(57)【要約】  本発明は、腐敗し易い動物性及び／又は植物性製品の保存又は貯蔵寿命を維持又は延長するための抗菌剤として、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）葉に由来する抽出物を含有する抽出物又は組成物を提供する。場合によっては、抽出物はＴ．フェルジナンジアナ果実抽出物を含み得る。葉抽出物は、メタノール、水、酢酸エチル、アルコール、クロロホルム又はヘキサン抽出物であり得る。組成物は、ヒト又は動物のための食物等の腐敗し易い動物性及び／又は植物性製品のための抗菌剤であり得る。本発明は、食品調製表面、食品調製器具又は用品、食品包装又は食品の内部若しくは外部表面上の制御細菌の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、細菌に適用することを含み、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の葉抽出物を含有する組成物を、浸漬又は潅注することなどによって適用することを含む。
2020510412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腐敗しやすい動物性および／または植物性製品の保存または貯蔵寿命を維持または延長するための抗菌剤として、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の葉に由来する抽出物を含有する組成物。
【請求項２】
Ｔ．フェルジナンジアナの葉の前記抽出物に加えて、Ｔ．フェルジナンジアナの果実抽出物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｔ．フェルジナンジアナの葉の前記抽出物は、メタノール抽出物、水抽出物、酢酸エチル抽出物、アルコール抽出物、クロロホルム抽出物またはヘキサン抽出物のうちの１つ以上を含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
Ｔ．フェルジナンジアナの葉の前記抽出物は、少なくとも１つの割合で抗酸化物質を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの抗酸化物質は、エラグ酸またはトリメチルエラグ酸のうちの１つ以上を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
新鮮な、調理済みまたは半調理された動物および／または植物製品である、腐敗しやすい動物性および／または植物性製品と共に使用するための抗菌剤としての、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記動物製品および／または植物製品は、ヒト、ペット、飼育動物または家畜のうちの１つ以上による消費のための１つ以上の食品を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記動物製品は、海洋動物性製品を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記海洋動物性製品は、海産食品、魚、タコ、コウイカ、イカ、クラゲ、チルド調理されたまたは生の甲殻類、貝、エビ、シュリンプ、カニ、ロブスター、魚、筋肉、カキのうちの１つ以上を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
食品調製表面、食品調製器具または用品、食品包装または食品の内部もしくは外部表面上の制御細菌の増殖を阻害する方法であって、前記方法は、細菌を適用することを含み、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の葉抽出物を含有する組成物を、それぞれの食品調製表面、食品調製器具または用品、食品包装または食品の内部もしくは外部表面に適用することを含む、方法。
【請求項１１】
前記組成物を適用することは、前記組成物をそれぞれの表面にスプレーすること、またはそれぞれの表面を前記組成物を含有する溶液に入れることのうちの１つ以上を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物を含有する溶液中に食品を浸漬または潅注することにより前記組成物を適用することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物は、乳酸を含み得る。前記乳酸は、フリーラジカル捕捉剤および／または抗酸化物質として提供され得る。
【請求項１４】
抗菌剤として提供されるＴ．フェルジナンジアナの葉抽出物を含む、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の抽出物。
【請求項１５】
少なくとも１つのタンニンおよび／または少なくとも１つのフラボンを含む、請求項１４に記載の抽出物。
【請求項１６】
少なくとも１つのタンニンを含む、請求項１４または１５に記載の抽出物。
【請求項１７】
ケブル酸、コリラゲン、ケブリン酸およびケブラジン酸のうちの１つ、または２つ以上の組み合わせを含む、請求項１６に記載の抽出物。
【請求項１８】
少なくとも１つのフラボンまたはフラボノイドを含む、請求項１４、１５、１６または１７に記載の抽出物。
【請求項１９】
１つ以上の抗酸化物質を含む、請求項１４〜１８のいずれか一項に記載の抽出物。
【請求項２０】
前記少なくとも１つの抗酸化物質は、エラグ酸を含む、請求項１９に記載の抽出物
【請求項２１】
前記エラグ酸は、エラグ酸脱水物および／またはトリメチルエラグ酸を含む、請求項２０に記載の抽出物。
【請求項２２】
抗菌剤として、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）葉に由来する抽出物を含有する組成物を有する、スプレー溶液、後に希釈するための使用前の濃縮物、すぐに使用できる溶液、溶液中に分散させるための固体製品、または包装または輸送容器に含ませる固体製品。
【請求項２３】
テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の葉に由来する抽出物を含有する抗菌組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の天然抽出物／誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下、参照を容易にするために、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ  ｆｅｒｄｉｎａｎｄｉａｎａ）はＴ．フェルジナンジアナと称され得る。
【０００３】
Ｔ．フェルジナンジアナは、オーストラリアの北部地域の亜熱帯の森林地帯、典型的にはノーザンテリトリーおよびウェスタンオーストラリアで広範囲にわたって野生で成長する小さな落葉樹である。
【０００４】
Ｔ．フェルジナンジアナには、小さなプラム様の果実が豊富に実をつける。その果実は非常にビタミンＣ含有量が高いことで知られており、抗酸化物質、葉酸、鉄の供給源である。その果実および果実抽出物は、食品、栄養補助食品および医薬品に使用されている。
【０００５】
Ｔ．フェルジナンジアナの果実の最も一般的な用途は、グルメジャム、ソース、ジュース、アイスクリーム、化粧品、香料、医薬品である。
【０００６】
