(57)【要約】  キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）で使用されるキャピラリーをコーティングするために、表面限定型水性可逆的付加開裂連鎖移動（ＳＣＡＲＡＦＴ）重合法が開発された。このコーティングは、市販の線状ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）コーティングキャピラリーよりも１桁低い電気浸透圧を生成した。コーティングされたキャピラリーは、ＣＺＥを使用したボトムアッププロテオーム解析で評価された。電気浸透移動度が非常に低いため、２００分の分離と改善されたシングルショット分析が可能となる。重合混合物中の機能性ビニルモノマーを単に変更することにより、様々な種類のコーティングが調製された。
2020517453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）溶融シリカキャピラリーと；
ｂ）前記溶融シリカキャピラリーの内面に共有結合した連鎖移動部分を含むコーティングと；
ｃ）前記連鎖移動部分に共有結合した置換ポリエチレンポリマーであって、前記ポリマーのポリエチレン単位は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｇで置換され、式中、ＧはＮＲ２またはＯＲであり；Ｒは、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｎ（Ｒａ）３Ｘであり；各Ｒａは、独立してＨ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、またはアリールであり；Ｘは対イオンである、ポリマーと
を含む、ポリマーコーティング分離キャピラリーであって、
前記ポリマーコーティング分離キャピラリーは、キャピラリーゾーン電気泳動用に約０．１×１０−６ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１〜約１０×１０−４ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１の電気浸透流を有し、前記コーティングは金属およびフリーラジカルスカベンジャーで汚染されていない、ポリマーコーティング分離キャピラリー。
【請求項２】
前記電気浸透流が約０．１×１０−６ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１〜約１０×１０−６ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１である、請求項１に記載の分離キャピラリー。
【請求項３】
−Ｃ（＝Ｏ）Ｇが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２である、請求項１に記載の分離キャピラリー。
【請求項４】
−Ｃ（＝Ｏ）Ｇが−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３Ｘである、請求項１に記載の分離キャピラリー。
【請求項５】
前記ポリマーが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２置換エチレン単位および−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３置換エチレン単位のランダムポリマーまたはブロックコポリマーを含む、請求項１に記載の分離キャピラリー。
【請求項６】
約２００，０００〜約８００，０００の理論段を含む請求項１に記載の分離キャピラリー。
【請求項７】
前記連鎖移動部分が−ＳｉＪ２（ＣＨ２）３ＳＣ（＝Ｓ）Ｓ−を含み、各Ｊは独立してＨ、Ｇ、またはハロである、請求項１に記載の分離キャピラリー。
【請求項８】
前記分離キャピラリーが約２００，０００〜約８００，０００の理論段を含み、前記電気浸透流が約１×１０−６ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１〜約１０×１０−６ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１であり、−Ｃ（＝Ｏ）Ｇが−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２である、請求項１に記載の分離キャピラリー。
【請求項９】
ＲがＨである、請求項８に記載の分離キャピラリー。
【請求項１０】
前記コーティングが式Ｉまたは式ＩＩ：
【化１】
2020517453.tif 000008
のポリマーを含み、
式中、
Ｊは、メトキシ、エトキシまたはハロであり；
Ｘはハロであり；
Ｅは、Ｈ、アリール、アルキル、シアノであり；
ｎは０〜１０，０００であり；
ｍは０〜１０，０００であり、ｎおよびｍの両方が０となることはできない、
請求項１に記載の分離キャピラリー。
【請求項１１】
請求項１に記載のポリマーコーティング分離キャピラリーを製造する方法であって：
ａ）溶融シリカキャピラリーの内面を連鎖移動試薬と接触させて、前記溶融シリカキャピラリーの共有結合改質内面を提供するステップと；
ｂ）前記改質内面を、ラジカル開始剤、置換ビニルモノマー、および任意選択の第２のモノマーの水性混合物と接触させるステップと；
ｃ）前記混合物を加熱または照射することによりリビングラジカル重合を開始させるステップと
を含み、それにより前記ポリマーコーティング分離キャピラリーを製造する方法。
【請求項１２】
前記水性混合物が緩衝剤を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ラジカル開始剤の濃度が約１０−５モル〜約１０−３モルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記置換ビニルモノマーの濃度が約０．１モル〜約２モルである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポリマーコーティング分離キャピラリーが中性電荷を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリマーコーティング分離キャピラリーが正に帯電している、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリマーコーティング分離キャピラリーの内面がブロックコポリマーでコーティングされている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記置換ビニルモノマーが−Ｃ（＝Ｏ）Ｇで置換され、前記任意選択の第２のモノマーが−Ｃ（＝Ｏ）Ｇで置換されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ポリマーコーティング分離キャピラリーにおけるリビングラジカル重合が、前記第２のモノマーでステップｂ）およびｃ）を繰り返すことにより再開される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリマーコーティング分離キャピラリーが式ＩＡまたは式ＩＩＡ：
【化２】
2020517453.tif 000009
のポリマーでコーティングされた内面を含み、
式中、
Ｘはハロであり；
ｎは０〜１０，０００であり；
ｍは０〜１０，０００であり、ｎおよびｍの両方が０となることはできない、
請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリマーコーティング分離キャピラリーが、少なくとも１００時間の連続操作の間、少なくとも５，０００個の同定可能なペプチドのキャピラリーゾーン電気泳動により再現可能な分離を行う、請求項２０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２０１７年４月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／４８８，８９２号の優先権を主張し、これは参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府支援
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ＧＭ０９６７６７の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）は、その感度、逆相クロマトグラフィーとの直交性、および低コストにより、質量分析ベースのプロテオーム分析において注目を集めている。分離は、ＣＺＥの分析物の電荷対サイズ比に基づいているが、キャピラリーの特性は電気泳動性能において重要な役割を果たす。キャピラリー内面上のシラノール基への分析物の非特異的吸着は、試料の損失、ピークのテーリング、および再現性の低下につながる。シラノール基によって生成される高い電気浸透流（ＥＯＦ）は、比較的短い分離ウィンドウをもたらし、このことがプロテオーム分析中に生成可能なタンデム質量スペクトルの数を制限し、ペプチド同定の数を制限する。
【０００４】
これらの問題を克服するために、様々なキャピラリーコーティングが開発されてきた。現在、最も広く使用されているコーティング方法は、フリーラジカル重合反応に基づいている。この方法では、融合キャピラリーの内壁は、γ−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン等の二官能性化合物を使用して前処理されるが、一方の基がキャピラリーの内壁のシラノール基と特異的に反応し、他方が重合プロセスに関与するモノマーと反応する。次いで、前処理されたキャピラリーに、典型的にはアクリルアミド、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン、および過硫酸カリウムで構成される脱気重合混合物が充填される。この手順により、通常は線状ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）と呼ばれる非架橋ポリアクリルアミドの層が形成される。
【０００５】
この方法にはいくつかの欠点がある。フリーラジカルスカベンジャーが微量レベルで存在する可能性があり、再現性のないコーティング特性につながる。さらに、アクリルアミドモノマーはキャピラリーの内壁の官能基と反応するだけでなく、溶液中の他のアクリルアミドモノマーとも反応し、溶液中に形成されたポリマーがキャピラリーを詰まらせる可能性があり、コーティングプロセスの失敗につながる。さらに、膜厚が予測不可能である。
【０００６】
