(57)【要約】  本発明は、眼科分野における神経変性病状の治療、特に緑内障の治療に使用するための、好ましくは臍帯血由来の血清に関し、ここで、前記血清は、神経成長因子−β（ＮＧＦ−β）と例えばＢＤＮＦ等の他の因子を含む。前記血清は、その進行が神経炎症プロセスの活性化に関連する眼科学的病状の治療にも使用され得る。本発明は、前記血清及び１つ以上の賦形剤、及び／又はヒトでの使用に許容される担体及び／又は防腐剤を含む組成物に関し、前記組成物は、例えば洗眼剤の形態であり得る。本発明の他の態様は、血液、好ましくは臍帯血から、本発明で使用するための血清を調製する方法に関する。【選択図】図１
2020523416.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経変性眼科学的病状の治療に使用するための血清であって、前記血清が神経成長因子−β（ＮＧＦ−β）を含む血清。
【請求項２】
前記神経成長因子−β（ＮＧＦ−β）が、５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度の存在する、請求項１に記載の使用のための血清。
【請求項３】
６ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度、好ましくは７ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度、より好ましくは８ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度の前記神経成長因子−β（ＮＧＦ−β）を含む、請求項１に記載の使用のための血清。
【請求項４】
５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以下の濃度、好ましくは０．５〜５ｐｇ／ｍｌ、有利には０．７〜４ｐｇ／ｍｌの濃度の前記神経成長因子−β（ＮＧＦ−β）を含む、請求項１に記載の使用のための血清。
【請求項５】
好ましくは９５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をさらに含む、請求項１に記載の使用のための血清。
【請求項６】
−  好ましくは５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度である、上皮成長因子（ＥＧＦ）；
−  好ましくは５０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上又は５０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以下の濃度である、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）；
−  好ましくは５０００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度である、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；
−  好ましくは２００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度である、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）；
−  好ましくは５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度である、インターロイキン１０（ＩＬ−１０）；
−  好ましくは１００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度である、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）；
−  好ましくは０．５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度である、グリア細胞系統由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、
からなる群から選択される１つ以上の分子をさらに含む、請求項１〜５の何れか１項に記載の使用のための血清。
【請求項７】
前記血清が、臍帯血由来の血清である、上記請求項の何れか１項に記載の使用のための血清。
【請求項８】
前記血清が、ヒト血液由来の血清である、上記請求項の何れか１項に記載の使用のための血清。
【請求項９】
前記神経変性眼科学的病状が、網膜の変性病状、視覚神経の変性病状、及び進行が神経炎症プロセスの活性化に関連する眼科学的病状からなる群から選択される、上記請求項の何れか１項に記載の使用のための血清。
【請求項１０】
前記神経変性眼科学的病状が、緑内障である、請求項９に記載の使用のための血清。
【請求項１１】
前記進行が神経炎症プロセスの活性化に関連する眼科学的病状が、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症又はアッシャー症候群の中から選択される、請求項９に記載の使用のための血清。
【請求項１２】
以下の；
−  対応する血液サンプルから得られた血清サンプル中のＮＧＦ−βの濃度を分析する工程； 及び
−  ５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上のＮＧＦ−βの濃度を有する血清サンプルを選択する工程、
を含む、請求項１〜１１の何れか１項に記載の使用のための血清の調製方法。
【請求項１３】
以下の；
ｉ．対応する血液サンプルから得られた血清サンプル中のＢＤＮＦの濃度を分析する工程； 及び
ｉｉ．ＢＤＮＦの濃度が、９５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の血清サンプルを選択する工程、
を含む、請求項１〜１１の何れか１項に記載の使用のための血清の調製方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の血液サンプルが、ヒト臍帯からの血液サンプルである、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１の何れか１項に記載の使用のための血清、及び任意で、ヒトの使用に許容される１つ以上の賦形剤及び／又は担体及び／又は保存料を含む組成物。
【請求項１６】
前記１つ以上の賦形剤が、生理学的水性溶液である、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、洗眼剤、点眼薬又は点鼻薬、眼用軟膏又は鼻用軟膏、眼用ゲル又は鼻用ゲル、又は鼻スプレーからなる群から選択される形態である、請求項１５又は請求項１６に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経変性眼科学的病状、特に緑内障等の網膜及び視覚神経の変性病等の神経変性眼科学的病状、及びその進行が神経炎性のプロセスの活性化に関連する眼科学的病状の治療のための血清、好ましくは臍帯血由来の血清（ｓｅｒｕｍ）の使用に関する。本発明で使用するための血清は、好ましくは５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度の神経成長因子−β（ＮＧＦ−β）を含む。
【０００２】
本発明はまた、本発明の血清を含む、洗眼剤、点眼薬、眼軟膏、眼用ゲル（ｅｙｅ ｇｅｌ）の形態の組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
神経変性眼科学的病状、特に網膜の変性病、視覚神経の変性病及びその進行が神経炎症のプロセスの活性化に関連する眼科学的病状は、進行性であり視覚機能を不能にする障害を引き起こし、これは、最も影響を受ける社会的及び経済的な意味で理解される病状によって影響を受ける個人の生活の質の劇的な低下を伴う。最も広く知られている身体障害性眼科学的病状は、緑内障である。
【０００４】
「緑内障」という用語は、一般に、視覚神経自体の外観及び網膜神経線維の層の特徴的な変化を伴う、視覚神経の慢性進行性損傷を共通で有する目の一連の病状を指す。緑内障は、視力に不可逆的な損傷を引き起こし、場合によっては、低視力又は失明を引き起こす可能性がある。より進行した段階において、緑内障患者の視野は、中心部のみに縮小されるが、周辺視力は低下する。「視野」とは、目の前の一点に視線を固定することによって知覚される空間の部分として定義される。変化が無い場合において、いわゆる「通常の」視野は、一時的に９０°を超え、鼻から６０°を超え、そして約７０°を下回る。変化がある場合において、これらの範囲は、４象限で徐々に選択的に減少する。
【０００５】
「神経保護」という表現は、一般に、多くの神経変性病状で起こるように、組織損傷後の神経細胞への初期及び後期損傷の両方を減らすことを目的とした全ての介入を指す。現在行われている研究（パーキンソン病及び筋萎縮性側索硬化症等の神経変性疾患に主に向けられている）は、問題の病状においてレベルが低下する特定の神経栄養因子（又はそのような特定の神経栄養因子の内因性の合成を誘発する因子）の投与の治療効果を実証している。
【０００６】
眼科分野における神経変性病状に関して、現在提案されている神経保護治療は、アミノ酸及び／又はビタミン等の天然由来物質（その有効性の証拠は無いが、いずれにせよ、市場に出すための登録の段階では必要ない）、又は植物由来の他の化合物（クルクミン、フラボノイド、ゴジベリーに含まれるＬＢＰ多糖類等）の投与に広く基づいている。そのような自然由来の物質は、食事を通して（例えば、リンゴ及びオレンジ等の果物の消費を増やすことによって）直接摂取することも、又は栄養補助食品又は機能性食品として摂取することもできる。代替的な治療戦略は、合成又は抽出された分子（メマンチン、シチコリン、ブリモニジン、ホモタウリン、ポリフェノール等）の投与に基づく。いずれにせよ、眼科分野における神経変性病状の神経保護に関する臨床研究は、初期の段階であり、これらの治療アプローチの臨床的妥当性を確認する利用可能なデータはない。
【０００７】
従って、近年の臨床的な進展にもかかわらず、網膜及び緑内障等の視覚神経の神経変性病状、並びに進行が神経炎症プロセスの活性化に関連する眼科学的病状を治療するための新しい戦略の開発の可能性は、非常に興味深いものである。特に、病状の進行を遅らせるだけでなく（機能的損傷及び視覚障害を含むように）、病症及び臨床病症の退行を可能にし、患者が知覚できる持続的な効果をもたらすために、より効果的な治療戦略を開発する必要性が強く存在する。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、眼科分野における神経変性病状を治療するための血清の使用に関する： 使用される血清は、好ましくは５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度の神経成長因子−β（ＮＧＦ−β）を含む。
【０００９】
一実施形態において、血清は、５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以下の濃度のＮＧＦ−βを含む。
