(57)【要約】  本発明は、遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入された１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む異種鳥類病原菌抗原をコードする遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターに関する。本発明はさらに、前記遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター、および任意選択でさらにマレック病ウイルスベクターを含むワクチンと、１もしくは複数の鳥類病原菌に対して鳥類を保護するためのワクチンの使用に関する。鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患に対する保護のために鳥類を処置するさらなる方法、および異種鳥類病原菌抗原をコードする遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターを作製する方法が提供される。
2020517307.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入された、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクター。
【請求項２】
前記遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクターが、ガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）菌株ＳＢ−１ベクターである、請求項１に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
【請求項３】
前記少なくとも１つの抗原が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）またはトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）に対して保護的であって、そしてここで、該少なくとも１つの抗原が、好ましくは、
（ａ）ＩＢＤＶのＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＸ；
（ｂ）ＩＬＴＶのグリコプロテインＢ、グリコプロテインＩ、グリコプロテインＤ、グリコプロテインＥおよびグリコプロテインＣ；
（ｃ）ＮＤＶのニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）およびウイルス血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＮＤＶ−ＮＨ）；
（ｄ）トリインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）；ならびに
（ｅ）ＩＢＶのＳ１またはＳ２タンパク質、
から成る群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
【請求項４】
任意選択で、医薬的に許容し得る賦形剤、担体またはアジュバントを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターを含むワクチン。
【請求項５】
ガリドヘルペスウイルス３ベクター、天然の弱毒化ＭＤＶ−１菌株Ｒｉｓｐｅｎｓ（ＣＶＩ−９８８）ベクターおよびシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）菌株Ｆｃ１２６ベクターから成る群から選択されるさらなるマレック病ウイルス（ＭＤＶ）ベクターを含む、請求項４に記載のワクチン。
【請求項６】
前記さらなるＭＤＶベクターが、遺伝子組換えＭＤＶベクターであり、かつ、前記遺伝子組換えマレック病ウイルス（ＭＤＶ）ベクターが、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む、請求項５に記載のワクチン。
【請求項７】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の第一の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターに加えて、前記遺伝子組換えマレック病ウイルスベクターが、第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター、好ましくは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターであり、そしてここで、
（ａ）前記第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターが、前記第二のガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２、に挿入された１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含み；および
（ｂ）前記第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターが、第一の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターの１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドとして鳥類病原菌の異なった抗原をコードおよび発現する少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む、
請求項６に記載のワクチン。
【請求項８】
請求項１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターをコードするポリヌクレオチドを含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）。
【請求項９】
マレック病および１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患に対する、鳥類のワクチン接種における使用のための、請求項４〜７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１０】
マレック病ウイルスによって引き起こされる臨床的症状および１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる臨床的症状に対する、鳥類の保護における使用のための、請求項４〜７のいずれか１項に記載のワクチン。
【請求項１１】
（ａ）前記１もしくは複数の疾患または臨床的症状が、１もしくは複数の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）またはトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）によって引き起こされ、および／または
（ｂ）前記鳥類が、家禽であり、好ましくは、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、ホロホロチョウまたはハトであり、より好ましくは、シチメンチョウまたはニワトリである、
請求項９または１０に記載の使用のためのワクチン。
【請求項１２】
ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入された１もしくは複数のマーカーを含み、ここで、該マーカーが、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子またはＤＮＡバーコードである、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクター。
【請求項１３】
遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターを製造する方法であって：
（ａ）ガリドヘルペスウイルス３ベクターを準備し、
（ｂ）ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に、鳥類病原菌について少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを挿入し、そして
任意選択で（ｃ）ステップ（ｂ）の鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含むガリドヘルペスウイルス３ベクターを増幅すること、
を含む方法。
【請求項１４】
遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターを製造する方法であって：
（ａ）ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に１もしくは複数のマーカーを含むガリドヘルペスウイルス３ベクターを準備し、
（ｂ）該１もしくは複数のマーカーを、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドが含む発現カセットで置換し、そして、
（ｃ）ステップ（ｂ）の鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含むガリドヘルペスウイルス３ベクターを増幅すること、
を含む方法。
【請求項１５】
前記ステップ（ａ）が、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターをコードするポリヌクレオチドを含む細菌人工染色体を準備することを含む、請求項１３または１４に記載の方法であって、任意選択で、さらに、以下のステップ：
（ｄ）ステップ（ｂ）の鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターをコードするポリヌクレオチドを含む細菌人工染色体を単離し、
（ｅ）ニワトリ胎児線維芽細胞に、ステップ（ｄ）の細菌人工染色体をトランスフェクトすること、
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入された１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む異種鳥類病原菌抗原をコードする遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターに関する。本発明はさらに、前記遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター、および任意選択でさらにマレック病ウイルスベクターを含むワクチンと、１もしくは複数の鳥類病原菌に対して鳥類を保護するためのワクチンの使用に関する。鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患に対する保護のために鳥類を処置するさらなる方法、および異種鳥類病原菌抗原をコードする遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターを作製する方法が提供される。
【背景技術】
【０００２】
マレック病（ＭＤ）は、Ｔ細胞性悪性リンパ腫の急激な発生を特徴とする家禽の接触伝染病である。その疾患は、世界的に広がっており、そして、家禽産業に巨大な経済的損失をもたらす。疾患の原因菌である、マレック疾患ウイルス−１（ＭＤＶ−１、ガリドヘルペスウイルス２、ＧａＨＶ−２））は、マルディウイルス属のαヘルペスウイルス（ICTV, 2006）であり、そしてそれはまた、１９６０年以来ＭＤに対するワクチンとして広く使用される菌株である、シチメンチョウの抗原性関連ヘルペスウイルス（ＨＶＴ、シチメンチョウヘルペスウイルス１）も含む（Kawamura et al., 1969; Witter et al., 1970）。マルディウイルス属の第三のメンバーは、ＭＤＶ−２（ガリドヘルペスウイルス３、ＧａＨＶ−３）であり、そしてそれには、その一部がＭＤに対する生ワクチンとして使用される非病原性菌株が含まれる（von Bulow et al., 1975）。
【０００３】
マレック病（ＭＤ）の原因菌である、マレック病ウイルス−１（ＭＤＶ−１）またはガリドヘルペスウイルス２（ＧａＨＶ２）が、主要な家禽病原菌の１つある。ＭＤＶ−１は、ヘルペスウイルス科のファミリーのマルディウイルス属のメンバーである。感染したトリでは、ＭＤＶ−１は、羽嚢上皮細胞で複製され、そして、死滅した皮膚および鱗屑で脱落した伝染性ウイルスが混入した家禽ハウスダストの吸入による呼吸経路を通して拡散する。ＭＤは、広範囲のＴ細胞リンパ腫を特徴とし、リンパ球のニューロン浸潤による麻痺症状である。ＭＤによる死滅率は、通常１０〜３０％の間で変化するが、最大６０〜８０％に及ぶ。異なる系統を含む生ワクチンが、ここ４０年間、ＭＤの制御のための様々な組み合わせで使用される（Witter RL. Curr Top Microbiol Immunol. 2001; 255: 57-90; Calnek BW et al., Avian diseases. 1983;27:844-9）。これらには、天然に弱毒化するＭＤＶ−１菌株Ｒｉｓｐｅｎｓ（ＣＶＩ−９８８）、ＭＤＶ−２（ＧａＨＶ３）菌株ＳＢ−１およびシチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）菌株Ｆｃ１２６が挙げられる。
【０００４】
ＭＤに対して長期保護を引き起こす良好なワクチンとしてのその利用に加えて、鳥ヘルペスウイルスワクチン株もまた、他の主要な鳥類感染症に対する保護を誘発するための遺伝子組換えウイルスベクターとして認識された。最も良好な、かつ、広く使用される組換えワクチンベクターは、ＨＶＴであり、そしてそれは、多くの鳥類ウイルス病原体に対する保護に非常に効果的であることが示された（Morgan RW, et al., Avian diseases 1993; 37: 1032-40; Li Y, et al., Vaccine. 2011; 29: 8257-66; Darteil R et al., Virology 1995;211:481-90; Kapczynski DR et al., Vaccine. 2015; 33: 1197-205）。個々の遺伝子組換えＨＶＴワクチンは非常に効果的であると判明したが、複数のＨＶＴベクターワクチンを使用するとき、混合ワクチンの各成分に対して所望の免疫応答を得ることには問題が多かった。外来挿入物に対してわずかな有効性をもたらす干渉が存在するであろう場合には、遺伝子組換えベクターと共に他のＨＶＴを使用しないという明確な助言がある（米国家禽疫病学会 Ａ．ウイルス性腫瘍疾患についてよくある質問http://www.aaap.info/frequently-asked-questions-on-viral-tumor-diseases, 2012）。多価ワクチンとしてのその使用に関するＨＶＴベクターのこの制約条件により、ワクチン中の複合成分に対する保護を妨げるよりむしろ補足する他のベクタープラットフォームの必要が存在する。
【０００５】
ワクチンとしての使用が認可された最初のＧａＨＶ３（ＭＤＶ−２）が、ＳＢ−１菌株である（Schat KA et al., J Natl Cancer Inst. 1978; 60: 1075-82）。それは、１９８０年代の半ばでは、ＭＤに対するワクチンとして元々導入され、そして、ＨＶＴワクチンと組み合わせて使用された（Calnek BW et al., Avian diseases. 1983; 27: 844-9）。ＳＢ−１およびＨＶＴ Ｆｃ１２６菌株を含有する二価ワクチンが、米国、南米およびアジアを含めた多くの国々で良好に使用された（Witter RL. Curr Top Microbiol Immunol. 2001; 255: 57-90; Bublot M, Sharma J. Vaccination against Marek's disease. In: Davison F, Nair V, editors. Marek's Disease-An Evolving Problem. London: Elsevier Academic Press; 2004. p. 168-85）。ＳＢ−１／ＨＶＴ二価ワクチンは、分子機序は同定されていないが、相乗効果によって優れた保護を提供すると考えられていた（Calnek BW et al., Avian diseases. 1983;27:844-9; Witter RL et al., Avian pathology: journal of the WVPA. 1984;13:75-92）。ＳＢ−１はまた、母親由来抗体陽性のヒヨコでさえ非常に良好な保護を誘発すると報告された（Witter RL et al., Avian pathology: journal of the WVPA. 1984; 13: 75-92）。ＧａＨＶ３のＳＢ−１菌株の１６６ＫＢのゲノムには、多くの相同遺伝子（Spatz SJ et al., Virus Genes. 2011;42:331-8）ならびに遺伝子とマイクロＲＮＡとの独特なセットを共有する（Yao Y et al., J Virol. 2007;81:7164-70）、ＭＤＶ−１との類似のゲノム組成を有する。
【０００６】
様々な生物的特性の決定分子を調べるために広範囲な研究が実施された、ＭＤＶ−１と異なって、ＧａＨＶ３（ＭＤＶ−２）ゲノムに対しては、このウイルスに関連しているいくつかの特有の性質を解明するための限られた試験しか実施されなかった。ＭＤＶ−２プロトタイプ株ＨＰＲＳ−２４の完全ゲノム配列の決定は、他のＭＤＶ種とのゲノム構造および配列の比較を可能にした（Izumiya et al., 2001）。細菌人工染色体（ＢＡＣ）としてのヘルペスウイルスゲノムのクローニングにおける最近の進歩（Adler et al., 2003; Zelnik, 2003）が、ＭＤＶ−１（(Petherbridge et al., 2004, 2003; Schumacher et al., 2000）、ＨＶＴ（Baigent et al., 2006）およびＭＤＶ−２ワクチン株ＳＢ−１（Petherbridge et al., 2009）を含めた、いくつかのヘルペスウイルスの分子的特徴を同定する助けとなった。
【０００７】
遺伝子組換えヘルペスウイルスＭＤＶ菌株に基づくＭＤＶに対するワクチンは、ＭＤＶおよび少なくともさらなるウイルス病原体に対する免疫の同時達成の利点を示す。様々な方法が、斯かる二価ワクチンを製造するために利用された。幅広く使用され、かつ、良好なアプローチの１つが、ＨＶＴ（Tsukamoto K et al., J Virol. 2002; 76: 5637-45; Perozo F et al., Avian diseases. 2009; 53: 624-8）、ＭＤＶ−１（Tsukamoto K et al., Virology. 1999; 257: 352-62; Zhou X et al., Vaccine. 2010;28:3990-6）および伝染性上皮腫ウイルスベクター（Tsukamoto K et al., Virology. 2000; 269: 257-67）を含めた、様々なＭＤＶワクチンベクタープラットフォームによるＩＢＤＶ ＶＰ２抗原の送達である。複数の病原菌に対して家禽を保護する必要性を考えた場合、互いに妨げることなく、ワクチン中のすべての成分に保護免疫反応を送達する、さらなるベクタープラットフォームの必要性が存在する。
【０００８】
ＭＤＶおよびＩＢＤＶは、その高い死亡率が何十年間にもわたってそれらを世界の家禽産業にとって常に脅威となっている非常に伝染性の高いウイルスである。母親由来抗体、新変種の出現、製造コストおよび症例によっては、ディーバストラテジー（Muller H, et al., Avian pathology: journal of the WVPA. 2012; 41: 133-9で概説）順守の不足が、ＩＢＤＶの効果的な制御を制限する課題である。ＩＢＤＶは、遺伝子組換え鳥類生ワクチンを使用することに対して保護することが最も難しいウイルスの１つなので、そのため、好適な保護有効性が示される必要がある。二価のＭＤＶ／ＩＢＤＶワクチンは、製造および接種のコストを下げる、両疾患の同時のワクチン接種を可能にする。それらはまた、より安全でもあり、そして、ヒヨコにおける潜在的ＩＢＤの原因となり、かつ、胎児にとって致命的である、異なった弱毒化ＩＢＤＶワクチンを卵内にもたらし得る。ＶＡＸＸＩＴＥＫHVT+IBDは、ＨＶＴベースの既存のＭＤＶ／ＩＢＤＶ二価ワクチンである。それでも、さらなる二価ＭＤＶワクチンに対する必要性はいまだに存在している。
【発明の概要】
【０００９】
ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入された、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクターが、本明細書中に提供される。好ましくは、その遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターである。一実施形態において、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４に挿入された１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、その少なくとも１つの抗原は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）またはトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）に対して保護的である。少なくとも１つの抗原は、（ａ）伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＸ；（ｂ）ＩＬＴＶのグリコプロテインＢ、グリコプロテインＩ、グリコプロテインＤ、グリコプロテインＥおよびグリコプロテインＣ；（ｃ）ＮＤＶのニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）およびウイルス血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＮＤＶ−ＮＨ）；（ｄ）トリインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）；ならびに（ｅ）ＩＢＶのＳ１またはＳ２タンパク質、から成る群から選択され得る。好ましくは、その少なくとも１つの抗原は、ＩＢＤＶに対して保護的である。より好ましくは、その少なくとも１つの抗原は、ＩＢＤＶのＶＰ２である。一実施形態において、ＶＰ２タンパク質アミノ酸配列は、配列番号１２に記載の配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有する。別の実施形態において、ＶＰ２タンパク質は、配列番号１２に記載の配列を有する。
