(57)【要約】【課題】本発明は、エボラウイルス阻害剤の調製におけるベルバミン二塩酸塩の使用を開示する。【解決手段】本発明では、エボラウイルス活性化エンベロープ糖タンパク質（ＥＢＯＶ−ＧＰｃｌ）を標的として使用し、ＥＢＯＶ−ＧＰｃｌに結合する能力を有する抗ウイルス活性化合物を、構造に基づく仮想スクリーニングにより取得し、該化合物はベルバミン二塩酸塩である。ベルバミン二塩酸塩は、標的タンパク質ＥＢＯＶ−ＧＰｃｌに結合することによりエボラ組換えウイルスの侵入を特異的に阻害し、エボラウイルス感染に抵抗する効果を達成できる。抗ＥＢＯＶのベルバミン二塩酸塩の半最大効果濃度（ＥＣ５０）は０．４９μＭであり、ベルバミン二塩酸塩はＥＢＯＶに対して強い阻害効果があることを示す。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｕ１又はＵ２であることを特徴とする、ベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩の使用。
Ｕ１．ウイルス阻害剤の調製におけるベルバミン二塩酸塩又は薬学的に許容されるその塩の使用であって、前記ウイルスは、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスである。
Ｕ２．ウイルス阻害におけるベルバミン二塩酸塩又は薬学的に許容されるその塩の使用であって、前記ウイルスは、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスである。
【請求項２】
前記ウイルスは、フィロウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルス、例えばエボラウイルス、マールブルグウイルス及び／又はラッサウイルスであることを特徴とする、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
Ｕ３又はＵ４であることを特徴とする、ベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩の使用。
Ｕ３．ウイルス性出血熱の治療及び／又は予防のための製品の調製におけるベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩の使用であって、前記ウイルス性出血熱は、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスによって引き起こされる疾患である。
Ｕ４．ウイルス性出血熱の治療及び／又は予防におけるベルバミン二塩酸塩又は薬学的に許容されるその塩の使用であって、前記ウイルス性出血熱は、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスによって引き起こされる疾患である。
【請求項４】
前記ウイルス性出血熱は、エボラ出血熱、マールブルグ出血熱及び／又はラッサ熱であることを特徴とする、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
ウイルス活性化エンベロープ糖タンパク質と結合する製品の調製におけるベルバミン二塩酸又はその薬学的に許容される塩の使用。
【請求項６】
前記ウイルスは、フィロウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルス、例えばエボラウイルス、マールブルグウイルス及び／又はラッサウイルスであることを特徴とする、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
ベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩であることを特徴とする、医薬化合物。
【請求項８】
前記医薬化合物は、動物のウイルス感染を阻害するために用いられ、前記ウイルスは、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスであることを特徴とする、請求項７に記載の医薬化合物。
【請求項９】
受容体動物にベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩を投与することによって動物のウイルス感染を阻害することを含み、
前記ウイルスは、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスである、動物のウイルス感染を阻害する方法。
【請求項１０】
受容体動物にベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩を投与してウイルス性出血熱の治療及び／又は予防を行うことを含み、
前記ウイルス性出血熱は、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスによって引き起こされる疾患である、ウイルス性出血熱の治療及び／又は予防方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年８月１日に中国特許庁に出願され、出願番号２０１８１０８６３８０９．５、発明の名称「エボラウイルス阻害剤の調製におけるベルバミン二塩酸塩の使用」の中国特許出願の優先権を主張し、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、ベルバミン二塩酸塩の使用に関し、特にエボラウイルス阻害剤の調製におけるベルバミン二塩酸塩の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
ウイルス性出血熱は、ウイルスによって引き起こされる自然な流行病のグループであり、発熱、出血、ショックが主な臨床的特徴である。このような病気は世界中に広く分布しており、臨床症状はより重症であり、死亡率は高く、現在、世界で十数種類が発見されている。一般的なウイルス性出血熱は、エボラ出血熱、マールブルグ出血熱、ラッサ熱、クリミア・コンゴ出血熱、リフトバレー熱、デング出血熱、黄熱病及び天然痘等を含む。
【０００４】