これらの問題を克服するために、Ｈｕａｎｇら（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．、１９９８、７０、４０２３）は、線形および架橋ポリマー膜の両方をシリカに共有結合させる表面限定型原子移動ラジカル重合（ＳＣＡＴＲＰ）法を開発した。赤外分光法により、膜の成長が制御可能であることが示され、原子間力顕微鏡により、滑らかな膜が調製されたことが明らかとなった。ＳＣＡＴＲＰコーティングキャピラリーを使用した強塩基性タンパク質のＣＺＥは、ポリアクリルアミドに期待される高い効率を提供した。しかしながら、ＡＴＲＰは遷移金属触媒による活性化および不活性化の平衡に支配されており、従来のＡＴＲＰシステムでは、重合中の活性を維持するために高い触媒濃度が必要である。重合反応後に遷移金属イオンを除去することは困難であり、ポリマー中の金属触媒の残留量の存在は、生物医学用途において懸念を引き起こすことが多く、ＡＴＲＰ中のビピリジン吸着は、低ｐＨでのＣＺＥ中にアノードＥＯＦをもたらす。
【０００７】
対照的に、可逆的付加開裂連鎖移動（ＲＡＦＴ）重合は、金属触媒の使用を回避し、多種多様な反応条件および官能性を許容する。ＡｌｉおよびＣｈｅｏｎｇ（Ｊ．Ｓｅｐ．Ｓｃｉ．、２０１５、３８、１７６３）は、キャピラリーエレクトロクロマトグラフィー（ＣＥＣ）における応用のために、ＲＡＦＴ重合でキャピラリーの内面上にＮ−フェニルアクリルアミド−スチレンコポリマーを固定化する方法を報告した。末端ハロゲン（４−クロロメチルフェニルイソシアナート）または４−（トリフルオロメトキシ）フェニルイソシアナートを有する配位子を、触媒としてのジブチルスズジクロリドの存在下で、前処理されたシリカキャピラリーの内面に、イソシアナート−ヒドロキシル反応を介して結合させた。開始剤（ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム）の結合配位子への付着を行い、その後ｉｎ  ｓｉｔｕ重合を行った。得られたキャピラリーは、ＵＶ検出を使用したＣＥＣにおいて、誘導体化されたサッカリド異性体およびシトクロムＣのトリプシン消化物に対して良好な分離性能を示した。ＲＡＦＴ重合反応の前に全てのモノマーが重合混合物に添加されたため、調製されたブロックコポリマーの構造は明確ではない。さらに、得られたポリマーのリビング特性は実証されていない。さらに、反応は環境に優しくない有機溶媒（トルエンまたはｐ−キシレン）中で行われた。最後に、ＲＡＦＴ重合コーティングカラムは、ＣＺＥにおけるプロテオミクス用途では評価されなかった。
【０００８】
問題は、ＣＺＥによるタンパク質またはタンパク質消化物の分離のためのポリマーコーティングキャピラリーの性能を改善する必要があることである。したがって、プロテオミクス分析において物質を分解する要求を満たす低ＥＯＦのコーティング、ならびに極めて塩基性および酸性の検体の非特異的吸着を最小限に抑え、スループットを向上させる帯電（高ＥＯＦ）コーティングが必要である。
【発明の概要】
【０００９】
本書では、ポリマーをキャピラリー内面に共有結合させるための、表面限定型水性可逆的付加開裂連鎖移動（ＳＣＡＲＡＦＴ）重合反応に基づく環境に優しいコーティング法について説明する。ＳＣＡＲＡＦＴ法が様々なビニルモノマーに適用可能であることを示すために、中性および正電荷コーティングの両方を調製した。さらに、ＳＣＡＲＡＦＴ法により調製されたコーティングのリビング特性は、ブロックコポリマーコーティングを調製することにより確認され、中性コーティングおよび正電荷コーティングが連続的に調製された。ＥＯＦを測定し、トリプシン消化物およびタンパク質混合物をＣＺＥで分析することにより、コーティングキャピラリーを評価した。
【００１０】
したがって、本開示は、ａ）溶融シリカキャピラリーと；
ｂ）溶融シリカキャピラリーの内面に共有結合した連鎖移動部分を含むコーティングと；
ｃ）連鎖移動部分に共有結合した置換ポリエチレンポリマーであって、ポリマーのポリエチレン単位は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｇで置換され、式中、Ｇは、ＮＲ２またはＯＲであり；Ｒは、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｎ（Ｒａ）３Ｘであり；各Ｒａは、独立してＨ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、またはアリールであり；Ｘは、対イオンである、ポリマーと
を含む、ポリマーコーティング分離キャピラリーであって、
ポリマーコーティング分離キャピラリーは、キャピラリーゾーン電気泳動用に約０．１×１０−６ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１〜約１０×１０−４ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１の電気浸透流を有し、コーティングは、金属およびフリーラジカルスカベンジャーで汚染されていない、ポリマーコーティング分離キャピラリーを提供する。
【００１１】
本開示は、コーティングが、式Ｉまたは式ＩＩ：
【化１】
2020517453.tif 000003
のポリマーを含み、
式中、
Ｊは、メトキシ、エトキシまたはハロであり；
Ｘはハロであり；
Ｅは、Ｈ、アリール、アルキル、シアノであり；
ｎは０〜１０，０００であり；
ｍは０〜１０，０００であり、ｎおよびｍの両方が０となることはできない、
コーティング分離キャピラリーを提供する。
【００１２】
さらに、本開示は、請求項１に記載のポリマーコーティング分離キャピラリーを製造する方法であって、
ａ）溶融シリカキャピラリーの内面を連鎖移動試薬と接触させて、溶融シリカキャピラリーの共有結合改質内面を提供するステップと；
ｂ）改質内面を、ラジカル開始剤、置換ビニルモノマー、および任意選択の第２のモノマーの水性混合物と接触させるステップと；
ｃ）混合物を加熱または照射することにより、リビングラジカル重合を開始させるステップと
を含み、それによりポリマーコーティング分離キャピラリーを製造する方法を提供する。
【００１３】
本発明は、式ＩおよびＩＡならびに式ＩＩおよびＩＩＡの新規ポリマーコーティングと、式ＩおよびＩＡならびに式ＩＩおよびＩＩＡのポリマーコーティングの合成の中間体と、式ＩおよびＩＡならびに式ＩＩおよびＩＩＡのポリマーコーティングを調製する方法とを提供する。本発明はまた、他の有用なポリマーコーティングの合成のための中間体として有用な式ＩおよびＩＡならびに式ＩＩおよびＩＩＡのポリマーコーティングを提供する。
【００１４】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の実施形態または様々な態様をさらに実証するために含まれている。いくつかの場合において、本発明の実施形態は、本明細書に提示される詳細な説明と組み合わせて添付の図面を参照することにより最もよく理解することができる。説明および添付の図面は、ある特定の具体例、または本発明のある特定の態様を強調する場合がある。しかしながら、当業者は、例または態様の一部が本発明の他の例または態様と組み合わせて使用され得ることを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】ＳＣＡＲＡＦＴによるコーティングキャピラリーの調製の概略図である。
【図２】大腸菌トリプシン消化物のＣＺＥおよびＵＰＬＣ分析の間で重複したペプチド（Ａ）およびタンパク質群（Ｂ）を示す図である。
【図３】ＨｅＬａ消化物のＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析の代表的な電気泳動図である。実験条件：Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計；内径５０μｍ×外径１５０μｍ×長さ１００ｃｍのＬＰＡコーティングキャピラリー；２５ｎｇのＨｅＬａ消化物；１Ｍ  ＨＡｃ分離緩衝剤；２１．６ｋＶの分離電圧；１．６ｋＶのスプレー電圧。
【図４】ＨｅＬａ消化物から同定されたペプチドのｐＩ分布である。実験条件は図３と同じである。
【図５】直接正電荷コーティング（Ａ）およびブロックコポリマーコーティング（Ｂ）を有するキャピラリーを使用した無傷タンパク質の分離を示す図である。ピーク：（１）炭酸脱水酵素、（２）ミオグロビン、（３）リボヌクレアーゼＡ、（４）リゾチーム。実験条件：内径５０μｍ×外径１５０μｍ×長さ６２ｃｍ；１Ｍ  ＨＡｃバックグラウンド電解質；１．６ｋＶのスプレー電圧、−１９．６ｋＶの分離電圧。
【図６】大腸菌消化物のＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析の代表的なクロマトグラムである。実験条件：ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計、市販のＣ１８逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ、１００μｍ×１００ｍｍ、１．７μｍ粒子、ＢＥＨ１３０Ｃ１８）、５０ｎｇのＥ．ｃｏｌｉ消化物、緩衝剤Ａ（水中０．１％ＦＡ）および緩衝剤Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＦＡ）を勾配分離の移動相として使用：０〜１０分、２％Ｂ；１０〜１１分、２〜８％Ｂ；１１〜７１分、８〜３０％Ｂ；７１〜７２分、３０〜８０％Ｂ；７２〜７７分、８０％Ｂ；７７〜７８分、８０〜２％Ｂ；７８〜９０分、２％Ｂ。
【図７】μＥＯＦ測定の検出器トレースを示す図である。（Ａ）第１のコーティングキャピラリー。（Ｂ）第２のコーティングキャピラリー。（Ｃ）第３のコーティングキャピラリー。実験条件：ＢＧＥ、１Ｍ  ＨＡｃ、キャピラリー：内径５０μｍ×外径１５０μｍ、長さ＝１００ｃｍ、ｔｉｎｊ＝２秒、ｔｔｒ＝４０秒、ｔｍｉｇｒ＝５０分。ピークはベンジルアルコール、１．６のｋＶスプレー電圧、２６．６ｋＶの分離電圧である。
【図８】ＬＰＡコーティングキャピラリーの長期安定性およびキャリーオーバーを試験するための代表的な電気泳動図である。実験条件：ＬＴＱ  ＸＬ質量分析計；内径５０μｍ×外径１５０μｍ×長さ１００ｃｍのＬＰＡコーティングキャピラリー；３０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３中の２ｍｇ／ｍＬのアフリカツメガエル消化物２５ｎＬ；ブランク分析では、２５ｎＬの１Ｍ  ＨＡｃを注入；１Ｍ  ＨＡｃ分離緩衝剤；２６．６ｋＶの分離電圧；１．６ｋＶのスプレー電圧。
【図９】ＨｅＬａ消化物から同定されたペプチドの移動時間の累積分布である。実験条件：Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計；内径５０μｍ×外径１５０μｍ×長さ１００ｃｍのＬＰＡコーティングキャピラリー；２５ｎｇのＨｅＬａ消化物；１Ｍ  ＨＡｃ分離緩衝剤；２１．６ｋＶの分離電圧；１．６ｋＶのスプレー電圧。
【図１０】様々なｐＩを有するペプチドの移動時間を示す図である。実験条件は図８と同じである。
【図１１】同定されたホスホペプチドの移動時間分布を示す図である。実験条件は図８と同じである。
