用語は、別途オーダーの指定のない限り、ＩＬ１３Ｒ及びＩＬ４Ｒポリペプチドが、連続ポリペプチドに現れるオーダーの指標ではない。例えば、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又はＩＬ４Ｒ／ＩＬ１３Ｒ連続ポリペプチドは、ＩＬ１３Ｒポリペプチドによる配列に先行する又はＩＬ１３Ｒポリペプチドによる配列に続くＩＬ４Ｒポリペプチドを指してもよい。加えて、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又はＩＬ４Ｒ／ＩＬ１３Ｒ連続ポリペプチドは、ＩＬ４Ｒポリペプチドによる配列に先行する又はＩＬ４Ｒポリペプチドによる配列に続くＩＬ１３Ｒポリペプチドを指してもよい。
【００４１】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、ＩＬ１３ＲポリペプチドのＣ末端で又はＩＬ１３ＲポリペプチドのＮ末端で、ＩＬ４Ｒポリペプチドに連結されるＩＬ１３Ｒポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、ＩＬ４ＲポリペプチドのＣ末端で又はＩＬ４ＲポリペプチドのＮ末端で、ＩＬ１３Ｒポリペプチドに連結されるＩＬ４Ｒポリペプチドを含む。
【００４２】
本発明のＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、コンパニオン動物種に由来する、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメイン及び／又はＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインを含んでいてもよい。例えば、連続ポリペプチドは、イヌ、ネコ、若しくはウマからのＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインを含んでいてもよい及び／又はイヌ、ネコ、若しくはウマからのＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインを含んでいてもよい。
【００４３】
「野生型」は、自然界で生じるポリペプチドの非変異バージョン、又はその断片を指す。野生型ポリペプチドは、組換え的に生産されてもよい。「野生型ＩＬ１３Ｒ  ＥＣＤ」又は「野生型ＩＬ４Ｒ  ＥＣＤ」は、自然界で生じるＩＬ１３Ｒ又はＩＬ４Ｒの細胞外ドメインの同部分と同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。
【００４４】
「バリアント」は、単一又は複数のアミノ酸置換、欠失、及び／又は付加によって指示対象の核酸分子又はポリペプチドと異なり、指示対象の核酸分子又はポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を実質的に保持する、核酸分子又はポリペプチドである。
【００４５】
「生物学的に活性」又は「生物活性」を有する実体は、代謝性又は生理的プロセスに関する又は関連する任意の機能を有する及び／又は天然に存在する分子の構造上の、調節性の、又は生化学的な機能を有する実体である。生物学的に活性なポリヌクレオチド断片は、同様の活性を示すが、本発明のポリヌクレオチドの活性と必ずしも同一ではないものである。生物学的に活性なポリペプチド又はその断片は、リガンド−受容体相互作用又は抗原−抗体結合を含む、生物学的反応に参加することができるものを含むが、これらに限定されない。生物活性は、改善された所望の活性又は減少した望ましくない活性を含み得る。ハイブリダイゼーションなどの別の分子との分子相互作用に参加する場合、疾患状態の緩和に治療的価値を有する場合、免疫応答の誘導に予防的価値を有する場合、ポリヌクレオチド分子に対してユニークであるとして検出することができるポリヌクレオチドの生物学的に活性な断片などの分子の存在の決定に診断的及び／又は予後的価値を有する場合、並びにポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）におけるプライマーとして使用することができる場合、実体は生物活性を実証することができる。
【００４６】
本明細書において使用される、核酸分子又はポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」及び「相同性」は、必要に応じて、最大配列同一性パーセントを達成させるために、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しないで、配列を整列させ、ギャップを導入後、特定の核酸分子又はポリペプチド配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸残基と同一である、指示対象の配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。配列同一性のパーセントを決定する目的のためのアラインメントは、当該技術分野の範囲内の種々の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、又はＭＥＧＡＬＩＮＥ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアのような市販のコンピュータソフトウエアを使用して達成することができる。当業者は、比較されている配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態において、バリアントは、必要に応じて、最大配列同一性パーセントを達成させるために、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮しないで、配列を整列させ、ギャップを導入後、指示対象の核酸分子又はポリペプチドと少なくとも約５０％の配列同一性を有する。このようなバリアントには、例えば、１つ又は複数のアミノ酸残基が、ポリペプチドのＮ又はＣ末端に追加され、欠失されたポリペプチドが含まれる。いくつかの実施形態において、バリアントは、指示対象の核酸又はポリペプチドの配列と、少なくとも約５０％配列同一性、少なくとも約６０％配列同一性、少なくとも約６５％配列同一性、少なくとも約７０％配列同一性、少なくとも約７５％配列同一性、少なくとも約８０％配列同一性、少なくとも約８５％配列同一性、少なくとも約９０％配列同一性、少なくとも約９５％配列同一性、少なくとも約９８％配列同一性を有する。
【００４８】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号３２、配列番号３４、又は配列番号３６のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％配列同一性を有するＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号３３、配列番号３５、又は配列番号３７のアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％配列同一性を有するＩＬ４Ｒポリペプチドの細胞外ドメインを含む。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、配列番号２２の１８位に対応する位置、配列番号２４の１８位に対応する位置、又は配列番号２６の１８位に対応する位置でシステインを含む、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、配列番号２２の１８位、配列番号２４の１８位、配列番号２６の１８位、配列番号３２の１５位、配列番号３４の１５位、又は配列番号３６の１５位にシステインを含む、ＩＬ１３Ｒポリペプチドの細胞外ドメインを含む。
【００５０】
「点突然変異」は、単一ヌクレオチド又はアミノ酸残基が関与する変異である。変異は、１つのヌクレオチド若しくはアミノ酸の欠損、１つのヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の別のものでの置換、又は追加のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基の挿入であってもよい。
【００５１】
アミノ酸置換は、ポリペプチド中の１つのアミノ酸の別のアミノ酸での置き換えが含まれ得るが、これに限定されない。例示的な置換は、表２に示される。アミノ酸置換は、所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合性、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣ若しくはＣＤＣ又は増強した薬物動態に関してスクリーニングされる目的とする分子及び産物に導入されてもよい。
2020517262.tif 000016
【００５２】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従って：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性で親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅに分類できる。
【００５３】
非保存的置換は、これらのクラスの１つの一員を別のクラスで変換することを伴う。
【００５４】
本明細書において使用される、「融合パートナー」は、追加のポリペプチド、例えば、アルブミン、アルブミン結合断片、又は免疫グロブリン分子の断片などの、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドの追加の成分を指す。融合パートナーは、オリゴマー形成ドメイン、例えば、重鎖免疫グロブリンのＦｃドメインを含んでいてもよい。
【００５５】
