(57)【要約】本発明は、標識された抗体のカクテルを使用して、マイクロベシクルを特徴づけるための方法を提供する。本発明はまた、この目的に使用され得るキットを提供する。白血球由来マイクロベシクルは、種々の疾患（例えば、心血管疾患、炎症、および敗血症）に関する重要なバイオマーカーとして識別されている。ＬＭＶの正確かつ時宜を得た検出は、従って、心血管疾患の診断、防止、および処置にとって重要である。本発明は、これらの課題を解決する手段を提供する。
2020523586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マイクロベシクルを特徴づけるための方法であって、該方法は、
染色した微小小胞体マイクロベシクルを形成するために、マイクロベシクルを含むサンプルをカクテルで染色する工程；
該染色したマイクロベシクルをフローサイトメトリーによって測定して、シグナルセットを得る工程；および
該測定されたマイクロベシクルのシグナルセットがシグナル領域内にある場合に、該染色したマイクロベシクルを白血球由来マイクロベシクルとして識別する工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記カクテルは、ＨＬＡ  ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１８、およびＣＤ１５７のうちの少なくとも１種に対する標識された抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記カクテルは、標識されたアネキシンＶを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記カクテルは、
ｉ）ＨＬＡ  ＤＲに対する抗体およびＣＤ１１ｃに対する抗体を含み、各々が第１の標識で標識された、標識された抗体の第１の群；
ｉｉ）ＣＤ６６ｃに対する抗体を含み、第２の標識で標識された、標識された抗体の第２の群；
ｉｉｉ）ＣＤ１８に対する抗体およびＣＤ１５７に対する抗体を含み、各々が第３の標識で標識された、標識された抗体の第３の群、
のうちの少なくとも１つを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の群は、ＣＤ１５に対する標識された抗体をさらに含み、前記第３の群は、ＣＤ４５に対する標識された抗体をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記標識されたアネキシンＶは、第４の標識で標識される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記カクテルは、第５の標識で標識されたＴＩＡ−１に対する抗体をさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記識別する工程は、前記シグナルセットが前記第１の群のうちの少なくとも１種の抗体の結合を示す場合に、前記マイクロベシクルを単球由来として割り当てることを包含する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項９】
前記識別する工程は、前記シグナルセットが前記第２の群のうちの少なくとも１種の抗体の結合を示す場合に、前記マイクロベシクルを顆粒球由来として割り当てることを包含する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１０】
前記識別する工程は、前記シグナルセットが前記第３の群のうちの少なくとも１種の抗体の結合を示す場合に、前記マイクロベシクルを骨髄球由来として割り当てることを包含する、請求項５または６に記載の方法。
【請求項１１】
前記識別する工程は、前記シグナルセットがＴＩＡ−１に対する抗体の結合を示す場合に、前記マイクロベシクルを活性化された細胞に由来するとして割り当てることを包含する、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
結合していない物質を前記染色したマイクロベシクルから分離する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記結合していない物質を分離する工程は、装填したサイズ排除クロマトグラフィーカラム上の前記染色した混合物をカルシウム含有緩衝液で洗浄することを包含する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＬＡ  ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１８、およびＣＤ１５７のうちの少なくとも１つに対する標識された抗体を含むカクテルを含むキット。
【請求項１５】
ＨＬＡ  ＤＲおよびＣＤ１１ｃに対する標識された抗体の第１の群；
ＣＤ６６ｃに対する標識された抗体の第２の群；
ＣＤ１８およびＣＤ１５７に対する標識された抗体の第３の群；ならびに
ＴＩＡ−１に対する標識された抗体の第４の群、
のうちの少なくとも１つを含むカクテルを含むキット。
【請求項１６】
前記第２の群は、ＣＤ１５に対する標識された抗体をさらに含み、前記第３の群は、ＣＤ４５に対する標識された抗体をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
前記第１の群における抗体の各々は、第１の標識で標識され、前記第２の群における抗体の各々は、第２の標識で標識され、前記第３の群における抗体の各々は、第３の標識で標識され、そして前記第４の群における抗体の各々は、第４の標識で標識される、請求項１５または１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記カクテルは、第５の標識で標識されたアネキシンＶをさらに含む、請求項１４〜１７のいずれかに記載のキット。
【請求項１９】
溶出緩衝液をさらに含む、請求項１４〜１８のいずれかに記載のキット。
【請求項２０】
１またはこれより多くのプロセッサおよび１またはこれより多くのプロセッサに連結されたメモリを含む、マイクロベシクルを特徴づけるためのシステムであって、該メモリは、
カクテルで染色したマイクロベシクルの測定値を、フローサイトメーターから得る工程、および
