(57)【要約】【課題】本発明は、免疫活性物質を含む多重ドメインカプセル、前記多重ドメインカプセルの製造方法、及び前記多重ドメインカプセルを含む免疫調節組成物を提供する。【解決手段】本発明の一態様によれば、互いに接触し連結されている二つ以上のリポソーム、及び前記二つ以上のリポソームを囲む多重ドメインカプセル外壁を含む多重ドメインカプセルであって、前記多重ドメインカプセルは、有機相と水溶液相からなり、前記有機相は、第１免疫調節物質及び流動性オイルを含み、前記有機相は、前記リポソームのメンブレイン、及び前記多重ドメインカプセル外壁を形成し、前記水溶液相は、第２免疫調節物質を含み、前記水溶液相は、前記リポソームメンブレインの内部水溶液相及びリポソームメンブレインの外部水溶液相であり、前記第１免疫調節物質は、脂溶性免疫活性物質であり、前記第２免疫調節物質は、水溶性免疫活性物質であり、前記流動性オイルは、互いに接触し連結されている二つ以上のリポソームの構造安定性を向上させることを特徴とする、多重ドメインカプセルが提供される。【選択図】図１
2020510663.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに接触し連結されている二つ以上のリポソーム、及び前記二つ以上のリポソームを囲む多重ドメインカプセル外壁を含む多重ドメインカプセルであって、
前記多重ドメインカプセルは有機相と水溶液相からなり、
前記有機相は第１免疫調節物質及び流動性オイルを含み、前記有機相は前記リポソームのメンブレイン、及び前記多重ドメインカプセル外壁を形成し、
前記水溶液相は第２免疫調節物質を含み、前記水溶液相は前記リポソームメンブレインの内部水溶液相及びリポソームメンブレインの外部水溶液相であり、
前記第１免疫調節物質は脂溶性免疫活性物質であり、前記第２免疫調節物質は水溶性免疫活性物質であり、
前記流動性オイルは互いに接触し連結されている二つ以上のリポソームの構造安定性を向上させることを特徴とする、多重ドメインカプセル。
【請求項２】
前記多重ドメインカプセルのサイズは、１μｍ乃至１００μｍである、請求項１に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項３】
前記流動性オイルは、動物性オイル、植物性オイル、トコフェロール、ミネラルオイル、キャスターオイル、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれたものを含む、請求項１に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項４】
前記動物性オイルは、スクアレンであり、前記植物性オイルは、オレイン酸である、請求項３に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項５】
前記脂溶性及び水溶性免疫活性物質は、抗原提示細胞、Ｂ細胞、又はＴ細胞の活性化を誘導する物質を含む、請求項１に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項６】
前記脂溶性免疫活性物質は、カチオン性脂質、ＭＰＬＡ、ＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７、ＰＨＡＤ、３Ｄ−ＰＨＡＤ、ＧＬＡ、脂質ペプチド、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｌｉｐ、イミキモド（ｂａｓｅ  ｆｏｒｍ）、レシキモド（ｂａｓｅ  ｆｏｒｍ）、ＶＴＸ−２３３７、ＣＲＸ６４２、サポニン（ＱＳ２１）、ＴＤＢ、ＣＬ４０１、ＣＬ４２９、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含む、請求項１に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項７】
前記水溶性免疫活性物質は、ＣｐＧ、イミキモド（ＨＣｌ  ｆｏｒｍ）、レシキモド（ＨＣｌ  ｆｏｒｍ）、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＳＴＩＮＧ、フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）、サポニン、ＫＬＫペプチド、ＮＯＤアゴニストペプチド、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含む、請求項１に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項８】
前記カチオン性脂質は、ＤＣ−コレステロール、ＤＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＥＰＣ、ＭＶＬ５、ＤＯＤＡＰ、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含む、請求項６に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載の多重ドメインカプセル及び抗原を含む、免疫調節物質。
【請求項１０】
前記抗原は、タンパク質、遺伝子、細胞、ウイルス、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれるものである、請求項９に記載の免疫調節物質。
【請求項１１】
第１免疫調節物質及び流動性オイルを溶媒に溶解して、オイル相溶液を製造する段階；
第２免疫調節物質を含む第１水溶液相を前記オイル相溶液に分散させて、油中−水（Ｗ／Ｏ）エマルジョンを製造する段階；及び
前記油中−水エマルジョンを第２水溶液と混合し、前記溶媒を蒸発させる段階；を含み、
前記第１免疫調節物質は、脂溶性免疫活性物質であり、前記第２免疫調節物質は、水溶性免疫活性物質であることを特徴とする、多重ドメインカプセルの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫活性物質を含む多重ドメインカプセル、前記多重ドメインカプセルの製造方法、及び前記多重ドメインカプセルを含む免疫調節組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、多様な薬物が封入されたリポソーム素材が使用されている。しかしながら、このような単一リポソーム（ｓｉｎｇｌｅ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）素材を利用した技術では、低いローディング効率と生体内での不安定性が大きい短所として指摘されている。
最近、免疫細胞を活性化するために、免疫活性化物質が搭載された多様なリポソーム及びエマルジョン素材（例えば、ＧＳＫ社のＡＳＯ１、ＡＳＯ２、ＡＳ１５及びノバルティス社のＭＦ５９）が、多様な感染性疾患及び癌を予防したり治療するための免疫活性化物質として使用されている。前記単一リポソーム基盤素材は、感染性疾患予防ワクチン組成物であって、現在臨床試験段階にあるが、抗原及び免疫活性化物質の低い持続時間に起因して、生体内免疫細胞を効果的に活性化させるためには、このような物質を一定の期間をもって２〜３回ずつ追加に注入しなければならないという短所があった。
【０００３】
このような短所を克服するために、最近、ＭＩＴのＩｒｖｉｖｅ  Ｄａｒｒｅｌグループでは、多層ラメラリポソーム（ｍｕｌｔｉｌａｍｅｌｌａｒ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）構造を有する免疫活性化癌ワクチンを開発した（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、１０、２４３−２５１、２０１１）。前記癌ワクチンは、多層ラメラ構造を有するリポソーム内部に抗原及び免疫活性化物質をローディングした後に、各脂質層を多価性金属イオン又は化学的リンカーを利用して架橋（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ）構造を形成させることによって、単一リポソーム素材が有していた根本的な短所である低い封入効率と安定性の問題を解決しようとする試みであった。
しかしながら、多層ラメラ構造を有するリポソームの形態が非常に不均一であり、特定構造を有する多層ラメラ構造を製造するための製造過程が任意的であるので、製造時ごとに均一な特性を有するワクチン組成物を得ることができないという短所があり、化学的架橋結合を利用するので、人体に毒性を引き起こすことができるという限界があった。
【０００４】
また、これと類似した形態として、従来、多重リポソーム（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ）と呼ぶ薬物伝達体が米国カリフォルニア大学のキム・シンイル研究チーム［Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １９８３  Ｍａｒ．９  ７２８（３）３３９−３４８］、２００２年Ｍａｎｔｒｉｐｒａｇａｄａの研究チーム［Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４１（２００２）３９２−４０６］、２００７年Ｗａｆａの研究チーム［Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ３３１（２００７）１８２−１８５］などで発表されたことがある。このような多重リポソームは、中性脂質とコレステロール及びトリオレイン（ｔｒｉｏｌｅｉｎ）よりなる群から選ばれた物質の混合物からなる。
従来の多重リポソームにおいて微小小胞体（ｖｅｓｉｃｌｅ）が一つの固まりのマイクロクラスタを維持する原理は、個々の小胞体の脂質膜の間でトリオレイン物質が接触する脂質膜の急激なカーブ変化でも二重膜が破壊されずに散らないように固定するためであった。このような多重リポソームは、現在痛み調節剤（ｐａｉｎ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）であるブピバカイン（ｂｕｐｉｖａｃａｉｎｅ）がローディングされた薬品として開発されて、ＥＸＰＡＲＥＬ（登録商標）という商品名で市販中にある。
【０００５】
しかしながら、このように製造された多重リポソームは、トリオレインによる構造安定化効率が非常に低いため、準備過程中に（例えば、遠心分離及び温度変化など）にマイクロクラスタが崩壊されて、サイズや形態が不均一になる問題点がある。また、現在まで免疫活性化薬物が導入された多重リポソーム形態は発見されないものと調査された。一方、このような免疫活性化（ｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）技術と共に、免疫機能の調節において重要なものが、体内の免疫抑制（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ）を調節できる技術の開発である。特に、現在抗癌免疫治療の低い治療効率と副作用を解決するためには、癌微小環境での免疫抑制現象を克服できる技術の開発が非常に急を要するのが現状である。
【０００６】
体内の免疫システムを利用して癌を治療する抗癌免疫治療方法は、既存の化学的療法や放射線治療方法に比べて副作用を最小化することができるという長所がある。このような抗癌免疫治療技法のうち治療用免疫細胞であるＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔを含む）、樹状細胞（Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ）、ナチュラルキラー細胞（Ｎａｔｕｒａｌ  Ｋｉｌｌｅｒ  Ｃｅｌｌｓ）等を体外で活性化させた後に体内に直接注入する細胞治療剤方法と、癌抗原と免疫活性化物質を体内に注入することによって、体内に存在する免疫細胞を直接的に活性化することによって抗癌効能を高める抗癌ワクチンに対する方法などが活発に進行されている。しかしながら、このような細胞治療剤や抗癌ワクチンは、主に血液癌関連病気に主に使用されており、固形癌では、大部分その治療効能が非常に低いという短所を有している。
【０００７】
このような理由のうち一つは、固形癌の周囲で免疫機能を抑制する微小環境要因に起因する。実際に、腫瘍微小環境で免疫細胞の機能を低下させる細胞（ＭＤＳＣ：ｍｙｅｏｌｏｉｄ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ、Ｔｒｅｇ：ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ、ＴＡＭ：ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃａｉｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ）や免疫抑制誘発サイトカイン、メタボロームなどが活発に作用することによって、免疫活性化物質と治療用免疫細胞の活性を急激に低下させる。したがって、固形癌の治療効率を上げるためには、固形癌微小環境で免疫抑制因子を制御できる新しい治療プラットホーム技術の開発が非常に急を要する。
【０００８】
最近、腫瘍微小環境内の多様な免疫抑制因子を制御できる薬物の開発に対する研究が全世界的に活発に進行されている。しかしながら、このような薬物は、体内に注入時に生体内の多様な生理的環境及び酵素により容易に分解されたり、腫瘍部位でない他の組織に伝達されて所望しない多様な副作用を招く短所を有している。
【０００９】
このような短所を克服するために、実際臨床分野では、高用量（ｈｉｇｈ−ｄｏｓｅ）の薬物を繰り返して投与することによって、免疫治療効果を増進させようとする試みが進行されているが、多様な薬物毒性及び副作用に起因して、治療効果を減少させる結果を招いている。
【００１０】
したがって、固形癌微小環境で、免疫治療剤の治療機能を阻害する免疫抑制環境因子を制御できる薬物を固形癌の周囲で徐放型に放出することによって、免疫抑制因子を効果的にターゲットし、薬物による副作用を最小化できる抗癌免疫治療剤及びこれを利用した抗癌免疫治療の治療効果向上技術の開発が非常に急を要するのが現況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、免疫活性物質を含む多重ドメインカプセル、前記多重ドメインカプセルの製造方法、及び前記多重ドメインカプセルを含む免疫調節組成物を提供することにある。
【００１２】
しかしながら、本願が解決しようとする課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明の一態様によれば、互いに接触し連結されている二つ以上のリポソーム、及び前記二つ以上のリポソームを囲む多重ドメインカプセル外壁を含む多重ドメインカプセルであって、前記多重ドメインカプセルは有機相と水溶液相からなり、前記有機相は、第１免疫調節物質及び流動性オイルを含み、前記有機相は前記リポソームのメンブレイン、及び前記多重ドメインカプセル外壁を形成し、前記水溶液相は第２免疫調節物質を含み、前記水溶液相は前記リポソームメンブレインの内部水溶液相及びリポソームメンブレインの外部水溶液相であり、前記第１免疫調節物質は脂溶性免疫活性物質であり、前記第２免疫調節物質は水溶性免疫活性物質であり、前記流動性オイルは互いに接触し連結されている二つ以上のリポソームの構造安定性を向上させることを特徴とする、多重ドメインカプセルを提供することができる。
【００１４】
本発明の他の態様によれば、前記多重ドメインカプセル及び抗原を含む、免疫調節物質を提供することができる。
本発明のさらに他の態様によれば、第１免疫調節物質及び流動性オイルを溶媒に溶解して、オイル相溶液を製造する段階；第２免疫調節物質を含む第１水溶液相を前記オイル相溶液に分散させて、油中−水（Ｗ／Ｏ）エマルジョンを製造する段階；及び前記油中−水エマルジョンを第２水溶液と混合し、前記溶媒を蒸発させる段階；を含み、前記第１免疫調節物質は脂溶性免疫活性物質であり、前記第２免疫調節物質は水溶性免疫活性物質であることを特徴とする、多重ドメインカプセルの製造方法を提供することができる。
【発明の効果】
【００１５】
本発明は、免疫調節物質を基本成分として複数のリポソームがそれぞれのドメインを形成しつつ互いに連結され、導入された流動性オイル成分により連結された複数のリポソームの構造的安定性が向上したマイクロサイズのカプセル形態を有する免疫調節多重ドメインカプセルを提供することができる。
【００１６】
また、本発明による免疫調節組成物は、多様な薬学的組成物として使用されている単一リポソーム素材の低い封入効率及び短い有効持続時間の短所を克服し、免疫調節効果の有効持続時間を増やすことができるという長所を有する。
【００１７】
そして、本発明による多重ドメインカプセルの製造方法は、従来多重リポソームの構造的安定性を維持するために導入されたトリオレインの代わりに、スクアレンのような流動性オイルを導入することによって、多重ドメインカプセルの製造過程での安定性及び貯蔵安定性を向上させることができ、前記流動性オイルの導入によって、一般的な有機溶媒に溶けない代表的な難溶性免疫調節物質を容易に可溶化することができ、これにより、前記多様な難溶性免疫調節物質を含む多重ドメインカプセルを製造することができるという長所がある。
【００１８】
また、本発明による多重ドメインカプセルは、多重ドメインカプセルの表面電荷を調整することによって、反対の電荷特性を有する抗原及び免疫調節物質の封入効率及び有効持続時間を増加させることができ、カチオン性脂質を含んで多重ドメインカプセルを構成することによって、アニオン性及び／又は負電荷を呈する多様な免疫調節物質及びＤＮＡ、ＲＮＡのようなバイオ素材が多重ドメインカプセルに効果的にローディングされ得る。
【００１９】
そして、多重ドメインカプセルの外壁から内側メンブレインに徐々に崩壊が起こることによって、多重ドメインカプセルの外壁及び内部にローディングされた抗原及び／又は免疫調節物質が放出されるので、抗原及び免疫調節物質の有効持続時間が増加することができるという長所を有する。
【００２０】
一方、本発明による多重ドメインカプセルは、リポソームのメンブレイン及び／又は前記多重ドメインカプセルの外壁に親油性性質を有する多様な免疫調節物質をローディングすることによって、免疫調節物質の有効持続時間を増加させることができ、リポソームの内部に親水性性質を有する多様な免疫調節物質をローディングすることによって、免疫調節物質の有効持続時間を増加させることができ、リポソームの内部に親水性性質を有する多様な免疫調節物質、リポソームのメンブレイン及び／又は前記カプセルの外壁に親油性免疫調節化物質を同時にローディングすることによって、免疫調節物質の有効持続時間を増加させることができる。
【００２１】
なお、本発明による多重ドメインカプセルは、界面活性剤が多重ドメインカプセルの外部にコーティングされて多重ドメインカプセルが水溶液内に安定的に分散され得るようにすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、本発明の一具現例において、免疫機能調節多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ）の構造を示す模式図である。
【図２】図２の（ａ）乃至（ｄ）は、本発明の一実施例において、スクアレンを含む多重ドメインカプセルの光学顕微鏡イメージ（ａ）及びサイズ分布を示すグラフ（ｃ）、及びスクアレンを含まない多重ドメインカプセルの光学顕微鏡イメージ（ｂ）及びサイズ分布を示すグラフ（ｄ）である（スケールバー：２０μｍ）。
