(57)【要約】本発明は、細胞における二重鎖ＤＮＡの標的化改変に関し、それにより、オープンリーディングフレームが第２のインデルの後では改変されないように、２つの部位特異的ヌクレアーゼがインデルを生成する。本発明は、二重鎖ＤＮＡのオープンリーディングフレームを標的化改変するためのそのようなヌクレアーゼの使用、及び本発明の方法において使用するためのキットオブパーツにさらに関する。本発明の方法の使用により、改善された除草剤耐性を有する新規植物が得られた。したがって、本発明はまた、改変されたＡＬＳタンパク質の発現により除草剤耐性が改善された植物に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重鎖ＤＮＡのコード配列（ＣＤＳ）を標的化改変するための方法であって、二重鎖ＤＮＡを少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼに曝露するステップを含み、第１の部位特異的ヌクレアーゼがＤＮＡを切断してＯＲＦ内の第１の位置で第１のインデルを生成し、第２の部位特異的ヌクレアーゼがＤＮＡを切断して同一ＣＤＳ内の第２の位置で第２のインデルを生成し、前記第１のインデルの前及び前記第２のインデルの後のＣＤＳは同一リーディングフレームのままであり、改変されたＣＤＳは終止コドンを含まない、方法。
【請求項２】
ＣＤＳが、第１の位置で少なくとも１つのヌクレオチドを導入又は欠失することにより、及び第２の位置で少なくとも１つのヌクレオチドを導入又は欠失することにより改変され、導入されるヌクレオチドの合計が、好ましくは０、３、６、９若しくは１２個であり、及び／又は欠失されるヌクレオチドの合計が、好ましくは０、３、６、９若しくは１２個である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
改変されたＣＤＳの長さが約１〜３００コドンの間であり、好ましくは約１〜２５０、１〜２００、１〜１５０、１〜１００、１〜５０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０又は１〜５コドンの間である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであり、前記方法が二重鎖ＤＮＡを、
ｉ）第１のヌクレアーゼを二重鎖ＤＮＡの第１の位置にターゲティングするための第１のガイド配列を含む第１のガイドＲＮＡ；及び／又は、
ｉｉ）第２ヌクレアーゼを二重鎖ＤＮＡの第２の位置にターゲティングするための第２のガイド配列を含む第２ガイドＲＮＡ
に曝露することをさらに含む 、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがＣａｓ９又はＣｐｆ１である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つがジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
二重鎖ＤＮＡが２、３又は４つの部位特異的ヌクレアーゼに曝露され、前記２、３又は４つの部位特異的ヌクレアーゼが同一ＣＤＳの二重鎖ＤＮＡを切断する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
二重鎖ＤＮＡが細胞内にある、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、前記部位特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つ及び／又は前記ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つで形質転換される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、前記部位特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つ及び／又は前記ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つをコードする核酸構築物でトランスフェクトされ、前記核酸構築物が、好ましくは、少なくとも２つのガイドＲＮＡをコードする、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記標的化改変を含む植物又はその子孫を再生するステップをさらに含む、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１１の方法によって得ることができる植物であって、前記植物が対照と比較した場合に標的化改変を含むことにより修飾されており、前記対照が、標的化改変が導入される前の植物であり、
前記植物が、
ｉ）配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、５４７〜５７０位が配列番号３〜５のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有する、
少なくとも１つの改変されたＡＬＳ遺伝子を含み；又は、
ｉｉ）前記ＡＬＳ遺伝子が配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有し、５４１〜５６４位が配列番号３〜５のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有し、
前記植物が対照と比較して改善された除草剤耐性を有する、植物。
【請求項１３】
改善された除草剤耐性を有する植物であって、前記植物が、
ｉ）配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有し、１８３〜１９２位が配列番号１１〜１３のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有するか；又は、
ｉｉ）配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有し、１８１〜１９０位が配列番号１１〜１３のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有する、
アミノ酸配列を含む少なくとも１つの改変されたＡＬＳタンパク質を発現するように遺伝子操作されており、
前記植物が、改変されたＡＬＳタンパク質を発現しない同一植物と比較して改善された除草剤耐性を有する、植物。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法において使用するためのキットオブパーツであって、
部位特異的ヌクレアーゼ及び／又は前記部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸構築物を含む容器；
請求項１〜１１のいずれか一項で定義した方法に従って細胞における二重鎖ＤＮＡのＣＤＳを標的化改変するためのマニュアル；及び任意選択で、
少なくとも２つのガイドＲＮＡ又は少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸構築物を含む第２の容器
を含み、
第１の容器が、好ましくは、
ｉ）少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼ；
ｉｉ）前記部位特異的ヌクレアーゼをコードする少なくとも２つの核酸構築物；又は、
ｉｉｉ）少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸構築物
を含む、キットオブパーツ。
【請求項１５】
細胞における二重鎖ＤＮＡのＣＤＳを標的化改変するための、請求項１〜９のいずれか一項で定義した少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼ、又は請求項１４で定義したキットオブパーツの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞の二重鎖ＤＮＡの標的化変異誘発及び修飾に関し、そのような変異及び修飾を生成するための方法及び組成物を含む。
【背景技術】
【０００２】
生細胞の遺伝物質に故意に変化を生成させるプロセスは、その細胞、又はその細胞が一部を形成するか若しくはその細胞から再生され得る生物体の１つ又は複数の遺伝的にコードされた生物学的特性を修飾するという目的を有する。これらの変化は、例えば、遺伝物質の一部の欠失、外因性遺伝物質の付加、又は遺伝物質の既存のヌクレオチド配列の変化の形態をとる。真核生物の遺伝物質を改変する方法は２０年以上にわたり公知であり、農業、人間の健康、食品の品質及び環境の保護の分野における改善のために、植物、ヒト及び動物の細胞、並びに微生物において広く適用されることがわかっている。最も一般的な方法は、外因性ＤＮＡ断片を細胞のゲノムに加えることからなり、これが、既存の遺伝子の発現がそれにより抑制される適用を含め、既存の遺伝子によりコードされている特性に加えて、その細胞又はその生物体に新しい特性が付与される。多くのこのような例は望ましい特性を得るのに効果的であるが、これらの方法はいくつかの欠点を有する。例えば、これらの従来の方法はそれほど正確ではなく、その理由としては、外因性ＤＮＡ断片が挿入されるゲノム位置について（したがって、最終的な発現レベルにて）常にコントロールできるものでなく、また望ましい効果が、元の十分にバランスがとれたゲノムによってコードされている自然の特性を超えて出現しなければならないからである。対照的に、所定のゲノム遺伝子座におけるヌクレオチドの付加、欠失又は変換をもたらすゲノム編集の方法は、既存の遺伝子の正確な修飾を可能にする。
【０００３】
最近、ゲノム編集のための新しい方法が報告されている。ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）は、複数の短い直接配列リピートを含む遺伝子座であり、配列決定された細菌の４０％及び配列決定された古細菌の９０％で確認されている。ＣＲＩＳＰＲリピートは、遺伝的病原体、例えばバクテリオファージ及びプラスミドに対して獲得された細菌免疫のシステムを形成する。細菌が病原体により攻撃された場合、病原体のゲノムの小さな断片がＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質（Ｃａｓ）によってプロセシングされ、ＣＲＩＳＰＲリピート間の細菌ゲノムに組み込まれる。次いで、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は転写され、プロセシングされて、病原体ゲノムと同一の約３０ｂｐの配列を含む、いわゆるｃｒＲＮＡを形成する。これらのＲＮＡ分子は、その後、感染の際に病原体を認識するベースを形成し、病原体ゲノムの直接消化を介して病原体の遺伝要素のサイレンシングをもたらす。Ｃａｓ９タンパク質は、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの必須成分であり、ｃｒＲＮＡと、ｃｒＲＮＡにより規定されるゲノムの位置にＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を導入することによって、分解のため侵入病原性ＤＮＡを標的とするトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と呼ばれる第２のＲＮＡと組み合わされた場合にエンドヌクレアーゼを形成する。最近、Ｊｉｎｅｋら（２０１２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６〜８２０）は、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの必須配列を単一ＲＮＡ分子に結合させることにより生成される単鎖キメラＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ、ｓＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ）が、Ｃａｓ９との組合せで機能性エンドヌクレアーゼを形成できることを証明した。多くの様々なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが異なる細菌種から同定されている（Ｚｅｔｓｃｈｅら  ２０１５  Ｃｅｌｌ  １６３，  ７５９〜７７１；Ｋｉｍら  ２０１７，  Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ８，  １〜７；Ｒａｎら  ２０１５．  Ｎａｔｕｒｅ  ５２０，  １８６〜１９１）。
【０００４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムは、幅広い様々な生物体及び細胞タイプにおけるゲノム編集に使用することができる。最初に、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼがＤＳＢを誘導するゲノム配列が同定され、次いでこれがプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在についてスクリーニングされる。ＰＡＭ配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ活性にとって不可欠であり、比較的短く、したがって、通常、ある程度の長さの任意の所定の配列に複数回存在する。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９タンパク質のＰＡＭモチーフはＮＧＧであり、これにより確実に、任意の所定のゲノム配列について複数のＰＡＭモチーフが存在し、多くの異なるガイドＲＮＡが設計され得る。さらに、同一の二本鎖配列の反対鎖を標的とするガイドＲＮＡも設計され得る。ＰＡＭに直接隣接する配列がガイドＲＮＡに組み込まれる。これは、使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに応じて長さが異なり得る。例えば、Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡのターゲティング配列の最適な長さは２０ｎｔであり、ほとんどの場合、この長さの配列は植物ゲノム内で固有である。植物細胞における発現については、ガイドＲＮＡをコードする遺伝子をＲＮＡポリメラーゼ−ＩＩＩプロモーターに、例えばシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＵ６プロモーター、又は実験が実施される細胞タイプ、生物体、植物の種若しくはファミリー由来の対応する若しくは機能的に類似したｐｏｌ−ＩＩＩプロモーターに連結させることができる。
【０００５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、実験が実施される生物体又は細胞タイプに適した構成的プロモーター又は誘導性プロモーターの任意の形態から細胞において発現され得る。場合によっては、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼのタンパク質発現レベルは、特定の細胞タイプ又は生物体に対するそのコドン使用頻度の最適化により改善することができる。
【０００６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムの２つの構成要素であるエンドヌクレアーゼ及びターゲティングＲＮＡ（複数可）は、異所性ゲノム要素、例えば、（非複製）プラスミド構築物、ウイルスベクターから細胞において発現され得るか、又は細胞若しくは生物体においてタンパク質（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ）及びＲＮＡ（ガイドＲＮＡ）として直接導入され得る。さらに、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓエンドヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡが使用可能である。プラスミド又はウイルスベクターが形質転換細胞において複製できない場合、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ及びガイドＲＮＡ（複数可）は短時間発現又は存在した後、細胞から除去される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質及びガイドＲＮＡの安定的発現はトランスジェニック手法を使用して達成することができ、それにより、それらをコードする遺伝子が宿主ゲノムに組み込まれる。
【０００７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡが細胞内において存在／発現した場合、２つの構成要素の複合体が、ガイドＲＮＡ及び隣接するＰＡＭ配列のターゲティング配列に相補的な配列についてゲノムＤＮＡをスキャンする。使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼに応じて、複合体はその後、ＰＡＭから様々な距離で両方のＤＮＡ鎖においてニックを誘発する。例えば、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ配列の３ｂｐ上流の両ＤＮＡ鎖にニックを導入し、平滑ＤＮＡ  ＤＳＢを生成する。ＤＮＡ  ＤＳＢが生成されると、細胞のＤＮＡ修復機構、特に非相同性末端結合（ＮＨＥＪ）経路に属するタンパク質がＤＮＡ末端の再連結に関与する。このＤＳＢが正確に修復されたならば、その後、配列はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ガイドＲＮＡ複合体による切断の標的を形成する。しかし、一部の再連結事象は不正確であり、切断時に数個のヌクレオチドがランダム欠失したり又は付加されたりする可能性があり、その結果、ゲノムＤＮＡにインデル変異が生じる。これが、ガイドＲＮＡの結合を阻止し、したがって任意のさらなるＤＳＢ誘導を阻止する標的配列の改変をもたらす。ＤＳＢがコード配列において誘導される場合、インデルが生成され、タンパク質リーディングフレームの改変が起こり、ヌル変異が生成される。或いは、３ヌクレオチドの倍数の欠失又は挿入（例えば、＋３、＋９、−６）をもたらす任意のインデルは、インフレーム変異を生成し、これはタンパク質機能の消去というよりタンパク質機能に影響を及ぼし得るのみである。Ｉｐｓａｒｏら（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．  ２０１７；１２（２）：ｅ０１７２１７７）は、二本鎖切断がこのような稀なインフレーム変異が生じ、いくつかのアミノ酸残基に影響を及ぼす単一ガイドＲＮＡの導入を教示している。それにもかかわらず、単一ガイドＲＮＡの導入がインフレーム変異を引き起こす確率は非常に低い。
【０００８】
最近、植物細胞におけるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用したインデル変異の生成を説明するいくつかの刊行物があった（Ｌｉら  （２０１３）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３１：６８８〜６９１；Ｓｈａｎら  （２０１３）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３１：６８６〜６８８；Ｎｅｋｒａｓｏｖら  （２０１３）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３１：６９１〜６９３；Ｆｅｎｇら  （２０１３）  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  ２３：１２２９〜１２３１）。これらのすべての研究において、植物細胞におけるＣａｓ９タンパク質及びキメラＲＮＡの生成は、ＤＮＡベースの発現ベクター、例えばプラスミド又はＴ−ＤＮＡを使用して達成されている。これらは植物プロトプラストに導入されるか、又は植物ゲノムに組み込まれ、次いで、標的配列にＩＮＤＥＬ変異を含有する細胞又は再生植物が同定された。他の刊行物には、Ｃａｓ９タンパク質及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現されたガイドＲＮＡの植物プロトプラストへの導入による変異の生成（Ｍａｌｎｏｙら（２０１６）  Ｆｒｏｎｔ．  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ．  ７：  １９０４）、並びにこれらのプロトプラストの植物への再生（Ｗｏｏら  （２０１５）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３３  （１１）：  １１６２〜１１６５）が説明されている。
【０００９】
２つの単一ガイドＲＮＡが同一細胞に導入され、それぞれのｇＲＮＡが２つの別個の遺伝子座の編集を目的とする異なるＣＤＳを標的とすることが当技術分野でさらに説明されている（Ｆａｒｂｏｕｄ及びＭｅｙｅｒ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  ２０１５  Ａｐｒ；  １９９（４）：９５９〜７１）。さらに、介在する非コード調節ＤＮＡ要素を欠失又は反転させる目的で、２つの単一ガイドＲＮＡが、同一ＤＮＡ分子内の別々の非コード領域でＤＳＢを生成するために単一細胞に導入された（Ｓｅｒｕｇｇｉａら，  ２０１５，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ；４３（１０）：４８５５〜６７）。
【００１０】
