(57)【要約】本発明の対象は天然形のフコイダン多糖、脱硫酸化フコイダンおよびフコースオリゴ糖のレベルまで処理することにより得られる誘導体、好ましくはグリコシド結合によってアルファ結合された単糖フコース単位が２０以下で、平均分子量が３ｋＤａ以下であるが、これに限定されない誘導体にある。本発明の多糖およびオリゴサッカライドは天然かつ安全で、ノロウイルスまたはロタウイルス、サルモネラ種または緑膿菌またはカンピロバクタージェジュニおよびその他のエンテロウイルスおよび細菌性胃腸炎を引き起こす腸内病原体に関連する病状の予防および治療において栄養補助食品として、また、食品製造プロセスで使用される。本発明はさらにフコイダンの脱硫酸化と断片化によって脱硫酸化ポリ−またはオリゴフコースを製造する方法にも関する。
2020537032.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
唯一の構成要素としてフコースの単糖ユニットを含み、その全てがグリコシド結合によってアルファ結合されている、天然のＦ−フコイダン、脱硫酸化Ｆ−フコイダンおよび部分的または完全に脱硫酸化されたオリゴ糖またはその生理学的に許容される塩を含む加工されたＦ−フコイダン。
【請求項２】
オリゴ糖構造または構造要素Ｆｕｃｌ−２Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−３Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−４Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−２Ｆｕｃｌ−３Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−２（Ｆｕｃｌ−４）Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−２（Ｆｕｃｌ−３）Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−３（Ｆｕｃｌ−２）ＦｕｃおよびＦｕｃｌ−２Ｆｕｃｌ−３Ｆｕｃ（Ｆｕｃｌ−４）Ｆｕｃを含む、請求項１に記載の天然Ｆ−フコイダン、脱硫酸化Ｆ−フコイダンおよび部分的または完全に脱硫酸化されたオリゴ糖またはその生理学的に許容される塩を含む加工Ｆ−フコイダン。
【請求項３】
多糖から３ｋＤ以下のオリゴ糖までの全サイズ範囲にわたって抗ウイルス活性を有する、請求項1または２に記載の天然Ｆ−フコイダン、脱硫酸化Ｆ−フコイダンおよび部分的または完全に脱硫酸化したオリゴ糖またはその生理学的に許容される塩を含む加工Ｆ−フコイダン。
【請求項４】
上記の多糖またはオリゴ糖が宿主の上皮ムチンの血液型関連グリカンに結合するノロウイルス／病原体に対する阻害効果を有する請求項1〜３のいずれか一項に記載の天然Ｆ−フコイダン、脱硫酸化Ｆ−フコイダンおよび部分的または完全に脱硫酸化されたオリゴ糖またはそれらの生理学的に許容される塩を含む加工Ｆ−フコイダン。
【請求項５】
感染症を引き起こす病原体、例えばノロウイルスやロタウイルス、サルモネラ属、緑膿菌、カンピロバクタージェジュニに対して上皮胃腸管への血液型Ｈ関連オリゴ糖への病原体の結合を阻害する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の天然のＦ−フコイダン、脱硫酸化Ｆ−フコイダンおよび部分的または完全に脱硫酸化されたオリゴ糖またはそれらの生理学的に許容される塩を含む加工されたＦ−フコイダン。
【請求項６】
血液型に関係ない構造、フコイダンまたはフコイダン由来のオリゴフコースの要素が競合活性を示し、従って、腸内病原性ノロウイルスまたはロタウイルス、サルモネラ属、緑膿菌およびカンピロバクタージェジュニのヒトＨ−およびルイス−ｂ血液型陽性上皮ムチンへの結合に対する競合活性、従って腸病原性ノロウイルスまたはロタウイルス、サルモネラ属、緑膿菌およびカンピロバクタージェジュニの結合に対して阻害効果を示す、請求項１〜５のいずれか一項に記載の天然のＦ−フコイダン、脱硫酸化Ｆ−フコイダンおよび部分的または完全に脱硫酸化されたオリゴ糖またはそれらの生理学的に許容される塩を含む加工されたＦ−フコイダン。
【請求項７】
下記の構造要素：Ｆｕｃｌ−２Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−３Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−４Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−２Ｆｕｃｌ−３Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−２（Ｆｕｃｌ−４）Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−２（Ｆｕｃｌ−３）Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−３（Ｆｕｃｌ−２）ＦｕｃおよびＦｕｃｌ−２Ｆｕｃｌ−３Ｆｕｃ（Ｆｕｃｌ−４）Ｆｕｃを含み且つ
硫酸化の天然状態で活性を示すか、加溶媒分解または部分的な酸加水分解による処理の後に硫酸塩を完全または部分的に損失して活性を示す、脱硫酸化および／または処理されたＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓ、褐藻、海藻、その他の海洋動物または植物から単離された、脱硫酸化および／またはフコイダン多糖類の部分加水分解によって加工された、請求項１〜６のいずれか一項に記載の天然のＦ−フコイダン、脱硫酸化Ｆ−フコイダンおよび部分的または完全に脱硫酸化されたオリゴ糖またはそれらの生理学的に許容される塩を含む加工されたＦ−フコイダン。
【請求項８】
請求項1〜７のいずれか一項に記載の部分的な酸触媒加水分解によってフコイダンから単離された脱硫酸化低分子量オリゴ糖の製造方法であって、上記脱硫酸化が効果的な脱硫酸化が達成できる高温かつ反応時間で無機酸または有機酸で行い、脱硫酸化と同時に２〜２０の単糖ユニットのサイズ範囲のオリゴ糖レベルへ断片化する方法。
【請求項９】
上記脱硫酸化が化学的脱硫酸化／断片化とフコイダナーゼおよびスルファターゼによる酵素処理との組み合わせに依存する加工形態のフコイダンを製造する方法である、請求項1〜７のいずれか一項に記載の部分的な酸触媒加水分解によってフコイダンから単離された脱硫酸化低分子量オリゴ糖を製造する方法。
【請求項１０】
上記脱硫酸化がフコイダナーゼおよびスルファターゼによる酵素処理のみを適用する上記加工形態のフコイダンを製造する方法である、請求項1〜７のいずれか一項に記載のフコイダンから単離された脱硫酸化低分子量オリゴ糖を製造する方法。
【請求項１１】
脱硫酸化／断片化が溶解性の高分子量ポリスチレンスルホン酸を用いた加熱された反応混合物からの透析によって行われ、所定の膜カットオフ以下の低質量のオリゴ糖生成物を連続的に分離する、請求項1〜７のいずれか一項に記載の部分的な酸触媒加水分解によってフコイダンから単離された脱硫酸化低分子量オリゴ糖を製造する方法。
【請求項１２】
上記脱硫酸化が中和された乾燥Ｆ−フコイダンをジメチルスルホキシド／ピリジン５：１２（ｖ：ｖ）で１００℃で９時間、加溶媒分解によって行い、その後に有機化学物質の大規模な透析と乾燥とを行う、請求項1〜７のいずれか一項に記載の脱硫酸化Ｆ−フコイダン多糖の製造方法。
【請求項１３】
ノロウイルスの作用により引き起こされる疾患の予防または治療において食品添加物または食品生産での添加物として使用される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の天然、脱硫酸化および処理されたフコイダンまたはその生理学的に許容される塩。
【請求項１４】
ロタウイルスの作用により引き起こされる疾患の予防または治療において食品添加物または食品生産の添加物としての使用される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の天然、脱硫酸化および処理されたフコイダンまたはその生理学的に許容される塩。
【請求項１５】
サルモネラ菌の作用により引き起こされる疾患の予防または治療において食品添加物または食品生産の添加物としての使用される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の天然、脱硫酸化および処理されたフコイダンまたはその生理学的に許容される塩。
【請求項１６】
シュードモナスの作用により引き起こされる疾患の予防または治療において食品添加物または食品生産の添加物としての使用される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の天然、脱硫酸化および処理されたフコイダンまたはその生理学的に許容される塩。
【請求項１７】
