(57)【要約】【課題】ＣＯＰＤ患者における増悪の軽減に使用するのに好適な方法およびナノ粒子が本明細書に開示される。【解決手段】本方法および組成物は、ＲＳＶへの曝露またはＲＳＶによる感染などの環境からの刺激に応答して発生するＣＯＰＤ患者の入院の発生率を有利に減少させる。投与量、製剤、ならびにワクチンおよびナノ粒子を調製するための方法も開示される。【選択図】図１
2020528883.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象における慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の増悪を軽減する方法であって、
前記対象にナノ粒子ワクチンを投与することを含み、前記ナノ粒子が、非イオン性界面活性剤コアおよびウイルス糖タンパク質を含み、前記ウイルス糖タンパク質が、前記コアと結合しており、前記界面活性剤が約０．０３％〜約０．０５％で存在する、方法。
【請求項２】
前記増悪が、環境からの刺激によって引き起こされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記環境からの刺激が病原体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記病原体がウイルス病原体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ウイルス病原体が、ＲＳＶウイルスおよびインフルエンザウイルスからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
入院率によって決定される増悪の発生率が約５０％減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒトが少なくとも７５歳、少なくとも６５歳、好ましくは少なくとも６０歳である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記非イオン性界面活性剤が、ＰＳ２０、ＰＳ４０、ＰＳ６０、ＰＳ６５、およびＰＳ８０からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ウイルス糖タンパク質が、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、インフルエンザＨＡタンパク質、インフルエンザＮＡタンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルス糖タンパク質がＲＳＶ  Ｆタンパク質であり、非イオン性界面活性剤対ウイルス糖タンパク質のモル比が約３０：１〜約６０：１である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質が、配列番号２のアミノ酸１３７〜１４６に対応する１〜１０個のアミノ酸の欠失、および配列番号２のアミノ酸１３１〜１３６に対応する不活性化された一次フューリン切断部位を含み、前記一次フューリン切断部位は変異により不活性化されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組成物が任意の他の界面活性剤を実質的に含まない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＳＶ−Ｆタンパク質が、配列番号１〜１３およびＮ末端シグナルペプチドの一部または全部を欠く配列番号１〜１３のバリアントからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質が配列番号１９を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＳＶ  Ｆタンパク質が配列番号１９からなる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記非イオン性界面活性剤がＰＳ８０である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を有するヒトにおける、環境からの刺激に応答するＣＯＰＤの増悪を軽減する方法であって、免疫原性組成物を前記ヒトに投与することを含み、前記免疫原性組成物は第１のナノ粒子を含み、前記第１のナノ粒子はＰＳ８０非イオン性界面活性剤コアおよび第１のウイルス糖タンパク質を含み、前記ウイルス糖タンパク質、前記コアに結合しており、前記界面活性剤が、約０．０３％〜約０．０５％で存在する、方法。
【請求項１８】
前記第１のウイルス糖タンパク質がＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫原性組成物が第２のナノ粒子を含み、前記第２のナノ粒子がＰＳ８０非イオン性界面活性剤コアおよび第２のウイルス糖タンパク質を含み、前記第２のウイルスタンパク質がインフルエンザＨＡタンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ＣＯＰＤを有するヒト対象におけるＣＯＰＤの増悪を治療する方法における使用のための免疫原性組成物であって、前記ワクチン組成物は、第１のナノ粒子を含み、前記第１のナノ粒子はＰＳ８０非イオン性界面活性剤コアおよび第１のウイルス糖タンパク質を含み、前記ウイルス糖タンパク質は前記コアに結合しており、前記界面活性剤が、約０．０３％〜約０．０５％で存在する、免疫原性組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年７月２４日に出願された米国仮特許出願第６２／５３６，２３５号の優先権を主張し、その開示はあらゆる目的のために本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願には、２０１６年９月６日に出願された米国特許出願第１５／２５７，４３６号、および２０１５年９月３日に出願された米国仮特許出願第６２／２１３，９４７号、２０１５年１１月１６日に出願された同第６２／２５５，７８６号、２０１６年３月１６日に出願された同第６２／３０９，２１６号、および２０１６年６月１６日に出願された同第６２／３５０，９７３号の開示が、あらゆる目的のためにそれらの全体として組み込まれる。
【０００３】
電子的に提出されたテキストファイルの記載
本明細書と共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、参照により本明細書にそれらの全体が組み込まれる。配列表のコンピューター可読形式のコピー（ファイル名：ＮＯＶＶ＿０７５＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０１８年７月１９日、ファイルサイズ：約６７キロバイト）。
【０００４】
［技術分野］
本開示は、概して、呼吸器疾患の治療および呼吸器疾患に関連する増悪(exacerbation)の予防に有用な、ナノ粒子、およびそれらを含む免疫原性組成物に関する。ナノ粒子は、界面活性剤コアに結合した抗原、例えば糖タンパク質抗原を提供し、典型的には、組換えアプローチを使用して生成される。ナノ粒子は、特に高齢者集団において、慢性閉塞性肺（ＣＯＰＤ）の増悪および関連する入院を減少させた。本開示はまた、ナノ粒子を含む組成物、それらを生成する方法、および呼吸器疾患（例えばＣＯＰＤ）を治療し、さらなる増悪を予防する方法も提供する。
【背景技術】
【０００５】
呼吸器疾患および感染症は世界中で依然として問題である。いくつかの病原体に対するワクチンの開発は進展してきているが、多くは依然として人間の健康に対して脅威のままである。最も有名なものはＨＩＶであり、それに対するワクチンは、なかなか見つからないままである。特定の病原体に対するワクチンを生成する試みがなされているが、失敗に終わっており、これによりさらなる病態が引き起こされた。
【０００６】
世界保健機関は、世界の全ての死の６％、年間３００万人を超える死が、世界の主要な呼吸器疾患の１つである慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に起因すると推定している。ＣＯＰＤの増悪は、患者に深刻な悪影響を及ぼし、ヘルスケア資源に大きな負担をかける。各増悪後の肺機能の回復不可能な低下の明確な証拠がある。増悪の予防と治療はＣＯＰＤの臨床管理の主な目的である（Ｄｅｃｒａｍｅｒ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，（２００８）“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＣＯＰＤ  Ｅｘａｃｅｒｂａｔｉｏｎ”Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｍｅｄ  １０２：Ｓ３−Ｓ１５、およびＲａｂｅ  ＫＦ，ｅｔ  ａｌ．，（２００７）“Ｇｌｏｂａｌ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＧＯＬＤ  Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｓｕｍｍａｒｙ”Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｒｉｔ  Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ  １７６：５３２−５５５を参照されたい）。
【０００７】
他の治療法の選択肢の中で、アメリカ肺協会はＣＯＰＤ患者への予防接種、特に毎年のインフルエンザと肺炎のワクチン接種を推奨している。したがって、ＣＯＰＤ集団の増悪を軽減または排除して疾患の負担および関連コストを削減するための治療薬および予防薬の製造に、絶えず関心が払われている。
【発明の概要】
【０００８】
本開示は、呼吸器疾患および障害の治療に好適なナノ粒子を提供する。特定の態様では、ナノ粒子は慢性閉塞性肺障害（ＣＯＰＤ）を治療する。他の態様では、ナノ粒子は呼吸器系の刺激、例えば、病原体への曝露に応答する、ＣＯＰＤの増悪を防ぐ。
【０００９】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子は病原体に対する免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、病原体はウイルスであり、典型的には、ウイルスナノ粒子を生成するために使用される抗原はウイルス糖タンパク質である。
【００１０】
一態様では、本開示は、向上した安定性を有するウイルスタンパク質を含むナノ粒子を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、非イオン性界面活性剤、ウイルス糖タンパク質、および薬学的緩衝液を含むナノ粒子を含むワクチン組成物を含む。典型的な実施形態では、非イオン性界面活性剤は、ＰＳ２０、ＰＳ４０、ＰＳ６０、ＰＳ６５、およびＰＳ８０からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態では、組成物は遊離非イオン性界面活性剤を一切含まない。１以上の糖タンパク質抗原分子は、非イオン性界面活性剤を含む界面活性剤コアを取り囲み、これにより、免疫原性を促進し、抗原の分解を阻害するナノ粒子構造が提供される。
