(57)【要約】  提供されるのは、早期膵管腺癌の検出のための方法および関連するキットである。同様に提供されるのは、膵管腺癌に対して感受性である患者または膵管腺癌に対して感受性の疑いがある患者を処置する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
前記患者から生体サンプルを得ること、
前記生体サンプル中のＣＡ１９−９抗原のレベルを測定すること、
前記生体サンプル中のＴＩＭＰ１抗原のレベルを測定すること、
前記生体サンプル中のＬＲＧ１抗原のレベルを測定すること
を含み、
ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原の量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
【請求項２】
膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
前記患者から生体サンプルを得ること、
前記サンプルを、ＣＡ１９−９抗原に結合する第１のレポーター分子と接触させること、
前記サンプルを、ＴＩＭＰ１抗原に結合する第２のレポーター分子と接触させること、
前記サンプルを、ＬＲＧ１抗原に結合する第３のレポーター分子と接触させること
を含み、
前記第１のレポーター分子、前記第２のレポーター分子および前記第３のレポーター分子の量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
【請求項３】
膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
前記患者から生体サンプルを得ること、
ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原に結合するための手段を有する表面を提供すること、
前記生体サンプルと共に前記表面をインキュベートすること、
前記表面を、ＣＡ１９−９抗原に結合する第１のレポーター分子と接触させること、
前記表面を、ＴＩＭＰ１抗原に結合する第２のレポーター分子と接触させること、
前記表面を、ＬＲＧ１抗原に結合する第３のレポーター分子と接触させること、
前記表面と会合している前記第１のレポーター分子の量を測定すること、
前記表面と会合している前記第２のレポーター分子の量を測定すること、
前記表面と会合している前記第３のレポーター分子の量を測定すること
を含み、
前記第１のレポーター分子、前記第２のレポーター分子および前記第３のレポーター分子の前記量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または疾患に対して感受性ではないと分類する、方法。
【請求項４】
膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
前記患者から生体サンプルを得ること、
ＣＡ１９−９抗原に結合するための手段を有する第１の表面を提供すること、
ＴＩＭＰ１抗原に結合するための手段を有する第２の表面を提供すること、
ＬＲＧ１抗原に結合するための手段を有する第３の表面を提供すること、
前記生体サンプルと共に前記第１の表面をインキュベートすること、
前記生体サンプルと共に前記第２の表面をインキュベートすること、
前記生体サンプルと共に前記第３の表面をインキュベートすること、
前記第１の表面を、ＣＡ１９−９抗原に結合する第１のレポーター分子と接触させること、
前記第２の表面を、ＴＩＭＰ１抗原に結合する第２のレポーター分子と接触させること、
前記第３の表面を、ＬＲＧ１抗原に結合する第３のレポーター分子と接触させること、
前記第１の表面と会合している前記第１のレポーター分子の量を測定すること、
前記第２の表面と会合している前記第２のレポーター分子の量を測定すること、
前記第３の表面と会合している前記第３のレポーター分子の量を測定すること
を含み、
前記第１のレポーター分子、前記第２のレポーター分子および前記第３のレポーター分子の前記量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または疾患に対して感受性ではないと分類する、方法。
【請求項５】
膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
前記患者から生体サンプルを得ること、
ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原に結合するための手段を有する表面を提供すること、
前記生体サンプルと共に前記表面をインキュベートすること、
前記表面を、ＣＡ１９−９抗原に結合する第１のリレー分子と接触させること、
前記表面を、ＴＩＭＰ１抗原に結合する第２のリレー分子と接触させること、
前記表面を、ＬＲＧ１抗原に結合する第３のリレー分子と接触させること、
前記表面を、前記第１のリレー分子に結合する第１のレポーター分子と接触させること、
前記表面を、前記第２のリレー分子に結合する第２のレポーター分子と接触させること、
前記表面を、前記第３のリレー分子に結合する第３のレポーター分子と接触させること、
前記第１のリレー分子およびＣＡ１９−９抗原と会合している前記第１のレポーター分子の量を測定すること、
前記第２のリレー分子およびＴＩＭＰ１抗原と会合している前記第２のレポーター分子の量を測定すること、
前記第３のリレー分子およびＬＲＧ１抗原と会合している前記第３のレポーター分子の量を測定すること
を含み、
前記第１のレポーター分子、前記第２のレポーター分子および前記第３のレポーター分子の前記量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
【請求項６】
膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
前記患者から生体サンプルを得ること、
ＣＡ１９−９抗原に結合するための手段を有する第１の表面を提供すること、
ＴＩＭＰ１抗原に結合するための手段を有する第２の表面を提供すること、
ＬＲＧ１抗原に結合するための手段を有する第３の表面を提供すること、
前記生体サンプルと共に前記第１の表面をインキュベートすること、
前記生体サンプルと共に前記第２の表面をインキュベートすること、
前記生体サンプルと共に前記第３の表面をインキュベートすること、
前記第１の表面を、ＣＡ１９−９抗原に結合する第１のリレー分子と接触させること、
前記第２の表面を、ＴＩＭＰ１抗原に結合する第２のリレー分子と接触させること、
前記第３の表面を、ＬＲＧ１抗原に結合する第３のリレー分子と接触させること、
前記第１の表面を、前記第１のリレー分子に結合する第１のレポーター分子と接触させること、
前記第２の表面を、前記第２のリレー分子に結合する第２のレポーター分子と接触させること、
前記第３の表面を、前記第３のリレー分子に結合する第３のレポーター分子と接触させること、
前記第１のリレー分子およびＣＡ１９−９抗原と会合している前記第１のレポーター分子の量を測定すること、
前記第２のリレー分子およびＴＩＭＰ１抗原と会合している前記第２のレポーター分子の量を測定すること、
前記第３のリレー分子およびＬＲＧ１抗原と会合している前記第３のレポーター分子の量を測定すること
を含み、
前記第１のレポーター分子、前記第２のレポーター分子および前記第３のレポーター分子の前記量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
【請求項７】
前記表面の少なくとも１つは、ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１からなる群から選択される抗原に選択的に結合する少なくとも１つのレセプター分子を含む、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記表面の少なくとも１つは、固体粒子の表面である、請求項３〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記固体粒子は、ビーズである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記レポーター分子の少なくとも１つは、酵素に連結されている、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のレポーター分子の少なくとも１つは、検出可能なシグナルを生成する、請求項２〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
検出可能なシグナルは、分光測定法によって検出可能である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分光測定法は、質量分析法である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のレポーター分子は、ＣＡ１９−９抗原に選択的に結合する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２のレポーター分子は、ＴＩＭＰ１抗原に選択的に結合する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第３のレポーター分子は、ＬＲＧ１抗原に選択的に結合する、請求項２〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
前記患者から生体サンプルを得ること、
前記生体サンプルをＣＡ１９−９抗体と接触させ、かつ前記抗原と前記抗体との間の結合を観察することにより、前記生体サンプル中のＣＡ１９−９抗原のレベルを測定すること、
前記生体サンプルをＴＩＭＰ１抗体と接触させ、かつ前記抗原と前記抗体との間の結合を観察することにより、前記生体サンプル中のＴＩＭＰ１抗原のレベルを測定すること、
前記生体サンプルをＬＲＧ１抗体と接触させ、かつ前記抗原と前記抗体との間の結合を観察することにより、前記生体サンプル中のＬＲＧ１抗原のレベルを測定すること、
ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１レベルの測定値によって決定されるように、前記患者の状態を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないかのいずれかに割り当てること
を含む方法。
【請求項１８】
膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
前記患者から生体サンプルを得ること、
前記生体サンプル中のＣＡ１９−９抗原のレベルを測定すること、
前記生体サンプル中のＴＩＭＰ１抗原のレベルを測定すること、
前記生体サンプル中のＬＲＧ１抗原のレベルを測定すること、
第１の標準値と比較してＣＡ１９−９抗原のレベルを決定することであって、比は、膵管腺癌を予測する、決定すること、
第２の標準値と比較してＴＩＭＰ１抗原のレベルを決定することであって、比は、膵管腺癌を予測する、決定すること、
第３の標準値と比較してＬＲＧ１抗原のレベルを決定することであって、比は、膵管腺癌を予測する、決定すること、および
ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１レベルの前記比の統計分析によって決定されるように、前記患者の状態を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないかのいずれかに割り当てること
を含む方法。
【請求項１９】
膵管腺癌に対する患者の感受性を予測する方法であって、
前記患者から生体サンプルを得ること、
前記生体サンプル中のＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルを測定すること、および
前記ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１レベルの統計分析によって決定されるように、予測因子を算出すること
を含む方法。
【請求項２０】
膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
前記患者から生体サンプルを得ること、
前記生体サンプル中のＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルを測定すること、および
前記生体サンプル中の前記ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルの統計分析によって決定されるように、前記患者の状態を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないかのいずれかに割り当てること
を含む方法。
【請求項２１】
患者から得られた生体サンプルを使用して、膵管腺癌に対する感受性を検出する方法であって、
前記生体サンプル中に存在するＣＡ１９−９抗原のレベルに関して、前記ＣＡ１９−９抗原に特異的な少なくとも１つの抗体または抗体画分を使用してアッセイすること、および
前記生体サンプル中に存在するＴＩＭＰ１抗原のレベルに関して、前記ＴＩＭＰ１抗原に特異的な少なくとも１つの抗体または抗体画分を使用してアッセイすること、および
前記生体サンプル中に存在するＬＲＧ１抗原のレベルに関して、前記ＬＲＧ１抗原に特異的な少なくとも１つの抗体または抗体画分を使用してアッセイすること、および
前記ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原の前記レベルが、膵管腺癌を有する前記患者の指標であるかどうかを決定すること
を含む方法。
【請求項２２】
膵管腺癌に対する感受性を検出する方法であって、
対象から生体サンプルを得ること、
抗ＣＡ１９−９抗体またはその抗原結合断片による前記サンプルへのイムノアッセイを実施すること、
抗ＬＲＧ１抗体またはその抗原結合断片による前記サンプルへのイムノアッセイを実施すること、
抗ＴＩＭＰ１抗体またはその抗原結合断片による前記サンプルへのイムノアッセイを実施すること
を含み、
前記抗体の結合は、前記対象中での膵管腺癌の指標であり、かつ前記イムノアッセイは、早期膵管腺癌を検出し得る、方法。
【請求項２３】
膵管腺癌に対する感受性を検出する方法であって、
個体から生体サンプルを得ること、
抗ＣＡ１９−９抗体またはその抗原結合断片によるイムノアッセイを実施すること、
抗ＬＲＧ１抗体またはその抗原結合断片によるイムノアッセイを実施すること、
抗ＴＩＭＰ１抗体またはその抗原結合断片によるイムノアッセイを実施すること、
ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルが、膵管腺癌を有する患者の指標であるかどうかを決定すること
を含む方法。
【請求項２４】
ＣＡ１９−９、ＬＲＧ１およびＴＩＭＰ１レベルの決定は、実質的に同時に行われる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＡ１９−９、ＬＲＧ１およびＴＩＭＰ１レベルの決定は、段階的に行われる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
膵管腺癌を有するか、または膵管腺癌を有しないという割り当てへの患者の病歴情報の包含を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
膵管腺癌を有すると割り当てられた患者に少なくとも１つの代替診断試験を施すことを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの代替診断試験は、少なくとも１つのｃｔＤＮＡのアッセイまたは配列決定を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法のためのキットであって、
ＣＡ１９−９抗原の検出のための第１の溶質、
ＬＲＧ１抗原の検出のための第２の溶質、および
ＴＩＭＰ１抗原の検出のための第３の溶質
を含む試薬溶液を含むキット。
【請求項３０】
請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法のためのキットであって、
ＣＡ１９−９抗原の検出のための第１の溶質を含む第１の試薬溶液、
ＬＲＧ１抗原の検出のための第２の溶質を含む第２の試薬溶液、および
ＴＩＭＰ１抗原の検出のための第３の溶質を含む第３の試薬溶液
を含むキット。
【請求項３１】
前記試薬溶液を生体サンプルと接触させるためのデバイスを含む、請求項２９または３０に記載のキット。
【請求項３２】
少なくとも１つの抗原に結合するための手段を有する少なくとも１つの表面を含む、請求項２９または３０に記載のキット。
【請求項３３】
前記少なくとも１つの抗原は、ＣＡ１９−９、ＬＲＧ１およびＴＩＭＰ１からなる群から選択される、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記少なくとも１つの表面は、ｃｔＤＮＡに結合するための手段を含む、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記生体サンプル中の（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）のレベルを測定すること、
前記生体サンプル中のジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）のレベルを測定すること、
前記生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）のレベルを測定すること、
前記生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）のレベルを測定すること、および
前記生体サンプル中のインドール誘導体のレベルを測定すること
をさらに含み、
（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）および前記インドール誘導体の量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
前記患者から生体サンプルを得ること、
前記生体サンプル中の（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）のレベルを測定すること、
前記生体サンプル中のジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）のレベルを測定すること、
前記生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）のレベルを測定すること、
前記生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）のレベルを測定すること、および
前記生体サンプル中のインドール誘導体のレベルを測定すること
を含み、
（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）および前記インドール誘導体の量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
【請求項３７】
血漿由来バイオマーカーパネルおよびタンパク質マーカーパネルを含む、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
前記血漿由来バイオマーカーパネルは、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体を含み、
前記タンパク質バイオマーカーパネルは、ＣＡ１９−９、ＬＲＧ１およびＴＩＭＰ１を含み、
前記方法は、
前記患者から生体サンプルを得ること、
前記生体サンプル中の前記血漿由来バイオマーカーおよび前記タンパク質バイオマーカーのレベルを測定すること
を含み、
前記血漿由来バイオマーカーおよび前記タンパク質バイオマーカーの量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
【請求項３８】
１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーおよび１つまたは複数の代謝産物マーカーのレベルを決定することを含む、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
前記患者から生体サンプルを得ること、
前記サンプルを、ＣＡ１９−９抗原に結合する第１のレポーター分子と接触させること、
前記サンプルを、ＴＩＭＰ１抗原に結合する第２のレポーター分子と接触させること、
前記サンプルを、ＬＲＧ１抗原に結合する第３のレポーター分子と接触させること、および
前記１つまたは複数のバイオマーカーの前記レベルを決定することであって、前記１つまたは複数のバイオマーカーは、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体からなる群から選択される、決定すること
を含み、
前記第１のレポーター分子、前記第２のレポーター分子、前記第３のレポーター分子および前記１つまたは複数のバイオマーカーの量は、前記患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法。
【請求項３９】
膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、
前記患者から生体サンプルを得ること、
前記生体サンプル中のＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルを測定すること、および
前記生体サンプル中の、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体からなる群から選択される１つまたは複数の代謝産物マーカーのレベルを測定すること、
前記生体サンプル中のＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原、ＬＲＧ１抗原、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）および前記インドール誘導体の前記レベルの統計的分析によって決定されるように、前記患者の状態を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないかのいずれかに割り当てること
