(57)【要約】本発明は、骨髄細胞に発現するヒトトリガー受容体−２（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合し、それを活性化する、モノクローナル抗体などの抗原結合タンパク質、及びそのような抗原結合タンパク質を含む医薬組成物に関する。本発明のアゴニスト抗原結合タンパク質（例えば、抗体）は、抗原結合タンパク質のＦｃ媒介架橋の非存在下で、骨髄細胞においてＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２シグナル伝達を活性化することができる。アルツハイマー病及び多発性硬化症などのＴＲＥＭ２機能の喪失に関連する状態を抗原結合タンパク質を用いて処置又は予防する方法もまた記載される。
2020517249.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する単離アゴニスト抗原結合タンパク質であって、架橋剤の非存在下、細胞ベースのｐＳｙｋアッセイによる測定で、５００ｐＭ未満のＥＣ５０でＴＲＥＭ２媒介ｐＳｙｋレベルを増加させる単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項２】
架橋剤の非存在下、細胞ベースのｐＳｙｋアッセイによる測定で、３００ｐＭ未満のＥＣ５０でＴＲＥＭ２媒介ｐＳｙｋレベルを増加させる、請求項１に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項３】
架橋剤の非存在下、細胞ベースのｐＳｙｋアッセイによる測定で、約１５０ｐＭ〜約５００ｐＭのＥＣ５０でＴＲＥＭ２媒介ｐＳｙｋレベルを増加させる、請求項１に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項４】
ヒトＴＲＥＭ２に５０ｎＭ未満のＫＤで特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項５】
ヒトＴＲＥＭ２に１０ｎＭ未満のＫＤで特異的に結合する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項６】
ヒトＴＲＥＭ１に特異的に結合しない、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項７】
ヒトＴＲＥＭ２との結合に関して参照抗体と競合し、前記参照抗体は
（ａ）配列番号６１の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２４の配列を含む重鎖可変領域；
（ｂ）配列番号６２の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２５の配列を含む重鎖可変領域；
（ｃ）配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１５の配列を含む重鎖可変領域；又は
（ｄ）配列番号５６の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１９の配列を含む重鎖可変領域
を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項８】
ヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する単離アゴニスト抗原結合タンパク質であって、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号５〜１８から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含み；ＣＤＲＬ２は配列番号１９〜３０から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含み；ＣＤＲＬ３は配列番号３１〜４５から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含み；ＣＤＲＨ１は配列番号７７〜８６から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含み；ＣＤＲＨ２は配列番号８７〜９４から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含み；ＣＤＲＨ３は配列番号９５〜１０９から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含む、単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項９】
ＣＤＲＬ１は配列番号５〜１８から選択される配列を含み；ＣＤＲＬ２は配列番号１９〜３０から選択される配列を含み；ＣＤＲＬ３は配列番号３１〜４５から選択される配列を含み；ＣＤＲＨ１は配列番号７７〜８６から選択される配列を含み；ＣＤＲＨ２は配列番号８７〜９４から選択される配列を含み；且つＣＤＲＨ３は配列番号９５〜１０９から選択される配列を含む、請求項８に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項１０】
前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号４６〜６３から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号４６〜６３から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号４６〜６３から選択される配列を含む、請求項８又は９に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項１１】
前記軽鎖可変領域は、配列番号５４の配列、又は１つ以上のアミノ酸位置６４、７９、８０、８５、９４、及び／若しくは１００に変異を有する配列番号５４の配列を含む、請求項１０に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項１２】
前記変異は、Ｖ６４Ｇ、Ｖ６４Ａ、Ｑ７９Ｅ、Ｑ７９Ｄ、Ｓ８０Ｐ、Ｓ８０Ａ、Ｆ８５Ｖ、Ｆ８５Ｌ、Ｆ８５Ａ、Ｆ８５Ｄ、Ｆ８５Ｉ、Ｆ８５Ｌ、Ｆ８５Ｍ、Ｆ８５Ｔ、Ｗ９４Ｆ、Ｗ９４Ｙ、Ｗ９４Ｓ、Ｗ９４Ｔ、Ｗ９４Ａ、Ｗ９４Ｈ、Ｗ９４Ｉ、Ｗ９４Ｑ、Ｐ１００Ｒ、Ｐ１００Ｑ、Ｐ１００Ｇ、又はそれらの組み合わせである、請求項１１に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項１３】
前記軽鎖可変領域は、配列番号５５の配列、又は１つ以上のアミノ酸位置６４、７９、８０、９４、及び／若しくは１００に変異を有する配列番号５５の配列を含む、請求項１０に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項１４】
前記変異は、Ｖ６４Ｇ、Ｖ６４Ａ、Ｑ７９Ｅ、Ｑ７９Ｄ、Ｓ８０Ｐ、Ｓ８０Ａ、Ｗ９４Ｆ、Ｗ９４Ｙ、Ｗ９４Ｓ、Ｗ９４Ｔ、Ｗ９４Ａ、Ｗ９４Ｈ、Ｗ９４Ｉ、Ｗ９４Ｑ、Ｐ１００Ｒ、Ｐ１００Ｑ、Ｐ１００Ｇ、又はそれらの組み合わせである、請求項１３に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項１５】
前記変異は、Ｖ６４Ｇ、Ｖ６４Ａ、Ｑ７９Ｅ、Ｓ８０Ｐ、Ｓ８０Ａ、Ｗ９４Ｙ、Ｗ９４Ｓ、Ｐ１００Ｒ、Ｐ１００Ｑ、又はそれらの組み合わせである、請求項１４に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項１６】
前記軽鎖可変領域は、配列番号６０の配列、又は１つ以上のアミノ酸位置６０、９２、及び／若しくは９３に変異を有する配列番号６０の配列を含む、請求項１０に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項１７】
前記変異は、Ｌ６０Ｓ、Ｌ６０Ｐ、Ｌ６０Ｄ、Ｌ６０Ａ、Ｄ９２Ｅ、Ｄ９２Ｑ、Ｄ９２Ｔ、Ｄ９２Ｎ、Ｓ９３Ａ、Ｓ９３Ｎ、Ｓ９３Ｑ、Ｓ９３Ｖ、又はそれらの組み合わせである、請求項１６に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項１８】
前記軽鎖可変領域は、配列番号６１の配列、又は１つ以上のアミノ酸位置５６、５７、９２、及び／若しくは９３に変異を有する配列番号６１の配列を含む、請求項１０に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項１９】
前記変異は、Ｎ５６Ｓ、Ｎ５６Ｔ、Ｎ５６Ｑ、Ｎ５６Ｅ、Ｇ５７Ａ、Ｇ５７Ｖ、Ｄ９２Ｅ、Ｄ９２Ｑ、Ｄ９２Ｔ、Ｄ９２Ｎ、Ｓ９３Ａ、Ｓ９３Ｎ、Ｓ９３Ｑ、Ｓ９３Ｖ、又はそれらの組み合わせである、請求項１８に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項２０】
前記変異は、Ｎ５６Ｓ、Ｎ５６Ｑ、Ｇ５７Ａ、Ｄ９２Ｅ、Ｄ９２Ｑ、Ｓ９３Ａ、又はそれらの組み合わせである、請求項１９に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項２１】
前記軽鎖可変領域は、配列番号６２の配列、又はアミノ酸位置３６、４６、６１、及び／若しくは１００に変異を有する配列番号６２の配列を含む、請求項１０に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項２２】
前記変異は、Ｆ３６Ｙ、Ｓ４６Ｌ、Ｓ４６Ｒ、Ｓ４６Ｖ、Ｓ４６Ｆ、Ｋ６１Ｒ、Ｐ１００Ｑ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１００Ｒ、又はそれらの組み合わせである、請求項２１に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項２３】
前記変異は、Ｆ３６Ｙ、Ｋ６１Ｒ、Ｐ１００Ｑ、又はそれらの組み合わせである、請求項２２に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項２４】
前記軽鎖可変領域は、配列番号５２の配列、又はアミノ酸位置９１に変異を有する配列番号５２の配列を含む、請求項１０に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項２５】
前記変異は、Ｆ９１Ｖ、Ｆ９１Ｉ、Ｆ９１Ｔ、Ｆ９１Ｌ、又はＦ９１Ｄである、請求項２４に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項２６】
前記変異は、Ｆ９１Ｖである、請求項２５に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項２７】
前記重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１１０〜１２６から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号１１０〜１２６から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１１０〜１２６から選択される配列を含む、請求項８〜２６のいずれか一項に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項２８】
前記重鎖可変領域は、配列番号１１７の配列、又は１つ以上のアミノ酸位置１９、５５、５６、５７、５８、及び／若しくは１０４に変異を有する配列番号１１７の配列を含む、請求項２７に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項２９】
前記変異は、Ｍ１９Ｋ、Ｍ１９Ｒ、Ｍ１９Ｔ、Ｍ１９Ｅ、Ｍ１９Ｎ、Ｍ１９Ｑ、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｄ５５Ｎ、Ｄ５５Ｔ、Ｓ５６Ａ、Ｓ５６Ｑ、Ｓ５６Ｖ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｅ、Ｄ５７Ｑ、Ｔ５８Ａ、Ｔ５８Ｖ、Ｗ１０４Ｆ、Ｗ１０４Ｙ、Ｗ１０４Ｔ、Ｗ１０４Ｓ、Ｗ１０４Ａ、Ｗ１０４Ｈ、Ｗ１０４Ｉ、Ｗ１０４Ｑ、又はそれらの組み合わせである、請求項２８に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項３０】
前記重鎖可変領域は、配列番号１１８の配列、又は１つ以上のアミノ酸位置１９、５５、５６、５７、５８、及び／若しくは１０４に変異を有する配列番号１１８の配列を含む、請求項２７に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項３１】
前記変異は、Ｍ１９Ｋ、Ｍ１９Ｒ、Ｍ１９Ｔ、Ｍ１９Ｅ、Ｍ１９Ｎ、Ｍ１９Ｑ、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｄ５５Ｎ、Ｄ５５Ｔ、Ｓ５６Ａ、Ｓ５６Ｑ、Ｓ５６Ｖ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｅ、Ｄ５７Ｑ、Ｔ５８Ａ、Ｔ５８Ｖ、Ｗ１０４Ｆ、Ｗ１０４Ｙ、Ｗ１０４Ｔ、Ｗ１０４Ｓ、Ｗ１０４Ａ、Ｗ１０４Ｈ、Ｗ１０４Ｉ、Ｗ１０４Ｑ、又はそれらの組み合わせである、請求項３０に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項３２】
前記変異は、Ｍ１９Ｋ、Ｄ５５Ｅ、Ｓ５６Ａ、Ｄ５７Ｅ、Ｔ５８Ａ、Ｗ１０４Ｙ、Ｗ１０４Ｔ、又はそれらの組み合わせである、請求項３１に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項３３】
前記重鎖可変領域は、配列番号１２３の配列、又は１つ以上のアミノ酸位置２７、５５、５６、５７、５８、１０５、及び／若しくは１０６に変異を有する配列番号１２３の配列を含む、請求項２７に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項３４】
前記変異は、Ｈ２７Ｙ、Ｈ２７Ｄ、Ｈ２７Ｆ、Ｈ２７Ｎ、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｄ５５Ｎ、Ｄ５５Ｔ、Ｓ５６Ａ、Ｓ５６Ｑ、Ｓ５６Ｖ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｅ、Ｄ５７Ｑ、Ｔ５８Ａ、Ｔ５８Ｖ、Ｄ１０５Ｅ、Ｄ１０５Ｑ、Ｄ１０５Ｔ、Ｄ１０５Ｎ、Ｄ１０５Ｇ、Ｓ１０６Ａ、Ｓ１０６Ｑ、Ｓ１０６Ｖ、Ｓ１０６Ｔ、又はそれらの組み合わせである、請求項３３に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項３５】
前記重鎖可変領域は、配列番号１２４の配列、又は１つ以上のアミノ酸位置５５、５６、５７、５８、１０５、及び／若しくは１０６に変異を有する配列番号１２４の配列を含む、請求項２７に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項３６】
前記変異は、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｄ５５Ｎ、Ｄ５５Ｔ、Ｓ５６Ａ、Ｓ５６Ｑ、Ｓ５６Ｖ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｅ、Ｄ５７Ｑ、Ｔ５８Ａ、Ｔ５８Ｖ、Ｄ１０５Ｅ、Ｄ１０５Ｑ、Ｄ１０５Ｔ、Ｄ１０５Ｎ、Ｄ１０５Ｇ、Ｓ１０６Ａ、Ｓ１０６Ｑ、Ｓ１０６Ｖ、Ｓ１０６Ｔ、又はそれらの組み合わせである、請求項３５に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項３７】
前記変異は、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｓ５６Ａ、Ｄ５７Ｅ、Ｔ５８Ａ、Ｄ１０５Ｅ、Ｄ１０５Ｎ、Ｓ１０６Ａ、又はそれらの組み合わせである、請求項３６に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項３８】
前記重鎖可変領域は、配列番号１２５の配列、又は１つ以上のアミノ酸位置４３、７６、８５、９９、１００、及び／若しくは１１６に変異を有する配列番号１２５の配列を含む、請求項２７に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項３９】
前記変異は、Ｌ４３Ｑ、Ｌ４３Ｋ、Ｌ４３Ｈ、Ｉ７６Ｔ、Ｒ８５Ｓ、Ｒ８５Ｇ、Ｒ８５Ｎ、Ｒ８５Ｄ、Ｄ９９Ｅ、Ｄ９９Ｑ、Ｄ９９Ｓ、Ｄ９９Ｔ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｙ、Ｇ１００Ｖ、Ｔ１１６Ｌ、Ｔ１１６Ｍ、Ｔ１１６Ｐ、Ｔ１１６Ｒ、又はそれらの組み合わせである、請求項３８に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項４０】
前記変異は、Ｌ４３Ｑ、Ｉ７６Ｔ、Ｒ８５Ｓ、Ｄ９９Ｅ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｙ、Ｔ１１６Ｌ、又はそれらの組み合わせである、請求項３９に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項４１】
前記重鎖可変領域は、配列番号１１５の配列、又はアミノ酸位置６２、及び／若しくは６３に変異を有する配列番号１１５の配列を含む、請求項２７に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項４２】
前記変異は、Ｄ６２Ｅ、Ｄ６２Ｑ、Ｄ６２Ｔ、Ｄ６２Ｎ、Ｓ６３Ａ、Ｓ６３Ｑ、Ｓ６３Ｖ、又はそれらの組み合わせである、請求項４１に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項４３】
前記変異は、Ｄ６２Ｅ、Ｄ６２Ｑ、Ｓ６３Ａ、又はそれらの組み合わせである、請求項４２に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項４４】
ヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する単離アゴニスト抗原結合タンパク質であって、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号１６の配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号１３９の配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１４０の配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号８５の配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１４１の配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１４２の配列を含む単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項４５】
ＣＤＲＬ１は配列番号１６の配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号２６及び１４３〜１４７から選択される配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号４３及び１４８〜１５２から選択される配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号８５の配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号９１及び１７０〜１７５から選択される配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１７６〜１７９から選択される配列を含む、請求項４４に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項４６】
前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１５３〜１６２から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号１５３〜１６２から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１５３〜１６２から選択される配列を含む、請求項４４又は４５に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項４７】
前記重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１８０〜１９０から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号１８０〜１９０から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１８０〜１９０から選択される配列を含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項４８】
ヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する単離アゴニスト抗原結合タンパク質であって、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号２８４の配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号２８５の配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号２８６の配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号２８７の配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２８８の配列を含み、且つＣＤＲＨ３は配列番号２８９の配列を含む単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項４９】
ＣＤＲＬ１は配列番号１６、２９０、及び２９１から選択される配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号２８、２９２、及び２９３から選択される配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号４３、２９４、及び２７１から選択される配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号８５又は配列番号３０２の配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号９１又は配列番号３０３の配列を含み、且つＣＤＲＨ３は配列番号１０７及び３０４〜３０６から選択される配列を含む、請求項４８に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項５０】
前記軽鎖可変領域は、（ｉ）配列番号６１及び２９５〜３００から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号６１及び２９５〜３００から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号６１及び２９５〜３００から選択される配列を含む、請求項４８又は４９に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項５１】
前記重鎖可変領域は、（ｉ）配列番号１２４及び３０７〜３１２から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号１２４及び３０７〜３１２から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１２４及び３０７〜３１２から選択される配列を含む、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項５２】
モノクローナル抗体又はその結合断片である、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項５３】
前記モノクローナル抗体又はその結合断片は、キメラ抗体又はその結合断片、ヒト化抗体又はその結合断片、或いは完全ヒト抗体又はその結合断片である、請求項５２に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項５４】
前記モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である、請求項５２又は５３に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項５５】
前記モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ２抗体である、請求項５４に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項５６】
前記モノクローナル抗体は、その重鎖にＥＵ番号付けによるＣ１３１Ｓ変異を含む、請求項５５に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項５７】
前記モノクローナル抗体は、その軽鎖に、ＥＵ番号付けによるＣ２１４Ｓ変異を含み、且つその重鎖に、ＥＵ番号付けによるＣ２２０Ｓ変異を含む、請求項５５に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項５８】
前記モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体である、請求項５４に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項５９】
前記モノクローナル抗体は、アグリコシル化ヒトＩｇＧ１抗体である、請求項５８に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項６０】
前記モノクローナル抗体は、その重鎖にＥＵ番号付けによるアミノ酸位置Ｎ２９７に変異を含む、請求項５９に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項６１】
前記変異はＮ２９７Ｇである、請求項６０に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項６２】
前記モノクローナル抗体は、その重鎖にＥＵ番号付けによるＲ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃの変異をさらに含む、請求項６０又は６１に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項６３】
前記モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域と、ヒトＩｇＧ２抗体由来のＣＨ１領域及びヒンジ領域とを含む、請求項５２に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項６４】
前記モノクローナル抗体は、その重鎖にＥＵ番号付けによるアミノ酸位置Ｎ２９７に変異を含む、請求項６３に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項６５】
前記変異はＮ２９７Ｇである、請求項６４に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項６６】
前記モノクローナル抗体は、その重鎖にＥＵ番号付けによるＲ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃの変異をさらに含む、請求項６４又は６５に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項６７】
前記モノクローナル抗体は、その重鎖にＥＵ番号付けによるＣ１３１Ｓ変異を含む、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項６８】
前記モノクローナル抗体は、その軽鎖に、ＥＵ番号付けによるＣ２１４Ｓ変異を含み、且つその重鎖に、ＥＵ番号付けによるＣ２２０Ｓ変異を含む、請求項６３〜６６のいずれか一項に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項６９】
ヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する単離アゴニスト抗原結合タンパク質であって、軽鎖可変領域を含む軽鎖及び重鎖可変領域を含む重鎖を含み、
（ａ）軽鎖可変領域は配列番号３２６のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域は配列番号３２７のアミノ酸配列を有する；
（ｂ）軽鎖可変領域は配列番号３２８のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域は配列番号３２９のアミノ酸配列を有する；
（ｃ）軽鎖可変領域は配列番号３３０のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域は配列番号３３１のアミノ酸配列を有する；又は
（ｄ）軽鎖可変領域は配列番号３３２のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域は配列番号３３３のアミノ酸配列を有する
単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項７０】
（ａ）軽鎖は配列番号３３４のアミノ酸配列を有し、重鎖は配列番号３３５のアミノ酸配列を有する；
（ｂ）軽鎖は配列番号３３４のアミノ酸配列を有し、重鎖は配列番号３３６のアミノ酸配列を有する；
（ｃ）軽鎖は配列番号３３７のアミノ酸配列を有し、重鎖は配列番号３３８のアミノ酸配列を有する；
（ｄ）軽鎖は配列番号３３９のアミノ酸配列を有し、重鎖は配列番号３４０のアミノ酸配列を有する；又は
（ｅ）軽鎖は配列番号３４１のアミノ酸配列を有し、重鎖は配列番号３４２のアミノ酸配列を有する、
請求項６９に記載の単離アゴニスト抗原結合タンパク質。
【請求項７１】
請求項１〜７０のいずれか一項に記載のアゴニスト抗原結合タンパク質、及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項７２】
請求項１〜７０のいずれか一項に記載のアゴニスト抗原結合タンパク質をコードする単離ポリヌクレオチド。
【請求項７３】
請求項７２に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
【請求項７４】
請求項７３に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項７５】
ヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合するアゴニスト抗原結合タンパク質の製造方法であって、前記抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項７４に記載の宿主細胞を培養する工程；及び前記培養培地又は宿主細胞から前記抗原結合タンパク質を回収する工程を含む方法。
【請求項７６】
それを必要とする患者において、マクロファージ又はミクログリアの生存又は増殖を増加させる方法であって、請求項１〜７０のいずれか一項に記載のアゴニスト抗原結合タンパク質の有効量を、前記患者に投与することを含む方法。
【請求項７７】
それを必要とする患者において、ヒトＴＲＥＭ２の機能の喪失に関連する状態を処置又は予防する方法であって、請求項１〜７０のいずれか一項に記載のアゴニスト抗原結合タンパク質の有効量を、前記患者に投与することを含む方法。
【請求項７８】
前記状態は、アルツハイマー病、那須・ハコラ病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症、プリオン病、又は脳卒中である、請求項７７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、バイオ医薬品の分野に関する。特に、本発明は、骨髄細胞に発現するヒトトリガー受容体−２（ＴＲＥＭ２）に特異的に結合し、それを活性化する抗体などの抗原結合タンパク質、その抗原結合タンパク質を含む医薬組成物、並びにそのような抗原結合タンパク質を製造及び使用する方法に関する。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルに記録された配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルに記録された以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式（ＣＲＦ）（ファイル名：Ａ−２１２９−ＷＯ−ＰＣＴ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５、作成日：２０１８年４月１８日、サイズ：２８５，０４４バイト）。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ＴＲＥＭ２は、マクロファージ、樹状細胞、及びミクログリアを含む骨髄系列の細胞で発現する受容体のＩｇスーパーファミリーのメンバーである（Ｓｃｈｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．８３：１３０９−１３２０，２００２；Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３：４４５−４５３，２００３；Ｋｉｉａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．１８：３１４−３２２，２００５）。ＴＲＥＭ２は短い細胞内ドメインを有するオーファン免疫受容体であり、アダプタータンパク質ＤＡＰ１２（その細胞質ドメインはＩＴＡＭモチーフを含む）を介するシグナル伝達によって機能する（Ｂｏｕｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１９４：１１１１−１１２２，２００１）。ＴＲＥＭ２の活性化に際しては、ＤＡＰ１２中のＩＴＡＭモチーフ内のチロシン残基が、キナーゼのＳｒｃファミリーによってリン酸化され、それらのＳＨ２ドメインを介してチロシンキナーゼζ鎖関連タンパク質７０（ＺＡＰ７０）及び脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）のためのドッキング部位を提供する（Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３：４４５−４５３，２００３；Ｕｌｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．７：４２０−４２７，２０１６）。ＺＡＰ７０及びＳｙｋキナーゼは、ホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ）、及び細胞内カルシウムの上昇を含むいくつかの下流シグナル伝達カスケードの活性化を誘導する（Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３：４４５−４５３，２００３；Ｕｌｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．７：４２０−４２７，２０１６）。
【０００４】
ＴＲＥＭ２は、食作用、増殖、生存、及び炎症性サイトカイン産生の調節を含む、いくつかの骨髄細胞プロセスに関与している（Ｕｌｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．７：４２０−４２７，２０１６）。ここ数年、ＴＲＥＭ２はいくつかの疾患に関連付けられている。例えば、ＴＲＥＭ２及びＤＡＰ１２の両方の変異が、骨嚢胞、筋肉消耗及び脱髄表現型を特徴とする常染色体劣性遺伝疾患の那須・ハコラ病に関連付けられている（Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３６８：１１７−１２７，２０１３）。より最近では、ＴＲＥＭ２遺伝子の変異体が、アルツハイマー病（ＡＤ）及び前頭側頭型認知症を含む他の型の認知症のリスクの増加と関連付けられている（Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３６８：１０７−１１６，２０１３；Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７０：７８−８４，２０１３；Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．２１２：２８７−２９５，２０１５）。特に、Ｒ４７Ｈ変異体は、ゲノムワイド研究において、ＡｐｏＥとアルツハイマー病との強力な遺伝的関連性に次ぐ２．３の全体的に調整されたオッズ比（全ての年齢の集団について）で、遅発性ＡＤのリスクの増加と関連することが確認されている。Ｒ４７Ｈ変異はＴＲＥＭ２タンパク質の細胞外ＩｇＶセットドメイン上に存在し、脂質結合及びアポトーシス細胞及びベータアミロイドの取り込みに影響を及ぼすことが示され（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１６０：１０６１−１０７１，２０１５；Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，Ｖｏｌ．９１：３２８−３４０，２０１６）、疾患に関連する機能喪失を示唆している。さらに、Ｒ４７Ｈ突然変異を伴うＡＤ患者の脳と伴わないＡＤ患者の脳の死後比較は、変異保持者のミクログリアバリア機能の新たな喪失を支持し、Ｒ４７Ｈ保持者のミクログリアの、プラークを圧縮しそれらの広がりを制限する能力の低下を推定的に示している（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，Ｖｏｌ．９０：７２４−７３９，２０１６）。小膠細胞症における障害はプリオン病、多発性硬化症、及び脳卒中の動物モデルにおいて報告されており、ＴＲＥＭ２が、中枢神経系における病理又は損傷に応答して小膠細胞症の支援に重要な役割を果たし得ることを示唆している（Ｕｌｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．７：４２０−４２７，２０１６）。
ＴＲＥＭ２活性の欠損がマクロファージ及びミクログリア機能に影響を及ぼし、特定の神経変性障害と相関することを示すデータを考慮すると、ＴＲＥＭ２媒介機能を誘導又は増強し得る治療用分子の必要性が、当該技術分野において存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｃｈｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．８３：１３０９−１３２０，２００２
【非特許文献２】Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３：４４５−４５３，２００３
【非特許文献３】Ｋｉｉａｌａｉｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．１８：３１４−３２２，２００５
【非特許文献４】Ｂｏｕｃｈｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．１９４：１１１１−１１２２，２００１
【非特許文献５】Ｕｌｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．７：４２０−４２７，２０１６
【非特許文献６】Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３６８：１１７−１２７，２０１３
【非特許文献７】Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３６８：１０７−１１６，２０１３
【非特許文献８】Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７０：７８−８４，２０１３
【非特許文献９】Ｊａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．２１２：２８７−２９５，２０１５
【非特許文献１０】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１６０：１０６１−１０７１，２０１５
【非特許文献１１】Ｙｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，Ｖｏｌ．９１：３２８−３４０，２０１６
【非特許文献１２】Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｎ，Ｖｏｌ．９０：７２４−７３９，２０１６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要旨
本発明は、一つには、さらなる架橋を必要とせずにヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合し、それを活性化する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の設計及び生成に基づいている。本発明のアゴニスト抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質の凝集、クラスター化、及び／又はＦｃ媒介架橋の非存在下で、骨髄細胞においてＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２シグナル伝達を活性化することができる。したがって、特定の実施形態では、本発明は、ヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合し、１つ以上のＴＲＥＭ２媒介機能を誘導又は活性化する単離されたアゴニスト抗原結合タンパク質を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＴＲＥＭ２を発現する細胞において架橋剤の非存在下でリン酸化Ｓｙｋ（ｐＳｙｋ）レベルを増加させる。細胞は、単球、樹状細胞、ミクログリア細胞、及びマクロファージを含む骨髄系列の細胞であり得る。特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合は、細胞ベースのｐＳｙｋアッセイによる測定で、架橋剤の非存在下において、５００ｐＭ未満のＥＣ５０でＴＲＥＭ２発現細胞におけるｐＳｙｋレベルを増加させる。他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合は、細胞ベースのｐＳｙｋアッセイによる測定で、架橋剤の非存在下において、３００ｐＭ未満のＥＣ５０を有するＴＲＥＭ２発現細胞におけるｐＳｙｋレベルを増加させる。さらに他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合は、細胞ベースのｐＳｙｋアッセイによる測定で、架橋剤の非存在下において、約１５０ｐＭ〜約５００ｐＭのＥＣ５０を有するＴＲＥＭ２発現細胞におけるｐＳｙｋレベルを増加させる。
【０００８】
ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２（配列番号１）、又はヒトＴＲＥＭ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（例えば、配列番号２に記載されるＥＣＤ）に、例えば、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、又は５ｎＭ未満の平衡解離定数（ＫＤ）で特異的に結合する。特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ１などの他のＴＲＥＭタンパク質と交差反応しない。したがって、一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ１（配列番号４）に特異的に結合しない。
【０００９】
本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２との結合に関して、本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２抗体（例えば、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂに列挙される抗体）のいずれかと競合し得る。一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２との結合に関して参照抗体と競合するが、この参照抗体は配列番号６１の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２４の配列を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２との結合に関して、参照抗体と競合するが、この参照抗体は配列番号６２の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２５の配列を含む重鎖可変領域を含む。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２との結合に関して、参照抗体と競合するが、この参照抗体は配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１５の配列を含む重鎖可変領域を含む。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２との結合に関して、参照抗体と競合するが、この参照抗体は配列番号５６の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１９の配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００１０】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含む。これらの軽鎖及び重鎖可変領域、又はＣＤＲは、本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２抗体のいずれか又はその変異体由来であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号５〜１８から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＣＤＲＬ１；配列番号１９〜３０から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＣＤＲＬ２；配列番号３１〜４５から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＣＤＲＬ３；配列番号７７〜８６から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＣＤＲＨ１；配列番号８７〜９４から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＣＤＲＨ２；及び配列番号９５〜１０９から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＣＤＲＨ３を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号４６〜６３から選択される配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１０〜１２６から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号５４の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１７の配列を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号５５の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１８の配列を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号６０の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２３の配列を含む重鎖可変領域を含む。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号６１の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２４の配列を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号６２の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２５の配列を含む重鎖可変領域を含む。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１５の配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２抗体のいずれかの軽鎖可変領域に由来する軽鎖可変領域を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域は、配列番号４６〜６３から選択される配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、又は少なくとも９５％同一である配列を含む。例えば、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表１３〜１８に記載される遺伝子操作された抗ＴＲＥＭ２抗体変異体のいずれかの軽鎖可変領域を含み得る。一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置６４、７９、８０、８５、９４、及び／又は１００に変異を有する配列番号５４の配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかのそのような実施形態では、変異は、Ｖ６４Ｇ、Ｖ６４Ａ、Ｑ７９Ｅ、Ｑ７９Ｄ、Ｓ８０Ｐ、Ｓ８０Ａ、Ｆ８５Ｖ、Ｆ８５Ｌ、Ｆ８５Ａ、Ｆ８５Ｄ、Ｆ８５Ｉ、Ｆ８５Ｌ、Ｆ８５Ｍ、Ｆ８５Ｔ、Ｗ９４Ｆ、Ｗ９４Ｙ、Ｗ９４Ｓ、Ｗ９４Ｔ、Ｗ９４Ａ、Ｗ９４Ｈ、Ｗ９４Ｉ、Ｗ９４Ｑ、Ｐ１００Ｒ、Ｐ１００Ｑ、Ｐ１００Ｇ、又はそれらの組み合わせである。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置６４、７９、８０、９４、及び／又は１００に変異を有する配列番号５５の配列を含む軽鎖可変領域を含む。このような変異には、Ｖ６４Ｇ、Ｖ６４Ａ、Ｑ７９Ｅ、Ｑ７９Ｄ、Ｓ８０Ｐ、Ｓ８０Ａ、Ｗ９４Ｆ、Ｗ９４Ｙ、Ｗ９４Ｓ、Ｗ９４Ｔ、Ｗ９４Ａ、Ｗ９４Ｈ、Ｗ９４Ｉ、Ｗ９４Ｑ、Ｐ１００Ｒ、Ｐ１００Ｑ、Ｐ１００Ｇ、又はこれらの組み合わせが含まれ得る。特定の実施形態では、変異は、Ｖ６４Ｇ、Ｖ６４Ａ、Ｑ７９Ｅ、Ｓ８０Ｐ、Ｓ８０Ａ、Ｗ９４Ｙ、Ｗ９４Ｓ、Ｐ１００Ｒ、Ｐ１００Ｑ、又はこれらの組み合わせである。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置６０、９２、及び／又は９３に変異を有する配列番号６０の配列を含む軽鎖可変領域を含む。そのような実施形態における変異は、Ｌ６０Ｓ、Ｌ６０Ｐ、Ｌ６０Ｄ、Ｌ６０Ａ、Ｄ９２Ｅ、Ｄ９２Ｑ、Ｄ９２Ｔ、Ｄ９２Ｎ、Ｓ９３Ａ、Ｓ９３Ｎ、Ｓ９３Ｑ、Ｓ９３Ｖ、又はこれらの組合せから選択することができる。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置５６、５７、９２、及び／又は９３に変異を有する配列番号６１の配列を含む軽鎖可変領域を含む。このような実施形態では、変異は、Ｎ５６Ｓ、Ｎ５６Ｔ、Ｎ５６Ｑ、Ｎ５６Ｅ、Ｇ５７Ａ、Ｇ５７Ｖ、Ｄ９２Ｅ、Ｄ９２Ｑ、Ｄ９２Ｔ、Ｄ９２Ｎ、Ｓ９３Ａ、Ｓ９３Ｎ、Ｓ９３Ｑ、Ｓ９３Ｖ、又はこれらの組合せであり得る。特定の実施形態では、変異は、Ｎ５６Ｓ、Ｎ５６Ｑ、Ｇ５７Ａ、Ｄ９２Ｅ、Ｄ９２Ｑ、Ｓ９３Ａ、又はこれらの組み合わせである。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、アミノ酸位置３６、４６、６１、及び／又は１００に変異を有する配列番号６２の配列を含む軽鎖可変領域を含む。このような突然変異には、Ｆ３６Ｙ、Ｓ４６Ｌ、Ｓ４６Ｒ、Ｓ４６Ｖ、Ｓ４６Ｆ、Ｋ６１Ｒ、Ｐ１００Ｑ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１００Ｒ、又はこれらの組み合わせが含まれ得る。特定の実施形態では、変異は、Ｆ３６Ｙ、Ｋ６１Ｒ、Ｐ１００Ｑ、又はこれらの組み合わせである。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、アミノ酸位置９１に変異を有する配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域を含み、その変異は、Ｆ９１Ｖ、Ｆ９１Ｉ、Ｆ９１Ｔ、Ｆ９１Ｌ、又はＦ９１Ｄから選択される。一実施形態では、変異はＦ９１Ｖである。
【００１３】
特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２抗体のいずれかの重鎖可変領域に由来する重鎖可変領域を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域は、配列番号１１０〜１２６から選択される配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、又は少なくとも９５％同一である配列を含む：例えば、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表１３〜１８に記載される遺伝子操作された抗ＴＲＥＭ２抗体変異体のいずれかの重鎖可変領域を含み得る。一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置１９、５５、５６、５７、５８、及び／又は１０４に変異を有する配列番号１１７の配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかのそのような実施形態では、変異は、Ｍ１９Ｋ、Ｍ１９Ｒ、Ｍ１９Ｔ、Ｍ１９Ｅ、Ｍ１９Ｎ、Ｍ１９Ｑ、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｄ５５Ｎ、Ｄ５５Ｔ、Ｓ５６Ａ、Ｓ５６Ｑ、Ｓ５６Ｖ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｅ、Ｄ５７Ｑ、Ｔ５８Ａ、Ｔ５８Ｖ、Ｗ１０４Ｆ、Ｗ１０４Ｙ、Ｗ１０４Ｔ、Ｗ１０４Ｓ、Ｗ１０４Ａ、Ｗ１０４Ｈ、Ｗ１０４Ｉ、Ｗ１０４Ｑ、又はこれらの組み合わせである。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置１９、５５、５６、５７、５８、及び／又は１０４に変異を有する配列番号１１８の配列を含む重鎖可変領域を含む。このような変異には、Ｍ１９Ｋ、Ｍ１９Ｒ、Ｍ１９Ｔ、Ｍ１９Ｅ、Ｍ１９Ｎ、Ｍ１９Ｑ、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｄ５５Ｎ、Ｄ５５Ｔ、Ｓ５６Ａ、Ｓ５６Ｑ、Ｓ５６Ｖ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｅ、Ｄ５７Ｑ、Ｔ５８Ａ、Ｔ５８Ｖ、Ｗ１０４Ｆ、Ｗ１０４Ｙ、Ｗ１０４Ｔ、Ｗ１０４Ｓ、Ｗ１０４Ａ、Ｗ１０４Ｈ、Ｗ１０４Ｉ、Ｗ１０４Ｑ、又はこれらの組み合わせが含まれ得る。特定の実施形態では、変異は、Ｍ１９Ｋ、Ｄ５５Ｅ、Ｓ５６Ａ、Ｄ５７Ｅ、Ｔ５８Ａ、Ｗ１０４Ｙ、Ｗ１０４Ｔ、又はこれらの組み合わせである。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置２７、５５、５６、５７、５８、１０５、及び／又は１０６に変異を有する配列番号１２３の配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、変異は、Ｈ２７Ｙ、Ｈ２７Ｄ、Ｈ２７Ｆ、Ｈ２７Ｎ、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｄ５５Ｎ、Ｄ５５Ｔ、Ｓ５６Ａ、Ｓ５６Ｑ、Ｓ５６Ｖ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｅ、Ｄ５７Ｑ、Ｔ５８Ａ、Ｔ５８Ｖ、Ｄ１０５Ｅ、Ｄ１０５Ｑ、Ｄ１０５Ｔ、Ｄ１０５Ｎ、Ｄ１０５Ｇ、Ｓ１０６Ａ、Ｓ１０６Ｑ、Ｓ１０６Ｖ、Ｓ１０６Ｔ、又はこれらの組み合わせから選択される。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置５５、５６、５７、５８、１０５、及び／又は１０６に変異を有する配列番号１２４の配列を含む重鎖可変領域を含む。そのような実施形態における変異は、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｄ５５Ｎ、Ｄ５５Ｔ、Ｓ５６Ａ、Ｓ５６Ｑ、Ｓ５６Ｖ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｅ、Ｄ５７Ｑ、Ｔ５８Ａ、Ｔ５８Ｖ、Ｄ１０５Ｅ、Ｄ１０５Ｑ、Ｄ１０５Ｔ、Ｄ１０５Ｎ、Ｄ１０５Ｇ、Ｓ１０６Ａ、Ｓ１０６Ｑ、Ｓ１０６Ｖ、Ｓ１０６Ｔ、又はこれらの組み合わせから選択することができる。特定の実施形態では、変異は、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｓ５６Ａ、Ｄ５７Ｅ、Ｔ５８Ａ、Ｄ１０５Ｅ、Ｄ１０５Ｎ、Ｓ１０６Ａ、又はこれらの組み合わせである。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置４３、７６、８５、９９、１００、及び／又は１１６に変異を有する配列番号１２５の配列を含む重鎖可変領域を含む。このような変異には、Ｌ４３Ｑ、Ｌ４３Ｋ、Ｌ４３Ｈ、Ｉ７６Ｔ、Ｒ８５Ｓ、Ｒ８５Ｇ、Ｒ８５Ｎ、Ｒ８５Ｄ、Ｄ９９Ｅ、Ｄ９９Ｑ、Ｄ９９Ｓ、Ｄ９９Ｔ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｙ、Ｇ１００Ｖ、Ｔ１１６Ｌ、Ｔ１１６Ｍ、Ｔ１１６Ｐ、Ｔ１１６Ｒ、又はこれらの組み合わせが含まれ得る。特定の実施形態では、変異は、Ｌ４３Ｑ、Ｒ８５Ｓ、Ｄ９９Ｅ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｙ、Ｔ１１６Ｌ、又はこれらの組み合わせである。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、アミノ酸位置６２及び／又は６３に変異を有する配列番号１１５の配列を含む重鎖可変領域を含む。このような実施形態では、変異は、Ｄ６２Ｅ、Ｄ６２Ｑ、Ｄ６２Ｔ、Ｄ６２Ｎ、Ｓ６３Ａ、Ｓ６３Ｑ、Ｓ６３Ｖ、又はこれらの組み合わせから選択することができる。いくつかの実施形態では、変異は、Ｄ６２Ｅ、Ｄ６２Ｑ、Ｓ６３Ａ、又はこれらの組み合わせである。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、本明細書中に記載の抗ＴＲＥＭ２抗体の変異体の１つ以上のＣＤＲを含む。例えば、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、及び１９に記載される抗ＴＲＥＭ２抗体変異体の１つ以上のＣＤＲを含み得る。特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、結合親和性が向上した抗ＴＲＥＭ２抗体変異体の１つ以上のＣＤＲを含む。これらの実施形態及び他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号１６の配列を含むＣＤＲＬ１；ＣＤＲＬ２コンセンサス配列を含むＣＤＲＬ２；ＣＤＲＬ３コンセンサス配列を含むＣＤＲＬ３；配列番号８５の配列を含むＣＤＲＨ１；ＣＤＲＨ２コンセンサス配列を含むＣＤＲＨ２；及びＣＤＲＨ３コンセンサス配列を含むＣＤＲＨ３を含む。一実施形態では、ＣＤＲＬ２コンセンサス配列はＸ１ＡＳＳＸ２ＱＸ３（配列番号１３９）（ここで、Ｘ１はＡ又はＧであり；Ｘ２はＬ又はＲであり；Ｘ３はＮ、Ｋ、Ｒ、Ｌ又はＴである）である。関連する実施形態では、ＣＤＲＬ３コンセンサス配列はＸ１ＱＡＤＸ２Ｘ３ＰＸ４Ｔ（配列番号１４０）（ここで、Ｘ１はＱ又はＧであり；Ｘ２はＳ又はＲであり；Ｘ３はＦ、Ｌ又はＹであり；Ｘ４はＲ又はＨである）である。これらの実施形態及び他の実施形態では、ＣＤＲＨ２コンセンサス配列はＸ１ＩＹＰＧＤＳＤＸ２ＲＸ３Ｘ４ＰＸ５ＦＱＸ６（配列番号１４１）（ここで、Ｘ１はＩ又はＴであり；Ｘ２はＴ又はＶであり；Ｘ３はＹ又はＬであり；Ｘ４はＳ又はＡであり；Ｘ５はＳ、Ｇ又はＥであり；Ｘ６はＧ又はＤである）である。ＣＤＲＨ３コンセンサスはＸ１ＲＴＦＹＹＤＳＳＤＹＸ２ＤＹ（配列番号１４２）（ここで、Ｘ１はＱ、Ｇ、Ｓ又はＭであり；Ｘ２はＦ又はＳである）であり得る。さらなる実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のＣＤＲＬ２は、配列番号２６及び１４３〜１４７から選択される配列を含み得る。なおさらなる実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のＣＤＲＬ３は、配列番号４３及び１４８〜１５２から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のＣＤＲＨ２は、配列番号９１及び１７０〜１７５から選択される配列を含み得る。他の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のＣＤＲＨ３は、配列番号１７６〜１７９から選択される配列を含み得る。
