(57)【要約】  アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターおよびその使用を提供する。具体的には、特定の標的組織、例えば中枢神経系（ＣＮＳ）および脂肪組織に対し特異的な指向性を示し、標的組織に関心の遺伝子を導入するよう細胞に形質導入するのに使用しうるＡＡＶベクターを提供する。ＡＡＶベクターおよび薬学的に許容しうる賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物も提供する。
2020533968.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）図１Ａに示されるｒＡＡＶＲｅｃ２のＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３配列の１つまたはそれ以上；および／または
（ii）図１Ａに示されるｒＡＡＶＲｅｃ３のＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３配列の１つまたはそれ以上
をコードする核酸分子。
【請求項２】
該核酸が組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
組換え哺乳動物細胞において発現され、ここで、該細胞は、
（ｉ）図１Ａに示されるｒＡＡＶＲｅｃ２のＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３配列の１つまたはそれ以上；および／または
（ｉ）図１Ａに示されるｒＡＡＶＲｅｃ３のＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３配列の１つまたはそれ以上
を発現する、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
（ii）図１Ａに示されるｒＡＡＶＲｅｃ２のＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３配列の１つまたはそれ以上；および／または
（iii）図１Ａに示されるｒＡＡＶＲｅｃ３のＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３配列の１つまたはそれ以上
を含む組換えｒＡＡＶＲｅｃカプシド。
【請求項５】
哺乳動物または哺乳動物の細胞に異種ポリヌクレオチド配列を送達する方法において、該方法は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを該哺乳動物または該哺乳動物の細胞に投与することを含み、ここで、該ベクターが、
（ｉ）図１Ａに示されるｒＡＡＶＲｅｃ２のＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３配列の１つまたはそれ以上；および／または
（ii）図１Ａに示されるｒＡＡＶＲｅｃ３のＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３配列の１つまたはそれ以上；および
（iii）異種ポリヌクレオチド配列
を含み、それによって該異種ポリヌクレオチド配列を該哺乳動物または該哺乳動物の細胞に送達される、方法。
【請求項６】
該哺乳動物細胞が神経細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該哺乳動物細胞が脂肪細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該異種ポリヌクレオチド配列が、野生型ＴＳＣ１、野生型ＴＳＣ２または野生型ＳＭＡ遺伝子である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
該哺乳動物が、タンパク質の発現または機能を欠損しており、処置を必要としている、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
薬学的に許容しうる賦形剤、希釈剤および／または担体をさらに含む、請求項２に記載の核酸。
【請求項１１】
請求項２に記載の核酸を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．技術分野
本開示は全般に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターおよびその使用に関する。より具体的には、本開示は、ある特定の標的組織、例えば中枢神経系（ＣＮＳ）および脂肪組織に特異的な指向性を示し、関心の遺伝子を標的組織に導入するために細胞に形質導入するのに使用しうるベクターに関する。
【背景技術】
【０００２】
２．背景
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子治療のために現在用いられている一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡＡＶはパルボウイルス科ディペンドウイルス属の一員である。ＡＡＶゲノムは約４．７ｋｂの長さを有し（１、２）、末端逆位反復配列（ＩＴＲ）に挟まれたｒｅｐおよびｃａｐの２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む（３）。ＡＡＶには、細胞標的および抗原性の異なる１１の血清型が知られている（Wu et al., 2006）。最近、これら主要なＡＡＶ血清型の約１００のゲノムバリアントが見出されている（６）。
【０００３】
最初のＡＡＶベクターは、３０年前にＡＡＶ２に基づいて作製された（Tratschin et al., 1984; Hermonat et al., 1984）。ＡＡＶ２に基づくベクター（ＡＡＶ２）は、最もよく研究されており、現在、嚢胞性線維症、血友病Ｂ、前立腺癌およびメラノーマ癌、カナバン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋ジストロフィー、関節リウマチならびにＨＩＶワクチンを包含する数多くの疾患のために臨床試験がなされている（１５）。そのようなベクターは、動物モデルにおいて、筋肉、脳、網膜、肝および肺の広範な細胞に遺伝子を送達することが示されている（５、１６〜２２）。現在のＡＡＶベクター系に伴う問題として、ある種の組織における意図されない形質導入、および関心の組織における効率的形質導入の欠如がある。したがって、特定の関心の組織、例えばＣＮＳ組織への、安全かつ効率的な遺伝子送達は、依然として当分野における大きな課題である。
【発明の概要】
【０００４】
３．概要
本開示にしたがって、ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３と称される組換えＡＡＶベクター血清型が提供される。ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターは、それぞれ、脂肪組織およびＣＮＳ組織に対する向上された指向性を有する。本ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ２およびＡＡＶ５と比較して、カプシドＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３領域中にアミノ酸残基の改変を含む（図１Ａ）。さらに、ｒＡＡＶＲｅｃ３は、高いウイルス力価レベルに増殖される能力を有する。そのような増殖性は、有用なウイルスストックを効率的かつ安価に製造するために有利である。
【０００５】