カンピロバクターの作用により引き起こされる疾患の予防または治療において食品添加物または食品生産の添加物として使用される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の天然、脱硫酸化および処理されたフコイダンまたはその生理学的に許容される塩。
【請求項１８】
食品工業用の工業的ファーミンド（農業）における生物の処理に使用される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の天然、脱硫酸化および処理されたフコイダンまたはその生理学的に許容される塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ムチンの血液型グリカン上および哺乳動物の消化管上皮上のムチン型Ｏ-糖タンパク質に結合するノロウイルスまたはロタウイルス、サルモネラ種または緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）またはカンピロバクター ジェジュニ（Campylobacter jejuni）によって引き起こされる胃腸炎、感染症の治療または予防に使用する天然材料（Ｆ−フコイダン）から単離された天然、脱硫酸化および加工フコイダン、脱硫酸化オリゴ糖（desulfated oligosaccharides）またはオリゴフコース（oligo-fucoses）と、その製造方法とに関するものである。本発明はＩＰＣのクラスＡ６１Ｋ  ３１／７０、Ａ６１Ｋ  ３６／００、Ａ６１Ｐ  ３１／１２、Ａ６１Ｐ  ３１／１４、Ａ６１Ｐ  ３１／０４に属する。
【０００２】
本発明が解決しようとする課題は、病原体に対する強力な中和活性を有する安価、安全な天然の組成物を得ることにある。関連するプロセスパラメータを技術的プロセスの全ての段階で適宜選択することによって天然での硫酸化された多糖類（naturally sulfated polysaccharides）、フコイダン（fucoidans）の脱硫（desulfation）を完全に実行することができ、それによって完全または部分的に脱硫酸化されたフコイダンおよび多糖類断片（fragment）を得ることができる。そうして得られた脱硫酸化／処理済みフコイダン（desulfated/processed fucoida）は予想外の強力な抗ウイルス活性と抗菌治療活性とを示す。天然のＦ−フコイダンのこの本質的な修飾（essential modification）は多糖の脱硫酸化を意味し、これはフコースリガンドを裸（demask）にして薬剤価（valency of the agent.）を高くするに寄与する。さらに、脱硫酸化オリゴ糖の活性はその単糖単位数が減少するにつれて増加するということも観察された。
【０００３】
本発明は、大人および子供の両方でノロウイルス、ロタウイルス、サルモネラ属、緑膿菌およびカンピロバクタージェジュニによって引き起こされる問題の予防または抑制のための栄養補助食品等として使用可能な効果的で安全、無毒かつ経済的な天然産物を提供する。この多糖類とそれに由来するオリゴ糖は上記病原菌による感染の危険に曝される牡蠣、その他の食品の製造での工業的条件下でも使用できる。
【０００４】
ノロウイルスはヒトの急性胃腸炎の最も一般的な原因であり、急速に変異し、伝染性が高く、制御不能になり易く、致命的な集団感染になる可能性がある。ノロウイルスは、ロタウイルスとともに発展途上国および先進国の人口において最も頻繁に起こるウイルス誘発性急性胃腸炎の原因である。外来患者の下痢関連患者の年間数は先進国で800万人、入院数は50万人であり、開発途上国では900万人が入院し、約200万人が死亡する。
【０００５】
３歳以下の子供にとって世界で最も一般的な死因の１つはノロウイルス感染症およびその症状である。2011年だけでもドイツでは0歳から12ヶ月の乳幼児に15.000を超える感染が報告されており、世界中で約2,000万人の感染者がいる。乳児死亡の200.000件以上はノロウイルス感染が原因であると推定されている。
【０００６】
患者数が前年の症例数の100％を超える場合があることが観察されているので、１シーズンに病気になる人の数を予測することは一般に不可能である。症状が軽度な患者の大多数は医師の診察を受けないため、報告された全ての症例で文書化されていない症例が約300人存在する可能性があると推定されるということも指摘しておく必要がある。従って、例えば英国での2013年の流行の最初の月の患者数は120万人を超えたと推定される。
【０００７】
他の研究では、これまでにテストした成人の最大90％はノロウイルスに対する抗体を持っているが、その免疫が不完全で、約6か月間しか持続しないので同じ感染株に再感染することが分かっている。
【０００８】
ノイロウイルスはカリシウイルス科の属で、キャプシドに囲まれた一本鎖ＲＮＡゲノムを含む単純な非エンベロープウイルスである。このカプシドは1つの主構造タンパク質によって形成される。
【０００９】
フコースは組織−血液型抗原またはルイス様抗原の構造的部分としてウイルスの上記キャプシドタンパク質のＰドメインによって認識されるという証拠が蓄積されている。
【００１０】
ノロウイルス研究は、動物モデルが存在しないため、依然として実施が困難であるが、その病原性を評価するための細胞培養モデルが最近開発された。さらに、組換えウイルス粒子とテストボランティアとを使用することでノロウイルスの受容体として機能する組織血液型抗原（histo-blood group antigens、ＨＢＧＡと略記）がウイルスの侵入と感染プロセスの開始の初期ターゲットとして同定された。このＨＢＧＡは赤血球、胃粘膜、気道、泌尿生殖器系および腸管の表面上で発現する複雑なオリゴ糖である。α−１、２−フコシルトランスフェラーゼであるＦＵＴ２を介してエンコードされるＨＢＧ抗原ＨＩが最も重要な遺伝的素因として同定されており、このＦＵＴ２のホモ接合型ゼロ変異対立遺伝子を持つ個体はノロウイルスによって引き起こされる胃腸感染に対してほぼ耐性があるということが分かっている。
【００１１】
また、ロタウイルスによって引き起こされる感染症は乳幼児の重度下痢の２番目に多い原因である。ロタウイルスは、レオウイルス科に属する二本鎖ＲＮＡウイルスの属である。世界中のほぼ全ての子供は５歳までに少なくとも一度はロタウイルスに感染する。ノロウイルスと同様に、ロタウイルスも主として糞便経路で感染する。
【００１２】
世界中の45万人以上の５歳以下の子供達が毎年ロタウイルス感染症で死亡しており、そのほとんどは発展途上国に住んでおり、200万人以上が重症になる。ロタウイルスワクチンを小児期の定期予防接種ポリシーに追加した国ではロタウイルス感染症の発生率と重症度が減少しているが、ノロウイルスとロタウイルスの両方の感染を防ぐワクチンは非常に価値がある。
【００１３】
ノロウイルスを原因とする胃腸炎を治療するためのワクチンや利用可能な原因療法は今日までない。そのため、ノロウイルス胃腸炎の治療は電解質による経口および非経口の緩和的な再水和（rehydration）に制限されている。
【００１４】
ノロウイルスおよびそれと同様な侵入機構および組織浸潤を有する病原体によって引き起こされる胃腸感染を効果的に防止および治療することができる新しい物質および組成物に対するニーズが存在し、それが本発明の目的につながっている。
【背景技術】
【００１５】
海洋性褐色藻類から「フコイダン」を最初に分離することは90年前に報告されている（Killing、1913）。それから35年後にフカンが海洋無脊椎動物でも発生することを示す証拠が発表された（Vasseur、1948）。これらの多糖類は主として硫酸化Ｌ−フコースで構成され、褐藻（すなわち、褐藻綱）の細胞壁か熱湯（Percival and Ross、1950）または酸性溶液（Black、1954）で簡単に抽出され、単離された細胞壁の乾燥重量の40％以上を占めている（Kloareg、1984）。海洋無脊椎動物では硫酸化フカンがウニの卵ゼリーのコート（Mulloy et al、1994）およびナマコの体壁（Mourao and Bastos、1987）で生じる。
【００１６】
褐藻のフカン（フコイダンと呼ばれる）は他の藻類多糖類と同様に凝固のモジュレーターとして機能することが以前から知られている（Chargaff et al．1936）。哺乳類の粘膜から調製される抗凝固剤ヘパリンの代替品として、フコイダン製剤が提案されていた。これは植物起源であり、ウイルスやプリオンなどの感染因子を含む可能性は低い。フコイダンもヘパリンと同様に炎症、細胞増殖および接着、ウイルス感染、受精などの多くの生物学的活動に影響を与えることが示されていた（Boisson-Vidal et al、1995）。
【００１７】
しかし、分子構造の観点からフコイダンの生物活性を解釈した研究は比較的少ない。ほとんど全ての生物学的研究は精製されたフコイダンではなく、Fucus vesiculosusから得られる市販の硫酸化多糖類の粗調製物を使用している（Mulloy et al．1994）。各種の植物や動物の種に由来するフカン構造に対する最近の研究が研究試薬または潜在的な治療法としてのその活性様式を説明するのに役立っている。