【図３】図３の（ａ）乃至（ｃ）は、本発明の一実施例において、スクアレンを含む多重ドメインカプセルの光学顕微鏡イメージであり、（ｄ）乃至（ｆ）は、本発明の一実施例において、スクアレンを含まない多重ドメインカプセルの光学顕微鏡イメージである（スケールバー：４μｍ）。
【図４】図４の（ａ）乃至（ｄ）は、本発明の一実施例において、多重ドメインカプセルの安定性の分析結果であって、スクアレンを含む多重ドメインカプセルの遠心分離前（ａ）及び遠心分離後（ｃ）の顕微鏡イメージ、及びスクアレンを含まない多重ドメインカプセルの遠心分離前（ｂ）及び遠心分離後（ｄ）の顕微鏡イメージである。
【図５】図５は、本発明の一実施例において、スクアレン基盤のＭＰＬＡを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ（ＭＰＬＡ））の光学顕微鏡イメージである。
【図６】図６は、本発明の一実施例において、ｉｍＭＤＶ（ＳＱ）をＢＭＤＣに処理したときに分泌されるサイトカインの発現量を示す（ａ：ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ｂ：ＩＬ−６）。
【図７】図７は、本発明の一実施例において、ｉｍＭＤＶ（ＭＰＬＡ）をＢＭＤＣに処理したときに分泌されるサイトカインの発現量を示す（ａ：ＴＮＦ−ａｌｐｈａ、ｂ：ＩＬ−６、ｃ：ＩＬ−１２ｐ７０）。
【図８】図８は、本発明の一実施例において、タンパク質抗原（ＯＶＡ、ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）がローディングされた多重ドメインカプセルにおいてスクアレン包含有無によるＯＶＡの放出挙動を示すグラフである。
【図９】図９は、本発明の一実施例において、免疫活性化物質であるイミキモド（ａｃｉｄ及びｂａｓｅ構造）がローディングされた免疫機能調節用多重ドメインカプセルを示すものである（ａ：ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）ｓａｍｐｌｅ、ｂ：ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ｂａｓｅ）ｓａｍｐｌｅ、ｃ：ｉｍＭＤＶ［Ｒ８３７−ＨＣｌ：Ｒ８３７−ｂａｓｅ（１：１）ｓａｍｐｌｅ］。
【図１０】図１０は、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた免疫調節用多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）において時間によるＲ８３７の放出挙動を示すものである。
【図１１】図１１は、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ））をＢＭＤＣに濃度が相異に処理したときに分泌されるＩＬ−６サイトカインの発現量を示す。
【図１２ａ】図１２ａは、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセルに対して、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ、１  ｗｅｅｋ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を示すグラフである（ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）サンプル／１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ＯＶＡ＋ｉｍＭＤＶ  ｓａｍｐｌｅ）。
【図１２ｂ】図１２ｂは、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセルに対して、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ、１  ｗｅｅｋ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を示すグラフである（ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ｂａｓｅ）サンプル／１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ＯＶＡ＋ｉｍＭＤＶ  ｓａｍｐｌｅ）。
【図１２ｃ】図１２ｃは、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセルに対して、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ、１  ｗｅｅｋ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を示すグラフである（ｉｍＭＤＶ［Ｒ８３７−ＨＣｌ：Ｒ８３７−ｂａｓｅ（１：１）／１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ＯＶＡ＋ｉｍＭＤＶ  ｓａｍｐｌｅ）。
【図１３ａ】図１３ａは、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセルに対して、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ、３  ｗｅｅｋ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を示すグラフである（ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）サンプル／１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ＯＶＡ＋ｉｍＭＤＶ  ｓａｍｐｌｅ）。
【図１３ｂ】図１３ｂは、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセルに対して、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ、３  ｗｅｅｋ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を示すグラフである（ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ｂａｓｅ）サンプル／１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ＯＶＡ＋ｉｍＭＤＶ  ｓａｍｐｌｅ）。
【図１３ｃ】図１３ｃは、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセルに対して、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ、３  ｗｅｅｋ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を示すグラフである（ｉｍＭＤＶ［Ｒ８３７−ＨＣｌ：Ｒ８３７−ｂａｓｅ（１：１）サンプル／１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ＯＶＡ＋ｉｍＭＤＶ  ｓａｍｐｌｅ）。
【図１４ａ】図１４ａは、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセルに対して、ＯＶＡ癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ、５  ｗｅｅｋ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を示すグラフである（ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）サンプル、１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ＯＶＡ＋ｉｍＭＤＶ）。
【図１４ｂ】図１４ｂは、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセルに対して、ＯＶＡ癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ、５  ｗｅｅｋ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を示すグラフである（ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ｂａｓｅ）サンプル、１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ＯＶＡ＋ｉｍＭＤＶ）。
【図１４ｃ】図１４ｃは、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセルに対して、ＯＶＡ癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ、５  ｗｅｅｋ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を示すグラフである（ｉｍＭＤＶ［Ｒ８３７−ＨＣｌ：Ｒ８３７−ｂａｓｅ（１：１）サンプル、１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ＯＶＡ＋ｉｍＭＤＶ）。
【図１５ａ】図１５ａは、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセルに対して、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ、１  ｗｅｅｋ  ａｆｔｅｒ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ５  ｗｅｅｋｓ  ｍｉｃｅ）を示すグラフである（ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）サンプル／１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ＯＶＡ＋ｉｍＭＤＶ  ｓａｍｐｌｅ）。
【図１５ｂ】図１５ｂは、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセルに対して、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ、１  ｗｅｅｋ  ａｆｔｅｒ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ５  ｗｅｅｋｓ  ｍｉｃｅ）を示すグラフである（ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ｂａｓｅ）サンプル／１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ＯＶＡ＋ｉｍＭＤＶ  ｓａｍｐｌｅ）。
【図１５ｃ】図１５ｃは、本発明の一実施例において、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセルに対して、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ、１  ｗｅｅｋ  ａｆｔｅｒ  ｂｏｏｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ５  ｗｅｅｋｓ  ｍｉｃｅ）を示すグラフである（ｉｍＭＤＶ［Ｒ８３７−ＨＣｌ：Ｒ８３７−ｂａｓｅ（１：１）サンプル／１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ＯＶＡ＋ｉｍＭＤＶ  ｓａｍｐｌｅ）。
【図１６】図１６は、本発明の一実施例において、ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）＋ＯＶＡ  ｓａｍｐｌｅをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後に、５週目にｂｏｏｓｔｉｎｇをしたマウスとｂｏｏｓｔｉｎｇをしないマウスにおいてＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ）を示すグラフである（１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）＋ＯＶＡ）。
【図１７】図１７は、本発明の一実施例において、ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ｂａｓｅ）＋ＯＶＡ  ｓａｍｐｌｅをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後に、５週目にｂｏｏｓｔｉｎｇをしたマウスとｂｏｏｓｔｉｎｇをしないマウスにおいてＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ）を示すグラフである（１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ｂａｓｅ）＋ＯＶＡ）。
【図１８】図１８は、本発明の一実施例において、ｉｍＭＤＶ［Ｒ８３７−ＨＣｌ：Ｒ８３７−ｂａｓｅ（１：１）ｓａｍｐｌｅ］＋ＯＶＡ  ｓａｍｐｌｅをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後に、５週目にｂｏｏｓｔｉｎｇをしたマウスとｂｏｏｓｔｉｎｇをしないマウスにおいてＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ）を示すグラフである（１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ｉｍＭＤＶ［Ｒ８３７−ＨＣｌ：Ｒ８３７−ｂａｓｅ（１：１）ｓａｍｐｌｅ］。
【図１９】図１９は、本発明の一実施例において、ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）＋ＯＶＡ  ｓａｍｐｌｅをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎし、５週目にｂｏｏｓｔｉｎｇをした。Ｂｏｏｓｔｉｎｇ後、１、２、６週目に持続的に示すＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ）を示すグラフである（１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）＋ＯＶＡ  ｓａｍｐｌｅ）。
【図２０】図２０は、本発明の一実施例において、ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ｂａｓｅ）＋ＯＶＡ  ｓａｍｐｌｅをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎし、５週目にｂｏｏｓｔｉｎｇをした。Ｂｏｏｓｔｉｎｇ後、１、２、６週目に持続的に示すＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ）を示すグラフである（１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ｂａｓｅ）＋ＯＶＡ  ｓａｍｐｌｅ）。
【図２１】図２１は、本発明の一実施例において、ｉｍＭＤＶ［Ｒ８３７−ＨＣｌ：Ｒ８３７−ｂａｓｅ（１：１）ｓａｍｐｌｅ］＋ＯＶＡ  ｓａｍｐｌｅをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎし、５週目にｂｏｏｓｔｉｎｇをした。Ｂｏｏｓｔｉｎｇ後、１、２、６週目に持続的に示すＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ）を示すグラフである（１：ＰＢＳ、２：ＯＶＡ、３：ＯＶＡ＋Ｒ８３７−ＨＣｌ、４：ｉｍＭＤＶ［Ｒ８３７−ＨＣｌ：Ｒ８３７−ｂａｓｅ（１：１）ｓａｍｐｌｅ）。
【図２２】図２２は、本発明の一実施例において、ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）＋ＯＶＡ  ｓａｍｐｌｅをｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎし、１乃至４週目に示すＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ）をオイル形態のアジュバント（ＤＭＳＯ（Ｒ８３７）＋ＯＶＡ）と比較したデータである（１：ＯＶＡ、２：ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）＋ＯＶＡ、３：ＤＭＳＯ（Ｒ８３７）＋ＯＶＡ、４：ＤＭＳＯ）。
【図２３】図２３は、本発明の一実施例において、二つのワクチン［ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）＋ＯＶＡとＤＭＳＯ（Ｒ８３７）＋ＯＶＡ］をマウスにｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎした後に、現れる炎症反応効果を比較したものである。
【図２４】図２４は、本発明の一実施例において、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）ウイルス抗原に対する免疫調節物質の体液性免疫効果（筋肉注射２週後）を示すグラフである。
【図２５】図２５は、本発明の一実施例において、ＨＡ（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）ウイルス抗原に対する免疫調節物質の体液性免疫効果（筋肉注射４週後）を示すグラフである。
【図２６】図２６は、本発明の一実施例において、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する免疫調節物質の体液性免疫効果を示すグラフである。
【図２７】図２７は、本発明の一実施例において、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）癌抗原に対する免疫調節物質の細胞性免疫誘導効果を示すグラフである。
【図２８】図２８は、本発明の一実施例において、多重ドメインカプセルｉｍＭＤＶ（ＳＱ−Ｇｅｍ）、ｉｍＭＤＶ（ＯＡ−Ｇｅｍ）、及びｉｍＭＤＶ（Ｇｅｍ）試料の光学顕微鏡イメージを示すものである。
【図２９】図２９は、本発明の一実施例において、スクアレンを含む多重ドメインカプセルではローディングされたゲムシタビンが徐々に放出される反面、スクアレンを含まない多重ドメインカプセルでは２４時間内にローディングされた大部分の薬物が放出されることを確認したグラフである。
【図３０】図３０は、本発明の一実施例において、スクアレンのような動物性オイルの代わりにオレイン酸植物性オイルを使用した場合、ローディングされたゲムシタビンの徐放型放出挙動が２４〜７２時間の間にプラトー（ｐｌａｔｅａｕ）形状を示し、７２時間以後に線形（ｌｉｎｅａｒ）挙動を示すことを確認したグラフである。
【図３１】図３１は、本発明の実施例４−２において、ｉｍＭＤＶ（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）及びその薬物放出挙動を示すグラフである。