【００１０】
ガリドヘルペスウイルス３ベクターは、好ましくは、１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含有する発現カセットを含み、ここで、任意選択で、発現カセットはさらに、プロモーターを含む。一実施形態において、プロモーターは、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、モルモットＣＭＶプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、偽狂犬病ウイルスプロモーターのグリコプロテインＸプロモーター、ヘルペス単純ウイルス−１α４プロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβ−グロビンプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、マレック病ウイルスプロモーターのグリコプロテインｇＣ、ｇＢ、ｇＥまたはｇｌ遺伝子および伝染性喉頭気管炎ウイルスプロモーターのグリコプロテインｇＢ、ｇＥ、ｇｌ、ｇＤの遺伝子から成る群から選択される。
【００１１】
別の態様において、ワクチンは、本発明の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターを含むものが提供される。そのワクチンはさらに、医薬的に許容し得る賦形剤、担体またはアジュバントを含んでもよい。一実施形態において、そのワクチンはまた、ガリドヘルペスウイルス３ベクター、天然の弱毒化ＭＤＶ−１菌株Ｒｉｓｐｅｎｓ（ＣＶＩ−９８８）ベクターおよびシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）菌株Ｆｃ１２６ベクターから成る群から選択されるさらなるマレック病ウイルス（ＭＤＶ）ベクターも含み、ここで、さらなるＭＤＶベクターは、遺伝子組換えＭＤＶベクターであってもよい。具体的な実施形態において、さらなるマレック病ウイルス（ＭＤＶ）ベクターは、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えマレック病ウイルス（ＭＤＶ）ベクターである。本発明によると、本発明による第一の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターに加えて、さらなる遺伝子組換えマレック病ウイルスベクターが、第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターであってもよく、好ましくは、第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターである。
【００１２】
一実施形態において、第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターもまた、前記第二のガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２、好ましくは、第二のガリドヘルペスウイルス３の遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４に挿入された１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含み、ここで、第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、第一の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターの１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドとして鳥類病原菌の異なった抗原をコードおよび発現する少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む。さらなるマレック病ウイルスベクターおよび本発明による（第一の）遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、一緒に投与されても、または互いに別個に投与されてもよい。
【００１３】
別の態様において、本発明は、本発明による遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターをコードする単離されたＤＮＡを提供する。
【００１４】
さらに別の態様において、本発明は、本発明による遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターをコードするポリヌクレオチドを含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）を提供する。
【００１５】
さらに別の態様において、本発明のワクチンは、１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患に対して、好ましくはマレック病および１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患に対して、鳥類へのワクチン接種における使用のために提供される。一実施形態において、１もしくは複数の疾患は、１もしくは複数の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）またはトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）によって引き起こされる。ワクチンはさらに、１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる臨床的症状に対して、好ましくは、マレック病ウイルスによって引き起こされる臨床的症状および１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる臨床的症状に対して、鳥類を保護する際の使用が提供される。一実施形態において、疾患または臨床的症状を引き起こす１もしくは複数の鳥類病原菌は、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、トリ伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリインフルエンザウイルス、および鳥類の伝染性気管支炎ウイルスから成る群から選択される。
【００１６】
鳥類は、家禽であってもよく、好ましくは、鳥類は、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、ホロホロチョウまたはハトであり、より好ましくは、鳥類は、シチメンチョウまたはニワトリ、より一層好ましくはニワトリである。本発明によるワクチンは、スプレー投与、卵内、皮下、筋肉内、経口的または経鼻的に投与されてもよい。特定の実施形態において、ワクチンは、卵内、好ましくは１８日齢の孵化卵において卵内に投与される。代替の実施形態において、ワクチンは、ヒヨコ、好ましくは１日齢のヒヨコにおいて、皮下または筋肉内に投与される。
【００１７】
マレック病および１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患に対する保護のために鳥類を処置する方法であって、有効量の本発明によるワクチンを投与するステップを含む方法が、さらに提供され、ここで、好ましくは、１もしくは複数の疾患は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）またはトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）のうちの１もしくは複数によって引き起こされる。
【００１８】
さらに別の態様において、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクターは、ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２、好ましくはガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４に挿入された１もしくは複数のマーカーを含み、ここで、該マーカーは、好ましくは選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子またはＤＮＡバーコードである。好ましくは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターである。ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入された１もしくは複数のマーカーを含む遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターをコードするポリヌクレオチドを含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）もまた提供され、ここで、該遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは好ましくは遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターである。
【００１９】
（ａ）ガリドヘルペスウイルス３ベクターを準備し、（ｂ）ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に、鳥類病原菌について少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを挿入し、そして任意選択で（ｃ）ステップ（ｂ）の鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含むガリドヘルペスウイルス３ベクターを増幅すること、を含む遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターを製造する方法もまた提供される。一実施形態において、その方法は、（ａ）ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に１もしくは複数のマーカーを含むガリドヘルペスウイルス３ベクターを準備し、（ｂ）該１もしくは複数のマーカーを、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドが含む発現カセットで置換し、そして、（ｃ）ステップ（ｂ）の鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含むガリドヘルペスウイルス３ベクターを増幅することを含む。好ましくは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターである。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】Ａ）（上、Ａ−ｉ）ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２、（中央、Ａ−ｉｉ）ＳＢ−１−ＵＬ１０／１１ＶＰ２および（下、Ａ−ｉｉｉ）ＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２を製造するための作り出す遺伝子組換えプロセス。ＶＰ２発現カセットを、遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４、ＵＬ１０／ＵＬ１１、およびＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入した。ＶＰ２発現カセットを、実線の矢印として示す。ＳＢ−１からの遺伝子の位置および方向を示す。Ｂ）感染細胞のプラークにおけるＶＰ２免疫染色（濃紺）。ＣＥＦ細胞に（Ｂ−ｉ）ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２、（Ｂ−ｉｉ）ＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２および（Ｂ−ｉｉｉ）ＳＢ−１−ＵＬ１０／１１ＶＰ２を感染させた。細胞を、感染５日後に固定し、そして、材料と方法の項に記載のように染色した（スケールバー＝２０００μｍ）。
【００２１】
【図２】インビトロにおけるＳＢ−１組換えウイルスの成長曲線。ＣＥＦ細胞１００万個あたりのゲノムコピー数を、感染後の時間数に対してプロットする；ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２（■）、ＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２（●）、ＳＢ−１−ＵＬ１０／１１ＶＰ２（○）およびＳＢ−１（▲）ワクチンウイルス。感染後２４時間において、ＳＢ−１とＳＢ−１ＵＬ３／４ＶＰ２との間に有意差は観察されなかった。ＳＢ−１−ＵＬ１０／１１ＶＰ２およびＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２の複製レベルは、ＳＢ−１およびＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２ウイルスのものより低かった。各時点を、３つの複製物に基づいて計算した。各複製物を三連で計測した。エラーバーは標準偏差を表す。
【００２２】
【図３】ＶＡＸＸＩＴＥＫHVT+IBD（◆）、ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２（■）、ＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２（●）、ＳＢ−１−ＵＬ１０／１１ＶＰ２（○）およびＳＢ−１（▲）ワクチンウイルスをワクチン接種したニワトリ血清中のＶＰ２に対する中和抗体の力価。血清サンプルを、ワクチン接種後２、３、および４週間で採取した。各群の平均力価を、水平な棒線として示す。
【００２３】
【図４】ニワトリに、ＶＡＸＸＩＴＥＫHVT+IBD（◆）、ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２（■）、ＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２（●）およびＳＢ−１（▲）をワクチン接種し、それに続いて、時点０にてＩＢＤＶ ＵＫ６６１を感染させた。Ａ）ＩＢＤＶ ＵＫ６６１を用いて抗原投与した、ワクチン接種トリの平均臨床スコア。バーは標準偏差を示す、ｎ＝８。Ｂ）ＩＢＤＶ ＵＫ６６１を用いて抗原投与した、ワクチン接種トリの生存百分率。ｐＳＢ−１を予防接種したトリは、人道的理由で安楽死させたか、またはＩＢＤＶ感染の５５時間後に死滅した。
【００２４】
【図５】ニワトリに、ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２（■）、ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２、ＨＶＴ−９ＨＡ（▲）およびワクチンなし（陰性対照）（●）をワクチン接種した。０、１、３、４、５および６週目におけるＩＢＤＶ ＶＰ２に対する中和抗体の力価を示す（ｎ＝１０）。エラーバーは標準偏差を表す。
【詳細な説明】
【００２５】
一般的な実施形態である「含む」または「含んだ」は、より特異的な実施形態である「から成る」を包含する。さらに、単数形および複数形は、限定する手段に使用されない。本明細書中に使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、単数のみを示すことが明確に記述されない限り、単数と複数の両方を示す。
【００２６】
「動物」という用語は、すべての哺乳動物、トリおよびサカナを含むように本明細書中で使用される。この特定の状況において、動物は、例えばニワトリや、アヒルや、ガチョウや、シチメンチョウや、ウズラや、ホロホロチョウや、ハトや、ハクチョウや、キジや、オウムや、ヒワや、タカや、カラスや、ダチョウや、エミューや、ヒクイドリなどの鳥類を指す。「動物」および「トリ」という用語はまた、胚形成期および胎児期を含めた、すべての生育ステージにある個々の動物を含む。好ましくは、動物は家禽である。用語本明細書中で使用される場合、「家禽」は、それらが生産する卵、肉または羽のために飼育された家庭内または商業的な鳥類を指す。家禽は、例えばニワトリや、アヒルや、ガチョウや、シチメンチョウや、ウズラや、ホロホロチョウや、ハトなどのキジ目の鳥類であってもよい。
【００２７】
「鳥類」という用語は、本明細書中で使用される場合、鳥類、好ましくは家禽、例えばニワトリ、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、ホロホロチョウまたはハトなどを指す。シチメンチョウまたはニワトリが、本発明との関連において特に好まれ、より一層好ましくは、ニワトリである。
【００２８】
「核酸」、「ヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、互換的に使用され、かつ、５’から３’末端へと読まれるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを指し、そして、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、またはｃＲＮＡおよびその誘導体、例えば修飾骨格含有する物などが挙げられる。ガリドヘルペスウイルス３ベクターとの関連において、当業者は、それがデオキシリボ核酸、すなわち、ＤＮＡまたはｃＤＮＡを指すことを理解するであろう。本発明によるポリヌクレオチドは、様々な方法（例えば、化学合成による、遺伝子のクローン化によるなど）で調製され、かつ、様々な形態（例えば、直鎖または分岐、一本鎖または二本鎖、その混合物、プローブ、プライマーなど）をとる。「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」という用語は、個々の一本鎖または二本鎖のいずれかとしての、核酸のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を指す。「リボ核酸」（ＲＮＡ）という用語は、ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉（inhibitory RNA））、ｄｓＲＮＡ（二本鎖ＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ（small interfering RNA））、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ｔＲＮＡ（対応するアシル化アミノ酸により荷電されているかまたは非荷電であるかにかかわらず、転移ＲＮＡ）、およびｃＲＮＡ（相補性ＲＮＡ）を含んでいる。
【００２９】
「ゲノムＤＮＡ」または「ゲノム」という用語は、互換的に使用され、かつ、宿主生物の相続可能な遺伝情報を指す。ゲノムＤＮＡは、核のＤＮＡ（染色体ＤＮＡとも呼ばれる）を含むが、他の細胞オルガネラ（例えば、ミトコンドリア）のものもまた含む。
【００３０】
「ゲノムＲＮＡ」または「ゲノム」という用語は、ＲＮＡウイルスの相続可能な遺伝情報を指す。ゲノムＲＮＡは、プラス鎖ＲＮＡであっても、またはマイナス鎖ＲＮＡであってもよい。
【００３１】
「遺伝子」という用語は、本明細書中で使用される場合、機能的な産物として発現されることによって、または遺伝子発現の調節によって、生物体の形質に影響を及ぼす、相続可能なゲノム配列のＤＮＡまたはＲＮＡ遺伝子座を指す。遺伝子およびポリヌクレオチドは、ゲノム配列にあるようなイントロンおよびエクソン、または開始コドン（メチオニンコドン）と翻訳終止コドンを含めた、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）などの、ｃＤＮＡにあるような単なるコード配列、を含んでもよい。遺伝子およびポリヌクレオチドはまた、例えば転写開始、翻訳および転写停止などのそれらの発現を調整する領域も含み得る。よって、プロモーターなどの調節要素もまた含まれる。
【００３２】
「異種ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書中で使用される場合、異種タンパク質をコードする受容個体とは異なった生物体または異なった種から得られたポリヌクレオチドを指す。ガリドヘルペスウイルス３ベクターとの関連において、当業者は、それがＤＮＡまたはｃＤＮＡを指すことを理解する。異種ポリヌクレオチドは、導入遺伝子とも呼ばれ得る。よって、それは、異種タンパク質をコードする遺伝子またはオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）であってもよい。ガリドヘルペスウイルス３との関連において、「異種ポリヌクレオチド」は、鳥類の感染症を引き起こすファミリーヘルペスウイルス科の異なったウイルスおよびガリドヘルペスウイルス３の異系統を含めた、異なった鳥類病原菌またはウイルス（異なった種および／または菌株）、特に異なったトリウイルスから得られたポリヌクレオチドを指す。「異種」という用語は、核酸の一部に関して使用されるとき、核酸が、天然に互いに同様の関係中に見られない２以上の配列を含むことを示す。異種はまた、例えば、それが典型的には見られないウイルスゲノム内に挿入された、遺伝子もしくは導入遺伝子、またはその一部など、あるいは、その中ではそれが典型的には見られない生物体内に導入された遺伝子などのウイルス性ポリヌクレオチド配列を指してもよい。
【００３３】
「遺伝子組換えウイルスベクター」または「ウイルスベクター」は、本明細書中で使用される場合、宿主細胞の形質導入のためのウイルスゲノムおよび異種ポリヌクレオチドを含む組換えウイルスを指す。本発明によるそのような遺伝子組換えウイルスベクターは、ガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１またはＨＰＲＳ２４から得られてもよい。適宜、ウイルス性の遺伝子コード配列またはタンパク質コード配列は、１もしくは複数のウイルス病に対して、ニワトリまたは他の家禽にワクチン接種するために、本明細書中に記載の遺伝子組換えウイルスベクターに組み入れられてもよい。遺伝子組換えウイルスベクターはまた、マーカーをコードおよび発現する異種ポリヌクレオチドを含んでもよい。典型的に、遺伝子組換えウイルスベクターは、異種ポリヌクレオチドまたは導入遺伝子（その導入遺伝子の転写に作用するようにプロモーターに作動可能に連結されるもの）を含んでいる。「遺伝子組換え」という用語はさらに、その天然型または構造のポリヌクレオチドまたはタンパク質の任意の修飾、変更または操作を含むか、あるいは、その自然環境または周辺におけるポリヌクレオチドまたはタンパク質の修飾、変更または操作を含む。ポリヌクレオチドまたはタンパク質の修飾、変更または操作としては、これだけに限定されるものではないが、１もしくは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失、全遺伝子の欠失、遺伝子のコドン最適化、アミノ酸の保存的置換、および１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドの挿入が挙げられる。