いくつかの態様において、新規ｒＡＡＶカプシドタンパク質、および該新規カプシドをコードする核酸分子が提供される。特定の態様において、新規カプシドアミノ酸配列は、図１Ａに示すもの（ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３）を包含する。本開示のいくつかの側面において、本開示のウイルスカプシドをコードする核酸分子、およびカプシドタンパク質が提供される。本カプシドタンパク質をコードする核酸分子は、図１Ｂに示すもの（ｒＡＡＶＲｅｃ３）を包含する。さらに、ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３カプシドタンパク質をコードする核酸分子を含むベクター、ならびに本開示のｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３核酸および／またはベクターを含む細胞（インビボまたはインビトロ）が提供される。そのような核酸、ベクターおよび細胞は、例えば、ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３カプシドタンパク質の発現の誘導のために使用することができる。そのようなタンパク質発現は、本書に記載されるような新規ＡＡＶベクターの作製のための試薬（例えば、ヘルパーコンストラクトまたはパッケージング細胞）の開発に利用しうる。さらに、カプシドタンパク質がｒＡＡＶＲｅｃ２のカプシドタンパク質またはｒＡＡＶＲｅｃ３のカプシドタンパク質である組換えウイルス（ビリオン）が提供される。そのようなウイルスは、標的細胞または組織に、関心の異種核酸を導入するために使用しうる。
【０００６】
本開示のいくつか側面において、哺乳動物または哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチド配列を送達または導入する方法が提供され、該方法は、本開示のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、すなわち図１Ａに示されるｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３のＶＰ１、ＶＰ２またはＶＰ３カプシドタンパク質の１つまたはそれ以上、および異種ポリヌクレオチド配列を含むベクターを、該哺乳動物または該哺乳動物の細胞に投与し、それによって該哺乳動物または該哺乳動物の細胞に該異種ポリヌクレオチド配列を送達または導入するステップを含む。いくつかの態様において、ＡＡＶベクターはｒＡＡＶＲｅｃ２であり、哺乳動物細胞または哺乳動物の細胞は、脂肪組織の細胞、例えば、脂肪細胞である。いくつかの態様において、ＡＡＶはｒＡＡＶＲｅｃ３であり、哺乳動物細胞または哺乳動物の細胞は、ＣＮＳの細胞、例えば、神経細胞である。
【０００７】
本開示のさらなる一側面において、タンパク質の発現または機能を欠損する哺乳動物を処置する方法が提供され、該方法は、ｒＡＡＶＲｅｃ３のカプシドタンパク質の１つまたはそれ以上をコードし、かつ、前記欠損タンパク質発現または機能を矯正しうるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを、該ポリペプチドが該哺乳動物において発現される量で投与するステップを含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶはｒＡＡＶＲｅｃ３であり、哺乳動物細胞または哺乳動物の細胞は、ＣＮＳの細胞、例えば神経細胞である。ＣＮＳの細胞の関与する遺伝子治療のために、異種ポリヌクレオチド配列は、例えば、結節性硬化症の処置のための野生型ハマルチン（ＴＳＣ１）またはチュベリン（ＴＳＣ２）タンパク質をコードしうる。他の一態様において、異種ポリヌクレオチド配列は、脊髄性筋萎縮症の処置のための野生型ＳＭＡ（ＳＭＡ）タンパク質をコードしうる。
【０００８】
いくつかの態様において、タンパク質の発現または機能を欠損する哺乳動物を処置する方法が提供され、該方法は、ｒＡＡＶＲｅｃ２のカプシドを含み、前記欠損タンパク質発現または機能を矯正しうるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを、該ポリペプチドが該哺乳動物において発現される量で投与するステップを含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶはｒＡＡＶＲｅｃ２であり、哺乳動物細胞または哺乳動物の細胞は、脂肪組織の細胞、例えば脂肪細胞である。
【０００９】
遺伝性リポジストロフィーにおける体脂肪の減少は、多数の遺伝子における変異の結果としての脂肪組織の発達および／または分化の欠損によって引き起こされうる。本開示のいくつかの態様において、異種ポリヌクレオチド配列は、リポジストロフィーに関連する欠損遺伝子の野生型カウンターパートをコードしうる。したがって、脂肪組織の細胞に関係する遺伝子治療のために、異種ポリヌクレオチド配列は、例えば、野生型ＰＰＡＲＧ、ＡＧＰＡＴ２、ＡＫＴ２、ＢＳＣＬ２、ラミンＡ／Ｃ、核ラミナタンパク質およびＺＭＰＳＴＥ２４遺伝子をコードしうる。
【００１０】
本開示のさらなる一側面において、ＡＡＶＲｅｃ３およびｒＡＡＶＲｅｃ２ベクター、および薬学的に許容しうる賦形剤、希釈剤または担体を含む医薬組成物が提供される。本開示の他の一側面において、ｒＡＡＶＲｅｃ３およびｒＡＡＶＲｅｃ２ベクター組成物の１つまたはそれ以上を、１つまたはそれ以上の薬学的に許容しうる賦形剤、担体、希釈剤、佐剤および／または他の成分、ならびに対象の障害の処置における該ｒＡＡＶベクターの使用のための指示書と共に含むキットが提供される。該キットは、典型的には、適当な市販のための包装用の容器をさらに含みうる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
４．図面の簡単な説明
本発明の組換えベクター、タンパク質、組成物および方法のさまざまな態様が、本書において図面を参照して説明される。
【図１Ａ】ｒＡＡＶＲｅｃ３、ｒＡＡＶＲｅｃ２、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５のＶＰタンパク質のアラインメントを示す。ｒＡＡＶＲｅｃ３およびｒＡＡＶＲｅｃ２のアミノ酸配列。
【図１Ｂ】ｒＡＡＶＲｅｃ３およびｒＡＡＶＲｅｃ２のヌクレオチド配列を示す。
【図２Ａ】ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびｒＡＡＶＲｅｃ１〜４にパッケージされたＣＡＧプロモーターにより駆動されたＧＦＰの発現を示す。マウス脳の２．５倍の倍率の画像。線条体の注射部位におけるＧＦＰ発現を示す切片を示す（第２欄）。
【図２Ｂ】脳内の形質導入域の総体積。
【図３】神経またはグリア細胞集団の、ｒＡＡＶベクターによる形質導入を示す。マージＧＦＰ蛍光（第１段、緑）。ＮｅｕＮまたはＧＦＡＰ（第２段、赤）は、いくつかのＧＦＰ陽性細胞が、ＮｅｕＮまたはＧＦＡＰのためにも染色されたことを示し、これにより、黄色のマージ蛍光（第３段）がもたらされた。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
５．詳細な説明
５．１  組換えＡＡＶ血清型
ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３と称される組換えＡＡＶベクター血清型が提供される。いくつかの態様において、本ＡＡＶ血清型は、図１Ａに示されるハイブリッドＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３アミノ酸配列の１つまたはそれ以上を含む。本ｒＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶ２およびＡＡＶ５と比較して、カプシドコードＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３領域のアミノ酸残基の改変を含む（図１Ａ）。本開示の組換え血清型は、さまざまな関心の細胞、組織および器官の形質導入において、改善された形質導入効率を示す。特に、ｒＡＡＶＲｅｃ２血清型は脂肪組織の細胞の形質導入において、より高い効率を示し、ｒＡＡＶＲｅｃ３血清型は、中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞の形質導入において、より高い効率を示す。さらに、ｒＡＡＶＲｅｃ３ウイルスは、他のＡＡＶウイルスと比較して、高い力価に増殖される能力を有する（表１参照）。
【００１３】
