(57)【要約】移植拒絶の分野において、SNPに関してレシピエントおよびドナーに存在するバリアントにおけるミスマッチが移植成績の予測因子となる、SNPが同定されており、これらSNPは、新たに拒絶と関係づけられた非HLA遺伝子座に相当する。本発明により、列挙したSNPについてドナーとレシピエントとの間のミスマッチを分析することによって、抗体媒介拒絶のリスク上昇、T細胞媒介拒絶のリスク上昇、または低い拒絶リスクなどの、移植成績を予測することができる。列挙したSNPの特定のものは、腎臓移植の成績の予測因子である。予測的ドナーの適合性をレシピエントに対して評価し、最適化されたドナーとレシピエントのペアリングを可能にすることができる。2020526218.tif 000024
2020526218.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ドナーとレシピエントとの間のミスマッチが、選択された移植片タイプの移植成績の予測因子である、拒絶に関連する遺伝的ミスマッチを同定する方法であって、
各レシピエントが、該選択された移植片タイプを含む移植片をドナーから受けている、複数のドナー-レシピエントペアを選択する段階;
該移植片の受け入れ後に、選択された期間、各レシピエントの移植成績をモニタリングする段階;
各ドナー-レシピエントペアのドナーおよびレシピエントの各々からサンプルを得る段階;
選択された遺伝分析を該サンプルに対して実施して、各ドナーおよびレシピエントの遺伝子プロファイルを作成する段階;
ドナーとレシピエントとの間のミスマッチ多型バリアントのセットを含む各ドナー-レシピエントペアのミスマッチプロファイルを作成する段階; ならびに
事後統計分析を実施して、ミスマッチが移植成績の予測因子である多型遺伝子座を同定する段階
を含む、前記方法。
【請求項２】
選択された移植片タイプが、腎臓、心臓、肺、肝臓、皮膚、角膜、腸、膵臓、四肢、指、骨、靭帯、軟骨、および腱からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
2つまたはそれ以上の移植成績が、拒絶なし、AMR拒絶、およびCMR拒絶として分類される、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
サンプルが、血液、血清、組織、移植片組織、間質液、皮膚、および口腔スワブからなる群より選択される生体材料を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項５】
遺伝分析が、全ゲノム配列決定、エクソーム配列決定、およびトランスクリプトーム配列決定からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。
【請求項６】
以下の段階を含む、選択されたドナー-レシピエントペアに対して、選択された移植片タイプの移植成績を予測する方法:
ドナーからサンプルを得て、該サンプルにより、拒絶に関連する遺伝的ミスマッチの1つまたは複数の選択された多型遺伝子座で発現されるドナーバリアントを同定する段階;
レシピエントからサンプルを得て、該サンプルにより、拒絶に関連する遺伝的ミスマッチの該選択された多型遺伝子座で発現されるレシピエントバリアントを同定する段階;
ドナーとレシピエントとの間のミスマッチバリアントのセットを含むミスマッチプロファイルをコンパイルする段階; ならびに
ミスマッチを移植成績に関連付ける予測モデルにミスマッチプロファイルを入力する段階であって、予測モデルの出力が該ドナー-レシピエントペアの移植成績の予測である、段階。
【請求項７】
拒絶に関連する遺伝的ミスマッチの多型遺伝子座で発現されるバリアントが、
2020526218.tif 000013
からなる群より選択される1つまたは複数のSNPのバリアントを含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
1つまたは複数のSNPが、
2020526218.tif 000014
からなる群より選択される1つまたは複数のSNPからなる群より選択される少なくとも10個のSNPを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
1つまたは複数のSNPが、
2020526218.tif 000015
からなる群より選択される少なくとも50個のSNPを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１０】
1つまたは複数のSNPが、
2020526218.tif 000016
からなる群より選択される少なくとも100個のSNPを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１１】
1つまたは複数のSNPが、
2020526218.tif 000017
からなる群より選択されるSNPを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１２】
移植成績がAMRを含み、1つまたは複数のSNPが、
2020526218.tif 000018
からなる群より選択される1つまたは複数のAMR SNPを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１３】
移植成績がCMRを含み、1つまたは複数のSNPが、
2020526218.tif 000019
からなる群より選択される1つまたは複数のCMR SNPを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１４】
1つまたは複数のSNPが、
2020526218.tif 000020
からなる群より選択される1つまたは複数の腎臓関連SNPを含む、請求項7に記載の方法。
【請求項１５】
移植成績がAMRおよび拒絶なしを含み、AMR成績が、より多数のミスマッチの発生によって予測される、請求項6に記載の方法。
【請求項１６】
ドナー-レシピエントペアが予測的ドナー-レシピエントペアである、請求項6に記載の方法。
【請求項１７】
ドナー-レシピエントペアが実現ドナー-レシピエントペアであり、レシピエントがドナーから移植片を受けている、請求項6に記載の方法。
【請求項１８】
選択された移植片が、腎臓、心臓、肺、肝臓、皮膚、角膜、腸、膵臓、四肢、指、骨、靭帯、軟骨、および腱からなる群より選択される移植片を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項１９】
サンプルが、血液、血清、組織、移植片組織、間質液、皮膚、および口腔スワブからなる群より選択される生体材料を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項２０】
予測モデルの出力が、指数スコア、確率スコア、または分類である、請求項6に記載の方法。
【請求項２１】
以下の段階を含む、ドナーのミスマッチバリアント抗原に対するレシピエントの免疫感作を評価する方法:
ドナーからサンプルを得て、該サンプルにより、拒絶に関連する遺伝的ミスマッチの多型遺伝子座で発現されるドナーバリアントを同定する段階;
レシピエントからサンプルを得て、該サンプルにより、拒絶に関連する遺伝的ミスマッチの多型遺伝子座で発現されるレシピエントバリアントを同定する段階;
ドナーに存在しレシピエントには存在しない遺伝子バリアントのセットを含むミスマッチプロファイルをコンパイルする段階; ならびに
ドナーに存在しレシピエントには存在しない遺伝子バリアントにより発現されるタンパク質を含むミスマッチバリアント抗原に対する免疫要素を検出するために、レシピエントに由来するサンプルをアッセイする段階であって、そのような抗原に対する免疫要素の存在が免疫媒介性の移植リスクを示す、段階。
【請求項２２】
バリアントが、
2020526218.tif 000021
からなる群より選択される1つまたは複数のSNPのバリアントを含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２３】
移植片が、腎臓、心臓、肺、肝臓、皮膚、角膜、腸、膵臓、四肢、指、骨、靭帯、軟骨、および腱からなる群より選択される移植片を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２４】
免疫系要素が抗体を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２５】
免疫系要素がT細胞を含む、請求項21に記載の方法。
【請求項２６】
2020526218.tif 000022
からなる群より選択される1つまたは複数のSNPのバリアントの同定のためのプローブ
を含む、SNPアレイ。
【請求項２７】
固定化されたタンパク質のアレイであって、該タンパク質が、
2020526218.tif 000023
からなる群より選択される1つまたは複数のSNPによりコードされるバリアントを含む、前記固定化されたタンパク質のアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年7月14日付で出願された「Novel Methods of Predicting Transplant Rejection Risk」と題する米国仮出願第62/532,424号の優先権の恩典を主張するものであり、その内容は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究または開発に関する声明
該当なし
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
移植拒絶は、毎年多数の患者に影響を及ぼす深刻な問題である。例えば、米国だけでも、毎月約2,500件の移植腎臓が拒絶され、喪失されている。移植は組織適合性抗原(HLA)の障壁を越えて行われ、有害なドナー特異的免疫応答を効果的に抑制するために生涯にわたる免疫抑制を必要とする一方で、外来および感染抗原の免疫認識を維持する。移植失敗は一般的な移植の結果である。T細胞媒介拒絶(CMR)はT細胞活性化を伴う。抗体媒介拒絶(AMR)は、内皮上のHLAおよび/または非HLA (nHLA)分子に結合するドナー特異的抗体(DSA)の生成をもたらすB細胞および形質細胞の活性化を伴う。ドナーとレシピエントのミスマッチに特有の既成および新規(新たに形成された) DSAの存在は、AMRの主要なリスク因子であり、急性および慢性の両方の移植損傷をもたらし、早期および後期同種移植片の喪失加速の主な原因である。
【０００４】
臓器移植におけるドナーとレシピエントのマッチングのための現在のアプローチは、血液型適合性、主要HLA遺伝子座でのドナーとレシピエントのマッチング、および主要HLA遺伝子座に対する事前形成抗体の評価による感作リスク評価の3つの主要な基準の評価に依存している。