【００１８】
藻類のフコイダンは主としてフカレス（Fucales）とミミズ（nd Laminarial）目だけでなく、脊索動物門、有耳虫類、指虫類、外手虫類、および有毛虫にもいくらかのオーダーで存在する。実際、これまでに調査された全ての褐藻（褐藻類）中に広く存在するが、緑藻（緑藻綱）、紅藻（紅藻綱）、黄金藻（Xanthophyceae）、および淡水藻および陸生植物にはフコイダンは存在しないようである。
【００１９】
フコイダン画分（A. nodosum）の抗凝固作用および抗血栓作用は、分子量と硫酸塩含有量の増加に伴って増加するが、硫酸化の本来のパターンが損なわれていない画分は同じ分子量の画分およびこのパターンが部分的な脱硫酸化によって破壊された全硫酸化画分よりも強い（Boisson-Vidal et al、2000）。
【００２０】
脱硫酸化フコイダンではないフコイダンおよび低分子量フコイダンはＨｅｐ  Ｇ２細胞でプラスモディウムベルゲイの発生とチャイニーズハムスター卵巣細胞でのスポロゾイト侵入を阻害する（Ying et al．1997）。 
【００２１】
特定の酵素的方法を使用することで生物学的研究に合ったオリゴ糖を調整でき、元のフコイダンの構造を推定することができる簡略化されたサンプルを取得することができる。現在採用されている化学修飾方法は分析（加水分解、脱硫酸化、脱アセチル化）する前に高温での強い塩基性または酸性条件を必要とすることがよくあり、多糖類を修飾するする可能性がある。例えば、近年研究されたほとんど全ての藻類フコイダンでアセチル基が見つかった（C. filum、C．okamuranus、F．evanescens）が、調整プロセス中に除去される可能性がある（Chizov et al、1999）。
【００２２】
ある研究ではフコイダンのいくつかの硫酸基に特異的に作用できるスルファターゼが示されている（Daniel et al．2001）。ホタテガイP. maximusから部分的に精製されたこの酵素はモノ硫酸化Ｌ−フコース、またはＡ．ノドスムフコイダン（A. nodosum fucoidan）からの二糖のモノおよび二硫酸化成分の２位に存在する硫酸基を放出できる。同じ軟体動物から精製されたα−Ｌ-フコシダーゼと共役することでフカンの分解を増加させることができると思われる（Berteau et al．2002）。従って、これらの酵素は選択的に修飾されたフカンを生成するためのユニークなツールであり、それによって生物活性における分岐および硫酸基の関与を直接決定することができる。
【００２３】
フコイダンは、他の多くの硫酸化多糖類と同様に、細胞のウイルス感染を抑制することができる。これは単純ヘルペス、サイトメガロウイルスおよびヒト免疫不全ウイルス（Hoshino et a．1998）およびウシウイルス性下痢ウイルス（Iqbal et al、2000）で実証されており、ウイルスへの結合に対して細胞表面ＨＳと競合するためと思われる。サイトメガロウイルス感染の症状での治療への適用可能性を示すデータもいくつか提供されているが、それは厳密かつ完全に多糖類上の硫酸塩の存在に依存する。一方、本発明者の加工（処理）製品は、関連するフコース残基を保護（マスク）するときに硫酸塩を完全に含まないか、少なくとも部分的に含まない。
【００２４】
Marionneau et alは組換えノロウイルスウイルス様粒子はヒト胃十二指腸上皮細胞上に存在する炭水化物をリガンドとして使用することを示した［非特許文献１］（Norwalk Virus Binds to Histo-Blood Group Antigens Present on Gastroduodenal Epithelial Cells of Secretor Individuals, Gastroenterology (2002) 122:1967-1977)。
【００２５】
さらに、Morrow et al. は乳オリゴ糖のパーセントとして高レベルの２−結合フコシルオリゴ糖を含む母乳を与えられた乳児ではカンピロバクターおよびカリシウイルスで下痢を引き起こすことはあまりないことを観察した。［非特許文献２］（Human Milk Oligosaccharides are associated with protection against Diarrhea in Breast-fed Infants, J. Pediatr. (2004) 145:297-3）。
【００２６】
これに関連して［特許文献１］（欧州特許第ＥＰ１６８９３４８（Ｂ１）号公報（２００３）はオリゴ糖組成物、特に２−フコシルラクトースがヒト血清アルブミンに連結した糖タンパク質の感染症の治療における使用を開示している。
【００２７】
乳オリゴ糖の治療効果はよく知られている。［特許文献２］（国際公開第ＷＯ２０１０／１２０６８２号公報）は乳オリゴ糖と動物の感染症の治療におけるその使用を開示している。［特許文献３］（国際公開第ＷＯ２０１２／０９２１５３号公報）はヒト乳オリゴ糖とヌクレオチドを含む栄養組成物と腸内ウイルス感染を治療および／または予防するためのその使用を開示している。［特許文献４］（国際公開第ＷＯ２０１４／１２８０５７号公報）は哺乳動物のノロウイルスまたはロタウイルスによる感染の治療または予防に使用するための合成フコシル化オリゴ糖を開示している。この特許に記載されているオリゴ糖にはフコースだけでなく、ガラクトース、グルコース、関連するβ１−４およびβ１−３グリコシド結合、ならびにＮ−アセチルガラクトサミンも含まれている。フコイダンに由来するオリゴ糖と天然フコイダン自体との混合物は、本発明の説明および実施形態で示すように、乳オリゴ糖よりも約１桁活性が高い。
【００２８】
本発明に最も関連性の高い文献はサイトメガロウイルス感染に関連する潜在的な用途についてのみ報告している。［非特許文献３］（Wang et al. Mar Drugs. 2012; 12;10(12):2795-816 The antiviral activities and mechanisms of marine polysaccharides: an overview.）、［非特許文献４］（Li at al. Molecules 2008; 12;13(8):1671-95). Fucoidan: structure and bioactivity）。これらの用途では多糖類の天然状態の硫酸化に依存する。従来技術の知識では、脱硫酸化した多糖または多糖由来のオリゴ糖はそれぞれ（ノロウイルス、ロタウイルス、サルモネラ属緑膿菌およびカンピロバクタージェジュニ）の症状において不活性であると予想される。それに対して、本発明者は、ノロウイルスのコンテキスト（文脈）では硫酸残基が優先的に削除され、関連するフコース残基がデマスク（demask）されることを示した。さらに、多糖は約２０ｍｅｒまでのサイズ範囲のオリゴ糖のレベルに断片化されると多糖の生物活性が増加する（天然のフコイダンの場合のように、より大きなサイズのオリゴ糖もアクティブである）。
【００２９】
海洋多糖類および褐藻に由来する関連多糖類の部分的酸加水分解に関する論文は多数あるが、その手順は断片化と完全な脱硫酸化の両方を単一ステップで達成する単純で効果的な方法ではない。この点はヒトの胃ムチンへのノロウイルスの結合をブロックする能力によって製品である脱硫酸化オリゴ糖（オリゴフコース）を特徴付ける上で重要である。［非特許文献５］（Pielesz at al. Mild acid hydrolysis of fucoidan: characterization by electrophoresis および［非特許文献６］（Kusaykin at al. Fucoidanases Glycobiology. 2016; 26(1):3-12)
【００３０】
血液型抗原、特に血液型Ｈ抗原（Fucal-2Gal）、さらには血液型Ｈ２抗原（Fucal-2Gall-4GlcNAc／Glc）の一部である末端フコースへの関連株のノロウイルスの特定の結合メカニズムを説明する論文は多数存在する。［非特許文献７］（Koromyslova at al. The sweet quartet: Binding of fucose to the norovirus capsid. Virology. 2015; 483:203-8、［非特許文献８］（Singh at al. Structural Evolution of the Emerging 2014-2015 GII.17 Noroviruses. 2015; 23;90(5):2710-5）、［非特許文献９］（Chen at al. Crystallography of a Lewis-binding norovirus, elucidation of strain-specificity to the polymorphic human histo-blood group antigens. Pathog. 201 1; 7(7):el002152）、［非特許文献１０］（Singh at al. Human noroviruses fondness for histo-blood group antigens. Virol. 2015; 89(4):2024-40)