エボラ出血熱（エボラウイルス病）は、フィロウイルス科のエボラウイルス（Ｅｂｏｌａ  ｖｉｒｕｓ、ＥＢＯＶ）によって引き起こされる急性出血性感染症で、死亡率は９０％と高く、これは人間にとって最も致命的なウイルス感染症の一つである。ＥＢＯＶは５つの種に分けられ、つまりザイール型（Ｚａｉｒｅ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ、ＺＥＢＯＶ）、スーダン型（Ｓｕｄａｎｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ、ＳＵＤＶ）、タイフォレスト型（Ｔａｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ，ＴＡＦＶ）、ブンディブギョ型（Ｂｕｎｄｉｂｕｇｙｏｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ、ＢＤＢＶ）及びレストン型（Ｒｅｓｔｏｎ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ、ＲＥＳＴＶ）である。そのうち、ザイール型エボラウイルスは最も病原性がある。
【０００５】
マールブルグ出血熱は、マールブルグウイルス（Ｍａｒｂｅｒｇ  ｖｉｒｕｓ、ＭＡＲＶ）によって引き起こされる急性発熱性疾患であり、重度の出血症状がある。それはエボラ出血熱と同じファミリーに属し、いずれも非常に致命的な感染症である。マールブルグウイルスとエボラウイルスは、フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）の糸状ウイルス（Ｆｉｌｏｖｉｒｕｓ）属に属する。
【０００６】
ラッサ熱は、ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）によって引き起こされ、げっ歯類をホストとして伝染する急性感染症である。ラッサウイルスは、アレナウイルス科（Ａｒｅｎａｖｉｒｉｄａｅ）のマンマレナウイルス（Ｍａｍｍａｒｅｎａｖｉｒｕｓ）属に属する。
【０００７】
エンベロープ糖タンパク質（Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＰ）とは、ウイルス自体によってエンコードされ、ウイルスの外層にコーティングされている糖タンパク質のことである。ＧＰは、ウイルスの吸着と宿主細胞への浸透、病原性、宿主細胞表面タンパク質発現のダウンレギュレーション及びウイルスの組み立てと出芽の増加中に重要な役割を果たす多機能タンパク質である。
【０００８】
現在では、対症療法と支持療法が主にウイルス性出血熱に使用されており、体系的で臨床的に証明された効果的な特定の治療薬やワクチンはない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明が解決しようとする技術的課題は、エボラウイルス、マールブルグウイルス及び／又はラッサウイルスなどのウイルス性出血熱を引き起こすウイルスをいかに阻害するかである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
以上の技術的課題を解決するために、本発明はベルバミン二塩酸塩の用途を提供する。
【００１１】
ベルバミン二塩酸塩の構造式は図１に示すとおり、そのＣＡＳ登録番号は６０７８−１７−７である。
【００１２】
本発明によって提供されるベルバミン二塩酸塩の用途は、Ｕ１からＵ５までのいずれか一種であり、
Ｕ１．ウイルス阻害剤の調製におけるベルバミン二塩酸塩又は薬学的に許容されるその塩の使用であって、前記ウイルスは、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスであってもよく；
Ｕ２．ウイルス阻害におけるベルバミン二塩酸塩又は薬学的に許容されるその塩の使用であって、前記ウイルスは、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスであってもよく；
Ｕ３．ウイルス性出血熱の治療及び／又は予防のための製品（例えば薬物、ワクチン又は薬物製剤）の調製におけるベルバミン二塩酸塩又は薬学的に許容されるその塩の使用であって、前記ウイルス性出血熱は、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスによって引き起こされる疾患であってもよく；
Ｕ４．ウイルス性出血熱の治療及び／又は予防におけるベルバミン二塩酸塩又は薬学的に許容されるその塩の使用であって、前記ウイルス性出血熱は、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスによって引き起こされる疾患であってもよく；
Ｕ５．ウイルス活性化エンベロープ糖タンパク質と結合する製品（例えば薬物、ワクチン又は薬物製剤）の調製におけるベルバミン二塩酸塩又は薬学的に許容されるその塩の使用である。
【００１３】
上記用途において、前記ウイルスは、フィロウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルス、例えばウイルス性出血熱を引き起こすウイルスであってもよい。ウイルス性出血熱を引き起こす前記ウイルスは、エボラウイルス、マールブルグウイルス及び／又はラッサウイルスであってもよい。
【００１４】
上記用途において、前記ウイルス性出血熱は、エボラ出血熱、マールブルグ出血熱及び／又はラッサ熱であってもよい。
【００１５】
上記用途において、前記ウイルス阻害剤、ウイルス性出血熱の治療及び／又は予防のための前記製品及びウイルス活性化エンベロープ糖タンパク質に結合する製品は、ベルバミン二塩酸塩又は薬学的に許容されるその塩を含む以外、さらに適切な担体又は賦形剤を含むことができる。ここでの担体材料は、水溶性担体材料（例えばポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、有機酸など）、難溶性担体材料（例えばエチルセルロース、ステアリン酸コレステリルなど）、腸溶性担体材料（例えば酢酸セルロースフタル酸エステル及びカルボキシメチルエチルセルロースなど）を含むが、これらに限定されない。このうち、水溶性担体材料が好ましい。これらの材料を使用して複数の剤形にすることができ、錠剤、カプセル剤、滴下丸剤、エアゾール剤、丸剤、散剤、液剤、懸濁剤、乳剤、顆粒剤、リポソーム、経皮吸収剤、バッカル錠剤、坐剤、凍結乾燥粉末注射剤等を含むが、これらに限定されない。それは、一般的な製剤、徐放性製剤、放出制御製剤、及びさまざまな微粒子薬物送達システムであってもよい。
【００１６】