該測定されたマイクロベシクルのシグナルセットがシグナル領域内にある場合に、該染色したマイクロベシクルを白血球由来マイクロベシクルとして識別する工程、
を包含する方法を行うように構成された指示セットでコードされる、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、米国仮特許出願第６２／５１９，０５９号（２０１７年６月１３日出願）の利益を主張する。上記仮特許出願の全内容は、全ての目的のために本明細書によって参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、マイクロベシクルを検出および特徴づけるための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
白血球由来マイクロベシクル（ＬＭＶ）は、種々の疾患（例えば、心血管疾患、炎症、および敗血症）に関する重要なバイオマーカーとして識別された。ＬＭＶの正確かつ時宜を得た検出は、従って、心血管疾患の診断、防止、および処置にとって重要である。フローサイトメトリーは、細胞構造を検出するために有用なツールである。しかし、このアプローチは、ＬＭＶの希少性、小さなサイズ、および低い抗原密度が原因で、ＬＭＶを検出するにおいて困難であることが示されている。現行のフローサイトメトリー法はまた、機器の感度および高いバックグラウンドノイズによって制限される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の簡単な要旨
本発明は、マイクロベシクルを特徴づけるための歩言う方およびキットを提供する。一局面において、本開示は、マイクロベシクルを特徴づけるための方法を提供し、上記方法は、染色した微小小胞体マイクロベシクルを形成するために、マイクロベシクルを含むサンプルをカクテルで染色する工程；シグナルセットを得るために、上記染色したマイクロベシクルをフローサイトメトリーによって測定する工程；および上記測定されたマイクロベシクルのシグナルセットが、シグナル領域内にある場合に、上記染色したマイクロベシクルを白血球由来マイクロベシクルとして識別する工程を包含する。
【０００５】
別の局面において、本開示は、ＨＬＡ  ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１８、およびＣＤ１５７のうちの少なくとも１つに対する標識された抗体を含むカクテルを含むキットを提供する。ＨＬＡ  ＤＲおよびＣＤ１１ｃに対する標識された抗体の第１の群、ＣＤ６６ｃに対する標識された抗体の第２の群、ＣＤ１８およびＣＤ１５７に対する標識された抗体の第３の群、ならびにＴＩＡ−１に対する標識された抗体の第４の群のうちの少なくとも１つを含むカクテルを含むキットがまた、提供される。
【０００６】
本発明のさらなる特徴および利点は、実施形態およびその図面の以下の説明において、ならびに請求項からより完全に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、マイクロベシクル（ＭＶ）の生成および精製の手順を図示する。
【０００８】
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、ＬＭＶを含むサンプルのフローサイトメトリー分析からの結果を示す。サンプルを、ＰＥ標識ＨＬＡ  ＤＲ抗体およびＦＩＴＣ標識アネキシンＶ（図２Ａ）；ＰＥ標識ＣＤ１５抗体およびＦＩＴＣ標識アネキシンＶ（図２Ｂ）；またはＰＥ標識ＣＤ１８抗体およびＦＩＴＣ標識アネキシンＶ（図２Ａ）で染色した。
【０００９】
【図３】図３Ａは、血漿で段階希釈したサンプル中でのＬＭＶの検出を示す。そのサンプルを、ＰＥ標識ＣＤ１５抗体およびＦＩＴＣ標識アネキシンＶで染色した。図３Ｂは、二重陽性ＬＭＶの量を、各サンプルの希釈率に対してプロットしたグラフを示す。
【００１０】
【図４Ａ】図４Ａは、結合していない抗体を除去するために、染色したＬＭＶをサイズ排除クロマトグラフィーによって洗浄する工程を包含する方法を使用するＬＭＶの検出を示す。図４Ｂは、洗浄工程を、種々の抗体、すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ抗体、ＣＤ４５抗体、ＣＤ６６ｃ抗体、ＣＤ１４抗体、ＣＤ３１抗体、ＣＤ１８抗体、ＣＤ１５７抗体、ＣＤ１１Ｃ抗体、およびＣＤ１５抗体のうちの各１つで染色したサンプルに導入することによるバックグラウンドノイズの低減に対する改善を示す。
【図４Ｂ】同上。
【００１１】
【図５】図５Ａは、同じアッセイにおいてＬＭＶを染色するためにＰＥ標識抗体のパネル（ＣＤ１８抗体、ＣＤ１４７抗体、およびＣＤ４５抗体）を使用する、ＬＭＶ検出の結果を示す。そのアッセイを、洗浄条件なしの下で行った。すなわち、フローサイトメトリー分析を行う前に、サイズ排除クロマトグラフィーを使用せずに結合していない抗体を除去した。図５Ｂは、その３種抗体組み合わせが、その３種の抗体のうちのいずれを単独で使用したより多量のＬＭＶを検出したことを示し、図５Ｃは、その３種抗体抗体組み合わせを使用するアッセイからの平均蛍光強度（ＭＦＩ）がまた、任意の個々の抗体を単独で使用するアッセイからのＭＦＩよりわずかに高かったことを示す。
【００１２】
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して、フローサイトメトリー分析の前に結合していない抗体を除去する洗浄工程を含めたことを除いて、図５Ａおよび図５Ｂにおけるものと同一の条件下で行ったアッセイの結果を示す。図５Ａおよび図５Ｂにおける結果と同様に、その３種抗体組み合わせは、その３種の抗体のうちのいずれかを単独で使用したより多くのＬＭＶを検出した。図６Ｃは、その３種抗体組み合わせがまた、その３種の抗体のうちのいずれかを単独で使用したより顕著にＭＦＩを増大したことを示す。
【００１３】
