(57)【要約】  本開示は、ＣＤ９Ｐ−１経路を阻害する、好ましくはＣＤ９Ｐ−１／スタビリン１経路および／またはＣＤ９Ｐ−１／ＴＲＡＦ−２経路を阻害する単離タンパク質、具体的にはヒトＣＤ９Ｐ−１に対する単離抗体ならびに治療法または診断法へのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ９Ｐ−１経路を阻害する、好ましくはＣＤ９Ｐ−１／スタビリン１経路および／またはＣＤ９Ｐ−１／ＴＲＡＦ−２経路を阻害する、単離タンパク質。
【請求項２】
ＣＤ９Ｐ−１の内部移行および／または分解を誘導し、好ましくは、スタビリン１の内部移行および／または分解ならびに／あるいはＴＲＡＦ−２の分解をさらに誘導する、請求項１に記載の単離タンパク質。
【請求項３】
ＣＤ９Ｐ−１と結合し、好ましくは、全抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、二量体一本鎖抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、脱フコシル化抗体、二特異性抗体、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディからなる群より選択される抗体分子、ユニボディ、ドメイン抗体およびナノボディからなる群より選択される抗体フラグメント、またはアフィボディ、アフィリン、アフィチン、アドネクチン、アトリマー、エバシン、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、ファイノマー、バーサボディおよびデュオカリンからなる群より選択される抗体模倣物である、請求項１または請求項２に記載の単離タンパク質。
【請求項４】
ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基２０２〜２３２の、またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基２０２〜２３２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の、少なくとも１つのアミノ酸残基と、
ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４２２〜４４２の、またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４２２〜４４２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の、少なくとも１つのアミノ酸残基と、
ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４７２〜５０２の、またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４７２〜５０２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の、少なくとも１つのアミノ酸残基と
を含む立体構造エピトープと結合する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離タンパク質。
【請求項５】
重鎖の可変領域が、以下のＣＤＲ：
ＶＨ−ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号１）；
ＶＨ−ＣＤＲ２：ＩＦＰＧＴＧＴＴ（配列番号２）；および
ＶＨ−ＣＤＲ３：ＳＲＤＦＤＶ（配列番号３）
のうちの少なくとも１つのＣＤＲ、または配列番号１〜３と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含み、かつ／あるいは
軽鎖の可変領域が、以下のＣＤＲ：
ＶＬ−ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＤＩＤＧＫＴＹ（配列番号４）；
ＶＬ−ＣＤＲ２：ＬＶＳ；および
ＶＬ−ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＬＰＲＴ（配列番号５）
のうちの少なくとも１つのＣＤＲ、または配列番号４、ＬＶＳおよび配列番号５と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含む、
請求項３または請求項４に記載のヒトＣＤ９Ｐ−１に対する単離抗体。
【請求項６】
前記重鎖の可変領域が、請求項４で定められるＣＤＲのうちの少なくとも１つのＣＤＲを含み、前記軽鎖の可変領域が、請求項４で定められるＣＤＲのうちの少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項３〜５のいずれか１項に記載のヒトＣＤ９Ｐ−１に対する単離抗体。
【請求項７】
前記重鎖の可変領域が、以下のＣＤＲ：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号１）、ＩＦＰＧＴＧＴＴ（配列番号２）およびＳＲＤＦＤＶ（配列番号３）を含み、前記軽鎖の可変領域が、以下のＣＤＲ：ＱＳＬＬＤＩＤＧＫＴＹ（配列番号４）、ＬＶＳおよびＷＱＧＴＨＬＰＲＴ（配列番号５）、または前記配列番号１〜５およびＬＶＳと少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含む、請求項３〜６のいずれか１項に記載のヒトＣＤ９Ｐ−１に対する単離抗体。
【請求項８】
前記重鎖可変領域のアミノ酸配列が配列番号６であり、配列中、Ｘ１がＱまたはＲであり、Ｘ２がＲまたはＧであり、Ｘ３がＴまたはＡであり、Ｘ４がＳまたはＴであり、前記軽鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号７であり、配列中、Ｘ５がＰまたはＬであり、Ｘ６がＳまたはＦであり、Ｘ７がＳであるか、存在しない、または前記配列番号６〜７と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意の配列である、請求項３〜７のいずれか１項に記載のヒトＣＤ９Ｐ−１に対する単離抗体。
【請求項９】
配列番号６のＸ１がＲであり、Ｘ２がＲであり、Ｘ３がＴであり、Ｘ４がＴであり（配列番号８）、かつ／または配列番号７のＸ５がＬであり、Ｘ６がＳであり、Ｘ７がＳである（配列番号２４）、請求項８に記載のヒトＣＤ９Ｐ−１に対する単離抗体。
【請求項１０】
配列番号６のＸ１がＱであり、Ｘ２がＲであり、Ｘ３がＴであり、Ｘ４がＴであり（配列番号１１）、かつ／または配列番号７のＸ５がＬであり、Ｘ６がＳであり、Ｘ７がＳである（配列番号２４）、請求項８に記載のヒトＣＤ９Ｐ−１に対する単離抗体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質を含む、組成物。
【請求項１２】
癌を治療するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離タンパク質。
【請求項１３】
生体試料中のＣＤ９Ｐ−１を検出するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質を用いる、生体試料中のＣＤ９Ｐ−１、好ましくは１３５ｋＤａのグリコシル化膜貫通型ＣＤ９Ｐ−１、の存在を判定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏの診断アッセイまたは予後予測アッセイ。
【請求項１５】
請求項７に記載の抗体をコーティング抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法である、請求項１４に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏの診断アッセイまたは予後予測アッセイ。
【請求項１６】
少なくとも１つの請求項３〜１０のいずれか１項に記載のヒトＣＤ９Ｐ−１に対する抗体、好ましくは請求項７に記載の抗体と、任意選択で顕示抗体と、を含む、キット。
【請求項１７】
配列番号３２および配列番号３３または前記配列番号３２〜３３と少なくとも６０％の同一性を共有する核酸配列を有する任意の配列のうちの少なくとも１つのものを含む、発現ベクター。
【請求項１８】
ＣＮＣＭ  Ｉ−５２１３およびＣＮＣＭ  Ｉ−５２１４で登録されているヒトＣＤ９Ｐ−１に対する抗体を産生する、ハイブリドーマ細胞系。
【請求項１９】
必要とする対象において癌細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、前記対象に有効量の請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項２０】
必要とする対象においてＭ２マクロファージのＭ１マクロファージへの再分極化を誘導するための方法であって、前記対象に有効量の請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質を投与することを含む、方法。
【請求項２１】
必要とする対象において免疫応答および／または炎症性応答を誘導するための方法であって、前記対象に有効量の請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト分化クラスター９パートナー１（ＣＤ９Ｐ−１）を標的とするタンパク質、具体的にはＣＤ９Ｐ−１に対する新規な抗体ならびに治療法および診断法へのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
化学薬品に耐性のある腫瘍転移の制止不可能な増殖および拡散が、癌による死亡の主要な原因の１つとなっている。腫瘍転移は、クローン分裂から生じ、多数の様々な前駆細胞に由来するものであり得る。さらに、転移性細胞は非腫瘍性細胞と比較して、自然変異率が高く、ＤＮＡ修復機序に欠陥がみられる。このことはいずれも、同じ化学療法に対して転移の感受性の範囲が広いため従来の治療薬が奏効しない患者が存在することの説明となる。このため、癌細胞に対する宿主免疫応答を操作する癌免疫療法が、外科手術、細胞傷害性治療および放射線療法と並んで癌治療の基礎の１つとなっている。
【０００３】
抗ＣＴＬ４および抗ＰＤＬ１／抗ＰＤ１モノクローナル抗体による免疫チェックポイント遮断を用いた最近の臨床結果から、免疫療法が癌治療の極めて有望な方法となることが明確に確認されている。チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ、免疫チェックポイント阻害剤またはＩＣＩと呼ばれることもある）は、抗腫瘍応答を刺激するために正常な免疫細胞を標的とするものである。チェックポイント阻害剤は、Ｔ細胞上に発現する抑制性受容体とそのリガンドとの間の相互作用を遮断することによって作用する。その効果は複数のタイプの癌で示されていた。しかし、これらの治療法が奏効する患者はごく一部に限られており、新たな免疫療法の標的が必要とされている。
【０００４】
腫瘍関連マクロファージの標的化も有望な免疫療法戦略であると考えられている。実際、固形腫瘍の腫瘍間質の主要な構成要素である殺腫瘍マクロファージは、腫瘍性細胞を認識し、取込み、分解すると同時に、転移性細胞は無傷のままにしておくことができるため、腫瘍形成の予防および治療のための優れた標的となっている。このため、現在、新規な抗癌治療を開発するため、腫瘍環境内へのマクロファージ動員の阻害（ＣＳＦ−１Ｒ阻害剤）、殺腫瘍エフェクター（ＢＣＧ）の開発、Ｍ２  ＴＡＭ枯渇の誘導またはその抗腫瘍エフェクター、「Ｍ１様」モードとしての「再教育」（抗ＣＤ４０）；ならびに癌細胞の食作用および細胞内破壊を誘発する腫瘍標的化モノクローナル抗体（抗ＣＤ４７）の開発といった戦略が臨床試験で検討されている。
【０００５】
腫瘍を破壊するには非特異的な自然免疫および抗原特異的で記憶促進的な適応免疫をともに採り入れる戦略が最も有望な癌治療法である。例えばアポトーシスの活性化による細胞死、食作用および共刺激経路を誘導するナチュラルキラー（ＮＫ）、マクロファージ、顆粒球および樹状細胞を含めた自然免疫の要素ならびに／あるいは適応免疫の要素、具体的には、体液性免疫応答（Ｂ細胞）または細胞性免疫応答（Ｔ細胞）に関与するリンパ球（Ｂ細胞およびＴ細胞）によって駆動される抗腫瘍応答を誘導する治療法の組合せ。Ｔ細胞を効果的に活性化させるには、２種類の別個のＴ細胞受容体が関与する必要がある。抗原特異的Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は外来ペプチド抗原−ＭＨＣ複合体と結合し、ＣＤ２８受容体は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面に発現するＢ７（ＣＤ８０／ＣＤ８６）共刺激分子と結合し、このＡＰＣは、単球、マクロファージ、樹状細胞またはＢリンパ球であり得る。
【０００６】
テトラスパニンタンパク質は、特に腫瘍の成長、拡散および血管新生を支えることによって、腫瘍形成に様々な形で寄与する。ＣＤ９は、最も試験が実施されているテトラスパニンであり、膜融合、分化および細胞運動性を含めた複数の細胞事象で機能することがわかっており、転移に重要な役割を果たしているものと思われる。臨床観察から、ＣＤ９のダウンレギュレーションが固形腫瘍と進行と相関することが示唆されている。テトラスパニンは、４つの膜貫通ドメインを有し、血管新生、細胞遊走、細胞間の接触および融合を含めた多数の生理学的過程に関与している大きさの異なる２つの細胞外ドメインの輪郭となる、タンパク質ファミリーを形成している。テトラスパニンの機能は、それらが互いに作用するとともに、様々な他の表面タンパク質とも相互作用して、テトラスパニンウェブと呼ばれる分子相互作用のネットワークを形成することができることと関係があると考えられている。テトラスパニンは、そのパートナータンパク質との相互作用を介して、癌に対する免疫応答にも関与している。テトラスパニンは、パターン認識受容体（ＰＲＲ）およびその下流で誘導されるシグナル伝達の統合ならびにＭＨＣ−ＩＩペプチド輸送の調節を介して、抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原の認識ならびに提示に関与する。ＣＤ９は、単球由来樹状細胞のＭＨＣ−ＩＩ輸送を調節する。ＣＤ８１は、癌および転移における免疫抑制を調節する。
【０００７】
免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）に属するＣＤ９パートナー１（「ＣＤ９Ｐ−１」、「ＦＰＲＰ」または「ＥＷＩ−Ｆ」とも呼ばれる）は、ＣＤ９、ＣＤ８１およびＣＤ１５１と関連し、したがって、テトラスパニンウェブ内に局在している。ＣＤ９Ｐ−１は、脂質マイクロドメインと関連するグリコシル化１型内在性膜タンパク質であり、多数の癌細胞系に過剰発現する。ＣＤ９Ｐ−１遺伝子発現は、癌の転移状態と関連することが明らかにされており、ＣＤ９Ｐ−１が固形腫瘍のＣＤ９発現消失の主な原因である可能性が示唆されている。具体的には、短縮型のＣＤ９Ｐ−１であるＧＳ−１６８ＡＴ２は、ヌードマウスの腫瘍誘導性血管新生を強力に阻害し、それによりｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍成長を抑える。さらに、ヒト胎児腎細胞（ＨＥＫ２９３）にＣＤ９Ｐ−１をコードするベクターをトランスフェクトすることにより、細胞遊走、すなわち、ほぼ確実に腫瘍細胞浸潤が有意に増大した。このため、癌治療のためのＣＤ９Ｐ−１に特異的な阻害剤を開発することが喫緊に必要とされている。
【０００８】
本発明者らは、ＣＤ９Ｐ−１タンパク質を特異的に標的とするモノクローナル抗体（以降、９ｂＦ４および１０ｂＢ１）を開発した。驚くべきことに、これらの抗体は実際に、具体的には癌細胞アポトーシスの誘導を介する効果的な抗癌活性をそれ自体で有する。
【０００９】
前臨床試験および臨床試験では、マクロファージが様々な癌の腫瘍の主な構成要素となり、血管新生および転移の促進によって予後を不良にする可能性があることが明らかにされている。これらの腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）はＭ２表現型を発現すると考えられている。驚くべきことに、本発明の抗体は、Ｍ２からＭ１へのマクロファージの再分極化を誘発し、それにより、Ｍ２状態のＴＡＭによる有害な抗炎症作用および腫瘍促進作用を抑えることが明らかになった。
【００１０】
さらに、本発明の抗体は、有利な点として、単球およびリンパ球の増殖／活性を介して癌細胞アポトーシスを誘導することが明らかになった。したがって、９ｂＦ４抗体および１０ｂＢ１抗体は、例えば、２つの主な殺腫瘍サイトカインおよび免疫応答の重要なエフェクターであるＴＮＦアルファおよびＩＦＮガンマの発現を、その組換え対応物の欠点（例えば、大量に生産することが困難であること、長期保管により生物活性が失われること、患者に投与すると副作用が生じることなど）を伴わずに誘発することができることから、これまでに知られている癌治療法に代わる予想外で有利な代替法となる。
【００１１】
したがって、本発明は、ヒトＣＤ９Ｐ−１を標的とする新規な単離タンパク質、具体的にはＣＤ９Ｐ−１に対する新規な抗体ならびにその治療剤および診断剤に関する。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、ＣＤ９Ｐ−１経路を阻害する、好ましくはＣＤ９Ｐ−１／スタビリン１経路および／またはＣＤ９Ｐ−１／ＴＲＡＦ−２経路を阻害する、単離タンパク質に関する。
【００１３】
一実施形態では、前記タンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１の内部移行および／または分解を阻害し、好ましくは、スタビリン１の内部移行および／または分解ならびに／あるいはＴＲＡＦ−２の分解をさらに誘導する。
【００１４】
一実施形態では、本発明のタンパク質はＣＤ９Ｐ−１と結合し、好ましくは、前記タンパク質は、全抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、二量体一本鎖抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、脱フコシル化抗体、二特異性抗体、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディからなる群より選択される抗体分子、ユニボディ、ドメイン抗体およびナノボディからなる群より選択される抗体フラグメント、またはアフィボディ、アフィリン、アフィチン、アドネクチン、アトリマー、エバシン、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、ファイノマー、バーサボディおよびデュオカリンからなる群より選択される抗体模倣物である。
【００１５】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基２０２〜２３２の、またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基２０２〜２３２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基および
−ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４２２〜４４２の、またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４２２〜４４２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基および
−ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４７２〜５０２の、またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４７２〜５０２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基
を含む立体構造エピトープと結合する。
【００１６】
一実施形態では、重鎖の可変領域は、以下のＣＤＲ：
ＶＨ−ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号１）；
ＶＨ−ＣＤＲ２：ＩＦＰＧＴＧＴＴ（配列番号２）；および
ＶＨ−ＣＤＲ３：ＳＲＤＦＤＶ（配列番号３）
のうちの少なくとも１つのＣＤＲ、
または配列番号１〜３と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲ
を含み、かつ／あるいは
軽鎖の可変領域は、以下のＣＤＲ：
ＶＬ−ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＤＩＤＧＫＴＹ（配列番号４）；
ＶＬ−ＣＤＲ２：ＬＶＳ；および
ＶＬ−ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＬＰＲＴ（配列番号５）
のうちの少なくとも１つのＣＤＲ、
または配列番号４、ＬＶＳおよび配列番号５と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲ
を含む。
【００１７】
一実施形態では、重鎖の可変領域は、上記ＣＤＲのうちの少なくとも１つのＣＤＲを含み、軽鎖の可変領域は、上記ＣＤＲのうちの少なくとも１つのＣＤＲを含む。
【００１８】
一実施形態では、重鎖の可変領域は、以下のＣＤＲ：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号１）、ＩＦＰＧＴＧＴＴ（配列番号２）およびＳＲＤＦＤＶ（配列番号３）を含み、軽鎖の可変領域は、以下のＣＤＲ：ＱＳＬＬＤＩＤＧＫＴＹ（配列番号４）、ＬＶＳおよびＷＱＧＴＨＬＰＲＴ（配列番号５）、または前記配列番号１〜５およびＬＶＳと少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意のＣＤＲを含む。
【００１９】
一実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号６であり、配列中、Ｘ１はＱまたはＲであり、Ｘ２はＲまたはＧであり、Ｘ３はＴまたはＡであり、Ｘ４はＳまたはＴであり、軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号７であり、配列中、Ｘ５はＰまたはＬであり、Ｘ６はＳまたはＦであり、Ｘ７はＳであるか、存在しない、または前記配列番号６〜７と少なくとも６０％の同一性を共有するアミノ酸配列を有する任意の配列である。
【００２０】
一実施形態では、配列番号６のＸ１はＲであり、Ｘ２はＲであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＴであり（配列番号８）、かつ／または配列番号７のＸ５はＬであり、Ｘ６はＳであり、Ｘ７はＳである（配列番号２４）。
【００２１】
一実施形態では、配列番号６のＸ１はＱであり、Ｘ２はＲであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＴであり（配列番号１１）、かつ／または配列番号７のＸ５はＬであり、Ｘ６はＳであり、Ｘ７はＳである（配列番号２４）。
【００２２】
本発明はさらに、上記タンパク質を含む組成物に関する。
【００２３】
本発明はさらに、癌を治療するための上記単離タンパク質に関する。
【００２４】
本発明はさらに、生体試料中のＣＤ９Ｐ−１の検出への上記タンパク質の使用に関する。
【００２５】
本発明はさらに、上記タンパク質を用いて、生体試料中のＣＤ９Ｐ−１、好ましくは１３５ｋＤａのグリコシル化膜貫通型ＣＤ９Ｐ−１の存在を判定する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの診断アッセイまたは予後予測アッセイに関する。
【００２６】
一実施形態では、アッセイは、上記抗体をコーティング抗体として用いるサンドイッチＥＬＩＳＡ法である。
【００２７】
本発明はさらに、少なくとも１つの上記ヒトＣＤ９Ｐ−１に対する抗体、好ましくは、上に示した６つのＣＤＲ配列を特徴とする抗体と、任意選択で顕示抗体（ｒｅｖｅａｌｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とを含む、キットに関する。
【００２８】
本発明はさらに、配列番号３２および配列番号３３または前記配列番号３２〜３３と少なくとも６０％の同一性を共有する核酸配列を有する任意の配列のうちの少なくとも１つのものを含む、発現ベクターに関する。
【００２９】
本発明はさらに、ＣＮＣＭ  Ｉ−５２１３およびＣＮＣＭ  Ｉ−５２１４で登録されているヒトＣＤ９Ｐ−１に対する抗体を産生するハイブリドーマ細胞系に関する。
【００３０】
本発明はさらに、必要とする対象に癌細胞のアポトーシスを誘導する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載されるタンパク質を投与することを含む、方法に関する。
【００３１】
本発明はさらに、必要とする対象にＭ２マクロファージのＭ１マクロファージへの再分極化を誘導する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載されるタンパク質を投与することを含む、方法に関する。
【００３２】
本発明はさらに、必要とする対象に免疫応答および／または炎症性応答を誘導する方法であって、対象に有効量の本明細書に記載されるタンパク質を投与することを含む、方法に関する。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
定義
本発明では、以下に挙げる用語は以下のような意味を有する。
【００３４】
ＣＤ９Ｐ−１は、免疫グロブリンドメインを有する細胞表面タンパク質であり、テトラスパニンタンパク質ＣＤ９と関連するテトラスパニンウェブの主要な構成要素である。ヒトＣＤ９Ｐ−１タンパク質の完全なアミノ酸配列（配列番号３４）（アクセッション番号ＮＰ＿０６５１７３．２）は以下の通りである：
ＭＧＲＬＡＳＲＰＬＬＬＡＬＬＳＬＡＬＣＲＧ（シグナルペプチド）
ＲＶＶＲＶＰＴＡＴＬＶＲＶＶＧＴＥＬＶＩＰＣＮＶＳＤＹＤＧＰＳＥＱＮＦＤＷＳＦＳＳＬＧＳＳＦＶＥＬＡＳＴＷＥＶＧＦＰＡＱＬＹＱＥＲＬＱＲＧＥＩＬＬＲＲＴＡＮＤＡＶＥＬＨＩＫＮＶＱＰＳＤＱＧＨＹＫＣＳＴＰＳＴＤＡＴＶＱＧＮＹＥＤＴＶＱＶＫＶＬＡＤＳＬＨＶＧＰＳＡＲＰＰＰＳＬＳＬＲＥＧＥＰＦＥＬＲＣＴＡＡＳＡＳＰＬＨＴＨＬＡＬＬＷＥＶＨＲＧＰＡＲＲＳＶＬＡＬＴＨＥＧＲＦＨＰＧＬＧＹＥＱＲＹＨＳＧＤＶＲＬＤＴＶＧＳＤＡＹＲＬＳＶＳＲＡＬＳＡＤＱＧＳＹＲＣＩＶＳＥＷＩＡＥＱＧＮＷＱＥＩＱＥＫＡＶＥＶＡＴＶＶＩＱＰＳＶＬＲＡＡＶＰＫＮＶＳＶＡＥＧＫＥＬＤＬＴＣＮＩＴＴＤＲＡＤＤＶＲＰＥＶＴＷＳＦＳＲＭＰＤＳＴＬＰＧＳＲＶＬＡＲＬＤＲＤＳＬＶＨＳＳＰＨＶＡＬＳＨＶＤＡＲＳＹＨＬＬＶＲＤＶＳＫＥＮＳＧＹＹＹＣＨＶＳＬＷＡＰＧＨＮＲＳＷＨＫＶＡＥＡＶＳＳＰＡＧＶＧＶＴＷＬＥＰＤＹＱＶＹＬＮＡＳＫＶＰＧＦＡＤＤＰＴＥＬＡＣＲＶＶＤＴＫＳＧＥＡＮＶＲＦＴＶＳＷＹＹＲＭＮＲＲＳＤＮＶＶＴＳＥＬＬＡＶＭＤＧＤＷＴＬＫＹＧＥＲＳＫＱＲＡＱＤＧＤＦＩＦＳＫＥＨＴＤＴＦＮＦＲＩＱＲＴＴＥＥＤＲＧＮＹＹＣＶＶＳＡＷＴＫＱＲＮＮＳＷＶＫＳＫＤＶＦＳＫＰＶＮＩＦＷＡＬＥＤＳＶＬＶＶＫＡＲＱＰＫＰＦＦＡＡＧＮＴＦＥＭＴＣＫＶＳＳＫＮＩＫＳＰＲＹＳＶＬＩＭＡＥＫＰＶＧＤＬＳＳＰＮＥＴＫＹＩＩＳＬＤＱＤＳＶＶＫＬＥＮＷＴＤＡＳＲＶＤＧＶＶＬＥＫＶＱＥＤＥＦＲＹＲＭＹＱＴＱＶＳＤＡＧＬＹＲＣＭＶＴＡＷＳＰＶＲＧＳＬＷＲＥＡＡＴＳＬＳＮＰＩＥＩＤＦＱＴＳＧＰＩＦＮＡＳＶＨＳＤＴＰＳＶＩＲＧＤＬＩＫＬＦＣＩＩＴＶＥＧＡＡＬＤＰＤＤＭＡＦＤＶＳＷＦＡＶＨＳＦＧＬＤＫＡＰＶＬＬＳＳＬＤＲＫＧＩＶＴＴＳＲＲＤＷＫＳＤＬＳＬＥＲＶＳＶＬＥＦＬＬＱＶＨＧＳＥＤＱＤＦＧＮＹＹＣＳＶＴＰＷＶＫＳＰＴＧＳＷＱＫＥＡＥＩＨＳＫＰＶＦＩＴＶＫＭＤＶＬＮＡＦＫＹＰ（細胞外ドメイン）
ＬＬＩＧＶＧＬＳＴＶＩＧＬＬＳＣＬＩＧＹＣＳＳＨＷＣＣＫＫＥＶＱＥＴＲＲＥＲＲＲＬＭＳＭＥＭＤ（膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン）。
【００３５】
ＣＤ９Ｐ−１タンパク質は、具体的にはグリコシル化、すなわち、アミノ酸残基への糖部分の付加を含めた翻訳後修飾を受ける。グリコシル化は、糖タンパク質が細胞表面の受容体に対するリガンドとして細胞付着を媒介する、またはシグナル伝達経路を刺激する役割を果たすことを可能にすることを含めた多岐にわたる生物学的過程に極めて重要である。したがって、１３５ｋＤａ型のＣＤ９Ｐ−１がグリコシル化膜貫通型タンパク質に相当する可能性が高い。
【００３６】
数字の前にある「約」という用語は、前記数字の値の±１０％を意味する。
【００３７】
本明細書で使用される「抗体」（Ａｂ）という用語は、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書では「抗体」と互換的に使用される。
【００３８】
「単離抗体」とは、その天然環境の構成要素から分離および／または回収した抗体のことである。その天然環境の夾雑構成要素とは、抗体の診断または治療への使用に干渉する物質のことであり、酵素、ホルモンおよびその他のタンパク質成分または非タンパク質成分がこれに含まれ得る。好ましい実施形態では、抗体を（１）ローリー法による測定で抗体の９５重量％超まで、最も好ましくは９９重量％まで；（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで；または（３）還元条件もしくは非還元条件下、クーマシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥによって示される均一性まで精製する。単離抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しなくなることから、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕの抗体を含む。ただし、少なくとも１つの精製段階により単離抗体を調製するのが通常である。
【００３９】