【００１１】
いくつかの実施形態では、抗原は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、インフルエンザＨＡタンパク質、インフルエンザＮＡタンパク質、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。典型的には、抗原は糖タンパク質である。
【００１２】
任意で、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は三量体ＲＳＶ  Ｆタンパク質である。ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、中和抗体の生成を誘導する。さらなる実施形態では、中和抗体は、融合後状態および／または融合前状態のＲＳＶ  Ｆタンパク質を認識する。さらなる態様では、各ＰＳ８０粒子は４〜７個のＲＳＶ  Ｆタンパク質を含んでもよい。
【００１３】
いくつかの実施形態では、ＲＳＶ  Ｆ組成物は、１５ｍＭ〜２５ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、１２５ｍＭ〜１７５ｍＭの濃度のＮａＣｌ、０．２５％〜２％ｗ／ｖのヒスチジンを含んでもよく、組成物のｐＨは５．８〜７．２である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＨＡまたはＮＡインフルエンザ組成物は、１５ｍＭ〜２５ｍＭの濃度のリン酸ナトリウム、１２５ｍＭ〜３００ｍＭの濃度のＮａＣｌ、０．２５％〜２％ｗ／ｖのヒスチジンを含んでもよく、組成物のｐＨはｐＨ約６．８よりも高く、典型的には、ｐＨ約８．０よりも低い。
【００１５】
いくつかの実施形態では、組成物はアジュバントを含む。さらなる実施形態では、アジュバントはミョウバン（alum）またはサポニンベースのマトリックスアジュバントである。いくつかの実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
【００１６】
いくつかの実施形態では、感染を予防する方法は、ワクチン組成物の１以上の用量を投与することを含む。本方法のいくつかの実施形態では、組成物の単回用量が投与され、防御免疫応答を誘導する。本方法のいくつかの実施形態では、各用量は約１００μｇ〜約１５０μｇのタンパク質抗原からなる。本方法のさらなる実施形態では、１以上の用量は皮下投与される。本方法のいくつかの実施形態では、組成物はアジュバントを含む。本方法のさらなる実施形態では、アジュバントはミョウバンである。本方法のいくつかの実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
【００１７】
本方法のさらなる実施形態では、組成物の１以上の用量は成人に投与される。本方法のさらなる実施形態では、成人は７５歳超、７０歳超、６５歳超、６０歳超、５５歳超、５０歳超、または４５歳超である。したがって、特定の態様では、成人は約４５〜約７５歳であり得る。
【００１８】
ＲＳＶワクチンに関して、いくつかの実施形態では、組成物は、少なくとも３つのＲＳＶ  Ｆナノ粒子タイプの異種集団を含み、各ナノ粒子は、ＰＳ８０を含む界面活性剤含有コアを取り囲む少なくとも１つのＲＳＶ  Ｆタンパク質三量体を含み、第１のＲＳＶ  Ｆナノ粒子タイプは異方性ロッドを含み、第２のＲＳＶ  Ｆナノ粒子タイプは球状オリゴマーを含み、第３のＲＳＶ  Ｆナノ粒子タイプは異方性ロッドと球状オリゴマーの中間体を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質ナノ粒子を製造する方法は、第１の界面活性剤を使用して宿主細胞からＲＳＶ  Ｆタンパク質抽出物を調製し、第１の界面活性剤を第２の界面活性剤に交換することを含み、第２の界面活性剤はＰＳ８０であり、これによって、ナノ粒子は向上した安定性を示す。本方法のさらなる実施形態では、第１の界面活性剤はＮＰ−９である。本方法のいくつかの実施形態では、向上した安定性は、プロテアーゼ耐性、酸化ストレス耐性、熱ストレス耐性、および撹拌耐性から選択される。本方法のいくつかの実施形態では、ＰＳ８０：ＲＳＶ  Ｆタンパク質のモル比は、約３５対約６５である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＲＳＶ  Ｆナノ粒子は、ＰＳ８０界面活性剤コアに結合した１以上のＲＳＶ  Ｆタンパク質三量体を含む。ＲＳＶ  Ｆナノ粒子、ナノ粒子は、動的光散乱により測定される約２０ｎｍ〜約６０ｎｍの平均直径を有する。ＲＳＶ  Ｆナノ粒子のいくつかの実施形態では、各ＲＳＶ  Ｆタンパク質三量体は、配列番号２の残基１３７〜１４６に対応する１〜１０アミノ酸の欠失を有するＲＳＶ  Ｆタンパク質からなる群から選択されるＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む。ＲＳＶ  Ｆナノ粒子のいくつかの実施形態では、各ＲＳＶ  Ｆタンパク質三量体は、配列番号２の残基１３７〜１４６に対応する１〜１０アミノ酸の欠失および不活性化された一次融合切断部位を有するＲＳＶ  Ｆタンパク質からなる群から選択されるＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む。
【００２１】
ＲＳＶ  Ｆナノ粒子のいくつかの実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は配列番号２の、残基１３７〜１６６に対応する１０個のアミノ酸の欠失、および位置１３３、１３５、および１３６でのアルギニン残基のグルタミンへの変異による一次フューリン切断部位の不活性化を含む。ＲＳＶ  Ｆナノ粒子のさらなる実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、成熟ペプチドである配列番号１９を含むかまたはそれからなる。ＲＳＶ  Ｆナノ粒子のある特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は配列番号８を含むかまたはそれからなる。ＲＳＶ  Ｆナノ粒子を含むワクチン製剤は、いくつかの完全長ペプチド（配列番号８）を含む成熟ペプチドから実質的になる。経時的に、タンパク質分解により、少量の切断されたＲＳＶ  Ｆペプチドが生じる場合がある。しかしながら、有利なことに、本明細書に開示されるＲＳＶ  Ｆナノ粒子は、そのような分解を最小限に抑え、長期の安定性を提供する。
【００２２】
同様に、インフルエンザタンパク質である、ＨＡ、ＮＡ、またはその両方と組み合わせたＲＳＶ  Ｆタンパク質を含むナノ粒子が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】修飾されたＲＳＶ  Ｆタンパク質のアミノ酸配列（配列番号１９）を示し、明るい色のテキスト（残基１〜８４）のＦ１ドメイン、暗い色のテキスト（残基８５〜５３９）のＦ２ドメイン、ジスルフィド結合を形成するシステインを結ぶ黒い線、Ｎ結合型グリコシル化部位を示す下線を付したアスパラギン、フューリン切断部位を示す明るい縦の点線および主要な切断部位を示す黒の縦の点線を含む。
【図２】ＰＳ８０のコアに結合したＲＳＶ  Ｆタンパク質三量体を有するＲＳＶ  Ｆナノ粒子の電子顕微鏡写真を示す。複数のＲＳＶ  Ｆ三量体が各粒子に結合する（直径４０〜５０ｎｍ）。
【図３】Ｅ−３０１およびＥ２０１研究における全原因（ＲＳＶ検出に関連しない）ＣＯＰＤ増悪のための入院の分析を示す。
【図４】Ｅ−３０１研究における経時的なＣＯＰＤ増悪による入院のない集団の減少を詳細に示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書に開示されるのは、呼吸器疾患および障害を治療するためのナノ粒子、それらを生成および投与する方法、ならびにそれらを含むワクチン組成物である。ナノ粒子は、界面活性剤コアを取り囲み、結合した抗原を提供し、これにより、多数の手段により向上した安定性を提供する構造が得られる。理論に縛られるものではないが、開示されたナノ粒子によって誘導される免疫応答および関連する防御は、呼吸器疾患または障害（例えば、ＣＯＰＤ）の増悪の軽減をもたらす。界面活性剤のコアと抗原は、抗原と界面活性剤の特性によって媒介される物理化学的相互作用を介して結合する。さらに、ナノ粒子は、免疫系に特に優れた抗原提示を提供し、これは、理論に拘束されることなく、界面活性剤コアの周りの抗原の配向性に起因すると考えられている。
【００２５】
一態様では、本開示は、組換えウイルス糖タンパク質ナノ粒子を含む組成物を提供する。特定の態様では、糖タンパク質は好適な宿主細胞で組換え発現される。一実施形態では、宿主細胞は昆虫細胞である。例示的な実施形態では、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００２６】
特定の態様では、本開示は、ナノ粒子構造に１以上のウイルス糖タンパク質種を含む免疫原性組成物であって、糖タンパク質が三量体の形態であり、各ナノ粒子が非イオン性界面活性剤に結合した少なくとも１つの三量体を含む、免疫原性組成物を提供する。特定の態様では、ナノ粒子は、１つの病原体のみからのウイルス糖タンパク質などの抗原からなる。
【００２７】
ナノ粒子は、呼吸器疾患または障害の治療に使用することができる。いくつかの実施形態では、ナノ粒子はＣＯＰＤを治療するために使用される。いくつかの実施形態では、ナノ粒子は、病原体または他の環境的なＣＯＰＤトリガーなどの呼吸器系の刺激に応答するＣＯＰＤの増悪の発生率を減少させる。
【００２８】
ナノ粒子は、ウイルス感染の予防および／または治療に使用することができる。したがって、別の態様では、本開示は、ウイルスに対する免疫応答を誘発する方法を提供する。本方法は、ナノ粒子を含む免疫学的に有効な量の組成物を対象に投与することを含む。
【００２９】
本開示は、ナノ粒子を含むワクチン組成物を提供する。組成物は、複数の病原体からの抗原を有するナノ粒子を含んでもよい。いくつかの態様では、ワクチン組成物は、同一の種のウイルスからの１つを超えるウイルス系統からの抗原を有するナノ粒子を含んでもよい。態様において、ワクチン組成物は、異なるウイルス種からの抗原を含むナノ粒子を含んでもよい。別の実施形態では、本開示は、ワクチン組成物の成分の１以上で満たされた１以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。
【００３０】
別の実施形態では、本開示は、ナノ粒子の有効量を組成物に添加することを含む、哺乳動物に対する感染またはその少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘導するワクチン組成物を製剤化する方法を提供する。開示されたナノ粒子は、感染性因子に対する免疫または実質的な免疫を付与する免疫応答を刺激する組成物の調製に有用である。したがって、一実施形態では、本開示は、ナノ粒子の少なくとも１回の有効用量を投与することを含む、対象における感染またはその少なくとも１つの疾患症状に対する免疫を誘導する方法を提供する。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ナノ粒子はアジュバントと共に投与される。他の態様では、ナノ粒子はアジュバントを含まずに投与される。いくつかの態様では、アジュバントは、非共有相互作用などによってナノ粒子に結合されてもよい。他の態様では、アジュバントはナノ粒子と同時投与されるが、アジュバントとナノ粒子は実質的に相互作用しない。
