(57)【要約】  本発明は、ナノ構造コンジュゲート、より具体的には、特定の細胞および組織タイプへのそれらのコンジュゲートされた治療薬の選択的送達に適したナノ構造融合タンパク質に関する。それはまた、そのようなナノ構造タンパク質を含んでなるナノ粒子およびその治療的使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を含んでなる、融合タンパク質：
（ｉ）ポリカチオン性ペプチド、
（ｉｉ）介在ポリペプチド領域、および
（ｉｉｉ）正に帯電したアミノ酸に富む領域、
ここで、前記介在ポリペプチド領域は、少なくとも１つの治療薬にコンジュゲートされたものである。
【請求項２】
ポリカチオン性ペプチドが下記からなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質：
（ｉ）アルギニンに富む配列、
（ｉｉ）細胞表面上の受容体と特異的に相互作用し、前記細胞上の融合タンパク質の内在化を促進し得る配列、
（ｉｉｉ）ＧＷＨ１ペプチド、
（ｉｖ）ＣＤ４４リガンド、
（ｖ）血液脳関門を通過できるペプチド、
（ｖｉ）細胞透過性ペプチド、および
（ｖｉｉ）ヌクレオリン結合ペプチド。
【請求項３】
ポリカチオン性ペプチドが、ＲＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号１）、ＲＲＲＧＲＧＲＲＲ（配列番号２）、ＲＡＲＧＲＧＲＲＲ（配列番号３）およびＲＡＲＧＲＧＧＧＡ（配列番号３）からなる群から選択される配列を含んでなるアルギニンに富む配列である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ポリカチオン性ペプチドが細胞表面上の受容体と特異的に相互作用し、前記細胞上の融合タンパク質の内在化を促進し得る配列を含んでなり、前記配列がＣＸＣＲ４リガンドである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ＣＸＣＲ４リガンドが、配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号５）を含んでなるペプチド、Ｖ１ペプチド（配列番号６）、ＣＸＣＬ１２（配列番号７）ペプチド、ｖＣＣＬ２（配列番号８）、またはその機能的に等価な多様体からなる群から選択される、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ポリカチオン性ペプチドが、ＣＤ４４リガンドＡ５Ｇ２７（配列番号１５）またはＦＮＩ／ＩＩ／Ｖ（配列番号１６）である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ポリカチオン性ペプチドが、Ｓｅｑ−１−７（配列番号１７）、Ｓｅｑ−１−８（配列番号１８）、Ａｎｇｉｏｐｅｐ−２−７（配列番号１９）からなる群から選択される血液脳関門を通過することができるペプチドである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
正に帯電したアミノ酸に富む領域がポリアルギニン領域である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ポリヒスチジン領域が２〜１０個の連続したヒスチジン残基を含んでなる、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
介在ポリペプチドが、蛍光タンパク質、アルブミン（配列番号３６）、ニドゲン１（配列番号３７）、ニドゲン２（配列番号３８）、絨毛性ゴナドトロピン（配列番号３９）、およびシスタチンからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
介在ポリペプチドが、シスタチンＡ、シスタチンＢ、シスタチンＣ、シスタチンＤおよびシスタチンＭからなる群から選択されるシスタチンである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
介在ポリペプチドが、配列番号４０の配列を有するシスタチンＡ、または、配列番号４０の番号付けに関して、Ｇ４Ｗ、Ｇ４Ｒ、Ｖ４８Ｄ、Ｖ４８Ｌ、Ｇ５０Ｓ、Ｋ７１Ｎ、Ｓ７２Ｇ、Ｌ７３Ｐ、Ｌ８２Ｒ、およびＴ８３Ｓからなる群から選択される１つまたはそれ以上の変異を有するその多様体である、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
ポリカチオン性ペプチドが融合タンパク質のＮ末端に位置し、および正に帯電したアミノ酸に富む領域が融合タンパク質のＣ末端に位置する、または、正に帯電したアミノ酸に富む領域が融合タンパク質のＮ末端に位置し、およびポリカチオン性ペプチドが融合タンパク質のＣ末端に位置する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
ポリカチオン性領域が第一のペプチドリンカーを介して介在ポリペプチドと連結され、および／または介在ポリペプチドが第二のペプチドリンカーを介して正に帯電したアミノ酸に富む領域と連結される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
第一のペプチドリンカーがＧＧＳＳＲＳＳ配列（配列番号３３）、またはＧＧＧＮＳ配列（配列番号３４）を含んでなる、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
治療薬が下記からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質：
（ｉ）化学療法薬、
（ｉｉ）細胞傷害性ポリペプチド、
（ｉｉｉ）抗血管新生ポリペプチド、
（ｉｖ）腫瘍抑制遺伝子によってコードされるポリペプチド、
（ｖ）プロアポトーシスポリペプチド、
（ｖｉ）抗転移活性を有するポリペプチド、
（ｖｉｉ）腫瘍に対する免疫応答を活性化できるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、および
（ｖｉｉｉ）抗血管新生分子、
（ｉｘ）毒素。
【請求項１７】
介在ポリペプチドが複数の治療薬にコンジュゲートされ、前記複数の治療薬が同じまたは異なる、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
治療薬が化学療法薬である、請求項１６または１７に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
化学療法薬が代謝拮抗薬である、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
代謝拮抗薬がピリミジンアナログまたはそのオリゴマー型である、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
ピリミジンアナログがフロクスウリジンである、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
レポータータンパク質をさらに含んでなる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
下記から選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質を調整する方法：
（ｉ）下記を含んでなる方法
ａ）下記を含んでなる融合タンパク質の提供、
ｉ．ポリカチオン性ペプチド、
ｉｉ．介在ポリペプチド領域、および
ｉｉｉ．正に帯電したアミノ酸に富む領域、
ここで、前記ポリカチオン性ペプチドおよび前記正に帯電したアミノ酸に富む領域は、前記タンパク質の末端に位置し、および
ｂ）前記融合タンパク質を治療薬の活性化形態またはそのオリゴマー形態と接触させ、ここで、治療剤またはそのオリゴマー形態の前記活性化形態は、融合タンパク質の介在領域内の少なくとも１つの官能基と反応することができる反応性基を含有し、前記接触は、治療薬の反応性基および介在ポリペプチド領域の官能基の間の結合の形成に適切な条件下で実施され、または、
（ｉｉ）下記を含んでなる方法
ａ）下記を含んでなる融合タンパク質の提供、
ｉ．ポリカチオン性ペプチド、
ｉｉ．介在ポリペプチド領域、および
ｉｉｉ．正に帯電したアミノ酸に富む領域、
ここで、ポリカチオン性ペプチドおよび正に帯電したアミノ酸に富む領域は、前記タンパク質の末端に位置し、および、融合タンパク質は、活性化形態で提供され、融合タンパク質の前記活性化形態は、介在領域に反応性基を含有し、および
ｂ）前記融合タンパク質を治療薬またはそのオリゴマー形態と接触させ、ここで、前記治療薬は、融合タンパク質中の反応性基と反応することができる官能基を含有し、前記接触は、融合タンパク質中の反応性基と治療薬中の官能基との間の結合の形成に適切な条件下で実施される。
【請求項２４】
治療薬が化学療法薬であり、ここで、その活性化形態が介在ポリペプチド領域の少なくとも一つの側鎖と反応する官能基を含有する、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
介在ポリペプチド領域の少なくとも一つの側鎖と反応する官能基がチオール基である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
活性化された化学療法薬がチオール官能化オリゴフロクスウリジンである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記融合タンパク質の調製物を低塩バッファーに入れることを含んでなる、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の融合タンパク質の複数のコピーを含んでなるナノ粒子の調製方法。
【請求項２８】
低塩バッファーが、炭酸塩バッファー、トリスバッファーおよびリン酸塩バッファーからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
炭酸塩バッファーが１００〜３００ｍＭの濃度の重炭酸ナトリウムを含んでなり、トリスバッファーが１０〜３０ｍＭの濃度のトリスを含んでなり、および／またはリン酸塩バッファーが５〜２０ｍＭの総濃度でＮａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４を含んでなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
低塩バッファーがデキストロースおよび／またはグリセロールをさらに含んでなる、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
バッファーのｐＨが６．５〜８．５である、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
バッファーが下記からなる群から選択される、請求項２７〜３１のいずれか一項に記載の方法：
（ｉ）１６６ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．４、
（ｉｉ）２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭ、５％デキストロース、ｐＨ７．４、および
（ｉｉｉ）１４０ｍＭのＮａＣｌ、７．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０％グリセロール、ｐＨ７．４。
【請求項３３】
請求項１〜２４のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項２７〜３２のいずれか一項に記載の方法により得られた融合タンパク質の複数のコピーを含んでなる、ナノ粒子。
【請求項３４】
１０〜１００ｎｍの直径を有する、請求項３３に記載のナノ粒子。
【請求項３５】
医薬に使用するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項３５または３６に記載のナノ粒子。
【請求項３６】
ポリカチオン性ペプチドが細胞表面上の受容体と特異的に相互作用し、前記細胞上の融合タンパク質の内在化を促進し得る配列であり、前記細胞が癌において存在する腫瘍細胞であり、治療薬が、癌の処置に使用するための、下記からなる群から選択される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質、または請求項３３または３４に記載のナノ粒子：
（ｉ）化学療法薬、
（ｉｉ）細胞傷害性ポリペプチド、
（ｉｉｉ）抗血管新生ポリペプチド、
（ｉｖ）腫瘍抑制遺伝子によってコードされるポリペプチド、
（ｖ）プロアポトーシスポリペプチド、
（ｖｉ）抗転移活性を有するポリペプチド、
（ｖｉｉ）腫瘍に対する免疫応答を活性化できるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、および
（ｖｉｉｉ）抗血管新生分子、
（ｉｘ）毒素。
【請求項３７】
抗腫瘍ペプチドが、ＢＡＫのＢＨ３ドメイン（配列番号４２）、ＰＵＭＡ（配列番号４３）、ＧＷＨＩ（配列番号１４）、ジフテリア毒素Ｉの活性セグメント（配列番号４４）、および緑膿菌外毒素（配列番号４５）である、請求項３６に記載の使用のための融合タンパク質またはナノ粒子。
【請求項３８】
ポリカチオン性ペプチドがＣＸＣＲ４リガンドであり、および癌がＣＸＣＲ４を発現または過剰発現する癌細胞を含んでなることを特徴とする、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質またはナノ粒子。
【請求項３９】
ＣＸＣＲ４リガンドが、配列ＲＲＷＣＹＲＫＣＹＫＧＹＣＹＲＫＣＲ（配列番号１）を含んでなるペプチド、Ｖ１ペプチド（配列番号２）、ＣＸＣＬ１２ペプチド（配列番号３）、ｖＣＣＬ２（配列番号４）、またはその機能的に等価な多様体からなる群から選択される、請求項３９に記載の使用のための融合タンパク質またはナノ粒子。
【請求項４０】
ポリカチオン性ペプチドがＣＸＣＲ４リガンドであり、および癌がＣＸＣＲ４を発現または過剰発現する癌細胞を含んでなることを特徴とする、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質またはナノ粒子。
【請求項４１】
ＣＸＣＲ４を発現または過剰発現する癌細胞が転移性幹細胞である、請求項４０に記載の使用のための融合タンパク質またはナノ粒子。
【請求項４２】
癌が膵臓癌または大腸癌である、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質またはナノ粒子。
【請求項４３】
腫瘍癌が原発腫瘍または転移である、請求項３６〜４２のいずれか一項に記載の使用のための融合タンパク質またはナノ粒子。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ナノ構造タンパク質材料の分野に関し、より具体的には、治療に使用できる治療薬担持融合タンパク質に関する。
【発明の背景】
【０００２】
ナノコンジュゲートの形態での薬物の全身投与は、遊離分子と比較した場合、薬物の安定性が向上するという利点がある。細胞標的等の貴重な追加特性はまた、ナノ材料の高い表面／体積比から利益を得て、ナノスケールの担体に官能基を化学的に組み込むことにより、特定のハイブリッド複合材料に統合されてもよい。全身投与されると、肺または他の血管が高度に組織化された臓器に凝集がないため、結果として得られた大きさが約８〜１００ｎｍの薬物負荷コンジュゲートは腎濾過から逃れる。この事実は、材料の適切な物理化学的特性と組み合わされて、循環時間が長く、標的器官への薬物曝露が長くなっても良く、したがって患者への治療効果と利益が向上する。
【０００３】
金属、セラミック、ポリマー、カーボンナノチューブを含む薬物担体として調査中の材料の多様性の中で、タンパク質は、ナノ毒性の懸念が高まる中で特に魅力的である生体適合性と分解性に関する独自の特性を提供する。ナノ構造材料へのタンパク質の自己集合の工学が急速に進行し、最終的な形状と物理化学的特性の制御が厳しくなるにつれて、タンパク質材料は化学的に結合した薬物からの担体として機能的および構造的な汎用性を獲得している。
【０００４】
実際に、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するための細胞毒性「低分子薬（ｐａｙｌｏａｄ）」の抗体への結合が、抗体の癌選択的な細胞表面分子への特異的結合を介して細胞毒性薬を癌細胞に選択的に送達するメカニズムを提供するために示されている。ゲムツズマブオゾガマイシンのように、この戦略の複数の例が効果的であることが証明されており、それは、急性骨髄性白血病に対して使用された非常に強力なＤＮＡ標的抗生物質カリケアマイシンにコンジュゲートした抗ＣＤ３３抗体を含んでなる。また、非常に強力な微小管破壊剤であるメイタンシノイドは、ＡＤＣの低分子薬として試験されており、ＨＥＲ２陽性乳癌の処置用の製剤であるアドトラスツズマブエムタンシンが得られている。
【０００５】
それにもかかわらず、抗体の構造の複雑さは、コストと合成の面で厄介な障害になる可能性がある。本発明者らは、コアタンパク質へのカチオン性Ｎ末端ドメインに加えてＣ末端ポリヒスチジンの付加に基づくナノ構造上の原理を適用することにより、ナノ医学の分野を事前に調査した（Ｓｅｒｎａ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ、２０１６、Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ、１２：１２４１−５１）。当技術分野では、これらの末端タグと融合全体の結果として生じる電荷バランスが、細胞標的ペプチドで強化された場合、血漿で安定し（Ｃｅｓｐｅｄｅｓ，Ｍ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ、２０１４、ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．，８：４１６６−４１７６）、高い細胞透過性を備えた（Ｘｕ，Ｚ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ、２０１５、Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、１５４：１４０−３）堅牢なトロイドナノ粒子として、モノマータンパク質の自己組織化とオリゴマー化を促進することが開示されている。これらのタンパク質構造の構成要素には、細胞標的薬剤、エンドソーム溶解薬、または核局在化シグナル等の機能的ペプチドが、モジュール構造と融合したストレッチの形態で含まれているかもしれない。
【０００６】
現在の治療法は、化学療法に最も耐性のある細胞の腫瘍内クローン選択に起因する可能性のある腫瘍耐性現象が主な原因で、依然として失敗の余地を示しているため、例えば、治療薬の副作用および標的外効果を低減しながら、治療の失敗および腫瘍進行の原因となる具体的な腫瘍細胞を標的とすることができる、より具体的な治療アプローチの開発が依然として必要となる。
【発明の概要】
【０００７】
第一の側面において、本発明は、下記を含んでなる融合タンパク質に関する。
(i)ポリカチオン性ペプチド、
(ii)介在ポリペプチド領域、および
(iii)正に帯電したアミノ酸に富む領域、
ここで、介在ポリペプチド領域は、少なくとも１つの治療薬にコンジュゲートされたものである。
【０００８】
さらなる側面において、本発明は、第一の側面の融合タンパク質を調製する方法、本発明の第一の側面による融合タンパク質の複数のコピーを含んでなるナノ粒子を調製する方法、本発明の融合タンパク質の複数のコピーを含んでなるナノ粒子、またはナノ粒子を調製するため本発明の方法により得られたナノ粒子、に関する。
【０００９】
本発明はまた、医薬に使用するための本発明による融合タンパク質またはナノ粒子に関する。
【００１０】
最後の側面において、本発明は、癌の処置に使用するための本発明による融合タンパク質またはナノ粒子に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】チオール官能化オリゴＦＤＵの合成と物理化学的特性。（ａ）チオールで官能化されたＯＬＩＧＯ−ＦＤＵの合成：ペンタマーオリゴ−（ＦＤＵ）５−ＳＨ（ＯＬＩＧＯ−ＦＤＵ）は、Β−シアノエチルホスホロアミダイト法を使用して、ＲＮＡ／ＤＮＡシンセサイザーで１μｍｏｌスケールで合成された。３’−チオール修飾剤Ｃ３制御細孔ガラス（ＣＰＧ）（ＬＩＮＫ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）が合成の固体支持体として使用された。最初に、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）ホスホラミダイト（ＧＬＥＮ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ）が組み込まれた。次に、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−保護−５−フルオロ−２’−デオキシウリジンホスホロアミダイト単位を繰り返し添加することにより合成が完了された。配列を組み立てた後、オリゴヌクレオチド支持体が０．１ＭのＤＴＴ（１，４−ジチオトレイトール）を含むアンモニア水（３２％）で室温で２時間処理された。１８アンモニア溶液を濃縮乾固し、生成物を使用前に水で溶出したＮＡＰ−１０（ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−２５）カラムで脱塩された。遊離オリゴ−ＦＤＵ合成：ＨＥＧおよびチオール基を含まない対照ペンタマーオリゴ−ＦＤＵを以前と同様に調製されたが、３’−スクシニル−ＦＤＵ制御細孔ガラスを固体支持体として使用した。最後に、オリゴヌクレオチドがアンモニア水（３２％）で室温で２時間脱保護された。（ｂ）オリゴ−（ＦＤＵ）５−ＳＨの物理化学的特性。ペンタマーＦＤＵ−ＨＥＧ−ＳＨのＨＰＬＣ分析（条件：Ｘ−ＢＲＩＤＧＥＴＭ  ＯＳＴ  Ｃ１８（１０ｘ５０ｍｍ、２．５μｍ）、０％から４０％までの２０分の直線勾配、流速２ｍＬ／ｍｉｎ、溶液Ａは０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＡ）中、５％のＡＣＮであり、Ｂは０．１ＭのＴＥＡＡ中、７０％のＡＣＮであった。（ｃ）ペンタマーＦｄＵ−ＨＥＧ−ＳＨのＵＶスペクトル。ペンタマーは、２６０ｎｍでの吸収によって定量化された。（ｄ）ペンタマーＦｄＵ−ＨＥＧ−ＳＨ（オリゴ−ＦｄＵ）のＭＳスペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）。計算分子量は１９７６．２、測定分子量は１９７４．０。（ｅ）対照ペンタマーＦｄＵ（遊離オリゴＦｄＵ）のＭＳスペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）。計算分子量は１４７８．１、測定分子量は１４７６．５。
【図２】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵナノコンジュゲートの物理化学的特性および薬物とナノ粒子の比率。コンジュゲーション生成物の分析は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦスペクトルによって実施された。（ａ）１個のオリゴＦｄＵまたは２個のオリゴＦｄＵ低分子薬、非コンジュゲートＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６タンパク質、カプラーコンジュゲートＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６を含む生成物の分子量を特定するＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵコンジュゲート生成物の質量分析。（ｂ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６ナノ粒子と比較した、動的光散乱によって決定されるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの大きさ。（ｃ）透過型電子顕微鏡で検出された代表的なＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ画像。（ｄ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ自己組織化ナノ粒子の分子モデリング（出展：Ｒｕｅｄａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ、Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ  ２７、７８１６−７８２２（２０１５）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓの許可を得て印刷）。（ｅ）薬物／ナノ粒子の比率：Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６およびＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートのＵＶスペクトルの分析により、平均で８分子のペンタマーオリゴＦｄＵが得られ、これはＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６ナノ粒子あたり合計４０個のＦｄＵ分子に対応する。
【図３】転移の退縮と予防プロトコルにおける抗転移効果を評価するために使用されるマウスモデル、実験設定、およびＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵ投与量。（ａ）確立された転移の退縮プロトコルに使用されるマウスモデル：スイスのヌードマウスにおけるＣＸＣＲ４＋生物発光ＳＷ１４１７  ＣＲＣ細胞の直接同所移植、それは、リンパ節と肺に転移を生じさせる。スケールバー、１ｃｍ。（ｂ）確立された転移の退縮を誘導するナノコンジュゲート能力を評価するために、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ投与は、１０回投与あたり２０μｇｑ３ｄの投与量で、ＣＲＣ細胞の盲腸移植の２か月後に開始された（確立された転移がすでに存在する場合）。（ｃ）転移の予防プロトコルに使用されるマウスモデル：ＣＸＣＲ４＋生物発光ＳＷ１４１７細胞の皮下通過後、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに解離した腫瘍細胞（ＳＣ＋ＯＲＴ）の同所移植、それは、リンパ節（ＬＮ）、肝臓、肺、および腹膜に転移を起こす。（ｄ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの投与は、転移の発生を防ぐためのナノコンジュゲート能力を評価するため、ＣＲＣ細胞の盲腸移植の１週間後（転移がまだ発生しない場合）、１２用量あたり２０μｇｑ３ｄの用量で開始された。両方の実験において、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ抗転移効果は、等分子量の遊離オリゴＦｄＵによって達成される効果と比較される。転移の予防の実験を開始する前に、使用したマウスモデルには処置開始前にミクロまたはマクロ転移が欠如していることを別のマウスで確認した。転移の退縮の実験が始まる前に、処置開始前に転移巣がすでに存在していることを別のマウスで確認した。スケールバー、１００μｍ。
【図４】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートの合成と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＸＣＲ４＋ＣＲＣ細胞の選択的内在化および致死の実証。（ａ）ナノコンジュゲートは、ＣＸＣＲ４リガンド、緑色蛍光タンパク質、および低分子薬と結合するヒスチジンテール、としてのペプチドＴ２２で構成された融合タンパク質、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６（Ｕｎｚｕｅｔａ  ２０１２において開示）を含んでなる。（ｂ）オリゴ−ＦｄＵと命名された、抗腫瘍薬５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦｄＵ）の７〜９個のペンタマーオリゴヌクレオチド（約４０分子）が、カプラーを使用してＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６標的ベクターにコンジュゲートされる。（ｃ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ化学合成：Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６は、最初に外部リジンのアミノ基を介してＭＢＨＳ（６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）カプラーに共有結合する。次に、チオール官能化オリゴ−ＦｄＵ（オリゴ−（ＦｄＵ）５−ＳＨ）（補足図１を参照）は、マレイミドで官能化されたＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６と反応される（マイケル反応）。（ｄ）フローサイトメトリーを使用して、蛍光発光で測定された、１μＭで１時間曝露した後のＣＸＣＲ４過剰発現（ＣＸＣＲ４＋）ＳＷ１４１７  ＣＲＣ細胞におけるナノコンジュゲート内在化。（ｅ）２４時間１μＭでの曝露後の共焦点顕微鏡によるＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７細胞におけるＴ２２−ＧＦＰ４８９−Ｈ６−ＦｄＵの細胞内輸送。（ｆ）非コンジュゲート遊離オリゴＦｄＵ曝露と比較した、線形化されたＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ用量反応傾向線の表示。抗腫瘍効果は、開示された濃度として、７２時間暴露後、ＭＴＴによりＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７細胞の生存率として測定された。（ｇ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６または遊離オリゴ−ＦｄＵと比較して、１μＭＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵに４８時間曝露したＳＷ１４１７細胞の光学顕微鏡画像によって決定された細胞生存率の低下。スケールバー、１００μｍ。
【図５】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞に選択的に内在化し、致死する。（ａ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートまたはＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６のＨｅＬａ細胞への内在化は、１μＭ濃度で１時間の細胞暴露後、フローサイトメトリーにより放出された蛍光として検出された。ＣＸＣＲ４拮抗薬ＡＤＭＤ３１００による細胞の前処理により得られた完全な内在化ブロック。（ｂ）１μＭで２４時間暴露した後の共焦点顕微鏡によるＨｅＬａ細胞でのＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの細胞内輸送。（ｃ）遊離オリゴＦｄＵ曝露と比較した、線形化されたＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ用量反応傾向線の表示。抗腫瘍効果は、開示された濃度として、７２時間暴露後、ＭＴＴによりＨｅＬａ細胞の生存率として測定された。（ｄ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６または遊離オリゴＦｄＵと比較して、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートに４８時間曝露したＨｅＬａ細胞の光学顕微鏡画像で記録された細胞生存率の低下。スケールバー、１００μｍ。
【図６】ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＸＣＲ４＋細胞におけるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵの選択的かつ受容体依存的な取り込み。（ａ）転移性幹細胞の標的化された薬物送達と選択的死滅を達成するためのアプローチ：ＣＸＣＲ４−ナノコンジュゲート相互作用は、原発腫瘍および転移巣において、ＭｅｔＳＣのＣＸＣＲ４媒介内在化、続いて、ＣＸＣＲ４＋細胞の選択的死滅につながる二重鎖切断を誘導するため、細胞質基質へのＦｄＵ放出と核への拡散を誘発する。（ｂ）ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ２００を使用して、蛍光発光で測定されるように、１００μｇの単回静脈内投与の５時間後の皮下ＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７  ＣＲＣ腫瘍組織における選択的Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲート生体内分布。生体内分布は、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６標的ベクターによって達成されるものと類似しており、バッファーまたは遊離オリゴ−ＦｄＵ処理後は検出できない。（ｃ）抗ＧＦＰ  ＩＨＣで測定されたような、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６と同様のレベルでの、腫瘍組織におけるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ蓄積の検出。バッファーまたは遊離オリゴＦｄＵ対照でのＧＦＰ検出の欠如。（ｄ）ＣＸＣＲ４拮抗薬ＡＭＤ３１００の投与は、蛍光発光によって測定されるように、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ腫瘍の生体内分布を完全にブロックする。蛍光は、バッファーまたは遊離オリゴＦｄＵ対照では検出されない。（ｅ）ＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７腫瘍組織で観察されるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの取り込みは、抗ＧＦＰ  ＩＨＣ  Ｈスコアを使用して、定量化されるように、前のＡＭＤ３１００投与によりほぼ完全にブロックされる。（ｆ）抗ＧＦＰ免疫染色によるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの取り込みおよびＡＭＤ３１００競合の代表的な画像、この定量はパネルｅにおいて報告されている。スケールバー、５０μｍ。