「結晶性断片（Ｆｃ）ポリペプチド（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ  （Ｆｃ）  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、エフェクター分子及び細胞と相互作用する抗体分子の一部である。それは、免疫グロブリン重鎖のＣ末端部分を含む。本明細書において使用される、Ｆｃポリペプチドは、Ｆｃポリペプチド全体（ｅｎｔｉｒｅ  Ｆｃ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）の１つ又は複数の生物活性を有するＦｃドメインの断片を含む。Ｆｃポリペプチドの「エフェクター機能」は、刺激への応答における任意の抗体による全体又は一部で行われる作用又は活性であり、補体結合又はＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）誘導を含み得る。
【００５６】
用語「ＩｇＸ」又は「ＩｇＸ  Ｆｃ」は、Ｆｃ領域が特定の抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、など）に由来することを意味し、ここで、「Ｘ」は、抗体アイソタイプを示す。したがって、「ＩｇＧ」又は「ＩｇＧ  Ｆｃ」は、γ鎖のＦｃ領域を示し、「ＩｇＡ」又は「ＩｇＡ  Ｆｃ」は、α鎖のＦｃ領域を示し、「ＩｇＤ」又は「ＩｇＤ  Ｆｃ」は、δ鎖のＦｃ領域を示し、「ＩｇＥ」又は「ＩｇＥ  Ｆｃ」は、ε鎖のＦｃ領域を示し、「ＩｇＭ」又は「ＩｇＭ  Ｆｃ」は、μ鎖のＦｃ領域を示す、等々である。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＬ１を含む。「ＩｇＸＮ」又は「ＩｇＸＮ  Ｆｃ」は、Ｆｃ領域が、抗体アイソタイプの特定のサブクラス（イヌＩｇＧサブクラスＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤ；ネコＩｇＧサブクラス１、２ａ、又は２ｂ；又はウマＩｇＧサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６、又はＩｇＧ７など）に由来することを示し、ここで、「Ｎ」は、サブクラスを示す。
【００５７】
いくつかの実施形態において、ＩｇＸ又はＩｇＸＮ領域は、コンパニオン動物、例えば、イヌ、ネコ、又はウマに由来する。いくつかの実施形態において、ＩｇＧ領域は、イヌγ重鎖、例えば、ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ、又はＩｇＧＤから単離される。いくつかの場合において、ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ネコγ重鎖、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、又はＩｇＧ２ｂから単離される。他の場合において、ＩｇＧ領域は、ウマγ重鎖、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＧ５、ＩｇＧ６、又はＩｇＧ７から単離される。ＩｇＧＡ、ＩｇＧＢ、ＩｇＧＣ、又はＩｇＧＤのＦｃ領域を含むポリペプチドは、組換え生産システムにおいてより高い発現レベルを提供し得る。
【００５８】
「シグナル配列」は、目的とするポリペプチドの分泌を促進し、細胞表面膜の外側へのポリペプチドの輸送の際に典型的には切断されるようなものをコードするアミノ酸残基又はポリヌクレオチドの配列を指す。
【００５９】
「リンカー」は、第１のポリペプチドを第２のポリペプチドと接続する、１つ又は複数のアミノ酸残基を指す。
【００６０】
いくつかの実施形態において、リンカーは、グリシンリッチ、セリンリッチ、又はＧＳリッチな可動性、非構造リンカーである。いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸Ｇ（Ｇｌｙ）及び／又はＳ（Ｓｅｒ）を含む。例えば、リンカーは、Ｇ又はＧの反復（例えば、ＧＧ、ＧＧＧ、など）を含んでいてもよい；ＧＳ又はＧＳの反復（例えば、ＧＳＧＳ（配列番号３８）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号３９）、など）；ＧＧＳ又はＧＧＳの反復（例えば、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号４０）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号４１）、など）；ＧＧＧＳ（配列番号４２）又はＧＧＧＳの反復（配列番号４２）（例えば、ＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４３）、ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号４４）、など）；ＧＳＳ又はＧＳＳの反復（例えば、ＧＳＳＧＳＳ（配列番号４５）、ＧＳＳＧＳＳＧＳＳ（配列番号４６）、など）；又はＧＧＳＳ（配列番号４７）又はＧＧＳＳの反復（配列番号４７）（例えば、ＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号４８）、ＧＧＳＳＧＧＳＳＧＧＳＳ（配列番号４９）、など）。
【００６１】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、少なくとも１つの融合パートナー及び／又は少なくとも１つのリンカーを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、任意選択のシグナル配列、任意選択の融合パートナー、及び少なくとも１つの任意選択のリンカーを含む。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、シグナル配列、融合パートナー、又はリンカーを含まない。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３／ＩＬ４連続ポリペプチドは、シグナル配列とともに翻訳されるが、シグナル配列はＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドから切断される。
【００６２】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは：
式（Ｉ）：ＩＬ１３Ｒ−Ｌ１−ＩＬ４Ｒ−Ｌ２−ＦＰ又は
式（ＩＩ）：ＩＬ４Ｒ−Ｌ１−ＩＬ１３Ｒ−Ｌ２−ＦＰを含み、
ここで、ＩＬ１３Ｒはコンパニオン動物種に由来するＩＬ１３Ｒ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）ポリペプチドであり、ＩＬ４Ｒはコンパニオン動物種に由来するＩＬ４Ｒ  ＥＣＤポリペプチドであり、Ｌ１は第１の任意選択のリンカーであり、Ｌ２は第２の任意選択のリンカーであり、ＦＰは任意選択の融合パートナーである。
【００６３】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６４】
ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド発現及び生産
シグナル配列の存在下又は非存在下でＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドの全て又は一部（例えば、細胞外ドメイン）をコードするポリヌクレオチド配列が、提供される。相同的なシグナル配列（すなわち、天然ＩＬ−４Ｒ又はＩＬ１３Ｒのシグナル配列）が核酸分子の構築に使用されない場合、例えば、ＰＣＴ  ＵＳ０６／０２９５１に記載されたシグナル配列のいずれか１つの別のシグナル配列が使用されてもよい。
【００６５】
典型的には、目的とするヌクレオチド配列をコードするヌクレオチド配列、例えば、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、選択された宿主細胞における発現について適切な発現ベクターに挿入される。
【００６６】
「ベクター」は、ＤＮＡ配列を１つの生物体から別の生物体に導入する又は目的とする遺伝子を発現させるのに使用することができるプラスミドである。典型的には、ベクターは、目的とする遺伝子の発現を制御する、複製開始点及び制御配列を含む並びに選択マーカー遺伝子、例えば、抗生物質耐性遺伝子を保有してもよい又はしなくてもよい。ベクターは、それが発現される宿主細胞に適切である。ベクターは、目的とする遺伝子が、ベクターに存在する場合に、「組換えベクター」と命名されてもよい。
【００６７】
「宿主細胞」は、ベクター又は単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得る又はレシピエントである細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞又は真核生物細胞であってもよい。例示的な真核生物細胞には、哺乳動物細胞、例えば、霊長類又は非霊長類動物細胞；真菌細胞、例えば、酵母；植物細胞；及び昆虫細胞が含まれる。非限定的な例示的な哺乳動物細胞には、ＮＳ０細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞（Ｃｒｕｃｅｌｌ）、２９３細胞、及びＣＨＯ細胞、並びにそれらの誘導体、例えば、２９３−６Ｅ、ＤＧ４４、ＣＨＯ−Ｓ、及びＣＨＯ−Ｋ細胞が含まれるが、これらに限定されない。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、その子孫は、天然の、偶発的、又は意図的な変異が原因で元の親細胞と（形態において又はゲノムＤＮＡ全体（ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において）必ずしも完全に同一でなくてもよい。宿主細胞には、本明細書に提供されるアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドをインビボでトランスフェクトされた細胞が含まれる。
【００６８】