【図１２】ホスホペプチドのｐＩ分布を示す図である。実験条件は図８と同じである。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
キャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）で使用されるキャピラリーをコーティングするために、表面限定型水性可逆的付加開裂連鎖移動（ＳＣＡＲＡＦＴ）重合法が開発された。ＳＣＡＲＡＦＴ重合は主に、溶液中ではなくキャピラリーの内面上で生じ、これはコーティングの均一性を大幅に改善する。このコーティングで処理されたキャピラリーは、２．８±０．２×１０−６ｃｍ２・Ｖ−１・ｓ−１（Ｎ＝３）の電気浸透移動度を生成したが、これは、市販の線形ポリアクリルアミド（ＬＰＡ）コーティングキャピラリーのそれよりもおおよそ１桁低い。コーティングされたキャピラリーは、ＣＺＥを使用したボトムアッププロテオーム解析で評価された。電気浸透移動度が非常に低いため、２００分の分離と改善されたシングルショット分析が可能となる。Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計に結合されたＳＣＡＲＡＦＴ−アクリルアミドキャピラリーによるシングルショット分析を使用して、５０ｎｇの大腸菌消化物から平均９７７のタンパク質群および５６０５の固有のペプチドが特定され、２５ｎｇのＨｅＬａ消化物から２１５８のタンパク質群および１０００５のペプチドが特定された。コーティングは安定している。２００時間（８．４日）の連続操作で単一のキャピラリーが使用された。移動時間のＲＳＤは、６つのイオンに対して生成された選択されたイオン電気泳動図（ＳＩＥ）で２〜３％であり、これらのＳＩＥの理論段数の中央値は２４００００〜６０００００であった。重合混合物中の機能性ビニルモノマーを単に変更することにより、様々な種類のコーティングが調製された。直接付着およびブロックコポリマーの形成を使用した正帯電コーティングを調製し、無傷タンパク質の混合物の分離について実証した。
【００１７】
定義
以下の定義は、明細書および特許請求の範囲の明確で一貫した理解を提供するために含まれる。本明細書で使用される場合、列挙された用語は、以下の意味を有する。本明細書で使用される他の全ての用語および語句は、当業者が理解するであろう通常の意味を有する。そのような通常の意味は、Ｒ．Ｊ．ＬｅｗｉｓによるＨａｗｌｅｙ’ｓ  Ｃｏｎｄｅｎｓｅｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  １４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、２００１等の技術辞書を参照することにより得ることができる。
【００１８】
本明細書における「一実施形態」、「実施形態」等への言及は、説明される実施形態が特定の態様、特徴、構造、部分、または特性を含み得ることを示すが、必ずしも全ての実施形態がその態様、特徴、構造、部分、または特性を含むわけではない。さらに、そのような語句は、必ずしもそうとは限らないが、本明細書の他の部分で言及される同じ実施形態を指す場合がある。さらに、特定の態様、特徴、構造、部分、または特性が実施形態に関連して説明されている場合、明示的に記述されているかどうかにかかわらず、そのような態様、特徴、構造、部分、もしくは特性に影響を与える、またはそれらを他の実施形態と結び付けることは、当業者の知識の範囲内である。
【００１９】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には、文脈で明確に指示されていない限り、複数の言及が含まれる。したがって、例えば、「化合物」への言及は、複数のそのような化合物を含み、したがって化合物Ｘは、複数の化合物Ｘを含む。さらに、請求項は、任意選択の要素を除外するように作成される場合があることに留意されたい。そのため、この声明は、本明細書に記載の任意の要素、および／または請求要素の列挙もしくは「負の」限定の使用に関連して、「唯一」、「のみ」等の排他的な用語を使用するための前提的根拠としての役割を果たすことを意図している。
【００２０】
「および／または」という用語は、この用語が関連付けられている項目のいずれか１つ、項目の任意の組み合わせ、または項目の全てを意味する。「１つ以上」および「少なくとも１つ」という語句は、特にその使用の文脈で読まれる場合、当業者によって容易に理解される。例えば、この語句は、１、２、３、４、５、６、１０、１００、または記載された下限の約１０、１００、もしくは１０００倍の任意の上限を意味する。例えば、フェニル環上の１つ以上の置換基は、例えばフェニル環が置換されている場合、１〜５、または１〜４を指す。
【００２１】
当業者によって理解されるように、成分の量、分子量等の特性、反応条件等を表すものを含む全ての数字は近似値であり、全ての場合において「約」という用語によって任意選択で修飾されていると理解される。これらの値は、本明細書における説明の教示を利用して、当業者が得ようとする所望の特性に応じて変動し得る。また、そのような値は、それぞれの試験測定で判明した標準偏差から必然的に生じる変動性を本質的に含むことも理解される。先行詞「約」を使用することにより値が近似値として表される場合、修飾子「約」のない特定の値もさらなる態様を形成することが理解されよう。
【００２２】
「約」および「およそ」という用語は、同義的に使用される。両方の用語は、指定された値の±５％、±１０％、±２０％、または±２５％の変動を指す。例えば、「約５０」パーセントは、いくつかの実施形態において、４５〜５５パーセントの変動を有し得る、または特定の請求項により別様に定義され得る。整数範囲の場合、「約」という用語は、範囲の各端の列挙された整数よりも大きいおよび／または小さい１つまたは２つの整数を含むことができる。本明細書において別段の指定がない限り、用語「約」および「およそ」は、個々の成分、組成物、または実施形態の機能性に関して同等である列挙された範囲に近い値、例えば重量パーセントを含むことを意図している。「約」および「およそ」という用語はまた、この段落で前述したように、列挙された範囲の端点を修飾し得る。
【００２３】
当業者によって理解されるように、特に記述による説明を提供することに関して、あらゆる目的のために、本明細書に列挙される全ての範囲はまた、そのあらゆる可能な部分範囲および部分範囲の組み合わせ、ならびに範囲を構成する個々の値、特に整数値を包含する。したがって、２つの特定の単位間の各単位も開示されることが理解される。例えば、１０〜１５が開示される場合、１１、１２、１３、および１４も個別に、また範囲の一部として開示される。列挙された範囲（重量パーセントまたは炭素基等）には、範囲内の各特定の値、整数、小数、または同一性が含まれる。任意の列挙された範囲は、少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、または１０分の１に分割された同じ範囲を十分に説明し、有効化するものとして容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書で説明される各範囲は、下の３分の１、中央の３分の１、および上の３分の１等に容易に分割され得る。また、当業者には理解されるように、「最大」、「少なくとも」、「より大きい」、「より小さい」、「超」、「以上」等の言語は全て、列挙された数を含み、そのような用語は、上記で議論されるように、その後部分範囲に分割され得る範囲を指す。同様に、本明細書に列挙される全ての比率は、より広い比率内にある全ての部分比率も含む。したがって、ラジカル、置換基、および範囲について列挙された特定の値は、説明のみを目的としており、ラジカルおよび置換基に関する他の定義された値、または定義された範囲内の他の値を除外しない。さらに、各範囲の端点は、他の端点に関連して、および他の端点とは無関係に重要であることがさらに理解される。
【００２４】
また、当業者は、メンバーがマーカッシュ群等の共通様式でグループ化されている場合、本発明は、全体として列挙された群全体だけでなく、群の個別の各メンバー、および主要な群の全ての可能な部分群を包含することを容易に認識するであろう。さらに、全ての目的において、本発明は、主要な群だけでなく、群のメンバーの１つ以上がない主要な群も包含する。したがって、本発明は、列挙された群のメンバーの任意の１以上の明示的な除外を想定している。したがって、開示されたカテゴリまたは実施形態のいずれかに条件が適用され得、列挙された要素、種、または実施形態のいずれか１つ以上が、例えば明示的な負の制限で使用するために、そのようなカテゴリまたは実施形態から除外され得る。
【００２５】
「接触する」という用語は、触れる、接触する、または直近もしくはすぐ近くに近付けたりする行為を指す。例えば、溶液中、反応混合物中等での化学反応または物理的変化をもたらすためである。
【００２６】
「実質的に」という用語は、本明細書で使用される場合広義の用語であり、その通常の意味で使用され、必ずしも全部ではないが大部分が指定されたものであることを含むがこれに限定されない。例えば、この用語は、完全な数値の１００％でなくてもよい数値を指す場合がある。完全な数値は、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、約１０％、約１５％、または約２０％小さくてもよい。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「置換」または「置換基」という用語は、「置換」（または「置換基」）を使用する表現において示された基の１個以上（例えば１〜２０個、様々な実施形態において１〜１０個、他の実施形態において１、２、３、４、または５個、いくつかの実施形態において１、２、または３個、他の実施形態において１または２個）の水素が、示された基からの選択肢、または当業者に知られた適切な基で置換されていることを意図しているが、但し、示された原子の通常の原子価を超えないこと、および置換により安定な化合物が得られることを条件とする。適切な示された基には、例えば、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチル、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、およびシアノが含まれる。