【図３２】図３２は、本発明の実施例４−２において、ｉｍＭＤＶ（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）を示すものである。
【図３３】図３３は、本発明の実施例４−２において、ｉｍＭＤＶ（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）を示すものである。
【図３４】図３４は、本発明の実施例４−２において、ｉｍＭＤＶ（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）を示すものである。
【図３５】図３５は、本発明の実施例４−３において、ｉｍＭＤＶ（ＭＫ−２２０６）を示すものである。
【図３６】図３６は、本発明の実施例４−４において、ｉｍＭＤＶ（ＰＦ−０４６９１５０２）を示すものである。
【図３７】図３７は、本発明の実施例４−５において、ｉｍＭＤＶ（Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）を示すものである。
【図３８】図３８は、本発明の実施例４−５において、ｉｍＭＤＶ（Ｒｅｓｍｏｎｏｓｔａｔ）、及びその薬物放出挙動を示すグラフである。
【図３９】図３９は、本発明の実施例４−５において、ｉｍＭＤＶ（Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）、及びその薬物放出挙動を示すグラフである。
【図４０】図４０は、本発明の実施例４−５において、ｉｍＭＤＶ（ＯＴＸ０１５（ｉＢＥＴ））を示すものである。
【図４１】図４１は、本発明の実施例４−６において、ｉｍＭＤＶ（ＢＬＺ９４５）を示すものである。
【図４２】図４２は、本発明の実施例４−７において、ｉｍＭＤＶ（Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ）を示すものである。
【図４３】図４３は、本発明の実施例５において、ｉｍＭＤＶ（ＧＥＭ／Ｒ８３７）を示すものである。
【図４４】図４４は、本発明の実施例５において、ｉｍＭＤＶ（ＢＬＺ９４５／Ｒ８３７）を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
以下、添付の図面を参照して本願の属する技術分野における通常の知識を有する者が容易に実施できるように本発明の実施例を詳細に説明する。しかしながら、本発明は、いろいろな異なる形態で具現され得、ここで説明する実施例に限定されない。そして、図面において本願を明確に説明するために説明と関係ない部分は省略し、明細書全体において、類似した部分に対しては、類似した参照符号を付けた。
【００２４】
本願明細書の全体において、任意の部分が他の部分と「連結」されているというとき、これは、「直接的に連結」されている場合だけでなく、その中間に他の素子を間に置いて「電気的に連結」されている場合も含む。
本願明細書の全体において、任意の部材が他の部材「上に」位置しているというとき、これは、任意の部材が他の部材に接している場合だけでなく、二つの部材の間にさらに他の部材が存在する場合も含む。
【００２５】
本願明細書の全体において、任意の部分が或る構成要素を「含む」というとき、これは、特に反対される記載がない限り、他の構成要素を除くものではなく、他の構成要素をさらに含むことができることを意味する。本願明細書の全体において使用される程度の用語「約」、「実質的に」などは、言及された意味に固有な製造及び物質許容誤差が提示されるとき、その数値で又はその数値に近接した意味として使用され、本発明の理解を助けるために、正確であるか又は絶対的な数値が言及された開示内容を非良心的な侵害者が不当に利用するのを防止するために使用される。本願明細書の全体において使用される用語「〜（する）段階」又は「〜の段階」は、「〜のための段階」を意味しない。
【００２６】
本願明細書の全体において、マーカッシュ形式の表現に含まれた「これらの組合せ」の用語は、マーカッシュ形式の表現に記載された構成要素よりなる群から選ばれる一つ以上の混合又は組合せを意味するものであって、前記構成要素よりなる群から選ばれる一つ以上を含むことを意味する。
【００２７】
本願明細書の全体において、「Ａ及び／又はＢ」の記載は、「Ａ又はＢ、又はＡ及びＢ」を意味する。
【００２８】
以下、添付の図面を参照して本発明の具現例及び実施例を詳細に説明する。しかしながら、本願がこのような具現例及び実施例と図面に制限されるものではない。
【００２９】
本発明の一態様によれば、互いに接触し連結されている二つ以上のリポソーム、及び前記二つ以上のリポソームを囲む多重ドメインカプセル外壁を含む多重ドメインカプセルであって、前記多重ドメインカプセルは有機相と水溶液相からなり、前記有機相は第１免疫調節物質及び流動性オイルを含み、前記有機相は前記リポソームのメンブレイン、及び前記多重ドメインカプセル外壁を形成し、前記水溶液相は第２免疫調節物質を含み、前記水溶液相は前記リポソームメンブレインの内部水溶液相及びリポソームメンブレインの外部水溶液相であり、前記第１免疫調節物質は脂溶性免疫活性物質であり、前記第２免疫調節物質は水溶性免疫活性物質であり、前記流動性オイルは互いに接触し連結されている二つ以上のリポソームの構造安定性を向上させることを特徴とする、多重ドメインカプセルが提供され得る。
【００３０】
図１は、本発明の一具現例による免疫機能調節用多重ドメインカプセル（ｉｍｍｕｎｏｍｏｄｕｌａｔｏｒｙ  ｍｕｌｔｉ  ｄｏｍａｉｎ  ｖｅｓｉｃｌｅ、ｉｍＭＤＶ）の構造を示す断面図である。図１に示されたように、多重ドメインカプセルは、脂溶性免疫活性物質を含む多重ドメインカプセルの外壁を含み、前記二つ以上のリポソームを囲む前記多重ドメインカプセルの外壁内部に、二つ以上のリポソームがそれぞれのドメインを形成している、サイズが約１μｍ乃至約１００μｍのカプセル構造であり得る。
【００３１】
前記二つ以上のリポソームを含んでいる多重ドメインカプセルは、従来の単一リポソーム及び単独エマルジョンに比べて、免疫細胞活性化物質の持続時間、免疫細胞活性化効能、封入効率、又は生理学的安定性が向上したものであり得る。
【００３２】
本発明の一具現例において、図１に示されたように、前記リポソームメンブレインの内部は内部水溶液相を意味し、前記リポソームメンブレインの外部は外部水溶液相を意味し、前記内部水溶液相及び前記外部水溶液相はいずれも「第１水溶液相」を意味する。前記リポソームメンブレインの外部である外部水溶液相は前記リポソームメンブレインと前記多重ドメインカプセルの外壁の間の空間を意味する。また、前記多重ドメインカプセルは溶媒に分散しているものであってもよく、この際、多重ドメインカプセルが分散する分散相、すなわち多重ドメインカプセルの外部は、「第２水溶液相」を意味する。
【００３３】
本発明の一具現例において、前記多重ドメインカプセルのサイズは、約１μｍ乃至約１００μｍ、約１μｍ乃至約８０μｍ、約１μｍ乃至約６０μｍ、約１μｍ乃至約４０μｍ、約１μｍ乃至約２０μｍ、約１μｍ乃至約１０μｍ、約１０μｍ乃至約１００μｍ、約１０μｍ乃至約８０μｍ、約１０μｍ乃至約６０μｍ、約１０μｍ乃至約４０μｍ、約１０μｍ乃至約２０μｍ、約２０μｍ乃至約１００μｍ、約２０μｍ乃至約８０μｍ、約２０μｍ乃至約６０μｍ、約２０μｍ乃至約４０μｍ、約４０μｍ乃至約１００μｍ、約４０μｍ乃至約８０μｍ、約４０μｍ乃至約６０μｍ、約６０μｍ乃至約１００μｍ、約６０μｍ乃至約８０μｍ、又は約８０μｍ乃至約１００μｍの範囲であり得る。
【００３４】
本発明の一具現例において、前記多重ドメインカプセルは、前記カプセルの外側を構成する外壁から、前記二つ以上のリポソームを含んでいる内側メンブレインに徐々に崩壊が起こるので、前記カプセルにローディングされた抗原及び／又は免疫調節物質が放出時間を単一リポソーム又は単一エマルジョンに比べて延長させることができ、結果的には、長時間にわたって生体内の免疫細胞の機能を調節することができる。
本発明の一具現例において、二つ以上のリポソームは、外皮が互いに接触しているリポソームを含むことができる。例えば、前記多重ドメインカプセルのリポソームは、外皮間の界面接触がなされ、これにより、外皮が互いに離れている多重リポソームに比べてリポソームが容易にこわれないので、多重ドメインカプセルの構造的安定性及び徐放性効果が向上することができる。
【００３５】
本発明の一具現例において、前記流動性オイルは、各リポソームから構成されたドメインの間にグルー（ｇｌｕｅ）の役割をすることによって、前記多重ドメインカプセルの安定性を向上させることができる。例えば、前記多重ドメインカプセルは、流動性オイルを前記ドメインカプセルの外壁に導入し、前記リポソームの外壁を接触させることによって、前記多重ドメインカプセルの安定性が向上することができ、これにより、徐放性効果及び構造安定性が増大することができる。
【００３６】
本発明の一具現例において、前記流動性オイルにより前記脂溶性免疫活性物質が前記多重ドメインカプセルに容易にローディングされることができる。例えば、前記流動性オイルにより、一般的な有機溶媒に可溶化しにくい難溶性免疫調節物質である、イミキモド（Ｒ８３７）などが容易に可溶化されて、リポソームとリポソームの間の空間に流動性オイルと共に多重ドメインカプセルにローディングされ得る。
【００３７】
本発明の一具現例において、前記流動性オイルは、免疫細胞の活性化を助けるアジュバントの役割を行うことができ、例えば、動物性オイル、植物性オイル、トコフェロール、ミネラルオイル、キャスターオイル、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれたものを含むことができる。
【００３８】
本発明の一具現例において、前記動物性オイルは、魚類オイルを含むことができる。
【００３９】
本発明の一具現例において、前記魚類オイルは、代謝可能なオイルであると、制限なしに使用することができ、例えば、タラ肝オイル、鮫肝オイル、又は鯨オイルなどを含むことができる。前記鮫肝オイルは、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして知られた分子、不飽和テルペンを含有し、スクワランに対する飽和類似体をも含むことができる。スクアレン又はスクワランを含む魚類オイルの場合、市販の供給源から容易に利用可能であるか又は当業界に公知となっている方法で獲得され得る。
【００４０】
本発明の一具現例において、前記動物性由来オイルは、ラード、獣脂（ｔａｌｌｏｗ）オイル、又は牛脂などを含むことができる。
【００４１】
本発明の一具現例において、前記植物性由来オイルは、堅果、種子、又は穀物などに由来するオイルであり得、例えば、ピーナッツオイル、大豆オイル、ココナッツオイル、又はオリーブオイルなどを含むことができる。
【００４２】
本発明の一具現例において、前記トコフェロールは、ビタミンＥが含有されたトコフェロールであり得る。多様なトコフェロールが存在するが（α、β、γ、δ、ε又はξ）、一般的にα−トコフェロールが使用され得、例えば、ＤＬ−α−トコフェロールが使用され得る。
【００４３】
本発明の一具現例において、前記流動性オイルを前記多重ドメインカプセルに導入することによって、前記免疫調節物質を容易に可溶化することができ、前記多重ドメインカプセルの構造的安定性を強化することができる。例えば、前記流動性オイルとしてスクアレン及びオレイン酸を利用する場合、親油性又は難溶性免疫調節物質を容易に可溶化することができ、スクアレン及びオレイン酸自体の免疫活性化効果により前記免疫調節とのシナジー効果を示すことができ、前記多重ドメインカプセルの構造的安定性を増加させることができるが、これに制限されるものではない。
【００４４】
本発明の一具現例において、前記脂溶性及び水溶性免疫活性物質は、ストレスを受けた癌細胞で発現する免疫調節物質、例えば熱−衝撃タンパク質（ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり得、又はＴ細胞の活性化を誘導する物質であり得る。
【００４５】
本発明の一具現例において、前記脂溶性及び水溶性免疫活性物質は、トル様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ）、サポニン、抗ウイルス性ペプチド、インフラマソームインデューサー（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＮＯＤリガンド（ＮＯＤ  ｌｉｇａｎｄ）、ＣＤＳリガンド（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｎｓｏｒ  ｌｉｇａｎｄ）、ＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ）リガンド、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる一つ以上の物質を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００４６】
本発明の一具現例において、前記トル様受容体アゴニストは、直接的リガンドとして又は間接的リガンドとして、内因性又は外因性リガンドの生成を通じてＴＬＴ信号伝達経路を介した信号伝達反応を惹起させることができる成分を意味するものであり得る。
【００４７】
本発明の一具現例において、前記トル様受容体アゴニストは、天然トル様受容体アゴニスト又は合成トル様受容体アゴニストであり得る。
【００４８】
本発明の一具現例において、前記トル様受容体アゴニストは、ＴＬＲ−１を介して信号伝達反応を惹起させることができるものであり得、例えば、トリ−アシル化した脂質ペプチド（ＬＰ）；フェノール−可溶性モジュリン（ｍｏｄｕｌｉｎ）；マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）脂質ペプチド；Ｓ−（２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２−ＲＳ）−プロピル）−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ（４）−ＯＨ；ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）からのバクテリア脂質ペプチド；ＯｓｐＡ脂質ペプチドのアセチル化したアミノ末端を模倣するトリヒドロクロリド（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）脂質ペプチド；及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる一つ以上の物質を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００４９】
本発明の一具現例において、前記トル様受容体アゴニストは、ＴＬＲ−２アゴニストを含むものであり得、例えば、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｌｉｐを含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００５０】
本発明の一具現例において、前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−３アゴニストを含むものであり得、例えば、ポリアイシ系としてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐｏｌｙ（ＩＣＬＣ）、Ｐｏｌｙ（ＩＣ１２Ｕ）、ａｍｐｌｉｇｅｎなどを含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００５１】
本発明の一具現例において、前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−４アゴニストを含むものであり得、例えば、シゲラフレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）外膜タンパク質製造物、ＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７、ＭＰＬＡ、ＰＨＡＤ、３Ｄ−ＰＨＡＤ、ＧＬＡ、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる一つ以上の物質を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００５２】
本発明の一具現例において、前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−５アゴニストを含むものであり得、例えば、フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）又はその断片を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００５３】
本発明の一具現例において、前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−７アゴニスト又はＴＬＲ−８アゴニストを含むものであり得、例えば、イミキモド、Ｒ８３７、レシキモド、又はＲ８４８のようなイミダゾキノリン分子；ＶＴＸ−２３３７；ＣＲＸ６４２；リン脂質基又はホスホノ脂質基に共有的に結合されたイミダゾキノリン；及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる一つ以上の物質を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００５４】
本発明の一具現例において、前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−９アゴニストを含むものであり得、例えば、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００５５】
本発明の一具現例において、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、一つ以上のＣｐＧモチーフを含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００５６】
本発明の一具現例において、前記サポニンは、ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ７、ＱＳ１７、β−エスキン、ジギトニン及びこれらの組合せよりなる群から選ばれたものであり得るが、これに制限されるものではない。
【００５７】
本発明の一具現例において、前記抗ウイルス性ペプチドは、ケイエルケイ（ＫＬＫ）を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００５８】
本発明の一具現例において、前記インフラマソームインデューサーは、ＴＤＢ（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ−６，６−ｄｉｂｅｈｅｎａｔｅ）であり得るが、これに制限されるものではない。
【００５９】
本発明の一具現例において、前記ＮＯＤリガンドは、Ｍ−ＴｒｉＬＹＳ（ＮＯＤ２アゴニスト−合成ムラミルトリペプチド）又はＮＯＤ２アゴニスト（Ｎ−ｇｌｙｃｏｌｙｌａｔｅｄ  ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄ）であり得るが、これに制限されるものではない。