を含む方法。
【請求項４０】
膵管腺癌に対して感受性の疑いがある患者を処置する方法であって、
前記患者を、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法により、膵管腺癌に対する感受性に関して分析すること、
前記腺癌に対して治療上有効な量の処置を施すこと
を含む方法。
【請求項４１】
前記処置は、外科手術、化学療法、放射線療法、標的療法またはこれらの組合せである、請求項４０に記載の処置する方法。
【請求項４２】
ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１からなる群から選択される抗原に選択的に結合する少なくとも１つのセレプター分子を含む、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１、ＬＲＧ、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）または前記インドール誘導体の前記量の検出は、固体粒子の使用を含む、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記固体粒子は、ビーズである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記レポーター分子の少なくとも１つは、酵素に連結されている、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記タンパク質マーカーまたは代謝産物マーカーの少なくとも１つは、検出可能なシグナルを生成する、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
検出可能なシグナルは、分光測定法によって検出可能である、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記分光測定法は、質量分析法である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
膵管腺癌を有するか、または膵管腺癌を有しないという割り当てへの患者の病歴情報の包含を含む、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
膵管腺癌を有すると割り当てられた患者に少なくとも１つの代替診断試験を施すことを含む、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記少なくとも１つの代替診断試験は、少なくとも１つのｃｔＤＮＡのアッセイまたは配列決定を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法のためのキットであって、
ＣＡ１９−９抗原の検出のための第１の溶質、
ＬＲＧ１抗原の検出のための第２の溶質、
ＴＩＭＰ１抗原の検出のための第３の溶質、
（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）の検出のための第４の溶質、
ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）の検出のための第５の溶質、
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）の検出のための第６の溶質、
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）の検出のための第７の溶質、および
前記インドール誘導体の検出のための第８の溶質
を含む試薬溶液を含むキット。
【請求項５３】
請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法のためのキットであって、
ＣＡ１９−９抗原の検出のための第１の溶質を含む第１の試薬溶液、
ＬＲＧ１抗原の検出のための第２の溶質を含む第２の試薬溶液、
ＴＩＭＰ１抗原の検出のための第３の溶質を含む第３の試薬溶液、
（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）の検出のための第４の溶質を含む第４の試薬溶液、
ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）の検出のための第５の溶質を含む第５の試薬溶液、
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）の検出のための第６の溶質を含む第６の試薬溶液、
リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）の検出のための第７の溶質を含む第７の試薬溶液、および
前記インドール誘導体の検出のための第８の溶質を含む第８の試薬溶液
を含むキット。
【請求項５４】
前記試薬溶液を生体サンプルと接触させるためのデバイスを含む、請求項５２または５３に記載のキット。
【請求項５５】
少なくとも１つの抗原に結合するための手段を有する少なくとも１つの表面を含む、請求項５２または５３に記載のキット。
【請求項５６】
前記少なくとも１つの抗原は、ＣＡ１９−９、ＬＲＧ１およびＴＩＭＰ１からなる群から選択される、請求項５５に記載のキット。
【請求項５７】
前記少なくとも１つの表面は、ｃｔＤＮＡに結合するための手段を含む、請求項５５に記載のキット。
【請求項５８】
患者の膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の処置またはその悪化の予防の方法であって、前記患者におけるＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、前記患者を、ＰＤＡＣを有するか、またはＰＤＡＣに対して感受性であると分類し、前記方法は、
ｉ．ＰＤＡＣを有する前記患者に化学療法剤を投与すること、
ｉｉ．ＰＤＡＣを有する前記患者に治療放射線を投与すること、および
ｉｉｉ．ＰＤＡＣを有する前記患者の癌性組織の部分的または完全な外科的切除のための外科手術
の１つまたは複数を含む、方法。
【請求項５９】
前記ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、上昇している、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、ＰＤＡＣを有しない参照患者または参照群でのＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルと比較して上昇している、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記参照患者または参照群は、健康である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＡＵＣ（９５％ＣＩ）は、少なくとも０．８５０である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
ＡＵＣ（９５％ＣＩ）は、少なくとも０．９００である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
前記患者のＰＤＡＣを有するとの分類は、それぞれ９５％および９９％の特異度で０．８４９および０．６５８の感度を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、慢性膵炎を有する参照患者または参照群でのＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルと比較して上昇している、請求項５８に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、良性の膵疾患を有する参照患者または参照群でのＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルと比較して上昇している、請求項５８に記載の方法。
【請求項６７】
ＡＵＣ（９５％ＣＩ）は、少なくとも０．８５０である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
ＡＵＣ（９５％ＣＩ）は、少なくとも０．９００である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記患者のＰＤＡＣを有するとの分類は、それぞれ９５％および９９％の特異度で０．８４９および０．６５８の感度を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項７０】
前記ＰＤＡＣは、切除可能境界病期においてまたはその前に診断されている、請求項５８に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＰＤＡＣは、切除可能病期で診断されている、請求項５８に記載の方法。
【請求項７２】
患者の膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の処置またはその悪化の予防の方法であって、前記患者におけるＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原、ＬＲＧ１、Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体のレベルは、前記患者を、ＰＤＡＣを有するか、またはＰＤＡＣに対して感受性であると分類し、前記方法は、
ｉ）ＰＤＡＣを有する前記患者に化学療法剤を投与すること、
ｉｉ）ＰＤＡＣを有する前記患者に治療放射線を投与すること、および
ｉｉｉ）ＰＤＡＣを有する前記患者の癌性組織の部分的または完全な外科的切除のための外科手術
の１つまたは複数を含む、方法。
【請求項７３】
前記ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、上昇している、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、ＰＤＡＣを有しない参照患者または参照群でのＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルと比較して上昇している、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記参照患者または参照群は、健康である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、慢性膵炎を有する参照患者または参照群でのＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルと比較して上昇している、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、良性の膵疾患を有する参照患者または参照群でのＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルと比較して上昇している、請求項７２に記載の方法。
【請求項７８】
前記患者は、ＰＤＡＣのリスクが高い、請求項７２に記載の方法。
【請求項７９】
前記患者は、真性糖尿病が新たに発症した５０歳超であるか、慢性膵炎を有するか、膵臓のムチン分泌嚢胞と偶然に診断されているか、または前記高リスク群の１つの無症候性家系である、請求項５８〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
膵管腺癌に対する感受性の疑いがある患者を処置する方法であって、
前記患者を、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の方法により、膵管腺癌に対する感受性に関して分析すること、
前記腺癌に対して治療上有効な量の処置を施すこと
を含む方法。
【請求項８１】
前記処置は、外科手術、化学療法、放射線療法、標的療法またはこれらの組合せである、請求項８０に記載の処置する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１６年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／４３５，０２４号明細書および米国仮特許出願第６２／４３５，０２０号明細書の利益を主張するものであり、これらの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより与えられた助成金番号Ｒ０３  ＣＡ１２３５４６の下で政府の支援により行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、５年生存率がわずか８％であり、かつ死亡率が罹患率に密接に近づいている最も致死型の癌の１つである。切除可能なＰＤＡＣは、より良好な生存と関連しているが、ＰＤＡＣ患者の１５〜２０％のみで局所性疾患を呈する。ＰＤＡＣが疑われている対象またはこの疾患のリスクが高い対象の精密検査で現在使用されているのは、画像診断法であり、特に内視鏡超音波検査および磁気共鳴胆管膵管造影である。しかしながら、既知の危険因子は、ＰＤＡＣ発生率にわずかな影響のみを及ぼす。
【０００４】
癌抗原１９−９（ＣＡ１９−９）は、現在、ＰＤＡＣバイオマーカーとして臨床で使用されている。ＣＡ１９−９は、前臨床および早期のＰＤＡＣの両方の診断バイオマーカーとしての可能性を示している（Ｒｉｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ６：１５７−６９，１９９８）。しかしながら、ＣＡ１９−９単独では、早期疾患のバイオマーカーとしての性能が限定されおり、膵癌患者の７５％未満がＣＡ１９−９の上昇を示し、多くの良性障害によりＣＡ１９−９レベルが上昇する可能性がある。さらに、ＣＡ１９−９は、フコシルトランスフェラーゼ欠乏症でありＬｅｗｉｓ血液型の抗原を合成不能な患者の５〜１０％で検出不能である。そのため、ＰＤＡＣを有すると誤って特定された個人の割合およびＰＤＡＣを有しないと誤って特定された個人の割合は、診断ツールとしてのＣＡ１９−９のみへの依存を許容できないほど高い。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
診断の遅れ、発生率の増加および処置の手段の制限に起因して、ＰＤＡＣは、癌関連死の主要な原因となり始めている。この疾患は、概して、多くの患者で進行期に診断され、独立型バイオマーカーとしてのＣＡ１９−９の使用が明らかに不適切であることを考慮すると、早期での膵癌の検出のための試験を開発する必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示は、膵がんの早期検出のための方法およびキットを提供する。この方法およびキットは、対象から得られた生体サンプルに含まれるバイオマーカーの多重アッセイを使用する。下記の少なくとも３種のバイオマーカー：炭水化物抗原１９−９（ＣＡ１９−９）、ＴＩＭＰメタロペプチダーゼインヒビター１（ＴＩＭＰ１）およびロイシンリッチのアルファ−２−糖タンパク質１（ＬＲＧ１）の複合分析は、状態が既知であるコホートに対してスクリーニングされた場合、ＰＤＡＣの高精度診断をもたらす。
【０００７】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１の分析は、さらなるバイオマーカーの分析と組み合わされ得る。いくつかの実施形態では、このさらなるバイオマーカーは、タンパク質バイオマーカーであり得る。いくつかの実施形態では、このさらなるタンパク質バイオマーカーは、ＡＬＣＡＭ、ＣＨＩ３Ｌ１、ＣＯＬ１８Ａ１、ＩＧＦＢＰ２、ＬＣＮ２、ＬＹＺ、ＰＡＲＫ７、ＲＥＧ３Ａ、ＳＬＰＩ、ＴＨＢＳ１、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＷＦＤＣ２およびこれらの任意の組合せからなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、このさらなるバイオマーカーは、非タンパク質バイオマーカーであり得る。いくつかの実施形態では、この非タンパク質バイオマーカーは、循環腫瘍ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書で説明される方法は、この生体サンプル中の（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）のレベルを測定すること、この生体サンプル中のジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）のレベルを測定すること、およびこの生体サンプル中のインドール誘導体のレベルを測定することをさらに含み得、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体の量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する。
【０００８】
対象からの生体サンプルで見出されるＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１のレベルに基づいて、この対象のＰＤＡＣ状態を予測し得る回帰モデルが明らかにされた。
【０００９】
いくつかの実施形態では、患者から採取された血液サンプル中のバイオマーカーが測定される。いくつかの実施形態では、生体サンプル中でのバイオマーカーの存否が決定され得る。いくつかの実施形態では、生体サンプル中のバイオマーカーのレベルが定量され得る。
【００１０】
いくつかの実施形態では、生体サンプルを分析するために表面が提供される。いくつかの実施形態では、この表面上には、目的のバイオマーカーが非特異的に吸着する。いくつかの実施形態では、この表面上には、目的のバイオマーカーに特異的なレセプターが組み込まれている。
【００１１】
いくつかの実施形態では、この表面は、粒子（例えば、ビーズ）と会合している。いくつかの実施形態では、この表面は、同時測定を容易にするためにマルチウェルプレートに含まれている。
【００１２】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーの並行評価のために複数の表面が提供される。いくつかの実施形態では、この複数の表面は、単一のデバイスに設けられ、例えば９６ウェルプレートに設けられる。いくつかの実施形態では、この複数の表面は、バイオマーカーの同時測定を可能にする。いくつかの実施形態では、単一の生体サンプルが複数の表面に順次適用され得る。いくつかの実施形態では、複数の表面への同時適用のために生体サンプルが分割される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、本バイオマーカーは、特定のレセプター分子に結合し、バイオマーカー−レセプター複合体の存否を決定し得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカー−レセプター複合体の量が定量され得る。いくつかの実施形態では、このレセプター分子は、酵素に連結されており、検出および定量を容易にする。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本バイオマーカーは、特定のリレー分子（ｒｅｌａｙ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）に結合し、バイオマーカー−リレー分子複合体は、次にレセプター分子に結合する。いくつかの実施形態では、このバイオマーカー−リレー−レセプター複合体の存否が決定され得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカー−リレー−レセプター複合体の量が定量され得る。いくつかの実施形態では、このレセプター分子は、酵素に連結されており、検出および定量を容易にする。いくつかの実施形態では、この酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、生体サンプルは、個々のバイオマーカーに関して順次分析される。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、別々の部分に分割され、複数のバイオマーカーに関する同時分析を可能にする。いくつかの実施形態では、生体サンプルは、複数のバイオマーカーについての単一のプロセスで分析される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーの存否が目視検査によって決定され得る。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの量が分光学的技術の使用によって決定され得る。いくつかの実施形態では、この分光学的技術は、質量分析である。いくつかの実施形態では、この分光学的技術は、ＵＶ／Ｖｉｓ分光法である。いくつかの実施形態では、この分光学的技術は、蛍光分光法等の励起／発光技術である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、生体サンプルの分析のためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、このキットは、この分析を実施するのに必要な化学物質および試薬を含み得る。いくつかの実施形態では、このキットは、避けられない操作者の介入を最小限に抑えるために生体サンプルを扱う手段を含む。
【００１８】
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この患者から生体サンプルを得ること、この生体サンプル中の（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）のレベルを測定すること、この生体サンプル中のジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）のレベルを測定すること、およびこの生体サンプル中のインドール誘導体のレベルを測定することを含み、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体の量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
