(57)【要約】  本発明は、養殖を改善するための微生物ベースの製品及びその使用を提供するものである。特に、本発明は、酵母及び／又はバイオサーファクタントベースの組成物を養魚場に適用することにより、健康で高品質な飼育魚を生成するための材料及び方法を提供する。一実施形態において、本発明は、魚を飼育する環境を改善する。他の実施形態において、本発明は、低コストで高栄養魚飼料及び魚を飼育する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
培養した生化学生成酵母の１つ以上の菌株及び／又は１つ以上の微生物成長副生成物を含む、養殖を改善する組成物。
【請求項２】
前記酵母は、バイオサーファクタント生成酵母である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記酵母は、Starmerella bombicola、Candida apicola、Pseudozyma aphidis、Wickerhamomyces anomalus、Pichia guilliermondii、Pichia occidentalis及びこれらの種のいずれかの変異体から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記酵母は、不活性形態にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
２つ以上の酵母菌株を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記２つ以上の酵母のそれぞれは、個別に培養されてから組み合わされて、組成物を形成する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記成長副生成物は、バイオサーファクタントである、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記酵母が培養された発酵ブロスをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記成長副生成物は、前記発酵ブロスに存在する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記バイオサーファクタントは、精製形態で前記組成物に添加される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
前記バイオサーファクタントは、グリコリピド及びリポペプチドから選択される、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
前記グリコリピドは、ソホロリピド、マンノシルエリスリトールリピド、トレハロースリピド及びラムノリピドから選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記リポペプチドは、サーファクチン及びイツリンから選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
生化学生成酵母の１つ以上の菌株及び／又は微生物成長副生成物を含む組成物を、水を含む養魚場に適用することを含む、養殖を改善する方法。
【請求項１５】
前記組成物は、請求項１〜１３のいずれかに記載の組成物である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記組成物は、前記養魚場の水に適用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物は、壁及び／又は床を含む前記養魚場内の表面に適用される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記養魚場は、池、湖、海洋、フィヨルド、水路、川、水槽、タンク又はケージである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法を用いて、魚が飼育される環境の質を改善する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記方法を用いて、養魚場から粘泥又は藻類を除去する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記方法を用いて、前記養魚場の水中の硫化水素及び／又は二酸化炭素濃度を減じる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法を用いて、養魚池の下部の汚泥を減じる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法を用いて、養魚場の病原体による感染を防ぐ、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記方法を用いて、養殖魚の健康と質を改善する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法を用いて、魚のバクテリア、ウイルス、真菌又は寄生虫病による感染を防ぐ、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法を用いて、魚の消化管における栄養の吸収を改善する、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
不活性微生物及び／又はその成長副生成物を含む組成物を、養魚場に適用し、魚に前記組成物を摂取させることを含む、魚の給餌方法。
【請求項２８】
前記組成物は、乾燥粉末、ミール、ペレット、顆粒又はフレークの形態である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記方法を用いて、従来の給餌を補助する、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願を相互参照
本出願は、２０１７年４月２０日出願の米国仮出願第６２／４８７，６７６号の優先権を主張するものであり、内容を参照することにより組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
養殖では、制御された条件下で、淡水又は塩水生物群の培養が行われている。具体的には、養殖は、エビや牡蠣のような食用、観賞用、その他水生生物の飼育である。一般的に、水生生物の培養には、個体群を定期的に貯蔵したり、個体群に給餌したり、捕食者から個体群を保護したりする飼育プロセスにおいて、何らかの介入をすることによって、生産を改善することが含まれる。世界的な養殖業によって、人間が消費する魚及び貝の半分以上を供給していることが報告されている。
【０００３】
魚個体群、特に、大規模養殖の場合の給餌は、養殖操業費用の大部分を占める。魚の飼料は、消化の良いタンパク質源を、アミノ酸、炭水化物、ビタミン、ミネラル、コレステロール及び必須脂肪酸をはじめとする適正な栄養素に必要なあらゆる種類のその他成分と共に含むものでなければならない。飼料源は、例えば、魚粉、エビミックス、イカ粉、大豆粉、スピルリナ、全粒粉、又はこれらの組み合わせが含まれる。
【０００４】
養殖方法の中には、多角的システム、場合によっては、植物栽培と魚の養殖を一体化する最新のアクアポニックスもある。他の方法、例えば、大規模工場での魚の養殖は、できる限り大量の魚を、できる限り安価に生産するという目標で操業されている。魚とエビは、過密な状態となり、個体自体及び周囲の水の両方が汚染されるリスクがある。魚の養殖工場は衛生的でなく、疾患の蔓延を制御するために、大量の抗生物質、ホルモン、殺虫剤が必要となることが多い。
【０００５】
養殖の操業が直面するその他の問題は、二酸化炭素「窒息」による魚生産量の大幅減である。養魚池における二酸化炭素の主たる源は、魚及び池の生物相を形成する微小植物及び動物の呼吸による。有機物の分解もまた、二酸化炭素の主たる源である。養魚池において二酸化炭素のレベルが上がると、窒息や魚の死を招いたり、魚の死骸から水分も出る。
【０００６】
二酸化炭素を除去する現在の方法には、生石灰、消石灰、炭酸ナトリウムなどの石灰剤により池の水を化学処理するものがある。これらの溶剤は、二酸化炭素と直接反応して、二酸化炭素を減じ、アルカリ性を増大させる。しかしながら、過剰の二酸化炭素を処理する化学薬品の適用だけでは、一時的な解決に過ぎず、用いる化学薬品の毒性によってそれにも限界がある。通気や混合といった機械的な方法も、二酸化炭素及び溶解酸素の管理に使えるが、こうした方法はエネルギーの消費が大きい。
【０００７】
養殖におけるもう一つの根強い問題は、粘泥形成、池の藻類である。池の粘泥形成は、様々な藻類、菌類及び魚の生命現象の結果である。粘泥が蓄積した領域は、腐敗臭がすることが多く、魚にも悪臭が移る。さらに、粘泥を生成する有機物の中には、有害な副生成物を生成するものもあり、魚や、それを摂取した人にも毒になる可能性がある。
【０００８】
養殖産業で生じる更なる問題としては、魚集団での感染蔓延の発生である。全ての魚は、病原体や寄生虫を宿しており、魚の感染病は、養殖や水槽の魚に関係している。疾病は、特に、幼魚の死亡の一因であり、相互作用する因子によって、軽度の感染が大規模の伝染病となって、魚の質及び商業利用の可能性が大幅に減少してしまう。
【０００９】
商品の品質の減少や、大規模工場での魚の養殖の増大する環境の結果にも関わらず、産業は拡大し続けている。魚の給餌のコストを減じ、高い操業コストや養殖における魚の商品としての健康や質を減じる原因となる様々な問題を減少するための、非毒性で環境にやさしい製品が必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、養殖を改善するための微生物ベースの製品及びその使用を提供するものである。特に、本発明は、健康で高品質な飼育魚を生成するための材料及び方法を提供する。利点としては、本発明は、例えば、毒性の化学化合物や抗生物質を用いることなく、養殖を改善することがある。このように、本発明の材料及び方法は、環境にやさしく、操作が容易で、コスト効率が良い。
