(57)【要約】本発明は、生体試料中において呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るための、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けについてフコースα(1-2)ガラクトースユニットを認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関する。特定の一実施形態において、前記少なくとも１つのレクチンは、レクチンUlex Europaeus凝集素1（UEA-I）、またはその同族体のTrichosanthes japonica凝集素II(TJA-II)、Agaricus Bisporus凝集素(ABA)、Amaranthus Caudatus凝集素(ACA)、ジャカリン、Griffonia Simplicifolia lectin I (GSL-I)およびGriffonia Simplicifolia lectin II (GSL-II)から選択される。特定の一実施形態において、前記呼吸に関与する器官は扁桃腺と耳下腺を含む、肺、喉頭、咽頭、口、鼻、喉、舌、副鼻腔、気管、唾液腺から選択される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体試料中において呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るために、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用。
【請求項２】
フコースα 1-2 ガラクトース基がフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である、請求項1に記載のインビトロ使用。
【請求項３】
前記少なくとも1つのレクチンが、レクチンUlex Europaeus凝集素1（UEA-I）、またはその同族体のTrichosanthes japonica凝集素II(TJA-II)、Agaricus Bisporus凝集素(ABA)、Amaranthus Caudatus凝集素(ACA)、ジャカリン、Griffonia Simplicifolia lectin I (GSL-I)およびGriffonia Simplicifolia lectin II (GSL-II)から選択され、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも２つのレクチン、特にGSL-IとGSL-IIの混合物、またはUEA-IとGSL-Iの混合物であり、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも３つのレクチン、特にUEA-IとジャカリンとABAとの混合物、またはUEA-IとジャカリンとACAとの混合物である、請求項1または2のいずれか一項に記載のインビトロ使用。
【請求項４】
少なくとも2つのレクチンが使用され、該少なくとも2つのレクチンが等モル量である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のインビトロ使用。
【請求項５】
少なくとも2つのレクチンが使用され、該少なくとも2つのレクチンが非等モル量である、請求項1〜3のいずれか一項に記載のインビトロ使用。
【請求項６】
2つのレクチンが使用され、該2つのレクチンが重量比2：1、3：1、または4：1の非等モル量のUEA-IとGSL-Iである、請求項5に記載のインビトロ使用。
【請求項７】
呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けが、以下：
-特にローダミン、FITCまたはAlexa Fluorから選択されるフルオロフォア
-特にヨウ素125、トリチウム、またはテクネチウムから選択される放射性同位体
-発色基質または発光基質を利用する酵素であって、特にホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、またはβ-ガラクトシダーゼから選択される酵素
-金ビーズ、または
-ビオチン
から選択される標識と接合したレクチンを使って実施される、請求項1〜6のいずれか一項に記載のインビトロ使用。
【請求項８】
呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けが、接合したレクチンを使って実施され、次に接合したレクチンの検出によって、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞が検出される、請求項１〜7のいずれか一項に記載のインビトロ使用。
【請求項９】
標識と接合したレクチンを用いる呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けの後に、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞の単離が続き、前記標識がビオチンであり、
前記単離がストレプトアビジンもしくはアビジンで官能化された、磁気ビーズからなる支持体を介して、磁気の存在下で行われるか、または
前記標識がフルオロフォアであり、前記単離がフローサイトメトリーにより行われる、
請求項１〜8のいずれか一項に記載のインビトロ使用。
【請求項１０】
前記生体試料が呼吸に関与する器官の生体試料である、請求項1〜9のいずれか一項に記載のインビトロ使用。
【請求項１１】
呼吸に関する前記器官が扁桃腺および耳下腺を含む、肺、喉頭、咽頭、口、鼻、喉、舌、副鼻腔、気管、唾液腺から選択される、請求項1〜10のいずれか一項に記載のインビトロ使用。
【請求項１２】
生体試料中において呼吸に関与する器官の癌幹細胞を検出する、以下のステップ：
(a)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けして、呼吸に関与する器官の癌幹細胞が少なくとも1つのレクチンで標識付けされた生体試料を得るステップであって、該レクチンがフルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ、またはビオチンから選択される標識と接合されている、ステップ、
次に
(b)少なくとも1つのレクチンを用いて標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞を検出するステップ
を含むインビトロ方法。
【請求項１３】
前記フコースα 1-2 ガラクトース基がフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である、請求項1２に記載のインビトロ検出方法。
【請求項１４】
前記少なくともの１つのレクチンが、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択され、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも２つのレクチン、特にGSL-IとGSL-IIの混合物、またはUEA-IとGSL-Iの混合物であり、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも３つのレクチン、特にUEA-IとジャカリンとABAとの混合物、またはUEA-IとジャカリンとACAとの混合物である、請求項１2または13のいずれか一項に記載のインビトロ検出方法。
【請求項１５】
少なくとも2つのレクチンが使用され、該少なくとも2つのレクチンが等モル量である、請求項１2〜1４のいずれか一項に記載のインビトロ検出方法。
【請求項１６】
少なくとも2つのレクチンが使用され、該少なくとも2つのレクチンが非等モル量である、請求項12〜14のいずれか一項に記載のインビトロ検出方法。
【請求項１７】
2つのレクチンが使用され、該2つのレクチンが重量比2：1、3：1、または4：1の非等モル量のUEA-IとGSL-Iである、請求項16に記載のインビトロ検出方法。
【請求項１８】
前記生体試料が呼吸に関与する器官の生体試料である、請求項１2〜17のいずれか一項に記載のインビトロ検出方法。
【請求項１９】
前記呼吸に関与する器官が扁桃腺および耳下腺を含む、肺、喉頭、咽頭、口、鼻、喉、舌、副鼻腔、気管、唾液腺から選択される、請求項12〜18のいずれか一項に記載のインビトロ検出方法。
【請求項２０】
生体試料中において呼吸に関与する器官の癌幹細胞を単離する、以下のステップ：
(a)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けして、呼吸に関与する器官の癌幹細胞が少なくとも1つのレクチンで標識付けされた生体試料を得るステップであって、前記レクチンがビオチンまたはフルオロフォアと接合されている、ステップ、
次に
(b)少なくとも1つのレクチンを用いて標識付けされた呼吸に関与する器官の前記癌幹細胞を単離するステップであって、
前記レクチンがビオチンと接合されている場合磁気ビーズで構成される、ストレプトアビジンまたはアビジンで官能化された支持体を介して磁気の存在下で行われ、
前記単離のステップが、レクチンがフルオロファアと接合されている場合、フローサイトメトリーでの細胞選別により行われる、ステップ
を含むインビトロ方法。
【請求項２１】
前記フコースα 1-2 ガラクトース基がフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である、請求項20に記載のインビトロ単離方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのレクチンが、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択され、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも２つのレクチン、特にGSL-IとGSL-IIの混合物、またはUEA-IとGSL-Iの混合物であり、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも３つのレクチン、特にUEA-IとジャカリンとABAとの混合物、またはUEA-IとジャカリンとACAとの混合物である、請求項20または21のいずれか一項に記載のインビトロ単離方法。
【請求項２３】
少なくとも２つのレクチンが使用され、該少なくとも２つのレクチンが等量または不等量である、請求項20〜22のいずれか一項に記載のインビトロ単離方法。
【請求項２４】
少なくとも2つのレクチンが使用され、該少なくとも2つのレクチンが非等モル量である、請求項20〜22のいずれか一項に記載のインビトロ単離方法。
【請求項２５】
少なくとも2つのレクチンが使用され、該2つのレクチンが重量比2：1、3：1、または4：1の非等モル量のUEA-IとGSL-Iである、請求項24に記載のインビトロ単離方法。
【請求項２６】
前記生体試料が呼吸に関与する器官の生体試料である、請求項20〜25のいずれか一項に記載のインビトロ単離方法。
【請求項２７】
前記呼吸に関与する器官が扁桃腺および耳下腺を含む、肺、喉頭、咽頭、口、鼻、喉、舌、副鼻腔、気管、唾液腺から選択される、請求項20〜26のいずれか一項に記載のインビトロ単離方法。
【請求項２８】
呼吸に関与する器官の癌の治療適応性についての予後予測値を規定するための、呼吸に関与する器官の癌の再発のリスクおよび／または呼吸に関与する器官の癌の悪性度のインビトロ診断方法であって、
フコースα 1-2 ガラクトース単位を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の生体試料の呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けし、
前記試料中の少なくとも1つのレクチンにより標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞を得るステップを含む、方法。
【請求項２９】
以下に記載のステップを含む請求項28に記載の診断方法：
(a)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けして、前記生体試料中の少なくとも1つのレクチンにより標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞を得るステップであって、前記レクチンがフルオロフォアまたはビオチンから選択される標識と接合されているステップ、
(b)前記少なくとも1つの接合されたレクチンにより標識付けされる呼吸に関与する器官の癌幹細胞の単離ステップであって、
−ビオチンと接合されたレクチンを用いた標識付けの場合、前記単離はストレプトアビジンまたはアビジンで官能化された支持体を介して行われ、特に官能化された支持体はストレプトアビジンまたはアビジンで官能化された磁気ビーズからなり、前記単離は磁気の存在下で磁気細胞選別により行われるか、または
−フルオロファアと接合されたレクチンを用いた標識付けの場合、前記単離はフローサイトメトリーにおける細胞選別により行われる、ステップ
(c)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも１つのレクチンを用いて、単離された呼吸に関与する器官の癌幹細胞に新たな標識付けして、単離および標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞を得るステップであって、前記レクチンがフルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ、またはビオチンから選択される標識に接合された、ステップ
(d)単離および標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出ステップであって、
−レクチンがフルオロファアに接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンと接合されているフルオロフォアを介して検出されるとき、蛍光顕微鏡または蛍光読取装置
−レクチンが化学発光基質を利用する酵素に接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている化学発光基質を利用する酵素を介して検出されるとき、発光顕微鏡または発光読取装置
−レクチンが放射性同位体に接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている放射性同位体を介して検出されるとき、ガンマカメラ
−レクチンが発色基質を利用する酵素に接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている発色基質を利用する酵素を介して検出されるとき、紫外光／可視光顕微鏡または吸光読取装置
−レクチンが金ビーズに接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている金ビーズを介して検出されるとき、電子顕微鏡を用いて行われるステップ
(e)場合により、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の定量化ステップ
(f)前記生体試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出強度と、前記生体試料に隣接した健全な試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出強度との比較ステップであって、
任意に、前記生体試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の量と、前記生体試料に隣接した健全な試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の量との比較ステップ
(g)呼吸に関与する器官の癌幹細胞の存在および、場合によりその量から呼吸に関与する器官の癌の再発のリスクおよび／または呼吸に関与する器官の癌の悪性度を推定して、呼吸に関与する器官の癌の治療適応性についての予後予測値を規定するステップ。
【請求項３０】
以下のステップを含む請求項28に記載の診断方法：
(a)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けして、前記生体試料中の少なくとも1つのレクチンにより標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞を得るステップであって、前記レクチンがフルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ、またはビオチンから選択される標識と接合されているステップ、
(b)標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出ステップであって、
−レクチンがフルオロファアに接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンと接合されているフルオロフォアを介して検出されるとき、蛍光顕微鏡または蛍光読取装置
−レクチンが化学発光基質を利用する酵素に接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている化学発光基質を利用する酵素を介して検出されるとき、発光顕微鏡または発光読取装置
−レクチンが放射性同位体に接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合されているときにストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている放射性同位体を介して検出されるとき、ガンマカメラ
−レクチンが発色基質を利用する酵素に接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている発色基質を利用する酵素を介して検出されるとき、紫外光／可視光顕微鏡または吸光読取装置
−レクチンが金ビーズに接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている金ビーズを介して検出されるとき、電子顕微鏡を用いて行われるステップ
(c)場合により、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の定量化ステップ
(d)前記生体試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出強度と、前記生体試料に隣接した健全な試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出強度との比較ステップであって、
任意に、前記生体試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の量と、前記生体試料に隣接した健全な試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の量との比較ステップ
(e)呼吸に関与する器官の癌幹細胞の存在および、場合によりその量から呼吸に関与する器官の癌の再発のリスクおよび／または呼吸に関与する器官の癌の悪性度を推定して、呼吸に関与する器官の癌の治療適応性についての予後予測値を規定するステップ。
【請求項３１】
前記フコースα 1-2 ガラクトース基がコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である、請求項28〜30のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項３２】
前記少なくとも１つのレクチンが、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択され、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも２つのレクチン、特にGSL-IとGSL-IIの混合物、またはUEA-IとGSL-Iの混合物であり、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも３つのレクチン、特にUEA-IとジャカリンとABAとの混合物、またはUEA-IとジャカリンとACAとの混合物である、請求項28〜31のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項３３】
少なくとも２つのレクチンが使用され、該少なくとも２つのレクチンが等量または不等量である、請求項28〜32のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項３４】
