(57)【要約】  本発明は、医学の分野、より詳細には、ワクチン学の分野にある。本発明は、新規なボルデテラＬＰＳ及びかかる改変されたＬＰＳを含む、ボルデテラ属の改変された細菌に関する。本発明のＬＰＳは、改変されていないボルデテラＬＰＳと比較して、低下した内毒素性を有する。したがって、本発明の改変されたＬＰＳは、対象における免疫応答を誘導すること又は刺激することにおける使用のために特に適しており、免疫応答は、ボルデテラ感染症に対して誘導される又は刺激される。本発明の改変されたボルデテラＬＰＳは、ボルデテラ細胞において、異種アシルトランスフェラーゼの発現を導入することにより取得可能である。特に、本発明の改変されたボルデテラ細胞は、異種ＬｐｘＡ、ＬｐｘＬ又はＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼの増加した発現を有する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１本のアシル鎖の長さがより短いという点で、野生型ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分と比較して、改変されている脂質Ａ部分を有するボルデテラＬＰＳ。
【請求項２】
改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さが、同じ３位における野生型ボルデテラ脂質Ａ部分のアシル鎖よりも大きい長さを有さず、改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さが、Ｃ１０より大きくないことが好ましく、改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さが、同じ３位における野生型ボルデテラ脂質Ａ部分のアシル鎖と同じ長さであることがより好ましく、３位におけるアシル鎖の長さが、Ｃ１０であることが好ましい、請求項１に記載のボルデテラＬＰＳ。
【請求項３】
改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さが、３’位におけるアシル鎖の長さと同じである、請求項１又は請求項２に記載のボルデテラＬＰＳ。
【請求項４】
より短いアシル鎖が、
ｉ）脂質Ａ部分の３’位におけるアシル鎖；
ｉｉ）脂質Ａ部分の２’位における第１のアシル鎖；
ｉｉｉ）脂質Ａ部分の２’位における第２のアシル鎖；及び
ｉｖ）脂質Ａ部分の２位におけるアシル鎖からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のボルデテラＬＰＳ。
【請求項５】
アシル鎖が、Ｃ原子が少なくとも２、４又は６個短く、
及び／又は、改変された脂質Ａ部分を除き、ＬＰＳが、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌の構造を有し、ＬＰＳが、改変された脂質Ａ部分を除き、百日咳菌の構造を有することが好ましく、
及び／又は改変された脂質Ａ部分が、式（Ｉ）：
【化１】
2020510726.tif 000010
［式中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ２’、Ｘ３’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ２’、及びＲ３’は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｙ、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−Ｙ、及び−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙからなる群から選択され、Ｙは、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、Ｙのそれぞれの場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５から独立に選ばれる整数である］の構造を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のボルデテラＬＰＳ。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のボルデテラＬＰＳを含む、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌。
【請求項７】
細菌が、異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変を有するという点で、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変され、
異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変が、異種ＬｐｘＡ、ＬｐｘＬ及びＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼ活性のうちの少なくとも１種を、細胞に与えることが好ましく、
遺伝子改変が、異種ｌｐｘＡ、ｌｐｘＬ、及びｌｐｘＤ遺伝子のうちの少なくとも１種の発現を導入することがより好ましく、
ｉ）ｌｐｘＡ遺伝子が、配列番号１と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するＬｐｘＡアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有し；
ｉｉ）ｌｐｘＬ遺伝子が、配列番号２と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するＬｐｘＬアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有し；及び／又は
ｉｉｉ）ｌｐｘＤ遺伝子が、配列番号４と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有し、
及び／又は改変された細菌が、内因性ｌｐｘＡ遺伝子及び／又は内因性ｌｐｘＤ遺伝子によりコードされたＬｐｘＡ及び／又はＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼの活性を減少させる又は除去する遺伝子突然変異をさらに含む、請求項６に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項８】
細菌が、異種ＵＤＰ−２，３−ジアシルグルコサミンピロホスファターゼ活性を導入する遺伝子改変を有するという点で、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変され、遺伝子改変が、異種ｌｐｘＨ遺伝子の発現を導入することが好ましく、ｌｐｘＨ遺伝子が、配列番号５と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するＬｐｘＨをコードするヌクレオチド配列を有することがより好ましく、
及び／又は細菌が、遺伝子改変百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌であり、遺伝子改変細菌が、遺伝子改変百日咳菌であることが好ましく、百日咳菌Ｂ２１３株であることが最も好ましく、
及び／又は細菌が、脂質Ａ３−Ｏ−デアシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変を有する、請求項６又は請求項７に記載の遺伝子改変細菌。
【請求項９】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌から取得可能である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のボルデテラＬＰＳ。
【請求項１０】
請求項１〜５及び９のいずれか一項に記載のボルデテラＬＰＳを含むＯＭＶであって、請求項６〜８のいずれか一項に記載の遺伝子改変細菌から取得可能であることが好ましい、ＯＭＶ。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の、ボルデテラＬＰＳ、遺伝子改変細菌及びＯＭＶのうちの少なくとも１種を含む、組成物。
【請求項１２】
医薬品としての使用のための、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
免疫応答が、ボルデテラ感染症、好ましくは、百日咳菌感染症に対して誘導される又は刺激されることが好ましく、
及び／又は処置が、百日ぜき（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）の予防又は処置であることが好ましく、
及び／又は組成物が、薬学的に許容される添加剤をさらに含む医薬組成物である、対象における免疫応答を誘導すること又は刺激することを含む処置における使用のための、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項６〜８のいずれか一項に記載の細菌を含む全細胞ワクチンであり、細菌が、不活性化されることが好ましい、請求項１２又は請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項１〜５及び９のいずれか一項に記載のボルデテラＬＰＳ、又は請求項１０に記載のＯＭＶを含む無細胞ワクチンであり、及び／又は少なくとも１種の非ボルデテラ抗原をさらに含む、請求項１２又は請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ワクチン学の分野にあり、特に、ボルデテラ感染症の予防又は処置の分野にある。
【０００２】
本発明は、内毒素性（ｅｎｄｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）が低いボルデテラＬＰＳ及びかかる改変されたＬＰＳを含むボルデテラ属の遺伝子改変細菌に関する。本発明は、さらに、前記改変細菌から取得可能な外膜小胞（ＯＭＶ：ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｖｅｓｉｃｌｅ）に関する。本発明はまた、前記ＬＰＳ、遺伝子改変細菌及び／又はＯＭＶを含む組成物並びに医薬品としての前記組成物の使用に関する。本発明は、さらに、対象における免疫応答を誘導すること又は刺激することを含む処置における使用のための前記組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）は、グラム陰性菌及び百日ぜき（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）としても知られる急性気道疾患である百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）を引き起こす偏性のヒト病原体である。いくつかのワクチン配合物は、百日咳に対して開発されている。前世紀の５０年代に導入された全細胞百日咳ワクチンは、有効であったが、許容できない副作用が生じた。したがって、このワクチンは、先進工業国において、現在は、市場には入れない。サブユニット−ベースのワクチンは、安全であり、疾患に対して相対的な保護（被覆度５５〜９５％）を与えることが示されたため、全細胞ワクチンと置き換えられた。しかしながら、その中でもとりわけ、病原体の高速の適応及び免疫の急速な漸減は、これらの配合物の効果を低下させている。こうしたことから、この数十年間に、特に、先進工業国において懸念が抱かれるようになり、これは、ワクチンの間に含まれる症例の数のかなり増加によって証明されている［１］。したがって、新たな、安全及び有効なワクチン処方についての強い医学的必要性がある。この目標を達成する戦略は、低下した毒性を有する新たな全細胞ワクチンの導入であり得る。毒性が、リポ多糖類（ＬＰＳ）の脂質Ａ部分によって、主に決定されるため［２］、この手法は、脂質Ａエンジニアリングを要する。
【０００４】
ＬＰＳは、グラム陰性菌の外膜の主な構成成分である。ＬＰＳは、脂質Ａ部分、コアオリゴ糖及びＯ−抗原として公知の長い多糖類からなるが、百日咳菌を含めた、いくつかの種において欠如している［３〜５］。脂質Ａ部分は、哺乳動物ＬＰＳ受容体、ＴＬＲ４／ＭＤ−２複合体によって認識され、炎症誘発性サイトカイン及びケモカインの産生に終わるシグナル伝達カスケードの活性化をもたらす［６］。これらのメディエーターは、免疫防御を活性化するが［７；８］、過剰刺激によって、様々な障害を引き起こし、しばしば致命的な結果になる［９］。したがって、ＬＰＳは、アジュバントとして作用し得るが、強力な内毒素としても作用し得る。大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の脂質Ａは、１位及び４’位でリン酸化されるグルコサミン二糖類からなり、アミド結合を介して２及び２’位に連結され、エステル結合を介して３及び３’位に連結される、４本のヒドロキシル化された脂肪アシル鎖を含有する。２本の第２のアシル鎖は、２’及び３’位で脂肪酸のヒドロキシル基にエステル化される［４］。脂質Ａの生合成経路は、９種のよく保存された酵素を要する［４］。第１のステップにおいて、３−ヒドロキシルアシル鎖は、アシルキャリアータンパク質から、ＬｐｘＡによる活性された糖ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃにおいて、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）の３位に転移される［１０；１１］。次いで、得られた生成物は、ＬｐｘＣにより脱アセチル化され、続いて、ＬｐｘＤにより２位で３−ヒドロキシルアシル鎖によりアシル化される。次いで、ＬｐｘＨは、得られた分子の割合からＵＭＰ分子を除去し、１個の改変された分子は、ＬｐｘＢにより改変されていない分子と連結される。得られた生成物は、ＬｐｘＫにより４’位でリン酸化されて、テトラ−アシル化及びビス−リン酸化脂質ＩＶＡを創出する。次いで、２つの３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクタ−２−ウロソン酸（ＫＤＯ）残基は、ＷａａＡにより６’位に加えられ、その後、第２のアシル鎖は、ＬｐｘＬ及びＬｐｘＭアシルトランスフェラーゼにより加えられる。
【０００５】
脂質Ａ構造における差異は、異なる細菌種において見出されている。これらの差異は、ＬＰＳ受容体の活性化に影響を与える。特に、アシル鎖の数及び長さ並びにリン酸基の数は、活性化の強度をすべて決定し得る［４；１２；１３］。
【０００６】
アシル鎖の長さにおける差異は、アシルトランスフェラーゼＬｐｘＡ、ＬｐｘＤ、ＬｐｘＬ及びＬｐｘＭにおいて分子定規により決定され、これらは、異なる細菌種のこれらの酵素間で変わる［１４］。さらに、保存された生合成経路の後、改変は、内膜又は外膜に位置している酵素により、外膜へのその輸送中又は輸送後に、脂質Ａ中に導入することができる。これらの改変には、アシル化、脱アシル化及び脱リン酸化が含まれ、これらの酵素の存在は、細菌種間で異なる［１５］。
【０００７】
百日咳菌の脂質Ａ（図１Ａ）は、ペンタ−アシル化であるという点で大腸菌の脂質Ａと異なる。すなわち、これは、３’位で第１のアシル鎖に連結された第２のアシル鎖が欠落している。さらに、残りの第２のアシル鎖は、大腸菌において見出されるＣ１２の代わりにＣ１４であり、奇妙なことに、３及び３’位における第１のヒドロキシル化アシル鎖は、同じＬｐｘＡ酵素によって加えられるにもかかわらず、長さが異なる（図１Ａ）。
【０００８】
ボルデテラ３−Ｏ−脱アシル化ＬＰＳが、ＬＰＳ毒性を減少させることが前もって報告された（例えば、国際公開第２００６／０６５１３９号を参照のこと）。それにもかかわらず、３位における第１のアシル鎖を損失した百日咳菌ＬＰＳの毒性の低下は、これらの膜からのその放出の増加により全−細胞の調製において無効になった［２］。
【０００９】
したがって、内毒素性の低下したボルデテラＬＰＳについて当技術分野では、依然として強く必要とされている。特に、内毒素性の低下したかかるＬＰＳを有するボルデテラ種についての必要性がある。ＬＰＳの内毒素性が、ボルデテラ感染症の予防又は処置における使用に適当であるほど十分低いことが好ましい。さらに正確には、内毒素性が低いＬＰＳを含む全細胞ボルデテラワクチンについて当技術分野で、依然として必要とされている。
【発明の概要】
【００１０】
第１の態様では、本発明は、少なくとも１本のアシル鎖の長さがより短いという点で、野生型ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分と比較して、改変されている脂質Ａ部分を有するボルデテラＬＰＳに関する。
【００１１】
改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さは、同じ３位における野生型ボルデテラ脂質Ａ部分のアシル鎖よりも長さが大きくないことが好ましく、改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さは、Ｃ１０よりも大きくないことが好ましい。改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さが、同じ３位における野生型ボルデテラ脂質Ａ部分のアシル鎖と同じ長さであることが好ましく、３位におけるアシル鎖の長さが、Ｃ１０であることが好ましい。
【００１２】
本発明の好ましい実施形態において、改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さは、３’位におけるアシル鎖の長さと同じである。
【００１３】
より短いアシル鎖は、ｉ）脂質Ａ部分の３’位におけるアシル鎖；ｉｉ）脂質Ａ部分の２’位における第１のアシル鎖；ｉｉｉ）脂質Ａ部分の２’位における第２のアシル鎖；及びｉｖ）脂質Ａ部分の２位におけるアシル鎖からなる群から選択されることが好ましい。アシル鎖が、Ｃ原子が少なくとも２、４又は６個短いことが好ましい。さらに好ましい実施形態では、本発明は、改変された脂質Ａ部分を除き、百日咳菌、パラ百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）又は気管支敗血症菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）の構造を有する、本明細書で定義されるボルデテラＬＰＳに関する。ＬＰＳは、改変された脂質Ａ部分を除き、百日咳菌の構造を有することが好ましい。
さらに好ましい実施形態では、本発明は、改変された脂質Ａ部分が、式（Ｉ）：
【００１４】
【化１】
2020510726.tif 000002
［式中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ２’、Ｘ３’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ２’、及びＲ３’は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｙ、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−Ｙ、及び−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙからなる群から選択され、Ｙは、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、Ｙのそれぞれの場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５から独立に選ばれる整数である］の構造を有する、本明細書で定義されるボルデテラＬＰＳに関する。
【００１５】
第２の態様では、本発明は、細菌は、本明細書で定義されるＬＰＳを含む、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌に関する。異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変を有するという点で、細菌は、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変されることが好ましい。異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変は、異種ＬｐｘＡ、ＬｐｘＬ及びＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼ活性のうちの少なくとも１つを細胞に与えることが好ましい。遺伝子改変は、異種ｌｐｘＡ、ｌｐｘＬ、及びｌｐｘＤ遺伝子のうちの少なくとも１つの発現を導入することが好ましく、ｉ）ｌｐｘＡ遺伝子は、配列番号１と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するＬｐｘＡアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有し；ｉｉ）ｌｐｘＬ遺伝子は、配列番号２と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するＬｐｘＬアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有し；及び／又はｉｉｉ）ｌｐｘＤ遺伝子は、配列番号４と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有する。
【００１６】
改変された細菌は、内因性ｌｐｘＡ遺伝子及び／又は内因性ｌｐｘＤ遺伝子によってコードされたＬｐｘＡ及び／又はＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼの活性を減少させる又は除去する遺伝子突然変異をさらに含むことが好ましい。
【００１７】
さらに好ましい実施形態では、本明細書で定義される細菌は、異種ＵＤＰ−２，３−ジアシルグルコサミンピロホスファターゼ活性を導入する遺伝子改変を有するという点で、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変され、遺伝子改変は、異種（ｈｅｔｅｒｅｌｏｇｏｕｓ）ｌｐｘＨ遺伝子の発現を導入することが好ましく、ｌｐｘＨ遺伝子は、配列番号５と少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有するＬｐｘＨをコードするヌクレオチド配列を有することが好ましい。
【００１８】
本明細書で定義される細菌は、遺伝子改変百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌であることが好ましく、遺伝子改変細菌は、遺伝子改変百日咳菌であることが好ましく、百日咳菌Ｂ２１３株であることが最も好ましい。本明細書で定義される遺伝子改変細菌は、さらに、脂質Ａ３−Ｏ−デアシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変を有することが好ましい。
【００１９】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、本明細書で定義される遺伝子改変細菌から取得可能である、本明細書で定義されるボルデテラＬＰＳに関する。
【００２０】
第３の態様では、本発明は、本明細書で定義されるボルデテラＬＰＳを含むＯＭＶに関する。ＯＭＶは、本明細書で定義される遺伝子改変細菌から取得可能であることが好ましい。
【００２１】