【００３２】
本明細書でまた提供されるのは、ナノ粒子およびワクチン組成物を製造する方法である。有利なことに、この方法は、バキュロウイルス／Ｓｆ９システムでのタンパク質の組換え発現に関連するタンパク質など、他のタンパク質による汚染が実質的にないナノ粒子を提供する。
【００３３】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、その内容について別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を包含する。したがって、例えば、「タンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」への言及は、１つのタンパク質またはそのようなタンパク質の混合物を指し得る。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「アジュバント」という用語は、免疫原と組み合わせて使用されるとき、免疫原に対して誘導される免疫応答を増強するか、そうでなければ改変または修飾する薬剤を指す。免疫応答の修飾は、抗体と細胞性免疫応答のいずれかまたは両方の特異性の強化または拡大を含んでもよい。ワクチン組成物は、有効量の１以上のアジュバントを含んでもよい。
【００３５】
本明細書で使用されるとき、数値に先行する場合の「約」または「およそ」という用語は、値のプラスまたはマイナス１０％の範囲を示す。例えば、「約１００」は、９０および１１０を包含する。
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「免疫原」、「抗原」、および「エピトープ」という用語は、免疫応答を誘発することができる糖タンパク質を含むタンパク質、およびペプチドなどの物質を指す。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「免疫原性組成物」は、対象への組成物の投与が抗原に対する体液性および／または細胞性免疫応答の対象での発生をもたらす抗原を含む組成物である。
【００３８】
本明細書で使用する「サブユニット」組成物、例えば、ワクチンは、病原体からの全ての抗原ではなく、１以上の選択された抗原を含む。そのような組成物は、無傷のウイルスまたはそのような細胞もしくは粒子の溶解物を実質的に含まず、典型的には少なくとも部分的に精製され、しばしば実質的に精製された病原体からの免疫原性ポリペプチドから調製される。本明細書に開示されるサブユニット組成物中の抗原は、典型的には組換え的に調製され、しばしばバキュロウイルス系を使用する。
【００３９】
本明細書で使用されるとき、「実質的に」とは、物質が含まれる試料の大部分を形成するような物質（例えば、化合物、ポリヌクレオチド、もしくはポリペプチド）またはほぼ完了している、プロセスステップを指す。例えば、試料において、実質的に精製された成分は、試料の８５％、好ましくは８５％〜９０％、より好ましくは少なくとも９５％〜９９．５％、最も好ましくは少なくとも９９％を構成する。成分が実質的に交換される場合、試料中に残っている量は約０．５％〜約１０％またはそれら未満、好ましくは約０．５％〜約１．０％未満である。
【００４０】
本明細書で使用されるとき、「治療する」、「治療」、および「治療すること」という用語は、有益なまたは望ましい結果、例えば臨床結果を得るためのアプローチを指す。本開示の目的のために、有益または望ましい結果は、感染もしくは疾患の開始もしくは進行の阻害もしくは抑制、感染もしくは疾患の症状の改善、もしくはその発症の低減またはそれらの組み合わせを含み得る。
【００４１】
本明細書で使用されるとき、「予防」（Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）は、「予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）」と交換可能に使用され、感染もしくは疾患の完全な予防、またはその感染もしくは疾患の症状の発症の予防、感染もしくは疾患もしくはその症状の発症の遅延、または、その後に発症する感染もしくは疾患もしくはその症状の重症度の低下を意味し得る。
【００４２】
本明細書で使用されるとき、「有効用量」または「有効量」は、病原体感染の少なくとも１つの症状を軽減する免疫応答を誘導するのに十分な免疫原の量を指す。有効用量または有効量は、例えば、分泌性および／または血清抗体の中和量を測定することにより、例えば、プラーク中和、補体固定、酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）、または微量中和アッセイにより決定され得る。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、「ワクチン」という用語は、防御免疫（例えば、病原体による対象の感染から対象を防御する、および／または病原体の感染によって引き起こされる疾患または状態の重症度を低下させる、免疫）を提供する病原体に対する免疫応答を誘導するために使用される、病原体に由来する免疫原などの免疫原性組成物を指す。防御免疫応答には、抗体の形成および／または細胞媒介性応答が含まれ得る。文脈に応じて、「ワクチン」という用語は、防御免疫を生成するために対象に投与される免疫原の懸濁液または溶液を指し得る。
【００４４】
本明細書で使用されるとき、「対象」という用語には、ヒトおよび他の動物が含まれる。典型的には、対象はヒトである。例えば、対象は、成人、１０代、小児（２歳〜１４歳）、幼児（１ヶ月〜２４ヶ月）、または新生児（１ヶ月まで）であり得る。いくつかの態様では、成人は約６５歳以上、または約６０歳以上の高齢者である。いくつかの態様では、対象は妊娠中の女性または妊娠しようとしている女性である。他の態様では、対象はヒトではなく、例えば、非ヒト霊長類、例えば、ヒヒ、チンパンジー、ゴリラ、またはマカクである。ある特定の態様では、対象はイヌまたはネコなどのペットであり得る。
【００４５】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される」という用語は、米国連邦政府または州政府の規制当局によって承認されること、または哺乳動物、特にヒトにおいて使用するために米国薬局方、欧州薬局方、またはその他の一般に認められた薬局方に記載されることを意味する。薬学的に許容される担体または賦形剤は、本明細書に開示される組成物に含まれてもよい。
【００４６】
本明細書で使用されるとき、「呼吸器疾患」または「呼吸器障害」は、気道および／または肺の他の構造の疾患または障害を意味する。これには、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、喘息、アレルギー性鼻炎および副鼻腔炎、気管支拡張症、および肺高血圧が含まれるが、これらに限定されない。ＣＯＰＤとは、気道閉塞、ならびに肺気腫、慢性気管支炎、場合によっては喘息を含む呼吸関連の問題の１以上を含む症状を共有する疾患群を指す（ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｔｏｂａｃｃｏ／ｃａｍｐａｉｇｎ／ｔｉｐｓ／ｄｉｓｅａｓｅｓ／ｃｏｐｄ．ｈｔｍｌを参照されたい）。
【００４７】
本明細書で使用されるとき、「約」という用語は、示された数値のプラスまたはマイナス１０％を意味する。
【００４８】
概要
ＣＯＰＤの症状は、典型的に、対象にすでに重大な肺損傷があるときに現れ、症状はしばしば、経時的に悪化する。ＣＯＰＤは、肺気腫または慢性気管支炎を患っている対象の一般的な結果である。慢性気管支炎では、主な症状は、連続した２年間での１年に少なくとも３か月間の、毎日の咳と粘液（痰）の生成である。肺気腫は、肺の最小の気道（細気管支）の端にある肺胞が、典型的には喫煙により破壊される状態である。ＣＯＰＤの他の症状には、特に身体活動中の息切れ、喘鳴、胸の圧迫感、しばしば粘液を伴う慢性咳、唇または爪床の青み（チアノーゼ）などが含まれ得る。
【００４９】
ＣＯＰＤに罹患した対象は増悪と呼ばれるエピソードも経験する可能性が高く、その間、これらの症状は通常の日々の変動よりも悪化し、少なくとも数日間持続する。増悪は、典型的には、対象が遭遇する環境からの刺激(environmental insult)に応答して発生する。受動喫煙、ガソリンからの煙、細菌、およびウイルス感染を含む、さまざまな生物学的および非生物学的な、環境からの刺激は、ＣＯＰＤ患者の増悪を引き起こす可能性がある。
【００５０】
本明細書で使用される方法および組成物は、増悪または増悪に関連する１以上の症状の重症度を軽減または排除するために使用され得る。本開示の免疫原性組成物は、ナノ粒子形態の病原体に由来する１以上の抗原を含む。
【００５１】
病原体に由来する抗原は、非イオン性界面活性剤と組み合わされて、安定性が改善され、優れた免疫原性を有し、呼吸器疾患および障害を治療する界面活性剤コアを取り囲むナノ粒子を提供する。本開示はまた、呼吸器の疾患および障害を治療するために病原体に対して対象にワクチン接種するための方法および組成物も提供する。抗原は通常、ウイルスタンパク質であり、しばしば糖タンパク質である。呼吸器の疾患および障害を治療するためのワクチン組成物としての用途を見出すナノ粒子を含む組成物もまた開示されている。
【００５２】
特定の態様では、組成物は、ＲＳＶ単独に対する免疫応答を誘導するナノ粒子を含む。他の態様では、組成物はＲＳＶ由来の糖タンパク質を含むＲＳＶに対するナノ粒子を含み、それは、例えば、ＲＳＶ−Ｆタンパク質、および１以上のインフルエンザＨＡ糖タンパク質系統である（例えば、１、２、３、または４つの異なるインフルエンザ系統からのＨＡ糖タンパク質を含むナノ粒子）。
【００５３】
ナノ粒子に加えて、対象には追加の免疫原性組成物を投与してもよい。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ（百日咳病原体）、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅｂ型（Ｈｉｂ）、および麻疹のうちの１以上に対する免疫応答を誘導する組成物を対象に投与することができる。
【００５４】
本明細書に開示される免疫原性組成物の注目すべき結果は、ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質を含むナノ粒子組成物の投与により、「全ての原因による(all-cause)」ＣＯＰＤ増悪の入院が減少することであり、これは、組成物に対する応答が、ＲＳＶ刺激による増悪を軽減するだけでなく、より一般的な利点もあり、全ての原因の増悪を軽減することを意味する。例えば、図４および図５を参照されたい。したがって、ナノ粒子を含む組成物は、ＣＯＰＤを有する対象に投与して、環境からの刺激に応答する憎悪を防ぐのに有用である。
