(57)【要約】本開示は、ポリヌクレオチドライブラリーを構築するための方法および／またはポリヌクレオチドシークエンシングに関する。また、関連するキットおよびデバイスが、開示される。また、本開示は、例えば、ポリヌクレオチドシークエンシングによって、遺伝子解析およびゲノム解析を行うための組成物、キット、デバイスおよび方法に関する。特定の態様においては、シークエンシング中のライゲーション効率および変換率が改善したライブラリーを構築するための組成物、キットおよび方法が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態においては、本明細書中の組成物、キットおよび方法は、ポリヌクレオチド断片、例として、循環腫瘍ＤＮＡを含む、被験体の体内の循環ポリヌクレオチド断片を解析するのに有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法であって、
前記ライゲーションが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼによって触媒され；
各一本鎖ポリヌクレオチドが、５’末端でのライゲーションを防止するために前記５’末端でブロックされており；
各アダプターが、前記アダプターがライゲーションされる前記一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含み、３’末端でのライゲーションを防止するために前記３’末端でブロックされており；かつ
前記アダプターの５’末端が、前記ｓｓＤＮＡリガーゼによって前記一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成し、
それによって、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得る、
方法。
【請求項２】
前記ライゲーションステップ前に、試料から一本鎖ポリヌクレオチドの前記ライブラリーを得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記得るステップが、前記試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させることを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、生物学的試料であり、必要に応じて、（１）前記生物学的試料が、いかなる処理も行わずに被験体から直接得られるか；（２）前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、亜硫酸水素塩変換に供されていないか；または（３）前記生物学的試料中のポリヌクレオチドが、部分的なもしくは完全な亜硫酸水素塩変換に供されている、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記生物学的試料が、疾患または状態、例として、がんまたは新生物を有するか、またはそれを有する疑いのある被験体からのものである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生物学的試料が、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む試料、例として、血液、血清、血漿もしくは体液試料またはそれらの任意の組み合わせである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記一本鎖ポリヌクレオチドが、約２０〜約４００核酸残基の長さである、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ｓｓＤＮＡリガーゼが、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））、古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、切断型Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼである、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
各一本鎖ポリヌクレオチドの前記ブロックが、その５’末端でのライゲーションを防止するための脱リン酸化を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
各アダプターの前記ブロックが、その３’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび／またはヘキサエチレングリコールを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
各アダプターが、前記５’末端において、前記ＵＭＩ配列に対して５’側であるジヌクレオチド配列、例として、ＧＡ（５’〜３’）、ＧＧ（５’〜３’）、ＡＡ（５’〜３’）またはＡＧ（５’〜３’）を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
各アダプター中の前記ＵＭＩ配列が、約６〜約１５核酸残基の長さであり、例えば、前記ＵＭＩ配列が、１２ｍｅｒである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ライゲーション反応が、密集剤の存在下で行われる、請求項１から１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記密集剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例として、ＰＥＧ４０００もしくはＰＥＧ６０００、デキストランおよび／またはフィコールを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
直鎖状一本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーに変換することをさらに含む、請求項１から１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記変換が、各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ／または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは１組のプライマーを使用する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを増幅および／または精製することをさらに含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記精製が、約５０ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを選択的に精製し、前記精製が、必要に応じて、ビーズベースまたはカラムベースであり、前記精製が、一方が前記直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体（例として、ビーズ）に結合する特定の結合対（例として、ビオチン／ストレプトアビジン）を使用することを含まない、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ／または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、１組のプライマー；および
標的配列（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子配列）にハイブリダイズ可能なプライマーであって、必要に応じて、配列番号４〜１５２９からなる群より選択される配列もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマー
を使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記ライブラリーを増幅し、
それによって、前記標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ること
をさらに含む、請求項１５から１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
各々が前記標的配列に特異的な配列を含む、複数のプライマーが、使用され、前記プライマーが、同じまたは異なる標的配列を有し、必要に応じて、前記複数のプライマーが、配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標的配列の前記配列情報が、変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、コピー数多型（ＣＮＶ）またはエピジェネティック変化を含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記変異が、点変異、挿入、欠失、インデル、逆位、トランケーション、融合、転座、増幅またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記増幅したライブラリーが、全ゲノムライブラリーではない、請求項１９から２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の前記増幅したライブラリーを精製することをさらに含む、請求項１９から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記精製が、ビーズベースであり、約１５０ヌクレオチドを超える長さのポリヌクレオチドを選択的に精製し、前記精製が、一方が前記直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体（例として、ビーズ）に結合する特定の結合対（例として、ビオチン／ストレプトアビジン）を使用することを含まない、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅し、精製したライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記シークエンシングステップが、シークエンシングアダプターおよび／または試料特異的バーコードを各直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記結合ステップが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して行われる、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記シークエンシングの変換率（シークエンシングリードを生ずる、前記ライブラリーにおける一本鎖ポリヌクレオチドの割合）が、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
被験体における疾患もしくは状態の診断および／または予後、被験体の処置に対する応答性を予測すること、前記疾患／状態もしくは処置についての薬理遺伝学マーカーを同定すること、ならびに／または遺伝情報について集団をスクリーニングすることのために使用される、請求項２６から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患または状態が、がんまたは新生物であり、前記処置が、がんまたは新生物処置である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１から１４のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリー。
【請求項３３】
請求項１５から１８のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリー。
【請求項３４】
請求項１９から２５のいずれかに記載の方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリー。
【請求項３５】
請求項２６から３１のいずれかに記載の方法によって生成されたシークエンシングライブラリー。
【請求項３６】
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼ；
複数のアダプターであって、各アダプターが、３’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、前記アダプターの５’末端が、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能であり、各アダプターが、前記一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む、複数のアダプター
を含む、ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキット。
【請求項３７】
試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させて前記一本鎖ポリヌクレオチドを得るための変性試薬をさらに含む、請求項３６に記載のキット。
【請求項３８】
前記ｓｓＤＮＡリガーゼが、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））、古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、切断型Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼである、請求項３６または３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記一本鎖ポリヌクレオチドの５’ホスフェート基を除去するための脱リン酸化試薬をさらに含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
各アダプターが、その３’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび／またはヘキサエチレングリコールを含む、請求項３６から３９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４１】
各アダプターが、その５’末端において、ジヌクレオチド配列、例として、ＧＡ（５’〜３’）、ＧＧ（５’〜３’）、ＡＡ（５’〜３’）またはＡＧ（５’〜３’）を含む、請求項３６から４０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４２】
各アダプター中の前記ＵＭＩ配列が、約６〜約１５核酸残基の長さであり、例えば、前記ＵＭＩ配列が、１２ｍｅｒである、請求項３６から４１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４３】
ライゲーション反応のための密集剤をさらに含む、請求項３６から４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４４】
前記密集剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例として、ＰＥＧ４０００もしくはＰＥＧ６０００、デキストランおよび／またはフィコールを含む、請求項１３に記載のキット。
【請求項４５】
前記一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに変換するための、各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ／または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは１組のプライマーをさらに含む、請求項３６から４４のいずれかに記載のキット。
【請求項４６】
プライマーダイマーを除去するための試薬をさらに含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
標的配列の配列情報を含む増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物を得るための、前記標的配列（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子配列）に特異的な配列を含むプライマーであって、必要に応じて、配列番号４〜１５２９からなる群より選択される配列もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマーをさらに含む、請求項４５または４６に記載のキット。
【請求項４８】
複数のプライマーを含み、各々が前記標的配列に特異的な配列を含み、前記プライマーが、同じまたは異なる標的配列を有し、必要に応じて、前記複数のプライマーが、配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数もしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物をシークエンシングするための、シークエンシングアダプターおよび／または試料特異的バーコードをさらに含む、請求項４７または４８に記載のキット。
【請求項５０】
各構成成分のための別々のバイアルおよび／または前記構成成分を使用するための指示をさらに含む、請求項３６から４９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５１】
被験体から循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む試料を得るための指示および／または前記試料、例として、血液、血清、血漿もしくは体液試料もしくはそれらの任意の組み合わせから一本鎖ポリヌクレオチドを得るための指示をさらに含む、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号１）またはその一部、例えば、約１８〜２２個のヌクレオチド残基を含む一部を含むポリヌクレオチド。
【請求項５３】
Ｎ１〜Ｎｉが、任意の核酸残基、例えば、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ｉが、約４〜約２５の整数である、Ｎ１．．．ＮｉＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧまたはその一部を含む、請求項５２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５４】
Ｎが、任意の核酸残基、例えば、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである、ＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号２）またはその一部、例えば、約３２〜３６個のヌクレオチド残基を含む一部を含む、請求項５２または５３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５５】
ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（配列番号３）またはその一部、例えば、約１２〜２０個のヌクレオチド残基を含む一部を含むポリヌクレオチド。
【請求項５６】
配列番号４〜１５２９からなる群より選択される任意の１つもしくは複数の配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマー。
【請求項５７】
配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、配列番号４〜１５２９のうちの約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマー組。
【請求項５８】
配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、配列番号４〜１５２９のうちの約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲、および
ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（配列番号３）またはその一部を含むプライマー
を含むプライマー組。
【請求項５９】
配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、配列番号４〜１５２９のうちの約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０もしくは３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列もしくはその数値範囲もしくは部分範囲、
ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（配列番号３）もしくはその一部を含むプライマー、および／または
ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号１）もしくはその一部を含むポリヌクレオチド
を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１７年４月１９日に出願された米国仮出願第６２／４８７，４２３号、および２０１８年４月１３日に出願された米国仮出願第６２／６５７，５４４号（両出願の内容は、全ての目的のためにそれらの全体が参考として本明細書に援用される）に対する優先権の利益を主張する。一部の態様では、本開示は、２０１７年４月１９日に出願された米国仮出願第６２／４８７，４２２号（この内容は、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される）に関する。
【０００２】
本開示は、例えば、ポリヌクレオチドシークエンシングによって、遺伝子解析およびゲノム解析を行うための組成物、キット、デバイスおよび方法に関する。特定の態様においては、シークエンシング中のライゲーション効率および変換率が改善したライブラリーを構築するための組成物、キットおよび方法が、本明細書で提供される。ある特定の実施形態においては、本明細書中の組成物、キットおよび方法は、ポリヌクレオチド断片、例として、循環腫瘍ＤＮＡを含む、被験体の体内の循環ポリヌクレオチド断片を解析するのに有用である。
【背景技術】
【０００３】
以下の説明において、ある特定の物品および方法が、背景および導入の目的のために説明されている。本明細書中に含有されるいずれのものも、先行技術の「承認」として解釈されるべきではない。出願人は、該当する場合、適用される法律規定の下に本明細書で参照される物品および方法が先行技術を構成しないことを示す権利を明確に保持している。
【０００４】
ここ数年にわたるライブラリー構築におけるいくつかの改善にもかかわらず、次世代シークエンシングのためのライブラリー構築プロセスは、非効率的なままであり、そのため多くの元の分子が様々なステップ中に失われる。二本鎖ライゲーション効率は低いままであり、適切にライゲーションされるのは分子の約２０〜３０％である。加えて、多くの分子は、精製およびハイブリダイゼーション捕捉ステップ中に失われ、そのため、最終的な変換率は、およそ１０〜２０％である。低対立遺伝子率バリアント、例えば、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）において見られるバリアントを調べる場合、感度は低いままである。低対立遺伝子率を含むライブラリーを検査する場合、低効率が感度の喪失をもたらすので、このことは、低対立遺伝子率変異体をコールする場合、精度を制限することとなる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
当技術分野の上記の問題を克服するための解析技術の改善が要求されている。本開示は、この、および他の関連する要求に取り組む。
【０００６】
本概要は、特許請求の範囲の主題の範囲を限定するために使用されるとは意図されない。特許請求の範囲の主題の他の特色、詳細、利用性および利点は、付属の図面において、および付属の特許請求の範囲において開示される態様を含む、詳細な説明から明らかである。
【０００７】
一実施形態においては、１組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法が本明細書に提供される。一態様においては、ライゲーションは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼによって触媒される。別の態様においては、各一本鎖ポリヌクレオチドは、５’末端でのライゲーションを防止するために５’末端でブロックされている。なお別の態様においては、各アダプターは、アダプターがライゲーションされる一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む。一つの別の態様においては、各アダプターは、３’末端でのライゲーションを防止するために３’末端でブロックされている。一態様においては、アダプターの５’末端は、ｓｓＤＮＡリガーゼによって前記一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成している。前述の実施形態のいずれかにおいて、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーが得られ得る。
【０００８】
別の実施形態においては、１組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法が提供され、この方法においては、ライゲーションが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼによって触媒され、各一本鎖ポリヌクレオチドが、５’末端でのライゲーションを防止するために５’末端でブロックされており、各アダプターが、そのアダプターがライゲーションされる一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含み、各アダプターが、３’末端でのライゲーションを防止するために３’末端でブロックされており、アダプターの５’末端が、ｓｓＤＮＡリガーゼによって一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成し、それによって、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得る。
【０００９】
