(57)【要約】  本発明は、抗腫瘍薬の調製におけるリポソーム製剤の応用分野に属し、具体的には、複数細胞標的化リポソームの構築及び応用に関する。異なる細胞を対象とする複数の抗体を単一のリポソームに含有させ、且つ、分子の自己集合を利用して安定構造及び体内での長期循環特性を有するリポソームを構成する。これにより、抗体の作用によって、逐次に又は同時に複数の異なる細胞に結合可能とし、異なる細胞間の認識、コミュニケーション、細胞障害性、アポトーシス又は除去等の作用を促進する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リポソームと、リポソームの表面に修飾された主要抗体及び補助抗体を構造に含み、前記主要抗体は標的細胞の表面の標的分子に特異的に結合し、前記補助抗体は免疫エフェクター細胞に特異的に結合することを特徴とする複数細胞標的化リポソーム。
【請求項２】
前記複数細胞標的化リポソームは、同時又は逐次に免疫エフェクター細胞と標的細胞に結合することで、免疫エフェクター細胞による標的細胞の認識及び免疫効果の活性化を実現可能であることを特徴とする請求項１に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項３】
各リポソーム上の主要抗体と補助抗体のモル比は、１００／１〜１／１の間であることを特徴とする請求項１に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項４】
各リポソームの表面には、１〜１０００個の主要抗体と１〜１０００個の補助抗体が存在することを特徴とする請求項１に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項５】
前記主要抗体と補助抗体は、それぞれ共有結合又は疎水性と親水性の相互作用によってリポソームの表面に現れることを特徴とする請求項１に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項６】
前記主要抗体が対象とする抗原は、微生物抗原、腫瘍関連抗原、腫瘍細胞表面の特異的抗原、腫細胞表面で高発現する抗原、腫瘍組織又は腫瘍血管中で高発現する抗原から選択され、
前記補助抗体が対象とする抗原は、腫瘍細胞、リンパ球又は骨髄系細胞で発現する抗原から選択されることを特徴とする請求項１に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項７】
同時又は逐次に、腫瘍細胞、リンパ球又は骨髄系細胞に結合可能であることを特徴とする請求項１に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項８】
前記複数細胞標的化リポソームは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ又は好中球に標的結合可能であることを特徴とする請求項１に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項９】
前記複数細胞標的化リポソームは、未活性のＴ細胞、又は、体外で活性化及び増幅したＴ細胞に標的結合可能であることを特徴とする請求項１に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞は、抗原特異性Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、リンホカイン活性化キラー細胞、γδＴ細胞、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体遺伝子導入Ｔ細胞から選択されることを特徴とする請求項９に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項１１】
前記主要抗体と補助抗体の形式は、ＩｇＧ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、一本鎖Ｆｖ断片、及び、マイクロ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体（ｕｎｉｂｏｄｙ）、二重ドメイン抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）から選択されることを特徴とする請求項１に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項１２】
前記主要抗体が対象とする抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ又はＬＧＲ５から選択されることを特徴とする請求項１に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項１３】
前記補助抗体は、ＣＤ３抗体及びその断片、ＰＤ１抗体及びその断片、ＣＴＬＡ４抗体及びその断片、ＣＤ４０Ｌ抗体及びその断片の１又は複数から選択されることを特徴とする請求項１に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項１４】
前記リポソームの構成成分には、ホスファチジルコリン、コレステロール、主要抗体と連結する脂質、及び補助抗体と連結する脂質分子が含まれることを特徴とする請求項１に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項１５】
前記リポソームは、ブランクリポソームであってもよいし、薬物送達リポソームであってもよいことを特徴とする請求項１に記載の複数細胞標的化リポソーム。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の複数細胞標的化リポソームの調製方法であって、
（１）主要抗体と補助抗体をそれぞれ脂質分子に連結し、主要抗体−脂質分子及び補助抗体−脂質分子を取得するステップと、
（２）取得した主要抗体−脂質分子及び補助抗体−脂質分子を構築済みのリポソームと混合し、培養することで混合溶液を取得するステップと、
（３）取得した混合溶液を透析又は限外濾過し、未封入の抗体及び抗体脂質複合物を除去することで、複数細胞標的化リポソームを取得するステップ、を含むことを特徴とする方法。
【請求項１７】
免疫治療薬、抗腫瘍薬の調製における請求項１〜１５のいずれか１項に記載の複数細胞標的化リポソームの応用。
【請求項１８】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の複数細胞標的化リポソームを腫瘍患者に適用するステップを含む腫瘍の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、薬物・製剤、リポソーム薬物キャリア、及び抗体標的化の技術分野に属し、具体的には、免疫エフェクター細胞及び標的細胞に同時に作用する複数細胞標的化リポソーム製剤に関する。
【背景技術】
【０００２】
リポソームとは、リン脂質及び／又はコレステロールを基礎としてなる二分子膜小胞状構造を有する薬物キャリアである。また、リポソームは脂質分子からなる人工的に作製された二分子膜小胞である。脂質分子は親水性頭部と疎水性尾部を有するため、内部の水相（内水相）に親水性薬物を含有させ、脂質二層膜内に疎水性薬物を挿入することが可能である。また、リポソームは良好な組織適合性を有し、毒性が低く、生物学的に安全なことから、薬物送達システムの分野で幅広く注目され、応用されている。特に、リポソームを用いた標的化技術の発展に伴い、脂質薬物キャリアには、標的部位に集積して標的細胞と特異的に作用する能力を有するよう、独特の体内動態が付与されている。一方、標的の選択性を最適化し、且つ標的化リガンドの構造及び性能を改良することで、薬剤の全身毒性の低下や治療指数の向上等を含むリポソーム製剤の臨床効果の改善を可能とすることが求められている。
【０００３】
標的化リポソーム薬物送達システムの研究開発の考え方では、腫瘍細胞の表面で高発現又は特異的に発現する受容体を標的として、各種タイプの能動的標的化リガンド及び薬物キャリアを設計する。このような設計思想に基づき開発された能動的標的化製剤は、非標的化キャリアで搬送される遊離型薬物と比べて、例えば標的部位における薬物濃度の向上や薬効の改善というように、病巣部位への優れた標的化能力を有する。しかし、この種の標的化薬物送達システムは任意の特定腫瘍細胞にのみ作用するため、効果的に腫瘍を除去するには不十分なだけでなく、微小残存病変や腫瘍の多剤耐性といった問題も誘発し得る。
【０００４】