【００５５】
ナノ粒子の構造と形態
本開示のナノ粒子は、非イオン性界面活性剤コアに結合した糖タンパク質抗原を含む。図２は、界面活性剤コアに結合した複数のＲＳＶ  Ｆ抗原の例を図示する。
【００５６】
特定の実施形態では、ナノ粒子は、非イオン性界面活性剤コアを取り囲む複数のタンパク質三量体から構成される。例えば、各ナノ粒子は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１５個の三量体を含んでもよい。典型的には、各ナノ粒子は２〜９個の三量体を含む。特定の実施形態では、各ナノ粒子は２〜６個の三量体を含む。本明細書に開示される組成物は、異なる数の三量体を有するナノ粒子を含んでもよい。例えば、組成物には、三量体の数が２〜９個の範囲のナノ粒子が含まれてもよく、他の実施形態では、組成物中のナノ粒子は、２〜６個の三量体を含んでもよい。特定の実施形態において、組成物は、ナノ粒子当たり２〜６個の三量体、またはナノ粒子当たり２〜９個の三量体を有するナノ粒子の異種集団を含む。他の実施形態では、組成物は、ナノ粒子の実質的に均質な集団を含んでもよい。例えば、集団は、５つの三量体を有する約９５％のナノ粒子を含んでもよい。
【００５７】
抗原は、ナノ粒子の非イオン性界面活性剤含有コアに結合している。典型的には、界面活性剤はポリソルベート−２０（ＰＳ２０）、ポリソルベート−４０（ＰＳ４０）、ポリソルベート−６０（ＰＳ６０）、ポリソルベート−６５（ＰＳ６５）、およびポリソルベート−８０（ＰＳ８０）から選択される。界面活性剤の存在は、抗原を組織化し提示するコアを形成することにより、ナノ粒子の形成を促進する。したがって、ある特定の実施形態では、ナノ粒子は、ヘッド領域が外側に突出し、疎水性領域とＰＳ８０界面活性剤が抗原に取り囲まれた中心コアを形成するマルチオリゴマー糖タンパク質−ＰＳ８０タンパク質−界面活性剤ナノ粒子に組み立てられた抗原を含んでもよい。
【００５８】
本明細書に開示されるナノ粒子は、約２０ｎｍ〜約６０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約４５ｎｍ、または約２５ｎｍ〜約４５ｎｍのＺ−ａｖｅサイズの範囲である。粒子サイズ（Ｚ−ａｖｅ）は、特に指定がない限り、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｚｅｔａｓｉｚｅｒを使用する動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される。
【００５９】
本明細書に開示されるワクチン組成物には、いくつかのナノ粒子タイプを含んでもよい。いくつかの態様では、ナノ粒子タイプは、異方性ロッドの形態であり、二量体または単量体であり得る。他の態様では、ナノ粒子タイプは球状オリゴマーである。さらに他の態様では、ナノ粒子は、最初の２つのタイプの中間の沈降特性を有する中間ナノ粒子として記載され得る。ナノ粒子タイプの形成は、生成プロセス中に界面活性剤とタンパク質濃度を制御することにより調整することができる。ナノ粒子タイプは、沈降係数を測定することで決定することができる。
【００６０】
ナノ粒子生成
本開示のナノ粒子は、天然に存在しない生成物であり、その成分は自然界では一緒に発生しない。一般に、本明細書に開示される方法は、タンパク質を単離するために第１の界面活性剤が使用され、次いで、その第１の界面活性剤が第２の界面活性剤と交換されてナノ粒子を形成する界面活性剤交換アプローチを使用する。
【００６１】
ナノ粒子に含まれる抗原は典型的には、宿主細胞での組換え発現によって生成される。標準的な組換え技術を使用してもよい。典型的には、タンパク質はバキュロウイルスシステムを使用して昆虫宿主細胞で発現される。好ましい実施形態では、バキュロウイルスはカテプシン−Ｌノックアウトバキュロウイルスである。他の好ましい実施形態では、バキュロウイルスはキチナーゼノックアウトバキュロウイルスである。さらに他の好ましい実施形態では、バキュロウイルスは、カテプシン−Ｌとキチナーゼの両方のダブルノックアウトである。昆虫細胞発現系で高レベルの発現が得られる場合がある。昆虫細胞の非限定的な例は、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ（Ｓｆ）細胞、例えばＳｆ９、Ｓｆ２１、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ細胞、例えばＨｉｇｈ  Ｆｉｖｅ細胞（ＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４とも呼ばれる）、およびショウジョウバエＳ２細胞である。
【００６２】
細胞の培養には、一般的なトランスフェクションおよび細胞増殖法を使用することができる。ベクター、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、当該技術分野で周知の方法に従って宿主細胞にトランスフェクトされ得る。例えば、真核細胞への核酸の導入は、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、およびポリアミントランスフェクション試薬を使用したトランスフェクションによって達成することができる。一実施形態では、ベクターは組換えバキュロウイルスである。
【００６３】
宿主細胞を増殖させる方法には、バッチ、バッチ供給、連続、および灌流細胞培養技術が含まれるが、これらに限定されない。細胞培養とは、バイオリアクター（発酵チャンバー）内での細胞の増殖（ｇｒｏｗｔｈ）と増殖（ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ）を意味し、ここでは、精製と単離のために細胞が増殖し、タンパク質（例えば、組換えタンパク質）を発現する。典型的には、細胞培養は、バイオリアクター内で無菌の、制御された温度と大気条件下で実施される。バイオリアクターは、温度、雰囲気、撹拌、および／またはｐＨなどの環境条件をモニターすることができる細胞の培養に使用されるチャンバーである。一実施形態では、バイオリアクターはステンレス鋼チャンバーである。別の実施形態では、バイオリアクターは、滅菌済みのプラスチックバッグ（例えば、Ｃｅｌｌｂａｇ（登録商標），Ｗａｖｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ，Ｎ．Ｊ．）である。他の実施形態では、滅菌済みのプラスチックバッグは、約５０Ｌ〜３５００Ｌのバッグである。
【００６４】
ナノ粒子の界面活性剤抽出と精製
宿主細胞の増殖後、界面活性剤と精製プロトコルを使用して、宿主細胞からタンパク質を回収することができる。宿主細胞が４８〜９６時間増殖したら、細胞を培地から単離し、界面活性剤含有溶液を添加して細胞膜を可溶化し、界面活性剤抽出物中のタンパク質を放出する。Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＮＰ−９としても知られるテルギトールは、それぞれ抽出に適した界面活性剤である。界面活性剤は、約０．１％〜約１．０％の最終濃度まで添加されてもよい。例えば、濃度は約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．５％、約０．７％、約０．８％、または約１．０％であってもよい。ある特定の実施形態では、範囲は約０．１％〜約０．３％であってもよい。好ましくは、濃度は約０．５％である。
【００６５】
他の態様において、宿主細胞からタンパク質を単離するために、異なる第１の界面活性剤が使用してもよい。例えば、第１の界面活性剤は、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、ノノキシノール−９、ビス（ポリエチレングリコールビス［イミダゾイルカルボニル］）、Ｂｒｉｊ（登録商標）３５、Ｂｒｉｊ（登録商標）５６、Ｂｒｉｊ（登録商標）７２、Ｂｒｉｊ（登録商標）７６、Ｂｒｉｊ（登録商標）９２Ｖ、Ｂｒｉｊ（登録商標）９７、Ｂｒｉｊ（登録商標）５８Ｐ、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ（登録商標）ＥＬ、デカエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、ｎ−デシルアルファ−Ｄグルコピラノシド、デシルベータ−Ｄ−マルトピラノシド、ｎ−ドデカノイル−Ｎ−メチルグルカミド、ｎドデシルアルファ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシルベータ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシルベータ−Ｄ−マルトシド、ヘプタエチレングリコールモノデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘプタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、ｎ−ヘキサデシルベータ−Ｄ−マルトシド、ヘキサエチレングリコールモノドデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ヘキサエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、イゲパルＣＡ−６３０、イゲパルＣＡ−６３０、メチル−６−０−（Ｎ−ヘプチルカルバモイル）−アルファ−Ｄ−グルコピラノシド、ノナエチレングリコールモノドデシルエーテル、Ｎ−ノナノイル−Ｎ−メチルグルカミン、Ｎ−ノナノイルＮ−メチルグルカミン、オクタエチレングリコールモノデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノドデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、オクタエチレングリコールモノテトラデシルエーテル、オクチル−ベータ−Ｄグルコピラノシド、ペンタエチレングリコールモノデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノドデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノヘキサデシルエーテルペンタエチレングリコールモノオクタデシルエーテル、ペンタエチレングリコールモノオクチルエーテル、ポリエチレングリコールジグリシジルエーテル、ポリエチレングリコールエーテルＷ−１、ポリオキシエチレン１０トリデシルエーテル、ポリオキシエチレン１００ステアレート、ポリオキシエチレン２０イソヘキサデシルエーテル、ポリオキシエチレン２０オレイルエーテル、ポリオキシエチレン４０ステアレート、ポリオキシエチレン５０ステアレート、ポリオキシエチレン８ステアリン酸塩、ポリオキシエチレンビス（イミダゾリルカルボニル）、ポリオキシエチレン２５プロピレングリコールステアリン酸塩、Ｑｕｉｌｌａｊａ樹皮のサポニン、Ｓｐａｎ（登録商標）２０、Ｓｐａｎ（登録商標）４０、Ｓｐａｎ（登録商標）６０、Ｓｐａｎ（登録商標）６５、Ｓｐａｎ（登録商標）８０、Ｓｐａｎ（登録商標）８５、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｔｙｐｅ  １５−Ｓ  −１２、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｔｙｐｅ  １５−Ｓ−３０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｔｙｐｅ  １５−Ｓ−５、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｔｙｐｅ  １５−Ｓ−７、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｔｙｐｅ  １５−Ｓ−９、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｔｙｐｅ  ＮＰ−１０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｔｙｐｅ  ＮＰ−４、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｔｙｐｅ  ＮＰ−４０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｔｙｐｅ  ＮＰ−７、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｔｙｐｅ  ＮＰ−９、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｔｙｐｅ  ＴＭＮ−１０、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  Ｔｙｐｅ  ＴＭＮ−６、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、またはそれらの組み合わせであってもよい。
【００６６】
次いで、遠心分離を使用して、ナノ粒子を細胞破片から単離することができる。いくつかの実施形態では、塩化セシウム、スクロース、およびイオジキサノールを使用するなどの勾配遠心分離を使用してもよい。例えば、イオン交換、アフィニティ、およびゲルろ過クロマトグラフィーを含む標準的な精製技術など、他の技術を代替としてまたは追加で使用してもよい。
【００６７】
例えば、第１のカラムはＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）などのイオン交換クロマトグラフィー樹脂であってもよく、第２のカラムはレンズマメ（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）レクチンアフィニティ樹脂であってもよく、第３のカラムはＦｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＥＭＤ  ＳＯ３（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）樹脂などの陽イオン交換カラムであってもよい。他の態様では、陽イオン交換カラムはＭＭＣカラムまたはＮｕｖｉａ  Ｃ  Ｐｒｉｍｅカラム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ）であってもよい。好ましくは、本明細書に開示される方法は、界面活性剤抽出カラム、例えば、疎水性相互作用カラムを使用しない。このようなカラムは、精製中に界面活性剤を除去するためにしばしば使用されるが、ここで開示する方法に悪影響を及ぼす可能性がある。
【００６８】
界面活性剤交換
ナノ粒子を形成するために、宿主細胞からタンパク質を抽出するために使用された第１の界面活性剤は、ナノ粒子構造に到達するために第２の界面活性剤に実質的に置き換えられる。ＮＰ−９は、好ましい抽出界面活性剤である。典型的には、ナノ粒子は、ＨＰＬＣで測定されたときに検出可能なＮＰ−９を含まない。第２の界面活性剤は、典型的には、ＰＳ２０、ＰＳ４０、ＰＳ６０、ＰＳ６５、およびＰＳ８０からなる群から選択される。好ましくは、第２の界面活性剤はＰＳ８０である。ナノ粒子製剤の安定性を維持するために、第２の界面活性剤とタンパク質の比率は特定の範囲内に維持される。
【００６９】
特定の態様において、界面活性剤交換は、糖部分を介して糖タンパク質を結合するアフィニティークロマトグラフィーを使用して実施される。例えば、アフィニティークロマトグラフィーはマメ科植物のレクチンカラムを使用してもよい。マメ科植物のレクチンは、植物で最初に同定されたタンパク質であり、糖残基と特異的かつ可逆的に相互作用することが判明している。例えば、Ｓｈａｒｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｓ，  “Ｌｅｇｕｍｅ  ｌｅｃｔｉｎｓ−−ａ  ｌａｒｇｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”ＦＡＳＥＢＪ．１９９０  Ｎｏｖ；４（１４）：３１９８−２０８；Ｌｉｅｎｅｒ，“Ｔｈｅ  Ｌｅｃｔｉｎｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１２を参照されたい。好適なレクチンには、コンカナバリンＡ（ｃｏｎ  Ａ）、エンドウレクチン、イガマメレクチン、およびレンズマメレクチンが含まれる。レンズマメレクチンは、その結合特性により、界面活性剤交換に適したカラムである。例えば、実施例１０を参照されたい。レクチンカラムは市販されており、例えば、Ｃａｐｔｏ  Ｌｅｎｔｉｌ  ＬｅｃｔｉｎはＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから入手可能である。特定の態様では、レンズマメレクチンカラムは組換えレクチンを使用してもよい。分子レベルでは、糖部分はレンズマメレクチンに結合し、タンパク質のアミノ酸を遊離して界面活性剤の周りで合体して界面活性剤コアの形成をもたらし、抗原の複数のコピーを有するナノ粒子、例えば、界面活性剤に固定された二量体、三量体、または四量体であり得る糖タンパク質オリゴマーを提供すると考えられる。
【００７０】
界面活性剤は、タンパク質とインキュベートされて界面活性剤交換中にナノ粒子を形成するとき、初期の精製ステップ中に約０．１％（ｗ／ｖ）までで存在してもよく、この量は最適な安定性を有する最終ナノ粒子を達成するために下げられる。例えば、非イオン性界面活性剤（例えば、ＰＳ８０）は、約０．０３％〜約０．１％であってもよい。好ましくは、安定性を改善するために、ナノ粒子は約０．０３％〜約０．０５％のＰＳ８０を含む。製剤中の約０．０３％未満のＰＳ８０の量は、良好な安定性を示さない。さらに、ＰＳ８０が約０．０５％超存在すると、凝集体が形成される。したがって、約０．０３％〜約０．０５％のＰＳ８０は、分解を軽減したナノ粒子の長期安定性を可能にする構造的および安定性の利点を提供する。
【００７１】
界面活性剤交換は、上記のように精製されたタンパク質を用いて実行することができ、精製され、保存のために凍結され、その後、界面活性剤交換のために解凍される。
【００７２】
ナノ粒子の強化された安定性と強化された免疫原性
理論に縛られるものではないが、抗原を非イオン性界面活性剤コアと結合させると、優れた安定性と抗原提示をもたらすと考えられている。本明細書に開示されるナノ粒子は、驚くほど良好な安定性と免疫原性を提供する。
【００７３】
界面活性剤コアに固定された糖タンパク質の位置は、望ましくない相互作用を減らすことにより安定性を高めると考えられている。例えば、プロテアーゼベースの分解に対する改善された防御は、本明細書に開示されたモル比において糖タンパク質をコアに固定して、立体障害がプロテアーゼアクセスをブロックすることになるシールド効果により達成され得る。
【００７４】
ナノ粒子抗原
典型的な実施形態では、ナノ粒子を生成するために使用される抗原はウイルスタンパク質である。いくつかの態様では、タンパク質は修飾されてもよいが、天然ペプチドに対する免疫応答を刺激する能力を保持している。いくつかの態様では、タンパク質は、膜貫通ドメインを本質的に含むか、または含むように適合されて、タンパク質の界面活性剤コアへの結合を促進する。多くの場合、タンパク質は必然的に糖タンパク質である。
【００７５】
ＲＳＶ抗原
一態様では、ウイルスは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）であり、ウイルス抗原は融合（Ｆ）糖タンパク質である。ＲＳＶ  Ｆタンパク質の構造と機能はよく特性評価されている。本明細書に記載の組成物で使用するのに好適なＲＳＶ−Ｆタンパク質は、Ａ２、Ｌｏｎｇ、ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６、１９、６２６５、Ｅ４９、Ｅ６５、Ｂ６５、ＲＳＢ８９−６２５６、ＲＳＢ８９−５８５７、ＲＳＢ８９−６１９０、およびＲＳＢ８９−６６１４などのＲＳＶ系統に由来し得る。特定の実施形態では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、それらの天然のバリアントと比較して変異している。これらの変異は、タンパク質発現の改善、免疫原性の強化などの望ましい特性を付与する。ＲＳＶ−Ｆタンパク質の構造を説明する追加情報は、Ｓｗａｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｕｎｃｌｅａｖｅｄ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  Ｖｉｒｕｓ  Ｆ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｔａｉｎｓ  Ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ｅｐｉｔｏｐｅｓ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２０１４，８８，１１８０２−１１８１０．Ｊａｓｏｎ  Ｓ．ＭｃＬｅｌｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＲＳＶ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｒｉｍｅｒ  Ｂｏｕｎｄ  ｔｏ  ａ  Ｐｒｅｆｕｓｉｏｎ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３，３４０，１１１３−１１１７に見出すことができる。
【００７６】
一次融合切断は、配列番号２に対応する残基１３１〜１３６に位置する。一次融合切断部位の不活性化は、部位内の残基を変異させることにより達成され、結果として、もはやフューリンはコンセンサス部位を認識できなくなる。例えば、一次フューリン切断部位の不活性化は、野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号２）のアルギニン１３３、アルギニン１３５、およびアルギニン１３６に対応する位置に少なくとも１つのアミノ酸置換を導入することにより達成され得る。特定の態様では、アルギニンの１つ、２つ、または３つ全てがグルタミンに変異している。他の態様では、不活性化は、野生型部位を以下の配列の１つに変異させることにより達成される：ＫＫＱＫＱＱ（配列番号１４）、ＱＫＱＫＱＱ（配列番号１５）、ＫＫＱＫＲＱ（配列番号１６）、およびＧＲＲＱＱＲ（配列番号１７）。