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、ライゲーションステップ前に、試料から一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーを得るステップをさらに含み得る。一態様においては、得るステップは、試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させることを含む。
【００１０】
前述の実施形態のいずれかにおいては、試料は、生物学的試料であり得る。いくつかの実施形態においては、生物学的試料は、いかなる処理も行わずに被験体から直接得られる。いくつかの実施形態においては、生物学的試料中のポリヌクレオチドは、亜硫酸水素塩変換に供されていない。いくつかの実施形態においては、生物学的試料中のポリヌクレオチドは、部分的なもしくは完全な亜硫酸水素塩変換に供されている。ある特定の態様においては、生物学的試料は、疾患または状態、例として、がんまたは新生物を有するか、またはそれを有する疑いのある被験体からのものである。
【００１１】
前述の実施形態のいずれかにおいては、一本鎖ポリヌクレオチドは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む試料、例として、血液、血清、血漿もしくは体液試料またはそれらの任意の組み合わせからのものであり得る。
【００１２】
前述の実施形態のいずれかにおいては、一本鎖ポリヌクレオチドは、約２０〜約４００核酸残基の長さ、例えば、約８０、約１００、約１２０、約１４０、約１６０、約１８０、約２００、約２２０または約２４０核酸残基の長さであり得る。
【００１３】
前述の実施形態のいずれかにおいては、ｓｓＤＮＡリガーゼは、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））または古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１であり得る。他の態様においては、ｓｓＤＮＡリガーゼは、ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２０４Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２３９Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２４２Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱ、例えば、Ｍ０３７３ＳまたはＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０３５１Ｓである。前述の実施形態のいずれかにおいては、また、キットは、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０３１９ＳまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２０２Ｓを含み得る。
【００１４】
前述の実施形態のいずれかにおいては、各一本鎖ポリヌクレオチドのブロックは、その５’末端でのライゲーションを防止するための脱リン酸化を含み得る。
【００１５】
前述の実施形態のいずれかにおいては、各アダプターのブロックは、その３’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび／またはヘキサエチレングリコールを含み得る。
【００１６】
前述の実施形態のいずれかにおいては、各アダプターは、５’末端において、ＵＭＩ配列に対して５’側であるジヌクレオチド配列、例として、ＧＡ（５’〜３’）、ＧＧ（５’〜３’）、ＡＡ（５’〜３’）またはＡＧ（５’〜３’）を含み得る。
【００１７】
前述の実施形態のいずれかにおいては、各アダプター中のＵＭＩ配列は、約６〜約１５核酸残基の長さであり、例えば、前記ＵＭＩ配列が、１２ｍｅｒであり得る。
【００１８】
前述の実施形態のいずれかにおいては、ライゲーション反応は、密集剤の存在下で行われ得る。一態様においては、密集剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例として、ＰＥＧ４０００もしくはＰＥＧ６０００、デキストランおよび／またはフィコールを含む。
【００１９】
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーに変換することをさらに含み得る。一態様においては、変換は、各々が、アダプターに逆相補的であり、かつ／またはアダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは１組のプライマーを使用する。
【００２０】
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを増幅および／または精製することをさらに含み得る。一態様においては、精製は、ビーズベースである。別の態様においては、精製は、サイズ選択に基づき、例えば、精製ステップは、約５０ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを選択的に精製し、例えば、約４０ヌクレオチドの長さのアダプター（ならびに約４０ｂｐのプライマーダイマーおよび／またはプライマー−アダプター二本鎖）は除去される。別の態様においては、精製は、一方が直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体（例として、ビーズ）に結合する特定の結合対（例として、ビオチン／ストレプトアビジン）を使用することを含まない。一態様においては、精製は、例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ精製カラム、例として、ＺｙｍｏまたはＱｉａｇｅｎからのカラムを使用することによる、カラムベースである。
【００２１】
前述の実施形態のいずれかにおいては、本明細書の方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを増幅して、標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ることをさらに含み得る。一態様においては、方法は、各々が、アダプターに逆相補的であり、かつ／またはアダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは１組のプライマーを使用することを含む。別の態様においては、方法は、標的配列（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子配列）にハイブリダイズ可能なプライマーを使用することをさらに含む。
【００２２】
前述の実施形態のいずれかにおいては、本明細書の方法は、各々が、アダプターに逆相補的であり、かつ／またはアダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは１組のプライマー、標的配列（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子配列）にハイブリダイズ可能なプライマーを使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを増幅し、それによって、標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ることを含み得る。
【００２３】
前述の実施形態のいずれかにおいては、標的特異的プライマーは、配列番号４〜１５２９からなる群より選択される任意の１つもしくは複数の配列またはその相補的もしくは実質的に相補的な配列を含み得る。
【００２４】
前述の実施形態のいずれかにおいては、各々が標的配列に特異的な配列を含む、複数のプライマーを使用してもよく、プライマーは、同じまたは異なる標的配列を有する。一態様においては、複数のプライマーは、配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含む。
【００２５】
前述の実施形態のいずれかにおいては、標的配列の配列情報は、変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、コピー数多型（ＣＮＶ）またはエピジェネティック変化を含み得る。一態様においては、変異は、点変異、挿入、欠失、逆位、トランケーション、融合、増幅またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００２６】
前述の実施形態のいずれかにおいては、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーは、全ゲノムライブラリー以外のライブラリー、例えば、半標的化（ｓｅｍｉ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）ゲノムライブラリーであり得る。
【００２７】
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを精製することをさらに含み得る。一態様においては、精製は、ビーズベースである。別の態様においては、精製は、サイズ選択に基づき、例えば、精製ステップは、約１５０ヌクレオチドを超える長さのポリヌクレオチドを選択的に精製する。別の態様においては、精製は、一方が直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体（例として、ビーズ）に結合する特定の結合対（例として、ビオチン／ストレプトアビジン）を使用することを含まない。一態様においては、精製は、例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ精製カラム、例として、ＺｙｍｏまたはＱｉａｇｅｎからのカラムを使用することによる、カラムベースである。
【００２８】
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅し、精製したライブラリーをシークエンシングすることをさらに含み得る。一態様においては、シークエンシングステップは、シークエンシングアダプターおよび／または試料特異的バーコードを各直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合することを含む。特定の一態様においては、結合ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して行われる。
【００２９】
前述の実施形態のいずれかにおいては、シークエンシングの変換率（シークエンシングリードを生ずる、ライブラリーにおける一本鎖ポリヌクレオチドの割合）は、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％または少なくとも約９０％であり得る。
【００３０】
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、被験体における疾患もしくは状態の診断および／または予後、被験体の処置に対する応答性を予測すること、疾患／状態もしくは処置についての薬理遺伝学マーカーを同定すること、ならびに／または遺伝情報について集団をスクリーニングすることのために使用され得る。一態様においては、疾患または状態は、がんまたは新生物であり、処置は、がんまたは新生物処置である。
【００３１】
別の態様においては、前述の実施形態のいずれかによる方法によって生成された直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーが本明細書に開示される。
【００３２】
なお別の態様においては、前述の実施形態のいずれかによる方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーが本明細書に開示される。
【００３３】
さらに別の態様においては、前述の実施形態のいずれかによる方法によって生成された直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーが本明細書に開示される。
【００３４】
別の一態様においては、前述の実施形態のいずれかによる方法によって生成されたシークエンシングライブラリーが本明細書に開示される。
【００３５】
別の態様において本明細書に開示されるのは、ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキットである。別の態様においては、キットは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを含む。別の態様においては、キットは、複数のアダプターを含む。特定の態様においては、各アダプターは、３’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、アダプターの５’末端は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能である。さらに特定の態様においては、各アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む。
【００３６】
前述の実施形態のいずれかにおいては、ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキットは、ｓｓＤＮＡリガーゼおよび複数のアダプターを含んでもよく、各アダプターは、３’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、アダプターの５’末端は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能であり、各アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるＵＭＩ配列を含む。
【００３７】
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させて一本鎖ポリヌクレオチドを得るための変性試薬をさらに含み得る。
【００３８】
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））または古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１を含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２０４Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２３９Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２４２Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱ、例えば、Ｍ０３７３ＳまたはＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０３５１Ｓを含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいては、また、キットは、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０３１９ＳまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２０２Ｓを含み得る。
【００３９】
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、一本鎖ポリヌクレオチドの５’ホスフェート基を除去するための脱リン酸化試薬をさらに含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいては、各アダプターのブロックは、その３’末端でのライゲーションを防止するための、炭素スペーサー、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ヘキサンジオール、トリエチレングリコールおよび／またはヘキサエチレングリコールを含み得る。キットの実施形態のいずれかにおいては、各アダプターは、その５’末端において、ジヌクレオチド配列、例として、ＧＡ（５’〜３’）、ＧＧ（５’〜３’）、ＡＡ（５’〜３’）またはＡＧ（５’〜３’）を含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいては、各アダプター中のＵＭＩ配列は、約６〜約１５核酸残基の長さであり、例えば、前記ＵＭＩ配列が、１２ｍｅｒであり得る。
【００４０】
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、ライゲーション反応のための密集剤をさらに含み得る。一態様においては、密集剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例として、ＰＥＧ４０００もしくはＰＥＧ６０００、デキストランおよび／またはフィコールを含む。
【００４１】
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに変換するための、各々が、前記アダプターに逆相補的であり、かつ／または前記アダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは１組のプライマーをさらに含み得る。
【００４２】
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、プライマーダイマーおよび／またはプライマー−アダプター二本鎖を除去するための試薬をさらに含み得る。
【００４３】
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、標的配列の配列情報を含む増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物を得るための、標的配列（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子配列）に特異的な配列を含むプライマーをさらに含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいては、標的特異的プライマーは、配列番号４〜１５２９からなる群より選択される任意の１つもしくは複数の配列またはその相補的もしくは実質的に相補的な配列を含み得る。
【００４４】
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、各々が標的配列に特異的な配列を含む、複数のプライマーを含んでもよく、プライマーは、同じまたは異なる標的配列を有する。一態様においては、複数のプライマーは、配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含む。
【００４５】
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物をシークエンシングするための、シークエンシングアダプターおよび／または試料特異的バーコードをさらに含み得る。
【００４６】
前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、各構成成分のための別々のバイアルおよび／または構成成分を使用するための指示をさらに含み得る。一態様においては、指示は、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）を含む試料、例として、血液、血清、血漿もしくは体液試料またはそれらの任意の組み合わせから一本鎖ポリヌクレオチドを得ることを含む。
【００４７】
ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号１）またはその一部、例えば、約１８〜２２個のヌクレオチド残基を含む一部を含むポリヌクレオチドも本明細書に開示される。
【００４８】
一態様においては、Ｎ１〜Ｎｉが、任意の核酸残基、例えば、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧであり、ｉが、約４〜約２５の整数である、Ｎ１．．．ＮｉＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧまたはその一部を含む、ポリヌクレオチドが本明細書に開示される。
【００４９】
別の態様においては、Ｎが、任意の核酸残基、例えば、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧである、ＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号２）またはその一部、例えば、約３２〜３６個のヌクレオチド残基を含む一部を含む、ポリヌクレオチドが本明細書に開示される。
【００５０】
一態様においては、ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（配列番号３）またはその一部、例えば、約１２〜２０個のヌクレオチド残基を含む一部を含むポリヌクレオチドが本明細書に開示される。
【００５１】
他の一態様においては、配列番号４〜１５２９からなる群より選択される任意の１つもしくは複数の配列を含むプライマーが本明細書に開示される。一態様においては、配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲を含むプライマー組が本明細書に開示される。一態様においては、配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列またはその数値範囲もしくは部分範囲、および  ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（配列番号３）またはその一部を含むプライマーを含むプライマー組が本明細書に開示される。一態様においては、配列番号４〜１５２９のうちの任意の１つもしくは複数、例えば、約１０、２０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００もしくは１５２９個すべてもしくはその相補的もしくは実質的に相補的な配列もしくはその数値範囲もしくは部分範囲、ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（配列番号３）もしくはその一部を含むプライマー、および／またはＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号１）もしくはその一部を含むポリヌクレオチドを含むキットが本明細書に開示される。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、本開示の一態様による、一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーを構築し、ライブラリーを使用してシークエンシング解析を行うためのステップを示す。
【００５３】
【図２】図２は、本開示の一態様による、シークエンシングのための標的分子を含む構築物を示す。
【００５４】
【図３】図３は、本明細書で開示する方法を使用して予測された対立遺伝子率と観察された対立遺伝子率との線形相関を示し、本方法が優れた再現性を有することを示す。
【００５５】
【図４】図４は、本明細書で開示する方法を使用した、エラー補正前後の複数のバリアントについての対立遺伝子率を比較する。
【００５６】
【図５】図５は、本明細書で開示する方法とライブラリー構築およびシークエンシングのための従来型ハイブリダイゼーション捕捉法との性能パラメータを比較する。
【００５７】
【図６】図６は、本明細書で開示する方法（ＴｉｔａｎＳｅｑ）と従来型ハイブリダイゼーション捕捉法との変換率を比較する。
【００５８】