【０００５】
非宿主HLAタイプを示す細胞は身体の免疫系により異物と見なされ、それらの細胞を担持する組織/臓器の拒絶を引き起こしうるため、HLAミスマッチは移植後の移植片拒絶の重要なリスク因子に相当する。しかしながら、移植片の損傷および急性拒絶反応は、HLAが非常によくマッチし、HLAが同一の移植、例えば、腎臓移植でも発生しうる。最近、ドナーとレシピエントとの間のミスマッチの非HLA抗原が免疫原性および移植拒絶を推進することが認識されている。
【０００６】
例えば、Sigdel et al, Non-HLA antibodies to immunogenic epitopes predict the evolution of chronic renal allograft injury, J Am Soc Nephrol (2012) 23:750-63（非特許文献1）に開示されているように、MIG (CXCL9とも呼ばれる)、ITAC (CXCL11とも呼ばれる)、IFN-γ、およびグリア由来神経栄養因子を含む、さまざまな非HLA抗原に対して事前に形成された抗体は、腎臓での移植損傷を予測するものである。腎臓移植における非HLA抗原の別の研究では、Jackson et al., Endothelial cell antibodies associated with novel targets and increased rejection. J Am Soc Nephrol (2015) 26:1161-71（非特許文献2）により、エンドグリン、Fms様チロシンキナーゼ-3リガンド、EGF様リピート・ディスコイジンI-様ドメイン3、および細胞間接着分子4を含む、内皮細胞上に発現される4つの抗原性標的に対する抗体は、移植拒絶反応に関与することが示されている。例えば、Taniguchi, et al.,「Higher risk of kidney graft failure in the presence of anti-angiotensin II Type-1 receptor antibodies」, American Journal of Transplantation, vol. 13, no. 10, pp. 2577-2589, 2013（非特許文献3）に開示されているように、抗アンジオテンシンIIタイプ1受容体抗体は、移植拒絶反応に関連することも知られている。これらの最近の報告は、非HLA抗原が移植拒絶反応において重要な役割を果たしうることを実証している。残念ながら、移植拒絶反応を推進する特定の非HLA免疫原性抗原ドナー・レシピエントミスマッチは予測することが困難であり、現在は十分に定義されていない。
【０００７】
例えば、Goldfarb-Rumyantzev and  Naiman in Genetic predictors of acute renal transplant rejection, Nephrol Dial Transplant (2010) 25:1039-47（非特許文献4）によって要約されているように、移植拒絶反応に連関する非HLA候補遺伝子の遺伝的関連研究から、移植拒絶反応に関与しているとしてサイトカイン、ケモカイン、toll様受容体、およびVEGFをコードする遺伝子でのいくつかの単一ヌクレオチド多型(SNP)が報告されている。Ghisdal et al., Genome-wide association study of acute renal graft rejection, Am J Transplant (2016) 17(1):201-9（非特許文献5）によるゲノム規模での関連研究により、CMRの特定の表現型に関連している遺伝子座PTPROおよびCCDC67が同定された。さらに、Exome sequencing and prediction of long-term kidney allograft function, PLoS Comput Biol (2016)（非特許文献6）のなかで、Mesnardらにより記述されているように、エクソーム配列決定を用いて、細胞表面タンパク質におけるドナーとレシピエントとのペア間のミスマッチの全体的なレベルを評価し、このスコアは腎臓移植レシピエントでの長期の移植片機能を予測することが分かった。
【０００８】
これらの報告された結果は、遺伝子レベルでの多型が移植成績の予測因子として有用でありうることを示唆している。しかしながら、以前の研究の範囲は限られており、本開示の発明者らの知る限りでは、拒絶を予測する非HLA遺伝因子を体系的に同定する研究は公表されていない。したがって、腎臓および他のタイプの移植における拒絶を予測または推進するドナーおよびレシピエント遺伝子間の非HLAミスマッチを包括的に評価するためのツールの継続的な必要性が当技術分野において残ったままである。当技術分野では、免疫応答、移植損傷、および拒絶反応に寄与する非HLA因子を同定する必要がある。さらに、最適なペアリングを実施できるように、予測的ドナー-レシピエントペアの移植拒絶リスクを判定する予測ツールが当技術分野において必要とされている。さらに、移植レシピエントにおける拒絶反応のリスク、発症、および重症度を評価し、移植損傷を予防または軽減するための介入を可能にするモニタリングツールが当技術分野において必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Sigdel et al, Non-HLA antibodies to immunogenic epitopes predict the evolution of chronic renal allograft injury, J Am Soc Nephrol (2012) 23:750-63
【非特許文献２】Jackson et al., Endothelial cell antibodies associated with novel targets and increased rejection. J Am Soc Nephrol (2015) 26:1161-71
【非特許文献３】Taniguchi, et al.,「Higher risk of kidney graft failure in the presence of anti-angiotensin II Type-1 receptor antibodies」, American Journal of Transplantation, vol. 13, no. 10, pp. 2577-2589, 2013
【非特許文献４】Goldfarb-Rumyantzev and  Naiman in Genetic predictors of acute renal transplant rejection, Nephrol Dial Transplant (2010) 25:1039-47
【非特許文献５】Ghisdal et al., Genome-wide association study of acute renal graft rejection, Am J Transplant (2016) 17(1):201-9
【非特許文献６】Mesnard et al., Exome sequencing and prediction of long-term kidney allograft function, PLoS Comput Biol (2016)
【発明の概要】
【００１０】
移植成績を予測する非HLA遺伝因子の包括的同定のための新規の方法が本明細書において記述される。第1の局面において、本発明の範囲は、遺伝子レベルで重要な非HLAミスマッチを同定する新規の戦略を包含する。本方法は、不良な移植成績を予測する特定の多型を明らかにし、さまざまな集団で、多くのタイプの移植の移植リスクを評価するために適用されうる。
【００１１】
第2の局面において、本発明の範囲は、拒絶リスクの予測因子である新たに同定された遺伝的ミスマッチを用いて移植成績を予測する新規の方法を包含する。これらの新たに発見された遺伝的ミスマッチとそれに基づく予測モデルは、ドナーとレシピエントのペアリングが最適化されうるように、予測的ドナー-レシピエントペアの拒絶リスクを評価するための包括的なツールを提供する。
【００１２】
第3の局面において、本発明の範囲は、本明細書において開示されるミスマッチ抗原の使用による、予測的なまたは移植された移植片に対するレシピエント免疫感作の評価のための新規の方法を包含する。本方法は、移植前にドナーとレシピエントのペアリングを最適化するために、または移植後に移植片に対するレシピエントの免疫応答をモニターするために用いることができる。
【００１３】
第5の局面において、本発明の範囲は、本明細書において開示される診断方法の使用によりガイドされる、新規の処置方法を包含し、最適化された処置が移植を必要とするまたは移植を受けた対象に施されうる。
【００１４】
第6の局面において、本発明の範囲は、本明細書において記述されるさまざまな診断方法を実施するために利用されうる新規の診断製品およびキットを包含する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】移植成績の予測因子である遺伝的多型を同定する方法の例示的な実施の概略を描く。
【図２】抗体媒介拒絶(AMR)、T細胞媒介拒絶(CMR)、および拒絶反応なし(NoRej)の臨床エンドポイントによって層別化された、各ドナー-レシピエントペアでのミスマッチバリアントの分布を表す箱ひげ図である。
【図３】抗体媒介拒絶(AMR)、T細胞媒介拒絶(CMR)、および拒絶反応なし(NoRej)に対しての、非同義エクソンバリアントのみに制限された臨床エンドポイントごとの各群でのミスマッチバリアントの分布を表す箱ひげ図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本明細書において開示されるさまざまな発明は、レシピエントにおける移植拒絶リスクの評価を可能にする新規の方法、プロセス、研究ツール、診断ツール、および他の有用な態様を包含する。
【００１７】
本明細書において開示されるさまざまな発明は、移植片の移植成績を予測することに関する。移植片は、任意の選択された移植片タイプ、例えば、臓器、組織、細胞、腎臓、心臓、肺、肝臓、皮膚、角膜、腸、膵臓、四肢、指、骨、靭帯、軟骨、および腱からなる群より選択されるタイプを含みうる。本明細書において用いられる移植片への言及は、臓器全体およびその一部を包含する。
【００１８】
移植は、ドナー個人とレシピエント個人の間で行われると理解される。1つの態様において、レシピエントは予測的レシピエント、すなわち、予測的ドナーからの移植片の移植がまだ行われていない潜在的なレシピエントである。1つの態様において、レシピエントは、ドナーに由来する同種移植片が実際にレシピエントに移植された、実現(realized)ドナーである。