【００３４】
「遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３、ＭＤＶ−２）ベクター」という用語は、本明細書中で使用される場合、例えば菌株ＳＢ−１またはＨＰＲＳ２４などの、ＧａＨＶ３のすべての必須遺伝子を含む組換えウイルスを指す。遺伝子組換えウイルスベクターに使用されるガリドヘルペスウイルス３（ＭＤＶ−２）菌株は、これだけに限定されるものではないが、GenBank受託番号ＨＱ８４０７３８．１によって規定されるゲノム配列を有する市販のマレック病ワクチン（ＳＢ−１ワクチン）を含めたあらゆるＳＢ−１菌株であってもよい（Merial Select Inc., Gainesville, GA 30503, USA）。遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３、ＭＤＶ−２）ベクターはさらに、欠失または変異させた非必須遺伝子を含んでもよい。ガリドヘルペスウイルス３（ＭＤＶ−２）は、GenBank受託番号ＨＱ８４０７３８．１（挿入された異種ポリヌクレオチド配列を考慮しない）で規定されるガリドヘルペスウイルス３（ＭＤＶ−２）菌株ＳＢ−１の配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するゲノム配列を含む任意のガリドヘルペスウイルス３（ＭＤＶ−２）であり得る。また、任意の非必須遺伝子の欠失は、配列アラインメントに関して考慮されない。
【００３５】
ＳＢ−１以外のガリドヘルペスウイルス３（ＭＤＶ−２）菌株は、GenBank受託番号ＮＣ＿００２５７７．１（ＩＮＳＤＣ：ＡＢ０４９７３５．１）によって規定されるゲノム配列を有するＨＰＲＳ２４菌株である。ＨＰＲＳ２４とＳＢ−１のゲノムは、９８．４％の配列同一性を共有する（Spatz and Schat, 201 1; Virus Gene 42, 331-338）。遺伝子組換えウイルスベクターに使用されるガリドヘルペスウイルス３（ＭＤＶ−２）菌株は、公報に記載されたＨＮ−１、２８７Ｃ／１、４０１／１、４３７Ａ／１、３０１Ｂ／１、４７１Ｂ／１、２８１ＭＩ／１、および２９８Ｂ／１単離株であってもよい（Witter (1987) Avian Dis 31, 752-765; Witter et al. (1987) Avian Dis 31, 829-840; Witter (1995) Avian Pathology (1995) 24, 665-678）。これまでワクチンとして使用されなかったが、菌株ＨＰＲＳ２４または上記のＭＤＶ−２の単離株のいずれかもまた、それらの関連性と抗原類似性のため、好適なワクチン菌株と考えることもできる。
【００３６】
「タンパク質」という用語は、「アミノ酸残基配列」または「ポリペプチド」と互換的に使用され、かつ、あらゆる長さのアミノ酸の重合体も指す。これらの用語はまた、これだけに限定されるものではないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化またはタンパク質プロセシングを含めた反応を通して翻訳後修飾されるタンパク質も含む。修飾および変更、例えば、他のタンパク質への融合、アミノ酸配列の置換、欠失または挿入は、ポリペプチドの構造において成され得るが、その分子は、生物学的な機能的活性を維持している。例えば、特定のアミノ酸配列置換は、ポリペプチドまたはその根本にある核酸コード配列において成され、そして、同じ特性を有するタンパク質が得られる。
【００３７】
本明細書中で使用される「抗原」という用語は、宿主動物における適応的免疫反応を誘発する物質であり、免疫原とも呼ばれる。抗原は、典型的には、高分子量のものであり、かつ、タンパク質または多糖類である。ペプチド、脂質、核酸および多くのその他の物質もまた、抗原として機能する。抗原は、生物体全体、死滅したもの、弱毒化したものもしくは生きているもの、または生物体のサブユニットもしくは部分；宿主動物に対して、存在により免疫応答を誘発することができるＤＮＡの部分または断片；ポリペプチド、その断片、エピトープ、ハプテン、またはあらゆるそれらの組み合わせ、であり得る。免疫原または抗原はまた、毒素であっても、または非毒素であってもよい。本発明による異種ポリヌクレオチドによってコードおよび発現された抗原は、典型的には、免疫原性または抗原性タンパク質である。抗原本明細書中で使用される場合、抗原はまた、エピトープを含めた免疫原性部分または断片、例えば（単数もしくは複数の）ペプチドを指してもよい。
【００３８】
本明細書中で使用される場合、「鳥類病原菌の抗原」という用語は、構造的および非構造的タンパク質を含めた、病原菌、好ましくは、本明細書中に記載したウイルス、によってコードされたタンパク質を指す。斯かる抗原は、ＶＰ２、Ｆ、および／またはＨＮタンパク質を含めた、ＩＢＤＶ、ＮＤＶ、ＡＩＶ、ＩＬＴＶ、および／またはＩＢＶからの天然または非天然のウイルスタンパク質を含んでもよい。本明細書中に使用される場合、「抗原」とは、例えばウイルスポリペプチドなどのウイルスタンパク質またはポリペプチド、ならびにウイルス粒子を指す。いくつかの実施形態において、本発明による抗原はまた、ウイルス性核酸であってもよい。
【００３９】
本明細書で用いられる「免疫原性タンパク質またはペプチド」という用語には、宿主に一度投与されると、当該タンパク質に対して液性および／または細胞性タイプの免疫応答を引き起こすことができるという意味で免疫学的に活性なポリペプチドが含まれる。好ましくは、前記タンパク質フラグメントは、完全長タンパク質と実質的に同じ免疫学的活性を有するものである。したがって、本発明のタンパク質フラグメントは、少なくとも１つのエピトープまたは抗原決定基を含むか、本質的に前記から成るか、または前記から成る。本明細書で用いられる、「免疫原性」タンパク質またはペプチドには、当該タンパク質の完全長配列、そのアナローグ、またはその免疫原性フラグメントが含まれる。「免疫原性フラグメント」とは、1つ以上のエピトープを含み、したがって上記に記載の免疫学的応答を引き出すタンパク質のフラグメントを意味する。
【００４０】
「免疫原性タンパク質またはペプチド」という用語はさらに、当該ポリペプチドが機能して本明細書に規定の免疫学的応答を生じる限り、当該配列への欠失、付加および置換を意図する。「保存的バリエーション」という用語は、あるアミノ酸残基の別の生物学的に類似する残基による入れ替え、または当該コードされるアミノ酸残基が変化しないかまたは別の生物学的に類似する残基であるような核酸配列中のヌクレオチドの入れ替えを指す。これに関して、特に好ましい置換は一般的に特性が保存的であろう（すなわちアミノ酸の1つのファミリー内で生じる置換）。例えばアミノ酸は一般的に以下の4つのファミリーに分類される：（1）酸性−アスパラギン酸およびグルタミン酸；（2）塩基性−リジン、アルギニン、ヒスチジン；（3）非極性−アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；および（4）非荷電極性−グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンはときに芳香族アミノ酸として分類される。保存的置換には以下が含まれる：ある疎水性残基、例えばイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンによる別の疎水性残基の置換；またはある極性残基による別の極性残基の置換、例えばアルギニンによるリジンの置換、グルタミン酸によるアスパラギン酸の置換またはグルタミンによるアスパラギンの置換など；またはあるアミノ酸の生物学的に大きな影響をもたない構造的に関連するアミノ酸による同様な保存的入れ替え。参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、該タンパク質の免疫原性に実質的に影響しない小さなアミノ酸置換を有するタンパク質は、したがって参照ポリペプチドの規定内に入る。これらの改変によって生成されるポリペプチドの全てがここに含まれる。「保存的バリエーション」という用語にはまた、置換済みポリペプチドに対して生じた抗体がまた未置換ポリペプチドとも免疫反応することを条件に、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸を使用することが含まれる。
【００４１】
「エピトープ」という用語は、特異的B細胞および／またはT細胞が応答する抗原またはハプテン上の部位を指す。該用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と互換的に用いられる。同じエピトープを認識する抗体は、ある抗体が別の抗体の標的抗原との結合を阻止する能力を示す簡単な免疫アッセイで同定できる。エピトープは、直鎖であっても、または立体構造であってもよい。立体構造エピトープは、抗原のアミノ酸配列の不連続な部分で構成される。
【００４２】
組成物またはワクチンとの「免疫学的応答」は、対象の組成物またはワクチンによって誘発され、かつ、それらに対する細胞性および／または抗体媒介性免疫応答の発生である。通常は、「免疫学的応答」には以下の作用の1つ以上が含まれる（ただしこれらに限定されない）：対象の組成物またはワクチンに含まれる1つの抗原または複数の抗原に特異的に誘導される抗体、B細胞、ヘルパー細胞および／または細胞傷害性T細胞の産生。好ましくは、宿主は、新規感染に対する抵抗性が強化されるように、および／または当該疾患の重症度が低下するように治療的または保護的応答のいずれかを開陳するであろう。そのような保護は、通常感染宿主が示す症状の緩和若しくは欠如、より短い回復期間および／または感染宿主におけるウイルス力価の低下によって示されるであろう。
【００４３】
「鳥類病原菌」という用語は、本明細書中で使用される場合、細菌、ウイルス、酵母、線虫、真菌などを含めた、トリにおいて病原性である伝染性物質を指す。トリウイルスおよびトリ細菌が、本明細書の文脈において特に好まれ、より好ましくは、トリウイルスである。特に着目のトリウイルスは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、ニューカッスル疾患ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）およびトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）である。
【００４４】
本明細書中に使用される場合、「挿入部位」とは、その中に異種ポリヌクレオチドが挿入され、かつ、非必須領域である、ウイルスゲノム内の領域を指す。本発明の挿入部位は、遺伝子間領域または遺伝子間遺伝子座、特に、ゲノムの固有長鎖（ＵＬ）領域のＵＬ３とＵＬ４の間の遺伝子間遺伝子座および／またはＵＬ２１とＵＬ２２の間の遺伝子間遺伝子座、好ましくはＵＬ３とＵＬ４の間の遺伝子間遺伝子座であってもよい。これらの領域のうちの１つへの１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドの挿入は、１もしくは複数の疾患に対する保護のためにニワトリまたは他の家禽にその後導入され得る、遺伝子組換えウイルスベクターの製造を可能にする。いくつかの実施形態において、本明細書中に記載の鳥類病原菌の抗原をコードおよび発現する異種ポリヌクレオチドは、当該技術分野で知られている１もしくは複数の挿入部位に加えて、本明細書中に開示した挿入部位に挿入されてもよい。好適な挿入部位は、ウイルスの複製および成長に影響することなく、ポリヌクレオチドの挿入を可能にしなければならない。当業者は、ワクチンとの関連において、好適な挿入部位はまた、挿入されたポリヌクレオチドがそれぞれの鳥類病原菌に対する適切な免疫応答および保護を誘発することも可能にしなければならないことを理解する。
【００４５】
「非必須領域」という用語は、宿主の組織培養において、ウイルスの複製および増殖に不可欠でないウイルスゲノムの領域を指す。理論的には、あらゆる非必須領域またはその一部は、ガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１もしくはＨＰＲＳ２４ゲノムまたはそれに挿入され得る外来配列から欠失していてもよく、そして、欠失または挿入から生じた遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターの生存率および安定性は、欠失領域またはその一部が実際に非必須であるかどうかを確認するために使用され得る。
【００４６】
「遺伝子間遺伝子座」という用語は、本明細書中で使用される場合、２つの遺伝子間の領域を指し、そして、本発明との関連において、ガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３、ＭＤＶ−２）ベクターの固有長鎖（ＵＬ）領域の２つの遺伝子の間の遺伝子座を指す。特定の位置における遺伝子間遺伝子座への挿入は、導入遺伝子または異種ポリヌクレオチドが遺伝子を置換または欠失することなく、２つの遺伝子間、より具体的には、ＵＬ領域の２つの遺伝子間に挿入されることを意味する。例えば、ＵＬ３／ＵＬ４およびＵＬ２１／ＵＬ２２の遺伝子間遺伝子座は、それぞれ、配列番号１および２で提供される配列を有する。
【００４７】
本明細書中に使用される場合、「発現カセット」という用語は、宿主細胞におけるポリヌクレオチドの発現に必要とされるすべての要素を含むベクターの部分を指す。それは、発現を制御するタンパク質および配列、すなわち、調節要素、をコードする１もしくは複数の遺伝子を含んでいる。よって、それは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に作動可能に連結されたプロモーター、および転写終止部位を含む３’非翻訳領域を含む。追加要素は、例えば、エンハンサーである。発現カセットは、ベクター、典型的には、プラスミドまたはウイルスベクターを含めた、発現ベクターの一部であってもよい。それはまた、例えば、相同組換えまたはウイルス組込みなどのランダムまたは標的組込みによって染色体内に組込まれてもよい。発現カセットは、クローン技術を使用することによって調製されるので、そのため、天然に存在する遺伝子構造を指していない。
【００４８】
本明細書中に使用される場合、「プロモーター」という用語は、特定の遺伝子またはオープンリーディングフレームの転写を開始するＤＮＡ領域を指す。プロモーターは、同じ鎖上の遺伝子の転写開始部位付近の５’領域に位置している。典型的には、プロモーターは、約１００〜１０００塩基対の長さである。ベクターに使用するのに好適なプロモーターは、当該技術分野で周知であり、例えば、細菌プロモーター、ウイルスプロモーターまたは同様のものなどである。例えば、本発明とは関係なく、有用なプロモーターとしては、これだけに限定されるものではないが、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、モルモットＣＭＶプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、グリコプロテインＸプロモーターの偽狂犬病ウイルスプロモーター、ヘルペス単純ウイルス−１α４プロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβ−グロビンプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、例えば、ＭＤＶ−１、ＭＤＶ−２およびＨＶＴなどのＭＤＶのあらゆる単離株または菌株を含めた、マレック病ウイルスのグリコプロテインのプロモーター、例えば、グリコプロテイン、例えば、ｇＣ、ｇＢ、ｇＥ、またはｇｌなど、の発現を制御するプロモーター、伝染性喉頭気管炎ウイルスプロモーター、例えば、グリコプロテインｇＢ、ｇＥ、ｇｌ、ｇＤ遺伝子、あるいは、その他の好適なプロモーター、が挙げられる。
【００４９】
転写終止領域は、転写の効果的な終止を提供する。終止領域は、プロモーター配列と同じ遺伝子からのものであっても、またはそれは、異なった遺伝子からのものであってもよい。それはさらに、ＯＲＦと同じ遺伝子からのものであっても、またはそれは異なった遺伝子からのものであってもよい。
【００５０】
「同一」または「パーセント同一性」という用語は、２以上の核酸またはポリペプチド配列との関連において、以下で記載する初期設定パラメーターを用いたＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して計測した場合、または手作業での整列および目視検査によって、同じであるか、あるいは、同じものであるアミノ酸残基またはヌクレオチドに関して指定されたパーセンテージ（すなわち、比較ウィンドウまたは指定された領域にわたる最大一致のために比較および整列されたとき、約６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはより高い同一性）を有する２以上の配列または部分配列を指す（例えば、https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgiにあるＮＣＢＩウェブサイトなど）。斯かる配列は、そのとき、「実質的に同一」とも呼ばれる。この定義もまた、特定の配列の相補体も指すか、またはそれらにも適用される。その定義はまた、欠失、付加、および／または置換を有する配列を含んでもよい。
【００５１】
配列比較のために、典型的には、一方の配列が参照配列としての役割を果たし、他の配列がそれに対して比較される。配列比較アルゴリズムを使用するとき、参照配列と比較配列が、コンピューターに入力され、そして、配列比較アルゴリズムプログラムのパラメーターが所望されるように選択され得る。次に、パーセント配列同一性が、選択したパラメーターに基づいて、参照配列に対する比較配列に関してもたらされる。パーセント配列同一性および配列類似性の決定に好適であり得るアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、そしてそれらは、それぞれ、Altschulら（Nuc Acids Res 25:3389-3402, 1977）およびAltschulら（J Mol Biol 215:403-410, 1990）に記載されている。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、当該技術分野で周知であり、例えば、本明細書中に記載したものなどのあらゆる核酸またはタンパク質のパーセント配列同一性を決定するのに使用され得る。ＲＮＡ配列が類似である、またはＤＮＡ配列とある程度の配列同一性または相同性を有すると言われるとき、そのＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）は、そのＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に相当すると考えられる。よって、ＲＮＡ配列は、本発明の範囲内にあり、そして、ＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）に相当すると考えられるＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）によって、ＤＮＡ配列から導かれ得る。
【００５２】
本明細書中に使用される場合、「ワクチン」または「免疫原性組成物」は、対象、例えば、鳥類の対象など、に投与するのに好適な組成物を包含することを意味する。一般的に、「ワクチン」は、無菌であり、そして、好ましくは、対象の体内で望ましくない応答を引き出すこし得る混入物を含んでおらず（例えば、ワクチン中の（単数もしくは複数の）化合物は医薬グレードである）、かつ、抗原を含んでいる。本明細書の文脈中において、ワクチンは、少なくとも、抗原としての、本発明の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター、そして場合により、さらに、本明細書中に記載したマレック病ウイルスベクターを含んでいる。ワクチンは、卵内、経口、静脈内、頬側、直腸、非経口、腹腔内、皮内、気管内（intracheal）、筋肉内、皮下、吸引などを含めた、多くの異なった投与経路を介して、それを必要とする対象に投与するために設計されてもよい。好ましくは、ワクチンは、卵内、筋肉内または皮下に投与される。本明細書中で使用される「ワクチン接種」という用語は、保護免疫反応を与え、それにより、鳥類病原菌によって引き起こされる疾患から保護することを意味する。
【００５３】
用語「多価ワクチン（polyvalent vaccine）」、「組み合わせワクチンまたはコンボワクチン」および「多価ワクチン（multivalent vaccine）」は、２つ以上の抗原を含有するワクチンを指すために、互換的に使用される。多価ワクチンは、２、３、４まそれ以上の抗原を含み得る。多価ワクチンは、遺伝子組換えウイルスベクター、活性もしくは弱毒化、または死滅した野生株ウイルス、あるいは、遺伝子組換えウイルスベクター、活性もしくは弱毒化、または死滅した野生株ウイルの混合物を含んでもよい。
【００５４】
本明細書中で使用される場合、「マレック病ウイルス」または「ＭＤＶ」という用語は、シチメンチョウのヘルペスウイルス（ＨＶＴ）、マレック病ウイルス血清型１（ＭＤＶ−１）およびガリドヘルペスウイルス３を含めたマルディウイルス属のあらゆるアルファヘルペスウイルスを指す。典型的には、ワクチンウイルスとして使用されるＭＤＶは、ガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１、天然の弱毒化ＭＤＶ−１菌株Ｒｉｓｐｅｎｓ（ＣＶＩ−９８８）およびシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）菌株Ｆｃ１２６である。本明細書中に使用される場合、斯かるウイルスとしては、ウイルスの遺伝子成分、すなわち、そのゲノムおよび転写産物、ゲノムによってコードされた（構造的および非構造的タンパク質を含めた）タンパク質、ならびに機能性または無機能性ウイルス粒子が挙げられ得る。斯かるウイルスをコードするポリヌクレオチドおよびポリペプチド配列は、当該技術分野で周知であり、そして、当業者によって容易に見つけられるであろう。ＭＤＶとしては、野生型標準ウイルス、天然の弱毒化野生型している野生型標準ウイルス、および遺伝子組換えＭＤＶが挙げられる。遺伝子組換えＭＤＶは、鳥類病原菌少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する、１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００５５】