基本的な四本鎖抗体の単位は、２本の同一の軽（Ｌ）鎖と２本の同一の重（Ｈ）鎖とからなるヘテロ四量体糖タンパク質である。任意の脊椎動物種のＬ鎖は、その定常ドメイン（ＣＬ）のアミノ酸配列に基づき、カッパ（［カッパ］）およびラムダ（［ラムダ］）と呼ばれる２つの明確に異なるタイプのうちの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、その重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには５つのクラス、すなわち、それぞれアルファ（［アルファ）、デルタ（［デルタ］）、イプシロン（［イプシロン］）、ガンマ（［ガンマ］）およびミュー（［ミュー］）と命名される重鎖を有する、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがある。［ガンマ］および［アルファ］のクラスはさらに、ＣＨの配列および機能の比較的小さな差に基づいてサブクラスに分けられ、例えば、ヒトは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２のサブクラスを発現する。各Ｌ鎖は１つの共有ジスルフィド結合によってＨ鎖と連結しており、２本のＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つまたは複数のジスルフィド結合により互いに連結している。各Ｈ鎖およびＬ鎖には、規則的間隔の鎖間ジスルフィド架橋もある。各Ｈ鎖のＮ末端には可変ドメイン（ＶＨ）があり、それに続いて、［アルファ］鎖および［ガンマ］鎖ではそれぞれ３つの定常ドメイン（ＣＨ）があり、［ミュー］アイソタイプおよび［イプシロン］アイソタイプでは４つのＣＨドメインがある。各Ｌ鎖のＮ末端には可変ドメイン（ＶＬ）があり、それに続いて、その他方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）がある。ＶＬはＶＨと並んでおり、ＣＬは重鎖の１番目の定常ドメイン（ＣＨ１）と並んでいる。特定のアミノ酸残基が軽鎖と重鎖の可変ドメイン間の境界面を形成すると考えられている。ＶＨとＶＬが対になることによって単一の抗原結合部位を形成する。ＩｇＭ抗体は、基本的なヘテロ四量体単位５つと、Ｊ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドとからなり、したがって、抗原結合部位が１０含まれており、分泌型ＩｇＡ抗体は、多量体化して、基本的な４本鎖単位２〜５個個とＪ鎖とを含む、多価集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合、４本鎖単位は一般に、約１５０，０００ダルトンである。様々クラスの抗体の構造および特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４の７１ページおよび第６章を参照されたい。
【００４０】
「可変」という用語は、Ｖドメインの特定のセグメントの配列が抗体間で大きく異なることを指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、特定の抗体のその特定の抗原に対する特異性を定める。ただし、この可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸の長さ全体に均一に分布しているわけではない。実際、Ｖ領域は、長さがそれぞれ９〜１２アミノ酸で極めて可変性の高い「超可変領域」と呼ばれる短い領域によって隔てられた１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、比較的変化しにくい一続きの部分からなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、大部分が［ベータ］シート立体配置をとり、その［ベータ］シート構造をつなぎ、場合によってはその一部を形成するループを形成する３つの超可変領域によってつながった、４つのＦＲを含む。各鎖の超可変領域は、ＦＲにより接近して結びついており、他の鎖の超可変領域とともに抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｄａ、Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい）。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接関与するわけではないが、様々なエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）への抗体の関与などを示す。
【００４１】
本明細書で使用される「超可変領域」という用語は、抗体の抗原結合を担うアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基（例えば、Ｋａｂａｔ番号付け法；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｄａ、Ｍｄ．（１９９１）に従って番号付けした場合、ＶＬの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）前後ならびにＶＨの３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）前後）；ならびに／あるいは「超可変ループ」のアミノ酸残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ番号付け法；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７）に従って番号付けした場合、ＶＬの残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびにＶＨの２６〜３２（Ｈ１）、５２〜５６（Ｈ２）および９５〜１５  １０１（Ｈ３））；ならびに／あるいは「超可変ループ」／ＣＤＲのアミノ酸残基（例えば、ＩＭＧＴ番号付け法；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２０９−２１２（１９９９），Ｒｕｉｚ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２１９−２２１（２０００）に従って番号付けした場合、ＶＬの残基２７〜３８（Ｌ１）、５６〜６５（Ｌ２）および１０５〜１２０（Ｌ３）ならびにＶＨの２７〜３８（Ｈ１）、５６〜６５（Ｈ２）および１０５〜１２０（Ｈ３））を含む。抗体は任意選択で、ＡＨｏ（Ｈｏｎｎｅｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｐｌｕｎｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０（２００１））に従って番号付けした場合のＶＬの２８、３６（Ｌ１）、６３、７４〜７５（Ｌ２）および１２３（Ｌ３）ならびにＶＨの２８、３６（Ｈ１）、６３、７４〜７５（Ｈ２）および１２３（Ｈ３）の地点のうちの１つまたは複数の地点に対称性の挿入を有する。
【００４２】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団、すなわち、集団に含まれている個々の抗体が、少数存在する可能性のある天然の変異を除いて同一である集団から得られる抗体を指す。モノクローナル抗体は、単一の抗原性部位に対する極めて特異的なものである。さらに、様々な決定基（エピトープ）に対する様々な抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体は、それぞれが抗原上の単一の決定基に対するものである。モノクローナル抗体は、その特異性に加えて、他の抗体が混入せずに合成され得る点で有利である。
【００４３】
「モノクローナル」という修飾語は、何らかの特定の方法による抗体の作製を必要とするものであると解釈されるべきではない。例えば、本発明に有用なモノクローナル抗体は、最初にＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）に記載されたハイブリドーマ方法論により調製しても、または細菌、真核動物細胞または真核植物細胞に組換えＤＮＡ法を用いて作製してもよい（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。「モノクローナル抗体」を例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離してもよい。
【００４４】
本明細書のモノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、鎖の残りの部分（１つまたは複数）が、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体のほか、所望の生物活性を示す限り、このような抗体のフラグメントも含む（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）を参照されたい）。本発明は、ヒト抗体に由来する可変ドメイン抗原結合配列を提供する。
【００４５】
したがって、本明細書で最も関心のあるキメラ抗体としては、１つまたは複数のヒト抗原結合配列（例えば、ＣＤＲ）を有し、非ヒト抗体に由来する１つまたは複数の配列、例えばＦＲ領域またはＣ領域の配列が含まれる、抗体が挙げられる。さらに、本明細書で最も関心のあるキメラ抗体としては、１つの抗体クラスまたはサブクラスのヒト可変ドメイン抗原結合配列と、別の配列、例えば、別の抗体クラスまたはサブクラスに由来するＦＲ領域またはＣ領域の配列とを含む、抗体が挙げられる。本明細書で関心のあるキメラ抗体としては、本明細書に記載されるものと関連するか、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）などの異なる種に由来する可変ドメイン抗原結合配列が含まれる、抗体も挙げられる。
【００４６】
「キメラ抗体」とは、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なる、または変化したクラス、エフェクター機能および／または種の定常領域、あるいはキメラ抗体に新たな特性を与える全く異なる分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、増殖因子、薬物などと連結するように、定常領域あるいはその一部分を変化させた、置き換えた、あるいは交換した；あるいは（ｂ）異なる、または変化した抗原特異性を有する可変領域を用いて、可変領域またはその一部分を変化させた、置き換えた、または交換した、抗体分子のことである。
【００４７】
キメラ抗体としては、霊長類化抗体、具体的にはヒト化抗体も挙げられる。さらに、キメラ抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にもみられない残基を含み得る。これらの改変を施して、抗体の性能をさらに高める。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００４８】
「ヒト化」または「ヒト」抗体は、１つまたは複数のヒト免疫グロブリンの定常および可変フレームワーク領域が結合領域、例えば、動物の免疫グロブリンのＣＤＲと融合している抗体を指す。このような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性は維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応は回避するよう設計されている。このような抗体は、抗原投与に応答して特異的ヒト抗体を産生するよう「操作」されたトランスジェニックマウスまたはその他の動物から得ることができる（例えば、教示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ  ７：１３；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ５  ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６：５７９を参照されたい）。遺伝子または染色体トランスフェクション法およびファージディスプレイ技術により完全ヒト抗体を構築してもよく、これらの方法および技術はいずれも当該技術分野で公知である（例えば、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３を参照されたい）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性化したＢ細胞によりヒト抗体を作製してもよい（例えば、全体が参照により組み込まれる米国特許第５，５６７，６１０号および同第５，２２９，２７５号を参照されたい）。
【００４９】
「抗体フラグメント」は、インタクト抗体の一部分、好ましくはインタクト抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］を参照されたい）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体の「機能性フラグメントまたは類似体」という語句は、完全長抗体と共通の定性的生物活性を有する化合物のことである。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能性フラグメントまたは類似体とは、ＩｇＥ免疫グロブリンが高親和性受容体であるＦｃ［イプシロン］ＲＩと結合する能力をもたないようにするか、そのような能力をもつ分子の能力を実質的に低下させるようにＩｇＥ免疫グロブリンと結合することができる、機能性フラグメントまたは類似体のことである。抗体をパパインで消化すると、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメントと、残りの「Ｆｃ」フラグメントが得られ、後者の名称は、容易に結晶化できることを表している。Ｆａｂフラグメントは、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）を伴うＬ鎖全体と、１本の重鎖の１番目の定常ドメイン（ＣＨ１）とからなる。各Ｆａｂフラグメントは、抗原結合に関して一価である、すなわち、単一の抗原結合部位を有する。抗体をペプシンで処理すると、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂフラグメントにほぼ相当し、依然として抗原を架橋することが可能である、単一の大きいＦ（ａｂ’）２フラグメントが得られる。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域の１つまたは複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に追加の残基を数個有する点で、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基（１つまたは複数）が遊離チオール基を有するＦａｂ’を表す名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは最初、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として得られたものであった。これ以外の抗体フラグメントの化学的結合も知られている。
【００５０】
「Ｆｃ」フラグメントは、ジスルフィドによって結合した両Ｈ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域の配列によって決まり、このＦｃ領域は、特定のタイプの細胞上にみられるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。
【００５１】
「Ｆｖ」とは、完全な抗原認識部位と抗原結合部位を含む最小限の抗体フラグメントのことである。このフラグメントは、１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域ドメインが非共有結合で固く結合した二量体からなる。この２つのドメインが折り畳まれることにより、抗原結合のアミノ酸残基となり、抗体に抗原結合特異性を与える、６つの超可変ループ（Ｈ鎖およびＬ鎖それぞれに由来する３つのループ）が生じる。ただし、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的なＣＤＲを３つしか含まない半分のＦｖ）であっても、結合部位全体よりも親和性が低いものの、抗原を認識し、これと結合する能力がある。
【００５２】
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「一本鎖Ｆｖ」は、結合して単一のポリペプチド鎖になったＶＨ抗体ドメインとＶＬ抗体ドメインを含む、抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ  １９９５，下記を参照されたい。
【００５３】
本明細書で使用される「エピトープ」という用語は、抗体が結合する１つまたは複数のタンパク質上にある特定のアミノ酸配置を指す。エピトープは多くの場合、アミノ酸または糖側鎖などの化学的に活性な表面分子団からなり、特有の三次元構造的特徴および特有の電荷的特徴を有する。エピトープは、直線状のものであっても、または立体構造的なもの、すなわち、抗原の様々な領域に必ずしも連続的とは限らない２つ以上のアミノ酸の配列を含むものであってもよい。
【００５４】
「ダイアボディ」という用語は、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間に対が形成されるように短いリンカー（約５〜１０残基）を用いてｓＦｖフラグメント（前の段落を参照されたい）を構築し、二価のフラグメント、すなわち、２つの抗原結合部位を有するフラグメントを得ることによって調製される小型の抗体フラグメントを指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶＨドメインとＶＬドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する２つの「クロスオーバー」ｓＦｖフラグメントのヘテロ二量体である。ダイアボディについては、例えば、欧州特許第４０４，０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；およびＨｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）にさらに十全に記載されている。
【００５５】
本明細書で使用される抗体は、それが検出可能なレベルで、好ましくは約１０４Ｍ−１以上、または約１０５Ｍ−１以上、約１０６Ｍ−１以上、約１０７Ｍ−１以上、または１０８Ｍ−１以上、または１０９Ｍ−１以上、または１０１０Ｍ−１以上の親和性定数Ｋａで抗原と反応する場合、「免疫特異的である」、抗体に「対して特異的である」、または抗体と「特異的に結合する」と言う。抗体のそのコグネイト抗原に対する親和性は、解離定数Ｋｄで表されることも多く、ある特定の実施形態では、抗体は、それが１０−４Ｍ以下、約１０−５Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下、または５×１０−９Ｍ以下、または１０−９Ｍ以下、または５×１０−１０Ｍ以下、または１０−１０Ｍ以下のＫｄで結合する場合、抗原と特異的に結合することになる。抗体の親和性は、従来の技術、例えばＳｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ５１：６６０（１９４９））によって記載されている技術などを用いて容易に求めることができる。抗体のその抗原、細胞または組織に対する結合特性は一般に、例えば免疫組織化学（ＩＨＣ）および／または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの免疫蛍光法ベースのアッセイを含めた免疫検出法を用いて求め、評価し得る。
【００５６】
癌細胞表面での本発明のタンパク質とＣＤ９Ｐ−１抗原との結合に関係して使用される「内部移行する」という用語は、タンパク質−リガンド複合体（例えば抗体−抗原複合体）が受容体介在性エンドサイトーシス、微飲作用、食作用およびその他の同様の細胞内取込みおよび／または輸送経路によって外部環境から迅速に取り込まれることを指す。したがって、一実施形態では、本発明のタンパク質の「内部移行」は、それが細胞膜陥入および小胞形成を含む機序によって外部環境から取り込まれることに関するものである。一実施形態では、前記内部移行は、細胞膜上での本発明のタンパク質とそのリガンドとの結合と、それに続くタンパク質−リガンド複合体の細胞質小胞への輸送を含む、受容体介在性エンドサイトーシスを含む。本発明のタンパク質の「内部移行」は、ＣＤ９Ｐ−１相互作用タンパク質、例えばスタビリン１およびＴＲＡＦ−２などを含むＣＤ９Ｐ−１タンパク質複合体の取込みを指すこともある。
【００５７】
「単離核酸」または「単離核酸配列」とは、天然の状態では天然の配列に付随する他のゲノムＤＮＡ配列ならびにタンパク質または複合体、例えばリボソームおよびポリメラーゼなどから実質的に分離されている、核酸のことである。この用語は、その天然の環境から取り出された核酸配列を包含し、組換えＤＮＡまたはクローンＤＮＡ単離物および化学合成した類似体または異種の系によって生物学的に合成した類似体がこれに含まれる。実質的に純粋な核酸には、単離形態の核酸が含まれる。当然のことながら、これは、最初に単離された核酸を指し、のちに人為的にその単離核酸に付加した遺伝子も配列も除外するものではない。
【００５８】
「ポリペプチド」という用語は、その従来の意味で、すなわち、一続きのアミノ酸として使用される。ポリペプチドは特定の長さの産物に限定されるものではない。ポリペプチドの定義にはペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質が含まれ、このような用語は、別途具体的に明記されない限り、本明細書で互換的に使用され得る。一実施形態では、本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、ペプチド結合によって互いに結合し、好ましくは鎖長が１５〜５０アミノ酸残基である、アミノ酸の線状重合体を指し；「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって互いに結合した少なくとも５０アミノ酸の線状重合体を指し；タンパク質は特に、任意選択でグリコシル化された１つまたは複数のペプチドまたはポリペプチドおよび任意選択で非ポリペプチド補因子から形成される、機能性の実体を指す。したがって、一実施形態では、「タンパク質」という用語は、上で定義したペプチドを指す。この用語はまた、天然のもの、非天然のものともにポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などおよび当該技術分野で公知のその他の修飾を指すわけでも除外するわけでもない。ポリペプチドは、タンパク質全体またはその部分配列を指し得る。本発明において目的とする特定のポリペプチドは、ＣＤＲを含み、抗原と結合することが可能なアミノ酸部分配列である。
【００５９】
「単離ポリペプチド」とは、その天然の環境の構成要素から同定され、分離および／または回収されたポリペプチドのことである。好ましい実施形態では、単離ポリペプチドを（１）ローリー法による測定でポリペプチドの９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超まで、（２）スピニングカップ配列決定装置の使用によってＮ末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）還元条件もしくは非還元条件下、クーマシーブルー、もしくは好ましくは銀染色を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥにより均一になるまで精製する。単離ポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの構成要素が存在しなくなることから、組換え細胞内のｉｎ  ｓｉｔｕのポリペプチドを含む。ただし、少なくとも１つの精製段階により単離ポリペプチドを調製するのが通常である。
【００６０】
「天然配列」ポリヌクレオチドとは、自然に由来するポリヌクレオチドと同じヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドのことである。「天然配列」ポリペプチドとは、自然（例えば、任意の種）に由来するポリペプチド（例えば、抗体）と同じアミノ酸配列を有するポリペプチドのことである。このような天然配列ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、自然から単離するか、組換え手段または合成手段によって作製することができる。ポリヌクレオチド「バリアント」とは、同用語が本明細書で使用される場合、通常、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入がある点で、本明細書に具体的に開示されるポリヌクレオチドとは異なるポリヌクレオチドのことである。このようなバリアントは、天然に存在するものであっても、あるいは例えば、本明細書に記載されるように、本発明の１つもしくは複数のポリヌクレオチド配列を改変し、コードされるポリペプチドの１つもしくは複数の生物活性を評価することによって、および／または当該技術分野で周知の多数の技術のうちのいずれかを用いることによって、合成により作製したものであってもよい。ポリペプチド「バリアント」とは、同用語が本明細書で使用される場合、通常、１つまたは複数の置換、欠失、付加および／または挿入がある点で、本明細書に具体的に開示されるポリペプチドとは異なるポリペプチドのことである。このようなバリアントは、天然に存在するものであっても、あるいは例えば、本明細書に記載されるように、１つもしくは複数の上記の本発明のポリペプチド配列を改変し、そのポリペプチドの１つもしくは複数の生物活性を評価することによって、および／または当該技術分野で周知の多数の技術のうちのいずれかを用いることによって、合成により作製したものであってもよい。改変を本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に施してもよく、依然として、所望の特性を有するバリアントまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能性分子が得られる。ポリペプチドのアミノ酸配列を変化させて、本発明のポリペプチドと同等の、または場合によっては改善されたバリアントまたは一部分を作出することを望む場合、当業者は通常、コードＤＮＡ配列の１つまたは複数のコドンを変化させる。例えば、タンパク質が他のポリペプチド（例えば、抗原）または細胞と結合する能力をそれほど失わせずに、特定のアミノ酸をタンパク質構造内の他のアミノ酸の代わりに用い得る。タンパク質の生物学的機能活性を決めるのはタンパク質の結合能および性質であるため、タンパク質配列および当然のことながら、その元となるＤＮＡコード配列に特定のアミノ酸配列置換を施し、それでも類似した特性を有するタンパク質を得ることができる。したがって、本発明のペプチド配列または前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列に、その生物学的な有用性も活性もそれほど失わせずに様々な変化を施し得ることが企図される。多くの場合、ポリペプチドバリアントには１つまたは複数の保存的置換が含まれる。「保存的置換」とは、あるアミノ酸を類似した特性を有する別のアミノ酸の代わりに用いる置換のことであり、このため、ペプチド化学の当業者であれば、そのポリペプチドの二次構造およびハイドロパシー性が実質的に変化しないことが予想できる。したがって、上に概説した通り、アミノ酸置換は一般に、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、その疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づくものである。様々な上記の特性を考慮に入れた例示的置換は当業者に周知であり、アルギニンとリジン；グルタミン酸とアスパラギン酸；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；およびバリンとロイシンとイソロイシンがこれに含まれる。さらに、アミノ酸置換を残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性の類似性に基づいて施してもよい。例えば、負荷電アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられ；正荷電アミノ酸としてはリジンおよびアルギニンが挙げられ；非荷電極性頭部基を有し、同程度の親水性値を有するアミノ酸としては、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンが挙げられる。保存的変化となり得る他のアミノ酸のグループとしては、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが挙げられる。バリアントには、これに加えて、またはこれに代えて、非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態では、バリアントポリペプチドは、５個以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によって天然配列とは異なるものである。これに加えて（またはこれに代えて）、バリアントを例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造およびハイドロパシー性に対する影響が最小限であるアミノ酸の欠失または付加によって改変してもよい。
【００６１】
