(57)【要約】  本発明は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達が阻害され、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達が増強される培養条件を使用する胆管細胞オルガノイド（ＣＯ）の形での初代胆管細胞の増殖に関する。初代胆管細胞を増殖させる方法、増殖された胆管細胞の集団及び増殖された胆管細胞の医療用途が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
初代胆管細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させる方法であって、
（ｉ）分離された初代胆管細胞の集団を準備することと、
（ｉｉ）前記集団を、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地中で培養することで、増殖された胆管細胞の集団を生成することと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記胆管細胞は、増殖培地中でオルガノイドを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記初代胆管細胞は、肝外胆管細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記初代胆管細胞は、肝内胆管細胞である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
前記増殖培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤とを含む栄養培地である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤は、Ｗｎｔアゴニストである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｗｎｔアゴニストは、Ｒ−スポンジンである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ−１）である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記初代胆管細胞は、ドナー個体由来の初代胆組織から取得又は分離することができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
集団は、前記増殖培地中で３Ｄ培養において培養される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記増殖培地は、足場マトリックスを更に含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
増殖培地は、足場マトリックスと、（ｉ）ＥＧＦ、（ｉｉ）前記古典的Ｗｎｔ阻害剤及び（ｉｉｉ）前記非古典的Ｗｎｔ増強剤が補充された栄養培地とを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
増殖培地は、足場マトリックスと、（ｉ）ＥＧＦ、（ｉｉ）前記古典的Ｗｎｔ阻害剤及び（ｉｉｉ）前記非古典的Ｗｎｔ増強剤が補充された栄養培地とからなる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記栄養培地は、化学的に定義されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記化学的に定義された栄養培地は、任意にニコチンアミド、重炭酸ナトリウム、２−ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩、ピルビン酸ナトリウム、グルコース、ＨＥＰＥＳ、ＩＴＳ＋プレミックス、デキサメタゾン、グルタマックス、ペニシリン及びストレプトマイシンのうちの１つ以上が補充されたウィリアムＥ培地である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
初代胆管細胞はヒトである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記初代胆管細胞の集団には、幹細胞は含まれない、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記増殖された集団における前記胆管細胞は、ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＨＮＦ１Ｂ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、Ｊａｇｇｅｄ  １（ＪＡＧ１）、ＮＯＴＣＨ２、ＣＦＴＲ、ＳＣＲ、ＳＳＴＲ２、頂端側塩胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）、アクアポリン１及び陰イオン交換体２型を発現する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記増殖された集団における前記胆管細胞は、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、ＭＤＲ１媒介性分泌、セクレチン及びソマトスタチンへの生理学的応答、胆汁酸の移出、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、ＡＴＰ及びアセチルコリンへの生理学的応答並びにＶＥＧＦに応答する増殖の増加を示す、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記増殖された集団における前記胆管細胞は、ＭＨＣ抗原を発現しない、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記胆管細胞は、前記増殖培地中で２０代以上の継代にわたり培養される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記増殖された集団が個別の細胞を含むように胆管細胞オルガノイドを破壊することを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記増殖された胆管細胞の集団を生体適合性の足場中へと播種することを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記生体適合性の足場を、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地中で、前記胆管細胞が前記足場に定着するように培養することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記胆管細胞は、前記足場中で胆管上皮を形成する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記増殖された胆管細胞の集団又は足場を貯蔵することを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記増殖された集団又は足場を治療的に許容可能な賦形剤と混合することを含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法により生成される分離された胆管細胞の集団。
【請求項２９】
前記胆管細胞は、オルガノイド、オルガノイドに満たないクラスター又は個別の細胞の形である、請求項２８に記載の集団。
【請求項３０】
前記胆管細胞は、生体適合性の足場内にある、請求項２８又は２９に記載の集団。
【請求項３１】
前記胆管細胞は、ＣＫ７、ＣＫ１８、ＣＫ１９、ＨＮＦ１Ｂ、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、Ｊａｇｇｅｄ  １（ＪＡＧ１）、ＮＯＴＣＨ２、ＣＦＴＲ、ＳＣＲ、ＳＳＴＲ２、頂端側塩胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）、アクアポリン１及び陰イオン交換体２型を発現する、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の集団。
【請求項３２】
前記増殖された集団における前記胆管細胞は、ＭＨＣ抗原を発現しない、請求項２８〜３３１のいずれか一項に記載の集団。
【請求項３３】
前記胆管細胞は、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、ＭＤＲ１媒介性分泌、セクレチン及びソマトスタチンへの生理学的応答、胆汁酸の移出、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、ＡＴＰ及びアセチルコリンへの生理学的応答並びにＶＥＧＦに応答する増殖の増加を示す、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載の集団。
【請求項３４】
請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の分離された集団を含む、生体適合性の足場。
【請求項３５】
胆管障害の治療において使用するための、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の分離された胆管細胞の集団又は請求項３４に記載の足場。
【請求項３６】
胆管障害を伴う患者を治療する方法であって、
請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の分離された胆管細胞の集団又は請求項３４に記載の足場を、それを必要とする個体に投与することを含む、方法。
【請求項３７】
化合物をスクリーニングする方法であって、
請求項２８〜３３のいずれか一項に記載の分離された胆管細胞の集団又は請求項３４に記載の足場を試験化合物と接触させることと、
前記胆管細胞若しくは前記足場に対する前記試験化合物の効果及び／又は前記試験化合物に対する前記胆管細胞若しくは足場の効果を測定することと、
を含む、方法。
【請求項３８】
増殖、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、ＭＤＲ１媒介性分泌、セクレチン及び／又はソマトスタチン応答性、胆汁酸移出、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、並びにＡＴＰ応答性、アセチルコリン応答性及びＶＥＧＦ応答性のうちの１つ以上に対する前記試験化合物の効果を測定する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
治療化合物への患者の感受性を決定する方法であって、
（ｉ）疾患状態を伴う個体由来の疾患表現型を有する分離された初代胆管細胞の集団を準備することと、
（ｉｉ）前記集団を、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地中で培養することで、疾患表現型を示す増殖された胆管細胞の集団を生成することと、
（ｉｉｉ）特許請求の範囲に記載される方法により生成される増殖された胆管細胞の集団を治療化合物と接触させることと、
（ｉｖ）前記胆管細胞に対する前記治療化合物の効果を測定することと、
を含み、前記胆管細胞の疾患表現型の改善は、前記個体が前記治療化合物による治療に感受性があることの指標である、方法。
【請求項４０】
上皮成長因子（ＥＧＦ）と、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤とを含む増殖培地を含む、胆管細胞オルガノイドの生成のためのキット。
【請求項４１】
胆管細胞オルガノイドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生成のための培養培地の使用であって、前記培養培地は、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤とを含む、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［資金提供］
本発明につながる研究は、欧州連合の第７フレームワークプログラム（European Union's Seventh Framework Programme）（ＦＰ７／２００７−２０１３）のＥＲＣ助成契約番号２８１３３５に基づく欧州研究評議会と、ＭＲＣ−Ｓｐａｒｋｓ臨床研究トレーニングフェローシップ（MRC-Sparks Clinical Research Training Fellowship）（ＭＲ／Ｌ０１６７６１／１）とから資金提供を受けた。
【０００２】
本発明は、例えば疾患モデリング、薬物スクリーニング及び再生医療において使用するための成人又は小児のヒト初代胆管細胞の分離及び成長に関する。
【背景技術】
【０００３】
肝外胆管の障害は、かなりの罹患率及び死亡率をもたらす。実際、小児肝移植の７０％は胆管閉鎖症を治療するために行われる（非特許文献１）。原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）単独で米国の肝移植の５％を占め（非特許文献２）、そして胆管合併症は死肝移植後の移植不全の主な原因である（非特許文献３、非特許文献４）。しかしながら、肝外胆管上皮の研究は、長期培養と初代胆管細胞の大規模な増殖とにおける技術的課題より限定される。これらの課題により、これまでＰＳＣ及びその他の胆管症を標的とする薬物スクリーニング及び細胞療法のための大規模な実験は不可能となっていた。さらに、罹患した胆管及び／又は胆嚢を再建及び置換するために使用され得る健康なドナー組織が不足しているため、治療の選択肢は限られたままである（非特許文献５、非特許文献６）。
【０００４】
天然の胆管細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖は、この課題に対処することができ、胆管再建等の組織エンジニアリング用途に適した細胞を提供することができる。しかしながら、初代胆管上皮の培養には、問題が残されたままである（非特許文献７）。オルガノイド培養システムを使用する初代肝幹細胞の取得は以前に報告されている（非特許文献８）。しかしながら、得られた細胞が機能的胆管細胞へと分化し、ｉｎ  ｖｉｖｏで胆管系に定着する能力は、まだ実証されていない。さらに、そのようなプラットフォームのｉｎ  ｖｉｖｏでの適用は、移植後に不適切に増殖する能力及び／又は非胆管の細胞型へと分化する能力を有する幹細胞のコンタミネーションにより限定される。ヒト組織の入手の制限は、初代細胞に基づくシステムにとって大きな障害となる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Murray K.F. & Carithers R.L., Hepatology 2005, 41:1407-1432
【非特許文献２】Perkins J.D., Liver Transplant 2007, 13, 465-466
【非特許文献３】Skaro A.I. et al., Surgery 2009, 146:543-553
【非特許文献４】Enestvedt C.K. et al., Liver Transpl. 2013, 19:965-72
【非特許文献５】Gallo A. & Esquivel C.O, Pediatr. Transplant. 2013, 17:95-98
【非特許文献６】Felder S.I. et al., JAMA Surg 2013, 148:253-7-8
【非特許文献７】Sampaziotis, F et al., Hepaology 2015, 62:303-311
【非特許文献８】Huch M et al.; Cell 2014 160:299-312
【発明の概要】
【０００６】
本発明者らは、古典的Ｗｎｔシグナル伝達が阻害され、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達が増強される培養条件により、予想外にも胆管細胞オルガノイド（ＣＯ）の形で初代胆管細胞の効率的な増殖が可能となることを認識した。本明細書に記載されるように増殖された初代胆管細胞の集団は、例えば再生医療において有用であり得る。
【０００７】
本発明の態様は、初代胆管細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖させる方法であって、
（ｉ）分離された初代胆管細胞の集団を準備することと、
（ｉｉ）前記集団を、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地中で培養することで、増殖された集団を生成することと、
を含む、方法を提供する。
【０００８】
前記胆管細胞は、増殖培地中でオルガノイドを形成することができる。
【０００９】
非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤は、古典的及び非古典的Ｗｎｔシグナル伝達の増強剤、好ましくはＲ−スポンジンであり得る。
【００１０】
前記古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ−１）であり得る。
【００１１】
好ましくは、初代胆管細胞は、増殖培地中で３次元培養において培養される。
【００１２】
幾つかの実施の形態では、上記方法は、オルガノイドを破壊して、分離された胆管細胞の集団を生成させることを更に含み得る。分離された胆管細胞を、増殖培地中で更に培養することで、上記集団を増殖又は成長させることができる。
【００１３】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法により生成された分離された胆管細胞の集団を提供する。胆管細胞は、オルガノイド、オルガノイドに満たない（sub-organoid）集成体又は個別の細胞の形であり得る。
【００１４】
前記初代胆管細胞は、肝外胆管細胞であることが好ましい。
【００１５】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法により生成された胆管細胞を含む足場を提供する。