【図７】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵによる腫瘍組織のＣＸＣＲ４過剰発現癌細胞の枯渇と投与間隔の定義。（ａ）処置前の比較群（バッファー、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６、および遊離オリゴ−ＦｄＵ）の皮下腫瘍組織における同様のレベルのＣＸＣＲ４過剰発現（上のパネル）。ＤＮＡ二重鎖切断誘導（抗ｇＨ２ＡＸ  ＩＨＣで測定、投与後５時間、中央のパネル）およびアポトーシス誘導（ヘキスト染色、２４時間、下のパネル）の代表的な画像。遊離オリゴＦｄＵと比較されるように、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵのＤＳＢとアポトーシス誘導のより高いレベルに注意する。白い矢印はアポトーシス細胞を示す。（ｂ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、１００μｇ単回投与後、ＳＷ１４１７  ＣＲＣ腫瘍組織からＣＸＣＲ４＋癌細胞を枯渇させる。抗ＣＸＣＲ４  ＩＨＣを使用して、注射の２４時間後の腫瘍におけるＣＸＣＲ４＋細胞画分の減少、４８時間でのそれらの完全な消失、および、基礎レベルと同様の割合に達するような投与後７２時間でのＣＸＣＲ４＋細胞の再出現に注意する。対照的に、腫瘍組織におけるＣＸＣＲ４＋癌細胞画分（ＣＸＣＲ４＋ＣＣＦ）は、遊離オリゴＦｄＵ処置後も一定である。ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の再出現の３日間の時間経過は、その抗転移効果を評価する実験でのナノコンジュゲート投与の反復投与スケジュールで使用される投与間隔を定義する。スケールバー、５０μｍ。
【図８】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵはＣＸＣＲ４依存的に転移を防ぐ。（ａ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、遊離オリゴＦｄＵと比較されるように、転移の予防の実験の終了時に、ＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７同所性モデルの生物発光リンパ節（ＬＮ）、肝臓および肺転移（ｍｅｔｓ）の出現をブロックする。（ｂ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、遊離オリゴＦｄＵと比較して、転移の予防の実験の最後にあるＨ＆Ｅ染色組織切片に記録されているように、肝臓、肺、および腹膜転移の合計数を大幅に減らすことで転移を防ぐ。対照的に、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは遊離オリゴＦｄＵ投与後、リンパ節転移の数は減少しない、＊Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーの検定。ナノコンジュゲートが誘発する平均病巣数の減少に関する結果については、表１を参照。部位ごとの転移巣の大きさの減少については、補足表１を参照。（ｃ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、抗ＣＸＣＲ４  ＩＨＣで測定されるように、実験の終了時に、肝臓、肺、および腹膜の転移組織に残っているＣＸＣＲ４＋癌細胞画分（ＣＸＣＲ４＋ＣＣＦ）の遊離オリゴＦｄＵよりも高い減少を誘発する。対照的に、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６  ＦｄＵまたは遊離オリゴＦｄＵは、治療後にリンパ節転移または原発腫瘍組織に残るＣＸＣＲ４＋ＣＣＦを減少させない。（ｄ）治療終了時にＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは遊離オリゴＦｄＵによって誘発されたＣＸＣＲ４＋ＣＣＦの減少の代表的な画像、この定量はパネルｃに報告されている。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵによって誘発されたＣＸＣＲ４＋ＣＣＦの減少（パネルｃ）と各転移部位でのその抗転移効果（パネルｂ）の相関に注意する。スケールバー、１００μｍ。アスタリスク：腫瘍組織、ｖＬ：リンパ管、ＬＮ：リンパ転移。
【図９】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵは、ＣＸＣＲ４依存的に確立された転移の退縮を誘導する。（ａ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、転移の退縮の実験の終了時に生物発光により測定されるように、遊離オリゴＦｄＵよりも高い肺転移の阻害を示すが、両方の化合物はＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７同所性モデルで同様のレベルのリンパ節転移の阻害を示す。（ｂ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、転移の退縮の実験の終了時にＨ＆Ｅ染色組織切片で記録されたように、遊離オリゴＦｄＵよりも肺転移の数の高い減少を示すが、両方の化合物はリンパ節転移の同様のレベルの阻害を示す。
【図１０】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵ原発腫瘍成長の阻害。（ａ）７８転移の予防の実験では、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは遊離オリゴ−ＦｄＵ処理後のｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光により測定されたように、バッファーで処理されたマウスと比較して、実験時間に沿って原発腫瘍成長の有意な抑制は観察されなかった。（ｂ）実験終了時の切除後に原発腫瘍より放出された生体発光のＥｘ  ｖｉｖｏ記録も、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ、遊離オリゴ−ＦｄＵ、およびバッファー処理マウス間で同様のレベルを示した。（ｃ）確立された転移の退縮の実験において、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、ｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光（ＢＬＩ）によって検出されるように、遊離オリゴＦｄＵによって達成されるものと同様のレベルまで、実験時間に沿って原発腫瘍の成長を抑制した。両方の化合物は、バッファーで処理した動物と比較して、腫瘍の成長を有意に抑制した。（ｄ）実験終了時の切除後、原発腫瘍より放出された生物発光のＥｘ  ｖｉｖｏ記録もまた、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵマウスと遊離オリゴＦｄＵマウス間で同様のレベルを示した。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは遊離オリゴＦｄＵ処置に対する原発腫瘍の同様の反応の記録とは対照的に、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵによって誘発される抗転移効果は、特に転移予防に関する遊離オリゴＦｄＵ処置後に観察されたものよりも有意に高かったことに注意する（図４、補足図５、表１および補足表１を参照）。
【図１１】無視できるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵ生体内分布または非腫瘍組織に対する毒性。（ａ）検出不能なＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、２４時間で消失するが１００μｇ投与後５時間の肝臓での一時的な蓄積を除き、正常組織で蛍光を発した。肝臓から放出される蛍光は一過性であり、腫瘍組織で記録されるものよりも著しく低い。腫瘍／肝臓比＝７．５（同じ実験で記録された、図２ｂの腫瘍強度を参照）、スケールバー、１ｃｍ。（ｂ）抗ｇ−Ｈ２ＡＸで測定されたような、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは遊離オリゴ−ＦｄＵ投与の５時間後の正常な骨髄での同様に低レベルのＤＮＡ二本鎖切断誘導、分析された他の正常組織には存在しない効果、を示す代表的な画像。（ｃ）Ｈ＆Ｅ染色組織の組織病理学的変化の欠如、またはＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは等分子５５４用量の遊離オリゴＦｄＵ１００μｇ投与後２４時間のＣＸＣＲ４＋（骨髄）およびＣＸＣＲ４−（脳、腎臓、肝臓、肺および心臓）正常組織のＨ＆Ｅ染色サンプルのアポトーシス誘導の欠如を示す代表的な画像。肝臓への一時的なナノコンジュゲート分布または骨髄で誘発されたＤＮＡ損傷は、これらの非腫瘍組織の細胞毒性をもたらさないことに注意する。（ｄ）転移の退縮の実験の経時的に記録された群間の体重の差の欠如。（ｅ）転移の予防の実験の経時的に記録された群間の体重差の欠如。スケールバー、１００μｍ。
【図１２】骨髄９２または循環血球において検出不能なＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵの蓄積。（ａ）１０〜１００μｇの範囲の用量でＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは遊離ＦｄＵの対照等分子量（１．３−１３．０ｎｍｏｌの範囲）を投与してから５時間後にフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）密度勾配を使用して血液から分離した赤血球、白血球、または血小板の蛍光発光の欠如。（ｂ）フィコールプロトコル後に分離された白血球および血小板ペレットで観察される検出不能な蛍光発光。（ｃ）（ａ）に開示されている範囲で、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは対照遊離オリゴＦｄＵの単回注射でマウスを処置し、５時間後に得られた脾臓または骨髄の蛍光発光の欠如。
【図１３】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵナノコンジュゲートの物理化学的特性、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＸＣＲ４＋ＣＲＣ細胞の選択的内在化と致死の実証。（Ａ）初期Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６タンパク質およびＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵコンジュゲートの質量分析。（Ｂ）逆反応を使用したＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵコンジュゲートのＤＬＳ。（Ｃ）ＭＴＴ生存率アッセイで分析された、異なる濃度のＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵコンジュゲートに４８時間曝露したＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞の用量反応表示。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明者らは、細胞選択効果を有するポリカチオン性ペプチドおよび固有の生理学的または生物学的活性のないタンパク質を含む融合タンパク質の使用により、ナノ構造タンパク質構築の背後にある原理を試験した。融合タンパク質は、後に治療薬とコンジュゲートされるが、本発明者らは、驚くべきことに、融合タンパク質が治療薬の効果的な標的選択的送達システムとして機能することを見出した。
【００１３】
本発明の融合タンパク質
したがって、第一の側面において、本発明は、下記を含んでなる融合タンパク質に関する。
(i)ポリカチオン性ペプチド、
(ii)介在ポリペプチド領域、および
(iii)正に帯電したアミノ酸に富む領域、
ここで、介在ポリペプチド領域は、少なくとも１つの治療薬にコンジュゲートされたものである。
【００１４】
用語「融合タンパク質」は当技術分野で公知であり、天然および／または人工の異なる起源に由来する２つまたはそれ以上の配列を含む人工的に設計された単一のポリペプチド鎖を表している。定義によると、融合タンパク質は自然界では決して見出されない。
【００１５】
本明細書で使用される用語「単一ポリペプチド鎖」は、融合タンパク質のポリペプチド成分が端と端をコンジュゲートできることを意味するが、それらの間に挿入され、共有結合によって結合された、１つまたはそれ以上の任意のペプチドまたはポリペプチド「リンカー」または「スペーサー」も含んでもよい。
【００１６】
本明細書で使用される用語「ペプチド」または「ポリペプチド」は、一般に、ペプチド結合で連結された約２〜４０個のアミノ酸残基の直鎖を表している。用語「ペプチド結合」、「ペプチド」、「ポリペプチド」およびタンパク質は、当業者に知られていることが理解されるだろう。これ以降、「ペプチド」と「ポリペプチド」は区別なく使用されるだろう。
【００１７】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸残基」は、当技術分野で公知のいかなる天然アミノ酸、いかなるアミノ酸誘導体、またはいかなる任意のアミノ酸模倣物も表している。特定の実施態様において、タンパク質またはペプチド残基は連続的であり、アミノ酸残基配列を中断する非アミノ酸はない。他の実施態様において、配列は、１つまたはそれ以上の非アミノ酸部分を含んでもよい。特定の実施態様において、タンパク質またはペプチド残基の配列は、１つまたはそれ以上の非アミノ酸部分によって中断されてもよい。
【００１８】
本明細書で使用される用語「コンジュゲート」は、２つまたはそれ以上の個々の化合物の共有結合により生じるいかなる化合物も表している。本発明において、コンジュゲートは、介在ポリペプチド領域、および共有結合しており、前記結合が直接または連結化合物を介している、少なくとも１つの治療薬を表している。
【００１９】
用語「共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）」または「共有結合（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ）」は、ポリペプチド領域および少なくとも１つの治療薬が、化学共有結合を介して互いに直接共有結合するか、そうでなければ、リンカー、またはブリッジ、またはスペーサー、１つの部分または複数の部分等の、介在する１つの部分または複数の部分を介して互いに間接的に共有結合することを意味している。
【００２０】
Ａ．ポリカチオン性ペプチド
本明細書で使用される用語「ポリカチオン性ペプチド」または「第一の正に帯電したアミノ酸に富む領域」は、複数の正荷に帯電したアミノ酸を含むポリペプチド配列に対応する。ポリカチオン性ペプチドは、正に帯電したアミノ酸によってのみ形成されてもよく、またはｐＨ７の領域の全体の正味電荷が正であるという条件で他のアミノ酸を含んでもよい。
【００２１】
アミノ酸およびそれらの対応するアミノ酸残基は、それらの側鎖に応じて異なる特性を有し、それらはそれらの特性に応じてグループ化されてもよいことは、当該分野で公知である。したがって、生理的なｐＨでは、５つのアミノ酸が電荷を示し、アルギニン、ヒスチジン、およびリジンは正に帯電し、アスパラギン酸とグルタミン酸は負に帯電する。それから、当業者は、本発明のポリカチオン性ペプチドが、生理的ｐＨ条件において１つ以上の正電荷の正味電荷を有するポリペプチドに対応することを認識するだろう。したがって、本発明のポリカチオン性ペプチドは、２つまたはそれ以上の正味の正電荷をもたらすのに常に十分に正に帯電したアミノ酸残基が存在する限り、１つまたはそれ以上の負に帯電したアミノ酸残基の存在によって制限されない。
【００２２】
したがって、本発明の一つの実施態様において、本発明のポリカチオン性ペプチドは、下記からなる群から選択される。
(i)アルギニンに富む配列、
(ii)細胞表面上の受容体と特異的に相互作用し、前記細胞上の融合タンパク質の内在化を促進し得る配列、
(iii)ＧＷ−Ｈ１ペプチド、
(iv)ＣＤ４４リガンド、
(v)血液脳関門を通過できるペプチド、
(vi)細胞透過性ペプチド、および
(vii)ヌクレオリン結合ペプチド。
【００２３】
（ｉ）アルギニンに富む配列
前記のように、アルギニンアミノ酸とその残基は、生理的ｐＨで正電荷を示す。「アルギニンに富む配列」は、複数のアルギニン残基を含むポリペプチド配列を表していることが理解されるだろう。したがって、ポリペプチド配列は、アルギニン残基としてのその完全な配列のアミノ酸残基の３３％、好ましくは４０％、好ましくは４５％、好ましくは５０％、好ましくは５５％、好ましくは６０％、好ましくは６５％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９９％、さらにより好ましくは１００％を含んでもよい。アルギニンに富む配列の配列がアルギニン残基として配列の１００％未満を含んでなるときはいつでも、これらの残基は互いに関してすべて隣接または連続している必要はないことが理解されるだろう。
【００２４】
当業者は、アルギニン残基の正電荷だけでなく他の正に帯電したアミノ酸にも起因する、生理的ｐＨでのポリペプチドの総正電荷が２またはそれ以上である限り、１つまたはそれ以上のアルギニン残基を有するポリペプチドがポリカチオン性ペプチドであることを認識するだろう。
【００２５】
本発明の実施態様において、本発明のポリカチオン性ペプチドは、アルギニンに富む配列である。
【００２６】
本発明の好ましい実施態様において、本発明のポリカチオン性ペプチドのアルギニンに富む配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４からなる群から選択される。
【００２７】
（ii）細胞表面上の受容体と特異的に相互作用し、前記細胞上の融合タンパク質の内在化を促進し得る配列
本明細書で使用する、用語「細胞表面上の受容体と特異的に相互作用し、前記細胞上の融合タンパク質の内在化を促進し得る配列」は、細胞の表面の受容体に結合するいかなるポリペプチド配列も表し、ここで、前記受容体は、前記ポリペプチド配列の結合に応答してエンドサイトーシスを受ける。この結合特異性は、ポリペプチド配列、ならびにそれが一部である融合タンパク質の残りを、前記受容体を発現する細胞、組織または器官に送達することを可能にする。このようにして、前記ポリペプチド配列を含んでなる融合タンパク質は、動物に投与される、または異なるタイプの細胞集団とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触される場合、前記細胞に特異的に向けられる。
【００２８】
用語「受容体」は「リガンド」と呼ばれる生物活性分子に結合する細胞関連タンパク質を意味する。「受容体」と「リガンド」の両方は、当業者に一般的に知られている。
【００２９】
本明細書で使用される、「内在化」は、分子または分子を含む構築物が細胞膜の外表面上の標的要素に結合し、結果として生じる複合体が細胞によって内在化される過程を表している。内在化後、細胞質内で、結果として生じる複合体の解離が起こってもよい。次に、標的要素は、分子または構築物とともに、特定の細胞区画に局在化してもよい。好ましくは、本発明のポリカチオン性ペプチドは、内在化促進に加えて、融合タンパク質のエンドソーム回避を促進するだろう。
【００３０】
さらに幅広い数の受容体特異的リガンドを伴う、広範な取り込み受容体および担体が、当該技術分野で知られている。
【００３１】
本発明のポリカチオンの標的となり得る受容体の非限定的な例には、アンジオテンシン受容体、ボンベシン受容体、ブラジキニン受容体、カルシトニン受容体、ケモカイン受容体、コレシストキニン受容体、コルチコトロピン放出因子受容体、エンドセリン受容体、エフリン受容体、ホルミルペプチド受容体、フリズルド受容体、ガラニン受容体、成長ホルモン分泌促進物質受容体（グレリン）受容体、キスペプチン受容体、メラノコルチン受容体、ニューロペプチドＦＦ／ニューロペプチドＡＦ受容体、ニューロペプチドＳ受容体、ニューロペプチドＷ／ニューロペプチドＢ受容体、ニューロペプチドＹ受容体、ニューロテンシン受容体、オレキシン受容体、ペプチドＰ５１８受容体、ソマトスタチン受容体、タキキニン受容体、Ｔｏｌｌ様受容体、バソプレッシンおよびオキシトシン受容体、およびＶＥＧＦ受容体、が含まれる。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様において、細胞表面上の受容体と特異的に相互作用し、前記細胞上の融合タンパク質の内在化を促進し得る配列を含んでなるポリカチオン性ペプチドは、ＣＸＣＲ４リガンドである。
【００３３】
本明細書で使用される、用語「ＣＸＣＲ４」は、Ｇタンパク質共役７回膜貫通ケモカイン受容体を表している。他のケモカイン受容体と同様に、ＣＸＣＲ４は、白血球の指向性遊走と活性化を媒介することにより、免疫反応および炎症反応において重要な役割を果たす。ＣＸＣＲ４は、乳癌、前立腺癌、肺癌、卵巣癌、大腸癌、膵臓癌、腎臓癌、脳癌、および非ホジキンリンパ腫や慢性リンパ性白血病を含むさまざまな癌細胞株や組織で発現または過剰発現している。ＣＸＣＲ４に対する唯一の公知のリガンドは、間質細胞由来因子１（ＳＤＦ−１またはＣＸＣＬ１２）である。ＣＸＣＲ４とＳＤＦ−１の相互作用は、腫瘍の成長、浸潤、血管新生、転移を含む、腫瘍形成の複数の段階で重要な役割を果たす。
【００３４】
本明細書で使用される、「ＣＸＣＲ４に特異的に結合する」という表現は、本発明のコンジュゲートが、より頻繁に、より迅速に、より長い持続時間でおよび／または、他の分子に実質的に結合しない代替となる受容体または細胞よりも、ＣＸＣＲ４またはそれを発現する細胞に対してより高い親和性で結合する能力を表している。
【００３５】
結合親和性は、例えば、Ｔａｍａｍｕｒａ等によって開示されているように、ペプチドをＣＸＣＲ４トランスフェクト細胞株（例えば、ＣＨＯ細胞）および標識ＣＸＣＲ４リガンド（例えば、１２５Ｉ−ＳＤＦ−１α）と接触させること、および標識ＣＸＣＲ４リガンドの結合に対する標的ペプチドの阻害割合の測定を含んでなるオイルクッション法（Ｈｅｓｓｅｌｇｅｓｓｅｔ  ｅｔ  ａｌ、１９９８、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６０：８７７−８８３参照）により測定される。
【００３６】
例えば、少なくとも約１０−４ＭのＫｄを有する低親和性標的化剤により特異的結合を示すことができる。例えば、ＣＸＣＲ４がリガンドに対して１より大きい結合部位を有する場合、低親和性を有するリガンドは標的化に有用であり得る。特異的結合は、また、高親和性リガンド、例えば、少なくとも約１０−７Ｍ、少なくとも約１０−８Ｍ、少なくとも約１０−９Ｍ、少なくとも約１０−１０ＭのＫｄを有するリガンドにより示すことができ、または約１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍまたはそれ以上のＫｄを有することができる。低および高親和性標的リガンドの両方が、本発明のコンジュゲートにおける組み込みに有用である。
【００３７】
ＣＸＣＲ４を発現する細胞により内在化される本発明のコンジュゲートの能力は、コンジュゲートがＧＦＰ等の蛍光タンパク質を含んでなる場合、蛍光法により便利に決定されてもよい。前記融合タンパク質は組換え核酸を調製することにより得ることができ、ここで、Ｔ２２ペプチドおよび蛍光タンパク質をコードする核酸はインフレームで融合され、適切な宿主細胞または生物で発現される。次に、融合タンパク質を、ＣＸＣＲ４を発現する細胞の培養物と接触させる、またはＣＸＣＲ４を発現する組織とｉｎ  ｖｉｖｏで適切な時間接触させた後、構築物が細胞に浸透したかどうか判断するため蛍光顕微鏡が使用されてもよい。細胞質における蛍光の存在は、蛍光タンパク質から得られる蛍光顕微鏡画像を公知の細胞質染色で得られた画像と比較することによりさらに調査されてもよい。
【００３８】
本明細書で使用される「エンドソーム脱出（endosomal escape）を促進する」という表現は、受容体媒介エンドサイトーシスによる内在化後のエンドソーム区画からの融合タンパク質の放出を誘導するポリカチオン性ペプチドの能力を表している。
【００３９】
本発明のさらにより好ましい実施態様では、ＣＸＣＲ４リガンドは、Ｔ２２ペプチド（配列番号５）、Ｖ１ペプチド（配列番号６）、ＣＸＣＬ１２ペプチド（配列番号７）、ｖＣＣＬ２ペプチド（配列番号８）またはその機能的に等価な多様体(variant)を含んでなる群から選択される。
【００４０】
Ｔ２２ペプチドは、タンパク質ポリフェムシンＩＩ（アメリカカブトガニ（Ｌｙｍｕｌｕｓ  ｐｏｌｙｐｈｅｍｕｓ）の血球破片から抽出された）に由来するペプチドに対応する。ｖＣＣＬ２は、ウイルスマクロファージ炎症性タンパク質ＩＩ、ヒトヘルペスウイルス８によってコードされたヒトケモカインＣＣＬ２の相同体に対応する。Ｖ１ペプチドは、ｖＣＣＬ２のＮ末端の残基１〜２１に対応する。間質細胞由来因子１（ＳＤＦ１）としても知られるＣＸＣＬ１２、Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフケモカイン１２は、炎症誘発性メディエーターとして機能するケモカインファミリーのメンバーである。Ｌｉａｎｇ，Ｘ、２００８、Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｓ．７２：９１−１１０．に示されているように、４つのペプチドはすべて、ＣＸＣＲ４受容体と相互作用することが知られている。
【００４１】
一つの実施態様では、標的化ペプチドは下記からなる群から選択される。
・配列ＲＲＸ１ＣＹＲＫＸ２ＰＹＲＸ３ＣＲ（配列番号９）を有するＴ１４０ペプチド（式中、Ｘ１はＬ−３−（２−ナフチル）アラニン、Ｘ２はＤ−Ｌｙｓ、およびＸ３はＬ−シトルリンである）、
・配列ＲＲＸ１ＣＹＸ２ＫＸ３ＰＹＲＸ４ＣＲ（配列番号１０）を有するＴＮ１４００３ペプチド（式中、Ｘ１がＬ−３−（２−ナフチル）アラニン、Ｘ２がＬ−シトルリン、Ｘ３がｄＬｙｓ、およびＸ４がＬ−シトルリンである）、
・配列ＲＲＸ１ＣＹＥＫＸ２ＰＹＲＸ３ＣＲ（配列番号１１）を有するＴＣ１４０１２ペプチド（式中、Ｘ１がＬ−３−（２−ナフチル）アラニンであり、Ｘ２がＤ−シトルリンであり、およびＸ３がＬ−シトルリンである）、
・配列ＲＲＸ１ＣＹＸ２ＫＸ３ＰＹＲＸ４ＣＲ（配列番号１２）を有するＴＥ１４０１１ペプチド（式中、Ｘ１がＬ−３−（２−ナフチル）アラニン、Ｘ２がＬ−シトルリン、Ｘ３がＤ−Ｇｌｕ、およびＸ４がＬ−シトルリンである）、および
・配列ＲＲＸ１ＣＹＸ２ＫＸ３ＰＹＲＸ４ＣＲ（配列番号１３）を有するＴＺ１４０１１ペプチド（式中、Ｘ１がＬ−３−（２−ナフチル）アラニン、Ｘ２がＬ−シトルリン、Ｘ３がＤ−Ｌｙｓ、およびＸ４がＬ−シトルリン、またはその多様体（式中、Ｎ末端アルギニン残基はアセチル化されている（Ａｃ−ＴＺ１４０１１として知られる）））。
【００４２】
用語「機能的多様体」および「機能的に同等な多様体」は互換性があり、本明細書では、ＣＸＣＲ４への結合および融合タンパク質の内在化の機能が実質的に維持されるという条件で、１つまたはそれ以上のアミノ酸の修飾、挿入、および／または欠失によるＴ２２、Ｖ１、ＣＸＣＬ１２、および／またはｖＣＣＬ２ペプチドに由来するすべてのペプチドとして理解される。
【００４３】
一つの実施態様において、カチオン性ポリペプチドの機能的に等価な多様体は、それぞれの配列番号に従って、ヒトＴ２２、Ｖ１、ＣＸＣＬ１２および／またはｖＣＣＬ２ペプチドに関して少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％を超える同一性の程度を示すものである。２つのアミノ酸配列間の同一性の程度は、従来の方法、例えば、ＢＬＡＳＴ等の現在の技術水準で知られている標準的な配列アラインメントアルゴリズムによって決定されることができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．ｉｏｌ．，１９９０  Ｏｃｔ  ５；２１５（３）：４０３−１０）。本発明のカチオン性ポリペプチドは、グリコシル化、アセチル化、イソプレニル化、ミリストイル化、タンパク質分解プロセシング等の翻訳後修飾を含んでもよい。
【００４４】
あるいは、カチオン性ポリペプチドの適切な機能的多様体は、１つまたはそれ以上の位置が、上記のＴ２２、Ｖ１、ＣＸＣＬ１２、および／またはｖＣＣＬ２ペプチドに存在するアミノ酸の保存的置換であるアミノ酸を含むものである。「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸を類似の構造的および／または化学的性質を有する別のアミノ酸で置換することにより生じる。例えば、下記の６つの群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含む、１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、および６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。前記保存的アミノ酸置換の選択は、当該技術における通常技術の一つの範囲内であり、例えば、Ｄｏｒｄｏらにより［Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、１９９９、２１７；７２１−７３９］、およびＴａｙｌｏｒらにより［Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，１９８６、１１９：２０５−２１８］で開示されている。
【００４５】
所定のペプチドがその機能的に等価な多様体とみなされるかどうかを判定するための適切なアッセイは、例えば、次の、推定Ｔ２２、Ｖ１、ＣＸＣＬ１２またはｖＣＣＬ２ペプチド多様体が、マーカーポリペプチド（例えば、蛍光タンパク質）とインフレームで融合しているアッセイである。前記融合タンパク質は、組換え核酸を調製することにより得ることができ、ここで、ペプチドおよび蛍光タンパク質をコードする核酸はインフレームで融合され、適切な宿主細胞または生物で発現される。次に、融合タンパク質を細胞ＣＸＣＲ４（例えば、ＨｅＬａ細胞）の培養物と適切な時間接触させ、その後、蛍光顕微鏡が、構築物が細胞に浸透したかどうかを判断するために使用されてもよい。ペプチドが対応するペプチドの機能的に同等な多様体である場合、マーカータンパク質は内在化され、細胞の細胞質内の蛍光の存在が可視となるだろう。さらに、機能的に同等な多様体の性能は、蛍光タンパク質から得られる蛍光顕微鏡画像を公知の細胞質染色液（例えば、ＤＡＰＩ）で得られた画像と比較することで評価されることができる。
【００４６】
（iii）ＧＷ−Ｈ１ペプチド
ＧＷ−Ｈ１ペプチドは、以前にＣｈｅｎおよび同僚によって開示された［Ｃｈｅｎ，Ｙ−Ｌ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ、２０１２、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、３６：２５７−２６５］。ＧＷ−Ｈ１ペプチドは抗菌ペプチドとして第一に選択されたが、細胞膜に結合し、それ自身細胞質に内在化し、真核細胞の核に移動する能力もまた特徴である。細胞内に入ると、ＧＷ−Ｈ１はアポトーシスを誘導し得る。ＧＷ−Ｈ１は両親媒性ヘリックスに折り畳まれることにより、細胞溶解活性を発揮することが提案されている［Ｃｈｅｎおよびｃｏｌｌｅａｇｕｅｓ、ｓｕｐｒａ］。したがって、このペプチドは、細胞膜への結合とその後の透過化からなる２つの連続した事象により、その細胞溶解効果を発揮すると考えられている。本発明の好ましい実施態様において、本発明のポリカチオン性ペプチドは、配列番号１４を有するＧＷ−Ｈ１ペプチドである。
【００４７】
（iv）ＣＤ４４リガンド
ＣＤ４４は、細胞間相互作用、細胞マトリックス相互作用、細胞接着および移動に関与する細胞表面膜貫通糖タンパク質である。ＣＤ４４は、炎症や癌等の疾患に関係している（Ｂａｊｏｒａｔｈ，Ｊ．２０００．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．３９：１０３−１１１）。多くのアイソフォームが知られ、それらは細胞特異的な方法で発現され、また特異的にグリコシル化されている。
【００４８】
したがって、「ＣＤ４４リガンド」は、ＣＤ４４に結合し得る分子である。ＣＤ４４は、細胞外マトリックスの成分であるヒアルロン酸の主要な表面受容体だが、フィブロネクチン、オステオポンチン、セルグリシン、コラーゲンおよびラミニンのヘパリン結合ドメインであるコンドロイチン硫酸等、他のリガンドがある。その上、ＣＤ４４はまたメタロプロテイナーゼおよびセレクチンとも相互作用できる。
【００４９】
本発明の実施態様において、本発明のポリカチオン性ペプチドはＣＤ４４リガンドである。本発明の好ましい実施態様において、ＣＤ４４リガンドは、Ａ５Ｇ２７（配列番号１５）およびＦＮＩ／ＩＩ／Ｖ（配列番号１６）からなる群から選択される。
【００５０】
ペプチドＦＮＩ／ＩＩ／Ｖは、フィブロネクチンのＨＢＦＮフラグメントＶに対応する。ペプチドＡ５Ｇ２７は、ラミニンのα５鎖のペプチドに対応する（Ｐｅｓａｒｒｏｄｏｎａ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ、２０１４、Ｉｎｔ．Ｊ．ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．４７３：２８６−２９５）。
【００５１】
（v）血液脳関門を通過できるペプチド