近年、腫瘍内不均一性に対する認識の高まりを受けて、例えば、異なる患者間の腫瘍分子マーカーの違い、同一患者の同一腫瘍内における異なる腫瘍細胞間の分子マーカーの違い、同一腫瘍内に存在する異なる細胞の種類及びそれらの相互作用など、単一細胞標的化の限界の背後に潜むメカニズムが明らかとなっている。そこで、研究者らは、腫瘍内不均一性の特性に着目して標的化送達の設計思想を拡大している。例えば、二重標的化リポソームによれば、キャリアと細胞との結合能力を強化して、細胞の薬物取り込みを促進することが可能である。また、腫瘍関連細胞を標的とする薬物キャリアは、例えば、腫瘍新生血管、線維芽細胞、腫瘍幹細胞等への作用といった別のメカニズムにより腫瘍の成長を抑制可能である。
【０００５】
上記の標的化送達技術によれば、ある程度の治療改善は見込まれるが、設計思想は依然として単一細胞標的化という既定の枠組を抜け出せていない。腫瘍内部の異なる細胞間には、例えば、リンパ球浸潤、マクロファージによる貪食、抗原提示、サイトカインやエクソソームに基づく細胞間コミュニケーションなど様々な動態や相互作用が存在している。これらの相互作用には、腫瘍の成長を抑制する免疫監視や除去が含まれる一方で、腫瘍の成長を促進する微小環境も含まれる。また、これらの細胞間相互作用のブロック又は促進が実行可能であり、且つ有効であることが臨床実践において証明されている（例えば、抗原特異性Ｔ細胞によるワクチン療法、ＮＫ細胞の細胞障害性作用による抗体療法、腫瘍の免疫エスケープ作用をブロックする免疫チェックポイント阻害剤療法など）。これに対し、単一細胞を標的とする薬物送達システムでは特定の標的細胞について生理過程を調節す
るにとどまり、腫瘍組織内の細胞間相互作用を利用して効果的な治療を実現することは不可能である。
【０００６】
そこで、異なる細胞を対象とする抗体を１つのリポソームに修飾し、分子の自己集合を利用して、安定構造及び体内での長期循環特性を有するリポソームを構成する。そして、抗体の作用によって逐次に又は同時に複数の異なる細胞に結合し、細胞間相互作用の促進又はブロックを実現することで、異なる細胞間の認識、コミュニケーション、細胞障害性、アポトーシス促進又は除去等の作用を調節する。且つ、脂質薬物キャリアを利用して複数細胞を対象とする標的化薬物送達を実現することで、薬理作用を改善するとともに、併用療法で発生の恐れのある薬物相互作用等の問題を回避する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従来技術に存在する課題を解消するために、本発明は、逐次に又は同時に複数の異なる細胞に結合可能な複数細胞標的化リポソーム製剤とその調製及び応用を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記の目的及び関連する他の目的を実現するために、本発明は以下の技術手段を用いる。
【０００９】
本発明は、第一の局面において、リポソームと、リポソームの表面に修飾された主要抗体及び補助抗体を構造に含み、前記主要抗体が標的細胞の表面の標的分子に特異的に結合し、前記補助抗体が免疫エフェクター細胞に特異的に結合する複数細胞標的化リポソームを提供する。
【００１０】
更に、前記複数細胞標的化リポソームは、同時又は逐次に免疫エフェクター細胞と標的細胞に結合することで、免疫エフェクター細胞による標的細胞の認識及び免疫効果の活性化を実現可能である。
【００１１】
更に、各リポソーム上の主要抗体と補助抗体のモル比は、１００／１〜１／１の間である。
【００１２】
更に、各リポソームの表面には、１〜１０００個の主要抗体と１〜１０００個の補助抗体が存在する。
【００１３】
更に、前記主要抗体と補助抗体は、それぞれ共有結合又は疎水性と親水性の相互作用によってリポソームの表面に現れる。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態で提示するように、前記主要抗体と補助抗体はそれぞれ前記リポソームの脂質分子と連結する。前記脂質分子はマレイミド基を有する。前記主要抗体と補助抗体は、それぞれ脂質分子のマレイミド基と連結する。また、前記主要抗体と補助抗体は、それぞれチオエーテル結合により脂質分子と連結する。
【００１５】
更に、前記標的細胞は、腫瘍細胞、微生物又は微生物が感染した細胞から選択される。そのため、前記主要抗体が対象とする抗原は、微生物抗原、腫瘍関連抗原、腫瘍細胞表面の特異的抗原、腫細胞表面で高発現する抗原、腫瘍組織又は腫瘍血管中で高発現する抗原から選択される。つまり、前記標的分子は、微生物抗原、腫瘍関連抗原、腫瘍細胞表面の特異的抗原、腫細胞表面で高発現する抗原、腫瘍組織又は腫瘍血管中で高発現する抗原から選択される。
【００１６】
更に、前記主要抗体の特異的標的分子は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＬＧＲ５又はＰＤＬ１から選択される。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態では、前記主要抗体の特異的標的分子がＣＤ１９の場合を提示した。前記ＣＤ１９は、ヒトＢ細胞白血病又はヒトＢ細胞リンパ腫のヒトＣＤ１９抗原である。
【００１８】
更に、前記免疫エフェクター細胞は、標的細胞に対し、細胞障害性の発生、アポトーシス促進又は除去作用を発生可能なエフェクター細胞である。前記免疫エフェクター細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、マクロファージ又は好中球から選択される。よって、前記補助抗体が対象とする抗原は、腫瘍細胞、リンパ球又は骨髄系細胞で発現する抗原から選択される。そのため、前記複数細胞標的化リポソームは、同時又は逐次に、腫瘍細胞、リンパ球又は骨髄系細胞に結合可能である。即ち、一つのリポソームは、まず腫瘍細胞に結合してからリンパ球に結合するか、又はその逆である。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態では、前記免疫エフェクター細胞がＴ細胞の場合を提示した。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態では、前記免疫エフェクター細胞が作用する抗原がＣＤ３であり、前記補助抗体がＣＤ３抗体である場合を提示した。
【００２１】
更に、前記補助抗体は、ＣＤ３抗体及びその断片、ＰＤ１抗体及びその断片、ＣＴＬＡ４抗体及びその断片、ＣＤ４０Ｌ抗体及びその断片から選択される。
【００２２】
前記Ｔ細胞は、未活性のＴ細胞としてもよいし、体外で活性化及び増幅したＴ細胞としてもよく、例えば、抗原特異性Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、リンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）、γδＴ細胞、キメラ抗原受容体Ｔ細胞、Ｔ細胞受容体遺伝子導入Ｔ細胞である。
【００２３】
前記Ｔ細胞は、未活性のＴ細胞又は体外で活性化及び増幅したＴ細胞である。
【００２４】
前記活性化又は増幅は、抗原、抗体、ポリペプチド、ポリペプチド−主要組織適合遺伝子複合体、小分子、サイトカイン、免疫チェックポイント阻害剤、遺伝子編集による活性化又は増幅とすればよい。
【００２５】
更に、前記主要抗体と補助抗体の形式は、ＩｇＧ、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、一本鎖Ｆｖ断片、マイクロ抗体（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）、ナノ抗体（ｎａｎｏｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体（ｕｎｉｂｏｄｙ）又は二重ドメイン抗体（ｄｉａｂｏｄｙ）から選択される。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態では、前記抗体が抗体のＦａｂ’断片であり、抗体からＦｃ断片を除去し還元したあとに取得される場合を提示した。また、取得される断片は軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含む。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態では、前記主要抗体がＣＤ１９抗体のＦａｂ’断片であり、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列が具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示される場合を提示した。