【００１６】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されるように生成された分離された胆管細胞の集団を胆管障害の治療を必要とする個体に投与することを含む、胆管障害の治療方法を提供する。
【００１７】
本発明の別の態様は、化合物をスクリーニングする方法であって、
本明細書に記載されるように生成された胆管細胞の集団を試験化合物と接触させることと、
前記胆管細胞に対する前記試験化合物の効果及び／又は前記試験化合物に対する前記胆管細胞の効果を測定することと、
を含む、方法を提供する。
【００１８】
好ましくは、胆管細胞は、オルガノイド（ＣＯ）の形で試験化合物と接触される。
【００１９】
本発明の別の態様は、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地を含む、胆管細胞の生成のためのキットを提供する。
【００２０】
本発明の別の態様は、胆管障害のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデリングをする方法であって、
（ｉ）胆管障害を伴う個体由来の分離された初代胆管細胞の集団を準備することと、
（ｉｉ）上記集団を、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地中で培養することで、胆管障害の遺伝子型又は表現型を示す増殖された胆管細胞の集団を生成することと、
を含む、方法を提供する。
【００２１】
本発明の別の態様は、個体を胆管障害について試験する方法であって、
上記個体由来の分離された初代胆管細胞の集団を準備することと、
上記胆管細胞の集団を、上記の本発明の一態様の方法を使用して増殖させることと、
上記胆管細胞の表現型を決定することと、
を含む、方法を提供する。
【００２２】
本発明の態様及び実施形態を、以下でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】種々の方法による初代胆管細胞の分離後の平均生存率を示す図である。Ｃ＋Ｄ：コラゲナーゼ＋ディスパーゼ。エラーバーは、標準偏差を示す；ｎ＝３。アスタリスクは、機械的解離とその他の分離法との間の生存率における統計的有意差を表す；＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１（多重比較のためのダネットの補正を伴う一元配置分散分析）。
【図２】ＥＣＯの取得のための機械的「スクレイピング」法の概略図を示す。
【図３】様々な成長因子との７日間の培養後に得られる細胞の平均数を示す図である。ＥＧＦ：上皮成長因子、Ｒ：Ｒ−スポンジン、Ｄ：ＤＫＫ−１、ＩＬ６：インターロイキン−６、ＨＧＦ：肝細胞成長因子、ＶＥＧＦ：血管内皮成長因子、ＦＢＳ：ウシ胎児血清、Ｆ２：線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）２、Ｆ７：ＦＧＦ−７、Ｆ１０：ＦＧＦ−１０、Ａ：アクチビン−Ａ、ＳＢ：アクチビン阻害剤ＳＢ−４３１５４２。エラーバーは、標準偏差を示す；ｎ＝３。アスタリスクは、Ｅ＋Ｒ＋Ｄとその他の培養条件との間での、得られる細胞の数における統計的有意差を表す（＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；多重比較のためのダネットの補正を伴う一元配置分散分析）。
【図４】種々の培養条件下で７日間にわたり成長させた分離したての初代胆管細胞の代表的なライブイメージを示す図である。ＥＧＦ：上皮成長因子。スケールバー：５００μｍ。
【図５】ポジティブコントロールとして使用されるＲ−スポンジン単独又はＲスポンジン及びＧＳＫ−３阻害剤ＣＨＩＲ  ９９０２１（ＣＨＩＲ）と比較した、Ｒ−スポンジン及びＤＫＫで処理されたＥＣＯにおけるリン酸化β−カテニンのレベルの増加を示す定量的ウェスタンブロット分析を示す図である。
【図６】Ｒｈｏキナーゼ阻害剤Ｙ−２７６３２、Ｒ−スポンジン単独、Ｒ−スポンジン及びＧＳＫ−３阻害剤ＣＨＩＲ  ９９０２１、又はＲ−スポンジン及びＤＫＫで処理されたＥＣＯにおけるＲｈｏキナーゼ活性のアッセイを示す図である。精製されたＲｈｏＫは、参照のために含まれる。これは、Ｒ−スポンジン及びＤＫＫで処理されたＥＣＯが、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達／ＰＣＰ経路の活性化と一致するＲｈｏキナーゼ活性の増加を示すことを裏付けている。エラーバーは、標準偏差を示す；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；多重比較のためのダネットの補正を伴う一元配置分散分析；ｎ＝３。
【図７】胆嚢及び総胆管のブラッシングからのＥＣＯの取得方法の概略図を示す。
【図８】ネガティブコントロールとして使用される分離したての初代胆管細胞（ＰＣ）及び胚性幹（ＥＳ）細胞と比較した、１代継代（Ｐ１）、１０代継代（Ｐ１０）及び２０代継代（Ｐ２０）のＥＣＯにおける胆管マーカーの定量的リアルタイムＰＣＲ（ＱＰＣＲ）の結果を示す図である（ｎ＝４つのＥＣＯ系統）。中心線、中央値；ボックス、四分位範囲（ＩＱＲ）；ひげ、範囲（最小から最大まで）。値はハウスキーピング遺伝子のヒドロキシメチルビラン合成酵素（ＨＭＢＳ）を基準とする。
【図９】初代胆管細胞（Ｐｒｉｍａｒｙ）、２０代継代ＥＣＯ（ＥＣＯ）、ｈＩＰＳＣ由来の肝内胆管細胞様細胞（ｉＣｈｏＬＣ）、ＥＳ細胞（ＥＳ）及び肝細胞（ＨＥＰ）のトランスクリプトームを比較するユークリッド階層的クラスター分析を示す図である。各プローブについて、標準スコア（ｚ−スコア）は、全ての試料にわたる平均レベルからの標準偏差の数で測定された発現差異を示している。ＥＣＯ、初代胆管細胞又は両方の細胞型において発現された遺伝子のクラスターが示されている。
【図１０】ＭＤＲ１阻害剤のベラパミルによって阻害される、ＥＣＯの内腔におけるＭＤＲ１蛍光性基質のローダミン１２３の分泌を示す図である。スケールバー、１００μｍ。
【図１１】播種したての初代胆管細胞（Ｒｈｏ  ＰＣ）、２０代継代ＥＣＯ（Ｒｈｏ  Ｐ２０）及びベラパミルで処理されたＰ２０のＥＣＯ（Ｖｅｒ）における、バックグラウンドに対して正規化された平均腔内ローダミン１２３蛍光強度を示す図である。エラーバーは、標準偏差を示す；ｎ＝全体で１５６５の測定。＊＊＊＊Ｐ＜０．００１、多重比較のためのダンの補正を伴うクラスカル・ウォリス検定。
【図１２】フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）が負荷されたコントロールと比較した、胆汁酸の移動が確認される蛍光性胆汁酸コリル−リジル−フルオレセイン（ＣＬＦ）の内腔排出を示す図である。スケールバー、１００μｍ。
【図１３】ＦＩＴＣが負荷された播種したての初代胆管細胞（ＦＩＴＣ）、ＣＬＦで負荷された播種したての初代胆管細胞（ＣＬＦ  ＰＣ）及びＣＬＦが負荷された２０代継代ＥＣＯ（ＣＬＦ  ＰＣ２０）における、バックグラウンドに対して正規化された平均腔内蛍光強度を示す図である。ｎ＝全体で１９４７の測定。エラーバーは、標準偏差を示す；＊＊＊＊Ｐ＜０．００１；多重比較のためのダンの補正を伴うクラスカル・ウォリス検定。
【図１４】Ｐ２０  ＥＣＯ及び播種したてのＰＣの平均γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）活性を示す図である；エラーバーは、標準偏差を示す；ｎ＝３；＊＊＊＊Ｐ＜０．００１；多重比較のためのダネットの補正を伴う一元配置分散分析。
【図１５】セクレチン又はセクレチン及びソマトスタチンで処理されたＥＣＯの平均直径測定を示す図である（ｎ＝８）。エラーバーは、標準偏差を示す；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＃Ｐ＞０．０５（多重比較のためのダンの補正を伴うクラスカル・ウォリス検定）。
【図１６】ＥＣＯとして成長した初代胆管細胞（ＥＣＯ）と比較した、単層として播種された初代胆管細胞（２Ｄ）の成長曲線を示す図であり、こうして２Ｄの胆管細胞は数代の継代後に増殖を止めることが裏付けられる。同じ数の細胞（５×１０５）から出発して、２Ｄの胆管細胞は、ＰＧＡ足場に播種するのに必要とされる細胞数（１０７個の細胞）を提供することができない。
【図１７】２Ｄの胆管細胞が増殖してＰＧＡ足場に定着することができず、注入部位に限定されたままであることを裏付ける明視野画像を示す。単一細胞に解離されたＥＣＯが定着した足場（ＥＣＯ−ＳＣ）の明視野画像は、ポジティブコントロールとして提供される。その足場には、２Ｄの胆管細胞足場と同じ数の細胞が播種され、それと同じ時間にわたり培養された。スケールバー：１００μｍ。
【図１８】ＥＣＯを使用する肝外胆管損傷（ＥＨＢＩ）マウスモデルにおける胆管再建のために使用される方法の概略図を示す。
【図１９】ＥＣＯを使用するＥＨＢＩマウスモデルにおける胆管再建後のカプラン・マイヤー生存分析を示す図であり、こうして、無細胞足場（足場のみ）ではなくＥＣＯが定着した足場（被移植）により胆管再建した後のＥＨＢＩマウスのレスキューが裏付けられる。＊＊Ｐ＜０．０１（ログ・ランク検定）。
【図２０】無細胞ＰＧＡ足場（足場のみ）、ＥＣＯが定着したＰＧＡ足場（被移植）により再建された胆嚢及び天然の未再建胆嚢コントロール（移植なし）を示す図であり、こうしてＥＣＯが定着した足場による完全再建が裏付けられる。ＣＤ：胆嚢管、ＣＢＤ：総胆管、ＣＨＤ：総肝管、Ｆ：底部、Ａ：前面、Ｐ：後面。スケールバー、５００μｍ。
【図２１】被移植のＥＣＯが定着した足場の無作為に選択された断面で定量化されたＣＫ１９陽性／ＣＫ７陽性、ＣＫ１９陽性／ＧＦＰ陽性、及びＶＩＭ／ＧＦＰ陽性の細胞の比を示す図である（ｎ＝１８）。エラーバーは、標準偏差を表す。
【図２２】ＥＣＯ集団のための高密度化コラーゲン管状足場の作製に使用される方法の概略図を示す。
【図２３】ＧＦＰ陽性ＥＣＯが定着した管のその作製後の最大強度投影画像（左）と、ＥＣＯが定着したコラーゲン管の内腔開通性を示す共焦点顕微鏡写真（右）とを示す。スケールバー、３０μｍ。
【図２４】ＥＣＯが定着した高密度化コラーゲン管を使用する胆管置換の方法の概略図を示す。
【図２５】ＥＣＯが定着した高密度化コラーゲン管及び線維芽細胞が定着した高密度化コラーゲン管のヘマトキシリン及びエオシン染色並びに免疫蛍光分析を示す図であり、こうしてＥＣＯ管においてＧＦＰ陽性／ＣＫ１９陽性の上皮により裏打ちされた胆管上皮及び開存内腔が存在するが、内腔が閉塞した線維芽細胞構築物には存在しないことが裏付けられる。
【図２６】ＥＣＯが定着した高密度化コラーゲン管及び線維芽細胞が定着した高密度化コラーゲン管を使用する胆管置換のＦＩＴＣ胆管造影図を示し、こうして線維構造物における内腔閉塞と比較したＥＣＯ管における内腔開通性が裏付けられる。スケールバー、１００μｍ（ＥＣＯ）及び５００μｍ（線維芽細胞）。
【図２７】本明細書に記載される肝外胆管細胞オルガノイドを作製する方法を使用することで、肝臓全体、生検組織又はＥＰＣＡＭソーティングされた肝内胆管細胞からも肝内胆管細胞オルガノイド（ＩＣＯ）を取得し得ることを裏付ける明視野画像を示す。Ｐ０、Ｐ２０：０代継代、２０代継代。
【図２８】ＩＣＯによる肝系譜マーカーの不存在下での重要な胆管マーカーの発現を実証することにより、この集団が均質であることが確認されるＱＰＣＲ分析を示す図である。ハウスキーピング遺伝子発現の倍率変化は、マーカーＣＫ１９、ＣＫ７、ＳＯＸ９、ＣＦＴＲ、ＥＰＣＡＭ、ＧＧＴ、ＡＬＢ、Ａ１ＡＴ及びＨＮＦ４Ａについて示されている。
【図２９】ＩＣＯがアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示すためＩＣＯが機能的であることを示す図である。
【図３０】ＩＣＯがγ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）活性を示すためＩＣＯが機能的であることを示す図である。
【図３１】ベラパミルの存在下で阻害される（左下）ＩＣＯによるローダミン１２３の内腔蓄積（左上）及び蛍光性胆汁酸のＣＬＦの内腔排泄（右下）によって示されるように、ＩＣＯが薬物を輸送し得るためＩＣＯが機能的であることを裏付ける図である。
【図３２】ＣＯの単一細胞ＲＮＡシーケンシングの特性を示す図であり、これは、胆管細胞オルガノイド（ＥＣＯ及びＩＣＯ）が、それらの元の組織とは免疫遺伝子を含む特定の因子の発現について異なることを示している。胆管系の種々の領域からの胆管細胞オルガノイドを初代胆管細胞と比較するＰＣＡプロットが示されている。左のパネルは、細胞型に基づくアノテーション（オルガノイド対初代）を示す。右のパネルは、元の領域に基づくアノテーションを示す（ＣＢＤ：総胆管、ＧＢ：胆嚢、及びＩＨＤ：肝内）。
【図３３】胆管細胞オルガノイド（ＣＯ）と初代胆管細胞との間での遺伝子発現の差異を裏付けるヒートマップを示す。表示遺伝子は、右側に示されている。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明は、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤とを含む細胞培養培地（「増殖培地」と呼称する）を使用する初代胆管細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖に関する。本明細書に記載されるように増殖された胆管細胞は、例えば再生医療及びスクリーニングにおいて有用であり得る。
【００２５】
胆管細胞は、胆管系の内腔表面を覆う単層である胆管組織の上皮由来の細胞である。胆管細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで胆汁分泌及び電解質輸送に重要な役割を担う。
【００２６】
初代胆管細胞は、胆管又は胆嚢等の肝内又は肝外胆管組織の上皮から直接分離され、連続（人工的に不死化された）胆管細胞系統とは異なる。初代胆管細胞は、肝内又は肝外胆管細胞であり得る。
【００２７】
本明細書に記載される使用のための初代胆管細胞は、哺乳動物、好ましくはヒトである。初代胆管細胞は、成人又は小児のドナーから取得され得る。
【００２８】
初代胆管細胞の集団は、幹細胞又はその他の多能性細胞若しくは複能性細胞を含まない。上記集団における初代胆管細胞の分化能力は、その起源の系譜に限定されており、肝細胞又は膵臓細胞等のその他の系譜の細胞へと分化することはできない（すなわち、上記集団は、胆管細胞及び胆管細胞前駆体からなる）。
【００２９】
幾つかの実施形態では、初代胆管細胞は、癌性細胞であり得て、該細胞は、例えば薬物スクリーニングにおいて有用であり得る。
【００３０】
初代胆管細胞は、本明細書に記載される方法において初代胆組織から取得若しくは分離されてもよく、又は初代胆組織から以前に取得されたものであってもよい。適切な胆組織は、胆嚢、並びに総胆管（ＣＢＤ）、胆嚢管、総肝管、右肝管、左肝管、肝内管及び膵管を含む、肝膵胆管（ＨＰＢ）、膵胆管（ＰＢ）又は胆管系の任意の部分からの胆管を含み得る。初代胆組織は、例えば、肝外植片、肝組織、肝生検材料、胆管切除物、胆嚢摘出物又は膵臓切除物から取得され得る。
【００３１】
幾つかの好ましい実施形態では、胆管細胞は、肝外胆管細胞である。肝外胆管細胞は、肝外胆管系の胆管上皮に由来し、胆嚢、胆嚢管、総胆管又は総肝管等の肝外胆組織から取得され得る。
【００３２】
他の実施形態では、胆管細胞は、肝内胆管細胞である。肝内胆管細胞は、肝内胆管系の胆管上皮に由来する。
【００３３】
胆管細胞が得られる元の初代胆組織は、ドナー個体においてｉｎ  ｓｉｔｕであっても、又は例えば胆管切除、肝切除若しくは移植、膵臓切除、胆道鏡検査若しくは胆嚢摘出等の手術若しくは解剖後にドナー個体から以前に取得された組織試料であってもよい。適切な組織は、使用前に保存液中に貯蔵され得る。
【００３４】
胆管細胞の集団は、任意の適切な技術によって初代胆組織から取得され得る。幾つかの実施形態では、初代胆細胞の集団を取り外すために、例えばブラッシング又はスクレイピングによる初代胆組織の機械的解離等の周術期技術が使用され得る。他の実施形態では、内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）ブラッシング等の侵襲が最小限の技術が使用され得る。
【００３５】
幾つかの実施形態では、胆管細胞の集団は、肝生検材料又は外植組織の機械的解離により、例えば、本明細書に記載される培養条件での組織の小（例えば、ミリメートル未満）切片をＨＧＦ及びフォルスコリン等の因子を添加して又はそれらの因子を添加せずに播種することにより取得され得る。あるいは肝組織、胆嚢及び胆管外植片は、機械的解離（スクレイピング／ダイシング）とリベラーゼ、コラゲナーゼ又はヒアルロニダーゼ等のマトリックス消化酵素を使用する酵素的消化との組み合わせを使用して、単一の初代細胞又は小塊へと解離され得る。引き続き、単一の初代細胞は、ＥＰＣＡＭ等の胆管マーカーに対する抗体で標識され、磁気関連細胞ソーティング又は蛍光関連細胞ソーティング（ＭＡＣＳ又はＦＡＣＳ）等の免疫単離法で分離され得る。
【００３６】
分離された単一細胞は、本明細書に記載される３Ｄ培養条件を使用して播種され得るか、又は単一細胞ＲＮＡシーケンシングのために処理され得る。本明細書におけるデータは、本明細書に記載される３Ｄ培養条件で、胆管細胞オルガノイドが選択的に増殖することを示している。肝細胞等のその他の肝細胞型はこれらの条件で成長しない。これは、例えば、肝マーカーの下方調節により示され得る（図２８）。
【００３７】
初代胆組織は、健康な個体又は疾患モデリングを可能にすることが知られる病理を有する患者に由来し得る。
【００３８】
胆管障害を伴う個体に由来する胆管細胞を使用することで、胆管障害に関連する遺伝子型又は表現型を示す増殖された集団を作製することができる。胆管障害に関連する遺伝子型又は表現型を有する胆管細胞を生成する方法は、
胆管障害を伴う個体由来の初代胆管細胞の集団を準備することと、
本明細書に記載されるように初代胆管細胞を増殖させることと、
それにより胆管障害に関連する遺伝子型又は表現型を有する胆管細胞の集団を生成することと、
を含み得る。
【００３９】