さらに、置換された炭素（または他の）原子に結合できる置換基の非限定的な例には、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＲ’、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｒ’、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、メチレンジオキシ、エチレンジオキシ、Ｎ（Ｒ’）２、ＳＲ’、ＳＯＲ’、ＳＯ２Ｒ’、ＳＯ２Ｎ（Ｒ’）２、ＳＯ３Ｒ’、Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＣＨ２Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｓ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、ＯＣ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）２、（ＣＨ２）０〜２ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ’、Ｎ（Ｒ’）Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｎ（Ｒ’）Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、Ｎ（Ｒ’）Ｎ（Ｒ’）ＣＯＮ（Ｒ’）２、Ｎ（Ｒ’）ＳＯ２Ｒ’、Ｎ（Ｒ’）ＳＯ２Ｎ（Ｒ’）２、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）ＯＲ’、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｒ’、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｒ’、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ’）２、Ｎ（Ｒ’）Ｃ（Ｓ）Ｎ（Ｒ’）２、Ｎ（ＣＯＲ’）ＣＯＲ’、Ｎ（ＯＲ’）Ｒ’、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｒ’）２、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＯＲ’）Ｒ’、またはＣ（＝ＮＯＲ’）Ｒ’が含まれ、式中、Ｒ’は、水素または炭素ベースの部分であり、炭素ベースの部分はそれ自体がさらに置換されてもよい。置換基が、例えばＦまたはＣｌ等の一価である場合、単結合により置換されている原子に結合している。置換基が、二価であるＯ等の一価以上である場合、２つ以上の結合により置換されている原子に結合でき、すなわち、二価の置換基は、二重結合により結合されており；例えば、Ｏで置換されたＣは、カルボニル基、Ｃ＝Ｏを形成し、ここで、ＣおよびＯは二重結合している。代替として、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）、Ｓ（Ｏ）、またはＳ（Ｏ）２等の二価の置換基は、２つの単結合により２つの異なる炭素原子に結合してもよい。例えば、二価の置換基であるＯは、２つの隣接する炭素原子のそれぞれに結合してエポキシド基を提供し得るか、または、Ｏは、隣接または非隣接炭素原子間に架橋エーテル基を形成し得、例えばシクロヘキシル基の１，４−炭素を架橋して［２．２．１］−オキサビシクロ系を形成し得る。さらに、任意の置換基は、（ＣＨ２）ｎまたは（ＣＲ’２）ｎ（式中、ｎは、１、２、３、またはそれ以上であり、各Ｒ’は、独立して選択される）等のリンカーによって炭素または他の原子に結合し得る。
【００２８】
「アルキル」という用語は、例えば１〜２０個の炭素原子、しばしば１〜１２、１〜１０、１〜８、１〜６、または１〜４個の炭素原子を有する分岐または非分岐炭化水素を指す。本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、以下に定義される「シクロアルキル」も包含する。例には、これらに限定されないが、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル（イソプロピル）、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル（イソブチル）、２−ブチル（ｓｅｃ−ブチル）、２−メチル−２−プロピル（ｔ−ブチル）、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、３，３−ジメチル−２−ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル等が含まれる。アルキルは、非置換であってもよく、または例えば以下に記載の置換基で置換されていてもよい。アルキルは、任意選択で部分的または完全に不飽和であってもよい。したがって、アルキル基の列挙は、アルケニル基およびアルキニル基の両方を含むことができる。アルキルは、上記で説明および例示したように、一価の炭化水素ラジカルであってもよく、または二価の炭化水素ラジカル（すなわちアルキレン）であってもよい。
【００２９】
「アリール」という用語は、親芳香環系の単一の炭素原子から少なくとも１個の水素原子を除去することにより得られる芳香族炭化水素基を指す。ラジカル付着部位は、親環系の飽和または不飽和炭素原子にあってもよい。アリール基は、６〜３０個の炭素原子、例えば約６〜１０個の炭素原子を有してもよい。他の実施形態において、アリール基は、６〜６０個の炭素原子、６〜１２０個の炭素原子、または６〜２４０個の炭素原子を有してもよい。アリール基は、単環（例えばフェニル）または複数の縮合（融合）環を有してもよく、少なくとも１つの環は芳香族（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル、またはアントリル）である。典型的なアリール基には、これらに限定されないが、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル等から誘導されるラジカルが含まれる。アリールは、非置換であってもよく、または任意選択で置換されていてもよい。
【００３０】
本明細書に記載の化合物およびポリマーの置換基は、再帰的な程度まで存在し得る。これに関連して、「再帰的置換基」とは、置換基がそれ自体の別のインスタンスを列挙できることを意味する。そのような置換基の再帰的な性質のために、理論的には、所与の請求において多数が存在する可能性がある。有機化学の当業者は、そのような置換基の総数が意図する化合物の所望の特性によって合理的に制限されることを理解している。そのような特性には、限定ではなく例示として、分子量、溶解度またはｌｏｇ  Ｐ等の物理的特性、意図する標的に対する活性等の適用特性、および合成の容易さ等の実用的な特性が含まれる。再帰的置換基は、本発明の意図された態様である。有機化学の当業者は、そのような置換基の汎用性を理解している。本発明の請求項において再帰的置換基が存在する程度まで、ポリマーの例の繰り返し単位の総数は、例えば、約１〜５０、約１〜４０、約１〜３０、約１〜２０、約１〜１０、または約１〜５であってもよい。
【００３１】
「反復単位」、「繰り返し単位」、または「ブロック」という用語は、本明細書で使用される場合、反復的なポリマーの部分を指す。反復単位は、例えば反復単位Ａ、反復単位Ｂ、反復単位Ｃ等とラベル付けされた１つ以上の反復単位を含むことができる。例えば、反復単位Ａ〜Ｃは、共有結合して組み合わされた反復単位を形成し得る。モノマーまたは１つ以上の異なるモノマーの組み合わせを組み合わせて、ポリマーまたはコポリマーの（組み合わされた）反復単位を形成することができる。
【００３２】
本明細書に開示されるコポリマーの「分子量」という用語は、平均数分子量（Ｍｎ）を指す。対応する重量平均分子量（Ｍｗ）は、当業者に知られている方法により（例えば計算により）他の開示されたパラメータから決定され得る。
【００３３】
本明細書に開示されるコポリマーは、ランダム「ｒ」またはブロック「ｂ」コポリマーを含み得る。様々な実施形態において、ポリマーまたはコポリマーの末端（すなわち開始剤末端または終端）は、特に明記しない限り、Ｈ、ＯＨ、ＯＯＨ、ＣＨ２ＯＨ、ＣＮ、ＮＨ２等の低分子量部分（例えば５００Ｄａ未満）、または、アルキル（例えば開始剤末端および終端のブチルもしくは２−シアノプロパ−２−イル部分）、アルケンもしくはアルキン等の炭化水素、またはコポリマー内の最初および／もしくは最後の反復単位での脱離反応の結果としての部分である。
【００３４】
本発明の実施形態
本開示は、
ａ）溶融シリカキャピラリーと；
ｂ）溶融シリカキャピラリーの内面に共有結合した連鎖移動部分を含むコーティングと；
ｃ）連鎖移動部分に共有結合した置換ポリエチレンポリマーであって、ポリマーのポリエチレン単位は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｇで置換され、式中、Ｇは、ＮＲ２またはＯＲであり；Ｒは、Ｈ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、または（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル−Ｎ（Ｒａ）３Ｘであり；各Ｒａは、独立してＨ、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル、またはアリールであり；Ｘは、対イオンである、ポリマーと
を含む、ポリマーコーティング分離キャピラリーであって、
ポリマーコーティング分離キャピラリーは、キャピラリーゾーン電気泳動用に約０．１×１０−６ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１〜約１０×１０−４ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１の電気浸透流を有し、コーティングは、金属およびフリーラジカルスカベンジャーで汚染されていない、
ポリマーコーティング分離キャピラリーの様々な実施形態を提供する。
【００３５】
追加の実施形態において、請求項１に記載の分離キャピラリーで、電気浸透流（ＥＯＦ）が、約１×１０−６ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１〜約１０×１０−６ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１であるキャピラリー。他の実施形態において、ＥＯＦは、０．１×１０−７ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１〜約１０×１０−７ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１、０．１×１０−６ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１〜約１０×１０−６ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１、０．１×１０−５ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１〜約１０×１０−５ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１、０．１×１０−４ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１〜約１０×１０−４ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１である。