第４の態様では、本発明は、本明細書で定義されるボルデテラＬＰＳ、遺伝子改変細菌及びＯＭＶのうちの少なくとも１つを含む組成物に関する。
【００２２】
第５の態様では、本発明は、医薬品としての使用のための本明細書で定義される組成物に関する。
【００２３】
第６の態様では、本発明は、対象における免疫応答を誘導すること又は刺激することを含む処置における使用のための本明細書で定義される組成物に関する。免疫応答は、ボルデテラ感染症、好ましくは、百日咳菌感染症に対して誘導される又は刺激されることが好ましい。好ましい実施形態において、処置は、百日ぜき（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）の予防又は処置である。本明細書において指定される使用のための組成物は、薬学的に許容される添加剤をさらに含む医薬組成物であることが好ましい。
【００２４】
本明細書において指定される使用のための組成物は、本明細書で定義される細菌を含む全細胞ワクチンであることが好ましく、細菌は、不活性化されることが好ましい。
【００２５】
好ましい実施形態において、本明細書で定義される使用のための組成物は、本明細書において指定されるボルデテラＬＰＳ又は本明細書で定義されるＯＭＶを含む無細胞ワクチンである。
【００２６】
好ましい実施形態において、本明細書で定義される使用のための組成物は、少なくとも１種の非ボルデテラ抗原をさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】野生型及び遺伝子改変百日咳菌の脂質Ａ構造を示す図である。（Ａ）野生型百日咳菌の脂質Ａ構造。Ｂ）ＬｐｘＡ（Ｎｍ）ΔｌｐｘＡを発現する百日咳菌の脂質Ａ構造の予測。Ｃ）ＬｐｘＡ（Ｐａ）ΔｌｐｘＡを発現する百日咳菌の脂質Ａ構造。Ｄ）ＬｐｘＬ（Ｎｍ）ΔｌｐｘＬを発現する百日咳菌の脂質Ａ構造及びＥ）ＬｐｘＬ（Ｐｇ）ΔｌｐｘＬを発現する百日咳菌の脂質Ａ構造及びＦ）ＬｐｘＤ（Ｐａ）ΔｌｐｘＤ及びΔｌｐｘＡを発現する百日咳菌の脂質Ａ構造、ΔｌｐｘＬ及びΔｌｐｘＤは、それぞれ、染色体ｌｐｘＡ、ｌｐｘＬ及びΔｌｐｘＤ遺伝子の不活性化を示す。
【図２】増殖における異種酵素の発現の影響を示すグラフである。Ａ）１ｍＭ  ＩＰＴＧの存在下でのＶｅｒｗｅｉｊ培地中で１８ｈ増殖した後、ｐＭＭＢ６７ＥＨプラスミドから得られた、Ｂ２１３及びＬｐｘＬ（Ｎｍ）、ＬｐｘＡ（Ｐａ）、又はＬｐｘＬ（Ｐｇ）を発現する誘導体の培養のＯＤ５９０を示す。出発ＯＤ５９０は、０．０５であった。データは、２回行われた代表的な１つの実験から得られ、その中で、平均及び標準偏差が得られる。ＬｐｘＬ（Ｎｍ）を発現する株の増殖異常は、２つの追加の実験において再現された。Ｂ）ＬｐｘＤ（Ｐａ）。ＩＰＴＧ１ｍＭの存在下でのＶｅｒｗｅｉｊ液体培地中での増殖の１２及び２４ｈ後、Ｂ２１３及びＢ２１３−ｐＬｐｘＤＰａクローン４（ｃｌ４）及びクローン５（ｃｌ５）の培養の５９０ｎｍ（ＯＤ５９０）におけるＯＤを示す。出発ＯＤ５９０は、０．０５であった。
【図３】脂質ＡのＥＳＩ−ＭＳによる構造分析を示す図である。負イオン脂質Ａ質量スペクトルを、Ｂ２１３、ＬｐｘＡ（Ｐａ）を発現するＢ２１３（Ｂ２１３−ｐＬｐｘＡ（Ｐａ））、ＬｐｘＡ（Ｐａ）バックグラウンドを発現するＢ２１３（Ｂ２１３ΔｌｐｘＡ−ｐＬｐｘＡ（Ｐａ））のΔｌｐｘＡ突然変異、ＬｐｘＬ（Ｎｍ）を発現するＢ２１３（Ｂ２１３−ｐＬｐｘＬ（Ｎｍ））、ＬｐｘＬ（Ｐｇ）を発現するＢ２１３（Ｂ２１３−ｐＬｐｘＬ（Ｐｇ））及びＬｐｘＤ（Ｐａ）を発現するＢ２１３（Ｂ２１３−ｐＬｐｘＤ（Ｐａ））（クローン４及び５）の細胞から単離された未変化ＬＰＳのインソースの衝突によって誘導された解離ナノＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳによって得られた。細菌を、ＩＰＴＧ１ｍＭの存在下でのＶｅｒｗｅｉｊ液体培地中で１２ｈ増殖させた。ｍ／ｚ１５５７．９７における主な単独で−脱プロトン化されたイオンは、典型的な百日咳菌脂質Ａ構造と解釈された。すなわち、図１中で例示される２つのリン酸残基（２Ｐ）によるジグルコサミン（２個のＧｌｃＮ）ペンタ−アシル化（３つの３ＯＨ−Ｃ１４、１つの３ＯＨ−Ｃ１０及び１つのＣ１４）である。追加の単独で−脱プロトン化された脂質Ａイオンは、異なる誘導体において検出され、これらの解釈はまた、示される。脂質Ａイオンを包含するｍ／ｚ範囲のみ示す。
【図４】精製されたＬＰＳ（Ａ、Ｂ）又はＢ２１３及びＬＰＳ突然変異誘導体（Ｃ、Ｄ）の全−細胞調製による、ｈＴＬＲ４（Ａ、Ｃ）又はｍＴＬＲ４（Ｂ、Ｄ）を発現するＨＥＫ２９３細胞の刺激を示すグラフである。ＯＤ５９０を０．１に調整した、ＬＰＳ調製及び細菌性懸濁液を、連続的に希釈した。ｍＴＬＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞で２ｈインキュベートした後又はｈＴＬＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞で４ｈインキュベートした後、アルカリホスファターゼ活性を、基質を加え、６３０ｎｍにおけるＯＤを測定することにより決定した。代表的な１つの実験を示す。
【図５】Ｂ２１３、Ｂ２１３ΔｌｐｘＡ−ｐＬｐｘＡ（Ｐａ）、並びにＢ２１３−ｐＬｐｘＤ（Ｐａ）ｃｌ４及びｃｌ５から精製されたＬＰＳによる、ｈＴＬＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞の刺激を示すグラフである。２μｇ／ｍｌの濃度における精製されたＬＰＳを、連続的に希釈し、培養細胞に加え、４ｈインキュベートした。ＳＥＡＰ活性を得られる６３０ｎｍにおけるＯＤを提供する。
【図６】Ｉｎ  ｖｉｖｏにおける発熱性を示すグラフである。すべて百日咳菌野生型ＬＰＳ及びＯＭＶと比較した、ｌｐｘＡ（Ｐａ）突然変異及びｌｐｘＤ（Ｐａ）突然変異から精製された、突然変異百日咳菌ＬＰＳにより、並びにｌｐｘＤ（Ｐａ）突然変異から抽出されたＯＭＶにより誘導されたウサギにおける発熱性。発熱性は、０〜４８ｈ及び０〜８ｈ間隔で曲線下面積として表される。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
定義
用語「相同性」、「配列同一性」等は、本明細書において同義的に用いられる。配列同一性は、これらの配列を比較することにより決定される通り、２種以上のアミノ酸（ポリペプチド又はタンパク質）配列又は２種以上の核酸（ポリヌクレオチド）配列の間の関係として本明細書において定義される。当技術分野で、「同一性」はまた、かかる配列の弦線間の一致により決定される通り、場合に応じて、アミノ酸又は核酸配列の間の配列の因果関係の程度を意味する。２つのアミノ酸配列間の「類似性」は、アミノ酸配列及び第２のポリペプチドの配列への１つのポリペプチドのその保存されたアミノ酸置換を比較することにより決定される。「同一性」及び「類似性」は、公知の方法により容易に算出することができる。
【００２９】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じて、グローバル又はローカルアラインメントアルゴリズムを用いた、２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列のアラインメントにより決定することができる。類似の長さの配列は、全長にわたってこれらの配列を最適に整列させるグローバルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ法）を用いて整列させることが好ましく、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法）を用いて整列させることが好ましい。次いで、（例えば、デフォルトパラメーターを用いたＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴプログラムにより最適に整列させる場合）これらは、（下記に定義される通り）配列同一性の少なくともある最小の百分率を共有する場合、配列は、「ほぼ同一の」又は「本質的に類似の」と称され得る。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムを用いて、これらの全長（完全長）にわたって２つの配列を整列させ、一致の数を最大限にし、ギャップの数を最小限にする。グローバルアラインメントは、２つの配列が類似の長さを有する場合、配列同一性を決定するために、好適に用いられる。一般的には、ＧＡＰデフォルトパラメーターは、ギャップ挿入時のペナルティ（ｇａｐ  ｃｒｅａｔｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）及びギャップ継続時のペナルティ（ｇａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｅｎａｌｔｙ）＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）と共に用いられる。ヌクレオチドの場合、用いられるデフォルトスコアリングマトリックス（ｄｅｆａｕｌｔ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｍａｔｒｉｘ）は、ｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、デフォルトスコアリングマトリックスは、Ｂｌｏｓｕｍ６２である（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ＆  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ  ８９巻、９１５〜９１９）。百分率配列同一性についての配列アラインメント及びスコアは、コンピュータプログラム、例えば、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから入手可能なＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３を用いて、又はオープンソースソフトウェア、例えば、ＥｍｂｏｓｓＷＩＮ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．１０．０における（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを用いた）「ｎｅｅｄｌｅ」又は（ローカルＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いた）「ｗａｔｅｒ」というプログラムを用いて、上記ＧＡＰに関して同じパラメーターを用いて、又はデフォルト設定（「ｎｅｅｄｌｅ」の場合と「ｗａｔｅｒ」の場合の両方並びにタンパク質の場合とＤＮＡアラインメントの場合の両方、デフォルトギャップ開始時のペナルティ（Ｇａｐ  ｏｐｅｎｉｎｇ  ｐｅｎａｌｔｙ）は、１０．０であり、デフォルトギャップ継続時のペナルティは、０．５であり；デフォルトスコアリングマトリックスは、タンパク質の場合Ｂｌｏｓｕｍ６２であり、ＤＮＡの場合ＤＮＡＦｕｌｌである）を用いて決定してもよい。配列が、実質的に異な���全体の長さを有する場合、ローカルアラインメント、例えば、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いたもの等が好ましい。
【００３０】
或いは、百分率類似性又は同一性は、アルゴリズム、例えば、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等を用いて、公開データベースに対して検索することにより決定することができる。したがって、本発明の核酸及びタンパク質配列は、「問い合わせ配列」としてさらに用いて、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定するために、公開データベースに対して調査を行うことができる。かかる検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０）を用いて行うことができる。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で行って、本発明のアシルトランスフェラーゼ核酸分子と相同のヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で行って、本発明のタンパク質分子と相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較のために、ギャップを作った（ｇａｐｐｅｄ）アラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５巻（１７号）：３３８９〜３４０２頁に記載されている通り、利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのホームページ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を参照のこと。
【００３１】
任意選択で、アミノ酸類似性の程度を決定するときに、当業者はまた、当業者に明らかなように、いわゆる「保存的」アミノ酸置換を考慮に入れることもできる。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の基は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり；脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の基は、セリン及びトレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の基は、アスパラギン及びグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸の基は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸の基は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンであり；硫黄−含有側鎖を有するアミノ酸の基は、システイン及びメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、アスパラギン酸−グルタミン酸及びアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示されるアミノ酸配列の置換変異体は、開示された配列中の少なくとも１つの残基が、除去され、異なる残基が、その場所に挿入されるものである。アミノ酸の変化は、保存的であることが好ましい。天然に存在するアミノ酸のそれぞれの場合の好ましい保存的置換は、次の通りである。すなわち、Ａｌａからｓｅｒ；ａｒｇからｌｙｓ；ａｓｎからｇｌｎ又はｈｉｓ；ａｓｐからｇｌｕ；ｃｙｓからｓｅｒ又はａｌａ；ｇｌｎからａｓｎ；ｇｌｕからａｓｐ；ｇｌｙからｐｒｏ；ｈｉｓからａｓｎ又はｇｌｎ；ｉｌｅからｌｅｕ又はｖａｌ；ｌｅｕからｉｌｅまたｖａｌ；ｌｙｓからａｒｇ；ｇｌｎ又はｇｌｕ；ｍｅｔからｌｅｕ又はｉｌｅ；ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕ又はｔｙｒ；ｓｅｒからｔｈｒ；ｔｈｒからｓｅｒ；ｔｒｐからｔｙｒ；ｔｙｒからｔｒｐ又はｐｈｅ；及びｖａｌからｉｌｅ又はｌｅｕである。
【００３２】
本明細書で使用される場合、用語「選択的にハイブリダイズしている」、「選択的にハイブリダイズする」及び類似の用語は、ハイブリダイゼーション及び洗浄の場合の条件を記載することを目的としており、その条件下で、互いに少なくとも６６％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％又はより好ましくは少なくとも９９％相同のヌクレオチド配列は、通常、互いにハイブリダイズしたままである。すなわち、かかるハイブリダイズしている配列は、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、より好ましくは、少なくとも９８％又はより好ましくは、少なくとも９９％配列同一性を共有し得る。
【００３３】
かかるハイブリダイゼーション条件の好ましい限定しない例では、約４５℃で６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でハイブリダイズし、その後、約５０℃、好ましくは約５５℃、好ましくは約６０℃、さらにより好ましくは約６５℃で、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回又は複数回洗浄する。
【００３４】
非常に厳密な条件には、例えば、５×ＳＳＣ／５×デンハート液／１．０％ＳＤＳ中の約６８℃でのハイブリダイゼーション及び室温での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中の洗浄が含まれる。或いは、洗浄は、４２℃で行ってもよい。
【００３５】
当業者は、厳密な及び非常に厳密なハイブリダイゼーション条件に適用するべきかを知っている。かかる条件に関する追加の指針は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎ．Ｙ．；及びＡｕｓｕｂｅｌら（編）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１年）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９５年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．）において、当技術分野で容易に利用可能である。
【００３６】
もちろん、ポリＡ配列（例えば、ｍＲＮＡｓの３’末端ポリ（Ａ）トラクト等）にのみ、又はＴ（若しくはＵ）残基の相補的な伸展にのみハイブリダイズするポリヌクレオチドは、このようなポリヌクレオチドが、ポリ（Ａ）伸展又はその補体（例えば、実際には、任意の二重鎖ｃＤＮＡクローン）を含有する任意の核酸分子にハイブリダイズするはずであるため、本発明の核酸の部分に特異的にハイブリダイズするために用いられる本発明のポリヌクレオチドに含まれないはずである。
【００３７】
「核酸コンストラクト」又は「核酸ベクター」は、本明細書において、組換え型ＤＮＡ技術の使用から生じる人工の核酸分子を意味するものと理解される。したがって、核酸コンストラクトが、天然に存在する核酸分子（の部分）を含むことができるが、用語「核酸コンストラクト」は、天然に存在する核酸分子を含まない。用語「発現ベクター」又は「発現コンストラクト」とは、かかる配列に適合する宿主細胞又は宿主生物において遺伝子の発現を行うことが可能であるヌクレオチド配列を意味する。これらの発現ベクターには、通常、少なくとも適当な転写制御配列、任意選択で、３’転写終結シグナルが含まれる。発現を行う上で必要な又は有益な追加の因子はまた、例えば、発現エンハンサー要素等が存在し得る。発現ベクターは、適当な宿主細胞に導入され、宿主細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養中で、コード配列の発現を行うことが可能である。発現ベクターは、本発明の宿主細胞又は生物における複製に適している。
【００３８】
本明細書で使用される場合、用語「プロモーター」又は「転写制御配列」とは、１つ又は複数のコード配列の転写を制御するために機能し、コード配列の転写開始部位の転写の方向に対して上流に位置し、ＤＮＡ−依存ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、転写開始部位及び、それだけには限らないが、転写因子結合部位、リプレッサー及びアクチベータータンパク質結合部位を含めた任意の他のＤＮＡ配列、並びにプロモーターからの転写の量を調節するために、直接又は間接的に作用することが当業者に公知のヌクレオチドの任意の他の配列の存在によって構造的に同定される、核酸断片を意味する。「構成的な」プロモーターは、ほとんどの生理的及び発生的条件下で、ほとんどの細胞、好ましくは、細菌の細胞中で活性があるプロモーターである。「誘導性」プロモーターは、例えば、化学誘導物質の適用により、生理学的に又は発生学的に調節されるプロモーターである。
【００３９】
用語「選択可能なマーカー」は、当業者によく知られている用語であり、本明細書において、任意の遺伝子実体を記載するために用いられ、これは、表す場合、選択可能なマーカーを含有する１つ又は複数の細胞について選択するために用いることができる。用語「レポーター」は、可視のマーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等を意味するために主に用いられるが、マーカーと同義的に用いることができる。選択可能なマーカーは、優性でも劣性でも双方向性でもよい。
【００４０】
本明細書で使用される場合、用語「動作可能に連結される」とは、機能的関連性におけるポリヌクレオチド要素の連結を意味する。別の核酸配列と機能的関連性に配置される場合、核酸は、「動作可能に連結される」。例えば、転写制御配列は、コード配列の転写に影響を与える場合、コード配列に動作可能に連結される。動作可能に連結されるとは、連結されているＤＮＡ配列が、通常、連続し、２つのタンパク質コード化領域と一緒になる必要がある場合、連続し、読み枠内であることを意味する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、用語「ペプチド」は、通常、定義された配列を有する、アミノ酸残基の鎖として定義される。本明細書で使用される場合、用語ペプチドは、用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」と置換え可能である。本発明に関連して、用語「ペプチド」は、改変された又は改変されていないペプチド結合によって連結される少なくとも２つのアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質であると定義される。用語「ペプチド」とは、短鎖分子、例えば、オリゴペプチド若しくはオリゴマー等を意味し、又は長鎖分子、例えば、タンパク質等を意味する。タンパク質／ペプチドは、直鎖、分枝又は環式となり得る。ペプチドは、Ｄアミノ酸、Ｌアミノ酸、又はその組合せを含むことができる。本発明によるペプチドは、修飾アミノ酸を含むことができる。したがって、本発明のペプチドはまた、自然過程、例えば、転写後の修飾等により又は化学過程により修飾することもできる。これらの修飾のいくつかの例は、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンとの共有結合、ヘムとの共有結合、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体との共有結合、改変された又は改変されていない炭水化物部分への共有結合、脂質又は脂質誘導体との結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）との共有結合、架橋結合、環化、ジスルフィド結合形成、脱メチル化、システイン分子形成、ピログルタミン酸形成、ホルミル化、γ−カルボキシル化、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、酸化、リン酸化、ラセミ化等である。したがって、ペプチドの免疫原性を除去する効果を有さないペプチドの任意の修飾は、本発明の範囲内で包含される。
【００４２】