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、Ｇａｌｌｉｏｓ  対  ＣｙｔｏＦＬＥＸを使用して分析した同じサンプルからのＬＭＶカウントの結果を比較する。ＦＩＴＣ標識アネキシンＶで染色されることに加えて、サンプルを、ＰＥ標識ＨＬＡ  ＤＲ抗体（図７Ａ）、またはＰＥ標識ＣＤ１１ｃ抗体（図７Ｂ）でも染色した。図７Ｃは、ＣｙｔｏＦＬＥＸによって検出されたＭＶのカウントが、Ｇａｌｌｉｏｓによって検出されたＭＶのカウントより顕著に多かったことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
１．概観
本発明は、フローサイトメトリー分析において１またはこれより多くの抗体を使用して、所望の感度および特異性で生物学的サンプル中のＬＭＶを検出する、組成物、キット、および方法を提供する。いくつかの実施形態において、開示される組成物、キットおよび方法は、そのＬＭＶを検出するために蛍光を検出するにあたって超高感度である、特有の抗体パネル、洗浄工程、および／または機器を利用する。
【００１５】
２．定義
本明細書で使用される場合、「標識分子（ｌａｂｅｌｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」とは、フローサイトメトリーにおいて識別され得る、検出可能な標識に付着される分子をいう。その分子とその検出可能な標識との間の付着は、直接的であっても間接的であってもよい。好ましい実施形態において、その分子とその検出可能な標識との間の付着は、直接結合体化によって形成される。
【００１６】
本明細書で使用される場合、用語「シグナル領域（ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｇｉｏｎ）」とは、目的のマーカーを発現するＭＶに由来するシグナルが中に入る、フローサイトメトリープロットにおける領域をいう。いくつかの場合には、そのマーカーは、そのＭＶを染色するために使用されるカクテルの構成要素（例えば、抗体）によって認識され得る、そのＭＶ上の分子（例えば、抗原）である。フローサイトメトリーの当業者は、例えば、陽性コントロール、すなわち、そのマーカーを発現することが公知のサンプルの結果を、陰性コントロール、すなわち、非染色サンプル、またはそのマーカーを発現しないことが公知のサンプルの結果と比較することによって、各マーカーのシグナル領域を容易に決定し得る。
【００１７】
本明細書で使用される場合、用語「陽性（ｐｏｓｉｔｉｖｅ）」とは、そのＭＶにおける目的のマーカーの存在を示すシグナルに言及する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、用語「シグナルセット（ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｔ）」とは、サンプル中のＭＶに結合するカクテルの構成要素によって生成されるシグナルのセットをいう。
【００１９】
用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、合成抗体およびキメラ抗体（例えば、コンビナトリアル変異誘発およびファージディスプレイによって生成される）を含む。用語「抗体」はまた、抗体の模倣物またはペプチド模倣物を含む。ペプチド模倣物は、ペプチドおよびタンパク質に基づくかまたはペプチドおよびタンパク質に由来する化合物である。本発明のペプチド模倣物は、代表的には、非天然アミノ酸、配座拘束因子（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｔｒａｉｎｔ）、等価物交換（ｉｓｏｓｔｅｒｉｃ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）などを使用して既知のペプチド配列の構造的改変によって得られ得る。抗体のフラグメントは、いくつかの実施形態において抗体の代わりに役立ち得る。
【００２０】
３．具体的実施形態
サンプル
本発明は、サンプル中のマイクロベシクルの起源を特徴づけるために使用され得る。本発明の方法によってＬＭＶの存在に関してアッセイされるべきサンプルとしては、例えば、ヒトおよび動物の体液（例えば、全血、血清、血漿、脳脊髄液、喀痰、気管支洗浄物、気管支吸引物、尿、リンパ液ならびに呼吸路、腸管、および泌尿生殖路の種々の外分泌物、涙液、唾液、乳汁、白血球、骨髄腫など）；生物学的流体（例えば、細胞培養上清）；組織標本；胸膜液、またはホモジネートが挙げられる。
【００２１】
白血球
白血球（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ）（一般には、白血球（ｗｈｉｔｅ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）といわれる）は、代表的には、染色される場合に、形態的特徴および染色的特徴に基づいていくつかのクラスに分けられる：顆粒球（好中球、好酸球、および好塩基球が挙げられる）、単球、およびリンパ球。顆粒球および単球はともに、骨髄系細胞のカテゴリーに属する。
【００２２】
マイクロベシクル（ＭＶ）
ＭＶは、１００ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲に及ぶ形質膜のフラグメントであり、これは、静止細胞または刺激した細胞からの形質膜から脱ぎ捨てられる。それらは、タンパク質、ＲＮＡおよび生物学的情報を含む他の分子を輸送するように機能する。それらはまた、誤って折りたたまれたタンパク質、細胞傷害性作用物質および代謝的廃棄物を細胞から除去し得、細胞内連絡において重要な役割を果たし得る。
【００２３】
白血球由来ＭＶは、白血球の形質膜の殻から出たＭＶである。いくつかの実施形態において、そのＬＭＶは、骨髄系細胞に、例えば、顆粒球または単球に由来する。いくつかの実施形態において、そのＬＭＶは、基底状態または刺激状態の下での白血球に由来する。ＬＭＶは、そのＬＭＶが由来する白血球の抗原性内容物を反映し、特に、アテローム硬化症、糖尿病、または敗血症を有する患者に関する潜在的バイオマーカーであり得る。従って、白血球の特定のサブタイプおよび特定の状態に由来するＬＭＶを検出および特徴づけることは、臨床上重大な意味を有する。
【００２４】
カクテル