【００３１】
ノロウイルスとロタウイルスは液型Ｈ抗原／オリゴ糖に結合することが知られている２番目に関連性の高いウイルスはであるので、処理（加工）された多糖を適用することでロタウイルス感染を防止することが期待できる。同じことがシュードモナスとサルモネラ菌株にも当てはまる。すなわち、これら両方の結合は血液型Ｈ関連乳オリゴ糖２−フコシルラクトースによってブロックされる可能性がある。［非特許文献１１］（Tan at al. Histo-bloodgroup antigens: a common niche for norovirus and rotavirus. Expert Rev Mol Med. 2014; 10;16:e5、［非特許文献１２］（Weichert at al.Bioengineered 2'-fucosyllactose and 3-fucosyllactose inhibit the adhesion of Pseudomonas aeruginosa and other enteric pathogens, like Campylobacter jejuni, to human intestinal and respiratory cell lines. Nutr Res. 2013; 33(10):831-8、［非特許文献１３］（Wu at al. Interactions of the fucose-specific Pseudomonas aeruginosa lectin, PA-IIL, with mammalian glycoconjugates bearing polyvalent Lewis(a) and ABH bloodgroup glycotopes Biochimie. 2006; 88(10): 1479-92、［非特許文献１４］（Topin at al. Deciphering the glycan preference of bacterial lectins by glycan array and molecular docking with validation by microcalorimetry and crystallography. PLoS One. 2013; 19;8(8):e71149）
【００３２】
以下の論文は動物（アサリ、ムール貝、牡蠣、ブタ）の消化管の血液型関連抗原に結合するノロウイルスについて説明したものである。［非特許文献１５］（Tian at al. Norovirus recognizes histo-blood group antigens on gastrointestinal cells of clams, mussels, and oysters: a possible mechanism of bioaccumulation. Food Prot. 2007; 70(9):2140-7、［非特許文献１６］（Schaeffer at al. Norovirus contamination on French marketed oysters. Food Microbiol. 2013; 2; 166(2):244-8、［非特許文献１７］（Thebault at al. Infectivity of GI and Gil noroviruses established from oyster related outbreaks. Epidemics. 2013; 5(2):98-l 10、［非特許文献１８］（Maalouf at al. Distribution in tissue and seasonal variation of norovirus genogroup I and II ligands in oysters、H, Zakhour M, Le Pendu J, Le Saux JC, Atmar RL, Le Guyader FS. Appl. Environ. Microbiol. 2010; 76(16):5621-30、［非特許文献１９］（Tian at al. Binding of recombinant norovirus like particle to histo-blood group antigen on cells in the lumen of pig duodenum. P, Jiang X, Zhong W, Jensen HM, Brandl M, Bates AH, Engelbrektson AL, Mandrell R. Res Vet Sci. 2007; 83(3):410-8） 
【００３３】
従来技術には褐藻類Laminaria japonicaに関する特許および出願もある。［特許文献５］（中国特許第CN105147743号公報）はＥＶ７１感染症を治療するためのラミナリア抽出物の使用を開示している。この特許は、エンテロウイルス（ＥＶ７１）に関連したグルカン（ポリグルコース）の健康効果に言及している。［特許文献６］（中国特許第CN103665120号公報）は、CN103665120（2013）は褐藻類Laminaria japonicaからのレクチンの製造方法に関するものであり、［特許文献７］（中国特許第CN102367282（B）号公報）、［特許文献８］（中国特許第CN102274247（B）号公報および［特許文献９］（韓国特許第KR100485686（B）号公報）はフコイダンとは無関係の褐藻類Laminaria japonicaから単離された多糖類の製造方法について説明している。［特許文献１０］（韓国特許第KR20090127785号公報（2008）は褐藻類Laminaria japonicaからフコイダンを分離方法に関するものである。フコイダンの抽出と精製の種々バリエーションを説明するこれらの特許は全て本発明が提供する関連情報と矛盾するものではない。［特許文献１１］（米国特許第US9241951(B2)号明細書、２００９）はグルカンおよび／またはフカンを含む組成物による直接的な食事介入による胃腸の健康、免疫および能力の改善に関するものである。この目的のためには褐藻類、特にミカン科、フカ科およびレッソニア科が使用されてきた。
【００３４】
［特許文献１２］（米国特許第US5646130号明細書）は約２０の単糖単位を含む低分子量（５ｋＤａ以下）の硫酸化多糖を開示している。この特許に記載のオリゴ糖には、ンヌロノピラノース（マノース）およびグルクロン酸が含まれる。これらのオリゴ糖は、心臓および中枢神経系の血栓症誘発虚血性血管疾患の予防および治療、急性血栓症誘発脳梗塞の治療、冠動脈虚血誘発狭心症の治療および高リポタンパク血症の治療に使用され、コレステロールの相対量を低下させる。
【００３５】
［特許文献１３］（米国特許第US2002019991(A)号明細書）にはα−1,2-フコースを含む組成物が記載されている。これはEscherichia coliおよびVibrio choleraeによって引き起こされる胃腸感染症の治療および予防で使用される。
【００３６】
［特許文献１４］（米国特許第US6126961(A)号明細書）(1998)にはサルモネラ種、その他の細菌性病原体による動物の腸のコロニー形成を低減するためのシス−ヒドロキシ糖単位またはその誘導体を含む多糖または単糖リボースまたはラムノースまたはその誘導体と動物飼料とを含有する組成物および方法が記載されている。多糖シス−ヒドロキシ糖単位は、マンノース、マンノース誘導体、ガラクトース、ガラクトース誘導体、ガラクトマンナン、ガラクトサミン、フコースおよびアラビノースの１つ以上にできる。動物の飼料には食用ガムまたは他の生体高分子の形で多糖類を組み込むことができる。
【００３７】
［特許文献１５］（日本特許第JP5364352(B)(2003)号公報）は脱硫酸化およびオリゴマー化フコイダンの製造方法と、脱硫酸化およびオリゴマー化フコイダンそれぞれの活性を有するフコイダン同化細菌すなわちフラボバクテリウムリミコラナイトＡＰ−６７４またはLuteolibacter algae AP-675、AP-676、またはそれらの抽出物などのフラボバクテリウム属に属する細菌にフコイダンを供することを開示している。［特許文献１６］（米国特許第US6140481(B)(1994)号明細書）にはシリル化剤および脱硫酸化ヘパリンを用いて脱硫酸化多糖を生成するための方法が記載されている。［特許文献１７］（日本特許第JP3497209(B)(1993)号公報）はシリル化剤の存在下で硫酸化糖の脱硫酸化を実施する方法を開示している。このシリル化剤は好ましくは２−トリメチルシロキシペント−２−エン−４−オンである。［非特許文献２０］（Pomin et al. (Mild acid hydrolysis of sulfated fucans: a selective 2-desulfation reaction and an alternative approach for preparing tailored sulfated oligosaccharides, Glycobiology (2005) 15(12): 1376-1385)は部分的な脱硫酸化について説明している。