少なくとも2つのレクチンが使用され、該少なくとも2つのレクチンが非等モル量である、請求項28〜32のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項３５】
2つのレクチンが使用され、該2つのレクチンが重量比2：1、3：1、または4：1の非等モル量のUEA-IとGSL-Iである、請求項34に記載の診断方法。
【請求項３６】
前記生体試料が呼吸に関与する器官の生体試料である、請求項28〜35のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項３７】
前記呼吸に関与する器官が扁桃腺および耳下腺を含む、肺、喉頭、咽頭、口、鼻、喉、舌、副鼻腔、気管、唾液腺から選択される、請求項28〜36のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項３８】
前記癌が肺癌、喉頭癌、咽頭癌、口腔癌、鼻の癌、咽喉癌、舌癌、副鼻腔癌、気管癌、および唾液腺癌（扁桃腺癌および／または耳下腺癌など）から選択される、請求項28〜36のいずれか一項に記載の診断方法。
【請求項３９】
ビオチンに接合されたフコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンと、ストレプトアビジンで官能化された磁気ビーズ、任意に、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、または金ビーズに接合された、フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンとを含み、または、
フルオロフォアに接合されたフコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンと、任意に、ビオチン、放射性同位体、酵素、または金ビーズに接合された、フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンとを含む、
呼吸に関与する器官の癌の再発のリスクおよび／または呼吸に関与する器官の癌の悪性度を診断して、呼吸に関与する器官の癌の治療適応性についての予後予測値を規定するインビトロキット。
【請求項４０】
前記フコースα 1-2 ガラクトース基がフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である、請求項39に記載の診断キット。
【請求項４１】
前記少なくとも１つのレクチンが、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択され、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも２つのレクチン、特にGSL-IとGSL-IIの混合物、またはUEA-IとGSL-Iの混合物であり、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも３つのレクチン、特にUEA-IとジャカリンとABAとの混合物、またはUEA-IとジャカリンとACAとの混合物である、求項39または40のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項４２】
少なくとも２つのレクチンが使用され、該少なくとも２つのレクチンが等量または不等量である、請求項40〜41のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項４３】
少なくとも2つのレクチンが使用され、該少なくとも2つのレクチンが非等モル量である、請求項40〜41のいずれか一項に記載の診断キット。
【請求項４４】
２つのレクチンが使用され、該２つのレクチンが重量比2：1、3：1、または4：1の非等モル量のUEA-IとGSL-Iである、請求項43に記載の診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は呼吸に関与する器官の癌幹細胞（CSCs）を単離および検出する方法に関する。
【０００２】
フランスでは肺癌が男性死亡原因の一番目、また女性の死亡原因では二番目で、女性での一番目が乳癌である。年間に37,000人が侵されている。5年生存率は非常に低いので、この病理の早期診断の概念おいて本発明は意味がある。
【０００３】
他の種類の癌と同じく肺癌には、特に後期診断で心配されている人々の高死亡率に繋がる多くの要因があり、より進行した癌の転移および高再発率となる。確かにこの比率の値は癌が検出されたステージに直接依存する。しかしながら、この検出ステージが早期であったとしても、いくつかのパラメータの考慮の欠如ゆえに高い再発率のままであることに留意する必要がある。
【０００４】
確かに再発の現象は、今日まで考慮されていない癌幹細胞または腫瘍始原細胞または前癌細胞の存在に基づいて、腫瘍の進行と耐性機構により部分的な説明は可能である。放射線治療と化学療法へと腫瘍治療的回避を行うかは、腫瘍内のこれらの細胞の存在に依存する。このことから腫瘍組織内のこれらの細胞の検出は腫瘍の悪性度のレベルを規定する1つの方法である。従って癌幹細胞に特異的なバイオマーカーの特性は癌の治療における診断および予後において重要である。しかし現時点では癌幹細胞（CSCs）について、別の腫瘍細胞から確実に識別できる特異的なマーカーは存在していない。
【０００５】
CSCsの単離と特性を調べる主たる困難さは、その集団のサイズが小さいこと（腫瘍集団の3〜4%）と特異的なマーカーの不存在にある。
【０００６】
このことから早期診断および癌幹細胞を検出および/または単離する新たな方法を開発する必要性がある。
【０００７】
癌幹細胞の存在の早期同定により、医師に疾患に対する予測因子を提供する。
【０００８】
加えて癌の危険性の診断において新たな視点を提示することとなる。確かに医師が利用できる付加的な情報によって、治療により再発または悪化リスクの限定が可能となる。
【０００９】
肺の他に呼吸に関与する器官の癌は、フランスではよく見られる癌であり、男性の癌では4番目であり癌全体の10%を占めている。加えて広範な格差がフランス北部と南部の間にあり、北部では全国平均と比べて20%を超える高い発症率である。また死亡率では社会的な不平等が大きく存在する。
【００１０】
2012年の時点では、肺癌の他に呼吸に関与する器官の癌の新たな発症は11,320件と推計され、その内の71%が男性となっている。
以下、頻度の高い順に記す：
・咽頭癌、47%  
・舌癌を含む口腔癌、25%  
・喉頭癌、25%  
・唾液腺癌、6%  
・顔の鼻腔の癌、1%未満
これらは主として男性（男性7人に対して女性1人）で、特に喫煙家が侵される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、呼吸に関与する器官の癌性幹細胞のみを認識するので、従来の方法よりも効果的で特異的な検出方法に関する。加えてその実施は、非再現性により一般化ができない従来の方法よりも速く、かつ癌性幹細胞と癌性非幹細胞の両方で行う。
【００１２】
「呼吸に関与する器官」とは呼吸に積極的に関与する、つまり吸気と排気に積極的に関与する器官であり、吸入された空気の通路に位置する器官という意味である。
従って本発明の目的において「呼吸に関与する器官」とは肺、喉頭、咽頭、口、鼻、喉、舌、副鼻腔、気管、および唾液腺（扁桃腺および耳下腺）である。
【００１３】
第1の観点では、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞を検出および/または単離におけるマーキング手段としてのレクチンの使用に関する。
【００１４】
第2の観点では、本発明は、少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けを含む、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の単離および検出方法に関する。
【００１５】
第3の観点では、本発明は、呼吸に関与する器官の癌の悪性度および/または再発リスクの診断方法に関し、呼吸に関与する器官の癌細胞の単離および/または検出のステップを含む、呼吸に関与する器官の癌の治療適応性についての予後予測値を規定する。
【００１６】
第4の観点では、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞を検出または単離するレクチンを含むキットに関する。
【００１７】
本発明は、発明者らによるフコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細には呼吸に関与する器官の癌幹細胞の表面上にあるフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基の存在の同定と共に、これらの細胞の検出と単離を可能にするレクチンが認識する可能性とに基づく。
【００１８】
本発明の目的において「呼吸に関与する器官の癌幹細胞のマーキング手段」とは、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の表面上の基に特異的に結合できる物質という意味である。
【００１９】
一般的な観点では、本発明は、生体試料中において呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るために、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関する。
【００２０】
特定の実施形態では、フコースα 1-2 ガラクトース基は、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。
【００２１】
従って本発明はまた、生体試料中において呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るために、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関する。
【００２２】
特定の実施形態では、本発明のレクチンは、レクチンUlex Europaeus凝集素1(UEA-I)、Agaricus Bisporus凝集素(ABA)、Amaranthus Caudatus凝集素(ACA)、ジャカリン、Griffonia Simplicifolia lectin I(GSL-I)およびGriffonia Simplicifolia lectin II(GSL-II)、およびこれらの同族体から選択される。
【００２３】
例えば、レクチンTrichosanthes japonica凝集素II（TJA-II）はレクチンUEA-Iの同族体である。
【００２４】
従って本発明はまた、生体試料中において呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るために、レクチンUlex Europaeus凝集素1（UEA-I）、またはその同族体のTrichosanthes japonica凝集素II（TJA-II）、Agaricus Bisporus凝集素(ABA)、Amaranthus Caudatus凝集素(ACA)、ジャカリン、Griffonia Simplicifolia lectin I (GSL-I)およびGriffonia Simplicifolia lectin II(GSL-II)から選択される、少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関する。
【００２５】
これらのレクチンは当業者に周知であり市販化されている（特にVector Laboratories）。いくつかのレビューはそれらの構造を列挙しており（Lectin Structure、Rini JM、Annu Rev Biophys Biomol Struct、1995；24：551-77）、また別のより最近のレビューは、それらの全歴史（Insight of Lectins-A review, Singhら、 International Journal of Scientific and Engineering Research、Volume 3、Issue 4、April 2012）と、特に免疫組織化学におけるそれらの使用の進歩（Lectin Histochemistry：Historical Perspectives、State of the Art、およびthe Future、 Brooks SA、Methods Mol Biol、2017、1560：93-107）を記載している。
【００２６】
特定の実施形態では、本発明は、生体試料中において呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るための、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-IIのインビトロ使用に関する。
【００２７】
本発明の目的において、生体試料は、呼吸に関与する器官に癌を有する患者または呼吸に関与する器官に癌の可能性のある患者から採取した試料である。
【００２８】
本発明の目的において「呼吸に関与する器官の癌」は肺癌、喉頭癌、咽頭癌、口腔癌、鼻の癌、咽喉癌、舌癌、副鼻腔癌、気管癌、または唾液腺癌（扁桃腺癌および/または耳下腺癌など）である。
【００２９】
本発明において、用語「肺癌（lung cancer）」と「肺癌（pulmonary cancer）」は置き換えて使用され得る。
【００３０】
この試料は一定の癌幹細胞を含む可能性が有る。
【００３１】
解剖病理学での通常の分析に反してまたは追加して、本発明のレクチンを使用することで、腫瘍前もしくは腫瘍のような早いステージの前記試料を特徴付けることを可能にする。
【００３２】
用語「腫瘍前」とは、試料に腫瘍の性質を持ち込むか、または持ちこまない可能性のある腫瘍の前段階（upstream）を意味する。
【００３３】
確かに解剖病理学は、塗抹または即時の生検を用いる病気または死亡した生体から採取された組織の肉眼的および顕微鏡的病変の研究である。従って医学のこの分野は、生物学的組織および収集された病理学的細胞の肉眼的および顕微鏡的異常の形態学的研究に集中しているが、癌幹細胞の調査に集中しておらず、よって細胞の自己複製特性を重視していない。
【００３４】
観察された異常が癌細胞の自己複製的な性質が既に発現されたステージで起こるので、解剖病理学は形態学的研究に基づいて、試料の初期特性化の確立を認めていない。
【００３５】
逆に本発明が癌幹細胞の存在の検出に直接的に関係しており、解剖病理学よりも早いステージで、例えば癌幹細胞が組織内の形態異常に繋がる自己複製の性質を発現する前でも、試料を特徴付けることができる。
【００３６】
本発明の方法は、解剖病理学的分析後に使用できる。この場合、試料は解剖病理学の研究後に、腫瘍である、腫瘍の疑いがある、または腫瘍の疑いがない、に特性化される。本発明の方法は特異的に癌幹細胞に関係していることで、この場合解剖病理学で得られた診断を確認できるか、またはこの診断を無効にできる。
【００３７】
確かに試料が解剖病理学において腫瘍であると疑われない場合には、本発明は前記試料の腫瘍または前腫瘍の特性を明らかにすることにより、この診断を無効にでき得る。なぜなら、癌幹細胞の存在と場合によってその定量の際には、解剖病理学とは異なるパラメータに基づくからである。
【００３８】
一実施形態によれば、本発明は、UEA-Iまたは同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-IIから選択される、少なくとも2つのレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
【００３９】
このことから一実施形態では、本発明は(UEA-I、ABA)、(UEA-I、ACA)、(UEA-I、ジャカリン)、(UEA-I、GSL-I)、(UEA-I、GSL-II)、(ABA、ACA)、(ABA、ジャカリン)、(ABA、GSL-I)、(ABA、GSL-II)、(ACA、ジャカリン)、(ACA、GSL-I)、(ACA、GSL-II)、(ジャカリン、GSL-I)、(ジャカリン、GSL-II)、(GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA)、(TJA-II、ACA)、(TJA-II、ジャカリン)、(TJA-II、GSL-I)、(TJA-II、GSL-II)の混合物から選択される2つのレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明は、2つのレクチンGSL-IとGSL-I1の混合物のインビトロ使用に関する。
【００４１】
特定の実施形態では、本発明は、2つのレクチンGSL-IとUEA-Iまたはその同族体TJA-11との混合物のインビトロ使用に関する。
【００４２】
一実施形態によれば、本発明は、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも3つのレクチンの混合物、特にUEA-Iまたはその同族体TJA-IIとジャカリンとABAとの混合物、あるいはUEA-Iまたはその同族体TJA-IIとジャカリンとACAとの混合物のインビトロ使用に関する。
【００４３】
従って特定の実施形態では、本発明は以下の混合物から選択される3つのレクチンの混合物のインビトロ使用に関する：
(UEA-I、ABA、ACA)、(UEA-I、ABA、ジャカリン)、(UEA-I、ABA、GSL-I)、(UEA-I、ABA、GSL-II)、(UEA-I、ACA、ジャカリン)、(UEA-I、ACA、GSL-I)、(UEA-I、ACA、GSL-II)、(UEA-I、ジャカリン、GSL-I)、(UEA-I、ジャカリン、GSL-II)、(UEA-I、GSL-I、GSL-II)、(ABA、ACA、ジャカリン)、(ABA、ACA、GSL-I)、(ABA、ACA、GSL-II)、(ABA、ジャカリン、GSL-I)、(ABA、ジャカリン、GSL-II)、(ABA、GSL-I、GSL-II)、(ACA、ジャカリン、GSL-I)、(ACA、ジャカリン、GSL-II)、(ACA、GSL-I、GSL-II)、(ジャカリン、GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA、ACA)、(TJA-II、ABA、ジャカリン)、(TJA-II、ABA、GSL-I)、(TJA-II、ABA、GSL-II)、(TJA-II、ACA、ジャカリン)、(TJA-II、ACA、GSL-I)、(TJA-II、ACA、GSL-II)、(TJA-II、ジャカリン、GSL-I)、(TJA-II、ジャカリン、GSL-II)、(TJA-II、GSL-I、GSL-II)。
【００４４】
一実施形態では、本発明は、3つのレクチンの混合物（UEA-I、ジャカリン、ABA）、または混合物（UEA-I、ジャカリン、ACA）のインビトロ使用に関する。
【００４５】
いくつかの場合、2つまたは3つのレクチンの使用による癌幹細胞の標識において、より良い特異性が可能となる。
【００４６】
2つのGSL、またはUEA-IとGSL-I、もしくはTJA-IIとGSL-Iの組み合わせは、CSCsを検出および単離する有利な実施形態である。
【００４７】
特定の実施形態では、本発明は、生体試料中において標識付けされた肺癌幹細胞を得るために、肺癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンが、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択され、
特にUEA-I、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも２つのレクチン、特にGSL-IとGSL-IIの混合物、またはUEA-IとGSL-Iの混合物であり、
特にUEA-I、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも３つのレクチン、特にUEA-IとジャカリンとABAとの混合物、またはUEA-IとジャカリンとACAとの混合物
のインビトロ使用に関する。
【００４８】
本発明で使用されたレクチンは組合せ可能である。
【００４９】
本発明の目的において用語「接合されている」とは、レクチンが別の分子に共有結合されているという意味である。
【００５０】
一実施形態によれば、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関し、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けが、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズまたはビオチンから選択される標識と接合されているレクチンを使って実施される。