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【００２８】
また、重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示される。
2020533360.tif 000004
【００２９】
また、主要抗体はＨｅｒ２抗体としてもよい。前記Ｈｅｒ２抗体のＬＣ配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示される。
2020533360.tif 000005
【００３０】
前記Ｈｅｒ２抗体のＨＣ配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４で示される。
2020533360.tif 000006
【００３１】
更に、前記主要抗体はＥＧＦＲ抗体のｓｃＦｖ断片としてもよい。前記ＥＧＦＲ抗体のｓｃＦｖのＶＨ配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５で示される。
2020533360.tif 000007
【００３２】
前記ＥＧＦＲ抗体のＶＬ配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６で示される。
2020533360.tif 000008
【００３３】
更に、前記主要抗体はＰＳＭＡ抗体としてもよい。前記ＰＳＭＡ抗体のＶＨ配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７で示される。
2020533360.tif 000009
【００３４】
前記ＰＳＭＡ抗体のＶＬ配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８で示される。
2020533360.tif 000010
【００３５】
更に、前記主要抗体はＰＤＬ１抗体としてもよい。前記ＰＤＬ１抗体の重鎖配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９で示される。
2020533360.tif 000011
【００３６】
前記ＰＤＬ１抗体の軽鎖配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０で示される。
2020533360.tif 000012
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態では、前記補助抗体がＣＤ３抗体のＦａｂ’断片であり、前記ＣＤ３抗体のＶＨ配列が具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１で示される場合を提示した。
2020533360.tif 000013
【００３８】
前記ＣＤ３抗体のＶＬ配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２で示される。
2020533360.tif 000014
【００３９】
或いは、前記ＣＤ３抗体のＶＨ配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３で示される。
2020533360.tif 000015
【００４０】
前記ＣＤ３抗体のＶＬ配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４で示される。
2020533360.tif 000016
【００４１】
更に、前記補助抗体はＰＤ−１抗体としてもよい。前記ＰＤ−１抗体のＶＨ配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５で示される。
2020533360.tif 000017
【００４２】
前記ＰＤ−１抗体のＶＬ配列は、具体的に下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６で示される。
2020533360.tif 000018
【００４３】
本発明ではリポソームの成分については特に制限せず、リポソームでありさえすればよい。前記リポソームの構成成分は、レシチン、水素化大豆ホスファチジルコリン、水素化卵ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルグリセロホスホコリン、１−ミリストイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−ステアロイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−パルミトイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、１−ステアロイル−２−リノレオイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、水素化ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルグリセロホスホコリン、ジミリストイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、脳ホスファチジルセリン、ジミリストイルホスファチジルセリン、ジパルミトイルホスファチジルセリン、卵ホスファチジルグリセロール、ジラウロイルホスファチジルグリセロール、ジミリストイルホスファチジルグリセロール、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール、ジステアロイルホスファチジルグリセロール、ジオレオイルホスファチジルグリセロール、脳スフィンゴミエリン、ジパルミトイルスフィンゴミエリン、又はジステアロイルスフィンゴミエリン、コレステロール、ジオレオキシプロピルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、ジオレオイルクロリドプロピルトリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジメチルジステアリルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、コレステリル３Β−Ｎ−（ジメチルアミノ−エチル）−カルバメート塩酸塩（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（ＤＯＧＳ）、ジオレオイルスクシニルグリセロールコリンエステル（ＤＯＳＣ）、ジオレオイルクロリドスペルミンカルボキシアミドエチルジメチルプロピルトリフルオロ酢酸アンモニウム（ＤＯＳＰＡ）、のいずれか１つ又は２つ或いは２つ以上の組み合わせから選択すればよい。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態で提示するように、前記リポソームの構成成分には、ホス
ファチジルコリン、コレステロール、主要抗体と連結する脂質、及び補助抗体と連結する脂質分子が含まれる。
【００４５】
更に、前記リポソームは、ブランクリポソームとしてもよいし、薬物送達リポソームとしてもよい。
【００４６】
本発明は、第二の局面において、前記複数細胞標的化リポソームの調製方法を提供する。当該方法はポストインサーション法で調製を行い、以下のステップを含む。
（１）主要抗体と補助抗体をそれぞれ脂質分子に連結し、主要抗体−脂質分子及び補助抗体−脂質分子を取得する。
（２）取得した主要抗体−脂質分子及び補助抗体−脂質分子を構築済みのリポソームと混合し、培養することで混合溶液を取得する。
（３）取得した混合溶液を透析又は限外濾過し、未封入の抗体及び抗体脂質複合物を除去することで、複数細胞標的化リポソームを取得する。
【００４７】
好ましくは、前記主要抗体と脂質分子のモル比は（０．１〜５）：１０００の範囲である。
【００４８】
好ましくは、前記補助抗体と脂質分子のモル比は（０．１〜５）：１０００の範囲である。
【００４９】
本発明は、第三の局面において、免疫治療薬、抗腫瘍薬の調製における前記複数細胞標的化リポソームの応用を提供する。
【００５０】
本発明は、第四の局面において、前記複数細胞標的化リポソームを腫瘍患者に適用するステップを含む腫瘍の治療方法を開示する。前記方法は、体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での方法としてもよい。前記方法は、非治療目的であってもよい。前記腫瘍は、細胞表面がＣＤ１９陽性の腫瘍としてもよい。