２つ以上のポリペプチドまたは核酸配列の配列の間に関連して使用される「同一性」または「同一である」という用語は、一続きの２つ以上のアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の間のマッチ数によって求められるポリペプチドまたは核酸配列間の配列類似度を指す。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータプログラム（すなわち、「アルゴリズム」）によって扱われる、ギャップアライメント（存在する場合）を有する２つ以上の配列のうち短い方の間の同一マッチのパーセントを測定するものである。関連するポリペプチドまたは核酸配列の同一性は、既知の方法によって容易に算出することができる。このような方法としては、特に限定されないが、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  １，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，ｅｄｓ．，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  １０  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｄｓ．，Ｍ．Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１およびＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８，１０７３（１９８８）に記載されているものが挙げられる。同一性を求めるのに好ましい方法は、被験配列の間のマッチが最大になるよう設計される。同一性を求める方法は、公開されているコンピュータプログラムに記載されている。２つの配列の間の同一性を求めるのに好ましいコンピュータプログラム法としては、ＧＡＰを含めたＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ．Ｒｅｓ．＼２，３８７（１９８４）；Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、米国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）およびその他の入手源（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＮＣＢ／ＮＬＭ／ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，上記）に公開されている。よく知られているＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを用いて同一性を求めてもよい。
【００６２】
「治療すること」または「治療」または「緩和」は、治療的処置および予防措置の両方を指し、その目的は、標的とする病的状態または障害を予防する、またはその進行を遅らせる（低下させる）ことである。治療を必要とする者には、既に障害がある者のほかにも障害が発現しやすい者または障害を予防するべき者が含まれる。治療量の本発明によるタンパク質を投与した後、対象に観察可能かつ／または測定可能な病原細胞数の減少；病原性のある細胞全体のパーセントの減少；ならびに／あるいは特定の疾患または病態に関連する１つまたは複数の症状のある程度の軽減；罹患率および死亡率の低下ならびに／あるいは生活の質に関する問題の改善がみられる場合、その対象は良好に「治療された」ことになる。疾患の良好な治療および改善を評価するための上記パラメータは、医師がよく知るルーチンの方法によって容易に測定可能なものである。
【００６３】
「治療有効量」という用語は、標的に有意な負の副作用も有害な副作用も引き起こさずに、（１）標的とする病的状態もしくは障害の発症を遅らせる、もしくは予防すること；（２）標的とする病的状態もしくは障害の１つもしくは複数の症状の進行、悪化もしくは増悪を遅らせる、もしくは止めること；（３）標的とする病的状態もしくは障害の症状に改善をもたらすこと；（４）標的とする病的状態もしくは障害の重症度もしくは発症率を抑えること；または（５）標的とする病的状態もしくは障害を治癒させることを目標とする、薬剤のレベルまたは量を指す。予防処置には、標的とする病的状態または障害が発症する前に治療有効量を投与し得る。上記のものに代えて、またはこれに加えて、治療処置には、標的とする病的状態または障害が発症した後に治療有効量を投与し得る。
【００６４】
「薬学的に許容される添加剤」または「薬学的に許容される担体」という用語は、動物、好ましくはヒトに投与したとき、有害反応もアレルギー反応もその他の望ましくない反応も引き起こさない添加剤を指す。ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などがこれに含まれる。ヒト投与には、調製物は、規制当局、例えばＦＤＡ局またはＥＭＡなどの無菌性、発熱原性、全般的安全性および純度に関する基準を満たすものであるべきである。
【００６５】
「対象」という用語は、温血動物、好ましくは哺乳動物（ヒト、家畜および農業動物ならびに動物園、スポーツまたはペットの動物、例えば犬、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギなどを含む）、より好ましくはヒトを指す。好ましくは、対象は患者である、すなわち、医療を受けるのを待っている、もしくは現在受けている、または医療処置の対象であった／対象である／対象となる、または疾患発現が監視されている。一実施形態では、対象は男性である。別の実施形態では、対象は女性である。
【００６６】
（詳細な説明）
本発明の１つの目的は、ＣＤ９Ｐ−１経路を阻害するタンパク質である。一実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１／スタビリン１経路および／またはＣＤ９Ｐ−１／ＴＲＡＦ−２経路を阻害する。
【００６７】
本明細書で使用される「経路を阻害する」という用語は、タンパク質が、ＣＤ９Ｐ−１とそのパートナーの１つ、例えばスタビリン１またはＴＲＡＦ−２などとの結合によって生じるシグナル伝達を遮断する、低下させる、妨げる、または打ち消すことが可能であることを意味する。
【００６８】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、細胞表面膜に存在するＣＤ９Ｐ−１の細胞質内への内部移行を誘導する。一実施形態では、本発明のタンパク質はさらに、細胞表面膜に存在するスタビリン１の細胞質内への内部移行を誘導する。
【００６９】
あるタンパク質がＣＤ９Ｐ−１および／またはスタビリン１の内部移行を誘導するかどうかを判定する方法は当業者に周知であり、特に限定されないが、部位特異的免疫標識とそれに続くフローサイトメトリー、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、固定および透過処理した標本を用いるレーザー走査共焦点顕微鏡法（ＬＳＣＭ）、生きた標本を用いる蛍光生細胞イメージング（ＦＬＣＩ）または蛍光退色後回復測定（ＦＲＡＰ）など、および非特異的細胞表面化学架橋（例えば、ビオチン化など）とそれに続くイムノブロッティングまたは放射標識抗体による染色、および細胞膜の超遠心分離または連続界面活性剤抽出による細胞内タンパク質の分画とそれに続くイムノブロッティングがこれに含まれる。
【００７０】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１および／またはスタビリン１および／またはＴＲＡＦ−２の分解を誘導する。タンパク質がＣＤ９Ｐ−１、スタビリン１および／またはＴＲＡＦ−２の分解を誘導するかどうかを判定する方法は当業者に周知であり、特に限定されないが、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、イムノブロッティングなどがこれに含まれる。
【００７１】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１とスタビリン１および／またはＣＤ９Ｐ−１とＴＲＡＦ−２の結合を不安定化する。
【００７２】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１とスタビリン１の結合および／またはＣＤ９Ｐ−１とＴＲＡＦ−２の結合を阻害する。
【００７３】
本明細書で使用される「結合を不安定化する」という用語は、タンパク質が、ＣＤ９Ｐ−１とスタビリン１の結合および／またはＣＤ９Ｐ−１とＴＲＡＦ−２の結合を遮断する、低下させる、妨げる、または打ち消すことが可能であることを意味する。
【００７４】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１／スタビリン１複合体および／またはＣＤ９Ｐ−１／ＴＲＡＦ−２複合体の解離を誘導する。
【００７５】
一実施形態では、ＣＤ９Ｐ−１／スタビリン１複合体および／またはＣＤ９Ｐ−１／ＴＲＡＦ−２複合体の不安定化または解離は、スタビリン１および／またはＴＲＡＦ−２の内部移行および／または分解に関連する、またはこれに起因するものである。
【００７６】
ＣＤ９Ｐ−１とスタビリン１の結合および／またはＣＤ９Ｐ−１とＴＲＡＦ−２の結合の阻害または不安定化を検討する方法は当業者に周知であり、特に限定されないが、免疫沈降、共免疫沈降、免疫蛍光、タンパク質複合体の架橋および化学架橋とそれに続く高質量分解ＭＡＬＤＩ質量分析がこれに含まれる。
【００７７】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１とスタビリン１の結合を阻害または不安定化する。一実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１および／またはスタビリン１および／またはＣＤ９Ｐ−１／スタビリン１複合体の分解を誘導する。一実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１および／またはスタビリン１および／またはＣＤ９Ｐ−１／スタビリン１複合体の内部移行を誘導する。
【００７８】
スタビリン１（アクセッション番号ＮＰ＿０５５９５１）は、２５７０のアミノ酸からなり、内皮細胞のサブタイプおよび活性化Ｍ２マクロファージ上に発現する膜貫通タンパク質である。スタビリン１は、炎症、血管新生、腫瘍微小環境の局所免疫抑制、腫瘍の成長および転移に関与する。スタビリン１の遺伝子サイレンシングまたは抗体処理が、ＴＮＦ−αを含む炎症誘発性応答を増大させ、リンパ球による高ＩＦＮガンマ産生を補助し、腫瘍成長を抑える。一実施形態では、ＣＤ９Ｐ１／スタビリン１の阻害が細胞遊走および腫瘍に対する免疫寛容の低下を誘導する。
【００７９】
別の実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１とＴＲＡＦ−２の結合を阻害または不安定化する。一実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１および／またはＴＲＡＦ−２および／またはＣＤ９Ｐ−１／ＴＲＡＦ−２複合体の分解を誘導する。
【００８０】
ＴＲＡＦ−２（アクセッション番号Ｑ１２９３３．２）は、ＴＮＦＲシグナル伝達経路のアダプターとして知られ、ＴＮＦ受容体関連因子（ＴＲＡＦ）ファミリーに属する、５０１のアミノ酸からなるタンパク質である。ＴＲＡＦ−２は免疫応答および炎症性応答に関与する。ＴＲＡＦ−２タンパク質は、免疫応答および炎症性応答の重要な側面、例えば、Ｂリンパ球およびＴリンパ球の機能、ＮＦカッパＢ炎症シグナル伝達経路ならびにマクロファージ分極化などの鍵となる調節因子であることが明らかにされていた。ＴＲＡＦ−２の喪失が、炎症誘発性サイトカイン（例えば、ＴＮＦアルファおよびＩＬ１ベータなど）の過剰発現を特徴とするマクロファージのＭ１様抗腫瘍機能を促進して抗腫瘍免疫を誘導し、ＩＦＮγを産生するＣＤ４＋およびＣＤ８＋エフェクターＴ細胞による腫瘍浸潤を引き起こすことが示唆されている。さらに、ＴＲＡＦ−２には、ｃ−ＩＡＰタンパク質を含むタンパク質複合体を介して抗アポトーシスシグナルを伝達する役割がある。ＴＲＡＦ−２およびＴＲＡＦ−２／ｃ−ＩＡＰの欠乏が、癌細胞をＴＮＦ誘導性アポトーシスに対して感作する。ＴＲＡＦ−２は最近、上皮癌の発癌遺伝子であることが確認された。ＴＲＡＦ−２過剰発現を示す癌細胞のＴＲＡＦ−２を抑制すると、増殖、ＮＦ−κＢ活性化、足場非依存性増殖および腫瘍形成が阻害される。いかなる理論にも束縛されるものではないが、本出願者は、本発明のタンパク質によって誘導されるＴＲＡＦ−２の分解が、マクロファージの炎症性応答および癌細胞のアポトーシス経路を活性化することを示唆する。
【００８１】
一実施形態では、本発明のタンパク質は単離されている。
【００８２】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１、好ましくはヒトＣＤ９Ｐ−１と結合する。一実施形態では、本発明のタンパク質はＣＤ９Ｐ−１の細胞外ドメインと結合する。一実施形態では、細胞外ドメインまたはＣＤ９Ｐ−１は、配列番号３４のアミノ酸２２〜８３２に対応する。別の実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号３４のアミノ酸２２〜７２４を含むＣＤ９Ｐ−１の領域に含まれるエピトープと結合する。別の実施形態では、本発明のタンパク質は、配列番号３４のアミノ酸７２４〜８３２を含むＣＤ９Ｐ−１の領域に含まれるエピトープとは結合しない。
【００８３】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基２０２〜２３２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基２０２〜２３２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、エピトープと結合する。
【００８４】
一実施形態では、エピトープは、ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基２０２〜２３２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基２０２〜２３２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列のアミノ酸残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個または３１個含む。
【００８５】
一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒ、２１５Ｙおよび２２４Ｔのうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ）の残基を含む。
【００８６】
一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち２１１Ｙを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち２１４Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち２１５Ｙを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち２２４Ｔを含む。
【００８７】
一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙおよび２１４Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙおよび２１５Ｙを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙおよび２２４Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１４Ｒおよび２１５Ｙを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１４Ｒおよび２２４Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１５Ｙおよび２２４Ｔを含む。
【００８８】
一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒおよび２１５Ｙを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒおよび２２４Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１５Ｙおよび２２４Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１４Ｒ、２１５Ｙおよび２２４Ｔを含む。
【００８９】
一実施形態では、エピトープは、ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒ、２１５Ｙおよび２２４Ｔを含む。
【００９０】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４２２〜４４２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４２２〜４４２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、エピトープと結合する。
【００９１】
一実施形態では、エピトープは、ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４２２〜４４２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４２２〜４４２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列のアミノ酸残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個または２１個含む。
【００９２】
一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４２５Ｔおよび４３６Ｓのうちの少なくとも１つ（例えば、１つまたは２つ）の残基を含む。
【００９３】
一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち４２５Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち４３６Ｓを含む。
【００９４】
一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４２５Ｔおよび４３６Ｓを含む。
【００９５】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４７２〜５０２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４７２〜５０２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を含む、エピトープと結合する。
【００９６】
一実施形態では、エピトープは、ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４７２〜５０２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４７２〜５０２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列のアミノ酸残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個または３１個含む。
【００９７】
一実施形態では、エピトープは、ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒのうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）の残基を含む。
【００９８】
一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち４７２Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち４７４Ｋを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち４７８Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち５０１Ｒを含む。
【００９９】
一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔおよび４７４Ｋを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔおよび４７８Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔおよび４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋおよび４７８Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋおよび４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７８Ｒおよび４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７８Ｒおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。
【０１００】
一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋおよび４７８Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋおよび４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７８Ｒおよび４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７８Ｒおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋ、４７８Ｒおよび４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋ、４７８Ｒおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋ、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。
【０１０１】
一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒおよび４９７Ｔを含む。
【０１０２】
一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。
【０１０３】
一実施形態では、本発明のタンパク質は立体構造エピトープと結合する。
【０１０４】
一実施形態では、前記立体構造エピトープは、ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基２０２〜２３２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基２０２〜２３２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。
【０１０５】
一実施形態では、立体構造エピトープは、ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基２０２〜２３２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基２０２〜２３２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列のアミノ酸残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個または３１個含む。
【０１０６】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒ、２１５Ｙおよび２２４Ｔのうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ）の残基を含む。
【０１０７】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち２１１Ｙを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち２１４Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち２１５Ｙを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち２２４Ｔを含む。
【０１０８】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙおよび２１４Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙおよび２１５Ｙを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙおよび２２４Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１４Ｒおよび２１５Ｙを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１４Ｒおよび２２４Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１５Ｙおよび２２４Ｔを含む。
【０１０９】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒおよび２１５Ｙを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒおよび２２４Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１５Ｙおよび２２４Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１４Ｒ、２１５Ｙおよび２２４Ｔを含む。
【０１１０】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒ、２１５Ｙおよび２２４Ｔを含む。
【０１１１】
一実施形態では、立体構造エピトープは、ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４２２〜４４２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４２２〜４４２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。
【０１１２】
一実施形態では、立体構造エピトープは、ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４２２〜４４２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４２２〜４４２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列のアミノ酸残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個または２１個含む。
【０１１３】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４２５Ｔおよび４３６Ｓのうちの少なくとも１つ（例えば、１つまたは２つ）の残基を含む。
【０１１４】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち４２５Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち４３６Ｓを含む。
【０１１５】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４２５Ｔおよび４３６Ｓを含む。
【０１１６】
一実施形態では、立体構造エピトープは、ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４７２〜５０２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４７２〜５０２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基を含む。
【０１１７】
一実施形態では、立体構造エピトープは、ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４７２〜５０２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４７２〜５０２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列のアミノ酸残基を１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個または３１個含む。
【０１１８】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒのうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）の残基を含む。
【０１１９】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち４７２Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち４７４Ｋを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち４７８Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち５０１Ｒを含む。
【０１２０】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔおよび４７４Ｋを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔおよび４７８Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔおよび４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋおよび４７８Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋおよび４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７８Ｒおよび４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７８Ｒおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。