【００１１】
一実施形態において、本発明の組成物及び方法を用いると、水の質及び透明度を改善し、魚の病原体防御を増強し、魚の成長を刺激することができる。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、養殖及び養魚を改善する、微生物ベースの組成物及びその組成物を用いる方法を提供する。具体的な実施形態において、本発明は、生化学生成微生物及びバイオサーファクタント、溶媒及び／又は酵素等の成長副生成物を含む組成物を利用する。一実施形態において、組成物は、微生物の培養から得られる発酵ブロスを含む。
【００１３】
好ましい実施形態において、本組成物の微生物は、培養したバイオサーファクタント、溶媒及び／又は酵素生成酵母である。一実施形態において、微生物は、例えば、培養したStarmerella bombicola、Candida apicola、Wickerhamomyces anomalus、Pichia guilliermondii、Pichia occidentalis及び／又はPseudozyma aphidisである。一実施形態において、微生物は、これらの種の酵母のいずれかの培養した変異体である。
【００１４】
好ましい実施形態において、本組成物の微生物成長副生成物は、バイオサーファクタント、溶媒、酵素又はその他代謝物である。一実施形態において、微生物により生成された成長副生成物は、互いに相乗効果により作用して、所望の効果をもたらす。
【００１５】
特定の実施形態において、微生物成長副生成物は、微生物成長の結果、組成物に存在する。ある実施形態において、精製した微生物成長副生成物、例えば、１つ以上のグリコリピド及び／又はリポペプチドバイオサーファクタントを、組成物に添加することができる。
【００１６】
一実施形態において、本発明による微生物ベースの組成物は、小規模から大規模の培養プロセスを通じて得られる。培養プロセスは、例えば、液内培養、固体発酵（ＳＳＦ）及び／又はこれらの組み合わせである。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、例えば、バイオサーファクタント、溶媒及び／又は酵素単体に対して次のような利点がある。酵母細胞壁の外側表面の一部に高濃度のマンノタンパク質がある、酵母細胞壁にベータグルカンが存在している、培養物にバイオサーファクタント、その他代謝物及び／又は溶媒（例えば、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、エタノール、酢酸エチル等）が存在している。
【００１８】
一実施形態において、本発明は、微生物の１つ以上の菌株及び／又は成長副生成物を含む微生物ベースの組成物を、養魚場に加えることにより、養殖を改善する方法を提供する。一実施形態において、組成物は、本発明の微生物ベースの組成物である。
【００１９】
本方法に従って「養殖を改善する」とは、例えば、水中での二酸化炭素の蓄積を減少し、養魚場に存在する病原体による感染や侵入を防止したり、処置する、或いは、飼料の補給や栄養素吸収の改善を通して、魚の成長を刺激することによって、養魚場の水の質及び透明度を改善することを意味する。
【００２０】
好ましい実施形態において、養魚場に適用した微生物は、培養したバイオサーファクタント、溶媒及び／又は酵素生成酵母、例えば、Starmerella bombicola、Candida apicola、Wickerhamomyces anomalus、Pichia guilliermondii、Pichia occidentalis及び／又はPseudozyma aphidisである。一実施形態において、微生物は、酵母の種の培養した変異体である。
【００２１】
特定の実施形態において、本発明の微生物は、他の化学及び／又は微生物処理と共に用いることができる。例えば、Wickerhamomyces anomalusやPseudozyma aphidisといった異なる種の酵母を、同時に用いることができる。微生物の他の組み合わせも考えられる。
【００２２】
微生物は、適用時は、生きている（生存）、或いは不活性とすることができる。本発明の方法はさらに、材料を添加して、適用中の微生物の成長を増進することを含む（例えば、栄養素を添加して、微生物の成長を促進する）。一実施形態において、栄養素源としては、例えば、窒素及び／又は炭素の有機源が含まれる。
【００２３】
好ましい実施形態において、本方法による微生物成長副生成物は、バイオサーファクタント、溶媒、酵素やその他代謝物である。一実施形態において、微生物により生成された成長副生成物は、互いに相乗効果により作用して、所望の効果をもたらす。
【００２４】
特定の実施形態において、微生物成長副生成物は、微生物成長の結果として存在する。ある実施形態において、精製した微生物成長副生成物、例えば、１つ以上のグリコリピド及び／又はリポペプチドバイオサーファクタントを、微生物ベースの組成物に適用することができる。
【００２５】
一実施形態において、本発明の微生物ベースの組成物を用いて、魚に給餌する方法が提供される。微生物ベースの組成物は、魚にとって高栄養補助食品及び病原性微生物による魚の飼料の汚染を防ぐ予防策として機能する。一実施形態において、魚に給餌する方法は、微生物ベースの組成物を、養魚場又は水槽に導入して、魚に組成物を摂取させることを含む。利点としては、本発明を用いて、養殖魚に給餌するコストを減じることができる点である。
【００２６】
本発明は、大量の無機化合物を環境に放出することなく用いることができる点が利点である。さらに、本組成物及び方法は、生物分解性かつ毒物安全性のある成分を利用するものであるため、本発明を用いて、「グリーン」な処理として、魚の飼育を改善することができる。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、養殖を改善する微生物ベースの生成物及びその使用を提供する。特に、本発明は、健康で高品質な養殖魚を生成する材料及び方法を提供する。利点として、本発明は、例えば、毒性のある化学化合物や抗生物質を使わずに養殖を改善することが挙げられる。このように、本発明の材料及び方法は、環境にやさしく、操作が容易で、コスト効率が良い。
【００２８】
特定の実施形態において、本発明は、例えば、水の質及び透明度を改善し、魚の病原体防御を増強し、魚の成長を刺激することのできる微生物ベースの組成物によって、養魚場や水槽の処理により、養殖を改善する。特に、本発明の組成物を用いると、例えば、魚に給餌し、魚の消化管における栄養の吸収を改善し、魚の池及びタンクの水を清浄にし、魚を感染から保護したり、水中における二酸化炭素の蓄積を減じることができる。
【００２９】
選択された定義
本明細書で用いる「養殖」や「養魚」は、養魚場における水生動物の飼育と収穫を意味する。養殖は、集中的（人工的な容器での養魚技術に依拠）又は広範囲（海洋、天然及び人口湖、湾、川、フィヨルド、その他水域）に行うことができる。養殖は、容器、池、タンク、水槽、ケージ、水路などから、養殖魚及び貝から魚介類を生育するものである。さらに、養殖には、公海やその制限区域内で、海洋生物を培養する海洋養殖が含まれる。さらに、養殖には、野生集団や沿岸生息地を再構築する取り組みとして、養殖魚や貝を野生に戻す個体群回復や「増強」が含まれる。さらにまた、養殖には、水槽取引のための観賞魚の生育や、水槽内での観賞魚の養殖も含まれる。養殖可能なのは、淡水又は塩水魚介類であり、観賞魚、食用魚、遊魚、釣魚、甲殻類、藻、海藻類、魚卵が含まれる。
【００３０】
本明細書で用いる「養魚場」は、養殖が行われる水のある環境である。本開示による養魚場は、水のある環境であれば、人口と天然のいずれの環境も含まれ、例えば、池、灌漑用水路、川、湖、海洋、フィヨルド、タンク、水槽、ケージ又は水路がある。
【００３１】
本明細書で用いる、「微生物ベースの組成物」とは、微生物又はその他細胞培養の結果生成された成分を含む組成物を意味する。このように、微生物ベースの組成物は、微生物自体及び／又は微生物成長の副生成物を含む。微生物は、植物状態、胞子形態、菌糸体、繁殖体のその他の形態、又はこれらの混合物であってよい。微生物は、プランクトン又はバイオフィルム形態、或いはその混合であってよい。成長副生成物は、例えば、代謝物（バイオサーファクタント）、細胞膜成分、発現タンパク質及び／又はその他細胞成分であってよい。微生物は、無傷又は溶解させてよい。細胞は、存在していなくても、又は、例えば、組成物１ミリリットル当たり、１×１０４、１×１０５、１×１０６、１×１０７、１×１０８、１×１０９、１×１０１０又は１×１０１１以上の細胞又は繁殖体濃度で存在してよい。
【００３２】
本明細書で用いる繁殖体は、新生物及び／又は成熟有機体が成長する微生物の一部であり、細胞、分生子、包嚢、胞子（例えば、生殖核、芽胞、外生胞子）菌糸体、芽、種が挙げられるが、これらに限られるものではない。
【００３３】
本発明は、さらに、所望の結果を得るために実際に適用すべき生成物である、「微生物ベースの生成物」を提供する。微生物ベースの生成物は、単に、微生物培養プロセスから収穫された微生物ベースの組成物であってよい。或いは、微生物ベースの生成物は、さらに添加済みの成分を含む。追加の成分としては、例えば、安定剤、バッファ、適切な担体、例えば、水、塩溶液、又はその他適切な担体、更なる微生物成長をサポートする添加栄養剤、非栄養素成長促進剤、例えば、植物ホルモン、適用される環境において、微生物及び／又は組成物の追跡を促す薬剤が挙げられる。微生物ベースの生成物はまた、微生物ベースの組成物の混合物を含んでいてもよい。微生物ベースの生成物はまた、これらに限られるものではないが、ろ過、遠心分離、溶解、乾燥、精製等、何らかの方法により処理された微生物ベースの組成物の１つ以上の成分も含んでいてよい。