本書に開示されるｒＡＡＶカプシドタンパク質は、ＣＮＳ（ｒＡＡＶＲｅｃ３）または脂肪組織（ｒＡＡＶＲｅｃ２）の細胞に優先的に形質導入することができる。いくつかの態様において、ｒＡＡＶカプシドタンパク質は、図１に示されるｒＡＡＶＲｅｃ２およびＡＡＶＲｅｃ３のＶＰ１〜３のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３カプシドタンパク質のアミノ酸配列（図１Ａ）との同一性が少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であるアミノ酸配列を有する組換えｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３カプシドタンパク質が提供される。そのような組換えカプシドタンパク質は、実質的に、ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３の持つ指向性を維持する。例えば、組換えカプシドまたは組換えカプシドタンパク質を含むウイルス粒子は、実質的に、図１ＡのｒＡＡＶＲｅｃ３カプシドまたはカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶＲｅｃ３ウイルス粒子の持つＣＮＳ指向性を維持することができる。さらに、組換えカプシドまたは組換えカプシドタンパク質を含むウイルス粒子は、実質的に、図１ＡのｒＡＡＶＲｅｃ２カプシドまたはカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶＲｅｃ２ウイルス粒子の持つ脂肪組織指向性を維持することができる。
【００１４】
図１のＡＡＶカプシドタンパク質（ＶＰ１〜３）の１つまたはそれ以上をコードする核酸分子が提供される。いくつかの態様において、該核酸分子は、図１Ｂのものを包含する。いくつかの態様において、ＡＡＶカプシドをコードする配列は、図１Ｂのヌクレオチド配列との同一性が少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％であり、ＣＮＳの細胞に対する指向性を有するＡＡＶカプシドタンパク質をコードする。
【００１５】
当分野で知られるように、ある核酸またはポリペプチドがある既知配列との配列同一性を有するかを決定するために用いることができるプログラムには、多くの異なるプログラムがある。本書において同一性パーセントとは、ＢＬＡＳＴＮを用いて、ある核酸またはその断片が、もう１つの核酸に対して、この核酸（またはその相補鎖）と最適に（適切なヌクレオチド挿入または欠失を伴って）アラインされたときに、記載されるパーセントの値の同一性を有することを意味する。２つの異なる核酸の間の同一性パーセントを決定するために、該同一性パーセントは、ＢＬＡＳＴＮプログラム“BLAST 2 sequences”を用いて決定されるものとする。このプログラムは、National Center for Biotechnology Information (NDBI)から公に利用可能である。ポリペプチドについて同一性または類似性のパーセントをいうとき、これは、そのポリペプチドが、他のタンパク質またはその一部との比較において、ＢＬＡＳＴＰを用いて決定される相対する長さにわたって、記載される同一性または類似性のパーセントを示すことを意味する。このプログラムも、National Center for Biotechnology Information (NDBI)から公に利用可能である。
【００１６】
本開示のＡＡＶカプシドタンパク質は、ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３のＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３配列の全長、ならびに該全長タンパク質の機能および組織指向性を維持する、機能性のタンパク質断片、組換え形態または配列バリアントを包含する。さらに、図１ＡのＡＡＶカプシドタンパク質は、所望の性質を付与するための当分野において知られる改変を含むように、さらに組換えることができる。いくつかの態様において、該カプシドタンパク質は、精製および／または検出を促進する配列（「タグ」）を含むように組換えることができる。そのようなタグは、例えば、ポリヒスチジン（ＨＩＳ）またはグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、およびストレプトアビジン結合タンパク質タグを包含する。そのような改変をＡＡＶカプシドに組み込む方法は、当分野において知られている。
【００１７】
本開示はさらに、ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３カプシドタンパク質をコードする核酸分子を含む発現ベクターに関する。ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３カプシドタンパク質をコードする核酸分子は、単離または精製しうる発現ベクターの一部として用いうる。そのような発現ベクターは、ｒＡＡＶストックの製造のためのヘルパーベクターとしての使用のために、単離および精製しうる。そのようなウイルスストックは、関心の異種核酸を有するベクターゲノムを含みうる。該配列は、ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３カプシドタンパク質を産生するように細胞に形質導入するためにも使用しうる。ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３カプシドタンパク質をコードする核酸分子は、発現のために、後述の方法のいずれかを用いて、個別に、または一緒に、発現ベクターに挿入することができる。該配列は、例えば部分的なＶＰ１−ＶＰ２−ＶＰ３またはＶＰ１−ＶＰ３またはＶＰ１−ＶＰ１−ＶＰ２−ＶＰ３のように、トランケートされてもよい。
【００１８】
いくつかの態様において、ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３タンパク質の発現のためのベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、またはバキュロウイルスベクター）、哺乳動物ベクター、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）を包含するが、それに限定されない。ベクターは、５’および／または３’末端反復配列（例えば、５’および／または３’ＡＡＶ末端反復配列）を含むＡＡＶベクターを包含しうる。本開示のベクターは、発現調節エレメント、例えば転写／翻訳調節シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、エンハンサー等をさらに含みうる。
【００１９】
本書に記載するＡＡＶベクターは、標的組織内に関心の遺伝子を導入するために、特定の種類の哺乳動物細胞、例えばＣＮＳおよび脂肪組織の細胞に形質導入するために使用しうる。ＣＮＳの細胞は、例えばニューロンおよびグリア細胞を包含する。脂肪組織の細胞は、脂肪細胞を包含する。したがって、本開示は、ＡＡＶに基づく発現系、およびベクターであって、ＡＡＶ発現ベクターが、処置用のペプチド、タンパク質、ポリペプチドをコードする第１の異種核酸分子またはアンチセンス分子を少なくとも含むものを企図する。
【００２０】
遺伝子疾患は、タンパク質産物を産生できないか、適正に機能しないタンパク質産物を産生するか、または細胞の適正な機能を妨害する機能不全タンパク質産物を産生する欠陥遺伝子の存在に関連する。そのような遺伝子疾患の治療のために、遺伝子導入を用いることができる。したがって、本開示のいくつかの側面において、本開示のｒＡＡＶベクターは、治療的に機能するタンパク質、または機能不全タンパク質の産生もしくは活性を抑制するポリヌクレオチドをコードしうる異種核酸を含む。
【００２１】
ｒＡＡＶ発現ベクターにニューロンを標的とさせることができるので、このことは、ニューロン機能不全に関連する疾患または障害、例えばＣＮＳの遺伝子疾患の処置のために特に有用でありうる。いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターは、脳の細胞、例えば神経細胞に導入するための異種核酸を含む。いくつかの態様において、該ベクターは、ニューロンに有益な効果を提供する（例えばニューロンの増殖および／または分化を促進する）ポリペプチドまたは核酸の発現のために有用である。