【００６０】
本発明の一具現例において、前記ＣＤＳリガンドは、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）であり得るが、これに制限されるものではない。
【００６１】
本発明の一具現例において、前記ＳＴＩＮＧリガンドは、ｃＧＡＭＰ、ｄｉ−ＡＭＰ、又はｄｉ−ＧＭＰであり得るが、これに制限されるものではない。
【００６２】
本発明の一具現例において、前記免疫調節物質は、一つ又は二つ以上のトル様受容体アゴニストの組合せを含むことができ、例えば、ＣＬ４０１（デュアルＴＬＲ２及びＴＬＲ７アゴニスト）又はＣＬ４２９（デュアルＴＬＲ２及びＮＯＤ２アゴニスト）を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００６３】
本発明の一具現例において、多重ドメインカプセルに含まれる免疫調節物質は、例えば、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｌｉｐ、ポリアイシ(Poly(I:C))、ＣＲＸ−５２７、ＭＰＬＡ、フラジェリン、イミキモド、レシキモド、ＣｐＧ、ＱＳ２１、Ｍ−ＴｒｉＬｙｓ（ＭｕｒＮＡｃ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−Ｌｙｓ）、ＴＤＢ（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ−６，６−ｄｉｂｅｈｅｎａｔｅ）、８８３７、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）、ｃＧＡＭＰ、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれるものであり得るが、これに制限されるものではない。
【００６４】
本発明の一具現例において、前記脂溶性免疫活性物質は、例えば、カチオン性脂質、ＭＰＬＡ、ＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７、ＰＨＡＤ、３Ｄ−ＰＨＡＤ、ＧＬＡ、脂質ペプチド、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｌｉｐ、ＤＤＡ、イミキモド（ｂａｓｅ  ｆｏｒｍ）、レシキモド（ｂａｓｅ  ｆｏｒｍ）、ＶＴＸ−２３３７、ＣＲＸ６４２、サポニン（ＱＳ２１）、ＴＤＢ、ＣＬ４０１、ＣＬ４２９、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含むことができる。
【００６５】
本発明の一具現例において、前記親水性免疫活性物質は、例えば、ＣｐＧ、イミキモド（ＨＣｌ  ｆｏｒｍ）、レシキモド（ＨＣｌ  ｆｏｒｍ）、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＳＴＩＮＧ、フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）、サポニン、ＫＬＫペプチド、ＮＯＤアゴニストペプチド、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含むことができる。例えば、前記親水性物質は、末端基の化学的結合基を介して前記多重ドメインカプセルの外壁にコンジュゲーションされ得るが、これに制限されるものではない。
【００６６】
本発明の一具現例において、前記カチオン性脂質により、アニオン性である細胞膜との静電気的引力が誘導されて、前記免疫調節物質の細胞内伝達効率がさらに向上することができる。
【００６７】
本発明の一具現例によれば、カチオン性脂質を含んで多重ドメインカプセルを構成することによって、アニオン性及び／又は負電荷を呈する多様な免疫調節物質及びＤＮＡ、ＲＮＡのようなバイオ素材が前記多重ドメインカプセルに効果的にローディングされ得る。例えば、アニオン性又は負電荷を呈するバイオ素材及び／又はＤＮＡ、ＲＮＡアミノ酸基盤の免疫調節物質は、カチオン特性を示す前記多重ドメインカプセルの外壁又は内部リポソームのメンブレインに静電気的結合を通じてローディングされ得るが、これに制限されるものではない。
【００６８】
本発明の一具現例において、前記カチオン性脂質は、ＤＣ−コレステロール（３β−［Ｎ−（Ｎ´，Ｎ′−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｙｌ］ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ｄｉ−Ｏ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｒｏｐａｎｅ）、ＥＰＣ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＭＶＬ５（Ｎ１−［２−（（１Ｓ）−１−［（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］−４−［ｄｉ（３−ａｍｉｎｏ−ｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｕｔｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−３，４−ｄｉ［ｏｌｅｙｌｏｘｙ］−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＤＯＤＡＰ（ｌｉｐｉｄｓ１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ）、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００６９】
本発明の一具現例によれば、界面活性剤が多重ドメインカプセルの外部にコーティングされて、前記多重ドメインカプセルが水溶液内で安定的に分散され得るようにすることを特徴とする。
【００７０】
前記界面活性剤は、前記多重ドメインカプセルの外部にコーティングされて、前記多重ドメインカプセルが水溶液内に分散され得るようにするものであり、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０及びポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；オクトシノール（例えば、トリトンＸ−１００、又はＴ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスホリピド（リン脂質成分）として、ホスファチジルコリン（レシチン）ホスファチジルエタノールアニリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン及びカルジオリピン；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（商標）ＮＰシリーズのようなノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）のようなラウリル、セチル及びオレイルアルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤と知られた）に由来したポリオキシエチレンファティーエーテル；及びソルビタントリオレート（Ｓｐａｎ８５）及びソルビタンモノラウレートのようなソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮと知られる）を単独で使用したり、２種以上の界面活性剤を組み合わせて共に使用することができる。例えば、前記界面活性剤は、これら界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物が利用され得る。ポリオキシエチレンソルビタンエステル及びオクトシノールの組合も使用され得る。他の有用な組合せは、ラウレス９、ポリオキシエチレンソルビタンエステル及び／又はオクトシノールを含むことができる。前記界面活性剤は、全体前記多重ドメインカプセルの総重量に対して０．００１乃至２０％の重量で使用され得、例えば、０．０１乃至１％、０．００１乃至０．１％、０．００５乃至０．０２％；０．１乃至２０％、０．１乃至１０％、０．１乃至１％又は約０．５％の重量で使用され得る。
【００７１】
本発明の他の態様によれば、本発明による多重ドメインカプセル及び抗原を含む、免疫調節物質を提供する。
【００７２】
本発明の一具現例において、前記抗原は、タンパク質、遺伝子、細胞、ウイルス、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれるものを含むことができるが、これに制限されるものではない。例えば、前記タンパク質は、オボアルブミン、組み換えタンパク質、サブユニット（ｓｕｂｕｎｉｔ）、スプリット（ｓｐｌｉｔ）タンパク質抗原を含むことができ、前記細胞は、例えば、樹状細胞、Ｔ細胞を含むことができ、前記ウイルスは、例えば、インフルエンザ、ＨＢＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＡＶ（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）、ＨＰＶ（ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００７３】
本発明の一具現例において、前記抗原は、弱毒化した生きている完全体微生物、不活性微生物、破裂微生物、病原体のタンパク質、組み換えタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、多糖類、脂質多糖類、リポペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、ウイルス、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれたものを含むことができるが、これに制限されるものではない。例えば、前記抗原は、インフルエンザ由来抗原又は癌細胞由来抗原を含むことができるが、これに制限されるものではない。例えば、前記皮内投与用免疫調節物質は、一つ以上の抗原を含むことによって、体内で多重免疫反応が誘導され得るが、これに制限されるものではない。
【００７４】
本発明の一具現例において、前記癌細胞は、癌細胞株（ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）を利用して収得されたり、体内に存在する癌組織（ｔｕｍｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ）から分離されるものであり得る。また、実際癌組織で抗癌剤や放射線を加えることによって、細胞内ストレスと関連したタンパク質の生成を誘導した後に、癌細胞を溶解することによって製造されるものであり得るが、これに制限されるものではない。
【００７５】
本発明の一具現例において、前記癌細胞は、肺、結腸、中枢神経系、皮膚、卵巣、腎臓、乳房、胃、又は大腸の癌細胞を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００７６】
本発明の他の態様によれば、第１免疫調節物質及び流動性オイルを溶媒に溶解して、オイル相溶液を製造する段階；第２免疫調節物質を含む第１水溶液相を前記オイル相溶液に分散させて、油中−水（Ｗ／Ｏ）エマルジョンを製造する段階；及び前記油中−水エマルジョンを第２水溶液と混合し、前記溶媒を蒸発させる段階；を含み、前記第１免疫調節物質は、脂溶性免疫活性物質であり、前記第２免疫調節物質は、水溶性免疫活性物質であることを特徴とする、多重ドメインカプセルの製造方法が提供される。
【００７７】
本発明の一具現例において、前記多重ドメインカプセルは、前記カプセルの外側を構成する外壁から、前記二つ以上のリポソームを含んでいる内側メンブレインに徐々に崩壊が起こるので、前記カプセルにローディングされた抗原及び／又は免疫調節物質が放出時間を単一リポソーム又は単一エマルジョンに比べて延長させることができ、結果的には、長時間にわたって生体内の免疫細胞の機能を調節することができる。
【００７８】
本発明の一具現例において、二つ以上のリポソームは、外皮が互いに接触しているリポソームを含むことができる。例えば、前記多重ドメインカプセルのリポソームは、外皮間の界面接触がなされ、これにより、外皮が互いに離れている多重リポソームに比べてリポソームが容易にこわれないので、多重ドメインカプセルの構造的安定性及び徐放性効果が向上することもできる。
【００７９】
本発明の一具現例において、前記流動性オイルは、各リポソームから構成されたドメインの間にグルー（ｇｌｕｅ）の役割をすることによって、前記多重ドメインカプセルの安定性が向上することを特徴とする。例えば、前記多重ドメインカプセルは、流動性オイルを前記ドメインカプセルの外壁に導入し、前記リポソームの外壁を接触させることによって、前記多重ドメインカプセルの安定性が向上するものであり得、これにより、徐放性効果及び構造安定性が増大するものであり得る。
【００８０】
本発明の一具現例において、前記流動性オイルにより前記親油性免疫調節物質が前記多重ドメインカプセルに容易にローディングされるものであり得る。例えば、前記流動性オイルにより、一般的な有機溶媒に可溶化しにくい難溶性免疫調節物質である、イミキモド（Ｒ８３７）などが容易に可溶化されて、リポソームとリポソームの間の空間に流動性オイルと共に多重ドメインカプセルにローディングされ得る。
本発明の一具現例において、前記流動性オイルは、免疫細胞の活性化を助けるアジュバントの役割を行うことができ、例えば、動物性オイル、植物性オイル、トコフェロール、ミネラルオイル、キャスターオイル、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれたのを含むことができる。
【００８１】
本発明の一具現例において、前記動物性オイルは、魚類オイルを含むものであり得る。
本発明の一具現例において、前記魚類オイルは、代謝可能なオイルであると、制限なしに使用することができ、例えば、タラ肝オイル、鮫肝オイル、又は鯨オイルなどを含むことができる。前記鮫肝オイルは、スクアレン、２，６，１０，１５，１９，２３−ヘキサメチル−２，６，１０，１４，１８，２２−テトラコサヘキサエンとして知られた分子、不飽和テルペンを含有し、スクワランに対する飽和類似体をも含むことができる。スクアレン又はスクワランを含む魚類オイルの場合、市販の供給源から容易に利用可能し，又は当業界に公知となっている方法で獲得され得る。
本発明の一具現例において、前記動物性由来オイルは、ラード、獣脂（ｔａｌｌｏｗ）オイル、又は牛脂などを含むものであり得る。
本発明の一具現例において、前記植物性由来オイルは、堅果、種子、又は穀物などに由来したオイルであり得、例えば、ピーナッツオイル、大豆オイル、ココナッツオイル、又はオリーブオイルなどを含むことができる。
本発明の一具現例において、前記トコフェロールは、ビタミンＥが含有されたトコフェロールであり得る。多様なトコフェロールが存在するが（α、β、γ、δ、ε又はξ）、一般的にα−トコフェロールが使用され得、例えば、ＤＬ−α−トコフェロールが使用され得る。
【００８２】
本発明の一具現例において、前記流動性オイルを前記多重ドメインカプセルに導入することによって、前記免疫調節物質を容易に可溶化することができ、前記多重ドメインカプセルの構造的安定性を強化することができる。例えば、前記流動性オイルとしてスクアレン及びオレイン酸を利用する場合、親油性又は難溶性免疫調節物質を容易に可溶化することができ、スクアレン及びオレイン酸自体の免疫活性化効果により前記免疫調節物質とのシナジー効果を示すことができ、前記多重ドメインカプセルの構造的安定性を増加させることができるが、これに制限されるものではない。
【００８３】
本発明の一具現例において、前記脂溶性及び水溶性免疫活性物質は、ストレスを受けた癌細胞で発現する免疫調節物質、例えば熱−衝撃タンパク質（ｈｅａｔ−ｓｈｏｃｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ）であり得、又はＴ細胞の活性化を誘導する物質であり得る。
【００８４】
本発明の一具現例において、前記脂溶性及び水溶性免疫活性物質は、トル様受容体アゴニスト（ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｇｏｎｉｓｔ）、サポニン、抗ウイルス性ペプチド、インフラマソームインデューサー（ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ  ｉｎｄｕｃｅｒ）、ＮＯＤリガンド（ＮＯＤ  ｌｉｇａｎｄ）、ＣＤＳリガンド（ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ＤＮＡ  ｓｅｎｓｏｒ  ｌｉｇａｎｄ）、ＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅｓ）リガンド、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる一つ以上の物質を含むものであり得るが、これに制限されるものではない。
【００８５】
本発明の一具現例において、前記トル様受容体アゴニストは、直接的リガンドとして又は間接的リガンドとして、内因性又は外因性リガンドの生成を通じてＴＬＴ信号伝達経路を介した信号伝達反応を惹起させることができる成分を意味するものであり得る。
【００８６】
本発明の一具現例において、前記トル様受容体アゴニストは、天然トル様受容体アゴニスト又は合成トル様受容体アゴニストであり得る。
本発明の一具現例において、前記トル様受容体アゴニストは、ＴＬＲ−１を介して信号伝達反応を惹起させることができるものであり得、例えば、トリ−アシル化した脂質ペプチド（ＬＰ）；フェノール−可溶性モジュリン（ｍｏｄｕｌｉｎ）；マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）脂質ペプチド；Ｓ−（２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２−ＲＳ）−プロピル）−Ｎ−パルミトイル−（Ｒ）−Ｃｙｓ−（Ｓ）−Ｓｅｒ−（Ｓ）−Ｌｙｓ（４）−ＯＨ；ボレリア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）からのバクテリア脂質ペプチド；ＯｓｐＡ脂質ペプチドのアセチル化したアミノ末端を模倣するトリヒドロクロリド（Ｐａｍ３Ｃｙｓ）脂質ペプチド；及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる一つ以上の物質を含むことができるが、これに制限されるものではない。
本発明の一具現例において、前記トル様受容体アゴニストは、ＴＬＲ−２アゴニストを含むものであり得、例えば、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｌｉｐを含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００８７】