当該技術では、脳の病理に対する治療アプローチの開発に対する主要な障害の１つが血液脳関門（ＢＢＢ）であることはよく知られる。脳は、２つのバリアシステム、血液脳関門（ＢＢＢ）と血液脳脊髄液関門（ＢＣＳＦＢ）の存在により、潜在的に有毒な物質から保護されている。ＢＢＢは、その表面積がＢＣＳＦＢの表面積よりも約５０００倍大きいため、血清リガンドの主要な摂取経路であると考えられている。ＢＢＢを構成する脳内皮は、ＣＮＳの多くの障害に対する潜在的な薬物の使用に対する主要な障害を示している。原則として、小さな親油性分子のみがＢＢＢを通過、つまり、循環血液から脳へと通過する。より大きなサイズまたはより高い疎水性を有する多くの薬物は、ＣＮＳ障害を処置するための動物研究で有望な結果を示している。
【００５２】
したがって、「血液脳関門を通過することができるペプチド」は、それ自体を、それ自体が結合する任意の分子、好ましくはタンパク質、も同様に、血液急流からＣＮＳに輸送できるペプチドである。
【００５３】
１９８３年、ペプチド、β−カソモルフィン−５がＢＢＢを克服できることが報告された（Ｅｒｍｉｓｃｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ、１９８３、Ｊ．ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．４１：１２２９−１２３３）。それ以来、ＢＢＢ透過性を持つ他の多くのペプチドが同定、特性評価、カタログ化され、２０１２年にＶａｎ  Ｄｏｒｐｅらにより報告されたように、包括的なデータベースが確立された（Ｖａｎ  Ｄｏｒｐｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ、２０１２、Ｂｒａｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｆｕｎｃｔ．２１７：６８７−７１８）。前記のデータベースにリスト化されているペプチドのほとんどは、本発明の融合タンパク質に適している。
【００５４】
本発明の実施態様において、本発明のポリカチオン性ペプチドは、血液脳関門を通過することができるペプチドである。本発明の好ましい実施態様において、血液脳関門を通過することができるペプチドは、Ｓｅｑ−１−７（配列番号１７）、Ｓｅｑ−１−８（配列番号１８）、およびＡｎｇｉｏｐｅｐ−２−７（配列番号１９）からなる群から選択される。
【００５５】
（vi）細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）
用語「細胞透過性ペプチド」（ＣＰＰ）は、典型的には約５〜６０アミノ酸残基長のペプチドを表し、分子積荷（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃａｒｇｏ）、特にそれらが一部であるタンパク質の細胞取り込みを促進することができる。タンパク質は１つまたはそれ以上のＣＰＰを提示できる。ＣＰＰは、脂質二重層、細胞膜、オルガネラ膜、小胞膜、または細胞壁の１つまたはそれ以上を通過（ａｃｒｏｓｓ）／通過（ｔｈｒｏｕｇｈ）する分子積荷の移動または横断を促進できると特性評価されることもできる。本明細書のＣＰＰはポリカチオン性である。
【００５６】
本明細書で有用なＣＰＰの例、および一般的なＣＰＰのさらなる説明は、Ｓｃｈｍｉｄｔら（２０１０、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ、５８４：１８０６−１８ｌ３）、Ｈｏｌｍら（２００６、Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １：１００１−１００５）、Ｙａｎｄｅｋら（２００７、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．９２：２４３４−２４４４）、Ｍｏｒｒｉｓら（２００１、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１１７３−１１７６）および米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号において開示されている。ＣＰＰはトランスポーターや受容体に依存せず、他の細胞成分が関与する必要性なしに、脂質二重層を直接通過する、それらが一部であるタンパク質の輸送を促進する。
【００５７】
（vii）ヌクレオリン結合ペプチド
したがって、「ヌクレオリン結合ペプチド」は、細胞内のヌクレオリンタンパク質、好ましくはヌクレオリンの細胞表面発現画分に結合できるペプチドである。本発明の実施態様において、本発明のポリカチオン性ペプチドは、ヌクレオリン結合ペプチドである。
【００５８】
国際特許出願公開番号ＷＯ２０１１／０３１４７７Ａ２は、本発明の融合タンパク質での使用に適したヌクレオリン結合ペプチドの多数の例を提供している。
【００５９】
本発明の好ましい態様において、本発明のヌクレオリン結合ペプチドは、配列番号２０のペプチドまたは配列番号２１のペプチドである。
【００６０】
Ｂ．正に帯電したアミノ酸に富む領域
本明細書で使用される、用語「正に帯電したアミノ酸」または「第二の正に帯電したアミノ酸に富む領域」は、複数の正に帯電するアミノ酸含むことを特徴とするポリカチオン性領域または第一の正に帯電したアミノ酸に富む領域、とは異なるポリペプチド配列を表す。さらに、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、正に帯電したアミノ酸のみによって形成されてもよく、ｐＨ７の領域の全体の正味電荷が正であれば他のアミノ酸を含有してもよい。したがって、正に帯電したアミノ酸に富む領域配列は、正に帯電したアミノ酸残基としてその完全な配列のアミノ酸残基の、３３％、好ましくは４０％、好ましくは４５％、好ましくは５０％、好ましくは５５％、好ましくは６０％、好ましくは６５％、好ましくは７０％、好ましくは７５％、好ましくは８０％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、より好ましくは９５％、さらにより好ましくは９９％、さらにより好ましくは１００％を含んでもよい。
【００６１】
正に帯電したアミノ酸に富む領域は、１種類の正に帯電したアミノ酸のみを含んでもよく、それ以上の種類の正に帯電したアミノ酸を含んでもよい。一つの実施態様において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、ポリヒスチジン領域である。一つの実施態様において、正に帯電したアミノ酸に富む領域はポリアルギニン領域である。一つの実施態様において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、ポリヒスチジン領域である。一つの実施態様において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、リジンおよびアルギニン残基を含んでなる。一つの実施態様において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、リジンおよびヒスチジン残基を含んでなる。一つの実施態様において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、アルギニンおよびヒスチジン残基を含んでなる。一つの実施態様において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、リジン、アルギニン、およびヒスチジン残基を含んでなる。
【００６２】
いくつかの実施態様において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、または少なくとも１５の正に帯電したアミノ酸残基を含んでなり、ここで、正に帯電したアミノ酸はヒスチジン、リジン、アルギニンまたはそれらの組み合わせであることができる。
【００６３】
いくつかの実施態様において、正に帯電したアミノ酸が豊富な領域は、１００未満、９０未満、８０未満、７０未満、６０未満、５０未満、４０未満、３０未満、２９未満、２８未満、２７未満、２６未満、２５未満、２４未満、２３未満、２２未満、２１未満、２０未満、１９未満、１８未満、１７未満、１６未満、１５未満、１４未満、１３未満、１２未満、１１未満、１０未満またはより少ない正に帯電したアミノ酸残基を含んでなり、ここで、正に帯電したアミノ酸はヒスチジン、リジン、アルギニンまたはそれらの組み合わせであってもよい。
【００６４】
いくつかの実施態様において、正に帯電したアミノ酸が豊富な領域は、２〜５０個のアミノ酸、２〜４０個のアミノ酸、２〜３０個のアミノ酸、２〜２５個のアミノ酸、２〜２０個のアミノ酸、２〜１０個のアミノ酸、または２〜８個のアミノ酸を含んでなる。
【００６５】
いくつかの実施態様において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、３から５０個のアミノ酸、３から４０個のアミノ酸、３から３０個のアミノ酸、３から２５個のアミノ酸、３から２０個のアミノ酸、３から１０個のアミノ酸、または３〜８個のアミノ酸を含んでなる。いくつかの実施態様において、正に帯電したアミノ酸に富む領域は、４から５０個のアミノ酸、４から４０個のアミノ酸、４から３０個のアミノ酸、４から２５個のアミノ酸、４から２０個のアミノ酸、４から１０個のアミノ酸、または４〜８アミノ酸を含んでなる。いくつかの実施態様において、正に帯電したアミノ酸が豊富な領域は、５から５０個のアミノ酸、５から４０個のアミノ酸、５から３０個のアミノ酸、５から２５個のアミノ酸、５から２０個のアミノ酸、５から１０個のアミノ酸、または５〜８個のアミノ酸を含んでなる。
【００６６】
本発明の実施態様において、本発明の融合タンパク質の正に帯電したアミノ酸に富む領域はポリヒスチジン領域である。本発明の好ましい実施態様において、ポリヒスチジン領域は、２〜１０個の連続したヒスチジン残基を含んでなる。
【００６７】
本発明の実施態様において、本発明の融合タンパク質の正に帯電したアミノ酸に富む領域はポリアルギニン領域である。本発明の好ましい実施態様において、ポリアルギニン領域は、２〜１０個の連続したアルギニン残基を含んでなる。
【００６８】
本発明の実施態様において、本発明の融合タンパク質の正に帯電したアミノ酸に富む領域はポリリジン領域である。本発明の好ましい実施態様において、ポリリジン領域は、２〜１０個の連続したポリリジン残基を含んでなる。
【００６９】
Ｃ．融合タンパク質の要素と結合要素の相対位置
本発明の融合タンパク質の異なる要素（ポリカチオン性ペプチド、介在ポリペプチド領域、および正に帯電したアミノ酸に富む領域）は、ポリカチオン性ペプチドおよび正に帯電したアミノ酸に富む領域が融合タンパク質のいかなる位置でも機能的であり、介在ポリペプチド領域もまた全体的または部分的に機能的であれば、いかなる相対的な順序で配置されることもできる。
【００７０】
本明細書で使用される、用語、ポリペプチドの「Ｎ末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ）」、「Ｎ末端（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」、および「アミノ末端」は不明瞭である。同様に、用語「Ｃ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｅｎｄ）」、「Ｃ末端（Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」、および「カルボキシ末端」は同等と考えられる。これらの用語は、タンパク質に含まれるポリペプチド鎖の末端のアミノ酸の遊離部分に関して、当業者にとって一般的な使用法である。
【００７１】
したがって、本発明の実施態様において、融合タンパク質のポリカチオン性ペプチドはタンパク質のＮ末端に位置し、一方、融合タンパク質の正に帯電したアミノ酸に富む領域はタンパク質のＣ末端に位置する。本発明の別の実施態様において、融合タンパク質の正電に帯電したアミノ酸に富む領域はタンパク質のＮ末端に位置し、一方、融合タンパク質のポリカチオン性ペプチドはタンパク質のＣ末端に位置する。本発明の別の実施態様において、介在ポリペプチド領域は、融合タンパク質のＣ末端またはＮ末端のいずれかに配置されることができ、一方、ポリカチオン性ペプチドは融合タンパク質の中間位置、正に帯電したアミノ酸に富む領域は介在ポリペプチド領域の反対側の融合タンパク質の末端にある、または正に帯電したアミノ酸に富む領域は融合タンパク質の中間位置、ポリカチオン性ペプチドは介在ポリペプチド領域の反対側の融合タンパク質の末端に位置する。
【００７２】
したがって、本発明による融合タンパク質の要素の相対的順序は次のとおりであってもよい、
・Ｎ―ポリカチオン性ペプチド―介在領域ポリペプチド―正に帯電したアミノ酸に富む領域―Ｃ、
・Ｎ―正に帯電したアミノ酸に富む領域―介在領域ポリペプチド―ポリカチオン性ペプチド―Ｃ、
・Ｎ―ポリカチオン性ペプチド―正に帯電したアミノ酸に富む領域―介在領域ポリペプチド―Ｃ、
・Ｎ―正に帯電したアミノ酸に富む領域―ポリカチオン性ペプチド―介在領域ポリペプチド―Ｃ、
・Ｎ―介在領域ポリペプチド―ポリカチオン性ペプチド―正に帯電したアミノ酸に富む領域―Ｃ、または
・Ｎ―介在領域ポリペプチド―正に帯電したアミノ酸に富む領域―ポリカチオン性ペプチド―Ｃ。
【００７３】
用語「Ｎ末端」および「Ｃ末端」は、構成部分が直接端から端にコンジュゲートされている必要があることを意味するのではなく、リンカー／スペーサー等のいずれかの構成部分の末端にまたはそれらの要素の間に挿入されている追加要素が存在するかに関係なく、位置の相対的な順序を維持していることを意味する。
【００７４】
したがって、本発明の融合タンパク質は、前記の要素（（１）ポリカチオン性ペプチド、（２）介在ポリペプチド領域、および（３）正に帯電したアミノ酸に富む領域）を含んでなり、これらは端から端にコンジュゲートされることができ、しかしまた、好ましくはペプチド結合によってそれらの間に挿入された、連結された、１つまたはそれ以上の任意のペプチドまたはポリペプチド「リンカー」または「スペーサー」を含んでもよい。
【００７５】
本発明による、スペーサーまたはリンカーのアミノ酸配列は、構成部分（１）および（２）、並びに（２）および（３）の間のヒンジ領域として機能し、ペプチドスペーサーまたはリンカーの存在が、構成部分（１）、（２）、および（３）の機能を変更しないように、個々のドメインの３次元形態を維持しながら、互いに独立して移動できるようにする。この意味において、本発明による好ましい中間アミノ酸配列は、この運動を可能にする構造的延性により特徴付けられるヒンジ領域であるだろう。特定の実施態様において、前記中間アミノ酸配列は柔軟なリンカーである。リンカー領域の効果は、構成部分（１）および（２）、並びに（２）および（３）の間にスペースを提供することである。したがって、構成成分（１）、（２）または（３）の二次および三次構造は、他のいずれかの存在によって影響を受けないことが保証されている。スペーサーはポリペプチド性のものである。リンカーペプチドは、好ましくは、少なくとも２個のアミノ酸、少なくとも３個のアミノ酸、少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸、少なくとも４０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも６０個のアミノ酸、少なくとも７０個のアミノ酸、少なくとも８０個のアミノ酸、少なくとも９０個のアミノ酸、または約１００個のアミノ酸を含んでなる。
【００７６】
スペーサーまたはリンカーは、共有結合によって、好ましくはペプチド結合によって、本発明のコンジュゲートの２つの構成成分に隣接する構成成分に結合されることができ、また、好ましくは、スペーサーは本質的に非機能的であり、および／またはタンパク質分解性開裂を受けにくく、および／またはいかなるシステイン残基も含まない。同様に、スペーサーの三次元構造は、好ましくは線形または実質的に線形である。
【００７７】
スペーサーまたはリンカーペプチドの好ましい例には、結合ペプチドの機能を実質的に悪化させることなく、または少なくとも結合ペプチドの１つの機能を実質的に悪化させることなく、タンパク質を結合するために使用されるものが含まれる。より好ましくは、ペプチドを結合するために使用されるスペーサーまたはリンカーは、コイルドコイル構造を含んでなる。
【００７８】
リンカーペプチドの好ましい例は、グリシン、セリン、アラニン、およびトレオニンからなる群から選択される２つまたはそれ以上のアミノ酸を含んでなる。柔軟なリンカーの好ましい例は、ポリグリシンリンカーである。リンカー／スペーサー配列の可能な例には、ＳＧＧＴＳＧＳＴＳＧＴＧＳＴ（配列番号２２）、ＡＧＳＴＳＴＧＳＳＴＧＰＧＳＴＴ（配列番号２３）、またはＧＧＧＳＧＧＡＰ（配列番号２４）が含まれる。これらの配列は、設計されたコイルドコイルを他のタンパク質ドメインに結合するために使用されている（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｋ．Ｍ．，Ａｒｎｄｔ，Ｋ．Ｍ．およびＡｌｂｅｒ，Ｔ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２０００，３２８：２６１−２８１）。適切なリンカーのさらなる非限定的な例は、アミノ酸配列ＧＧＧＶＥＧＧＧ（配列番号２５）、マウスＩｇＧ３の上部ヒンジ領域の１０アミノ酸残基の配列（ＰＫＰＳＴＰＰＧＳＳ、配列番号２６）、これはコイルドコイルによるダイマー化抗体の生産に使用されている（Ｐａｃｋ，Ｐ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１：１５７９−１５８４）、配列ＡＰＡＥＴＫＡＥＰＭＴのペプチド（配列番号２７）、配列ＧＡＰのペプチド、配列ＡＡＡのペプチド、および配列ＡＡＡＬＥのペプチド（配列番号４６）を含んでなる。
【００７９】
あるいは、本発明のコンジュゲートの構成成分は、その配列がプロテアーゼの切断標的を含むペプチドにより連結されることができ、したがって、構成成分のいずれかの分離を可能にする。本発明のポリペプチドへのそれらの取り込みに適したプロテアーゼ切断部位には、エンテロキナーゼ（切断部位ＤＤＤＤＫ、配列番号２８）、Ｘａ因子（切断部位ＩＥＤＧＲ、配列番号２９）、トロンビン（切断部位ＬＶＰＲＧＳ、配列番号３０）、ＴＥＶプロテアーゼ（切断部位ＥＮＬＹＦＱＧ、配列番号３１）、ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ（切断部位ＬＥＶＬＦＱＧＰ、配列番号３２）、インテインなどが含まれる。
【００８０】
したがって、本発明の実施態様において、ポリカチオン性ペプチドは、リンカーを介して介在ポリペプチド領域に結合する。本発明の別の実施態様において、介在ポリペプチド領域は、リンカーを介して正に帯電したアミノ酸に富む領域に結合する。本発明のさらに別の実施態様において、ポリカチオン性ペプチドはリンカーを介して介在ポリペプチド領域に結合し、介在ポリペプチド領域もまたリンカーを介して正に帯電したアミノ酸に富む領域に結合する。
【００８１】
当業者が認めるであろうように、ポリカチオン性ペプチドを介在ポリペプチド領域に、および介在ポリペプチド領域を正に帯電したアミノ酸に富む領域に連結するリンカーは、リンカーの存在および／または配列がポリカチオン性ペプチド、介在ポリペプチド領域、および／または正に帯電したアミノ酸に富む領域の機能的変化をもたらさないという前記の制限を伴い（例えば、これらに限定されるわけではないが、融合タンパク質の二次もしくは三次構造の修飾、またはジスルフィド結合の形成による）、同じ配列または異なる配列を含んでもよい。
【００８２】
融合タンパク質の要素のＮ末端からＣ末端までの相対位置に関する前記の考慮事項はまた、それらの間にあるリンカーの存在下で、それらの数または間に配置される要素と無関係に適用される。したがって、可能な要素の組み合わせ、および相対的な順序は次のようになる（式中、要素についての上記の番号は保持される。（１）ポリカチオン性ペプチド、（２）介在ポリペプチド領域、（３）正に帯電したアミノ酸に富む領域）。
・      Ｎ−（１）−（２）−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−リンカー−（２）−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−（２）−リンカー−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−リンカー−（２）−リンカー−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−（２）−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−リンカー−（２）−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−（２）−リンカー−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−リンカー−（２）−リンカー−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−（１）−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−リンカー−（１）−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−（１）−リンカー−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−リンカー−（１）−リンカー−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−（３）−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−リンカー−（３）−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−（３）−リンカー−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−リンカー−（３）−リンカー−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−（３）−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−（３）−リンカー−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−リンカー−（３）−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−リンカー−（３）−リンカー−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−（１）−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−リンカー−（１）−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−（１）−リンカー−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−リンカー−（１）−リンカー−（２）−Ｃ
【００８３】
本発明の好ましい実施態様において、本発明の融合タンパク質のリンカーはＧＧＧＮＳ配列（配列番号３４）の配列ＧＧＳＳＲＳＳ（配列番号３３）配列を含んでなる。
【００８４】
Ｄ．介在ポリペプチド領域
用語「介在ポリペプチド領域」および「介在領域」は、本明細書では同等と考えられる。
【００８５】
本発明の融合タンパク質の介在ポリペプチド領域は、生理的学機能性ペプチドを含んでなり、細胞成分とのその相互作用が生理学的変化をもたらすことを意味する。しかしながら、介在ポリペプチド領域は、本発明の融合タンパク質に組み込まれると、生理学的に機能的である必要はない。したがって、本発明にしたがった融合タンパク質の異なる要素を連結するリンカー領域は、介在領域とは考えられない。したがって、好ましい実施態様において、介在領域は少なくとも５個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個、少なくとも１００個、またはそれ以上のアミノ酸を含んでなる。
【００８６】
好ましい実施態様において、介在ポリペプチド領域は、本発明の融合タンパク質に組み込まれると生理学的機能が低下する生理学的機能ペプチド、または断片、またはその変異体である。別の実施態様において、介在ポリペプチド領域は、本発明の融合タンパク質に組み込まれるといかなる生理学的機能も持たない。別の好ましい実施態様において、介在ポリペプチド領域は、本発明の融合タンパク質に組み込まれる前の野生型生理学的機能ポリペプチドと比較して、生理学的機能がすでに低下している生理学的機能ポリペプチドの断片、または変異体である。さらに好ましくは、介在ポリペプチド領域は、不活性化変異の存在のために、本発明の融合タンパク質の一部を形成しない場合、いかなる生理学的機能も既に持たないタンパク質である。
【００８７】
本発明の融合タンパク質の介在ポリペプチド領域は、治療薬に結合しているタンパク質である。
【００８８】
治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）に関して本明細書で使用される、用語「治療的（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」は、一般的な意味で使用され、治療薬（ｔｒｅａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）、予防薬（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、および代替薬（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｇｅｎｔｓ）を含む。
【００８９】
ポリカチオン性ペプチドおよび正に帯電したアミノ酸に富む領域をもつ本発明の融合タンパク質の一部であるため、介在領域の性質は、治療薬に関する場合を除いて、実質的にポリペプチド性である。融合タンパク質にコンジュゲートされた治療薬は、その化学構造に限定されないことが意図される。
【００９０】
本発明の実施態様において、融合タンパク質の介在領域は、蛍光タンパク質、アルブミン、ニドゲン(nidogen)、絨毛性ゴナドトロピン、およびシスタチンからなる群から選択される。
【００９１】
本明細書で使用される「蛍光タンパク質」は、その原子構造により蛍光を提示することができ、それは当該技術において公知の現象である、タンパク質に関連する。本発明の融合タンパク質に適した一般的に使用される蛍光タンパク質の非限定的な例は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａで最初に発見）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、シアン蛍光タンパク質、または任意の他の多様体であり、これらの例は、Ｋｒｅｍｅｒｓら（Ｋｒｅｍｅｒｓ，Ｇ−Ｊ−ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１２４：１５７−１６０）において見出されることができる。
【００９２】
本発明の融合タンパク質に適した蛍光タンパク質の追加の非限定的な例は、強化緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）、強化シアン蛍光タンパク質ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、強化ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、エメラルド、トパーズ（ＴＹＦＰ）、ビーナス、シトリン、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、セルリアン、Ｔ−サファイア、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−モノマー、Ｊ−Ｒｅｄ、ダイマー２、ｔ−ダイマー２（１２）、ｍＲＦＰｌ、ポシロポリン、レニラＧＦＰ、モンスターＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、カエデタンパク質およびキンドリングタンパク質、Ｂ−フィコエリスリン、Ｒ−フィコエリスリンおよびアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質およびフィコビリタンパク質コンジュゲート、である。他の実施態様において、介在ポリペプチドは、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅｌ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９０５−９０９）、等からなる群から選択される蛍光タンパク質である。
【００９３】
好ましい実施態様において、本発明の融合タンパク質の介在領域の蛍光タンパク質はＧＦＰ（配列番号３５）である。
【００９４】
本明細書で使用される「アルブミン」は、動物、特に哺乳動物の血漿に一般的に見られる水溶性の非グリコシル化球状タンパク質を表す。好ましい実施態様において、融合タンパク質の介在領域のタンパク質はアルブミンであり、より好ましくはヒトアルブミン（配列番号３６）である。
【００９５】
本明細書で使用される「ニドゲン」は、基底膜に位置する硫酸化モノマー糖タンパク質である、以前はエンタクチンとして知られている、ニドゲンファミリーの任意のタンパク質に関する。
【００９６】
本発明のより好ましい実施態様において、融合タンパク質の介在領域のタンパク質は、ヒトニドゲン１（ＮＩＤ１、配列番号３７）およびヒトニドゲン２（ＮＩＤ２、配列番号３８）からなる群から選択される。
【００９７】
本明細書で使用される「絨毛性ゴナドトロピン」（ＧＣ）は、受精卵移植後に哺乳動物の胎盤で産生される糖タンパク質およびホルモンを表している。ヒト絨毛性ゴナドトロピンは、２つのサブユニット、アルファ（α）およびベータ（β）を提示する。２つのサブユニットのいずれか１つが別々に、および両方が一緒に、本発明の目的に適していることが意図されている。
【００９８】
したがって、本発明の別の実施態様において、融合タンパク質の介在領域のタンパク質は絨毛性ゴナドトロピンである。
【００９９】
本発明の別の好ましい実施態様において、融合タンパク質の介在領域のタンパク質は、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＧＣ、配列番号３９）である。
【０１００】
本明細書で使用されるシスタチンという用語は、ペプチダーゼファミリーＣ１（パパインファミリー）およびＣ１３（レグマインファミリー）に属するペプチダーゼ酵素の活性を阻害することができるシスタチンとして知られるプロテアーゼ阻害剤ファミリーのメンバーを表している。好ましい実施態様において、シスタチンは、シスタチンＡ、シスタチンＢ、シスタチンＣ、シスタチンＤおよびシスタチンＭからなる群から選択される。さらに別の好ましい実施態様において、シスタチンは、ステフィンＡとしてもまた知られる、シスタチンＡである。好ましい実施態様において、ステフィンＡは、配列番号４０の配列を有するヒト起源のものである。さらに別の実施態様において、シスタチンは、Ｇ４Ｗ、Ｇ４Ｒ、Ｖ４８Ｄ、Ｖ４８Ｌ、Ｇ５０Ｓ、Ｋ７１Ｎ、Ｓ７２Ｇ、Ｌ７３Ｐ、Ｌ８２Ｒ、Ｔ８３Ｓ変異からなる群から選択される１つまたはそれ以上の変異を有するステフィンＡ多様体である。他の実施態様において、ステフィンＡ多様体は、配列番号４０に示される配列に関して下記の変異を含有する。
・Ｗｏｏｄｗａｒｄら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００５）３５２，１１１８−１１３３）およびＨｏｆｆｍａｎら（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｄｅｓｉｇｎ＆Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｖｏｌ．２３  ｎｏ．５  ｐｐ．４０３−４１３，２０１０）にＳＴＭ変異体として定義された変異体に対応するＧ４Ｗ、Ｖ４８Ｄ、Ｋ７１Ｎ、Ｓ７２Ｇ、およびＬ７３Ｐ。
・前出のＨｏｆｆｍａｎらにＳＱＭ変異体として定義された変異体に対応するＧ４Ｒ、Ｖ４８Ｌ、Ｇ５０Ｓ、Ｋ７１Ｎ、Ｓ７２Ｇ、Ｌ７３Ｐ、Ｌ８２ＲおよびＴ８３Ｓ。
・前出のＨｏｆｆｍａｎらにＳＵＮ変異体として定義された変異体に対応するＧ４Ｒ。
・前出のＨｏｆｆｍａｎらにＳＵＭ変異体として定義された変異体に対応するＶ４８ＬおよびＧ５０Ｓ。
・前出のＨｏｆｆｍａｎらにＳＵＣ変異体として定義された変異体に対応するＫ７１Ｎ、Ｓ７２Ｇ、Ｌ７３Ｐ、Ｌ８２ＲおよびＴ８３Ｓ。
・前出のＨｏｆｆｍａｎらにＳＤＭ変異体として定義された変異体に対応するＶ４８Ｌ、Ｇ５０Ｓ、Ｋ７１Ｎ、Ｓ７２Ｇ、Ｌ７３Ｐ、Ｌ８２ＲおよびＴ８３Ｓ。
【０１０１】
介在領域の構成成分として使用されることができる他の適切なポリペプチドおよびタンパク質には、生物学的に非反応性のペプチドまたはタンパク質も同様、それ自体で生理学的または生物学的活性のないポリペプチドまたはタンパク質が含まれる。
【０１０２】
本発明の別の実施態様において、融合タンパク質の介在領域のタンパク質は不活性タンパク質である。
【０１０３】
本明細書で使用する「不活性タンパク質」とは、既知の生理学的または生物学的活性のない、または生物学的機能のために他の高分子と特異的に相互作用する能力のないポリペプチドまたはタンパク質またはタンパク質の断片またはドメイン、および既知の治療活性（例えば、抗腫瘍活性）を欠くタンパク質の断片またはドメインを表している。融合タンパク質の一部である不活性タンパク質は非反応性であり、治療薬の結合のための物理的構造として機能する。不活性タンパク質は、固有の酵素的、生理学的、または生物学的活性をそれ自体で有するいかなるモチーフも含まず、免疫反応性を示さない、適応免疫反応も生来免疫反応も刺激しないこと意味している、ことが意図されている。
【０１０４】
一般に、融合タンパク質の介在領域のタンパク質が関連する場合、前記タンパク質の固有の活性は本発明の目的には関連がなく、治療薬の生物学的活性に寄与も妨害もしないことが意図されている。
【０１０５】