【００１９】
別の態様では、本開示は、血漿由来バイオマーカーパネルおよびタンパク質マーカーパネルを含む、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この血漿由来バイオマーカーパネルは、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体を含み、このタンパク質バイオマーカーパネルは、ＣＡ１９−９、ＬＲＧ１およびＴＩＭＰ１を含み、この方法は、この患者から生体サンプルを得ること、この生体サンプル中の血漿由来バイオマーカーおよびタンパク質バイオマーカーのレベルを測定することを含み、血漿由来バイオマーカーおよびタンパク質バイオマーカーの量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
【００２０】
別の態様では、本開示は、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーおよび１つまたは複数の代謝産物マーカーのレベルを決定することを含む、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この患者から生体サンプルを得ること、このサンプルを、ＣＡ１９−９抗原に結合する第１のレポーター分子と接触させること、このサンプルを、ＴＩＭＰ１抗原に結合する第２のレポーター分子と接触させること、このサンプルを、ＬＲＧ１抗原に結合する第３のレポーター分子と接触させること、およびこの１つまたは複数のバイオマーカーのレベルを決定することを含み、この１つまたは複数のバイオマーカーは、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体からなる群から選択され、この第１のレポーター分子、第２のレポーター分子、第３のレポーター分子およびこの１つまたは複数のバイオマーカーの量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
【００２１】
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この患者から生体サンプルを得ること、この生体サンプル中のＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルを測定すること、この生体サンプル中の、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体からなる群から選択される１つまたは複数の代謝産物マーカーのレベルを測定すること、この生体サンプル中のＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原、ＬＲＧ１抗原、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体のレベルの統計的分析によって決定されるように、この患者の状態を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと割り当てることを含む方法を提供する。
【００２２】
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対して感受性の疑いがある患者を処置する方法であって、この患者を、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法により、膵管腺癌に対する感受性に関して分析すること、この腺癌に対して治療上有効な量の処置を施すことを含む方法を提供する。一実施形態では、この処置は、外科手術、化学療法、放射線療法、標的療法またはこれらの組合せである。
【００２３】
一実施形態では、本明細書で説明される方法は、ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１からなる群から選択される抗原に選択的に結合する少なくとも１つのセレプター分子を含む。
【００２４】
一実施形態では、ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１、ＬＲＧ、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）またはインドール誘導体の量の検出は、固体粒子の使用を含む。別の実施形態では、この固体粒子は、ビーズである。
【００２５】
一実施形態では、本レポーター分子の少なくとも１つは、酵素に連結されている。
【００２６】
一実施形態では、本タンパク質マーカーまたは本代謝産物マーカーの少なくとも１つは、検出可能なシグナルを生成する。別の実施形態では、この検出可能なシグナルは、分光測定法によって検出可能である。別の実施形態では、この分光測定法は、質量分析法である。
【００２７】
一実施形態では、本明細書で説明される方法は、膵管腺癌を有するか、または膵管腺癌を有しないという割り当てへの患者の病歴情報の包含を含む。
【００２８】
一実施形態では、本明細書で説明される方法は、膵管腺癌を有すると割り当てられた患者に少なくとも１つの代替診断試験を施すことを含む。別の実施形態では、この少なくとも１つの代替診断試験は、少なくとも１つのｃｔＤＮＡのアッセイまたは配列決定を含む。
【００２９】
別の態様では、本開示は、本明細書で説明される方法のためのキットであって、ＣＡ１９−９抗原の検出のための第１の溶質、ＬＲＧ１抗原の検出のための第２の溶質、ＴＩＭＰ１抗原の検出のための第３の溶質、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）の検出のための第４の溶質、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）の検出のための第５の溶質、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）の検出のための第６の溶質、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）の検出のための第７の溶質およびインドール誘導体の検出のための第８の溶質を含む試薬溶液を含むキットを提供する。
【００３０】
一実施形態では、そのようなキットは、ＣＡ１９−９抗原の検出のための第１の溶質を含む第１の試薬溶液、ＬＲＧ１抗原の検出のための第２の溶質を含む第２の試薬溶液、ＴＩＭＰ１抗原の検出のための第３の溶質を含む第３の試薬溶液、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）の検出のための第４の溶質を含む第４の試薬溶液、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）の検出のための第５の溶質を含む第５の試薬溶液、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）の検出のための第６の溶質を含む第６の試薬溶液、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）の検出のための第７の溶質を含む第７の試薬溶液およびインドール誘導体の検出のための第８の溶質を含む第８の試薬溶液を含み得る。
【００３１】
一実施形態では、本明細書で説明されるキットは、この試薬溶液を生体サンプルと接触させるためのデバイスを含み得る。別の実施形態では、そのようなキットは、少なくとも１つの抗原に結合するための手段を有する少なくとも１つの表面を含み得る。別の実施形態では、この少なくとも１つの抗原は、ＣＡ１９−９、ＬＲＧ１およびＴＩＭＰ１からなる群から選択される。別の実施形態では、この少なくとも１つの表面は、ｃｔＤＮＡに結合するための手段を含む。
【００３２】
別の態様では、本開示は、本明細書で説明されるような方法であって、本生体サンプル中の（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）のレベルを測定すること、この生体サンプル中のジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）のレベルを測定すること、およびこの生体サンプル中のインドール誘導体のレベルを測定することを含み、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体の量は、本患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
【００３３】
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この患者から生体サンプルを得ること、この生体サンプル中の（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）のレベルを測定すること、この生体サンプル中のジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）のレベルを測定すること、この生体サンプル中のリゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）のレベルを測定すること、およびこの生体サンプル中のインドール誘導体のレベルを測定することを含み、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体の量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
【００３４】
別の態様では、本開示は、血漿由来バイオマーカーパネルおよびタンパク質マーカーパネルを含む、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この血漿由来バイオマーカーパネルは、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体を含み、このタンパク質バイオマーカーパネルは、ＣＡ１９−９、ＬＲＧ１およびＴＩＭＰ１を含み、この方法は、この患者から生体サンプルを得ること、この生体サンプル中の血漿由来バイオマーカーおよびタンパク質バイオマーカーのレベルを測定することを含み、血漿由来バイオマーカーおよびタンパク質バイオマーカーの量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
【００３５】
別の態様では、本開示は、１つまたは複数のタンパク質バイオマーカーおよび１つまたは複数の代謝産物マーカーのレベルを決定することを含む、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この患者から生体サンプルを得ること、このサンプルを、ＣＡ１９−９抗原に結合する第１のレポーター分子と接触させること、このサンプルを、ＴＩＭＰ１抗原に結合する第２のレポーター分子と接触させること、このサンプルを、ＬＲＧ１抗原に結合する第３のレポーター分子と接触させること、およびこの１つまたは複数のバイオマーカーのレベルを決定することであって、この１つまたは複数のバイオマーカーは、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体からなる群から選択される、決定することを含み、第１のレポーター分子、第２のレポーター分子、第３のレポーター分子および１つまたは複数のバイオマーカーの量は、この患者を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないと分類する、方法を提供する。
【００３６】
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対する患者の感受性を決定する方法であって、この患者から生体サンプルを得ること、この生体サンプル中のＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルを測定すること、およびこの生体サンプル中の、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体からなる群から選択される１つまたは複数の代謝産物マーカーのレベルを測定すること、この生体サンプル中のＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原、ＬＲＧ１抗原、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体のレベルの統計的分析によって決定されるように、この患者の状態を膵管腺癌に対して感受性であるか、または膵管腺癌に対して感受性ではないかのいずれかに割り当てることを含む方法を提供する。
【００３７】
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対して感受性の疑いがある患者を処置する方法であって、この患者を、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法により、膵管腺癌に対する感受性に関して分析すること、この腺癌に対して治療上有効な量の処置を施すことを含む方法を提供する。一実施形態では、この処置は、外科手術、化学療法、放射線療法、標的療法またはこれらの組合せである。別の実施形態では、そのような方法は、ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１からなる群から選択される抗原に選択的に結合する少なくとも１つのセレプター分子を含む。別の実施形態では、ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１、ＬＲＧ、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）またはインドール誘導体の量の検出は、固体粒子の使用を含む。別の実施形態では、この固体粒子は、ビーズである。別の実施形態では、本レポーター分子の少なくとも１つは、酵素に連結されている。別の実施形態では、本タンパク質マーカーまたは本代謝産物マーカーの少なくとも１つは、検出可能なシグナルを生成する。別の実施形態では、この検出可能なシグナルは、分光測定法によって検出可能である。別の実施形態では、この分光測定法は、質量分析法である。別の実施形態では、そのような方法は、膵管腺癌を有するか、または膵管腺癌を有しないという割り当てへの患者の病歴情報の包含を含む。別の実施形態では、そのような方法は、膵管腺癌を有すると割り当てられた患者に少なくとも１つの代替診断試験を施すことを含む。別の実施形態では、この少なくとも１つの代替診断試験は、少なくとも１つのｃｔＤＮＡのアッセイまたは配列決定を含む。
【００３８】
別の態様では、本開示は、請求項３６〜４０のいずれか一項に記載の方法のためのキットであって、ＣＡ１９−９抗原の検出のための第１の溶質、ＬＲＧ１抗原の検出のための第２の溶質、ＴＩＭＰ１抗原の検出のための第３の溶質、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）の検出のための第４の溶質、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）の検出のための第５の溶質、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）の検出のための第６の溶質、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）の検出のための第７の溶質およびインドール誘導体の検出のための第８の溶質を含む試薬溶液を含むキットを提供する。別の実施形態では、本明細書で開示されたキットは、ＣＡ１９−９抗原の検出のための第１の溶質を含む第１の試薬溶液、ＬＲＧ１抗原の検出のための第２の溶質を含む第２の試薬溶液、ＴＩＭＰ１抗原の検出のための第３の溶質を含む第３の試薬溶液、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）の検出のための第４の溶質を含む第４の試薬溶液、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）の検出のための第５の溶質を含む第５の試薬溶液、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）の検出のための第６の溶質を含む第６の試薬溶液、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）の検出のための第７の溶質を含む第７の試薬溶液およびインドール誘導体の検出のための第８の溶質を含む第８の試薬溶液を含む。一実施形態では、そのようなキットは、この試薬溶液を生体サンプルと接触させるためのデバイスを含む。別の実施形態では、そのようなキットは、少なくとも１つの抗原に結合するための手段を有する少なくとも１つの表面を含む。別の実施形態では、この少なくとも１つの抗原は、ＣＡ１９−９、ＬＲＧ１およびＴＩＭＰ１からなる群から選択される。別の実施形態では、この少なくとも１つの表面は、ｃｔＤＮＡに結合するための手段を含む。
【００３９】
別の態様では、本開示は、患者の膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の処置またはその悪化の予防の方法であって、ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、この患者を、ＰＤＡＣを有するか、またはＰＤＡＣに対して感受性であると分類し、この方法は、ＰＤＡＣを有する患者に化学療法剤を投与すること、ＰＤＡＣを有する患者に治療放射線を投与すること、およびＰＤＡＣを有する患者の癌性組織の部分的または完全な外科的切除のための外科手術の１つまたは複数を含む、方法を提供する。一実施形態では、ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、上昇している。別の実施形態では、ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、ＰＤＡＣを有しない参照患者または参照群でのＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルと比較して上昇している。別の実施形態では、この参照患者または参照群は、健康である。別の実施形態では、ＡＵＣ（９５％ＣＩ）は、少なくとも０．８５０である。別の実施形態では、ＡＵＣ（９５％ＣＩ）は、少なくとも０．９００である。別の実施形態では、患者のＰＤＡＣを有するとの分類は、それぞれ９５％および９９％の特異度で０．８４９および０．６５８の感度を有する。別の実施形態では、ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、慢性膵炎を有する参照患者または参照群でのＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルと比較して上昇している。別の実施形態では、ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、良性の膵疾患を有する参照患者または参照群でのＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルと比較して上昇している。別の実施形態では、ＡＵＣ（９５％ＣＩ）は、少なくとも０．８５０である。別の実施形態では、ＡＵＣ（９５％ＣＩ）は、少なくとも０．９００である。別の実施形態では、患者のＰＤＡＣを有するとの分類は、それぞれ９５％および９９％の特異度で０．８４９および０．６５８の感度を有する。別の実施形態では、ＰＤＡＣは、切除可能境界病期（ｂｏｒｄｅｒｌｉｎｅ  ｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ  ｓｔａｇｅ）においてまたはその前に診断されている。別の実施形態では、ＰＤＡＣは、切除可能病期で診断されている。
【００４０】
別の態様では、本開示は、患者の膵管腺癌（ＰＤＡＣ）の処置またはその悪化の予防の方法であって、ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原、ＬＲＧ１、Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（２０：３）およびインドール誘導体のレベルは、この患者を、ＰＤＡＣを有するか、またはＰＤＡＣに対して感受性であると分類し、この方法は、ＰＤＡＣを有する患者に化学療法剤を投与すること、ＰＤＡＣを有する患者に治療放射線を投与すること、およびＰＤＡＣを有する患者の癌性組織の部分的または完全な外科的切除のための外科手術の１つまたは複数を含む、方法を提供する。別の実施形態では、ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、上昇している。別の実施形態では、ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、ＰＤＡＣを有しない参照患者または参照群でのＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルと比較して上昇している。別の実施形態では、この参照患者または参照群は、健康である。別の実施形態では、ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、慢性膵炎を有する参照患者または参照群でのＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルと比較して上昇している。別の実施形態では、ＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルは、良性の膵疾患を有する参照患者または参照群でのＣＡ１９−９抗原、ＴＩＭＰ１抗原およびＬＲＧ１抗原のレベルと比較して上昇している。別の実施形態では、この患者は、ＰＤＡＣのリスクが高い。別の実施形態では、この患者は、真性糖尿病を新たに発症した５０歳超であるか、慢性膵炎を有するか、膵臓のムチン分泌嚢胞と偶然に診断されているか、またはこれらの高リスク群の１つの無症候性家系である。