【００２２】
いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶベクターは、結節性硬化症（ＴＳＣ）患者の処置用に組換えうる。結節性硬化症は、脳を冒しうる遺伝子疾患で、癲癇、行動障害、例えば多動および攻撃性、ならびに知的障害または学習障害の原因となりうる。ＴＳＣの子供の一部は自閉症の症状を有する。さらに、ＴＳＣ患者において良性脳腫瘍も生じうる。
【００２３】
ＴＳＣは、ハマルチンおよびチュベリンタンパク質をそれぞれコードするＴＳＣ１またはＴＳＣ２遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体優性の遺伝子疾患である。したがって、本開示のｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターは、ＴＳＣ患者の神経細胞内に野生型ハマルチンまたはチュベリン遺伝子を導入する遺伝子治療用に組換えて使用しうる。いくつかの態様において、野生型ハマルチンタンパク質をコードする異種核酸を含むＡＡＶベクターが提供される。他のいくつかの態様においては、野生型チュベリンタンパク質をコードする異種核酸を含むＡＡＶベクターが提供される。（Kwiatkowski et al., 2010. Tuberous Sclerosis Complex: Genes, Clinical Features and Therapeutics. Wiley-Blackwell, Weinheim, Germany参照。）
【００２４】
いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターは、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）１型の処置のために使用しうる。ＳＭＡは、随意筋の運動をコントロールする神経系の部分を冒す遺伝子疾患である。ＳＭＡには、脊髄における運動ニューロンと呼ばれる神経細胞の欠失が関与する。この遺伝子疾患は、ＳＭＮ１と称される運動ニューロンタンパク質の欠失によって引き起こされる。したがって、本開示のｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターは、ＳＭＮ患者の神経細胞内に野生型ＳＭＮ１遺伝子を導入する遺伝子治療用に組換えて使用しうる。いくつかの態様において、野生型ＳＭＮ１タンパク質をコードする異種核酸を含むｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターが提供される。（Lefebvre S, et al. Cell. 1995;80:155-165: Wetz and Sahin Ann NY Acad Sci 2016 1366(1):5-19参照。）
【００２５】
また、ＡＡＶ発現ベクターに脂肪細胞を標的とさせることができるので、このことは、脂肪細胞機能不全に関連する疾患または障害、例えばリポジストロフィーのような遺伝子疾患の処置のために特に有用でありうる。遺伝性リポジストロフィーは、多数の遺伝子における変異の結果としての脂肪組織の発達および／または分化の欠損によって引き起こされうる。そのような遺伝子の例としては、欠陥ＰＰＡＲＧ、ＡＧＰＡＴ２、ＡＫＴ２、ＢＳＣＬ２、ラミンＡ／Ｃ、核ラミナタンパク質およびＺＭＰＳＴＥ２４遺伝子があるが、それに限定されない。いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶベクターは、脂肪の細胞、例えば脂肪細胞に導入するための異種核酸を含む。いくつかの態様において、該ベクターは、脂肪細胞に有益な効果を提供する（例えば脂肪細胞の増殖および／または分化を促進する）ポリペプチドまたは核酸の発現のために有用である。一態様において、異種ポリヌクレオチド配列は、リポジストロフィーに関与する欠陥遺伝子の野生型カウンターパートをコードしうる。したがって、脂肪組織の細胞に作用する遺伝子治療のために、異種ポリヌクレオチド配列は、例えば、野生型のＰＰＡＲＧ、ＡＧＰＡＴ２、ＡＫＴ２、ＢＳＣＬ２、ラミンＡ／Ｃ、核ラミナタンパク質およびＺＭＰＳＴＥ２４遺伝子をコードしうる。
【００２６】
当業者に理解されるように、関心の異種核酸を適当な調節配列に作動可能に連結しうる。例えば、異種核酸を、発現調節エレメント、例えば、転写／翻訳調節シグナル、複製起点、ポリアデニル化シグナル、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、プロモーター、エンハンサー等に作動可能に連結しうる。そのようなエレメントは、場合により、転写終結シグナルをも含む。転写終結シグナルの例は、ＳＶ４０転写終結シグナルであるが、それに限定されない。さらに、異種核酸分子は、新規ＡＡＶカプシド内への該分子の封入のために、ＡＡＶ５’および／または３’末端反復配列（例えば、５’および／または３’ＡＡＶ末端反復配列）を含みうる。標的細胞において異種核酸が転写され、次いで翻訳されるいくつかの態様において、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために、特異的な開始シグナルが通常用いられる。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含みうる、そのような外来の翻訳調節配列は、さまざまな天然物および合成物に由来するものでありうる。
【００２７】
所望の発現レベルおよび発現組織特異性に応じて、さまざまなプロモーター／エンハンサーエレメントを使用しうる。プロモーター／エンハンサーは、所望の発現パターンに応じて、構成型または誘導型であってよい。プロモーター／エンハンサーエレメントは通常、関心の標的細胞において機能しうるものを選択する。いくつかの代表的な態様において、プロモーター／エンハンサーエレメントは、哺乳動物のプロモーター／エンハンサーエレメントである。特定の態様において、プロモーター／エンハンサーは、ＣＮＳの細胞または脂肪組織の細胞において特異的に機能するエレメントである。このプロモーター／エンハンサーエレメントも、構成型または誘導型でありうる。
【００２８】
本開示は、ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３ウイルス粒子（すなわち、ビリオン）を提供し、ここで、該ウイルス粒子は、ベクターゲノム、場合により、関心の異種核酸を含むＡＡＶベクターゲノムをパッケージする。そのようなウイルス粒子は、脂肪組織（ｒＡＡＶＲｅｃ２）またはＣＮＳ組織（ｒＡＡＶＲｅｃ３）に対する指向性を示す。ウイルス粒子の増殖方法は当業者に知られている（例えば、Shin et al., Methods Mol. Biol. 798;267-284参照）。ＡＡＶは、溶菌ウイルスとして増殖させることも、プロウイルスとして増殖させることもできる。溶菌増殖のためには、ＡＡＶは、例えばアデノウイルスまたは単純ヘルペスウイルスのようなヘルパーウイルスの同時感染を必要とする。ヘルパーウイルスが存在しない場合、ＡＡＶは、組み込まれたプロウイルスとして存在しうる。ＡＡＶプロウイルスを含む細胞に後でヘルパーを感染させた場合、組み込まれたＡＡＶゲノムは解放され、増殖溶菌のサイクルが始まる。ヘルパーウイルス機能を提供する別の方法として、染色体に組み込まれるか、または安定な染色体外エレメントとして維持されるヘルパー遺伝子を持つパッケージング細胞を用いうる。
【００２９】
ウイルス粒子の増殖のために、該細胞は典型的には、ＡＡＶウイルス複製を可能にする細胞である。当分野において知られる任意の適当な細胞、例えば哺乳動物細胞を使用しうる。複製欠損ヘルパーウイルスから欠失された機能を提供するトランス相補的パッケージング細胞系、例えば２９３細胞または他のＥ１Ａトランス相補的細胞も適当である。
【００３０】
いくつかの態様において、組換えウイルス粒子を作製する方法は、
（ａ）ベクターゲノム；ここで、該ベクターゲノムは、（ｉ）異種核酸、および（ii）該ベクターゲノムのウイルス粒子内へのカプシド封入に十分なパッケージングシグナル配列（例えばＡＡＶ末端反復配列）を含む；および