【００１５】
他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、結合親和性が低下した抗ＴＲＥＭ２抗体変異体の１つ以上のＣＤＲを含む。これらの実施形態及び他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１コンセンサス配列を含むＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２コンセンサス配列を含むＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３コンセンサス配列を含むＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１コンセンサス配列を含むＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２コンセンサス配列を含むＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３コンセンサス配列を含むＣＤＲＨ３を含む。一実施形態では、ＣＤＲＬ１コンセンサス配列はＸ１ＡＳＱＧＩＳＸ２ＷＬＡ（配列番号２８４）（ここで、Ｘ１はＲ又はＡであり；Ｘ２はＳ又はＲである）である。関連する実施形態では、ＣＤＲＬ２コンセンサス配列はＸ１ＡＸ２ＳＬＱＮ（配列番号２８５）（ここで、Ｘ１はＡ又はＳであり；Ｘ２はＳはＧである）である。他の関連する実施形態では、ＣＤＲＬ３コンセンサス配列はＱＱＡＸ１ＳＦＰＸ２Ｔ（配列番号２８６）（ここで、Ｘ１はＤ又はＶであり；Ｘ２はＲ又はＬである）である。これらの実施形態及び他の実施形態では、ＣＤＲＨ１コンセンサス配列はＳＸ１ＷＩＡ（配列番号２８７）（ここで、Ｘ１はＹ又はＥである）である。関連する実施形態では、ＣＤＲＨ２コンセンサス配列はＩＩＹＰＸ１ＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２８８）（ここで、Ｘ１はＧ又はＳである）である。ＣＤＲＨ３コンセンサスはＱＲＸ１ＦＸ２Ｘ３ＤＳＳＤＹＦＤＹ（配列番号２８９）（ここで、Ｘ１はＴ又はＧであり；Ｘ２はＹ又はＲであり；Ｘ３はＹ又はＧである）であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のＣＤＲＬ１は、配列番号１６、２９０及び２９１から選択される配列を含み得る。さらなる実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のＣＤＲＬ２は、配列番号２８、２９２及び２９３から選択される配列を含み得る。なおさらなる実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のＣＤＲＬ３は、配列番号４３、２９４及び２７１から選択される配列を含み得る。いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のＣＤＲＨ１は、配列番号８５又は配列番号３０２の配列を含み得る。他の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のＣＤＲＨ２は、配列番号９１又は配列番号３０３の配列を含み得る。さらに他の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のＣＤＲＨ３は、配列番号１０７及び３０４〜３０６から選択される配列を含み得る。
【００１６】
特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表２Ａ、２Ｂ、３Ａ、３Ｂ、及び１９に記載される抗ＴＲＥＭ２変異抗体のいずれかの軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含む。したがって、いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の軽鎖可変領域は、配列番号６１、１５３〜１６２及び２９５〜３００から選択される配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、又は少なくとも９５％同一である配列を含む。これらの実施形態及び他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の重鎖可変領域は、配列番号１２４、１８０〜１９０及び３０７〜３１２から選択される配列と少なくとも９０％同一、少なくとも９１％同一、少なくとも９２％同一、少なくとも９３％同一、少なくとも９４％同一、又は少なくとも９５％同一である配列を含む。
【００１７】
上記の実施形態を含む、本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、抗体又はその結合断片、好ましくはモノクローナル抗体又はその結合断片である。いくつかの実施形態では、モノクローナル抗体又はその結合断片は、キメラ抗体又はその結合断片である。他の実施形態では、モノクローナル抗体又はその結合断片は、ヒト化抗体又はその結合断片である。さらに他の実施形態では、モノクローナル抗体又はその結合断片は、完全ヒト抗体又はその結合断片である。モノクローナル抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４などの任意のアイソタイプのものであり得る。特定の一実施形態では、モノクローナル抗体はヒトＩｇＧ１抗体である。特定の別の実施形態では、モノクローナル抗体はヒトＩｇＧ２抗体である。
【００１８】
ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質が抗体（例えば、モノクローナル抗体）である特定の実施形態では、抗体は、抗体のグリコシル化に影響を及ぼす１つ以上の改変を含み得る。いくつかの実施形態では、抗体は、グリコシル化を減少又は排除する１つ以上の変異を含む。このような実施形態では、アグリコシル化抗体は、その重鎖に、Ｎ２９７Ｇ変異などの、アミノ酸位置Ｎ２９７（ＥＵ番号付けスキームによる）突然変異を含み得る。アグリコシル化抗体は、抗体構造を安定化する変異をさらに含み得る。このような変異には、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、並びにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃ（ＥＵ番号付けスキームによるアミノ酸位置）などの、システイン置換対が含まれ得る。一実施形態では、アグリコシル化抗体は、その重鎖に、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含む。特定の実施形態では、アグリコシル化抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体は、配列番号２０２又は配列番号２０３のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。
【００１９】
ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質がヒトＩｇＧ２抗体（例えば、モノクローナル抗体）であるか、又はヒトＩｇＧ２抗体のＣＨ１領域及びヒンジ領域を含むさらなる実施形態では、抗体は、抗体のヒンジ構造に影響を及ぼす１つ以上の改変を含み得る。このような一実施形態では、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体は、その重鎖に、Ｃ１３１Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含む。別の実施形態では、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体は、その軽鎖に、Ｃ２１４Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含み、その重鎖に、Ｃ２１９Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含む。別の実施形態では、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体は、その軽鎖に、Ｃ２１４Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含み、その重鎖に、Ｃ２２０Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含む。
【００２０】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ２抗体（例えば、配列番号２０７のアミノ酸）のＣＨ１領域及びヒンジ領域、並びにヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を含み得る。一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ２抗体（例えば、配列番号２０７のアミノ酸配列）のＣＨ１領域及びヒンジ領域、並びにヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を含み、Ｆｃ領域は配列番号２８１のアミノ酸配列を含む。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、軽鎖可変領域を含む軽鎖、及び重鎖可変領域を含む重鎖を含み、ここで（ａ）軽鎖可変領域は配列番号３２６のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域は配列番号３２７のアミノ酸配列を有する；（ｂ）軽鎖可変領域は配列番号３２８のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域は配列番号３２９のアミノ酸配列を有する；（ｃ）軽鎖可変領域は配列番号３３０のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域は配列番号３３１のアミノ酸配列を有する；又は（ｄ）軽鎖可変領域は配列番号３３２のアミノ酸配列を有し、重鎖可変領域は配列番号３３３のアミノ酸配列を有する。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、軽鎖及び重鎖を含み、ここで、（ａ）軽鎖は配列番号３３４のアミノ酸配列を有し、重鎖は配列番号３３５のアミノ酸配列を有する；（ｂ）軽鎖は配列番号３３４のアミノ酸配列を有し、重鎖は配列番号３３６のアミノ酸配列を有する；（ｃ）軽鎖は配列番号３３７のアミノ酸配列を有し、重鎖は配列番号３３８のアミノ酸配列を有する；（ｄ）軽鎖は配列番号３３９のアミノ酸配列を有し、重鎖は配列番号３４０のアミノ酸配列を有する；又は（ｅ）軽鎖は配列番号３４１のアミノ酸配列を有し、重鎖は配列番号３４２のアミノ酸配列を有する。
【００２２】
本発明はまた、本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及び発現ベクター、並びにコードするポリヌクレオチド及び発現ベクターを含む、ＣＨＯ細胞などの宿主細胞を提供する。特定の実施形態では、本発明は、抗ＴＲＥＭ２アゴニストモノクローナル抗体及びその結合断片を含む、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質を製造する方法を含む。一実施形態では、本方法は、抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下で、抗原結合タンパク質をコードする発現ベクターを含む宿主細胞を培養する工程、及び培養培地又は宿主細胞から抗原結合タンパク質を回収する工程を含む。
【００２３】
本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、アルツハイマー病、那須・ハコラ病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症、プリオン病、又は脳卒中などのＴＲＥＭ２の欠損又はＴＲＥＭ２の生物学的活性の喪失に関係する状態の処置又は予防のための医薬組成物又は医薬の製造に使用することができる。したがって、本発明はまた、本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明は、それを必要とする患者におけるＴＲＥＭ２の欠損又はＴＲＥＭ２の生物学的活性の喪失に関係する状態を発症するリスクを処置、予防又は減少させるための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のいずれかの有効量を患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、処置、予防、又は改善される状態はアルツハイマー病である。他の実施形態では、処置、予防、又は改善される状態は多発性硬化症である。処置を必要とする患者は、本発明の方法に従って処置することができる疾患又は状態を発症するリスクの増加に関係する１つ以上の遺伝子型を有すると決定し得る。例えば、いくつかの実施形態では、患者は、本明細書に記載される遺伝子型などの、アルツハイマー病を発症するリスクの増大に関係する遺伝子型を有する。さらなる実施形態では、患者は、アルツハイマー病を発症するリスクの増大に関係するＴＲＥＭ２変異体をコードするアレルを保有すると決定し得る。そのような変異体には、Ｒ４７Ｈ  ＴＲＥＭ２変異体及びＲ６２Ｈ  ＴＲＥＭ２変異体が含まれ得る。
【００２５】
本発明はまた、マクロファージ、ミクログリア、及び樹状細胞などの骨髄細胞の生存又は増殖を、それを必要とする患者において増加させる方法を含む。一実施形態では、この方法は、本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のいずれかの有効量を患者に投与することを含む。いくつかの実施形態では、処置を必要とする患者は、アルツハイマー病などの神経変性障害のリスクがあるか、それに罹患しているか、又はそれと診断されている。他の実施形態では、処置を必要とする患者は、多発性硬化症などの自己免疫疾患のリスクがあるか、それに罹患しているか、又はそれと診断されている。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１Ａ】図１Ａは、採取物１からの精製モノクローナルヒト抗ＴＲＥＭ２抗体のアゴニスト活性の用量反応曲線を示す。ヒトＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるリン酸化Ｓｙｋ（ｐＳｙｋ）レベルの倍数増加を、ヒト抗ＴＲＥＭ２抗体の濃度の関数としてプロットする。比較のために、市販のラット抗ヒト／マウスＴＲＥＭ２抗体（ｍＡｂ１７２９１；「Ｒ＆Ｄ  ｍＡｂ」又は「抗体１」）のアゴニスト活性を含む。ヒトＩｇＧ２及びラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ抗体を対照として使用した。
【図１Ｂ】図１Ｂは、採取物３、４及び５のハイブリドーマ上清からの非精製モノクローナルヒト抗ＴＲＥＭ２抗体のアゴニスト活性の用量反応曲線を示す。ヒトＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるｐＳｙｋレベルの倍数増加を、ヒト抗ＴＲＥＭ２抗体の濃度の関数としてプロットする。ヒトＩｇＧ２アイソタイプ抗体を対照として用いた。
【図２Ａ】図２Ａ及び２Ｂは、元の生殖系列配列に対する例示的な抗ＴＲＥＭ２抗体のカッパ軽鎖可変領域の配列アラインメントである。図２Ｂは、図２Ａの配列の続きである。
【図２Ｂ】図２Ａ及び２Ｂは、元の生殖系列配列に対する例示的な抗ＴＲＥＭ２抗体のカッパ軽鎖可変領域の配列アラインメントである。図２Ｂは、図２Ａの配列の続きである。
【図３Ａ】図３Ａ及び３Ｂは、元の生殖系列配列に対する例示的な抗ＴＲＥＭ２抗体のラムダ軽鎖可変領域の配列アラインメントである。図３Ｂは、図３Ａの配列の続きである。
【図３Ｂ】図３Ａ及び３Ｂは、元の生殖系列配列に対する例示的な抗ＴＲＥＭ２抗体のラムダ軽鎖可変領域の配列アラインメントである。図３Ｂは、図３Ａの配列の続きである。
【図４Ａ】図４Ａ及び４Ｂは、元の生殖系列配列に対する例示的な抗ＴＲＥＭ２抗体の重鎖可変領域の配列アラインメントである。図４Ｂは、図４Ａの配列の続きである。
【図４Ｂ】図４Ａ及び４Ｂは、元の生殖系列配列に対する例示的な抗ＴＲＥＭ２抗体の重鎖可変領域の配列アラインメントである。図４Ｂは、図４Ａの配列の続きである。
【図５】図５は、点線（「第１Ａｂ捕捉」）で示す時間で６Ｅ７抗体をロードした抗ヒトＦｃカイネティクスセンサ（Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸ装置；Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）の時間の関数としての結合シグナルのプロットである。第１の実線は非特異的結合事象を減少させるために、無関係なヒトＩｇＧ２抗体をセンサーに添加した時間を示す（「Ｇ２によるセンサーブロッキング」）。第２の実線は、捕捉された６Ｅ７抗体と相互作用する標的抗原（可溶性ヒトＴＲＥＭ２）をセンサーに添加した時間を示す。最後の実線は、サンドイッチ抗体（５Ｅ３、６Ｅ７、又は対照ＩｇＧ２抗体）をセンサーに添加した時間を示す。５Ｅ３抗体が添加されたときに結合の増加が観察され、これは、６Ｅ７抗体が結合するエピトープとは異なるヒトＴＲＥＭ２上のエピトープに５Ｅ３抗体が結合することを示唆している。
【図６】図６は、分化したＴＨＰ−１細胞におけるモノクローナルヒト抗ＴＲＥＭ２抗体（４Ｃ５、４Ｇ１０、５Ｅ３、６Ｅ７、１０Ｅ３、１３Ｅ７、２４Ｇ６、１６Ｂ８、２５Ｆ１２、２６Ｆ２、３２Ｅ３、及び３３Ｂ１２）のアゴニスト活性の用量反応曲線を示す。ベースラインに対するリン酸化Ｓｙｋ（ｐＳｙｋ）レベルの倍数増加を、ヒト抗ＴＲＥＭ２抗体の濃度の関数としてプロットする。ヒトＩｇＧ２及びラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ抗体を対照として使用した。比較のために、市販のラット抗ヒト／マウスＴＲＥＭ２抗体（ｍＡｂ１７２９１；「ＲｎＤ」）のアゴニスト活性を含む。
【図７】図７は、ＩｇＧ２（「Ｇ２」）、ＩｇＧ１（「Ｇ１」）、又はアグリコシル化ＩｇＧ１（「ＳＥＦＬ２」）フォーマットにおける精製６Ｅ７及び５Ｅ３ヒト抗ＴＲＥＭ２抗体のアゴニスト活性の用量反応曲線を示す。ヒトＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２を発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞における対応するアイソタイプ対照からのリン酸化Ｓｙｋ（ｐＳｙｋ）レベルの倍数増加を、ヒト抗ＴＲＥＭ２抗体の濃度の関数としてプロットする。ＩｇＧ２アイソタイプからＩｇＧ１アイソタイプへの６Ｅ７及び５Ｅ３抗体の変換は、アゴニスト活性の部分的損失をもたらす。
【図８−１】図８Ａは、ＣＳＦ−１の制限条件下での異なる培養日数における野生型（ＴＲＥＭ＋／＋）及びＴＲＥＭ２−／−マウスに由来する骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の数の棒グラフである。ＴＲＥＭ２−／−ＢＭＤＭは、これらの培養条件において生存欠陥を示す。図８Ｂは、ＣＳＦ−１の制限条件下での培養における異なる時点の野生型（ＴＲＥＭ＋／＋）及びＴＲＥＭ２−／−マウスに由来するマウス成熟期ミクログリアのパーセント細胞コンフルエンスの棒グラフである。ＴＲＥＭ２−／−マウス成熟ミクログリアは、これらの培養条件において生存欠陥を示す。
【図８−２】図８Ｃは、ＣＳＦ−１の制限条件下での培養における異なる時点の野生型（ＴＲＥＭ＋／＋）及びＴＲＥＭ２−／−マウスに由来するマウス新生児期ミクログリアのパーセント細胞コンフルエンスの棒グラフである。新生児期ＴＲＥＭ２−／−ミクログリアは、経時的な生存欠陥を示す。図８Ｄは、ＣＳＦ−１の制限条件下での異なる培養日数における野生型（ＴＲＥＭ＋／＋）及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマウスに由来するＢＭＤＭの数の棒グラフである。ＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨマウスＢＭＤＭは、これらの培養条件において生存欠陥を示す。
【図８−３】図８Ｅは、ＣＳＦ−１の制限条件下での培養における異なる時点の野生型（ＴＲＥＭ＋／＋）及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマウスに由来するマウス成熟期ミクログリアのパーセント細胞コンフルエンスの棒グラフである。ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマウス成熟期ミクログリアは、これらの培養条件において生存欠陥を示す。図８Ｆは、ＣＳＦ−１の制限条件下での培養における異なる時点の野生型（ＴＲＥＭ＋／＋）及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマウスに由来するマウス新生児期ミクログリアのパーセント細胞コンフルエンスの棒グラフである。新生児期ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈミクログリアは、経時的に増加する生存欠陥を示す。
【図９Ａ】図９Ａは、抗ＴＲＥＭ２抗体又はアイソタイプ対照で処理したＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ及び野生型（ＴＲＥＭ＋／＋）ＢＭＤＭからの細胞溶解物のウェスタンブロットである。抗ＴＲＥＭ２抗体はｐＳｙｋレベルの増加によって示されるように、両タイプのマクロファージにおいてＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２シグナル伝達を活性化する。
【図９Ｂ】図９Ｂは、抗ＴＲＥＭ２抗体又はアイソタイプ対照で処理したＴＲＥＭ２−／−及び野生型（ＴＲＥＭ＋／＋）ＢＭＤＭからの細胞溶解物のウェスタンブロットである。抗ＴＲＥＭ２抗体は、ＴＲＥＭ２−／−ＢＭＤＭ中のｐＳｙｋレベルを増加させず、その効果がＴＲＥＭ２に特異的であることを確認する。
【図１０Ａ】図１０Ａは、実時間細胞コンフルエンスアッセイによって測定された、アイソタイプ対照抗体又は抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体で処理したＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨＢＭＤＭの経時的なパーセント細胞コンフルエンスを示すグラフである。データは平均＋／−ｓ．ｄ．としてプロットされており、これは単一の代表的な実験からのものである。この実験は独立して２回実施した（ｎ＝２、且つ３回アッセイした）。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、実時間細胞コンフルエンスアッセイによって測定された、アイソタイプ対照抗体又は抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体で処理した野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）ＢＭＤＭの経時的なパーセント細胞コンフルエンスを示すグラフである。データは平均＋／−ｓ．ｄ．としてプロットされており、これは単一の代表的な実験からのものである。この実験は独立して２回実施した（ｎ＝２、且つ３回アッセイした）。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、ビヒクル、アイソタイプ対照、又は抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体で１４日間処理したＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ及びＴＲＥＭ２＋／−ＢＭＤＭについてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  Ｇｌｏ  ＡＴＰ検出アッセイによって測定された細胞生存率を示す棒グラフである。
【図１０Ｄ】図１０Ｄは、アイソタイプ対照抗体又は抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体で処理したＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ成熟マウスミクログリアの培養中の特定の時間におけるパーセント細胞コンフルエンスを示す棒グラフである。ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈミクログリアの生存率の増加は、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体による処理で観察される。
【図１０Ｅ】図１０Ｅは、実時間細胞コンフルエンスアッセイによって測定された、アイソタイプ対照抗体又は本発明の抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体（以下、「抗体２」と呼ぶ）で処理した老齢（月齢１８ヶ月）の野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）マウス（ｎ＝３匹）から採取したＢＭＤＭの、経時的なパーセント細胞コンフルエンスを示すグラフである。データは平均＋／−ｓ．ｄ．としてプロットされており、これは単一の代表的な実験からのものである。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、多重比較のためのシダックの補正を含む２要因分散分析。
【図１０Ｆ】図１０Ｆは、実時間細胞コンフルエンスアッセイによって測定された、アイソタイプ対照抗体又は抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体（抗体２）で処理した老齢（月齢１８ヶ月）のＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマウス（ｎ＝３匹、除外−ノックアウト実験における６日目の試料に対する野生型年齢適合同腹対照）から採取したＢＭＤＭの、経時的なパーセント細胞コンフルエンスを示すグラフである。データは平均＋／−ｓ．ｄ．としてプロットされており、これは単一の代表的な実験からのものである。＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、多重比較のためのシダックの補正を含む２要因分散分析。野生型及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージの生存率の増加は、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体による処理で観察される。
【図１１−１】図１１Ａは、実時間細胞コンフルエンスアッセイによって測定された、アイソタイプ対照抗体又は抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体（抗体１）で処理した野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）ＢＭＤＭの遊走アッセイにおける培養室中の経時的なパーセント細胞コンフルエンスを示すグラフである。抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体は、このアッセイでは、野生型ＢＭＤＭの遊走に対してわずかな効果を有した。図１１Ｂは、実時間細胞コンフルエンスアッセイによって測定された、アイソタイプ対照抗体又は抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体（抗体１）で処理したＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨＢＭＤＭの遊走アッセイにおける培養室中の経時的なパーセント細胞コンフルエンスを示すグラフである。抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体は、このアッセイでは、ＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨＢＭＤＭの遊走に対して小さいが統計学的に有意な減少をもたらした。
【図１１−２】図１１Ｃは、実時間細胞コンフルエンスアッセイによって測定された、アイソタイプ対照抗体又は抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体（抗体１）で処理したＴＲＥＭ２−／−ＢＭＤＭの遊走アッセイにおける培養室中の経時的なパーセント細胞コンフルエンスを示すグラフである。このアッセイでは、ＴＲＥＭ２−／−ＢＭＤＭの遊走に対して、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体は効果がなかった。
【図１１−３】図１１Ｄ及び図１１Ｅは、実時間細胞コンフルエンスアッセイによって測定された、アイソタイプ対照抗体又は抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体（抗体２）で処理した野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）ＢＭＤＭ及びＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨＢＭＤＭのそれぞれの遊走アッセイにおける培養室中の経時的なパーセント細胞コンフルエンスを示すグラフである。このアッセイでは、野生型及びＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨのＢＭＤＭの遊走に対して、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体による処理は効果がなかった。
【図１２Ａ】図１２Ａは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ、及びＴＲＥＭ２−／−マクロファージにおいて５日目及び６日目にｑＰＣＲによって測定したＣＤＣ２０転写物の差次的調節を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ、及びＴＲＥＭ２−／−マクロファージにおいて５日目及び６日目にｑＰＣＲによって測定したＰＫＢ転写物の差次的調節を示す。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ、及びＴＲＥＭ２−／−マクロファージにおいて５日目及び６日目にｑＰＣＲによって測定したＮＤＣ８０転写物の差次的調節を示す。
【図１２Ｄ】図１２Ｄは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ、及びＴＲＥＭ２−／−マクロファージにおいて５日目及び６日目にｑＰＣＲによって測定したＣＣＲ２転写物の差次的調節を示す。
【図１３−１】図１３Ａは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、ヘテロ接合性（ＴＲＥＭ２＋／−）、及びノックアウト（ＴＲＥＭ２−／−）マクロファージにおける、培養中の異なる時点でのｑＰＣＲによって測定されるＡｐｏＥ転写物の差次的調節を示す。全ての遺伝子発現レベルを、培養４日目の野生型対照マクロファージに対して正規化する。図１３Ｂは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、Ｒ４７Ｈヘテロ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ／＋）、及びＲ４７Ｈホモ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ）マクロファージにおける、培養中の異なる時点でのｑＰＣＲによって測定されるＡｐｏＥ転写物の差次的調節を示す。全ての遺伝子発現レベルを、培養４日目の野生型対照マクロファージに対して正規化する。
【図１３−２】図１３Ｃは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、ヘテロ接合性（ＴＲＥＭ２＋／−）、及びノックアウト（ＴＲＥＭ２−／−）マクロファージにおける、培養中の異なる時点でのｑＰＣＲによって測定されるＩＬ−１ａ転写物の差次的調節を示す。全ての遺伝子発現レベルを、培養４日目の野生型対照マクロファージに対して正規化する。図１３Ｄは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、Ｒ４７Ｈヘテロ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ／＋）、及びＲ４７Ｈホモ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ）マクロファージにおける、培養中の異なる時点でのｑＰＣＲによって測定されるＩＬ−１ａ転写物の差次的調節を示す。全ての遺伝子発現レベルを、培養４日目の野生型対照マクロファージに対して正規化する。
【図１３−３】図１３Ｅは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、ヘテロ接合性（ＴＲＥＭ２＋／−）、及びノックアウト（ＴＲＥＭ２−／−）マクロファージにおける、培養中の異なる時点でのｑＰＣＲによって測定されるＣＸ３ＣＲ１転写物の差次的調節を示す。全ての遺伝子発現レベルを、培養４日目の野生型対照マクロファージに対して正規化する。図１３Ｆは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、Ｒ４７Ｈヘテロ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ／＋）、及びＲ４７Ｈホモ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ）マクロファージにおける、培養中の異なる時点でのｑＰＣＲによって測定されるＣＸ３ＣＲ１転写物の差次的調節を示す。全ての遺伝子発現レベルを、培養４日目の野生型対照マクロファージに対して正規化する。
【図１３−４】図１３Ｇは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、ヘテロ接合性（ＴＲＥＭ２＋／−）、及びノックアウト（ＴＲＥＭ２−／−）マクロファージにおける、培養中の異なる時点でのｑＰＣＲによって測定されるＦＬＴ１転写物の差次的調節を示す。全ての遺伝子発現レベルを、培養４日目の野生型対照マクロファージに対して正規化する。図１３Ｈは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、Ｒ４７Ｈヘテロ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ／＋）、及びＲ４７Ｈホモ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ）マクロファージにおける、培養中の異なる時点でのｑＰＣＲによって測定されるＦＬＴ１転写物の差次的調節を示す。全ての遺伝子発現レベルを、培養４日目の野生型対照マクロファージに対して正規化する。
【図１３−５】図１３Ｉ及び１３Ｊは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、Ｒ４７Ｈヘテロ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ＋／−）、及びＲ４７Ｈホモ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ）マクロファージにおける、培養中の異なる時点でのｑＰＣＲによって測定されるＣ１ｑａ転写物の差次的調節を示す。全ての遺伝子発現レベルを、培養４日目の野生型対照マクロファージに対して正規化する。
【図１３−６】図１３Ｋ及び１３Ｌは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、Ｒ４７Ｈヘテロ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ＋／−及びＴＲＥＭ２＋／−）、並びにＲ４７Ｈホモ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ及びＴＲＥＭ２−／−）マクロファージにおける、培養中の異なる時点でのｑＰＣＲによって測定されるＣｃｌ５転写物の差次的調節を示す。全ての遺伝子発現レベルを、培養４日目の野生型対照マクロファージに対して正規化する。
【図１３−７】図１３Ｍ及び１３Ｎは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、Ｒ４７Ｈヘテロ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ＋／−及びＴＲＥＭ２＋／−）、並びにＲ４７Ｈホモ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ及びＴＲＥＭ２−／−）マクロファージにおける、培養中の異なる時点でのｑＰＣＲによって測定されるＣｃｌ２２転写物の差次的調節を示す。全ての遺伝子発現レベルを、培養４日目の野生型対照マクロファージに対して正規化する。
【図１３−８】図１３Ｏ及び１３Ｐは、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、Ｒ４７Ｈヘテロ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ＋／−及びＴＲＥＭ２＋／−）、並びにＲ４７Ｈホモ接合性（ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ及びＴＲＥＭ２−／−）マクロファージにおける、培養中の異なる時点でのｑＰＣＲによって測定されるＣ３転写物の差次的調節を示す。全ての遺伝子発現レベルを、培養４日目の野生型対照マクロファージに対して正規化する。
【図１４】図１４Ａは、実時間細胞コンフルエンスアッセイによって測定された、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）及びノックアウト（ＴＲＥＭ２−／−）ＢＭＤＭの遊走アッセイにおける培養室中の経時的なパーセント細胞コンフルエンスを示すグラフである。ＴＲＥＭ２ノックアウトマクロファージは、このインビトロアッセイにおいて、野生型マクロファージと比較して遊走欠陥を示す。図１４Ｂは、実時間細胞コンフルエンスアッセイによって測定された、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）及びＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨＢＭＤＭの遊走アッセイにおける培養室中の経時的なパーセント細胞コンフルエンスを示すグラフである。ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージは、このインビトロアッセイにおいて、野生型マクロファージと比較して遊走欠陥を示す。
【図１５Ａ】図１５Ａは、ＥＬＩＳＡによる測定で、ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ及びＴＲＥＭ２−／−マクロファージからの分泌ＣＣＬ２タンパク質が野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）マクロファージと比較して減少したことを示す。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体又はアイソタイプ対照で処理したＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ及び野生型ＴＲＥＭ２＋／＋マクロファージからのＥＬＩＳＡによって測定した分泌ＣＣＬ２タンパク質のレベルを示す。抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体による処理は、ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージから分泌されるＣＣＬ２タンパク質のレベルを回復させる。
【図１６Ａ】図１６Ａは、ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージにおける抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体による処理により調節される遺伝子の経路分析の結果を示す。調節される遺伝子には、骨髄細胞遊走、増殖、細胞周期及び生存の調節に関与する遺伝子が含まれる。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、ＣＳＦ−１の制限条件下での７日目の野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）、ノックアウト（ＴＲＥＭ２−／−）及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージを比較するＲＮＡ−Ｓｅｑ分析を示す。経路分析（ＷＧＣＮＡ）により、野生型と比較してノックアウト及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージにおいて差次的に調節される５つのモジュール／遺伝子ネットワークが同定された。結果は、細胞周期／増殖及び生存、免疫応答及び遊走、並びに脂質及びコレステロールの恒常性におけるＴＲＥＭ２の役割を示す。
【図１６Ｃ】図１６Ｃは、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体（抗体１）又はアイソタイプ対照で処理した野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）及びＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨマクロファージにおいてｑＰＣＲによって測定したＵＢＥ２Ｃ、ＭＥＬＫ及びＭＭＰ１４転写物の差次的調節を示す。データは、ＵＢＥ２Ｃ及びＭＥＬＫ酵素の発現がＲ４７Ｈマクロファージにおいて下方制御される一方で、ＭＭＰ１４酵素の発現は上方制御されることを示すが、これらの変化は抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体による処理で回復され得る。
【図１７−１】図１７は、抗体による処理が、ＷＴ及びＲ４７Ｈ  ＫＩミクログリア、ＷＴミクログリア単独、並びにＲ４７Ｈ  ＫＩミクログリア単独（Ａ、Ｂ及びＣ）における恒常性ミクログリア遺伝子（Ｐ２ｒｙ１２、Ｔｍｅｍ１１９）の発現を増加させることを示す。また、抗体による処理は、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｉｌ１２ｂなどの炎症誘発性ケモカイン及びサイトカインの発現を減少させる（Ｄ、Ｅ及びＦ）。全ての統計は、ウィルコクソンのランクスコアである。式はｌｎ（カウント数＋１）である。
【図１７−２】図１７は、抗体による処理が、ＷＴ及びＲ４７Ｈ  ＫＩミクログリア、ＷＴミクログリア単独、並びにＲ４７Ｈ  ＫＩミクログリア単独（Ａ、Ｂ及びＣ）における恒常性ミクログリア遺伝子（Ｐ２ｒｙ１２、Ｔｍｅｍ１１９）の発現を増加させることを示す。また、抗体による処理は、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｉｌ１２ｂなどの炎症誘発性ケモカイン及びサイトカインの発現を減少させる（Ｄ、Ｅ及びＦ）。全ての統計は、ウィルコクソンのランクスコアである。式はｌｎ（カウント数＋１）である。
【図１７−３】図１７は、抗体による処理が、ＷＴ及びＲ４７Ｈ  ＫＩミクログリア、ＷＴミクログリア単独、並びにＲ４７Ｈ  ＫＩミクログリア単独（Ａ、Ｂ及びＣ）における恒常性ミクログリア遺伝子（Ｐ２ｒｙ１２、Ｔｍｅｍ１１９）の発現を増加させることを示す。また、抗体による処理は、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ４、Ｃｃｌ５、Ｉｌ１２ｂなどの炎症誘発性ケモカイン及びサイトカインの発現を減少させる（Ｄ、Ｅ及びＦ）。全ての統計は、ウィルコクソンのランクスコアである。式はｌｎ（カウント数＋１）である。
【図１８−１】図１８は、ミクログリア浸潤集団が骨髄性及び炎症性遺伝子の発現を増加させ、恒常性ミクログリア遺伝子の発現をわずかに低下させ（Ａ及びＢ）、またＴｒｅｍ２抗体の投与がＷＴ及びＲ４７Ｈ  ＫＩマウス、ＷＴのみのマウス、及びＲ４７Ｈ  ＫＩのみのマウスからの浸潤ミクログリア細胞における炎症誘発性ケモカイン及びサイトカインを減少させた（Ｃ、Ｄ、及びＥ）ことを示している。全ての統計は、ウィルコクソンのランクスコアである。式は、ｕｍｉカウントで補正されたｌｎ（カウント数＋１）である。
【図１８−２】図１８は、ミクログリア浸潤集団が骨髄性及び炎症性遺伝子の発現を増加させ、恒常性ミクログリア遺伝子の発現をわずかに低下させ（Ａ及びＢ）、またＴｒｅｍ２抗体の投与がＷＴ及びＲ４７Ｈ  ＫＩマウス、ＷＴのみのマウス、及びＲ４７Ｈ  ＫＩのみのマウスからの浸潤ミクログリア細胞における炎症誘発性ケモカイン及びサイトカインを減少させた（Ｃ、Ｄ、及びＥ）ことを示している。全ての統計は、ウィルコクソンのランクスコアである。式は、ｕｍｉカウントで補正されたｌｎ（カウント数＋１）である。
【図１８−３】図１８は、ミクログリア浸潤集団が骨髄性及び炎症性遺伝子の発現を増加させ、恒常性ミクログリア遺伝子の発現をわずかに低下させ（Ａ及びＢ）、またＴｒｅｍ２抗体の投与がＷＴ及びＲ４７Ｈ  ＫＩマウス、ＷＴのみのマウス、及びＲ４７Ｈ  ＫＩのみのマウスからの浸潤ミクログリア細胞における炎症誘発性ケモカイン及びサイトカインを減少させた（Ｃ、Ｄ、及びＥ）ことを示している。全ての統計は、ウィルコクソンのランクスコアである。式は、ｕｍｉカウントで補正されたｌｎ（カウント数＋１）である。
【図１８−４】図１８は、ミクログリア浸潤集団が骨髄性及び炎症性遺伝子の発現を増加させ、恒常性ミクログリア遺伝子の発現をわずかに低下させ（Ａ及びＢ）、またＴｒｅｍ２抗体の投与がＷＴ及びＲ４７Ｈ  ＫＩマウス、ＷＴのみのマウス、及びＲ４７Ｈ  ＫＩのみのマウスからの浸潤ミクログリア細胞における炎症誘発性ケモカイン及びサイトカインを減少させた（Ｃ、Ｄ、及びＥ）ことを示している。全ての統計は、ウィルコクソンのランクスコアである。式は、ｕｍｉカウントで補正されたｌｎ（カウント数＋１）である。
【図１８−５】図１８は、ミクログリア浸潤集団が骨髄性及び炎症性遺伝子の発現を増加させ、恒常性ミクログリア遺伝子の発現をわずかに低下させ（Ａ及びＢ）、またＴｒｅｍ２抗体の投与がＷＴ及びＲ４７Ｈ  ＫＩマウス、ＷＴのみのマウス、及びＲ４７Ｈ  ＫＩのみのマウスからの浸潤ミクログリア細胞における炎症誘発性ケモカイン及びサイトカインを減少させた（Ｃ、Ｄ、及びＥ）ことを示している。全ての統計は、ウィルコクソンのランクスコアである。式は、ｕｍｉカウントで補正されたｌｎ（カウント数＋１）である。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
詳細な説明
本発明は、ＴＲＥＭ２、特にヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質に関する。ヒトでは、ＴＲＥＭ２遺伝子は染色体６ｐ２１．１のＴＲＥＭ遺伝子クラスター内に位置する。ＴＲＥＭ遺伝子クラスターは、４つのＴＲＥＭタンパク質（ＴＲＥＭ１、ＴＲＥＭ２、ＴＲＥＭ４、及びＴＲＥＭ５）並びに２つのＴＲＥＭ様タンパク質（ＴＬＴ−１及びＴＬＴ−２）をコードする。ＴＲＥＭ２遺伝子は、細胞外ドメイン、膜貫通領域、及び短い細胞質尾部からなる２３０アミノ酸タンパク質をコードする（Ｐａｒａｄｏｗｓｋａ−Ｇｏｒｙｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７４：７３０−７３７，２０１３）。細胞外ドメインは、３つの潜在的なＮ−グリコシル化部位を有する単一のＶ型Ｉｇスーパーファミリードメインを含む。野生型ヒトＴＲＥＭ２アミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６１８３８．１）を、配列番号１として以下に示す。
【化１】
2020517249.tif 000003
【００２８】
野生型ヒトＴＲＥＭ２タンパク質（配列番号１）のアミノ酸１〜１８はシグナルペプチドであり、これは一般に成熟タンパク質から除去される。成熟ヒトＴＲＥＭ２タンパク質は、配列番号１のアミノ酸１９〜１７４の細胞外ドメイン、配列番号１のアミノ酸１７５〜１９５の膜貫通ドメイン、配列番号１のアミノ酸１９６〜２３０の細胞質ドメインを含む。ヒトＴＲＥＭ２の細胞外ドメイン（シグナルペプチドを含む）のアミノ酸配列を、配列番号２として以下に示す。
【化２】
2020517249.tif 000004
【００２９】
用語「骨髄細胞に発現するヒトトリガー受容体−２」又は「ヒトＴＲＥＭ２」は、配列番号１のポリペプチド、配列番号２のポリペプチド、配列番号１若しくは配列番号２からシグナルペプチド（アミノ酸１〜１８）を除いたポリペプチド、ヒトＴＲＥＭ２のアレル変異体、又はヒトＴＲＥＭ２のスプライス変異体を指し得る。いくつかの実施形態では、用語「ヒトＴＲＥＭ２」は、変異Ｒ４７Ｈ、Ｑ３３Ｘ（Ｘは終止コドンである）、Ｙ３８Ｃ、Ｔ６６Ｍ、Ｄ８７Ｎ、Ｈ１５７Ｙ、Ｒ９８Ｗ、及びＳ１１６ＣなどのＴＲＥＭ２の天然に存在する変異体を含む。
【００３０】
ＴＲＥＭ２の細胞質ドメインはシグナル伝達能力を欠いているので、ＴＲＥＭ２活性化シグナルを伝達する他のタンパク質と相互作用しなければならない。そのようなタンパク質の１つは、１２ｋＤａのＤＮＡＸ活性化タンパク質（ＤＡＰ１２）である。ＤＡＰ１２はキラー細胞活性化受容体関連タンパク質（ＫＡＲＡＰ）及びチロシンキナーゼ結合タンパク質（ＴＹＲＯＢＰ）としても知られている。ＤＡＰ１２は、その細胞質ドメインにＩＴＡＭモチーフを含むＩ型膜貫通アダプタータンパク質である。ＩＴＡＭモチーフは、ＺＡＰ７０及びＳｙｋチロシンキナーゼの活性化によってシグナル伝播を媒介し、次に、ＰＩ３Ｋ、ＰＫＣ、ＥＲＫ、及び細胞内カルシウムの上昇を含むいくつかの下流シグナル伝達カスケードを活性化する（Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３：４４５−４５３，２００３；Ｕｌｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．７：４２０−４２７，２０１６）。ＤＡＰ１２及びＴＲＥＭ２は、それらの膜貫通ドメインを介して会合し、ＴＲＥＭ２の膜貫通ドメイン内の荷電リジン残基がＤＡＰ１２の膜貫通ドメイン内の荷電アスパラギン酸残基と相互作用する。
【００３１】
ヒトＤＡＰ１２は、染色体１９ｑ１３．１上に位置するＴＹＲＯＢＰ遺伝子によってコードされる。このヒトタンパク質は１１３アミノ酸長であり、リーダー配列（配列番号３のアミノ酸１〜２７）、短い細胞外ドメイン（配列番号３のアミノ酸２８〜４１）、膜貫通ドメイン（配列番号３のアミノ酸４２〜６５）、及び細胞質ドメイン（配列番号３のアミノ酸６６〜１１３の）を含む（Ｐａｒａｄｏｗｓｋａ−Ｇｏｒｙｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７４：７３０−７３７，２０１３）。ＤＡＰ１２は、短い細胞外ドメイン中の２つのシステイン残基を介してホモダイマーを形成する。野生型ヒトＤＡＰ１２アミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００３３２３．１）を、配列番号３として以下に示す。
【化３】
2020517249.tif 000005
【００３２】
用語「ヒトＤＡＰ１２」は、配列番号３のポリペプチド、配列番号３からリーダーペプチド（アミノ酸１〜２７）を除いたポリペプチド、ヒトＤＡＰ１２のアレル変異体、又はヒトＤＡＰ１２のスプライス変異体を指し得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、本発明は、ヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する単離された抗原結合タンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、用語「抗原結合タンパク質」は、１つ以上の標的抗原に特異的に結合するタンパク質を指す。抗原結合タンパク質は、一般に、抗原に特異的に結合する抗原結合断片を含み、且つ任意選択的に、抗原結合断片が、抗原結合タンパク質の抗原への結合を促進するコンフォメーションをとることを可能にする骨格又はフレームワーク部分を含むタンパク質である。本明細書において「結合断片」又は「断片」と互換的に使用される「抗原結合断片」は、完全長の重鎖及び／又は軽鎖に存在するアミノ酸の少なくともいくつかを欠くが、それでもなお抗原に特異的に結合することができる抗体の一部である。抗原結合断片には、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、ナノボディ（例えば、ラクダ重鎖抗体のＶＨドメイン；ＶＨＨ断片、Ｃｏｒｔｅｚ−Ｒｅｔａｍｏｚｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ．６４：２８５３−５７，２００４を参照）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、及び相補性決定領域（ＣＤＲ）断片が含まれるが、これらに限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、又はラクダなどの任意の哺乳動物供給源に由来し得る。抗原結合断片は、標的抗原との結合で完全な抗体と競合し得、そして断片は完全な抗体の改変（例えば、酵素的又は化学的切断）によって生成されるか、又は組換えＤＮＡ技術若しくはペプチド合成を使用して新たに合成され得る。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体由来の少なくとも１つのＣＤＲ、例えば、抗原に結合する抗体由来の重鎖ＣＤＲ３を含む。他の実施形態では、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体の重鎖由来の３つのＣＤＲの全て、又は抗原に結合する抗体の軽鎖由来の３つのＣＤＲの全てを含む。さらに他の実施形態では、抗原結合断片は、抗原に結合する抗体由来の６つのＣＤＲの全て（重鎖由来の３つ、及び軽鎖由来の３つ）を含む。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は抗体又はその結合断片である。
【００３４】
抗原結合タンパク質はまた、単一のポリペプチド鎖又は複数のポリペプチド鎖に組み込まれた１つ以上の抗原結合断片を含むタンパク質を含み得る。例えば、抗原結合タンパク質は、二重特異性抗体（例えば、欧州特許第４０４，０９７号明細書、国際公開第９３／１１１６１号パンフレット、及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９０：６４４４−６４４８，１９９３を参照）；細胞内抗体；ドメイン抗体（単一ＶＬ若しくはＶＨドメイン、又はペプチドリンカーによって結合した２つ以上のＶＨドメイン；Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．３４１：５４４−５４６，１９８９を参照）；マキシボディ（Ｆｃ領域に融合した２つのｓｃＦｖ、Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．１７：９５−１０６，２００４、及びＰｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌ．２５１：１２３−１３５，２００１を参照）；三重特異性抗体；四重特異性抗体；ミニボディ（ＣＨ３ドメインに融合したｓｃＦｖ；Ｏｌａｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．，Ｖｏｌ．１７：３１５−２３，２００４を参照）；ペプチボディ（Ｆｃ領域に接続した１つ以上のペプチド、国際公開第００／２４７８２号パンフレット）；線状抗体（相補的軽鎖ポリペプチドと一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）、Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，Ｖｏｌ．８：１０５７−１０６２，１９９５を参照）；小モジュラー免疫薬（米国特許公開第２００３０１３３９３９号明細書を参照）；並びに免疫グロブリン融合タンパク質（例えば、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ、ＩｇＧ−Ｆａｂ、２ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、４ｓｃＦｖ−ＩｇＧ、ＶＨ−ＩｇＧ、ＩｇＧ−ＶＨ、及びＦａｂ−ｓｃＦｖ−Ｆｃ；例えば、Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．６７（２  Ｐｔ  Ａ）：９５−１０６，２０１５を参照）を含み得るが、これらに限定されない。
【００３５】
用語「単離された分子」（分子が、例えば、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、抗原結合タンパク質、又は抗体である場合）は、その起源又は誘導源のために、（１）その天然状態ではそれに付随する天然に会合した成分と会合していない、（２）同じ種由来の他の分子を実質的に含まない、（３）異なる種からの細胞によって発現する、又は（４）天然に存在しない分子である。したがって、化学的に合成されるか、又はそれが天然に由来する細胞とは異なる細胞系において発現する分子は、その天然に会合する成分から「単離されて」いる。分子はまた、当該技術分野でよく知られた精製技術を使用して、単離によって、天然に会合した成分を実質的に含まないようにされ得る。分子の純度又は均質性は、当該技術分野でよく知られた多くの手段によってアッセイすることができる。例えば、ポリペプチド試料の純度は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、及び、当該技術分野でよく知られた技術を使用してポリペプチドを可視化するゲルの染色を使用してアッセイすることができる。特定の目的のためには、ＨＰＬＣ又は当該技術分野でよく知られた他の精製手段を使用することによって、より高い分解能が提供され得る。
【００３６】