【００１０】
本発明の一実施形態において、本発明の血清は、好ましくは９５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度の脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を含む。
【００１１】
血清は、好ましくは臍帯血からの血清であり得る。本発明の血清は、それ自体で、又は網膜又は視覚神経の変性病状、特に緑内障の治療のために組成物内で使用され得る。
【００１２】
本発明の血清は、それ自体で、又は例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症又はアッシャー症候群等の進行が神経炎症プロセスの活性化に関連する眼科学的病状の治療のために組成物内で使用され得る。
【００１３】
従って、本発明はまた、上記血清及び任意で1つ以上の賦形剤及び／又は担体及び／又は防腐剤を含む組成物に関する。
【００１４】
さらに、本発明は、上記の使用のための血清を調製する方法に関し、それにより、神経変性眼科学的病状の治療に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）に罹患した患者の視野（ＰＺ１）における感度のＭＤ（平均偏差）値のパターンを示すグラフである。２０１６年６月にある矢印は、血清による治療の開始を示す。ＯＤ＝右目； ＯＳ＝左目。
【図２】図２は、本発明の洗眼剤による治療の前後における原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）に罹患した患者の視野（ＰＺ１）における感度のＰＳＤ（パターン標準偏差）値のパターンを示すグラフである。２０１６年６月にある矢印は、血清による治療の開始を示す。ＯＤ＝右目； ＯＳ＝左目。
【図３】図３は、本発明の洗眼剤による治療の前後における原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）に罹患した患者の視野（ＰＺ２）における感度のＭＤ（平均偏差）値のパターンを示すグラフである。２０１６年３月にある矢印は、血清による治療の開始を示す。血清は、右目にのみ投与された。ＯＤ＝右目； ＯＳ＝左目。
【図４】図４は、本発明の血清由来の洗眼剤による治療の前後における原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）に罹患した患者の視野（ＰＺ２）における感度のＰＳＤ（パターン標準偏差）値のパターンを示すグラフである。２０１６年３月にある矢印は、血清による治療の開始を示す。血清は、右目にのみ投与された。ＯＤ＝右目； ＯＳ＝左目。
【図５】図５は、輝度値の増加のフラッシュに対応して記録された網膜電図（ｆＥＲＧ）であり、これは、以下； 本発明の血清で治療後、及び未治療のコントロール動物における目の刺激（Ａ及びＢ）； 光への曝露後に損傷したコントロールの目の刺激（ＬＤコントロール）及び光へ曝露された同じ動物における治療後の目及び未治療の目の刺激（ＬＤ治療後の目及び未治療の目）（Ｃ及びＤ）に関連して２つの異なる強度で記録されたａ波及びｂ波の振幅を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、両方の光ＬＤに暴露された処置後の目のサンプル（上段）及び未治療の目のサンプル（下段）における視神経乳頭を通過する背側から腹側の網膜までの測定された光受容体層（ＯＮＬ）の厚さを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、処置後の目のサンプル（左）及び未治療の目のサンプル（右）の「ホットスポット」の範囲（最大損傷の領域）を示す。
【図７】図７は、ＦＢＳ／ＣＢＳの存在下において、Ｈ２Ｏ２に暴露した後のＲＭＣ−１細胞の細胞生存率の分析を示す。グラフは、ＦＢＳ又はＣＢＳで培養したＲＭＣ−１細胞間でのＨ２Ｏ２処理後の細胞生存率の違いを示す。図中のアスタリスクは、それぞれ、＊： ｐ＜０．０５； ＊＊＊： ｐ＜０．０１； ＊＊＊＊： ｐ＜０．０００１を意味する。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、神経変性眼科学的病状又は進行が神経炎症プロセスの活性化に関連する眼科学的病状の治療に使用するための、好ましくは５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度の神経成長因子−β（ＮＧＦ−β）を含む血清に関する。
【００１７】
一実施形態において、本発明による使用のための血清は、６ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＮＧＦ−βを含むことができ； より好ましくは、本発明による使用のための血清は、７ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＮＧＦ−βを含むことができ； さらにより好ましくは、本発明による使用のための血清は、８ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＮＧＦ−βを含むことができる。
【００１８】
一実施形態において、ＮＧＦ−β因子は、血清中に５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以下の濃度で存在し、好ましくは０．５〜５ｐｇ／ｍｌの間の濃度を含み、有利には０．７〜４ｐｇ／ｍｌの間の濃度を含む濃度で存在する。
【００１９】
神経成長因子−β（ＮＧＦ−β）は、神経細胞及びグリアの成長及び生存をサポートする強力な神経栄養因子（ニュートロフィンのファミリーに属する）である。ＮＧＦ−βは、血清中に存在する他の因子と組み合わせて、本発明による血清の神経保護及び抗炎症効果の要因である。
【００２０】
細胞の成長、増殖及び分化における多くの成長因子及びサイトカインの役割は、以前から知られており、しかしながら、多くの細胞連絡経路は、未だ完全に理解されておらず、細胞連絡の様々な経路が互いに交差する経路は不明である。従って、ＮＧＦ−βに加えて、眼科学的病状に対する神経保護効果を媒介する上で他の様々な分子が重要な役割を果たす可能性があり； これらの分子の中で、上皮成長因子（ＥＧＦ）、形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−ｂａｓｉｃ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）及びグリア細胞系統由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）等の成長分子を示すことが可能である。
【００２１】
上記で特定された1つ以上の他の因子と組み合わせて、眼科学的病状に対する神経保護効果又は抗炎症効果を媒介するために重要な役割を果たす可能性のある他の因子は、ＴＧＦ−β１、β２及びβ３（形質転換成長因子−β１、β２及びβ３）、ＩＧＦ−１（インスリン様成長因子１）、ＩＧＦ−２（インスリン様成長因子２）及びＶＥＧＦ（血管内皮成長因子）である。
【００２２】
形質転換成長因子−α（ＴＧＦ−α）は、マクロファージ、脳細胞及びケラチノサイトによって産生される。ＴＧＦ−αは、上皮の発達を誘導し、その作用は、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）の作用と密接に相関しており、これは、細胞の成長、増殖及び分化の制御に重要な役割を果たす。ＴＧＦ−αはまた、損傷した成人の脳の神経細胞の増殖を刺激する。
【００２３】
血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）は、間葉由来の細胞の主要な血清有糸分裂促進因子である。生物学的に活性なタンパク質は、２つのポリペプチド（サブユニットＡ及びＢ）のダイマーであり、これは、ホモダイマー（ＡＡ又はＢＢ）及びヘテロダイマー（ＡＢ）の形態で存在可能である。
【００２４】
線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、血管新生、創傷治癒及び胚発生等のプロセス、並びに様々な内分泌シグナル経路に関与する成長因子のファミリーである。例えば、中枢神経系の発達中に、ＦＧＦは、神経細胞の増殖、神経新生、軸索の発達及び分化において重要な役割を果たす。ＦＧＦ２は、ミュラー細胞（網膜グリア）によって生成及び放出され、自己保護メカニズムで活性化される。
【００２５】
最近の実験的な証拠に照らし合わせて、ＢＤＮＦは、動物モデルにおいて光による損傷から光受容体を保護していると考えられ、ＧＤＮＦは、網膜ニューロンを保護する能力を有すると考えられる。
【００２６】
間接的な神経保護又は抗炎症の役割は、インターロイキン１０及び１３（ＩＬ−１０及びＩＬ−１３）等のいくつかのサイトカイニンによっても果たすことができ、これらは、抗炎症作用により、神経変性プロセスの阻害に寄与する。インターロイキンＩＬ−１β、ＩＬ−４及びＩＬ−６は、神経保護又は抗炎症の役割も果たす。
【００２７】
従って、好ましい実施形態において、本発明による使用のための血清は、ＮＧＦ−βに加えて、１つ以上の成長因子又はサイトカインをさらに含むことができる。特に、血清は、以下：
−  ＥＧＦ、好ましくは５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度；
−  ＴＧＦ−α、好ましくは５０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度；
−  ＰＤＧＦ、好ましくは５０００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度；
−  ＦＧＦ、好ましくは２００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度；
−  ＩＬ−１０、好ましくは５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度；
−  ＩＬ−１３、好ましくは１００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度；
−  ＢＤＮＦ、９５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度；
−  ＧＤＮＦ、０．５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度；
からなる群から選択される１つ以上の分子を含むことができる。
【００２８】
一実施形態において、ＥＧＦは、本発明による使用のために、血清中に７００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、好ましくは、１０００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度で存在することができる。
【００２９】
一実施形態において、ＥＧＦは、５００〜１５００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは５００〜１２００ｐｇ／ｍｌ、有利には７００〜１０００ｐｇ／ｍｌの濃度で血清中に存在する。
