(57)【要約】本開示は、機能的ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を集合させる能力が欠如または減少しており、その結果、細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患または障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激するための方法を提供する。前記方法は、十分量の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）経路アクチベーターを患者に投与して、少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激することを含む。
2020517650.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
機能的ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を集合させる能力が欠如または減少しており、その結果、細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患または障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激する方法であって、十分量の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）経路アクチベーターを前記患者に投与して、前記少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激することを含む、方法。
【請求項２】
前記疾患または障害が筋ジストロフィーであり、前記サテライト幹細胞が、ペアードボックス７（ＰＡＸ７）タンパク質およびＥＧＦＲタンパク質の発現と、筋原性因子５（Ｍｙｆ５）タンパク質およびＭｙｏＤタンパク質の発現の欠如とを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ジストログリカノパチー、先天性筋ジストロフィーまたは肢帯筋ジストロフィーである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サテライト幹細胞がジストロフィン欠損サテライト幹細胞である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
十分量の前記ＥＧＦＲ経路アクチベーターを投与して、前記サテライト幹細胞におけるリン酸化ＥＧＦＲのレベルの少なくとも２０％の増加をもたらすか；
十分量の前記ＥＧＦＲ経路アクチベーターを投与して、前記少なくともいくつかのサテライト幹細胞におけるＡｕｒｋａキナーゼＡを活性化して頂底極性を誘導するか；
十分量の前記ＥＧＦＲ経路アクチベーターを投与して、前記サテライト幹細胞における非対称分裂の割合を、正常サテライト幹細胞の集団における非対称分裂の割合（ｐｒｏｐｔｉｏｎ）の少なくとも５０％であるレベルに増加させるか；または
それらの任意の組み合わせである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＦＧＲ経路アクチベーターがＥＧＦＲ経路の間接アクチベーターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記間接ＥＦＧＲ経路アクチベーターが、ＰＴＰ１ｂに対するＩＣ５０よりも２桁超大きいＳＨＰ１ホスファターゼおよびＳＨＰ２ホスファターゼに対するＩＣ５０を有するＰＴＰ１ｂインヒビターである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＴＰ１ｂインヒビターが、
３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾイル）−２−エチル−Ｎ−［４−［（２−チアゾリルアミノ）スルホニル］フェニル］−６−ベンゾフランスルホンアミド；
２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸塩；
Ｎ−アルキル−２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸塩；または
それらのプロドラッグである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＴＰ１ｂインヒビターが、
３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾイル）−２−エチル−Ｎ−［４［（２−チアゾリルアミノ）スルホニル］フェニル］−６−ベンゾフランスルホンアミド；
２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸塩酸塩；または
６−メチル−２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸トリフルオロ酢酸塩である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＥＦＧＲ経路アクチベーターがＥＧＦＲ経路の直接アクチベーターである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記直接ＥＦＧＲ経路アクチベーターが、
上皮成長因子（ＥＧＦ）、
ＴＧＦ−アルファ、
アンフィレグリン、
ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、
ベータセルリン、
エピレグリン、
抗ＥＧＦＲ抗体もしくはその抗原結合断片、
参照配列と少なくとも８０％同一の配列を有するその変異体、または
そのナノ粒子コンジュゲートである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、ＥＧＦＲ上のＥＧＦ結合ドメインに結合する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗ＥＧＦＲ抗体の前記抗原結合断片が、ＥＧＦＲの細胞内キナーゼドメインに結合する細胞透過性ナノボディである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂の刺激が、サテライト細胞機能を向上もしくはレスキューするか；前記サテライト幹細胞の非対称分裂の割合を向上もしくは回復するか；前記患者における前記疾患もしくは障害の１つもしくはそれを超える症状の重症度を改善するか；またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
機能的ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を集合させる能力が欠如または減少しており、その結果、細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患または障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂をシミュレートするために十分な量で前記患者に投与するために製剤化された、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）経路アクチベーター。
【請求項１６】
前記疾患または障害が筋ジストロフィーであり、前記サテライト幹細胞が、ペアードボックス７（ＰＡＸ７）タンパク質およびＥＧＦＲタンパク質の発現と、筋原性因子５（Ｍｙｆ５）タンパク質およびＭｙｏＤタンパク質の発現の欠如とを特徴とする、請求項１５に記載のＥＧＦＲ経路アクチベーター。
【請求項１７】
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ジストログリカノパチー、先天性筋ジストロフィーまたは肢帯筋ジストロフィーである、請求項１５に記載のＥＧＦＲ経路アクチベーター。
【請求項１８】
前記サテライト幹細胞がジストロフィン欠損サテライト幹細胞である、請求項１５または１６に記載のＥＧＦＲ経路アクチベーター。
【請求項１９】
前記サテライト幹細胞におけるリン酸化ＥＧＦＲのレベルの少なくとも２０％の増加をもたらす量で投与するために製剤化されているか；
前記少なくともいくつかのサテライト幹細胞におけるＡｕｒｋａキナーゼＡを活性化して頂底極性を誘導する量で投与するために製剤化されているか；
前記サテライト幹細胞における非対称分裂の割合を、正常サテライト幹細胞の集団における非対称分裂の割合の少なくとも５０％であるレベルに増加させる量で投与するために製剤化されているか；または
それらの任意の組み合わせである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ経路アクチベーター。
【請求項２０】
ＥＧＦＲ経路の間接アクチベーターである、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ経路アクチベーター。
【請求項２１】
前記間接ＥＦＧＲ経路アクチベーターが、ＰＴＰ１ｂに対するＩＣ５０よりも２桁超大きいＳＨＰ１ホスファターゼおよびＳＨＰ２ホスファターゼに対するＩＣ５０を有するＰＴＰ１ｂインヒビターである、請求項２０に記載のＥＧＦＲ経路アクチベーター。
【請求項２２】
前記ＰＴＰ１ｂインヒビターが、
３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾイル）−２−エチル−Ｎ−［４［（２−チアゾリルアミノ）スルホニル］フェニル］−６−ベンゾフランスルホンアミド；
２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸塩；
Ｎ−アルキル−２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸塩；または
それらのプロドラッグである、請求項２１に記載のＥＧＦＲ経路アクチベーター。
【請求項２３】
前記ＰＴＰ１ｂインヒビターが、
３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾイル）−２−エチル−Ｎ−（４−［（２−チアゾリルアミノ）スルホニル］フェニル］−６−ベンゾフランスルホンアミド；
２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸塩酸塩；または
６−メチル−２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸トリフルオロ酢酸塩である、請求項２２に記載のＥＧＦＲ経路アクチベーター。
【請求項２４】
ＥＧＦＲ経路の直接アクチベーターである、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ経路アクチベーター。
【請求項２５】
前記直接ＥＦＧＲ経路アクチベーターが、
上皮成長因子（ＥＧＦ）、
ＴＧＦ−アルファ、
アンフィレグリン、
ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、
ベータセルリン、
エピレグリン、
抗ＥＧＦＲ抗体もしくはその抗原結合断片、
参照配列と少なくとも８０％同一の配列を有するその変異体、または
そのナノ粒子コンジュゲートである、請求項２４に記載のＥＧＦＲ経路アクチベーター。
【請求項２６】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、ＥＧＦＲ上のＥＧＦ結合ドメインに結合する、請求項２５に記載のＥＧＦＲ経路アクチベーター。
【請求項２７】
前記抗ＥＧＦＲ抗体の前記抗原結合断片が、ＥＧＦＲの細胞内キナーゼドメインに結合する細胞透過性ナノボディである、請求項２５に記載のＥＧＦＲ経路アクチベーター。
【請求項２８】
前記患者への投与が、サテライト細胞機能を向上もしくはレスキューするか；前記サテライト幹細胞の非対称分裂の割合を向上もしくは回復するか；前記患者における前記疾患もしくは障害の１つもしくはそれを超える症状の重症度を改善するか；またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１５〜２７のいずれか一項に記載のＥＧＦＲ経路アクチベーター。