本発明の特定の実施形態では、抗原結合タンパク質はヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する。抗原結合タンパク質は、標的抗原に対し、類似の結合アッセイ条件下で、他の無関係なタンパク質に対するその親和性と比較して、有意に高い結合親和性を有し、その結果、その抗原を区別することができる場合、標的抗原に「特異的に結合する」。抗原に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、平衡解離定数（ＫＤ）≦１×１０−６Ｍを有し得る。抗原結合タンパク質は、ＫＤが≦１×１０−８Ｍである場合に、「高親和性」で抗原に特異的に結合する。一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、≦５×１０−７ＭのＫＤでヒトＴＲＥＭ２に結合する。別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、≦１×１０−７ＭのＫＤでヒトＴＲＥＭ２に結合する。さらに別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、≦５×１０−８ＭのＫＤでヒトＴＲＥＭ２に結合する。別の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、≦１×１０−８ＭのＫＤでヒトＴＲＥＭ２に結合する。特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、≦５×１０−９ＭのＫＤでヒトＴＲＥＭ２に結合する。他の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、≦１×１０−９ＭのＫＤでヒトＴＲＥＭ２に結合する。特定の一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、≦５×１０−１０ＭのＫＤでヒトＴＲＥＭ２に結合する。別の特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、≦１×１０−１０ＭのＫＤでヒトＴＲＥＭ２に結合する。
【００３７】
親和性は、種々の手法を用いて決定され、その一例は親和性ＥＬＩＳＡアッセイである。様々な実施形態で、親和性は表面プラズモン共鳴アッセイ（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）ベースのアッセイ）によって決定される。この方法論を用いて、会合速度定数（ｋａ単位：Ｍ−１ｓ−１）及び解離速度定数（ｋｄ単位：ｓ−１）を測定することができる。次いで、平衡解離定数（ＫＤ単位：Ｍ）を、速度定数の比（ｋｄ／ｋａ）から計算することができる。いくつかの実施形態では、親和性は、Ｒａｔｈａｎａｓｗａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．３７３：５２−６０，２００８に記載されているような結合平衡除外法（ＫｉｎＥｘＡ）などの速度論的方法によって決定される。ＫｉｎＥｘＡアッセイを用いて、平衡解離定数（ｋＤ単位：Ｍ）及び会合速度定数（ｋａ単位：Ｍ−１ｓ−１）を測定することができる。解離速度定数（Ｋｄ単位：ｓ−１）は、これらの値（ＫＤ×ｋａ）から計算することができる。他の実施形態では、親和性は、Ｋｕｍａｒａｓｗａｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．１２７８：１６５−８２，２０１５に記載され、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システム（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）で使用されているようなバイオレイヤー干渉法によって決定される。速度定数（ｋａ及びｋｄ）及び親和性定数（ＫＤ）は、バイオレイヤー干渉法を用いて実時間で計算することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質は、約１０−２、１０−３、１０−４、１０−５、１０−６ｓ−１若しくはそれ以下のヒトＴＲＥＭ２に対するｋｄ（解離速度定数）によって測定される結合親和力（値が小さいほどより大きい結合親和力を示す）、及び／又は約１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１Ｍ若しくはそれ以下のヒトＴＲＥＭ２に対するＫＤ（平衡解離定数）によって測定される結合親和性（値が小さいほどより高い結合親和性を示す）などの望ましい特性を示す。
【００３８】
特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でのバイオレイヤー干渉法による測定で、約１ｐＭ〜約１００ｎＭのＫＤでヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する。例えば、いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でのバイオレイヤー干渉法による測定で、１００ｎＭ未満のＫＤでヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する。他の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でのバイオレイヤー干渉法による測定で、５０ｎＭ未満のＫＤでヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する。さらに他の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でのバイオレイヤー干渉法による測定で、２５ｎＭ未満のＫＤでヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する。特定の一実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でのバイオレイヤー干渉法による測定で、１０ｎＭ未満のＫＤでヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でのバイオレイヤー干渉法による測定で、５ｎＭ未満のＫＤでヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する。別の特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、２５℃でのバイオレイヤー干渉法による測定で、１ｎＭ未満のＫＤでヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する。
【００３９】
本発明の抗原結合タンパク質は、いくつかの実施形態では、ヒトＴＲＥＭ２の特定の領域又はエピトープに結合し得る。本明細書で使用される場合、「エピトープ」は抗体又はその断片などの抗原結合タンパク質によって特異的に結合され得る任意の決定基を指す。エピトープは、その抗原を標的とする抗原結合タンパク質によって結合されるか、又はそれと相互作用する抗原の領域であり、抗原がタンパク質である場合、抗原結合タンパク質と直接接触するか、又はそれと相互作用する特定のアミノ酸を含む。エピトープは、タンパク質の三次フォールディングによって並置された連続アミノ酸又は非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「線状エピトープ」は、アミノ酸一次配列が認識されるエピトープを含むエピトープである。線状エピトープは、一般的には、少なくとも３又は４個のアミノ酸を含み、より一般的には、少なくとも５個、少なくとも６個、又は少なくとも７個のアミノ酸、例えば、特有の配列の約８〜約１０個のアミノ酸を含む。「立体構造エピトープ」は線状エピトープとは対照的に、不連続なアミノ酸の群（例えば、ポリペプチドにおいて、ポリペプチドの一次配列は連続していないが、ポリペプチドの三次及び四次構造の観点では、抗原結合タンパク質によって結合されるのに十分に互いに近いアミノ酸残基）である。エピトープ決定基は、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル基又はスルホニル基などの分子の化学的に活性な表面グループを含む得、且つ特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有し得る。一般に、特定の標的分子に特異的な抗原結合タンパク質は、タンパク質及び／又は巨大分子の複合混合物中の標的分子上のエピトープを優先的に認識する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質はヒトＴＲＥＭ２の細胞外ドメイン（配列番号２）内のエピトープでヒトＴＲＥＭ２に結合する。関連する実施形態では、抗原結合タンパク質は配列番号１のアミノ酸１９〜１７４内のエピトープでヒトＴＲＥＭ２に結合する特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は配列番号１のアミノ酸２３〜１２８内のエピトープでヒトＴＲＥＭ２に結合する。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はヒトＴＲＥＭ１には特異的に結合しない。ＴＲＥＭ２と同様に、ＴＲＥＭ１は、骨髄細胞に発現し、ＤＡＰ１２を介してシグナル伝達する膜貫通糖タンパク質である。ＴＲＥＭ１シグナル伝達の活性化は、炎症誘発性サイトカインの産生、好中球の脱顆粒、及び食作用などの炎症効果をもたらす（Ａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．９３：２０９−２１５，２０１３）。上記のように、ＴＲＥＭ１は、染色体６ｐ２１．１のＴＲＥＭ２遺伝子と共にＴＲＥＭ遺伝子クラスターに位置するＴＲＥＭ１遺伝子によってコードされる。野生型ヒトＴＲＥＭ１アミノ酸配列（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６１１１３．１）を、配列番号４として以下に示す。
【化４】
2020517249.tif 000006
【００４１】
用語「ヒトＴＲＥＭ１」は、配列番号４のポリペプチド、配列番号４からシグナルペプチド（アミノ酸１〜２０）を除いたポリペプチド、ヒトＴＲＥＭ１のアレル変異体、又はヒトＴＲＥＭ１のスプライス変異体を指し得る。本発明の抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ１に対する結合親和性が、無関係なヒト抗原タンパク質に対する結合親和性と同等又はそれより低い場合、ヒトＴＲＥＭ１に「特異的に結合しない」。ヒトＴＲＥＭ１に特異的に結合しない抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の親和性測定方法のいずれかによる測定で、ヒトＴＲＥＭ１に対し、≧１×１０−５Ｍ、≧１×１０−４Ｍ、又は≧１×１０−３ＭのＫＤを有し得る。本発明の抗原結合タンパク質は、当該技術分野で知られる任意の方法、例えば、実施例２に記載のＦＡＣＳ結合方法による測定で、アイソタイプ対照抗体のヒトＴＲＥＭ１への結合と比較して、ヒトＴＲＥＭ１に対する結合が同等又はより低い場合、ヒトＴＲＥＭ１に特異的に結合しないと見なし得る。
【００４２】
特定の実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質はアゴニスト抗原結合タンパク質である。「アゴニスト抗原結合タンパク質」又は「活性化抗原結合タンパク質」は、１つ以上のＴＲＥＭ２媒介機能又は活性に結合し、それを誘導又は増大させる抗原結合タンパク質（例えば、抗体）である。ＴＲＥＭ２媒介機能又は活性には、ＤＡＰ１２リン酸化（例えば、ＤＡＰ１２細胞質ドメイン内のＩＴＡＭモチーフ内のチロシンリン酸化）；Ｓｙｋリン酸化；Ｓｒｃリン酸化／活性化；細胞外調節キナーゼ（ＥＲＫ１／２）の活性化／リン酸化；活性化ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）の膜への転位；タンパク質キナーゼＢ（ＰＫＢ、Ａｋｔとしても知られる）の活性化；ＮＦ−κＢ及びＮＦ−κＢ媒介転写の活性化；活性化Ｔ細胞核因子（ＮＦＡＴ）媒介転写の核因子の活性化；プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化；細胞内イノシトール（１，４，５）−三リン酸（ＩＰ３）の上昇；マクロファージ、ミクログリア及び樹状細胞などの骨髄細胞の生存又は増殖の増加；マクロファージ、ミクログリア及び樹状細胞などのなどの骨髄細胞のアポトーシスの減少；マクロファージにおけるＣＣＬ２タンパク質発現の増加；炎症性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、及びＩＦＮ−γ）の骨髄細胞（例えば、マクロファージ）からの産生の減少、並びに壊死細胞及び／又はアポトーシス細胞（例えば、ニューロン細胞）、細胞残屑、及びミスフォールドされたペプチドのマクロファージ及びミクログリアによる食作用の増加が含まれるが、これに限定されない。
【００４３】
本発明のアゴニストＴＲＥＭ２抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質の凝集、クラスター化、及び／又はＦｃ媒介架橋がない場合に、ＴＲＥＭ２媒介機能を誘導又は活性化することができる。したがって、インビトロでは、抗原結合タンパク質のアゴニスト活性を、可溶性（すなわち、固体支持体に結合していない）で単量体の二価形態の抗原結合タンパク質又は抗体を用いて検出することができる。インビボでは、本発明の抗原結合タンパク質のアゴニスト活性は、抗原結合タンパク質をクラスター化又は凝集させるために隣接細胞の受容体（例えば、Ｆｃ受容体）に抗原結合タンパク質が結合していない場合に生じ得る。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質のアゴニスト活性は、抗原結合タンパク質がＦｃ受容体に結合するか又はＦｃ受容体と相互作用する能力とは無関係である。抗原結合タンパク質がＦｃ領域を含む実施形態（例えば、抗体）では、抗原結合タンパク質は、ＦｃγＲＩＩＢ受容体などのＦｃγ受容体と結合又は相互作用することなく、ＴＲＥＭ２アゴニスト活性を保持する。本発明のアゴニスト抗原結合タンパク質の架橋非依存性は、抗原結合タンパク質のアゴニスト活性がＦｃγ受容体の発現又は作用の治療部位における接近のしやすさによって変化しないため、抗原結合タンパク質の治療的使用に有利である。
【００４４】
抗原結合タンパク質の架橋、凝集、及び／又はクラスター化に対するＴＲＥＭ２アゴニスト活性の依存性は、架橋剤の非存在下で本明細書に記載のＴＲＥＭ２媒介機能のいずれかの活性化又は誘導を測定することによって評価することができる。架橋剤は、抗原結合部位以外の部位で抗原結合タンパク質と相互作用して２つ以上の抗原結合タンパク質をクラスター化する任意の薬剤であり得る。抗原結合タンパク質がＦｃ領域を含む実施形態（例えば、抗体）では、架橋剤は、プロテインＡ、プロテインＧ、抗Ｆｃ抗体、又はＦｃγ受容体などのＦｃ領域に結合するか、又はＦｃ領域と相互作用するタンパク質であり得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、抗原結合タンパク質の非存在下でのｐＳｙｋレベルと比較して、又は対照の存在下でのｐＳｙｋレベルと比較して、ＴＲＥＭ２タンパク質（例えば、ヒトＴＲＥＭ２タンパク質）を発現する細胞中のリン酸化Ｓｙｋ（ｐＳｙｋ）のレベルを増加させる。細胞は、単球、マクロファージ、ミクログリア細胞、樹状細胞、破骨細胞、好中球、好塩基球、好酸球、巨核球、及び血小板を含むがこれらに限定されない骨髄系列の細胞であり得る。特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、約１００ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約４０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約５ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約５００ｐＭ未満、約３００ｐＭ未満、又は約１００ｐＭ未満のＥＣ５０でｐＳｙｋレベルを増加させる。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、約１ｐｍ〜約１００ｎＭ、約１０ｐＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｐＭ〜約５ｎＭ、約１００ｐＭ〜約１ｎＭ、又は約１５０ｐＭ〜約５００ｐＭのＥＣ５０でｐＳｙｋレベルを増加させる。「ＥＣ５０」又は「半数効果濃度」は、抗原結合タンパク質の効力の尺度であり、特定の曝露期間後にベースラインと最大応答との間の中間の応答を誘導するために必要とされる抗原結合タンパク質の濃度を指す。任意の特定のアゴニストのＥＣ５０は、用量反応曲線を構築し、特定の機能アッセイにおける活性（例えば、ｐＳｙｋレベル）を誘導する際の異なる濃度のアゴニストの効果を試験することによって決定することができる。ＥＣ５０は、最大効果の５０％が観察されるアゴニストの濃度である。本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質によって誘導される細胞内ｐＳｙｋレベルの増加は、例えば、実施例２及び６に記載される細胞ベースのアッセイなどの種々の方法によって評価することができる。例えば、ＴＲＥＭ２を発現する細胞（例えば、ヒトＴＲＥＭ２）を１つ以上の濃度のアゴニスト抗原結合タンパク質と接触させ、細胞を溶解し、細胞溶解物中のｐＳｙｋレベルを、例えば、ウェスタンブロット、ＦＲＥＴベースのアッセイ又は化学発光法（例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡベースのアッセイ）によって評価する。細胞ベースのアッセイにおける細胞は、ＴＲＥＭ２（例えば、ヒトＴＲＥＭ２）を組換えで発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞又はＣＨＯ細胞などの細胞であり得る。或いは、細胞ベースのアッセイにおける細胞は、ＴＨＰ−１細胞、マクロファージ、ミクログリア細胞、又は樹状細胞などのＴＲＥＭ２（例えば、ヒトＴＲＥＭ２）を天然に発現する細胞である。
【００４６】
特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２を発現する細胞（例えば、ヒトＴＲＥＭ２）におけるｐＳｙｋレベルを誘導又は増加させるＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の効力は、架橋剤の非存在下で保持される。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、架橋剤の非存在下、細胞ベースのｐＳｙｋアッセイによる測定で、約１ｐＭ〜約１００ｎＭ、約１０ｐＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｐＭ〜約５ｎＭ、約１００ｐＭ〜約１ｎＭ、又は約１５０ｐＭ〜約５００ｐＭのＥＣ５０でｐＳｙｋレベルを増加させる。一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、架橋剤の非存在下、細胞ベースのｐＳｙｋアッセイによる測定で、５ｎＭ未満のＥＣ５０でｐＳｙｋレベルを増加させる。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、架橋剤の非存在下、細胞ベースのｐＳｙｋアッセイによる測定で、１ｎＭ未満のＥＣ５０でｐＳｙｋレベルを増加させる。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、架橋剤の非存在下、細胞ベースのｐＳｙｋアッセイによる測定で、５００ｐＭ未満のＥＣ５０でｐＳｙｋレベルを増加させる。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、架橋剤の非存在下、細胞ベースのｐＳｙｋアッセイによる測定で、３００ｐＭ未満のＥＣ５０でｐＳｙｋレベルを増加させる。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、架橋剤の非存在下、細胞ベースのｐＳｙｋアッセイによる測定で、１００ｐＭ未満のＥＣ５０でｐＳｙｋレベルを増加させる。
【００４７】
本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、本明細書に記載されるように、ヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する抗体の軽鎖及び重鎖可変領域由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み得る。用語「ＣＤＲ」は、抗体可変配列内の相補性決定領域（「最小認識単位」又は「超可変領域」とも呼ばれる）を指す。３つの重鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２及びＣＤＲＨ３）及び３つの軽鎖可変領域ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２及びＣＤＲＬ３）が存在する。本明細書で使用される用語「ＣＤＲ領域」は、単一の可変領域に存在する３つのＣＤＲ（すなわち、３つの軽鎖ＣＤＲ又は３つの重鎖ＣＤＲ）の群を指す。２つの鎖の各々におけるＣＤＲは、通常、フレームワーク領域（ＦＲ）によって整列され、標的タンパク質（例えば、ヒトＴＲＥＭ２）上の特定のエピトープ又はドメインと特異的に結合する構造を形成する。Ｎ末端からＣ末端まで、天然に存在する軽鎖及び重鎖可変領域は両方とも、通常、これらの要素が以下の順序に従う：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３及びＦＲ４。これらのドメインの各々に位置を占めるアミノ酸に番号を割り当てるための番号付けシステムが考案されている。この番号付けシステムは、Ｋａｂａｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（１９８７及び１９９１，ＮＩＨ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）又はＣｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７８−８８３に定義されている。所与の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）及びフレームワーク領域（ＦＲ）は、このシステムを使用して同定され得る。免疫グロブリン鎖におけるアミノ酸のための他の番号付けシステムには、ＩＭＧＴ（登録商標）（ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ；Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９：１８５−２０３；２００５）及びＡＨｏ（Ｈｏｎｅｇｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９（３）：６５７−６７０；２００１）が含まれる。１つ以上のＣＤＲを、共有結合的又は非共有結合的に分子に組み込み、それを抗原結合タンパク質にすることができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質は、より大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲを組み込み、そのＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合により結合させる、又はそのＣＤＲを非共有結合により組み込むことができる。抗原結合タンパク質においては、本明細書に記載のＣＤＲの少なくとも１つが、生体適合性フレームワーク構造に組み込まれて含まれていてもよい。一例では、生体適合性フレームワーク構造は、局在化表面領域において抗原に結合するアミノ酸の１つ以上の配列（例えば、ＣＤＲ、可変領域など）を提示することができる、構造的に安定した構造支持体、又はフレームワーク、又は足場を形成するのに十分なポリペプチド又はその一部を含む。このような構造は、天然に存在するポリペプチド又はポリペプチド「フォールド」（構造モチーフ）であるか、或いは天然に存在するポリペプチド又はフォールドと比較して、アミノ酸の付加、欠失又は置換などの１つ以上の改変を有し得る。これらの足場は、ヒト、他の哺乳動物、他の脊椎動物、無脊椎動物、植物、細菌又はウイルスなどの任意の種（又は２つ以上の種）のポリペプチドに由来し得る。
【００４９】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体の、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む少なくとも１つの軽鎖可変領域、並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む少なくとも１つの重鎖可変領域を含む。例示的なヒト抗ＴＲＥＭ２抗体の軽鎖及び重鎖可変領域並びに関連するＣＤＲを、以下の表１Ａ及び１Ｂにそれぞれ記載する。
【００５０】
【表１Ａ−１】
2020517249.tif 000007
【００５１】
【表１Ａ−２】
2020517249.tif 000008
【００５２】
【表１Ａ−３】
2020517249.tif 000009
【００５３】
【表１Ｂ−１】
2020517249.tif 000010
【００５４】
【表１Ｂ−２】
2020517249.tif 000011
【００５５】
【表１Ｂ−３】
2020517249.tif 000012
【００５６】
【表１Ｂ−４】
2020517249.tif 000013
【００５７】
【表１Ｂ−５】
2020517249.tif 000014
【００５８】
本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表１Ａ（軽鎖ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲＬ）及び表１Ｂ（重鎖ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲＨ）に示すＣＤＲの１つ以上を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号５〜１８から選択されるＣＤＲＬ１、（ｉｉ）配列番号１９〜３０から選択されるＣＤＲＬ２、及び（ｉｉｉ）配列番号３１〜４５から選択されるＣＤＲＬ３、並びに（ｉｖ）１つ以上、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、５つ、４つ、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の欠失又は挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＬから選択される１つ以上の軽鎖ＣＤＲを含む。これらの実施形態及び他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号７７〜８６から選択されるＣＤＲＨ１、（ｉｉ）配列番号８７〜９４から選択されるＣＤＲＨ２、及び（ｉｉｉ）配列番号９５〜１０９から選択されるＣＤＲＨ３、並びに（ｉｖ）１つ以上、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ又はそれ以上のアミノ酸置換（例えば、保存的アミノ酸置換）、５つ、４つ、３つ、２つ又は１つ以下のアミノ酸の欠失又は挿入を含む（ｉ）、（ｉｉ）及び（ｉｉｉ）のＣＤＲＨから選択される１つ以上の重鎖ＣＤＲを含む。
【００５９】
特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表１Ａ及び１Ｂに列挙したＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの変異体形態（それぞれ、表１Ａ及び１Ｂに列挙したＣＤＲ配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、又は９５％の配列同一性を有する）を含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表１Ａ及び１Ｂに列挙したＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つ（それぞれ、これらの表に列挙したＣＤＲと１、２、３、４、又は５個以下のアミノ酸が異なる）を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号５〜１８から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＣＤＲＬ１；配列番号１９〜３０から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＣＤＲＬ２；配列番号３１〜４５から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＣＤＲＬ３；配列番号７７〜８６から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＣＤＲＨ１；配列番号８７〜９４から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＣＤＲＨ２；及び配列番号９５〜１０９から選択される配列、又は１、２、３若しくは４個のアミノ酸置換を有するその変異体を含むＣＤＲＨ３を含む。他の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号５〜１８から選択される配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号１９〜３０から選択される配列を含むＣＤＲＬ２、配列番号３１〜４５から選択される配列を含むＣＤＲＬ３、配列番号７７〜８６から選択される配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号８７〜９４から選択される配列を含むＣＤＲＨ２、及び配列番号９５〜１０９から選択される配列を含むＣＤＲＨ３を含む。
【００６０】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ここで（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５、１９、及び３１の配列を有する；（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号６、２０、及び３２の配列を有する；（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号６、２１、及び３３の配列を有する；（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号６、２０、及び３３の配列を有する；（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号７、２２、及び３４の配列を有する；（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号８、２２、及び３５の配列を有する；（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号９、２２、及び３６の配列を有する；（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１０、２３、及び３７の配列を有する；（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１１、２３、及び３８の配列を有する；（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１２、２４、及び３９の配列を有する；（ｋ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１３、２５、及び４０の配列を有する；（ｌ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１４、２６、及び４１の配列を有する；（ｍ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１５、２７、及び４２の配列を有する；（ｎ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２８、及び４３の配列を有する；（ｏ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１７、２９、及び４４の配列を有する；又は（ｐ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１８、３０、及び４５の配列を有する。
【００６１】
他の特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ここで（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７７、８７、及び９５の配列を有する；（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７８、８８、及び９６の配列を有する；（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７８、８８、及び９７の配列を有する；（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７８、８９、及び９６の配列を有する；（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７７、９０、及び９８の配列を有する；（ｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７９、９０、及び９９の配列を有する；（ｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８０、９１、及び１００の配列を有する；（ｈ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８１、９１、及び１０１の配列を有する；（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８２、９２、及び１０２の配列を有する；（ｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８１、９１、及び１０３の配列を有する；（ｋ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８１、９１、及び１０４の配列を有する；（ｌ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８３、９３、及び１０５の配列を有する；（ｍ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８４、９１、及び１０６の配列を有する；（ｎ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１０７の配列を有する；（ｏ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８６、９４、及び１０８の配列を有する；又は（ｐ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１０９の配列を有する。
【００６２】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ここで、
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号５、１９、及び３１の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７７、８７、及び９５の配列を有する；
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号６、２０、及び３２の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７８、８８、及び９６の配列を有する；
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号６、２１、及び３３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７８、８８、及び９７の配列を有する；
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号６、２０、及び３３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７８、８８、及び９７の配列を有する；
（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号６、２０、及び３３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７８、８９、及び９６の配列を有する；
（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号７、２２、及び３４の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７７、８７、及び９５の配列を有する；
（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号８、２２、及び３５の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７７、９０、及び９８の配列を有する；
（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号９、２２、及び３６の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７９、９０、及び９９の配列を有する；
（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１０、２３、及び３７の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８０、９１、及び１００の配列を有する；
（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１０、２３、及び３７の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８１、９１、及び１０１の配列を有する；
（ｋ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１１、２３、及び３８の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８２、９２、及び１０２の配列を有する；
（ｌ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１２、２４、及び３９の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８１、９１、及び１０３の配列を有する；
（ｍ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１３、２５、及び４０の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８１、９１、及び１０４の配列を有する；
（ｎ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１４、２６、及び４１の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８３、９３、及び１０５の配列を有する；
（ｏ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１５、２７、及び４２の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８４、９１、及び１０６の配列を有する；
（ｐ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２８、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１０７の配列を有する；
（ｑ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１７、２９、及び４４の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８６、９４、及び１０８の配列を有する；又は
（ｒ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１８、３０、及び４５の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１０９の配列を有する。
【００６３】
一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１０、２３、及び３７の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８０、９１、及び１００の配列を有する。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１０、２３、及び３７の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８１、９１、及び１０１の配列を有する。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１５、２７、及び４２の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８４、９１、及び１０６の配列を有する。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２８、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１０７の配列を有する。特定の一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１７、２９、及び４４の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８６、９４、及び１０８の配列を有する。別の特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域と、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域とを含み、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号８、２２、及び３５の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号７７、９０、及び９８の配列を有する。
【００６４】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する抗体、例えば本明細書中に記載される抗体由来の、免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）及び免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。本明細書において「可変ドメイン」（軽鎖の可変領域（ＶＬ）、重鎖の可変領域（ＶＨ））と互換的に使用される「可変領域」は、抗体の抗原への結合に直接関与する、軽免疫グロブリン鎖及び重免疫グロブリン鎖のそれぞれにおける領域を指す。上記のように、可変軽鎖及び可変重鎖の領域は同じ一般構造を有し、各領域は４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、それらの配列は広く保存され、３つのＣＤＲによって連結されている。フレームワーク領域はベータシート構造を採用し、ＣＤＲはベータシート構造を接続するループを形成し得る。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によってそれらの三次元構造に保持され、他方の鎖のＣＤＲと共に抗原結合部位を形成する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表１Ａに示すようなＬＶ−０１、ＬＶ−０２、ＬＶ−０３、ＬＶ−０４、ＬＶ−０５、ＬＶ−０６、ＬＶ−０７、ＬＶ−０８、ＬＶ−０９、ＬＶ−１０、ＬＶ−１１、ＬＶ−１２、ＬＶ−１３、ＬＶ−１４、ＬＶ−１５、ＬＶ−１６、ＬＶ−１７、及びＬＶ−１８から選択される軽鎖可変領域、並びに／又は表１Ｂに示すようなＨＶ−０１、ＨＶ−０２、ＨＶ−０３、ＨＶ−０４、ＨＶ−０５、ＨＶ−０６、ＨＶ−０７、ＨＶ−０８、ＨＶ−０９、ＨＶ−１０、ＨＶ−１１、ＨＶ−１２、ＨＶ−１３、ＨＶ−１４、ＨＶ−１５、ＨＶ−１６、及びＨＶ−１７から選択される重鎖可変領域と、これらの軽鎖及び重鎖可変領域の機能的断片、誘導体、変異タンパク質及び変異体とを含み得る。
【００６６】
表１Ａに列挙した軽鎖可変領域の各々は、表１Ｂに列挙した重鎖可変領域のいずれかと組み合わされて、本発明の抗原結合タンパク質の抗ＴＲＥＭ２結合ドメインを形成し得る。このような組み合わせの例には、ＬＶ−０１（配列番号４６）とＨＶ−０１（配列番号１１０）；ＬＶ−０２（配列番号４７）とＨＶ−０２（配列番号１１１）；ＬＶ−０３（配列番号４８）とＨＶ−０３（配列番号１１２）；ＬＶ−０４（配列番号４９）とＨＶ−０４（配列番号１１３）；ＬＶ−０５（配列番号５０）とＨＶ−０５（配列番号１１４）；ＬＶ−０６（配列番号５１）とＨＶ−０１（配列番号１１０）；ＬＶ−０７（配列番号５２）とＨＶ−０６（配列番号１１５）；ＬＶ−０８（配列番号５３）とＨＶ−０７（配列番号１１６）；ＬＶ−０９（配列番号５４）とＨＶ−０８（配列番号１１７）；ＬＶ−１０（配列番号５５）とＨＶ−０９（配列番号１１８）；ＬＶ−１１（配列番号５６）とＨＶ−１０（配列番号１１９）；ＬＶ−１２（配列番号５７）とＨＶ−１１（配列番号１２０）；ＬＶ−１３（配列番号５８）とＨＶ−１２（配列番号１２１）；ＬＶ−１４（配列番号５９）とＨＶ−１３（配列番号１２２）；ＬＶ−１５（配列番号６０）とＨＶ−１４（配列番号１２３）；ＬＶ−１６（配列番号６１）とＨＶ−１５（配列番号１２４）；ＬＶ−１７（配列番号６２）とＨＶ−１６（配列番号１２５）；及びＬＶ−１８（配列番号６３）とＨＶ−１７（配列番号１２６）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６７】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＬＶ−０９（配列番号５４）の配列を含む軽鎖可変領域、及びＨＶ−０８（配列番号１１７）の配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＬＶ−１０（配列番号５５）の配列を含む軽鎖可変領域、及びＨＶ−０９（配列番号１１８）の配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＬＶ−１５（配列番号６０）の配列を含む軽鎖可変領域、及びＨＶ−１４（配列番号１２３）の配列を含む重鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＬＶ−１６（配列番号６１）の配列を含む軽鎖可変領域、及びＨＶ−１５（配列番号１２４）の配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＬＶ−１７（配列番号６２の配列を含む軽鎖可変領域、及びＨＶ−１６（配列番号１２５）の配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＬＶ−０７（配列番号５２）の配列を含む軽鎖可変領域、及びＨＶ−０６（配列番号１１５）の配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表１Ａの軽鎖可変領域の配列、すなわち、ＬＶ−０１、ＬＶ−０２、ＬＶ−０３、ＬＶ−０４、ＬＶ−０５、ＬＶ−０６、ＬＶ−０７、ＬＶ−０８、ＬＶ−０９、ＬＶ−１０、ＬＶ−１１、ＬＶ−１２、ＬＶ−１３、ＬＶ−１４、ＬＶ−１５、ＬＶ−１６、ＬＶ−１７、又はＬＶ−１８から選択されるＶＬと、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸残基のみで異なる連続するアミノ酸の配列を含む軽鎖可変領域を含み、そのような配列の相違はそれぞれ独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入又は置換であり、欠失、挿入及び／又は置換は前述の可変ドメイン配列に対して１５以下のアミノ酸の変化をもたらす。いくつかのＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質中の軽鎖可変領域は、配列番号４６〜６３のアミノ酸配列（すなわち、表１Ａ中の軽鎖可変領域）に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号４６〜６３から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号４６〜６３から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号４６〜６３から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号５４の配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号５５の配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号６０の配列を含む軽鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号６１の配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号６２の配列を含む軽鎖可変領域を含む。他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００６９】
これらの実施形態及び他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表１Ｂの重鎖可変領域の配列、すなわち、ＨＶ−０１、ＨＶ−０２、ＨＶ−０３、ＨＶ−０４、ＨＶ−０５、ＨＶ−０６、ＨＶ−０７、ＨＶ−０８、ＨＶ−０９、ＨＶ−１０、ＨＶ−１１、ＨＶ−１２、ＨＶ−１３、ＨＶ−１４、ＨＶ−１５、ＨＶ−１６、又はＨＶ−１７から選択されるＶＨと、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５個のアミノ酸残基のみで異なる連続するアミノ酸の配列を含む重鎖可変領域を含み、そのような配列の相違はそれぞれ独立して、１つのアミノ酸の欠失、挿入又は置換であり、欠失、挿入及び／又は置換は前述の可変ドメイン配列に対して１５以下のアミノ酸の変化をもたらす。いくつかのＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質中の重軽鎖可変領域は、配列番号１１０〜１２６のアミノ酸配列（すなわち、表１Ｂ中の重鎖可変領域）に対して少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％又は少なくとも９９％の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号１１０〜１２６から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列を含む重鎖可変領域を含む。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号１１０〜１２６から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列を含む重鎖可変領域を含む。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号１１０〜１２６から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号１１７の配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号１１８の配列を含む重鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号１２３の配列を含む重鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号１２４の配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号１２５の配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号１１５の配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００７０】
用語「同一性」は、本明細書で使用される場合、配列を整列させ、比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド分子又は２つ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。「同一性パーセント」は、本明細書中で使用される場合、比較する分子中のアミノ酸又はヌクレオチド間の同一残基のパーセントを意味し、比較する分子の最小の大きさに基づいて計算される。これらの計算のために、アラインメントにおけるギャップ（もしあれば）を、特定の数学的モデル又はコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって対処しなければならない。整列させた核酸又はポリペプチドの同一性を計算するために使用され得る方法には、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ，ＡＭ．，ｅｄ．），１９８８，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，（Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．），１９９３，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，（Ｇｒｉｆｆｉｎ、Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．），１９９４，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ：Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，１９８７，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．），１９９１，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；及びＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３に記載されるものが含まれる。例えば、配列同一性は、２つのポリペプチドのアミノ酸の位置の類似性を比較するために一般に使用されている標準的な方法によって決定することができる。ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどのコンピュータプログラムを用いて、２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチド配列を、それらのそれぞれの残基が最適に一致するように整列させる（一方又は両方の配列の全長に沿って、又は一方又は両方の配列の所定の部分に沿って）。プログラムは、デフォルトの開始ペナルティ及びデフォルトのギャップペナルティーを提供し、ＰＡＭ  ２５０（Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｖｏｌ．５，ｓｕｐｐ．３，１９７８）又はＢＬＯＳＵＭ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９）などのスコアリングマトリックスをコンピュータプログラムとともに使用することができる。例えば、次に、同一性パーセントを次のように計算することができる：完全一致の総数に１００を掛け、次いで、２つの配列を整列させるために、一致したスパン内のより長い配列の長さと、より長い配列に導入されたギャップの数の合計で割る。同一性パーセントを計算する際には、比較す���配列を、配列間の最大の一致を与えるような方法で整列させる。
【００７１】
ＧＣＧプログラムパッケージは、同一性パーセントを決定するために使用することができるコンピュータプログラムであり、このパッケージはＧＡＰを含む（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）。コンピュータアルゴリズムＧＡＰは、配列同一性パーセントを決定しようとする２つのポリペプチド又は２つのポリヌクレオチドを整列させるために使用される。配列は、それらのそれぞれのアミノ酸又はヌクレオチドが最適に一致するように並べられる（アルゴリズムによって決定される「一致スパン」）。ギャップ開始ペナルティ（３×平均対角として計算される。ここで、「平均対角」は使用される比較マトリックスの対角の平均であり、「対角」は特定の比較マトリックスによってそれぞれの完全アミノ酸一致に割り当てられるスコア又は数である）及びギャップ伸長ペナルティ（通常、ギャップ開始ペナルティの１／１０倍である）、並びにＰＡＭ  ２５０又はＢＬＯＳＵＭ  ６２などの比較マトリックスが、アルゴリズムと共に使用される。特定の実施形態では、標準比較マトリックス（ＰＡＭ  ２５０比較マトリックスについては、Ｄａｙｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５：３４５−３５２を参照；ＢＬＯＳＵＭ  ６２比較マトリックスについては、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，、１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５−１０９１９を参照）もまたアルゴリズムによって使用される。
【００７２】
ＧＡＰプログラムを用いてポリペプチド又はヌクレオチド配列の同一性パーセントを決定するために推奨されるパラメータには、以下が含まれる：
アルゴリズム：Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３；
比較マトリックス：Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２（上記）のＢＬＯＳＵＭ  ６２；
ギャップペナルティー：１２（ただし、エンドギャップに対するペナルティなし）
ギャップ長ペナルティ：４
類似性の閾値：０
【００７３】
２つのアミノ酸配列を整列させるための特定のアラインメントスキームは、２つの配列の短い領域のみの一致をもたらし得、この小さい整列領域は、２つの全長配列の間に有意な関係がないにもかかわらず、非常に高い配列同一性を有し得る。したがって、選択したアラインメント方法（ＧＡＰプログラム）は、所望であれば、標的ポリペプチドの少なくとも５０個の連続するアミノ酸にわたるアラインメントを生じるように調節し得る。
【００７４】
本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２抗体の変異体は、実施例７に記載されるように、化学的不利（例えば、アスパラギン酸塩異性化、アスパラギン脱アミド化、トリプトファン及びメチオニンの酸化）又は正確な共変異違反（covariance  violations）に対処するために、軽鎖又は重鎖可変領域中の１つ以上のアミノ酸を置換することによって生成することができる（国際公開第２０１２／１２５４９５号パンフレット（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照）。このような変異体は、親抗体と比較して、より良好な生物物理学的特性、発現特性、及び／又は安定性を有し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表１３〜１８のいずれかに記載されるアミノ酸置換の１つ以上を有する軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含む。
【００７５】