【００５１】
一実施形態によれば、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関し、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けが、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズまたはビオチンから選択される標識と接合されているレクチンを使って実施される。
【００５２】
一実施形態によれば、前記レクチンはUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1のレクチンから選択される。
【００５３】
従って特定の実施形態では、前記レクチンはフルオロフォアと接合される。
【００５４】
本発明の目的において、フルオロフォアはフローサイトメトリーに使用できる任意のフルオロフォアであってよい。そのようなフルオロフォアは市販されている。例としてAlexa fluor、特にAlexa fluor350、405、430、488、500、514、532、532、546、555、568、594、610、610、633、647、660、680、700、750、または790、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、ローダミン、アロフィコシアニン（APC）、およびフィコエリスリン（PE）がある。
【００５５】
フルオロフォアはローダミン、FITCまたはAlexa fluorから、特にAlexa fluor488、Alexa fluor594、またはAlexa fluor633から有利に選択される。
【００５６】
本発明の目的において、フルオロファアの特徴付けは、フルオロファアに関する本発明の任意の実施形態に適用する。
【００５７】
別の特定の実施形態では、レクチンは放射性同位体と接合される。
【００５８】
本発明の目的において、放射性同位体はヨウ素125、トリチウム、またはテクネチウムから選択される。
【００５９】
別の特定の実施形態では、レクチンは酵素と接合される。
【００６０】
本発明の目的において、酵素は例えば発色基質を使用する酵素などの着色生成物の形成を触媒する酵素、または例えば化学発光基質を使用する酵素などの発光生成物の形成を触媒する酵素である。
【００６１】
本発明の目的において、「発色基質」は酵素による変換後に着色生成物が得られる基質をいう。
【００６２】
本発明の目的において、「化学発光基質」は酵素による変換後に発光生成物が得られる基質をいう。
【００６３】
特定の実施形態では、着色生成物の形成を触媒する前記酵素は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、またはβ-ガラクトシダーゼから選択される。
【００６４】
特にHRPの場合、発色基質は3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）、または2,2'-アジノ-ビス-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）（ABTS）から選択される。
【００６５】
特にアルカリホスファターゼの場合、発色基質はNBT（テトラゾリウム ニトロブルー）とBCIP（ブロモクロリルインドロリン酸（bromochlorylindolophosphate））である。
【００６６】
特定の実施形態では、発光生成物の形成を触媒する前記酵素はHRPであり、発光基質はルミノールである。
【００６７】
別の特定の実施形態では、前記レクチンは金ビーズと接合される。
【００６８】
別の特定の実施形態では、前記レクチンはビオチンと組み合わされる。
【００６９】
呼吸に関与する器官の癌幹細胞が、呼吸に関与する器官の前記癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基を認識するレクチンの使用により検出されることも本発明者らにより立証された。
【００７０】
特定の実施形態では、フコースα 1-2 ガラクトース基はフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。このことから呼吸に関与する器官の癌幹細胞は、呼吸に関与する器官の前記癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識するレクチンの使用により検出される。
【００７１】
本発明の目的において、「検出」は生体試料中において呼吸に関与する器官の癌幹細胞の存在を、の紫外光/可視光、発光、蛍光、放射線、酵素学の方法により同定するという意味である。
【００７２】
従って、本発明はまた呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンの使用に関し、次に接合されたレクチンの検出により、生体試料中の癌幹細胞検出を行なう。
【００７３】
一実施形態において、レクチンはフルオロファアに共有結合され得る。
【００７４】
このことから一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関し、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けが、フルオロフォアと接合されているレクチンを使って実施され、次に蛍光顕微鏡または蛍光読取装置による呼吸に関与する器官の前記癌幹細胞の検出を行なう。
【００７５】
一実施形態において、レクチンは放射性同位体と組み合わせ得る。
【００７６】
このことから一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関し、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けが、放射性同位体と接合されているレクチンを使って実施され、次にガンマカメラによる呼吸に関与する器官の前記標識付けされた癌幹細胞の検出を行なう。
【００７７】
一実施形態において、レクチンは発色基質または化学発光基質を用いた酵素と接合され得る。
【００７８】
このことから一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関し、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けが、ホースラディッシュペルオキシダーゼと接合されているレクチンを使って実施され、次にルミノールなどの化学発光基質を加えることで、発光顕微鏡または発光読取装置による呼吸に関与する器官の前記標識付けされた癌幹細胞の検出を行なう。
【００７９】
別の実施形態では、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関し、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けが、ホースラディッシュペルオキシダーゼと接合されているレクチンを使って実施され、次に3,3'-ジアミノベンジジン（DAB）、3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）、または2,2'-アジノ-ビス-(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸）（ABTS）から選択される発色基質を加えることで、紫外光／可視光顕微鏡、または吸光読取装置による呼吸に関与する器官の前記標識付けされた癌幹細胞の検出を行う。
【００８０】
一実施形態において、レクチンは金ビーズと組み合わせられる。
【００８１】
このことから一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関し、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けが、金ビーズと接合されているレクチンを使って実施され、次に電子顕微鏡による呼吸に関与する器官の前記標識付けされた癌幹細胞の検出を行なう。
【００８２】
一実施形態において、レクチンはビオチンと組み合わせてビオチン化レクチンを得る。
【００８３】
このことから一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関し、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けが、ビオチンと接合されているレクチンを使って実施され、次に
前記標識、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズがストレプトアビジンまたはアビジンと接合されている、先に記載された実施形態の一つにより、ビオチンと接合されているレクチンにより標識付けされる呼吸に関与する器官の前記癌幹細胞の検出を行なう。
【００８４】
呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けが、ビオチンと接合されているレクチンを使って実施され、次にビオチンと接合されているレクチンにより標識付けされている呼吸に関与する器官の前記癌幹細胞の検出が、以下の方法で実施される：
・  ストレプトアビジンまたはアビジンと接合されているフルオロフォアを使用する場合、蛍光顕微鏡、
・  ストレプトアビジンまたはアビジンと接合されている化学発光基質を用いた酵素を使用する場合、発光読取装置、
・  ストレプトアビジンまたはアビジンと組み合わされた放射性同位体を使用する場合、ガンマカメラ、
・  ストレプトアビジンまたはアビジンと接合されている金ビーズを使用する場合、電子顕微鏡、
・  ストレプトアビジンまたはアビジンと接合されている発色基質を用いた酵素を使用する場合、紫外光/可視光顕微鏡。
【００８５】
呼吸に関与する器官の癌幹細胞は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基を認識するレクチンの使用により単離されることも、本発明者らにより立証された。
【００８６】
特定の実施形態では、前記フコースα 1-2 ガラクトース基はフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。このことから呼吸に関与する器官の癌幹細胞は、呼吸に関与する器官の前記癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識するレクチンの使用により単離され得る。
【００８７】
「呼吸に関与する器官の癌幹細胞の単離」とは、何か他の細胞型が含まれない、生体試料の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の抽出という意味である。
【００８８】
従って本発明はまた、生体試料中の癌幹細胞の単離の後の、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する、接合されている少なくとも1つのレクチンの使用に関する。
【００８９】
この単離により試料は呼吸に関与する器官の癌幹細胞により強化することができる。
【００９０】
用語「強化」とは非幹癌細胞中の試料の涸渇により、試料中の全細胞に対する呼吸に関与する器官の癌幹細胞の比率が増加するという意味である。
【００９１】
これは呼吸に関与する器官の癌幹細胞を用いて強化された試料である。
【００９２】
このことから本発明の目的において語句「呼吸に関与する器官の癌幹細胞の単離」とは、「呼吸に関与する器官の癌幹細胞を用いた試料の強化」という意味である。
【００９３】
従って本発明の目的において「単離」とは、生体試料から呼吸に関与する器官の癌幹細胞を用いて強化された細胞の集団の取得という意味もある。本発明の目的において、用語「強化された」とは、フローサイトメトリーを用いてEpcam high＋cells / Epcam high− 細胞の比率により決定される癌幹細胞／細胞の全数の比率が少なくとも8である細胞の集団をいう。
【００９４】
癌幹細胞を用いた試料の強化で所望の細胞集団が試料中により大きい集団で存在するので、癌幹細胞の検出と定量の信頼性がより高く、より簡単になる。
【００９５】
このことからフコースα 1-2 ガラクトース基を認識するレクチンを用いた特に効果的な方法で、生体試料が癌幹細胞を用いて強化できることが本発明者らにより立証された。
【００９６】
特定の実施形態では、前記フコースα 1-2 ガラクトース基はフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。このことからフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識するレクチンを用いた特に効果的な方法で、生体試料が癌幹細胞を用いて強化できることが本発明者らにより立証された。
【００９７】
特定の実施形態では、フコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンにより標識付けされた癌幹細胞の単離の後、細胞増幅ステップが続く。従って、細胞の単離後に、これらは呼吸に関与する器官の癌幹細胞の量を増加できる溶媒で培養され得る。
【００９８】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関し、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けが、接合されているレクチンを使って実施され、次に呼吸に関与する器官の前記標識付けされた癌幹細胞の単離を行なう。
【００９９】
特定の実施形態では、レクチンはビオチンと接合され、また呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞の単離は、ストレプトアビジンまたはアビジンで官能化された支持体を介して行われる。
【０１００】
この実施形態では、ビオチンと接合されているレクチンで標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞は、ビオチン-ストレプトアビジン親和性またはビオチン-アビジン親和性により、ストレプトアビジンまたはアビジンで官能化された支持体に固定される。
【０１０１】
また支持体はガラス、ポリジメチルシロキサン（PDMS）、シリコーン、またはポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリスチレン（PS）、または環状オレフィン共重合体（COC）などのプラスチックで作られ得る。
【０１０２】
好適な支持体の例は、Kimら(Protein immobilization techniques for microfluidics assays、Kimら、Biomicrofluidics、7、041501、2013)によるレビューに記載されている。
【０１０３】
用語「官能化」とは、支持体が固定されたストレプトアビジンまたはアビジンで被覆されるように化学的に改変されるという意味である。
【０１０４】
上記で引用したKimらのレビューは、支持体の官能化を例示している。
【０１０５】
より特定の実施形態では、前記支持体は磁気ビーズで作られる。
【０１０６】
このことから、本発明の特定の実施形態において、前記支持体は磁気ビーズからなり、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞の単離は、磁石の存在下で磁気選別により行われる。
【０１０７】
この実施形態では、ビオチンと接合されているレクチンを有する呼吸に関与する器官の癌幹細胞は、ビオチン-ストレプトアビジン親和性またはビオチン-アビジン親和性により、ストレプトアビジンまたはアビジンで官能化された磁気ビーズに固定される。
【０１０８】
磁気の影響下で、磁気ビーズに固定された呼吸に関与する器官の癌幹細胞は、試料内で単離される。
【０１０９】
この単離の後に、上清の除去と、続けて前記支持体に連結する癌幹細胞を溶出することで、癌幹細胞を用いて強化された試料の回収を行なう。
【０１１０】
前記溶出は、ストレプトアビジン‐ビオチンまたはアビジン‐ビオチン結合を壊す酸性条件下で行え得る。
【０１１１】
前記支持体が磁気ビーズからなり、ストレプトアビジンまたはアビジンがDNA結合により磁気ビーズと結合している特定の場合には、前記溶出はDNAse処理法で行う。
【０１１２】
別の実施形態において、標識に使用されたレクチンは、フルオロフォアと接合されているレクチンであり、その単離はフローサイトメトリーでの細胞選別により行われる。
【０１１３】
従ってフローサイトメトリーによる細胞選別により、呼吸に関与する器官の癌幹細胞を用いて強化された試料の分画の取得が可能になる。
【０１１４】
フローサイトメトリーは、蛍光標識により細胞を異なる分画に特に選別できるとして、当業者には周知された技術である。
【０１１５】
このことから、本発明の部分であるフローサイトメトリーによる細胞選別により、以下の取得が可能になる：
-一方において、フルオロフォアと接合されているレクチンで標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞を含む試料の分画
-他方において、もとの試料に含まれ他の細胞型を含む試料の分画。
【０１１６】
本発明は、少なくとも1つの接合されているレクチンを用いて、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識、単離、およびその後の検出も可能にする。
【０１１７】
別の実施形態では、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関し、接合されているレクチンを用いた呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けの後に、呼吸に関与する器官の前記標識付けられた癌幹細胞の検出が続き、
次にフルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズまたはビオチンから選択される標識と接合されているレクチンを使って、前記単離された呼吸に関与する器官の癌幹細胞を再標識することによる、前記単離された呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出を行なう。
【０１１８】
特定の実施形態では、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関し、接合されているレクチンを用いた呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けの後に、呼吸に関与する器官の前記標識付けられた癌幹細胞の検出が続き、
次にフルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズまたはビオチンから選択される標識と接合されているレクチンを使って、前記単離された呼吸に関与する器官の癌幹細胞を再標識することによる、前記単離された呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出を行なう。
【０１１９】
このことから別の実施形態では、本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンの使用に関し、
呼吸に関与する器官の癌幹細胞の前記標識付けが、ビオチンまたはフルオロフォアと接合されているレクチンを使って実施され、次に、
-標識付けされ単離された呼吸に関与する器官の癌幹細胞を得るために、本発明に記載されているようにビオチンに接合されたレクチンの場合、ストレプトアビジンまたはアビジンで官能化された支持体を介して、または
本発明に記載されているようにフルオロファアに接合されたレクチンの場合、フローサイトメトリーを介して
呼吸に関与する器官の前記標識付けされた癌幹細胞の単離を行い、
-その後、本発明による接合されているレクチンを用いての前記標識付けされ単離された呼吸に関与する器官の癌幹細胞の再標識付けにより、本発明に記載された検出方法による前記細胞の検出を行う。
【０１２０】
本発明の一実施形態において、癌幹細胞が単離または検出された生体試料は、呼吸に関与する器官の生体試料である。
【０１２１】
呼吸に関与する器官の生体試料は、特に呼吸に関与する器官の癌患者からの、またはその様な癌が疑われる患者からの腫瘍生検である。
【０１２２】
呼吸に関与する器官の生体試料はまた、呼吸に関与する器官の癌幹細胞株か、または例えばマウスまたはラットなどにおいて癌細胞株の注入により動物内で誘発された腫瘍である。好ましくは、細胞株は呼吸に関与する器官の癌幹細胞である。この実施形態において、誘発された腫瘍は、研究のために別の腫瘍細胞から有利に単離された呼吸に関与する器官の癌幹細胞を含む。