【００１９】
移植ドナーおよびレシピエントはヒトであってよく、例えば、レシピエントは処置を必要とするヒト患者であってよい。別の態様において、対象は、非ヒト動物、例えば動物患者または試験動物を含んでもよい。便宜上、本明細書において提供される記述はヒト対象に関する。当業者は、本明細書において開示される遺伝子およびタンパク質のホモログおよび/またはオルソログを利用することにより、本明細書において記述される方法および組成物を非ヒト動物に適用しうることが理解される。
【００２０】
本発明のいくつかの態様は、ドナー-レシピエントペアでの移植成績を予測することに関する。移植成績は、移植片の健全性および機能ならびに/または拒絶プロセスおよび事象に基づき必要に応じて定義されうる。いくつかの実施形態において、移植成績は「拒絶なし」であり、これは移植片の生存、移植片機能の維持、および/または移植片に対する免疫応答の欠如と定義されうる。1つの実施形態において、移植片の成績は「拒絶」であり、これは移植片の損傷、移植片の不全、移植片を標的とする免疫応答、または拒絶もしくは拒絶の症状の根底にある任意のプロセスの現れと定義されうる。1つの実施形態において、移植片の成績は抗体媒介拒絶(AMR)であり、これは移植片に対する抗体媒介傷害の発生、抗体媒介移植片不全、移植片中に、例えば移植内皮上に存在する種に結合するドナー特異的抗体(DSA)の存在、ならびに/または抗体媒介傷害および/または拒絶の任意の他の尺度と定義されうる。別の実施形態において、拒絶は細胞媒介拒絶(CMR)であり、これは移植組織に対して活性化されたT細胞により媒介される移植片の損傷もしくは不全、移植片抗原に対する活性化T細胞の存在、および/または細胞媒介拒絶の任意の他の尺度と定義されうる。
【００２１】
本明細書において開示されるさまざまな方法は、サンプル中の因子の評価に関する。選択されるサンプルタイプは、任意の生体材料を含みうる。例示的なサンプルとしては、血液、血清、移植片組織を含む組織、間質液、皮膚、口腔スワブまたは移植片を反映する遺伝情報および宿主の遺伝子プロファイルを含む任意の他の生体材料が挙げられる。1つの態様において、ドナーサンプルはドナーに由来する。1つの態様において、ドナーサンプルは、例えば生検による、レシピエントでの移植後の移植片に由来する。
【００２２】
拒絶に関連するミスマッチ
第1の局面において、本発明の目的は、さまざまなタイプの移植片に対して、拒絶を予測するおよび/または拒絶を推進する非HLA遺伝的ミスマッチを体系的に同定することである。そのような因子の判定は、レシピエントと予測的ドナーとのいっそう良好なマッチングの手段を提供し、同様に移植後のケアの改善も提供する。本明細書において開示される戦略は、拒絶において重要な遺伝的ミスマッチを解明するために用いられうる。
【００２３】
1つの実施形態において、本発明の範囲は、移植成績の予測因子である遺伝的ミスマッチを同定する方法を包含する。所定の遺伝子について、遺伝子の1つ(ホモ接合性遺伝子座の場合)または2つの(ヘテロ接合性遺伝子座の場合)バリアントが個体に存在する。ドナーに存在するバリアントが、レシピエントに存在する同じバリアントではない場合、これはミスマッチと見なされる。これらの遺伝的ミスマッチは、さまざまな手段により、移植片組織によって発現されるタンパク質とレシピエントによって発現されるタンパク質との間の相違として現れ、すなわち、ここで移植片は、レシピエントによって発現されるバリアントとは異なるタンパク質のバリアントを発現する。移植片によって発現された非宿主タンパク質バリアントは、免疫系により異物として認識されるリスクがあり、したがって移植片組織はさまざまな免疫プロセスの標的となり、重大な移植片の損傷および拒絶を引き起こしうる。
【００２４】
拒絶に関連する遺伝的ミスマッチはそれぞれ、ドナーとレシピエントが属する集団に、遺伝子座で配列の2つまたはそれ以上のバリアントが存在する、特定の多型遺伝子座で発生する。バリアントは、任意の構造的または多型的な相違によって互いに異なりうる。1つの態様において、多型はSNPである。SNPは、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を改変するコード遺伝子配列の変化を含む、非同義的置換を含みうる。SNPは、不適合なタンパク質表現型の直接的な原因でありうる(すなわちタンパク質の構造は遺伝的多型によって変化する)か、またはSNPは調節性であり、レシピエントにとってタンパク質を抗原性にさせるようにタンパク質の発現を引き起こしうる。別の態様において、SNPは、不適合なタンパク質表現型のマーカーである(すなわち多型は、不適合な移植片タンパク質をもたらす因子に連関している)。他の態様において、多型は対立遺伝子であり、染色体であり、可変数のタンデムリピートに基づくか、または挿入もしくは欠失変異を含む。
【００２５】
いくつかの場合には、多型はタンパク質のコード配列にある。他の場合には、多型は、例えば発現定量的形質遺伝子座(eQTL)を含む、調節配列にある。eQTLは、例えばタイミング、位置、発現の大きさなどに関して、1つまたは複数の遺伝子の発現を制御する。ドナーとレシピエントとの間のeQTL多型は、1つまたは複数のタンパク質の差次的発現をもたらしうる。
【００２６】
そのような多型のほとんどについて、遺伝子のドナーとレシピエントのバリアント間のミスマッチは、拒絶反応のリスクの増大と関連している。多型の小サブセットについては、ミスマッチは拒絶のリスクが低いことに関連している。本明細書において用いられる場合、拒絶に関連する多型は、例えば遺伝子レベルまたはタンパク質レベルで移植成績を予測する、任意の多型をいう。
【００２７】
第1の局面において、本発明の範囲は、選択された集団での拒絶に関連する遺伝的ミスマッチを同定する方法を包含する。選択された集団は、任意の数の人口学的特性を共有する複数の個体、例えば、同様の健康パラメータを有する選択された国もしくは国群の対象、または選択された人種もしくは民族群の対象を包含する。
【００２８】
拒絶に関連する遺伝的ミスマッチを同定する方法は、既知の移植成績を有する対象におけるミスマッチデータの事後分析の実施を包含する。拒絶に関連する多型を同定するための例示的な戦略を図1に描く。
【００２９】
1つの態様において、本発明は、以下の段階を含む、選択された移植片タイプの移植成績の予測因子である、拒絶に関連する遺伝的ミスマッチを同定する方法を包含する:
各レシピエントが、該選択された移植片タイプを含む移植片をドナーから受けている、複数のドナー-レシピエントペアを選択する段階;
該移植片の受け入れ後に、選択された期間、各レシピエントの移植成績をモニタリングする段階;
各ドナー-レシピエントペアのドナーおよびレシピエントの各々からサンプルを得る段階;
選択された遺伝分析を該サンプルに対して実施して、各ドナーおよびレシピエントの遺伝子プロファイルを作成する段階;
ドナーとレシピエントとの間のミスマッチ多型遺伝子座バリアントのセットを含む各ドナー-レシピエントペアのミスマッチプロファイルを作成する段階; ならびに
事後統計分析を実施して、ミスマッチが移植成績の予測因子である多型遺伝子座を同定する段階。
【００３０】
分析により、移植リスクへの寄与を有する拒絶に関連する遺伝的ミスマッチが同定されうる。そのような各ミスマッチは、遺伝子座(ミスマッチの部位)およびその遺伝子座で発現される2つまたはそれ以上のバリアントを包含し、ここでミスマッチのドナーおよびレシピエントのバリアントは移植成績に影響を及ぼす。
【００３１】
本発明の方法は上記に提示される段階の順序に限定されないこと、および本発明の範囲は段階の順序の変形を包含することが理解されるであろう。例えば、サンプルは、移植前または移植後に得られうる。
【００３２】
移植成績がモニターされる移植手順後の選択された期間は、移植手順後の、任意の期間、例えば、少なくとも3ヶ月、少なくとも6ヶ月、少なくとも9ヶ月、少なくとも1年、少なくとも18ヶ月、または少なくとも2年でありうる。
【００３３】
移植成績は、例えば、移植片の生存、移植片の機能、または移植片の損傷に基づいて、移植の成功または失敗の尺度により定義される2つまたはそれ以上の成績のうちの1つを含みうる。1つの態様において、例えば、成績は以下を含む: 移植後の選択された期間中に、移植片が不全とならず、および/または重大な損傷もしくは機能障害を経験しない、拒絶なし; 移植片の損傷および/または不全に関与する1つまたは複数の抗体媒介プロセスが、移植後の選択された期間中に関与している、AMR; ならびに1つまたは複数のT細胞媒介プロセスが、移植後の選択された期間中に移植片の損傷および/または不全に関与している、CMR。別の態様において、成績は移植後の選択された期間中に、上記に定義される、拒絶なし、ならびにいずれかの移植片の損傷および/または不全と定義される、拒絶である。
【００３４】
方法が成功するために、複数のドナー-レシピエントペアは、各成績の統計的に有効なサンプルが分析に含まれるように、移植後の選択された期間中に選択された各移植成績を有する複数のレシピエントを含む。そのような数は、ドナーとレシピエントのゲノムおよび移植成績のバラツキ、ならびに統計的厳密さの望ましい程度に依存するであろう。各成績のサンプルサイズは、例えば、少なくとも5名のレシピエント; 少なくとも10名のレシピエント、少なくとも20名のレシピエント; 少なくとも50名のレシピエント; および少なくとも100名のレシピエントを含みうる。
【００３５】
遺伝分析は、ドナーとレシピエントとの間の遺伝的差異を判定するための任意の遺伝分析でありうる。1つの態様において、遺伝分析は、全ゲノムまたはその選択された部分の配列決定を含む全ゲノム分析である。1つの態様において、遺伝分析は、タンパク質コード遺伝子配列の全部または一部が配列決定されるエキソソーム分析である。1つの態様において、分析は、発現される遺伝子の全部または一部が配列決定されるトランスクリプトーム分析である。好ましい実施形態において、全ての遺伝子の包括的分析を実施して、関心対象の全ての多型を捕捉する。別の実施形態において、遺伝子のサブセット、例えば、臓器特異的遺伝子が分析のために選択される。
【００３６】
分析は、当技術分野において公知の任意の適切なDNA分析ツールの使用により、例えばハイブリダイゼーションに基づく技法(例えば動的な対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、SNP遺伝子アレイ)、酵素に基づく方法(例えばRFLP、PCR分析、プライマー伸長アッセイ法、およびオリゴヌクレオチドライゲーションアッセイ法)、ならびに他の検出方法(例えば一本鎖コンフォメーション多型、温度勾配ゲル電気泳動、変性HPLC)により実施されうる。別の実施形態において、当技術分野において公知の方法を用いて、例えば免疫アッセイ法、タンパク質チップ、および他の検出技法によって、適当なサンプルから得られたタンパク質配列を比較することにより、拒絶に関連するミスマッチがタンパク質レベルで評価される。