【００３４】
本明細書で用いる「収穫」とは、微生物ベースの組成物の一部又は全てを成長容器から取り出すことを指す。
【００３５】
本明細書で用いる、「バイオフィルム」は、バクテリアといった微生物の細胞が表面で互いに接合した凝集体である。バイオフィルム中の細胞は、液体媒体中に浮かぶ、又は泳ぐ単一細胞である、同じ生物のプランクトン細胞とは生理的に別のものである。
【００３６】
本明細書で用いる、「単離」又は「精製」核酸分子、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質又は有機化合物、例えば、小分子、は、自然に係わる、細胞材料のような他の化合物を実質的に含まない。本明細書で用いる、微生物菌株に関連して「単離された」とは、菌株が、自然に存在する環境から取り出されたことを意味する。このように、単離された菌株は、例えば、担体に関連する生物的に純粋培養又は胞子（又は菌株の他の形態）として存在する。精製又は単離ポリヌクレオチド（リボ核酸（ＲＮＡ）又はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ））は、天然由来の状態の側鎖の遺伝子又はシーケンスを含まない。精製又は単離ポリペプチドは、天然由来の状態で、側鎖の他の分子又はアミノ酸を含まない。
【００３７】
特定の実施形態において、精製化合物は、当該化合物の少なくとも６０重量％（乾燥重量）である。好ましくは、処方は、当該化合物の少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも９０重量％、最も好ましくは少なくとも９９重量％である。例えば、精製化合物は、所望の化合物の少なくとも９０重量％、９１重量％、９２重量％、９３重量％、９４重量％、９５重量％、９８重量％、９９重量％又は１００重量％（ｗ／ｗ）のものである。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、薄層クロマトグラフィー又は高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析による適切な標準的方法により測定される。
【００３８】
「代謝物」とは、代謝により生成される物質又は特定の代謝プロセスを担うのに必要な物質のことを意味する。代謝物は、代謝の出発材料（例えば、グルコース）、中間体（例えば、アセチル−ＣｏＡ）又は最終生成物（例えば、ｎ−ブタノール）である有機化合物とすることができる。代謝物としては、これらに限られるものではないが、酵素、毒素、酸、溶媒、アルコール、タンパク質、炭水化物、ビタミン、ミネラル、微量要素、アミノ酸、ポリマー及び界面活性剤が例示される。
【００３９】
本明細書で用いる「調整する」は、変更（例えば、増加や減少）と区別なく用いられる。このような代替は、本明細書に記載したような公地の方法により検出される。
【００４０】
ここに挙げた範囲は、その範囲内の値の全てが略されているものとする。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９又は５０からなる群からの任意の数、数の組み合わせ、又は下位範囲、同様に、上述した整数間の全ての中間の１０進法の値、例えば、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８及び１．９を含む。下位範囲に対して、その範囲のいずれかの終点から広がる「入れ子下位範囲」も具体的に予測される。例えば、１〜５０の例示範囲の入れ子下位範囲は、一方向からは１〜１０、１〜２０、１〜３０、１〜４０、他の方向からは５０〜４０、５０〜３０、５０〜２０、５０〜１０である。
【００４１】
本明細書で用いる、「減少する」は、少なくとも１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％又は１００％の負の変化を意味する。
【００４２】
本明細書で用いる、「参照」は、標準又は対照条件を意味する。
【００４３】
本明細書で用いる、「界面活性剤」とは、２種類の液体間又は液体と固体間の表面張力（又は界面張力）を下げる化合物を意味する。界面活性剤は、洗剤、湿潤剤、乳化剤、発泡剤及び／又は分散剤として作用する。「バイオサーファクタント」は、生存生物により生成される表面活性物質を意味する。
【００４４】
移行句「含む（comprising）」は、「有する（including）」や「含有する（containing）」と類語であり、包括的又は制約がなく、追加の、挙げられていない要素や方法工程を排除しない。対照的に、移行句「からなる（consisting of）」は、請求項に記載されていない要素、工程又は成分は排除する。移行句「から実質的になる（consisting essentially of）は、請求項の範囲を特定の材料や工程に限定し、請求された発明の「基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しないもの」である。
【００４５】
特に断りのない限り、本明細書で用いる用語「又は」は、包括的と理解される。特に断りのない限り、本明細書で用いる用語「一つの（a, an）」及び「該、その、前記（the）」は単数又は複数と理解される。
【００４６】
特に断りのない限り、本明細書で用いる用語「約（about）」は、業界における一般公差の範囲内、例えば、平均の２標準偏差、と理解される。約は、示した値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％又は０．０１％以内と理解される。特に断りのない限り、本明細書に挙げた数値には全て、「約」を付けることができる。
【００４７】
本明細書で挙げた化学基は可変で、単一又は組み合わせた基とすることができる。可変の態様として挙げた実施形態は、単一又は組み合わせた実施形態とすることができる。
【００４８】
微生物ベースの組成物
本発明は、微生物、その成長副生成物、例えば、バイオサーファクタント、溶媒及び／又は酵素を提供する。本発明はまた、これらの微生物及び副生成物を、改善された養殖や養魚で用いる方法も提供する。さらに、本発明は、微生物ベースの組成物及び微生物成長副生成物の材料及び製造方法を提供する。
【００４９】
利点として、本発明による微生物ベースの組成物は非毒性（すなわち、摂取毒性は５ｇ／ｋｇを超える）であり、例えば、皮膚に刺激を与えることなく高濃度で適用することができる。このように、本発明は、人間が消費するために製造された魚やエビといった生存生物の存在下で、微生物ベースの組成物の適用がなされる場合、特に有利である。
【００５０】
一実施形態において、本発明は、養殖や養魚を改善するための微生物ベースの組成物及びその組成物を用いる方法を提供する。具体的な実施形態において、本発明は、生化学製造微生物及びその成長副生成物、例えば、バイオサーファクタント、溶媒及び／又は酵素を含む組成物を利用するものである。一実施形態において、組成物は、微生物の倍量から得られる発酵ブロスを含む。
【００５１】
好ましい実施形態において、本組成物の微生物は、培養バイオサーファクタント、溶媒及び／又は酵素生成酵母である。
【００５２】
これらの微生物は、天然又は遺伝子組み換え微生物であってよい。例えば、微生物は、特異遺伝子により転換され、特別な特性を示す。微生物はまた、所望の菌株の変異体であってもよい。本明細書で用いる、「突然変異」とは、参照微生物の菌株、遺伝子変異体又はサブタイプを意味し、突然変異は、参照微生物と比べたとき、１つ以上の遺伝子変異（例えば、点突然変異、ミスセンス突然変異、ナンセンス突然変異、欠失、複製、フレームシフト突然変異又はリピート伸長）を有する。突然変異を生じる手順は微生物分野において周知されている。例えば、ＵＶ突然変異誘発及びニトロソグアニジンはこの目的で大規模に使われている。
【００５３】
本発明に従って用いるのに好適な酵母及び菌類は、例えば、Candida（例えば、C. apicola)、Saccharomyces（例えば、S. cerevisiae、S. boulardii sequela、S. torula）、Issatchenkia、Kluyveromyces、Pichia、Wickerhamomyces（例えば、W. anomalus）、Starmerella（例えば、S. bombicola）、Mycorrhiza、Mortierella、Phycomyces、Blakeslea、Thraustochytrium、Phythium、Entomophthora、Aureobasidium pullulans、Pseudozyma aphidis、Aspergillus及び／又はRhizopus sppである。
【００５４】
一実施形態において、微生物は、キラー酵母である。本明細書で用いる、「キラー酵母」とは、菌株自体が免疫性である、毒性タンパク質又は糖タンパク質の分泌を特徴とする酵母の菌株を意味する。キラー酵母が分泌する外毒素は、酵母、菌類又はバクテリアの他の菌株を殺すことができる。例えば、キラー酵母により制御できる微生物としては、Fusarium及びその他糸状菌類が挙げられる。本発明によるキラー酵母としては、これらに限られるものではないが、Wickerhamomyces（例えば、W．anomalus）、Pichia（例えば、P．anomala、P．guielliermondii、P．occidentalis、P．kudriavzevii）、Hansenula、Saccharomyces、Hanseniaspora、（例えば、H．uvarum）、Ustilago maydis、Debaryomyces hansenii、Candida、Cryptococcus、Kluyveromyces、Torulopsis、Ustilago、Williopsis、Zygosaccharomyces（例えば、Z．bailii）等が挙げられる。