【００４１】
別の態様では、本開示は、膵管腺癌に対する感受性の疑いがある患者を処置する方法であって、この患者を、本明細書で説明される方法により、膵管腺癌に対する感受性に関して分析すること、この腺癌に対して治療上有効な量の処置を施すことを含む。別の実施形態では、この処置は、外科手術、化学療法、放射線療法、標的療法またはこれらの組合せである。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】検証済のバイオマーカーモデルを発見するためのフローチャートを示す。
【図２Ａ−Ｂ】トリアージセットにおいて健康コントロールと比べてＰＤＡＣのレベルが有意に高いバオマーカー候補を示す。トリアーゼセットにおける（図２Ａ）ＰＤＡＣ（ｎ＝７５）対健康コントロール（ｎ＝２７）の比較および（図２Ｂ）ＰＤＡＣ対慢性膵炎患者（ｎ＝１９）の比較でのバイオマーカー候補の性能。バーは、ＡＵＣ（９５％ＣＩ）を示す。＊は、逆順が使用されたことを示す。ＡＵＣ、曲線下面積。
【図３Ａ−Ｂ】組み合わせた検証セットにおける、ＴＩＭＰ１＋ＬＲＧ１＋ＣＡ１９−９に基づくバイオマーカーパネルの性能を示す。（図３Ａ）ＰＤＡＣ対健康コントロールおよび（図３Ｂ）ＰＤＡＣ対良性の膵疾患（「ＯＲ」規則の組合せ）のために開発されたバイオマーカーパネルのＲＯＣ分析。上方の線は、モデルを示し、下方の線は、ＣＡ１９−９を示す。ＡＵＣ、曲線下面積。
【図４】検証セット＃２における、バイオマーカーパネル（ＴＩＭＰ１、ＬＲＧ１およびＣＡ１９−９）ベースのスコアと腫瘍サイズ値との間の相関分析を示す。基礎となる線形回帰モデルは、切片および傾きがそれぞれ３．７３２９および−０．２６４６である（傾き９５％ＣＩ＝−０．７４５〜０．２１６；Ｗａｌｄベースの両側ｐ値＝０．２７）。腫瘍サイズは、ＣＴ／ＭＲＩ／ＥＵＳにより評価した２つの測定値の大きい方を指す。
【図５】試験セットにおける、ＴＩＭＰ１＋ＬＲＧ１＋ＣＡ１９−９に基づくバイオマーカーモデルの性能を示す。ＰＤＡＣ対健康コントロールのための、組み合わされた検証セットで開発された固定係数を有する組合せモデルのＲＯＣ分析。上方の線は、モデルを示し、下方の線は、ＣＡ１９−９を示す。ＡＵＣ、曲線下面積。
【図６】研究デザインおよびフィルタリング戦略の概略を示す。
【図７】発見コホートにおけるリゾホスファチジルコリン、スフィンゴミエリンおよびセラミドの検出に関する個々のＡＵＣを示す。略語：ＬＰＣ：リゾホスファチジルコリン；ＳＭ：スフィンゴミエリン。
【図８】インドール誘導体に関するＭＳＭＳスペクトルを示し、対応するフラグメントは、約１１８、約１４８および約１８８ｍ／ｚで生じる。
【図９Ａ−Ｂ】訓練セットにおける個々の代謝産物および５−マーカー代謝産物パネルのＡＵＣ曲線を示す。組み合わされた発見および「確認」コホートに基づく性能。（図９Ａ）健康な対象（ｎ＝１０）からのＰＤＡＣ（ｎ＝２９）の識別のための個々の代謝産物および５−マーカー代謝産物パネルに関する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線。（図９Ｂ）良性の膵疾患（慢性膵炎（ｎ＝１０）および低悪性度嚢胞（ｎ＝５０））と診断された対象に対してＰＤＡＣ（ｎ＝２９）を比較する、個々の代謝産物および５−マーカー代謝産物パネルに関するＲＯＣ曲線。
【図１０Ａ−Ｂ】試験セットにおける個々の代謝産物および５−マーカー代謝産物パネルの検証を示す。（図１０Ａ）健康な対象（ｎ＝８２）からの切除可能なＰＤＡＣ（ｎ＝３９）の識別のための個々の代謝産物および５−マーカー代謝産物パネルに関する受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線（試験セット＃１）。（図１０Ｂ）良性の膵疾患（低悪性度嚢胞（ｎ＝１０２））と診断された対象に対して切除可能なＰＤＡＣ（ｎ＝２０）を比較する、個々の代謝産物および５−マーカー代謝産物パネルに関するＲＯＣ曲線（試験セット＃２）。
【図１１Ａ−Ｂ】代謝産物パネルおよびタンパク質パネルからなるハイパーパネルは、タンパク質パネルのみと比較して分類を改善することを示す。（図１１Ａおよび図１１Ｂ）訓練セット（２９例のＰＤＡＣ対１０例の健康対象）および独立した検証コホート（試験セット＃１；３９例のＰＤＡＣ対８２例の健康対象）におけるハイパーパネルおよびタンパク質パネルのみのＲＯＣ曲線。
【図１２Ａ−Ｃ】膵管腺癌は、細胞外リゾリン脂質を異化することを示す。（図１２Ａ）２４、４８および７２時間の培養後のＰＡＮＣ１細胞株およびＳＵ８６８６  ＰＤＡＣ細胞株におけるリゾホスファチジルコリン（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（２０：３）およびグリセロホスホコリンの血清含有培地組成の変化率（％）。（図１２Ｂ）ホスファチジルコリンおよびリゾホスファチジルコリンの異化に関与する酵素の概要を示す。（図１２Ｃ）ＰＤＡＣおよび隣接コントロール組織でのＰＬＡ２Ｇ１０、ＬＹＰＬＡ１およびＥＮＰＰ２のｍＲＮＡ発現＋／−ＳＥＭ。統計的優位性を対応のあるｔ検定により決定した（ｐ：＊＊＜０．０１、＊＊＊＊＜０．００１）。ｍＲＮＡ発現データをＯｎｃｏｍｉｎｅから得ており、Ｂａｄｅａデータセットに基づく。
【図１３】馴化培地中の脂質種の組成を示す。培地ブランクと比較した、ＰＤＡＣ細胞株ＰＡＮＣ−１およびＳＵ８６８６に由来の２４、４８および７２時間の馴化の血清含有培地中の脂質種の組成の変化％を示すヒートマップ。略語：ＰＣ：ホスファチジルコリン；ＰＥ：ホスファチジルエタノールアミン；ＬＰＣ：リゾホスファチジコリン；ＬＰＥ：リゾホスファチジルエタノールアミン；Ｐｌａｓ：プラスマロゲン。
【図１４Ａ−Ｃ】膵管腺癌は、ポリアミンの異化の上昇を示すことを示す。（図１４Ａ）５種のＰＤＡＣ細胞株（ＣＦＰＡＣ−１、ＭｉａＰａＣａ、ＳＵ８６８６、ＰＡＮＣ０３−２７およびＳＷ１９９０）の細胞溶解物中におけるＮ１／Ｎ８−アセチルスペルミジンまたはジアセチルスペルミンの存在量（単位面積±ｓｔＤｅｖ）。（図１４Ｂ）５種のＰＤＡＣ細胞株（ＣＦＰＡＣ−１、ＭｉａＰａＣａ、ＳＵ８６８６、ＰＡＮＣ０３−２７およびＳＷ１９９０）からの馴化の１、２、４および６時間後に回収した血清フリー培地中におけるＮ１／Ｎ８−アセチルスペルミジンまたはジアセチルスペルミンの存在量（単位面積±ｓｔｄｅｖ）。（図１４Ｃ）ポリアミンおよびそのアセチル化誘導体の生合成に関与する酵素を表示するネットワーク。ノードの陰影（淡灰色＝減少；濃灰色＝増加）および大きさは、ＰＤＡＣと隣接コントロール組織との間のそれぞれの酵素のｍＲＮＡ発現における変化の方向および大きさを示す。太いノード境界は、統計的有意性（対応のあるｔ検定＜０．０５）を示す。箱ひげ図は、ＰＤＡＣと隣接コントロール組織との間のそれぞれの酵素のｍＲＮＡ発現の分布を示す。ｍＲＮＡ発現データをＯｎｃｏｍｉｎｅから得ており、Ｂａｄｅａデータセットに基づく。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
提供されるのは、ヒト対象において膵癌を同定する方法であって、
（ａ）この対象から得られた血液サンプルを少なくとも３種のバイオマーカー：ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１の分析のためのアッセイに適用すること、
（ｂ）この血液サンプル中に存在する少なくとも３種のバイオマーカーの量を定量すること、
（ｃ）存在するバイオマーカーの量に基づく統計的分析を適用して、対応する膵癌に関するバイオマーカースコアを決定し、それにより対象を膵癌に関して陽性または陰性のいずれかに分類すること
を概して含む方法である。
【００４４】
本明細書の方法は、高リスク対象のスクリーニングを可能にし、例えば膵癌の家族歴を有するものまたは他の危険因子（例えば、慢性膵炎、肥満、重度の喫煙および場合により糖尿病）を有する患者のスクリーニングを可能にする。本明細書で提供されたロジスティック回帰モデルは、これらの因子を分類方法に組み込み得る。
【００４５】
ＰＤＡＣ陽性と分類された対象のためにＰＤＡＣ状態を明らかにするためのさらなる方法が提供され得る。ＰＤＡＣ陽性との分類後、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、内視鏡超音波検査（ＥＵＳ）または内視鏡的逆行性膵胆管造影（ＥＲＣＰ）が挙げられるが、これらに限定されない方法が続き得る。
【００４６】
ＣＡ１９−９の検出を、配列Ｎｅｕ５Ａｃα２，３Ｇａｌβ１，３（Ｆｕｃα１，４）ＧｌｃＮＡｃを有するシアリル−Ｌｅｗｉｓ  Ａ（血液型抗原のＬｅｗｉｓファミリの一部）と呼ばれる炭水化物構造であるＣＡ１９−９抗原との接触により達成し得る。シアリル−Ｌｅｗｉｓ  Ａは、Ｎ連結グリカンおよびＯ連結グリカンの両方に単糖前駆体を逐次連結させるグリコシルトランスフェラーゼにより合成される。シアリル−Ｌｅｗｉｓ  Ａは、多くの異なるタンパク質（例えば、ムチン、癌胎児性抗原および血中循環アポリポタンパク質（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ａｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ））に付着している。標準的なＣＡ１９−９臨床アッセイでは、モノクローナル抗体がサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットでＣＡ１９−９抗原を捕捉して検出し、このサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットは、多くの異なるキャリアタンパク質上でＣＡ１９−９抗原を測定する（Ｐａｒｔｙｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １２（１３）：２２１３−２０，２０１２）。
【００４７】
ＴＩＭＰ１（配列番号１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１０３３）の検出を、ＴＩＭＰ１に特異的に結合するレポーター分子との接触により達成し得る。
【化１】
2020514689.tif 000002
【００４８】
ＬＲＧ１（配列番号２；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０２７５０）の検出を、ＬＲＧ１に特異的に結合するレポーター分子との接触により達成し得る。
【化２】
2020514689.tif 000003
【００４９】
少なくとも３種のバイオマーカーＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１の組合せにより、これまでにない信頼性の高いＰＤＡＣ予測力を得ることができる。３９例の切除可能なＰＤＡＣ症例および８２例の対応する健康コントロールからの血漿サンプルで構成された盲検試験セットに適応された場合、本明細書で説明される方法により、健康コントールと比べた早期ＰＤＡＣの識別において、９５％の特異度で感度が０．６６７である０．８８７（０．８１７〜０．９５７）のＡＵＣ（９５％ＣＩ）が得られる。このバイオマーカーパネルの性能は、早期膵癌の高精度検出と、ＣＡ１９−９単独と比較して統計的に有意な改善（ｐ＝０．００８、試験セット）とを示した。
【００５０】
本明細書で詳述されたバイオマーカーの検出に関して、本開示は、本明細書で報告された特定のバイオマーカーに限定されない。いくつかの実施形態では、本開示のバイオマーカーの検出および分析のために他の生体分子が選択され得、この生体分子として、タンパク質、抗体、核酸、アプタマーおよび合成有機化合物に基づく生体分子が挙げられるが、これに限定されない。他の分子は、感度、効率、アッセイ速度、費用、安全性または製造もしくは貯蔵の容易さの観点で利点を示し得る。これに関して、本明細書で開示されたバイオマーカーの予測力および診断力は、このバイオマーカーのタンパク質形態のみならず、さらにはこのバイオマーカーの他の表現（例えば、核酸）の分析まで及び得ることを当業者は認識するであろう。さらに、本明細書で開示されたバイオマーカーの予測力および診断力も、ＰＤＡＣと関連する他のバイオマーカーの分析と組み合わせて使用され得ることを当業者は認識するであろう。いくつかの実施形態では、ＰＤＡＣと関連する他のバイオマーカーは、タンパク質ベースのバイオマーカーであり得る。いくつかの実施形態では、ＰＤＡＣと関連する他のバイオマーカーは、非タンパク質ベースのバイオマーカー（例えば、ｃｔＤＮＡ）であり得る。
【００５１】
ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１は、本明細書で開示されている検証研究においてＣＡ１９−９の性能を補完する。遺伝子発現および／またはＴＩＭＰ１の分泌の増加がＰＤＡＣで既に観察されており、腫瘍細胞増殖を誘導することが分かっている。血中循環ＴＩＭＰ１レベルの上昇は、ＰＤＡＣと関連しているが、レベルの上昇は、他の上皮腫瘍タイプでも見出されている。ＬＲＧ１の役割は、ＴＧＦ−β経路の活性化を介した血管新生の促進で示唆されている。ＰＤＡＣ以外に、ＬＲＧ１血漿レベルの増加が他の癌タイプでも見出されている。
【００５２】
３種のマーカーパネルの性能は、早期ＰＤＡＣの対応する健康対象または良性の膵疾患コントロールからの識別において、ＣＡ１９−９単独を超える統計的に有意な改善を示した。この３種のマーカーパネルは、リスクが平均的な無症候性対象のスクリーニングとは対照的に、リスクが高い対象（即ち家族歴、嚢胞性病変、慢性膵炎を有する対象）または成人発症ＩＩ型糖尿病を呈する対象間でのＰＤＡＣの評価を可能にする。
【００５３】
本明細書で開示されているのは、切除可能なＰＤＡＣ患者および対応するコントロールからのサンプルの複数の独立したセットにおいて、同定されたバイオマーカー候補の逐次検証を実行するために、ヒト診断前およびマウスの両方の早期ＰＤＡＣ血漿サンプルを使用して実行される最初のプロテオミクスベースの研究である。
【００５４】
いくつかの実施形態では、生体サンプル中のＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１のレベルを測定する。いくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１をレポーター分子と接触させ、それぞれのレポーター分子のレベルを測定する。いくつかの実施形態では、それぞれＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１に特異的に結合する３種のレポーター分子が提供される。レポーター分子の使用により、アッセイの利便性および感度が増大し得る。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１は、キットに備えられた表面上に吸着される。いくつかの実施形態では、レポーター分子は、表面に吸着されたＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１に結合する。バイオマーカーの吸着は、非選択的または選択的であり得る。いくつかの実施形態では、この表面は、１つまたは複数のバイオマーカーの吸着に対する選択性を増加させるためのレセプター官能基を含む。
【００５６】
いくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１は、これらのバイオマーカーの１つまたは複数に対して選択的な３種の表面上に吸着される。次いで、あるレポーター分子または複数のレポーター分子が、表面に吸着されたバイオマーカーに結合し得、特定の表面と会合しているレポーター分子のレベルは、この表面上に存在する特定のバイオマーカーの容易な定量を可能にし得る。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１は、キットに備えられた表面上に吸着され、これらのバイオマーカーの１つまたは複数に対して特異的なリレー分子が、表面に吸着されたバイオマーカーに結合し得、１つまたは複数のリレー分子に特異的なレセプター分子がリレー分子に結合し得る。リレー分子は、特定のバイオマーカーに対する特異性を付与し得、レセプター分子は、検出を可能にし得る。
【００５８】
いくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９、それぞれＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１に特異的に結合する３種のリレー分子が用意される。これらのリレー分子は、バイオマーカーに対して特異的に設計され得るか、またはこれらの結合特性に起因して候補のプールから選択され得る。これらのリレー分子は、これらのバイオマーカーに結合するように生成された抗体であり得る。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１は、キットに備えられた３種の別々の表面上に吸着され、これらのバイオマーカーの１つまたは複数に特異的なリレー分子が、表面に吸着されたバイオマーカーに結合し得、レセプター分子がリレー分子に結合し得る。これらの表面の分析を段階的にまたは同時に達成し得る。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本レポーター分子は、酵素に連結されており、このレポーター分子の定量は、容易である。いくつかの実施形態では、定量は、望ましい分光特性を有する物質の触媒産生により達成され得る。
【００６１】
いくつかの実施形態では、バイオマーカーの量を、分光法を使用して決定する。いくつかの実施形態では、この分光法は、ＵＶ／可視分光法である。いくつかの実施形態では、バイオマーカーの量を、質量分析法を使用して決定する。
【００６２】
特定のアッセイで見出されたバイオマーカーの量は、オペレータに直接報告され得るか、あるいはデジタル的に保存されて数学的処理に容易に利用され得る。数学的分析を実施するためにシステムが設けられ得、ＰＤＡＣ陽性またはＰＤＡＣ陰性としての分類がオペレータにさらに報告され得る。
【００６３】
いくつかの実施形態では、当業者に既知のさらなるアッセイが本開示の範囲内で機能し得る。他のアッセイの例として、下記を利用するアッセイが挙げられるが、これらに限定されない：質量分析法、免疫親和性ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ、表面プラズモン共鳴、クロマトグラフィー、電気化学、音波、免疫組織化学およびアレイ技術。
【００６４】
同様に本明細書で提供されるのは、ＰＤＡＣ陽性と分類された対象の処置方法である。ＰＤＡＣ陽性患者の処置として、外科手術、化学療法、放射線療法、標的療法またはこれらの組合せを挙げ得るがこれらに限定されない。
【００６５】
上記は、詳細な説明がよりよく理解され得るように本開示の特徴および技術的利益をやや広く概説している。開示された具体的な実施形態は、本開示の同一の目的を実行するための他の構造またはプロセスの改変または設計の基礎として容易に利用され得ることを当業者は認識すべきである。本開示は、説明される特定の実施形態に限定されないことを理解すべきであり、なぜなら、この特定の実施形態の変更形態がなされ得、かつ添付された特許請求の範囲内に依然として含まれるからである。
【００６６】
定義
本明細書で使用される場合、用語「膵癌」は、細胞の異常な増殖を特徴とする膵臓の悪性新生物を意味し、この細胞の増殖は、この細胞の周囲の正常な組織の増殖を上回りかつこの正常な細胞の増殖と調和していない。
【００６７】
本明細書で使用される場合、用語「ＰＤＡＣ」は、膵管腺癌を指し、この膵管腺癌は、膵臓の管に生じる可能性がある膵癌である。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「ＰＤＡＣ陽性」は、ＰＤＡＣを有するとの対象の分類を指す。
【００６９】
本明細書で使用される場合、用語「ＰＤＡＣ陰性」は、ＰＤＡＣを有しないとの対象の分類を指す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、用語「膵炎」は、膵臓の炎症を指す。膵炎は、概して癌には分類されないが、膵癌に進行する場合がある。
【００７１】
本明細書で使用される場合、用語「対象」または「患者」は、本明細書で使用される場合、ＰＤＡＣ陽性またはＰＤＡＣ陰性としての分類が望まれており、かつさらなる処置が施され得る哺乳動物（好ましくはヒト）を指す。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「参照患者」または「参照群」は、ＰＤＡＣを有するか、またはＰＤＡＣに対して感受性であるとの疑いがある患者からの試験サンプルが比較され得る患者または対象の群を指す。いくつかの実施形態では、そのような比較は、試験対象がＰＤＡＣを有するかどうかを決定するために使用され得る。参照患者または参照群は、試験または診断の目的のためのコントロールとして役立ち得る。本明細書で説明される場合、参照患者または参照群は、単一の患者から得られたサンプルであり得、またはサンプル群（例えば、プールされたサンプル群）を表し得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「健康な」は、健康な膵臓を有する個体を指し、即ち正常で損なわれていない膵臓機能を有する個体を指す。健康な患者または対象は、ＰＤＡＣまたは他の膵疾患の症状を有しない。いくつかの実施形態では、健康な患者または対象は、ある患者または患者の群でのＰＤＡＣの決定のための罹患サンプルまたは罹患が疑われるサンプルとの比較のための参照患者として使用され得る。
【００７４】