【請求項２９】
機能的ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を集合させる能力が欠如もしくは減少しており、その結果、細胞極性を確立する能力が欠如もしくは減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患もしくは障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激するための、または機能的ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を集合させる能力が欠如もしくは減少しており、その結果、細胞極性を確立する能力が欠如もしくは減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患もしくは障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激するための医薬の製造における、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）経路アクチベーターの使用。
【請求項３０】
前記疾患または障害が筋ジストロフィーであり、前記サテライト幹細胞が、ペアードボックス７（ＰＡＸ７）タンパク質およびＥＧＦＲタンパク質の発現と、筋原性因子５（Ｍｙｆ５）タンパク質およびＭｙｏＤタンパク質の発現の欠如とを特徴とする、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記筋ジストロフィーが、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ジストログリカノパチー、先天性筋ジストロフィーまたは肢帯筋ジストロフィーである、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
前記サテライト幹細胞がジストロフィン欠損サテライト幹細胞である、請求項２９または３０に記載の使用。
【請求項３３】
前記ＥＧＦＲ経路アクチベーターもしくは前記医薬が、前記サテライト幹細胞におけるリン酸化ＥＧＦＲのレベルを少なくとも２０％増加させるためのものであるか；
前記ＥＧＦＲ経路アクチベーターもしくは前記医薬が、前記少なくともいくつかのサテライト幹細胞におけるＡｕｒｋａキナーゼＡを活性化して頂底極性を誘導するためのものであるか；
前記ＥＧＦＲ経路アクチベーターもしくは前記医薬が、前記サテライト幹細胞における非対称分裂の割合を、正常サテライト幹細胞の集団における非対称分裂の割合の少なくとも５０％であるレベルに増加させるためのものであるか；または
それらの任意の組み合わせである、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
前記ＥＦＧＲ経路アクチベーターがＥＧＦＲ経路の間接アクチベーターである、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
前記間接ＥＦＧＲ経路アクチベーターが、ＰＴＰ１ｂに対するＩＣ５０よりも２桁超大きいＳＨＰ１ホスファターゼおよびＳＨＰ２ホスファターゼに対するＩＣ５０を有するＰＴＰ１ｂインヒビターである、請求項３４に記載の使用。
【請求項３６】
前記ＰＴＰ１ｂインヒビターが、
３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾイル）−２−エチル−Ｎ−［４−［（２−チアゾリルアミノ）スルホニル］フェニル］−６−ベンゾフランスルホンアミド；
２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸塩；
Ｎ−アルキル−２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸塩；または
それらのプロドラッグである、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
前記ＰＴＰ１ｂインヒビターが、
３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾイル）−２−エチル−Ｎ−［４［（２−チアゾリルアミノ）スルホニル］フェニル］−６−ベンゾフランスルホンアミド；
２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸塩酸塩；または
６−メチル−２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸トリフルオロ酢酸塩である、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記ＥＦＧＲ経路アクチベーターがＥＧＦＲ経路の直接アクチベーターである、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３９】
前記直接ＥＦＧＲ経路アクチベーターが、
上皮成長因子（ＥＧＦ）、
ＴＧＦ−アルファ、
アンフィレグリン、
ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、
ベータセルリン、
エピレグリン、
抗ＥＧＦＲ抗体もしくはその抗原結合断片、
参照配列と少なくとも８０％同一の配列を有するその変異体、または
そのナノ粒子コンジュゲートである、請求項３８に記載の使用。
【請求項４０】
前記抗ＥＧＦＲ抗体が、ＥＧＦＲ上のＥＧＦ結合ドメインに結合する、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記抗ＥＧＦＲ抗体の前記抗原結合断片が、ＥＧＦＲの細胞内キナーゼドメインに結合する細胞透過性ナノボディである、請求項３９に記載の使用。
【請求項４２】
前記患者への投与が、サテライト細胞機能を向上もしくはレスキューするか；前記サテライト幹細胞の非対称分裂の割合を向上もしくは回復するか；前記患者における前記疾患もしくは障害の１つもしくはそれを超える症状の重症度を改善するか；またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載の使用。
【請求項４３】
前記間接ＥＦＧＲ経路アクチベーターがＰＴＰインヒビターである、請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本開示は、サテライト幹細胞の非対称分裂を刺激するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
以下の段落は、それらにおいて議論されているいかなるものも先行技術であることや当業者の知識の一部であると認めるものではない。
【０００３】
筋ジストロフィーは、経時的な骨格筋の減弱および衰弱の増加をもたらす筋肉疾患群である。異なるタイプの筋ジストロフィーは、筋肉タンパク質の生成に関与する異なる遺伝子の変異によるものである。筋ジストロフィーのいくつかの変異型は、ジストロフィンの喪失または産生減少によるものである。ジストロフィンの主な機能は、筋線維の膜を安定化することである。ジストロフィンの喪失は筋線維膜の減弱につながり、患者を筋肉損傷になりやすくする。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
イントロダクション
以下のイントロダクションは、読者に本明細書を紹介するものであり、本発明を定義するものではない。１つまたはそれを超える本発明は、以下に記載される装置要素もしくは方法工程の組み合わせもしくは下位組み合わせまたはこの文書の他の部分に存在し得る。本発明者らは、このような他の１つまたは複数の発明を特許請求の範囲に単に記載しないことにより、本明細書に開示されるいかなる１つまたは複数の発明に対する権利を断念も放棄もしない。
【０００５】
筋幹細胞機能の調節不全は、加齢における再生の減少およびデュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）（ジストロフィンの機能喪失型変異により引き起こされる進行性および重度のミオパシー）に直接関連する。ヒトジストロフィンタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー番号Ｐ１１５３２に記載されている配列を有し得る。損傷筋線維の修復または新たな筋線維の形成のためには、筋肉サテライト細胞が活性化して増殖、分化および融合することが必要である。しかしながら、サテライト細胞におけるジストロフィンの喪失は細胞極性の喪失につながり、これが非対称細胞分裂を妨げ、コミットされた筋原性前駆体の生成を妨げる。ジストロフィン欠損サテライト幹細胞はまた、長期の細胞周期動態および異常な分裂パターンを示す。
【０００６】
ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）の成分をコードする遺伝子、またはそれらのプロセシング、例えばグリコシル化に関与する遺伝子の変異を有するものを含む他の遺伝病もまた、膜におけるＤＧＣ集合の失敗をもたらし、膜におけるジストロフィンの安定化不能をもたらし得る。
【０００７】
ジストロフィン欠損サテライト幹細胞は、正常サテライト幹細胞と比較して減少した比率で、筋再生に必要な筋原性前駆体を生成する。同様に、機能的ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を集合させる能力が欠如または減少しており、その結果、細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞もまた、減少した比率で筋原性前駆体を生成する。サテライト幹細胞非対称分裂の調節は、筋再生プログラムの効率に影響を与える制御点である。このような疾患または障害を患っている患者におけるサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激する化合物または方法が依然として必要である。このような疾患または障害の一例は、筋ジストロフィー、例えばデュシェンヌ型筋ジストロフィーである。このような化合物または方法は、患者におけるサテライト細胞機能を向上またはレスキューし、それにより、疾患または障害の症状の重症度を軽減し得る。いくつかの場合では、このような化合物または方法は、疾患または障害の１つまたはそれを超える症状を改善または転換し得る。
【０００８】
本発明者らは、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）経路の極性化伝播が非対称サテライト幹細胞分裂の決定因子であることを決定した。上皮成長因子受容体は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー番号Ｐ００５３３に記載されている配列を有し得る。本発明者らは、ＥＧＦＲ極性経路がジストロフィンとは独立して作用し、組換えＥＧＦによるＥＧＦＲ経路の刺激がＡｕｒｋａキナーゼＡを刺激して極性を確立し、ジストロフィン欠損サテライト細胞の非対称分裂の割合の増加をもたらすことができることを確認した。ヒトＡｕｒｋａキナーゼＡは、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー番号Ｏ１４９６５に記載されている配列を有し得る。
【０００９】