【００５５】
一実施形態において、微生物は、Wickerhamomyces anomalus（Pichia anomala）、Pichia guielliermondii及び／又はPichia occidentalis等の培養したキラー酵母菌株又はその変異体である。
【００５６】
ある実施形態において、微生物は、培養したPseudozyma酵母、例えば、Pseudozyma aphidisである。他の実施形態において、微生物は、培養したStarmerella bombicolaである。さらに他の実施形態において、微生物は、培養したCandida apicolaである。
【００５７】
大量の、例えば、バイオサーファクタントを蓄積可能なその他の微生物菌株も本発明に従って用いることができる。本発明に有用なバイオサーファクタントとしては、グリコリピド、マンノタンパク質、ベータグルカン及び生物乳化及び表面／界面張力減少特性を有するその他の代謝物が挙げられる。
【００５８】
特定の実施形態において、本発明の微生物は、他の化学及び／又は微生物処理と組み合わせて用いることができる。例えば、Wickerhamomyces anomalusとPseudozyma aphidisのような異なる種の酵母を同時に用いることができる。微生物のその他の組み合わせも考えられる。
【００５９】
好ましい実施形態において、本発明の微生物成長副生成物は、バイオサーファクタント、溶媒、酵素又はその他代謝物である。より好ましくは、微生物成長副生成物は、バイオサーファクタントである。一実施形態において、微生物により生成された代謝物は、互いに相乗効果により作用して、所望の効果をもたらす。
【００６０】
本発明の微生物及び微生物ベースの組成物は、養殖を改善するのに有用な数多くの有益な特性を有する。例えば、本発明により生成されたバイオサーファクタントは、バイオフィルムの形成を防ぎ、強力な乳化及び解乳化剤特性を有する。さらに、バイオサーファクタントは、例えば、養魚場や水槽における水の表面及び界面張力を減じることができる。
【００６１】
特定の実施形態において、本発明に有用なバイオサーファクタントは、例えば、マンノシルエリスリトールリピドやソホロリピドを含むグリコリピドバイオサーファクタントである。マンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）は、例えば、Pseudozymaにより大量生産されるグリコリピドである。ソホロリピド（ＳＬＰ）は、例えば、Starmerella, Candida及びWickerhamomycesにより生成されたグリコリピドバイオサーファクタントである。
【００６２】
ＭＥＬ及びＳＬＰは、優れた水表面及び界面張力減少特性、並びに多様な生化学及び生理学的影響を示す。例えば、本発明のバイオサーファクタントは、抗真菌性、抗菌性、駆虫及び抗ウイルス性を有する。さらに、本バイオサーファクタントは、極めて有効な乳化及び解乳化剤特性を有する。
【００６３】
微生物ベースの組成物に添加できる更なる成分としては、例えば、バッファ、担体、同一又は異なる設備で生成されたその他の微生物ベースの組成物、粘度調節剤、保存料、微生物成長のための栄養素、追跡剤、殺生物剤、その他微生物、界面活性剤、乳化剤、潤滑剤、溶解度制御剤、ｐＨ調節剤、保存料、安定剤及び耐紫外線剤が挙げられる。
【００６４】
特定の実施形態において、本発明の微生物ベースの組成物は、さらに担体を含む。担体は、酵母又は酵母副生成物を、生成物が生存したまま、或いは、不活性酵母の場合には、有効とするのに必要な成分を保持しながら、対象の水域、表面及び／又は魚等に分配可能な業界で公知の好適な担体である。
【００６５】
一実施形態において、組成物は、ｐＨを好ましい値近くに安定化させるため、有機及びアミノ酸又はその塩を含むバッファをさらに含む。好適なバッファとしては、これらに限られるものではないが、クエン酸塩、グルコン酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、乳酸塩、シュウ酸塩、アスパラギン酸塩、マロン酸塩、グルコヘプトン酸塩、ピルビン酸塩、ガラクタル酸塩、サッカリン酸塩、タルトロン酸塩、グルタミン酸塩、グリシン、リシン、グルタミン、メチオニン、システイン、アルギニン及びこれらの混合物が挙げられる。リン酸及び亜リン酸又はその塩も用いてよい。合成バッファは、用いるのに好適であるが、有機及びアミノ酸、又はその塩のような天然バッファを用いるのが好ましい。
【００６６】
更なる実施形態において、ｐＨ調節剤としては、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、炭酸又は重炭酸カリウム、塩酸、硝酸、硫酸又はこれらの混合物が挙げられる。
【００６７】
微生物ベースの組成物のｐＨは、当該微生物に好適なものとする。好ましい実施形態において、最終微生物ベースの組成物のｐＨは６．５〜７．５の範囲である。
【００６８】
一実施形態において、重炭酸又は炭酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等の多塩基酸として、塩の調製水溶液のような追加の成分を、処方に含めることができる。
【００６９】
任意で、組成物は、使用前貯蔵することができる。貯蔵時間は短い方が好ましい。このように、貯蔵時間は、６０日、４５日、３０日、２０日、１５日、１０日、７日、５日、３日、２日、１日又は１２時間未満である。好ましい実施形態において、生きた細胞が生成物中に存在する場合は、生成物は、例えば、２０℃、１５℃、１０℃、５℃未満といった冷温で貯蔵する。一方、バイオサーファクタント組成物は、典型的に、周囲温度で貯蔵することができる。
【００７０】
一実施形態において、本発明の微生物ベースの組成物は、小規模から大規模の培養プロセスにより得られる。培養プロセスは、例えば、液内培養、固体発酵（ＳＳＦ）及び／又はこれらの組み合わせである。
【００７１】
発酵生成物は、抽出や精製なしで直接用いることができる。所望であれば、抽出及び精製は、標準的な抽出及び／又は精製方法又は当業者に知られた技術を用いて容易に行うことができる。ある実施形態において、本発明の微生物ベースの組成物は、生存及び／又は不活性培養物及び／又は微生物及び／又は残渣栄養素により生成される微生物代謝物を含有する発酵ブロスを含む。
【００７２】
組成物は、例えば、少なくとも、１重量％、５重量％、１０重量％、２５重量％、５０重量％、７５重量％又は１００重量％であってよい。組成物中のバイオマスの量は、例えば、０重量％〜１００重量％であり、その間のパーセンテージも含まれる。
【００７３】
発酵ブロスのバイオマス含量は、例えば、５ｇ／ｌ〜１８０ｇ／ｌ以上である。一実施形態において、ブロスの固体含量は、１０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌである。
【００７４】
特定の実施形態において、本発明の組成物は、例えば、バイオサーファクタント、溶媒及び／又はバイオサーファクタントのみよりも有利である。すなわち、次のような１つ以上の利点がある。酵母細胞壁の外側表面に高濃度のマンノタンパク質がある、酵母細胞壁にバイオポリマーベータグルカンが存在する、培養物中にバイオサーファクタント、代謝物及び溶媒（例えば、乳酸、エタノール、酢酸エチル等）が存在する。
【００７５】
微生物ベースの組成物の微生物は、活性又は不活性形態であってよい。微生物ベースの生成物組成物は、活性及び不活性微生物の組み合わせを含有していてよい。
【００７６】
微生物ベースの組成物は、安定化、保存及び貯蔵せずに用いてよい。利点として、微生物ベースの生成物を直接用いると、異物や望ましくない微生物による汚染の可能性が減じ、微生物成長副生成物の活性が維持される。
【００７７】
本発明による微生物の成長
本発明は、微生物の培養と、微生物代謝物及び／又はその他の微生物成長副生成物の製造方法を用いる。本発明はさらに、所望の規模での微生物の培養と、微生物代謝物の生成に好適な培養プロセスを利用する。培養プロセスとしては、これらに限られるものではないが、液内培養／発酵、固体発酵（ＳＳＦ）及び／又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００７８】
本明細書で用いる「発酵」とは、制御された条件下での細胞の成長を意味する。成長は、好気性又は嫌気性とすることができる。
【００７９】
一実施形態において、本発明は、バイオマス（例えば、成長可能な気泡材料）、細胞外代謝物（例えば、小分子及び排出タンパク質）、残渣栄養素及び／又は細胞内（例えば、酵素及びその他タンパク質）を生成するための材料及び方法を提供する。
【００８０】
本発明で用いる微生物成長容器は、産業用であれば、任意の発酵槽又は培養リアクターとすることができる。一実施形態において、容器は、機能制御／センサを有している、又は機能制御／センサに接続されて、培養プロセスにおいて重要な因子、例えば、ｐＨ、酸素、圧力、温度、攪拌機軸動力、湿度、粘度、微生物密度、及び／又は代謝物濃度を測定するものであってよい。
【００８１】
更なる実施形態において、容器はまた、容器内の微生物の成長をモニター（例えば、細胞数及び成長相の測定）できるものであってもよい。或いは、デイリーサンプルを容器から取り出して、希釈平板法等、業界で公知の技術により列挙してもよい。希釈平板は、サンプル中の微生物の数を推定するのに用いられる簡易な技術である。この技術はまた、異なる環境や処理を比べるための指標も提供することができる。