【００３７】
統計分析は、ミスマッチを移植成績と相関させるための当技術分野において公知の任意の統計方法を含みうる。例えば、使用されうる分析方法は、ロジスティック回帰分析、線形判別分析、部分最小二乗判別分析、多重線形回帰分析、多変量非線形回帰、後方段階的回帰、閾値に基づく方法、ツリーに基づく方法、ピアソンの相関係数、サポートベクターマシン、一般化加法モデル、教師ありおよび教師なし学習モデル、クラスタ分析、ならびに当技術分野において公知の他の統計モデル生成方法を含む。
【００３８】
統計分析はさらに、ミスマッチデータを予測された移植成績に関連付ける予測モデルを生成するために利用されてもよい。予測モデルの入力は、ドナーとレシピエントのミスマッチのセットであり、モデルの出力は、ミスマッチのセットのリスク移植拒絶に関連するスコア、分類、もしくは確率、またはその他の出力である。入力はさらに、確率閾値、感度閾値、特異性閾値、または統計的有意性閾値を含めて、選択された閾値を含んでもよく、ここで出力は指定された閾値の範囲に入る。
【００３９】
予測モデルはミスマッチの数に基づいてもよく、例えば、ここでリスクはミスマッチの数とともに増加する。予測モデルはミスマッチのタイプに基づいてもよく、例えば、ここでAMRに関連するミスマッチの数とともにAMRリスクが増加するか、またはCMRに関連するミスマッチの数とともにCMRリスクが増加する。別の態様において、ミスマッチには、拒絶への相対的な寄与を反映する加重値が割り当てられる。このモデルは、ドナーおよびレシピエントの年齢、性別、人種、以前の移植数、ならびにHLA遺伝子座でのバリアントミスマッチの程度、拒絶に関連する抗体の存在、クレアチニン、または移植リスクの他の指標のような、移植リスクに関連する他の変数も考慮しうる。
【００４０】
モデルの出力は、予測される成績が正しいことの統計的有意性または尤度を示す確率スコアまたは他のスコアを含みうる。1つの態様において、予測モデルの出力はインデックススコアであり、移植成績を反映する定義された範囲内の値である。1つの態様において、モデルの出力は、確率スコア、例えば、Zスコアまたは拒絶の発生確率、例えば、AMRまたはCMRの発生確率である。1つの態様において、モデルの出力は分類、例えば拒絶なし、AMR拒絶、またはCMR拒絶としての移植の分類である。別の態様において、分類は、低い拒絶リスク、中間の拒絶リスク、または高い拒絶リスクである。
【００４１】
本発明の方法により、本発明者らは、表1に列挙されるいくつかの拒絶に関連する遺伝的ミスマッチを有利に同定した。これらの拒絶に関連する遺伝的ミスマッチは、腎臓を含む、多くの移植片タイプに広く適用可能である。表1に示されるように、本発明の特定の拒絶に関連する遺伝的ミスマッチは、抗体媒介拒絶に関連するミスマッチを含む「AMR」ミスマッチである。示されているように、表1の特定の拒絶に関連する遺伝的ミスマッチは、細胞媒介拒絶に関連するミスマッチを含む「CMR」ミスマッチである。表1のごく一握りの拒絶に関連する遺伝的ミスマッチは、より良好な移植成績、例えば拒絶なし(表1で「NoRej」と表示)に関連するミスマッチを含む、有益なミスマッチである。表1に列挙されているATP2B2、PLEKHM3、SEC13、およびTBCELに対して指定されたミスマッチは、有益なミスマッチを含む。示されているように、表1における特定の多型は、腎臓移植における拒絶に特に関連する(しかし、排他的予測ではない)ミスマッチを含む、腎臓拒絶に関連する遺伝的ミスマッチを含む。
【００４２】
表1
表1には、移植拒絶成績に関連するSNPが記載されている。各SNPは、例えば全米バイオテクノロジー情報センターdbSNPデータベースにおいてアクセスされうる、または別の方法で当技術分野において公知である、登録識別子によって識別される、当技術分野において公知のSNPである。各SNPリストには、遺伝子識別子(遺伝子)、遺伝子座情報(染色体および位置)、2つのバリアント遺伝子配列(参照配列および置換配列)、ならびにCMR、AMR、またはNoRejとしての分類(拒絶タイプ)が含まれる。特定のSNPは、腎臓に関連するSNPであることが示されている。
【００４３】
（表１）
2020526218.tif 000003
2020526218.tif 000004
2020526218.tif 000005
2020526218.tif 000006
【００４４】
移植成績の予測
1つの実施形態において、本発明の範囲は、選択されたドナー-レシピエントペアの移植成績を予測する方法を包含する。一般的方法は、以下の段階を含む:
ドナーからサンプルを得て、該サンプルにより、拒絶に関連する遺伝的ミスマッチの多型遺伝子座で発現されるドナーバリアントを同定する段階;
レシピエントからサンプルを得て、該サンプルにより、拒絶に関連する遺伝的ミスマッチの多型遺伝子座で発現されるレシピエントバリアントを同定する段階;
ドナーとレシピエントとの間のミスマッチバリアントのセットを含むミスマッチプロファイルをコンパイルする段階; ならびに
ミスマッチを移植成績に関連付ける予測モデルにミスマッチプロファイルを入力する段階であって、予測モデルの出力が該ドナー-レシピエントペアの移植成績の予測である、段階。
【００４５】
1つの実施形態において、予測方法は予測的ドナー-レシピエントペアに適用される。予測的ドナー-レシピエントペアにおいて、移植はまだ行われていない。予測的ドナー-レシピエントペアにおいて、レシピエントは移植を必要とする対象を含み、ドナーは必要とされる移植片の潜在的な供給源を含む。この文脈において、本発明の方法は、ドナーおよびレシピエントの適合性を評価するために適用される。結果として得られる適合性の尺度は、仮定上の移植を進めるかどうかを判定するための決定ツールとして用いられうる。例えば、選択された閾値を拒絶のリスクが超える場合、より適合性のあるドナーの方が良いとして仮定上の移植が撤回されうる。1つの実施形態において、本方法は、プール内の適合ドナーと不適合ドナーを同定するために、複数の潜在的ドナーのプールをスクリーニングするように実施される。
【００４６】
別の実施形態において、本発明のツールは移植後に適用される。これに関連して、本方法を適用して、対象の拒絶リスク、例えばAMRまたはCMR拒絶を判定することが可能である。
【００４７】
本発明の予測方法において、分析されるバリアントは、表1に列挙される1つまたは複数のSNP、例えば、
2020526218.tif 000007
からなる群より選択される1つまたは複数のSNPの代替配列を含みうる。さまざまな実施形態において、表1のSNPの少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも100個、または全てもしくは実質的に全てのバリアントのミスマッチが分析される。
【００４８】
1つの実施形態において、分析されるバリアントは、ランダムフォレスト分析によって同定された、1つまたは複数のSNP、例えば、
2020526218.tif 000008
からなる群より選択される少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも20個または少なくとも50個のSNPの代替配列を含みうる。
【００４９】
1つの態様において、移植成績はAMRを含み、分析されるバリアントは、
2020526218.tif 000009
からなる群より選択される1つまたは複数のAMR SNPのバリアントを含む。さまざまな実施形態において、表1のAMR SNPの少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも75個、または全てもしくは実質的に全てのバリアントのミスマッチが分析される。
【００５０】
1つの態様において、分析に用いられる1つまたは複数のAMR SNPは、AMR拒絶の予測因子である複数のミスマッチが見出される遺伝子からのSNPである。そのような遺伝子は、AP3D1 (例えば、SNP rs2072306、rs20567、rs2074959、rs2066775、およびrs4807203)、CDC123 (例えば、SNP rs2271804およびrs10951)、CDYL2 (例えば、SNP rs9940301およびrs9933302)、CSMD3 (例えば、SNP rs55980973、rs6992564、およびrs7839990)、FAM129B (例えば、SNP rs2251409およびrs2251409)、IL7 (例えば、SNP rs13264965およびrs4739138)、MUC3A (例えばSNP rs78118592およびrs200242471)、MYOM2 (例えば、SNP rs3817699およびrs3817700)、OR51F1 (例えばSNP rs1030723、rs11033793、rs10836609、およびrs1083661)、OR8G1 (例えば、SNP rs4268525およびrs2466636)、OR8G5 (例えば、SNP rs2512168、rs2512167、およびrs2466701)、PNPLA6 (例えば、SNP rs577219およびrs574663)、PSEN2 (例えば、SNP rs11405、rs2236910、rs2802267、およびrs10753428)、RASA3 (例えば、SNP rs4074317およびrs2274716)、ZNF280D (例えば、SNP rs28620278およびrs12911191)、ならびにSLCファミリー由来の遺伝子(例えば、SNP rs1061040、rs3803956、rs12706498、rs12737742、およびrs3734518)を含む。
【００５１】
1つの態様において、移植成績はCMRを含み、分析されるバリアントは、rs11247924; rs11247925; rs112586932; rs117918036; rs12191479; rs12293627; rs12562454; rs13074171; rs1573040; rs17046589; rs17696575; rs2231546; rs2231547; rs3745213; rs41282822; rs41282824; rs4719480; rs56307226; rs57268417; rs61884560; rs71255153; rs7448965; rs75004274からなる群より選択される1つまたは複数のCMR SNPのバリアントを含む。さまざまな実施形態において、表1のCMR SNPの少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも20個、または全てもしくは実質的に全てのバリアントのミスマッチが分析される。