一態様では、本開示は、機能的ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を集合させる能力が欠如または減少しており、その結果、細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患または障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激するための方法を提供する。前記方法は、十分量の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）経路アクチベーターを患者に投与して、少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激することを含む。別の態様では、本開示は、機能的ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を集合させる能力が欠如または減少しており、その結果、細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患または障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激するためのＥＧＦＲ経路アクチベーターを提供する。さらに他の態様では、本開示は、機能的ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を集合させる能力が欠如もしくは減少しており、その結果、細胞極性を確立する能力が欠如もしくは減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患もしくは障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激するための、または機能的ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を集合させる能力が欠如もしくは減少しており、その結果、細胞極性を確立する能力が欠如もしくは減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患もしくは障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激するための医薬の製造におけるＥＧＦＲ経路アクチベーターの使用を提供する。
【００１０】
疾患または障害が筋ジストロフィーである場合、サテライト幹細胞は、ペアードボックス７（ＰＡＸ７）タンパク質およびＥＧＦＲタンパク質の発現と、筋原性因子５（Ｍｙｆ５）タンパク質およびＭｙｏＤタンパク質の発現の欠如とを特徴とする。ヒトＰＡＸ７タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー番号Ｐ２３７５９に記載されている配列を有し得る。ヒトＭｙｆ５タンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー番号Ｐ１３３４９に記載されている配列を有し得る。ヒトＭｙｏＤタンパク質は、Ｐ１５１７２に記載されている配列を有し得る。
【００１１】
少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂の刺激は、サテライト細胞機能を向上もしくはレスキューし得るか；サテライト幹細胞の非対称分裂の割合を向上もしくは回復し得るか；またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂の刺激は、患者における疾患または障害の１つまたはそれを超える症状の重症度を軽減し得る。
図面の説明
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１および２は、ＥＧＦＲシグナル伝達が非対称サテライト幹細胞分裂をどのように調節するかの描写である。  図１（Ａ）は、ＤＭＳＯ対照（ビヒクル）またはビヒクル対照に対して正規化したラパチニブの存在下で４２時間培養した時点における筋線維当たりの非対称サテライト幹細胞分裂の数を示す。  図１（Ｂ）は、ＤＭＳＯ対照（ビヒクル）またはビヒクル対照に対して正規化したラパチニブの存在下で４２時間培養した時点における筋線維当たりのＹＦＰ−サテライト幹細胞分裂の数を示す。  図１（Ｃ）は、スクランブル対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＣＲ）またはｓｉＳＣＲ対照に対して正規化したＥＧＦＲに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＲ）でのトランスフェクション後に４２時間培養した時点における筋線維当たりの非対称サテライト幹細胞分裂の数を示す。  図１（Ｄ）は、スクランブル対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＣＲ）またはｓｉＳＣＲ対照に対して正規化したＥＧＦＲに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＲ）でのトランスフェクション後に４２時間培養した時点における筋線維当たりのＹＦＰ−サテライト幹細胞分裂の相対数を示す。図１のエラーバーは平均±ＳＥＭを表す；ｐ値：＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００５。
【図２】図１および２は、ＥＧＦＲシグナル伝達が非対称サテライト幹細胞分裂をどのように調節するかの描写である。  図２（Ａ）は、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ対照（ビヒクル）または組換えＥＧＦの存在下で４２時間培養した時点における筋線維当たりの非対称サテライト幹細胞分裂の相対数（elative  number）を示す。  図２（Ｂ）は、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ対照（ビヒクル）または組換えＥＧＦの存在下で３６時間培養した時点における頂底方向有糸分裂サテライト細胞分裂の相対数を示す。  図２（Ｃ）は、３６時間培養した時点における単一筋線維におけるサテライト細胞のｐ−Ａｕｒｋ中心体染色の平面（上）および頂底（下）方向を示す。サテライト細胞のホスト筋線維は破線で描かれている。図２のエラーバーは平均±ＳＥＭを表す；ｐ値：＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００５。
【図３】図３〜１３は、ＥＧＦ刺激がｍｄｘサテライト細胞の極性欠損をどのようにレスキューするかを示す。  図３（Ａ）は、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ対照（ビヒクル）または１００ｎｇ／ｍＬ組換えＥＧＦを含むハムＦ１０培地で１時間培養した後におけるＥＤＬ筋線維におけるＰａｘ７＋（灰色）サテライト細胞のｐ−ＥＧＦＲ（白色）のシグナル伝達状態を示す。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色されている（暗灰色）。  図３（Ｂ）は、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ対照（ビヒクル）または組換えＥＧＦの存在下で３６時間培養した時点におけるｍｄｘ筋線維におけるサテライト細胞の異常有糸分裂紡錘体、対平面および頂底方向有糸分裂紡錘体の定量を示す。図３のエラーバーは平均±ＳＥＭを表す；ｐ値：＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００５。
【図４】図３〜１３は、ＥＧＦ刺激がｍｄｘサテライト細胞の極性欠損をどのようにレスキューするかを示す。  図４（Ａ）は、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ対照（ビヒクル）または組換えＥＧＦの存在下で４２時間培養した時点におけるＷＴおよびｍｄｘ筋線維の総サテライト幹細胞分裂に対する非対称分裂の定量を示す。  図４（Ｂ）は、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ対照（ビヒクル）または組換えＥＧＦの存在下で４２時間培養した時点におけるＷＴおよびｍｄｘ筋線維の筋線維当たりの非対称分裂の定量を示す。  図４（Ｃ）は、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ対照（ビヒクル）または組換えＥＧＦの存在下で７２時間培養した時点におけるｍｄｘ筋線維当たりのＭｙｏｇ発現細胞の定量を示す。  図４（Ｄ）は、ＰＢＳ中１％ＢＳＡ対照（ビヒクル）または組換えＥＧＦの存在下で７２時間培養した時点におけるｍｄｘ筋線維当たりの総筋原性細胞（Ｐａｘ７発現またはＭｙｏｇ発現細胞）の定量を示す。図４のエラーバーは平均±ＳＥＭを表す；ｐ値：＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００５。
【図５】図３〜１３は、ＥＧＦ刺激がｍｄｘサテライト細胞の極性欠損をどのようにレスキューするかを示す。図５（Ａ）は、ｍｄｘマウスにおける心臓毒誘発性傷害および組換えＥＧＦタンパク質による処置の概略図を示す。  図５（Ｂ）は、心臓毒誘発性傷害および食塩水（ビヒクル）または組換えＥＧＦタンパク質による処置の１０日後における再生ｍｄｘ  ＴＡ筋肉由来の凍結切片におけるＰａｘ７＋細胞の定量を示す。  図５（Ｃ）は、心臓毒誘発性傷害および食塩水（ビヒクル）または組換えＥＧＦタンパク質による処置の１０日後における再生ｍｄｘ  ＴＡ筋肉由来の凍結切片におけるＭｙｏｇ＋細胞の定量を示す。  図５（Ｄ）は、心臓毒誘発性傷害および食塩水（ビヒクル）または組換えＥＧＦタンパク質による処置の１０日後における再生ｍｄｘ  ＴＡ筋肉由来の筋線維の最小フェレットの分布を示す。図５のエラーバーは平均±ＳＥＭを表す；ｐ値：＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００５。
【図６】図３〜１３は、ＥＧＦ刺激がｍｄｘサテライト細胞の極性欠損をどのようにレスキューするかを示す。  図６Ａ）は、幼若ｍｄｘマウスにおけるＥＧＦ発現ベクターのエレクトロポレーション、ならびに傷害３０日および１５０日後のインサイチュー力測定および組織学の概略図を示す。  図６（Ｂ）は、３０日および１５０日の時点における対側脚に対して正規化した、空ベクター（ＥＶ）またはＥＧＦ発現ベクター（ＥＧＦ）をエレクトロポレーションしたｍｄｘマウスのＴＡ筋肉の相対筋肉量を示す。  図６（Ｃ）は、３０日および１５０日の時点における対側脚に対して正規化した、空ベクター（ＥＶ）またはＥＧＦ発現ベクター（ＥＧＦ）をエレクトロポレーションしたｍｄｘマウスのＴＡ筋肉の断面積を示す。  図６（Ｄ）は、３０日および１５０日の時点における対側脚に対して正規化した、空ベクター（ＥＶ）またはＥＧＦ発現ベクター（ＥＧＦ）をエレクトロポレーションしたｍｄｘマウスの筋線維１ｍｍ２当たりのＭｙｏｇ発現細胞の相対発現（telative  expression）を示す。  図６（Ｅ）は、対側脚と比較した、空ベクター（ＥＶ）またはＥＧＦ発現ベクター（ＥＧＦ）をエレクトロポレーションしたｍｄｘマウスのＴＡ筋肉の筋線維の定量を示す。図６のエラーバーは平均±ＳＥＭを表す；ｐ値：＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００５。
【図７】図３〜１３は、ＥＧＦ刺激がｍｄｘサテライト細胞の極性欠損をどのようにレスキューするかを示す。  図７（Ａ）は、対側脚と比較した、空ベクター（ＥＶ）またはＥＧＦ発現ベクター（ＥＧＦ）により処置された、心臓毒誘発性傷害後３０日（ｄｐｉ）における再生ｍｄｘ  ＴＡ筋肉由来の筋線維の最小フェレットの分布を示す。  図７（Ｂ）は、対側脚と比較した、空ベクター（ＥＶ）またはＥＧＦ発現ベクター（ＥＧＦ）により処置された、心臓毒誘発性傷害後１５０日における再生ｍｄｘ  ＴＡ筋肉由来の筋線維の最小フェレットの分布を示す。図７のエラーバーは平均±ＳＥＭを表す；ｐ値：＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００５。
【図８】図３〜１３は、ＥＧＦ刺激がｍｄｘサテライト細胞の極性欠損をどのようにレスキューするかを示す。  図８（Ａ）は、空ベクター（ＥＶ）またはＥＧＦ発現ベクター（ＥＧＦ）により処置された、３０ｄｐｉおよび１５０ｄｐｉにおける再生ｍｄｘ  ＴＡ筋肉由来の筋線維の最大強縮力（ｍＮ）を示す。  図８（Ｂ）は、空ベクター（ＥＶ）またはＥＧＦ発現ベクター（ＥＧＦ）により処置された、３０ｄｐｉおよび１５０ｄｐｉにおける再生ｍｄｘ  ＴＡ筋肉由来の筋線維の最大比力（ｍＮ／ｃｍ２）を示す。図８のエラーバーは平均±ＳＥＭを表す；ｐ値：＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００５。