用語「処置」または「処置すること」は、本明細書で使用される場合、対象または患者が患っている場合の虚弱、または病気、または状態、または事象の発症または再発の予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）（予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ））、あるいはこの発症または再発の程度または可能性の治癒または低減のための、この対象に関する医薬の投与または医療処置の実施を指す。本開示に関連して、この用語は、薬理学的物質もしくは製剤の投与または非薬理学的方法（例えば、限定されないが、放射線療法および外科手術）の実施も意味し得る。本明細書で使用される薬理学的物質として、下記が挙げられ得るが、これらに限定されない：当技術分野で確立されている化学療法剤、例えばゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ）、オキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ）、アルブミン結合パクリタキセル（ＡＢＲＡＸＡＮＥ）、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）、シスプラチン、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）およびイリノテカンリポソーム（ＯＮＩＶＹＤＥ）。薬理学的物質は、免疫療法で使用される物質（例えば、チェックポイント阻害剤）を含み得る。処置は、多様な薬理学的物質または多様な処置方法（例えば、限定されないが、外科手術および化学療法）を含み得る。
【００７５】
本明細書で使用される場合、用語「ＥＬＩＳＡ」は、酵素結合免疫吸着アッセイを指す。このアッセイは、概して、タンパク質の蛍光タグ付きサンプルを、そのタンパク質に対して特異的親和性を有する抗体と接触させることを含む。このタンパク質の検出は、レーザー蛍光定量法が挙げられるが、これに限定されない様々な手段により達成され得る。
【００７６】
本明細書で使用される場合、用語「回帰」は、サンプルの観察可能な形質（または観察可能な形質のセット）に基づいて、前記サンプルの基本的な特性についての予測値を割り当て得る統計的方法を指す。いくつかの実施形態では、この特性は、直接観察可能ではない。例えば、本明細書で使用される回帰方法は、特定の対象に関する特定のバイオマーカー試験またはバイオマーカー試験のセットの定性的または定量的な結果を、前記対象がＰＤＡＣ陽性であるという可能性に関連付け得る。
【００７７】
本明細書で使用される場合、用語「ロジスティック回帰」は、モデルからの予測の割り当てがいくつかの許容離散値の１つを有し得る回帰方法を指す。例えば、本明細書で使用されるロジスティック回帰モデルは、特定の対象に関してＰＤＡＣ陽性またはＰＤＡＣ陰性のいずれかの予測を割り当て得る。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「バイオマーカースコア」は、特定の対象に関する特定のバイオマーカーレベルを統計的方法に入力することにより算出される、前記対象に関する数値スコアを指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、用語「カットオフポイント」は、対象のバイオマーカースコアに基づいて前記対象にＰＤＡＣ陽性またはＰＤＡＣ陰性の分類を割り当てるために使用され得る具体的な統計的方法と関連する数学的値を指す。
【００８０】
本明細書で使用される場合、用語「分類」は、対象に関して得られたバイオマーカースコアの結果に基づく、ＰＤＡＣ陽性またはＰＤＡＣ陰性のいずれかとしての前記対象の割り当てを指す。
【００８１】
本明細書で使用される場合、用語「ＰＤＡＣ陽性」は、本開示の方法の転帰の結果に基づいて対象がＰＤＡＣに対して感受性と予測される指標を指す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、用語「ＰＤＡＣ陰性」は、本開示の方法の転帰の結果に基づいて対象がＰＤＡＣに対して感受性ではないと予測される指標を指す。
【００８３】
本明細書で使用される場合、用語「Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定」（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−Ｗｉｌｃｏｘｏｎ検定またはＷｉｌｃｏｘｏｎ−Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定としても既知である）は、２つの集団の比較に使用される特定の統計的方法を指す。例えば、本明細書では、この検定を使用して、観察可能な形質（特にバイオマーカーレベル）を特定の集団の対象でのＰＤＡＣの有無に関連付け得る。
【００８４】
本明細書で使用される場合、用語「真陽性率」は、特定の方法により陽性と分類された所与の対象が真に陽性である確率を指す。
【００８５】
本明細書で使用される場合、用語「偽陽性率」は、特定の方法により陽性と分類された所与の対象が真には陰性である確率を指す。
【００８６】
本明細書で使用される場合、用語「ＲＯＣ」は、様々なカットオフポイントでの特定の診断方法の性能を評価するために本明細書で使用されるグラフィカルプロットである受信者動作特性を指す。ＲＯＣプロットを様々なカットオフポイントでの真陽性および偽陽性の割合から構築し得る。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「ＡＵＣ」は、ＲＯＣプロットの曲線下面積を指す。ＡＵＣを使用して特定の診断試験の予測力を推定し得る。一般に、より大きいＡＵＣは、予測誤差の頻度の減少と共に予測力の増加に対応する。ＡＵＣの可能な値は、０．５〜１．０の範囲であり、後者の値は、誤差のない予測方法の特性である。
【００８８】
本明細書で使用される場合、用語「ｐ値」または「ｐ」は、陽性ＰＤＡＣの対象および非陽性ＰＤＡＣの対象に関するバイオマーカースコアの分布がＷｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定との関連で同一である確率を指す。一般に、ゼロに近いｐ値は、特定の統計的方法が対象の分類で高い予測力を有するであろうことを示す。
【００８９】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＩ」は、信頼区間（即ち特定の値が特定の信頼レベルにあると予測され得る区間）を指す。本明細書で使用される場合、用語「９５％ＣＩ」は、特定の値が９５％の信頼レベルにあると予測され得る区間を指す。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「感度」は、様々な生化学アッセイとの関連で、疾患を有するものを正確に同定するアッセイの能力（即ち真陽性率）を指す。比較すると、本明細書で使用される場合、用語「特異度」は、様々な生化学アッセイとの関連で、疾患を有しないものを正確に同定するアッセイの能力（即ち真陰性率）を指す。感度および特異度は、二値分類検定の能力（即ち分類関数）の統計的尺度である。感度は、偽陰性の回避を定量化し、特異度は、偽陽性に監視で同じことをする。
【００９１】
本明細書で使用される場合、用語「ＡＬＣＡＭ」は、活性化白血球細胞接着分子を指す。
【００９２】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＨＩ３Ｌ１」は、キチナーゼ−３様−１を指す。
【００９３】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＯＬ１８Ａ１」は、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンアルファ１を指す。
【００９４】
本明細書で使用される場合、用語「ＩＧＢＦＰ２」は、インスリン様成長因子結合タンパク質２を指す。
【００９５】
本明細書で使用される場合、用語「ＬＣＮ２」は、リポカリン２を指す。
【００９６】
本明細書で使用される場合、用語「ＬＲＧ１」は、ロイシンリッチアルファ−２−糖タンパク質１を指す。
【００９７】
本明細書で使用される場合、用語「ＬＹＺ」は、リゾチーム２を指す。
【００９８】
本明細書で使用される場合、用語「ＰＡＲＫ７」は、プロテインデグリカーゼ（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｇｌｙｃａｓｅ）ＤＪ−１を指す。
【００９９】
本明細書で使用される場合、用語「ＲＥＧ３Ａ」は、再生ファミリメンバー３アルファ（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｆａｍｉｌｙ  ｍｅｍｂｅｒ  ３  ａｌｐｈａ）を指す。
【０１００】
本明細書で使用される場合、用語「ＳＬＰＩ」は、アンチロイコプロテイナーゼ（ａｎｔｉｌｅｕｋｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）としても当技術分野で既知である分泌型白血球プロテアーゼインヒビターを指す。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、用語「プロ−ＣＴＳＳ」は、プロカテプシンＳを指す。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、用語「総−ＣＴＳＳ」は、総カテプシンＳを指す。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、用語「ＴＨＢＳ１」は、トロンボスポンジン１を指す。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、用語「ＴＩＭＰ１」は、メタロプロテイナーゼインヒビター１としても当技術分野で既知であるＴＩＭＰメタロペプチダーゼインヒビター１を指す。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、用語「ＴＮＦＲＳＦ１Ａ」は、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリメンバー１Ａを指す。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、用語「ＷＦＤＣ２」は、ＷＡＰ  ４−ジスルフィドコアドメイン２を指す。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、用語「ＣＡ１９−９」は、炭水化物抗原１９−９を指し、癌抗原１９−９およびシアリル化Ｌｅｗｉｓａ抗原としても当技術分野で既知である。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、用語「ｃｔＤＮＡ」は、無細胞ＤＮＡまたは血中循環腫瘍ＤＮＡを指す。ｃｔＤＮＡは、癌患者の血液中を自由に循環していることが分かっている腫瘍ＤＮＡである。理論に制限されることなく、ｃｔＤＮＡは、死滅しかけている腫瘍細胞から生じると考えられ、様々なレベルおよび変異対立遺伝子画分ではあるが、広範囲の癌で存在し得る。一般に、ｃｔＤＮＡは、元々の腫瘍細胞中で形成され、かつ宿主の健康な細胞中で見出されない特有の体細胞変異を持つ。従って、このｃｔＤＮＡ体細胞変異は、癌に特異的なバイオマーカーとして作用し得る。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「代謝産物」は、細胞代謝の中間体および／または産物である小分子を指す。代謝産物は、細胞中で様々な機能を発揮し得、例えば酵素に対する構造的な、シグナル伝達の、刺激性のおよび／または阻害性の効果を発揮し得る。いくつかの実施形態では、代謝産物は、非タンパク質の血漿由来代謝産物マーカーであり得、このマーカーとして、例えばアセチルスペルミジン、ジアセチルスペルミン、リゾホスファチジルコリン（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（２０：３）およびインドール誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「インドール誘導体」は、インドールに由来する化合物を指す。インドールは、式Ｃ８Ｈ７Ｎの芳香族複素環有機化合物である。インドールは、二環式構造を有し、５員の窒素含有ピロール環に縮合した６員のベンゼン環からなる。本明細書で説明されるインドール誘導体は、インドールのあらゆる誘導体であり得る。代表例として、下記が挙げられるが、これらに限定されない：トリプトファン、インドール−３−エタノール、１０，１１−メチレンジオキシ−２０（Ｓ）−ＣＰＴ、９−メチル−２０（Ｓ）−ＣＰＴ、９−アミノ−１０，１１−メチレンジオキシ−２０（Ｓ）−ＣＰＴ、９−クロロ−１０，１１−メチレンジオキシ−２０（Ｓ）−ＣＰＴ、９−クロロ−２０（Ｓ）−ＣＰＴ、１０−ヒドロキシ−２０（Ｓ）−ＣＰＴ、９−アミノ−２０（Ｓ）−ＣＰＴ、１０−アミノ−２０（Ｓ）−ＣＰＴ、１０−クロロ−２０（Ｓ）−ＣＰＴ、１０−ニトロ−２０（Ｓ）−ＣＰＴ、２０（Ｓ）−ＣＰＴ、９−ヒドロキシ−２０（Ｓ）−ＣＰＴ、（ＳＲ）−インドリン−２−カルボン酸、ＩＡＡ、ＩＡＡ−Ｌ−Ｉｌｅ、ＩＡＡ−Ｌ−Ｌｅｕ、ＩＢＡ、ＩＣＡ−ＯＥｔ、ＩＣＡ、インドール−３−アクリル酸、インドール−３−カルボン酸メチルエステル、インドール−３−カルボン酸、インドール−４−カルボン酸メチルエステル、Ｂｏｃ−Ｌ−Ｉｇｌ−ＯＨ。
【０１１１】
膵癌の診断、病期分類および処置。
膵癌を分類するための最も一般的な方法は、膵癌を外科手術により切除し得るかどうか、および膵癌が広がっている場所に基づいて膵癌を下記の４つのカテゴリに分類することである：切除可能、切除可能境界、局所進行性または転移性。切除可能な膵癌を外科手術により切除し得る。この腫瘍は、膵臓のみに存在し得るかまたは膵臓を超えて広がり得るが、この腫瘍は、この領域の重要な動脈または静脈まで増殖していない。この腫瘍が膵臓外の領域に広がっているという証拠はない。今日の医療業界で一般的な標準的方法を使用すると、この病期で診断されるのは、患者のわずか約１０％〜１５％である。切除可能境界は、最初に診断された場合、外科手術により切除することが困難な場合または不可能な場合であるが、化学療法および／または放射線療法により最初に腫瘍を小さくし得、その後に切除縁陰性で切除し得る腫瘍を説明する。切除縁陰性は、視認できるがん細胞が取り残されていないことを意味する。局所進行性の膵癌は、膵臓周辺の領域にのみ依然として存在するが、近くの動脈もしくは静脈までまたは近くの臓器まで増殖していることから、外科手術により切除され得ない。しかしながら、局所進行性の膵癌が身体の任意の遠い部位まで広がっているという徴候はない。今日の医学業界で一般的な標準的方法を使用すると、この病期で診断されるのは、患者の約３５％〜４０％である。転移性は、癌が膵臓の領域を超えて他の臓器（例えば、肝臓または腹部の遠い領域）まで広がっていることを意味する。今日の医学業界で一般的な標準的方法を使用すると、この病期で診断されるのは、患者の約４５％〜５５％である。あるいは、他の癌で一般的に使用されているＴＮＭ病気分類システムを使用し得る（しかしながら、膵癌では一般的ではない）。このシステムは、腫瘍サイズ（Ｔ）、リンパ節への広がり（Ｎ）および転移（Ｍ）に基づく。
【０１１２】
膵癌の処置の選択肢として、癌性組織の部分的または完全な外科的切除のための外科手術（例えば、ウィップル法、膵体尾部切除術または膵全摘術）、１つまたは複数の化学療法剤の投与および罹患した組織への治療用放射線（例えば、従来の／標準的な定位部分的放射線療法（ＳＢＲＴ））の投与が挙げられる。膵癌の処置のために承認されている化学療法剤として、下記が挙げられるが、これらに限定されない：カペシタビン（Ｘｅｌｏｄａ）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ）、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、ロイコボリン（Ｗｅｌｌｃｏｖｏｒｉｎ）、ｎａｂ−パクリタキセル（Ａｂｒａｘａｎｅ）、ナノリポソーム型イリノテカン（ｎａｎｏｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎ）（Ｏｎｉｖｙｄｅ）およびオキサリプラチン（Ｅｌｏｘａｔｉｎ）。
【０１１３】
膵癌は、早期に診断された場合、好ましくは切除可能境界病期においてまたはその前に診断された場合、より好ましくは切除可能病期で診断された場合に最も効果的に処置される。
【実施例】
【０１１４】
下記の実施例は、本開示の実施形態を実証するために含まれる。下記の実施例は、例証としてのみかつ本開示を使用する当業者を補助するために示される。実施例は、本開示の範囲を別途限定することを決して意図しない。当業者は、本開示に照らして、開示された具体的な実施形態に対する多くの変更形態がなされ得、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果が依然として得られることを認識すべきである。
【０１１５】
実施例１：質量分析法。
ヒト血漿サンプルの定量的質量分析（ＭＳ）分析を、既に説明されている（Ｆａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ．５（６）：ｅ１２３，２００８）ように行った。症状の発症および診断前に血液を採取した膵臓の症例からなる１つのプールを重１，２，３−１３Ｃ−アクリルアミド同位体で標識し、コントロールプールをこれらのプールの混合前に軽アクリルアミドで標識した。タンパク質を、Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  Ｃｌａｓｓ−ＶＰ  ７．４（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により制御される自動化オンライン２Ｄ−ＨＰＬＣシステムで分離した。分離は、陰イオン交換クロマトグラフィーと、それに続く逆相クロマトグラフィーとからなった。各画分を凍結乾燥させ、溶液中で消化し、ＮａｎｏＬＣ−１Ｄ（Ｅｋｓｉｇｅｎｔ）と共にＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ（Ｔｈｅｒｍｏ）質量分析計を使用するＭＳにより分析した。
【０１１６】
得られたＬＣ−ＭＳ／ＭＳデータをＣｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＣＰＡＳ）パイプライン（Ｒａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．５（１）：１１２−２１，  ２００６）で処理した。カスタムスコアリングプラグインＣｏｍｅｔを有するＸ！ＴａｎｄｅｍをヒトＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｄｅｘ（ＩＰＩ）バージョン３．１３．のデータベースに対する検索エンジンとして使用した。検索アルゴリズムパラメータをトリプシン特異度および最大で２つの開裂欠損について設定した。質量許容度は、前駆体イオンの場合には１．５Ｄａであり、断片トイオンの場合には０．５Ｄａであった。［１２Ｃ］アクリルアミドによるシステインアルキル化（＋７１．０３６５７）を固定改変として設定し、［１３Ｃ］アクリルアミド（＋３．０１００６）とメチオニンの酸化（＋１５．９９４９１）とを可変改変として設定した。同定したペプチドをＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｐｈｅｔ（Ｋｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７４（２０）：５３８３−９２，２００２）によりさらに検証し、タンパク質をＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｐｈｅｔ（Ｎｅｓｖｉｚｈｓｋｉｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７５（１７）：４６４６−５８，２００３）により推測した。タンパク質同定をＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｐｈｅｔ評価に基づいて５％のエラー率でフィルタリングした。指定されたツールＱ３によりタンパク質の定量的情報を抽出して、ＭＳ／ＭＳにより同定されたシステイン残基を含む各対のペプチドを定量した（Ｆａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｒｅｓ．５（８）：２００９−１８，２００６）。最小で０．７５のＰｅｐｔｉｄｅＰｒｏｐｈｅｔスコアおよび最大で２０ｐｐｍの分数デルタ質量を有するペプチドのみを定量に選択した。［１３Ｃ］アクリルアミド標識ペプチド対［１２Ｃ］アクリルアミド標識ペプチドの比をヒストグラム（ｌｏｇ２スケール）上でプロットし、分布の中央値の中心をゼロに置いた。特定のタンパク質に関する全ての正規化ペプチド比を平均化して、全体のタンパク質比を算出した。
【０１１７】
この分析により、５％未満のエラー率で０．８以上のＰｒｏｔｅｉｎＰｒｏｐｈｅｔスコアを使用して１，７３２種のタンパク質を同定した。結果は、下流の分析に使用される少なくとも２種の定量したペプチドによる３９５種のタンパク質の定量も含んだ。
【０１１８】
実施例２：ＥＬＩＳＡ法。
全てのＥＬＩＳＡ実験に関して、各サンプルを二重にアッセイし、吸光度または化学発光をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓで測定した。内部コントロールサンプルを全てのプレートで実行し、プレート間のばらつきを補正するために、サンプルの各値を同一のプレート中の内部コントロールの平均値で除算した。
【０１１９】
ＮＰＣ２
組換えＮＰＣ２（ａａ  ２０〜１５１；配列番号３；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ６１９１６）に対するマウスモノクローナル抗体（＃６３５および＃６７５）を作製し、サンドインチＥＬＩＳＡで使用した。
【化３】
2020514689.tif 000004
【０１２０】