用語「遺伝子」とは、適当な制御領域（例えば、プロモーター）に動作可能に連結される、細胞中でＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）を含む、ＤＮＡ断片を意味する。遺伝子は、通常、いくつかの動作可能に連結される断片、例えば、プロモーター、５’リーダー配列、コード領域及びポリアデニル化部位を含む３’−非翻訳配列（３’−末端）を含む。「遺伝子の発現」とは、適切な制御領域、特に、プロモーターに動作可能に連結されるＤＮＡ領域が、ＲＮＡに転写され、生物学的活性がある、すなわち、生物学的活性があるタンパク質又はペプチドに翻訳されることが可能である過程を意味する。用語「相同の」とは、所与の（組換え型）核酸又はポリペプチド分子と所与の宿主生物又は宿主細胞との間の関連を示すために用いる場合、性質上、核酸又はポリペプチド分子が、同種、好ましくは、同じ変種又は株の宿主細胞又は生物によって産生されることを意味するものと理解される。宿主細胞と相同である場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、通常、別の（異種）プロモーター配列に動作可能に連結される（が、必ずしも動作可能に連結されるわけではなく）、適用可能な場合、その自然環境中よりも別の（異種）分泌型シグナル配列及び／又は転写終結配列に動作可能に連結される。制御配列、シグナル配列、転写終結配列等は、宿主細胞と相同となり得ることが理解される。
【００４３】
核酸（ＤＮＡ若しくはＲＮＡ）又はタンパク質に関して用いられる場合、用語「異種」及び「外因性の」とは、それが存在している生物、細胞、ゲノム又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列の部分として自然に生じない、又は自然に見出されるものと異なるゲノム又はＤＮＡ又はＲＮＡ配列の、細胞又は１カ所若しくは複数カ所の位置において判明している核酸又はタンパク質を意味する。異種及び外因性の核酸又はタンパク質は、細胞に内因性でなく、そこに導入されるが、別の細胞から得られている又は合成によって若しくは組換えによって産生されている。一般には、必ずしもそうでないが、かかる核酸は、タンパク質、すなわち、ＤＮＡが、転写される又は発現される細胞によって通常産生されない外因性のタンパク質をコードする。同様に、外因性のＲＮＡは、外因性のＲＮＡが存在する細胞中で通常発現しないタンパク質をコードする。異種／外因性の核酸及びタンパク質はまた、外来の核酸又はタンパク質とも称され得る。当業者が、それが発現される細胞に対して外来と認識しているはずである任意の核酸又はタンパク質は、本明細書では、用語異種若しくは外因性の核酸又はタンパク質によって包含される。用語異種及び外因性はまた、核酸又はアミノ酸配列の非天然の組合せ、すなわち、合わせた配列のうちの少なくとも２つが、互いに対して外来である組合せに適用する。
【００４４】
本明細書で使用される場合、用語「免疫応答」とは、その表面で抗原及び／又は抗原エピトープを運搬する及び／又は抗原及び／又は抗原エピトープを発現する又は抗原及び／又は抗原エピトープを提示する、ある特定の抗原実体の分解及び／又は阻害に対して方向づける及び／又はある特定の抗原実体の分解及び／又は阻害において支援する抗体及び／又は細胞（例えば、Ｔリンパ球）の産生を意味する。本発明の目的の場合、語句「有効な免疫防御応答」、「免疫保護」及び同様の用語とは、ワクチン接種した対象において、病原体による感染に対して又はがんに対して保護するために、病原体、病原体に感染した細胞又はがん細胞の１種又は複数の抗原エピトープに対して方向づけられる免疫応答を意味する。本発明の目的の場合、病原体による感染に対する保護又はがんに対する保護には、感染症又はがんの絶対的な予防だけでなく、病原体による感染症又はがんの程度若しくは速度の任意の検出可能な減少、又は例えば、ワクチン未接種の感染した対象と比較して、ワクチン接種した対象において、病原体又はがんにより感染症を生じる疾患又は任意の症状若しくは状態の重症度の任意の検出可能な減少も含まれる。がんの場合における有効な免疫防御応答には、がん細胞を一掃し、それによって、がんのサイズを縮小し、さらに、がんを消滅させることも含まれる。これを達成するためのワクチン接種は、治療的ワクチン接種とも呼ばれる。或いは、有効な免疫防御応答は、病原体に前もって感染していない対象及び／又は病原体に感染してない対象又はワクチン接種時にがんにいまだ罹ってない対象において誘導することができ、かかるワクチン接種は、予防ワクチン接種と称することができる。
【００４５】
本発明によれば、用語「抗原」の本明細書における一般的な使用は、ある抗体に特異的に結合する任意の分子を意味する。用語はまた、ＭＨＣ分子によって結合し、Ｔ−細胞受容体に提示することができる任意の分子又は分子の断片を意味する。抗原は、例えば、タンパク質性分子となり得る、すなわち、任意選択で、非−タンパク質基、例えば、炭水化物部分及び／又は脂質部分又は抗原を含む、ポリアミノ酸配列は、例えば、タンパク質性でない分子、例えば、炭水化物等となり得る。抗原は、例えば、タンパク質（ペプチド、部分タンパク質、全長タンパク質）の任意の部分となり得、タンパク質は、ある特定の対象において抗原−特異的免疫応答（体液性及び／又は細胞性免疫応答）を誘発することが可能であり、免疫応答が、好ましくは、アッセイ又は方法によって測定可能である、天然に存在する又は合成に由来する、細胞の構成（全細胞、細胞ライセート又は破壊された細胞）、生物（全生物、ライセート若しくは破壊された細胞）又は炭水化物又は他の分子、又はその部分である。
【００４６】
用語「抗原」は、本明細書において、適応免疫応答の受容体についての標的として働く構造物質として理解される。したがって、抗原は、ＴＣＲ（Ｔ−細胞受容体）又はＢＣＲ（Ｂ−細胞受容体）又はＢＣＲの分泌形態、すなわち、抗体についての標的として働く。したがって、抗原は、タンパク質、ペプチド、炭水化物又は通常、より大型の構造の部分、例えば、細胞又はビリオン等である、他のハプテンとなり得る。抗原は、体内（「自己」）から又は外部環境（「非自己」）から生じ得る。免疫系は、胸腺においてＴ細胞の負の選択により、正常な条件下で「自己」抗原に対して、通常、非反応性であり、外の世界からの「非自己」の侵入者又は例えば、疾患状態下で、体内に存在する改変された／有害な物質のみを同定し攻撃すると想像される。細胞性免疫応答の標的である抗原の構造は、処理された抗原ペプチドの形態の抗原提示細胞（ＡＰＣ）により、組織適合性分子を介して、適応免疫系のＴ細胞に提示される。提示される抗原及び組織適合性分子のタイプに応じて、Ｔ細胞のいくつかのタイプは、活性化することができる。Ｔ−細胞受容体（ＴＣＲ）認識の場合、抗原は、細胞の内側で小型のペプチド断片に加工され、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）によりＴ−細胞受容体に提示される。
【００４７】
用語「免疫原」は、好ましくは、適切なアジュバントと一緒に対象に投与される場合、エピトープ及びエピトープを含む抗原に対して対象において特異的な体液性及び／又は細胞性免疫応答を誘発するように、抗原の少なくとも１種のエピトープを含む又はコードする実体を記載するために本明細書において用いられる。免疫原は、抗原と同一となり得、又は抗原の一部、例えば、抗原のエピトープを含む一部分を少なくとも含む。したがって、ある特定の抗原に対して対象にワクチン接種することは、一実施形態では、抗原の少なくとも１種のエピトープを含む免疫原の投与の結果として、免疫応答が、抗原又はその免疫原性部分に対して誘発されることを意味する。ワクチン接種は、保護又は治療効果をもたらすことが好ましく、抗原（又は抗原の発生源）へのその後の曝露によって、対象において疾患又は状態を軽減する又は予防する抗原（又は発生源）に対する免疫応答が誘発される。ワクチン接種の概念は、当技術分野で周知である。本発明の予防用又は治療用組成物の投与によって誘発される免疫応答は、ワクチンの投与がない場合と比較して、免疫状態（例えば、細胞応答、体液性応答、サイトカイン産生）の任意の面において、任意の検出可能な変化となり得る。
【００４８】
「エピトープ」は、対象において免疫応答を誘発するのに十分である所与の抗原内で、単一の免疫原性部位と、本明細書において定義される。当業者は、Ｔ細胞エピトープが、サイズ及び組成物がＢ細胞エピトープと異なり、クラスＩ  ＭＨＣ経路を通して提示されるＴ細胞エピトープが、クラスＩＩ  ＭＨＣ経路を通して提示されるエピトープと異なることを認識している。エピトープは、免疫応答のタイプに応じて、直線的な配列又は立体構造エピトープ（保存される結合領域）となり得る。抗原は、単一のエピトープくらい小型でもより大型でもよく、複数のエピトープを含むこともできる。したがって、抗原のサイズは、約５〜１２個のアミノ酸（例えば、ペプチド）くらい小型となり得、多量体タンパク質、タンパク質複合体、ビリオン、粒子、細胞全体、微生物全体、又はそれらの部分（例えば、細胞全体のライセート又は微生物の抽出物）を含めて、全長タンパク質くらい大型となり得る。
【００４９】
アジュバントは、本明細書において、対象において抗原に対して免疫応答を高めるために、ヒト又は動物対象に抗原と組み合わせて投与される場合、免疫系を刺激し、それによって、好ましくは、必ずしも、アジュバント自体に、ある特定の免疫応答を引き起こさせずに、抗原に対して免疫応答を誘発する、増強する又は促進する実体であることが理解される。好ましいアジュバントは、同じ条件下であるが、アジュバントの非存在下で、抗原に対して引き起こされた免疫応答と比較して、１．５、２、２．５、５、１０又は２０個のうちの少なくとも１つの因子により、所与の抗原に対して免疫応答を増強する。対応する対照群に対する動物又はヒト対象の群におけるアジュバントにより産生された所与の抗原に対する免疫応答の統計的平均の増強を決定するための試験は、当技術分野で利用可能である。アジュバントは、好ましくは、少なくとも２つの異なる抗原に対して免疫応答を増強することが可能である。
【００５０】
ＯＭＶ（「ｂｌｅｂｓ」とも称される）は、グラム陰性菌の外膜からつまみ取られる、二分子膜構造、通常、球状であり、直径が、２０〜２５０ｎｍ（時には１０〜５００ｎｍ）の範囲である。ＯＭＶ膜は、内側にリン脂質（ＰＬ）を含有し、外側にリポ多糖類（ＬＰＳ）及びＰＬを含有し、様々な位置で膜タンパク質と混合され、細菌の外膜の構造を大いに反映し、そこから、これらをつまみ取る。ＯＭＶの管腔は、周辺質又は細胞質からの様々な化合物、例えば、タンパク質、ＲＮＡ／ＤＮＡ、及びペプチドグリカン（ＰＧ）を含有することができるが、細菌の細胞と異なり、ＯＭＶは、自己複製する能力が欠如している。本発明に関連して、ＯＭＶの３つのタイプは、これらの産生の方法に応じて、区別することができる。ｓＯＭＶは、未変化の細胞を、既に形成されたＯＭＶから分離することにより、培養上清から精製され濃縮された、自然発生の又は天然のＯＭＶである。界面活性剤ＯＭＶ、ｄＯＭＶは、界面活性剤、例えば、デオキシコラート（ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ）によって細胞から抽出され、これはまた、反応源性ＬＰＳの含有量を減少させる。界面活性剤を抽出した後、ｄＯＭＶは、細胞及び細胞残渣から分離され、さらに精製され、濃縮される。最後に、用語未変性ｎＯＭＶは、本明細書において、非界面活性剤細胞破壊技法により、濃縮された死細胞から生成される、又は他の（非破壊的）界面活性剤無しで行う方法によって（例えば、キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ等を用いて）、細胞から抽出されるＯＭＶについて用いて、野生型の自然発生のＯＭＶ及び界面活性剤によって抽出されたｄＯＭＶと明らかに区別することが可能である。
【００５１】
本明細書における公開配列データベースでアクセス可能なヌクレオチド又はアミノ酸配列に関する任意の参照は、この文献の提出日において利用可能な配列のエントリーのバージョンを意味する。
【００５２】
ボルデテラＬＰＳの改変された脂質Ａ部分のアシル鎖の長さ
本発明は、ボルデテラ脂質Ａ部分のアシル鎖の長さを縮小することにより、ＬＰＳ内毒素性を低下させるという驚くべき発見に関する。本発明は、脂質Ａ部分の３位でアシル鎖の長さを増加させることによって、ボルデテラ種の致死性をもたらすという予期しない知見をさらに開示している。したがって、本発明は、アシルトランスフェラーゼのある特定のサブセットが、ボルデテラ種において用いて、アシル鎖の長さを縮小し、したがって、ボルデテラＬＰＳの内毒素性を低下させることができるということを開示している。
【００５３】
したがって、第１の態様では、本発明は、少なくとも１本のアシル鎖の長さがより短いという点で、野生型ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分と比較して、改変されている脂質Ａ部分を有するボルデテラＬＰＳに関する。いかなる理論によっても縛られることを望まないが、アシル鎖の長さのかかる改変は、アクセサリー分子、例えば、ＣＤ１４の結合に影響を与え得る。アクセサリー分子は、異なる細菌のＬＰＳへの有意に異なる結合親和性を有し［２３］、これは、アシル鎖の長さによって潜在的に影響を与えられ得る。
【００５４】
野生型ボルデテラリポ多糖類（ＬＰＳ）は、ペンタ−アシル化される脂質Ａ部分を含有する。野生型百日咳菌ＬＰＳの脂質Ａ部分は、図１に示される。図１中に示されるように、百日咳菌の脂質Ａ部分は、４本の第１のアシル鎖及び１本の第２のアシル鎖を含有する。第２のアシル鎖は、２’（２プライム）位で第１のアシル鎖に連結され、第２のアシル鎖の野生型の長さは、Ｃ１４である。さらに第２のアシル鎖に対して、第１のアシル鎖は、常に、これらの３’−末端（３−ＯＨ）でヒドロキシル化される。
【００５５】
第１のアシル鎖は、それぞれ、脂質Ａ部分の２及び３位並びに２’（２プライム）及び３’（３プライム）位となる。第１のアシル鎖のアシル鎖の野生型の長さは、２、２’及び３’位でＣ１４であり、３位における野生型アシル鎖の長さは、Ｃ１０である。
【００５６】
さらに、用語「２、３、２’又は３’位におけるアシル鎖」及び「２、３、２’又は３’位における第１のアシル鎖」は、本明細書において置換え可能で用いることができるということが理解される。
【００５７】
さらに、脂質Ａ部分中の「プライム」位におけるアシル鎖を参照する場合、非還元末端におけるグルコサミンの位置が意図されることが、本明細書において理解される。例えば、３’位におけるアシル鎖は、非還元末端においてグルコサミンの３位に結合されるアシル鎖である。
【００５８】
また、脂質Ａ部分中のある特定の（すなわち、プライムでない）位置におけるアシル鎖を参照する場合、還元末端におけるグルコサミンの位置が意図されることが本明細書において理解される。例えば、３位におけるアシル鎖は、還元末端においてグルコサミンの３位に結合されるアシル鎖である。同様に、語句「〜より大きいアシル鎖」及び「〜より長いアシル鎖」は、本明細書において置換え可能で用いることができる。
【００５９】
語句「〜より短いアシル鎖」及び「〜より小さいアシル鎖」は、本明細書において置換え可能で用いることができる。
【００６０】
より短いアシル鎖が、アシル鎖の完全な非存在を含まないことが、本明細書において理解される。したがって、より短いアシル鎖は、野生型脂質Ａ部分の同じ位置におけるアシル鎖の長さよりも短いにもかかわらず、アシル鎖の存在を意味する。アシル鎖は、３−ヒドロキシプロピオン酸より短くない、又はプロピオン酸（Ｃ３）より短くないことが好ましい。
【００６１】
本文中の野生型脂質Ａ部分（又は修飾されていない脂質Ａ部分）について言及される場合、別段の指示がない限り、図１において例示される野生型百日咳菌ＬＰＳの脂質Ａ部分が最小限で意図される。同様に、他のボルデテラ種の野生型脂質Ａ部分は、開示された発明の一部である。ボルデテラ脂質Ａ部分は、例えば、Ｃａｒｏｆｆら（Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ４（２００２年）：９１５〜９２６頁、参照により本明細書に組み込まれる）の図２に開示される。野生型脂質Ａ部分は、ペンタ−又はヘキサ−アシル化され得る。野生型ＬＰＳの脂質Ａ部分が、ヘキサ−アシル化される場合には、２本の第２のアシル鎖がある（一方が２’位で、もう一方が３’位である）。脂質Ａ部分のボルデテラ野生型アシル鎖が、ヘキサ−アシル化される場合には、第２のアシル鎖が、２’位における及び／又は３’位における第２のアシル鎖として解釈されるべきであることについて、本文中の任意の参照がなされた。
【００６２】
好ましい実施形態において、１本のみのアシル鎖の長さは、同じ位置で、野生型脂質Ａ部分のアシル鎖より短い。１本の第１のアシル鎖の長さは、より短いことが好ましい。２、３、２’又は３’位における第１のアシル鎖の長さのみが、それぞれ２、３、２’又は３’位で、野生型ボルデテラアシル鎖の長さよりも短いことがより好ましい。或いは、第２のアシル鎖の長さのみが、野生型ボルデテラ第２のアシル鎖の長さよりも短い。
【００６３】
代替の実施形態では、少なくとも１本のアシル鎖の長さは、より短い。特に、少なくとも２位におけるアシル鎖の長さは、２位における野生型の長さよりも短い、したがって、Ｃ１４よりも短い。或いは、少なくとも３位における又は２’位におけるアシル鎖は、それぞれ３又は２’位で野生型の長さよりも短い、したがって、それぞれＣ１０又はＣ１４より短い。他の実施形態では、少なくとも３’位におけるアシル鎖の長さは、３’位におけるアシル鎖の野生型の長さよりも短い、したがって、Ｃ１４よりも短い。或いは、第２のアシル鎖における少なくともアシル鎖の長さは、野生型第２のアシル鎖の長さよりも短い、したがって、Ｃ１４よりも短い。
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも１本のアシル鎖の長さがより短く、より短いアシル鎖が、
ｉ）脂質Ａ部分の３’位におけるアシル鎖；
ｉｉ）脂質Ａ部分の２’位における第１のアシル鎖；
ｉｉｉ）脂質Ａ部分の２’位における第２のアシル鎖；及び
ｉｖ）脂質Ａ部分の２位におけるアシル鎖からなる群から選択されるという点で、野生型ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分と比較して、改変されている脂質Ａ部分を有するボルデテラＬＰＳに関する。
【００６４】
さらに好ましい実施形態では、脂質Ａ部分中の少なくとも２、３、４又は５本（すべて）のアシル鎖の長さは、同じ位置で野生型の長さよりも短い。２及び２’位における（少なくとも）アシル鎖の長さが、それぞれ２及び２’位における野生型アシル鎖のアシル鎖の長さよりも短いことが好ましい。
【００６５】
したがって、好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも１本のアシル鎖の長さがより短く、アシル鎖が、Ｃ原子が少なくとも２、４又は６個短いという点で、野生型ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分と比較して、改変されている脂質Ａ部分を有するボルデテラＬＰＳに関する。少なくとも１本のより短いアシル鎖は、上記で指定したアシル鎖のうちのいずれかとなり得る。少なくとも１本のより短いアシル鎖は、野生型ボルデテラの脂質Ａ部分の同じ位置におけるアシル鎖の長さと比較して、好ましくは、Ｃ原子が少なくとも１２、１０、８、６、４又は２個短い。或いは、より短いアシル鎖は、好ましくは、Ｃ原子が最大でも２、４、６、８、１０又は１２個短い。より好ましくは、アシル鎖は、Ｃ原子が少なくとも８、６、４又は２個短く、より好ましくは、Ｃ原子が少なくとも４又は２個短く、さらにより好ましくは、Ｃ原子が少なくとも２個短い。最も好ましい実施形態では、改変されたアシル鎖は、野生型ボルデテラの脂質Ａ部分の同じ位置におけるアシル鎖の長さと比較して、Ｃ原子が２個短い。
【００６６】
好ましい実施形態において、２位におけるアシル鎖の長さは、野生型ボルデテラの脂質Ａ部分の２位におけるアシル鎖の長さと比較して、好ましくは、Ｃ原子が少なくとも１２、１０、８、６、４、又は２個短い。或いは、より短いアシル鎖は、好ましくは、Ｃ原子が最大でも２、４、６、８、１０又は１２個短い。したがって、改変された脂質Ａ部分の２位におけるアシル鎖の長さは、好ましくは、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０又はＣ１２である。
【００６７】
或いは又はさらに、３位におけるアシル鎖の長さは、野生型ボルデテラの脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さと比較して、好ましくは、Ｃ原子が少なくとも１４、１２、１０、８、６、４、又は２個短い。或いは、より短いアシル鎖は、好ましくは、Ｃ原子が最大でも２、４、６、８、１０、１２又は１４個短い。したがって、改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さは、好ましくは、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０、Ｃ１２又はＣ１４であり、より好ましくはＣ２、Ｃ４、Ｃ６又はＣ８である。
【００６８】
或いは又はさらに、２’位におけるアシル鎖の長さは、野生型ボルデテラの脂質Ａ部分の２’位におけるアシル鎖の長さと比較して、好ましくは、Ｃ原子が少なくとも１２、１０、８、６、４、又は２個短い。或いは、より短いアシル鎖は、好ましくは、Ｃ原子が最大でも２、４、６、８、１０又は１２個短い。したがって、改変された脂質Ａ部分の２’位におけるアシル鎖の長さは、好ましくは、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０又はＣ１２である。
【００６９】
或いは又はさらに、３’位におけるアシル鎖の長さは、野生型ボルデテラの脂質Ａ部分の３’位におけるアシル鎖の長さと比較して、好ましくは、Ｃ原子が少なくとも１２、１０、８、６、４、又は２個短い。或いは、より短いアシル鎖は、好ましくは、Ｃ原子が最大でも２、４、６、８、１０又は１２個短い。したがって、改変された脂質Ａ部分の３’位におけるアシル鎖の長さは、好ましくは、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０又はＣ１２である。
【００７０】
最後に、或いは又はさらに、第２のアシル鎖のアシル鎖の長さは、野生型ボルデテラの脂質Ａ部分の第２のアシル鎖の長さと比較して、好ましくは、Ｃ原子が少なくとも１２、１０、８、６、４、又は２個短い。或いは、より短いアシル鎖は、好ましくは、Ｃ原子が最大でも２、４、６、８、１０又は１２個短い。したがって、改変された脂質Ａ部分の第２のアシル鎖の長さは、好ましくは、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０又はＣ１２である。
【００７１】
さらに、野生型アシル鎖の長さよりも短くない、改変された脂質Ａ部分の１，２、３又は４本のアシル鎖の長さは、野生型脂質Ａ部分の同じ位置におけるアシル鎖よりも大きい長さを有し得る。したがって、さらなる実施形態では、改変された脂質Ａ部分の少なくとも１本のアシル鎖の長さは、好ましくは、上記で指定した長さにおいてより短い、同じ改変された脂質Ａ部分中の別のアシル鎖に加えて、脂質Ａ部分中の同じ位置における野生型アシル鎖の長さよりも大きい。少なくとも２、３、２’及び／又は３’位における、より好ましくは、２、２’及び／又は３’位における第１のアシル鎖の長さは、脂質Ａ部分中の同じ位置における野生型アシル鎖の長さよりも大きいことが好ましい。或いは、又はさらに、第２のアシル鎖の長さは、野生型ボルデテラ脂質Ａ部分の第２のアシル鎖の長さよりも大きい。