【００３０】
一実施形態において、ＴＧＦ−αは、本発明による使用のために、血清中に、例えば、５０〜１００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは６０〜９０ｐｇ／ｍｌの間を含む値で、６０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、好ましくは７５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度で存在することができる。
【００３１】
一実施形態において、ＴＧＦ−αは、本発明による使用のために、血清中に、５０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以下、好ましくは１５〜４５ｐｇ／ｍｌ、有利には２０〜４０ｐｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。
【００３２】
一実施形態において、ＰＤＧＦは、本発明による使用のために、血清中に、例えば、５０００〜１４０００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは７０００〜１００００ｐｇ／ｍｌの間を含む値で、７０００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、好ましくは９０００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度で存在し得る。
【００３３】
一実施形態において、ＥＧＦは、本発明による使用のために、血清中に、例えば、２００〜５００ｐｇ／ｍｌの間を含む値で、３００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、好ましくは４００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度で存在し得る。
【００３４】
一実施形態において、ＩＬ−１０は、本発明による使用のために、血清中に、例えば、５〜１５ｐｇ／ｍｌ、好ましくは７〜１３ｐｇ／ｍｌの間を含む値で、７ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、好ましくは、９ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度で存在し得る。
【００３５】
一実施形態において、ＩＬ−１３は、本発明による使用のために、血清中に、例えば、１３０〜３００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは１３０〜２００ｐｇ／ｍｌの間を含む値で、１３０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、好ましくは１５０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度で存在し得る。
【００３６】
一実施形態において、ＢＤＮＦは、本発明による使用のために、血清中に、１００００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、好ましくは１２０００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、有利には１３０００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度で存在する。
【００３７】
一実施形態において、ＢＤＮＦは、９５００〜２００００ｐｇ／ｍｌ、好ましくは１００００〜１８０００ｐｇ／ｍｌの間の濃度で血清中に含まれる。
【００３８】
一実施形態において、ＧＤＮＦは、本発明による使用のために、血清中に、１ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、好ましくは、１．１ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度で存在する。
【００３９】
一実施形態において、ＧＤＮＦは、０．５〜４ｐｇ／ｍｌ、好ましくは１〜３ｐｇ／ｍｌの間の濃度で血清中に存在する。
【００４０】
特に好ましい一実施形態において、本発明による使用のために血清は、以下：
−  ＮＧＦ−β、好ましくは５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度；
−  ＥＧＦ、好ましくは５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度；
−  ＴＧＦ−α、好ましくは５０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度；
−  ＢＤＮＦ、好ましくは９５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度；
−  ＧＤＮＦ、好ましくは０．５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度；
を含む。
【００４１】
一実施形態において、本発明の血清は、好ましくは９５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度で存在するＢＤＮＦ、任意で、好ましくは０．５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度で存在するＧＤＮＦを含む。
【００４２】
一実施形態において、当該血清は、好ましくは９５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度で存在するＢＤＮＦを含み、また好ましくは０．５〜５ｐｇ／ｍｌを含み、有利には０．７〜４ｐｇ／ｍｌを含む、５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以下の濃度のＮＧＦ−βも含む。
【００４３】
一実施形態において、当該血清は、ＢＤＮＦ、ＮＧＦ−β、ＧＤＮＦ、ＥＧＦ及びＴＧＦ−αを含む。
【００４４】
本発明の一実施形態において、本明細書で説明する使用のための血清は、臍帯血からの血清であり得る。以下、簡潔にするために、用語「コード（ｃｏｒｄ）」は、臍帯からの特定の原料の由来を示すために使用され； 従って、例えば、「コード血液（ｃｏｒｄ ｂｌｏｏｄ）」は、臍帯血を意味し、「コード血清（ｃｏｒｄ ｓｅｒｕｍ）」は、臍帯血等に由来する血清を意味する。本発明による使用のための臍帯血を好む理由は、その中に天然に含まれる成長因子の高い含有率によるためである。あるいは、本明細書に記載される使用のための血清は、成体の血液由来の血清でもあり得る。
【００４５】
本発明の他の実施形態において、本明細書に記載された使用のための血清は、好ましくはヒト血液に由来し得る。
【００４６】
本発明の他の実施形態において、本明細書に記載された使用のための血清は、以下に記載される調製方法により得られ得る。
【００４７】
成長因子及び／又はサイトカインを含む本発明による血清は、眼科学的領域における神経変性病状の治療に使用される。さらに、当該血清は、進行が神経炎症プロセスの活性化に関連する眼科学的な病状、例えば、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）、糖尿病性網膜症又はアッシャー症候群の治療に使用され得る。
【００４８】
特に、本明細書に記載される血清は、網膜の変性病状及び視覚神経の変性病状の治療に使用され得る。時間が経つにつれて、これらのタイプの変性眼科学的病状は、視野の大きな減少及び視力の永久的な損傷をもたらす。従って、このような病状を治療するための本発明の血清の使用は、ニューロン損傷を抑えること、及び／又はその進行を遅らせることにより、そのような病状の影響を受ける対象の生活の質を改善することが可能である。
【００４９】
より詳細には、本発明の血清は、緑内障の治療に使用され得る：一実施形態において、本発明の血清は、原発性開放隅角緑内障の治療に使用され得る；他の実施形態において、本発明の血清は、原発性閉塞隅角緑内障の治療に使用され得る。
【００５０】
本発明の他の態様は、本明細書に記載の使用のための血清を調製する方法に関する。本発明による方法は、以下の；
ｉ．対応する血液サンプルから得られた血清サンプル中のＮＧＦ−βの濃度を分析する工程； 及び
ｉｉ．５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上のＮＧＦ−βの濃度を有する血清サンプルを選択する工程、
を含む。
【００５１】
本発明の方法の工程ｉにおいて、血清の特徴付けが行われる：ＮＧＦ−βの濃度を決定するために、血清サンプルが分析される。当該方法の工程ｉｉにおいて、様々なサンプルに対して決定されたＮＧＦ−βの濃度に基づき、ＮＧＦ−βの濃度が５ｐｇ／ｍｌを超えるサンプルのみが選択される。
【００５２】
工程ｉにおいて、何れか他の成長因子及び／又はサイトカインの濃度がまた、任意で評価され得る： この場合、工程ｉｉにおける血清サンプルの選択は、これら追加の成長因子及び／又はサイトカイン（並びにＮＧＦ−β）の濃度に基づき行うこともでき、これは、上記で指定した閾値濃度より大きくなり得る。一実施形態において、血清の特徴付けの工程ｉにおいて、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＰＤＧＦ、ＦＧＦ、ＩＬ−１０及びＩＬ−１３、ＢＤＮＦ及びＧＤＮＦからなる群から選択される１つ以上の分子濃度を決定することが可能である。
【００５３】
例えば、使用のための血清を調製するための代替方法は、以下の；
ｉ．対応する血液サンプルから得られた血清サンプル中のＢＤＮＦの濃度を分析する工程； 及び
ｉｉ．ＢＤＮＦの濃度が、９５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の血清サンプルを選択する工程、
を含む。
【００５４】
本発明の方法の工程ｉにおいて、血清の特徴付けが行われる：ＢＤＮＦの濃度を決定するために、血清サンプルが分析される。当該方法の工程ｉｉにおいて、様々なサンプルに対して決定されたＢＤＮＦの濃度に基づき、ＢＤＮＦの濃度が９５００ｐｇ／ｍｌを超えるサンプルのみが選択される。
【００５５】
当該方法の工程ｉにおいて分析に供される血清サンプルは、当該技術分野で公知であり一般的に使用される標準的な手順に従って血液から得られ得る。血液サンプルは、通常、室温で約２〜３時間の期間凝固させ（血液の固形成分が沈殿するように）、次いで、通常２５００ｒｐｍ〜３５００ｒｐｍの速度で遠心分離に供される。次いで、例えば吸引により血清（上清）が回収される。
【００５６】
当該方法の一実施形態において、工程ｉｉで選択した血清サンプルは、２４か月以内の期間凍結乾燥され得る。血清サンプルは、好ましくは−２０℃〜−８５℃の温度で凍結され得る。
【００５７】