Ｔ．フェルジナンジアナの果実抽出物における化粧品ビヒクルの例は、欧州特許第１５８１５１３号明細書に提案されている。別の特許文献米国特許第７１７５８６２号明細書は、Ｔ．フェルジナンジアナ植物の果実からアスコルビン酸（ビタミンＣ）、抗酸化物質および植物化学物質を含有する粉末を製造する方法を開示している。米国特許第７１７５８６２号明細書は、ヒト体内のフリーラジカルを低減するための粉末状のＴ．フェルジナンジアナ果実の使用について言及している。
【０００７】
Ｔ．フェルジナンジアナの果実は抗菌性を持つことでも知られている。北オーストラリアの天然果実として、この果実はオーストラリア先住民によって食品および薬剤として使用されてきた長い歴史がある。この果実は、オーストラリア先住民による長い狩猟移動の間、食品としてよりもその薬効性のために食べられていた。Ｔ．フェルジナンジアナの薬効性は十分に理解されていないか、または完全に評価されていない。
【０００８】
Ｔ．フェルジナンジアナの果実パルプの抗菌性の評価に関するＩ．Ｅ．ＣｏｃｋおよびＳ．Ｍｏｈａｎｔｙの報告による研究は、「Ｐｈａｒｍａｃｇｎｏｓｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２０１１［ｖｏｌ  ３、ｉｓｓｕｅ  ２０］」に掲載された。その研究は、Ｔ．フェルジナンジアナの果実パルプの細菌増殖阻害能力に焦点が当てられており、Ｔ．フェルジナンジアナの果実の他の医薬的に重要な生物活性を調べるためにさらなる研究が必要であることが認識された。
【０００９】
チルド調理されたおよび新鮮な海産食品は、特に、貯蔵寿命が比較的短く腐敗につながりやすいと広く認識されている。
【００１０】
腐敗および廃棄される食品を削減するために、養殖および野生で捕獲される海産食品業界において、提示特性および嗜好特性を維持することは、大きな課題である。製品供給元の場所が遠い、および物流／配送チェーンが長いことで、これらの問題は悪化する。「農場での」加工と包装のプロトコルによる保存寿命および貯蔵寿命の延長は、海産食品業界に大きな利益をもたらすであろう。
【００１１】
貯蔵寿命および保存の時間枠、ならびにそれに関連する腐敗の問題は、海産食品業界に限られていない。新鮮な果実および野菜、ならびに赤身や白身の肉製品は、全て保存および貯蔵寿命が限られており、それぞれの業界において腐敗に関連する割合を有する。
【００１２】
包装中での不活性ガスの使用、および流体を吸収するための吸収性パッドの使用などの、冷却、クックチルおよび優れた包装技術の使用によって、製品の保存および貯蔵寿命を延ばすことができる。しかしながら、かかる技術には限界があり、より広範な技術および貯蔵寿命／保存機構は、これらの全ての食品製造産業にとって非常に価値があり、消費者の利益となるであろう。
【００１３】
腐敗による食品の劣化は、大量の廃棄食品、ならびに食品媒介性疾患をもたらす可能性がある。腐敗は、食品の風味、外観、食感または栄養価の劣化をもたらすことがある。食べられはするが消費者の目には不快または魅力的ではない食品は、売れずに廃棄される可能性が高い。傷んだ食品は、病気や食中毒の危険性も増加させる。
【００１４】
食品腐敗の主な原因の１つは、酸化による酸敗である。これは、食品の多価不飽和および一価不飽和成分が酸素と反応して過酸化物を形成し、続いてそれが分解してケトン、アルデヒドおよび他の揮発性化合物を形成するときに起こる。この酸化を制限することで、生鮮食品および加工食品の寿命が大幅に延びるであろう。
【００１５】
生鮮食品および加工食品に抗酸化性の高い果実、ハーブ、スパイスを取り入れて酸敗を遅らせ、貯蔵寿命および安全性を改善することは、酸化による酸敗を減少させ、食品の貯蔵寿命を延ばすことは、現在認められている方法である。しかしながら、高含有量の抗酸化物質の存在下では、微生物による腐敗が依然として継続することがしばしばある。
【００１６】
微生物による腐敗は、特に腐敗しやすい食品では、食品の劣化の主な要因であり、全ての食品廃棄物の推定２５％を占めている。この種類の腐敗は、不適切な取り扱い／保存技術の結果としての微生物の取り込み、または、条件が増殖にとって好ましい場合の既存の微生物の繁殖のいずれかによって誘発され得る。
【００１７】
さらには、いくつかの一般的な食品腐敗性微生物も深刻な食中毒を引き起こす可能性がある。これは特に懸念される分野であり、改善された保存方策を開発するために多くの労力が費やされている。微生物の増殖を阻害することを目的とする方法は、初期集団、加工後の残存微生物の再増殖、および汚染物質誘導集団を効果的に制御する必要がある。これは、温度変更（加熱、冷却）、ｐＨ（発酵最終産物）、水分活性（脱水）または酸素利用能（缶詰、収縮包装、低酸素包装、高圧）、照射などの多くの方法論、または化学的保存によって達成され得る。
【００１８】
初期の収穫から製品の加工および包装に至るまでの食品加工を通して、食品はさまざまな非生物的要素（温度、熱、酸素）および生物的要素（酵母、菌類、昆虫、細菌）に曝露される。
【００１９】
肉、魚介類などの海産食品、青果物などの腐敗しやすい食材を一定期間保存する主な方法は、低温での保存（例えば、氷による冷却または冷凍）、調理、乾燥（脱水）によるものである。
【００２０】
これらは多くの食品腐敗性細菌の増殖を抑制する効果的な方法であり得るが、冷却およびクックチル加工は、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．などの好冷性および低温性細菌の増殖を阻害するのに非効率的であり、他の保存方法が必要である。
【００２１】
腐敗しやすい食品の乾燥および／または塩の添加による水分活性の低下、または発酵または酸（例えば、酢酸、クエン酸、乳酸）の直接添加による肉／筋肉のｐＨの変更は、保存された肉中の細菌増殖の阻害に効果的である。
【００２２】
しかしながら、これらの方法は、食品の味および食感特性にも大きな影響を及ぼしている。さらには、ナトリウムの過剰消費に関連する健康上の懸念により、近年、保存料としての塩の使用が減少している。
【００２３】
腐敗しやすい可食製品の腐敗を遅らせる他の方法は、化学保存料の添加を必要とする。一般的に使用される化学食品保存料としては、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、硝酸塩、亜硝酸塩、二酸化硫黄（ＳＯ２）および亜硫酸塩（ＳＯ３）が挙げられる。
【００２４】
懸念されるのは、食品に使用される多くの化学保存料の安全性がいまだに決定されておらず、場合によってはこれらの保存料は深刻な健康問題と関連していることである。
【００２５】
化学保存料は、呼吸器系の問題を引き起こし、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）を悪化させ、影響を受けやすい個体にアナフィラキシーショックを引き起こすことがある。消費者の意識の高まりおよび人工保存料に対する否定的な認識により、消費者は化学由来の保存料を含有する食品をますます避けている。加工食品の貯蔵寿命および安全性を高めるために、天然の抗菌代替物の需要が増えている。
【００２６】
したがって、生の製品の初期集団の微生物の増殖を制御すること、ならびに加工後の残存微生物の再増殖、および汚染物質誘導集団を制御することが有益であることが認識されている。
【００２７】
本発明が開発されたのは、上記の制限の少なくとも１つを念頭に置いたものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２８】
本発明は、腐敗しやすい製品の保存および／または貯蔵寿命を維持するための既知の製品および／または方法の少なくとも１つの欠点を改善する少なくとも１つの代替または追加の製品および／または方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
