(57)【要約】  完全ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体とそれに対応する応用が開示される。完全ヒト抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合できる。酵母ディスプレイライブラリーベースのスクリーニング技術を採用し、また、ＰＤ−Ｌ１に対する親和性をさらに向上させる親和性成熟によって抗体を得た。開示される完全ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、良好な特異性、親和性、安定性を示す。それらは、腫瘍成長を顕著に阻害する一方で、活性化Ｔ細胞に結合することによりＴ細胞の活性を高めることができる。開示される完全ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ＰＤ−Ｌ１関連のがんおよびその他の関連疾患の診断および治療に使用することができる。
2020517239.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（１）配列番号１、２および３にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号４、５および６にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；
（２）配列番号７、８および９にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号１０、１１および１２にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；
（３）配列番号１３、１４および１５にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号１６、１７および１８にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；
（４）配列番号１、２および１９にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号４、５および６にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；
（５）配列番号７、２０および９にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号１０、１１および１２にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖；ならびに
（６）配列番号１３、１４および１５にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む重鎖、ならびに配列番号２１、１７および１８にそれぞれ対応するＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む軽鎖
からなる群から選択されるポリペプチドの群を含む、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合部分。
【請求項２】
以下の中から選択される配列を有する重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分：配列番号４７、４９、５１、５３もしくは５４、または前記配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である配列。
【請求項３】
以下の中から選択される配列を有する軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分：配列番号４８、５０、５２、５５もしくは５６、または前記配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％同一である配列。
【請求項４】
抗体全体、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖに対応する、請求項１から３のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分。
【請求項５】
重鎖可変領域と軽鎖可変領域との間に連結ペプチドをさらに含むｓｃＦｖである、請求項４に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分。
【請求項６】
前記連結ペプチドが配列番号６７の配列を含む、請求項５に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分。
【請求項７】
重鎖定常領域が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＡを含む群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分。
【請求項８】
重鎖定常領域が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む群から選択される、請求項７に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分。
【請求項９】
軽鎖定常領域がκ領域またはλ領域である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分。
【請求項１０】
抗体重鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子であって、前記抗体重鎖可変領域が、
（ｉ）配列番号１〜３；
（ｉｉ）配列番号７〜９；
（ｉｉｉ）配列番号１３〜１５；
（ｉｖ）配列番号１、２および１９；ならびに
（ｖ）配列番号７、２０および９
からなる群から選択されるアミノ酸配列の群を含む、核酸分子。
【請求項１１】
前記抗体重鎖可変領域が以下の中から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の核酸分子：配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、および配列番号５４。
【請求項１２】
抗体軽鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子であって、前記抗体軽鎖可変領域が：
（ｉ）配列番号４〜６；
（ｉｉ）配列番号１０〜１２；
（ｉｉｉ）配列番号１６〜１８；ならびに
（ｉｖ）配列番号２１、１７、および１８
からなる群から選択されるアミノ酸配列の群を含む、核酸分子。
【請求項１３】
前記抗体重鎖可変領域が以下の中から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の核酸分子：配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５５、配列番号５６。
【請求項１４】
抗体重鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子を含むベクターであって、前記抗体重鎖可変領域が：
（ｉ）配列番号１〜３；
（ｉｉ）配列番号７〜９；
（ｉｉｉ）配列番号１３〜１５；
（ｉｖ）配列番号１、２および１９；ならびに
（ｖ）配列番号７、２０および９
からなる群から選択されるアミノ酸配列の群を含む、ベクター。
【請求項１５】
抗体軽鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子をさらに含み、前記抗体軽鎖可変領域が：
（ｉ）配列番号４〜６；
（ｉｉ）配列番号１０〜１２；
（ｉｉｉ）配列番号１６〜１８；ならびに
（ｉｖ）配列番号２１、１７、および１８
からなる群より選択されるアミノ酸配列の群を含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
配列番号８５のアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号８７のアミノ酸配列を有する軽鎖を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体、または抗体の抗原結合部分。
【請求項１７】
配列番号８５および配列番号８７からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードすることができる核酸配列を含む核酸分子。
【請求項１８】
配列番号８６または配列番号８８の配列を含む、請求項１７に記載の核酸分子。
【請求項１９】
配列番号８５および配列番号８７からなる群から選択される配列を有するポリペプチドをコードすることができる核酸を含む宿主細胞。
【請求項２０】
配列番号８５の重鎖および配列番号８７の軽鎖を有する抗体、または抗体の抗原結合部分；ならびに医薬的に許容される賦形剤またはアジュバントを含む組成物。
【請求項２１】
約５．９のｐＨを有する、約２７５ｍＭのセリン、約１０ｍＭのヒスチジンを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２２】
約５．８のｐＨを有する、約０．０５％のポリソルベート８０、約１％のＤ−マンニトール、約１２０ｍＭのＬ−プロリン、約１００ｍＭのＬ−セリン、約１０ｍＭのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌを含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ヒトＰＤ−Ｌ１の活性の調節に関連する疾患を治療または予防する必要がある患者に配列番号８５の重鎖および配列番号８７の軽鎖を有する抗体、または抗体の抗原結合部分を含む医薬組成物の治療有効量を投与することを含む、ヒトＰＤ−Ｌ１の活性の調節に関連する疾患または状態を治療または予防する方法。
【請求項２４】
前記疾患が肺がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮がんまたは骨肉腫である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患がＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染である、請求項２４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、生物医学の分野に関連し、完全ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその医薬的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞が外因性抗原に反応するとき、休止Ｔリンパ球に２つのシグナルを提供するために抗原提示細胞（ＡＰＣ）が必要である：最初のシグナルは、ＴＣＲの助けによりＴ細胞がＭＨＣ分子に結合した抗原ペプチドを認識する際に生成され、その後、抗原認識シグナルがＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介して伝達される；そして、第２の信号は一連の共刺激分子によって提供される；そして、このようにして、Ｔ細胞は正常に活性化されることがあり、その結果、正常な免疫応答が生じる。これらの共刺激分子は、２番目の信号によって生じる効果に応じて、正の共刺激分子または負の共刺激分子のいずれかに分類することができ、正および負の共刺激信号の調節と、前記信号間の相対バランスは、体全体の免疫反応を通じて重要な調節の役割を果たす。
【０００３】
ＰＤ−１はＣＤ２８受容体ファミリーのメンバーであり、前記ファミリーにはＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡもまた含まれる。このファミリーの最初のメンバーであるＣＤ２８およびＩＣＯＳは、モノクローナル抗体を加えたときに発見され、Ｔ細胞増殖の増加として観察された［Hutloff et al. (1999) Nature 397: 263-266; Hansen et al. (1980) Immunogenics 10: 247-260］。ＰＤ−１のリガンドにはＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２が含まれ、受容体がリガンドに結合するとＴ細胞の活性化と関連サイトカインの分泌を下方制御することが研究結果によりすでに示されている［Freeman et al. (2000) J Exp Med 192: 1027-34; Latchman et al. (2001) Nat Immunol 2: 261-8; Carter et al. (2002) Eur J Immunol 32: 634-43; Ohigashi, et al. (2005) Clin Cancer Res 11: 2947-53］。
【０００４】
ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１）は、Ｂ７ファミリーに属する細胞表面糖タンパク質であり、ＩｇＶおよびＩｇＣ様領域、膜貫通領域、細胞質尾部領域を含む。１９９９年に対応する遺伝子が最初に発見およびクローン化され［Dong H, et al. (1999) Nat Med 5: 1365-1369］、糖タンパク質自体がＴ細胞受容体ＰＤ−１と相互作用し、免疫応答の負の調節において重要な役割を果たすと判断された。Ｔ細胞で発現するＰＤ−１に作用することに加えて、ＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞で発現する場合、ＡＰＣ上でＣＤ８０と相互作用して負のシグナルを伝達し、Ｔ細胞阻害剤として機能することができる。マクロファージ系細胞で発現することに加えて、ＰＤ−Ｌ１は正常なヒト組織においても低レベルで発現するが、糖タンパク質は、例えば肺がん、卵巣がん、結腸がんおよびメラノーマを含む特定の腫瘍細胞株で比較的高い発現を示す［Iwai et al. (2002) PNAS 99: 12293-7; Ohigashi, et al. (2005) Clin Cancer Res 11: 2947-53］。腫瘍細胞におけるＰＤ−Ｌ１の発現の増加がＴ細胞アポトーシスを上昇させ、それにより、腫瘍細胞が免疫応答を回避するのに重要な役割を果たすことが、研究結果により示唆されている。研究者は、ＰＤ−Ｌ１遺伝子をトランスフェクトしたＰ８１５腫瘍細胞株が特定のＣＴＬ溶解に対してインビトロで耐性を示すことがあり、マウスに接種するとき、前記細胞がより高い腫瘍形成性および侵襲性を示し得ることを発見した。これらの生物学的特性は、ＰＤ−Ｌ１をブロックすることで反転させることができる。ＰＤ−１ノックアウトマウスでは、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路がブロックされ、接種された腫瘍細胞は腫瘍を形成することができない［Dong H et al. (2002) Nat Med 8: 793-800］。
【０００５】
高い親和性でＰＤ−Ｌ１に結合することができ、したがってＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の結合をブロックすることができる抗ＰＤ−Ｌ１抗体が依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の特定の態様において、スクリーニングおよび親和性成熟と組み合わせた酵母ディスプレイシステムを利用して、良好な特異性および比較的高い親和性および安定性を示す完全ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体を得て、それにより本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の第１の態様は、以下の１つから選択されるＣＤＲ領域の群を含む抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合部分に関する：
（１）配列番号１〜３にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４〜６にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（２）配列番号７〜９にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号１０〜１２にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（３）配列番号１３〜１５にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号１６〜１８にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（４）配列番号１、２および１９にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号４〜６にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（５）配列番号７、２０および９にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号１０〜１２にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列；
（６）配列番号１３〜１５にそれぞれ対応する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、ならびに配列番号２１、１７および１８にそれぞれ対応する軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％を超えて同一である配列。
【０００８】
本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つは、以下の１つから選択される重鎖可変領域フレームワーク領域の群もまた含む：
１）配列番号２２〜２５にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
２）配列番号３０〜３３にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
３）配列番号３８〜４１にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
４）配列番号３０〜３３にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列。
【０００９】
本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つは、以下の１つから選択される軽鎖可変領域フレームワーク領域の群もまた含む：
１）配列番号２６〜２９にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
２）配列番号３０〜３３にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
３）配列番号３８〜４１にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列；
４）配列番号３０〜３３にそれぞれ対応するＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％を超えて同一である配列。
【００１０】
本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つは、以下の１つから選択される重鎖可変領域の群を含む：
１）配列番号４７、４９、５１、５３もしくは５４に対応する配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である配列。
【００１１】
本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分のいずれか１つは、以下から選択される軽鎖可変領域の群を含む：
１）配列番号４８、５０、５２、５５もしくは５６に対応する配列、または前述の配列の１つとそれぞれ７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは９９％同一である配列。
【００１２】
本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つは、抗体全体、二重特異性抗体、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦｖに対応する。
【００１３】
本発明のいずれの例においても、本発明がｓｃＦｖにより構成される場合、連結ペプチドもまた、前述の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合部分の重鎖および軽鎖可変領域の間に含まれる。
【００１４】
本発明のいくつかの特定の例において、前述の連結ペプチドの配列は、配列番号６７に示される通りである。
【００１５】
本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分のいずれか１つの例は、抗体全体に対応する。
【００１６】
重鎖定常領域が、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＡを含む群から選択される、本発明の第１の態様によって構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその対応する抗原結合部分のいずれか１つの例。
【００１７】
本発明の特定の例において、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される。
【００１８】
本発明の特定の例において、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１に対応する。
【００１９】
本発明の特定の例において、ＩｇＧ１アミノ酸配列は配列番号６８に示される通りである。
【００２０】
軽鎖定常領域がκ領域またはλ領域である、本発明の第１の態様によって構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つ。
【００２１】
本発明の特定の例において、κ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号７０に示される通りである。
【００２２】
本発明の特定の例において、λ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号７２に示される通りである。
【００２３】
本発明の第２の態様は、抗体重鎖可変領域をコードする核酸配列を含む核酸分子に関し、ここで、前述の抗体重鎖可変領域は、以下から選択されるアミノ酸配列の群を含む：
（ｉ）配列番号１〜３；
（ｉｉ）配列番号７〜９；
（ｉｉｉ）配列番号１３〜１５；
（ｉｖ）配列番号１、２および１９；
（ｖ）配列番号７、２０および９；
【００２４】
本発明の第２の態様によって構成される核酸分子のいずれか１つであって、前述の抗体重鎖可変領域は、以下から選択される核酸配列の群を含む：配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５４、または前述の配列の１つのフレーム領域に含まれるアミノ酸の１つまたはいくつかを置換することによって作成される配列。
【００２５】
本発明のいくつかの例において、前述の核酸は、配列番号５７〜６１に示されるものから選択される配列を含む。
【００２６】
本発明のいくつかの例において、前述の核酸は、抗体重鎖定常領域をコードする核酸配列もまた含み、前記重鎖定常領域は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＡを含む群から選択される。
【００２７】
本発明のいくつかの例において、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む群から選択される。
【００２８】
本発明の特定の例において、重鎖定常領域はＩｇＧ１に対応する。
【００２９】
本発明の特定の例において、ＩｇＧ１核酸配列は配列番号６９に示される通りである。
【００３０】
本発明の第３の態様は、抗体軽鎖可変領域をコードすることができる核酸配列を含む核酸分子に関し、ここで、前述の抗体軽鎖可変領域は、以下から選択されるアミノ酸配列の群を含む：
（ｉ）配列番号４〜６；
（ｉｉ）配列番号１０〜１２；
（ｉｉｉ）配列番号１６〜１８；
（ｉｖ）配列番号２１、１７および１８。
【００３１】