【０１２３】
一実施形態において、本発明は、生体試料中、懸濁液中の細胞で構成される前記生体試料中において、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るため、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関する。
【０１２４】
特定の実施形態では、本発明はまた、生体試料中、懸濁液中の細胞で構成される前記生体試料中において、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るため、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用にも関する。
【０１２５】
特定の実施形態では、前記少なくとも1つのレクチンはUEA-Iレクチンまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０１２６】
このことから本発明は、生体試料中、懸濁液中の細胞で構成される前記生体試料中において、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るため、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのための、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関する。
【０１２７】
別の実施形態において、本発明は、生体試料中、細胞組織で構成される前記生体試料中において、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るため、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関する。
【０１２８】
特定の実施形態では、本発明はまた、生体試料中、細胞組織で構成される生体試料中において、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るため、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのためのフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用にも関する。
【０１２９】
特定の実施形態では、前記少なくとも1つのレクチンは、UEA-Iレクチンまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０１３０】
このことから、本発明は、生体試料中、細胞組織で構成される前記生体試料中において、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るため、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の標識付けのための、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも1つのレクチンのインビトロ使用に関する。
【０１３１】
一実施形態において、本発明は先に記載されたように、少なくとも2つのレクチンが等モル量であるインビトロ使用に関する。
【０１３２】
一実施形態において、本発明は、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも2つのレクチンのインビトロ使用に関し、前記少なくとも2つのレクチンが等モル量である。
【０１３３】
一実施形態において、本発明は、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される2つのレクチンの混合物のインビトロ使用に関し、前記2つのレクチンが前記混合物中で等モル量である。
【０１３４】
等モル量とは、2つのレクチンの各々が互いに同じ量で使用されるという意味である。これは2つのレクチンの重量比が1：1ということである。
【０１３５】
一実施形態において、本発明は、（UEA-I、ABA)、(UEA-I、ACA)、(UEA-I、ジャカリン)、(UEA-I、GSL-I)、(UEA-I、GSL-II)、(ABA、ACA)、(ABA、ジャカリン)、(ABA、GSL-I)、(ABA、GSL-II)、(ACA、ジャカリン)、(ACA、GSL-I)、(ACA、GSL-II)、(ジャカリン、GSL-I)、(ジャカリン、GSL-II)、(GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA)、(TJA-II、ACA)、(TJA-II、ジャカリン)、(TJA-II、GSL-I)、(TJA-II、GSL-II)の混合物から選択される2つのレクチンの混合物のインビトロ使用に関し、前記2つのレクチンが前記混合物中で等モル量である
【０１３６】
一実施形態において、本発明は、2つのレクチンのインビトロ使用に関し、前記2つのレクチンが混合物（GSL-I、GSL-II）であり、前記２つのレクチンの各々が等モル量である。
【０１３７】
一実施形態において、本発明は、2つのレクチンのインビトロ使用に関し、前記2つのレクチンが混合物(UEA-I、GSL-I)であり、前記２つのレクチンの各々が等モル量である。
【０１３８】
一実施形態において、本発明は先に記載されたように、少なくとも2つのレクチンが非等モル量であるインビトロ使用に関する。
【０１３９】
一実施形態において、本発明は、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも2つのレクチンのインビトロ使用に関し、前記少なくとも2つのレクチンが非等モル量である。
【０１４０】
実現方法において、一実施形態において、本発明は、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される2つのレクチンの混合物のインビトロ使用に関し、前記2つのレクチンが前記混合物中で非等モル量である。
【０１４１】
非等モル量とは、レクチンの各々が互いに異なった量で存在することを言う。それは特に2つのレクチンの重量比が2：1、3：1、または4：1である。
【０１４２】
このことから一実施形態において、本発明は、(UEA-I、ABA)、(ABA、UEA-I)、(UEA-I、ACA)、(ACA、UEA-I)、(UEA-I、ジャカリン)、(ジャカリン、UEA-I)、(UEA-I、GSL-I)、(GSL-I、UEA-I)、(UEA-I、GSL-II)、(GSL-II、UEA-I)、(ABA、ACA)、(ACA、ABA)、(ABA、ジャカリン)、(ジャカリン、ABA)、(ABA、GSL-I)、(GSL-I、ABA)、(ABA、GSL-II）、(GSL-II、ABA)、(ACA、ジャカリン)、(ジャカリン、ABA)、(ACA、GSL-I)、(GSL-I、ACA)、(ACA、GSL-II)、(GSL-II、CA)、(ジャカリン、GSL-I)、(GSL-I、ジャカリン)、(ジャカリン、GSL-II)、(GSL-II、ジャカリン)、(GSL-I、GSL-II)、(GSL-II、GSL-I)、(TJA-II、ABA)、(ABA、TJA-II)、(TJA-II、ACA)、(ACA、TJA-II)、(TJA-II、ジャカリン)、(ジャカリン、TJA-II)、(TJA-II、GSL-I)、(GSL-I、TJA-II)、(TJA-II、GSL-II)、(GSL-II、TJA-II)の混合物から選択される2つのレクチンの混合物のインビトロ使用に関し、前記2つのレクチンが前記混合物中で非等モル量であり、特に重量比2：1、3：1、または4：1であり、特に2：1である。
【０１４３】
特定の実施形態において、本発明は、2つのレクチンのインビトロ使用に関し、前記2つのレクチンが混合物(UEA-I、GSL-I)であり、そのレクチンが重量比2：1の非等モル量、つまり1のGSL-Iに対して2のUEA-Iである。
【０１４４】
特定の実施形態において、本発明は、2つのレクチンのインビトロ使用に関し、前記2つのレクチンが混合物(UEA-I、GSL-I)であり、そのレクチンが重量比3：1の非等モル量、つまり1のGSL-Iに対して3のUEA-Iである。
【０１４５】
特定の実施形態において、本発明は、2つのレクチンのインビトロ使用に関し、前記2つのレクチンが混合物(UEA-I、GSL-I)であり、そのレクチンが重量比4：1の非等モル量、つまり1のGSL-Iに対して4のUEA-Iである。
【０１４６】
一実施形態において、本発明は、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも3つのレクチンのインビトロ使用に関し、前記少なくとも3つのレクチンが等モル量である。
【０１４７】
一実施形態において、本発明は、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される3つのレクチンの混合物のインビトロ使用に関し、前記3つのレクチンの各々が前記混合物中で等モル量である。
【０１４８】
等モル量とは、3つのレクチンの各々が互いに同じ量で使用されるという意味である。これは3つのレクチンの重量比が1：1：1ということである。
【０１４９】
このことから一実施形態において、本発明は、（UEA-I、ABA、ACA)、(UEA-I、ABA、ジャカリン)、(UEA-I、ABA、GSL-I)、(UEA-I、ABA、GSL-II)、(UEA-I、ACA、ジャカリン)、(UEA-I、ACA、GSL-I)、(UEA-I、ACA、GSL-II)、(UEA-I、ジャカリン、GSL-I)、(UEA-I、ジャカリン、GSL-II)、(UEA-I、GSL-I、GSL-II)、(ABA、ACA、ジャカリン)、(ABA、ACA、GSL-I)、(ABA、ACA、GSL-II)、(ABA、ジャカリン、GSL-I)、(ABA、ジャカリン、GSL-II)、(ABA、GSL-I、GSL-II)、(ACA、ジャカリン、GSL-I)、(ACA、ジャカリン、GSL-II)、(ACA、GSL-I、GSL-II)、(ジャカリン、GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA、ACA)、(TJA-II、ABA、ジャカリン)、(TJA-II、ABA、GSL-I)、(TJA-II、ABA、GSL-II)、(TJA-II、ACA、ジャカリン)、(TJA-II、ACA、GSL-I)、(TJA-II、ACA、GSL-II)、(TJA-II、ジャカリン、GSL-I)、(TJA-II、ジャカリン、GSL-II)、(TJA-II、GSL-I、GSL-II)の混合物から選択される3つのレクチンの混合物のインビトロ使用に関し、前記3つのレクチンが前記混合物中で等モル量である。
【０１５０】
一実施形態において、前述のとおり本発明は、3つのレクチンのインビトロ使用に関し、前記3つのレクチンがUEA-Iまたはその同族体TJA-IIとジャカリンとABAとの混合物、あるいはUEA-Iまたはその同族体TJA-IIとジャカリンとACAとの混合物から選択され、前記3つのレクチンの各々が混合物中に等モル量で存在している。
【０１５１】
一実施形態において、本発明は、、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも3つのレクチンのインビトロ使用に関し、前記少なくとも3つのレクチンが非等モル量である。
【０１５２】
一実施形態において、本発明は、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される3つのレクチンの混合物のインビトロ使用に関し、前記少なくとも3つのレクチンが前記混合物中で非等モル量である。
【０１５３】
3つのレクチンの使用の場合、非等モル量とは3つのレクチンが互いに対して等モル量で使用されず、かつ3つのレクチンのうち少なくとも2つが異なる量で使用されるという意味である。特にそれは3つのレクチンの重量比が2：1：1である。
【０１５４】
このことから特定の実施形態において、本発明は、(UEA-I、ABA、ACA)、(UEA-I、ABA、ジャカリン)、(UEA-I、ABA、GSL-I)、(UEA-I、ABA、GSL-II)、(UEA-I、ACA、ジャカリン)、(UEA-I、ACA、GSL-I)、(UEA-I、ACA、GSL-II)、(UEA-I、ジャカリン、GSL-I)、(UEA-I、ジャカリン、GSL-II)、(UEA-I、GSL-I、GSL-II)、(ABA、ACA、ジャカリン)、(ABA、ACA、GSL-I)、(ABA、ACA、GSL-II)、(ABA、ジャカリン、GSL-I)、(ABA、ジャカリン、GSL-II)、(ABA、GSL-I、GSL-II)、(ACA、ジャカリン、GSL-I)、(ACA、ジャカリン、GSL-II)、(ACA、GSL-I、GSL-II)、(ジャカリン、GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA、ACA)、(TJA-II、ABA、ジャカリン)、(TJA-II、ABA、GSL-I)、(TJA-II、ABA、GSL-II)、(TJA-II、ACA、ジャカリン)、(TJA-II、ACA、GSL-I)、(TJA-II、ACA、GSL-II)、(TJA-II、ジャカリン、GSL-I)、(TJA-II、ジャカリン、GSL-II)、(TJA-II、GSL-I、GSL-II)の混合物から選択される3つのレクチンの混合物のインビトロ使用に関し、前記3つのレクチンが前記混合物中で非等モル量であり、特に重量比2：1:1、1:2：1、または1:1:2である。
【０１５５】
本発明はまた、生体試料中において、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るために、フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて、呼吸に関与する器官を標識付けする癌幹細胞のステップを含む、呼吸に関与する器官の癌幹細胞のインビトロ標識付け方法に関する。
【０１５６】
特定の実施形態では、本発明はまた、生体試料中において、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るために、フコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて、呼吸に関与する器官を標識付けする癌幹細胞のステップを含む、呼吸に関与する器官の癌幹細胞のインビトロ標識付け方法に関する。
【０１５７】
特定の実施形態では、前記少なくとも1つのレクチンは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０１５８】
従って、本発明はまた、本発明はまた、生体試料中において、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞を得るために、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも1つのレクチンを用いて、呼吸に関与する器官を標識付けする癌幹細胞のステップを含む、呼吸に関与する器官の癌幹細胞のインビトロ標識付け方法に関する。
【０１５９】
この標識付け方法は、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、ビオチンまたは金ビーズから選択される標識に接合されたビオチンを使用して、呼吸に関与する器官の癌幹細胞を検出する方法に組込み可能である。
【０１６０】
本発明はまた、生体試料中において呼吸に関与する器官の癌幹細胞を検出する、以下のステップ：
(a)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けして、呼吸に関与する器官の癌幹細胞が少なくとも1つのレクチンで標識付けされた生体試料を得るステップであって、該レクチンがフルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ、またはビオチンから選択される標識と接合されている、ステップ、
次に
(b)少なくとも1つのレクチンを用いて標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞を検出するステップ
を含むインビトロ方法に関する。
【０１６１】
特定の実施形態では、本発明のレクチンにより認識される前記フコースα 1-2 ガラクトース基は、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。
【０１６２】
特定の実施形態では、前記少なくとも1つのレクチンは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０１６３】
従って特定の実施形態では、本発明は、少なくともの１つのレクチンが、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択され、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも２つのレクチン、特にGSL-IとGSL-IIの混合物、またはUEA-IとGSL-Iの混合物であり、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも３つのレクチン、特にUEA-IとジャカリンとABAとの混合物、またはUEA-IとジャカリンとACAとの混合物である、
前述のようなインビトロ検出方法に関する。
【０１６４】
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも2つのレクチンが使用され、前記少なくとも2つのレクチンが等モル量である、前述のようなインビトロ検出方法に関する。
【０１６５】
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも2つのレクチンが使用され、前記少なくとも2つのレクチンが非等モル量である、前述のようなインビトロ検出方法に関する。
【０１６６】
特定の実施形態では、本発明は、2つのレクチンが使用され、前記2つのレクチンが重量比2：1、3：1、または4：1の非等モル量であるUEA-IとGSL-Iである、前述のようなインビトロ検出方法に関する。
【０１６７】
特定の実施形態では、本発明は、前記生体試料が呼吸に関与する器官の生体試料である、前述のようなインビトロ検出方法に関する。
【０１６８】
特定の実施形態では、本発明は、前記呼吸に関与する器官が肺、喉頭、咽頭、口、鼻、喉、舌、副鼻腔、気管、および唾液腺（扁桃腺および耳下腺）から選択される、前述のようなインビトロ検出方法に関する。
【０１６９】
特定の実施形態では、本発明は、生体試料中において肺癌幹細胞を検出する、以下のステップ：
(a)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて肺癌幹細胞を標識付けして、肺癌幹細胞が少なくとも1つのレクチンで標識付けされた生体試料を得るステップであって、UEA-I、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択され、該レクチンがフルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ、またはビオチンから選択される標識と接合されている、ステップ、
次に
(b)少なくとも1つのレクチンを用いて標識付けされた肺癌幹細胞を検出するステップ
を含むインビトロ方法に関する。
【０１７０】
レクチンがフルオロフォアに接合された本方法の一実施形態において、呼吸に関与する器官の癌幹細胞は蛍光顕微鏡または蛍光読取装置により検出される。
【０１７１】
レクチンが放射性同位体に接合された本方法の一実施形態において、呼吸に関与する器官の癌幹細胞はガンマカメラにより検出される。
【０１７２】
レクチンがホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、またはβ-ガラクトシダーゼなどの着色生成物の形成を触媒する酵素に接合される方法の一実施形態において、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞は、発色基質を追加した後、紫外光/可視光顕微鏡または吸光読取装置により検出される。
【０１７３】
レクチンがHRPなどの発光生成物の形成を触媒する酵素に接合される方法の一実施形態において、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞は、ルミノールなどの化学発光基質を追加した後、発光顕微鏡または発光読取装置により検出される。
【０１７４】
レクチンが金ビーズに接合される方法の一実施形態において、呼吸に関与する器官の標識付けされた癌幹細胞は、電子顕微鏡により検出される。