ＬＭＶを検出するために使用され得るカクテルが本明細書で開示される。そのカクテルは、ＨＬＡ  ＤＲ抗体、ＣＤ１１ｃ抗体、ＣＤ１８抗体、ＣＤ１５７抗体、アネキシンＶ、およびＴＩＡ−１抗体のうちの１またはこれより多くを含み、各々は、フローサイトメトリーにおいて検出され得る標識（以下で考察されるとおり）で標識される。いくつかの実施形態において、そのカクテルは、第１の群、第２の群、および／または第３の群を含む。その第１の群は、ＨＬＡ  ＤＲに対する抗体およびＣＤ１１ｃに対する抗体を含み、各々、第１の標識で標識される；その第２の群は、ＣＤ６６ｃに対する抗体を含み、第２の標識で標識される；そして第３の群は、ＣＤ１８に対する抗体およびＣＤ１５７に対する抗体を含む。いくつかの実施形態において、その第２の群は、ＣＤ１５に対する標識された抗体をさらに含む。いくつかの実施形態において、その第３の群は、ＣＤ４５に対する標識された抗体をさらに含む。いくつかの実施形態において、そのカクテルは、第４の標識で標識されたアネキシンＶをさらに含む。アネキシンＶは、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を認識する。無傷の細胞では、ＰＳは、形質膜の内葉（ｉｎｎｅｒ  ｌｅａｆｌｅｔ）上にある。マイクロベシクルは、無傷の細胞から出て、そのうちのいくつかは、露出されかつアネキシンＶにアクセス可能なＰＳを有する。従って、アネキシンＶは、全ての関連するＭＶを、非特異的に染色した粒子、活性化されていない血小板、およびデブリから区別するために使用され得る。ＴＩＡ−１は、刺激された細胞の表面上に存在するマーカーである。いくつかの実施形態において、ＬＭＶを検出するために使用されるカクテルは、第５の標識で標識されたＴＩＡ−１に対する抗体をさらに含む。
【００２５】
いくつかの場合には、ＬＭＶを検出するための方法は、その第１の群からの少なくとも１種の抗体および標識されたアネキシンＶを含むカクテルでサンプルを染色する工程を包含し、ただしその第１の標識（抗体の第１の群を標識するために使用される）は、その第４の標識（アネキシンＶを標識するために使用される）から区別可能である。そのＬＭＶは、その第１の群からの少なくとも１種の抗体によって認識されるマーカーおよびアネキシンＶによって認識されるマーカーに関して陽性である場合、単球由来として割り当てられる。いくつかの実施形態において、標識された抗体の第１の群は、ＨＬＡ−ＤＲ抗体、ＣＤ４４抗体、ＣＤ３１抗体、ＣＤ４５抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ１５７抗体、およびＣＤ１８抗体を含む。いくつかの実施形態において、その第１の群からの少なくとも１種の抗体は、ＨＬＡ  ＤＲ抗体および／またはＣＤ１１ｃ抗体である。
【００２６】
いくつかの場合には、その方法は、サンプルを、標識された抗体の第２の群からの少なくとも１種の抗体およびその標識されたアネキシンＶを含むカクテルで染色する工程を包含し、ただしその第２の標識（抗体の第２の群を標識するために使用される）および第４の標識（アネキシンＶを標識するために使用される）は、区別可能である。そのＬＭＶは、その第２の群からの少なくとも１種の抗体によって認識されるマーカーおよびアネキシンＶによって認識されるマーカーに関して陽性である場合、顆粒球由来として割り当てられる。いくつかの実施形態において、その第２の群から選択される少なくとも１種の抗体は、ＣＤ１５抗体および／またはＣＤ６６ｃ抗体である。いくつかの実施形態において、その第２の群は、ＣＤ１５抗体、ＣＤ１８抗体、ＣＤ２４抗体、ＣＤ６６ｃ抗体、ＣＤ５９抗体、ＣＤ１５７抗体、ＣＤ６６ｂ抗体、ＣＤ１１ｂ抗体、ＣＤ４５抗体、ＣＤ６５抗体、およびラクトフェリン抗体を含む。
【００２７】
いくつかの場合には、その方法は、サンプルを、標識された抗体の第３の群からの少なくとも１種の抗体およびその標識されたアネキシンＶを含むカクテルで染色する工程を包含し、ただしその第３の標識（抗体の第３の群を標識するために使用される）およびその第４の標識（アネキシンＶを標識するために使用される）は、区別可能である。そのＬＭＶは、その第３の群からの少なくとも１種の抗体によって認識されるマーカーおよびアネキシンＶによって認識されるマーカーに関して陽性である場合、骨髄球由来として割り当てられる。いくつかの実施形態において、その第３の群は、ＣＤ１８抗体、ＣＤ１５７抗体、およびＣＤ４５抗体を含む。
【００２８】
いくつかの場合には、その方法は、サンプルを、標識されたＴＩＡ−１抗体およびその標識されたアネキシンＶを含むカクテルで染色する工程を包含し、ただしその第５の標識（ＴＩＡ−１を標識するために使用される）およびその第４の標識（アネキシンＶを標識するために使用される）は、区別可能である。そのＬＭＶは、ＴＩＡ−１によって認識されるマーカーおよびアネキシンＶによって認識されるマーカーに関して陽性である場合、活性化された細胞に由来するとして割り当てられる。
【００２９】
いくつかの場合には、その方法は、ＬＭＶを含むサンプルを、標識されたアネキシンＶならびにｉ）その第１の群、ｉｉ）その第２の群、ｉｉｉ）その第３の群、およびｉｖ）そのＴＩＡ−１抗体のうちの２またはこれより多くに由来する抗体を含むカクテルで染色する工程を包含し、ただし、その染色のために使用される抗体上の標識は、互いから区別可能である。例えば、方法は、そのサンプルを、その第１の群からの少なくとも１種の抗体、１種のＴＩＡ−１抗体、およびアネキシンＶ（各々は、互いから区別可能な標識で標識されている）で染色する工程を包含し得る；ＬＭＶは、全３種のマーカーに関して陽性である場合、活性な単球に由来するとして割り当てられ得る。
【００３０】
標識
本発明において使用される標識は、フローサイトメトリーによって検出され得る任意の標識であり得る。その標識の非限定的な例としては、以下の表１に列挙されるものが挙げられる。
【表１】
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【００３１】
その抗体を標識するために使用され得る他の標識としては、量子ドットが挙げられる。量子ドットは、広い吸光度スペクトラムを有するので、種々の波長の範囲によって励起され得る蛍光ナノクリスタルである。それらの発光波長はまた変動し、青から濃赤色までの範囲に及び得る。当業者は、どのタイプの標識をそのアッセイの目的に基づいて使用するかを容易に決定し得る。いくつかの実施形態において、その第１の、第２の、第３の標識（これらは、抗体を標識するために使用される）のうちの少なくとも１つは、ＰＥであり、その第４の標識（これは、アネキシンＶを標識するために使用される）は、ＦＩＴＣである。