特定の実施態様において、本発明の融合タンパク質の介在ポリペプチドは、このセクションＤの実施態様のいずれかに開示されているタンパク質のいずれかの断片である。
【０１０６】
別の好ましい実施態様において、本発明の融合タンパク質の介在ポリペプチドは、このセクションＤの実施態様のいずれかに開示されているタンパク質のいずれかの変異体である。
【０１０７】
Ｅ．治療薬
本明細書で使用される、用語「治療薬」は、化学構造の制限なしに、状態、障害または疾患の治療および／または処置に適した任意の化合物を明示する。
【０１０８】
治療薬の性質は、融合タンパク質中で活性のままであるか、または細胞の内部に送達されると活性化され得る限り、本発明にとって特に限定的ではない。したがって、活性を示すか、コンジュゲートされていない治療薬の活性の少なくとも１００％、少なくとも９０％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、またはそれ以下で細胞内に送達されると活性に達することができるという条件で、いかなる治療薬も融合タンパク質において使用されることができる。あるいは、本発明の目的は、その選択性を高め、オフターゲット効果を減らすことにより治療薬の作用を促進することであるため、融合タンパク質にコンジュゲートされた治療薬の効果は相乗的であり、特定の治療薬についての既知のパラメータ化された値を超えてもよいと考えられる。したがって、本発明の融合タンパク質にコンジュゲートされた治療薬のいくつかの実施態様はまた、治療薬単独の機能の少なくとも１０１％、少なくとも１０５％、少なくとも１１０％、少なくとも１１５％、少なくとも１２０％、少なくとも１２５％、少なくとも１３０％、少なくとも１３５％、少なくとも１４０％、少なくとも１４５％、少なくとも１５０％、少なくとも１７５％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％、少なくとも５００％、少なくとも１０００％、またはそれ以上、を示すことが意図されている。
【０１０９】
本発明の実施態様において、本発明の融合タンパク質の介在領域の治療薬は、下記からなる群から選択される。
（i）化学療法薬、
（ii）細胞傷害性ポリペプチド、
（iii）抗血管新生ポリペプチド、
（iv）腫瘍抑制遺伝子によってコードされるポリペプチド、
（v）プロアポトーシスポリペプチド、
（vi）抗転移活性を有するポリペプチド、
（vii）腫瘍に対する免疫応答を活性化できるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（viii）抗血管新生分子、および
（ix）毒素。
【０１１０】
（i）化学療法薬
用語「化学療法薬」は、抗癌剤を表すことが理解されるだろう。
【０１１１】
本明細書で使用される抗癌剤は、たとえ短期であっても、癌に関連する症状の全体または一部を阻害することを含む、癌の発生または進行を少なくとも部分的に阻害する薬剤である。
【０１１２】
いくつかの抗癌剤はＤＮＡ損傷剤として分類でき、これらには、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシド、ランプトテシン、トポテカン、テニポシド、ミトキサントロン）、ＤＮＡアルキル化剤（例えば、シスプラチン、メクロレタミン、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン、コランブシル、ブスルファン、チオテパ、カルムスチン、ロムスチン、カルボプラチン、ダカルバジン、プロカルバジン）、ＤＮＡ鎖切断誘導剤（例えば、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ）、抗微小管剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン）、抗代謝剤（例えば、シタラビン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、６−チオグアニン、６−メルカプトプリン、フルダラビン、ペントスタチン、クロロデオキシアデノシン）、アントラサイクリン、ビンカアルカロイド、またはエピポドフィロトキシンが含まれる。
【０１１３】
抗癌剤の追加の例には、アシビシン、アクラルビシン、アコダゾール塩酸塩、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩化ビサントレン、ビスナフィドジメシレート、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ボルテゾミブ（ベルケイド）、ブレキナールナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カーベタイマー、カルボプラチン（白金含有レジメン）、カルムスチン、カルビシン塩酸塩、カルゼレシン、セデフィンゴール、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン（白金含有レジメン）、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、ジアジコン、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン、ドロロキシフェン、ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロメイト、エピプロピジン、エピルビシン、エルブロゾール、エルロチニブ（タルセバ）、エソルビシン、エストラムスチン、エタニダゾール、エトポシド、エトプリン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、フルロシタビン、ホスキドン、フォストリシン、ゲフィチニブ（イレッサ）、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イルモフォシン、メシル酸イマチニブ（グリーバク）、インターフェロンα−２ａ、インターフェロンα−２ｂ、インターフェロンα−ｎｌ、インターフェロンα−ｎ３、インターフェロンβ−Ｉａ、インターフェロンγ−Ｉｂ、イプロプラチン、イリノテカン、ランレオチド、レナリドマイド（レブリミド、レビミド）、レトロゾール、ロイプロリド、リアロゾール、ロメトレキソール、ロムスチン、ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、メクロレタミン、メゲストロール、メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトプリン、メツレデパ、ミチンドマイド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスパー、ミトタン、ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペメトレキセド（アリムタ）、ペガスパルガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、ペントモン、ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、イセチオン酸ピリトレキシム、ピロキサントロン、プリカマイシン、プルメスタン、ポルフィマー、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロカルバジン、ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、セムスチン、シムトラゼン、シトグルシド、スパルフォセート、スパルソマイシン、スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌール、タリスマイシン、タムスロシン、タキソール、タキソテール、テコガラン、テガフール、テロキサントロン、テモポルフィン、テモゾロミド（テモダール）、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、サリドマイド（サロミド）およびその誘導体、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、トポテカン、トレミフェン、トレストロン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、ツブロゾール、ウラシル、マスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビネピジン、ヴィングリシナート、ビンレウロシン、ビノレルビン、ビンロシジン、ビンゾリジン、ヴォロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、ゾルビシンが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１４】
一つの実施態様において、抗癌剤は、抗癌分子のいくつかのユニットを含有するオリゴマーとして提供される。一つの実施態様において、抗癌剤は、いくつかのフロクスウリジン分子を含んでなる、フロクスウリジンポリ、またはオリゴヌクレオチドである。フロクスウリジンポリまたはオリゴヌクレオチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上のフロクスウリジン分子を含有する。好ましい実施態様において、フロクスウリジンポリヌクレオチドは、フロクスウリジンペンタヌクレオチド、すなわち、５つのフロクスウリジン分子を含有するオリゴヌクレオチドである。
【０１１５】
抗癌剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤、ＭＡＰキナーゼ阻害剤、またはＥＧＦＲ阻害剤を含むが、これらに限定されない、酵素阻害剤であってもよい。チロシンキナーゼ阻害剤は、限定されるわけではないが、ゲニステイン（４’、５、７−トリヒドロキシイソフラボン）、チルホスチン２５（３，４，５−トリヒドロキシフェニル）、メチレン］−プロパンジニトリル、ハービマイシンＡ、ダイゼイン（４’、７−ジヒドロキシイソフラボン）、ＡＧ−１２６、トランス−１−（３’−カルボキシ−４’−ヒドロキシフェニル）−２−（２”、５”−ジヒドロキシ−フェニル）エタン、またはＨＤＢＡ（２−ヒドロキシ５−（２，５−ジヒドロキシベンジルアミノ）−２−ヒドロキシ安息香酸であってもよい。ＣＤＫ阻害剤は、限定されるわけではないが、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ｐ１５、ｐ１６、ｐ１８、またはｐ１９であってもよい。ＭＡＰキナーゼ阻害剤は、限定されるわけではないが、ＫＹ１２４２０（Ｃ２３Ｈ２４Ｏ８）、ＣＮＩ−１４９３、ＰＤ９８０５９、または４−（４−フルオロフェニル）−２−（４−メチルスルフィニルフェニル）−５−（４−ピリジル）１Ｈ−イミダゾールであってもよい。ＥＧＦＲ阻害剤は、限定されるわけではないが、エルロチニブ（タルセバ）、ゲフィチニブ（イレッサ）、ＷＨＩ−Ｐ９７（キナゾリン誘導体）、ＬＦＭ−Ａ１２（レフルノミド代謝物アナログ）、ＡＢＸ−ＥＧＦ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＺＤ−６４７４（ザクティマ）、ＡＥＥ７８８、およびＡＧ１４５８であってもよい。
【０１１６】
抗癌剤は、限定されるわけではないが、ベバシズマブ（アバスチン）、ラニビズマブ（ルセンティス）、ペガプタニブ（マクジェン）、ソラフェニブ、スニチニブ（サテン）、バタラニブ、ＺＤ−６４７４（ザクティマ）、アネコルタブ（レタネ）、乳酸スクアラミン、およびをセマフォリン含むＶＥＧＦ阻害剤であってもよい。抗癌剤は、これらに限定されないが、ベバシズマブ（アバスチン）、トラスツズマブ（ハーセプチン）、アレムツズマブ（キャンパス、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病に適応）、ゲムツズマブ（マイロターグ、ｈＰ６７．６、抗ＣＤ３３、急性骨髄性白血病等の白血病に適応）、リツキシマブ（リツキサン）、トシツモマブ（ベキサール、抗ＣＤ２０、Ｂ細胞悪性腫瘍に適応）、ＭＤＸ−２１０（二重特異性抗体ＨＥＲ−２／ｎｅｕ癌遺伝子タンパク質生成物および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）（ＦｃガンマＲＩ）のＩ型Ｆｃ受容体）、オレゴボマブ（オバレクス、卵巣癌に適応）、エドレコロマブ（パノレクス）、ダクリズマブ（ゼナパクス）、パリビズマブ（シナジス、ＲＳＶ感染等の呼吸器状態に適応）、イブリツモマブチキセタン（ゼバリン、非ホジキンリンパ腫に適応）、セツキシマブ（エルビタックス）、ＭＤＸ−４４７、ＭＤＸ−２２、ＭＤＸ−２２０（抗ＴＡＧ−７２）、Ｉ０Ｒ−Ｃ５、１０Ｒ−Ｔ６（抗ＣＤ  １）、ＩＯＲ  ＥＧＦ／Ｒ３、セロゴバブ（ＯＮＣＯＳＣＩＮＴ  ＯＶ  １０３）、エプラツズマブ（リンフォシド）、ペムツモマブ（Ｔｈｅｒａｇｙｎ）、およびグリオマブ−Ｈ（脳腫瘍、黒色腫に適応）を含むがこれらに限定されない抗体または抗体断片を含む抗体または抗体断片であってもよい。
【０１１７】
本発明の特定の実施態様において、血管新生阻害剤として作用するタンパク質は腫瘍に標的とされることが企図される。これらの薬剤には、上記の抗血管新生ポリペプチドに加えて、マリマスタット、ＡＧ３３４０、ＣＯＬ−３、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、２−メトキシエストラジオール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、ペントサンポリサルフェート、アンジオポエチン２（レジェネロン）、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アクチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４またはミノサイクリンが含まれる。
【０１１８】
他の適切な活性剤は、ＤＮＡ切断剤である。方法の実施に使用されるコンジュゲートに細胞毒素として含めるのに適したＤＮＡ切断剤の例には、限定されるわけではないが、アントラキノン−オリゴピロール−カルボキサミド、ベンズイミダゾール、レイナマイシン、ダインマイシンＡ、エンジイン、またはその生物学的に活性なアナログまたは誘導体（すなわち、実質的に同等の生物学的活性を有するもの）が含まれる。既知のアナログおよび誘導体は、例えば、Ｉｓｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３４  ２９５４−６１，１９９１、Ｓｋｉｂｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：７８−９２，１９９４、Ｂｅｈｒｏｏｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１５６８−７４，１９９６、Ｈｅｌｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ．１１：５２７−５１，１９９６、Ｕｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４５：１２５−３３，１９９７、Ｕｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５：９０３−１９，１９９７、Ｕｎｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，５：  ８８３−９０１，１９９７、およびＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：１８９０−７，１９９８に開示されている。他の例には、限定されるわけではないが、エンジインキノンイミン（米国特許第５，６２２，９５８号）、２，２ｒ−ビス（２−アミノエチル）−４−４’−ビチアゾール（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｉｎｔ．４０：１５１−７，１９９６）、エピリチシン−サレン銅コンジュゲート（Ｒｏｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，８：７８９−９２，１９９７）が含まれる。
【０１１９】
前記の化学療法薬のいくつかは、代謝拮抗薬として共通のカテゴリーに分類されることができる。本明細書で使用される「代謝拮抗薬」は、正常な代謝の一部である代謝生成物の使用を阻害する化合物を表している。代謝拮抗薬は、葉酸の使用を妨げる葉酸拮抗薬等、妨げる代謝生成物と構造が似ていることがしばしばある。代謝拮抗薬の非限定的な例には、次の化合物が含まれる：ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルムスチン、カルボプラチン、クロロデオキシアデノシン、シスプラチン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イホスファミド、イリノテカン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサートマイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、プロカルバジン、ＳＮ−３８、チオグアニン、チオテパ、テニポシドビンブラスチン、ビンクリスチン、およびビノレルビン。
【０１２０】
（ii）細胞傷害性ポリペプチド
本明細書で使用される、用語「細胞傷害性ポリペプチド」は、細胞機能を阻害し得る薬剤を表している。薬剤は、増殖を阻害してもよく、または細胞に有毒であってもよい。細胞に内在化されたとき細胞代謝を妨げるまたは有害に変更する、または任意の方法で細胞の成長または増殖を阻害する、いかなるポリペプチドも、この用語の範囲内に含まれ、限定されるわけではないが、細胞に輸送されたときに毒性効果が媒介される薬剤であり、また、細胞表面で毒性効果が媒介される薬剤である。有用な細胞毒性ポリペプチドには、細菌毒素等のタンパク質性毒素が含まれる。
【０１２１】
本発明によるコンジュゲートへの組み込みに有用なタンパク質性細胞毒素の例には、限定されるわけではないが、１型および２型リボソーム不活性化タンパク質（ＲＩＰ）が含まれる。有用なタイプ１植物ＲＩＰには、限定されるわけではないが、ダイアンチン３０、ダイアンチン３２、リクニン、サポリン１〜９、ヤマゴボウ活性化タンパク質（ＰＡＰ）、ＰＡＰＩＩ、ＰＡＰ−Ｒ、ＰＡＰ−Ｓ、ＰＡＰ−Ｃ、マパルミン、ドデカンドリン、ブリオジンＬ、ブリオジン、コリシン１および２、ルフィンＡ、ルフィンＢ、ルフィンＳ、１９Ｋタンパク質合成阻害タンパク質（ＰＳＩ）、１５Ｋ−ＰＳＩ、９Ｋ−ＰＳＩ、αキリロビン、βキリロビン、ゲロニン、モモルジン、モモルジンＩＩ、モモルジンＩｃ、ＭＡＰ−３０、αモモルカリン、βモモルカリン、トリコサンチン、ＴＡＰ−２９、トリチョキリン、大麦ＲＩＰ、亜麻ＲＩＰ、トリチン、コーンＲＩＰ、アスパリン１および２（Ｓｔｉｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：４０５−１２）が含まれる。有用なタイプ２ＲＩＰには、限定されるわけではないが、ボルケンシン、リシン、ニグリン−ｂ、ＣＩＰ−２９、アブリン、モデシン、エブリチン−α、エブリチン−β、エブルチン−γ、バークミン、ポレクチン、またはその生物学的に活性な酵素サブユニット（Ｓｔｉｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０：４０５−１２、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３３１−５４、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，１９９４．Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１９８：２７−４５、およびＳａｎｄｖｉｇ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓ，１９９６．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６：９４９−６６）が含まれる。
【０１２２】
細胞毒素として有用な細菌毒素の例には、限定されるわけではないが、志賀毒素および志賀様毒素（すなわち、同じ活性または構造を有する毒素）、またはその触媒サブユニットおよび生物学的に機能する断片が含まれる。これらの細菌毒素はまたタイプ２ＲＩＰである（Ｓａｎｄｖｉｇ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｕｒｓ，１９９６．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７６：９４９−６６、Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，１９９５．Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１７１：１０４２−５、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４１：８０５−８、およびＳｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．２４：１１７−２２）。有用な細菌毒素の追加の例には、限定されるわけではないが、シュードモナス外毒素およびジフテリア毒素が含まれる（Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３３１−５４、およびＢｒｉｎｋｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，１９９４．Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１９８：２７−４５）。毒素酵素サブユニットの切断型および変異体もまた細胞毒素部分として使用されることができる（Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３３１−５４、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１９８：２７−４５，１９９４、Ｍｅｓｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：４８５２−６２，１９９３、Ｓｋｉｎｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．２４：１１７−２２，１９９８、および米国特許第５，０８２，９２７号）。他の標的薬剤には、限定されるわけではないが、コリシンＡ、Ｂ、Ｄ、Ｅ１−９、クロアシンＤＦ１３および真菌ＲＮａｓｅ、α−サルシンを含む３４より大きい、開示されたＲＮａｓｅ毒素のコリシンファミリーが含まれる（Ｏｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：２０９７−１００、Ｓｍａｒｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８．  Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ（Ｐｒａｈａ）４３：５６３−８２、Ｗｏｏｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１７：２６６−６９）。
【０１２３】
（iii）抗血管新生ポリペプチド
腫瘍細胞の増殖は、癌の進行に伴う広範な腫瘍血管新生に大きく依存している。したがって、抗血管新生剤による新しい血管形成の阻害、および既存の血管の標的破壊は、腫瘍処置への効果的で比較的非毒性のアプローチとして導入されている。
【０１２４】
本明細書で使用される、用語「抗血管新生ポリペプチド」は、血管新生を阻害することができるポリペプチドを意味する。適切な抗血管新生ポリペプチドには、限定されるわけではないが、アンジオスタチン、エンドスタチン、抗血管新生抗トロンビンＩＩＩ、ＷＯ２００７１１５３７６に開示のｓＦＲＰ−４、およびアニビズマブ、ベバシズマブ（アバスチン）、Ｆａｂ  ＩＭＣ１１２１およびＦ２００  Ｆａｂ等の抗ＶＥＧＦ抗体が含まれる。
【０１２５】
（iv）腫瘍抑制遺伝子によってコードされるポリペプチド
本明細書で使用される「腫瘍抑制因子（ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ）」は、細胞の無秩序な成長を抑制する通常の生物学的役割を有する遺伝子または遺伝子産物である。腫瘍抑制因子の機能的対応物は、正常な細胞増殖を促進する遺伝子は「原癌遺伝子」として知られていてもよい癌遺伝子である。そのような遺伝子または遺伝子生成物を活性化する突然変異はさらにそれを、細胞増殖活動を、しかし調節不全の方法で継続する「癌遺伝子」に変換する。腫瘍抑制遺伝子および遺伝子生成物の例は文献でよく知られており、ＰＴＣ、ＢＲＣＡ１、ＢＲＣＡ２、ｐ１６、ＡＰＣ、ＲＢ、ＷＴ１、ＥＸＴ１、ｐ５３、ＮＦ１、ＴＳＣ２、ＮＦ２、ＶＨＬ、ＳＴ７、ＳＴ１４、ＰＴＥＮ、ＡＰＣ、ＣＤ９５またはＳＰＡＲＣが含まれてもよい。
【０１２６】
（v）プロアポトーシスポリペプチド
本明細書で使用される、用語「プロアポトーシスポリペプチド」は、細胞または細胞集団において細胞死を誘導することができるタンパク質を表している。アポトーシスに関与するこれらのタンパク質の過剰発現は、抗アポトーシス因子とプロアポトーシス因子の慎重なバランスを、アポトーシスの結果に向かって、置き換える。適切なプロアポトーシスポリペプチドには、限定されることなく、ＢＡＸ、ＢＡＫ、ＢＯＫ／ＭＴＤ、ＢＩＤ、ＢＡＤ、ＢＩＫ／ＮＢＫ、ＢＬＫ、ＨＲＫ、ＢＩＭ／ＢＯＤ、ＢＮＩＰ３、ＮＩＸ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＭＦ、ＥＧＬ−Ｉ、およびウイルスホモログ等のタンパク質のＢＣＬ−２ファミリーのプロアポトーシスメンバー、カスパーゼ−８などのカスパーゼ、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ４遺伝子、ｐ５３経路遺伝子、ＴＮＦ、ＦａｓＬ、ＴＲＡＩＬ等のプロアポトーシスリガンドおよび／または、ＴＮＦＲ、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１およびＴＲＡＩＬ−Ｒ２等のそれらの受容体が含まれる。
【０１２７】
（vi）抗転移活性を有するポリペプチド
本明細書で使用される、用語「転移抑制因子」は、癌を有する生物の体内に転移（二次腫瘍）が広がるのを遅らせるまたは防ぐように作用するタンパク質を表している。適切な転移抑制因子には、限定されるわけではないが、ＢＲＭＳ１、ＣＲＳＰ３、ＤＲＧ１、ＫＡＩ１、ＫＩＳＳ−１、ＮＭ２３、ＴＩＭＰファミリータンパク質およびウテログロビン等のタンパク質が含まれる。
【０１２８】
（vii）腫瘍に対する免疫応答を活性化できるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド
本明細書で使用される場合、免疫刺激性ポリペプチド剤は、単独でまたは別の薬剤と組み合わせて投与される対象において、免疫応答を活性化または刺激する（既存の免疫応答の増強を含む）ことができるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドである。免疫刺激ペプチドの適切な非限定的な例には、フラジェリン、ムラミルジペプチド、インターロイキンを含むサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５（またはこれらのサイトカインのスーパーアゴニスト／変異型）、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ、ＩＦＮ−α、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ３−リガンドなど）、免疫刺激抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４、抗ＣＤ２８、抗ＣＤ３、またはこれらの分子の単鎖／抗体断片）などが含まれる。
【０１２９】
（viii）抗血管新生分子
特定の実施態様において、本発明の融合タンパク質の介在領域は、血管新生阻害剤が腫瘍へ標的とされるように作用するタンパク質に対応することもまた企図される。これらの薬剤には、上記の抗血管新生ポリペプチドに加えて、マリマスタット、ＡＧ３３４０、ＣＯＬ−３、ＢＭＳ−２７５２９１、サリドマイド、エンドスタチン、ＳＵ５４１６、ＳＵ６６６８、ＥＭＤ１２１９７４、２−メトキシエストラジオール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣＭ１０１、ペントサンポリサルフェート、アンジオポエチン２（レジェネロン）、ハービマイシンＡ、ＰＮＵ１４５１５６Ｅ、１６Ｋプロラクチン断片、リノミド、サリドマイド、ペントキシフィリン、ゲニステイン、ＴＮＰ４７０、エンドスタチン、パクリタキセル、アクチン、アンジオスタチン、シドフォビル、ビンクリスチン、ブレオマイシン、ＡＧＭ−１４７０、血小板因子４またはミノサイクリンが含まれる。また、限定されるわけではないが、ベバシズマブ（アバスチン）、ラニビズマブ（ルセンティス）、ペガプタニブ（マクジェン）、ソラフェニブ、スニチニブ（サテン）、バタラニブ、ＺＤ−６４７４（ザクティマ）、アネコルタブ（レタネ）、乳酸スクアラミン、およびセマホリンを含むＶＥＧＦ阻害剤も含まれる。
【０１３０】
（ix）毒素
本明細書で使用される、用語「毒素」は、異なる生物から得られる非タンパク質性／非ポリペプチド性細胞毒性化合物、ならびにそれらの同じ化合物の化学修飾誘導体および化学合成により得られる化合物を表している。生物起源のこのカテゴリーの化合物は、微生物（細菌、古細菌、原生動物、単細胞真菌）または多細胞生物（多細胞真菌、植物、または軟体動物等の動物）から入手されてもよい。これらの毒素の化学組成と構造は、それらの非ポリペプチド性を超えるいかなる方法でも制限されず、したがって、それらの基本組成の一部であろうと化学的派生の結果であろうと、構造に関与するすべてのアミノ酸がペプチド結合によってともに結合されていない限り、１つまたはそれ以上のアミノ酸がそれらの構造の一部であってもよいことが意図されている。
【０１３１】
本発明に適した毒素の例は、カリケアマイシンγ１、ドラスタチン１０、メイタンシノイド（ＤＭ１）およびピロロベンゾジアゼピンダイマー（ＰＢＤ）である。
【０１３２】
Ｆ．治療薬と介在領域の結合
本発明の治療薬は、本発明の融合タンパク質にコンジュゲートされている。前記のように、治療薬は、Ｎ末端およびＣ末端に関して介在領域内のコンジュゲーションの位置を制限することなく、融合タンパク質の介在領域にコンジュゲートされることが意図されている。したがって、治療薬は、Ｎ末端およびＣ末端に関して等距離の位置で介在ポリペプチド領域に結合することができ、またはそれらのいずれかのより近くであることができる。したがって、治療薬は、Ｎ末端またはＣ末端から１００、９０、８０、７５、７０、６５、６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、３０、２５、２０、１５、２０、１０、またはそれ以下のアミノ酸残基の距離で、またはＮ末端またはＣ末端の同じ残基で、介在ポリペプチド領域にコンジュゲートされることができる。
【０１３３】
治療薬のコンジュゲーション位置の唯一の意図された制限は、治療薬と融合タンパク質の要素が機能的であり、治療薬のコンジュゲーションが治療薬または融合タンパク質の活性を妨げないことである。それゆえ、治療薬、ポリカチオン性ペプチド、および正に帯電したアミノ酸に富む領域は、融合タンパク質および治療薬のそれぞれの非コンジュゲート形態に対する機能性の、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、さらにより好ましくは１００％が保存される。
【０１３４】
治療薬は、融合タンパク質の介在ポリペプチドの残基に直接コンジュゲートできるか、またはその結合は結合部分によって媒介されてもよいことが意図されている。本明細書で使用される「連結部分」は、治療用ペプチドを融合タンパク質の介在領域に連結する分子に関する。連結部分はその化学的性質および／または構造が限定されないこともまた意図されている、したがって、連結部分は、とりわけ、多糖類、ポリペプチド、脂肪酸、リン脂質、またはそれらの化学誘導体であってもよい。治療薬は、ペプチド結合、イソペプチド結合、アミド結合、イミン結合などの任意の化学結合を介して連結部分に結合されてもよいことがさらに意図されている。
【０１３５】
当業者は、カプラーが治療剤と融合タンパク質との間の結合を媒介するときはいつでも、融合タンパク質および治療剤の要素の機能性に関する以前の条件がまた適用されることを認識するだろう。したがって、治療薬が結合部分を介して融合タンパク質にコンジュゲートされるときはいつでも、介在領域におけるコンジュゲーションの位置、連結部分の化学組成または構造、および連結部分と治療薬の間、および連結部分と介在領域の間の結合の化学的性質に関係なく、治療薬、ポリカチオン性ペプチド、および正に帯電したアミノ酸に富む領域は、融合タンパク質および治療薬のそれぞれの非コンジュゲート形態に対する機能性の、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９９％、さらにより好ましくは１００％が保存される。
【０１３６】
したがって、本発明の実施態様において、治療薬は、融合タンパク質の介在ポリペプチド領域に直接結合されている。
【０１３７】
本発明の別の実施態様において、治療薬は、結合部分を介して融合タンパク質の介在領域に結合されている。
【０１３８】
本発明の好ましい実施態様において、治療薬の融合タンパク質の介在領域への結合を媒介する連結部分は、６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。別の好ましい実施態様において、融合タンパク質の介在領域への治療薬の結合を媒介する連結部分は、４−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【０１３９】
本発明のいくつかの実施態様において、融合タンパク質の介在領域に治療薬を結合する結合部分は、細胞質に存在する酵素によって処理されやすく、融合タンパク質にコンジュゲートされた治療薬が細胞内に内在化されると、融合タンパク質から治療薬を放出する。
【０１４０】