単位剤形を錠剤にするために、本分野で知られている様々な担体を広く使用することができる。担体に関する例は、例えば澱粉、デキストリン、硫酸カルシウム、乳糖、マンニトール、スクロース、塩化ナトリウム、グルコース、尿素、炭酸カルシウム、白粘土、微結晶セルロース、ケイ酸アルミニウムなどの希釈剤及び吸収剤、例えば水、グリセリン、ポリエチレングリコール、エタノール、プロパノール、澱粉スラリー、デキストリン、シロップ、蜂蜜、グルコース溶液、アラビアゴム粘液、ゼラチン溶液、カルボキシメチルセルロースナトリウム、シェラック、メチルセルロース、リン酸カリウム、ポリビニルピロリドンなどの湿潤剤及び結合剤、例えば乾燥澱粉、アルギン酸塩、寒天粉末、褐藻澱粉、炭酸水素ナトリウム及びクエン酸、炭酸カルシウム、ポリオキシエチレン、ソルビトール脂肪酸エステル、ドデシルスルホン酸ナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロースなどの崩壊剤、例えばスクロース、グリセリルトリステアレート、ココアバター、硬化油などの崩壊抑制剤、例えば四級アンモニウム塩、ラウリル硫酸ナトリウムなどの吸収促進剤、例えばタルク粉、シリカ、コーンスターチ、ステアリン酸塩、ホウ酸、流動パラフィン、ポリエチレングリコールなどの潤滑剤である。錠剤はまた、例えば糖衣錠、フィルムコーティング錠、腸溶性コーティング錠、又は二層錠及び多層錠などの被覆錠にすることができる。
【００１７】
単位剤形を丸剤にするために、本分野で知られている様々な担体を広く使用することができる。担体に関する例は、例えばグルコース、ラクトース、澱粉、ココアバター、硬化植物油、ポリビニルピロリドン、Ｇｅｌｕｃｉｒｅ、カオリン、タルク粉などの希釈剤及び吸収剤、例えばアラビアゴム、トラガカント、ゼラチン、エタノール、蜂蜜、液糖、米シリアル又はバッターなどの結合剤、例えば寒天粉末、乾燥澱粉、アルギン酸塩、ドデシルスルホン酸ナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロースなどの崩壊剤である。単位剤形を坐剤にするために、本分野で知られている様々な担体を広く使用することができる。担体に関する例は、例えばポリエチレングリコール、レシチン、ココアバター、高級アルコール、高級アルコールのエステル、ゼラチン、半合成グリセリドなどである。
【００１８】
単位投与剤型を、例えば液剤、乳剤、凍結乾燥粉末注射剤及び懸濁剤といった注射用製剤にするために、本分野において一般的に使用されるすべての希釈剤、例えば、水、エタノール、ポリエチレングリコール、１，３−プロパンジオール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリ酸化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル等を使用することができる。また、等張注射液を調製するために、注射用製剤に適切な量の塩化ナトリウム、グルコース又はグリセロールを添加することができ、また、従来の共溶媒、緩衝剤、ｐＨ調整剤等も添加できる。また、必要に応じて、着色剤、防腐剤、香味料、矯味剤、甘味剤又は他の材料も薬物製剤に添加することができる。上記剤形は、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射及び腔内注射などを含む注射、直腸及び膣などの腔内投与、鼻腔などの経気道投与、経粘膜投与によって投与することができる。
【００１９】
本発明はさらに医薬化合物を提供する。
【００２０】
本発明によって提供される医薬化合物は、ベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩である。
【００２１】
上記医薬化合物において、前記医薬化合物は、動物のウイルス感染を阻害するために使用することができる。前記ウイルスは、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスであってもよい。前記ウイルスは、フィロウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルス、例えばウイルス性出血熱を引き起こすウイルスであってもよい。ウイルス性出血熱を引き起こす前記ウイルスは、エボラウイルス、マールブルグウイルス及び／又はラッサウイルスであってもよい。
【００２２】
本発明はさらに、動物のウイルス感染を阻害する方法を提供する。
【００２３】
本発明によって提供される動物のウイルス感染を阻害する方法は、動物のウイルス感染を阻害するために受容体動物へのベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩の投与を含み、前記ウイルスは、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスであってもよい。さらに、前記ウイルスは、フィロウイルス科及び／又はアレナウイルス科のウイルス、例えばウイルス性出血熱を引き起こすウイルスであってもよい。ウイルス性出血熱を引き起こす前記ウイルスは、エボラウイルス、マールブルグウイルス及び／又はラッサウイルスであってもよい。
【００２４】
本発明はさらに、ウイルス性出血熱の治療及び／又は予防方法を提供する。
【００２５】
本発明により提供されるウイルス性出血熱の治療及び／又は予防方法は、受容体動物にベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩を投与してウイルス性出血熱の治療及び／又は予防を行うことを含み、前記ウイルス性出血熱は、活性化されたエンベロープ糖タンパク質を介してベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩に結合できるウイルスによって引き起こされる疾患であってもよい。
【００２６】
本発明において、前記動物は、ヒトなどの哺乳動物であってもよく、前記動物はまた、哺乳動物以外の前記ウイルスに感染した鳥類などの他の動物であってもよい。
【００２７】
本発明において、用語「薬学的に許容される塩」は、信頼性の高い医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応などのない、ヒト及び下等動物の組織との接触に適し、且つ合理的な効果／リスク比に見合った塩である。薬学的に許容される塩は、本分野で公知のものである。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９７７，６６：１において、薬学的に許容される塩が詳細に記載されている。
【００２８】
本発明において、前記エボラウイルスは、ザイール型、スーダン型、タイフォレスト型、ブンディブギョ型及び／又はレストン型エボラウイルスであってもよい。