【００３２】
方法
いくつかの実施形態において、本開示は、ＭＶを特徴づけるための方法を提供し、この方法は、染色したＭＶを形成するために、ＭＶを含むサンプルをカクテルで染色する工程、その染色したＭＶを測定する工程およびその測定されたマイクロベシクルのシグナルセットがシグナル領域内にある場合に、その染色したマイクロベシクルを白血球由来マイクロベシクルとして識別する工程を包含する。そのサンプルを染色するために使用されるカクテルは、その標識された抗体のうちの１もしくはこれより多くおよび／または標識されたアネキシンＶ（上記のとおり）を含み得る。一実施形態において、その染色したＭＶを測定する工程は、フローサイトメトリーによるものである。
【００３３】
いくつかの実施形態において、ＭＶを含むサンプルは、フィコール勾配法を使用して全血を分離し、続いて限外濾過を行って、ＭＶを濃縮することによって調製される。いくつかの実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィーがまた、限外濾過後にＭＶを精製するために使用される。
【００３４】
いくつかの実施形態において、そのサンプルを染色する工程は、その標識された抗体および／またはアネキシンＶをそのサンプルに添加し、その混合物を、代表的には、２０分〜１時間の間の期間にわたってインキュベートすることによって行われ得る。そのインキュベーションは、代表的には、室温において、例えば、１８℃〜２５℃、例えば、２０℃〜２５℃で行われる。
【００３５】
いくつかの実施形態において、その方法は、結合していない物質（例えば、抗体）を、その染色したＭＶからのシグナルを測定する前に、その染色したＭＶから分離する工程をさらに包含する。結合していない物質を分離する工程は、サイズ排除クロマトグラフィーカラム上のその染色した混合物を、カルシウム含有緩衝液で洗浄することを包含し得る。その分離のために使用され得る適切なサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムとしては、ｑＥＶ（これは、Ｉｚｏｎから市販されている）が挙げられる。いくつかの実施形態において、そのカルシウム含有緩衝液中のカルシウムの量は、０．５〜２．５ｍＭ、例えば、１〜２ｍＭの範囲に及び得る。一実施形態において、そのカルシウム含有緩衝液は、アネキシンＶ結合緩衝液であり、これは、種々の商業的供給源から容易に得られ得る。調製に関して、いくつかの実施形態において、そのＳＥＣカラムは、セファロースマトリクスおよびアネキシンＶ結合緩衝液とともに装填される。その染色したＭＶは、次いで、そのカラムに装填されて、その結合していない物質を分離する。その染色したＭＶは、次いで、溶出緩衝液を使用してそのカラムから溶出される。好ましくは、その溶出緩衝液は、カルシウムを含む。一実施形態において、その溶出緩衝液は、アネキシン結合緩衝液である。
【００３６】
上記のようにサイズ排除クロマトグラフィーカラム上の染色した混合物を洗浄すると、蛍光バックグラウンドノイズが劇的に減少し得、従って、より多くの染色したＬＭＶ（低シグナルを生じるものを含む）が検出され得る。改善の程度は、染色のために使用される抗体のタイプおよびその抗体の濃度に依存して変動し得る。いくつかの実施形態において、洗浄する工程を含め、フローサイトメトリー分析の前のＳＥＣカラム上の染色した混合物は、その検出されるＬＭＶのカウントを１０％〜３３０％の間、例えば、５０％〜３３０％の間、９０％〜２００％の間、または１７０％〜２１０％の間、増大し得る。１つの特定の実施形態において、図４Ａに示されるように、その方法は、そのサンプルを、標識されたＣＤ４５抗体および標識されたアネキシンＶで染色する工程、およびＳＥＣカラム上のその染色した混合物を洗浄することによってその結合していない物質を分離する工程を包含し；検出される骨髄球由来ＬＭＶのカウントは、そのＳＥＣを使用する洗浄工程を使用しない方法と比較して、約１５０％増大した。別の特定の実施形態において、図４Ｂに示されるように、その方法は、標識されたＨＬＡ  ＤＲおよび標識されたアネキシンＶを使用してサンプルを染色し、その結合していない物質を、ＳＥＣカラム上の染色した混合物を洗浄することによって分離する；その検出される単球由来ＬＭＶのカウントは、その洗浄工程を使用しなかった方法と比較して、約１００％増大した。
【００３７】
フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、細胞および構造（例えば、流体中のＭＶ）を、これらがフローサイトメーターの内側で１または複数のレーザーを通過するときに測定および特徴づけるために使用され得る。標識されたＭＶは、特定のレーザーによる励起およびその発光の際に、種々の波長の光を発する。そのフローサイトメーターは、相対的蛍光、細胞サイズ、および相対的粒度（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｇｒａｎｕｌａｒｉｔｙ）を記録および／または分析し、従って、バイオマーカー検出（例えば、ＭＶ上のマーカー）のために特に有用であり得る。
【００３８】
本明細書で開示される方法およびキットは、その染色したＬＭＶを検出するために任意のフローサイトメーターで使用され得る。フローサイトメーターの非限定的な例としては、Ｇａｌｌｉｏｓ、ＣｙｔｏＦＬＥＸ、およびＮａｖｉｏｓが挙げられる。ＬＭＶの希少性およびそのＬＭＶの抗原性部位の密度の低さに起因して、高い蛍光検出感度を有するフローサイトメーター（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＣｏｕｌｔｅｒのＣｙｔｏＦＬＥＸ）は好ましい。図７Ａ〜７Ｃに示されるように、ＬＭＶカウントの顕著な増大は、Ｇａｌｌｉｏｓと比較して、ｃｙｔｏＦＬＥＸを使用して検出した場合に観察された。
【００３９】
キット