上記を念頭に置いて、本発明の態様は、腐敗しやすい動物性および／または植物性製品の保存または貯蔵寿命を維持または延長するための抗菌剤として、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の葉に由来する抽出物を含有する組成物を提供する。
【００３０】
好ましくは、腐敗しやすい動物性および／または植物性製品としては、新鮮な、調理済みまたは半調理された、例えば部分調理後冷却した、動物および／または植物製品が挙げられる。
【００３１】
本明細書において、植物製品には、キノコおよびキノコベースの腐敗しやすい食品などの菌類製品が含まれると理解され読まれるべきである。
【００３２】
動物製品および／または植物製品は、ヒト、ペット、飼育動物または家畜のうちの１つ以上による消費のための食品を含んでもよい。
【００３３】
動物製品には、海産食品（例えば、調理済み、チルド調理されたまたは生の甲殻類、エビ、シュリンプ、カニ、ロブスター、魚、筋肉、カキ、タコ、コウイカ、イカ、貝など）などの海洋動物性製品を含んでもよい。
【００３４】
組成物は、Ｔ．フェルジナンジアナの葉抽出物に加えて、Ｔ．フェルジナンジアナの果実抽出物を含んでもよい。
【００３５】
Ｔ．フェルジナンジアナの葉抽出物は、葉のメタノール抽出物、水抽出物、酢酸エチル抽出物、アルコール抽出物、クロロホルム抽出物、またはヘキサン抽出物のうちの１つ以上を含む。
【００３６】
好ましくは、Ｔ．フェルジナンジアナの葉抽出物は、少なくとも１つの割合でタンニンを含む。より好ましくは、少なくとも１つのタンニンは、ケブル酸、コリラゲン、ケブリン酸およびケブラジン酸のうちの１つ以上を含む。
【００３７】
Ｔ．フェルジナンジアナの葉抽出物は、好ましくは、ルテオリンなどの少なくとも１つのフラボンまたはフラボノイドを含んでもよい。
【００３８】
本発明のさらなる態様は、食品調製表面、食品調製器具または用品、食品包装または食品の内部もしくは外部表面上の制御細菌の増殖を阻害する方法を提供し、この方法は、細菌を適用することを含み、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の葉抽出物を含有する組成物を、それぞれの食品調製表面、食品調製器具または用品、食品包装または食品の内部もしくは外部表面に適用することを含む。
【００３９】
好ましくは、組成物を適用する工程は、組成物をそれぞれの表面にスプレーすること、またはそれぞれの表面を組成物を含有する溶液に入れることのうちの１つ以上を含む。
【００４０】
乳酸は、フリーラジカル捕捉剤および／または抗酸化物質として提供され得る。
【００４１】
本発明のさらなる態様は、抗菌剤として提供されるＴ．フェルジナンジアナの葉抽出物を含むＴ．フェルジナンジアナの抽出物を提供する。
【００４２】
抽出物または組成物は、１つ以上の抗酸化物質を含んでもよい。１つ以上の抗酸化物質は、エラグ酸を含んでもよい。エラグ酸は、エラグ酸脱水物および／またはトリメチルエラグ酸を含んでもよい。
【００４３】
本発明のさらなる態様は、抗菌剤として、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）の葉に由来する抽出物を含有する組成物を有する、スプレー溶液、後に希釈するための使用前の濃縮物、すぐに使用できる溶液、溶液中に分散させるための固体製品、または包装または輸送容器に含ませる固体製品を提供する。
【００４４】
本発明の別の態様は、テルミナリアフェルジナンジアナ（Ｔ．フェルジナンジアナ）葉に由来する抽出物を含有する抗菌組成物を含んでもよい。
【００４５】
組成物は、組成物を含有する溶液中に食品を浸漬または潅注することにより適用され得る。
【００４６】
組成物または抽出物は乳酸を含んでもよい。乳酸は、フリーラジカル捕捉剤および／または抗酸化物質として提供され得る。
【００４７】
好ましくは、抽出物は、細菌阻害組成物で使用するためのものである。
【００４８】
Ｔ．フェルジナンジアナの抽出物または組成物は、少なくとも１つのタンニンおよび／または少なくとも１つのフラボンを含んでもよい。
【００４９】
少なくとも１つのタンニンは、ケブル酸、コリラゲン、ケブリン酸およびケブラジン酸のうちの１つまたは２つ以上の組み合わせを含んでもよい。
【００５０】
あるいは、またはさらに、抽出物または組成物は、ルテオリンなどの少なくとも１つのフラボンおよびフラボノイドを含んでもよい。
【００５１】
本発明の１つ以上の形態は、以下の製品：スプレー溶液（エアロゾルまたはポンプスプレーなど）、後に希釈するための使用前の濃縮物、すぐに使用できる溶液、溶液中に分散させるための固体製品、加工済みまたは前加工された生の、または調理済みまたは部分的に調理済みの動物または植物製品を有する包装または輸送容器に含ませる固体製品のうちの１つ以上であり得るか、またはそれらに含まれるかまたは組み込まれ得ることが理解される。
【００５２】
本発明の１つ以上の実施形態または実施例を、添付の図面を参照して以下に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】本発明の少なくとも１つの実施形態に関して阻害領域（ｍｍ）として測定されたＳ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ環境分離株に対するテルミナリアフェルジナンジアナ抽出物の増殖阻害活性を示す図である。
【００５４】
【図２】本発明の少なくとも１つの実施形態に関して阻害領域（ｍｍ）として測定されたＳ．ｂａｌｔｉｃａ環境分離株に対するテルミナリアフェルジナンジアナ抽出物の増殖阻害活性を示す図である。
【００５５】
【図３】本発明の少なくとも１つの実施形態に関して阻害領域（ｍｍ）として測定されたＳ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ環境分離株に対するテルミナリアフェルジナンジアナ抽出物の増殖阻害活性を示す図である。
【００５６】
【図４】本発明の少なくとも１つの実施形態に関して阻害領域（ｍｍ）として測定されたＳ．ｌｏｉｈｉｃａ環境分離株に対するテルミナリアフェルジナンジアナ抽出物の増殖阻害活性を示す図である。
【００５７】
Ｍ＝メタノール抽出物、Ｗ＝水抽出物、Ｅ＝酢酸エチル抽出物、Ｃ＝クロロホルム抽出物、Ｈ＝ヘキサン抽出物、Ａｍｐ＝アンピシリン（１０ｇ）。結果を、平均阻害領域±ＳＥＭとして表す。
【００５８】
【図５】Ｔ．フェルジナンジアナの果実および葉のメタノール抽出物によるミナミクロダイの魚の切り身における細菌増殖の阻害を示す図である。
【００５９】
図５に示した結果に関して、総生存細菌の増殖を、１５日間にわたってｌｏｇ１０  ＣＦＵとして計算し、各処理における未処理細菌の増殖の％として報告する。接種後、５日間隔で全ての処理群において細菌増殖を測定した。結果を、各時間間隔において３回にわたって３つの部分の平均阻害領域±ＳＥＭとして表す。＊は、未処理の対照と有意に異なる結果を示している（ｐ＜０．０１）。
【００６０】
【図６】図６ａおよび図６ｂからなる図である。図６は、２４時間曝露後のＡｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａノープリウスに対するテルミナリアフェルジナンジアナ抽出物（２０００ｇ／ｍＬ）と二クロム酸カリウム（１０００ｇ／ｍＬ）および海水対照での致死率を示している。Ｍ＝メタノール抽出物、Ｗ＝水抽出物、Ｅ＝酢酸エチル抽出物、Ｃ＝クロロホルム抽出物、Ｈ＝ヘキサン抽出物、ＮＣ＝陰性（海水）対照、ＰＣ＝二クロム酸カリウム対照（１０００ｇ／ｍＬ）。結果を、平均死亡率（％）±ＳＥＭとして表される。