【００５２】
1つの態様において、分析に用いられる1つまたは複数のCRM SNPは、CMR拒絶の予測因子である複数のミスマッチが見出される遺伝子からのSNPである。そのような遺伝子は、AIM1L (例えば、SNP rs12562454、rs57268417、rs11247924、およびrs11247925)、CHRNA10 (例えば、SNP rs2231547およびrs2231546)、ならびにKIAA1755 (例えば、SNP rs112586932、rs41282822、およびrs41282824)を含む。
【００５３】
1つの態様において、ミスマッチ分析は非同義エクソンSNPを含む1つまたは複数のSNPを利用する。非同義エクソンAMR SNPは、rs1030723; rs1052748; rs11033793; rs12737742; rs2466613; rs2512167; rs2512168; rs28620278; rs4904448; rs7107539; およびrs78118592を含む。非同義CMRエクソンSNPは、rs11247924; rs11247925; rs12562454; rs2231546; rs2231547; rs41282824; rs57268417; およびrs75004274を含む。
【００５４】
1つの態様において、移植タイプは腎臓であり、移植成績の予測は、rs1061040; rs12706498; rs12962744; rs17046589; rs20567; rs2066775; rs2072306; rs2074959; rs2243558; rs2251409; rs3803956; rs4719480; rs4807203; rs58394656; rs7448965; およびrs8124907からなる群より選択される1つまたは複数の腎臓関連SNPのバリアントを分析する。
【００５５】
1つの態様において、ミスマッチバリアントの数は移植成績の予測因子として利用される。1つの態様において、移植成績はAMRおよび拒絶なしを含み、AMR拒絶のリスク上昇は、拒絶なしの成績で観察されるよりも多数のミスマッチバリアントによって示される。例えば、図2に描かれるように、有意に多数のミスマッチバリアントはAMRを予測する。1つの態様において、中間の数のミスマッチバリアントはCMRを予測する。
【００５６】
例示的な態様において、本発明の範囲は、バリアントミスマッチの分析により移植成績を予測する方法を含み、ここで移植成績はAMR、CMR、および拒絶なしを含み、分析されるバリアントは、表1のSNPの少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも100個または全てもしくは実質的に全てを含むSNPのバリアントを含む。1つの態様において、表1の少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも20個、または少なくとも50個のSNPは、
2020526218.tif 000010
からなる群より選択される。1つの態様において、移植は腎臓移植を含む。1つの態様において、ドナーは予測的ドナーである。1つの態様において、AMRは、CMRおよび拒絶なしで観測されるよりも多数のミスマッチにより予測される。
【００５７】
有形製品
特定の態様において、本発明の範囲は、移植成績の予測因子であるミスマッチに関与するバリアントを検出するために用いられうる有形製品のコレクションを含む有形の製品またはキットを包含する。本発明の予測方法を実施する際に、サンプルに存在する選択されたバリアントを検出するために、さまざまな有形の構成要素が用いられうる。1つの実施形態において、予測方法はアレイ、すなわち、選択されたバリアントに特異的な核酸配列に相補的な固定化プローブを含む基材または複数の基材(例えばビーズ)の使用によって達成される。1つの態様において、アレイはSNPアレイである。1つの態様において、予測方法の実践において利用されるアレイは、表1に列挙されるSNPの1つまたは複数のバリアントを選択的に検出するであろう。さまざまな実施形態において、本発明のアレイは、表1のSNPの少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも100個、または全てもしくは実質的に全てを含むSNPのバリアントを検出できるプローブを含む。1つの態様において、アレイは、
2020526218.tif 000011
からなる群のSNPの少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも50個、または全てもしくは実質的に全てを含むSNPのバリアントを検出するであろう。
【００５８】
他の実施形態において、本発明の予測方法は、選択されたバリアントに特異的な核酸の選択的な増幅および/または検出のためのプライマーセットまたは有形製品の他のコレクションの使用によって達成される。1つの態様において、バリアントの選択的な増幅および/または検出のためのプライマーセットまたは有形製品のコレクションは、表1のSNPの少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも100個、または全てもしくは実質的に全てを含むSNPのバリアントを増幅する複数のプライマーを含む。1つの態様において、SNPは、
2020526218.tif 000012
からなる群より選択されるSNPの少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも50個、または全てもしくは実質的に全てを含む。
【００５９】
感作アッセイ法
本明細書において開示される新たに発見された拒絶に関連する遺伝的ミスマッチは、ドナーの移植片とのレシピエントの適合性を評価するためのツールを当技術分野に提供する。本明細書において開示されるさまざまな多型遺伝子バリアントはタンパク質をコードし、ここで宿主に存在しないバリアントを含む移植片タンパク質(すなわち、ミスマッチバリアントに由来する)は潜在的に抗原性であり、移植された移植片におけるそれらの存在が免疫介在性の移植片損傷をもたらしうる。そのようなタンパク質は、ミスマッチタンパク質に対する潜在的なまたは進行中のレシピエント免疫活性を評価するための診断方法において用いられうる。本明細書において用いられる場合、「バリアントコード抗原」とは、多型性の拒絶関連遺伝子の遺伝子座の各バリアントによりコードされるタンパク質をいう。バリアントコード抗原は、拒絶に関連する遺伝子における多型に起因する多型構造領域を断片または切断部分が包含する程度まで、タンパク質全体およびその断片または切断部分を包含する。本明細書において用いられる場合、「ミスマッチバリアント抗原」とは、ドナーに存在し、レシピエントには存在しないバリアントコード抗原をいう。
【００６０】
1つの実施形態において、本発明の範囲は、ミスマッチバリアント抗原に対するレシピエントの免疫感作を評価する方法を含む。本方法は以下の段階を含む:
ドナーからサンプルを得て、該サンプルにより、拒絶に関連する遺伝的ミスマッチの多型遺伝子座で発現されるドナーバリアントを同定する段階;
レシピエントからサンプルを得て、該サンプルにより、拒絶に関連する遺伝的ミスマッチの多型遺伝子座で発現されるレシピエントバリアントを同定する段階;
ドナーに存在しレシピエントには存在しない遺伝子バリアントのセットを含むミスマッチプロファイルをコンパイルする段階; ならびに
ミスマッチバリアント抗原に対する免疫要素を検出するために、レシピエントに由来するサンプルをアッセイする段階であって、そのようなバリアント抗原に対する免疫要素の存在が免疫媒介性の移植リスクを示す、段階。
【００６１】
本方法により、移植片に存在する可能性が高いミスマッチバリアント抗原に対するレシピエントの感作が評価されうる。偶然または遺伝的素因により、レシピエントは、移植片に見出され、レシピエントには見出されない抗原を標的とする1つまたは複数の事前に形成されたドナー特異的免疫要素を有し、移植が実施されるか、または実施された場合に拒絶リスクを生み出しうる。免疫要素は、AMRのエフェクタまたはCMRのエフェクタ、例えば、移植片のミスマッチ抗原に選択的に結合する抗体およびT細胞を含みうる。拒絶リスクの程度は一般に、レシピエントの免疫系により標的とされる異なるミスマッチ抗原バリアントの数ならびに/またはそのような抗原を標的とする免疫要素の多様性および豊富さとともに増加するであろう。
【００６２】
第1の実施形態において、感作アッセイ法は予測的ドナーペアにおいて実施される。本方法により、移植前のレシピエントの免疫状態に基づいて、予測的ドナー-レシピエントペアの適合性が評価されうる。これは、適合ドナーの選択および不適合ドナーの除外に役立つ。
【００６３】
第2の実施形態において、感作アッセイ法は実現ドナーペアにおいて実施される。本方法により、ミスマッチ移植片抗原に対するレシピエントの免疫系の感作を評価し、進行中の拒絶リスクまたは進行中の免疫媒介移植片損傷の尺度を提供しうる。ミスマッチ移植片抗原に対するレシピエントの免疫応答をモニターするために、評価は経時的に実施されうる。
【００６４】
本方法の実施において、バリアントコード抗原は、表1の1つまたは複数のSNPのバリアント、例えば、表1のSNPの少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、少なくとも100個、または全てもしくは実質的に全てを含む表1のSNPによりコードされるバリアントによりコードされるタンパク質を含みうる。1つの態様において、AMR拒絶のリスクは、表1の1つまたは複数のAMR SNP、例えば、表1の少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、または少なくとも75個のAMR SNPによりコードされるバリアントコード抗原に対するレシピエントの感受性によって評価される。1つの態様において、CMR拒絶のリスクは、表1の1つまたは複数のCMR SNP、例えば、表1の少なくとも5個、少なくとも20個、または少なくとも50個のCMR SNPによりコードされるバリアントコード抗原に対するレシピエントの感受性によって評価される。1つの態様において、腎臓移植拒絶のリスクは、表1に列挙される1つまたは複数の腎臓関連SNPによりコードされるバリアントコード抗原に対するレシピエントの感受性によって評価される。1つの態様において、バリアントコード抗原は、非同義エクソンAMR SNP: rs1030723; rs1052748; rs11033793; rs12737742; rs2466613; rs2512167; rs2512168; rs28620278; rs4904448; rs7107539; およびrs78118592; ならびに非同義CMRエクソンSNP: rs11247924; rs11247925; rs12562454; rs2231546; rs2231547; rs41282824; rs57268417; およびrs75004274を含む、非同義エクソンSNPのバリアントによってコードされるタンパク質である。
