(57)【要約】本発明は、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）およびｍＴＯＲ抑制剤を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学的組成物；およびストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抑制剤を有効成分として含む、血管新生抑制用組成物に関する。また、本発明は、ストレプトニグリンおよびｍＴＯＲ抑制剤を利用した癌の治療方法、抗癌剤の製造時に使用するための用途および癌の予防または治療に使用するための組成物；およびストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抑制剤を利用した血管新生抑制方法、血管新生抑制用薬剤の製造時に使用するための用途および血管新生抑制に使用するための組成物に関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）およびラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項２】
前記ストレプトニグリンおよびラパマイシンは、１：０．０１〜１：１００のモル比率で混合されることを特徴とする請求項１に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項３】
前記癌は、ｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性が誘発される癌腫であることを特徴とする請求項１に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項４】
前記ｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性が誘発される癌は、腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項３に記載の癌の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項５】
請求項１に記載の薬学的組成物に抗癌剤を追加にさらに含む、癌の予防または治療用薬学的組成物。
【請求項６】
ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抑制剤を有効成分として含む、血管新生抑制用組成物。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦ抑制剤は、パゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）であることを特徴とする請求項６に記載の血管新生抑制用組成物。
【請求項８】
前記ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ抑制剤は、１：１×１０−５〜１：１×１０５のモル比率で混合されることを特徴とする請求項６に記載の血管新生抑制用組成物。
【請求項９】
請求項６に記載の組成物を含む、癌の予防、治療または転移抑制用薬学的組成物。
【請求項１０】
前記癌は、腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項９に記載の癌の予防、治療または転移抑制用薬学的組成物。
【請求項１１】
ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）およびラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）を癌患者に投与する段階を含む癌の治療方法。
【請求項１２】
前記ストレプトニグリンおよびラパマイシンは、１：０．０１〜１：１００のモル比率で癌患者に投与されることを特徴とする請求項１１に記載の癌の治療方法。
【請求項１３】
前記癌は、ｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性が誘発される癌腫であることを特徴とする請求項１１に記載の癌の治療方法。
【請求項１４】
前記ｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性が誘発される癌は、腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項１３に記載の癌の治療方法。
【請求項１５】
抗癌剤を投与する段階を追加に含むことを特徴とする請求項１１に記載の癌の治療方法。
【請求項１６】
ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抑制剤を処理する段階を含む血管新生抑制方法。
【請求項１７】
前記ＶＥＧＦ抑制剤は、パゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）であることを特徴とする請求項１６に記載の血管新生抑制方法。
【請求項１８】
前記ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ抑制剤は、１：１×１０−５〜１：１×１０５のモル比率で処理されることを特徴とする請求項１６に記載の血管新生抑制方法。
【請求項１９】
前記血管新生は、癌であることを特徴とする請求項１６に記載の血管新生抑制方法。
【請求項２０】
前記癌は、腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項１９に記載の血管新生抑制方法。
【請求項２１】
ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）およびラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）を含む組成物の抗癌剤の製造時に使用するための用途。
【請求項２２】
前記ストレプトニグリンおよびラパマイシンは、１：０．０１〜１：１００のモル比率で含まれることを特徴とする請求項２１に記載の抗癌剤の製造時に使用するための用途。
【請求項２３】
前記癌は、ｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性が誘発される癌腫であることを特徴とする請求項２１に記載の抗癌剤の製造時に使用するための用途。
【請求項２４】
前記ｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性が誘発される癌は、腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項２３に記載の抗癌剤の製造時に使用するための用途。
【請求項２５】
ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抑制剤を含む組成物の血管新生抑制用薬剤の製造時に使用するための用途。
【請求項２６】
前記ＶＥＧＦ抑制剤は、パゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）であることを特徴とする請求項２５に記載の血管新生抑制用薬剤の製造時に使用するための用途。
【請求項２７】
前記ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ抑制剤は、１：１×１０−５〜１：１×１０５のモル比率で含まれることを特徴とする請求項２５に記載の血管新生抑制用薬剤の製造時に使用するための用途。
【請求項２８】
前記血管新生は、癌であることを特徴とする請求項２５に記載の血管新生抑制用薬剤の製造時に使用するための用途。
【請求項２９】
前記癌は、腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項２８に記載の血管新生抑制用薬剤の製造時に使用するための用途。
【請求項３０】
癌の予防または治療に使用するための、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）およびラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）を含む組成物。
【請求項３１】
前記ストレプトニグリンおよびラパマイシンは、１：０．０１〜１：１００のモル比率で含まれることを特徴とする請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記癌は、ｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性が誘発される癌腫であることを特徴とする請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
前記ｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性が誘発される癌は、腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
前記組成物に抗癌剤を追加に含むことを特徴とする請求項３０に記載の組成物。
【請求項３５】
血管新生抑制に使用するための、ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抑制剤を含む組成物。
【請求項３６】
前記ＶＥＧＦ抑制剤は、パゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）であることを特徴とする請求項３５に記載の組成物。
【請求項３７】
前記ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ抑制剤は、１：１×１０−５〜１：１×１０５のモル比率で含まれることを特徴とする請求項３５に記載の組成物。
【請求項３８】
前記血管新生は、癌であることを特徴とする請求項３５に記載の組成物。
【請求項３９】
前記癌は、腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であることを特徴とする請求項３８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１０月２４日に出願された韓国特許出願第１０−２０１７−０１３８４８１号を優先権として主張し、前記明細書の全体は、本出願の参考文献である。
【０００２】
本発明は、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）およびｍＴＯＲ抑制剤を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学的組成物；およびストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抑制剤を有効成分として含む、血管新生抑制用組成物に関する。
【０００３】
また、本発明は、ストレプトニグリンおよびｍＴＯＲ抑制剤を利用した癌の治療方法、抗癌剤の製造時に使用するための用途および癌の予防または治療に使用するための組成物；およびストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抑制剤を利用した血管新生抑制方法、血管新生抑制用薬剤の製造時に使用するための用途および血管新生抑制に使用するための組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