【００６１】
【図７】本発明の少なくとも１つの実施形態に関して（ａ）陽イオン逆相ＨＰＬＣモードおよび（ｂ）陰イオン逆相ＨＰＬＣモードでのＴ．フェルジナンジアナの葉のメタノール抽出物の２Ｌ注入における総化合物クロマトグラム（ＴＣＣ）の図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
Ｔ．フェルジナンジアナの葉を、脱水機で広範囲に脱水した。得られた乾燥した葉材料を−３０℃で保存した。
【００６３】
Ｔ．フェルジナンジアナの果実パルプを、脱水機で広範囲に脱水した。得られた乾燥した果実パルプを−３０℃で保存した。
【００６４】
乾燥した葉および果肉植物材料を、使用前に粗い粉末に粉砕した。質量１ｇの粉砕した果実および葉の粉末を、メタノール、脱イオン水、酢酸エチル、クロロホルムまたはヘキサンのいずれか５０ｍＬ中で、または４℃で２４時間穏やかに振とうして広範囲で抽出した。抽出物を濾紙で濾過し、室温で風乾した。水抽出物を濃縮器中で回転蒸発により凍結乾燥させた。得られたペレットを１０ｍＬの脱イオン水（０．５％ジメチルスルホキシドＤＭＳＯを含有する）に溶解し、続いて０．２２ｍの濾紙を通過させ、使用するまで４℃で保存した。
【００６５】
抗酸化能：各サンプルの抗酸化能を、修飾２，２−ジフェニル−１−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカル捕捉法を使用して評価した。アスコルビン酸（ウェルあたり０〜２５ｇ）を参照として使用し、５１５ｎｍで吸光度を測定し、記録した。全試験を各プレート上で対照とともに完了させ、全て３回にわたって実行した。
【００６６】
ＤＰＰＨフリーラジカル捕捉能力に基づく抗酸化能を、各抽出物について決定し、抽出された元の植物材料のグラムあたりのアスコルビン酸当量として表した。
【００６７】
抗菌スクリーニング：環境Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ菌株：Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ菌株２００、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｂａｌｔｉｃａ菌株ＯＳ１５５、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ菌株ＮＣＩＭＢ  ４００およびＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｌｏｉｈｉｃａ菌株ＰＶ−４を使用した。抗菌スクリーニングは、１ｇ／Ｌのペプトン、１．５ｇ／Ｌの酵母抽出物、７．５ｇ／ＬのＮａＣｌ、１ｇ／Ｌの過硫酸アンモニウム、２．４ｇ／ＬのＨＥＰＥＳバッファ（ｐＨ７．５）および１６ｇ／Ｌの細菌用寒天を含有する修飾ペプトン／酵母抽出物（ＰＹＥ）寒天を使用して達成した。
【００６８】
Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓおよびＳ．ｌｏｉｈｉｃａの培養物を３０℃で２４時間インキュベートした。Ｓ．ｂａｌｔｉｃａおよびＳ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａの培養液を１５℃で７２時間インキュベートした。全ての保存培養物を継代培養し、４℃のＰＹＥ培地で維持した。
【００６９】
抗菌活性の評価：Ｔ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物の抗菌活性スクリーニングは、改変ディスク拡散アッセイを使用して評価した。簡潔に言うと、１００Ｌの個々のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．を、およそ１０８細胞／ｍＬの菌数が達成されるまで、２０ｍＬの新鮮な栄養ブロスで個別に培養した。体積１００Ｌの各細菌懸濁液を栄養寒天プレートに広げ、５ｍｍの滅菌濾紙ディスクを使用して、抗菌活性について抽出物を試験した。ディスクに１０ＬのＴ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物を注入し、乾燥させて接種されたプレートに置いた。プレートをインキュベーション前に４℃で２時間静置した。
【００７０】
Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓまたはＳ．ｌｏｉｈｉｃａの培養物を接種したプレートを３０℃で２４時間インキュベートした。Ｓ．ｂａｌｔｉｃａまたはＳ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａの培養液を１５℃で７２時間インキュベートした。阻害領域の直径は、最も近いミリメートル数で測定した。各アッセイは、少なくとも３回行って完了した。本研究では、平均値（±ＳＥＭ）が報告されている。アンピシリンディスク（１０ｇ）が得られ、抗菌活性を比較するための陽性対照として使用した。１０Ｌの蒸留水を注入した濾紙ディスクを陰性対照として使用した。
【００７１】
最小阻害濃度（ＭＩＣ）の決定：各抽出物の最小阻害濃度を、２つの方法を使用して決定した。一般的に最も感度の高い細菌増殖阻害アッセイと考えられているため、液体希釈ＭＩＣアッセイを採用した。
【００７２】
さらには、マイクロプレート液体希釈ＭＩＣアッセイは、細菌増殖阻害効果を定量化するためにしばしば使用される方法であるため、本方法を使用することで比較が可能になる。固相寒天ディスク拡散アッセイは、固形魚保存システムに関連する環境および条件においてより近い表現をもたらすとみなされたため、このバイオアッセイも本研究で使用した。
【００７３】
マイクロプレート液体希釈ＭＩＣアッセイ：抽出物のＭＩＣを、標準的な方法で評価した。簡潔に言うと、一晩培養した細菌培養物を新鮮な栄養ブロスに滴下し、濁度を視覚的に調整して、マクファーランド番号１標準培養物を生成した。続けて、これを栄養ブロスで５０分の１に希釈し、ＭＩＣアッセイの接種培養物を得た。体積１００Ｌの滅菌ブロスを９６ウェルプレートの全ウェルに加えた。次に、試験抽出液または対照抗生物質（１００Ｌ）を各プレートの一番上の列に加え、各カラムの一番上のウェルから次のウェルに１００Ｌを移すなどによって、ウェルの各カラム内で２倍に連続希釈して調製した。
【００７４】
増殖対照（抽出物なし）および滅菌対照（接種なし）が各プレートに含まれていた。滅菌対照ウェルを除く全ウェルに、体積１００Ｌの細菌培養接種物を加えた。
【００７５】
Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓまたはＳ．ｌｏｉｈｉｃａの培養物を接種したプレートを３０℃で２４時間インキュベートした。Ｓ．ｂａｌｔｉｃａまたはＳ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａの培養液を接種したプレートを１５℃で７２時間インキュベートした。ｐ−ヨードニトロテトラゾリウムバイオレット（ＩＮＴ）が得られ、滅菌脱イオン水に溶解して０．２ｍｇ／ｍＬのＩＮＴ溶液を調製した。
【００７６】
体積４０Ｌのこの溶液を全ウェルに加え、プレートを３０℃でさらに６時間インキュベートした。インキュベーション後、発色が阻害される最低用量としてＭＩＣを視覚的に決定した。
【００７７】