当業者に知られているように、血清サンプルの保存温度は、その最大保存期間と直接的に相関する。従って、例えば、血清サンプルは、−２０℃で最大６か月の期間、−８０℃で最大４８か月の期間保存することが可能である。
【００５８】
当該サンプルは、好ましくは、約６〜８週間の間、冷凍保存（好ましくは約−７０℃で）することが可能である。
【００５９】
凍結状態を少なくとも６〜８週間維持することを「検疫期間」と呼び、回収した血清に汚染が無く、無菌状態に維持されていることを確認することができる。
【００６０】
本発明の血清の使用を進めるために、1つ以上の選択された血清サンプルが、任意で合わせられ得（凍結している場合、解凍後に）、そのまま使用するか、又は進行が神経炎症プロセスの活性化に関連する神経変性病状又は眼科学的病状の治療のための眼用製剤の製造に使用され得る。
【００６１】
本発明の方法で使用される血清が得られる血液サンプルは、好ましくはヒト臍帯からの血液サンプルであり得る。
【００６２】
本発明による方法は、最小の閾値として上記の値を超える成長因子及び／又はサイトカインの濃度のおかげで、罹患した眼組織の神経保護に有効であり、抗炎症剤として有効な血清の調製を可能にする。
【００６３】
本発明による神経変性眼科学的病状の治療に使用するための血清は、本明細書で特定される成長因子及びサイトカインを自然に含むことができる。前記成長因子及びサイトカインの天然の由来は、合成的に得られた（例えば、まだ市販されていないが研究に利用できる組換え合成技術により）対応する産物の生物学的利用可能性を超える同一の生物学的利用可能性と相関するように思われる。
【００６４】
本発明による血清は、そのまま、すなわち、本明細書に記載の使用のために、純粋な形態で使用することが可能であり、又は組成物内に含めることが可能である。
【００６５】
従って、本発明は、神経変性眼科学的病状の治療に使用するため、又はその進行が本明細書に記載される神経炎症プロセスの活性化に関連する眼科学的病状の治療に使用するための血清、及び任意で1つ以上の追加の物質を含む組成物に関する。当該技術分野で知られているように、そのような物質は、典型的に、ヒトへの使用に許容される賦形剤、担体及び防腐剤からなる群から選択され得る。当該組成物は、好ましくは、本明細書に記載される血清、及び典型的にｐＨ７〜８を有する生理的水性溶液を含むことができる。
【００６６】
当該組成物は、液体形態、ゲル形態、親水コロイド形態、スプレー形態、例えば、当該組成物が、好ましくは液体形態であり得る鼻スプレーであり得る。さらに、当該組成物は、通常、結膜円蓋内又は鼻粘膜を通して経鼻的に投与することにより局所的に使用される。
【００６７】
当該組成物は、眼科学での使用に適した形で調製され得る： 例えば、当該組成物は、洗眼剤、点目薬又は点鼻薬、眼用軟膏又は鼻用軟膏、眼用ゲル又は鼻用ゲル又は鼻スプレーの形態であり得る； 当該組成物は、好ましくは洗眼剤の形態であり得る。例えば、生理学的水性溶液の使用により血清が液体形態で製剤化される場合、上記の成長因子及びサイトカインの濃度は、１：２〜１：１０の間に含まれる係数で希釈され、例えば１：５の希釈係数である。
【００６８】
従って、好ましい実施形態において、液体の形で製剤化された血清は、１：２の係数で希釈され、１：２の係数に基づいて計算され上記で特定された、いくつかの係数のいくつかの濃度値は、以下の通りである：
−  ２５０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は３５０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＥＧＦ；
−  ２５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は３５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は４５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＰＤＧＦ；
−  １００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は１５０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は２００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＦＧＦ；
−  ２．５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は３．５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は４．５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＩＬ−１０；
−  ５０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は６５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は７５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＩＬ−１３；
−  ４７５０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は５０００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、好ましくは６０００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＢＤＮＦ；
−  ０．２５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は０．５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は０．５５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＧＤＮＦ。
【００６９】
液体の形態で製剤化された血清は、１：１０の係数で希釈され、１：２の希釈に基づいて計算され上記で特定された、いくつかの係数のいくつかの濃度の例は、以下に示す通りである：
−  ５０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は７０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は１００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＥＧＦ；
−  ５００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は７００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は９００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＰＤＧＦ；
−  ２０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は３０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は４０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＦＧＦ；
−  ０．５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は０．７ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は０．９ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＩＬ−１０；
−  １０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は１３ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は１５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＩＬ−１３；
−  ９５０ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は１０００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、好ましくは１２００ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＢＤＮＦ；
−  ０．０５ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は０．１ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上、又は０．１１ｐｇ／ｍｌと同等かそれ以上の濃度のＧＤＮＦ。
【００７０】
液体の形態で製剤化された血清が、１：５の係数又は１：２〜１：１０の間を含む何れか他の係数、又は上記で特定されていない他の係数によって希釈される実施形態において、組成物中に存在する成長因子及びサイトカインの濃度は、前述のように、当業者により容易に計算され得る。
【００７１】
本発明はまた、神経変性眼科学的病状、例えば緑内障に罹患している、又はその進行が神経炎症プロセスの活性化に関連する１つ以上の眼科学的病状に罹患しているヒト又は動物を治療する方法に関し、これは、本発明の血清の治療有効量を、治療を必要とする対象に投与する工程を含む。
【００７２】
投与は、好ましくは、結膜円蓋又は鼻粘膜を通して経鼻的に投与することにより、局所的に行われる。
【００７３】
当該血清は、そのまま投与され得る、又は組成物として製剤化され得る。
【００７４】
一実施形態において、当該方法は、本発明の血清を含む組成物の治療有効量の前記対象への投与を含む。前記組成物は、液体形態、ゲル形態、親水コロイド形態又はスプレー形態であり得る。当該組成物は、好ましくは、洗眼剤、点目薬又は点鼻薬、眼用軟膏又は鼻用軟膏、眼用ゲル又は鼻用ゲルである。
【００７５】
さらに、当該組成物は、通常、結膜円蓋又は鼻粘膜を通して経鼻的に投与することにより、局所的に使用される。
【００７６】
投与される当該組成物は、好ましくは、本発明の血清と、典型的に７〜８の間に含まれるｐＨを有する生理学的水性溶液とを含む。本発明の血清を含む液体形態の組成物の治療有効量及び／又は投与量は、その中に存在する成長因子及びサイトカインの濃度に依存する。前記用量及び／又は投与量は、当業者によって容易に推定され得る。
【００７７】
臍帯血血清の調製及びそれを含む調製物（洗眼剤）に関するいくつかの例は、神経変性のプロセスの治療における前記血清又は洗眼剤の有効性の細胞モデルに関するインビトロ評価及び動物モデルに関するインビボ評価と共に以下に提供される。さらなる例は、眼科学的神経変性に罹患した患者を治療するために前記血清又は洗眼剤の使用に関する。当該例は、明らかに、特許出願の保護範囲を制限するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【００７８】