（ｂ）該ベクターゲノムの複製およびウイルス粒子内へのカプシド封入に十分なＡＡＶｒｅｐ配列およびＡＡＶｃａｐ配列
を、インビトロで細胞に提供することを含む。該ベクターゲノム核酸ならびにＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ配列は、該ベクターゲノムを含む組換えウイルス粒子が、該細胞内で産生されるカプシドの中にパッケージされる条件下に提供される。
【００３１】
いくつかの態様において、該ウイルス粒子は、例えばインビボ投与用に効果を高め汚染を少なくするために、単離および精製される。本パッケージング方法は、高力価のウイルス粒子ストックを製造するために用いることができる。いくつかの態様において、該ウイルスストックは、少なくとも約１０５形質導入単位（ｔｕ）／ｍｌ、少なくとも約１０６ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０７ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０８ｔｕ／ｍｌ、少なくとも約１０９ｔｕ／ｍｌ、または少なくとも約１０１０ｔｕ／ｍｌの力価を有しうる。
【００３２】
５．２  組換えウイルスベクターの使用
本開示は、特定の標的組織、例えばＣＮＳおよび脂肪組織に対し特異的な指向性を示すｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターおよびウイルス（ビリオン）を提供する。いくつかの態様において、ｒＡＡＶベクターおよびビリオンは、哺乳動物宿主細胞、例えば哺乳動物のＣＮＳ細胞および脂肪組織細胞の形質導入に使用する。ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターまたはビリオンは、異種核酸配列を、細胞およびその子孫に、安定または一過性に導入または送達するために使用することができる。異種核酸は、任意のポリヌクレオチド、例えばポリペプチドもしくはタンパク質をコードする遺伝子、または抑制性のポリヌクレオチドに転写されるポリヌクレオチドを含む。
【００３３】
本書に開示されるｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターは、ヌクレオチド配列を、それを必要とする対象に、例えば該対象においてインビボで処置用ポリペプチドまたは核酸を発現させるために、送達する方法において有用である。対象は、該ポリペプチドを欠失する故に、または該対象における該ポリペプチドまたは核酸の産生が何らかの処置効果をもたらしうる故に、該ポリペプチドまたは核酸を必要としうる。
【００３４】
本書において、哺乳動物または哺乳動物細胞に異種ポリヌクレオチド配列を送達する方法が開示される。いくつかの態様において、該方法は、哺乳動物または哺乳動物細胞に、異種核酸を含むｒＡＡＶベクターを、哺乳動物または哺乳動物細胞への異種ポリヌクレオチド配列の送達に適当な条件下に投与し、それによって異種ポリヌクレオチドを送達することを含む。一側面において、該方法は、異種核酸の哺乳動物および／または細胞への送達を可能にする。他の一側面において、該方法は、異種ポリヌクレオチドの哺乳動物および／または細胞への送達、およびその後の該異種ポリヌクレオチドの転写による転写物の生成を可能にする。さらなる一側面において、該方法は、異種ポリヌクレオチドの細胞への送達、その後の転写による転写物の生成、およびその後の翻訳による遺伝子産物（タンパク質）の生成を可能にする。
【００３５】
一側面において、関心の核酸を脂肪組織の細胞に送達する方法が提供され、該方法は、脂肪組織の細胞を本書に開示されるｒＡＡＶＲｅｃ２粒子と接触させるステップを含む。他の一側面において、関心の核酸を哺乳動物対象の脂肪組織に送達する方法が提供され、該方法は、本開示のｒＡＡＶＲｅｃ２ウイルス粒子または医薬製剤を有効量で哺乳動物対象に投与するステップを含む。
【００３６】
他の一側面において、関心の核酸をＣＮＳの細胞に送達する方法が提供され、該方法は、ニューロンを本書に開示されるｒＡＡＶＲｅｃ３粒子と接触させるステップを含む。他の一側面において、関心の核酸を哺乳動物対象の脳組織に送達する方法が提供され、該方法は、本開示のｒＡＡＶＲｅｃ３ウイルス粒子または医薬製剤を有効量で哺乳動物対象に投与するステップを含む。
【００３７】
一態様において、本開示の方法は、ある量の本開示のｒＡＡＶベクターを哺乳動物対象に投与するステップを含み、ここで、該ベクターは、タンパク質をコードする異種核酸を含み、該異種核酸は、該核酸の転写をもたらす発現調節エレメントに作動可能に連結されており、該タンパク質は該哺乳動物において発現される。いくつかの側面において、該タンパク質の発現は、該哺乳動物に処置利益を提供する。
【００３８】
ｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターの中枢神経系への指向性を、脳障害の処置のために利用しうる。ｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターは、ポリペプチドまたは核酸をインビトロで産生するため、またはエクスビボ遺伝子治療のために、関心のヌクレオチド配列をＣＮＳの細胞に送達するために使用しうる。一態様において、該ベクターは、ＣＮＳの細胞に有益な効果を提供する（例えばニューロンの増殖および／または分化を促進する）ポリペプチドまたは核酸の発現のために有用である。ベクターのニューロン標的化が可能であることは、ニューロン機能障害に関連する疾患または障害を処置するために有用でありうる。
【００３９】
一態様において、対象における神経学的疾患または障害を処置する方法は、ＣＮＳの細胞に選択的に形質導入することのできるｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターを投与するステップを含む。多くの神経学的疾患または障害が当業者に知られており、その例には、脳、脊髄、神経節、運動神経、感覚神経、自律神経、視神経、網膜神経および聴神経の疾患または障害がある。脳の疾患または障害は、癌または他の脳腫瘍、炎症、細菌感染、ウイルス感染（狂犬病を包含する）、アメーバまたは寄生虫感染、卒中、麻痺、神経変性疾患、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病または他の認知症もしくは認知機能低下、プラーク、脳症、ハンチントン病、動脈瘤、遺伝性または後天性の奇形、後天性脳損傷、トゥレット症候群、ナルコレプシー、筋ジストロフィー、振戦、脳性麻痺、自閉症、ダウン症候群、注意欠陥および注意欠陥・多動性障害、慢性炎症、癲癇、昏睡、髄膜炎、多発性硬化症、重症筋無力症、さまざまなニューロパシー、レストレスレッグス症候群、およびテイ-サックス病を包含しうる。
【００４０】
一側面において、本開示の組成物は、結節性硬化症（ＴＳＣ）の患者の処置に使用しうる。ＴＳＣは、ハマルチンおよびチュベリンをそれぞれコードするＴＳＣ１またはＴＳＣ２遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体優性の遺伝子疾患である。本開示のｒＡＡＶベクターは、ＴＳＣ患者の細胞内に野生型ハマルチンまたはチュベリン遺伝子を導入する遺伝子治療に使用しうる。
【００４１】
他の一側面において、本開示のｒＡＡＶベクターは、ＳＭＡ導入遺伝子を発現するよう組換えたｒＡＡＶＲｅｃ３ウイルスを患者に投与することにより、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）１型を処置するために使用しうる。ＳＭＡは、随意筋の運動をコントロールする神経系の部分を冒す遺伝子疾患である。ＳＭＡは、脊髄における運動ニューロンと呼ばれる神経細胞の欠失が関与する疾患であり、運動ニューロン疾患として分類される。この遺伝子疾患は、ＳＭＮと称される運動ニューロンタンパク質の欠失によって引き起こされる
【００４２】