ヌル対立遺伝子の生成は、遺伝子機能を研究するための非常に強力な技術であり、細胞又は生物体の表現型に対する遺伝子の喪失の影響を調査することができる。ヌル対立遺伝子の生成は非常に極端な表現型を提供する可能性があり、多くの場合、植物育種においては、より微妙な形態の対立遺伝子変異がより有益となり得る。例えば、単一アミノ酸の変化は、商業的に興味がもたれる表現型を有する優れた対立遺伝子を生成する可能性がある。したがって、個々の（又は隣接する）ヌクレオチドを改変することができる技術もまた価値がある。最近、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼとシトシンデアミナーゼタンパク質の融合からなるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムのバリエーションが公開された（Ｋｏｍｏｒら  ２０１６．  Ｎａｔｕｒｅ  ５３３，  ４２０〜４２４；Ｚｏｎｇら  ２０１７．  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３５，  ４３８〜４４０；Ｓｈｉｍｉｔａｎｉら  ２０１７．  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３５，４４１〜４４３）。この場合、融合タンパク質は、特定のゲノム配列を標的化し、そこで特定のシトシンがチミンに変換され、コード配列のコドンを改変してタンパク質内の個々のアミノ酸を変化させるが、これにより、遺伝子のリーディングフレームは変化しない。しかし、単一アミノ酸の改変は、多くの場合、タンパク質機能を改変するには不十分な可能性がある。さらに、ＣからＴへのすべての変化が、コードされたアミノ酸を改変するわけではない。したがって、当技術分野においては、所定のアミノ酸ストレッチを改変するための効率的な方法が依然として必要とされている。
【００１１】
対立遺伝子変異は、単一の点変異の良性効果とヌル対立遺伝子の重篤な効果の間のレベルへと増加する可能性があり、例えば、それにより、いくつかの（所定の）隣接アミノ酸が同時に改変される。したがって、これを可能にする技術の開発、例えば、限定するものではないが、１つ又は複数の除草剤に対する耐性をもたらす新しい変異体、例えばＡＬＳ変異体の開発における使用が必要とされている。
【００１２】
植物及び細菌で確認されているアセト乳酸合成酵素遺伝子（ＡＬＳ）は、分岐アミノ酸（バリン、ロイシン及びイソロイシン）の合成に関与する必須タンパク質である。ＡＬＳはまた、いくつかの公知の除草剤、例えば、スルホニル尿素（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭ）、トリアザロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）、及びスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン（ＳＣＴ）の標的タンパク質でもある。１つ又はいくつかのクラスのＡＬＳ阻害剤に様々な程度の除草剤耐性を付与する多数の優性ＡＬＳ変異が公知である（Ｒｏｕｘら  ２００５．  Ｗｅｅｄ  Ｒｅｓ．  ４５，  ２２０〜２２７）。ＳＵクラスの除草剤に対する耐性を付与する多数の変異は、Ｐ１８４のコドン内又はコドン周辺に存在する（例えば、Ｐ１８４Ｌ、Ｐ１８４Ｒ、Ｐ１８４Ｑなど）。そのような変異は雑草種で自発的に生じるか、又は組織培養増殖若しくはランダム変異誘発手法の際に作物種において選択されている。そのような変異の有用性は、除草剤／作物の組合せ、及び変異が植物に付与し得る耐性のレベルに応じて変化する。多くのＳＵクラスの除草剤、例えば、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロンメチル、クロルスルフロン、シノスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロンメチル、フォラムスルフロン、ロドスルフロン、メソスルフロン、メスルフロンメチル、ニコスルフロン、リムスルフロン、チフェンスルフロンメチル、トリアスルフロン、トリベヌロンメチル、トリフルスルフロンメチル、イマザモックス、イマザピル、イマザキン及びメトスラムがあり、これらの多くは市販の製剤に使用されている。したがって、（１）より広範囲の化合物、及び／又は（２）除草剤の高い濃度に対する耐性を付与する新規ＡＬＳ耐性変異を同定することも必要とされている。
【００１３】
本発明の方法を使用することにより、本発明者らは、他の作物種において操作され得る新規の除草剤耐性ＡＬＳ対立遺伝子を同定した。
【００１４】
ここにおいて、新規の特性をスクリーニングするためのＤＮＡの変異誘発（例えば、変異誘発物質への曝露の結果として）は、当技術分野においては長く知られている。しかし、そのような変異は、多くの場合、１つ又は複数のタンパク質コード配列のランダムな位置に生成される。或いは、タンパク質をコードするＤＮＡは、特定の位置で、変異、例えば切断され得る。変異されたＤＮＡは、結果的に、先に切断された位置に１つ又は複数のインデルを含み、それによって、切断された位置の後にフレームシフトを引き起こし得る。そのようなフレームシフトは、通常、タンパク質の機能の喪失をもたらす。
【００１５】
しかし、そのような大幅な機能の喪失は、特に、変異されたタンパク質が目的の機能を実現する場合、必ずしも好まれるとは限らない。そのような場合、代わりに、例えばその機能を変更するために、タンパク質の短い所定のストレッチを修飾することが望まれることがある。したがって、タンパク質の特定部分のみを選択的に修飾することが当技術分野で依然として強く必要とされている。特に、例えば、変異されたタンパク質によって付与される新しい特性をスクリーニングするために、タンパク質コード配列の特定部分を簡単な方法でランダムに改変し、変異タンパク質を生成することが当技術分野において必要とされている。
【００１６】
〔発明の概要〕
第１の態様では、本発明は、二重鎖ＤＮＡのコード配列（ＣＤＳ）を標的化改変するための方法であって、二重鎖ＤＮＡを少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼに曝露するステップを含み、第１の部位特異的ヌクレアーゼがＤＮＡを切断してＯＲＦ内の第１の位置で第１のインデルを生成し、第２の部位特異的ヌクレアーゼがＤＮＡを切断して同一ＣＤＳ内の第２の位置で第２のインデルを生成し、第１のインデルの前及び第２のインデルの後のＣＤＳが同一リーディングフレームのままであり、改変されたＣＤＳは終止コドンを含まない、方法に関する。
【００１７】
好ましくは、ＣＤＳは、第１の位置で少なくとも１つのヌクレオチドを導入又は欠失することにより、及び第２の位置で少なくとも１つのヌクレオチドを導入又は欠失することにより改変され、導入されるヌクレオチドの合計は、好ましくは０、３、６、９若しくは１２個であり、及び／又は欠失されるヌクレオチドの合計は、好ましくは０、３、６、９若しくは１２個である。
【００１８】
好ましい方法では、改変されたＣＤＳの長さは、約１〜３００コドンであり、好ましくは約１〜２５０、１〜２００、１〜１５０、１〜１００、１〜５０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０又は１〜５コドンである。好ましくは、ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであり、この方法は、二重鎖ＤＮＡを、
ｉ）第１のヌクレアーゼを二重鎖ＤＮＡの第１の位置にターゲティングするための第１のガイド配列を含む第１のガイドＲＮＡ；及び／又は、
ｉｉ）第２のヌクレアーゼを二重鎖ＤＮＡの第２の位置にターゲティングするための第２のガイド配列を含む第２のガイドＲＮＡ
に曝露することをさらに含む。好ましくは、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１である。
【００１９】
好ましい実施形態では、ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮからなる群から選択される。
【００２０】
好ましくは、二重鎖ＤＮＡは、２、３又は４つの部位特異的ヌクレアーゼに曝露され、２、３又は４つの部位特異的ヌクレアーゼは同一ＣＤＳの二重鎖ＤＮＡを切断する。
【００２１】
本発明の好ましい方法では、二重鎖ＤＮＡは細胞内にある。
【００２２】
好ましくは、細胞は、部位特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つ及び／又はガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つで形質転換される。
【００２３】
好ましくは、細胞は、部位特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つ及び／又はガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つをコードする核酸構築物でトランスフェクトされ、その核酸構築物は、好ましくは、少なくとも２つのガイドＲＮＡをコードする。
【００２４】
好ましくは、本発明の方法は、標的化改変を含む植物又はその子孫を再生するステップをさらに含む。
【００２５】
第２の態様では、本発明は、本明細書で定義した方法によって得ることができる植物であって、その植物は、対照と比較した場合に標的化改変を含むことにより修飾されており、その対照は標的化改変が導入される前の植物であり、その植物は、好ましくは、
ｉ）配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有し、５４７〜５７０位が配列番号３〜５のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有する、
少なくとも１つの改変されたＡＬＳ遺伝子を含み、又は、
ｉｉ）ＡＬＳ遺伝子は配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性を有し、５４１〜５６４位が配列番号３〜５のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有し、
その植物は、対照と比較して改善された除草剤耐性を有する、植物に関する。
【００２６】
第３の態様では、本発明は、改善された除草剤耐性を有する植物であって、その植物は、
ｉ）配列番号９と少なくとも８０％の配列同一性を有し、１８３〜１９２位が配列番号１１〜１３のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有するか；又は、
ｉｉ）配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を有し、１８１〜１９０位が配列番号１１〜１３のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性を有する、
アミノ酸配列を含む少なくとも１つの改変されたＡＬＳタンパク質を発現するように遺伝子操作されており、
その植物が、改変されたＡＬＳタンパク質を発現しない同一植物と比較して改善された除草剤耐性を有する、植物に関する。
【００２７】
第４の態様では、本発明は、本発明の方法において使用するためのキットオブパーツであって、
部位特異的ヌクレアーゼ及び／又は部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸構築物を含む容器；
本発明の方法に従って細胞における二重鎖ＤＮＡのＣＤＳを標的化改変するためのマニュアル；及び任意選択で、
少なくとも２つのガイドＲＮＡ又は少なくとも１つのガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸構築物を含む第２の容器
を含み、
第１の容器が、好ましくは、
ｉ）少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼ；
ｉｉ）部位特異的ヌクレアーゼをコードする少なくとも２つの核酸構築物；又は、
ｉｉｉ）少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸構築物
を含む、キットオブパーツに関する。
【００２８】
第５の態様では、本発明は、細胞の二重鎖ＤＮＡ中のＣＤＳの標的化改変のための、本明細書で定義した少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼ又は本明細書で定義したキットオブパーツの使用に関する。
【００２９】
定義
本発明の方法、組成物、使用及び他の態様に関する各種用語は、本明細書及び特許請求の範囲の全体にわたって使用される。そのような用語には、特段の明示のない限り、本発明が関係する技術分野における通常の意味が付与されるものとする。他の詳細に定義された用語は、本明細書で提供された定義と一致する方法で解釈されるものとする。本明細書に記載のものと類似の又は同等の任意の方法及び材料を本発明の試験の実施において使用することができ、好ましい材料及び方法は本明細書に記載されている。
【００３０】
「Ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」：これらの単数形の用語は、文脈で特に明示されていない限り、複数の指示物を含む。したがって、不定冠詞の「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。したがって、例えば、「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」への言及は、２つ以上の細胞の組合せなどを含む。
【００３１】
「約」及び「およそ」：これらの用語は、測定可能な値、例えば、量、一時的な期間などに言及する場合、そのような変動は開示した方法を実施するのに適切であるので、指定値から±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、さらにより好ましくは±０．１％の変動を含むことを意味する。さらに、量、比率、及び他の数値が本明細書において範囲形式で示されている場合がある。そのような範囲形式は、便宜的かつ簡潔にするために使用されており、範囲の制限として明示的に示した数値を含むように柔軟に理解されるべきであるが、あたかも各数値及び部分的範囲が明示的に示されているように、その範囲内に含まれるすべての個々の数値又は部分的範囲もまた含むように理解されたい。例えば、約１〜約２００の範囲の比は、約１〜約２００の明示的に記載された範囲を含むが、約２、約３、及び約４などの個々の比、並びに約１０〜約５０、約２０〜約１００などの部分的範囲も含むものと理解されたい。
【００３２】
「及び／又は」：用語の「及び／又は」とは、１つ又は複数の記載した事例が単独で、又は記載した事例の少なくとも１つと組み合わせて、記載したすべての事例に至るまで起こり得る状況を意味する。
【００３３】
「含む」：この用語は、包括的で制限はなく、排他的ではないと解釈される。詳しくは、この用語及びその変化形は、指定した特徴、ステップ、又は構成要素が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ、又は構成要素の存在を排除するものと解釈されるべきではない。
【００３４】
「例示的」：この用語は「例、事例、又は実例として有用である」ことを意味し、本明細書で開示されている他の構成を排除するものと解釈されるべきではない。
【００３５】
「植物」：これは、植物細胞、植物プロトプラスト、植物が再生され得る植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、及び植物又は植物の一部、例えば、胚、花粉、胚珠、配偶子、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯、粒などの無傷の植物細胞を含む。「植物細胞（複数可）」は、分離の、又は組織、器官若しくは生物内のプロトプラスト、配偶子、懸濁培養物、小胞子、花粉粒などを含む。
【００３６】
「構築物」又は「核酸構築物」又は「ベクター」：これは、組換えＤＮＡ技術の使用によって得られる人工的核酸分子を意味し、多くの場合、構築物に含まれるＤＮＡ領域を宿主細胞内で発現させる目的で、外因性ＤＮＡを宿主細胞に送達するために使用される。構築物のベクター骨格は、例えば、（キメラ）遺伝子が組み込まれたプラスミドであってもよく、又は、適切な転写調節配列がすでに存在する場合（例えば（誘導性）プロモーター）、所望のヌクレオチド配列のみ（例えばコード配列）が転写調節配列の下流に組み込まれる。ベクターは、分子クローニングにおける使用を容易にするために、遺伝要素、例えば、選択可能なマーカー、複数のクローニング部位などをさらに含むことができる。
【００３７】
「配列」又は「ヌクレオチド配列」：これは、核酸の又は核酸内のヌクレオチドの順序を意味する。言い換えると、核酸のヌクレオチドの任意の順序は、配列又はヌクレオチド配列と呼ばれ得る。
【００３８】
用語の「相同性」、「配列同一性」などは、本明細書では互換的に使用される。配列同一性は、本明細書では、配列を比較することにより決定した場合に、２つ以上のアミノ酸（ポリペプチド若しくはタンパク質）配列間、又は２つ以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列間の関係として定義される。当技術分野では、「同一性」はまた、そのような配列のストリング間の一致により決定される事例のように、アミノ酸配列又は核酸配列間の配列関係性の程度を意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、１つのポリペプチドのアミノ酸配列及びその保存されたアミノ酸置換を第２のポリペプチドの配列と比較することにより決定される。
【００３９】
用語の「相補性」とは、本明細書では、完全に相補的な鎖（本明細書で以下に定義したもの、例えば、第２の鎖）に対する配列の配列同一性として定義される。例えば、１００％相補的（又は完全に相補的）である配列は、本明細書では、相補鎖と１００％の配列同一性を有するものと理解され、例えば、８０％相補的である配列は、本明細書では、（完全に）相補的な鎖に対して８０％の配列同一性を有するものと理解される。
【００４０】
「同一性」及び「類似性」は、公知の方法により容易に算出することができる。「配列同一性」及び「配列類似性」は、グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを使用し、２つの配列の長さに応じて、２つのペプチド配列又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントによって決定することができる。同様の長さの配列は、好ましくは、配列を全長にわたり最適に整列するグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ）を使用して整列されるが、実質的に異なる長さの配列は、好ましくは、ローカルアライメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して整列される。配列は、（例えば、デフォルトパラメータを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴにより最適に整列される場合に）、（下記で定義した）配列同一性の少なくとも特定のパーセンテージを共有する場合、「実質的に同一の」又は「本質的に類似の」と呼ばれ得る。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのグローバルアライメントアルゴリズムを使用して、２つの配列をその全長（完全長）にわたり整列し、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。グローバルアライメントは、２つの配列が類似の長さを有する場合に配列の同一性を決定するのに適切に使用される。一般的には、ＧＡＰデフォルトパラメータは、ギャップ作成ペナルティ（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ伸長ペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）とともに使用される。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトスコアリングマトリックスはｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、デフォルトスコアリングマトリックスはＢｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ＆Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２、ＰＮＡＳ  ８９、９１５〜９１９）。配列アラインメント及び配列同一性パーセンテージのスコアは、コンピュータープログラム、例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．，  ９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン１０．３を使用し、又はオープンソースソフトウェア、例えば、上記のＧＡＰと同じパラメータを使用するか、若しくはデフォルト設定を使用するＥｍｂｏｓｓＷＩＮ  バージョン２．１０．０のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用）を使用して決定することができる（「ｎｅｅｄｌｅ」及び「ｗａｔｅｒ」の両方、並びにタンパク質アラインメント及びＤＮＡアライメントの両方において、デフォルトギャップ作成ペナルティは１０．０であり、デフォルトギャップ伸長ペナルティは０．５である；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質についてはＢｌｏｓｕｍ６２であり、ＤＮＡについてはＤＮＡＦｕｌｌである）。配列が実質的に異なる全長を有する場合は、ローカルアラインメント、例えばＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴ���ズムを使用するものが好ましい。
【００４１】