特定の配列を参照することによって別段の指示がされない限り、本明細書及び特許請求の範囲全体にわたって、免疫グロブリン重鎖又は軽鎖におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈＥｄ．，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２、ｐｐ６６２，６８０，６８９（１９９１）及びＥｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．６３：７８−８５（１９６９）に記載されるようなＫａｂａｔ−ＥＵ番号付けに従う。Ｋａｂａｔ番号付けスキームは、通常、可変領域内のアミノ酸の位置に言及する場合に使用され、一方、ＥＵ番号付けスキームは、免疫グロブリン定常領域を有するアミノ酸の位置に言及する場合に一般に使用される。Ｋａｂａｔ及びＥＵ番号付けスキームと他の番号付けスキームとの対応を要約した図は、ＩＭＧＴ（登録商標）ウェブサイト（ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ）で利用可能である。
【００７６】
アミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、本明細書においては、通常、特定の位置におけるアミノ酸残基が一文字略語で示され、次いで、目的の元の配列に対するアミノ酸位置の数字が続き、次いで、置換されたアミノ酸残基の１文字の略語が続く。例えば、「Ｔ３０Ｄ」は、目的の元の配列に対して、アミノ酸位置３０でのアスパラギン酸塩残基によるトレオニン残基の置換を表す。別の例「Ｓ２１８Ｇ」は、目的の元のアミノ酸配列に対して、アミノ酸位置２１８でのグリシン残基によるセリン残基の置換を表す。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置６４、７９、８０、８５、９４、及び／又は１００に変異を有する配列番号５４の配列を含む軽鎖可変領域を含む。このような変異には、Ｖ６４Ｇ、Ｖ６４Ａ、Ｑ７９Ｅ、Ｑ７９Ｄ、Ｓ８０Ｐ、Ｓ８０Ａ、Ｆ８５Ｖ、Ｆ８５Ｌ、Ｆ８５Ａ、Ｆ８５Ｄ、Ｆ８５Ｉ、Ｆ８５Ｌ、Ｆ８５Ｍ、Ｆ８５Ｔ、Ｗ９４Ｆ、Ｗ９４Ｙ、Ｗ９４Ｓ、Ｗ９４Ｔ、Ｗ９４Ａ、Ｗ９４Ｈ、Ｗ９４Ｉ、Ｗ９４Ｑ、Ｐ１００Ｒ、Ｐ１００Ｑ、Ｐ１００Ｇ、又はこれらの組み合わせが含まれ得る。これらの実施形態及び他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置１９、５５、５６、５７、５８、及び／又は１０４に変異を有する配列番号１１７の配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、変異は、Ｍ１９Ｋ、Ｍ１９Ｒ、Ｍ１９Ｔ、Ｍ１９Ｅ、Ｍ１９Ｎ、Ｍ１９Ｑ、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｄ５５Ｎ、Ｄ５５Ｔ、Ｓ５６Ａ、Ｓ５６Ｑ、Ｓ５６Ｖ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｅ、Ｄ５７Ｑ、Ｔ５８Ａ、Ｔ５８Ｖ、Ｗ１０４Ｆ、Ｗ１０４Ｙ、Ｗ１０４Ｔ、Ｗ１０４Ｓ、Ｗ１０４Ａ、Ｗ１０４Ｈ、Ｗ１０４Ｉ、Ｗ１０４Ｑ、又はこれらの組み合わせから選択される。
【００７８】
他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置６４、７９、８０、９４、及び／又は１００に変異を有する配列番号５５の配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、変異は、Ｖ６４Ｇ、Ｖ６４Ａ、Ｑ７９Ｅ、Ｑ７９Ｄ、Ｓ８０Ｐ、Ｓ８０Ａ、Ｗ９４Ｆ、Ｗ９４Ｙ、Ｗ９４Ｓ、Ｗ９４Ｔ、Ｗ９４Ａ、Ｗ９４Ｈ、Ｗ９４Ｉ、Ｗ９４Ｑ、Ｐ１００Ｒ、Ｐ１００Ｑ、Ｐ１００Ｇ、又はこれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、変異は、Ｖ６４Ｇ、Ｖ６４Ａ、Ｑ７９Ｅ、Ｓ８０Ｐ、Ｓ８０Ａ、Ｗ９４Ｙ、Ｗ９４Ｓ、Ｐ１００Ｒ、Ｐ１００Ｑ、又はこれらの組み合わせから選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、Ｖ６４Ｇ、Ｑ７９Ｅ、Ｓ８０Ｐ、Ｗ９４Ｙ、及びＰ１００Ｑから選択される１つ以上の変異を有する配列番号５５の配列を含む軽鎖可変領域を含む。これらの実施形態及び他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置１９、５５、５６、５７、５８、及び／又は１０４に変異を有する配列番号１１８の配列を含む重鎖可変領域を含む。このような変異には、Ｍ１９Ｋ、Ｍ１９Ｒ、Ｍ１９Ｔ、Ｍ１９Ｅ、Ｍ１９Ｎ、Ｍ１９Ｑ、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｄ５５Ｎ、Ｄ５５Ｔ、Ｓ５６Ａ、Ｓ５６Ｑ、Ｓ５６Ｖ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｅ、Ｄ５７Ｑ、Ｔ５８Ａ、Ｔ５８Ｖ、Ｗ１０４Ｆ、Ｗ１０４Ｙ、Ｗ１０４Ｔ、Ｗ１０４Ｓ、Ｗ１０４Ａ、Ｗ１０４Ｈ、Ｗ１０４Ｉ、Ｗ１０４Ｑ、又はこれらの組み合わせが含まれ得る。特定の実施形態では、変異は、Ｍ１９Ｋ、Ｄ５５Ｅ、Ｓ５６Ａ、Ｄ５７Ｅ、Ｔ５８Ａ、Ｗ１０４Ｙ、Ｗ１０４Ｔ、又はこれらの組み合わせから選択される。
【００７９】
特定の他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置６０、９２、及び／又は９３に変異を有する配列番号６０の配列を含む軽鎖可変領域を含む。変異は、Ｌ６０Ｓ、Ｌ６０Ｐ、Ｌ６０Ｄ、Ｌ６０Ａ、Ｄ９２Ｅ、Ｄ９２Ｑ、Ｄ９２Ｔ、Ｄ９２Ｎ、Ｓ９３Ａ、Ｓ９３Ｎ、Ｓ９３Ｑ、Ｓ９３Ｖ、又はこれらの組合せから選択することができる。これらの実施形態及び他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置２７、５５、５６、５７、５８、１０５、及び／又は１０６に変異を有する配列番号１２３の配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、変異は、Ｈ２７Ｙ、Ｈ２７Ｄ、Ｈ２７Ｆ、Ｈ２７Ｎ、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｄ５５Ｎ、Ｄ５５Ｔ、Ｓ５６Ａ、Ｓ５６Ｑ、Ｓ５６Ｖ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｅ、Ｄ５７Ｑ、Ｔ５８Ａ、Ｔ５８Ｖ、Ｄ１０５Ｅ、Ｄ１０５Ｑ、Ｄ１０５Ｔ、Ｄ１０５Ｎ、Ｄ１０５Ｇ、Ｓ１０６Ａ、Ｓ１０６Ｑ、Ｓ１０６Ｖ、Ｓ１０６Ｔ、又はこれらの組み合わせから選択される。
【００８０】
いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置５６、５７、９２、及び／又は９３に変異を有する配列番号６１の配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、変異は、Ｎ５６Ｓ、Ｎ５６Ｔ、Ｎ５６Ｑ、Ｎ５６Ｅ、Ｇ５７Ａ、Ｇ５７Ｖ、Ｄ９２Ｅ、Ｄ９２Ｑ、Ｄ９２Ｔ、Ｄ９２Ｎ、Ｓ９３Ａ、Ｓ９３Ｎ、Ｓ９３Ｑ、Ｓ９３Ｖ、又はこれらの組合せから選択される。いくつかの実施形態では、変異は、Ｎ５６Ｓ、Ｎ５６Ｑ、Ｇ５７Ａ、Ｄ９２Ｅ、Ｄ９２Ｑ、Ｓ９３Ａ、又はこれらの組み合わせから選択される。特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、Ｎ５６Ｓ、Ｄ９２Ｅ、及びＳ９３Ａから選択される１つ以上の変異を有する配列番号６１の配列を含む軽鎖可変領域を含む。これらの実施形態及び他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置５５、５６、５７、５８、１０５、及び／又は１０６に変異を有する配列番号１２４の配列を含む重鎖可変領域を含む。変異は、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｄ５５Ｎ、Ｄ５５Ｔ、Ｓ５６Ａ、Ｓ５６Ｑ、Ｓ５６Ｖ、Ｄ５７Ｓ、Ｄ５７Ｅ、Ｄ５７Ｑ、Ｔ５８Ａ、Ｔ５８Ｖ、Ｄ１０５Ｅ、Ｄ１０５Ｑ、Ｄ１０５Ｔ、Ｄ１０５Ｎ、Ｄ１０５Ｇ、Ｓ１０６Ａ、Ｓ１０６Ｑ、Ｓ１０６Ｖ、Ｓ１０６Ｔ、又はこれらの組み合わせから選択することができる。特定の実施形態では、変異は、Ｄ５５Ｅ、Ｄ５５Ｑ、Ｓ５６Ａ、Ｄ５７Ｅ、Ｔ５８Ａ、Ｄ１０５Ｅ、Ｄ１０５Ｎ、Ｓ１０６Ａ、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、Ｄ５５Ｅ、Ｓ５６Ａ、Ｄ５７Ｅ、Ｄ１０５Ｅ、及びＳ１０６Ａから選択される１つ以上の変異を有する配列番号１２４の配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００８１】
他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、アミノ酸位置３６、４６、６１、及び／又は１００に変異を有する配列番号６２の配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、変異がＦ３６Ｙ、Ｓ４６Ｌ、Ｓ４６Ｒ、Ｓ４６Ｖ、Ｓ４６Ｆ、Ｋ６１Ｒ、Ｐ１００Ｑ、Ｐ１００Ｇ、Ｐ１００Ｒ又はそれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、変異は、Ｆ３６Ｙ、Ｋ６１Ｒ、Ｐ１００Ｑ、又はこれらの組み合わせである。いくつかの実施形態では、変異は、Ｓ４６Ｌ、Ｐ１００Ｑ、又はこれらの組み合わせである。これらの実施形態及び他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置４３、７６、８５、９９、１００、及び／又は１１６に変異を有する配列番号１２５の配列を含む重鎖可変領域を含む。変異は、Ｌ４３Ｑ、Ｌ４３Ｋ、Ｌ４３Ｈ、Ｉ７６Ｔ、Ｒ８５Ｓ、Ｒ８５Ｇ、Ｒ８５Ｎ、Ｒ８５Ｄ、Ｄ９９Ｅ、Ｄ９９Ｑ、Ｄ９９Ｓ、Ｄ９９Ｔ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｙ、Ｇ１００Ｖ、Ｔ１１６Ｌ、Ｔ１１６Ｍ、Ｔ１１６Ｐ、Ｔ１１６Ｒ、及び／又はこれらの組み合わせから選択することができる。特定の実施形態では、変異は、Ｌ４３Ｑ、Ｉ７６Ｔ、Ｒ８５Ｓ、Ｄ９９Ｅ、Ｇ１００Ａ、Ｇ１００Ｙ、Ｔ１１６Ｌ、又はこれらの組み合わせである。
【００８２】
さらに他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、アミノ酸位置９１に変異を有する配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域を含む。変異は、Ｆ９１Ｖ、Ｆ９１Ｉ、Ｆ９１Ｔ、Ｆ９１Ｌ、又はＦ９１Ｄから選択することができる。一実施形態では、変異はＦ９１Ｖである。これらの実施形態及び他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、アミノ酸位置６２及び／又は６３に変異を有する配列番号１１５の配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、変異は、Ｄ６２Ｅ、Ｄ６２Ｑ、Ｄ６２Ｔ、Ｄ６２Ｎ、Ｓ６３Ａ、Ｓ６３Ｑ、Ｓ６３Ｖ、又はこれらの組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、変異は、Ｄ６２Ｅ、Ｄ６２Ｑ、Ｓ６３Ａ、又はこれらの組み合わせから選択される。
【００８３】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号３２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号３２７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号３３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号３３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号３３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００８４】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号３２６、３２８、３３０又は３３２のアミノ酸配列からなる、又は本質的に配列番号３２６、３２８、３３０又は３３２のアミノ酸配列からなる軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号３２７、３２９、３３１又は３３３のアミノ酸配列からなる、又は本質的に配列番号３２７、３２９、３３１又は３３３のアミノ酸配列からなる重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号３２６のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３２６のアミノ酸配列からなり、重鎖可変領域は配列番号３２７のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３２７のアミノ酸配列からなる。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号３２８のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３２８のアミノ酸配列からなり、重鎖可変領域は配列番号３２９のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３２９のアミノ酸配列からなる。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号３３０のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３３０のアミノ酸配列からなり、重鎖可変領域は配列番号３３１のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３３１のアミノ酸配列からなる。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号３３２のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３３２のアミノ酸配列からなり、重鎖可変領域は配列番号３３３のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３３３のアミノ酸配列からなる。
【００８５】
本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２抗体のさらなる変異体は、本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２抗体のいずれかを親和性調節することによって生成し得る。「親和性調節抗体」は、その軽鎖可変領域配列及び／又は重鎖可変領域配列中に１つ以上のアミノ酸置換を含み、アミノ酸置換を含まない親抗体と比較して、標的抗原に対する抗体の親和性を増加又は減少させる抗体である。抗体親和性調節方法は当業者に知られており、ＣＤＲウオーキング変異誘発法（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４，３９２−４０３，１９９５）、鎖シャフリング法（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０，７７９−７８３，１９９２）、Ｅ．ｃｏｌｉの変異株の使用（Ｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５０，３５０−３６８，１９９６）、ＤＮＡシャフリング法（Ｐａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８，７２４−７３３、１９９７）、ファージディスプレイ法（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６，７−８８，１９９６）、ＰＣＲ技術（Ｃｒａｍｅｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１，２８８−２９１，１９９８）、及び他の変異誘発戦略（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：３８０９−３８１３、１９９４；Ｓｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６９：１４７−１５５、１９９５；Ｙｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：１９９４−２００４、１９９５；Ｊａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４（７）：３３１０−９，１９９５；及びＨａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６，１９９２）を含み得る。親和性調節の方法は、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５：６２−７０，１９９５、及びＶａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１６：５３５−５３９，１９９８に記載されている。本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２抗体の親和性調節変異体を生成するための特定の一方法は、実施例８に記載されるような酵母ディスプレイＦａｂ変異誘発ライブラリーの使用である。
【００８６】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、６Ｅ７抗体の親和性調節変異体由来の軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含む（実施例８）。例えば、いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表２３に記載されるアミノ酸置換の１つ以上を有する軽鎖可変領域及び／又は重鎖可変領域を含む。一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置２４、３１、５０、５２、５４、５６、８９、９２、９３、９４、及び／又は９６に変異を有する配列番号６１の配列を含む軽鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、変異は、Ｒ２４Ａ、Ｓ３１Ｒ、Ａ５０Ｓ、Ａ５０Ｇ、Ｓ５２Ｇ、Ｌ５４Ｒ、Ｎ５６Ｋ、Ｎ５６Ｒ、Ｎ５６Ｌ、Ｎ５６Ｔ、Ｑ８９Ｇ、Ｄ９２Ｖ、Ｓ９３Ｒ、Ｆ９４Ｙ、Ｆ９４Ｌ、Ｒ９６Ｈ、Ｒ９６Ｌ、又はこれらの組み合わせから選択される。これらの実施形態及び他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、１つ以上のアミノ酸位置２７、２８、３０、３２、５０、５４、５８、６０、６１、６３、６６、９９、１０１、１０３、１０４、及び／又は１１０に変異を有する配列番号１２４の配列を含む重鎖可変領域を含む。いくつかの実施態様では、変異は、Ｙ２７Ｓ、Ｓ２８Ｇ、Ｓ２８Ｈ、Ｔ３０Ｎ、Ｔ３０Ｇ、Ｔ３０Ｅ、Ｔ３０Ａ、Ｙ３２Ｅ、Ｉ５０Ｔ、Ｇ５４Ｓ、Ｔ５８Ｖ、Ｙ６０Ｌ、Ｓ６１Ａ、Ｓ６３Ｇ、Ｓ６３Ｅ、Ｇ６６Ｄ、Ｑ９９Ｇ、Ｑ９９Ｓ、Ｑ９９Ｍ、Ｔ１０１Ｇ、Ｙ１０３Ｒ、Ｙ１０４Ｇ、Ｆ１１０Ｓ、又はそれらの組み合わせから選択される。親和性が向上した６Ｅ７抗体の例示的な変異体の軽鎖及び重鎖可変領域並びに関連するＣＤＲのアミノ酸配列を、以下の表２Ａ及び２Ｂにそれぞれ示す。親和性が低下した６Ｅ７抗体の例示的な変異体の軽鎖及び重鎖可変領域並びに関連するＣＤＲのアミノ酸配列を、以下の表３Ａ及び３Ｂにそれぞれ示す。６Ｅ７抗体の対応する配列を比較のために列挙する。
【００８７】
【表２Ａ−１】
2020517249.tif 000015
【００８８】
【表２Ａ−２】
2020517249.tif 000016
【００８９】
【表２Ｂ−１】
2020517249.tif 000017
【００９０】
【表２Ｂ−２】
2020517249.tif 000018
【００９１】
【表２Ｂ−３】
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【００９２】
【表２Ｂ−４】
2020517249.tif 000020
【００９３】
本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表２Ａ（軽鎖ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲＬ）及び表２Ｂ（重鎖ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲＨ）に示す親和性の向上した変異体のＣＤＲの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、親和性の向上した変異体に由来するコンセンサスＣＤＲ配列を含む。例えば、一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、Ｘ１ＡＳＳＸ２ＱＸ３（配列番号１３９）（ここで、Ｘ１はＡ又はＧであり；Ｘ２はＬ又はＲであり、Ｘ３はＮ、Ｋ、Ｒ、Ｌ又はＴである）からなるＣＤＲＬ２コンセンサス配列を含む。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、Ｘ１ＱＡＤＸ２Ｘ３ＰＸ４Ｔ（配列番号１４０）（ここで、Ｘ１はＱ又はＧであり；Ｘ２はＳ又はＲであり、Ｘ３はＦ、Ｌ又はＹであり；Ｘ４はＲ又はＨである）からなるＣＤＲＬ３コンセンサス配列を含む。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、Ｘ１ＩＹＰＧＤＳＤＸ２ＲＸ３Ｘ４ＰＸ５ＦＱＸ６（配列番号１４１）（ここで、Ｘ１はＩ又はＴであり；Ｘ２はＴ又はＶであり、Ｘ３はＹ又はＬであり；Ｘ４はＳ又はＡであり；Ｘ５はＳ、Ｇ又はＥであり；Ｘ６はＧ又はＤである）からなるＣＤＲＨ２コンセンサス配列を含む。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、Ｘ１ＲＴＦＹＹＤＳＳＤＹＸ２ＤＹ（配列番号１４２）（ここで、Ｘ１はＱ、Ｇ、Ｓ又はＭであり；Ｘ２はＦ又はＳである）からなるＣＤＲＨ３コンセンサス配列を含む。特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号１６の配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号１３９のコンセンサス配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号１４０のコンセンサス配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号８５の配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号１４１のコンセンサス配列を含み、ＣＤＲＨ３は配列番号１４２のコンセンサス配列を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号１６の配列を含むＣＤＲＬ１、配列番号２６及び１４３〜１４７から選択される配列を含むＣＤＲＬ２、配列番号４３及び１４８〜１５２から選択される配列を含むＣＤＲＬ３、配列番号８５の配列を含むＣＤＲＨ１、配列番号９１及び１７０〜１７５から選択される配列を含むＣＤＲＨ２、並びに配列番号１７６〜１７９から選択される配列を含むＣＤＲＨ３を含む。
【００９５】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ここで（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４３、及び１４８の配列を有する；（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４４、及び１４９の配列を有する；（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４５、及び４３の配列を有する；（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４６、及び１４８の配列を有する；（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２６、及び１５０の配列を有する；（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４３、及び１５１の配列を有する；（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４５、及び１４８の配列を有する；（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４５、及び１５２の配列を有する；（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４４、及び４３の配列を有する；又は（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４７、及び４３の配列を有する。
【００９６】
関連する実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ここで（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７０、及び１７６の配列を有する；（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７１、及び１７７の配列を有する；（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７２、及び１７７の配列を有する；（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７１、及び１７８の配列を有する；（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７１、及び１７９の配列を有する；（ｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７３、及び１７７の配列を有する；（ｇ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１７６の配列を有する；（ｈ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７４、及び１７６の配列を有する；（ｉ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７５、及び１７８の配列を有する；又は（ｊ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１７８の配列を有する。
【００９７】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ここで、
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４３、及び１４８の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７０、及び１７６の配列を有する；
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４４、及び１４９の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７１、及び１７７の配列を有する；
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４５、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７２、及び１７７の配列を有する；
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４６、及び１４８の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７１、及び１７８の配列を有する；
（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２６、及び１５０の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７１、及び１７９の配列を有する；
（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４３、及び１５１の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７３、及び１７７の配列を有する；
（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４５、及び１４８の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１７６の配列を有する；
（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４５、及び１５２の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７１、及び１７８の配列を有する；
（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４３、及び１５１の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７４、及び１７６の配列を有する；
（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４４、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、１７５、及び１７８の配列を有する；又は
（ｋ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、１４７、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１７８の配列を有する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表２Ａに示すようなＬＶ−１０１、ＬＶ−１０２、ＬＶ−１０３、ＬＶ−１０４、ＬＶ−１０５、ＬＶ−１０６、ＬＶ−１０７、ＬＶ−１０８、ＬＶ−１０９、及びＬＶ−１１０から選択される軽鎖可変領域、並びに／又は表２Ｂに示すようなＨＶ−１０１、ＨＶ−１０２、ＨＶ−１０３、ＨＶ−１０４、ＨＶ−１０５、ＨＶ−１０６、ＨＶ−１０７、ＨＶ−１０８、ＨＶ−１０９、ＨＶ−１１０、及びＨＶ−１１１から選択される重鎖可変領域、或いは表２Ａ及び２Ｂ中の配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一である配列を含み得る。例えば、特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１５３〜１６２から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号１５３〜１６２から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１５３〜１６２から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。関連する実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１８０〜１９０から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号１８０〜１９０から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１８０〜１９０から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。
【００９９】
表２Ａに列挙した軽鎖可変領域の各々は、表２Ｂに列挙した重鎖可変領域のいずれかと組み合わされて、本発明の抗原結合タンパク質の抗ＴＲＥＭ２結合ドメインを形成し得る。このような組み合わせの例には、ＬＶ−１０１（配列番号１５３）とＨＶ−１０１（配列番号１８０）；ＬＶ−１０２（配列番号１５４）とＨＶ−１０２（配列番号１８１）；ＬＶ−１０３（配列番号１５５）とＨＶ−１０３（配列番号１８２）；ＬＶ−１０４（配列番号１５６）とＨＶ−１０４（配列番号１８３）；ＬＶ−１０５（配列番号１５７）とＨＶ−１０５（配列番号１８４）；ＬＶ−１０６（配列番号１５８）とＨＶ−１０６（配列番号１８５）；ＬＶ−１０７（配列番号１５９）とＨＶ−１０７（配列番号１８６）；ＬＶ−１０８（配列番号１６０）とＨＶ−１０８（配列番号１８７）；ＬＶ−１０６（配列番号１５８）とＨＶ−１０９（配列番号１８８）；ＬＶ−１０９（配列番号１６１）とＨＶ−１１０（配列番号１８９）；及びＬＶ−１１０（配列番号１６２）とＨＶ−１１１（配列番号１９０）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１００】
【表３Ａ】
2020517249.tif 000021
【０１０１】
【表３Ｂ−１】
2020517249.tif 000022
【０１０２】
【表３Ｂ−２】
2020517249.tif 000023
【０１０３】
【表３Ｂ−３】
2020517249.tif 000024
【０１０４】
本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表３Ａ（軽鎖ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲＬ）及び表３Ｂ（重鎖ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲＨ）に示す親和性の低下した変異体のＣＤＲの１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、親和性の低下した変異体に由来するコンセンサスＣＤＲ配列を含む。例えば、一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、Ｘ１ＡＳＱＧＩＳＸ２ＷＬＡ（配列番号２８４）（ここで、Ｘ１はＲ又はＡであり；Ｘ２はＳ又はＲである）からなるＣＤＲＬ１コンセンサス配列を含む。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、Ｘ１ＡＸ２ＳＬＱＮ（配列番号２８５）（ここで、Ｘ１はＡ又はＳであり；Ｘ２はＳ又はＧである）からなるＣＤＲＬ２コンセンサス配列を含む。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＱＱＡＸ１ＳＦＰＸ２Ｔ（配列番号２８６）（ここで、Ｘ１はＤ又はＶであり；Ｘ２はＲ又はＬである）からなるＣＤＲＬ３コンセンサス配列を含む。別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＳＸ１ＷＩＡ（配列番号２８７）（ここで、Ｘ１はＹ又はＥである）からなるＣＤＲＨ１コンセンサス配列を含む。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＩＩＹＰＸ１ＤＳＤＴＲＹＳＰＳＦＱＧ（配列番号２８８）（ここで、Ｘ１はＧ又はＳである）からなるＣＤＲＨ２コンセンサス配列を含む。さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＱＲＸ１ＦＸ２Ｘ３ＤＳＳＤＹＦＤＹ（配列番号２８９）（ここで、Ｘ１はＴ又はＧであり；Ｘ２はＹ又はＲであり；Ｘ３はＹ又はＧである）からなるＣＤＲＨ３コンセンサス配列を含む。特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、相補性決定領域ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びに相補性決定領域ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ＣＤＲＬ１は配列番号２８４の配列を含み、ＣＤＲＬ２は配列番号２８５のコンセンサス配列を含み、ＣＤＲＬ３は配列番号２８６のコンセンサス配列を含み、ＣＤＲＨ１は配列番号２８７の配列を含み、ＣＤＲＨ２は配列番号２８８のコンセンサス配列を含み、且つＣＤＲＨ３は配列番号２８９のコンセンサス配列を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号１６、２９０及び２９１から選択される配列を含むＣＤＲＬ１；配列番号２８、２９２及び２９３から選択される配列を含むＣＤＲＬ２；配列番号４３、２９４及び２７１から選択される配列を含むＣＤＲＬ３；配列番号８５又は配列番号３０２の配列を含むＣＤＲＨ１；配列番号９１又は配列番号３０３の配列を含むＣＤＲＨ２；並びに配列番号１０７及び３０４〜３０６から選択される配列を含むＣＤＲＨ３を含む。
【０１０６】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域を含み、ここで（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２８、及び４３の配列を有する；（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２９２、及び４３の配列を有する；（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２８、及び２９４の配列を有する；（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号２９０、２８、及び４３の配列を有する；（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２９３、及び４３の配列を有する；（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２８、及び２７１の配列を有する；又は（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号２９１、２８、及び４３の配列を有する。
【０１０７】
関連する実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ここで（ａ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び３０４の配列を有する；（ｂ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１０７の配列を有する；（ｃ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び３０５の配列を有する；（ｄ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、３０３、及び１０７の配列を有する；（ｅ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び３０６の配列を有する；又は（ｆ）ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号３０２、９１、及び１０７の配列を有する。
【０１０８】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３を含む軽鎖可変領域、並びにＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３を含む重鎖可変領域を含み、ここで、
（ａ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２８、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び３０４の配列を有する。
（ｂ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２９２、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１０７の配列を有する；
（ｃ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２８、及び２９４の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１０７の配列を有する；
（ｄ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２８、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１０７の配列を有する；
（ｅ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２８、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び３０５の配列を有する；
（ｆ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２８、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、３０３、及び１０７の配列を有する；
（ｇ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号２９０、２８、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１０７の配列を有する；
（ｈ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２８、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び３０６の配列を有する。
（ｉ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２９３、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１０７の配列を有する；
（ｊ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号１６、２８、及び２７１の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号８５、９１、及び１０７の配列を有する；又は
（ｋ）ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３はそれぞれ配列番号２９１、２８、及び４３の配列を有し、且つＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３はそれぞれ配列番号３０２、９１、及び１０７の配列を有する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、表３Ａに示すようなＬＶ−１６、ＬＶ−２０１、ＬＶ−２０２、ＬＶ−２０３、ＬＶ−２０４、ＬＶ−２０５、及びＬＶ−２０６から選択される軽鎖可変領域、並びに／又は表３Ｂに示すようになＨＶ−１５、ＨＶ−２０１、ＨＶ−２０２、ＨＶ−２０３、ＨＶ−２０４、ＨＶ−２０５、及びＨＶ−２０６から選択される重鎖可変領域、或いは表３Ａ及び３Ｂ中の配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも８５％同一、少なくとも９０％同一、又は少なくとも９５％同一である配列を含み得る。例えば、特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号６１及び２９５〜３００から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号６１及び２９５〜３００から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号６１及び２９５〜３００から選択される配列を含む軽鎖可変領域を含む。関連する実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１２４及び３０７〜３１２から選択される配列と少なくとも９０％同一である配列、（ｉｉ）配列番号１２４及び３０７〜３１２から選択される配列と少なくとも９５％同一である配列、又は（ｉｉｉ）配列番号１２４及び３０７〜３１２から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０１１０】
表３Ａに列挙した軽鎖可変領域の各々は、表３Ｂに列挙した重鎖可変領域のいずれかと組み合わされて、本発明の抗原結合タンパク質の抗ＴＲＥＭ２結合ドメインを形成し得る。このような組み合わせの例には、ＬＶ−１６（配列番号６１）とＨＶ−２０１（配列番号３０７）；ＬＶ−２０１（配列番号２９５）とＨＶ−１５（配列番号１２４）；ＬＶ−２０２（配列番号２９６）とＨＶ−１５（配列番号１２４）；ＬＶ−１６（配列番号６１）とＨＶ−２０２（配列番号３０８）；ＬＶ−１６（配列番号６１）とＨＶ−２０３（配列番号３０９）；ＬＶ−１６（配列番号６１）とＨＶ−２０４（配列番号３１０）；ＬＶ−２０３（配列番号２９７）とＨＶ−１５（配列番号１２４）；ＬＶ−１６（配列番号６１）とＨＶ−２０５（配列番号３１１）；ＬＶ−２０４（配列番号２９８）とＨＶ−１５（配列番号１２４）；ＬＶ−２０５（配列番号２９９）とＨＶ−１５（配列番号１２４）；及びＬＶ−２０６（配列番号３００）とＨＶ−２０６（配列番号３１２）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体又はその結合断片である。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、２つの軽鎖ポリペプチド（それぞれ約２５ｋＤａ）及び２つの重鎖ポリペプチド（それぞれ約５０〜７０ｋＤａ）を含む四量体免疫グロブリンタンパク質を指す。「抗体」は、抗原結合タンパク質の一種である。用語「軽鎖」又は「免疫グロブリン軽鎖」は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、単一の免疫グロブリン軽鎖可変領域（ＶＬ）及び単一の免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を含むポリペプチドを指す。免疫グロブリン軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）は、ヒトカッパ（κ）又はヒトラムダ（λ）定常ドメインであり得る。用語「重鎖」又は「免疫グロブリン重鎖」は、アミノ末端からカルボキシル末端へ、単一の免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、免疫グロブリンヒンジ領域、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン２（ＣＨ２）、免疫グロブリン重鎖定常ドメイン３（ＣＨ３）、及び任意選択により免疫グロブリン重鎖定常ドメイン４（ＣＨ４）を含むポリペプチドを指す。重鎖は、ミュー（μ）、デルタ（Δ）、ガンマ（γ）、アルファ（α）、及びイプシロン（ε）として分類され、抗体のアイソタイプをそれぞれ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥと定義する。ＩｇＧクラス及びＩｇＡクラス抗体は、サブクラス、すなわちＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、並びにＩｇＡ１及びＩｇＡ２にそれぞれさらに分けられる。ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＤ抗体の重鎖は、３つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有し、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体の重鎖は、４つのドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を有する。免疫グロブリン重鎖定常ドメインは、サブタイプを含む任意の免疫グロブリンアイソタイプ由来であり得る。抗体鎖は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間（すなわち軽鎖と重鎖との間）及び抗体重鎖のヒンジ領域間の、ポリペプチド間ジスルフィド結合を介して連結されている。
【０１１２】
本発明の抗ＴＲＥＭ２抗体は、任意の免疫グロブリン定常領域を含むことができる。本明細書で使用される用語「定常領域」は、可変領域以外の抗体の全てのドメインを指す。定常領域は抗原の結合に直接関与しないが、種々のエフェクタ機能を示す。上記のように、抗体は、それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、特定のアイソタイプ（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ）及びサブタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１  ＩｇＡ２）に分けられる。軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型又はラムダ型軽鎖定常領域、例えば、５つの抗体アイソタイプ全てに見出される、カッパ型又はラムダ型軽鎖定常領域、例えば、ヒトカッパ型又はラムダ型軽鎖定常領域であり得る。ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域配列の例を以下の表に示す。
【０１１３】
【表４】
2020517249.tif 000025
【０１１４】
本発明の抗ＴＲＥＭ２抗体の重鎖定常領域は、例えば、アルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、又はミュー型重鎖定常領域、例えば、ヒトアルファ型、デルタ型、イプシロン型、ガンマ型、又はミュー型重鎖定常領域であり得る。いくつかの実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。一実施形態において、抗ＴＲＥＭ２抗体は、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。このような実施形態では、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリン定常領域は、本明細書により詳細に記載されるように、抗体のグリコシル化を防止する１つ以上の変異を含み得る。別の実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、ヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。さらに別の実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、ヒトＩｇＧ４免疫グロブリン由来の重鎖定常領域を含む。ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４重鎖定常領域配列の例を下記の表５に示す。
【０１１５】
【表５−１】
2020517249.tif 000026
【０１１６】
【表５−２】
2020517249.tif 000027
【０１１７】
表１Ａ、２Ａ、及び３Ａに開示される軽鎖可変領域の各々、並びに表１Ｂ、２Ｂ、及び３Ｂに開示される重鎖可変領域の各々は、上記の軽鎖定常領域（表４）及び重鎖定常領域（表５）に結合されて、完全な抗体の軽鎖及び重鎖をそれぞれ形成し得る。さらに、このようにして生成された重鎖及び軽鎖配列の各々は、完全な抗体構造を形成するために組み合わされ得る。本明細書中に提供される重鎖及び軽鎖可変領域はまた、上に列挙された例示的な配列とは異なる配列を有する他の定常ドメインにも結合され得ることは理解されなければならない。
【０１１８】
本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、本明細書中に開示する抗ＴＲＥＭ２抗体のいずれかであり得る。例えば、特定の実施形態では、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、抗体１２Ｇ１０、２６Ａ１０、２６Ｃ１０、２６Ｆ２、３３Ｂ１２、２４Ｃ１２、２４Ｇ６、２４Ａ１０、１０Ｅ３、１３Ｅ７、１４Ｃ１２、２５Ｆ１２、３２Ｅ３、２４Ｆ４、１６Ｂ８、４Ｃ５、６Ｅ７、５Ｅ３及び４Ｇ１０から選択される抗ＴＲＥＭ２抗体であり、その可変領域及びＣＤＲ配列は、表１Ａ及び１Ｂに記載されている。いくつかの実施形態では、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、抗体２４Ｇ６、１０Ｅ３、１３Ｅ７、４Ｃ５、６Ｅ７及び５Ｅ３から選択される抗ＴＲＥＭ２抗体である。他の実施形態では、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、抗体Ｖ３、Ｖ２４、Ｖ２７、Ｖ４０、Ｖ４８、Ｖ４９、Ｖ５２、Ｖ６０、Ｖ７３、Ｖ７６及びＶ８４から選択される抗ＴＲＥＭ２抗体であり、その可変領域及びＣＤＲ配列は、表２Ａ及び２Ｂに記載されている。特定の他の実施形態では、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、抗体Ｖ９、Ｖ１０、Ｖ２３、Ｖ３０、Ｖ３３、Ｖ４４、Ｖ５７、Ｖ６８、Ｖ７０、Ｖ８３、及びＶ９０から選択される抗ＴＲＥＭ２抗体であり、その可変領域及びＣＤＲ配列は表３Ａ及び３Ｂに記載されている。
【０１１９】
本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体又は多重特異性抗体であり得る。特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質はモノクローナル抗体である。そのような実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体、又はヒト免疫グロブリン定常ドメインを有する完全ヒト抗体であり得る。これらの実施形態及び他の実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体である。したがって、抗ＴＲＥＭ２抗体は、いくつかの実施形態では、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４定常ドメインを有し得る。一実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、モノクローナルヒトＩｇＧ１抗体である。別の実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、モノクローナルヒトＩｇＧ２抗体である。さらに別の実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、モノクローナルヒトＩｇＧ４抗体である。
【０１２０】
本明細書で使用される用語「モノクローナル抗体」（又は「ｍＡｂ」）は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、わずかに存在し得る可能性のある天然に存在する変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は、通常異なるエピトープに対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、特異性が高く、個々の抗原部位又はエピトープに対するものである。モノクローナル抗体は、当該技術分野で知られた任意の手法を用いて、例えば免疫スケジュールの完了後に動物から採取した脾臓細胞を不死化することによって生成され得る。脾臓細胞は、当該技術分野で知られた任意の手法を用いて、例えばそれらを骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマを生成することによって不死化し得る。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１ｓｔＥｄｉｔｉｏｎ（例えば、１９８８からの）、又は２ｎｄＥｄｉｔｉｏｎ（例えば、２０１４からの）を参照されたい。ハイブリドーマ生成融合手順に使用するための骨髄腫細胞は、好ましくは、非抗体産生性であり、高い融合効率を有し、且つ所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増殖を支持する特定の選択培地においてそれらの増殖を不可能にする酵素欠損を有する。マウス細胞との融合に使用するのに好適な細胞株の例には、Ｓｐ−２０、Ｐ３−Ｘ６３／Ａｇ８、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ  ４  １、Ｓｐ２１０−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ１１−Ｘ４５−ＧＴＧ  １．７及びＳ１９４／５ＸＸＯ  Ｂｕｌが含まれるが、これらに限定されない。ラット細胞との融合に使用するのに好適な細胞株の例には、Ｒ２１０．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ  １．２．３、ＩＲ９８３Ｆ及び４Ｂ２１０が含まれるが、これらに限定されない。細胞融合に有用な他の細胞株は、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２及びＵＣ７２９−６である。
【０１２１】
いくつかの例では、ハイブリドーマ細胞株は、動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、又はヒト免疫グロブリン配列を有するトランスジェニック動物）をＴＲＥＭ２免疫原（例えば、実施例１に記載される免疫原）で免疫し、この免疫された動物から脾臓細胞を採取し；採取した脾臓細胞を骨髄腫細胞株に融合させ、それによってハイブリドーマ細胞を生成し、このハイブリドーマ細胞からハイブリドーマ細胞株を確立し、そしてヒトＴＲＥＭ２に結合する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株を同定することによって生成される。モノクローナル抗体を生成するための別の有用な方法は、Ｂａｂｃｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．９３：７８４３−７８４８，１９９６に記載されているＳＬＡＭ法である。
【０１２２】
ハイブリドーマ細胞株によって分泌されたモノクローナル抗体は、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーなどの、当該技術分野で知られた任意の技術を使用して精製され得る。ハイブリドーマ上清又はｍＡｂをさらにスクリーニングして、特定の特性、例えば、ヒトＴＲＥＭ２に結合する能力、他の種由来のＴＲＥＭ２タンパク質（例えば、マウスＴＲＥＭ２、ラットＴＲＥＭ２、及びカニクイザルＴＲＥＭ２）に対する交差反応性、他のＴＲＥＭファミリーメンバー（例えば、ヒトＴＲＥＭ１）に対する交差反応性、例えば、本明細書に記載のｐＳｙｋアッセイを使用して、ＴＲＥＭ２媒介シグナル伝達を誘導又は増加させる能力、或いは本明細書に記載のＴＲＥＭ２媒介機能又は活性（例えば、ＴＲＥＭ２発現骨髄細胞の増殖又は生存）を誘導又は増加させる能力を有するｍＡｂを特定し得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２抗体のＣＤＲ及び可変領域配列に基づくキメラ又はヒト化抗体である。キメラ抗体は、共有結合して機能的免疫グロブリン軽鎖若しくは重鎖又はそれらの結合断片を生成する、異なる抗体由来のタンパク質セグメントから構成される抗体である。一般に、重鎖及び／又は軽鎖の一部は、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同であり、一方、鎖の残りは、別の種に由来する、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である。キメラ抗体に関する方法は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−６８５５を参照されたい。これらの両文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１２４】