【０１７５】
レクチンがビオチンに接合される方法の一実施形態において、前記呼吸に関与する器官の癌幹細胞は、前記標識がストレプトアビジンまたはアビジンに接合されている、前述の検出モードの1つにより検出される。
【０１７６】
標識付け方法はまた、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、ビオチン、または金ビーズから選択される標識に接合されるレクチンを使用して、呼吸に関与する器官の癌幹細胞を単離する方法に組込み可能である。
【０１７７】
一実施形態において、本発明の方法は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の単離を可能にする。特に、この単離ステップは、例えば再発または転移をしばしば引き起こすこれらの癌幹細胞を除去できる新たな治療を発見するための、呼吸に関与する器官の腫瘍試料に検出された呼吸に関与する器官の癌幹細胞の研究を可能にする。
【０１７８】
「インビトロ単離方法」とは、呼吸に関与する器官の癌非幹細胞（CNSCs）の涸渇により、生体試料が呼吸に関与する器官の癌幹細胞（CSCs）を用いて強化されるという意味である。
【０１７９】
呼吸に関与する器官の癌幹細胞は、フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも１つのレクチンの使用により、呼吸に関与する器官の癌非幹細胞（CNSCs）などの、試料中に存在すると見られる別の細胞型から特異的に分離される。
【０１８０】
特定の実施形態では、呼吸に関与する器官の癌幹細胞は、フコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも１つのレクチンの使用により、呼吸に関与する器官の癌非幹細胞（CNSCs）などの、試料中に存在すると見られる別の細胞型から特異的に分離される。
【０１８１】
特定の実施形態では、呼吸に関与する器官の癌幹細胞は、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも１つのレクチンの使用により、呼吸に関与する器官の癌非幹細胞（CNSCs）などの、試料中に存在すると見られる別の細胞型から特異的に分離される。
【０１８２】
CSCsによる試料の強化は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞が主に見られる、すなわち特にCNSCsと比べて別の細胞型よりも大きな量で存在する、生体試料の取得を可能にする。
【０１８３】
従って本発明はまた、生体試料中において呼吸に関与する器官の癌幹細胞を単離するための、以下のステップ：
(a)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けして、呼吸に関与する器官の癌幹細胞が少なくとも1つのレクチンで標識付けされた生体試料を得るステップであって、前記レクチンがビオチンまたはフルオロフォアと接合している、ステップ、
次に
(b)少なくとも1つのレクチンを用いて標識付けされた呼吸に関与する器官の前記癌幹細胞を単離するステップ
を含むインビトロ方法に関する。
【０１８４】
特定の実施形態では、本発明のレクチンにより認識される前記フコースα 1-2 ガラクトース基は、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。
【０１８５】
特定の実施形態では、前記少なくとも1つのレクチンは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０１８６】
特定の実施形態では、本発明はまた、試料中において呼吸に関与する器官の癌幹細胞を単離するための、以下のステップ：
(a)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けして、呼吸に関与する器官の癌幹細胞が少なくとも1つのレクチンで標識付けされた生体試料を得るステップであって、前記レクチンがビオチンと接合している、ステップ、
次に
(b)ストレプトアビジンまたはアビジンを用いた支持体を介して、少なくとも1つのレクチンを用いて標識付けされた呼吸に関与する器官の前記癌幹細胞を単離するステップ
を含むインビトロ方法に関する。
【０１８７】
特定の実施形態では、本発明のレクチンにより認識される前記フコースα 1-2 ガラクトース基は、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。
【０１８８】
特定の実施形態では、前記少なくとも1つのレクチンは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０１８９】
この単離の後に、上清の除去と、続けて前記支持体に連結する癌幹細胞を溶出することで、癌幹細胞を用いて強化された試料の回収を行なう。
【０１９０】
前記溶出は、ストレプトアビジン/アビジン‐ビオチン結合を壊す酸性条件下で行い得る。
【０１９１】
一実施形態において、前記支持体はストレプトアビジンまたはアビジンで官能化された磁気ビーズから成り、また前記単離ステップは磁石の存在における磁気選別により実施される。
【０１９２】
前記支持体が磁気ビーズからなり、ストレプトアビジンまたはアビジンがDNA結合により磁気ビーズと結合している特定の場合には、前記溶出はDNAse処理法で行う。
【０１９３】
特定の実施形態では、本発明はまた、生体試料中において呼吸に関与する器官の癌幹細胞を単離するための、以下のステップ：
(a)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けして、呼吸に関与する器官の癌幹細胞が少なくとも1つのレクチンで標識付けされた生体試料を得るステップであって、前記レクチンがフルオロフォアと接合されている、ステップ、
次に
(b)フローサイトメトリーによる細胞選別により、少なくとも1つのレクチンを用いて標識付けされた呼吸に関与する器官の前記癌幹細胞を単離するステップ
を含むインビトロ方法に関する。
【０１９４】
特定の実施形態では、本発明のレクチンにより認識される前記フコースα 1-2 ガラクトース基は、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。
【０１９５】
特定の実施形態では、前記少なくとも1つのレクチンは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０１９６】
特定の実施形態では、本発明はまた、前記少なくとも１つのレクチンが、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択され、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも２つのレクチン、特にGSL-IとGSL-IIの混合物、またはUEA-IとGSL-Iの混合物であり、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも３つのレクチン、特にUEA-IとジャカリンとABAとの混合物、またはUEA-IとジャカリンとACAとの混合物である、前述のようなインビトロ単離方法に関する。
【０１９７】
特定の実施形態では、本発明はまた、少なくとも2つのレクチンが使用され、前記少なくとも2つのレクチンが等量または不等量である、前述のようなインビトロ単離方法に関する。
【０１９８】
特定の実施形態では、本発明はまた、少なくとも2つのレクチンが使用され、前記少なくとも2つのレクチンが非等モル量である、前述のようなインビトロ単離方法に関する。
【０１９９】
特定の実施形態では、本発明はまた、2つのレクチンが使用され、前記2つのレクチンが重量比2：1、3：1、または4：1の非等モル量であるUEA-IとGSL-Iである、前述のようなインビトロ単離方法に関する。
【０２００】
特定の実施形態では、本発明はまた、前記生体試料が呼吸に関与する器官の生体試料である、前述のようなインビトロ単離方法に関する。
【０２０１】
特定の実施形態では、本発明はまた、前記呼吸に関与する器官が肺、喉頭、咽頭、口、鼻、喉、舌、副鼻腔、気管、および唾液腺（扁桃腺および耳下腺）から選択される、前述のようなインビトロ単離方法に関する。
【０２０２】
特定の実施形態では、本発明は、生体試料中において肺癌幹細胞を単離するための、以下のステップ：
(a)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて肺癌幹細胞を標識付けして、肺癌幹細胞が少なくとも1つのレクチンで標識付けされた生体試料を得るステップであって、UEA-I、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択され、該レクチンがビオチンまたはフルオロフォアと接合されている、ステップ、
次に
(b)少なくとも1つのレクチンを用いて標識付けされた肺癌幹細胞を検出するステップであって、
該レクチンがビオチンと接合されている場合、磁石の存在において、該単離ステップが、磁気ビーズで構成されるストレプトアビジンまたはアビジンで官能化された支持体を介して行われるステップ、および
該レクチンがフルオロフォアと接合されている場合、該単離ステップがフローサイトメトリーによる細胞選別により行われるステップ
を含むインビトロ方法に関する。
【０２０３】
従って、フローサイトメトリー細胞選別は、癌幹細胞で強化された試料の画分の取得を可能にする。
【０２０４】
呼吸に関与する器官の癌幹細胞がステップ（a）で標識付けされる前に、試料中の細胞は有利に、互いに分離される。この細胞の分離は、通常の手順、例えば細胞表面に発現されたグリカン、特にフコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を変えること無しに、細胞を互いに分離できる1つ以上の酵素を使用して行うことができる。例えば、細胞の分離はRoche Diag混合物UEA-I/GSL-Istic社によるLiberase(R)混合液を用いて実現できる。
【０２０５】
従って、本発明はまた、標識付けステップの前に試料の細胞を互いに分離させる予備ステップを含む本発明の方法に関する。
【０２０６】
今日では調査と診断を目的とした癌幹細胞の研究は、特にこれらの細胞に対して有効である新たな物質の同定のためには必須である。また、これらの細胞の研究は個人向け医療という面において特に有用である。
【０２０７】
化学療法に対する抵抗性により、呼吸に関与する器官の癌幹細胞は、腫瘍の再現および腫瘍の再発へと導く特異的な集団細胞である。このことから本発明は、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出と単離によって、呼吸に関与する器官の癌の再発リスクの評価を可能にする。
【０２０８】
呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出は、場合により定量が続き、腫瘍の進行のリスク評価を可能にする。
【０２０９】
従って、本発明はまた、呼吸に関与する器官の癌の治療適応性についての予後予測値を規定するため、呼吸に関与する器官の癌の再発のリスクおよび/または悪性度のインビトロ診断のためのフコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する1つのレクチンの使用に関する。
【０２１０】
従って、本発明はまた、試料中の少なくとも1つのレクチンにより標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞を得るための、フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の生体試料の呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けするステップを含む、呼吸に関与する器官の癌の治療適応についての予後予測値を規定するため、呼吸に関与する器官の癌の再発のリスクおよび/または呼吸に関与する器官の癌の悪性度のインビトロ診断のための方法に関する。
【０２１１】
特定の実施形態では、本発明はまた、試料中の少なくとも1つのレクチンにより標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞を得るための、フコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の生体試料の呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けするステップを含む、呼吸に関与する器官の癌の治療適応性についての予後予測値を規定するため、呼吸に関与する器官の癌の再発のリスクおよび/または呼吸に関与する器官の癌の悪性度のインビトロ診断のための方法に関する。
【０２１２】
従って、本発明はまた、試料中の少なくとも1つのレクチンにより標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞を得るための、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも1つのレクチンを用いて、呼吸に関与する器官の生体試料の呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けするステップを含む、呼吸に関与する器官の癌の治療適応性についての予後予測値を規定するため、呼吸に関与する器官の癌の再発のリスクおよび/または呼吸に関与する器官の癌の悪性度のインビトロ診断のための方法に関する。
【０２１３】
特定の実施形態において、本発明の診断方法は以下に記載のステップを含む：
(a)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けして、前記生体試料中の少なくとも1つのレクチンにより標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞を得るステップであって、前記レクチンがフルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ、またはビオチンから選択される標識と接合されているステップ、
(b)以下の記載によって標識付けされる呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出ステップであって、
−レクチンがフルオロファアに接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンと接合されているフルオロフォアを介して検出されるとき、蛍光顕微鏡または蛍光読取装置
−レクチンが化学発光基質を利用する酵素に接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている化学発光基質を利用する酵素を介して検出されるとき、発光顕微鏡または発光読取装置
−レクチンが放射性同位体に接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている放射性同位体を介して検出されるとき、ガンマカメラ
−レクチンが発色基質を利用する酵素に接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている発色基質を利用する酵素を介して検出されるとき、紫外光／可視光顕微鏡または吸光読取装置
−レクチンが金ビーズに接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている金ビーズを介して検出されるとき、電子顕微鏡を用いて行われるステップ
(c)場合により、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の定量化ステップ
(d)前記生体試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出強度と、前記生体試料に隣接した健全な試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出強度との比較ステップであって、
任意に、前記生体試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の量と、前記生体試料に隣接した健全な試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の量との比較ステップ
(e)呼吸に関与する器官の癌幹細胞の存在および、場合によりその量から呼吸に関与する器官の癌の再発のリスクおよび／または呼吸に関与する器官の癌の悪性度を推定して、呼吸に関与する器官の癌の治療適応性についての予後予測値を規定するステップ。
【０２１４】
特定の実施形態では、レクチンにより認識される前記フコースα 1-2 ガラクトース基は、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。
【０２１５】
特定の実施形態では、前記少なくとも1つのレクチンは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０２１６】
特定の実施形態において、本発明の診断方法は以下に記載のステップを含む：
(a)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて呼吸に関与する器官の癌幹細胞を標識付けして、前記生体試料中の少なくとも1つのレクチンにより標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞を得るステップであって、前記レクチンがフルオロフォアまたはビオチンから選択される標識と接合されているステップ、
(b)前記少なくとも1つの接合されたレクチンにより標識付けされる呼吸に関与する器官の癌幹細胞の単離ステップであって、
−ビオチンと接合されたレクチンを用いた標識付けの場合、前記単離はストレプトアビジンまたはアビジンで官能化された支持体を介して行われ、特に官能化された支持体はストレプトアビジンまたはアビジンで官能化された磁気ビーズからなり、前記単離は磁気の存在下で磁気細胞選別により行われるか、または
−フルオロファアと接合されたレクチンを用いた標識付けの場合、前記単離はフローサイトメトリーにおける細胞選別により行われる、ステップ
(c)フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも１つのレクチンを用いて、単離された呼吸に関与する器官の癌幹細胞に新たな標識付けして、その新たな標識付けによって単離および標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞を得るステップであって、前記レクチンがフルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ、またはビオチンから選択される標識に接合された、ステップ
(d)新たな標識付けによって単離および標識付けされた呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出ステップであって、
−レクチンがフルオロファアに接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンと接合されているフルオロフォアを介して検出されるとき、蛍光顕微鏡または蛍光読取装置
−レクチンが化学発光基質を利用する酵素に接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている化学発光基質を利用する酵素を介して検出されるとき、発光顕微鏡または発光読取装置
−レクチンが放射性同位体に接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている放射性同位体を介して検出されるとき、ガンマカメラ
−レクチンが発色基質を利用する酵素に接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている発色基質を利用する酵素を介して検出されるとき、紫外光／可視光顕微鏡または吸光読取装置
−レクチンが金ビーズに接合されているとき、またはレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジンもしくはアビジンに接合されている金ビーズを介して検出されるとき、電子顕微鏡を用いて行われるステップ
(e)場合により、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の定量化ステップ