【００８２】
一実施形態において、本方法は、窒素源によって培養を補助する。窒素源は、例えば、硝酸カリウム、硝酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、アンモニア、尿素及び／又は塩化アンモニウムとすることができる。これらの窒素源は、独立して、又は２つ以上の組み合わせで用いてよい。
【００８３】
本方法は、成長培養物に酸素を供給することができる。一実施形態によれば、緩慢な空気流により、低酸素含有空気を除去し、酸素供給された空気を導入する。酸素供給された空気は、液体の機械的撹拌のためのインペラと、酸素を液体に溶解するための気体の泡を液体に供給するエアスパージャを含む機構により、デイリーに補充される周囲空気である。
【００８４】
本方法は、さらに、炭素源によって培養を補助する。炭素源は、典型的に、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、トレハロース、マンノース、マンニトール及び／又はマルトースといった炭水化物、酢酸、フマル酸、クエン酸、プロピオン酸、リンゴ酸、マロン酸及び／又はピルビン酸といった有機酸、エタノール、プロパノール、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール、イソブタノール及び／又はグリセロールといったアルコール、大豆油、米糠油、キャノーラ油、ココナツ油、オリーブ油、コーン油、胡麻油及び／又は亜麻仁油といった油脂等である。これらの炭素源は、独立して、又は２つ以上の組み合わせで用いてよい。
【００８５】
一実施形態において、微生物のための成長因子及び微量栄養素が媒体に含まれる。これは、成長微生物が、必要な全てのビタミンを生成できないときは特に好ましい。鉄、亜鉛、銅、マンガン、モリブデン及び／又はコバルトといった微量要素を含む無機栄養素もまた媒体に含まれる。さらに、ビタミン、必須アミノ酸及び微量元素の源を、例えば、コーンフラワーのような小麦粉又は挽き割り粉の形態、酵母エキス、ジャガイモエキス、ビーフエキス、大豆エキス、バナナ果皮エキス等のエキスの形態、或いは精製形態で含めることができる。タンパク質の生合成に有用なアミノ酸、例えば、Ｌ−アラニンを含めることもできる。
【００８６】
一実施形態において、無機塩も含めてよい。有用な無機塩は、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、リン酸水素二ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、硫酸鉄、塩化鉄、硫酸マンガン、塩化マンガン、硫酸亜鉛、塩化鉛、硫酸銅、塩化カルシウム、炭酸カルシウム及び／又は炭酸ナトリウムである。これらの無機塩は、独立して、又は２つ以上の組み合わせで用いてよい。
【００８７】
ある実施形態において、培養方法はさらに、追加の酸及び／又は抗菌剤を、培養プロセスの前及び／又は最中に液体媒体に添加することを含む。抗菌剤又は抗生物質は、培養物を汚染から守るために用いられる。さらに、消泡剤も添加して、培養中気体が発生するときに、発泡及び／又は泡の蓄積から守る。
【００８８】
混合物のｐＨは、当該微生物に好適なものとしなければならない。炭酸塩やリン酸塩のようなバッファ及びｐＨ制御剤を用いて、好ましい値近くにｐＨを安定化させてもよい。培養は、一定のｐＨで連続して行ってもよいし、ｐＨを変えてもよい。
【００８９】
高濃度の金属イオンが存在するときは、液体媒体中でキレート化剤を用いる必要がある。
【００９０】
微生物の培養及び微生物副生成物の精製の方法及び機器は、バッチ、半バッチ又は連続プロセスで用いることができる。
【００９１】
微生物は、プランクトン形態又はバイオフィルムとして成長し得る。バイオフィルムの場合には、容器の中には、微生物がバイオフィルム状態で成長し得る基質がある。例えば、そのシステムはまた、バイオフィルム成長特性を促進し、改善する刺激（剪断応力等）を与える能力も有していてよい。
【００９２】
一実施形態において、微生物の培養方法は、約５℃〜約１００℃、好ましくは、１５〜６０℃、より好ましくは、２５〜５０℃で行う。更なる実施形態において、培養は、一定の温度で連続して行う。他の実施形態において、培養は、温度を変更して行ってもよい。
【００９３】
一実施形態において、本方法及び培養プロセスで用いる機器は殺菌されている。リアクター／容器等の培養機器は、殺菌ユニット、例えば、オートクレーブと離して接続する。培養機器はまた、イノキュレートを開始する前に、現場で殺菌する殺菌ユニットを有していてもよい。空気は、業界に知られた方法により殺菌することができる。例えば、周囲空気は、容器に入る前に、少なくとも１つのフィルタを通過する。他の実施形態において、細菌成長を制御するために、低水分活性及び低ｐＨを用いる場合は、媒体は、低温殺菌、又は、任意で、全く加熱しないで殺菌する。
【００９４】
他の実施形態において、培養システムは、自己殺菌性、すなわち、抗菌性成長副生成物又は代謝物の生成による、培養する生物の他の生物によるコンタミネーションを防ぐことができる。
【００９５】
発酵ブロスのバイオマス含量は、例えば、５ｇ／ｌ〜１８０ｇ／ｌ以上である。一実施形態において、ブロスの固体含量は、１０ｇ／ｌ〜１５０ｇ／ｌである。
【００９６】
当該微生物により生成される微生物成長副生成物は、微生物に保持されるか、液体媒体に分泌される。他の実施形態において、微生物成長副生成物を生成する方法はさらに、当該微生物成長副生成物を濃縮し精製する工程を含む。更なる実施形態において、液体媒体は、微生物成長副生成物を安定化させる化合物を含有していてよい。
【００９７】
一実施形態において、微生物を生成する方法は、さらに、本発明の微生物ベースの組成物に用いる微生物を不活性化することを含む。好ましくは、不活性化は、微生物の細胞壁の所望の成分を変性しない方法を用いて行われる。
【００９８】
一実施形態において、成長及びバイオサーファクタント生成に適切な条件下で、本発明の酵母菌株を培養し、任意で、バイオサーファクタントを精製することにより、バイオサーファクタントは生成される。本発明の微生物菌株を、成長及び酵素／タンパク質発現に適切な条件下で、培養し、任意で、酵素又はその他タンパク質を精製することにより、酵素又はその他タンパク質を生成することもできる。
【００９９】
一実施形態において、微生物培養組成物は、培養完了時に（例えば、所望の細胞密度、ブロスにおける特定の代謝物の密度が達成された時点で）全て取り出される。このバッチ手順において、第１のバッチを取り出した時点で、全く新しいバッチが開始される。
【０１００】
他の実施形態において、どの時点でも、発酵生成物の一部のみを取り出す。本実施形態において、生存細胞のバイオマスは、新たな培養バッチのためのイノキュレートとして容器に残る。取り出された組成物は、細胞フリーのブロス又は細胞を含む。このようにして、半連続システムが作られる。
【０１０１】
微生物ベースの生成物の調製
本発明の１つの酵母ベースの生成物は、単に、微生物及び／又は残渣栄養素により生成される微生物及び／又は微生物代謝物を含有する発酵ブロスである。発酵生成物は、抽出や精製なしで直接用いることができる。所望であれば、抽出及び精製は、標準的な抽出及び／又は精製方法又は文献に記載された技術を用いて容易に行うことができる。
【０１０２】
微生物ベースの生成物中の微生物は、活性又は不活性形態であってよい。微生物ベースの生成物は、活性微生物と不活性微生物の組み合わせを含有していてもよい。好ましくは、微生物は不活性である。
【０１０３】
微生物ベースの生成物は、安定化、保存及び貯蔵せずに用いてよい。利点として、微生物ベースの生成物を直接用いると、異物や望ましくない微生物による汚染の可能性が減じ、微生物成長副生成物の活性が維持される。
【０１０４】
微生物成長により得られた微生物及び／又はブロスは、成長容器から取り出して、例えば、すぐ利用できるよう管を通して移される。他の実施形態において、微生物は、使用前、不活性化することができる。
【０１０５】
他の実施形態において、組成物（微生物、ブロス、微生物とブロス）は、例えば、意図する用途、予定の適用方法、発酵タンクのサイズ、微生物成長設備から使用場所までの輸送形式を考慮して、適切なサイズの容器に入れることができる。このように、微生物ベースの組成物を入れる容器は、例えば、１ガロン〜１，０００ガロン以上である。他の実施形態において、容器は、２ガロン、５ガロン、２５ガロン以上である。
【０１０６】
利点として、本発明によれば、微生物ベースの生成物は、微生物が成長したブロスを含むことである。生成物は、例えば、少なくとも１重量％、５重量％、１０重量％、２５重量％、５０重量％、７５重量％又は１００重量％のブロスであってよい。生成物中のブロスの量は、例えば、０重量％〜１００重量％であり、その間のパーセンテージも含まれる。
【０１０７】
酵母ベースの組成物を成長容器から取り出す際、更なる成分を収穫生成物として添加し、容器に入れたり、管に通す（或いは、使用するために輸送する）。添加剤は、例えば、バッファ、担体、同じ又は異なる設備で生成されたその他微生物ベースの組成物、粘度調節剤、保存料、追跡剤、溶媒、殺生物剤、意図する用途向けのその他の微生物及びその他成分である。
【０１０８】
特定の実施形態において、バイオサーファクタントは、微生物ベースの組成物に添加することができる。好ましい実施形態において、バイオサーファクタントは、精製形態にある。
【０１０９】
バイオサーファクタントは、微生物により生成された表面活性物質の構造の異なるグループである。バイオサーファクタントは生物分解性で、選択した生物を用いて、再生可能な基質で容易かつ安価に生成することができる。バイオサーファクタントは全て両親媒性であり、極性（親水性）部分と非極性（疎水性）基の２つの部分からなる。両親媒性構造のため、バイオサーファクタントは、疎水性の水不溶物質の表面積を増大し、かかる物質の水の生物学的利用能を増大し、微生物細胞表面の特性を変える。