本発明はまた、ＨＬＡ  ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１８、およびＣＤ１５７のうちの少なくとも１つに対する標識された抗体を含むカクテルを含むキットを提供する。いくつかの実施形態において、そのキットは、ｉ）ＨＬＡ  ＤＲおよびＣＤ１１ｃに対する標識された抗体の第１の群；ｉｉ）ＣＤ６６ｃに対する標識された抗体の第２の群；ｉｉｉ）ＣＤ１８およびＣＤ１５７に対する標識された抗体の第３の群；ならびにｉｖ）ＴＩＡ−１に対する標識された抗体の第４の群、のうちの少なくとも１つを含むカクテルを含む。いくつかの実施形態において、その第２の群は、ＣＤ１５に対する標識された抗体をさらに含み、その第３の群は、ＣＤ４５に対する標識された抗体をさらに含む。いくつかの実施形態において、その第１の群における抗体の各々は、第１の標識で標識され、その第２の群における抗体の各々は、第２の標識で標識され、その第３の群における抗体の各々は、第３の標識で標識され、そしてその第４の群における抗体の各々は、第４の標識で標識される。いくつかの実施形態において、そのカクテルは、第５の標識で標識されたアネキシンＶをさらに含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、そのキットは、溶出緩衝液および／またはそのキットをどのように使用するかに関する説明書をさらに含む。
【００４１】
システム
本発明はまた、マイクロベシクルを含むサンプルをカクテルで染色して、染色したマイクロベシクルを形成するための構成要素、その染色したマイクロベシクルを測定するための構成要素、およびその測定されたマイクロベシクルのシグナルセットがシグナル領域内にある場合に、その染色したマイクロベシクルを白血球由来マイクロベシクルとして識別するための構成要素を含むシステムを提供する。いくつかの実施形態において、その染色したマイクロベシクルを測定するための構成要素は、フローサイトメーターを含む。いくつかの実施形態において、そのシステムの構成要素のうちの１またはこれより多くは、１またはこれより多くのコンピュータープロセッサを含み、これらプロセッサは、上記で開示されるとおりのマイクロベシクルを特徴づけるための方法のうちのいずれかの工程を行う指示を実行する。
【００４２】
実施形態
以下は、本開示のいくつかの例示的実施形態である。
【００４３】
１．  マイクロベシクルを特徴づけるための方法であって、上記方法は、
染色した微小小胞体マイクロベシクルを形成するために、マイクロベシクルを含むサンプルをカクテルで染色する工程；
シグナルセットを得るために、上記染色したマイクロベシクルをフローサイトメトリーによって測定する工程；および
上記測定されたマイクロベシクルのシグナルセットがシグナル領域内にある場合に、上記染色したマイクロベシクルを白血球由来マイクロベシクルとして識別する工程、
を包含する方法。
【００４４】
２．  上記カクテルは、ＨＬＡ  ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１８、およびＣＤ１５７のうちの少なくとも１種に対する標識された抗体を含む、実施形態１に記載の方法。
【００４５】
３．  上記カクテルは、標識されたアネキシンＶを含む、実施形態２に記載の方法。
【００４６】
４．  上記カクテルは、
ｉ）ＨＬＡ  ＤＲに対する抗体およびＣＤ１１ｃに対する抗体を含み、各々が第１の標識で標識された、標識された抗体の第１の群；
ｉｉ）ＣＤ６６ｃに対する抗体を含み、第２の標識で標識された、標識された抗体の第２の群；
ｉｉｉ）ＣＤ１８に対する抗体およびＣＤ１５７に対する抗体を含み、各々が第３の標識で標識された、標識された抗体の第３の群、
のうちの少なくとも１つを含む、実施形態２または３に記載の方法。
【００４７】
５．  上記第２の群は、ＣＤ１５に対する標識された抗体をさらに含み、上記第３の群は、ＣＤ４５に対する標識された抗体をさらに含む、実施形態４に記載の方法。
【００４８】
６．  上記標識されたアネキシンＶは、第４の標識で標識される、実施形態４に記載の方法。
【００４９】
７．  上記カクテルは、第５の標識で標識されたＴＩＡ−１に対する抗体をさらに含む、実施形態５または６に記載の方法。
【００５０】
８．  上記識別する工程は、上記シグナルセットが上記第１の群のうちの少なくとも１種の抗体の結合を示す場合に、上記マイクロベシクルを単球由来として割り当てる工程を包含する、実施形態５または６に記載の方法。
【００５１】
９．  上記識別する工程は、上記シグナルセットが上記第２の群のうちの少なくとも１種の抗体の結合を示す場合に、上記マイクロベシクルを顆粒球由来として割り当てる工程を包含する、実施形態５または６に記載の方法。
【００５２】
１０．  上記識別する工程は、上記シグナルセットが上記第３の群のうちの少なくとも１種の抗体の結合を示す場合に、上記マイクロベシクルを骨髄球由来として割り当てる工程を包含する、実施形態５または６に記載の方法。
【００５３】
１１．  上記識別する工程は、上記シグナルセットがＴＩＡ−１に対する抗体の結合を示す場合に、上記マイクロベシクルを活性化された細胞に由来するとして割り当てる工程を包含する、実施形態７に記載の方法。
【００５４】
１２．  結合していない物質を上記染色したマイクロベシクルから分離する工程をさらに包含する、実施形態１に記載の方法。
【００５５】
１３．  上記結合していない物質を分離する工程は、装填したサイズ排除クロマトグラフィーカラム上の上記染色した混合物をカルシウム含有緩衝液で洗浄することを包含する、実施形態１２に記載の方法。
【００５６】
１４．  ＨＬＡ  ＤＲ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ１８、およびＣＤ１５７のうちの少なくとも１つに対する標識された抗体を含むカクテルを含むキット。
【００５７】
１５．  
ＨＬＡ  ＤＲおよびＣＤ１１ｃに対する標識された抗体の第１の群；
ＣＤ６６ｃに対する標識された抗体の第２の群；
ＣＤ１８およびＣＤ１５７に対する標識された抗体の第３の群；ならびに
ＴＩＡ−１に対する標識された抗体の第４の群、
のうちの少なくとも１つを含むカクテルを含むキット。
【００５８】
１６．  上記第２の群は、ＣＤ１５に対する標識された抗体をさらに含み、上記第３の群は、ＣＤ４５に対する標識された抗体をさらに含む、実施形態１５に記載のキット。