【図９】図３〜１３は、ＥＧＦ刺激がｍｄｘサテライト細胞の極性欠損をどのようにレスキューするかを示す。  図９（Ａ）は、幼若ｍｄｘマウスにおけるＥＧＦ発現ベクターのエレクトロポレーション、ならびに採取および力測定時点の概略図を示す。  図９（Ｂ）は、対側脚に対して正規化した、２４週間の時点における空ベクター（ＥＶ）またはＥＧＦ発現ベクター（ＥＧＦ）をエレクトロポレーションしたｍｄｘマウスのＴＡ筋肉の相対筋肉量を示す。  図９（Ｃ）は、対側脚に対して正規化した、２４週間の時点における空ベクター（ＥＶ）またはＥＧＦ発現ベクター（ＥＧＦ）をエレクトロポレーションしたｍｄｘマウスの再生ＴＡ筋肉由来の筋線維の相対平均最小フェレットを示す。  図９（Ｄ）は、２４週間の時点における空ベクター（ＥＶ）またはＥＧＦ発現ベクター（ＥＧＦ）をエレクトロポレーションしたｍｄｘマウスの対側（ｃｏｎｔｒａ）脚および処置脚の再生ＴＡ筋肉由来の筋線維の数を示す。図９のエラーバーは平均±ＳＥＭを表す；ｐ値：＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００５。
【図１０】図３〜１３は、ＥＧＦ刺激がｍｄｘサテライト細胞の極性欠損をどのようにレスキューするかを示す。  図１０（Ａ）は、ｍｄｘマウスのエレクトロポレーションＴＡ筋肉由来の凍結切片におけるＭｙｈ３＋（灰色（ｇｅｒｙ））新形成筋線維、Ｍｙｈ４＋（黒色）タイプＩＩｂ速筋筋線維およびマウス免疫グロブリンＧ浸潤壊死筋線維（ｍｓＩｇＧ＋、白色）の免疫染色を示す。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色されている（暗灰色）。  図１０（Ｂ）は、対側脚と比較した、空ベクター（ＥＶ）またはＥＧＦ発現ベクター（ＥＧＦ）をエレクトロポレーションしたｍｄｘマウスのＴＡ筋の再生指数を示す。エラーバーは平均±ＳＥＭを表す；ｐ値：＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００５。
【図１１】図３〜１３は、ＥＧＦ刺激がｍｄｘサテライト細胞の極性欠損をどのようにレスキューするかを示す。  図１１（Ａ）は、ｍｄｘマウスのエレクトロポレーションＴＡ筋肉由来の凍結切片におけるコムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）染色（灰色）線維沈着物の代表的な画像を示す。ＤＮＡはＤＡＰＩで染色されている（暗灰色）。  図１１（Ｂ）は、対側脚に対して正規化した、空ベクター（ＥＶ）またはＥＧＦ発現ベクター（ＥＧＦ）をエレクトロポレーションしたｍｄｘマウスのＴＡ筋肉のＷＧＡ＋線維面積の定量を示す。図１１のエラーバーは平均±ＳＥＭを表す；ｐ値：＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００５。
【図１２】図３〜１３は、ＥＧＦ刺激がｍｄｘサテライト細胞の極性欠損をどのようにレスキューするかを示す。  図１２（Ａ）は、成長培地、組換えＥＧＦを補充した成長培地、ＰＴＰ１ｂインヒビターを補充した成長培地、または組換えＥＧＦおよびＰＴＰ１ｂインヒビターを補充した成長培地を１時間再補給した血清飢餓筋芽細胞におけるｐ−ＥＧＦＲのイムノブロット分析を示す。  図１２（Ｂ）は、組換えＥＧＦおよびＰＴＰ１ｂインヒビターで処置した筋芽細胞におけるｐ−ＥＧＦＲの濃淡値（grey  value）の定量を示す。  図１２（Ｃ）は、ビヒクル対照、組換えＥＧＦ、ＰＴＰ１ｂインヒビターまたは組換えＥＧＦおよびＰＴＰ１ｂインヒビターの両方の存在下で４２時間培養した時点におけるＷＴ筋線維の総サテライト幹細胞分裂に対する非対称分裂の定量を示す。  図１２（Ｄ）は、ビヒクル対照、組換えＥＧＦ、ＰＴＰ１ｂインヒビターまたは組換えＥＧＦおよびＰＴＰ１ｂインヒビターの両方の存在下で４２時間培養した時点におけるｍｄｘ筋線維の総サテライト幹細胞分裂に対する非対称分裂の定量を示す。図１２のエラーバーは平均±ＳＥＭを表す；ｐ値：＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００５。
【図１３】図３〜１３は、ＥＧＦ刺激がｍｄｘサテライト細胞の極性欠損をどのようにレスキューするかを示す。  図１３（Ａ）は、ｍｄｘマウスにおける心臓毒誘発性傷害およびＰＴＰ１ｂインヒビターによる処置の概略図を示す。  図１３（Ｂ）は、ＤＭＳＯ（ビヒクル）またはＰＴＰ１ｂインヒビターによる処置の心臓毒誘発性傷害後１０日におけるｍｄｘマウスの再生ＴＡ筋肉由来の凍結切片におけるＭｙｈ３＋（灰色）新形成筋線維、Ｍｙｈ４＋（黒色）タイプＩＩｂ速筋筋線維およびマウス免疫グロブリンＧ浸潤壊死筋線維（ｍｓＩｇＧ＋、白色）の免疫染色を示す。  図１３（Ｃ）は、対側脚に対して正規化した、ＤＭＳＯ（ビヒクル）またはＰＴＰ１ｂインヒビターにより処置された心臓毒誘発性傷害後１０日におけるｍｄｘマウスの再生ＴＡ筋肉の相対量を示す。  図１３（Ｄ）は、ＤＭＳＯ（ビヒクル）またはＰＴＰ１ｂインヒビターにより処置された、心臓毒誘発性傷害後１０日におけるｍｄｘマウスの再生ＴＡ筋肉由来の筋線維の相対平均最小フェレットを示す。  図１３（Ｅ）は、非傷害対側脚と比較した、ＤＭＳＯ（ビヒクル）またはＰＴＰ１ｂインヒビターにより処置された、心臓毒誘発性傷害後１０日におけるｍｄｘマウスの再生ＴＡ筋肉由来の筋線維の最小フェレットの分布を示す。  図１３（Ｆ）は、ＤＭＳＯ（ビヒクル）またはＰＴＰ１ｂインヒビターにより処置された、心臓毒誘発性傷害後１０日における再生ｍｄｘ  ＴＡ筋肉由来の凍結切片におけるＰａｘ７＋細胞の定量を示す。図１３のエラーバーは平均±ＳＥＭを表す；ｐ値：＊≦０．０５；＊＊≦０．０１；＊＊＊≦０．００５。
【図１４】図１４は、筋幹細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達を刺激するＰＴＰ１ｂの薬理学的阻害の概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
詳細な説明
一般に、本開示は、機能的ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を集合させる能力が欠如または減少しており、その結果、細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患または障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激するための方法を提供する。疾患または障害は、筋ジストロフィーであり得る。前記方法は、十分量の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）経路アクチベーターを患者に投与して、少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激することを含む。
【００１４】
本開示では、「機能的ジストロフィン関連糖タンパク質複合体（ＤＧＣ）を集合させる能力が欠如または減少しており、その結果、細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患または障害」は、簡潔にするために、「疾患または障害」または「細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患または障害」と称され得る。
【００１５】
いくつかの例では、ＥＧＦＲ経路アクチベーターは、サテライト幹細胞におけるリン酸化ＥＧＦＲのレベルを、ＥＧＦＲ経路アクチベーターの投与前に存在するリン酸化ＥＧＦＲのレベルと比較して少なくとも２０％増加させるために十分な量で投与される。いくつかの例では、ＥＧＦＲ経路アクチベーターは、ＡｕｒｋａキナーゼＡを活性化してサテライト細胞の頂底極性を誘導するために十分な量で投与される。いくつかの例では、ＥＧＦＲ経路アクチベーターは、サテライト幹細胞における非対称分裂の割合を、正常サテライト幹細胞の集団における非対称分裂の割合の少なくとも５０％であるレベルに増加させるために十分な量で投与される。いくつかの特定の例では、レベルは、正常サテライト幹細胞の少なくとも８０％である。いくつかの例では、ＥＧＦＲ経路アクチベーターは、筋線維当たりのサテライト幹細胞の非対称分裂の数を、ＥＧＦＲ経路アクチベーターの投与前の筋線維当たりのサテライト幹細胞の非対称分裂の数よりも少なくとも８５％増加させるために十分な量で投与される。いくつかの特定の例では、増加は最大１５０％であった。例えば、投与前の筋線維当たりの非対称分裂の平均数が０．２３５であり、ＥＧＦＲ経路アクチベーターの投与後の筋線維当たりの非対称分裂の平均数が０．４６３である場合、増加は９７％である。
【００１６】
本開示の文脈では、疾患または障害が筋ジストロフィーである場合、サテライト幹細胞の対称分裂は、Ｍｙｆ５タンパク質およびＭｙｏＤタンパク質の発現の欠如を特徴とする娘サテライト幹細胞と、Ｍｙｆ５タンパク質、ＭｙｏＤタンパク質またはＭｙｆ５タンパク質およびＭｙｏＤタンパク質の両方の発現を特徴とする娘細胞とを生成する細胞分裂を指すと理解すべきである。ＭＹＦ５タンパク質および／またはＭｙｏＤタンパク質の発現を特徴とする娘細胞は、コミットされた筋原性前駆細胞と称され得る。
【００１７】
疾患または障害は、細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞を特徴とする。細胞極性を確立するサテライト幹細胞の能力は、基底板と、中心体ペア間の整列との間の角度を測定することにより決定され得る。角度を測定する方法は、Ｄｕｍｏｎｔら、「Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２０１５）２１：１４５５−６３に記載されている。前記方法は、参照により本明細書に組み込まれる。有糸分裂面を頂底方向（基底板に対して約９０度）に向けることができる場合、細胞は細胞極性を確立する能力を有し、非対称分裂を受けることができると理解される。単一のサテライト幹細胞は、細胞極性を確立することができるか、できない場合があるかのいずれかであるが、サテライト幹細胞の集団は、全体として、細胞極性を確立する能力が低下している場合がある。例えば、サテライト幹細胞の集団では、５０％が細胞極性を確立することができ、５０％が細胞極性を確立することができない場合がある。このような状況では、集団は、細胞極性を確立する能力が５０％減少していると称され得る。細胞極性を確立する能力のこの欠如または減少は、サテライト幹細胞によるジストロフィン産生の喪失または減少によるものであり得る。いくつかの例では、疾患または障害は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ジストログリカノパチー、先天性筋ジストロフィーまたは肢帯筋ジストロフィーなどの筋ジストロフィーである。
【００１８】
ＥＧＦＲ経路アクチベーターは、ＥＧＦＲ経路の直接アクチベーターまたはＥＧＦＲ経路の間接アクチベーターであり得る。
【００１９】
直接アクチベーターは、サテライト幹細胞の細胞表面上のＥＧＦ受容体に直接結合してＥＧＦＲ−Ａｕｒｋａシグナル伝達経路を活性化することにより作用する化合物、ペプチドまたはタンパク質であると理解される。ＥＧＦＲ−Ａｕｒｋａ経路を活性化するために使用され得る直接アクチベーターの例としては、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−アルファ、アンフィレグリン、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）、ベータセルリン、エピレグリン、参照配列と少なくとも８０％同一の配列を有する任意のその変異体、および少なくともいくらかの活性化活性を維持する任意のその断片が挙げられる。ヒトＥＧＦタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー番号Ｐ０１１３３に記載されている配列を有し得る。ヒトＴＧＦＡタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー番号Ｐ０１１３５に記載されている配列を有し得る。ヒトアンフィレグリンタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー番号Ｐ１５５１４に記載されている配列を有し得る。ヒトＨＧ−ＥＧＦタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー番号Ｏ９９０７５に記載されている配列を有し得る。ヒトベータセルリンタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー番号Ｐ３５０７０に記載されている配列を有し得る。ヒトエピレグリンタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー番号Ｏ１４９４４に記載されている配列を有し得る。