【００７２】
しかしながら、好ましい実施形態において、本発明は、少なくとも１本のアシル鎖の長さがより短く、改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さが、同じ３位における野生型ボルデテラ脂質Ａ部分のアシル鎖よりも長さが大きくないという点で、野生型ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分と比較して、改変されている脂質Ａ部分を有するボルデテラＬＰＳに関する。
【００７３】
したがって、３位におけるアシル鎖は、上記で指定した通り、（野生型ボルデテラの脂質Ａ部分が、例えば、パラ百日咳菌（Ｂ．ｐａｒａｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）である場合では）好ましくは、Ｃ１６若しくはそれ以下、（野生型ボルデテラの脂質Ａ部分が、例えば、気管支敗血症菌（Ｂ．ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）又はボルデテラ・ヒンジイ（Ｂ．ｈｉｎｚｉｉ）の場合では）Ｃ１２若しくはそれ以下（野生型ボルデテラの脂質Ａ部分が、例えば、百日咳菌である場合では）又はＣ１０若しくはそれ以下である。特に、下記に例示される本発明は、３位におけるアシル鎖の長さが、同じ３位における野生型アシル鎖の長さを超えて増加することによって、ボルデテラ種の致死性をもたらし得るということを教示している。したがって、最も好ましい実施形態では、改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さは、Ｃ１０を超えない。
【００７４】
同様に、好ましい実施形態において、改変された脂質Ａ部分の２、２’又は３’位における第１のアシル鎖の長さは、Ｃ１４を超えない及び／又は第２のアシル鎖の長さは、Ｃ１４を超えない。
【００７５】
或いは又はさらに、改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さは、３’位におけるアシル鎖の長さと同じである。したがって、３位におけるアシル鎖並びに３’位におけるアシル鎖は両方とも、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ１０、Ｃ１２、Ｃ１４又はＣ１６である。両方のアシル鎖は、Ｃ１０又はＣ１２であることが好ましく、両方のアシル鎖は、Ｃ１０であることが最も好ましい。
【００７６】
上記で概略した通り、改変された脂質Ａ部分中の１本又は複数本のアシル鎖の長さは、脂質Ａ部分中の同じ位置における野生型アシル鎖の長さよりも短い。野生型の長さと比較して短くないアシル鎖は、野生型アシル鎖の長さと同じ長さでもよく、より長くてもよい。野生型の長さと比較して短くないアシル鎖は、野生型ボルデテラ脂質Ａ部分のアシル鎖と同じ長さのままであることが好ましく、例えば、不変のままである。
【００７７】
特に好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１本のアシル鎖の長さがより短く、改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さが、同じ３位における野生型ボルデテラ脂質Ａ部分のアシル鎖と同じ長さであるという点で、野生型ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分と比較して、改変されている脂質Ａ部分を有するボルデテラＬＰＳに関する。したがって、改変されたボルデテラ脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さは、Ｃ１０であることが好ましい。さらに又は或いは、改変された脂質Ａ部分中の２、２’及び３’位のうちの少なくとも１本のアシル鎖は、野生型ボルデテラ脂質Ａ部分のそれぞれ２、２’又は３’位においてアシル鎖と同じ長さを有し得る。したがって、好ましい実施形態において、改変された脂質Ａ部分の２、２’又は３’位のうちの少なくとも１本のアシル鎖の長さは、Ｃ１４である。同様に、２’位における第２のアシル鎖の長さは、野生型第２のアシル鎖と同じ長さである、すなわち、Ｃ１４である。
【００７８】
したがって、本発明の改変されたボルデテラ脂質Ａ部分は、野生型ボルデテラ脂質Ａ部分において同じ位置（複数可）でアシル鎖（複数可）より短い１本又は複数本のアシル鎖及び／又は野生型ボルデテラ脂質Ａ部分において同じ位置（複数可）でアシル鎖（複数可）よりも長い１本又は複数本のアシル鎖及び／又は野生型ボルデテラ脂質Ａ部分において同じ位置（複数可）でアシル鎖（複数可）と同じ長さを有する１本又は複数本のアシル鎖を有し得る。改変された脂質Ａ部分は、野生型ボルデテラ脂質Ａ部分の同じ位置でアシル鎖の長さよりも短い少なくとも１本のアシル鎖を有することが最も好ましい。
【００７９】
他の実施形態では、改変された脂質Ａ部分のアシル鎖中のＣ原子の総数は、前述した野生型ボルデテラ脂質Ａ部分のアシル鎖中のＣ原子の総数と同じである。野生型ボルデテラの脂質Ａ部分のアシル鎖中のＣ原子の総数は、Ｃ１４（２位）＋Ｃ１０（３位）＋Ｃ１４（２’位）＋Ｃ１４（第２のアシル鎖）＋Ｃ１４（３’位）であり、合計で６６個のＣ原子である。したがって、好ましい実施形態において、改変された脂質Ａ部分中のアシル鎖中のＣ原子の総数は、６６個のＣ原子である。
【００８０】
或いは、改変された脂質Ａ部分中のアシル鎖中のＣ原子の総数は、野生型ボルデテラ脂質Ａ部分のアシル鎖中のＣ原子の総数よりも高く、したがって、６６個のＣ原子よりも高く、好ましくは、６８、７０、７２又は７４個のＣ原子よりも高い。
【００８１】
しかしながら、改変された脂質Ａ部分のアシル鎖中のＣ原子の総数は、野生型ボルデテラ脂質Ａ部分のアシル鎖中のＣ原子の総数よりも低く、したがって、６６個のＣ原子よりも低く、好ましくは、合計で、６４、６２、６０、５８、５６、５４、５２、５０、４８、４６、４４、４２又は４０個のＣ原子であることが好ましい。
【００８２】
特に、下記に例示される本発明では、毒性に対する効果は、より短いアシル鎖の位置と無関係に得られることが示される。したがって、脂質Ａ分子の疎水性部分の総体積は、ｈＴＬＲ４複合体への適正な結合及びｈＴＬＲ４複合体の活性化のために明らかに重要である。おそらく、より短いアシル鎖は、ＬＰＳのその受容体との相互作用に影響を与える。この膜において、ＴＬＲ４は、ＭＤ−２との複合体を形成する［２１］。ＭＤ−２は、ＬＰＳを結合させ、疎水性ポケットにおけるヘキサ−アシル化脂質Ａの６本のアシル鎖のうち５本を収容し、１本の鎖は、外側に存在し、第２のＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体のその結合によってＴＬＲ４二量体化を刺激する。また、脂質Ａのリン酸基は、第２のＴＬＲ４分子において正の電荷をもつ残基と相互作用することにより、受容体二量体化に寄与する。テトラ−アシル化脂質Ａ種において、アシル鎖は、ＭＤ−２リガンド−結合ポケットに埋没され、受容体二量体化を刺激することができず、アシル鎖のエクスポジション（ｅｘｐｏｓｉｔｉｏｎ）は、ペンタ−アシル化ＬＰＳにおいて可変である［２２］。したがって、数によって決定される、リガンドのアシル鎖の総体積、アシル鎖の長さ及び位置は、ＴＬＲ４二量体化を誘発するアシル鎖のエクスポジションを決定することができる。いかなる理論によっても縛られることを望まないが、ボルデテラ脂質Ａのアシル鎖の長さを縮小すると、アシル鎖の体積が減少し、これは、ＭＤ−２結合ポケット内のこれらの総収容を可能にすることができ、それによって、受容体二量体化のために要するアシル鎖の曝露を防止する。
【００８３】
さらに好ましい実施形態では、本発明のボルデテラＬＰＳは、上記で定義した改変された脂質Ａ部分を有する。改変された脂質Ａ部分を除いて、本発明のボルデテラＬＰＳは、他の点で、ボルデテラ属の細菌から得られる又は取得可能であるリポ多糖類の構造を有する。ボルデテラ属は、９種のグラム陰性菌を含む。これらのうち大規模に研究されているのは、呼吸器病原菌の百日咳菌、パラ百日咳菌、及び気管支敗血症菌である。百日咳菌は、ヒトのみ感染し、乳児における百日ぜき（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）の病原因子及び成人における持続性呼吸器感染症の病原因子である。パラ百日咳菌は、２種の別々の系統として存在する。１種は、ヒト宿主に適合され、百日ぜき（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）を引き起こし；もう１種は、ヒツジの宿主に適合され、慢性肺炎を引き起こすおそれがある。それに対して、気管支敗血症菌は、多数の動物の気道にコロニー形成し、これが、一部の家畜、伴侶動物、及び野生動物において、呼吸器感染症を引き起こすが、ほとんどの気管支敗血症菌感染症は、無症候性及び慢性である。気管支敗血症菌は、ヒトの気道から時折単離され、感染した動物との接触を通して獲得される可能性がある（Ｐｒｅｓｔｏｎら、Ｊ．ｏｆ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２００６年、２８１巻（２６号）：１８１３５〜１８１４４）。
【００８４】
例えば、百日咳菌、パラ百日咳菌、ボルデテラ・ヒンジイ及び気管支敗血症菌の脂質Ａ部分は、Ｃａｒｏｆｆら（参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ４巻（２００２年）：９１５〜９２６）の図２に開示されている。気管支敗血症菌及びパラ百日咳菌のＬＰＳと対照的に、百日咳菌のＬＰＳは、Ｏ−抗原ドメインをまったく含有しない（Ｐｅｐｐｌｅｒ、１９８４年；Ｄｉ  Ｆａｂｉｏら、１９９２年）。したがって、百日咳菌ＬＰＳはしばしば、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）と称される。本発明に関連して、用語「ＬＯＳ」及び「ＬＰＳ」は、本明細書において置換え可能で用いられる。コンシステンシーの理由で、本発明者らは、ＬＰＳをさらに参照するものとする。百日咳菌は、２つの優性ＬＰＳ形態、バンドＡ及びバンドＢ  ＬＰＳを産生する（Ｐｅｐｐｌｅｒ、１９８４年）。バンドＢ  ＬＰＳは、脂質Ａ及び９種の炭水化物からなるコアオリゴ糖から構成される（Ｃａｒｏｆｆら、２０００年）。Ｎ−アセチルグルコサミン、２，３−ジアセトアミド−２，３−ジデオキシ−マンヌロン酸、及び２−アセトアミド−４−Ｎ−メチル−２，４−ジデオキシ−フコースからなる末端三糖を、バンドＢ  ＬＰＳに加えると、バンドＡと称されるＬＰＳを形成する。
【００８５】
したがって、本発明は、少なくとも１本のアシル鎖の長さがより短く、本明細書で定義される、改変された脂質Ａ部分を除き、ＬＰＳが、百日咳菌、パラ百日咳菌若しくは気管支敗血症菌の構造、又は例えば、下記に本明細書に記載した通り、遺伝子改変を有するこれらの種の株を有するという点で、野生型ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分と比較して、改変されている脂質Ａ部分を有するボルデテラＬＰＳに関することが好ましい。ボルデテラＬＰＳは、改変された脂質Ａ部分を除き、百日咳菌又はパラ百日咳菌の構造を有することが好ましく、そのうち百日咳菌が、最も好ましい。
さらに好ましい実施形態では、本発明は、少なくとも１本のアシル鎖の長さがより短く、改変された脂質Ａ部分が、式（Ｉ）：
【００８６】
【化２】
2020510726.tif 000003
［式中、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ２’、Ｘ３’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ２’、及びＲ３’は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｙ、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−Ｙ、及び−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙからなる群から選択され、
Ｙは、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、Ｙのそれぞれの場合が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５から独立に選ばれる整数である］の構造を有するという点で、野生型ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分と比較して、改変されている脂質Ａ部分を有するボルデテラＬＰＳに関する。
【００８７】
Ｘ２、Ｘ３、Ｘ２’、Ｘ３’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ２’、及びＲ３’は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｙ、及び−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙからなる群から選択され、Ｙは、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、Ｙのそれぞれの場合が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５から独立に選ばれる整数であることが好ましい。
【００８８】
一般式（Ｉ）の好ましい化合物では、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ２’、及びＸ３’は、それぞれ独立に、−Ｈ、−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−Ｙ、及び−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−Ｙからなる群から選択され、Ｙは、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、Ｙのそれぞれの場合が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５から独立に選ばれる整数であり、より好ましくは、１、３、５、７、９、１１、１３又は１５から独立に選ばれる整数である。
【００８９】
一般式（Ｉ）の好ましい化合物では、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ２’、及びＲ３’は、それぞれ−Ｙであり、Ｙは、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、Ｙのそれぞれの場合が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５から独立に選ばれる整数であり、より好ましくは、１、３、５、７、９、１１、１３又は１５から独立に選ばれる整数である。
熟練した読者には明らかな通り、Ｙは、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ２’、Ｘ３’、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ２’、及びＲ３’のそれぞれの場合に異なり得、したがって、Ｙの複数の異なる場合は、一般式（Ｉ）の単一の化合物内で生じ得る。したがって、一般式（Ｉ）の好ましい化合物では、
Ｘ２は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＹＸ２、−Ｏ−ＹＸ２、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＹＸ２、及び−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２からなる群から選択され、ＹＸ２は、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５から選ばれる整数であり；Ｘ２は、−ＯＨ又は−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２であることが好ましく、Ｘ２は、−ＯＨであることが最も好ましく；
Ｘ３は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＹＸ３、−Ｏ−ＹＸ３、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＹＸ３、及び−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ３からなる群から選択され、ＹＸ３は、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５から選ばれる整数であり；Ｘ３は、−ＯＨ又は−Ｈであることが好ましく、Ｘ３は、−ＯＨであることが最も好ましく；
Ｘ２’は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＹＸ２’、−Ｏ−ＹＸ２’、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＹＸ２’、及び−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２’からなる群から選択され、ＹＸ２’は、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５から選ばれる整数であり；Ｘ２’は、−ＯＨ、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＹＸ２’、又は−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２’であることが好ましく、Ｘ２’が、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２’である場合、ｎは、１、３、５、７、９、１１、又は１３から選ばれる整数であることが好ましく、ｎは、１１又は１３であることがより好ましく、ｎは、１３であることが最も好ましく、Ｘ２’が、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＹＸ２’である場合、ｎは、２、４、６、８、１０、又は１２から選ばれる整数であることが好ましく、ｎは、１０又は１２であることがより好ましく、ｎは、１２であることが最も好ましく；Ｘ２’は、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２’であることが最も好ましく、ｎは、１３であり；
Ｘ３’は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＹＸ３’、−Ｏ−ＹＸ３’、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＹＸ３’、及び−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ３’からなる群から選択され、ＹＸ３’は、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５から選ばれる整数であり；Ｘ３’は、−ＯＨ又は−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ３’であることが好ましく、Ｘ３’が、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ３’である場合、ｎは、１、３、５、７、９、１１、１３又は１５から選ばれる整数であることが好ましく、ｎは、１３又は１５であることがより好ましく、ｎは、１５であることが最も好ましく；Ｘ３’は、−ＯＨであることが最も好ましく；
Ｒ２は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＹＲ２、−Ｏ−ＹＲ２、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＹＲ２、及び−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＲ２からなる群から選択され、ＹＲ２は、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５から選ばれる整数であり；Ｒ２は、ＹＲ２であることが好ましく；ｎは、１、３、５、７、９、又は１１から選ばれる整数であることが好ましく、ｎは、９又は１１であることがより好ましく、ｎは、１１であることが最も好ましく；Ｒ２は、ＹＲ２であることが最も好ましく、ｎは、１１であり；
Ｒ３は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＹＲ３、−Ｏ−ＹＲ３、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＹＲ３、及び−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＲ３からなる群から選択され、ＹＲ３は、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５から選ばれる整数であり；Ｒ３は、ＹＲ３であることが好ましく、ｎは、１、３、５、７、９、１１、又は１３から選ばれる整数であることが好ましく、ｎは、７、９、又は１３から選ばれる整数であることがより好ましく、ｎは、７であることが最も好ましく；Ｒ３は、ＹＲ３であることが最も好ましく、ｎは、７であり；
Ｒ２’は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＹＲ２’、−Ｏ−ＹＲ２’、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＹＲ２’、及び−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＲ２’からなる群から選択され、ＹＲ２’は、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５から選ばれる整数であり；Ｒ２’は、ＹＲ２’であることが好ましく、ｎは、１、３、５、７、９、又は１１から選ばれる整数であることが好ましく、ｎは、９又は１１であることがより好ましく、ｎは、１１であることが最も好ましく；Ｒ２’はＹＲ２’であることが最も好ましく、ｎは、１１であり；
Ｒ３’は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＹＲ３’、−Ｏ−ＹＲ３’、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＣＨ（ＯＨ）−ＹＲ３’、及び−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＲ３’からなる群から選択され、ＹＲ３’は、一般式−（ＣＨ２）ｎ−Ｈのアルキル部分であり、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５から選ばれる整数であり；Ｒ３’は、ＹＲ３’であることが好ましく、ｎは、１、３、５、７、９、又は１１から選ばれる整数であることが好ましく、ｎは、７又は１１であることがより好ましく、ｎは、１１であることが最も好ましく；Ｒ３’は、ＹＲ３’であることが最も好ましく、ｎは、１１であり；