本発明の第３の態様により構成される核酸分子のいずれか１つであって、前述の抗体軽鎖可変領域は、以下から選択される核酸配列の群を含む：配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５５、配列番号５６、または前述の配列の１つのフレーム領域に含まれるアミノ酸の１つまたはいくつかを置換することによって作成された配列。
【００３２】
本発明のいくつかの態様において、前述の核酸は、配列番号６２〜６６に示されるものから選択される配列を含む。
【００３３】
本発明のいくつかの態様において、前述の核酸は、抗体軽鎖定常領域をコードすることができる核酸配列も含み、ここで、前記軽鎖定常領域は、κ領域またはλ領域である。
【００３４】
本発明の特定の態様において、κ軽鎖定常領域の核酸配列は配列番号７０に示される通りである。
【００３５】
本発明の特定の態様において、λ軽鎖定常領域のアミノ酸配列は、配列番号７２に示される通りである。
【００３６】
本発明の第４の態様は、本発明の第２または第３の態様により構成される核酸のいずれか１つを含むベクターに関する。
【００３７】
本発明の第４の態様により構成されるベクターのいずれかは、本発明の第２の態様により構成される核酸のいずれか１つと、本発明の第３の態様により構成される核酸のいずれか１つを含む。
【００３８】
本発明の第５の態様は、本発明の第２または第３の態様により構成される核酸のいずれか１つ、または本発明の第４の態様により構成されるベクターのいずれか１つを含む宿主細胞に関する。
【００３９】
本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つ、ならびに他の生物活性物質を含むコンジュゲートに関し、ここで、前述の抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分は、直接または連結断片を介して、別の生物活性物質にコンジュゲートされている。
【００４０】
本発明のいくつかの態様では、前述のさらなる生物活性物質は、化学物質、毒素、ポリペプチド、酵素、同位体、サイトカインまたは直接もしくは間接的に細胞の増殖を阻害することができるかもしくは細胞を殺傷することができるか、そうでなければ細胞をアウリスタチンＭＭＡＥ（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  ＭＭＡＥ）、アウリスタチンＭＭＡＦ（Ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ  ＭＭＡＦ）、メイタンシンＤＭ１（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ  ＤＭ１）、メイタンシンＤＭ４（Ｍａｙｔａｎｓｉｎｅ  ＤＭ４）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、デュオカルマイシンＭＧＢＡ（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎ  ＭＧＢＡ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、リシン、ジフテリア毒素およびその他の関連毒素、Ｉ１３１、インターロイキン、腫瘍壊死因子、ケモカイン、ナノ粒子などの免疫応答の活性化を介して阻害もしくは殺傷することができる他の個々の生物活性物質またはそれらの混合物を含む群から選択される。
【００４１】
本発明の第７の態様は、本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つ、本発明の第２または第３の態様により構成される核酸のいずれか１つ、本発明の第４の態様により構成されるベクターのいずれか１つ、本発明の第５の態様により構成される宿主細胞のいずれか１つ、または本発明の第６の態様により構成されるコンジュゲートのいずれか１つ、ならびに任意の医薬的に許容されるベクターまたは賦形剤および任意の他の生物活性物質を含む組成物（医薬組成物など）に関する。
【００４２】
本発明の第７の態様により構成される組成物のいずれか１つ（医薬組成物など）、前述のさらなる生物活性物質には、他の抗体、融合タンパク質または薬物（例えば、化学療法薬および放射線療法薬のような抗がん剤）が含まれるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明はさらに、本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つを含む試薬または試薬キットに関し、前述の検出試薬または試薬キットは、ＰＤ−Ｌ１タンパク質またはその誘導体の有無を検出するために使用される。
【００４４】
本発明はさらに、本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つを含む診断試薬または試薬キットに関し、ここで、前述の診断試薬または試薬キットはインビトロ（細胞や組織など）またはインビボ（ヒトやモデル動物など）でのＰＤ−Ｌ１関連疾患（例えば、高いＰＤ−Ｌ１発現を示すウイルス感染や、または高いＰＤ−Ｌ１発現を示す腫瘍の場合のような、腫瘍またはウイルス感染）の診断において使用される。
【００４５】
本発明のいくつかの態様において、前述の抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分は、検出に使用することができるか、または別の試薬で検出することができる蛍光色素、化学物質、ポリペプチド、酵素、同位体、標識などにさらに結合される。
【００４６】
本発明のいくつかの態様において、前述の腫瘍には、肺がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮がん、骨肉腫、甲状腺がん、前立腺がんが含まれるが、これらに限定されない。
【００４７】
本発明のいくつかの態様において、前述のウイルス感染には、急性、亜急性または慢性のＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染が含まれるが、これらに限定されない。
【００４８】
本発明はさらに、本発明の第１の態様によって構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つ、第２または第３の態様によって構成される核酸のいずれか１つ、本発明の第４の態様により構成されるベクターのいずれか１つ、本発明の第５の態様により構成される宿主細胞のいずれか１つ、本発明の第６の態様により構成されるコンジュゲートのいずれか１つ、または本発明の第７の態様によって構成される組成物のいずれか１つを使用して、ＰＤ−Ｌ１関連疾患（例えば、高いＰＤ−Ｌ１発現を示すウイルス感染や、または高いＰＤ−Ｌ１発現を示す腫瘍の場合のような、腫瘍またはウイルス感染）の予防または治療に使用される薬物を調製する用途に関する。
【００４９】
本発明の特定の態様において、前述の腫瘍は、高レベルのＰＤ−Ｌ１発現を示す腫瘍などのＰＤ−Ｌ１関連腫瘍を指す。
【００５０】
本発明の特定の態様において、前述の腫瘍には、肺がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮がん、骨肉腫、甲状腺がん、前立腺がんが含まれるが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明のいくつかの態様において、前述のウイルス感染には、急性、亜急性または慢性のＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
本発明はさらに、本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つを使用して、ＰＤ−Ｌ１関連疾患（例えば、高いＰＤ−Ｌ１発現を示すウイルス感染や、または高いＰＤ−Ｌ１発現を示す腫瘍の場合のような、腫瘍またはウイルス感染）の診断のための試薬または試薬キットを調製する用途に関する。
【００５３】
本発明のいくつかの態様において、前述の腫瘍は、高レベルのＰＤ−Ｌ１発現を示す腫瘍などのＰＤ−Ｌ１関連腫瘍を指す。
【００５４】
本発明の特定の態様において、前述の腫瘍には、肺がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮がん、骨肉腫、甲状腺がん、前立腺がんが含まれるが、これらに限定されない。
【００５５】
本発明のいくつかの態様において、前述のウイルス感染には、急性、亜急性または慢性のＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染が含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
本発明のいくつかの態様において、前述の抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分は、検出に使用することができるか、または別の試薬で検出することができる蛍光色素、化学物質、ポリペプチド、酵素、同位体、標識などにさらに結合される。
【００５７】
本発明はさらに、本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つを使用して、ＣＤ８０関連疾患の予防または治療のための薬物を調製する用途に関する。
【００５８】
本発明の文脈において、上記で言及したＣＤ８０関連疾患には、高いＣＤ８０発現に関連する疾患が含まれる。
【００５９】
本発明はさらに、ＰＤ−Ｌ１関連疾患（例えば、高いＰＤ−Ｌ１発現を示すウイルス感染や、または高いＰＤ−Ｌ１発現を示す腫瘍の場合のような、腫瘍またはウイルス感染）を予防または治療するために使用される方法に関し、前述の方法は、任意選択の放射線療法（Ｘ線照射など）の投与と組み合わせた、有効な予防または治療用量の本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つ、本発明の第２または第３の態様により構成される核酸のいずれか１つ、本発明の第４の態様により構成されるベクターのいずれか１つ、本発明の第５の態様により構成される宿主細胞のいずれか１つ、本発明の第６の態様により構成されるコンジュゲートのいずれか１つ、または本発明の第７の態様によって構成される組成物のいずれか１つを対象に与えることを含む。
【００６０】
本発明のいくつかの態様において、前述の腫瘍は、高レベルのＰＤ−Ｌ１発現を示す腫瘍などのＰＤ−Ｌ１関連腫瘍を指す。
【００６１】
本発明の特定の態様において、前述の腫瘍には、肺がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮がん、骨肉腫、甲状腺がん、前立腺がんが含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
本発明のいくつかの態様において、前述のウイルス感染には、急性、亜急性または慢性のＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
本発明はさらに、有効な予防または治療用量の本発明の第１の態様により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つを対象に与えることを含む、ＣＤ８０関連疾患を予防または治療するために使用される方法に関する。
【００６４】
本発明の文脈において、上記で言及したＣＤ８０関連疾患には、高いＣＤ８０発現に関連する疾患が含まれる。
【００６５】
本発明は以下の本文でさらに記載される。
【００６６】
本発明の文脈において、特に示さない限り、本文で使用される科学技術用語は、当業者により理解されるようなそれぞれの共通の意味に対応するものとする。さらに、タンパク質および核酸化学、分子生物学、細胞および組織培養、微生物学および免疫学関連の用語、ならびに本文で使用される実験室手順はすべて、それぞれの分野で広く採用されている用語および標準手順に対応する。しかしながら、関連用語の定義および説明を以下に提供して、本発明をさらに明確にする。
【００６７】
本発明の文脈において、「抗体」という用語は、通常２対の同一ポリペプチド鎖［各対は１つの「軽」（Ｌ）鎖と１つの「重」（Ｈ）鎖を有する］からなる免疫グロブリン分子を指す。抗体の軽鎖は、κまたはλ軽鎖のいずれかに分類されることがある。重鎖は、μ、δ、γ、α、またはεのいずれかに分類することができ、それぞれの対応する抗体アイソタイプは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥとして定義される。軽鎖と重鎖については、可変領域と定常領域はおよそ１２以上のアミノ酸「Ｊ」領域で接続される一方で、重鎖はおよそ３以上のアミノ酸「Ｄ」領域もまた含む。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）と重鎖定常領域（ＣＨ）で構成されている。重鎖定常領域は、３つの構造ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）で構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されている。軽鎖定常領域は、１つの構造ドメイン（ＣＬ）で構成されている。抗体の定常領域は、免疫系のさまざまな細胞（エフェクター細胞など）および古典的な補体系（Ｃ１ｑ）の第１のコンポーネントを含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）として知られる、より保存された領域で散在された、ばらつきの大きい領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）として知られる）にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４の順序で配置されている。各重鎖／軽鎖ペアの可変領域（ＶＨおよびＶＬ）は、それぞれ抗体の各結合部位を形成する。各領域または構造ドメインへのアミノ酸の割り当ては、Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest［National Institutes of Health, Bethesda, Md (1987 and 1991)］またはChothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917およびChothia et al. (1989) Nature 342: 878-883により与えられた定義に従う。「抗体」という用語は、抗体を産生するために使用される方法に関して特定の制限を受けない。例えば、それには、特には組換え抗体、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。抗体は、例えばＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ抗体を含む、異なるアイソタイプの抗体であり得る。
【００６８】
本発明の文脈において、抗体の「抗原結合部分」とは、抗体の全長に沿った１つまたは複数の部分を指し、ここで、前記部分は、抗体が結合する同じ抗原（例えば、ＰＤ−Ｌ１）に結合する能力を維持し、インタクトな抗体と競合して、所与の抗原に特異的に結合する。一般的には、全文の引用を介してすべての目的について本明細書に組み込まれるFundamental Immunology, Ch. 7 (Paul, W., ed., 2nd edition, Raven Press, NY (1989)を参照されたい。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術または全体の抗体の酵素または化学的分解によって生成することができる。いくつかの例において、抗原結合部分には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｄＡｂ、相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディおよび類似のポリペプチドが含まれ、これらは、ポリペプチド特異的抗原結合能力を付与することができる抗体の少なくとも一部を含む。
【００６９】
本発明の文脈において、「Ｆｄ断片」という用語は、ＶＨおよびＣＨ１構造ドメインからなる抗体断片を指す；「Ｆｖ断片」という用語は、抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨ構造ドメインからなる抗体断片を指す；「ｄＡｂ断片」という用語は、ＶＨ構造ドメインから構成される抗体断片を指す［Ward et al., Nature 341: 544-546 (1989)］；「Ｆａｂ断片」という用語は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１構造ドメインから構成される抗体断片を指す；ならびに「Ｆ（ａｂ’）２断片」という用語は、ヒンジ領域のジスルフィド架橋を介して接続された２つのＦａｂ断片を含む抗体断片を指す。
【００７０】
いくつかの場合において、抗体の抗原結合部分は単鎖抗体（例えば、ｓｃＦｖ）であり、ＶＬおよびＶＨ構造ドメインは、単一ポリペプチド鎖リンカーとして生成させることによりペアリングを介して一価分子を形成する［例えば、Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) および Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)を参照されたい］。そのようなｓｃＦｖ分子は、ＮＨ２−ＶＬ−コネクタ−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−コネクタ−ＶＬ−ＣＯＯＨの一般構造を持つことができる。適切な従来のコネクタ（連結ペプチド）は、ＧＧＧＧＳアミノ酸配列の繰り返しまたはその変異体で構成されている。例えば、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）４を持つコネクタが使用できるが、変異体もまた使用できる［Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448］  。本発明に使用することができる他のコネクタは、Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999) , J. Mol. Biol. 293: 41-56 and Roovers et al. (2001) , Cancer Immunolに記載されている。本発明の一態様において、前述の連結ペプチドの配列は（ＧＧＧＧＳ）３である。
【００７１】
いくつかの例において、抗体は、２つの異なる種類の抗原もしくは抗原エピトープにそれぞれ結合することができる二重特異性抗体によって構成され、一次抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、またはその抗原結合部分、ならびに二次抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、またはその抗原結合部分を含む。本発明のいくつかの態様において、前述の二重特異性抗体に含まれる一次抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、またはその抗原結合部分は、本発明により構成される抗体または対応する抗原結合部分のいずれか１つに対応し得、前述の二重特異性抗体に含まれる二次抗原に特異的に結合する抗体の軽鎖および重鎖、またはその抗原結合部分は、異なる抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくは対応する抗原結合部分、または異なる抗原を標的とする抗体もしくは対応する抗原結合部分に対応し得る。
【００７２】
いくつかの場合において、抗体はダイアボディ、すなわち二価抗体に対応し、ここで、ＶＨおよびＶＬ構造ドメインが単一のポリペプチド鎖で発現されるが、使用されるリンカーが短すぎるため、同じ鎖上の２つの構造ドメイン間でペアリングができず、そのことにより、構造ドメインを別の鎖の相補構造ドメインと強制的にペアリングさせ、２つの抗原結合部位が生じる［例えば、Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), およびPoljak R.J. et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)を参照されたい］。
【００７３】
当業者に知られている従来の技術（例えば、組換えＤＮＡ技術または酵素的または化学的切断）を使用して、所定の抗体（モノクローナル抗体２Ｅ１２のような）から抗原結合部分（例えば、上記の抗体断片）を得て、抗体全体について使用されるものと同じ方法を使用して、抗体の抗原結合部分を選択的にスクリーニングすることができる。
【００７４】
本発明の文脈において、上記の抗原結合部分には、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ二価分子、ｄＡｂおよび相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆａｂ’断片、ＦｖおよびＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。
【００７５】
本発明の文脈において、上記のＩｇＧ１重鎖定常領域には、Ｇ１ｍ（ｆ）、Ｇ１ｍ（ｚ）、Ｇ１ｍ（ｚ、ａ）およびＧ１ｍ（ｚ、ａ、ｘ）などのアロタイプが含まれる。本発明のいくつかの態様において、前述のＩｇＧ１重鎖定常領域はＧ１ｍ（ｆ）に対応する。
【００７６】
本発明の文脈において、前述のκ軽鎖定常領域はＫｍ１、Ｋｍ１，２およびＫｍ３などのさまざまなアロタイプを含む。本発明のいくつかの態様において、前述のκ軽鎖定常領域はＫｍ３型領域に対応する。
【００７７】
本発明の文脈において、前述のλ軽鎖定常領域はλＩ、λＩＩ、λＩＩＩおよびλＶＩなどのさまざまなアロタイプを含む。本発明のいくつかの態様において、前述のλ軽鎖定常領域はλＩＩ型領域に対応する。
【００７８】
本発明に関する抗体核酸は、従来の遺伝子工学組換え技術または化学合成法を介しても得ることができる。一方で、本発明に関する抗体核酸の配列には、抗ＰＤ−Ｌ１抗体重鎖可変領域または抗体分子に属する部分核酸配列が含まれる。一方で、本発明に関する抗体核酸の配列には、抗ＰＤ−Ｌ１抗体軽鎖可変領域または抗体分子に属する部分核酸配列も含まれる。さらに別の一方で、本発明に関する抗体核酸の配列は、重鎖および軽鎖可変領域に属するＣＤＲ配列もさらに含む。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、抗原エピトープに結合する部位であり、本発明の文脈内で、ＣＤＲ配列はＩＭＧＴ／Ｖ−ＱＵＥＳＴ（http://imgt.cines.fr/textes/vquest/）を介して検証される。しかしながら、異なる解析法で得たＣＤＲ配列はわずかに異なる。
【００７９】
本発明の一態様は、抗体Ｂ６０−５５、ＢＩＩ６１−６２、Ｂ５０−６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖および軽鎖可変領域配列をコードする核酸分子に関する。抗体Ｂ６０−５５、ＢＩＩ６１−６２、Ｂ５０−６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖可変領域配列をコードする核酸分子は、それぞれ配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１および配列番号５９に対応する。抗体Ｂ６０−５５、ＢＩＩ６１−６２、Ｂ５０−６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１、およびＢ５０軽鎖可変領域配列をコードする核酸分子は、それぞれ配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６２、配列番号６５および配列番号６６に対応する。本発明は、抗体Ｂ６０−５５、ＢＩＩ６１−６２、Ｂ５０−６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖および軽鎖可変領域配列をコードする核酸分子の変異体または類似体にも関する。
【００８０】
他方で、本発明はまた、さまざまな分離された核酸分子変異体にも関する；具体的には、前記核酸変異体の配列は、以下の核酸配列と少なくとも７０％の類似性を示すはずである：配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号５９、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６２、配列番号６５および配列番号６６、ここで少なくとも７５％に達する類似性が好ましく、少なくとも８０％に達する類似性がより好ましく、少なくとも８５％に達する類似性がさらに好ましく、少なくとも９０％に達する類似性がさらにより好ましく、少なくとも９５％に達する類似性が最も好ましい。