【発明の効果】
【００５１】
従来技術と比較して、本発明は以下の有益な効果を有する。
【００５２】
本発明の複数細胞標的化リポソームは、複標的化抗体と類似の作用メカニズムを有するが、更に、主要抗体と補助抗体の密度及び相対比率を調整することで、異なる標的細胞と標的分子に対するエフェクター細胞の活性化効果を最適化可能である。更に、リポソームに封入された薬物によって、標的細胞及びエフェクター細胞に対する作用がいっそう強化される。また、最後に、複数細胞リポソームは、複標的化抗体よりも生産、調製及び品質制御を実行可能である。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１Ａ】図１Ａは、ＣＤ３完全長抗体、精製した抗ＣＤ３抗体のＦ（ａｂ’）２断片、抗ＣＤ３抗体のＦａｂ’断片−高分子−ＤＳＰＥ連結生成物の還元型及び非還元型のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である（クマシーブリリアントブルー染色）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＣＤ１９完全長抗体、精製した抗ＣＤ１９抗体のＦ（ａｂ’）２断片、抗ＣＤ１９抗体のＦａｂ’断片−高分子−ＤＳＰＥ連結物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である（クマシーブリリアントブルー染色）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、抗ＣＤ３の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）断片、抗ＣＤ３の一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）断片−高分子−ＤＳＰＥ連結物のＳＤＳ−ＰＡＧＥ図である（クマシーブリリアントブルー染色）。
【図２】図２は、複数細胞標的化リポソーム、単一標的化リポソーム、非標的化リポソームの粒径分布である。
【図３Ａ】図３Ａは、ＣＤ３及びＣＤ１９に対する複数細胞標的化リポソーム及び単一標的化リポソームと標的細胞Ｊｕｒｋａｔとの特異的結合を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＣＤ３及びＣＤ１９に対する複数細胞標的化リポソーム及び単一標的化リポソームと標的細胞Ｒａｊｉとの特異的結合を示す。
【図４】図４は、複数細胞標的化リポソーム、単一標的化リポソーム、非標的化リポソームにより媒介されたＣＤ３＋標的細胞とＣＤ１９＋標的細胞との細胞間結合を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、予め活性化されたエフェクター細胞による標的細胞Ｒａｊｉに対する細胞殺傷作用を複数細胞標的化リポソームが媒介した場合に、ＬＤＨ法で投薬２４時間後の細胞障害性を検出したものである。エフェクター細胞は、ＣＤ３及びＣＤ２８抗体で３日間活性化・増幅したＴ細胞である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、予め活性化されたエフェクター細胞による標的細胞Ｒａｊｉに対する細胞殺傷作用を複数細胞標的化リポソームが媒介した場合に、ＬＤＨ法で投薬２４時間後の細胞障害性を検出したものである。エフェクター細胞は、ヒトＩＬ−２で活性化・増幅したＬＡＫ細胞である。
【図６Ａ】図６Ａは、予め活性化されたエフェクター細胞による標的細胞Ｒａｊｉに対する細胞殺傷作用を複数細胞標的化リポソームが媒介した場合に（エフェクター細胞はゾレドロン酸で増幅したヒトγδＴ細胞）、投薬２４時間後の細胞障害性として、エフェクター細胞／標的細胞の比率の違いによる細胞殺傷状況をＬＤＨ法で検出したものである。
【図６Ｂ】図６Ｂは、予め活性化されたエフェクター細胞による標的細胞Ｒａｊｉに対する細胞殺傷作用を複数細胞標的化リポソームが媒介した場合に（エフェクター細胞はゾレドロン酸で増幅したヒトγδＴ細胞）、投薬２４時間後の細胞障害性として、投与量・標的の異なるリポソームにより媒介された細胞殺傷状況をＬＤＨ法で検出したものである。
【図６Ｃ】図６Ｃは、予め活性化されたエフェクター細胞による標的細胞Ｒａｊｉに対する細胞殺傷作用を複数細胞標的化リポソームが媒介した場合に（エフェクター細胞はゾレドロン酸で増幅したヒトγδＴ細胞）、投薬２４時間後の細胞障害性として、投与量・標的の異なるリポソームにより媒介された細胞殺傷状況をＬＤＨ法で検出したものである。
【図７Ａ】図７Ａは、未刺激のエフェクター細胞による標的細胞Ｒａｊｉに対する細胞殺傷作用を複数細胞標的化リポソームが媒介した場合に（エフェクター細胞は未活性のヒトリンパ球）、投薬５時間後の細胞障害性として、投薬５時間後の標的細胞の殺傷状況をＰＩ染色法により検出したものである。
【図７Ｂ】図７Ｂは、未刺激のエフェクター細胞による標的細胞Ｒａｊｉに対する細胞殺傷作用を複数細胞標的化リポソームが媒介した場合に（エフェクター細胞は未活性のヒトリンパ球）、投薬２４時間後の細胞障害性として、投薬２４時間後の標的細胞の殺傷状況をＰＩ染色法により検出したものである。
【図８Ａ】図８Ａは、未刺激のリンパ球による標的細胞Ｒａｊｉに対する細胞殺傷作用を複数細胞標的化リポソームが媒介した場合の（エフェクター細胞は未活性のヒトリンパ球）、エフェクター細胞／標的細胞の比率の違いによる細胞殺傷状況を示す（ＰＩ染色法）。
【図８Ｂ】図８Ｂは、未刺激のリンパ球による標的細胞Ｒａｊｉに対する細胞殺傷作用を複数細胞標的化リポソームが媒介した場合の（エフェクター細胞は未活性のヒトリンパ球）、投与量・標的の異なるリポソームにより媒介された細胞殺傷状況を示す（ＬＤＨ法）。
【図８Ｃ】図８Ｃは、未刺激のリンパ球による標的細胞Ｒａｊｉに対する細胞殺傷作用を複数細胞標的化リポソームが媒介した場合の（エフェクター細胞は未活性のヒトリンパ球）、投与量・標的の異なるリポソームにより媒介された細胞殺傷状況を示す（ＬＤＨ法）。
【図９Ａ】図９Ａは、複数細胞標的化リポソームが未刺激のリンパ球による標的細胞殺傷作用を媒介した場合に（エフェクター細胞は未活性のリンパ球、標的細胞は標的細胞Ｒａｊｉ細胞）、ＬＤＨ法により投薬５時間後の細胞障害性を検出したものである。なお、複数細胞標的化リポソームの主要抗体は抗ＣＤ３抗体のＵＣＨＴ１クローンのＦａｂ’２断片ではなく、別のクローンの抗ＣＤ３ ＩｇＧモノクローナル抗体（２Ｃ１１）に変更した。
【図９Ｂ】図９Ｂは、複数細胞標的化リポソームが未刺激のリンパ球による標的細胞殺傷作用を媒介した場合に（エフェクター細胞は未活性のヒトリンパ球、標的細胞はＣＤ１９＋ヒトＢ細胞白血病ＳＵＰ−Ｂ１５細胞）、ＬＤＨ法により投薬２４時間後の細胞障害性を検出したものである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、複数細胞標的化リポソームが未刺激のリンパ球による標的細胞殺傷作用を媒介した場合に（エフェクター細胞は未活性のＣＤ４＋Ｔ細胞、標的細胞はＬＧＲ５＋ヒト非小細胞性肺癌Ａ５４９細胞）、ＬＤＨ法により投薬５時間後の細胞障害性を検出したものである。なお、複数細胞標的化リポソームの補助抗体はＬＧＲ５抗体とした。
【図１０】図１０は、未刺激のリンパ球による標的細胞Ｒａｊｉに対する細胞殺傷作用を複数細胞標的化リポソームが媒介した場合のＩＦＮ−γの分泌状況を示す。エフェクター細胞は未活性のヒトリンパ球とした。図中の、ＰｘＰは非標的化リポソーム群、ＨｘＰはＣＤ１９単一標的化リポソーム群、ＵｘＰはＣＤ３単一標的化リポソーム群、ＵｘＨはＣＤ１９及びＣＤ３複数細胞標的化リポソーム群を示す。
【図１１】図１１は、未刺激のリンパ球による標的細胞Ｒａｊｉに対する細胞殺傷作用を複数細胞標的化リポソームが媒介した場合の濃度別のＥＧＴＡの影響を示す。エフェクター細胞は未活性のヒトリンパ球とした。
【図１２】図１２は、複数細胞標的化リポソームが未刺激のリンパ球による標的細胞殺傷作用を媒介した場合に（エフェクター細胞は未活性のヒトリンパ球、標的細胞はＣＤ１９＋Ｒａｊｉ細胞）、ＬＤＨ法により投薬２４時間後の細胞障害性を検出したものである。図中のＵｘＨ−ｌｉｐｏは複数細胞標的化ブランクリポソーム群、ＵｘＨ−ＤＡＳ−ｌｉｐｏは複数細胞標的化ダサチニブリポソーム群を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ）とは、脂質分子からなる人工的に作製された二分子膜小胞である。通常、脂質分子の構造は、親水性頭部、疎水性尾部及び結合部の３つの部分から構成される。水媒体内では、疎水性の相互作用によって、脂質分子の疎水性尾部が互いに近寄り、親水性頭部が水相側を向いて並ぶことで二分子膜が形成される。このような構造によれば、リポソーム内部の水相（内水相）に親水性薬物を含ませることができる一方、脂質二層膜内には疎水性薬物を挿入可能である。