癌とは、個体の必要に応じて規則的かつ節制のある増殖と抑制をすることができる正常細胞とは異なって、組織内で必要な状態を無視し、無制限の増殖をする未分化細胞から構成された細胞塊りであって、腫瘍ともいう。このような無制限の増殖をする癌細胞は、周囲の組織に浸透し、さらに深刻な場合は、身体の他の器官に転移されて、深刻な苦痛を伴い、結局には、死を招く難病である。医学の発展にもかかわらず、韓国の癌患者の発生者の数は、持続的に増加して、最近１０年間約４４％が増加し、国際的にも抗癌剤の市場もやはり増加して、年間約１０００億ドルの規模を有すると報告されたことがある。
【０００５】
抗癌治療には、１世代抗癌剤である化学抗癌剤、２世代抗癌剤である標的抗癌剤があり、これらの副作用を克服するために、３世代抗癌剤として免疫抗癌剤が開発された後、継続的に研究が進行されている。しかしながら、癌治療の最も大きい問題は、再発にあり、癌突然変異の多様性に起因して癌特定標的が不在にして、治療過程で癌が抗癌剤耐性に発展して抗癌治療に困難を経験したり、原発癌を治療した後にも、転移および再発した癌により患者が死亡する場合が大部分を占めると知られている。これに伴い、抗癌剤の効果を増進させるために、抗癌剤を混合して併用治療しようとする戦略が提示されている。
【０００６】
トランスグルタミナーゼ（Ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ  ２，ＴＧａｓｅ２）は、特異ペプチドに結合されたグルタミン残基のγ−カルボキサミド基と多様なアミン間の結合を促進する酵素であって、一次的には、損傷の予防と防御および復旧を促進するにあたって主要な役割をするものと知られているが、最近の研究によれば、非正常的に過度な発現が現れれば、神経退行性疾患、粥状動脈硬化症、炎症性疾患、および自己免疫疾患のような疾病の発生に原因を提供できると報告されたことがある。特に、ＴＧａｓｅ２の発現がｐ５３を重合化し、不安定にして消滅させることが報告され、これに伴い、ＴＧａｓｅ２の抑制を通じてＴＧａｓｅ２が過発現した腎臓癌に対する抗癌効果を示すことができることが報告されたことがある（特許文献１）。
【０００７】
これより、本発明者らは、ＴＧａｓｅ２抑制剤を利用した抗癌治療においてより効果的な抗癌効果を得るために努力した結果、ＴＧａｓｅ２抑制剤として抗癌剤に使用され得ることが確認されたストレプトニグリンと共に、ｍＴＯＲ抑制剤であるラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）を併用処理したとき、それぞれを単独処理する場合より抗癌活性のシナジー効果を示すことができることを確認することによって、本発明を完成した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】韓国特許第１０−１６４３４５９号公報（２０１６．０７．２１）
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｆｅｎｇ，Ｑｉｙｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ８（２０１７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
当業界においてＴＧａｓｅ２の抑制を通じてＴＧａｓｅ２が過発現した腎臓癌に対する抗癌効果を示すことができることが報告されたことがあるが、抗癌剤を通した癌治療過程で癌が抗癌剤耐性に発展して抗癌治療に困難を経験するなど多様な副作用が現れることができて、抗癌剤の効果を増進させるために抗癌剤を混合して併用治療しようとする戦略が提示されている。
【００１１】
したがって、本発明の目的は、ＴＧａｓｅ２抑制剤およびｍＴＯＲ抑制剤を有効成分とする癌の予防または治療用薬学的組成物を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、ＴＧａｓｅ２抑制剤およびＶＥＧＦ抑制剤を有効成分とする血管新生抑制用組成物を提供することにある。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、ＴＧａｓｅ２抑制剤およびｍＴＯＲ抑制剤を利用した癌の治療方法、抗癌剤の製造時に使用するための用途および癌の予防または治療に使用するための組成物を提供することにある。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、ＴＧａｓｅ２抑制剤およびＶＥＧＦ抑制剤を利用した血管新生抑制方法、血管新生抑制用薬剤の製造時に使用するための用途および血管新生抑制に使用するための組成物を提供することにある。
【００１５】
以下、本発明を具体的に説明する。
【００１６】
本発明は、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）およびラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１７】
また、本発明は、前記薬学的組成物に抗癌剤を追加にさらに含む、癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００１８】
本発明の薬学的組成物において、前記「ストレプトニグリン」および「ラパマイシン」を併用投与することを通じて、癌細胞増殖抑制および死滅誘導効果において有意的なシナジー効果を得ることができる。この際、ストレプトニグリンおよびラパマイシンは、１：０．０１〜１：１００のモル比率で混合されることが好ましく、具体的に１：０．１〜１：１０のモル比率で混合されることがより好ましい。本発明の薬学的組成物を通じて少ない濃度の抗癌剤を使用して有意的に抗癌効果を得ようとする観点から、前記ストレプトニグリンおよびラパマイシンは、１：０．５〜１：５のモル比率で混合されることがより好ましい。