本明細書中で使用される場合、「単離されたＤＮＡ」という用語は、
それが天然にそれらと共に生じるであろうその他の物質から実質的に分離されたか、または相対的に濃縮されたＤＮＡを意味する。単離されたＤＮＡは、通常、少なくとも約８０重量％純粋、少なくとも９０重量％純粋、少なくとも９８重量％純粋、または少なくとも約９９重量％純粋であり、かつ、最小限の量のＤＮＡまたはタンパク質の混入があるだけである。
【００５６】
「細菌人工染色体」という用語は、ＢＡＣと簡略化され、本明細書中で使用される場合、
エシェリキア・コリ（Escherichia coli）などの細菌における形質転換およびクローニングに使用される、約１５０〜３５０ｋｂｐの挿入物を含むＦプラスミドベースのＤＮＡ構築物を指す。ＢＡＣベクターは、例えば、ＤＮＡウイルスゲノム、またはＲＮＡウイルスゲノムをコードするＤＮＡ配列などの巨大ＤＮＡ配列を担持し得る。これは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮｓ）またはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮｓ）などの、Ｅ．コリ（E.coli）における十分に確立された突然変異誘発技術を使用することでウイルスゲノムの効率的な修飾を可能にする。細菌Ｐ１プラスミドベースのクローニングベクターがさらに担持されているので、Ｐ１由来の人工染色体（ＰＡＣ）と呼ばれることも多い。
【００５７】
本明細書中に使用される場合、「医薬的に許容し得る担体」、「医薬的に許容し得るアジュバント」、または「アジュバント」は、他の剤の効果を修飾する剤を指し、そして、一般的に、安全で、無毒性の、かつ、生物学的にも、他の形でも好ましいワクチンを作製するのに有用である。斯かる剤は、例えば、より多くの量の抗体やより持続的な保護を与えるなどの、応答を促進することによって対象の免疫応答を修飾するために、ワクチンに加えられてもよい。斯かる剤は、獣医学または医薬的な使用において許容される賦形剤、希釈剤、担体、またはアジュバントを含んでもよい。斯かる剤は、天然に存在しないものであっても、または天然に存在するが、天然には、免疫原性組成物中の他の剤と組み合わされた状態で見られることがなくてもよい。
【００５８】
本明細書中に使用される場合、「抗体」は、特異的に結合するおよび抗原を認識する免疫グロブリン遺伝子またはその断片からのフレームワーク領域を含むポリペプチドを指す。認識された免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子を含んでもよい。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類され得る。重鎖は、それぞれ、順に、免疫グロブリンクラス、ＩｇＹ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥを規定するγ、μ、α、δ、またはεとして分類されてもよい。
遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクター
【００５９】
本発明は、ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４、および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入された鳥類病原菌をコードする少なくとも１つの抗原を発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクター、好ましくは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）菌株ＳＢ−１ベクターを提供する。好ましくは、そのベクターは、ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４に挿入された１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む。異種ポリヌクレオチドは、遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４、および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２の中のどこに組込まれてもよい。菌株ＳＢ−１（ＨＱ８４０７３８．１）の遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４は、配列番号１のヌクレオチド配列を有し、そして、菌株ＳＢ−１のＵＬ２１／ＵＬ２２の遺伝子間遺伝子座は、配列番号２のヌクレオチド配列を有する。遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４とＵＬ２１／ＵＬ２２のヌクレオチド配列は、菌株ＨＰＲＳ２４（ＮＣ＿００２５７７．１）と同じである。異種ポリヌクレオチドは、配列番号１または配列番号２の配列の中、好ましくは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド１０〜９０の中、より好ましくは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド２０〜８０の中、より好ましくは配列番号１または配列番号２のヌクレオチド３０〜７０の中のどこに組込まれてもよい。
【００６０】
鳥類病原菌は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（すなわち、ＩＢＤＶまたはガンボロ病ウイルス）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、トリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）、トリ脳脊髄炎ウイルス、および他のピコルナウイルス、トリレオウイルス、トリパラミクソウイルス、トリメタニューモウイルス、トリインフルエンザウイルス、トリアデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、トリコロナウイルス、トリロタウイルス、トリパルボウイルス、トリアストロウイルスおよびニワトリ貧血ウイルス、コクシジウム症（アイメリア属（Eimeria sp.））、カンピロバクター属（Campylobacter sp.）、サルモネラ属（Salmonella sp.）、マイコプラズマ・ガリセプチカム（Mycoplasma gallisepticum）、マイコプラズマ・シノビエ（Mycoplasma synoviae）、パスツレラ属（Pasteurella sp.）、アビバクテリウム属（Avibacterium sp）、Ｅ．コリまたはクロストリジウム属（Clostridium sp.）であり得る。好ましくは鳥類病原菌の抗原はトリウイルスの抗原である。より好ましくは、遺伝子組換えベクターは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）、または同様のものからの遺伝子をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む。
【００６１】
本発明による鳥類病原菌の特に好適な抗原は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）またはトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）などのトリウイルスの抗原である。代表的な抗原は、ＩＢＤＶのＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＸ；ＩＢＤＶのグリコプロテインＢ、グリコプロテインＩ、グリコプロテインＤ、グリコプロテインＥおよびグリコプロテインＣ、好ましくはグリコプロテインＢ、グリコプロテインＩまたはグリコプロテインＥ；ＮＤＶのニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）およびウイルス血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＮＤＶ−ＮＨ）；トリインフルエンザウイルスのトリインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）タンパク質、好ましくは、トリインフルエンザウイルスＡ型、より好ましくは、トリインフルエンザＡ血清型Ｈ５赤血球凝集素（Ｈ５ ＨＡ）、トリインフルエンザＡ血清型Ｈ７株赤血球凝集素（Ｈ７ ＨＡ）、トリインフルエンザＡ血清型Ｈ９赤血球凝集素（Ｈ９ ＨＡ）またはトリインフルエンザＡ血清型Ｈ５Ｎ１ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１ ＮＡ）；ならびにＩＢＶのＳ１またはＳ２タンパク質である。Ｓ１およびＳ２タンパク質は、スパイクグリコプロテイン（Ｓグリコプロテイン）の切断産物であるグリコプロテインである。ＩＢＤＶの抗原が特に好ましく、ＩＢＤＶの抗原ＶＰ２がさらに好ましい。鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原はまた、先に列挙した抗原のうちの２つ以上の組み合わせであってもよい。
【００６２】
特定の実施形態において、本発明の遺伝子組換えウイルスベクターは、例えば、ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質または遺伝子産物などのＩＢＤＶウイルス性タンパク質または遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを有してもよい。別の実施形態において、斯かる遺伝子組換えウイルスベクターは、例えば、ＩＬＴＶ ｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇｌ、ＵＬ−３２タンパク質または遺伝子産物などの伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）ウイルス性タンパク質または遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを有してもよい。別の実施形態において、斯かる遺伝子組換えウイルスベクターは、例えば、ＮＤＶ Ｆ、ＨＮタンパク質または遺伝子産物などのＮＤＶウイルス性タンパク質または遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを有してもよい。別の実施形態において、斯かる遺伝子組換えウイルスベクターは、例えば、ＡＩＶ ＨＡ、ＮＡタンパク質または遺伝子産物などのトリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）ウイルス性タンパク質または遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを有してもよい。別の実施形態において、斯かる遺伝子組換えウイルスベクターは、例えば、ＩＢＶ Ｓ１、Ｓ２タンパク質または遺伝子産物などの伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）ウイルス性タンパク質または遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを有してもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、ＮＤＶ Ｆ−ＨＮ融合タンパク質、キメラ、または遺伝子産物などの遺伝子融合タンパク質または遺伝子産物を含む２つ以上の遺伝子を有してもよい。いくつかの実施形態において、斯かる遺伝子の完全コード配列は、完全長または完全機能的タンパク質またはポリペプチドが産生されるように、使用され得る。あるいは、ウイルスタンパク質またはポリペプチドの一部または断片は、特定の（単数もしくは複数の）ウイルスに対する保護を提供するのに十分であり得る。
【００６３】
好ましい実施形態において、本発明の遺伝子組換えウイルスベクターは、例えば、ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質または遺伝子産物などのＩＢＤＶウイルス性タンパク質または遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを有する。一実施形態において、ＩＢＤＶのＶＰ２をコードおよび発現する異種ポリヌクレオチドは、配列番号１０に規定される配列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列類似性を有し、好ましくは、配列番号６に規定される配列を有するポリヌクレオチドに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、より好ましくは配列番号１０の配列を有する。別の実施形態において、鳥類病原菌の抗原は、ＶＰ２であり、そして、配列番号１２に規定されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列類似性を有し、好ましくは、配列番号１２に規定されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、より好ましくは配列番号１２のタンパク質配列を有する。抗原はまた、配列番号１２の少なくとも８または少なくとも１０の連続したアミノ酸を含む免疫原性断片であってもよい。そのうえ、ＩＢＤＶ ＶＰ２の免疫原性断片または完全長タンパク質は、鳥類病原菌の別の抗原の免疫原性断片または完全長タンパク質に融合されてもよい。
【００６４】
別の実施形態において、鳥類病原菌の抗原は、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ガリドヘルペスウイルス１）グリコプロテインＥ（ｇＥ）、グリコプロテインＩ（ｇＩ）またはグリコプロテインＢ（ｇＢ）であり、そして、それぞれ、配列番号３１（ｇＥ）、配列番号３２（ｇＩ）または配列番号３３（ｇＢ）に規定されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列類似性を有し、好ましくは、それぞれ、配列番号３１（ｇＥ）、配列番号３２（ｇＩ）または配列番号３３（ｇＢ）に規定されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、より好ましくは、それぞれ、配列番号３１（ｇＥ）、配列番号３２（ｇＩ）または配列番号３３（ｇＢ）のタンパク質配列を有する。抗原はまた、それぞれ、配列番号３１（ｇＥ）、配列番号３２（ｇＩ）または配列番号３３（ｇＢ）の少なくとも８または少なくとも１０の連続したアミノ酸を含む免疫原性断片であってもよい。そのうえ、ＩＬＴＶ ｇＥ、ｇＩまたはｇＢの免疫原性断片または完全長タンパク質は、鳥類病原菌の別の抗原の免疫原性断片または完全長タンパク質に融合されてもよい。
【００６５】
別の実施形態において、鳥類病原菌の抗原は、ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）またはニューカッスル病ウイルス赤血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＮＤＶ−ＮＨ）であり、そして、それぞれ、配列番号３４（ＮＤＶ−Ｆ）または配列番号３５（ＮＤＶ−ＮＨ）に規定されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列類似性を有し、好ましくは、それぞれ、配列番号３４（ＮＤＶ−Ｆ）または配列番号３５（ＮＤＶ−ＮＨ）に規定されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、より好ましくは、それぞれ、配列番号３４（ＮＤＶ−Ｆ）または配列番号３５（ＮＤＶ−ＮＨ）のタンパク質配列を有する。抗原はまた、それぞれ、配列番号３４（ＮＤＶ−Ｆ）または配列番号３５（ＮＤＶ−ＮＨ）の少なくとも８または少なくとも１０の連続したアミノ酸を含む免疫原性断片であってもよい。そのうえ、ＮＤＶ−ＦまたはＮＤＶ−ＮＨの免疫原性断片または完全長タンパク質は、鳥類病原菌の別の抗原の免疫原性断片または完全長タンパク質に融合されてもよい。
【００６６】
別の実施形態において、鳥類病原菌の抗原は、トリインフルエンザＡ血清型Ｈ５赤血球凝集素（Ｈ５ ＨＡ）、トリインフルエンザＡ血清型Ｈ７株赤血球凝集素（Ｈ７株ＨＡ）、トリインフルエンザＡ血清型Ｈ９赤血球凝集素（Ｈ９ ＨＡ）またはトリインフルエンザＡ血清型Ｈ５Ｎ１ノイラミニダーゼ（Ｈ５Ｎ１ ＮＡ）であり、そして、それぞれ、配列番号３６（Ｈ５ ＨＡ）、配列番号３７（Ｈ７株ＨＡ）、配列番号３８（Ｈ９ ＨＡ）または配列番号３９（Ｈ５Ｎ１ ＮＡ）に規定されるので、アミノ酸配列を有するタンパク質に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列類似性を有し、好ましくは、それぞれ、配列番号３６（Ｈ５ ＨＡ）、配列番号３７（Ｈ７株ＨＡ）、配列番号３８（Ｈ９ ＨＡ）または配列番号３９（Ｈ５Ｎ１ ＮＡ）に規定されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。より好ましくは、それぞれ、配列番号３６（Ｈ５ ＨＡ）、配列番号３７（Ｈ７株ＨＡ）、配列番号３８（Ｈ９ ＨＡ）または配列番号３９（Ｈ５Ｎ１ ＮＡ）のタンパク質配列を有する。抗原はまた、それぞれ、配列番号３６（Ｈ５ ＨＡ）、配列番号３７（Ｈ７株ＨＡ）、配列番号３８（Ｈ９ ＨＡ）または配列番号３９（Ｈ５Ｎ１ ＮＡ）の少なくとも８または少なくとも１０の連続したアミノ酸を含む免疫原性断片であってもよい。そのうえ、Ｈ５ ＨＡ、Ｈ７株ＨＡ、Ｈ９ ＨＡまたはＨ５Ｎ１ ＮＡの免疫原性断片または完全長タンパク質は、鳥類病原菌の別の抗原の免疫原性断片または完全長タンパク質に融合されてもよい。
【００６７】
さらに別の実施形態において、鳥類病原菌の抗原は、ＩＢＶのＳ１またはＳ２グリコプロテインであり、そして、それぞれ、配列番号４０（Ｓ１）のアミノ酸２５〜５３０または配列番号４０（Ｓ２）のアミノ酸５５３〜１１４６に規定されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列類似性を有し、好ましくは、それぞれ、配列番号４０（Ｓ１）のアミノ酸２５〜５３０または配列番号４０（Ｓ２）のアミノ酸５５３〜１１４６に規定されるアミノ酸配列を有するタンパク質に対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。より好ましくは、それぞれ、配列番号４０（Ｓ１）のアミノ酸２５〜５３０または配列番号４０（Ｓ２）のアミノ酸５５３〜１１４６のタンパク質配列を有する。抗原はまた、それぞれ、配列番号４０（Ｓ１）のアミノ酸２５〜５３０または配列番号４０（Ｓ２）のアミノ酸５５３〜１１４６の少なくとも８または少なくとも１０の連続したアミノ酸を含む免疫原性断片であってもよい。そのうえ、Ｓ１またはＳ２タンパク質の免疫原性断片または完全長タンパク質は、鳥類病原菌の別の抗原の免疫原性断片または完全長タンパク質に融合されてもよい。
【００６８】
本発明に好適な抗原はまた、本明細書中に開示した鳥類病原菌の抗原の任意の対立遺伝子変異体であってもよい。「対立遺伝子変異体」という用語は、タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらし、かつ自然界の集団（例えばウイルス種又は変異体）内に存在する多形性を含むポリヌクレオチド又はポリペプチドを指す。そのような自然界の対立遺伝子変異は、典型的には１−５％の相違をポリヌクレオチド又はポリペプチドにもたらし得る。対立遺伝子変異体は、多数の異なる種で対象の核酸配列を配列決定することによって同定することができる（前記は、それらの種の同じ遺伝子の位置を同定するハイブリダイゼーションプローブを用いることによって容易に実施できる）。自然界の対立遺伝子変異の結果であり、かつ対象の遺伝子の機能的活性を変化させないそのような核酸変異及びその結果であるアミノ酸多形性又は変異はいずれも全てが本発明の範囲内に含まれる。
【００６９】
本発明に使用されるポリヌクレオチドは、特定の宿主に最適化されたコドンであってもよい。本明細書中で使用される場合、「最適化されたコドン」は、遺伝的に操作されて、ある種でその発現が向上したポリヌクレオチドを指す。ＩＢＤＶ ＶＰ２ポリペプチドをコードする最適化ポリヌクレオチドを提供するために、ＶＰ２タンパク質遺伝子のＤＮＡ配列を以下のように改変することができる：（１）個々の種で強力に発現される遺伝子が好むコドンを含む；（２）前記の種で実質的に見出される、ヌクレオチド塩基組成のＡ＋Ｔ又はＧ＋Ｃ含有量を含む；（３）前記の種の開始配列を形成する；（４）ＲＮＡの不安定化、不適切なポリアデニル化、分解及び停止を引き起こす配列又は二次構造ヘアピン又はＲＮＡスプライス部位を形成する配列を除去する。前記の種でのＶＰ２タンパク質の発現の向上は、真核細胞及び原核細胞又は個々の種におけるコドン使用の配分頻度を利用することによって達成できる。
【００７０】
本発明の遺伝子組換えウイルスベクターによってコードおよび発現されたウイルス抗原は、ウイルス遺伝子によってコードされてもよい。しかしながら、当業者は、所望の免疫応答を得るために特定のウイルス遺伝子の全体を組込むことを必要としないことをこれに関して理解する。むしろ、斯かる遺伝子の一部でも十分であり得る。タンパク質の長さにかかわらず斯かるタンパク質をコードする所望のウイルスタンパク質またはポリヌクレオチドの最適化が、当該技術分野で知られている方法を使用することで容易に実施され得る。当業者は、対象に導入されるときにウイルスタンパク質の免疫原性を増強するために、修飾が、（単数もしくは複数の）ウイルス遺伝子、またはそれらによってコードされるタンパク質に対してなされてもよいことをさらに理解する。
【００７１】
そのうえ、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する２つ以上の異種ポリヌクレオチドを含んでもよい。一実施形態において、本発明のベクターは、２または３つの、好ましくは、２つの、異種ポリヌクレオチドを含む。好ましくは、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドは、先に記載のＩＢＤＶ ＶＰ２をコードおよび発現する。
【００７２】