本発明の一具現例において、前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−３アゴニストを含むものであり得、例えば、ポリアイシ系としてＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、Ｐｏｌｙ（ＩＣＬＣ）、Ｐｏｌｙ（ＩＣ１２Ｕ）、ａｍｐｌｉｇｅｎなどを含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００８８】
本発明の一具現例において、前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−４アゴニストを含むものであり得、例えば、シゲラフレクスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｆｌｅｘｎｅｒｉ）外膜タンパク質製造物、ＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７、ＭＰＬＡ、ＰＨＡＤ、３Ｄ−ＰＨＡＤ、ＧＬＡ、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる一つ以上の物質を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００８９】
本発明の一具現例において、前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−５アゴニストを含むものであり得、例えば、フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）又はその断片を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００９０】
本発明の一具現例において、前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−７アゴニスト又はＴＬＲ−８アゴニストを含むものであり得、例えば、イミキモド、Ｒ８３７、レシキモド、又はＲ８４８のようなイミダゾキノリン分子；ＶＴＸ−２３３７；ＣＲＸ６４２；リン脂質基又はホスホノ脂質基に共有的に結合されたイミダゾキノリン；及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる一つ以上の物質を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００９１】
本発明の一具現例において、前記トル様アゴニストは、ＴＬＲ−９アゴニストを含むものであり得、例えば、免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００９２】
本発明の一具現例において、前記免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、一つ以上のＣｐＧモチーフを含むことができるが、これに制限されるものではない。
本発明の一具現例において、前記サポニンは、ＱＳ２１、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ７、ＱＳ１７、β−エスキン、ジギトニン及びこれらの組合せよりなる群から選ばれたものであり得るが、これに制限されるものではない。
本発明の一具現例において、前記抗ウイルス性ペプチドは、ケイエルケイ（ＫＬＫ）を含むことができるが、これに制限されるものではない。
本発明の一具現例において、前記インフラマソームインデューサーは、ＴＤＢ（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ−６，６−ｄｉｂｅｈｅｎａｔｅ）であり得るが、これに制限されるものではない。
本発明の一具現例において、前記ＮＯＤリガンドは、Ｍ−ＴｒｉＬＹＳ（ＮＯＤ２アゴニスト−合成ムラミルトリペプチド）又はＮＯＤ２アゴニスト（Ｎ−ｇｌｙｃｏｌｙｌａｔｅｄ  ｍｕｒａｍｙｌｄｉｐｅｐｔｉｄ）であり得るが、これに制限されるものではない。
【００９３】
本発明の一具現例において、前記ＣＤＳリガンドは、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）であり得るが、これに制限されるものではない。
本発明の一具現例において、前記ＳＴＩＮＧリガンドは、ｃＧＡＭＰ、ｄｉ−ＡＭＰ、又はｄｉ−ＧＭＰであり得るが、これに制限されるものではない。
【００９４】
本発明の一具現例において、前記免疫調節物質は、一つ又は二つ以上のトル様受容体アゴニストの組合せを含むことができ、例えば、ＣＬ４０１（デュアルＴＬＲ２及びＴＬＲ７アゴニスト）又はＣＬ４２９（デュアルＴＬＲ２及びＮＯＤ２アゴニスト）を含むことができるが、これに制限されるものではない。
本発明の一具現例において、多重ドメインカプセルに含まれる免疫調節物質は、例えば、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｌｉｐ、ポリアイシ(POLY(I:C))、ＣＲＸ−５２７、ＭＰＬＡ、フラジェリン、イミキモド、レシキモド、ＣｐＧ、ＱＳ２１、Ｍ−ＴｒｉＬｙｓ（ＭｕｒＮＡｃ−Ａｌａ−Ｄ−ｉｓｏＧｌｎ−Ｌｙｓ）、ＴＤＢ（ｔｒｅｈａｌｏｓｅ−６、６−ｄｉｂｅｈｅｎａｔｅ）、８８３７、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）、ｃＧＡＭＰ、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれるものであり得るが、これに制限されるものではない。
【００９５】
本発明の一具現例において、前記脂溶性免疫調節物質は、例えば、カチオン性脂質、ＭＰＬＡ、ＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７、ＰＨＡＤ、３Ｄ−ＰＨＡＤ、ＧＬＡ、脂質ペプチド、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｌｉｐ、ＤＤＡ、イミキモド（ｂａｓｅ  ｆｏｒｍ）、レシキモド（ｂａｓｅ  ｆｏｒｍ）、ＶＴＸ−２３３７、ＣＲＸ６４２、サポニン（ＱＳ２１）、ＴＤＢ、ＣＬ４０１、ＣＬ４２９、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含むことができる。
【００９６】
本発明の一具現例において、前記親水性免疫調節物質は、例えば、ＣｐＧ、イミキモド（ＨＣｌ  ｆｏｒｍ）、レシキモド（ＨＣｌ  ｆｏｒｍ）、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＳＴＩＮＧ、フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）、サポニン、ＫＬＫペプチド、ＮＯＤアゴニストペプチド、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含むことができる。例えば、前記親水性物質は、末端基の化学的結合基を介して前記多重ドメインカプセルの外壁にコンジュゲーションされ得るが、これに制限されるものではない。
【００９７】
本発明の一具現例において、前記カチオン性脂質により、アニオン性である細胞膜との静電気的引力が誘導されて、前記免疫調節物質の細胞内伝達効率がさらに向上することができる。
【００９８】
本発明の一具現例によれば、カチオン性脂質を含んで多重ドメインカプセルを構成することによって、アニオン性及び／又は負電荷を呈する多様な免疫調節物質及びＤＮＡ、ＲＮＡのようなバイオ素材が前記多重ドメインカプセルに効果的にローディングされ得る。例えば、アニオン性又は負電荷を呈するバイオ素材及び／又はＤＮＡ、ＲＮＡアミノ酸基盤の免疫調節物質は、カチオン特性を示す前記多重ドメインカプセルの外壁又は内部リポソームのメンブレインに静電気的結合を通じてローディングされ得るが、これに制限されるものではない。
【００９９】
本発明の一具現例において、前記カチオン性脂質は、ＤＣ−コレステロール（３β−［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈａｎｅ）−ｃａｒｂａｍｏｙｌ］ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、ＤＤＡ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｄｉｏｃｔａｄｅｃｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ）、ＤＯＴＡＰ（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ）、ＤＯＴＭＡ（１，２−ｄｉ−Ｏ−ｏｃｔａｄｅｃｅｎｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ  ｐｒｏｐａｎｅ）、ＥＰＣ（１，２−ｄｉｍｙｒｉｓｔｏｌｅｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｃｈｏｌｉｎｅ）、ＭＶＬ５（Ｎ１−［２−（（１Ｓ）−１−［（３−ａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］−４−［ｄｉ（３−ａｍｉｎｏ−ｐｒｏｐｙｌ）ａｍｉｎｏ］ｂｕｔｙｌｃａｒｂｏｘａｍｉｄｏ）ｅｔｈｙｌ］−３，４−ｄｉ［ｏｌｅｙｌｏｘｙ］−ｂｅｎｚａｍｉｄｅ）、ＤＯＤＡＰ（ｌｉｐｉｄｓ１、２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ）、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【０１００】
本発明の一具現例によれば、界面活性剤が多重ドメインカプセルの外部にコーティングされて、前記多重ドメインカプセルが水溶液内で安定的に分散され得るようにすることを特徴とする。
【０１０１】
前記界面活性剤は、前記多重ドメインカプセルの外部にコーティングされて、前記多重ドメインカプセルが水溶液内に分散され得るようにするものであり、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（一般的にＴｗｅｅｎと呼ばれる）、特にポリソルベート２０及びポリソルベート８０；エチレンオキシド（ＥＯ）、プロピレンオキシド（ＰＯ）、及び／又はブチレンオキシド（ＢＯ）のコポリマー；オクトシノール（例えば、トリトンＸ−１００、又はＴ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール）；（オクチルフェノキシ）ポリエトキシエタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０／ＮＰ−４０）；ホスホリピド（リン脂質成分）として、ホスファチジルコリン（レシチン）ホスファチジルエタノールアニリン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジン酸、スフィンゴミエリン及びカルジオリピン；Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰシリーズのようなノニルフェノールエトキシレート；トリエチレングリコールモノラウリルエーテル（Ｂｒｉｊ  ３０）のようなラウリル、セチル及びオレイルアルコール（Ｂｒｉｊ界面活性剤と知られた）に由来したポリオキシエチレンファティーエーテル；及びソルビタントリオレート（Ｓｐａｎ８５）及びソルビタンモノラウレートのようなソルビタンエステル（一般的にＳＰＡＮと知られる）を単独で使用したり、２種以上の界面活性剤を組み合わせて共に使用することができる。
【０１０２】
例えば、前記界面活性剤は、これら界面活性剤の混合物、例えばＴｗｅｅｎ  ８０／Ｓｐａｎ  ８５混合物が利用され得る。ポリオキシエチレンソルビタンエステル及びオクトシノールの組合せがまた使用され得る。他の有用な組合せは、ラウレス９、ポリオキシエチレンソルビタンエステル及び／又はオクトシノールを含むことができる。前記界面活性剤は、全体前記多重ドメインカプセルの総重量に対して０．００１乃至２０％の重量で使用され得、例えば、０．０１乃至１％、０．００１乃至０．１％、０．００５乃至０．０２％；０．１乃至２０％、０．１乃至１０％、０．１乃至１％又は約０．５％の重量で使用され得る。
【０１０３】
本発明の他の態様によれば、互いに接触し連結されている二つ以上のリポソーム、及び前記二つ以上のリポソームを囲む多重ドメインカプセル外壁を含む多重ドメインカプセルであって、前記多重ドメインカプセルは、有機相と水溶液相からなり、前記有機相は、第１免疫調節物質及び流動性オイルを含み、前記有機相は、前記リポソームのメンブレイン、及び前記多重ドメインカプセル外壁を形成し、前記水溶液相は、第２免疫調節物質を含み、前記水溶液相は、前記リポソームメンブレインの内部水溶液相及びリポソームメンブレインの外部水溶液相であり、前記第１免疫調節物質、及び第２免疫調節物質は、免疫抑制因子制御物質であり、前記流動性オイルは、互いに接触し連結されている二つ以上のリポソームの構造安定性を向上させることを特徴とする、多重ドメインカプセルが提供され得る。
【０１０４】
前記第１免疫調節物質、及び第２免疫調節物質は、上述した免疫活性物質をさらに含むことができる。すなわち、前記第１免疫調節物質、及び第２免疫調節物質は、免疫活性物質と共に免疫抑制因子制御物質を含むことができる。
【０１０５】
そして、本発明のさらに他の態様によれば、前記多重ドメインカプセル及び抗原を含む、免疫調節物質が提供され得る。
【０１０６】
また、第１免疫調節物質及び流動性オイルを溶媒に溶解して、オイル相溶液を製造する段階；第２免疫調節物質を含む第１水溶液相を前記オイル相溶液に分散させて、油中−水（Ｗ／Ｏ）エマルジョンを製造する段階；及び前記油中−水エマルジョンを第２水溶液と混合し、前記溶媒を蒸発させる段階；を含み、前記第１免疫調節物質、及び第２免疫調節物質は、免疫抑制因子制御物質であることを特徴とする、多重ドメインカプセルの製造方法が提供され得る。
【０１０７】
本発明において多重ドメインカプセル基盤固形癌微小環境制御組成物は、癌の微小環境を調節するための新しい形態の免疫調節組成物であって、上記で言及した生体内免疫細胞を活性化する物質以外に、固形癌微小環境で現れる免疫抑制細胞及び免疫抑制物質の機能を制御できる薬物（免疫抑制因子制御物質）を含むことを特徴とする。
本発明の一具現例によれば、免疫抑制因子、すなわち免疫抑制細胞及び免疫抑制物質の機能を制御できる免疫抑制因子制御物質を基本成分として複数のリポソームがそれぞれのドメインを形成しつつ互いに連結され、導入された流動性オイル成分により連結された複数のリポソームの構造的安定性が向上したマイクロサイズのカプセル形態を有する免疫調節用多重ドメインカプセルを製造することができる。また、本発明の一具現例によれば、多様な薬学的組成物として使用されている単一リポソーム素材の低い封入効率及び短い有効持続時間の短所を克服し、免疫機能調節効果の有効持続時間を増やすことができる新しい多重ドメインカプセル基盤の抗癌免疫治療剤組成物を製造することができる。
本発明の一具現例による多重ドメインカプセルは、前記カプセルの外壁から内側メンブレインに徐々に崩壊が起こることによって、前記カプセルの外壁及び内部にローディングされた免疫抑制細胞及び免疫抑制物質の機能を制御できる免疫抑制因子制御物質が放出されるので、免疫機序調節物質の有効持続時間が増加することができるという長所を有する。
【０１０８】
また、本発明の一具現例による多重ドメインカプセルは、リポソームのメンブレイン及び／又は前記多重ドメインカプセルの外壁に親油性性質を有する多様な免疫抑制細胞及び免疫抑制物質の機能を制御できる免疫抑制因子制御物質をローディングすることによって、免疫活性物質の有効持続時間を増加させることができる。
本発明の一具現例による多重ドメインカプセルは、リポソームの内部に親水性性質を有する多様な免疫抑制細胞及び免疫抑制物質の機能を制御できる免疫抑制因子制御物質をローディングすることによって、免疫抑制因子制御物質の有効持続時間を増加させることができる。
【０１０９】
本発明の一具現例による多重ドメインカプセルは、リポソームの内部に親水性性質を有する多様な免疫抑制因子制御物質、リポソームのメンブレイン及び／又は前記カプセルの外壁に親油性免疫抑制因子制御物質を同時にローディングすることによって、免疫抑制細胞及び免疫抑制物質の機能を制御できる免疫抑制因子制御物質の有効持続時間を増加させることができる。
本発明の一例においてＭＤＳＣ（Ｍｙｅｏｌｏｉｄ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｃｅｌｌ）の機能を制御できる薬物、すなわち免疫抑制因子制御物質としては、
Tadalafil, Sildenafil, L-AME, Nitroaspirin, Celecoxib, NOHA, Bardoxolone methyl, D,L-1-methyl-tryptophan, 5-Fluorouracil, Gemcitabine, 17-DMAG, Peptide-Fc fusionproteins, ATRA, Vitamin A, Vitamin D3, Vitamin E, GR1 antibodies, Zoledronic acid, Sunitinib,Axitinib, Decetaxel, Sorafenib, CucurbitacinB, JSI-124, Anti IL-17 antibodies, Anti-glycan antibodies, Anti-VEGF antibodies, Bevacizumab, Antracycline, Tasquinimod, Imatinib, cyclophosphamide があるが、これに限定されない。
【０１１０】
本発明の一例において、PI3K inhibitorsは、PX-866, Wortmannin, PI-103, Pictilisib, GDC-0980, PF-04691502, BEZ235, XL765, XL147, BAY80-6946, GSK-2126458, Buparlisib,BYL719, AZD8186, GSK-2636771, CH5132799, INK-1117などであることを特徴とする。
【０１１１】
本発明の一例においてＰＩ３Ｋｄｅｌｔａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ物質としては、 AMG-319, Idelalisib, TRG-1202, INCB050465, IPI-145, Duvelisib,Acalisib, TG-1202, RV1729, RP-6530, GDC-0032などであることを特徴とする。
本発明の一例においてＰＩ３Ｋｇａｍｍａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ物質としては、ＩＰＩ−５４９、ＩＰＩ−１４５などであることを特徴とする。
【０１１２】