胆管障害に関連する表現型を有する増殖された集団は、胆管障害の１つ以上の特徴を示し得る。幾つかの実施形態では、胆管障害の１つ以上の特徴は、特定の条件又は処理に応答して示され得る。例えば、胆管細胞を１種以上のその他の細胞型と共培養することで、胆管障害に関連する表現型を誘発することができる。例えば、胆管細胞をＴ細胞等の免疫細胞と共培養することで、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）等の自己免疫性胆管障害に関連する表現型を誘発することができる。
【００４０】
生成されたら、胆管障害に関連する表現型を有する胆管細胞は、例えばスクリーニングで使用するために培養、増殖及び維持され得る。
【００４１】
胆管障害に関連する表現型を有する胆管細胞は、胆管障害の１つ以上の特性、特徴又は病理を示し得る。
【００４２】
増殖培地は、オルガノイド（胆管細胞オルガノイド）の形の肝外胆管細胞の増殖に対応する細胞培養培地である。
【００４３】
増殖培地は、ＥＧＦと、古典的Ｗｎｔ阻害剤と、非古典的Ｗｎｔ増強剤とを含む栄養培地である。
【００４４】
非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤は、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性を刺激、促進又は増加させる化合物である。
【００４５】
非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路は、脊椎動物における組織極性及び形態発生過程に関与するβ−カテニン非依存性経路である（Komiya, Y. & Habas, R. Organogenesis 4, 68-75 (2008)；Patel, V. et al.. Hum. Mol. Genet. 17, 1578-1590 (2008)；Strazzabosco, M. & Somlo, S. Gastroenterology 140, (2011)）。
【００４６】
非古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の構成要素としては、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ１１、ＬＲＰ５／６、Ｄｓｈ、Ｆｚ、Ｄａａｍ１、Ｒｈｏ、Ｒａｃ、Ｐｒｉｃｋｌｅ及びＳｔｒａｂｉｓｍｕｓが挙げられる。非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路の活性を測定するために適した方法は、当該技術分野でよく知られており、ＡＴＦ−２に基づくレポーターアッセイ（Ohkawara et al (2011) Dev Dyn 240 (1) 188-194）及びＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）に基づくアッセイが挙げられる。
【００４７】
非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤は、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達を選択的に増強し得るか、又はより好ましくは、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達及び古典的Ｗｎｔシグナル伝達の経路の両方を増強し得る（すなわち、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニスト）。
【００４８】
好ましい非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤としては、Ｗｎｔシグナル伝達アゴニストのＲ−スポンジンが挙げられる。
【００４９】
Ｒ−スポンジンは、Ｗｎｔシグナル伝達経路を正に制御する２つのシステインリッチのフリン様ドメインと１つのトロンボスポンジン１型ドメインとを有する分泌性活性化タンパク質である。好ましくは、Ｒ−スポンジンは、ヒトＲ−スポンジンである。
【００５０】
Ｒ−スポンジンとしては、ＲＳＰＯ１（遺伝子ＩＤ２８４６５４  核酸配列リファレンスＮＭ＿００１０３８６３３．３、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿００１０３３７２２．１）、ＲＳＰＯ２（遺伝子ＩＤ３４０４１９  核酸配列リファレンスＮＭ＿００１２８２８６３．１、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿００１２６９７９２．１）、ＲＳＰＯ３（遺伝子ＩＤ８４８７０、核酸配列リファレンスＮＭ＿０３２７８４．４、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿１１６１７３．２）又はＲＳＰＯ４（遺伝子ＩＤ３４３６３７、核酸配列リファレンスＮＭ＿００１０２９８７１．３、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿００１０２５０４２．２）が挙げられ得る。
【００５１】
Ｒ−スポンジンは、商業的供給業者（例えば、R&D Systems社、ミネソタ州、ミネアポリス）から容易に入手可能である。本明細書に記載される胆管細胞を増殖させるために適したＲ−スポンジンの濃度は、標準的な技術を使用して容易に決定することができる。例えば、増殖培地は、５０ｎｇ／ｍｌ〜５μｇ／ｍｌ、好ましくは約５００ｎｇ／ｍｌのＲ−スポンジンを含み得る。
【００５２】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性を阻害、遮断又は減少させる化合物である。
【００５３】
古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路は、遺伝子発現の調節に関与するβ−カテニン依存性経路である（Klaus et al Nat. Rev. Cancer (2008) 8 387-398、Moon et al (2004) Nat. Rev. Genet. 5 691-701、Niehrs et al Nat Rev Mol. Cell Biol. (2012) 13 763-779）。古典的Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性を測定するために適した方法は、当該技術分野でよく知られており、ＴＯＰ−ｆｌａｓｈアッセイ（Molenaar et al Cell. 1996 Aug 9; 86(3):391-9）及びβ−カテニンのためのアッセイが挙げられる。
【００５４】
適切な古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤としては、Ｄｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１〜４（ＤＫＫ１〜４）、Ｓｏｇｇｙ−１／Ｄｋｋｌ１、分泌性Ｆｒｉｚｚｌｅｄ関連タンパク質１〜５（ｓＦＲＰ１〜５）、Ｗｎｔ阻害因子−１（ＷＩＦ−１）、ドラキシン、ＳＯＳＴ／スクレロスチン、ＩＧＦＢＰ−４、ＵＳＡＧ１及びＮｏｔｕｍが挙げられる。
【００５５】
好ましくは、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤は、ＤＫＫ−１である。ＤＫＫ−１（遺伝子ＩＤ２２９４３  核酸配列リファレンスＮＭ＿０１２２４２．２、アミノ酸配列リファレンスＮＰ＿０３６３７４．１）は、胚形成に役割を果たす２つのシステインリッチ領域を有する分泌性タンパク質である。ＤＫＫ−１は、商業的供給業者（例えば、R&D Systems社、ミネソタ州、ミネアポリス）から容易に入手可能である。本明細書に記載される胆管細胞オルガノイドを増殖させるために適したＤＫＫ−１の濃度は、標準的な技術を使用して容易に決定することができる。例えば、増殖培地は、１０ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、例えば約１００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ−１を含み得る。
【００５６】
上皮成長因子（ＥＧＦ；ＮＣＢＩ  遺伝子ＩＤ：１９５０、核酸配列ＮＭ＿００１１７８１３０．１  ＧＩ：２９６０１１０１２；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１７１６０１．１  ＧＩ：２９６０１１０１３）は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に結合することにより、細胞の成長、増殖及び細胞分化を刺激するタンパク質因子である。ＥＧＦは、通常の組み換え技術を使用して製造することができるか、又は商業的供給業者（例えば、R&D Systems社、ミネソタ州、ミネアポリス；Stemgent Inc社、米国）から得ることができる。本明細書に記載される胆管細胞オルガノイドを増殖させるために適したＥＧＦの濃度は、標準的な技術を使用して容易に決定することができる。例えば、増殖培地は、２ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを含み得る。
【００５７】
好ましくは、初代胆管細胞は、増殖培地中で３次元培養において培養される。３次元培養の場合に、増殖培地は３次元での細胞の成長及び増殖を支持し、胆管細胞がオルガノイドに集成することを可能にする足場マトリックスを更に含む。
【００５８】
適切な足場マトリックスは、当該技術分野においてよく知られており、ハイドロゲル、例えばコラーゲン、コラーゲン／ラミニン、圧縮コラーゲン（例えば、ＲＡＦＴ（商標）、TAP Biosystems社）、アルギン酸塩、アガロース、複合タンパク質ハイドロゲル、例えば基底膜抽出物、及び合成ポリマーハイドロゲル（Gjorevski et al Nature（2016）539 560-564）、例えばポリグリコール酸（ＰＧＡ）ハイドロゲル及び架橋デキストラン及びＰＶＡハイドロゲル（例えば、Cellendes Gmbh社、ドイツ、ロイトリンゲン）、不活性マトリックス、例えば多孔質ポリスチレン、並びに単離された天然ＥＣＭ足場（Engitix Ltd社、英国、ロンドン）が挙げられる。
【００５９】
足場マトリックスは、化学的に定義されたもの、例えばコラーゲン若しくは高密度化コラーゲンハイドロゲル、又は化学的に定義されていないもの、例えば複合タンパク質ハイドロゲルであり得る。好ましくは、増殖培地中の足場マトリックスは、複合タンパク質ハイドロゲルである。適切な複合タンパク質ハイドロゲルは、ラミニン、コラーゲンＩＶ、エナクチン及びヘパリン硫酸プロテオグリカン等の細胞外マトリックス成分を含み得る。複合タンパク質ハイドロゲルとしては、Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞由来の細胞外マトリックスタンパク質のハイドロゲルも挙げられ得る。適切な複合タンパク質ハイドロゲルは、商業的供給業者から入手可能であり、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）（Corning Life Sciences社）又はＣｕｌｔｒｅｘ（商標）ＢＭＥ  ２  ＲＧＦ（Amsbio（商標）Inc社）が挙げられる。例えば、増殖培地は、６６％のＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含み得る。
【００６０】
増殖培地は、足場マトリックスと、（ｉ）ＥＧＦ、（ｉｉ）ＤＫＫ−１等の古典的Ｗｎｔ阻害剤、及び（ｉｉｉ）Ｒ−スポンジン等の非古典的Ｗｎｔ増強剤が補充された栄養培地とを含むか又はそれらからなり得る。
【００６１】
栄養培地は、基礎培地を含み得る。適切な基礎培地としては、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハムＦ１２、アドバンスト・ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）又はＤＭＥＭ／Ｆ１２（Price et al Focus (2003), 25 3-6）、ウィリアムＥ（Williams, G.M. et al  Exp. Cell Research, 89, 139-142 (1974)）及びＲＰＭＩ−１６４０（Moore, G.E. and Woods L.K., (1976) Tissue Culture Association Manual. 3, 503-508）が挙げられる。幾つかの実施形態においては、ウィリアムＥ培地、例えば３３％のウィリアムＥ培地が好ましい場合がある。
【００６２】
基礎培地には、培地添加物及び／又は１つ以上の追加成分、例えばトランスフェリン、１−チオグリセロール、脂質、Ｌ−グルタミン若しくはＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン（例えば、Ｇｌｕｔａｍａｘ（商標））等の代用物、ニコチンアミド、リノール酸及び亜セレン酸（例えば、ＩＴＳ＋プレミックス）、デキサメタゾン、セレン、ピルビン酸塩、ＨＥＰＥＳ等のバッファー、重炭酸ナトリウム、ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩、グルコース並びにペニシリン及びストレプトマイシン等の抗生物質、そして任意にポリビニルアルコール、ポリビニルアルコール及びインスリン、血清アルブミン、又は血清アルブミン及びインスリンが補充され得る。
【００６３】
例えば、基礎培地には、１０ｍＭのニコチンアミド、１７ｍＭの重炭酸ナトリウム、０．２ｍＭの２−ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩、６．３ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１４ｍＭのグルコース、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、６μｇ／ｍｌのインスリン、６μｇ／ｍｌのヒトトランスフェリン、６ｎｇ／ｍｌの亜セレン酸、５μｇ／ｍｌのリノール酸、０．１μＭのデキサメタゾン、２ｍＭのＬ−アラニル−Ｌ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンが補充され得る。
【００６４】
栄養培地は、化学的に定義された基礎栄養培地であり得る。化学的に定義された培地は、規定の成分、好ましくは化学構造が既知の成分のみを含有する細胞培養のための栄養液である。化学的に定義された培地には、未定義の成分、又は未定義の成分を含む構成成分、例えばフィーダー細胞、間質細胞、血清、血清アルブミン及びＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）等の複雑な細胞外マトリックスは含まれない。化学的に定義された培地は、ヒト化されていてよい。化学的に定義されたヒト化培地には、非ヒト動物に由来する又は非ヒト動物から単離された成分又は添加物、例えばウシ胎児血清（ＦＢＳ）及びウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）及びマウスフィーダー細胞は含まれない。コンディショニングされた培地は、培養される細胞からの未定義の成分を含み、化学的に定義されていない。
【００６５】
適切な化学的に定義された栄養培地は、当該技術分野でよく知られており、ニコチンアミド、重炭酸ナトリウム、２−ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩、ピルビン酸ナトリウム、グルコース、ＨＥＰＥＳ、ＩＴＳ＋プレミックス（インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸及びリノール酸）、デキサメタゾン、グルタマックス、ペニシリン及びストレプトマイシンが補充されたウィリアムＥ培地が挙げられる。
【００６６】
胆管細胞は、増殖培地中で多重継代にわたり培養され得る。例えば、胆管細胞は、１０代以上、２０代以上、３０代以上、４０代以上又は５０代以上の継代にわたり培養され得る。１代継代には、２日間〜８日間、好ましくは約５日間かかり得る。
【００６７】
胆管細胞は、足場マトリックスを消化し、遠心分離により胆管細胞オルガノイドを採取し、該オルガノイドを個別の胆管細胞に破壊することにより継代され得る。胆管細胞は、増殖培地中で上記のように再懸濁及び培養され、そこで胆管細胞はオルガノイドへと再編する。
【００６８】
細胞培養のために適した技術は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、Basic Cell Culture Protocols, C. Helgason, Humana Press Inc. U.S. (15 Oct 2004) ISBN: 1588295451、Human Cell Culture Protocols (Methods in Molecular Medicine S.) Humana Press Inc., U.S. (9 Dec 2004) ISBN: 1588292223、Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, R. Freshney, John Wiley & Sons Inc (2 Aug 2005) ISBN: 0471453293、Ho WY et al J Immunol Methods. (2006) 310:40-52, Handbook of Stem Cells (ed. R. Lanza) ISBN: 0124366430、Basic Cell Culture Protocols' by J. Pollard and J. M. Walker (1997)、'Mammalian Cell Culture: Essential Techniques' by A. Doyle and J. B. Griffiths (1997)、'Human Embryonic Stem Cells' by A. Chiu and M. Rao (2003), Stem Cells: From Bench to Bedside' by A. Bongso (2005)、Peterson & Loring (2012)Human Stem Cell Manual: A Laboratory Guide  Academic Press and 'Human Embryonic Stem Cell Protocols' by K. Turksen (2006)を参照）。その培地及び成分は、商業的供給業者（例えば、Gibco社、Roche社、Sigma社、Europa bioproducts社、R&D Systems社）から取得され得る。標準的な哺乳動物細胞培養条件、例えば３７℃、２１％酸素、５％二酸化炭素が上記培養工程のために使用され得る。培地を、好ましくは２日毎に交換し、細胞は重力により沈降させた。