よって、いくつかの実施形態において、遺伝子組換えウイルスベクターは、単独ウイルス種からの１つの異種タンパク質を発現してもよいし、あるいは、ＭＤＶおよびトリウイルスによって引き起こされるさらなる疾患に対する保護を得るために、ガリドヘルペスウイルス３とは異なる、単独ウイルス種からの２つ以上の異種タンパク質を発現してもよい。例えば、一実施形態において、本発明は、ＧａｌＨＶ３ゲノム、ならびに異なる病原菌の抗原をコードおよび発現するポリヌクレオチドを含み、これにより、マレック病、および異なる鳥類病原菌によって引き起こされる少なくとも１つの他の疾患に対して、家禽などの鳥類における保護を提供する遺伝子組換えウイルスベクターを提供する。具体的には、本発明は、ＧａｌＨＶ３ゲノム、ならびに異なるウイルスの抗原をコードおよび発現するポリヌクレオチドを含み、これにより、マレック病、および異なるトリウイルス病原体によって引き起こされる少なくとも１つの疾患に対して、家禽などの鳥類における保護を提供する遺伝子組換えウイルスベクターを提供する。例えば、本発明による遺伝子組換えウイルスベクターは、ＭＤＶおよびＩＢＤＶに対して、家禽などの鳥類の保護を提供してもよく、またはＭＤＶおよびＩＬＴＶに対して保護を提供してもよく、またはＭＤＶおよびＮＤＶに対して保護を提供してもよく、またはＭＤＶおよびＡＩＶに対して保護を提供してもよく、またはＭＤＶおよびＩＢＶに対して保護を提供してもよい。好ましくは、本発明による遺伝子組換えウイルスベクターは、ＭＤＶおよびＩＢＤＶに対して、家禽などの鳥類の保護を提供してもよい。
【００７３】
他の実施形態において、遺伝子組換えウイルスベクターは、ＭＤＶに加えて複数のウイルスに対する保護を得るために、２つ以上のウイルス種から異種タンパク質を発現してもよい。例えば、一実施形態において、本発明は、ＧａｌＨＶ３ゲノム、ならびに２つの異なる病原菌の抗原をコードおよび発現する少なくとも２つのポリヌクレオチドを含み、これにより、マレック病、および鳥類病原菌によって引き起こされる少なくとも２つの他の疾患に対して、家禽などの鳥類における保護を提供する遺伝子組換えウイルスベクターを提供する。具体的には、本発明は、ＧａＨＶ３ゲノム、ならびに２つの異なるウイルスの抗原をコードおよび発現する少なくとも２つの異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えウイルスベクターを提供し、これにより、マレック病、およびトリウイルス病原体によって引き起こされる少なくとも２つの他の疾患に対して、家禽などの鳥類における保護を提供する。例えば、本発明による遺伝子組換えウイルスベクターは、ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ならびにＮＤＶ、ＡＩＶおよびＩＢＶから選択される疾患の１つに対して；またはＭＤＶ、ＮＤＶ、ならびにＩＢＤＶ、ＡＩＶおよびＩＢＶから選択される疾患の１つに対して；またはＭＤＶ、ＡＩＶ、ならびにＩＢＤＶ、ＮＤＶおよびＩＢＶから選択される疾患の１つに対して；またはＭＤＶ、ＩＢＶ、ならびにＩＢＤＶ、ＮＤＶおよびＡＩＶから選択される疾患の１つに対して、家禽などの鳥類における保護を提供し得る。好ましくは、本発明による遺伝子組換えウイルスベクターは、ＭＤＶ、ＩＢＤＶ、ならびにＮＤＶ、ＡＩＶおよびＩＢＶから選択される疾患の１つに対して、家禽などの鳥類における保護を提供し得る。
【００７４】
遺伝子組換えウイルスベクターが２つ以上の異種ポリヌクレオチドを含む場合、そのポリヌクレオチドは、同じ挿入部位に挿入されても、または、異なる挿入部位に挿入されてもよい。好ましくは、少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドが、ＵＬ３／ＵＬ４の遺伝子間遺伝子座に挿入される。さらに、２つ以上異種ポリヌクレオチドが、１つのプロモーターを使用する同じ発現カセットによってコードおよび発現されても、または別々の発現カセットによってコードおよび発現されてもよい。
【００７５】
よって、本発明によると、遺伝子組換えウイルスベクターは、１もしくは複数のウイルスタンパク質もしくはペプチド、またはその断片もしくは一部の発現のために１もしくは複数のプロモーターに作動可能に連結された１もしくは複数の導入遺伝子を含んでもよい。いくつかの実施形態において、単一の導入遺伝子が、単一プロモーターに作動可能に連結されても、または２つ以上の導入遺伝子が、単一プロモーターに作動可能に連結されてもよい。他の実施形態において、２つ以上の導入遺伝子が、第一の導入遺伝子が第一のプロモーターに作動可能に連結され、かつ、第二の導入遺伝子が第二のプロモーターに作動可能に連結される遺伝子組換えベクター中に存在してもよい。
【００７６】
改変した伝染性ウイルスによって挿入されたｃＤＮＡの遺伝子配列の発現成功には２つの条件が要求される。第一に、修飾ウイルスにとって、例えば、遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２への挿入によって、生存活性（完全な複製および増幅）を維持するように、挿入物はウイルスゲノムの非必須領域に導入されなければならない。挿入ｃＤＮＡの発現のための第二の条件は、該遺伝子の発現を可能にするウイルス骨格中の調節配列の存在である（例えば、プロモーター、エンハンサー、ドナーおよびアクセプタースプライシング部位ならびにイントロン、Ｋｏｚａｋ翻訳開始コンセンサス配列、ポリアデニル化シグナル、非翻訳配列エレメント）。
【００７７】
一般的には、真核細胞で強力なプロモーター機能を利用することが有利である。前記プロモーターには、極初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、モルモットＣＭＶプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、偽狂犬病ウイルスプロモーター（例えば糖タンパク質Ｘプロモーター）、単純ヘルペスウイルス−１のα４プロモーターなど、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβ−グロビンプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、マレック病ウイルス（ＭＤＶ−１、ＭＤＶ−２およびＨＶＴを含む）プロモーター（例えばｇＣ、ｇＢ、ｇＥまたはｇＩ糖タンパク質発現を駆動するプロモーター）、伝染性喉頭気管炎ウイルスプロモーター（例えばｇＢ、ｇＥ、ｇＩ、ｇＤ遺伝子のプロモーター）、または他のヘルペスウイルスプロモーターが含まれるが、ただしこれらに限定されない。挿入される位置がＳＢ−１遺伝子（例えばｇＣ、ｇＤ、ＵＳ２またはＵＳ１０遺伝子）から成るとき、外来遺伝子は別のプロモーター配列を付け加えることなく挿入できる。なぜならば、当該ベクターの欠失させた遺伝子のプロモーターが挿入される外来遺伝子の転写を駆動するからである。
１もしくは複数のマーカーを含む、中間体遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクター
【００７８】
さらなる態様において、本発明は、本発明の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３の製造に使用される反応中間体に関する。この中間体遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入された１もしくは複数のマーカーを含み、ここで、該遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、好ましくは、ガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターである。好ましくは、１もしくは複数のマーカーは、ＵＬ３／ＵＬ４の遺伝子間遺伝子座に挿入される。
【００７９】
マーカーは、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子またはＤＮＡバーコードであってもよい。選択マーカーは、例えば、殺生物剤抵抗性、または抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシンなど）抵抗性をコードしてもよい。好ましい選択マーカーは、Ｅ．コリガラクトキナーゼ遺伝子Ｋ（ｇａｌＫ）であって、そしてそれは、２−デゾキシ−ガラクトース（２−ＤＯＧ）に対する感受性を与えるが、唯一の炭素源としてのガラクトースによる生存および成長を可能にする。別の好ましい選択マーカーは、ｋａｎ／ｓａｃＢ、Ｔｎ５からのネオマイシン（カナマイシン）遺伝子およびバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）からのｓａｃＢ遺伝子を含む発現カセットである。選択マーカーは、当業者にとって周知であり、そして、本発明による使用に好適な任意のマーカーを含んでもよい。レポーター遺伝子は、発現を観察するのに使用され得るが、通常、細胞の死滅をもたらさない。好適なレポーター遺伝子としては、例えば、βグルクロニダーゼまたはｕｉｄＡ遺伝子（ＧＵＳ）、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、または固有波長にて蛍光発光するタンパク質の大ファミリーのうちのいずれか１つなどの様々な蛍光タンパク質遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、様々な発色基質が知られている酵素をコードする遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子、ｘｙｌＥ遺伝子（色原性カテコールを変換するカテコールジオキシゲナーゼをコードする）、ｏｃ−アミラーゼ遺伝子、チロシナーゼ遺伝子（チロシンをＤＯＰＡおよび（順番にメラニンに凝縮する）ドーパキノンに酸化させることができる酵素をコードする）、またはα−ガラクトシダーゼ（色原性α−ガラクトース基質を触媒する）が挙げられる。ＤＮＡバーコードは、検出可能、かつ、独特な配列を有する以外の特別な機能を有しない。好ましくは、マーカーは、選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子である。より好ましくは、中間体遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、選択マーカー遺伝子および／またはレポーター遺伝子を含む、１もしくは複数の発現カセットを含む。好ましい実施形態において、選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子は、ｇａｌＫまたはｋａｎ／ｓａｃＢ組み合わせである。マーカーは、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原のためのＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２の遺伝子間遺伝子座におけるプレースホルダとしての役割を果たし得るが、それが、以下で記載する鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原によって容易に置換され得るからである。
遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクターを製造する方法
【００８０】
本発明は、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターの製造方法であって、ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２への１、２またはそれ以上のポリヌクレオチドの導入を含み、ここで、該ガリドヘルペスウイルス３ベクターが、好ましくはガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターである方法をさらに提供する。
【００８１】
一実施形態において、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターを製造する方法は、（ａ）ガリドヘルペスウイルス３ベクターを準備し、（ｂ）鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを、そのガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入し、そして、任意選択で（ｃ）ステップ（ｂ）の鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含むガリドヘルペスウイルス３ベクターを増幅すること、を含む。
【００８２】
別の実施形態において、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターを製造する方法は、（ａ）ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に１もしくは複数のマーカーを含む、ガリドヘルペスウイルス３ベクターを準備し、ｂ）その１もしくは複数のマーカーを、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む発現カセットで置換し、そして、（ｃ）ステップ（ｂ）の鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含むガリドヘルペスウイルス３ベクターを増幅すること、を含む。遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３は、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）、好ましくはＢＡＣ、をコードおよび発現してもよい。よって、ステップ（ａ）は、（遺伝子組換え）ガリドヘルペスウイルス３ベクターをコードするポリヌクレオチドを含む細菌人工染色体またはＰ１由来人工染色体を準備することを含んでもよい。当業者は、ガリドヘルペスウイルス３のベクターとしてＢＡＣまたはＰＡＣを使用する利点が、１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドの挿入および増幅が、Ｅ．コリで実施できることである点を理解しているであろう。これはまた、所望のウイルスベクターのスクリーニングステップも含む。そのため、前記方法は、（ｄ）ステップ（ｂ）の鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターをコードするポリヌクレオチドを含むＢＡＣまたはＰＡＣを単離し、そして、（ｅ）ニワトリ胎児線維芽細胞に、ステップ（ｄ）のＢＡＣまたはＰＡＣをトランスフェクトする、ステップを含んでもよい。
【００８３】
先に概説したとおり、「ガリドヘルペスウイルス３ベクターを増幅」という用語は、使用したガリドヘルペスウイルス３ベクターにより、Ｅ．コリまたはニワトリ胎児線維芽細胞などのトリ宿主細胞における増幅に関する。Ｅ．コリでは、これは、好適な条件下、所望のウイルスベクターをコードするプラスミド（ＢＡＣまたはＰＡＣ）をトランスフェクトされたＥ．コリを培養し、そして、プラスミドＤＮＡを単離することを伴う。ニワトリ細胞では、所望のウイルスベクターを含む細胞を培養し、そして、所望のウイルスベクターを含む上清または細胞全体のいずれかが採集される。ウイルスの増殖のために、採集した所望のウイルスベクターは、鳥類の宿主細胞に形質導入するためにそのまま使用されてもよいし、またはさらなる使用前に凍結および保存されてもよい。
【００８４】
「１もしくは複数のマーカーを置換する」という用語は、本明細書中で使用される場合、当業者に知られている標的組込みのための任意の方法による、１もしくは複数のマーカーの部位における発現カセットの挿入を意味する。例えば、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む発現カセットは、相同組換えによって挿入されてもよい。あるいは、１もしくは複数のマーカー、好ましくは１もしくは複数のマーカーをコードする発現カセットは、部位特異的レコンビナーゼ（例えば、ＣｒｅまたはＦｌｐリコンビナーゼ）の認識部位（例えば、ｌｏｘＰまたはＦＲＴ部位）が両側に配置されてもよく、次に、１もしくは複数のマーカーが、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む発現カセットによって置換され、ここで、発現カセットはまた、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組換えまたはＦｌｐ−ＦＲＴ組換え技術を使用することで、同じ部位特異的レコンビナーゼの認識部位が両側に配置される。
【００８５】
遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス−３（ＭＤＶ−２）ウイルスベクターは、２ステップで、ＷＯ２０１３／０５７２３５およびＷＯ２０１７／０２７３２４に記載のように構成されてもよい。最初に、挿入の遺伝子座を両側に配置したガリドヘルペスウイルス−３（ＭＤＶ−２）ゲノム領域が、Ｅ．コリプラスミド構築物内にクローン化される；ドナー発現カセットＤＮＡの挿入を可能にするために、（単数もしくは複数の）固有の制限部位が、２つのフランキング領域（挿入プラスミド）の間に配置される。別々に、挿入されるｃＤＮＡまたはＤＮＡ遺伝子配列は、ガリドヘルペスウイルス−３（ＭＤＶ−２）ベクターおよび／または哺乳動物細胞などの真核細胞に特異的であるプロモーター領域（遺伝子開始領域）およびターミネーター（または、ポリアデニル化、ポリＡ）配列が前に置かれる。次に、発現カセット全体（プロモーター−導入遺伝子−ポリＡ）は、挿入プラスミドの固有の制限部位内にクローン化されて、挿入部位を両側に配置したガリドヘルペスウイルス−３（ＭＤＶ−２）「アーム」が両側に配置された発現カセットを含む「ドナープラスミド」を構築する。得られたドナープラスミド構築物は、Ｅ．コリで増幅され、そして、プラスミドＤＮＡが抽出される。次に、そのプラスミドは、プラスミド骨格（ガリドヘルペスウイルス−３（ＭＤＶ−２）アームおよび発現カセットの外側）を切断する制限酵素を使用することで線状化される。次に、ニワトリ胚線維芽細胞が、親ガリドヘルペスウイルス−３（ＭＤＶ−２）ＤＮＡおよび線状化ドナープラスミドＤＮＡによって同時トランスフェクトされる。次に、得られたウイルス集団は、導入遺伝子を発現する遺伝子組換えウイルスベクターが非発現性ウイルス集団から分離される複数回の極限希釈ステップによってクローン化される。同様に、別の外来性カセットが、別の挿入遺伝子座に挿入されて、２つの組換え遺伝子（ポリヌクレオチド）を発現する二重ガリドヘルペスウイルス−３（ＭＤＶ−２）ベクターが作成される。第二のカセットもまた、同じ遺伝子座に挿入され得る。遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス−３（ＭＤＶ−２）は、親ガリドヘルペスウイルス−３（ＭＤＶ２）菌株ＳＢ−１ＭＤワクチンと同様に、初代ニワトリ胚線維芽細胞内に産生される。インキュベーション後に、感染細胞は、採集され、冷凍培地と混合されて感染細胞を生存させ、そして、通常クライオバイアルまたはガラス製アンプル内で凍結させ、液体窒素中に保存される。
【００８６】
あるいは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス−３（ＭＤＶ−２）ベクターは、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）として構成されてもよい。具体的には、ガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ゲノム全体（Genebank受託番号ＨＱ８４０７３８．１）を含むｐＳＢ−１ ＢＡＣクローン（Petherbridge L et al., J Virol Methods. 2009; 158: 11-7）が、示した遺伝子座内に挿入されたｇａｌＫ発現カセット（配列番号８）を伴った組換えウイルスを作製するのに使用され得る。プライマー（表２で列挙されたプライマーなど）は、断片が挿入される領域の正確なヌクレオチドの相同性配列を有する。プライマーからの相同性配列とベクター内の遺伝子座のヌクレオチド配列との間の相同組換えが、断片の挿入をもたらす。陽性コロニーは、最少培地中の単独炭素源としてガラクトースを利用することができるそれらの能力に基づいて選択される。次に、ｇａｌＫ発現カセット（配列番号８）は、ＶＰ２発現カセット（配列番号９）によって置換されても、またはその他の異種ポリヌクレオチド発現カセットによって置換されてもよい。陽性のコロニーは、２−デオキシ−ガラクトースの存在下で成長するそれらの能力に基づいて選択され、そして、ＶＰ２発現カセットの組込みは、特異的ＰＣＲおよび配列決定によって確認される。本発明による遺伝子組換えガリドヘルペスウイルスベクターは、Ｅ．コリから単離され、そして、ＣＥＦが、本発明の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス−３ベクターをコードするＢＡＣ ＤＮＡを用いてトランスフェクトされ、そして、再構成されたウイルスが継代されて、作業用ウイルスストックが作製される。
ワクチン
【００８７】
いくつかの態様において、本発明による１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、１もしくは複数のトリウイルスから保護を提供するために、ニワトリまたは他の家禽などの対象に投与される、ワクチン、すなわち、免疫原性組成物として使用され得る。よって、ワクチンは、ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入された鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクターを含み、ここで、該遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、好ましくは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターである。
【００８８】
本発明のワクチンは、本発明の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス−３（ＭＤＶ−２）ベクターおよび医薬的または獣医学的に許容し得る担体、賦形剤またはアジュバントを含んでもよい。
【００８９】