【００２９】
本発明において、前記ウイルス阻害は抗ウイルスとも呼ばれる。前記ウイルス阻害は、細胞へのウイルス侵入の阻害であってもよい。前記細胞へのウイルス侵入の阻害は、ウイルス活性化エンベロープ糖タンパク質（ＧＰｃｌ）を介した細胞へのウイルス侵入の阻害であってもよい。
【００３０】
本発明では、エボラウイルス活性化エンベロープ糖タンパク質（ＥＢＯＶ−ＧＰｃｌ）を標的として使用し、ＥＢＯＶ−ＧＰｃｌに結合する能力を有する抗ウイルス活性化合物を、構造に基づく仮想スクリーニングにより取得し、該化合物はベルバミン二塩酸塩である。ベルバミン二塩酸塩は、標的タンパク質ＥＢＯＶ−ＧＰｃｌに結合することによりエボラ組換えウイルスの侵入を特異的に阻害し、エボラウイルス感染に抵抗する効果を達成できる。抗ＥＢＯＶのベルバミン二塩酸塩の半最大効果濃度（ＥＣ５０）は０．４９μＭであり、ベルバミン二塩酸塩はＥＢＯＶに対して強い阻害効果があることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ベルバミン二塩酸塩の構造式。
【図２】実施例１のベルバミン二塩酸塩は、ＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ組換えウイルスの侵入に対して特異的な阻害効果を有し、図２では、ＶＳＶＧはＶＳＶ−Ｇ／ＨＩＶ−ｌｕｃを示し、Ｅｂｏｌａ−ＧＰはＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ、ウイルス感染率＝１−阻害率、ＤＭＳＯはブランクコントロール処理を示し、ＴＥＴはテトランドリン処理を示し、１−２２はそれぞれ２２種類の化合物処理を示し、そのうち１０はベルバミン二塩酸塩処理である。
【図３】実施例２の細胞増殖実験は、２９３Ｔ細胞の増殖に対するベルバミン二塩酸塩の効果を検証し、図３において、ＤＭＳＯはブランクコントロール処理を示し、ＴＥＴはテトランドリン処理を示し、ＥＥＩ−１０はベルバミン二塩酸塩処理を示す。
【図４】実施例３のＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ組換えウイルスに対するベルバミン二塩酸塩の阻害効果は、良好な用量依存効果を持つ。
【図５】実施例４の薬物の作用点の実験は、ベルバミン二塩酸塩がウイルスの侵入段階に作用することを示し、図５において、ＴＥＴはテトランドリン処理を示し、ＥＥＩ−１０はベルバミン二塩酸塩処理を示し、ＲＴはエファビレンツ処理を示す。
【図６】実施例５では、ベルバミン二塩酸塩は、ＭＡＲＶ−ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ組換えウイルス及びＬＡＳＶ−ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ組換えウイルスの両方に対して阻害効果を示した。
【図７】バイオレイヤーの光学干渉技術を使用して、異なる濃度のベルバミン二塩酸塩と標的タンパク質ＧＰｃｌのキネティック結合曲線をインビトロで測定した。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
以下では、発明を実施するための形態を参照しながら本発明をさらに詳細に説明するが、これらの例は本発明を説明するためだけに与えられ、本発明の範囲を限定するものではない。以下に提供される実施形態は、当業者がさらなる改善を行うためのガイドとして機能することができるが、いかなる形においても本発明に対する制限を構成するものではない。
【００３３】
特に明記しない限り、以下の実施例の実験方法は、当業者に知られている従来の方法であるか又は製造業者が推奨する条件に従っている。以下の実施例で使用されている材料、試薬などは、特に指定がない限り、商業的供給源から入手することができる。
【００３４】
ベルバミン二塩酸塩は公知の化合物であり、市販品から購入することができ、具体的な取得手段は従来技術であり、本発明はこれを特に限定しない。下記実施例におけるベルバミン二塩酸塩は、ＴａｒｇｅｔＭｏｌ社の製品である。
下記実施例における真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社の製品である。
【００３５】
下記実施例におけるルシフェラーゼレポーター遺伝子を運ぶＨＩＶ−ｌｕｃプラスミドｐＮＬ４−３Ｌｕｃ（Ｒ−Ｅ−）（Ｍａ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．（２３Ｍａｙ  ２０１８）．「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＨＩＶ−１Ｖｉｆ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ  ｂｙ  ｖｉｒｔｕａｌ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ．」Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ８（１）：８０６７）について、一般市民は、中国医学アカデミーの医療バイオテクノロジー研究所（中国語表記：中国医学科学院医薬生物技術研究所）から該生物学的材料を入手できる。該生物学的材料は、本発明の実験を繰り返すためにのみ使用され、他の目的には使用できない。
【００３６】
以前の研究によれば、エボラウイルスのエンベロープ糖タンパク質（ＥＢＯＶ−ＧＰ）は、リソソームに入った後に酵素消化され、酵素消化後の活性化されたエンベロープ糖タンパク質（Ｐｒｉｍｅｄ  ＧＰ、ＧＰｃｌ）は、エンドソーム受容体−ヒトコレステロール輸送体（Ｎｉｅｍａｎｎ−Ｐｉｃｋ  Ｃ１，ＮＰＣ１）と直接相互作用し、それによりウイルスと宿主細胞間の膜融合プロセスを開始することとなる。本発明において、発明者は、ＥＢＯＶ−ＧＰｃｌ（エボラウイルス活性化エンベロープ糖タンパク質）とＮＰＣ１−Ｃの相互作用に応じて、新しい薬物設計法を使用して、ＥＢＯＶ−ＧＰｃｌに特異的に結合し、細胞へのエボラウイルスの侵入を阻害できる活性ペプチドを設計及び合成する。発明者は、活性ポリペプチドとＥＢＯＶ−ＧＰｃｌとの間の水素結合、静電相互作用及び疎水性相互作用等に基づいてファーマコフォアモデルを構築し、ＥＢＯＶ−ＧＰｃｌを標的とするエボラウイルス侵入阻害剤の仮想スクリーニング法を確立し、それによりＥＢＯＶ−ＧＰｃｌに特異的に結合した低分子化合物を見つけ、それによってＥＢＯＶ−ＧＰｃｌのＮＰＣ１−Ｃへの結合を阻害し、さらにエボラウイルスの複製を阻害する。このモデルを利用してデータベースをスクリーニングし、複数のソフトウェアを使用してスコアリングした後、最終的に標的化合物が取得され、それを生物学的活性について試験し、最終的にＥＢＯＶ−ＧＰｃｌを標的とする抗ウイルス活性化合物が得られ、該化合物はベルバミン二塩酸塩であり、それはＥＢＯＶ−ＧＰｃｌと結合する能力を有する。