【００５９】
１７．  上記第１の群における抗体の各々は、第１の標識で標識され、上記第２の群における抗体の各々は、第２の標識で標識され、上記第３の群における抗体の各々は、第３の標識で標識され、そして上記第４の群における抗体の各々は、第４の標識で標識される、実施形態１５または１６に記載のキット。
【００６０】
１８．  上記カクテルは、第５の標識で標識されたアネキシンＶをさらに含む、実施形態１４〜１７のいずれかに記載のキット。
【００６１】
１９．  溶出緩衝液をさらに含む、実施形態１４〜１８のいずれかに記載のキット。
【００６２】
２０．  １またはこれより多くのプロセッサおよび１またはこれより多くのプロセッサに連結されたメモリを含む、マイクロベシクルを特徴づけるためのシステムであって、上記メモリは、
カクテルで染色したマイクロベシクルの測定値を、フローサイトメーターから得る工程、および
上記測定したマイクロベシクルのシグナルセットが、シグナル領域内にある場合に、上記染色したマイクロベシクルを白血球由来マイクロベシクルとして識別する工程、
を包含する方法を行うように構成された指示セットでコードされる、システム。
【００６３】
２１．  １またはこれより多くのプロセッサおよび１またはこれより多くのプロセッサに連結されたメモリを含む、マイクロベシクルを特徴づけるためのシステムであって、上記メモリは、実施形態１〜１３のいずれかに記載の方法の１またはこれより多くの方法工程を行うように構成された指示セットでコードされる、システム。
【実施例】
【００６４】
ＩＶ．実施例
本発明は、以下の実施例に言及することによって記載され、以下の実施例は、例証によって提供されるのであって、本発明をいかなる様式でも限定するとは意図されない。当該分野で周知の標準的な技術または以下で具体的に記載される技術を利用した。
【００６５】
実施例１．方法
単球および顆粒球、マイクロベシクルを生成および精製するための手順は、図１に図示される。簡潔には、新鮮な全血を、フィコール勾配によって分離し、次いで、免疫−磁性分離によって分離して、単球および顆粒球を抽出した。その方法を使用して得た単球および顆粒球は、９４％超の純度を有した。次いで、細胞を、単球を生成するためにＬＰＳを、および顆粒球を生成するためにｆＭＬＰを補充した培地中で２４時間の期間の間にインキュベートした。次いで、細胞培養物からの上清を集め、一連の遠心分離後に、ＭＶを、ＭＶを濃縮するために限外濾過を、そしてＭＶを精製するためにサイズ排除クロマトグラフィー使用して精製した。その得られたＭＶを、ＰＢＳ緩衝液中に再懸濁し、アリコートに分け、研究のために−８０℃で凍結した。
【００６６】
実施例２．  ＬＭＶに対する抗体スクリーニング
実施例１から調製したＭＶを使用して、抗体のパネルをスクリーニングした。表２に列挙される白血球特異的抗体の各々を使用して、アネキシンＶと組み合わせてサンプルを染色した。アネキシンＶは、ＭＶを無傷の細胞から区別し得るので、これを使用してＭＶを染色した。この実験では、各抗体をＰＥに結合体化し、アネキシンＶをＦＩＴＣに結合体化する。５種の異なる濃度での力価測定を、全ての抗体に関して行った。凝集を回避するために、抗体を、使用する前に１３，０００ｇで２分間遠心分離した。さらに、蛍光に合致したアイソタイプコントロールを、各濃度について使用した。全アネキシンＶ陽性ＭＶ集団の中のＰＥおよびアネキシンＶ二重陽性集団のパーセンテージを、各抗体に関して計算し、そして２０％をカットオフと見做した−  そのパーセンテージが２０％またはこれより高い場合、その抗体は、そのＭＶ集団を検出するために使用され得る。
【００６７】
表２に示されるように、１１種の抗体（すなわち、ＣＤ１５、ＣＤ１８、ＣＤ２４、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ５９、ＣＤ１５７、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ４５、ＣＤ６５、ラクトフェリンに対する抗体）は、顆粒球由来ＭＶを検出するための基準を満たし、７種の抗体（すなわち、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ４４、ＣＤ３１、ＣＤ４５、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１５７、ＣＤ１８に対する抗体）は、単球由来ＭＶを検出するための基準を満たすことが示された。これらの抗体を、検出されるＬＭＶのパーセンテージ（高から低）に基づいてランク付けした。単球由来ＭＶを検出するために使用され得る最上位の機能の抗体は、表３に示され、顆粒球由来ＭＶを検出するために使用され得る最上位の機能の抗体は、表４に示される。骨髄球ＭＶ（すなわち、単球由来および顆粒球由来両方のＭＶ）を検出するために使用され得る抗体は、表５に示される。これらの抗体は、白血球の異なる亜集団上の特異的マーカーを認識することが公知である；例えば、ＨＬＡ−ＤＲは、単球のマーカーであり、ＣＤ１５は、顆粒球のマーカーであり、ＣＤ１８は、単球および顆粒球両方のマーカーである。図２Ａは、ＨＬＡ  ＤＲ抗体およびアネキシンＶ両方の染色に関して陽性である集団（これは、単球由来ＭＶに相当する）を示す。図２Ｂは、ＣＤ１５抗体およびアネキシンＶ両方の染色に関して陽性である集団（これは、顆粒球由来ＭＶに相当する）を示す。図２Ｃは、ＣＤ１８抗体およびアネキシンＶ両方の染色に関して陽性でである集団（これは、骨髄球由来ＭＶに相当する）を示す。
【表２−１】
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【表２−２】
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【００６８】
注：  「Ｍｏｎｏ」は、単球に由来するＭＶを表す。「Ｇｒａｎ」は、顆粒球に由来するＭＶを表す。「ＮＳ」は、刺激されていないまたは基底状態下にある細胞に由来するＭＶを表す。「Ｓ」は、刺激状態下にある細胞に由来するＭＶを表す。表２〜５の中の数値は、全アネキシンＶ陽性ＭＶ集団の中でＰＥおよびアネキシンＶ二重陽性ＭＶ集団のパーセンテージを表す。
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【００６９】