【０１２１】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋおよび４７８Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋおよび４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７８Ｒおよび４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７８Ｒおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋ、４７８Ｒおよび４９７Ｔを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋ、４７８Ｒおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋ、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。
【０１２２】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７４Ｋ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒおよび５０１Ｒを含む。一実施形態では、エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒおよび４９７Ｔを含む。
【０１２３】
一実施形態では、立体構造エピトープはヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒを含む。
【０１２４】
一実施形態では、前記立体構造エピトープは、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基２０２〜２３２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基２０２〜２３２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基と、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４２２〜４４２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４２２〜４４２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基と
を含む。
【０１２５】
一実施形態では、前記立体構造エピトープは、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒ、２１５Ｙおよび２２４Ｔのうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ）の残基と、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４２５Ｔおよび４３６Ｓのうちの少なくとも１つ（例えば、１つまたは２つ）の残基と
を含む。
【０１２６】
一実施形態では、前記立体構造エピトープは、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒ、２１５Ｙおよび２２４Ｔと、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４２５Ｔおよび４３６Ｓと
を含む。
【０１２７】
一実施形態では、前記立体構造エピトープは、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基２０２〜２３２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基２０２〜２３２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基と、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４７２〜５０２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４７２〜５０２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基と
を含む。
【０１２８】
一実施形態では、前記立体構造エピトープは、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒ、２１５Ｙおよび２２４Ｔのうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ）の残基と、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒのうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）の残基と
を含む。
【０１２９】
一実施形態では、前記立体構造エピトープは、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒ、２１５Ｙおよび２２４Ｔと、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒと
を含む。
【０１３０】
一実施形態では、前記立体構造エピトープは、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４２２〜４４２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４２２〜４４２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基と、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４７２〜５０２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４７２〜５０２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基と
を含む。
【０１３１】
一実施形態では、前記立体構造エピトープは、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４２５Ｔおよび４３６Ｓのうちの少なくとも１つ（例えば、１つまたは２つ）の残基と、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒのうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）の残基と
を含む。
【０１３２】
一実施形態では、前記立体構造エピトープは、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４２５Ｔおよび４３６Ｓと、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒと
を含む。
【０１３３】
一実施形態では、前記立体構造エピトープは、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基２０２〜２３２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基２０２〜２３２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基と、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４２２〜４４２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４２２〜４４２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基と、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）内のアミノ酸残基４７２〜５０２またはヒトＣＤ９Ｐ−１（配列番号３４）のアミノ酸残基４７２〜５０２と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する配列の少なくとも１つのアミノ酸残基と
を含む。
【０１３４】
一実施形態では、前記立体構造エピトープは、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒ、２１５Ｙおよび２２４Ｔのうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つまたは４つ）の残基と、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４２５Ｔおよび４３６Ｓのうちの少なくとも１つ（例えば、１つまたは２つ）の残基と、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒのうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ）の残基と
を含む。
【０１３５】
一実施形態では、前記立体構造エピトープは、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、２１１Ｙ、２１４Ｒ、２１５Ｙおよび２２４Ｔと、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４２５Ｔおよび４３６Ｓと、
−ヒトＣＤ９Ｐ−１配列（配列番号３４）の以下の残基、すなわち、４７２Ｔ、４７４Ｋ、４７８Ｒ、４９７Ｔおよび５０１Ｒと
を含む。
【０１３６】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、ヒトＣＤ９Ｐ−１との結合のＫＤが約１０−５Ｍ以下、好ましくは約５×１０−６Ｍ以下、約１０−６Ｍ以下、約５×１０−７Ｍ以下または約１０−７Ｍ以下である。
【０１３７】
一実施形態では、単離タンパク質は、ヒトＣＤ９Ｐ−１との結合のｋｄが約５×１０−２ｓｅｃ−１以下、好ましくは約２×１０−２ｓｅｃ−１以下、より好ましくは約５×１０−３ｓｅｃ−１以下である。
【０１３８】
一実施形態では、単離タンパク質は、ヒトＣＤ９Ｐ−１との結合のｋａが少なくとも約１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１、好ましくは少なくとも約５×１０４Ｍ−１ｓｅｃ−１である。
【０１３９】
タンパク質のリガンドに対する親和性を求める（例えば、ＫＤ、ｋａおよびｋｄを求めることを含む）方法は当該技術分野で周知であり、特に限定されないが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡｃｏｒｅ）がこれに含まれる。
【０１４０】
一実施形態では、前記タンパク質は、全抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、二量体一本鎖抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、脱フコシル化抗体、二特異性抗体、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディからなる群より選択される抗体分子である。
【０１４１】
別の実施形態では、前記タンパク質は、ユニボディ、ドメイン抗体およびナノボディからなる群より選択される抗体フラグメントである。
【０１４２】
別の実施形態では、前記タンパク質は、アフィボディ、アフィリン、アフィチン、アドネクチン、アトリマー、エバシン、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、ファイノマー、バーサボディおよびデュオカリンからなる群より選択される抗体模倣物である。
【０１４３】
ドメイン抗体は、当該技術分野で周知であり、抗体の重鎖または軽鎖の可変領域に相当する、抗体の最も小さい機能性結合単位を指す。
【０１４４】
ナノボディは、当該技術分野で周知であり、天然の重鎖抗体に固有の構造的特性および機能的特性を有する、抗体由来の治療タンパク質を指す。これらの重鎖抗体には、単一の可変ドメイン（ＶＨＨ）と２つの定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）が含まれている。
【０１４５】
ユニボディは、当該技術分野で周知であり、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域がない抗体フラグメントを指す。ヒンジ領域の欠如により、実質的に従来のＩｇＧ４抗体の半分の大きさであり、ＩｇＧ４抗体の二価の結合領域ではなく一価の結合領域を有する分子が生じる。
【０１４６】
アフィボディは、当該技術分野で周知であり、ブドウ球菌プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つに由来する５８アミノ酸残基のタンパク質ドメインをベースとする、親和性タンパク質を指す。
【０１４７】
ＤＡＲＰｉｎｓ（設計アンキリン反復タンパク質）は、当該技術分野で周知であり、非抗体ポリペプチドの結合能を利用するよう開発された抗体模倣物ＤＲＰ（設計反復タンパク質）技術を指す。
【０１４８】
アンチカリンは、当該技術分野で周知であり、結合特異性がリポカリンに由来する、また別の抗体模倣物技術を指す。アンチカリンは、デュオカリンと呼ばれる二重標的化タンパク質としてもフォーマットされ得る。
【０１４９】
アビマーは、当該技術分野で周知であり、また別の抗体模倣物技術を指す。
【０１５０】
バーサボディは、当該技術分野で周知であり、また別の抗体模倣物技術を指す。バーサボディは、システインを１５％超含み、それが高ジスルフィド密度の足場を形成し、典型的なタンパク質にある疎水性コアの代わりとなっている、３〜５ｋＤａの小型のタンパク質である。
【０１５１】
アフィリンは、当該技術分野で周知であり、抗原と選択的に結合するよう設計された人工タンパク質を指す。アフィリンは、その抗原に対する親和性および特異性の点では抗体と類似しているが、構造の点では類似しておらず、このため、抗体模倣物の一種とされる。
【０１５２】
モノボディとしても知られるアドネクチンは、当該技術分野で周知であり、抗原と高い親和性および特異性で結合するよう設計されたタンパク質を指す。アドネクチンは、「抗体模倣物」と総称される分子のクラスに属する。
【０１５３】
アトリマーは、当該技術分野で周知であり、生物活性の特典として三量体化する、標的タンパク質に対する結合分子を指す。アトリマーは、他の抗体模倣物足場と比較して大きい。
【０１５４】
エバシンは、当該技術分野で周知であり、ケモカイン結合タンパク質のクラスの１つを指す。
【０１５５】
ファイノマーは、当該技術分野で周知であり、抗体模倣物のクラスに属するタンパク質を指す。ファイノマーは、熱安定性が高く、免疫原性が低いため、魅力的な結合分子である。
【０１５６】
別の実施形態では、前記タンパク質は、造影剤とコンジュゲートした本発明のタンパク質を含む、コンジュゲートである。前記タンパク質は、例えばイメージング用途に使用することが可能である。
【０１５７】
一実施形態では、前記タンパク質はモノクローナル抗体である。
【０１５８】
別の実施形態では、前記タンパク質はポリクローナル抗体である。
【０１５９】
一実施形態では、前記タンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１に対する、好ましくはヒトＣＤ９Ｐ−１に対する単離抗体である。
【０１６０】
一実施形態では、前記抗ＣＤ９Ｐ−１抗体は１３５ｋＤａ型のＣＤ９Ｐ−１と結合する。いかなる理論にも束縛されるものではないが、本出願者は、１３５ｋＤａ型のＣＤ９Ｐ−１がグリコシル化型のタンパク質に対応することを示唆する。
【０１６１】
一実施形態では、前記抗ＣＤ９Ｐ−１抗体は、天然の条件下でＣＤ９Ｐ−１を免疫沈降させることが可能である。
【０１６２】
ある抗体が天然の条件下でＣＤ９Ｐ−１を免疫沈降させることが可能であるかどうかを判定する方法は当業者に周知である。このような方法の非限定的な例として、以下のものがある：細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１％のｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００緩衝液で４℃にて１時間溶解させる。本発明の抗体を加えることによりタンパク質を免疫沈降させ；例えばプロテインＧセファロースビーズを用いて、免疫複合体を回収し、溶解緩衝液で洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、タンパク質を膜（例えば、ＰＶＤＦ膜）に移し、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体で明らかにする。
【０１６３】
本発明の１つの目的は、重鎖の可変領域が以下のＣＤＲ：
ＶＨ−ＣＤＲ１：ＧＹＴＦＴＳＹＷ（配列番号１）；
ＶＨ−ＣＤＲ２：ＩＦＰＧＴＧＴＴ（配列番号２）；および
ＶＨ−ＣＤＲ３：ＳＲＤＦＤＶ（配列番号３）
のうちの少なくとも１つのＣＤＲを含む、ヒトＣＤ９Ｐ−１に対する抗体である。
【０１６４】
ＣＤＲの番号付けおよび定義はＩＭＴＧの定義に従うものである。
【０１６５】
本発明のまた別の目的は、軽鎖の可変領域が以下のＣＤＲ：
ＶＬ−ＣＤＲ１：ＱＳＬＬＤＩＤＧＫＴＹ（配列番号４）；
ＶＬ−ＣＤＲ２：ＬＶＳ；および
ＶＬ−ＣＤＲ３：ＷＱＧＴＨＬＰＲＴ（配列番号５）
のうちの少なくとも１つのＣＤＲを含む、ヒトＣＤ９Ｐ−１に対する抗体である。
【０１６６】
本発明の一実施形態では、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体は、その重鎖内に１つのＶＨ−ＣＤＲ１（ＧＹＴＦＴＳＹＷ）（配列番号１）、１つのＶＨ−ＣＤＲ２（ＩＦＰＧＴＧＴＴ）（配列番号２）および／または１つのＶＨ−ＣＤＲ３（ＳＲＤＦＤＶ）（配列番号３）を含む。
【０１６７】
本発明の別の実施形態では、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体は、その軽鎖内に１つのＶＬ−ＣＤＲ１（ＱＳＬＬＤＩＤＧＫＴＹ）（配列番号４）、１つのＶＬ−ＣＤＲ２（ＬＶＳ）および／または１つのＶＬ−ＣＤＲ３（ＷＱＧＴＨＬＰＲＴ）（配列番号５）を含む。
【０１６８】
本発明の別の実施形態では、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体は、その重鎖内に３つのＣＤＲ、すなわち、配列番号１、配列番号２および配列番号３を含む。
【０１６９】
本発明の別の実施形態では、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体は、その軽鎖内に３つのＣＤＲ、すなわち、配列番号４、ＬＶＳおよび配列番号５を含む。
【０１７０】
本発明の一実施形態では、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体は、
−その重鎖内に３つのＣＤＲ、すなわち、配列番号１、配列番号２および配列番号３；ならびに
−その軽鎖内に３つのＣＤＲ、すなわち、配列番号４、ＬＶＳおよび配列番号５
を含む。
【０１７１】
本発明では、重鎖および軽鎖のＣＤＲ１、２および３のうちのいずれかが、対応する配列番号１〜５およびＬＶＳに挙げられる特定のＣＤＲまたはＣＤＲの組と少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有するアミノ酸配列を有することを特徴とするものであり得る。
【０１７２】
本発明の一実施形態では、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体は、配列番号６の配列の重鎖可変領域を含む。
【０１７３】
（配列番号６）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＶＫＰＧＴＳＶＫＬＳＣＫＴＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＱＷＩＫＸ１ＲＰＧＱＧＬＧＷＩＧＥＩＦＰＧＴＧＴＴＳＹＨＥＫＦＫＧＫＡＴＬＴＩＤＴＳＳＳＴＡＹＬＱＬＳＮＬＴＳＥＤＳＡＶＹＦＣＳＸ２ＤＦＤＶＷＧＡＧＸ３Ｘ４ＶＴＶＳＳ；
配列中、Ｘ１はＱまたはＲであり、Ｘ２はＲまたはＧであり、Ｘ３はＴまたはＡであり、Ｘ４はＳまたはＴである。
【０１７４】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＲであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＴである（配列番号８の配列に対応する）。
【０１７５】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＱであり、Ｘ２はＲであり、Ｘ３はＡであり、Ｘ４はＴである（配列番号９の配列に対応する）。
【０１７６】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＱであり、Ｘ２はＲであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＳである（配列番号１０の配列に対応する）。
【０１７７】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＱであり、Ｘ２はＲであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＴである（配列番号１１の配列に対応する）。
【０１７８】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＱであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＡであり、Ｘ４はＳである（配列番号１２の配列に対応する）。
【０１７９】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＱであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＡであり、Ｘ４はＴである（配列番号１３の配列に対応する）。
【０１８０】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＱであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＳである（配列番号１４の配列に対応する）。
【０１８１】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＱであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＴである（配列番号１５の配列に対応する）。
【０１８２】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＲであり、Ｘ３はＡであり、Ｘ４はＳである（配列番号１６の配列に対応する）。
【０１８３】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＲであり、Ｘ３はＡであり、Ｘ４はＴである（配列番号１７の配列に対応する）。
【０１８４】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＲであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＳである（配列番号１８の配列に対応する）。
【０１８５】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＱであり、Ｘ２はＲであり、Ｘ３はＡであり、Ｘ４はＳである（配列番号１９の配列に対応する）。
【０１８６】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＡであり、Ｘ４はＳである（配列番号２０の配列に対応する）。
【０１８７】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＡであり、Ｘ４はＴである（配列番号２１の配列に対応する）。
【０１８８】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＳである（配列番号２２の配列に対応する）。
【０１８９】
一実施形態では、配列番号６において、Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＧであり、Ｘ３はＴであり、Ｘ４はＴである（配列番号２３の配列に対応する）。
【０１９０】
したがって、本発明では、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体の重鎖可変領域は、配列番号８〜２３と少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を有する。
【０１９１】
本発明の一実施形態では、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体は、配列番号７の配列の軽鎖可変領域を含む。
【０１９２】
（配列番号７）
ＤＶＶＭＴＱＴＰＸ５ＴＬＳＶＴＩＧＱＰＡＳＩＳＣＫＳＳＱＳＬＬＤＩＤＧＫＴＹＬＮＷＬＬＱＲＰＧＱＸ６ＰＫＲＬＩＹＬＶＳＫＬＤＳＧＶＰＤＲＶＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＸ７ＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＹＣＷＱＧＴＨＬＰＲＴＦＧＧＧＴＮＬＥＩＫ；
配列中、Ｘ５はＰまたはＬであり、Ｘ６はＳまたはＦであり、Ｘ７はＳであるか、存在しない。
【０１９３】
一実施形態では、配列番号７において、Ｘ５はＬであり、Ｘ６はＳであり、Ｘ７はＳである（配列番号２４の配列に対応する）。
【０１９４】
一実施形態では、配列番号７において、Ｘ５はＰであり、Ｘ６はＳであり、Ｘ７は存在しない（配列番号２５の配列に対応する）。
【０１９５】
一実施形態では、配列番号７において、Ｘ５はＰであり、Ｘ６はＦであり、Ｘ７はＳである（配列番号２６の配列に対応する）。
【０１９６】
一実施形態では、配列番号７において、Ｘ５はＰであり、Ｘ６はＦであり、Ｘ７は存在しない（配列番号２７の配列に対応する）。
【０１９７】
一実施形態では、配列番号７において、Ｘ５はＰであり、Ｘ６はＳであり、Ｘ７はＳである（配列番号２８の配列に対応する）。
【０１９８】
一実施形態では、配列番号７において、Ｘ５はＬであり、Ｘ６はＳであり、Ｘ７は存在しない（配列番号２９の配列に対応する）。
【０１９９】
一実施形態では、配列番号７において、Ｘ５はＬであり、Ｘ６はＦであり、Ｘ７はＳである（配列番号３０の配列に対応する）。
【０２００】
一実施形態では、配列番号７において、Ｘ５はＬであり、Ｘ６はＦであり、Ｘ７は存在しない（配列番号３１の配列に対応する）。
【０２０１】
したがって、本発明では、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体の軽鎖可変領域は、配列番号２４〜３１と少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を有する。
【０２０２】
一実施形態では、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体は、配列番号６の配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７の配列を有する軽鎖可変領域とを含む。
【０２０３】
本発明の別の実施形態では、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体は、配列番号８〜２３から選択される配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２４〜３１から選択される配列を有する軽鎖可変領域とを含む。
【０２０４】
一実施形態では、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体は、配列番号８の配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２４の配列を有する軽鎖可変領域とを含む。
【０２０５】
一実施形態では、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体は、配列番号１１の配列を有する重鎖可変領域と、配列番号２４の配列を有する軽鎖可変領域とを含む。
【０２０６】
配列番号６の配列を有する重鎖可変領域と、配列番号７の配列を有する軽鎖可変領域とを含む抗体のグループには、具体的には抗体９ｂＦ４および１０ｂＢ１が含まれる。
【０２０７】
本発明の抗体９ｂＦ４は、配列番号６の配列を有し、Ｘ１がＱであり、Ｘ２がＲであり、Ｘ３がＴであり、Ｘ４がＴである（配列番号１１の配列に対応する）、重鎖可変領域を含む。Ｘ３位には、Ｔ残基の代わりにＡ残基であり得るクローン変異が認められ得る。さらに、本発明の抗体９ｂＦ４は、配列番号７の配列を有し、Ｘ５がＬであり、Ｘ６がＳであり、Ｘ７がＳである（配列番号２４の配列に対応する）、軽鎖可変領域を含む。
【０２０８】
本発明の抗体１０ｂＢ１は、配列番号６の配列を有し、Ｘ１がＱであり、Ｘ２がＲであり、Ｘ３がＴであり、Ｘ４がＴである（配列番号１１の配列に対応する）、重鎖可変領域を含む。Ｘ１位（Ｑ残基の代わりにＲ残基であり得る）、Ｘ２位（Ｒ残基の代わりにＧ残基であり得る）および／またはＸ４位（Ｔ残基の代わりにＳ残基であり得る）には、クローン変異が認められ得る。さらに、本発明の抗体１０ｂＢ１は、配列番号７の配列を有し、Ｘ５がＬであり、Ｘ６がＳであり、Ｘ７がＳである（配列番号２４の配列に対応する）、軽鎖可変領域を含む。Ｘ６位（Ｓ残基の代わりにＦ残基であり得る）および／またはＸ７位（Ｓ残基である代わりに不在であり得る）にはクローン変異が認められ得る。
【０２０９】
本発明では、重鎖可変領域または軽鎖可変領域のアミノ酸のうちの１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上のアミノ酸を異なるアミノ酸に置換し得る。
【０２１０】
本発明では、重鎖可変領域は、配列番号６または８〜２３と少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を包含する。
【０２１１】
本発明では、軽鎖可変領域は、配列番号７または２４〜３１と少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有する配列を包含する。