実施例１．０：臍帯血血清の調製
【００７９】
臍帯血のサンプルは、出産後直ぐに数人の女性から寄付され、インフォームドコンセントの受け入れと、移植目的、臨床又は研究用途及び／又は知財保護のための血液自体の使用の許可を使用の条件とする。
【００８０】
臍帯血は、分娩時に胎盤血管から採取され、その使用のために臨床的に検証された専用の試験管に回収され、Ｓ．Ｏｒｓｏｌａ−マルピーギ大学病院総合病院の地域の臍帯血バンクに送られた。
【００８１】
臍帯血サンプルは、最初に室温で２時間凝固された後、＋４／＋１０℃の冷蔵遠心分離機で１５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離に供された。臍帯血サンプルに由来する血清サンプル（すなわち、遠心分離の最後に得られた上清）を吸引により回収し、試験管に入れ、ＮＧＦ−β及び他の成長因子とサイトカインの濃度を評価するために分析した。
【００８２】
５ｐｇ／ｍｌを超えるＮＧＦ−β濃度を有する選択された血清サンプルは、保存チューブに入れられ、洗眼剤の調製での使用時まで−８０℃で維持された。
【００８３】
特定の成長因子（ＥＧＦ）の濃度は、保存期間の終了時及びそれ以降で評価され、−８０℃で６か月の維持の後もほぼ一定であることが実証された。
【００８４】
実施例１．１：臍帯血に基づく洗眼剤の調製
【００８５】
−８０℃で保存した臍帯血血清サンプルが解凍され、クラスＤ制御環境でのラミナーフローフードにおいて作業することで、より多くの臍帯血血清サンプル（同じ血液型で臨床的に検証済）が、それぞれ３０ｍｌ以上の血清量を含む４つの「プール」を得るような方法で集められた。
【００８６】
産生された４つのプールの成長因子及びインターロイキンの濃度は次に示す通りであった（ｐｇ／ｍｌで表した値）。
【表１】
2020523416.tif 000003
【００８７】
ラミナーフローフードにおいて、各プールは、プールの容量の４倍に等しいｐＨ７．４の滅菌生理学的溶液で希釈され（１〜５希釈）、濾過され、１ｍｌ単回投与バイアルに分注された。
【００８８】
個々のバイアルは、ラベルが付けられ、全てのロット（連続する番号でマークされた１５個のバイアルで構成される）が、透明な密閉プラスチックバッグに梱包され、そこに識別ラベルが貼られた。好気性及び嫌気性の細菌及び真菌の調査は、関連する血液成分について検証されたＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴボトル(登録商標)（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）を使用して、全てのロットで実行された。微生物検査の結果が陰性であることが確認された後にのみ、患者での実験のために洗眼剤ロットが利用可能になった。
【００８９】
実施例１．２： 患者のインビボ評価
【００９０】
視野（ＶＦ）のコンピュータ制御された検査
【００９１】
視野（ＶＦ）のコンピュータ制御された検査は、眼を囲む空間の視力を測定し、網膜及び／又は視覚神経の病状に起因する視野感度の変化の存在を評価することに役立つ。視野感度の変化は、通常の視野の様々なポイントでの知覚を評価することによって調べられる。
【００９２】
ＶＦ検査は、網膜の局所的な光刺激の測定によって行われる：実際には、３３ｃｍの距離で患者の目の前に置かれた半ドーム型のスクリーンに投影又は作動させる様々な形及び強度の光刺激を知覚し、それに応答する患者の能力の評価が行われる。検査は、それぞれの目で個別に行われ（従って、検査を受けていない患者の目は閉じられている）、片目で約１５分間続き、痛みは無い。分析に使用される機器は、光シグナルが投影される背景が白いドーム型のスクリーンで構成される：患者が光シグナルを感知すると、患者は、例えば発光又は音響プッシュボタンを押すことにより、これをオペレーターに示す。最近の研究において、２００３Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｄｉｔｅｃ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ＨＦＡ ＩＩ ７４５−２２０５機器が使用された。
【００９３】
検査中に収集されたデータは、目的の周囲の長さの指標を推定するソフトウェアの測定によって処理される。本研究において、２００３Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｄｉｔｅｃ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ＨＦＡ ＩＩ ７４５−２２０５の機器ソフトウェアのアップグレード１２．５／１２．６が使用された。
【００９４】
本研究において、周囲の長さの指標ＭＤ（平均偏差）及びＰＳＤ（パターン標準偏差）が考慮された。ＭＤ値は、検査を受ける対象の網膜感度及び年齢に対して補正された正常な感度及び検査中に試された視野の全てのポイントに対し正常な範囲とみなされ、年齢に対して補正され、算術により平均と計算された感度との間の平均である。ＭＤは、デシベル（ｄＢ）で測定され、−２〜＋２ｄＢの値で正常とみなされる： （正の）ＭＤ値が高いほど、視覚欠損が大きくなる。ＰＳＤ値は、平均偏差の分散である。すなわち、平均偏差が視野においてどのように分散されているかを示す。ＰＳＤは、局所的な視覚欠損の存在を示すため、欠損の不均一性を表す：ＰＳＤは、デシベル（ｄＢ）でも測定される：値が高いほど、視野の象限における欠損の分布が大きくなる。
【００９５】
以下に記載する研究において、本発明の血清による治療の前後に、最近検査された患者の視野の感度のＭＤ及びＰＳＤ値のパターンの評価が行われた。
【００９６】
患者
【００９７】
臨床研究は、ボローニャ（Ｂｏｌｏｇｎａ）のＡｌｍａ Ｍａｔｅｒ Ｓｔｕｄｉｏｒｕｍ大学の眼科手術ユニット及びボローニャのＳ．Ｏｒｓｏｌａ−Ｍａｌｐｉｇｈｉ大学病院で治療を受けている２人の患者に対して行われた。
【００９８】
患者１、６６歳男性、真性糖尿病（Ｉ）の影響を受けていた、２００６年から薬物療法を受けていた、糖尿病性網膜症及び原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）を呈し、２０１４年１月に診断され、眼圧の値を正常範囲内に維持するために効果的な局所的眼圧低下薬で治療された。患者が訴えた症状は、両眼の痛み（刺激、灼熱感、眼に砂が入った感触、不快感として説明される）であった。生体顕微鏡検査では、付随する何れかの角膜症は明らかにならなかった； 細隙灯での観察は、角膜上皮の欠損を示さなかった。
【００９９】
患者２、６０歳女性、１０年間原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）の影響を受けていた、眼圧測定を定期的に受け、局所眼圧低下薬による治療を受けていた。患者が訴えた症状は、痛み（刺激、灼熱感、眼に砂が入った感触、不快感として説明される）、右目で激しい、左目で耐えられる程度であった；観察の６か月前に計画された治療（代用涙液、抗炎症薬、局所コルチゾン）は、症状に対して最小限の効果しかもたらさなかった。生体顕微鏡検査では、付随する何れかの角膜症は明らかにならなかった； 細隙灯での観察は、角膜上皮の欠損を示さなかった。
【０１００】
治療及び結果
【０１０１】
患者１は、２０１６年６月に治療を開始し、血清プール１及び２から調製した２ロットの臍帯血血清に基づく洗眼剤で２か月間治療された；各ロットには３０個のバイアルが含まれ、合計６０回の投与が行われた。全てのバイアルには、両眼の１日間に必要な量の洗眼剤が含まれていた： バイアルを開けてから１２時間以内に内容物全体を投与し、１回の投与と別の投与の間、４〜１０℃の温度で保管した。投与ごとに各眼に１滴を点眼することにより、覚醒時〜就寝時まで、約２時間ごとに１日８回、洗眼剤が投与された。
【０１０２】
２０１６年１月、患者１は、健康診断を受けた際に、より耐えられる程度で数日間痛みを感じなかったという刺激と痛みの症状の有意な軽減を報告した。
【０１０３】
２０１４年１月、２０１６年６月、２０１６年９月に実施された検査で測定された視野感度のＭＤ値の傾向が示されている添付の図１を参照すると、２０１４年〜２０１６年６月までの期間にＭＤ値の漸進的な悪化が観察され、その後２０１６年６月〜９月の期間に改善が見られる。この期間は、臍帯血血清に基づく洗眼剤による治療と一致する（治療開始は、２０１６年６月に対応するグラフの箇所に矢印で示される）。
【０１０４】
同様に、２０１４年１月、２０１６年６月、２０１６年９月に実施された検査で測定された視野感度のＰＳＤ値の傾向が示されている添付の図２を参照すると、２０１４年〜２０１６年６月までの期間にＰＳＤ値の漸進的な悪化が観察された。患者が臍帯血血清に基づく洗眼剤で治療された２０１６年６月〜９月の期間において（治療開始は、２０１６年６月に対応するグラフの箇所に矢印で示される）、対照的に、左眼のＰＳＤ値において改善（減少）が検出され、一方、右眼のＰＳＤ値は実質的に変化せず、いずれの場合も本発明の血清による治療の好ましい効果を示した。
【０１０５】
患者２は、２０１６年３月に治療を開始し、血清プール３及び４から調製された２ロットの臍帯血に基づく洗眼剤で２か月間治療された；各ロットは、１５個のバイアルを含み、合計６０回の投与が行われた。全てのバイアルには、片眼（右眼）のみの２日間の治療に必要な量の洗眼剤が含まれていた：バイアルを開けてから３６時間以内に内容物全体を投与し、１回の投与と投与の間にバイアルは、４℃〜１０℃の温度で保存された。治療される眼に、投与ごとに１滴を点眼することにより、覚醒時から就寝時まで、およそ２時間ごとに１日８回、洗眼剤が投与された。
【０１０６】
２０１６年６月、患者２は、健康診断を受けた際に、患者が日常の活動に満足できる方法で取り組むことができるという点まで耐え得るという刺激及び痛みの症状の有意な軽減を報告した。
【０１０７】
２００６年１２月、２００８年６月、２０１１年２月、２０１２年９月、２０１３年１１月、２０１６年３月、２０１６年６月及び２０１６年９月に実施された検査で測定された視野感度のＭＤ値の傾向が示されている添付の図３を参照すると、２００６年〜２０１６年３月までの期間にＭＤ値の漸進的な悪化が観察され、その後２０１６年３月〜６月の期間にその値が改善されている。この期間は、臍帯血血清に基づく洗眼剤による治療と一致する（治療開始は、２０１６年３月に対応するグラフの箇所に矢印で示される）。治療終了の４か月後の２０１６年９月に記録されたＭＤ値は、大幅に改善されており、疾患の最初の年に記録されたＭＤ値に近い値であった。
【０１０８】
同様に、２００６年１２月、２００８年６月、２０１１年２月、２０１２年９月、２０１３年１１月、２０１６年３月、２０１６年６月及び２０１６年９月に実施された検査で測定された視野感度のＰＳＤ値の傾向が示されている添付の図４を参照すると、２００６年〜２０１６年３月までの期間にＰＳＤ値の漸進的な悪化が観察される。患者が臍帯血血清に基づく洗眼剤で治療された２０１６年３月〜６月の期間において（治療開始は、２０１６年３月に対応するグラフの箇所に矢印で示される）、対照的に、ＰＳＤ値の改善（減少）が見出された。治療終了の４か月後の２０１６年９月に記録されたＰＳＤ値は、病状の最初の年（２００６年）に記録されたＰＳＤ値よりも大幅に改善され、さらに低くなっている。