【図７−１】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−２】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−３】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−４】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−５】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−６】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−７】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−８】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−９】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−１０】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−１１】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−１２】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−１３】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−１４】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−１５】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−１６】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−１７】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−１８】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−１９】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−２０】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−２１】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−２２】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−２３】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−２４】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−２５】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−２６】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−２７】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−２８】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−２９】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−３０】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−３１】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−３２】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−３３】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−３４】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−３５】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−３６】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−３７】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−３８】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−３９】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−４０】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−４１】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−４２】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−４３】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−４４】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−４５】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−４６】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−４７】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−４８】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−４９】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−５０】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−５１】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−５２】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−５３】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−５４】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−５５】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−５６】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−５７】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−５８】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−５９】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−６０】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−６１】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−６２】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−６３】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−６４】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【図７−６５】図７は、追加の例示的なプライマーまたはプライマープールを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本開示の完全な理解を提供するために、以下の説明において多くの特定の詳細が示されている。これらの詳細は、例の目的のために提供され、特許請求の範囲の主題は、これらの特定の詳細の一部またはすべてを伴わず、特許請求の範囲によって実施され得る。特許請求の範囲の主題の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を使用してもよく、構造的変化を行ってもよいことが理解されるべきである。個々の実施形態のうちの１つまたは複数において説明されている様々な特色および機能性は、それらが説明されている特定の実施形態へのそれらの適用可能性において限定されないことを理解すべきである。その代わりに、それらは、そのような実施形態が説明されているかどうかにかかわらず、およびそのような特色が説明されている実施形態の一部であると示されているかどうかにかかわらず、単独で、または組み合わせで、本開示の他の実施形態のうちの１つまたは複数に適用することができる。明確にするために、特許請求の範囲の主題が不必要に不明確にならないように、特許請求の範囲の主題に関連する技術分野において公知の技術材料については詳細に説明していない。
【００６０】
この出願において参照される特許文献、科学論文およびデータベースを含むすべての刊行物は、各個々の刊行物が参照により個々に組み込まれているのと同様にすべての目的についてその全体が参照により組み込まれている。刊行物または文献の引用は、それらのいずれかが関係先行技術であるという承認とは意図されず、それが、これらの刊行物または文献の内容または日付についてのいかなる承認を構成することもない。
【００６１】
すべての見出しは、読み手の便利のためであり、指定されない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用されるべきではない。
【００６２】
提供される実施形態の実施は、別に示されない限り、当技術分野において実施する当業者の技術の範囲内である有機化学、ポリマー技術、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学およびシークエンシング技術の従来技術および説明を用いる。そのような従来技術として、ポリペプチドおよびタンパク質合成および修飾、ポリヌクレオチド合成および修飾、ポリマーアレイ合成、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーションおよびライゲーション、ハイブリダイゼーションの検出ならびにヌクレオチドシークエンシングが挙げられる。好適な技術の特定の例示は、本明細書の実施例を参照して行われ得る。しかしながら、他の同等の従来手順もまた、もちろん、使用することができる。そのような従来技術および説明は、標準の試験室マニュアル、例として、それらのすべてをすべての目的について参照によりそれらを全体として本明細書に組み込む、Ｇｒｅｅｎら編、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ（Ｉ〜ＩＶ巻）（１９９９年）；Ｗｅｉｎｅｒ、Ｇａｂｒｉｅｌ、Ｓｔｅｐｈｅｎｓ編、Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｖａｒｉａｔｉｏｎ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００７年）；Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ、Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００３年）；ＢｏｗｔｅｌｌおよびＳａｍｂｒｏｏｋ、ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ：  Ａ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｍａｎｕａｌ（２００３年）；Ｍｏｕｎｔ、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（２００４年）；ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００６年）；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２００２年）（すべてＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓから）；Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７年）；Ｔ．  Ｂｒｏｗｎ編、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９１年）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇｏｅｄｄｅｌ編、Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１年）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａ．  Ｂｏｔｈｗｅｌｌら編、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｇｅｎｅｓ（１９９０年）、Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌ．；Ｍ．  Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（１９９０年）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ；Ｒ．  Ｗｕら編、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ（１９８９年）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｍ．  ＭｃＰｈｅｒｓｏｎら、ＰＣＲ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９１年）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓｔｒｙｅｒ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第４版）（１９９５年）、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．；Ｇａｉｔ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（２００２年）、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ；ＮｅｌｓｏｎおよびＣｏｘ、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２０００年）第３版、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．；Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２００２年）第５版、Ｗ．  Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  Ｐｕｂ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．において見ることができる。
【００６３】
Ａ．  定義
別に定めない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。この節において示されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている特許、出願、公開出願および他の刊行物において示されている定義に反するか、または別の点で矛盾する場合、この節において示されている定義が、参照により本明細書に組み込まれている定義に優先する。
【００６４】
本明細書で使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つまたは複数」を意味する。本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別のように指定しない限り、複数の参照物を含む。
【００６５】
この開示全体を通して、特許請求の範囲の主題の様々な態様が、範囲形式で示される。範囲形式での説明は、単に便利および簡潔にするためであり、特許請求の範囲の主題の範囲に対する融通の利かない限定として解釈されるべきではないことを理解するべきである。したがって、範囲の説明は、具体的に開示されるすべての可能な部分範囲およびその範囲内の個々の数値を有すると考えられるべきである。例えば、値の範囲が示される場合、その範囲の上限と下限との間の各間の値、および任意の他の示される値またはその示される範囲内の間の値は、特許請求の範囲の主題に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は独立して、より小さい範囲内に含まれてもよく、これらもまた、示される範囲内の任意の具体的に除外される限界を条件として、特許請求の範囲の主題に包含される。示される範囲が、限界のうちの１つまたは両方を含む場合、それらの含まれる限界のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、特許請求の範囲の主題に含まれる。このことは、範囲の広さにかかわらず、適用される。
【００６６】
「約」について、本明細書中の値またはパラメータは、その値またはパラメータそれ自体を対象とする変形を含む（かつ説明する）。例えば、「約Ｘ」について言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。加えて、数の任意の連なりに先行する「約」の使用は、その連なりにおいて列挙される数のうちの「約」各数を含む。例えば、「約Ｘ、ＹまたはＺ」について言及する説明は、「約Ｘ、約Ｙまたは約Ｚ」を説明すると意図される。
【００６７】
「平均」という用語は、本明細書で使用されるとき、文脈が明確に別のように示さない限り、平均値もしくは中央値、または平均値もしくは中央値に近似するために使用される任意の値のいずれかを指す。
【００６８】
「被験体」とは、本明細書で使用されるとき、提供される組成物、方法、キット、デバイスおよび系が投与または適用され得る生物または生物の一部もしくは構成成分を指す。例えば、被験体は、哺乳動物または哺乳動物の細胞、組織、器官もしくは一部であり得る。本明細書で使用されるとき、「哺乳動物」とは、哺乳動物クラスの種のいずれか、好ましくはヒト（ヒト、ヒト被験体またはヒト患者を含む）を指す。哺乳動物として、家畜、狩猟用動物、ペット、霊長類、ウマ、イヌ、ネコならびにげっ歯類、例として、マウスおよびラットが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、「試料」という用語は、生物学的試料を含む、解析が所望される標的分子を含有し得るいかなるものも指す。本明細書で使用されるとき、「生物学的試料」とは、生きている供給源もしくはウイルス（またはプリオン）供給源、または高分子および生体分子の他の供給源から得た任意の試料を指してもよく、核酸、タンパク質および／または他の高分子を得ることができる被験体の任意の細胞型または組織を含む。生物学的試料は、生物学的供給源から直接得た試料または加工された試料であり得る。例えば、単離され、増幅された核酸は、生物学的試料を構成する。生物学的試料として、体液、例として、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、汗、精液、便、痰、涙、粘液、羊水その他、滲出液、骨髄試料、腹水、骨盤洗浄液（ｐｅｌｖｉｃ  ｗａｓｈ  ｆｌｕｉｄ）、胸水、髄液、リンパ液、眼液（ｏｃｕｌａｒ  ｆｌｕｉｄ）、鼻抽出物、咽頭もしくは生殖器スワブ、消化した組織からの細胞懸濁物、または糞便物質抽出物、ならびに動物および植物からの組織および器官試料およびそれに由来する加工試料が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７０】
「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指し、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドおよびそのアナログまたは混合物を含む。この用語は、三本鎖、二本鎖および一本鎖デオキシリボ核酸（「ＤＮＡ」）ならびに三本鎖、二本鎖および一本鎖リボ核酸（「ＲＮＡ」）を含む。また、それは、ポリヌクレオチドの、例えば、アルキル化によって、および／またはキャッピングによって修飾した形態、ならびに非修飾形態を含む。より特に、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、スプライシングされているか、スプライシングされていないかにかかわらずｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｈＲＮＡおよびｍＲＮＡを含むポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）、プリンまたはピリミジン塩基のＮ−またはＣ−グリコシドである任意の他の種類のポリヌクレオチド、および非ヌクレオチド骨格を含有する他のポリマー、例えば、ポリアミド（例えば、ペプチド核酸（「ＰＮＡ」））およびポリモルホリノ（Ａｎｔｉ−Ｖｉｒａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ、ＯＲからＮｅｕｇｅｎｅとして市販されている）ポリマー、ならびにポリマーがＤＮＡおよびＲＮＡにおいて見られるような塩基対形成および塩基スタッキングを可能にする構成で核酸塩基を含有するならば他の合成配列特異的核酸ポリマーを含む。したがって、これらの用語は、例えば、３’−デオキシ−２’，５’−ＤＮＡ、オリゴデオキシリボヌクレオチドＮ３’〜Ｐ５’ホスホルアミデート、２’−Ｏ−アルキル−置換ＲＮＡ、ＤＮＡとＲＮＡとのハイブリッドまたはＰＮＡとＤＮＡもしくはＲＮＡとのハイブリッドを含み、また、公知の種類の修飾、例えば、標識、アルキル化、「キャップ」、ヌクレオチドのうちの１つまたは複数のアナログによる置換、ヌクレオチド間修飾、例として、例えば、非荷電連結を有するもの（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホルアミデート、カルバメートなど）、負荷電連結を有するもの（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）および正荷電連結を有するもの（例えば、アミノアルキルホスホルアミデート、アミノアルキルホスホトリエステル）、ペンダント部分、例として、例えば、タンパク質（酵素（例えば、ヌクレアーゼ）、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジンなどを含む）を含有するもの、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を有するもの、（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属などの）キレートを含有するもの、アルキレーターを含有するもの、修飾連結を有するもの（例えば、アルファ芳香族核酸など）ならびにポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの非修飾形態を含む。核酸は一般的に、ホスホジエステル結合を含有するが、一部の場合、代替の骨格、例として、ホスホルアミダイト、ホスホロジチオエートもしくはメチルホスホルアミダイト（ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｐｈｏｒｏａｍｉｄｉｔｅ）連結、またはペプチド核酸骨格および連結を有する核酸アナログが含まれ得る。他のアナログ核酸として、ロックド核酸を含む二環式構造、正電骨格（ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）、非イオン性骨格および非リボース骨格を有するアナログ核酸が挙げられる。リボース−ホスフェート骨格の修飾は、分子の安定性を増大させるために行われ得る；例えば、ＰＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、一部の環境においてより高い安定性を示し得る。「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」という用語は、任意の好適な長さ、例として、少なくとも５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、１，０００またはそれよりも多いヌクレオチドを含み得る。
【００７１】
本明細書で使用されるとき、「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、公知のプリンおよびピリミジン塩基のみでなく、また、修飾されている他のヘテロ環式塩基を含有する部分を含むことが理解される。そのような修飾として、メチル化プリンもしくはピリミジン、アシル化プリンもしくはピリミジンまたは他のヘテロ環が挙げられる。また、修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドは、糖部分についての修飾を含んでもよく、例えば、ヒドロキシル基のうちの１つまたは複数は、ハロゲン、脂肪族基で置換されるか、またはエーテル、アミンその他として官能化される。「ヌクレオチド単位」という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドを包含すると意図される。
【００７２】
「相補的」および「実質的に相補的」という用語は、ヌクレオチドまたは核酸間、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子の２鎖間またはオリゴヌクレオチドプライマーと一本鎖核酸上のプライマー結合部位との間の、ハイブリダイゼーションまたは塩基対形成または二本鎖形成を含む。相補的ヌクレオチドは一般的に、ＡおよびＴ（またはＡおよびＵ）またはＣおよびＧである。２つの一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡ分子は、１つの鎖のヌクレオチドが、最適にアラインメントおよび比較され、適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って、他の鎖の少なくとも約８０％、通常少なくとも約９０％〜約９５％、さらに約９８％〜約１００％と対形成する場合、実質的に相補的と言われる。一態様においては、２つの相補的ヌクレオチド配列は、相対するヌクレオチド間で好ましくは２５％未満の、より好ましくは１５％未満の、さらにより好ましくは５％未満のミスマッチ、最も好ましくはミスマッチなしでハイブリダイズすることができる。好ましくは、２つの分子は、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。
【００７３】
参照配列について、本明細書で使用されるとき、逆相補配列は、逆の順序の参照配列の相補配列である。例えば、５’−ＡＴＣＧ−３’について、相補配列は、３’−ＴＡＧＣ−５’であり、逆相補配列は、５’−ＣＧＡＴ−３’である。
【００７４】
「ハイブリダイゼーション」は、本明細書で使用されるとき、２つの一本鎖ポリヌクレオチドが非共有結合して、安定な二本鎖ポリヌクレオチドを形成するプロセスを指し得る。一態様においては、得られる二本鎖ポリヌクレオチドは、「ハイブリッド」または「二本鎖」であり得る。「ハイブリダイゼーション条件」は典型的に、およそ１Ｍ未満、多くの場合約５００ｍＭ未満の塩濃度を含み、約２００ｍＭ未満であってもよい。「ハイブリダイゼーション緩衝液」は、緩衝塩溶液、例として、５％ＳＳＰＥ、または当技術分野で公知の他のそのような緩衝液を含む。ハイブリダイゼーション温度は、５℃程度に低くてもよいが、典型的には２２℃を超え、より典型的には約３０℃を超え、典型的には３７℃を超える。ハイブリダイゼーションは多くの場合、ストリンジェントな条件、すなわち、配列がその標的配列にハイブリダイズするが、他の非相補配列にはハイブリダイズしない条件下で行われる。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況においては異なる。例えば、より長い断片は、短い断片より、特異的ハイブリダイゼーションのためにより高いハイブリダイゼーション温度を必要とし得る。相補鎖の塩基組成および長さ、有機溶媒の存在ならびに塩基ミスマッチ形成の程度を含む他の因子は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼし得るので、パラメータの組み合わせは、任意の１つのパラメータ単独の絶対的な尺度より重要である。一般的に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列についてのＴｍより約５℃低く選択される。融解温度Ｔｍは、二本鎖核酸分子の集団の半分が解離して一本鎖になる温度であり得る。核酸のＴｍを計算するためのいくつかの式が、当技術分野で周知である。標準の参考文献によって示される通り、核酸が１Ｍ  ＮａＣｌの水溶液中に存在する場合、Ｔｍ値の単純な見積もりは、式、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）によって計算することができる（例えば、ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＹｏｕｎｇ、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（１９８５年）を参照されたい）。他の参考文献（例えば、ＡｌｌａｗｉおよびＳａｎｔａＬｕｃｉａ，  Ｊｒ．、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３６巻：１０５８１〜９４頁（１９９７年））は、構造特徴および環境特徴ならびに配列特徴を考慮してＴｍの計算を行う代替の計算法を含む。