本明細書において使用される用語「単離された」は、自然界で典型的に見出される又は生産される少なくともいくつかの成分から分離されている分子を指す。例えば、ポリペプチドは、それが生産された細胞の少なくともいくつかの成分から分離される場合に「単離された」と称される。ポリペプチドが発現後に細胞によって分泌される場合、それを生産する細胞からポリペプチドを含有する上清を物理的に分離することは、ポリペプチドを「単離すること」と考えられる。同様に、ポリヌクレオチドは、それが自然界で典型的に見出される又はそれが生産された（例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドのケース）細胞の少なくともいくつかの成分から分離される大きなポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドのケースでは、ゲノムＤＮＡ又はミトコンドリアＤＮＡなど）の一部ではない場合に「単離された」と称される。したがって、宿主細胞の内側のベクターに含有されるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」と称されてもよい。
【００６９】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、クロマトグラフィー、例えば、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、プロテインＡカラムクロマトグラフィー、疎水的相互作用クロマトグラフィー、及びＣＨＴクロマトグラフィーを使用して単離される。
【００７０】
用語「標識」及び「検出可能な標識」は、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドに付着して、それを検出可能にする部分を意味する。いくつかの実施形態において、標識は、視覚的又は機器的手段、例えば、放射性標識アミノ酸の取り込み又はマークされたアビジン（例えば、光学又は比色法によって検出することができる蛍光性マーカー又は酵素活性を含有する、ストレプトアビジン）によって検出することができるビオチン化部分のポリペプチドへの付着によって検出可能なシグナルを生産することができる検出可能なマーカーである。ポリペプチドに対する標識の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１７７Ｌｕ、１６６Ｈｏ、又は１５３Ｓｍ）；クロモゲン、蛍光性標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）；化学発光マーカー；ビオチン化基；二次レポーター（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体に関する結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）によって認識される既定のポリペプチドエピトープ；及び磁性剤、例えば、ガドリニウムキレート。イムノアッセイに一般に用いられる標識の代表的な例には、光を発生する部分、例えば、アクリジニウム化合物、及び蛍光を発生する部分、例えば、フルオレセインが含まれる。この関連で、その部分自身が、許容可能に標識されていなくてもよいが、さらに別の部分との反応に際して検出可能となってもよい。
【００７１】
デコイ受容体トラップとしてのＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド
本発明のＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、ＩＬ１３又はＩＬ４をトラップする並びにそれらの細胞表面におけるＩＬ１３ＲとＩＬ４Ｒとの相互作用を阻害するためのデコイ受容体として機能することができる。デコイ受容体（例えば、本発明のもの）は、それらのリガンドを高親和性で且つ特異的に認識するが、構造的にシグナル伝達する能力がない。それらは、リガンド結合について野生型受容体と競合し、リガンド／受容体相互作用に参加し、したがって機能する受容体の活性若しくは数及び／又は受容体の下流の細胞活性をモジュレートする。デコイ受容体は、アゴニストリガンドに対する分子トラップとして機能を果たすことができ、それによって、リガンドにより誘導される受容体活性化が阻害される。
【００７２】
本明細書において使用される「ＩＬ１３」は、細胞におけるＩＬ１３の発現及びプロセシングからもたらされる任意の天然ＩＬ１３を指す。その用語は、別途指示がない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザルサル）、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）、及びコンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ、及びウマ）を含む、任意の脊椎動物源からのＩＬ１３を含む。その用語は、ＩＬ１３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも含む。
【００７３】
いくつかの実施形態において、イヌＩＬ１３は、配列番号４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ネコＩＬ１３は、配列番号５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ウマＩＬ１３は、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【００７４】
本明細書において使用される「ＩＬ４」は、細胞におけるＩＬ４の発現及びプロセシングからもたらされる任意の天然ＩＬ４を指す。その用語は、別途指示がない限り、哺乳動物、例えば、霊長類（例えば、ヒト及びカニクイザルサル）、及びげっ歯類（例えば、マウス及びラット）、及びコンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ、及びウマ）を含む、任意の脊椎動物源からのＩＬ４を含む。その用語は、ＩＬ４の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも含む。
【００７５】
いくつかの実施形態において、イヌＩＬ４は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ネコＩＬ４は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ウマＩＬ４は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００７６】
本発明は、治療剤としてのＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドを提供する。本発明のＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、本明細書により詳細に記載され、アレルギー性疾患と関連することが実証されてきた、ＩＬ１３及び／又はＩＬ４に結合する。種々の実施態様において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、非常に高親和性でＩＬ１３及びＩＬ４に結合することができる。種々の実施態様において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、ＩＬ１３及びＩＬ４シグナル伝達に干渉することができる。
【００７７】
用語「親和性」は、分子の単一の結合部位（例えば、受容体）と、その結合パートナー（例えば、リガンド）との間の非共有結合性相互作用の合計の強度を意味する。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（ＫＤ）によって表すことができる。親和性は、当該技術分野で公知の共通の方法、例えば、免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ  ＫＤ、ＫｉｎＥｘ  Ａ、バイオレイヤー干渉測定（ＢＬＩ）、又は表面プラズモン共鳴装置などによって測定することができる。
【００７８】
交換可能に使用される、用語「ＫＤ」、「Ｋｄ」、「Ｋｄ」又は「Ｋｄ値」は、受容体融合−リガンド相互作用の平衡解離定数を指す。いくつかの実施形態において、融合分子の、そのリガンドに対するＫｄは、供給業者の指示書に従ってＯｃｔｅｔ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＬＬＣ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）などのバイオセンサーを使用するバイオレイヤー干渉測定アッセイを使用することによって測定される。簡単に述べると、ビオチン化抗原はセンサーチップに結合し、融合分子の会合は９０秒間モニタリングされ、解離は６００秒間モニタリングされる。希釈及び結合ステップのためのバッファーは、２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２である。バッファーのみのブランク曲線は、任意の変動を補正するため引かれる。データを、ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアを使用する２：１結合モデルに適合させて会合速度定数（ｋｏｎ）、解離速度定数（ｋｏｆｆ）、及びＫｄが決定される。平衡解離定数（Ｋｄ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算される。用語「ｋｏｎ」は分子ＸのそのパートナーＹに対する会合に対する速度定数を指し、用語「ｋｏｆｆ」は分子Ｘ／パートナーＹ複合体からの分子Ｘ又はパートナーＹの解離に対する速度定数を指す。
【００７９】
物質に対する用語「結合」は、当該技術分野でよく理解される用語であり、このような結合を決定する方法も当該技術分野で周知である。特定の細胞又は物質に対して反応する、会合する、又は親和性を有する場合に、分子は「結合」を示すと言われ、反応、会合、又は親和性は、例えば、免疫ブロット、ＥＬＩＳＡ  ＫＤ、ＫｉｎＥｘ  Ａ、バイオレイヤー干渉測定（ＢＬＩ）、表面プラズモン共鳴装置などの当該技術分野で公知の１つ又は複数の方法によって検出可能である。
【００８０】