ｒＡＡＶＲｅｃ２ベクターの脂肪組織への指向性を、脂肪組織障害の処置のために利用しうる。ｒＡＡＶＲｅｃ２ベクターは、ポリペプチドまたは核酸をインビトロで産生するため、またはエクスビボ遺伝子治療のために、関心のヌクレオチド配列を脂肪組織の細胞に送達するために使用しうる。該ベクターは、脂肪組織の細胞に有益な効果を提供する（例えば脂肪細胞の増殖および／または分化を促進する）ポリペプチドまたは核酸の発現のために有用である。ベクターの脂肪細胞標的化が可能であることは、脂肪細胞機能障害に関連する疾患または障害を処置するために有用でありうる。例えば、遺伝性リポジストロフィーは、例えばＰＰＡＲＧ、ＡＧＰＡＴ２、ＡＫＴ２、ＢＳＣＬ２、ラミンＡ／Ｃ、核ラミナタンパク質およびＺＭＰＳＴＥ２４遺伝子を包含する、多数の遺伝子における変異の結果としての脂肪組織の発達および／または分化の欠損によって引き起こされうる。いくつかの態様において、異種ポリヌクレオチド配列は、リポジストロフィーに関与する欠損遺伝子の野生型カウンターパートをコードしうる。
【００４３】
一態様において、ｒＡＡＶＲｅｃ２またはｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターを含む医薬組成物が提供される。本医薬組成物は、薬学的に許容しうる賦形剤、希釈剤または担体を含みうる。「薬学的に許容しうる担体」は、組成物の活性成分と組み合わされたとき、該成分が生物学的活性を維持することを可能にし、有害な生理学的反応、例えば意図されない免疫反応を引き起こさない、任意の材料を包含する。薬学的に許容しうる担体は、水、リン酸緩衝食塩液、エマルジョン、例えば水中油型エマルジョン、および湿潤剤を包含する。そのような担体を含む組成物は、従来知られる方法、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, current Ed., Mack Publishing Co., Easton Pa. 18042, USA; A. Gennaro (2000)“Remington: The Science and Practice of Pharmacy”, 20th edition, Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Ansel et al., 7th ed., Lippincott, Williams, & Wilkins; およびHandbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbe et al., 3rd ed. Amer. Pharmaceutical Assoc.に記載される方法で調製される。
【００４４】
そのような組成物は、従来の方法で調製することができ、適当な用量で対象に投与することができる。投与レジメンは、担当の医師によって、また他の臨床的条件に応じて、決定されうる。医薬の分野において知られるように、ある患者に対する用量は、患者の体格、体表面積、年齢、性別、投与する化合物の種類、投与時間および投与経路、感染または疾患の種類およびステージ、全身的健康状態、ならびに併用薬物を包含する多くの条件に拠る。当業者は前記条件および他の条件に基づいて、ある特定の疾患または障害を有する患者の処置に有効なｒＡＡＶＲｅｃ２またはｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターの用量範囲を容易に決定することができる。
【００４５】
処置のための「有効」量は、典型的には、疾患の、１つ、複数またはすべての有害な症状、影響または合併症や、疾患によって引き起こされるかまたは関連する１つまたはそれ以上の有害な症状、障害、疾患、病状または合併症等に対する反応を、測定可能な程度に提供するのに有効な量である。ただし、疾患の進行または悪化を軽減、緩和、抑制、防止、制限または制御することが、十分なアウトカムである。
【００４６】
処置に適する対象は、機能的遺伝子産物（タンパク質）の産生量が十分でないかもしくはそれを欠損する対象、または疾患をもたらしうる、異常な、部分的に機能する、もしくは機能しないタンパク質を産生する対象、またはそのようなリスクのある対象を包含する。処置に適する対象はまた、疾患をもたらす異常な、もしくは欠陥のあるタンパク質を産生する対象、またはそのリスクのある対象であって、該異常な、または欠陥のあるタンパク質の量、発現または機能の低下によって、該疾患の処置、または該疾患の１つもしくはそれ以上の症状の軽減、または該疾患の改善をもたらしうる対象を包含する。したがって、標的となる対象は、疾患の種類、発症の時期もしくは程度、進行度、重篤度、頻度、または症状の種類もしくは持続期間を問わず、前記のような欠陥を有する対象を包含する。
【００４７】
投与方法の例は、経口、直腸、経粘膜、局所、鼻内、吸入（例えば、エアロゾルによる）、口腔内（例えば、舌下）、経腟、蜘蛛膜下、眼内、経皮、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、筋肉内［骨格筋、横隔膜筋および／または心筋への投与を包含する］、皮内、胸腔内、脳内および関節内を包含する）、局所（例えば、皮膚および粘膜表面（気道表面を包含する）の両方に対するもの、および経皮投与）、リンパ内等、ならびに組織または器官（例えば、肝、骨格筋、心筋、横隔膜筋または脳）への直接の注射を包含する。腫瘍への（例えば、腫瘍またはリンパ節の中またはその近傍における）投与も可能である。任意の特定の症例において最適な投与経路は、処置する障害の性質および重篤度、ならびに使用する特定のベクターの性質に拠る。
【００４８】
いくつかの態様において、本開示のｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターは、ＣＮＳ、例えば脳または脊髄に直接投与される。ＣＮＳにベクターを直接投与するための当分野において知られる任意の方法を用いることができる。ｒＡＡＶベクターを、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭、側頭、頭頂および前頭葉を含む大脳、皮質、脳幹神経節、海馬および扁桃体）、大脳辺縁系、新皮質、線条体、大脳、および下丘に導入しうる。ｒＡＡＶベクターを、脳脊髄液中に、例えば腰椎穿刺によって送達しうる。さらに、投与が静脈内投与による場合、患者の脳の標的部位において、ｒＡＡＶベクターの取り込みのために血液脳関門の透過性を高めるために、該標的部位に超音波を適用しうる。患者の血液脳関門の透過性を高めるために超音波を適用することは、米国仮出願第６２／４７１６３５号に開示されておりその内容全体を引用により本書の一部とする。
【００４９】
一側面において、本書に記載される遺伝子組換えｒＡＡＶベクター組成物１つまたはそれ以上を、薬学的に許容しうる賦形剤、担体、希釈剤、佐剤および／または他の成分１つまたはそれ以上と共に含むキットが提供され、これは特定のｒＡＡＶ送達製剤の調製の調製、および対象（特にヒト）への投与用の処置剤の調製に使用されうる。特に、そのようなキットは、本開示のｒＡＡＶ組成物１つまたはそれ以上を、該ウイルスベクターを対象の疾患の処置に使用するための指示書との組み合わせとして含み得、典型的にはさらに、市販に適する包装のための容器を含みうる。そのようなキットのための該容器手段は、典型的には、本開示のｒＡＡＶ組成物を入れることができ、好ましくは適当に小分けして入れることができる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段含みうる。第２の処置用ポリペプチド組成物も提供される場合は、キットは、該第２の組成物を入れることのできる第２の別の容器手段をさらに含んでもよい。あるいは、複数の生物学的に活性な処置用組成物を１つの医薬組成物中に調製し得、１つの容器手段、例えば１つのバイアル、フラスコ、シリンジ、ボトルまたは他の適当な１つの容器手段中に包装しうる。本開示のキットは、典型的には、市販のために前記バイアルを収容して厳密に閉じ込めるための手段、例えば、所望のバイアルを収容する射出または吹込み成形プラスチック容器をも含みうる。
【００５０】
別に定義しない限り、本書に使用される技術用語および科学用語はいずれも、本発明が属する分野における通常の技術を有する者に通常理解されるのと同じ意味を有する。本書に記載されるのと同様または等価な方法および材料を使用して本発明を実施または試験することができるが、適当な方法および材料が本書に記載される。