一般式（Ｉ）の化合物が、−ＹＸ２、−ＹＸ３、−ＹＸ２’、又は−ＹＸ３’を含む場合、ｎは、奇数であることが好ましく、５、７、９、１１、１３、又は１５であることがより好ましく、１１又は１３であることが最も好ましい。一般式（Ｉ）の化合物が、−ＹＲ２、−ＹＲ３、−ＹＲ２’、又は−ＹＲ３’を含む場合、ｎは、奇数であることが好ましく、３、５、７、９、１１、又は１３であることがより好ましく、７又は１１であることが最も好ましい。
【００９０】
一般式（Ｉ）の好ましい化合物では、Ｒ２は、ＹＲ２であり、ｎは、９又は１１である。したがって、一般式（Ｉ）の好ましい化合物では、Ｒ２は、−（ＣＨ２）９−Ｈである又はＲ２は、−（ＣＨ２）１１−Ｈである。一般式（Ｉ）のさらに好ましい化合物では、Ｘ２は、−ＯＨである。一般式（Ｉ）のより好ましい化合物では、Ｒ２は、−（ＣＨ２）９−Ｈ又は−（ＣＨ２）１１−Ｈであり、Ｘ２は、−ＯＨである。一般式（Ｉ）の最も好ましい化合物では、Ｒ２は、−（ＣＨ２）１１−Ｈであり、Ｘ２は、−ＯＨである。
【００９１】
一般式（Ｉ）の好ましい化合物では、Ｒ２’は、ＹＲ２’であり、ｎは、９又は１１である。したがって、一般式（Ｉ）の好ましい化合物では、Ｒ２’は、−（ＣＨ２）９−Ｈである、又はＲ２’は、−（ＣＨ２）１１−Ｈである。一般式（Ｉ）のさらに好ましい化合物では、Ｘ２’は、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２’である。一般式（Ｉ）のより好ましい化合物では、Ｒ２’は、−（ＣＨ２）９−Ｈである又はＲ２’は、−（ＣＨ２）１１−Ｈであり、Ｘ２’は、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２’である。一般式（Ｉ）の最も好ましい化合物では、Ｒ２’は、−（ＣＨ２）１１−Ｈであり、Ｘ２’は、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２’である。
【００９２】
一般式（Ｉ）のより好ましい化合物では、Ｒ２は、ＹＲ２であり、ｎは、９又は１１であり、Ｒ２’は、ＹＲ２’であり、ｎは、９又は１１である。したがって、一般式（Ｉ）の好ましい化合物では、Ｒ２及びＲ２’は、−（ＣＨ２）９−Ｈ又は−（ＣＨ２）１１−Ｈである。一般式（Ｉ）のさらにより好ましい化合物では、Ｘ２は−ＯＨであり、Ｘ２’は、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２’である。一般式（Ｉ）のより一層好ましい化合物では、Ｒ２及びＲ２’は、−（ＣＨ２）９−Ｈ又は−（ＣＨ２）１１−Ｈであり、Ｘ２は、−ＯＨであり、Ｘ２’は、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２’である。Ｒ２及びＲ２’は、いずれも−（ＣＨ２）９−Ｈである、又はいずれも−（ＣＨ２）１１−Ｈであることがより好ましく、Ｒ２及びＲ２’は、−（ＣＨ２）１１−Ｈであることがさらにより好ましい。一般式（Ｉ）の最も好ましい化合物では、Ｒ２及びＲ２’は、−（ＣＨ２）１１−Ｈであり、Ｘ２は、−ＯＨであり、Ｘ２’は、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２’である。
【００９３】
一般式（Ｉ）の好ましい化合物では、Ｒ３は、ＹＲ３である。一般式（Ｉ）のさらに好ましい化合物では、Ｒ３’は、ＹＲ３’である。一般式（Ｉ）のより好ましい化合物では、Ｒ３は、ＹＲ３であり、Ｒ３’は、ＹＲ３’である。一般式（Ｉ）のより一層好ましい化合物では、Ｒ３は、ＹＲ３であり、Ｒ３’は、ＹＲ３’であり、Ｘ３は、−Ｈ又は−ＯＨである。
【００９４】
１セットの一般式（Ｉ）の最も好ましい化合物では、Ｒ２及びＲ２’は、−（ＣＨ２）９−Ｈであり、Ｘ２は、−ＯＨであり、Ｘ２’は、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２’であり、Ｒ３は、ＹＲ３であり、Ｒ３’は、ＹＲ３’であり、Ｘ３は、−Ｈ又は−ＯＨである。かかる化合物は、一般式（ＩＩ１２）の化合物である。一般式（ＩＩ１２）は、以下に示される。
【００９５】
別のセットの一般式（Ｉ）の最も好ましい化合物では、Ｒ２及びＲ２’は、−（ＣＨ２）１１−Ｈであり、Ｘ２は、−ＯＨであり、Ｘ２’は、−Ｏ−（Ｃ＝Ｏ）−ＹＸ２’であり、Ｒ３は、ＹＲ３であり、Ｒ３’は、ＹＲ３’であり、Ｘ３は、−Ｈ又は−ＯＨである。かかる化合物は、一般式（ＩＩ１４）の化合物である。一般式（ＩＩ１４）は、以下に示される。一般式（ＩＩ１２）又は（ＩＩ１４）の化合物は、一般式（ＩＩ）の化合物と称することができる。このような場合では、一般式（ＩＩ１２）及び一般式（ＩＩ１４）の両方に独立した参照がなされる。
【００９６】
【化３】
2020510726.tif 000004
一般式（ＩＩ）の好ましい化合物では、Ｘ３は、−ＯＨである。一般式（ＩＩ）の他の好ましい化合物では、Ｘ３’は−ＯＨである。一般式（ＩＩ）のより好ましい化合物では、Ｘ３及びＸ３’は、−ＯＨである。
【００９７】
一般式（ＩＩ）の好ましい化合物では、ＹＲ３は、−（ＣＨ２）７−Ｈである。一般式（ＩＩ）のより好ましい化合物では、ＹＲ３は、−（ＣＨ２）７−Ｈであり、Ｘ３及びＸ３’は、−ＯＨである。かかる化合物は、一般式（ＩＩＩ１２）又は一般式（ＩＩＩ１４）の化合物である。一般式（ＩＩＩ１２）及び（ＩＩＩ１４）は、下記に示される。一般式（ＩＩＩ１２）又は（ＩＩＩ１４）の化合物は、一般式（ＩＩＩ）の化合物と称することができる。このような場合では、一般式（ＩＩＩ１２）及び一般式（ＩＩＩ１４）の両方に独立した参照がなされる。
【００９８】
【化４】
2020510726.tif 000005
一般式（ＩＩ）の好ましい化合物では、ｎは、ＹＲ３’の場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１であり；ｎは、ＹＲ３’の場合、５、７、又は９であることがより好ましく；ｎは、ＹＲ３’の場合、７又は９であることがさらにより好ましく；ｎは、ＹＲ３’の場合、７であることが最も好ましい。一般式（ＩＩＩ）の好ましい化合物では、ｎは、ＹＲ３’の場合、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、又は１１であり；ｎは、ＹＲ３’の場合、５、７、又は９であることがより好ましく；ｎは、ＹＲ３’の場合、７又は９であることがさらにより好ましく；ｎは、ＹＲ３’の場合、７であることが、最も好ましい。
【００９９】
一般式（ＩＩ）の好ましい化合物では、ｎは、ＹＸ２’の場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３であり；ｎは、ＹＸ２’の場合、７、９、１１、又は１３であることがより好ましく；ｎは、ＹＸ２’の場合、９、１１、又は１３であることがさらにより好ましく；ｎは、ＹＸ２’の場合、１１又は１３であることが最も好ましい。一般式（ＩＩＩ）の好ましい化合物では、ｎは、ＹＸ２’の場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３であり；ｎは、ＹＸ２’の場合、７、９、１１、又は１３であることがより好ましく；ｎは、ＹＸ２’の場合、９、１１、又は１３であることがさらにより好ましく；ｎは、ＹＸ２’の場合、１１又は１３であること最も好ましい。
【０１００】
一般式（ＩＩ）のより好ましい化合物では、ｎは、ＹＲ３’の場合、５、７、９、又は１１であり、ｎは、ＹＸ２’の場合、７、９、１１、又は１３であり；ｎは、ＹＲ３’の場合、７又は９であり、ｎは、ＹＸ２’の場合、９、１１、又は１３であることがさらにより好ましく；ｎは、ＹＲ３’の場合、７であり、ｎは、ＹＸ２’の場合、１１又は１３であることが最も好ましい。一般式（ＩＩ）の非常に好ましい化合物では、ｎは、ＹＲ３’の場合、７であり、ｎは、ＹＸ２’の場合、１１である。一般式（ＩＩ）の別の非常に好ましい化合物では、ｎは、ＹＲ３’の場合、７であり、ｎは、ＹＸ２’の場合、１３である。一般式（ＩＩＩ）のより好ましい化合物では、ｎは、ＹＲ３’の場合、５、７、９、又は１１であり、ｎは、ＹＸ２’の場合、７、９、１１、又は１３であり；ｎは、ＹＲ３’の場合、７又は９であり、ｎは、ＹＸ２’の場合、９、１１、又は１３であることがさらにより好ましく；ｎは、ＹＲ３’の場合、７であり、ｎは、ＹＸ２’の場合、１１又は１３であることが最も好ましい。
【０１０１】
一般式（ＩＩＩ）の非常に好ましい化合物では、化合物は、一般式（ＩＩＩ１４）の化合物であり、ｎは、ＹＲ３’の場合、７であり、ｎは、ＹＸ２’の場合、１１である。一般式（ＩＩＩ）の別の非常に好ましい化合物では、化合物は、一般式（ＩＩＩ１４）の化合物であり、ｎは、ＹＲ３’の場合、７であり、ｎは、ＹＸ２’の場合、１３である。一般式（ＩＩＩ）の非常に好ましい化合物では、化合物は、一般式（ＩＩＩ１２）の化合物であり、ｎは、ＹＲ３’の場合、７であり、ｎは、ＹＸ２’の場合、１１である。一般式（ＩＩＩ）の別の非常に好ましい化合物では、化合物は、一般式（ＩＩＩ１２）の化合物であり、ｎは、ＹＲ３’の場合、７であり、ｎは、ＹＸ２’の場合、１３である。
【０１０２】
さらなる実施形態では、上記で定義したＬＰＳは、下記で本明細書で定義される遺伝子改変細菌から得られる又は取得可能である。
【０１０３】
遺伝子改変細菌
第２の態様では、本発明は、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌に関する。細菌は、好ましくは、上記で定義した改変された脂質Ａ部分を有するＬＰＳを含む。遺伝子改変細菌は、ＬＰＳを含むことができ、その総ＬＰＳのうちの少なくとも１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０又は９０％は、本明細書で定義される改変された脂質Ａ部分を有する。或いは、その総ＬＰＳのうち１００％は、本明細書で定義される改変された脂質Ａ部分を有する。
【０１０４】
好ましい実施形態において、細菌は、細菌が、異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変を有するという点で、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変される。異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変は、異種ＬｐｘＡ、ＬｐｘＬ、及びＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼ活性のうちの少なくとも１つを、細胞に与えることが好ましい。
【０１０５】
異種アシルトランスフェラーゼ活性の導入は、当技術分野で公知の任意の方法を用いて達成することができる。例えば、異種アシルトランスフェラーゼ活性は、内因性野生型ボルデテラアシルトランスフェラーゼ遺伝子を改変することにより、好ましくは、内因性ｌｐｘＡ、ｌｐｘＬ、及びｌｐｘＤアシルトランスフェラーゼ遺伝子のうちの少なくとも１つを改変することにより、導入することができる。
【０１０６】
好ましい実施形態において、内因性アシルトランスフェラーゼの分子定規の構造は、改変される。この目的を達成するために、アシルトランスフェラーゼが、アシル鎖の長さの特異性を決定する厳密な分子（炭化水素）定規を有することは、当技術分野で公知である。したがって、かかる炭化水素定規の構造を改変することにより、アシル鎖の長さの特異性を変化させる。アシルトランスフェラーゼ炭化水素定規のアミノ酸配列は、当技術分野で公知である（例えば、Ｗｙｃｋｏｆｆ  ＴＪら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８年２７３巻（４９号）：３２３６９−７２及びＷｉｌｌｉａｍｓ  ＡＨら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００７年；１０４巻（３４号）：１３５４３−５０を参照のこと）又は例えば、公知の炭化水素定規を有するアシルトランスフェラーゼを用いたコンピュータによる整列を用いて、直接検索することができる。
【０１０７】
内因性アシルトランスフェラーゼは、アシル鎖の長さの特異性を変化させるために、ある特定のヌクレオチド又はコドンの置換、付加又は欠失を含めた、当技術分野で一般に知られる任意の方法を用いて、改変することができる。
【０１０８】
アシルトランスフェラーゼ活性は、ボルデテラ属の細菌中の少なくとも１種の異種遺伝子の発現により、例えば、異種アシルトランスフェラーゼを発現することにより、導入されることが好ましい。この目的を達成するために、単一の又は様々な異種アシルトランスフェラーゼは、細菌に導入されて、本明細書に開示される改変されたＬＰＳを得ることができる。本発明による使用のためのかかるアシルトランスフェラーゼは、ある（より短い）長さのアシル鎖を、ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分に転移し、それによって、少なくとも１本のアシル鎖の長さがより短いという点で、野生型ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分と比較して、改変されている脂質Ａ部分を得ることが可能である。異種アシルトランスフェラーゼの発現は、当技術分野で公知の任意の方法により達成することができる。
【０１０９】
特に好ましい実施形態では、異種アシルトランスフェラーゼ活性の導入は、ＬｐｘＡ、ＬｐｘＤ、及びＬｐｘＬのうちの少なくとも１つである、異種アシルトランスフェラーゼを導入することにより、達成される。或いは又はさらに、導入された異種アシルトランスフェラーゼは、ＬｐｘＭである。かかるアシルトランスフェラーゼは、当技術分野で公知であり、本明細書で定義される野生型ボルデテラ細菌でない任意のグラム陰性菌から得られる又は取得可能となり得る。さらに、異種アシルトランスフェラーゼは、野生型ボルデテラ細菌よりも異なる種から得られるボルデテラから得られる又は取得可能となり得るということがやはり考えられる。
【０１１０】
アシル鎖の長さの差異は、アシルトランスフェラーゼにおいて分子定規により決定され、これは、異なる細菌種のこれらの酵素間で変わり得る。したがって、本発明の好ましい実施形態において、異種ＬｐｘＡアシルトランスフェラーゼは、長さがＣ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０又はＣ１２であるアシル鎖を転移することができる。同様に、異種ＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼは、長さがＣ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０又はＣ１２であるアシル鎖を転移することができ、異種ＬｐｘＬアシルトランスフェラーゼは、長さがＣ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０又はＣ１２であるアシル鎖を転移することができる及び／又は異種ＬｐｘＭアシルトランスフェラーゼは、長さが、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ６、Ｃ８、Ｃ１０又はＣ１２であるアシル鎖を転移することができる。
【０１１１】
さらに好ましい実施形態では、アシルトランスフェラーゼは、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）属、ポルフィロモナス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）属又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属から得られる又は取得可能である。したがって、アシルトランスフェラーゼＬｐｘＡは、ナイセリア属、ポルフィロモナス属又はシュードモナス属から得られる又は取得可能となり得、アシルトランスフェラーゼＬｐｘＤは、ナイセリア属、ポルフィロモナス属又はシュードモナス属から得られる又は取得可能となり得る、及び／又はアシルトランスフェラーゼＬｐｘＬは、ナイセリア属、ポルフィロモナス属又はシュードモナス属から得られる又は取得可能となり得る。しかしながら、他のアシルトランスフェラーゼが、本発明における使用のために同様に適し得るということは、当業者には明らかである。
【０１１２】
ナイセリア属の好ましい種には、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）及びナイセリア・ラクタミカ（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｌａｃｔａｍｉｃａ）が含まれ、それによって、髄膜炎菌種は、最も好ましい。
【０１１３】
ポルフィロモナス属の好ましい種には、ポルフィロモナス・ジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ポルフィロモナス・アサッカロリティカ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ａｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃａ）、ポルフィロモナス・カンジンジバリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｎｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ）、ポルフィロモナス・カノリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｎｏｒｉｓ）、ポルフィロモナス・カンスルシイ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｎｓｕｌｃｉ）、ポルフィロモナス・カトニア（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃａｔｏｎｉａｅ）、ポルフィロモナス・サーカムデンタリア（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｉｒｃｕｍｄｅｎｔａｒｉａ）、ポルフィロモナス・クレビオリカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｃｒｅｖｉｏｒｉｃａｎｉｓ）、ポルフィロモナス・エンドドンタリス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｅｎｄｏｄｏｎｔａｌｉｓ）、ポルフィロモナス・ジンジビカニス（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖｉｃａｎｉｓ）、ポルフィロモナス・グラエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｕｌａｅ）、ポルフィロモナス・レビイ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｌｅｖｉｉ）、ポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）及びポルフィロモナス・サリボサ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｓａｌｉｖｏｓａ）が含まれ、ポルフィロモナス・ジンジバリス種が、最も好ましい。
【０１１４】
シュードモナス属の好ましい種には、緑膿菌（Ｐｅｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｅｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｅｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）及びシュードモナス・シリンガエ（Ｐｅｓｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ）が含まれ、それによって、緑膿菌種が、最も好ましい。
【０１１５】
特に好ましい実施形態では、ボルデテラ属の細菌は、異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変を有し、遺伝子改変は、ｌｐｘＡ遺伝子の発現を導入し、ｉ）ｌｐｘＡ遺伝子は、緑膿菌種から得られる又は取得可能である、ｉｉ）ｌｐｘＤ遺伝子は、緑膿菌種から得られる又は取得可能である及びｉｉｉ）ｌｐｘＬ遺伝子は、髄膜炎菌種から得られる又は取得可能であるうちの少なくとも１つである。
【０１１６】
他の実施形態では、本発明は、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌であって、細菌は、異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変を有するという点で、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変され、遺伝子改変は、少なくとも１種の異種ｌｐｘＡ遺伝子の発現を導入し、ｌｐｘＡ遺伝子は、配列番号１又は配列番号６の配列を有するＬｐｘＡアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有し、又はＬｐｘＡアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１又は配列番号６と少なくとも４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％のアミノ酸配列同一性を有し、遺伝子改変は、少なくとも１種の異種ｌｐｘＡ遺伝子の発現を導入することが好ましく、ｌｐｘＡ遺伝子は、配列番号１の配列を有するＬｐｘＡアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、又はＬｐｘＡアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１と少なくとも４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する、遺伝子改変細菌に関する。
【０１１７】
或いは又はさらに、本発明は、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌であって、細菌は、異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変を有するという点で、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変され、遺伝子改変は、少なくとも１種の異種ｌｐｘＬ遺伝子の発現を導入し、ｌｐｘＬ遺伝子は、配列番号２、配列番号３又は配列番号３２の配列を有するＬｐｘＬアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有し、又はＬｐｘＬアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号３又は配列番号３２と少なくとも４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％のアミノ酸配列同一性を有しており、ｌｐｘＬ遺伝子は、配列番号２の配列を有するＬｐｘＬアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有することが好ましい、又はＬｐｘＬアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２と少なくとも４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％のアミノ酸配列同一性を有することが好ましい、遺伝子改変細菌に関する。