【００８１】
本発明はさらに、配列番号４７、４９、５１、５３、５４、および５１のアミノ酸配列の形で抗体Ｂ６０−５５、ＢＩＩ６１−６２、Ｂ５０−６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖可変領域配列をコードする、対応する分離された核酸分子に関する。本発明はまた、配列番号４８、５０、５２、４８、５５および５６のアミノ酸配列の形で抗体Ｂ６０−５５、ＢＩＩ６１−６２、Ｂ５０−６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１、およびＢ５０軽鎖可変領域配列をコードする、対応する核酸分子にも関する。
【００８２】
本発明は、前述の核酸分子を含む組換え発現ベクターに関し、さらに、前記分子で形質転換された宿主細胞に関する。さらに、本発明は、前述の核酸分子を含む宿主細胞の特定の条件下での培養、引き続き、本発明に記載の抗体を得るための分離に使用される方法に関する。
【００８３】
抗体のアミノ酸配列
モノクローナル抗体ｍＡｂ  Ｂ６０−５５、ＢＩＩ６１−６２、Ｂ５０−６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖および軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、対応する核酸配列に由来してもよい。抗体ｍＡｂ  Ｂ６０−５５、ＢＩＩ６１−６２、Ｂ５０−６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０重鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４７、４９、５１、５３、５４および５１に対応する。抗体ｍＡｂ  Ｂ６０−５５、ＢＩＩ６１−６２、Ｂ５０−６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４８、５０、５２、４８、５５および５６に対応する。
【００８４】
一方で、本発明により提供される抗体の重鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４７、４９、５１、５３、５４および５１で与えられる配列と少なくとも７０％の類似性を示すはずであり、類似性は少なくとも８０％に達することが好ましく、類似性は少なくとも８５％に達することがより好ましく、類似性は少なくとも９０％に達することがさらにより好ましく、類似性は少なくとも９５％に達することが最も好ましい。
【００８５】
一方で、本発明により提供される抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号４８、５０、５２、４８、５５および５６に示される配列と少なくとも７０％の類似性を示すはずであり、類似性は少なくとも８０％に達することが好ましく、類似性は少なくとも８５％に達することがより好ましく、類似性は少なくとも９０％に達することがさらにより好ましく、類似性は少なくとも９５％に達することが最も好ましい。
【００８６】
抗体Ｂ６０−５５、ＢＩＩ６１−６２、Ｂ５０−６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０の重鎖および軽鎖可変領域のＣＤＲアミノ酸配列は次のように決定される：抗体Ｂ６０−５５の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１〜３に対応する。抗体Ｂ６０−５５の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４〜６に対応する。
【００８７】
抗体ＢＩＩ６１−６２の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号７〜９に対応する。抗体ＢＩＩ６１−６２の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１０〜１２に対応する。
【００８８】
抗体Ｂ５０−６の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３〜１５に対応する。抗体Ｂ５０−６の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６〜１８に対応する。
【００８９】
一方で、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその断片の重鎖のＣＤＲに含まれるアミノ酸配列は、配列番号１〜３、７〜９、１３〜１５、１９および２０の１つまたは複数のアミノ酸の変異、付加または欠失を介して得てもよい。好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は３を超えてはならない。より好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は２を超えてはならない。最も好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は１を超えてはならない。
【００９０】
一方で、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその断片の軽鎖のＣＤＲに含まれるアミノ酸配列は、配列番号４〜６、１０〜１２、１６〜１８、および２１の１つまたは複数のアミノ酸の変異、追加、または欠失を介して得てもよい。好ましくは、変異、付加、または欠失に供されるアミノ酸の数は３を超えてはならない。より好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は２を超えてはならない。最も好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は１を超えてはならない。
【００９１】
抗体Ｂ６０−５５、ＢＩＩ６１−６２、Ｂ５０−６、Ｂ６０、ＢＩＩ６１およびＢ５０の重鎖および軽鎖可変領域のＦＲアミノ酸配列は次のように決定される：抗体Ｂ６０−５５およびＢ６０の重鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号２２〜２５に対応する。軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号２６〜２９に対応する。
【００９２】
抗体ＢＩＩ６１−６２の重鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号３０〜３３に対応する。軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号３４〜３７に対応する。
【００９３】
抗体Ｂ５０−６およびＢ５０の重鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号３８〜４１に対応する。軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号４２〜４５に対応する。
【００９４】
抗体ＢＩＩ６１の重鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号３０〜３３に対応する。軽鎖可変領域のＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４配列は、それぞれ配列番号３４、４６、３６、３７に対応する。
【００９５】
一方で、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖可変領域のＦＲに含まれるアミノ酸配列は、配列番号２２〜４６の１つまたは複数のアミノ酸の変異、付加、または欠失を介して得てもよい。好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は３を超えてはならない。より好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は２を超えてはならない。最も好ましくは、変異、付加または欠失に供されるアミノ酸の数は１を超えてはならない。
【００９６】
前述の抗体、ＣＤＲ、またはフレーム領域に含まれるアミノ酸の変異、付加、または欠失後に得られる変異体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する能力を依然として保持するはずである。本発明は、抗原結合部分のそのような変異体もまた含む。
【００９７】
前述の抗体の変異体は、配列番号８５の完全な重鎖および配列番号８７の完全な軽鎖を有する抗体Ｂ６０−５５−１であり、重鎖のＣ末端の末端リジン残基は無くてもよい。Ｂ６０−５５−１の重鎖は、配列番号８６の核酸配列を利用することにより発現させることができる。核酸配列は、発現細胞株へのさらなる組み込みのために発現ベクターに組み込むことができる。Ｂ６０−５５−１の軽鎖は、配列番号８８の核酸配列を利用することにより発現させることができる。核酸配列は、発現細胞株へのさらなる組み込みのために発現ベクターに組み込むことができる。
【００９８】
Ｂ６０−５５−１抗体は、医薬的に許容される賦形剤またはアジュバントを添加することにより、医薬組成物として製剤化できる。組成物は、約２７５ｍＭのセリン、約１０ｍＭのヒスチジンを含み、約５．９のｐＨ値を有し得る。組成物は、約０．０５％のポリソルベート８０、約１％のＤ−マンニトール、約１２０ｍＭのＬ−プロリン、約１００ｍＭのＬ−セリン、約１０ｍＭのＬ−ヒスチジン−ＨＣｌを含み、約５．８のｐＨを有し得る。
【００９９】
本発明により構成されるモノクローナル抗体変異体は、従来の遺伝子工学法により得ることができる。当業者は、核酸変異を用いてＤＮＡ分子を修飾する方法を十分にわかっている。さらに、重鎖および軽鎖の変異体をコードする核酸分子もまた化学合成を介して得ることができる。
【０１００】
本発明の文脈において、配列同一性および配列類似性パーセンテージを決定するために使用されるアルゴリズムの例には、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０が含まれ、これらはそれぞれAltschul et al. (1977) Nucl. Acid. Res. 25: 3389-3402およびAltschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410に記載されている。例えば、文献において与えられるパラメータまたはデフォルトパラメータを使用して、本発明により構成されるアミノ酸配列のパーセンテージ類似性をＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０を使用して決定することができる。ＢＬＡＳＴ分析を実行できるソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を介して一般の任意のメンバーが得ることができる。
【０１０１】
本発明の文脈において、上記の所与のアミノ酸配列と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列には、本文中で概説された方法（例えば、標準パラメータを用いたＢＬＡＳＴ分析）が使用される場合、本発明により構成されるポリペプチド配列と少なくとも７０％同一であると決定される配列など、前記アミノ酸配列と基本的に同一であるポリペプチド配列が含まれ、少なくとも７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上を示す配列が好ましい。
【０１０２】
本発明の文脈において、「ベクター」という用語は、特定のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記タンパク質の発現を可能にする核酸送達媒体のタイプを指す。ベクターは、宿主細胞の形質転換、形質導入またはトランスフェクション後に前記宿主細胞内にそれが運ぶ、遺伝物質成分の発現を可能にする。例えば、ベクターには以下が含まれる：プラスミド；ファージミド；コスミド；酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）のような人工染色体；λファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージおよび動物ウイルス。ベクターとして使用される動物ウイルスの例には、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス（単純ヘルペスウイルスなど）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス、パポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が含まれる。ベクターには、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択エレメント、レポーター遺伝子を含む、いくつかの発現制御エレメントが含まれてもよい。さらに、ベクターには複製起点が含まれてもよい。ベクターはまた、ウイルス粒子、リポソームまたはタンパク質コートなどの細胞への侵入を促進する成分を含んでもよいが、前記成分は上記物質に限定されない。
【０１０３】
本発明の文脈において、「宿主細胞」という用語は、大腸菌もしくは枯草菌などの原核細胞、酵母細胞もしくはアスペルギルスなどの真菌細胞、ショウジョウバエＳ２細胞もしくはＳｆ９などの昆虫細胞、または線維芽細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＮＳ０細胞、ＨｅＬａ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＫ  ２９３細胞もしくは他のヒト細胞などの動物細胞を含む、多くの異なる細胞型を含む、ベクターが導入される細胞を指す。
【０１０４】
本発明により構成される抗体断片は、抗体分子全体の加水分解を介して得ることができる［Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods 24: 107-117 (1992)およびBrennan et al., Science 229: 81 (1985)を参照されたい］。さらに、これらの抗体断片は、組換え宿主細胞によって直接生成することもできる［Hudson, Curr. Opin. Immunol. 11: 548-557 (1999); Little et al., Immunol. Today, 21: 364-370 (2000)においてレビューされる］。例えば、Ｆａｂ’断片は、大腸菌細胞から直接得られるか、または化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる［Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)］。別の例として、ＧＣＮ４ロイシンジッパーを使用した連結を介してＦ（ａｂ’）２断片を得ることができる。さらに、Ｆｖ、Ｆａｂ、またはＦ（ａｂ’）２断片も、組換え宿主細胞培養培地から直接、単離できる。当業者は、抗体断片の生成についての他の技術を十分にわかっているであろう。
【０１０５】
本発明の文脈において、「特異的結合」という用語は、抗体と対応する抗原との間で起こる反応など、２つの分子の間のランダムでない結合反応を指す。ここで、一次抗原に結合する抗体の二次抗原に対する結合親和性は非常に弱いか、または検出不能である。特定の態様において、所与の抗原に特異的な抗体は、≦１０−５Ｍ（例えば、１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、または１０−１０Ｍ）の親和性（ＫＤ）で前記抗原に結合し、ここでＫＤは解離速度の結合速度に対する比（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を指し、この量は当業者がよく知る方法で測定することができる。
【０１０６】
本発明のいくつかの態様において、本発明により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、同時にマウスＰＤ−Ｌ１にも結合することができるが、ＰＤ−Ｌ２またはＢ７Ｈ３には結合しない。
【０１０７】
本発明のいくつかの態様において、本発明により構成される抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、ｈＰＤ−Ｌ１にｈＰＤ−１に対して競合的に結合することができる。
【０１０８】
本発明の文脈において、ＰＤ−Ｌ１関連疾患には、例えば、ＰＤ−Ｌ１に関与する腫瘍およびウイルス感染、特に高レベルのＰＤ−Ｌ１発現に関連する腫瘍およびウイルス感染が含まれる。
【０１０９】
本発明のいくつかの態様では、前述の腫瘍には、肺がん、卵巣がん、結腸がん、結腸直腸がん、メラノーマ、腎臓がん、膀胱がん、乳がん、肝臓がん、リンパ腫、血液悪性腫瘍、頭頸部がん、神経膠腫、胃がん、鼻咽頭がん、喉頭がん、子宮頸がん、子宮がん、骨肉腫、甲状腺がん、前立腺がんが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１０】
本発明のいくつかの態様において、前述のウイルス感染には、急性、亜急性または慢性のＨＢＶ、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染が含まれるが、これらに限定されない。
【０１１１】
本発明の文脈において、２０の従来のアミノ酸およびそれらの略語は従来の用法に従う。Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991))を参照されたい。
【発明の効果】
【０１１２】
本発明は、酵母ディスプレイ技術をスクリーニングおよび親和性成熟を組み合わせて使用して、良好な特異性および比較的高い親和性および安定性を示す完全ヒト抗ＰＤ−Ｌ１抗体を得る。ここで、前記抗体はヒトＰＤ−Ｌ１に特異的に結合することができ、または、同時にマウスＰＤ−Ｌ１にも結合することができるが、Ｂ７Ｈ３またはＰＤ−Ｌ２には結合しない；また、前記抗体は、活性化されたＴ細胞に結合して、Ｔ細胞の活性化をさらに増強し、腫瘍成長の顕著な阻害をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】精製した抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖによるｈＰＤ−Ｌ１／ｈＰＤ−１リガンド受容体結合の阻害。Ｘ軸はＥＧＦＰ蛍光強度を表し、Ｙ軸はＳＡ−ＰＥ蛍光強度を表す。Ａはブランク対照に対応し、Ｂは陰性対照に対応し、ＣはＢ５０  ｓｃＦｖに対応し、ＤはＢ６０  ｓｃＦｖに対応し、ＥはＢＩＩ６１  ｓｃＦｖに対応する。
【図２】親和性成熟スクリーニング後のｈＰＤ−Ｌ１酵母に対する親和性の増加を示す酵母ここで、Ｘ軸はｍｙｃの蛍光強度を表し（全抗体断片を発現する酵母に対応するｍｙｃ陽性）、Ｙ軸は抗原結合能を示す蛍光強度ＳＡ−ＡＰＣを表す。
【図３】親和性成熟後に得られた抗体がｈＰＤ−１と競合してｈＰＤ−Ｌ１に結合する能力の比較ここで、横軸は抗体濃度に対応し（単位：ｎｇ／ｍｌ）、縦軸はＯＤ値に対応する。Ａ）ＢＩＩ６１−６２とＢＩＩ６１の比較を示す、Ｂ）Ｂ５０とＢ５０−６の比較を示す、Ｃ）Ｂ６０とＢ６０−５５の比較を示す。
【図４】抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体およびｈＰＤ−Ｌ１結合能のＥＬＩＳＡ測定ここで、横軸は抗体濃度に対応し（単位：ｎｇ／ｍｌ）、縦軸はＯＤ値に対応する。
【図５】抗ｈＰＤ−Ｌ１およびｈＰＤ−１の、ｈＰＤ−Ｌ１との競合結合の競合ＥＬＩＳＡ測定ここで、横軸は抗体濃度に対応し（単位：ｎｇ／ｍｌ）、縦軸はＯＤ値に対応する。グラフ＃５はＢＩＩ６１−６２  ｍＡｂに対応し、グラフ＃２はＢ５０−６  ｍＡｂに対応し、グラフ＃３はＢ６０−５５  ｍＡｂに対応する。
【図６】ｈＰＤ−Ｌ１の抗ｈＰＤ−Ｌ１およびＣＤ８０競合結合の競合ＥＬＩＳＡ測定
【図７】抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体特異性の検出ここで、Ｘ軸はＥＧＦＰ蛍光強度を表し、Ｙ軸は対応する抗体結合の蛍光強度を表し、Ａはブランク対照に対応し、Ｂは陰性対照に対応し、ＣはＢＩＩ６１−６２  ｍＡｂに対応し、ＤはＢ６０−５５  ｍＡｂに対応し、ＥはＢ５０−６  ｍＡｂに対応する；（１）はｈＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰタンパク質に対応し、（２）はｈＢ７Ｈ３−ＥＧＦＰに対応し、（３）はｈＰＤ−Ｌ２−ＥＧＦＰタンパク質に対応する。
【図８】抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体とｍＰＤ−Ｌ１結合能。ここで、Ｘ軸はＥＧＦＰ蛍光強度を表し、Ｙ軸は対応する抗体結合の蛍光強度を表す。Ａはブランク対照に対応し、Ｂは陰性対照に対応し、ＣはＢ６０−５５  ｍＡｂに対応し、ＤはＢＩＩ６１−６２  ｍＡｂに対応し、ＥはＢ５０−６  ｍＡｂに対応する；（１）はｈＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰタンパク質に対応し、（２）はｍＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰタンパク質に対応する。
【図９】抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体とカニクイザルＰＤ−Ｌ１の結合能力
【図１０】抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体によるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化
【図１１】腫瘍成長における抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体Ｂ５０−６の阻害活性
【図１２】腫瘍成長における抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体Ｂ６０−５５およびＢＩＩ６１−６２の阻害活性ここで、Ａは、３  ｍｇ／ｋｇの用量を使用した場合の腫瘍成長のＢＩＩ６１−６２  ｍＡｂおよびＢ６０−５５阻害に対応する；Ｂは異なる用量を使用した場合の腫瘍成長におけるＢＩＩ６１−６２  ｍＡｂの阻害効果に対応する。
【図１３】Ｂ６０−５５と抗体２．４１Ｈ９０Ｐの安定性の比較ここで、Ａは経時的なＢ６０−５５および抗体２．４１Ｈ９０ＰのＩＣ５０値に対応する。Ｂは経時的な抗体二量体の割合に対応する；ＣはＢ６０−５５加速安定性試験で得られた競合ＥＬＩＳＡ結果に対応する。
【図１４】ＣａＰｕｒｅ−ＨＡでのＢ６０−５５−１のクロマトグラフィー；Ｂ６０−５５−１保持時間は約４５分である。
【図１５】ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ）カラムでの精製Ｂ６０−５５−１のサイズ排除クロマトグラフィー分析。
【図１６】精製Ｂ５０−５５−１のクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析：レーン１−還元条件下、レーン２−非還元条件下、レーン３−分子量マーカー。
【図１７】ＳＰＲ測定の代替捕捉アプローチ：パネルＡ  −  抗ヒトＩｇＧは抗体を捕捉するようにチップ上に固定化し；Ｂ６０−５５−１またはアテゾリズマブ（ａｔｅｚｏｌｉｚｕｍａｂ）を固定した抗体によって捕捉し、さまざまな濃度のＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓリガンドを適用した。パネルＢ  −  ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質をセンサーチップ上に直接固定し、さまざまな濃度のＢ６０−５５−１またはアテゾリズマブを適用した。パネルＣ  −  ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質およびＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓの両方の相互作用を調査するために、Ｂ６０−５５−１またはアテゾリズマブをチップ上に直接固定化した；  ＰＤ−Ｌ１−ＨｉｓタグまたはＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの濃度範囲を適用した。