【０２１２】
本発明の抗体、例えば９ｂＦ４および１０ｂＢ１では、特定の可変領域およびＣＤＲ配列が保存的配列改変を含み得る。保存的配列改変は、そのアミノ酸配列を含む抗体の結合特性に大きな影響を及ぼすことも、それを大幅に変化させることもないアミノ酸改変を指す。このような保存的改変としては、アミノ酸の置換、付加および欠失が挙げられる。当該技術分野で公知の標準的技術、例えば部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介性変異誘発などにより、本発明の抗体に改変を導入することができる。
【０２１３】
保存的アミノ酸置換とは通常、あるアミノ酸残基を、物理化学的特性の類似した側鎖を有するアミノ酸残基で置き換える、アミノ酸置換のことである。特定の可変領域およびＣＤＲ配列がアミノ酸の挿入、欠失または置換を１つ、２つ、３つ、４つまたはそれ以上含み得る。置換を施す場合、好ましい置換は保存的改変である。当該技術分野ではこれまでに、類似した側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが明らかにされている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内にある１つまたは複数のアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基に置き換えることができ、その変化させた抗体が保持している機能（すなわち、本明細書に記載される特性）について、本明細書に記載されるアッセイを用いて試験することができる。
【０２１４】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１との結合に関してモノクローナル抗体９ｂＦ４および１０ｂＢ１のうちのいずれか１つと競合する。一実施形態では、競合は一方向性である。別の実施形態では、競合は双方向性であり、このことは、本発明のタンパク質がＣＤ９Ｐ−１との結合に関してモノクローナル抗体９ｂＦ４および１０ｂＢ１のうちのいずれか１つと競合し、その逆も同様であることを意味する。
【０２１５】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、ＣＤ９Ｐ−１上（好ましくは、ＣＤ９Ｐ−１の細胞外ドメイン上）にあるヒトモノクローナル抗体９ｂＦ４または１０ｂＢ１のうちのいずれか１つと同じエピトープまたは同じエピトープのグループと結合する。
【０２１６】
本発明では、ＣＤ９Ｐ−１との結合に関して本発明の９ｂＦ４もしくは１０ｂＢ１抗体と（一方向性または双方向性に）競合し、かつ／または実質的に本発明の９ｂＦ４もしくは１０ｂＢ１抗体と同じエピトープと結合する抗体を、それぞれ９ｂＦ４様抗体または１０ｂＢ１様抗体と呼ぶ。
【０２１７】
本発明のまた別の目的は、配列番号８の配列の重鎖可変領域をコードする単離核酸配列である。
【０２１８】
一実施形態では、前記核酸配列は配列番号３２である。
【０２１９】
配列番号３２
ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＡＣＴＴＣＡＧＴＧＡＡＡＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＡＧＡＣＴＴＣＴＧＧＣＴＡＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＡＧＣＴＡＣＴＧＧＡＴＴＣＡＧＴＧＧＡＴＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＧＡＣＡＧＧＧＣＣＴＴＧＧＧＴＧＧＡＴＴＧＧＡＧＡＧＡＴＡＴＴＴＣＣＴＧＧＡＡＣＴＧＧＣＡＣＧＡＣＴＴＣＣＴＡＣＣＡＴＧＡＧＡＡＡＴＴＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＴＡＴＡＧＡＣＡＣＡＴＣＣＴＣＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＡＣＴＴＧＣＡＧＣＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＣＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＴＴＣＡＡＧＡＧＡＣＴＴＣＧＡＴＧＴＣＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＧＣＡＣＣＡＣＴＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡＡ。
【０２２０】
本発明のまた別の目的は、配列番号２４の配列の軽鎖可変領域をコードする単離核酸配列である。
【０２２１】
一実施形態では、前記核酸配列は配列番号３３である。
【０２２２】
配列番号３３
ＧＡＴＧＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＣＴＣＣＡＣＴＣＡＣＴＴＴＧＴＣＧＧＴＴＡＣＣＡＴＴＧＧＧＣＡＡＣＣＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＴＣＡＡＧＴＣＡＧＡＧＣＣＴＣＴＴＡＧＡＴＡＴＴＧＡＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＴＡＴＴＴＧＡＡＴＴＧＧＴＴＧＴＴＡＣＡＧＡＧＧＣＣＡＧＧＣＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＧＣＧＣＣＴＡＡＴＣＴＡＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＡＡＡＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＣＣＴＧＡＣＡＧＧＧＴＣＡＣＴＧＧＣＡＧＴＧＧＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＴＴＴＣＡＣＡＣＴＧＡＡＡＡＴＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＧＣＴＧＡＧＧＡＴＴＴＧＧＧＡＧＴＴＴＡＴＴＡＴＴＧＴＴＧＧＣＡＡＧＧＴＡＣＡＣＡＴＣＴＴＣＣＴＣＧＧＡＣＧＴＴＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＡＣＣＡＡＣＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＡＡＣ。
【０２２３】
本発明のまた別の目的は、本発明の抗ＣＤ９Ｐ−１抗体をコードする核酸配列を含む、発現ベクターである。一実施形態では、本発明の発現ベクターは、配列番号３２、配列番号３３または前記配列番号３２〜３３と少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を共有する核酸配列を有する任意の配列のうちの少なくとも１つのものを含む。
【０２２４】
本発明のまた別の目的は、前記ベクターを含む単離宿主細胞である。前記宿主細胞は、本発明の抗体の組換え産生に使用し得る。
【０２２５】
本発明のまた別の目的は、本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞系である。
【０２２６】
本発明による好ましいハイブリドーマ細胞系は、Ｇｅｎｏｐｏｌｅ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社のＧＥＮＥ  ＳＩＧＮＡＬ（４  ｒｕｅ  Ｐｉｅｒｒｅ  Ｆｏｎｔａｉｎｅ、９１０００  Ｅｖｒｙ、フランス）がパスツール研究所のＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ）（２５  ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｏｃｔｅｕｒ  Ｒｏｕｘ、７５０１４  Ｐａｒｉｓ）に寄託したものである：
【表１】
2020528932.tif 000002
【０２２７】
本発明の一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。本発明の抗体のフラグメントおよび誘導体（別途明記されない限り、または文脈上明らかに矛盾しない限り、本願で使用される「抗体」（１つまたは複数）という用語に包含される）、好ましくは９ｂＦ４様抗体または１０ｂＢ１様抗体を当該技術分野で公知の技術により作製することができる。「フラグメント」は、インタクト抗体の一部分、一般には抗原結合部位または可変領域を含む。抗体フラグメントの例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；途切れのない連続するアミノ酸残基の１つの配列からなるポリペプチドである、抗体フラグメント（本明細書では「一本鎖抗体フラグメント」または「一本鎖ポリペプチド」と呼ぶ）、特に限定されないが、（１）一本鎖Ｆｖ分子、（２）重鎖部分が付随せず、軽鎖可変ドメインを１つだけ含む一本鎖ポリペプチドまたは軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含むそのフラグメント、および（３）軽鎖部分が付随せず、重鎖可変領域を１つだけ含む一本鎖ポリペプチドまたは重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含むそのフラグメント；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体が挙げられる。本発明の抗体のフラグメントは、標準的な方法を用いて得ることができる。
【０２２８】
例えば、従来技術に従い、単離抗体のプロテアーゼ消化によってＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製し得る。既知の方法を用いて免疫反応性のフラグメントを改変して、例えばｉｎ  ｖｉｖｏのクリアランスの速度を低下させ、より望ましい薬物動態プロファイルを得ることができることが理解されよう。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）でフラグメントを改変し得る。ＰＥＧとＦａｂ’フラグメントにカップリングし、部位特異的にコンジュゲートする方法については、例えば、Ｌｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  １６（３）：１０６−１１９（２００１）およびＤｅｌｇａｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５  ７３（２）：１７５−１８２（１９９６）に記載されており、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２９】
あるいは、本発明の抗体、好ましくは９ｂＦ４様抗体または１０ｂＢ１様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡを、本発明のフラグメントをコードするよう改変してもよい。次いで、改変ＤＮＡを発現ベクターに挿入し、適切な細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに使用し、次いで、これに所望のフラグメントを発現させる。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体、好ましくは９ｂＦ４様抗体または１０ｂＢ１様抗体を産生するハイブリドーマのＤＮＡを発現ベクターに挿入する前に、それを例えば、相同な非ヒト配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列に置き換えることにより（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ｐｐ．６８５１（１９８４））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合で結合させることにより、改変することができる。このようにして、元の抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体を調製する。通常、このような非免疫グロブリンポリペプチドを本発明の抗体の定常ドメインの代わりに用いる。
【０２３１】
したがって、別の実施形態では、本発明の抗体、好ましくは９ｂＦ４様抗体または１０ｂＢ１様抗体はヒト化である。本発明による「ヒト化」型の抗体とは、マウス免疫グロブリンに由来する最小限の配列が含まれる、特異的な免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体のその他の抗原結合部分配列など）のことである。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、相補性決定領域（ＣＤＲ）の残基が元の抗体（ドナー抗体）のＣＤＲの残基に置き換えられていると同時に、元の抗体の所望の特異性、親和性および能力を保持している、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。
【０２３２】
いくつかの場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基を対応する非ヒト残基で置き換え得る。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも移入するＣＤＲおよびフレームワーク配列にもみられない残基を含み得る。これらの改変を施して、抗体の性能をさらに高め最適化する。ヒト化抗体は一般に、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が元の抗体のものに対応し、ＦＲ領域の全部または実質的に全部がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも１つ、通常２つの可変ドメインを実質的に全て含む。
【０２３３】
ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常はヒト免疫グロブリンのＦｃの少なくとも一部分も含むのが最適である。さらなる詳細については、開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１，ｐｐ．５２２（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２，ｐｐ．３２３（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２，ｐｐ．５９３（１９９２）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９，ｐｐ．１５３４；および米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。本発明の抗体をヒト化する方法は当該技術分野で周知である。ヒト化抗体の作製に使用するヒト可変ドメインの選択は軽鎖、重鎖ともに、抗原性を低下させるのに極めて重要である。
【０２３４】
いわゆる「ベストフィット」法では、本発明の抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。次いで、マウス配列に最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）とする（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，ｐｐ．２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，ｐｐ．９０１）。
【０２３５】
また別の方法では、特定のサブグループの軽鎖または重鎖の全ヒト抗体のコンセンサス配列から特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークを複数の異なるヒト化抗体に用いることができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ８９，ｐｐ．４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，５１（１９９３））。さらに、ＣＤ９Ｐ−１に対する高い親和性およびその他の好ましい生物学的特性を保持しながら抗体をヒト化するのが重要である。この目的を達成するには、好ましい方法では、親配列およびヒト化配列の三次元モデルを用いて親配列および様々な概念上のヒト化産物を解析する過程によりヒト化抗体を調製する。
【０２３６】
三次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能なものであり、当業者によく知られている。選択した候補免疫グロブリン配列に対して可能な三次元構造を図解し表示するコンピュータプログラムが入手可能である。
【０２３７】
このように表示されたものを調べることにより、残基が候補免疫グロブリン配列の機能に果たす可能性のある役割の解析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の解析が可能になる。このようにして、抗体の所望の特性、例えば標的抗原（１つまたは複数）に対する親和性の増大などが得られるよう、コンセンサス配列および重要な配列からＣＤＲ残基を選択して組み合わせることができる。ＣＤＲ残基は一般に、抗原結合に影響を及ぼすことに直接的に、かつ最も大きく関与する。「ヒト化」モノクローナル抗体を作製するまた別の方法として、免疫感作に使用するマウスとしてＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（Ａｂｇｅｎｉｘ社、フリーモント、カリフォルニア州）を用いるものがある。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅは、免疫グロブリン遺伝子が機能性ヒト免疫グロブリン遺伝子に置き換えられた本発明によるマウス宿主である。したがって、このマウスによって、またはこのマウスのＢ細胞から作製したハイブリドーマで産生される抗体は、既にヒト化されている。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅについては、全体が参照により組み込まれる米国特許第６，１６２，９６３号に記載されている。
【０２３８】
様々な他の技術に従い、例えば、ヒト抗体レパートリーを発現するよう操作した他のトランスジェニック動物を免疫感作に用いること（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２（１９９３）２５５）、またはファージディスプレイ方法を用いる抗体レパートリーの選択などにより、ヒト抗体を作製してもよい。このよう技術は当業者に公知であり、本願に開示されるモノクローナル抗体から出発して実施することができる。
【０２３９】
本発明の抗体、好ましくは９ｂＦ４様抗体または１０ｂＢ１様抗体を、重鎖／軽鎖（１つまたは複数）の一部分が元の抗体の対応する配列と同一または相同であると同時に、鎖（１つまたは複数）の残りの部分が別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）のほか、所望の生物活性および結合特異性を示す限り、このような抗体のフラグメントに誘導体化してもよい（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，ｐｐ．６８５１（１９８４））。
【０２４０】
本発明のまた別の目的は、少なくとも１つの本発明のタンパク質、好ましくは９ｂＦ４様抗体または１０ｂＢ１様抗体を含むか、実質的にこれよりなるか、これよりなる、組成物である。
【０２４１】
本明細書で組成物に関して使用される「実質的に〜よりなる」は、少なくとも１つの上に記載した本発明のタンパク質が、前記組成物内で生物学的活性を有する唯一の治療剤であることを意味する。
【０２４２】
本発明のまた別の目的は、少なくとも１つの上に記載した本発明のタンパク質、好ましくは９ｂＦ４様抗体または１０ｂＢ１様抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物である。
【０２４３】
薬学的に許容される担体の例としては、特に限定されないが、媒体、溶媒、コーティング剤、等張剤および吸収遅延剤、添加剤、安定剤、保存剤、界面活性剤、酵素による分解を阻害する物質、アルコール、ｐＨ調整剤および噴射剤が挙げられる。
【０２４４】
薬学的に許容される媒体の例としては、特に限定されないが、水、リン酸緩衝生理食塩水、通常の生理食塩水もしくはその他の生理学的緩衝生理食塩水またはその他の溶媒、例えばグリコール、グリセロールおよび油など、例えばオリーブ油もしくは注射用有機エステルなどが挙げられる。薬学的に許容される媒体は、リポソームまたはミセルを含有してもよく、ポリペプチドまたはペプチド抗原と界面活性剤およびグリコシドとを混合することによって調製した免疫刺激複合体を含有し得る。
【０２４５】
コーティング材料の例としては、特に限定されないがレシチンが挙げられる。
【０２４６】
等張剤の例としては、特に限定されないが、糖、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
【０２４７】
吸収を遅らせる物質の例としては、特に限定されないが、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンが挙げられる。
【０２４８】
添加剤の例としては、特に限定されないが、マンニトール、デキストラン、糖、グリシン、ラクトースもしくはポリビニルピロリドンまたはその他の添加剤、例えば抗酸化剤もしくは不活性ガス、安定剤またはｖｉｖｏ投与に適した組換えタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン）などが挙げられる。
【０２４９】
適切な安定剤の例としては、特に限定されないが、スクロース、ゼラチン、ペプトン、消化タンパク質抽出物、例えばＮＺ−ＡｍｉｎｅまたはＮＺ−Ａｍｉｎｅ  ＡＳなどが挙げられる。
【０２５０】
これらの組成物に使用し得る薬学的に許容される担体としてはさらに、特に限定されないが、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミンなど、緩衝物質、例えばリン酸塩など、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩など、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリラート、ロウ、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
【０２５１】
本発明のまた別の目的は、少なくとも１つの上に記載した本発明のタンパク質、好ましくは９ｂＦ４様抗体または１０ｂＢ１様抗体を含むか、これよりなるか、実質的にこれよりなる、薬物である。
【０２５２】
対象への投与に使用するには、対象への投与に合わせて組成物を製剤化する。本発明の組成物、医薬組成物および薬物は、経口的に、非経口的に、吸入スプレーにより、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、頬側的に、経膣的に、または埋込みリザーバーから投与し得る。本明細書の使用は、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、肝内、病巣内および頭蓋内への注射または注入技術を含む。
【０２５３】
本発明の無菌注射用形態の組成物は、水性または油性懸濁剤であり得る。これらの懸濁剤は、当該技術分野で公知の技術に従い、適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて製剤化し得る。無菌注射用製剤は、無毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒を用いた無菌注射用液剤または懸濁剤であってもよい。使用し得る許容される媒体および溶媒に含まれるものとして、水、リンガー溶液および等張塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌不揮発性油を従来通りに溶媒または懸濁媒として使用し得る。この目的のために、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含めた任意の無刺激性不揮発性油を使用し得る。注射用製剤の調製には、オレイン酸およびそのグリセリド誘導体などの脂肪酸が有用であり、オリーブ油またはヒマシ油などの天然の薬学的に許容される油、特にポリオキシエチル化型のものも同様である。これらの油性液剤または懸濁剤は、カルボキシメチルセルロースなどの長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤、または乳剤および懸濁剤を含めた薬学的に許容される剤形の製剤化によく使用される同様の分散剤も含有し得る。他のよく使用される界面活性剤、例えば、薬学的に許容される固体、液体またはその他の剤形の製造によく使用されるＴｗｅｅｎ、Ｓｐａｎおよびその他の乳化剤またはバイオアベイラビリティ促進剤なども製剤化の目的で使用し得る。
【０２５４】
本発明の組成物は、特に限定されないが，カプセル剤，錠剤，水性懸濁剤または液剤を含めた任意の経口的に許容される剤形の形で経口的に投与し得る。経口使用のための錠剤の場合、よく用いられる担体として、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられる。通常、ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤も添加する。
【０２５５】
カプセル形態での経口投与には、有用な希釈剤として、例えばラクトースが挙げられる。経口使用に水性懸濁剤が必要とされる場合、有効成分を乳化剤および懸濁化剤と組み合わせる。必要に応じて、特定の甘味剤、香味剤または着色剤を添加してもよい。
【０２５６】
本発明のタンパク質を本発明の医薬組成物の形で投与するためのスケジュールおよび用量は、これらの製品について知られている方法に従って、例えば製造業者の指示書を用いて決定することができる。
【０２５７】
本願では、本発明者は、本発明のタンパク質、具体的には本発明の抗体が、ＣＤ９Ｐ１、スタビリン１およびＴＲＡＦ−２の分解および／または内部移行を誘導することを明らかにした。
【０２５８】
したがって、本発明のまた別の目的は、ＣＤ９Ｐ−１関連病態、スタビリン１関連病態および／またはＴＲＡＦ−２関連病態を治療する、またはその治療に使用する、本発明のタンパク質である。
【０２５９】
「ＣＤ９Ｐ−１関連病態」という用語は、ＣＤ９Ｐ−１タンパク質の発現および／または機能の障害に関連する障害であって、好ましくはＣＤ９Ｐ−１の阻害が有益であり得る障害を指す。したがって、「スタビリン１関連病態」という用語は、スタビリン１タンパク質の発現および／または機能の障害に関連する障害であって、好ましくはスタビリン１の阻害が有益であり得る障害を指し、「ＴＲＡＦ−２関連病態」という用語は、ＴＲＡＦ−２タンパク質の発現および／または機能の障害に関連する障害であって、好ましくはＴＲＡＦ−２の阻害が有益であり得る障害を指す。
【０２６０】
本発明のまた別の目的は、癌を治療する、またはその治療に使用する、本発明のタンパク質である。
【０２６１】
本発明のタンパク質、組成物および方法によって治療し得る癌の例としては、特に限定されないが、肺癌、中皮腫、乳癌、膀胱癌、心臓の癌、消化管癌、泌尿生殖器癌、肝臓癌、骨癌、神経系癌、婦人科癌、血液系癌、皮膚癌および副腎癌が挙げられる。
【０２６２】
一実施形態では、前記癌は腫瘍、例えば固形腫瘍などである。別の実施形態では、前記癌は血液癌である。別の実施形態では、前記癌は血液悪性腫瘍である。
【０２６３】
肺癌の例としては、特に限定されないが、腺癌（以前の細気管支肺胞上皮癌）、未分化小細胞癌、未分化大細胞癌、小細胞癌、大細胞癌、大細胞神経内分泌腫瘍、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、未分化非小細胞肺癌、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨過誤腫、パンコースト腫瘍およびカルチノイド腫瘍が挙げられる。
【０２６４】
中皮腫の例としては、特に限定されないが、胸膜中皮腫、腹膜中皮腫、心膜中皮腫、末期中皮腫ならびに類上皮中皮腫、肉腫様中皮腫および二相性中皮腫が挙げられる。
【０２６５】
乳癌の例としては、特に限定されないが、非浸潤性乳管癌、浸潤性乳管癌、乳腺管状癌、乳腺髄様癌、乳腺粘液癌、乳腺乳頭癌、乳腺篩状癌、浸潤性小葉癌、炎症性乳癌、非浸潤性小葉癌、男性乳癌、乳頭パジェット病、乳腺葉状腫瘍および再発性・転移性乳癌が挙げられる。
【０２６６】
膀胱癌の例としては、特に限定されないが、移行細胞膀胱癌（以前の尿路上皮癌）、浸潤性膀胱癌、扁平上皮癌、腺癌、非筋肉浸潤性（表在または初期）膀胱癌、肉腫、膀胱小細胞癌および続発性膀胱癌が挙げられる。
【０２６７】
心臓の癌の例としては、特に限定されないが、肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫が挙げられる。
【０２６８】
消化管癌の例としては、特に限定されないが、食道癌（扁平上皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃癌（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓癌（導管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ＶＩＰ産生腫瘍）、小腸癌（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カルポジ肉腫（Ｋａｒｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸癌（腺癌、管状腺腫、絨毛状腺腫、過誤腫、平滑筋腫）、結腸癌、結腸直腸癌および直腸癌が挙げられる。
【０２６９】
泌尿生殖器癌の例としては、特に限定されないが、腎臓癌（腺癌、ウィン腫瘍（Ｗｉｈｎ’ｓ  ｔｕｍｏｒ）［腎芽腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道癌（扁平上皮癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）ならびに精巣癌（精上皮腫、奇形腫、胎児性癌、奇形腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）が挙げられる。