【０１１８】
或いは又はさらに、本発明は、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌であって、細菌は、異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変を有するという点で、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変され、遺伝子改変は、少なくとも１種の異種ｌｐｘＤ遺伝子の発現を導入し、ｌｐｘＤ遺伝子は、配列番号４の配列を有するＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有する、又はＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４と少なくとも４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する、遺伝子改変細菌に関する。
【０１１９】
さらに好ましい実施形態では、上記の本明細書で定義される配列番号１、６、２、３、３２又は４を有するある特定の程度の配列同一性を有する配列は、それぞれ、ＬｘｐＡ（Ｐａ）、ＬｐｘＡ（Ｎｍ）、ＬｐｘＬ（Ｎｍ）、ＬｐｘＬ（Ｐｇ）、ＬｐｘＬ（Ｐａ）又はＬｐｘＤ（Ｐａ）アシルトランスフェラーゼ活性を保持する。
【０１２０】
さらなる実施形態では、本発明は、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌であって、細菌は、異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変を有するという点で、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変され、遺伝子改変は、少なくとも１種の異種ｌｐｘＡ遺伝子の発現を導入し、ｌｐｘＡ遺伝子は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ＷＰ＿００３０９２３７３．１において定義される配列を有するＬｐｘＡアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有し、又はＬｐｘＡアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ジェンバンクＷＰ＿００３０９２３７３．１において定義される配列と少なくとも４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する、遺伝子改変細菌に関する。
【０１２１】
或いは又はさらに、本発明は、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌であって、細菌は、異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変を有するという点で、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変され、遺伝子改変は、少なくとも１種の異種ｌｐｘＬ遺伝子の発現を導入し、ｌｐｘＬ遺伝子は、ジェンバンクＷＰ＿００２２２２３０５．１において定義される若しくはジェンバンクＷＰ＿０４３８７６３４３．１において定義される配列を有するＬｐｘＬアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有し、又はＬｐｘＬアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ジェンバンクＷＰ＿００２２２２３０５．１において定義される又はジェンバンクＷＰ＿０４３８７６３４３．１において定義される配列と少なくとも４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する、遺伝子改変細菌に関する。
【０１２２】
或いは又はさらに、本発明は、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌であって、細菌は、異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する遺伝子改変を有するという点で、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変され、遺伝子改変は、少なくとも１種の異種ｌｐｘＤ遺伝子の発現を導入し、ｌｐｘＤ遺伝子は、ジェンバンクＷＰ＿００３０９８５８５．１において定義される配列を有するＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列を有し、又はＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼをコードするヌクレオチド配列は、ジェンバンクＷＰ＿００３０９８５８５．１において定義される配列と少なくとも４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する、遺伝子改変細菌に関する。
【０１２３】
さらに好ましい実施形態では、本発明は、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌であって、改変された細菌は、少なくとも１本のアシル鎖の長さがより短いという点で、野生型ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分と比較して、改変されている脂質Ａ部分を有するＬＰＳを含み、細菌は、異種アシルトランスフェラーゼ活性及び異種ＵＤＰ−２，３−ジアシルグルコサミンピロホスファターゼ活性のうちの少なくとも１つを導入する遺伝子改変を有するという点で、野生型ボルデテラ細菌と比較して、改変される、遺伝子改変細菌に関する。遺伝子改変細菌は、異種アシルトランスフェラーゼ活性及び異種ＵＤＰ−２，３−ジアシルグルコサミンピロホスファターゼ活性を導入する遺伝子改変を有することが好ましい。
【０１２４】
かかる遺伝子改変細菌は、改変された脂質Ａ部分の３位におけるアシル鎖の長さが、同じ３位における野生型ボルデテラ脂質Ａ部分のアシル鎖よりも長さが大きいという点で、野生型ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分と比較して、改変されている脂質Ａ部分を有することが好ましい。
【０１２５】
異種ＵＤＰ−２，３−ジアシルグルコサミンピロホスファターゼ活性の導入は、好ましくは、異種ＵＤＰ−２，３−ジアシルグルコサミンピロホスファターゼを導入することにより達成する。かかるＵＤＰ−２，３−ジアシルグルコサミンピロホスファターゼは、当技術分野で公知であり、本明細書で定義される野生型ボルデテラ細菌でない任意のグラム陰性菌から得られる又は取得可能となり得る。さらに、異種ＵＤＰ−２，３−ジアシルグルコサミンピロホスファターゼが、野生型ボルデテラ細菌よりも異なる種から得られるボルデテラから得られる又は取得可能となり得るということもやはり考えられる。
【０１２６】
好ましいＵＤＰ−２，３−ジアシルグルコサミンピロホスファターゼは、ＬｐｘＨである。したがって、好ましい実施形態において、遺伝子改変は、異種ｌｐｘＨ遺伝子の発現を導入する。したがって、異種ｌｐｘＨ遺伝子の発現は、細胞中で異種ＵＤＰ−２，３−ジアシルグルコサミンピロホスファターゼ活性を誘導する。
【０１２７】
ｌｐｘＨ遺伝子は、好ましくは、上記の本明細書で定義されるナイセリア属、ポルフィロモナス属又はシュードモナス属から得られる又は取得可能である。より好ましい実施形態では、ｌｐｘＨ遺伝子は、ナイセリアから得られる又は取得可能であり、ｌｐｘＨ遺伝子は、髄膜炎菌種から得られる又は取得可能であることがより好ましい。ｌｐｘＨ遺伝子は、配列番号５と少なくとも４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するＬｐｘＨをコードするヌクレオチド配列を有することが最も好ましい。
【０１２８】
さらに好ましい実施形態では、上記の本明細書で定義される配列番号５を有する、ある特定の程度の配列同一性を有する配列は、ＵＤＰ−２，３−ジアシルグルコサミンピロホスファターゼ活性を保持する。
【０１２９】
さらに好ましい実施形態では、ｌｐｘＨ遺伝子は、ジェンバンクＷＰ＿００２２２２８９７．１において定義される配列と少なくとも４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する、ＬｐｘＨをコードするヌクレオチド配列を有する。
【０１３０】
本明細書で定義されるボルデテラ属の遺伝子改変細菌は、内因性ｌｐｘＨ遺伝子、すなわち、内因性ＬｐｘＨ（ＵＤＰ−２，３−ジアシルグルコサミンピロホスファターゼ）を発現する遺伝子をさらに含むことができる、又は遺伝子改変細菌は、単に、異種ＬｐｘＨ活性を含み、例えば、内因性ＬｐｘＨ活性を有する。最も好ましい実施形態では、遺伝子改変細菌は、配列番号３０と少なくとも４０、５０、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％のアミノ酸配列同一性を有する内因性ＬｐｘＨを発現させない。
【０１３１】
ＬｐｘＨに関する代替の実施形態では、遺伝子改変細菌は、内因性ｌｐｘＨ遺伝子のみを含み、すなわち、内因性ＬｐｘＨのみを発現する。したがって、特に、遺伝子改変細菌は、異種ＬｐｘＨを発現する遺伝子を含まない。本明細書で定義される遺伝子改変細菌は、異種ナイセリアＬｐｘＨを発現しないことがより好ましく、異種髄膜炎菌ＬｐｘＨを発現しないことが最も好ましい。さらに好ましい実施形態では、遺伝子改変細菌のみが、異種ｌｐｘＡ、ｌｐｘＬ及びｌｐｘＤ遺伝子のうちの少なくとも１種の発現を導入する遺伝子改変を含む。
【０１３２】
本発明の遺伝子改変細菌は、ＬＰＳの異なるタイプの混合物を含有することができる。特に、改変された細菌は、本明細書に記載した少なくとも１本のより短いアシル鎖を有する脂質Ａ部分を有するＬＰＳに加えて、野生型ＬＰＳを含有することができる。或いは、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌は、本明細書で定義されるより短いアシル鎖を有するＬＰＳを優性に又は単独で含有する。したがって、改変された細菌は、痕跡量の野生型ＬＰＳを含有しなくてもよく、又はそれのみを含有する。痕跡量の野生型ＬＰＳを含まない又はそれのみを含むボルデテラ属の細菌を得るために、上記で定義した遺伝子改変細菌は、さらに改変することができる。この目的を達成するために、好ましい実施形態において、上記で定義したボルデテラ属の遺伝子改変細菌は、それぞれ、内因性ｌｐｘＡ、ｌｐｘＤ又は内因性ｌｐｘＬ遺伝子によってコードされたＬｐｘＡ、ＬｐｘＤ及びＬｐｘＬアシルトランスフェラーゼのうちの少なくとも１つの活性を減少させる又は除去する遺伝子突然変異をさらに含む。
【０１３３】
したがって、かかる遺伝子改変細菌は、異種アシルトランスフェラーゼ活性を導入する突然変異並びに対応する内因性ＬｐｘＡ及び／又はＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼ活性を低下させるさらなる突然変異を有し得る。したがって、遺伝子改変細菌の全体的なＬｐｘＡ及び／又はＬｐｘＤアシルトランスフェラーゼ活性は、野生型ボルデテラ細菌と比較して、増加しても類似しても低下してもよい。
【０１３４】
本明細書で定義されるボルデテラ属の遺伝子改変細菌は、配列番号２８の配列、又は配列番号２８を有する配列同一性が６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９若しくは１００％である配列を有する内因性遺伝子における遺伝子突然変異を含むことができる。
【０１３５】
或いは又はさらに、本明細書で定義されるボルデテラ属の遺伝子改変細菌は、配列番号２９の配列、又は配列番号２９を有する配列同一性が、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％である配列を有する内因性遺伝子における遺伝子突然変異を含むことができる。
【０１３６】
或いは又はさらに、本明細書で定義されるボルデテラ属の遺伝子改変細菌は、配列番号３１の配列、又は配列番号３１を有する配列同一性が、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９８、９９又は１００％である配列を有する内因性遺伝子における遺伝子突然変異を含むことができる。
【０１３７】
好ましい実施形態において、内因性ｌｐｘＡ遺伝子、内因性ｌｐｘＤ遺伝子の発現及び／又は内因性ｌｐｘＬ遺伝子の発現は、前記遺伝子の不活性化によって、例えば、それ自体当技術分野で公知の方法による、遺伝子の破損又は欠失により、除去される。
【０１３８】
本発明のさらなる実施形態では、本明細書で定義されるボルデテラ属の遺伝子改変細菌は、遺伝子改変百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌である。遺伝子改変細菌は、遺伝子改変百日咳菌であることが好ましい。さらに好ましい実施形態では、遺伝子改変細菌は、百日咳菌Ｔｏｈａｍａ  Ｉ型株又はその誘導体である。Ｔｏｈａｍａ  Ｉ誘導体株は、Ｔｏｈａｍａ  Ｉ株のストレプトマイシン−耐性誘導体であることが好ましく、遺伝子改変細菌は、Ｂ２１３株又はその誘導体に由来することが最も好ましい。或いは、遺伝子改変細菌は、百日咳菌Ｂ１９１７又はＢ１９２０株又はその誘導体である。
【０１３９】
さらに、本発明の遺伝子改変細菌は、１種又は数種のさらなる改変、例えば、ＬＰＳ内毒素性を低下させる突然変異を有し得る。例えば、本発明のボルデテラＬＰＳは、自己免疫応答を誘発する、及び／又は樹状細胞及びアジュバント活性への結合を増加させることが疑われるあり得るエピトープを取り除くように、改変されたオリゴ糖構造を有し得る。さらに、本明細書で定義される本発明の遺伝子改変細菌は、脂質Ａ３−Ｏ−デアシラーゼ活性を増加させる遺伝子改変をさらに含むことができる。
【０１４０】
上記で示したように、より短いアシル鎖が、アシル鎖の完全な非存在を含まないことが、本明細書において理解される。したがって、より短いアシル鎖は、アシル鎖の存在を示す。それにもかかわらず、改変された脂質Ａ部分は、より短いアシル鎖に加えて、野生型ボルデテラ脂質Ａ部分のアシル鎖の数と比較して、アシル鎖がやはり少ないこともある。例えば、少なくとも部分的に３−Ｏ−脱アシル化ＬＰＳ及び／又は脂質Ａの存在は、ＬＰＳ毒性をさらに低下させることができ、対象において副作用の数及び重症度を減少させることができる。
【０１４１】
したがって、ボルデテラ属の遺伝子改変細菌は、ＬＰＳ分子の混合物を含むことができ、ＬＰＳ分子は、ｉ）野生型ＬＰＳ及び／又はｉｉ）少なくとも１本のアシル鎖の長さがより短いという点で、野生型ボルデテラＬＰＳの脂質Ａ部分と比較して、改変されている脂質Ａ部分を有するＬＰＳ及び／又はｉｉｉ）脱アシル化される、例えば、３−Ｏ−脱アシル化されるＬＰＳの混合となり得る。或いは又はさらに、本発明の遺伝子改変細菌は、少なくとも１本のより短いアシル鎖を有し、また、３−Ｏ−脱アシル化される脂質Ａ部分を有するＬＰＳ分子を含むことができる。本発明は、さらに、かかる遺伝子改変細菌から得られたＬＰＳに関する。
【０１４２】
本明細書で定義されるボルデテラ属の遺伝子改変細菌は、配列番号２５（気管支敗血症菌及び百日咳菌のＰａｇＬタンパク質、ジェンバンクＷＰ＿００３８１３８４２．１）を有するポリペプチドをコードする核酸、又は配列番号２５と少なくとも２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５、９８又は９９％のアミノ酸同一性を有するポリペプチドをコードする核酸をさらに含み、ポリペプチドは、脂質Ａ３−Ｏ−デアシラーゼ活性を示すことが好ましい。
【０１４３】
本発明のＬＰＳを含むＯＭＶ
第３の態様では、本発明は、本明細書で定義されるボルデテラＬＰＳを含むＯＭＶに関する。例えば、ワクチンにおける使用のための、ＯＭＶ（「ｂｌｅｂｓ」としても公知である）は、界面活性剤抽出（ｄＯＭＶ精製プロセス）により従来から調製されており、例えば、デオキシコラート等の界面活性剤が用いられて、ＬＰＳを除去し、ベシクル放出を増加させる。細胞の超音波処理によって調製されたＯＭＶ調製、及びミョウバンアジュバントと組み合わせたＤＯＣによる処置は、マウスモデルにおける百日咳の誘発に対する保護を提供し［Ｒｏｂｅｒｔｓ、Ｒ．、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００８年、２６巻、４６３９〜４６４６］、これは、全−細胞ワクチンの効果に匹敵した。ＰａｇＬ−脱アシル化された改変されたＬＰＳを含有するＯＭＶの別のバージョンによって、保護及びより低い反応源性が示され、後者は、体重増加及びサイトカイン誘導によりｉｎ  ｖｉｖｏで決定される［Ａｓｅｎｓｉｏ、Ｃ．Ｊ．、Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１１年、２９巻、１６４９〜１６５６］。パラ百日咳菌ＯＭＶによる別の興味深い知見は、百日咳及びパラ百日咳に対するこれらの交差防御であった［Ｂｏｔｔｅｒｏ、Ｄ．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０１３年、３１巻、５２６２〜５２６８］。
【０１４４】
大部分のグラム陰性菌、例えば、ボルデテラ等のＬＰＳは、毒性がある。しかしながら、本発明のボルデテラＬＰＳは、毒性の野生型ＬＰＳよりはるかに大きい程度で、依然としてＯＭＶ中に存在し得る。したがって、界面活性剤抽出方法は、界面活性剤の存在を必要としない方法により置き換えることができる。したがって、本発明によるボルデテラＬＰＳを含むＯＭＶは、界面活性剤によって抽出されたＯＭＶとならなくてよい。しかしながら、界面活性剤によって抽出されたＯＭＶでないＯＭＶを調製するための方法は、いかなる界面活性剤の使用をも除外しないことが理解される。低濃度の界面活性剤の使用及び／又はマイルドな界面活性剤の使用は、本発明による改変されたボルデテラＬＰＳの大部分、すなわち、改変されたボルデテラＬＰＳの少なくとも５、１０、２０、５０、６０、７０、８０、９０、９５又は９９％が、例えば、自然に存在するボルデテラＬＰＳ又は等量の同じ培地から得られた上澄みＯＭＶの量と比較して、維持される限り、除外されない。
【０１４５】
本発明のボルデテラＬＰＳを含む好ましいＯＭＶは、上澄み又は自然ＯＭＶ、すなわち、上記で本明細書において定義されるｓＯＭＶ、又は未変性ＯＭＶ、すなわち、上記で本明細書において定義されるｎＯＭＶである。或いは、本発明のボルデテラＬＰＳを含むＯＭＶは、界面活性剤によって抽出されたＯＭＶである。ｄＯＭＶ、ｓＯＭＶ及びｎＯＭＶを調製するための方法は、ｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄら（２０１０年）及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄら（２０１３年）（ｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄ  Ｂら、Ｖａｃｃｉｎｅ．２０１０年；２８巻（３０号）：４８１０〜６及びｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄ  Ｂ  ，．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３年３１；８（５）：ｅ６５１５７）及び国際公開第２０１３／００６０５５号に記載され、それらのすべてを、参照により本明細書に組み込む。
【０１４６】
好ましい実施形態において、改変されたボルデテラＬＰＳを含むＯＭＶは、上記で定義した遺伝子改変細菌から取得可能である又は得られる。
【０１４７】
組成物
第４の態様では、本発明は、上記で本明細書において定義されるボルデテラＬＰＳ、遺伝子改変細菌及びＯＭＶのうちの少なくとも１種を含む組成物に関する。本組成物は、医薬組成物であることが好ましい。医薬組成物は、当技術分野で通常どおり公知である、薬学的に許容される添加剤、担体、培地又は送達ビヒクルをさらに含むことがより好ましい（例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ」、Ｒｏｗｅら編、第７版、２０１２年、ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｐｒｅｓｓ．ｃｏｍを参照のこと）。薬学的に許容される安定化剤、浸透物質、緩衝剤、分散化剤等はまた、医薬組成物に取り込むことができる。好ましい形態は、所期の投与のモード及び治療への適用に依存する。医薬用担体は、患者に送達するのに適した、任意の適合性の、非毒性物質となり得る。「本発明の有効成分」は、上記の本明細書で定義されるボルデテラＬＰＳ、遺伝子改変細菌又はＯＭＶのうちの１種又は複数であることが、本明細書において理解される。
【０１４８】
非経口送達のための薬学的に許容される担体は、任意選択で２０％アルブミンが補充された、無菌の緩衝０．９％ＮａＣｌ又は５％グルコースによって例示される。或いは、本発明の有効成分は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）に懸濁することができる。非経口投与のための調製は、無菌でなくてはならない。本発明の有効成分の投与のための非経口経路は、公知の方法、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、及び動脈内又は病巣内経路による注射又は注入に一致する。或いは、本組成物は、吸入により投与することができる。本組成物は、注入により又はボーラス注入により連続して投与することができる。本組成物は、ボーラス注入により投与することが好ましい。筋肉内注射用の典型的な医薬組成物は、例えば、本発明の有効成分の有効な用量を含むリン酸緩衝食塩水１〜１０ｍｌを含有するように作製されるはずである。非経口で投与可能な組成物を調製するための方法は、当技術分野で周知であり、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（Ｅｄ．Ａｌｌｅｎ、Ｌ．Ｖ．第２２版、２０１２年、ｗｗｗ．ｐｈａｒｍｐｒｅｓｓ．ｃｏｍ）を含めて、様々な情報源により詳細に記載されている。
【０１４９】
医学的使用
第５の態様では、本発明は、医薬品としての使用のための、上記で本明細書で定義されるボルデテラＬＰＳ、遺伝子改変細菌及びＯＭＶのうちの少なくとも１種を含む組成物に関する。したがって、別の表現でいうと、本発明は、本発明のボルデテラＬＰＳ、本発明の遺伝子改変細菌、本発明のＯＭＶ、及び本発明の医薬組成物のうちの少なくとも１種の医薬品としての使用に関する。本発明は、さらに、上記で本明細書で定義されるボルデテラＬＰＳ、遺伝子改変細菌及びＯＭＶのうちの少なくとも１種を用いた処置の方法に関する。
【０１５０】
第６の態様では、本発明は、対象における免疫応答を誘導するステップを含む処置における使用のための、上記で本明細書において定義されるボルデテラＬＰＳ、遺伝子改変細菌及びＯＭＶのうちの少なくとも１種を含む組成物に関する。或いは、本発明は、対象における免疫応答を刺激するステップを含む治療処置における使用のための、上記で本明細書において定義されるボルデテラＬＰＳ、遺伝子改変細菌及びＯＭＶのうちの少なくとも１種を含む組成物に関する。したがって、特に、本発明は、ワクチン接種のための方法に関する。
【０１５１】