一般に、キメラ抗体を作製する目的は、意図する種からのアミノ酸の数が最大となるキメラを作製することである。一例は、抗体が、特定の種に由来する、又は特定の抗体クラス又はサブクラスに属する１つ以上のＣＤＲを含み、一方、抗体鎖の残りは、別の種に由来する、又は別の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一又は相同である「ＣＤＲグラフト」抗体である。ＣＤＲグラフト化は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号明細書、同第５，６９３，７６２号明細書、同第５，６９３，７６１号明細書、同第５，５８５，０８９号明細書、及び同第５，５３０，１０１号明細書に記載されている。ヒトで使用するために、齧歯動物又はウサギ抗体由来の可変領域又は選択されたＣＤＲがしばしばヒト抗体にグラフトされ、ヒト抗体の天然に存在する可変領域又はＣＤＲを置換する。
【０１２５】
キメラ抗体の１つの有用な型は、「ヒト化」抗体である。一般に、ヒト化抗体は、齧歯動物又はウサギなどの非ヒト動物において最初に産生されたモノクローナル抗体から生成される。通常、抗体の非抗原認識部分に由来する、このモノクローナル抗体の特定のアミノ酸残基は、対応するアイソタイプのヒト抗体における対応する残基に相同であるように改変される。ヒト化は、例えば、種々の方法を用いて、齧歯動物又はウサギの可変領域の少なくとも一部をヒト抗体の対応する領域に置換することにより行うことができる（例えば、米国特許第５，５８５，０８９号明細書及び同第５，６９３，７６２号明細書、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−２７、並びにＶｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６を参照されたい）。
【０１２６】
一態様では、本明細書中に提示される抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域のＣＤＲ（表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂを参照）は、同一の、又は異なる系統発生的種由来の抗体のフレームワーク領域（ＦＲ）にグラフトされる。例えば、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂに列挙した重鎖及び軽鎖可変領域のＣＤＲが、コンセンサスヒトＦＲにグラフトされ得る。コンセンサスヒトＦＲを作製するために、いくつかのヒト重鎖又は軽鎖アミノ酸配列由来のＦＲを整列させて、コンセンサスアミノ酸配列を同定し得る。或いは、１つの重鎖又は軽鎖由来のグラフト可変領域が、本明細書に開示する特定の重鎖又は軽鎖の定常領域とは異なる定常領域とともに使用され得る。他の実施形態では、グラフト可変領域は一本鎖Ｆｖ抗体の一部である。
【０１２７】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、完全ヒト抗体である。ヒトＴＲＥＭ２に特異的に結合する完全ヒト抗体は、配列番号１及び２の配列からなるポリペプチド、又は実施例１に記載の免疫原などの、本明細書に記載の免疫原又はその断片を使用して生成することができる。「完全ヒト抗体」は、ヒト生殖系列の免疫グロブリン配列に由来するか、又はそれを示す可変領域及び定常領域を含む抗体である。完全ヒト抗体の生成を実施するために提供される１つの具体的な手段は、マウス体液性免疫系の「ヒト化」である。内因性Ｉｇ遺伝子が不活性化されたマウスへのヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座の導入は、任意の所望の抗原で免疫化され得る動物であるマウスにおいて完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を生成する１つの手段である。完全ヒト抗体を使用することにより、マウス又はマウス由来のｍＡｂを治療剤としてヒトに投与することによって引き起こされることがある免疫原性及びアレルギー反応を最小限に抑えることができる。
【０１２８】
完全ヒト抗体は、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（通常、マウス）を免疫化することによって生成することができる。この目的のための抗原は、通常、６個以上の連続するアミノ酸を有し、任意選択によりハプテンなどのキャリアに結合される。例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１−２５５５、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８、及びＢｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３を参照されたい。このような方法の一例では、トランスジェニック動物は、マウスの免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖をコードする内因性マウス免疫グロブリン遺伝子座を無能力化し、マウスのゲノム中に、ヒトの重鎖及び軽鎖タンパク質をコードする遺伝子座を含むヒトゲノムＤＮＡの大きい断片を挿入することによって生産される。次いで、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の完全相補体より少ない相補体を有する部分的に改変された動物を交雑して、所望の免疫系を全て改変した動物を得る。免疫原を投与すると、これらのトランスジェニック動物は、免疫原に対して免疫特異的であるが、マウスでなくヒトの、可変領域を含むアミノ酸配列を有する抗体を産生する。このような方法のさらなる詳細については、例えば、国際公開第９６／３３７３５号パンフレット及び国際公開第９４／０２６０２号パンフレットを参照されたい。ヒト抗体を作るためのトランスジェニックマウスに関連するさらなる方法は、米国特許第５，５４５，８０７号明細書、同第６，７１３，６１０号明細書、同第６，６７３，９８６号明細書、同第６，１６２，９６３号明細書、同第５，９３９，５９８号明細書、同第５，５４５，８０７号明細書、同第６，３００，１２９号明細書、同第６，２５５，４５８号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，８７４，２９９及び同第５，５４５，８０６号明細書、ＰＣＴ公報の国際公開第９１／１０７４１号パンフレット、国際公開第９０／０４０３６号パンフレット、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３０４９８号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、並びに欧州特許第５４６０７３Ｂ１号明細書及び欧州特許出願公開第５４６０７３Ａ１号明細書に記載されている。
【０１２９】
本明細書中で「ＨｕＭａｂ」マウスと呼ばれる上記のトランスジェニックマウスは、内因性のミュー及びカッパ鎖遺伝子座を不活性化する標的変異と共に、再配列されていないヒト重鎖（ミュー及びガンマ）及びカッパ軽鎖免疫グロブリン配列をコードするヒト免疫グロブリン遺伝子ミニ遺伝子座（ｍｉｎｉｌｏｃｕｓ）を含む（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９）。したがって、マウスは、マウスＩｇＭ及びカッパタンパク質の発現の減少を示し、免疫化に応答して、導入されたヒト重鎖及び軽鎖導入遺伝子は、クラススイッチ及び体細胞変異を受けて、高親和性ヒトＩｇＧカッパモノクローナル抗体を生成する（Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６）。ＨｕＭａｂの作製は、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０：６２８７−６２９５；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５：６４７−６５６；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：２９１２−２９２０；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９４，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  １１３：４９−１０１；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６：５７９−５９１；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｈｕｓｚａｒ，１９９５，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３；Ｈａｒｄｉｎｇ  ａｎｄ  Ｌｏｎｂｅｒｇ，１９９５，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７６４：５３６−５４６；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１に詳細に記載されており、これらの文献はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。さらに米国特許第５，５４５，８０６号明細書、同第５，５６９，８２５号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，７８９，６５０号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、同第５，８１４，３１８号明細書、同第５，８７４，２９９号明細書、及び同第．５，７７０，４２９号明細書、並びに米国特許第５，５４５，８０７号明細書、国際公開第９３／１２２７号パンフレット、国際公開第９２／２２６４６号パンフレット、及び国際公開第９２／０３９１８号パンフレットを参照されたい。これらのすべての開示はあらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。これらのトランスジェニックマウスにおいてヒト抗体を生成するために利用される技術はまた、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、及びＭｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（この文献は参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。例えば、ＨＣｏ７及びＨＣｏ１２トランスジェニックマウス株を用いて、完全ヒト抗ＴＲＥＭ２抗体を生成することができる。完全ヒト抗ＴＲＥＭ抗体の生成に好適な１つの特定のトランスジェニックマウス系統は、実施例１、並びに米国特許第６，１１４，５９８号明細書、同第６，１６２，９６３号明細書、同第６，８３３，２６８号明細書、同第７，０４９，４２６号明細書、同第７，０６４，２４４号明細書、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１；Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６；Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｉｓ，１９９８，Ｊ．Ｅｘ．Ｍｅｄ，１８８：４８３−４９５；Ｇｒｅｅｎ，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３，５９３−５９７，２００２（これらの文献は全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）トランスジェニックマウスである。
【０１３０】
ヒト由来抗体はまた、ファージディスプレイ技術を用いて生成することができる。ファージディスプレイは、例えば、Ｄｏｗｅｒ  ｅｔ  ａｌ．による国際公開第９１／１７２７１号パンフレット、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．による国際公開第９２／０１０４７号パンフレット、及びＣａｔｏｎ  ａｎｄ  Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：６４５０−６４５４（１９９０）に記載されており、これらの各文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ファージ技術によって生成される抗体は、通常、細菌において、抗原結合断片、例えばＦｖ又はＦａｂ断片として生成され、したがってエフェクタ機能を欠く。エフェクタ機能は、２つの戦略の１つによって導入することができる：断片は、必要に応じて、哺乳動物細胞で発現する完全な抗体へ、又はエフェクタ機能を誘発し得る第２の結合部位を有する二重特異性抗体断片へ操作され得る。通常、抗体のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１）及び軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）は、ＰＣＲによって別々にクローン化され、コンビナトリアルファージディスプレイライブラリーでランダムに組み換えられ、これは、その後、特定の抗原に結合するために選択され得る。抗体断片は、ファージ表面で発現し、抗原結合によるＦｖ又はＦａｂ（したがって抗体断片をコードするＤＮＡを含むファージ）の選択は、パンニングと呼ばれる手順である抗原結合及び再増幅を数ラウンド行うことによって達成される。抗原に特異的な抗体断片は濃縮され、最終的に単離される。ファージディスプレイ技術はまた、「ガイデッドセレクション（ｇｕｉｄｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）」と呼ばれる、齧歯類モノクローナル抗体のヒト化のためのアプローチにおいて使用することができる（Ｊｅｓｐｅｒｓ，Ｌ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２，８９９−９０３（１９９４）を参照）。このために、マウスモノクローナル抗体のＦｄ断片は、ヒト軽鎖ライブラリーと組み合わせて提示され得、次いで、得られたハイブリッドＦａｂライブラリーは、抗原を用いて選択され得る。これにより、マウスＦｄ断片は、選択を誘導するテンプレートを提供する。続いて、選択されたヒト軽鎖は、ヒトＦｄ断片ライブラリーと組み合わされる。得られたライブラリーの選択により、完全にヒトＦａｂが得られる。
【０１３１】
本発明による抗ＴＲＥＭ２抗体を産生する細胞が上記の免疫化及び他の技術のいずれかを使用して得られたなら、本明細書中に記載されるような標準的な手順にしたがって、それからＤＮＡ又はｍＲＮＡを単離し、増幅することによって、特異的抗体遺伝子がクローン化され得る。それから産生された抗体の配列を決定し、ＣＤＲを同定し、ＣＤＲをコードするＤＮＡを本明細書に記載のように操作して、本発明による他のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質又は抗体を生成することができる。
【０１３２】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２の１つ以上などの本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質（例えば、モノクローナル抗体又はその結合断片）は、ヒトＴＲＥＭ２（配列番号１）又はヒトＴＲＥＭ２の細胞外ドメイン（配列番号２）への結合を、参照抗体と競合する。用語「競合する」は、抗体又は他の抗原結合タンパク質が他の抗体又は結合断片の標的（例えば、ヒトＴＲＥＭ２）への結合を妨害する能力を指す。抗体又は結合断片が標的（例えば、ヒトＴＲＥＭ２）への別の抗体又は結合断片の結合を妨害することができる程度、したがって、それが競合すると言うことができるか否かは、競合結合アッセイによって決定することができる。多くの種類の競合結合アッセイを使用することができ、それには、例えば、固相直接又は間接ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、固相直接又は間接酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、サンドイッチ競合アッセイ（例えば、Ｓｔａｈｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ９：２４２−２５３を参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｋｉｒｋｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７：３６１４−３６１９を参照）、固相直接標識アッセイ、固相直接標識サンドイッチアッセイ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照）、Ｉ−１２５標識を用いた固相直接標識ＲＩＡ（例えば、Ｍｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２５：７−１５を参照）、固相直接ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えば、Ｃｈｅｕｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７６：５４６−５５２を参照）、表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムを使用）；バイオレイヤー干渉法に基づくアッセイ（例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）システムを使用）、及び直接標識ＲＩＡ（Ｍｏｌｄｅｎｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：７７−８２）が含まれる。通常、競合結合アッセイは、固体表面に結合した精製抗原又は抗原を保有する細胞、非標識試験抗体又は他の抗原結合タンパク質、及び標識参照抗体又は他の抗原結合タンパク質の使用を含む。競合阻害は、試験抗体又は他の抗原結合タンパク質の存在下で固体表面又は細胞に結合した標識の量を決定することによって測定される。通常、試験抗体又は他の抗原結合タンパク質は過剰に存在する。競合アッセイによって特定される抗体又は他の抗原結合タンパク質（すなわち、競合する抗体及び抗原結合タンパク質）には、参照抗体又は参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗体及び抗原結合タンパク質が含まれる。通常、競合する抗体又は他の抗原結合タンパク質が過剰に存在すると、それは、標的抗原に対する参照抗体又は他の抗原結合タンパク質の特異的結合を、少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％又は７５％阻害する。いくつかの例では、参照抗体又は他の抗原結合タンパク質の結合は、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５��、又は９７％以上阻害される。いくつかの実施形態において、競合する抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその結合断片）は、参照抗体のヒトＴＲＥＭ２への結合を、約４０％〜約１００％、例えば、約６０％〜約１００％、特に、約７０％〜約１００％、より特には、約８０％〜約１００％減少させる。
【０１３３】
競合結合を検出するための特に好適な定量アッセイは、表面プラズモン共鳴技術を用いて相互作用の程度を測定するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）機を用いる。例示的なＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ベースの競合結合アッセイは、参照抗体をセンサーチップに固定化することを含む。次いで、標的抗原をセンサーチップと接触させる。標的抗原はそこで固定化された参照抗体によって捕捉される。次いで、試験抗体を、捕捉された標的抗原上に注入する。注入された試験抗体が固定化された抗体によって認識されるエピトープとは異なるエピトープを認識した場合、第２の結合事象が観察され、試験抗体は、標的抗原と参照抗体との結合について競合しないと考えられる。
【０１３４】
競合結合を検出する別の特に好適なアッセイは、バイオレイヤー干渉法を用いて結合相互作用を測定するＯｃｔｅｔ（登録商標）システム（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）と共に使用される動力学的センサーを使用する。このようなアッセイは、実施例４に記載されており、そこでは、本明細書に記載の１６の異なる抗ＴＲＥＭ２抗体各々の相互のヒトＴＲＥＭ２への結合を競合する能力が評価された。表９に提供される分析の結果は、１６の異なる抗体は４つの異なるエピトープビンにグループ化され得ることを示している。すなわち、抗体の１つの群（抗体１０Ｅ３、１３Ｅ７、２４Ｆ４、４Ｃ５、４Ｇ１０、３２Ｅ３、及び６Ｅ７）はヒトＴＲＥＭ２への結合が互いに競合しており、これらがヒトＴＲＥＭ２上の同一又は類似のエピトープを共有することを示している。抗体１６Ｂ８、２６Ａ１０、２６Ｃ１０、２６Ｆ２、３３Ｂ１２、及び５Ｅ３は、ＴＲＥＭ２結合は互いに競合したが、第１の群又は抗体２４Ａ１０、２４Ｇ６、又は２５Ｆ１２とは競合せず、これはこの第２群の抗体がヒトＴＲＥＭ２上の異なるエピトープに結合することを示している。抗体２４Ａ１０及び２４Ｇ６はヒトＴＲＥＭ２上の類似のエピトープを共有し、これらの２つの抗体はヒトＴＲＥＭ２結合について互いに競合したが、他のいずれも抗体とも競合しなかった。抗体２５Ｆ１２はヒトＴＲＥＭ２結合について他の試験抗体のいずれとも競合せず、この抗体がさらに別のエピトープに結合することを示した。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２との結合に関して、参照抗体と競合する。この参照抗体は配列番号４６〜６３から選択される配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１０〜１２６から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。他の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２との結合に関して、参照抗体と競合する。この参照抗体は配列番号１５３〜１６２から選択される配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１８０〜１９０から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。さらに他の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２との結合に関して、参照抗体と競合する。この参照抗体は配列番号６１及び２９５〜３００から選択される配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２４及び３０７〜３１２から選択される配列を含む重鎖可変領域を含む。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２への結合に関し、本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２抗体、例えば、１２Ｇ１０、２６Ａ１０、２６Ｃ１０、２６Ｆ２、３３Ｂ１２、２４Ｃ１２、２４Ｇ６、２４Ａ１０、１０Ｅ３、１３Ｅ７、１４Ｃ１２、２５Ｆ１２、３２Ｅ３、２４Ｆ４、１６Ｂ８、４Ｃ５、６Ｅ７、５Ｅ３、４Ｇ１０、Ｖ３、Ｖ９、Ｖ１０、Ｖ２３、Ｖ２４、Ｖ２７、Ｖ３０、Ｖ３３、Ｖ４０、Ｖ４４、Ｖ４８、Ｖ４９、Ｖ５２、Ｖ５７、Ｖ６０、Ｖ６８、Ｖ７０、Ｖ７３、Ｖ７６、Ｖ８３、Ｖ８４及びＶ９０の１つ以上と競合する。
【０１３６】
一実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２との結合に関して、参照抗体と競合する。この参照抗体は配列番号６１の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２４の配列を含む重鎖可変領域を含む。このような実施形態では、ヒトＴＲＥＭ２への結合についてこの参照抗体と競合する抗原結合タンパク質は、実施例４に記載されるように、抗体６Ｅ７又はエピトープビンＡ中の他の抗体、例えば１０Ｅ３、１３Ｅ７、２４Ｆ４、４Ｃ５、４Ｇ１０、３２Ｅ３のいずれかと同一又は類似のエピトープに結合する。
【０１３７】
別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２との結合に関して、参照抗体と競合する。この参照抗体は配列番号６２の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１２５の配列を含む重鎖可変領域を含む。このような実施形態では、ヒトＴＲＥＭ２への結合についてこの参照抗体と競合する抗原結合タンパク質は、実施例４に記載されるように、抗体５Ｅ３又はエピトープビンＢ中の他の抗体、例えば１６Ｂ８、２６Ａ１０、２６Ｃ１０、２６Ｆ２、３３Ｂ１２のいずれかと同一又は類似のエピトープに結合する。
【０１３８】
さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２との結合に関して、参照抗体と競合する。この参照抗体は配列番号５２の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１５の配列を含む重鎖可変領域を含む。このような実施形態では、ヒトＴＲＥＭ２への結合がこの参照抗体と競合する抗原結合タンパク質は、抗体２４Ｇ６又は抗体２４Ａ１０と同一又は類似のエピトープ（実施例４に記載されるエピトープビンＣ）に結合する。
【０１３９】
さらに別の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２との結合に関して、参照抗体と競合する。この参照抗体は配列番号５６の配列を含む軽鎖可変領域、及び配列番号１１９の配列を含む重鎖可変領域を含む。このような実施形態では、ヒトＴＲＥＭ２への結合がこの参照抗体と競合する抗原結合タンパク質は、抗体２５Ｆ１２と同一又は類似のエピトープ（実施例４に記載されるエピトープビンＤ）に結合する。
【０１４０】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は定常領域に対する１つ以上の変異又は改変を含み得る。例えば、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質がＦｃ領域を含む実施形態（例えば、モノクローナル抗体）においては、抗原結合タンパク質（例えば、モノクローナル抗体）の重鎖定常領域又はＦｃ領域は、抗原結合タンパク質のグリコシル化、エフェクタ機能、及び／又はＦｃγ受容体結合に影響を及ぼす１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。
【０１４１】
用語「Ｆｃ領域」は無傷の抗体のパパイン消化によって生成され得る免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を指す。免疫グロブリンのＦｃ領域は、一般に、２つの定常ドメイン、ＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、任意選択によりＣＨ４ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４免疫グロブリン由来のＦｃ領域である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１又はヒトＩｇＧ２免疫グロブリン由来のＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。Ｆｃ領域は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害（ＡＤＣＣ）、及び食作用などのエフェクタ機能を保持し得る。他の実施形態では、Ｆｃ領域は以下にさらに詳細に記載されるように、エフェクタ機能を低下又は排除するように改変され得る。
【０１４２】
免疫グロブリンのＦｃ領域の機能の１つは、免疫グロブリンがその標的に結合するときに免疫系に伝達することである。これは一般に「エフェクタ機能」と呼ばれる。伝達は、ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、及び／又はＣＤＣを誘導する。ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰは、免疫系の細胞の表面上のＦｃ受容体へのＦｃ領域の結合を介して媒介される。ＣＤＣは、Ｆｃと補体系のタンパク質、例えばＣ１ｑとの結合を介して媒介される。いくつかの実施形態では、本発明の抗原結合タンパク質、例えばモノクローナル抗体は、Ｆｃ領域に、エフェクタ機能、例えば、ＡＤＣＣ活性、ＣＤＣ活性、ＡＤＣＰ活性、及び／又は抗原結合タンパク質のクリアランス若しくは半減期を増強する１つ以上のアミノ酸置換を含む。エフェクタ機能を増強し得る例示的なアミノ酸置換（ＥＵ番号付けスキームによる）には、Ｅ２３３Ｌ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３５Ｓ、Ｇ２３６Ａ、Ｓ２３９Ｄ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｖ、Ｐ２４７Ｉ、Ｄ２８０Ｈ、Ｋ２９０Ｓ、Ｋ２９０Ｅ、Ｋ２９０Ｎ、Ｋ２９０Ｙ、Ｒ２９２Ｐ、Ｅ２９４Ｌ、Ｙ２９６Ｗ、Ｓ２９８Ａ、Ｓ２９８Ｄ、Ｓ２９８Ｖ、Ｓ２９８Ｔ、Ｔ２９９Ａ、Ｙ３００Ｌ、Ｖ３０５Ｉ、Ｑ３１１Ｍ、Ｋ３２６Ａ、Ｋ３２６Ｅ、Ｋ３２６Ｗ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｍ、Ａ３３０Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｄ３３３Ａ、Ｅ３３３Ｓ、Ｅ３３３Ａ、Ｋ３３４Ａ、Ｋ３３４Ｖ、Ａ３３９Ｄ、Ａ３３９Ｑ、Ｐ３９６Ｌ、又は上記のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４３】
他の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質（例えば、モノクローナル抗体）は、重鎖定常領域に、エフェクタ機能を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。エフェクタ機能を低下させることができる例示的なアミノ酸置換（ＥＵ番号付けスキームによる）には、Ｃ２２０Ｓ、Ｃ２２６Ｓ、Ｃ２２９Ｓ、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｖ、Ｖ２３４Ａ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｇ２３７Ａ、Ｐ２３８Ｓ、Ｓ２６７Ｅ、Ｈ２６８Ｑ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｇ、Ｖ３０９Ｌ、Ｅ３１８Ａ、Ｌ３２８Ｆ、Ａ３３０Ｓ、Ａ３３１Ｓ、Ｐ３３１Ｓ、又は上記のいずれかの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０１４４】
グリコシル化は、抗体、特にＩｇＧ１抗体のエフェクタ機能に寄与し得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、結合タンパク質のグリコシル化のレベル又は型に影響を及ぼす１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合又はＯ結合である。Ｎ結合は、糖鎖のアスパラギン残基側鎖への結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生成する。Ｏ結合グリコシル化は、糖のＮ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの１つのヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はトレオニンへの結合を指すが、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用され得る。
【０１４５】
特定の実施形態では、本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のグリコシル化を、１つ以上のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域に付加することによって増加させる。抗原結合タンパク質へのグリコシル化部位の付加は、上記のトリペプチド配列の１つ以上を含むようにアミノ酸配列を改変することによって都合よく達成され得る（Ｎ結合グリコシル化部位の場合）。改変はまた、１つ以上のセリン又はトレオニン残基の開始配列への付加、又はそれによる置換によってなされ得る（Ｏ結合グリコシル化部位に場合）。容易にするために、抗原結合タンパク質アミノ酸配列を、ＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンが生成されるように、予め選択された塩基で標的ポリペプチドをコードするＤＮＡを変異させることによって改変し得る。
【０１４６】
本発明はまた、エフェクタ活性の変化をもたらす改変糖鎖構造を有するＴＲＥＭ２抗原結合タンパク質分子、例えば、ＡＤＣＣ活性の向上を示すフコシル化が存在しないか又は減少した抗原結合タンパク質の産生を包含する。フコシル化を減少又は排除する様々な方法が当該技術分野で知られている。例えば、ＡＤＣＣエフェクタ活性は抗体分子のＦｃγＲＩＩＩ受容体への結合によって媒介され、これはＣＨ２ドメインのＮ２９７残基でのＮ結合型グリコシル化の糖鎖構造に依存することが示されている。非フコシル化抗体は高い親和性でこの受容体に結合し、ＦｃγＲＩＩＩ媒介エフェクタ機能を天然のフコシル化抗体よりも効率的に誘発する。例えば、アルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素がノックアウトされているＣＨＯ細胞における非フコシル化抗体の組換え産生は、ＡＤＣＣ活性が１００倍増加した抗体を生じる（Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．８７（５）：６１４−２２，２００４を参照）。同様の効果は、フコシル化経路におけるアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ酵素又は他の酵素の活性を減少させることによって、例えば、ｓｉＲＮＡ若しくはアンチセンスＲＮＡ処理、酵素をノックアウトするための細胞株の操作、又は選択的グリコシル化阻害剤との培養によって達成され得る（Ｒｏｔｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２６（１２）：１１１３−２３，１９８９を参照）。いくつかの宿主細胞株、例えば、Ｌｅｃ１３又はラットハイブリドーマＹＢ２／０細胞株は、より低いフコシル化レベルを有する抗体を天然に産生する（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７７（３０）：２６７３３−４０，２００２及びＳｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７８（５）：３４６６−７３，２００３を参照）。例えば、ＧｎＴＩＩＩ酵素を過剰発現する細胞において抗体を組換え産生することによる、二分された糖鎖レベルの増加もまた、ＡＤＣＣ活性を増加させることが判明している（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（２）：１７６−８０，１９９９を参照）。
【０１４７】
他の実施形態では、本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のグリコシル化を、１つ以上のグリコシル化部位を、例えば、結合タンパク質のＦｃ領域から除くことによって減少又は排除する。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、アグリコシル化ヒトモノクローナル抗体、例えばアグリコシル化ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。Ｎ結合グリコシル化部位を排除又は改変するアミノ酸置換により、抗原結合タンパク質のＮ結合グリコシル化を減少又は排除することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｑ、Ｎ２９７Ａ、又はＮ２９７ＧなどのＮ２９７の位置（ＥＵ番号付けスキームによる）での変異を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７の位置に変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。特定の一実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、Ｎ２９７Ｇ変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。例えば、いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号２０２の配列を含む重鎖定常領域を含む。
【０１４８】
Ｎ２９７変異を含む分子の安定性を改善するために、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のＦｃ領域をさらに操作することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域における１つ以上のアミノ酸が、二量体状態のジスルフィド結合形成を促進するためにシステインで置換される。したがって、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＶ２５９、Ａ２８７、Ｒ２９２、Ｖ３０２、Ｌ３０６、Ｖ３２３、又はＩ３３２（ＥＵ番号付けスキームによる）に対応する残基が、システインで置換され得る。好ましくは、残基の特定の対が互いにジスルフィド結合を優先的に形成するようにシステインで置換し、それによってジスルフィド結合のスクランブルを制限又は防止する。好ましい対には、Ａ２８７Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｖ２５９Ｃ及びＬ３０６Ｃ、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ、並びにＶ３２３Ｃ及びＩ３３２Ｃが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃの変異を有するヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む。このような実施形態では、Ｆｃ領域はまた、Ｎ２９７Ｇ変異などの、Ｎ２９７変異を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号２０３の配列を含む重鎖定常領域を含む。
【０１４９】
本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質（例えば、モノクローナル抗体）の重鎖のヒンジ領域及び／又はＣＨ１ドメイン、並びに／或いは軽鎖の定常領域に対する改変は、ジスルフィド不均一性を低減又は排除するためになされ得る。ＩｇＧ２抗体の構造不均一性は、ＩｇＧ２抗体のヒンジ領域及びＣＨ１領域におけるジスルフィド結合がシャッフルされて、異なるレベルの活性を有し得る異なる構造ジスルフィドアイソフォーム（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、及びＩｇＧ２Ａ−Ｂ）を生成し得る場合に観察されている。例えば、Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８３：１６２０６−１６２１５；Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４７：７４９６−７５０８，２００８；及びＷｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２７：１３８−１４８，２０１５を参照されたい。アミノ酸置換はヒンジ領域、ＣＨ１ドメイン、及び／又は軽鎖定常領域で行われ、単一のジスルフィドアイソフォームの形成を促進するか、又は抗原結合タンパク質（例えば、モノクローナル抗体）を特定のジスルフィドアイソフォーム（例えば、ＩｇＧ２Ａ又はＩｇＧ２Ｂ）に固定する。このような変異は、国際公開第２００９／０３６２０９号パンフレット及びＷｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２７：１３８−１４８，２０１５に記載されており（これらの文献はいずれも参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、それには、重鎖のＣ１３１Ｓ、Ｃ２１９Ｓ、及びＣ２２０Ｓ（ＥＵ番号付けスキームによる）変異、並びに軽鎖のＣ２１４Ｓ（ＥＵ番号付けスキームによる）変異が含まれる。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ２抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体である。いくつかのこのような実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体は、その重鎖に、Ｃ１３１Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含む。他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体は、その軽鎖に、Ｃ２１４Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含み、その重鎖に、Ｃ２２０Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含む。さらに他の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体は、その軽鎖に、Ｃ２１４Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含み、その重鎖に、Ｃ２１９Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含む。
【０１５０】
他の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、ヒトＩｇＧ２抗体由来のＣＨ１領域及びヒンジ領域、並びにヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域を含む抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体である。ＩｇＧ２抗体のヒンジ領域におけるジスルフィド結合の特有の配置は、特定の抗癌抗体に対する刺激活性を増強することが報告されている（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２７：１３８−１４８，２０１５）。この増強された活性は、ＩｇＧ１抗体のＣＨ１及びヒンジ領域をＩｇＧ２抗体のものと交換することによって、ＩｇＧ１型抗体に転移され得る（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。ＩｇＧ２ヒンジ領域は、アミノ酸配列ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号２０６）を含む。ヒトＩｇＧ２抗体由来のＣＨ１領域及びヒンジ領域のアミノ酸配列は、
【化５】
2020517249.tif 000028
のアミノ酸配列を含み得る。したがって、いくつかの実施形態では、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体は、ヒトＩｇＧ１抗体のＦｃ領域とともに配列番号２０７の配列を含む。このような実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、抗ＴＲＥＭ２抗体を特定のジスルフィドアイソフォームに固定するために、上記の変異の１つ以上を含み得る。例えば、一実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、ヒトＩｇＧ２抗体由来のＣＨ１領域及びヒンジ領域と、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域とを含み、その重鎖にＣ１３１Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含む。別の実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、ヒトＩｇＧ２抗体由来のＣＨ１領域及びヒンジ領域と、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域とを含み、その軽鎖にＣ２１４Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含み、その重鎖にＣ２２０Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含む。さらに別の実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体は、ヒトＩｇＧ２抗体由来のＣＨ１領域及びヒンジ領域と、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域とを含み、その軽鎖にＣ２１４Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含み、その重鎖にＣ２１９Ｓ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含む。
【０１５１】
抗ＴＲＥＭ２抗体が、ヒトＩｇＧ２抗体由来のＣＨ１領域及びヒンジ領域と、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域とを含む実施形態においては、抗ＴＲＥＭ２抗体は、抗体のグリコシル化を調節するために、上記のＦｃ領域における変異のいずれかを含み得る。例えば、このような抗ＴＲＥＭ２抗体のヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域は、その重鎖のアミノ酸位置Ｎ２９７（ＥＵ番号付けスキームによる）に変異を含み得る。特定の一実施形態では、Ｎ２９７変異はＮ２９７Ｇ変異である。特定の実施形態では、Ｆｃ領域は、その重鎖に、Ｒ２９２Ｃ及びＶ３０２Ｃ変異（ＥＵ番号付けスキームによる）を含む。
【０１５２】
特定の実施形態では、本発明の抗ＴＲＥＭ２抗体は、ヒトＩｇＧ２抗体由来のＣＨ１領域及びヒンジ領域と、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域とを含み、Ｆｃ領域は、
【化６】
2020517249.tif 000029
のアミノ酸配列を含む。
【０１５３】
他の実施形態では、本発明の抗ＴＲＥＭ２抗体は、ヒトＩｇＧ２抗体由来のＣＨ１領域及びヒンジ領域と、ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域とを含み、Ｆｃ領域は、
【化７】
2020517249.tif 000030
のアミノ酸配列を含む。
【０１５４】
血清半減期を増加させるための本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の改変はまた、例えば、サルベージ受容体結合エピトープの組み込み又は追加（例えば、適切な領域の変異による、又はエピトープをペプチドタグに組み込み、次いで、例えば、ＤＮＡ若しくはペプチド合成によって、いずれかの末端又は中央で抗原結合タンパク質に融合されることによる；例えば、国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照）、或いは、ＰＥＧ又は他の水溶性ポリマー、例えば、多糖ポリマーなどの追加によって所望され得る。サルベージ受容体結合エピトープは、好ましくは、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の任意の１つ以上のアミノ酸残基が抗原結合タンパク質中の類似の位置に転移される領域を構成する。より一層好ましくは、Ｆｃ領域の１つ又は２つのループ由来の３つ以上の残基が転移される。さらにより好ましくは、エピトープがＦｃ領域（例えば、ＩｇＧ  Ｆｃ領域）のＣＨ２ドメインから取られ、抗原結合タンパク質のＣＨ１、ＣＨ３、若しくはＶＨ領域、又は２つ以上のそのような領域に移される。或いは、エピトープがＦｃ領域のＣＨ２ドメインから取られ、抗原結合タンパク質のＣＬ領域若しくはＶＬ領域、又はその両方に移される。Ｆｃ変異体及びサルベージ受容体とのそれらの相互作用の説明については、国際公開第９７／３４６３１号パンフレット及び国際公開第９６／３２４７８号パンフレットを参照されたい。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号３３４の配列を含む軽鎖、及び配列番号３３５の配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号３３４の配列を含む軽鎖、及び配列番号３３６の配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号３３７の配列を含む軽鎖、及び配列番号３３８の配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号３３９の配列を含む軽鎖、及び配列番号３４０の配列を含む重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号３４１の配列を含む軽鎖、及び配列番号３４２の配列を含む重鎖を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号３３４、３３７、３３９又は３４１のアミノ酸配列からなる、又は本質的に配列番号３３４、３３７、３３９又は３４１のアミノ酸配列からなる軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、配列番号３３５、３３６、３３８、３４０又は３４２のアミノ酸配列からなる、又は本質的に配列番号３３５、３３６、３３８、３４０又は３４２のアミノ酸配列からなる重鎖を含む。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は軽鎖及び重鎖を含み、（ａ）軽鎖は配列番号３３４のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３３４のアミノ酸配列からなり、重鎖は配列番号３３５のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３３５のアミノ酸配列からなる；（ｂ）軽鎖は配列番号３３４のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３３４のアミノ酸配列からなり、重鎖は配列番号３３６のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３３６のアミノ酸配列からなる；（ｃ）軽鎖は配列番号３３７のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３３７のアミノ酸配列からなり、重鎖は配列番号３３８のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３３８のアミノ酸配列からなる；（ｄ）軽鎖は配列番号３３９のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３３９のアミノ酸配列からなり、重鎖は配列番号３４０のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３４０のアミノ酸配列からなる；或いは（ｅ）軽鎖は配列番号３４１のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３４１のアミノ酸配列からなり、重鎖は配列番号３４２のアミノ酸配列からなるか又は本質的に配列番号３４２のアミノ酸配列からなる。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は「二重特異性」であり、２つの異なる抗原、ヒトＴＲＥＭ２及び第２の抗原に特異的に結合することができることを意味する。特定の実施形態では、第２の抗原は、血液脳関門輸送を媒介する受容体など、血液脳関門を横断する輸送を促進するタンパク質である。このような受容体には、インスリン受容体、トランスフェリン受容体、レプチン受容体、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）受容体、低密度リポタンパク質受容体（例えば、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質２（ＬＲＰ２））、ヘパリン結合上皮成長因子様成長因子、ＣＤ９８重鎖（ＣＤ９８ｈｃ）、ベイシジン、ヒト膜貫通タンパク質３０Ａ（ＴＭＥＭ３０Ａ）、及びグルコーストランスポーター１型（Ｇｌｕｔ１）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、第２の抗原はヒトインスリン受容体である。一実施形態では、第２の抗原はヒトインスリン様成長受容体である。別の実施形態では、第２の抗原はヒトトランスフェリン受容体である。一実施形態では、第２の抗原はＴＭＥＭ３０Ａである。これらのいずれの例においても、ヒトＴＲＥＭ２結合ドメインは、多価二重特異性（ＩｇＧ−Ｆａｂ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ）のＮ末端若しくはＣ末端にあるか、又はＳｐｉｅｓｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７，９５−１０６（２０１５）及びＢｒｉｎｋｍａｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，ＭＡＢＳ  ９（２）１８２−２１２（２０１７）に記載される多重特異性結合フォーマットで発現され得る。
【０１５８】
特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は多価である。結合タンパク質の結合価は、結合タンパク質内の個々の抗原結合ドメインの数を示す。例えば、本発明の抗原結合タンパク質に関する用語「一価」、「二価」、及び「四価」は、それぞれ、１つ、２つ、及び４つの抗原結合ドメインを有する結合タンパク質を指す。したがって、多価抗原結合タンパク質は２つ以上の抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は二価である。したがって、このような二重特異性二価抗原結合タンパク質は、２つの抗原結合ドメイン、すなわち、ヒトＴＲＥＭ２に結合する１つの抗原結合ドメイン、及び血液脳関門を横切る輸送を促進する抗原などの第２の抗原に結合する１つの抗原結合ドメインを含む。他の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は多価である。例えば、特定の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は三価又は四価であり、３つ又は４つの抗原結合ドメイン、すなわち、ヒトＴＲＥＭ２に結合する１つ又は２つの抗原結合ドメイン、及び血液脳関門を横切る輸送を促進する抗原などの第２の抗原に結合する１つ又は２つの抗原結合ドメインを含む。
【０１５９】
「結合ドメイン」と互換的に使用される用語「抗原結合ドメイン」は、抗原と相互作用し、抗原結合タンパク質にその抗原に対する特異性及び親和性を付与するアミノ酸残基を含む抗原結合タンパク質の領域を指す。結合ドメインは、抗原に特異的に結合する抗体又はその機能的断片に由来し得る。特定の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２に結合する１つの抗原結合ドメインと、ヒトインスリン受容体に結合する１つの抗原結合ドメインとを含む。他の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２に結合する１つの抗原結合ドメインと、ヒトトランンスフェリン受容体に結合する１つの抗原結合ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２に結合する２つの抗原結合ドメインと、ヒトインスリン受容体に結合する２つの抗原結合ドメインとを含む。他の実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２に結合する２つの抗原結合ドメインと、ヒトトランスフェリン受容体に結合する２つの抗原結合ドメインとを含む。一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２に結合する１つ又は２つの抗原結合ドメインと、ヒトインスリン様成長受容体に結合する１つ又は２つの抗原結合ドメインとを含む。一実施形態では、本発明の二重特異性抗原結合タンパク質は、ヒトＴＲＥＭ２に結合する１つ又は２つの抗原結合ドメインと、ＴＭＥＭ３０Ａに結合する１つ又は２つの抗原結合ドメインとを含む。二重特異性ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質のヒトＴＲＥＭ２に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体のいずれかに由来し得る。ヒトインスリン受容体、ヒトインスリン様成長受容体、ＴＭＥＭ３０Ａ、又はヒトトランスフェリン受容体に結合する抗原結合ドメインは、米国特許第７，３８８，０７９号明細書、米国特許第８，６６３，５９８号明細書、及び米国特許公開第２０１５／０１１０７９１号明細書、Ａｂｕｌｒｏｂ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．９５，１２０１−１２１４（２００５）、並びにＭｕｒｕｇａｎａｎｄａｍ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１６，２４０−２４２（２００２）に記載されるものなどの、当該技術分野で知られるこれらの受容体に対するモノクローナル抗体に由来し得る。特定の実施形態では、ヒトインスリン受容体、ヒトインスリン様成長受容体、ＴＭＥＭ３０Ａ、又はヒトトランスフェリン受容体に結合する抗原結合ドメインは、単一ドメイン抗体である。特定の実施形態では、ヒトＴＲＥＭ２結合ドメインは、多価二重特異性（ＩｇＧ−Ｆａｂ、ＩｇＧ−ｓｃＦｖ）のＮ末端若しくはＣ末端にあるか、又はＳｐｉｅｓｓ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６７，９５−１０６（２０１５）及びＢｒｉｎｋｍａｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，ＭＡＢＳ  ９（２）１８２−２１２（２０１７）に記載されるものなどの、当該技術分野で知られる多重特異性結合フォーマットで発現され得る。
【０１６０】
二重特異性抗体を作製する方法は、当該技術分野で知られている。「二重特異性」抗原結合タンパク質又は抗体を作製する１つのこのような方法には、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’断片の連結が含まれる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ  ａｎｄ  Ｌａｃｈｍａｎｎ，１９９０，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：１５４７−１５５３を参照されたい。別の方法は、重鎖のＦｃ部分を、例えば、細胞中で同時発現される場合に重鎖のヘテロ二量体形成を促進する「ノブ」及び「ホール」を作製するように操作することを含む。例えば、国際公開第９６／０２７０１１号パンフレットを参照されたい。さらに別の方法はまた、重鎖のＦｃ部分を操作することを含むが、静電的ステアリングを使用して、ヘテロ二量体形成を促進する一方、細胞中で同時発現される場合に、重鎖のホモ二量体形成を妨げる。例えば、国際公開第２００９０８９００４号パンフレット及び国際公開第２０１４０８１９５５号パンフレットを参照されたい。