【０１１０】
バイオサーファクタントとしては、低分子量グリコリピド（例えば、ラムノリピド、ソホロリピド、マンノシルエリスリトールリピド）、リポペプチド（例えば、サーファクチン、イツリン、フェンギシン）、フラボリピド、ホスホリピド及び高分子量ポリマー、例えば、リポタンパク質、リポ多糖タンパク質錯体及び多糖タンパク質脂肪酸錯体が挙げられる。バイオサーファクタント分子の共通親油性部分は、脂肪酸の炭化水素鎖であり、親水性部分は、中性リピドのエステル又はアルコール基により、脂肪酸又はアミノ酸（又はペプチド）のカルボキシレート基、フラボリピドの場合は、有機酸、炭水化物の場合は、グリコリピドにより形成される。
【０１１１】
バイオサーファクタントは、界面で蓄積するため、界面張力が減じ、溶液中での凝集ミセル構造の形成につながる。安全で効率的な微生物バイオサーファクタントは、液体、固体及び気体の分子間の表面及び界面張力を減じる。バイオサーファクタントが孔を形成し、生体膜を不安定にする能力によって、抗菌剤、抗真菌剤、及び溶血素として使用できる。低毒性及び生物分解能の特性を組み合わせると、バイオサーファクタントは、様々な用途について養殖産業において用いることができ、有利である。
【０１１２】
一実施形態において、本発明に従って用いることのできるバイオサーファクタントは、１つ以上のグリコリピド及び／又はリポペプチドを含む。一実施形態において、グリコリピドは、ラムノリピド（ＲＬＰ）、ソホロリピド（ＳＬＰ）、トレハロースリピド又はマンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）から選択される。一実施形態において、リポペプチドは、サーファクチン、イツリンＡ及びフェンギシンから選択される。
【０１１３】
好ましい実施形態において、これらのバイオサーファクタントの任意の組み合わせを、微生物ベースの組成物に適用することができる。好ましくは、組成物中のバイオサーファクタントの合計濃度は、５ｇ／ｋｇを超えない。特定の実施形態において、バイオサーファクタントの濃度は、合計組成物の０．０５重量％〜９０重量％、好ましくは、０．１重量％〜５０重量％、より好ましくは、０．５重量％〜２重量％である。
【０１１４】
本発明による処方に含ませてよいその他の好適な添加剤としては、このような処方に通常用いられる物質が挙げられる。かかる添加剤としては、界面活性剤、乳化剤、潤滑剤、バッファ、溶解度制御剤、ｐＨ調節剤、保存料、安定剤及び耐紫外線剤が例示される。
【０１１５】
任意で、生成物は、使用前貯蔵することができる。貯蔵時間は短い方が好ましい。このように、貯蔵時間は、６０日、４５日、３０日、２０日、１５日、１０日、７日、５日、３日、２日、１日又は１２時間未満である。好ましい実施形態において、生きた細胞が生成物中に存在する場合は、生成物は、例えば、２０℃、１５℃、１０℃、５℃未満といった冷温で貯蔵する。一方、バイオサーファクタント組成物は、典型的に、周囲温度で貯蔵することができる。
【０１１６】
一実施形態において、不活性な微生物ベースの組成物を生成する目的で、異なる微生物菌株を、異なるタンクで培養する。組成物は、殺菌温度（酵母細胞を１００％不活性化するのに十分な時間、６５℃〜７０℃で）及び約１０．０〜１２．０までの増大するｐＨで、培養物を不活性化することにより調製される。これにより、細胞の部分加水分解がなされ、栄養成分をなくすことができる。次に、組成物を約６．５〜７．５のｐＨまで中和し、加水分解物の様々な成分を混合する。得られた微生物ベースの生成物は、魚飼料や水処理に用いることができる。
【０１１７】
本発明の組成物を用いて養殖を改善する方法
特定の実施形態において、本発明は、環境にやさしく、コスト効率が良い材料及び養殖を改善する方法を提供する。具体的な実施形態において、本発明は、養魚場で養殖した魚の健康と質を改善する方法を提供する。他の実施形態において、養魚場で養殖した魚に給餌する方法が提供される。
【０１１８】
本明細書で用いる、組成物や生成物を「適用する」や養魚場を「処理する」とは、対象や現場と接触させて、組成物や生成物がその対象や現場に影響し得ることを意味する。影響は、例えば、微生物成長及び／又はバイオサーファクタント又はその他成長副生成物の作用による。本発明によれば、適用や処理は、例えば、養魚場内の水環境に組成物をパイピング、ポンピング又は注ぐことによって、或いは、例えば、養魚場の様々な表面、壁又は囲いに組成物をコーティングしたり、広げたりすることによって行うことができる。
【０１１９】
一実施形態において、微生物の１つ以上の菌株及び／又は微生物成長副生成物を含む微生物ベースの組成物を、養魚場や水槽に適用することによって、養殖を改善する方法が提供される。本方法は、任意で、炭素や窒素といった栄養素の有機源、その他薬剤を現場に添加して、微生物の成長を促進することを含む（活性微生物を用いる場合）。
【０１２０】
本明細書で用いる養殖の「改善」又は「向上」は、養魚場で養殖された魚の健康と質を改善することを意味する。養殖の向上は、例えば、魚の生育環境の質を改善することにより間接的に、或いは、例えば、栄養や健康上の恩恵を魚に与えることにより直接的になされる。
【０１２１】
本方法及び組成物は、例えば、水の質及び透明度を改善し、病原体防御を増強し、魚の成長を刺激することができる。特に、本発明の組成物を用いて、魚の池及びタンクの水や表面を清浄にし、魚を感染や蔓延から保護し、水中における二酸化炭素の蓄積を減じ、魚を飼育し、栄養の吸収を改善することができる。
【０１２２】
特定の実施形態において、本発明は、例えば、藻の成長の結果として、養魚場や水槽に蓄積した粘泥や藻類を除去することにより、養殖を改善する方法を提供する。本発明の微生物ベースの組成物は、例えば、魚の池、タンク、水槽の水、床、壁又はその他表面に適用することができる。一実施形態において、組成物は、粘泥成分を分散し、粘泥を含む生物を殺すことのできる生物解乳化剤として作用する。
【０１２３】
池の粘泥又は藻類は、概して、水体における藻の成長の結果である。藻は、天然に豊富に存在する水生生物である。これらの複雑な生物は、多くの湖、池、ラグーン、廃水処理システムにとって厄介であり、水中又は水の表面で、粘液性、悪臭マット又はコーティングの形態で水源全体に繁殖し、占領する可能性がある。藻類ブルームは、水源の酸素を枯渇し、その結果、魚が次々と死ぬ可能性がある。ブルームの中には、例えば、青緑藻類ブルーム（藍藻）も、それらが生成する毒性副生成物ゆえ、人や水生生物にとって有害となり得る。
【０１２４】
本発明を用いて効率的に制御できる池の藻類形成の藻の種類としては、これらに限られるものではないが、プランクトン藻（例えば、Anabaena, Chlorella、Pediastrum、Scenedesmus及びOocystis）、糸状藻（例えば、Spirogyra、Cladophora、Rhizoclonium、Mougeotia、Zygnema及びHydrodictyon、その他、例えば、Lyngbya、Pithophora、有害物大量発生藻、コロニアル珪藻が挙げられる。
【０１２５】
ある実施形態において、本発明は、養魚場の水の全体的な質を改善することによって、養殖を改善する方法を提供する。一実施形態において、水の質を改善するとは、養魚場の水中の二酸化炭素の量を減じることを意味する。他の実施形態において、水の質を改善するとは、養魚場の水中の硫化水素の量を減じることを意味する。さらに他の実施形態において、水の質を改善するとは、養魚場の水中の酸素レベルを増やす、及び／又はバランスをとることを意味する。
【０１２６】
特に、高圧、高容量の養殖操業で、養魚場が混雑している場合には、水の気体状成分のバランスが崩れ、魚にとって有害な生育条件となる。例えば、混雑した池の魚は、個体群の規模が大きいために酸素が欠乏し、二酸化炭素含量が増えて、魚の窒息や死につながる。
【０１２７】
さらに、養魚場の下部に池の汚泥が形成されると、水中における欠乏酸素レベルと、増加した硫化水素レベルにつながる。池の汚泥は、下部に沈んだ様々な有機材料、例えば、死滅藻類、バクテリア、魚廃棄物、ごみにより形成される。池の汚泥は、通常、酸素は通らないため、硫化水素生成嫌気性バクテリアの成長が促される。硫化水素は他の生物に対して毒性があり、強い腐卵臭を生成する。このように、硫化水素とその源を取り除くことが、養殖魚の健康にとって必須である。
【０１２８】
特定の実施形態において、本発明を用いた二酸化炭素及び／又は硫化水素の減少によって、養魚場の水中の酸素レベルが増大し、水と魚の質が向上する。しかしながら、ある実施形態において、水の更なる酸素化が望ましい場合には、本方法は更に、例えば、フィルタ、通気装置、ポンプ、その他、水に通気するのに知られた手段を用いて、酸素化する手段を水に適用することを含む。
【０１２９】
ある実施形態において、本発明は、養魚場の水中の二酸化炭素及び／又は硫化水素濃度を減じることにより、養殖を改善する方法を提供する。本発明の微生物ベースの組成物を水に適用して、水の界面張力を減じる作用をし、水にトラップされた二酸化炭素及び／又は硫化水素の放出を補助する。
【０１３０】
特定の実施形態において、二酸化炭素の減少は、二酸化炭素による魚の窒息死を防いで、養殖を改善する。
【０１３１】
他の実施形態において、本発明は、養魚場の水における硫化水素の形成を防いで、養殖を改善する方法を提供する。本発明の微生物ベースの組成物は、魚の池の水中、又は下部に適用され、嫌気性硫化水素生成バクテリアが繁殖する池の汚泥を解乳化する作用をする。更なる実施形態において、組成物は、組成物の抗菌性により、硫化水素を生成する嫌気性バクテリアを制御する作用をし得る。