別の実施形態において、ワクチンは：ｉ）ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入された鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス−３（ＭＤＶ−２）ベクター、ここで、該遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、好ましくは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターである；およびｉｉ）少なくともマレック病ウイルス（ＭＤＶ）ベクター、を含む。そのさらなるＭＤＶベクターは、好ましくは、ガリドヘルペスウイルス３ベクター、天然の弱毒化ＭＤＶ−１菌株Ｒｉｓｐｅｎｓ（ＣＶＩ−９８８）ベクターおよびシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴまたはＭＤＶ−３）菌株Ｆｃ１２６ベクター、より好ましくは、ガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクター、天然の弱毒化ＭＤＶ−１菌株Ｒｉｓｐｅｎｓ（ＣＶＩ−９８８）ベクターおよびシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴまたはＭＤＶ−３）菌株Ｆｃ１２６ベクターから成る群から選択される。さらなるＭＤＶベクターは、野性型ベクター、好ましくは、ガリドヘルペスウイルス３ベクター、天然の弱毒化ＭＤＶ−１菌株Ｒｉｓｐｅｎｓ（ＣＶＩ−９８８）ベクターおよびシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴまたはＭＤＶ−３）菌株Ｆｃ１２６ベクター、あるいは、遺伝子組換えＭＤＶベクター、好ましくは、ガリドヘルペスウイルス３ベクター、天然の弱毒化ＭＤＶ−１菌株Ｒｉｓｐｅｎｓ（ＣＶＩ−９８８）ベクターおよびシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴまたはＭＤＶ−３）菌株Ｆｃ１２６ベクターから成る群から選択されるＭＤＶベクター由来のもの、から成る群から選択されてもよい。
【００９０】
遺伝子組換えマレック病ウイルス（ＭＤＶ）ベクターは、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含んでもよい。遺伝子組換えＭＤＶベクターは、天然の弱毒化ＭＤＶ−１菌株Ｒｉｓｐｅｎｓ（ＣＶＩ−９８８）ベクターまたはシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴまたはＭＤＶ−３）菌株Ｆｃ１２６ベクターから得ることができる。本発明の第一の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターに加えて、遺伝子組換えＭＤＶベクターはまた、第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター、好ましくは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターであってもよい。当業者は、第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターが、それらが異なる異種ポリヌクレオチドを発現するという点において、第一の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターと異なっていることを理解する。よって、第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、第一の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターの１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドと異なる、鳥類病原菌の抗原をコードおよび発現する少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む。当業者は、２つの遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターが、異なる異種ポリヌクレオチドを発現し、したがって、マレック病に加えて鳥類病原菌によって引き起こされる異なる疾患に対する保護を付与し得ることをさらに理解する。この第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターは、同様に、前記の第二のガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２中に、好ましくは、遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４中に、挿入された１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含んでもよい。第一のベクターおよび第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターが、好ましくは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターであるが、それらはまた、例えば、第一のベクターがＳＢ−１菌株由来であり、かつ、第二のベクターがＨＰＲＳ２４菌株由来であるか、または第一のベクターがＨＰＲＳ２４菌株由来であり、かつ、第二のベクターがＨＰＲＳ２４菌株由来であるなど、異系統に由来してもよい。好ましくは、（第一の）遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターと先に記載したさらなるマレック病ウイルスは、１つの剤形で一緒に投与される。あるいは、（第一の）遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターと先に記載したさらなるマレック病ウイルスは、同時にまたは異なる時点にて、別々の剤形で投与されてもよい。
【００９１】
本発明によるワクチンは、対象における抗体免疫および／または細胞性免疫能を作り出すように設計されている。ワクチンはさらに、医薬的に許容し得る賦形剤、担体またはアジュバントを含んでもよい。医薬的に許容し得る賦形剤、担体またはアジュバントは、外因性抗原に対する対象の免疫応答を高める物質であってもよく、これだけに限定されるものではないが、アジュバント、リポソーム、生分解性ミクロスフェアを含む。医薬的に許容し得る担体またはアジュバントは、急速な異化から抗原を保護するように設計された物質、例えば、水酸化アルミニウムまたは鉱油など、あるいは、免疫応答の刺激物質、例えば、百日咳菌または結核菌から得られたタンパク質などを含んでもよい。本発明の医薬組成物およびワクチンは１つ以上のアジュバントを含むか、または本質的に前記から成る。本発明の実施に使用される適切なアジュバントは：（１）アクリル酸またはメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸およびアルケニル誘導体のポリマー、（２）免疫刺激配列（ＩＳＳ）、例えば１つ以上の非メチル化ＣｐＧユニットを有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman et al, 1996；ＷＯ９８／１６２４７）、（３）水中油エマルジョン、例えば、"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" published by M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995の１４７ページに記載されたＳＰＴエマルジョンおよび同書の１８３ページに記載されたエマルジョンＭＦ５９、（４）四級アンモニウム塩を含む陽イオン脂質、例えばＤＤＡ、（５）サイトカイン、（６）水酸化アルミニウムまたはリン酸アンモニウム、（７）サポニン、または（８）本出願に引用され参照により含まれる任意の文献で考察される他のアジュバント、または（９）前記の任意の組合せまたは混合物、である。市販のアジュバントは、例えば、フロイント不完全アジュバントおよび完全アジュバント、Merck Adjuvant65、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムゲル（ミョウバン）またはアルミニウムリン酸塩など；ＣｐＧオリゴヌクレオチド、カルシウム、鉄または亜鉛の塩；アシル化チロシンの不溶性懸濁液；アシル化糖；陽イオンまたは陰イオン誘導体化多糖類；ポリホスファゼン；生分解性ミクロスフェア；およびモノホスホリルリピドＡ、を含んでもよい。
【００９２】
当業者は、本発明を伴った使用に適切な医薬的に許容し得る担体を特定できる。好適な医薬的に許容し得る担体は、投与される特定の組成物、ならびにその組成物を投与するのに使用される特定の方法によって部分的に決定され得る。したがって、本発明で有用でもあり得る、ワクチンのさまざまな好適な配合物が、利用可能である。好適な医薬的に許容し得る担体としては、水性および非水性、等張滅菌注射液（意図される対象の血液と製剤を等張の状態にする、抗酸化剤、緩衝化剤、静菌剤および溶質を含む）、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存料を含み得る、水性および非水性滅菌懸濁液が挙げられる。医薬的に許容し得る担体または賦形剤は、ベクター（またはインビトロにおいて本発明のベクターから発現されたタンパク質）の投与を容易にするか、またはベクター（またはタンパク質）のトランスフェクションまたは感染を容易にする、および／または保存を改善する、任意の化合物または化合物の組み合わせであってもよい。本願発明の方法に使用される医薬的に許容し得る担体または賦形剤としては、これだけに限定されるものではないが、０．９％は、ＮａＣｌ（例えば、生理的食塩水）溶液またはリン酸緩衝液、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）またはポリビニールピロリドンが挙げられる。斯かるワクチンはまた、バッファー（例えば、中性緩衝生理的食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン）、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシンなど、抗酸化剤、静菌剤、キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオンなど、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、製剤を対象の血液と等張、低張、もしくはやや高張の状態にする溶質、懸濁化剤、増粘剤、および／または保存料、を含んでもよい。あるいは、本発明の組成物は、凍結乾燥製剤として処方されてもよい。注射液および懸濁液は、滅菌粉末、顆粒剤、および錠剤から調製されてもよい。
【００９３】
投与は、例えば、注射、経口投与、吸入、経皮投与、または直腸投与による、任意の簡便な様式であってもよい。投与はまた、卵内注射であってもよい。遺伝子組換えウイルスベクターまたは本明細書中に記載したワクチンの注射は、単回投与または用量において家禽などの対象に提供されても、または繰返し投与など複数回投与されてもよい。
【００９４】
ワクチンは、一般的に、予防的および／または処置的な目的に使用され得る。例えば、本発明によると、ワクチンは、１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患に対してワクチン接種するために鳥類などの対象に提供されてもよい。典型的には、ワクチンは、１もしくは複数の鳥類病原菌の感染症、または１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる臨床的症状の発症に対する保護に提供するために、鳥類病原菌の感染またはそれらへの曝露前に投与される。好ましくは、鳥類病原菌は、トリウイルスであり、より好ましくは、鳥類病原菌は、マレック病ウイルスおよび１もしくは複数のさらなるトリウイルスである。その１もしくは複数のさらなるトリウイルスは、好ましくは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリインフルエンザウイルスまたはトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）である。鳥類病原菌に対する保護を提供するか、またはワクチン接種するために、ワクチンは、若年時に、好ましくは、卵内に、例えば１８日齢の孵化卵などに、例えばニワトリ卵などに、または、ヒヨコに、好ましくは、１日齢のヒヨコに投与される。別の実施形態において、ワクチンはまた、例えば、対象における感染症の軽減または排除によるなど、対象において病原菌の処置を提供するために、１もしくは複数の鳥類病原菌の感染または曝露後に、トリなどの対象に提供されてもよい。
【００９５】
本発明によるワクチンは、単回投与または複数回用量コンテナ、例えば、密閉性アンプルまたはバイアルなどの状態で提供されてもよい。斯かるコンテナは、使用まで組成物の無菌的に保存するために密封されてもよい。一般的に、本明細書中に記載した組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳濁液として保存されてもよい。あるいは、斯かる組成物は、使用直前に無菌の液体担体の添加だけを必要とする凍結乾燥状態で保存されてもよい。
【００９６】
本発明との関連において、対象に投与される用量は、１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる臨床的症状に対して、経時的に対象に有益な予防応答、例えば、対象、例えばニワトリまたは他の家禽など、を保護することなど、に影響を及ぼすのに十分であるか、あるいは、１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患に対してワクチン接種するのに十分でなければならない。保護的な用量には、典型的には、約３０００〜５０００ｐｆｕの本発明の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３がいる。
ワクチンの使用
【００９７】
本発明の別の特徴は、１つ以上の抗原に対する免疫学的応答または１つ以上のトリ病原体に対する保護応答を動物で誘発する方法に関し、本方法は、本発明のワクチンを少なくとも１回動物に接種する工程を含む。本発明のさらに別の特徴は、１つ以上の抗原に対する免疫学的応答または１つ以上のトリ病原体に対する保護応答を動物でプライム−ブースト投与レジメンにより誘発する方法に関し、本方法は、少なくとも１つの共通のポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原を用いる、少なくとも１回の基礎投与および少なくとも１回のブースター投与を含む。基礎投与で用いられるワクチンは、ブースターとして用いられるものと同じであっても異なっていてもよい。
【００９８】
具体的には、本発明のワクチンは、１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患、好ましくは、マレック病、および１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患に対して鳥類にワクチン接種するために使用される。いくつかの実施形態において、本発明のワクチンは、１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる臨床的症状に対して、好ましくは、マレック病ウイルスによって引き起こされる臨床的症状および１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる臨床的症状に対して、鳥類を保護する際に使用するためのものである。
【００９９】
本発明によるワクチンの有効量を投与するステップを含む、マレック病および１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患に対する保護のための鳥類を処置する方法もまた、提供される。
【０１００】
ワクチン接種される動物は、鳥類であり、典型的には、家禽である。好適な動物は、例えば、シチメンチョウ、ニワトリ、ウズラ、ガチョウまたはハトである。好ましくは、ワクチン接種される動物は、シチメンチョウまたはニワトリであり、より好ましくは、ニワトリである。
【０１０１】
疾患または臨床的症状を引き起こす１もしくは複数の鳥類病原菌は、好ましくは、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、トリ伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）またはトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）から成る群から選択される鳥類病原菌である。
【０１０２】
他の好適な鳥類病原菌は、トリ脳脊髄炎ウイルスおよび他のピコルナウイルス、トリレオウイルス、トリパラミクソウイルス、トリメタニューモウイルス、トリアデノウイルス、ニワトリポックスウイルス、トリコロナウイルス、トリロタウイルス、トリパルボウイルス、トリアストロウイルスおよびニワトリ貧血ウイルス、コクシジウム症（アイメリア属）、カンピロバクター属、サルモネラ属、マイコプラズマ・ガリセプチカム、マイコプラズマ・シノビエ、パスツレラ属、アビバクテリウム属、Ｅ．コリまたはクロストリジウム属である。好ましくは、鳥類病原菌は、トリウイルスである。
【０１０３】
鳥類病原菌によって引き起こされ、それに対してワクチン接種または保護される好ましい疾患は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）によって引き起こされるニューカッスル病（ＮＤ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）によって引き起こされる伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ）、トリ伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）によって引き起こされるトリ伝染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）、トリインフルエンザウイルスによって引き起こされるトリインフルエンザ（ＡＩＶ）またはトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）によって引き起こされるトリ伝染性気管支炎（ＩＢ）である。
【０１０４】
通常、ワクチンの１回投与は、卵内またはヒヨコのいずれかで実施される。ヒヨコには、１日齢の時点で、皮下または筋肉内経路によって、好ましくは投与される。卵内投与は、１７〜１９日齢の孵化卵で、そして好ましくは、例えば、ニワトリからの、１８日齢の孵化卵で、典型的には実施される。動物は、最初の投与の時点で、好ましくは、少なくとも１７日齢の胎児または１日齢である。第二の投与は、生まれて１０日齢以内におこなわれ得る。
【０１０５】
一実施形態において、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクターまたは本発明のワクチンは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスによって引き起こされる臨床的症状に対して鳥類を保護するのに使用される。当業者は、１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドによってコードおよび発現される鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス、好ましくは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのＶＰ２、の抗原であることを理解する。
【０１０６】
１日齢のヒヨコでは多様な投与経路、例えば、皮下または筋肉内、皮内、経皮など、を用いることができる。卵内ワクチン接種は、羊膜嚢内および／または胚内に実施できる。市販の卵内およびｓ．ｃ．投与装置をワクチン接種に用いてもよい。
【実施例】
【０１０７】
ＳＢ−１ウイルスゲノム内へのｇａｌＫ発現カセットのクローニング
ガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ゲノム全体（Genebank受託番号ＨＱ８４０７３８．１）を含むｐＳＢ−１ ＢＡＣクローン（Petherbridge L et al., J Virol Methods. 2009; 158: 11-7）を、λファージから準備した組換えタンパク質を使用した相同組換えベースの技術を用いることによって、示した遺伝子座内に挿入されたｇａｌＫ発現カセット（配列番号８）を伴った組換えウイルスを作製するのに使用した。簡単に言えば、ｇａｌＫ発現カセットを、挿入が起こる特定の遺伝子座にタグ付与した特異的プライマー（表２）によって増幅した。ｐＳＢ−１ ＢＡＣを担持するＥ．コリ菌株ＳＷ１０２を、増幅した断片で形質転換した。相同組換えを用いて、断片を、相同性配列（タグ）によって指示した正確な位置に挿入した。例えば、プライマー対ＵＬ３／４Ｆ−ＧａｌＫＦとＵＬ３／４Ｒ−ＧａｌＫＲは、断片が相同組換えによってＵＬ３／ＵＬ４領域に挿入されるように、ｇａｌＫカセットにＵＬ３／４配列をタグ付与した。最少培地において単独炭素源としてガラクトースを利用するそれらの能力に基づいて、陽性コロニーを選択する。ｇａｌＫ選択ベースの遺伝子組換え工学的アプローチに関するプロトコルを記載した（Zhao Y, Nair V. Mutagenesis of the Repeat Regions of Herpesviruses Cloned as Bacterial Artificial Chromosomes. In: Braman J, editor. In Vitro Mutagenesis Protocols. 3rd ed: Humana Press; 2010. p. 53-74; Warming S et al., Nucleic Acids Res. 2005; 33:e36）。ｇａｌＫ発現カセットの組込みを、特異的ＰＣＲおよび配列決定によって確認した。
【０１０８】
ＵＬ３／４、ＵＬ１０／１１およびＵＬ２１／２２の代表的な挿入部位を以下に示す。正確な挿入部位の位置を、ボールド体で示し、挿入部位の２つのヌクレオチド５’および３’を強調表示する。表１に示した配列の５’および３’末端の数字、ならびに挿入部位に関して示した数字は、ガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ゲノム（GenBank受入番号ＨＱ８４０７３８．１）を指す。
表１：挿入遺伝子座
【表１】
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表２：ｇａｌＫ発現カセットを作製するために使用したプライマー