【００７５】
一般的に、ハイブリッドの安定性は、イオン濃度および温度の関数である。典型的に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、続いて、様々な、しかしより高いストリンジェンシーの洗浄が行われる。例示的な、ストリンジェントな条件として、約７．０〜約８．３のｐＨおよび少なくとも２５℃の温度における少なくとも０．０１Ｍ〜１Ｍ以下のナトリウムイオン濃度（または他の塩）の塩濃度が挙げられる。例えば、５×ＳＳＰＥ（ｐＨ７．４における７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５ｍＭ  ＥＤＴＡ）および約３０℃の温度の条件は、対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションに好適であるが、好適な温度は、ハイブリダイズする領域の長さおよび／またはＧＣ含有量に依存する。一態様においては、ミスマッチの割合の決定における「ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー」は、以下の通りであり得る：１）高ストリンジェンシー：０．１×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、６５℃；２）中程度のストリンジェンシー：０．２×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃（適度なストリンジェンシーとも呼ばれる）；および３）低ストリンジェンシー：１．０×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳ、５０℃。代替の緩衝液、塩および温度を使用して同等のストリンジェンシーが達成され得ることが理解される。例えば、適度にストリンジェントなハイブリダイゼーションは、核酸分子、例として、プローブが相補核酸分子に結合することを可能にする条件を指し得る。ハイブリダイズした核酸分子は一般的に、例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％の同一性のいずれかを含む、少なくとも６０％の同一性を有する。適度にストリンジェントな条件は、４２℃における５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、続いて４２℃における０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中での洗浄に相当する条件であり得る。高ストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃における５０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、続いて６５℃における０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ中での洗浄によって提供され得る。低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、２２℃における１０％ホルムアミド、５×デンハルト溶液、６×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、続いて３７℃における１×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中での洗浄に相当する条件を指し得る。デンハルト溶液は、１％フィコール、１％ポリビニルピロリドンおよび１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する。２０×ＳＳＰＥ（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ＥＤＴＡ）は、３Ｍ塩化ナトリウム、０．２Ｍリン酸ナトリウムおよび０．０２５Ｍ  ＥＤＴＡを含有する。他の好適な、適度なストリンジェンシーおよび高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション緩衝液および条件は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎ．Ｙ．（１９８９年）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（１９９９年）において説明されている。
【００７６】
あるいは、ＲＮＡまたはＤＮＡ鎖が選択的ハイブリダイゼーション条件下でその相補鎖にハイブリダイズするとき、実質的な相補性が存在する。典型的には、少なくとも１４〜２５個のヌクレオチドのストレッチにわたり少なくとも約６５％の相補性、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約９０％の相補性が存在する場合、選択的ハイブリダイゼーションが起こる。Ｍ．  Ｋａｎｅｈｉｓａ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  １２巻：２０３頁（１９８４年）を参照されたい。
【００７７】
本明細書で使用される「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型と二本鎖を形成する際に、核酸合成の開始点として作用し、その３’末端から鋳型に沿って伸長することができ、そのため伸長した二本鎖が形成される、天然または合成いずれかのオリゴヌクレオチドであり得る。伸長プロセス中に付加されるヌクレオチド配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定される。プライマーは通常、ポリメラーゼ、例えば、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。
【００７８】
「ライゲーション」は、鋳型で駆動される反応における、２つまたはそれよりも多い核酸、例えば、オリゴヌクレオチドおよび／またはポリヌクレオチドの末端間の共有結合または連結の形成を指し得る。結合または連結の性質は広く変動してもよく、ライゲーションは酵素的に行ってもよい。本明細書で使用されるとき、ライゲーションは通常、酵素的に行い、１つのオリゴヌクレオチドの５’炭素末端ヌクレオチドと別のヌクレオチドの３’炭素との間にホスホジエステル連結を形成する。
【００７９】
「増幅」は、本明細書で使用されるとき、一般的に、所望の配列の多数のコピーを生成するプロセスを指す。「多数のコピー」とは、少なくとも２つのコピーを意味する。「コピー」は、鋳型配列との完全な配列相補性または同一性を必ずしも意味しない。例えば、コピーは、ヌクレオチドアナログ、例として、デオキシイノシン、意図的な配列変化（例として、鋳型にハイブリダイズ可能であるが、相補的でない配列を含むプライマーを通して導入された配列変化）および／または増幅中に起こる配列エラーを含み得る。
【００８０】
「配列決定」などは、核酸のヌクレオチド塩基配列に関連する情報の決定を含む。そのような情報は、核酸の部分的および完全な配列情報の同定または決定を含み得る。配列情報は、様々な程度の統計的信頼性または信頼度で決定することができる。一態様においては、この用語は、核酸における複数の連続ヌクレオチドの同一性および順序の決定を含む。
【００８１】
「シークエンシング」、「ハイスループットシークエンシング」または「次世代シークエンシング」という用語は、本質的に並列様式で、すなわち、ＤＮＡ鋳型が一度に１つではなくバルクプロセスでシークエンシングのために調製され、かつ多くの配列が好ましくは並列して読み出される、多く（典型的に数千〜数十億）の核酸配列を決定する方法を使用する、またはあるいは、それ自体が並列化され得る超ハイスループット逐次プロセスを使用する配列決定を含む。そのような方法として、ピロシークエンシング（例えば、４５４  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｒａｎｆｏｒｄ、ＣＴによって市販されている）；ライゲーションによるシークエンシング（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）技術、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡにおいて市販されている）；修飾ヌクレオチドを使用する合成によるシークエンシング（例として、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡによるＴｒｕＳｅｑ（商標）およびＨｉＳｅｑ（商標）技術；Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡによるＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）；ならびにＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ、ＣＡによるＰａｃＢｉｏ  ＲＳにおいて市販されている）、イオン検出技術によるシークエンシング（例として、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）技術、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）；ＤＮＡナノボールのシークエンシング（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、ＣＡ）；ナノポアベースのシークエンシング技術（例えば、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＴＤ、Ｏｘｆｏｒｄ、ＵＫにより開発されている）および同様の高度に並列化したシークエンシング法が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
「ＳＮＰ」または「一塩基多型」は、個体間の遺伝的変異；例えば、生物のＤＮＡにおける可変性の単一の窒素性塩基位置を含み得る。ＳＮＰは、ゲノムにわたって見られ、個体間の遺伝的変異の多くは、ＳＮＰ遺伝子座における変異のためであり、多くの場合この遺伝的変異は、個体間の表現型変異をもたらす。本開示における使用のためのＳＮＰおよびそれらの各々の対立遺伝子は、任意の数の供給源、例として、公のデータベース（Ｕ．Ｃ．Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ  Ｇａｔｅｗａｙ（ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｈｇＧａｔｅｗａｙ）またはＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰウェブサイト（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ  ｇｏｖ／ＳＮＰ／））に由来してもよく、または米国特許第６，９６９，５８９号；および「Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ」という表題の米国公開公報第２００６／０１８８８７５号で説明されているように実験的に決定してもよい。ＳＮＰの使用は、本明細書で示す実施形態の一部において説明されているが、他の二対立遺伝子または多対立遺伝子マーカーもまた使用してもよいことが理解される。二対立遺伝子マーカーは、２つの多型または対立遺伝子を有するマーカーである。上述の通り、形質と関連付けられる二対立遺伝子マーカーについて、対照群と比較して症例群の遺伝組成においてより豊富な対立遺伝子は、「関連対立遺伝子」と呼ばれ、もう一方の対立遺伝子は、「非関連対立遺伝子」と呼ばれ得る。したがって、所与の形質（例えば、疾患または薬物応答）と関連付けられる各二対立遺伝子多型について、対応する関連付けられる対立遺伝子が存在する。本明細書で示す方法で使用され得る他の二対立遺伝子多型として、多ヌクレオチド変化、挿入、欠失および転座が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８３】
本明細書におけるＤＮＡについての言及は、ゲノムＤＮＡ、ミトコンドリアＤＮＡ、エピソームＤＮＡおよび／またはＤＮＡ誘導体、例として、アンプリコン、ＲＮＡ転写産物、ｃＤＮＡ、ＤＮＡアナログなどを含み得ることがさらに理解される。関連研究においてスクリーニングされる多型遺伝子座は、二倍体または一倍体状態で存在してもよく、理想的には、ゲノムにわたる部位に由来する。シークエンシング技術は、ＳＮＰシークエンシングについて利用可能であり、例として、ビーズアレイプラットホーム（ＧＯＬＤＥＮＧＡＴＥ（商標）アッセイ）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）（Ｆａｎら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｓｙｍｐ．  Ｑｕａｎｔ．  Ｂｉｏｌ．、６８巻：６９〜７８頁（２００３年）を参照されたい）を用いてもよい。
【００８４】
一部の実施形態においては、「メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ）」または「メチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  ｓｔａｔｕｓ）」という用語は、ＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドのうちの１つまたは複数における５−メチルシトシン（「５−ｍＣ」または「５−ｍＣｙｔ」）の存在または非存在を指す。ＤＮＡ配列内の１つまたは複数の特定のＣｐＧメチル化部位（各々、２つのＣｐＧジヌクレオチド配列を有する）におけるメチル化状態として、「非メチル化」、「完全メチル化」および「ヘミメチル化」がある。「ヘミメチル化（ｈｅｍｉ−ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）」または「ヘミメチル化（ｈｅｍｉｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ）」という用語は、１つの鎖のみがメチル化されている二本鎖ＤＮＡのメチル化状態を指す。「高メチル化」という用語は、正常対照ＤＮＡ試料内の対応するＣｐＧジヌクレオチドにおいて見られる５−ｍＣｙｔの量と比較した、試験ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドのうちの１つまたは複数における５−ｍＣｙｔの存在の増大に対応する平均メチル化状態を指す。「低メチル化」という用語は、正常対照ＤＮＡ試料内の対応するＣｐＧジヌクレオチドにおいて見られる５−ｍＣｙｔの量と比較した、試験ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドのうちの１つまたは複数における５−ｍＣｙｔの存在の減少に対応する平均メチル化状態を指す。
【００８５】
本明細書中の「多重化」または「多重アッセイ」とは、２つ以上のマーカーを使用することによって多数の標的、例えば、多数の核酸配列の存在および／または量を同時にアッセイすることができるアッセイまたは他の解析法を指してもよく、マーカーの各々は、少なくとも１つの異なる検出特徴、例えば、蛍光特徴（例えば、励起波長、発光波長、発光強度、ＦＷＨＭ（半値幅のピーク高さ（ｆｕｌｌ  ｗｉｄｔｈ  ａｔ  ｈａｌｆ  ｍａｘｉｍｕｍ  ｐｅａｋ  ｈｅｉｇｈｔ））または蛍光寿命）またはユニークな核酸もしくはタンパク質配列特徴を有する。
【００８６】
本明細書で使用されるとき、「疾患または障害」とは、例えば、感染または遺伝的欠陥から生じ、同定可能な症状によって特徴付けられる生物における病理学的状態を指す。
【００８７】
Ｂ．  ライブラリー構築およびポリヌクレオチドシークエンシングによるポリヌクレオチド断片解析の概略
一態様においては、本方法の標的（または鋳型）ポリヌクレオチドは、例えば、約１００残基〜約１０００残基の範囲、一部の実施形態においては、約１５０残基〜約４００残基の範囲の、断片化ポリヌクレオチドである。
【００８８】
標的または鋳型ＤＮＡとして、標準のゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、染色体外ＤＮＡ（例として、ミトコンドリアＤＮＡ）またはそれらの断片が挙げられ得る。他の実施形態においては、標的または鋳型ＤＮＡは、加工されたＤＮＡ、例えば、酵素消化、架橋結合、化学的もしくは物理的剪断、亜硫酸水素塩変換および／または分解を受けたＤＮＡである。
【００８９】
亜硫酸水素塩変換は、亜硫酸水素塩を使用して、ＤＮＡのメチル化パターンを決定する方法である。ＤＮＡメチル化は、メチル基の、シトシンまたはアデニンＤＮＡヌクレオチドへの付加に関する生化学プロセスである。細胞が分裂して、胚性幹細胞から特定の組織に分化する際に、ＤＮＡメチル化により、細胞における遺伝子発現が安定に変更される。亜硫酸水素塩変換においては、最初に、非メチル化シトシンをウラシルに特異的に変換するが、メチル化シトシンには影響を有しない亜硫酸水素塩試薬で、標的核酸を処理する。亜硫酸水素塩変換の１つの結果は、配列相補性の喪失のために、元の標的の二本鎖コンフォメーションが破壊されることである。標的配列は、試料調製および解析または診断試験中に２つの別々の一本鎖ＤＮＡとして存在する。また、標的核酸配列は多くの場合、非常に低い濃度で存在する。このことは、循環腫瘍ＤＮＡ（「無細胞腫瘍ＤＮＡ」または「ｃｔＤＮＡ」とも呼ばれる）については、多くの場合、循環中のその低い濃度および非常に低い対立遺伝子率のためにとりわけ重要な考慮事項である。
【００９０】
一部の実施形態においては、本明細書で開示する目的の核酸分子は、無細胞ＤＮＡ、例として、無細胞胎児ＤＮＡ（「ｃｆＤＮＡ」とも呼ばれる）またはｃｔＤＮＡである。ｃｆＤＮＡは、妊娠中の女性の体内で、例として、血中で循環し、胎児ゲノムを表し、一方、ｃｔＤＮＡは、がん患者の体内で、例として、血中で循環し、一般的に事前に断片化されている。他の実施形態においては、本明細書で開示する目的の核酸分子は、例えば、有害な条件下での保存のための、古いかつ／もしくは損傷を受けたＤＮＡ、例として、ホルマリン固定試料、または部分的に消化された試料中のＤＮＡである。
【００９１】
がん細胞が死滅すると、それらはＤＮＡを血流へと放出する。このＤＮＡは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）として公知であり、非常に断片化されており、平均の長さは約１５０塩基対である。白血球を除去すると、ｃｔＤＮＡは一般的に、残りの血漿ＤＮＡのわずかな割合を構成し、例えば、ｃｔＤＮＡは、血漿ＤＮＡの約１０％未満を構成し得る。一般的に、この割合は、約１％未満、例えば、約０．５％未満または約０．０１％未満である。加えて、血漿ＤＮＡの全量は一般的に非常に低く、例えば、血漿１ｍＬ当たり約１０ｎｇである。
【００９２】
ｃｔＤＮＡ中のバリアントは、次世代シークエンシングを含む、様々な方法を使用して調べることができる。ｃｔＤＮＡの血漿ＤＮＡに対する低い比率のために、ＰＣＲおよびシークエンシングエラーのため高信頼度でバリアントをコールすることは困難である。ユニーク分子識別子（ＵＭＩ）は一般的に、確認された任意のバリアントをコンセンサス配列と比較することができるように、元の分子にタグ付けするために使用される。これは、偽陽性から真の陽性を分けるのに有効な方法である。バリアントがコンセンサスとマッチする場合、それは真の陽性である。そうでなければ、それは解析から除去される。さらに、感度を高く維持するために、高い割合の元の分子がシークエンシングライブラリーに変えられること、すなわち、バリアントが脱落のために失われないことが重要である。したがって、ライブラリー構築中のライゲーション効率は、非常に重要である。
【００９３】
一態様においては、ライゲーション効率を大いに改善し、依然として選択されたゲノム領域を標的化する技術が、本明細書で提供される。一実施形態においては、シークエンシングによって検出されるポリヌクレオチド、例として、ｃｔＤＮＡは最初に、ｃｔＤＮＡのそれ自体へのライゲーションを防止するために、脱リン酸化して５’ホスフェートを除去する。その後、すべてのＤＮＡが一本鎖になるように、ｃｔＤＮＡを変性させる。一本鎖ＤＮＡリガーゼであるＣｉｒｃｌｉｇａｓｅ（商標）を使用して、アダプターをｃｔＤＮＡの３’末端にライゲーションする。一態様においては、アダプターは、ライゲーション効率を最適化するための５’末端上の２つの特異的塩基、およびそれに続くＵＭＩを含有する。一態様においては、アダプターの３’末端は、アダプターの自己ライゲーションを防止するために炭素スペーサーを含有する。別の態様においては、ライゲーション反応は、密集剤（ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例として、ＰＥＧ４０００を使用してさらに最適化される。一態様においては、ライゲーション後、アダプターに逆相補的なプライマーを使用して分子を二本鎖にする。このことにより、標準の精製による、使用可能なＤＮＡの除去を伴わない、過剰のライゲーションしていないアダプターの効率的な除去が可能になる。
【００９４】
一態様においては、その後、ＤＮＡは、半標的化ＰＣＲを使用して増幅される。一方のプライマーは、アダプターに逆相補的であり、一方で、もう一方（例えば、プライマープール中の１つのプライマーとして）は、特異的な標的化ゲノム領域にアニールする。特異的プライマーは、プライマー−ダイマー相互作用およびオフターゲットアニーリングを最小限にするように設計された。一態様においては、標的特異的プライマーは、小さいＤＮＡサイズのために特定のバリアントに近接して配置するようにさらに最適化される。別のクリーンアップ後、ＰＣＲにより、全長シークエンシングアダプターおよびバーコードを付加する。その後、最終的なライブラリーを、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ機でシークエンシングする。
【００９５】
一態様においては、半標的化ＰＣＲは、約３０，０００ｂｐの比較的小さい標的領域を有するにもかかわらず、元の分子組の約４０，０００倍を超える濃縮をもたらす。一態様においては、標準のライブラリー構築およびハイブリダイゼーション捕捉と比較すると、本方法の全変換率は、少なくとも６０％であり、元の分子の少なくとも約３倍多い分子がシークエンシング可能な材料に変換されることを示唆する。他の実施形態においては、全変換率は、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％または９０％を超える。一態様においては、本方法はしたがって、例えば、０．０１％もの低さの、極めて低い変異対立遺伝子率での遺伝子バリアントまたはゲノムバリアント、例として、ＳＮＶ、インデル、ＣＮＶおよび融合を正確にコールすることができる。他の態様においては、遺伝子バリアントまたはゲノムバリアントの対立遺伝子率は、約０．０５％、約０．１％、約０．５％、約１％または約２％である。
【００９６】
以下の節は、本方法のある特定のステップをより詳細に説明する。
【００９７】
Ｃ．  一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーおよびそれを構築する方法
例えば、ｃｔＤＮＡについての、次世代シークエンシングのためのライブラリー構築は一般的に、末端修復、Ａ−テーリングおよびアダプター分子の二本鎖ライゲーションを含む、いくつかのステップからなる。その後、これらのライゲーションされた分子を、ハイブリダイゼーション捕捉を使用してある特定のゲノム領域について１０００〜２０００倍に濃縮し得る。ここ数年にわたるライブラリー構築におけるいくつかの改善にもかかわらず、プロセスは非効率的なままであり、そのため多くの元の分子が様々なステップ中に失われる。二本鎖ライゲーション効率は低いままであり、適切にライゲーションされるのは分子の約２０〜３０％である。加えて、多くの分子は、精製およびハイブリダイゼーション捕捉ステップ中に失われ、そのため、最終的な変換率は、およそ１０〜２０％である。ｃｔＤＮＡにおいて見られる低対立遺伝子率バリアントを調べる場合、感度は低いままである。低対立遺伝子率のライブラリーを検査する場合、低効率が感度の喪失をもたらすので、このことは、低対立遺伝子率変異体をコールする場合、精度を制限することとなる。
【００９８】
加えて、ある特定のポリヌクレオチド、例として、ｃｔＤＮＡは、小さいサイズのために、タグ付断片化法（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）ベースのライブラリー構築の使用が妨げられる。例えば、最初に、ポリヌクレオチドに（例えば、ビオチンで）タグ付けして標的化ライブラリーを産生し、その後、（例えば、ストレプトアビジンによって）タグを捕捉することによって濃縮する。このようにして、目的の領域についてのライブラリーを、約１０００〜２０００倍に濃縮することができる。最後に、ＰＣＲを行って、シークエンシングのために分子を増幅およびインデックス付けする。しかしながら、ＰＣＲベースの方法は、元の分子にＵＭＩを付加することが困難であることが明らかになっており、高エラー率をもたらす。
【００９９】
一態様においては、本明細書で説明する組成物、キットおよび方法は、上記の問題に取り組んだ。一部の実施形態においては、組成物、キットおよび方法は、様々なライブラリーの構築、様々な増幅反応（例として、ＰＣＲおよび／またはプライマー伸長による）、構築したライブラリーの精製およびシークエンシングリードの解析を含むが、これらに限定されない、核酸分子のシークエンシングにおいて有用である。
【０１００】
ある特定の態様においては、シークエンシングライブラリーは、例えば、断片化ポリヌクレオチド、例として、断片ＤＮＡを含有する試料から調製することができる。一態様においては、試料、例えば、直接、患者からの、天然に存在する試料、例として、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、汗、精液、痰、涙、粘液または羊水を含むが、これらに限定されない組織液または体液を得る。他の態様においては、シークエンシングライブラリーは、（例えば、ＤＮＡを剪断することによって）ＤＮＡの断片を形成し、ＤＮＡ断片に本明細書中のアダプターを結合することによって調製することができる。特定の実施形態においては、断片化ポリヌクレオチドおよびアダプターは、一本鎖である。