「表面プラズモン共鳴」は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）システム（ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ、ａ  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ｃｏｍｐａｎｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ  ａｎｄ  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、Ｎ．Ｊ．）を使用して、バイオセンサーマトリックス内のタンパク質濃度の変更を検出することにより、リアルタイムの生体特異的な相互作用の分析を可能とする光学現象を示す。さらなる記載に関して、Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎ．Ｂｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．５１：１９−２６を参照されたい。
【００８１】
「バイオレイヤー干渉測定」は、バイオセンサーチップに固定化されているタンパク質の層及び内部参照層から反射された光の干渉パターンを分析する光学分析技術を指す。バイオセンサーチップに結合する分子の数の変化は、リアルタイムに測定することができる干渉パターンにシフトを引き起こす。バイオレイヤー干渉測定に関する非限定的な例示的な装置は、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ＬＬＣ）である。例えば、Ａｂｄｉｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００８、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３７７：２０９−２７７を参照されたい。
【００８２】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、イヌＩＬ１３及び／又はＩＬ４、ネコＩＬ１３及び／又はＩＬ４、又はウマＩＬ１３及び／又はＩＬ４と、バイオレイヤー干渉測定によって測定した場合、５×１０−６Ｍ未満、１×１０−６Ｍ未満、５×１０−７Ｍ未満、１×１０−７Ｍ未満、５×１０−８Ｍ未満、１×１０−８Ｍ未満、５×１０−９Ｍ未満、１×１０−９Ｍ未満、５×１０−１０Ｍ未満、１×１０−１０Ｍ未満、５×１０−１１Ｍ未満、１×１０−１１Ｍ未満、５×１０−１２Ｍ未満、又は１×１０−１２Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）で結合する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、イヌＩＬ１３及び／又はＩＬ４、ネコＩＬ１３及び／又はＩＬ４、又はウマＩＬ１３及び／又はＩＬ４と、バイオレイヤー干渉測定によって測定した場合、５×１０−６Ｍから１×１０−６Ｍの間、５×１０−６Ｍから５×１０−７Ｍの間、５×１０−６Ｍから１×１０−７Ｍの間、５×１０−６Ｍから５×１０−８Ｍの間、５×１０−６Ｍ及び１×１０−８Ｍ、５×１０−６Ｍから５×１０−９Ｍの間、５×１０−６Ｍから１×１０−９Ｍの間、５×１０−６Ｍから５×１０−１０Ｍの間、５×１０−６Ｍから１×１０−１０Ｍの間、５×１０−６Ｍから５×１０−１１Ｍの間、５×１０−６Ｍから１×１０−１１Ｍの間、５×１０−６Ｍから５×１０−１２Ｍの間、５×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍの間、１×１０−６Ｍから５×１０−７Ｍの間、１×１０−６Ｍから１×１０−７Ｍの間、１×１０−６Ｍから５×１０−８Ｍの間、１×１０−６Ｍ及び１×１０−８Ｍ、１×１０−６Ｍから５×１０−９Ｍの間、１×１０−６Ｍから１×１０−９Ｍの間、１×１０−６Ｍから５×１０−１０Ｍの間、１×１０−６Ｍから１×１０−１０Ｍの間、１×１０−６Ｍから５×１０−１１Ｍの間、１×１０−６Ｍから１×１０−１１Ｍの間、１×１０−６Ｍから５×１０−１２Ｍの間、１×１０−６Ｍから１×１０−１２Ｍの間、５×１０−７Ｍから１×１０−７Ｍの間、５×１０−７Ｍから５×１０−８Ｍの間、５×１０−７Ｍ及び１×１０−８Ｍ、５×１０−７Ｍから５×１０−９Ｍの間、５×１０−７Ｍから１×１０−９Ｍの間、５×１０−７Ｍから５×１０−１０Ｍの間、５×１０−７Ｍから１×１０−１０Ｍの間、５×１０−７Ｍから５×１０−１１Ｍの間、５×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍの間、５×１０−７Ｍから５×１０−１２Ｍの間、５×１０−７Ｍから１×１０−１２Ｍの間、１×１０−７Ｍから５×１０−８Ｍの間、１×１０−７Ｍ及び１×１０−８Ｍ、１×１０−７Ｍから５×１０−９Ｍの間、１×１０−７Ｍから１×１０−９Ｍの間、１×１０−７Ｍから５×１０−１０Ｍの間、１×１０−７Ｍから１×１０−１０Ｍの間、１×１０−７Ｍから５×１０−１１Ｍの間、１×１０−７Ｍから１×１０−１１Ｍの間、１×１０−７Ｍから５×１０−１２Ｍの間、１×１０−７Ｍから１×１０−１２Ｍの間、５×１０−８Ｍから１×１０−８Ｍの間、５×１０−８Ｍから５×１０−９Ｍの間、５×１０−８Ｍから１×１０−９Ｍの間、５×１０−８Ｍから５×１０−１０Ｍの間、５×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍの間、５×１０−８Ｍから５×１０−１１Ｍの間、５×１０−８Ｍから１×１０−１１Ｍの間、５×１０−８Ｍか���５×１０−１２Ｍの間、５×１０−８Ｍから１×１０−１２Ｍの間、１×１０−８Ｍ及び５×１０−９Ｍ、１×１０−８Ｍから１×１０−９Ｍの間、１×１０−８Ｍから５×１０−１０Ｍの間、１×１０−８Ｍから１×１０−１０Ｍの間、１×１０−８Ｍから５×１０−１１Ｍの間、１×１０−８Ｍから１×１０−１１Ｍの間、１×１０−８Ｍから５×１０−１２Ｍの間、１×１０−８Ｍから１×１０−１２Ｍの間、５×１０−９Ｍから１×１０−９Ｍの間、５×１０−９Ｍから５×１０−１０Ｍの間、５×１０−９Ｍから１×１０−１０Ｍの間、５×１０−９Ｍから５×１０−１１Ｍの間、５×１０−９Ｍから１×１０−１１Ｍの間、５×１０−９Ｍから５×１０−１２Ｍの間、５×１０−９Ｍから１×１０−１２Ｍの間、１×１０−９Ｍから５×１０−１０Ｍの間、１×１０−９Ｍから１×１０−１０Ｍの間、１×１０−９Ｍから５×１０−１１Ｍの間、１×１０−９Ｍから１×１０−１１Ｍの間、１×１０−９Ｍから５×１０−１２Ｍの間、１×１０−９Ｍから１×１０−１２Ｍの間、５×１０−１０Ｍから１×１０−１０Ｍの間、５×１０−１０Ｍから５×１０−１１Ｍの間、１×１０−１０Ｍから５×１０−１１Ｍの間、１×１０−１０Ｍ及び１×１０−１１Ｍ、１×１０−１０Ｍから５×１０−１２Ｍの間、１×１０−１０Ｍから１×１０−１２Ｍの間、５×１０−１１Ｍから１×１０−１２Ｍの間、５×１０−１１Ｍから５×１０−１２Ｍの間、５×１０−１１Ｍから１×１０−１２Ｍの間、１×１０−１１Ｍから５×１０−１２Ｍの間、又は１×１０−１１Ｍから１×１０−１２Ｍの間のＫｄで結合する。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、イヌＩＬ１３及び／又はＩＬ４、ネコＩＬ１３及び／又はＩＬ４、及び／又はウマＩＬ１３及び／又はＩＬ４に結合する。
【００８３】
「低下」又は「阻害」させることは、参照と比較して、活性、機能、又は量を、減少、低下、又は停止させることを意味する。いくつかの実施形態において、「低下」又は「阻害」によって、２０％以上の全体的な減少を引き起こす能力が意味される。いくつかの実施形態において、「低下」又は「阻害」によって、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力が意味される。いくつかの実施形態において、「低下」又は「阻害」によって、７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体的な減少を引き起こす能力が意味される。いくつかの実施形態において、上で留意された量は、同じ期間にわたってコントロール用量（プラセボなど）と比べて、ある期間にわたって阻害又は減少される。本明細書において使用される「参照」は、比較目的で使用される任意の試料、標準、又はレベルを指す。参照は、健常、又は無疾患試料から得られてもよい。いくつかの例において、参照は、コンパニオン動物の無疾患又は未治療試料から得られる。いくつかの例において、参照は、試験されている又は処置された動物ではない、特定の種の１つ又は複数の健常動物から得られる。
【００８４】
本明細書において使用される用語「実質的に低下」は、数値と参照数値との間の低下が十分に高いことを示し、当業者は、２つの値の間の差が、前記値によって測定される生物学的特性の文脈内において統計学的に有意なものであると考えるであろう。いくつかの実施形態において、実質的に低下した数値は、参照値と比較して、約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％のいずれか１つを超えて低下する。