【００３７】
ＥＢＯＶは、危険性で言えばレベル４のウイルスに分類されるため、本発明は、インビトロで低分子化合物の生物学的活性を評価するための安全で効果的な研究手段として偽ウイルス技術を使用する。最も毒性の高いザイール型ＥＢＯＶのＧＰタンパク質を使用してＨＩＶコアをコーティングして、複製欠損型偽ウイルスＥＢＯＶ−ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃを調製し、サンプルの抗ウイルス活性をフェラーゼレポーター遺伝子検出技術によって判定した。それと同時に、ＶＳＶＧ／ＨＩＶ−ｌｕｃ組換えウイルスモデルを使用して、低分子化合物の特異性を分析した。細胞毒性を除外した後、薬物の作用点実験により、低分子化合物の作用メカニズムをさらに検証した。最後に、光ファイバーバイオセンサーに基づくバイオレイヤーの光学干渉技術を使用して、標的タンパク質ＧＰｃｌへの低分子化合物の結合能力をインビトロで測定し、低分子化合物のターゲティングを確認した。具体的な実験方法及び結果は下記のとおりである。
【実施例】
【００３８】
実施例１
ＥＢＯＶが阻害剤スクリーニングモデルに入り、ベルバミン二塩酸塩がＥＢＯＶ活性を特異的に阻害できることを検証した。
【００３９】
細胞レベルでの組換えウイルス技術を使用して、Ｚａｉｒｅ−ＥＢＯＶのＧＰをＨＩＶコアプラスミド（ｐＮＬ４−３．Ｌｕｃ）と共発現させ、組換えウイルスを調製し、ＧＰタンパク質を標的とするＥＢＯＶ侵入阻害剤のハイスループットスクリーニングモデルを使用して、化合物の抗ウイルス活性を評価した。具体的な手順は以下のとおりである。
【００４０】
２９３Ｔ細胞を培養用に取り、細胞を培養フラスコで満たした後、古い培地を廃棄し、０．２５％トリプシンと０．０２％ＥＤＴＡを含む消化液で消化する。細胞が丸くなった後、消化液を捨て、１０％ＦＢＳ（ＧＩＢＣＯから購入）を含む高グルコースＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＩＣＯからを直ちに添加し、ボトルの底をピペットで優しく吹くことにより、ボトルの底から細胞を完全に放出し且つ単一の細胞懸濁液に分散させる。カウント後、細胞濃度を培地で２．２×１０５細胞／ｍｌに調整し、６ウェルプレート、２ｍＬ／ウェルに播種する。２４ｈ後（細胞の量は約７０％）にトランスフェクトし、プラスミド投与量：２μｇｐＺＥＢＯＶ−ＧＰ及びルシフェラーゼレポーター遺伝子を運ぶ３μｇのＨＩＶ−ｌｕｃプラスミドｐＮＬ４−３Ｌｕｃ（Ｒ−Ｅ−）、トランスフェクション試薬はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ株式会社）であり、取扱説明書に従ってトランスフェクションを行い、エボラ偽型ウイルスを生成し、該エボラ偽型ウイルスをＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃと名付ける。トランスフェクション後の４８時間に偽型ウイルスを含む上清を収集し、結合し、低速遠心分離により浮遊細胞及び細胞破片から清澄化し、且つ０．４５μｍ孔径フィルターで濾過した。ＥＬＩＳＡアッセイを使用してウイルス関連ＨＩＶ  ｐ２４レベルを測定することにより偽ウイルス粒子を定量化した。
【００４１】
ここで、ｐＺＥＢＯＶ−ＧＰはＺａｉｒｅ  ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｅ  Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ−ｗｔ／ＧＩＮ／２０１４／Ｍａｋｏｎａ−Ｇｕｅｃｋｅｄｏｕ−Ｃ０７のＧＰ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＫＪ６６０３４７．２（Ｕｐｄａｔｅ  Ｄａｔｅ  Ｄｅｃ１８，２０１４  ０１：２５ＰＭ）の第５９００−８３０５位置をベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）に挿入して得られた、Ｚａｉｒｅ−ＥＢＯＶの糖タンパク質（ＧＰ）を発現する組換え発現プラスミドである。
【００４２】
ＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ偽ウイルス粒子を２９３Ｔ細胞とともに９６ウェルプレートにインキュベートした。４８時間後、細胞を収集して溶解し、ホタルルシフェラーゼ活性を測定した。ルシフェラーゼ活性の値は、ウイルス感染を表す。
【００４３】
化合物をＤＭＳＯに溶解した後にそれぞれＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ偽ウイルスと混合し、化合物の含有量が１０μＭになるように２９３Ｔ細胞に添加した。４８時間後、２９３Ｔ細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、ウイルスに対する化合物の阻害率を評価した。溶媒ＤＭＳＯをブランクコントロールとして使用し、同時にＥＢＯＶ侵入阻害剤テトランドリン（ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ、ＴＥＴ）をコントロールとして導入した。テトランドリンをＤＭＳＯに溶解した後にＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ偽ウイルスと混合し、２９３Ｔ細胞に添加した。テトランドリンの含有量は１μＭである。４８時間後、２９３Ｔ細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定することにより、ウイルスに対する化合物の阻害率を評価した。ウイルスに対する化合物の阻害率＝１−相対ルシフェラーゼ活性。相対ルシフェラーゼ活性は、ブランクコントロールに対するルシフェラーゼ活性を指す。ルシフェラーゼ活性は、実際にはウイルス感染性を表す。
【００４４】