【０１０１】
断片（例えば、ｃｔＤＮＡ、またはより長いＤＮＡ鎖を断片化することによって形成される断片）は、アダプター、例として、本明細書で開示する一本鎖アダプターに隣接して「挿入」またはライゲーションされ得るので、「インサート」と呼ばれることがある。また、例えば、ＲＮＡ分子を逆転写してＤＮＡ分子を形成し、それをアダプターに結合することによって、ＲＮＡ分子をシークエンシングすることができる。
【０１０２】
一態様においては、１組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む方法が提供され、この方法においては、ライゲーションが、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼによって触媒される。本明細書で使用されるとき、ｓｓＤＮＡリガーゼは、相補配列の非存在下でｓｓＤＮＡの末端をライゲーションすることができる。例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼおよびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩ  ｓｓＤＮＡリガーゼは両方とも、典型的に５’−ホスフェートおよび３’−ヒドロキシル基を有するｓｓＤＮＡ鋳型の分子内ライゲーション（すなわち、環状化）を触媒するために使用される熱安定性リガーゼである。相補ＤＮＡ配列上で互いに隣接してアニールするＤＮＡ末端をライゲーションするＴ４  ＤＮＡリガーゼおよびＡｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）ＤＮＡリガーゼとは対照的に、ｓｓＤＮＡリガーゼは、相補配列の非存在下でｓｓＤＮＡの末端をライゲーションする。それゆえ、この酵素は、直鎖状ｓｓＤＮＡから環状ｓｓＤＮＡ分子を作製するのに有用である。環状ｓｓＤＮＡ分子は、ローリングサークル型複製またはローリングサークル型転写のための基質として使用することができる。ｓｓＤＮＡに対するその活性に加えて、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ酵素は、３’−ヒドロキシルリボヌクレオチドおよび５’−リン酸化リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを有する一本鎖核酸をライゲーションすることにおいても活性を有する。
【０１０３】
ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ｓｓＤＮＡリガーゼまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）ＩＩ  ｓｓＤＮＡリガーゼのいずれかを、本開示において使用することができる。２つの酵素は、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩがＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩよりはるかにアデニル化されておらず、最大活性のためにはＡＴＰを必要とする点で異なる。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  Ｉは、ＡＴＰの存在下でｓｓＤＮＡを再環状化する。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩは、ほぼ１００％アデニル化されており、それゆえ、反応緩衝液にＡＴＰを添加する必要はない。ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩは、化学量論反応として働き、酵素は、オリゴの５’末端に結合し、オリゴを酵素活性部位においてアデニル化し、その後、オリゴをライゲーションし、停止する。反応はＡＴＰを含有しないので、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩは、１：１の酵素：オリゴ構成で働く。環状化が完了すると、環状ｓｓＤＮＡは、活性部位から放出され、反応は停止する。また、他の好適なｓｓＤＮＡリガーゼを使用してもよい。例えば、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０３１９ＳまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２０２ＳまたはＴ４  ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２０４Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２３９Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２４２Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱ、例えば、Ｍ０３７３ＳまたはＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０３５１Ｓを使用することができる。
【０１０４】
一態様においては、各一本鎖ポリヌクレオチドは、５’末端でのライゲーションを防止するために５’末端でブロックされており、各アダプターは、そのアダプターがライゲーションされる一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含み、各アダプターは、３’末端でのライゲーションを防止するために３’末端でブロックされており、アダプターの５’末端は、ｓｓＤＮＡリガーゼによって一本鎖ポリヌクレオチドの３’末端にライゲーションされて直鎖状ライゲーション生成物を形成し、それによって、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを得る。一本鎖ＤＮＡの鋳型非依存的環状化は、その開示を、それらを全体として本明細書に組み込む、ＷＯ２０１０／０９４０４０  Ａ１において説明されている。しかしながら、ＷＯ２０１０／０９４０４０  Ａ１は、一本鎖ポリヌクレオチドの分子内ライゲーション（例えば、環状化）のみを開示している。
【０１０５】
したがって、本方法は、ｓｓＤＮＡリガーゼ、例として、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅまたはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩを、非従来型様式で使用する。環状化の代わりに、本ライゲーション法は、一本鎖標的ポリヌクレオチドとアダプター分子との直鎖状ライゲーション生成物を産生することを目的とする。一態様においては、本開示は、例えば、アダプターを一本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションするために、分子内ライゲーションを行うためのｓｓＤＮＡリガーゼを使用する。一態様においては、それを行うために、一本鎖ポリヌクレオチドは、環状化を防止するために５’末端でブロックされている。このようにして、ｓｓＤＮＡの３’末端の、それ自体の５’末端への分子内ライゲーション、および１つのｓｓＤＮＡの３’末端の、同じライブラリー内の別のｓｓＤＮＡの５’末端への分子間ライゲーションを防止する。したがって、一態様においては、ライゲーション反応中の一本鎖ポリヌクレオチドの環状化および（一本鎖ポリヌクレオチドおよび／またはアダプターを含有する）直鎖状コンカテマーの形成の両方が防止される。図１で示す通り、各一本鎖ポリヌクレオチドのブロックは、５’末端でのライゲーションを防止するために、その５’末端での脱リン酸化を含み得る。
【０１０６】
別の態様においては、各アダプターは、３’末端でのライゲーションを防止するために３’末端でブロックされている。このようにして、アダプターの３’末端の、それ自体の５’末端への分子内ライゲーション、および１つのアダプター分子の３’末端の、別のアダプター分子の５’末端への分子間ライゲーションを防止する。各アダプターのブロックは、その３’末端でのライゲーションを防止するために、炭素スペーサー、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ヘキサンジオール、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）および／またはヘキサエチレングリコールを含み得る。したがって、一態様においては、ライゲーション反応中の一本鎖アダプターの環状化および（一本鎖ポリヌクレオチドおよび／またはアダプターを含有する）直鎖状コンカテマーの形成の両方が防止される。
【０１０７】
アダプターは、任意の好適な組み合わせの、１つまたは複数のスペーサーの１つまたは複数のコピーを含み得る。例えば、ＧａｎｓａｕｇｅおよびＭｅｙｅｒは、Ｃ３スペーサーおよびビオチニル化ＴＥＧスペーサーの１０個のコピーを含むアダプターを開示した。その全体を参照により本明細書に援用する、ＧａｎｓａｕｇｅおよびＭｅｙｅｒ（２０１３年）、「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｃｉｅｎｔ  ｏｒ  ｄａｍａｇｅｄ  ＤＮＡ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、８巻（４号）：７３７〜４８頁。しかしながら、この参考文献は、ライゲーション直後に、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介して、ライゲーションしたｓｓＤＮＡを捕捉することを必要とする。このステップは、ライブラリーにおけるｓｓＤＮＡ分子の顕著な喪失をもたらし得る。その後、この参考文献は、捕捉したｓｓＤＮＡをｄｓＤＮＡに変換し、一方で、ｓｓＤＮＡは、ビーズ上に捕捉されたまま残る。
【０１０８】
図１で示す通り、本開示は、ライゲーション直後に、ライゲーションしたｓｓＤＮＡを捕捉することを必要としない。代わりに、ライゲーションしたｓｓＤＮＡは、ｄｓＤＮＡに変換されるとき、ライゲーション反応体積中に残る。
【０１０９】
一態様においては、ライブラリー中のｓｓＤＮＡのライゲーション効率は高く、例えば、試料中の一本鎖ポリヌクレオチドの少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または少なくとも約９９％が、アダプターにライゲーションする。特定の実施形態においては、ライゲーション効率は、約８０％である。この大いに改善されたライゲーション効率でも、特許請求される方法は、以下に説明する通り、選択されたゲノム領域を依然として標的化することができる。
【０１１０】
一態様においては、アダプターは、以下の構造：／５’ホス／Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ−Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ−ブロッカーを有し、「５’ホス」は５’ホスフェート基を表し、「Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ」はＵＭＩ配列に対する５’側の配列を表し、「Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ」はＵＭＩ配列に対する３’側の配列を表し、「ブロッカー」は、アダプターの３’末端がアダプターへのライゲーションを防止するためにブロックされていることを示す。ｉおよびｊは両方とも整数であり、ｉは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０または３０を超えてもよく；ｊは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０または５０を超えてもよい。特定の実施形態においては、ｉは２であり得る。一部の実施形態においては、Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉの５’末端におけるジヌクレオチド配列Ｎ１Ｎ２は、ライゲーション効率を向上させるために、ＧＡ（５’〜３’）、ＧＧ（５’〜３’）、ＡＡ（５’〜３’）またはＡＧ（５’〜３’）であり得る。
【０１１１】
一態様においては、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ配列の一部またはすべては、ライゲーションした一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに変換するためのプライマーとして使用される逆相補配列を設計するために、かつ／または選択された標的配列を増幅するための半標的化ＰＣＲのために（プライマー対のもう一方のプライマーは、標的特異的プライマーである）、後のステップにおいて使用される。一態様においては、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ配列は、ＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ（配列番号１）または約１８〜２２個のヌクレオチド残基を含むその一部を含む。
【０１１２】
別の態様においては、「ブロッカー」は、５’〜３’方向で任意の好適な組み合わせおよび順序にて、１つまたは複数のブロッカー基の１つまたは複数のコピーにおいて、炭素スペーサー、ｄｄＣＴＰ、ｄｄＡＴＰ、ｄｄＴＴＰ、ｄｄＧＴＰ、ヘキサンジオール、トリエチレングリコール（ＴＥＧ）および／またはヘキサエチレングリコールを含む。
【０１１３】
一態様においては、ＵＭＩの使用は、標的配列のエラーのないシークエンシングリードの決定、選択および／または単離を促進し、シークエンシングリードは、高精度および高スループットで選択することができる。そのような確証された、エラーのないシークエンシングリードは、より大きな公知配列の分子の構築、多型および／または変異スクリーニング、大規模並列シークエンシングならびに方法における偏りを排除するための定量化法を含む、配列忠実度を必要とする任意の技術において有用である。
【０１１４】
一態様においては、ユニーク分子識別子は、一本鎖標的ポリヌクレオチドおよびアダプターを含むライゲーションした構築物と関連付けられ、ライゲーションした構築物をユニークに識別する。換言すれば、同じ配列を有する２つの一本鎖標的ポリヌクレオチドを、それらのＵＭＩ配列において互いに異なる２つの異なるアダプターにライゲーションしてもよく；得られるライゲーション生成物は異なり、（同じ配列を有する標的ポリヌクレオチドではなく）各ライゲーション生成物は、ＵＭＩによってユニークに識別される。別の態様においては、一本鎖ライゲーション生成物を二本鎖ポリヌクレオチドに変換し、増幅した場合、非常に高い忠実度のポリメラーゼが利用可能であるとしても、反復複製中に増幅エラーが導入され得る。その結果、低いエラー率でさえも、特に、大きなライブラリーの構築においては、顕著な影響を有し得る。大規模並列シークエンシングは、コストおよびスループットにおいて利点を有するが、リードの精度は、増幅および／または検出技術の限界によって構成され得る。
【０１１５】
ＵＭＩを使用することによって、本方法は、エラーのない増幅生成物および／またはシークエンシングリードを識別し、技術的エラーを有するものを解析から除外することができる。同じＵＭＩを有する増幅生成物および／またはシークエンシングリードは、関連する（同祖的な（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ  ｂｙ  ｄｅｓｃｅｎｔ））ものとして確認することができ、したがって、同じＵＭＩを有する分子間の配列の相違は、配列中の実際の相違（例えば、野生型配列とがん関連変異配列との間の配列の相違）ではなく技術的エラーとして識別することができる。換言すれば、各一本鎖ライゲーション生成物は、そのＵＭＩによってユニークに識別可能であるので、技術的エラーが導入されていない場合、（増幅および／またはシークエンシングによる）その子孫のすべては、同じ標的配列を有するはずである。しかしながら、エラー、例として、単一ヌクレオチド挿入が増幅および／またはシークエンシング中に標的配列に導入された場合、同祖的な（例えば、同じＵＭＩを共有する）一部の増幅生成物および／またはシークエンシングリードは、挿入を有し、一方で、その他は有しない。挿入を有する生成物と挿入を有しない生成物との正確な比は、エラーが増幅および／またはシークエンシングプロセス中のいつ起こったかに依存して変動する。一般的に、非常に高い忠実度のポリメラーゼを使用した場合、エラーを伴わない生成物が大多数で存在する。別の態様においては、同祖的な増幅生成物および／またはシークエンシングリードを識別することができるので、多数の分子からのデータを使用してコンセンサス配列を決定し、それによって、高精度のハイスループットシークエンシングを達成することができる。
【０１１６】
一態様においては、ＵＭＩは縮重核酸配列であり、ＵＭＩ中のヌクレオチドの数は、ＵＭＩ配列によって表される潜在的配列および実際の配列の数が、最初のライブラリー中の標的一本鎖標的ポリヌクレオチドの総数より多くなるように設計される。一態様においては、ＵＭＩ配列多様性（または各単一のＵＭＩ配列についての「特有性」）は、各位置においてすべての４つの塩基の混合物により合成することによってランダムに産生された配列の縮重した集合物を使用することによって提供することができる。あるいは、多様な、しかし事前に規定された組の配列を合成し、最初の一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーにライゲーションしてもよい。ＵＭＩの組の多様性は、同祖的でない分子が同祖的として間違えられない程度に十分である必要がある。一態様においては、「ユニーク」分子識別子は、絶対的にユニークである必要はなく、それらが異なり、同祖的な分子について間違えられないことが明らかであるという条件で、異なる標的一本鎖ポリヌクレオチドについて使用され得る。ヌクレオチドのランダムアセンブリから産生され得る多数のＵＭＩ配列は、各個々のライゲーション生成物がユニークに識別され得る高い確率を提供する。例えば、ＵＭＩが、各位置においてＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物により合成される１２ｍｅｒを含む場合、４１２個の可能性のある配列が存在する。ＵＭＩが、各位置においてＡ、Ｃ、ＧおよびＴの混合物により合成される２０ｍｅｒを含む場合、４２０個（約１０１２個）の可能性のある配列が存在する。そのようなランダムな識別子の使用は、互いに個々に区別され得る一本鎖標的ポリヌクレオチドの大きなライブラリーを可能にする。
【０１１７】
特定の態様においては、ＵＭＩは、５ｍｅｒ、６ｍｅｒ、７ｍｅｒ、８ｍｅｒ、９ｍｅｒ、１０ｍｅｒ、１１ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１３ｍｅｒ、１４ｍｅｒ、１５ｍｅｒ、１６ｍｅｒ、１７ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、１９ｍｅｒ、２０ｍｅｒ、２１ｍｅｒ、２２ｍｅｒ、２３ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、２５ｍｅｒ、またはさらにそれよりも長い縮重配列である。一態様においては、アダプターは、以下の構造：／５’ホス／ＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ／３ＳｐＣ３／を有し、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」は１２ｍｅｒ  ＵＭＩ配列を表し、「３ＳｐＣ３」は３’炭素スペーサーを表す。ＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧの配列は、配列番号２である。
【０１１８】
ＤＮＡの濃度は、縮合剤、例として、コバルトヘキサミンおよび生体ポリアミン、例として、スペルミジンを添加することによって、または同様に酵素の有効濃度を増大させる密集剤、例として、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用することによって、人為的に増大することができる。一態様においては、添加剤、例として、コバルトヘキサミンは、分子間反応を排他的に生成し、環状生成物ではなく直鎖状ライゲーション生成物をもたらし得る。したがって、一本鎖標的ポリヌクレオチドの５’末端および一本鎖アダプターの３’末端がライゲーションを防止するために完全にブロックされていない場合、添加剤、例として、コバルトヘキサミンは、分子間反応を向上させ、一本鎖標的ポリヌクレオチドおよび／またはアダプターの環状化をさらに防ぐために使用され得る。
【０１１９】
一部の実施形態においては、同じライゲーション反応においてアダプターの２つ以上の構成を使用することができる。例えば、アダプターの２つの構成を使用してもよい：
構成番号１：／５’ホス／Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ１−Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ−ブロッカー１、および
構成番号２：／５’ホス／Ｐ１Ｐ２．．．Ｐｋ−ＵＭＩ２−Ｑ１Ｑ２．．．Ｑｌ−ブロッカー２。
【０１２０】
Ｎ１Ｎ２．．．ＮｉおよびＰ１Ｐ２．．．Ｐｋは同じでも、異なってもよく、ＵＭＩ１およびＵＭＩ２は同じでも、異なってもよく、Ｍ１Ｍ２．．．ＭｊおよびＱ１Ｑ２．．．Ｑｌは同じでも、異なってもよく、ブロッカー１およびブロッカー２は同じでも、異なってもよい。一実施形態においては、ＵＭＩ１は、ＵＭＩ２とは異なる（例えば、ＵＭＩ１は１２ｍｅｒ縮重配列であり、一方で、ＵＭＩ２は１３ｍｅｒ縮重配列である）が、アダプターの他の特徴は同じである。別の実施形態においては、Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉは、Ｐ１Ｐ２．．．Ｐｋとは異なる（例えば、一方はＡＧであり、一方で、もう一方はＧＡである）が、アダプターの他の特徴は同じである。また別の実施形態においては、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊは、Ｑ１Ｑ２．．．Ｑｌとは異なるが、アダプターの他の特徴は同じである。さらに別の実施形態においては、ブロッカー１とブロッカー２とは異なるが、アダプターの他の特徴は同じである。
【０１２１】
ライゲーション反応後、一本鎖ライゲーション生成物は、精製（例えば、過剰のライゲーションしていないアダプター分子からのライゲーション生成物の分離）を一切必要とせず、二本鎖ライゲーション生成物への変換に即座に供することができる。加えて、一本鎖標的ポリヌクレオチドも、アダプターも、後続のライゲーション生成物の二本鎖ポリヌクレオチドへの変換および／または増幅ステップのために（例えば、ビーズへのビオチン−ストレプトアビジン媒介結合によって）固体支持体上に捕捉する必要がない。したがって、本方法は、一本鎖ライゲーション生成物の精製または単離のための、ＤＮＡ試料、例としてｃｔＤＮＡ中の既に対立遺伝子率が小さい変異体の喪失を回避および／または低減する。代わりに、一態様においては、一本鎖ライゲーション生成物は、溶液中に残り、それはプライマー伸長に直接供される。
【０１２２】
Ｄ．  一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーの二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーへの変換
一態様においては、図１で示す通り、一本鎖ライゲーション生成物を含有するライブラリーの構築後、本方法は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーに変換することをさらに含み得る。一態様においては、変換は、各々が、アダプターに逆相補的であり、かつ／またはアダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、プライマーまたは１組のプライマーを使用する。
【０１２３】
以下の構造：／５’ホス／Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ−Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ−ブロッカーを有するアダプターについて、プライマーは、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊに逆相補的であり、かつ／またはこれにハイブリダイズ可能な配列を含み得る。この例においては、プライマーが、構造ｓｓＤＮＡ−Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ−Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ−ブロッカーを有するライゲーションされた生成物にハイブリダイズする場合、プライマー伸長反応は、ｓｓＤＮＡ−Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ配列（および必要に応じて、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ配列のすべてまたは一部）を二本鎖ポリヌクレオチドに変換し得る。特定の一例においては、逆相補的プライマーは、配列番号３で示される配列：ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（５’〜３’）を含む。
【０１２４】
一部の実施形態においては、プライマーは、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊまたはその一部の完全な逆相補体でなくてもよく；それにもかかわらず、プライマーは、ストリンジェントな条件下でＭ１Ｍ２．．．Ｍｊにハイブリダイズ可能である（およびしたがって、ｓｓＤＮＡはアダプターにライゲーションされる）。
【０１２５】