【００５５】
標的化リポソームの標的化作用は、表面に修飾されるリガンドによって実現される。リガンドとしては、抗体、ポリペプチド、小分子等が可能であり、リガンドを介することで標的細胞の特異的受容体との相互作用が奏される。これらのうち、抗体及びその断片をリポソームの表面に修飾する場合には、小分子リガンドやポリペプチドリガンドの場合よりも良好な結合活性及び特異性が備わる。また、脂質分子の自己集合原理を利用すれば、１つのリポソームの表面に対する２つ以上の異なるリガンドの修飾も比較的良好に実行可能である。
【００５６】
本発明では、抗体修飾リポソーム技術をベースとし、標的細胞を対象とする主要抗体とエフェクター細胞を対象とする補助抗体を巧みに組み合わせることで、新規且つ独特のリポソームによる腫瘍細胞殺傷メカニズム及び効果を取得する。現在知られている複標的化リポソーム製剤技術では、異なるリガンドを組み合わせ、異なる抗原に同時に結合させることで、特定の細胞に対する標的化送達効率及び選択性を向上させている。これに対し、本発明で提供する複数細胞標的化リポソームでは、複数の細胞間での相互作用を促進又は
ブロックすることで、異なる細胞間での認識、結合及び活性化等の生理機能を調節する。つまり、リガンド標的化リポソーム技術に対し全く新しい方向性を提案するものである。
【００５７】
また、脂質薬物キャリアの表面に複数細胞標的性を構築することは、同一の抗体構造上に標的性の異なる２種類の抗体配列を構築する場合よりも遥かに容易なだけでなく、リポソーム表面の主要抗体及び補助抗体の密度や比率を調節することで抗腫瘍効果を最適化できる。このほか、こうした複数細胞標的化リポソームの構築及び調製方法によれば、抗体の配列ミス等の問題も回避されるため、生産及び治療効果の欠点が解消される。特に、リポソームは体内において独特の薬物動態と分布特性を更に有することから、従来の複標的化抗体は体内での作用半減期が短いとの欠点を大幅に改善可能である。
【００５８】
更に、本発明で得られる複数細胞標的化リポソームは、リポソーム薬物送達技術との組み合わせも可能である。よって、臨床における既存の複標的化抗体とその他の薬物との併用療法と比べて便利で迅速、多様且つ制御可能である。リポソームに薬物を封入することで、薬物の標的化送達及び放出を実現可能となる。即ち、薬物の選択性が向上し、薬物の放出部位や時間を変化させられる。例えば、腫瘍免疫療法の副作用には、患者におけるサイトカインストームの発生が含まれる。そのため、この副作用を抑えるべく、臨床では患者に対しデキサメタゾンを予め服用することを求めている。また、例えば、一部の免疫製剤はＩＬ−２等のサイトカイン製剤を同時に系統的に投与しなければ理想的な免疫活性化作用を得ることができない。これに対し、リポソームは、薬物送達キャリアとして薬物を封入し、且つ主要抗体及び補助抗体を利用することで薬物の標的化送達を実現可能である。
【００５９】
そこで、本発明は、標的細胞を対象とする主要抗体とエフェクター細胞を対象とする補助抗体を含む複数細胞標的化リポソームを調製することで、腫瘍細胞に対する免疫細胞の結合及び認識を促進し、更には免疫細胞の効果・機能の活性化を実現可能とする。このような複数細胞標的化リポソームは独特の体内作用メカニズムを有している。且つ、臨床で応用されている複標的化抗体よりも、生産・調製及び体内作用といった多くの面において実質的に進歩している。また、薬物送達リポソームを利用して複数細胞標的化製剤を調製することで、いっそう良好な治療効果を実現可能となる。
【００６０】
本発明の一部の実施形態で提示するように、本発明の技術手段は以下の利点を有する。
（１）本発明は、複数細胞標的化リポソームの調製を出発点とし、同一のリポソームに２種類の異なる特異的な標的化抗体又は抗体断片を修飾する。リポソームの調製及び表面の標的化修飾技術はすでに成熟しているため、設計が容易であり、大規模な生産・調製及び分離・精製を行いやすい。また、標的化基は臨床の必要性に応じて調整可能なことから、疾病に応じて各種の異なる特異的な複数細胞標的化結合を開発及び設計するのに有利である。
（２）本発明におけるＣＤ１９抗原及びＣＤ３抗原と特異的に結合する２種類の抗体断片−脂質連結物、蛍光標識リポソームで調製した複数細胞標的化リポソーム及び単一標的化リポソーム、及びＣＤ１９陽性細胞及びＣＤ３陽性細胞をそれぞれ培養したところ、いずれにも強い結合活性が見られた。且つ、これらの結合は特異的であった。
（３）本発明におけるＣＤ１９抗原及びＣＤ３抗原と特異的に結合する複数細胞標的化リポソームと、異なる蛍光で標識したＣＤ１９陽性細胞及びＣＤ３陽性細胞を一緒に培養し、フローサイトメーターで検出したところ、２種類の蛍光による二重陽性信号が出現した。これより、複数細胞標的化リポソームが細胞間結合を効果的に媒介可能なことが示された。即ち、免疫エフェクター細胞による標的細胞認識能力を促進可能なことが示された。
（４）本発明におけるＣＤ１９抗原及びＣＤ３抗原と特異的に結合する複数細胞標的化リポソームと、免疫エフェクター細胞及び腫瘍細胞を一緒に培養したところ、腫瘍細胞に
対する免疫エフェクター細胞の大変強い殺傷能力が示された。且つ、この殺傷能力は、パーフォリン−グランザイム経路により媒介された。
（５）本発明におけるＣＤ１９抗原及びＣＤ３抗原と特異的に結合する複数細胞標的化リポソームと、免疫エフェクター細胞及び腫瘍細胞を一緒に培養し、ＥＬＩＳＡで検出したところ、複数細胞標的化リポソームが免疫エフェクター細胞によるＩＦＮ−γサイトカインの分泌を効果的に刺激可能なことが示された。
（６）本発明におけるＣＤ１９抗原及びＣＤ３抗原と特異的に結合する複数細胞標的化リポソームについて表面の抗体密度を調節し、ＬＤＨで検出したところ、複数細胞標的化リポソームが制御可能な細胞相互作用の調節能力を有することが示された。
（７）本発明におけるＣＤ１９抗原及びＣＤ３抗原と特異的に結合する複数細胞標的化リポソームは、複標的化抗体の利点を有するだけでなく、薬物送達リポソームを利用して複数細胞標的化薬物送達システムを調製することも可能である。ＣＤ１９抗原及びＣＤ３抗原と特異的に結合する２種類の抗体断片−脂質連結物と、免疫調節薬ダサチニブを搭載した薬物送達リポソームを原料として調製される薬物送達複数細胞標的化リポソームは、薬物送達量が多い場合には、免疫エフェクター細胞により媒介される細胞殺傷に対し効果的な抑制能力を示した。薬物送達複数細胞標的化リポソームは、標的化薬物キャリアとして疾病に対する標的化薬物送達システムに発展し得るため、良好な治療効果が実現される。
【００６１】
本発明の具体的実施形態について更に記載する前に、本発明による保護の範囲は後述する特定の具体的実施形態に限らないと解釈すべきである。更に、本発明の実施例で使用する用語は特定の具体的実施形態を記載するためのものであって、本発明による保護の範囲を制限するものではないと解釈すべきである。また、以下の実施例で具体的条件を明記していない試験方法については、一般的に、汎用条件又はメーカーごとの推奨条件に基づき実施する。
【００６２】
実施例で数値範囲を提示している場合には、本発明において別途説明がない限り、各数値範囲の２つの端点及び２つの端点の間の任意の数値をいずれも適用可能であると解釈すべきである。また、別途定義しない限り、本発明で使用するあらゆる技術及び科学用語は、当業者が一般的に理解する意味と同義である。また、実施例で使用される具体的方法、デバイス、材料のほかに、当業者が把握する従来技術及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例で記載する方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。
【００６３】
また、別途説明がない限り、本発明で開示する実験方法、検出方法、調製方法には、当該分野において一般的な分子生物学、生物化学、クロマチン構造及び分析、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術及び関連分野の一般技術を採用すればよい。これらの技術については従来の文献で十分に説明されている。具体的には、以下の文献等を参照すればよい。
【００６４】
Ｓａｍｂｒｏｏｋほか，ＭＯＬＥＣΜＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１