【００７７】
特定の態様では、以下に示される好適なＲＳＶ  Ｆタンパク質の特定の例を含む、配列番号２のアミノ酸１３７〜１４５に対応する１〜１０アミノ酸が削除され得る。配列番号３〜１３の各々は、任意で、活性な一次融合切断部位ＫＫＲＫＲＲ（配列番号１８）を有して調製されてもよい。配列番号２の野生型系統には、配列番号３〜１３では修正されている配列エラー（ＡからＰへ、ＶからＩへ、およびＶからＭへ）がある。宿主細胞でのＲＳＶ−Ｆタンパク質の発現に続いて、Ｎ末端シグナルペプチドが切断されて最終配列が提供される。通常、シグナルペプチドは宿主細胞のプロテアーゼによって切断される。しかしながら、他の態様では、完全長タンパク質が宿主細胞から単離され、その後シグナルペプチドが切断され得る。Ｎ末端ＲＳＶ  Ｆシグナルペプチドは、配列番号２０（ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧ）のアミノ酸からなる。したがって、例えば、発現および精製中の配列番号８からのシグナルペプチドの切断に続いて、配列番号１９の配列を有する成熟タンパク質が得られ、ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンを生成するために使用される。図１を参照されたい。任意で、ＲＳＶ  Ｆシグナルペプチドアミノ酸の１以上から全てまでを欠失、変異、またはシグナルペプチド全体を欠失、および異なるシグナルペプチドに置き換えて、発現を増強してもよい。開始メチオニン残基は、発現を開始するために維持される。
【表１】
2020528883.tif 000003
【００７８】
いくつかの態様では、本明細書に開示されるＲＳＶ  Ｆタンパク質は、野生型系統から、融合ドメインの欠失によってのみ変更され、場合により一次切断部位の不活性化を伴う。他の態様では、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に追加の変更を加えることができる。典型的には、システイン残基は変異している。典型的には、Ｎ結合型グリコシル化部位は変異していない。図１を参照されたい。さらに、パリビズマブ抗体がその部位に結合する能力のために、本明細書でパリビズマブ部位とも呼ばれる抗原部位ＩＩが保存されている。モタビズマブ抗体もまた部位ＩＩで結合する。追加の好適なＲＳＶ−Ｆタンパク質は、特に図１Ｃに開示される残基１００〜１５０に及ぶ配列を含むＲＳＶ−Ｆタンパク質を含む参照により組み込まれる米国特許公開第２０１１／０３０５７２７号に見出せる。
【００７９】
特定の他の態様では、配列番号２に示されるように、ＲＳＶ  Ｆ１またはＦ２ドメインは野生型株と比べて修飾されていてもよい。例えば、Ｆ１ドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変更を有してもよく、それらは変異または欠失であってもよい。同様に、Ｆ２ドメインには１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の変更があってもよく、それらは変異または欠失であってもよい。Ｆ１およびＦ２ドメインは、それぞれ独立して、野生型配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を保持し得る。
【００８０】
特定の例では、ＲＳＶナノ粒子製剤は、約２７０μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、または約６０μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬの範囲のＲＳＶ  Ｆと共に約０．０２５％〜約０．０３％のＰＳ８０を含むことができる。他の態様では、ナノ粒子製剤は、３００μｇ／ｍＬ〜約５００μｇ／ｍＬのＲＳＶ  Ｆを含む組成物中に約０．０３５％〜約０．０４％のＰＳ８０を含んでもよい。さらに他の態様では、ナノ粒子製剤は、３５０〜５００μｇ／ｍＬのＲＳＶ  Ｆを含む組成物中に約０．０３５％〜約０．０４％のＰＳ８０を含んでもよい。
【００８１】
抗原と界面活性剤の濃度は変化する可能性があるため、それぞれの量は、非イオン性界面活性剤：タンパク質のモル比として言及する場合がある。例えば、ＰＳ８０のタンパク質に対するモル比は、ＰＳ８０濃度およびＥＬＩＳＡ／Ａ２８０で測定した抗原のタンパク質濃度、ならびにそれぞれの分子量を使用して計算される。計算に使用されるＰＳ８０の分子量は１３１０であり、ＲＳＶ  Ｆを例にとると、ＲＳＶ  Ｆの分子量は６５ｋＤである。モル比は次のように計算される：（ＰＳ８０濃度×１０×６５０００）÷（１３１０×ｍｇ／ｍＬでのＲＳＶ  Ｆ濃度）。したがって、例えば、タンパク質によって測定されるナノ粒子の濃度が２７０μｇ／ｍＬであり、ＰＳ８０の濃度が０．０１５％および０．０３％である。これらはそれぞれ、ＰＳ８０：ＲＳＶ  Ｆタンパク質のモル比が２７：１（つまり、０．０１５×１０×６５０００／（１３１０×０．２７））および５５：１である。
【００８２】
特定の態様では、モル比は、約３０：１〜約８０：１、約３０：１〜約７０：１、約３０：１〜約６０：１、約４０：１〜約７０：１、または約４０：１〜約５０：１の範囲内である。しばしば、代替の非イオン性界面活性剤はＰＳ８０であり、モル比は約３０：１〜約５０：１のＰＳ８０：タンパク質である。ＲＳＶ−Ｆ糖タンパク質の場合、３５：１〜約６５：１の範囲のモル比、特に約４５：１の比を有するナノ粒子が特に安定している。
【００８３】
修飾された抗原
本明細書に開示される抗原は、これらの抗原のバリエーションおよび変異体を包含する。ある特定の態様では、抗原は開示された抗原と同一性を共有し得る。一般に、そして特定の抗原に関して特に定義されない限り、同一性のパーセンテージは少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、または少なくとも９８％であり得る。同一性のパーセンテージは、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｃｌｕｓｔａｌｗ２／で入手可能なアライメントプログラムＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用して計算することができる。次のデフォルトパラメータは、ペアワイズアラインメントに使用することができる：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｗｅｉｇｈｔ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ；Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ＝１０；  Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ＝０．１。
【００８４】
特定の態様では、ナノ粒子に含まれるタンパク質はそのタンパク質からなる。他の態様では、ナノ粒子に含まれるタンパク質はそのタンパク質を含む。さまざまな目的のために、タンパク質自体への付加をすることができる。いくつかの態様では、抗原は、Ｎ末端、Ｃ末端、またはその両方で伸長され得る。いくつかの態様では、伸長は、精製または検出などの機能に有用なタグである。いくつかの態様では、タグはエピトープを含む。例えば、タグは、ポリグルタメートタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、ポリＨｉｓタグ（約５〜１０個のヒスチジンを有する）、Ｍｙｃタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ、緑色蛍光タンパク質タグ、マルトース結合タンパク質タグ、チオレドキシンタグ、またはＦｃタグであってもよい。他の態様では、伸長は、発現を増強するためにタンパク質に融合されたＮ末端シグナルペプチドであってもよい。そのようなシグナルペプチドは細胞内での発現中にしばしば切断されるが、いくらかのナノ粒子は無傷のシグナルペプチドと共に抗原を含む場合がある。したがって、ナノ粒子が抗原を含むとき、抗原は伸長を含む場合があり、したがって、ナノ粒子に組み込まれたとき、融合タンパク質である場合がある。配列の同一性を計算するために、伸長は含まれない。
【００８５】
いくつかの態様では、抗原は切断されていてもよい。例えば、Ｎ末端は、約１０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、または約２００個のアミノ酸により切断され得る。Ｎ末端の代わりに、またはＮ末端に加えて、Ｃ末端が切断され得る。例えば、Ｃ末端は、約１０個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約７５個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、または約２００個のアミノ酸により切断され得る。切断されたタンパク質の同一性を計算するために、タンパク質の残りの部分に対して同一性が測定される。
【００８６】
組み合わせナノ粒子
本明細書で使用されるとき、組み合わせナノ粒子は、２以上の異なる病原体に対する免疫応答を誘導するナノ粒子を指す。特定の組み合わせに応じて、病原体は同じ種の異なる系統またはサブタイプであっても、病原体が異なる種であってもよい。組み合わせナノ粒子を調製するために、複数の病原体からの糖タンパク質は、界面活性剤交換段階でそれらを結合することにより、組み合わせて単一のナノ粒子にすることができる。糖タンパク質のカラムへの結合とその後の界面活性剤交換により、界面活性剤コアの周りに複数の糖タンパク質のタイプが形成され、組み合わせナノ粒子が提供される。
【００８７】
本開示はまた、それぞれが異なる病原体に対する応答を誘導する２以上のナノ粒子を組み合わせることにより、２以上の異なる病原体に対する免疫応答を誘導するワクチン組成物を提供する。任意で、ワクチン組成物は、対象に投与されるワクチン組成物の数を減らしながら複数の病原体に対する免疫応答を最大化する目的で、１以上の組み合わせナノ粒子を単独でまたは追加のナノ粒子と組み合わせて含んでもよい。
【００８８】