９６ウェルポリスチレンプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｃａｎｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）を捕捉抗体としての１μｇ／ｍＬの抗ＮＰＣ２マウスモノクローナル抗体（＃６３５）でコーティングし、それに続いてＲｅａｇｅｎｔ  Ｄｉｌｕｅｎｔ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）でブロックした。血漿サンプルを１：２００に希釈し、組換えタンパク質の段階希釈を適用して標準曲線を作成した。１：４０００希釈でのビオチン化抗ＮＰＣ２マウスモノクローナル抗体（＃６７５）を検出に使用した。洗浄後、各ウェルをストレプトアビジン−ＨＲＰと共にインキュベートし、それに続いて発色試薬および停止溶液（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）と共にインキュベートした。
【０１２１】
実施例３：血液サンプルセット。
独立した複数の血液サンプルコホートを、ＰＤＡＣ症例（ｎ＝１８７）、良性の膵疾患（ｎ＝９３）および健康コントロール（ｎ＝１６９）からなるプールから得た。全てのヒト血液サンプルをＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｅｖａｎｓｔｏｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ）の承認およびインフォームドコンセント後に得た。
【０１２２】
初期発見セット
綿密な定量的ＭＳを使用する研究のために、６例の診断前ＰＤＡＣ症例（性別、男性；年齢中央値、６６．５歳；範囲、６２〜７６歳）および６例の対応するコントロール（性別、男性；年齢中央値、６７．０歳、範囲：６１〜７６歳）から血漿プールを構成した。これらのサンプルを、Ｃａｒｏｔｅｎｅ  ａｎｄ  Ｒｅｔｉｎｏｌ  Ｅｆｆｉｃａｃｙ  Ｔｒｉａｌの一部としてのサンプル収集から平均９．３ヶ月（範囲、８〜１２ヶ月）後に病期ＩＡ（Ｎ＝１）、ＩＢ（Ｎ＝２）およびＩＩＢ（Ｎ＝３）ＰＤＡＣと後に診断した対象から、ならびに年齢、性別および喫煙歴が一致しかつ４年間のフォローアップ期間をかけて癌と診断されていない同一のコホートからの６つのコホートから収集した。
【０１２３】
トリアージセット
７５例のＰＤＡＣ症例、２７例の健康コントロールおよび１９例の慢性膵炎症例からなる、Ｅａｒｌｙ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋの後援の下でＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒから得た血漿サンプルを初期検証およびバイオマーカー選択（トリアージセット）に使用した。
【０１２４】
検証セット
７３例の早期ＰＤＡＣを有する患者、６０例の健康コントロール、６０例の慢性膵炎を有する患者および１４例の良性の膵嚢胞を有する患者からの血漿サンプルのさらなるセットをバイオマーカーの連続検証およびパネル開発に使用した。全ての慢性膵炎サンプルを、急性の再燃がない状態で診療所での選択的な設定で採取した。
【０１２５】
Ｅｖａｎｓｔｏｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌの検証セット＃１は、病期ＩＢ〜ＩＩＢのＰＤＡＣ症例（ｎ＝１０）、健康コントロール（ｎ＝１０）および慢性膵炎症例（ｎ＝１０）からなり、検証セット＃２（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｕｔａｈ）は、早期（ＩＡ〜ＩＩＡ）ＰＤＡＣ症例（ｎ＝４２）、健康コントロール（ｎ＝５０）および慢性膵炎症例（ｎ＝５０）からなり、検証セット＃３（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）は、切除可能なＰＤＡＣ症例（ｎ＝２１）、および良性の膵嚢胞症例（ｎ＝１４）からなった。
【０１２６】
これらの３種の検証セットの人口統計を表１に表す。
【０１２７】
試験セット
３９例の早期ＰＤＡＣおよび８２例の健康コントロールからなる、組み合わされたバイオマーカーパネルを試験するためのさらなる独立した血漿サンプルセットをＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒから得た。この試験セットの人口統計を表２に表す。
【０１２８】
【表１】
2020514689.tif 000005
【０１２９】
【表２】
2020514689.tif 000006
【０１３０】
実施例４：統計的方法
各アッセイに関して最低の検出値を補完した後、生アッセイデータを検出限界未満の値にｌｏｇ２変換した。片側Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定を使用し、ＰＤＡＣ症例と、健康コントロール、慢性膵炎症例および膵嚢胞症例とを比較してｐ値を算出した。適用した検定は、対立仮説ＡＵＣ＞０．５０に対してＡＵＣ＝０．５０の帰無仮説を検定することを目的とした片側であった。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を実施して、ＰＤＡＣ症例の健康コントロール、慢性膵炎症例および膵嚢胞症例からの識別でのバイオマーカーの性能を評価した。各セットの小さいサンプルサイズのために、検証セット＃１、＃２および＃３を、健康コントールの場合に平均が０でありかつ標準偏差が１であるようにデータを標準化することによるモデル開発のために組み合わせた。検証セット＃３は、健康コントロールを含まなかったことから、良性の膵嚢胞サンプルが慢性膵炎サンプルと同一の平均および標準偏差を有するように結果を標準化した。ＭＡＴＬＡＢ  Ｒ２０１４ｂおよびＳＡＳバージョン９．３を使用して統計的分析を実施した。ｐ＜０．０５を全ての分析において統計的に有意であるとみなした。
【０１３１】
７種の検証されたバイオマーカー候補の全ての可能な組合せを調査し、Ａｋａｉｋｅ情報量規準（ＡＩＣ）に基づいて、健康コントロール、慢性膵炎および膵嚢胞から膵癌を識別するためにロジスティック回帰モデルを選択した。合計で１２７個のロジスティック回帰モデルをフィットさせた。係数の変動性を考慮して、標準誤差、信頼区間およびｐ値を１０００倍ブートストラップにより得た。バイオマーカーパネルおよびＣＡ１９−９単独を比較するためのｐ値は、１０００倍ブートストラップにより算出され、ＡＵＣ（パネル）＝ＡＵＣ（ＣＡ１９−９）対代替ＡＵＣ（パネル）＞ＡＵＣ（ＣＡ１９−９）の帰無仮説を参照する。尤度比検定も適用して、バイオマーカーパネルの適合度をＣＡ１９−９単独と比較した。ＬｅａｖｅＭＯｕｔ交差検証技術を適用して、得られたロジスティック回帰モデルを検証した。データをトレーニングセットおよび試験セットに分割し、これらのセットは、それぞれ元のデータの２／３および１／３に対応する。そのような分割スキームを１０００回繰り返し、試験セットから得られた１０００個のＡＵＣを平均化することにより、モデルを検証した。改変された計画共変量行列を適用して、慢性膵炎および良性の膵嚢胞の患者から膵癌を識別し得るＯＲ規則を有するロジスティック回帰モデルを構築した：［Ｉ（Ｃａ１９−９＞＝ａ）Ｃａ１９−９＊Ｉ（Ｃａ１９−９＞＝ａ）Ｉ（Ｃａ１９−９＜ａ）ＴＩＭＰ１＊Ｉ（Ｃａ１９−９＜ａ）ＬＲＧ１＊Ｉ（Ｃａ１９−９＜ａ）ＣＡ１９−９＊Ｉ（Ｃａ１９−９＜ａ）］。ＣＡ１９−９閾値「ａ」の全ての可能な値をスキャンして、１０００倍ブートストラップにより可能な限り高いＡＵＣを達成した。ブートストラップにより最初に選択されなかった測定値を使用して予測スコアを作成し、ＡＵＣを評価した。この手順を１０００回繰り返し、得られた１０００個のＡＵＣに対して両側ｐ値を算出した。最も高いＡＵＣを「ａ」＝１．６で得た。
【０１３２】
３種のバイオマーカーＴＩＭＰ１、ＬＲＧ１、ＣＡ１９−９と一緒に共変量（求人センター、性別、年齢、喫煙状況および飲酒により表される）を含むロジスティック回帰モデルの試験セットでの開発の過剰フィッティングを避けるために二段階戦略に従った。最初に、共変量のみを含むロジスティック回帰モデルをフィッティングすることにより共変量ベースのスコアを作成し、次いでこの共変量ベースのスコアを単一の共変量としての３種のバイオマーカーロジスティック回帰モデルに追加した。
【０１３３】
実施例５：バイオマーカーパネル候補の選択。
上記で説明したＮＰＣ２アッセイをこの研究に利用した。少なくとも１７種のさらなるバイオマーカーパネル候補を表３に列挙する。
【０１３４】
【表３】
2020514689.tif 000007
【０１３５】
実施例６：バイオマーカーパネル組成の発見。
トリアージ
この研究のためのフロー図を図１に示す。簡潔に言うと、１８種のバイオマーカー候補のプールをトリアーゼセットに対するスクリーニングによりトリミングした。１２種のバイオマーカーのレベルは、健康コントロールと比較して、ＰＤＡＣにおいて統計的に有意な程度まで高く、それぞれ曲線下面積（ＡＵＣ）＞０．６０およびｐ＜０．０５（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）であった（図２Ａ）。これらのバイオマーカーの７種（ＩＧＦＢＰ２、ＬＲＧ１、ＣＡ１９−９、ＲＥＧ３Ａ、ＣＯＬ１８Ａ１、ＴＩＭＰ１およびＴＮＦＲＳＦ１Ａ）のレベルも、慢性膵炎症例と比較しＰＤＡＣ症例で統計的に有意な程度まで高く（ｐ＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）、＞０．６０のＡＵＣであった（図２Ｂ）。これらの７種のバイオマーカー候補を検証セット＃１、＃２および＃３に対するさらなる評価のためにトリアーゼパネルとして選択した。
【０１３６】
検証
次いで、トリアージパネル中のこれらの７種のバイオマーカー候補を、上記で説明される３種の検証セットによる分析にかけた。トリアージセットで選択された７種の全てのバイオマーカーのＡＵＣ値は、検証セット＃１、＃２および＃３の対応するコントロールと比較して、血漿レベルがＰＤＡＣ患者で一貫して上昇したことを示す（表４、表５および表６）。検証セット＃２におけるＰＤＡＣ対慢性膵炎症例の比較でのこれらの７種のマーカー（ＩＧＦＢＰ２を除く）のＡＵＣは、両方の検証セット＃１および＃２における健康コントロールおよび慢性膵炎症例からのＰＤＡＣ症例の識別で＞０．６０であった。加えて、４種のバイオマーカー（ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１、ＬＲＧ１およびＩＧＦＢＰ２）も、検証セット＃３において良性の膵嚢胞症例と比較して、ＰＤＡＣ症例からの血漿サンプル中で＜０．６０のＡＵＣを生じた（表６）。
【０１３７】
【表４】
2020514689.tif 000008
【０１３８】
【表５】
2020514689.tif 000009
【０１３９】
【表６】
2020514689.tif 000010
【０１４０】
パネル構築
早期ＰＤＡＣのためのバイオマーカーパネルを開発するために、検証セット＃１、＃２および＃３の結果を標準化して組み合わせた。組み合わせた検証セットでは、ＰＤＡＣ症例における７種の全てのバイオマーカーのレベルは、健康コントロールおよび良性の膵疾患症例（慢性膵炎症例と良性の膵嚢胞症例との組合せ）の場合と比べて統計的に有意な程度（ＡＵＣ＞０．６０；ｐ＜０．０５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定）まで高かった（表７）。次に、ロジスティック回帰モデルに基づく早期ＰＤＡＣのためのバイオマーカーパネルを開発した。
【０１４１】
得られた回帰モデルは、
ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−１．９７＋１．７００５×ｌｏｇＴＩＭＰ１＋０．９３８５６×ｌｏｇＬＲＧ１＋０．６０６３９×ｌｏｇＣＡ１９．９
であり得、ここで、ｐは、所与のサンプル中に症例が存在する可能性を示す。このモデルは、ロジットリンク関数を使用する正規ロジスティック回帰モデルである。二値疾患状態（ｂｉｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｔａｔｕｓ）は、反応の役割を果たしており、マーカーは、共変量の役割を果たす。そのような回帰モデルをフィットさせるためのアルゴリズムは、標準的なものであり、一般化線形モデルの標準的なテキストで詳細に説明されている反復再加重手順に基づく（ＭｃＣｕｌｌｏｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｌｉｎｅａｒ  ａｎｄ  Ｍｉｘｅｄ  Ｍｏｄｅｌｓ（２００８）；Ｗｉｌｅｙ  Ｓｅｒｉｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｂｏｋｅｎ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）。しかしながら、この標準的なアプローチは、モデルフィッティングに適用されるにもかかわらず、基礎となるＡＵＣに推論を提供し得ない。ＡＵＣを参照するｐ値および信頼区間を提供するために、推定される係数の変動性を考慮に入れ得るために各ブートストラップサンプル内で係数の再推定（合計で１０００回）が行われるブートストラップスキームを採用した。
【０１４２】
ＬｅａｖｅＭＯｕｔ交差検証技術を適用して、得られたロジスティック回帰モデルを検証した。ＰＤＡＣ症例と健康コントロールとの比較では、得られたパネルは、０．９４９（０．９１７〜０．９８１）のＡＵＣ（９５％ＣＩ）および０．９３６の交差検証関連平均ＡＵＣを生じるＴＩＭＰ１、ＬＲＧ１およびＣＡ１９−９からなり、これは、ＣＡ１９−９単独のＡＵＣ（ＡＵＣ（９５％ＣＩ）＝０．８８２（０．８０９〜０．９５６））と比べて統計的に有意な程度まで大きかった（ｐ＝０．００３、ブートストラップ；ｐ＜０．００１、尤度比検定；表８および図３Ａ）。このパネルは、それぞれ９５％および９９％の特異度で０．８４９および０．６５８の感度を生じたが、ＣＡ１９−９単独の場合の９５％および９９％の特異度での感度は、それぞれ０．７２６および０．４１１であった。同一のバイオマーカー組合せ（ＴＩＭＰ１、ＬＲＧ１およびＣＡ１９−９）に基づくモデルを検証セット＃２で訓練し、検証セット＃１において固定係数で試験した（ｐ＝０．０４、訓練セットでのブートストラップ；ｐ＝０．０２、試験セットでのブートストラップ；（表９））場合、ＰＤＡＣ症例と健康コントロールとの比較においてＣＡ１９−９単独を超える有意な改善も観察した。この結果は、腫瘍サイズが利用可能であった検証セット＃２では、パネルベースのバイオマーカースコアが腫瘍サイズに対する統計的有意性と相関しなかったことも示す。理論に制限されることなく、これは、バイオマーカーの組合せの、寸法が小さい腫瘍を検出する能力を示唆する（図４）。
【０１４３】
同一のバイオマーカー組合せ（ＴＩＭＰ１、ＬＲＧ１およびＣＡ１９−９）に基づくロジスティック回帰モデルを開発し、ＰＤＡＣを良性の膵疾患症例から識別した（ＡＵＣ（９５％ＣＩ）＝０．８４６（０．７８１〜０．９１１）および交差検証関連平均ＡＵＣ＝０．８３０、表８）。「ＯＲ」規則に基づく線形回帰モデルが、ＣＡ１９−９単独または３種の全てのマーカーの組合せのいずれかにより、ＰＤＡＣと良性の膵疾患症例との間の識別を可能にすることがあるかどうかも調査した。ＴＩＭＰ１、ＬＲＧ１およびＣＡ１９−９の「ＯＲ」規則の組合せは、０．８９０（０．８０２〜０．９７８）のＡＵＣ（９５％ＣＩ）を生じ、これは、ＣＡ１９−９単独の場合（ＡＵＣ（９５％ＣＩ）＝０．８３１（０．７５４〜０．９０７）と比べて統計的に有意な程度まで大きかった（ｐ＜０．００１  ブートストラップ；ｐ＜０．００１、尤度比検定；表８および図３Ｂ）。
【０１４４】
良性の膵疾患からのＰＤＡＣの識別のための回帰モデルは、
ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−１．２４９７＋０．５０３０６×ｌｏｇＴＩＭＰ１＋０．２５３５５×ｌｏｇＬＲＧ１＋０．５１５６４×ｌｏｇＣＡ１９．９
であり得、ここで、ｌｏｇは、２を底とする対数を指す。これは、ロジットリンク関数を利用し、かつ応答として二値疾患状態および共変量としてマーカーを使用することにより、正規ロジスティック回帰モデルをフィットさせることによって得られた。そのような回帰モデルをフィットさせるためのアルゴリズムは、標準的なものであり、一般化線形モデルの標準的なテキスト（ＭｃＣｕｌｌｏｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，上記を参照されたい）で詳細に説明されている反復再加重手順に基づく。ＣＡ１９−９単独と３種のマーカーパネルとの間のトレードオフを、グリッド検索によって変動した決定値に基づいて検討して、ＯＲ規則をさらに検討した。即ち、ＣＡ１９−９のみまたは３種の全てのマーカーを通して計画行列が寄与している正規ロジスティック回帰モデルを検討した。この寄与を決定することになる閾値の点の細かいグリッドに基づいて、グリッドの全ての点に関して全てのモデルを繰り返しフィットさせた後に導き出し得る例示的なＡＵＣを抽出した。
【０１４５】
このパネルは、９５％特異度で０．４５２の感度を生じ、これは、ＣＡ１９−９単独の場合の９５％特異度での０．２８８の感度を超える改善を表す。ＴＩＭＰ１、ＬＲＧ１およびＣＡ１９−９の「ＯＲ」規則の組合せは、０．９５５（０．８９０〜１）のＡＵＣ（９５％ＣＩ）を生じる、ＰＤＡＣ患者と健康コントロ−ルとの比較に適用した場合に高い診断制度をもたらす（ｐ対ＣＡ１９−９：ｐ＜０．００１  ブートストラップ；ｐ＜０．００１、尤度比検定；表８）。
【０１４６】
Ｙｏｕｄｅｎ指数ベースの最適カットオフポイントでのオッズ比を推定した。早期ＰＤＡＣ症例対健康コントロールに関するモデルの場合、ｌｏｇ（オッズ比）は、感度が０．８４９であり、特異度が０．９５０であるカットオフポイントで４．６７（９５％ＣＩ＝３．２９〜６．０５）であった。早期ＰＤＡＣ症例対良性の膵疾患症例に関するモデルの場合、ｌｏｇ（オッズ比）は、感度が０．８６３であり、特異度が０．７５７であるカットオフポイントで２．９８（９５％ＣＩ＝２．０４〜３．９１）であった。
【０１４７】
【表７】
2020514689.tif 000011
【０１４８】
【表８】
2020514689.tif 000012
【０１４９】
【表９】
2020514689.tif 000013
【０１５０】
実施例７：バイオマーカーパネルの評価。
試験セットを使用して、３種のバイオマーカーＴＩＭＰ１、ＬＲＧ１およびＣＡ１９−９のパネルのさらなる盲検検証を実施した。３種の全てのバイオマーカーのレベルは、健康コントロールの場合と比べてＰＤＡＣ症例において有意に高く、ＡＵＣ（９５％ＣＩ）は、ＣＡ１９−９に関して０．８２１（０．７３６〜０．９０６）であり、ＴＩＭＰ１に関して０．７３０（０．６２６〜０．８３４）であり、ＬＲＧ１に関して０．８３２（０．７５５〜０．９０９）であった（表１０）。これらの３種のマーカーの線形結合により、ＡＵＣ（９５％ＣＩ）は０．９０３（０．８３８〜０．９６７）となり、これは、ＣＡ１９−９単独のＡＵＣと比べて統計的に有意な程度まで大きかった（ｐ＝０．００１、ブートストラップ；ｐ＜０．００１、尤度比検定；表１１）。さらに、ＴＩＭＰ１、ＬＲＧ１、ＣＡ１９−９および共変量（求人センター、性別、年齢、喫煙状況およびアルコール消費で表される）の線形結合により、ＡＵＣ（９５％ＣＩ）は、０．９２９（０．８７８〜０．９８０）となり、これは、ＣＡ１９−９および共変量の組合せのみ（ＡＵＣ（９５％ＣＩ）＝０．８４８（０．７７８〜０．９２０）を超える統計的に有意な改善を示す（ｐ＝０．０１、ブートストラップ；ｐ＜０．００１、尤度比検定；表１１）。共変量の包含により、３種のバイオマーカーパネルのみと比較して、性能が統計的に有意に改善された（ｐ＝０．０３、ブートストラップ；ｐ＝０．００４、尤度比検定；表１１）。
【０１５１】
注目すべきことに、ＰＤＡＣ対健康コントロールのための組み合わされた検証セットで開発された固定係数を有するＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１のロジスティック回帰モデルは、０．８８７のＡＵＣを生じ、同様にＣＡ１９−９単独と比較して性能が統計的に有意に改善された（ｐ＝０．００８、尤度比検定；表１０および図５）。このモデルは、それぞれ９５％および９９％の特異度で０．６６７および０．４１０の感度を生じたが、ＣＡ１９−９単独に関する９５％および９９％の特異度での感度は、それぞれ０．５３８および０．４６２であった。Ｙｏｕｄｅｎ指数ベースの最適カットオフポイントでの対数変換オッズ比は、感度が０．８７２であり、特異度が０．７８０であるカットオフポイントで３．１９（９５％ＣＩ＝２．１１〜４．２６）であった。
【０１５２】
実施例８：回帰モデルの診断スコアの範囲における特異度および感度。
様々な試薬を使用することを含み得る、バイオマーカーの検出、定量および分析の様々な方法またはアッセイは、この回帰モデルの改変を必要とする場合がある様々な結果を生じることを当業者は認識するであろう。具体的には、様々なアッセイは、例えば、様々な単位で表される結果を生じ得る。さらに、同一サンプルの二重アッセイにおける二重反応も異なる生結果を生じ得る。しかしながら、少なくとも３種のバイオマーカーＴＩＭＰ１、ＬＲＧ１およびＣＡ１９−９の組み合わされた検出、定量および分析は、本明細書で開示された回帰モデルに組み込まれた場合にＰＤＡＣの決定的な診断をもたらす。
【０１５３】
３種のバイオマーカーの検出、定量および分析に使用される特定の各アッセイに関して報告される結果の範囲は、感度または特異度の程度に部分的に依存する、得られたＰＤＡＣ予測スコアの範囲を有する（表１２；Ｙｏｕｄｅｎ  Ｉｎｄｅｘに基づく好ましいカットオフは、特異度が０．９５であり、感度が０．８４９３である０．８８０５である）。ＰＤＡＣ予測スコアを生成するために使用される回帰モデルは、マーカーを試験するために利用される特定のアッセイに依存する可能性がある。当業者に理解されるように、様々なアッセイは、３種のバイオマーカーの異なるエピトープを標的とし得るか、または異なる親和性および感度を有し得る。従って、ＰＤＡＣ予測スコアを生成するために使用される回帰モデルアルゴリズムは、これらのアッセイ変動を考慮するために改変され得る。
【０１５４】
実施例９：サンプルのアッセイおよびＰＤＡＣ患者の診断。