【００３６】
他の実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｇは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２である。他の実施形態において、−Ｃ（＝Ｏ）Ｇは、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３Ｘである。さらに他の実施形態において、ポリマーは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ２置換エチレン単位および−−Ｃ（＝Ｏ）ＯＣＨ２Ｎ（ＣＨ３）３置換エチレン単位のランダムポリマーまたはブロックコポリマーを含む。追加の実施形態において、分離キャピラリーは約２００，０００から約８００，０００の理論段を含む。他の実施形態において、理論段の数は、約２００，０００〜約３００，０００、約３００，０００〜約４００，０００、約４００，０００〜約５００，０００、約５００，０００〜約６００，０００、約７００，０００〜約８００，０００、約８００，０００〜約１．０００，０００である。
【００３７】
様々な実施形態において、連鎖移動部分は、−ＳｉＪ２（ＣＨ２）３ＳＣ（＝Ｓ）Ｓ−（各Ｊは、独立してＨ、Ｇ、もしくはハロである）、または他の連鎖移動剤、例えば、これらに限定されないが、−−ＳＣ（＝Ｓ）Ｓ−を含む連鎖移動剤を含む。追加の実施形態において、分離キャピラリーは、約２００，０００〜約８００，０００の理論段を含み、電気浸透流は、約１×１０−６ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１〜約１０×１０−６ｃｍ２Ｖ−１ｓ−１であり、−Ｃ（＝Ｏ）Ｇは、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２である。さらに他の実施形態において、Ｒは、Ｈである。
【００３８】
本開示は、本開示は、コーティングが、式Ｉまたは式ＩＩ：
【化２】
2020517453.tif 000004
のポリマーを含み、
式中、
Ｊは、メトキシ、エトキシまたはハロであり；
Ｘはハロであり；
Ｅは、Ｈ、アリール、アルキル、シアノであり；
ｎは０〜１０，０００であり；
ｍは０〜１０，０００であり、ｎおよびｍの両方が０となることはできない、
ポリマーコーティング分離キャピラリーの様々な実施形態を提供する。
【００３９】
様々な実施形態において、式Ｉまたは式ＩＩの記号ｂは、ｎおよびｍがそれぞれ１より大きい場合、式Ｉまたは式ＩＩがブロックコポリマーであることを示す。他の実施形態において、ｎは、０〜１０００、１〜５００、または５００〜２０００である。さらに他の実施形態において、ｍは、０〜１０００、１〜５００、または５００〜２０００である。
【００４０】
本開示はさらに、上述のポリマーコーティング分離キャピラリーを製造する方法であって、
ａ）溶融シリカキャピラリーの内面を連鎖移動試薬と接触させて、溶融シリカキャピラリーの共有結合改質内面を提供するステップと；
ｂ）改質内面を、ラジカル開始剤、置換ビニルモノマー、および任意選択の第２のモノマーの水性混合物と接触させるステップと；
ｃ）混合物を加熱または照射することにより、リビングラジカル重合を開始させるステップと
を含み、それによりポリマーコーティング分離キャピラリーを製造する方法を提供する。
【００４１】
追加の実施形態において、水性混合物は、緩衝剤を含む。他の実施形態において、ラジカル開始剤の濃度は、約１０−５モル〜約１０−４モルである。さらに他の実施形態において、ラジカル開始剤の濃度は、約１０−６モル〜約１０−５モル、約１０−５モル〜約１０−３モル、または約１０−４モル〜約１０−３モルである。他の実施形態において、置換ビニルモノマーの濃度は、約０．１モル〜約２モルである。
【００４２】
様々な実施形態において、ポリマーコーティング分離キャピラリーは、中性電荷を有する。追加の実施形態において、ポリマーコーティング分離キャピラリーは、正に帯電している。さらに他の実施形態において、ポリマーコーティング分離キャピラリーは、負に帯電している。
【００４３】
いくつかの実施形態において、分離キャピラリーは、置換ビニルモノマーおよび第２のモノマーを含む。他の実施形態において、第２のモノマーもまた置換ビニルモノマーである。他の実施形態において、ラジカル開始剤は、ハロゲン分子、アゾ化合物、有機過酸化物、または無機過酸化物を含む。
【００４４】
様々な追加の実施形態において、ポリマーコーティング分離キャピラリーの内面は、ブロックコポリマーでコーティングされている。他の実施形態において、置換ビニルモノマーは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｇで置換され、任意選択の第２のモノマーは、−Ｃ（＝Ｏ）Ｇで置換されている。さらなる実施形態において、置換ビニルモノマーまたは任意選択の第２のモノマーは、上記の置換基で置換されており、２つ以上の置換基を有してもよい。上記の方法の他の様々な実施形態において、ポリマーコーティング分離キャピラリーにおけるリビングラジカル重合は、第２のモノマーでステップｂ）およびｃ）を繰り返すことにより再開される。いくつかの他の実施形態において、混合物を加熱することによりリビングラジカル重合を開始するステップは、室温より少し上の加熱温度で行われる。他の実施形態において、加熱温度は、約０℃〜約４００℃、約２０℃〜約８０℃、約５０℃〜約１００℃、約５０℃〜約１５０℃、約８０℃〜約２００℃、または約１２０℃〜約３００℃である。いくつかの他の実施形態において、混合物を照射することによりリビングラジカル重合を開始するステップは、電磁スペクトルの可視領域の波長で行われる。
【００４５】
本開示は、さらに、式ＩＡまたは式ＩＩＡ：
【化３】
2020517453.tif 000005
のポリマーでコーティングされた内面を含み、
式中、
Ｘはハロであり；
ｎは０〜１０，０００であり；
ｍは０〜１０，０００であり、ｎおよびｍの両方が０となることはできない、
ポリマーコーティング分離キャピラリーの様々な実施形態を提供する。
【００４６】
様々な実施形態において、式ＩＡまたは式ＩＩＡの記号ｂは、ｎおよびｍがそれぞれ１より大きい場合、式ＩＡまたは式ＩＩＡがブロックコポリマーであることを示す。
【００４７】
他の様々な実施形態において、ポリマーコーティング分離キャピラリーは、少なくとも１００時間の連続操作の間、少なくとも５，０００個の同定可能なペプチドのキャピラリーゾーン電気泳動（ＣＺＥ）により再現可能な分離を行う。他の実施形態において、ポリマーコーティング分離キャピラリーは、約５，０００〜約５０，０００個、約７，５００〜約１５，０００個、約１０，０００〜約２０，０００個、または約１５，０００〜約３０，０００個の同定可能なペプチドのＣＺＥによる再現可能な分離を行う。他の実施形態において、ポリマーコーティング分離キャピラリーは、約１００時間〜約１００，０００時間の連続運転、約２００時間〜約５００時間、または約１０００時間〜約１０，０００時間の連続運転で再現性よく機能する、または安定である。
【００４８】
本開示は、体積、質量、パーセンテージ、比率等の変数の範囲、制限、および偏差を提供する。「数値１」から「数値２」等の範囲は、整数および小数を含む数の連続した範囲を意味することが、当業者には理解される。例えば、１〜１０は１、２、３、４、５、・・・９、１０を意味する。これはまた、１．０、１．１、１．２、１．３、・・・９．８、９．９、１０．０を意味し、また１．０１、１．０２、１．０３等も意味する。開示された変数が「数値１０」未満の数である場合、これは、上記のように、数値１０未満の整数および小数を含む連続範囲を意味する。同様に、開示された変数が「数値１０」より大きい数である場合、これは、数値１０を超える整数および小数を含む連続範囲を意味する。これらの範囲は、「約」という用語によって修飾され得、その意味は上記で説明されている。
【００４９】
結果および考察
表面限定型水性可逆的付加開裂移動（ＳＣＡＲＦＴ）重合法によるコーティングキャピラリーの調製
ＳＣＡＲＡＦＴ法によるＬＰＡコーティングキャピラリーの調製の概略図を図１に示す。溶融シリカキャピラリー（内径５０μｍ×外径１５０μｍ）を、０．１Ｍ  ＮａＯＨで２時間洗浄し、流出液が約ｐＨ７．０に達するまで水で洗浄し、０．１Ｍ  ＨＣｌで１２時間洗浄し、流出液が約ｐＨ７．０に達するまで再度水で洗浄することにより前処理した。最後に、キャピラリーを窒素流で室温で一晩乾燥させた。次いで、キャピラリーに５０％シアノメチル［３−（トリメトキシシリル）プロピル］トリチオカーボナートのＭｅＯＨ（ｖ／ｖ）溶液を充填し、４５℃の水浴で１２時間インキュベートした。次いで、キャピラリーをＭｅＯＨで濯ぎ、残留試薬を洗い流し、窒素流で乾燥させた。この時点で、キャピラリーの内壁は、シアノメチル［３−（トリメトキシシリル）プロピル］トリチオカーボナートの層によって修飾されたが、これは、その後ＳＣＡＲＡＦＴ重合反応中にポリマーを壁に付着させるための連鎖移動剤である。キャピラリーのコーティングには、報告からの修正された方法を使用した（Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１１、３２、９５８）。酢酸緩衝液（ｐＨ５．２、０．２７Ｍ酢酸、０．７３Ｍ酢酸ナトリウム）中でアクリルアミド（０．５６Ｍ）および４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（５．４２×１０−４Ｍ）を室温で混合し、窒素下で約１０分間攪拌して均一な溶液を形成することにより、予備重合可能な混合物を調製した。次いで、混合物を前処理されたキャピラリーに導入し、６０℃で様々な反応時間インキュベートした。コーティングキャピラリーをＭｅＯＨで洗浄してキャピラリー内の残留物を除去し、ＣＺＥ分析の前にバックグラウンド電解質で調整した。
【００５０】
濃度の影響
モノマー濃度、開始剤濃度、反応時間は、コーティングプロセスに影響する。一般に、モノマーおよび開始剤の濃度を増加させると、コーティングの厚さが増加し、必要な反応時間が減少する。最適化実験のために、開始剤濃度を２．１７×１０−５Ｍ、反応時間を２１時間に維持し、異なるモノマー濃度でコーティングキャピラリーを調製した。ＥＯＦは、モノマー濃度が０．３９Ｍから０．５６Ｍに増加したときに、２．４×１０−５ｃｍ２・Ｖ−１・ｓ−１から８．６２×１０−６ｃｍ２・Ｖ−１・ｓ−１（Ｎ＝２、ＲＳＤ＝０．９％）に減少した。０．３９Ｍモノマーで調製されたコーティングキャピラリーを使用して、５０ｎｇの大腸菌消化物から３９０のタンパク質群および１，９２３のペプチドが同定された。一方、０．５６Ｍモノマーで調製されたコーティングキャピラリーを使用して、５０ｎｇの大腸菌消化物から５２５のタンパク質群および２，７４２のペプチドが同定された。同定されたタンパク質群およびペプチドは、例に列挙されている。モノマー濃度を増加させると、モノマー間のフリーラジカル重合が増加し、キャピラリーが詰まる可能性がある。したがって、その後の試験では、０．５６Ｍのモノマー濃度を使用した。