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを増幅および／または精製することをさらに含み得る。一態様においては、二本鎖ライゲーション生成物を精製およびサイズ選択して、非結合アダプター分子および／または非結合プライマーおよび／またはアダプターとその逆相補的プライマーとの間で形成された複合体を除去する。一般的に所望の二本鎖ライゲーション生成物より短いこれらの断片を除去するために、任意の好適な方法を使用することができる。例えば、ＱｉａｇｅｎからのＰＣＲ精製カラムを使用すると、試料からより小さい断片を削除することを補助することができ、カラム精製した試料を２％保証の低域ウルトラアガロースゲルで泳動すると、所望の断片サイズを選択することを補助することができる。ＡＭＰｕｒｅ法を含むビーズベースのＤＮＡ精製も、より小さい断片を除去するのに役立つ。一部の実施形態においては、所望の二本鎖ライゲーション生成物サイズは、約１００ｂｐ〜約６００ｂｐ、例として、約１００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐおよび約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐである。一実施形態においては、ｄｓＤＮＡ（１５０ｂｐより長く４００ｂｐより短い）を、例えば、Ｔｒｉ−ＥＤＴＡ緩衝液中に懸濁したビーズを溶出することによって、精製および収集する。
【０１２６】
一態様においては、精製は、ビーズベースである。別の態様においては、精製は、サイズ選択に基づき、例えば、精製ステップは、約５０ヌクレオチド〜約１０００ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチドを選択的に精製し、例えば、約４０ヌクレオチドの長さのアダプター（ならびに約４０ｂｐのプライマーダイマーおよび／またはプライマー−アダプター二本鎖）が除去される。一態様においては、精製は、例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ精製カラム、例として、ＺｙｍｏまたはＱｉａｇｅｎからのカラムを使用することによる、カラムベースである。
【０１２７】
別の態様においては、精製は、一方が直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体（例として、ビーズ）に結合する特定の結合対（例として、ビオチン／ストレプトアビジン）を使用することを含まない。
【０１２８】
前述の実施形態のいずれかにおいては、本明細書の方法は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物のライブラリーを増幅して、標的配列の配列情報を含む直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを得ることをさらに含み得る。この増幅は、例えば、ユニバーサルアダプター対を二本鎖ライゲーション生成物の末端にライゲーションし、ユニバーサルプライマー対ですべてのタグ付けした二本鎖ライゲーション生成物を増幅することによる、偏りのない増幅であり得る。他の実施形態においては、偏りのない増幅の代わりに、またはこれに加えて、半標的化増幅を行う。半標的化増幅は、偏りのない増幅の前に行っても、後に行ってもよい。
【０１２９】
Ｅ．  二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーの半標的化増幅
一態様においては、図１で示す通り、二本鎖ライゲーション生成物ライブラリーの半標的化増幅は、アダプターに逆相補的であり、かつ／またはこれにハイブリダイズ可能な配列を含むプライマー、および標的配列（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子配列）にハイブリダイズ可能な１つのプライマーまたは同じ標的配列もしくは多数の標的配列にハイブリダイズ可能な複数のプライマーを使用することを含む。
【０１３０】
以下の構造：／５’ホス／Ｎ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ−Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ−ブロッカーを有するアダプターについて、プライマーは、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊに逆相補的であり、かつ／またはこれにハイブリダイズ可能な配列を含み得る。このように、プライマーがｄｓＤＮＡの１つの鎖にハイブリダイズし、標的特異的プライマーがｄｓＤＮＡの他の鎖にハイブリダイズする場合、ＰＣＲ産物は、標的配列およびＮ１Ｎ２．．．Ｎｉ−ＵＭＩ配列（および必要に応じて、Ｍ１Ｍ２．．．Ｍｊ配列のすべてまたは一部）を含有する。特定の一例においては、逆相補的プライマーは、配列番号３で示される配列：ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（５’〜３’）を含む。
【０１３１】
一態様においては、各々が、同じまたは異なる標的配列について特異的な配列を含む、複数の標的特異的プライマーを使用してもよい。換言すれば、プライマーは、同じまたは異なる標的配列を有してもよい。一部の実施形態においては、標的特異的プライマーのプールは、約５、約１０、約２５、約５０、約１００、約１５０、約２００、約２５０、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００個または約１０００個よりも多い様々なプライマー、例として、約１０４、約１０５、約１０６個またはそれよりも多いプライマーを含む。他の実施形態においては、プールは、約２０〜約６０、約６０〜約１００、約１００〜約１４０、約１４０〜約１８０、約１８０〜約２２０、約２２０〜約２６０、約２６０〜約３００、約３００〜約３５０または約３５０〜約４００個の様々なプライマーを含む。一態様においては、標的特異的プライマーのプールは、１つの共通の逆相補的プライマーと共に使用され、共通の逆相補的プライマーは、プール中の各個々の標的特異的プライマーとプライマー対を形成して、半標的化様式でこれらのプライマー間の標的配列を増幅する。したがって、この態様においては、半標的化増幅は、全ゲノム増幅ではない。
【０１３２】
ｃｔＤＮＡはランダムに断片化するので、一態様においては、標的特異的プライマーのプライマー位置は重要であり得る。例えば、プライマーの配置が切断点にまたがる場合、それはより低い変換率をもたらし得る。より大きな標的特異的プライマープールおよび／または同じ標的配列についての多数の部分重複プライマーの使用は、この問題を解決し得る。
【０１３３】
一態様においては、標的配列の配列情報は、変異、一塩基多型（ＳＮＰ）、コピー数多型（ＣＮＶ）またはエピジェネティック変化を含み得る。一態様においては、変異は、点変異、挿入、欠失、逆位、トランケーション、融合、増幅またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【０１３４】
一部の実施形態においては、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーは、全ゲノムライブラリー以外のライブラリー、例えば、半標的化ゲノムライブラリーであり得る。
【０１３５】
一部の実施形態においては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅したライブラリーを精製することをさらに含み得る。プライマーダイマーを含むより小さい断片を除去するために、任意の好適な方法を使用することができる。例えば、ＱｉａｇｅｎからのＰＣＲ精製カラムを使用すると、試料からより小さい断片を削除することを補助することができ、カラム精製した試料を２％保証の低域ウルトラアガロースゲルで泳動すると、所望の断片サイズを選択することを補助することができる。ＡＭＰｕｒｅ法を含むビーズベースのＤＮＡ精製も、より小さい断片を除去するのに役立つ。一部の実施形態においては、増幅生成物サイズは、約１００ｂｐ〜約６００ｂｐ、例として、約１００ｂｐ〜約４００ｂｐ、約１５０ｂｐ〜約２００ｂｐ、約２００ｂｐ〜約２５０ｂｐおよび約２５０ｂｐ〜約３００ｂｐである。一実施形態においては、ｄｓＤＮＡ（１５０ｂｐより長く４００ｂｐより短い）を、例えば、Ｔｒｉ−ＥＤＴＡ緩衝液中に懸濁したビーズを溶出することによって、精製および収集する。
【０１３６】
一態様においては、精製は、ビーズベースである。別の態様においては、精製は、サイズ選択に基づき、例えば、精製ステップは、約１５０ヌクレオチドを超える長さのポリヌクレオチドを選択的に精製する。別の態様においては、精製は、一方が直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合し、もう一方が固体支持体（例として、ビーズ）に結合する特定の結合対（例として、ビオチン／ストレプトアビジン）を使用することを含まない。一態様においては、精製は、例えば、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ精製カラム、例として、ＺｙｍｏまたはＱｉａｇｅｎからのカラムを使用することによる、カラムベースである。
【０１３７】
Ｆ．  配列ライブラリーの構築およびシークエンシングリードの解析
一態様においては、方法は、直鎖状二本鎖ライゲーション生成物の増幅し、精製したライブラリーをシークエンシングすることをさらに含む。一態様においては、シークエンシングステップは、シークエンシングアダプターおよび／または試料特異的バーコードを各直鎖状二本鎖ライゲーション生成物に結合することを含む。特定の一態様においては、結合ステップは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して行われる。
【０１３８】
図２は、シークエンシングのための標的分子を含む構築物の例示的な構成を示す。Ｉｌｌｕｍｉｎａシークエンシングのために、これらの構築物は、各末端上に、ライブラリー断片がフローセル表面に結合することを可能にするフローセル結合部位、Ｐ５およびＰ７を有する。一本鎖ライブラリー断片のＰ５およびＰ７領域は、フローセル表面上のそれらの相補的オリゴにアニールする。フローセルオリゴは、プライマーとして作用し、ライブラリー断片に相補的な鎖が合成される。その後、元の鎖を洗い流すと、混合した配向で、フローセル表面に共有結合している断片コピーが残る。その後、各断片のコピーを架橋増幅によって産生し、クラスターを作製する。その後、Ｐ５領域を切断し、Ｐ７領域によって結合している断片のみを含有するクラスターを得る。このことにより、すべてのコピーが同じ向きでシークエンシングされることが確実になる。シークエンシングプライマーを、断片のＰ５末端にアニールし、合成プロセスによってシークエンシングを開始する。試料がバーコード化されている場合、インデックスリードが行われる。リード１を終了すると、リード１からのすべてを除去し、インデックスプライマーを添加し、これは断片のＰ７末端にアニールし、バーコードをシークエンシングする。その後、鋳型からすべてを取り除き、これは、リード１と同様に架橋増幅によってクラスターを形成する。これにより、混合した配向で、フローセル表面に共有結合している断片コピーが残る。今度は、Ｐ５の代わりにＰ７を切断し、Ｐ５領域によって結合している断片のみを含有するクラスターを得る。このことにより、すべてのコピーが（リード１と反対の）同じ向きでシークエンシングされることが確実になる。シークエンシングプライマーを、Ｐ７領域にアニールし、鋳型の他の末端をシークエンシングする。
【０１３９】
次世代シークエンシングプラットホーム、例として、ＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）は、高多重化アッセイリードアウトのために使用することができる。様々な統計的ツール、例として、比例検定（ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ  ｔｅｓｔ）、偽陽性率に基づく多重比較補正（ＢｅｎｊａｍｉｎｉおよびＨｏｃｈｂｅｒｇ、１９９５年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｂ  （Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｃａｌ）  ５７巻、２８９〜３００頁を参照のこと）および多重検定のボンフェローニ補正は、アッセイ結果を解析するために使用することができる。加えて、ＲＮＡ−Ｓｅｑデータからの差次的発現の解析のために開発されたアプローチを使用して、各標的配列についての分散を低減し、解析における全体的な検出力を増大させることができる。Ｓｍｙｔｈ、２００４年、Ｓｔａｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎｅｔ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ３巻、論文３を参照されたい。
【０１４０】
全体として、一部の実施形態においては、本方法の変換率は、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％である。一態様においては、変換率は、シークエンシングリードを生ずる、最初のライブラリーにおける標的化された一本鎖ポリヌクレオチドの割合である。
【０１４１】
前述の実施形態のいずれかにおいては、方法は、被験体における疾患または状態の診断および／もしくは予後、被験体の処置に対する応答性を予測すること、疾患／状態もしくは処置についての薬理遺伝学マーカーを同定すること、ならびに／または遺伝情報について集団をスクリーニングすることのために使用することができる。一態様においては、疾患または状態は、がんまたは新生物であり、処置は、がんまたは新生物処置である。
【０１４２】
変異体ＤＮＡ分子は、非常に特異的であるため、がん関連バイオマーカーに優るユニークな利点を提供する。変異は、個々の正常細胞において低率（約１０−９〜１０−１０個の変異／ｂｐ／世代）で起こるが、そのような変異は、全正常ＤＮＡのうちのわずかな割合であるので、ある特定の技術法の検出限界未満の桁である。いくつかの研究により、変異体ＤＮＡは、ＣＲＣ患者の便、尿および血液中で検出され得ることが示されている（ＯｓｂｏｒｎおよびＡｈｌｑｕｉｓｔ、Ｓｔｏｏｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ２００５年；１２８巻：１９２〜２０６頁）。
【０１４３】
本明細書のシークエンシング結果に基づいて、患者における循環腫瘍ＤＮＡの検出を行うことができ、がんの診断および腫瘍再発についての予測を行うことができる。この予測に基づいて、処置およびサーベイランスの決定を行うことができる。例えば、将来の再発を示す循環腫瘍ＤＮＡにより、追加のまたはより積極的な療法、ならびに追加のまたはより精巧な画像化およびモニタリングを行い得る。循環ＤＮＡは、腫瘍に対して異所性のＤＮＡを指す。
【０１４４】
ｃｔＤＮＡについてモニタリングすることができる試料として、血液および便が挙げられる。血液試料は、例えば、血液の画分、例として、血清または血漿であってもよい。同様に、便は、ＤＮＡを他の構成成分から精製するために分画してもよい。腫瘍試料を使用して、腫瘍の体細胞変異遺伝子を同定し、これは、体内の他の場所において腫瘍マーカーとして使用することができる。したがって、例として、腫瘍における特定の体細胞変異は、当技術分野で公知の任意の標準の手段によって同定することができる。典型的な手段として、対立遺伝子特異的プローブ、対立遺伝子特異的増幅、プライマー伸長などを使用する、腫瘍ＤＮＡの直接的なシークエンシングが挙げられる。体細胞変異が特定されると、それを身体の他の区画において使用して、腫瘍由来ＤＮＡを身体の他の細胞由来のＤＮＡと区別することができる。体細胞変異は、それらが同じ患者の身体の正常組織において存在しないことを決定することによって確認される。この様式で診断および／またはモニタリングすることができる腫瘍のタイプは、事実上無制限である。細胞および／またはＤＮＡを血液もしくは便または他の体液に放出する任意の腫瘍を使用することができる。そのような腫瘍として、結腸直腸腫瘍に加えて、乳房、肺、腎臓、肝臓、膵臓、胃、脳、頭頸部、リンパ管、卵巣、子宮、骨、血液などの腫瘍が挙げられる。
【０１４５】
一態様においては、本明細書で開示する方法は、シークエンシングにおける、および／または標的配列の１つもしくは複数の領域のエピジェネティック状態（ｓｔａｔｕｓ／ｓｔａｔｅ）の決定における使用のためのライブラリーを構築するために使用することができる。ＤＮＡメチル化は、最初は、発見されたエピジェネティックな目印であった。エピジェネティックスは、根底にあるＤＮＡ配列における変化以外の機構によって引き起こされた遺伝子発現または細胞表現型における変化の研究である。メチル化は主に、ジヌクレオチドＣｐＧのシトシン残基の炭素５位へのメチル基の付加に関し、転写活性の抑制または阻害と関連付けられる。
【０１４６】
亜硫酸水素塩変換は、ＤＮＡのメチル化パターンを決定するための、ＤＮＡを処理する亜硫酸水素塩試薬の使用である。ＤＮＡの亜硫酸水素塩での処理は、シトシン残基をウラシルに変換するが、５−メチルシトシン残基は影響を受けずに残る。したがって、亜硫酸水素塩処理は、ＤＮＡ配列において、個々のシトシン残基のメチル化状態に依存する特定の変化を導入する。この情報を検索するために、例えば、亜硫酸水素塩変換から生ずる一塩基多型（ＳＮＰ）を区別するために、変化した配列について様々な解析を行うことができる。すべて参照により本明細書に組み込む、米国特許第７，６２０，３８６号、同第９，３６５，９０２号および米国特許出願公開第２００６／０１３４６４３号は、亜硫酸水素塩変換により変更された配列の検出についての当業者に公知の方法を例示している。亜硫酸水素塩変換は、任意の好適な技術、手順または試薬を使用して行うことができる。一部の実施形態においては、亜硫酸水素塩変換は、以下のキットおよびキットで提供される手順：ＥｐｉＭａｒｋ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ３３１８Ｓ；ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５００１；ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＥＣＯＶ５０；ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｇｏｌｄ  Ｋｉｔ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５００５；ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｋｉｔ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５０２０；ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５０３０Ｔ；ＥｐｉＪＥＴ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ１４６１；またはＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、５９１０４のいずれかを使用して行うことができる。
【０１４７】
上記に説明する通り、亜硫酸水素塩変換の１つの結果は、配列相補性の喪失のために、元の標的の二本鎖コンフォメーションが破壊されることである。このことは、二本鎖ライブラリーを構築するための伝統的方法については問題を引き起こし得るが、本方法は、一態様においては、ユニークに、シークエンシング解析のための亜硫酸水素塩変換試料から一本鎖ライブラリーを構築するのに適している。
【０１４８】
別の態様においては、本方法は、例えば、すべての目的についてその全体を参照により本明細書に組み込む、２０１７年４月１９日出願の「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖａｒｉａｎｃｅ  ａｎｄ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｔａｔｕｓ」という表題の米国仮出願第６２／４８７，４２２号（代理人整理番号７３７９９３０００１００）において説明されている通り、メチル化状態（ｓｔａｔｅ／ｓｔａｔｕｓ）を決定するための方法と組み合わせて使用することができる。一実施形態においては、試料を、脱リン酸化および／または変性ステップの前にメチル化感受性制限酵素（ＭＳＲＥ）と接触させ、その後、メチル化プロファイルを、本明細書で開示するライゲーションにより一本鎖ライブラリーを構築することによって解析する。
【０１４９】
Ｇ．  ライブラリー構築および／またはシークエンシングのためのキット
ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキットが、本明細書で別の態様において開示される。一実施形態においては、キットは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを含む。別の態様においては、キットは、複数のアダプターを含む。特定の態様においては、各アダプターは、３’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、アダプターの５’末端は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能である。さらに特定の態様においては、各アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含む。
【０１５０】
一態様においては、ライゲーション生成物のライブラリーを構築するためのキットは、ｓｓＤＮＡリガーゼおよび複数のアダプターを含んでもよく、各アダプターは、３’末端でのライゲーションを防止するためにブロックされており、一方で、アダプターの５’末端は、直鎖状一本鎖ライゲーション生成物を形成するために一本鎖ポリヌクレオチドへのライゲーションに利用可能であり、各アダプターは、一本鎖ポリヌクレオチドに目印を付けるＵＭＩ配列を含む。
【０１５１】
別の態様においては、キットは、試料からの二本鎖ポリヌクレオチドを変性させて一本鎖ポリヌクレオチドを得るための変性試薬をさらに含み得る。
【０１５２】
また別の態様においては、キットは、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））または古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１を含み得る。前述の実施形態のいずれかにおいては、キットは、ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱまたはＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑを含み得る。また、本キットは、他の好適なｓｓＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、切断型Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼを含み得る。
【０１５３】
一態様においては、キットは、ライゲーション反応のための密集剤をさらに含み得る。一態様においては、密集剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例として、ＰＥＧ４０００もしくはＰＥＧ６０００、デキストランおよび／またはフィコールを含む。
【０１５４】
別の態様においては、キットは、一本鎖ポリヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドに変換するための、各々が、アダプターに逆相補的であり、かつ／またはアダプターにハイブリダイズ可能な配列を含む、１組のプライマーをさらに含み得る。
【０１５５】
一態様においては、キットは、プライマーダイマーおよび／またはプライマー−アダプター二本鎖を除去するための試薬をさらに含み得る。
【０１５６】
別の態様においては、キットは、標的配列の配列情報を含む増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物を得るための、標的配列（例えば、ＥＧＦＲ遺伝子配列）に特異的な配列を含むプライマーをさらに含み得る。さらなる態様においては、キットは、増幅した直鎖状二本鎖ライゲーション生成物をシークエンシングするための、シークエンシングアダプターおよび／または試料特異的バーコードをさらに含み得る。
【０１５７】
また、上記のキット構成成分に基づく診断キットが提供され、それらは、被験体において疾患または状態、例えば、がんを診断するために使用することができる。別の態様においては、キットは、薬物、療法、処置またはそれらの組み合わせへの個体の応答を予測するために使用することができる。そのような試験キットは、被験体が医療提供者の助けなく、例えば、ｃｔＤＮＡの、試料を得るために使用することができるデバイスおよび指示を含み得る。
【０１５８】
上記に説明または示唆される適用における使用のために、また、キットまたは製造物品が提供される。そのようなキットは、疾患または状態についてのマーカーを遺伝子型決定するために特異的な少なくとも１つの試薬を含んでもよく、本明細書で説明する方法を実行するための指示をさらに含み得る。
【０１５９】
一部の実施形態においては、ポリヌクレオチドのまたはその任意の特定の部分の特異的増幅を可能にするプライマーおよびプライマー対、ならびに定性的にまたは定量的に、検出の目的のために核酸分子にまたはその任意の部分に選択的または特異的にハイブリダイズするプローブを含む、組成物およびキットが本明細書で提供される。プローブは、検出可能なマーカー、例として、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素で標識してもよい。そのようなプローブおよびプライマーは、試料中のポリヌクレオチドの存在を検出するために、およびポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質を発現する細胞を検出するための手段として、使用することができる。当業者によって理解されるように、非常に多くの様々なプライマーおよびプローブが、本明細書で提供される配列に基づいて調製され、ポリヌクレオチド、例として、ゲノムＤＮＡ、ｍｔＤＮＡおよびその断片を増幅する、クローニングするおよび／またはそれらの存在および／またはレベルを決定するために有効に使用され得る。
【０１６０】
一部の実施形態においては、キットは、ポリペプチドの存在を検出するための試薬をさらに含み得る。そのような試薬は、ポリペプチドに特異的に結合する抗体または他の結合分子であってもよい。一部の実施形態においては、そのような抗体または結合分子は、多型の結果としてのポリペプチドについての構造的変種を区別することができてもよく、したがって、遺伝子型決定するために使用してもよい。抗体または結合分子は、検出可能なマーカー、例として、例えば、放射性同位体、蛍光化合物、生物発光化合物、化学発光化合物、金属キレーターまたは酵素で標識してもよい。結合アッセイ、例として、ＥＬＩＳＡを行うための他の試薬をキットに含めてもよい。
【０１６１】