ディスク拡散ＭＩＣアッセイ：抽出物の最小阻害濃度（ＭＩＣ）もディスク拡散アッセイにより評価した。簡潔に言えば、Ｔ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物を脱イオン水で希釈し、さまざまな濃度範囲にわたって試験した。ディスクに１０Ｌの抽出希釈液を含浸させ、乾燥させ、接種されたプレート上に置いた。上記で概説したように、アッセイを達成し、阻害領域と濃度とのグラフをプロットした。ＭＩＣ値の決定は、線形回帰を使用して達成した。
【００７８】
Ｔ．フェルジナンジアナ抽出物による魚の切り身における細菌増殖の阻害：ミナミクロダイの切り身の接種：新鮮な切り身のミナミクロダイ（Ａｃａｎｔｈｏｐａｇｒｕｓ  ｂｕｔｃｈｅｒｉ  Ｍｕｎｒｏ）を入手した。魚の切り身は全て４℃で新鮮に保存し、収穫と同じ日の午前１０時に購入した。縁部を無菌状態で切除し、各切り身から取り除いた。切り身の残りの部分を無菌状態で切除し、１ｃｍ四方の端面を有し、大気中の細菌汚染に曝露された２つの表面（各１ｃｍ３）を各々有する魚の切り身の立方体を作成した。立方体を５つのグループに分けた（ｎ＝４５）：
【００７９】
（１）１ＭのＮａＣＩ溶液に浸漬したもの（対照）、（２）２０００  ｇ／ｍＬのＴ．フェルジナンジアナの果実のメタノール抽出物を１ＭのＮａＣＩ溶液に浸漬したもの、（３）５００  ｇ／ｍＬのＴ．フェルジナンジアナの果実のメタノール抽出物を１ＭのＮａＣＩ溶液に浸漬したもの、（４）１ＭのＮａＣＩ溶液に２０００  ｇ／ｍＬのＴ．フェルジナンジアナの葉のメタノール抽出物を浸漬したもの、（５）１ＭのＮａＣＩ溶液に５００  ｇ／ｍＬのＴ．フェルジナンジアナの葉のメタノール抽出物を浸漬したもの。
【００８０】
全試験グループを、それぞれの処理液に６時間浸漬した。続けて、立方体を処理液から出し、無菌状態で排水させた。各グループの３つの部分をただちにサンプリングした（０日目）。各グループにおける残りの部分は、４℃の密閉滅菌容器に別々に保存した。増殖時間経過研究のため、接種後５、１０および１５日目に、各グループからさらに３つの部分をサンプリングした。
【００８１】
ミナミクロダイの切り身中のコロニー形成単位（ｃｆｕ）の決定：ミナミクロダイの切り身の細菌増殖時間に対するＴ．フェルジナンジアナの果実および葉のメタノール抽出物の影響を調べるために、処理後０、５、１０、および１５日において、各処理につき３回ずつ個別の部分をサンプリングした。オーバーヘッド浸漬ブレンダーを使用して各部分を個別に均質化し、ワットマンＮｏ．５４濾紙で４℃で濾過した。均質化後、１０−３〜１０−７の範囲にわたって、１ＭのＮａＣｌ溶液において各均質液から連続希釈で１０倍の希釈液を調製した。生菌数を数えるために、体積１００Ｌの各懸濁液を個々の栄養寒天プレートに広げた。プレートを３０℃で２４時間インキュベートし、直接コロニーを計数して細菌負荷（サンプルのコロニー／ｍＬ）を数え、各時点での未処理の対照コロニー数（グループ１）の±ＳＥＭ（％）として表した。
【００８２】
Ａｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａノープリウス毒性スクリーニング：修飾Ａｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａノープリウス致死率アッセイを使用して、毒性を評価した。簡潔に言うと、約５３（平均５２．７、ｎ＝１２５、ＳＤ１１．８）Ａ．ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａノープリウスを含有する４００Ｌの海水を４８ウェルプレートのウェルに加え、ただちにバイオアッセイに使用した。体積４００Ｌの参照毒素または希釈した植物抽出物をウェルに移し、人工光（１０００ルクス）の下で２５±１℃でインキュベートした。各プレートにおいて、４００Ｌの海水陰性対照を３回繰り返して実施した。一定間隔でウェルを評価し、死亡数を計数した。１０秒以内に付属器官の動きが観察されなかった場合、ノープリウスは死亡したとみなした。２４時間後、全ノープリウスを犠死させて計数し、ウェルあたりの総死亡率（％）を決定した。プロビット分析を使用して、各処理において９５％信頼限界でのＬＣ５０を計算した。
【００８３】
ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：Ｚｏｒｂａｘ  Ｅｃｌｉｐｓｅ  ｐｌｕｓ  Ｃ１８カラム（２．１×１００ｍｍ、粒径１．８ｍ）を設置したＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０  ＨＰＬＣシステムにサンプルを２Ｌ注入して、クロマトグラフィー分離を行った。移動相は、（Ａ）超純水および（Ｂ）流速０．７ｍＬ／分の９５：５アセトニトリル／水からなるものであった。両方の移動相を、陽性モードでの質量分析において０．１％（ｖ／ｖ）の氷酢酸、陰性モードでの分析において５ｍＭ酢酸アンモニウムで修飾した。研究に用いたクロマトグラフィー条件は、５％Ｂの均一濃度で最初の５分間分析を行い、５％から１００％までの（Ｂ）の勾配を５分から３０分まで適用し、その後１００％で３分間均一濃度で行った。
【００８４】
質量分析は、陽性モードと陰性モードの両方でエレクトロスプレーイオン化源を備えた四重極飛行時間型分光計で実行した。データは、定性分析ソフトウェアパッケージを使用して分析した。
【００８５】
ソフトウェアパッケージのＦｉｎｄ  ｂｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｅａｔｕｒｅアルゴリズムを使用して、各溶媒抽出システムを使用したブランクを分析し、１０，０００カウントを超える豊富な分子の化合物リストを作製した。次に、これを除外リストとして使用して、抽出物の分析から背景汚染化合物を除去した。次に、各抽出物をＦｉｎｄ  ｂｙ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｆｅａｔｕｒｅ機能を使用して、同じパラメータを使用して分析し、抽出物中の化合物の推定リストを作製した。次に、化合物リストを３つの正確な質量データベースに対してスクリーニングした；本研究のために特別に作製された治療上重要な既知の植物化合物のデータベース（８００化合物）；Ｍｅｔｌｉｎメタボロミクスデータベース（２４，７６８化合物）；およびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによる法医毒性学データべース（７，５０９化合物）。同定されていない化合物の実験式は、ソフトウェアパッケージのＦｉｎｄ  Ｆｏｒｍｕｌａ関数を使用して決定した。
【００８６】
統計分析：データは、少なくとも３つの独立した実験の平均値±ＳＥＭとして表される。一元配置分散分析を使用して、対照群と統計的に有意とみなされるＰ値＜０．０１を有する処理群との間の統計的有意性を計算した。
【００８７】
結果：液体抽出物収率および定性的な植物化学スクリーニング：さまざまな溶媒によるＴ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物（１ｇ）により、１８ｍｇ〜４８３ｍｇ（果実抽出物）および５８ｍｇ〜４７１ｍｇ（葉抽出物）の範囲の乾燥した植物抽出物を得た（表１）。
【００８８】
水およびメタノール抽出物は、低〜中程度の収率をもたらしたクロロホルム、酢酸エチル、およびヘキサンの抽出物に比べて抽出された材料の収率が著しく向上した。乾燥した抽出物を１０ｍＬの脱イオン水（１％ＤＭＳＯ含有）に再懸濁し、表１に示す濃度にした。
【００８９】
【表１】
2020510412.tif 000003
【００９０】
表１では、＋＋＋は大きな応答を示し、＋＋は中程度の応答を示し、＋は小さな応答を示し、−はアッセイで応答がないことを示す。
【００９１】
ＦＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実のメタノール抽出物；ＦＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実の水抽出物；ＦＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実の酢酸エチル抽出物；ＦＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ果実のクロロホルム抽出物；ＦＨ  Ｔ．フェルジナンジアナ果実のヘキサン抽出物。
【００９２】
ＬＭ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉のメタノール抽出物；ＬＷ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉の水抽出物；ＬＥ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉の酢酸エチル抽出物；ＬＣ＝Ｔ．フェルジナンジアナ葉のクロロホルム抽出物；ＬＨ  Ｔ．フェルジナンジアナ葉のヘキサン抽出物。
【００９３】
抗酸化能をＤＰＰＨ還元によって決定し、抽出された植物材料（果実または葉）のグラム（ｇ）あたりのアスコルビン酸当量（ミリグラム（ｍｇ））として表した。
【００９４】
抗ｘｏｄｉｄａｎｔの含有量：植物抽出物の抗酸化能（表１）は、抽出された乾燥植物材料（メタノール果実抽出物）のグラムあたり０．４ｍｇ（ヘキサン葉抽出物）〜最高６６０ｍｇのアスコルビン酸当量までの範囲であった。一般的に、水およびメタノール抽出物は、対応するクロロホルム、ヘキサンおよび酢酸エチル抽出物よりも高い抗酸化能を有していた。
【００９５】
Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．の増殖阻害：Ｔ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．を阻害する能力を決定するために、ディスク拡散アッセイを使用して１０Ｌの各抽出物をスクリーニングした。Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓの増殖は、Ｔ．フェルジナンジアナ果実のメタノール、水および酢酸エチル抽出物および葉の全ての抽出物によって阻害された（図１）。
【００９６】
クロロホルムおよびヘキサン果実抽出物のみが、Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓの増殖阻害活性を欠いていた。
【００９７】
メタノールおよび水葉抽出物は、Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓの特に強力な阻害剤であり、それぞれ実質的に１１ｍｍを超える阻害領域を有していた。これは、８．３±０．６ｍｍの阻害領域を有するアンピシリン対照（１０ｇ）と比較してより優れたものであった。Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓは微生物による魚の腐敗の主な原因物質であるため（中温条件と低温条件の両方で）、これらは特に注目に値する結果である。
【００９８】
メタノール、水および酢酸エチル果実抽出物、ならびにクロロホルムおよびヘキサン葉抽出物もＳ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓの増殖を阻害したが、それらは一般的に、対応するメタノール抽出物よりも効力が低かった。
【００９９】
高極性抽出物と比較して低極性抽出物の有効性が低いことは、最も強力なおよび／または最も豊富な増殖阻害化合物が極性であることを示している。
【０１００】
海産食品は一般に、低温条件で保存されるため、他の低温性および好冷性のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．は、低温において重要性が増加している。
【０１０１】
Ｓ．ｂａｌｔｉｃａの増殖の制御、および程度は低いがＳ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａの増殖の制御は、海産食品（例えば、魚）を低温で長期間保存し、Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓの寄与が減少する場合により重要になる。
【０１０２】
Ｓ．ｂａｌｔｉｃａの増殖は、Ｔ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物にも影響を受けやすかった（図２）。
【０１０３】
Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓの増殖阻害について指摘された傾向と一致して、Ｓ．ｂａｌｔｉｃａは、水抽出物および極性の低い抽出物よりもメタノール抽出物に対してより影響を受けやすいようであった。
【０１０４】
さらには、葉抽出物は、対応するＴ．フェルジナンジアナ果実抽出物よりも実質的により強力な増殖阻害剤であった。
【０１０５】
Ｓ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓの増殖阻害について上記で報告したように、メタノールおよび水葉抽出物は、Ｓ．ｂａｌｔｉｃａ増殖に対する特に強力な阻害剤であり、阻害領域はそれぞれ１４．６±０．３ｍｍおよび１２．７±０．６ｍｍであった。
【０１０６】
この細菌の増殖はアンピシリンの影響を受けないため、Ｓ．ｂａｌｔｉｃａの増殖の阻害は特に注目に値し、抗生物質耐性株であることを示している。
【０１０７】
メタノール果実抽出物は、Ｓ．ｂａｌｔｉｃａ増殖の優れた阻害剤でもあった（阻害領域＝９．８±０．４ｍｍ）。阻害活性を欠いた果実のクロロホルムおよびヘキサン抽出物を除いて、他の全ての抽出物は、Ｓ．ｂａｌｔｉｃａ増殖の中程度の阻害剤であった（阻害領域により決定）。
【０１０８】
Ｓ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａの増殖は、いくつかのＴ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物によっても阻害された（図３）。
【０１０９】
Ｓ．ｂａｌｔｉｃａおよびＳ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａの増殖の阻害について明らかなように、メタノール抽出物は一般的に、他の対応する溶媒抽出物よりも強力なＳ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａ増殖阻害剤であった。
【０１１０】
メタノール葉抽出物は特に強力で、１８．６±０．６ｍｍの阻害領域を有していた。
【０１１１】
特に、他の低温性細菌種（Ｓ．ｂａｌｔｉｃａ）に関しては、Ｓ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａの増殖も、アンピシリン曝露に耐性があった。
【０１１２】
水の葉抽出物も強力な増殖阻害剤であった（阻害領域＝９．８±０．４ｍｍ）。
【０１１３】
果実のメタノール抽出物、水抽出物、および酢酸エチル抽出物、ならびに葉の酢酸エチル抽出物も、より小さな阻害領域を有し、中程度の阻害活性を示すものではあるが、Ｓ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａの増殖を阻害した。
【０１１４】