(f)前記生体試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出強度と、前記生体試料に隣接した健全な試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出強度との比較ステップであって、
任意に、前記生体試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の量と、前記生体試料に隣接した健全な試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の量との比較ステップ
(g)呼吸に関与する器官の癌幹細胞の存在および、場合によりその量から呼吸に関与する器官の癌の再発のリスクおよび／または呼吸に関与する器官の癌の悪性度を推定して、呼吸に関与する器官の癌の治療適応性についての予後予測値を規定するステップ。
【０２１７】
特定の実施形態では、レクチンにより認識される前記フコースα 1-2 ガラクトース基は、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。
【０２１８】
特定の実施形態では、前記少なくとも1つのレクチンはレクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０２１９】
特定の実施形態では、本発明は、前記少なくとも１つのレクチンが、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択され、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも２つのレクチン、特にGSL-IとGSL-IIの混合物、またはUEA-IとGSL-Iの混合物であり、
特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも３つのレクチン、特にUEA-IとジャカリンとABAとの混合物、またはUEA-IとジャカリンとACAとの混合物である、
前述のような診断方法に関する。
【０２２０】
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも2つのレクチンが使用され、前記少なくとも2つのレクチンが等量または不等量である、前述のようなインビトロ単離方法に関する。
【０２２１】
特定の実施形態では、本発明は、少なくとも2つのレクチンが使用され、前記少なくとも2つのレクチンが非等モルである、前述のような診断方法に関する。
【０２２２】
特定の実施形態では、本発明は、2つのレクチンが使用され、前記2つのレクチンが重量比2：1、3：1、または4：1の非等モル量であるUEA-IとGSL-Iである、前述のような診断方法に関する。
【０２２３】
特定の実施形態では、本発明は、前記生体試料が呼吸に関与する器官の生体試料である、前述のような診断方法に関する。
【０２２４】
特定の実施形態では、本発明は、前記呼吸に関与する器官が肺、喉頭、咽頭、口、鼻、喉、舌、副鼻腔、気管、および唾液腺（扁桃腺および耳下腺）から選択される、前述のような診断方法に関する。
【０２２５】
特定の実施形態では、本発明は、前記癌が肺癌、喉頭癌、咽頭癌、口腔癌、鼻の癌、咽喉癌、舌癌、副鼻腔癌、気管癌、および唾液腺癌（扁桃腺癌および／または耳下腺癌など）から選択される、前述のような診断方法に関する。
【０２２６】
特定の実施形態では、本発明は、
試料中の少なくとも1つのレクチンにより標識付けされた肺癌幹細胞を得るための、レクチンUEA-I、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択されフコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを用いて、肺の生体試料の肺癌幹細胞を標識付けするステップを含む、肺癌の治療適応性についての予後予測値を規定するため、肺癌の再発のリスクおよび/または肺癌の悪性度のインビトロ診断のための方法に関する。
【０２２７】
用語「肺癌（pulmonary cancer）」は「肺癌（lung cancer）」を言う。
【０２２８】
呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出強度、および場合によりそれらの量は、生体試料に隣接した健全な試料に関して比較される。
【０２２９】
生体試料に隣接した健全な試料は、対照として使用される。
【０２３０】
「生体試料に隣接した健全な試料」とは、生体試料として同じ個人から採取されで試料であって、解剖病理学的な分析において腫瘍細胞が無く、かつ本発明の方法による癌幹細胞が無い生体試料が採取された組織に近い組織で採取された試料という意味である。
【０２３１】
このことから、健全な試料は、解剖病理学的分析において腫瘍細胞が無いこと、および本発明の方法により癌幹細胞が無いことを特徴とする試料である。
【０２３２】
呼吸に関与する器官の癌の定量化は、呼吸に関与する器官の癌の悪性度の規定を可能にする。この定量化はフローサイトメトリー、ウエスタン・ブロット、Oct-4、cMyc1、Gli-1、またはEpCamなどの一般の標識を用いる定量PCR、またはクローン形成能試験などの異なる方法で達成できる。
【０２３３】
CSCsのビームを形成するのと並行してこれらの方法を使用でき、それにより定量化の信頼性が高まる。
【０２３４】
特定の実施形態では、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の定量化は、クローン形成能試験によって行われる。
【０２３５】
クローン形成能試験は、細胞が腫瘍球体を再構成する能力を観察するための生体試料の培養からなる。自己再生および自己複製の特性は癌幹細胞に特異的であり、単一の癌幹細胞は形成された腫瘍球体の起源である。このことから形成された腫瘍球体を計数することで試料中の癌幹細胞を定量できる。
【０２３６】
これらの方法、好ましくは癌幹細胞の単離ステップ後にOct-4、cMyc1、Gli-1、またはEpCamなどの一般の標識を用いる定量qPCRは、癌幹細胞の単離ステップの後、これらの細胞の有無の決定のために癌幹細胞を検出することも可能にする。
【０２３７】
このことから、これらの方法は、呼吸に関与する器官の単離された癌幹細胞の新たな標識付けおよび検出にそれぞれ対応する、前述のステップ(c)と(d)の代替として示されている。
【０２３８】
この検出は癌幹細胞の試料を強化することで容易になり、信頼性が向上する。
【０２３９】
これらの方法による検出はまた、本発明の方法による呼吸に関与する器官の癌幹細胞を用いる試料の強化の有効性、つまり呼吸に関与する器官の癌幹細胞を単離方法の有効性を検証する。
【０２４０】
本発明の診断方法では、生体試料に隣接した健全な試料と比べて、生体試料中の検出強度が高いほど、呼吸に関与する器官の癌の再発リスクは高く、癌の悪性度も高くなる。
【０２４１】
同様に、生体試料に隣接した健全な試料と比べて、生体試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の量が多いほど、呼吸に関与する器官の癌の再発リスクは高く、癌の悪性度も高くなる。
【０２４２】
このことから、生体試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出と定量化は、呼吸に関与する器官の癌の悪性度と、その進展する能力の測定とを可能にする。
【０２４３】
呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出と定量化はまた、個人向けの医療アプローチの一部である。確かに生体試料中の呼吸に関与する器官の癌の検出が治療の予後予測値を可能にすることにより、治療が適応可能となる。
【０２４４】
本発明はまた、フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを含み、該レクチンがフルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ、またはビオチンから選択される標識と接合されている、生体試料中において呼吸に関与する器官の癌幹細胞のインビトロ検出のためのキットに関する。
【０２４５】
特定の実施形態では、レクチンにより認識される前記フコースα 1-2 ガラクトース基は、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。
【０２４６】
特定の実施形態では、前記少なくとも1つのレクチンは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０２４７】
本発明はまた、フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも１つのレクチン、ビオチンと接合されている該レクチン、およびストレプトアビジンで官能化された磁気ビーズを含む、生体試料中の呼吸に関与する器官の癌幹細胞のインビトロ単離のためのキットに関する。
【０２４８】
特定の実施形態では、レクチンにより認識される前記フコースα 1-2 ガラクトース基は、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。
【０２４９】
特定の実施形態では、前記少なくとも1つのレクチンはレクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０２５０】
本発明はまた、フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチンを含み、該レクチンがフルオロフォアと接合されている、生体試料中において呼吸に関与する器官の癌幹細胞のインビトロ単離のためのキットに関する。
【０２５１】
特定の実施形態では、レクチンにより認識される前記フコースα 1-2 ガラクトース基は、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。
【０２５２】
特定の実施形態では、前記少なくとも1つのレクチンはレクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０２５３】
本発明はまた、呼吸に関与する器官の癌の治療適応性についての予後予測値を規定するための、呼吸に関与する器官の癌の再発のリスクおよび／または呼吸に関与する器官の癌の悪性度のインビトロ診断のためのキットに関し、
‐ビオチンと接合されている、フコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチン、およびストレプトアビジンで官能化された磁気ビーズ、
‐任意にはフルオロファア、放射性同位体、酵素、または金ビーズに接合された少なくとも1つのレクチン
を含む。
【０２５４】
特定の実施形態では、レクチンにより認識される前記フコースα 1-2 ガラクトース基は、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。
【０２５５】
特定の実施形態では、少なくとも1つのレクチンは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０２５６】
本発明はまた、呼吸に関与する器官の癌の治療適応性についての予後予測値を規定するための、呼吸に関与する器官の癌の再発のリスクおよび／または呼吸に関与する器官の癌の悪性度のインビトロ診断のためのキットに関し、
‐フルオロフォアと接合されているフコースα 1-2 ガラクトース基を認識する少なくとも1つのレクチン、
‐任意にはビオチン、放射性同位体、酵素、または金ビーズに接合された少なくとも1つのレクチン
を含む。
【０２５７】
特定の実施形態では、レクチンにより認識される前記フコースα 1-2 ガラクトース基は、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基である。
【０２５８】
特定の実施形態では、前記少なくとも1つのレクチンは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される。
【０２５９】
従って、特定の実施形態では、本発明は、少なくとも１つのレクチンが、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択され、特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも２つのレクチン、特にGSL-IとGSL-IIの混合物、またはUEA-IとGSL-Iの混合物であり、特に、UEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも３つのレクチン、特にUEA-IとジャカリンとABAとの混合物、またはUEA-IとジャカリンとACAとの混合物である、前述のような診断方法に関する。
【０２６０】
本発明の診断法は生体試料中において、特に呼吸に関与する器官の試料において行われる。
【０２６１】
特定の実施形態では、本発明は、肺癌の治療適応性についての予後予測値を規定するための、肺癌の再発のリスクおよび/または肺癌の悪性度のインビトロ診断のためのキットに関し、
レクチンUEA-I、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-I、およびGSL-IIから選択されフコースα 1-2 ガラクトース基を認識し、ビオチンと接合されている少なくとも１つのレクチン、およびストレプトアビジンで官能化された磁気ビーズ、
任意に、レクチンUEA-I、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-I、およびGSL-IIから選択され、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、または金ビーズと接合されている少なくとも１つのレクチンを含み、または
レクチンUEA-I、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-I、およびGSL-IIから選択されフコースα 1-2 ガラクトース基を認識し、フルオロフォアと接合されている少なくとも１つのレクチン、および任意に、レクチンUEA-I、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-I、およびGSL-IIから選択され、ビオチン、放射性同位体、酵素、または金ビーズと接合されている少なくとも１つのレクチンを含む。
【０２６２】
前述の本発明のキットは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも2つの接合されているレクチンを含み得、該少なくとも２つの接合されているレクチンは等モル量である。
【０２６３】
一実施形態において、本発明のキットはレクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される2つのレクチンを含み得、該２つのレクチンは等モル量である。
【０２６４】
一実施形態において、本発明のキットは、（UEA-I、ABA)、(UEA-I、ACA)、(UEA-I、ジャカリン)、(UEA-I、GSL-I)、(UEA-I、GSL-II)、(ABA、ACA)、(ABA、ジャカリン)、(ABA、GSL-I)、(ABA、GSL-II)、(ACA、ジャカリン)、(ACA、GSL-I)、(ACA、GSL-II)、(ジャカリン、GSL-I)、(ジャカリン、GSL-II)、(GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA)、(TJA-II、ACA)、(TJA-II、ジャカリン)、(TJA-II、GSL-I)、(TJA-II、GSL-II)の混合物から選択される2つのレクチンを含み得、該2つのレクチンは等モル量である。
【０２６５】
一実施形態において、本発明のキットは、2つのレクチンを含み得、該2つのレクチンが各々等モル量である混合物（GSL-I、GSL-II）である。
【０２６６】
一実施形態において、本発明のキットは、2つのレクチンを含み得、該2つのレクチンが各々等モル量である混合物(UEA-I、GSL-I) である。
【０２６７】
一実施形態において、本発明のキットは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも2つのレクチンを含み得、該少なくとも2つのレクチンが非等モル量である。
【０２６８】
一実施形態において、本発明のキットは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される2つのレクチンを含み得、該2つのレクチンが非等モル量である。
【０２６９】
一実施形態において、本発明のキットは、(UEA-I、ABA)、(ABA、UEA-I)、(UEA-I、ACA)、(ACA、UEA-I)、(UEA-I、ジャカリン)、(ジャカリン、UEA-I）、(UEA-I、GSL-I)、(GSL-I、UEA-I)、(UEA-I、GSL-II)、(GSL-II、UEA-I)、(ABA、ACA)、(ACA、ABA)、(ABA、ジャカリン)、(ジャカリン、ABA)、(ABA、GSL-I)、(GSL-I、ABA)、(ABA、GSL-II）、（GSL-II、ABA)、(ACA、ジャカリン)、(ジャカリン、ABA)、(ACA、GSL-I)、(GSL-I、ACA)、(ACA、GSL-II)、(GSL-II、CA)、(ジャカリン、GSL-I)、(GSL-I、ジャカリン)、(ジャカリン、GSL-II）、(GSL-II、ジャカリン)、(GSL-I、GSL-II)、(GSL-II、GSL-I)、(TJA-II、ABA)、(ABA、TJA-II)、(TJA-II、ACA)、(ACA、TJA-II)、(TJA-II、ジャカリン)、（ジャカリン、TJA-II)、(TJA-II、GSL-I)、(GSL-I、TJA-II)、(TJA-II、GSL-II)、(GSL-II、TJA-II)の混合物から選択される2つのレクチンの混合物を含み得、前記2つのレクチンが非等モル量であり、特に重量比2：1、3：1、または4:1、より特には2:1である。
【０２７０】
一実施形態において、本発明のキットは、2つのレクチンを含み得、前記レクチンが混合物(UEA-I、GSL-I)である、そのレクチンが重量比2：1の非等モル量、つまり1のGSL-Iに対して2のUEA-Iである。
【０２７１】
一実施形態において、本発明のキットは、2つのレクチンを含み得、前記2つのレクチンが混合物(UEA-I、GSL-I)であり、そのレクチンが重量比3：1の非等モル量、つまり1のGSL-Iに対して3のUEA-Iである。
【０２７２】
一実施形態において、本発明のキットは、2つのレクチンを含み得、前記2つのレクチンが混合物(UEA-I、GSL-I)であり、そのレクチンが重量比4：1の非等モル量、つまり1のGSL-Iに対して4のUEA-Iである。
【０２７３】
前述の本発明のキットは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される接合された少なくとも3つのレクチンを含み得、前記少なくとも2つの接合されたレクチンが等モル量である。
【０２７４】
一実施形態において、本発明のキットは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される3つのレクチンを含み得、前記3つのレクチンが等モル量である。
【０２７５】
一実施形態において、本発明のキットは、（UEA-I、ABA、ACA)、(UEA-I、ABA、ジャカリン)、(UEA-I、ABA、GSL-I)、(UEA-I、ABA、GSL-II)、(UEA-I、ACA、ジャカリン)、(UEA-I、ACA、GSL-I)、(UEA-I、ACA、GSL-II)、(UEA-I、ジャカリン、GSL-I)、(UEA-I、ジャカリン、GSL-II)、(UEA-I、GSL-I、GSL-II)、(ABA、ACA、ジャカリン)、(ABA、ACA、GSL-I)、(ABA、ACA、GSL-II)、(ABA、ジャカリン、GSL-I)、(ABA、ジャカリン、GSL-II)、(ABA、GSL-I、GSL-II)、(ACA、ジャカリン、GSL-I)、(ACA、ジャカリン、GSL-II)、（ACA、GSL-I、GSL-II)、(ジャカリン、GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA、ACA)、(TJA-II、ABA、ジャカリン)、(TJA-II、ABA、GSL-I)、(TJA-II、ABA、GSL-II)、(TJA-II、ACA、ジャカリン)、(TJA-II、ACA、GSL-I)、(TJA-II、ACA、GSL-II)、(TJA-II、ジャカリン、GSL-I)、(TJA-II、ジャカリン、GSL-II)、(TJA-II、GSL-I、GSL-II)の混合物から選択される３つのレクチンを含み得、前記3つのレクチンが等モル量である。