或いは、類似性又は同一性のパーセンテージは、アルゴリズム、例えばＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなどを使用して、公共データベースに対して検索することにより決定することができる。したがって、本発明の核酸配列及びタンパク質配列は、「クエリ配列」としてさらに使用することができ、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、公共データベースに対して検索を実施することができる。このような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら  （１９９０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３〜１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を用いて実施し、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を用いて実施し、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較の目的でギャップを加えたアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５（１７）：  ３３８９〜３４０２に記載のように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴのプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）を使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／の米国国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のホームページを参照されたい。
【００４２】
「標的配列」は、標的とされる核酸内のヌクレオチドの順序を示すものであり、例えば、改変は導入されるか、又は検出される。例えば、標的配列は、ＤＮＡ二重鎖の第１の鎖に含まれるヌクレオチドの順序である。
【００４３】
「エンドヌクレアーゼ」は、その認識部位に結合した際に、二重鎖ＤＮＡの少なくとも１つの鎖を加水分解する酵素である。エンドヌクレアーゼは、本明細書では、部位特異的エンドヌクレアーゼと理解されたく、用語の「エンドヌクレアーゼ」及び「ヌクレアーゼ」は、本明細書では互換的に使用される。制限エンドヌクレアーゼは、本明細書では、二重鎖の両鎖を同時に加水分解し、ＤＮＡに二本鎖切断を導入するエンドヌクレアーゼとして理解されたい。「ニッキング」エンドヌクレアーゼは、二重鎖の１つの鎖のみを加水分解し、切断されるというよりはむしろ「切れ目が入れられた」ＤＮＡ分子を生成するエンドヌクレアーゼである。
【図面の簡単な説明】
【００４４】
【図１】水平方向の白色の矢印は、遺伝子の通常のタンパク質コーディングフレームを示す。Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用し、矢印が示した位置にインデルが導入される。Ｂ）では、このインデルは、陰影を付けた区分で示したようにタンパク質コーディングフレームを改変しており、ヌル対立遺伝子をもたらす。Ｃ）では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを使用し、矢印で示した２つのインデルが導入される。この場合、第１のインデルは再度タンパク質コーディングフレームを改変し、第２のインデルはそれを修復する。結果として、２つのインデル間のアミノ酸がすべて改変される。
【図２】使用したガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）カセットを示している。シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）のＵ６  ｐｏｌＩＩＩプロモーター及びターミネーター配列には下線を引いている。２０ｎｔのＡＬＳ２特異的配列は太字の下線付きタイプで示され、ｓｇＲＮＡの残りは斜体である。カセットＫＧ１０１７７（配列番号２５）、ＫＧ１０１９０（配列番号２６）及びＫＧ１０１９１（配列番号２７）は、単一ｓｇＲＮＡを発現する。カセットＫＧ１０２４０（配列番号２８）は、ｔＲＮＡ配列（太字の斜体）で分けられているＫＧ１０１７７、ＫＧ１０１９０、及びＫＧ１０１９１で確認されたすべてのｓｇＲＮＡを表している。
【図３Ａ】Ａ．ガイドＲＮＡ試験。４つのガイドＲＮＡ構築物（ｓｇＲＮＡ１＝ＫＧ１０１７７、ｓｇＲＮＡ２＝ＫＧ１０１９０、ｓｇＲＮＡ３＝ＫＧ１０１９１、ｓｇＲＮＡ１＋２＋３＝ＫＧ１０２４０）のそれぞれについて、任意のインデルを含有する読み取りデータの数（配列読み取りデータの総数のパーセンテージとして表される）を計算した。Ｂ．ＡＬＳ２標的領域を示し（ＷＴ、配列番号２９）、異なるＰＡＭ配列には下線を引いている。それぞれのガイドＲＮＡについて、生成されたインデルの例を、その特定のインデル（配列番号３０〜４９）を含む読み取りデータのパーセンテージとともに示している。Ｃ．ＡＬＳ１標的領域を示すとともに（ＷＴ、配列番号５０）、ＡＬＳ１標的領域で確認されたインデルを示す（配列番号５１〜６６）。
【図３Ｂ】Ａ．ガイドＲＮＡ試験。４つのガイドＲＮＡ構築物（ｓｇＲＮＡ１＝ＫＧ１０１７７、ｓｇＲＮＡ２＝ＫＧ１０１９０、ｓｇＲＮＡ３＝ＫＧ１０１９１、ｓｇＲＮＡ１＋２＋３＝ＫＧ１０２４０）のそれぞれについて、任意のインデルを含有する読み取りデータの数（配列読み取りデータの総数のパーセンテージとして表される）を計算した。Ｂ．ＡＬＳ２標的領域を示し（ＷＴ、配列番号２９）、異なるＰＡＭ配列には下線を引いている。それぞれのガイドＲＮＡについて、生成されたインデルの例を、その特定のインデル（配列番号３０〜４９）を含む読み取りデータのパーセンテージとともに示している。Ｃ．ＡＬＳ１標的領域を示すとともに（ＷＴ、配列番号５０）、ＡＬＳ１標的領域で確認されたインデルを示す（配列番号５１〜６６）。
【図３Ｃ】Ａ．ガイドＲＮＡ試験。４つのガイドＲＮＡ構築物（ｓｇＲＮＡ１＝ＫＧ１０１７７、ｓｇＲＮＡ２＝ＫＧ１０１９０、ｓｇＲＮＡ３＝ＫＧ１０１９１、ｓｇＲＮＡ１＋２＋３＝ＫＧ１０２４０）のそれぞれについて、任意のインデルを含有する読み取りデータの数（配列読み取りデータの総数のパーセンテージとして表される）を計算した。Ｂ．ＡＬＳ２標的領域を示し（ＷＴ、配列番号２９）、異なるＰＡＭ配列には下線を引いている。それぞれのガイドＲＮＡについて、生成されたインデルの例を、その特定のインデル（配列番号３０〜４９）を含む読み取りデータのパーセンテージとともに示している。Ｃ．ＡＬＳ１標的領域を示すとともに（ＷＴ、配列番号５０）、ＡＬＳ１標的領域で確認されたインデルを示す（配列番号５１〜６６）。
【図４Ａ】Ａ．３つのガイドＲＮＡによって標的化されるＡＬＳ１及びＡＬＳ２領域のＤＮＡ（配列番号２０及び２１）配列及びタンパク質（配列番号２２）配列の両方を示す。ＡＬＳ１遺伝子とＡＬＳ２遺伝子との間のＳＮＰをハイライト表示している。ＡＬＳ１におけるＣからＡへのＳＮＰはｓｇＲＮＡ２  ＰＡＭ配列を取り除き、その結果、このガイドＲＮＡはＡＬＳ１に対して活性を有さない。各ｓｇＲＮＡのＡＬＳ２配列は、ワトソン（＋）又はクリック（−）鎖のいずれかに対応する。Ｂ．除草剤耐性植物由来のＡＬＳ遺伝子の配列。欠失は（−）で示され、挿入には下線を引いている。アミノ酸配列での２つのインデルの結果を太字で示している。インデル変異を生成したガイドＲＮＡの組合せ（例えば、ｓｇＲＮＡ２＆ｓｇＲＮＡ１、２＋１）を示す。
【図４Ｂ】Ａ．３つのガイドＲＮＡによって標的化されるＡＬＳ１及びＡＬＳ２領域のＤＮＡ（配列番号２０及び２１）配列及びタンパク質（配列番号２２）配列の両方を示す。ＡＬＳ１遺伝子とＡＬＳ２遺伝子との間のＳＮＰをハイライト表示している。ＡＬＳ１におけるＣからＡへのＳＮＰはｓｇＲＮＡ２  ＰＡＭ配列を取り除き、その結果、このガイドＲＮＡはＡＬＳ１に対して活性を有さない。各ｓｇＲＮＡのＡＬＳ２配列は、ワトソン（＋）又はクリック（−）鎖のいずれかに対応する。Ｂ．除草剤耐性植物由来のＡＬＳ遺伝子の配列。欠失は（−）で示され、挿入には下線を引いている。アミノ酸配列での２つのインデルの結果を太字で示している。インデル変異を生成したガイドＲＮＡの組合せ（例えば、ｓｇＲＮＡ２＆ｓｇＲＮＡ１、２＋１）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
単一部位特異的ヌクレアーゼによるコード配列（ＣＤＳ）内の二本鎖切断の生成を使用して、二本鎖切断の位置でのインデルによって生じるフレームシフトが生成され、主として機能不全タンパク質がもたらされる。本発明者らは、二重鎖ＤＮＡを２つの部位特異的エンドヌクレアーゼに曝露することにより、ＣＤＳの所定の、例えばわずかな部分のみが改変され、リーディングフレームは維持される、変異体を生成するための新規で有効な方法を見出した。本発明者らは、単一ＣＤＳ内での２つの二本鎖切断の生成が、インデルが生成される２つの位置の間でのみＣＤＳを改変させ得るという知見に至った（図１）。
【００４６】
したがって、用語の「改変されたＣＤＳ」とは、本明細書では、第１のインデルから開始して第２のインデルまでを含めたＣＤＳとして定義される。改変されたＣＤＳは、タンパク質の特性の改変、例えば、その機能の増加又は低下に結びつく可能性がある。言い換えれば、タンパク質の機能性の完全喪失の代わりに、二本鎖切断の生成を使用して、例えば、タンパク質の機能性を巧妙に改変することができる。
【００４７】
したがって、第１の態様では、本発明は、二重鎖ＤＮＡのＣＤＳを標的化改変する方法であって、二重鎖ＤＮＡを少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼに曝露するステップを含み、第１の部位特異的ヌクレアーゼがＣＤＳ内の第１の位置で第１のインデルを生成するＤＮＡを切断し、第２の部位特異的ヌクレアーゼが同一ＣＤＳ内の第２の位置で第２のインデルを生成するＤＮＡを切断し、ＣＤＳが第１のインデルの前及び第２のインデルの後に同一リーディングフレームのままである、方法に関する。
【００４８】
本発明は、さらに、改変されたＣＤＳを含む二重鎖ＤＮＡ分子を生成する方法であって、改変されたＣＤＳが本明細書で定義した標的化改変により生成される、方法に関する。
【００４９】
好ましくは、改変されたＣＤＳは終止コドンを含まない。第１及び第２の位置は、ＣＤＳの同一エクソン内にある。しかし、第１の位置は、第２の位置を含むエクソンの上流のエクソン（すなわち、コード鎖の視点からは５’）にあることもまた実現可能である。したがって、一実施形態では、第１の位置を含むエクソン及び第２の位置を含むエクソンは、少なくとも１つのイントロンにより分離されていてよく、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上のイントロンにより分離されていてよい。
【００５０】
好ましくは、ＣＤＳ内の第１及び第２の位置は、５’末端開始コドン、３’末端終止コドン、及びＣＤＳの一部であって前駆体メッセンジャーＲＮＡからイントロンを除去してスプライシング中に成熟ｍＲＮＡを形成するのに必要とされる任意の機能的スプライス部位の外側にある。言い換えると、好ましくは、本発明の方法は、５’末端開始コドン、３’末端終止コドン及び／又はＣＤＳ内の任意の機能的スプライス部位を無傷にする。
【００５１】
本発明の方法の標的化改変は、細胞の外側で実施され、ＤＮＡは、部位特異的ヌクレアーゼが二本鎖切断を導入することを可能にし、ＮＨＥＪを可能にする酵素を含むマトリックス中にある。標的化改変を含むＤＮＡは、その後のタンパク質の翻訳のために細胞に導入され得る。或いは、タンパク質の翻訳はまた、細胞の外側でも生じ得る。好ましくは、本発明の方法の標的化改変は、細胞又は細胞内においてであり、より好ましくは、本明細書でさらに詳述された細胞においてである。
【００５２】
本発明の方法は、好ましくは、例えば、ＣＤＳの特定部分のみを改変することにより、非変異タンパク質と比較して改変された機能性を有する変異タンパク質をスクリーニングするために使用される。例えば、変異タンパク質の機能性は、非変異タンパク質の機能性と比較して、増加又は低下され得る。変異タンパク質がｄｅ  ｎｏｖｏ機能性、例えば、非変異タンパク質に以前は存在しなかった機能性、例えば、（新規）基質との新規な相互作用を有し得ることも本発明の範囲内であるとさらに考えられる。さらに、本発明の方法は、例えば、タンパク質の残りの部分を改変することなく、酵素の活性ドメインを不活性化するために、又は、例えば受容体−リガンド相互作用に関する結合ドメインの特異性を改変するために使用することができる。したがって、本発明の方法はツールがＣＤＳの一部を特異的に改変させることができ、そのような方法に幅広い適用があることを見出すことを当業者は理解する。ＣＤＳの標的化改変は、本明細書では、（少なくとも１つの）特定の、例えば所定の位置でのＣＤＳの改変として理解するものとする。前記改変は、好ましくは少なくとも１つのヌクレオチドの導入又は欠失を介したフレームシフトであることが好ましい。
【００５３】
ＣＤＳ内の前記特定の位置は、好ましくは、標的配列、好ましくはＤＮＡ二重鎖の第１の鎖に存在する連続したヌクレオチドのストレッチによって決定される。細胞の二重鎖ＤＮＡは、第１のＤＮＡ鎖及び第２のＤＮＡ鎖を含む。第２のＤＮＡ鎖は第１のＤＮＡ鎖の相補体であり、それと対になり二重鎖を形成する。例えば、第１のＤＮＡ鎖配列ＡＴＴＴ（５’から３’方向）の相補体は、ＴＡＡＡ（３’から５’方向）である。二重鎖ＤＮＡのＤＮＡは、細胞に対して内因性又は外因性の任意のタイプのＤＮＡであってよく、例えば、ゲノムＤＮＡ、染色体ＤＮＡ、人工染色体、プラスミドＤＮＡ、又はエピソームＤＮＡであってよい。二重鎖は、核又はオルガネラ（例えばミトコンドリア）ＤＮＡであり得る。好ましくは、ＤＮＡ二重鎖は染色体ＤＮＡであり、好ましくは細胞にとって内因性である。さらに、本明細書では、標的配列は細胞の導入遺伝子又は内因性遺伝子であってもよいことを理解されたい。
【００５４】
本発明の文脈内で、ＤＮＡ二重鎖の第１のＤＮＡ鎖はＣＤＳを含み、第２の鎖はＣＤＳに相補的である第２の核酸配列を含む。コード配列又はＣＤＳは、特定のタンパク質を一緒にコードする１つ又は複数の後続のエクソンで構成されるＤＮＡの一部分として定義される。当技術分野において公知であるように、ＤＮＡのこの部分を中断する可能性のあるイントロンは、ＣＤＳの一部分ではない。リーディングフレームは、本明細書では、核酸中のヌクレオチドの連続する重複しないトリプレットのセットへの分割として理解されたい。したがって、核酸は、５’から３’方向に読み取ることができる３つのリーディングフレームを含み、各リーディングフレームはトリプレットの異なるヌクレオチドから始まる。二重鎖ＤＮＡ分子では、さらなる３つのリーディングフレームが５’から３’方向の別の相補鎖から読み取られ得る。したがって、二重鎖ＤＮＡ分子は、６つのリーディングフレームを含有する。さらに、フレームシフトは、本明細書では、リーディングフレームのシフトとして定義され、すなわち、３で割り切ることができないいくつかのヌクレオチドの挿入また欠失により生じる。或いは、欠失又は導入されるヌクレオチドの数が３の（倍数の）場合、リーディングフレームは、したがって、シフトせず、すなわち、リーディングフレームの配列はフレームのままである。フレームシフトは、ＣＤＳの異なる翻訳をもたらし得る。さらに、本明細書では、フレームシフト変異は、ヌクレオチドが挿入又は欠失されるというよりも置き換えられる単一ヌクレオチド多型と同じではないことを理解されたい。フレームシフト変異は、変異後のコドンの読み取りが異なるアミノ酸をコードすることを引き起こし得る。本明細書では、ＣＤＳは、好ましくは同一リーディングフレーム内において開始コドンで始まり、終止コドンで終わるコドンの連続したストレッチ（トリプレット）であると理解されたい。ＣＤＳの文脈においてトリプレットに言及する場合、単語のトリプレットとコドンは本明細書では互換的に使用される。
【００５５】
改変されたコード配列
本発明の方法では、第１のヌクレアーゼはＤＮＡを切断して第１の位置で第１のインデルを生成し、第２のヌクレアーゼはＤＮＡを切断して第２の位置で第２のインデルを生成する。本明細書では、第２の位置は、第１の位置の下流（すなわち、コード鎖の視点からは３’）であることを理解されたい。本発明の方法によれば、リーディングフレームは、第２の位置の後は改変されない。同様に、リーディングフレームはまた、第１の位置の前も改変されない。言い換えると、第２のインデルの後（下流）のコード配列は、第１のインデルの前（上流）と同一リーディングフレームのままである。
【００５６】
したがって、ＣＤＳは、第１の位置と第２の位置との間で改変され、好ましくは、ＣＤＳは、第１の位置と第２の位置との間でのみ改変される。改変されたＣＤＳは、第１の位置で生成されたインデルから始まり、第２の位置で生成されたインデルまでを含む。
【００５７】
一実施形態では、第１のインデルは第１の位置で生成され、第２のインデルは同一ＣＤＳの第２の位置で生成される。言い換えれば、第１のインデル及び第２のインデルは単一ＣＤＳで生成され、したがって、特定のタンパク質を一緒にコードする１つ又は複数の後続のエクソンで構成されるＤＮＡの一部で生成される。
【００５８】
本発明の文脈において、第１及び第２の位置で得られるインデルは、ＣＤＳ内の挿入又は欠失ヌクレオチドの正味の結果がこれらの２つのインデル数０、３又は３の任意の複数によって引き起こされるという意味で互いにバランスがとれる。これは、０、３、又は３の任意の複数であるヌクレオチドの合計導入によって達成され得る。或いは、欠失されたヌクレオチドの合計は、０、３、又は３の任意の複数である。好ましくは、導入されたヌクレオチドの合計は、好ましくは０、３、６、９若しくは１２個であり、及び／又は欠失されたヌクレオチドの合計は、好ましくは０、３、６、９若しくは１２個である。
【００５９】
導入されたヌクレオチドの合計は、本明細書では、第１の位置及び第２の位置で導入されたヌクレオチドの合計として、すなわち、第１及び第２の位置で導入／欠失されたヌクレオチドの合計として理解されたい。例えば、１つのヌクレオチドは第１の位置で導入され（＋１）、２つのヌクレオチドは第２の位置で導入され（＋２）、（＋１／＋２）と注釈をされる。この例における導入されたヌクレオチドの合計は３個である。別の例において、１つのヌクレオチドは第１の位置で欠失され（−１）、１つのヌクレオチドは第２の位置で付加される（＋１）。この例における付加／欠失されたヌクレオチドの合計（−１／＋１）は０である。
【００６０】
任意選択で、リーディングフレームは、第１の位置と第２の位置の間で改変される。この実施形態では、ＤＮＡがそれぞれ第１のヌクレアーゼのみ、又は第２のヌクレアーゼのみで切断される場合、リーディングフレームは第１及び第２の位置の後で改変される。
【００６１】
さらに、本明細書では、未改変のリーディングフレームは、二重鎖ＤＮＡが第１及び／又は第２のヌクレアーゼで切断される前のリーディングフレームと同一であると理解されたい。同様に、本明細書では、改変されたリーディングフレームは、二重鎖ＤＮＡが第１及び／又は第２のヌクレアーゼで切断される前のリーディングフレームと異なる（すなわち、同一ではない）ことを理解されたい。
【００６２】
第１及び第２のインデルを含めたその間に位置している改変されたリーディングフレーム中のすべてのトリプレットは、ＤＮＡが第１及び／又は第２のヌクレアーゼで切断される前のリーディングフレームと比較して異なり得る。しかし、第１の位置と第２の位置の間のすべてのトリプレットが修飾されないこともまた、本発明の一部である。改変されたリーディングフレームは、例えば、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０個の修飾されたトリプレットを含み得る。或いは、改変されたリーディングフレームは、最大で約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０個の修飾されたトリプレットを含み得る。より好ましくは、改変されたリーディングフレームは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５又は５０個の修飾されたトリプレットを含み得る。
【００６３】
同様に、改変されたＣＤＳ（第１のインデルから始まり第２のインデルまでを含むＣＤＳ）のトリプレットは、ＤＮＡが第１及び／又は第２のヌクレアーゼで切断される前のＣＤＳのトリプレットと比較して１００％異なる可能があり、すなわち、第１の位置と第２の位置の間のすべてのトリプレットが改変されている。同様に、本明細書では、５０％の差が第１の位置と第２の位置との間のトリプレットの５０％が改変されていることを示すために使用される。改変されたＣＤＳは、例えば、非切断ＤＮＡと少なくとも約５、１０、１５、２０、３５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、又は１００％異なり得る。或いは、改変されたＣＤＳのトリプレットは、非切断ＤＮＡと最大で約５、１０、１５、２０、３５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、又は１００％異なり得る。好ましくは、改変されたＣＤＳのトリプレットは、非切断ＤＮＡと約５、１０、１５、２０、３５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９５、又は１００％異なり得る。
【００６４】
さらに好ましい実施形態では、第１及び第２のヌクレアーゼは、特定の位置でＤＮＡの両方の鎖を切断する。しかし、生成された二本鎖切断をその後修復するＤＮＡ修復メカニズムは、エラーを起こす傾向がある。その結果として、ＤＮＡを修復する際、１つ若しくは複数のヌクレオチドが新たに付加され得るか、又は元のＤＮＡ配列の１つ若しくは複数のヌクレオチドが除去され得る。言い換えれば、二本鎖ＤＮＡ切断の修復は、インデルの生成をもたらし得る（ヌクレオチドの挿入又は欠失）。インデルの導入の結果、リーディングフレームはシフトし得る。