【００８５】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、コンパニオン動物種におけるＩＬ１３及び／又はＩＬ４シグナル伝達を、融合分子の非存在下のＩＬ１３及び／又はＩＬ４シグナル伝達と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％低下させ得る。いくつかの実施形態において、シグナル伝達は、ＩＬ４−依存性（ｄｅｐｅｄｅｎｔ）ＴＦ−１細胞増殖の低下によって測定される。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３及び／又はＩＬ４シグナル伝達の低下又は増殖の低下は、１０％から１５％の間、１０％から２０％の間、１０％から２５％の間、１０％から３０％の間、１０％から３５％の間、１０％から４０％の間、１０％から４５％の間、１０％から５０％の間、１０％から６０％の間、１０％から７０％の間、１０％から８０％の間、１０％から９０％の間、１０％から１００％の間、１５％から２０％の間、１５％から２５％の間、１５％から３０％の間、１５％から３５％の間、１５％から４０％の間、１５％から４５％の間、１５％から５０％の間、１５％から６０％の間、１５％から７０％の間、１５％から８０％の間、１５％から９０％の間、１５％から１００％の間、２０％から２５％の間、２０％から３０％の間、２０％から３５％の間、２０％から４０％の間、２０％から４５％の間、２０％から５０％の間、２０％から６０％の間、２０％から７０％の間、２０％から８０％の間、２０％から９０％の間、２０％から１００％の間、２５％から３０％の間、２５％から３５％の間、２５％から４０％の間、２５％から４５％の間、２５％から５０％の間、２５％から６０％の間、２５％から７０％の間、２５％から８０％の間、２５％から９０％の間、２５％から１００％の間、３０％から３５％の間、３０％から４０％の間、３０％から４５％の間、３０％から５０％の間、３０％から６０％の間、３０％から７０％の間、３０％から８０％の間、３０％から９０％の間、３０％から１００％の間、３５％から４０％の間、３５％から４５％の間、３５％から５０％の間、３５％から６０％の間、３５％から７０％の間、３５％から８０％の間、３５％から９０％の間、３５％から１００％の間、４０％から４５％の間、４０％から５０％の間、４０％から６０％の間、４０％から７０％の間、４０％から８０％の間、４０％から９０％の間、４０％から１００％の間、４５％から５０％の間、４５％から６０％の間、４５％から７０％の間、４５％から８０％の間、４５％から９０％の間、４５％から１００％の間、５０％から６０％の間、５０％から７０％の間、５０％から８０％の間、５０％から９０％の間、５０％から１００％の間、６０％から７０％の間、６０％から８０％の間、６０％から９０％の間、６０％から１００％の間、７０％から８０％の間、７０％から９０％の間、７０％から１００％の間、８０％から９０％の間、８０％から１００％の間、又は９０％から１００％の間である。
【００８６】
薬学的組成物
用語「薬学的製剤」及び「薬学的組成物」は、活性成分の生物活性を有効にするような形態であり、製剤が投与されるであろう対象に容認できない毒性がある追加成分を含有しない調製物を指す。
【００８７】
「薬学的に許容される担体」は、対象に投与するための「薬学的組成物」を一緒に含む治療剤とともに使用するための、当該技術分野の従来の非毒性固体、半流動性若しくは液体充填剤、希釈剤、カプセル化材料、処方助剤、又は担体を指す。薬学的に許容される担体は、用いられる用量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の成分と適合性である。薬学的に許容される担体は、用いられる製剤に適切である。薬学的に許容される担体の例には、以下が含まれる；アルミナ；ステアリン酸アルミニウム；レシチン；血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、イヌ又は他の動物のアルブミン；バッファー、例えば、リン酸塩、クエン酸塩、トロメタミン又はＨＥＰＥＳバッファー；グリシン；ソルビン酸；ソルビン酸カリウム；飽和植物性脂肪酸の部分的グリセリド混合物；水；塩又は電解質、例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩、コロイド状シリカ、又は三ケイ酸マグネシウム；ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質；ポリエチレングリコール；スクロース；マンニトール；又はアルギニンを含むが、これらに限定されないアミノ酸。
【００８８】
薬学的組成物は、凍結乾燥形態に保存することができる。したがって、いくつかの実施形態において、調製プロセスには、凍結乾燥ステップが含まれる。凍結乾燥された組成物は、次いで、典型的には、イヌ、ネコ、又はウマへの投与の前に非経口投与に適切な水性組成物として再製剤化されてもよい。他の実施態様において、特に融合分子が熱及び酸化的変性に対して高度に安定である場合に、薬学的組成物は、液体、すなわちイヌ、ネコ、又はウマに対して直接的に又は適切に希釈して投与され得る水性組成物として保存することができる。凍結乾燥された組成物は、滅菌注射用水（ＷＦＩ）で復元することができる。静菌性試薬、例えばベンジルアルコールが含まれてもよい。したがって、本発明は、固体又は液体形態の薬学的組成物を提供する。
【００８９】
薬学的組成物のｐＨは、投与する場合、約ｐＨ５から約ｐＨ８の範囲であってもよい。本発明の組成物は、それらが治療目的で使用される場合、滅菌される。無菌状態は、滅菌濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通す濾過を含む、当該技術分野で公知のいくつかの手段のいずれかによって達成することができる。無菌状態は、抗細菌剤の有り無しで維持されてもよい。
【００９０】
ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド及び薬学的組成物の使用
本発明のＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又はＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドを含む薬学的組成物は、ＩＬ１３−及び／又はＩＬ４により誘導される状態を治療するのに有用であり得る。本明細書において使用される、「ＩＬ１３又はＩＬ４により誘導される状態」は、ＩＬ１３又はＩＬ４の上昇したレベル又は変更された分布と関連する、それによって引き起こされる、又はそれを特徴とする、疾患を意味する。そのようなＩＬ１３及び／又はＩＬ４により誘導される状態には、掻痒性又はアレルギー疾患が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３−及び／又はＩＬ４により誘導される状態は、アトピー性皮膚炎、そう痒症、喘息、乾癬、強皮症、又は湿疹である。ＩＬ１３−又はＩＬ４により誘導される状態は、イヌ、ネコ、又はウマが含まれるが、これらに限定されないコンパニオン動物で示され得る。
【００９１】
本明細書において使用される、「治療」は、有益な又は所望の臨床結果を得るための手法である。本明細書において使用される「治療」は、コンパニオン動物を含む、哺乳動物における疾患の治療の任意の投与又は適用を包含する。本開示の目的に関して、有益な又は所望の臨床結果には、１つ又は複数の症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患の伝播又は防止又は遅延、疾患の再発の防止又は遅延、疾患進行の遅延又は緩徐化、病状の改善、疾患又は疾患の進行の阻害、疾患又はその進行の阻害又は緩徐化、その発生の停止、及び寛解（部分であろうと完全であろうと）のいずれか１つ又は複数が含まれるが、これらに限定されない。増殖性疾患の病理学的帰結の低下も「治療」に包含される。本明細書に提供される方法は、これらの態様の治療の１つ又は複数のいずれかを企図する。上記と一致して、治療の用語は、障害の全ての態様の１００パーセント除去を必要としない。
【００９２】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又はそれを含む薬学的組成物は、ＩＬ１３−又はＩＬ４により誘導される状態を治療する本明細書の方法に従って利用することができる。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又は薬学的組成物は、ＩＬ１３−及びＩＬ４により誘導される状態を治療するコンパニオン動物、例えばイヌ、ネコ、又はウマに投与される。
【００９３】
物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの「治療的有効量」は、治療される疾患のタイプ、病状、疾患の重症度及び経過、治療目的のタイプ、任意の以前の治療、病歴、前の治療に対する応答、担当獣医師の裁量、年齢、性別、及び動物の重量、及び動物に所望の応答を誘発する物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの能力などの要素に従って変動し得る。また、治療的有効量は、物質／分子、アゴニスト又はアンタゴニストの任意の毒性又は有害な作用が治療的に有益な作用を上回るものであり得る。治療的有効量は、１つ又は複数の投与で送達されてもよい。治療的有効量は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な用量及び期間において有効な量を指す。
【００９４】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又はＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドを含む薬学的組成物は、皮下投与、静脈内注入、又は筋肉内注射によって非経口的に投与される。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又はＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドを含む薬学的組成物は、ボーラス注射として又はある期間にわたって連続的注入によって投与される。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又はＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドを含む薬学的組成物は、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、動脈内、滑膜内、髄腔内、又は吸入経路によって投与される。
【００９５】