【図１８】ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓタグリガンドの固定した比較薬抗体アテゾリズマブまたはＢ６０−５５−１への結合のセンサーグラム；アプローチは左パネルに模式的に示されており、キネティックパラメータは表にまとめた；抗ヒト捕捉抗体をセンサーチップに固定し、アテゾリズマブまたはＢ６０−５５−１を捕捉した後、さまざまな濃度のＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓリガンドを続けた：パネルＡ  −  アテゾリズマブの結果；パネルＢ  −  Ｂ６０−５５−１の結果。
【図１９】固定したＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質へのアテゾリズマブまたはＢ６０−５５−１の結合のセンサーグラム；アプローチは左パネルに模式的に示されており、キネティックパラメータは表にまとめた；さまざまな濃度のＢ６０−５５−１またはアテゾリズマブをチップに適用した。パネルＡ  −  アテゾリズマブの結果；パネルＢ  −  Ｂ６０−５５−１の結果。
【図２０】ＰＤ−Ｌ１−ＨｉｓまたはＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの固定化Ｂ６０−５５−１への結合のセンサーグラム；アプローチは左パネルに模式的に示されており、キネティックパラメータは表にまとめた。
【図２１】ＰＤ−Ｌ１−ＨｉｓまたはＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの固定化アテゾリズマブへの結合のセンサーグラム；アプローチは左パネルに模式的に示されており、キネティックパラメータは表にまとめた。
【図２２】Ｂ６０−５５−１とアテゾリズマブは、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＡＤＣＣ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｂｉｏａｓｓａｙ  Ｋｉｔの対照抗体と比較してＡＤＣＣ活性を有さない。
【図２３】Ｃ１ｑへのＢ６０−５５−１およびアテゾリズマブ結合の評価。
【図２４】ＭＬＲアッセイにおけるＴ細胞活性化に対するＢ６０−５５−１および比較薬抗体の濃度依存効力。
【図２５】薬物治療に際しての体重変化；矢印は投与時間を示す。
【図２６】薬物治療に際しての腫瘍容量阻害；矢印は投与時間を示す。
【図２７】グループ分け（ｎ＝８）後、２９日間の観察期間中の３つのグループにおける個々の腫瘍成長。
【図２８】投与後２９日目の腫瘍重量阻害。
【図２９】以下の表７に示す実験計画からの３つの試験グループの平均腫瘍容量。
【図３０】以下の表７において示されている実験計画の２１日目と４１日目での３つの試験グループの平均腫瘍容量；各日の３つのカラムは、グループ１（左）、２（中央）、３（右）に対応している。
【発明を実施するための形態】
【０１１４】
以下のセクションでは、本発明の態様を以下の例を介してさらに説明する；しかしながら、当業者によって理解されるべきであるように、以下の例は本発明を説明するためにのみ使用されるのであって、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。以下の例で指定されていない条件は、従来使用されている条件または製造業者が推奨する条件に設定されよう。製造業者が指定されていない試薬または機器はすべて、市販の標準製品に対応する。
【実施例１】
【０１１５】
組換えヒトＰＤ−Ｌ１およびＰＤ−１発現および関連ＥＧＦＰ細胞の調製。
ヒトＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔに含まれるＰＤ−Ｌ１（Ｑ９ＮＺＱ７）のアミノ酸配列（すなわち、Ｑ９ＮＺＱ７に含まれる残基１から残基２３８の配列）に基づいて得られた；ＩｇＧ１−Ｆｃの構造ドメインのアミノ酸配列は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔに含まれるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ１（ＩｇＧ１）（Ｐ０１８５７）の定常領域のアミノ酸配列に基づいて得られた（すなわち、Ｐ０１８５７に含まれる残基１０４から残基３３０の配列）；および、ＩｇＧ１−Ｆｃの構造ドメインのアミノ酸配列は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔに含まれるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ１（ＩｇＧ１）（Ｐ０１８６８）の定常領域のアミノ酸配列に基づいて得られた（すなわち、Ｐ０１８６８に含まれる残基９８から残基３２４の配列）。オンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を使用して、対応コードするＤＮＡ配列を設計し、ｈＰＤ−Ｌ１−ＦｃおよびｈＰＤ−Ｌ１−ｍｕＦｃ融合タンパク質遺伝子を得て、同じ方法を使用してｈＰＤ−１−Ｆｃ遺伝子を得た。増強した緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のアミノ酸配列（Ｃ５ＭＫＹ７）、ならびにヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（Ｑ９ＮＺＱ７）、マウスＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列（Ｑ９ＥＰ７３）およびヒトのアミノ酸配列ＰＤ−１（Ｑ１５１１６）は、タンパク質データベースＵｎｉｐｒｏｔに含まれる情報に基づいて得られた。オンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を使用して、対応コードするＤＮＡ配列を設計し、ＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰ融合タンパク質遺伝子を得て、同じ方法を使用してｈＰＤ−１−ＥＧＦＰおよびｍＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰ遺伝子を得た。対応するＤＮＡ断片は、人工合成によって得られた。合成した遺伝子配列は、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ製のＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩで二重切断され、市販のベクターｐｃＤＮＡ４／ｍｙｃ−ＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｖ８６３−２０）にクローンし、その後、プラスミドが正確に構築されて組換えプラスミドＤＮＡ；すなわち、ｐｃＤＮＡ４−ｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＰＤ−Ｌ１−ｍｕＦｃ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＰＤ１−Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＰＤ１−ＥＧＦＰおよびｐｃＤＮＡ４−ｍＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰが得られたことを確認するために配列決定を行った。
【０１１６】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、実験室で培養した樹状細胞（ＤＣ細胞）からヒトＰＤ−Ｌ２およびＢ７Ｈ３遺伝子を増幅した（前記ＤＣ細胞は、ＰＢＭＣから単離された単核細胞のＴＮＦ−α成熟により得られた）。使用した遺伝子増幅プライマーは以下の通りである：
ＰＤＬ２−Ｆ  ＨｉｎｄＩＩＩ：GCGCAAGCTTGCCACCATGATCTTCCTCCTGCTAATG（配列番号７４）、
ＰＤＬ２−Ｒ  ＥｃｏＩ：
GCCGAATTCGATAGCACTGTTCACTTCCCTC（配列番号７５）；
ｈＢ７Ｈ３−Ｆ  ＨｉｎｄＩＩＩ：GCGCAAGCTTGCCACCATGCTGCGTCGGCGGGGCAGC（配列番号７６）；
ｈＢ７Ｈ３−Ｒ  ＢａｍＨＩ：GCGCGAATTCGGCTATTTCTTGTCCATCATCTTC（配列番号７７）
【０１１７】
次いで、得られたＰＣＲ産物をＦｅｒｍｅｎｔａｓ  ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩを使用して二重切断し、前もって構築されたｐｃＤＮＡ４−ｈＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰにクローニング後、プラスミドが正確に構築され組換えプラスミドＤＮＡ；すなわち、ｐｃＤＮＡ４−ｈＰＤ−Ｌ２−ＥＧＦＰおよびｐｃＤＮＡ４−ｈＢ７Ｈ３−ＥＧＦＰが得られたことを確認するために配列決定を行った。
【０１１８】
対応するＥＧＦＰ組換えプラスミドをＨＥＫ２９３［ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１５７３（商標）］細胞にトランスフェクトし、ｈＰＤ−Ｌ１、ｍＰＤ−Ｌ１、ｈＰＤ−Ｌ２およびｈＢ７Ｈ３の発現を確認するためにトランスフェクションの４８時間後に蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を実行した。
【０１１９】
タンパク質産生のために、ｐｃＤＮＡ４−ｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ４−ｈＰＤ−Ｌ１−ｍｕＦｃ、およびｐｃＤＮＡ４−ｈＰＤ１−Ｆｃを一時的にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。組換え発現プラスミドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地に希釈し、形質転換に必要なＰＥＩ（ポリエチレンイミン）溶液に加えた後、各プラスミド／ＰＥＩ混合物をそれぞれ別々に細胞懸濁液に加え、３７℃、１０％ＣＯ２および９０ｒｐｍで培養した；同時に、５０μｇ／Ｌのインスリン様成長因子（ＩＧＦ−１）の補充添加が行われた。その４時間後、ＥＸ２９３培地、２ｍＭグルタミン、および５０μｇ／Ｌ  ＩＧＦ−１の補充添加を行い、１３５ｒｐｍで培養を継続した。さらに２４時間後、３．８ｍＭバルプロ酸ナトリウム（ＶＰＡ）を添加した。５〜６日間の培養後、一過性発現培養液の上清を回収し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを使用して一次精製し、以下の例に使用するためにｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ、ｈＰＤ−Ｌ１−ｍｕＦｃおよびｈＰＤ−１−Ｆｃタンパク質サンプルを得た。このようにして得られたタンパク質サンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用した予備試験に供し、標的バンドが明らかに見られた。
【実施例２】
【０１２０】
酵母ディスプレイライブラリーにおける抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体のスクリーニング、クローニング発現および同定。
酵母ディスプレイ技術を使用して、ＰＤ−Ｌ１についての完全ヒト抗体をスクリーニングした。２１人の健康なヒト対象から得られた脾臓およびリンパ節ＩｇＭおよびＩｇＧ  ｃＤＮＡに含まれるＶＨおよびＶＬ遺伝子のクローニングを行って、ｓｃＦＶ酵母ディスプレイライブラリーを構築した（ＶＨとＶＬ間の連結配列は連結ペプチド
GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号６７）
および連結ペプチドであった）ライブラリーのストレージ容量は５×１０８であった。１０倍容量の酵母ライブラリーを起こし、その表面に抗体が発現するように酵母を誘導した。１００ｎＭのビオチン化ｈＰＤ−Ｌ１抗原磁気ビーズを使用して２ラウンドの濃縮を行い、その後、抗ｍｙｃ抗体とビオチン化ｈＰＤ−Ｌ１フローソーティングを使用してさらに２ラウンドの濃縮を行った。このようにして得られた酵母をプレーティングし、単一クローンを採った。増幅および発現の誘導に供されたモノクローナル酵母は、抗ｍｙｃ抗体ならびにビオチン化ｈＰＤ−Ｌ１または対照抗原ｈＰＤ−１を使用した染色分析にさらに供され、抗原−陽性または対照−陰性である酵母は陽性酵母として評価された。
【０１２１】
ＦＡＣＳによって確認した酵母クローンを、以下のＰＣＲプライマーを使用した酵母コロニーＰＣＲおよび配列決定に供した：
ｐＮＬ６−Ｆ：
GTACGAGCTAAAAGTACAGTG（配列番号７８）；
ｐＮＬ６−Ｒ：
TAGATACCCATACGACGTTC（配列番号７９）；
ここで、使用された配列決定プライマーはｐＮＬ６−Ｒであった。配列決定後に得られた配列結果は、ＢｉｏＥｄｉｔソフトウェアパッケージを使用したアライメント解析に供した。
【０１２２】
上記のように得られた単鎖抗体ｓｃＦｖ遺伝子と以前に得られたＩｇＧ１−Ｆｃ遺伝子を融合し、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ酵素の二重切断を使用して市販ベクターｐＥＥ６．４（Ｌｏｎｚａ）にクローニングし、その後、標準的な分子クローニング手順に従ってクローニングおよびプラスミドミニプレップを行った。抽出されたプラスミドをＨＥＫ２９３細胞で一時的に発現し、プロテインＡカラムを使用して精製した。
【０１２３】
ｈＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰ細胞を０．５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液に再懸濁し、その後、前述の精製抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ抗体を加え、一方で同時に、２μｇのｈＩｇＧＩタンパク質を陰性対照として使用し、ｈＰＤ−１−Ｆｃを陽性対照に加え、対応する対照を確立した。使用した二次抗体は、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅの抗ｈＩｇ−ＰＥであった。染色が完了した後、フローサイトメトリーで検出を行った。上記の方法を使用して、細胞表面ＰＤ−Ｌ１抗原に結合できる抗体を同定した。
【０１２４】
ｈＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰ細胞を０．５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液に再懸濁し、その後、前述の精製抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ抗体を添加し、一方で同時に、２μｇのｈＩｇＧ１タンパク質を陰性対照として使用して陰性対照を確立した；０．３μｇのｈＰＤ−１−Ｆｃ−ビオチンをすべてのサンプルに加え、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＳＡ−ＰＥを二次抗体として使用した；染色が完了した後、フローサイトメトリーで検出を行い、結果を図１に示す。上記の方法を使用して、細胞表面ＰＤ−Ｌ１抗原とＰＤ−１結合をブロックできる抗体を特定した。
【０１２５】
スクリーニングと同定の後、好ましい特性を示した３つの抗体株が得られた：Ｂ５０、Ｂ６０およびＢＩＩ６１。結果からわかるように、３つの抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体株すべてがｈＰＤ−１受容体との結合をブロックすることができた。
【０１２６】
連結ペプチド配列
GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号６７）
は前述の抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間に含まれていた。
【０１２７】
Ｂ５０重鎖可変領域のアミノ酸配列は：
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTKAAWYWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSKWYNDYADSVKSRLTINPDTSKNQFSLQLKSVSPEDTAVYYCARGQYTAFDIWGQGTMVTVSS（配列番号５１）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号１３〜１５に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号３８〜４１に対応する；
【０１２８】
対応するＤＮＡ配列は：
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCACCAAGGCTGCTTGGTACTGGATCAGGCAGTCCCTTCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTTCCGGTCCAAGTGGTATAATGACTATGCCGACTCTGTGAAAAGTCGATTAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAATTAAGTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGCAATACACTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA（配列番号５９）；
【０１２９】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は：
QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGTSSDVGGYDLVSWYQQYPGQAPRLIIYEVIKRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL（配列番号５６）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号２１、１７および１８に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号４２〜４５に対応する；
【０１３０】
ならびに対応するＤＮＡ配列は：
CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTATCTCCTGTACTGGCACCAGTAGTGATGTTGGAGGTTATGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTACCCGGCCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGCTGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTTCATGGTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAGCTGACCGTCCTC（配列番号６６）
【０１３１】
Ｂ６０重鎖可変領域のアミノ酸配列は：
QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFSYGWFDYWGQGTLVTVSS（配列番号５３）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号１、２および１９に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号２２〜２５に対応する；
【０１３２】
対応するＤＮＡ配列は：
CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAGCTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号６０）；
【０１３３】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIK（配列番号４８）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号４〜６に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号２６〜２９に対応する；
【０１３４】
ならびに対応するＤＮＡ配列は：
GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGATTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAA（配列番号６２）
【０１３５】
ＢＩＩ６１重鎖可変領域のアミノ酸配列は：
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYDDYAVSVKSRISINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTVSS（配列番号５４）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２０および３を構成し、それぞれ配列番号７、２および９に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号３０〜３３に対応する。
【０１３６】
対応するＤＮＡ配列は：
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTATGCAGTATCTGTGAAAAGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATATTTTGTCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号６１）；
【０１３７】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は：
DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYGASSLQSGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK（配列番号５５）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号１０〜１２に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号３４、４６、３６および３７に対応する；
【０１３８】
対応するＤＮＡ配列は：
GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCTAAGCTCCTGATCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTACTACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATA TCAAA（配列番号６５）
【実施例３】
【０１３９】
抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ親和性改善酵母ライブラリーの構築。
テンプレートとしてｐＥＥ６．４−Ｂ５０−Ｆｃ、ｐＥＥ６．４−Ｂ６０−ＦｃおよびｐＥＥ６．４−ＢＩＩ６１−Ｆｃプラスミド、ならびに：
ｐＥＥ６．４−Ｆ：
TCTGGTGGTGGTGGTTCTGCTAGC（配列番号８０）および
ｃＭｙｃ−ＢＢＸｈｏＩ：GCCAGATCTCGAGCTATTACAAGTCTTCTTCAGAAATAAGCTTTTGTTCTAGAATTCCG（配列番号８１）
をプライマーとして使用して、標準ＰＣＲ反応をそれぞれ行った。ＰＣＲ産物を精製し、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＮｈｅＩおよびＢｇｌＩＩを用いて市販のｐＣＴ３０２ベクター市販（ａｄｄｇｅｎｅ：＃４１８４５）にクローニングして、組換えプラスミドｐＣＴ３０２−Ｂ５０、ｐＣＴ３０２−Ｂ６０およびｐＣＴ３０２−ＢＩＩ６１を得た。次に、Ginger et al. (2006) Nat Protoc 1(2):755-68に詳述されている方法に基づいて、エラープローンＰＣＲを使用し、ｓｃＦｖランダム変異ＰＣＲ産物を得た。使用したプライマーは：
Ｔ７プロショート：
TAATACGACTCACTATAGGG（配列番号８２）および
スプライス４／Ｌ：
GGCAGCCCCATAAACACACAGTAT（配列番号８３）