好ましい実施形態において、免疫応答は、ボルデテラ感染症に対して誘導される又は刺激される。この目的を達成するために、３種のボルデテラ種は、公知のヒト病原体（百日咳菌、パラ百日咳菌及び気管支敗血症菌である。したがって、特に好ましい実施形態では、免疫応答は、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌感染症に対して誘導される又は刺激される。
【０１５２】
百日咳菌及び時折パラ百日咳菌は、ヒトにおいて百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）又は百日ぜき（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）を引き起こし、いくつかのパラ百日咳菌株は、ヒツジにコロニー形成することができる。免疫無防備状態の患者における疾患が報告されているが、気管支敗血症菌は、まれに健康なヒトに感染する。気管支敗血症菌は、イヌ感染性気管気管支炎（ｋｅｎｎｅｌ  ｃｏｕｇｈ）及びそれぞれイヌ及びブタにおける萎縮性鼻炎を含めた、他の哺乳動物におけるいくつかの疾患を引き起こす。この属の他のメンバーは、他の哺乳動物、及びトリにおける類似の疾患（ボルデテラ・ヒンジイ、ボルデテラ・アビウム（Ｂ．ａｖｉｕｍ））を引き起こす。
【０１５３】
免疫応答は、百日咳菌感染症に対して誘導される又は刺激されることが最も好ましい。さらに好ましい実施形態では、本発明は、対象における免疫応答を誘導すること又は刺激することを含む処置であって、百日ぜき（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）の処置である処置における使用のための、上記で本明細書で定義される組成物に関する。この目的を達成するために、対象は、ワクチン未接種である又はボルデテラに対して前もってワクチン接種されていることもある。さらに又は或いは、処置は、百日ぜき（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）の予防である。用語「百日ぜき（ｗｈｏｏｐｉｎｇ  ｃｏｕｇｈ）」、「百日咳（ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）」及び「１００日咳」は、本明細書において置換え可能で用いることができるということがさらに留意される。
【０１５４】
好ましい実施形態において、本発明の医薬組成物は、ワクチンである。ワクチンは、上記で本明細書で定義されるボルデテラＬＰＳ及びＯＭＶのうちの少なくとも１種を好ましくは含む、無細胞ワクチンとなり得る。より好ましくは、ワクチンは、上記で本明細書において定義される少なくとも１種の細菌を含む全細胞ワクチンである。
【０１５５】
したがって、本発明は、医薬品としての使用のための、好ましくは、対象における免疫応答を誘導すること又は刺激することを含む処置における使用のための（医薬）組成物であって、上記で定義した遺伝子改変細菌を含む全細胞ワクチンである、組成物に関する。本発明の遺伝子改変細菌は、生若しくは弱毒生細菌でも生育不能の細菌でもよい。細菌は、それ自体当技術分野で公知の手段を用いて、不活性化又は死滅させることが好ましい。例えば、遺伝子改変細菌は、凍結、加熱処置、機械的な破損、化学処置又は薬学の分野で公知の他の方法及びワクチン接種により不活性化されていることもある（例えば、Ｊ．Ｌ．Ｐａｃｅ、Ｈ．Ａ．Ｒｏｓｓｉ、Ｖ．Ｍ．Ｅｓｐｏｓｉｔｏ、Ｓ．Ｍ．Ｆｒｅｙ、Ｋ．Ｄ．Ｔｕｃｋｅｒ、Ｒ．Ｉ．Ｗａｌｋｅｒ．Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｖａｃｃｉｎｅｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｎｏｖｅｌ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ  １６巻：１５６３〜１５７４（１９９８年）を参照のこと）。細菌は、百日咳菌、パラ百日咳菌又は気管支敗血症菌であることが好ましく、百日咳菌であることが最も好ましい。
【０１５６】
代替的に好ましい実施形態では、本発明による（医薬）組成物は、上記で本明細書で定義されるボルデテラＬＰＳ又は上記で本明細書で定義されるＯＭＶを含む無細胞ワクチンである。
【０１５７】
本発明の（無細胞）ワクチンは、ボルデテラ属の細菌の１、２、３種又はそれ以上の免疫原性構成成分をさらに含むことができる。（無細胞）ワクチンは、単独又は他のボルデテラ構成成分、例えば、糸状赤血球凝集素（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、線毛抗原及びパータクチン等と組み合わせて、不活性化されたボルデテラ毒素をさらに含むことが好ましい。
【０１５８】
本明細書で定義される、改変されたＬＰＳ又はＯＭＶは、それを産生するボルデテラ細菌に対して、防御免疫応答を誘発するために用いることができるが、或いは、他の組成物を用いることもでき、他の組成物に混合することもできる。したがって、他の実施形態では、本発明は、医薬品としての使用のための、又は対象における免疫応答を誘導すること又は刺激することを含む処置における使用のための、上記で定義した組成物であって、少なくとも１種の非ボルデテラ抗原をさらに含む組成物に関する。抗原は、上記で定義した任意の抗原である。特に、ボルデテラワクチンは、当技術分野で公知の他のワクチンと合わせることができる。好ましい実施形態において、ボルデテラワクチン、最も好ましくは、全細胞ボルデテラワクチンは、ジフテリア及び破傷風ワクチンのうちの少なくとも１種と合わされる。最も好ましい実施形態では、（全細胞）ボルデテラワクチンは、ジフテリア並びに破傷風ワクチンと合わされる。
【０１５９】
第７の態様では、本発明のＬＰＳは、適当なアジュバント物質として用いるためである。ＬＰＳは、Ｔｏｌｌ様受容体を活性化する及び自然免疫応答を刺激するワクチン接種の目的のための適当なアジュバントであることが、当技術分野で公知である。部分的に解毒された、本発明によるＬＰＳ及び／又は脂質Ａは、この免疫刺激（アジュバント）活性を保持することができ、低い毒性に関連する有害な副作用、例えば、局所腫脹、発赤、疼痛及び発熱を引き起こす。
【０１６０】
本発明による薬学的に許容される組成物及びワクチンは、本発明による医薬組成物、全細胞若しくは無細胞ワクチンを投与するステップを含む、病原性、グラム陰性菌感染症、好ましくは、ボルデテラ感染症に罹患している又はこれを獲得するリスクがある対象の処置の方法において用いることができる。特定のアジュバントの使用、組成物中の物質の相対量及び絶対量及び投与のための用法（ｄｏｓｅｓ  ｒｅｇｉｍｅｎ）は、公知である又は当業者によって決定することができる及び状況、例えば、特定の病原性感染症又は処置しようとする特定の対象の状態のために適合することができる。用法は、単回投与を含むことができるが、多回投与、例えば、ブースター投与を含むこともでき、経口で、鼻腔内に又は非経口で投与することができる。ワクチン接種の目的のための様々な用法は、当技術分野で公知であり、当業者により適当に適合され得る。
【０１６１】
第８の態様では、本発明は、Ｔｏｌｌ−様受容体４（ＴＬＲ４）アンタゴニストとしての使用のための、本発明の改変されたボルデテラＬＰＳに関する。かかるアンタゴニストは、敗血症の処置若しくは減少において又は広範囲の免疫反応、例えば、サイトカインストームにおいて用いることができることが好ましい。本発明の改変されたＬＰＳは、インフルエンザ感染症中に発生するサイトカインストームの処置のために用いられることがより好ましい。
【０１６２】
第９の態様では、本発明は、本発明のボルデテラ属の遺伝子改変細菌、ボルデテラＬＰＳ又はＯＭＶを産生するための方法に関する。本方法は、好ましくは、ａ）上記で本明細書において定義される遺伝子改変細菌を培養するステップと；任意選択で、ｂ）遺伝子改変細菌を精製するステップ及び不活性化するステップのうちの少なくとも１つを含む。さらに、又はステップｂ）の代わりに、ＬＰＳ又はＯＭＶは、抽出する及び／又は精製することができる。ボルデテラを精製する及び不活性化するための方法は、当技術分野で周知である。同様に、ＬＰＳ又はＯＭＶの精製／抽出は、当技術分野で公知の任意の適当な方法を用いて行うことができる。
【０１６３】
第１０の態様では、本発明は、本明細書で定義される、不活性化された、改変されたボルデテラ細菌、ＯＭＶ及びＬＰＳのうちの少なくとも１種を含むワクチン配合物の生成に関する。本方法は、好ましくは、ａ））上記で本明細書において定義される遺伝子改変細菌を培養するステップと；ｂ）遺伝子改変細菌を精製するステップ及び不活性化するステップのうちの少なくとも１つと、ｃ）ワクチン配合物に、任意選択で、さらなるワクチン構成成分と共に、ボルデテラ細菌、ＯＭＶ及びＬＰＳのうちの少なくとも１種を配合するステップとを含む。ステップｂ）に加えて、又はステップｂ）の代わりに、ＬＰＳ又はＯＭＶは、抽出する及び／又は精製することができる。
【０１６４】
上記で指定した医学上の状態の処置における組成物の使用にはやはり、対応する医学的処置のための医薬品の製造のための組成物の使用、並びに、組成物の有効量を対象に投与することにより、かかる医学上の状態に罹患している対象を処置するための方法が含まれることがさらに理解される。
【０１６５】
本文献中及びその特許請求の範囲の中で、動詞「を含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用は、その限定しない意味で用いられて、単語に続く項目が含まれるが、詳細に述べられていない項目は除外されないことを意味する。さらに、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」による要素への参照は、要素の１つ及び唯一であることが文脈で明らかに要求されない限り、要素の１つ以上が存在する可能性を除外しない。したがって、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。
【０１６６】
本明細書中で引用されるすべての特許及び参考文献は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０１６７】
次の例は、例示的な目的にのみ提供され、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを目的としない。
【実施例】
【０１６８】
実施例１
材料及び方法
プラスミド、菌株及び増殖条件
表１では、本試験に用いられるすべてのプラスミド及び菌株を示す。百日咳菌株を、１５％ヒツジ脱線維血（Ｂｉｏｔｒａｄｉｎｇ）が補充されたＢｏｒｄｅｔ−Ｇｅｎｇｏｕ寒天（Ｄｉｆｃｏ）で３５℃で４８ｈ培養した。液体培養中で細菌を増殖させるために、細菌を、固形培地から収集し、ＯＤ５９００．０５までＶｅｒｗｅｉｊ培地［１６］に希釈し、１２５ｍｌ角培地ボトル中で１７５ｒｐｍで絶え間なく振とうしながら、インキュベートした。いくつかのアッセイにおいて、細菌を、６０℃で１ｈインキュベートすることにより、不活性化させ、ＰＢＳに再懸濁し、ＯＤ５９００．５に調整した。大腸菌株を、３７℃で溶原性ブロス（ＬＢ）又はＬＢ寒天中で増殖させた。
【０１６９】
すべての株について、培地に、要求される場合、カナマイシン（１００μｇ  ｍｌ−１）、ゲンタマイシン（１０μｇ  ｍｌ−１）、アンピシリン（１００μｇ  ｍｌ−１）、ナリジクス酸（５０μｇ  ｍｌ−１）、又はストレプトマイシン（３００μｇ  ｍｌ−１）及び大腸菌又は百日咳菌用に、それぞれ０．１若しくは１ｍＭイソプロピル−β−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を補充して、タンパク質発現を誘導した。
【０１７０】
【表１】
2020510726.tif 000006
ＡｍｐＲ、アンピシリン耐性；ＧｍＲ、ゲンタマイシン耐性；ＫａｎＲ、カナマイシン耐性；ＳｔｒＲ、ストレプトマイシン耐性
【０１７１】
遺伝学的操作
ＰＣＲを、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行った。ＰＣＲミックスは、鋳型ＤＮＡ１μｌ、２００μＭ  ｄＮＴＰｓ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、異なるプライマーの組合せ（配列番号７〜２４、表２を参照のこと）０．２５μＭ、０．５Ｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰＣＲ緩衝液からなる。これらの混合物を、ＤＮＡ変性のために９５℃で１０分間インキュベートし、その後、９５℃で１分、５８℃で０．５分及び７２℃で期待される増幅産物サイズｋｂｐ当たり１分での伸長の３０サイクルでインキュベートした。反応を、７２℃で１０分間拡張された伸長ステップによって終了した。得られた産物を、電気泳動により１％アガロースゲルで分離し、臭化エチジウムを用いて可視化した。
【０１７２】
異なる細菌のＬＰＳ生合成酵素をコードする遺伝子を、ＰＣＲにより細菌原液から増幅し、広範な宿主域発現ベクターｐＭＭＢ６７ＥＨにクローン化した。この目的を達成するために、ＰＣＲ産物及びプラスミドｐＭＭＢ６７ＥＨ−ＰａｇＬ（Ｐａ）を、Ｐｒｏｍｅｇａによって提供された、Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｓｙｓｔｅｍ及びプラスミド抽出キットをそれぞれ用いて精製した。精製されたプラスミド及びＰＣＲ産物を、制限酵素（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で消化し、その部位は、プライマー（配列番号７〜２４、２６及び２７、表２を参照のこと）中に含まれ、続いて、一緒に結合させた。染色体ｌｐｘＡ及びｌｐｘＬ遺伝子をノックアウトするために、プラスミドを用いた。
【０１７３】
大腸菌ＤＨ５αを、標準プロトコールに従って連結反応産物又はプラスミドで形質転換した。正確なクローンをＰＣＲにより選出し、プラスミドを精製し、Ｍａｃｒｏｇｅｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｓｅｒｖｉｃｅ（Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）で配列決定した。次いで、プラスミドを、形質転換により大腸菌株ＳＭ１０λｐｉｒに転移し、続いて、それぞれ、選択及び対抗選択のためにアンピシリン及びナリジクス酸を用いた連結により百日咳菌Ｂ２１３株に導入した。染色体突然変異をもたらすために、ストレプトマイシン感受性を与えているｒｐｓＬ遺伝子（Ｓｋｏｒｕｐｓｋｙ  ａｎｄ  Ｔａｙｌｏｒ、１９９６年）を含有したノックアウトプラスミドを、カナマイシン−又はゲンタマイシン−耐性接合完了体について選択することによる単一の乗換えによって染色体に統合し；得られた細菌は、ストレプトマイシン耐性を喪失した。続いて、第２の乗換えによるプラスミド喪失について選択するために、細菌を、液体培地中で培養し、突然変異を、ストレプトマイシン及びカナマイシン又はゲンタマイシンを用いてプレート上で選択した。百日咳菌接合完了体中のプラスミドの存在及びノックアウト突然変異の適切な発生を、ＰＣＲにより検証した。
【０１７４】
百日咳菌中で標的酵素ＬｐｘＤＰａを発現させるために、ベクターｐＭＭＢ６７ＥＨを用い、ｌｐｘＤを、（配列番号２６を有する）プライマーＬｐｘＤ−Ｆｗ  Ｐａ  ＮｄｅＩ及び（配列番号２７を有する）ＬｐｘＤ−ｒｅｖ−Ｈｉｓ  Ｐａ  ＨｉｎｄＩＩＩと共に、プルーフリーディング酵素（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）を用いた緑膿菌株ＰＡＯ１からＰＣＲにより増幅した。プライマーは、いずれもクローン化を容易にする制限酵素のための配列を含有し、逆方向プライマーはまた、ウエスタンブロット法による組換えタンパク質の検出を容易にするために、Ｈｉｓ６−タグをコードする配列を含有する。ｐＭＭＢ６７ＥＨにおいてｔａｃプロモーターの後にＰＣＲ産物をクローン化した後、その挿入断片の正確な配列を確認した。
【０１７５】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮＡを得るために、指数関数的に増殖する培養から得られた細胞を、ＯＤ５５０４に調整した、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ  ５４２４において５０００ｒｐｍで１０分間遠心することにより収集し、トリゾール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｕ．Ｋ．）に再懸濁させた。次いで、トリゾール１ｍｌ当たり、クロロホルム２００μｌを加え、その後、５０００ｒｐｍで３０分間遠心した。得られた上層を、氷冷７５％エタノールの等量で混合した。次いで、ＲＮＡを、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡ  ＩＩ  ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて、製造業者の指示に従って、単離した。得られた溶液を、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ  ｆｒｅｅ（Ａｍｂｉｏｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で３７℃で１ｈ処理して、ゲノムＤＮＡを除去し、その後、製造業者の推奨に従ってＤＮａｓｅ不活性化を行って、純粋なＲＮＡを生成した。これを、直ちに用いて、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｒ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いてｃＤＮＡを生成した。ＲＮＡ、ｃＤＮＡ及び染色体ＤＮＡを、ＰＣＲにおいて、プライマー（表２を参照のこと、配列番号７〜２４、２６及び２７）により鋳型として用いて、特異的な転写物の発生を決定した。
【０１７６】
電気泳動技法
全細胞ライセートを、ＯＤ６００５．０に調整して二重強度（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒｅｎｇｔｈ）サンプル緩衝液に１：１で可溶化し、１００℃で１０分間加熱した。ＬＰＳを可視化するために、沸騰後、全細胞ライセートを、３７℃で１ｈの間プロテイナーゼＫで処理した。タンパク質及びＬＰＳを、１４％及び１６％アクリルアミドゲルでそれぞれ分離し、その後、これらを、クマシーブリリアントブルーＧ２５０又は銀染色でそれぞれ染色した。
【０１７７】
ＬＰＳ精製及び分析
ＬＰＳを、熱フェノール−水（Ｗｅｓｔｐｈａｌ、１９６５年）で細菌から抽出し、Ｃ８逆相カートリッジにおける固相抽出（ＳＰＥ）によりさらに精製した。簡単にいうと、細菌を、遠心により培養懸濁液から収集し、水で７０℃で懸濁し、同じ温度でフェノール０．８体積で混合した。遠心により水相及びフェノール相を分離した後、水相を、１体積の０．３５６Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＡ）（ｐＨ７）（溶媒Ａ）及び１／３体積の２−プロパノール：水：トリエチルアミン：酢酸（７０：３０：０．０３：０．０１、ｖ／ｖ）（ｐＨ８．９）（溶媒Ｂ）を加えることにより、ＳＰＥのために調製した。ＬＰＳ抽出物を、２０−ポジションバキュームマニホルド（Ｗａｔｅｒｓ）を用いた逆相Ｓｅｐ−Ｐａｋ  Ｃ８カートリッジ（３ｍｌシリンジバレルタイプＶａｃカートリッジ、Ｃ８樹脂２００ｍｇ、Ｗａｔｅｒｓ）におけるＳＰＥにより同時に精製した。カートリッジを、溶媒Ｂ３×１ｍｌ、２−プロパノール：水：トリエチルアミン：酢酸（１０：９０：０．０３：０．０１、ｖ／ｖ）（ｐＨ８．９）（溶媒Ｃ）、０．０７ｍＭ  ＴＥＡＡ（ｐＨ７）（溶媒Ｄ）及び溶媒Ａを減圧下で連続的に適用することにより、ＳＰＥのために条件付けした。次いで、サンプルを、カートリッジに添加し、各カートリッジを、溶媒Ａ、Ｄ及びＣ３×１ｍｌのこの順序で洗浄した。ＬＰＳを、溶媒Ｂ２×０．３ｍｌを適用することにより、カラムから溶出した。溶出液を、遠心真空濃縮器（ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｖａｃｕｕｍ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ）において乾燥し、水に懸濁した。精製したサンプルの純度及び完全性を、ＬＰＳ銀及びクマシー染色と合わせたトリシン−ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判断した。脂質Ａ構造の分析について、精製されたＬＰＳの負イオンナノ−エレクトロスプレーイオン化−フーリエ変換質量分析（ナノＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳ）を、ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ機器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）において行った。ＬＰＳサンプルを、２−プロパノール、水及びトリエチルアミンの混合物（５０：５０：０．００１、体積／体積／体積）（ｐＨ８．５）に溶解し、前述の通り（Ｐｕｐｏら、２０１４年）、金でコーティングされたプルドガラスキャピラリー（ｐｕｌｌｅｄ  ｇｌａｓｓ  ｃａｐｉｌｌａｒｙ）を用いて、ナノ−ＥＳＩにより、質量分析計に注入した（Ｋｏｎｄａｋｏｖ、Ａ．、ａｎｄ  Ｌｉｎｄｎｅｒ、Ｂ．（２００５年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄｓ  ｂｙ  Ｆｏｕｒｉｅｒ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ（Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ、Ｅｎｇ）１１巻、５３５〜５４６頁）。スプレー電圧を、−１．２ｋＶ及び加熱したキャピラリーの温度を２５０℃に設定した。これらのイオン化条件下で、ＬＰＳの断片化はあまり生じなかった。脂質Ａ質量スペクトルを記録するために、ＬＰＳのナノＥＳＩ−ＦＴ−ＭＳを、電位差１００Ｖでインソースの衝突によって誘導された解離（ＣＩＤ）で行った。この設定下のインソースＣＩＤは、未変化の脂質Ａドメインに対応する強いフラグメントイオン��生成し、これは、野生型Ｂ２１３株の脂質Ａの質量スペクトルに示す通り（図３ａ）、最小の脂質Ａの断片化を有する、非還元脂質ＡグルコサミンとＫｄｏとの間の不安定な連結の破損から生じる。
【０１７８】
真核細胞株培養及び刺激
ＭＤ−２及びＣＤ１４と組み合わせた、ヒト又はマウスＴＬＲ４のいずれかで形質移入されたヒトＮＦ−κＢ／ＳＥＡＰレポーターＨＥＫ２９３細胞を、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した。両方の細胞株は、ＮＦ−κＢ−誘導性分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ：ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）レポーター遺伝子を含有し、これは、ＴＬＲシグナル伝達後に発現する。これらの細胞を、先に記載した通り、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ培養培地中で増殖した［１９］。ＳＥＡＰを、基質クワンティ−ブルー（Ｑｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を加えた後、培養上清中で検出した。ヒト単核球細胞株ＭｏｎｏＭａｃ６（ＭＭ６；ＤＳＭＺ）を、１０％熱失活ＦＣＳ、５０Ｕ／ｍｌペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンが補充されたＩｓｃｏｖｅのダルベッコ改変培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ）中で増殖させた。すべての細胞株を、５％飽和ＣＯ２雰囲気中で３７℃で培養した。