本明細書に記載されるＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、１用量当たり０．１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与されてもよい。いくつかの実施形態において、抗ＩＬ１３／ＩＬ４融合体は、１用量当たり０．５ｍｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与されてもよい。いくつかの実施形態において、抗ＩＬ１３／ＩＬ４融合体は、１用量当たり１ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与されてもよい。いくつかの実施形態において、融合分子は、０．５ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、５ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、１０ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、２０ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、５０ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、１ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、５ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、０．５ｍｇ／ｋｇ体重から１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲、又は５ｍｇ／ｋｇ体重から５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の量で投与されてもよい。
【００９６】
ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又はＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドを含む薬学的組成物は、単回、又は一連の治療にわたってコンパニオン動物に投与することができる。例えば、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又はＩＬ１３Ｒ及びＩＬ４Ｒを含む薬学的組成物は、少なくとも１回、１回超、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、又は少なくとも５回投与されてもよい。
【００９７】
いくつかの実施形態において、用量は、少なくとも２又は３週間連続して、１週当たり１回投与される、及びいくつかの実施形態において、このサイクルの治療は任意選択的に、１又は複数の週の治療無しの期間をおき、分散して２又はそれ以上の回数で反復される。他の実施形態において、治療有効用量は、２から５日間連続して、１日当たり１回投与される、及びいくつかの実施形態において、このサイクルの治療は任意選択的に、１又は複数の日又は週の治療無しの期間をおき、分散して２又はそれ以上の回数で反復される。
【００９８】
１つ又は複数のさらなる治療剤との「組み合わせ投与」には、同時（同時発生）及び任意の順序での逐次的又は連続的投与が含まれる。用語「同時発生」が本明細書に使用され、これは少なくとも一部の投与が時間的にオーバーラップする或いは１つの治療剤の投与が他の治療剤の投与と比べて短い期間範囲内に入る、２又はそれ以上の治療剤の投与を指す。例えば、２又はそれ以上の治療剤は、およそ特定の分以下の時間を離して投与される。用語「連続的」が本明細書に使用され、これは１つ又は複数の剤の投与が、１つ又は複数の他の剤の投与の不連続の後に連続する或いは１つ又は複数の剤の投与が、１つ又は複数の他の剤の投与前に開始される、２又はそれ以上の治療剤の投与を指す。例えば、２又はそれ以上の治療剤の投与は、およそ特定の分を超える時間を離して投与される。本明細書において使用される、「併せて（ｉｎ  ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ）」は、別の治療様式に加えられる１つの治療様式の投与を指す。このため、「併せて」は、動物への他の治療様式の投与前、投与中又は投与後の１つの治療様式の投与を指す。
【００９９】
いくつかの実施形態において、方法は、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又はＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドを含む薬学的組成物、Ｊａｋ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、又はＭＡＰＫ阻害剤の組み合わせを投与することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又はＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドを含む薬学的組成物、抗ＩＬ１７抗体、抗ＴＮＦα抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２５抗体、抗ＩＬ３１抗体、抗ＩＬ２３抗体、抗ＩｇＥ抗体、抗ＣＤ１１α抗体、抗ＩＬ６Ｒ抗体、抗α４−インターグリン抗体、抗ＩＬ１２抗体、抗ＩＬ１β抗体、又は抗ＢｌｙＳ抗体の組み合わせを投与することを含む。
【０１００】
細胞を、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又はＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドを含む薬学的組成物と、ＩＬ１３又はＩＬ４に対する結合についての許容条件下で、接触させる方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、細胞は、エクスビボでＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又は薬学的組成物に曝露される。いくつかの実施形態において、細胞は、インビボでＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又は薬学的組成物に曝露される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドに曝露される。いくつかの実施形態において、細胞は、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又は薬学的組成物に、細胞外ＩＬ１３又はＩＬ４に対する融合分子の結合についての許容条件下で、曝露される。いくつかの実施形態において、細胞は、対象への腹腔内、筋肉内、静脈内注射が含まれるが、これらに限定されない、本明細書に記載される、１つ又は複数の投与方法のいずれかによって、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又は薬学的組成物にインビボで曝露されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、細胞を融合分子又は薬学的組成物を含む培地に曝露することによって、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド又は薬学的組成物にエクスビボで曝露されてもよい。いくつかの実施形態において、細胞膜の透過性は、細胞を融合分子又は薬学的組成物を含む培地に曝露する前に、当業者によって理解される任意の数の方法（細胞をエレクトロポレーションすること又は細胞を塩化カルシウムを含有する溶液に曝露することなど）を使用して影響を受け得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、曝露は、細胞によるＩＬ１３又はＩＬ４シグナル伝達機能の低下をもたらす。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、細胞におけるＩＬ１３又はＩＬ４シグナル伝達を、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドの非存在下のＩＬ１３又はＩＬ４シグナル伝達と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は１００％低下させ得る。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３又はＩＬ４シグナル伝達の低下又はＴＦ−１増殖の低下は、１０％から１５％の間、１０％から２０％の間、１０％から２５％の間、１０％から３０％の間、１０％から３５％の間、１０％から４０％の間、１０％から４５％の間、１０％から５０％の間、１０％から６０％の間、１０％から７０％の間、１０％から８０％の間、１０％から９０％の間、１０％から１００％の間、１５％から２０％の間、１５％から２５％の間、１５％から３０％の間、１５％から３５％の間、１５％から４０％の間、１５％から４５％の間、１５％から５０％の間、１５％から６０％の間、１５％から７０％の間、１５％から８０％の間、１５％から９０％の間、１５％から１００％の間、２０％から２５％の間、２０％から３０％の間、２０％から３５％の間、２０％から４０％の間、２０％から４５％の間、２０％から５０％の間、２０％から６０％の間、２０％から７０％の間、２０％から８０％の間、２０％から９０％の間、２０％から１００％の間、２５％から３０％の間、２５％から３５％の間、２５％から４０％の間、２５％から４５％の間、２５％から５０％の間、２５％から６０％の間、２５％から７０％の間、２５％から８０％の間、２５％から９０％の間、２５％から１００％の間、３０％から３５％の間、３０％から４０％の間、３０％から４５％の間、３０％から５０％の間、３０％から６０％の間、３０％から７０％の間、３０％から８０％の間、３０％から９０％の間、３０％から１００％の間、３５％から４０％の間、３５％から４５％の間、３５％から５０％の間、３５％から６０％の間、３５％から７０％の間、３５％から８０％の間、３５％から９０％の間、３５％から１００％の間、４０％から４５％の間、４０％から５０％の間、４０％から６０％の間、４０％から７０％の間、４０％から８０％の間、４０％から９０％の間、４０％から１００％の間、４５％から５０％の間、４５％から６０％の間、４５％から７０％の間、４５％から８０％の間、４５％から９０％の間、４５％から１００％の間、５０％から６０％の間、５０％から７０％の間、５０％から８０％の間、５０％から９０％の間、５０％から１００％の間、６０％から７０％の間、６０％から８０％の間、６０％から９０％の間、６０％から１００％の間、７０％から８０％の間、７０％から９０％の間、７０％から１００％の間、８０％から９０％の間、８０％から１００％の間、又は９０％から１００％の間である。
【０１０２】