全てのクロロホルムおよびヘキサン抽出物は、Ｓ．ｆｒｉｇｉｄｉｍａｒｉｎａの増殖阻害活性を完全に欠いていた。
【０１１５】
Ｓ．ｌｏｉｈｉｃａおよびＳ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓは、同様の遺伝子型と表現型の特徴を共有し、同様の最適な増殖条件を有している。
【０１１６】
したがって、Ｔ．フェルジナンジアナの果実および葉のＳ．ｌｏｉｈｉｃａを阻害する能力も試験した（図４）。他のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．とは対照的に、Ｓ．ｌｏｉｈｉｃａはアンピシリン対照（１９．６±１．３ｍｍの阻害領域）に対して特に影響を受けやすかった。Ｔ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物のほとんどに対して、実質的により小さな阻害領域が記録されたが、いくつかは強力なＳ．ｌｏｉｈｉｃａ増殖阻害を示した。実際、Ｓ．ｌｏｉｈｉｃａのメタノール果実および葉抽出物への曝露によって、１０ｍｍを超える阻害領域が生成された。他のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．の増殖阻害について明らかなように、メタノールによるＴ．フェルジナンジアナ果実抽出物は最も強力な増殖阻害剤であり（阻害直径により評価）、１５．３±１．２ｍｍの阻害領域が測定された。
【０１１７】
他方、メタノール果実抽出物については、１０．８±０．８ｍｍの阻害領域が測定された。果実の水、酢酸エチルおよびクロロホルム抽出物、ならびに葉のヘキサン抽出物もＳ．ｌｏｉｈｉｃａの増殖を阻害したが、実質的により小さな阻害領域が測定された。
【０１１８】
最小阻害濃度（ＭＩＣ）の定量化：Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．に対する各抽出物のＭＩＣ値（表２）を決定することにより、抗菌活性の相対レベルをさらに評価し、ディスク拡散スクリーニングアッセイでは影響を受けやすいことが示された。
【０１１９】
スクリーニングアッセイで見られたのと同様の傾向、すなわち、Ｔ．フェルジナンジアナの葉抽出物は、対応する果物抽出物よりも全てのＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．増殖において実質的に優れた阻害剤であることが認められた。
【０１２０】
さらには、メタノール抽出物は一般的に最も強力な増殖阻害剤であった。メタノール葉抽出物は、特に強力なＳ．ｐｕｔｒｅｆａｃｉｅｎｓ増殖阻害剤であり、ディスク拡散（ＤＤ）および液体希釈（ＬＤ）のＭＩＣ値はそれぞれ９３および７３  ｇ／ｍＬであった。これは、メタノール果実抽出物（ＤＤ  ＭＩＣ  １１６０  ｇ／ｍＬ；ＬＤ  ＭＩＣ  ９８０  ｇ／ｍＬ）よりも実質的に強力である。Ｔ．フェルジナンジアナメタノール葉抽出物は、Ｓ．ｂａｌｔｉｃａ（ＤＤ  ＭＩＣ  １０４  ｇ／ｍＬ；ＬＤ  ＭＩＣ  ８５  ｇ／ｍＬ）、Ｓ．ｆｈｄｉｄｉｍａｒｉｎａ（ＤＤ  ＭＩＣ  ４６６  ｇ／ｍＬ；ＬＤ  ＭＩＣ  ３９１  ｇ／ｍＬ）およびＳ．ｌｏｉｈｉｃａ増殖（ＤＤ  ＭＩＣ  ９５  ｇ／ｍＬ；ＬＤ  ＭＩＣ  ５５  ｇ／ｍＬ）の強力な阻害剤でもあった。水および酢酸エチルのＴ．フェルジナンジアナ葉抽出物も、多くの場合、対応する葉抽出物よりも１桁高いＭＩＣ値ではあるが、全てのＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．増殖に対して低いＭＩＣ値を有していた。さらに、メタノール抽出物が最も強力であった葉抽出物とは対照的に、酢酸エチル抽出物は一般的に、果実抽出物の中で最も強力であった。
【０１２１】
ミナミクロダイの切り身における細菌増殖の阻害：低温性および好冷性のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．は、冷蔵魚の腐敗の主な原因として一般的に認められているが、他の細菌種も腐敗の原因となるであろう。
【０１２２】
さらには、本発明者らの研究で使用されているＭＩＣアッセイ法は、抽出物がｉｎ  ｖｉｔｒｏでＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．の増殖を阻害する能力に関する重要な情報を提供するが、市販の冷蔵魚の細菌による腐敗を必ずしも正確に描写しているわけではない。したがって、Ｔ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物を、冷蔵条件下で魚の切り身の細菌の増殖を阻害する能力について試験した。
【０１２３】
メタノール抽出物は、一般的に最も効果的な増殖阻害剤であったため（表２）、魚の切り身の腐敗評価ではこれらの抽出物のみを試験した。本研究では、細菌種を区別せず、その代わりにコロニー形成単位（ｃｆｕ）として総生菌数を測定した。さらに、冷蔵は、新鮮な魚の最も一般的な保存方法であるため、本研究で使用した魚の切り身も評価期間中４℃で保存した。結果は、冷蔵のみでの改善の程度を決定するために、対照の魚の切り身（処理なし、４℃で保持）のｃｆｕ（％）として表す。
【０１２４】
メタノールによるＴ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物による全ての処理は、処理直後の切り身の生菌数を減少させるのに効果的であり、抽出物が０．５ｍｇ／ｍＬで殺菌性であることを示している。実際、処理された全グループのｃｆｕは、対照の切り身と比較して約９５％阻害された。
【０１２５】
０．５ｍｇ／ｍＬのメタノール果実抽出物を除き、全ての抽出物は、試験開始時と同様に１０日間の冷蔵後もほぼ有効であり、各々が対照の切り身と比較して、依然として約９５％細菌の増殖を阻害していた。０．５ｍｇ／ｍＬのメタノール果実抽出物は、１０日間の増殖後には効果的ではなかったが、対照の切り身と比較して、依然として約３５％細菌の増殖を阻害していた。
【０１２６】
１５日間の冷蔵後、果実抽出物（両方の濃度）および０．５ｍｇ／ｍＬの葉抽出物の処理は、試験の初期よりも効果が低く、細菌の増殖は対照の切り身のレベルの５０〜８５％まで増加した。
【０１２７】
これらの値は、細菌の増殖の著しい減少を表しており、抽出物の全てが少なくとも１５日間腐敗を著しく減少させることを示している。
【０１２８】
注目すべきことに、２ｍｇ／ｍＬのメタノール葉抽出物の処理は、１５日目の細菌増殖の阻害に依然として非常に効果的であった。実際、この処理における試験の１５日目では細菌の増殖が約９０％減少していた。つまりは、２ｍｇ／ｍＬのメタノールＴ．フェルジナンジアナ葉抽出物で処理すると、１５日間で細菌による腐敗が大幅に減少し、冷蔵魚の貯蔵寿命が延びる可能性を示している。
【０１２９】
図５は、メタノールによるＴ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物によるミナミクロダイの魚の切り身における細菌増殖の阻害における図を示している。
【０１３０】
図５において、総生存細菌の増殖を、１５日間にわたってｌｏｇ１０  ＣＦＵとして計算し、各処理における未処理細菌の増殖の％として報告している。
【０１３１】
接種後、５日間隔で全ての処理群において細菌増殖を測定した。結果は、各時間間隔において３回にわたって３つの部分の平均阻害領域±ＳＥＭとして表される。＊は、未処理の対照と有意に異なる結果を示している（ｐ＜０．０１）。
【０１３２】
図６に示すように、毒性の定量化を行った。全ての抽出物は、Ａｒｔｅｍｉａノープリウスアッセイで２０００ｇ／ｍＬで最初にスクリーニングした。