【０２７０】
肝臓癌の例としては、特に限定されないが、ヘパトーマ（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫および血管腫が挙げられる。
【０２７１】
骨癌の例としては、特に限定されないが、骨肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫脊索腫、骨軟骨腫（骨軟骨性外骨腫）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液性線維腫、類骨骨腫および巨細胞腫が挙げられる。
【０２７２】
神経系癌の例としては、特に限定されないが、頭蓋の癌（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜癌（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）および脳腫瘍（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形性膠芽腫、乏突起神経膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）が挙げられる。
【０２７３】
婦人科癌の例としては、特に限定されないが、子宮癌（子宮内膜癌）、子宮頸部の癌（子宮頸癌、前腫瘍子宮頸部異形成）、卵巣の癌（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、未分類癌腫］、顆粒膜−莢膜細胞腫、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部癌（扁平上皮癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、メラノーマ）および膣癌（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫［胎児性横紋筋肉腫］、ファロピウス管癌［癌腫］）が挙げられる。
【０２７４】
血液系癌の例としては、特に限定されないが、血液癌（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］が挙げられる。
【０２７５】
皮膚癌の例としては、特に限定されないが、悪性メラノーマ、基底細胞癌、扁平上皮癌、カルポジ肉腫（Ｋａｒｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ）、奇胎異形成母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫およびケロイドが挙げられる。
【０２７６】
副腎癌の例としては、特に限定されないが神経芽腫が挙げられる。
【０２７７】
本発明のタンパク質、組成物および方法によって治療され得る癌のその他の例としては、特に限定されないが、乳癌、前立腺癌、結腸癌、卵巣癌、結腸直腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、脳癌、精巣癌、胃癌、膵臓癌、皮膚癌、小腸癌、大腸癌、咽喉癌、頭頸部癌、口腔癌、骨癌、肝臓癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および血液癌が挙げられる。
【０２７８】
本発明のタンパク質、組成物および方法によって治療され得る癌のその他の例としては、特に限定されないが、リンパ腫および白血病が挙げられる。
【０２７９】
本発明のタンパク質、組成物および方法は、腫瘍細胞転移を予防する、または減少させることも目的とする。実際、本出願者は、本発明のタンパク質をヒト転移性非小細胞肺癌（ＮＣＩ−Ｈ４６０）細胞と共培養すると、同タンパク質がヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）に２つの主要な殺腫瘍サイトカインおよび重要な免疫応答誘発因子（ＴＮＦアルファおよびＩＦＮガンマ、図５を参照されたい）の産生を誘導することを明らかにした。本出願者はさらに、本発明のタンパク質をＰＢＭＣ細胞と共培養すると、同タンパク質が転移性ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞に細胞アポトーシスを誘発することも明らかにした（図４を参照されたい）。
【０２８０】
一実施形態では、本発明は、癌細胞がＣＤ９Ｐ−１を発現する癌および／または腫瘍の治療に使用する、本発明のタンパク質または本発明による組成物に関する。
【０２８１】
本発明は、治療を必要とする対象の癌細胞および／または腫瘍細胞がＣＤ９Ｐ−１を発現する癌および／または腫瘍を治療する方法にも関する。
【０２８２】
一実施形態では、癌細胞および／または腫瘍細胞はＴＲＡＦ−２を発現する。
【０２８３】
一実施形態では、対象はヒトである。
【０２８４】
一実施形態では、対象は癌を有する。一実施形態では、対象は癌であると診断されているか、そのように診断されたことがある。
【０２８５】
一実施形態では、対象は腫瘍を有する。一実施形態では、対象は腫瘍を有すると診断されているか、そのように診断されたことがある。
【０２８６】
一実施形態では、癌は初期または末期の癌である。
【０２８７】
一実施形態では、対象は、これまでに別の癌治療法による治療を受けていない（すなわち、本発明の方法が一次治療である）。
【０２８８】
別の実施形態では、対象は、これまでに１つ、２つまたはそれ以上の癌治療を受けている（すなわち、本発明の方法が、二次治療、三次治療または四次以上の治療である）。一実施形態では、対象は、これまでに１つまたは複数の他の癌治療を受けているが、その治療が奏効していないか、十分に奏効しておらず、このことは、上記の治療によって治療利益が全く得られないか、少な過ぎることを意味する。
【０２８９】
別の実施形態では、対象は、癌が発症するリスクがある。癌が発症する危険因子の例としては、特に限定されないが、癌の家族歴、遺伝的素因または発癌物質への曝露が挙げられる。
【０２９０】
本発明の別の実施形態では、本発明のタンパク質を含む組成物を少なくとも１つの他の有効成分と組み合わせて癌および／または腫瘍の治療に使用し得る。本発明の一態様では、本発明のタンパク質または本発明のタンパク質を含む組成物を追加の相乗的抗癌剤として癌および／または腫瘍の治療に使用し得る。
【０２９１】
「相乗的」は、有効成分の組合せの総合的効果が、別個に摂取した各有効成分の効果よりも大きいことを意味する。「追加の相乗的治療法」は、単独療法の治療効果を改善する相補的な作用機序のある薬剤を用いる併用療法を意味する。
【０２９２】
本発明の特定の実施形態では、組成物は、細胞毒性剤、化学療法剤または抗癌剤をさらに含む。
【０２９３】
抗癌剤の例としては、特に限定されないが、アルキル化剤またはアルキル化作用のある薬剤、例えば、シクロホスファミド（ＣＴＸ；例えば、ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標））、クロランブシル（ＣＨＬ；例えば、ＬＥＵＫＥＲＡＮ（登録商標））、シスプラチン（ＣｉｓＰ；例えば、ＰＬＡＴＩＮＯＬ（登録商標））、オキサリプラチン（例えば、ＥＬＯＸＡＴＩＮ（商標））、ブスルファン（例えば、ＭＹＬＥＲＡＮ（登録商標））、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（ＴＥＭ）、マイトマイシンＣなど；抗代謝産物剤、例えば、メトトレキサート（ＭＴＸ）、エトポシド（ＶＰ１６；例えば、ＶＥＰＥＳＩＤ（登録商標））、６−メルカプトプリン（６ＭＰ）、６−チオクグアニン（６−ｔｈｉｏｃｇｕａｎｉｎｅ）（６ＴＧ）、シタラビン（Ａｒａ−Ｃ）、５‐フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（例えば、ＸＥＬＯＤＡ（登録商標））、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）など；抗生物質、例えば、アクチノマイシンＤ、ドキソルビシン（ＤＸＲ；例えば、アドリアマイシン（登録商標））、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンなど；アルカロイド、例えばビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン（ＶＣＲ）、ビンブラスチンなど；ならびにその他の抗腫瘍剤、例えば、パクリタキセル（例えば、ＴＡＸＯＬ（登録商標））およびパクリタキセル誘導体、細胞分裂阻害剤、グルココルチコイド、例えばデキサメタゾン（ＤＥＸ；例えば、ＤＥＣＡＤＲＯＮ（登録商標））などおよび副腎皮質ステロイド、例えばプレドニゾンなど、ヌクレオシド酵素阻害剤、例えばヒドロキシウレアなど、アミノ酸を枯渇させる酵素、例えばアスパラギナーゼなど、ロイコボリン、ホリン酸、ラルチトレキセドおよびその他の葉酸誘導体ならびにこれらと同様の多様な抗腫瘍剤が挙げられる。追加の薬剤として以下の薬剤も使用し得る：アミホスチン（例えば、ＥＴＨＹＯＬ（登録商標））、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロルヌスチン（ｌｏｒｎｕｓｔｉｎｅ）（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシンリポ（例えば、ＤＯＸＩＬ（登録商標））、ゲムシタビン（例えば、ＧＥＭＺＡＲ（登録商標））、ダウノルビシンリポ（例えば、ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ（登録商標））、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル（例えば、タキソテール（登録商標））、アルデスロイキン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、１０−ヒドロキシ７−エチル−カンプトテシン（ＳＮ３８）、フロクスウリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビンまたはクロランブシル。
【０２９４】
上記の細胞毒性剤、化学療法剤およびその他の抗癌剤の化学療法レジメンへの使用は一般に、癌治療の分野で十分に特徴付けられており、本明細書でのその使用にあたっては、多少の調整を加えて、耐容性および有効性の監視ならびに投与経路および用量の管理が同じように考慮される。効果的な細胞毒性剤の典型的な用量は、製造業者によって推奨される範囲内であり得、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの応答または動物モデルでの応答によって示す場合、濃度または量をほぼ一桁分減量し得る。したがって、実際の用量は、初代培養悪性細胞もしくは組織培養した組織試料のｉｎ  ｖｉｔｒｏの応答または適切な動物モデルで観察された応答に基づき、医師の判断、患者の状態および治療法の有効性によって決まる。
【０２９５】
一実施形態では、本発明の組成物、医薬組成物または薬物は、少なくとも１つの本発明のタンパク質、好ましくは９ｂＦ４様抗体または１０ｂＢ１様抗体と、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）とを含む。様々な腫瘍が、自身を免疫系による攻撃から防御する分子因子を発現することが可能であり、したがって、免疫系による監視制御を首尾よく免れることができる。この「腫瘍免疫逃避」は主として、免疫細胞リガンドが標的とする受容体および結合部位の拮抗的遮断によるものである。免疫チェックポイント阻害剤は、特に腫瘍性細胞が発達させたこの種の阻害機序を標的とする分子である。ＩＣＩの例としては、特に限定されないが、ＣＴＬＡ−４阻害剤（例えば、イピルマブ（ｉｐｉｌｕｍａｂ）およびトレメリムマブなど）、ＰＤ−１阻害剤（例えば、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、ニボルマブおよびＡＭＰ−２２４など）、ＰＤ−Ｌ１阻害剤（例えば、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブおよびＢＭＳ−９３６５５９など）、ＬＡＧ３阻害剤（例えば、ＩＭＰ３２１など）およびＢ７−Ｈ３阻害剤（例えば、ＭＧＡ２７１）などが挙げられる。
【０２９６】
実際、本発明者らは、本発明のタンパク質の投与によって化学誘引分子の産生が誘導され、それにより、腫瘍部位でのＴリンパ球およびＮＫ細胞の有意な動員が誘導されることを明らかにしている。いかなる理論にも束縛されるものではないが、本発明者らは、したがって、ＩＣＩの添加によって、本発明の方法の免疫療法としての可能性を十全に引き出し得ることを示唆する。実際、ＩＣＩによって、免疫系が腫瘍を攻撃する能力を回復させることが可能であり、したがって、本発明のタンパク質により腫瘍周辺に動員された免疫細胞によって放出された分子が再び、癌細胞表面にある標的タンパク質と効率的に結合する可能性が考えられる。
【０２９７】
したがって、別の実施形態では、本発明は、少なくとも１つの本発明のタンパク質、好ましくは９ｂＦ４様抗体または１０ｂＢ１様抗体と、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）とを含む、本発明の組成物、医薬組成物または薬物、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の機能を増強して細胞性免疫応答をアップレギュレートするためのその使用、ならびに癌および／または腫瘍を治療するための腫瘍免疫などのＴ細胞および／またはＮＫ細胞機能不全の治療へのその使用に関する。
【０２９８】
特定の実施形態では、治療する対象は、ＣＤ９Ｐ−１を発現する癌細胞、好ましくは細胞表面にＣＤ９Ｐ−１を発現する癌細胞の存在を試験する、または既に試験した者である。
【０２９９】
前記ＣＤ９Ｐ−１を発現する癌細胞の同定は、当該技術分野で周知の任意の方法、例えば、ＣＤ９Ｐ−１に特異的なプライマー、配列または抗体を用いる免疫組織化学、ＰＣＲまたはｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどによって実施し得る。使用し得る抗ＣＤ９Ｐ−１抗体の例としては、特に限定されないが、本発明の抗体または既に記載されている抗体、例えば、ＳＡＢ２７００３７９またはＨＰＡ０１７０７４（Ｓｉｇｍａ社）などが挙げられる。
【０３００】
本発明のまた別の目的は、本発明の治療を必要とする対象を選択する診断キットである。一実施形態では、前記診断キットは、ＣＤ９Ｐ−１の発現を測定するイムノアッセイ試薬またはプライマーまたは配列を含む。ＣＤ９Ｐ−１をコンパニオン診断検査のバイオマーカーとして使用する。一実施形態では、前記診断キットは、本発明のＣＤ９Ｐ−１標的化抗体または既に記載されている抗体、例えば、ＳＡＢ２７００３７９またはＨＰＡ０１７０７４（Ｓｉｇｍａ社）などを含む。
【０３０１】
本発明のまた別の目的は、必要とする対象の癌を治療する方法であって、
−対象のＣＤ９Ｐ−１を発現する癌細胞の存在を評価することと；
−ＣＤ９Ｐ−１を発現する癌細胞が検出された場合、対象に本発明のタンパク質を投与することによって対象を治療することと
を含む、方法である。
【０３０２】
本発明のまた別の目的は、必要とする対象の癌を治療する方法であって、
−治療前に対象のコンパニオン診断検査を実施し、前記コンパニオン診断検査が、本発明のタンパク質、好ましくは本発明の抗体を用いて、ＣＤ９Ｐ−１を発現する癌細胞の存在を検出することを含むことと；
−コンパニオン診断検査の陽性の結果に従って（すなわち、ＣＤ９Ｐ−１発現細胞が検出された場合）、ＣＤ９Ｐ−１を阻害する化合物で対象を治療することと
を含む、方法である。
【０３０３】
ＣＤ９Ｐ−１を阻害する化合物の例としては、特に限定されないが、本発明のタンパク質（具体的には、本発明の抗体）および国際公開第２０１５／１２１４２８号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているペプチド、例えば、配列ＧＮＹＹＣＳＶＴＰＷＶＫＳ（配列番号３５）のペプチドまたは配列ＩＨＳＫＰＶＦＩＴＶＫＭＤＶＬＮＡ（配列番号３６）のペプチドなどが挙げられる。
【０３０４】
本発明のまた別の目的は、試料中、好ましくは生体試料中のＣＤ９Ｐ−１をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで検出することへの少なくとも１つの本発明のタンパク質の使用である。
【０３０５】
一実施形態では、治療前、対象から採取した癌および／または腫瘍細胞を含む試料のＣＤ９−Ｐ１の発現を試験する。
【０３０６】
本発明のまた別の目的は、ＣＤ９Ｐ−１を阻害する分子をｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでスクリーニングすることへの少なくとも１つの本発明のタンパク質の使用である。
【０３０７】
本発明のタンパク質を使用し得るアッセイの例としては、特に限定されないが、ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、組織免疫組織化学、ウエスタンブロットおよび免疫沈降が挙げられる。
【０３０８】
本発明のまた別の目的は、試料中のＣＤ９Ｐ−１を検討する方法であって、試料と本発明のタンパク質とを接触させることと、ＣＤ９Ｐ−１と結合した抗ＣＤ９Ｐ−１抗体を検出し、それにより試料中のＣＤ９Ｐ−１の存在を示すことを含む、方法である。
【０３０９】
本発明の一実施形態では、試料は生体試料である。生体試料の例としては、特に限定されないが、体液、好ましくは血液、より好ましくは血清、血漿、滑液、気管支肺胞洗浄液、痰、リンパ液、腹水、尿、羊水、腹水、脳脊髄液、胸水、心膜液ならびに患部組織から調製した肺胞マクロファージ、組織溶解物および組織抽出物が挙げられる。
【０３１０】
本発明の一実施形態では、「試料」という用語は、任意の解析の前に個人から採取した試料を意味するものとする。一実施形態では、本発明の方法は、個人から前記試料を回収する段階を含まない。
【０３１１】
本発明の一実施形態では、本発明のタンパク質を検出可能な標識で直接標識し、直接検出し得る。別の実施形態では、本発明のタンパク質は未標識であり（第一／一次抗体と呼ぶ）、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体と結合することができる二次抗体またはその他の分子を標識する。当該技術分野で周知の通り、特定の種およびクラスの一次抗体と特異的に結合することができる二次抗体を選択する。
【０３１２】
試料中の抗ＣＤ９Ｐ−１／ＣＤ９Ｐ−１複合体の存在は、標識二次抗体の存在を検出することによって検出および測定することができる。例えば、一次抗体／抗原複合体を含むウェルから、または複合体を含む膜（ニトロセルロース膜またはナイロン膜など）から未結合の二次抗体を洗い流した後、結合した二次抗体を、例えば標識の化学発光に基づいて、発色させ、検出することができる。
【０３１３】
抗ＣＤ９Ｐ−１抗体または二次抗体の標識としては、特に限定されないが、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、磁性剤および放射性物質が挙げられる。このような酵素の例としては、特に限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；補欠分子族の例としては、特に限定されないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；蛍光物質の例としては、特に限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシン（ｄａｎｓｙｎｅ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ）またはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、特に限定されないがルミナールが挙げられ；磁性薬の例としては、ガドリニウムが挙げられ；適切な放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓまたは３Ｈが挙げられる。
【０３１４】
本発明のまた別の目的は、対象試料中のＣＤ９Ｐ−１レベルを求めることによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ診断アッセイへの本発明のタンパク質の使用である。このようなアッセイは、ＣＤ９Ｐ−１の過剰発現または低発現に関連する疾患を診断するのに有用であり得る。
【０３１５】
本発明のまた別の目的は、対象にＣＤ９Ｐ−１関連疾患が発症するリスクをｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定することへの本発明のタンパク質の使用である。
【０３１６】
本発明のまた別の目的は、ＣＤ９Ｐ−１関連病態、好ましくは癌および／または腫瘍、例えば、上に挙げた癌および／または腫瘍などが発症するリスクをｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定することへの本発明のタンパク質の使用である。
【０３１７】
本発明のまた別の目的は、対象に本発明のタンパク質による治療が奏効する可能性が高いかどうかをｉｎ  ｖｉｔｒｏで判定することへの本発明のタンパク質の使用である。
【０３１８】
対象試料中に存在するＣＤ９Ｐ−１の濃度または量は、存在するＣＤ９Ｐ−１の量を特異的に求める方法を用いて求めることができる。このような方法としてはＥＬＩＳＡ法が挙げられ、この方法では、例えば、本発明のタンパク質を従来通りにポリマーマトリックスなどの不溶性マトリックス上に固定化し得る。あるいは、サンドイッチＥＬＩＳＡ法を用いることができる。免疫組織化学染色アッセイを用いてもよい。進行または治療の各段階について統計的に有意な結果が得られる試料集団を用いて、疾患の各段階に特徴的であると考えられるＣＤ９Ｐ−１の様々な濃度を割り当てることができる。
【０３１９】
一実施形態では、対象から血液または血清の試料を採取し、試料中に存在するＣＤ９Ｐ−１の濃度を求めて、試験中の対象の疾患の段階を評価する、または治療過程にある対象の奏効を特徴付ける。このようにして得た濃度を用いて、その値が収まる濃度の範囲を特定する。このようにして特定した範囲は、診断した対象の様々な集団の疾患進行の段階または治療の段階と相関があり、それにより試験中の対象の段階が得られる。
【０３２０】
本発明の１つの目的は、対象から採取した試料中の結合ＣＤ９Ｐ−１タンパク質のレベルを閾値レベルと比較して、対象がＣＤ９Ｐ−１関連病態を有するかどうかを判定するのに使用し得る、サンドイッチＥＬＩＳＡ法である。本明細書で使用される「閾値レベル」は、ＣＤ９Ｐ−１発現のレベルであって、疾患について、そのレベルを上回る対象試料を「陽性」であるとし、下回る試料を「陰性」に分類する、レベルを指す。特定のバイオマーカー（例えば、ＣＤ９Ｐ−１）の閾値発現レベルは、健常対象試料（すなわち、健常対象集団）のデータを収集したものに基づくものであり得る。例えば、閾値発現レベルは、健常対象の試料の解析に基づき、平均ＣＤ９Ｐ−１発現レベルに標準偏差の２倍を加えたものとして確立したものであり得る。当業者には、発現の閾値レベルを確立するための様々な統計学的および数学的方法が当該技術分野で公知であることが理解されよう。
【０３２１】
当業者には、補足抗体および顕示抗体（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を上記のように逐次的に、または同時に試料と接触させ得ることがさらに理解されよう。さらに、最初に顕示抗体（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）を試料とインキュベートした後、試料と、固定化した捕捉抗体とを接触させ得る。
【０３２２】
ある特定の実施形態では、捕捉抗体はモノクローナル抗体９ｂＦ４または１０ｂＢ１であり、顕示抗体（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、ＣＤ９Ｐ−１（好ましくはＣＤ９Ｐ−１上の別のエピトープ）と結合する別の抗体、例えば、特に限定されないが、ＳＡＢ２７００３７９またはＨＰＡ０１７０７４（Ｓｉｇｍａ社）を含めた既に記載されている抗体など、より具体的には、そのようなＨＲＰ標識抗体である。本発明の抗体を、特に限定されないがマルチプレックスビーズアッセイを含め、ＣＤ９Ｐ−１を検出する任意のアッセイフォーマットに使用し得る。
【０３２３】
同じバイオマーカー（すなわち、ＣＤ９Ｐ−１）に対して２つの抗体を用いる上記のサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットに関して、ＣＤ９Ｐ−１を標的とする補足抗体および顕示抗体（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、異なる抗原部位を有するべきである。「異なる抗原部位」は、一方の抗体が、他方の抗体とバイオマーカータンパク質との結合にあまり干渉しないように、それらの抗体が、目的とするバイオマーカータンパク質（すなわち、ＣＤ９Ｐ−１）上の異なる部位に特異的なものであることを表す。相補的でない抗体は、上記のサンドイッチＥＬＩＳＡ法に使用するのに適していない。
【０３２４】
本発明のまた別の目的は、少なくとも１つの本発明のタンパク質、好ましくは抗ＣＤ９Ｐ−１モノクローナル抗体を含む、キットである。
【０３２５】
「キット」は、少なくとも１つの試薬、好ましくは、ＣＤ９Ｐ−１の発現を特異的に検出する抗体を含む、任意の製品（例えば、パッケージまたは容器）を表す。
【０３２６】
一実施形態では、本発明のキットは、少なくとも１つの本発明の抗体（例えば、９ｂＦ４または１０ｂＢ１）と、ＣＤ９Ｐ−１（好ましくはＣＤ９Ｐ−１上の別のエピトープ）と結合する別の抗体、例えば、特に限定されないがＳＡＢ２７００３７９またはＨＰＡ０１７０７４（Ｓｉｇｍａ社）を含めた既に記載されている抗体などとを含む。
【０３２７】
キットは、本発明の方法を実施するユニットとして宣伝、配布または販売し得る。さらに、キット試薬のいずれか、または全部を、それを外部環境から保護する容器、例えば密閉容器などに入れて提供し得る。
【０３２８】
キットは、キットおよびその使用方法を記載した添付文書も含み得る。
【０３２９】
本発明のサンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施するキットは一般に、任意選択で固体支持体（例えば、マイクロタイタープレート）上に固定化されている、捕捉抗体と、検出可能な物質、例えば、ＨＲＰ、蛍光標識、放射性同位元素、ベータガラクトシダーゼおよびアルカリホスファターゼなどと結合した顕示抗体（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）とを含む。
【０３３０】
別の実施形態では、検出可能な物質は、固体支持体（例えば、マイクロタイタープレート）上に固定化されている。
【０３３１】
ある特定の実施形態では、捕捉抗体および顕示抗体（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は抗ＣＤ９Ｐ−１モノクローナル抗体であり、具体的には、補足抗ＣＤ９Ｐ−１モノクローナル抗体は９ｂＦ４または１０ｂＢ１  ｍＡｂを表し、顕示抗体（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）は、ＣＤ９Ｐ−１（好ましくはＣＤ９Ｐ−１上の別のエピトープ）と結合する別の抗体、例えば、特に限定されないがＳＡＢ２７００３７９またはＨＰＡ０１７０７４（Ｓｉｇｍａ社）を含めた既に記載されている抗体などを表す。サンドイッチＥＬＩＳＡ法を実施する１つの本発明のキットは、捕捉抗体が、任意選択でマイクロタイタープレート上に固定化されている、抗ＣＤ９Ｐ−１モノクローナル抗体９ｂＦ４または１０ｂＢ１であり、顕示抗体（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）がＨＲＰ標識抗体またはビオチン標識抗体である。キットには任意選択で、固体支持体に結合した顕示抗体（ｒｅｖｅｌａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）のレベル（試料中のＣＤ９Ｐ−１のレベルと直接相関する）を検出および定量化する化学薬品が含まれていてよい。精製ＣＤ９Ｐ−１を抗原標準品として提供してもよい。
【０３３２】
別の実施形態では、本発明のタンパク質をｉｎ  ｖｉｖｏで使用して、ＣＤ９Ｐ−１を発現する組織および器官または細胞を特定し得る。
【０３３３】
一実施形態では、この方法は、そのような診断検査を必要とする患者に検出可能に標識したタンパク質または検出可能に標識したタンパク質を含む医薬組成物を投与する段階と、患者にイメージング解析を実施して、タンパク質またはフラグメントが結合したＣＤ９Ｐ−１発現組織の位置を明らかにする段階とを含む。イメージング解析は、医学分野で周知であり、特に限定されないが、Ｘ線解析、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）またはコンピュータ断層撮影法（ＣＴ）がこれに含まれる。
【０３３４】
この方法の別の実施形態では、患者にイメージング解析を実施するのではなく、患者から生検試料を採取して、目的とする組織がＣＤ９Ｐ−１を発現するかどうかを明らかにする。
【０３３５】
上記の通り、本発明の一実施形態では、患者体内で撮像することができる検出可能な薬剤で本発明のタンパク質を標識する。例えば、Ｘ線解析に使用し得るバリウムなどの造影剤またはＭＲＩもしくはＣＴに使用し得るガドリニウムキレートなどの磁性造影剤でタンパク質を標識し得る。その他の標識剤としては、特に限定されないが、（９９）Ｔｃなどの放射性同位元素；または本明細書で考察される他の標識が挙げられる。これらの方法を用いて、例えば、ＣＤ９Ｐ−１媒介性障害を診断し得る、またはこのような障害の治療過程を追跡し得る。
【０３３６】
本発明のまた別の目的は、必要とする対象のＣＤ９Ｐ−１活性またはＣＤ９Ｐ−１経路を阻害する方法であって、対象に有効量の本発明のタンパク質を投与することを含む、方法である。一実施形態では、前記方法は、ＣＤ９Ｐ−１／スタビリン１経路を阻害するためのものである。別の実施形態では、前記方法は、ＣＤ９Ｐ−１／ＴＲＡＦ−２経路を阻害するためのものである。一実施形態では、本発明のタンパク質は、上記のＣＤ９Ｐ−１に対する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）である。