ＩＬ１３−又はＩＬ４により誘導される状態の検出、診断及びモニタリングのためにＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド、ポリペプチド及びポリヌクレオチドを使用する方法が、本明細書に提供される。コンパニオン動物が、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチド治療に反応するかどうかを検出する方法が、本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、方法は、動物が、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドを使用して、ＩＬ１３又はＩＬ４を発現する細胞を有するかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態において、検出の方法は、試料を抗体、ポリペプチド、又はポリヌクレオチド接触とさせること及び結合のレベルが参照又は比較試料（コントロールなど）のレベルと異なるかどうかを決定することを含む。いくつかの実施形態において、方法は、本明細書に記載されるＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドが、対象動物に対して適切な治療であるかどうかを決定することに有用であり得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、試料は、生物学的試料である。用語「生物学的試料」は、生物又は以前生きていた生物（ｆｏｒｍｅｒｌｙ  ｌｉｖｉｎｇ  ｔｈｉｎｇ）からのある量の物質を意味する。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、細胞又は細胞／組織溶解物である。いくつかの実施形態において、生物学的試料には、血液（例えば、全血）、血漿、血清、尿、滑液、及び上皮細胞が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、細胞又は細胞／組織溶解物は、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドと接触され、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドと細胞との間の結合が決定される。試験細胞が同じ組織タイプの参照細胞と比較して結合活性を示す場合、それは対象がＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドの治療から利益を受ける可能性があることを示し得る。いくつかの実施形態において、試験細胞は、コンパニオン動物の組織に由来する。
【０１０５】
特異的な抗体−抗原結合を検出するための、当該分野において公知である種々の方法を使用することができる。行うことができる例示的なイムノアッセイには、蛍光偏光イムノアッセイ（ＦＰＩＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、比濁分析阻害イムノアッセイ（ＮＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）が含まれる。インジケーター部分又は標識基は、対象抗体に結合することができ、方法の種々の使用の必要性を満たすよう選択され、これはアッセイ設備及び適合するイムノアッセイ手順の利用可能性によって決定づけられることが多い。適切な標識には、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、又は３２Ｐ）、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、又はｐ−ガラクトシダーゼ）、蛍光部分又はタンパク質（例えば、フルオレセイン、ローダミン、フィコエリトリン、ＧＦＰ、又はＢＦＰ）、又は発光部分（例えば、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、Ｃａｌｉｆ．によって供給されたＱｄｏｔ（商標）ナノ粒子）が含まれるが、これらに限定されない。上で留意された種々なイムノアッセイを行うことに使用される一般的な技術は、当業者に公知である。
【０１０６】
診断の目的に関して、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、当該技術分野で公知の放射性同位体、蛍光性標識、及び種々の酵素基質標識を含むが、これらに限定されない検出可能な部分で標識することができる。標識をポリペプチドにコンジュゲートする方法は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、標識される必要がなく、その存在は、例えば、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドに結合する抗体を使用して検出することができる。いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、任意の公知のアッセイ法、例えば、競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降法アッセイを用いることができる。Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．１９８７）。抗ＩＬ１３及びＩＬ４抗体及びポリペプチドはまた、インビボ診断アッセイ、例えば、インビボイメージングに使用することができる。一般に、抗体又はポリペプチドは、放射性核種（例えば、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、又は任意の他の放射性核種標識であり、本明細書に概略されるものを含む）で標識され、目的とする細胞又は組織は、免疫シンチグラフィ（ｉｍｍｕｎｏｓｃｉｎｔｉｏｇｒａｐｈｙ）を使用して位置を決定することができる。ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドはまた、当該技術分野で周知される技術を使用して病理学における染色試薬として使用され得る。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは診断に使用される、及びＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは治療剤として使用される。いくつかの実施形態において、第１及び第２のＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドは、異なる。
【０１０８】
以下の実施例は、開示の特定の態様を例示するが、開示をいかようにも制限することを目的とするものではない。
【実施例】
【０１０９】
実施例１
イヌＩＬ４及びＩＬ１３の発現及び精製
イヌＩＬ１３タンパク質（配列番号４）をコードするヌクレオチド配列を、Ｃ末端にポリ−Ｈｉｓタグを加えて合成し、哺乳動物発現ベクターにクローニングし、２９３細胞又はＣＨＯＳにトランスフェクトした。同じ方法を使用して、クローニングし、Ｃ末端にポリ−Ｈｉｓタグを加えたイヌＩＬ４タンパク質（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列を発現させた。
【０１１０】
イヌＩＬ１３タンパク質を含有する上清を、収集し、濾過した。イヌＩＬ１３を、Ｎｉ−ＮＴＡカラム（ＣａｐｔｉｖＡ（登録商標）プロテインＡ親和性樹脂、Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）を使用して親和性精製した。同じ方法を使用して、イヌＩＬ４を精製した。
【０１１１】
実施例２
ＩＬ１３Ｒ及びＩＬ４Ｒの細胞外ドメイン
イヌ、ネコ及びウマＩＬ４及び／又はＩＬ１３の結合を担うイヌ、ネコ、及びウマＩＬ４Ｒの細胞外ドメインを特定し、境界を定義した。イヌＩＬ４Ｒ、ネコＩＬ４Ｒ、及びウマＩＬ４の完全長細胞外ドメインを、それぞれ配列番号２３、配列番号２５、及び配列番号２７として特定した。生物活性を保持することが想定されるイヌＩＬ４Ｒ、ネコＩＬ４Ｒ、及びウマＩＬ４Ｒの細胞外ドメイン断片を、それぞれ配列番号３３、配列番号３５、及び配列番号３７として特定した。
【０１１２】
イヌ、ネコ及びウマＩＬ４及び／又はＩＬ１３の結合を担うイヌ、ネコ、及びウマＩＬ１３Ｒの細胞外ドメインを特定し、境界を定義した。イヌＩＬ１３Ｒ、ネコＩＬ１３Ｒ、及びウマＩＬ１３Ｒの完全長細胞外ドメインを、それぞれ配列番号２２、配列番号２４、及び配列番号２６として特定した。生物活性を保持することが想定されるイヌＩＬ１３Ｒ、ネコＩＬ１３Ｒ、及びウマＩＬ１３Ｒの細胞外ドメイン断片を、それぞれ配列番号３２、配列番号３４、及び配列番号３６として特定した。
【０１１３】
イヌＩＬ１３Ｒ（配列番号２２の１８位で）、ネコＩＬ１３Ｒ（配列番号２４の１８位で）、及びウマＩＬ１３Ｒ（配列番号２６の１８位で）中の対になっていないシステイン（Ｃｙｓ）を、インフォーマティックスで特定し、３−Ｄモデル化に基づいて埋没（未露出）していると決定した。対になっていないシステインがジスルフィド結合を形成する可能性は低く、凝集の見込みは低い。したがって、このＣｙｓ残基の部位特異的突然変異誘発は、導入されなかった。
【０１１４】
実施例３
ＣＨＯ細胞からのイヌＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドの発現及び精製
Ｆｃ  ＩｇＧＢと連結されたイヌＩＬ１３Ｒ／ＩＬ４Ｒ連続ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、シグナル配列とともに設計した。連続ポリペプチド「ＩＬ１３Ｒ−ＩＬ４Ｒ−ＩｇＧＢ」（配列番号２０）に関して、ＩＬ１３Ｒ（配列番号２２）の細胞外ドメインは、ＩＬ４Ｒ（配列番号２３）の細胞外ドメインに先行する。連続ポリペプチドＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−ＩｇＧＢ（配列番号２１）に関して、ＩＬ４Ｒの細胞外ドメインは、ＩＬ１３Ｒの細胞外ドメインに先行する。
【０１１５】