【０１４０】
このようにして得られたＰＣＲ産物はＦｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｅｎｅＪＥＴ  ＤＮＡ精製キットを使用して精製し、エタノール沈殿により１μｇ／μｌを超える濃度に濃縮した。Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを使用して市販ベクターｐＣＴ３０２を二重切断し、同時にＦｅｒｍｅｎｔａｓ  ＦａｓｔＡＰ脱リン酸化酵素を使用してベクターの脱リン酸化を行い、その後Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＧｅｎｅＪＥＴ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用して精製を再び行い、エタノール沈殿を行って、産物を１μｇ／μｌを超える濃度に濃縮した。酵母の電気形質転換およびインビボ組換えをGinger et al. (2006) Nat. Protoc. 1(2): 755-68に記載された方法に従って行い、親和性成熟酵母ライブラリーを得た。
【実施例４】
【０１４１】
親和性が改善された抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖを発現する酵母のスクリーニング。
上記のように得られた親和性成熟酵母ライブラリーを１０ｎＭおよび１ｎＭのｈＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質を使用した２ラウンドのフローソーティングに供し、このようにして得られた酵母産物をプレーティングし、同定のためにモノクローンを採った。低濃度の抗原染色を使用してフロー染色を行い、以前に得た野生型酵母を対照として使用することにより、親和性が増加した酵母モノクローンを同定した。
【０１４２】
上記の方法論を使用し、ＦＡＣＳ検証を通過した酵母クローンを酵母コロニーＰＣＲおよび配列決定に供した。親和性成熟後に得られたｓｃＦｖ遺伝子と前に得られたＩｇＧ１−Ｆｃ遺伝子を融合し、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ酵素の二重切断を使用して市販ベクターｐＥＥ６．４にクローニングし、その後標準分子クローニング手順に従ってクローニングとプラスミドミニプレップを行った。抽出されたプラスミドは、ＨＥＫ２９３細胞内に一時的に発現され、プロテインＡカラムを使用して精製された。
【０１４３】
抗体結合能力およびブロッキング能力は、実施例２に記載の方法を使用して測定した。
【０１４４】
結合能力試験の結果については、図２を参照されたい；結果は、親和性成熟後に得られた３つの抗体株が親和性を著しく増加させたことを示している。
【０１４５】
ブロッキング能力試験の結果については、図３を参照されたい；結果は、親和性成熟後に得られた３つの抗体株について得られたＰＤ−１との競合におけるＰＤ−Ｌ１への競合的結合のＩＣ５０値は、ＢＩＩ６１−６２について０．８３７μｇ／ｍｌ（ＢＩＩ６１について０．８８４μｇ／ｍｌ）、Ｂ５０−６について４．５６μｇ／ｍｌ（Ｂ５０について５．６３μｇ／ｍｌ）、Ｂ６０−５５について１．１４μｇ／ｍｌ（Ｂ６０について１６．８μｇ／ｍｌ）であることを示している。
【０１４６】
親和性成熟後、親和性の増加を示す３つの抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ抗体配列、すなわちＢ５０−６、Ｂ６０−５５およびＢＩＩ６１−６２が得られた。Ｂ５０と比較して、Ｂ５０−６はそのＶＬ  ＣＤＲ１内でＤからＮへのアミノ酸変異を示した；Ｂ６０と比較して、Ｂ６０−５５はそのＶＨ  ＣＤＲ３内でＳからＮへのアミノ酸変異を示した；および、ＢＩＩ６１と比較して、ＢＩＩ６１−６２は、そのＶＨ  ＣＤＲ２内でＳからＧへのアミノ酸変異、ならびにそのＶＬ  ＦＲ２内でＩからＶへのアミノ酸変異を示した。連結ペプチド配列
GGGGSGGGGSGGGGS（配列番号６７）
が前述の抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域の間に含まれていた。
【０１４７】
Ｂ５０−６重鎖可変領域のアミノ酸配列は：
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSTKAAWYWIRQSPSRGLEWLGRTYFRSKWYNDYADSVKSRLTINPDTSKNQFSLQLKSVSPEDTAVYYCARGQYTAFDIWGQGTMVTVSS（配列番号５１）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号１３〜１５に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号３８〜４１に対応する；
【０１４８】
対応するＤＮＡ配列は：
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCACCAAGGCTGCTTGGTACTGGATCAGGCAGTCCCTTCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATACTTCCGGTCCAAGTGGTATAATGACTATGCCGACTCTGTGAAAAGTCGATTAACCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAATTAAGTCTGTGAGTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAGGGCAATACACTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCA（配列番号５９）；
【０１４９】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は：
QSALIQPASVSGSPGQSITISCTGTSSNVGGYDLVSWYQQYPGQAPRLIIYEVIKRPSGISDRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYAGRRLHGVFGGGTQLTVL（配列番号５２）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号１６〜１８に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号４２〜４５に対応する。
【０１５０】
対応するＤＮＡ配列は：
CAGTCTGCTCTGATTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCCCCTGGACAGTCGATCACTATCTCCTGTACTGGCACCAGTAGTAATGTTGGAGGTTATGACCTTGTCTCCTGGTACCAACAGTACCCGGGCCAAGCCCCCAGACTCATCATTTATGAGGTCATTAAGCGGCCCTCAGGGATTTCTGATCGCTTCTCTGGTTCCAAGTCTGGCACACGGCCTCCCTGACAATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTATTGCAGCTCATATGCAGGTAGACGTCTTCATGGTGTGTTCGGAGGAGGCACCCAG CTGACCGTCCTC（配列番号６４）；
【０１５１】
Ｂ６０−５５重鎖可変領域のアミノ酸配列は：
QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFNYGWFDYWGQGTLVTVSS（配列番号４７）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号１〜３に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号２２〜２５に対応する；
【０１５２】
対応するＤＮＡ配列は：
CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAACTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号５７）；
【０１５３】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKLGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIK（配列番号４８）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号４〜６に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号２６〜２９に対応する；
【０１５４】
対応するＤＮＡ配列は：
GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACTTGGCCAGGTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAAT CAAA（配列番号６２）；
【０１５５】
ＢＩＩ６１−６２重鎖可変領域のアミノ酸配列は：
QVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSVSSNSASWNWIRQSPSRGLEWLGRTYYRSKWYDDYAVSVKGRISINPDTSKNQFSLQLNSVTPEDTAVYYCARSQGRYFVNYGMDVWGQGTTVTV SS（配列番号４９）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号７〜９に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号３０〜３３に対応する；
【０１５６】
対応するＤＮＡ配列は：
CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGGTCCAGGACTGGTGAAGCCCTCGCAGACCCTCTCACTCACCTGTGCCATCTCCGGGGACAGTGTCTCTAGCAACAGTGCTTCTTGGAACTGGATCAGGCAGTCCCATCGAGAGGCCTTGAGTGGCTGGGAAGGACATATTACAGGTCCAAATGGTATGATGATTATGCAGTATCTGTGAAAGGTCGAATCAGCATCAACCCAGACACATCCAAGAACCAGTTCTCCCTGCAGTGAACTCTGTGACTCCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCAAGAAGCCAGGGACGATATTTTGTCAACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA（配列番号５８）；
【０１５７】
軽鎖可変領域のアミノ酸配列は：
DIRLTQSPSSLSASVGDRITITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLVYGASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQSYFTPRGITFGPGTKVDIK（配列番号５０）；
ここで、下線部はＣＤＲ１、２および３を構成し、それぞれ配列番号１０〜１２に対応し、非下線部はＦＲ１、２、３および４を構成し、それぞれ配列番号３４〜３７に対応する；
【０１５８】
ならびに対応するＤＮＡ配列は：
GACATCCGGTTGACCCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAATCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGTTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCTAAGCTCCTGGTCTATGGTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATGTTGCAACTACTACTGTCAACAGAGTTACTTTACCCCCCGCGGGATCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA（配列番号６３）
【実施例５】
【０１５９】
ｓｃＦｖ抗体のＩｇＧ抗体へのフォーマット。
Ｕｎｉｐｒｏｔタンパク質データベース（Ｐ０１８５７）に含まれるヒト免疫グロブリンｇａｍｍａ１（ＩｇＧ１）の定常領域のアミノ酸配列に基づいて、ヒトＩｇＧ１定常領域のアミノ酸配列が得られた。ヒトＩｇＧ１定常領域遺伝子を得るため、オンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（ｈｔｔｐ：／／ｈｅｌｉｘｗｅｂ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｄｎａｗｏｒｋｓ／）を使用して対応するエンコードＤＮＡ配列を設計し、スクリーニングにより得られたＢ５０−６、Ｂ６０−５５およびＢＩＩ６１−６１の重鎖可変領域のＶＨ配列をヒトＩｇＧ１定常領域遺伝子とともにスプライスし、同時にＶＨの５’末端に以下のシグナルペプチド配列を加えた：
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT（配列番号８４）；
【０１６０】
スプライスされた遺伝子を合成し、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ酵素を使用して二重切断を行い、遺伝子をベクターｐＥＥ６．４にクローニングしてｐＥＥ６．４−Ｂ５０−６ＨＣ；ｐＥＥ６．４−Ｂ６０−５５ＨＣ；およびｐＥＥ６．４−ＢＩＩ６１−６２ＨＣを得た。Ｕｎｉｐｒｏｔタンパク質データベース（Ｐ０１８３４）に含まれるヒト免疫グロブリンカッパの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、ヒトカッパ軽鎖定常領域のアミノ酸配列が得られた。ヒトカッパ軽鎖定常領域遺伝子を得るため、オンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を使用して対応するエンコードＤＮＡ配列を設計し、スクリーニングにより得られたＢ６０−５５およびＢＩＩ６１−６１の重鎖可変領域のＶＬ配列をヒトカッパ軽鎖定常領域遺伝子とともにスプライスし、同時にＶＬの５’末端に以下のシグナルペプチド配列を加えた：
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT（配列番号８４）；
【０１６１】
ヒトラムダ（λ）軽鎖定常領域遺伝子を得るため、オンラインツールＤＮＡｗｏｒｋｓ（http://helixweb.nih.gov/dnaworks/）を使用して対応するエンコードＤＮＡ配列を設計し、スクリーニングにより得られたＢ５０−６の軽鎖可変領域のＶＬ配列をヒトラムダ軽鎖定常領域遺伝子とともにスプライスし、同時にＶＬの５’末端に以下のシグナルペプチド配列を加えた：
ATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACCGGT（配列番号８４）；
【０１６２】
スプライスされた遺伝子を合成し、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ酵素を使用して二重切断を行い、遺伝子をベクターｐＥＥ１２．４（Ｌｏｎｚａ）にクローニングしてｐＥＥ１２．４−Ｂ５０−６ＬＣ；ｐＥＥ１２．４−Ｂ６０−５５ＬＣ；およびｐＥＥ１２．４−ＢＩＩ６１−６２ＬＣを得た。
【０１６３】
上記のようにして得られた重鎖および軽鎖プラスミドは、ＡｉｄＬａｂ  Ｍａｘｉｐｒｅｐキット（ＰＬ１４）を使用して調製された。組換えにより構築された軽鎖および重鎖プラスミドをＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトし、抗体を発現させた。組換え発現プラスミドをＦｒｅｅｓｔｙｌｅ２９３培地で希釈し、形質転換に必要なＰＥＩ（ポリエチレンイミン）溶液に加えた後、各プラスミド／ＰＥＩ混合物を別々に細胞懸濁液に加え、３７℃、１０％ＣＯ２および９０ｒｐｍで培養した；同時に、５０μｇ／ＩＧＦ−１の補充添加を行った。４時間後、ＥＸ２９３培地、２ｍＭグルタミン、５０μｇ／Ｌ  ＩＧＦ−１の補充添加を行い、１３５ｒｐｍで培養し続けた。さらなる２４時間後、３．８ｍＭ  ＶＰＡを添加した。５〜６日間の培養後、一過性発現培養の上清を収集し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィーを使用して、抗ｈＰＤ−Ｌ１  Ｂ５０−６、Ｂ６０−５５およびＢＩＩ６１−６２  ｍＡｂ抗体を精製および取得した。
【０１６４】
ＩｇＧ１鎖定常領域のアミノ酸配列は：
ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK（配列番号６８）；
【０１６５】
ＩｇＧ１鎖定常領域の核酸配列は：
GCCAGCACTAAGGGGCCCTCTGTGTTTCCACTCGCCCCTTCTAGCAAAAGCACTTCCGGAGGCACTGCAGCACTCGGGTGTCTGGTCAAAGATTATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGAGCTGGAACTTGGCGCCCTCACCTCCGGGGTTCACACCTTTCCAGCCGTCCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTCGTTACCGTGCCATCCTCTTCTCTGGGGACCCAGACATACATCTGCAATGTCACCATAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTCGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACACACACCTGCCCTCCATGCCCCGCACCTGAACTCCTGGGCGGGCCTTCCGTTTTCCTGTTTCCTCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATTAGCCGCACCCCCGAAGTCACTTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCAGAAGTTAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGGGTCGAGGTGCACAATGCTAAACAAAGCCCAGGGAGGAGCAATATAACTCCACATACAGAGTGGTGTCCGTTCTGACAGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCACTGCCAGCCCCATAGAGAAGACAATCTCTAAAGCTAAAGGCCAACCACGCGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCATCCAGGGACGAACTGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACTTGTCTCGTCAAAGGATTCTACCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCCAACGGCCAACCAGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCAGTCCTGGACTCTGATGGGAGCTTTTTCCTGTATTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGTGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTGCATAACCACTATACCCAGAAAAGCCTCAGCCTGTCCCCCGGGAAATAATGA（配列番号６９）；
【０１６６】
カッパ鎖定常領域のアミノ酸配列は：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC（配列番号７０）；
【０１６７】
カッパ鎖定常領域の核酸配列は：
CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGTACCGCTAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTATCCACGGGAGGCTAAGGTGCAGTGGAAAGGGACAATGCCCTCCAGAGCGGAAATAGCCAAGAGTCCGTTACCGAACAGGACTCTAAAGACTCTACATACTCCCTGTCCTCCACACTGACCCTCTCCAAGGCCGACTATGAGAAACACAAGGTTTACCATGCGAGGTCACACACCAGGGACTCTCCTCTCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGAGAATGC（配列番号７１）；
【０１６８】
Ｂ５０−６軽鎖（ラムダ）定常領域のアミノ酸配列は：
GQPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLVSDFYPGAVTVAWKADGSPVKVGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCRVTHEGSTVEKTVAPAECS（配列番号７２）；
【０１６９】
ならびにＢ５０−６軽鎖（ラムダ）定常領域核酸配列は：
GGTCAGCCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCACCCTCCTCTGAGGAGCTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCGTAAGTGACTTCTACCCGGGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGTGGGAGTGGAGACCACCAAACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTATGCGGCCAGCAGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACGCTGCCGGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTGCAGAATGCTCT（配列番号７３）
【実施例６】
【０１７０】
抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂ特性の検証。
精製抗ｈＰＤ−ＬＩ抗体およびｈＰＤ−Ｌ１結合能の測定（ＥＬＩＳＡ法）：
コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６）を使用してｈＰＤ−ＬＩ−ｍｕＦｃを２μｇ／ｍｌに希釈し、その後、溶液を１００μＬ／ウェルに分注し、４℃で一晩静置した。次に、プレート上の液体を捨て、ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｖ／Ｖ）を使用して洗浄を行い、サンプルを３％ＢＳＡ−ＰＢＳで１時間シールした。抗体Ｂ５０−６ｍＡｂ、Ｂ６０−５５ｍＡｂ、およびＢＩＩ６１−６２ｍＡｂは、対照として使用される希釈液（１％ＢＳＡ−ＰＢＳ）で、それぞれ２０００ｎｇ／ｍｌから始まる２倍連続希釈に供して合計１１種類の濃度とし、３７℃で２時間、インキュベーションを行った。次いで、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ（ヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰコンジュゲート）を添加し、１時間、インキュベーションを行った。次に、可溶性の単一成分ＴＭＢ発色基質溶液を添加し、各サンプルを室温で暗い環境で５〜１０分間展開した。２ＮＨ２ＳＯ４を５０μＬ／ウェルで添加して、展開反応を停止した。次に、各サンプルをＭＤ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４マイクロプレートリーダー上に置き、ＯＤ４５０ｎｍ−６５０ｎｍの値を読み取り、その後、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４ソフトウェアパッケージを使用してデータ処理とマッピング分析を行った；結果を図４に示す。
【０１７１】