【０１７９】
ＴＬＲ４シグナル伝達について、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞株（２．５×１０４）を、９６ウェルプレート中で、精製されたＬＰＳ又は熱失活した全細胞調製の段階希釈によってインキュベートした。３７℃でのインキュベーションの２、４又は６ｈ後、上清を、収集し、クワンティ−ブルー基質で２ｈインキュベートし、ＯＤ６３０を、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）リーダーを用いて測定した。
【０１８０】
結果
百日咳菌における異種ＬｐｘＬ及びＬｐｘＡの発現
百日咳菌脂質Ａにおける、３及び３’位における第１のアシル鎖及び第２のアシル鎖のみの長さを改変するために、本発明者らは、他の細菌から得られたＬｐｘＡ及びＬｐｘＬアシルトランスフェラーゼを使用した。百日咳菌脂質Ａは、それぞれ３及び３’位において、３ＯＨ−Ｃ１０及び３ＯＨ−Ｃ１４鎖を含有する（図１Ａ）。本発明者らは、髄膜炎菌（ＬｐｘＡ（Ｎｍ））又は緑膿菌（ＬｐｘＡ（Ｐａ））から得られた対応する酵素によるＬｐｘＡの置換が、アシル鎖の改変をもたらすか否かを調査した。同様に、本発明者らは、ポルフィロモナス・ジンジバリス（ＬｐｘＬ（Ｐｇ））又は髄膜炎菌（ＬｐｘＬ（Ｎｍ））から得られた、対応する酵素による百日咳菌のＬｐｘＬの置換が、アシル鎖の改変をもたらすか否かを調査した。
【０１８１】
異種酵素についての遺伝子を、ｔａｃプロモーターの制御下で広範な宿主域発現ベクターｐＭＭＢ６７ＥＨにクローン化した。組換え型酵素ＬｐｘＡ及びＬｐｘＬの発現を、ＲＴ−ＰＣＲによりクローン化する宿主大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において最初に評価した（データは図示せず）。これらのアッセイによって、細菌が、ＩＰＴＧで増殖する場合、目的とする遺伝子の転写物の存在が確認され、細菌が、ＩＰＴＧの非存在下で増殖する場合、これらの転写物は、それほど多くなかった又は検出不可能であった。タンパク質発現をやはり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検出し；ＬｐｘＡタンパク質を、ＬｐｘＬタンパク質よりも高い存在量で発現した（データは図示せず）。
【０１８２】
次いで、プラスミドを、百日咳菌Ｂ２１３株、Ｔｏｈａｍａ  Ｉ株の誘導体に転移した（表１）。驚くべきことに、ｐＭＭＢ６７ＥＨ−ＬｐｘＡ（Ｎｍ）が、ＰＣＲによって証明される通り百日咳菌にうまく導入されたが、接合完了体は、プラスミド維持のためにアンピシリンを含有し、ＩＰＴＧを含有しないプレート上に再播種した後増殖に失敗した。したがって、明らかに、髄膜炎菌から得られたＬｐｘＡの誘導されない発現量でさえ、百日咳菌において致死性であるが、これは大腸菌においては当てはまらない。Ｌｐｘ（Ｎｍ）酵素の導入によって産生されることが予測されるＬＰＳを、図１Ｂに示す。本発明者らは、ＬｐｘＬ（Ｎｍ）の発現によって、増殖が損なわれることにも注目した（図Ｓ１Ｃ）。すべての他の組換え型株は、野生型として増殖した（図２（Ｓ１Ｃ））。
【０１８３】
組換えタンパク質ＬｐｘＤ（Ｐａ）の発現を、大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）中で最初に試験し、それに、プラスミドを転移した。得られた菌株は、ＢＬ２１−ｐＬｐｘＤＰａと呼ばれる。ＩＰＴＧを培養に加えても、増殖に影響を与えなかった（データは図示せず）。タンパク質の発現は、通常のクマシーブルー−染色ゲルにおいて検出されず、そこで、ＢＬ２１（ＤＥ３）及びＢＬ２１−ｐＬｐｘＤＰａの全細胞ライセートを分析した。しかしながら、ウエスタンブロットアッセイによって、ＢＬ２１−ｐＬｐｘＤＰａにおけるＬｐｘＤＰａの期待されたサイズ（３６．４ｋＤａ）のバンドとの抗−Ｈｉｓ６−タグ抗体の反応が示され（データは図示せず）、これは、ＢＬ２１（ＤＥ３）のサンプル中に存在しなかった。次に、プラスミドを、ドナーとして大腸菌株ＳＭ１０λｐｉｒを用いた連結により百日咳菌Ｂ２１３に転移し、２つの接合完了体を保存した。１ｍＭ  ＩＰＴＧの存在下で、クローンはいずれも、親と比較して増殖異常が示され（図２Ｂ）、これは、クローン５についてより明白であった。ウエスタンブロットアッセイによって、両方のクローンにおける酵素の発現が確認され（データは図示せず）、発現量における差は、観察されなかった。
【０１８４】
組換え型脂質Ａ構造の分析
次いで、脂質Ａ構造を、１ｍＭ  ＩＰＴＧの存在下で１２ｈ増殖させた細胞全体から抽出した精製されたＬＰＳを用いて、ナノ−ＥＳＩ−ＭＳにより分析した（対数増殖）。野生型株について、主なピークを、期待されたビス−リン酸化ペンタ−アセチル化脂質Ａと対応する、ｍ／ｚ１５５７．９７で観察した（図３ａ）。ＬｐｘＡ（Ｐａ）を発現する株において、スペクトルによって、ｍ／ｚ１５５７．９７におけるイオンの他、ｍ／ｚ１５０１．９１及び１５２９．９４における２個の追加のイオンが明らかになった（図３ｂ）。ｍ／ｚ１５０１．９１におけるイオンは、３ＯＨ−Ｃ１０による３’位における第１の３ＯＨ−Ｃ１４アシル鎖の置換と対応し（図１Ｃ）、ｍ／ｚ１５２９．９４イオンによって、長さが中間のＣ１２鎖である、ヒドロキシル化された脂肪酸の存在が示される。２つの新種の相対的な存在量は、ｍ／ｚ１５５７．９７における野生型構造に対して、４８及び７５％に過ぎず、これは、染色体における内因性ｌｐｘＡの発現によるものとなり得る。したがって、本発明者らは、染色体ｌｐｘＡコピーをノックアウトすることを決定した。得られた菌株のＭＳ分析によって、ｍ／ｚ１５５７．９７イオンの完全な喪失及び置換に対応するｍ／ｚ１５０１．９１の主なピークを残すｍ／ｚ１５２９．９４イオンの存在量の大幅な減少が証明された（図１Ｃ及び図３ｃ）。
【０１８５】
Ｂ２１３−ＬｐｘＬ（Ｎｍ）のＭＳ分析によって、少数の種としての野生型ｍ／ｚ１５５７．９７イオンが検出され、ｍ／ｚ１５２９．９４の主なピークは、Ｃ１２による第２のＣ１４アシル鎖の置換と対応した（図１Ｄ及び図３ｄ）。染色体ｌｐｘＬを除去する試みは失敗した。百日咳菌は、染色体における２つの隣接するｌｐｘＬ相同体を含有するが、ｌｐｘＬ２と呼ばれる１種のみ、実験室の増殖条件下で活性がある［２０］。異なるコンストラクトを用いて、部分的に又は完全にｌｐｘＬ２遺伝子を除去するが；相当な努力にもかかわらず、本発明者らは、所望のノックアウトを得ることができなかった。
【０１８６】
明らかに、酵素だけでなくｌｐｘＬ２遺伝子配列は、野生型株においてＬｐｘＬ（Ｎｍ）の発現によって、脂質Ａ構造の約６５％が既に変更されていることを考慮することが、百日咳菌について必須である。これは、下流遺伝子ｄａｐＦの発現に対するｌｐｘＬ２破損の正反対の効果によるものとなり得、下流遺伝子ｄａｐＦは、メソ−ＤＡＰ中でＬ，Ｌ−ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）を触媒するＬ，Ｌ−ＤＡＰエピメラーゼについてコードする。メソ−ＤＡＰは、細胞壁合成及びリジン生合成にとって重要である。しかしながら、メソ−ＤＡＰの存在下でｌｐｘＬ２遺伝子を不活性化する試みはやはり、失敗した。Ｂ２１３−ＬｐｘＬ（Ｐｇ）のＭＳ分析によって、ｍ／ｚ１５５７．９８イオンの存在量の大幅な減少及びＣ１６鎖によるＣ１４の置換と対応するｍ／ｚ１５８６．０１の新しいピークの出現が証明された（図１Ｅ及び図２ｅ）。要約すると、百日咳菌におけるＬｐｘＡ（Ｐａ）、ＬｐｘＬ（Ｎｍ）、及びＬｐｘＬ（Ｐｇ）の異種発現によって、図１に示す通り、ＬＰＳの変更がもたらされた。
【０１８７】
Ｂ２１３−ｐＬｐｘＤ（Ｐａ）クローン４及び５の分析によって、両方の突然変異において、ｍ／ｚ１５５７．９７におけるイオンが、野生型において見出された通り、標準ペンタ−アシル化脂質Ａと対応することが見出されたことが明らかになった（図３ｆ及び３ｇ）。さらに、ｍ／ｚ１５２９．９４及び１５０１．９１における大量のイオンは、それぞれ３ＯＨ−Ｃ１４から３ＯＨ−Ｃ１２までの１本又は２本のアシル鎖の長さの短縮と対応することが判明した（図３ｆ及び３ｇ）。これらの追加の主なイオンの存在量は、両クローン間で変わり；ｍ／ｚ１５２９．９４におけるピークの相対的な存在量は、クローン４よりもクローン５において低く、ｍ／ｚ１５０１．９１のピークの場合、逆もまた同様であった。したがって、クローン５は、クローン４よりも、脂質Ａにおける両アシル鎖の長さの改変全体で、脂質Ａ分子の量がより大きかったが、不変の脂質Ａのかなりの量は、両方の場合に残存した。これらの結果によって、ＬｐｘＤＰａの発現によって、図１に示される通り、脂質Ａの構造が改変されたことが示される。
【０１８８】
ＬＰＳ変異体によるＴＬＲ４の差次的な活性化
次に、本発明者らは、変更された構造が、ＬＰＳの毒性に影響を与えるか否か調査した。この目的を達成するために、精製されたＬＰＳ調製を、ヒト又はマウスＴＬＲ４複合体（それぞれ、ｈＴＬＲ４及びｍＴＬＲ４）を発現するＨＥＫ２９３細胞の培養に加えた。曝露後、受容体の活性化を、レポーター遺伝子の発現により評価した（図４）。興味深いことに、Ｂ２１３−ｐＬｐｘＡ（Ｐａ）から得られたＬＰＳは、野生型株から得られたＬＰＳよりもｈＴＬＲ４をそれほど刺激しなかった（図４Ａ）。さらに検出した残りの活性化は、この遺伝子の不活性化後に完全に除去されたため、染色体ｌｐｘＡ遺伝子の発現によるものであった（図４Ａ）。したがって、３’位における第１のアシル鎖の長さは、百日咳ＬＰＳによるｈＴＬＲ４の活性化に関連する。Ｂ２１３−ｐＬｐｘＬ（Ｎｍ）及びＢ２１３−ｐＬｐｘＬ（Ｐｇ）から得られたＬＰＳは、それぞれ、ｈＴＬＲ４活性化を減少させ、増加させた（図４Ａ）。したがって、ｈＴＬＲ４の刺激は、Ｃ１６＞Ｃ１４＞Ｃ１２の順序で第２のアシル鎖の長さと相関する。
【０１８９】
ＬｐｘＤ（Ｐａ）を発現する菌株の変更されたＬＰＳの毒性を評価するために、両方の突然変異及び野生型から得られた、精製されたＬＰＳの調製を、ヒトＴＬＲ４受容体（ｈＴＬＲ４）（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を発現するＨＥＫ−Ｂｌｕｅ細胞の培養に加えた。陰性対照として、本発明者らは、Ｂ２１３ΔｌｐｘＡ−ｐＬｐｘＡ（Ｐａ）株から得られた、精製されたＬＰＳを用い、これは、３’位における３ＯＨ−Ｃ１４の代わりに３ＯＨ−Ｃ１０アシル鎖を含有し、ｈＴＬＲ４を活性化しなかった。受容体の活性化を、曝露の４ｈ後、ＳＥＡＰレポーター遺伝子の発現により評価し、結果を、図５に示す。Ｂ２１３−ｐＬｐｘＤ（Ｐａ）クローン４及びクローン５から得られたＬＰＳは、野生型ＬＰＳよりもかなり低い活性を示した。クローン５から得られたＬＰＳで刺激された細胞のＳＥＡＰ活性は、刺激されていない細胞のＳＥＡＰ活性と同様に低く、クローン４から得られたＬＰＳで刺激された細胞は、恐らく、このクローンにおいて、アシル鎖のいくらか効率的でない改変に従って、残りの活性が低いことを示した（図３）。Ｂ２１３ΔｌｐｘＡ−ｐＬｐｘＡ（Ｐａ）から得られたＬＰＳで刺激された細胞は、刺激されていない細胞よりもＳＥＡＰ活性がさらに低いことを示した。
【０１９０】
野生型株Ｂ２１３から得られたＬＰＳ調製によるｍＴＬＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞の刺激によって、ｈＴＬＲ４を発現する細胞において観察されたものよりもより強く反応した（図４Ａ及びＢを比較する）。異種酵素を発現するＢ２１３細胞から得られたＬＰＳ調製は、これらの細胞を刺激することにおいて、わずかに有効でなかった（図４Ｂ）。しかしながら、染色体ｌｐｘＡ遺伝子が、ＬｐｘＡ（Ｐａ）を発現するＢ２１３において不活性化された場合、得られたＬＰＳは、ｍＴＬＲ４を全く活性化しなかった（図４Ｂ）。したがって、ヒト及びマウスＴＬＲ４は、改変された百日咳ＬＰＳによって別に活性化するが、３’位における第１のアシル鎖の長さは、どちらの場合においても重要である。３位における第１のアシル鎖を喪失した百日咳菌ＬＰＳの毒性の低下は、これらの膜からその放出を増加させることにより、全細胞調製において無効になったことが、以前に報告された［２］。このことを考慮して、本発明者らは、全細胞調製の生物活性を決定することを望んだ。Ｂ２１３株における異種ＬＰＳ酵素の発現は、全細胞及び精製されたＬＰＳ調製において同様に、ｈＴＬＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞の刺激に影響を及ぼした（図４Ａ及びＣを比較する）。全細胞調製によるｍＴＬＲ４を発現するＨＥＫ２９３細胞の刺激は、Ｂ２１３における異種酵素の発現にほとんど影響を受けなかった（図４Ｄ）。しかしながら、ＬｐｘＡ（Ｐａ）を発現するＢ２１３のΔｌｐｘＡ突然変異の全細胞調製は、これらの細胞を活性化するのに失敗した（図４Ｄ）。
【０１９１】
考察
これらの反応源性は、サブユニットワクチンによる全細胞百日咳ワクチンの置換をもたらしているが、十分な保護を実現していない。新たな、反応源性が少ない全細胞ワクチンの開発によって、解決策が提供され得る。ＬＰＳは、かなりの程度まで、細胞の百日咳ワクチンの毒性の原因である［２］。本試験において、本発明者らは、百日咳菌脂質Ａにおけるアシル鎖の長さの改変によって、毒性を低下させ得るかどうかを調査した。本発明者らは、異種ＬｐｘＡ及びＬｐｘＬアシルトランスフェラーゼの発現により、３’位における第１のアシル鎖の長さ及び２’位における第２のアシル鎖の長さを改変した。本発明者らは、両方のアシル鎖の長さの短縮によって、ＬＰＳ毒性が大幅に低下したことを見出した（図４）。
【０１９２】
さらに正確には、脂質Ａの３’位で存在する３ＯＨ−Ｃ１４鎖についての３ＯＨ−Ｃ１０アシル鎖の置換によって、内毒素性が消失した。さらに、Ｃ１２によって２’位における第１のアシル鎖に付着させた第２のＣ１４鎖の置換によって、内毒素性が低下した。一貫して、この鎖がＣ１６によって置換された場合、内毒素性は増加した。
【０１９３】
百日咳菌脂質Ａの２及び２’位におけるアシル鎖の長さの短縮が、ｈＴＬＲ４の活性化にやはり大きな影響があることがさらに観察された。毒性に対する効果が、より短いアシル鎖の位置と無関係に得られることを考慮すると、脂質Ａ分子の疎水性部分の総体積は、ｈＴＬＲ４複合体への適正な結合及びｈＴＬＲ４複合体の活性化のために明らかに重要である。産生された新規なＬＰＳ種は、これらが、野生型ＬＰＳのかなりの量の存在下でさえ（図３）、任意のｈＴＲＬ４応答を枯渇させ得る限り、ｈＴＬＲ４アンタゴニストとして機能すると思われる（図５）。ＬｐｘＡ（Ｐａ）又はＬｐｘＤ（Ｐａ）を発現する菌株から得られた、精製されたＬＰＳ調製よりもより低量の野生型ＬＰＳを含有したとしても、Ｂ２１３−ｐＬｐｘＬ（Ｎｍ）から得られたＬＰＳによって、ｈＴＬＲ４を活性化することにおいて残りの活性が示されるため、これは、より短い第２のアシル鎖を有するＬＰＳについての場合となり得ない。百日咳菌におけるＬｐｘＤ（Ｐａ）の発現によって、増殖異常が引き起こされることを留意されるべきである。同様に、本発明者らの先の結果によって、ＬｐｘＬ（Ｎｍ）を発現する百日咳菌の増殖異常が示された。
【０１９４】
要約すると、本発明者らの結果によって、免疫系の活性化及び百日咳菌ＬＰＳの内毒素性についてのアシル鎖の長さの重要性が実証された。
【０１９５】
本発明者らの結果はまた、マウス及びヒトＴＬＲ４の活性化に対するＬＰＳの改変の異なる効果が明らかになり、ほとんどの場合では、ｍＴＬＲ４は、この改変に感受性がなかった。先の試験では、ＴＬＲ４活性化に関する種に依存的な差（ｓｐｅｃｉｅｓ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ）が報告された［２４；２５］。これらの差は、ＭＤ−２及びＴＬＲ４における種間の改変により説明可能である。これらの差は、ワクチン試験における実験動物からヒトへのデータの外挿を制限する［２５］。しかしながら、重要なことに、ＬｐｘＡ（Ｐａ）を発現するＢ２１３株のｌｐｘＡノックアウト突然変異のＬＰＳは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｍＴＬＲ４及びｈＴＬＲ４を活性化することに失敗して、マウスからヒトにおける計画された実験の結果の外挿が可能になった。
【０１９６】
百日咳菌脂質Ａの３及び３’位におけるアシル鎖は、長さが異なることは注目に値する［４］。ＬｐｘＡは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ中のＧｌｃＮＡｃの３位においてある特定の長さのアシル鎖を転移することにより、脂質Ａ生合成経路において第１の反応を触媒する。このアシル鎖の正確な長さは、ＬｐｘＡにおいて炭化水素定規により定義される［２６］。この経路の後、ＬｐｘＨは、脂質Ｘを産生するＵＤＰ−ジアシルグルコサミン（ＵＤＰ−ＤＡＧ）前駆体の母集団の割合でＵＭＰを除去し、その後、ＬｐｘＢは、ＵＤＰ−ＤＡＧ及びモノ−リン酸化された、テトラ−アシル化グルコサミン二糖類を産生する脂質Ｘ分子を連結し、３及び３’位におけるこれらのアシル鎖は、いずれもＬｐｘＡによる最初のアシル化に由来し、したがって、通常、同一である。極めてまれに、３及び３’位における異なるアシル鎖の長さを有するＬＰＳ種は、天然で見出される。異なるアシル鎖の長さと一致して、大腸菌における発現試験によって、百日咳菌ＬｐｘＡが、鎖長の特異性を低下させるが、様々な長さのアシル鎖は、３及び３’位で取り込まれたことが示される［２７］。したがって、百日咳菌脂質Ａにおける欠点のない非対称は、経路において酵素下流の鎖長の特異性により説明されなければならず、これは、本発明者らの仮定によると、ＬｐｘＨである。本発明者らの研究では、ＬｐｘＡ（Ｐａ）の発現によって、３及び３’位における２本の３ＯＨ−Ｃ１０鎖が生じ、これは、耐容性を示した。しかしながら、これらの位における２本の１次３ＯＨ−Ｃ１２鎖を生じるはずである（図１）ＬｐｘＡ（Ｎｍ）の発現は、致死性であると思われる。百日咳菌のＬｐｘＨが、３位における短い３ＯＨ−Ｃ１０鎖を含有するＵＤＰ−ＤＡＧ分子からのみＵＭＰを除去し得る場合、これを説明することができる。実際、本発明者らが、百日咳菌においてＬｐｘＨ（Ｎｍ）を発現させた場合、非対称は消滅し、本発明者らのＬｐｘＨ仮説が確認される（データは図示せず）。同様に、ＬｐｘＡ（Ｎｍ）及びＬｐｘＨ（Ｎｍ）の異種発現によって、生存可能な細胞が生じた（データは図示せず）。したがって、３ＯＨ−Ｃ１０よりも長い３位におけるアシル鎖を有する改変されたボルデテラ脂質Ａ部分を得るために、（改変されたアシルトランスフェラーゼの他に）改変されたＬｐｘＨ、例えば、ＬｐｘＨ（Ｎｍ）等の存在を要し得る。
【０１９７】
結論として、本明細書に開示される脂質Ａエンジニアリングにより全細胞百日咳菌ワクチンの毒性を低下させる本発明者らの手法は、有効であった。本発明者らの結果から、百日咳菌ＬＰＳの内毒素活性が、その脂肪アシル鎖の長さによって、大いに決定されることが示される。初めて、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおいて内毒素活性に全体として欠けている株を設計することに成功した。重要なことに、このＬＰＳは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｍＴＬＲ４をやはり活性化せず、計画された動物試験において得られたデータをヒトに外挿することを可能にした。したがって、本発明者らの知見によって、百日咳菌及び他の病原体用の新たな細胞ワクチンの生成が可能になる。
【０１９８】
【表２】
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【０１９９】
【表３】
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実施例２
ｌｐｘＤ（Ｐａ）及びｌｐｘＡ（Ｐａ）ＬＰＳ突然変異によって、ウサギにおける発熱性の低下が示される
百日咳菌突然変異は、緑膿菌から得られたｌｐｘＡ及びｌｐｘＤ遺伝子の異種発現によるこれらのＬＰＳにおける変更された脂質Ａ部分によって構成された。詳細には、百日咳菌Ｂ１９１７株は、構成され、染色体ｌｐｘＡ遺伝子又はｌｐｘＤ遺伝子は、対応する緑膿菌バージョンで置換された。両方の場合では、これによって、質量分析により示される通り、期待された短縮されたアシル鎖を有するＬＰＳが合成された。
【０２００】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのこれらの変更の効果を試験するために、ウサギによる発熱性試験を、野生型とすべて比較して、ｌｐｘＡ突然変異及びｌｐｘＤ突然変異から精製されたＬＰＳ並びにＬｐｘＤ突然変異から抽出したＯＭＶで実施した。ＯＭＶ（ｎＯＭＶ）を、ｖａｎ  ｄｅ  Ｗａｔｅｒｂｅｅｍｄら（２０１０年、Ｖａｃｃｉｎｅ、２８巻（３０号）：４８１０−６）によって本質的に記載される通り、キレート化剤としてＥＤＴＡを用いて、細菌バイオマスの界面活性剤無しで行う抽出により抽出した。
【０２０１】
ニュージーランド白ウサギに、ｎＯＭＶ（タンパク質５０μｇ）又は精製されたＬＰＳ（１０μｇ）を含有する溶液０．５ｍｌ、並びに対照として、無細胞百日咳ワクチン及び食塩水を、筋肉内に注射した。次の群を用いた（１群当たり動物５匹）：
１．ビヒクル対照（食塩水）
２．参照ワクチン（ａｃＰ）
３．ワクチン１：Ｂ１９１７  ｎＯＭＶ  ｏｍｐＡ  ｐｒｎ
４．ワクチン２：Ｂ１９１７  ｎＯＭＶ  ｏｍｐＡ  ｐｒｎ  ｌｐｘＤ
５．ワクチン３：Ｂ１９１７  ＬＰＳ  ｌｐｘＤ
６．ワクチン４：Ｂ１９１７  ＬＰＳ  ｌｐｘＡ
７．ワクチン５：Ｂ１９１７  ＬＰＳ野生型
【０２０２】
体温を、注射の０．５、１、２、４、６、２４及び４８ｈｒ後に、皮下に移植されたトランスポンダから外付けスキャナーを用いて測定した。これらの結果を、表３（表４）及び図６に示す。
【０２０３】
結果
体温の統計的に有意な上昇が、ワクチン１（注射の１，２及び４ｈ後）及びワクチン５（注射の４ｈ後）により示される。精製されたＬＰＳでは、野生型により誘導されるが、ｌｐｘＤ及びｌｐｘＡ突然変異により誘導されない明白な発熱ピークがある。ＯＭＶでは、野生型及びｌｐｘＤ突然変異についてのより長期間の発熱があるが、後者の方が、低い。ＯＭＶが、ＬＰＳの他に、他の発熱性構成成分を含有するため、これは、期待されるものである。
【０２０４】
結論
これらのデータによって、野生型ボルデテラの脂質Ａ部分と比較して、少なくとも１本のアシル鎖の長さがより短い、脂質Ａ部分を有する突然変異ボルデテラＬＰＳは、ウサギにおいて発熱性を明らかに低下させることを示すということが実証される。したがって、ＴＬＲ４を発現するＨＥＫ細胞による上記の観察されるｉｎ  ｖｉｔｒｏデータは、これらのｉｎ  ｖｉｖｏデータによって実証される。
【０２０５】
【表４】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2020510726.tif 000019
2020510726.tif 000020
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