【０２７６】
一実施形態において、本発明のキットは、3つのレクチンを含み得、前記3つのレクチンがUEA-Iまたはその同族体TJA-IIとジャカリンとABAとの混合物、あるいはUEA-Iまたはその同族体TJA-IIとジャカリンとACAとの混合物から選択され、前記3つのレクチンの各々が混合物中に等モル量で存在している。
【０２７７】
一実施形態において、本発明のキットは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される少なくとも3つのレクチンを含み得、前記少なくとも3つのレクチンが非等モル量である。
【０２７８】
一実施形態において、本発明のキットは、レクチンUEA-Iまたはその同族体TJA-II、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-I1から選択される3つのレクチンを含み得、前記3つのレクチンが非等モル量である。
【０２７９】
一実施形態において、本発明のキットは、(UEA-I、ABA、ACA)、(UEA-I、ABA、ジャカリン)、(UEA-I、ABA、GSL-I)、(UEA-I、ABA、GSL-II)、(UEA-I、ACA、ジャカリン)、(UEA-I、ACA、GSL-I)、(UEA-I、ACA、GSL-II)、(UEA-I、ジャカリン、GSL-I)、(UEA-I、ジャカリン、GSL-II)、(UEA-I、GSL-I、GSL-II)、(ABA、ACA、ジャカリン)、(ABA、ACA、GSL-I)、(ABA、ACA、GSL-II)、(ABA、ジャカリン、GSL-I)、(ABA、ジャカリン、GSL-II)、(ABA、GSL-I、GSL-II)、(ACA、ジャカリン、GSL-I)、(ACA、ジャカリン、GSL-II)、(ACA、GSL-I、GSL-II)、(ジャカリン、GSL-I、GSL-II)、(TJA-II、ABA、ACA)、(TJA-II、ABA、ジャカリン)、(TJA-II、ABA、GSL-I)、(TJA-II、ABA、GSL-II)、(TJA-II、ACA、ジャカリン)、(TJA-II、ACA、GSL-I)、(TJA-II、ACA、GSL-II)、(TJA-II、ジャカリン、GSL-I)、(TJA-II、ジャカリン、GSL-II)、(TJA-II、GSL-I、GSL-II)の混合物から選択される3つのレクチンの混合物を含み得、前記3つのレクチンが前記混合物中で非等モル量であり、特に重量比2：1：1、1：2：1、または1：1：2である。
【０２８０】
別の観点において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の前、後、または同時に行われ得るステップ
c) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞が存在する場合および腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップであって、前記1つ以上の化学療法剤の投与が放射線治療および/または標的治療と併用し得るステップ
を含む方法に関する。
【０２８１】
ここで「癌幹細胞の有無の診断」とは、癌幹細胞の有無を診断する任意の試験という意味である。これには器官の構造が定義できるHES染色（Hematoxylin Eosin Safran）、分析された組織の細胞増殖指数を測定できるKI-67蛋白質標識、または腫瘍標識である癌胎児性抗原（CEA）標識からなる、古典的な解剖病理学的な分析が含まれる。
【０２８２】
ここで「呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を検出するステップ」とは、前述のように本発明の診断方法を実施するステップという意味である。
【０２８３】
ここで「標的治療」とは、受容体、遺伝子、またはタンパク質のような特異的な標的を同定することによる癌細胞を標的とする選択的治療という意味である。一般的に標的治療は治療不全の場合の第2または第3の選択治療として利用される。標的治療において推奨薬は以下の種類に属する薬である：
−抗VEGF、つまり血管内皮増殖因子を標的にする薬剤
−抗EGF、つまり上皮成長因子を標的にする薬剤抗
−抗ALKs、つまり「ALK」キナーゼ（未分化リンパ腫キナーゼ）を標的にする薬剤。
【０２８４】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の前、後、または同時に行われ得るステップ
c) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞が存在する場合および腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップ
を含む方法に関する。
【０２８５】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の前、後、または同時に行われ得るステップ
c) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞が存在する場合および腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップであって、前記1つ以上の化学療法剤の投与が放射線治療と関連しているステップ
を含む方法に関する。
【０２８６】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の後に行われるステップ
c) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞が存在する場合および腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップであって、前記1つ以上の化学療法剤の投与が放射線治療および/または標的治療と併用し得るステップ
を含む方法に関する。
【０２８７】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の後に行われるステップ
c) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞が存在する場合および腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップ
を含む方法に関する。
【０２８８】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の後に行われるステップ
c) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞が存在する場合および腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップであって、前記1つ以上の化学療法剤の投与が放射線治療と関連しているステップ
を含む方法に関する。
【０２８９】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)と同時に行われるステップ
c) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞が存在する場合および腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップであって、前記1つ以上の化学療法剤の投与が放射線治療および/または標的治療と併用し得るステップ
を含む方法に関する。
【０２９０】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)と同時に行われるステップ
c) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞が存在する場合および腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップ
を含む方法に関する。
【０２９１】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)と同時に行われるステップ
c) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞が存在する場合および腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップであって、前記1つ以上の化学療法剤の投与が放射線治療と関連しているステップ
を含む方法に関する。
【０２９２】
本発明の前記化学療法剤は、ビノレルビン(NavelbineTM)、シスプラチン、ゲムシタビン(GemzarTM)、カルボプラチン、パクリタキセル(TaxolTM)、ドセタキセル(TaxotereTM)、ペメトレキセド(AlimtaTM)、エルロチニブ(TarcevaTM)、ニボルマブ、またはベバシズマブ(Avastin)、あるいは2つずつの組合せから選択される。
【０２９３】
特定の実施形態では、使用される2つの化学療法剤は、ビノレルビン(NavelbineTM)とシスプラチン、ゲムシタビン(GemzarTM)とシスプラチン、ゲムシタビンGemzarTM)とカルボプラチン、パクリタキセル(TaxolTM)とシスプラチン、パクリタキセル(TaxolTM)とカルボプラチン、ドセタキセル(TaxotereTM)とシスプラチン、ドセタキセル(TaxotereTM)とカルボプラチン、またはペメトレキセド(AlimtaTM)とシスプラチンである。
【０２９４】
別の観点において、発明は、呼吸に関与する器官の癌を予防するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の前、後、または同時に行われ得るステップ
c) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞が存在する場合および腫瘍病変が存在しない場合での、ステップa)で検出される呼吸に関与する器官の癌幹細胞の進行の経過観察を設定するステップ
を含む方法に関する。
【０２９５】
ここで「呼吸に関与する器官の癌幹細胞の進展の経過観察」とは、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の検出ができるか、または本発明のフコースα 1-2 ガラクトース基、より詳細にはフコースα 1-2 ガラクトースβ 1-4 N-アセチルグルコサミン基を特異的に認識するレクチンを用いる、呼吸に関与する器官の癌幹細胞の新たな標識付けを伴う新たな生検を行う、上記の予防方法の新たな実施という意味である。この経過観察は、悪性度の原因である呼吸に関する器官の癌幹細胞の退縮、または不在および/または量を観察するために、上記のような化学療法剤、放射線治療および/または標的治療を用いる種々の治療の後に実施されるであろう。この検出により、経過観察および/または実施すべき治療を正確に方向付けることが可能となり、これは患者のための個人向けの方法となる。
【０２９６】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を予防するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の後に行われるステップ
c) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞が存在する場合および腫瘍病変が存在しない場合での、ステップa)で検出される呼吸に関与する器官の癌幹細胞の進行の経過観察を設定するステップ
を含む方法に関する。
【０２９７】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を予防するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)と同時に行われるステップ
c) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞が存在する場合および腫瘍病変が存在しない場合での、ステップa)で検出される呼吸に関与する器官の癌幹細胞の進行の経過観察を設定するステップ
を含む方法に関する。
【０２９８】
別の態様において、発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の前、後、または同時に行われ得るステップ
c)腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップであって、前記1つ以上の化学療法剤の投与が放射線治療および/または標的治療と併用し得るステップ
を含む方法に関する。
【０２９９】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の前、後、または同時に行われ得るステップ
c)腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップ
を含む方法に関する。
【０３００】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の後に行われるステップ
c)腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップであって、前記1つ以上の化学療法剤の投与が放射線治療と関連しているステップ
を含む方法に関する。
【０３０１】
実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の前、後、または同時に行われ得るステップ
c)腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップであって、前記1つ以上の化学療法剤の投与が放射線治療および/または標的治療と併用し得るステップ
を含む方法に関する。
【０３０２】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の後に行われるステップ
c)腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップ
を含む方法に関する。
【０３０３】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)の後に行われるステップ
c)腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップであって、前記1つ以上の化学療法剤の投与が放射線治療と関連しているステップ
を含む方法に関する。
【０３０４】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)と同時に行われるステップ
c)腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップであって、前記1つ以上の化学療法剤の投与が放射線治療および/または標的治療と併用し得るステップ
を含む方法に関する。
【０３０５】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)と同時に行われるステップ
c)腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップ
を含む方法に関する。
【０３０６】
一実施形態において、本発明は、呼吸に関与する器官の癌を治療するための、以下のステップ：
a) 呼吸に関与する器官での腫瘍病変の有無を検出するステップ、
b) 呼吸に関与する器官の癌幹細胞の有無を診断するステップであって、前記癌幹細胞の有無を診断するステップ(b)が、腫瘍病変の有無を検出するステップ(a)と同時に行われるステップ
c)腫瘍病変が存在する場合、呼吸に関与する器官の癌を治療するための1つ以上の化学療法剤を投与するステップであって、前記1つ以上の化学療法剤の投与が放射線治療と関連しているステップ
を含む方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【０３０７】
【図１】図1は、ストレプトアビジンが移植され、ビオチン化UEA-I (UEA-I レクチン)、ビオチン化ABA (ABA レクチン)、ビオチン化ACA (ACA レクチン)、ビオチン化ジャカリン (ジャカリン レクチン)、ビオチン化GSL-I (GSL-I レクチン)、ビオチン化GSL-II (GSL-II レクチン)、さらにビオチン化レクチンUEA-I/ジャカリン/ABAの混合物（混合物１：当モル量のUEA-I、ジャカリン、ABA）、ビオチン化レクチンUEA-I/ジャカリン/ACAの混合物（混合物２：当モル量のUEA-I、ジャカリン、ACA）、ビオチン化レクチンGSL-I/GSL-IIの混合物（混合物３：当モル量のGSL-IおよびGSL-II）、ビオチン化レクチンUEA-I/GSL-Iの混合物（混合物４：等モル量のUEA-IおよびGSL-I）、ビオチン化レクチン2UEA-I/GSL-Iの混合物（混合物５：非等モル量のUEA-IおよびGSL-I、UEA-IはGSL-Iの2倍の量）、ビオチン化レクチン3UEA-1/GSL-Iの混合物（混合物６：非等モル量のUEA-IおよびGSL-I、UEA-IはGSL-Iの3倍の量）、およびビオチン化レクチン4UEA-I/GSL-Iの混合物（混合物７：非等モル量のUEA-IおよびGSL-I、UEA-IはGSL-Iの4倍の量）である磁気ビーズの使用後に、上皮細胞接着分子（Epcam） high + /Epcam high - の比率を用いて同定された、株A549からの細胞試料における呼吸器癌の主要例である肺癌幹細胞の分離の結果を示す。
【図２Ａ】図2は、等モル量のUEA-I/GSL-Iの混合物により標識付けされた、呼吸器癌の主要例である肺起源の2つの腫瘍組織の画像を示し、2人の異なる患者からである（上の画像2Aは第一の患者のものであり、下の画像2Bは第二の患者のものである）。画像2Bは、レクチンUEA-I/GSL-Iの混合物により簡易に標識付けされた腫瘍細胞を表し、この容易に扱える（sweet）標的の存在を標識付けする暗色の標識（細胞の周囲の暗色、矢印を参照）を有する相当な数の肺癌幹細胞を示す。逆に画像2Aでは全く逆になっている。このことから悪性度の基準は、基底部において同じ病理の患者に対して、UEA-I/GSL-Iレクチンの混合物のおかげにより、癌幹細胞のみを標的にする標識付けの特異性により規定される。
【図２Ｂ】図2は、等モル量のUEA-I/GSL-Iの混合物により標識付けされた、呼吸器癌の主要例である肺起源の2つの腫瘍組織の画像を示し、2人の異なる患者からである（上の画像2Aは第一の患者のものであり、下の画像2Bは第二の患者のものである）。画像2Bは、レクチンUEA-I/GSL-Iの混合物により簡易に標識付けされた腫瘍細胞を表し、この容易に扱える（sweet）標的の存在を標識付けする暗色の標識（細胞の周囲の暗色、矢印を参照）を有する相当な数の肺癌幹細胞を示す。逆に画像2Aでは全く逆になっている。このことから悪性度の基準は、基底部において同じ病理の患者に対して、UEA-I/GSL-Iレクチンの混合物のおかげにより、癌幹細胞のみを標的にする標識付けの特異性により規定される。
【図３Ａ】図3は、等モル量のUEA-I/GSL-Iの混合物によって標識付けされた、呼吸器（Aは舌、Bは喉頭、Cは鼻）に属する組織のパネルを示す。レクチン混合物UEA-I/GSL-Iによって標識付けされた腫瘍組織の対応する画像は、癌幹細胞の存在を示す暗色の標識（細胞の周囲の暗色、矢印を参照）を有する相当な数の癌幹細胞を示す。このことから、肺と同様に悪性度の基準は、呼吸器に影響する癌の患者に対して、等モル量のレクチンUEA-I/GSL-Iの混合物のおかげにより、癌幹細胞のみを標的にする標識付けの特異性により規定される。
【図３Ｂ】図3は、等モル量のUEA-I/GSL-Iの混合物によって標識付けされた、呼吸器（Aは舌、Bは喉頭、Cは鼻）に属する組織のパネルを示す。レクチン混合物UEA-I/GSL-Iによって標識付けされた腫瘍組織の対応する画像は、癌幹細胞の存在を示す暗色の標識（細胞の周囲の暗色、矢印を参照）を有する相当な数の癌幹細胞を示す。このことから、肺と同様に悪性度の基準は、呼吸器に影響する癌の患者に対して、等モル量のレクチンUEA-I/GSL-Iの混合物のおかげにより、癌幹細胞のみを標的にする標識付けの特異性により規定される。
【図３Ｃ】図3は、等モル量のUEA-I/GSL-Iの混合物によって標識付けされた、呼吸器（Aは舌、Bは喉頭、Cは鼻）に属する組織のパネルを示す。レクチン混合物UEA-I/GSL-Iによって標識付けされた腫瘍組織の対応する画像は、癌幹細胞の存在を示す暗色の標識（細胞の周囲の暗色、矢印を参照）を有する相当な数の癌幹細胞を示す。このことから、肺と同様に悪性度の基準は、呼吸器に影響する癌の患者に対して、等モル量のレクチンUEA-I/GSL-Iの混合物のおかげにより、癌幹細胞のみを標的にする標識付けの特異性により規定される。