本発明の一例においてＴｒｅｇ（Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ）の機能を制御できる薬物、すなわち免疫抑制因子制御物質としては、Anti-CD25 antibodies (daclizumab), Basiliximab, LMB-2, Denileukin diftitox(Ontak), Bivalent IL-2 fusiontoxin, Anti-TGF-beta antibodies, fresolimumab, TGF-betaR kinase inhibitors, LY2157299, Soluble TGF-betaR I/II, Ipilimumab, Tremelimumab, Pembrolizumab, Nivolumab, TIM-3 antibodies, LAG-3 antibodies, Anti-CD39 antibodies, Anti-73 antibodies, A(2A)R inhibitors, Celecoxib, Indomethacin, Diclofenac, Ibuprofen, TNFR2 antibodies, Anti-GITR antibodies, Bevacizumab, Anti-OX40(CD134) antibodies, soluble GITR ligand, Blockades for chemokine receptors (CCR4, 5, 6,10), cyclophosphamide, Sunitinib,Fludarabine, PI3K p110(delta) inhibitors, CliniMACs, Mogamulizumab, Fingolimod, Regulators for miRNA (miR-155, miR-146a, miR-181a), 5-aza-2-deoxycytidine, paclitaxel, Imatinib, Sorafenib, Cyclosporin A, Tacrolimus, Dasatinib, Poly-G-oligonucleotide, TLR8 ligands, gemcitabine及び5-fluorouracilがあるが、これに限定されない。
【０１１３】
本発明の一例は、ＴＡＭ（ｔｕｍｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ）の機能を調整できる薬物、すなわち免疫抑制因子制御物質としては、Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅのｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔを阻害できる薬物であって、CCL2/CCR2 inhibitors (Yondeli, RS102895), M-CSF M-CSFR inhibitors (anti-M-CSF antibodies, JNJ-28312141, GW2580), chemoattractants (CCL5, CXCL-12, VEGF)とその受容体に対するｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ、ＨＩＦｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓであることを特徴とするが、これに限定されない。
また、ＴＡＭの生存を抑制できる薬物、すなわち免疫抑制因子制御物質として、Bisphosphonates, Clodronate, Dasatinib, anti-FRbeta antibodies, Shigella flexneri, LegumainとＣＤ１ｄの発現を誘導できる薬物であることを特徴とするが、これに限定されない。
【０１１４】
そして、Ｍ１  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅの特性を向上させることができる薬物、すなわち免疫抑制因子制御物質として、ＮＦ−ｋＢアゴニストであるＴＬＲアゴニスト、Ａｎｔｉ−ＣＤ４０  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ、Ｔａｓｑｕｉｎｉｍｏｄ、Ａｎｔｉ−ＩＬ−１０Ｒ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａｎｔｉ−ＩＬ−１０  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、オリゴヌクレオチド（Ａｎｔｉ−ＩＬ−１０Ｒ  Ａｎｔｉ−ＩＬ−１０）、ＳＴＡＴ１アゴニストであるインターフェロン（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ）、Ｍ１  ｐａｔｈｗａｙを誘導できるＳＨＩＰとＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１２、Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  ａｌｐｈａ１などであることを特徴とするが、これに限定されない。
また、Ｍ２  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ基盤の癌細胞成長を助けるメカニズムを阻害できる薬物、すなわち免疫抑制因子制御物質としては、ＳＴＡＴ３  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒであるｓｕｎｉｔｉｎｉｂ、ｓｏｒａｆｅｎｉｂ、ＷＰ１０６６、ｃｏｒｏｓｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ｏｌｅａｎｏｌｉｃ  ａｃｉｄ、ＳＴＡＴ６  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓらとＭ２  ｐａｔｈｗａｙ（ｃ−Ｍｙｃ、ＰＰＡＲ−ａｌｐｈａ／ｇａｍｍａ、ＰＩ３Ｋ、ＫＬＦ４、ＨＩＦｓ、Ｅｔｓ２、ＤｃＲ３、ｍＴＯＲ）ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓとＨＲＧ、ＣｕＮＧ、ＭＤＸＡＡ、Ｓｉｌｉｂｉｎｉｎ、ＰＰＺであることを特徴とするが、これに限定されない。
【０１１５】
そして、腫瘍微小環境下でｍａｃｒｏｐｈａｇｅの機能を制御できるターゲットｍｉＲＮＡは、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−５１１−３ｐ、ｍｉＲ−２６ａ）であることを特徴とする。
【０１１６】
そして、腫瘍微小環境下でＭａｃｒｏｐｈａｇｅをターゲッティングすることによって、抗癌効能を高めることができるターゲット薬物としては、Paclitaxel, Docetaxel, 5-Flurouracil, Alendronate, Doxorubicin, Simvastatin, Hydrazinocurcumin, Amphotericin B, Ciprofloxacin, Rifabutin, Rifampicin, Efavirenz, Cisplatin, Theophyline, Pseudomonas exotoxin A, Zoledronic acid, Trabectedin, Siltuximab (Anti-IL-6 antibodies), Dasatinib, CpG-ODN, Interferon-alpha, beta, gamma, GM-CSF, IL-12, Thymosin alpha-1, Sunitinib,5,6-Dimethylxanthenone-4-acetic acid, Silibinin, CCL2-CCR2 inhibitors (PF-04136309, Trabectedin, Carlumab), CSF1-CSF1R 信号伝達blocker (BLZ945, PLX3397, Emactuzumab(RG7155), AMG-820, IMC-CS4, GW3580, PLX6134)とトル様受容体７のリガンド(imiquimod, 852A), NF-kB inhibitors (N-acetyl-l-cystein, Vitamin C, bortezomib, aspirin, salicylates, Indolecarboxamide derivatives, quinazolineanalogues, Thalidomide, prostaglandin metabolites), HIF-1 inhibitors (2ME2, 17-AAG, Camptothecin, Topotecan, Pleurotin, 1-methylpropyl, 2-imidazolyl dissulphide, YC-1), CXCR4 アゴニスト (AMD3100, AMD1498), ALX40-4C, T22, T140, CGP64222, KRH-1636)であることを特徴とするが、これに限定されるものではない。
【０１１７】
本発明の一例は、免疫抑制環境因子抑制因子(Transforming growth factor beta (TGF-beta) inhibitors, Nitro aspirin, Cycloxygenase-2(COX2) inhibitors, Indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) inhibitors, Phosphodiesterase-5 (PDE-5) inhibitors, Anti-Interleukin 10 (IL-10))薬物を含有する多重ドメインカプセル基盤組成物を提供することができる。
【０１１８】
本発明の一例においてＴＧＦ−ｂｅｔａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは、ＳＢ−５０５１２４、ＬＹ−３６４９７４などを含むか、これに限定されない。
本発明の一例においてＮｉｔｒｏ  ａｓｐｉｒｉｎは、ＮＣＸ  ４０４０などを含むが、これに限定されない。
本発明の一例においてＣＯＸ−２  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは、Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂなどを含むか、これに限定されない。
本発明の一例においてＩＤＯ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは、Ｉｎｄｏｘｉｍｏｄ、ＮＬＧ９１９等を含むが、これに限定されない。
本発明の一例においてＰＤＥ−５  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒは、Ｔａｄａｌａｆｉｌ（Ｃｉａｌｉｓ）等を含むが、これに限定されない。
本発明の一具現例において、多重ドメインカプセルが含有する固形癌微小環境免疫抑制因子制御物質は、上記の薬物が二つ以上の組合せからなることができる。
本発明の一具現例において、体内に存在する癌細胞を探して直接死滅させる治療能を持っているナチュラルキラー細胞及びＴ細胞が体内で効果的に生存し、治療効能を向上させることができる多重ドメインカプセルを含む免疫調節物質であり得る。
本発明の一例は、固形癌微小環境で直接結合を介したＴ細胞活性化方法で免疫チェックポイント（ＰＤ−１、ＰＤＬ−１  ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＥＡＣＡＭ１）の抑制役割をする抗体を含む多重ドメインカプセル基盤組成物を提供することができる。
本発明の一例においてＡｎｔｉ−ＣＴＬＡ−４  ａｎｔｉｂｏｄｙは、Ｉｐｉｌｉｍｕｍａｂなどを含むが、これに限定されない。
本発明の一例においてＡｎｔｉ−ＰＤ１−ａｎｔｉｂｏｄｙは、Ｎｉｖｏｌｕｍａｂなどを含むが、これに限定されない。
本発明の一例においてＡｎｔｉ−ＰＤＬ１  ａｎｔｉｂｏｄｙは、Ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂなどを含むが、これに限定されない。
本発明の一例においてＡｎｔｉ−ＬＡＧ−３  ａｎｔｉｂｏｄｙは、ＢＭＳ−９８６０１６などを含むが、これに限定されない。
本発明の一例においてＡｎｔｉ−ＴＩＭ−３  ａｎｔｉｂｏｄｙは、ＴＳＲ−０２２などを含むが、これに限定されない。
本発明の一例においてＡｎｔｉ−ＣＥＡＣＡＭ１  ａｎｔｉｂｏｄｙは、ＣＭ−２４などを含むが、これに限定されない。
本発明の一例は、固形癌微小環境で直接結合を介したＴ細胞活性化方法で補助活性因子（ＯＸ４０、ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＣＤ４０）などを含む多重ドメインカプセル基盤組成物を提供する。
本発明の一例においてＡｎｔｉ−ＯＸ４０は、ＲＧ７８８８などを含むが、これに限定されない。
本発明の一例においてＡｎｔｉ−ＣＤ１３７は、Ｕｒｅｌｕｍａｂなどを含むが、これに限定されない。
本発明の一例においてＡｎｔｉ−ＣＤ２７は、Ｖａｒｌｉｌｕｍａｂなどを含むが、これに限定されない。
本発明の一例においてＡｎｔｉ−ＣＤ４０は、ＢＭＳ−９８６０９０などを含むが、これに限定されない。
本発明の一例は、固形癌微小環境で間接結合を介したＴ細胞活性化方法で免疫抑制誘発因子（Ｔｒｅｇ、ＭＤＳＣ、ＴＡＭ、ＩＤＯ、ＰＤ−Ｌ１）を抑制できる薬物を含有する多重ドメインカプセル基盤組成物を提供する。
【０１１９】
本発明の一例は、化学療法を介した免疫原性細胞死（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）の誘導を通じて免疫細胞の効能を増加させる抗癌剤を含む多重ドメインカプセル基盤組成物を提供することができる。
【０１２０】
本発明の一例は、エピジェネティック機序（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を通じて癌細胞を死滅したり、腫瘍微小環境を制御できる薬物を含む多重ドメインカプセル基盤組成物を提供する。
【０１２１】
本発明においてエピジェネティック機序の一例としてＤＮＡメチルトランスフェラーゼインヒビター（ＤＮＭＴｉ）物質としては、5-Azacytidine, 5-Aza-2-deoxycytidine, Decitabine, SGI-110, Zebularine, CP-4200, Cladribine, Fludarabine, Clofarabine, Procainamide, Procaine, Hydralazine, Disulfiram, RG108, Nanaomycin A, Genistein, Equol, Curcumin,EGCG, Resveratrol, Parthenolideなどから選ばれることを特徴とするが、これに限定されない。
【０１２２】
本発明においてエピジェネティック機序の一例として、ヒストンデアセチラーゼインヒビター（ＨＤＡＣｉ）物質としては、Vorinostat, Abexinostat, Suberoylanilide,Hydroxamic acid, Belinostat, Panobinostat, Romidepsin, Valproic acid, Entinostat, Givinostat, Resminostat, Quisinostat,Pracinostat, Dacinostat, Pyroxamide, CHR-3996, CBHA, Trichostatin A, Oxamflatin, MC1568, Tubacin,PCI-30451, Tacedinaline, Mocetinostat, Chidamide, BML-210, M344, Butyrate,Sodium butyrate,Trapoxin A, Apicidin, Nicotinamide, Splitomicin, EX-527, Dihydrocoumarin, Tenovin-D3, AGK2, AEM1, AEM2, Cambinol, Sirtinol, Salermide, Tenovin-6, TMP-269, Psammaplin A, Nexturastat A, RGFP966などから選ばれることを特徴とするが、これに限定されない。
【０１２３】
以下、本発明の実施例を通じて本発明をより詳細に説明しようとするが、下記の実施例は、本発明の理解を助けるために例示するものに過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１２４】
実施例１．免疫調節物質を含む多重ドメインカプセルの製造及び特性化
本発明の実施例では、多重ドメインカプセルを次のように製造した。
【０１２５】
１−１．スクアレン基盤の多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ（ＳＱ））の製造及び特性化
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｔｒｉｏｌｅａｔｅ、１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かしてオイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンをジクロロメタン溶液に分散させた。減圧蒸留装置を使用して前記ジクロロメタンを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。また、スクアレンを含まないことを除いては、前記実施例と同じ方法で対照群を共に製造した。
【０１２６】
上記のように多重ドメインカプセルの構造を光学顕微鏡とＤＬＳ（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、大塚）を利用して観察した結果、スクアレンを含む多重ドメインカプセルが、スクアレンを含まない対照群に比べてサイズが均一し、分散相との界面でも明確な境界を示した［図２の（ａ）及び（ｂ）］。これに対し、スクアレンを含まない対照群では、不均一なサイズと形態を維持することが分かった［図２の（ｃ）及び（ｄ）］。
【０１２７】
また、図３の（ａ）乃至（ｃ）は、スクアレンを含む多重ドメインカプセルの光学顕微鏡イメージであり、図３の（ｄ）乃至（ｆ）は、スクアレンを含まない多重ドメインカプセルの光学顕微鏡イメージである。図３に示されたように、オイル相溶液にローダミン蛍光染料を可溶することによって、多重ドメインカプセル構造を明確に観察することができ、スクアレンを含む多重ドメインカプセルの場合が明確な境界点を示し、水溶液相に分散していることが分かった。
製造後、安定性分析のために、不純物を除去する過程や又は多重ドメインカプセルをサイズ別に分類するために遠心分離（約２５００ｒｐｍ）工程を行った場合、スクアレンを含む多重ドメインカプセルの構造［図４の（ａ）及び（ｃ）］は、遠心分離前後に形状がほとんど変わらず、安定した構造を成しているが、スクアレンを含まない対照群では、大部分の構造が破壊されることを確認することができた［図４の（ｂ）及び（ｄ）］。
【０１２８】
１−２．スクアレン基盤のＭＰＬＡを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−１：ｉｍＭＤＶ（ＭＰＬＡ））の製造及び特性化