【０１３２】
具体的な実施形態において、硫化水素の減少及び／又はその形成を防止することによって、硫化水素堆積の毒性による魚の死を防いで、養殖が改善される。
【０１３３】
ある実施形態において、本発明は、養魚場の個体群に感染が蔓延するのを防ぐことによって、養殖を改善する方法を提供する。さらに、本発明を用いて、病原体や寄生虫等の感染を防ぐことができる。本発明の微生物ベースの組成物は、例えば、養魚場の水や表面に適用することができ、組成物の抗菌性、抗真菌性、抗ウイルス性、駆虫性や付着防止性によって、魚の疾患や死の原因として知られた様々な疾病が魚に接種されるのを防ぎ、また、養魚場の環境における疾病を引き起こす感染を防ぐ。
【０１３４】
本方法及び組成物が有用な病原体としては、これらに限られるものではないが、ウイルス（例えば、Aquabirnavirus、Betanodavirus、Orthomyxovirus、Alphavirus、rhabdoviruses、及びRanavirus）、バクテリア（例えば、Pseudomonas fluorescens、Aeromonas、Edwardsiella、Flavobacterium、Francisella、Photobacterium、Piscirickettsia、Pseudomonas、Tenacibaculum、Vibrio、Yersinia、Lactococcus、Renibacterium及びStreptococcus）、菌類（例えば、Saprolegnia、Aspergillus、Penicillium、Exophiala、Ichthyophonus、Branchiomyces、Dermocystidium、Prototheca、Oscillatoria、Phoma herbarum及びPaecilomyces）、水生菌（例えば、Saprolegnia sp.)、寄生虫（例えば、線虫、サナダムシ、回虫、ヒル、シラミ、メタゾア寄生虫、例えば、カイアシ類、単細胞性寄生虫、Ichthyophthirius multifiliis、や蠕虫、Eustrongylides）が例示される。
【０１３５】
本発明を用いて緩和又は防止できるウイルス性疾患としては、これらに限られるものではないが、伝染性膵臓壊死症、ウイルス性神経壊死症、サケ貧血性ウイルス、膵臓疾患、伝染性造血器壊死症ウイルス、ウイルス性出血性敗血症及び流行性造血器壊死症ウイルスが例示される。
【０１３６】
本発明を用いて緩和又は防止できる細菌病としては、これらに限られるものではないが、鰭腐敗病、松かさ病、自動性エロモナス敗血症、せつ腫症、クライス細菌、ナマズの腸管敗血症、エドワジエラ症又は腐敗症、カラムナリス、疑カラムナリス、フラボ細菌症又はニジマスフライシンドローム、細菌性鰓病細菌性鰓病、ビブリオ症、パスツレラ症、ピシリケッチア症又はリケッチア敗血症、シュードモナス敗血症又は赤点病、テナシバキュラム感染症、線維症、エルジニア症又は腸内赤口病、ラクトコッカス症、ノルカジア症、細菌性腎臓病、ブドウ球菌症、連鎖球菌症及び出血性敗血症が挙げられる。
【０１３７】
本発明を用いて緩和又は防止できるその他の疾患又は感染症としては、これらに限られるものではないが、真菌性鰓病、イクチオフォヌス症、ミズカビ病、ベルベット病、穴あき病、回旋病が挙げられる。利点として、本方法は、刺激の強い化学薬品や抗生物質を用いることなく、養殖魚の病原体防御を改善することができる点がある。
【０１３８】
ある実施形態において、本発明は、養殖魚の消化管における栄養の吸収を改善することにより、養殖を改善する方法を提供する。具体的には、魚が摂取すると、本発明の微生物ベースの組成物中のバイオサーファクタントは、魚の消化管内の油溶性ビタミンをはじめとする栄養素の吸収（すなわち、生物学的利用能）を改善することにより、養殖魚の全体の健康及び質を上げるのに寄与する。
【０１３９】
組成物は、例えば、溶液、乾燥粉末、ミール、フレーク、顆粒、ペレット等の形態で、養魚場の水に適用することができる。本組成物を摂取した魚は、従来のフィッシュミールを給餌した魚に比べて、体重が増加し、この体重増加の大半は、体脂肪のパーセンテージの減少に伴う体タンパク質の増加の結果である。
【０１４０】
他の実施形態において、本発明は、魚の給餌を補助する方法及び魚の給餌コストを下げる方法を提供する。本発明の微生物ベースの組成物は、酵母細胞と、任意で、精製済みバイオサーファクタントを含む単細胞タンパク質源として養魚場の水に適用することができる。酵母細胞は、例えば、濃縮量で、多数のタンパク質、炭水化物、リピド、脂肪酸、ミネラル及びビタミンを与えることができる。
【０１４１】
特定の実施形態において、組成物は、顆粒として処方され、従来のフィッシュミールの顆粒と共に魚に給餌することができる。ある実施形態において、組成物は、従来のフィッシュミールの成分と組み合わせて、これを用いて顆粒にする。さらに他の実施形態において、組成物は、従来のフィッシュミールの代わりに、それ自体を魚に給餌する。利点として、魚の栄養吸収を増大するのに加えて、本組成物は、組成物の抗菌性のために、ウイルス、菌類及びバクテリア剤による魚の汚染を防ぐことができることがある。
【０１４２】
従来の魚及び魚油由来の飼料の値上がりのために、多くの養殖操業では、魚に給餌するのに穀物ベースの飼料を利用し始めている。コーン、大豆、ソルガム等が魚餌を製造するのに用いられている。穀物ベースの飼料による魚の健康に与える影響は、決定的には知られていないが、経時においては望ましくない可能性がある。
【０１４３】
さらに、例えば、シーフード産業の成功は、高レベルのオメガ３脂肪酸のようなシーフードを人間が消費することによる健康上魅力的な点を部分的に頼っている。養殖魚を、肉食又は雑食から、厳格な植物由来飼料に変えることで、最終的な魚加工品の栄養成分が変化する。例えば、魚加工品の脂肪酸含量が減少する。シーフード産業と人間の栄養に対するこのような変化の影響は広範囲に及ぶ。
【０１４４】
このように、既存の魚の飼料の補助として作用させることにより、本発明を用いて、従来の魚ベースの魚の飼料を用いることによるコストの増大を緩和することができる。本発明によれば、養殖魚の健康及び質を損なうことなく、魚の給餌のコストを下げ、従来の魚ベースの飼料に戻すことができる。
【０１４５】
微生物ベースの生成物の現場生成
本発明の特定の実施形態において、微生物成長設備は、所望の規模で、新たな高密度微生物及び／又は当該の微生物成長副生成物を生成する。微生物成長設備は、適用場所又はその近傍に位置する。設備は、バッチ、準連続又は連続培養で高密度微生物ベースの組成物を生成する。
【０１４６】
本発明の微生物成長設備は、微生物ベースの生成物を用いる場所に位置させることができる（例えば、養魚場）。例えば、微生物成長設備は、使用場所から３００、２５０、２００、１５０、１００、７５、５０、２５、１５、１０、５、３又は１マイル未満である。
【０１４７】
酵母ベースの生成物は、従来の生成における安定化、保存、長期貯蔵及び大規模輸送プロセスを必要とすることなく、現場又は適用場所近くで生成されるため、さらに高密度の生存微生物を生成することができる。このように、現場適用において用いるのに必要な微生物ベースの生成物の量が少量で済む。これによって、スケールダウンしたバイオリアクタ（例えば、発酵タンクが小さくなる、出発材料、栄養素、ｐＨ制御剤及び消泡剤の供給量が減じる、等）が可能となり、システムを効率的なものとする。さらに、現場生成によって、製品の携帯性が促される。
【０１４８】
微生物ベースの生成物の現場生成はまた、生成物に成長ブロスが含まれるのを促す。現場使用に特に好適な発酵中に生成される溶剤をブロスに含めることができる。
【０１４９】
現場生成される高密度かつ濃厚な微生物の培養は、植物細胞を安定化させたものや、しばらくの間サプライチェーンにあるものよりも現場においてより効率的である。本発明の微生物ベースの生成物は、従来の生成物に比べ、細胞が代謝物から分離され、栄養素が発酵成長媒体に存在するという点で特に利点がある。搬送時間が減じることで、現場で要求される時間と量で、新たなバッチの微生物及び／又はその代謝物の生成及び分配が可能となる。
【０１５０】
本発明の微生物成長設備は、微生物自体、微生物代謝物及び／又は微生物が成長するブロスのその他の成分を含む新たな微生物ベースの組成物を生成する。所望であれば、組成物は、高密度の植物細胞、不活性細胞、植物細胞、不活性細胞、生殖胞子、菌糸体及び／又はその他微生物繁殖体を含み得る。利点を挙げると、組成物は、特定の場所で用いるために適応させることができる。一実施形態において、微生物成長設備は、微生物ベースの生成物を用いる現場又はその近傍に位置する。
【０１５１】
遠方の産業規模の生産者の製品品質は、上流処理の遅延、サプライチェーンのボトルネック、不適切な貯蔵、及びその他不測の事態によって損なわれてしまい、例えば、生存している細胞数及び／又は繁殖体の多い生成物、細胞が元来成長した関連ブロス及び代謝物の適時な分配及び適用が阻害される。利点として、これらの微生物成長設備は、こうした遠方の産業規模の生産者に頼っている現在の問題の解決策となることである。
【０１５２】
利点として、好ましい実施形態において、本発明のシステムは、天然由来の現場微生物及びその代謝副生成物を活用して、植物病原体バクテリアを処理する。現場微生物は、例えば、塩耐性、高温での成長能力及びシーケンスの遺伝子的同定の使用に基づいて識別することができる。さらに、微生物成長設備は、行先地域との相乗効果を改善するために、微生物ベースの生成物を適合する能力があるので、製造融通性が与えられる。
【０１５３】
個々の容器の培養時間は、例えば、１日〜２週間以上である。培養生成物は、数多くの異なるやり方で、収穫することができる。
【０１５４】