【００６５】
ＣＤＳは、第１の位置で少なくとも１つのヌクレオチドを導入又は欠失することによる、及び第２の位置で少なくとも１つのヌクレオチドを導入又は欠失することによる本発明の方法によって改変される。好ましくは、ＣＤＳは、第１の位置で少なくとも１つの塩基対を導入し、第２の位置で少なくとも１つの塩基対を欠失することにより改変され、又は好ましくは、ＣＤＳは、第１の位置で少なくとも１つの塩基対を欠失し、第２の位置で少なくとも１つの塩基対を導入することにより改変される。
【００６６】
より好ましくは、第１の位置で１、２、３、４、５若しくは６個のヌクレオチドが導入され得るか、又は１、２、３、４、５若しくは６個のヌクレオチドが除去され得る。さらに、好ましくは、第２の位置で１、２、３、４、５若しくは６個のヌクレオチドが導入され得るか、又は１、２、３、４、５若しくは６個のヌクレオチドが除去され得る。第１の位置で１若しくは２個のヌクレオチドが導入され得るか、又は１若しくは２個のヌクレオチドが除去され得ることが好ましい。さらに、好ましくは、第２の位置で１若しくは２個のヌクレオチドが導入され得るか、又は１若しくは２個のヌクレオチドが除去され得る。
【００６７】
本発明の文脈内で、導入／欠失されたヌクレオチドの合計は、第２の位置の後のフレームシフトを防止するために、常に０、３又は任意の３の複数である。
【００６８】
好ましい実施形態では、導入／欠失されたヌクレオチドの合計は０であり、それにより、第２のインデルの後のＣＤＳのコードされたアミノ酸の物理的位置は変化しないままとなる。好ましくは、第１の位置のインデルはフレームシフトを引き起こし（すなわち、３又は任意の３の複数を除く１つ又は複数のヌクレオチドの挿入又は欠失を含む）、次いで、第２の位置のインデルの下流にある元のリーディングフレームを復元するフレームシフトを引き起こす第２の位置のインデルによって修正される。しかし、本発明の範囲内では、第１の位置での導入／欠失されたヌクレオチドの数は３又は任意の３の複数であり、第２の位置での導入／欠失されたヌクレオチドの数は３又は任意の３の複数であるとも考えられる。このシナリオでは、フレームシフトが第１のインデルの後になかった場合であっても、ＣＤＳが改変される。
【００６９】
本発明の方法は、第１及び第２の位置でのインデルの導入によるＣＤＳの修飾／改変をもたらし、改変されたＣＤＳは、第１のインデルから始まり第２のインデルまでを含めたＣＤＳである。改変されたＣＤＳの長さは、未改変の／元のＣＤＳとほぼ同じ、又は全く同じ長さを有し得る。元のＣＤＳの実質的な部分を含むフレームシフトは、多くの場合、非機能性タンパク質をもたらす可能性がある。代わりに、本発明の方法はまた、単一タンパク質内のアミノ酸の短いストレッチの修飾も可能にする。したがって、本発明の好ましい実施形態では、改変されたＣＤＳの長さ（第１のインデルから始まり第２のインデルまでを含む）は、約３〜７５０ヌクレオチド（ｎｔ）、３〜６００ｎｔ、３〜４５０ｎｔ、３〜３００ｎｔ、３〜１５０ｎｔ、３〜７５ｎｔ、３〜６０ｎｔ、３〜４５ｎｔ、３〜３０ｎｔ又は３〜１５ｎｔである。本発明のさらに好ましい実施形態では、改変されたＣＤＳの長さ（第１のインデルから始まり第２のインデルまでを含む）は、約６〜７５０ヌクレオチド（ｎｔ）、６〜６００ｎｔ、６〜４５０ｎｔ、６〜３００ｎｔ、６〜１５０ｎｔ、６〜７５ｎｔ、６〜６０ｎｔ、６〜４５ｎｔ、６〜３０ｎｔ又は６〜１５ｎｔである。本発明のさらに好ましい実施形態では、改変されたＣＤＳの長さ（第１のインデルから始まり第２のインデルまでを含む）は、約９〜７５０ヌクレオチド（ｎｔ）、９〜６００ｎｔ、９〜４５０ｎｔ、９〜３００ｎｔ、９〜１５０ｎｔ、９〜７５ｎｔ、９〜６０ｎｔ、９〜４５ｎｔ、９〜３０ｎｔ又は９〜１５ｎｔである。本発明のさらに好ましい実施形態では、改変されたＣＤＳの長さ（第１のインデルから始まり第２のインデルまでを含む）は、約１２〜７５０ヌクレオチド（ｎｔ）、１２〜６００ｎｔ、１２〜４５０ｎｔ、１２〜３００ｎｔ、１２〜１５０ｎｔ、１２〜７５ｎｔ、１２〜６０ｎｔ、１２〜４５ｎｔ、１２〜３０ｎｔ又は１２〜１５ｎｔである。本発明のさらに好ましい実施形態では、改変されたＣＤＳの長さ（第１のインデルから始まり第２のインデルまでを含む）は、約１５〜７５０ヌクレオチド（ｎｔ）、１５〜６００ｎｔ、１５〜４５０ｎｔ、１５〜３００ｎｔ、１５〜１５０ｎｔ、１５〜７５ｎｔ、１５〜６０ｎｔ、１５〜４５ｎｔ、１５〜３０ｎｔである。同様に、改変されたＣＤＳの長さ、好ましくは全長（第１のインデルから始まり第２のインデルまでを含む）は、好ましくは、約１〜１０００コドン、１〜５００コドン、１〜３００コドンの間であり、好ましくは、約１〜２５０、１〜２００、１〜１５０、１〜１００、１〜５０、１〜２５、１〜２０、１〜１５、１〜１０又は１〜５コドンの間である。改変されたＣＤＳの長さ、好ましくは、全長は、約２〜１０００コドン、２〜５００コドン、２〜３００コドンの間であり、好ましくは約２〜２５０、２〜２００、２〜１５０、２〜１００、２〜５０、２〜２５、２〜２０、２〜１５又は２〜１０コドンの間である。改変されたＣＤＳの長さ、好ましくは、全長は、約３〜１０００コドン、３〜５００コドン、３〜３００コドンの間であり、好ましくは約３〜２５０、３〜２００、３〜１５０、３〜１００、３〜５０、３〜２５、３〜２０、３〜１５又は３〜１０コドンの間である。改変されたＣＤＳの長さ、好ましくは、全長は、約４〜１０００コドン、４〜５００コドン、４〜３００コドンの間であり、好ましくは約４〜２５０、４〜２００、４〜１５０、４〜１００、４〜５０、４〜２５、４〜２０、４〜１５又は４〜１０コドンの間である。改変されたＣＤＳの長さ、好ましくは、全長は、約５〜１０００コドン、５〜５００コドン、５〜３００コドンの間であり、好ましくは約５〜２５０、５〜２００、５〜１５０、５〜１００、５〜５０、５〜２５、５〜２０、５〜１５、又は５〜１０コドンの間である。好ましくは、改変されたＣＤＳの長さは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、５００、又は１０００コドンである。
【００７０】
特に好ましい実施形態では、改変されたＣＤＳは、終止コドン、すなわち、翻訳の終止をタンパク質に（ｍＲＮＡで）シグナルするコドンを含まない。したがって、好ましくは、改変されたＣＤＳは、５'から３'方向に配列のＴＡＧ（アンバー）、ＴＧＡ（オパール／アンバー）又はＴＡＡ（オーカー）を有するトリプレットを含まない。
【００７１】
さらに好ましい実施形態では、標的化改変（すなわち、改変されたＣＤＳ）を含む本発明の方法で得られたＣＤＳは、タンパク質産物をコードする。より正確には、得られたＣＤＳは、好ましくは、タンパク質に翻訳される可能性を維持する。好ましくは、得られたＣＤＳから翻訳されたタンパク質は、機能性タンパク質であり、例えば、生物活性を有するタンパク質である。生物活性は、未改変のＣＤＳを含む出発材料から翻訳されたタンパク質の生物活性と比較して、同一の又は異なる生物活性である可能性がある。好ましくは、得られたＣＤＳから翻訳されたタンパク質の生物活性は、未改変のＣＤＳから翻訳されたタンパク質の生物活性と比較して、増加又は低下し得る。
【００７２】
さらに好ましい実施形態では、本発明の方法はｅｘ  ｖｉｖｏ方法であり、好ましくは、本方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。本発明の方法は、ヒト又は動物の身体を治療する方法であり得る。好ましくは、本方法は、ヒト又は動物の身体を治療する方法ではない。
【００７３】
改変されたコード配列の分析
一実施形態では、本発明の方法は、改変されたコード配列を分析又は同定するステップを含む。第１の位置の周囲のヌクレオチド配列及び／又は第２の位置の周囲の配列を分析することができる。好ましくは、少なくとも第１の位置で生成されたインデル及び第２の位置で生成されたインデルが決定される。少なくとも改変されたＣＤＳの完全ヌクレオチド配列を分析することができる。さらに、少なくともＣＤＳの完全配列を分析することができる。
【００７４】
ヌクレオチド配列の分析は、当技術分野で公知の任意の従来の方法を使用して実施することができる。非限定的な例として、ヌクレオチド配列は、制限酵素分析、電気泳動、及び／又は配列決定、例えば限定するものではないが、サンガー配列決定若しくはハイスループット配列決定を使用して分析することができる。
【００７５】
ヌクレオチド配列の分析により、好ましくは、ヌクレオチド配列の同定が得られる。
【００７６】
或いは、又はさらに、得られたＣＤＳ（すなわち、標的化改変を含む）から転写されたタンパク質は、当技術分野で公知の任意の従来の方法を使用して分析することができる。そのような分析は、タンパク質の機能又は構造に基づき得る。構造分析の非限定的な例として、転写されたタンパク質のアミノ酸組成は、例えば、加水分解されたアミノ酸のクロマトグラフィー分離を使用して同定される。タンパク質の機能は、本発明の方法によって改変されたＣＤＳによりコードされているタンパク質の性質に応じた任意の適切な機能分析アッセイにより分析することができる。本発明の方法によるＣＤＳの改変は、タンパク質機能の喪失、すなわち、タンパク質機能の停止若しくは低下、又はタンパク質機能の獲得、すなわち、タンパク質機能の増加若しくは新たな発生をもたらし得る。任意選択で、そのようなタンパク質機能は、好ましくはその自然環境若しくは細胞環境からタンパク質を精製した後にｉｎ  ｖｉｔｒｏで、又は、好ましくはその自然環境若しくは細胞環境においてｉｎ  ｖｉｖｏで、好ましくは本発明の方法に由来の改変された二重鎖ＤＮＡを含む細胞に存在する場合、又は、任意の細胞、組織若しくはそれらが由来した生物体に存在する場合に分析することができる。
【００７７】
そのような細胞、組織又は生物体におけるタンパク質機能の分析は、そのような細胞、組織、又は生物体の表現型を分析することによって実施することができる。
【００７８】
ＣＤＳの一部の改変は、好ましくは、改変されたＣＤＳを含まない同一の細胞、組織又は生物体と比較して、修飾された表現型の特徴をもたらし得る。非限定的な例として、植物遺伝子内の特定のＣＤＳの一部の改変は、表現型の植物の特徴に改変がもたらされる可能性がある。好ましい表現型の植物の特徴は、植物の発達、植物の成長、収量、バイオマス生産、植物の構造、植物生化学、植物生理学、代謝、除草剤耐性、生存能力、及びストレス耐性からなる群から選択することができる。或いは、又はさらに、植物の特徴は、ＤＮＡ合成、ＤＮＡ修飾、核内倍加、細胞周期、細胞壁生合成、転写調節、シグナル伝達、貯蔵脂質動員、及び光合成からなる群から選択される。好ましくは、改変された植物の特徴は、経済的により有用な植物表現型をもたらす。
【００７９】
一実施形態では、本明細書で定義した改変されたＣＤＳ及び／又は本明細書で定義した改変されたＣＤＳを含む若しくは発現する細胞、組織若しくは生物体は、単離することができる。好ましくは、本明細書で定義した改変されたＣＤＳは、少なくとも本明細書で定義した未改変のＣＤＳから単離又は分離することができる。さらに、又は或いは、本明細書で定義した改変されたＣＤＳは、少なくとも修飾されたＣＤＳから単離又は分離することができ、その修飾されたＣＤＳは、第１のインデルの前及び／又は第２のインデルの後の同一リーディングフレームのままではない。さらに、又は或いは、本明細書で定義した改変されたＣＤＳは、少なくとも修飾されたＣＤＳから単離又は分離することができ、この修飾されたＣＤＳは終止コドンを含む。
【００８０】
好ましくは、本明細書で定義した改変されたＣＤＳを含む細胞、組織又は生物体は、少なくとも本明細書で定義した未改変のＣＤＳを含む細胞、組織又は生物体から単離又は分離することができる。さらに、又は或いは、本明細書で定義した改変されたＣＤＳを含む細胞、組織又は生物体は、少なくとも修飾されたＣＤＳを含む細胞、組織又は生物体から単離又は分離することができ、この修飾されたＣＤＳは、第１のインデルの前及び／又は第２のインデルの後の同一リーディングフレームのままではない。さらに、又は或いは、本明細書で定義した改変されたＣＤＳを含む細胞、組織又は生物体は、少なくとも修飾されたＣＤＳを含む細胞、組織又は生物体から単離又は分離することができ、この修飾されたＣＤＳは終止コドンを含む。
【００８１】
細胞タイプ
当業者は、本発明の方法が特定の細胞タイプに限定されないことを理解する。特に、本明細書に開示した本発明の方法は、分裂細胞及び非分裂細胞に適用することができる。細胞は、トランスジェニックであっても非トランスジェニックであってもよい。さらに、本発明の方法は、動物、植物若しくは真菌に由来する細胞に適用することができるか、又は細菌細胞若しくは酵母細胞であり得る。本発明の方法で使用するのに好ましい細胞は、動物細胞又は植物細胞である。好ましい動物細胞は哺乳動物細胞であり、好ましくは、非ヒト霊長類細胞又はヒト細胞である。植物細胞は、例えば、植物が再生され得る植物細胞組織培養物、植物カルス、植物塊、及び植物又は植物の一部、例えば、胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、穀粒、穂、穂軸、殻、茎、根、根端、葯、粒などが無傷の植物細胞から得ることができる。
【００８２】
好ましい実施形態では、植物細胞は植物プロトプラストである。当業者には、植物プロトプラストを調製及び繁殖する方法及びプロトコルは公知であり、例えば、Ｐｌａｎｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  （ＩＳＢＮ：  ９７８−０−１２−４１５９２０−４，  Ｒｏｂｅｒｔａ  Ｈ．  Ｓｍｉｔｈ）を参照されたい。本発明の方法で使用するための植物プロトプラストは、植物細胞プロトプラストの生成で使用される一般的手順を使用して提供することができる（例えば、細胞壁は、セルロース、ペクチナーゼ及び／又はキシラナーゼを使用して分解され得る）。
【００８３】
植物細胞プロトプラスト系は、例えば、トマト、タバコ、及び他の多くのもの（セイヨウアブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、ニンジン（Ｄａｕｃｕｓ  ｃａｒｏｔａ）、レタス（Ｌａｃｔｕｃｃａ  ｓａｔｉｖａ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ベンサミアナタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）、ペチュニア（Ｐｅｔｕｎｉａ  ｈｙｂｒｉｄａ）、ジャガイモ（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）、イネ（Ｏｒｙｚａ  ｓａｔｉｖａ））に対して記載されている。本発明は、一般に、限定するものではないが、以下の参考文献：Ｂａｒｓｂｙら  １９８６，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５（２）：  １０１〜１０３；  Ｆｉｓｃｈｅｒら  １９９２，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．  １１（１２）：  ６３２〜６３６；  Ｈｕら  １９９９，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，  Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ５９：  １８９〜１９６；  Ｎｉｅｄｚら  １９８５，  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３９：  １９９〜２０４；  Ｐｒｉｏｌｉ及びＳｏｎｄａｈｌ，  １９８９，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：  ５８９〜５９４；  Ｓ．  Ｒｏｅｓｔ及びＧｉｌｉｓｓｅｎ  １９８９，  Ａｃｔａ  Ｂｏｔ．  Ｎｅｅｒｌ．  ３８（１）：  １〜２３；  Ｓｈｅｐａｒｄ及びＴｏｔｔｅｎ，  １９７５，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．５５：  ６８９〜６９４；  Ｓｈｅｐａｒｄ及びＴｏｔｔｅｎ，  １９７７，  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ６０：  ３１３〜３１６のいずれか１つに記載の系を含む任意のプロトプラスト系に適用することができ、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
植物細胞は、好ましくは、作物植物、例えば単子葉植物若しくは双子葉植物、又は作物若しくは穀物植物、例えばキャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、大豆、小麦、オート麦若しくは米から得ることができる。作物植物とは、ヒトによって栽培及び育種された植物種である。作物植物は、食用（例えば畑作物）又は観賞用（例えば、刈り取るための花、芝生用草などの生産）に栽培され得る。本明細書で定義した作物植物は、非食料品、例えば、燃料用油、プラスチックポリマー、医薬品、コルクなどが収穫される植物も含む。
【００８５】
植物細胞はまた、藻類、樹木、又は生産の植物、果物若しくは野菜（例えば、樹木、例えば柑橘類の樹木、例えばオレンジ、グレープフルーツ若しくはレモンの樹木；桃若しくはネクタリンの樹木；リンゴ若しくはナシの樹木；堅果類の樹木、例えばアーモンド若しくはクルミ若しくはピスタチオの樹木；イヌホオヅキ植物；アブラナ属の植物；レタス属の植物；ホウレンソウ属の植物；トウガラシ属の植物；ナス属の植物）であり得る。
【００８６】
別の好ましい実施形態では、細胞は、アスパラガス、大麦、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、キャベツ、キャノーラ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、チコリ、ココア、コーヒー、ワタ、キュウリ、ナス、ブドウ、トウガラシ、レタス、トウモロコシ、メロン、アブラナ、コショウ、ジャガイモ、カボチャ、ラズベリー、コメ、ライムギ、モロコシ、ホウレンソウ、カボチャ、イチゴ、サトウキビ、テンサイ、ヒマワリ、ピーマン、タバコ、トマト、スイカ、小麦、及びズッキーニからなる群から選択される植物から得ることができる。
【００８７】
好ましくは、標的化改変を含む得られた植物細胞は、植物又はそれらの子孫に再生される。したがって、本発明の好ましい実施形態である本方法は、標的化改変を含む植物又はその子孫を再生するステップをさらに含む。
【００８８】
部位特異的ヌクレアーゼ
本発明の方法は、ＤＮＡを少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼに曝露するステップを含む。当業者は、任意の部位特異的ヌクレアーゼが本発明の方法における使用に適し得ることを理解する。好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼは、部位特異的制限エンドヌクレアーゼ又は部位特異的ニッキングエンドヌクレアーゼである。
【００８９】
制限エンドヌクレアーゼは、本明細書では、二重鎖の両鎖を同時に加水分解してＤＮＡに二本鎖切断を導入するエンドヌクレアーゼと理解されたい。ニッキングエンドヌクレアーゼは、二重鎖の１本の鎖のみを加水分解し、切断されるというよりはむしろ「切れ目が入れられた」ＤＮＡ分子を生成するエンドヌクレアーゼである。好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼは、部位特異的制限エンドヌクレアーゼである。或いは、ヌクレアーゼは、ニッキングエンドヌクレアーゼであり得る。好ましくは、少なくとも２つのニッキングヌクレアーゼを本発明の方法において使用することができ、それにより少なくとも２つのニッキングエンドヌクレアーゼは、好ましくは、同じ二重鎖ＤＮＡの反対の鎖を認識してニックを入れ、その結果、二本鎖切断が第１又は第２の位置で生じる。
【００９０】
二本鎖切断の位置は部位特異的ヌクレアーゼによって決定され、時には、本明細書で下記に詳述するガイドＲＮＡと組み合わされる。ヌクレアーゼが二重鎖ＤＮＡの特定の位置で切断することを確実にするように部位特異的ヌクレアーゼを設計する方法は、当技術分野において周知である。したがって、当業者は、所定の第１又は第２の位置でＤＮＡを切断するように部位特異的ヌクレアーゼを設計する方法について知っている。切断部位（第１の位置及び第２の位置）は、ヌクレアーゼにより標的化される配列、すなわち標的配列によって決定される。好ましくは、標的配列は、長さが８ヌクレオチドを超えるが、長さが２０１ヌクレオチド未満の配列を含む二重鎖ＤＮＡ分子を意味する。好ましくは、標的配列は８〜３０塩基の間である。標的配列は、一般には、二重らせん核酸の鎖のうちの１つのヌクレオチド配列によって規定される。
【００９１】
好ましい実施形態では、ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ及びメガヌクレアーゼからなる群から選択される。好ましい実施形態では、少なくとも１つのヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのヌクレアーゼは、ＴＡＬＥＮである。
【００９２】
ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ）は標的可能なヌクレアーゼであり、特定のＤＮＡ部位への一本鎖切断及び二本鎖切断を誘導するために使用され、次いで切断部位でインデルを生成し得るメカニズムによって修復される。ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合領域を操作するために使用される基本的な構成要素は、キサントモナス属種プロテオバクテリア（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ）によりコードされている天然に存在するＴＡＬＥに由来する高度に保存されたリピートドメインである。ＴＡＬＥＮによるＤＮＡ結合は、リピートのアミノ末端及びカルボキシ末端に追加のＴＡＬＥ由来ドメインに隣接する高度に保存された３３〜３５アミノ酸リピートのアレイにより媒介される。これらのＴＡＬＥリピートはＤＮＡの単一塩基に特異的に結合し、その同一性はリピートの１２位及び１３位で典型的に確認される２つの超可変残基により決定され、アレイ内のリピートの数は所望の標的核酸の長さに対応し、リピートの同一性は標的核酸配列と一致するように選択される。