【０３３７】
一実施形態では、本発明のＣＤ９Ｐ−１抗体は、ＣＤ９Ｐ−１とスタビリン１および／またはＴＲＡＦ−２との間の相互作用を調節する、例えば、これを遮断する、これを阻害する、これを低下させる、これに拮抗する、これを打ち消す、または別の方法でこれに干渉する。
【０３３８】
一実施形態では、本発明のＣＤ９Ｐ−１抗体は、ＣＤ９Ｐ−１の発現、活性および／またはシグナル伝達を調節する、例えば、これを遮断する、これを阻害する、これを低下させる、これに拮抗する、これを打ち消す、または別の方法でこれに干渉すること、あるいはＣＤ９Ｐ−１と相互作用するタンパク質（好ましくはＣＤ９Ｐ−１と結合するタンパク質）、例えばスタビリン１およびＴＲＡＦ−２などを調節することが可能である。
【０３３９】
本発明のまた別の目的は、必要とする対象にＣＤ９Ｐ−１、スタビリン１および／またはＴＲＡＦ−２の内部移行および／または分解を誘導する方法であって、対象に有効量の本発明のタンパク質を投与することを含む、方法である。
【０３４０】
一実施形態では、本発明のＣＤ９Ｐ−１抗体は、細胞表面のＣＤ９Ｐ−１と結合し、ＣＤ９Ｐ−１／スタビリン１複合体および／またはＣＤ９Ｐ−１／ＴＲＡＦ−２複合体の内部移行および／または分解を引き起こす。
【０３４１】
本発明のまた別の目的は、必要とする対象（好ましくは、対象は癌を有する）に免疫応答および／または炎症性応答を誘導する方法であって、対象に有効量の本発明のタンパク質を投与することを含む、方法である。一実施形態では、本発明のタンパク質は、上記のＣＤ９Ｐ−１に対する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）である。一実施形態では、この方法は、自然免疫系を活性化するためのものである。別の実施形態では、この方法は、適応免疫系を活性化するためのものである。別の実施形態では、この方法は、自然免疫系および適応免疫系をともに活性化するためのものである。
【０３４２】
一実施形態では、本発明の方法は、免疫抑制性Ｍ２型マクロファージの分極化を阻害するためのものであり、かつ／または炎症誘発性Ｍ１型マクロファージを誘導する。
【０３４３】
「Ｍ１型マクロファージ」は、急性炎症表現型を有する免疫エフェクター細胞を指す。同マクロファージは、癌細胞に対する攻撃性が高く、大量のサイトカインを産生する。「Ｍ２型マクロファージ」は、免疫の調節、免疫寛容の維持および組織修復を含めた様々な異なる機能を有する抗炎症性マクロファージを指す。一般的に認められているＭ１マクロファージのマーカープロファイルとしては、特に限定されないが、ＴＮＦαおよびＣＤ８０が挙げられるのに対し、Ｍ２マクロファージは、具体的にはＣＤ１６３を発現するのが特徴である。
【０３４４】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、Ｍ１型マクロファージの炎症誘発機能を刺激し、かつおよび／またはＭ２型マクロファージのプロファイルを阻害する。
【０３４５】
一実施形態では、本発明の方法は、ヒト単球およびＭ２マクロファージにＴＮＦアルファ産生を誘導するためのものである。
【０３４６】
一実施形態では、本発明の方法は、Ｍ１マクロファージにＭ２マクロファージ再分極化を誘導する方法である。
【０３４７】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、リンパ球の増殖を刺激し、かつ／あるいは、例えば、グランザイムＢおよびＩＦＮガンマの産生および放出ならびに抗原提示細胞（ＡＰＣ）上のＢ７．１（ＣＤ８０）のような共刺激タンパク質の誘導を含めた、Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ１）、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）ならびに／あるいはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の応答を刺激する。
【０３４８】
一実施形態では、本発明のタンパク質（好ましくは本発明のＣＤ９Ｐ−１抗体）は、特に限定されないが、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）、マクロファージおよび活性化ミクログリアを含めた免疫細胞によるグランザイムＢの産生を誘導し、かつ／またはグランザイムＢを介する癌細胞死を刺激する。
【０３４９】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、ＡＰＣによるＣＤ８０の産生を増大させ、それによりＴ細胞の活性化を誘導する。
【０３５０】
一実施形態では、本発明のタンパク質（好ましくは本発明の抗体）は、腫瘍部位で免疫細胞の生体内分布に影響を及ぼす化学誘引分子の産生を誘発する。一実施形態では、化学誘引分子には、特に限定されないが、古典的な化学誘引物質およびケモカインが含まれる。
【０３５１】
古典的な化学誘引物質には、特に限定されないが、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＭＣＰ１（単球化学誘引タンパク質１）、ＲＡＮＴＥＳ（活性化で制御され、正常Ｔ細胞が発現し分泌する）、ＣＸＣＬ１２／ＳＤＦ（間質細胞由来因子１）、ＭＩＦ（マクロファージ遊走阻止因子）などが含まれる。
【０３５２】
一実施形態では、ケモカインは特定のサイトカイン、すなわち、免疫細胞によって放出され、炎症部位に免疫細胞を誘引する（すなわち、走化性を誘導する）ことによって機能する、シグナル伝達分子である。ケモカインは、７０〜１００ａａの分泌タンパク質（８〜１４ｋＤａ）であり、その一次配列には２０〜７０％の類似性がみられ、その配列内には保存されたシステイン残基が４つ含まれている。ケモカインは、ＣＣ、ＣＸＣ、ＸＣおよびＣＸと呼ばれる４つの異なるファミリーを形成し、Ｃはシステイン残基を表し、Ｘは、Ｃ残基の間に介在する任意のアミノ酸を表す。一実施形態では、ＣＣファミリーのケモカインには、特に限定されないがＣＣＬ１〜ＣＣＬ２８が含まれる。一実施形態では、ＣＸＣファミリーのケモカインには、特に限定されないがＣＸＣＬ１〜ＣＸＣＬ１７が含まれる。ＣＸＣＬ−８はインターロイキン８（ＩＬ−８）とも呼ばれる。一実施形態では、ＸＣファミリーのケモカインには、特に限定されないがＸＣＬ１〜ＸＣＬ３が含まれる。一実施形態では、ＣＸファミリーのケモカインには、特に限定されないがＣＸ３ＣＬ１が含まれる。
【０３５３】
一実施形態では、本発明の方法は、ヒトリンパ球にＴＮＦアルファおよびＩＦＮガンマの産生を誘導するためのものである。
【０３５４】
本発明のまた別の目的は、必要とする対象に癌細胞（例えば、ＣＤ９Ｐ−１発現癌細胞など）のアポトーシスを誘導する方法であって、対象に有効量の本発明のタンパク質を投与することを含む、方法である。一実施形態では、癌細胞のアポトーシスは、本発明のタンパク質によって誘導されるＴＲＡＦ−２の内部移行および分解によるものである。
【０３５５】
本発明のまた別の目的は、必要とする対象の癌細胞（例えば、ＣＤ９Ｐ−１発現癌細胞など）の増殖を阻害する方法であって、対象に有効量の本発明のタンパク質を投与することを含む、方法である。
【０３５６】
本発明のまた別の目的は、必要とする対象の（例えば、ＣＤ９Ｐ−１発現癌細胞などの）腫瘍成長を阻害する方法であって、対象に有効量の本発明のタンパク質を投与することを含む、方法である。
【０３５７】
本発明のまた別の目的は、必要とする対象のＣＤ９Ｐ−１および／またはスタビリン１および／またはＴＲＡＦ−２関連病態を治療する方法であって、対象に有効量の本発明のタンパク質を投与することを含む、方法である。一実施形態では、前記ＣＤ９Ｐ−１および／またはスタビリン１および／またはＴＲＡＦ−２関連病態は、癌および／または腫瘍である。
【０３５８】
本発明のまた別の目的は、必要とする対象の癌を治療する方法であって、対象に有効量の本発明のタンパク質を投与することを含む、方法である。
【０３５９】
一実施形態では、本発明のタンパク質（好ましくは本発明のＣＤ９Ｐ−１抗体）は、免疫系に影響を及ぼす（すなわち、炎症性応答および／または免疫応答を誘導する）間接的経路および／またはＣＤ９Ｐ−１発現癌細胞のアポトーシスに影響を及ぼし、ＴＲＡＦ−２の内部移行および分解経路によって生じる経路を介して、癌を治療することを可能にする。
【０３６０】
一実施形態では、本発明のタンパク質は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し、それにより癌の治療を可能にする。したがって、一実施形態では、本発明のタンパク質（好ましくは本発明のＣＤ９Ｐ−１抗体）は、ＣＤ９Ｐ−１発現癌細胞に影響を及ぼすＡＤＣＣを介して、癌を治療することを可能にする。
【図面の簡単な説明】
【０３６１】
【図１】図１は、ＱＰＣＲによって定量化したＪｕｒｋａｔ細胞およびＫ５６２細胞溶解物でのＣＤ９Ｐ−１  ｍＲＮＡ発現を示すヒストグラムである。Ｊｕｒｋａｔ細胞は不死化したＴ細胞急性リンパ芽球性白血病細胞系（Ｔ−ＡＬＬ）であり、Ｋ５６２細胞は不死化した骨髄性白血病系細胞（ＣＭＬ）である。Ｋ５６２細胞はＣＤ９Ｐ−１を発現するが、Ｊｕｒｋａｔ細胞はＣＤ９Ｐ−１を発現しない。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨをＱＰＣＲの内部対照として用いた。
【図２】図２は、Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＫ５６２細胞溶解物のＣＤ９Ｐ−１タンパク質発現を示す、抗ＣＤ９Ｐ−１モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの写真である。Ｋ５６２細胞はＣＤ９Ｐ−１を発現するが、Ｊｕｒｋａｔ細胞はＣＤ９Ｐ−１を発現しない。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨをウエスタンブロッティングの内部対照として用いた。
【図３】図３は、Ｋ５６２細胞系およびＪｕｒｋａｔ細胞系に関するフローサイトメトリーによるハイブリドーマ上清のスクリーニングを示すヒストグラムである。簡潔に述べれば、ハイブリドーマの上清およびＰＥコンジュゲートヤギ抗マウス抗体で表面ＣＤ９Ｐ−１タンパク質を検出した。Ｋ５６２細胞の細胞表面は９ｂＦ４および１０ｂＢ１ハイブリドーマ上清で染色されたが、Ｊｕｒｋａｔ細胞は染色されなかった。
【図４】図４は、フローサイトメトリーによって測定したＫ５６２細胞系およびＪｕｒｋａｔ細胞系でのＣＤ９Ｐ−１表面発現の定量化を示すヒストグラムである。簡潔に述べれば、モノクローナル抗体（アイソタイプまたは抗ＣＤ９Ｐ−１抗体）およびＰＥコンジュゲートヤギ抗マウス抗体で表面ＣＤ９Ｐ−１タンパク質を検出した。Ｋ５６２細胞の細胞表面は９ｂＦ４および１０ｂＢ１精製抗体で染色されたが、Ｊｕｒｋａｔ細胞は染色されなかった。
【図５】図５は、ＱＰＣＲによって定量化したＣＤ９Ｐ−１トランスフェクトＣＴ２６細胞の溶解物でのＣＤ９Ｐ−１  ｍＲＮＡ発現を示すヒストグラムである。ＣＴ２６細胞は不死化した結腸癌系細胞である。ＣＤ９Ｐ−１トランスフェクトＣＴ２６細胞はＣＤ９Ｐ−１を発現するが、ＧＦＰトランスフェクトＣＴ２６細胞はＣＤ９Ｐ−１を発現しない。ＧＦＰトランスフェクトＣＴ２６細胞および非トランスフェクトＣＴ２６細胞をトランスフェクションの対照として用いた。ハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨをＱＰＣＲの内部対照として用いた。
【図６−１】図６は、一連のウエスタンブロットの写真である。（Ａ）ＣＤ９Ｐ−１トランスフェクトＣＴ２６細胞の溶解物でのＣＤ９Ｐ−１タンパク質発現を示す、抗ＣＤ９Ｐ−１モノクローナル抗体を用いたウエスタンブロットの写真である。ＣＤ９Ｐ−１トランスフェクトＣＴ２６細胞はＣＤ９Ｐ−１を発現するが、非トランスフェクトＣＴ２６細胞はＣＤ９Ｐ−１を発現しない。（Ｂ）ＣＤ９Ｐ−１トランスフェクト（または非トランスフェクト）本発明の９ｂＦ４  ｍＡｂで免疫沈降させた（ＩＰ）ＣＴ２６細胞の溶解物でのＣＤ９Ｐ−１タンパク質発現を示すウエスタンブロットの写真である。ＩｇＧアイソタイプ抗体をＩＰ陰性対照として用いた。ＣＤ９Ｐ１過剰発現ＣＴ２６細胞から９ｂＦ４により免疫沈降した１３５ｋＤａ型ＣＤ９Ｐ−１が、ＣＤ９Ｐ−１標的化ｍＡｂを用いた免疫ブロットにより検出された。
【図６−２】同上。
【図７−１】図７は、一連のヒストグラムおよびウエスタンブロットの写真である。（Ａ）１）９ｂＦ４および１０ｂＢ１ハイブリドーマ上清ならびに２）９ｂＦ４および１０ｂＢ１精製ｍＡｂでそれぞれ免疫沈降させたＫ５６２細胞およびＮＣＩ−Ｈ４６０細胞の溶解物でのＣＤ９Ｐ−１タンパク質発現を示すウエスタンブロットの写真である。ＩｇＧアイソタイプ抗体をＩＰ陰性対照として用いた。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＣＤ９Ｐ−１標的化ｍＡｂを用いてイムノブロットを実施した。２つのＣＤ９Ｐ１発現ヒト癌細胞系で、９ｂＦ４  ｍＡｂおよび１０ｂＢ１  ｍＡｂにより１３５ｋＤａ型のＣＤ９Ｐ−１が免疫沈降した。非産生ハイブリドーマの上清をウエスタンブロット対照として用いた；（Ｂ）フローサイトメトリーによるＣＤ９Ｐ−１標的化ｍＡｂのＫ５６２白血病細胞への内部移行の解析を示すヒストグラムである。簡潔に述べれば、Ｋ５６２細胞を様々なＣＤ９Ｐ−１標的化抗体（９ｂＦ４、１０ｂＢ１および１３ａＡ６）で４℃にて処理し、洗浄し、次いで、３７℃でインキュベートして内部移行させた。様々な時間（０分、１５分、３０分ならびに１時間、２時間および１８時間）の後、細胞を収集し、４℃にてＰＥ標識二次抗体で染色し、対応する細胞表面シグナルをサイトメーターで解析した。その結果から、Ｋ５６２細胞は、２時間以内では細胞表面結合抗体を５１％（９ｂＦ４）および５２％（１０ｂＢ１）、１８時間後ではそれぞれ６６％および６９％取り込んだが、１３ａＡ６  ｍＡｂは１８時間後でわずか１３％であったことがわかる；（Ｃ）９ｂＦ４  ｍＡｂによって、５時間、２４時間、４８時間および７２時間のインキュベーション後にＫ５６２細胞でのＣＤ９Ｐ−１発現が大幅に低下したことを示す、ウエスタンブロットの写真である；（Ｄ）９ｂＦ４によって、ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞の膜画分および細胞質画分でのＣＤ９Ｐ１発現が大幅に低下したことを示し、したがって、９ｂＦ４がこの細胞に迅速なＣＤ９Ｐ１の内部移行および分解を誘導することを示す、ウエスタンブロットの写真である；（Ｅ）９ｂＦ４  ｍＡｂおよび１０ｂＢ１  ｍＡｂによって、２時間のインキュベーション後にＫ５６２細胞でのＣＤ９Ｐ−１発現が大幅に低下したことを示す、ウエスタンブロットの写真である（Ｃ：対照）。
【図７−２】同上。
【図７−３】同上。
【図８】図８は、ヒト単球（Ａ）およびＭ２分極化マクロファージ（Ｂ）が、ヒトＣＤ９Ｐ−１に対する抗体に応答してＴＮＦアルファの分泌を増大させたことを示す、ヒストグラムである。このヒストグラムには、上清中のＴＮＦアルファ濃度（ｐｇ／ｍｌ）が被験抗体の関数として示されている。ＴＮＦアルファ濃度はサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測定した。ＣＤ９Ｐ−１標的化抗体（マウスＩｇＧ  ９ｂＦ４、１ｍＬ当たり１０〜２０μｇ）およびＩｇＧアイソタイプ対照で得られた結果が比較されている。Ｍ２マクロファージからＭ１マクロファージへの分極化切換えのトリガーとしてＬＰＳを用いた。
【図９】図９は、ヒトリンパ球が、ヒトＣＤ９Ｐ−１に対する抗体に応答してＴＮＦアルファ（Ａ）およびＩＦＮガンマ（Ｂ）の分泌を増大させたことを示す、ヒストグラムである。このヒストグラムには、上清中のＴＮＦアルファおよびＩＦＮガンマの濃度（ｐｇ／ｍｌ）が被験抗体の関数として示されている。ＴＮＦアルファおよびＩＦＮガンマの濃度はサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測定した。ＣＤ９Ｐ−１標的化１抗体（マウスＩｇＧ  ９ｂＦ４、１ｍＬ当たり５〜２０μｇ）およびＩｇＧアイソタイプ対照で得られた結果が比較されている。
【図１０】図１０は、ＭＴＴ試験によって定量化したヒトリンパ球増殖の増大の割合をインキュベーションで使用したヒトＣＤ９Ｐ−１に対する抗体の濃度の関数として示すヒストグラムである。ＣＤ９Ｐ−１標的化抗体（Ａｃ９ｂＦ４、１ｍＬ当たり０〜４０μｇ）およびＩｇＧアイソタイプ対照で得られた結果が比較されている。
【図１１】図１１は、Ｍ１分化またはＭ２分化ＰＢＭＣの溶解物に関するＭ１／Ｍ２マクロファージ（ＣＤ８０／ＣＤ１６３）およびＭ２分極化マクロファージ（スタビリン１）の分子マーカーの発現を示すウエスタンブロットの写真である。Ｍ２分化ＰＢＭＣをＣＤ９Ｐ−１標的化抗体（マウスＩｇＧ  ９ｂＦ４、１ｍＬ当たり２０μｇ）またはそのＩｇＧアイソタイプ対照と４８時間プレインキュベートした。ＣＤ９Ｐ−１抗体は、スタビリン１経路を介してＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへの再分極化を誘導する。ＧＡＰＤＨをウエスタンブロットの負荷対照として用い、ＬＰＳをＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへの極性変化のトリガーとして用いた。
【図１２】図１２は、ヒトＰＢＭＣが、ヒトＣＤ９Ｐ−１に対する抗体に応答してＴＮＦアルファ（Ａ）およびＩＦＮガンマ（Ｂ）の分泌を増大させたことを示す、ヒストグラムである。ＰＢＭＣをヒト癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０）と４８時間共培養した。ヒストグラムには、上清中のＴＮＦアルファおよびＩＦＮガンマの濃度（ｐｇ／ｍｌ）が被験抗体の関数として示されている。ＴＮＦアルファおよびＩＦＮガンマの濃度はサンドイッチＥＬＩＳＡ法によって測定した。ＣＤ９Ｐ−１標的化抗体（マウスＩｇＧ  ９ｂＦ４、１ｍＬ当たり１０〜２０μｇ）およびＩｇＧアイソタイプ対照で得られた結果が比較されている。Ｍ２マクロファージからＭ１マクロファージへの分極化切換えのトリガーとしてＬＰＳを用いた。
【図１３】図１３は、単球およびＰＢＭＣの溶解物での切断型カスパーゼ３（１７〜１９ｋＤａ）およびグランザイムＢの発現を示すウエスタンブロットの写真である。単球およびＰＢＭＣをヒト癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０）と４８時間共培養し、ＣＤ９Ｐ−１標的化抗体（マウスＩｇＧ  ９ｂＦ４、１ｍＬ当たり１０〜２０μｇ）またはそのＩｇＧアイソタイプ対照とプレインキュベートした。免疫細胞によって放出される主要なアポトーシス誘発因子であるグランザイムＢの発現増大によって示されるように、ＣＤ９Ｐ−１抗体は、ほぼ確実に単球およびリンパ球の活性化を介して、ＣＤ９Ｐ−１発現癌細胞のアポトーシスを誘導する。試料をＧＡＰＤＨに対して正規化した。
【図１４】図１４は、一連の写真である。（Ａ）ヒトＭ０またはＭ１／Ｍ２マクロファージの細胞溶解物でのスタビリン１およびＣＤ９Ｐ−１の発現を示すウエスタンブロットの写真である。Ｍ２マクロファージにはＭ０／Ｍ１マクロファージと比較してＣＤ９Ｐ−１およびスタビリン１が過剰発現する。ＧＡＰＤＨをウエスタンブロットの負荷対照として用い、ＣＤ１６３をＭ２分極化マーカーとして用いた。（Ｂ）シスプラチンおよびペルメトレキセド（ｐｅｒｍｅｔｒｅｘｅｄ）（Ａｌｉｍｔａ（商標））による化学療法後のヒト肺腺癌（ｙｐＴ１ａＮ２）におけるＣＤ９Ｐ−１とスタビリン１の同時発現を示す写真である。ＣＤ９Ｐ−１およびスタビリン１の発現レベルおよび局在が、Ｍ２マクロファージマーカー（ＣＤ１６３）を用いた免疫組織化学染色によって明示され、Ｌａｍｉｎａスキャナ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）ＳＣＡＮ（２０倍ズーム）でスキャンされている。
【図１５】図１５は、単球およびＭ１分化またはＭ２分化ＰＢＭＣの溶解物でのＴＮＦ受容体関連因子２（ＴＲＡＦ−２）の発現を示すウエスタンブロットの写真である。Ｍ２分化ＰＢＭＣを抗ＣＤ９Ｐ−１抗体（マウスＩｇＧ  ９ｂＦ４、１ｍＬ当たり２０μｇ）またはそのＩｇＧアイソタイプ対照と４８時間インキュベートした。９ｂＦ４  ｍＡｂによりＭ２分極化マクロファージでのＴＲＡＦ−２発現が低下した。ＧＡＰＤＨをウエスタンブロットの負荷対照として用い、ＬＰＳをＭ１分極化の誘発因子として用いた。
【図１６】図１６は、ヒト癌細胞、すなわち、（Ａ）Ｋ５６２細胞および（Ｂ）ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を異種移植したヌードマウスの腫瘍成長に対するマウス抗ｈＣＤ９Ｐ１抗体（９ｂＦ４  ｍＡｂ）のｉｎ  ｖｉｖｏの効果を示すグラフの組合せである。
【実施例】
【０３６２】
以下の実施例により本発明をさらに説明する。
【０３６３】
材料および方法
ＣＤ９Ｐ−１を認識するモノクローナル抗体の作製および特徴付け
ＣＤ９Ｐ−１に対するｍＡｂを作製するため、ＣＨＯ発現系（Ｅｖｉｔｒｉａ社、チューリッヒ、スイス）で作製したＣＤ９Ｐ−１細胞外ドメイン（アミノ酸２２〜８３２、アクセッション番号ＮＰ＿０６５１７３．２）に対応する精製組換えタンパク質でマウス（Ｂａｌｂｃ、Ｈａｒｌａｎ社、ガナ、フランス）を４回感作した。ＣｌｏｎａＣｅｌｌ（商標）−ＨＹキット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、グルノーブル、フランス）を用いて、半固形クローニング方法によりモノクローナルハイブリドーマを単離した。抗ＣＤ９Ｐ−１  ｍＡｂを産生するハイブリドーマを、１）Ｓｔｒｅｐ−ＣＤ９Ｐ１−ＥＣＤ（ＥＣＤは細胞外ドメインを表す）をプラスチック製ウェルにコートし、抗原として用いた上清の直接ＥＬＩＳＡにより；ならびに２）上清のＣＤ９Ｐ−１発現細胞（Ｋ５６２）に対する反応性およびＣＤ９Ｐ−１非発現細胞（Ｊｕｒｋａｔ）に対する無反応性に基づく流動サイトメトリーにより選択した（図１〜３）。ヒト慢性骨髄性白血病細胞系であるＫ５６２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−２４３（商標））を１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ中、３７℃、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下で維持した。Ｈｉｔｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社、ヴェリジー＝ヴィラクブレー、フランス）との親和性によりハイブリドーマ上清から精製した後、サイトメトリーにより、抗ＣＤ９Ｐ−１  ｍＡｂが生細胞表面のＣＤ９Ｐ−１と結合することが可能であることを確認し（図４）、Ｃｈａｒｒｉｎら（２００１）によって既に報告されている１３５ｋＤａ型のＣＤ９Ｐ−１を免疫沈降させた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００を製造業者の指示（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、サントーバン、フランス）通りに用いて、ＣＤ９Ｐ−１をわずかに発現する細胞系ＣＴ２６（マウス結腸癌、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−２６３８（商標））にヒトｃＤＮＡ配列由来ｐｃＤＮＡ３．１−ＣＤ９Ｐ−１、アクセッション番号ＮＭ＿０２０４４０．３（Ｇｅｎｅｃｕｓｔ社、デュードランジュ、ルクセンブルク）をトランスフェクトした。ＣＤ９Ｐ−１を安定に過剰発現する細胞系を、５００μｇ／ｍｌのＧ４１８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、サン＝カンタン＝ファラヴィエ、フランス）を含む半固形培地で樹立した。ＱＰＣＲおよびウエスタンブロットによる特徴付けの後、選択した陽性クローン細胞をＧ４１８選択培地で約３週間培養した。次いで、２５０μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培地でＣＴ２６−ＣＤ９Ｐ−１細胞を維持した。１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン、１０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭナトリウムおよびＧ４１８を添加したＲＰＭＩで細胞系を培養した。細胞を３７℃の加湿恒温器中、５％ＣＯ２の存在下で維持した。免疫沈降実験で９ｂＦ４  ｍＡｂの特異性を制御した。ＣＴ２６−ＣＤ９Ｐ−１細胞およびＣＴ２６−ＷＴ細胞を冷ＰＢＳで２回洗浄し、組織培養フラスコ中、１ｍＭフェニル−メチルスルホニルフルオリド、１μｇ／ｍｌロイペプチン、１μｇ／ｍｌペプスタチンＡおよび１μｇ／ｍｌアプロチニンを含有する１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００  ＣＳＴ細胞溶解緩衝液（Ｏｚｙｍｅ社、モンティニー＝ル＝ブルトンヌー、フランス）で直接溶解させた（７５ｃｍ２のフラスコに対して２ｍｌ）。４℃で３０分間インキュベートした後、不溶性物質を１４，０００ｇ、１０分間、４℃の遠心分離によって除去し、ブラッドフォードアッセイによりタンパク質濃度を求めた。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋ  Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを製造業者の指示（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、コートアボフ、フランスコートアボフ、フランス）通りに用いて、アガロース対照ビーズを２０μｌ添加することにより細胞溶解物を事前に１時間清澄化し、アガロースビーズ（１０μｌ）と結合した９ｂＦ４  ｍＡｂ  ６μｇで免疫沈降させた。次いで、Ｇｕｉｌｍａｉｎら（２０１１）によって報告されている抗ＣＤ９Ｐ−１  ｍＡｂ（２２９ｔ  ｍＡｂ）を用いて、ウエスタンブロットにより１３５ｋＤａ型のＣＤ９Ｐ−１を検出した（図５〜６Ａ）。免疫沈降による９ｂＦ４および１０ｂＢ１の特異性をＣＤ９Ｐ−１発現ヒト癌細胞Ｋ５６２およびＮＣＩ−Ｈ４６０でも試験した。９ｂＦ４および１０ｂＢ１ハイブリドーマの上清を用いて、Ｋ５６２細胞溶解物からＣＤ９Ｐ−１を免疫沈降させた。上清５００μｌをタンパク質１ｍｇおよびアガロースビーズ１０μｌとインキュベートした。９ｂＦ４および１０ｂＢ１精製ｍＡｂを用いて、ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞溶解物からＣＤ９Ｐ−１を免疫沈降させた（図６Ｂ〜７）。
【０３６４】
ヒトＰＢＭＣの単離および単球／リンパ球の分離
健常成人志願者からヒト末梢血を採取した（ＥＦＳ、フランス）。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ（１１１４５４５、Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、グルノーブル、フランス）を用いて、ヘパリン処置した血液から末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を密度勾配遠心分離により単離した。細胞を一部の実験またはのちの単球およびリンパ球の単離に直接用いた。接着法により、リンパ球（ＮＫ細胞が含まれている可能性がある）と単球（樹状細胞が含まれている可能性がある）を分離した。５％ＣＯ２の加湿恒温器中、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび１０％熱不活性化ウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ−１６４０を入れたプラスチック製プレートでＰＢＭＣを３７℃にて１８時間培養した。インキュベーション後、接着単球と剥離したリンパ球を分離した。単球およびリンパ球を同じ培地で維持し、異なる実験に別個に使用した。一部の実験では、ＭＡＣＳシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社、パリ、フランス）を製造業者のプロトコル通りに用い、単球をＣＤ１４＋細胞のポジティブ選択によりＰＢＭＣから単離して結果を確認した。
【０３６５】
マクロファージ再分極化
６ウェルプレートの１０×１０６個のＰＢＭＣから接着により単球を単離した後、非接着細胞を除去し、２回洗浄した後、培地を交換した。Ｍ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を６日間添加し（Ｍ０マクロファージ）、次いで、２０ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＧＦベータと２４時間インキュベートすることによって、Ｍ２マクロファージ表現型を得た。ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を６日間添加し（Ｍ０マクロファージ）、次いで、ＧＭ−ＣＳＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＦＮガンマ（２０ｎｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（５０ｎｇ／ｍｌ）とインキュベートすることによって、Ｍ１マクロファージ表現型を得た。
【０３６６】
ＭＴＴ試験
ＭＴＴ試験には、新鮮なリンパ球を９６ウェルプレートに１×１０５細胞の密度で播いた。２％の不活性化ウシ胎児血清を含有し、様々な濃度の抗体（抗ＣＤ９Ｐ−１クローン９ｂＦ４およびそのアイソタイプ対照）を添加したＲＰＭＩ培地で細胞を３７℃、５％ＣＯ２で４８時間培養した後、ＭＴＴ染色および測定を製造業者の指示通り実施した。４９０ｎｍでのＯＤ値を記録し、細胞増殖の算出に用いた。
【０３６７】
癌細胞とＰＢＭＣの共培養