そのアッセイを検証しかつその線形性を評価するために、実施例１に記載される方法を使用して得たＭＶを、１：２〜１：３２の範囲においてＭＶ非含有血漿中で段階希釈した。ＭＶの絶対的定量を、ビーズを計数することを使用して行った。ＭＶを含むサンプルを、ＰＥで標識したＣＤ１５抗体およびＦＩＴＣで標識したアネキシンＶで染色し、フローサイトメトリーによって分析した（図３Ａ）。類似の実験を、ＨＬＡ  ＤＲ抗体およびＣＤ６６ｃ抗体で行った。その結果は、そのＨＬＡ  ＤＲ抗体、ＣＤ６６ｃ抗体、およびＣＤ１５抗体の各々を使用するアッセイが、そのサンプル中のＭＶの濃度が非常に低い、例えば、５０  ＭＶ／μｌ未満、例えば、３０〜５０の間のＭＶ／μｌである場合ですら、線形的であることを示した（図３Ｂ）。
【００７０】
実施例３．  染色したＭＶＳを洗浄するためのサイズ排除クロマトグラフィー
実施例２において識別されるとおりの特異的マーカーに対する抗体で標識したサンプルを、アネキシンＶ結合緩衝液（これはカルシウムを含む）とともに、セファロースマトリクスを有するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに装填した。その結果は、概して、そのＳＥＣカラム上の染色した混合物を洗浄する工程は、その検出されたＭＶカウントの増大およびシグナルの平均蛍光の増大によって反映されるように、バックグラウンド蛍光を低減することを示した；検出されるＭＶのパーセンテージは、１０％〜２００％増大し得る（図４Ｂを参照のこと）。増大の程度は、染色において使用される抗体の本質的特性および濃度、ならびにそのＭＶ上の抗原密度に依存して変動し得る。例えば、１つの実験では、バックグラウンドノイズのごくわずかな低減および二重陽性ＭＶのカウントにおけるごくわずかなゲインは、非洗浄サンプルと比較して、そのＳＥＣカラムを使用して洗浄したＣＤ６６ｃ染色されたサンプルに関して観察された。別の実験では、検出されるＬＭＶの増大および洗浄工程によって引き起こされるＭＦＩの増大は、洗浄しなかった同様に染色したサンプルと比較して、ＣＤ４５またはＨＬＡ  ＤＲ染色したサンプルで顕著であった（図４Ａ）。
【００７１】
実施例４．  ＬＭＶ検出のための抗体組み合わせ
この実施例では、個々に、ある種のＭＶ集団を検出するための使用に適しているとして先に識別された種々の抗体の組み合わせを、同じアッセイにおいて使用した。この実験の目的は、それらの抗体の組み合わせが、抗体の各々を単独で使用したものと比較して、そのアッセイの感度を改善し得るか否かを決定することであった。１つの実験では、ＣＤ１８、ＣＤ１５７およびＣＤ４５（各々、ＰＥに標識され、骨髄球由来ＭＶを検出し得ることが先に示された）（表５を参照のこと）を組み合わせ、その同じアッセイにおいてサンプルを染色するために使用した。この実験では、洗浄工程を使用せずに、すなわち、サイズ排除クロマトグラフィーを使用せずに、その染色された混合物を洗浄した。図５Ａ〜５Ｃは、このような洗浄条件なしの下で、その３種抗体組み合わせは、その３種の抗体のうちのいずれかを単独で使用したより、高いＭＶのパーセンテージを検出し、およびわずかにより高い平均蛍光強度（ＭＦＩ）を生じたことを示す。別の実験では、その同じ３種抗体組み合わせを使用して、ＭＶを含むサンプルを染色し、次いで、その染色した混合物を、フローサイトメトリー分析の前にＳＥＣカラムとともに洗浄した。その結果は、その３種抗体組み合わせがより高いパーセンテージのＭＶを検出し、顕著により高いＭＦＩを生じることを示した（図６Ａ〜６Ｃ）。
【００７２】
実施例５．  ＬＭＶ検出のための蛍光感受性サイトメーター
この実施例における実験は、種々のフローサイトメーター：  ＧａｌｌｉｏｓおよびＣｙｔｏＦＬＥＸによる同じサンプル中のＭＶの検出を比較することである。Ｇａｌｌｉｏｓと比較して、ＣｙｔｏＦＬＥＸは、蛍光を検出するにあたって、特に、ＰＥチャネルを有するので超高感度であるという利点を有する。さらに、ＣｙｔｏＦＬＥＸは、ＦＩＴＣチャネルとＰＥチャネルとの間でのシグナルの拡がりを制限する黄緑色レーザーを使用する。
【００７３】
１つの実験では、ＭＶを含むサンプルを、ＰＥ標識ＨＬＡ  ＤＲ抗体およびＦＩＴＣ標識アネキシンＶで染色した。その二重陽性ＭＶカウントのカウントは、Ｇａｌｌｉｏｓの使用と比較して、ＣｙｔｏＦＬＥＸを使用して分析した場合に４０％より多かった（図７Ａ）。別の実験では、ＭＶを含むサンプルをＰＥ標識ＣＤ１１ｃ抗体およびＦＩＴＣ標識アネキシンＶで染色した。Ｇａｌｌｉｏｓを使用して分析した場合、二重陽性集団は非常に低く、検出するのが困難であり、ＰＥチャネルのＭＦＩもまた非常に低かった。ＣｙｔｏＦＬＥＸを使用して分析した場合、ＰＥチャネルシグナルのＭＦＩは顕著に増大し、二重陽性集団の顕著な量が検出された（図７Ｂ）。図７Ｃは、ＭＶを含むサンプルを、ＣｙｔｏＦＬＥＸを使用して分析した場合、Ｇａｌｌｉｏｓを使用して分析されるものと比較して、統計的に、ＭＶカウントの有意な増大があったことを示す。そのサンプルを、ＨＬＡ−ＤＲ抗体、ＣＤ４５抗体、ＣＤ６６ｃ抗体、ＣＤ１４抗体、ＣＤ３１抗体、ＣＤ１８抗体、ＣＤ１５７抗体、ＣＤ１１Ｃ抗体、およびＣＤ１５抗体の各１種で染色した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2020523586.tif 000011
【図２Ｃ】
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【図３】
2020523586.tif 000013
【図４Ａ】
2020523586.tif 000014
【図４Ｂ】
2020523586.tif 000015
【図５】
2020523586.tif 000016
【図６】
2020523586.tif 000017
【図７】
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【国際調査報告】
2020523586.tif 000019
2020523586.tif 000020
2020523586.tif 000021
2020523586.tif 000022
2020523586.tif 000023