【００５１】
コーティングに対する開始剤濃度の影響も試験した。モノマー濃度（０．５６Ｍ）を変化させずに、様々な開始剤濃度でキャピラリーを調製した。開始剤濃度が２．１７×１０−５Ｍ未満の場合、コーティングを完了するために２１時間以上が必要であった。開始剤濃度が２．１７×１０−３Ｍよりはるかに高いと、溶液中のモノマー間でフリーラジカル重合反応が生じ、２１時間後にキャピラリーが詰まった。実験結果に基づき、５．４２×１０−４Ｍの開始剤濃度を我々の研究に使用した。
【００５２】
また、コーティング時間に対する反応時間の影響も調査した。キャピラリーを、０．５６Ｍのアクリルアミドおよび５．４２×１０−４Ｍの開始剤でコーティングした。ＥＯＦは、重合時間が３時間（６．１×１０−６ｃｍ２・Ｖ−１・ｓ−１、Ｎ＝２、ＲＳＤ＝７％）から７時間（４．７×１０−６ｃｍ２・Ｖ−１・ｓ−１、Ｎ＝２、ＲＳＤ＝１３％）に増加しても本質的に変化しなかった。３時間の反応で調製されたコーティングキャピラリーを使用して、５０ｎｇの大腸菌消化物から７３８のタンパク質群および４，０８６のペプチドが同定された。一方、７時間の反応で調製されたコーティングキャピラリーを使用して、５０ｎｇの大腸菌消化物から８１６のタンパク質群および４，０８４のペプチドが同定された。同定されたタンパク質群およびペプチドの情報は、例に列挙されている。
【００５３】
Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計を用いて５０ｎｇの大腸菌消化物のボトムアッププロテオミクス用にＳＣＡＲＡＦＴコーティングキャピラリーで得られた結果は、１００ｎｇの試料投入量の市販のＬＰＡコーティングキャピラリーおよび同じ質量分析計を使用した以前の報告よりもはるかに優れている。
【００５４】
ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法との比較
ＳＣＡＲＦＴコーティングキャピラリーを用いたＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを、大腸菌消化物を用いたＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計を使用して、ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳと比較した。大腸菌消化物を逆相Ｃ１８分析カラムに投入した後、９０分の勾配ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析を行った（図６）。ＵＰＬＣおよびＣＺＥ法で同定されたペプチドおよびタンパク質群のベン図を図２に示す。ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ法を使用して、５０ｎｇの大腸菌消化物で８８０のタンパク質群および４，７２７の固有のペプチドが同定された。上記のように、同様の実験条件下でＳＣＡＲＦＴコーティングキャピラリーでＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳを使用することにより、５０ｎｇの大腸菌消化物から８１６のタンパク質群および４０８４のペプチドが同定された。同定されたタンパク質群およびペプチドの情報は、例に列挙されている。ＵＰＬＣ法で同定されたタンパク質群の７６％およびペプチドの５２％は、ＣＺＥ法でも同定された。しかしながら、ＣＺＥ法によって同定されたタンパク質群の１８％およびペプチドの４０％は、ＵＰＬＣ法によって識別されなかった。結果は、ＣＺＥおよびＵＰＬＣが相補的なペプチドレベルの同定を提供したことを示している。
【００５５】
再現性
ＳＣＡＲＡＦＴ法を使用して、２つのＬＰＡコーティングキャピラリーを調製した。これらのキャピラリーの電気浸透移動度の平均および標準偏差は、２．８±０．３×１０−６ｃｍ２・Ｖ−１・ｓ−１（Ｎ＝２）であったが、これは市販のＬＰＡコーティングキャピラリー（２．５×１０−５ｃｍ２・Ｖ−１・ｓ−１）よりほぼ１桁低い。μＥＯＦ測定の検出器トレースを図７に示した。
【００５６】
プロテオミクス分析の再現性は、これらのキャピラリーのうち２つをシングルショットボトムアッププロテオミクス用のＱ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計で使用して評価した。第１のキャピラリーで５０ｎｇの大腸菌消化物から９９０のタンパク質群および５，５１４のペプチドが同定され、第２のキャピラリーで９６４のタンパク質群および５，７０３のペプチドが同定された。これらの同定数は、市販のＬＰＡコーティングキャピラリーおよびＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ質量分析計を用いたシングルショットＣＺＥ分析を使用した、約２５０ｎｇの大腸菌消化物から報告された結果（９５６のタンパク質群および４，７４１のペプチド）よりも大幅に優れている。同定されたタンパク質群およびペプチドは、例に列挙されている。
【００５７】
長期安定性試験
アフリカツメガエル消化物を、２０１．７時間（８．４日間）の連続分離の間１００分毎に圧力により注入し、アフリカツメガエル消化物の１２１の連続した分離物を生成した。代表的なベースピーク電気泳動図を図８に示す。任意に選択された６つのｍ／ｚ値（ｍ／ｚ＝５４２．３、５６６．１、５７７．６、６５２．６、７０３．６、および７２２．２）で選択されたイオン電気泳動図が生成され、平均移動時間は２７〜８９分の範囲であった。選択されたイオン電気泳動図を、移動時間およびピーク幅を推定するための非線形最小二乗ルーチンを使用してガウス関数にフィッティングした。移動時間の相対標準偏差は、２．０〜３．０％の範囲であった。この変動は、部屋の温度の変動に支配され得、水の粘度、ひいては電気泳動および電気浸透移動度は、１℃当たり約２．５％減少する。ピーク幅は移動時間と共にほぼ直線的に増加し（ｒ＝０．９１、ｎ＝７４４）、６つのｍ／ｚ値で生成された選択されたイオン電気泳動図の理論段数の中央値は、２４０，０００〜６００，０００の範囲であった。
【００５８】
分離中のキャリーオーバーをチェックするために、２５ｎＬの１Ｍ  ＨＡｃを注入することにより、アフリカツメガエル消化物の１２１回目の分離後にブランク分析を行った。基本ピークの電気泳動図を図８に示す。無視できるキャリーオーバーが観察された。
【００５９】
ＨｅＬａ消化物の分析
ＨｅＬａ消化物の分析には、ＳＣＡＲＡＦＴコーティングキャピラリーおよびＱ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計を使用した。２５ｎｇのＨｅＬａ消化物で２，１５８のタンパク質群および１０，００５のペプチドが同定された。同定されたタンパク質群およびペプチドは、例に列挙されている。代表的な電気泳動図を図３に示す。これらの同定数は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ質量分析計を使用したこの群の以前の報告と類似しているが、現在使用している試料量は１６分の１である。同定されたペプチドのｐＩ分布を図４に示す。
【００６０】
ＳＣＡＲＡＦＴコーティングキャピラリーの改善された性能は、非常に低いＥＯＦによるものであり、市販のコーティングＬＰＡキャピラリーの使用と比較して分離ウィンドウが２倍になった。さらに、ＳＣＡＲＡＦＴコーティングキャピラリーはより均質であり、試料の損失が少なくなるため、少量の試料の分析が容易になると考えられる。ＨｅＬａペプチドの累積移動時間分布を図９に示す。分析時間は２００分であったが、ペプチドのほとんど（＞９６％）は１２０分以内に移動した。さらに、ペプチドの移動時間対ｐＩを図１０に示す。１００分後に移動したペプチドのほとんどはｐＩ＜６であるが、これは、低ｐＩのペプチドが低電荷を有し、ゆっくりと移動するためである。
【００６１】
最後に、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェアバージョン１．４のｐｈｏｓｐｈｏＲＳ  ３．０を使用して、ＨｅＬａペプチドのリン酸化を調査した。１５３のリン酸化部位（９５％を超えるｐｈｏｓｐｈｏＲＳ部位確率）および１６３のホスホペプチドが同定された。リン酸化部位およびホスホペプチドの適度な数は、それらの低い存在量によるものであり、分析の前にチタン（ＩＶ）イオンアフィニティクロマトグラフィーまたは他の形態の濃縮を使用することで濃縮後に結果を間違いなく改善することができた。ホスホペプチドの移動時間分布を図１１に示す。予想通り、同定されたホスホペプチドの９６％超が、負に帯電したリン酸化部位に起因して６０分後に移動した。ホスホペプチドのｐＩ分布を図１２に示すが、それらのほとんど（＞８０％）は７未満のｐＩを有する。
【００６２】
ＳＣＡＲＡＦＴ法による正電荷キャピラリーの調製
ＳＣＡＲＡＦＴ法を使用して、正電荷コーティングキャピラリーを調製した。アノードＥＯＦは、５．６３×１０−４ｃｍ２・Ｖ−１・ｓ−１（Ｎ＝３、ＲＳＤ＝０．７６％）であった。逆方向および強力なＥＯＦにより、コーティングプロセスの成功が確認された。４つのタンパク質の混合物がカチオン性キャピラリーで分離された（図５（Ａ））。
【００６３】
ＥＯＦが高いため、分離ウィンドウが短くなった。その結果、５０ｎｇの大腸菌消化物の分析から３９０のタンパク質群および１６０４のペプチドのみが同定された。同定されたタンパク質群およびペプチドは、例でさらに説明される。
【００６４】
ブロックコポリマーコーティングの調製
ＳＣＡＲＡＦＴ法を使用して調製したコーティングのリビング特性を証明するために、ブロックポリマーコーティングを調製した。第１のコーティング（ＬＰＡコーティング）プロセス後、カソードＥＯＦは２．４２×１０−６ｃｍ２・Ｖ−１・ｓ−１であった。しかしながら、ＥＯＦは、第２のコーティング（正帯電コーティング）プロセスの後、５．４６×１０−４ｃｍ２・Ｖ−１・ｓ−１のアノードＥＯＦに反転した。逆方向のＥＯＦにより、ブロックコポリマーコーティングの調製の成功、およびＳＣＡＲＡＦＴ法を使用して調製されたコーティングのリビング特性が確認された。４つのタンパク質混合物の分離を、図５（Ｂ）に示す。
【００６５】
ミオグロビン、リボヌクレアーゼＡ、およびリゾチームの移動時間のＲＤＳを表１に示す。ブロックコポリマーコーティングキャピラリーによって生成される移動時間の再現性は、直接正電荷コーティングによって生成されるものよりも２倍超優れている。