【００６９】
胆管細胞の集団は、本明細書に記載される増殖培地中でオルガノイドとして１０５倍以上、１０１０倍以上、１０１５倍以上、１０２０倍、又は１０３０倍以上に増殖され得る。
【００７０】
初代胆管細胞の集団は、増殖培地中で増殖し、オルガノイド（ＣＯ）へと集成する。胆管細胞オルガノイドは、内腔を取り囲み、それを外部環境から隔離する、密着結合により連結された胆管細胞の層を含む３次元多細胞集成体又は嚢胞である。胆管細胞は、ＣＦＴＲ等のマーカーの極性発現を示し得る。
【００７１】
増殖培地中で胆管細胞により形成されるオルガノイドは、胆管細胞、例えばＣＢＤ胆管細胞等の肝外胆管細胞の形態又は物理的特性を示し得る。オルガノイドは、例えば繊毛、密着結合、微絨毛、エキソソーム及び／又は管状構造を含み得る。オルガノイドの形態及び物理的特性は、標準的な顕微鏡法によって測定され得る。
【００７２】
オルガノイドの形でも又は個別の細胞の形でも、増殖された胆管細胞の集団はその他の細胞型を含み得ないか又は実質的に含み得ない。すなわち、胆管細胞の集団は均質又は実質的に均質であり得る。例えば、該集団は培地中での培養後に８０％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上又は９９％以上の胆管細胞を含み得る。好ましくは、胆管細胞の集団は、精製が必要とされないほど十分にその他の細胞型を含まない。
【００７３】
胆管細胞は１つ以上の胆管マーカーを発現し得る。例えば、胆管細胞は、サイトケラチン７（ＫＲＴ７又はＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＫＲＴ１９又はＣＫ１９）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、肝細胞核因子１ベータ（ＨＮＦ１Ｂ）、セクレチン受容体（ＳＣＴＲ）、ナトリウム依存性胆汁酸輸送体１（ＡＳＢＴ／ＳＬＣ１０Ａ２）、ＳＲＹ−ｂｏｘ  ９（ＳＯＸ９）、Ｊａｇｇｅｄ  １（ＪＡＧ１）、ＮＯＴＣＨ２、ＳＣＲ、ＳＳＴＲ２、頂端側塩胆汁輸送体（Apical Salt and Bile Transporter）（ＡＳＢＴ）、アクアポリン１及び陰イオン交換体及び嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）を発現し得る。典型的には、集団中の胆管細胞の少なくとも９８％は、本明細書に記載されるように増殖培地中で２０代継代した後にＣＫ７及びＣＫ１９を共発現し得る。
【００７４】
好ましくは、胆管細胞は、初代総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞に相当するレベルで成熟胆管マーカーを発現する。胆管細胞は成熟胆管細胞であり得て、胎児の特徴を欠如し得る。
【００７５】
初代胆管細胞とは対照的に、増殖された集団における胆管細胞は、ＭＨＣクラス１又はクラス２のタンパク質、例えばＨＬＡ−Ｅ又はＨＬＡ−ＤＲＢ１等のＨＬＡタンパク質の発現を欠如し得る。さらに、胆管細胞は、初代胆管細胞の領域特異性に特有の遺伝子、例えば炎症又は胆汁酸の勾配により誘導される遺伝子の発現を欠如し得る。それらの胆管細胞は増殖性であり、免疫プロファイルマーカーが少ないか又は免疫プロファイルマーカーが存在しないので、本明細書に記載されるように生成される胆管細胞は、増殖せず免疫プロファイルマーカーが高い初代胆管細胞とは異なる。
【００７６】
胆管細胞の集団には、幹細胞又はその他の多能性細胞若しくは複能性細胞は含まれない。胆管細胞は、コントロール細胞に対して、幹細胞マーカー、例えばＰＯＵ５Ｆ１、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、プロミニン１（ＰＲＯＭ１）、ＬＧＲ−４、５若しくは６等のロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体（ＬＧＲ）、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、ＫＬＦ−４及びｃ−ｍｙｃの発現を示さないか又はそれらの発現が低い。幾つかの好ましい実施形態では、胆管細胞は、高レベルの胆管マーカー、低レベルのＬＧＲ５及びＰＲＯＭ１等の幹細胞マーカーを発現し、Ｏｃｔ４、ＮＡＮＯＧ及びＳｏｘ２等の多能性マーカーは発現しない。
【００７７】
胆管細胞の集団には、肝細胞又は膵臓細胞等の非胆管細胞は含まれない。胆管細胞は、肝細胞マーカー又は膵マーカー等の非胆管系譜のマーカーを発現しない。例えば、胆管細胞は、アルブミン（ＡＬＢ）、α１−アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１又は６  Ａ１ＡＴ）、膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）、インスリン（ＩＮＳ）、グルカゴン（ＧＣＧ）及びＡＦＰ等の胎児肝芽細胞マーカーの発現を欠如し得る。
【００７８】
胆管細胞の集団は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）マーカーを発現しない。例えば、胆管細胞は、ビメンチン（ＶＩＭ）、ｓｎａｉｌファミリー転写リプレッサー１（ＳＮＡＩ１）及び／又はＳ１００カルシウム結合タンパク質９Ａ４（Ｓ１００Ａ４）の発現を欠如し得る。
【００７９】
１つ以上の胆管マーカーの発現及び１つ以上の非胆管マーカーの発現の不存在は、増殖された胆管細胞の集団において観察及び／又は検出され得る。例えば、増殖された胆管細胞の集団における上記の成熟胆管マーカーの１つ以上の発現又は生成が測定され得る。これにより、増殖された胆管細胞の集団の均質性を測定及び／又は観察することが可能となる。
【００８０】
本明細書に記載されるように生成された増殖された胆管細胞の集団は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで初代胆管細胞、例えば初代総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞等の肝外胆管細胞の１つ以上の機能的特性を示し得る。例えば、胆管細胞は、以下に記載される特性の１つ以上、好ましくは全てを示すオルガノイドへと集成し得る。
【００８１】
胆管細胞オルガノイドは、胆汁酸の移動、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性及び／又はγ−グルタミルトランスペプチダーゼ（ＧＧＴ）活性を示し得る。ＡＬＰ及びＧＧＴ活性の量は、初代総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞によって示されるＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性の量に相当し得る。ＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性は、例えば本明細書に記載されるように測定され得る。
【００８２】
胆管細胞オルガノイドは、能動分泌、例えば多剤耐性タンパク質−１（ＭＤＲ１）によって媒介される分泌を示し得る。この分泌は、本明細書に記載されるように、ＭＤＲ１阻害剤のベラパミルの存在下及び不存在下で、胆管細胞オルガノイドの内腔におけるローダミン１２３等の蛍光性ＭＤＲ１基質の蓄積を計測することにより測定され得る。
【００８３】
胆管細胞オルガノイドは、セクレチン及びソマトスタチンに対する応答を示し得る。例えば、胆管細胞オルガノイドは、セクレチンに応答して分泌活性の増加を示し、ソマトスタチンに応答して活性の減少を示し得る。これは、オルガノイドのサイズの変化を計測することにより測定され得る。例えば、セクレチンは胆管細胞オルガノイドのサイズを増大させ得て、ソマトスタチンはそのサイズを減少させ得る。
【００８４】
胆管細胞オルガノイドは、胆汁酸の能動的移動、例えば頂端側塩胆汁輸送体（ＡＳＢＴ）により媒介される移動を示し得る。胆汁酸移動活性は、例えば、本明細書に記載されるように、ＦＩＴＣ等の別の蛍光性化合物に対するＣＬＦ等の蛍光性胆汁酸塩の能動的移動を計測することにより測定され得る。
【００８５】
胆管細胞オルガノイドは、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）活性を示し得る。ＣＴＦＲ活性は、本明細書に記載されるように、様々な塩化物濃度、例えば、蛍光性の塩化物指示薬のＮ−（６−メトキシキノリル）アセトエチルエステル（ＭＱＡＥ）を有する培地に応答する細胞内及び腔内の塩化物濃度を計測することにより測定され得る。
【００８６】
胆管細胞オルガノイドは、ＡＴＰ及びアセチルコリンに対する応答を示し得る。例えば、細胞内Ｃａ２＋レベルは、胆管細胞オルガノイドにおいて、ＡＴＰ又はアセチルコリンに応答して増大し得る。細胞内Ｃａ２＋レベルは、標準的な技術を使用して測定され得る。
【００８７】
胆管細胞オルガノイドは、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＩＬ６等のマイトジェン及びエストロゲンに対する応答を示し得る。例えば、胆管細胞オルガノイドは、ＶＥＧＦに応答して増殖の増加を示し得る。
【００８８】
胆管細胞オルガノイドは、ルマカフトール（ＶＸ８０９）等の薬物に対する応答を示し得る。例えば、サイズ、ＣＦＴＲ活性及び／又は腔内液分泌は、嚢胞性線維症を伴うドナー個体から得られた初代胆管細胞から増殖された胆管細胞オルガノイドにおいてルマカフトールに応答して増加し得る。ルマカフトールに対する応答を測定するために適した方法は、以下に記載される。
【００８９】
特許請求の範囲に記載される方法により生成される胆管細胞オルガノイドの応答及び／又は活性の量は、初代胆管細胞、好ましくは初代肝内胆管細胞又は初代肝外胆管細胞、例えば総胆管（ＣＢＤ）胆管細胞によって示される応答及び／又は活性の量に相当し得る。
【００９０】
上記のような増殖培地中での増殖後に、胆管細胞オルガノイドを解離又は破壊することで、個別の胆管細胞が生成され得る。
【００９１】
オルガノイドを個別の構成細胞へと解離する適切な方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、胆管細胞オルガノイドを、ディスパーゼ又は非酵素的回収溶液、例えばＣｅｌｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（商標）（Corning社）を使用して増殖培地から採取し、トリプシン等のプロテアーゼを使用して解離させることができる。適切な試薬は市販されており、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（ThermoFisher Scientific社）が挙げられる。
【００９２】
本明細書に記載されるように増殖された胆管細胞が１つ以上の胆管細胞機能を発揮する能力が観察及び／又は測定され得る。例えば、細胞がオルガノイドへと集成する能力、及び／又はＭＤＲ１機能、胆汁酸の移動、ＶＥＧＦ応答、アセチルコリン応答若しくはＡＴＰ応答、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、若しくはセクレチン応答若しくはソマトスタチン応答の１つ以上を発揮する能力が観察及び／又は測定され得る。
【００９３】
本明細書に記載されるように生成される胆管細胞は、本明細書に記載されるように増殖されるか、又は標準的な哺乳動物細胞培養技術を使用して培養若しくは維持されるか、又は更なる操作若しくは処理に供され得る。幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるように生成された胆管細胞集団は、例えば凍結乾燥及び／又は凍結保存により貯蔵され得る。胆管細胞は、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体又は個別の細胞として貯蔵され得る。適切な貯蔵方法は、当該技術分野においてよく知られている。例えば、胆管細胞は、凍結保存培地（例えば、Ｃｅｌｌｂａｎｋｅｒ（商標）（AMS Biotechnology Ltd社、英国））中に懸濁され、例えば−７０℃以下で凍結され得る。
【００９４】
胆管細胞の集団は、バッファー、担体、希釈剤、保存剤及び／又は薬学的に許容可能な賦形剤等のその他の試薬と混合され得る。適切な試薬は、以下でより詳細に記載される。本明細書に記載される方法は、胆管細胞の集団を治療的に許容可能な賦形剤と混合して、治療組成物を生成することを含み得る。混合される胆管細胞は、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体又は個別の細胞の形であり得る。
【００９５】
幾つかの実施形態では、胆管細胞は、治療において有用であり得る。治療用途のために、胆管細胞は、好ましくは臨床グレードの細胞である。治療に使用するための胆管細胞の集団は、好ましくは本明細書に記載される初代胆管細胞から、化学的に定義された増殖培地を使用して生成される。胆管細胞は、特定の用途に応じて、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体又は個別の細胞の形であり得る。
【００９６】
増殖された胆管細胞の集団は、個体へと移植、注入又はその他の方法で投与され得る。適切な技術は、当該技術分野においてよく知られている。
【００９７】
増殖された胆管細胞の集団は自系であり得る。すなわち、胆管細胞は、後に投与されるのと同じ個体から当初得られた初代胆管細胞から増殖されたものである（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体とは同じである）。レシピエント個体に投与するのに適した増殖された胆管細胞の集団は、個体から得られた初代胆管細胞の初期集団を準備することと、上記の胆管細胞の集団を増殖させて、投与のための増殖された胆管細胞の集団を生成することとを含む方法によって生成され得る。
【００９８】
増殖された胆管細胞の集団は同種異系であり得る。すなわち、初代胆管細胞は、胆管細胞が後に投与される個体と異なる個体から当初得られたものである（すなわち、ドナー個体とレシピエント個体とは異なる）。ドナー個体及びレシピエント個体は、拒絶反応及びその他の望ましくない免疫効果を避けるためにＨＬＡ適合され得る。レシピエント個体に投与するのに適した増殖された胆管細胞の集団は、ドナー個体から得られた初代胆管細胞の初期集団を準備することと、上記の胆管細胞の集団を増殖させて、投与のための増殖された胆管細胞の集団を生成することとを含む方法によって生成され得る。幾つかの実施形態では、増殖された集団は、ＨＬＡ等の免疫原性抗原の発現を低減又は不活性化させるように操作され得る。
【００９９】
幾つかの好ましい実施形態では、増殖された胆管細胞の集団は、生体適合性の足場と混合され得る。
【０１００】
生体適合性の足場に、上記のように増殖された胆管細胞が播種され得る。例えば、個別の胆管細胞又は胆管細胞のオルガノイドに満たない集成体が、足場上若しくは足場中に注入され得るか、又は製造過程の間に足場中に混合され得る。次いで、胆管細胞を含む足場は、胆管細胞が足場に定着するように増殖培地中で培養され得る。胆管細胞は足場内で増殖し、オルガノイドへと集成し、その後に多層上皮へと集成し得る。
【０１０１】
適切な生体適合性の足場としては、ハイドロゲル、例えばフィブリン、キトサン、グリコサミノグリカン類、絹、フィブリン、フィブロネクチン、エラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン等の糖タンパク質、又はキチン等の多糖、又はセルロースコラーゲン、コラーゲン／ラミニン、高密度化コラーゲン、アルギン酸塩、アガロース、複合タンパク質ハイドロゲル、例えば基底膜抽出物、生物有機ゲル（bio-organic gels）及び合成ポリマーハイドロゲル、例えばポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）ハイドロゲル、架橋デキストラン及びＰＶＡハイドロゲル（例えば、Cellendes Gmbh社、ドイツ、ロイトリンゲン）、不活性マトリックス、例えば多孔質ポリスチレン、ポリエステル、可溶性ガラス繊維、多孔質ポリスチレン及び単離された天然ＥＣＭ足場、例えば脱細胞化された胆嚢及び胆管の足場（Engitix Ltd社、英国、ロンドン）が挙げられ得る。足場は生分解性であり得る。
【０１０２】
足場のサイズ又は形状は、意図される用途に依存する。適切な足場形状としては、例えば、パッチ、シート並びに最大で例えば１０ｍｍ〜１２ｍｍの直径を有する直管及び分岐管を含む管が挙げられ得る。
【０１０３】
生体適合性の足場内で培養される本明細書に記載されるように生成された胆管細胞は、機能的胆管上皮へと組織化する。定着された足場は、胆管上皮の１つ以上の特性を示し得る。例えば、定着された足場は、胆汁耐性であり得て、上記の機能的特性の１つ以上を示し得る。胆管細胞が定着した足場は、例えば治療又はスクリーニングで使用するための人工胆管上皮組織として有用であり得る。
【０１０４】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法により生成された分離された胆管細胞の集団を提供する。該集団は、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体若しくはクラスター又は個別の細胞の形であり得る。
【０１０５】
本明細書に記載されるように作製された胆管細胞の集団は、その他の細胞型を実質的に有し得ない。例えば、該集団は、増殖培地中での培養後に７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上又は９５％以上の胆管細胞を含み得る。集団における胆管細胞の存在又は割合は、上記のように胆管マーカーの発現によって測定され得る。