【００３８】
［特許文献１８］（米国特許第US2005255564(A)(2002)号明細書）はプロセス特許で、硫酸化フカンのフラグメンテーションすなわち硫酸化をそのままにしておく酵素的アプローチに言及している。 
【００３９】
［特許文献１９］（国際公開第WO2014170505(A)号公報）および［特許文献２０］（米国特許第US7846452(B)号明細書）は、免疫調節に有用な植物種およびFucus vesiculosusを含む海藻の抽出物の調製および組成を開示している。［特許文献２１］（中国特許第CN102936293（B）（2012）号公報）はFucus vesiculosusから、［特許文献２２］（米国特許第US9447199（B）（2014）号明細書）は褐色藻類からのフコイダンの抽出および精製のためのマイクロ波ベースのプロトコルについて説明している。
【００４０】
［特許文献２３］（日本特許第JPH01313433(A)(1988)号公報）および［特許文献２４］（欧州特許第EP0606882(A)号公報）は抗ＨＩＶ活性を説明しているが、これはフコイダンの硫酸化に大きく依存する。 
【００４１】
この多糖類に関してはKillingによる発見以来、種々の化学構造が提案されてきた。多糖類フコイダンはフコースのホモポリマー（Ｆ−フコイダン）またはヘテロ多糖類として存在する。その組成はソースと季節性によって異なる。ほとんどの多糖類フコイダンの化学組成は複雑である。Ｆ−フコイダンはその供給源に応じてその構造によって２つのグループに分けることができる。その１つのグループは（l−＞3）リンクされたα−Ｌ−フコピラノース残基で構成される中央鎖を有するLaminaria種を含む。第２のグループには繰り返し（1−＞3）および（1−＞4）リンクされたα−Ｌ−フコピラノース残基で構成される中央鎖を有するAscophyllumおよびFucus種から単離された多糖フコイダンが含まれる。
【００４２】
少量のα−Ｌ−フコピラノースはコア鎖のフコースに（１−２）リンクされる。側部フコースおよび硫酸基（Ｆ−フコイダン）の他に、マンノース、ガラクトース、グルコース、キシロース、ウロン酸などの単糖残基の存在がＵ−フコイダンで示された。硫酸残基はフコースを1つおきに置換ができるので高密度で見られる。実験研究ではフカン源としてフカス・ベシクロシイを使用しているが、本発明は規定された部分的または完全に脱硫酸化されたオリゴ糖に関するもので、特定の天然源に限定されることを意図するものではない。潜在的な発生源は全ての種の褐藻および海藻にすることができるが、他の海洋動物または植物源にすることができる。
【００４３】
［特許文献２５］（国特許第US7838004 B2(US20060211652 A1号明細書)は、フコイダンを部分的に加水分解して、乳児用調合乳（［特許文献２６］（米国特許第US 20060210697 A1)号明細書）を調製するために使用されるスルホン化形態を与える方法を記載している。これらのフコイダンの供給源は日本のモズク、日本の昆布、トンガリムムーイである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００４４】
【非特許文献１】Marionneau et al、Gastroenterology (2002) 122:1967-1977)、Norwalk Virus Binds to Histo-Blood Group Antigens Present on Gastroduodenal Epithelial Cells of Secretor Individuals
【非特許文献２】Morrow et al. J. Pediatr. (2004) 145:297-3、Human Milk Oligosaccharides are associated with protection against Diarrhea in Breast-fed Infants
【非特許文献３】Wang et al. Mar Drugs. 2012; 12;10(12):2795-816 The antiviral activities and mechanisms of marine polysaccharides: an overview.
【非特許文献４】Li at al. Molecules 2008; 12;13(8):1671-95). Fucoidan: structure and bioactivity
【非特許文献５】Pielesz at al. Mild acid hydrolysis of fucoidan: characterization by electrophoresis and FT-Raman spectroscopy. Carbohydr. Res. 201 1 ; 27;346(13):1937-44
【非特許文献６】Kusaykin at al. Fucoidanases Glycobiology. 2016; 26(1):3-12)
【非特許文献７】Koromyslova at al. The sweet quartet: Binding of fucose to the norovirus capsid. Virology. 2015; 483:203-8
【非特許文献８】Singh at al. Structural Evolution of the Emerging 2014-2015 GII.17 Noroviruses. 2015; 23;90(5):2710-5
【非特許文献９】Chen at al. Crystallography of a Lewis-binding norovirus, elucidation of strain-specificity to the polymorphic human histo-blood group antigens. Pathog. 201 1; 7(7):el002152
【非特許文献１０】Singh at al. Human noroviruses fondness for histo-blood group antigens. Virol. 2015; 89(4):2024-40)
【非特許文献１１】Tan at al. Histo-bloodgroup antigens: a common niche for norovirus and rotavirus. Expert Rev Mol Med. 2014; 10;16:e5,
【非特許文献１２】Weichert at al.Bioengineered 2'-fucosyllactose and 3-fucosyllactose inhibit the adhesion of Pseudomonas aeruginosa and other enteric pathogens, like Campylobacter jejuni, to human intestinal and respiratory cell lines. Nutr Res. 2013; 33(10):831-8,
【非特許文献１３】Wu at al. Interactions of the fucose-specific Pseudomonas aeruginosa lectin, PA-IIL, with mammalian glycoconjugates bearing polyvalent Lewis(a) and ABH bloodgroup glycotopes Biochimie. 2006; 88(10): 1479-92
【非特許文献１４】Topin at al. Deciphering the glycan preference of bacterial lectins by glycan array and molecular docking with validation by microcalorimetry and crystallography. PLoS One. 2013; 19;8(8):e71149.
【非特許文献１５】Tian at al. Norovirus recognizes histo-blood group antigens on gastrointestinal cells of clams, mussels, and oysters: a possible mechanism of bioaccumulation. Food Prot. 2007; 70(9):2140-7,
【非特許文献１６】Schaeffer at al. Norovirus contamination on French marketed oysters. Food Microbiol. 2013; 2; 166(2):244-8,