【００２０】
あるいは、直接アクチベーターは、受容体二量体化を促進することができる抗ＥＧＦＲ抗体または抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合断片であり得る。抗ＥＧＦＲ抗体は、ＥＧＦＲ上のＥＧＦ結合ドメインに結合し得る。抗ＥＧＦＲ抗体の抗原結合断片は、ＥＧＦＲの細胞内キナーゼドメインに結合する細胞透過性ナノボディであり得る。
【００２１】
間接アクチベーターは、ＥＧＦ受容体ではないがＥＧＦＲ−Ａｕｒｋａシグナル伝達経路と相互作用するタンパク質または経路に関与するタンパク質と相互作用することにより作用する化合物、ペプチドまたはタンパク質であると理解される。例えば、プロテインチロシンホスファターゼ１ｂ（ＰＴＰ１ｂ、Ｐｔｐｎ１とも称される）は、ＥＧＦＲのリサイクルまたは分解（degredation）の前にＥＧＦＲを脱リン酸化する。ヒトＰＴＰ１ｂタンパク質は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー番号Ｐ１８０３１に記載されている配列を有し得る。ＰＴＰ１ｂ活性の阻害は、脱リン酸化の全体的な比率を減少させ、ＰＴＰ１ｂインヒビターの非存在下で見られるよりも多くのＥＧＦＲ経路活性化をもたらす。ＰＴＰ１ｂ脱リン酸化のインヒビターはＰＴＰ１ｂと相互作用し、そのＰＴＰ１ｂが活性化ＥＧＦＲに対するＥＧＦＲの相対量に影響を与えるので、ＰＴＰ１ｂ脱リン酸化のインヒビターはＥＧＦＲ経路の間接アクチベーターの例であると理解される。
【００２２】
間接ＥＦＧＲ経路アクチベーターは、ＰＴＰインヒビターであり得る。好ましい実施形態では、ＰＴＰインヒビターはＰＴＰ１ｂインヒビターである。さらにより好ましい実施形態では、ＰＴＰ１ｂインヒビターは、ＰＴＰ１ｂに対するＩＣ５０よりも２桁超大きいＳＨＰ１ホスファターゼおよびＳＨＰ２ホスファターゼに対するＩＣ５０を有する。ＳＨＰ１ホスファターゼおよびＳＨＰ２ホスファターゼはＥＧＦＲシグナル伝達に関与するので、このようなＰＴＰ１ｂインヒビターが望ましい。
【００２３】
いくつかの例では、ＰＴＰ１ｂインヒビターは、３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシベンゾイル）−２−エチル−Ｎ−［４−［（２−チアゾリルアミノ）スルホニル］フェニル］−６−ベンゾフランスルホンアミド；２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸塩；Ｎ−アルキル−２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸塩；またはそれらのプロドラッグであり得る。いくつかの具体的な例では、ＰＴＰ１ｂインヒビターは、２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸塩酸塩（「ＴＣＳ４０１」）；６−メチル−２−（オキサリルアミノ）−４，５，６，７−テトラヒドロチエノ［２，３−ｃ］ピリジン−３−カルボン酸トリフルオロ酢酸塩（「ＢＭＬ−２６７」）；またはそれらのプロドラッグであり得る。
【００２４】
「プロドラッグ」は、投与後に活性薬物化合物に代謝される化合物を指すと理解される。例えば、プロドラッグは、各カルボン酸化合物へのプロドラッグエステルの化学的または酵素的加水分解により代謝され得る。患者への投与後に代謝され得るエステルとしては、アルキルエステル（例えば、Ｃ２−Ｃ８アルキルエステル）が挙げられる。
【００２５】
サテライト幹細胞またはサテライト細胞は、骨格筋細胞に分化することができる前駆細胞を生じさせる。サテライト幹細胞はサテライト細胞を生じさせ得、これらは両方とも、融合して分化骨格筋細胞を形成する前駆体を生じさせる。サテライト細胞の対称分裂は２つのサテライト細胞を生じさせ、サテライト細胞の非対称分裂は、１つのサテライト細胞および１つのコミットされた筋原性前駆細胞を生じさせる。筋ジストロフィーにおけるサテライト幹細胞は、ペアードボックス７（ＰＡＸ７）タンパク質およびＥＧＦＲタンパク質の発現と、筋原性因子５（ＭＹＦ５）タンパク質およびＭｙｏＤタンパク質の発現の欠如とを特徴とする。本開示の文脈では、ＰＡＸ７およびＥＧＦＲタンパク質の発現は、疾患も障害も有しない人由来のサテライト細胞におけるタンパク質発現レベルと実質的に等しいタンパク質発現のレベルを指すと理解すべきである。ＰＡＸ７および／またはＥＧＦＲタンパク質は、免疫蛍光を使用して検出され得る。
【００２６】
別の態様では、本開示は、細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患または障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激するために十分な量で前記患者に投与するために製剤化されたＥＧＦＲ経路アクチベーターを提供する。いくつかの例では、疾患または障害は筋ジストロフィーである。
【００２７】
さらに別の態様では、本開示は、細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患または障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激するためのＥＧＦＲ経路アクチベーターの使用を提供する。いくつかの例では、疾患または障害は筋ジストロフィーである。
【００２８】
さらに別の態様では、本開示は、細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患または障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激するための医薬の製造におけるＥＧＦＲ経路アクチベーターの使用を提供する。いくつかの例では、疾患または障害は筋ジストロフィーである。
【００２９】
さらなる態様では、本開示は、細胞極性を確立する能力が欠如または減少しているサテライト細胞を特徴とする疾患または障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激する方法において使用するためのＥＧＦＲ経路アクチベーターを提供する。いくつかの例では、疾患または障害は筋ジストロフィーである。
【００３０】
上記疾患または障害を患っている患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂の刺激は、サテライト細胞機能を向上もしくはレスキューし得るか、サテライト幹細胞の非対称分裂の割合を向上もしくは回復し得るか、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。本開示の文脈では、「向上する」という用語は、ＥＧＦＲ経路アクチベーターの投与前のレベル、機能または量と比較したものであると理解すべきである。本開示の文脈では、「レスキューする」および「回復する」という用語は、疾患も障害も有しない人におけるレベル、機能または量に近づくかまたはそれとほぼ等しくなるように、レベル、機能または量を変化させることを意味すると理解すべきである。サテライト幹細胞機能は、分化適格前駆体、筋再生、または筋肉による力発生を測定することにより間接的に決定され得る。分化適格前駆体の測定は、免疫蛍光により検出される組織切片におけるＰａｘ７＋およびＭｙｏＤ＋細胞またはＰａｘ７＋およびＭｙｇ＋（ミオゲニン）細胞の密度を測定することにより達成され得る。筋線維損傷の測定は、ＩｇＧ浸潤を示す筋線維の数をカウントすることにより達成され得る。筋線維再生の測定は、新再生筋線維を示すＭｙｈ３発現を示す筋線維の数をカウントすることにより達成され得る。サテライト幹細胞機能を決定する方法は、ｖｏｎ  Ｍａｌｔｚａｈｎ，Ｊら、「Ｗｎｔ７ａ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ．」、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ（２０１２）１０９：２０６１４−２０６１９において議論されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３１】
例えば、疾患または障害を有する患者由来の細胞におけるサテライト細胞機能の回復またはレスキューは、回復またはレスキューされたサテライト幹細胞が、疾患も障害も有しない人由来のサテライト幹細胞の対応する能力に近いかまたはそれとほぼ等しい細胞極性確立能力を有するように、細胞極性を確立する能力が欠如している少なくともいくつかのサテライト幹細胞を恒久的または一時的に変化させることを指すと理解され得る。
【００３２】
患者における少なくともいくつかのサテライト幹細胞の非対称分裂の刺激は、患者における疾患もしくは障害の１つまたはそれを超える症状の重症度を軽減し得る。例えば、筋ジストロフィーを有する患者は、疾患進行の減少、筋肉強度の減少率の減少、筋肉強度の増加またはそれらの組み合わせを有し得る。例えば、筋ジストロフィーを有する患者は、呼吸、嚥下、握る、歩行またはそれらの組み合わせの改善された能力を有し得る。
【００３３】
ＥＧＦＲ経路アクチベーターは、潜在的なアクチベーターをスクリーニングする方法において同定され得る。前記方法は、複数のＺスタック平面でＭｙｆ５−Ｃｒｅ／ＲＯＳＡ２６−ＹＦＰマウス由来の単離、培養および染色された短趾屈（ＦＤＢ）筋線維を視覚化して投影画像を作成することを含む。筋肉サテライト細胞は、Ｐａｘ７発現に基づいて投影画像で同定される。同定された筋肉サテライト細胞のうち、（ｉ）サテライト幹細胞は、ＹＦＰ発現の非存在に基づいて同定され、（ｉｉ）コミットされたサテライト前駆細胞は、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）発現に基づいて同定される。潜在的なＥＧＦＲ経路アクチベーターをＦＤＢ筋線維に投与する。２つのＹＦＰ（＋）サテライト細胞の産生により同定されるサテライト筋原細胞の対称分裂の数をカウントする。２つのＹＦＰ（−）サテライト細胞の産生により同定される対称サテライト幹細胞分裂の数をカウントする；１つのＹＦＰ（＋）および１つのＹＦＰ（−）サテライト細胞の産生により同定される非対称サテライト細胞分裂の数をカウントする。非対称分裂であるＹＦＰ（−）分裂のパーセントが対照サンプルの対応するパーセントよりも大きい場合、潜在的なＥＧＦＲ経路アクチベーターをＥＧＦＲ経路アクチベーターとして同定する。「ＹＦＰ（−）分裂」という表現は、娘細胞の１つがＹＦＰ（−）であるすべての細胞分裂を指す。
【００３４】
前記方法は自動化され、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓプラットフォーム（これは、高含有量分析のために蛍光顕微鏡法、画像処理、自動細胞測定および情報学ツールを合わせたものである）を使用したハイスループットスクリーニングに適合され得る。Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓプラットフォームの使用により、サテライト幹細胞の検出は、少なくとも９０％の検出率、約２％未満の偽陽性検出率および０．９３のｚ因子スコアで達成され得る。個別の幹細胞分裂の検出は、少なくとも７８％の検出率、約２％未満の偽陽性検出率および０．８１のｚ因子スコアで達成され得る。
【実施例】
【００３５】
本発明者らは、ＥＧＦＲシグナル伝達が非対称サテライト幹細胞分裂を調節し、ＥＧＦ処置がジストロフィン欠損サテライト幹細胞における非対称分裂を刺激することを確認した。本開示の著者らはまた、ＥＧＦ処置がインビボで筋原前駆細胞の数の増加をもたらすことを確認した。本発明者らはさらに、ＰＴＰ、特にＰＴＰ１ｂの阻害がＥＧＦＲのリサイクルまたは分解を減少させ、ＥＧＦＲ活性を増加させ、それにより、ジストロフィン欠損サテライト幹細胞における非対称分裂を刺激し得ることを確認した。本発明者らはまた、ＰＴＰ１ｂ阻害がインビボで筋原性前駆細胞の数の増加をもたらすことを確認した。これらの結果は、以下でより詳細に議論されている。