【００６５】
ミスマッチバリアント抗原に対する抗体の検出は、特定の抗原に対する抗体の検出のための当技術分野における任意の適切なツールを用いて実施されうる。例示的な方法としては、免疫沈降アッセイ法、抗原アレイ、抗体ELISAおよび当技術分野において公知の他の抗体検出方法の使用が挙げられる。1つの態様において、本発明の範囲はキットまたはアッセイ法の有形の構成要素を包含し、ここでそのようなキットまたはアッセイ法は、表1の多型遺伝子拒絶関連遺伝子によってコードされる1つまたは複数のバリアントコード抗原に対する抗体の検出を対象とし、例えば、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、または少なくとも100個のそのようなバリアントコード抗原の検出を対象とする。
【００６６】
CD8+ T細胞のような、CMRエフェクタの検出は、抗原特異的免疫細胞の検出のための当技術分野において公知の方法を用いて、例えば分泌サイトカインアッセイ法、フローサイトメトリーアッセイ法、酵素結合免疫スポット(Enzyme-Linked ImmunoSpot)アッセイ法、および当技術分野において公知の他の技法によって実施することができる。1つの態様において、本発明の範囲はキットまたはアッセイ法の有形の構成要素を包含し、ここでそのようなキットまたはアッセイ法は、表1の多型遺伝子拒絶関連遺伝子によってコードされる1つまたは複数のバリアントコード抗原に対するCD8+ T細胞または他のCMRエフェクタの検出を対象とし、例えば、少なくとも5個、少なくとも10個、少なくとも20個、少なくとも50個、または少なくとも100個のそのようなバリアントコード抗原の検出を対象とする。
【００６７】
処置の方法
別の局面において、本発明の範囲は、対象を処置する方法を包含する。第1の実施形態において、本方法は、以下のプロセスによって移植片を必要とする対象を処置する方法を包含する:
レシピエントと1人または複数人の仮定上のドナーとの間の選択された拒絶に関連する遺伝的ミスマッチの使用により、対象と1人または複数人の仮定上のドナーとの間の移植拒絶のリスクを評価する段階;
評価された移植拒絶リスクに基づいて適合ドナーを選択する段階;
選択されたドナーからの移植片のレシピエントへの移植を実施する段階。
【００６８】
別の実施形態において、本発明の方法は、以下の段階を含む、ドナーから移植片を受け入れたレシピエントにおける移植拒絶のリスクを改善する方法を含む:
レシピエントとドナーとの間の拒絶に関連する遺伝的ミスマッチの使用によりドナー-レシピエントペアの移植拒絶リスクの評価を実施する段階;
評価に基づき処置を施して移植拒絶のリスクを改善する段階。
【００６９】
例えば、1つの態様において、評価は拒絶リスクの上昇である。1つの態様において、評価は低い拒絶リスクである。1つの態様において、評価はAMRリスクの上昇である。1つの態様において、評価はCMRリスクの上昇である。評価に基づいて、適切な処置が対象に適用されうる。
【００７０】
例えば、拒絶リスクが高いと判定される場合、対象は、移植片機能または移植片損傷のいっそう頻繁なモニタリングに供されうる。同様に、拒絶リスクが上昇していると判定される場合、拒絶リスクを軽減するためのより積極的な処置が、低い拒絶リスクを有する対象に適用されるよりも移植後の対象に適用されうる。逆に、移植拒絶のリスクが低い場合、免疫抑制処置およびモニタリングが低減されうる。1つの態様において、CMRのリスクが上昇していると判明した場合、コルチコステロイドおよびT細胞枯渇剤の使用のような、CMRを軽減するのに適した処置が施される。1つの態様において、AMRのリスクが上昇している場合、AMRを処置するのに適した処置、例えば、血漿交換、静脈内免疫グロブリンの投与、およびB細胞枯渇が適用される。
【実施例】
【００７１】
非組織適合性抗原ミスマッチバリアントは、腎臓移植における抗体媒介拒絶リスクを予測する能力を改善する
研究デザイン
腎臓ドナー28名由来の腎臓移植(tx) 27例からのドナー-レシピエント(D/R)によりペアになった個体55名(レシピエント1名は2回目のtxをしなければならなかった)を選択し、血液DNAを用いて配列決定した。各血液サンプルは、txの前にドナーおよびレシピエントから得られた。レシピエントは、tx後の最初の6ヶ月中に生検により確定診断された拒絶の有無に基づき、3つの臨床カテゴリのうちの1つで選択された。AMRと確認されたレシピエントが14名、CMRと確認されたレシピエントが7名、および拒絶なしの安定したレシピエントが7名存在した。正常な6ヶ月のプロトコル生検および血清クレアチニンの評価に基づく安定した移植片機能を有する患者は、NoRej群に分類された。移植片機能不全の徴候生検(ベースラインを超える血清クレアチニンの20%超の上昇)に基づき、生検により確認された急性拒絶反応を有する患者は、腎臓同種移植組織病理学の標準バンフ(Banff)分類に基づいてCMRまたはAMRに分類された。移植後生検により最初の6ヶ月中に確認された拒絶反応を有する患者を豊富にするために、高度に感作された患者が選択された(平均cPRA 47±45)。AMRコホート中のレシピエント14名中12名が移植時に検査でDSA陽性となり、14名中13名が生検時に検査でDSA陽性となった。患者は、誘導のためにサイモグロブリンを投与され、その維持免疫抑制療法のためにステロイド、タクロリムス、およびミコフェノール酸モフェチルで維持された。移植後生検により最初の6ヶ月中に確認された拒絶反応を有する患者を豊富にするために、高度に感作された患者が選択された(平均cPRA 47±45)。分子HLAタイピングは、逆配列特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションによって実施された。ドナー特異的HLA抗体は、実施された固相免疫アッセイ法を用いて評価された。許容できないHLA抗原の割り当てとCPRAの計算は、陽性のフローサイトメトリークロスマッチを生成するのに十分な強度のHLA抗体特異性に基づいた。このコホートでは、exomeSeqおよび臨床データが、選択された公的に利用可能なデータセットを活用する機能的に関連する遺伝子発現データと統合された。全体的なデザインを図1に示す。
【００７２】
DNA抽出およびexomeSeq
ドナーおよびレシピエントから収集したPBMCからDNAを抽出し、標準的なエクソーム捕捉方法を適用した。エクソーム捕捉ライブラリを次に、エクソームあたり平均5500万リードおよび平均カバレッジ80xで55個のDNA血液サンプルにて配列決定した。bwa-mem (0.7.15)を用いて未加工のデータをヒトゲノムビルド37 (hg19)に割り当てた。配列データの品質管理ツールとしてFastqc (0.11.5)を用いた。bamファイル内の重複をマークするためにPicard (1.141)を用いた。高速大量処理配列決定データの分析用Genome Analysis Toolkit (GATK) (3.4-46)ソフトウェアパッケージを用いて、部分配列分析を実施した。再較正および再整合されたbamファイルを作成するためにGATKのBaseRecalibratorを用いた。バリアント呼び出しのためにGATKのHaplotypeCallerを用い、GATK Best Practicesの推奨にしたがいバリアント品質スコア再較正を用いてフィルタリングを行った。バリアント再較正(recalibrator)は、2段階のプロセスでバリアントを評価し、それぞれが異なるツールによって実施される: (1) VariantRecalibrator: 入力コールセットの高品質サブセットでアノテーション値を見てガウス混合モデルを作成し、全ての入力バリアントを評価する。この段階で再較正ファイルが作成される。(2) ApplyRecalibration: モデルパラメータを入力VCFファイル中の各バリアントに適用し、各バリアントにそのVQSLOD値が注釈された再較正済みVCFファイルを作成する。さらに、この段階は、指定されたVSQLOD閾値を満たさないバリアントのFILTER列に行を追加することにより、この新しいVQSLODスコアに基づいて呼び出しをフィルタ処理する。マルチアレルSNPならびに挿入および欠失(indels)は除外された。使用しているバリアントには、常染色体に限定された総数515,899個のバリアントを同定するANNOVARという注釈が付された。これらのバリアントから、サンプルの少なくとも95%で呼び出されたバリアントのみが考慮され、後続の分析で計488,539個のバリアントが得られた。
【００７３】
D/Rバリアントミスマッチ
D/Rペア間のバリアントミスマッチは、少なくとも1名の個体での1つの対立遺伝子の差異を考慮して測定された。分析のデータマトリックスは、全てのバリアントおよびD/Rペアを考慮しミスマッチについて考慮された。ミスマッチの総数により、ANOVA検定を実施して、臨床エンドポイント(AMR、CMR、またはNoRej)との全体的な関連について考慮し、各D/Rペアの人種および近縁性情報を考慮した「ゲノム距離」によってモデルを調整した。ゲノム距離は、主成分分析(PCA)での最初の2つの主成分を1000 Genomes Projectパネルで評価し、ユークリッド距離をペアで取得することにより取得された。
【００７４】
臨床エンドポイントを考慮した関連分析
臨床エンドポイントとのバリアントの関連性を評価した。列として28のD/Rペアを有し、行として少なくとも1つのペアがミスマッチの全てのバリアント(472,400バリアント)を有するデータマトリックスを用い、フィッシャーの直接確率検定を適用して、各特定のミスマッチバリアントと臨床エンドポイントとの間の関連性を見出した。AMRおよび/またはCMRのリスクの増大に関連するミスマッチバリアントを見出すために、ペアの数がその他との比較で各群において多かったバリアントの数を観察した。
【００７５】
遺伝子濃縮分析
公的に利用可能なデータセットを用いて、観察されたバリアントと関心対象の遺伝子に機能的に注釈を付した。標準ツールを用いて、関心対象の遺伝子の4つのリストを作成した: (1および2) 腎臓および血管において高度に発現され差次的に発現される(DE)遺伝子、(3) 免疫関連の遺伝子、ならびに(4) 細胞表面上に発現される遺伝子。遺伝子濃縮分析を実施するために、AMRに関連するバリアントを2つの異なる方法で遺伝子に注釈付けした: (1) それらが位置する遺伝子を考慮する、ならびに(2) 血管および全血中でGTExの発現定量的形質遺伝子座(eQTL)分析からのeGenesを考慮する。バリアントのこれら2つの注釈、4つの遺伝子リスト(腎臓、血管、免疫関連、および細胞表面)を用いたカイ2乗検定を使った濃縮分析を考慮する。注釈付きのバリアントをEnrichRツールで分析した。