【０１０９】
さらに興味深い観察結果は、右眼（臍帯血血清に基づく洗眼剤で治療）及び左眼（治療無し）のＭＤ値とＰＳＤ値を比較した結果である。血清に基づく洗眼剤による治療を受けている眼（右、図中のＯＤ）がＭＤ値及びＰＳＤ値の有意な改善を示しただけではなく、未治療の反対側の眼（左、図中のＯＳ）も、ＭＤ値及びＰＳＤ値の改善を示した。この結果は、両眼の間に神経クロストークの関係が存在することを示唆する。
【０１１０】
実施例２．０：臍帯血血清の調製
【０１１１】
臍帯血サンプルは、実施例１．０の女性とは異なる数人の女性の群から出産後直ぐに寄付され、インフォームドコンセントの受け入れと、移植目的、臨床又は研究用途及び／又は知財保護のための血液自体の使用の許可を使用の条件とする。
【０１１２】
臍帯血は、分娩時に胎盤血管から採取され、その使用のために臨床的に検証された専用の試験管に回収され、Ｓ．Ｏｒｓｏｌａ−マルピーギ大学病院総合病院の地域の臍帯血バンクに送られた。
【０１１３】
臍帯血サンプルは、最初に室温で２時間凝固された後、＋４／＋１０℃の冷蔵遠心分離機で１５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離に供された。臍帯血サンプルに由来する血清サンプル（すなわち、遠心分離の最後に得られた上清）を吸引により回収し、試験管に入れ、ＮＧＦ−β、ＥＧＦ及び他の成長因子とサイトカインの濃度を評価するために分析した。
【０１１４】
ＥＧＦ濃度が５００ｐｇ／ｍｌを超える選択された血清サンプルを保存チューブに入れ、洗眼剤の調製に使用するまで−８０℃で維持した。
【０１１５】
特定の成長因子（ＥＧＦ）の濃度は、保存期間の終了時及びそれ以降で評価され、−８０℃で６か月の維持の後もほぼ一定であることが実証された。−８０℃で保存した臍帯血血清サンプルが解凍され、クラスＤ制御環境でのラミナーフローフードにおいて作業することで、より多くの臍帯血血清サンプル（同じ血液型で臨床的に検証済）が、それぞれ３０ｍｌ以上の血清量を含む「プール」を得るような方法で集められた。
【０１１６】
産生されたプールの成長因子及びインターロイキンの濃度は以下に示す通りであった（ｐｇ／ｍｌで表した値）。
【表２】
2020523416.tif 000004
【０１１７】
実施例２．１：網膜変性を誘導された動物モデルでのインビボ評価
【０１１８】
本発明による実施例２．０のように得られた純粋な臍帯血血清の有効性は、網膜変性を誘導された動物モデルにおける神経変性プロセスの治療において試験された。
【０１１９】
アルビノラットに高強度の光を照射すると、光受容体の死滅が誘導され、その結果、神経変性プロセスの進行をもたらす。
【０１２０】
網膜の光損傷（ＬＤ）は、神経保護剤の有効性を試験するための確立されたモデルである。
【０１２１】
特に、使用されるモデルは、「ホットスポット」と呼ばれるより敏感な背部領域を示す：この領域が、変性が開始するゾーンである。変性は、その後、時間の経過と共に広がる神経炎症を引き起こす様々な拡散因子によって進められる。視覚機能も大きく損なわれる：このため、神経保護剤の有効性は、電気生理学的及び形態学的手法の両方を用いるような方法によって評価され得る。
【０１２２】
実験は、合計２４匹のアルビノラット（Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統）で行われ、その年齢は全て３〜４か月であった。動物は、低輝度条件（５ルクス）及び明暗が交互に変わる条件（１２時間の明及び１２時間の暗）で、発明者自身の施設で生まれ育った； 分析された動物は、４つの群に分けられた：
１）本発明の血清で処置されていない正常なコントロール群；
２）本発明の血清で処置された正常なコントロール群；
３）光への曝露により誘導される網膜変性を伴うコントロール群；
４）本発明の血清で処置された片方の眼と未処置の片方の眼での光への曝露により誘導された網膜変性を有する群。
【０１２３】
提示されたラットの群における本発明の血清による処置は、高強度の光への曝露の７日前に始まった。群４のラットの場合において、片眼のみを１日３回１滴（約１０μＬ）で処置し、もう片方の眼はコントロールとして未処置のままとした。高強度の光への曝露後、ラットをモニターし、７日間同じプロトコルで処置した。
【０１２４】
光損傷
【０１２５】
群３及び４のアルビノラットは、ケージ内に等輝度（１０００ルクス）の環境を確保するように、上部と下部の両方にライトを配置したケージに１匹ずつ置かれた。ラットが眼を光から隠すのを防ぐために、敷物（ｌｉｔｔｅｒ）が取り除かれた。光への露出は、自然な昼間の開始段階、つまり、１２時間の暗闇の直後に始まった。動物は、２４時間連続して１０００ルクスの光に曝され、その後直ぐに通常のケージに戻し、通常の状態に戻した。
【０１２６】
電気生理学的分析
【０１２７】
その後、有害な光への曝露の１週間後、網膜の視覚機能を評価するために、網膜電図（ｆＥＲＧｓ）が輝度の増加に対応して記録された。網膜電図を記録する前に、アルビノラットは、１２時間暗所に保たれ、暗いチャンバーで分析が行われた。
【０１２８】
ラットは、ケタミン／キシラジン（１０〜１．２ｍｇ／１００ｇ）の腹腔内注射によって麻酔され、Ｇａｎｚｆｅｌｄドーム（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａ Ｍａｎｇｏｎｉ、Ｐｉｓａ、Ｉｔａｌｙ）の開口部分に配置された定位固定装置内に取付けられた。直腸プローブで制御される加熱プレートを使用して、体温が３７．５℃に維持された。
【０１２９】
角膜は、一滴のノボカインで麻酔され、瞳孔は、１％のトロピカミドで拡張された。
【０１３０】
使用されるフラッシュ生成ユニットは、０．００１〜１００ｃｄ／ｍ２の間を含む強度のフラッシュを生成する。反応が、３００ｍｓプラス２５ｍｓの事前試験ベースラインで記録され、差動方式で増幅され、０．３〜３００Ｈｚのバンドパスフィルターで処理され、最後に、ＰＣインターフェイス（ＬａｂＶＩＥＷ ８．２、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｍｉｌａｎ、Ｉｔａｌｙ）を介して０．２５〜０．３行の間隔でデジタル化された。
【０１３１】
Ａ波、Ｂ波及び振動電位が分析された。
【０１３２】
２つのフラッシュ強度で記録されたａ波及びｂ波の振幅が、図５に示される。図５において、文字Ａ及びＢは、健常な眼の洗眼剤での処置ありと処置無しで記録されたａ波及びｂ波を示す： 処置された眼と未処置の眼は、同等の振幅反応を示す。文字Ｃ及びＤは、対照的に、洗眼剤で処置された及び処置されていない有害な光に供された眼及びコントロールの眼に対して記録されたａ及びｂ波を示す。予想された結果に従って、ａ波及びｂ波の両方の振幅は、光誘導性損傷の結果として大幅に減少された。しかしながら、洗眼剤での処置は、網膜の機能性を未処置のもの又はコントロールサンプルと比較して、処置された眼の網膜の機能が大きく維持された。
【０１３３】
振動電位に関する限り、有意な効果は検出されなかった。
【０１３４】
記録セッションの終了後に、動物は、屠殺された。眼及び網膜を取り除き、その後の形態学的分析に使用した。
【０１３５】
形態学的解析
【０１３６】
網膜の調製のために、眼は、切除され、その後４℃の温度で４％パラホルムアルデヒドの固定緩衝液に２４時間浸漬することにより固定された。
【０１３７】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液で３回洗浄した後、今後の凍結保護を確実にするために眼は１５％スクロース溶液の中に一晩置かれた。次に、液体窒素で急速凍結することにより、眼が封入剤（Ｔｉｓｓｕｅ Ｔｅｋ ＯＣＴ ｃｏｍｐｏｕｎｄ； Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）に挿入された。その後、背側から腹側に広がる２０ｍｍの凍結切片が得られた。
【０１３８】
次いで、切片は、ゼラチンに封入され、スライドをポリ−Ｌ−リジンでコーティングし、次いで５０℃のオーブンで一晩乾燥させ、−２０℃で保存した。
【０１３９】
細胞層を評価するために、切片は、ＤＮＡ特異的染色色素ビスベンズイミド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）でマークされ、０．１Ｍ ＰＢＳの１：１００００溶液で２分間インキュベートされた。小乳頭状突起（視覚神経の起源）を通過するように切断された切片が選択された。全ての切片は、網膜の背側から腹側の端までスキャンされた。
【０１４０】
強い光で損傷した網膜において、光受容体は、最初に「ホットスポット」の領域で死滅し、隣接する領域で神経細胞死が次第に増加し、その結果、外側核層（ＯＮＬ）の厚さが著しく減少する。
【０１４１】
次に、光受容体の生存は、外側核層（ＯＮＬ）の厚さを測定することにより推定された。特に、ＯＮＬの厚さは、小乳頭状突起を通る背側から腹側までの網膜の全範囲にわたって記録された； 前記厚さは、０．４０ｍｍの間隔で測定された。ＯＮＬの絶対的な厚さ（ｍｍ）を使用するのではなく、ＯＮＬの厚さと網膜の厚さの比率をＯＮＬ自体の厚さの尺度として使用し、何れかの斜めの部分を補正した。さらに、損傷の程度と保護の有効性を評価するために、「ホットエリア」の範囲が測定された。全ての測定は、ＩｍａｇｅＪ２．０ソフトウェアを使用して実行された。
【０１４２】
図６Ａに見られるように、処置された眼では、背側網膜では、対応する未処置の眼よりもＯＮＬが良好に保存されるが、腹側網膜は同様に見える。さらに、「ホットスポット」の範囲は、背側周辺から小乳頭状突起までを測定し、２つの値の比率が図６Ｂに示される。損傷したゾーンの範囲は、処置された眼で大幅に減少する。
【０１４３】
従って、この研究結果は、臍帯血に基づく洗眼剤が網膜の神経変性プロセスを緩和するために首尾よく使用され得るという仮説を裏付ける。機能性は、部分的に維持され、網膜の形態は、損傷に曝された未処置の動物と比較して良好な状態を維持する。
【０１４４】
実施例３．０： 臍帯血血清の調製
【０１４５】
臍帯血サンプルは、実施例１．０及び２．０の女性とは異なる数人の女性の群から出産後直ぐに寄付され、インフォームドコンセントの受け入れと、移植目的、臨床又は研究用途及び／又は知財保護のための血液自体の使用の許可を使用の条件とする。
【０１４６】
臍帯血は、分娩時に胎盤血管から採取され、その使用のために臨床的に検証された専用の試験管に回収され、Ｓ．Ｏｒｓｏｌａ−マルピーギ大学病院総合病院の地域の臍帯血バンクに送られた。
【０１４７】
臍帯血サンプルは、最初に室温で２時間凝固された後、＋４／＋１０℃の冷蔵遠心分離機で１５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離に供された。臍帯血サンプルに由来する血清サンプル（すなわち、遠心分離の最後に得られた上清）を吸引により回収し、試験管に入れ、ＮＧＦ−β及び他の成長因子及びサイトカインの濃度を評価するために分析した。
【０１４８】