【００３６】
ＥＧＦＲシグナル伝達は、非対称サテライト幹細胞分裂を調節する。非対称分裂におけるＥＧＦＲの役割を評価するために、本発明者らは、Ｍｙｆ５−Ｃｒｅ／Ｒ２６Ｒ−ｅＹＦＰマウス由来の長趾伸筋（ＥＤＬ）筋肉から単離した筋線維においてサテライト細胞を培養し、機能喪失実験および機能獲得実験の両方を実施した。最初に、ラパチニブ（ＥＧＦＲシグナル伝達の特異的インヒビター）による処置ありおよびなしで単離筋線維を４２時間培養した。スクリーニングにおいて使用した濃度のラパチニブは、ＥＧＦＲシグナル伝達を完全に無効化する（データは示さず）。非対称分裂の比率が８３％減少することから明らかなように、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害は、サテライト幹細胞対称分裂への顕著なシフトをもたらした（図１Ａ）。したがって、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害は、サテライト幹細胞の数の７１％の増加をもたらした（図１Ｂ）。
【００３７】
実際にＥＧＦＲがラパチニブの特異的遺伝子標的であることを検証するために、Ｍｙｆ５−Ｃｒｅ／Ｒ２６Ｒ−ｅＹＦＰマウスから単離した単一ＥＤＬ筋線維において、ＥＧＦＲに対するｓｉＲＮＡ（ｓｉＥＧＦＲ）をサテライト細胞にトランスフェクトした。薬理学的阻害と同様に、ｓｉＥＧＦＲは、スクランブルｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＣＲ）によるトランスフェクションと比較して、非対称分裂の比率を６５％減少させた（図１Ｃ）。ｓｉＥＧＦＲのトランスフェクションはまた、対称分裂の比率を増加させ、サテライト幹細胞数の７６％の増加をもたらした（図１Ｄ）。したがって、本発明者らは、サテライト幹細胞における非対称分裂の比率の制御において、ＥＧＦＲが直接的な役割を果たすと結論付ける。
【００３８】
ＥＧＦＲシグナル伝達の活性化が非対称分裂の駆動因子として作用するかを調べるために、組換えＥＧＦタンパク質を、Ｍｙｆ５−Ｃｒｅ／Ｒ２６Ｒ−ｅＹＦＰマウスから単離した単一ＥＤＬ筋線維の培養培地に補充した（図２）。注目すべきことに、本発明者らは、ＥＧＦ処置が、非対称サテライト幹細胞分裂の比率を２．５倍の増加させたことを観察した（図２Ａ）。極性上皮ＭＤＣＫ細胞の最近の研究では、有糸分裂軸を頂底軸に沿って向けさせる際のＥＧＦＲの役割が同定されている。また、非対称サテライト細胞分裂は、頂底方向で起こる。本発明者らは単一ＥＤＬ筋線維を３６時間培養し、リン酸化オーロラキナーゼ（ｐ−Ａｕｒｋ）の免疫染色により、サテライト細胞中心体を検出した。ＥＧＦ処置にかかわらず、３６時間の時点で、細胞の約５％がｐ−Ａｕｒｋで標識された。ＥＧＦ処置は、頂底軸に沿って整列した有糸分裂細胞の割合の５０％の増加をもたらした（図２Ｂおよび２Ｃ）。理論に縛られるものではないが、サテライト細胞のＥＧＦ刺激は、極性ｐ−ＥＧＦＲシグナルに沿って中心体を動員することにより、有糸分裂方向の変化を刺激すると考えられる。
【００３９】
ＥＧＦ処置は、ジストロフィン欠損サテライト細胞の極性欠損をレスキューする。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）におけるジストロフィンの喪失は、ｍｄｘマウス（ＤＭＤのマウスモデル）におけるサテライト細胞の極性欠損を引き起こす。ジストロフィンを欠くサテライト幹細胞は、非対称分裂の数の１０倍の減少を示し、Ｍｙｏｇ発現筋原性前駆体の生成の減少および再生の遅延をもたらす。
【００４０】
ＥＧＦＲの局在化および活性化がジストロフィンの喪失により影響を受けるかを確立するために、組換えＥＧＦ刺激の有りまたは無しでの１時間後に、リン酸化ＥＧＦＲ（ｐ−ＥＧＦＲ）について、ｍｄｘマウス由来の単一ＥＤＬ筋線維を免疫染色した。ＥＧＦで処置したｍｄｘ線維においてのみ、Ｐ−ＥＧＦＲが観察された（図３Ａ）。また、野生型（ＷＴ）細胞と同程度に、ｍｄｘ細胞の基底表面上の「ストリーク」様構造では、ｐ−ＥＧＦＲが同様に局在化していた。したがって、本発明者らは、ｍｄｘサテライト細胞では、ＥＧＦＲシグナル伝達が通常起こると結論付ける。
【００４１】
ＥＧＦＲシグナル伝達がジストロフィン欠損サテライト幹細胞の非対称分裂を刺激するかを評価するために、ＷＴおよびｍｄｘＭｙｆ５−Ｃｒｅ／Ｒ２６Ｒ−ｅＹＦＰマウスからＥＤＬ筋線維を単離し、組換えＥＧＦ刺激ありおよびなしで４２時間培養した。非対称ｍｄｘサテライト幹細胞分裂の比率は、ＷＴサテライト細胞と比べて有意に減少している。ＷＴサテライト細胞のＥＧＦ処置は、非対称分裂の２９％の増加をもたらした。ｍｄｘサテライト細胞のＥＧＦ刺激は、非対称分裂の比率の６７％の増加をもたらした。ＥＧＦＲシグナル伝達のＥＧＦ刺激は、ジストロフィン欠損サテライト細胞の非対称分裂をシミュレートすることができた（図３Ｂおよび４Ａ）。
【００４２】
ＷＴサテライト細胞と同様に、ｍｄｘサテライト細胞のＥＧＦ処置は、頂底方向有糸分裂中心体の数の増加を誘導した。しかしながら、ｐ−Ａｕｒｋ染色の異常パターンにより証明されるようにｍｄｘサテライト細胞における異常細胞分裂の比率は、ＥＧＦ刺激により影響を受けなかった。この観察結果は、極性シグナル伝達のみにより、細胞周期調節不全が完全にはレスキューされないことを意味する。しかしながら、非対称分裂の比率の増加により、ＥＧＦ処置は、再生ｍｄｘ筋肉において観察された生成の減少を改善することができることが示唆された。したがって、ＥＧＦ駆動性非対称分裂が、ｍｄｘ培養物中の筋原性前駆体の生成の減少を改善することができるかを評価するために、ｍｄｘマウス由来の単一ＥＤＬ筋線維を７２時間培養し、Ｍｙｏｇの発現について免疫染色した。特に、ｍｄｘサテライト細胞のＥＧＦ刺激は、４２時間の筋線維培養後に、非対称サテライト幹細胞分裂の絶対数の２倍の増加をもたらし（図４Ｂ）、７２時間の筋線維培養後に、ＭｙｏＧ発現細胞の数の２０％の増加をもたらした（図４Ｃ）。ＥＧＦ処置は、筋原細胞の総数を約１４％増加させた（図４Ｄ）。
【００４３】
ＥＧＦ処置は、ｍｄｘ筋肉の再生を増強する。本発明者らは、ＥＧＦ処置がジストロフィン欠損サテライト幹細胞非対称分裂の増加を刺激し、培養筋線維における前駆体の数を増加させることを見出した。
【００４４】
以前に、本発明者らは、ジストロフィンまたはＤａｇ１欠損筋肉が、ＣＴＸ傷害後に、Ｐａｘ７発現細胞およびＭｙｏｇ発現細胞の数の減少をもたらすことを観察した。インビボにおけるジストロフィン欠損サテライト細胞に対するＥＧＦ処置の効果を評価するために、ＣＴＸ誘発性傷害時および傷害の２日後に、１０ｎｇの組換えＥＧＦタンパク質を筋肉内（ＩＭ）注射した（図５Ａ）。傷害ｍｄｘ筋肉へのＥＧＦ注射は、Ｐａｘ７発現細胞の２６％の増加をもたらし（図５Ｂ）、Ｍｙｏｇ発現細胞の数の５０％の増加をもたらす（図５Ｃ）ことが観察された。また、ＥＧＦ処置筋肉における再生筋線維は、ビヒクル注射対照と比較して、フェレット直径の増加を示した（図ｆＤ）。これらの結果は、組換えＥＧＦの筋肉内補充が筋原性前駆体の生産的生成を増加させて、ｍｄｘ筋肉の再生を増強することを示唆している。
【００４５】
長期ＥＧＦ処置の効果について取り組むために、本発明者らは、ヒトＥＧＦ  ｃＤＮＡを含有する発現プラスミド（Ｓｕｎら、２０１５）をｍｄｘ前脛骨筋（ＴＡ）筋肉にエレクトロポレーションした（図６Ａ）。印象的なことに、ＥＧＦ発現ベクターをエレクトロポレーションしたｍｄｘ筋肉は、３０ｄ．ｐ．ｉ．までに量の１８％の増加を示した（図６Ｂ）。この筋肉量の増加は、空ベクター対照と比較して、ＥＧＦエレクトロポレーションＴＡ筋肉の全体的な断面積に反映されている（図６Ｃ）。
本発明者らが短期ＥＧＦ処置で観察した効果と同様に、ＥＧＦベクターのエレクトロポレーションは、３０ｄ．ｐ．ｉ．におけるＭｙｏｇ＋筋原性前駆体の数を増大させ、１５０ｄ．ｐ．ｉ．であってもそれらの数を維持したのに対して、空ベクター対照で見られたＭｙｏｇ＋細胞はより少なかった（図６Ｄ）。驚くべきことに、Ｍｙｏｇ＋細胞の差は、肥大の増加に寄与しなかった。代わりに、本発明者らは、３０ｄ．ｐ．ｉ．および１５０ｄ．ｐ．ｉ．において一貫して、ＥＧＦベクターをエレクトロポレーションした筋肉における筋線維の数の有意な増加を見出している（図６Ｅ、７Ａ、７Ｂ）。
筋肉機能のレベルでこれらの組織学的変化の影響を測定するために、本発明者らは、ＴＡ筋力発生のインサイチュー測定を実施した。印象的なことに、ＥＧＦ発現ベクターをエレクトロポレーションしたＴＡ筋肉は、３０ｄ．ｐ．ｉ．において、空ベクターをエレクトロポレーションしたものと比較して、３２％大きな強縮を生成した（図８Ａ）。また、筋肉の生理学的断面積に対して正規化した後、本発明者らは、ＥＧＦベクターをエレクトロポレーションした筋肉が、３０ｄ．ｐ．ｉ．において２５％高い比力を有し、１５０ｄ．ｐ．ｉ．において空ベクター筋肉と比較してそれが依然として１７％高いことを見出した（図８Ｂ）。
【００４６】
短期ＥＧＦ処置の効果について取り組むために、本発明者らは、ヒトＥＧＦ  ｃＤＮＡを含有する発現プラスミド（Ｓｕｎら、２０１５）をｍｄｘ前脛骨筋（ＴＡ）筋肉にエレクトロポレーションした。４週齢（筋肉変性の発症中）においてＴＡ筋肉にエレクトロポレーションし、２４週間後に収集した（図９Ａ）。印象的なことに、ＥＧＦ発現ベクターをエレクトロポレーションしたｍｄｘ筋肉は、量の１７％の増加を示した（図９Ｂ）。筋線維のフェレット直径の差は観察されなかったが（図９Ｃ）、本発明者らは、筋線維の数の２２％の増加を見出した（図９Ｄ）。
【００４７】
ｍｄｘ筋肉は変性と再生との間でバランスするので、新形成胚性ミオシン重鎖（Ｍｙｈ３）発現筋線維および血清ＩｇＧ（ｍｓＩｇＧ）浸潤壊死筋線維について、エレクトロポレーションマウス由来の筋肉切片を定量した（図１０Ａ）。新形成筋線維と壊死筋線維との間の比は、ジストロフィー表現型の進行を定量する相対再生指数を表す（図１０Ｂ。これらのｍｄｘマウスの対側ＴＡは、０．３に近い再生指数で定常状態を維持したのに対して（図１０Ｂ、空ベクターをエレクトロポレーションしたＴＡは平均して、新形成筋線維よりも多くの壊死筋線維を有しており、その結果、平均再生指数は−０．０９であった（図１０Ｂ。ＥＧＦ発現ベクターをエレクトロポレーションしたＴＡはすべて、壊死性のものよりも多くのＭｙｈ３＋筋線維を含有しており、０．９９の平均再生指数を示した（図１０Ｂ）。ＥＧＦエレクトロポレーション筋肉の再生指数の増加は、ＴＡ筋当たりの筋線維の数の増加に対応していた。ジストロフィー病状の緩和と一致して、ＥＧＦエレクトロポレーションは、コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ）染色により測定した場合に線維症の漸進的増加を２６％減少させた（図１０Ａ、１０Ｂ）。
【００４８】
ＰＴＰ１ｂの阻害はＥＧＦＲ活性を増加させる。フィードバック機構は、ＥＧＦＲシグナル伝達活性を抑制し得る。例えば、リン酸化ＥＧＦＲは、リサイクルまたは分解される前に脱リン酸化される。この脱リン酸化事象は、プロテインチロシンホスファターゼ１ｂ（ＰＴＰ１ｂ、Ｐｔｐｎ１としても公知）により行われ、薬理学的インヒビターによりターゲティングされ得る。
【００４９】
ＰＴＰ１ｂ阻害がＥＧＦＲ活性をさらに増加させ得るかを評価するために、本発明の発明者らは、成長培地（３−（３，５−ジブロモ−４−ヒドロキシ−ベンゾイル）−２−エチル−ベンゾフラン−６−スルホン酸−（４−（チアゾール−２−イルスルファミル）−フェニル）−アミド（ＰＴＰ１ｂインヒビター、ＣＡＳ７６５３１７−７２−４）、組換えＥＧＦまたはそれらの両方を補充した成長培地）を再補給した血清飢餓筋芽細胞におけるＥＧＦＲリン酸化を測定した（図１２Ａ）。これらの細胞におけるｐ−ＥＧＦＲの濃淡値の定量により、ＰＴＰ１ｂ阻害は、成長培地のみではＥＧＦＲリン酸化を８０％増加させ、添加した組換えＥＧＦの存在下では２０％増加させることが示された（図１２Ａおよび１２Ｂ）。
【００５０】