【０１６１】
本発明は、本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２アゴニストモノクローナル抗体などのＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質をコードする１つ以上の単離されたポリヌクレオチド又は単離された核酸を含む。加えて、本発明は、核酸を含むベクター、核酸を含む宿主細胞又は細胞株、及び本発明の抗原結合タンパク質を作製する方法を包含する。核酸は、例えば、抗原結合タンパク質の全部又は一部、例えば、本発明の抗体の一方若しくは両方の鎖、又はその断片、誘導体、ムテイン、若しくは変異体をコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定、分析、変異又は増幅するためのハイブリダイゼーションプローブ、ＰＣＲプライマー又はシークエンシングプライマーとして使用するのに十分なポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの発現を阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、及び上記の相補的配列を含む。核酸は、所望の使用又は機能に適した長さであり得、１つ以上のさらなる配列、例えば、調節配列を含み得、且つ／又はより大きな核酸、例えば、ベクターの一部であり得る。本発明の核酸分子には、一本鎖及び二本鎖の両方の形態のＤＮＡ及びＲＮＡ、並びに対応する相補的配列が含まれる。ＤＮＡには、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせが含まれる。本発明の核酸分子には、全長遺伝子又はｃＤＮＡ分子、並びにそれらの断片の組み合わせを含まれる。本発明の核酸は、ヒト供給源及び非ヒト種に由来し得る。
【０１６２】
免疫グロブリン又はその領域（例えば、可変領域、Ｆｃ領域など）又は目的のポリペプチドからの関連するアミノ酸配列は、直接タンパク質配列決定法によって決定され得、そして好適なコードヌクレオチド配列は普遍コドン表に従って設計し得る。或いは、本発明のモノクローナル抗体又はその結合断片をコードするゲノム又はｃＤＮＡは、実施例３に記載される方法のような従来の手順を使用して、そのような抗体を産生する細胞（例えば、ハイブリドーマ）から単離し、配列決定することができる。
【０１６３】
本明細書において「単離されたポリヌクレオチド」と互換的に使用される「単離された核酸」は、天然に存在する供給源から単離された核酸の場合、核酸が単離された生物のゲノムに存在する隣接遺伝子配列から分離された核酸である。例えば、ＰＣＲ産物、ｃＤＮＡ分子、又はオリゴヌクレオチドなどの、鋳型から酵素的に、又は化学的に合成された核酸の場合、このようなプロセスから得られる核酸は、単離された核酸であると理解される。単離された核酸分子は、別個の断片の形態の核酸分子、又はより大きな核酸構築物の成分としての核酸分子を指す。好ましい一実施形態では、核酸は、混入する内因性物質を実質的に含まない。核酸分子は、好ましくは、実質的に純粋な形態で、且つ標準的な生化学的方法（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に概説されるもの）によるその成分ヌクレオチド配列の同定、操作、及び回収を可能にする量又は濃度で、少なくとも１回単離されたＤＮＡ又はＲＮＡから誘導されている。このような配列は、好ましくは、通常、真核生物遺伝子に典型的に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供且つ／又は構築される。翻訳されないＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’又は３’に存在することができ、この場合、これはコード領域の操作又は発現を妨害しない。特に明記しない限り、本明細書で考察する任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左側末端は５’末端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左側方向は５’方向と呼ばれる。新生ＲＮＡ転写産物の５’から３’への産生の方向は転写方向と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の５’末端の５’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「上流配列」と呼ばれ、ＲＮＡ転写産物の３’末端の３’側にあるＲＮＡ転写産物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
【０１６４】
本発明はまた、中程度にストリンジェントな条件下、より好ましくは高度にストリンジェントな条件下で、本明細書中に記載されるようなポリペプチドをコードする核酸にハイブリダイズする核酸を含む。ハイブリダイゼーション条件の選択及び好適な条件を考案するための手引きに影響を及ぼす基本的なパラメータは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ９  ａｎｄ  １１、及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，１９９５，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ｓｅｃｔｉｏｎｓ  ２．１０  ａｎｄ  ６．３−６．４）に記載されており、当業者であればＤＮＡの長さ及び／又は塩基組成に基づいて容易に決定することができる。中程度にストリンジェントな条件を達成する１つの方法は、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、約５０％ホルムアミドのハイブリダイゼーション緩衝液、６×ＳＳＣ、及び約５５℃のハイブリダイゼーション温度を含む前洗浄溶液（又は、約４２℃のハイブリダイゼーション温度を有する約５０％ホルムアミドを含有するものなどの他の類似のハイブリダイゼーション溶液）、並びに０．５×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおける約６０℃の洗浄条件の使用を含む。一般に、高度にストリンジェントな条件は、約６８℃、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄する以外は、上記のようなハイブリダイゼーション条件として定義される。ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、及び１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）である）を、ハイブリダイゼーション緩衝液及び洗浄緩衝液中のＳＳＣ（１×ＳＳＣは０．１５Ｍ  ＮａＣｌ及び１５ｍＭクエン酸ナトリウム）に置き換えることができ、ハイブリダイゼーションが完了した後、１５分間洗浄を行う。当業者に知られており、以下にさらに記載するように、ハイブリダイゼーション反応及び二重鎖安定性を支配する基本原理を適用することによって、所望の程度のストリンジェンシーを達成するために、洗浄温度及び洗浄塩濃度を必要に応じて調節し得ることは理解されるべきである（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照）。
【０１６５】
核酸を未知の配列の標的核酸にハイブリダイズさせる場合、ハイブリッド長はハイブリダイズする核酸の長さであると仮定する。既知の配列の核酸をハイブリダイズする場合、ハイブリッド長は、核酸の配列を整列させ、最適な配列相補性の領域又は領域群を同定することによって決定することができる。長さが５０塩基対未満であると予想されるハイブリッドのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くなければならず、ここで、Ｔｍは以下の式に従って決定される。長さが１８塩基対未満のハイブリッドの場合、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。長さが１８塩基対を超えるハイブリッドでは、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］＋）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣの［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ）。好ましくは、このようなハイブリダイズする核酸の各々は、少なくとも１５ヌクレオチド（又はより好ましくは、少なくとも１８ヌクレオチド、若しくはは少なくとも２０ヌクレオチド、若しくは少なくとも２５ヌクレオチド、若しくは少なくとも３０ヌクレオチド、若しくは少なくとも４０ヌクレオチド、又は最も好ましくは、少なくとも５０ヌクレオチド）、或いはそれがハイブリダイズする本発明の核酸の長さの少なくとも２５％（より好ましくは、少なくとも５０％、若しくは少なくとも６０％、若しくは少なくとも７０％、及び最も好ましくは、少なくとも８０％）である長さを有し、且つ、それがハイブリダイズする本発明の核酸と少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％、及び最も好ましくは、少なくとも９９．５％）を有する。ここで、配列同一性は、上でより詳細に記載されるように、配列ギャップを最小化しながら、重複及び同一性が最大となるように整列させたときのハイブリダイズする核酸の配列を比較することによって決定される。
【０１６６】
本明細書に記載の変異体を含む抗原結合タンパク質の変異体は、ポリペプチドをコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異導入によって調製することができ、カセット若しくはＰＣＲ変異導入、又は当該技術分野でよく知られた他の技術を使用して、変異体をコードするＤＮＡを産生し、その後、本明細書に概説するように、細胞培養において組換えＤＮＡを発現する。しかし、約１００〜１５０個までの残基を有する変異体ＣＤＲを含む抗原結合タンパク質は、確立された技術を使用してインビトロ合成によって調製することができる。変異体は、通常、天然に存在するアナログと同じ定性的な生物学的活性、例えば、抗原への結合を示す。このような変異体は、例えば、抗原結合タンパク質のアミノ酸配列内の残基の欠失及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入及び置換のいずれかの組合せは、最終構築体が所望の特徴を有するなら、その最終構築体に到達するようになされる。アミノ酸の変化はまた、グリコシル化部位の数又は位置を変化させるなど、抗原結合タンパク質の翻訳後プロセスを変化させ得る。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質変異体は、エピトープ結合に直接関与するアミノ酸残基を改変する目的で調製される。他の実施形態では、エピトープ結合に直接関与しない残基、又はエピトープ結合に何ら関与しない残基の改変が、本明細書で論じる目的のために望ましい。ＣＤＲ領域、フレームワーク領域、及び／又は定常領域のいずれかにおける変異誘発が意図される。抗原結合タンパク質のアミノ酸配列における有用な修飾を設計するために、当業者は共変異分析技術を使用することができる。例えば、Ｃｈｏｕｌｉｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ４１：４７５−４８４，２０００；Ｄｅｍａｒｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：４１−４８，２００４；Ｈｕｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６（５）：３８１−８６，２００３；Ａｕｒｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願公開第２００８／０３１８２０７Ａ１号明細書；Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願公開第２００９／００４８１２２Ａ１号明細書；Ｕｒｅｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２００８／１１０３４８Ａ１号パンフレット；Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，国際公開第２００９／００００９９Ａ２号パンフレットを参照されたい。共変異分析によって決定されるそのような改変は、抗原結合タンパク質の効力、薬物動態、薬力学、及び／又は製造可能性の特性を向上させることができる。
【０１６７】
表６は、本明細書に記載の抗ＴＲＥＭ２抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードする例示的な核酸配列を示す。抗ＴＲＥＭ２抗体可変領域をコードするポリヌクレオチドは、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質を構築するために使用され得る。
【０１６８】
【表６−１】
2020517249.tif 000031
【０１６９】
【表６−２】
2020517249.tif 000032
【０１７０】
【表６−３】
2020517249.tif 000033
【０１７１】
【表６−４】
2020517249.tif 000034
【０１７２】
【表６−５】
2020517249.tif 000035
【０１７３】
【表６−６】
2020517249.tif 000036
【０１７４】
【表６−７】
2020517249.tif 000037
【０１７５】
【表６−８】
2020517249.tif 000038
【０１７６】
【表６−９】
2020517249.tif 000039
【０１７７】
【表６−１０】
2020517249.tif 000040
【０１７８】
本発明の抗原結合タンパク質の抗ＴＲＥＭ２結合ドメインをコードする単離された核酸は、表６に列挙したヌクレオチド配列のいずれかと少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、又は少なくとも９８％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体軽鎖可変領域をコードする単離された核酸は、配列番号２０８〜２３６及び３１３〜３１８から選択される配列と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、又は少なくとも９８％同一である配列を含む。特定の実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体軽鎖可変領域をコードする単離された核酸は、配列番号２０８〜２３６及び３１３〜３１８から選択される配列を含む。関連する実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体重鎖可変領域をコードする単離された核酸は、配列番号２３７〜２６４及び３１９〜３２５から選択される配列と少なくとも８０％同一、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、又は少なくとも９８％同一である配列を含む。他の関連する実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体重鎖可変領域をコードする単離された核酸は、配列番号２３７〜２６４及び３１９〜３２５から選択される配列を含む。
【０１７９】
表６に示す核酸配列は例示にすぎない。当業者に理解されるように、遺伝コードの縮重のために、極めて多数の核酸が作製され得、それらの全ては、本明細書の抗原結合タンパク質のＣＤＲ、可変領域、及び重鎖及び軽鎖、又は他の成分をコードする。したがって、特定のアミノ酸配列を同定したなら、当業者は、コードされたタンパク質のアミノ酸配列を変化させない方法で１つ以上のコドンの配列を単に改変することによって、任意の数の異なる核酸を作製し得るであろう。
【０１８０】
本発明はまた、本発明の抗原結合タンパク質の１つ以上の構成要素（例えば、可変領域、軽鎖、及び重鎖）をコードする１つ以上の核酸を含むベクターを含む。用語「ベクター」は、タンパク質コード情報を宿主細胞に移入するために使用される任意の分子又は実体（例えば、核酸、プラスミド、バクテリオファージ又はウイルス）を指す。ベクターの例には、プラスミド、ウイルスベクター、非エピソーム哺乳動物ベクター、及び発現ベクター、例えば組換え発現ベクターが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される用語「発現ベクター」又は「発現構築物」は、特定の宿主細胞における作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な、所望のコード配列及び適切な核酸制御配列を含む組換えＤＮＡ分子を指す。発現ベクターには、転写、翻訳、及びイントロンが存在する場合、それに作動可能に連結されたコード領域のＲＮＡスプライシングに影響を及ぼすか、又は制御する配列を含み得るが、これらに限定されない。原核生物での発現に必要な核酸配列には、プロモーター、任意選択によりオペレーター配列、リボソーム結合部位、及び、場合によりその他の配列が含まれる。真核細胞は、プロモーター、エンハンサー、並びに終結及びポリアデニル化シグナルを利用することが知られている。目的のコード配列に作動可能に連結された分泌シグナルペプチド配列もまた、任意選択的に、発現ベクターによってコードされ得、その結果、所望するなら細胞から目的ポリペプチドがより容易に単離されるように、組換え宿主細胞に発現ポリペプチドを分泌させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、シグナルペプチド配列は、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂに列挙された可変領域ポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に付加／融合され得る。特定の実施形態では、ＭＤＭＲＶＰＡＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＲＧＡＲＣ（配列番号２６５）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂ中の可変領域ポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合される。他の実施形態では、ＭＡＷＡＬＬＬＬＴＬＬＴＱＧＴＧＳＷＡ（配列番号２６６）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂ中の可変領域ポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合される。さらに他の実施形態では、ＭＴＣＳＰＬＬＬＴＬＬＩＨＣＴＧＳＷＡ（配列番号２６７）のアミノ酸配列を有するシグナルペプチドが、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂ中の可変領域ポリペプチド配列のいずれかのアミノ末端に融合される。本明細書に記載の可変領域ポリペプチド配列のアミノ末端に融合され得る他の好適なシグナルペプチド配列には、ＭＥＡＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号２６８）、ＭＥＷＴＷＲＶＬＦＬＶＡＡＡＴＧＡＨＳ（配列番号２６９）、ＭＥＴＰＡＱＬＬＦＬＬＬＬＷＬＰＤＴＴＧ（配列番号２７０）、ＭＫＨＬＷＦＦＬＬＬＶＡＡＰＲＷＶＬＳ（配列番号２７２）、ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号２７３）、ＭＤＩＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＫＣ（配列番号２７４）、ＭＤＩＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号２７５）、ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＴＦ（配列番号２７６）、ＭＤＴＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号２７７）、ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣ（配列番号２７８）、ＭＥＴＧＬＲＷＬＬＬＶＡＶＬＫＧＶＱＣＱＥ（配列番号２７９）、及びＭＤＭＲＡＰＴＱＬＬＧＬＬＬＬＷＬＰＧＡＲＣ（配列番号２８０）が含まれる。他のシグナル又は分泌ペプチドは当業者に知られており、例えば、特定の宿主細胞における発現を促進又は最適化するために、表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂに列挙された可変領域ポリペプチド鎖のいずれかに融合され得る。
【０１８１】
一般に、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質を産生するために宿主細胞中で使用される発現ベクターは、プラスミド維持のための配列、並びに抗原結合タンパク質の成分をコードする外因性ヌクレオチド配列のクローニング及び発現のための配列を含む。特定の実施形態において集合的に「フランキング配列」と呼ばれるこのような配列は、一般に、以下のヌクレオチド配列の一つ以上を含む：プロモーター、１つ以上のエンハンサー配列、複製起点、転写終結配列、ドナー及びアクセプタースプライス部位を含む完全イントロン配列、ポリペプチド分泌のためのリーダー配列をコードする配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化配列、発現されるべきポリペプチドをコードする核酸を挿入するためのポリリンカー領域、並びに選択マーカーエレメント。これらの配列の各々を以下に論じる。
【０１８２】
任意選択により、ベクターは「タグ」コード配列、すなわち、ポリペプチドコード配列の５’又は３’末端に位置するオリゴヌクレオチド分子を含み得、このオリゴヌクレオチドタグ配列はポリＨｉｓ（ｈｅｘａＨｉｓなど）、ＦＬＡＧ、ＨＡ（ヘマグルチニンインフルエンザウイルス）、ｍｙｃ、又は商業的に入手可能な抗体が存在する別の「タグ」分子をコードする。このタグは、通常、ポリペプチドの発現の際にポリペプチドに融合され、宿主細胞からのポリペプチドの親和性精製又は検出のための手段として機能し得る。親和性精製は、例えば、親和性マトリックスとしてタグに対する抗体を使用するカラムクロマトグラフィーによって達成され得る。任意選択により、その後、特定の切断用ペプチダーゼを使用するなどの様々な手段によって、精製されたポリぺプチドからタグを除去することができる。
【０１８３】
フランキング配列は、同種（すなわち、宿主細胞と同じ種及び／又は株由来）、異種（すなわち、宿主細胞種又は株以外の種由来）、ハイブリッド（すなわち、２つ以上の供給源由来のフランキング配列の組み合わせ）、合成又は天然であり得る。したがって、フランキング配列の供給源は、そのフランキング配列が宿主細胞機構において機能的であり、且つ宿主細胞機構によって活性化され得ることを条件として、任意の原核生物若しくは真核生物、任意の脊椎生物若しくは無脊椎生物、又は任意の植物であり得る。
【０１８４】
本発明のベクターに有用なフランキング配列は、当該技術分野でよく知られたいくつかの方法のいずれかによって得ることができる。通常、本明細書において有用なフランキング配列は、マッピング及び／又は制限エンドヌクレアーゼ消化によって以前に同定されており、したがって、適切な制限エンドヌクレアーゼを使用して適切な組織供給源から単離することができる。いくつかの例では、フランキング配列の完全なヌクレオチド配列が既知であり得る。ここでは、フランキング配列は、核酸合成又はクローニングに日常的に行われている方法を使用して合成することができる。
【０１８５】
フランキング配列の全て又は一部のみが知られているか否かにかかわらず、それは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して、及び／又はゲノムライブラリーを、同じ種又は別の種由来のオリゴヌクレオチド及び／又はフランキング配列断片などの好適なプローブでスクリーニングすることによって得ることができる。フランキング配列が知られていない場合、フランキング配列を含むＤＮＡの断片を、例えば、コード配列、又は別の遺伝子を含み得るＤＮＡのより大きな断片から単離することができる。単離は、制限エンドヌクレアーゼ消化によって適当なＤＮＡ断片を生成し、続いて、アガロースゲル精製、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）カラムクロマトグラフィー（Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、ＣＡ）、又は当業者に知られた他の方法を使用して単離することにより達成され得る。この目的の達成に好適な酵素の選択は、当業者には容易に明らかである。
【０１８６】
通常、複製起点は商業的に購入された原核生物の発現ベクターの一部であり、起点は宿主細胞におけるベクターの増幅を補助する。選択したベクターが複製部位の起点を含まない場合、既知の配列に基づいて化学的に合成し、ベクターに結合することができる。例えば、プラスミドｐＢＲ３２２（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）の複製起点は、ほとんどのグラム陰性細菌に好適であり、種々のウイルス起点（例えば、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、水疱性口炎ウイルス（ＶＳＶ）、又はＨＰＶ若しくはＢＰＶなどのパピローマウイルス）は、哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに有用である。一般に、複製成分の起点は哺乳動物発現ベクターには必要ではない（例えば、ＳＶ４０起点は、それがウイルス初期プロモーターも含むという理由からのみ、しばしば使用される）。
【０１８７】
転写終止配列は、一般に、ポリペプチドコード領域の３’側末端に位置し、転写を終結させる働きをする。通常、原核細胞における転写終止配列は、Ｇ−Ｃに富む断片とそれに続くポリＴ配列である。この配列はライブラリーから容易にクローニングされるか、又はベクターの一部として商業的に購入されるが、知られた核酸合成の方法を使用して容易に合成することもできる。
【０１８８】
選択マーカー遺伝子は、選択培養培地中で増殖させた宿主細胞の生存及び増殖に必要なタンパク質をコードする。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核宿主細胞に、抗生物質又は他の毒素、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、又はカナマイシンに対する耐性を付与する；（ｂ）細胞の栄養要求性欠損を補完する；又は（ｃ）複合培地又は限定培地からは利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。特異的選択マーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、及びテトラサイクリン耐性遺伝子である。有利なことに、ネオマイシン耐性遺伝子はまた、原核宿主細胞及び真核宿主細胞の両方で選択に使用することができる。
【０１８９】
他の選択遺伝子を用いて、発現される遺伝子を増幅することができる。増幅は、増殖又は細胞生存に重要なタンパク質の産生に必要とされる遺伝子が組換え細胞の累代の染色体内でタンデムに繰り返されるプロセスである。哺乳動物細胞に好適な選択マーカーの例には、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）及びプロモーターレスチミジンキナーゼ遺伝子が含まれる。哺乳動物細胞形質転換体を、この形質転換体のみがベクター中に存在する選択可能な遺伝子によって生存するように特異的に適合されている選択圧下に置く。選択圧は、培地中の選択剤の濃度が連続的に増加する条件下で形質転換された細胞を培養することによって課され、それによって、選択可能な遺伝子と、本明細書中に記載される抗原結合タンパク質の１つ以上の成分などの別の遺伝子をコードするＤＮＡとの両方の増幅を導く。その結果、増幅されたＤＮＡから多量のポリペプチドが合成される。
【０１９０】
リボソーム結合部位は、通常、ｍＲＮＡの翻訳開始に必要であり、シャイン・ダルガノ配列（原核生物）又はコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。このエレメントは、通常、プロモーターの３’及び発現されるべきポリペプチドのコード配列の５’に位置する。特定の実施形態では、１つ以上のコード領域は、内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結され得、単一のＲＮＡ転写物から２つのオープンリーディングフレームの翻訳を可能にする。
【０１９１】
真核宿主細胞発現系においてグリコシル化が所望される場合などのいくつかの場合には、グリコシル化又は収率を向上させるために、種々のプレ配列又はプロ配列を操作し得る。例えば、特定のシグナルペプチドのペプチダーゼ切断部位を改変するか、又はプロ配列を付加することができ、これもまたグリコシル化に影響し得る。最終タンパク質産物は−１位（成熟タンパク質の最初のアミノ酸に対して）に、発現に付随する１つ以上の追加のアミノ酸を有し得、これは、完全には除去されていなかったのかもしれない。例えば、最終タンパク質産物は、アミノ末端に結合した、ペプチダーゼ切断部位に見出される１個又は２個のアミノ酸残基を有し得る。或いは、酵素が成熟ポリペプチド内のこのような領域で切断する場合、いくつかの酵素切断部位の使用は所望のポリペプチドのわずかに切断された形態を生じ得る。
【０１９２】
本発明の発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、ポリペプチドをコードする分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む。本明細書で使用される用語「作動可能に連結された」は、所与の遺伝子の転写及び／又は所望のタンパク質分子の合成を指令することができる核酸分子が生成されるような方法で２つ以上の核酸配列が連結されていることを指す。例えば、タンパク質コード配列に「作動可能に連結される」ベクター中の制御配列は、タンパク質コード配列の発現が制御配列の転写活性と適合する条件下で行われるように、タンパク質コード配列に連結される。より具体的には、プロモーター及び／又はエンハンサー配列（シス作用性転写制御エレメントの任意の組み合わせを含む）は、それが適切な宿主細胞又は他の発現系においてコード配列の転写を刺激又は調節する場合、そのコード配列に作動可能に連結されている。
【０１９３】
プロモーターは、構造遺伝子の開始コドンの上流（すなわち、５’）に位置する非転写配列（一般に、約１００〜１０００ｂｐ以内）であり、構造遺伝子の転写を制御する。プロモーターは、通常、２つのクラス、誘導性プロモーター及び構成的プロモーターのうちの１つに分類される。誘導性プロモーターは、栄養素の有無又は温度の変化などの培養条件の何らかの変化に応じて、その制御下でＤＮＡからの転写レベルの増加を開始する。一方、構成的プロモーターはそれらが作動可能に連結されている遺伝子を均一に、すなわち、遺伝子発現に対する制御をほとんど又は全く行わずに転写する。種々の潜在的宿主細胞によって認識される多数のプロモーターがよく知られている。好適なプロモーターは、制限酵素消化により供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、所望のプロモーター配列をベクターに挿入することによって、例えば、本発明の抗原結合タンパク質の重鎖、軽鎖、又は他の成分をコードするＤＮＡに作動可能に連結される。
【０１９４】
酵母宿主と共に使用するのに好適なプロモーターもまた、当該技術分野においてよく知られている。酵母エンハンサーは、酵母プロモーターと共に有利に使用される。哺乳動物宿主細胞と共に使用するのに好適なプロモーターはよく知られており、以下に限定されるものではないが、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス血清型２、８又は９など）、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから得られるものが含まれる。他の好適な哺乳動物プロモーターには、異種哺乳動物プロモーター、例えば、熱ショックプロモーター及びアクチンプロモーターが含まれる。
【０１９５】
興味深いさらなるプロモーターには、ＳＶ４０初期プロモーター（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０）；ＣＭＶプロモーター（Ｔｈｏｒｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６５９−６６３）；ラウス羅臼肉腫ウイルスの３’側の長い末端反復に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０、Ｃｅｌｌ２２：７８７−７９７）；ヘルパスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４４−１４４５）；メタロチオニン遺伝子由来のプロモーター及び調節配列（Ｐｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２）；及びベータ−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物プロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）；又はｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５）が含まれるが、これらに限定されない。組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域もまた興味深い：膵臓腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−１２２）；リンパ系細胞において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４）；精巣、乳房、リンパ球及び肥満細胞において活性であるマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−４９５）；肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）；肝臓において活性であるアルファ−フェト−タンパク質遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：５３−５８）；肝臓において活性であるアルファ１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）；骨髄細胞において活性であるベータグロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４）；脳におけるオリゴデンドロサイト細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−７１２）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖２遺伝子制御領域（Ｓａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−２８６）；及び視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４）：１３７２−１３７８）。
【０１９６】
エンハンサー配列をベクターに挿入して、高等真核生物による抗原結合タンパク質の成分（例えば、軽鎖、重鎖、又は可変領域）をコードするＤＮＡの転写を増加させることができる。エンハンサーは、プロモーターに作用して転写を増加させる、通常、約１０〜３００ｂｐ長のＤＮＡのシス作用性エレメントである。エンハンサーは比較的方向及び位置に依存せず、転写単位に対して５’及び３’の両方の位置に見出されている。哺乳動物遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトタンパク質及びインスリン）。しかし、通常、ウイルス由来のエンハンサーが使用される。当該技術分野で知られているＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的な増強エレメントである。エンハンサーはコード配列に対して５’又は３’のいずれかでベクター中に位置し得るが、一般的にはプロモーターの５’の部位に位置する。適切な天然又は異種のシグナル配列（リーダー配列又はシグナルペプチド）をコードする配列を発現ベクターに組み込んで、抗原結合タンパク質の細胞外分泌を促進することができる。シグナルペプチド又はリーダーの選択は、抗原結合タンパク質が産生される宿主細胞の型に依存し、異種シグナル配列が天然シグナル配列を置換し得る。シグナルペプチドの例は上に記載されている。哺乳動物宿主細胞において機能する他のシグナルペプチドには、米国特許第４，９６５，１９５号明細書に記載されるインターロイキン−７（ＩＬ−７）のシグナル配列；Ｃｏｓｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：７６８に記載されるインターロイキン−２受容体のシグナル配列；欧州特許第０３６７  ５６６号明細書に記載されるインターロイキン−４受容体シグナルペプチド；米国特許第４，９６８，６０７号明細書に記載されるＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチド；欧州特許第０  ４６０  ８４６号に記載されるＩＩ型インターロイキン−１受容体シグナルペプチドが含まれる。
【０１９７】
発現ベクターは、市販のベクターなどの出発ベクターから構築し得る。このようなベクターは、所望のフランキング配列の全てを含むことも、また含まないこともあり得る。本明細書に記載のフランキング配列の１つ以上がベクター中にまだ存在しない場合、それらを個別に得て、ベクターに結合させることができる。フランキング配列の各々を得るために使用される方法は、当業者に周知である。発現ベクターを宿主細胞に導入し、それによって、本明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質を含むタンパク質を産生することができる。
【０１９８】
特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の異なる成分をコードする核酸を、同じ発現ベクターに挿入することができる。例えば、抗ＴＲＥＭ２抗体軽鎖又は可変領域をコードする核酸を、抗ＴＲＥＭ２抗体重鎖又は可変領域をコードする核酸と同じベクターにクローニングすることができる。そのような実施形態では、軽鎖及び重鎖が同じｍＲＮＡ転写物から発現されるように、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）により、且つ単一のプロモーターの制御下で、２つの核酸が分離され得る。或いは、２つの核酸は、軽鎖及び重鎖が２つの別個のｍＲＮＡ転写物から発現されるように、２つの別個のプロモーターの制御下にあり得る。いくつかの実施形態では、抗ＴＲＥＭ２抗体軽鎖又は可変領域をコードする核酸が１つの発現ベクターにクローニングされ、抗ＴＲＥＭ２抗体重鎖又は可変領域をコードする核酸が第２の発現ベクターにクローニングされる。このような実施形態では、宿主細胞は、本発明の完全な抗原結合タンパク質を産生するために、両方の発現ベクターで同時トランスフェクトされ得る。
【０１９９】
ベクターが構築され、本明細書に記載の抗原結合タンパク質の成分をコードする１つ以上の核酸分子がベクターの適当な部位に挿入された後、完成したベクターは、増幅及び／又はポリペプチド発現に好適な宿主細胞に挿入され得る。したがって、本発明は、本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の成分をコードする１つ以上の発現ベクターを含む、単離された宿主細胞又は細胞株を包含する。本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、核酸で形質転換されているか、又は形質転換され得、それによって目的遺伝子を発現する細胞を指す。この用語には、目的遺伝子が存在する限り、子孫の形態又は遺伝的構成が元の親細胞と同一であるか否かにかかわらず、親細胞の子孫が含まれる。好ましくは少なくとも１つの発現制御配列（例えば、プロモーター又はエンハンサー）に作動可能に連結された、本発明の単離された核酸を含む宿主細胞は、「組換え宿主細胞」である
【０２００】
抗原結合タンパク質の発現ベクターの選択された宿主細胞への形質転換は、トランスフェクション、感染、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、又は他の知られた技術を含むよく知られた方法によって達成され得る。選択される方法は、部分的に、使用される宿主細胞の型の機能である。これらの方法及び他の好適な方法は当業者によく知られており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１に記載されている。
【０２０１】
宿主細胞は、適切な条件下で培養されると、抗原結合タンパク質を合成し、これは、続いて、培養培地（宿主細胞がそれを培地中に分泌する場合）から、又はそれを産生する宿主細胞（それが分泌されない場合）から直接回収され得る。適切な宿主細胞の選択は、所望する発現レベル、活性（グリコシル化又はリン酸化など）のために所望されるか又は必要であるポリペプチドの改変）及び生物学的に活性な分子へのフォールディングの容易さなどの種々の因子に依る。
【０２０２】
例示的な宿主細胞には、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞が含まれる。原核生物の宿主細胞には、グラム陰性又はグラム陽性微生物などの真正細菌、例えば腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）、例えばエシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、例えばサルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、例えばセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）、及びシゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、並びにバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、例えばＢ．ズブチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、Ｂ．リケニフォルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）が含まれる。真核生物の微生物、例えば糸状菌又は酵母は、組換えポリペプチドに好適な適切なクローニング宿主又は発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）又は一般的なパン酵母は、下等真核生物宿主微生物の中で最も一般的に使用される。しかしながら、ピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）、例えばＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、クロイベロミセス属（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ヤロウイア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、トリコデルマ・レシア（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｉａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、シュヴァンニオミセス属（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ）、例えばシュヴァンニオミセス・オシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ）、並びに糸状菌、例えばニューロスポラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラジウム属（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、及びアスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）宿主、例えばＡ．ニドゥランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）などの多くの他の属、種及び株が一般に利用可能であり、ここで有用である、
【０２０３】
グリコシル化抗原結合タンパク質の発現のための宿主細胞は、多細胞生物由来であり得る。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変異体、並びにツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（イモ虫）、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（蚊）、ヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）（蚊）、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ミバエ）、及びカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）などの宿主由来の対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。このような細胞のトランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファカリフォルニアＮＰＢ（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ  ＮＰＶ）のＬ−１変異体及びカイコＮＰＶ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ  ＮＰＶ）のＢｍ−５株）が公に入手可能である。
【０２０４】
脊椎動物宿主細胞もまた好適な宿主であり、このような細胞からの抗原結合タンパク質の組換え産生は常法となっている。発現の宿主として利用可能な哺乳動物細胞株は、当該技術分野でよく知られており、限定はされないが、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）から入手可能な不死化細胞株、例えば、限定はされないが、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ６１）、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６，１９８０）；ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株；ヒト胚腎臓株（懸濁培養液中の増殖用としてサブクローニングされた２９３又は２９３細胞（Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９，１９７７）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞癌細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８，１９８２）；ＭＲＣ  ５細胞又はＦＳ４細胞；哺乳動物骨髄腫細胞、及び多くの他の細胞株が含まれる。特定の実施形態では、どの細胞株が高い発現レベルを有し、ヒトＴＲＥＭ２結合特性を有する抗原結合タンパク質を構成的に産生するかを決定することによって、細胞株を選択することができる。別の実施形態では、それ自身の抗体を作製しないが、異種抗体を作製及び分泌する能力を有する、Ｂ細胞系列由来の細胞株を選択することができる。いくつかの実施形態では、ＣＨＯ細胞が、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の発現に好ましい宿主細胞である。
【０２０５】
宿主細胞はＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の産生のために、上記の核酸又はベクターで形質転換又はトランスフェクトされ、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために適切に改変された従来の栄養培地中で培養される。さらに、選択マーカーによって分離された転写単位の複数のコピーを有する新規ベクター及びトランスフェクトされた細胞株は、抗原結合タンパク質の発現に特に有用である。したがって、本発明はまた、本明細書に記載されるＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質、例えば、抗ＴＲＥＭ２アゴニストモノクローナル抗体又はその結合断片を産生するための方法を提供し、これは、本明細書に記載される１つ以上の発現ベクターを含む宿主細胞を、１つ以上の発現ベクターによってコードされる抗原結合タンパク質の発現を可能にする条件下、培養培地中で培養する工程；及び抗原結合タンパク質を培養培地又は宿主細胞から回収する工程を包含する。
【０２０６】
本発明の抗原結合タンパク質を産生するために使用される宿主細胞は、様々な培地中で培養され得る。ハムＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４，１９７９；Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５，１９８０；米国特許第４，７６７，７０４号明細書；同第４，６５７，８６６号明細書；同第４，９２７，７６２号明細書；同第４，５６０，６５５号明細書；若しくは同第５，１２２，４６９号明細書；国際公開第９０１０３４３０号パンフレット；国際公開第８７／００１９５号パンフレット；又は米国再発行特許第３０，９８５号明細書に記載される培地のいずれかを宿主細胞の培養培地として使用することができる。これらの培地のいずれかは、必要に応じて、ホルモン及び／又は他の成長因子（インスリン、トランスフェリン、又は上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸塩など）、緩衝液（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（ゲンタマイシン（商標）薬剤）、微量元素（通常、マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物として定義される）、並びにグルコース又は同等のエネルギー源を補充され得る。任意の他の必要な栄養補助物質もまた、当業者に知られる適切な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前に使用されたものであり、当業者に明らかである。
【０２０７】
宿主細胞を培養すると、抗原結合タンパク質は、細胞内、細胞膜周辺腔内で産生されるか、又は培地中に直接分泌され得る。抗原結合タンパク質が細胞内で産生される場合、第１の工程として、微粒子の破片、すなわち宿主細胞又は溶解した断片を、例えば、遠心分離又は限外濾過によって除去する。抗原結合タンパク質は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、カチオン若しくはアニオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、又は好ましくは、親和性リガンドとして目的の抗原又はプロテインＡ若しくはプロテインＧを使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができる。プロテインＡは、ヒト免疫グロブリンγ１、γ２又はγ４重鎖に基づくポリペプチドを含むタンパク質を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３，１９８３。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒト免疫グロブリンγ３に推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：１５６７１５７５，１９８６）。親和性リガンドが結合するするマトリックスはほとんどの場合アガロースであるが、他のマトリックスも利用可能である。コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）又はポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。タンパク質がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製に有用である。回収される特定の抗原結合タンパク質に応じて、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のための他の技術も可能である。
【０２０８】
特定の実施形態では、本発明は、本発明の１つ又は複数のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質（例えば、抗ＴＲＥＭ２アゴニストモノクローナル抗体又はその結合断片）を、薬学的に許容される希釈剤、担体、賦形剤、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、及び／又はアジュバントと共に含む組成物（例えば、医薬組成物）を提供する。本発明の医薬組成物には液体、凍結及び凍結乾燥組成物が含まれるが、これらに限定されない。「薬学的に許容される」とは、使用される用量及び濃度でヒトレシピエントに対して非毒性であり、且つ／又はヒトに投与された場合にアレルギー若しくは副作用を生じない分子、化合物、及び組成物を指す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、例えば、組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭気、無菌性、安定性、溶解又は放出速度、吸着又は浸透を改変、維持又は保存するための製剤材料を含有し得る。このような実施形態において、好適な製剤材料には、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなど）；抗微生物剤；抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム又は亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、重炭酸塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩又は他の有機酸など）；増量剤（メンニトール又はグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ−シクロデキストリン又はヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖類；及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤及び希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸又は過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール又はポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトール又はソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤又は湿潤剤（例えば、ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０などのポリソルベート、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパールなど）；安定性増強剤（スクロース又はソルビトール）；等張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウム又は塩化カリウム、マンニトール  ソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤、並びに／或いは医薬アジュバントが含まれるが、これらに限定されない。治療使用のための分子を製剤化する方法及び好適な材料は医薬分野において知られており、例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されている。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、滅菌リン酸緩衝生理食塩水、静菌水などの標準的な医薬担体を含む。種々の水性担体、例えば、水、緩衝水、０．４％生理食塩水、０．３％グリシンなどを使用することができ、穏やかな化学的改変などに供されるアルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの、安定性を高めるための他のタンパク質を含み得る。
【０２１０】
製剤中の抗原結合タンパク質の例示的な濃度は、約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約２００ｍｇ／ｍｌ、又は約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、又は約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２５ｍｇ／ｍＬ、又は約２ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。抗原結合タンパク質の水性製剤は、例えば、約４．５〜約６．５、又は約４．８〜約５．５、又は約５．０のｐＨの、ｐＨ緩衝溶液で調製され得る。この範囲のｐＨに好適な緩衝液の例には、酢酸塩（例えば、酢酸ナトリウム）、コハク酸塩（例えば、コハク酸ナトリウム）、グルコン酸塩、ヒスチジン、クエン酸塩、及び他の有機酸緩衝液が含まれる。緩衝液濃度は、例えば、緩衝液及び製剤の所望の等張性に応じて、約１ｍＭ〜約２００ｍＭ、又は約１０ｍＭ〜約６０ｍＭであり得る。
【０２１１】
抗原結合タンパク質を安定化させることもできる等張化剤を製剤に含めることができる。例示的な等張化剤には、マンニトール、スクロース又はトレハロースなどのポリオールが含まれる。好ましくは、水性製剤は等張性であるが、高張性又は低張性の溶液が好適であり得る。製剤中のポリオールの例示的な濃度は、約１重量／体積％〜約１５重量／体積％の範囲であり得る。
【０２１２】
界面活性剤を抗原結合タンパク質製剤に添加して、製剤化抗原結合タンパク質の凝集を減少させ、且つ／又は製剤中の粒子の形成を最小限にし、且つ／又は吸着を減少させることもできる。例示的な界面活性剤には、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０若しくはポリソルベート８０）又はポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。界面活性剤の例示的な濃度は、約０．００１重量／体積％〜約０．５重量／体積％、又は約０．００５重量／体積％〜約０．２重量／体積％、又は約０．００４重量／体積％〜約０．０１％重量／体積の範囲であり得る。
【０２１３】