Ａｕｓｕｂｅｌほか，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣΜＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ ｕｐｄａｔｅｓ
ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ
Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，
Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８
ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９
ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣΜＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９
【００６５】
特に説明がない限り、以下の実施例で使用する実験材料はいずれも一般的な生化学試薬メーカーから購入したものである。
実験用試薬及び細胞
【００６６】
レシチン（ＥＰＣ）、水素化大豆リン脂質（ＨＳＰＣ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール２０００−マレイミド（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−ｍａｌ）は、ＮＯＦ社（日油株式会社）（東京，日本）より購入した。また、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン−ポリエチレングリコール２０００（ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００）は、アバンティポーラリピッド社（米国，アラバマ州）より購入した。
【００６７】
ＤｉＩはシグマ社、ＣＦＳＥはインビトロジェン社より購入した。
【００６８】
ＲＰＭＩ−１６４０培地、ウシ胎児血清、ペニシリン−ストレプトマイシン二重抗体試薬（１００×）はジブコ（Ｇｉｂｃｏ）社から購入した。
【００６９】
Ｒａｊｉヒトリンパ腫細胞、Ｊｕｒｋａｔヒトリンパ腫細胞は、中国科学院細胞所から購入した。
【００７０】
実施例１：複数細胞標的化リポソームの調製
【００７１】
１．抗ＣＤ１９抗体及び抗ＣＤ３抗体のＦ（ａｂ’）２断片の調製
固定化酵素であるペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）又はフィシン（ｆｉｃｉｎ）で酵素切断反応を発生させ、ＩｇＧのＦｃ断片を切断してＦ（ａｂ’）２断片を調製した。ヒト由来及びマウス由来のＩｇＧにはペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）を用いて酵素切断反応を発生させ、マウス由来のＩｇＧ１にはフィシン（ｆｉｃｉｎ）を使用した。具体的な手順としては、５００μｌの抗体を遠心分離して脱塩カラムを通過させ、フロースルーを固定化酵素に加えて３７℃の定温で均一に混合した。そして、ペプシン（ｐｅｐｓｉｎ）で４ｈ培養するか、フィシン（ｆｉｃｉｎ）で２４ｈ培養するかしたあと、５０００ｇで１ｍｉｎ遠心分離してフロースルーを回収した。次に、プロテインＡバインディングバッファーで固定化酵素を洗浄し、フロースルーを回収したあと、フロースルーを合わせることで酵素切断産物を取得した。
【００７２】
酵素切断産物をプロテインＡカラム内において定温で１０ｍｉｎ均一に混合してから、遠心分離によりフロースルーを回収した。そして、プロテインＡバインディングバッファーでプロテインＡカラムを洗浄し、フロースルーを回収したあと、フロースルーを合わせることで、プロテインＡカラムにより精製し且つＩｇＧ及びＦｃ大断片を除去した酵素切断産物を取得した。次に、前記酵素切断産物を５０ＫＤの透析袋で透析した。透析媒体はｐＨ＝７．０のＰＢＳ溶液とし、２ｈ、２ｈ、１６ｈの順で透析することで、Ｆｃ断片を除去した精製抗体のＦ（ａｂ’）２断片を取得した。
【００７３】
取得した抗ＣＤ１９抗体のＦ（ａｂ’）２断片が抗ＣＤ１９完全長抗体からＦｃ断片を除去して取得したものであることを従来技術により確認した。
【００７４】
取得した抗ＣＤ３抗体のＦ（ａｂ’）２断片が抗ＣＤ３完全長抗体からＦｃ断片を除去して取得したものであることを従来技術により確認した。また、取得した断片は軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域を含んでいた。このうち、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は、具体的には下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１の通りであった。
2020533360.tif 000019
【００７５】
また、重鎖の可変領域のアミノ酸配列は、具体的には下記のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の通りであった。
2020533360.tif 000020
【００７６】
２．抗ＣＤ１９抗体及び抗ＣＤ３抗体のＦａｂ’断片−高分子−脂質連結物の調製
システアミンを還元剤とし、抗体のＦ（ａｂ’）２断片をＦａｂ’に還元してＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌのマレイミド基に化学的に連結した。具体的な手順としては、抗体のＦ（ａｂ’）２断片（１〜１０ｍｇ／ｍｌ）を５０ｍＭのＥＤＴＡ含有システアミンと混合し、Ｎ２で保護しつつ、３７℃の定温で９０ｍｉｎ振蕩反応させた。その後、遠心分離して脱塩カラムを通過させ、フロースルーを回収した。これにより、システアミンを除去した抗体のＦ（ａｂ’）２断片の還元生成物Ｆａｂ’を取得した。次に、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌのミセルが６００μＭである３０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液を加えた。Ｆａｂ’とＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌのモル比は１：１とした。これをＮ２で保護しつつ、１０℃の定温で１６ｈ振蕩反応させた。これにより、抗体のＦａｂ’断片−高分子−脂質連結物であるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ−Ｆａｂ’のミセルを取得した。また、取得した連結生成物の連結状況をＳＤＳ−ＰＡＧＥで考察した。結果を図１Ａ及び図１Ｂに示す。
【００７７】
３．抗ＣＤ３抗体のＦａｂ’断片−高分子−脂質連結物の調製
トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）を還元剤とし、抗体のｓｃＦｖ断片及びそのポリマーを遊離スルフヒドリル基を含むｓｃＦｖに還元してＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌのマレイミド基に化学的に連結した。具体的な手順としては、８００μｌの抗体のｓｃＦｖ断片（１〜１０ｍｇ／ｍｌ）をＴＣＥＰが１．２ＭｍであるＨＥＰＥＳ溶液と混合した。ｓｃＦｖとＴＣＥＰのモル比は１：５とした。その後、すぐにＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌのミセルが６００μＭである３０ｍＭのＨＥＰＥＳ溶液を加え、Ｎ２で保護しつつ１０℃の定温で１６ｈ振蕩反応させた。これにより、抗体のｓｃＦｖ断片−高分子−脂質連結物であるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ−ｓｃＦｖのミセルを取得した。また、取得した連結生成物の連結状況をＳＤＳ−ＰＡＧＥで考察した。結果は図１Ｃに示す通りであった。
【００７８】
４．抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３の単一標的化リポソーム及び複数細胞標的化リポソームの調製
ポストインサーション法によって単一標的化リポソーム及び複数細胞標的化リポソームを調製した。複数細胞標的化リポソームについては、調製した抗ＣＤ１９のＦａｂ’断片−高分子−脂質連結物であるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ−Ｆａｂ’と、抗ＣＤ３