ＰＴＰ１ｂ阻害は、筋芽細胞におけるＥＧＦＲシグナル伝達を増加させることができるので、本発明者らは、ＰＴＰ１ｂ阻害がサテライト幹細胞非対称分裂に影響を与えるかについて取り組むことにした。野生型およびｍｄｘＭｙｆ５−Ｃｒｅ／Ｒ２６Ｒ−ｅＹＦＰマウスからＥＤＬ筋線維を単離し、ＰＴＰ１ｂインヒビター、組換えＥＧＦまたはそれらの両方の存在下で４２時間培養した（図１２Ｃおよび１２Ｄ）。やはり、ＥＧＦは単独で、野生型およびｍｄｘサテライト幹細胞の両方における非対称分裂を刺激することができた。ＰＴＰ１ｂ阻害は単独で、非対称分裂を刺激するために十分であった。ＥＧＦまたはＰＴＰ１ｂインヒビターで処置した野生型細胞では、非対称分裂の比率は同様であった。表１は、ビヒクル対照、組換えＥＧＦ、ＰＴＰ１ｂインヒビター（ＣＡＳ７６５３１７−７２−４）または組換えＥＧＦおよびＰＴＰ１ｂインヒビターの両方の存在下で４２時間培養した時点におけるＷＴおよびｍｄｘ筋線維における総サテライト幹細胞分裂に対する非対称分裂の定量を示す。Ｓ．Ｅ．Ｍ．は、平均の標準誤差である。
【表１】
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【００５１】
理論に縛られるものではないが、これらの結果は、ＰＴＰ１ｂ阻害が活性ＥＧＦＲ経路の増加をもたらし、筋幹細胞非対称分裂を誘導することを示唆している。サテライト幹細胞における非対称分裂の刺激は、コミットされた筋原性前駆体の数を増加させ、筋肉組織再生を加速させる。
【００５２】
ＰＴＰ１ｂ阻害はｍｄｘ筋肉の再生を増強する。ＰＴＰ１ｂ阻害はＥＧＦＲシグナル伝達を増加させ、ｍｄｘサテライト幹細胞の非対称分裂を刺激したので、本発明者らは、ＰＴＰ１ｂ阻害を使用してインビボで非対称分裂を刺激し得るかを調べることにした。
【００５３】
ＰＴＰ１ｂインヒビターを心臓毒と共にｍｄｘ  ＴＡ筋肉に同時投与し、傷害の２日後に再補充した（図１３Ａ）。傷害後の筋幹細胞機能および処置ｍｄｘ筋肉の再生能力を評価するために、本発明者らは、心臓毒注射の１０日後に再生筋肉の組織学を検査した。対照ビヒクル処置筋肉は依然として、大きな面積の壊死線維（ｍｓＩｇＧ＋）を含有していたのに対して、ＰＴＰ１ｂインヒビターで処置した筋肉は、５０％少ないＭｙｈ３発現筋線維の存在により明らかなようにより良好に再生された（図１３Ｂ）。ＰＴＰ１ｂインヒビター処置筋肉もまた、ビヒクル処置対照と比較して量が１４％増加した（図１３Ｃ）。組換えＥＧＦによる処置と同様に、ＰＴＰ１ｂインヒビター処置筋肉は、対照筋肉と比較して、フェレット直径が平均２倍増加した筋線維を含有していた（図１３ＤおよびＥ）。最後に、ＰＴＰ１ｂインヒビター処置筋肉は、増加した数のサテライト細胞を含有していた（図１３Ｆ）。これらの知見は、ＰＴＰ１ｂ阻害がＥＧＦＲシグナル伝達の増加を誘導して再生ｍｄｘ筋肉におけるデノボ筋線維形成を加速させたことと一致する（図１４）。
実験手順
【００５４】
マウスおよび動物管理。以下のマウス系統を使用した：ｍｄｘ、Ｍｙｆ５−ＣｒｅおよびＲＯＳＡ２６−ｅＹＦＰ。動物の取り扱いおよび管理に関するオタワ大学ガイドラインにしたがって、すべての実験を実施した。別途指定がなければ、６〜８週齢マウスをすべての実験に使用した。
【００５５】
ＥＤＬ線維培養およびｓｉＲＮＡトランスフェクション。Ｄｕｍｏｎｔ，Ｎ．Ａら、「Ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅｉｒ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ．」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．（２０１５）２１：１４５５−６３（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように筋線維培養を実施した。簡潔に言えば、ＥＤＬを慎重に解剖し、０．２％コラゲナーゼ１（Ｓｉｇｍａ）を含有する２％Ｌ−グルタミン、４．５％グルコース、および１１０ｍｇ／ｍＬピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭで４５分間インキュベートした。ガラスピペットによる穏やかなトリチュレーションを使用して、筋線維を単離した。２０％ＦＢＳ（Ｗｉｓｅｎｔ）、１％ニワトリ胚抽出物（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）および２．５ｎｇ／ｍｌ  ｂＦＧＦ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を含有するＤＭＥＭで筋線維を３６、４２または７２時間培養した。薬理学的阻害のために、ラパチニブジトシレート（ＤＭＳＯ中１ｍＭ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＰＴＰ１ｂインヒビターＣＡＳ７６５３１７−７２−４（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれ１μＭまたは１０μＭの最終濃度で培養培地に添加した；ＤＭＳＯの等希釈液をビヒクル対照として使用した。ＥＧＦ処置のために、ヒト組換えＥＧＦ（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中１００ｎｇ／μｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を１００ｎｇ／ｍＬで培養培地に添加した。
【００５６】
静止サテライト細胞におけるＥＧＦＲのシグナル伝達状態を評価するために、解剖直後にＥＤＬ筋肉を４％ＰＦＡで固定した。ピンセットにより、固定筋肉から筋線維束を掻き裂いた。ＥＧＦＲの活性化に関する研究では、２％Ｌ−グルタミン、４．５％グルコースおよび１１０ｍｇ／ｍＬピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）を含むＤＭＥＭによる無血清条件で筋線維を単離し、次いで、ヒト組換えＥＧＦ（０．１％ＢＳＡを含むＰＢＳ中１００ｎｇ／μｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）１００ｎｇ／ｍＬで１時間処置し、ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡの等希釈液をビヒクル対照として使用した。
【００５７】
リポフェクタミンＲＮＡｉｍａｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＥＧＦＲ、Ａｕｒｋａまたはスクランブル（ＳＣＲ）用の検証済みＳｍａｒｔｐｏｏｌ  ｓｉＲＮＡｓ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、筋線維におけるサテライト細胞のトランスフェクションを実施した。Ｌｅ  Ｇｒａｎｄら、（２００９）Ｗｎｔ７ａ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｐｌａｎａｒ  ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｔｏ  ｄｒｉｖｅ  ｔｈｅ  ｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  ４，ｐｐ  ５３５−５４７（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、筋線維単離の４時間および１６時間後に、２回のトランスフェクションを実施した。ウエスタンブロットおよびｑＲＴ−ＰＣＲにより、筋芽細胞においてｓｉＲＮＡのノックダウン効率を検証した。
【００５８】
サテライト細胞分裂の特性評価。Ｄｕｍｏｎｔら（２０１５）に記載されているように、サテライト細胞における有糸分裂紡錘体の方向を測定した。上記のように、３６時間のインビトロ培養後に単一筋線維を固定した。免疫蛍光により検出した核におけるＰａｘ７発現により、サテライト細胞を同定した。核エンベロープの解離後、有糸分裂サテライト細胞では、Ｐａｘ７染色は細胞質性になるが、依然として識別可能である。前中期から細胞質分裂までの細胞を標識する陽性ｐ−Ａｕｒｋ染色により、有糸分裂サテライト細胞を同定した。ＷＴ細胞では観察されなかったｐ−Ａｕｒｋ染色パターン（単極、多極（＞２）および脱離欠陥（abscission  defect）を含む）を有する有糸分裂サテライト細胞を異常として定量した。有糸分裂紡錘体と、筋線維へのサテライト細胞の付着点の接平面との間の角度にしたがって、有糸分裂の方向を手動でカウントした。
【００５９】
細胞培養および免疫共沈降。蛍光活性化細胞選別によりＷＴマウスからサテライト細胞を単離し、初代筋芽細胞成長培地（２０％ＦＢＳ（Ｗｉｓｅｎｔ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）および５ｎｇ／ｍＬ  ｂＦＧＦ（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を含むハムＦ１０培地（Ｇｉｂｃｏ））中、コラーゲンコーティングプレート上で、初代筋芽細胞として培養した。ＥＧＦ刺激のために、ハムＦ１０培地中で筋芽細胞を１時間血清飢餓させ、次いで、組換えヒトＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）を含むまたは含まない初代成長培地をさらに１時間再補給した。
【００６０】
イムノブロッティング。１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでタンパク質を分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ  ＰＶＤＦ膜（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に転写した。膜を一次抗体でプローブし、続いて、１：５０００の軽鎖特異的ＨＲＰ結合二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でプローブし、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ＨＲＰ基質（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して顕色した。ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  ＨＤ２（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ）を使用して膜を視覚化し、またはＢＩＯＭＡＸフィルム（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｋｏｄａｋ）に曝露した。
【００６１】
エレクトロポレーションおよび心臓毒傷害。筋肉内（ｉ．ｍ．）心臓毒注射液（Ｌａｔｏｘａｎ、５０μｌの食塩水中１０μＭ溶液）を、全身麻酔下で皮膚から右ＴＡ筋肉に直接注射した。薬理学的阻害のために、ラパチニブジトシレート（ＤＭＳＯ中１ｍＭ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ＰＴＰ１ｂインヒビターＣＡＳ７６５３１７−７２−４（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）をそれぞれ１μＭまたは２０μＭの最終濃度で心臓毒溶液に混合した；ＤＭＳＯの等希釈液をビヒクル対照として使用した。インヒビター（食塩水で希釈した２０μＬの２．５μＭラパチビンまたは５０μＭ  ＰＴＰ１ｂインヒビター）の補助注射を、心臓毒注射の２日後に実施した。組換えＥＧＦ注射では、１０ｎｇのヒト組換えＥＧＦ（食塩水中１００ｎｇ／μＬ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を５０μＬの心臓毒溶液または２０μＬの食塩水に混合し、等量の食塩水をビヒクル対照として使用した。
【００６２】
Ｂｅｎｔｚｉｎｇｅｒ，Ｃ．Ｆら、「Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  Ｗｎｔ７ａ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ．」、Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．（２０１３）１２：７５−８７（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、エレクトロポレーションを実施した。３０μｇの食塩水中精製エンドトキシンフリー発現プラスミドを、全身麻酔下で皮膚から４週齢ｍｄｘマウスの右後部ＴＡ筋肉に注射した。注射直後に、５ｍｍ針電極（ＢＴＸ）を使用して、２０ミリ秒の固定持続時間および２００ミリ秒の間隔で、６パルスで１００〜１５０ボルトのパルスジェネレーター（ＥＣＭ８３０，ＢＴＸ）により、電気刺激をＴＡに印加した。