【００６６】
ブロックポリマーコーティングキャピラリーを使用して、５０ｎｇの大腸菌消化物から３５５のタンパク質群および１，４８３のペプチドが同定されたが、これは直接正電荷コーティングと同様である。同定されたタンパク質群およびペプチド情報は、例でさらに説明される。
【表１】
2020517453.tif 000006
【００６７】
結論
キャピラリーをコーティングするための表面限定型水性可逆的付加開裂連鎖移動（ＳＣＡＲＡＦＴ）重合反応に基づく汎用的な方法が開発された。重合反応は主に、溶液中ではなく最適化された条件下でキャピラリーの内面上で生じ、これは、目詰まりの可能性を防ぎ、コーティングの均質性を大幅に改善する。コーティングキャピラリーのＥＯＦは、市販のＬＰＡコーティングキャピラリーのＥＯＦよりもおおよそ１桁低くなる。ＥＯＦが非常に低いため、分離ウィンドウが長くなり、ボトムアッププロテオミクス分析の性能が改善される。重合混合物中の機能性ビニルモノマーを単に置き換えることにより、様々な種類のコーティングを調製することができた。ＳＣＡＲＡＦＴ重合反応により調製されたコーティングのリビング特性を利用することにより、ブロックコポリマーに基づくキャピラリーコーティングの調製が容易になる。これらのブロックコポリマーは、ＣＺＥ分離性能を改善し、その用途範囲を拡大する大きな可能性を有する。
【実施例】
【００６８】
以下の例は、上記の発明を説明することを意図しており、その範囲を狭めるものとして解釈されるべきではない。例は本発明が実施され得る多くの他の様式を示唆することが、当業者には容易に認識されるであろう。本発明の範囲内にとどまりながら、多数の変形および修正が行われてもよいことを理解されたい。
【００６９】
例１  低電気浸透流ポリマーコーティング
試薬および化学物質。ギ酸（ＦＡ）、酢酸（ＨＡｃ）、アクリルアミド、［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリド溶液（Ｈ２Ｏ中８０重量％）、４，４−アゾビス（４−シアノ吉草酸）、シアノメチル［３−（トリメトキシシリル）プロピル］トリチオカーボナート、酢酸アンモニウム、ウシ膵臓ＴＰＣＫ処理トリプシン、ベンジルアルコール、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）、およびヨードアセトアミド（ＩＡＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＵＳＡ）から購入した。Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＨｅＬａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔ  Ｓｔａｎｄａｒｄは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｈａｎｏｖｅｒ  Ｐａｒｋ、ＵＳＡ）から購入した。メタノールは、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ  Ｂｕｒｄｉｃｋ＆Ｊａｃｋｓｏｎ（Ｗｉｃｋｌｏｗ、アイルランド）から購入した。コーティングされていない溶融シリカキャピラリー（内径５０μｍ×外径１５０μｍ）は、Ｐｏｌｙｍｉｃｒｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｐｈｏｅｎｉｘ、ＡＺ）から購入した。水は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＯＨ）のＮａｎｏ  Ｐｕｒｅシステムで脱イオン化した。
【００７０】
ＳＣＡＲＡＦＴ法による正電荷キャピラリーの調製。アクリルアミドを０．５６Ｍの［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリドで置き換えることにより、ＳＣＡＲＡＦＴ法を使用して正電荷を有するコーティングキャピラリーを調製した。
【００７１】
ブロックコポリマーコーティングの調製。まず、ＬＰＡコーティングを上述のＳＣＡＲＡＦＴ法を使用して調製した。次いで、アクリルアミドを０．５６Ｍの［２−（メタクリロイルオキシ）エチル］トリメチルアンモニウムクロリドで置き換えることにより、ＳＣＡＲＡＦＴ法を使用してＬＰＡコーティング上に正電荷コーティングを調製した。
【００７２】
ＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析。ＣＺＥシステムは、２つの高電圧電源（Ｓｐｅｌｌｍａｎ  ＣＺＥ  １０００Ｒ）、およびＣＺＥ分離キャピラリーを質量分析計に結合する界面動電ポンプナノスプレーインターフェースからなっていた。エレクトロスプレーエミッタは、Ｓｕｔｔｅｒ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｐ−１０００フレーミング／ブラウンマイクロピペットプラーで引っ張られたホウケイ酸ガラスキャピラリー（外径１．０ｍｍ×内径０．７５ｍｍ、長さ１０ｃｍ）で作製され、エミッタ開口部のサイズは１５〜２０μｍであった。エレクトロスプレーシース電解質は、０．５％ＦＡを含む１０％（ｖ／ｖ）メタノールであった。バックグラウンド電解質は、水中の１Ｍ  ＨＡｃであった。試料は窒素圧によって注入した。キャピラリーの注入端に分離電圧を印加した。エレクトロスプレーのためにシースフローリザーバーに１．６ｋＶを印加した。電圧プログラミングは、ＬａｂＶｉｅｗソフトウェアによって制御した。質量分析計の操作パラメータは、以下で説明される。
【００７３】
ＥＯＦの測定。ＥＯＦの測定に使用した方法は、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＶｉｇｎによって報告された方法（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６、６８、１１７４）にわずかな変更を加えたものと同様であった。
【００７４】
大腸菌試料の調製。大腸菌試料の調製に使用した方法は、以下で説明される。
【００７５】
アフリカツメガエル試料の調製。アフリカツメガエル試料の調製に使用した方法は、以下で説明される。
【００７６】
長期安定性試験。内径５０μｍ×外径１５０μｍ×１００ｃｍのＬＰＡコーティングキャピラリーの長期安定性を、３０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３に溶解した２ｍｇ／ｍＬのアフリカツメガエルタンパク質消化物を使用して評価した。ＬＴＱ  ＸＬ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に結合されたＰｒｉｎＣＥ  Ｎｅｘｔ  ８４０  Ｓｅｒｉｅｓオートサンプラー（ＰｒｉｎＣＥ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を使用して、アフリカツメガエル消化物の１２１回の連続分離とそれに続くブランク注入を行った。この分析では、２５ｎＬの試料を２０１．７時間（８．４日間）の連続分離の間１００分毎に圧力により注入した。注入の間に濯ぎまたは再生ステップは行わなかった。
【００７７】
ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析。ペプチドの分離および同定のために、ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  １３０  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ、１００μｍ×１００ｍｍ、１．７μｍ）を搭載したｎａｎｏＡＣＱＵＩＴＹ  ＵｌｔｒａＰｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ＬＣＨ（ＵＰＬＣＨ）システム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）を、ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に結合した。緩衝剤Ａ（水中０．１％ＦＡ）および緩衝剤Ｂ（ＡＣＮ中０．１％ＦＡ）を、勾配分離の移動相として使用した。ペプチドは、市販のＣ１８逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ、１００μｍ×１００ｍｍ、１．７μｍ粒子、ＢＥＨ１３０Ｃ１８、カラム温度４０℃）に自動的に投入され、１μＬ／分の流量で１０分間２％緩衝剤Ｂで洗浄され、次いで、１０〜１１分、２〜８％Ｂ；１１〜７１分、８〜３０％Ｂ；７１〜７２分、３０〜８０％Ｂ；７２〜７７分、８０％Ｂ；７７〜７８分、８０〜２％Ｂ；７８〜９０分、２％Ｂの勾配が続いた。Ｃ１８カラムから溶出したペプチドは、エレクトロスプレー用のキャピラリーチップにポンプで送られた。ＭＳパラメータは、ＣＺＥ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ分析に使用したものと同じであった。
【００７８】
質量分析計の操作パラメータ。ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、コーティング条件を最適化し、ＣＺＥ法およびＵＰＬＣ法を比較した。エレクトロスプレー電圧は１．６ｋＶであり、イオン移動管の温度は３００℃に維持した。Ｓ−レンズのＲＦレベルは５０．００であった。質量分析計は、データ依存モードでプログラムされた。Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器で、ｍ／ｚ  ３８０〜１８００の範囲にわたり３０，０００（ｍ／ｚ  ４００）の分解能でフルＭＳスキャンを取得し、マイクロスキャンの数を１に設定した。目標値は１．００Ｅ＋０６で、最大注入時間は５００ミリ秒であった。ＭＳ／ＭＳスキャンの場合、電荷状態が２以上の２０個の最も強いピークが連続的に分離され、１回のフルＭＳスキャンに続く衝突誘起解離モードでさらに断片化された。正規化された衝突エネルギーは３５％であった。
【００７９】
Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、コーティング法の再現性を評価し、ＨｅＬａ消化物の分析を行った。質量分析計は、データ依存モードでプログラムされた。トップ２０法が使用された。ＳレンズのＲＦレベルを６０に設定し、キャピラリーを３００℃に加熱した。フルスキャン解像度は、ｍ／ｚ  ２００で６０，０００に設定した。フルスキャン目標は３．００Ｅ＋０６で、最大充填時間は５０ミリ秒であった。質量範囲はｍ／ｚ  ３５０〜１，８００に設定した。フラグメントスキャンの目標値は１．００Ｅ＋０５に設定し、強度の閾値は１．００Ｅ＋０５に維持した。分離幅は１．４Ｔｈに設定した。１００の固定された最初の質量を使用した。正規化された衝突エネルギーは２８に設定した。タンパク質混合物を無傷モードで分析した。Ｏｒｂｉｔｒａｐでｍ／ｚ  ６００〜２０００にわたりフルＭＳスキャンを取得した。電荷状態≧５の３つの最も強いピークが、開裂のためにデータ依存的様式で選択された。ＭＳ１のＡＧＣ目標値は１．００Ｅ＋０６で、最大注入時間は１００ミリ秒であったが、ＭＳ２スキャンのＡＧＣ目標値は５．００Ｅ＋０５で、最大注入時間は２００ミリ秒である。ＭＳ１およびＭＳ２スキャンでは、それぞれ７回および３回のマイクロスキャンを使用した。選択された各前駆体のモノアイソトピックピークの周囲に５秒間、±１０ｐｐｍの除外ウィンドウが構築された。他のパラメータは上記と同じであった。