のＦａｂ’断片−高分子−脂質連結物であるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ−Ｆａｂ’又はｓｃＦｖ断片−高分子−脂質連結物とを、リポソームとモル比（０．１〜５）：（０．１〜５）：１０００で混合し、Ｎ２で保護しつつ、３７℃の定温で２４ｈ振蕩反応させた。その後、３００ＫＤの限外濾過でリポソームを５回洗浄し、未連結の抗体Ｆａｂ’断片を除去することで、抗ＣＤ１９及び抗ＣＤ３複数細胞標的化リポソームを取得した。一方、抗ＣＤ３単一標的化リポソームについては、抗ＣＤ１９のＦａｂ’断片−高分子−脂質連結物であるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ−Ｆａｂ’等のモルをＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００に置き換えた。また、抗ＣＤ１９単一標的化リポソームについては、抗ＣＤ３のＦａｂ’断片−高分子−脂質連結物であるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ−Ｆａｂ’等のモルをＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ２０００に置き換えた。結果を図２及び表１に示す。調製した標的化リポソームの粒径は約８０〜９０ｎｍ、ＰＤＩは約０．１であった。
【表１】
2020533360.tif 000021
【００７９】
実施例２：複数細胞標的化リポソームの体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）での特異的結合作用の評価
【００８０】
ＣＤ１９陽性Ｒａｊｉ細胞とＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞の場合を例に、複数細胞標的化リポソームの体外での特異的結合作用について考察した。
【００８１】
Ｊｕｒｋａｔ，Ｃｌｏｎｅ Ｅ６−１ヒトＴ細胞白血病細胞株及びＲａｊｉヒトＢ細胞リンパ腫細胞株は、中国科学院細胞バンクから購入した。細胞株は、１％ｐｌｓ二重抗体＋１０％ＦＢＳを含む完全培地ＲＰＭＩ−１６４０（ＧＩＢＣＯ）で培養した。
【００８２】
フローサイトメーターを用いてＣＤ３陽性細胞株Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＣＤ１９陽性細胞株Ｒａｊｉ細胞及びヒト末梢血液リンパ球を分析し、複数細胞標的化リポソームの体外での特異的結合能力を考察した。１×１０６個のＲａｊｉ細胞又はＪｕｒｋａｔ細胞を４００μｌの完全培地で再懸濁し、４８ウェルマイクロプレートに注入した。また、各ウェルに単一標的化ＤｉＩ標識リポソーム又は複数細胞標的化ＤｉＩ標識リポソームを１μｇずつ注入した。これを３７℃の細胞インキュベーター内で２ｈ培養した。次に、細胞を取り出してフローサイトメトリー用チューブに投入し、５００×ｇで５ｍｉｎ遠心分離したあと上清を除去した。その後、ＰＢＳで細胞を２回洗浄した。続いて、４００μｌのＰＢＳで細胞を再懸濁し、フローサイトメーターＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＦＡＣＳ ＬＳＲＩＩにサンプルを投入して検出した。結果は図３Ａ及び図３Ｂに示す通りであった。
【００８３】
実施例３：標的細胞間結合に対する複数細胞標的化リポソームの媒介作用の評価
【００８４】
ＣＤ１９陽性Ｒａｊｉ細胞とＣＤ３陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞の場合を例に、複数細胞標的化リポソームが異なる標的細胞間の細胞−細胞結合を媒介可能なことを証明した。
【００８５】
ＣＦＳＥでＪｕｒｋａｔ細胞を染色し、ＤｉＩでＲａｊｉ細胞を染色した。１．２５×
１０５個のＲａｊｉ−ＤｉＩと１．２５×１０５個のＪｕｒｋａｔ−ＣＦＳＥ細胞をフェノールスルホンフタレインを含まない４００μｌの完全培地で再懸濁して混合し、４８ウェルマイクロプレートに注入した。また、各ウェルに単一標的化リポソーム又は複数細胞標的化リポソームを１μｇずつ注入した。これを３７℃の細胞インキュベーター内で３０ｍｉｎ培養した。そして、フローサイトメーターで、ＣＦＳＥ陽性Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＤｉＩ陽性Ｒａｊｉ細胞及びＣＦＳＥ／ＤｉＩ二重陽性細胞クラスターを分析し、標的細胞間結合に対する複数細胞標的化リポソームの媒介作用を考察した。結果は図４に示す通りであった。
【００８６】
実施例４：エフェクター細胞の腫瘍細胞殺傷作用に対する複数細胞標的化リポソームの媒介評価
【００８７】
細胞培地の配合として、フェノールスルホンフタレインを含まないＲＰＭＩ−１６４０培地に５％ＦＢＳ、１％二重抗体、１００ＩＵ／ｍｌのｈＩＬ−２を添加した。
【００８８】
１．ＬＤＨ法による腫瘍細胞殺傷作用の評価
プロメガ社の非ＲＩ細胞障害性アッセイキットＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）により、エフェクター細胞の腫瘍細胞殺傷作用に対する複数細胞標的化リポソームの媒介を検出した。
【００８９】
エフェクター細胞（未刺激のヒトリンパ球、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で増幅・活性化したヒトＴ細胞、γδＴ細胞、ＬＡＫ細胞）及び標的細胞（Ｒａｊｉ細胞、ＳＵＰ−Ｂ１５細胞、Ａ５４９細胞）を、フェノールスルホンフタレインを含まない完全培地で再懸濁した。なお、細胞濃度はそれぞれ１＊１０６個／ｍｌ及び１．１１＊１０５個／ｍｌとした。次に、１００μｌのエフェクター細胞と９０μｌの標的細胞を９６ウェルマイクロプレートに注入し、吹き付けにより均一に混合しながら細胞をプレーティングした。このとき、標的細胞とエフェクター細胞の比率は１：１０とした。また、各ウェルに、濃度及び標的の異なるリポソームを１０μｌずつ注入し、吹き付けにより均一に混合した。次に、９６ウェルマイクロプレートを細胞インキュベーターに配置して２４時間培養した。そして、培養終了４５分前に、体積補正対照ウェルと標的細胞最大溶解ウェルに１０μｌの溶解液を注入した。培養終了後、９６ウェルマイクロプレートを２５０ｇで４ｍｉｎ遠心分離し、遠心分離後に５０μｌの上清液を新たな９６ウェルマイクロプレートに取り出した。そして、新たなマイクロプレートに５０μｌのＬＤＨ基質を注入し、２２℃で１５分間培養した。培養終了後に、マイクロプレートリーダーにおいて波長４９０ｎｍで吸光度を検出した。
【００９０】
結果は、図５Ａ、図５Ｂ、図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図８Ｂ、図８Ｃ、図９に示す通りであった。
【００９１】
これらの実験データが十分に示すように、本発明の複数細胞標的化リポソームは、エフェクター細胞による標的細胞の効果的な殺傷を有効に媒介可能であった。また、エフェクター細胞は、未刺激のリンパ球、体外で増幅させたリンパ球、体外で活性化させたリンパ球、体外で分化誘導したリンパ球を含んでいた。また、この細胞殺傷作用は細胞溶解作用によるものであり、且つ投与量との間に依存関係を有していた。
【００９２】
２．ＰＩ染色法による腫瘍細胞殺傷作用の評価
エフェクター細胞（未刺激のヒトリンパ球、ＣＤ３／ＣＤ２８抗体で増幅・活性化したヒトＴ細胞、γδＴ細胞、ＬＡＫ細胞）及びＣＦＳＥで標識した標的細胞（Ｒａｊｉ細胞）を、フェノールスルホンフタレインを含まない完全培地で再懸濁した。なお、細胞濃度はそれぞれ１＊１０６個／ｍｌ及び１．１１＊１０５個／ｍｌとした。次に、１００μｌ
のエフェクター細胞と９０μｌの標的細胞を９６ウェルマイクロプレートに注入し、吹き付けにより均一に混合しながら細胞をプレーティングした。このとき、標的細胞とエフェクター細胞の比率は１：１、１：５、１：１０とした。また、各ウェルに、濃度及び標的の異なるリポソームを１０μｌずつ注入し、吹き付けにより均一に混合した。次に、９６ウェルマイクロプレートを細胞インキュベーターに配置して２４時間培養した。そして、培養終了後に細胞をフローサイトメトリー用チューブに回収し、５μｌ、１ｍｇ／ｍｌのＰＩを添加してから１５分間培養したあと、フローサイトメトリー用緩衝液２００μｌを添加してサンプルを投入した。
【００９３】
結果は、図７Ａ、図７Ｂ、図８Ａ、図９Ｂに示す通りであった。