【０１０６】
好ましくは、胆管細胞の集団は、精製が必要とされないほど十分にその他の細胞型を含まない。必要に応じて、胆管細胞の集団又は胆管細胞オルガノイドは、ＦＡＣＳを含む任意の適切な技術によって精製され得る。
【０１０７】
幾つかの実施形態では、胆管細胞は、異種タンパク質、例えばＧＦＰ等のマーカータンパク質若しくは酵素を発現し、及び／又は１つ以上の内因性タンパク質、例えば免疫原性に関連するタンパク質の発現を低減する若しくは妨げるように操作され得る。例えば、胆管細胞は、異種タンパク質、内因性タンパク質の発現を抑制するサプッレサーＲＮＡ、又は内因性タンパク質を不活性化させる部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸を含むベクターでトランスフェクションされ得る。幾つかの実施形態では、胆管細胞は、遺伝子欠陥を修正するように操作され得る。例えば、ＣＦＴＲ遺伝子中の欠陥は、嚢胞性線維症を伴う個体に由来する胆管細胞において修正され得る。他の実施形態では、胆管細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）等の免疫原性抗原を除去するように操作され得る。これは、同種異系の使用のための低免疫原性細胞又は非免疫原性細胞を作製するのに有用であり得る。
【０１０８】
本発明の別の態様は、本明細書に記載される方法による胆管細胞を含む足場を提供する。適切な足場は、先に記載されている。
【０１０９】
本発明の別の態様は、例えば治療に使用するための、本明細書に記載の方法により生成される胆管細胞が定着した足場を含む人工胆管上皮組織を提供する。胆管細胞に加えて、人工組織は、間質細胞及び／又は内皮細胞等のその他の細胞を含み得る。
【０１１０】
本発明の態様はまた、溶液又は生体適合性の足場において本明細書に記載されるように生成される胆管細胞を含む医薬組成物、医薬、薬物又はその他の組成物並びにそのような胆管細胞を薬学的に許容可能な賦形剤、ビヒクル、担体又は生分解性の足場と、任意に１種以上のその他の成分とを混合することを含む医薬組成物の作製方法にも及ぶ。
【０１１１】
本発明により増殖される胆管細胞を含む医薬組成物は、１種以上の追加成分を含み得る。医薬組成物は、胆管細胞に加えて、薬学的に許容可能な賦形剤、担体、バッファー、保存剤、安定化剤、酸化防止剤又は当業者によく知られるその他の材料を含み得る。そのような材料は、非毒性であるべきであり、胆管細胞の活性を妨害すべきではない。担体又はその他の材料の厳密な性質は、投与経路に依存することとなる。
【０１１２】
液体医薬組成物は、一般的に水、鉱油（petroleum）、動物油若しくは植物油、鉱物油又は合成油等の液体担体を含む。生理食塩溶液、組織培地若しくは細胞培養培地、デキストロース若しくはその他の糖類溶液、又はエチレングリコール、プロピレングリコール若しくはポリエチレングリコール等のグリコール類が含まれ得る。
【０１１３】
組成物は、パイロジェンフリーでありかつ適切なｐＨ、等張性及び安定性を有する非経口的に許容可能な水溶液の形で存在し得る。当業者は、例えば塩化ナトリウム、リンゲル注射液又は乳酸加リンゲル注射液等の等張性ビヒクルを使用して、適切な溶液を十分に調製することが可能である。組成物は、人工脳脊髄液を使用して調製され得る。
【０１１４】
本発明の別の態様は、本明細書に記載されるように生成された胆管細胞の集団をそれを必要とする個体に投与することを含む、胆管障害又は肝疾患の治療方法を提供する。
【０１１５】
本発明の別の態様は、個体へと本明細書に記載されるように生成される胆管細胞の集団を投与することを含む胆管障害又は肝疾患の治療方法においてそれを必要とする個体に使用するための上記集団を提供する。
【０１１６】
本発明の別の態様は、胆管障害又は肝疾患の治療において使用するための医薬の製造における、本明細書に記載されるように生成される胆管細胞の集団の使用を提供する。
【０１１７】
胆管細胞は、オルガノイド、オルガノイドに満たない集成体若しくはクラスター又は個別の細胞の形であり得る。
【０１１８】
胆管障害は、個体における胆管組織が損傷、欠陥又はその他には機能不全に陥っている状態、例えば胆管への損傷若しくは胆管の破壊、胆管の異常又は胆管の欠如を特徴とする障害である。胆管障害としては、胆管組織損傷、虚血性狭窄、外傷性胆管損傷及び胆管症、例えば遺伝性、発達性、自己免疫性及び環境誘発性の胆管症、例えば嚢胞性線維症関連胆管症、薬物誘発性胆管症、アラジール症候群、多発性嚢胞性肝疾患、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、ＡＩＤＳ関連胆管症、胆管消失症候群、胆管癌、突発性成人胆管減少症等の胆管減少症、術後胆管合併症、胆管閉鎖症、並びに肝外胆管又は肝内胆管のその他の障害が挙げられ得る。
【０１１９】
幾つかの実施形態では、増殖された胆管細胞の集団は、溶液において個体に投与され得る。胆管細胞の集団の溶液での投与は、例えば肝疾患、胆管減少症、例えば虚血性胆管減少症、先天性胆管減少症、例えばアラジール症候群、代謝性胆管減少症、複合病、例えば肝内ＰＳＣ及びＰＢＣ、薬物誘発性胆管減少症、胆管消失症候群、並びに肝内胆管系を冒す状態の治療において有用であり得る。
【０１２０】
他の実施形態では、胆管細胞の集団は、生体適合性の足場内で個体に投与され得る。例えば、胆管細胞が定着した足場が個体に投与され得る。足場における胆管細胞の集団の投与は、例えば胆管閉鎖症、胆管狭窄、外傷性又は医原性の胆管損傷及び肝外胆管系を冒す状態の治療において有用であり得る。
【０１２１】
溶液中又は足場中の胆管細胞は、当該技術分野において知られる任意の技術により患者へと移植され得る（例えば、Lindvall, O. (1998) Mov. Disord. 13, Suppl. 1:83-7、Freed, C.R., et al., (1997) Cell Transplant, 6, 201-202、Kordower, et al., (1995) New England Journal of Medicine, 332, 1118-1124、Freed, C.R.,(1992) New England Journal of Medicine, 327, 1549-1555、Le Blanc et al, Lancet 2004 May 1;363(9419):1439-41）。特に、細胞懸濁液は、患者の胆管、胆嚢、門脈、肝実質、腹腔又は脾臓に注射又は注入され得る。胆管細胞の懸濁液は、静脈内、腹腔内、又は内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）若しくは経皮的胆管造影（ＰＴＣ）を介して投与され得る。胆管細胞が定着した足場は、外科移植により個体に投与され得る。
【０１２２】
本発明による組成物の投与は、好ましくは「予防的有効量」又は「治療的有効量」（場合に応じて、予防が治療とみなされる場合がある）でなされ、その際、この量は個体に有益性を示すのに十分である。投与される実際の量並びに投与の速度及び時間的経過は、治療対象の性質及び重症度に依存することとなる。治療の処方、例えば投与量の決定等は、一般開業医及び他の医師の責任の範囲内である。
【０１２３】
胆管細胞を含む組成物は、単独で又は他の治療と組み合わせて、治療される状態に応じて同時に又は逐次に投与され得る。
【０１２４】
本発明の他の態様は、患者の薬物への感受性を決定するための、本明細書に記載されるように増殖される胆管細胞の使用に関する。方法は、
（ｉ）疾患状態、例えば胆管障害又は肝疾患を伴う個体由来の分離された初代胆管細胞の集団を準備することと、
（ｉｉ）前記集団を、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤と、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤とを含む増殖培地中で培養することで、疾患表現型を示す増殖された胆管細胞の集団を生成することと、
（ｉｉｉ）本明細書に記載される方法により生成される増殖された胆管細胞の集団を治療化合物と接触させることと、
（ｉｖ）前記胆管細胞に対する前記治療化合物の効果を測定することと、
を含み得て、前記胆管細胞の疾患表現型の改善は、前記個体が前記治療化合物に感受性があることの指標である。
【０１２５】
胆管細胞の増殖、成長、生存率若しくは胆汁酸耐性、胆管細胞が以下に記載される１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力、又は胆管細胞が（ｉ）移植後の非ヒト動物モデルへの生着、（ｉｉ）非ヒト動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの胆管の形成、（ｉｉｉ）非ヒト動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの疾患表現型のレスキュー、（ｉｖ）移植後の非ヒト動物モデルの生存の延長、（ｖ）非ヒト動物モデルにおけるｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞機能の維持、（ｖｉ）ｉｎ  ｖｉｖｏでの胆管減少症の回復、及び（ｖｉｉ）非ヒト動物モデルにおける移植後の血清肝機能マーカーの改善の１つ以上を発揮する能力は、治療化合物の不存在下と比較してその存在下において測定され得る。
【０１２６】
疾患表現型を有する増殖された胆管細胞が、治療化合物の不存在下と比較してその存在下でこれらの機能の１つ以上を発揮する能力の増加は、その化合物が個体における疾患に対して改善効果を有することの指標である。
【０１２７】
上記のように生成される分離された胆管細胞の集団は、試験化合物と胆管細胞の相互作用のモデリング、例えば毒性スクリーニング、胆管障害のモデリング、又は潜在的な治療効果を有する化合物のスクリーニングにおいて有用であり得る。
【０１２８】
幾つかの実施形態では、胆管細胞は、健康な一次組織から取得され得る。他の実施形態では、胆管細胞は、胆管疾患を伴うドナー由来の一次組織から取得され得て、疾患表現型を示し得る。
【０１２９】
本発明の別の態様は、疾患モデリング及び胆管障害の病因の研究のための、正常な患者又は胆管障害を伴う患者に由来する胆管細胞の集団の使用を提供する。
【０１３０】
モデリング及びスクリーニングに使用するための胆管細胞は、オルガノイド（胆管細胞オルガノイド）、オルガノイドに満たないクラスター又は例えば胆管細胞オルガノイドの破壊により生成された個別の細胞（胆管細胞）の形であり得る。
【０１３１】
化合物のスクリーニング方法は、
本明細書に記載される方法により生成される胆管細胞の集団を試験化合物と接触させることと、
上記胆管細胞に対する試験化合物の効果及び／又は試験化合物に対する上記胆管細胞の効果を測定することと、
を含み得る。
【０１３２】
胆管細胞の増殖、成長、生存率若しくは胆汁酸耐性、又は胆管細胞が１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力は、試験化合物の不存在下と比較してその存在下において測定され得る。
【０１３３】
増殖、成長、生存率又は１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力の減少は、化合物が毒性効果を有することの指標であり、成長、生存率又は１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力の増加は、化合物が胆管細胞に対して改善効果を有することの指標である。
【０１３４】
幾つかの実施形態では、胆管細胞は、胆管腫瘍に由来し得て、腫瘍由来細胞の増殖、成長、生存率又は１つ以上の細胞機能若しくはオルガノイド機能を発揮する能力に対する試験化合物の効果が測定され得る。
【０１３５】
遺伝子発現は、試験化合物の不存在下と比較してその存在下において測定され得る。例えば、１つ以上の胆管マーカー遺伝子の発現が測定され得る。発現の複合的な減少は、化合物が毒性効果を有するか、又は胆管細胞の機能的状態を変更し得ることの指標である。遺伝子発現は、例えばＲＴ−ＰＣＲにより核酸レベルで測定され得るか、又は例えばＥＬＩＳＡ等の免疫学的技術により、若しくは活性アッセイによりタンパク質レベルで測定され得る。シトクロムｐ４５０アッセイ、例えば発光、蛍光又は発色アッセイは、当該技術分野においてよく知られており、商業的供給業者から入手可能である。
【０１３６】
幾つかの実施形態では、胆管疾患のためのリスク遺伝子座又は胆管疾患、例えば上記の疾患に関連する遺伝子の発現が測定され得る。
【０１３７】
胆管細胞による試験化合物の代謝、分解又は破壊が測定され得る。幾つかの実施形態では、試験化合物及び／又は上記試験化合物の代謝産物の量又は濃度の変化が、連続的に又は１つ以上の時点で経時的に測定又は計測され得る。例えば、試験化合物の量若しくは濃度の減少、及び／又は上記試験化合物の代謝産物の量若しくは濃度の増加が測定又は計測され得る。幾つかの実施形態では、試験化合物及び／又は代謝産物の量又は濃度の変化速度が測定され得る。試験化合物又は代謝産物の量を計測するための適切な技術としては、質量分析法が挙げられる。
【０１３８】
これは、試験化合物のｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期、毒性、有効性又はその他のｉｎ  ｖｉｖｏでの特性の測定において有用であり得る。
【０１３９】
胆管細胞の１つ以上の機能は、試験化合物の不存在下と比較してその存在下において測定及び／又は計測され得る。例えば、胆管細胞がＭＤＲ１機能、胆汁酸の移動、ＶＥＧＦ応答、アセチルコリン応答又はＡＴＰ応答、ＣＦＴＲ媒介性塩化物輸送、ＧＧＴ活性、ＡＬＰ活性又はセクレチン応答若しくはソマトスタチン応答、フォルスコリン誘発腫脹（Dekkers et al Nat Med 2013; 19:939-45）、胆汁抵抗性、重炭酸塩分泌、内腔の保全性（すなわち、該化合物は、密着結合を破壊し、オルガノイドの内腔を崩壊させる）、オルガノイドの腔内外への化合物の移動、及び腔内の細菌の存在又は生存率の１つ以上を発揮する能力が測定及び／又は計測され得る。胆管細胞が胆管細胞オルガノイドへと集成する能力も測定され得る。
【０１４０】
胆管細胞が、試験化合物の不存在下と比較してその存在下でこれらの機能の１つ以上を発揮する能力の減少は、その化合物が胆管上皮に対して毒性効果を有することの指標である。胆管細胞が、試験化合物の不存在下と比較してその存在下でこれらの機能の１つ以上を発揮する能力の増加は、その化合物が胆管誘発効果を有する（例えば、その化合物は胆管上皮の活性を促進する）ことの指標である。
【０１４１】
本発明の別の態様は、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、非古典的Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達増強剤と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤とを含む増殖培地を含む、胆管細胞オルガノイドの生成のためのキットを提供する。
【０１４２】
適切な増殖培地は、先により詳細に記載されている。
【０１４３】
キットは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）等の足場マトリックスを更に含み得る。足場マトリックスは、増殖培地の一部として提供され得るか又は別個に提供され得る。
【０１４４】
増殖培地は、脱イオンされ蒸留された水中で配合され得る。増殖培地は、典型的には、コンタミネーションを防ぐために、例えば紫外光、加熱、照射又は濾過によって使用前に滅菌される。１種以上の培地は、貯蔵又は輸送のために凍結（例えば、約−２０℃又は−８０℃で）され得る。１種以上の培地は、コンタミネーションを防ぐために１種以上の抗生物質を含有し得る。
【０１４５】
キットは、初代胆組織から初代胆管細胞を分離するためのブラシ又はスクレイパー等の試料採取器を更に有し得る。キットは、組織試料から胆管細胞を機械的に分離するためのプレート又は容器と、組織破片から細胞を分離するための遠心分離管とを更に有し得る。
【０１４６】
キットは、細胞の抽出前に組織を保存するための保存培地を更に有し得る。適切な培地としては、ＵＷ溶液（例えば、Ｖｉｖａｓｐｉｎ（商標））並びに生存促進性サイトカイン及び／又はＲｏｃｋ阻害剤が補充されたウィリアムＥ培地が挙げられる。
【０１４７】
キットは、洗浄培地を更に有し得る。適切な洗浄培地としては、ＥＧＦ及びＲｏｃｋ阻害剤が補充されたウィリアムＥ培地が挙げられ得る。
【０１４８】
キットは、ＲＯＣＫ阻害剤等の生存促進性サイトカインを更に有し得る。
【０１４９】
キットは、プレートヒーターを更に有し得る。
【０１５０】
キットは、冷凍保存溶液を更に有し得る。適切な冷凍保存培地は、先に記載されている。
【０１５１】
１つ以上の培地は、１倍配合物又はそれより濃縮された配合物、例えば２倍〜２５０倍濃縮された培地配合物であり得る。１倍配合物では、培地中の各成分は、細胞培養を目的とする濃度、例えば上記の濃度である。濃縮された配合物では、１つ以上の成分が、細胞培養を目的とする濃度よりも高い濃度で存在する。濃縮された培養培地は、当該技術分野においてよく知られている。培養培地は、既知の方法、例えば塩沈殿又は選択的濾過を使用して濃縮され得る。濃縮された培地は、使用のために水（好ましくは、脱イオンされ蒸留された）又は任意の適切な溶液、例えば生理食塩水溶液、水性緩衝液若しくは培養培地で希釈され得る。
【０１５２】
キット中の１つ以上の培地は、気密封止された容器中に収容され得る。気密封止された容器は、培養培地の輸送又は貯蔵につき、コンタミネーションを防ぐために好ましい場合がある。容器は、フラスコ、プレート、ボトル、ジャー、バイアル又はバッグ等の任意の適切な容器であり得る。
【０１５３】
本発明の別の態様は、初代胆管細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖のための、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達増強剤と、古典的Ｗｎｔシグナル伝達阻害剤とを含む増殖培地の使用を提供する。