当業者が認識するであろうように、融合タンパク質の介在領域のポリペプチド鎖の多数の残基は、治療薬が結合または連結できる複数の位置だけでなく、同じまたは異なる治療薬の複数の分子を同じ融合タンパク質に結合する可能性を提供する。前記のように、融合タンパク質の要素、治療薬の機能性に関する条件が維持され、同じまたは異なる治療薬の分子数の増加、異なる治療薬の結合、それらの化学的性質、またはそれらの結合位置は、各治療薬の有効性および機能性に影響を与えないことが意図されている。
【０１４１】
加えて、いくつかの治療薬は、ヌクレオチドのアナログのポリマーがオリゴヌクレオチド、例えば５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦｄＵ）であるように、同じ分子の複数のコピーが一緒に結合されてもよく、それがオリゴ−ＦｄＵをもたらすような方法で、重合されてもよい。本発明のいくつかの実施態様において、そのようなポリマーを含んでもよいことが意図されている。また、本発明のいくつかの他の実施態様は、治療薬が互いの生理学的または生物学的効果を妨げないという条件で、治療薬の２つまたはそれ以上の異なる分子のポリマーを含んでもよいことが意図されている。当業者は、治療薬のポリマーを特徴とする本発明のこれらの実施態様は１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０またはそれ以上の割合で、１つまたはそれ以上の異なる治療薬が一緒に重合される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、１５、３０、４０、５０またはそれ以上の分子を特徴としてもよいことを認識するだろう。
【０１４２】
したがって、本発明の別の実施態様において、融合タンパク質の介在ポリペプチドは、複数の治療薬にコンジュゲートされ、ここで、前記複数の治療薬は同じ、または異なる。
【０１４３】
本発明の好ましい態様において、融合タンパク質の介在ポリペプチド領域にコンジュゲートされた治療薬は化学療法薬である。
【０１４４】
本発明のより好ましい実施態様において、融合タンパク質の介在領域にコンジュゲートされた化学療法薬は代謝拮抗薬である。
【０１４５】
本発明のさらにより好ましい実施態様において、融合タンパク質の介在領域にコンジュゲートされた化学療法薬は代謝拮抗薬である。
【０１４６】
本発明のさらにより好ましい実施態様において、融合タンパク質の介在領域にコンジュゲートされた代謝拮抗剤は、ピリミジンアナログまたはそのオリゴマー型である。
【０１４７】
本発明の最も好ましい実施態様において、融合タンパク質の介在領域にコンジュゲートされたピリミジンアナログはフロクスウリジンである。
【０１４８】
Ｇ．レポータータンパク質
本発明の別の実施態様において、本発明の融合タンパク質は、レポータータンパク質をさらに含んでなる。
【０１４９】
当業者によれば、用語「レポータータンパク質」は、「レポーター遺伝子」の発現から生じるタンパク質を表しているものとして認識するだろう。レポータータンパク質はよく知られており、組織、細胞または細胞内位置におけるレポーター遺伝子の発現の位置、タンパク質−タンパク質相互作用、形質膜または内膜を通過する輸送、小胞輸送、リガンドと受容体の相互作用、などの複数の目的に適したマーカーとして当該技術分野で一般的に使用されている。
【０１５０】
本発明の文脈において、有用なレポータータンパク質には、ホタル（Ｐｈｏｔｉｎｕｓ  ｐｙｒａｌｉｓ）由来のルシフェラーゼ−４−モノオキシゲナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、チミジンキナーゼなどが含まれる。レポータータンパク質にはまた蛍光タンパク質も含まれ、それはすでに議論された。
【０１５１】
本発明の融合タンパク質に含まれるレポータータンパク質は、正に帯電したアミノ酸に富む領域に直接隣接するか、またはリンカーによって分離される。しかしながら、正に帯電したアミノ酸に富む領域の相対的な位置は、融合タンパク質の要素の相対的な位置に関する前記考慮事項に基づいたままである。したがって、融合タンパク質の位置とは無関係に、蛍光タンパク質は常に、直接またはリンカーによって分離のいずれかで、それに隣接している。
【０１５２】
したがって、蛍光タンパク質を含んでなる本発明の実施態様において、本発明の融合タンパク質の要素の可能な相対位置は、以下のスキームに適合する（式中、ＲＰはレポータータンパク質を表しており、要素についての上記の番号が保持される：（１）ポリカチオン性ペプチド、（２）介在ポリペプチド領域、（３）正に帯電したアミノ酸領域）。
・      Ｎ−（１）−（２）−ＲＰ−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−リンカー−（２）−ＲＰ−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−（２）−リンカー−ＲＰ−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−リンカー−（２）−リンカー−ＲＰ−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−ＲＰ−（２）−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−ＲＰ−リンカー−（２）−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−ＲＰ−（２）−リンカー−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−ＲＰ−リンカー−（２）−リンカー−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−（２）−ＲＰ−リンカー−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−リンカー−（２）−ＲＰ−リンカー−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−（２）−リンカー−ＲＰ−リンカー−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−リンカー−（２）−リンカー−ＲＰ−リンカー−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−リンカー−ＲＰ−（２）−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−リンカー−ＲＰ−リンカー−（２）−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−リンカー−ＲＰ−（２）−リンカー−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−リンカー−ＲＰ−リンカー−（２）−リンカー−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−（１）−ＲＰ−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−リンカー−（１）−ＲＰ−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−（１）−リンカー−ＲＰ−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−リンカー−（１）−リンカー−ＲＰ−（３）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−ＲＰ−（３）−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−（３）−ＲＰ−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−リンカー−ＲＰ−（３）−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−リンカー−（３）−ＲＰ−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−ＲＰ−（３）−リンカー−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−（３）−ＲＰ−リンカー−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−リンカー−ＲＰ−（３）−リンカー−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（２）−リンカー−（３）ＲＰ−−リンカー−（１）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−ＲＰ−（３）−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−（３）−ＲＰ−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−ＲＰ−（３）−リンカー−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−（３）−ＲＰ−リンカー−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−リンカー−ＲＰ−（３）−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−リンカー−（３）−ＲＰ−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−リンカー−ＲＰ−（３）−リンカー−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（１）−リンカー−（３）−ＲＰ−リンカー−（２）−Ｃ
・      Ｎ−ＲＰ−（３）−（１）−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−ＲＰ−（１）−（２）−Ｃ
・      Ｎ−ＲＰ−（３）−リンカー−（１）−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−ＲＰ−リンカー−（１）−（２）−Ｃ
・      Ｎ−ＲＰ−（３）−（１）−リンカー−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−ＲＰ−（１）−リンカー−（２）−Ｃ
・      Ｎ−ＲＰ−（３）−リンカー−（１）−リンカー−（２）−Ｃ
・      Ｎ−（３）−ＲＰ−リンカー−（１）−リンカー−（２）−Ｃ
【０１５３】
本発明の好ましい融合タンパク質
好ましい実施態様において、融合タンパク質は、下記を含んでなるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−５ＦｄＵである。
（i）ポリカチオン性ペプチドとしてのＴ２２ペプチド、
（ii）介在ポリペプチド領域としてのＧＦＰ、
（iii）正荷電アミノ酸に富む領域としてのヘキサヒスチジン領域、
（iv）治療薬としてのフロクスウラシルペンタヌクレオチド。
【０１５４】
より好ましい実施態様において、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−５ＦｄＵは、ＧＦＰタンパク質の側鎖のアミノ基と６原子のスペーサー領域で連結された治療薬のチオール基との結合によって形成される。
【０１５５】
好ましい実施態様において、融合タンパク質は、下記を含んでなるＴ２２−ＳＴＭ−Ｈ６−５ＦｄＵである、
（i）ポリカチオン性ペプチドとしてのＴ２２ペプチド、
（ii）介在ポリペプチド領域として上記で定義したＳｔｅ２のＳＴＭ多変体、
（iii）正に帯電したアミノ酸に富む領域としてのヘキサヒスチジン領域、
（iv）治療薬としてのフロキシラシルペンタヌクレオチド。
【０１５６】
より好ましい実施態様において、Ｔ２２−ＳＴＭ−Ｈ６−５ＦｄＵは、ＳＴＭタンパク質の側鎖のアミノ基と６原子のスペーサー領域で連結された治療薬のチオール基との結合によって形成される。
【０１５７】
本発明の融合タンパク質およびナノコンジュゲートの化学量論
本発明の融合タンパク質にコンジュゲートされる治療薬の数は、特に限定的ではないが、治療薬との化学的コンジュゲーションに利用可能な介在ポリペプチドの利用可能な残基の数に依存する。ほとんどのコンジュゲーションは、介在ポリペプチドの一部を形成するアミノ酸の側鎖に存在するアミノ基またはスルフヒドリル基を介して発生するため、融合タンパク質にコンジュゲートされた治療薬の数は、リジンおよびアルギニン残基の数（側鎖のアミノ基を介したコンジュゲーションの場合）、またはシステイン残基の数（側鎖のスルフヒドリル基を介したコンジュゲーションの場合）、またはコンジュゲーション反応の収率に依存する。したがって、本発明の特定の実施態様において、本発明の融合タンパク質は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、２５、３０種類の治療薬にコンジュゲートされる。
【０１５８】
治療薬がポリマーとして提供される特定の場合、治療薬の数はまた、ポリマー中のモノマーの数に依存することが理解されるだろう。ＦｄＵオリゴマーの特定の場合、所定の融合タンパク質中の治療薬の数は、融合タンパク質に付着したオリゴマーの数にモノマーの数をかけた結果になるだろう。ＦｄＵペンタマーの好ましい場合、好ましい実施態様は、融合タンパク質あたり少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７５、８５、１００、１２５、１５０またはそれ以上の治療薬を含む融合タンパク質を含み、それぞれ、１分子あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１５、１７、２０、２５または３０のコンジュゲートされたＦｄＵペンタマーに対応する。
【０１５９】
加えて、本発明によるナノ粒子は、本発明の融合タンパク質の複数のコピーの集合から生じる。好ましい実施態様において、ナノ粒子は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１７、２０、２５個、より好ましくは少なくとも１５個の本発明の融合タンパク質のモノマーを含んでなる。
【０１６０】
したがって、各ナノ粒子に付着した治療薬の総数は、（ｉ）各融合タンパク質にコンジュゲートされた治療薬の数、（ｉｉ）治療薬のオリゴマー化状態、および（ｉｉｉ）ナノ粒子を形成する融合タンパク質の数、に依存するだろう。好ましい実施態様において、ナノ粒子は、少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、５７、８０、８５、９０、５９、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００の治療薬にコンジュゲートされている。さらに好ましい実施態様において、ナノ粒子は、ＦｄＵペンタマーの少なくとも３０、３５、４０、４５、５０、６０、６５、７０、５７、８０、８５、９０、５９、１００、より好ましくは少なくとも６０分子にコンジュゲートされている。
【０１６１】
本発明の融合タンパク質の調製方法
第二の側面において、本発明は、下記の工程を含んでなる本発明の融合タンパク質を調製する方法に関する。
ａ）下記を含んでなる融合タンパク質の提供。
i．ポリカチオン性ペプチド、
ii．介在ポリペプチド領域および
iii．正に帯電したアミノ酸に富む領域、
ここで、ポリカチオン性ペプチドおよび正に帯電したアミノ酸に富む領域は、タンパク質の末端に位置されている、および
ｂ）前記融合タンパク質を治療薬の活性化形態またはそのオリゴマー形態と接触させ、ここで、治療剤またはそのオリゴマー形態の前記活性化形態は、融合タンパク質の介在領域内の少なくとも１つの官能基と反応することができる反応性基を含有し、ここで、接触は、治療薬の反応性基および介在ポリペプチド領域の官能基の間の結合の形成に適切な条件下で実施される。
【０１６２】
別の実施態様において、本発明は、下記の工程を含んでなる本発明の融合タンパク質を調製する方法に関する。
ａ）下記を含んでなる融合タンパク質の提供
i．ポリカチオン性ペプチド、
ii．介在ポリペプチド領域および
iii．正に帯電したアミノ酸に富む領域、
ここで、ポリカチオン性ペプチドおよび正に帯電したアミノ酸に富む領域は、タンパク質の末端に位置されている、およびここで、融合タンパク質は、活性化形態で提供され、ここで融合タンパク質の前記活性化形態は、介在領域に反応性基を含有する、および
ｂ）前記融合タンパク質を治療薬またはそのオリゴマー形態と接触させ、ここで、前記治療薬は、融合タンパク質中の反応性基と反応することができる官能基を含有し、ここで、前記接触は、融合タンパク質中の反応性基と治療薬中の官能基との間の結合の形成に適切な条件下で実施される。
【０１６３】
当業者は、本明細書で使用される、「反応性基」が通常、１つ以上の追加の分子の放出をともなう、２つの分子を一緒に結合するような様式で別の分子からの別の部分と化学的に反応することができる分子の任意の部分を表していることを認識するだろう。カルボキシル基とアミン基との間のペプチド結合の形成がそれらのうちの１つの非限定的な例である等、多くのそのような反応が当該技術分野で知られている。
【０１６４】
本明細書で分子を表す際に使用される「活性化された」とは、化学修飾を含有する分子の修飾体を表し、それにより、前記分子は分子内に以前には存在しなかった方法で（例えば、活性化は、以前は存在しなかった部分を追加し、以前は実現不可能だった結合を可能にする）、または増加した反応性で（分子と別の分子との反応には不活性化状態よりも低い活性化エネルギーが要求されることを意味する）化学反応することができる。本発明は、治療薬を活性化し、次に活性化治療薬を融合タンパク質と接触させるか、または融合タンパク質を活性化し、次に活性化融合タンパク質を治療薬と接触させる可能性を考慮している。両方の場合において、融合タンパク質または治療薬の活性化は、通常、活性化される分子を、活性化される分子の適切な部分に反応性基を導入する試薬と反応させることにより実施される。治療薬または融合タンパク質の活性化を可能にする反応性基の例には、限定されるわけではないが、当業者に一般的に知られている他の多くのものの中で、カルボキシル、アミン、イミン、チオール、スルホン、ヒドロキシル、硫酸、およびリン酸部分が含まれる。治療薬の活性化形態はまた、本明細書では「活性化治療薬」と表される。融合タンパク質の活性化形態はまた、本明細書では「活性化融合タンパク質」と表される。融合タンパク質の他の領域に追加の反応性基がまた見出されることも除外されないが、活性化された融合タンパク質の反応性基は介在領域に位置する。
【０１６５】
連結部分が融合タンパク質と治療薬との間の結合を媒介する本発明の実施態様において、連結部分は、Ｋａｌｉａ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ．Ｃｕｒｒ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ  ２０１０  Ｊａｎｕａｒｙ，１４（２）：１３８−１４７で開示されているように、チオエーテル、アミド結合、炭素−窒素二重結合、または環化付加によって生成された結合等の他の結合の中で使用している、治療薬および融合タンパク質の官能基と順次、（最初に活性化治療薬と次に融合タンパク質と、または最初に融合タンパク質と次に活性化治療薬とのいずれかの反応をすること）または同時に反応する、二官能性架橋剤、より好ましくは、ヘテロ二官能性架橋剤である。例として、典型的なチオール反応性官能基には、ヨードアセトアミド、マレイミド、およびジスルフィドが含まれる。加えて、タンパク質は、リシン側鎖およびＮ末端のアミノ基とアミド結合を形成するために、小分子または活性化エステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル）を提示する表面で処理されることができる。別の実施態様において、連結部分は、チオール基およびアミノ基と反応できる反応性基を含有するヘテロ二官能性架橋剤である。一つの実施態様において、ヘテロ二官能性架橋剤は６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルである。
【０１６６】
好ましい実施態様において、結合部分は、第一工程で活性化治療薬と反応し、第二工程で融合タンパク質と反応する。別の実施態様において、結合部分は、第一工程で融合タンパク質と反応し、第二工程で治療薬と反応する。
【０１６７】
本発明の融合タンパク質を治療剤の活性化形態と接触させる工程は、それらの間の結合を確立する反応に有利な媒体中で実施されることが意図されている。反応に適した媒体は、水性バッファーおよび非水性バッファーを含んでおり、当業者に一般的に知られている。１つが含まれる実施形態において、活性化治療薬および融合タンパク質、治療薬、およびまた連結部分のコンジュゲートの合成を実施する反応工程のいずれかのために、固体担体は媒体と組み合わせて使用されることができることもまた意図されている。さらに、融合タンパク質および治療薬との間のコンジュゲートの調製方法は、融合タンパク質、活性化治療薬、および連結部分に限定されないが、いくつかの実施態様はまた、反応において１つまたはそれ以上の触媒および補因子の使用も含むことが意図されている。
【０１６８】
したがって、本発明の一つの実施態様において、治療薬の活性化形態は、融合タンパク質のペプチド領域、好ましくは融合タンパク質の介在領域の残基の側鎖の少なくとも１つと反応する官能基を含有する。
【０１６９】
別の好ましい実施態様において、前記残基は外部リジンである。本発明のさらに好ましい実施態様において、融合タンパク質の介在領域の側鎖と反応する活性化治療薬、好ましくは化学療法薬の官能基はチオール基である。
【０１７０】
本発明のさらにより好ましい実施態様において、活性化治療薬は、活性化された化学療法薬、より好ましくはチオール官能化オリゴフロクスウリジンである。
【０１７１】
さらに好ましい実施態様において、連結部分は、４−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、活性化治療薬と、このセクションの前の実施態様で示された融合タンパク質のペプチド領域の残基の側鎖とのコンジュゲーションを媒介する。さらにより好ましい実施態様において、結合部分４−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、第１工程で治療薬、好ましくは活性化ＦｄＵ、さらにより好ましくはスルフヒドリルで官能化されたＦｄＵに結合し、第２工程で融合タンパク質の残基の側鎖、より好ましくは融合タンパク質の外部リジン、さらにより好ましくは融合タンパク質の介在領域の外部リジンに結合する。
【０１７２】
本発明の活性化融合タンパク質を治療薬と接触させる工程は、それらの間の結合を確立する反応に有利な媒体中で実施されることがまた意図されている。反応に適した媒体は、水性バッファーおよび非水性バッファーを含んでおり、当業者に一般的に知られている。１つが含まれる実施形態において、融合タンパク質、治療薬、およびまた連結部分のコンジュゲートの合成を導く反応工程のいずれかのために、固体担体は媒体と組み合わせて使用されることができることもまた意図されている。さらに、融合タンパク質および治療薬との間のコンジュゲートの調製方法は、融合タンパク質、活性化治療薬、および連結部分に限定されないが、いくつかの実施態様はまた、反応において１つまたはそれ以上の触媒および補因子の使用も含むことが意図されている。
【０１７３】
したがって、本発明の一つの実施態様において、融合タンパク質の活性化形態は、治療薬中の少なくとも１つの部分と反応する官能基を含有する。本発明のさらに好ましい実施態様において、活性化融合タンパク質と反応する治療薬、好ましくは化学療法薬の官能基はチオール基である。
【０１７４】
本発明のさらにより好ましい実施態様において、活性化融合タンパク質剤は、アミノ官能化融合タンパク質であり、ここで、介在ポリペプチドの一部を形成するアミノ酸の側鎖の１つまたはそれ以上のアミノ基は、チオール反応性を有する活性化官能基で修飾されている。さらに好ましい実施態様において、連結部分は、４−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルであり、治療薬のチオール基と、融合タンパク質のアミノ基とのコンジュゲーションを媒介する。さらにより好ましい実施態様において、結合部分４−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、第１工程で融合タンパク質に、より好ましくは融合タンパク質の外部リジンに結合し、第２工程で融合タンパク質の残基の治療薬側鎖に結合する。
【０１７５】
本発明のナノ粒子および本発明の融合タンパク質を用いてそれらを調製する方法。
第三の側面において、本発明は、前記融合タンパク質の調製物を低塩バッファーに入れることを含んでなる、本発明の第１の側面にしたがった、融合タンパク質の複数のコピーを含んでなるナノ粒子を調製する方法に関する。
【０１７６】
当業者が認識するであろうように、「ナノ粒子」は、大きさがナノメートルで測定される微小粒子である。本発明のナノ粒子は、前のセクションで定義された本発明の融合タンパク質の複数のコピーの凝集体から生じるナノ粒子を含んでなる。本発明の融合タンパク質を用いてナノ粒子を調製する方法において、本発明の融合タンパク質の調製物は、非共有結合性静電結合を形成し、低塩バッファーの条件下で自発的に凝集するのに熱力学的に有利な本発明の融合タンパク質のモノマー形態を含んでなる。
【０１７７】
当業者は、ナノ粒子の大きさが１〜１０００ｎｍ、より好ましくは２．５〜５００ｎｍ、さらにより好ましくは５〜２５０ｎｍ、さらにより好ましくは１０〜１００ｎｍの範囲であることができることを認識するだろう。
【０１７８】
表現「低塩バッファー」は、ｐＨの変化を緩和する能力を有する１つまたはそれ以上の塩の水への溶解から生じる任意の緩衝液を含んでなり、ここで、溶解された塩の量は、例えば、細胞質または細胞外媒体等の生理学的液体の浸透圧より低いまたは等しい浸透圧をもたらすことが理解されるだろう。したがって、低塩バッファーは、生理学的値の範囲内でｐＨと浸透圧を維持すると理解されており、生理学的温度の範囲内で使用されるだろう。
【０１７９】
当業者は、生理学的温度の範囲が１５〜４５℃、より好ましくは２０〜４０℃、さらにより好ましくは２５〜３９℃、さらにより好ましくは３０〜３７℃の間で変動できることを認識するだろう。当業者は、低塩バッファーの浸透圧は、１００〜４００ミリオスモル／Ｌ（ｍＯｓｍ／Ｌ）、好ましくは１５０〜３５０ｍＯｓｍ／Ｌ、より好ましくは２００〜３００ｍＯｓｍ／Ｌ、さらにより好ましくは２２５〜２７５ｍＯｓｍ／Ｌの範囲内であるだろうと認識するだろう。
【０１８０】
本発明に適した低塩バッファーは、例えば、Ｔｒｉｓ−デキストロースバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ＋５％デキストロース、ｐＨ７．４）、Ｔｒｉｓ−ＮａＣｌバッファー（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）、ＰＢＳ−グリセロールバッファー（リン酸緩衝生理食塩水、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、当該技術分野でよく知られている、＋１０％グリセロール）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）−デキストロース（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５、当技術分野でよく知られている、２００ＮａＣｌ、＋５％デキストロース）、トリス緩衝生理食塩水−Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）バッファー（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ、＋０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０）、またはｐＨが６より低くない当該技術分野で知られている任意の生理学的バッファー、である。
【０１８１】
本発明の好ましい実施態様において、本発明の方法の低塩バッファーは、炭酸塩バッファー(carbonate buffer)、トリスバッファーおよびリン酸塩バッファー(phosphate buffer)からなる群から選択される。
【０１８２】
本発明の特に好ましい実施態様において、本発明の方法の低塩バッファーは、１００〜３００ｎＭの濃度の重炭酸ナトリウムを含んでなる炭酸塩バッファーである。本発明の別の特に好ましい実施態様において、本発明の方法の低塩バッファーは、１０〜３０ｎＭの濃度のトリスを含んでなるトリスバッファーである。本発明の方法の別の特に好ましい実施態様において、本発明の低塩バッファーは、５〜２０ｍＭの総濃度でＮａ２ＨＰＯ４およびＮａＨ２ＰＯ４を含んでなるリン酸塩バッファーである。
【０１８３】
本発明のさらにより好ましい実施態様において、本発明の方法の低塩バッファーは、デキストロースおよび／またはグリセロールをさらに含んでなる。
【０１８４】
本発明のさらにより好ましい実施態様において、本発明の方法の低塩バッファーは６．５〜８．５のｐＨを有する。
【０１８５】
本発明のさらにより好ましい実施態様において、本発明の方法の低塩バッファーは、下記からなる群から選択される。
（i）１６６ｍＭのＮａＨＣＯ３、ｐＨ７．４
（ii）２０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％デキストロース、ｐＨ７．４
（iii）１４０ｍＭのＮａＣｌ、７．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２．５ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０％グリセロール、ｐＨ７．４
【０１８６】
本発明の別の側面において、本発明は、本発明の第一の側面の融合タンパク質の複数のコピーを含んでなる、またはナノ粒子を調製するための方法または本発明に従って調製された、ナノ粒子に関する。
【０１８７】
したがって、本発明のナノ粒子は、本発明の融合タンパク質の複数のコピーの凝集体を含み、これは、生理学的条件での非共有結合およびカップリングを促進する構造内の領域間の静電相互作用から生じる。ナノ粒子の調製のための本発明の方法は、低塩バッファー中に本発明の融合タンパク質の調製物を入れることを含んでなるので、こうして形成されたナノ粒子はまた融合タンパク質の複数のコピーの凝集体も含んでなることが理解される。
【０１８８】
本発明の好ましい実施態様において、本発明のナノ粒子は１０〜１００ｎｍの直径を有する。
【０１８９】
本発明の融合タンパク質およびナノ粒子の医薬での使用。
別の側面において、本発明は、医薬に使用するための本発明にしたがった融合タンパク質またはナノ粒子に関する。別の側面において、本発明は、本発明の融合タンパク質の一部を形成する治療薬に応答する疾患に罹患している患者の処置のための、本発明にしたがった融合タンパク質またはナノ粒子の使用に関する。
【０１９０】
本明細書で使用する、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、状態、障害または疾患の進行、重症度および／または持続時間の減少または改善、または１つまたはそれ以上の状態、障害または疾患の兆候（好ましくは、１つまたはそれ以上の識別可能な兆候）の改善を表している。用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」はまた、患者が必ずしも認識できない状態、障害、または疾患の少なくとも１つの測定可能な身体的パラメータの改善を表している。さらに、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」はまた、物理的、例えば認識可能な兆候の安定化、生理学的、例えば身体的パラメータの安定化、のいずれかまたは両方による、状態、障害または疾患の進行の阻害を表している。「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」はまた、状態、障害または疾患の軽減または安定化を表してもよい。
【０１９１】
医薬での使用により、治療応答を誘導するために、本発明の融合タンパク質またはナノ粒子が患者に投与されることができることは、当業者によって理解されるだろう。
【０１９２】
治療応答は、病状または患者が罹患した疾患の原因の抑制、軽減、または停止、状態または疾患の兆候の除去、軽減、停止、または改善、または患者の状態もしくは疾患の進行の消滅、停止、または減速を含んでなる。
【０１９３】
当業者は、医薬での使用に適した本発明の融合タンパク質またはナノ粒子が、薬学的に許容可能な担体を伴って提供されてもよいことを認識するだろう。本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容可能な担体」は、非毒性の不活性固体、半固体または液体充填剤（ｌｉｑｕｉｄ  ｆｉｌｌｅｒ）、希釈剤（ｄｉｌｕｅｎｔ）、カプセル化材料または任意のタイプの製剤補助剤を意味する。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｅｄ．ｂｙ  Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９５は、医薬組成物の製剤化に使用される様々な担体およびその調製のための既知の技術を開示している。
【０１９４】
したがって、本発明の融合タンパク質またはナノ粒子および薬学的に許容可能な担体を含んでなる組成物は、医薬組成物である。
【０１９５】
本発明の医薬組成物は、経口および非経口経路を含む当該技術分野で知られている任意の手段によって患者に投与されることができる。そのような実施態様によれば、本発明の組成物は、注射（例えば、静脈内、皮下または筋肉内、腹腔内注射）、直腸、膣、局所（粉末、クリーム、軟膏、またはドロップによる）、または吸入（スプレーによる）によって投与されてもよい。
【０１９６】
Ａ−癌の治療における本発明の融合タンパク質またはナノ粒子の使用。