【００７６】
臨床エンドポイントの予測分析
MT補正問題と統計的検出力の不足を克服するためにランダムフォレスト(RF)を適用した。RFは、予測および分類の問題のための機械学習法であり、小さなサンプルサイズで十分に機能し、いくつかのランダムツリーの作成を用いて、偽陽性および過剰適合の検出を回避する。RFは、それ自体で変数選択を実行しないため、アウトオブバッグエラー(OOB)率を最小化することによってRFに基づく変数選択法を提案するRパッケージ変数選択法を適用した。臨床エンドポイントに基づいてサンプルを分類するバリアントの特定のサブセットを見出すため。RFにおいて、各ツリーは元のデータからのブートストラップされたサンプルを用いて構築されるため、交差検証または不偏推定値を取得するための個別の試験セットは必要ない。事例の3分の1はツリーの構築から除外され、OOBエラーを取得するための試験セットとして用いられる。
【００７７】
結果
異なる臨床エンドポイントは、3つのカテゴリのうちの1つに28名のレシピエントを分配した: (1) NoRej群(n = 7): 安定な移植片機能(安定な血清クレアチニン)およびプロトコル生検により確認された何らの重大な病理または拒絶がない; (2) CMR群(n = 7): 移植片機能不全(ベースラインからの血清クレアチニンの20%超の増加)およびバンフ(Banff)基準を用いて生検により確認されたCMR; ならびに(3) AMR群(n = 14): 主要HLA抗原に対するDSAの有無に関わらずバンフ基準を用いた移植片機能不全および生検により確認された抗体媒介拒絶。D/Rバリアントミスマッチングの分析を実施するために、腎臓臓器txの前に28のD/RペアでexomeSeqを実施した。全ての患者は、ミコフェノール酸モフェチル、タクロリムス、およびステロイドによる同様の維持免疫抑制と、サイモグロブリンによる誘導を受けていた。ESRDの原因を含めて、人口学的パラメータは、患者の3つのサブセット間でマッチした。
【００７８】
txの前に評価されたD/Rバリアントミスマッチの総数は、AMR群で有意に高いことが示された(ANOVA検定, AMR vs. NoRej, p値 = 0.02)。1つまたは複数の臨床エンドポイントに特に関連する特定のD/Rバリアントミスマッチの追加分析により、123バリアントの新規セットが同定された(フィッシャーの直接確率検定, p値 <0.001)。65バリアントの最小限のセット(123バリアントのセットからの)をRF (精度エラー = 0.03)で選択し、繰り返し並べ替え検定の非常に堅牢な性能で、tx後のレシピエントに全3サンプルの表現型結果の明確な分類を提供した。拒絶プロセスで濃縮された候補(免疫関連)を選択するため、およびレシピエントの免疫応答により認識される可能性がより高い候補(細胞表面発現)を選択するため、AMRの影響を最も受けた解剖学的部位(血管)に、移植された臓器(腎臓)において高度に濃縮された遺伝子。
【００７９】
より多数のtx前D/Rミスマッチバリアントはtx後AMRのリスクの増大と関連する
D/Rペアごとのバリアントの違いを、ヒト参照ゲノムビルド37 (hg19)に関して評価した。特定のSNP位置のドナーとレシピエントとの間の対立遺伝子の1つが異なる場合、バリアントミスマッチが考慮された。少なくとも1つのD/Rペアにおいてミスマッチであった472,400個のバリアントが同定された; AMR群では386,958個が少なくとも1つのミスマッチを有し、CMR群では268,722個、およびNoRej群では248,531個が有していた。NoRej群との比較でAMR群において有意に増加した数のミスマッチバリアントが観察され(ANOVA p値 = 0.04) (図2)、予想通り、ミスマッチバリアントの数も、ドナーとレシピエントとの間の人種差、およびD/Rペアが近縁であるかどうかに依存していることが観察された。AMR群は最大数のD/R人種ミスマッチを有することが認められたため、PCAを実施することにより各D/Rペアにおいてバリアントミスマッチ数に対するAMRおよび人種ミスマッチを分析した。予想通り、研究のドナーとレシピエントは、ミスマッチバリアントの数にしたがって、より遠くまたはより近くにクラスタ化し、また彼らが自己申告した人種と一致する集団とともにクラスタ化した。ゲノム距離は、D/Rペアによるプロットでのユークリッド距離を考えるために考慮された。この変数は、先のANOVA分析を調整するために用いられ、AMRは依然としてかなり多数のミスマッチと有意に関連していることが観察された(p値 = 0.02; AMR vs. NoRej)。
【００８０】
観察されたミスマッチバリアントの生物学的意義を評価するために、その機能分類を調べた。ミスマッチバリアントの25%はエクソンであり、それらのほぼ半数が非同義であり、したがってタンパク質機能に影響を与える可能性がいっそう高い。非同義バリアントのみを考慮するANOVA検定を適用し、前の結果と同様に、これらはレシピエントがtx後にAMRを発症したD/Rペアで有意に高いことが分かった(図3)。
【００８１】
D/Rミスマッチバリアントは移植後のAMRと関連する
123個の独特なバリアント(19個の非同義) (p < 0.001; フィッシャーの直接確率検定)は、AMRでは87%、CMRでは57%、およびNoRejでは20%の発生率で、tx後のAMR、CMR、またはNoRejの3つの臨床エンドポイントのいずれかに名目上関連付けられると特定された。臨床群ごとに最も有意なバリアントを最良に評価するため、他の2つと比較してD/Rペアコホートごとにバリアントセットの最大の影響を評価した; この場合も先と同様に、(大域分析によって先に見られたように) 94個のバリアントがAMRで最も濃縮され(AMR > CMR > NoREJ)、25個のバリアントがCMRで(CMR > NoRej > AMR)、ならびに4個のバリアントが低免疫リスクおよびNoRejで濃縮され(NoRej > AMR > CMR)、AMRのミスマッチバリアントの濃縮が示された。D/Rペア間の人種ミスマッチと近縁性の独立性を説明するために、フィッシャーの直接確率検定を用いて123個のバリアントがこれら2つの変数のいずれかに関連付けられ、独立性を有意に裏付けるものがないかどうかを試験した。
【００８２】
HLA領域中のD/RミスマッチバリアントはミスマッチnHLAバリアントよりもtx後AMRに及ぼす影響が少ない
同定された123個のバリアントのどれもHLA領域に属していなかった。これらのサンプルにおけるHLAミスマッチの潜在的な役割に対処するため、臨床エンドポイントおよびDSAの存在により9つの主要なHLA遺伝子(HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5、HLA-DQB1、HLA-DPB1)を考慮してHLAミスマッチ間で関連分析を実施したところ、血清型およびexomeSeqによるHLA測定は、非常に一致した結果を示した。この分析は、HLA血清型決定(標準処置)によって検出された抗原により測定されたデータを考慮し、これら9つのHLA遺伝子におけるバリアントミスマッチの数を考慮して実施された。HLAとtx後の拒絶または拒絶なしの臨床エンドポイントとの関連について有意な結果は観察されなかった(p値 = 0.3, HLA抗原データ; p値 = 0.6 HLA exomeSeqデータ)が、どちらの場合にも、拒絶群におけるHLAミスマッチの数は多くなる傾向がある。予想通り、DSAの数が多いほど、HLAミスマッチの数が多い境界線上の有意性を有していた(p値 = 0.07, HLA抗原データ)。さらに、データ分析の陽性対照として、HLAミスマッチ、人種ミスマッチおよび近縁性の間で関連分析を行い、予想通り、近縁のD/Rペアにおいて有意に減少した数のHLAミスマッチが見出され(p値 = 0.03)、人種ミスマッチD/RペアにおいてHLAミスマッチ数の有意でない増加が見出された。
【００８３】
tx後AMRのリスク増大に関連するバリアントは、関連する遺伝子セットにおいて濃縮されている
123個の有意に関連するミスマッチバリアントの生物学的影響を評価するために、バリアントの影響を異なる遺伝子発現データセットで評価した。第1の仮定は、対応する遺伝子における変異がドナーまたはレシピエントの腎臓で変異mRNA、および結果として変異タンパク質をもたらし、これがレシピエントで抗体応答を誘発し、腎同種移植片拒絶および損傷をもたらしうるというものであった。第2の仮定は、遺伝子における変異が、同じ遺伝子中(シス)でのまたは別の遺伝子座(トランス)での異なるmRNA発現(eQTL)をもたらし、これが次に、ドナー腎臓におけるタンパク質発現の変化を生み出し、その結果、レシピエントでの抗体応答を誘発し、腎同種移植片拒絶および損傷を推進するというものである。これを念頭に置き、GTExのeQTL分析を用いてバリアントを遺伝子に注釈付けした。ドナー腎臓におけるAMR損傷の重要な病理生物学はドナーの微小血管系で発生するため、全血および血管における関連eQTLのみが考慮された。AMRに関連する94個のバリアントは、72個の独特な遺伝子に存在することが分かった。これは、予測モデルでの生物学的関連性の重み付けに用いられうる因子である、バリアントを2つ以上有する遺伝子があるためである。複数のバリアントを有する遺伝子は、AP3D1 (バリアント5-同義1)、CDC123 (バリアント2)、CDYL2 (バリアント2)、CSMD3 (バリアント3)、FAM129B (バリアント2)、IL7 (バリアント2)、MUC3A (バリアント2-非同義1, 同義1)、MYOM2 (バリアント2)、OR51F1 (バリアント4-非同義2)、OR8G1 (バリアント2)、OR8G5 (非同義バリアント2, 同義1)、PNPLA6 (バリアント2)、PSEN2 (バリアント4-同義1)、RASA3 (バリアント2)、ZNF280D (バリアント2-非同義1)、およびSLCファミリー(バリアント5-非同義1, 同義2)であった。19個の非同義バリアントのうちの7個(37%)がAMR特異的遺伝子に位置していた。CMRに関連する25個のバリアントは22個の独特な遺伝子に存在し、そのうちの以下が複数のバリアントを有していた: AIM1L (非同義バリアント4)、CHRNA10 (非同義バリアント2)およびKIAA1755 (バリアント3-非同義1, 同義1)。CMRについて、19個のうち7個(37%)の非同義バリアントは、複数のバリアントを有する遺伝子に位置していた。
【００８４】