【非特許文献１７】Thebault at al. Infectivity of GI and Gil noroviruses established from oyster related outbreaks. Epidemics. 2013; 5(2):98-l 10,
【非特許文献１８】Maalouf at al. Distribution in tissue and seasonal variation of norovirus genogroup I and II ligands in oysters、H, Zakhour M, Le Pendu J, Le Saux JC, Atmar RL, Le Guyader FS. Appl. Environ. Microbiol. 2010; 76(16):5621-30
【非特許文献１９】Tian at al. Binding of recombinant norovirus like particle to histo-blood group antigen on cells in the lumen of pig duodenum. P, Jiang X, Zhong W, Jensen HM, Brandl M, Bates AH, Engelbrektson AL, Mandrell R. Res Vet Sci. 2007; 83(3):410-8
【非特許文献２０】Pomin et al. (Mild acid hydrolysis of sulfated fucans: a selective 2-desulfation reaction and an alternative approach for preparing tailored sulfated oligosaccharides, Glycobiology (2005) 15(12): 1376-1385),
【特許文献】
【００４５】
【特許文献１】欧州特許第EP1689348(B1)号公報
【特許文献２】国際公開第WO2010／120682号公報
【特許文献３】国際公開第WO2012／092153号公報
【特許文献４】国際公開第WO2014／128057号公報
【特許文献５】中国特許第CN105147743号公報
【特許文献６】中国特許第CN103665120号公報
【特許文献７】中国特許第CN102367282（B）号公報
【特許文献８】中国特許第CN102274247（B）号公報
【特許文献９】韓国特許第KR100485686（B）号公報
【特許文献１０】韓国特許第KR20090127785号公報
【特許文献１１】米国特許第US9241951(B2)号明細書
【特許文献１２】米国特許第US5646130号明細書
【特許文献１３】米国特許第US2002019991(A)号明細書
【特許文献１４】米国特許第US6126961(A)号明細書
【特許文献１５】日本特許第JP5364352(B)(2003)号公報
【特許文献１６】米国特許第US6140481(B)(1994)号明細書
【特許文献１７】日本特許第JP3497209(B)(1993)号公報
【特許文献１８】米国特許第US2005255564(A)(2002)号明細書
【特許文献１９】国際公開第WO2014170505(A)号公報
【特許文献２０】米国特許第US7846452(B)号明細書
【特許文献２１】中国特許第CN102936293（B）（2012）号公報
【特許文献２２】米国特許第US9447199（B）（2014）号明細書
【特許文献２３】日本特許第JPH01313433(A)(1988)号公報
【特許文献２４】欧州特許第EP0606882(A)号公報
【特許文献２５】米国特許第US7838004 B2(US20060211652 A1号明細書
【特許文献２６】米国特許第US 20060210697 A1)号明細書
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００４６】
上記背景技術に記載の通り、現在までにノロウイルス、その他の腸内病原菌による感染の治療または予防のためのさまざまなアプローチがあるが、これらの治療／予防に有効であることが実際に証明された組成物はまだ提供されていない。 
【課題を解決するための手段】
【００４７】
本発明は、天然のＦ−フコイダン、脱硫酸化Ｆ−フコイダンおよびＦ−フコイダンの脱硫酸化および断片化で得られるアルファグリコシド結合にリンクした低分子量でフコースのモノマー単位が２０以下の範囲にある最適サイズを有する新規な脱硫酸化オリゴ糖に関するものである。フカンの供給源としては褐藻類Fucus vesiculosusを使用したが、本発明がそれのみに限定されるもではない。褐藻およびその他の魚介類中のオリゴ糖の含有量は１２〜２０％であることはが知られているので、これらがオリゴを経済的な条件下で単離するのに適している。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】実施例１Ａでの種々のフコイダン濃度での２回のアッセイの結果を示す図。
【図２】実施例１Ｂ、ＣでのｐＨ７．４（Ｂ）およびｐＨ１．５〜５．５（Ｃ）でのヒト胃ムチン（ＨＧＭ）へのＧＩＩ．４（Sydney 2012）ＶＬＰの結合を示す図。
【図３】実施例１ＤＢ、ＣでのＨＩＩへのＧＩＩ．４の結合アッセイに対するブロッキング条件の変化（５％スキムミルク／ＰＢＳ対５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）を示す図。
【図４】実施例２での天然Ｆ−フコイダンおよびＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓからの脱硫酸化Ｆ−フコイダンによるＨＧＭ（１０μｇ／ｍｌ）へのＧＩＩ．４（Sydney 2012）ＶＬＰの結合阻害を示す図。
【図５】実施例３での加工したＦ−フコイダン（０．０１Ｍ  ＨＣｌで６０℃で４時間、部分的酸加水分解した後に中和処理）によるＧＩＩ．４（Sydney 2012）ＶＬＰのＨＧＭ（１０μｇ／ｍｌ）への結合阻害を示す図。
【図６】実施例４での天然および加工フコイダンによる各種チャージ／調製物によるＨＧＭ（１０μｇ／ｍｌ）へのＧＩＩ．４（Sydney、2012）ＶＬＰの結合阻害を示す図。
【図７】実施例５での加工フコイダンによるＨＧＭへのＧＩＩ．４（２０１２）（Ａ、およびＧＩＬ  １７（２０１５）（Ｂ）ＶＬＰの結合阻害を示す図。
【図８】実施例６でのＧＩＩ．４（Sydney、2012）ＶＬＰを使用した結合阻害アッセイに基づく希塩酸中のフコイダン処理の時間的変化を示す図。
【図９】実施例７での各種精密検査手順の比較評価を示す図。
【図１０】実施例８での酸、その濃度およびインキュベーション時間の変化を示す図。
【図１１】実施例９でのポリスチレンスルホン酸処理フコイダン（ＰＳＳＡ）によるＨＧＭへのＧＩＩ．４  ＶＬＰの結合阻害を示す図。
【図１２】実施例１０でのＢｉｏＧｅｌ−Ｐ２上でのフコイダン加工製品の分画を示す図。
【図１３】実施例１１Ａでの限外濾過後の過メチル化フコイダン加工製品のUltraflextreme ＴＯＦ／ＴＯＦ装置でのＭＡＬＤＩ質量分析、陽イオンサーベイスペクトル（ＭＳＩ）。
【図１４】実施例１１Ｂでのｍｚ  １５５１でのノナメリックオリゴフコースのＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトル（ＬＩＦＴモードでのポストソースディケイスペクトル）
【図１５】実施例１２でのフコイダン加工製品からの部分的メチル化酢酸アルジトール（ＰＭＡＡ）のＧＣＭＳによる連鎖分析を示す図
【発明を実施するための形態】
【００４９】
フコイダンは褐藻の主要成分として存在する（例えば、F．vesiculosusの場合、バイオマスの１２％の比率で存在する）。中国で養殖されている最も重要な経済的海藻の1つは茶色の海藻Laminaria japonica Aresch（Laminariales）で、これは日本料理や韓国料理で広く使用されている。L. japonicaの利用は1000年以上の間、伝統的な中国医学書中に文書化されてきた。フコイダンは低コストで無制限にアクセスできる、簡単に抽出でき、市場ですぐに入手できるという利点がある。前述のように、多糖類が人間や動物の健康に悪影響（毒性）を及ぼすことはない。
【００５０】
これまでに知られている刊行物は海藻由来の多糖類の加水分解と、その部分的断片化（fragmentation）に関するもので、フコイダンを完全脱硫酸化し、１つのステップで断片化を実行できる単純で効率的なプロセスについて記載した刊行物はない。本発明の好ましい対象は脱硫酸化Ｆ−フコイダンと、それから誘導される脱硫酸化オリゴ糖（オリゴフコース）とである。これらはノロウイルスおよび血液型Ｈ抗原への結合に使用する感染経路が類似しているその他の腸内病原体の結合を競合的に遮断（competitively block）する能力が特異的である。本発明の明確に定義された脱硫酸化多糖およびオリゴ糖の生成方法は経済的で、シンプルかつ効率的な方法で、完全脱硫酸化のみ、または、それと多糖の断片化との組み合わせの両方を単一ステップで実行することができる。