一部の実施形態においては、キットは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも５、少なくとも１０個またはそれよりも多いマーカーを遺伝子型決定するための試薬を含む。マーカーは、ポリヌクレオチドマーカー（例として、がん関連変異またはＳＮＰ）であっても、ポリペプチドマーカー（例として、過剰発現、またはタンパク質の高リン酸化もしくは低リン酸化を含む翻訳後修飾）であっても、それらの任意の組み合わせであってもよい。一部の実施形態においては、キットは、増幅した核酸の検出のための捕捉プローブのための表面または基材（例として、マイクロアレイ）をさらに含み得る。
【０１６２】
キットは、１つまたは複数の容器手段、例として、バイアル、管などを近接して拘束して受容するために区画化されている担体手段をさらに含んでもよく、容器手段の各々は、方法において使用される別々の要素のうちの１つを含む。例えば、容器手段の１つは、検出可能に標識された、または検出可能に標識され得るプローブを含んでもよい。そのようなプローブは、バイオマーカーに特異的なポリヌクレオチドであってもよい。また、キットは、標的核酸配列の増幅のためのヌクレオチドを含有する容器、および／またはレポーター分子、例として、酵素標識、蛍光標識もしくは放射性同位体標識に結合したレポーター手段を含む容器を有してもよい。
【０１６３】
キットは典型的に、上記の容器（複数可）、ならびに緩衝液、希釈剤、フィルター、針、シリンジおよび使用のための指示を有する添付文書を含む商業的観点およびユーザーの立場から望ましい材料を含む１つまたは複数の他の容器を含む。組成物が特定の療法または非療法的適用に使用されることを示すために、容器上に標識があってもよく、また、上記の使用のようなｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用いずれかについての手引きを示してもよい。
【０１６４】
キットは、組織または細胞または体液試料を調製し、試料から核酸（例として、ｃｔＤＮＡ）を調製するための１組の指示および材料をさらに含んでもよい。
【０１６５】
Ｈ．  さらなる例示的な実施形態
前述の実施形態のいずれかにおいては、ｓｓＤＮＡリガーゼは、ＴｈｅｒｍｕｓバクテリオファージＲＮＡリガーゼ、例として、バクテリオファージＴＳ２１２６  ＲＮＡリガーゼ（例えば、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ（商標）およびＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ＩＩ（商標））または古細菌ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ  ＲＮＡリガーゼ１であり得る。他の態様においては、ｓｓＤＮＡリガーゼは、ＲＮＡリガーゼ、例として、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２０４Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２３９Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２４２Ｓ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱ、例えば、Ｍ０３７３ＳまたはＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０３５１Ｓである。前述の実施形態のいずれかにおいては、また、ｓｓＤＮＡリガーゼは、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０３１９ＳまたはＴ４  ＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２０２Ｓであり得る。
【０１６６】
一部の実施形態においては、本方法は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを使用して１組のアダプターを一本鎖ポリヌクレオチドのライブラリーにライゲーションすることを含む。本明細書で開示するｓｓＤＮＡリガーゼを含む任意の好適なｓｓＤＮＡリガーゼを使用することができる。アダプターは、任意の好適なレベルまたは濃度、例えば、約１μＭ〜約１００μＭ、例として、約１μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭもしくは１００μＭまたはそれらの任意の部分範囲で使用することができる。アダプターは、任意の好適な配列もしくは塩基を含むか、または任意の好適な配列もしくは塩基で始まってもよい。例えば、アダプター配列は、塩基のすべての２ｂｐの組み合わせで始まることができる。
【０１６７】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、密集剤の存在下で行ってもよい。一態様においては、密集剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例として、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００もしくはＰＥＧ８０００、デキストランおよび／またはフィコールを含む。密集剤、例えば、ＰＥＧは、任意の好適なレベルまたは濃度で使用することができる。例えば、密集剤、例えば、ＰＥＧは、約０％（ｗ／ｖ）〜約２５％（ｗ／ｖ）のレベルまたは濃度で、例えば、約０％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）、２％（ｗ／ｖ）、３％（ｗ／ｖ）、４％（ｗ／ｖ）、５％（ｗ／ｖ）、６％（ｗ／ｖ）、７％（ｗ／ｖ）、８％（ｗ／ｖ）、９％（ｗ／ｖ）、１０％（ｗ／ｖ）、１１％（ｗ／ｖ）、１２％（ｗ／ｖ）、１３％（ｗ／ｖ）、１４％（ｗ／ｖ）、１５％（ｗ／ｖ）、１６％（ｗ／ｖ）、１７％（ｗ／ｖ）、１８％（ｗ／ｖ）、１９％（ｗ／ｖ）、２０％（ｗ／ｖ）、２１％（ｗ／ｖ）、２２％（ｗ／ｖ）、２３％（ｗ／ｖ）、２４％（ｗ／ｖ）もしくは２５％（ｗ／ｖ）またはそれらの任意の部分範囲で使用することができる。
【０１６８】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、任意の好適な期間の間、行ってもよい。例えば、ライゲーション反応は、約２〜約１６時間の期間の間、％、例えば、約２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間もしくは１６時間またはその任意の部分範囲の間、行うことができる。
【０１６９】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応中のｓｓＤＮＡリガーゼは、任意の好適な体積で使用してもよい。例えば、ライゲーション反応中のｓｓＤＮＡリガーゼは、約０．５μｌ〜約２μｌの体積で、％、例えば、約０．５μｌ、０．６μｌ、０．７μｌ、０．８μｌ、０．９μｌ、１μｌ、１．１μｌ、１．２μｌ、１．３μｌ、１．４μｌ、１．５μｌ、１．６μｌ、１．７μｌ、１．８μｌ、１．９μｌもしくは２μｌまたはその任意の部分範囲で使用することができる。
【０１７０】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、ライゲーションエンハンサー、例えば、ベタインの存在下で行ってもよい。ライゲーションエンハンサー、例えば、ベタインは、任意の好適な体積、例えば、約０μｌ〜約１μｌで、例えば、約０μｌ、０．１μｌ、０．２μｌ、０．３μｌ、０．４μｌ、０．５μｌ、０．６μｌ、０．７μｌ、０．８μｌ、０．９μｌ、１μｌまたはその任意の部分範囲で使用することができる。
【０１７１】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：１×反応緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ）、２５％（ｗｔ／ｖｏｌ）ＰＥＧ８０００、１ｍＭヘキサミン塩化コバルト（必要に応じて）、１μｌ（１０ユニット）Ｔ４  ＲＮＡリガーゼおよび１ｍＭ  ＡＴＰ中で、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼＩ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴ４  ＲＮＡリガーゼＩ、Ｍ０２０４Ｓを使用して行うことができる。反応を、２５℃で１６時間インキュベートしてもよい。反応は、４０μｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することによって停止してもよい。
【０１７２】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：ｓｓＤＮＡ／ＲＮＡ基質２０ｐｍｏｌ（１ｐｍｏｌ／μｌ）、５’Ａｐｐ  ＤＮＡオリゴヌクレオチド４０ｐｍｏｌ（２ｐｍｏｌ／μｌ）、１０×ＮＥ緩衝液１（２μｌ）、５０ｍＭ  ＭｎＣｌ２（ｓｓＤＮＡライゲーションのみのため）（２μｌ）、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ（２μｌ（４０ｐｍｏｌ））およびヌクレアーゼ非含有水（全部で２０μｌになるように）中で、熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからの熱安定性５’Ａｐｐ  ＤＮＡ／ＲＮＡリガーゼ、Ｍ０３１９Ｓを使用して行うことができる。反応を、６５℃で１時間インキュベートしてもよい。反応は、９０℃で３分間加熱することによって停止してもよい。
【０１７３】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（２μｌ）、酵素（１μｌ）、ＰＥＧ（１０μｌ）、ＤＮＡ（１μｌ）、アダプター（２μｌ）および水（４μｌ）中で、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２、Ｍ０２３９Ｓを使用して行うことができる。反応を、２５℃で１６時間インキュベートしてもよい。反応は、６５℃で２０分間加熱することによって停止してもよい。
【０１７４】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（２μｌ）、酵素（１μｌ）、ＰＥＧ（１０μｌ）、ＤＮＡ（１μｌ）、アダプター（２μｌ）および水（４μｌ）中で、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型、Ｍ０２４２Ｓを使用して行うことができる。反応を、２５℃で１６時間インキュベートしてもよい。反応は、６５℃で２０分間加熱することによって停止してもよい。
【０１７５】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（２μｌ）、酵素（１μｌ）、ＰＥＧ（１０μｌ）、ＤＮＡ（１μｌ）、アデニル化アダプター（０．７２μｌ）および水（５．２８μｌ）中で、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型Ｋ２２７Ｑ、Ｍ０３５１Ｓを使用して行うことができる。反応を、２５℃で１６時間インキュベートしてもよい。反応は、６５℃で２０分間加熱することによって停止してもよい。
【０１７６】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（２μｌ）、酵素（１μｌ）、ＰＥＧ（１０μｌ）、ＤＮＡ（１μｌ）、アデニル化アダプター（０．７２μｌ）および水（５．２８μｌ）中で、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２切断型ＫＱ、Ｍ０３７３Ｓを使用して行うことができる。反応を、２５℃で１６時間インキュベートしてもよい。反応は、６５℃で２０分間加熱することによって停止してもよい。
【０１７７】
一部の実施形態においては、ライゲーション反応は、以下の例示的な反応混合物（２０μｌ）：Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液（２μｌ）、酵素（１μｌ）、ＰＥＧ（１０μｌ）、ＤＮＡ（１μｌ）、アデニル化アダプター（０．７２μｌ）および水（５．２８μｌ）中で、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＴ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｍ０２０２Ｓを使用して行うことができる。反応を、１６℃で１６時間インキュベートしてもよい。反応は、６５℃で１０分間加熱することによって停止してもよい。
【０１７８】
第２鎖合成ステップは、任意の好適な酵素を使用して行うことができる。例えば、第２鎖合成ステップは、Ｂｓｔポリメラーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２７５ＳまたはＫｌｅｎｏｗ断片（３’−＞５’エキソ−）、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２１２Ｓを使用して行うことができる。
【０１７９】
一部の実施形態においては、第２鎖合成ステップは、以下の例示的な反応混合物（１０μｌ）：水（１．５μｌ）、プライマー（０．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１μｌ）、ＴｈｅｒｍｏＰｏｌ反応緩衝液（５μｌ）およびＢｓｔ（２μｌ）中で、Ｂｓｔポリメラーゼ、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２７５Ｓを使用して行うことができる。反応は、６２℃で２分間および６５℃で３０分間インキュベートしてもよい。反応後、二本鎖ＤＮＡ分子を、さらに精製してもよい。
【０１８０】
一部の実施形態においては、第２鎖合成ステップは、以下の例示的な反応混合物（１０μｌ）：水（０．５μｌ）、プライマー（０．５μｌ）、ｄＮＴＰ（１μｌ）、ＮＥＢ緩衝液（２μｌ）およびエキソ−（３μｌ）中で、Ｋｌｅｎｏｗ断片（３’−＞５’エキソ−）、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍ０２１２Ｓを使用して行うことができる。反応は、３７℃で５分間および７５℃で２０分間インキュベートしてもよい。反応後、二本鎖ＤＮＡ分子を、さらに精製してもよい。
【０１８１】
第２鎖合成後であるが、最初のまたは半標的化ＰＣＲの前に、二本鎖ＤＮＡを精製してもよい。二本鎖ＤＮＡは、任意の好適な技術または手順を使用して精製することができる。例えば、二本鎖ＤＮＡは、以下のキット：Ｚｙｍｏ  ｃｌｅａｎ  ａｎｄ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ、Ｚｙｍｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ４１０３；Ｑｉａｑｕｉｃｋ、Ｑｉａｇｅｎ、２８１０４；Ｚｙｍｏ  ｓｓＤＮＡ精製キット、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ７０１０；Ｚｙｍｏオリゴ精製キット、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ４０６０；およびＡｍｐｕｒｅＸＰビーズ、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ａ６３８８２：１．２×〜４×ビーズ比のいずれかを使用して精製することができる。
【０１８２】
最初のまたは半標的化ＰＣＲは、任意の好適な酵素または反応条件を使用して行うことができる。例えば、ポリヌクレオチドまたはＤＮＡ鎖は、約５２℃〜約７２℃の範囲の温度で、例えば、約５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃、６１℃、６２℃、６３℃、６４℃、６５℃、６６℃、６７℃、６８℃、６９℃、７０℃、７１℃もしくは７２℃またはその任意の部分範囲でアニールすることができる。最初のまたは半標的化ＰＣＲは、任意の好適な回数のサイクルにわたって行うことができる。例えば、最初のまたは半標的化ＰＣＲは、１０〜４０サイクルにわたって、例えば、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９または４０サイクルにわたって行うことができる。プライマープールは、任意の好適な濃度で使用することができる。例えば、プライマープールは、約５ｎＭ〜約２００ｎＭの範囲の濃度で、例えば、約５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１１０ｎＭ、１２０ｎＭ、１３０ｎＭ、１４０ｎＭ、１５０ｎＭ、１６０ｎＭ、１７０ｎＭ、１８０ｎＭ、１９０ｎＭもしくは２００ｎＭまたはその任意の部分範囲で使用することができる。
【０１８３】
最初のまたは半標的化ＰＣＲは、任意の好適な温度サイクル条件を使用して行うことができる。例えば、最初のまたは半標的化ＰＣＲは、以下のサイクル条件：９５℃  ３分間、（９５℃  １５秒間、６２℃  ３０秒間、７２℃  ９０秒間）×３もしくは×５、または（９５℃  １５秒間、７２℃  ９０秒間）×２３もしくは×２１、７２℃  １分間、その後永久に４℃のいずれかを使用して行うことができる。
【０１８４】
一部の実施形態においては、最初のまたは半標的化ＰＣＲは、以下の例示的な反応混合物（５０μｌ）：ＤＮＡ（２μｌ）、ＫＡＰＡＳＹＢＲ（２５μｌ）、プライマープール（各々２６ｎＭ）（１０μｌ）、Ａプライマー（１００μＭ）（０．４μｌ）および水（１２．６μｌ）中で、ＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ  ＦＡＳＴ、例えば、ＫＡＰＡ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＫＫ４６００を使用して行うことができる。最初のまたは半標的化ＰＣＲは、以下のサイクル条件：９５℃  ３０秒間、（９５℃  １０秒間、５０〜５６℃  ４５秒間、７２℃  ３５秒間）×４０のいずれかを使用して行うことができる。
【０１８５】
一部の実施形態においては、最初のまたは半標的化ＰＣＲは、以下の例示的な反応混合物（５０μｌ）：ＤＮＡ（１５μｌ）、ＫＡＰＡＨｉＦｉ（２５μｌ）、プライマープール（各々２６ｎＭ）（１０μｌ）およびＡプライマー（１００μＭ）（０．４μｌ）中で、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ、例えば、ＫＡＰＡ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＫＫ２６０１を使用して行うことができる。最初のまたは半標的化ＰＣＲは、以下のサイクル条件：９５℃  ３分間、（９８℃  ２０秒間、５３〜５４℃  １５秒間、７２℃  ３５秒間）×１５、７２℃  ２分間、その後永久に４℃のいずれかを使用して行うことができる。
【０１８６】
亜硫酸水素塩変換は、任意の好適な技術、手順または試薬を使用して行うことができる。一部の実施形態においては、亜硫酸水素塩変換は、以下のキットおよびキットで提供される手順：ＥｐｉＭａｒｋ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｅ３３１８Ｓ；ＥＺ  ＤＮＡ  ＭＥＴＨＹＬＡＴＩＯＮ  ＫＩＴ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５００１；ＭｅｔｈｙｌＣｏｄｅ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＥＣＯＶ５０；ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｇｏｌｄ  Ｋｉｔ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５００５；ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｋｉｔ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５０２０；ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  Ｋｉｔ、Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｄ５０３０Ｔ；ＥｐｉＪＥＴ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋ１４６１；またはＥｐｉＴｅｃｔ  Ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  Ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ、５９１０４のいずれかを使用して行うことができる。
【０１８７】
一部の実施形態においては、ＤＮＡ分子は、一本鎖ポリヌクレオチドを構築するためのステップ、一本鎖ポリヌクレオチドライブラリーの二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーへの変換のためのステップ、二本鎖ポリヌクレオチドライブラリーの半標的化増幅のためのステップおよび配列ライブラリーの構築のためのステップを含む、実施例４で例示する手順を使用して調製することができる。そのようなＤＮＡ分子は、任意の好適な方法または手順を使用してメチル化状態についてさらに解析してもよい。
【実施例】
【０１８８】
Ｉ．  実施例
（実施例１）
この実施例においては、鋳型（例えば、シークエンシングされるポリヌクレオチド）は、約２００ｂｐ長未満の短いＤＮＡ断片である。これらのＤＮＡ断片は、血漿から抽出したＤＮＡ、（例えば、断片化酵素（ｆｒａｇｍｅｎｔａｓｅ）によって）酵素処理したゲノムＤＮＡまたは物理的に剪断したＤＮＡを含み得る。物理的に剪断したＤＮＡは、末端修復してもよい。特定の態様においては、鋳型は、ライゲーションのための３’ヒドロキシル基を有する。
【０１８９】
典型的に、１０〜３０ｎｇの適切に調製した鋳型ＤＮＡを、例えば、１００ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、２０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ＤＴＴおよび５ｍＭ  ＭｎＣｌ２中で３７℃にて１０分間、１ＵのＦａｓｔＡＰ熱感受性アルカリホスファターゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して脱リン酸化した。その後、ＤＮＡを、例えば、９５℃で２分間変性させ、氷上に１分間置いた。
【０１９０】
一本鎖アダプターを、５’ホスフェート基および３’炭素スペーサーを伴って、ＩＤＴで合成した。５’末端は、ＧＡ、およびそれに続く１２ｍｅｒのユニーク分子識別子（ＵＭＩ）配列を含有する。典型的な一本鎖アダプターは、以下の配列：／５ホス／ＧＡＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＡＧＡＴＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＴＣＧＴＧＴＡＧＧＧＡＡＡＧＡＧＴＧ／３ＳｐＣ３／（「５ホス」は５’ホスフェート基を表し、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」は１２ｍｅｒ  ＵＭＩ配列を表し、「３ＳｐＣ３」は３’炭素スペーサーを表す）を有する。
【０１９１】
その後、脱リン酸化した一本鎖ＤＮＡを鋳型として使用して、ライゲーション反応を行った。ライゲーション反応において以下の最終濃度：５０ｍＭ  ＭＯＰＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴおよび２．５ｍＭ  ＭｎＣｌ２、５０％  ＰＥＧ４０００、０．５μＭアダプター、１２５μＭ  ＡＴＰならびに２００Ｕ  Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ（商標）を使用した。反応を、６０℃で２時間、８０℃で１０分間、８５℃で２分間インキュベートし、４℃で維持した。
【０１９２】
その後、以前の反応体積を以下のもの：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．２５Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）、１μＭ逆相補的プライマー（アダプターに逆相補的なプライマー）および２００μＭ  ｄＮＴＰミックスに添加することによって、ＤＮＡを二本鎖にした。反応を、９５℃で３０秒間、６２℃で２分間、６８℃で１０分間インキュベートし、４℃で維持した。典型的な逆相補的プライマーは、配列番号３：ＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣ（５’〜３’）で示される配列を含む。以下のものは、アダプターと逆相補的プライマーとのアラインメントである：
【化１】
2020517298.tif 000003
【０１９３】
その後、１．６（ビーズ比）×ＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズを使用して、反応を精製した。ビーズを添加し、１０分間インキュベートした。その後、混合物を磁石に移して、５分間置いた。その後、上清を除去した。ビーズを、１５０μＬの８０％エタノールで２回、各３０秒間洗浄した。その後、すべての残留エタノールを除去し、ビーズを磁石から外して室温で３分間乾燥させた。１５μｌの低ＴＥ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）をビーズに添加し、２分間インキュベートした。その後、ビーズを磁石に戻して１分間置いた。上清を除去し、次の反応のために保存した。一態様においては、ビーズ比は、精製プロセスにおいてサイズ選択性をもたらし、約１００ｂｐより短い分子を除去するビーズ比（例として、１．６倍）が選択され得る。
【０１９４】
１組のＰＣＲプライマーを、プライマー−プライマー相互作用およびオフターゲットアニーリングを最小限にするように設計した。プライマーを、特定のバリアントに近接して配置するようにさらに最適化した。設計後、ＩＤＴによってプライマーを合成した。プライマーを等しい体積比で混合してプライマープールにした。半標的化ＰＣＲ反応を、以下の試薬：以前の反応からのすべての精製ＤＮＡ、１×ＫＡＰＡ  ２Ｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘマスターミックス、プールからの６６ｎＭの各プライマーおよび８００ｎＭ逆相補的プライマーで行った。反応を、以下の熱サイクリングプログラム：９５℃  ３分間、（９５℃  １５秒間、７２℃  ９０秒間）×２０、７２℃  １分間に供し、４℃で維持した。
【０１９５】