一実施形態では、製剤は上記の薬剤（すなわち、抗原結合タンパク質、緩衝液、ポリオール、及び界面活性剤）を含有し、ベンジルアルコール、フェノール、ｍ−クレゾール、クロロブタノール、及び塩化ベンゼトニウムなどの１種以上の防腐剤を実質的に含まない。別の実施形態では、防腐剤は、例えば、約０．１％〜約２％、又は約０．５％〜約１％の範囲の濃度で製剤に含まれ得る。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ，ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙに記載されているものなどの１種以上の他の薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤は、製剤の所望の特性に悪影響を及ぼさないならば、製剤中に含まれてもよい。
【０２１４】
抗原結合タンパク質の治療製剤は、所望の純度を有する抗原結合タンパク質を、任意選択による生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ、ｅｄ．），１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）と、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で混合することによって、貯蔵のために調製される。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、使用される用量及び濃度でレシピエントに対して無毒であり、緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸）；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、及びメチオニン）；防腐剤（塩化オクタデシルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼチオニウム、フェノール、ブチル若しくはベンジルアルコール、メチルパラベン若しくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾール）；低分子量（例えば、約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン）；グルコース、マンノース、マルトース又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；並びに／或いは、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０若しくはポリソルベート８０）、又はポロキサマー（例えば、ポロキサマー１８８）、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれる。
【０２１５】
一実施形態では、特許請求される本発明の好適な製剤は、リン酸塩、酢酸塩、又はトリス緩衝液などの等張性緩衝液を、ポリオール、ソルビトール、スクロース、又は塩化ナトリウムなどの等張化剤（これは等張化し、安定化する）と組み合わせて含有する。このような等張化剤の一例は、５％ソルビトール又はスクロースである。さらに、製剤は、例えば、凝集を防止するため、又は安定性を高めるために、０．０１重量／体積％〜０．０２％重量／体積の界面活性剤を、任意選択的に含むことができる。製剤のｐＨは、４．５〜６．５又は４．５〜５．５の範囲であり得る。抗原結合タンパク質のための医薬製剤の他の例示的な説明は、米国特許出願公開第２００３／０１１３３１６号明細書及び米国特許第６，１７１，５８６号明細書に見出すことができ、これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２１６】
抗原結合タンパク質の懸濁液及び結晶形態もまた意図される。懸濁液及び結晶形態を作製する方法は当業者に知られている。
【０２１７】
インビボでの投与に使用される製剤は無菌でなければならない。本発明の組成物は、従来のよく知られた滅菌技術によって滅菌され得る。例えば、滅菌は、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。得られた溶液は、使用のために包装され得るか、又は無菌条件下で濾過され、凍結乾燥され得る。凍結乾燥された調製物は投与の前に滅菌溶液と組み合わされる。
【０２１８】
凍結乾燥のプロセスは、特にポリペプチドが液体組成物中で比較的不安定である場合、長期保存にポリペプチドを安定化するためにしばしば使用される。凍結乾燥サイクルは、通常、３つの工程、すなわち、凍結、一次乾燥、及び二次乾燥からなる（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｐｏｌｌｉ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３８、Ｎｕｍｂｅｒ  ２，ｐａｇｅｓ  ４８−５９，１９８４を参照）。凍結工程では、溶液を、十分に凍結するまで冷却する。溶液中のバルク水はこの段階で氷を形成する。氷は一次乾燥段階で昇華する。これは、真空を使用して、氷の蒸気圧未満にチャンバー圧力を低下させることによって行われる。最後に、吸着又は結合した水が、二次乾燥段階において、減圧したチャンバー圧力及び高い棚温度下で除去される。この方法は、凍結乾燥ケーキとして知られる物質を製造する。その後、ケーキは使用前に再溶解することができる。
【０２１９】
凍結乾燥物質の標準的な再溶解の実施は、ある量の純水（通常、凍結乾燥の間に除去された量に等しい）を加えることであるが、時には、抗菌剤の希釈溶液が非経口投与用の医薬の製造において使用される（Ｃｈｅｎ，Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８：１３１１−１３５４，１９９２を参照）。
【０２２０】
場合によっては、賦形剤が凍結乾燥製品の安定剤として作用することが知られている（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｏｌｕｍｅ  ７４：２２５−２３９，１９９１を参照）。例えば、知られている賦形剤には、ポリオール（マンニトール、ソルビトール及びグリセロールを含む）、糖（グルコース及びスクロースを含む）、並びに及びアミノ酸（アラニン、グリシン及びグルタミン酸を含む）が含まれる。
【０２２１】
さらに、ポリオール及び糖はまた、ポリペプチドを凍結及び乾燥によって誘発される損傷から保護し、且つ乾燥状態での保存の間の安定性を増強するために使用される。一般に、糖、特に二糖類は、凍結乾燥プロセス及び貯蔵中の両方で有効である。単糖類及び二糖類、並びにＰＶＰなどのポリマーを含む他のクラスの分子も、凍結乾燥製品の安定剤として報告されている。
【０２２２】
注射には、医薬製剤及び／又は薬剤は、上記のような適切な溶液で再溶解するのに好適な粉末であり得る。これらの例には、凍結乾燥、回転乾燥又は噴霧乾燥した粉末、非晶質粉末、顆粒、沈殿物、又は粒子が含まれるが、これらに限定されない。注射には、製剤は、任意選択により、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、バイオアベイラビリティ調整剤、及びこれらの組み合わせを含有し得る。
【０２２３】
徐放性製剤が調製され得る。徐放性製剤の好適な例には、抗原結合タンパク質を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスは成形品、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、又はポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号明細書）、Ｌ−グルタミン酸とｙ−エチル−Ｌ−グルタミン酸とのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、Ｌｕｐｒｏｎ  Ｄｅｐｏｔ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドから構成される注射可能なマイクロスフェア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン酢酸ビニル及び乳酸−グリコール酸などのポリマーは、１００日間を超えて分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間の間しかタンパク質を放出できない。カプセル化ポリペプチドが長時間体内に残存する場合、それらは３７℃で水分に曝露される結果、変性又は凝集し、生物学的活性の喪失及び免疫原性の可能性のある変化を生じ得る。関与するメカニズムに応じた安定化のための合理的方法を考えることができる。例えば、凝集メカニズムが分子間のチオ−ジスルフィド交換によるＳ−Ｓであることがわかったなら、安定化は、スルフヒドリル残基の改変、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含量の制御、適切な添加剤の使用、及び特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成し得る。
【０２２４】
本発明の製剤は、短時間作用性、迅速放出性、長時間作用性、又は持続放出性であるように設計され得る。したがって、医薬製剤はまた、制御放出又は徐放のために製剤化され得る。
【０２２５】
具体的な用量は、処置される疾患、障害、又は状態（例えば、アルツハイマー病、多発性硬化症、前頭側頭型認知症、又は那須・ハコラ病）、対象の年齢、体重、一般的な健康状態、性別、及び食事、用量間隔、投与経路、排泄速度、並びに薬物の組み合わせに応じて調節され得る。
【０２２６】
本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、くも膜下、脳内、脳室内、及び鼻腔内を含む任意の好適な手段によって、並びに、所望であれば、局所処置のために、病変内投与によって投与され得る。非経口投与には、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮内又は皮下投与が含まれる。さらに、抗原結合タンパク質は、好適には、パルス注入によって、特に抗原結合タンパク質の用量を減少させて投与される。投与が短期的なものか長期的なものかにある程度基づき、投与は注射により行われることが好ましく、静脈内又は皮下注射によって行なわれることが最も好ましい。局所、特に経皮、経粘膜、直腸、経口、又は、例えば、所望の部位の近くに配置されるカテーテルによる局所の投与を含む、他の投与方法が意図される。特定の実施形態では、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、生理学的溶液中、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で、毎日〜毎週〜毎月（例えば、毎日、１日おき、３日おき、又は１、２、３、４、５、若しくは６回／週）の頻度で、好ましくは、０．１〜４５ｍｇ／ｋｇ、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ、又は０．１〜１０ｍｇ／ｋｇの用量で、週に１回、２週に１回、又は月に１回の頻度で静脈内又は皮下投与される。
【０２２７】
本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質（例えば、抗ＴＲＥＭ２アゴニストモノクローナル抗体及びその結合断片）は、それを必要とする患者におけるＴＲＥＭ２欠損、すなわちＴＲＥＭ２の生物学的機能の喪失に関連する状態の予防、処置又は改善に有用である。本明細書で使用される場合、用語「処置する」又は「処置」は、障害の発生を予防するか、又は障害の病状を改変することを意図して行われる介入である。したがって、「処置」は、治療的処置と、予防的又は防止的措置の両方を指す。処置を必要とする患者には、障害又は状態と既に診断されているか、又はそれに罹患している患者、並びに障害又は状態を予防すべき患者、例えば、遺伝マーカーに基づいて障害又は状態を発症するリスクがある患者が含まれる。「処置」には、任意の客観的又は主観的パラメータ（例えば、症状の軽減、寛解、減少、或いは損傷、病変若しくは状態を患者により耐えられるようにすること、変性若しくは衰弱の速度を遅くすること、変性の最終点をより悪化させないようにすること、又は患者の身体的若しくは精神的健康を改善すること）を含む、損傷、病変又は状態の改善における成功の任意の指標を含む。症状の処置又は改善は、身体検査の結果、患者による自己報告、認知検査、運動機能検査、神経精神病学的検査、及び／又は精神鑑定を含む、客観的又は主観的パラメータに基づき得る。
【０２２８】
ＴＲＥＭ２生物学的活性は、食作用、増殖、生存、及び炎症性サイトカイン産生の調節などの骨髄細胞プロセス；破骨細胞形成；破骨細胞分化；自己免疫の負の調節；炎症反応；骨再形成及び修復；骨吸収；組織修復、小膠細胞症、並びに脳ホメオスタシスを含む、種々の生理学的プロセスに関与している。例えば、Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３：４４５−４５３、２００３；Ｐａｒａｄｏｗｓｋａ−Ｇｏｒｙｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．７４：７３０−７３７，２０１３；及びＵｌｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．７：４２０−４２７，２０１６を参照されたい。ＴＲＥＭ２機能の喪失又はＴＲＥＭ２欠損は、硬化性白質脳症を伴う脂肪膜性多発嚢胞性骨異形成症（ＰＬＯＳＬ；那須・ハコラ病としても知られている）、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症、プリオン病、脳卒中、骨粗鬆症、及び大理石骨病を含むいくつかの障害及び疾患に関連している。例えば、Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３６８：１０７−１１６，２０１３；Ｇｕｅｒｒｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３６８：１１７−１２７，２０１３；Ｐａｒａｄｏｗｓｋａ−Ｇｏｒｙｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．７４：７３０−７３７，２０１３；及びＵｌｒｉｃｈ  ａｎｄ  Ｈｏｌｔｚｍａｎ，ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，Ｖｏｌ．７：４２０−４２７，２０１６を参照されたい。したがって、本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、これらの疾患若しくは障害、或いはＴＲＥＭ２欠損又はＴＲＥＭ２の生物学的機能若しくは活性の喪失に関連する他の状態のいずれかを予防、改善、又は処置するために患者に投与され得る。特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の有効量を患者に投与することを含む、それを必要としている患者におけるＴＲＥＭ２欠損又はＴＲＥＭ２機能の喪失に関連する状態を予防、処置、又は改善するための方法を提供する。特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、抗ＴＲＥＭ２アゴニストモノクローナル抗体又はその結合断片である。用語「患者」にはヒト患者が含まれ、用語「対象」と互換的に使用される
【０２２９】
「有効量」は一般に、症状の重症度及び／若しくは頻度を減少させ、症状及び／若しくは根底にある原因を排除し、症状及び／若しくはその根底にある原因の発生を予防し、且つ／又は特定の状態から生じるか、又は特定の状態に関連する損傷を改善又は修復するのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、治療有効量又は予防有効量である。「治療有効量」は、疾患状態又は症状、特に疾患状態に関連する状態又は症状を治療するのに十分な量、或いは、疾患状態又は疾患に関連する他の望ましくない症状の進行をいかなる方法であれ防止、妨害、遅延又は逆転させる（すなわち「治療効果」を提供する）のに十分な量である。「予防有効量」は、対象に投与されると、意図した予防効果、例えば、状態の発症（又は再発）を防止若しくは遅延させる、又は状態の発症開始（又は再発）の可能性を減少させる抗原結合タンパク質の量である。完全な治療又は予防効果は、必ずしも１用量の投与によって生じず、一連の用量の投与後にのみ生じ得る。したがって、治療又は予防有効量を、１回以上の投与で投与することができる。
【０２３０】
本発明の方法に従って予防、処置又は改善され得るＴＲＥＭ２欠損又はＴＲＥＭ２機能の喪失に関連する状態又は障害には、那須・ハコラ病、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症、ギラン・バレー症候群、筋萎縮性側索硬化症、パーキンソン病、外傷性脳損傷、脊髄損傷、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、プリオン病、脳卒中、骨粗鬆症、大理石骨病、及び骨硬化症が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、本発明の方法に従って予防、処置、又は改善される状態又は障害は、アルツハイマー病、那須・ハコラ病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症、プリオン病、又は脳卒中である。
【０２３１】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の有効量を患者に投与することを含む、それを必要としている患者のアルツハイマー病を予防、処置、又は改善するための方法を提供する。特定の実施形態では、患者に投与されるＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、抗ＴＲＥＭ２アゴニストモノクローナル抗体、例えば、その可変配列及びＣＤＲ配列が表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂに記載されている抗体である。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質を投与される患者は、アルツハイマー病を発症するリスクのある患者である。例えば、一実施形態では、患者は、ＴＲＥＭ２遺伝子にｒｓ７５９３２６２８−Ｔ変異を含む少なくとも１つのアレルを有することが確定しており、例えば、患者はｒｓ７５９３２６２８にＣＴの遺伝子型を有する。関連する実施形態では、アルツハイマー病を発症するリスクのある患者は、配列番号１の４７位のアルギニンの代わりにヒスチジンをコードするＴＲＥＭ２変異体アレルを保有することが確定している患者である。他の実施形態では、患者は、ＴＲＥＭ２遺伝子にｒｓ１４３３３２４８４−Ｔ変異を含む少なくとも１つのアレルを有することが確定しており、例えば、患者はｒｓ１４３３３２４８４にＣＴの遺伝子型を有する。関連する実施形態では、アルツハイマー病を発症するリスクのある患者は、配列番号１の６２位のアルギニンの代わりにヒスチジンをコードするＴＲＥＭ２変異体アレルを保有することが確定している患者である。いくつかの実施形態では、アルツハイマー病を発症するリスクのある患者は、ＴＲＥＭ１遺伝子にｒｓ６９１０７３０−Ｇ変異を含む少なくとも１つのアレルを有する、ＴＲＥＭ２遺伝子の上流にｒｓ７７５９２９５−Ｃ変異を含む少なくとも１つのアレルを有する、且つ／又はＡＰＯＥ遺伝子の少なくとも１つのε４アレルを有することが確定している。
【０２３２】
別の形態では、本発明は、本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の有効量を患者に投与することを含む、それを必要としている患者の前頭側頭型認知症、又は那須・ハコラ病を予防、処置、又は改善するための方法を提供する。特定の実施形態では、患者に投与されるＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、抗ＴＲＥＭ２アゴニストモノクローナル抗体、例えば、その可変配列及びＣＤＲ配列が表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂに記載されている抗体である。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質を投与される患者は、前頭側頭型認知症、又は那須・ハコラ病を発症するリスクのある患者である。例えば、そのような一実施形態では、患者は、ＴＲＥＭ２遺伝子にｒｓ１０４８９４００２−Ａ変異を含む少なくとも１つのアレルを有することが確定しており、例えば、患者はｒｓ１０４８９４００２にＧＡ又はＡＡの遺伝子型を有する。関連する実施形態では、前頭側頭型認知症、又は那須・ハコラ病を発症するリスクのある患者は、配列番号１の３３位のグルタミンの代わりに終止コドンの置換の結果として切断されたＴＲＥＭ２タンパク質をコードするＴＲＥＭ２変異体アレルを保有することが確定している患者である。別の実施形態では、患者は、ＴＲＥＭ２遺伝子にｒｓ２０１２５８６６３−Ａ変異を含む少なくとも１つのアレルを有することが確定しており、例えば、患者はｒｓ２０１２５８６６３にＧＡ又はＡＡの遺伝子型を有する。関連する実施形態では、前頭側頭型認知症、又は那須・ハコラ病を発症するリスクのある患者は、配列番号１の６６位のトレオニンの代わりにメチオニンをコードするＴＲＥＭ２変異体アレルを保有することが確定している患者である。いくつかの実施形態では、前頭側頭型認知症、又は那須・ハコラ病を発症するリスクのある患者は、配列番号１の３８位のチロシンの代わりにシステインをコードするＴＲＥＭ２変異体アレルを保有することが確定している患者である。
【０２３３】
さらに別の形態では、本発明は、本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質の有効量を患者に投与することを含む、それを必要としている患者の多発性硬化症を予防、処置、又は改善するための方法を提供する。特定の実施形態では、患者に投与されるＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、抗ＴＲＥＭ２アゴニストモノクローナル抗体、例えば、その可変配列及びＣＤＲ配列が表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂに記載されている抗体である。いくつかの実施形態では、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質を投与される患者は、多発性硬化症を発症するリスクのある患者である。
【０２３４】
実施例９及び１０に記載されるように、ｐＳｙｋレベルの増加によって測定されるＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２シグナル伝達を活性化し得るアゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体は、ＴＲＥＭ２の機能喪失変異に起因するマクロファージ及びミクログリアの生存能力血管を救済し、ＴＲＥＭ２欠損マクロファージのＣＣＬ２分泌を回復させた。これらの結果は、アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体によるＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２シグナル伝達の活性化がマクロファージ／ミクログリア機能を増強し得、これが次に、不十分なマクロファージ／ミクログリア機能に関連した状態の治療に繋がり得ることを示している。したがって、特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される有効量のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質を患者に投与することを含む、それを必要とする患者における、ミクログリア、マクロファージ、又は樹状細胞などの骨髄細胞の生存又は増殖を増加させる方法を含む。特定の実施形態では、患者に投与されるＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、抗ＴＲＥＭ２アゴニストモノクローナル抗体、例えば、その可変配列及びＣＤＲ配列が表１Ａ、１Ｂ、２Ａ、２Ｂ、３Ａ及び３Ｂに記載されている抗体である。いくつかの実施形態では、神経変性障害のリスクがあるか、それに罹患しているか、又はそれと診断されている。一実施形態では、神経変性障害はアルツハイマー病である。いくつかの実施形態では、処置を必要とする患者は、自己免疫疾患のリスクがあるか、それに罹患しているか、又はそれと診断されている。一実施形態では、自己免疫疾患は多発性硬化症である。
【０２３５】
本発明のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質はまた、生体試料中のヒトＴＲＥＭ２の検出、及びヒトＴＲＥＭ２を発現する細胞又は組織の同定に有用である。例えば、抗原結合タンパク質は、診断アッセイ、例えば、組織又は細胞（マクロファージ若しくはミクログリア）において発現されるＴＲＥＭ２、或いは脳脊髄液、血液、血清、又は血漿などの体液中の可溶性形態のＴＲＥＭ２の存在を検出及び／又は定量するためのイムノアッセイに使用され得る。さらに、本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、骨髄細胞におけるＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２シグナル伝達を活性化し、それによってこれらの細胞の生物学的活性を調節するために使用され得る。そのような生物学的活性には、サイトカインの放出、食作用、及び小膠細胞症が含まれる。
【０２３６】
本明細書に記載のＴＲＥＭ２アゴニスト抗原結合タンパク質は、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病）、中枢神経系損傷（外傷性脳損傷、脊髄損傷、脳卒中）、自己免疫疾患（多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス）、前頭側頭型認知症、那須・ハコラ病、及び骨障害（例えば、骨粗鬆症、大理石骨病、骨硬化症）などの、ＴＲＥＭ２機能不全に関連する状態を検出、診断、又はモニターする診断目的に使用され得る。例えば、脳脊髄液中のＴＲＥＭ２の可溶性形態のレベルの上昇が多発性硬化症を有する患者において観察されている（Ｐｉｃｃｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒａｉｎ，Ｖｏｌ．１３１：３０８１−３０９１，２００８）。また、当業者に知られた古典的な免疫組織学的方法（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，Ｖｏｌ  １５（Ｅｄｓ  Ｒ．Ｈ．Ｂｕｒｄｏｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ｈ．ｖａｎ  Ｋｎｉｐｐｅｎｂｅｒｇ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）；Ｚｏｌａ，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｐｐ．１４７−１５８（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６−９８５；Ｊａｌｋａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７−３０９６）を使用して、試料中のＴＲＥＭ２の存在を検出する方法が提供される。ＴＲＥＭ２の存在の検出に有用な方法の例には、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を使用する、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及びラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイが含まれる。ＴＲＥＭ２の検出は、インビボ又はインビトロで実施することができる。
【０２３７】
診断の適用では、抗原結合タンパク質は検出可能な標識基で標識され得る。好適な標識基には、放射性同位体若しくは放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素基（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光基、ビオチニル基、又は二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、標識基は潜在的な立体障害を減少させるために、種々の長さのスペーサーアームを介して抗原結合タンパク質に結合される。タンパク質を標識するための様々な方法が当該技術分野で知られており、使用することができる。
【０２３８】
別の実施形態では、本明細書に記載の抗原結合タンパク質を使用して、ＴＲＥＭ２を発現する１つ又は複数の細胞を同定することができる。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は標識基で標識され、標識された抗原結合タンパク質のＴＲＥＭ２への結合が検出される。抗原結合タンパク質はまた、生体試料の免疫沈降アッセイにおいて使用することができる。さらなる特定の実施形態では、ＴＲＥＭ２への抗原結合タンパク質の結合は、インビボで検出される。さらなる特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、当該技術分野で知られた技術を使用して単離され、測定される。例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ｅｄ．１９９１  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）；Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ｅｄ．，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓを参照されたい。
【０２３９】
実施された実験及び達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のみのために提供されるものであり、添付の特許請求の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２４０】
実施例１．ヒト抗ＴＲＥＭ２抗体の作製
免疫化
ヒトＴＲＥＭ２に対する完全ヒト抗体を、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）トランスジェニックマウスを免疫化することによって作製した。これらのトランスジェニックマウスは、免疫化時に抗原特異的完全ヒト抗体の産生を可能にするヒト免疫グロブリン導入遺伝子を保有する。例えば、米国特許第６，１１４，５９８号明細書、同第６，１６２，９６３号明細書、同第６，８３３，２６８号明細書、同第７，０４９，４２６号明細書、同第７，０６４，２４４号明細書；Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１；Ｍｅｎｄｅｚｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６；Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｉｓ，１９９８，Ｊ．Ｅｘ．Ｍｅｄ，１８８：４８３−４９５；Ｇｒｅｅｎ，１９９９，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：１１−２３；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３，５９３−５９７，２００２を参照されたい。これらの文献は全て参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ＸＭＧ２−Ｋ、ＸＭＧ２−ＫＬ、ＸＭＧ４−Ｋ及びＸＭＧ４−ＫＬ  ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株由来の動物を免疫化のために使用した。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株ＸＭＧ２−Ｋ及びＸＭＧ２−ＫＬのマウスは、カッパ軽鎖（ＸＭＧ２−Ｋ）又はカッパ及びラムダ軽鎖の両方（ＸＭＧ２−ＫＬ）を有する完全ヒトＩｇＧ２抗体を産生する。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株ＸＭＧ４−Ｋ及びＸＭＧ４−ＫＬのマウスは、カッパ軽鎖（ＸＭＧ４−Ｋ）又はカッパ及びラムダ軽鎖の両方（ＸＭＧ４−ＫＬ）を有する完全ヒトＩｇＧ４抗体を産生する。
【０２４１】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）株においてヒトＴＲＥＭ２に対する免疫反応を引き起こすために、複数の免疫原及び免疫経路を使用した。可溶性組換えタンパク質免疫化のために、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒリンカーを介してヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域のＮ末端に融合したヒトＴＲＥＭ２の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（アミノ酸１〜１７４；配列番号２）を含む融合タンパク質である可溶性ＴＲＥＭ２タンパク質を用いてマウスを免疫化した。動物を、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ）又はＣｐＧ−ＯＤＮ及びポリイノシン：ポリシチジル酸（ポリＩ：Ｃ）とＱＳ−２１アジュバントを混合した可溶性ＴＲＥＭ２タンパク質で、皮下注射を用いて４〜８週間にわたって８〜１２回免疫した。最初のブーストは１０μｇのタンパク質を含み、その後のブーストは５μｇのタンパク質を含んだ。
【０２４２】
遺伝子による免疫化のための免疫原は、金ビーズ（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）をマウスＧＭ−ＣＳＦ、ＣｐＧ−ＯＤＮと、野生型ヒトＴＲＥＭ２（配列番号１）及び野生型ヒトＤＡＰ１２（配列番号３）をコードする発現ベクターでコーティングすることによって作製した遺伝子免疫原を、製造業者の使用説明書（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に従ってＨｅｌｉｏｓ  Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎシステムを使用して、剃毛したマウス腹部の表皮に送達した。マウスを、６〜８週間にわたって遺伝子免疫原で１２〜１６回免疫した。
【０２４３】
ヒトＴＲＥＭ２特異的血清力価を、Ａｃｃｕｒｉ又はＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）フローサイトメーターによる生細胞ＦＡＣＳ分析によって、又はＴＲＥＭ２特異的ＥＬＩＳＡによってモニターした。４つの別々の採取物からのヒトＴＲＥＭ２に対する最高血清天然力価を有する動物を屠殺し、ハイブリドーマ生成に使用した。下記の表７は、各採取物群の説明を提示する。
【０２４４】
【表７】
2020517249.tif 000041
【０２４５】
モノクローナル抗体の調製
好適な抗原特異的血清力価を示す動物を識別し、リンパ球を脾臓及び／又は流入領域リンパ節から得た。プールされたリンパ球（各採取物から）を、好適な培地（例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）中で磨砕することによってリンパ組織から分離した。Ｂ細胞を、標準的な方法を用いて選択及び／又は増殖させ、従来の技術を用いて好適な融合パートナー（例えば、非分泌性骨髄腫Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞）と融合させた。
【０２４６】
採取物１に対しては、選択免疫組織採取物からの融合ハイブリドーマプールをポリクローナルウェルとしてプレーティングし、疲弊させて条件培地を生成し、次いで可溶性ヒトＴＲＥＭ２タンパク質（上記の融合タンパク質）への結合についてスクリーニングした。このプレーティングからのヒットをプールし、次いで、１ウェルあたり１つの生細胞を得るためにクローン的にＦＡＣＳソートした。採取物３、４及び５に対しては、選択免疫組織からの融合ハイブリドーマプールを、ＦＡＣＳベースの濃縮のための材料の供給源として使用した。具体的には、ハイブリドーマ細胞を解凍し、ＤＭＥＭ選択培地中で３〜４日間培養した。バルクソートの１日前に培地をＢＤＱＹハイブリドーマ培地に交換した。細胞を１０ｍＬの滅菌ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、次いで、２〜５μｇ／ｍＬの濃度のビオチン化可溶性ＴＲＥＭ２タンパク質と共に、１ｍＬの反応容量で、４℃で１時間インキュベートした。可溶性ＴＲＥＭ２タンパク質で免疫化された採取物３群については、この工程を、１００μｇ／ｍＬポリクローナルヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）の存在下で実施して、Ｆｃ領域へのあらゆる結合体をブロックした。ポリクローナルヒトＩｇＧブロッキング工程は、これらの採取物が遺伝子により免疫化された動物からのものであるので、採取物４及び５については省略した。
【０２４７】
１０ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液で１回希釈洗浄した後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７結合ストレプトアビジン（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）を各々５μｇ／ｍＬ含有する１ｍＬの抗体カクテルを細胞に添加した。次いで、細胞を４℃で３０分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を１０ｍＬのＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄し、５μＬの７−ＡＡＤ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カタログ番号５５９９２５）を含有する２ｍＬのＢＤＱＹハイブリドーマ培地に再懸濁し、次いで、４０ミクロンの細胞ストレーナーに通して、凝集塊を除去した。細胞を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８及びＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７蛍光シグナルに二重陽性の生細胞集団にゲーティングすることにより、ＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａでバルクソートした。
【０２４８】
ソートした細胞を２４ウェル組織培養プレートに移し、数日間培養した後、それらを計数し、抗原特異的細胞の濃縮を調べるために上記の方法を用いて再び染色した。次いで、細胞を、ＢＤＱＹハイブリドーマ培地を含有する３８４ウェルマイクロタイタープレートに単一細胞をソート選別し、最大で２週間培養した後、上清をスクリーニングのために収集した。
【０２４９】
実施例２．ＴＲＥＭ２特異的結合抗体の選択
実施例１に記載のハイブリドーマから産生された抗体を、ヒトＴＲＥＭ２への結合、ヒトＴＲＥＭ２のアゴニスト活性、及び他のＴＲＥＭタンパク質に対する交差反応性についてスクリーニングした。これらのスクリーニングの方法及び結果を以下に記載する。
【０２５０】
一次ＴＲＥＭ２結合スクリーニング
疲弊したハイブリドーマ上清をＥＬＩＳＡによりヒトＴＲＥＭ２への結合について試験した。簡単に記載すると、３８４ウェルのＣｏｒｎｉｎｇアッセイプレート３７０２を、１×ＰＢＳ中、１０μｇ／ｍＬ（４０μＬ／ウェル）のニュートラアビジン（Ｔｈｅｒｍｏ  ３１００Ｂ）と共に４℃で一晩インキュベートすることによってニュートラアビジンプレートを生成した。プレートを、Ｂｉｏｔｅｋプレートウォッシャーを使用して１×ＰＢＳで洗浄し、次いで、１％乳／１×ＰＢＳ（９０μＬ／ウェル）により室温（ＲＴ）で３０分間ブロックした。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用して１×ＰＢＳで再び洗浄した。捕捉試料はビオチン化可溶性ヒトＴＲＥＭ２タンパク質（ＴＲＥＭ２  ＥＣＤ−ｈｕＩｇＧ１  Ｆｃ融合タンパク質）であり、１％乳／１×ＰＢＳ中０．５μｇ／ｍＬで４０μＬ／ウェルの容量で添加した。次いで、プレートをＲＴで１時間インキュベートして、ＴＲＥＭ２タンパク質をプレートのウェルに固定した。次いで、プレートをプレートウォッシャーを使用して１×ＰＢＳで再び洗浄した。試験する各ハイブリドーマ上清１０μＬ及び１％乳／１×ＰＢＳ（１：５希釈）４０μＬをプレートの各ウェルに添加し、ＲＴで１時間インキュベートした。再度、プレートをプレートウォッシャーを使用して１×ＰＢＳで洗浄した。ヤギ抗ヒトカッパ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０６０−０５）及びヤギ抗ヒトラムダ−ＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２０７０−０５）を一緒に１％乳／１×ＰＢＳで１：２０００に希釈したもの、又は１％乳／１×ＰＢＳで１：４０００に希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ  ＰＯＤをプレートに入れ（４０μｌ／ウェル）、プレートをＲＴで１時間インキュベートした。プレートウォッシャーを用いてプレートを１×ＰＢＳで洗浄した後、４０μＬ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｎｅｏｇｅｎ、ロット番号１５０１１４）をプレートに加え、プレートをＲＴで３０分間インキュベートした。インキュベーション期間の後、反応を１Ｎ塩酸（４０ｕＬ／ウェル）で停止させた。プレートリーダーを用いて４５０ｎｍでのＯＤ読み取りを得た。
【０２５１】
一次ＥＬＩＳＡスクリーニングは、４つの別々の採取物群からのＴＲＥＭ２結合について陽性であった２，５２３抗体を確認した。これらの確認された抗体を機能アッセイスクリーニングに進めた。
【０２５２】
ＴＲＥＭ２機能アッセイスクリーニング
ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＴＲＥＭ２結合について陽性であると判定された抗体を、細胞ベースのホスホ−Ｓｙｋ（ｐＳｙｋ）シグナル伝達アッセイにおいてヒトＴＲＥＭ２のアゴニスト活性を評価した。膜貫通糖タンパク質であるヒトＴＲＥＭ２は、チロシンキナーゼζ鎖関連タンパク質７０（ＺＡＰ７０）及び脾臓チロシンキナーゼ（Ｓｙｋ）の動員を介してシグナル伝達及び機能のために、アダプタータンパク質のＤＡＰ１２と結合する（Ｃｏｌｏｎｎａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３：４４５−４５３，２００３）。Ｓｙｋのリン酸化型はＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２シグナル伝達の活性化を示す。したがって、ＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２調節に応えてＳｙｋのリン酸化型を検出する細胞ベースのＡｌｐｈａＬＩＳＡ（Ｐｅｒｋｉｎｓ  Ｅｌｍｅｒ）アッセイを開発した。このアッセイは、ウサギ抗ｐＳｙｋ抗体、ビオチン化マウス抗全Ｓｙｋ抗体、抗ウサギＩｇＧ抗体に結合したアクセプタービーズ、及びストレプトアビジンでコーティングされたドナービーズを使用する。細胞溶解物中に存在するＳｙｋのリン酸化型は、ウサギ抗ｐＳｙｋ抗体及びマウス抗全Ｓｙｋ抗体の両方によって結合される。抗ウサギＩｇＧ抗体に結合したアクセプタービーズはウサギ抗ｐＳｙｋ抗体に結合し、ストレプトアビジンでコーティングされたドナービーズはビオチン化マウス抗全Ｓｙｋ抗体に結合する。６８０ｎｍの波長でのドナービーズの励起は一重項酸素の放出をもたらし、これは、次に、アクセプタービーズにおいて増幅された蛍光シグナルを生成し、それによって、６１５ｎｍでの発光を生成する。ドナービーズ及びアクセプタービーズが互いに近接して位置しない場合（すなわち、Ｓｙｋはリン酸化されず、したがってウサギ抗ｐＳｙｋ抗体によって結合されないため、アクセプタービーズは複合体に動員されない）、６１５ｎｍでの発光は検出されない。したがって、６１５ｎｍで放出される光の量は細胞溶解物中に存在するリン酸化Ｓｙｋの量に比例し、これは、抗ＴＲＥＭ２抗体によるＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２シグナル伝達の活性化を示す。
【０２５３】
ヒトＴＲＥＭ２及びヒトＤＡＰ１２を安定に発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ｇ１３細胞株）を、組織培養処理した９６−ハーフエリアウェルプレートに１ウェル当たり４０，０００細胞（９０又は８０μＬ）、又はポリ−Ｄ−リジンコートプレートに１ウェル当たり５０，０００細胞（２００μＬ）で、増殖培地中にプレーティングした。細胞を３７℃及び５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。抗ヒトＴＲＥＭ２抗体を、単一濃度（初期単一点スクリーニングのため）又は一連の濃度（効力試験のため）で添加した。細胞及び抗体を室温で３０〜４０分間インキュベーションした後、培養培地を完全に除去した。細胞を、氷上でプロテアーゼ／ホスファターゼ阻害剤を含有する２０μＬ（４０，０００細胞に対して）又は２５μＬ（５０，０００細胞に対して）の溶解緩衝液で４５〜６０分間溶解した。細胞溶解物（５μＬ）を、ウサギ抗ｐＳｙｋ抗体（最終濃度：１ｎＭ）、ビオチン化マウス抗Ｓｙｋ抗体（最終濃度：１ｎＭ）、及び抗ウサギＩｇＧ抗体に結合したアクセプタービーズ（最終濃度：１０μｇ／ｍＬ）の混合物１５μＬを含有する３８４ウェル白色アッセイプレートの適切なウェルに移した。次いで、このアッセイプレートを氷上で２時間インキュベートした。続いて、ストレプトアビジン（５μＬ）でコーティングしたドナービーズをウェルに添加し（最終濃度：４０μｇ／ｍＬ）、アッセイプレートを暗所にて室温で１時間インキュベートした。ＡｌｐｈａＬＩＳＡシグナル（カウント）をＥｎ  Ｖｉｓｉｏｎマルチラベルリーダーにより測定した。抗体アゴニスト活性は、対照に対する倍数（Ｓ／Ｂ）として報告した：Ｓ／Ｂ＝試料ｐＳｙｋシグナル（カウント）／基礎ｐＳｙｋシグナル（アイソタイプ対照ｐＳｙｋシグナルカウント）。
【０２５４】
ＴＲＥＭ２結合について陽性と判定されたたハイブリドーマ上清由来の抗体を、ｐＳｙｋアッセイにおいて単一濃度で最初に試験した。この単一点スクリーニングでは、抗ｈｕＴＲＥＭ２抗体を含有する疲弊ハイブリドーマ上清（ＥＳＮ）を、容量（採取物１は１０μＬ、１：１０希釈）又は濃度（採取物３、４及び５では１０μｇ／ｍＬに予め標準化された２０μＬのＥＳＮ、１：５希釈）に基づいて細胞に添加した。４つの別々の採取物からのＴＲＥＭ２結合に陽性の２，５２３抗体のうち、１４０抗体が、単一濃度のｐＳｙｋアッセイにおいて活性を示した。これらの抗体を効力スクリーニングに進めた。
【０２５５】
効力スクリーニングは最初に未精製の定量化クローンハイブリドーマ由来抗ＴＲＥＭ２抗体で実施し、後に精製ハイブリドーマ由来及び／又は組換えモノクローナル抗体で実施した。採取物１では、抗ＴＲＥＭ２抗体を１００μｇ／ｍＬから０．００５μｇ／ｍＬまで３倍で連続的に滴定し、各希釈物１０μＬを細胞に添加した（最終抗体濃度１０μｇ／ｍＬ〜０．０００５μｇ／ｍＬ、６６．６７ｎＭ〜０．００３ｎＭ）。採取物３、４及び５の効力スクリーニングでは、培養培地を細胞から完全に除去した。抗ＴＲＥＭ２抗体を増殖培地中２μｇ／ｍＬから０．００３μｇ／ｍＬまで３倍で連続的に滴定し、各希釈物５０μＬを細胞に添加した（最終抗体濃度１３．３３ｎＭ〜０．０２ｎＭ）。各抗ＴＲＥＭ２抗体のＥＣ５０値を、１０点用量反応曲線からＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．０７の４パラメータロジスティックフィットモデルによって決定した。
【０２５６】
効力についてスクリーニングした１４０個の抗体のうち、９３個の抗体を、さらなるスクリーニング及び特徴付けのために選択した。図１Ａは採取物１からの上位アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体の用量反応曲線を示し、一方、図１Ｂは、採取３、４及び５からの上位アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体の用量反応曲線を示す。４つの採取物全てからの上位１８抗体のＥＣ５０値を下記の表８に示す。低いナノモル又はサブナノモルＥＣ５０値から明らかなように、抗ＴＲＥＭ２抗体の大部分はＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２シグナル伝達の強力なアゴニストである。抗体のいくつかはより強力であり、このアッセイにおいて０．５０ｎＭのＥＣ５０値及び１３．８のＥｍａｘを有する市販のラット抗ヒト／マウスＴＲＥＭ２抗体（ｍＡｂ１７２９１；ラットＩｇＧ２ｂクローン＃２３７９２０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）よりも高いレベルのＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２シグナル伝達の最大活性化を生じる。重要なことに、抗ＴＲＥＭ２抗体のアゴニスト活性は架橋剤（例えば、プロテインＧ、プロテインＡ、又は抗ヒト二次抗体）又は抗体の固定化（例えば、プレート結合抗体）の非存在下で観察され、このことは、この抗体が可溶性のモノマー形態でヒトＴＲＥＭ２に有効に係合し、活性化し得ることを示唆している。多くのアゴニスト抗体では、標的受容体を有効に活性化するために抗体をクラスター化するのに、それらのＦｃ領域の架橋が必要とされている。例えば、Ｎａｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３９：５６８−５７７，２００７；Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ａｎｄ  Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ．１９：１０３５−１０４３，２０１３を参照されたい。他のＴＲＥＭ２抗体に対するアゴニスト活性を達成するためのこのような架橋要件が観察されている。例えば、米国特許第８，９８１，０６１号明細書及び国際公開第２０１６／０２３０１９号パンフレットを参照されたい。本明細書に記載のＴＲＥＭ２抗体は、それらがヒトＴＲＥＭ２の独立したアゴニストを架橋する点で、他のＴＲＥＭ２抗体に対して利点を有する（例えば、それらは、アゴニスト活性のためにそれらのＦｃドメインを介する架橋又はオリゴマー化を必要としない）。
【０２５７】
ＴＲＥＭ２抗体の選択性と交差反応性
効力スクリーニングにおいてアゴニスト活性を示す抗ＴＲＥＭ２抗体の、マウス及びカニクイザルＴＲＥＭ２に対する交差反応性、並びにヒトＴＲＥＭ１タンパク質に対する交差反応性をさらに評価した。種交差反応性スクリーニングのために、ＨＥＫ２９３細胞を、マウスＴＲＥＭ２及びマウスＤＡＰ１２  ｃＤＮＡ又はカニクイザルＴＲＥＭ２及びカニクイザルＤＡＰ１２  ｃＤＮＡを含む発現ベクター、Ｇｉｂｃｏ（商標）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）培地（Ｇｉｂｃｏ，カタログ番号３１９８５０８８）、並びに２９３Ｆｅｃｔｉｎ（商標）試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２３４７０１９）により、製造業者によって設定されたプロトコルに従ってトランスフェクトした。ＴＲＥＭ１交差反応性を、ヒトＴＲＥＭ１／ＤＡＰ１２を安定に発現する細胞株を用いて評価した。ハイブリドーマ上清を、ヒトＴＲＥＭ１、マウスＴＲＥＭ２又はカニクイザルＴＲＥＭ２に結合するモノクローナル抗体の存在について、トランスフェクトされた細胞のそれぞれの上清を１時間インキュベートし、続いて洗浄工程を行うことによってスクリーニングした。次いで、細胞を、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ６４７（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ  １０９−６０５−０９８）に結合したヤギ抗ヒトＦｃ抗体と共に１５分間インキュベートした。結合は、Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔオートサンプラーを備えたＡｃｃｕｒｉ  ＦＡＣＳ機によって検出した。無関係なアイソタイプ対照抗体をＦＡＣＳ分析に含めた。データは、無関係な対照抗体結合の幾何平均（ＧＭ）倍数として報告した。交差反応性についてスクリーニングした４つの採取物からの９３個の抗体のうち、５０個の抗体がカニクイザルＴＲＥＭ２と交差反応し、９個の抗体がマウスＴＲＥＭ２と交差反応した。試験した抗体はいずれもヒトＴＲＥＭ１とは交差反応しなかった。４つの採取物全てからの上位１８の抗ＴＲＥＭ２モノクローナル抗体についての全てのスクリーニングからのデータを、以下の表８に要約する。
【０２５８】
【表８】
2020517249.tif 000042
【０２５９】
実施例３．ヒト抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体の配列決定
ＲＮＡ（全て又はｍＲＮＡ）を、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮｅａｓｙミニ又はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｍＲＮＡキャッチャープラスキットを使用して、ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体産生ハイブリドーマ細胞を含有するウェルから精製した。精製したＲＮＡを用いて、逆転写によるｃＤＮＡ合成、続いてポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により抗体重鎖及び軽鎖可変領域（Ｖ）遺伝子を増幅した。完全ヒト抗体ガンマ重鎖を、Ｑｉａｇｅｎ１ステップ逆転写酵素ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて得た。このキットを用いて、ＲＮＡ鋳型から最初のｃＤＮＡ鎖を生成し、次いで、マルチプレックスＰＣＲによりガンマ重鎖の可変領域を増幅した。５’ガンマ鎖特異的プライマーは抗体重鎖のシグナル配列にアニーリングし、一方、３’プライマーはガンマ定常ドメインの領域にアニーリングした。完全ヒトカッパ軽鎖を、Ｑｉａｇｅｎ１ステップ逆転写酵素ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて得た。このキットを用いて、ＲＮＡ鋳型から最初のｃＤＮＡ鎖を生成し、次いで、マルチプレックスＰＣＲによりカッパ軽鎖の可変領域を増幅した。５’カッパ軽鎖特異的プライマーは抗体軽鎖のシグナル配列にアニーリングし、一方、３’プライマーはカッパ定常ドメインの領域にアニーリングした。完全ヒトラムダ軽鎖を、Ｑｉａｇｅｎ１ステップ逆転写酵素ＰＣＲキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて得た。このキットを用いて、ＲＮＡ鋳型から最初のｃＤＮＡ鎖を生成し、次いで、マルチプレックスＰＣＲによりラムダ軽鎖の可変領域を増幅した。５’ラムダ軽鎖特異的プライマーは軽鎖のシグナル配列にアニーリングし、一方、３’プライマーはラムダ定常ドメインの領域にアニーリングした。
【０２６０】
増幅したｃＤＮＡをエキソヌクレアーゼＩ及びアルカリホスファターゼを用いて酵素的に精製し、精製したＰＣＲ産物を直接配列決定した。アミノ酸配列は、対応する核酸配列からバイオインフォマティックスにより推定した。観察されたいずれの変異もＰＣＲの結果ではないことを確認するために、各ハイブリドーマ試料について、２つの追加の独立したＲＴ−ＰＣＲ増幅及び配列決定サイクルを完了した。例示的な抗体の軽鎖可変領域及び関連するＣＤＲのアミノ酸配列を表１Ａに示し、一方、抗体の重鎖可変領域及び関連するＣＤＲのアミノ酸配列を表１Ｂに示す。表６は、例示的な抗体の軽鎖可変領域及び重鎖可変領域をコードする例示的な核酸配列を示す。
【０２６１】
次いで、各軽鎖可変領域及び重鎖可変領域について得られたアミノ酸配列を分析して、抗体の生殖系列配列起点を決定し、生殖系列配列からの差異を同定した。軽鎖可変領域及び重鎖可変領域の配列の各々とそれらの元の生殖系列配列との比較を図２Ａ〜４Ｂに示す。生殖系列遺伝子の同一性は、各抗体クローン番号の隣に示す。配列決定された抗体のＣＤＲに対応するアミノ酸配列を整列させ、これらのアラインメントを用いてクローンを類似性によってグループ化した。
【０２６２】
実施例４．アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体のエピトープビニング分析
アゴニスト抗ヒトＴＲＥＭ２抗体のサブセットのエピトープビンを、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸ機器（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）の抗ヒトＦｃ（カイネティックス）センサー（１８〜５０９０）を使用して決定した。ハイブリドーマから産生された１６個の異なる抗ＴＲＥＭ２抗体の各々を定量し、５μｇ／ｍＬで２分間、抗ヒトＦｃセンサーの１つにロードした（「ロード抗体」）。次いで、センサーを、１００μｇ／ｍＬの無関係なヒトＩｇＧ２抗体で５分間ブロックした。組換え可溶性ヒトＴＲＥＭ２タンパク質（Ｆｌａｇ／Ｈｉｓタグに結合したヒトＴＲＥＭ２細胞外ドメイン（アミノ酸１〜１７４）（ヒトＴＲＥＭ２  ＥＣＤ−ＦｌａｇＨｉｓ））を４μｇ／ｍＬで５分間センサーに添加して、可溶性ＴＲＥＭ２タンパク質をロード抗体へ結合させた。次に、１６個の異なる抗ＴＲＥＭ２抗体（「サンドイッチ抗体」）の各々を、５μｇ／ｍＬでセンサーに添加し、５分間結合させた。アッセイ緩衝液は全て、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有した。このアッセイを２５℃で実施した。実験カイネティックス結果を１：１結合モデルに適合させた。
【０２６３】
ロード抗体及びサンドイッチ抗体がヒトＴＲＥＭ２上の類似のエピトープに結合する場合、サンドイッチ抗体のセンサーへの添加により結合事象は生じない。しかし、サンドイッチ抗体の添加により結合事象が生じるなら、サンドイッチ抗体はロード抗体とは異なるヒトＴＲＥＭ２上のエピトープに結合し、２つの抗体は異なるエピトープビンに分類される。図５は、６Ｅ７抗体をロードし、サンドイッチ抗体として５Ｅ３抗体又は６Ｅ７抗体に暴露したセンサーの結合データを示す。予想されたように、可溶性ヒトＴＲＥＭ２タンパク質の添加により結合の増加が観察され、６Ｅ７抗体がヒトＴＲＥＭ２上のエピトープに特異的に結合したことが示された。サンドイッチ抗体として６Ｅ７を添加した場合、センサー固定化６Ｅ７抗体がヒトＴＲＥＭ２上のこの特定のエピトープに既に結合しているので、さらなる結合は観察されなかった。しかし、５Ｅ３抗体がサンドイッチ抗体として添加された場合、結合の増加が観察され、これは、６Ｅ７抗体とは異なるヒトＴＲＥＭ２上のエピトープに５Ｅ３抗体が結合することを示唆している。
【０２６４】
１６個の異なる抗ＴＲＥＭ２抗体についてのエピトープビニングデータの要約を下記の表９に示す。結合データに基づいて、抗体を４つの別個のエピトープビンにグループ化することができる。抗体１０Ｅ３、１３Ｅ７、２４Ｆ４、４Ｃ５、４Ｇ１０、３２Ｅ３、及び６Ｅ７は、抗体１６Ｂ８、２６Ａ１０、２６Ｃ１０、２６Ｆ２、３３Ｂ１２、及び５Ｅ３によって結合されたエピトープ（ビンＢ）とは異なる、類似のエピトープ（ビンＡ）を共有するようである。抗体２４Ａ１０及び２４Ｇ６は、ヒトＴＲＥＭ２上の類似のエピトープ（ビンＣ）を共有し、一方、抗体２５Ｆ１２は、他の試験された抗体のいずれかとも異なる結合エピトープ（ビンＤ）を有する。
【０２６５】
【表９】
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【０２６６】