一例では、本明細書で開示された３種のバイオマーカーパネルに基づいてＰＤＡＣに関してスクリーニングされた患者から血液サンプル（または他の流体生検もしくは組織生検）を採取し、ＥＬＩＳＡ（または他のアッセイ）で評価して、この患者中でのＴＩＭＰ１、ＬＲＧ１およびＣＡ１９−９のレベルを定量した。使用される特定のアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ；表３）を考慮する少なくともこれらのバイオマーカーの正規化値は、例えば、ＴＩＭＰ１＝０．６５２８ｎｇ／ｍＬ；ＬＲＧ１＝２．０４９８ｎｇ／ｍＬ；およびＣＡ１９−９＝１．８１６０Ｕ／ｍＬであり得た。次いで、生アッセイデータをｌｏｇ２変換し、各コホートにおける健康サンプルに関する平均および標準偏差を算出する。次いで、健康サンプルが０の平均および１の標準偏差を有するようにデータを標準化し（Ｒｅａｄｊ−ｍｅａｎｈｅａｌｔｈｙ）／（ｓｔｄｈｅａｌｔｈｙ）、ここで、ｊは、ｊ番目のサンプルである。
【０１５５】
下記の回帰モデル：
ｌｏｇｉｔ（ｐ）＝−１．９７＋１．７００５×ｌｏｇＴＩＭＰ１＋０．９３８５６×ｌｏｇＬＲＧ１＋０．６０６３９×ｌｏｇＣＡ１９．９
を使用して分析された場合、上記の患者は、２．１６５３の組み合わされたスコアを有することになる。特異度および感度の両方の考慮のための好ましいカットオフを考慮すると（表１２）、そのような組み合わされたスコアを有する患者は、ほぼ確実にＰＤＡＣを有するはずであり、その結果として、本明細書で論じたおよび当業者に既知の他のモダリティを使用するＰＤＡＣの追跡試験および処置に向けられる。本明細書で説明される回帰モデルを使用すると、組み合わされたＰＤＡＣ予測スコアがプラスであるほど、患者は、より確実にＰＤＡＣを有する。逆に、組み合わされたＰＤＡＣ予測スコアがマイナスであるほど、患者は、より確実にＰＤＡＣを有しない。
【０１５６】
対照的に、別の例では、使用される特定のアッセイを考慮するバイオマーカーＴＩＭＰ１、ＬＲＧ１およびＣＡ１９−９の正規化値は、例えば、ＴＩＭＰ１＝−２．０３７０ｎｇ／ｍＬ；ＬＲＧ１＝−１．５７９２ｎｇ／ｍＬ；およびＣＡ１９−９＝１．０７１２Ｕ／ｍＬであり得た。上記と同一の回帰モデルを使用して分析した場合、そのような患者は、−６．２６６６の組み合わされたスコアを有することになる。特異度および感度の両方の考慮のための好ましいカットオフを考慮すると（表１２）、そのような組み合わされたスコアを有する患者は、ほぼ確実にＰＤＡＣを有しないはずであり、従って、続いて任意の他の臨床条件の強さに基づくさらなる試験を行っても行わなくてもよい。
【０１５７】
【表１０】
2020514689.tif 000014
【０１５８】
【表１１】
2020514689.tif 000015
【０１５９】
【表１２】
2020514689.tif 000016
【０１６０】
【表１３】
2020514689.tif 000017
【０１６１】
【表１４】
2020514689.tif 000018
【０１６２】
実施例１０：早期膵癌の検出のための血漿代謝産物マーカーおよびタンパク質マーカーを組み合わせたパネル
非標的メタボロミクスアプローチを使用して、切除可能な膵管腺癌（ＰＤＡＣ）のために血漿由来代謝産物バイオマーカーパネルを開発した。液体クロマトグラフィー／質量分析を使用するマルチアッセイメタボロミクスアプローチを、２０例（１０例の早期および１０例の後期）のＰＤＡＣ症例ならびに２０例の対応するコントロール（１０例の健康対象；１０例の慢性膵炎を有する対象）から採取した血漿に適用して、ＰＤＡＣのための候補代謝産物マーカーを同定し、候補マーカーを、９例のＰＤＡＣおよび５０例の良性の膵疾患（ＢＰＤ）を有する対象からなる別の「確認」コホートに基づいて絞り込んだ。３９例の切除可能なＰＤＡＣ症例および８２例の対応するコントロールからなる独立したコホートで盲検化検証を実施した。ＰＤＡＣのための候補バイオマーカーマーカーとして、下記を含む５種の代謝産物：アセチルスペルミジン、ジアセチルスペルミン、リゾホスファチジルコリン（１８：０）、リゾホスファチジルコリン（２０：３）およびインドール誘導体を発見コホートおよび「確認」コホートで同定した。ロジスティック回帰モデルに基づいて代謝産物パネルを開発し、組み合わされた発見コホートおよび「確認」コホートにおいて、この代謝産物パネルの、健康コントロールからＰＤＡＣを識別する能力に関して評価した。得られたパネルは、０．９０（９５％Ｃ．Ｉ．：０．８１８〜０．９８９）の曲線下面積（ＡＵＣ）を生じた。この代謝産物パネルの盲検化検証では、独立した検証コホートにおいて０．８９（９５％Ｃ．Ｉ．：０．８２８〜０．９５６）のＡＵＣが生じた。この代謝産物マーカーと、本発明者らが既に同定したタンパク質マーカー（ＣＡ１９−９、ＴＩＭＰ１およびＬＲＧ１）との組合せの重要な評価では、検証コホートにおいて０．９２のＡＵＣが生じ、これは、このタンパク質パネルのみ（ＡＵＣ＝０．８６；ｐ−値：０．０２４）と比べて統計的に有意に大きく、これは、３種タンパク質マーカーパネルと組み合わせた場合のこの代謝産物パネルの相補的性質を強調する。
【０１６３】
膵管腺癌（ＰＤＡＣ）は、米国において男女の両方での癌関連死亡率の３番目に主要な原因であり、全体の５年生存率、わずか約８％である。残念ながら、早期でのＰＤＡＣの診断は、一般的ではなく、通常、患者の大部分（約８５％）は、局所的に進行した疾患また転移性疾患を呈する偶発的なものである。
【０１６４】
現在、無症候性個体において早期ＰＤＡＣに望ましい性能特性を示す臨床マーカーは存在しない。スクリーニングバイオマーカーとしてのＣＡ１９−９の現在の使用は、このＣＡ１９−９の変わりやすい精度、疾患の診断前病期での性能の低下およびフコシルトランスフェラーゼ欠乏症を有する対象の約１０％で検出され得ないことにより制限される。その結果、無症候性個体での少量のＰＤＡＣの確実な検出のために、より高い感度および特異度をまとめて示すさらなるマーカーが非常に必要とされている。これに関連して、血液ベースのバイオマーカーは、理想的であり、かつ早期での疾患の検出のための比較的非侵襲で費用対効果が高い方法を表す。
【０１６５】
近年では、ＣＡ１９−９を補完し得る、早期ＰＤＡＣの検出のためのタンパク質ベースのバイオマーカーパネルの開発およびその後の検証が実施された。分類性能は、ＣＡ１９−９のみと比べて改善されたが、改善の余地が残っていた。そのため、この困難な用途に最適なバイオマーカー組合せモデルの開発を可能にするために、代謝産物等の様々な種類のバイオマーカーの相対的寄与を試験する必要がある。
【０１６６】
本研究では、非標的メタボロミクスアプローチを適用して、ＰＤＡＣのための血漿由来代謝産物バイオマーカーパネルを開発した。固定されたバイオマーカーパネルを、その後、既に同定したタンパク質パネルに対する比較に加えて、３９例の切除可能なＰＤＡＣ症例および８２例の対応する健康コントロールからなる独立した試験コホートで盲検的に検証した。この代謝産物パネルの、良性の膵嚢胞と診断された対象からＰＤＡＣ症例を識別する性能をさらに試験した。
【０１６７】
研究対象集団
全てのヒト血液サンプルをＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄの承認およびインフォームドコンセント後に得た。初期の代謝産物発見研究のために、２０例のＰＤＡＣを有する患者（１０例の早期ＰＤＡＣおよび１０例の後期ＰＤＡＣを含む）、１０例の健康コントロールならびに１０例の慢性膵炎を有する患者からの血漿サンプルをＥｖａｎｓｔｏｎ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから得た（発見セット）。全ての慢性膵炎サンプルを、急性の再燃がない状態で診療所での選択的な設定で採取した。５０例の低形成異常グレードの膵嚢胞を有する患者および９例の浸潤性ＩＰＭＮ（５例の早期腺癌および４例の後期腺癌）を有する患者からなる、Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅから得られた血漿サンプルをバイオマーカーの順次選択および初期検証（確認セット）に使用した。全ての患者は、嚢胞性病変の外科的切除を受け、外科手術前に血漿サンプルを採取した。形成異常グレードを外科的切除後に組織病理学的に確認し、ＷＨＯ基準に従って決定した。３９例の早期ＰＤＡＣおよび８２例の健康コントロールからなる、組み合わされたバイオマーカーパネルを試験するためのさらなる独立した血漿サンプルをＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｅｎｃｙ  ｆｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｏｎ  Ｃａｎｃｅｒから得た（試験セット＃１）。１０２例の低形成異常グレードの膵嚢胞を有する患者、１２例の切除可能な浸潤性ＩＰＭＮを有する患者およびＩＰＭＮを有する切除可能な８例のＰＤＡＣ患者からなる、Ｉｎｄｉａｎａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅからの別のサンプルセットを試験セット＃２として適用した。この検証セットおよび試験セットにおける研究の流れ図および患者の臨床的特徴を図６ならびに表１３および表１４に表す。
【０１６８】
【表１５】
2020514689.tif 000019
【０１６９】
【表１６】
2020514689.tif 000020
【０１７０】
【表１７】
2020514689.tif 000021
【０１７１】
【表１８】
2020514689.tif 000022
【０１７２】
細胞株のメタボロミック実験
ＰＤＡＣ細胞株（ＣＦＰＡＣ、ＭｉａＰａＣａ、ＳＵ８６８６、ＢｘＰＣ３、ＣＡＰＡＮ２、ＰＡＮＣ０３．２７およびＳＷ１９９０）を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させた。各細胞株の同一性を、ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  １．２キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ｍＲＮＡおよび全タンパク質の溶解物の調製時に短いタンデム反復によるＤＮＡフィンガープリンティングにより確認した。フィンガープリンティングの結果を、細胞株の一次供給源により維持されている参照フィンガープリントと比較した。細胞を６ｃｍディッシュ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に播種し、この細胞は、最初の播種から２４時間後に７０％（５０〜８０％）培養密度に達した。２４時間後、細胞溶解物を、予め冷却した０．９％ＮａＣｌで２回洗浄し、続いて予め冷却した抽出緩衝液（３：１イソプロパノール：超純水）１ｍＬを添加してクエンチし、細胞培地を除去した。次いで、細胞を、抽出溶媒中で２５ｃｍセルスクレーパ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ）を使用して掻き取り、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移した。短時間にわたりボルテックスした後、抽出された細胞溶解物を２，０００×ｇで１０分にわたり４℃において遠心分離した。その後、抽出された代謝産物を含む上清１ｍＬを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、メタボロミック分析に必要とされるまで−２０℃で貯蔵した。
【０１７３】
エクソメタボローム（Ｅｘｏｍｅｔａｂｏｌｏｍｅ）実験
細胞を１２ウェルディッシュ（Ｃｏｓｔａｒ）中においてＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ＦＢＳ  １ｍｌ中で増殖させ、この細胞は、最初の播種の２４時間後に７０％（５０〜８０％）培養密度に達した。実験当日、この細胞を、５ｍＭグルコースおよび０．５ｍＭグルタミンを含む血清フリーＲＰＭＩ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）５００μＬで２回洗浄した。次いで、５ｍＭグルコースおよび０．５ｍＭグルタミンを含む血清フリーＲＰＭＩ（３００μＬ）を各ウェルに添加し、細胞をインキュベートした。所定のインキュベーション期間（１、２、４および６時間）後に馴化培地２５０μＬを回収した。ベースライン（Ｔ０）のために、培地を３００μＬ添加した直後に２５０μＬ回収した。全ての時点を三重または四重に実施した。培地のみを含むブランクサンプルを含め、Ｔ０およびＴ６で回収した。６時間サンプルを使用して、データ正規化のために細胞数を計数した。全ての培地サンプルを回収した時点で、チューブを１０分にわたり２０００×ｇで遠心分離して残留細片を除去し、上清を１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに移し、メタボロミクス分析に使用するまで−８０℃で貯蔵した。
【０１７４】
一次代謝産物および生体アミン
９６ウェルマイクロプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中において、ＬＣＭＳグレードのメタノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）３０μＬにより、予め分注したＥＤＴＡ血漿（１０μＬ）から血清代謝産物を抽出した。プレートを加熱密封し、７５０ｒｐｍで５分にわたりボルテックスし、室温で１０分にわたり２０００×ｇにおいて遠心分離した。上清（１０μＬ）を９６ウェルプレートに慎重に移し、沈殿したタンパク質を残した。この上清を１００ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３）１０μＬでさらに希釈した。親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）分析のために、このサンプルをＬＣＭＳグレードのアセトニトリル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）６０μＬで希釈し、Ｃ１８分析のためのサンプルを水６０μＬ（ＧｅｎＰｕｒｅ超純水システム、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で希釈した。各サンプル溶液をＬＣＭＳ分析のために３８４ウェルマイクロプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移した。
【０１７５】
細胞溶解物のために、１００μＬ（３：１イソプロパノール：超純水）を２枚の３００μＬの９６ウェルプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に分注し、真空下で蒸発乾固させた。次いで、このサンプルを下記の通りに再構築した：ＨＩＬＩＣアッセイのために、乾燥させたサンプルをＡＣＮ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）：１００ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３）（９：１）６５μＬに溶解させ、逆相Ｃ１８アッセイのために、乾燥させたサンプルをＨ２Ｏ：１００ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３）（９：１）６５μＬに溶解させた。次いで、このサンプルを遠沈させてあらゆる不溶性物質を除去し、ＬＣＭＳを使用するハイスループット分析のために３８４ウェルプレートに移した。
【０１７６】
凍結培地サンプルを氷上で解凍し、３０μｌを、１００ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３．０）３０μＬが入った９６ウェルマイクロプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移した。このマイクロプレートを加熱密封し、７５０ｒｐｍで５分にわたりボルテックスし、室温で１０分にわたり２０００×ｇにおいて遠心分離した。親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）分析のために、サンプル２５μＬを、アセトニトリル７５μＬが入った新たな９６ウェルプレートに移し、Ｃ１８分析のためのサンプルを、水７５μＬ（ＧｅｎＰｕｒｅ超純水システム、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）が入った新たな９６ウェルプレートに移した。各サンプル溶液をＬＣＭＳ分析のために３８４ウェルマイクロプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移した。
【０１７７】
各バッチに関して、サンプルを無作為化し、マトリックスに適合させた参照品質コントロールおよびバッチ特異的にプールした品質コントロールを含めた。
【０１７８】
複雑な脂質
９６ウェルマイクロプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）中において、ＬＣＭＳグレードの２−プロパノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）３０μＬにより、予め分注したＥＤＴＡ血漿サンプル（１０μＬ）を抽出した。プレートを加熱密封し、７５０ｒｐｍで５分にわたりボルテックスし、室温で１０分にわたり２０００×ｇにおいて遠心分離した。上清（１０μＬ）を９６ウェルプレートに慎重に移し、沈殿したタンパク質を残した。この上清を１：３：２  １００ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３）（Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）：アセトニトリル：２−プロパノール  ９０μＬでさらに希釈し、ＬＣＭＳを使用する液体分析のために３８４ウェルマイクロプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移した。
【０１７９】
細胞溶解物のために、３００μＬの９６ウェルプレート中において、抽出された細胞溶解物代謝産物の上清（３：１イソプロパノール：超純水）１０μＬを１：３：２  １００ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３）：アセトニトリル：２−プロパノール（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）９０μＬで希釈し、ＬＣＭＳを使用する分析のために３８４ウェルマイクロプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に移した。
【０１８０】
各バッチに関して、サンプルを無作為化し、マトリックスに適合させた参照品質コントロールおよびバッチ特異的にプールした品質コントロールを含めた。
【０１８１】
一次代謝産物および生体アミンの非標的分析
Ｘｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ四重極飛行時間（ｑＴＯＦ）質量分析計に連結された２Ｄカラム再生構成（ＩクラスおよびＨクラス）を有するＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣシステムで非標的メタボロミクス分析を実行した。４５℃でＨＩＬＩＣ（Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ  ＢＥＨアミド、１００Å、１．７μｍ  ２．１×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ）およびＣ１８（Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３、１００Å、１．８μｍ、２．１×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ）カラムを使用して、クロマトグラフィー分離を実施した。
【０１８２】
四級溶媒系移動相は、（Ａ）水中の０．１％ギ酸、（Ｂ）アセトニトリル中の０．１％ギ酸および（Ｄ）１００ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３）であった。サンプルを、下記の勾配プロファイルを使用して分離した：ＨＩＬＩＣ分離のために、９５％Ｂおよび５％Ｄの出発勾配を０．４ｍＬ／分の流速で５分間かけて７０％Ａ、２５％Ｂおよび５％Ｄへ直線的に増加させ、その後、０．４ｍＬ／分の流速で１００％Ａにおいて１分間の定組成勾配を続けた。Ｃ１８分離の場合、クロマトグラフィー勾配は、下記の通りであった：開始条件、１００％Ａ、５％Ａ、９５％Ｂの最終条件までの直線的な増加、その後の１分にわたる９５％Ｂ、５％Ｄでの定組成勾配。
【０１８３】
カラムの再生および平衡化に二成分ポンプを使用した。溶媒系移動相は、（Ａ１）１００ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３）、（Ａ２）２−プロパノール中の０．１％ギ酸および（Ｂ１）アセトニトリル中の０．１％ギ酸であった。ＨＩＬＩＣカラムを、５分にわたり９０％Ａ２を使用してストリップし（ｓｔｒｉｐ）、その後、０．３ｍＬ／分の流速で１００％Ｂ１を使用して２分にわたり平衡化した。２分にわたり９５％Ａ１、５％Ｂ１を使用して逆相Ｃ１８カラム再生を実施し、その後、５分にわたり５％Ａ１、９５％Ｂ１を使用してカラムを平衡化した。
【０１８４】
複雑な脂質の非標的分析
リピドミック（ｌｉｐｉｄｏｍｉｃ）アッセイのために、Ｘｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ四重極飛行時間（ｑＴＯＦ）質量分析計に連結された２Ｄカラム再生構成（ＩクラスおよびＨクラス）を有するＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣシステムで非標的メタボロミクス分析を実行した。５５℃でＣ１８（Ａｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ  ＨＳＳ  Ｔ３、１００Å、１．８μｍ、２．１×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，Ｕ．Ｓ．Ａ）カラムを使用して、クロマトグラフィー分離を実施した。移動相は、（Ａ）水、（Ｂ）アセトニトリル、（Ｃ）２−プロパノールおよび（Ｄ）５００ｍＭギ酸アンモニウム（ｐＨ３）であった。２０％Ａ、３０％Ｂ、４９％Ｃおよび１％Ｄの出発溶出勾配を５．５分にわたり１０％Ｂ、８９％Ｃおよび１％Ｄへ直線的に増加させ、その後、１．５分にわたり１０％Ｂ、８９％Ｃおよび１％Ｄでの定組成溶出ならびに１分にわたる最初の条件によるカラム平衡化が続いた。