【００９３】
いくつかの実施形態では、核酸中の標的配列は、標的部位の選択性を最大化するために１５〜２０塩基対の間である。標的核酸の切断は、典型的には、ＴＡＬＥＮ結合の５０塩基対以内で生じる。ＴＡＬＥＮ認識部位を設計するためのコンピュータープログラムは、当技術分野において開示されてきた。例えば、Ｃｅｒｍａｋら，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２０１１  Ｊｕｌｙ；  ３９（１２）：  ｅ８２を参照されたい。
【００９４】
所望の標的配列と一致するように設計された場合、ＴＡＬＥＮを組換えにより発現させ、外因性タンパク質としてプロトプラストに導入させるか、又はプロトプラスト内のプラスミドから発現させるか、又はｍＲＮＡとして投与され得る。
【００９５】
好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼであり得る。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼは、非特異的切断ドメイン、典型的にはＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの切断ドメインを、特定のＤＮＡ配列に結合するように操作されたジンクフィンガータンパク質ドメインと結合する。ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼのモジュラー構造は、それらをゲノムへの部位特異的二本鎖切断を生成するための多用途のプラットフォームにする。ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼは二量体として切断するので、オフターゲット切断事象を防止する戦略の１つは、隣接する９塩基対部位で結合するジンクフィンガードメインを設計することであった。米国特許第７，２８５，４１６号；同第７，５２１，２４１号；同第７，３６１、６３５号；同第７，２７３，９２３号；同第７，２６２，０５４号；同第７，２２０，７１９号；同第７，０７０，９３４号：同第７，０１３，２１９号：同第６，９７９，５３９号；同第６，９３３，１１３号；同第６，８２４，９７８号も参照されたい；これらのそれぞれの特許は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９６】
好ましい実施形態では、ヌクレアーゼは、メガヌクレアーゼであり得る。メガヌクレアーゼとしても知られるホーミングエンドヌクレアーゼは、その大きな（例えば、＞１４ｂｐ）標的配列により高度の特異性を有する、ゲノムＤＮＡに二本鎖切断を生成する配列特異的エンドヌクレアーゼである。標的部位に対するホーミングエンドヌクレアーゼの特異性が誘導されたＤＮＡ切断の正確なターゲティングを可能にするが、ホーミングエンドヌクレアーゼ切断部位は珍しく、標的化遺伝子に天然に存在する切断部位を発見する可能性は低い。人工エンドヌクレアーゼの別のクラスは、操作されたメガヌクレアーゼである。操作されたホーミングエンドヌクレアーゼは、既存のホーミングエンドヌクレアーゼの特異性を変更することにより生成される。１つのアプローチにおいては、変異が天然に存在するホーミングエンドヌクレアーゼのアミノ酸配列に導入され、次いで、得られる操作されたホーミングエンドヌクレアーゼがスクリーニングされて、標的化結合部位を切断する機能性タンパク質が選択される。別のアプローチにおいては、キメラホーミングエンドヌクレアーゼは、２つの異なるホーミングエンドヌクレアーゼの認識部位を組み合わせて、それぞれのホーミングエンドヌクレアーゼの半分の部位で構成される新しい認識部位を生成することによって操作される。例えば、米国特許第８，３３８，１５７号を参照されたい。
【００９７】
さらに好ましい実施形態では、部位特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓである。用語のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、Ｃａｓ、Ｃａｓタンパク質又はＣａｓ様タンパク質とは、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質を意味し、限定するものではないがＣＡＳ９、ＣＳＹ４、ニッカーゼ（例えば、Ｃａｓ９＿Ｄ１０Ａ、Ｃａｓ９＿Ｈ８２０Ａ又はＣａｓ９＿Ｈ８３９Ａ）、Ｍａｄ７及び融合タンパク質（例えば、異種ニッカーゼ／エンドヌクレアーゼドメインなどのさらなる機能性ドメインに融合されているＣａｓ９又はＣａｓ様分子）、並びにＣｐｆ１又はＣｐｆ１＿Ｒ１２２６Ａなどの他の例、及び例えば、参照により本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／００６７４７号、国際公開第２０１８／１１５３９０号及び米国特許第９，９８２，２７９号に記載されているものを含む。Ｃａｓ９の変異体及び誘導体並びに他のＣａｓタンパク質は、本明細書に開示されている方法において使用することができる。好ましくは、そのような他のＣａｓタンパク質はエンドヌクレアーゼ活性を有し、標的配列を認識するために操作されるｇＲＮＡの存在下で細胞内にある場合に、標的核酸配列を認識することができる。ＣＡＳタンパク質又はＣＡＳ様タンパク質は、Ｃｐｆ１のＣＡＳ９タンパク質であることが好ましい。
【００９８】
ＣＡＳ又はＣＡＳ様タンパク質は、限定するものではないが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ９９ＺＷ２）、フランシセラ・ツラレンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ）由来のＣａｓ９（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ｑ５Ｙ３）、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）由来のＣａｓ９（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｊ７ＲＵＡ５）、アクチノミセス・ネスランディイ（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ）由来のＣａｓ９（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｊ３Ｆ２Ｂ０）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のＣａｓ９（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｇ３ＥＣＲ１；ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ−Ｑ０３ＪＩ６；Ｑ０３ＬＦ７）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）由来のＣａｓ９（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｃ９Ｘ１Ｇ５；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ１ＩＱ６８）；リステリア・イノキュア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ９２７Ｐ４）；ストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）由来のＣａｓ９（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ８ＤＴＥ３）；パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のＣａｓ９（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ９ＣＬＴ２）；ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）由来のＣａｓ９（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ６ＮＫＩ３）；カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）由来のＣａｓ９（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ０Ｐ８９７）、フランシセラ・ツラレンシス由来のＣｐｆ１（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ａ０Ｑ７Ｑ２）、アシドアミノコックス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）由来のＣｐｆ１（例えばＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｕ２ＵＭＱ６）、それらの任意のオルソログ又はそれらに由来する任意のＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼからなる群から選択することができる。
【００９９】
本発明の方法において使用するのに好ましいＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１である。他の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＲｕｖＣ、ＨＮＨ、ＲＥＣ及びＢＨドメインのうちの少なくとも１つが高度に保存されているＣａｓ９のホモログであり得る。
【０１００】
好ましいＣａｓヌクレアーゼは、Ｃａｓ９である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９システムは、次の３つの基本的な設計構成要素を含有する：１）Ｃａｓタンパク質；２）ｃｒＲＮＡ；及び３）トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）。好ましい実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡは、単鎖キメラＲＮＡ（単一ガイドＲＮＡ／ｓｇＲＮＡ／ｇＲＮＡ）に組み合わせることができる。Ｃａｓ９タンパク質は広く市販されており、またその変更バージョン（及び本発明の文脈においてＣＡＳタンパク質とも考えられる）も広く市販されている。Ｃａｓ９タンパク質は（エンド）ヌクレアーゼ活性を有し、標的配列で特定のＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を生成することができる。実際、ゲノム配列を標的とするＣａｓ９タンパク質（ヌクレアーゼ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲシステムの構成要素）又はｓｇＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡのキメラ融合）は、ゲノム標的配列で標的化ＤＳＢを生成するが、これは多くの場合、細胞ＤＮＡ機構によって誤修復され、その結果、小さな挿入また欠失（インデル）が生じることが明らかになっている（Ｆｅｎｇら  （２０１３）  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．  １：  ４；  Ｌｉら  （２０１３）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  １０  ３１：  ６８９〜６９１；  Ｎｅｋｒａｓｏｖら  （２０１３）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３１：  ６９１〜６９３；  Ｓｈａｎら  （２０１３）  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈ．  ３１：  ６８６〜６８８）。
【０１０１】
別の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＣｐｆ１である。Ｃｐｆ１は、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの単一ＲＮＡ−誘導型エンドヌクレアーゼである（Ｃｅｌｌ  （２０１５）  １６３（３）：７５９〜７７１）。特に、Ｃｐｆ１は単一ｃｒＲＮＡ−誘導型エンドヌクレアーゼであり、Ｔリッチプロトスペーサー隣接モチーフを利用する。干渉の媒介にｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを必要とするＣａｓ９とは異なり、Ｃｐｆ１−ｃｒＲＮＡ複合体は、単独で、すなわち、追加のＲＮＡ種を必要とすることなく、標的ＤＮＡ分子を切断し得る。したがって、Ｃｐｆ１は、代替ＣＡＳタンパク質として使用することができる。
【０１０２】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、基本的には２つの構成要素：「ガイド」ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）及び非特異的ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１）で構成されている。ｇＲＮＡは、Ｃａｓ結合に必要な足場配列、及び修飾されるゲノム標的を規定するユーザー定義のヌクレオチド「ターゲティング」配列で構成されるショートＲＮＡである。したがって、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例えばＣａｓ９又はＣｐｆ１）のゲノム標的を、ｇＲＮＡに存在するターゲティング配列を単に変更することにより変更することができる。ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、ｔｒａｃｒＲＮＡにハイブリダイズしたｃｒＲＮＡであってもよく、又は、例えばＣａｓ９ヌクレアーゼと組み合わせて使用される場合、例えばＪｉｎｅｋら  （２０１２，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：  ８１６〜８２０）に記載されている単鎖ガイドＲＮＡであってもよい。ｇＲＮＡは、さらに、Ｃｐｆ−１とともに使用するためのような単一ＲＮＡガイド（ｃｒＲＮＡ）であると理解されたい。したがって、ｇＲＮＡは、ヌクレアーゼを二重鎖ＤＮＡの特定の標的配列に導くＲＮＡ分子である。
【０１０３】
ガイドＲＮＡは、例えばＣａｓ９と組み合わせて使用される場合、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合体であり得る。しかし、単一ｓｇＲＮＡの代わりに、個別のＲＮＡ分子としてのｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡが、例えばＣａｓ９と組み合わせて使用することができることも本発明の範囲内である。しかし、好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼは、単一の（例えばキメラ）ｇＲＮＡと組み合わせて使用される。
【０１０４】
上で明記したように、ＣＲＩＳＰＲシステムは、少なくとも２つの基本構成要素、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びガイドＲＮＡを必要とする。当業者は、ＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼシステムの異なる構成要素をどのように調製するかについて知っている。従来技術において、その設計及び使用に関する多数の報告が利用可能である。例えば、ｓｇＲＮＡの設計及びＣＡＳタンパク質ＣＡＳ９（元はストレプトコッカス・ピオゲネスから取得されたもの）とのその併用についてのＨａｅｕｓｓｌｅｒら（Ｊ  Ｇｅｎｅｔ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．（２０１６）４３（５）：２３９〜５０）による最近の概説を参照されたい。
【０１０５】
したがって、本発明の好ましい方法では、ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであり、好ましくは、本方法は、二重鎖ＤＮＡを少なくとも１つのガイドＲＮＡに曝露することをさらに含む。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを第１の位置又は第２の位置に導く。したがって、少なくとも１つのガイドＲＮＡは、第１のヌクレアーゼを二重鎖ＤＮＡの第１の位置にターゲティングするための第１のガイド配列を含むか、又はガイドＲＮＡは、第２のヌクレアーゼを二重鎖ＤＮＡの第２の位置にターゲティングするための第２のガイド配列を含む。
【０１０６】
好ましくは、本発明の方法の第１及び第２のヌクレアーゼのうちの少なくとも１つは、ＰＡＭ及びガイドＲＮＡを結合するための標的配列、又は少なくとも本発明の方法のそれぞれの別のヌクレアーゼの標的配列へのガイドＲＮＡの効率的結合に必須のヌクレオチドのいずれも切断しない。ヌクレアーゼはそれらの結合及び切断事象を連続的に行い得るので、本発明の方法の第１及び第２のヌクレアーゼの１つのみが、ＰＡＭ又はガイドＲＮＡのそれぞれの他のヌクレアーゼの標的配列への効率的結合に必須のヌクレオチドを切断する場合、本発明の方法は依然として機能する。
【０１０７】
好ましくは、第１のヌクレアーゼは、第２のヌクレアーゼを第２の位置に標的化するために第２のガイドＲＮＡにより必要とされる位置でＤＮＡを切断しない。或いは、又はさらに、第２のヌクレアーゼは、第１のヌクレアーゼを第１の位置に標的化するために第１のガイドＲＮＡにより必要とされる位置でＤＮＡを切断しない。
【０１０８】
一実施形態では、第１のヌクレアーゼは、
第２のヌクレアーゼを第２の位置にターゲティングするために必要とされるＰＡＭ配列；及び、
第２のヌクレアーゼを第２の位置にターゲティングするためのＤＮＡ標的配列
のうちの少なくとも１つを切断しない。
【０１０９】
好ましくは、第１のヌクレアーゼは、第２のヌクレアーゼを第２の位置にターゲティングするために必要とされるＰＡＭ配列を少なくとも切断しない。
【０１１０】
さらに、又は或いは、第２のヌクレアーゼは、
第１のヌクレアーゼを第１の位置にターゲティングするために必要とされるＰＡＭ配列；及び、
第１のヌクレアーゼを第１の位置にターゲティングするためのＤＮＡ標的配列
のうちの少なくとも１つを切断しない。
【０１１１】
好ましくは、第２のヌクレアーゼは、第１のヌクレアーゼを第１の位置にターゲティングするために必要とされるＰＡＭ配列を少なくとも切断しない。
【０１１２】
当業者は、第１又は第２のヌクレアーゼが、それぞれ第２又は第１のヌクレアーゼをＤＮＡにターゲティングするために必要とされる位置でＤＮＡを切断しないように、ガイドＲＮＡを設計する方法を知っている。
【０１１３】
以下に、第１の位置及び第２の位置の両方をターゲティングするＣａｓ９ヌクレアーゼについての非限定的な例を提供する。したがって、この非限定的な例は、ＰＡＭ部位の上流で切断する部位特異的ヌクレアーゼに関する。しかし、当業者は、ＰＡＭ部位の下流のＤＮＡ、例えばＣｐｆ１及びＭＡＤ７を切断する部位特異的ヌクレアーゼ、又は第１及び第２の位置をそれぞれターゲティングする異なるヌクレアーゼの組合せについて、同様の計算を行うことができることをすぐに理解する。
【０１１４】
例えば第１及び第２の位置の両方をターゲティングするＣａｓ９ヌクレアーゼの非限定的な例として、ヌクレアーゼの切断部位は、ＰＡＭ部位の３ｎｔ上流（５’）に位置し得る。ＰＡＭ配列は、３ヌクレオチド（例えばＮＧＧ）の長さを有し得る。第１のガイドＲＮＡは、第１のヌクレアーゼを第１の位置にターゲティングするためにＰＡＭ部位に隣接して結合し、第２のガイドＲＮＡは、第２のヌクレアーゼを第２の位置にターゲティングするためにさらなるＰＡＭ部位に隣接して結合する。したがって、少なくとも２つのＰＡＭ部位が同じＣＤＳ内に存在するものである。
【０１１５】
２つのＰＡＭ部位が同じ鎖上に位置している場合、好ましくは、第１のヌクレアーゼをターゲティングするために必要とされるＰＡＭ部位と第２のヌクレアーゼをターゲティングするために必要とされるＰＡＭ部位との間の距離は少なくとも３ｎｔであり、すなわち、ＰＡＭ部位間の最短距離は、好ましくは、少なくともＰＡＭ部位と切断部位との間の距離と同じである。
【０１１６】
したがって、第１のヌクレアーゼをターゲティングするための第１のＰＡＭ部位と第２のヌクレアーゼをターゲティングするための第２のＰＡＭ部位が同じ鎖上に位置している実施形態では、２つのＰＡＭ部位間の距離は、下流の（３’）ＰＡＭ部位とその切断部位の間の距離と少なくとも同じである。２つのＰＡＭ部位間の距離は、好ましくは、少なくとも約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２３、２５ヌクレオチド、又は少なくとも約３０ヌクレオチドである。好ましくは、２つのＰＡＭ部位間の距離は、少なくとも５ｎｔである。
【０１１７】