【００５１】
褐藻Fucus vesiculosusからのＦ−フコイダンの抽出は大藻からの他の硫酸オリゴ糖の抽出に使用される通常の方法で行われ、熱水で開始され、沈殿は塩または有機溶媒で行われる。 
【００５２】
このタイプの抽出で得られるフコイダン（％）の収量は藻類バイオマス乾燥重量の０．２６％〜２０％の範囲である。抽出されたフコイダン多糖類の物理化学的特性は抽出処理の強度（厳しさ）、例えば温度、反応時間、化学物質の濃度、および藻の固有要因、例えば藻の種やサイズ、地域の気候および環境要因に依存する。
【００５３】
本発明で脱硫酸化Ｆ−フコイダンの製造方法とは、加溶媒分解（solvolysis）によって硫酸塩を遊離させためにジメチルスルホキシド／ピリジン（５：１２ｖ：ｖ）の混合物で中性の乾燥ピリミジニウム塩を１１０℃で９時間、単一の化学的処理する処理を意味する。得られた製品は広範囲（extensively）に透析して有機試薬を除去し、真空回転で乾燥される。
【００５４】
本発明でフコイダンから脱硫酸化された低質量のオリゴ糖を製造する方法とは、鉱酸または有機酸によって触媒される部分酸加水分解によるか、透析／限外濾過によって酸から低質量のオリゴフコースを分離することができる可溶性高分子量ポリスチレンスルホン酸によって実行される脱硫酸化／断片化(desulfation/fragmentation)を意味する。生成物を連続的に取り出し、黒鉛化炭素(graphitized carbon)上に補足（entrapment）することでこれらのサイズは透析膜または限外濾過膜のカットオフによって制御できる。プロセス全体は連続的で、工業プロセスに簡単に拡張できる。
【００５５】
本発明ではＦ−フコイダンの処理方法が後処理ステップもカバーする。これは部分酸加水分解のモード：揮発性酸の真空蒸発による乾燥後の中和の１つに依存する（酸触媒脱硫酸中に硫酸が形成され、中和する必要がある）。さらに、限外濾過によりサブ分画して関連オリゴ糖画分を濃縮したり、グラファイト化炭素（Carbographカートリッジ）上での固相抽出を含めることもできる。さらなる変形例では、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）を含めてグリカンをサブフ分画したり、グループ分画（group fractionation）によってグリカン画分を脱塩することができる。同様に、アミノ−、アミド−またはジオール−相の極性相クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によってグリカンをさらに分画することもできる。
【００５６】
フコイダンの抗ウイルス作用は周知であるが、それらの作用は硫酸化に大きく依存し（ＣＭＶ、ＨＩＶ）、その作用のメカニズムは炭水化物の血液型競争とは無関係であるということを強調しておく必要がある。胃腸炎を引き起こす病原体に関しては、天然（硫酸化）フコイダンは脱硫酸化またはその加工誘導体と比較して活性が低い。
【００５７】
関連株のノロウイルスは、血液型抗原の一部である末端フコース、特にＨＩ抗原（Ｆｕｃαｌ−２Ｇａｌβ１−３ＧｌｃＮＡｃ）に特に結合するが、Ｈ２抗原（Ｆｕｃαｌ−２Ｇａｌｌ−４ＧｌｃＮＡｃ）にはほとんど結合しない。
【００５８】
ロタウイルスは、ノロウイルスに加えて血液型Ｈ抗原／オリゴ糖に結合することが知られている２番目に関連性の高いウイルスである。従って、上記方法で処理された多糖類を適用することでロタウイルス感染も防止できることが期待できる。緑膿菌、カンピロバクタージェジュニ、サルモネラ種についても、これらの結合は血液型Ｈ関連の乳オリゴ糖２−フコシルラクトースによってブロックできるので、同様である。
【００５９】
２−フコシルラクトースのような微生物的に生産された乳オリゴ糖は、乳児用調合乳の添加物として現在市場承認に近づいており、一定の保護的価値を示している。
【００６０】
本発明の新規性は、ポリフコースの硫酸基はノロウイルスの遮断効果に役割を果たしておらず、逆に、それを削除する方が有利でなり、置換されたフコースが少ないほどアクセスし易くなるという裏付けのある証拠から来る。脱硫酸化多糖またはオリゴ糖の構造が血液型関連の炭水化物との競合によってウイルスの結合をブロックする。本発明により、脱硫酸化多糖の生物活性が増加する。
【００６１】
この脱硫酸化オリゴ糖の治療活性はヒト感染に関連するノロウイルスの全てのバリアント（１９７４年または２０１２年のＧＩＩ．４、ＧＩＩ．１０およびＧＩＩ．１７）に適用でき、さらに、ロタウイルスのように上皮上の血液型Ｈ関連オリゴ糖への結合によって侵入する侵入経路が同一のウイルスにも同様に適用できる。本発明の抗ウイルス剤の標的ウイルスはノロウイルスであるが、同様な感染経路を使用する他の腸内病原菌、例えばロタウイルス、サルモネラ菌、緑膿菌、カンピロバクタージェジュニなどのも標的ウイルスである。これらの病原体は全てムチンの血液型グリカンおよび消化管上皮のムチン型Ｏ糖タンパク質に結合することで感染症を引き起こす。
【００６２】
本発明による脱硫酸化多糖およびオリゴ糖はノロウイルスおよび上皮に結合するその分岐株に対して強力な阻害能力を発揮する。特に、処理された植物フコイダンを用いてウイルス様粒子（ＶＬＰ）としてのヒトの病原体ＧＩＩ．４（Sydney 2012）、ＧＩＩ．４（CHDC 1974）、ＧＩＬ  １７およびＧＩＬ  １０を直接結合アッセイ、ヒト胃ムチン結合阻害（ルイス血液型が定義）および／またはカプシド結合に対するヒト乳のオリゴ糖に由来するネオ糖脂質を使用した結合阻害で調べた。
【００６３】
褐色藻類から調製したフコイダンの種々の調製物が抑制力を発揮することが示され、多糖類をＤＭＳＯ／ピリジン（５：１２、ｖ：ｖ）を用いて１００℃で９時間、加溶媒分解するか、天然物質を０．０１Ｍ  ＨＣｌ（６０℃、４時間）で部分的な酸加水分解して完全な脱硫酸化と部分的な断片化を行った後に抑制力を大幅に増加する。塩素酸の代わりに他の酸（例えば、ギ酸または酢酸）を０．１Ｍ（６０℃、一晩）使用するか、同様な断片化と脱硫酸化を達成できる変形パラメーターを使用することができる。部分的な酸の加水分解をベースにした脱硫酸化と断片化を同時に行う別の変形例では可溶性の高分子量のポリスチレンスルホン酸（ＰＳＳＡ）を使用する。この場合には、連続的な透析およびと黒鉛化炭素捕捉によって処理製品（オリゴフコース）をサイズベースで分離することが可能になる。脱硫酸化をスルファターゼ処理で達成することもできる。多糖類の部分的な断片化にはフコイダナーゼ(fucoidanases)を使用できる。
【００６４】
本発明は、天然多糖（フコイダン）の構造要素がヒト胃ムチンへのノロウイルスカプシドの結合に対して競合阻害効果を発揮するという中心的な証拠に基づいている。この証拠は全てが胃のムチンへ同様な強い結合を示す最も関連性の高いノロウイルス株群のＶＬＰを使用したＥＬＩＳＡ形式のアッセイ技術に基づいており、血液型とは無関係な多糖類およびその加工製品によって同様な有効性でブロックされた。
【００６５】
活性グリカンまたはフコイダンの部分構造の構造的証拠は天然および過メチル化オリゴ糖のＭＡＬＤＩ質量分析（ＭＳおよびＭＳ／ＭＳ）で得られ、さらに、ＧＣ−ＭＳによる結合分析によって得られた。阻害効果が最も高い活性画分は構造要素：Ｆｕｃｌ−２Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−３Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−４Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−２Ｆｕｃｌ−３Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−２（Ｆｕｃｌ−３）Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−２（Ｆｕｃｌ−４）Ｆｕｃ、Ｆｕｃｌ−３（Ｆｕｃｌ−２）ＦｕｃおよびＦｕｃｌ−２Ｆｕｃｌ−３（Ｆｕｃｌ−４）Ｆｕｃを含むオリゴ糖からイコサ糖（２０ｍｅｒ）までで構成されている。
【００６６】
量的に支配的なフコースオリゴマーはペンタ-からデカマーまでのサイズ範囲で変化する。フコースのアノマー構成はアルファである。上記定義の構造要素はいずれも既知の血液型のＨＩまたはＨ２構造と同一ではなく、関連もない。逆に、Ｌ−Ｆｕｃａｌ−２−Ｌ−Ｆｕｃ（フコースが６−デオキシガラクトースと同じ）でも、サブターミナルの糖がＬ対Ｄ形態であり、Ｌ−Ｆｕｃｌ−２−Ｄ−Ｇａｌと比較して構造が著しく異なる。
【００６７】
本発明によって、２０マー以下の最適サイズ範囲の脱硫酸化または部分的脱硫酸化したオリゴ糖はヒト胃腸上皮に結合するノロウイルスの非常に強力な阻害剤であることが示された。
発明を実施するための最良の形態 
【００６８】