【０１８５】
質量分析データの取得
質量分析データを、一次代謝産物の場合には５０〜１２００Ｄａ範囲内での、および複雑な脂質の場合には１００〜２０００Ｄａ内での感度、正および負のエレクエトロスプレーイオン化モードで取得した。エレクエトロスプレー取得のために、キャピラリー電圧を１．５ｋＶ（正）、３．０ｋＶ（負）に設定し、３０Ｖのサンプルコーン電圧、１２０℃の供給源温度、５０Ｌ／時のコーンガス流、および連続モードでの０．５秒のスキャン時間を有する８００Ｌ／時の脱溶媒和ガス流速に設定した。ロックスプレー補正およびスキャンのためのロイシンエンケファリン；５５６．２７７１Ｄａ（正）および５５４．２６１５Ｄａ（負）を０．５分で実施した。別途指定しない限り、各サンプルの注入量は、３μＬであった。サンプル取得期間にわたり装置感度を最適化するために装置の自動利得制御により取得を実行した。
【０１８６】
プールされた品質コントロールサンプルを規定の数のサンプル後に分析して、複製精度を評価し、注入順序によるＬＯＥＳＳ補正を可能にした。プールされた品質コントロールサンプルに関するＭＳｅ関数を使用して、さらなるデータを取得した。
【０１８７】
データ処理
ＬＣ−ＭＳおよびＭＳｅのデータのピークピッキングおよび保持時間アラインメントを、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  ＱＩ（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ，Ｗａｔｅｒｓ）を使用して実施した。データ処理およびピークアノテーションを、インハウスの自動パイプラインを使用して実施した。信頼のおける標準から作成したカスタマイズライブラリを使用して正確な質量および保持時間を一致させることにより、かつ／またはＮＩＳＴ  ＭＳＭＳ、ＬｉｐｉｄＢｌａｓｔもしくはＨＭＤＢ  ｖ３理論的断片化に対する実験に基づくタンデム質量分析データを一致させることにより、アノテーションを決定した。注入順序のドリフトを補正するために、実行シーケンスを通じて１０回の注入毎に収集した品質コントロールサンプルの反復注入からのデータを使用して各特徴を正規化した。既に説明されている（１）Ｌｏｃａｌｌｙ  Ｗｅｉｇｈｔｅｄ  Ｓｃａｔｔｅｒｐｌｏｔ  Ｓｍｏｏｔｈｉｎｇ  （ＬＯＥＳＳ）シグナル補正（ＱＣ−ＲＬＳＣ）により、測定データを平滑化した。品質コントロールサンプルにおいて３０未満の相対標準偏差（ＲＳＤ）を示す検出された特徴のみをさらなる統計分析のために考慮した。データマトリックスの複雑さを低減するために、複数の付加物または取得モードの反復を有する注釈付きの機能を１つの代表的な固有の機能に折りたたんだ。特徴を複製精度（ＲＳＤ＜３０）、強度、および理論的同位体分布に一致する最良の同位体類似性に基づいて選択した。所与の分析物に関する分析バッチ毎に実行された過去の品質コントロール参照サンプルの中央値に対する比として値を報告する。
【０１８８】
酵素結合免疫吸着アッセイ
ＣＡ１９−９、ＬＲＧ１およびＴＩＭＰ１の血漿タンパク質濃度を、既に説明されているように決定した（Ｃａｐｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。全てのＥＬＩＳＡ実験に関して、各サンプルを二重にアッセイし、吸光度または化学発光をＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で測定した。内部コントロールサンプルを全てのプレートで流し、サンプルの各値を同一プレート中の内部コントールの平均値で除算して、内挿変動性を補正した。
【０１８９】
遺伝子発現のデータおよびネットワーク
Ｂａｄｅａデータセットに関する遺伝子発現をｏｎｃｏｍｉｎｅデータベースからダウンロードした。サイトスコープを使用してネットワークを可視化した。
【０１９０】
統計分析
受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析を実施して、健康コントロールおよび良性の膵疾患（慢性膵炎または膵嚢胞）と診断された対象からのＰＤＡＣ症例の識別でのバイオマーカーの性能を評価した。
【０１９１】
全てのバイオマーカーの個々の性能に対応するＡＵＣを、受信者動作特性曲線（ＲＯＣ）の経験に基づく推定量下の面積を使用して推定する。各バイオマーカーの個々の性能に関して提示された標準誤差（Ｓ．Ｅ．）および対応する９５％信頼区間は、コントロールおよび罹患した１０００例のブートストラップサンプルに関する別々の置き換えにより再サンプリングを実施したブートストラップ手順に基づいていた。マーカーＬＰＣ（１８：０）、ＬＰＣ（２０：３）およびインドール−３−ラクテートの場合、これらのマーカーは、癌関連サンプルに対応する測定値と比較してコントロールに関して高い測定値を示す傾向があることから、逆方向性を考慮することに留意した。モデル構築は、ロジットリンク関数を使用するロジスティック回帰モデルに基づいていた。このモデルに対応する線形結合の経験に基づく推定量を使用することにより、提案された代謝産物パネルの推定ＡＵＣ（０．９０３４）を導き出した。ＡＵＣ（０．８１８０〜０．９８８９）に基づく代謝産物パネルに関して報告された９５％信頼区間は、基礎となるロジスティック回帰モデルの係数が推定されたという事実を考慮しており、そのため、１０００回の反復でブートストラップを使用することにより、全てのブートストラップ反復で適切な推論を提供するためにモデルの係数が再推定される変動性を示す。ハイパーパネル（即ち２つの基礎となるパネル（タンパク質のためのパネルおよび代謝産物のためのパネル）の組合せを指すパネル）は、固定されたそれぞれの係数を考慮して、これらの２つのパネルを２種の複合マーカー（タンパク質のための１つの複合マーカーおよび代謝産物のための１つ）として使用して開発されている。このハイパーパネルを、本発明者らがロジットリンク関数を考慮したロジスティック回帰モデルを使用して、これらの２つの基礎となる複合マーカーを組み合わせることにより開発した。
【０１９２】
結果
膵癌代謝産物バイオマーカーの同定
非標的メタボロミクス分析を、２０例のＰＤＡＣ症例（１０例の早期および１０例の後期）ならびに２０例の対応するコントロール（１０例の健康対象および１０例の慢性膵炎（ＣＰ）を有する対象）からなる発見コホート（セット＃１）で実行した（図６）。有意なＲＯＣ  ＡＵＣ（両側Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定＜０．０５）に基づいて候補バイオマーカーを最初に選択し、９１種の代謝産物が得られた（表１５）。候補リストをさらに絞り込むために、メタボロミック分析を、９例のＰＤＡＣ（５例の早期および４例の後期）ならびに５０例の良性の膵疾患（ＢＰＤ）（良性の膵嚢胞）を有する対象からなる独立した「確認」コホート（セット＃２）で実行した。９１種の元々の特徴のうち、１６種は、有意なＡＵＣを保持し、セット１で観察されたのと同一の相対的な変化の方向（増加／減少）を維持した（表１６）。候補代謝産物をさらに洗練させて、（１）早期ＰＤＡＣとＣＰを有する対象との間で類似のレベルを示した代謝産物（片側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定ｐ＜０．１）、および（２）ＣＰと健康コントロールとの間で異なる代謝産物（片側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定ｐ＜０．１）を除外した（表１６）。個々の脂質種の場合、食事パターン等の外的要因に起因する非特異性を軽減するために、脂質クラス全体の中で性能特性の均一性を示す脂質を強調した（即ち、所与の脂質クラスにおいて検出された個々の脂質の＞８０％は、コントロールを比較して症例の一致した増加／減少を示した）（図７）。上述の基準を満たす合計５例の代謝産物を選択した。これらの５種の代謝産物は、（Ｎ１／Ｎ８）−アセチルスペルミジン（ＡｃＳｐｅｒｍ）、ジアセチルスペルミン（ＤＡＳ）、リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）（１８：０）、ＬＰＣ（２０：３）およびインドール誘導体であった（図８および表１７）。
【０１９３】
【表１９】
2020514689.tif 000023
【０１９４】
【表２０】
2020514689.tif 000024
【０１９５】
【表２１】
2020514689.tif 000025
【０１９６】
【表２２】
2020514689.tif 000026
【０１９７】
【表２３】
2020514689.tif 000027
【０１９８】
【表２４】
2020514689.tif 000028
【０１９９】
【表２５】
2020514689.tif 000029
【０２００】
【表２６】
2020514689.tif 000030
【０２０１】
【表２７】
2020514689.tif 000031
【０２０２】
【表２８】
2020514689.tif 000032
【０２０３】
【表２９】
2020514689.tif 000033
【０２０４】
【表３０】
2020514689.tif 000034
【０２０５】
【表３１】
2020514689.tif 000035
【０２０６】
【表３２】
2020514689.tif 000036
【０２０７】
【表３３】
2020514689.tif 000037
【０２０８】
次に、ロジスティック回帰モデルに基づいてＰＤＡＣのためのバイオマーカーパネルを開発した。セット＃１および＃２からのＰＤＡＣ症例（ｎ＝２９）を組み合わせ、セット＃１からの健康対象（ｎ＝１０）に対して評価した（図７）。ロジットリンク関数を組み込むロジスティック回帰モデルにより得られた推定係数を表１８に示す。組み合わされたデータセットに関する５−代謝産物マーカーの個々の性能を表１７に示す。ＰＤＡＣと健康な対象との比較において、得られたＡｃＳｐｅｒｍ＋ＤＡＳ＋ＬＰＣ（１８：０）＋ＬＰＣ（２０：３）＋インドール誘導体のパネルは、０．９０（９５％Ｃ．Ｉ．＝０．８１８〜０．９８９）のＡＵＣを生じ、９９％の特異度で６９％の感度を示す（図９Ａ）。ＢＰＤ（慢性膵炎および低悪性度嚢胞）からのＰＤＡＣの識別のための代謝産物パネルの性能は、９５％の特異度で４１％の感度において０．６９（９５％Ｃ．Ｉ．＝０．５５７〜０．８１９）のＡＵＣを生じたが、達成された最大ＡＵＣは、インドール誘導体のみで得られた（ＡＵＣ＝０．８３３）（図９Ｂ）。
【０２０９】
切除可能なＰＤＡＣ血漿サンプルの２つの独立したセットにおける代謝産物バイオマーカーパネルの試験
５種の代謝産物の盲検検証を個々におよびパネルとして３９例の切除可能なＰＤＡＣ症例および８２例の対応する健康コントロールからなる血漿サンプルの独立したセットで実施した（試験セット＃１）。５種の全てのバイオマーカーは、０．７３〜０．８４の範囲の個々のＡＵＣを有する健康コントロールと比較して、ＰＤＡＣ症例において有意に異なっていた（片側ｐ＜０．００１）（表１９）。５種の全ての代謝産物は、初期コホートで観察されたものと同一の変化の方法（増加／減少）を示した。５−代謝産物パネルに関するロジスティック回帰モデルは、０．８９（９５％Ｃ．Ｉ．＝０．８２８〜０．９５６）のＡＵＣを生じ、９５％の特異度で６％の感度を示す（図１０および表１９）。
【０２１０】
【表３４】
2020514689.tif 000038
【０２１１】
【表３５】
2020514689.tif 000039
【０２１２】
個々の代謝産物およびパネルの、ＢＰＤ（低悪性度嚢胞）からＰＤＡＣを識別する能力を、確認セット（セット＃２）と同一の研究に由来するが、別々に分析した、２０例の切除可能なＰＤＡＣおよび１０２例のＰＢＤと診断された対象からなる別のコホート（試験セット＃２）で試験した。個々の分類性能は、０．６０〜０．７３の範囲であった（表２）。５−代謝産物パネルに関する固定されたロジスティック回帰モデルは、０．７０（９５％Ｃ．Ｉ．＝０．５７３〜０．８３３）のＡＵＣを生じ、９５％の特異度で１５％の感度を示した（図１０Ｂおよび表１９）。
【０２１３】
代謝産物マーカーおよびタンパク質マーカーの組合わせは、分類性能を改善する
既に早期ＰＤＡＣのためのタンパク質由来バイオマーカーパネルを開発し、このパネルを、本明細書で説明される同一の独立コホート（試験セット＃１）で検証した。従って、代謝産物パネルおよびタンパク質パネルからなるハイパーパネルは、タンパク質パネルのみと比較して分類性能を改善するかどうかを調べた。訓練セット（２９例のＰＤＡＣ対１０例の健康コントロール）におけるハイパーパネルのＡＵＣは、９５％ＣＩで０．９７のＡＵＣ（０．９２７８〜１．０００）を生じた。１％のＦＰＲ値に対する代謝産物パネルのみの感度は、０．６８９７であると推定される。訓練セットにおけるハイパーパネルを考慮する場合、この推定値は、０．８６２１まで統計的に有意に改善される（対応する片側ｐ値＝０．０３９０）。訓練セットにおける、ＡＵＣに関するタンパク質パネル（ＡＵＣ＝０．９５）およびハイパーパネル（ＡＵＣ＝０．９７）の比較により、０．１０７４のｐ値が得られる（図１１Ａ）。タンパク質パネルに関する盲検検証（試験セット＃１）中の対応する推定値は、０．８６のＡＵＣを生じたが、ハイパーパネルは、０．０２３６に等しい比較のための対応する片側ｐ値と共に０．９２のＡＵＣを生じた（図１１Ｂ）。これは、タンパク質パネルと比較してハイパーパネルの性能の全体としての統計的に有意な改善を実証し、これは、代謝産物パネルおよびタンパク質パネルが相補的であることを示す。
【０２１４】
ＰＤＡＣは、アセチル化ポリアミンを分泌する
血漿ＡｃＳｐｅｒｍおよびＤＡＳの上昇が病状と関連しているかどうかを決定するために、５種のＰＤＡＣ細胞株（ＣＦＰＡＣ−１、ＭｉａＰａＣａ、ＳＵ８６８６、ＰＡＮＣ０３−２７およびＳＷ１９９０）由来の細胞溶解物および血清フリー馴化培地を分析した。細胞溶解物のメタボロミック分析により、５種の全ての細胞株におけるＡｃＳｐｅｒｍおよびＤＡＳの検出可能なレベルを明らかにした。馴化培地の分析は、５種の全ての細胞株における陽性率のＡｃＳｐｅｒｍ蓄積を示し、５種の細胞株の３種で陽性率のＤＡＳ蓄積を観察した（図１２Ａ）。Ｂａｄｅａデータセットにおけるポリアミン関連酵素のｍＲＮＡの発現の調査は、隣接コントロール組織と比較してスペルミンシンターゼ（ＳＭＳ）およびスペルミジン／スペルミンアセチルトランスフェラーゼ（ＳＡＴ１）の有意な（対応のあるＴ検定）ＰＤＡＣ関連上昇を示したが、スペルミジンシンターゼ（ＳＲＭ）、ポリアミンオキシダーゼ（ＰＡＯＸ）およびスペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）は、有意に減少し（図１１Ｂ））、これは、これらの酸化よりもむしろポリアミンのアセチル化の増加およびその後の分泌をまとめて示唆する。
【０２１５】
ＰＤＡＣは、細胞外リゾホスファチジルコリンを異化する
ＰＤＡＣ細胞が細胞外脂質を異化する／除去するかどうかを決定するために、ＰＡＮＣ１細胞およびＳｕ８６８６細胞に由来の血清含有培地の脂質組成を馴化から２４、４８および７２時間後に調べた。この分析は、ＬＰＣ（１８：０）およびＬＰＣ（２０：３）（図１２Ａ）を含むいくつかのリゾリン脂質（図１３）の時間依存的な減少を示した。同時に、ＬＰＣの分解生成物であるグリセロホスホコリンは、馴化培地中で時間依存的増加を示し（図１２Ｂ）、これは、細胞外ＬＰＣの活発な異化をまとめて示唆する。リン脂質およびリゾリン脂質の異化に関与する酵素のｍＲＮＡ発現の評価（図１２Ｃ）は、Ｂａｄｅａデータセットにおける隣接コントロール組織と比べて、可溶性ホスホリパーゼＡ２−Ｘ（ＰＬＡ２Ｇ１０）、オートタキシン（ＥＮＰＰ２）およびリゾホスホリパーゼＬＹＰＬＡ１の有意な（両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定）ＰＤＡＣ関連の上昇を示した（図１２Ｄ）。
【０２１６】
考察
本研究の主な目的は、切除可能なＰＤＡＣに関する血漿代謝産物由来バイオマーカーパネルを同定して検証することであった。非標的メタボロミクスアプローチを使用して、検証コホート（試験セット＃１）において０．８９のＡＵＣを生じる健康個体から切除可能なＰＤＡＣ症例を識別し得る５−マーカー代謝産物バイオマーカーパネルを同定して検証した。代謝産物および既に同定したタンパク質パネルからなるハイパーパネルは、タンパク質パネルのみと比較して分類性能を有意に改善する（ＡＵＣ：０．９２対０．８６；ｐ：０．０２４；試験セット＃１）ことが同様に実証され、これは、この代謝産物パネルの相補的性質を強調する。
【０２１７】
ＰＤＡＣの低い有病率を考えると、マルチマーカーシグネチャは、平均リスク集団よりもむしろ高リスク対象を標的とするスクリーニングプログラムに最も適しているはずである。これらには、真性糖尿病を新たに発症した５０歳超、高リスク家族の無症候性家系、慢性膵炎を有する対象および膵臓のムチン分泌嚢胞と偶発的に診断された患者が含まれる。代謝産物−バイオマーカーパネルは、２つの別々のサンプルセットにおいて低悪性度の膵嚢胞からＰＤＡＣを有意に識別し得、それぞれ検証セットおよび試験セット＃２において０．６９および０．７０に等しいＡＵＣを生じた。
【０２１８】
特に、これまでの発見とは対照的に、症例と、それぞれのコントロールとの間に血漿分枝鎖アミノ酸（ＢＣＡＡ）の差異を観察しなかった。しかしながら、診察時に採取されたサンプル中の血漿ＢＣＡＡに差異がないという観察と一致して、ＢＣＡＡの予測値は、診断から２〜５年前に最も顕著であり、診断の０〜２年前にレベルは、ベースラインに戻ることに注目すべきである。
【０２１９】
ポリアミン代謝の変化は、腫瘍形成および過剰増殖性障害と長く関連しており、細胞周期の進行に密接に関与している。ポリアミン合成は、律速酵素ＯＤＣ１およびＡＭＤ１により調節されるのに対して、それらの異化作用は、ＳＡＴ１により調節される。これまでの発見は、組織学的に影響を受けない膵臓と比較して膵癌におけるプトレシンおよびＡｃＳｐｅｒｍの存在量の増加を示した。反対に、健康コントロールと比較して、ＡｃＳｐｅｒｍを含む多くのポリアミンが症例の血清中で上昇していることが既に発見された。これらの発見は、Ｂａｄｅａデータセットにおける隣接コントロール組織と比較したＰＤＡＣ中のＳＡＴ１のｍＲＮＡ発現の上昇、ならびに細胞溶解物中でのＡｃＳｐｅｒｍおよびＤＡＳの検出、ならびにそれらの馴化培地中での同時蓄積と一致している（図１１）。本研究および他の研究で説明されている発見は、ＰＤＡＣを有する対象の血漿に反映されている概念であるポリアミン異化の増幅を示す。特に、ＤＡＳの上昇は、膵癌にのみ起因するのではなく、これは、癌のスクリーニングマーカーとしてのより広い有用性におけるより一般的な役割を本質的に示唆する。
【０２２０】
これまでの研究は、本研究の発見と一致して、血漿ＬＰＣが、健康コントロールまたは慢性膵炎を有する対象と比較してＰＤＡＣ中で有意に低いことを示した。細胞株データは、ＰＤＡＣ細胞がＢａｄｅａデータセット中の遺伝子発現データにより支持される概念であるリゾリン脂質を異化し（図１２）、それによりＰＤＡＣ対象中での血漿ＬＰＣの観察された減少の妥当性がもたらされることを示した。それにもかかわらず、ＰＤＡＣ単独では、特に疾患の早期では、血漿ＬＰＣレベルの低下が完全には説明され得ない。脂質代謝を調節する重要な器官である肝臓への転移は、膵癌の早期で起こることが示されている。そのため、血漿ＬＰＣの減少は、癌性細胞による異化の増加と、疾患と同時に起こる肝機能の変化との両方を反映し得ることが有力であり、この概念は、現在の研究とは無関係にさらなる調査を必要とするであろう。
【０２２１】
結論として、早期ＰＤＡＣのための代謝産物由来バイオマーカーパネルを開発し、既に同定されたタンパク質ベースのバイオマーカーパネルを補完することを検証した。
【０２２２】
他の実施形態
上記の詳細な説明は、本開示の実施において当業者を補助するために提供される。しかしながら、本明細書で説明されかつ特許請求された開示は、本明細書で開示された具体的な実施形態により範囲が限定されるべきではなく、なぜなら、この実施形態は、本開示のいくつかの態様の例示として意図されているからである。あらゆる均等な実施形態が本開示の範囲内であることが意図されている。実際には、本開示の様々な改変形態は、本明細書で示されかつ説明されたものに加えて、本発明の発見の趣旨または範囲から逸脱しない上述の説明から当業者に明らかになるであろう。そのような改変形態も添付の特許請求の範囲に含まれることが意図されている。
【図１】
2020514689.tif 000040
【図２Ａ】
2020514689.tif 000041
【図２Ｂ】
2020514689.tif 000042
【図３Ａ】
2020514689.tif 000043
【図３Ｂ】
2020514689.tif 000044
【図４】
2020514689.tif 000045
【図５】
2020514689.tif 000046
【図６】
2020514689.tif 000047
【図７】
2020514689.tif 000048
【図８】
2020514689.tif 000049
【図９Ａ】
2020514689.tif 000050
【図９Ｂ】
2020514689.tif 000051
【図１０Ａ】
2020514689.tif 000052
【図１０Ｂ】
2020514689.tif 000053
【図１１Ａ】
2020514689.tif 000054
【図１１Ｂ】
2020514689.tif 000055
【図１２】
2020514689.tif 000056
【図１３】
2020514689.tif 000057
【図１４】
2020514689.tif 000058
【国際調査報告】
2020514689.tif 000059
2020514689.tif 000060
2020514689.tif 000061