例えばＣａｓ９ヌクレアーゼに関するさらなる非限定的な例として、ＰＡＭ部位が反対の鎖に位置しており、一方のＰＡＭ部位が他方のＰＡＭ部位の上流（５’）に位置してる場合（すなわち、ＰＡＭ部位の５’末端がＰＡＭ部位の３’末端よりも近くにある場合）、２つのＰＡＭ部位間の距離は、好ましくは、少なくともＰＡＭ部位と切断部位との差であり、例えば３ｎｔであり、またガイドＲＮＡの結合に必須である標的ＤＮＡ配列の配列の長さは、例えば少なくとも１２ヌクレオチド又は少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９若しくは２０ヌクレオチドである。ＤＮＡ標的配列は、例えば２０ヌクレオチドの長さを有していてもよく、ＰＡＭ配列を含む鎖のすぐ上流に、相補的に存在し得る。ＰＡＭ部位が反対の鎖に位置しており、一方のＰＡＭ部位が他方のＰＡＭ部位の５’に位置している場合、ＰＡＭ部位間の距離は、好ましくは、少なくとも１５ヌクレオチドであるか、又は少なくとも１６、１７、１８、１８、１９、２０、２１、２２若しくは２３ヌクレオチドである。この距離は、ＰＡＭ部位と切断部位間の距離（３ｎｔ）プラス、ガイドＲＮＡの結合に必須である標的配列の長さ（少なくとも１２ｎｔ、又は少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０ｎｔ）として算出される。
【０１１８】
したがって、第１のヌクレアーゼをターゲティングする第１のＰＡＭ部位及び第２のヌクレアーゼをターゲティングする第２のＰＡＭ部位が反対の鎖に位置しており、一方のＰＡＭ部位が他方のＰＡＭ部位の上流（５’）に位置している（すなわち、２つのＰＡＭ部位の５’末端がＰＡＭ部位の３’末端よりも近い）実施形態では、２つのＰＡＭ部位間の距離は、好ましくは、少なくともＰＡＭ部位とその切断部位との間の距離である。好ましくは、２つのＰＡＭ部位間の距離は、好ましくは少なくともＰＡＭ部位と切断部位との間の距離（３ｎｔ）プラス、標的配列の長さ（２０ｎｔ）である。好ましくは、２つのＰＡＭ部位間の距離は、少なくとも約２０、２５、３０、３５、４０、４５又は約５０ヌクレオチドである。
【０１１９】
例えばＣａｓ９ヌクレアーゼに関するさらなる非限定的な例として、ＰＡＭ部位が反対の鎖に位置しており、一方のＰＡＭ部位が他方のＰＡＭ部位の下流（３’）に位置している場合（すなわち、ＰＡＭ部位の３’末端がＰＡＭ部位の５’末端よりも近くにある場合）、ＰＡＭ部位は互いに下流に位置しているので、ＰＡＭ部位間に最短距離はないことが好ましいが、この非限定的な例では、Ｃａｓ９切断部位はＰＡＭ部位の上流に位置している。したがって、ヌクレアーゼは、他方のＰＡＭ部位又はＤＮＡ標的配列のうちの少なくとも１つを切断しない。
【０１２０】
上記で示したように、ＰＡＭ部位の下流で切断する部位特異的ヌクレアーゼ又はヌクレアーゼの組合せについては、同様に算出することができる。本発明の方法の両方のヌクレアーゼがＰＡＭ部位の下流で切断する例においては、第１のヌクレアーゼをターゲティングするための第１のＰＡＭ部位と第２のヌクレアーゼをターゲティングするための第２のＰＡＭ部位が同じ鎖上に位置している実施形態では、２つのＰＡＭ部位間の距離は、少なくとも上流（５’）ＰＡＭ部位とその切断部位との間の距離と同じである。
【０１２１】
一実施形態では、ＰＡＭ部位間の距離は、好ましくは、ヌクレアーゼがＰＡＭ部位の上流又は下流のＤＮＡを切断するか否かにかかわらず、少なくとも、約３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２３、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５ヌクレオチドであるか、又は少なくとも約５０ヌクレオチドである。
【０１２２】
さらに好ましい実施形態では、ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つはＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼであり、本方法は、二重鎖ＤＮＡを、
ｉ）第１のヌクレアーゼを二重鎖ＤＮＡの第１の位置にターゲティングするための第１のガイド配列を含む第１のガイドＲＮＡ；及び
ｉｉ）第２のヌクレアーゼを二重鎖ＤＮＡの第２の位置にターゲティングするための第２のガイド配列を含む第２のガイドＲＮＡ
に曝露することをさらに含む。
【０１２３】
さらに好まし実施形態では、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、Ｃａｓ９又はＣｐｆ１である。したがって、第１の位置はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼで切断され得るか、又は第１の位置はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１ヌクレアーゼで切断され得る。同様に、第２の位置はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ヌクレアーゼで切断され得るか、又は第２の位置はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１ヌクレアーゼで切断され得る。さらに、第１及び第２の位置は、同一（タイプの）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって切断され得るが、例えば、両方の位置は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１のいずれかで切断され得る。或いは、第１及び第２の位置は、異なる（タイプの）ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによって切断され得るが、例えば、一方の位置はＣａｓ９で切断され、他方の位置はＣｐｆ１で切断され得る。
【０１２４】
さらに好ましい実施形態では、ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、及びＴＡＬＥＮからなる群から選択される。本発明は、二重鎖ＤＮＡを切断するための異なるタイプの部位特異的ヌクレアーゼの使用、例えば、限定するものではないが、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＴＡＬＥＮの組合せの使用を意図する。好ましくは、本発明の方法で使用されるヌクレアーゼは同一タイプのヌクレアーゼであり、例えば、第１及び第２の位置の両方がＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ又はＴＡＬＥＮによって切断される。
【０１２５】
好ましくは、少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼが同一ＣＤＳ内の少なくとも２つの位置でＤＮＡを切断する。さらに、ＤＮＡはまた、同一ＣＤＳ内で３つ以上の位置で切断され得る。非限定的な例として、ＤＮＡは同一ＣＤＳ内の３つの位置で切断され得、ＣＤＳ内の第１、第２及び第３の位置でインデルが生成され、第１のインデルの前、及び第３のインデルの後のＣＤＳは同一リーディングフレームのままである。この実施形態の範囲内では、第１のインデルと第２のインデルの間、及び第２のインデルと第３のインデルの間のリーディングフレームはシフトし得る。同様に、同一ＣＤＳは、例えば４、５、６、７、又は８つの位置で切断され得、各位置でインデルが生成され、それぞれ第４、第５、第６、第７、又は第８の位置の後のリーディングフレームは、第１の位置の前のリーディングフレームとともにフレームのままであるが、第１のインデルと最後のインデルの間のリーディングフレームはシフトし得る。
【０１２６】
或いは、二重鎖ＤＮＡは同一ＣＤＳ内の２つ以上の位置で切断されることによりインデルが各位置で生成される可能性があり、その結果、第１の位置と最後の位置の間でリーディングフレームの一部がシフトし、リーディングフレームの一部が第１のインデルの前のＣＤＳとともにフレームのままである。非限定的な例として、第１のインデルはフレームシフトを生成する可能性があり、これは第２のインデルによって修正される。続いて、第３の位置のインデルは、第４の位置のインデルによって修正される新しいフレームシフトを生成する。上記で例示したような単一リーディングフレーム内でのいくつかのフレームシフトの生成は、同一リーディングフレーム内の複数の部分での標的化改変が所望される場合に有用となり得る。本発明の方法を使用した場合、同一ＣＤＳの少なくとも１、２、３又は４つの所定部分が、好ましくは、それぞれ少なくとも２、４、６又は８つの部位特異的ヌクレアーゼを使用して、少なくとも１、２、３又は４回フレームシストを導入することにより改変され得る。本明細書では、任意選択で、同一ＣＤＳの少なくとも１、２、３又は４つの所定の部分が同一の又は異なるエクソン内にあると理解されたい。任意選択で、それぞれの所定の部分は、同一ＣＤＳを有する別個のエクソンにある。
【０１２７】
したがって、好ましい実施形態では、二重鎖ＤＮＡは少なくとも２、３、４、５、６、７又は８つの部位特異的ヌクレアーゼに曝露され、少なくとも２、３、４、５、６、７又は８つの部位特異的ヌクレアーゼは同一ＣＤＳの二重鎖ＤＮＡを切断する。好ましくは、二重鎖ＤＮＡは２、３又は４つの部位特異的ヌクレアーゼに曝露され、２、３又は４つの部位特異的ヌクレアーゼは同一ＣＤＳの二重鎖ＤＮＡを切断する。より好ましくは、二重鎖ＤＮＡは２又は３つの部位特異的ヌクレアーゼに曝露され、２又は３つの部位特異的ヌクレアーゼは同一ＣＤＳの二重鎖ＤＮＡを切断する。
【０１２８】
部位特異的ヌクレアーゼの導入
部位特異的ヌクレアーゼ、及び部位特異的ヌクレアーゼがＣＲＩＳＰＲ−ヌクレアーゼである好ましい実施形態では、ガイドＲＮＡもまた、当技術分野で公知の任意の従来の方法を使用して細胞に導入され得る。非限定的な例として、部位特異的ヌクレアーゼ（及びガイドＲＮＡ）の細胞への導入は、プラスミドベクターからの一過性発現、タンパク質の直接送達、ｍＲＮＡの細胞への直接送達、並びに／又はタンパク質をコードするＤＮＡ及び／若しくはガイドＲＮＡの細胞ゲノムへの安定的統合を構成し得る。部位特異的ヌクレアーゼタンパク質は、１つ又は複数の核局在化シグナル配列（ＮＬＳ）、変異、欠失、改変、又はトランケーションを含むことができる。さらに、部位特異的ヌクレアーゼをコードする遺伝子は、例えば、高等植物、藻類、酵母又は動物における発現のためにコドン最適化されていてもよく、適用可能な場合、構成的、誘導的、組織特異的又は種特異的プロモーターのいずれかによって駆動することができる。例示的なヌクレアーゼ転写終止及びポリアデニル化シグナルは、ＮｏｓＴ、ＲＢＣＴ、ＨＳＰ１８．２Ｔ、又は他の遺伝子特異的若しくは種特異的ターミネーターのいずれかである。ヌクレアーゼ遺伝子カセット又はｍＲＮＡは、ネイティブで、又は遺伝子特異的プロモーター及び／若しくは合成プロモーターとの組合せでイントロンを含み得る。
【０１２９】
好ましい実施形態では、細胞は、部位特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つで形質転換され、すなわち、ヌクレアーゼタンパク質は細胞に直接送達される。さらなる実施形態では、細胞は、ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つで形質転換される。好ましくは、細胞は、部位特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つ及びガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つで形質転換される。好ましくは、細胞は、１つの部位特異的ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び２つのガイドＲＮＡで形質転換される。
【０１３０】
別の好ましい実施形態では、細胞は、部位特異的ヌクレアーゼのうちの少なくとも１つコードする核酸構築物でトランスフェクトされる。さらなる実施形態では、細胞は、ガイドＲＮＡのうちの少なくとも１つをコードする核酸構築物でトランスフェクトされ、好ましくは、その核酸構築物は少なくとも２つのガイドＲＮＡをコードする。好ましくは、細胞は、本明細書に記載の標的化改変の方法において使用されるすべてのガイドＲＮＡをコードする核酸構築物でトランスフェクトされる。
【０１３１】
さらに、異なる核酸構築物を本発明の方法では使用することができ、それによりそれぞれの核酸構築物は部位特異的ヌクレアーゼ又はガイドＲＮＡのいずれかをコードする。或いは、単一核酸構築物は、少なくとも２つのガイドＲＮＡ、又は少なくとも１つのガイドＲＮＡ及び少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼをコードし得る。好ましい実施形態では、細胞は、少なくとも２つのガイドＲＮＡをコードする核酸構築物、及び少なくとも１つの部位特異的ヌクレアーゼをコードする別個の核酸構築物でトランスフェクトされる。
【０１３２】
さらに好ましい実施形態では、本明細書で定義した改変されたＣＤＳを含む細胞は、改変されたＣＤＳを含まない細胞から分離される。非限定的な例として、形質転換又はトランスフェクトされた細胞を増殖させ、続いて、当技術分野で公知の任意の従来の方法を使用して遺伝子型を同定することができる。好ましい実施形態では、形質転換／トランスフェクトされた細胞は、ディープ配列決定技術、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ又は４５４配列決定などを使用して遺伝子型が同定され得る。
【０１３３】
改変されたＣＤＳを含むタンパク質は、任意の従来の手段を使用して、改変された機能性についてさらに評価することができる。
【０１３４】
核酸（部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸及び／若しくはガイドＲＮＡ（をコードする）核酸）又はタンパク質を細胞に送達するための当技術分野で公知の多くの適切な手法がある。送達システムは、例えば、ウイルスベースの送達システム又は非ウイルス性の送達システムを構成し得る。
【０１３５】
非ウイルス性の送達システムの非限定的な例としては、化学ベースのトランスフェクション（例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、シクロデキストリン、ポリマー、リポソーム、又はナノ粒子の使用）、非化学ベースの方法（例えば、エレクトロポレーション、細胞圧搾、ソノポレーション、光学トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、熱ショック及び流体力学的送達）、粒子ベースの方法（例えば、遺伝子銃又は磁石介在トランスフェクション）並びに細菌ベースの送達システム（例えば、アグロバクテリウム（ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介送達）が挙げられる。ウイルス送達システムの非限定的な例としては、レンチウイルス及びアデノウイルスが挙げられる。
【０１３６】
好ましい実施形態では、核酸及び／又はタンパク質は、水性媒体を使用して細胞に導入され、その水性媒体はＰＥＧを含む。任意の適切な方法を使用することができ、好ましくは、媒体は５〜８の間、好ましくは６〜７．５の間のｐＨ値を有する。部位特異的ヌクレアーゼ及び任意選択でのｇＲＮＡの水性媒体中の存在に次いで、媒体はポリエチレングリコールを含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、工業的製造から医薬まで多くの用途を有するポリエーテル化合物である。ＰＥＧはまた、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）又はポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られている。ＰＥＧの構造は、一般に、Ｈ−（Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２）ｎ−ＯＨとして表される。好ましくは、使用されるＰＥＧは、２０，０００ｇ／ｍｏｌ未満の分子量を有するオリゴマー及び／若しくはポリマー、又はそれらの混合物である。
【０１３７】
例えば植物細胞の集団を含む水性媒体は、好ましくは１００〜４００ｍｇ／ｍｌのＰＥＧを含む。そのため、ＰＥＧの最終濃度は、好ましくは１００〜４００ｍｇ／ｍｌの間であり、例えば１５０〜３００ｍｇ／ｍｌの間、例えば１８０〜２５０ｍｇ／ｍｌの間である。好ましいＰＥＧは、ＰＥＧ  ４０００  Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ｎｏ．８１２４０である（すなわち、平均Ｍｎ  ４０００を有する（Ｍｎ、数平均分子量は、試料中のすべてのポリマー分子の総重量を試料中のポリマー分子の総数で除算したものである））。好ましくは、ＰＥＧは、約１０００〜１００００、例えば２０００〜６０００の間のＭｎとして使用される。
【０１３８】
さらに好ましい実施形態では、ＰＥＧを含む水性媒体は、約０．００１％、０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、２％、５％、１０％又は２０％（ｖ／ｖ）を超えるグリセロールを含まない。好ましくは、媒体は、約０．００１％、０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、２％、５％、１０％又は２０％（ｖ／ｖ）未満のグリセロールを含む。特に部位特異的ヌクレアーゼタンパク質の導入においては、水性媒体は、約０．１％未満（例えば、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％（ｖ／ｖ）未満のグリセロール）を含む。任意選択で、植物細胞の集団を含む水性媒体は、グリセロールを完全に含まない。
【０１３９】
好ましくは、例えば植物細胞の細胞周期は、二重鎖ＤＮＡを少なくとも２つの部位特異的阻害剤に曝露した場合に同調される。同調は、好ましくは、本明細書で詳述したように、部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸が細胞に導入された場合に起こる。同調は、好ましくは、（植物）細胞を同調剤と接触させることにより実施する。
【０１４０】
そのような（植物）細胞の細胞周期を同調する方法は、欧州特許第２５１６６５２号に詳細に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。より詳しくは、（植物）細胞、例えば植物プロトプラストを同調することにより、二重鎖ＤＮＡの改変の導入の有効性をさらに高めるために本発明の特定の実施形態では有利となり得る。したがって、特定の実施形態では、本方法は、細胞、好ましくは植物細胞の細胞周期を同調するステップを含む。
【０１４１】
同調は、好ましくは、部位特異的ヌクレアーゼ又は部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸が本明細書に詳述されているように細胞に導入される場合に起こり、その結果、ほとんどの（植物）細胞が、二重鎖ＤＮＡが本明細書で定義した部位特異的ヌクレアーゼに曝露された際に細胞周期の同じ段階になる。これは有利であり、二重鎖ＤＮＡの改変の導入率を上昇させ得る。
【０１４２】
（植物）細胞の同調は、任意の適切な手段によって達成することができる。例えば、細胞周期の同調は、栄養枯渇、例えば、リン酸塩枯渇、硝酸塩枯渇、イオン枯渇、血清枯渇、スクロース枯渇、オーキシン枯渇によって達成され得る。
【０１４３】
同調は、同調剤を（植物）細胞に添加することによっても達成することができる。好ましくは、同調剤は、アフィディコリン（ａｐｈｉｄｏｃｏｌｉｎ）、ヒドロキシ尿素、チミジン、コルヒチン、コブトリン（ｃｏｂｔｏｒｉｎ）、ジニトロアニリン、ベネフィン、ブトラリン、ジニトラミン、エタルフルラリン、オリザリン、ペンジメタリン、トリフルラリン、アミプロホスメチル、ブタミホスジチオピル、チアゾピルプロピザミド、テブタムＤＣＰＡ（クロルタールジメチル）、ミモシン、アニソマイシン、アルファアマニチン、ロバスタチン、ジャスモン酸、アブシジン酸、メナジオン、クリプトゲイン（ｃｒｙｐｔｏｇｅｉｎｅ）、過酸化水素、過マンガン酸ナトリウム、インドメタシン、エポキソマイシン、ラクタシスチン（ｌａｃｔａｃｙｓｔｅｉｎ）、ｉｃｒｆ  １９３、オロモウシン、ロスコビチン、ボヘミン、スタウロスポリン、Ｋ２５２ａ、オカダ酸、エンドタール（ｅｎｄｏｔｈａｌ）、カフェイン、ＭＧ  １３２、サイクリン依存性キナーゼ、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、並びにそれらの標的メカニズムからなる群から選択される。量及び濃度、並びにそれらに関連する細胞周期段階は、例えば、「Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｗｉｔｈ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ」，  Ｊ．  Ｄｏｌｅｚｅｌ  ｃ．ｓ．  Ｅｄｓ．  Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇ  ２００７  ｐｐ  ３２７  ｆｆに記載されている。好ましくは、同調剤は、アフィディコリン及び／又はヒドロキシ尿素である。
【０１４４】
好ましくは、本発明の方法では、細胞周期の同調は、細胞周期のＳ期、Ｍ期、Ｇ１期及び／又はＧ２期に（植物）細胞を同調させる。
【０１４５】
キットオブパーツ
第２の態様では、本発明は、任意選択で、本発明の方法において使用するためのキットオブパーツに関する。好ましくは、キットオブパーツは、
部位特異的ヌクレアーゼ及び／又は部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸構築物を含む第１の容器；
本明細書で定義した方法に従って細胞における二重鎖ＤＮＡのＯＲＦを標的化改変するためのマニュアル
を含む。
【０１４６】
好ましい実施形態では、キットオブパーツは、少なくとも２つのガイドＲＮＡ、及び／又は少なくとも１つのガイドＲＮＡ、好ましくは少なくとも２つのガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸構築物を含む第２の容器をさらに含み得る。好ましくは、ガイドＲＮＡは、第１又は第２のヌクレアーゼが、それぞれ第２又は第１のヌクレアーゼをＤＮＡにターゲティングするために必要とされる位置でＤＮＡを切断しないように設計される。