【００８０】
ＬＴＱ  ＸＬ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、ＬＰＡコーティングキャピラリーの長期安定性を評価した。フルＭＳスキャンを、３８０〜１８００ｍ／ｚの範囲で取得した。
【００８１】
データベース検索。生ファイルのデータベース検索は、ＭＡＳＣＯＴ  ２．５を使用したＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ  １．４で行った。大腸菌およびホモサピエンスとしての分類を有するＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースを、それぞれ大腸菌細胞溶解物およびＨｅＬａ細胞株プロテオーム消化物のデータベースとして使用した。誤検出率を評価するために、反転したデータベースのデータベース検索も行った。データベース検索パラメータには完全トリプシン分解が含まれ、最大２つの切断ミスを許容し、前駆体質量許容値は１０ｐｐｍに設定され、フラグメントの質量許容値は、ＬＴＱ−Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ質量分析計で得られたデータに対して０．５Ｄａ、Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ機器で得られたデータに対して０．０５Ｄａであった。カルバミドメチル化（Ｃ）を固定修飾として設定した。酸化（Ｍ）および脱アミド化（ＮＱ）を可変の修飾として設定した。ペプチドレベルでは、ペプチド同定のフィルタリングに高いペプチド信頼値が使用され、ペプチドレベルでの対応する誤検出率は１％未満であった。タンパク質レベルでは、タンパク質のグループ化を有効とした。
【００８２】
例２  試料調製
大腸菌試料の調製。固体溶原ブロス（ＬＢ）を使用して、大腸菌培養用の寒天プレートを作製した。３００ｍＬの脱イオン水に３ｇのＮａＣｌ、３ｇのトリプトン、１．５ｇの酵母エキス、および６ｇの寒天を溶解することにより、固体ＬＢを調製した。液体ＬＢ培地（寒天なし）も、１Ｌの脱イオン水に１０ｇのＮａＣｌ、１０ｇのトリプトン、および５ｇの酵母エキスを混合することにより、大腸菌培養用に調製した。全ての培地、プレート、ならびに他の器具およびフラスコは、使用前にオートクレーブ処理した。大腸菌の凍結培養物（Ｄｈ５−アルファ）を解凍し、調製した寒天プレートに播種した。３７℃で２４時間インキュベートした後、単一コロニーを分離し、４ｍＬの液体ＬＢ培地を含むチューブで増殖させ、３７℃で一晩、シェーカーでインキュベートした。チューブの内容物が不透明になったら、液体培地を新しいフラスコに移し、３７℃で一晩振盪した。大腸菌を含む液体ＬＢ培地を遠心分離し、得られた大腸菌ペレットをリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した。次いで、プロテアーゼ阻害剤を添加した８Ｍの尿素および１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）緩衝液に大腸菌ペレットを懸濁させ、細胞溶解のために氷上で１５分間超音波処理した。溶解物を１８０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。タンパク質濃度は、ＢＣＡ法により測定した。タンパク質のアリコート（９００μｇ）を冷アセトンで−２０℃で一晩沈殿させた。遠心分離後、ペレットを再び冷アセトンで洗浄した。得られたタンパク質ペレットを室温で乾燥させた。
【００８３】
８Ｍの尿素を含む１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８）１００μＬに乾燥した大腸菌タンパク質（１２０μｇ）を溶解し、３７℃で１時間変性させた。１０μＬの１Ｍ  ＤＴＴを加えた後、混合物を３７℃で１時間インキュベートして、ジスルフィド結合を低減した。続いて、２０μＬの２Ｍ  ＩＡＡを混合物に加え、室温で３０分間暗所でインキュベートした。次いで、１００ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３（ｐＨ８）９００μＬを加え、尿素の濃度を１Ｍ未満に低減した。最後に、３７℃で１６時間、トリプシン／タンパク質比１／２５（ｗ／ｗ）でのトリプシンとのインキュベーションによって、処理したタンパク質を消化した。消化物を１０％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）で酸性化し、反応を停止させた。トリプシン消化物をＣ１８  ＳｅｐＰａｋカラム（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）で脱塩し、続いて真空濃縮器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｍａｒｉｅｔｔａ、ＯＨ）で凍結乾燥した。乾燥タンパク質消化物を５０ｍＭのＦＡに溶解した。
【００８４】
アフリカツメガエル試料の調製。動物に対する手順は全て、ノートルダム大学施設動物管理・使用委員会（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｒｅ  Ｄａｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）によって承認されたプロトコルに従って行われた。３２細胞期のアフリカツメガエルの卵（合計２０個の卵）をエッペンドルフチューブに収集した。卵培養緩衝液を除去した後、５００μＬの哺乳動物細胞−ＰＥ  ＬＢ緩衝液および完全プロテアーゼ阻害剤をエッペンドルフチューブにすぐに加え、１分間ボルテックスして卵を予備溶解した。次いで、卵をＰｏｗｅｒＧｅｎ  Ｍｏｄｅｌ  １２５ホモジナイザ（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により氷上で２分間ホモジナイズし、Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｂａｔａｖｉａ、ＩＬ）で氷上でさらに２０分間（５分×４）超音波処理して、卵を完全に溶解した。次いで、溶解物を１８０００ｇで２０分間遠心分離し、エッペンドルフチューブ内に３つの層（上層（脂質）、中間層（タンパク質）およびペレット）を得た。最後に、タンパク質層を別のエッペンドルフチューブに移し、タンパク質溶液のごく一部をビシンコニン酸法によるタンパク質濃度測定に供した。２００μｇのタンパク質に分割し、アセトン沈殿を使用して精製した。試料量の６倍の冷アセトンをタンパク質溶液に添加し、混合物を−２０℃で一晩保存した。１８０００ｇで２０分間遠心分離した後、上清を除去し、タンパク質ペレットを再び冷アセトンで洗浄して、溶解緩衝液中の界面活性剤を完全に除去した。再度遠心分離した後、上清を除去し、タンパク質ペレットを約５分間室温でドラフト内に保持して、試料を乾燥させた。試料は、使用するまで−８０℃で保存した。
【００８５】
ＥＯＦの測定。ＥＯＦの測定に使用した方法は、以前に報告されたものにわずかな変更を加えたものと同様である（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．１９９６、６８、１１７４）。まず、キャピラリーに分離緩衝液（１ＭのＨＡｃ）を充填する。次に、中性マーカー、１ＭのＨＡｃで調製されたベンジルアルコールのプラグを、時間ｔｉｎｊのキャピラリーに注入する（バンドＮ１）。次いで、時間ｔｔｒの間圧力下で分離緩衝液のプラグをキャピラリーに投入する。第二に、中性マーカー溶液の別のバンド（バンドＮ２）を時間ｔｉｎｊの間再び注入する。次いで、キャピラリーがバックグラウンド電解質に切り替えられ、バンドＮ２が時間ｔｔｒの間、注入圧力下でキャピラリーに移動する。第三に、時間ｔｍｉｇｒの間、分離電圧Ｖｓｅｐａｒａｔｉｏｎを印加する。この間、バンドＮ１およびＮ２は、μＥＯＦに等しい移動度のカソード（カソードＥＯフローの場合）に向かって移動する。次いで、Ｖｓｅｐａｒａｔｉｏｎがゼロに戻った後、中性マーカーの第３のプラグを、時間ｔｉｎｊの間、キャピラリー（バンドＮ３）に注入する。最後に、注入圧力がバックグラウンド電解質バイアルに再び加えられ、データ収集が同時に開始されて、３つ全てのバンドの通過が記録される。次いで、μＥＯＦが次のように計算され得る。
【数１】
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式中、ｔＮ１、ｔＮ２、およびｔＮ３は、バンドＮ１、Ｎ２、およびＮ３の観察された移動化時間である。Ｌは、分離キャピラリーの長さである。
【００８６】
開示された実施形態および例を参照して特定の実施形態を上記で説明したが、そのような実施形態は例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものではない。添付の特許請求の範囲で定義されるより広範な態様において、本発明から逸脱することなく、当技術分野における通常の技術に従って変更および修正を行うことができる。
【００８７】
全ての出版物、特許、および特許文書は、参照により個別に組み込まれるのと同等に、参照により本明細書に組み込まれる。本開示と矛盾する制限は、そこから理解されるべきではない。本発明は、様々な特定の好ましい実施形態および技術を参照して説明されてきた。しかしながら、本発明の精神および範囲内にとどまりながら、多くの変形および修正が行われてもよいことを理解されたい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
2020517453.tif 000018
【図８−２】
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【図８−３】
2020517453.tif 000020
【図８−４】
2020517453.tif 000021
【図９】
2020517453.tif 000022
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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