【表２】
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ＳＢ−１ウイルスゲノム内へのＩＢＤＶ ＶＰ２発現カセットのクローニング
【０１０９】
ＳＢ−１ウイルスゲノムのＵＬ３／４（配列番号１）、ＵＬ２１／２２（配列番号２）またはＵＬ１０／１１（配列番号３）遺伝子内遺伝子座にｇａｌＫ発現カセット（配列番号８）を含むｐＳＢ−１ＢＡＣクローンを、ＩＢＤＶ ＶＰ２発現カセット（配列番号９）を含有する３つの別々の組換えウイルスｐＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２、ｐＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２、およびｐＳＢ−１−ＵＬ１０／１１ＶＰ２を作製するのに使用した。ｇａｌＫ発現カセット（配列番号８）を、
ＶＰ２をコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）およびネズミサイトメガロウイルス（ＩＥ）プロモーター、ならびにエンハンサー配列（配列番号１１）を含む、遺伝子組換えＨＶＴ発現性ＩＢＤＶ ＶＰ２（Darteil R et al., Virology 1995; 211: 481-90）から増幅したＶＰ２発現カセット（配列番号９）によって置換した。２−デオキシ−ガラクトースの存在下で成長するそれらの能力に基づいて、陽性コロニーを選択し（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  Ｓがら、２００５；３３であると暖める：  ｅ３６）、そして、ＶＰ２発現カセットの組込みを、特異的ＰＣＲおよび配列決定によって確認した。
細胞培養とウイルス増殖
【０１１０】
ニワトリ胎児線維芽細胞（ＣＥＦ）を、特定病原体不含（ＳＰＦ）Rhode Island Red（ＲＩＲ）トリの９〜１１日齢の孵化卵から、５％の血清を含んだＥ１９９培地（Sigma）中で調製した。ＤＦ−１細胞を、１０％の血清を含んだダルベッコ変法Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ、Sigma）中で増殖させた。ＤＴ４０細胞を、１０％の血清を含んだＲＰＭＩ−１６４０培地中で増殖させた。すべての細胞培養液には、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および０．２５μｇ／ｍｌのフンギゾンを補充した。
【０１１１】
組換えウイルスストックの調製のために、ＣＥＦに、Lipofectamine（登録商標）トランスフェクト試薬（ThermoFisher）を使用して、遺伝子組換え構築物からのＢＡＣ ＤＮＡをトランスフェクトし、そして、再構成ウイルスを、継代して、作業用ウイルスストックを作製した。ＳＢ−１ワクチンウイルスの滴定を、ＣＥＦで実施し、そして、感染４日後に、プラーク数をカウントすることによって、力価を計算した。組換えウイルスプラークを、ＩＢＤＶ ＶＰ２特異的マウスモノクローナル抗体ＨＨ７とＳＢ−１特異的マウスモノクローナル抗体Ｙ５（Lee LF, Liu X, Witter RL. Monoclonal antibodies with specificity for three different serotypes of Marek's disease viruses in chickens. J Immunol. 1983; 130: 1003-6）ならびにヤギ抗マウスＨＲＰ複合化抗体（DAKO）およびＴｒｕｅＢｌｕｅ（商標）（ＫＰＬ）ペルオキシダーゼ基質を用いた免疫組織化学を使用することで確認した。
【０１１２】
抗原投与のための毒性ＩＢＤＶ ＵＫ６６１株を、感染３日間後に採集した感染したトリからの嚢状組織溶解物として使用した（Eterradossi N et al., Zentralbl Veterinarmed B. 1992; 39: 683-91）。簡単に言えば、ＩＢＤＶが感染した嚢を、疾患の急性徴候を示すトリからサンプル抽出し、そして、クロロトリフルオロメタン（ＦＲＥＯＮ１３）中で均質化した。４℃、１５００ｇにて３０分間の遠心分離後に採取した上清を、０．４５μｍのフイルターを通して濾過し、そして、ペニシリンとストレプトマイシンで処理した。溶解物を滴定し、等分し、そして、使用まで−８０℃にて維持した。次に、それを、２０羽の４週齢のｓｐｆ白色レグホンニワトリに、鼻腔内に接種した（１羽あたり０．０５ｍｌ）。Ｄ７８菌株を、ＤＦ−１細胞内で増殖させ、そして、使用まで−８０℃にて保存した。ＵＫ６６１およびＤ７８ウイルス株の力価測定を、Spearman-Karber法により組織培養感染量の中央値（ＴＣＩＤ５０）を計算することによって、それぞれ、ＤＴ４０およびＤＦ−１細胞で実施した（Brownie C et al., Biologicals. 2011;39:224-30）。
ウイルス成長曲線の試験
【０１１３】
１０ｃｍ2ディッシュ内の集密ＣＥＦに、１０3ｐｆｕのＳＢ−１ウイルスを、三連で感染させた。感染に続いて、感染したＣＥＦ細胞を、感染後０、６、２４、４８、９６および１２０時間の時点にて採集した。採集した細胞を、ＰＢＳで洗浄し、ＤＮＡ抽出を実施するまで、−２０℃に維持した。ゲノムＤＮＡを、感染細胞からＱＩＡａｍｐ９６ＤＮＡキット（Qiagen）を使用して抽出した。ＳＢ−１ゲノムのコピー数の定量化を、表３に示したプライマーおよびプローブを使用したリアルタイムＰＣＲを使用することで実施した（Singh SM et al., Res Vet Sci. 2010; 89: 140-5; Islam A et al., J Virol Methods. 2004; 119: 103-13; Renz KGet al., J Virol Methods. 2006; 135: 186-91）。
表３：リアルタイムＰＣＲプライマー
【表３】
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血清中和試験
【０１１４】
遠心分離によって採取した血清サンプルを、中和試験前に５６℃にて３０分間熱処理して、補体因子を不活化した。簡単に言えば、血清サンプルの段階希釈物を、ＩＢＤＶのＤ７８菌株の１００ ＴＣＩＤ５０と共に３７℃にて１時間インキュベートし、そして、血清−ウイルス混合液を、９６ウェルプレート内のＤＦ−１細胞単層上でインキュベートし、その後、２％のＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地で置換した。その細胞を、４日後に、力価を測定するために細胞変性効果（ＣＰＥ）の徴候についてチェックした。
統計解析
【０１１５】
ＳＢ−１組換えウイルスの複製レベルを比較するために、線状モデルを利用した。Ｌｏｇ１０ ｐｆｕを応答変数とみなし、そして、感染後の時間数に加えて、組換えウイルスを、説明変数とみなした。時点とウイルスの間の有意差を、ｐｏｓｔ−ｈｏｃ Ｔｕｋｅｙ検定を使用して確認した。実験経過中の中和抗体のレベルおよび群間の差を、二元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して分析した。各群内の抗体レベルを、一元配置ＡＮＯＶＡ検定を使用して分析した。抗原投与後のトリの群間の生存率を、Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定を使用して比較した。
実施例１
発現カセットを挿入するための異なる遺伝子座の分析
【０１１６】
ＳＢ−１ゲノムを含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）の構造は、Petherbridge Lらによって報告された（J Virol Methods. 2009; 158: 11-7; Singh SM et al., Res Vet Sci. 2010; 89: 140-5）。このｐＳＢ−１ＢＡＣクローンを使用して、我々は、先に記載の十分に確立された遺伝子組換え工学技術を使用して、他の鳥類病原菌からの保護抗原を発現するための新規遺伝子組換えベクターとしてのＳＢ−１の可能性を調べる。鳥類病原菌の抗原をコードする発現カセットを挿入するためのＳＢ−１ゲノム内の位置を確認するために、ＵＬ１０／ＵＬ１１、ＵＬ３／ＵＬ４、ＵＬ２１／ＵＬ２２、ＵＬ４０／４１、ＵＬ２６／２７、およびＵＬ５０／ＵＬ５１遺伝子間領域を、中間体ＢＡＣ構築物を産生するようにｇａｌｋ細菌発現カセットを挿入することで試験した。記載した位置の中で、ＵＬ２６／２７およびＵＬ５０／５１遺伝子間領域は、非常に少量のウイルスを産生した（表４）。さらに、ｒＳＢ−１ ＵＬ４０／４１ ｇａｌＫは、伝染性ウイルスを産生したが（表４）、ｒＳＢ−１ ＵＬ４０／４１ ＩＢＤＶ ＶＰ２は、伝染性ウイルスを産生せず（データ未掲載）、恐らく、大きな挿入物のせいであった。その結果、これらの位置を試験から除外した。
表４．ｒＳＢ−１ウイルスの様々な遺伝子組換え体の間の比較。示した発現カセットを指定した位置に挿入することによって、組換えウイルスを作製した。
【表４】
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【０１１７】
組込み部位ＵＬ４０／４１、ＵＬ２６／２７およびＵＫ５０／５１は複製に欠陥があったため、我々は、挿入部位ＵＬ３／４、ＵＬ１０／１１およびＵＬ２１／２２のさらなる調査を続けた。
実施例２
ｒＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２、ｒＳＢ−１−ＵＬ１０／１１ＶＰ２およびｒＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２ウイルスの複製
【０１１８】
この試験では、我々は、ウイルスゲノムのＵＬ３／４、ＵＬ１０／１１またはＵＬ２１／２２遺伝子座の遺伝子間遺伝子座内のＩＢＤＶ ＶＰ２を発現した３つの独立した構築物を作製するための新規ウイルスベクターとしてＭＤＶ−２（ＧａＨＶ３）菌株ＳＢ−１を使用した。
【０１１９】
ｐＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２、ｐＳＢ−１−ＵＬ１０／１１ＶＰ２およびｐＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２の構造の詳細を、図１Ａにまとめる。ＢＡＣ ＤＮＡのトランスフェクション後に製造される遺伝子組換えＳＢ−１ウイルスを、ＣＥＦにおいて３回継代して、低継代数のウイルスストックを製造した。ウイルスの救済（rescue）に続いて、成長曲線実験を、図２に示したとおり、ＣＥＦ細胞における遺伝子組換えＳＢ−１ウイルスと親ＳＢ−１ウイルスの複製を比較するために実施した。感染後４８時間と１２０時間の間で、ｐＳＢ−１およびｒＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２ウイルスの増殖速度において、有意差は観察されなかった。ＵＬ１０／１１遺伝子座およびＵＬ２１／２２遺伝子座からのＶＰ２発現カセットの対照的な発現は、インビトロにおけるＳＢ−１の増殖を遅くするように見えた。複製（ウイルスの力価に基づく）に対する斯かる負の効果はまた、ｒＳＢ−１−ＵＬ１０／１１ｇａｌＫウイルスにｇａｌＫ発現カセットを挿入するときにも観察されたが、ｒＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ｇａｌＫウイルスについては観察されなかった（表４を参照）。遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／４への挿入とｐＳＢ−１ＢＡＣクローンとの間の複製の有意差は観察されなかった（図２）。
【０１２０】
そのため、ＵＬ３とＵＬ４の間の遺伝子間接合部へのＶＰ２発現カセットの挿入がインビトロにおけるウイルスの増殖速度にほとんど影響しないと結論づけられた。ｒＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２、ｒＳＢ−１−ＵＬ１０／１１ＶＰ２およびｒＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２ウイルスに感染した細胞におけるＶＰ２抗原の発現を、図１Ｂに示したとおり、ＨＨ７モノクローナルおよび抗マウス−ＨＲＰ抗体で感染細胞を染色することによってさらに評価した。
実施例３
【０１２１】
ＵＬ３／４、ＵＬ１０／１１およびＵＬ２１／２２に組込み部位を限定して、我々はさらに、遺伝子組換えＳＢ−１ベクターによって送達される伝染性ファブリキウス嚢病（ＩＢＤ、ガンボロ病）の起因物質である、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）のＶＰ２タンパク質（Fahey KJ et al., J Gen Virol. 1989;70 ( Pt 6):1473-81）の免疫原性について調べた。
ＩＢＤＶに対するワクチンの開発：免疫化試験
【０１２２】
Pirbrightの実験動物舎で飼育された１日齢のＳＰＦ ＲＩＲヒヨコを、立証実験に使用した。すべての手順を、内部倫理審査委員会の承認後に、内務省のパーソナルおよびプロジェクトライセンスの下、英国動物（研究手続き）法１９８６に従い実施した。
【０１２３】
４０羽の１日齢のヒヨコを、それぞれ１０羽ずつの４つの群に振り分けた。３つの群それぞれには、１００μｌの接種材料中に３×１０3ｐｆｕをそれぞれ含む、ｒＳＢ−１−ＵＬ１０／１１ＶＰ２、ｒＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２またはｒＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２ワクチンウイルスそれぞれの皮下注射を与えた。対照群の１０羽それぞれには、製造業者によって推薦されるとおり、３×１０3ｐｆｕのＶＡＸＸＩＴＥＫHVT+IBD（登録商標）ワクチン（Merial）をワクチン接種した。血液サンプルを、血清学的研究のためにワクチン接種後２週目から５週目まで毎週採取した。
【０１２４】
遺伝子組換えＳＢ−１ワクチンの免疫原性を、ワクチン接種したニワトリにおける中和抗体の産生を計測することによって評価した。ＶＡＸＸＩＴＥＫHVT+IBD、ｒＳＢ−１−ＵＬ１０／１１ＶＰ２、ｒＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２またはｒＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２ワクチンウイルスを用いた皮下ワクチン接種の結果を、図３に記載する。中和抗体は、２週目から現れ始め、そして、ワクチン接種後４週目には１：６４０の最大力価まで上昇した。中和抗体は、２週目以降、ｒＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２でワクチン接種したトリの群以外のすべての群で検出可能であったが、ｒＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２でワクチン接種したトリの群では、中和抗体のレベルが、２週目の間、検知されない状態が続いた。ワクチン接種後３週目には、４つの群すべてが、約５０％のトリの血清で中和抗体を示した。ワクチン接種後４週目には、すべてのトリが中和抗体を示した（図３）。群間の抗体の平均レベルの有意差は、それぞれの時点にて観察されなかったが、実験的なワクチンを接種した群の中和抗体の平均値は、市販のワクチンを与えた群のものより高かった。
実施例４
【０１２５】
抗原投与試験のために、ワクチン接種を、ｒＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２およびｒＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２を使用して実施した。ｒＳＢ−１−ＵＬ１０／１１ＶＰ２を試験から除外した。なぜなら、それが、ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２およびＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２と比較して、成長レベルが低かったからである。
ＩＢＤＶに対するワクチンの開発：抗原投与試験
【０１２６】
Pirbrightの実験動物舎で飼育された１日齢のＳＰＦ ＲＩＲヒヨコを、立証実験に使用した。すべての手順を、内部倫理審査委員会の承認後に、内務省のパーソナルおよびプロジェクトライセンスの下、英国動物（研究手続き）法１９８６に従い実施した。
【０１２７】
２つの群（１群あたり８羽）の１日齢のトリに、１０００ｐｆｕのｒＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２またはｒＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２ウイルス株を皮下接種した。２つの対照群には、それぞれ、１０００ｐｆｕｐのＳＢ−１−由来ウイルスまたは３０００ｐｆｕの市販のＶＡＸＸＩＴＥＫHVT+IBD（登録商標）ワクチンを接種した。ワクチン接種後４週間における血液サンプル採取後に、トリに、（２つの鼻孔で分割した１００μｌの全容量中）１０４．３ ＴＣＩＤ５０のＩＢＤＶの有毒なＵＫ６６１菌株を用いて鼻腔内に抗原投与した。体重の記録に加え、トリを定期的に観察し、そして、６時間間隔で、臨床徴候をスコア化した。（スコア９を超える）高い臨床徴候を示したトリを、頸椎脱臼によって安楽死させた。
【０１２８】
ワクチン接種後３週目に、ワクチン接種したトリにおいて抗体レベルを試験した。ＶＡＸＸＩＴＥＫHVT+IBDおよびｒＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２をワクチン接種した群からの１羽のトリ、ならびにｒＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２をワクチン接種した群からの３羽のトリは、それらの血清中に中和抗体を示した。実施例３と比較して、投与したＳＢ−１ワクチンの量は、（両実験で与えられた３０００ｐｆｕの用量のＶＡＸＸＩＴＥＫHVT+IBDと比較して）３０００ｐｆｕから１０００ｐｆｕまで低減した。おそらく、より少ない用量を与えたので、ごく限られた数のトリだけが、ワクチン接種後３週目に中和抗体を示した。しかしながら、毒性ウイルスを用いた実験的な抗原投与後に、すべての群（ＳＢ−１対照群を除く）が、ＩＢＤＶに対する１００％の保護を示した。よって、我々の試験では、新規遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス２ベクターのワクチンが、ＶＡＸＸＩＴＥＫHVT+IBDをワクチン接種したトリで達成されたのと同じレベルの保護を誘発したことを示した。平均臨床スコアおよび抗原投与試験中のトリの生存率を、図４に示す。臨床徴候は、ＳＢ−１ワクチン接種した対照群において見られただけであり、そしてそこでは、それらが抗原投与後３６時間から現れ始め、そして、最後の残っていたトリを安楽死させときの、抗原投与後５６時間まで急激に増強した。陰性対照群のトリのすべてが、ＩＢＤＶ感染後５６時間に安楽死させたかまたは死滅したのに対して、ＶＡＸＸＩＴＥＫHVT+IBD、ｒＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２およびｒＳＢ−１−ＵＬ２１／２２ＶＰ２をワクチン接種したトリのすべてが生き残った（ｐ＜０．０００１）。
【０１２９】
結果は、ＧａＨＶ３が、１日齢のヒヨコにおけるＩＢＤＶ ＶＰ２を用いた免疫化のための新規ベクターとして使用でき、そして、ＩＢＤＶの１００％致死量を用いた抗原投与に対する完全保護をもたらすことを示す。よって、ＧａＨＶ３ゲノム内の２つの位置：遺伝子間ＵＬ３／４遺伝子座および遺伝子間ＵＬ２１／２２遺伝子座、が、ベクターの複製に対して大きな犠牲を払うことなく、ＶＰ２カセットの有効な送達を可能にすることが確認された。これらの遺伝子座はまた、他の病原菌からの遺伝子の送達をサポートすることも予測される。結果は、ＧａＨＶ３、特に菌株ＳＢ−１、が、ニワトリのＩＢＤＶワクチン接種のためのベクターとしての使用に好適であり、しかも、それは、商業的に実施可能な用量において１００％の保護を示すことができ、その結果、鳥類疾患に対する組換えワクチンを開発するための新しいベクタープラットフォームを増やした。
実施例５
【０１３０】
干渉を試験するために、ranger goldの１日齢のヒヨコに、３つの別々の群において、ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２、ＨＶＴ−Ｈ９ＨＡ（ＨＶＴ発現性トリインフルエンザＨＡタンパク質）、ＨＶＴ−Ｈ９ＨＡとＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２の組み合わせを接種した。群間でワクチンウイルスの発散および移動の可能性を最小限にするために、トリを別々に収容した。トリの追加群には接種をおこなわず、陰性対照とみなした。表５に、試験に使用したトリの４つの群をまとめる。
表５．ＳＢ−１とＨＶＴワクチンウイルスとの相互作用を試験するための実験計画の概要
【表５】
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【０１３１】
血液サンプルを、６週間（０、１、３、４、５および６週目）にわたり週１回の頻度でニワトリの腕頭静脈を介して採取した。ウイルス中和アッセイのために、血清サンプルを、５６℃にて３０分間熱不活性化した。熱不活性化に続いて、血清の２倍段階希釈を、９６ウェルプレート内で作製し、１００ ＴＣＩＤ５０のＩＢＤＶ菌株Ｄ７８とインキュベートして、ウイルスを中和した。ウイルスと血清の複合体を、ＤＦ−１細胞上に移し、そして、その細胞を１時間インキュベートした。次に、ウイルス−血清複合体を、取り除き、そして、２％のウシ胎仔血清を補充したＤＭＥＭに置換した。細胞変性効果（ＣＰＥ）の出現を、ＤＦ−１細胞において接種の５日後に見つけた。ＤＦ−１細胞におけるＣＰＥの存在しなかった血清の最後の希釈を、血清中の中和抗体の力価として報告した。
【０１３２】