【０１４７】
一実施形態では、第１の容器は、少なくとも２つのガイドＲＮＡ、及び／又は少なくとも１つのガイドＲＮＡ、好ましくは少なくとも２つのガイドＲＮＡをコードする少なくとも１つの核酸構築物をさらに含み得る。好ましくは、ガイドＲＮＡは、第１又は第２のヌクレアーゼが、それぞれ第２又は第１のヌクレアーゼをＤＮＡにターゲティングするために必要とされる位置でＤＮＡを切断しないように設計される。
【０１４８】
さらに好ましい実施形態では、第１の容器は、
ｉ）少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼ；
ｉｉ）部位特異的ヌクレアーゼをコードする少なくとも２つの核酸構築物；及び
ｉｉｉ）少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼをコードする核酸構築物
のうちの少なくとも１つをさらに含む。
【０１４９】
試薬は、凍結乾燥された形態で存在していてもよく、又は適切な緩衝液中に存在していてもよい。キットはまた、本発明を実施するのに必要な任意の他の構成要素、例えば、緩衝液、ピペット、マイクロタイタープレート、及び書面の説明書を含むことができる。本発明のキットのためのそのような他の構成要素は、当業者には公知である。
【０１５０】
第３の態様では、本発明は、細胞における二重鎖ＤＮＡのＯＲＦを標的化改変するための本明細書で定義した少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼ又は本明細書で定義したキットオブパーツの使用に関する。
【０１５１】
本発明の方法により得ることができる生成物
第４の態様では、したがって、本発明は、本発明の方法により得ることができる改変されたＤＮＡ分子、若しくは任意の核酸（例えば、前記改変されたＤＮＡ分子から転写されるｍＲＮＡ）又はそれに由来する核酸構築物に関する。そのような核酸構築物は、同種系若しくは異種系翻訳及び／又は転写調節配列、例えばプロモーター配列をさらに含むキメラ又はベクターであり得る。前記改変されたＤＮＡ分子は、細胞のゲノムの一部であってもよい。
【０１５２】
本発明の方法により得ることができる細胞を続いて増殖させ、例えば、細胞、生物体（の一部）又は任意のその子孫の培養物を得ることができる。したがって、当業者は、細胞におけるＤＮＡの標的化改変のための方法が、二重鎖ＤＮＡ分子に標的化改変を有する細胞を提供するための方法としての使用も見出すことができることを理解するであろう。好ましくは、細胞は植物細胞である。同様に、本発明の方法は、二重鎖ＤＮＡ分子に標的化改変を含む、生物体及びその子孫を提供するための方法としての使用であって、その改変又は修飾が本発明による方法で処理されていない同じ生物体に対する改変又は修飾である、使用も見出すことができる。好ましくは、生物体は植物又は植物の一部である。
【０１５３】
第５の態様では、したがって、本発明は、本発明の方法により得られた、又は得ることができる細胞に関する。好ましくは、細胞は、植物細胞又はプロトプラストである。好ましくは、植物細胞又は植物プロトプラストは、対照と比較した場合に、標的化改変を含むことにより修飾されており、対照は、先行する請求項のいずれかの方法により標的化改変が導入される前の植物細胞又は植物プロトプラストである。
【０１５４】
標的化改変を含む植物細胞又は植物プロトプラストは、続いて、標的化改変を含む植物又はその子孫を再生するために使用され得る。
【０１５５】
非限定的な例として、本発明の方法を使用すると、改善された除草剤耐性を有する植物が作出された。特に、本発明の方法を使用して、複数のインデル変異をトマトのＡＬＳ遺伝子に導入した。簡単に説明すると、トマトプロトプラストに、ストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９  ＯＲＦをコードするプラスミドベクターを、ＡＬＳ遺伝子のＰ１８４コドンの周辺領域を標的とする３つのｓｇＲＮＡの発現用カセットを保持する別のプラスミドベクターと一緒にトランスフェクトした。様々な程度の除草剤耐性を付与する多くの優性ＡＬＳ変異が当技術分野において公知である（Ｒｏｕｘら、前掲）。ＳＵクラスの除草剤に対する耐性を付与する多くの変異は、Ｐ１８４のコドン内又はコドン周辺にある（例えば、Ｐ１８４Ｌ、Ｐ１８４Ｒ、Ｐ１８４Ｑなど）。したがって、本発明者らは、Ｐ１８４コドン周辺のフレームシフトを引き起こし得るこの領域におけるインデル変異の組合せも除草剤耐性表現型を生成し得ると仮定し、そのため本発明者らは、トランスフェクトされたプロトプラストをＳＵ除草剤クロルスルフロンの存在下で生育させた。
【０１５６】
興味深いことに、本発明者らは、プロトプラストのガイドＲＮＡの１つの発現のみでは除草剤耐性カルスを生成しなかったが、３つのガイドを同時に発現させた場合にクロルスルフロン耐性カルスを単離することができることを見出した。耐性カルスのＡＬＳ遺伝子は配列決定され、２つのインデル変異が密接にリンクしており、第１のインデル変異はタンパク質のリーディングフレームを改変し、第２のインデルはそれを修復することを確認した。すべての場合において、両方のインデルは、単一塩基対の挿入又は欠失で構成されていた。このフレームシフトにより、２つのインデル間のすべてのコドンが改変された。
【０１５７】
本明細書で詳述した本発明の方法を使用した際、本発明者らは、耐性カルスのＡＬＳ対立遺伝子がインデルの同じ組合せを有していることを見出したが、このことは、リーディングフレームの修復をもたらすすべての可能性のあるインデルの組合せのサブセットのみが除草剤耐性を付与することもまた示唆している。
【０１５８】
好ましい実施形態では、したがって、本発明は、本発明の方法により得ることができる二重鎖ＤＮＡであって、核酸が、対照と比較した場合に標的化改変を含むことにより修飾されており、その対照は標的化改変が導入される前のＤＮＡである、二重鎖ＤＮＡに関する。本発明はまた、任意の核酸又はそれに由来する構築物に関する。
【０１５９】
好ましい実施形態では、本発明は、本発明の方法により得ることができる改変されたＤＮＡを含む植物であって、その植物は、対照と比較した場合に標的化改変を含むことにより修飾されており、その対照は標的化改変が導入される前の植物である、植物に関する。
【０１６０】
特に好ましい実施形態では、植物は、好ましくは、少なくとも１つの改変されたＡＬＳ遺伝子を含む。好ましくは、改変されたＡＬＳ遺伝子は、配列番号１と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有し、５４７〜５７０位は、配列番号３〜５のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。さらに、又は或いは、標的化改変を含む植物は、配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する少なくとも１つの改変されたＡＬＳ遺伝子を含み、５４１〜５６４位は、配列番号３〜５のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。好ましくは、標的化改変を含む植物は、対照と比較した場合に改善された除草剤耐性を有する。
【０１６１】
好ましくは、植物は、スルホニル尿素（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭ）、トリアザロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）及びスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン（ＳＣＴ）からなる群から選択される除草剤に対して改善された耐性を有する。好ましいＳＵクラスの除草剤は、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロンメチル、クロルスルフロン、シノスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロンメチル、フォラムスルフロン、ロドスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロンメチル、ニコスルフロン、リムスルフロン、スルフォスルフロン、トリフェンスルフロンメチル、トリアスルフロン、トリベヌロンメチル、トリフルスルフロンメチル、イマザモックス、イマザピル、イマザキン及びメトスラムからなる群から選択され、好ましくは、除草剤はクロルスルフロンである。
【０１６２】
好ましくは、標的化改変を含む植物は、配列番号６、７又は８を有する配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む少なくとも１つの改変されたＡＬＳ遺伝子を含む。
【０１６３】
好ましくは、本発明の方法により得ることができる植物であって、植物は標的化改変を含むことにより修飾されており、植物は、配列番号６、７、又は８を有する配列を含む少なくとも１つの改変されたＡＬＳ遺伝子を含む。好ましくは、植物は、２つの改変されたＡＬＳ遺伝子を含む。好ましくは、植物は２つの改変されたＡＬＳ遺伝子を含み、改変されたＡＬＳ遺伝子は配列番号６、７又は８を有する配列を含む。好ましくは、第１のＡＬＳ遺伝子は、配列番号６又は７を有する配列を含み、第２のＡＬＳ遺伝子は、配列番号８を有する配列を含む。
【０１６４】
好ましくは、植物は、サトウダイコン（Ｂｅｔａ  ｖｕｌｇａｒｉｓ）、アマ（Ｌｉｎｕｍ  ｕｓｉｔａｔｉｓｓｉｍｕｍ）、ジャガイモ、トウモロコシ、コムギ属の種（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ｓｐｐ．）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、イネ、モロコシ（Ｓｏｒｇｈｕｍ  ｂｉｃｏｌｏｒ）、ヤマノイモ属の種（Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ  ｓｐｐ．）、キャッサバ（Ｍａｎｉｈｏｔ  ｅｓｃｕｌｅｎｔａ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ワタ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ  ｈｉｒｓｕｔｕｍ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、マカラスムギ（Ａｖｅｎａ  ｓａｔｉｖａ）、ライムギ（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）及びセイヨウアブラナからなる群から選択される。好ましくは、植物は、サトウダイコン、アマ及びトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）のうちの少なくとも１つである。
【０１６５】
好ましくは、植物はナス属の種（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｓｐｐ．）であり、好ましくはトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）である。
【０１６６】
本発明の方法を使用すると、改善された除草剤耐性を有する新規植物が作出された。第６の態様では、したがって、本発明は、少なくとも１つの改変されたＡＬＳタンパク質を発現するように遺伝子操作された、改善された除草剤耐性を有する植物に関する。
【０１６７】
好ましくは、発現されるＡＬＳタンパク質は、配列番号９と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％の配列同一性を有し、１８３〜１９２位は、配列番号１１〜１３のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。さらに、又は或いは、標的化改変を含む植物は、配列番号１０と少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する少なくとも１つの改変されたＡＬＳタンパク質を発現し、１８１〜１９０位は、配列番号１１〜１３のいずれか１つと少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する。好ましくは、改変されたＡＬＳタンパク質を発現する植物は、改変されたＡＬＳタンパク質を発現しない同一植物と比較して、改善された除草剤耐性を有する。
【０１６８】
好ましくは、改変されたＡＬＳタンパク質は、新たに発現される。改善された除草剤耐性を有する植物は、内因性の未改変のＡＬＳタンパク質をさらに発現し得る。或いは、改善された除草剤耐性を有する植物は、内因性の未改変のＡＬＳタンパク質を発現しない。
【０１６９】
好ましくは、植物は少なくとも１つの改変されたＡＬＳタンパク質を発現し、ＡＬＳタンパク質は、配列番号１４、１５、又は１６を有する配列と少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有する配列を含む。
【０１７０】
好ましくは、植物は少なくとも１つの改変されたＡＬＳタンパク質を発現し、ＡＬＳタンパク質は配列番号１４、１５、又は１６を有する配列を含む。好ましくは、植物は２つの改変されたＡＬＳタンパク質を含み、それにより各タンパク質は配列番号１４、１５、又は１６を有する配列を含む。好ましくは、植物は２つの改変されたＡＬＳタンパク質を含み、それにより、第１のＡＬＳタンパク質は配列番号１４又は１５を有する配列を含み、第２のＡＬＳタンパク質は、配列番号１６を有する配列を含む。
【０１７１】
好ましくは、植物は、ジャガイモ、トウモロコシ、コムギ属の種、コムギ、イネ、モロコシ、ヤマトイモ属の種、バショウ属の種（Ｍｕｓａ  ｓｐｐ．）、キャッサバ、ダイズ、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）、トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）、ワタ、オオムギ、マカラスムギ、ライムギ及びセイヨウアブラナからなる群から選択される。好ましくは、植物はナス属の種であり、好ましくはトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  Ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）であり、好ましくはトマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ）である。
【０１７２】
好ましくは、本発明の植物は、スルホニル尿素（ＳＵ）、イミダゾリノン（ＩＭ）、トリアザロピリミジン（ＴＰ）、ピリミジニルオキシベンゾエート（ＰＯＢ）及びスルホニルアミノカルボニルトリアゾリノン（ＳＣＴ）からなる群から選択される除草剤に対して改善された耐性を有する。好ましいＳＵクラスの除草剤は、アミドスルフロン、アジムスルフロン、ベンスルフロンメチル、クロルスルフロン、シノスルフロン、フラザスルフロン、フルピルスルフロンメチル、フォラムスルフロン、ロドスルフロン、メソスルフロン、メトスルフロンメチル、ニコスルフロン、リムスルフロン、スルフォスルフロン、トリフェンスルフロンメチル、トリアスルフロン、トリベヌロンメチル、トリフルスルフロンメチル、イマザモックス、イマザピル、イマザキン及びメトスラムからなる群から選択され、好ましくは、除草剤はクロルスルフロンである。
【０１７３】
好ましい修飾を以下の表１に示す。
【０１７４】
【表１】
2020533972.tif 000002
さらなる態様において、本発明は、植物、植物プロトプラスト又は植物細胞において少なくとも１つの改変されたＡＬＳタンパク質を発現させることを含む、植物における除草剤耐性を改善する方法であって、少なくとも１つのＡＬＳタンパク質が、配列番号１４、１５及び１６のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法に関する。
【０１７５】
改変されたＡＬＳタンパク質は、例えば、配列番号６、７及び８のいずれかと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされ得る。
【０１７６】
本方法は、例えば、植物、植物プロトプラスト又は植物細胞を遺伝子操作し、ＡＬＳタンパク質を発現させることを含み得る。本方法は、例えば、植物プロトプラスト又は植物細胞を、改変されたＡＬＳタンパク質をコードする組換え核酸を含むベクター又は発現構築物で形質転換することを含み得る。本方法は、例えば、アグロバクテリウム媒介性形質転換（例えば、植物プロトプラスト又は植物細胞を、ベクター又は発現構築物を含むアグロバクテリウム株と接触させ、組換え核酸を植物プロトプラスト又は植物細胞に導入する）を含み得る。
【０１７７】
本方法は、例えば、植物プロトプラスト又は植物細胞を植物に再生することをさらに含み得る。本方法は、例えば、改善された除草剤耐性を有する植物から種子を生成することをさらに含み得る。本方法は、例えば、種子を、改善された除草剤耐性を有する植物に生育させることをさらに含み得る。
【０１７８】
本方法は、例えば、植物、植物プロトプラスト又は植物細胞を、改変されたＡＬＳタンパク質の発現について試験することをさらに含み得る。（改変された）ＡＬＳタンパク質の発現を試験する方法としては、限定するものではないが、ＰＣＲ分析、ゲノムＤＮＡの配列決定、ｍＲＮＡ転写産物の配列決定、ｍＲＮＡ転写産物レベルの分析（ノーザンブロット分析）、コピー数の分析（サザンブロット分析）などが挙げられる。
【０１７９】
本方法は、例えば、植物、植物プロトプラスト又は植物細胞を、改善された除草剤耐性について試験することをさらに含み得る。除草剤耐性を試験する方法は、当技術分野において周知であり、以下の実施例の欄で例示されている。
【０１８０】
本方法は、例えば、植物、植物プロトプラスト又は植物細胞の子孫を生成し、本発明の少なくとも１つのＡＬＳタンパク質を発現する１つ又は複数の子孫を選択することをさらに含み得る。本方法は、例えば、植物、植物プロトプラスト又は植物細胞の子孫を生成し、改善された除草剤耐性を有する１つ又は複数の子孫植物を選択することをさらに含み得る。
【０１８１】
本発明の別の態様は、植物における除草剤耐性を改善する方法であって、改変されたＡＬＳタンパク質を発現するように遺伝子操作された複数の植物、植物プロトプラスト又は植物細胞を生成することであって、ＡＬＳタンパク質は、配列番号１４、１５及び１６のいずれかと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、こと、及び改善された除草剤耐性について遺伝子操作された植物、植物プロトプラスト又は植物細胞をスクリーニングすること、及び改善された除草剤耐性を有する植物、植物プロトプラスト又は植物細胞を選択することを含む方法に関する。
【０１８２】
本発明のさらなる態様は、改変されたＡＬＳタンパク質をコードする核酸であって、ＡＬＳタンパク質が、配列番号１４、１５及び１６のいずれかと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する核酸に関する。いくつかの実施形態では、この核酸配列は、配列番号６、７及び８のいずれかと少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。
【０１８３】
本明細書に記載の本発明の別の態様は、プロモーターに作動可能に連結されている改変されたＡＬＳタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸を含む組換え発現カセットに関する。いくつかの実施形態では、発現カセットは、異種プロモーターに作動可能に連結されている改変されたＡＬＳタンパク質をコードする核酸配列を含む組換え核酸を含む。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、プロモーターは、植物細胞において活性である。いくつかの実施形態では、プロモーターは異種プロモーターであるか、又は天然に存在する種におけるＡＬＳ遺伝子に作動可能に連結されていない。いくつかの実施形態では、プロモーターは、天然に存在する種におけるＡＬＳ遺伝子に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの実施形態では、プロモーターは、誘導性プロモーターである。
【０１８５】
本明細書に記載の本発明の別の態様は、本明細書で定義した発現カセット又は核酸を含むベクター又は発現構築物に関する。いくつかの実施形態では、ベクター又は発現構築物は、アグロバクテリウム媒介性形質転換のために構成されている。
【０１８６】
本発明のさらなる態様では、好ましくは本明細書で定義した本発明の方法において、植物における除草剤耐性を改善するための、改変されたＡＬＳタンパク質、前記タンパク質をコードするコード核酸又はコード発現カセットの使用を提供する。
【０１８７】
一態様では、本発明はさらに、本発明の方法において使用するための少なくとも２つの部位特異的ヌクレアーゼ、又はそれをコードする構築物を含む組成物に関する。一実施形態では、１つ又は複数の部位特異的ヌクレアーゼは、本明細書で定義したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼである。本組成物は、１つ若しくは複数のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを本明細書で定義した第１及び第２の位置にターゲティングするための１つ若しくは複数のガイドＲＮＡ、又はそれをコードする１つ若しくは複数の構築物をさらに含み得る。好ましくは、ガイドＲＮＡは、第１又は第２のヌクレアーゼが、それぞれ第２又は第１のヌクレアーゼをＤＮＡにターゲティングするために必要とされる位置でＤＮＡを切断しないように設計される。一実施形態では、本組成物は、薬学的に許容できる担体をさらに含む。実施形態では、１つ又は複数の構築物は、１つ又は複数の遺伝子治療ベクターであり得る。