本発明の別の実施態様は、本発明の融合タンパク質およびナノ粒子、またはそれらの対応する医薬組成物に関し、ここで、ポリカチオン性ペプチドは、細胞への融合タンパク質の内在化を促進することができる細胞表面上の受容体と特異的に相互作用することができる配列であり、ここで、受容体を発現する前記細胞は、癌に存在する腫瘍細胞であり、およびここで、治療薬は、癌の処置に使用するための、下記からなる群から選択される。
（i）化学療法薬、
（ii）細胞傷害性ポリペプチド、
（iii）抗血管新生ポリペプチド、
（iv）腫瘍抑制遺伝子によってコードされるポリペプチド、
（v）プロアポトーシスポリペプチド、
（vi）抗転移活性を有するポリペプチド、
（vii）腫瘍に対する免疫応答を活性化できるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、および
（viii）抗血管新生分子、
（ix）毒素
【０１９７】
本明細書で使用する、用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、癌の進行、重症度および／または持続時間の減少または改善、または１つまたはそれ以上の癌の兆候（好ましくは、１つまたはそれ以上の識別可能な兆候）の改善を表している。用語「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」はまた、患者が必ずしも認識できない腫瘍の成長など、癌の少なくとも１つの測定可能な身体的パラメータの改善を表している。さらに、「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」はまた、物理的、例えば認識可能な兆候の安定化、生理学的、例えば身体的パラメータの安定化、のいずれかまたは両方による、癌の進行の阻害を表している。「処置する（ｔｒｅａｔ）」、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」および「処置する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」はまた、腫瘍の大きさまたは癌細胞数の減少または安定化を表してもよい。
【０１９８】
用語「癌」は、他の組織、器官、または一般的には生体の遠い部分に侵入または拡散（転移）する可能性がある異常な、制御されていない細胞の成長および増殖（新生物）を含む疾患群を表しており、転移は、癌および癌性腫瘍の悪性度の特徴の１つである。癌性細胞の異常な成長および／または増殖は、それらの正常な生理機能を変化させる遺伝的および環境要因の組み合わせの結果である。癌性細胞の成長および／または増殖異常は、影響を受ける細胞型、組織、および臓器の機能障害または機能の喪失により、生理学的障害を引き起こし、多くの場合、個体の死を引き起こす。
【０１９９】
用語「癌」には、限定されないが、乳房、心臓、小腸、結腸、脾臓、腎臓、膀胱、頭、首、卵巣、前立腺、脳、膵臓、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睾丸、肝胆道系および肝臓の癌が含まれ、加えて、限定されるわけではないが、腺腫、血管肉腫、星状細胞腫、上皮癌、胚細胞腫、膠芽腫、神経膠腫、血管内皮腫、血管肉腫、血腫、肝芽腫、白血病、リンパ腫、髄芽腫、黒色腫、神経芽腫、肝胆道癌、骨肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、奇形腫等の腫瘍が含まれる。さらに、この用語には、先端黒質黒色腫、光線性角化腺癌、腺様嚢胞癌、腺腫、腺肉腫、腺扁平上皮癌、星状細胞腫瘍、バルトリン腺癌、基底細胞癌、気管支腺癌、毛細血管カルチノイド、癌腫、癌肉腫、胆管癌、嚢胞腺腫、内胚葉洞腫瘍、子宮内膜増殖症、子宮内膜間質肉腫、類内膜腺癌、上衣肉腫、ユーイング肉腫、限局性結節性過形成、胚細胞腫瘍、膠芽腫、グルカゴノーマ、血管芽腫、血管内皮腫、血腫、肝腺腫、肝腺腫症、肝細胞癌、肝胆道癌、インスリノーマ、上皮内腫瘍、扁平上皮内腫瘍、浸潤性扁平上皮癌、大細胞癌、平滑筋肉腫、黒色腫、悪性黒色腫、悪性中皮腫瘍、髄腺腫、髄上皮腫、粘表皮癌、神経芽腫、神経上皮腺癌、結節性黒色腫、骨肉腫、乳頭状漿液性腺癌、下垂体腫瘍、形質細胞腫、偽肉腫、肺芽腫、腎細胞癌、網膜芽腫、横紋筋肉腫、肉腫、漿液性癌、小嚢胞性癌（ｍｉｃｒｏｃｙｔｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、軟部組織癌、ソマトスタチン分泌腫瘍、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、扁平上皮癌（ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、未分化癌、ブドウ膜黒色腫、疣贅性癌、ＶＩＰ産生腫瘍、ウィルム腫瘍、脳内癌、頭頸部癌、直腸癌、星状細胞腫、膠芽腫、小嚢胞性癌（ｍｉｃｒｏｃｙｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）および非小嚢胞性癌（ｎｏｎ−ｍｉｃｒｏｃｙｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ）、転移性黒色腫、アンドロゲン非依存性転移性前立腺癌、アンドロゲン依存性転移性前立腺が癌および乳癌が含まれる。
【０２００】
したがって、本発明の好ましい実施態様において、治療薬は、下記からなる群から選択される。
（i）細胞傷害性ポリペプチド、
（ii）抗血管新生ポリペプチド、
（iii）腫瘍抑制遺伝子によってコードされるポリペプチド、
（iv）プロアポトーシスポリペプチド、
（v）抗転移活性を有するポリペプチド、
（vi）腫瘍に対する免疫応答を活性化できるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド、
（vii）化学療法薬、および
（viii）抗血管新生分子
【０２０１】
本発明のより好ましい実施態様において、本発明の融合タンパク質またはナノ粒子の抗腫瘍ペプチドは、ＢＡＫのＢＨ３ドメイン、ＰＵＭＡ、ＧＷ−Ｈ１、およびジフテリア毒素Ｉの活性セグメント、および緑膿菌外毒素Ａからなる群から選択される。
【０２０２】
本明細書で使用される「ＢＡＫ」は、抗アポトーシスタンパク質を不活性化し、ミトコンドリア膜を透過性にし、およびその結果の、シトクロムＣおよびその他のミトコンドリア細胞死因子の放出を介してカスパーゼ依存性アポトーシス経路によりプログラムされた細胞死を引き起こすＢｃｌ−２タンパク質ファミリーに属するよく知られたプロアポトーシス因子を表している（Ｌｌａｍｂｉ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．２０１１．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，４４：５１７−３１参照）。一つの実施態様において、ＢＡＫは、全長ＢＡＫ（配列番号４１）を表している。他の実施態様において、ＢＡＫは、機能的ＢＨ３ドメイン（配列番号４２）を含有するその任意の切断型を表している。
【０２０３】
本明細書で使用する場合、「ＰＵＭＡ」は、配列番号４３に対応する完全配列によって特徴付けられるタンパク質を表しており、これはＢｃｌ−２ファミリーのプロおよび抗アポトーシスタンパク質と相互作用することにより細胞死を引き起こすＢＨ３のみのタンパク質（Ｂｃｌ−２相同性３）である。
【０２０４】
本明細書で使用される場合、ＧＷ−Ｈ１は、両親媒性ヘリックスに折り畳まれることによりその細胞溶解活性を発揮する配列番号１４の配列を有するポリペプチドを表している。
【０２０５】
ジフテリア毒素Ｉ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ種の細菌によって産生される）（配列番号４４）および緑膿菌の外毒素（配列番号４５）は、ＡＤＰリボシル化毒素のファミリーに属している。両方の毒素は、真核生物の伸長因子−２（ｅＥＦ−２）に作用するタンパク質であり、基本的にそれらを組み込んだ細胞の翻訳活性を阻害し、アポトーシスを誘導する。両方の毒素の構造は、受容体結合ドメイン（細胞の表面受容体に結合してエンドサイトーシスを誘導する。ジフテリア毒素の場合はヘパリン結合表皮成長因子前駆体、外毒素Ａの場合はＣＤ９１）、転座ドメイン、およびｅＥＦ−２で作用を実施する触媒ドメインを提示する（概要は、Ｓｈａｐｉｒａ，Ａ．＆  Ｂｅｎｈａｒ，Ｉ．，２０１０，Ｔｏｘｉｎｓ，２：２５１９−２５８３で提供される）。
【０２０６】
本発明のさらにより好ましい実施態様において、本発明の融合タンパク質またはナノ粒子のポリカチオン性ペプチドはＣＸＣＲ４リガンドであり、本発明の融合タンパク質またはナノ粒子で処置される標的とされる癌は、ＣＸＣＲ４受容体を発現している細胞を含んでなることにより特徴付けられる。より好ましい実施態様において、ＣＸＣＲ４を発現または過剰発現する癌細胞は転移性幹細胞である。本明細書で使用される、用語「転移性幹細胞」は、転移の開始および転移の維持に関与する細胞を表している。
【０２０７】
本発明のさらにより好ましい実施態様において、本発明の融合タンパク質またはナノ粒子のＣＸＣＲ４リガンドは、Ｔ２２ペプチド、Ｖ１ペプチド、ＣＸＣＬ１２ペプチド、ｖＣＣＬ２ペプチドまたはその機能的に同等な多様体を含んでなる群から選択される。
【０２０８】
本発明の別のより好ましい実施態様において、本発明の融合タンパク質またはナノ粒子で処置される癌は、膵臓癌および大腸癌からなる群から選択される。
【０２０９】
本発明の別の好ましい実施態様において、本発明の融合タンパク質およびナノ粒子は、癌性腫瘍の治療に使用され、癌性腫瘍は原発腫瘍または転移である。
【０２１０】
以下の実施例により本発明が開示されるが、これらの実施例は単に例示的なものであり、本発明の範囲を限定するものではないとみなされるべきである。
【実施例】
【０２１１】
材料および方法
５’−ジメトキシトリチル−５−フルオロ−２’−デオキシウリジンの合成
５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦｄＵ）（３．２ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジン中の塩化ジメトキシトリチル（４．４ｍｍｏｌ）と反応させた。溶液は一晩撹拌され、溶媒は蒸発された。残留物を、純粋なＣＨ２Ｃｌ２からＣＨ２Ｃｌ２の１０％メタノールまでのグラジュエントを使用するカラムクロマトグラフィーにより精製し、所望のジメトキシトリチル−５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＤＭＴ−ＦｄＵ）を６５％得た。
【０２１２】
５′−ジメトキシトリチル−５−フルオロ−２′−デオキシウリジンホスホルアミダイトの合成
５’−ジメトキシトリチル−５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（１ｍｍｏｌ）を、減圧下で無水アセトニトリルとともに蒸発させることにより乾燥させた。次に、生成物はアルゴン下で無水ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）に溶解され、水分を排除してジイソプロピルエチルアミン（５ｍｍｏｌ）が加えられた。溶液は氷浴で冷却され、２−シアノエトキシ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノ−クロロホスフィン（２ｍｍｏｌ）がシリンジで滴下された。溶液は室温で１時間撹拌され、次に溶液はＣＨ２Ｃｌ２で希釈され、飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄された。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた後、溶媒は蒸発され、生成物はカラムクロマトグラフィーにより精製された。カラムは酢酸エチル／ヘキサン１：１の１０％トリエチルアミン溶液を使用してシリカゲルを充填され、化合物は酢酸エチル／ヘキサン１：１から純粋な酢酸エチルのグラジュエントで溶出された。所望のホスホラミダイトが７０％の収率で得られた。
【０２１３】
５′−ジメトキシトリチル−５−フルオロ−２′−デオキシウリジンで官能化された固体支持体の調製
ＤＭＴ−ＦｄＵ誘導体（０．４ｍｍｏｌ）は無水アセトニトリルで蒸発させて乾燥され、ＣＨ２Ｃｌ２（２０ｍＬ）中の無水コハク酸（０．６ｍｍｏｌ）およびＮ、Ｎ−ジメチルアミノピリジン（０．６ｍｍｏｌ）と反応された。反応混合物は室温で一晩撹拌された。反応混合物はＣＨ２Ｃｌ２３０ｍＬで希釈され、溶液を飽和ＮａＣｌ水溶液、１０％クエン酸水溶液で洗浄され、再び飽和ＮａＣｌ水溶液で洗浄された。有機層は無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥され、蒸発乾固された。得られたＤＭＴ−ＦｄＵヘミスクシネートは白色固体として得られ（８９％収率）、さらに精製することなく次の工程で使用された。ＤＭＴ−ＦｄＵヘミスクシネート誘導体は、長鎖アルキルアミン制御細孔ガラス支持体（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）に組み込まれた。アミノ−ＬＣＡＡ−ＣＰＧ（ＣＰＧ  Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ；４５０ｍｇ，７０μｍｏｌアミノ／ｇ）はポリプロピレンディスクを取り付けたポリプロピレンシリンジに入れられ、メタノール、ＣＨ２Ｃｌ２およびアセトニトリルで順次洗浄された。次に、アセトニトリル／  ＣＨ２Ｃｌ２（１：３）の混合物で０．６ｍＬに溶解した２，２´−ジチオビス（５−ニトロピリジン）（０．１８ｍｍｏｌ）がＤＭＴ−ＦｄＵヘミスクシネート（０．９ｍｍｏｌ）およびＮＮ−ジメチルアミノピリジン（０．１８ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（１．５ｍＬ）溶液に加えられた。次に、トリフェニルホスフィン（０．１８ｍｍｏｌ）が加えられ、混合物を数秒間攪拌され、支持体に加え、１時間反応させた。支持体はメタノール、ＣＨ２Ｃｌ２およびアセトニトリルで洗浄され、真空下で乾燥させた。樹脂の機能性は、ＤＭＴ定量（４２μｍｏｌ／ｇ）によって決定された。最後に、未反応のアミノ基をキャップするために、固体支持体が３０分間無水酢酸溶液で処理された。
【０２１４】
フロクスウリジンオリゴヌクレオチド（オリゴＦｄＵ）の合成
２つのペンタヌクレオチド配列が調整された、１）５’−（ＦｄＵ）５−３’は対照ＦｄＵペンタマー、２）３’−チオール化ＦｄＵペンタマー、ＦｄＵ５−フルオロ−２’−デオキシウリジンおよびヘキサエチレングリコールスペーサーとしてのＨＥＧをあわせた５’−（ＦｄＵ）５−ＨＥＧ−プロピル−ＳＨ３’。対照の５’−（ＦｄＵ）５−３’ペンタマーを合成するために、上記のように調製したＤＭＴ−ＦｄＵで官能化した制御細孔ガラス（ＣＰＧ）支持体が使用された。次に、対照ペンタマー配列は、ＤＭＴ保護ＦｄＵホスホルアミダイトの連続添加により１μｍｏｌの合成サイクルを使用して、ＤＮＡシンセサイザー（３９２  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、米国カリフォルニア州フォスターシティ）で組み立てられた。配列を組み立てた後、オリゴヌクレオチド支持体はアンモニア水（３２％）で室温で２時間処理され、得られた生成物はＨＰＬＣで精製された。ＨＰＬＣ条件：カラムＸ−ｂｒｉｄｇｅＴＭ  ＯＳＴ  Ｃ１８（１０ｘ５０ｍｍ、２．５μｍ）、２０分の０％〜４０％の線形グラジュエント、流速２ｍＬ／分、溶液Ａは、０．１Ｍトリエチル酢酸アンモニウム（ＴＥＡＡ）水溶液中の５％アセトニトリルであり、溶液Ｂは、０．１ＭのＴＥＡＡ水溶液中の７０％アセトニトリルであった。ペンタマーは、質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって特性評価された。
【０２１５】
ペンタマーＦｄＵオリゴヌクレオチドのいくつかのバッチは、β−シアノエチルホスホルアミダイト化学を使用し、標準プロトコルに従って自動ＲＮＡ／ＤＮＡシンセサイザーで１μｍｏｌスケールで合成された。３’末端にチオール基を導入するために３’−Ｔｈｉｏｌ−Ｍｏｄｉｆｉｅｒ  Ｃ３固体支持体（Ｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が使用され、次に、スペーサーとしてヘキサエチレングリコールホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、ＶＡ、米国）が使用された。最後に、ＤＭＴで保護されたＦｄＵホスホルアミダイトを繰り返し追加することにより、合成が完了した。配列の組み立て後、オリゴヌクレオチド支持体は、室温で２時間、０．１Ｍ  １，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を含むアンモニア水（３２％）で処理された。アンモニア溶液は濃縮乾固され、生成物は使用前に水で溶出したＮＡＰ−１０（Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５）カラムで脱塩された。ペンタマーＦｄＵ−ＨＥＧ−ＳＨの純度は、上記の開示された条件を使用してＨＰＬＣで分析された（図１参照）。ペンタマーは２６０ｎｍでの吸光度によって定量化され、ＭＡＬＤＩ質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって確認された。
【０２１６】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ治療用ナノコンジュゲートの特性評価および薬物／ナノ粒子比の決定。
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ合成反応後に得られた生成物は、分子量を測定するために質量分析を使用して、特性評価された。ナノ粒子の体積および大きさの分布は、６３３ｎｍでの動的光散乱によって決定された（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｍａｌｖｅｒｎ，  Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，英国）。ナノコンジュゲートの大きさは、精製サンプルを使用して測定され、０．２ｍｇ／ｍＬに希釈され、３３に開示されているように、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｈ−７０００透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で視覚化される前に、カーボンコーティングされたグリッドで１ｎｍ白金層の蒸発により対比された。ナノ粒子に対する薬物の比率は、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６およびＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートのＵＶスペクトルを分析、およびＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６ナノ粒子あたりのＦｄＵ分子の数の計算により得られた。
【０２１７】
ＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞におけるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ内在化、ＣＸＣＲ４特異性および細胞毒性。
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの第二の細胞型に内在化する能力が評価された、つまり、ＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａヒト子宮頸癌細胞株は、１時間、１μＭのＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ濃度で、１０％ＦＢＳおよび２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ）が添加された最小必須培地で培養され、フローサイトメーターＦＡＣＳ−Ｃａｎｔｏシステム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で内在化された細胞から放出される緑色蛍光を測定する。ＣＸＣＲ４受容体を介した内在化の特異性を評価するために、ＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞をＣＸＣＲ４拮抗薬ＡＭＤ３１００（オクタヒドロクロライド水和物、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）とインキュベートする競合研究が、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６について前に開示したとおり、ナノコンジュゲートに曝露する前に１時間、１：１０（タンパク質：拮抗薬）のモル比で実施された。
【０２１８】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの細胞内局在は、共焦点顕微鏡を使用して評価された。簡潔に、共焦点分析のために、細胞が培養皿（Ｍａｔ−Ｔｅｋ  Ｃｏ．）で成長させられ、次に、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵがＬ−グルタミンを添加したＯｐｔｉＰｒｏ培地に加えられた。核はヘキスト３３３４２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識され、細胞膜はＣｅｌｌＭａｓｋＴＭ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で標識された。顕微鏡写真はＴＣＳ−ＳＰ５共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗｅｔｚｌａｒ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮影され、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ局在化の３ＤモデルはＩｍａｒｉｓソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ）を使用して、生成された。
【０２１９】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの細胞毒性活性はまた、ＭＴＴ代謝試験（Ｒｏｃｈｅ）の使用により研究された。その目的のために、ＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞を１〜１，０００ｎＭの濃度範囲でＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵに曝露し、等分子濃度または遊離オリゴＦｄＵと比較して、４８時間での生存率が測定された。その後、両方の化合物の細胞生存率を比較するために、線形化されたＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ用量反応傾向線表示を表示するグラフィクが構築された。細胞生存率の低下はまた、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６または遊離ＦｄＵと比較して、１μＭのＴ２２−１９７  ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵに４８時間曝露したＨｅＬａ細胞の光学顕微鏡画像で確認された。
【０２２０】
確立された転移の処置のためのＣＣＲモデルとプロトコルの生成
スイスのヌードマウスのＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７同所性ＣＣＲモデルが、確立された転移の可能な阻害を評価するために使用された。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ投与は、腫瘍細胞移植の２ヶ月後に開始された（ＩＶＩＳスペクトルを使用した生物発光画像で測定されたマウスに転移がすでに存在する場合）。この目的のために、３２匹のスイスのヌードマウスをランダムに４つの群に分けた（バッファー、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６および遊離ＦｄＵペンタマー（ｎ＝１０／各群）。各化合物の単回静脈内注射用量（Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ：２０ｕｇ、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６：２０ｕｇ、等分子量の遊離オリゴＦｄＵ、またはバッファー）が３日ごとに合計１０回投与された。実験は、バッファー処置群の第一の動物が安楽死されたときに終了された。
【０２２１】
抗転移効果の評価
処置プロトコルで適用されたものと同じ評価が転移予防に適用された。簡潔に、剖検では、すべての臓器の目に見える転移の数と大きさはマウスごとに記録され、Ｅｘ  ｖｉｖｏで標的臓器に生物発光が放出される転移巣の数は、ＩＶＩＳ（商標）２００−Ｓｐｅｃｔｒｕｍを使用してカウントされ、転移の位置および数を確認するために組織病理学的および免疫組織化学分析が実施された。
【０２２２】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの生体内分布および骨髄および循環血球における毒性
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの取り込みは、骨髄および循環血球細胞における蛍光発光を測定して、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵを１０〜１００μｇで投与した５時間後に評価された。剖検時に、骨髄が抽出され、Ｅｘ  ｖｉｖｏでＩＶＩＳ（商標）２００−Ｓｐｅｃｔｒｕｍ機器に記録された。マウスの血液は上顎神経叢の穿刺により採取された。赤血球、白血球、血小板は、標準プロトコルを使用したフィコール密度勾配法により単離された。さらに、単離された細胞抽出物を６００ｇで１０分間遠心分離してペレットが得られ、次に、ＩＶＩＳ（商標）２００−Ｓｐｅｃｔｒｕｍを使用して、蛍光を測定するために記録された。
【０２２３】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ治療用ナノコンジュゲートの合成
ナノコンジュゲートは、組換えＤＮＡ戦略を使用して、細菌で産生されたタンパク質ナノ粒子である標的ベクターＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６、およびフロクスウリジン（５−フルオロ−２’−デオキシウリジン）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｅ  ＧｍｂＨ、Ｓｔｅｉｎｈｅｉｍ、ドイツ）のペンタマーオリゴヌクレオチドであるオリゴＦｄＵ、両方ともそれらのコンジュゲーション前に官能化されるが、の共有結合により合成された。オリゴＦｄＵは、図１に開示されているようにスルフヒドリルで官能化された。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６は、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎによって開示されたタンパク質の生体機能化のプロトコルに従って（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．２０１３．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，第３版，ＩＳＢＮ９７８０１２３８２２３９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ｐｐ．１２００）、リンカーＭＢＨＳ（４−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）と反応することによって官能化された。このリンカーは、マレイミド基を追加するＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６タンパク質の外部リジンのアミノ基に結合する。最終的なＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートは、マレイミドおよびオリゴＦｄＵ−チオールで官能化されたＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６と反応して得られた（マイケル反応）。最終反応生成物を透析により精製した。チオールによるオリゴＦｄＵの官能化と物理化学的特性評価が図１に開示される。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ合成の反応生成物の物理化学的および機能的特性評価が図２に開示される。
【０２２４】
得られたナノコンジュゲートにおけるオリゴＦｄＵとＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６の比の決定は、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６コンジュゲートの１ｍｇ／ｍｌ溶液とＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵコンジュゲートの１ｍｇ／ｍｌ溶液の２６０ｎｍのＵＶ光での吸光度に基づいて決定された。両方の溶液の吸光度の差は、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ溶液に存在するＦｄＵ分子の吸光度を提供する。ランバービールの法則（Ａｂｓ＝ｍｇ／ｍｌ＊Ｅ＊Ｌ、式中、Ｅ＝４４５００Ｍ−１．Ｃｍ−１）およびＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６タンパク質の分子量（ＭＷ＝３０，６９１ＫＤａ）を考慮して、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６タンパク質１ｍｇあたりのＦｄＵのモル数が決定された。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６の吸光度がタンパク質の約０．７／ｍｇであり、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの吸光度が融合タンパク質の約７．３２／ｍｇであることを考慮すると、結果は４．５６分子のオリゴＦｄＵが各融合タンパク質に結合していることを示した。
【０２２５】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＸＣＲ４＋細胞におけるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの内在化、ＣＸＣＲ４特異性および細胞毒性
ＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７−ｌｕｃ  ＣＲＣ細胞が、１０％ウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ）を添加した改良イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で培養され、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気でインキュベートされた。ＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１−ｌｕｃ細胞（ルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現）を１ｍＭのＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ濃度に１時間暴露し、１ｍｇ／ｍＬトリプシン（Ｇｉｂｃｏ）で１５分間処理し、４８８ｎｍの励起で１５ｍＷの空冷アルゴンイオンレーザーを使用して、フローサイトメーターＦＡＣＳ  Ｃａｎｔｏシステム（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）で内在化されたナノコンジュゲート粒子の緑色発光蛍光を測定することにより、ナノコンジュゲートの内在化能力を評価した。蛍光発光は、Ｄ検出器（５３０／３０ｎｍバンドパスフィルター）で測定された。ＣＸＣＲ４受容体を介した内在化の特異性を評価するため、ＣＲＣ  ＳＷ１４１７細胞とＣＸＣＲ４拮抗薬ＡＭＤ３１００（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を１：１０（タンパク質：拮抗薬）モル比で１時間インキュベートして、追加の１時間、ナノコンジュゲートに１ｍＭで曝露し、競合試験が実施された。
【０２２６】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ細胞内局在を評価するために、細胞はＭａｔＴｅｋ培養皿（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＭＡ、ＵＳＡ）で培養された。次に、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵがＬ−グルタミンを添加したＯｐｔｉＰｒｏ培地に添加された。核は０．２μｇ／ｍＬのヘキスト３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）で標識され、細胞膜は２．５μｇ／ｍＬのＣｅｌｌＭａｓｋＴＭ  Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で暗所で１０分間標識された。細胞はリン酸緩衝生理食塩水（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で洗浄された。開示されているように、Ｐｌａｎ  Ａｐｏ６３×／１．４（オイルＨＣ×ＰＬ  ＡＰＯラムダブルー）対物レンズを使用して、ＴＣＳ−ＳＰ５共焦点レーザー走査顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ、ドイツ）により生細胞が記録された。細胞内の粒子の局在を決定するために、細胞の厚さ０．５μｍの１０〜２０切片のスタックが収集され、Ｉｍａｒｉｓバージョン６．１．０ソフトウェア（Ｂｉｔｐｌａｎｅ、Ｚｕｅｒｉｃｈ、スイス）を使用して３次元モデルが生成された。