【００６３】
免疫染色および抗体。ＥＤＬ筋線維を２％ＰＦＡで１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。ウマ血清ブロッキングバッファー（５％ウマ血清、１％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）および０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳ）で線維を室温で１時間または４℃で一晩ブロッキングおよび透過処理した。一次抗体をブロッキング溶液に室温で２時間または４℃で一晩適用した。続いて、サンプルをＰＢＳで洗浄し、適切な蛍光標識二次抗体（Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８、５４６または６４７）で室温で１時間染色した。ＰＢＳで洗浄した後、サンプルをＰｅｒｍａｆｌｕｏｒ（Ｆｉｓｈｅｒ）でマウントした。
【００６４】
筋肉サンプルをＯＣＴ包埋化合物に包埋し、液体窒素冷却イソペンタンで凍結し、１２μｍスライスに凍結切片化した。薄片をＰＢＳで１回洗浄し、２％ＰＦＡで１０分間固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００／０．１５Ｍグリシン／ＰＢＳで１０分間透過処理し、ＰＢＳで十分に洗浄した。Ｍ．Ｏ．Ｍブロッキング試薬（Ｖｅｃｔｏｒ）を使用して、サンプルを２時間ブロッキングし、続いて、５％ＮＧＳ／２％ＢＳＡで４℃で一晩さらにブロッキングした。一次抗体を４℃で一晩のブロッキングに適用した。サンプルをＰＢＳで十分に洗浄し、二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｏｕｒ  ５４６、６４７）をＰＢＳに室温で１時間適用した。ＰＢＳ洗浄後、薄片をＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）で１０分間対比染色し、Ｐｅｒｍａｆｌｏｕｒ（Ｆｉｓｈｅｒ）でマウントした。
【００６５】
抗体は以下のとおりであった：マウス抗Ｐａｘ７（ＤＳＨＢ）、ニワトリ抗ＧＦＰ（ｃａｔ＃  ａｂ１３９７０，Ａｂｃａｍ）、ウサギ抗ＥＧＦＲ（ｃａｔ＃  ４２６７Ｓ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗ホスホ−ＥＧＦＲ  Ｙ１０６８（ｃａｔ＃  ３７７７Ｓ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ウサギ抗ホスホ−Ａｕｒｋ（ｃａｔ＃  ２９１４Ｓ，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびウサギ抗ミオゲニン（Ｍ２２５，ｃａｔ＃  ｓｃ−５７６，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）。
【００６６】
筋肉切片の組織学的分析。線維型分析のために、非固定サンプルをＰＢＳで洗浄し、１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）で室温１時間ブロッキングした。一次抗体を１０％ＮＧＳに室温で２時間適用した。切片をＰＢＳで十分に洗浄し、二次抗体をＰＢＳに室温１時間適用した。ＰＢＳ洗浄後、切片をＤＡＰＩで１０分間対比染色し、Ｐｅｒｍａｆｌｏｕｒでマウントした。抗体は以下のとおりであった：マウス抗ＭｙＨ３（クローンＦ１．６５２，ＤＳＨＢ）、マウス抗ＭｙＨ４（クローンＢＦ−Ｆ３，ＤＳＨＢ）。
【００６７】
「再生指数＝ｌｏｇ１０（新形成Ｍｙｈ３筋線維の数／壊死ＩｇＧ筋線維の数）」として、ｍｄｘ筋肉の再生指数を計算した。対数変換を使用して、指数のスケールを線形化した。上記指数の幾何平均に対して、統計的検定を実施した。
【００６８】
筋線維フェレット直径の分析のために、非固定サンプルをＰＢＳで洗浄し、コムギ胚芽凝集素Ａｌｅｘａ  ６４７コンジュゲート（Ｆｉｓｈｅｒ）で室温１時間染色した。サンプルをＰＢＳで１回洗浄し、ＤＡＰＩで対比染色した。サンプルをＰＢＳで洗浄し、Ｐｅｒｍａｆｌｏｕｒでマウントした。染色直後に、画像を撮影した。Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂａｒｔｏｎ，Ｅ．Ｒ．（２０１４）ＳＭＡＳＨ−ｓｅｍｉ−ａｕｔｏｍａｔｉｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ：ａ  ＭＡＴＬＡＢ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｓｋｅｌｅｔ．Ｍｕｓｃｌｅ  ４，２１（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ＭＡＴＬＡＢ  ２０１５ａのＳＭＡＳＨソフトウェアを使用して、最小線維フェレット測定を実施した。有意な染色アーチファクトを有するサンプルを自動分析から除外した。
【００６９】
統計分析。平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）としてコンパイルデータを表した。最低３回の生物学的反復で、実験を実施した。２つの条件の統計的比較のために、スチューデントｔ検定を使用した。生物学的にマッチしたサンプルについては、対応のある検定を使用した。非関連サンプルを比較するために、対応のない検定を使用した。有意水準は以下のように示されている：＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００５。
【００７０】
ＥＧＦＲ経路アクチベーターの同定。Ｍｙｆ５−Ｃｒｅ／Ｒｏｓａ−ＹＦＰマウスから短趾屈筋（ＦＤＢ）線維を単離し、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地；１１０ｍｇ／ｍｌピルビン酸ナトリウムを含む高グルコース、Ｌ−グルタミン）中、０．２５％コラゲナーゼタイプＩ（Ｓｉｇｍａ）で２．５〜３時間消化した。ガラスピペットによる穏やかなトリチュレーションを使用して、筋線維を解離した。
【００７１】
筋線維培養培地（２０％ＦＢＳ（Ｗｉｓｅｎｔ）、１％ニワトリ胚抽出物（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉａｃａｌｓ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｅｄｅｒｌａｎｅ）および２．５ｎｇ／ｍｌ塩基性線維芽細胞成長因子（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ）を補充したＤＭＥＭ）中で、筋線維を３７℃、５％ＣＯ２で４２時間培養する。
【００７２】
最初に、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で筋線維を５分間固定する。１％ウシ血清アルブミン、０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、５％ＨＳおよび０．０１％アジ化ナトリウムで筋線維を１〜２時間ブロッキングする。一次抗体をブロッキング溶液に室温で２時間または４℃で一晩適用する。筋線維をＰＢＳで洗浄し、適切な蛍光標識二次抗体（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、５４６）で室温１時間染色する。ＰＢＳで洗浄した後、線維核をＤＡＰＩで５分間染色する。以下の抗体を使用する：マウス抗Ｐａｘ７（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｂａｎｋ（ＤＳＨＢ））、ニワトリ抗ＧＦＰ（ｃａｔ．ｎｏ．ａｂ１３９７０，Ａｂｃａｍ）。
【００７３】
チャネル３（ＤＡＰＩ）染色に基づいて、サテライト細胞をフォーカスする。８５．３μｍの拡大被写界深度に対して１３μｍ間隔で撮影した７つのｚスタックをサンプリングすることにより、オートフォーカスを実施する。
【００７４】
Ｚスタック画像を統合して、フォーカスしたすべてのサテライト細胞の投影画像を作成した。２００（対物２０倍）倍率で４５．５μｍの拡大被写界深度に対して６．５μｍ間隔で撮影した７つのＺスタック画像から、分析のための投影画像の画像収集を行った。投影方向は中心に置かれ、中央のスタックは各筋線維の中心内にある。隣接するソース間のピクセル輝度の差を使用する最大最小差投影法（maximum-minimum  difference  projection  method）を使用して、バックグラウンドを減少させた。さらなるバックグラウンド減算を各チャネルに適用した：ローパスフィルタをチャネル１（Ｐａｘ７）およびチャネル３（ＤＡＰＩ）に適用し、３Ｄ表面フィッティングをチャネル２（ＹＦＰ）に適用した。
【００７５】
最初に、チャネル１（Ｐａｘ７）シグナルに基づいて潜在的なサテライト細胞を同定し、細胞間の蛍光強度に基づいて他のサテライト細胞から分離した。過度に暗いためにサテライト細胞とみなされない細胞について、残屑の偽陽性選択を防止するために、閾値を適用した。次いで、面積、形状、総強度、平均強度および強度の変動に基づいて、サテライト細胞を検証した。最後に、チャネル３（ＤＡＰＩ）によりサテライト細胞を検証し、シグナルの総強度および平均強度に基づいて真の核を同定した。
【００７６】
ウェル番号、フィールド番号、セル番号、セル座標（ピクセル数およびＸ、Ｙ座標）、平均チャネル１強度（Ｐａｘ７）、平均チャネル２強度（ＹＦＰ）および平均チャネル３強度（ＤＡＰＩ）に関するデータを取得し、サテライト細胞対および各サテライト細胞のコミットメント状態を同定するために使用した。
【００７７】
非対称サテライト細胞分裂の公知のアクチベーターとしてＥＧＦリガンドを使用し、非対称サテライト細胞分裂の公知のアクチベーターとしてＰＴＰ１ｂインヒビターを使用し、対称サテライト細胞分裂の公知のアクチベーターとしてＷｎｔ７ａリガンドを使用して、この方法を検証した。非対称分裂であったＹＦＰ（−）分裂のパーセンテージは、ＥＧＦリガンド処置細胞では７１％であり、ＰＴＰ１ｂ処置細胞では６７％であったのと対比して、対照処置細胞では５５％であった。対称分裂であったＹＦＰ（−）分裂のパーセンテージは、Ｗｎｔ７ａリガンド処置細胞では７８％であったのと対比して、対照処置細胞では６２％であった。対称分裂であったＹＦＰ（−）分裂のパーセンテージは、ＥＧＦリガンド処置細胞では２９％であり、ＰＴＰ１ｂ処置細胞では３３％であったのと対比して、対照処置細胞では４５％であった。
【００７８】
前述の説明では、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー番号を使用して、一般的に使用されている名称により特定されるタンパク質をさらに定義した。特定Ｕｎｉｐｒｏｔエントリーに列挙されているアミノ酸配列および天然変異体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７９】
前述の説明では、説明目的で、多数の詳細が、実施例の完全な理解を提供するために記載されている。しかしながら、これらの具体的な詳細が必要とされないことは当業者には明らかであろう。したがって、記載されているものは、記載されている実施例の適用を単に示すものであり、上記教示を考慮して多数の改変および変形が可能である。
【００８０】
上記説明は実施例を提供するので、当業者は、特定の例に対して改変および変更を行い得ると認識されよう。したがって、特許請求の範囲は、本明細書に記載される特定の実施例により限定されるべきではなく、全体として本明細書に沿った方法で解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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