現在では知られているＥＢＯＶ阻害剤のほとんどは、広域スペクトルの抗ウイルス薬であり、ＥＢＯＶに対する狭スペクトル阻害剤を見つけるには、スクリーニングされた活性化合物の特異性を分析することが必要である。水疱性口内炎ウイルスコート糖タンパク質（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＶＳＶＧ）とＥＢＯＶ−ＧＰｃｌは同様に作用し、ウイルス及び受容体の認識に重要な役割を果たすため、ＶＳＶＧを発現する偽ウイルスＶＳＶ−Ｇ／ＨＩＶ−ｌｕｃを使用して化合物の特異性を分析する。細胞毒性因子を除外した後、同様にルシフェラーゼの原理を使用して、ＶＳＶ−Ｇ／ＨＩＶ−ｌｕｃ偽ウイルスに対する化合物の阻害活性を検出し、方法は上記と同じである。化合物がＥＢＯＶ−ＧＰｃｌを介したウイルス侵入に対して有意な阻害効果のみを持ち、ＶＳＶを阻害しない場合、又は阻害率が非常に低い場合、この化合物はＥＢＯＶに特異的であることを示す。
【００４５】
実験を３回繰り返した結果を図２に示す。化合物のベルバミン二塩酸塩は、ＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ偽ウイルスを８０％以上阻害し、同じ濃度でのＶＳＶ−Ｇ／ＨＩＶ−ｌｕｃ偽ウイルスに対する抑制効果はほとんどない。これは、ベルバミン二塩酸塩がＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ偽ウイルスに対して特異的な阻害効果があることを示す。ポジティブコントロールとして、ＥＢＯＶ侵入阻害剤であるテトランドリン（ＴＥＴ）は、ベルバミン二塩酸塩と同様の選択的阻害効果がある。
【００４６】
ここで、ＶＳＶ−ＧＰを発現する偽ウイルスＶＳＶ−Ｇ／ＨＩＶ−ｌｕｃの調製方法は、ＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃの調製方法における、ｐＺＥＢＯＶ−ＧＰをｐＶＳＶ−ＧＰに置き換えることのみがＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃの調製方法と相違しており、他の操作はまったく同じである。ｐＶＳＶ−ＧＰは、水疱性口内炎ウイルスコート糖タンパク質ＧＰ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋＡｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｖ０１２１４．１（Ｕｐｄａｔｅ  Ｄａｔｅ  Ｆｅｂ  ４，２０１１）の第１４−１５６７位をベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）に挿入して得られた、水疱性口内炎ウイルスコート糖タンパク質を発現する組換え発現プラスミドである。
【００４７】
実施例２
ベルバミン二塩酸塩の抗ウイルス活性は、その細胞毒性とは関係がない。
【００４８】
化合物の毒性による非特異的な違いを除外するために、細胞カウントキット−８（ｃｅｌｌＣｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８，ＣＣＫ−８）を使用して、２９３Ｔ細胞の増殖に対するベルバミン二塩酸塩の効果を評価した。
【００４９】
ＣＣＫ−８キットは、細胞増殖、細胞生存、細胞毒性を検出するためのキットで、ＷＳＴ−８（水溶性テトラゾリウム塩、化学名：２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホベンゼン）−２Ｈ−テトラゾリウム一ナトリウム塩）に基づくＭＴＴ法の代替法として広く使用されている高速高感度検出キットである。キットは、水溶性テトラゾリウム塩−ＷＳＴ−８を使用し、電子カップリング試薬の存在下では、ミトコンドリア内のいくつかのデヒドロゲナーゼによって還元され、オレンジ−黄色のホルマザンを生成することができる。増殖する細胞が多ければ多いほど、色は濃くなり、細胞毒性が高いほど、色が薄くなる。同じ細胞の場合、色深度と細胞の数の間には良好な線形関係がある。４５０ｎｍの波長で酵素結合免疫測定器によってその光吸収値を測定し、生細胞の数を間接的に反映できる。具体的な手順は以下のとおりである。
【００５０】
２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートで培養し且つベルバミン二塩酸塩（ＤＭＳＯに溶解）でインキュベートした。培地中のベルバミン二塩酸塩の含有量は、それぞれ１０μＭ、２．５μＭ、０．６２５μＭである。４８時間後、細胞上清を１０％ＣＣＫ−８試薬含有細胞培養液に交換し、細胞をさらに３７°Ｃ、５％ＣＯ２のインキュベーターで１ｈ培養した。４５０ｎｍでの各ウェルの光学密度（ＯＤ）値をマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ）で記録した。
【００５１】
テトランドリン（ＴＥＴ）をコントロールとして使用して、２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートで培養し且つテトランドリン（ＤＭＳＯに溶解）でインキュベートした。培地中のテトランドリンの含有量は、それぞれ１０μＭ、２．５μＭ、０．６２５μＭである。４８時間後、細胞上清を１０％ＣＣＫ−８試薬含有細胞培養液に交換して、細胞をさらに３７°Ｃ、５％ＣＯ２のインキュベーターで１ｈ培養した。４５０ｎｍでの各ウェルの光学密度（ＯＤ）値をマイクロプレートリーダー（Ｔｈｅｒｍｏ、Ｖａｒｉｏｓｋａｎ  Ｆｌａｓｈ）で記録した。
溶媒ＤＭＳＯをブランクコントロール（ＤＭＳＯ）として使用した。ブランクコントロールのＯＤ４５０ｎｍを１００％細胞生存率として記録した。
【００５２】
実験を３回繰り返した。結果を図３に示す。図３に示すとおり、１０μＭの最高濃度（測定されたＩＣ  ５０値よりもはるかに高い）では、ベルバミン二塩酸塩は細胞の生存率に有意な影響を与えない。これは、ベルバミン二塩酸塩の抗ウイルス活性がその細胞毒性とは関係がないことを示す。
【００５３】
実施例３
ＥＢＯＶに対するベルバミン二塩酸塩の阻害効果は、良好な用量依存がある。
【００５４】