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、ＭＰＬＡ［ｍｏｎｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌ  ｌｉｐｉｄ  Ａ、１０ｍｇ、アヴァンティポーラリピッド（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、米国］、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｔｒｉｏｌｅａｔｅ、１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かしてオイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンをジクロロメタン溶液に分散させた。減圧蒸留装置を使用して前記ジクロロメタンを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。図５は、スクアレン基盤のＭＰＬＡを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−１：ｉｍＭＤＶ（ＭＰＬＡ））の光学顕微鏡イメージである。
【０１２９】
製造された多重ドメインカプセルの免疫細胞活性効果の評価
実施例１−１と１−２で製造されたｉｍＭＤＶ（ＳＱ）とｉｍＭＤＶ（ＭＰＬＡ）サンプルが骨髄由来樹状細胞（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、ＢＭＤＣｓ）と骨髄由来大食細胞（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ、ＢＭＭＣｓ）の活性化に及ぼす影響を前駆炎症サイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２）の分泌量をエライサ（ＥＬＩＳＡ）実験方法を利用して分析した。
【０１３０】
図６でｉｍＭＤＶ（ＳＱ）を処理した場合、ＴＮＦ−αとＩＬ−６の分泌が処理した濃度に比例して増加することが確認され、また、図７でｉｍＭＤＶ（ＭＰＬＡ）を処理した場合にも、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１２の分泌が処理した多重ドメインカプセルの濃度に比例して増加することを確認することができた。
【０１３１】
スクアレン基盤の抗原（オボアルブミン）を含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ）の製造及び放出挙動特性化
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（ｇｌｙｃｅｒｏｌ  ｔｒｉｏｌｅａｔｅ、１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液をオボアルブミン（５ｍｇ、シグマアルドリッチ、米国）を含む内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンをジクロロメタン溶液に分散させた。減圧蒸留装置を使用して前記ジクロロメタンを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。また、スクアレンを含まないことを除いては、前記実施例と同じ方法で対照群を共に製造した。
【０１３２】
オボアルブミン抗原とスクアレンを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ（ＳＱ−ＯＶＡ））とオボアルブミン抗原だけを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ（ＯＶＡ））の放出挙動を確認した結果、スクアレンが含まれた多重ドメインカプセルにおいてオボアルブミン抗原の放出挙動が遅延されて徐々に放出されることを確認することができた［図８］。
【０１３３】
１−３．スクアレン基盤のＤＤＡを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−２）の製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、ＤＤＡ（１０ｍｇ、アヴァンティポーラリピッド（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、米国）、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。その後、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。
【０１３４】
１−４．スクアレン基盤のＭＰＬＡ／ＴＤＢを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−３）の製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、ＭＰＬＡ（１０ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、ＴＤＢ（１０ｍｇ、アヴァンティポーラリピッド（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、米国）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。
【０１３５】
１−５．スクアレン基盤のＭＰＬＡ／ＤＤＡを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−４）の製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、ＭＰＬＡ（１０ｍｇ）、ＤＤＡ（１０ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。
【０１３６】
１−６．スクアレン基盤のＭＰＬＡ／ＱＳ２１を含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−５）の製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、ＭＰＬＡ（１０ｍｇ）、ＱＳ２１（１０ｍｇ、Ｄｅｓｅｒｔ  Ｋｉｎｇ、米国）、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。
【０１３７】
１−７．スクアレン基盤のＣｐＧを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−６）の製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ、ＣｐＧ  １ｍｇ、Ｂｉｏｎｅｅｒ、韓国）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。
【０１３８】
１−８．スクアレン基盤のＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−７）の製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相［ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）１ｍｇ］１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。
【０１３９】
１−９．スクアレン基盤のレシキモドを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−８）の製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ、レシキモド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）５ｍｇ）１ｍＬにホモジナイザー（ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ、２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。
【０１４０】
１−１０．スクアレン基盤のイミキモドを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−９）の製造及び免疫反応誘導効果の確認
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、オレイン酸（２ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）、イミキモド（ｂａｓｅ  ｆｏｒｍ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）（５ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。水溶液に溶解するＨＣｌ形態のイミキモドは、ｂａｓｅ形態のイミキモドを次のような過程を通じて製造した。イミキモド４００ｇを蒸留水２０００ｍｌとｎ−ブタノール（あるいは１−ブタノール）９００ｍｌ混合溶液に溶かす。撹拌（Ｓｔｉｒｒｉｎｇ）しながら、同時に３７％  ＨＣｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １５０ｍｌを追加に入れる。この溶液を６０〜６５度の範囲でイミキモドが全部溶けるまで撹拌した後に、イミキモドが全部溶けると、２０〜２５度でｃｏｏｌｉｎｇ  ｄｏｗｎさせた後、約３０分間維持する。残った溶液を常温乾燥機で乾燥させると、ＨＣｌ−イミキモドを得ることができる。このように製造されたＨＣｌ−イミキモドは、上記のｉｍＭＤＶ製造過程で内部水溶液相に溶解した後に、同一過程を経て製造した。図９は、ＨＣｌ形態のイミキモドとｂａｓｅ形態のイミキモド、及び二つの形態のイミキモドが同時にローディングされた多重ドメインカプセルの光学顕微鏡イメージを示す。収得された多重ドメインカプセルのうち（ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ））で、イミキモドの放出挙動をトランスウェル（ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）を利用して、３７℃で分析した。放出される薬物の量は、分光計（ＵＶ−Ｖｉｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ）を利用して定量化した（図１０）。図１０に示されたように、８日間ローディングされた薬物の約７０％が放出された。また、ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）サンプルを骨髄由来樹状細胞（Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ、ＢＭＤＣｓ）に処理したとき、Ｔｈ１免疫反応に関連した代表的な前駆炎症サイトカインＩＬ−６の分泌量をエライサ（ＥＬＩＳＡ）実験方法を利用して分析した。図１１から明らかなように、ＩＬ−６の分泌が処理した濃度に比例して増加することが確認され、対照群として使用されたＲ８３７−ＨＣｌと類似した挙動を示すことを確認することによって、多重ドメインカプセル内に封入されたＲ８３７−ＨＣｌが放出されて、免疫細胞を活性化させることが分かる。
【０１４１】
前記実施例で製造されたイミキモドを含む多重ドメインカプセル［ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）、ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ｂａｓｅ）、ｉｍＭＤＶ［Ｒ８３７−ＨＣｌ：Ｒ８３７−ｂａｓｅ］のオボアルブミンモデル抗原に対する抗体形成効果を、マウス実験（Ｃ５７ＢＬ／６、６乃至７週齢の雌性）を通じて検証した。マウスに多重ドメインカプセルを５０μｇを注入するにつれて体液性免疫反応が増加することをＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法で測定した。
【０１４２】
図１２ａ、図１２ｂ、及び図１２ｃから分かるように、ＯＶＡ（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）モデル抗原に対する体液性免疫効果（ＩｇＧ、１  ｗｅｅｋ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）が、イミキモドがローディングされた多重ドメインカプセルサンプル（１２ａ：ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ）ｓａｍｐｌｅ、１２ｂ：ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ｂａｓｅ）ｓａｍｐｌｅ、１２ｃ：ｉｍＭＤＶ［Ｒ８３７−ＨＣｌ：Ｒ８３７−ｂａｓｅ（１：１）ｓａｍｐｌｅ］）を投与した実験群において顕著に増加することを確認することができる。また、このように増加した体液性免疫効果は、注入後３週（図１３ａ、１３ｂ及び１３ｃ）と５週（図１４ａ、１４ｂ及び１４ｃ）が経過したときにも、持続することを確認することができる。
【０１４３】
体液性免疫増強効果は、一番目の注入後に５週が経過した時点で追加に１回ｂｏｏｓｔｉｎｇをしたとき、顕著に増加することが分かる（図１５ａ、図１５ｂ、図１５ｃ、図１６、図１７、及び図１８）。このような増加した体液性免疫効果は、５週目ｂｏｏｓｔｉｎｇ後に１、２、６週目にも持続的に維持されることを確認することができる（図１９、図２０、及び図２１）。このような多重ドメインカプセル基盤アジュバントによる免疫増強誘導及び持続性効果を臨床段階で使用されているオイル形態のアジュバント（ＤＭＳＯ（Ｒ８３７））と比較した場合にも、非常に優れていることを確認することができる（図２２）。何よりも、オイル形態のアジュバント（ＤＭＳＯ（Ｒ８３７））を投与したときに発生する炎症現象が、多重ドメインカプセル基盤アジュバント（ｉｍＭＤＶ（Ｒ８３７−ＨＣｌ））を使用したときには全く発生しない点が最も大きい長所である（図２３）。
【０１４４】
１−１１．スクアレン基盤のＳＴＩＮＧ（ｃｙｃｌｉｃ  ＤＮＡ）を含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−１０）の製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ、ＳＴＩＮＧ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、米国）１ｍｇ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。
【０１４５】
１−１２．スクアレン基盤のＭＰＬＡ／ＣｐＧを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−１１）の製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、ＭＰＬＡ（１０ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ、ＣｐＧ  １ｍｇ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。
【０１４６】
１−１３．スクアレン基盤のＭＰＬＡとＰｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−１２）の製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、ＭＰＬＡ（１０ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相［ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）１ｍｇ］１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。
【０１４７】
１−１４．スクアレン基盤のＣｐＧ／Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）を含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−１３）の製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相［ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ、ＣｐＧ  １ｍｇ、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）１ｍｇ］１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。
【０１４８】
１−１５．キャスターオイル基盤のＭＰＬＡを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−１４）の製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、ＭＰＬＡ（１０ｍｇ）、キャスターオイル（１２ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。
【０１４９】
１−１６．ミネラルオイル基盤のＭＰＬＡを含む多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ−１５）の製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、ＭＰＬＡ（１０ｍｇ）、ミネラルオイル（１２ｍｇ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ、４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、リポソームを収得した。
【０１５０】
実施例２．ウイルス抗原に対する多重ドメインカプセルの免疫向上効能の評価
実施例１で製造された免疫機能調節物質を含む多重ドメインカプセルサンプルの鳥インフルエンザウイルスに対する特異的免疫効果を調査するために、抗体特異的な免疫反応中、特に抗体生産と関連があるＢ細胞による体液性免疫反応に及ぼす影響を調査した。まず、雌性ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウス（５乃至６週齢）をＫＯＡＴＥＣＨ（韓国、平澤）で購入した。マウスを使用したすべての実験は、実験室研究動物の管理及び使用に対する韓国ＮＩＨ指針に従って実施された。
最初の筋肉注射２週（図２４）及び４週（図２５）後にマウス血清を採取して、血清中のＨＡタンパク質に対する抗体力価（ｔｉｔｅｒ）をＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法で測定した。前記ＥＬＩＳＡ法は、ＨＡタンパク質がコーティングされたプレートをＰＢＳ／３％ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）を使用してブロッキングした後、対照実験群血清を多様な一連の希釈率でインキュベーションした。その後、ホースラディッシュ  ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が付着したマウスＩｇＧを添加した。前記すべてのインキュベーションは、３７℃で１時間の間行われ、言及されたそれぞれの段階後には、ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を使用して３回ずつ洗浄した。基質としては、ＴＭＢ（ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）１００μＬを添加して反応を展開させた後、４５０ｎｍで吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定し、その結果を図２４及び図２５に示した。