そのような組成物は、病原体が何らかの態様で関連している場合に特に望ましい。一例では、組成物は、特定の年の季節性インフルエンザを形成すると当局によって毎年特定された系統に対するナノ粒子を含み得る。典型的には、季節性インフルエンザワクチンの場合、ワクチン組成物には、３、４、または５つのインフルエンザのサブタイプの系統に対する免疫応答を誘導するＨＡおよび／またはＮＡのナノ粒子と組み合わせたＲＳＶ抗原が含まれる。したがって、インフルエンザの異なる系統をワクチン組成物に組み合わせることができる。いくつかの態様では、組み合わせナノ粒子は、第１の系統由来のＨＡタンパク質および第２の系統由来のＮＡタンパク質を含み得る。他の態様では、ナノ粒子は、同一または異なるサブタイプ由来の１以上のＨＡおよび１以上のＮＡタンパク質を含んでもよい。例えば、ナノ粒子は、サブタイプＨ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、およびＨ１６から選択される１以上のＨＡナノ粒子、ならびに／またはサブタイプＮ１、Ｎ２、Ｎ３、Ｎ４、Ｎ５、Ｎ６、Ｎ７、Ｎ８、およびＮ９から選択される１以上のＮＡナノ粒子を含み得る。系統発生的に、ＨＡおよびＮＡタンパク質はグループに分けられる。ＨＡの場合、グループ１にはＨ１、Ｈ２、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、およびＨ１６が含まれ、グループ２にはＨ３、Ｈ４、Ｈ７、Ｈ１０、Ｈ１４、およびＨ１５が含まれる。ＮＡタンパク質も２つのグループを形成する：グループ１にはＮ１、Ｎ４、Ｎ５、およびＮ８が含まれ、グループ２にはＮ２、Ｎ３、Ｎ６、Ｎ７、およびＮ９が含まれる。ある特定の態様では、抗原は、天然のインフルエンザＨＡタンパク質および／またはＮＡタンパク質に対して少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９７％の同一性、または少なくとも９９％の同一性を有し得る。
【００８９】
別の例では、上記で説明したように、インフルエンザとＲＳＶの両方が呼吸器疾患の増悪を引き起こすため、ＨＡ、ＮＡ、および／またはＲＳＶ  Ｆを組み合わせナノ粒子に混合するか、免疫原性組成物に複数のナノ粒子を組み合わせて、ＲＳＶおよび１以上のインフルエンザ系統に対する免疫応答を誘導してもよい。
【００９０】
ワクチン組成物
本明細書に開示される組成物は、予防的または治療的に使用され得るが、典型的には予防的である。したがって、本開示は、感染を治療または予防する方法を含む。この方法は、治療量または予防量の本開示の免疫原性組成物を対象に投与することを含む。好ましくは、医薬組成物は、防御効果を提供するワクチン組成物である。他の態様では、防御効果には、曝露集団のパーセンテージにおける感染症に関連する症状の改善が含まれてもよい。例えば、病原体に応じて、組成物は、熱疲労、筋肉痛、頭痛、咽頭痛、嘔吐、下痢、発疹、腎および肝機能障害の症状、内出血、および外出血から選択される１以上のウイルス疾患症状を、未治療の対象と比較して、予防または軽減し得る。
【００９１】
ナノ粒子は、様々な賦形剤、緩衝液などの存在下でワクチンとして投与するために製剤化されてもよい。例えば、ワクチン組成物は、リン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、および／またはヒスチジンを含み得る。リン酸ナトリウムは、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１５ｍＭ〜約２５ｍＭ、または約２５ｍＭで存在し得、特定の場合には、約２２ｍＭのリン酸ナトリウムが存在する。ヒスチジンは、約０．１％（ｗ／ｖ）、約０．５％（ｗ／ｖ）、約０．７％（ｗ／ｖ）、約１％（ｗ／ｖ）、約１．５％（ｗ／ｖ）、約２％（ｗ／ｖ）、または約２．５％（ｗ／ｖ）で存在し得る。塩化ナトリウムは、存在するとき、約１５０ｍＭであり得る。特定の組成物、例えばインフルエンザワクチンでは、塩化ナトリウムは約２００ｍＭ、約３００ｍＭ、または約３５０ｍＭを含むより高い量で存在し得る。
【００９２】
特定のナノ粒子、特にＲＳＶ  Ｆナノ粒子は、わずかに酸性のｐＨレベルで向上した安定性を有する。例えば、ナノ粒子を含む組成物のｐＨ範囲は、約ｐＨ５．８〜約ｐＨ７．０、約ｐＨ５．９〜約ｐＨ６．８、約ｐＨ６．０〜約ｐＨ６．５、約ｐＨ６．１〜約ｐＨ６．４、約ｐＨ６．１〜約ｐＨ６．３、または約ｐＨ６．２であり得る。典型的には、ＲＳＶ  Ｆタンパク質ナノ粒子の組成物は約ｐＨ６．２である。他のナノ粒子では、組成物は中性になりやすい傾向にあり、例えば、インフルエンザのナノ粒子は約ｐＨ７．０〜ｐＨ７．４であり得、しばしばｐＨ７．２であり得る。
【００９３】
アジュバント
ある特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物は、免疫応答を増強するために１以上のアジュバントと組み合わせてもよい。他の実施形態では、組成物はアジュバントなしで調製され、したがって、アジュバントを含まない組成物として投与するために利用可能である。有利には、本明細書に開示されるアジュバントを含まない組成物は、単回投与として投与されたときに防御免疫応答を提供し得る。強い免疫応答を誘導する、ミョウバンを含まない組成物は、約６０歳以上の成人で特に有用である。
【００９４】
アルミニウムベースのアジュバント
いくつかの実施形態では、アジュバントはミョウバン（例えば、ＡｌＰＯ４またはＡｌ（ＯＨ）３）であってもよい。典型的には、ナノ粒子はミョウバンに実質的に結合している。例えば、ナノ粒子は、ミョウバンに少なくとも８０％結合、少なくとも８５％結合、少なくとも９０％結合、または少なくとも９５％結合していてもよい。しばしば、ナノ粒子は、組成物中のミョウバンに９２％〜９７％結合している。用量あたりのミョウバンの量は、典型的には約４００μｇ〜約１２５０μｇの範囲にある。例えば、ミョウバンは、用量あたり、約３００μｇ〜約９００μｇ、約４００μｇ〜約８００μｇ、約５００μｇ〜約７００μｇ、約４００μｇ〜約６００μｇ、または約４００μｇ〜約５００μｇの量で存在し得る。典型的に、ミョウバンは、タンパク質ナノ粒子の１２０μｇの用量に対して約４００μｇで存在する。
【００９５】
マトリックスアジュバント
本開示のマトリックス粒子は、１つのサポニン画分のみを使用して形成されたものを使用して形成される。サポニン画分を生成してマトリックス粒子を形成するためのいくつかのアプローチが好適である。画分Ａ、Ｂ、およびＣは、米国特許第６，３５２，６９７号に記載されており、次のように調製することができる。Ｑｕｉｌｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの粗水性抽出物であるＱｕｉｌ  Ａの親油性画分をクロマトグラフィーで分離し、７０％アセトニトリル水溶液で溶離して親油性画分を回収する。次いで、この親油性画分を、酸性水中の２５％〜６０％のアセトニトリルの勾配を使用して溶離するセミ分取ＨＰＬＣで分離する。本明細書で「画分Ａ」または「ＱＨ−Ａ」と呼ばれる画分は、約３９％のアセトニトリルで溶離される画分である。本明細書で「画分Ｂ」または「ＱＨ−Ｂ」と呼ばれる画分は、約４７％のアセトニトリルで溶離される画分であるか、それに対応する。本明細書で「画分Ｃ」または「ＱＨ−Ｃ」と呼ばれる画分は、約４９％のアセトニトリルで溶離される画分であるか、それに対応する。画分の精製に関するさらなる情報は、米国特許第５，０５７，５４０号に見出せる。本明細書に記載されるように調製されたとき、Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａの画分Ａ、Ｂ、およびＣはそれぞれ、定義可能な特性を有する化学的に密接に関連する分子のグループまたはファミリーを表す。それらが得られるクロマトグラフィー条件は、溶離プロファイルおよび生物学的活性に関してバッチ間の再現性が非常に一貫しているようなものである。
【００９６】
他の使用可能なサポニン画分が記載されている。画分Ｂ３、Ｂ４、およびＢ４ｂはＥＰ０４３６６２０に記載されている。画分ＱＡ１〜ＱＡ２２についてはＥＰ０３６３２２７９Ｂ２に記載される。Ｑ−ＶＡＣ（Ｎｏｒ−Ｆｅｅｄ，  ＡＳ  Ｄｅｎｍａｒｋ）、Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ  Ｓｐｉｋｏｓｉｄｅ（ｌｓｃｏｎｏｖａ  ＡＢ，Ｕｌｔｕｎａａｌｌｅｎ  ２Ｂ，７５６  ５１  Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）が記載される。ＥＰ  ０  ３６３２  ２７９  Ｂ２の画分ＱＡ−１、ＱＡ−２、ＱＡ−３、ＱＡ−４、ＱＡ−５、ＱＡ−６、ＱＡ−７、ＱＡ−８、ＱＡ−９、ＱＡ−１０、ＱＡ−１１、ＱＡ−１２、ＱＡ−１３、ＱＡ−１４、ＱＡ−１５、ＱＡ−１６、ＱＡ−１７、ＱＡ−１８、ＱＡ−１９、ＱＡ−２０、ＱＡ−２１、およびＱＡ−２２、特にＱＡ−７、ＱＡ−１７、ＱＡ−１８、およびＱＡ−２１を使用し得る。それらは、ＥＰ  ０  ３６３２  ２７９  Ｂ２、特に６ページおよび８ページと９ページの実施例１に記載されているように取得される。実施形態では、Ｑｕｉｌｌａｊａ  ｓａｐｏｎａｒｉａ  Ｍｏｌｉｎａ由来のサポニン画分は、ＱＡ１〜２１のいずれか１つから選択される。
【００９７】
ＱＳ−７およびＱＳ−２１画分などの他のサポニン画分、それらの生成およびそれらの使用は、米国特許第５，０５７，５４０号、同第６，２３１，８５９号、同第６，３５２，６９７号、同第６，５２４，５８４号、同第６，８４６，４８９号、同第７，７７６，３４３号、および同第８，１７３，１４１号に記載されている。これらの画分は、本明細書に開示される方法および組成物で使用するためのマトリックスを生成するために使用され得る。
【００９８】
いくつかの態様では、組成物は、サポニン画分を１つのみ有するマトリックス粒子を含む。他の態様では、組成物は、粒子タイプごとに１つのサポニン画分を各々含む複数のタイプのマトリックス粒子を含んでもよいが、粒子は異なる画分を有する。
【００９９】
各々１つのサポニン画分を有するマトリックス粒子は、重量％の任意の組み合わせで組成物中に存在してもよい。特定の態様では、組成物は、０．１重量％〜９９．９重量％、５重量％〜９５重量％、１０重量％〜９０重量％、１５重量％〜８５重量％、２０重量％〜８０重量％、２５重量％〜７５重量％、３０重量〜７０重量％、３５重量〜６５重量％、４０重量〜６０重量％、４５重量〜５５重量％、４０〜６０重量％、または５０重量％の、第１のサポニン画分を含むマトリックス粒子を含み得、残りの部分は異なるサポニン画分を含むマトリックス粒子で構成されている。
【０１００】
組成物中の各マトリックスの量は、組成物全体の割合として変動し得る。例えば、画分Ａマトリックスの量は、約８０％（ｗ／ｗ）、約８５％（ｗ／ｗ）、約９０％（ｗ／ｗ）、約９２％（ｗ／ｗ）、または約９５％（ｗ／ｗ）であり得、いずれの場合も、残りは画分Ｃマトリックスである。典型的には、画分Ａマトリックスが約８０％（ｗ／ｗ）〜約９５％（ｗ／ｗ）の範囲で、組成物の残りが画分Ｃマトリックスである。通常、約８５％（ｗ／ｗ）の画分Ａマトリックスと残りの画分Ｃマトリックス（すなわち、８５：１５）が使用される。８５：１５の画分Ａマトリックスと画分Ｃマトリックスの組み合わせの特定の例は、画分Ａマトリックスと画分Ｃマトリックスを約８５対約１５の比率で混合したＭａｔｒｉｘ−Ｍ（商標）（Ｎｏｖａｖａｘ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）である。
【０１０１】
他のアジュバント