【００９４】
これらの実験データが十分に示すように、本発明の複数細胞標的化リポソームは、エフェクター細胞による標的細胞の効果的な殺傷を有効に媒介可能であった。また、エフェクター細胞は、未刺激のリンパ球、体外で増幅させたリンパ球、体外で活性化させたリンパ球、体外で分化誘導したリンパ球を含んでいた。また、この細胞殺傷作用は細胞溶解による膜溶解作用に基づくものであり、且つ投与量との間に依存関係を有していた。このほか、複標的化抗体は、同じ抗原を発現する異なる標的細胞に対し、エフェクター細胞による殺傷を効果的に媒介可能であった（図９ＡのＣＤ１９＋ＳＵＰ−Ｂ１５細胞）。
【００９５】
異なる抗体分子又は標的細胞に変更した場合の結果は、図９Ａ、図９Ｂ、図９Ｃに示す通りであった。このうち、図９Ａでは主要抗体を抗ＣＤ３抗体の別のクローン（２Ｃ１１）及び異なる抗体形式（ＩｇＧ）に変更した。また、図９Ｂでは、同じ主要抗体及び補助抗体の複数細胞標的化リポソームであるが、標的細胞をＣＤ１９＋ヒト白血病ＳＵＰ−Ｂ１５細胞に変更した。また、図９Ｃでは、補助抗体を別の抗原（ＬＧＲ）を標的とする異なる標的化分子（ＲＳＰＯ−１タンパク）に変更し、標的細胞を非小細胞性肺癌Ａ５４９細胞（固形腫瘍モデル）に変更した。
【００９６】
これらの実験データが十分に示すように、本発明における複数細胞標的化リポソームの第１抗体及び補助抗体は、任意の抗原の任意の形式及び構造を標的とする標的化分子とすればよく、標的細胞及びエフェクター細胞は、主要抗体及び補助抗体が結合し得る任意の細胞とすればよい。複数細胞標的化リポソームは、標的性に基づいて、免疫エフェクター細胞と標的細胞の相互作用という独特のメカニズムを媒介する。そのため、疾病の種類の違いに応じて任意の標的化分子（主要抗体及び補助抗体）に変更することで、標的細胞に対するエフェクター細胞の作用を効果的に媒介可能となる。
【００９７】
実施例５：複数細胞標的化リポソームによるエフェクター細胞の活性化刺激作用の評価
【００９８】
エフェクター細胞（未刺激のヒトリンパ球）と標的細胞（Ｒａｊｉ細胞）をフェノールスルホンフタレインを含まない完全培地で再懸濁した。なお、細胞濃度はそれぞれ１＊１０６個／ｍｌ及び１．１１＊１０５個／ｍｌとした。次に、１００μｌのエフェクター細胞と９０μｌの標的細胞を９６ウェルマイクロプレートに注入し、吹き付けにより均一に混合しながら細胞をプレーティングした。このとき、標的細胞とエフェクター細胞の比率は１０：１とした。また、各ウェルに、濃度及び標的の異なるリポソームを１０μｌずつ注入し、吹き付けにより均一に混合した。次に、９６ウェルマイクロプレートを細胞インキュベーターに配置して２４時間培養した。培養が終了すると、９６ウェルマイクロプレートを２５０ｇで４ｍｉｎ遠心分離し、遠心分離後に５０μｌの上清液を新たな９６ウェルマイクロプレートに取り出した。そして、上清液中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡ法で検出した。結果は図１０に示す通りであった。これより、本発明の複数細胞標的化リポソームは、未刺激のリンパ球、体外で増幅させたリンパ球、体外で活性化させたリンパ球、体外で分化誘導したリンパ球による標的細胞の殺傷を効果的に媒介するとともに、エフェクタ
ー細胞の活性化を促進し、且つサイトカインの発生と放出を促進することが十分に示された。また、生成されるサイトカインは抗腫瘍活性を有していた。且つ、投与量との間に依存関係が存在していた。
【００９９】
実施例６：複数細胞標的化リポソームの作用メカニズムの研究
【０１００】
エフェクター細胞（未刺激のヒトリンパ球）と標的細胞（Ｒａｊｉ細胞）をフェノールスルホンフタレインを含まない完全培地で再懸濁した。なお、細胞濃度はそれぞれ１．１１＊１０６個／ｍｌ及び１．１１＊１０５個／ｍｌとした。次に、９０μｌのエフェクター細胞と９０μｌの標的細胞を９６ウェルマイクロプレートに注入し、吹き付けにより均一に混合しながら細胞をプレーティングした。このとき、標的細胞とエフェクター細胞の比率は１０：１とした。また、各ウェルに、複数細胞標的化リポソームを１０μｌずつ注入し、吹き付けにより均一に混合した。次に、各ウェルにＥＧＴＡ／ＭｇＣｌ２を１０μｌずつ添加し、最終濃度を０、０．１、１、１０ｍＭとして、吹き付けにより均一に混合した。そして、９６ウェルマイクロプレートを細胞インキュベーターに配置して２４時間培養した。また、培養終了４５分前に、体積補正対照ウェルと標的細胞最大溶解ウェルに１０μｌの溶解液を注入した。培養終了後、９６ウェルマイクロプレートを２５０ｇで４ｍｉｎ遠心分離し、遠心分離後に５０μｌの上清液を新たな９６ウェルマイクロプレートに取り出した。そして、新たなマイクロプレートに５０μｌのＬＤＨ基質を注入し、２２℃で１５分間培養した。培養終了後に、マイクロプレートリーダーにおいて波長４９０ｎｍで吸光度を検出した。
【０１０１】
結果は図１１に示す通りであった。これより、本発明の複数細胞標的化リポソームが媒介する標的細胞に対するエフェクター細胞の殺傷作用は、エフェクター細胞のカルシウムイオンに依存的なグランザイム／パーフォリン経路によるものであることが十分に示された。
【０１０２】
実施例７：複数細胞標的化リポソームによる標的化薬物送達作用の評価
【０１０３】
ポストインサーション法によって、薬物を送達する複数細胞標的化リポソームを調製した。この複数細胞標的化薬物送達リポソームについては、調製した抗ＣＤ１９のＦａｂ’断片−高分子−脂質連結物であるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ−Ｆａｂ’と、抗ＣＤ３のＦａｂ’断片−高分子−脂質連結物であるＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−Ｍａｌ−Ｆａｂ’及びダサチニブ薬物送達リポソームを、モル比０．１〜５：０．１〜５：１０００で混合し、Ｎ２で保護しつつ、３７℃の定温で２４ｈ振蕩反応させた。その後、３００ＫＤの限外濾過でリポソームを５回洗浄し、未連結の抗体Ｆａｂ’断片を除去することで、複数細胞標的化ダサチニブリポソームを取得した。
【０１０４】
次に、エフェクター細胞（未刺激のリンパ球）と標的細胞（Ｒａｊｉ細胞）をフェノールスルホンフタレインを含まない完全培地で再懸濁した。なお、細胞濃度はそれぞれ１＊１０６個／ｍｌ及び１．１１＊１０５個／ｍｌとした。次に、１００μｌのエフェクター細胞と９０μｌの標的細胞を９６ウェルマイクロプレートに注入し、吹き付けにより均一に混合しながら細胞をプレーティングした。このとき、標的細胞とエフェクター細胞の比率は１：１０とした。また、各ウェルに、ダサチニブ濃度は異なるが脂質濃度は同一の複数細胞標的化薬物送達リポソームを１０μｌずつ添加し、吹き付けにより均一に混合した。次に、９６ウェルマイクロプレートを細胞インキュベーターに配置して２４時間培養した。そして、培養終了４５分前に、体積補正対照ウェルと標的細胞最大溶解ウェルに１０μｌの溶解液を注入した。培養終了後、９６ウェルマイクロプレートを２５０ｇで４ｍｉｎ遠心分離し、遠心分離後に５０μｌの上清液を新たな９６ウェルマイクロプレートに取り出した。そして、新たなマイクロプレートに５０μｌのＬＤＨ基質を注入し、２２℃で
１５分間培養した。培養終了後に、マイクロプレートリーダーにおいて波長４９０ｎｍで吸光度を検出した。
【０１０５】
結果は図１２に示す通りであった。これより、主要抗体と補助抗体を薬物送達リポソームに連結することで、複数細胞標的化の作用メカニズムをベースとして薬物送達作用を存分に発揮可能なことが十分に示された。
【０１０６】
以上は本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を形式的及び実質的に制限するものではない。当業者であれば、本発明の方法から逸脱しないことを前提に、若干の改良及び補足が可能であり、これらの改良及び補足もまた本発明の保護の範囲内とみなすべきである。本専門分野に精通した技術者が、本発明の精神及び範囲を逸脱することなく、上記で開示した技術内容を利用して実施可能な些細な修正、追加及び変形による等価の変更は、いずれも本発明における等価の実施例である。また、本発明の実質的技術に基づいて上記実施例に対し実施される等価の変更としてのあらゆる修正、追加及び変形は、いずれも本発明の技術手段の範囲に属するものとする。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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