１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地の入った６ウェルプレートに、ヒト非小細胞肺癌ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＨＴＢ−１７７（商標））を２．５×１０５細胞の密度で一晩、３７℃で予め播種。単離ＰＢＭＣ（エフェクター細胞、Ｅ）を癌細胞（標的細胞、Ｔ）上にＥ：Ｔ＝２０：１の比で加え、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間培養した。次いで、２％のウシ胎児血清を含有するＲＰＭＩ培地を用い、共培養物をあらゆる処理条件で４８時間インキュベートした。一部の実験では、剥離細胞（リンパ球）を除去して、癌細胞を接着単球のみと共培養した。
【０３６８】
酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
リンパ球を６ウェルプレートに５×１０６細胞の密度で播いた。最初に６ウェルプレートに１０×１０６細胞の密度で播いたＰＢＭＣから単球およびＭ２マクロファージアッセイを実施した。いずれの細胞型も、２％の不活性化ウシ胎児血清を含有し、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体クローン９ｂＦ４およびアイソタイプ対照を含む培地で４８時間インキュベートした。インキュベーション後、上清を収集し、−２０℃で保管した。ＥＬＩＳＡキットを製造業者の指示（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ社、ヌイイ＝シュル＝セーヌ、フランス）通りに用いてサイトカイン（ＴＮＦアルファ、ＩＦＮガンマ）を定量化した。
【０３６９】
ウエスタンブロッティング
４８時間のインキュベーション後、細胞を６ウェルプレートの溶解緩衝液で直接溶解させた。タンパク質を抽出し、ブラッドフォードアッセイにより定量化した。同じ量のタンパク質を含有する細胞溶解物を溶解緩衝液でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。タンパク質をＰＶＤＦ膜（Ｂｉｏｒａｄ  ｓｙｓｔｅｍ社、マルヌ＝ラ＝コケット、フランス）に移し、一次抗体、Ｇｕｉｌｍａｉｎら（２０１１）により記載されている抗ＣＤ９Ｐ−１（２２９ｔ）、抗ＣＤ１６３、抗ＣＤ８０（Ａｂｃａｍ社、パリ、フランス）、抗スタビリン１（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、サン＝カンタン＝アン＝イヴリーヌ、フランス）、抗切断型カスパーゼ３、抗ＴＲＡＦ−２、抗グランザイムＢおよびＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社の抗ＧＡＰＤＨ（正規化に使用）（Ｏｚｙｍｅ、モンティニー＝ル＝ブルトンヌー、フランス）でブロットした。西洋ワサビペルオキシダーゼと結合した特異的ウマ抗マウスまたはヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体を二次抗体として用いた。化学発光試薬（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、セルジー＝ポントワーズ、フランス）で免疫検出を実施した。
【０３７０】
腫瘍切片の免疫組織化学
ヒト腫瘍切片の免疫染色を以下の通りに実施した。Ｌｅｉｃａ  ＢＯＮＤ−ＭＡＸシステムを製造業者の指示通りに用いて、脱パラフィン、再水和，エピトープ回復（ＣＤ９Ｐ−１、Ｓｔａｂｌｉｌｉｎ−１：ｐＨ６、ＣＤ１６３：ｐＨ９）および免疫組織化学染色を完全自動化した。Ｂｏｎｄ（商標）Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎキット（Ｌｅｉｃａ社，パリ、フランス）を用いてスライドを発色させ、Ｌａｍｉｎａスキャナ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社、ヴィルボン＝シュル＝イヴェット、フランス）でスキャンした。４μｍの切片を抗ＣＤ９Ｐ−１（クローン２２９ｔ）抗体、抗ＣＤ１６３抗体および抗スタビリン１抗体で免疫標識した。
【０３７１】
ＣＤ９Ｐ−１サンドイッチＥＬＩＳＡ法
サンドイッチＥＬＩＳＡを発色させて細胞溶解物および腫瘍組織でのＣＤ９Ｐ−１発現を定量化した。モノクローナルマウス抗ＣＤ９Ｐ−１  ｍＡｂ（クローン９ｂＦ４）を捕捉抗体として使用し、ＥＺ結合ＮＨＳ−ＬＣビオチン化キット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、セルジー＝ポントワーズ、フランス）を用いてビオチンとコンジュゲートしたモノクローナルマウス抗ＣＤ９Ｐ−１  ｍＡｂ（クローン２２９ｔ）を検出抗体として使用した。９６ウェルＰＶＣマイクロタイタープレートをＰＢＳ中１０μｇ／ｍｌの捕捉抗体（２００μｌ）でコートし、接着性プラスチックでカバーし、４℃で一晩インキュベートした。ＰＢＳ（希釈試薬）中０．０５％のｔｗｅｅｎ  ２０で２回洗浄した後、コートしたウェルに残っているタンパク質結合部位をＰＢＳ中１％のＢＳＡで１時間、室温でブロックした。ＰＢＳ中０．０５％のｔｗｅｅｎ  ２０で２回洗浄した後、適宜希釈した試料１００μｌを各ウェルに加えた。プレートを室温で２時間インキュベートした。３回洗浄した後、ＰＢＳ中１％のＢＳＡ＋ｔｗｅｅｎ  ０．０５％に溶かした２μｇ／ｍｌの２２９ｔ抗ＣＤ９Ｐ−１  ｍＡｂを加え、プレートを室温で２時間インキュベートした。３回洗浄した後、希釈試薬で１／８０００に希釈したストレプトアビジン−ＨＲＰを暗条件下、室温で３０分間加えた。室温で３０分間インキュベートした後、Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ基質、次いで２ＭのＨ２ＳＯ４（ｖ／ｖ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、セルジー＝ポントワーズ、フランス）を添加することにより、シグナルを明らかにした。ＫＣ４ソフトウェア（ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社、コルマール、フランス）を備えたマイクロプレートリーダーを用い、各ウェルの４５０ｎｍでの吸光度を測定した。ＣＨＯ系で作製した既知量の組換えタンパク質を用いた標準曲線と比較することによってＣＤ９Ｐ−１量を求めた。細胞系Ｌｅｗｉｓ（ＬＬ／２）、ＮＣＨ−Ｈ４６０、ＲＴ−１１２、Ｕｍｕｃ−３、ＮＣＩ−Ｈ６９  ＦａＤｕ、Ａ６４９、Ａ６７３、Ｕ９３７、Ｊｕｒｋａｔ、ＴＨＰ−１、（ＡＴＣＣ）、ＲＡＷ２６４．７（Ｓｉｇｍａ社）、ＲＨ−３０（ＤＳＭＺ）から細胞溶解物を得た。マウスモデルの腫瘍異種移植片から腫瘍溶解物を得た。
【０３７２】
ＣＤ９Ｐ−１の内部移行および分解
２％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ１６４０培地でＫ５６２細胞を一晩、３７℃でインキュベートし、次いで、１０パーミリリットルのマウスＩｇＧ  ９ｂＦ４またはＩｇＧアイソタイプ対照を添加した新鮮な培地の入った６ウェルプレートに様々な時間にわたって１×１０６細胞の密度で播種した。インキュベーション後、細胞を２２０ｇで１０分間遠心分離し、ＰＢＳで２回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤を含有する１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００  ＣＳＴ細胞溶解緩衝液で溶解させた。次いで、抗ＣＤ９Ｐ−１  ｍＡｂを用いたウエスタンブロットによりＣＤ９Ｐ１発現の解析を評価した。
【０３７３】
Ｔ−１７５フラスコ内に入れた１０％ＦＣＳを含有するＲＰＭＩで、ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を３７℃、５％ＣＯ２加湿雰囲気下で増殖させた。細胞が８０〜９０％のコンフルエンスに達したとき、培地を無血清培地に４時間置き換え、次いで、完全培地に変えた。次いで、細胞を１０μｇ／ｍｌの９ｂＦ４  ｍＡｂで０．５時間、２時間および１８時間、または対照ＩｇＧ１で１８時間処理した。ＰｒｏｔｅｏＥｘｔｒａｃｔ  Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、サン＝カンタン＝アン＝イヴリーヌ、フランス）を製造業者の指示通りに用いて、細胞内プロテオーム画分を調製した。細胞内プロテオーム画分に抗ＣＤ９Ｐ−１  ｍＡｂおよび抗ＴＲＡＦ−２  ｍＡｂを用いたウエスタンブロットを実施した。
【０３７４】
フローサイトメトリーにより評価したＣＤ９Ｐ−１内部移行
Ｋ５６２細胞から血清を５時間除去し、ＲＰＭＩ  １０％ＦＢＳの入った６ウェルプレートに抗ＣＤ９Ｐ−１抗体１０μｇの存在下、４℃にて３０分間、次いで、３７℃にて、示される時間で１．５×１０６細胞の密度で播種した。４℃で内部移行を停止させた。細胞を２２０ｇ、４℃で５分間遠心分離し、冷ＰＢＳで２回洗浄し、特異的に結合した抗体をＰＥ  Ｆ（ａｂ’）２−ヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、コートアボフ、フランス）で染色し、サイトメーターＦＣ５００（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、ヴィルパント、フランス）で解析して、Ｋ５６２細胞によって内部に取り込まれた抗体を測定した。ＣＸＰソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社）でデータを解析した。別の単離抗ＣＤ９Ｐ１  ｍＡｂ（クローン１３ａＡ６）を細胞表面でのＣＤ９Ｐ−１認識に関しては陽性対照、内部移行に関しては陰性対照として使用した。
【０３７５】
９ｂＦ４  ｍＡｂのエピトープマッピング
ＣｏｖａｌＸ社によって開発された高分解能の方法（国際公開第２０１７／１２１７７１号）を用いることにより、ヒトＣＤ９Ｐ１抗原上でマウス抗ＣＤ９Ｐ１（９ｂＦ４ｍＡｂ）によって認識されるエピトープを明らかにした。９ｂＦ４  ｍＡｂとヒトＣＤ９Ｐ１細胞外ドメインの可溶性調製物（Ｓｔｒｅｐ−ＣＤ９Ｐ１−ＥＣＤ）との複合体を形成させた。このタンパク質複合体を重水素化架橋剤とインキュベートし、複数の酵素によるタンパク質分解切断を実施した。架橋ペプチドが富化された後、試料を高分解能質量分析（ｎＬＣ−Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳ）により解析し、得られたデータをＸＱｕｅｓｔおよびＳｔａｖｒｏｘソフトウェアを用いて解析した。
【０３７６】
マウス抗ｈＣＤＰ１抗体９ｂＦ４  ｍＡｂのｉｎ  ｖｉｖｏの効果
Ｋ５６２（ヒト慢性骨髄性白血病）およびＮＣＩ−Ｈ４６０（ヒト非小細胞肺癌）を用いたマウス異種移植モデルで９ｂＦ４  ｍＡｂを単一薬剤として評価した。ヌードマウス（１グループあたりｎ＝４）にＫ５６２細胞またはＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を移植した（細胞５００万個を皮下に注射した）。細胞移植の１４日後、腫瘍体積が約１００ｍｍ３に達してから抗体療法を開始した。抗ＣＤ９Ｐ１抗体９ｂＦ４を週２回（２週間）、１投与当たり１０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射により注射した。
【０３７７】
結果
ＣＤ９Ｐ１発現またはＣＤ９Ｐ１非発現癌細胞系を用いたフローサイトメトリーによる９ｂＦ４  ｍＡｂおよび１０ｂＢ１  ｍＡｂの特異性の特徴付け：
最初に、本発明の９ｂＦ４抗体および１０ｂＢ１抗体のヒトＣＤ９Ｐ−１タンパク質に対する特異性を特徴付けることを狙いとした。これに関して、最初に、ＱＰＣＲ（図１）およびＣＤ９Ｐ−１標的化抗体によるウエスタンブロット解析（図２）を用いて、２つの癌細胞系（ＪｕｒｋａｔおよびＫ５６２）の細胞溶解物でのＣＤ９Ｐ−１発現を解析した。
【０３７８】
ＱＰＣＲには以下のプライマーペアを使用した：
−ｈＣＤ９Ｐ１−Ｆ  ５’−ＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧＣＡＣＡＡＡＧＴＧ−３’（配列番号３７）およびｈＣＤ９Ｐ１−Ｒ  ５’−ＣＣＴＴＧＧＡＡＧＣＡＴＴＣＡＧＧＴＡＣＡ−３’（配列番号３８）；
−ｈＧＡＰＤＨ−Ｆ  ５’−ＡＧＣＴＣＡＣＴＧＧＣＡＴＧＧＣＣＴＴＣ−３’（配列番号３９）およびｈＧＡＰＤＨ−Ｒ  ５’−ＧＡＧＧＴＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣ−３’（配列番号４０）。
【０３７９】
次いで、ＰＥコンジュゲートヤギ抗マウス抗体を用いた間接フローサイトメトリー法によりハイブリドーマ上清を試験して、抗ＣＤ９Ｐ−１抗体を産生するハイブリドーマを単離した。ＥＬＩＳＡにより陽性ハイブリドーマをクローニングしたところ、クローン９ｂＦ４および１０Ｂｂ１の上清がＫ５６２細胞系には強い染色を示し、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対しては陰性であった（図３）。精製後、９ｂＦ４  ｍＡｂと１０ｂＢ１  ｍＡｂは同じ特異性を示し、Ｋ５６２の染色が強く、Ｊｕｒｋａｔ細胞系に対しては標識が陰性であった（図４）。
【０３８０】
免疫沈降法による９ｂＦ４  ｍＡｂおよび１０ｂＢ１  ｍＡｂの特異性の特徴付け：
次いで、ＱＰＣＲ（図５）および抗ＣＤ９Ｐ−１  ｍＡｂによるウエスタンブロット（図６Ａ）により、ＣＤ９Ｐ−１トランスフェクト（またはＧＦＰ／非トランスフェクト）ＣＴ２６細胞でのＣＤ９Ｐ−１発現を検討した。ＱＰＣＲには以下のプライマーペアを使用した：
−ｈＣＤ９Ｐ１−ＦおよびｈＣＤ９Ｐ１−Ｒ；
−ｍＧＡＰＤＨ−Ｆ  ５’−ＧＧＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＴＴＴ−３（配列番号４１）；およびｍＧＡＰＤＨ−Ｒ  ５’−ＧＧＣＣＴＴＧＡＣＴＧＴＧＣＣＧＴＴＧＡＡＴＴＴ−３’（配列番号４２）。
【０３８１】
ＣＤ９Ｐ−１は、ＣＤ９Ｐ−１トランスフェクトＣＴ２６細胞には過剰発現するが、非トランスフェクトＣＴ２６細胞による発現が弱いことがわかった。次に、ＣＤ９Ｐ−１トランスフェクト（または非トランスフェクト）ＣＴ２６細胞の細胞溶解物を本発明の９ｂＦ４  ｍＡｂで免疫沈降させた後、ＣＤ９Ｐ−１標的化ｍＡｂを用いてＣＤ９Ｐ−１に対するイムノブロットを実施した。ＣＤ９Ｐ−１  ｍＡｂを用いた免疫ブロットにより、９ｂＦ４  ｍＡｂによって免疫沈降した１３５ｋＤａ型のＣＤ９Ｐ−１が検出された（図６Ｂ）。そののち、９ｂＦ４または１０ｂＢ１ハイブリドーマ上清でＫ５６２細胞溶解物を免疫沈降させ；精製した９ｂＦ４  ｍＡｂおよび１０ｂＢ１  ｍＡｂでＨ４６０細胞溶解物を免疫沈降させた。試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗ＣＤ９Ｐ−１  ｍＡｂを用いてイムノブロットを実施した。最終的には、２つのＣＤ９Ｐ１発現ヒト癌細胞系で、９ｂＦ４  ｍＡｂおよび１０ｂＢ１  ｍＡｂにより１３５ｋＤａ型のＣＤ９Ｐ−１の免疫沈降が良好に免疫沈降した（図７Ａ）。したがって、以上のデータから、９ｂＦ４／１０ｂＢ１  ｍＡｂのヒトＣＤ９Ｐ−１タンパク質に対する特異性が示される。
【０３８２】
本発明のＣＤ９Ｐ−１標的化抗体本発明（９ｂＦ４および１０ｂＢ１）にはＣＤ９Ｐ−１発現非接着性癌細胞の細胞質内に迅速かつ効率的に内部移行するという特有の特徴がある：
そののち、９ｂＦ４  ｍＡｂおよび１０ｂＢ１  ｍＡｂが、細胞表面に結合してからＣＤ９Ｐ−１発現癌細胞の細胞質内に内部移行するかどうかを検討するため、Ｋ５６２白血病細胞を１０μｇ／ｍｌの９ｂＦ４  ｍＡｂおよび１０ｂＢ１  ｍＡｂと４℃で３０分間インキュベートした。注目すべきこととして、ＣＤ９Ｐ−１と結合するが癌細胞内には取り込まれない抗体を内部移行の対照として使用した（クローン１３ａＡ６）。洗浄後、細胞を３７℃でインキュベートして内部移行させた。次いで、数種類の時間（０分、１５分、３０分ならびに１時間、２時間および１８時間）の後、細胞試料を収集し、４℃にてＰＥ標識二次抗体で染色した。最後に、対応する細胞表面ＰＥシグナルをフローサイトメーターで解析した。その結果から、Ｋ５６２細胞が９ｂＦ４抗体および１０ｂＢ１１抗体を対照（１３ａＡ６  ｍＡｂ）と比較して効率的かつ迅速に取り込むことがわかる（図７Ｂ）。
【０３８３】
本発明の抗体（９ｂＦ４または１０ｂＢ１）はＣＤ９Ｐ−１発現非接着性癌細胞にＣＤ９Ｐ−１分解を誘導する：
最後に、９ｂＦ４  ｍＡｂおよび１０ｂＢ１  ｍＡｂとＣＤ９Ｐ１との結合が癌細胞でのその発現レベルを調節するかどうかを明らかにするため、非接着性Ｋ５６２細胞をマウスＩｇＧ  ９ｂＦ４もしくはＩｇＧ  １０ｂＢ１またはＩｇＧアイソタイプ対照と様々な時間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、細胞を溶解させ、ウエスタンブロットによりＣＤ９Ｐ１発現を解析した。興味深いことに、５時間のインキュベーションから、９ｂＦ４  ｍＡｂによってＣＤ９Ｐ−１タンパク質発現の完全な欠乏が誘導されることがわかった。７２時間の９ｂＦ４  ｍＡｂとのインキュベーションまでＣＤ９Ｐ−１発現は検出されなかった（図７Ｃ）。さらに、対照条件（Ｃ）と比較して２つの抗体によるＣＤ９Ｐ１の分解が観察され、９ｂＦ４  ｍＡｂまたは１０ｂＢ１  ｍＡｂによって誘導される分解の動態は、２時間のインキュベーション後のＣＤ９Ｐ−１タンパク質発現の強い欠乏と極めて類似している（図７Ｅ）。
【０３８４】
本発明の抗体（９ｂＦ４）はＣＤ９Ｐ−１発現接着性癌細胞にＣＤ９Ｐ−１の内部移行および分解を誘発する：
最終的には、９ｂＦ４  ｍＡｂがＣＤ９Ｐ−１発現癌細胞にＣＤ９Ｐ−１の内部移行および分解を誘導するかどうかをさらに明らかにするため、接着性ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞を９ｂＦ４  ｍＡｂと０．５時間、２時間および１８時間、または対照ＩｇＧ１と１８時間インキュベートした。次いで、細胞内プロテオーム画分にウエスタンブロット解析を実施した。９ｂＦ４  ｍＡｂは、ＮＣＩ−Ｈ４６０細胞の膜画分および細胞質画分でのＣＤ９Ｐ−１発現を大幅に、かつ迅速に低下させる（早くもインキュベーションの０．５時間後に始まった）ことが明らかになり、この細胞に迅速なＣＤ９Ｐ−１の内部移行および分解を誘導することが示された（図７Ｄ）。この観察結果は、ＣＤ９Ｐ−１発現癌細胞による（早くもインキュベーションの１時間後にみられる）迅速な９ｂＦ４および１０ｂＢ１の内部移行を示す図７Ｂによってさらに裏付けられる。さらに、ＴＲＡＦ−２が抗アポトーシス活性を有し、その欠乏が腫瘍成長の抑制を引き起こすことを考慮して、本発明者らはさらに、９ｂＦ４  ｍＡｂが癌細胞のＣＤ９Ｐ１との相互作用を介してＴＲＡＦ−２をダウンレギュレートし得るかどうかを検討した。そのために、細胞成分分画後に９ｂＦ４と様々な時間にわたってインキュベートした上記の癌細胞またはそうしなかった上記の癌細胞でのＴＲＡＦ−２発現に関する免疫ブロット解析を実施した。９ｂＦ４が細胞質画分でのＴＲＡＦ−２発現を大幅に欠乏させるのが観察され、したがって、９ｂＦ４がＴＲＡＦ−２分解およびＴＲＡＦ−２／ＴＮＦＲシグナル伝達を介してＣＤ９Ｐ１発現癌細胞にアポトーシスを誘導する可能性もあることが示された（図７Ｄ）。
【０３８５】
本発明の抗体（９ｂＦ４）はヒト単球およびＭ２マクロファージでの炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦアルファ）の産生を刺激する：
本発明のＣＤ９Ｐ−１標的化抗体がヒト自然免疫細胞に対して免疫刺激効果を示すかどうかを検討するため、単球およびＭ２マクロファージを様々な濃度（１ｍＬ当たり１０〜２０μｇ）の本明細書に記載のＣＤ９Ｐ−１標的化抗体（マウスＩｇＧ  ９ｂＦ４）またはＩｇＧアイソタイプ対照で処理し、さらに、ＴＮＦアルファに関するＥＬＩＳＡアッセイを実施した。興味深いことに、ＩｇＧ  ９ｂＦ４抗体がヒト単球（図８Ａ）およびＭ２マクロファージ（図８Ｂ）による強力なＴＮＦアルファ放出を誘導することが明らかになり、このことは、９ｂＦ４が腫瘍環境中でのマクロファージを介する癌細胞アポトーシスおよびＴＮＦアルファ産生を特徴とするＭ１マクロファージ分極化をともに誘導し得ることを示している。
【０３８６】
本発明の抗体（９ｂＦ４）はヒトリンパ球に炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦアルファおよびＩＦＮガンマ）の産生を誘導する：
次いで、本発明の抗体がヒト適応免疫細胞に対して免疫刺激効果を示すかどうかを明らかにするため、リンパ球を様々な濃度（１ｍＬ当たり５〜２０μｇ）のＣＤ９Ｐ−１標的化抗体（マウスＩｇＧ  ９ｂＦ４）またはＩｇＧアイソタイプ対照で処理し、さらに、ＴＮＦアルファおよびＩＦＮガンマに関するＥＬＩＳＡアッセイを実施した。注目すべきことに、本発明の抗体がヒトリンパ球によるＴＮＦアルファ（図９Ａ）およびＩＦＮガンマ（図９Ｂ）の強力な分泌を誘導することがわかった。
【０３８７】
本発明の抗体（９ｂＦ４）はヒトリンパ球の増殖を誘発する：
抗ＣＤ９Ｐ−１抗体のヒト適応免疫細胞に対する免疫刺激能をさらに検討するため、リンパ球を様々な濃度（１ｍＬ当たり５〜４０μｇ）の９ｂＦ４抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照で処理し、さらに、細胞増殖を測定する比色ＭＴＴ試験を実施した。特筆すべきことに、本発明の抗体がヒトリンパ球増殖を強力に刺激することがわかった（図１０）。
【０３８８】
本発明の抗体（９ｂＦ４）はスタビリン１経路を介してヒトＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへの再分極化を誘発する：
さらに、これまでにＭ２マクロファージが腫瘍の血管新生および転移を促進することが明らかにされていることを考慮して、本発明の抗体がＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへの極性変化を誘発し、それにより、Ｍ２状態のマクロファージによる有害な抗炎症作用および腫瘍促進作用を抑え得るかどうかを問うた。そのために、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージの溶解物に関して、Ｍ１／Ｍ２マクロファージ（ＣＤ８０／ＣＤ１６３）およびＭ２分極化マクロファージ（スタビリン１）の分子マーカーの免疫ブロット解析を実施した。Ｍ２マクロファージをＣＤ９Ｐ−１標的化抗体（マウスＩｇＧ  ９ｂＦ４、１ｍＬ当たり２０μｇ）またはそのＩｇＧアイソタイプ対照と４８時間にインキュベートした。ＣＤ９Ｐ−１  ｍＡｂはＣＤ１６３発現（Ｍ２マクロファージ）を低下させ、ＣＤ８０過剰発現（Ｍ１マクロファージ）を誘導し、したがって、本発明の抗体が実際にＭ２マクロファージからＭ１マクロファージへの再分極化を促進することが示された（図１１）。さらに、９ｂＦ４  ｍＡｂはＣＤ９Ｐ１とスタビリン１の同時分解を誘導し、９ｂＦ４  ｍＡｂがＣＤ９Ｐ１／スタビリン１分子複合体の内部移行および分解を介して免疫刺激応答を誘発することが示された（図１１）。
【０３８９】
本発明の抗体（９ｂＦ４）は癌細胞と共培養したヒトＰＢＭＣに炎症誘発性サイトカイン（ＴＮＦアルファおよびＩＦＮガンマ）の産生を誘導する：
そののち、以前確認したＣＤ９Ｐ−１抗体の免疫刺激作用がヒト転移性癌細胞（ＮＣＩ−Ｈ４６０）の存在下でなおも認められることを確認するため、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を様々な濃度（１ｍＬ当たり１０〜２０μｇ）のマウスＩｇＧ  ９ｂＦ４またはＩｇＧアイソタイプ対照で処理し、さらに、ＴＮＦアルファおよびＩＦＮガンマに関するＥＬＩＳＡアッセイを実施した。注目すべきことに、９ｂＦ４によって誘導される炎症性サイトカインの産生増大が、ＮＣＩ−Ｈ４６０癌細胞の存在下でも依然として明らかであることが観察され（図１２Ａ〜１２Ｂ）；さらに興味深いことに、ＩＦＮガンマに対する９ｂＦ４抗体の免疫刺激作用が、この腫瘍細胞の存在下で強化されることがわかった（図１２Ｂ）。
【０３９０】
本発明の抗体（９ｂＦ４）は単球およびリンパ球の活性化を介してＣＤ９Ｐ−１発現癌細胞のアポトーシスを誘発する：
最後に、以前確認した９ｂＦ４抗体の免疫刺激作用を考慮し、本発明の抗体が実際にヒトＣＤ９Ｐ−１発現癌細胞のアポトーシスを調節し得るかどうかを検討した。重要なことに、アポトーシスマーカーである切断型カスパーゼ３のイムノブロッティングによって明らかなように、マウスＩｇＧ  ９ｂＦ４抗体はＩｇＧアイソタイプ対照とは異なり、ＰＢＭＣに由来する単球または単球／リンパ球と共培養すると、実際にＮＣＩ−Ｈ４６０細胞のアポトーシス増大を誘導することがわかった（図１３）。興味深いことに、この癌細胞死の増大は、癌細胞を単球単独よりも単球およびリンパ球の両方と培養したときの方が大きく、したがって、リンパ球の存在下でアポトーシス作用が増幅されることが明らかである、すなわち、堅固で相乗的な自然免疫応答および適応免疫応答が推測される。本発明の抗体がリンパ球増殖を引き起こしたことから、それがリンパ球の細胞傷害性機能も誘導し得るかどうかを検討し、したがって、癌細胞と共培養したヒトＰＢＭＣの細胞傷害性顆粒でグランザイムＢの発現レベルを検討した。驚くべきことに、本発明の抗体はＩｇＧアイソタイプ対照とは異なり、免疫療法応答の予測バイオマーカーである、リンパ球からのグランザイムＢ発現の大幅な増大を誘発することがわかった（図１３）。
【０３９１】
ＣＤ９Ｐ−１およびスタビリン１タンパク質はヒトのＭ２状態のマクロファージに過剰発現しヒト癌性肺組織に同時発現する：
次いで、ヒトＭ０マクロファージまたはＭ１／Ｍ２マクロファージ細胞溶解物にＭ２（ＣＤ１６３）分子マーカーを用いて免疫ブロットアッセイを実施することにより、様々なヒトマクロファージのＣＤ９Ｐ−１の発現プロファイルを評価した。Ｍ２マクロファージには、Ｍ０／Ｍ１マクロファージと比較してＣＤ９Ｐ−１およびスタビリン１が過剰発現することがわかった（図１４Ａ）。さらに、Ｍ２状態のマクロファージでは、ＣＤ９Ｐ−１発現がスタビリン１の発現増大と相関することがわかった（図１４Ａ）。
【０３９２】
さらに、Ｍ２マクロファージマーカー（ＣＤ１６３）による免疫組織化学染色を用いて、シスプラチンとペルメトレキセド（ｐｅｒｍｅｔｒｅｘｅｄ）（Ａｌｉｍｔａ（商標））による化学療法後のヒト肺腺癌におけるＣＤ９Ｐ−１およびスタビリン１の発現プロファイルを検討した。興味深いことに、ＣＤ９Ｐ−１およびスタビリン１タンパク質は、一次治療後のヒト肺癌の進行症例に同時発現し、腫瘍間質のＭ２マクロファージ表現型と相関することがわかった（図１４Ｂ）。この結果から、シスプラチンおよびペルメトレキセド（ｐｅｒｍｅｔｒｅｘｅｄ）による化学療法の後でも、腫瘍環境中のＭ２マクロファージが９ｂＦ４による腫瘍治療の有望な標的であることが確認される。
【０３９３】
本発明の抗ＣＤ９Ｐ−１  ｍＡｂ（９ｂＦ４）はＭ１再分極化の過程でＴＲＡＦ−２／ＴＮＦＲシグナル伝達を介して免疫応答を誘導する：
ＴＲＡＦ−２は、腫瘍関連マクロファージでの炎症性サイトカイン産生を調節し、腫瘍成長を促進し、興味深いことに、ＴＲＡＦ−２の喪失がマクロファージのＭ１様抗腫瘍機能を促進し得ることが示唆された。したがって、９ｂＦ４がヒト免疫細胞でのＴＮＦアルファ産生を調節すること、およびＴＲＡＦ−２が、ＴＮＦと結合するものを含めた特定のサイトカイン受容体の連結後にシグナルを伝達することがよく知られていることを考慮して、本発明者らはさらに、本発明の抗体（９ｂＦ４）がヒトマクロファージのＴＲＡＦ−２経路を調節するかどうかを検討した。そのために、９ｂＦ４（またはＩｇＧアイソタイプ対照）と４８時間インキュベートした場合またはそうでない場合のヒト単球およびＭ１マクロファージ対Ｍ２マクロファージにおけるＴＲＡＦ−２発現に関して免疫ブロット解析を実施した。９ｂＦ４はＭ２マクロファージでのＴＲＡＦ−２発現を低下させることが明らかになり、したがって、Ｍ１マクロファージ再分極化の過程で９ｂＦ４によって誘導される免疫応答が実際にＴＲＡＦ−２／ＴＮＦＲシグナル伝達を介して起こることが示された（図１５）。
【０３９４】
本発明の抗体（９ｂＦ４）はｉｎ  ｖｉｖｏの腫瘍成長を阻害する：
図１６に示されるように、抗ＣＤ９Ｐ１抗体の９ｂＦ４  ｍＡｂは、溶媒を注射したマウスの対照群と比較して処置マウスの腫瘍成長を有意に遅らせる（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）。したがって、この結果は、ヒトＣＤ９Ｐ−１を発現する癌細胞を異種移植した胸腺欠損マウスにおけるマウス抗ｈＣＤ９Ｐ１（９ｂＦ４）の抗腫瘍活性を示すものである。
【０３９５】
本発明の抗体（９ｂＦ４）はＣＤ９Ｐ〜１上の立体構造エピトープを認識する：
化学架橋による解析では、９ｂＦ４  ｍＡｂによって認識されるＳｔｒｅｐ−ＣＤ９Ｐ１−ＥＣＤ上のエピトープが不連続（立体構造エピトープ）であることがわかった。９ｂＦ４  ｍＡｂは、Ｓｔｒｅｐ−ＣＤ９Ｐ１−ＥＣＤのアミノ酸残基２１０〜２４０、４３０〜４５０、４８０〜５１０（それぞれＣＤ９Ｐ−１のアミノ酸残基２０２〜２３２、４２２〜４４２および４７２〜５０２に対応する）内の以下のアミノ酸：２１９、２２２、２２３、２３２、４３３、４４４、４８０、４８２、４８６、５０５および５０９（それぞれＣＤ９Ｐ−１のアミノ酸残基２１１、２１４、２１５、２２４、４２５、４３６、４７２、４７４、４７８、４９７および５０１に対応する）を含めた１つまたは複数のアミノ酸と結合する。１０ｂＢ１が９ｂＦ４  ｍＡｂと同一のＣＤＲ配列を共有することから、１０ｂＢ１は９ｂＦ４  ｍＡｂと同じエピトープを認識することが推測された。
【０３９６】
本発明の抗体（９ｂＦ４または１０ｂＢ１）のヒトＣＤ９Ｐ−１に対する親和性の決定：
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて、９ｂＦ４  ｍＡｂおよび１０ｂＢ１  ｍＡｂのＳｔｒｅｐ−ＣＤ９Ｐ１−ＥＣＤとの結合およびＳｔｒｅｐ−ＣＤ９Ｐ１−ＥＣＤに対する親和性を評価した。組換えＳｔｒｅｐ−ＣＤ９Ｐ１−ＥＣＤをセンサーチップにコートし、数種類の濃度の抗体をチップの上に流して、結合と解離の動態を得た。その結果を下の表１に示す。
【０３９７】
【表２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月1日(2020.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2020528932.tif 000023
2020528932.tif 000024
2020528932.tif 000025
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