eQTLのマッピングを実施すると、37個のeQTLが血管に関連するデータセットにおいて濃縮されていることが分かり、22個が全血に関連するデータセットにおいて濃縮されており、2つ以上の遺伝子に関連付けられたバリアントまたは2つ以上のバリアントに関連付けられた遺伝子によって定義される、いくつかの同定された「ホットスポット」を伴っていた。eQTLは、tx後AMRのリスクに関連するバリアントでのみ見出されることが観察された。
【００８５】
第3に、有意なSNPの濃縮を、研究に機能的に関連する4セットの遺伝子内で評価した。公的に利用可能なデータ、腎臓(関心対象の移植臓器)、内皮(AMRにおける関心対象の標的細胞)において、免疫細胞(拒絶における関心対象のエフェクタ細胞)において高発現またはDEの遺伝子、および細胞表面発現遺伝子(変異ドナー抗原エピトープとレシピエント抗体パラトープとの間の相互作用のいっそう高い可能性を有しうる)の使用。遺伝子の各セットについて、χ2検定を用い濃縮分析を実施した。tx後AMRのリスクに関連すると先に同定されたバリアントを考慮する場合、免疫関連遺伝子(p値 = 0.007)および細胞表面遺伝子(p値 = 4.7＊10-7)の統計的に有意な濃縮が見出された。CMRについては、免疫関連遺伝子の有意な濃縮も見られた(p値 = 0.02)。
【００８６】
さらに、AMRでのバリアントeQTL分析により、腎臓特異的遺伝子(eQTL血管: p値 = 0.004; eQTL全血: p値 = 0.0005)ならびに血管(eQTL血管: p値 = 0.02; eQTL全血: p値 = 0.002)の有意な濃縮が同定された。
【００８７】
ウェブに基づくツールEnrichRを用い、ミスマッチバリアントを有する拒絶特異的遺伝子における共通の生物学的経路およびプロセスを見出すために遺伝子セット濃縮分析を実施した(42, 43)。重要なことに、AMRに関連する72個の独特な遺伝子は、活性な膜貫通輸送体活性(GO:0022804) (p値 = 0.0008)および免疫応答活性化細胞表面受容体シグナル伝達経路(GO:0002429) (名目p値 = 0.1)について濃縮された。CMRに排他的に関連する22個の遺伝子を評価した場合、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞の濃縮が見出された(名目p値 = 0.1)。
【００８８】
機械学習技法は、新規D/Rミスマッチバリアントに基づきtx後拒絶リスクの堅牢な予測を提供する
フィッシャーの直接確率検定を用いた先の分析では、一度に単一のバリアントを多数の統計的検定で分析し、これを小さなサンプルサイズと組み合わせた結果、複数の仮説修正閾値を超えるバリアントはなかった。また、マルチクラス問題(臨床エンドポイントの3つ以上のカテゴリ)のモデリングは、統計的検出力にさらに悪影響を及ぼす。この問題に対処するため、より高度な統計手法を用いて、機械学習技法RFで統計的検出力の問題を回避した。RFは、各予測子の重要性を定量化する全ての予測子(ミスマッチバリアント)を用いて、応答変数(臨床エンドポイント)の分類モデルを構築する。研究の臨床エンドポイントを予測できるミスマッチバリアントの群があるかどうか見出すために、ランダムフォレストソフトウェアパッケージ(VSURF)を使った変数選択を用いた。VSURFアルゴリズムを適用した後に、非常に小さなOOBエラー率(0.03)で65個のミスマッチバリアントが見出された。ここでOOBは最終フォレストの精度を測定する。バイナリヒートマップにおいて、3つの臨床エンドポイントは、人種のミスマッチおよび近縁性に関係なく、完全にクラスタ化する。これらのバリアントをまた、人種のミスマッチおよび近縁性との関連を見出すために、前述のようにフィッシャーの直接確率検定で試験したところ、有意な関連性は観察されなかった。結果がランダムな偶然によるものではないことをさらに検証するために、元のデータセットから臨床エンドポイントのラベルをシャッフルする並べ替え検定を実施した。
【００８９】
考察
抗体媒介拒絶は、tx後の、レシピエントとのドナー特異的HLA抗原ミスマッチに対する新生DSAの発生の結果としての、同種移植片機能不全および移植片喪失の主な原因である。AMR応答の主な標的は高度に多型のHLA抗原であるが、拒絶プロセスはHLAが同一の兄弟でも観察されており、AMRでのこれらのミスマッチnHLA抗原に対する病原性抗体を推進しうるD/R nHLA抗原ミスマッチの重要な役割を示唆している。本明細書において記述される結果は、tx前のミスマッチバリアント数の有意な増加を示し、これはtx後のレシピエントでの生検により確認された急性拒絶反応の発生と有意に相関している。
【００９０】
D/Rペアがミスマッチのバリアントの総数は、レシピエントがtx後にAMRを生じ続ける場合にいっそう高い。また、生検により確認されるAMR、生検により確認されるCMR、または安定な機能かつ拒絶なしのいずれかの、tx後の異なる臨床エンドポイントを生じる群への、tx前の患者の免疫リスク層別化を正確に予測できる、非常に洗練されたバリアントセットが同定された。本研究に関与した患者はさまざまなHLA抗原に感作されていたにもかかわらず、これらの新たに同定されたバリアントはいずれもHLA領域に位置していなかった。重要なことに、AMR群は人種ミスマッチであったが、NoRejは近縁性において濃縮されており、この所見が人種ミスマッチと近縁性の両方で独立していることを実証していた。
【００９１】
tx後AMRのリスク増大と有意に関連する94個のバリアントはさらなる分析により、免疫関連機能において濃縮された72個の独特な遺伝子に位置し、拒絶プロセスにおけるその役割が支持された; さらに、これらのバリアントはまた、細胞表面に発現される可能性がより高い遺伝子にマッピングされ、これらの遺伝子の発現/機能の変化はレシピエントの免疫系によって認識される可能性がより高いことを示唆しており、nHLA標的に対する抗体応答発生の可能性を支持している。
【００９２】
残りの25個のバリアントはtx後CMRに排他的に関連していたことから、特定のnHLAバリアントミスマッチはCMRの発生に影響することも観察された。これらの25個のバリアントは22個の独特な遺伝子にマッピングされ、CD4+ T細胞およびCD8+ T細胞が関与する免疫関連機能において高度に濃縮されている。本研究はまた、AMRおよびCMRにおける損傷の引き金と機構との間の重要な本質的相違の存在を強調している。
【００９３】
本研究における拒絶に関連する遺伝子は生物学的に関連している; 具体的には、複数の関連バリアントも有するもの(AP3D1、CDC123、CDYL2、CSMD3、FAM129B、MUC3A、MYOM2、OR51F1、OR8G1、OR8G5、PNPLA6、PSEN2、RASA3、ZNF280D、AIM1L、CHRNA10およびKIAA1755ならびにSLCファミリー)である。これらの遺伝子のうちの18個中15個が移植後AMRのリスクに関連しており、非同義バリアントの大部分(74%)はこれらの遺伝子に位置し、tx後CMRのリスクに関連する3つの他の遺伝子(AIM1L、CHRNA10、およびKIAA1755)に位置している。これらのバリアントは、tx後の拒絶に対するその影響のために生物学的に重要である可能性が高い。
【００９４】
さらに、AMRとの関連での生物学的関連性は、AMRにおける損傷の標的臓器である血管および腎臓において有意に濃縮されているeQTL (1つまたは複数の遺伝子の発現レベルに影響を与えうるDNA配列バリアント)として同定されたバリアントの多くに帰することができる。内皮eQTLに多くのホットスポット(2つ以上のバリアントが1つの遺伝子に関連し、その逆も同様である)が観察された。例えば、FAM129B遺伝子に位置する2つのSNP (rs2251409およびrs2243558)は、血管組織において濃縮されている3つの異なる遺伝子(SLC2A8、ZNF79、およびRPL12)に関連する。その一方で、他の遺伝子は複数のバリアントに関連しており、例えば、AP3D1は、同じ遺伝子に位置する5つの異なるSNPに関連している。多くの嗅覚伝達因子遺伝子(OR51F1、OR8G1、およびOR8G5)におけるSNPは、循環血中VWFタンパク質のレベルの変動を引き起こし臓器tx後の生存に著しく影響を与えることが最近の研究において明らかにされた、共通遺伝子VWA5A (フォン・ヴィレブランド因子Aドメイン含有タンパク質5A)に対する血管中eQTLにマッピングされる。したがって、ドナーとレシピエントとの間の機能的に関連するバリアントの相違は、ペア間の特定の遺伝子でのミスマッチバリアントに関連しうるだけでなく、これらのバリアントが修飾しうる他の下流遺伝子にも関連しうる。
【００９５】
OOBエラー推定値およびRFの変数重要度測定値を用いて、各臨床エンドポイント(AMR、CMR、およびNoRej)の変数選択法を実施するアルゴリズムを構築する戦略VSURFの適用により、tx後の患者転帰に関して完全に全てのAMR、CMR、およびNoRejサンプルを分類する、フィッシャーの直接確率検定で見出された123個のバリアントのサブセットである65個のバリアントが検出された。また、tx後CMRを生じた患者は、CMRでの主要な細胞プレーヤーであるCD4/CD8+ T細胞における遺伝子機能に主に関連する独特なバリアントを有していた。NoRej群は、これらの患者のほとんどが拒絶群におけるバリアントでのミスマッチのいずれかを欠如しているため、十分よく分類される。
【００９６】
結論として、tx後の拒絶反応の高いリスクと関連し、tx後のAMRまたはCMRの異なる組織学的群と予後的群とを識別できるD/R特異的ミスマッチバリアントの有限かつ新規のセットが本明細書において同定される。この重要な情報は、2名以上のドナーが考慮されている場合に最適なドナーを選択するために、またはAMRおよびCMRのtx後の拒絶リスクを評価し、免疫リスクを軽減するよう誘導および維持免疫抑制を個人向けにするためにtx手術の前に得ることができる。ドナーの選択を最適化することにより、拒絶、特にAMRを防ぐことは、長期的なtx転帰の改善に大きなプラスになるであろう。
【００９７】
本明細書において引用された全ての特許、特許出願、および刊行物は、各独立した特許出願、または刊行物が参照により組み入れられることが具体的かつ個別的に示されるのと同程度に参照により本明細書に組み入れられる。開示された態様は、限定ではなく例示の目的で提示されている。本発明を、記述されたその態様を参照して記述してきたが、全体として本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の構造および要素に変更を加えることができることは当業者には理解されよう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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