ＢＤＮＦ濃度が９５００ｐｇ／ｍｌを超える選択された血清サンプルを保存チューブに入れ、洗眼剤の調製に使用するまで−８０℃で維持した。
【０１４９】
特定の成長因子（ＥＧＦ）の濃度は、保存期間の終了時及びそれ以降で評価され、−８０℃で６か月の維持の後もほぼ一定であることが実証された。
【０１５０】
−８０℃で保存した臍帯血血清サンプルが解凍され、クラスＤ制御環境でのラミナーフローフードにおいて作業することで、より多くの臍帯血血清サンプル（同じ血液型で臨床的に検証済）が、それぞれ３０ｍｌ以上の血清量を含む「プール」を得るような方法で集められた。
【０１５１】
産生されたプールの成長因子及びインターロイキンの濃度は以下に示す通りであった（ｐｇ／ｍｌで表した値）。
【表３】
2020523416.tif 000005
【０１５２】
実施例３．１： インビトロ細胞モデルの評価
【０１５３】
現在、グリア細胞が、様々な神経障害に対する保護において、ニューロンに対してその役割を担うことは、一般に認められている事実である。
【０１５４】
網膜に障害がある場合、網膜の主要なグリアの要素であるミュラー細胞は、形態学的、細胞的、及び分子的な著しい変化を受け、さらなる損傷から網膜を保護する。ミュラー細胞は、成長因子の作用に対し発現し、感受性があり、神経伝達物質輸送隊であり、及び網膜のニューロンへの細胞傷害性損傷の防止に重要な役割を担いうる抗酸化剤を産生する。さらにミュラー細胞は、内皮細胞と接触し、低酸素状態で血管新生のプロセスを促進する。
【０１５５】
実験は、ｒＭＣ−１細胞系統（網膜グリア細胞、ラットミューラー細胞）で実施された。
【０１５６】
この細胞系統は、ミュラー細胞に存在するマーカーであるＧＦＡＰ（グリア線維性酸性タンパク質）及びＣＲＡＬＢＰ（細胞性レチンアルデヒド結合タンパク質）を発現し、ウイルス性癌遺伝子ＳＶ−４０Ｔのトランスフェクションにより不死化される。
【０１５７】
細胞培養：ｒＭＣ−１細胞モデル
【０１５８】
ｒＭＣ−１細胞は、ＡＢＭ、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ Ｌｉｆｅ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）から購入され、提供元が推奨する特定の培地を使用して提供元が推奨する２４ウェルプレートで培養された。
【０１５９】
参加的損傷の誘導及び細胞生存率試験
【０１６０】
予備実験により、半集密（８０％十分にカバーされた）の条件下で培養にＨ２Ｏ２のスカラー濃度を使用する選択が行われた。簡単に説明すると、３７℃のＣＯ２インキュベータで３、６及び２４時間の接触時間で１０、５０、１００、２００、５００μＭを培養培地に添加することにより、培養物が、酸化的損傷の誘導に供された。
【０１６１】
低濃度のＨ２Ｏ２は、細胞の生存率にほとんど影響を与えず、高いＨ２Ｏ２濃度は有意な細胞剥離を誘導し、結果の再現が困難になるため、１００及び２００μＭのＨ２Ｏ２濃度を選択し、さらなる実験を行った。同様の考慮事項により、Ｈ２Ｏ２による損傷に対して６時間のインキュベーションを選択することとした。
【０１６２】
ｒＭＣ−１細胞培養を維持するための標準組成物として、培養液中の１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を使用して１つの実験ラインを実施し、一方、比較パーセンテージとして、培養培地中の１０％臍帯血血清（実施例３．０に記載のように投与されたロット）を使用して一連の実験が並行して行われた。
【０１６３】
生存率試験は、ホルマザンと呼ばれる濃い青色の産物の結晶になるミトコンドリア酵素コハク酸デヒドロゲナーゼ（ＳＤＨ）によるテトラゾリウムウ塩の細胞内還元に基づいた方法であるＭＴＴ試験（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）を使用して行われた。従って、反応は、代謝的に活性な細胞でのみ起こり、分光光度測定によって得られる光学密度（Ｏ．Ｄ．）の値は、存在する生存細胞の量と相関し得る。
【０１６４】
デジタル画像及び統計分析
【０１６５】
各実験処理で複製された少なくとも１つのウェルの中央部の位相コントラスト画像を、細胞の形態素示すために記録した； これらは、Ｃｏｏｌｐｉｘデジタルカメラを備えた倒立ＣＦＬテクノロジーを備えたＡｘｉｏｖｅｒｔ２５顕微鏡（Cａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ＬＬＣ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を使用して．ｔｉｆファイルとして記録された。細胞生存率分析の結果を図７に示し、平均±標準偏差（ＳＤ）として表す。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ６ソフトウェアを使用して実行された。光学密度値は、ＦＢＳ及びＣＢＳを含まない培地で培養されたＲＭＣ−１コントロールで正規化された。統計分析は、一元配置分散分析テスト及びＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較テストによって実行された。結果は、Ｈ２Ｏ２が細胞の生存率を大幅に低下させることを示す（両方の濃度で）；さらに、１０％ＣＢＳを含む培地で培養し、２００μＭＨ２Ｏ２で処理したＲＭＣ−１は、ＦＢＳの存在下で培養し２００μＭ Ｈ２Ｏ２で処理したＲＭＣ−１よりも高い生存率を示した。
【０１６６】
実施例４．０： 臍帯血血清の調製
【０１６７】
臍帯血サンプルは、実施例１．０、２．０又は３．０の女性とは異なる数人の女性の群から出産後直ぐに寄付され、インフォームドコンセントの受け入れと、移植目的、臨床又は研究用途及び／又は知財保護のための血液自体の使用の許可を使用の条件とする。
【０１６８】
臍帯血は、分娩時に胎盤血管から採取され、その使用のために臨床的に検証された専用の試験管に回収され、Ｓ．Ｏｒｓｏｌａ−マルピーギ大学病院総合病院の地域の臍帯血バンクに送られた。
【０１６９】
臍帯血サンプルは、最初に室温で２時間凝固された後、＋４／＋１０℃の冷蔵遠心分離機で１５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離に供された。臍帯血サンプルに由来する血清サンプル（すなわち、遠心分離の最後に得られた上清）を吸引により回収し、試験管に入れ、ＢＤＮＦ及び他の成長因子及びサイトカインの濃度を評価するために分析した。
【０１７０】
ＢＤＮＦ濃度が９５００ｐｇ／ｍｌを超える選択された血清サンプルを保存チューブに入れ、洗眼剤の調製に使用するまで−８０℃で維持した。
【０１７１】
特定の成長因子（ＥＧＦ）の濃度は、保存期間の終了時及びそれ以降で評価され、−８０℃で６か月の維持の後もほぼ一定であることが実証された。
【０１７２】
実施例４．１： 臍帯血血清に基づく洗眼剤の調製
【０１７３】
−８０℃で保存した臍帯血血清サンプルが解凍され、クラスＤ制御環境でのラミナーフローフードにおいて作業することで、より多くの臍帯血血清サンプル（同じ血液型で臨床的に検証済）が、それぞれ３０ｍｌ以上の血清量を含む「プール」を得るような方法で集められた。
【０１７４】
４人の患者に対して産生された４つのプールの成長因子及びインターロイキンの濃度は以下に示す通りであった（ｐｇ／ｍｌで表した値）。
【表４】
2020523416.tif 000006
【０１７５】
ラミナーフローフードにおいて、各プールは、プールの容量の４倍に等しいｐＨ７．４の滅菌生理学的溶液で希釈され（１〜５希釈）、濾過され、１ｍｌ単回投与バイアルに分注された。
【０１７６】
個々のバイアルは、ラベルが付けられ、全てのロット（連続する番号でマークされた１５個のバイアルで構成される）が、透明な密閉プラスチックバッグに梱包され、そこに識別ラベルが貼られた。好気性及び嫌気性の細菌及び真菌の調査は、関連する血液成分について検証されたＢａｃＴ／ＡＬＥＲＴボトル(登録商標)（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）を使用して、全てのロットで実行された。微生物検査の結果が陰性であることが確認された後にのみ、患者での実験のために洗眼剤のロットが利用可能になった。
【０１７７】
実施例４．２： 患者のインビボ評価
【０１７８】
視野（ＶＦ）のコンピュータ制御された検査
【０１７９】
視野（ＶＦ）のコンピュータ制御された検査は、眼を囲む空間の視力を測定し、網膜及び／又は視覚神経の病状に起因する視野感度の変化の存在を評価することに役立つ。視野感度の変化は、通常の視野の様々なポイントでの知覚を評価することによって調べられる。
【０１８０】
ＶＦ検査は、網膜の局所的な光刺激の測定によって行われる：実際には、３３ｃｍの距離で患者の目の前に置かれた半ドーム型のスクリーンに投影又は作動させる様々な形及び強度の光刺激を知覚し、それに応答する患者の能力の評価が行われる。検査は、それぞれの目で個別に行われ（従って、検査を受けていない患者の目は閉じられている）、片目で約１５分間続き、痛みは無い。分析に使用される危機は、光シグナルが投影される背景が白いドーム型のスクリーンで構成される：患者が光シグナルを感知すると、患者は、例えば発光又は音響プッシュボタンを押すことにより、これをオペレーターに示す。最近の研究において、２００３Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｄｉｔｅｃ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ＨＦＡ ＩＩ ７４５−２２０５機器が使用された。
【０１８１】
検査中に収集されたデータは、目的の周囲の長さの指標を推定するソフトウェアの測定によって処理される。本研究において、２００３Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｅｄｉｔｅｃ Ｈｕｍｐｈｒｅｙ ＨＦＡ ＩＩ ７４５−２２０５の機器ソフトウェアのアップグレード１２．５／１２．６が使用された。
【０１８２】
本研究において、周囲の長さの指標ＭＤ（平均偏差）及びＰＳＤ（パターン標準偏差）が考慮された。ＭＤ値は、検査を受ける対象の網膜感度及び年齢に対して補正された正常な感度及び検査中に試された視野の全てのポイントに対し正常な範囲とみなされ、年齢に対して補正され、算術により平均と計算された感度との間の平均である。ＭＤは、デシベル（ｄＢ）で測定され、−２〜＋２ｄＢの値で正常とみなされる： （正の）ＭＤ値が高いほど、視覚欠損が大きくなる。ＰＳＤ値は、平均偏差の分散である。すなわち、平均偏差が視野においてどのように分散されているかを示す。ＰＳＤは、局所的な視覚欠損の存在を示すため、欠損の不均一性を表す：ＰＳＤは、デシベル（ｄＢ）でも測定される：値が高いほど、視野の象限における欠損の分布が大きくなる。
【０１８３】
以下に記載する研究において、本発明の血清による治療の前後に、最近検査された患者の視野の感度のＭＤ及びＰＳＤ値のパターンの評価が行われた。
【０１８４】
眼圧の検査
【０１８５】