実施例１における方法を参照して、ベルバミン二塩酸塩をＤＭＳＯで溶解した後にそれぞれ実施例１のＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃと混合し、その後に２９３Ｔ細胞に添加した。ベルバミン二塩酸塩含有量をそれぞれ０．１５６２５、０．３１２５、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、２０μＭにした。４８時間後、２９３Ｔ細胞を溶解し、ルシフェラーゼ活性を測定することによりベルバミン二塩酸塩の抗ＥＢＯＶ活性を評価した。溶媒ＤＭＳＯをブランクコントロール（ＤＭＳＯ）として使用し、ブランクコントロールのルシフェラーゼ活性を細胞生存率の１００％とした。実験を３回繰り返した結果を図４に示す。図４に示すとおり、ベルバミン二塩酸塩は、用量依存的にＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ偽ウイルス活性を大幅に阻害した。抗ＥＢＯＶのベルベラミン二塩酸の半最大効果濃度（ＥＣ５０）は０．４９μＭであった。
【００５５】
実施例４
薬物の作用点実験により、ベルバミン二塩酸塩がウイルスの侵入段階に作用することが確認された。
【００５６】
ＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ偽ウイルスに対するベルバミン二塩酸塩の特異的阻害効果は、それらがＥＢＶＯ侵入阻害剤として作用する可能性があることを示す。これを確認するために、薬物の作用点（Ｔｉｍｅ  ｏｆ  ａｄｄｉｔｉｏｎ、ＴＯＡ）実験により、ウイルス感染サイクルにおいてベルバミン二塩酸塩が作用する段階を調べた。具体的な手順は以下のとおりである。
【００５７】
感染の１日前に、２９３Ｔ細胞を細胞数６×１０４細胞／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、実施例１のＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ５０μＬ感染細胞をそれぞれ添加する。感染（−１時間）、感染中（０時間）及び感染後２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６時間に、ベルバミン二塩酸塩（ＤＭＳＯで溶解、培地における含有量（最終濃度）は１×１０−５  ｍｏｌ・Ｌ−１）を添加し、ＥＢＯＶ侵入阻害剤テトランドリン（ｔｅｔｒａｎｄｒｉｎｅ，ＴＥＴ）（ＤＭＳＯで溶解、培地での含有量は１×１０−７ｍｏｌ・Ｌ−１）、非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤エファビレンツ（ｅｆａｖｉｒｅｎｚ、ＥＦＶ）（ＤＭＳＯで溶解、培地での含有量は１×１０−９ｍｏｌ・Ｌ−１）をコントロールとし、ＤＭＳＯを溶媒コントロールとした。感染の４８ｈ後、レポーター遺伝子ルシフェラーゼ活性の検出は、組換えウイルス複製のレベルを反映する。
【００５８】
ＥＢＯＶの１回の感染中の薬物の有効期限を測定することにより、薬物の作用段階を予備的に判断できる。図５に示すように、ベルバミン二塩酸塩は、ウイルス侵入の初期段階で非常に強力な阻害効果を示し、ウイルスが吸着プロセスを完了した後、ウイルス感染に対する阻害効果はない。これは、ＥＢＯＶ侵入阻害剤テトランドリンの作用時間と一致する。非ヌクレオシド系逆転写酵素阻害剤エファビレンツは、６ｈ後にも依然としてウイルスを阻止する作用がある。これらの結果は、ウイルスが宿主に結合した後且つそれらが膜融合する前に、ベルバミン二塩酸塩が機能することを示す。
【００５９】
実施例５
マールブルグ組換えウイルス及びラッサ組換えウイルスモデルを使用して化合物を評価した。
【００６０】
エボラウイルスは糸状ウイルス科に属し、組換えウイルス技術に基づき、他の２つの糸状組換えウイルスのモデルを確立し、それぞれマールブルグ組換えウイルス（ＭＡＲＶ−ＧＰを発現する偽ウイルスＭＡＲＶ−ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ）及びラッサ組換えウイルス（ＬＡＳＶ−ＧＰを発現する偽ウイルスＬＡＳＶ−ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ）である。ここで、ＭＡＲＢ−ＧＰを発現する偽ウイルスＭＡＲＶ−ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ及びＬＡＳＶ−ＧＰを発現する偽ウイルスＬＡＳＶ−ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃの調製方法は、いずれもＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃの調製方法とＥＢＯＶ−Ｚａｉｒｅ  ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃの調製方法におけるｐＺＥＢＯＶ−ＧＰを、それぞれｐＭＡＲＶ−ＧＰ及びｐＬＡＳＶ−ＧＰに置き換えることのみが相違しており、他の操作はまったく同じである。
【００６１】
ｐＭＡＲＶ−ＧＰは、マールブルグウイルスコート糖タンパク質ＧＰ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＣ＿００１６０８．３）（Ｕｐｄａｔｅ  Ｄａｔｅ  １２−ＮＯＶ−２０１４）の第５９４１−７９８６位をベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）に挿入して得られた、マールブルグウイルスコート糖タンパク質を発現する組換え発現プラスミドである。
【００６２】
ｐＬＡＳＶ−ＧＰは、ラッサウイルスコート糖タンパク質ＧＰ遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｊ０４３２４．１）（Ｕｐｄａｔｅ  Ｄａｔｅ  Ｊｕｎ  ２３，２０１０）の第１８７２−３３４７位をベクターｐｃＤＮＡ３．１（＋）に挿入して得られた、ラッサウイルスコート糖タンパク質を発現する組換え発現プラスミドである。
【００６３】
実施例３の方法を参照して、ＭＡＲＶ−ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ及びＬＡＳＶ−ＧＰ／ＨＩＶ−ｌｕｃ組換えウイルスモデルを使用して、マールブルグウイルス及びラッサウイルスに対するベルバミン二塩酸塩の半最大効果濃度を測定した。図６に示すように、ベルバミン二塩酸塩はマールブルグウイルスとラッサウイルスの宿主への侵入を阻害できる。ＥＣ５０は、それぞれ０．９９μＭと２．６４μＭである。本研究は、ベルバミン二塩酸塩が広域スペクトルの抗ウイルス効果を持っていることを示唆する。タンパク質配列比較の結果は、エボラウイルスとマールブルグウイルスＧＰタンパク質の２つの株間の配列相同性がわずか２３％であることを示す。化合物を評価するためにウイルスモデルの複数の株を使用すると、広域スペクトルの抗ウイルス薬の発見に有利であり、且つ薬物の作用メカニズムの研究に役立つ。