【０１５４】
本発明の他の態様及び実施形態は、「からなる（consisting of）」の用語によって置き換えられる「含む、有する（comprising）」の用語を伴う上に記載される態様及び実施形態、並びに「本質的にからなる（consisting essentially of）」の用語によって置き換えられる「含む、有する（comprising）」の用語を伴う上に記載される態様及び実施形態を提供する。
【０１５５】
本出願は、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、あらゆる上の態様及び上に記載される実施形態の互いとの全ての組み合わせを開示することが理解される。同様に、本出願は、文脈上他の意味に解釈すべき場合を除き、好ましい及び／又は任意の特徴の単独の又はあらゆる他の態様との全ての組み合わせを開示する。
【０１５６】
上の実施形態の変形形態、更なる実施形態及びそれらの変形形態は、本開示を読むことによって当業者に明らかとなり、それら自体が本発明の範囲に含まれる。
【０１５７】
本明細書で言及される全ての文書及び配列データベースエントリは、全ての目的に対してそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、２つの明示される特徴又は成分の各々の他方を含む又は他方を含まない具体的な開示として理解される。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示として、それぞれが本明細書において個別に述べられているかのように理解される。
【０１５９】
ここで、本発明の或る特定の態様及び実施形態を例として、また上に記載される図面を参照して解説する。
【０１６０】
実験
１．方法
１．１  初代胆管組織
初代胆組織（胆管又は胆嚢）を、移植のために臓器が摘出される死亡した臓器ドナーから取得した。ドナーの家族からインフォームドコンセントを得た後に、臓器摘出手術の間に胆嚢又は胆管の一部を切除した（ＲＥＣ受付番号：１２／ＥＥ／０２５３、ＮＲＥＳ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｅａｓｔ  ｏｆ  Ｅｎｇｌａｎｄ−Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ及び１５／ＥＥ／０１５２  ＮＲＥＳ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  Ｅａｓｔ  ｏｆ  Ｅｎｇｌａｎｄ−Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｓｏｕｔｈ）。
【０１６１】
１．２  初代胆管細胞の分離
切除した胆管セグメントを１０ｃｍのプレートに置き、ウィリアムＥ培地（Gibco社、Life Technologies社）で１回洗浄した。切除した胆管セグメントの壁に沿って縦方向の切開を行い、内腔を露出させ、１０ｍｌ〜１５ｍｌのウィリアムＥ培地を加えて、組織を覆った。培地中に浸しながら、外科用ブレードを使用して内腔上皮をスクレイピングした。上清を収集し、組織及びプレートをウィリアムＥ培地で２回〜３回洗浄して、全ての残りの細胞を採取した。上清及び洗浄液を、４４４ｇで４分間遠心分離した。ペレットをウィリアムＥで洗浄し、再遠心分離し、上清を廃棄した。
【０１６２】
切除した胆嚢を１５ｃｍのプレートに置き、切除した胆嚢の壁に沿って縦方向の切開を行い、内腔をウィリアムＥ培地（Gibco社、Life Technologies社）で１回洗浄した。上記の方法に従って、胆管細胞を分離及び採取した。
【０１６３】
ブラッシングによる分離のために、切除された胆管セグメントを１０ｃｍのプレートに置き、ＥＲＣＰブラシを使用して挿管した。内腔を１０回〜２０回ブラッシングし、４０ｍｌ〜５０ｍｌのウィリアムＥ培地が入ったファルコンチューブ中で数回ブラシを洗浄することにより細胞を採取した。
【０１６４】
１．３  ＥＣＯの作製及び培養
分離された初代胆管細胞を４４４ｇで４分間遠心分離し、６６％のｍａｔｒｉｇｅｌ（BD Biosciences社、カタログ番号：３５６２３７）と、３３％のウィリアムＥ培地（Gibco社、Life Technologies社）に１０ｍＭのニコチンアミド（Sigma-Aldrich社）、１７ｍＭの重炭酸ナトリウム（Sigma Aldrich社）、０．２ｍＭの２−ホスホ−Ｌ−アスコルビン酸三ナトリウム塩（Sigma-Aldrich社）、６．３ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Invitrogen社）、１４ｍＭのグルコース（Sigma-Aldrich社）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Invitrogen社）、ＩＴＳ＋プレミックス（BD Biosciences社）、０．１μＭのデキサメタゾン（R&D Systems社）、２ｍＭのグルタマックス（Invitrogen社）、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン当たりに１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、２０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦ（R&D Systems社）、５００ｎｇ／ｍｌのＲ−スポンジン（R&D Systems社）及び１００ｎｇ／ｍｌのＤＫＫ−１（R&D Systems社）が補充されたものとの混合物に再懸濁した。細胞懸濁液を、２４ウェルプレートフォーマットにおいて、ｍａｔｒｉｇｅｌの小さなドームが各ウェルの中心に形成されるように５０μｌ／ウェルで播種し、その後にそれが固化するまで１０分〜３０分にわたり３７℃でインキュベートした。添加物を含むウィリアムＥ培地１ｍｌを加えた。培養培地は４８時間毎に交換した。
【０１６５】
細胞を分離させるために、ｍａｔｒｉｇｅｌを、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Corning社）を加えることにより４℃で３０分間消化した。得られた細胞懸濁液を採取し、４４４ｇで４分間遠心分離し、ウィリアムＥ培地で１回洗浄し、上記のように６６％のｍａｔｒｉｇｅｌ及び添加物を含む３３％のウィリアムＥ培地中で再懸濁した。
【０１６６】
全ての実験は、別段の定めがない限り２０代継代のＥＣＯを使用して実施した。
【０１６７】
１．４  細胞系統識別
各ＥＣＯ系統に対応するドナーのデモグラフィックデータを以下の表に示す。取得後に、ＥＣＯ系統を、その核型を元のドナーの性別と整合させることにより確認した。それらの系統を定期的に試験して、マイコプラズマのコンタミネーションについて陰性であることを確かめた。
【０１６８】
【表１】
2020523994.tif 000002
【０１６９】
１．５  免疫蛍光、ＲＮＡ抽出、及び定量的リアルタイムＰＣＲ
ＩＦ、ＲＮＡ抽出及びＱＰＣＲを、Sampaziotis F.ら（Biotechnol. 2015 1-11, doi: 10.1038/nbt.3275）に記載されるように実施した。
【０１７０】
全てのＱＰＣＲデータは、別段の定めがない限り、４つの独立したＥＣＯ系統の中央値、四分位範囲（ＩＱＲ）及び範囲（最小から最大まで）として表される。値はハウスキーピング遺伝子のヒドロキシメチルビラン合成酵素（ＨＭＢＳ）を基準とする。
【０１７１】
全てのＩＦ画像は、Zeiss社のＡｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ倒立顕微鏡又はZeiss社のＬＳＭ  ７００共焦点顕微鏡を使用して取得した。Ｉｍａｇｅｊ  １．４８ｋソフトウェア（Wayne Rasband、ＮＩＨＲ、米国、http://imagej.nih.gov/ij）を画像処理のために使用した。
【０１７２】
１．６  マイクロアレイ
マイクロアレイ分析用のＲＮＡを、３つの異なるＥＣＯ系統（ｎ＝３）から収集した。ＳｐｅｃｔｒｏＳｔａｒ（BMG Labtech社、英国、アリスバーリー）及びＢｉｏａｎａｌｙｓｅｒ（Agilent Technologies社、英国、チードル）を使用して、ＲＮＡを濃度及び品質について評価した。マイクロアレイ実験を、ケンブリッジ大学のＣａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓで、ＨｕｍａｎＨＴ−１２  ｖ４  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ＢｅａｄＣｈｉｐ（Illumina社、英国、チェスターフォード）を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。簡潔には、２００ｎｇの総ＲＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｏｔａｌＰｒｅｐ  ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Life Technologies社、英国、ペイズリー）を使用して製造業者の使用説明書に従って線形増幅させた。得られたｃＲＮＡの濃度、純度及び完全性を、ＳｐｅｃｔｒｏＳｔａｒ及びＢｉｏａｎａｌｙｚｅｒによって計測した。最後に、ｃＲＮＡをＨｕｍａｎＨＴ−１２  ｖ４  ＢｅａｄＣｈｉｐに一晩ハイブリダイズさせた後に、洗浄し、染色し、そしてＢｅａｄ  Ａｒｒａｙ  Ｒｅａｄｅｒ（Illumina社）を使用してスキャンした。生データを、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒのｌｕｍｉパッケージ（Du P et al.; Bioinformatics 2008 24：1547-8）を使用してＲにロードし、比較される群に応じてサブセットに分割した。所与の比較に関係する試料のみが使用される。次いで、サブセットをIllumina社からの検出ｐ値を使用してフィルタリングして、非発現プローブを除去した。全ての試料にわたって、強度値がネガティブコントロールと統計的に有意に異ならない（Ｐ＞０．０１）プローブを、分析から除去した。フィルタリング後に、データをｌｕｍｉからの分散安定化変換（Lin et al., Nucliec Acids Res. 2008, 36）を使用して変換した後に、ｑｕａｎｔｉｌｅ正規化を使用して正規化することで、アレイ間の技術的変動を除去した。ｌｉｍｍａパッケージ（Smyth GK, Stat Appl Genet Mol Biol 2004 3）を使用して、多重検定のために偽発見率（ＦＤＲ）補正を使用して補正された結果との比較を行った。最後にデータの品質を、群内の試料間での相関と一緒に評価した。
【０１７３】
ＥＣＯの総合的な転写「シグネチャ」に相当するＨＥＰとＥＣＯとの間で発現が異なるプローブを、Ｐｅｒｓｅｕｓソフトウェア（ＭａｘＱｕａｎｔ）を使用してユークリッド階層クラスタリングのために選択した。種々の条件にわたるｌｏｇ２正規化プローブ発現値の標準スコア（ｚ−スコア）を計算し、この分析のために使用した。ヒートマップ及び主成分分析（ＰＣＡ）プロットは、ＭａｘＱｕａｎｔ  Ｐｅｒｓｅｕｓソフトウェア（Tyanova S et al., Nat. Methods 2016 13:731-40）を使用して作成した。NIAID／NIHのＤａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ，Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＤＡＶＩＤ）  ｖ６．８（Huang D.W. et al., Nat. Protoc. 2008, 4:44-57）を使用して、機能的アノテーション及び遺伝子オントロジー解析をＰＣとＥＣＯとの間で発現が異なる遺伝子に対して行った（図１ｄ）。
【０１７４】
１．７  ウェスタン分析
総タンパク質を、溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＳＤＳ、０．５％のデオキシコール酸ナトリウム、１％のＴｒｉｔｉｏｎ  Ｘ−１００並びにプロテアーゼ及びホスファターゼ阻害剤）を用いて抽出した。タンパク質濃度を、ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Thermo Fisher Scientific社）によって製造業者の使用説明書に従って測定した。１％のβ−メルカプトエタノールを含む１×ＮｕＰＡＧＥ  ＬＤＳサンプルバッファーを添加することによりウェスタンブロットのために試料を調製し、９５℃で５分間インキュベートした。タンパク質（２５μｇ）を、４％〜１２％のＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓタンパク質ゲル（Invitrogen社）により分離し、ＰＶＤＦメンブレン（Bio-Rad社）に転写した。タンパク質を、ホスホ−β−カテニン（Ｓｅｒ３３／３７／Ｔｈｒ４１）（Cell Signalling Technology社）、活性β−カテニン（Millipore社）、総β−カテニン（R&D社）、α−チューブリン（Sigma社）に特異的な抗体でプロービングした後に、西洋ワサビペルオキシダーゼ抗マウス、抗ヤギ又は抗ウサギ二次抗体と一緒にインキュベートすることによって検出した。メンブレンを、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＣＬウェスタンブロッティング基質（Thermo Scientific社）を使用して製造業者の使用説明書に従って現像した。
【０１７５】
１．８  Ｒｈｏキナーゼ活性分析
Ｒｈｏキナーゼ活性を、市販のキット（Cell Biolabs社、ＳＴＡ−４１６）を使用して製造業者の使用説明書に従って計測した。
【０１７６】
１．９  フローサイトメトリー分析
ＥＣＯオルガノイドを、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Corning社）を４℃で３０分間使用して採取し、４４４ｇで４分間遠心分離し、ＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ（Gibco社）を使用して単一細胞に解離させた。細胞を４％のＰＦＡを使用して４℃で２０分間にわたり固定した。細胞染色及びフローサイトメトリー分析は、Sampaziotis F.ら（Biotechnol. 2015 1-11, doi: 10.1038/nbt.3275）及びBertero A.ら（Genes Dev. 2015 29:702-17）に記載されるように実施した。
【０１７７】
１．１０  核型分析
ＥＣＯオルガノイドを、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Corning社）を使用して採取し、上記のように単一細胞に解離させ、ゼラチン被覆プレートに播種し、添加物を含むウィリアムＥ培地を使用して培養した。細胞がサブコンフルエントになったときに、通常は７２時間後に、培養物を、０．１μｇ／ｍｌのコルセミド（Ｋａｒｙｏｍａｘ（商標）、Gibco社）を含有する添加物を含むウィリアムＥ培地と一緒に３時間〜４時間にわたりインキュベートした。次いで、トリプシン−ＥＤＴＡ（０．０５％）（Gibco社）を３７℃で４分間〜５分間使用して細胞を採取し、３４４ｇで５分間遠心分離し、５ｍｌのＫＣｌ低張液（０．０５５Ｍ）中で再懸濁した。懸濁液を３４４ｇで５分間再遠心分離し、３：１の１００％メタノール：氷酢酸溶液２ｍｌを加え、記載されるように（Campos P.B. et al., J. Vis. Exp 2009 4-7）スライドを調製した。
【０１７８】
１．１１  比較ゲノムハイブリダイゼーション分析
ゲノムＤＮＡを、ＢｉｏＰｒｉｍｅ  ＤＮＡ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Invitrogen社）を使用して製造業者の使用説明書に従って標識し、試料をAgilent社のＳｕｒｅｐｒｉｎｔ  Ｇ３  ｕｎｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＣＧＨ  ＩＳＣＡ  ８ｘ６０Ｋヒトゲノムアレイに製造業者のプロトコルに従ってハイブリダイズさせた。データを、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＣｙｔｏＧｅｎｏｍｉｃｓソフトウェアを使用して分析した。
【０１７９】
１．１２  ローダミン１２３輸送アッセイ
ローダミン１２３輸送アッセイは、Sampaziotis F.ら（Nat. Biotechnol. 2015, 1-11）に記載されるように実施し、画像をZeiss社のＬＳＭ  ７００共焦点顕微鏡を使用して取得した。蛍光強度をオルガノイド内部と外部との間で計測し、内腔の蛍光を腔外空間のバックグラウンドに対して正規化した。各実験は３連で繰り返した。エラーバーは、標準偏差を表す。
【０１８０】
１．１３  コリル−リジル−フルオレセイン輸送アッセイ
コリル−リジル−フルオレセイン（ＣＬＦ、Corning Incorporated社）による負荷を実現するために、ＥＣＯオルガノイドを５μＭのＣＬＦ中で分割し、３７℃で３０分間インキュベートした。Zeiss社のＬＳＭ  ７００共焦点顕微鏡を使用して画像を取得し、ローダミン１２３輸送アッセイについて説明したように、オルガノイド内部と外部との間で蛍光強度を計測した。観察されたＣＬＦ蛍光強度の変化がオルガノイド内腔からのＣＬＦの能動的排出に続発することを裏付けるために、５μＭの非共役フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）（Sigma-Aldrich社）をコントロールとして用いて実験を繰り返した。蛍光強度測定は、ローダミン１２３輸送アッセイについて記載したように実施した。
【０１８１】
１．１４  ＧＧＴ活性
ＧＧＴ活性を、ＭａｘＤｉｓｃｏｖｅｒｙ（商標）γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）酵素アッセイキット（Bioo Scientific社）を使用して製造業者の使用説明書に基づいて３連で計測した。エラーバーは、標準偏差を表す。