さらに、バイオアッセイでは、参照毒素として重クロム酸カリウム（ＰＣ）も試験した。
【０１３３】
参照毒素は、死亡の発生が急速であり、曝露の最初の３時間以内にノープリウス死を促進し、５時間以内に１００％の死亡率が明らかになった（未発表の結果）。全てのメタノールおよび水抽出物も、２４時間の曝露後に１００％の死亡率を誘導した。同様に、酢酸エチル葉抽出物も２４時間の曝露で１００％の死亡率を誘発した。他の全ての抽出物は５０％未満の死亡率を誘発したため、非毒性であるとみなされた。
【０１３４】
死亡の開始における毒素濃度の影響をさらに定量化するために、抽出物を人工海水で連続希釈して、Ａｒｔｅｍｉａノープリウスバイオアッセイの濃度範囲で試験した。Ａ．ｆｒａｎｃｉｓｃａｎａに対するＴ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物の２４時間ＬＣ５０値を表２に示す。試験した全ての濃度で５０％未満の死亡率が見られたため、任意のクロロホルムまたはヘキサン抽出物、および果実の酢酸エチル抽出物についてＬＣ５０は報告していない。他の全ての抽出物について、実質的に１０００ｇ／ｍＬを超えるＬＣ５０値が測定された。Ａｒｔｅｍｉａノープリウスに対して１０００ｇ／ｍＬを超えるＬＣ５０値を有する抽出物は、本アッセイでは非毒性であると定義されているため、Ｔ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物は全て非毒性であるとみなされた。
【０１３５】
全てのメタノールおよび水抽出物も、２４時間の曝露後に１００％の死亡率を誘導した。同様に、酢酸エチル抽出物も２４時間の曝露で１００％の死亡率を誘発した。他の全ての抽出物は５０％未満の死亡率を誘発したため、非毒性であるとみなされた。
【０１３６】
図７は、（ａ）陽イオン、および（ｂ）陰イオンＲＰ−ＨＰＬＣモードでのメタノールによるＴ．フェルジナンジアナの葉抽出物の２Ｌインジェクションにおける総化合物クロマトグラム（ＴＣＣ）の図を示している。理解を容易にするために、推定上同定された注目すべき化合物をクロマトグラムに示している。
【０１３７】
以下の表２は、Ｓ．ｐｕｔｒｅ  ｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ｂａｌｔｉｃａ、Ｓ．ｆｈｇｉｄｉｍａｈｎａおよびＳ．ｌｏｉｈｉｃａの増殖（ｇ／ｍＬ）に対するディスク拡散および液体希釈ＭＩＣの結果、およびＴ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物のＡｒｔｅｍｉａノープリウスバイオアッセイＬＣ５０値（ｇ／ｍＬ）を示している。
【０１３８】
【表２】
2020510412.tif 000004
【０１３９】
メタノール葉抽出物は、最大の抗菌効果を示した（ＭＩＣによる判定、表２）。
【０１４０】
最適化されたＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳパラメータが開発され、メタノール葉抽出物の特定の化合物クラスを検索し、個々の成分を特定するために使用した。
【０１４１】
陽イオンおよび陰イオンのクロマトグラムで得られた総化合物クロマトグラム（ＴＣＣ）をそれぞれ図６（図６ａおよび６ｂ）に示す。
【０１４２】
陰イオンクロマトグラムは、本モードでの参照イオンのイオン化により、陽イオンクロマトグラムよりもバックグラウンドの吸収レベルが著しく高くなり、目的のピークの信号がマスクされる可能性がある。
【０１４３】
陽イオンクロマトグラム（図６ａ）では、特に極性化合物の溶出に対応するクロマトグラムの初期および中期に多数のピークが存在することが明らかになった。ほぼ全てのメタノール抽出化合物が１５分で溶出した（約４０％のアセトニトリルに対応）。５％アセトニトリルで最初の１分間にいくつかの主要なピークが溶出した。同様に、陰イオンのメタノールＴ．フェルジナンジアナ葉抽出物ＴＣＣで検出されたピークの大部分は、１５分までに溶出していた。最大３０分の溶出時間（１００％アセトニトリル）においてもいくつかの顕著なピークが明らかになり、この抽出物には低極性化合物も存在することが示された。
【０１４４】
本研究で使用されたメタボロミクスフィンガープリント手法は、２つの特定の植物化学クラスを対象としている。タンニン含有量が高いことがＴｅｒｍｉｎａｌｉａ  ｓｐｐ．の特徴であり、Ｔ．フェルジナンジアナにおいてタンニン含有量が高いことが報告されている（Ｃｏｃｋ、２０１５年）。
【０１４５】
さらに、最近の研究では、Ｔ．フェルジナンジアナ葉において、多くのタンニン成分が特徴づけられており、それらはいくつかの病原菌の増殖の阻害と関連付けられた（Ｃｏｕｒｔｎｅｙら、２０１４年）。Ｍｅｔｌｉｎメタボロミクス、法医毒性学（Ａｇｉｌｅｎｔ）および植物化学（本実験室で開発）データベースとの比較により、メタノールによるＴ．フェルジナンジアナ葉抽出物で総計１０個のタンニンを推定上同定した。
【０１４６】
ケブル酸（＋イオン化モードで２．２％の総ピーク面積）、ケブラジン酸（−イオン化モードで１．７％の総ピーク面積）、コリラゲン（−イオン化モードで７．２％の総ピーク面積）、エラグ酸（−イオン化モードで１．０％の総ピーク面積）およびトリメチルエラグ酸エステル（＋イオン化モードで１．７％の総ピーク面積）、エキシフォン（＋イオン化モードで１．９％の総ピーク面積）およびプニカリン（−イオン化モードで２．４％の総ピーク面積）は、特に高い相対存在量で存在した（相対ピーク面積（％）で評価）。他の全てのタンニンは、より低い相対的存在量で存在していた。
【０１４７】
Ｔ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物を、いくつかの方法で腐敗しやすい食品の貯蔵寿命に良い影響を与える可能性があるため、腐敗性細菌の増殖を阻止する能力についてスクリーニングするために選択した。
【０１４８】
肉製品などの生鮮食品、例えば海産食品、魚、肉などの腐敗の大部分は、酸化的腐敗の結果である。
【０１４９】
腐敗しやすい食品を高含量で抗酸化物質を含有する製剤（例えば、いくつかの植物抽出物）で処理すると、脂質の酸化が減少するため、酸化による酸敗が阻害される。
【０１５０】
Ｔ．フェルジナンジアナの果実および葉抽出物は、個別または組み合わせて、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．増殖の強力な阻害剤であるため、天然の魚／海産食品の保存料としての可能性を有している。
【０１５１】
Ｔ．フェルジナンジアナの葉抽出物は、全ての低温性および中温性のＳｈｅｗａｎｅｌｌａ  ｓｐｐ．に対して特に効果的であったため、魚および冷蔵魚の両方の保存の可能性を有している。
【０１５２】
全ての試験されたＴ．フェルジナンジアナの葉抽出物は、Ａｒｔｅｍｉａ  ｆｒａｎｓｉｓｃａｎａ（塩水エビ）バイオアッセイにおいて非毒性であることがわかった。
【０１５３】
さらには、全てのＴ．フェルジナンジアナ抽出物はＡｒｔｅｍｉａノープリウスに対して非毒性であったため、天然の魚の保存剤として安全に使用できる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０１５４】
【特許文献１】欧州特許第１５８１５１３号明細書
【特許文献２】米国特許第７１７５８６２号明細書
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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