実施例５．アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体の結合親和性の決定
ヒトＴＲＥＭ２に対するアゴニスト抗体の結合親和性を定量するために、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）ＨＴＸ機器（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）の抗ヒトＦｃ（カイネティクス）センサーを使用して、会合及び解離速度定数並びに平衡解離定数を決定した。アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体を、ＤＭＥＭヌル培地２５０μＬ中、１０μｇ／ｍＬで作製した。２５０μＬのアッセイ緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．６）、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＣａＣｌ２、及び１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ）を抗体溶液に添加し、最終容量５００μＬ、及び最終抗体濃度５μｇ／ｍＬとした。抗ヒトＦｃセンサーを、２００μＬのアッセイ緩衝液中で少なくとも１０分間プレインキュベートした。次いで、１０ｍＭグリシン（ｐＨ１．５）中でセンサーを５秒間再生した。試験アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体をセンサー上に２分間ロードし、ベースライン測定を２分間行った。抗体をロードしたセンサーを、１００ｎＭで開始する２倍連続希釈系列の６点希釈系列で、組換え可溶性ヒトＴＲＥＭ２タンパク質（Ｆｌａｇ／Ｈｉｓタグに結合させたヒトＴＲＥＭ２細胞外ドメイン（アミノ酸１〜１７４）（ヒトＴＲＥＭ２  ＥＣＤ−ＦｌａｇＨｉｓ））、又は組換え可溶性カニクイザルＴＲＥＭ２タンパク質（Ｆｌａｇ／Ｈｉｓタグに結合させたカニクイザルＴＲＥＭ２細胞外ドメイン）に結合させた。組換えＴＲＥＭ２タンパク質を、抗体をロードした負荷センサーと１０分間会合させ、次いで解離を１０分間測定した。このアッセイを２５℃で実施した。会合及び解離速度定数並びに平衡解離定数を決定するために、実験カイネティックス結果を１：１結合モデルに全体的に適合させた。表１０は選択された抗体のヒトＴＲＥＭ２についてのアッセイの結果を提供し、表１１は、選択された抗体についてのカニクイザルＴＲＥＭ２についてのアッセイの結果を提供する。
【０２６７】
【表１０】
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【０２６８】
【表１１】
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【０２６９】
実施例６．ＴＨＰ−１細胞における抗ＴＲＥＭ２抗体のアゴニスト活性
選択された抗ＴＲＥＭ２抗体を、ＴＨＰ−１細胞においてヒトＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２シグナル伝達を活性化するそれらの能力について評価した。ＴＨＰ−１細胞系はヒト白血病単球細胞系であり、ヒト単球及びマクロファージ機能のインビトロモデルとして一般的に使用されている（Ｃｈａｎｐｕｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３：３７−４５，２０１４）。
【０２７０】
懸濁ＴＨＰ−１細胞（１×１０６細胞／ｍＬ）を、２０ｎＭホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を含有する増殖培地（ＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳ（熱不活化、１％Ｇｌｕｔａｍａｘ、１％Ｈｅｐｅｓ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）中、３７℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートすることによって分化させた。７２時間刺激した後、細胞は組織培養処理皿の表面に付着した。ＰＭＡをＰＢＳで穏やかに洗い流し、１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−４を含有する新鮮な増殖培地に補充した。細胞を３７℃／５％ＣＯ２でさらに７２時間継続してインキュベートした。６日目（細胞分化の終わり）に、細胞を非酵素的細胞解離緩衝液又は細胞剥離剤で回収し、組織培養処理した９６ウェルプレートに１ウェルあたり１００，０００細胞で増殖培地中にプレーティングした。細胞を３７℃／５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【０２７１】
翌日、細胞を室温で１０分間、抗ヒトＴＲＥＭ２抗体で処理し、続いて培地を除去した。細胞を氷上で４５〜６０分間３０μｌの溶解緩衝液で溶解した。実施例２に記載のＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを用いてリン酸化Ｓｙｋ（ｐＳｙｋ）レベルを測定するために、細胞溶解物（５μＬ）を３８４ウェルプレートに移した。各抗ＴＲＥＭ２抗体のＥＣ５０値を、点用量反応曲線からＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６．０７の４パラメータロジスティックフィットモデルによって決定した。
【０２７２】
実験結果を図６及び表１２に示す。試験された抗ＴＲＥＭ２抗体は全て、分化したＴＨＰ−１細胞において用量依存的にｐＳｙｋレベルを誘導した。抗ＴＲＥＭ２抗体は全て、市販のラット抗ヒト／マウス抗体（ラットＩｇＧ２ｂクローン＃２３７９２０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）であるｍＡＢ１７２９１（「ＲｎＤ」）よりもＳｙｋをより活性化し、１０個の抗体は市販の抗体よりも２倍以上の最大活性化を生じた。抗体１０Ｅ３及び１３Ｅ７は最も高いＥｍａｘ値を示し、市販の抗体の約４．５倍以上であった。
【０２７３】
【表１２】
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【０２７４】
実施例７．アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体の操作
抗ＴＲＥＭ２抗体のサブセットを、抗体の生物物理学的特性、発現特性、及び／又は安定性特性を改善するその後の操作のために選択した。抗体１０Ｅ３、１３Ｅ７、４Ｃ５、６Ｅ７、５Ｅ３及び２４Ｇ６の軽鎖及び重鎖可変領域配列の、潜在的な化学的ホットスポット（例えば、アスパラギン酸塩異性化、アスパラギン脱アミド化、及びトリプトファン酸化）及び共変異違反を分析した。共変異違反を補正することによって、抗体の熱安定性、発現特性、及び生物物理学的特性を改善することができる（例えば、国際公開第２０１２／１２５４９５号パンフレットを参照）。下記の表１３〜１８に６個の抗体各々の配列分析の結果を要約し、抗体の安定性、発現特性、及び／又は生物物理学的特性を改善するためにされ得る重鎖及び軽鎖可変領域配列内の特定の位置での特異的変異を示す。配列内の特定の領域（例えば、フレームワーク領域１、２、３、若しくは４（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、若しくはＦＲ４）、又は相補性決定領域１、２、若しくは３（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、若しくはＣＤＲ３）も示す。
【０２７５】
【表１３】
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【０２７６】
【表１４】
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【０２７７】
【表１５】
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【０２７８】
【表１６】
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【０２７９】
【表１７】
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【０２８０】
【表１８】
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【０２８１】
【表１９】
2020517249.tif 000053
【０２８２】
【表２０−１】
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【０２８３】
【表２０−２】
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【０２８４】
【表２０−３】
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【０２８５】
ヒトＩｇＧ２抗体としてハイブリドーマから単離された選択抗ＴＲＥＭ２抗体を、抗体の可変領域をヒトＩｇＧ１定常領域に移行させることによって、ヒトＩｇＧ１抗体、又はヒトＩｇＧ１抗体のアグリコシル化変異体（ＥＵ番号付けによる変異Ｎ２９７Ｇ、Ｒ２９２Ｃ、Ｖ３０２Ｃ）に変換した。ＩｇＧ１型抗体のアゴニスト活性を、実施例２に記載のＡｌｐｈａＬＩＳＡ  ｐＳｙｋ活性化アッセイを用いて評価した。驚くべきことに、ＩｇＧ２アイソタイプからＩｇＧ１アイソタイプへのこれらの選択抗体の変換は、アゴニスト活性の部分的喪失をもたらした（図７）。
【０２８６】
ＩｇＧ２抗体のヒンジ領域におけるジスルフィド結合の特有の配置が、特定の抗癌抗体に対する刺激活性を増強することが報告されている（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２７：１３８−１４８，２０１５）。この増強された活性は、ＩｇＧ１抗体のＣＨ１及びヒンジ領域をＩｇＧ２抗体のものと交換することによって、ＩｇＧ１型抗体に転移され得る（Ｗｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。
【０２８７】
２４Ｇ６、６Ｅ７及び５Ｅ３抗ＴＲＥＭ２  ＩｇＧ２抗体のアゴニスト活性がＩｇＧ１アイソタイプに変換された場合に増強又は保持され得るか否かを評価するために、２４Ｇ６、６Ｅ７及び５Ｅ３抗体の各々からの重鎖可変領域配列が、ヒトＩｇＧ２抗体由来のＣＨ１及びヒンジ領域をコードする配列、並びにアグリコシル化ヒトＩｇＧ１抗体由来のＦｃ領域（ＣＨ２及びＣＨ３領域）をコードする配列にインフレームで挿入された構築物を作製した。アグリコシル化ヒトＩｇＧ１抗体Ｆｃ領域は、ＥＵ番号付けによるＮ２９７Ｇ、Ｒ２９２Ｃ、及びＶ３０２Ｃ変異を有するヒトＩｇＧ１ｚ  Ｆｃ領域の配列（配列番号２８２）を含んでいた。
【０２８８】
ＩｇＧ１抗体のＣＨ１及びヒンジ領域をＩｇＧ２抗体由来のもので置換することに加えて、ヒンジ及びＣＨ１領域内の特定の残基で点変異させて、抗体を特定のジスルフィド結合配置に固定した。ＩｇＧ２抗体のヒンジ領域及びＣＨ１領域におけるジスルフィド結合がシャッフルされて、異なる構造ジスルフィドアイソフォーム（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ、及びＩｇＧ２Ａ−Ｂ）を生成し、これらの異なるジスルフィドアイソフォームが異なるレベルの活性を有し得ることが報告されている。例えば、Ｄｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，Ｖｏｌ．２８３：１６２０６−１６２１５；Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．４７：７４９６−７５０８，２００８；及びＷｈｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．２７：１３８−１４８，２０１５を参照されたい。ヒンジ改変ＩｇＧ１抗体をＩｇＧ２Ｂジスルフィド配置に固定するために、次の２組の点変異を作製した：（１）Ｋａｂａｔ番号付けによる重鎖のＣ１２７Ｓ変異（ＥＵ番号付けによるＣ１３１Ｓ）及び（２）Ｋａｂａｔ番号付けによる軽鎖のＣ２１４Ｓ変異と重鎖のＣ２３３Ｓ変異（ＥＵ番号付けによるＣ２１４ＳとＣ２２０Ｓ）の組み合わせ。例えば、参照によりその全体が組み込まれる国際公開第２００９／０３６２０９号パンフレットを参照されたい。さらなる点変異を含む６Ｅ７及び５Ｅ３抗体のＩｇＧ２−ヒンジ改変ＩｇＧ１型は、親ＩｇＧ２分子としてＡｌｐｈａＬＩＳＡ  ｐＳｙｋ活性化アッセイにおいて同等又はより優れたアゴニスト活性を示すと予想される。
【０２８９】
【表２１−１】
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【０２９０】
【表２１−２】
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【０２９１】
【表２１−３】
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【０２９２】
【表２１−４】
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【０２９３】
【表２２−１】
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【０２９４】
【表２２−２】
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【０２９５】
【表２２−３】
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【０２９６】
【表２２−４】
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【０２９７】
【表２２−５】
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【０２９８】
【表２２−６】
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【０２９９】
【表２２−７】
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【０３００】
【表２２−８】
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【０３０１】
【表２２−９】
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【０３０２】
実施例８．アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体の親和性の調節
ヒトＴＲＥＭ２に対する親和性が増加又は減少した抗体変異体を作製するために、酵母ディスプレイＦａｂライブラリーの蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて、６Ｅ７アゴニスト抗ＴＲＥＭ２モノクローナル抗体の親和性調節を行った。偏りのないライブラリー構築戦略を使用し、ＮＮＫ飽和変異誘発を、各軽鎖及び重鎖ＣＤＲのアミノ酸残基ごとに完了させて、点変異を生成した。別々のＦａｂライブラリーを各ＣＤＲについて生成した。６つの酵母ディスプレイＦａｂライブラリーを別々に選別し、ＦＡＣＳを用いて、ヒトＴＲＥＭ２への結合が改善され、減少した変異体をスクリーニングした。ＣＤＲ及び鎖シャッフリングを介して結合富化変異を組み合わせた二次ライブラリーも構築し、選別し、スクリーニングした。６Ｅ７変異体についてのフローサイトメトリースクリーニングデータを下記の表１９に示す。６Ｅ７重鎖及び軽鎖可変領域の示された領域における点変異のアミノ酸位置は、６Ｅ７重鎖可変領域配列（配列番号１２４）及び６Ｅ７軽鎖可変領域配列（配列番号６１）に関して番号付けされている。２２の変異体をさらなる評価及び特徴付けのために選択した。６Ｅ７抗体と比較して改善された結合親和性を有する選択変異体の全重鎖変領域配列及び全軽鎖可変領域配列並びに関連ＣＤＲを表２Ａ及び２Ｂに提供し、一方、６Ｅ７抗体と比較して結合親和性が減少した選択変異体の全重鎖可変領域配列及び全軽鎖可変領域配列並びに関連ＣＤＲを表３Ａ及び３Ｂに提供する。
【０３０３】
【表２３−１】
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【０３０４】
【表２３−２】
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【０３０５】
【表２３−３】
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【０３０６】
【表２３−４】
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【０３０７】
実施例９．アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体によるマクロファージ及びミクログリア生存欠陥のレスキュー
ヒトＴＲＥＭ２のＲ４７Ｈ変異体は遅発性アルツハイマー病のリスク増加と関連している（Ｊｏｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．３６８：１０７−１１６，２０１３）。さらなる調節エレメントを混乱させることなくＴｒｅｍ２遺伝子を特異的に標的化するために、遺伝子編集に基づく方法を使用して、Ｔｒｅｍ２−／−又はＴｒｅｍ２Ｒ４７Ｈマウスを作製した。Ｔｒｅｍ２−／−株はＴｒｅｍ２遺伝子のエクソン１における５ｂｐ又は１１ｂｐの欠失を操作することによって生成し、Ｔｒｅｍ２Ｒ４７Ｈ株はヒト変異体に類似するマウスＴｒｅｍ２遺伝子における残基４７での点変異を操作することによって生成した。Ｔｒｅｍ２−／−及びＴｒｅｍ２Ｒ４７Ｈマウスからの脳ホモジネートの詳細なｑＰＣＲ分析により、ＴｒｅｍＲ４７Ｈマウスについての野生型年齢適合対照に匹敵するノックアウト及びＴｒｅｍ２発現における遺伝子の喪失が確認された（データは示さず）。野生型、Ｔｒｅｍ２−／−又はＴｒｅｍ２Ｒ４７Ｈマウスにおける基礎又はＬＰＳ刺激条件下で、遺伝子座における他のＴＲＥＭ遺伝子（Ｔｒｅｍ１、ＴｒｅｍＬ１、及びＴｒｅｍＬ２）において有意差は観察されなかった（データは示さず）。
【０３０８】
骨髄細胞に対するＴＲＥＭ２変化の効果を理解するために、ＴＲＥＭ２−／−骨髄由来マクロファージ（ＢＭＤＭ）の特性と、成人及び新生児ミクログリアの特性とを、ＣＳＦ−１の制限条件における野生型マクロファージ及びミクログリアと比較した。低レベルのＣＳＦ−１で生存欠損を受けているＴＲＥＭ２−／−ミクログリア及びマクロファージに関する最近の研究（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１６０；１０６１−１０７１，２０１５；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．２１２：６８１−６９７，２０１５）と一致して、我々のＴＲＥＭ２−／−マウスから単離されたＢＭＤＭ及びミクログリアの生存率の低下も観察され、それらが他のＴＲＥＭ２−／−モデルで報告されたＴＲＥＭ２依存行動を示すことが確認された（図８Ａ〜８Ｃ）。Ｒ４７Ｈ変異がチャレンジ条件下で生存する骨髄細胞の能力にも影響を及ぼすか否かを決定するために、同様の研究をＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨＢＭＤＭ及びミクログリアについて行った。興味深いことに、ＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨＢＭＤＭ及びミクログリアはまた、ＴＲＥＭ２−／−ＢＭＤＭ及びミクログリアと非常によく似て、同様の培養条件下で、より乏しい生存を示した（図８Ｄ〜８Ｆ）。しかし、ＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨＢＭＤＭ及びミクログリアの生存欠陥は、ＴＲＥＭ２−／−ＢＭＤＭ及びミクログリアの生存欠陥よりも顕著ではなかった。ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ骨髄細胞及びＴＲＥＭ２−／−骨髄細胞の両方の生存に対する遺伝子用量依存効果も観察され、その効果は、変異体細胞と比較してノックアウト細胞においてはるかに顕著であった（データは示さず）。ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージ表現型はＴＲＥＭ２−／−マクロファージと同じ傾向に従うが、野生型ＢＭＤＭ及びＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨＢＭＤＭは同等のレベルの表面ＴＲＥＭ２発現を有するようであったので、表現型はＲ４７Ｈ  ＴＲＥＭ２の細胞表面発現の減少によって簡単に説明することはできない（データは示さず）。全体として、これらの実験の結果は、遺伝子ノックアウトと比較してあまり顕著でない表現型ではあるが、ＴＲＥＭ２タンパク質の喪失に似るＲ４７Ｈ変異体の機能喪失を支持する。
【０３０９】
次に、ＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨＢＭＤＭにおけるＴＲＥＭ２活性化を評価した。市販のラット抗ヒト／マウスＴＲＥＭ２抗体（ｍＡｂ１７２９１；ラットＩｇＧ２ｂクローン＃２３７９２０、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）は、ウェスタンブロットによって測定されるように、Ｒ４７Ｈ  ＢＭＤＭ及び野生型ＢＭＤＭの両方においてｐＳｙｋレベルを増加させ、その効果は野生型ＢＭＤＭにおいてより顕著であった（図９Ａ）。抗体は、ＴＲＥＭ２の特異的活性化を支持するＴＲＥＭ２−／−マクロファージには影響を及ぼさなかった（図９Ｂ）。マクロファージにおけるＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２媒介Ｓｙｋシグナル伝達の活性化がより下流の生物学的表現型の改善（生存の減少を含む）をし得るか否かを決定するために、ＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨＢＭＤＭを、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体（ｍＡｂ１７２９１抗体）又はアイソタイプ対照で処置し、細胞コンフルエンスをＩｎｃｕｃｙｔｅ  Ｘｏｏｍイメージングシステムを使用してモニターした。驚くべきことに、ＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨＢＭＤＭの細胞生存のレスキューは、マクロファージを抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体で処理した場合に観察され、野生型レベルにほぼ完全に回復した（図１０Ａ〜１０Ｃ）。細胞生存の有意な上昇は、ライブタイムラプスイメ−ジング（図１０Ａ及び１０Ｂ）とエンドポイント細胞生存性（ＡＴＰ蓄積）アッセイ（図１０Ｃ）の両方において観察された。ＢＭＤＭをアイソタイプ対照抗体で処理した場合、細胞生存における同等のレスキューは観察されなかった（図１０Ａ〜１０Ｃ）。ホモ接合性ＴＲＥＭ２ノックアウトマクロファージの生存の増加は観察されず、この効果が抗体によるＴＲＥＭ２活性化に特異的であることが確認された（データは示さず）。同じ抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体で処理した場合、成人ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈミクログリアで同様の細胞生存のレスキューが観察されたが、ミクログリアをアイソタイプ対照抗体で処理した場合には細胞生存における同等のレスキューは観察されなかった（図１０Ｄ）。
【０３１０】
さらに、Ｓｙｋシグナル伝達を活性化したが市販の抗体と競合しなかった抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体（抗体２）は、老齢（１８ヶ月齢）野生型動物及びＲ４７Ｈ動物から採取したマクロファージの生存を促進したが（図１０Ｅ及び１０Ｆ）、ミクログリアをアイソタイプ対照抗体で処理した場合、細胞生存における同等のレスキューは観察されなかった（図１０Ｅ及び１０Ｆ）。
【０３１１】
野生型、ＴＲＥＭ２ノックアウト及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ骨髄細胞の遊走に対する抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体処置の効果を評価するために、異なる遺伝子型の各々のマウスから単離した骨髄由来マクロファージを遊走アッセイで評価した。ＴＲＥＭ２＋／＋、ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ及びＴＲＥＭ２−／−マウスから５日目のＢＭＤＭを採取し、５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦを補充した完全ＲＰＭＩ培地のＲａｄｉｕｓ（商標）９６ウェル遊走アッセイプレート（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）に播種した。細胞を、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体（抗体１又は抗体２）、アイソタイプ対照抗体、又はビヒクルで２４時間処理した。製造業者のプロトコルに従って、翌日、細胞を洗浄して、生体適合性ゲル層を除去し、遊走のために無細胞領域を露出させた。培地を、上記のように、５０ｎｇ／ｍｌのＭ−ＣＳＦ、及び抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体、アイソタイプ対照抗体、又はビヒクル対照を補充した新鮮な増殖培地と交換した。細胞コンフルエンスをＩｎｃｕｃｙｔｅ  Ｚｏｏｍ  イメージングシステムを用いてモニターし、データをコンフルエンスパーセントとしてプロットした。興味深いことに、抗体１での処理は、ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージの増殖／遊走において、小さいが統計学的に有意な減少をもたらし（図１１Ｂ）、野生型マクロファージ（ＴＲＥＭ２＋／＋）に対する効果はわずかであり（図１１Ａ）、ノックアウトマウス（ＴＲＥＭ２−／−）からのマクロファージに対しては効果はなかった（図１１Ｃ）。抗体２での処理は、野生型（ＴＲＥＭ２＋／＋）マクロファージ及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージのいずれに対しても遊走に影響を及ぼさなかった（図１１Ｄ及び１１Ｅ）。
【０３１２】
分子レベルでは、このマクロファージ遊走の減少は、抗ＴＲＥＭ２アゴニスト抗体による処理（リポ多糖による処理のあり及び無しの両方）時のＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージ及び野生型マクロファージの細胞表面ＦＬＴ１の減少によって反映されたが、他のケモカイン／ケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ５）における有意差は研究のために選択された時点では認められなかった（データは示さず）。異なる遺伝子型にわたる、また抗体を用いた薬理学的操作による、遊走とＦＬＴ１との間の一貫した相関関係は、ＴＲＥＭ２とＦＬＴ１との間の興味深い新規な関連性を示唆し、それはさらなる研究を必要とするであろう。しかし、同様に興味深いのは、ＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２シグナル伝達を近位に活性化する抗体が生存及び遊走に対して反対の効果を有し得るという観察であり；異なる抗体（それらがどこに結合するか、及びそれらが内因性リガンドとどのように相互作用するかに依存する）はおそらく異なる近位及び遠位活性プロファイルを有するであろう。
【０３１３】
これらの実験の結果は、ＴＲＥＭ２／ＤＡＰ１２シグナル伝達を活性化することができる抗体が、ＴＲＥＭ２における機能喪失変異から生じるマクロファージ及びミクログリアの生存能力の欠陥をレスキューすることができることを示している。これらの結果は、ＴＲＥＭ２を活性化し、マクロファージ／ミクログリア活性を高めることができるアゴニスト抗体が、アルツハイマー病及びＴＲＥＭ２の機能喪失に関連する他の状態を治療し得ることを示唆している。
【０３１４】
実施例１０．マクロファージ中のアゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体による遺伝子調節
トランスクリプトームのレベルでの実施例９に記載のＴＲＥＭ２−／−及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマウスに由来するマクロファージの表現型変化の基礎を理解するために、野生型、ＴＲＥＭ２−／−及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈのマクロファージを、ＣＳＦ−１の制限条件下、７日目に、ＲＮＡ−Ｓｅｑ分析し、比較した。７日目のＢＭＤＭを採取し、Ｒｎｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、製造者のプロトコルに従って、全ＲＮＡを単離した。
【０３１５】
骨髄由来のエクスビボマクロファージから精製した１〜２μｇの全ＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｔｒｕｓｅｑ  ＲＮＡ試料調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）及び鎖特異的ＲＮＡ−Ｓｅｑについて公表された方法（Ｐｅｒｋｉｎｓ，Ｔ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．５：ｅ１０００５６９，２００９；Ｐａｒｋｈｏｍｃｈｕｋ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３７：ｅ１２３，２００９）に基づく改変プロトコルを使用することによって、ｃＤＮＡライブラリー調製に使用した。ポリＡ選択、断片化、及びプライミングの後、ＲＮａｓｅＯｕｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）及びアクチノマイシン−Ｄ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、Ｓａｎｔａ  Ａｎａ、ＣＡ）の存在下で、第１鎖ｃＤＮＡ合成のために逆転写を行った。合成したｃＤＮＡを、ＡＭＰｕｒｅ  ＲＮＡＣｌｅａｎビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＣＡ）を用いて市販の使用説明書に従ってさらに精製した。ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを組み込むことによる改変法を用意し、第２鎖合成に使用した（Ｐｅｒｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．５，ｅ１０００５６９，２００９；Ｐａｒｋｈｏｍｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．３７，ｅ１２３，２００９）。ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ精製（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）後、Ｉｌｌｕｍｉｎａによって推奨される標準プロトコルに従って、ｃＤＮＡライブラリーの生成のために、末端修復、Ａテーリング、及びインデックスアダプターのライゲーションを連続的に行った。Ｐｉｐｐｅｎ  Ｐｒｅｐ（ＳＡＧＥ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）を用いたライブラリーのサイズ選択の後、ｄＵＴＰ含有ｃＤＮＡ鎖を、ＵＳＥＲ酵素（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＭＡ）の消化よって破壊し、続いて鎖特異性の導入のためのＰＣＲ濃縮の工程を行った。洗浄後、濃縮したｃＤＮＡライブラリーをＡｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーで分析し、Ｑｕａｎｔ−ｉＴＴＭＰｉｃｏ−Ｇｒｅｅｎアッセイ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって定量した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑプラットフォーム上で配列決定した。各ライブラリーは、下流分析のために少なくとも３５００万の７５ｂｐ対末端読み取りを生成した。
【０３１６】
ＲＮＡ−ｓｅｑ配列決定読み取りを、Ｏｍｉｃｓｏｆｔ  ＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏパイプライン（Ｏｍｉｃｓｏｆｔ  Ｉｎｃ、ＵＳＡ）に組み込まれたＯＳＡアライナー（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．２８：１９３３−１９３４，２０１２）を使用して整列させた。マウスゲノムバージョンＧＲＣｍ３８及びＵＣＳＣ遺伝子注釈をアラインメント及び定量に使用した。定量は、ＲＳＥＭ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１２：３２３，２０１１）に基づいて遺伝子及び転写物レベルに対して行った。正規化遺伝子発現レベルを、１キロベース／１００万リード当たりの断片数（ＦＰＫＭ）によって計算し、次いで、７０パーセンタイルで１０（ＦＰＫＱ）に四分位正規化した。ＦＰＫＱ≧１で発現した少なくとも１つの試料を有する遺伝子のみを、以下の統計解析に使用した。Ｒ  Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ＤＥＳｅｑ２を用いて、選択された遺伝子からの生のリードカウントを、負の二項分布（Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１５：５５０，２０１４）に従って比較した。ＢＨ補正ｐ値＜０．０５及び倍数変化≧１．５又は≦２／３を有する遺伝子を有意差発現遺伝子として選択した。経路分析をＩｎｇｅｎｕｉｔｙ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ、ＱＩＡＧＥＮ  Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ、ＵＳＡ）を用いて行った。
【０３１７】
ＴＲＥＭ２−／−、ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ、及び野生型のマクロファージにわたって観察された表現型の重症度の勾配と一致して、差次的に調節された転写産物において同様の傾向が観察され、効果の大きさは、ＴＲＥＭ２−／−マクロファージにおいて最も高く、ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージは野生型マクロファージとＴＲＥＭ２−／−マクロファージとの間であった。この差次的調節は、ｑＰＣＲによる独立した実験において遺伝子のサブセットで確認された（図１２Ａ〜１２Ｄ）。経路分析は、補体経路、脂質ホメオスタシス、ケモカイン／レセプター、及び遊走因子の間の推定上のクロストークを伴う、細胞周期、細胞生存、細胞増殖及び遊走におけるＴＲＥＭ２の役割を指摘する（データは示さず）。
【０３１８】
ＡｐｏＥ（図１３Ａ及び１３Ｂ）、Ｉｌ−１ａ（図１３Ｃ及び１３Ｄ）のような炎症性サイトカイン、及びＣｘ３ｃｒ１（図１３Ｅ及び１３Ｆ）、Ｃｃｌ５（図１３Ｋ及び１３Ｌ）、Ｃｃｌ２２（図１３Ｍ及び１３Ｎ）、Ｃｃｒ５、Ｃｃｒ２、及びＣｃｌ３を含むケモカイン／ケモカイン受容体の宿主、並びにＣ１ｑａ（図１３Ｉ及び１３Ｊ）及びＣ３（図１３Ｏ及び１３Ｐ）を含む補体遺伝子などの、アルツハイマー病に関連するいくつかの既知の遺伝因子を含む、継時的な転写調節の差異を、ｑＰＣＲによって確認した。各例において、効果は、ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージと比較して、ＴＲＥＭ２−／−マクロファージにおいて有意により顕著であった。初めて、ＴＲＥＭ２と血管新生促進受容体であるＶｅｇｆｒ１（Ｆｌｔ１）との間の関連が、ＴＲＥＭ２−／−マクロファージ及びＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨマクロファージにおけるＦｌｔ１の減少と共に認められた（図１３Ｇ及び１３Ｈ）。さらに、ＴＲＥＭ２−／−マクロファージ及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージの両方におけるＶＥＧＦ−ａの増加が、結合に利用可能な受容体の欠如と一致して観察された（データは示さず）。複数の遊走因子の減少は、ＴＲＥＭ２−／−マクロファージ及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージの遊走／運動性の減少をもたらす（図１４Ａ及び１４Ｂ）。最近の研究により、ＴＲＥＭ２ノックアウトにおけるプラーク及びアポトーシス細胞を取り囲む領域におけるミクログリアの数／遊走の減少が報告されている（Ｍａｚａｈｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  ｒｅｐｏｒｔｓ，ｅ２０１７４３９２２，２０１７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．１６０：１０６１−１０７１，２０１５）。
【０３１９】
ＲＮＡ  ｓｅｑ．データと一致して、ＴＲＥＭ２−／−マクロファージ及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージから分泌されたケモカインＭＣＰ−１／ＣＣＬ２の減少も観察された（図１５Ａ）。チャレンジ条件におけるＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨマクロファージによるＭＣＰ−１／ＣＣＬ２の分泌の減少は、アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体（ｍＡｂ１７２９１抗体）による処理で回復され得る（図１５Ｂ）。アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体の、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２を増加させる能力は、骨髄生存の改善（実施例９）とともに、注目に値すべきことであり、アゴニスト抗体による処置によって機能する骨髄細胞の様々な面における全体的な改善を示している。さらに、ＴＲＥＭ２Ｒ４７ＨマクロファージをＡベータオリゴマーで処理した場合、ＭＣＰ−１／ＣＣＬ２の増加が観察され、これはアゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体による処理でさらに増強された（データは示さず）。
【０３２０】
ＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマクロファージのアゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体による処理はまた、遺伝子型の効果とは反対の方向に遺伝子発現を調節し、骨髄性細胞の遊走、増殖、細胞周期及び生存の調節に関与する遺伝子を含んだ（図１６Ａ及び１６Ｂ）。差次的に調節される遺伝子の経路分析は、ＤＮＡ複製、細胞周期調節、増殖、細胞死及びケモカイン／サイトカイン調節を含むチャレンジ条件における骨髄細胞生物学の様々な面の調節におけるＴＲＥＭ２の推定される役割を明らかにする。アルツハイマー病の病因との関連で、これらのトランスジェニックのデータは、ＴＲＥＭ２における欠損が機能喪失変異体の形態、又は細胞表面での発現の減少で、プラーク／アポトーシス細胞の食作用、サイトカイン調節、又は潜在的に新規なバリア機能に関して効率的に機能することが実質的にできないことをもたらす基本的な増殖／生存欠損に寄与するという仮説を支持する。さらに、ＣＣＬ２及びＣＣＲ２のような遊走性ケモカインの分泌の減少に対する直接的な効果もまた、マクロファージ／ミクログリアがアポトーシス細胞及びプラークに向かって効率的に遊走する能力を減少させる可能性があり、疾患経過の早期におけるプラーク負荷の増加にさらに寄与し得る。近位シグナル伝達を増強し、生存能力の欠陥をレスキューし、ケモカインレベルを回復させる抗体の能力は、近位機能とより遠位の生物学との間の相関関係を的確に示し、マクロファージ／ミクログリア活性を増強し疾患を改善する可能性がある治療の抗体戦略を強く支持する。
【０３２１】
実施例１１．多発性硬化症のＥＡＥモデルにおけるアゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体の有効性
多発性硬化症の症状及び／又は疾患進行の改善における本明細書に記載のアゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体の有効性は、多発性硬化症の実験的自己免疫脳炎（ＥＡＥ）モデルにおいて評価される。ＥＡＥは以前にＦｅｉｎｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，Ｖｏｌ．５１：６９４−７０２，２００２に記載されているように、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）及び百日咳毒素によって動物に誘発される。簡単に記すと、７〜９週齢の雌のＴＲＥＭ２野生型（Ｃ５７ＢＬ／６株）、ＴＲＥＭ２−／−及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈマウスの群に、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ＲＡ  ４ｍｇ／ｍＬを含有する完全フロイントアジュバント中に乳化した１００μｇのＭＯＧペプチド３５−５５（ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号２８３））を皮下注射する。０日目及び２日目に、百日咳毒素を、２００μＬの生理食塩水中、２００ｎｇ／マウスで、腹腔内注射する。抗ＴＲＥＭ２抗体（３０ｍｇ／ｋｇ及び１００ｍｇ／ｋｇ）を０、７及び１４日目に投薬して、疾患進行の異なる時点での抗体による処置の効果を決定する。可溶性ＴＲＥＭ２、ＭＣＰ−１／２、ＭＩＰ１ａ及びｂ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２、並びにさらなるケモカイン／サイトカインを含む複数のサイトカイン及び炎症エンドポイントを、末梢、ＣＮＳ及びＣＳＦにおいて測定して、抗ＴＲＥＭ２抗体の効果を評価する。さらに、動物の神経学的障害を、以下のような臨床スコアによって評価する：０、ＥＡＥの臨床的徴候なし；１、尾の弛緩；２、尾の衰弱及び異常歩行（後肢の運動失調及び／又は麻痺）；３、重度の後肢麻痺；４、後部の完全麻痺；並びに５、瀕死状態又は死。
【０３２２】
実施例１２．腹膜炎及び敗血症の動物モデルにおけるアゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体の有効性
急性炎症反応の調節における本明細書に記載のアゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体の効果を、腹膜炎及び敗血症の動物モデルにおいて評価する。サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に由来する多糖類細胞壁成分であるザイモサンを動物の腹腔に注射することにより、腹膜炎に関連する炎症反応を再現することができる（Ｃａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４６１：３７９−３９６，２００９を参照）。ザイモサン（１ｍｇ／ｋｇ）を、抗ＴＲＥＭ２抗体（２０ｍｇ／ｋｇ）、アイソタイプ対照抗体、又はビヒクルの投与と同時に又は２４時間後に腹腔内投与する。血漿、ＣＳＦ、ＣＮＳ及び腹腔洗浄液、並びにマクロファージを、処置の４及び２４時間後に収集する。異なる骨髄細胞種の定量的評価、並びに可溶性ＴＲＥＭ２、ＭＣＰ−１／２、ＭＩＰ１ａ及びｂ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２、さらなるケモカイン／サイトカインを含む複数のサイトカイン及び炎症エンドポイントを、末梢、ＣＮＳ及びＣＳＦにおいて測定して、抗ＴＲＥＭ２抗体の炎症反応に対する効果を評価する。
【０３２３】
別の一連の実験において、アゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体の効果を、グラム陰性細菌性敗血症のリポ多糖（ＬＰＳ）モデルにおいて評価する。ＬＰＳ（１ｍｇ／ｋｇ）を、抗ＴＲＥＭ２抗体（２０ｍｇ／ｋｇ）、アイソタイプ対照抗体、又はビヒクルの投与の２４時間後に腹腔内に投与する。血漿、ＣＳＦ及びＣＮＳ試料を、処置の４及び２４時間後に収集する。異なる骨髄細胞種の定量的評価、並びに可溶性ＴＲＥＭ２、ＭＣＰ−１／２、ＭＩＰ１ａ及びｂ、ＣＣＬ２、ＣＣＲ２、さらなるケモカイン／サイトカインを含む複数のサイトカイン及び炎症エンドポイントを、末梢、ＣＮＳ及びＣＳＦにおいて測定して、抗ＴＲＥＭ２抗体の炎症反応に対する効果を評価する。
【０３２４】
実施例１３．抗ＴＲＥＭ２抗体のエピトープマッピング
抗ＴＲＥＭ２抗体のエピトープマッピングのイムノブロット法
ヒト可溶性Ｔｒｅｍ２に対するＰｅｐＳｐｏｔペプチド（ＪＰＴ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、全細胞外ドメイン（ヒスチジン２１から始まる）をカバーするように設計し、１セルロース膜当たり合計８０個のＰｅｐＳｐｏｔについて、付加的な６個の対照ペプチドを含む７４×１０量体の線状ペプチドを生成した。１０量体ペプチド配列を、タンパク質に沿って２個のアミノ酸進むことによって選択し、８アミノ酸のオーバーラップをもたらした。膜を、穏やかに振盪しながら室温で１０分間、４０ｍｌの１００％メタノールで洗浄し、続いて直ちに、それぞれ１０分間、４０ｍｌのＴＢＳＴ（ＴＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。膜を、希釈していないＬＩＣＯＲブロッキング緩衝液（Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ブロッキング緩衝液９２７−４００００）を用いて室温で一晩穏やかに振盪しながらブロッキングし、１μｇ／ｍｌ  ２４Ｇ６（ＰＬ−５２７０５、ロット日付２．２４．２０１７、［ｈｕ  ａｎｔｉ−＜ｈｕ  Ｔｒｅｍ２＞２１−１９１＿２４Ｇ６  ＶＫ４（１−２４２）ＶＬ］：：ｈｕＬＣ−ＣＬ＋［ｈｕ  ａｎｔｉ−＜ｈｕ  Ｔｒｅｍ２＞２１−１９１＿２４Ｇ６  ＶＨ３（１−４７１）ＶＨ］：：ｈｕＩｇＧ１ｚＳＥＦＬ２−２（モノクローナル抗体）、ｉＰＳ：５３６５５３、ＳＳ−２８３４６）と一晩、４℃で、１％のＴｗｅｅｎ２０を含有するＬｉｃｏｒブロッキング緩衝液中で穏やかに振盪しながらインキュベートした。翌日、ブロットをＴＢＳＴ緩衝液（トリスｓ緩衝生理食塩水＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で４回、それぞれ１５分間洗浄し、１％のＴｗｅｅｎ２０及び０．１％のＳＤＳを含むＬｉｃｏｒブロッキング緩衝液中、１：２０，０００希釈の二次抗体（Ｌｉｃｏｒカタログ番号９２５−３２２３２  ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ  ヤギ抗ヒト  ロット番号Ｃ７０４１９−０５）を用いてプローブした。ブロットを穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートし、光から保護し、続いてＴＢＳＴ中でさらに４回洗浄し、室温で１時間乾燥させた。ウェスタンブロットを、Ｌｉｃｏｒ  Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線蛍光イメージャーを用いて８００チャネルでスキャンした。
【０３２５】
抗ＴＲＥＭ２抗体のエピトープマッピングのＭＳＤ法
ペプチド（前述のように設計された配列）を、ヒト可溶性Ｔｒｅｍ２のＮ末端（Ｓｉｇｍａ）にビオチンを用いて合成して、１００％ＤＭＳＯ中、２０ｍｇ／ｍｌに標準化した。ＭＳＤ  ＧＯＬＤ  ９６−Ｗｅｌｌ  Ｓｍａｌｌ  Ｓｐｏｔ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＳＥＣＴＯＲプレート（ＭＳＤ＃Ｌ４５ＳＡ）を、１ウェル当たり５０μｌの全容量中、２×ＰＢＳ（−約／−ｍｇ）（ｐＨ７．８〜７．９）中に５μｇ／ｍｌのビオチン化ペプチドでコーティングし、穏やかに振盪しながら室温で２時間インキュベートした。プレートを、自動プレート洗浄機を使用して、ＴＢＳＴ緩衝液（トリス緩衝生理食塩水＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）で３回、１ウェルあたり１５０μｌで洗浄した。モノクローナル抗体２４Ｇ６．１（ＰＬ−５１５８５  ロット日付１２／９／２０１６、ｈｕ  ａｎｔｉ−＜ｈｕ  Ｔｒｅｍ２＞ＩｇＧ２）を、検出試薬として働くように、製造業者のＳＯＰに従ってＭＳＤスルホタグで標識し、ＭＳＤ希釈剤１００（＃Ｒ５０ＡＡ−３）中に１μｇ／ｍｌで、１ウェルあたり２５μｌの総容量で添加した。プレートを、穏やかに振盪しながら室温で１時間インキュベートし、次いで、自動プレート洗浄機を使用して、ＴＢＳＴ緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水＋０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）で３回、１ウェルあたり１５０μｌで洗浄し、反転させて、さらに３回洗浄した。ＭＳＤリード緩衝液Ｔ＋界面活性剤４×ストック（＃Ｒ９２ＴＣ−３）を、Ｈ２Ｏで１×に希釈し、１ウェルあたり総容量１５０μｌを加えることによって調製した。プレートをＭＳＤ  Ｓｅｃｔｏｒ  ６０００リーダーで直ちに読み取った。
【０３２６】
結果
２４Ｇ６抗体は、次のペプチド（ＨＲＤＡＧＤＬＷＦＰ（配列番号３６０）、ＡＧＤＬＷＦＰＧＥ（配列番号３６１）及びＧＤＬＷＦＰＧＥＳＥ（配列番号３６２））に結合することがわかった。これは、２４Ｇ６がＴＲＥＭ２の次のペプチド（ＨＲＤＡＧＤＬＷＦＰＧＥＳＥ（配列番号３６３））を認識するデータを提供した。わずかに長いペプチドＰＬＤＨＲＤＡＧＤＬＷＦＰＧＥＳＥ（配列番号３６４）のアラニンスキャニングもまた、主要な結合部位を特定するために実施した。２４Ｇ６は、２つのアラニンスキャニングペプチド（ＰＬＤＨＲＤＡＧＤＡＷＦＰＧＥＳＥ）（配列番号３６５）；ＰＬＤＨＲＤＡＧＤＬＷＡＰＧＥＳＥ（配列番号３６６）（下線を引いたアミノ酸）とほとんど接触しないか、又全く接触しないことがわかり、これらの接触がこのペプチドの認識の鍵であることを示唆している。この研究は、この抗体によるヒトＴＲＥＭ２の認識のための最小ペプチドをＧＤＬＷＦＰ（配列番号３６７）と定義するのに役立った。この抗体はまた、カニクイザルＴＲＥＭ２に対する親和性が低いことを示した。同様のデータが、対応するカニクイザルＴＲＥＭ２配列を含有するペプチドについて観察された。他の抗ＴＲＥＭ２抗体（６Ｅ７、５Ｅ３及び１３Ｅ７）については、記載の方法を用いてペプチドエピトープを解明するのに役立つ特異的ペプチドは確認されなかった。
【０３２７】
実施例１４．ミクログリア細胞上のアゴニスト抗ＴＲＥＭ２抗体の末梢調節
全体的なトランスクリプトームに対する薬理学的処置の効果を理解するために、ｓｃ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ研究を、我々のアゴニストＴＲＥＭ２抗体の１つのエフェクタレスバージョンを投与されたＷＴ及びＲ４７Ｈ  ＴＲＥＭ２マウスから単離されたＣＮＳ常在性Ｃｄ１１ｂ＋細胞について実施した。ＴＲＥＭ２＋／＋、ＴＲＥＭ２−／−、及びＴＲＥＭ２Ｒ４７Ｈ雄Ｂ６マウス（６０〜６７日齢）を単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ研究に使用した。抗マウスＴＲＥＭ２安定エフェクタ無機能（ＳＥＦＬ）抗体、又は抗ヒトＨｅｒアイソタイプ対照による抗体処置を、３０ｍｇ／ｋｇの用量で５ｍｌ／ｋｇで静脈内投与した。急性炎症モデルでは、抗体処置動物に、５ｍｇ／ｋｇで５ｍｇ／ｋｇの抗体処置の１６時間後にＬＰＳ（＜供給源＞）を腹腔内投与し、ＬＰＳで４時間刺激した。遺伝子型が一致し、年齢が一致し、且つ性が一致した同腹仔対照におけるアイソタイプ対照抗体を同時に投与した。
【０３２８】
ＣＯ２窒息後、処置マウスから脳を収集し、マウス及びラット用のＭｉｌｔｅｎｙｉ成体脳分離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  １３０−１０７−６７７）を用いて、標準的な製造業者のプロトコルに従って組織を分離した。ＣＤ１１ｂ＋細胞を、マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  １３０−０４９−６０１）を使用してポジティブに濃縮し、新しく調製した氷冷ＰＢＳ＋０．０４％ＢＳＡ中で２回洗浄し、新鮮なＰＢＳ＋０．０４％ＢＳＡ中に５００〜１０００細胞／μｌ、＞７０％生存率で再懸濁した。脳を収集し、以前に発表されたＭｉｌｔｅｎｙｉのＣｄ１１ｂ単離キットを使用してミクログリアを単離した。ＮＧＳライブラリーを、１０ｘ  Ｃｈｒｏｍｉｕｍ製造業者のガイドラインに記載されているように調製した。逆転写、全ｃＤＮＡ増幅、及びライブラリー構築は、製造業者のプロトコルに従って行った。単一細胞ＲＮＡ配列決定は、Ｖ２  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１０ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を有するＣｈｒｏｍｉｕｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ３’キットを使用して行った。濃縮ＣＤ１１ｂ＋細胞をロードし、Ｃｈｒｏｍｉｕｍ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｈｉｐ  Ａ（１０ｘ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）上にカプセル化して、１試料当たり５，０００細胞の細胞回収を達成した。１細胞当たり約２０９５個の遺伝子及び１細胞当たりｘＵＭＩが同定され、Ｋｅｒｅｎ−Ｓｈａｕｌらの研究の＞２×のシーケンシングリードデプスが達成された。Ｔ分布確率的近傍埋め込み法（ｔ−ＳＮＥ）を適用して、単一細胞遺伝子発現プロファイルを可視化し、細胞をｄｂｓｃａｎクラスタリングを用いて細胞型にグループ化した。
【０３２９】
全部で１１個の異なる集団が同定された。細胞の最も優性なクラスターは、予想どおり、Ｔｒｅｍ２＋、Ｔｍｅｍ１１９＋、Ｐ２ｒｙ１２＋、Ｈｅｘｂ＋、Ｌｙｚ２遺伝子シグネチャによって定義されるようなミクログリアであり、ミクログリア細胞は、全ての処置群及び遺伝子型にわたって分析された細胞の総数の６０％を占めた。内皮細胞、星状細胞、ＮＫ細胞、及び乏突起膠細胞のわずかな残留集団もまた同定され、これらは磁気濃縮後も持続した。優性ミクログリアクラスターは、ＬＰＳ処理に基づいて２つの群−より恒常性のミクログリアクラスター及び活性化ミクログリアクラスターに明確に分離した。ＬＰＳ活性化状態では、ＷＴ群及びＲ４７Ｈ群の両方において、遺伝子型の差異（ＷＴ対Ｒ４７Ｈ）及び抗体処理のより微妙な効果が観察された。これらのパターンは、ミクログリアクラスターのみを検査しても持続した。ミクログリア遺伝子の特徴を有するさらなるより小さな骨髄細胞クラスター並びに古典的な浸潤マーカーもまた注目された。
【０３３０】
ミクログリアクラスターに対する抗体処理の注意深い分析によって、抗体処理がいくつかの明確な生物学的効果を有することが明らかになった。第一に、抗体処理は、ＷＴ及びＲ４７Ｈ  ミクログリア、ＷＴミクログリア単独、並びにＲ４７Ｈ  ミクログリア単独における恒常性ミクログリア遺伝子、例えば、Ｃｘ３ｃｒ１、Ｔｍｅｍ１１９、Ｃｔｓｄ及びＰ２ｒｙ１２のレベルを増加させた（図１７Ａ、Ｂ及びＣ）。第二に、抗体処理は、炎症誘発性ケモカイン及びサイトカイン、例えば、Ｉｌ１ａ、Ｉｌ１ｂ、Ｉｌ２７、Ｉｌ１２ｂ、Ｃｃｒ７、Ｃｃｌ２、Ｃｃｌ３、Ｃｃｌ４及びＣｃｌ５の転写レベルを低下させた（図１７Ｄ、Ｅ及びＦ）。第三に、抗体処理は、いくつかのＤＵＳＰ（Ｓｒｃキナーゼを調節するホスファターゼ）含む、Ｓｙｋシグナル伝達に関与するいくつかの遺伝子、及びＭＡＰＫシグナル伝達経路におけるいくつかの遺伝子を調節した。正常な、チャレンジされていない、７週齢のマウスから単離されたＷＴミクログリアとＲ４７Ｈミクログリアとの間の差異はほとんど観察されなかった。
【０３３１】
乱されていない状態におけるＷＴミクログリアとＲ４７Ｈミクログリアとの間の差異を調べること、並びに抗体処理の効果を決定することにおいて、本発明者らは、ＬＰＳ／抗体処理動物において、より従来のミクログリア群でクラスター化された細胞の約１５％がＲ４７Ｈ遺伝子型のより高い表現を有する明確な遺伝子の特徴を有することに留意した。注意深い分析によって、これらの細胞は、恒常性ミクログリアを定義するために使用される古典的マーカーであるＴｒｅｍ２＋、Ｔｍｅｍ１１９＋、Ｃｘ３ｃｒ１＋及びＨｅｘｂ＋であったので、最初に、より大きなミクログリア群とクラスター化することが明らかになった。しかし、これらの細胞はまた、より大きく、より古典的なミクログリアクラスターと比較して、ＷＴ集団及びＲ４７Ｈ集団の両方において、Ｓ１００ａ８、Ｌｃｎ２、Ｓ１００ａ９、Ｃａｍｐ、Ｈｐ、Ｃｘｃｒ２及びＩｌ１ｒ２のような遺伝子について濃縮された。本発明者らはこのクラスターにおいて優先的に発現した上位遺伝子の経路分析を行い、これらのヒットが単球及び好中球機能と関連することを見出した（図１８Ａ及びＢ）。浸潤／ミクログリア細胞のこの群はまた、ＷＴ及びＲ４７Ｈ  ＫＩの両方、ＷＴのみ、及びＲ４７ＨＫｉのみのマウスからの炎症誘発性ケモカイン及びサイトカインの下方制御で抗体処置に反応した（図１８Ｃ、Ｄ及びＥ）。
【０３３２】
データは、ＬＰＳチャレンジモデルにおける本発明のアゴニスト抗体の急性投薬がＡＤのような慢性的徴候において構成的遺伝子過剰発現が行うのと同じ方法で、ミクログリア機能を正に調節するのに適切であることを示す。さらに、本発明のアゴニスト抗体によるＴＲＥＭ２の特異的活性化は、ＬＰＳ処理モードで複数の恒常性遺伝子に影響を与え、全体としてより恒常的な状態を回復させる。
【０３３３】
本明細書において議論及び引用された全ての刊行物、特許及び特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。開示した本発明は、記載された特定の方法論、プロトコル及び材料に限定されず、これらは変化し得ることが理解される。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものに過ぎず、添付の特許請求の範囲を限定することを意図されていないことも理解される。
【０３３４】
当業者であれば、単なる日常的な実験により、本明細に記載した本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識又は確認することができるであろう。このような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図８−３】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１３−６】
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【図１３−７】
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【図１３−８】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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