図１は、ＳＢ−１およびＨＶＴワクチンを用いてワクチン接種したトリの血清からのウイルス中和アッセイ結果をまとめる。ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２、ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２、ＨＶＴ−９ＨＡ、および陰性対照を用いてワクチン接種したトリに関するＩＢＤＶ ＶＰ２に対する中和抗体の力価を示す。それが図１に示すように、３つの群（ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２ワクチン接種群；ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２とＨＶＴ−９ＨＡを組み合わせたワクチン接種群；およびワクチン接種していない群）にわたるすべてのトリが、ワクチン接種前（０週目）に高力価の母親由来抗体を示した。抗体のレベルは、５週目までに３つの群すべてで下がり始めた。中和抗体における実際の立ち上がりは、５週目以降に見られ、そのとき、母親由来抗体の力価が６４まで下がり、そして、６週目にさらに下がり続けた。中和抗体の力価は、ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２ワクチン接種群、およびＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２とＨＶＴ−９ＨＡを組み合わせたワクチン接種群において、６週目にて１：２５６を超えるまで増加した。陰性群とワクチン接種群との間のこの差は、それぞれの時点のデータを比較するＴｕｋｅｙ検定を使用して有意であることがわかった。６週目において、ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２ワクチン接種群と、ＳＢ−１−ＵＬ３／４ＶＰ２とＨＶＴ−９ＨＡを組み合わせたワクチン接種群との間で、統計的有意差は観察されなかった。よって、データは、ＳＢ−１とＨＶＴが互いに干渉しないことを示す。
本発明は、以下の項目を包含する：
１．ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入された、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクター。
２．前記ガリドヘルペスウイルス３ベクターが、ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４に挿入された１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む、項目１に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
３．前記遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクターが、ガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）菌株ＳＢ−１ベクターである、項目１または２に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
４．前記少なくとも１つの抗原が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）またはトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）に対して保護的である、項目１〜３のいずれか１項に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
５．前記少なくとも１つの抗原が、
（ａ）ＩＢＤＶのＶＰ２、ＶＰ３、ＶＰ４およびＶＰＸ；
（ｂ）ＩＬＴＶのグリコプロテインＢ、グリコプロテインＩ、グリコプロテインＤ、グリコプロテインＥおよびグリコプロテインＣ；
（ｃ）ＮＤＶのニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）およびウイルス血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＮＤＶ−ＮＨ）；
（ｄ）トリインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）およびノイラミニダーゼ（ＮＡ）；ならびに
（ｅ）ＩＢＶのＳ１またはＳ２タンパク質、
から成る群から選択される、項目１〜４のいずれか１項に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
６．前記少なくとも１つの抗原が、ＩＢＤＶに対して保護的である、項目４に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
７．前記少なくとも１つの抗原が、ＩＢＤＶのＶＰ２である、項目１〜６のいずれか１項に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
８．以下の：
（ａ）ＶＰ２タンパク質アミノ酸配列が、配列番号１２に記載の配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するか、または、
（ｂ）ＶＰ２タンパク質が、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する、
項目７に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
９．前記ガリドヘルペスウイルス３ベクターが、１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含有する発現カセットを含む、項目１〜８のいずれか１項に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
１０．前記発現カセットがさらに、プロモーターを含む、項目９に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
１１．前記プロモーターが、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、モルモットＣＭＶプロモーター、マウスＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、偽狂犬病ウイルスプロモーターのグリコプロテインＸプロモーター、ヘルペス単純ウイルス−１α４プロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ウサギβ−グロビンプロモーター、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター、マレック病ウイルスプロモーターのグリコプロテインｇＣ、ｇＢ、ｇＥまたはｇｌ遺伝子および伝染性喉頭気管炎ウイルスプロモーターのグリコプロテインｇＢ、ｇＥ、ｇｌ、ｇＤの遺伝子から成る群から選択される、項目１０に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
１２．項目１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターを含むワクチン。
１３．さらに、医薬的に許容し得る賦形剤、担体またはアジュバントを含む、項目１２に記載のワクチン。
１４．ガリドヘルペスウイルス３ベクター、天然の弱毒化ＭＤＶ−１菌株Ｒｉｓｐｅｎｓ（ＣＶＩ−９８８）ベクターおよびシチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）菌株Ｆｃ１２６ベクターから成る群から選択されるさらなるマレック病ウイルス（ＭＤＶ）ベクターを含む、項目１２または１３に記載のワクチン。
１５．前記さらなるＭＤＶベクターが、遺伝子組換えＭＤＶベクターである、項目１４に記載のワクチン。
１６．前記遺伝子組換えマレック病ウイルス（ＭＤＶ）ベクターが、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む、項目１５に記載のワクチン。
１７．項目１〜１１のいずれか１項に記載の第一の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターに加えて、前記遺伝子組換えマレック病ウイルスベクターが、第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター、好ましくは、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターである、項目１４〜１６のいずれか１項に記載のワクチン。
１８．前記第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターが、前記第二のガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２、に挿入された１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む、項目１７に記載のワクチン。
１９．前記第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターが、該第二のガリドヘルペスウイルス３の遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４に挿入された１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む、項目１８に記載のワクチン。
２０．前記第二の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターが、第一の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターの１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドとして鳥類病原菌の異なった抗原をコードおよび発現する少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含む、項目１７〜１９のいずれか１項に記載のワクチン。
２１．項目１４〜２０のいずれか１項に記載のさらなるマレック病ウイルスベクターと項目１２または１３に記載の（第一の）遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターが、一緒に投与されるか、または互いに別個に投与される、項目１４〜２０のいずれか１項に記載のワクチン。
２２．項目１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターをコードする単離されたＤＮＡ。
２３．項目１〜１１のいずれか１項に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターをコードするポリヌクレオチドを含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）。
２４．１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患に対する、鳥類のワクチン接種における使用のための、項目１２〜２１のいずれか１項に記載のワクチン。
２５．１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる臨床的症状に対する、鳥類の保護における使用のための、項目１２〜２１のいずれか１項に記載のワクチン。
２６．マレック病および１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患に対する、鳥類のワクチン接種における使用のための、項目１２〜２１のいずれか１項に記載のワクチン。
２７．マレック病ウイルスによって引き起こされる臨床的症状および１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる臨床的症状に対する、鳥類の保護における使用のための、項目１２〜２１のいずれか１項に記載のワクチン。
２８．前記１もしくは複数の疾患が、１もしくは複数の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）またはトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）によって引き起こされる、項目２４または２６に記載の使用のためのワクチン。
２９．前記鳥類が、家禽であり、好ましくは、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、ホロホロチョウまたはハトである、項目２４〜２８のいずれか１項に記載の使用のためのワクチン。
３０．前記鳥類が、シチメンチョウまたはニワトリ、好ましくは、ニワトリである、項目２９に記載の使用のためのワクチン。
３１．疾患または臨床的症状を引き起こす１もしくは複数の鳥類病原菌が、ニューカッスル病ウイルス、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスおよびトリ伝染性喉頭気管炎ウイルス、トリインフルエンザウイルス、ならびにトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）から成る群から選択される、項目２４〜３０のいずれか１項に記載の使用のためのワクチン。
３２．前記ワクチンが、スプレー投与、卵内、皮下、筋肉内、経口的または経鼻的に投与される、項目２４〜３１のいずれか１項に記載の使用のためのワクチン。
３３．前記ワクチンが、卵内に、好ましくは、１８日齢の孵化卵において卵内に投与される、項目３２に記載のワクチン。
３４．前記ワクチンが、ヒヨコにおいて、好ましくは１日齢のヒヨコにおいて、皮下または筋肉内に投与される、項目３２に記載の使用のためのワクチン。
３５．伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスによって引き起こされる臨床的症状に対する、鳥類の保護のための、項目５〜８のいずれか１項に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクター。
３６．マレック病および１もしくは複数の鳥類病原菌によって引き起こされる１もしくは複数の疾患に対する保護のための、鳥類を処置する方法であって、項目１２〜２１のいずれか１項に記載のワクチンの有効量を投与するステップを含む方法。
３７．前記１もしくは複数の疾患が、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、トリインフルエンザウイルス（ＡＩＶ）またはトリ伝染性気管支炎ウイルス（ＩＢＶ）のうちの１もしくは複数によって引き起こされる、項目３６に記載の方法。
３８．前記投与経路が、スプレー投与、卵内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与または鼻腔内投与である、項目３６に記載の方法。
３９．前記投与経路が、卵内投与である、項目３８に記載の方法。
４０．前記鳥類が、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ウズラ、ホロホロチョウまたはハトから成る群から選択される、項目３６に記載の方法。
４１．前記鳥類が、ニワトリである、項目４０に記載の方法。
４２．ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に挿入された１もしくは複数のマーカーを含む、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３（ＧａＨＶ３；ＭＤＶ−２）ベクター。
４３．前記ガリドヘルペスウイルス３ベクターが、ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４に挿入された１もしくは複数のマーカーを含む、項目４２に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
４４．前記マーカーが、選択マーカー遺伝子、レポーター遺伝子またはＤＮＡバーコードである、項目４２または４３に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
４５．前記ガリドヘルペスウイルス３ベクターが、選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子を含む１もしくは複数の発現カセットを含む、項目４２または４３に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
４６．前記選択マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子が、ｇａｌＫまたはｋａｎ／ｓａｃＢ組み合わせである、項目４５に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクター。
４７．項目４２〜４６のいずれか１項に記載の遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターをコードするポリヌクレオチドを含む細菌人工染色体（ＢＡＣ）。
４８．遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターを製造する方法であって：
（ａ）ガリドヘルペスウイルス３ベクターを準備し、
（ｂ）ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に、鳥類病原菌について少なくとも１つの抗原をコードおよび発現する１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを挿入し、そして
任意選択で（ｃ）ステップ（ｂ）の鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含むガリドヘルペスウイルス３ベクターを増幅すること、
を含む方法。
４９．遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターを製造する方法であって：
（ａ）ガリドヘルペスウイルス３ベクターの遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／ＵＬ４および／またはＵＬ２１／ＵＬ２２に１もしくは複数のマーカーを含むガリドヘルペスウイルス３ベクターを準備し、
（ｂ）該１もしくは複数のマーカーを、鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドが含む発現カセットで置換し、そして、
（ｃ）ステップ（ｂ）の鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含むガリドヘルペスウイルス３ベクターを増幅すること、
を含む方法。
５０．前記ステップ（ａ）が、遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターをコードするポリヌクレオチドを含む細菌人工染色体を準備することを含む、項目４８または４９に記載の方法。
５１．前記ステップ（ｂ）および（ｃ）が、Ｅ．コリで実施される、項目５０に記載の方法。
５２．さらに、以下のステップ：
（ｄ）ステップ（ｂ）の鳥類病原菌の少なくとも１つの抗原をコードする１もしくは複数の異種ポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えガリドヘルペスウイルス３ベクターをコードするポリヌクレオチドを含む細菌人工染色体を単離し、
（ｅ）ニワトリ胎児線維芽細胞に、ステップ（ｄ）の細菌人工染色体をトランスフェクトすること、
を含む、項目５１に記載の方法。
５３．前記ガリドヘルペスウイルス３ベクターが、ガリドヘルペスウイルス３菌株ＳＢ−１ベクターである、項目４８〜５２のいずれか１項に記載の方法。
配列表：
配列番号１＿遺伝子間遺伝子座ＵＬ３／４
配列番号２＿遺伝子間遺伝子座ＵＬ１０／１１
配列番号３＿遺伝子間遺伝子座ＵＬ２１／２２
配列番号４＿遺伝子間遺伝子座ＵＬ４０／４１
配列番号５＿遺伝子間遺伝子座ＵＬ５０／５１
配列番号６＿遺伝子間遺伝子座ＵＬ２６／２７
配列番号７＿遺伝子間遺伝子座ＵＬ４５／４６
配列番号８＿ｇａｌＫ発現カセット
配列番号９＿ＩＢＤＶ ＶＰ２発現カセットヌクレオチド配列
配列番号１０＿ＩＢＤＶ ＶＰ２ヌクレオチド配列
配列番号１１＿ネズミサイトメガロウイルス（ＩＥ）プロモーターおよびエンハンサー配列
配列番号１２＿ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質配列
配列番号１３＿ＵＬ２１／２２Ｆ−ＧａｌＫＦプライマー
配列番号１４＿ＵＬ２１／２２Ｒ−ＧａｌＫＲプライマー
配列番号１５＿ＵＬ２６／２７Ｆ−ＧａｌＫＦプライマー
配列番号１６＿ＵＬ２６／２７Ｒ−ＧａｌＫＲプライマー
配列番号１７＿ＵＬ３．５／４Ｆ−ＧａｌＫＦプライマー
配列番号１８＿ＵＬ３．５／４Ｒ−ＧａｌＫＲプライマー
配列番号１９＿ＵＬ１０／１１Ｆ−ＧａｌＫＦプライマー
配列番号２０＿ＵＬ１０／１１Ｒ−ＧａｌＫＲプライマー
配列番号２１＿ＵＬ４０／４１Ｆ−ＧａｌＫＦプライマー
配列番号２２＿ＵＬ４０／４１Ｒ−ＧａｌＫＲプライマー
配列番号２３＿ＵＬ５０／５１Ｆ−ＧａｌＫＦプライマー
配列番号２４＿ＵＬ５０／５１Ｒ−ＧａｌＫＲプライマー
配列番号２５＿ＭＤＶ−２フォワードプライマー
配列番号２６＿ＭＤＶ−２リバースプライマー
配列番号２７＿ＭＤＶ−２プローブ
配列番号２８＿ｏｖｏフォワードプライマー
配列番号２９＿ｏｖｏリバースプライマー
配列番号３０＿ｏｖｏプローブ
配列番号３１＿ガリドヘルペスウイルス１グリコプロテインＥ（ｇＥ）
配列番号３２＿ガリドヘルペスウイルス１グリコプロテインＩ（ｇＩ）
配列番号３３＿ガリドヘルペスウイルス１グリコプロテインＢ（ｇＢ）
配列番号３４＿ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質
配列番号３５＿ニューカッスル病ウイルスヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）
配列番号３６＿インフルエンザウイルスＡ血清型Ｈ５血球凝集素（Ｈ５ ＨＡ）
配列番号３７＿インフルエンザウイルスＡ血清型Ｈ７株血球凝集素（Ｈ７株ＨＡ）
配列番号３８＿インフルエンザウイルスＡ血清型Ｈ９血球凝集素（Ｈ９ ＨＡ）
配列番号３９＿インフルエンザウイルスＡ血清型Ｈ５Ｎ１ノイラミニダーゼ（ＮＡ）
配列番号４０＿伝染性気管支炎ウイルス、スパイクグリコプロテイン
【図１Ａ】
2020517307.tif 000008
【図１Ｂ】
2020517307.tif 000009
【図２】
2020517307.tif 000010
【図３】
2020517307.tif 000011
【図４】
2020517307.tif 000012
【図５】
2020517307.tif 000013
【配列表】
2020517307000001.app
【国際調査報告】
2020517307.tif 000014
2020517307.tif 000015
2020517307.tif 000016
2020517307.tif 000017
2020517307.tif 000018