上記の方法を使用して、３つの抗体株の抗原結合ＥＣ５０値は、４０μｇ／ｍｌ（Ｂ６０−５５  ｍＡｂ）、１８．３μｇ／ｍｌ（ＢＩＩ６１−６２  ｍＡｂ）、および２８．１μｇ／ｍｌ（Ｂ５０−６  ｍＡｂ）と決定された。
【０１７２】
精製された抗ｈＰＤ−ＬＩ抗体およびｈＰＤ−Ｌ１結合キネティクス（ＳＰＲ）の測定：
組換えヒトＰＤ−Ｌ１に関する抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ｂ５０−６  ｍＡｂ、ＢＩＩ６１−６２  ｍＡｂおよびＢ６０−５５  ｍＡｂの結合キネティクスの測定は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｘ１００を使用して行われた表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）を使用して測定された。およそ１０００応答単位（ＲＵ）を得るために、組換えｈＰＤ−Ｌ１−ＦｃをＣＭ５バイオセンサーチップに直接コーティングした。キネティクス測定のために、ＨＢＳ−ＥＰ＋１×緩衝液（ＧＥ、カタログ番号：ＢＲ−１００６−６９）での３倍連続希釈（１．３７ｎｍから１０００ｎｍ）で抗体を希釈し、サンプリングを２５℃で１２０秒間行い、３０分の解離時間で、再生は１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．０）で１２０秒間行った。単純な１対１のＬａｎｇｕｉｒ結合モデル（Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェアバージョン３．２）を使用して、結合率（ｋｏｎ）と解離率（ｋｏｆｆ）を計算した。平衡解離定数（ｋＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。
【０１７３】
測定された抗ＰＤ−Ｌ１結合親和性値については、表１を参照されたい。
【０１７４】
【表１】
2020517239.tif 000003
【０１７５】
ｈＰＤ−１と競合したｈＰＤ−Ｌ１についての精製抗ｈＰＤ−ＬＩ抗体結合能の測定：
コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６）を使用してｈＰＤ−Ｌ１−ｈＩｇＧを５μｇ／ｍｌに希釈した後、溶液を４℃で一晩静置した。ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｖ／Ｖ）を使用して洗浄を行い、サンプルを３％ＢＳＡ−ＰＢＳで１時間シールした。測定待ちの抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの濃度を１００μｇ／ｍｌに希釈し、その後１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（１０μｇ／ｍｌのｈＰＤ−１−ｈＩｇＧ−ビオチンを含む）を用い、合計９種類の希釈液で１：６連続希釈し、希釈液を３７℃で２時間静置した。プレートを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートストレプトアビジン（ＳＡ−ＨＲＰ）を添加し、サンプルを室温で１．５時間インキュベートした。次に、可溶性の単一成分ＴＭＢ発色基質溶液を加え、各サンプルを室温、暗室環境で５〜１０分間展開し、その後２ＮＨ２ＳＯ４を加えて展開反応を停止した。次に、各サンプルをＭＤ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４マイクロプレートリーダー上に置き、ＯＤ４５０ｎｍ−６５０ｎｍの値を読み取り、その後、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４ソフトウェアパッケージを使用してデータ処理とマッピング分析を行った；また、測定データとＩＣ５０値に基づいて抗体の競合性を分析し、結果を図５に示す。
【０１７６】
上記の方法を使用して、ＰＤ−１に関する３つの抗体株のＰＤ−Ｌ１についての競合抗原結合ＩＣ５０値を０．２５５μｇ／ｍｌ  １．７ｎＭ（Ｂ６０−５５）、０．２４μｇ／ｍｌ  １．６ｎＭ（ＢＩＩ６１−６２）、および１．７６μｇ／ｍｌ  １１．７ｎＭ（Ｂ５０−６）と決定した。
【０１７７】
ＣＤ８０と競合するｈＰＤ−Ｌ１についての精製抗ｈＰＤ−ＬＩ抗体結合能の測定：
スクリーニングによって得られた３つの抗体株、Ｂ６０−５５、ＢＩＩ６１−６２およびＢ５０−６を競合ＥＬＩＳＡ法により、ＰＤ−Ｌ１およびＣＤ８０結合をブロックできるか否かを判定するために評価した。使用した特定の方法は以下の通りである：コーティング緩衝液（５０ｍＭ炭酸塩−重炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６）を使用してｈＰＤ−Ｌ１−ｈＦｃを５μｇ／ｍｌに希釈し、その後、溶液を４℃で一晩静置した。ＰＢＳＴ（ｐＨ７．４、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｖ／Ｖ）を使用して洗浄を行い、サンプルを３％ＢＳＡ−ＰＢＳで１時間シールした。測定待ちの抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂの濃度を１００μｇ／ｍｌに希釈し、その後１％ＢＳＡ−ＰＢＳＴ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（１００μｇ／ｍｌのｈＣＤ８０−ｈＦｃ−ビオチン、Ｒ＆Ｄ：１４０−Ｂ１−１００を含む）を使用して、合計９種類の希釈液に１：６連続希釈を行い、希釈液を３７℃で２時間静置した。プレートを洗浄した後、西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン−ビオチン（ＳＡ−ＨＲＰコンジュゲート）を加え、サンプルを室温で１．５時間インキュベートした。次に、可溶性の単一成分ＴＭＢ発色基質溶液を加え、各サンプルを室温、暗室環境で５〜１０分間展開し、その後２ＮＨ２ＳＯ４を加えて展開反応を停止した。次に、各サンプルをＭＤ  ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ３８４マイクロプレートリーダー上に置き、ＯＤ４５０ｎｍ−６５０ｎｍの値を読み取り、その後、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ５．４ソフトウェアパッケージを使用してデータ処理とマッピング分析を行った；また、測定データとＩＣ５０値に基づいて抗体の競合性を分析し、結果を図６に示す。
【０１７８】
上記の方法を使用して、ＣＤ８０に関する３つの抗体株のＰＤ−Ｌ１についての競合抗原結合ＩＣ５０値を０．５４３μｇ／ｍｌ（Ｂ６０−５５）、０．７０９μｇ／ｍｌ（ＢＩＩ６１−６２）、および０．５５３μｇ／ｍｌ  １１．７ｎＭ（Ｂ５０−６）と決定した。
【０１７９】
ＰＤ−Ｌ１が特異的に認識されるか否かを判定する検証：精製された抗ｈＰＤ−ＬＩのｈＰＤ−Ｌ１、ｈＰＤ−Ｌ２およびｈＢ７Ｈ３との結合
実施例１で構築されたｈＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰ、ｈＢ７Ｈ３−ＥＧＦＰおよびｈＰＤ−Ｌ２−ＥＧＦＰを含むＨＥＫ２９３細胞を０．５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液に懸濁し、その後、抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂタンパク質を添加し（陰性対照として使用したｈＩｇＧ  Ｆｃとともに）、氷上でインキュベーションを２０分間行った。洗浄後、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ二次抗体抗−ｈＩｇ−ＰＥを加え、サンプルを氷上に２０分間静置した。洗浄後、細胞を５００μｌの０．５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターでの測定に供した。
【０１８０】
結果を図６に示す。結果に示すように、３つの抗体株はすべてｈＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰ細胞と結合できたが、ｈＢ７Ｈ３−ＥＧＦＰおよびｈＰＤ−Ｌ２−ＥＧＦＰ細胞と結合できず、良好な特異性を実証した。
【０１８１】
精製抗ｈＰＤ−ＬＩのマウスＰＤ−Ｌ１（ｍＰＤ−Ｌ１）との結合：
実施例１で構築されたｈＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰおよびｍＰＤ−Ｌ１−ＥＧＦＰを含むＨＥＫ２９３細胞を０．５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液に懸濁し、その後、標的抗ｈＰＤ−Ｌ１  ｍＡｂを添加し（陰性対照として使用したｈＩｇＧ  Ｆｃとともに）、氷上でインキュベーションを２０分間行った；次に洗浄を行い、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ二次抗体抗ｈＩｇ−ＰＥを加え、サンプルを氷上に２０分間静置した。洗浄後、細胞を０．５％ＰＢＳ−ＢＳＡ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメーターでの測定に供した。結果を図７に示す。結果に示すように、Ｂ５０−６  ｍＡｂはマウスＰＤ−Ｌ１（ｍＰＤ−Ｌ１）と結合可能であったが、Ｂ６０−５５およびＢＩＩ６１−６２はｍＰＤ−Ｌ１と結合できなかった。
【０１８２】
精製抗ｈＰＤ−ＬＩのカニクイザルＰＤ−Ｌ１との結合：
カニクイザルＰＢＭＣはヒトリンパ球分離培地（Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｈａｏ  Ｙａｎｇ）を使用して分離し、細胞をＲＰＭＩ完全培地に再懸濁し、その後、細胞密度を１００万細胞／ｍｌに調整した；続けて、２００万のカニクイザルＰＢＭＣを２４ウェルプレートに加え、同時にフィトヘマグルチニン（ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ；ＰＨＡ）を最終濃度２μｇ／ｍｌで加えた；細胞を４８時間刺激した後、収集し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、抗体染色に供した。アイソタイプｃｔｒｌ（抗ＫＬＨ）を陰性対照として使用し、市販のＰＥ標識抗ヒトＰＤ−Ｌ１抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ：３２９７０５）を陽性対照として使用した。自家抗体を一次抗体として使用し、洗浄を行った後、二次抗体として抗ｈＩｇ−ＰＥを使用して抗体染色を行った。各染色工程の後、４℃で３０分間インキュベートし、染色を行った後、ＦＡＣＳ緩衝液を使用して遠心分離で細胞を２回洗浄し、その後、二次抗体を加えるか、または細胞を２％パラホルムアルデヒドで直接固定し、その後、グアバ（Ｇｕａｖａ）を使用して分析した。結果を図８に示す。結果は、カニクイザルＴ細胞がＰＨＡで刺激された後にＰＤ−Ｌ１を発現し、産生された３つの抗体株が活性化したカニクイザルＴ細胞と結合可能であることを示した。
【実施例７】
【０１８３】
樹状細胞−Ｔ細胞混合リンパ球反応におけるＣＤ４＋Ｔ細胞のＰＤ−Ｌ１抗体活性化の測定。
ヒトリンパ球分離培地（Ｔｉａｎｊｉｎ  Ｈａｏ  Ｙａｎｇ）を使用して、密度勾配遠心を介して健康なドナーから得られた濃縮末梢白血球細胞から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。次に、前記細胞を無血清ＲＰＭＩ１６４０に再懸濁し、１０ｃｍディッシュで１〜２時間培養した後、非接着細胞を除去し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ内で細胞を培養した。ＧＭ−ＣＳＦ（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｒｉｍｅｇｅｎｅ：１０２−０３）については２５０ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−４（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｒｉｍｅｇｅｎｅ：１０１−０４）については１００ｎｇ／ｍｌの最終濃度でサイトカインを加え、その後、２〜３日毎に新鮮なサイトカイン含有培地を加えた。培養６日目、５０ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｐｒｉｍｅｇｅｎｅ：１０３−０１）を使用して細胞成熟を誘導し、細胞をさらに２４時間インキュベートした。成熟樹状細胞を採取し、ＨＬＡ−ＤＲ抗体で染色して、成熟を確認した。その後、細胞を２０００００細胞／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ完全培地に再懸濁した。得られた懸濁液５０μｌを９６ウェルＵ底プレート（Ｃｏｓｔａｒ：３７９９）の各ウェルに加え、インキュベーター内で細胞を培養させた。
【０１８４】
磁気ビーズ単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ：１３０−０９６−５３３）を使用して、提供された取扱説明書に従って別のドナーから得たＰＢＭＣからＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。細胞をカウントし、２００万細胞／ｍｌの濃度でＲＰＭＩ完全培地に再懸濁した後、樹状細胞を含む９６ウェルＵ底プレートに加え、５０μｌを各ウェルに加えた。ＲＰＭＩ完全培地で連続希釈した１００μｌのＰＤ−Ｌ１抗体を各ウェルに加えて、最終抗体濃度１００、１０、１、０．１、０．０１、０．００１および０μｇ／ｍｌを得た。その後、細胞を５日間培養し、上清を取り、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ検出キット（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、上清中のＩＦＮ−γレベルを検出した。結果を図９に示す。結果は、ＰＤ−Ｌ１抗体が混合リンパ球反応でγ−ＩＦＮのＣＤ４＋Ｔ細胞分泌を増強できることを示している；つまり、ＰＤ−Ｌ１抗体はＴ細胞の活性化を増強した。ＢＩＩ６１−６２について得られたＥＣ５０値は０．０７８μｇ／ｍｌ（０．５ｎＭと等価）、Ｂ６０−５５について得られたＥＣ５０値は０．１８９μｇ／ｍｌ（１．２ｎＭと等価）であった。
【実施例８】
【０１８５】
腫瘍成長に対する抗ｈＰＤ−Ｌ１抗体の阻害活性。
体の抗腫瘍Ｔ細胞応答を弱める方法として、多くの腫瘍がＰＤ−１リガンドを発現することはすでに明らかである。ＰＤ−Ｌ１の発現レベルの特徴的な増加は、多くの異なる対象の腫瘍および腫瘍浸潤白血球において発見され、前記のＰＤ−Ｌ１発現の増加はしばしば予後不良と関連している。マウス腫瘍モデルは、腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１発現の同様の増加を示しており、腫瘍免疫の阻害におけるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の役割もまた実証している。
【０１８６】
ここで、本発明者らはＰＤ−Ｌ１のブロッキングが同系Ｃ５７Ｂ６マウスで見られるＭＣ３８細胞（マウス結腸直腸がん細胞）の腫瘍成長に影響することを示す実験結果を提供した。
【０１８７】
０日目に、１００万個のＭＣ３８細胞（シカゴ大学のＹａｎｇｘｉｎ  Ｆｕ教授の好意により提供されたもの）がＣ５７Ｂ６マウスに皮下接種された；その後、マウスを、０、３、７、１０日目に１０ｍｇ／ｋｇの抗ＰＤ−Ｌ１（Ｂ５０−６）またはＰＢＳの腹腔内注射に供した。３日目に腫瘍の大きさを測定し、腫瘍容量を計算して腫瘍成長曲線を描き（図１０を参照）；結果は、抗ＰＤ−Ｌ１（Ｂ５０−６）が腫瘍成長を著しく阻害可能であることを示している。
【０１８８】
免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤ（非肥満糖尿病／重症複合免疫不全）マウスを使用して、マウスＰＤ−Ｌ１を認識できないＰＤ−Ｌ１抗体Ｂ６０−５５およびＢＩＩ６１−６２のインビボ活性を調査した。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスおよびヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に皮下移植した場合にヒトＰＤ−Ｌ１を発現するメラノーマ細胞株Ａ３７５［ＡＴＣＣ、ＣＲＬ−１６１９（商標）］を使用した実験を、上記の目的を達成するために使用した。注射前に、Ａ３７５細胞とＰＢＭＣを５：１の比率で混合し、総容量１００μｌ（５００万個のＡ３７５細胞と１００万個のＰＢＭＣを含む）の皮下注射を行った；腫瘍接種後０、７、１４、２１および２８日目に抗体を腹腔内投与した（図１１−Ａについての抗体用量は３ｍｇ／ｋｇであり、図１１−Ｂについての抗体用量は図１１に直接示される）。ＰＢＳを陰性対照として用いた。各実験グループは、４〜６匹のマウスで構成された。腫瘍形成は週に２回観察され、大きさはノギスを使用して測定され、腫瘍容量を計算して腫瘍成長曲線を描いた（図１１を参照）；結果は、抗体Ｂ６０−５５およびＢＩＩ−６１−６２が腫瘍の成長を著しく阻害できることを示している。
【実施例９】
【０１８９】
Ｂ６０−５５と抗体２．４１Ｈ９０Ｐ（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）の安定性の比較。
抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ｂ６０−５５とＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣの抗体２．４１Ｈ９０Ｐの加速安定性試験を４５℃で行った。使用した具体的な試験手順は以下の通りであった：抗ＰＤ−Ｌ１抗体Ｂ６０−５５とＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  ＬＬＣの抗−ＰＤ−Ｌ１抗体２．４１Ｈ９０Ｐ（米国特許２０１３００３４５５９に記載されている２．１４Ｈ９の調製方法に従って調製され、その後抗体は２．４１Ｈ９０Ｐと名付け直した）を１０ｍｇ／ｍｌの濃度に濃縮し、その後１００μｇの抗体を２００μｇのＰＣＲチューブに加え、４５℃のバッチに設置した；０、１０、２０、３０日目にサンプルを取り、その後、競合ＥＬＩＳＡおよびＳＥ−ＨＰＬＣ分析試験を行った。ここで、ＩＣ５０値を得るために使用した競合ＥＬＩＳＡ法は、実施例６に記載したものと同じであった。ＳＥ−ＨＰＬＣはＳｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ  ＬＣ２０ＡＴ  ＨＰＬＣクロマトグラフを使用して行った；サンプルを１ｍｇ／ｍｌに濃縮し、５０μｇの総サンプル容量について、サンプルを０．５ｍｌ／分の流量でロードした；サンプルのロード後３０分間、アイソクラティック溶出を行い、結果を図１２に示した。
【０１９０】
図１２において、ＡはＢ６０−５５と抗体２．４１Ｈ９０Ｐの経時的なＩＣ５０値のグラフの比較を示しており、データは異なる時点でサンプルの競合力に有意な変化がなかったことを示している；Ｂは、抗体ダイマーの経時的な割合を示し、データはＢ６０−５５と２．４１Ｈ９０Ｐの両方でダイマー比が経時的に減少したことを示している；しかしながら、２．４１Ｈ９０ＰはＢ６０−５５よりも減少を示した速度は速く、Ｂ６０−５５がより安定であることを示している；ＣはＢ６０−５５加速安定性試験で得られた競合ＥＬＩＳＡ曲線を示しており、データはＢ６０−５５が比較的良好な活性と安定性を維持可能であることを示している。
【実施例１０】
【０１９１】
抗体変異体Ｂ６０−５５−１の調製スケールアップおよび製剤安定性。
抗体の調製スケールアップの可能性を評価するために、前に記載されるように例示的な抗体変異体Ｂ５０−５５−１を本質的にクローン化した。Ｂ６０−５５−１完全重鎖のアミノ酸配列は：
QVQLVQSGAEVKKPASSVKVSCTASGGSFSTYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTTKYAQRFQGRVTITADESTTTAYMELSSLISDDTALYYCTTSRGFNYGWFDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYASTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK
（配列番号８５）；
【０１９２】
対応するＤＮＡ配列は：
CAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGAAGCCTGCGTCCTCGGTCAAAGTCTCCTGCACGGCTTCTGGCGGCTCCTTCAGCACCTATGCTATCAGTTGGGTGCGACAGGCTCCTGGACAAGGGCTTGAATGGATGGGCGGGATCATCCCCATCTTTGGTACAACTAAGTACGCACAGAGGTTCCAGGGCAGGGTCACGATTACCGCGGACGAATCGACGACCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGATATCTGACGACACGGCCCTGTATTATTGTACGACGTCTCGTGGATTCAACTATGGCTGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCAGCACTAAGGGGCCCTCTGTGTTTCCACTCGCCCCTTCTAGCAAAAGCACTTCCGGAGGCACTGCAGCACTCGGGTGTCTGGTCAAAGATTATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGAGCTGGAACTCTGGCGCCCTCACCTCCGGGGTTCACACCTTTCCAGCCGTCCTGCAGTCCTCCGGCCTGTACTCCCTGAGCAGCGTCGTTACCGTGCCATCCTCTTCTCTGGGGACCCAGACATACATCTGCAATGTCAACCATAAGCCTAGCAACACCAAGGTGGACAAAAAGGTCGAGCCAAAGAGCTGCGATAAGACACACACCTGCCCTCCATGCCCCGCACCTGAACTCCTGGGCGGGCCTTCCGTTTTCCTGTTTCCTCCCAAGCCCAAGGATACACTGATGATTAGCCGCACCCCCGAAGTCACTTGCGTGGTGGTGGATGTGAGCCATGAAGATCCAGAAGTTAAGTTTAACTGGTATGTGGACGGGGTCGAGGTGCACAATGCTAAAACAAAGCCCAGGGAGGAGCAATATGCCTCCACATACAGAGTGGTGTCCGTTCTGACAGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGGAAGGAATACAAGTGCAAGGTGTCTAATAAGGCACTGCCAGCCCCCATAGAGAAGACAATCTCTAAAGCTAAAGGCCAACCACGCGAGCCTCAGGTCTACACACTGCCACCATCCAGGGAGGAAATGACCAAGAATCAGGTGAGCCTGACTTGTCTCGTCAAAGGATTCTACCCAAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAATCCAACGGCCAACCAGAGAACAACTACAAGACCACCCCACCAGTCCTGGACTCTGATGGGAGCTTTTTCCTGTATTCCAAGCTGACAGTGGACAAGTCTCGGTGGCAACAGGGCAACGTGTTCAGCTGCTCCGTGATGCATGAAGCCCTGCATAACCACTATACCCAGAAAAGCCTCAGCCTGTCCCCCGGGAAATAATGA
（配列番号８６）；
【０１９３】
完全軽鎖のアミノ酸配列は：
EIVMTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGIHLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQYGSLPRTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
（配列番号８７）；
【０１９４】
対応するＤＮＡ配列は：
GAAATTGTAATGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTGTAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCATACACTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCATCTATGGTGCATCCAGTAGGGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTTCTTTACCTCGGACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAAATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGTACCGCTAGCGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTTTATCCACGGGAGGCTAAGGTGCAGTGGAAAGTGGACAATGCCCTCCAGAGCGGAAATAGCCAAGAGTCCGTTACCGAACAGGACTCTAAAGACTCTACATACTCCCTGTCCTCCACACTGACCCTCTCCAAGGCCGACTATGAGAAACACAAGGTTTACGCATGCGAGGTCACACACCAGGGACTCTCCTCTCCCGTGACCAAGAGCTTCAACCGGGGAGAATGC
（配列番号８８）；
【０１９５】
Ｂ６０−５５−１は、ＡｃｔｉＣＨＯ（ＧＥ）またはＤｙｎａｍｉｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）培地のいずれかを使用して、バイオリアクターで増殖したＣＨＯ細胞で産生した。最初に、Ｂ６０−５５−１は、清澄化した細胞培養液から、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィー樹脂ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ  ＬＸ、ＧＥを使用し、その後に２つのクロマトグラフィーステップ−フロースルーモードでのＱ吸着剤（ＧＥ）膜上の陰イオン交換クロマトグラフィーおよび最終研磨工程であるヒドロキシアパタイト樹脂（ＣａＰｕｒｅ−ＨＡ、東ソー）上のカラムクロマトグラフィーで精製された。
【０１９６】
プロテインＡ樹脂でのＢ６０−５５−１精製の工程収率は約９５〜９８％と観察された。Ｑ−吸着剤クロマトグラフィーにおける工程収率は約９３％〜９５％と観察された。Ｂ６０−５５−１のダイマー、オリゴマー、および凝集体、残留ＤＮＡの痕跡、プロテインＡカラムから漏れるプロテインＡが除去されるＢ６０−５５−１の最終精製工程は、ＣａＰｕｒｅ−ＨＡの研磨クロマトグラフィーであり、これは良いウイルス除去工程としても機能する。最終的なヒドロキシアパタイトの工程収率は約７７％〜８５％であった。ＣａＰｕｒｅ−ＨＡでのＢ６０−５５−１精製のクロマトグラムを図１４に示す。
【０１９７】
サイズ排除ＨＰＬＣで評価したＣａＰｕｒｅ−ＨＡでのクロマトグラフィー後のＢ６０−５５−１の均一性は９９％以上であった。分析的サイズ排除クロマトグラムを図１５に示す。
【０１９８】
還元および非還元条件下でのＳＤＳ存在下ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）もまたＢ６０−５５−１調製物の高純度を示した。クマシー染色したゲルの像を図１６に示す。
【０１９９】
精製したＢ５０−５５−１のＬＣ−ＭＳトリプシンペプチドマッピング分析は、精製抗体の重鎖にＣ末端リジン残基が欠けていることを示したが、これは精製抗体の抗原結合特性に影響を与えない（実施例１１を参照）。
【０２００】
Ｂ６０−５５−１用に開発された、いくつかの液体製剤は、ストレス安定性調査で試験された。これらの調査中、約５０ｍｇ／ｍＬの濃度のＢ６０−５５−１を含むさまざまなＢ６０−５５−１製剤の滅菌サンプルを、４０℃で６週間インキュベートした。インキュベーション中、７つの時点でサンプルをプールし、分析した：０、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間および６週間。プールされたサンプルに対して、タンパク質濃度（Ｂ６０−５５−１の濃度）、純度、完全性、濁度、および浸透圧を測定する後続試験が行われた。タンパク質濃度は２８０ｎｍの吸光度で測定し、タンパク質の同一性と完全性はＳＤＳ−ＰＡＧＥで評価し、濁度はＡ６００で測定し、浸透圧は較正済み浸透圧計で測定した。ストレス安定性実験の結果に基づいて、後続調査に次の製剤を使用した：２７５ｍＭセリン、１０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．９。この製剤において、４０℃で５週間インキュベートした後もＢ６０−５５−１の純度は９５％を超えた。加えて、以下の製剤は、実質的に同様のタンパク質安定性をもたらした：０．０５％ポリソルベート８０、１％Ｄ−マンニトール、１２０ｍＭ  Ｌ−プロリン、１００ｍＭ  Ｌ−セリン、１０ｍＭ  Ｌ−ヒスチジン−ＨＣｌ、ｐＨ５．８。
【実施例１１】
【０２０１】
ＳＰＲによる精製Ｂ６０−５５−１およびｈＰＤ−Ｌ１結合キネティクス調査。
この調査の目的は、ＳＰＲ法を使用して、Ｂ６０−５５−１とアテゾリズマブのヒトＰＤ−Ｌ１との相互作用の結合パラメータを比較評価することであった。いくつかのアプローチを使用してアッセイを行い、ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓタグ付きタンパク質とＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質の２つのバージョンのヒトＰＤ−Ｌ１を使用した。一連の異なる濃度のＰＤ−Ｌ１リガンドを使用して、解離定数（Ｋｄ）を計算した。以下の機器を用いた：Ｒ７５０００ＤＣ、プラズモン共鳴分光計、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＳＰＲＡｕｔｏｌｉｎｋコントロールおよびＴｒａｃｅＤｒａｗｅｒ評価ソフトウェアパッケージを備えた機器番号００４７８−１１１５。センサーチップＳＲ７０００ゴールドセンサースライド、５００ｋＤａカルボキシメチルデキストラン、Ｒｅｉｃｈｅｒｔ、Ｉｎｃ、Ｐｒｔ  Ｎｏ：１３２０６０６６
【０２０２】
使用した試薬は次の通りである：１％Ｄ−マンニトール中のＢ６０−５５−１ストック溶液３２ｍｇ／ｍｌ、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．４中；アテゾリズマブ（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）、２０ｍＭヒスチジン中の６０ｍｇ／ｍｌ、１４ｍＭ酢酸、０．０４％ポリソルベート２０、４％スクロース、ロット３１０９９０４、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓタグ付き、ヒト組換え、ＨＥＫ２９３由来、Ｐｈｅ１９−Ｔｈｒ２３９、アクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７、Ｒ＆Ｄシステム、カタログ番号９０４９−Ｂ７−１００、ロット番号ＤＤＩＷ０１１６０８１；ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ、ヒトＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質、ヒト組換え、ＨＥＫ２９３由来、Ｐｈｅ１９−Ｔｈｒ２３９、アクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７、Ｒ＆Ｄシステム、カタログ番号１５６−Ｂ７−１００、ロット番号ＤＫＬ２１１６０３１；ヒト抗体捕捉キット、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号ＢＲ−１００８−３９、ロット番号１０２４７１２１；ランニング緩衝液：０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０を補充した１ｘＰＢＳ、脱気および０．２ｕフィルターでろ過したもの。
【０２０３】
結合パラメータを測定するための標準アプローチの１つは、チップ上に抗体を捕捉して固定化し、続いて試験抗体をロードして、その後リガンドを適用することである。しかしながら、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質内のヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片の存在のため、このリガンドには抗ヒト抗体を介した捕捉が使用できなかった。したがって、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃについては、図１７に示す代替アプローチを利用した。リガンドのＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓタグ付きバージョンについては、図１７、パネルＡに示された抗体捕捉アプローチを使用した。ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質の結合を試験するために、２つの代替方法を使用した：（１）図１７、パネルＢに示されたＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ自体の直接固定化、および（２）図１７、パネルＣに示された試験抗体、Ｂ６０−５５−１および比較薬アテゾリズマブの固定化。
【０２０４】
すべてのタンパク質は、同じ化学物質とプロトコルを使用してチップに共有結合させた。チップにコンジュゲートしたタンパク質には、モノクローナル抗ヒトＩｇＧ抗体、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃリガンド、Ｂ６０−５５−１およびアテゾリズマブが含まれていた。抗ヒトＩｇＧおよびＰＤ−Ｌ１−Ｆｃはコンジュゲーション手順に適合する緩衝液で使用し、Ｂ６０−５５−１およびアテゾリズマブ調製物はカップリング前に０．１ｘＰＢＳに対して十分に透析した。ＳＲ７０００  Ｇｏｌｄ  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｓｌｉｄｅを機器に設置し、ランニング緩衝液、０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を補充した１×ＰＢＳで２５０μｌ／分、５分間プライミングし、２５μｌ／分で安定させた。すべての工程は２５℃で行った。タンパク質調製物は、固定化緩衝液（１０ｍＭ酢酸ナトリウム  ｐＨ５．０）を使用して最終濃度２５μｇ／ｍｌに希釈した。固定化手順の試薬は、次のように調製した：水中のＥＤＣ［１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド］４０ｍｇ／ｍｌおよびＮＨＳ［Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド］１０ｍｇ／ｍｌからなるＥＤＣ／ＮＨＳ活性化剤、水中の１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌ、ｐＨ８．５。活性化：ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化剤を１０μｌ／分で８分間、チップ内に注入し、続いてランニング緩衝液で５分間洗浄した。固定化：最終濃度２５μｇ／ｍｌの抗ヒトＩｇＧを１０μｌ／分で８分間、チップに注入した。非活性化：チップ表面の未反応の活性基は、１０μｌ／分で７分間１Ｍエタノールアミン−ＨＣｌを注入することによりブロックした。抗体のコンジュゲート後、ランニング緩衝液で１５分間、２５μｌ／分でチップを洗浄した。
【０２０５】
ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓタグ付きリガンドとＢ６０−５５−１およびアテゾリズマブとの相互作用を調査するために、抗体捕捉アプローチを使用した。抗ヒトＩｇＧをチップに共有結合させ、図１７のパネルＡに示すように、試験抗体の捕捉に使用した。固定化抗ヒトＩｇＧを有するチップは、１０〜１５分間、２５μｌ／分の流速でランニング緩衝液を用いて平衡化した。試験抗体、Ｂ６０−５５−１またはアテゾリズマブを２５μｌ／分で２分間ロードした後、チップを３分間洗浄して未結合抗体を除去した。ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓリガンドの２倍希釈液は、１００ｎＭ濃度からランニング緩衝液を使用して調製した。７つの濃度を使用した：１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３，１２５および１．５６ｎＭ。リガンドを２５μｌ／分で３分間ロードした。リガンドをロードした後、２５μｌ／分の流速で５分間ランニング緩衝液を使用することにより実験の解離段階を行った。固定化された抗ヒトＩｇＧが結合したタンパク質複合体の解離は、３Ｍ  ＭｇＣｌ２をチップに２５μｌ／分で３０秒間通すことによって行った。図１８に示すように、さまざまなＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓリガンド濃度で、捕捉されたＢ６０−５５−１またはアテゾリズマブの一連のセンソグラムが生成され、分析に使用された。１：１結合モデルのキネティック評価は、ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓの試験抗体との相互作用の分析に使用した。次のＫｄ値が得られた：Ｂ６０−５５−１  Ｋｄ＝４０．２ｎＭ；アテゾリズマブ  Ｋｄ＝０．６７ｎＭ。
【０２０６】
調査の結果は、比較薬アテゾリズマブに対する単量体ＰＤ−Ｌ１の結合親和性が、Ｂ６０−５５−１に対するよりも約２−ｌｏｇ高く、それぞれ０．６７ｎＭ対４０．２ｎＭであることを示した。Ｂ６０−５５−１−ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ相互作用の低い親和性は解離速度が速いためであったが、Ｂ６０−５５−１とアテゾリズマブの会合相は図１８の表のように本質的に同一であった。
【０２０７】
ＰＤ−Ｌ１−ＦｃリガンドとＢ６０−５５−１およびその比較薬であるアテゾリズマブとの結合特性を調べるために、図１７、パネルＢに示すように、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質をチップ上に直接固定した。チップの効率的な再生の条件を同定するために、偵察実験が行われた。３Ｍ  ＭｇＣｌ２は、固定化ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃから結合抗体（Ｂ６０−５５−１やアテゾリズマブのどちらも）を解離しなかったことが見出された。ｐＨ３．０、ｐＨ２．５、ｐＨ２．０、１０ｍＭ  ＮａＯＨを有する１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ緩衝液を含むいくつかの再生条件が試験された。ｐＨ３．０およびｐＨ２．５の緩衝液は結合した抗体を効果的に除去せず、ＮａＯＨ処理はリガンドを不活性化し、結合の喪失をもたらすことが判明した。その後、グリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０がこれらの一連の実験に適すると結論された。
【０２０８】
この例で前に記載したように、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃリガンドをチップに固定し、一連の濃度のＢ６０−５５−１またはアテゾリズマブを適用した。ランニング緩衝液を使用して１００ｎＭ濃度から始めてＢ６０−５５−１またはアテゾリズマブの２倍希釈液を調製した。７つの濃度を使用した：１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３，１２５および１．５６ｎＭ。リガンドを２５μｌ／分で３分間ロードした。リガンドをロードした後、２５μｌ／分の流速で５分間、ランニング緩衝液を使用して実験の解離段階を行った。異なる濃度のＢ６０−５５−１またはアテゾリズマブで、固定化ＰＤ−Ｌ１−  Ｆｃについての一連のセンソグラムが生成され（図１９を参照）、分析に使用された。試験抗体との固定化ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ相互作用の分析に１：１結合モデルのキネティック評価を使用した。次のＫｄ値が得られた：Ｂ６０−５５−１  Ｋｄ＝０．６６ｎＭ；アテゾリズマブ  Ｋｄ＝０．２６ｎＭ。
【０２０９】
調査の結果、固定された二量体ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの結合親和性は、図１９の表に示すように、Ｂ６０−５５−１および比較薬アテゾリズマブで類似しており、それぞれ０．６ｎＭ対０．２６ｎＭであることが示された。観察された両方の抗体の親和性の類似性は、二量体リガンドとの相互作用を反映しており、リガンドの単量体Ｈｉｓタグ付きバージョンとの相互作用とは明らかに異なっていた。
【０２１０】
試験抗体の結合特性をさらに評価するため、図１７、パネルＣに示すように、Ｂ６０−５５−１またはアテゾリズマブをチップ上に共有結合でクロスリンクした。このアプローチにより、ＰＤ−Ｌ１リガンドの両方のバージョン、Ｈｉｓ−タグ付きおよびＦｃ融合タンパク質の直接的な比較が可能になった。この結合システムの再生条件を再評価し、１０ｍＭグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．０が十分な回復を提供することを見出した。この例で前に記載したように、Ｂ６０−５５−１およびアテゾリズマブを別々のセンサーチップに固定し、さまざまな濃度のＰＤ−Ｌ１−ＨｉｓまたはＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質を固定化抗体に順次適用した。１００ｎＭの濃度から始めてランニング緩衝液を用いて、ＰＤ−Ｌ１−ＨｉｓまたはＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの２倍希釈液を調製した。７つの濃度を使用した：１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３，１２５および１．５６ｎＭ。リガンドを２５μｌ／分で３分間ロードした。リガンドをロードした後、２５μｌ／分の流速で５分間、ランニング緩衝液を使用して実験の解離段階を行った。図２０および２１に示すように、異なる濃度のＰＤ−Ｌ１−ＨｉｓまたはＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質で、固定化Ｂ６０−５５−１またはアテゾリズマブの一連のセンソグラムが生成され、分析に使用された。ＰＤ−Ｌ１−ＨｉｓとＰＤ−Ｌ１−Ｆｃの両方のバージョンのリガンドとの固定化Ｂ６０−５５−１相互作用の分析に、１：１結合モデルのキネティック評価を使用した。Ｂ６０−５５−１については、以下のＫｄ値が得られた：単量体ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓリガンドについては、Ｋｄ＝１４．３ｎＭ；二量体ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃリガンドについては、Ｋｄ＝０．４５ｎＭ；アテゾリズマブについては：単量体ＰＤ−Ｌ１−ＨｉｓリガンドについてＫｄ＝０．６２ｎＭであり、二量体ＰＤ−Ｌ１−ＦｃリガンドについてＫｄ＝０．１９ｎＭであった。
【０２１１】
したがって、単量体ＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓおよび二量体ＰＤ−Ｌ１−ＦｃのＢ６０−５５−１およびその比較薬アテゾリズマブへの結合親和性の比較により、Ｂ６０−５５−１はＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓに対して約２−ｌｏｇ高いＰＤ−Ｌ１−Ｆｃへの親和性を示し、アテゾリズマブはＰＤ−Ｌ１−ＨｉｓおよびＰＤ−Ｌ１−Ｆｃに対して同様の親和性を有することが明らかとなった。後者は、アテゾリズマブがリガンドの単量体型と二量体型を区別できないことを示している。
【０２１２】
Ｂ６０−５５−１とアテゾリズマブの結合特性の評価により、Ｂ６０−５５−１は、現在臨床的に使用されている比較薬抗体とは異なり、そのコグネート標的ＰＤ−Ｌ１の二量体および単量体を実質的に区別できることが予想外に明らかとなった。
【実施例１２】
【０２１３】
Ｂ６０−５５−１抗体とアテゾリズマブのエフェクター機能の相互比較性。
この例では、Ｂ６０−５５−１抗体のエフェクター機能の比較薬抗体アテゾリズマブとのさらなる分析と比較を開示している。本開示は、Ｆｃガンマ受容体への結合の評価を含む：ＣＤ１６ａ、ＣＤ３２ａ、およびＣＤ６４；ＰＤ−Ｌ１陽性細胞を使用した抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性；補体誘導細胞毒性（ＣＤＣ）活性、Ｃ１ｑ結合、およびＦｃＲｎ結合評価。
【０２１４】
抗原の結合における役割に加えて、抗体は、抗体のＦｃ領域との相互作用を介してＦｃガンマ受容体と相互作用することにより免疫応答を調節することができる。ナチュラルキラー（ＮＫ）や他の骨髄系細胞に存在する受容体とのこれらの相互作用により、これらの細胞は、ＩＦＮγのようなサイトカインならびにパーフォリンおよびグランザイムを含む細胞傷害性顆粒を放出し、これはＡＤＣＣに達する。
【０２１５】
Ｂ６０−５５−１抗体はＣＤ１６ａ受容体への検出可能な結合を示さない一方で、ＣＤ１６ａに対するアテゾリズマブのＫｄは１．６Ｅ−５  Ｍであった；Ｂ６０−５５−１はＣＤ３２ａ受容体への検出可能な結合を示さない一方で、ＣＤ３２ａに対するアテゾリズマブのＫｄは４．１Ｅ−５  Ｍであった；Ｂ６０−５５−１は、他のＩｇＧ１抗体と比較してＣＤ６４受容体への結合が１０倍低いが、アテゾリズマブと比較してＣＤ６４への結合は同様であることが、行われた調査により明らかになった。
【０２１６】
抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）とは、ウイルスに感染した細胞やその他の病気の細胞が、ナチュラルキラー細胞のような細胞介在性免疫系の成分による破壊の標的となる抗体の作用機序である。ＰｒｏｍｅｇａのＡＤＤＣレポーターバイオアッセイコアキット（カタログ番号Ｇ７０１４）は、ＡＤＣＣを定量化するための生物発光レポーターアッセイである。このアッセイでは、標的受容体を発現する細胞の表面に結合した試験抗体のＦｃ断片に結合する細胞表面上のＦｃγＲＩＩＩａ受容体を発現するエフェクター細胞を組み合わせる。生物学的手法による標的細胞のエフェクター細胞への架橋は、エフェクター細胞におけるＮＦＡＴ経路を介した遺伝子転写の活性化をもたらし、発光によって定量化することができるホタルルシフェラーゼの発現を引き起こす。Ｂ６０−５５−１はＣＤ１６ａおよびＣＤ３２ａへの結合を示さなかったため、この分子はＡＤＣＣ活性を示すとは期待されなかった。アッセイは、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞株Ａ２０５８を使用して行われた。Ｂ６０−５５−１とアテゾリズマブのＡＤＣＣ活性を、強力なＡＤＣＣ活性を示すことが知られている抗体であるリツキシマブのＡＤＣＣと比較した。
【０２１７】
この操作されたＩｇＧ１抗体について期待されるように、Ｂ６０−５５−１はリツキシマブと比較して実質的なＡＤＣＣ活性を示さなかった（図２２における対照）が、アテゾリズマブと同等のＡＤＣＣ活性を示した。
【０２１８】
Ｂ６０−５５−１とアテゾリズマブはＰＤ−Ｌ１を標的とする抗体であり、両方の抗体のＣ１ｑへの結合を比較した。抗原結合２サイトＥＬＩＳＡを利用して、両方の抗ＰＤ−Ｌ１抗体がＣ１ｑと相互作用する親和性を調べた。このアッセイにおいて、両方の抗体をプレートに２５、２０、１５、１０、８、４、２、１、０．５および０μｇ／ｍＬで４℃一晩コーティングした。その後、プレートをＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ溶液で洗浄してブロッキングし、その後、結合緩衝液にＣ１ｑ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｃ１７４０）を２μｇ／ｍＬで添加し、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを洗浄し、抗Ｃ１ｑ−ＨＲＰコンジュゲート（Ｔｈｅｒｍｏ、カタログ番号ＰＡ１−８４３２４）を結合緩衝液中１：２５０希釈で室温、１時間プレートに加えた（１００μＬ／ウェル）。洗浄緩衝液で洗浄することにより、結合していないＨＲＰコンジュゲート抗体を除去した。ＨＲＰ活性は、発色基質ＴＭＢを使用して検出された。硫酸を加えることにより呈色反応を停止し、プレートを４５０ｎｍで読み取った。３−パラメータ曲線フィットの後、サンプルおよび参照標準についてＥＣ５０を計算した。報告可能な値は、サンプルのＥＣ５０に対する参照標準ＥＣ５０の％ＥＣ５０であり、％が高いほど、サンプルの効力が高い。これらの実験の目的は、ＥＬＩＳＡフォーマットを使用して、アテゾリズマブとＢ６０−５５−１のＣ１ｑへの結合を決定することであった。