【実施例】
【００５１】
６．実施例
本書に示す実施例は、本開示の増大のためにのみ示すので、何らかの限定のためのものと解釈すべきではない。
【００５２】
実施例Ｉ
線条体内注射後のｒＡＡＶＲｅｃ１〜４の導入遺伝子発現を、他の天然の血清型（ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）と比較した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子を駆動するＣＡＧプロモーターを含む発現カセットを、すべてのベクターに使用した。ＧＦＰ蛍光の偏見のない立体学的解析によって、導入遺伝子発現を評価した。試験したベクターの中で、ｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターが、輝度測定による測定で、注射部位における最も高い発現レベルをもたらした。ｒＡＡＶＲｅｃ３は、形質導入体積においても最大であり、ＡＡＶ９およびｒＡＡＶＲｅｃ４がそれに続いた。ｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターは、現在広く用いられる天然のバリアントと比較して改善された性質を示し、神経学的疾患の遺伝子治療に非常に有用でありうる。
【００５３】
材料および方法
ＡＡＶベクター
３つの霊長類由来ＡＡＶバリアントであるｃｙ５（カニクイザル - バリアント５）、ｒｈ２０（アカゲザル - バリアント２０）およびｒｈ３９が、Dr. Guang-Ping Gaoおよびthe Gene Therapy Program Vector Core, Department of Medicine, University of Pennsylvaniaから初めに入手された。これらバリアントは、その優れた形質導入効率の故に選択された（Lawlor et al., 2009）。ハイブリッド組換えカプシドを作製するために、文献に記載されるように既知の制限酵素部位を利用して、３つすべてのベクターおよびＡＡＶ８においてマッチするカプシド配列の断片をシャッフルした（Charbel Issa et al., 2013）。ハイブリッドＡＡＶベクターを作製するために、ＧＦＰをＣＡＧ（ハイブリッドＣＭＶ−ニワトリβ−アクチン）プロモーターの制御下にＡＡＶ発現プラスミドに組み込み、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）およびウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルをＡＡＶ末端逆位反復配列で挟んで組み込んだ。ヒト胎児腎２９３細胞を、３つのプラスミド、すなわち、ＡＡＶプラスミド、ｒｅｐおよびｃａｐ（Ｒｅｃ１〜４）遺伝子またはＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９をコードする適当なヘルパープラスミド、およびアデノウイルスヘルパーｐＦΔ６で、標準的なＣａＰＯ４トランスフェクションによって同時トランスフェクトした。ｒＡＡＶベクターを細胞溶解物から、イオジキサノール密度勾配を用いる超遠心分離によって精製した。ベクターの力価をリアルタイムＰＣＲ（ABI Prism 7700; Applied Biosystems, Foster City, CA）によって測定し、注射のために１．０×１０１３ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍｌに希釈した。
【００５４】
ＡＡＶ力価の比較
各血清型のウイルスを５つの１５０ｍｍプレートにおいて生産した。各プレートからの各ベクターストックのウイルスゲノム力価をリアルタイムＰＣＲによって測定し、各プレートにおけるウイルス収量（細胞当たりのウイルスゲノム粒子、ｖｇ／細胞）を計算した。
【００５５】
マウス
１４週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA）を、食物および水を自由に摂取させて１２時間の明暗サイクル（１８００時間で消灯）で、４つのグループで飼育した。動物の使用はすべて、the Ohio State University Animal Care and Use Committeeにより承認され、ＮＩＨガイドラインにしたがった。
【００５６】
ｒＡＡＶの線条体への注射
マウスをケタミン／キシラジンの単回投与（１００ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇ；ｉ．ｐ．）により麻酔し、Ｋｏｐｆ定位固定フレームに載せた。線条体への注射の座標（ブレグマから）は次のとおりであった：前後方向、＋１．０ｍｍ；左右方向、±１．７ｍｍ；背腹方向、−３．５ｍｍ（Franklin and Paxinos, 1997）。Micro4 Micro Syringe Pump Controller（World Precision Instruments Inc., Sarasota, USA）に接続した１０μＬ Hamiltonシリンジを用いて、１μＬのＡＡＶベクター（１×１０１３ｖｇ／ｍｌ)を、０．１μＬ／分の速度で、背側および腹側両方の海馬に両側で送達した。術後、麻酔から回復するまで、動物をモニターした。
【００５７】
免疫組織化学のための組織調製
ベクターの注射から４週間後にマウスを過量のペントバルビトンナトリウム（２０μＬＬ、ｉ.ｐ.）で殺し、１×ＰＢＳ、その後４％ＰＦＡで、経心腔的灌流した。３０％スクロース中で凍結保護した後、免疫組織化学用に、４０μｍのコロナル脳切片をクリオスタットで切り出した。
【００５８】
免疫組織化学
脳切片を、０．２５％のTriton X-100を含む１×ＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で洗い、１％の血清を含むＰＢＳＴ中で室温で１時間ブロックした。ブロッキングバッファーを除去した後、切片をウサギ抗ＮｅｕＮ抗体（Abcam、１：５００）またはヤギ抗ＧＦＡＰ抗体（Santa Cruz Biotechnology, Inc.、１：１００）と共に、４℃で一晩インキュベートした。翌日、切片をＰＢＳＴ中で十分に洗い、二次抗体であるＣｙ３結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.、１：２５０）またはロバ抗ヤギＩｇＧ−ＴＲ（Santa Cruz Biotechnology, Inc.、１：２５０）と共に３時間インキュベートした。その後、切片を洗い、スライドに載せ、蛍光封入剤（Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA）と共にカバースリップで覆った。
【００５９】
共焦点顕微鏡観察
脳切片を共焦点顕微鏡（Olympus FluoView（商標）FV1000, Tokyo, Japan）で観察した。ＧＦＰ、Ｃｙ３およびTexas Red（登録商標）の蛍光を、４８８ｎｍのアルゴンレーザーおよび５４３ｎｍのＨｅＮｅレーザーを用いて順次励起した。４０倍の油浸対物レンズを用いて画像を順次取得した。Olympus Viewerを用いてマージ画像を作製した。
【００６０】
立体学
Cavalieri Estimator in Stereo Investigator 7（MBF Bioscience, Willeston, VT）を用いて、脳組織の形質導入体積を立体学的に定量した。各切片における形質導入の面積を求めるために、ＧＦＰ陽性免疫反応性を含む各切片の領域の輪郭を取り、１００μｍのグリッドサイズでマーカーを置いた。１２個毎の４０μｍ切片において面積を測定し（導入遺伝子発現に応じて、１つの脳につき１０〜１２の切片を測定した）、平均値を求め、最初と最後の切片の間の前後方向の距離を掛けることによって、形質導入体積の推定値を得た。
【００６１】
ＧＦＰ発現の輝度
Collect Luminance Information command in Stereo Investigator 7（MBF Bioscience, Willeston, VT）を用いて、各脳組織におけるＧＦＰ発現の強さを測定した。各脳について、最も強い蛍光を示す切片の画像を取得し、ＧＦＰ発現の面積の輪郭を取った。輪郭内の各ピクセルの輝度を測定し、平均値を求めた。各ピクセルの輝度は、０〜２５５の範囲である。黒のピクセルは輝度が０であり、白のピクセルは輝度が２５５である。着色したピクセルについては、輝度を、（０．２９９＊赤）＋（０．５７９＊緑）＋（０．１１４＊青）として規定する。