【０１８２】
１．１５  アルカリホスファターゼ染色
アルカリホスファターゼを、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ発色基質（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート／ニトロブルーテトラゾリウム）（Promega社）を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。
【０１８３】
１．１６  セクレチン及びソマトスタチンへの応答
セクレチン及びソマトスタチンへの応答は、Sapazoits Fら（Biotechnol. 2015 1-11）に記載されるように評価した。
【０１８４】
１．１７  緑色蛍光タンパク質を発現するＥＣＯの作製
ＥＧＦＰを発現するＶＳＶ−Ｇ偽型の組み換えＨＩＶ−１レンチウイルス粒子を、３つのプラスミドをＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１１２６８）に一過性に同時トランスフェクションすることにより、最適化された第２世代パッケージングシステムを用いて作製した。ＥＧＦＰ発現は、コアＥＦ１αプロモーターの制御下にある。全てのプラスミドは、Didier Tronoからの寄贈であり、addgene社から取得した（ｐＷＰＴ−ＧＦＰ番号１２２５５、ｐｓＰＡＸ２番号１２２６０、ｐＭＤ２．Ｇ番号１２２５９）。オルガノイドのウイルス感染は、Koo, B-Kら（Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2013, 27 Unit 5A.6）に記載したように実施した。感染したＥＣＯを２代継代にわたり増殖させ、フローサイトメトリー分析について上記したように採取し、ＧＦＰ陽性細胞のためのフローサイトメトリーによるセルソーティングを実施した。ＧＦＰを発現する単一細胞を、本発明者らの標準的な播種法を使用して播種し、添加物を含むウィリアムＥ培地中で、完全に成長したＥＣＯオルガノイドに発達するまで１週間〜２週間にわたり培養した。
【０１８５】
１．１８  ＥＣＯが定着したＰＧＡ足場の作製
密度５０ｍｇ／ｃｃを有する１ｍｍの厚さのポリグリコール酸（ＰＧＡ）足場を全ての実験のために使用した。細胞を播種する前に、ＰＧＡ足場を１ＭのＮａＯＨで１０秒間〜３０秒間前処理して３回洗浄し、７０％のエタノール溶液で３０分間デコンタミネーションさせた後に、全てのエタノールが完全に蒸発するまで更に３０分間風乾させた。全ての足場は、Biomedical Structures社（Ｂｉｏｆｅｌｔ）から得た。
【０１８６】
フローサイトメトリー分析について上記したように、ＥＣＯを採取して単一細胞へと解離させた。５〜１０×１０６個の細胞を、添加物を含むウィリアムＥ培地１００μｌ中に再懸濁し、１ｃｍ２の足場表面積上に播種し、３７℃で３０分間〜６０分間インキュベートして、細胞を足場に付着させた。それらの足場を、２４ウェルプレートのウェル中に入れて、培地が蒸発しないことを保証するためにこの期間の間に規則的な間隔で確認した。必要に応じて、添加物を含むウィリアムＥ培地１０μｌ〜２０μｌを加えた。１時間後に、添加物を含むウィリアムＥ培地２ｍｌ〜３ｍｌをウェルに加え、培地を週に２回交換した。
【０１８７】
１．１９  高密度化コラーゲン管の作製
高密度化コラーゲン管は、新規アプローチを使用して製造した。漏斗状部品と底板とからなる３Ｄ印刷されたチャンバーを作製した。２５０μｍの太さの金属ワイヤを、漏斗の中心を通して送り底板中に取り付けた。２つの３Ｄ印刷された部品の間に吸収性のペーパータオルを詰め込んだ後に、それらを共に螺合させた。細胞を負荷したコラーゲンゲル溶液５ｍｇ／ｍＬを漏斗中に注ぎ込み、３７℃で３０分間にわたりゲル化させた。その後にネジを緩め、３Ｄ印刷されたチャンバーを３７℃で２時間〜４時間置くことにより、コラーゲンゲルから水を抜き取った。こうして、乾燥段階の持続時間によって決定される２５０μｍの内腔及び３０μｍ〜１００μｍの壁厚を有する細胞負荷された高密度化コラーゲン管が形成された。チャンバーから取り出したら、管の余分なコラーゲンを切り落とし、必要な長さに切断した。
【０１８８】
１．２０  ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）の培養
ＨＭＥＣ及び必要な組織培養消耗品は、Lonza社からキットとして購入し（カタログ番号ＣＣ−２５５１Ｂ）、細胞を供給業者の使用説明書に従って培養した。
【０１８９】
１．２１  動物実験
全ての動物実験は、英国内務省規制（英国内務省プロジェクトライセンス番号ＰＰＬ  ８０／２６３８及びＰＰＬ  ７０／８７０２）に従って実施した。Ｂリンパ球、Ｔリンパ球及びＮＫリンパ球を欠如する免疫不全ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ（ＮＳＧ）マウス（Shultz L.D. et al., J. Immunol. 2005 174:6477-6489）を、手順前後に食餌及び水の自由飲食にてインハウスで飼育した。約６週齢〜８週齢の雄と雌とが混ざった動物を使用した。使用された全てのＥＣＯ構築物に、総胆管由来のＥＣＯを定着させた。
【０１９０】
１．２２  肝外胆管損傷（ＥＨＢＩ）マウスモデルの作製
肝外胆管損傷のモデルを作製するために、正中線開腹術を実施し、イソフルラン全身麻酔下でその基底部を前腹壁に連結する靭帯付着部を分割することにより、胆嚢をまずは授動させた。次いで、胆嚢の長さの２／３に沿って基底部からハルトマン嚢（胆嚢頸部）に向かって縦切開を行った。
【０１９１】
１．２３  ＥＨＢＩマウスにおける胆管再建
胆嚢を再建するために、約１×１ｍｍの寸法の足場セクション（ＥＣＯが播種される又はコントロールではＥＣＯは播種されない）を「パッチ」として縫合し、欠損部を４０倍率下で４箇所〜６箇所の１０’０の非吸収性ナイロン結節縫合糸を使用して閉じた。開腹は、２層で５’０の吸収性Ｖｉｃｒｙｌ連続縫合糸により閉じた。動物にブプレノルフィン（ｔｅｍｇｅｓｉｃ  ０．１ｍｇ／ｋｇ）鎮痛薬をボーラスとして投与し、完全に回復するまで個々のケージで１５分毎に観察した。
【０１９２】
１．２４  胆管置換
天然の総胆管を分割して、短いセグメントを切除した。定着された高密度化コラーゲン管を、分割された近位総胆管と遠位総胆管との間で１０’０のナイロン結節縫合糸を使用して端々吻合した。長さ５’０のナイロン縫合材料（直径１００μｍ）をコラーゲン管に挿入し、近位総胆管及び遠位総胆管へと送ることで、吻合の間の内腔の開通性を確保した。吻合が完了した後に、遠位胆管を通じて５’０の縫合糸を十二指腸に押し込み、十二指腸の切開部から取り出した後に、１０’０のナイロン結節縫合糸で閉じた。内腔の開通性は、移植の時点で光学顕微鏡検査及び５’０の非吸収性縫合糸による内腔の挿管によって評価した。細胞浸潤により管が完全に閉塞された場合に、移植は無益であるので断念された。これらの事象は、外科合併症ではなく構築物／管の障害とみなされるため、生存分析において打ち切らなかった。
【０１９３】
１．２５  胆管結紮
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Jackson Laboratory社（メイン州、バーハーバー）から購入した。マウスを、オスロのリクショスピタレットにあるオスロ大学病院の動物施設の最小病棟に収容して飼育した。全ての実験は、８週齢から１２週齢の間の雄のマウスに対して行った。正中線開腹術を行い、総胆管を露出させ、肝胆管の接合部近くで結紮した。偽手術マウスには、結紮せずに同じ手順を行った。血清を５日後に採取した。アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）及びアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を、血清中でＡＤＶＩＡ  １８００（Siemens社）を使用してノルウェー獣医学校の中央研究所で計測した。全ての動物実験はノルウェー食品安全局（プロジェクトライセンス番号ＦＯＴＳ  ８２１０／１５）によって承認され、全ての動物は「実験動物の管理と使用に関する指針」（アメリカ国立衛生研究所出版、第８版、２０１１年）に沿って人道的管理を受けた。
【０１９４】
１．２６  血液試料収集及び処理
動物を選択し屠殺する時点で終末麻酔下にて下大静脈から直接的に２３ｇの針を使用して採血し、更なる処理のために１．５ｍｌ容のエッペンドルフチューブに移した。
【０１９５】
血液試料を、ケンブリッジ大学のコアバイオケミカルアッセイ研究所（Core biochemical assay laboratory）（ＣＢＡＬ）によって通常通りに処理した。試料分析の全ては、Siemens社のＤｉｍｅｎｓｉｏｎ  ＥＸＬアナライザーにおいてSiemens社により供給される試薬及びアッセイプロトコルを使用して実施した。
【０１９６】
１．２７  光学顕微鏡イメージング
切除された再建された胆嚢の光学顕微鏡画像は、Leica社のＭＺＦＬＩＩＩ蛍光解剖顕微鏡を使用して取得した。画像は５匹の動物の代表的なものである。
【０１９７】
１．２８  凍結切片及び組織学
切除した胆嚢を４％のＰＦＡ中で固定し、スクロース溶液に一晩浸し、最適切断温度（ＯＣＴ）化合物中に包埋し、切片化するまで−８０℃で貯蔵した。クライオスタットミクロトームを使用して切片を１０μｍの厚さに切断し、更なる分析のために顕微鏡スライド上で封入した。
【０１９８】
１．２９  ヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色
Ｈ＆Ｅ染色は、Sigma-Aldrich社の試薬を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。簡潔には、組織切片を水和し、マイヤーのヘマトキシリン液で５分間処理し（Sigma-Aldrich社）、温かい水道水で１５分間洗浄し、蒸留水中に３０秒間〜６０秒間置いて、エオシン溶液（Sigma-Aldrich社）で３０秒間〜６０秒間処理した。切片を脱水し、Ｅｕｋｉｔｔ（商標）速硬性封入剤（Sigma-Aldrich社）を使用して封入した。組織学切片は、肝胆管組織学に特に関心を持つ独立した組織病理学者によって再調査された。
【０１９９】
１．３０  ＴＵＮＥＬアッセイ
ＴＵＮＥＬアッセイは、市販のキット（abcam社、ａｂ６６１１０）を使用して製造業者の使用説明書に従って実施した。
【０２００】
１．３１  フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）胆管造影
ｉｎ  ｓｉｔｕでのＦＩＴＣ胆管造影は、屠殺された動物において、付着肝葉を有しない胆嚢を解剖した後であるが肝外胆管系の外科的切離の前に行われた。遠位胆管に２３と１／２ゲージの針を挿管し、ＦＩＴＣを胆嚢に逆行的に注入し、蛍光顕微鏡下で撮像した。
【０２０１】
１．３２  磁気共鳴胆管膵臓造影（ＭＲＣＰ）
磁気共鳴胆管膵臓造影は、動物の屠殺後に実施した。ＭＲＣＰは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｅｃ  ４７／４０システムを使用して４．７Ｔで実施した。緩和促進を伴う高速取得のシーケンスを、９．５ｍｓ間隔で４０エコーのエコートレイン長、１０００ｍｓの繰り返し時間、５．８４×４．１８×４．１８ｃｍ３の撮像視野と共に２５６×１８０×１８０のマトリックスにより使用することで、２３０μｍの等方性解像度が得られた。Bruker社により提供されるアクティブデカップリングされた４チャンネルマウス心臓アレイ（actively-decoupled four-channel mouse cardiac array）を撮像に使用した。
【０２０２】
撮像された２番目のマウスについては、信号対雑音比をより高くして胆管の視覚化を改善するために、２次元シーケンスを、僅かに変更したパラメーター（１１ｍｓ間隔で２４の離れたエコーにより、１１０ｍｓの有効エコー時間が得られる；繰り返し時間５７４１ｍｓ；マトリックスサイズ２５６×２５６；撮像視野４．３３×５．３５ｃｍ２により、平面解像度１７０×２００μｍ２が得られる）で使用した。１５枚のスライスを、厚さ０．６ｍｍで肝臓及び胆嚢を通して冠状に取得した。この取得のために、ボリュームコイルを使用して、無線周波数の不均一性の影響を減らした。
【０２０３】
胆管及び胆嚢を検査するために、最大値投影法により画像を作成した。腫瘍成長を除外する構造イメージングを、２５°のフリップ角、１４ｍｓの繰り返し時間及び７ｍｓのエコー時間でＴ１加重３Ｄ  ＦＬＡＳＨ（高速低角度励起）シーケンスを使用して実施した。マトリックスは５１２×２５６×２５６であり、撮像視野は５．１２×２．５６×２．５６ｃｍ３であり、最終的な等方性解像度は１００μｍであった。ＭＲＣＰ画像は、肝胆管放射線学に特に関心を持つ２人の独立した放射線学者によって再調査された。
【０２０４】
１．３３  統計分析
全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６を使用して行った。記述統計が適切でない小さなサンプルサイズの場合には、個々のデータ点をプロットした。２つの平均値を比較するために、両側スチューデントのｔ検定を使用して、統計的有意性を計算した。本発明者らの値の正規分布は、適宜、ダゴスティーノ・ピアソンの総括的な正規性検定を使用して確認した。サンプル間の分散は、ブラウン・フォーサイス検定を使用して検定された。多群と参照群との比較のために、分散が等しい群間で多重比較のためにダネット補正を伴う一元配置分散分析を使用し、その一方で、分散が等しくない群には、多重比較のためにダンの補正を伴うクラスカル・ワリス検定を適用した。生存率は、ログ・ランク（マンテル・コックス）検定を使用して比較した。反復数（ｎ）が与えられている場合に、これは、別段の定めがない限りＥＣＯ系統又は異なる動物の数を指す。
【０２０５】
２．結果
２．１  ヒト肝外胆管細胞はオルガノイドとして成長し得る
本発明者らはまず、胆管系の内腔表面を覆う単層を形成する胆管上皮から初代胆管細胞を分離するための最適条件の特定に焦点を絞った（Kanno N. et al., Hepatology 2000 31:555-61）。本発明者らは、これらの細胞を回収するために、機械的スクレイピング並びにトリプシン又はコラゲナーゼ及び／又はディスパーゼによる酵素的消化を含む幾つかのアプローチを試験した（図１）。胆管内腔をブラッシング又はスクレイピングすることによる機械的解離は、酵素的消化と比較して生存率の改善を伴った（図１及び図２）。さらに、得られた細胞の大部分は、胆管マーカーＣＫ７及びＣＫ１９を共発現したが（９４．６％±２．４％、標準偏差；ｎ＝３）、間葉系細胞型からのコンタミネーションは検出されなかった。したがって、機械的解離は、肝外胆管細胞を採取するための最適な方法とみなされる。
【０２０６】
これらの細胞の維持及び成長のために適切な条件を見分けるために、ヒト人工多能性幹細胞由来の肝内胆管細胞の３Ｄ培養用に確立されたシステムを最適化した（Sampaziotis F. et al., Biotechnol. 2015 -11、Sampaziotis F. et al., Nat. Protoc. 12:814-827）。胆管細胞及び上皮オルガノイドの増殖に対応することが知られている多数の成長因子のスクリーニング（LeSage, G et al., Liver 2001 21:73-80、Huch M et al., Cell 2014 160:299-312）により、上皮成長因子（ＥＧＦ）、Ｒ−スポンジン及びＤｉｃｋｋｏｐｆ関連タンパク質１（ＤＫＫ−１）の組み合わせが、初代胆管細胞のオルガノイドへの成長を促進するのに十分であると特定された（図４）。
【０２０７】
Ｗｎｔ増強剤（Ｒ−スポンジン）及び阻害剤（ＤＫＫ−１）の両方について矛盾するとみられる要求のため、本発明者らは、ＥＣＯにおける古典的及び非古典的／ＰＣＰ  Ｗｎｔ経路の活性の特性評価を行った。本発明者らの結果は、Ｒ−スポンジンで処理されたがＤＫＫ−１で処理されていない細胞と比較して、ＥＣＯにおけるβ−カテニンのリン酸化が高いことを裏付けており（図５）、これらの細胞において古典的ＷＮＴ経路の活性がより低いことを意味する。さらに、ＥＣＯは、Ｒ−スポンジンで処理されたがＤＫＫ−１で処理されていない細胞と比較して、より高いＲｈｏキナーゼ活性を示し（図６）、それはＥＣＯにおける非古典的／ＰＣＰシグナル伝達の増強と一致している。したがって、非古典的Ｗｎｔシグナル伝達はＥＣＯ増殖を制御し、以前のオルガノイド培養条件（Huch M et al.; Cell 2014 160:299-312）との顕著な違いが示される。
【０２０８】
これらの条件下で、本発明者らは、３３歳から７７歳までの様々な死亡したドナーから８種類のＥＣＯ系統を得た。特に、胆嚢から分離された胆管細胞を使用するか、又は内腔をスクレイピングするのではなく内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）ブラシを使用して総胆管の胆管細胞を採取することにより、同様の結果が得られた（図７）。重要なことには、本発明者らのシステムは、生検組織又はソーティングされた胆管細胞からの肝内ＣＯ（ＩＣＯ）を得るためにも使用された（図２７）。したがって、ＣＯは、胆管系（肝内、肝外又は胆嚢）のどの領域からも得られ、周術期（解剖、スクレイピング又はコラゲナーゼ及びリベラーゼ等の酵素を使用する酵素的解離）アプローチ又は低侵襲性（ＥＲＣＰブラッシング、肝生検）アプローチを使用して採取され得る。
【０２０９】
２．２  ＥＣＯは、培養において主要な胆管マーカー及び機能を維持する