【０２１９】
ＥＬＩＳＡアッセイの結果を図２３に示す。Ｃ１ｑに結合するアテゾリズマブのＥＣ−５０は１４．９μｇ／ｍＬであり、Ｂ６０−５５−１のＣ１ｑへの結合のＥＣ−５０は６．９μｇ／ｍＬであると決定された。したがって、これらの結合特性は同等である。
【０２２０】
さらに、ＰＤ−Ｌ１陽性細胞（Ａ２０５８細胞）においてＣＤＣを誘導する能力をＢ６０−５５−１とアテゾリズマブで比較した。このアッセイ細胞溶解においては、「細胞ゴースト」（溶解細胞）を顕微鏡で観察し、１時間細胞に添加した発光ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ試薬を介して定量化できる。
【０２２１】
両方の産物は、非常に低いＣＤＣ活性を示した。アテゾリズマブについてのＥＣ５０は０．０９μｇ／ｍｌであり、Ｂ６０−５５−１のＥＣ５０は０．０５μｇ／ｍｌであった。
【０２２２】
ＩｇＧの半減期は、新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に依存しており、これは、他の機能の中でも、異化からＩｇＧを保護する。ＦｃＲｎは酸性ｐＨでＩｇＧのＦｃドメインに結合し、エンドサイトーシスされたＩｇＧがリソソーム区画で分解されずに血流に放出されるようにする。ＣＨＯ細胞によって安定して発現されたＦｃＲｎ受容体への結合についてＢ６０−５５−１とアテゾリズマブを比較した。
【０２２３】
Ｂ６０−５５−１は、抗体に典型的な４．７ｅ−７ＭのＫｄでＦｃＲｎに結合し、アテゾリズマブは１Ｅ−７ＭのＫｄでＦｃＲｎにわずかに高い親和性を示したことがこの調査により示された。
【実施例１３】
【０２２４】
混合リンパ球反応によるＢ６０−５５−１抗体、アテゾリズマブおよびペンブロリズマブ（ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ）の効力の比較評価。
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイを行い、Ｔ細胞の活性化に対するＢ６０−５５−１およびアテゾリズマブの効力を評価した。Ｔ細胞の活性化は、Ｔ細胞によって分泌されるインターロイキン２（ＩＬ−２）の濃度によって測定された。樹状細胞（ＤＣ）およびＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離された。ＭＬＲにおけるＴ細胞活性化に対するペンブロリズマブの効力を、アッセイ性能を監視するための内部対照として使用した。ＧｒａｐｈＰａｄ  ＰｒｉｓｍによるＳ字型用量反応非線形回帰フィットを用いて、半最大有効濃度（ＥＣ５０）値を分析した。
【０２２５】
試薬と材料
ＲＰＭＩ  １６４０：Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号２２４００）；ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ、（カタログ番号１００９９）；ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）：Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号１０３７８）；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カタログ番号１００１０−０２３）；樹状細胞のＱＣ抗体：抗ＣＤ１ａ［ＨＩ１４９］（ＦＩＴＣ）、Ａｂｃａｍ（ａｂ１８２３１）、抗ＣＤ８３［ＨＢ１５ｅ］（ＦＩＴＣ）、Ａｂｃａｍ（ａｂ１３４４９１）、抗ＣＤ８６［ＢＵ６３］（ＦＩＴＣ）、Ａｂｃａｍ（ａｂ７７２７６）、抗ＨＬＡ  ＤＲ［ＧＲＢ１］（ＦＩＴＣ）、Ａｂｃａｍ（ａｂ９１３３５）；ＣＤ４＋  Ｔ細胞単離キット：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、（カタログ番号１３０−０９６−５３３）；パン単球単離キット：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、（カタログ番号１３０−０９６−５３７）。
【０２２６】
細胞株
単離されたばかりのヒト血液から調製された樹状細胞（２０人を超える健康なドナー）；単離されたばかりのヒト血液から調製されたＣＤ４＋  Ｔ細胞（２０人を超える健康なドナー）。
【０２２７】
アッセイキット
ヒトＩＬ２  ＨＴＲＦキット（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号６４ＩＬ２ＰＥＢ）。
【０２２８】
検出装置
ＰＨＥＲＡｓｔａｒＰｌｕｓ、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ。
【０２２９】
細胞の調製
ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞単離キットによって精製された。ＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐを使用して密度勾配遠心分離で調製した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのプロトコルに従って、細胞を完全培地で３７℃／５％ＣＯ２に維持した。
【０２３０】
樹状細胞は、パン単球単離キットで精製した。ＰＢＭＣは、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐを使用して密度勾配遠心分離で調製した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔのプロトコルに従って、細胞を完全培地で３７℃／５％ＣＯ２に維持した。樹状細胞の純度は、ＦＡＣＳによるそれらの表面マーカー（ＣＤ１ａ、ＣＤ８３、ＣＤ８６、およびＨＬＡ−ＤＲ）によって検証された。
【０２３１】
抗体の調製
サンプルはドライシッパーで配送され、試験前に４℃で保管された。サンプルをＲＰＭＩ  １６４０で希釈し、試験に適用した。
【０２３２】
抗体試験のための混合リンパ球反応
−  １０００ｒｐｍ、３分間の遠心分離によるエフェクター細胞（ＣＤ４＋  Ｔ細胞）の収穫。
−  アッセイ緩衝液での試験サンプルの連続希釈；
−  エフェクター細胞ストックを９６ウェルアッセイプレートに播種し、試験サンプルを加える；
−  １０００ｒｐｍで３分間の遠心分離による標的細胞（樹状細胞）の収穫；
−  標的細胞を加えて反応を開始し、穏やかに混合する；
−  プレートを３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターで３日間インキュベートする；
−  ヒトＩＬ−２試験を行い、プレートを読み取る；
−  Ｂ６０−５５−１およびアテゾリズマブの濃度範囲を試験する：３００ｎＭから開始して、３倍希釈、３重に１０ポイント；
−  ペンブロリズマブの試験濃度範囲：１０μｇ／ｍｌから開始、５倍希釈、３重で６ポイント。
【０２３３】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ
ＭＬＲアッセイの結果を図２４に示す。Ｂ６０−５５−１とアテゾリズマブは、異なるＩＬ−２分泌物でのＭＬＲにおけるＴ細胞を活性化することができた。対照として使用したペンブロリズマブのＴ細胞活性化データは、過去のデータと一致していた。ＭＬＲデータの分析を表２に示す。ＭＬＲアッセイにおけるＢ６０−５５−１およびアテゾリズマブのＥＣ５０値は、０．４６６５ｎＭおよび２１．５３ｎＭであった。したがって、Ｂ６０−５５−１は、ＭＬＲアッセイでＴ細胞を実質的に高い効力で活性化する。
【０２３４】
【表２】
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【実施例１４】
【０２３５】
ヒト化ＰＤ−Ｌ１マウスにおける皮下ＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１マウス結腸癌モデルの治療におけるＢ６０−５５−１の有効性の評価
この調査の目的は、ヒト化ＰＤ−Ｌ１マウスに移植された皮下ＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１マウス結腸癌の治療において、Ｂ６０−５５−１とその比較薬アテゾリズマブのインビボでの効力を、共に１０ｍｇ／ｋｇの用量で、試験することであった。
【０２３６】
試薬および機器
ダルベッコの改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）：Ｃｅｌｌｇｒｏ、カタログ番号１０−０１３−ＣＶＲ、４℃で保存。ウシ胎児血清（ＦＢＳ）：Ｅｘｃｅｌｌ、カタログ番号ＦＳＰ５００、−２０℃で保存。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）：Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号２００１２０２７、４℃で保存。バランス：Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｓｈｕｎ  Ｙｕ  Ｈｅｎｇ  Ｐｉｎｇ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ、カタログ番号ＭＰ５００２。キャリパー：Ｈｅｘａｇｏｎ  Ｍｅｔｒｏｌｏｇ、カタログ番号００５３４２２０。
【０２３７】
試験品と対照品
抗体Ｂ５０−５５−１は、濃度５０ｍｇ／ｍｌでＰＢＳに保存した；陰性対照ＩＶＩＧ：Ｇｕａｎｇ  Ｄｏｎｇ  Ｓｈｕａｎｇ  Ｌｉｎ  ＢＩＯ−Ｐｈａｒｍａｃｙ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ、ロット番号２０１６０４０７、ＰＢＳに５０ｍｇ／ｍｌで保存。陽性対照抗体アテゾリズマブ：Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ、ロット番号３１０９９０４、６０ｍｇ／ｍｌを、氷酢酸（１６．５ｍｇ）、Ｌ−ヒスチジン（６２ｍｇ）、ポリソルベート２０（８ｍｇ）およびスクロース（８２１．６ｍｇ）を含む緩衝液に保存した。
【０２３８】
投与溶液の調製
試験品および対照品は、投与前にＰＢＳで希釈し、２〜８℃で一時的に保存し、室温で４時間以内に使用した。希釈されていない残りの試験品および対照品は、２〜８℃で保存された。
【０２３９】
動物
４０匹の雄Ｂ−ｈＰＤ−Ｌ１ヒト化マウス株Ｃ５７ＢＬ／６は、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ  Ｃｏ．  Ｌｔｄ．から供給された（品質証明書番号：２０１７１６８１６）。
【０２４０】
動物飼育管理
動物はＢｅｉｊｉｎｇ  Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ  Ｃｏ．，  Ｌｔｄ．の動物センターの特定の病原体フリーバリアで、個々の換気ケージ（ＩＶＣ）あたり５匹の動物が飼育された。動物は到着後３日間から１週間気候順化させた。
【０２４１】
温度は２０〜２６℃に維持され、湿度は４０〜７０％に維持された。ケージはポリカーボネート製で、サイズは３００ｍｍ＊１８０ｍｍ＊１５０ｍｍであった。寝床の材料は、圧力滅菌された軟材で、週に１回交換された。各ケージの識別ラベルには、以下の情報が含まれていた：動物の数、性別、系統、受け取った日付、治療、グループ番号、および治療の開始日。動物は、調査期間全体の間、オートクレーブされた乾燥顆粒食品および水を自由に摂取させた。食品はＳＰＦグレードであり、Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｋｅａｏ  Ｘｉｅｌｉ  Ｆｅｅｄ  Ｃｏ．、Ｌｔｄから購入した。水は限外ろ過によって精製された。動物は耳コーディングによってマークされた。
【０２４２】
実験方法と手順
親のＭＣ３８マウス結腸癌細胞株は、Ｓｈｕｎｒａｎ  Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．Ｌｔｄから購入した。ＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１細胞株は、Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ  Ｃｏ、ＬｔｄによるマウスＰＤ−Ｌ１をヒトＰＤ−Ｌ１に置き換えることにより構築した。細胞は、１０％熱不活性化ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ中の単層培養で維持し、週２回継代培養した。対数増殖期で増殖する細胞を収穫し、腫瘍接種についてカウントした。
【０２４３】
腫瘍発達のため、右前腹部に０．１ｍＬのＰＢＳを含むＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１腫瘍細胞（５×１０５）を各マウスに皮下注射した。平均腫瘍サイズがおよそ１００ｍｍ３に達したときに、腫瘍を持つ動物を３つの調査グループへランダムに登録した。各グループは８匹のマウスで構成された。以下に示す所定のレジメンに従って、試験品および対照品を、腫瘍を持つマウスに投与した。
【０２４４】
【表３】
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【０２４５】
マウスの体重減少が１０％を超えた場合、治療スケジュールを調整し、それに応じて投与容量を減らすか、あるいは、その動物の調査を中止した。
【０２４６】
投与の完了後、腫瘍の容量と体重の監視を、週に２度、２週間まで続けた。
【０２４７】
動物をＣＯ２で安楽死させ、続いて骨髄破壊を行って、安楽死を確証させた。
【０２４８】
腫瘍測定指標
腫瘍の大きさは、キャリパーを使用して２次元で週に２回測定され、容量は式：Ｖ＝０．５  ａ＊ｂ２を使用してｍｍ３と表した。ここで、ａおよびｂはそれぞれ腫瘍の長径と短径である。
【０２４９】
腫瘍接種および動物のグループ分けの前に、その後、実験の間に週に２回、最後に、実験の終点で動物を安楽死させる前に、動物の体重を測定した。偶発的な死が起きたとき、または動物の死の寸前に、動物の体重を測定した。
【０２５０】
実験の全期間の間、動物は、腫瘍潰瘍の出現、動物の精神状態、食物と水の消費の視覚的推定などを含むが、それらに限定されない、行動と状態について、１日２回（午前と午後）チェックされた。
【０２５１】
調査終了時に腫瘍を収集し、重量を測定した。安楽死させた動物と収集した腫瘍の両方について写真を撮り、後に報告書に添付した。
【０２５２】
薬物評価指標
相対的な腫瘍成長阻害（ＴＧＩ％）：ＴＧＩ％＝（１−Ｔ／Ｃ）ｘ１００％。ＴおよびＣは、それぞれ、所与の日の治療群および媒体群の平均相対腫瘍容量（ＲＴＶ）を指す。Ｔ／Ｃ％は相対腫瘍増殖率［１］を表し、その式は：Ｔ／Ｃ％＝ＴＲＴＶ／ＣＲＴＶ×１００％（ＴＲＴＶ：治療群の平均ＲＴＶ；ＣＲＴＶ：媒体群の平均ＲＴＶ；ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０、Ｖ０はグループ分け時の腫瘍容量を指し、Ｖｔは治療後に示された各時点で測定された腫瘍容量を指す。）
【０２５３】
腫瘍重量の阻害率（ＩＲＴＷ％）：終点で、動物の腫瘍の重量を測定し、各群の平均腫瘍重量を決定し、ＩＲＴＷ％を式：
ＩＲＴＷ％＝（Ｗ対照群−Ｗ治療群）／Ｗ対照群×１００で計算した。Ｗは平均腫瘍重量を指す。
【０２５４】
スチューデントｔ検定／二元配置ＡＮＯＶＡを使用してデータを分析し、Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。統計分析と生物学的観察の両方を考慮した。
【０２５５】
結果
実験の全体の間で明らかな臨床徴候は観察されなかった。ほとんどの動物の体重は、調査の間、徐々に増加した。経時的な平均体重と平均体重変化率を図２５と表３に示した。Ｂ６０−５５−１群の動物は、対照群の動物と比較して、体重に統計的差異を示さなかった（Ｐ＞０．０５）。
【０２５６】
【表４】
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【０２５７】
すべてのマウスは、実験の全体を通じて腫瘍の成長を厳密に監視し、腫瘍の大きさを週に２回測定して記録した。腫瘍成長阻害（ＴＧＩ％）を計算し、最適な治療ポイント（グループ分けの２３日後）で分析した。統計分析結果を表４および５に示す。３つの群の個々のマウス腫瘍成長を図２６および図２７にプロットした。アテゾリズマブおよびＢ６０−５５−１の投与後、腫瘍成長率の低下が観察された。アテゾリズマブおよびＢ６０−５５−１群における明確な腫瘍退縮は、２／８および１／８マウスにおいて別々に観察された。
【０２５８】
【表５】
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【０２５９】
【表６】
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【０２６０】
グループ分け後２９日目、屠殺したマウスからすべての腫瘍を摘出し、写真を撮り、重量を測定した。腫瘍重量の統計分析結果を表６および図２８に示す。投与完遂後も腫瘍がなおも成長しているため、２３日目と比較して腫瘍成長阻害率（ＴＧＩＴＶ％）が低下した。調査の終点（２３日目）の治療群においての腫瘍重量は、媒体群との有意差はなかった（Ｐ＞０．０５）。
【０２６１】
【表７】
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【０２６２】
この調査では、ほとんどの動物の重量が徐々に増加した。Ｂ６０−５５−１群の動物は、対照群の動物と比較して体重に統計的差異を示さず（Ｐ＞  ０．０５）、Ｂ６０−５５−１が現在の投与量で安全であることを示している。アテゾリズマブとＢ６０−５５−１の投与後、腫瘍成長率の低下が観察された。最良の腫瘍成長阻害点（グループ分け後２３日目）で、媒体対照群の平均腫瘍容量は２０７８±４５９ｍｍ３であったが、陽性対照治療群では、平均腫瘍容量は１０４６±３３６ｍｍ３であり、Ｂ６０−５５−１治療群では、平均腫瘍容量は１０２２±５５２ｍｍ３であった。腫瘍成長阻害ＴＧＩＴＶ％は、それぞれ５２．７％と５３．９％であった。この調査の終点（グループ分け後２９日目）で、２／８および１／８マウスにおいてアテゾリズマブおよびＢ６０−５５−１群での明確な腫瘍退縮が観察され、腫瘍重量阻害ＩＲＴＷ％はそれぞれ４４．２％および３１．８％であった。対照群と比較して、Ｂ６０−５５−１群の動物の腫瘍容量は、化合物に抗腫瘍活性があったが、有意差はなかった。
【０２６３】
したがって、この調査において、Ｂ６０−５５−１は、動物の体重に悪影響を与えたりなんらかの異常な臨床所見を誘導したりすることなく、１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルでアテゾリズマブに匹敵する抗腫瘍効力を示した。
【実施例１５】
【０２６４】
ヒト化ＮＳＧ（商標）マウスを使用した乳がんの異種移植モデルにおけるＢ６０−５５−１の評価。
皮膚がんを除いて、乳がんは女性で最も一般的ながんの形態であり、７０歳（ＣＤＣ）に達するまでに女性の約７％が発症している。米国がん協会の推定によると、２０１７年は米国で新たに診断された患者は２５２，７１０人、死者は４０，６１０人となるであろう。２００６年から２０１２年までの５年間の相対生存率は、すべてのステージあわせておよそ９０％であった。トリプルネガティブ乳がんは、エストロゲンとプロゲステロン受容体とＨＥＲ２タンパク質の発現が臨床的に陰性である、乳がんのユニークで攻撃的なサブタイプである。現在、この形態の乳がんに対処する標的療法はない。原発性ヒトがんのマウスモデルは、ヒト疾患を再現する、マウスにおける臨床的に重要ながんモデルとなるため、その開発は、ヒト疾患にとって重要である。ジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）は、患者由来の異種移植（ＰＤＸ）乳がんモデルと、高度免疫不全ＮＳＧ（商標）マウス系統およびＮＳＧ（商標）−ＳＧＭ３のようなＮＳＧ（商標）由来系統における細胞株異種移植モデルを確立した。ＮＳＧ（商標）（ＮＯＤ．Ｃｇ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ）マウスは、ヒトの細胞と組織を効率的に移植するその能力について開発された。移植効率は、免疫系の先天性欠損症のため、他のマウス系統よりも大幅に改善されている。ヒト化ＮＳＧ（商標）［ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧ（商標）］マウスは、ヒトＣＤ３４＋造血幹細胞を注射したＮＳＧ（商標）マウスであり、インビボでヒトの免疫機能を調査するための重要なツールとなってきた。これらのマウスは、新規の免疫療法、特にヒト特異的であり、マウスと十分に交差反応しないものの応用のための強力な前臨床プラットフォームを提供する。さらに、これらのモデルは、疾患のゲノムプロファイリングおよび／または前臨床薬開発のために使用される。この調査においては、ヒト化ＮＳＧ（商標）マウスで確立された乳がんのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株異種移植モデルを使用し、新規の抗体を評価した。
【０２６５】
マウスおよび飼育
移植後１６週間の末梢血に＞２５％のヒトＣＤ４５＋細胞を有するヒトＣＤ３４＋細胞を移植した雌ｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧ（商標）マウスをこの調査に使用した。２人のドナーからのＣＤ３４＋細胞を移植したｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧ（商標）マウスのコホートを使用した。マウスは、１つのケージにつき５匹までのマウスの密度で、ＨＥＰＡろ過した空気で個別に換気されたポリスルホンケージで飼育された。動物室は、制御された１２時間の明暗サイクル（午前６時から午後６時）で、人工蛍光灯で全体を照らされた。動物室の通常温度と相対湿度の範囲は、それぞれ２２〜２６℃と３０〜７０％であった。動物室は、１時間あたり１５までの空気交換されるように設定された。ろ過された水道水をｐＨ２．５〜３．０に酸性化し、標準的なげっ歯類用固形飼料が自由に提供された。
【０２６６】
方法と記録
２人の個々のドナーからの３８匹のｈｕ−ＣＤ３４  ＮＳＧ（商標）マウスを、マトリゲルとの１：１混合物中、５ｘ１０６のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を用いて、乳房脂肪体に移植した。体重と臨床所見は、移植後週に１Ｘ〜２Ｘ記録され、腫瘍が触知可能になったら、デジタルキャリパー測定を使用して腫瘍容量を週に２Ｘ決定した。腫瘍容量が〜６２−９８ｍｍ３に達した時、腫瘍容量に基づいてマウスを無作為化し、０日目から始めて表７に従って投与した。体重、臨床所見およびデジタルキャリパー測定は、投与開始後週に２Ｘ記録した。≦２の身体状態スコア、≧２０％の体重減少、または≧２０００ｍｍ３の腫瘍容量に達した動物は、調査終了前に安楽死させた。潰瘍性腫瘍のある動物も調査終了前に安楽死させた。残りの動物はすべて、調査４１日目にＣＯ２窒息により安楽死させた。
【０２６７】
【表８】
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【０２６８】
結果
この調査の結果を図２９および図３０に要約する。この結果は、調査において使用した乳がんの異種移植モデルにおいて、抗体Ｂ６０−５５−１がペンブロリズマブと同等の効力を示すことを示している。
【０２６９】
Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  ＵＳＡ、Ｉｎｃ．の登録商標である。
【０２７０】
本発明の特定の実施形態をここで詳細に記載したが、当業者は、すでに公開されているガイドラインおよび教示に基づいて、より詳細な態様のさまざまな修正および置換を実行できることを理解するであろう。そして、前記変更はすべて本発明の範囲内にある。本発明の全範囲は、添付の特許請求の範囲および任意の同等の文書によって与えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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