【００６４】
実施例６
バイオレイヤーの光学干渉技術を使用して、ベルバミン二塩酸塩の標的タンパク質ＧＰｃｌへの結合能力をインビトロで測定した。
【００６５】
エボラウイルスエンベロープの表面の糖タンパク質ＧＰは、エンドソームで宿主プロテアーゼ  カテプシン（Ｃａｔｈｅｐｓｉｎ）によって消化され、活性化された糖タンパク質ＧＰｃｌになり、受容体結合部位を露出させる。ベルバミン二塩酸塩が標的タンパク質ＧＰｃｌに結合することによってウイルスの侵入を特異的に阻害することを検証するために、光ファイババイオセンサーベースのバイオレイヤー光学干渉（ＢｉｏＬａｙｅｒ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙ、ＢＬＩ）技術を使用して、ベルバミン二塩酸塩と標的タンパク質ＧＰｃｌの結合能力をインビトロで測定した。ＢＬＩ技術は、生体分子間の相互作用をリアルタイムで追跡でき、タンパク質と他の生体分子間の相互作用の研究に最適である。具体的な手順は以下のとおりである。
【００６６】
実験には、スーパーストレプトアビジン（Ｓｕｐｅｒ  ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ、ＳＳＡ）バイオセンサーが選択されているため、先ず、標的タンパク質ＧＰｃｌをビオチン化する必要がある。ビオチン（ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＴＭ  ＮＨＳ−ＬＣ−ＬＣ−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｃａｔ．＃２１３４３，ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＴＭ）を精製後の標的タンパク質ＧＰｃｌとモル比３：１で混合し、室温で１時間反応させた後に脱塩カラム（Ｚｅｂａ  ＴＭ  Ｓｐｉｎ  Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎｓ、Ｃａｔ．＃８９８８３、Ｔｈｅｒｍｏ）で未反応のビオチンを除去し、ビオチン化標的タンパク質ＧＰｃｌを取得する。
【００６７】
結合実験は、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｉｎｃ．，ＣＡ、ＵＳＡ）機器を使用し、主に、
ステップ１）ベースラインの検出：ＳＳＡセンサーを緩衝溶液に浸漬して１２０秒間静置して平衡状態にする；
ステップ２）センサーでビオチン化標的タンパク質ＧＰｃｌをインキュベートして、センサープローブをビオチン化ＧＰｃｌタンパク質溶液（５０μｇ／ｍｌ）に移動して６００秒間静置し、タンパク質をＳＳＡセンサーに固定する；
ステップ３）センサーのブロック：センサーを５μＭビオシチン（ＥＺ−Ｂｉｏｃｙｔｉｎ、Ｃａｔ．＃２８０２２、Ｔｈｅｒｍｏ）含有溶液に移動して６０ｓブロックする；
ステップ４）二回目のベースライン検出：センサーを緩衝溶液に移動して１２０ｓ静置して平衡状態にする；
ステップ５）結合：センサーを化合物溶液に移動し、６０ｓ静置してＫｏｎ値を測定する；
ステップ５）解離：センサーを緩衝溶液に移動し、６０ｓ静置してＫｏｆｆ値を得る；
というステップで実験を行う。実験で使用した緩衝液は、ＰＢＳ（タンパク質の溶解用）及びＰＢＳ＋５％ＤＭＳＯ（ベルバミン二塩酸塩の溶解用）である。今回の実験では、サンプルのロードと検出を別々に行い、第１のマイクロプレートには３列が含まれ、第１列ではＰＢＳをベースラインとして使用し、第２列はビオチン化標的タンパク質ＧＰｃｌのロードに用い、第３列では５μＭビオシチンはブロックに用いられる。センサーにロードした後に２枚目のマイクロプレートを検出する。その第１〜第６列は、ＰＢＳ＋５％ＤＭＳＯで、第７〜第１２列は、低濃度から高濃度の勾配（３１．２５μＭ−５００μＭ）のベルバミン二塩酸塩である。このプロセス中に、濃度が異なる５種類のベルバミン二塩酸塩溶液を使用して、最終的なキネティック曲線を取得する。ＦｏｒｔｅＢｉｏデータ分析ソフトウェアＤａｔａＡｎａｌｙｓｉｓ  ９．０を使用して実験データを分析する。解離速度定数ＫＤ＝Ｋ  ｏｆｆ／Ｋ  ｏｎ。
【００６８】
図７における横座標は反応時間で、その単位は秒である。縦座標はＧＰｃｌと化合物ベルバミン二塩酸塩の相互作用の信号強度で、その単位はｎｍである。結果は、ベルバミン二塩酸塩がＧＰｃｌタンパク質に結合できることを示す。
【００６９】
本発明はＥＢＶＯを例として本発明の技術的解決手段の抗ウイルスメカニズムを具体的に説明するが、本発明では、ベルバミン二塩酸塩又はその薬学的に許容される塩の用途の保護範囲はＥＢＯＶに限定されない。上記抗ウイルスメカニズムに適用するいかなるウイルスは、いずれも本発明の前記ウイルスの範囲内のものであり、例えばＥＢＯＶの他の４種類のサブタイプ及びマールブルグウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇ  ｖｉｒｕｓ、ＭＡＲＶ）、ラッサウイルス（Ｌａｓｓａ  ｖｉｒｕｓ、ＬＡＳＶ）等の他の糸状ウイルスであってもよい。
【００７０】
以上は、特別な実施例を与えて本発明を詳しく説明したが、言うまでもなく、本発明をさらに改善できる。要約すると、本発明の原理に従って、本出願は、本発明に対するいかなる変更、用途又は改善を含むことを意図し、本出願の開示範囲から逸脱し、本分野の既知の従来技術で行われる変更を含む。以下の添付の特許請求の範囲に従って、いくつかの基本的な特徴の応用を行うことができる。
【図１】
2020537693.tif 000002
【図２】
2020537693.tif 000003
【図３】
2020537693.tif 000004
【図４】
2020537693.tif 000005
【図５】
2020537693.tif 000006
【図６】
2020537693.tif 000007
【図７】
2020537693.tif 000008
【国際調査報告】
2020537693.tif 000009
2020537693.tif 000010
2020537693.tif 000011
2020537693.tif 000012
2020537693.tif 000013
2020537693.tif 000014