【０１５１】
実施例３．癌抗原に対する多重ドメインカプセルの免疫向上効能の評価
３−１：多重ドメインカプセルのＯＶＡ特異抗体生成の確認
前記実施例１で製造された免疫機能調節物質を含む多重ドメインカプセルのウイ癌予防ワクチンの効果を、マウス実験（Ｃ５７ＢＬ／６、６乃至７週齢の雌性）を通じて検証した。マウスに多重ドメインカプセルを含む免疫調節物質（癌予防ワクチン）を５０μｇを注入するにつれて体液性免疫反応が増加することをＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ  ｌｉｎｋｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）法で測定し、その結果を図２６に示した（ＩｇＧ生成量測定）。体液性免疫反応は、ワクチン接種が終わった後、マウスで眼窩採血を実施して、免疫グロブリンとＩｇＧの生成量を対照群と比較することによって確認した。
【０１５２】
３−２：多重ドメインカプセルの細胞媒介特定Ｔ細胞反応の確認
免疫機能調節物質を含む多重ドメインカプセルによるマウス脾臓内Ｔ細胞の細胞性免疫反応を調査した。前記実施例３−１で接種されたマウスのうち、ＯＶＡ及びＯＶＡ−多重ドメインカプセルグループのうち３匹のマウスを選択して２週後にそれぞれのマウスで脾臓を摘出した後、滅菌されたペトリディッシュに前記脾臓組織を移し、セルストレーナー（ｃｅｌｌ  ｓｔｒａｉｎｅｒ）を利用して前記脾臓をすりつぶして組織被膜から細胞を分離した。前記ペトリディッシュ内のすべての内容物を５０ｍＬチューブに移し、ＲＰＭＩ培地でいっぱいに満たした後、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を除去したペレットに赤血球溶出バッファー（ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を５ｍＬ入れ、３０℃水槽で５分乃至１０分間放置して、赤血球を溶血させた。チューブに含まれた細胞をＰＢＳで洗浄した後、ＲＰＭＩ培地に浮遊させて脾臓細胞（ｓｐｌｅｎｏｃｙｔｅ）を分離した。分離した脾臓細胞をＩＦＮ−ｇａｍｍａでコーティングされたプレートに５×１０５ｃｅｌｌ／１００μＬで９６−ウェルに敷設し、ＭＨＣクラスＩ−制限ＯＶＡペプチドを５μｇ／ｍＬの濃度で４８時間の間処理した。その後、ホースラディッシュ  ペルオキシダーゼが付着したＩＦＮ−ｇａｍｍａを添加した。基質としては、ＡＣＥ（３−ａｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌ−ｃａｒｂａｚｏｌｅ、ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）１００μＬを添加して反応を展開させた後、ＥＬＳＰＯＴ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｐｏｔ）法で測定した（図２７）。
【０１５３】
実施例４．固形癌微小環境調節用薬物がローディングされた多重ドメインカプセルの製造
４−１．ＭＤＳＣ細胞除去物質を含有する多重ドメインカプセルの製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液を内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ、ゲムシタビン（Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ：Ｇｅｍｚａｒ（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．，ＵＳＡ）），５ｍｇ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後、前記混合溶液を外部水溶液相（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ，７．５％ｇｌｕｃｏｓｅ，４０ｍＭ  ｌｙｓｉｎｅ）３ｍＬに１０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）した。最終的に、この形成された二重エマルジョンを減圧蒸留装置を使用して前記クロロホルムを除去し、温度を３７℃に上昇させて残余溶媒を除去した。溶媒が除去された多重ドメインカプセル分散液を低温で沈殿させたり、遠心分離機で沈降させて上澄み液を除去し、多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ（ＳＱ−Ｇｅｍ））を収得した。スクアレン流動性オイルの代わりに、オレイン酸オイルを含み、かつゲムシタビンがローディングされた多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ（ＯＡ−Ｇｅｍ））と、スクアレンを含まなく、かつゲムシタビンがローディングされた多重ドメインカプセル（（ｉｍＭＤＶ（Ｇｅｍ））は、上記の過程と同じ過程を通じて製造され得る。図２８は、このように製造された三つの試料の光学顕微鏡イメージを示す。スクアレンを含む多重ドメインカプセルでは、ローディングされたゲムシタビンが徐々に放出される反面、スクアレンを含まない多重ドメインカプセルでは２４時間内にローディングされた大部分の薬物が放出されることを確認することができる（図２９）。また、スクアレンのような動物性オイルの代わりにオレイン酸植物性オイルを使用した場合、ローディングされたゲムシタビンの徐放型放出挙動が２４乃至７２時間の間にプラトー（ｐｌａｔｅａｕ）形状を示し、７２時間以後に線形（ｌｉｎｅａｒ）挙動を示すことを確認することができた。これは、流動性オイルを利用して、ローディングされた薬物の放出挙動を調整することができることを意味する（図３０）。
【０１５４】
４−２．免疫原性細胞死（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ）を誘導する薬物を含む多重ドメインカプセルの製造
癌細胞の死滅を誘導することによって、抗原提示細胞が効果的に癌抗原を認識できるようにする役割をする抗癌剤のうちパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）及びオキサリプラチン（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）を選定して、これらの薬物がローディングされた多重ドメインカプセルを製造した。実施例４−１と同じ方法を利用して製造するものの、ｉｍＭＤＶ（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）（図３１）は、パクリタキセル薬物をオイル相溶液に添加して使用し、ｉｍＭＤＶ（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）（図３２）、ｉｍＭＤＶ（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）（図３３）及びｉｍＭＤＶ（ｏｘａｌｉｐｌａｔｉｎ）（図３４）は、それぞれの薬物を内部水溶液相に添加して多重ドメインカプセルを製造した。図３１から分かるように、ローディングされた薬物が２週間にわたって徐々に放出されることを確認することができた。
【０１５５】
４−３．Ｔｒｅｇ細胞除去物質を含有する多重ドメインカプセルの製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液をＭＫ−２２０６（ａｎ  Ａｋｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍ、５ｍｇ）が溶解している内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ、（Ｉｍａｔｉｎｉｂ：Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ、Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ、ＵＳＡ））５ｍｇ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後の過程は、前記実施例４−１と同じ過程を経て多重ドメインカプセルを製造した（図３５）。
【０１５６】
４−４．ＰＩ３Ｋ信号伝達を制御できる薬物を含有する多重ドメインカプセルの製造
ＤＯＰＣ（１０ｍｇ）、コレステロール（８ｍｇ）、スクアレン（１２ｍｇ）、グリセロールトリオレート（１２ｍｇ）をクロロホルム（１ｍＬ）に溶かして、オイル相溶液を製造した。製造されたオイル相溶液をＰＦ−０４６９１５０２（ＰＩ３Ｋ  ｉｎｈｂｉｔｏｒ、Ｓｅｌｌｅｃｋ Ｃｈｅｍ、５ｍｇ）が溶解している内部水溶液相（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ａｑｕｅｏｕｓ  ｐｈａｓｅ、５％ｓｕｃｒｏｓｅ、（Ｉｍａｔｉｎｉｂ：Ｇｌｅｅｖｅｃ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐ、Ｅａｓｔ  Ｈａｎｏｖｅｒ、ＮＪ、ＵＳＡ））５ｍｇ）１ｍＬにホモジナイザー（２０，０００×ｇ）を使用して１０分間分散させた。その後の過程は、前記実施例４−１と同じ過程を経て多重ドメインカプセルを製造した（図３６）。
【０１５７】
４−５．エピジェネティック機序（ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）を制御できる薬物を含む多重ドメインカプセルの製造
エピジェネティック機序を誘導できる薬物のうちＡｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ、Ｒｅｓｍｉｎｏｓｔａｔ、Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ及びＯＴＸ０１５（ｉＢＥＴ）を選定して、これらの薬物がローディングされた多重ドメインカプセルを製造した。具体的に、実施例４−１と同じ方法を利用してｉｍＭＤＶ（Ａｚａｃｙｔｉｄｉｎｅ）（図３７）、ｉｍＭＤＶ（Ｒｅｓｍｏｎｏｓｔａｔ）（図３８）、ｉｍＭＤＶ（Ｐａｎｏｂｉｎｏｓｔａｔ）（図３９）及びｉｍＭＤＶ（ＯＴＸ０１５（ｉＢＥＴ））（図４０）は、それぞれの薬物を内部水溶液相に添加して多重ドメインカプセルを製造した。図３８、図３９から分かるように、ローディングされた薬物が２週間にわたって徐々に放出されることを確認することができた。
【０１５８】
４−６．ＴＡＭ細胞除去物質を含有する多重ドメインカプセルの製造
実施例４−１と同じ工程を使用するものの、ＴＡＭ細胞を除去できる薬物であるＢＬＺ９４５（ＣＳＦ−１Ｒ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）オイル相に溶解した後に、多重ドメインカプセルを製造した（図４１）。
【０１５９】
４−７．腫瘍免疫抑制サイトカイン阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）を含有する多重ドメインカプセルの製造
実施例４−１において腫瘍免疫抑制サイトカイン阻害剤薬物（Ｃｅｌｅｃｏｘｉｂ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）５ｍｇをオイル相に溶解した後に、多重ドメインカプセルを製造した（図４２）。
【０１６０】
実施例５．固形癌微小環境免疫調節物質が組み合わせられた多重ドメインカプセルの製造
固形癌微小環境内免疫機能を調節する物質が組み合わせられた多重ドメインカプセル製造の一実施例としてＭＤＳＣ及び癌細胞を死滅できるゲムシタビン（実施例４−１）と免疫細胞活性化作用をするトル様受容体であるイミキモド（実施例１−９）を同時に含有しつつ安定した構造を有する多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ（ＧＥＭ／Ｒ８３７））を製造した（図４３）。
また、ＴＡＭ細胞を除去できる薬物であるＢＬＺ９４５（実施例４−６）と免疫細胞活性化作用をするトル様受容体であるイミキモド（実施例１−９）を同時に含有しつつ安定した構造を有する多重ドメインカプセル（ｉｍＭＤＶ（ＢＬＺ９４５／Ｒ８３７））を製造した（図４４）。
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本願の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的ないものと理解すべきである。例えば、単一型と説明されている各構成要素は、分散して実施されてもよく、同様に分散したものと説明されている構成要素も、結合された形態で実施されてもよい。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは後述する特許請求範囲により示され、特許請求範囲の意味及び範囲そしてその均等概念から導き出されるすべての変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【０１６１】
本発明による多重ドメインカプセルは、リポソームの内部に親水性性質を有する多様な免疫調節物質、リポソームのメンブレイン及び／又は前記カプセルの外壁に親油性免疫調節化物質を同時にローディングすることによって、免疫調節物質の有効持続時間を増加させることができる。また、本発明による多重ドメインカプセルの製造方法は、スクアレンのような流動性オイルを導入することによって、多重ドメインカプセルの製造過程での安定性及び貯蔵安定性を向上させることができ、前記流動性オイルの導入によって、一般的な有機溶媒に溶けない代表的な難溶性免疫調節物質を容易に可溶化することができ、これにより、前記多様な難溶性免疫調節物質を含む多重ドメインカプセルを製造することができるという長所がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５ａ】
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【図１５ｂ】
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【図１５ｃ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月29日(2019.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
互いに接触し連結されている二つ以上のリポソーム、及び前記二つ以上のリポソームを囲む多重ドメインカプセル外壁を含む多重ドメインカプセルであって、
前記多重ドメインカプセルは有機相と水溶液相からなり、
前記有機相は第１免疫調節物質及び流動性オイルを含み、前記有機相は前記リポソームのメンブレイン、及び前記多重ドメインカプセル外壁を形成し、
前記水溶液相は第２免疫調節物質を含み、前記水溶液相は前記リポソームメンブレインの内部水溶液相及びリポソームメンブレインの外部水溶液相であり、
前記第１免疫調節物質は脂溶性免疫活性物質であり、前記第２免疫調節物質は水溶性免疫活性物質であり、
前記流動性オイルは互いに接触し連結されている二つ以上のリポソームの構造安定性を向上させることを特徴とする、多重ドメインカプセル。
【請求項２】
前記多重ドメインカプセルのサイズは、１μｍ乃至１００μｍである、請求項１に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項３】
前記流動性オイルは、動物性オイル、植物性オイル、トコフェロール、ミネラルオイル、キャスターオイル、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれたものを含む、請求項１に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項４】
前記動物性オイルは、スクアレンであり、前記植物性オイルは、オレイン酸である、請求項３に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項５】
前記脂溶性及び水溶性免疫活性物質は、抗原提示細胞、Ｂ細胞、又はＴ細胞の活性化を誘導する物質を含む、請求項１に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項６】
前記脂溶性免疫活性物質は、カチオン性脂質、ＭＰＬＡ、ＡＧＰ、ＣＲＸ−５２７、ＰＨＡＤ、３Ｄ−ＰＨＡＤ、ＧＬＡ、脂質ペプチド、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｐａｍ３Ｃｙｓ−Ｌｉｐ、イミキモド（ｂａｓｅ  ｆｏｒｍ）、レシキモド（ｂａｓｅ  ｆｏｒｍ）、ＶＴＸ−２３３７、ＣＲＸ６４２、サポニン（ＱＳ２１）、ＴＤＢ、ＣＬ４０１、ＣＬ４２９、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含む、請求項１に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項７】
前記水溶性免疫活性物質は、ＣｐＧ、イミキモド（ＨＣｌ  ｆｏｒｍ）、レシキモド（ＨＣｌ  ｆｏｒｍ）、Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ＳＴＩＮＧ、フラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）、サポニン、ＫＬＫペプチド、ＮＯＤアゴニストペプチド、Ｐｏｌｙ（ｄＡ：ｄＴ）、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含む、請求項１に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項８】
前記カチオン性脂質は、ＤＣ−コレステロール、ＤＤＡ、ＤＯＴＡＰ、ＤＯＴＭＡ、ＥＰＣ、ＭＶＬ５、ＤＯＤＡＰ、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる物質を含む、請求項６に記載の多重ドメインカプセル。
【請求項９】
請求項１乃至８のいずれかに記載の多重ドメインカプセル及び抗原を含む、免疫調節組成物。
【請求項１０】
前記抗原は、タンパク質、遺伝子、細胞、ウイルス、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれるものである、請求項９に記載の免疫調節組成物。
【請求項１１】
第１免疫調節物質及び流動性オイルを溶媒に溶解して、オイル相溶液を製造する段階；
第２免疫調節物質を含む第１水溶液相を前記オイル相溶液に分散させて、油中−水（Ｗ／Ｏ）エマルジョンを製造する段階；及び
前記油中−水エマルジョンを第２水溶液と混合し、前記溶媒を蒸発させる段階；を含み、
前記第１免疫調節物質は、脂溶性免疫活性物質であり、前記第２免疫調節物質は、水溶性免疫活性物質であることを特徴とする、多重ドメインカプセルの製造方法。
【国際調査報告】
2020510663.tif 000055
2020510663.tif 000056
2020510663.tif 000057
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