その後、１．６（ビーズ比）×ＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズを使用して、反応を精製した。ビーズを添加し、１０分間インキュベートした。その後、混合物を磁石に移して、５分間置いた。その後、上清を除去した。ビーズを、１５０μＬの８０％エタノールで２回、各３０秒間洗浄した。その後、すべての残留エタノールを除去し、ビーズを磁石から外して室温で３分間乾燥させた。２０μｌの低ＴＥ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）をビーズに添加し、２分間インキュベートした。その後、ビーズを磁石に戻して１分間置いた。上清を除去し、次の反応のために保存する。遊離アダプター分子、遊離プライマー分子および／またはアダプター／プライマーダイマーを含む、約１００ｂｐより短い分子を除去するビーズ比（例として、１．６倍）が選択され得る。
【０１９６】
その後、全長シークエンシングアダプターおよび試料特異的バーコードを付加するための別のＰＣＲ反応を完了した。ＰＣＲ反応は、以下のもの：以前の反応からの２μＬの精製ＤＮＡ、１×ＮＥＢ  ｕｌｔｒａ  Ｑ５  ＩＩマスターミックス、４００ｎＭユニバーサルプライマーおよび４００ｎＭバーコード特異的プライマーを含有した。反応を、以下の熱サイクリングプログラム：９５℃  ３分間、（９８℃  １０秒間、６５℃  ７５秒間）×１０、６５℃  ２分間に供し、４℃で維持した。
【０１９７】
その後、０．８（ビーズ比）×ＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズを使用して、反応を精製した。ビーズを添加し、１０分間インキュベートした。その後、混合物を磁石に移して、５分間置いた。その後、上清を除去した。ビーズを、１５０μＬの８０％エタノールで２回、各３０秒間洗浄した。その後、すべての残留エタノールを除去し、ビーズを磁石から外して室温で３分間乾燥させた。２５μｌの低ＴＥ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）をビーズに添加し、２分間インキュベートする。その後、ビーズを磁石に戻して１分間置いた。上清を除去し、シークエンシングのために準備する。約２００ｂｐより短い分子の大部分を除去するビーズ比（例として、０．８倍）が選択され得る。
【０１９８】
（実施例２）
この実施例においては、公知のバリアントを含むゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）試料および血漿試料の両方を、１０ｎｇおよび２０ｎｇインプットを使用して試験した。ｇＤＮＡ試料は、一塩基多様性（ＳＮＶ：「一塩基変化」、ＳＮＣと互換的に使用される）、インデル、ＣＮＶおよび融合を含有した。各バリアントを、様々な対立遺伝子率：５％、１％、０．５％および０．１％でコールした。各変異型についての各対立遺伝子率における感度および特異性を測定した。ここで使用したプライマープールを、表１に示す。各標的特異的プライマーは、プール全体について同じ体積比で、または異なる体積比で使用することができる。例えば、体積比２のプライマーについては、そのプライマーは、比１のプライマーの２倍の体積で添加される。
【０１９９】
【表１−１】
2020517298.tif 000004
【表１−２】
2020517298.tif 000005
【表１−３】
2020517298.tif 000006
【表１−４】
2020517298.tif 000007
【表１−５】
2020517298.tif 000008
【表１−６】
2020517298.tif 000009
【表１−７】
2020517298.tif 000010
【表１−８】
2020517298.tif 000011
【表１−９】
2020517298.tif 000012
【表１−１０】
2020517298.tif 000013
【表１−１１】
2020517298.tif 000014
【表１−１２】
2020517298.tif 000015
【表１−１３】
2020517298.tif 000016
【表１−１４】
2020517298.tif 000017
【０２００】
一態様においては、本方法は、ある特定の遺伝子座における感度の増大を達成し得る。以下の表２において、本方法を、従来型ハイブリッド捕捉法と比較する。本方法は、ハイブリッド捕捉が捉え損ねたいくつかの遺伝子座をコールしており、このことは、本方法の変換率の増大に直接関連している。
【０２０１】
【表２】
2020517298.tif 000018
【０２０２】
約８０％の非常に高いライゲーション効率が達成され、標準ライブラリー（複数）の、それぞれ、約２５％および１０％と比較して、約６０％の変換率をもたらした。本方法の例示的な変換率を、表３に示す。
【０２０３】
【表３−１】
2020517298.tif 000019
【表３−２】
2020517298.tif 000020
【表３−３】
2020517298.tif 000021
【０２０４】
図６で示す通り、分布は、ハイブリッド捕捉よりも、本方法で、変換率が顕著に高くなっていることを示す。この実施例においては、従来型ハイブリダイゼーション捕捉法が、約４７％の変換率を達成し得る一方で、本方法は、約８８％の非常に高い変換率を達成する。この顕著により高い変換率、および単一の反応で数百の遺伝子座にわたり多重化する能力によって、本方法は、とりわけ、非常に低い対立遺伝子率を有する試料、例として、がん関連ＳＮＰおよび／または変異を有するｃｔＤＮＡについては、ポリヌクレオチドの高スループットおよび高精度シークエンシングおよび解析のために理想的なものとなっている。
【０２０５】
加えて、非常に小さい標的領域（約３０，０００塩基）についてのオンターゲット率は、最大で７０％であり、標準ライブラリーについての約２０００倍の濃縮係数と比較して、４０，０００倍を超える濃縮係数をもたらす。効率の改善は、より大きな感度をもたらし、多くのバリアントにおいて０．１％に至る正確なコールを可能にした。ＳＮＶ、インデル、ＣＮＶおよび融合は、正確にコールされた。さらに、手順は非常に堅固であり、０％の失敗率を有する。
【０２０６】
（実施例３）
この実施例においては、例えば、循環腫瘍ＤＮＡから、一塩基変化（ＳＮＣ）、インデル、コピー数多型（ＣＮＶ）および融合を調べるために、抽出した血漿ＤＮＡからライブラリーを構築するための方法を説明する。この実施例の原理として、（例えば、ヒトから）抽出した血漿ＤＮＡを、脱リン酸化および変性させる。一本鎖ＤＮＡライゲーションにより、ユニバーサルアダプターを各分子の３’末端に付加する。その後、部位特異的プライマーおよびアダプターに対する逆相補的プライマーを使用して、ＤＮＡを半標的化ＰＣＲに供する。全長アダプターおよびバーコードを各分子に付加する二次的ＰＣＲによりライブラリーを作製する。
【０２０７】
この実施例で使用される設備、材料および供給品として：Ｖｅｒｉｔｉ  Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ、９６ウェル磁石、９６ウェル氷ブロック、Ｖｏｒｔｅｘｅｒ、プレートミニ遠心分離器、Ｓｅｍｉ−ｓｋｉｒｔｅｄ  ９６ウェルＰＣＲプレート、プレートシール、ピペットおよびピペットチップがある。
【０２０８】
この実施例で使用される試薬および媒体として、ヌクレアーゼ非含有水（Ａｍｂｉｏｎ／Ｔｈｅｒｍｏ：ＡＭ９９３９）、低ＴＥ緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  ｆｉｓｈｅｒ：１２０９００１５）、Ｃｉｒｃｌｉｇａｓｅ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ：ＣＬ４１１５Ｋ）、ＦａｓｔＡＰ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ：ＥＦ０６５１）、５０％ＰＥＧ４０００（Ｓｉｇｍａ：９５９０４−２５０ｇ−Ｆ、ヌクレアーゼ非含有水Ａｍｂｉｏｎ／Ｔｈｅｒｍｏ：ＡＭ９９３９中で１０ｍＬ中５ｇを希釈する）、１０μＭ  Ｎ１２アダプター（ＩＤＴ）、Ｔａｑポリメラーゼ（ＮＥＢ：Ｍ０２７３Ｓ）、ｄＮＴＰミックス（ＮＥＢ：Ｎ０４４７Ｌ）、標準Ｔａｑ緩衝液（ＮＥＢ：Ｍ０２７３Ｓ）、Ａｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ａｇｉｎｃｏｕｒｔ／Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ：Ａ６３８８１）、１００μＭ逆相補的プライマー（ＩＤＴ）、プライマーミックス（ＩＤＴ）、ＫＡＰＡ  ２Ｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ（ＫＡＰＡ：ＫＫ５８０２）、ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｕｌｔｒａ  Ｑ５  ＩＩ（ＮＥＢ：Ｍ０５４４Ｌ）および１０μＭ  ＮＥＢＮｅｘｔ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｏｌｉｇｏｓ（ＩＤＴ）がある。
【０２０９】
手順
脱リン酸化：
１．以下のマスターミックスを作製する：
【表４】
2020517298.tif 000022
２．マスターミックスおよびＤＮＡを９６ウェルプレートに添加する。
３．プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
４．以下のプログラム：３７℃  １０分間、９５℃  ２分間を行う。
５．直後に、プレートを９６ウェル氷ブロック上に１分間置き、その後、プレートを除去して、以下のライゲーションを即座に続ける。
【０２１０】
ライゲーション：
１．以下のマスターミックスを作製する：
【表５】
2020517298.tif 000023
２．１８μｌのマスターミックスを脱リン酸化からの生成物に直接添加する。
３．プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
４．以下のプログラム：６０℃  ２時間、８０℃  １０分間、８５℃  ２分間、４℃で維持を行う。
５．以下の第２鎖合成に即座に進める。
【０２１１】
第２鎖合成：
１．以下のマスターミックスを作製する：
【表６】
2020517298.tif 000024
２．１０μｌのマスターミックスをライゲーション生成物に直接添加する。
３．プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
４．以下のプログラム：９５℃  ３０秒間、６２℃  ２分間、６８℃  １０分間、４℃で維持を行う。
５．以下のＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズクリーンアップに即座に進める。
【０２１２】
ＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズクリーンアップ：
１．ＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ビーズを、溶液が均一になるまでボルテックスする。
２．８０μｌのビーズを第２鎖合成からの生成物に添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
３．室温で１０分間インキュベートする。
４．プレートを磁石に移し、磁石上で５分間またはすべてのビーズが磁石に向かって移動するまでインキュベートする。
５．すべての上清を除去する。
６．１５０μＬの８０％  ＥｔＯＨを添加し、３０秒間インキュベートする。
７．上清を除去する。
８．ステップ６〜７を繰り返す。
９．すべての残留エタノールが除去されたことを確実にし、プレートを磁石から除去し、室温で３分間インキュベートする。
１０．１６μｌの低ＴＥ緩衝液を添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
１１．室温で２分間インキュベートする。
１２．プレートを磁石に移し、磁石上で１分間またはすべてのビーズが磁石に移動するまでインキュベートする。
１３．１５μｌの上清を取り出し、それをきれいなプレートに入れる。
１４．以下の第１ＰＣＲに進めるか、または−２０℃で保存する。
【０２１３】
第１ＰＣＲ：
１．以下のマスターミックスを作製する：
【表７】
2020517298.tif 000025
２．３５μｌのマスターミックスを１５μｌの精製ＤＮＡに添加する。
３．プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
４．以下のプログラム：９５℃  ３分間、（９５℃  １５秒間、７２℃  ９０秒間）×２０、７２℃  １分間、４℃で維持を行う。
５．以下のＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズクリーンアップに即座に進める。
【０２１４】
ＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズクリーンアップ
１．ＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズを、溶液が均一になるまでボルテックスする。
２．８０μｌのビーズを第２鎖合成からの生成物に添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
３．室温で１０分間インキュベートする。
４．プレートを磁石に移し、磁石上で５分間またはすべてのビーズが磁石に向かって移動するまでインキュベートする。
５．すべての上清を除去する。
６．１５０μＬの８０％  ＥｔＯＨを添加し、３０秒間インキュベートする。
７．上清を除去する。
８．ステップ６〜７を繰り返す。
９．すべての残留ＥｔＯＨが除去されたことを確実にし、プレートを磁石から除去し、室温で３分間インキュベートする。
１０．２０μｌの低ＴＥ緩衝液を添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
１１．室温で２分間インキュベートする。
１２．プレートを磁石に移し、磁石上で１分間またはすべてのビーズが磁石に移動するまでインキュベートする。
１３．１９μｌの上清を取り出し、それをきれいなプレートに入れる。
１４．以下の第２ＰＣＲに進めるか、または−２０℃で保存する。
【０２１５】
第２ＰＣＲ
１．以下のマスターミックスを作製し、インデックスプライマーおよびＤＮＡを別々に添加することに留意し、残りのＤＮＡは−２０℃で保存する：
【表８】
2020517298.tif 000026
２．新しいプレートに、４６μＬのマスターミックス、２μＬのインデックスプライマーおよび２μＬのＤＮＡを添加する。
３．プレートを密閉して、軽くボルテックスし、スピンダウンする。
４．以下のプログラム：９５℃  ３分間、（９８℃  １０秒間、６５℃  ７５秒間）×１０、６５℃  ２分間、４℃で維持を行う。
５．以下のビーズクリーンアップに即座に進める。
【０２１６】
ＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ＸＰビーズクリーンアップ
１．ＡｍＰｕｒｅ（登録商標）ビーズを、溶液が均一になるまでボルテックスする。
２．４０μｌのビーズを第２鎖合成からの生成物に添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
３．室温で１０分間インキュベートする。
４．プレートを磁石に移し、磁石上で５分間またはすべてのビーズが磁石に向かって移動するまでインキュベートする。
５．すべての上清を除去する。
６．１５０μＬの８０％  ＥｔＯＨを添加し、３０秒間インキュベートする。
７．上清を除去する。
８．ステップ６〜７を繰り返す。
９．すべての残留ＥｔＯＨが除去されたことを確実にし、プレートを磁石から除去し、室温で３分間インキュベートする。
１０．２５μｌの低ＴＥ緩衝液を添加し、ピペットで吸引・排出してビーズをホモジナイズする。
１１．室温で２分間インキュベートする。
１２．プレートを磁石に移し、磁石上で１分間またはすべてのビーズが磁石に移動するまでインキュベートする。
１３．２４μｌの上清を取り出し、きれいなプレートに入れて−２０℃で保存する。
【０２１７】
ＬａｂＣｈｉｐ  ＱＣ
ＬａｂＣｈｉｐ  ＨＳキットについて
１．ＬａｂＣｈｉｐおよび試薬を４℃から取り出し、ＲＴまで平衡化する（１０分間）。
２．必要な場合、新しいゲル−色素溶液を調製する。
３．活性チップウェルの各々を、吸引し、分子グレードのＨ２Ｏで２回すすぐ。
４．ラダー管中で１２μＬのラダー溶液を１０８μＬのＨ２Ｏと混合することによってＬａｂＣｈｉｐラダーを調製する。
５．緩衝液管中に７５０μｌのＨ２Ｏを調製する。
６．逆ピペッティング技術を使用して、ＬａｂＣｈｉｐを調製する。
７．ＢｉｏＲａｄ  ＨａｒｄｓｈｅｌｌまたはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ａｒｍａｄｉｌｌｏ９６ウェルプレート中で、１μＬのライブラリーを１９μＬの水中に希釈する。
８．ＬａｂＣｈｉｐを行う。
【０２１８】
ｑＰＣＲ  Ｑｕａｎｔ
１．必要な場合、３０μｌのＩｌｌｕｍｉｎａフォワードおよびリバースプライマーをＫａｐａ  ＳＹＢＲ  Ｆａｓｔ  ｑＰＣＲ  ＭＭ−５ｍＬ（ＫＫ４６０１）の新しい瓶に添加することによってｑＰＣＲマスターミックスを調製する。
２．すべてのライブラリーの１：１０，０００希釈物を調製する。
３．ＢｉｏＲａｄ  Ｈａｒｄ−ＳｈｅｌｌプレートまたはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ａｒｍａｄｉｌｌｏプレート中で、以下の反応を調製し、少なくとも１２個のウェルは空のままにする。
【表９】
2020517298.tif 000027
４．同じ９６ウェルプレート中で、６個のｑＰＣＲ標準を二連で調製する。
【表１０】
2020517298.tif 000028
５．プレートファイルをプレートレイアウトおよび標準濃度を反映するように編集する。
６．ＢｉｏＲａｄ  Ｃ１０００サーマルサイクラー上で以下のプログラム：９５℃  ５分間＞（９５℃  ３０秒間＞６０℃  ４５秒間＞画像ステップ）×３５を行う。
７．ｑＰＣＲデータをエクセル（登録商標）シートとしてエクスポートする。
８．開始濃度を（４５２／３００）倍して、Ｋａｐａ標準とライブラリーとの間のサイズの差について調節する。
９．ステップ８からの濃度を１０倍して、希釈因数について調節し、ｐＭをｎＭに変換する。
【０２１９】
シークエンシング（次世代シークエンシング）
１．３００サイクルの次世代シークエンシング試薬カートリッジを冷水に入れることによって解凍し、フローセルを４℃から取り出して室温まで平衡化する。
２．シークエンシングするライブラリーを１：１のモル比でプールする。
３．変性および希釈プロトコールを使用して、ライブラリープールを２．２ｐＭの最終濃度および１３００μＬを超える最終体積まで希釈する。
４．１３００μＬを次世代シークエンシング試薬カートリッジのウェル１０にロードする。
５．次世代シークエンシング廃液容器を空にし、新しいフローセルおよび緩衝液カートリッジをロードする。
６．ウェル１０にライブラリーを含有する次世代シークエンシング試薬カートリッジをロードする。次世代シークエンシングリード長についての設定を以下に示す：
【表１１】
2020517298.tif 000029
７．シークエンシングする。
【図１】
2020517298.tif 000030
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図７−１３】
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【図７−１４】
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【図７−１５】
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【図７−１６】
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【図７−１７】
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【図７−１８】
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【図７−１９】
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【図７−２０】
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【図７−２１】
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【図７−２２】
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【図７−２３】
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【図７−２４】
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【図７−２５】
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【図７−２６】
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【図７−２７】
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【図７−２８】
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【図７−２９】
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【図７−３０】
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【図７−３１】
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【図７−３２】
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【図７−３３】
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【図７−３４】
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【図７−３５】
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【図７−３６】
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【図７−３７】
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【図７−３８】
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【図７−３９】
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【図７−４０】
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【図７−４１】
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【図７−４２】
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【図７−４３】
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【図７−４４】
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【図７−４５】
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【図７−４６】
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【図７−４７】
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【図７−４８】
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【図７−４９】
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【図７−５０】
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【図７−５１】
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【図７−５２】
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【図７−５３】
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【図７−５４】
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【図７−５５】
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【図７−５６】
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【図７−５７】
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【図７−５８】
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【図７−５９】
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【図７−６０】
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【図７−６１】
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【図７−６２】
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【図７−６３】
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【図７−６４】
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【図７−６５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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