【０２２７】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ細胞傷害活性はまた、細胞生存率を測定し、メーカーの推奨事項に従って、代謝試験、３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトタゾリウムブロマイド（ＭＴＴ、Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｉｌｅａ、スイス）を使用して研究された。その目的のために、ＳＷ１４１７  ＣＲＣ細胞はＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵに１．０−１，０００ｎＭの濃度範囲で曝露され、７２時間でのＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６または遊離オリゴＦｄＵの等分子濃度と比較して生存率を測定した。次に、用量反応曲線が作成され、Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ  ｖｓ．１０．０ソフトウェアを使用して、各化合物の線形化されたＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ用量反応傾向線が決定された。
【０２２８】
ＣＲＣマウスモデルの生成
３つの異なるＣＲＣマウスモデルが使用された、１つは、ナノコンジュゲート生体内分布およびＣＲＣアポトーシスの誘導を研究するための皮下ＣＲＣ細胞移植によって生成され、２つは、転移の予防または確立された転移の退縮の誘導のいずれかのために、ナノコンジュゲート生体内分布および抗転移効果を研究するための同所性細胞移植により生成された。これらのモデルのうち２つを生成するために、５週齢のスイスのヌードマウスを使用され、１つのモデルではＮＯＤ−ＳＣＩＤマウスが用いられた。これらはすべて体重１８〜２０ｇの雌マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ、Ｌ’Ａｒｂｒｅｓｌｅ、フランス）で、寝具、水、γ線滅菌された食物を自由に摂取できる無菌環境に収容されていた。実験は、サン・パウ病院のマウス倫理委員会によって承認された。
【０２２９】
皮下（ＳＣ）マウスＣＲＣモデル
マウス脇腹の２５０μｌの培地に再懸濁した１ｘ１０７のＣＸＣＲ４＋ヒトＳＷ１４１７−ｌｕｃｉ  ＣＲＣ細胞（腫瘍成長の生物発光追跡を可能にするためにルシフェラーゼを発現）を注入することにより、皮下ＣＲＣモデルが作成された。腫瘍が７００ｍｍ３に達したら、それらは切除され、マウスのコホートにおいてトロッカーシステムによりＳＣ腫瘍アリコート（３ｘ３ｘ３ｍｍ）が移植された。ＳＣモデルは、ＣＸＣＲ４拮抗薬ＡＭＤ３１００の同時投与を使用して、腫瘍の取り込みおよびナノコンジュゲートの内在化およびｉｎ  ｖｉｖｏでの競合研究を評価するために使用された。それはまた、以下に開示されるように、処置後の経時的な、ＤＮＡ二本鎖切断の誘導、腫瘍細胞アポトーシスの誘導、および腫瘍組織に残存するＣＸＣＲ４＋癌細胞の割合（ＣＸＣＲ４＋ＣＣＦ）を決定するために使用された。次に、これらのデータは、その抗転移効果を決定することを目的とした後続の実験で、ナノコンジュゲート反復投与療法に必要な投与間隔を設計するために、使用された。
【０２３０】
確立された転移の退縮を研究するために使用される同所性（ＯＲＴ）ＣＲＣマウスモデル
スイスのヌードマウスをケタミンとキシラジンで麻酔し、開腹により盲腸を露出させた。２×１０６のＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７−ｌｕｃｉ  ＣＲＣ細胞（治療終了時に影響を受けた臓器の転移巣のＥｘ  ｖｉｖｏ生物発光同定を可能にするため、ルシフェラーゼを発現）が５０ｍｌの改良イーグル培地に懸濁され、滅菌マイクロピペットにロードされた。細胞懸濁液は双眼レンズの下で、約３０°の角度で、その先端を盲腸壁に５ｍｍ導入して、ゆっくりと注射された。その後、綿棒で注入点からピペット軸の方向に約２ｍｍの位置にわずかな圧力が加えられた。ピペットは引き出され、注射箇所の周囲は３％ヨウ素で洗浄された。注射後、腸は腹腔に戻され、外科用ステープルで閉じられた。このモデルは、確立された転移の退縮を誘導するＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートの能力を評価するために、使用された。
【０２３１】
転移の予防を研究するための同所性（ＯＲＴ）ＣＲＣマウスモデル
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの異なるコホートで以前に生成されたＳＣ腫瘍から解離したＳＷ１４１７−ｌｕｃｉ  ＣＲＣ細胞の脳内マイクロインジェクション（ＯＲＴ）を受けた、非常に効率的な転移モデルがＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで生成された。したがって、ＳＣ＋ＯＲＴモデルが作成された。ＳＣ腫瘍が７００ｍｍ３の体積に達すると、頸部脱臼によってマウスが犠牲になり、腫瘍が切除され、壊死領域が破棄された。次に、３００ｍｇの生存可能な腫瘍組織を小片に切り分けられ、０．０５％トリプシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１００ｍｇ／ｍｌ  ＤＮａｓｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の混合液で離散された。１０ｍｌピペットを使用して、混合物は３０回ピペッティングされ、３７℃で１０分間振とうしながらインキュベートされた。次に、１０ｍｌ、３ｍｌ、および１ｍｌのピペットを使用して３０回再ピペッティングされ、振とうしながら３７℃で５分間再インキュベートされた。次に、この再ピペッティング工程が繰り返された。得られたＳＷ１４１７単一細胞懸濁液はセルストレーナーでろ過され、細胞のカウント前に１，０００ｇで１０分間遠心分離された。次に、以前に培養で成長させ、５０μｌの培地に再懸濁した２×１０６個の細胞は、上記で開示された方法に従って各マウスの盲腸に微量注入された。このモデルは、転移進行を防ぐためのＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートの能力を評価するために使用された。
【０２３２】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ腫瘍の取り込み、腫瘍細胞の内在化、およびＤＮＡ損傷とアポトーシスの「ｉｎ  ｖｉｖｏ」での誘導
ＳＣ  ＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７  ＣＲＣモデルが、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵを単回静脈ボーラス投与として１００ｍｇ投与した後、バッファー、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６（非標的ナノコンジュゲート）およびオリゴＦｄＵ（非コンジュゲート遊離薬物）と比較した、ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の細胞質へのＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートの内在化を評価するために使用された。２時間、投与後５時間および２４時間だが、ＩＶＩＳ（商標）２００−Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＭＡ、米国）を使用して、腫瘍を切除し、腫瘍組織に生体分布したナノコンジュゲートによって放出された緑色蛍光の強度をＥｘ  ｖｉｖｏで記録するためにマウスを安楽死させた。続いて、腫瘍組織サンプルが採取され、処理され、免疫組織化学（ＩＨＣ）を実施し、抗ＧＦＰ抗体（１：３００、Ｓａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＣＡ、米国）を使用して、腫瘍細胞の細胞質へ移行する、対応するナノコンジュゲートの有無を決定した。二本鎖切断（ＤＳＢ）形成はまた、抗ｇＨ２ＡＸ  ｍＡｂ（１：４００、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、英国）を使用してＩＨＣにより測定され、各マウスの異なる腫瘍切片の５つの拡大領域において染色細胞の数がカウントされた。最後に、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵのアポトーシス誘導能力が、等分子量のオリゴＦｄＵまたはバッファーの投与の２４時間後に比較された。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＤＰ７３デジタルカメラおよびＣｅｌｌＤ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ３．３プログラム（Ｏｌｙｍｐｕｓ、東京、日本）を使用して、腫瘍組織切片のヘキスト染色による核凝縮を決定し、腫瘍ごとに異なる切片の５つの高倍率領域の凝縮またはデフラグされた核の数をカウントして、アポトーシスが評価された。
【０２３３】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ投与後のＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞数の変化による最適な投与間隔の定義
ＳＣ  ＳＷ１４１７マウスモデルは、ＣＸＣＲ４＋はナノコンジュゲートの標的細胞であるため、ＣＸＣＲ４発現腫瘍細胞の割合およびそれらの強度に関し、ナノコンジュゲートが腫瘍組織のＤＮＡ損傷およびアポトーシスを誘導する能力、処置後の腫瘍細胞の細胞膜におけるＣＸＣＲ４発現の動態を決定するために、使用された。その目的のために、１００μｇのＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの単回静脈ボーラス投与の２４、４８、７２時間後、抗ＣＸＣＲ４抗体とＩＨＣ（１：３００、Ａｂｃａｍ、英国）を使用してＣＸＣＲ４を発現する腫瘍細胞のレベルと割合を決定するために、マウスが安楽死され、腫瘍サンプルが採取され、その後、固定およびパラフィン包埋された。マウスは、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６、遊離オリゴＦｄＵ、またはバッファーの等分子量で処理されており、異なる時点で腫瘍組織におけるＣＸＣＲ４発現のレベルもまた決定された。抗転移効果を評価するために使用される反復投与スケジュールで最適なＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲート投与間隔を確立するために、腫瘍細胞におけるＣＸＣＲ４発現の動態の結果が使用された。
【０２３４】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵによる転移退縮の誘導の評価のための処置プロトコル
スイスのヌードマウスで開発された同所性および転移性ＣＲＣモデルは、転移退縮の実験を行うために採用された。４０匹のマウスを４つの群にランダム化し、（バッファー、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵおよび遊離オリゴ−ＦｄＵ（ｎ＝１０／群））、以下の等分子量の繰り返し静脈ボーラス投与がされた、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの２０μｇ、遊離オリゴ−ＦｄＵの２．６  ｎｍｏｌｓ、またはバッファー、３日に１回（ｑ３ｄ）、合計１０回の投与。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ投与は、腫瘍細胞移植の２か月後に開始され、これは、前の実験で、リンパ節および肺転移が存在すると判断された時間である（図３）。実験は、バッファー処理群の第一の動物を安楽死させる必要があるときに終了された。転移抑制効果を評価するためには、以下の研究されたパラメータを参照されたい。
【０２３５】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ転移防止効果の評価のための処置プロトコル
ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスで開発されたＳＣ＋ＯＲＴ転移性ＣＲＣモデルが、転移防止のためのナノコンジュゲートの能力を評価するために使用された。３４匹のマウスをランダムに３つの群に割り当て（バッファー（ｎ＝１１）、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ（ｎ＝１２）および遊離オリゴ−ＦｄＵ（ｎ＝１１））、以下の等分子量の繰り返し静脈ボーラス投与がされた、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの２０ｕｇ、遊離オリゴＦｄＵの２．６ｎｍｏｌｓ、またはバッファー、３日に１回（ｑ３ｄ）、合計１２回の投与。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ投与は、転移播種が生じる前に腫瘍細胞移植の１週間後に開始された（図３）。実験は、バッファー処理群の第一の動物を安楽死させる必要があるときに終了された。
【０２３６】
治療終了時の腫瘍組織における抗転移効果の評価およびＣＸＣＲ４＋癌細胞画分の決定
転移の退縮および予防の実験の両方の終わりに、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ抗転移効果を決定するために同じ方法論が適用された。剖検で、結腸直腸癌（リンパ節、肝臓、肺および腹膜）での播種が予想される臓器において目に見える転移の数および大きさが、すべての比較される群の各マウスについて記録された。また、生物発光（ＳＷ１４１７−ｌｕｃｉ  ＣＲＣ細胞に由来）を発した転移巣の数が、ＩＶＩＳ（商標）２００−Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）を使用して、転移の標的臓器においてＥｘ  ｖｉｖｏでカウントされた。病理組織学的および免疫組織化学的分析のサンプルが収集され、処理された。２人の独立した観察者が、各マウスの各器官の３つの切片（転移防止実験）または６つの切片（転移退縮実験）で観察されたすべての転移巣の数をカウントし、大きさを測定するためにＨ＆Ｅ染色サンプルを分析した。画像は撮影され、ＣｅｌｌＤ  Ｏｌｙｍｐｕｓソフトウェア（ｖ３．３）を搭載したＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡で測定は実施された。腫瘍組織におけるＣＸＣＲ４発現は、転移（腹膜、肝臓、肺およびリンパ節）による影響を受けた異なる臓器の原発腫瘍および転移巣を含む、処置後の腫瘍組織（ＣＸＣＲ４＋ＣＣＦ）に残っているＣＸＣＲ４＋癌細胞の割合を決定するために、上記で開示されるようにＩＨＣと抗ＣＸＣＲ４抗体を使用して決定された。得られた結果は、ＣＸＣＲ４＋ＣＣＦと異なる部位での抗転移効果との可能な相関関係を研究するために使用された。
【０２３７】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ生体内分布および正常臓器における毒性
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの取り込みは、上記で開示された方法論を使用して、ナノコンジュゲートのＧＦＰドメインにより発せられた緑色蛍光、正常（非腫瘍）組織におけるＤＮＡ  ＤＳＢおよびアポトーシス誘導、を測定することにより評価された。加えて、２人の独立した観察者が、毒性の兆候を探して、Ｈ＆Ｅ染色された非腫瘍組織サンプルで観察される可能な組織病理学的変化を評価した。これらの組織には、骨髄および脾臓等のナノコンジュゲートが蓄積する可能性があるＣＸＣＲ４発現器官（この受容体を腫瘍組織より顕著に低いレベルで発現するにもかかわらず）が含まれ、非ＣＸＣＲ４発現器官、特に肝臓等の非コンジュゲートオリゴＦｄＵが存在する器官の毒性もまた評価された。
【０２３８】
統計解析
異なる臓器での転移率の影響を受けたマウスの対照群と実験群の違いを分析するために、フィッシャーの正確確率検定が使用された。マン・ホイットニーの検定が、影響を受けた臓器の転移巣の数と大きさを群間で比較するために使用された。すべての定量値は平均±ＳＥとして表され、統計試験はＳＰＳＳバージョン１１．０（（ＩＢＭ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、米国）を使用して実行された。群間の差は、ｐ＜０．０５で有意とみなされた。
【０２３９】
例１  ＨＳ−オリゴ−ＦｄＵの物理化学的特性評価
官能化されたペンタマーＦｄＵ−ＨＥＧ−ＳＨを２６０ｎｍでの吸光度によって定量化され、ＭＷは１９７６．２であり、予想されるＭＷは１９７４．０であり、ＭＡＬＤＩ質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）によって確認された。質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）で特性評価される対照ペンタヌクレオチド（遊離オリゴＦｄＵ）のＭＷは１４７６．５で、予想されるＭＷは１４７８．１である。
【０２４０】
例２  Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートの物理化学的特性評価およびナノ粒子に対する薬物の比率の決定
コンジュゲーション生成物の分析は、図２に示す分子量のナノ粒子に結合したＦｄＵのペンタオリゴヌクレオチドの１つまたは２つの分子に対応するピークを特定して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦスペクトルにより実行された。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの大きさは、動的光散乱によって決定され、１４．６＋０．１４であり、対照Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６ナノ粒子の１３．４＋０．１１と比較して、透過型電子顕微鏡により決定された大きさと一致した。ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって決定されるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６ナノ粒子の分子量は４７７ｋＤａである。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６ポリペプチドの分子量が３０，６９１ｋＤａであることを考慮すると、これは各ナノ粒子が約１５個のモノマーを有することを意味する。６０の薬物／ナノ粒子比は、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６およびＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートのＵＶスペクトルに基づいて、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲート合成反応で得られた生成物について得られた。この生成物には、ペンタマーオリゴＦｄＵの平均４分子が組み込まれ、１５個の融合タンパク質モノマーを含有するナノ粒子に組み立てられた場合、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６ナノ粒子あたり合計６０個のＦｄＵ分子に対応する。
【０２４１】
例３  ＣＸＣＲ４＋ＣＲＣ細胞を標的とするナノコンジュゲートであるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの開発
ＣＸＣＲ４過剰発現（ＣＸＣＲ４＋）大腸癌（ＣＲＣ）細胞は転移開始能力（ＭＩＣ）を有し（Ｃｒｏｋｅｒ、Ａ．Ｋ．＆Ａｌｌａｎ、Ａ．Ｌ．２００８．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １２、３７４−３９０；Ｚｈａｎｇ、Ｓ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ、２０１２．ＢＭＣ  Ｍｅｄ  １０、８５（２０１２））、ＣＸＣＲ４ダウンレギュレーションによるその阻害（Ｍｕｒａｋａｍｉ、Ｔ．ｅｔ  ａｌ、２０１２．ＢＭＣ  Ｍｅｄ  １０、８５；Ｗａｎｇ．ｅｔ  ａｌ、２０１４．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｎｃｏｌ  ４４、１８６１−１８６９）は、これらの細胞を転移性幹細胞（ＭｅｔＳＣ）として識別することが以前に実証されている。これに基づき、本発明者らは、ＣＸＣＲ４＋ＣＲＣ細胞を選択的に除去することにより抗転移効果を達成できるかどうかを評価するために、ＣＸＣＲ４標的ナノコンジュゲートを生成した。この新しいＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートの構造と物理化学的特性は、図１、２、４ａ〜ｃに開示されている。コンジュゲートには、Ｔ２２（ＣＸＣＲ４受容体を標的とするリガンド）、緑色蛍光タンパク質（ｉｎ  ｖｉｖｏでのその追跡が可能）、およびＣＲＣ３１に対して活性な薬物のオリゴヌクレオチドであるオリゴＦｄＵが含有され、それはナノコンジュゲートへの多数の薬物分子のロードを可能にする。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、オリゴＦｄＵをチオールで官能化することで合成され（図４ｃおよび図１ａ）、それは、その後、化学カプラーに結合されるとＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６タンパク質ナノ粒子にコンジュゲートされた（図４ｃ）。本発明者らは、ＨＰＬＣ、ＵＶ分光法およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによりＨＳ−ｏｌｉｇｏ−ＦｄＵの物理化学的特性評価（図１ｂ−ｅ）、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、動的光散乱（ＤＬＳ）および電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥＳＥＭ）により最終Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ生成物の物理化学的特性評価（図２ａ−ｃ）を実施した。この生成物は、おおよそ４０の薬物／ナノ粒子（ＤＮＲ）比（図２）で、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６よりもわずかに大きい大きさ（１４．６６＋０．１４ｎｍ）を有し、自己集合能力を維持した（図２ｄ）。さらに、その大きさは腎濾過カットオフ（６−７ｎｍ）よりも大きく、効果的な標的薬物送達の要件である血液中の高い再循環時間を確保した。
【０２４２】
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６を第一に化学カプラーで官能化し、次にチオール官能化オリゴＦｄＵと接触させたＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの製造にも、インバート法が使用された。この方法（Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ  ＩＮＶＥＲＴとして知られている）を使用して得られたコンジュゲートは、次に、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよび動的光散乱（ＤＬＳ）によって物理化学的に特性評価された（図１３ＡおよびＢ）。
【０２４３】
例４  Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択的に内在化し、ＣＸＣＲ４＋ＣＲＣ細胞を致死する
続いて、発明者らは、薬物コンジュゲーションがタンパク質の立体構造と機能を変更できるという条件で、ロードされたオリゴＦｄＵがそのＣＸＣＲ４標的能力を維持しながらナノ粒子細胞傷害活性を付与するかどうかを評価した。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、フローサイトメトリーを使用して蛍光発光で測定されたように、ヒトＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７  ＣＲＣ細胞に内在化し（図４ｄ）、共焦点顕微鏡で観察されたようにその細胞質基質に蓄積および移動する（図４ｅ）。ＡＭＤ３１００  ＣＸＣＲ４アンタゴニストは膜におけるＣＸＣＲ４受容体をダウンレギュレートし、ナノコンジュゲートの内在化を完全にブロックすることができたため、ナノコンジュゲートはまた内在化のためのＣＸＣＲ４への依存性を維持する（図１ｄ）。加えて、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、細胞生存率（図４ｆ）または位相差顕微鏡（図１ｇ）で測定した同じ細胞で、遊離オリゴＦｄＵよりも有意に高い細胞毒性を誘導した。本発明者らは、ヒトＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞におけるＣＸＣＲ４依存性ナノコンジュゲートの内在化および遊離オリゴ−ＦｄＵよりも高い細胞毒性を確認した（図５ａ−ｄ）。
【０２４４】
インバート法を使用して得られたＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ  ＩＮＶＥＲＴコンジュゲートはまた、ＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞におけるその細胞毒性効果の点でも特性評価された（図１３Ｃ）。
【０２４５】
例５  Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵはｉｎ  ｖｉｖｏでＣＸＣＲ４＋ＣＲＣ細胞を選択的に標的にする
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性に対するＣＸＣＲ４依存性が確立されると、発明者らは、腫瘍組織の取り込み、ＣＸＣＲ４過剰発現ＭｅｔＳＣ（標的細胞）の内在化、細胞毒性薬ＦｄＵの細胞内放出、および選択的ＣＸＣＲ４＋ＭｅｔＳＣ致死に関する、その選択性およびＣＸＣＲ４依存性を評価することにより、ナノコンジュゲートがその静脈内投与後に標的薬物送達を達成できるかどうかを皮下（ＳＣ）ＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７  ＣＲＣモデルで調査した（図６ａ）。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６で実証されたように、マウスに１００ｍｇを注射した５時間後に、蛍光発光で測定されたような選択的な腫瘍の取り込みを示した（図６ｂ）（Ｃeｓｐｅｄｅｓ，Ｍ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．２０１６．Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．１２，１９８７−１９９６．）。さらに、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵとＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６の両方は、抗ＧＦＰ免疫組織化学（ＩＨＣ）で測定されるように、ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の細胞質基質に内在化され（図６ｃ）、バッファーまたは遊離オリゴＦｄＵ陰性対照では検出できないシグナルであった。加えて、ナノコンジュゲートの前にＣＸＣＲ４拮抗薬ＡＭＤ３１００のマウスへ投与することは、その腫瘍の取り込み（図６ｄ）、ＣＸＣＲ４＋癌細胞のその内在化（図６ｅ−ｆ）を完全にブロックした。したがって、ナノコンジュゲートは、選択的な腫瘍の生体内分布だけでなく、ＣＸＣＲ４依存的に標的ＣＸＣＲ４＋癌細胞の細胞質基質へのその特異的な内在化も達成する。
【０２４６】
例６  Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、ＣＲＣ腫瘍におけるＣＸＣＲ４＋ＣＲＣ細胞の選択的枯渇につながる標的薬物送達を達成する
次に、ナノコンジュゲートによって達成されたＣＸＣＲ４＋標的癌細胞の細胞質基質への選択的内在化が選択的ＦｄＵ送達につながるかどうかを評価するために、同じＳＣ  ＣＲＣモデルが使用された。本発明者らはまた、送達されたＦｄＵがＤＮＡ損傷およびアポトーシスを誘発し、ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の特異的排除を引き起こすことができるかどうか、およびこれらの効果が遊離オリゴＦｄＵによって達成される効果と異なるかどうかを評価した。その目的のため、ＤＳＢはＦｄＵ抗腫瘍活性３８を媒介するため、ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）の発生を測定するためにＨ２ＡＸｇ  ＩＨＣが使用された。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ処理の５時間後、腫瘍中のＤＳＢ病巣（ｆｏｃｉ）の数（２２．８±１．４）は、遊離オリゴＦｄＵの後（１３．４±０．７）よりも有意に高かった（ｐ＝０．０２）が、ＤＳＢはＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６またはバッファー処理マウスでは検出できなかった（図７ａ）。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵのＤＳＢの誘導は、標的細胞でＦｄＵを放出して核に到達し、ＤＮＡに組み込んでＤＮＡ損傷を誘導する能力を示した。さらに、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ注射の２４時間後のヘキスト核凝縮またはデフラグメンテーションにより測定された腫瘍組織のアポトーシス像の数（１３．９±０．５）は、遊離オリゴＦｄＵ（７．１±０．６）、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６（３．０±０．３）またはバッファー（１．９±０．４）処理後よりも有意に高かった（ｐ＜０．０５）ため（図７ａ）、増加したＤＳＢはより高い抗腫瘍活性を導いた。
【０２４７】
続いて、ＳＣ  ＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７  ＣＲＣモデルを使用して、遊離オリゴ−ＦｄＵと比較して、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵを１００ｍｇ単回投与した後、腫瘍組織に残っているＣＸＣＲ４＋がん細胞（ＣＸＣＲ４＋ＣＣＦ）の割合が経時的に測定された。処理前には、両グループは腫瘍組織で同様のＣＸＣＲ４＋ＣＣＦを示した（図７ｂ）、しかし、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ処理後、ＣＸＣＲ４＋ＣＣＦは２４時間で減少し、４８時間で検出できなくなった（図７ｂ）。したがって、投与後４８時間のＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵはｉｎ  ｖｉｖｏでＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の選択的除去を達成した。対照的に、遊離オリゴ−ＦｄＵの等分子量投与後の腫瘍組織におけるＣＸＣＲ４＋ＣＣＦは、経時的なその基礎レベルと同様のままであった。まとめると、これらの結果は、ＣＸＣＲ４＋がん細胞の選択的排除に関連するＤＮＡ損傷および腫瘍細胞死の増強によって示されるように、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵが腫瘍組織への選択的生体内分布および標的ＣＸＣＲ４＋がん細胞へのＦｄＵ送達を達成することを示しており、したがって、がん細胞を標的とする標的化されたＦｄＵ送達を達成する。
【０２４８】
例７  Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ繰り返し注入のための一時的な標的細胞の除去および投与間隔の定義
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、投与後４８時間で腫瘍組織のＣＸＣＲ４＋標的細胞の選択的枯渇を達成したが、腫瘍組織における注射後７２時間のＣＸＣＲ４＋癌細胞画分がその治療前のレベルと同様になったため、この効果は一過性であることが見出された（図７ｂ）。対照的に、遊離オリゴＦｄＵ療法後の腫瘍組織中のＣＸＣＲ４＋ＣＣＦは経時的に維持され、処理後２４時間、４８時間または７２時間は治療前と同じままであった（図７ｂ）。したがって、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの効果とは対照的に、遊離オリゴＦｄＵによる癌の致死は、ＣＸＣＲ４＋癌細胞に対する選択性を示さなかった。これらの結果に基づいて、およびＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ抗転移効果を評価するために、発明者らは、反復投与スケジュールでの投与に最適な７２時間（３日）の投与間隔として定義した。このスケジュールは、ＣＸＣＲ４＋癌細胞がＭｅｔＳＣとして機能するという条件で、転移の播種および／または病巣の成長を効率的にブロックするために、処理期間に沿って原発腫瘍および転移巣に残るＣＸＣＲ４＋がん細胞（ＣＸＣＲ４＋ＣＣＦ）の割合を十分に低く維持することが期待された。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの確立された転移の成長を阻害する能力は、リンパ節（ＬＮ）および肺の転移を生成するスイスのヌードマウスで同所性生物発光ＣＸＣＲ４＋ＣＲＣモデルを使用して、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６または遊離オリゴＦｄＵの等分子量と比較することにより評価され（図３ａ）、ＣＲＣ細胞移植の２ヶ月後、２０ｍｇ静脈内ｑ３ｄ投与量で治療を開始した（図３ｂ）。遊離オリゴＦｄＵと比較して、転移を防ぐＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの能力はまた、ＬＮ、肝臓、肺および腹膜での転移効率および播種が改善された同所発光ＣＸＣＲ４＋ＣＲＣ  ＮＯＤ／ＳＣＩＤモデルを使用して（図３ｃ）、ＣＲＣ移植後１週間で投与を開始して（図３ｄ）、評価された。