【０１８８】
一態様では、本発明は、医薬として使用するための本明細書で定義した組成物に関する。同様に、本発明は、本明細書で定義した組成物を患者に投与するステップを含む治療方法に関する。
【０１８９】
さらなる態様では、本発明は、遺伝性障害の治療において使用するための本明細書で定義した組成物に関する。遺伝性障害は、例えば部分的に異常のあるＣＤＳに起因する、１つ又は複数のタンパク質の機能不全によって引き起こされ得る。本明細書で定義した方法は、異常のあるＣＤＳを標的としてＣＤＳの前記部分を特異的に修飾することができる。
【０１９０】
一態様では、本発明は、疾患に関連したタンパク質の機能性の低下において使用するための本明細書で定義した組成物に関する。疾患の発症又は重症度において重要な多くのタンパク質が公知である。しかし、それらのノックアウトは致死的である。本発明の方法は、ＣＤＳの一部のみを特異的に修飾することによりタンパク質の機能性を低下させ、その結果、機能性を低下させることができる。例示的なタンパク質は、がん、アルツハイマー病及びパーキンソン病のうちの少なくとも１つで役割を果たすことが知られているタンパク質である。
【０１９１】
本明細書で引用したすべての特許及び文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。以下の実施例は単に例示目的で提供されており、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【実施例】
【０１９２】
インデルの生成による新規除草剤耐性の作出
構築物
使用したＣａｓ９  ＯＲＦのヌクレオチド配列を配列番号２４に示している。ＫＧ９３８７（１５７５８ｂｐｓ）は、シロイヌナズナにおける発現に最適化されたこのストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９遺伝子を運ぶ植物バイナリーベクターである。これは、植物細胞における発現のためにシロイヌナズナのユビギチンプロモーター（配列番号２３）に連結されている（ｐＵｂｉ：Ｃａｓ９）。このベクターは、抗生物質スペクチノマイシンへの細菌耐性を付与するａａｄ  ＯＲＦを有している。この研究で使用したガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を図２に示す。シロイヌナズナＵ６プロモーター、ガイドＲＮＡ及びターミネーター配列からなる各ガイドＲＮＡカセットを合成し、プラスミドベクターにクローニングした。
【０１９３】
ＤＮＡ調製
ベクターＫＧ９３８７、ＫＧ１０１７７、ＫＧ１０１９０、ＫＧ１０１９１、ＫＧ１０２４０をコンピテント大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞（ＴＯＰ１０細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に形質転換し、コロニーを適切な抗生物質（複数可）を含有するＬＢ培地で選択した。ラージスケールのプラスミドＤＮＡを単離するために、各株の５０ｍｌ培養物を生成し、標準プロトコルを使用してプラスミドＤＮＡを単離した。
【０１９４】
トマトプロトプラスト単離及びトランスフェクション
トマト（Ｓｏｌａｎｕｍ  ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ）のＭｏｎｅｙｂｅｒｇ種のｉｎ  ｖｉｔｒｏシュート培養は、高プラスチック容器に０．８％寒天を含むＭＳ２０培地において、２０００ルクスの光周期１６／８ｈで、２５℃及び６０〜７０％ＲＨにて維持した。若葉（１ｇ）を主脈（ｍｉｄ  ｎｅｒｖｅ）に対して垂直方向に静かにスライスし、酵素混合物の浸透を促進した。スライスした葉を酵素混合物（２％セルラーゼＯｎｏｚｕｋａ  ＲＳ、０．４％マセロザイムＯｎｏｚｕｋａ  Ｒ１０を含むＣＰＷ９Ｍ）に移し、細胞壁消化を暗所で２５℃にて一晩進行させた。プロトプラストを５０μｍのナイロン篩で濾過し、８００ｒｐｍで５分間遠心分離することによって回収した。プロトプラストをＣＰＷ９Ｍ（Ｆｒｅａｒｓｏｎ、１９７３）培地に再懸濁し、３ｍＬのＣＰＷ１８Ｓ（Ｆｒｅａｒｓｏｎら，  １９７３，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ３３：１３０〜１３７）を各チューブの底に長首ガラスパスツールピペットを使用して加えた。生存プロトプラストは、８００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、ショ糖とＣＰＷ９Ｍ培地の間の界面の細胞画分として回収した。プロトプラストをカウントし、ＭａＭｇ（Ｎｅｇｒｕｔｉｕら，  １９８７，  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ８：３６３〜３７３）培地に１ｍＬあたり１０６個の最終密度で再懸濁した。
【０１９５】
プロトプラストのトランスフェクションについては、１０μｇのＫＧ９３８７及び２０μｇのｓｇＲＮＡ発現プラスミド（ＫＧ１０１７７、ＫＧ１０１９０、ＫＧ１０１９１、ＫＧ１０２４０）のうちの１つをプロトプラスト懸濁液の５００μＬ（５０００００個のプロトプラスト）と混合し、次いでＰＥＧ溶液（４００ｇ／ｌのポリ（エチレングリコール）４０００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ＃８１２４０；０．１Ｍ  Ｃａ（ＮＯ３）２）の５００μＬを添加し、トランスフェクションを２０分間室温にて実施した。対照サンプルはまた、プラスミドの一方又は両方をトランスフェクションから省くことにより生成した。次いで、０．２７５ＭのＣａ（ＮＯ３）２溶液１０ｍＬを添加し、完全に、しかし穏やかに混合した。プロトプラストを５分間８００ｒｐｍで遠心分離することにより回収し、９Ｍの培養培地に０．５×１０６／ｍｌの密度で再懸濁し、直径４ｃｍのペトリ皿に移し、等量の２％アルギン酸塩溶液（２０ｇ／ｌ  Ａｌｇｉｎａｔｅ−Ｎａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  ＃Ａ０６８２）、０．１４ｇ／ｌのＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、９０ｇ／ｌのマンニトール）を添加した。次いで、プロトプラスト及びアルギン酸塩の混合物の１ｍｌアリコート（１２５０００個のトランスフェクトされたプロトプラスト）をＣａ−Ａｇａｒプレート（７２．５ｇ／ｌ  マンニトール、７．３５ｇ／ｌ  ＣａＣｌ２．２Ｈ２Ｏ、８ｇ／ｌ  寒天、ｐＨ５．８）に広げ、１時間重合させた。次いで、包埋されたプロトプラストを含むアルギン酸塩ディスクを、４ｍｌのＫ８ｐ（Ｋａｏら  １９７５．  Ｐｌａｎｔａ，  １２６：１０５〜１１０）培地を含む４ｃｍの組織培養皿に移した。ＡＬＳ１／ＡＬＳ２標的配列でのインデル形成の頻度を決定するため、トランスフェクトされたプロトプラストのディスクを４８時間後に皿から取り出し、アルギン酸塩を溶解させ、プロトプラストを遠心分離により単離した。カルスを再生させるため、プロトプラストをＫ８ｐ培地中で２１日間、２８℃で暗所にてインキュベートした。この期間の後、トランスフェクトされたプロトプラストのディスクを、１ｍｇ．ｌ-１のゼアチン、０．２ｍｇ．ｌ−１のＧＡ３及び２０ｎＭのクロルスルフロンを補充した固形ＧＭ培地（Ｔａｎら，  １９８７，  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  ６：１７２〜１７５）に移した。生存しているカルスがピンセットで採取するのに十分な大きさになるまで、ディスクを同じＧＭ培地の新しいプレートに３週間ごとに移し、その後、クロルスルフロン非含有のＧＭ培地で遺伝子型判定するために増殖させた。
【０１９６】
プロトプラスト及びカルスの遺伝子型判定
全ゲノムＤＮＡを、トマトプロトプラスト（トランスフェクションの４８時間後）からＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。次いで、このｇＤＮＡをＰＣＲ反応で用い、以下のプライマー（ＡＬＳ１  Ｆｗ、５’−ＴＧＧＣＧＣＴＣＡＴＣＡＣＴＴＣＴＴ（配列番号６７）；Ｒｅｖ、５’−ＣＧＴＴＡＣＣＴＣＡＡＣＡＡＴＡＧＧＣＧＴＴＴＣＣＴ（配列番号６８）：ＡＬＳ２  Ｆｗ、５’−ＣＡＣＣＴＣＡＴＴＴＴＣＡＴＧＧＣＣＣＴ（配列番号６９）；Ｒｅｖ、５’−ＡＧＣＣＴＴＣＡＣＧＡＡＣＡＡＣＣＣＴＡ（配列番号７０））を使用して、ＡＬＳ１又はＡＬＳ２標的部位を増幅した。これらのＰＣＲ産物をテンプレートとして用い、各サンプルからライブラリーを生成し、次いでこれをプールし、ＭｉＳｅｑプラットフォーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で１２６ｎｔ  ｐａｉｒｅｄ  ｅｎｄ  Ｎａｎｏ−ｒｕｎを使用して配列決定した。各サンプルは、固有の５ｂｐタグを使用して同定された。配列決定後、各サンプルから得た読み取りデータを処理して、標的部位に存在する配列変化の数及びタイプを同定した。除草剤耐性カルスを、ダイレクトＰＣＲキット（Ｐｈｉｒｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔ  ＰＣＲキット、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び上記の遺伝子特異的プライマーを使用して直接的に遺伝子型判定した。次いで、クロルスルフロン耐性カルスからのＡＬＳ１及びＡＬＳ２  ＰＣＲ産物をサンガー配列決定し、標的部位での突然変異のタイプを特徴付けた。
【０１９７】
植物の再生
クロルスルフロン耐性カルスを、最初のシュートが成長するまで、除草剤を含まないＧＭ培地で維持した。次いで、シュートが成長したカルスを、２ｍｇ．ｌ−１のゼアチン及び０．１ｍｇ．ｌ−１のＩＡＡ培地を補充したＭＳ培地に置いた。しばらくした後、再生トマト苗木を切り取り、０．５ｍｇ．ｌ−１のＩＢＡを補充したＭＳ培地で根ざさせた後、温室に移した。
【０１９８】
結果
標的化ヌクレアーゼ、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓタンパク質は、特定のゲノム配列を標的化し、そこで変異（インデル）を導入することができる。インデルは、標的化ヌクレアーゼによるＤＮＡ  ＤＳＢ誘導、及び内因性（エラー傾向がある）ＤＮＡ修復タンパク質によるこの破壊のその後の修復の結果である。遺伝子のコード配列におけるインデルの誘導は、コーディングフレームの改変により、多くの場合、遺伝子の不活性化（ヌル対立遺伝子の生成）を引き起こす。コーディングフレームを改変するインデルは、単一塩基対又は３で除算されない配列の大きなストレッチを導入又は欠失する。ほとんどのインデルはこれらのカテゴリーに分類されるので、標的化ヌクレアーゼは、細胞内における役割を研究するための遺伝子機能を破壊する非常に効率的なツールである。しかし、分断されたリーディングフレームは、第２の（密接に連結された）インデルによって元の状態に復元され得る。例えば、単一塩基対挿入（＋１）が導入された場合には、第２の下流の１ｂｐ欠失が元のリーディングフレームを復元する。この場合、２つのインデル間でコードされたすべてのアミノ酸は改変されるが、残りのタンパク質は改変されないままである。改変されたアミノ酸の数は２つのインデル間の距離に依存するが、これが比較的小さい場合には、タンパク質は元の機能の大部分を保持すると考えられ、おそらく、新規のアミノ酸によるいくつかの新しい有益な特性を有する。これは、対立遺伝子変異を導入する非常に強力な方法であり、その理由は、隣接するアミノ酸の全体ストレッチが改変され、これが表現型の違いをもたらす可能性が高いからである。反対に、ランダム変異誘発の他のより伝統的な形態、例えば、ＥＭＳなどの変異原による組織の治療は、個別の単一コドンを改変させ、結果として、タンパク質全体の単一アミノ酸の改変をもたらす。本発明者らの方法は、いくつかの隣接するコドンを改変するために使用することができるだけでなく、タンパク質の機能において重要な役割を果たすことが知られている特定の領域又はドメインを標的化することもできる。
【０１９９】
アセトヒドロキシ酸シンターゼ（ＡＨＡＳ）としても知られている植物アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）は、分岐鎖アミノ酸のイソロイシン、バリン、及びロイシンの生合成における最初の酵素である。ＡＬＳは、ＡＬＳ阻害剤として公知の除草剤ファミリーの標的タンパク質である。ＡＬＳのいくつかの変異、例えば、Ｐ１９７（シロイヌナズナＡＬＳタンパク質に基づく、Ｐ１８４はトマトにおけるその同等物である）は、特定のクラスのＡＬＳ阻害剤に対する耐性を付与することが知られている。例えば、Ｐ１９７での優性変異は、いくつかのスルホニル尿素、例えばクロルスルフロンに対する耐性を付与することが知られている（Ｒｏｕｘら  ２００４．  Ｗｅｅｄ  Ｒｅｓ．  ４５，  ２２０〜２２７）。クロルスルフロンなどの除草剤もまた、植物組織培養における選択剤として使用することができる。これは、植物合成培地に添加することができ、ＡＬＳ阻害剤耐性を付与するＡＬＳの変異を欠失する植物細胞の成長を阻止する。本発明者らの仮説は、Ｃｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ技術を使用してＡＬＳのＰ１８４コドンに隣接するインデルを導入でき、またこれによりインデル間のタンパク質リーディングフレームが改変されるというものであった。Ｐ１８４コドンもまた改変されるので、このような細胞はＡＬＳ阻害物質除草剤に耐性があり、したがって、組織培養中に選択され得る。
【０２００】
トマトにおいては、ＡＬＳ遺伝子の２つのコピー、ＡＬＳ１及びＡＬＳ２が存在しており、いずれかの遺伝子のＰ１８４でのアミノ酸変化が除草剤耐性を付与し得る。本発明者らは、ＡＬＳ２  Ｐ１８４周囲の領域をターゲティングする３つのｓｇＲＮＡを設計し、これらを植物細胞で発現させるためにシロイヌナズナＵ６プロモーターに連結させて、構築物ＫＧ１０１７７、ＫＧ１０１９０及びＫＧ１０１９１を生成した（図２）。構築物ＫＧ１０１７７及びＫＧ１０１９１は、ＡＬＳ１及びＡＬＳ２の配列が非常に良好に保存されているので、原理的にはＡＬＳ１で変異を生じることもある。しかし、ＡＬＳ１はこのガイドＲＮＡに必要なＰＡＭ配列が欠失していることから、ＫＧ１０１９０のｓｇＲＮＡはできない。植物細胞において３つのすべてのガイドＲＮＡを同時に発現させるために、本発明者らはまた、以前に報告されたようにして（Ｘｉｅら  ２０１５．  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１２，  ３５７０〜３５７５）、ｔＲＮＡ配列（ＫＧ１０２４０）によって分離されたそれぞれのｓｇＲＮＡを有する構築物を生成した。この３つのｓｇＲＮＡのこのアレイが細胞において発現された場合、介在するｔＲＮＡ配列が内因性ｔＲＮＡプロセシング機構によって除去され、個別のｓｇＲＮＡが放出され、次いでそれによりインデルが生成される。最初に、本発明者らは、これらのｓｇＲＮＡがトマトにおいて活性であるか否かを試験した。本発明者らはトマトの葉からプロトプラストを分離した後、これらの細胞に２つの構築物、Ｃａｓ９タンパク質を発現するＫＧ９３８７とガイドＲＮＡを発現するプラスミドの１つを導入した。４８時間後に、ゲノムＤＮＡをプロトプラストから単離し、ＡＬＳ１及びＡＬＳ２の両方の標的部位をそれぞれのサンプルから増幅した。次いで、これらのアンプリコンをライブラリー構築のテンプレートとして使用し、その後、ＭｉＳｅｑプラットフォームで配列決定した。特定のインデル変異を含有する読み取りデータのパーセンテージを算出し、それぞれのガイドＲＮＡの効率を決定した。結果を図３のＡ〜Ｃに示す。Ｃａｓ９発現構築物のＫＧ９３８７のみのトランスフェクションでは、インデルを含む配列読み取りデータを得ることはできなかった。しかし、ＫＧ９３８７をガイドＲＮＡ発現プラスミドの１つと一緒にトランスフェクトした場合、インデルを含む読み取りデータが回収された。本発明者らは、すべてのガイドＲＮＡがトマトのプロトプラストにおいて活性であり、３つのガイドＲＮＡのすべてを発現する構築物ＫＧ１０２４０が複数のインデルを含む読み取りデータをもたらすことを見出した。その後、本発明者らは実験を繰り返し、ＡＬＳ阻害剤クロルスルフロンを含有する培地でプロトプラストを成長させた。その結果を表２に示す。
【０２０１】
【表２】
2020533972.tif 000003
Ｃａｓ９発現プラスミドＫＧ９３８７のみがトランスフェクトされた場合、又はＫＧ９３８７が単一ガイドＲＮＡを発現するプラスミドと組み合わせてトランスフェクトされた場合、クロルスルフロン耐性カルスは回収されなかった。このことは、単一インデル変異の導入がクロルスルフロン耐性表現型をもたらさないことを示唆している。しかし、ＫＧ９３８７が３つのガイドＲＮＡをすべて発現するＫＧ１０２４０と一緒にトランスフェクトされた場合、本発明者らはクロルスルフロン耐性カルスを回収することができた。本発明者らは、ＡＬＳ１及びＡＬＳ２標的部位をそれぞれの耐性カルスから増幅し、これらを配列決定し、存在するインデル変異を決定した。その結果を図４に示す。本発明者らは、すべてのカルスが、ＡＬＳ１又はＡＬＳ２のいずれかに２つの連結されたインデル変異が含まれていることを確認した。驚いたことに、クロルスルフロン耐性を付与したインデル変異は、複数のカルスにおいて同一であり、常に二対立遺伝子におけるものであった（同一の２つのインデルを含有するＡＬＳ１又はＡＬＳ２の両対立遺伝子）。カルスは単一プロトプラストに由来するので、本発明者らは、これらが独立した変異誘発事象に由来すると推測することができる。カルスはまた、他の遺伝子においてさらなる変異も含有していた。例えば、ＡＬＳ２において２つのインデルを含むカルスは、多くの場合、ＡＬＳ１において単一インデル変異を有していた。単一変異は変動性であり、遺伝子機能の破壊をもたらすことが多く、耐性カルスが独立した事象であるというさらなる証拠を提供した。
【０２０２】
本発明者らが２つのインデルを含有するＡＬＳ１又はＡＬＳ２遺伝子を詳細に調べたところ、第１のインデル（単一ヌクレオチドの欠失又は付加）がタンパク質のリーディングフレームを改変し、第２のインデル（単一ヌクレオチドの変化）がそれを復元することを確認した。そのようなインデルは、−１／＋１又は＋１／−１として記載することができる。その結果、コード配列の長さは改変されなかった。興味深いことには、本発明者らは、任意の他のサイズのインデル、例えば、−２／＋２、−１／＋４ではリーディングフレームが復元されることは確認しなかった。配列決定されたすべてのカルスで、２つのインデル（コドンＰ１８４を含む）間のタンパク質リーディングフレームが変更され、ＡＬＳタンパク質に２〜５個の新しい隣接アミノ酸が存在するようになった。
【０２０３】
図３Ｂ及び３Ｃにおいて、本発明者らは、プロトプラストにおける３つのガイドＲＮＡの同時発現が、Ｐ１８４コドンに隣接する２つのインデルの誘導をもたらすことを示している。これらのいくつかは、リーディングフレームの修復をもたらす２つのインデル変異を含んでいた。しかし、除草剤の選択を適用した場合、本発明者らは、特定の位置と特定のサイズのインデルのペアを含むカルスのみを回収した。例えば、ＡＬＳ２について、本発明者らは、２つの異なる対立遺伝子（ＧＱＣＲＧＧＬＩＧＴ（配列番号７１）及びＧＱＳＡＲＲＭＩＧＴ（配列番号７２））のみを回収し、これらの変化のみがクロルスルフロン耐性表現型をもたらすことを示した。したがって、本発明者らは、他のアミノ酸に変化をもたらすが（例えば、ＧＱＶＰＧＧＬＭＩＧＴ（配列番号７３）及びＧＲＲＧＧＬＩＧＴ（配列番号７４））、クロルスルフロン耐性カルスで回収されない、配列データに存在する他のインデル変異のペアは、したがって耐性対立遺伝子ではなかったと結論付けた。また本発明者らは、いくつかのクロルスルフロン耐性カルスにＰ１８４コドンに隣接するインデル変異の同様のペア（−１／＋１）を見出したが、これらのインデルは若干異なるタンパク質配列（ＧＱＶＱＧＧＬＩＧＴ（配列番号７５））を示した。クロルスルフロン選択圧下では、野生型ＡＬＳタンパク質は除草剤によって阻害され、クロルスルフロン耐性対立遺伝子のみが分岐アミノ酸合成にとって利用可能となる。したがって、複数の隣接するアミノ酸（５個以下）の改変は、分岐アミノ酸合成経路において元の機能を維持する機能性ＡＬＳタンパク質を依然としてもたらす。
【０２０４】
本発明者らが特定したクロルスルフロン耐性対立遺伝子は、本発明者らが知る限り、これまでに報告されてはいない。したがって、それらは、同じ方法で他の植物種の内因性ＡＬＳ遺伝子に導入され得る新規の対立遺伝子であることを意味する。これらのカルスはスルホニル尿素クロルスルフロンを使用して選択されたが、他の広範囲のＡＬＳ阻害剤も知られている。特定のＡＬＳ突然変異（例えばＰ１８４Ｓ）が耐性を付与する程度は、使用する特定のＡＬＳ阻害剤及び使用する濃度に依存する。最も有用なＡＬＳ変異は、高濃度のすべての利用可能なＡＬＳ阻害剤に対して耐性を提供する。本発明者らが本明細書で説明した耐性対立遺伝子は、特に複数のアミノ酸が改変されているので、より広範囲のＡＬＳ阻害剤に、及び／又は高濃度で、耐性を付与することができる。
【０２０５】
本発明者らは、２つのインデルのコード配列における導入を使用して対立遺伝子変異を導入することができ、新規の特性を有するタンパク質が生成されることを明らかにした。この方法は、任意の細胞タイプに適用可能であり、バイオテクノロジーのすべての態様において適用が見出されるものである。
【図１Ａ】
2020533972.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2020533972.tif 000012
【配列表】
2020533972000001.app
【国際調査報告】
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