例えば、発酵２４時間以内の現場生成及び分配によって、純度、細胞密度の高い組成物が、実質的に低い発送コストで得られる。より効率的で強力な微生物イノキュレート剤の開発における急速な発展が見込まれるので、消費者は、この能力によって、微生物ベースの生成物の迅速な配達という多大な恩恵を受けられる。
【０１５５】
本発明の微生物ベースの生成物は、様々な独特の設定において用いることができる。というのは、例えば、以下のものを効率的に分配する能力による。１）活性代謝物を含む新たな発酵ブロス、２）微生物と発酵ブロスの混合物、３）生存細胞、胞子、菌糸体、分生子又はその他微生物繁殖体を含む組成物、４）生存細胞、胞子、菌糸体、分生子又はその他微生物繁殖体を含む高密度の微生物を含む組成物、５）即席の微生物ベースの生成物、及び６）遠隔地の微生物ベースの生成物。
【０１５６】
本明細書に記載した組成物や方法は、本明細書に記載した他の組成物や方法のいずれか１つ以上と組み合わせることができる。
【０１５７】
本発明の他の特徴及び利点は、好ましい実施形態の説明及び請求項から明らかになるであろう。本明細書に挙げた参考文献は全て組み込まれる。
【実施例】
【０１５８】
実施例１  WICKERHAMOMYCES ANOMALUS及びPSEUDOZYMA APHIDISの培養
Wickerhamomyces anomalus酵母を、非殺菌状態で、バイオマス及びソホロリピド生成のために、８００Ｌの作動容積を有するリアクターで成長させる。空容器衛生法を用いて、内側表面を２〜３％の過酸化水素で処理し、漂白剤及び高圧のお湯で濯ぐ。必要な成分を全て含んだ培養媒体成分を、８５〜９０℃の温度で浄化する、又は３％過酸化水素に溶解する。発酵温度は２５〜３０℃に保つ。ｐＨは、５．０〜５．５で始め、安定したら３．０〜３．５に下げる。バイオマスの生成が、約４８時間の発酵でなされる。
【０１５９】
ソホロリピドの堆積は、発酵の７〜９日後に生じる。発酵完了の際、バイオマスと、適用可能であれば、低濃度のソホロリピドを含む培養物を、例えば、養魚池又は魚を入れたタンクに適用することができる。
【０１６０】
Pseudozyma aphidisは、同条件下、同じリアクターで成長する。ただし、次の２つの例外がある。最良のｐＨは５．０〜５．５に保ち、バイオマス及びマンノシルエリスリトールリピド（ＭＥＬ）の生成は７〜１２日で行う。
【０１６１】
実施例２  魚の給餌と養魚場の処理のための組成物
処理と飼料生成物の両方を、グルコース、キャノーラ油、酵母エキス、ＮＨ４Ｃｌ、ＫＨ２ＰＯ４．Ｈ２Ｏ及びＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏを含む媒体を用いて得る。初期のｐＨは、ＫＯＨによって約５．５に調整する。培養物を安定化なしで、約２５℃で成長させる。
【０１６２】
Wickerhamomyces anomalus及びPseudozyma aphidisは別のタンクで培養する。発酵プロセス完了後、殺菌温度（酵母細胞を１００％不活性化するのに十分な時間、６５℃〜７０℃で）及び約１０．０〜１２．０までの増大するｐＨで、培養物を不活性化することにより組成物は調製される。これにより、細胞の部分加水分解がなされ、栄養成分をなくすことができる。次に、組成物を約６．５〜７．５のｐＨまで中和し、加水分解物の様々な成分を混合する。
【０１６３】
得られた微生物ベースの生成物は、魚飼料や水処理に用いることができる。
【０１６４】
実施例３  魚飼料
魚飼料の大部分又は全てを、本発明の組成物に置き換えることができる。一実施形態において、発酵バイオマス（例えば、W. anomalus、P. aphidis、S. bombicola及び／又はC. apicola）と、任意で、精製バイオサーファクタントを含む組成物を、１００〜１５０℃まで加熱した空気を用いて乾燥すると、魚飼料の顆粒が生成される。顆粒は、例えば、１：１、２：１又は１：２の比率で従来のフィッシュミールと混合することができる。顆粒を用いてまた、所望であれば、従来のフィッシュミールと全て置き換えることもできる。本発酵及びバイオサーファクタントベースの飼料組成物は、飼料が微生物病原体により汚染されたり、飼料を摂取した魚の後の潜在的な病気を防ぐ。組成物はまた、摂取した魚の栄養素の生物学的利用能も増大し得る。これによって、魚が全体的により健康となる。
【０１６５】
フィッシュミールの代わりに５０％の酵母単細胞タンパク質を含む飼料を用いると、体重増加のパーセンテージに関して、最良の成長応答を示す。全魚体の枝肉組成の近接検査によれば、５０％の酵母単細胞タンパク質を摂取した魚は、従来の飼料を摂取した魚に比べて、体のタンパク質のパーセンテージが高く、脂肪の量が少ないことが分かる。
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月13日(2020.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
不活性化バイオサーファクタント生成酵母及び／又は前記酵母からの１つ以上の成長副生成物を含む組成物であって、前記酵母は、Starmerella bombicola、Candida apicola、Pseudozyma aphidis、Wickerhamomyces anomalus、Pichia guilliermondii及びPichia occidentalisから選択される、養殖を改善する組成物。
【請求項２】
２つ以上の酵母菌株を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記２つ以上の酵母菌株のそれぞれは、個別に培養されてから組み合わされて、組成物を形成する、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
バイオサーファクタント成長副生成物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記酵母が培養された発酵ブロスをさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記１つ以上の成長副生成物は、前記発酵ブロスに存在する、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記バイオサーファクタントは、精製形態で前記組成物に添加される、請求項４に記載の組成物。
【請求項８】
前記バイオサーファクタントは、ホスホリピド、グリコリピド及びリポペプチドから選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項９】
前記グリコリピドは、ソホロリピド、マンノシルエリスリトールリピド、トレハロースリピド及びラムノリピドから選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記リポペプチドは、サーファクチン、イツリン及びフェンギシンから選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
不活性化バイオサーファクタント生成酵母及び／又は１つ以上の微生物成長副生成物を含む組成物を、水を含む養魚場に適用することを含む、養殖を改善する方法。
【請求項１２】
前記組成物は、請求項１に記載の組成物である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は、前記養魚場の水に適用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物は、壁及び／又は床を含む前記養魚場内の表面に適用される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記養魚場は、池、湖、海洋、フィヨルド、水路、川、水槽、タンク又はケージである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
魚が飼育される環境の質が改善される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
養魚場の粘泥及び／又は藻類が減じる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記養魚場の水中の硫化水素及び／又は二酸化炭素濃度を減じる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
池の下部の汚泥を減じる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
養魚場の病原体による感染を防ぐ、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
養殖水生動物の健康と質を改善する、請求項１１に記載の方法。
【請求項２２】
養殖水生動物のバクテリア、ウイルス、真菌又は寄生虫病による感染を防ぐ、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
水生動物の消化管における栄養の吸収を改善する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】
不活性バイオサーファクタント生成酵母及び／又は微生物成長副生成物を含む組成物を、養魚場に適用し、水生動物に前記組成物を摂取させることを含む、水生動物の給餌方法。
【請求項２５】
前記組成物は、乾燥粉末、ミール、ペレット、顆粒又はフレークの形態である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記方法を用いて、従来の給餌を補助する、請求項２４に記載の方法。
【国際調査報告】
2020517254.tif 000002
2020517254.tif 000003