得られた細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれらの遺伝的安定性を維持しながら長期間（２０代継代）にわたり増殖された。電子顕微鏡検査により、繊毛、微絨毛及び密着結合を含む特徴的な微細構造的特徴の存在が明らかになり、一方で、ＱＰＣＲ及び免疫蛍光（ＩＦ）分析により、図８及び図２８に示されるように、サイトケラチン７（ＫＲＴ７又はＣＫ７）、サイトケラチン１９（ＫＲＴ１９又はＣＫ１９）、肝細胞核因子１ベータ（ＨＮＦ１Ｂ）、ＧＧＴ、セクレチン受容体（ＳＣＴＲ）、ナトリウム依存性胆汁酸輸送体（ＡＳＢＴ／ＳＬＣ１０Ａ２）、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）及びＳＲＹ−ｂｏｘ  ９（ＳＯＸ９）（Sampaziotis F. et al., Biotechnol. 2015 1-11）等の主要な胆管マーカーの発現が確立された。重要なことには、本発明者らの培養システムは、胆管細胞オルガノイドの増殖のみを可能にする。肝細胞等の他の肝細胞型は、肝マーカーの下方調節によって示されるように、成長しない（例えば、図２８を参照）。
【０２１０】
注目すべきことに、ＰＯＵ５Ｆ１又はＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、プロミニン１（ＰＲＯＭ１）、ロイシンリッチリピート含有Ｇタンパク質共役受容体（ＬＧＲ）ＬＧＲ−４／５／６等の幹細胞マーカー、アルブミン（ＡＬＢ）、α１−アンチトリプシン（ＳＥＲＰＩＮＡ１又はＡ１ＡＴ）、ケラチン１８（ＫＲＴ１８）、膵臓及び十二指腸ホメオボックス１（ＰＤＸ１）、インスリン（ＩＮＳ）及びグルカゴン（ＧＣＧ）を含む非胆管系譜のマーカー、並びにＥＭＴマーカー（ビメンチン（ＶＩＭ）、ｓｎａｉｌファミリー転写リプレッサー１（ＳＮＡＩ１）及びＳ１００カルシウム結合タンパク質Ａ４（Ｓ１００Ａ４））は検出されなかった。他方で、２０代継代した後に細胞の９８．１％±０．９％（標準偏差；ｎ＝３）は、ＣＫ７及びＣＫ１９を共発現し、それにより胆管細胞のほぼ均質な集団の存在が確認された。
【０２１１】
トランスクリプトーム解析（図９）により、ＥＣＯが、多重継代にわたり安定した遺伝子発現プロファイルを維持し（１代継代（Ｐ１）対２０代継代（Ｐ２０）についてのピアソン相関係数ｒ＝０．９９）、主要な胆管マーカーを発現し、分離したての胆管細胞の近くでクラスター形成する（初代胆管細胞（ＰＣ）対２０代継代（Ｐ２０）についてのピアソン相関係数ｒ＝０．９２）が明らかになった。遺伝子オントロジー分析により、胆管上皮に特徴的な経路の濃縮が確認された。これは、肝外胆管系に由来する初代胆管細胞が、本来の特性を失うことなくｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖し得ることを裏付けている。胆管細胞オルガノイド（ＣＯ）由来の細胞の単一細胞ＲＮＡシーケンシングにより、ＣＯが、特に主要組織適合性複合体分子等のマーカー及び細胞周期遺伝子の発現に関して、初代胆管細胞とは異なるトランスクリプトームシグネチャを示す（図３２及び図３３）ことが分かった。
【０２１２】
次いで、本発明者らは更に、長期培養（２０代継代）後のそれらの機能に焦点を絞ることによりＥＣＯの特性決定を行った。胆管上皮は、イオン、水及び胆汁酸の輸送を通じて胆汁の恒常性を調節する。ＥＣＯの分泌能力を、胆管細胞表面糖タンパク質多剤耐性タンパク質−１（ＭＤＲ１）のための蛍光性基質であるローダミン１２３を使用して調べた（図１０及び図１１）。ローダミン−１２３は、ＭＤＲ−１アンタゴニストのベラパミルの不存在下でのみＥＣＯ内腔に蓄積し、それによりＭＤＲ−１による能動的な分泌が確認された。胆汁酸の腔内排出は、蛍光性胆汁酸のコリン−リジル−フルオレセイン（ＣＬＦ）がＥＣＯから能動的に移出されたことを示すことによっても裏付けられた（図１２、図１３及び図３１）。さらに、ＥＣＯのＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性は、播種したての初代胆管細胞に匹敵した（図１４、図２９及び図３０）。ＥＣＯのセクレチン及びソマトスタチンへの応答も評価した。セクレチンは、水分泌を促進し、胆管内腔を拡張させるが、ソマトスタチンはセクレチンの効果を打ち消す。したがって、セクレチンに曝されたオルガノイドは、未処理のコントロールと比較してその直径を増大させたが、ソマトスタチンは、セクレチンの効果を阻害した（図１５）。
【０２１３】
したがって、本発明者らのデータは、ＥＣＯがそれらの機能的特性を長期培養後でさえも維持することを裏付けている。
【０２１４】
２．３  ＥＣＯが定着した足場は、胆嚢壁を再建する
ＥＣＯの組織エンジニアリングのための可能性を評価するために、本発明者らは、組織再建に必要とされる構造的かつ機械的な支持物を提供するために通常使用されるポリグリコール酸（ＰＧＡ）の生分解性足場にそれらが定着する能力を調べた。実際、ＰＧＡは最も広く使用される合成ポリマーの１つである。それというのも、ＰＧＡは、周辺組織において炎症応答を誘発せず、生分解性であり、かつコラーゲン等の天然ポリマーと比較して、より柔軟で加工が容易であるからである。細胞のトラッキングを容易にするために、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するＥＣＯを、ウイルス形質導入により作製した。得られた細胞をＰＧＡ足場に播種し、２４時間〜４８時間後にＰＧＡ繊維に付着させ、足場がコンフルエントになるまで４週間成長させ続けた。注目すべきことに、２Ｄ条件で成長させた初代胆管細胞は、限られた増殖能力しか示さず（図１６）、足場に播種した場合にコンフルエンシーに達しなかった（図１７）ことから、ＥＣＯの増殖能力が、足場へのコロニー形成の成功に極めて重要であることを示唆している。定着されたＰＧＡ足場は、ピンセットで簡単に取り扱われ、手術用ブレードでより小さい部片へと分割された。足場に定着する細胞は、ＣＫ７及びＣＫ１９等の胆管マーカーの発現を保持し、上皮間葉転換（ＥＭＴ）マーカーのＣＫ１９及びＶＩＭの形跡を示さず、ＡＬＰ活性及びＧＧＴ活性を含むそれらの機能的特性を維持した。したがって、ＥＣＯは、それらの機能性及びマーカー発現を維持しつつＰＧＡ足場に定着し、それにより胆管上皮に似た生体工学による組織を得ることができる。
【０２１５】
次いで、本発明者らは、肝外胆管損傷（ＥＨＢＩ）のマウスモデルにおいてＥＣＯが胆管上皮を修復する能力を定義することを決定した。胆管再建を必要とする胆管系壁の欠陥をシミュレートするために、健康なＮＳＧマウスの胆管系を、胆嚢壁における縦方向の切開によって損傷させた（図１８）。続いて、ＧＦＰ−ＥＣＯが定着したＰＧＡ足場を、損傷した動物へと移植することにより胆嚢壁の手術による欠損を修復した。無細胞ＰＧＡ足場及びＧＦＰを発現する線維芽細胞が定着した足場をネガティブコントロールとして使用した。無細胞足場を受容した動物は手術の２４時間以内に死亡し（図１９）、死後検査により、胆汁漏出と一致する腹膜腔及び精嚢の黄色の色素沈着が明らかとなったが、一方で、線維芽細胞足場の群における全ての動物は、それらの胆嚢の再建に失敗し、胆嚢は胆汁の輸送又は貯蔵に不適合な線維化組織に置き換わった。対照的に、ＥＣＯを含む足場が移植された動物は、合併症なしで最大１０４日間生存し、選択して屠殺した。とりわけ、ＥＣＯ群において再建された胆嚢は、それらの天然の相当物の形態とそっくりに完全にリモデリングされた（図２０）。ＥＣＯ再建された胆嚢の組織学、ＩＦ及びＱＰＣＲ分析により、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＨＮＦ１Ｂ、ＳＯＸ９、ＣＦＴＲ、及びＫｕ８０に対するヒト特異的エピトープ等の胆管マーカーを発現するＧＦＰ陽性ＥＣＯの組み込みが明らかになった。注目すべきことに、これらのＩＦ分析により、ビメンチンを発現するマウス間葉系細胞及びＣＤ３１を発現する内皮細胞が、再建された胆管上皮に存在することも判明し、こうして移植後に内因性細胞が足場にコロニー形成することが示される。
【０２１６】
さらに、本発明者らは、ＧＦＰ陽性／ビメンチン陽性／ＣＫ１９陰性の細胞の集団も特定し、こうしてＥＣＯがｉｎ  ｖｉｖｏで、おそらくＥＭＴを通じて足場間質に寄与することも示唆される（図２１）。
【０２１７】
再建された胆嚢内腔の完全性及び胆管系との連続性を通じた胆汁へのその曝露を、臓器の摘出前に磁気共鳴胆管膵臓造影（ＭＲＣＰ）イメージングを使用して裏付け、ＦＩＴＣ胆管造影により更に確認した。死後の外科的検査及び移植１０４日後の全身磁気共鳴イメージングでは、腫瘍形成の形跡は認められず、ＩＦ分析では、隣接する肝組織におけるＧＦＰ陽性細胞が認められなかった。対照的に、線維芽細胞コントロールで再建された胆嚢は、胆嚢内腔の閉塞と、線維芽細胞特異的抗原Ｓ１００Ａ４を発現する線維芽細胞による内腔及び胆管上皮の置換とを示した。総合的に考えると、これにより、ＥＣＯがその生理的適所にコロニー形成して、合併症を起こすことなく胆管系の一部を再生する能力が裏付けられた。
【０２１８】
２．４  生体工学による胆管は、天然のマウス胆管を置換する
胆嚢壁の再建は、ＥＣＯが損傷後の胆管上皮を修復する能力の原理証明を提供した。しかしながら、肝外胆管障害の大部分は、総胆管（ＣＢＤ）を冒す。したがって、本発明者らは、胆管置換手術に使用され得るＥＣＯが定着した管状の足場の作製に焦点を絞った。マウスＣＢＤの内径は約１００μｍであり、壁厚は５０μｍ未満であり、このため、機械的特性のためＰＧＡ足場を使用することができなかった。代わりに、本発明者らは、ＧＦＰを発現するＥＣＯが定着した（図２３）高密度化コラーゲン管状足場（図２２）を作製した。高密度化コラーゲンの使用により、外径が２５０μｍから６００μｍまでの範囲にあり、開存内腔を維持するのに十分な強度を有する構築物の作製が可能となった。とりわけ、コラーゲン足場に定着している細胞は、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＨＮＦ１Ｂ、ＳＯＸ９及びＣＦＴＲ等の胆管マーカーの発現を維持し、ＧＧＴ酵素活性及びＡＬＰ酵素活性を示した。異なる起源の初代上皮細胞（ヒト乳腺上皮細胞；ＨＭＥＣ）は、同じ条件下で生存して高密度化コラーゲン管に十分に定着することができなかった。さらに、播種されたＨＭＥＣは、１０％（容量／容量）の胆汁溶液中で生存することができず、こうして胆汁耐性の生体工学による胆管を作製するためのＥＣＯの特有の能力が更に確認された。まとめると、これらの結果は、当初の特性を失うことなく、ＥＣＯが管状の高密度化コラーゲン足場に定着する能力を裏付けている。
【０２１９】
次いで、本発明者らは、ＮＧＳマウスの天然のＣＢＤを、上記のようなＥＣＯが定着した高密度化コラーゲン管からなる生体工学による管で置換することを決定した。天然のＣＢＤの中央部分を除去し、ＥＣＯが定着したコラーゲン管を近位胆管及び遠位胆管の残部に端々吻合した（図２４）。線維芽細胞が定着した管をネガティブコントロールとして使用した。胆管再建は、ＥＣＯが定着した管が移植された全ての動物で達成され、それらを移植後１ヶ月までの間追跡した。組織学及びＩＦ及びＱＰＣＲ分析により、開存内腔と共に、移植されたＧＦＰ陽性細胞による胆管上皮の形成が明らかとなり（図２５）、生着細胞によるＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＨＮＦ１Ｂ、ＣＦＴＲ、ＳＯＸ９等の胆管マーカーの発現が確認されたが、マウス間質細胞及び内皮細胞の存在も示された。さらに、移植された管において移植１ヶ月後に最小限のアポトーシス及び増殖しか観察されなかったことから、再建された胆管上皮の安定性及び完全性が確認される。内腔開通性を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）胆管造影、ＭＲＣＰ及び血清胆汁鬱滞マーカーの計測によって更に確認した（図２６）。したがって、ＥＣＯが定着した管を受容した動物は、血清胆汁鬱滞マーカー（ビリルビン、ＡＬＰ）の上昇を示さず、イメージングにおいて開存内腔を示した。一方で、生体人工総胆管は、ｉｎ  ｖｉｖｏでそのＡＬＰ活性を保持していた。対照的に、線維芽細胞が定着した全てのコラーゲン管は、内腔閉塞のために機能しなくなり、その結果、高い胆管圧及び吻合部位を通じた胆汁漏出が生じた。
【０２２０】
結論として、本発明者らの結果は、ＥＣＯが定着したコラーゲン管がｉｎ  ｖｉｖｏで天然のＣＢＤを置換する能力を裏付けている。
【０２２１】
さらに、本発明者らは、４、４'−メチレンジアニリン（ＭＤＡ）を投与することにより、ＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスに胆管減少症を引き起こした。ＭＤＡ投与後の胆管損傷の存在を、Ｈ＆Ｅ染色によって確認した。次いで、ＲＦＰを発現するように操作されたヒトＥＣＯをマウスに注入し、生着及びＲＦＰを発現するＥＣＯによる新生胆管の形成を、免疫蛍光分析によって評価した。マウスにおける種々のサイズの新生胆管の形成及び胆管マーカー発現（例えば、ＫＲＴ１９）の保持が観察された。これらの実験は、本明細書に記載される増殖された胆管細胞の集団が、肝外胆管症に加えて、肝内胆管症等の肝臓を冒す疾患に対する細胞ベースの治療において有用であり得ることを裏付けている。
【０２２２】
本明細書では、再生医療用途に適合する肝外胆管系及び肝内胆管系由来の初代ヒト胆管細胞の分離及び成長のための方法が開示されている。得られるＥＣＯ及びＩＣＯは、ＫＲＴ７、ＫＲＴ１９、ＧＧＴ及びＣＦＴＲ等の主要な胆管マーカーを発現し、ＡＬＰ活性、ＧＧＴ活性、並びにセクレチン及びソマトスタチンへの応答を含むそれらのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの機能的特性を維持する。ＥＣＯ及びＩＣＯの組織エンジニアリング及び臨床応用への適性は、それらが生分解性足場に定着し、機能的胆管上皮へと組織化し、肝外胆管損傷のマウスモデルをレスキューする能力によって更に示される。
【０２２３】
本発明者らは、肝外胆管系及び肝内胆管系由来の上皮細胞が、それらの胆管細胞の転写シグネチャ及び機能的特性を維持しつつ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖及び成長し得ることを実証した。さらに、本発明者らの結果は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでオルガノイドとして増殖された初代胆管細胞が、臓器再生の驚くべき特有の可能性を有することを示している。実際、本発明者らのシステムは、総胆管病理学の観点から再生医療用途のための最初の原理証明を提供する。罹患した総胆管をｉｎ  ｖｉｔｒｏで生体工学によるＣＯ管で置換する能力は、小児肝移植のための主因となる胆管閉鎖症（Murray & Carithers, Hepatology 2005 41:1407-1432）又は移植後の最も一般的な合併症の１つである虚血性狭窄（Skaro AI et al., Surgery 2009 146:543-553）等の障害の管理に大きな影響を及ぼす。したがって、ＣＯが定着した足場は、胆管症の分野で高い臨床的関連性を有する新規システムとみなされる。
【０２２４】
肝外胆管上皮の研究は、長期培養と初代胆管細胞の大規模な増殖とにおける技術的課題により限定されている。ＥＣＯ及びＩＣＯの大規模な増殖のための能力がこの課題に対処する。実際、本発明者らは、１０５個の肝外胆管細胞から始めて、２０代継代後に１０２０個〜１０２５個の細胞が生成され得ることを実証している。したがって、ＣＯは、細胞ベースの治療のための新しい細胞供給源に相当するだけでなく、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで肝外胆管系の生理学を研究し、その障害をモデリングするための特有のモデルシステムも提供する。
【０２２５】
ヒト組織の入手は、初代細胞に基づくシステムにとって大きな制限となる。しかしながら、本発明者らは、ＥＣＯが総胆管からだけでなく、胆嚢からも取得され得ることを示している。胆嚢組織は容易に入手可能であり、肝臓移植及び実施される最も一般的な外科的処置の１つである胆嚢摘出術の後に通常は破棄される。さらに、手術を受けていない個体においては、総胆管に、内視鏡的逆行性胆管膵管造影（ＥＲＣＰ）等の侵襲が最小限の処置を使用して到達することができ、本発明者らは、組織学標本を取得するために通常行われるブラッシングによって胆管細胞を得ることができることを実証している。とりわけ、これらの種々の方法で得られたオルガノイド間に、形態的又は機能的な差異は観察されなかった。さらに、本発明者らのシステムの拡張可能性のため、少量の出発材料しか必要とされない。これらのアプローチは、組織の利用可能性の課題に効果的に対処し、自系細胞及び同種異系の細胞ベースの治療を可能にする。
【０２２６】
オルガノイドと成体幹細胞との間の関連にもかかわらず（Koo BK & Clevers H, Gastroent. 2014 147:289-302）、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで又は移植後のいずれにおいても本発明者らの実験の間に肝細胞マーカー又は膵マーカーの発現は観察されなかったことから、ＥＣＯの分化能はそれらの元となる系譜に限定されることが裏付けられる。さらに、成体幹細胞オルガノイドの増殖に極めて重要な古典的ＷＮＴシグナル伝達（Farin HF et al.; Gastroent. 2012, 143:1518-1529.e7）は、本発明者らの培養条件においてＤＫＫ−１の使用により遮断される。これらの観察は、本発明者らの培養システムが幹細胞集団を含まないこと示している。
【０２２７】
ｈＩＰＳＣは、殆ど全ての組織を生成することが可能な細胞の起源を提供するが、ｈＩＰＳＣ系統の最初の取得／特性評価には時間がかかり、その一方で、分化能力の変動は依然として課題であるとみなされる。ＥＣＯ及びＩＣＯは、２４時間足らずで非常に高い効率で取得され得て、当初の特性を失うことなく多重継代にわたり増殖され得る。したがって、ＣＯ及びＣＬＣは拡張可能性の点で同等であり、かつ利用の点で補完的であり、ＣＯの成熟した表現型は、組織修復の観点から再生医療用途に特有の利点を提供する。
【０２２８】
要するに、本開示は、肝内及び肝外の初代胆管組織をｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究、疾患モデリング及び細胞ベースの治療用途のための新規プラットフォームとして使用するための新規手段を開拓する。
【０２２９】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【国際調査報告】
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