いくつかでは、組成物の他のアジュバントが、追加としてまたは代替として使用され得る。あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ  ａｎｄ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）”に記載される任意のアジュバントの包含は、本開示の範囲内で想定される。他のアジュバントには、フロイントの完全アジュバント（殺傷されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む免疫応答の非特異的刺激物質）、フロイントの不完全アジュバント、および水酸化アルミニウムアジュバントが含まれる。他のアジュバントには、ＧＭＣＳＰ、ＢＣＧ、ｔｈｕｒ−ＭＤＰおよびｎｏｒ−ＭＤＰなどのＭＤＰ化合物、ＣＧＰ（ＭＴＰ−ＰＥ）、リピドＡ、およびモノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、ＭＦ−５９、細菌から抽出された３つの構成要素を含むＲＩＢＩ、ＭＰＬ、トレハロースジミコレート（ＴＤＭ）、および２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０エマルション中の細胞壁骨格（ＣＷＳ）が含まれる。いくつかの実施形態では、アジュバントは少層膜(paucilamellar)脂質小胞、例えば、Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）であってもよい。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓ（登録商標）は、約１００ｎｍ〜約５００ｎｍの範囲の少重層膜非リン脂質小胞である。それらは、Ｂｒｉｊ  ７２、コレステロール、オレイン酸、およびスクアレンを含む。Ｎｏｖａｓｏｍｅｓは効果的なアジュバントであることが示されている（米国特許第５，６２９，０２１号、同第６，３８７，３７３号、および同第４，９１１，９２８号を参照されたい）。
【０１０２】
投与および投与量
本明細書に開示される組成物は、全身経路もしくは粘膜経路もしくは経皮経路を介して、または特定の組織に直接投与され得る。本明細書で使用されるとき、「全身投与」という用語には、非経口投与経路が含まれる。特に、非経口投与には、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、または胸骨内注射、静脈内、または腎臓透析注入技術が含まれる。典型的には、全身の非経口投与は筋肉内注射である。本明細書で使用されるとき、「粘膜投与」という用語には、経口、鼻腔内、膣内、直腸内、気管内、腸内、および眼内投与が含まれる。好ましくは、投与は筋肉内である。
【０１０３】
組成物は、単回投与スケジュールまたは複数回投与スケジュールで投与され得る。一次免疫スケジュールまたは追加免疫スケジュールで複数回投与が使用され得る。複数回投与スケジュールでは、様々な用量を同一または異なる経路、例えば、非経口で初回免疫および粘膜で追加免疫、粘膜で初回免疫および非経口で追加免疫などによって投与することができる。いくつかの態様では、後続の追加投与は、前の投与の約２週間後、約３週間後、約４週間後、約５週間後、または約６週間後に投与される。しかしながら、典型的には、本明細書に開示される組成物は一度だけ投与され、それでもなお防御免疫応答を提供する。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、μｇで測定されるときの用量は、溶質を含む用量の総重量、またはＲＳＶ  Ｆナノ粒子の重量、またはＲＳＶ  Ｆタンパク質の重量であり得る。用量は、Ａ２８０またはＥＬＩＳＡのいずれかのタンパク質濃度アッセイを使用して測定される。
【０１０５】
小児投与を含む抗原の用量は、約３０μｇ〜約３００μｇ、約９０μｇ〜約２７０μｇ、約１００μｇ〜約１６０μｇ、約１１０μｇ〜約１５０μｇ、約１２０μｇ〜約１４０μｇ、または約１４０μｇ〜約１６０μｇの範囲であり得る。特定の実施形態では、用量は、ミョウバンと共に投与される約１２０μｇである。特定の集団は、アジュバントと共に、またはアジュバントを伴わずに投与され得る。例えば、高齢者に投与するとき、ミョウバンがないことが好ましい。ある特定の態様では、組成物は添加されるアジュバントを含まなくてもよい。そのような状況では、用量は約１０％または約２０％増加し得る。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、用量は、約０．１ｍＬ〜約１．５ｍＬ、約０．３ｍＬ〜約１．０ｍＬ、約０．４ｍＬ〜約０．６ｍＬ、または典型的な量である約０．５ｍＬの体積で投与されてもよい。
【０１０７】
ＲＳＶワクチンの特定の実施形態では、用量は、約１７５μｇ／ｍＬ〜約３２５μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ〜約３００μｇ／ｍＬ、約２２０μｇ／ｍＬ〜約２８０μｇ／ｍＬ、または約２４０μｇ／ｍＬ〜約２６０μｇ／ｍＬのＲＳＶ  Ｆタンパク質濃度を含み得る。
【０１０８】
参照による組み込み
本明細書において引用される全ての参照文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、参照によりそれらの全体があらゆる目的のために組み入れられる。
【実施例】
【０１０９】
実施例１
ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現および精製
配列番号８を有するＲＳＶ  Ｆタンパク質をバキュロウイルス発現システムで発現させ、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現する組換えプラークを拾い上げて確認した。次いで、組換えウイルスは、Ｓｆ９昆虫細胞の感染によって増幅された。昆虫細胞の培養物にバキュロウイルスを約３ＭＯＩ（感染多重度＝ウイルスｆｆｕまたはｐｆｕ／細胞）で感染させた。感染後４８〜７２時間で培養物と上清を採取した。約３０ｍＬの粗細胞採取物を、約８００×ｇで１５分間遠心分離することにより清浄化した。得られたＲＳＶ  Ｆタンパク質を含む粗細胞採取物を以下に記載のように精製した。
【０１１０】
非イオン性界面活性剤Ｔｅｒｇｉｔｏｌ（登録商標）ＮＰ−９（ノニルフェノールエトキシレート）は、膜タンパク質抽出プロトコルで使用された。ＮＰ−９粗抽出物を、陰イオン交換クロマトグラフィー、レンズマメレクチンアフィニティ／ＨＩＣ、および陽イオン交換クロマトグラフィーを通過させることによりさらに精製した。洗浄された細胞は、界面活性剤処理によって溶解され、次いで低ｐＨ処理にかけられ、ＢＶおよびＳｆ９宿主細胞のＤＮＡおよびタンパク質の沈殿をもたらした。中和された低ｐＨ処理溶解物は、２回目の低ｐＨ処理が行われる前に、陰イオン交換およびアフィニティクロマトグラフィーで清澄化され、さらに精製された。
【０１１１】
アフィニティクロマトグラフィーを使用して、Ｓｆ９／ＢＶタンパク質、ＤＮＡ、およびＮＰ−９を除去し、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を濃縮した。簡潔に述べると、レンズマメレクチンはカルシウムとマンガンを含む金属タンパク質であり、多糖類とグルコースまたはマンノースを含むグリコシル化タンパク質とに可逆的に結合する。ＲＳＶ  Ｆ含有陰イオン交換フロースルー画分は、レンズマメレクチンアフィニティークロマトグラフィー樹脂（Ｃａｐｔｏ  Ｌｅｎｔｉｌ  Ｌｅｃｔｉｎ，  ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードされた。グリコシル化ＲＳＶ  Ｆタンパク質は選択的に樹脂に結合し、非グリコシル化タンパク質とＤＮＡはカラムのフロースルーで除去される。弱く結合した糖タンパク質は、高塩濃度および低モル濃度のメチルα−Ｄ−マンノピラノシド（ＭＭＰ）を含むバッファーで除去された。
【０１１２】
さらに、ＮＰ−９界面活性剤を界面活性剤ポリソルベート８０（ＰＳ８０）と界面活性剤交換するために、カラム洗浄も使用した。界面活性剤交換を行うために、ＲＳＶ  Ｆ糖タンパク質をレンズマメレクチンカラムに結合させた後、カラムを０．１％ＰＳ８０とインキュベートした。ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、高濃度のＭＭＰでレンズマメレクチンカラムから溶離した。溶離後、ＲＳＶ  Ｆタンパク質三量体は、界面活性剤コアに含まれるＲＳＶ  Ｆタンパク質三量体とＰＳ８０で構成されるミセルナノ粒子に組み立てられる。界面活性剤交換の後、低ｐＨ不活性化ステップがあり、続いて０．１％のＰＳ８０を含む緩衝液の存在下で硫酸塩カラムにおいてインキュベートした。
【０１１３】
溶離された物質は、ＰＳ８０：ＲＳＶ  Ｆタンパク質のモル比が約５０のバルク保存用の原薬（ＤＳ）を提供するのに十分なＰＳ８０を含む溶液で希釈された。ＤＳの適切な組成は、２２ｍＭリン酸ナトリウム、０．０３％ＰＳ８０、ｐＨ６．２のリン酸緩衝液を含む溶液でＲＳＶ  Ｆナノ粒子を組み合わせることにより達成された。界面活性剤交換中およびその後の各ステップで、組成物中のＰＳ８０と抗原の比率は、３５〜６０のモル比に維持された。ＥＬＩＳＡ／Ａ２８０で測定したＰＳ８０濃度とＲＳＶ  Ｆの濃度、およびそれぞれの分子量を使用して、モル比を計算した。ＰＳ８０の分子量は１３１０で、ＲＳＶは６５ｋＤである。
【０１１４】
実施例２
ワクチン組成物の調製
投与されるワクチン製剤のためのナノ粒子を提供するために、約５０のＰＳ８０：ＲＳＶタンパク質モル比の原薬を製剤に希釈した。原薬は解凍して希釈し、ガラスバイアルまたは充填済みシリンジに充填してから、投与前に２〜８℃で保存した。ナノ粒子はミョウバンアジュバントに結合した。ミョウバンのアジュバントを添加して混合し、ナノ粒子の約９５％がミョウバンに結合するようにし、これは、０．５ｍＬの体積での１２０μｇ用量のＲＳＶ  Ｆナノ粒子あたり約０．４ｍｇを意味する。
【０１１５】
実施例３
ナノ粒子中のＲＳＶ  ＦはＣＯＰＤ増悪入院を低減する
６０歳以上の１１，８５６人の対象の無作為化プラセボ対照研究では、ミョウバンのない１３５μｇＲＳＶ  Ｆナノ粒子を含むワクチンにより、全原因ＣＯＰＤ増悪入院が低減された（図３および図４で「Ｅ−３０１」と呼ばれる）。ワクチンの安全性、免疫原性、および有効性を確認するために、対象を１年間追跡した。驚くべきことに、ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンの投与は、研究の一般集団（ｐ＝０．０１７）と、以前にベースラインＣＯＰＤを有すると特定された対象の研究の部分集団（ｐ＝０．１４）の両方で、ＣＯＰＤ増悪による入院を低減した。
【０１１６】
６０歳以上の１，６００人の対象からなる小規模の同等の研究では、ＲＳＶ  Ｆナノ粒子ワクチンを投与した群はＣＯＰＤ増悪入院を経験しなかった（図３で「Ｅ−２０１」と呼ばれる）。データは、Ｅ−２０１研究では、プラセボを投与した８０１人の対象のうちの４人と比較して、ワクチンを投与した７９８人の対象のうちの０人が入院事象を起こし、１００％のワクチン有効率（ＶＥ％）をもたらした。
【図１】
2020528883.tif 000004
【図２】
2020528883.tif 000005
【図３】
2020528883.tif 000006
【図４】
2020528883.tif 000007
【配列表】
2020528883000001.app
【国際調査報告】
2020528883.tif 000008
2020528883.tif 000009