すなわち、ノロウイルス、ロタウイルス、サルモネラ種、緑膿菌またはカンピロバクタージェジュニ(Noroviruses, Rotaviruses, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa or Campylobacter jejuni)による感染は、本発明の対象であるフコイダン、脱硫酸化フコイダンおよびフコイダン由来の脱硫酸化オリゴ糖によって効率的に防止および／または治療することができる。
【００６９】
本発明はさらに、胃腸上皮へのウイルスの結合を遮断することノロウイルスによって引き起こされる感染を防止するために流行段階中に病院内または病院外で投与可能な予防剤および治療剤（食品添加物）としての天然フコイダン、脱硫酸化フコイダンまたは誘導脱硫酸化オリゴ糖の使用にも関するものである。本発明のフコイダン、脱硫酸化フコイダンまたはそれから誘導される脱硫酸化オリゴ糖は一般に血液型Ｈ様の炭水化物構造によって媒介される同じ侵入経路を有するその他の病原体、例えばロタウイルス、サルモネラ属、緑膿菌、カンピロバクタージェジュニによって引き起こされる他の感染症の予防および治療薬（食品添加物）としても使用できる。さらに、天然、脱硫酸化または加工フコイダンの溶液で牡蠣を洗浄することによって牡蠣のノロウイルス汚染を無くすこともできる。従って、産業（牡蠣）用途で非常に価値のあるものである。
【００７０】
以下の実施例は、ノロウイルス、ロタウイルス、サルモネラ属、緑膿菌またはカンピロバクタージェジュニなどの病原体の腸内滞留を減らすために、血液型Ｈ様炭水化物構造によって媒介される感染での脱硫酸化オリゴ糖の競合的親和性(competitive affinity)と病原体の結合阻害性(inhibition)とに関して本特許が明らかにした発明を記載することで本発明の概念を説明するものである。しかし、以下の実施例は単なる例を示すもので、本発明の全体的な範囲を制限するものであると解釈してはならないということを理解すべきである。
【００７１】
以下、本発明の実施形態をさらに説明するが、本発明をこれに限定するものではない。
【実施例】
【００７２】
実施例１
固定化された天然Ｆ−フコイダンへのＧＩＩ．４  ＶＬＰの結合
Ａ．固定化された天然Ｆ−フコイダン上へのＧＩＩ．４（Sydney 2012）ＶＬＰの結合
フコイダンをポリスチレン微量滴定プレート上に炭酸水素アンモニウム溶液から乾燥することによって固定化した。ブロッキングは５％ＢＳＡ／ＰＢＳで行った。ＶＬＰは０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ（タンパク質含有量で１０μｇ／ｍｌ）中に分散させた。結合アッセイでのインキュベーション条件はＶＬＰに対して３７℃で１時間、一次抗体（抗ＧＩＩ．４、ウサギポリクローナル、１：３０００）および二次抗体（抗ウサギ−Ｉｇ−アルカリホスファターゼ、１：５０００）にした。基質ｐ−ニトロフェニルホスフェート（５ｍｇ／ｍｌ）は一般に室温で３０分間インキュベートし、発色を４０５ｎｍで測定した。
図（[図１]）は種々のフコイダン濃度での２回のアッセイの結果を示している。
【００７３】
Ｂ、Ｃ．  ｐＨ７．４（Ｂ）およびｐＨ１．５〜５．５（Ｃ）でのヒト胃ムチン（ＨＧＭ）へのＧＩＩ．４（Sydney 2012）ＶＬＰの結合（[図２]）
【００７４】
Ｄ．  ＨＩＩへのＧＩＩ．４の結合アッセイに対するブロッキング条件の変化（５％スキムミルク／ＰＢＳ対５％ＢＳＡ／ＰＢＳ（［図３］）
【００７５】
実施例２
天然Ｆ−フコイダンおよびＦｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓからの脱硫酸化Ｆ−フコイダンによるＨＧＭ（１０μｇ／ｍｌ）へのＧＩＩ．４（Sydney 2012）ＶＬＰの結合阻害
一定の阻害剤濃度（１０ｍｇ／ｍｌ）で３回のアッセイ（［図４］）
【００７６】
実施例３
加工したＦ−フコイダン（０．０１Ｍ  ＨＣｌで６０℃で４時間、部分的酸加水分解した後に中和処理）によるＧＩＩ．４（Sydney 2012）ＶＬＰのＨＧＭ（１０μｇ／ｍｌ）への結合阻害
一定の阻害剤濃度（５ｍｇ／ｍｌ）で３回のアッセイ（［図５］）
【００７７】
実施例４
天然および加工フコイダンによる各種チャージ／調製物によるＨＧＭ（１０μｇ／ｍｌ）へのＧＩＩ．４（Sydney、2012）ＶＬＰの結合阻害
５℃で１０年以上保管したＦ−フコイダンと新鮮なサンプル（両方ともＳｉｇｍａから入手）を２回のアッセイした（「ニューチャージ」「オールドチャーア」。部分的な酸加水分解（０．０１Ｎ  ＨＣｌ、６０℃、４時間）した後、中和し、カプシド結合バッファー（０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０／ＰＢＳ）で各種濃度で可溶化した（［図６］）
【００７８】
実施例５
加工フコイダンによるＨＧＭへのＧＩＩ．４（２０１２）（Ａ、およびＧＩＬ  １７（２０１５）（Ｂ）ＶＬＰの結合阻害
Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓからのフコイダンを０．０１Ｎ  ＨＣｌを使用して６０℃で４時間部分酸加水分解し、中和し、乾燥後、カプシド結合バッファー（ＰＢＳ中０．０１％Ｔｗｅｅｎ−２０）で可溶化した（［図７］）
【００７９】
実施例６
ＧＩＩ．４（Sydney、2012）ＶＬＰを使用した結合阻害アッセイに基づく希塩酸中のフコイダン処理の時間的変化
Ｆｕｃｕｓ  ｖｅｓｉｃｕｌｏｓｕｓからのフコイダンを０．０１Ｎ  ＨＣｌで６０℃で反応時間を増加（０〜１６時間）させながらインキュベートし、ＮａＯＨで中和し、上記と同様にＧＩＩ．４キャプシドによるＶＬＰ結合アッセイで阻害活性をテストした（［図８］）
【００８０】
実施例７
各種精密検査手順の比較評価
後処理（Workup）手順には黒鉛化炭素上での固相抽出（１５０ｍｇ−Ｃａｒｂｏｇｒａｐｈカートリッジ）とセルロース膜での限外濾過（カットオフ１０ｋＤａ）とが含まれる。加工フコイダン（濃度は［図９］のグラフに示）を上記のＧＩＩ．４キャプシドを使用したＶＬＰ結合アッセイでの阻害活性でテストした。
【００８１】
実施例８
酸、その濃度およびインキュベーション時間の変化
パラメータは０．０１Ｍ  ＨＣｌ（４時間、６０℃）、０．１Ｍギ酸（ＦＡ）（１６時間、６０℃）、０．１Ｍ酢酸（ＡＡ）（１６時間、６０℃）である。上記のＧＩＩ．４キャプシドを使用したＶＬＰ結合アッセイで加工フコイダン（５ｍｇ／ｍｌ）の阻害活性をテストした（図［１０］）。
【００８２】
実施例９
ポリスチレンスルホン酸処理フコイダン（ＰＳＳＡ）によるＨＧＭへのＧＩＩ．４  ＶＬＰの結合阻害
３０ｍｇのフコイダンを４６．７μｌＰＳＳＡを含む３ｍｌの水に溶かし、透析バッグ（直径１ｃｍ、長さ１２ｃｍ、カットオフ６〜８ｋＤａ）に入れ、１８時間、６０℃に加熱した。濾液を５８０ｍｇの黒鉛化炭素を連続的に循環させた（流速２４ｍｌ／時）。黒鉛化炭素から８０％アセトニトリル水溶液を用いて溶出させた。濾過されたオリゴフコースの大部分（６５％）は透析バッグ内で結合せず、３５％がＧＣカラムから溶出された。各画分を個別にテストした（濾液：７ｍｇ／ｍｌ、ＧＣ溶出液：２．９ｍｇ／ｍｌ）（図［１１］）。
【００８３】
実施例１０
ＢｉｏＧｅｌ−Ｐ２上でのフコイダン加工製品の分画
ＢｉｏＧｅｌ−Ｐ２カラム（９．２ｍｌ、１．４×６ｃｍ）での分画と、ＨＧＭでのＧＩＩ．４  ＶＬＰの結合アッセイでの５〜９ｍｌで溶出された分画のグリカンによって生じた結合阻害の結果とを示す。挿入図（上部パネル）は糖の比色分析（フェノール硫酸分析）の結果を示す（［図１２］）。
【００８４】
実施例１１
フコイダン加工製品のＭＡＬＤＩ質量分析
Ａ、限外濾過後の過メチル化フコイダン加工製品のUltraflextreme ＴＯＦ／ＴＯＦ装置でのＭＡＬＤＩ質量分析、陽イオンサーベイスペクトル（ＭＳＩ）
質量増分１７４はメチル化デオキシヘキソース（「Ｆ」で示す）に対応する。約２０までの単糖ユニットを持つオリゴ糖が検出された（［図１３］）。
Ｂ、ｍｚ  １５５１でのノナメリックオリゴフコースのＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳスペクトル（ＬＩＦＴモードでのポストソースディケイスペクトル）
１７４の質量増分はメチル化デオキシヘキソース（「Ｆ」で示す）に対応する（［図１４］）。
【００８５】
実施例１２
フコイダン加工製品からの部分的メチル化酢酸アルジトール（ＰＭＡＡ）のＧＣＭＳによる連鎖分析
フルスキャンスペクトルおよびｍ／ｚ  １１８、１７５（末端フコース、Ｆｕｃ）、ｍ／ｚ  １９０および２４７（２−Ｆｕｃ、３−Ｆｕｃ）、ｍ／ｚ  ２０３（４−Ｆｕｃ）、ｍ／ｚ  ２６２（２，３−Ｆｕｃ）、ｍ／ｚ２７５（３，４−Ｆｕｃ）での単一イオンモニタリングを用いたＧＣクロマトグラム（ＴＩＣ、全イオン電流）で６つの異なるＰＭＡＡが同定された（［図１５］）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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