【実施例】
【０３０８】
実施例1：呼吸器癌の重要な例である肺癌幹細胞の単離のためのプロトコール
I.必要とされる材料
試薬および機器
−肺癌幹細胞を特異的に標識付けする個別のビオチン化レクチンまたはビオチン化レクチンの混合物（Vector Laboratories社の個別のレクチンから調製された）
−DNA結合によりストレプトアビジンに連結された磁気ビーズを含むキットCELLection  Biotin Binder（Invitrogen社）
−磁石
緩衝剤
−リン酸緩衝生理食塩水（PBS）およびEDTAを含むVersene（Invitrogen社）
−緩衝液１：0.1% BSA（ウシ血清アルブミン）のPBS（Ca2+およびMg2+の無いリン酸緩衝生理食塩水）、ｐH7.4 
−緩衝液2：0.1% BSA（ウシ血清アルブミン）および0.6%クエン酸ナトリウムのPBS（Ca2+およびMg2+の無いリン酸緩衝生理食塩水）
−緩衝液3：1%（ウシ胎児血清）、1mMのCal2および5mMのMgCl2のRPMI1640、pH7.0〜7.4
【０３０９】
II.実験の所要時間
−細胞の調製に20分
−細胞の標識付けに20分
−ビーズで標識付けされた細胞のインキュベーションに20分
−CSCsで強化されない懸濁液の回収に10分
−CSC／ビーズの結合を壊すのに15分
−目的のCSCsで強化された懸濁液の回収に5分
−合計時間は1時間30分
【０３１０】
III. 磁気選別作動モード
1.細胞の調製。株A549（肺癌患者の試料からの不死化肺癌株）の細胞は、37℃で10分間バーゼン液（Versene solution）を用いて支持体から持ち上げられる。
2.細胞は計数され、試料中の細胞数は1.107に調整される。
3.細胞懸濁液は300gで10分間遠心分離され、次にその上清は取り除かれる。
4.非特異部位のブロック。1mLの緩衝液２を加える。
5.細胞の標識付け。複数個のレクチンの場合、各々の量が同一になるように合計量が10μgのレクチンが添加される。
このことから、
−UEA-I、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-IおよびGSL-IIから選択される10μgの個別のビオチン化レクチン、または
−混合物1(UEA-I/ABA/ジャカリン)のために各レクチンが3.33μg、または
−混合物2(UEA-I/ACA/ジャカリン)のために各レクチンが3.33μg、または
−混合物3(GSL-I/GSL-II) のために各レクチンが5μg、または
−混合物4(UEA-I/GSL-I) のために各レクチンが5μg、または
−混合物5のために6.66μgのUEA-Iと3.33μgのGSL-I、または
−混合物6のために7.5μgのUEA-Iと2.5μgのGSL-I、または
−混合物7のために8μgのUEA-Iと2μgのGSL-I
が添加される。
得られた混合物は、4℃で10分間インキュベートされる。
6.細胞の洗浄のために500μLの緩衝液2を添加し、その懸濁液は300gで10分間遠心分離され、次に上清は取り除かれる。
7.ビーズの追加。細胞は1ｍLの緩衝液2で再度懸濁され、次に予め洗浄したストレプトアビジンに連結された磁気ビーズ25μLを加え、緩衝液1を用いて再度懸濁される。混合物は静かに撹拌しながら4℃で20分間インキュベートされる。
8.CSCsで強化されていない懸濁液の回収。次に試験管を2分間、磁石の上に置く。ビオチン化レクチンにより標識付けされ、ストレプトアビジンに連結された磁気ビーズと結合している細胞は、磁石に引かれて沈殿（磁気細胞選別）し、次いで標識付けされていない細胞から分離される。続けて標識付けされていない細胞を含む上清は、磁石上に置かれた試験管を保持することにより取り除かれ、ファルコン（Falcon）チューブに保存される。
9.次に標識付けされた癌幹細胞を含む試験管を磁石からはずし、1mLの緩衝液1を加え、ステップ8のように同じファルコンに再度上清を保管する前に、試験管を渦動し、磁石上に2分間戻す。このステップを2回繰り返す。
10.標識付けされた癌幹細胞はまだ磁気ビーズに付着しており、37℃に予熱された200μｌの緩衝液3を用いて再度懸濁される。DNaseIで構成される細胞/ビーズ結合の切断緩衝液4μLが添加される。この混合物は静かに撹拌しながら室温で15分間インキュベートされる。
11.懸濁液は細胞の放出を促進するために、ピペットで5回から10回勢いよく振盪する。
12.CSCsを用いて強化された懸濁液の回収。試験管を2分間磁石上に置く。次に磁気ビーズは標識付けされた癌幹細胞から分離され、標識付けされた癌幹細胞を含む上清は、37℃に予熱された200μLの緩衝液3を含む試験管の中に移す。収率を高めるためにステップ11とステップ12は再度繰り返すことができる。
【０３１１】
実験は同様の条件下で、個別のビオチン化レクチン（UEA-I、ABA、ACA、ジャカリン、GSL-I、GSL-II）、2つのビオチン化レクチンの混合物(GSL-I/GSL-II = 混合物3 ; UEA-I/GSL-I = 混合物4；2UEA-I/GSL-I = 混合物5；3UEA-I/GSL-I = 混合物6；4UEA-I/GSL-I = 混合物7）または3つのビオチン化レクチン（UEA-I/ABA/ジャカリン = 混合物1；UEA-I/ACA/ジャカリン = 混合物2）のそれぞれと実施した。
【０３１２】
これらの異なる試験結果を図1に示す。肺試料は呼吸器に属する癌幹細胞の特性を明らかにするために使用されることに留意されたい。これらの試験の結果が示すように、等モル量の混合物UEA-I/GSL-Iの使用により、肺癌幹細胞の単離が可能になり、より広範には呼吸器についての単離であり、これが卓越した方法である。
【０３１３】
良好な結果はまた、レクチンGSL-II単独、レクチンUEA-I単独、および混合物3（等モル量のレクチンGSL-I/GSL-IIの混合物からなる）、混合物5（2：1の非等モル量のレクチンUEA-IとレクチンGSL-Iの混合物からなる）、混合物6（3：1の非等モル量のレクチンUEA-IとレクチンGSL-Iの混合物からなる）を用いても得られる。
【０３１４】
加えて喉頭、咽頭、口、鼻、喉、舌、副鼻腔、気管、唾液腺（扁桃腺および耳下腺）からの癌幹細胞の単離は、実施例１に記載のプロトコールに従って実施された。得られた結果は肺癌幹細胞の単離の後に得られた結果と一致する。
【０３１５】
実施例2：クローン形成能試験
クローン形成能試験の目的は、球体を再構成（患者における腫瘍塊の再構成に相当）する細胞の能力、従って増殖能力の観察である。
本実施例においてクローン形成能試験は、肺癌幹細胞の存在を確認するために、および本発明に記載の単離方法による肺癌幹細胞の単離の後に試料中の前記細胞を定量するために使用される。このことからこの方法に従わない対照試料（選別されていない細胞）と比べると、本発明の単離方法の有効性を示すことができる。
【０３１６】
クローン形成能試験は、50ユニット/ｍLのペニシリン、50ユニット/ｍLのストレプトマイシン（Gibco）と2.4g／Lの重炭酸ナトリウム、１MのHEPES緩衝液（Sigma Aldrich, Saint-Quentin-Fallavier、フランス）、１Xのプロゲステロン（Sigma Aldrich）、１Xのプトレシン（Sigma）、0.025g/ｍLのヘパリン（Sigma Aldrich）、30% (m/v)のグルコース（Sigma Aldrich）、１Xの成長補足剤B27（Invitrogen, Carlsbad, CA）、20 ng/mLのEGF（Sigma Aldrich）、20 ng/mLの塩基性ヒトFGF（Sigma Aldrich）、１Xのインスリン-トランスフェリン亜セレン酸ナトリウム補足剤（Roche diag混合物UEA-I/GSL-Istics、Meylan、フランス）で補足されたDMEM組成培地（Gibco）で、500細胞/cm2の濃度にて6ウエルプレートで実施された。
【０３１７】
コロニーの進化が3週間CO2雰囲気中にて37℃のインキュベーション後に観察され、ImageJ(R)ソフトウエアを用いて定量された。
【０３１８】
呼吸に関与する器官の癌からの癌幹細胞は、対照とは違って、球体の発達へ導く本発明に記載の強化方法から単離される。これは、ビオチン化UEA-I (UEA-I レクチン)、ビオチン化ABA (ABA レクチン)、ビオチン化ACA (ACA レクチン)、ビオチン化ジャカリン (ジャカリン レクチン)、ビオチン化GSL-I (GSL-I レクチン)、ビオチン化GSL-II(GSL-II レクチン)、ビオチン化レクチンUEA-I/ジャカリン/ABAの混合物（混合物1：等モル量のUEA-I、ジャカリン、ABA）、ビオチン化レクチンUEA-I/ジャカリン/ACAの混合物（混合物2：等モル量のUEA-I、ジャカリン、ACA）、およびビオチン化レクチンGSL-I/GSL-IIの混合物（混合物3：等モル量のGSL-IおよびGSL-II）、ビオチン化レクチンUEA-I/GSL-Iの混合物（混合物4：等モル量のUEA-IおよびGSL-I）、ビオチン化レクチン2UEA-I/GSL-Iの混合物（混合物5：非等モル量のUEA-IおよびGSL-I、UEA-IはGSL-Iの量の2倍）、ビオチン化レクチン3UEA-I/GSL-Iの混合物（混合物6：非等モル量のUEA-IおよびGSL-I、UEA-IはGSL-Iの量の3倍）、およびビオチン化レクチン4UEA-I/GSL-Iの混合物（混合物7：非等モル量のUEA-IおよびGSL-I、UEA-IはGSL-Iの量の4倍）により明確に選別された細胞に対して、対照として選別されていない細胞（T-）を使用しているクローン形成能試験である。このことから本発明の方法は、腫瘍を改善できる幹細胞を得ることが可能にする（結果は表示していない）。
【０３１９】
実施例3：ワックス処理された組織切片上でのレクチンの可視標識付け：肺癌の例
使用機器：パラフィンブロック、氷、ミクロトーム、Superfrost(R)ブレード、コンピュータ付きのBond Max Automate(Leica Microsystems)、Leicaの消耗品（アルコール、洗浄緩衝液、ERI緩衝液、脱ワックス緩衝液、標識、カバースリップ、試験管）、5%のPBS-BSA緩衝液、ビオチン化レクチン（UEA-I、ジャカリン、ABA、ACA、GSL-I、GSL-II）（Vector Lab）、Kit Bond Intense R detection (Leica)、Leicaの封入剤、スライド、および顕微鏡。
【０３２０】
ミクロトーム切片を5μmの厚さにするために、番号（病理解剖学部門によって与えられた）で同定される患者それぞれからの肺癌試料を含むパラフィンブロックは、冷却するために約1時間氷上に置かれた。
【０３２１】
組織切片を最大限に接着する、いわゆる「スーパーフロスト」スライドは、ブロック上にある番号と同じ番号で同定される。水滴はこれらのスライドそれぞれの中央に置かれた。
【０３２２】
切片はミクロトームを用いて作られ、先に落とした水滴上に置かれる。次にそのスライドは接着を促進するために37℃の熱プレートに置かれ、過剰な水は除かれた。作られたスライドすべて、乾燥させるために37℃のオーブンに入れられた。
【０３２３】
次のステップでは、自動装置を制御するソフトウエアが入っているコンピュータに接続されたLeicaのBond Max Automatonの使用である。
【０３２４】
スライドがオーブン内にある間、そのプロセスを実施するのに必要な生成物それぞれの自動装置のレベルを点検するのを初めとして、自動装置を制御するソフトウエアにある番号と同じスライドの番号との確認などの、全ての免疫組織化学的標識付けプロセスが準備された。標準化されたプロトコールを可能にする標識が作られた。レクチンの希釈とその量は計算され、必要なキットが準備された。使用された生成物はスキャンされるべきであり、またそれぞれの実験の実施前にレベルをリセットすることに留意されるべきである。
【０３２５】
続けて標識はオーブンの出口にある対応するスライドに付着され、またその接触特性により実験中のスライドの全表面に生成物が均一に分布している切片上にある、プラスチック要素であるカバースリップはそれぞれのスライド上に置かれた。
【０３２６】
スライドホルダーは自動装置に置かれ、読取装置がそれぞれの要素を認識して、スライドが標識のバーコードで同定された後に操作が開始された。
【０３２７】
Leicaのロウ除去製品を使用して加熱によるロウ除去から始まり、その後に抗体への近接が可能になる。このステップは別のステップと同様に、前もって希釈されたBond Wash 10Xによる3回の洗浄が続いた。
【０３２８】
このステップの後に、ｐH = 6のクエン酸緩衝液（LeicaのERI緩衝液）による5分間の前処理が続き、この簡易な標識付けの一環として抗原を明らかにすることが可能に、つまりアクセスが可能になる。
【０３２９】
PBS BSA-5%希釈剤を使用している80分の1のビオチン化レクチンUEA-Iと200000分の１のビオチン化レクチンGSL-1は、20分間同時に切片上に置かれた。
【０３３０】
二次抗体の役割を果たすストレプトアビジン−HRPの介入のおかげで、Bond Intense R detection（Leica）キットはその特性を通じて、ビオチン/ストレプトマイシン‐HRP複合体を明らかにするHRP酵素（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）の基質であるDABの特性のおかげで、暗色のこれらビオチン化レクチンを明らかにすることができた。
【０３３１】
全ての試料を同定可能にするために、ヘマトキシリンを使用する青色とは逆の着色ステップが7分間行われた。
【０３３２】
スライドは自動装置から取り除かれた。次に切片は手動によりアルコール浴に5分間を2回浸して再加水された。この再加水のステップの後に、同様に5分間のトルエン浴が行われた。
【０３３３】
次にブレードは封入剤（Leica）の滴下により取付けられる。
【０３３４】
最後にスライドは顕微鏡にて観測され、画像は20倍で撮影された。
【０３３５】
その結果を図2Aと図2Bに示す。
【０３３６】
得られた結果は、肺腫瘍組織からの癌幹細胞を選択的に標識付けする、発明のレクチンの能力を強調する。
【０３３７】
ビオチン化レクチンUEA-I/GSL-Iの等モル量の混合物による2つの肺腫瘍細胞の簡易な標識付けは、同じ病理で全く異なる悪性度の基準を示していても、その組織の観察を可能にする。
【０３３８】
確かに癌幹細胞を標的とする本発明の標識の特異性は、画像2Aに示される第一の患者の肺腫瘍組織の観察において完全な陰性を示す（細胞の周囲に暗色が存在しない）一方、第二の患者の肺腫瘍組織の観察において強い陽性（細胞の周囲の暗色、矢印を参照）が認められるので、ここでは十分に強調される（図2B）。増大した悪性度（癌幹細胞の存在による）は患者を診療する際には考慮に入れなければならない。
【０３３９】
実施例4：ワックス処理された組織切片上でのレクチンを用いた可視標識付け：喉頭癌の例
この実施例は、等モル量のUEA-I/GSL-I混合物による喉頭腫瘍組織の標識付けを示す。標識付けは実施例3に記載のプロトコールに基づき実施された。
【０３４０】
得られた結果は、喉頭腫瘍組織の癌幹細胞を選択的に標識付けする、発明のレクチンの能力を強調する。
【０３４１】
確かに、図3Bは喉頭腫瘍組織の観察の際の非常に強い陽性（細胞の周囲の暗色、矢印を参照）を示す。増大した悪性度（癌幹細胞の存在による）は患者を診療する際には考慮に入れなければならない。
【０３４２】
実施例5：ワックス処理された組織切片上でのレクチンを用いた可視標識付け：鼻の癌の例
この実施例は、等モル量の混合物UEA-I/GSL-Iによる鼻からの腫瘍組織の標識付けを示す。標識付けは実施例3に記載のプロトコールに基づき実施された。
【０３４３】
得られた結果は、鼻からの腫瘍組織の癌幹細胞を選択的に標識付けする、発明のレクチンの能力を強調する。
【０３４４】
確かに、図3Cは鼻からの腫瘍組織の観察の際の非常に強い陽性（細胞の周囲の暗色、矢印を参照）を示す。増大した悪性度（癌幹細胞の存在による）は患者を診療する際には考慮に入れなければならない。
【０３４５】
実施例6：ワックス処理された組織切片上でのレクチンを用いた可視標識付け：舌癌の例
この実施例は、等モル量の混合物UEA-I/GSL-Iによる舌からの腫瘍組織の標識付けを示す。標識付けは実施例3に記載のプロトコールに基づき実施された。
【０３４６】
得られた結果は、舌からの腫瘍組織の癌幹細胞を選択的に標識付けする、発明のレクチンの能力を強調する。
【０３４７】
確かに、図3Aは舌からの腫瘍組織の観察の際の非常に強い陽性（細胞の周辺の暗色、矢印参照）を示す。増大した悪性度（癌幹細胞の存在による）は患者を診療する際には考慮に入れなければならない。
【０３４８】
実施例7：ワックス処理された組織切片上でのレクチンを用いた可視標識付け：咽頭癌の例
この実施例は、等モル量の混合物UEA-I/GSL-Iによる咽頭からの腫瘍組織の標識付けを示す。標識付けは実施例3に記載のプロトコールに基づき実施された。
【０３４９】
得られた結果は、咽頭からの腫瘍組織の癌幹細胞を選択的に標識付けする、発明のレクチンの能力を強調する。
【０３５０】
実施例8：ワックス処理された組織切片上でのレクチンを用いた可視標識付け：口腔癌の例
この実施例は、等モル量の混合物UEA-I/GSL-Iによる口からの腫瘍組織の標識付けを示す。標識付けは実施例3に記載のプロトコールに基づき実施された。
【０３５１】
得られた結果は、口からの腫瘍組織の癌幹細胞を選択的に標識付けする、発明のレクチンの能力を強調する。
【０３５２】
実施例9：ワックス処理された組織切片上でのレクチンを用いた可視標識付け：咽喉癌の例
この実施例は、等モル量の混合物UEA-I/GSL-Iによる喉からの腫瘍組織の標識付けを示す。標識付けは実施例3に記載のプロトコールに基づき実施された。
【０３５３】
得られた結果は、喉からの腫瘍組織の癌幹細胞を選択的に標識付けする、発明のレクチンの能力を強調する。
【０３５４】
実施例10：ワックス処理された組織切片上でのレクチンを用いた可視標識付け：気管癌の例
この実施例は、等モル量の混合物UEA-I/GSL-Iによる気管からの腫瘍組織の標識付けを示す。標識付けは実施例3に記載のプロトコールに基づき実施された。
【０３５５】
得られた結果は、気管からの腫瘍組織の癌幹細胞を選択的に標識付けする、発明のレクチンの能力を強調する。
【０３５６】
実施例11：ワックス処理された組織切片上でのレクチンを用いた可視標識：副鼻腔癌の例
この実施例は、等モル量の混合物UEA-I/GSL-Iによる副鼻腔からの腫瘍組織の標識付けを示す。標識付け付けは実施例3に記載のプロトコールに基づき実施された。
【０３５７】
得られた結果は、副鼻孔からの腫瘍組織の癌幹細胞を選択的に標識付けする、発明のレクチンの能力を強調する。
【０３５８】
実施例12：ワックス処理された組織切片上でのレクチンを用いた可視標識付け：扁桃腺癌の例（唾液腺癌の例）
この実施例は、等モル量の混合物UEA-I/GSL-Iによる扁桃腺からの腫瘍組織の標識付けを示す。標識付けは実施例3に記載のプロトコールに基づき実施された。
【０３５９】
得られた結果は、扁桃腺からの腫瘍組織の癌幹細胞を選択的に標識付けする、発明のレクチンの能力を強調する。
【０３６０】
実施例13：ワックス処理された組織切片上でのレクチンを用いた可視標識付け：耳下腺癌の例（唾液腺癌の例）
この実施例は、等モル量の混合物UEA-I/GSL-Iによる耳下腺からの腫瘍組織の標識付けを示す。標識付けは実施例3に記載のプロトコールに基づき実施された。
【０３６１】
得られた結果は、耳下腺からの腫瘍組織の癌幹細胞を選択的に標識付けする、発明のレクチンの能力を強調する。
【０３６２】
実施例3〜実施例13は、ビオチン化UEA-I/GSL-Iレクチンの当モル量の混合物による呼吸器に属する腫瘍組織の簡易な標識付けは、同じ病理を有する組織が全く異なる悪性度の基準を示すかもしれないことを観察できるようにし、種々の癌病理学のこれらのケースにおいて、特に呼吸器に属するケースでは、増大した悪性度は患者を診療する際には考慮に入れなければならない。
【図１】
2020523612.tif 000002
【図２Ａ】
2020523612.tif 000003
【図２Ｂ】
2020523612.tif 000004
【図３Ａ】
2020523612.tif 000005
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
2020523612.tif 000007
【国際調査報告】
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