通常の条件下では、眼内圧（ＩＯＰ）の値は１２〜２０ｍｍＨｇの範囲であり、毛様体の毛様体突起によって連続的に産生される房水及び前房隅角（カメルラー角度（ｃａｍｅｒｕｌａｒ ａｎｇｌｅ））のレベルで線維柱帯網から排出される量の間のバランスに実質的に依存する。慢性単純緑内障としても知られるＰＯＡＧは、成人の高齢での発症、ＩＯＰ＞２１ｍｍＨｇ、前房隅角の開放又は正常な外観、乳頭状突起の陥凹及び視野の縮小によって特徴付けられる。この疾患は、ゆっくりと進行し、一般に先行性の発症を伴う両側性であり、両眼に同程度の影響を及ぼす慢性疾患である。
【０１８６】
網膜電図
【０１８７】
パターン網膜電図（ＰＥＲＧ）は、チェッカーボード又は格子パターンで刺激によって誘発される網膜の生体電位である； これは主に、神経節細胞の機能を研究し、低時間周波数（最大４Ｈｚ、１秒当たり８回の反転に相当）、２Ｈｚの反転速度（４反転／秒）、黒及び白の正方形の最大コントラスト、明順応の輝度が得られる。パターン網膜電図（ＰＥＲＧ）において、Ｐ５０−Ｎ９５値で示される波長、及びＰ５０値で示される潜時波が一般的に考慮される。異なる時間に実行された２つの網膜電図トレースを比較すると、改善は、第２と第１トレースの間の振幅幅の増加と潜時波の減少に関連する。
【０１８８】
視覚誘発電位
【０１８９】
視覚誘発電位（ＶＥＰ）は、視覚刺激によって誘発される後頭葉大脳皮質の生体電位の変動を記録することにより、視覚経路の機能の電気生理学的調査を可能にする。
【０１９０】
６０’及び１５’のＶＥＰパターンにおいて、Ｎ７５−Ｐ１００値で示される波の振幅及びＰ１００値で示される波の潜時が一般的に考慮される。この場合も、異なる時間に実行された２つの網膜電図トレースを比較すると、改善は、第２と第１のトレース間で振幅値が増加し、潜時値が減少する場合に観察される。
【０１９１】
網膜神経節細胞層の厚さの測定
【０１９２】
光干渉断層法（ＯＣＴ）は、レーザービームを使用してインビボで網膜神経線維層の厚さを測定する非侵襲的検査である。従って、神経保護メカニズムを分析するための効果的な手法である。光干渉断層法において、一般に、生理学的に二重ハンプパターン（線維層の厚さは、側頭及び上位のセクターで厚くなるが、鼻及び下位のセクターでは薄くなる）を有する網膜神経線維層（ＲＮＦＬ）の平均の厚さを測定する。
【０１９３】
患者
【０１９４】
臨床研究は、ボローニャ（Ｂｏｌｏｇｎａ）のＡｌｍａ Ｍａｔｅｒ Ｓｔｕｄｉｏｒｕｍ大学の眼科手術ユニット及びボローニャのＳ．Ｏｒｓｏｌａ−Ｍａｌｐｉｇｈｉ大学病院で治療を受けている４人の患者に対して行われた。
【０１９５】
患者１、７６歳女性、４年間にわたり原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）の影響を受けていた、眼圧測定により測定される眼圧の良好な薬理学的制御が行われ、常に正常範囲内であった。
【０１９６】
患者２、５３歳男性、２年間にわたり原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）の影響を受けていた、眼圧測定により測定される眼圧の良好な薬理学的制御が行われ、常に正常範囲内であった。
【０１９７】
患者３、７４歳男性、７年間にわたり原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）の影響を受けていた、眼圧測定により測定される眼圧の良好な薬理学的制御が行われ、常に正常範囲内であった。
【０１９８】
患者３、７４歳男性、１１年間にわたり原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）の影響を受けていた、眼圧測定により測定される眼圧の良好な薬理学的制御が行われ、常に正常範囲内であった。
【０１９９】
治療及び結果
【０２００】
患者１（Ｐｚ１）は、２０１８年３月に治療を開始し、実施例４．１に従って準備された２ロット；各ロットに３０個のバイアルが含まれ、合計６０回の投与が行われた、の臍帯血血清に基づく洗眼剤で２か月治療された。全てのバイアルには、両眼の１日間の治療に必要な量の洗眼剤が含まれていた。バイアルを開けてから１２時間以内に内容物全体を投与し、１回の投与と別の投与の間でバイアルを４℃〜１０℃の温度で保管した。投与ごとに各眼に１滴を点眼することにより、覚醒時から就寝時まで、約２時間ごとに１日８回、洗眼剤を投与した。治療開始の２年前に行われたＨＦＡ３０−２分析は、とりわけ右眼（ＯＤ）でのＭＤ値の明らかな減少及び進行の悪化を明らかにした。特に２０１６年１２月〜２０１７年９月までの期間において、視野感度のＭＤ値は、右眼（ＯＤ）で−５．５５から−７．３９になり、左眼（ＯＳ）で−５．３１から−５．８２になった。
【０２０１】
本願の分析では、残りの視野の解像度を改善するために、より細かいグリッドモデルを備えたＨＦＡ２４−２及びＣｅｎｔｒａｌ１０−２プログラムが使用された。以下の表１は、２０１８年３月〜５月の期間に得られた分析の結果を示す。主に２つの「悪化（ｗｏｒｓｅ）」である右眼の視野欠損に関して、ＭＤ値の漸進的な改善を観察することができた。この期間は、本発明の臍帯血血清に基づく洗眼剤による治療と一致する。
【０２０２】
【表５】
2020523416.tif 000007
【０２０３】
また、両眼の治療後、ＲＮＦＬの厚さの値が増加したことにも注目することができる。さらに、ＰＥＲＧ及び６０’及び１５’値の改善が、左眼で観察され、これは、視野の観点から２つの「より良い（ｂｅｔｔｅｒ）」ものであった。
【０２０４】
患者２（Ｐｚ２）は、２０１８年４月に治療を開始し、実施例４．１に従って準備された２ロット；各ロットに３０個のバイアルが含まれ、合計６０回の投与が行われた、の臍帯血血清に基づく洗眼剤で２か月治療された。全てのバイアルには、両眼の１日間の治療に必要な量の洗眼剤が含まれていた。バイアルを開けてから１２時間以内に内容物全体を投与し、１回の投与と別の投与の間でバイアルを４℃〜１０℃の温度で保管した。投与ごとに各眼に１滴を点眼することにより、覚醒時から就寝時まで、約２時間ごとに１日８回、洗眼剤を投与した。
【０２０５】
治療開始の２年前に行われたＨＦＡ３０−２分析は、両眼でのＭＤ値の明らかな減少及び進行の悪化を明らかにした。特に、２０１７年１月〜２０１７年１０月までの期間において、視野感度のＭＤ値は、右眼（ＯＤ）で−４．０から−６．７３になり、左眼（ＯＳ）では−２．８７から−３．６３になった。
【０２０６】
本願の分析では、残りの視野の解像度を改善するために、より細かいグリッドモデルを備えたＨＦＡ２４−２及びＣｅｎｔｒａｌ１０−２プログラムが使用された。以下の表２は、２０１８年４月〜６月の期間に得られた分析の結果を示す。主に２つの「悪化（ｗｏｒｓｅ）」である主に右眼におけるＭＤ及びＶＥＰ６０’及び１５’値の漸進的な改善を観察することができた。この期間は、本発明の臍帯血血清に基づく洗眼剤による治療と一致する。
【０２０７】
【表６】
2020523416.tif 000008
【０２０８】
ＲＮＦＬの厚さの値は、両眼での治療後も実質的に変化しなかったが、ＰＥＲＧ値の明確な改善は、視野欠損に関して、２つの「より良い」である左眼だけではなく、右眼でも部分的に改善されたことにも注目することができる。
【０２０９】
患者３（Ｐｚ３）は、２０１８年４月に治療を開始し、実施例４．１に従って準備された２ロット；各ロットに３０個のバイアルが含まれ、合計６０回の投与が行われた、の臍帯血血清に基づく洗眼剤で２か月治療された。全てのバイアルには、両眼の１日間の治療に必要な量の洗眼剤が含まれていた。バイアルを開けてから１２時間以内に内容物全体を投与し、１回の投与と別の投与の間でバイアルを４℃〜１０℃の温度で保管した。投与ごとに各眼に１滴を点眼することにより、覚醒時から就寝時まで、約２時間ごとに１日８回、洗眼剤を投与した。
【０２１０】
治療開始の２年前に行われたＨＦＡ３０−２分析は、両眼でのＭＤ値の明らかな減少及び進行の悪化を明らかにした。特に、２０１７年１２月〜２０１８年３月までの期間において、視野感度のＭＤ値は、右眼（ＯＤ）で−２０．０３から−２２．４４になり、左眼（ＯＳ）では−７．９２から−９．３４になった。
【０２１１】
本願の分析では、残りの視野の解像度を改善するために、より細かいグリッドモデルを備えたＨＦＡ２４−２及びＣｅｎｔｒａｌ１０−２プログラムが使用された。
【０２１２】
以下の表３は、２０１８年４月〜６月の期間に得られた分析の結果を示す。主に２つの「悪化（ｗｏｒｓｅ）」である主に右眼におけるＭＤ値の漸進的な改善を観察することができた。この期間は、本発明の臍帯血血清に基づく洗眼剤による治療と一致する。
【０２１３】
【表７】
2020523416.tif 000009
【０２１４】
ＲＮＦＬの厚さの値は、両眼での治療後も実質的に変化しなかったが、ＰＥＲＧ及びＶＥＰ値の明確な改善は、視野欠損に関して、２つの「より良い」である左眼だけではなく、右眼でも部分的に改善されたことにも注目することができる。
【０２１５】
患者４（Ｐｚ４）は、２０１８年４月に治療を開始し、実施例４．１に従って準備された２ロット；各ロットに３０個のバイアルが含まれ、合計６０回の投与が行われた、の臍帯血血清に基づく洗眼剤で２か月治療された。全てのバイアルには、両眼の１日間の治療に必要な量の洗眼剤が含まれていた。バイアルを開けてから１２時間以内に内容物全体を投与し、１回の投与と別の投与の間でバイアルを４℃〜１０℃の温度で保管した。投与ごとに各眼に１滴を点眼することにより、覚醒時から就寝時まで、約２時間ごとに１日８回、洗眼剤を投与した。
【０２１６】
治療開始の２年前に行われたＨＦＡ３０−２分析は、両眼でのＭＤ値の明らかな減少及び進行の悪化を明らかにした。特に、２０１４年１月〜２０１８年３月までの期間において、視野感度のＭＤ値は、右眼（ＯＤ）で−０．３３から−０．５９になり、左眼（ＯＳ）では−２．９５から−９．３３になった。
【０２１７】
本願の分析では、残りの視野の解像度を改善するために、より細かいグリッドモデルを備えたＨＦＡ２４−２及びＣｅｎｔｒａｌ１０−２プログラムが使用された。
【０２１８】
以下の表４は、２０１８年４月〜６月の期間に得られた分析の結果を示す。両眼においてベースラインと比較して中央部のみでＭＤ値のわずかな改善を観察することができる。この期間は、本発明の臍帯血血清に基づく洗眼剤による治療と一致する。
【０２１９】
【表８】
2020523416.tif 000010
【０２２０】
ＲＮＦＬの厚さの値は、両眼での治療後も実質的に変化しなかったが、視野の欠損に関して、２つの「より良い」であるＰＥＲＧ値及びＶＥＰ値の明確な改善が、両眼、とりわけ左眼で観察されたことにも注目することができる。これは、右眼において部分的な改善も観察することができた。
【図１】
2020523416.tif 000011
【図２】
2020523416.tif 000012
【図３】
2020523416.tif 000013
【図４】
2020523416.tif 000014
【図５】
2020523416.tif 000015
【図６】
2020523416.tif 000016
【図７】
2020523416.tif 000017
【国際調査報告】
2020523416.tif 000018
2020523416.tif 000019
2020523416.tif 000020