【０２４９】
例８  Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは転移の発生を防ぎ、確立された転移の退縮を誘導する
転移の予防の実験の終了時に、および遊離オリゴＦｄＵ効果とは対照的に、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、Ｅｘ  ｖｉｖｏでの発光で測定されたように、肝臓および肺の転移の発生をブロックした（図８ａ）。実験の終了時に、組織学的分析はＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ処理マウスでは、遊離オリゴ−ＦｄＵマウスよりも、腹膜での転移の総数が１０．３倍減少し（ｐ＝０．０００１）、および肝臓では３．１−３．７倍減少し（ｐ＝０．００１）、または肺では（ｐ＝０．００６）であり、一方、ＬＮでは転移を予防しなかったことを示した（図８ｂ）。両方の群間でマウスあたりの腹膜、肝臓または肺の平均病巣数を比較すると、同様の結果が得られた（表１）。
【０２５０】
【表１】
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【０２５１】
重要なことに、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵとは対照的に、遊離オリゴ−ＦｄＵは、すべての部位（ＬＮ、肝臓、肺、腹膜）において、バッファー処理した動物と比較して、合計（図８ｂ）または平均（表１）の病巣数を減少させなかった。さらに、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵはまた、遊離オリゴＦｄＵと比較して、腹膜病巣の大きさの２．４倍の減少を誘導した（ｐ＝０．０１）（表２）。
【０２５２】
【表２】
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【０２５３】
転移の退縮の実験の終了時に、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ処理マウスは、Ｅｘ  ｖｉｖｏの蛍光発光（図９ａ）、または総肺病巣数の減少によって測定されるように、組織切片における、遊離オリゴＦｄＵ（ｐ＝０．０４）、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６（ｐ＝０．０３）、またはバッファー（ｐ＝０．０３）処理マウスより少ない肺転移の数を記録した（図９ｂ）。群間でマウスあたりの肺病巣数の平均を比較すると、同様の結果が得られた（表１）。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ処理マウスはまた、バッファー処理よりも有意に少ないリンパ節転移数を記録した（ｐ＝０．０３）、しかし、その効果は、遊離オリゴＦｄＵによって達成された効果と同様であった（図９ｂおよび表１）。
【０２５４】
要約すると、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの繰り返し投与は腹膜、肝臓および肺の転移発生を強力に防止したが、一方で、遊離オリゴＦｄＵはいかなる部位でも転移を防止しなかった。加えて、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、確立された肺転移の退縮の誘導において、遊離オリゴＦｄＵよりも強力であった。興味深いことに、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵおよび遊離オリゴＦｄＵの両方が、経時的なｉｎ  ｖｉｖｏでのまたは実験終了時のＥｘ  ｖｉｖｏでの蛍光発光によって測定されるように、転移の予防（図１０ａ、ｂ）または転移の退縮１９３（図１０ｃ、ｄ）の実験において、原発腫瘍の成長に対して同様の阻害効果を示した。
【０２５５】
例９  部位依存性ＣＸＣＲ４調節、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ  ＣＸＣＲ４＋細胞標的化および抗転移効果。
転移の防止の実験においてＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵによって達成された明確な部位依存性抗転移能（図８ｂおよび表１）、細胞内在化のためのＣＸＣＲ４膜発現へのその依存性（図２ｅ）およびＣＸＣＲ４＋癌細胞を選択的に致死させるその能力（図７ａ、ｂおよび図５ａ）に基づき、発明者らは、治療後に記録されたＣＸＣＲ４発現が、異なる部位において観察された抗転移効果と相関するか調査した。抗ＣＸＣＲ４  ＩＨＣによる検出（基礎レベルと比較して）、およびナノコンジュゲート感受性は、腹膜転移ではより高くなり、肝臓と肺転移では中間になり、および無反応のリンパ節転移では存在せず（図８ｃ〜ｄ）、異なる部位において抗転移効果と相関するが（図８ｂ）、実験終了時の転移巣におけるＣＸＣＲ４＋ＣＣＦの部位依存的減少が観察された。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵによる転移制御とは対照的に、遊離オリゴＦｄＵはバッファー処理マウスと比較して、ＣＸＣＲ４＋ＣＣＦを低下させず（図８ｃ）、肝臓および腹膜の処置終了時の転移数を減少させるのではなく増加させるようである（図８ｂおよび表１）。同様に、転移の退縮の実験において、本発明者らは、実験終了時に肺転移病巣のＣＸＣＲ４＋ＣＣＦの減少を観察し（図９ｃ）、この部位においてリンパ節病巣よりも高い抗転移効果を観察し（図９ｂ）、それは、ＣＸＣＲ４＋ＣＣＦの減少を示さずＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ療法に対する反応不良を示した（図９および表１）。
【０２５６】
例１０  Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの蓄積または正常組織の毒性の欠如
Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ治療濃度域を推定するために、非腫瘍組織におけるその生体内分布およびＤＮＡ損傷またはアポトーシスの誘導が分析された。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ注射は、蛍光発光で測定したように、高度に選択的な腫瘍組織の蓄積をもたらすが（図６ｂ）、同じ実験で、ＣＸＣＲ４陽性（骨髄、脾臓）またはＣＸＣＲ４陰性（腎臓、肺、脳、心臓または肝臓）正常組織の取り込みは、肝臓の一時的な蓄積を除いて、検出できなかった（図１１ａ）。さらに、抗ｇＨ２ＡＸ  ＩＨＣによって検出されたＤＳＢのレベルは、処置後５時間の正常な骨髄で遊離オリゴＦｄＵによって誘導されたレベルと同様であったが（図１１ｂ）、肝臓では検出されなかった。ＤＳＢ誘導は、投与後２４時間でそれらが骨髄または肝臓で検出されなかったため、アポトーシスまたは組織学的変化を引き起こさなかった（図１１ｃ）。したがって、正常組織への無視できるナノコンジュゲート分布と一貫して、骨髄または循環血液単球を含むすべての分析された組織における検出可能なアポトーシスまたは組織学的変化の欠如（図１２）、および転移の退縮（図１１ｄ）または予防（図１１ｅ）の実験におけるマウス体重減少の欠如、または臨床毒性の任意の兆候は、強力な抗転移効果を達成する用量でのＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの幅広い治療指数を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図６−４】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月9日(2020.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
【図１】チオール官能化オリゴＦＤＵの合成と物理化学的特性。（ａ）チオールで官能化されたＯＬＩＧＯ−ＦＤＵの合成：ペンタマーオリゴ−（ＦＤＵ）５−ＳＨ（ＯＬＩＧＯ−ＦＤＵ）は、Β−シアノエチルホスホロアミダイト法を使用して、ＲＮＡ／ＤＮＡシンセサイザーで１μｍｏｌスケールで合成された。３’−チオール修飾剤Ｃ３制御細孔ガラス（ＣＰＧ）（ＬＩＮＫ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）が合成の固体支持体として使用された。最初に、ヘキサエチレングリコール（ＨＥＧ）ホスホラミダイト（ＧＬＥＮ  ＲＥＳＥＡＲＣＨ）が組み込まれた。次に、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）−保護−５−フルオロ−２’−デオキシウリジンホスホロアミダイト単位を繰り返し添加することにより合成が完了された。配列を組み立てた後、オリゴヌクレオチド支持体が０．１ＭのＤＴＴ（１，４−ジチオトレイトール）を含むアンモニア水（３２％）で室温で２時間処理された。１８アンモニア溶液を濃縮乾固し、生成物を使用前に水で溶出したＮＡＰ−１０（ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−２５）カラムで脱塩された。遊離オリゴ−ＦＤＵ合成：ＨＥＧおよびチオール基を含まない対照ペンタマーオリゴ−ＦＤＵを以前と同様に調製されたが、３’−スクシニル−ＦＤＵ制御細孔ガラスを固体支持体として使用した。最後に、オリゴヌクレオチドがアンモニア水（３２％）で室温で２時間脱保護された。（ｂ）オリゴ−（ＦＤＵ）５−ＳＨの物理化学的特性。ペンタマーＦＤＵ−ＨＥＧ−ＳＨのＨＰＬＣ分析（条件：Ｘ−ＢＲＩＤＧＥＴＭ  ＯＳＴ  Ｃ１８（１０ｘ５０ｍｍ、２．５μｍ）、０％から４０％までの２０分の直線勾配、流速２ｍＬ／ｍｉｎ、溶液Ａは０．１Ｍの酢酸トリエチルアンモニウム水溶液（ＴＥＡＡ）中、５％のＡＣＮであり、Ｂは０．１ＭのＴＥＡＡ中、７０％のＡＣＮであった。（ｃ）ペンタマーＦｄＵ−ＨＥＧ−ＳＨのＵＶスペクトル。ペンタマーは、２６０ｎｍでの吸収によって定量化された。（ｄ）ペンタマーＦｄＵ−ＨＥＧ−ＳＨ（オリゴ−ＦｄＵ）のＭＳスペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）。計算分子量は１９７６．２、測定分子量は１９７４．０。（ｅ）対照ペンタマーＦｄＵ（遊離オリゴＦｄＵ）のＭＳスペクトル（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）。計算分子量は１４７８．１、測定分子量は１４７６．５。
【図２】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵナノコンジュゲートの物理化学的特性および薬物とナノ粒子の比率。コンジュゲーション生成物の分析は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦスペクトルによって実施された。（ａ）１個のオリゴＦｄＵまたは２個のオリゴＦｄＵ低分子薬、非コンジュゲートＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６タンパク質、カプラーコンジュゲートＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６を含む生成物の分子量を特定するＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵコンジュゲート生成物の質量分析。（ｂ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６ナノ粒子と比較した、動的光散乱によって決定されるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの大きさ。（ｃ）透過型電子顕微鏡で検出された代表的なＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ画像。（ｄ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ自己組織化ナノ粒子の分子モデリング（出展：Ｒｕｅｄａ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ、Ａｄｖ  Ｍａｔｅｒ  ２７、７８１６−７８２２（２０１５）、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓの許可を得て印刷）。
【図３】転移の退縮と予防プロトコルにおける抗転移効果を評価するために使用されるマウスモデル、実験設定、およびＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵ投与量。（ａ）確立された転移の退縮プロトコルに使用されるマウスモデル：スイスのヌードマウスにおけるＣＸＣＲ４＋生物発光ＳＷ１４１７  ＣＲＣ細胞の直接同所移植、それは、リンパ節と肺に転移を生じさせる。スケールバー、１ｃｍ。（ｂ）確立された転移の退縮を誘導するナノコンジュゲート能力を評価するために、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ投与は、１０回投与あたり２０μｇｑ３ｄの投与量で、ＣＲＣ細胞の盲腸移植の２か月後に開始された（確立された転移がすでに存在する場合）。（ｃ）転移の予防プロトコルに使用されるマウスモデル：ＣＸＣＲ４＋生物発光ＳＷ１４１７細胞の皮下通過後、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに解離した腫瘍細胞（ＳＣ＋ＯＲＴ）の同所移植、それは、リンパ節（ＬＮ）、肝臓、肺、および腹膜に転移を起こす。（ｄ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの投与は、転移の発生を防ぐためのナノコンジュゲート能力を評価するため、ＣＲＣ細胞の盲腸移植の１週間後（転移がまだ発生しない場合）、１２用量あたり２０μｇｑ３ｄの用量で開始された。両方の実験において、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ抗転移効果は、等分子量の遊離オリゴＦｄＵによって達成される効果と比較される。転移の予防の実験を開始する前に、使用したマウスモデルには処置開始前にミクロまたはマクロ転移が欠如していることを別のマウスで確認した。転移の退縮の実験が始まる前に、処置開始前に転移巣がすでに存在していることを別のマウスで確認した。スケールバー、１００μｍ。
【図４】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートの合成と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＸＣＲ４＋ＣＲＣ細胞の選択的内在化および致死の実証。（ａ）ナノコンジュゲートは、ＣＸＣＲ４リガンド、緑色蛍光タンパク質、および低分子薬と結合するヒスチジンテール、としてのペプチドＴ２２で構成された融合タンパク質、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６（Ｕｎｚｕｅｔａ  ２０１２において開示）を含んでなる。（ｂ）オリゴ−ＦｄＵと命名された、抗腫瘍薬５−フルオロ−２’−デオキシウリジン（ＦｄＵ）の７〜９個のペンタマーオリゴヌクレオチド（約４０分子）が、カプラーを使用してＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６標的ベクターにコンジュゲートされる。（ｃ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ化学合成：Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６は、最初に外部リジンのアミノ基を介してＭＢＨＳ（６−マレイミドヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）カプラーに共有結合する。次に、チオール官能化オリゴ−ＦｄＵ（オリゴ−（ＦｄＵ）５−ＳＨ）は、マレイミドで官能化されたＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６と反応される（マイケル反応）。（ｄ）フローサイトメトリーを使用して、蛍光発光で測定された、１μＭで１時間曝露した後のＣＸＣＲ４過剰発現（ＣＸＣＲ４＋）ＳＷ１４１７  ＣＲＣ細胞におけるナノコンジュゲート内在化。
【図５】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞に選択的に内在化し、致死する。（ａ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートまたはＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６のＨｅＬａ細胞への内在化は、１μＭ濃度で１時間の細胞暴露後、フローサイトメトリーにより放出された蛍光として検出された。ＣＸＣＲ４拮抗薬ＡＤＭＤ３１００による細胞の前処理により得られた完全な内在化ブロック。（ｂ）１μＭで２４時間暴露した後の共焦点顕微鏡によるＨｅＬａ細胞でのＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの細胞内輸送。（ｃ）遊離オリゴＦｄＵ曝露と比較した、線形化されたＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ用量反応傾向線の表示。抗腫瘍効果は、開示された濃度として、７２時間暴露後、ＭＴＴによりＨｅＬａ細胞の生存率として測定された。（ｄ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６または遊離オリゴＦｄＵと比較して、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲートに４８時間曝露したＨｅＬａ細胞の光学顕微鏡画像で記録された細胞生存率の低下。スケールバー、１００μｍ。
【図６】ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＸＣＲ４＋細胞におけるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵの選択的かつ受容体依存的な取り込み。（ａ）転移性幹細胞の標的化された薬物送達と選択的死滅を達成するためのアプローチ：ＣＸＣＲ４−ナノコンジュゲート相互作用は、原発腫瘍および転移巣において、ＭｅｔＳＣのＣＸＣＲ４媒介内在化、続いて、ＣＸＣＲ４＋細胞の選択的死滅につながる二重鎖切断を誘導するため、細胞質基質へのＦｄＵ放出と核への拡散を誘発する。（ｂ）ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ２００を使用して、蛍光発光で測定されるように、１００μｇの単回静脈内投与の５時間後の皮下ＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７  ＣＲＣ腫瘍組織における選択的Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵナノコンジュゲート生体内分布。生体内分布は、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６標的ベクターによって達成されるものと類似しており、バッファーまたは遊離オリゴ−ＦｄＵ処理後は検出できない。（ｃ）抗ＧＦＰ  ＩＨＣで測定されたような、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６と同様のレベルでの、腫瘍組織におけるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ蓄積の検出。バッファーまたは遊離オリゴＦｄＵ対照でのＧＦＰ検出の欠如。（ｄ）ＣＸＣＲ４拮抗薬ＡＭＤ３１００の投与は、蛍光発光によって測定されるように、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ腫瘍の生体内分布を完全にブロックする。蛍光は、バッファーまたは遊離オリゴＦｄＵ対照では検出されない。（ｅ）ＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７腫瘍組織で観察されるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの取り込みは、抗ＧＦＰ  ＩＨＣ  Ｈスコアを使用して、定量化されるように、前のＡＭＤ３１００投与によりほぼ完全にブロックされる。（ｆ）抗ＧＦＰ免疫染色によるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵの取り込みおよびＡＭＤ３１００競合の代表的な画像、この定量はパネルｅにおいて報告されている。スケールバー、５０μｍ。
【図７】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵによる腫瘍組織のＣＸＣＲ４過剰発現癌細胞の枯渇と投与間隔の定義。（ａ）処置前の比較群（バッファー、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６、および遊離オリゴ−ＦｄＵ）の皮下腫瘍組織における同様のレベルのＣＸＣＲ４過剰発現（上のパネル）。ＤＮＡ二重鎖切断誘導（抗ｇＨ２ＡＸ  ＩＨＣで測定、投与後５時間、中央のパネル）およびアポトーシス誘導（ヘキスト染色、２４時間、下のパネル）の代表的な画像。遊離オリゴＦｄＵと比較されるように、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵのＤＳＢとアポトーシス誘導のより高いレベルに注意する。白い矢印はアポトーシス細胞を示す。（ｂ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、１００μｇ単回投与後、ＳＷ１４１７  ＣＲＣ腫瘍組織からＣＸＣＲ４＋癌細胞を枯渇させる。抗ＣＸＣＲ４  ＩＨＣを使用して、注射の２４時間後の腫瘍におけるＣＸＣＲ４＋細胞画分の減少、４８時間でのそれらの完全な消失、および、基礎レベルと同様の割合に達するような投与後７２時間でのＣＸＣＲ４＋細胞の再出現に注意する。対照的に、腫瘍組織におけるＣＸＣＲ４＋癌細胞画分（ＣＸＣＲ４＋ＣＣＦ）は、遊離オリゴＦｄＵ処置後も一定である。ＣＸＣＲ４＋腫瘍細胞の再出現の３日間の時間経過は、その抗転移効果を評価する実験でのナノコンジュゲート投与の反復投与スケジュールで使用される投与間隔を定義する。スケールバー、５０μｍ。
【図８】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵはＣＸＣＲ４依存的に転移を防ぐ。（ａ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、遊離オリゴＦｄＵと比較されるように、転移の予防の実験の終了時に、ＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７同所性モデルの生物発光リンパ節（ＬＮ）、肝臓および肺転移（ｍｅｔｓ）の出現をブロックする。（ｂ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、遊離オリゴＦｄＵと比較して、転移の予防の実験の最後にあるＨ＆Ｅ染色組織切片に記録されているように、肝臓、肺、および腹膜転移の合計数を大幅に減らすことで転移を防ぐ。対照的に、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは遊離オリゴＦｄＵ投与後、リンパ節転移の数は減少しない、＊Ｐ＜０．０５、マン・ホイットニーの検定。ナノコンジュゲートが誘発する平均病巣数の減少に関する結果については、表１を参照。（ｃ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、抗ＣＸＣＲ４  ＩＨＣで測定されるように、実験の終了時に、肝臓、肺、および腹膜の転移組織に残っているＣＸＣＲ４＋癌細胞画分（ＣＸＣＲ４＋ＣＣＦ）の遊離オリゴＦｄＵよりも高い減少を誘発する。対照的に、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６  ＦｄＵまたは遊離オリゴＦｄＵは、治療後にリンパ節転移または原発腫瘍組織に残るＣＸＣＲ４＋ＣＣＦを減少させない。（ｄ）治療終了時にＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは遊離オリゴＦｄＵによって誘発されたＣＸＣＲ４＋ＣＣＦの減少の代表的な画像、この定量はパネルｃに報告されている。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵによって誘発されたＣＸＣＲ４＋ＣＣＦの減少（パネルｃ）と各転移部位でのその抗転移効果（パネルｂ）の相関に注意する。スケールバー、１００μｍ。アスタリスク：腫瘍組織、ｖＬ：リンパ管、ＬＮ：リンパ転移。
【図９】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵは、ＣＸＣＲ４依存的に確立された転移の退縮を誘導する。（ａ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、転移の退縮の実験の終了時に生物発光により測定されるように、遊離オリゴＦｄＵよりも高い肺転移の阻害を示すが、両方の化合物はＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７同所性モデルで同様のレベルのリンパ節転移の阻害を示す。（ｂ）Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、転移の退縮の実験の終了時にＨ＆Ｅ染色組織切片で記録されたように、遊離オリゴＦｄＵよりも肺転移の数の高い減少を示すが、両方の化合物はリンパ節転移の同様のレベルの阻害を示す。
【図１０】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵ原発腫瘍成長の阻害。（ａ）７８転移の予防の実験では、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは遊離オリゴ−ＦｄＵ処理後のｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光により測定されたように、バッファーで処理されたマウスと比較して、実験時間に沿って原発腫瘍成長の有意な抑制は観察されなかった。（ｂ）実験終了時の切除後に原発腫瘍より放出された生体発光のＥｘ  ｖｉｖｏ記録も、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵ、遊離オリゴ−ＦｄＵ、およびバッファー処理マウス間で同様のレベルを示した。（ｃ）確立された転移の退縮の実験において、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、ｉｎ  ｖｉｖｏ生物発光（ＢＬＩ）によって検出されるように、遊離オリゴＦｄＵによって達成されるものと同様のレベルまで、実験時間に沿って原発腫瘍の成長を抑制した。両方の化合物は、バッファーで処理した動物と比較して、腫瘍の成長を有意に抑制した。（ｄ）実験終了時の切除後、原発腫瘍より放出された生物発光のＥｘ  ｖｉｖｏ記録もまた、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵマウスと遊離オリゴＦｄＵマウス間で同様のレベルを示した。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは遊離オリゴＦｄＵ処置に対する原発腫瘍の同様の反応の記録とは対照的に、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵによって誘発される抗転移効果は、特に転移予防に関する遊離オリゴＦｄＵ処置後に観察されたものよりも有意に高かったことに注意する（図４および表１を参照）。
【図１１】無視できるＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵ生体内分布または非腫瘍組織に対する毒性。（ａ）検出不能なＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、２４時間で消失するが１００μｇ投与後５時間の肝臓での一時的な蓄積を除き、正常組織で蛍光を発した。肝臓から放出される蛍光は一過性であり、腫瘍組織で記録されるものよりも著しく低い。腫瘍／肝臓比＝７．５（同じ実験で記録された、図２ｂの腫瘍強度を参照）、スケールバー、１ｃｍ。（ｂ）抗ｇ−Ｈ２ＡＸで測定されたような、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは遊離オリゴ−ＦｄＵ投与の５時間後の正常な骨髄での同様に低レベルのＤＮＡ二本鎖切断誘導、分析された他の正常組織には存在しない効果、を示す代表的な画像。（ｃ）Ｈ＆Ｅ染色組織の組織病理学的変化の欠如、またはＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは等分子５５４用量の遊離オリゴＦｄＵ１００μｇ投与後２４時間のＣＸＣＲ４＋（骨髄）およびＣＸＣＲ４−（脳、腎臓、肝臓、肺および心臓）正常組織のＨ＆Ｅ染色サンプルのアポトーシス誘導の欠如を示す代表的な画像。肝臓への一時的なナノコンジュゲート分布または骨髄で誘発されたＤＮＡ損傷は、これらの非腫瘍組織の細胞毒性をもたらさないことに注意する。（ｄ）転移の退縮の実験の経時的に記録された群間の体重の差の欠如。（ｅ）転移の予防の実験の経時的に記録された群間の体重差の欠如。スケールバー、１００μｍ。
【図１２】骨髄９２または循環血球において検出不能なＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵの蓄積。（ａ）１０〜１００μｇの範囲の用量でＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは遊離ＦｄＵの対照等分子量（１．３−１３．０ｎｍｏｌの範囲）を投与してから５時間後にフィコール（Ｆｉｃｏｌｌ）密度勾配を使用して血液から分離した赤血球、白血球、または血小板の蛍光発光の欠如。（ｂ）フィコールプロトコル後に分離された白血球および血小板ペレットで観察される検出不能な蛍光発光。（ｃ）（ａ）に開示されている範囲で、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵまたは対照遊離オリゴＦｄＵの単回注射でマウスを処置し、５時間後に得られた脾臓または骨髄の蛍光発光の欠如。
【図１３】Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦＤＵナノコンジュゲートの物理化学的特性、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＣＸＣＲ４＋ＣＲＣ細胞の選択的内在化と致死の実証。（Ａ）初期Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６タンパク質およびＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵコンジュゲートの質量分析。（Ｂ）逆反応を使用したＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵコンジュゲートのＤＬＳ。（Ｃ）ＭＴＴ生存率アッセイで分析された、異なる濃度のＴ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵコンジュゲートに４８時間曝露したＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞の用量反応表示。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４３】
例４  Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択的に内在化し、ＣＸＣＲ４＋ＣＲＣ細胞を致死する
続いて、発明者らは、薬物コンジュゲーションがタンパク質の立体構造と機能を変更できるという条件で、ロードされたオリゴＦｄＵがそのＣＸＣＲ４標的能力を維持しながらナノ粒子細胞傷害活性を付与するかどうかを評価した。Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、フローサイトメトリーを使用して蛍光発光で測定されたように、ヒトＣＸＣＲ４＋ＳＷ１４１７  ＣＲＣ細胞に内在化し、共焦点顕微鏡で観察されたようにその細胞質基質に蓄積および移動する（図４ｄおよび５ａ）。ＡＭＤ３１００  ＣＸＣＲ４アンタゴニストは膜におけるＣＸＣＲ４受容体をダウンレギュレートし、ナノコンジュゲートの内在化を完全にブロックすることができたため、ナノコンジュゲートはまた内在化のためのＣＸＣＲ４への依存性を維持する（図１ｄ）。加えて、Ｔ２２−ＧＦＰ−Ｈ６−ＦｄＵは、細胞生存率または位相差顕微鏡（図１ｇ）で測定した同じ細胞で、遊離オリゴＦｄＵよりも有意に高い細胞毒性を誘導した。本発明者らは、ヒトＣＸＣＲ４＋ＨｅＬａ細胞におけるＣＸＣＲ４依存性ナノコンジュゲートの内在化および遊離オリゴ−ＦｄＵよりも高い細胞毒性を確認した（図５ａ−ｄ）。
【国際調査報告】
2020533400.tif 000033
2020533400.tif 000034