【００６２】
統計学的解析
異なる試験群からの平均値を、一元ＡＮＯＶＡ、次いでスチューデントのｔ検定によるペアワイズ比較によって比較した。すべての統計学的解析を、Jmpソフトウェア（SAS Institute Inc., Cary, NC, USA）を用いて、有意性をＰ＜０．０５で設定して行った。すべてのデータを、平均値±標準誤差（S.E.M）として表した。
【００６３】
結果
４つの新規な霊長類由来ハイブリッド組換えＡＡＶベクター（ＡＡＶＲｅｃ１〜４）のマウス脳における形質導入効率を、野生型カプシドで偽型化されたベクター（ＡＡＶ１、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９）と比較した。線条体内のＧＦＰ発現組織体積を、偏見のない立体学的方法で定量した。全体として、ｒＡＡＶＲｅｃ３およびＡＡＶ９が最も広域に及ぶＧＦＰ発現をもたらし、ｒＡＡＶＲｅｃ４がそれに続いた（図２；一元ＡＮＯＶＡ、Ｐ＜０．０００１）。ｒＡＡＶＲｅｃ１およびｒＡＡＶＲｅｃ２による形質導入体積はＡＡＶ１によるものと同等であり、ＡＡＶ８による形質導入体積は最も小さかった。ＡＡＶ９、ｒＡＡＶＲｅｃ３およびｒＡＡＶＲｅｃ４を注射した脳においては、淡蒼球、視床、皮質、および視床においても強いＧＦＰ蛍光が観察された。ｒＡＡＶＲｅｃ３を注射した脳をより詳細に調べると、ＧＦＰ陽性線維が、対側の注射していない線条体において、淡蒼球において、および黒質において見られた。さらに、ＧＦＰ陽性細胞が、視床および皮質において観察された。そのような皮質および視床細胞の形質導入は、ベクターの皮質線条体および視床線条体求心路を介する逆行性輸送によってもたらされたものでありうる。形質導入された皮質および視床ニューロンは注射部位から１ｍｍも離れたところでも検出されたが、この距離はかなり大きいので、ウイルス液の単なる拡散によっては説明できない（Aschauer et al., 2013）。
【００６４】
興味深いことに、新規血清型ｒＡＡＶＲｅｃ２は、褐色および白色脂肪組織の両方に、試験されたベクターのなかで最も効率的に形質導入することが最近示されたが（Liu et al., 2014）、脳を標的とする導入遺伝子送達を改善しなかった。対照的に、ｒＡＡＶＲｅｃ３、ｒＡＡＶＲｅｃ４およびＡＡＶ９は、高い効率で脳に形質導入するが、脂肪組織の形質導入には劣っていた。これら組換え血清型の組織指向性の相異は、基礎研究用にも臨床適用用にも現在のＡＡＶベクターツールキットを拡大発展させるのに有用である。
【００６５】
異なる血清型による導入遺伝子発現の強さを比較するために、各脳について最も強いＧＦＰ蛍光を示す切片を選択し、輝度を測定し平均値を求めた。ｒＡＡＶＲｅｃ３が最も高いＧＦＰ蛍光強度をもたらし、これはＡＡＶ８によるものの２倍であった（図２Ａ）。ｒＡＡＶＲｅｃ４による導入遺伝子発現は、ＡＡＶ９によるものと同程度であった。この結果は、標的部位において達成された導入遺伝子タンパク質発現の最高レベルは、ｒＡＡＶＲｅｃ３ベクターを用いた場合に、より高かったことを示している。これは、該新規ハイブリッド組換え血清型によって、形質導入された細胞における導入遺伝子発現がより高められたこと、またはより高い密度（ｍｍ３当たりの形質導入細胞数）で形質導入されたことによるものと考えられる。
【００６６】
ｒＡＡＶＲｅｃ１〜４の細胞指向性を調べるために、共焦点顕微鏡で、ＧＦＰ蛍光、および異なる神経細胞種の異なる細胞マーカーの免疫蛍光（ニューロン（ＮｅｕＮ）およびアストロサイト（ＧＦＡＰ）の細胞種特異的エピトープに対する抗体を用いた）の両方の存在位置を観察した。試験した血清型のいずれについても、ＧＦＰ陽性細胞の大部分がニューロンマーカーＮｅｕＮ免疫反応性であり、切片当たりわずかに２〜３個のアストロサイト特異的ＧＦＡＰ陽性細胞が検出可能であった（図３）。このことは、ｒＡＡＶＲｅｃ１〜４は主にニューロンに形質導入することを示している。予想通り、ｒＡＡＶＲｅｃ１〜４は細胞指向性を変化しておらず、このことは、形質導入された細胞の表現型は使用されるプロモーターに大きく依存する（Lawlor et al., 2009）という事実と一致する。ＡＡＶベクターによってアストロサイトに形質導入するには、グリア細胞特異的プロモーターの組み込みが必要かもしれない。さらに、異なるＡＡＶ血清型の細胞指向性は、脳の領域によっても異なりうる。例えば、Aschauerら (2013) は最近、ＡＡＶ６ベクターと比較してＡＡＶ８ベクターで形質導入した場合には、皮質中のアストロサイトはより高いＧＦＰレベルを示したが、アストロサイト形質導入におけるこのような差は、海馬においては観察されなかったことを示している（Aschauer et al. ,2013）。興味深いことに、同じ研究によって、ＡＡＶ８はアストロサイトおよびオリゴデンドロサイトに形質導入することができたが、ＡＡＶ１はミクログリアにいくらか形質導入したことが示されている。これには、用いた方法の違いが反映されている可能性がある。本発明者は形質導入パターンのより定性的な記述を報告するが（図３）、Aschauerらは、異なる細胞種の形質導入細胞それぞれにおいてＧＦＰシグナル強度を定量的に評価したので、高シグナル強度を示す細胞が少数であっても、高い細胞種特異的発現とされたかもしれない。しかしながら、本結果は、４つのｒＡＡＶＲｅｃベクターが神経指向性を有すること、ｒＡＡＶＲｅｃ３はアストロサイト指向性もある程度有することを明らかに示している（図３）。これらハイブリッドベクターの生産において、同一人物が同一の方法で生産しても、ベクターが異なれば生産収率が異なることがわかった（全体の差をＡＮＯＶＡによって解析、Ｐ＜０．０００１）。結果を表１に示す。
【００６７】
【表１】
2020533968.tif 000003
【００６８】
ｒＡＡＶＲｅｃ２およびｒＡＡＶＲｅｃ１は、その他のベクターよりも収率が高かった。ｒＡＡＶＲｅｃ３の力価は、ＡＡＶ８のほぼ２倍であったが、この差は統計学的に有意ではなかった。注目すべきことに、ＡＡＶ９は脳において非常に効率的な形質導入をもたらしたが、その生産の力価はｒＡＡＶＲｅｃ３の８分の１にも及ばなかった（Ｐ＜０．００１）。高い収率は、同じ生産コストでより大きい形質導入体積に変換されるから、実際的な意味を持つ。
【００６９】
異なるＡＡＶ血清型間のウイルスカプシドタンパク質配列の交換によって作製される本発明のｒＡＡＶベクターは、向上された形質導入効率および高められた生産収率を提供しうる。本発明のハイブリッドベクターは、免疫反応を回避することにおいて、再投与用の第２のベクターとして有用でありうる。該ハイブリッドベクターはさらに、現在のＡＡＶツールキットを拡大発現させ、神経学的研究用の生物学的ツールとして有用である。
【００７０】
本書に記載する実施例および態様は、例示的な実施例および態様であると理解すべきである。当業者は、本開示の範囲に含まれる、そのような実施例および態様におけるさまざまな変更を構想しうる。そのような変更は、特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【００７１】
本書において引用される特許、特許出願および参考文献はいずれも、引用により本書の一部とされる。
【００７２】
参考文献
2020533968.tif 000004
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【図１Ａ−１】
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【図１Ａ−２】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【配列表】
2020533968000001.app
【国際調査報告】
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2020533968.tif 000014