ヌクレオチド配列を、化学的に合成し、ＣＨＯ宿主細胞へのトランスフェクションに適切な発現ベクターに挿入した。ＣＨＯ細胞へのトランスフェクション後、融合タンパク質が細胞から分泌された。例えば、融合タンパク質は、単一ステップのプロテインＡカラムクロマトグラフィーによって精製された。
【０１１６】
ＩＬ１３Ｒ−ＩＬ４Ｒ−ＩｇＧＢ及びＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−ＩｇＧＢの各々は、発現され、タンパク質Ａカラム又は他のクロマトグラフ法、例えば、イオン交換カラムクロマトグラフィー、疎水的相互作用カラムクロマトグラフィー、混合モードカラムクロマトグラフィー、例えば、ＣＨＴ、又はマルチモーダルモードカラムクロマトグラフィー（ｍｕｌｔｉｍｏｄａｌ  ｍｏｄｅ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、例えば、ＣａｐｔｏＭＭＣでの単一ステップで精製され得る。低ｐＨ又は他のウイルス不活性化及びウイルス除去ステップを、適用してもよい。精製されたタンパク質は、賦形剤と混ぜ、濾過によって無菌化して、本発明の薬学的組成物を調製してもよい。薬学的組成物は、ＩＬ１３及び／又はＩＬ４のいずれかに結合する及び／又は阻害するのに十分な量で、アトピー性皮膚炎又は喘息を有するイヌに投与してもよい。
【０１１７】
次に、ベクターを、ＦｒｅｅｓｔｙｌｅＭａｘ（商標）トランスフェクション試薬（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＣＨＯ−Ｓ細胞においてパイロット−スケールトランスフェクションを行うために使用した。上清を、馴化培地を清澄化することによって採集した。タンパク質を、単回通過のプロテインＡクロマトグラフィーステップで精製し、さらなる調査に使用した。
【０１１８】
実施例４
ＩＬ１３及びＩＬ４結合活性の実証
この実施例は、ＩＬ１３Ｒ−ＩＬ４Ｒ−ＩｇＧＢ（配列番号２０）及びＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−ＩｇＧＢ（配列番号２１）の両方が、治療活性に不可欠な反応速度で、イヌＩＬ４及びＩＬ１３に結合することを実証する。
【０１１９】
結合分析を、下記の通りバイオセンサーＯｃｔｅｔを使用して行った。簡単に述べると、イヌＩＬ４（２９３細胞を使用して生産された）を、ビオチン化した。遊離の未反応ビオチンを、大規模な透析によってビオチン化ＩＬ４から除去した。ビオチン化イヌＩＬ４を、ストレプトアビジンセンサーチップに捕捉した。種々の濃度（１２、１６、及び４４ｎＭ）のＩＬ１３Ｒ−ＩＬ４Ｒ−ＩｇＧＢ（配列番号２０）でのＩＬ４会合を、９０秒間モニタリングした。解離を、６００秒間モニタリングした。バッファーのみのブランク曲線を、任意の変動を補正するため引いた。データを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）データ分析ソフトウェアを使用する１：１結合モデルに適合させてｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを決定した。希釈及び全ての結合ステップのためのバッファーは、２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２であった。ＩＬ１３Ｒ−ＩＬ４Ｒ−ＩｇＧＢ及びリガンドＩＬ４に対するＫｄは、８ｘ１０−１１であった。
【０１２０】
種々の濃度（４０．７及び１４０ｎＭ）のＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−ＩｇＧＢ（配列番号２１）でのイヌＩＬ４会合を、９０秒間モニタリングした。解離を、６００秒間モニタリングした。バッファーのみのブランク曲線を、任意の変動を補正するため引いた。データを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ（商標）データ分析ソフトウェアを使用する１：１結合モデルに適合させてｋｏｎ、ｋｏｆｆ、及びＫｄを決定した。希釈及び全ての結合ステップのためのバッファーは、２０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２であった。ＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−ＩｇＧＢ及びリガンドＩＬ４に対するＫｄは、１．１ｘ１０−１１であった。
【０１２１】
Ｃ末端ポリＨｉｓタグを有するイヌＩＬ４及びイヌＩＬ１３を、発現させ、２９３細胞から精製した。ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチンはＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（カタログ番号２１３３６）から得られ、ストレプトアビジンバイオセンサーはＦｏｒｔｅＢｉｏ（カタログ番号１８−５０９）から得られた。
【０１２２】
ＩＬ４及びＩＬ１３のＩＬ１３Ｒ−ＩＬ４Ｒ−ＩｇＧＢ（配列番号２０）との連続的な結合実験を行った。ビオチン化イヌＩＬ１３Ｒ−ＩＬ４Ｒ−ＩｇＧＢを、ストレプトアビジンセンサーチップに捕捉した。イヌＩＬ１３Ｒ−ＩＬ４Ｒ−ＩｇＧＢを、（１）イヌＩＬ４、その後、ＩＬ１３又は（２）イヌＩＬ１３、その後、ＩＬ４のいずれかに、ＰＢＳ中の濃度３０μｇ／ｍＬのＩＬ４及びＩＬ１３を使用して曝露した（図１）。実験は、一旦ＩＬ１３Ｒ−ＩＬ４Ｒ−ＩｇＧＢがＩＬ１３に結合すると、それはＩＬ４に結合しない場合があること及び一旦ＩＬ４に結合すると、そのＩＬ１３に結合する能力が低下することを実証した。
【０１２３】
ＩＬ４及びＩＬ１３のＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−ＩｇＧＢ（配列番号２１）との連続的な結合実験を行った。ビオチン化イヌＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−ＩｇＧＢを、ストレプトアビジンセンサーチップに捕捉した。イヌＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−ＩｇＧＢを、（１）イヌＩＬ４、その後、ＩＬ１３又は（２）イヌＩＬ１３、その後、ＩＬ４のいずれかに、ＰＢＳ中の濃度３０μｇ／ｍＬのＩＬ４及びＩＬ１３を使用して曝露した（図２）。これらの実験は、一旦ＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−ＩｇＧＢがＩＬ１３に結合すると、それはＩＬ４に結合しない場合があること及び一旦ＩＬ４に結合すると、そのＩＬ１３に結合する能力が低下することを実証した。
【０１２４】
ＩＬ１３Ｒ−ＩＬ４Ｒ−ＩｇＧＢ及びＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−ＩｇＧＢのＩＬ４又はＩＬ１３に対する緊密な結合は、ＩＬ４Ｒ及びＩＬ１３Ｒ両方によって作られる同時の結合寄与が原因であると考えられる。
【０１２５】
実施例５
イヌＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｆｃ（ＳＩＮＫ）の細胞機能活性
内因性インターロイキン４受容体を細胞表面に発現するヒト赤白血病細胞株であるＴＦ１細胞（ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ−２００３）を、増殖アッセイに使用した。指数増殖期に、熱不活化した１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２８６８）及び２ｎＭ／ｍｌヒトＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２１５−ＧＭ−０１０）を補充したＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１１８７５）において成長させた細胞を、アッセイに使用した。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、ＧＭ−ＣＳＦ無しの上記培地に再懸濁した。１ウェル当たり２０，０００細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３６１０）にプレーティングした。イヌＩＬ４Ｒ−ＩＬ１３Ｒ−Ｆｃ（ＳＩＮＫ）を希釈系列に追加し、その後、イヌＩＬ４（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ，カタログ番号７００２１−ＤＮＡＥ−５）を５０ｎｇ／ｍｌで付加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２、１００μｌの総容積で４８時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞を、室温に冷却し、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７０）を使用して細胞のＡＴＰ含有量を測定することによって増殖／変動性についてアッセイした。
【０１２６】
このアッセイでは、試薬Ａ及びＢをプレミックスした１００μｌを、各ウェルに追加した。オービタルシェーカーでの２分間の振漫後、細胞を溶解した。ルシフェリンの一酸素添加は、細胞中に存在するＭｇ２＋及びＡＴＰの存在下でルシフェラーゼによって触媒され、細胞中のＡＴＰの量に比例して発光シグナルの発生がもたらされる。ＡＴＰの量は、培養中に存在する細胞の数に直接的に比例する。プレートを、室温で１０分間インキュベートし、発光シグナルを安定化し、ルミネセンスをＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）を使用して検出した。
【０１２７】
データを４パラメータロジスティックフィットを使用して分析した、ＩＣ５０は２．０ｎＭである。図３を参照されたい。
【図１】
2020517262.tif 000017
【図２】
2020517262.tif 000018
【図３】
2020517262.tif 000019
【配列表】
2020517262000001.app
【国際調査報告】
2020517262.tif 000020
2020517262.tif 000021