【００１９】
本発明の薬学的組成物において、前記「癌」は、ｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性が誘発される癌腫でありうる。この際、ｍＴＯＲを抑制するｍＴＯＲ抑制剤に対して、細胞内で高い水準に発現したＴＧａｓｅ２が前記ｍＴＯＲ抑制剤を標的して活性を遮断すると、ｍＴＯＲ抑制剤に対する耐性癌に進行され得る。本発明では、ｍＴＯＲ抑制剤の活性を遮断するＴＧａｓｅ２の活性を抑制するＴＧａｓｅ２抑制剤をｍＴＯＲ抑制剤と併用処理して増加した抗癌効果を示すことができる。これより、本発明の薬学的組成物は、ＴＧａｓｅ２が発現してｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性が誘発され得る癌腫に対して有意的な抗癌効果を示すことができる。具体的に、本発明において対象とする癌腫は、腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上のものであり得、より具体的には、腎臓癌であることが最も好ましいが、これに限定されない。
【００２０】
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、ｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性を示すことができる腎臓癌において、ラパマイシンを処理するにつれてｍＴＯＲ関連因子の発現水準および活性水準が減少し、ＴＧａｓｅ２の発現が増加することを確認した（図１）。
【００２１】
これより、本発明者らは、ＴＧａｓｅ２の発現が増加するにつれてｍＴＯＲに対する耐性が誘発され得ると判断し、ｍＴＯＲ抑制剤であるラパマイシンおよびＴＧａｓｅ２抑制剤であるストレプトニグリンを混合して、腎臓癌細胞株に併用処理した。その結果、ラパマイシンおよびストレプトニグリンを併用処理した腎臓癌細胞株において単独処理群に比べて有意的に増加した癌細胞死滅および腫瘍成長抑制効果を示すことを確認した（図２および図９）。
【００２２】
また、本発明者らは、乳癌細胞株にドキシサイクリン（ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ，Ｄｏｘ）を処理してＴＧａｓｅ２の過発現を誘導したとき、ラパマイシンに対する耐性が現れてラパマイシンを単独で処理した細胞において有意的な癌細胞死滅効果を示さないことを確認した反面、ラパマイシンおよびストレプトニグリンを併用処理したときには、癌細胞死滅効果が顕著に増加することを確認した（図３）。
【００２３】
したがって、本発明のストレプトニグリンおよびラパマイシンは、併用処理することを通じてそれぞれの抗癌剤を単独で投与する場合より有意的に増加した癌細胞死滅効果を示すことができるので、本発明の薬学的組成物は、癌の予防または治療に有用に使用され得る。
【００２４】
また、本発明の癌の予防または治療用薬学的組成物には、抗癌剤を追加にさらに含むことができる。この際、追加に使用可能な抗癌剤は、ストレプトニグリンのようにＴＧａｓｅ２の活性を抑制できる阻害剤として知られていて、当業界において使用されている抗癌剤およびラパマイシンのようにｍＴＯＲを標的とする阻害剤として知られていて、当業界において使用されている抗癌剤のうちいずれか一方または両方の薬物でありうるが、これに限定されず、本発明の薬学的組成物に含まれて上昇された抗癌活性を示すことができるものに容易適用され得る範囲の抗癌剤であれば、制限なしに使用され得る。
【００２５】
本発明の組成物を医薬品に使用する場合、ストレプトニグリンおよびラパマイシンを含む薬学的組成物は、臨床投与時に多様な下記の経口または非経口投与形態に製剤化されて投与され得るが、これに限定されるものではない。
【００２６】
経口投与用剤形としては、例えば錠剤、丸剤、硬／軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、顆粒剤、エリキシル剤などがあるが、これらの剤形は、有効成分以外に希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよび／またはグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸およびそのマグネシウムまたはカルシウム塩および／またはポリエチレングリコール）を含有している。錠剤は、また、マグネシウムアルミニウムシリケート、デンプンペースト、ゼラチン、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよび／またはポリビニルピロリジンのような結合剤を含有することができ、場合によってデンプン、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩のような崩解剤または沸騰混合物および／または吸収剤、着色剤、香味剤、および甘味剤を含有することができる。
【００２７】
本発明のストレプトニグリンおよびラパマイシンを含む薬学的組成物は、非経口投与することができ、非経口投与は、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射を注入する方法による。この際、非経口投与用剤形に製剤化するためにストレプトニグリンおよびラパマイシンを安定剤または緩衝剤とともに水に混合して溶液または懸濁液に製造し、これをアンプルまたはバイアル単位投与型に製造することができる。前記組成物は、滅菌され／されるか、防腐剤、安定化剤、水和剤または乳化促進剤、浸透圧調節のための塩および／または緩衝剤などの補助剤、およびその他治療的に有用な物質を含有することができ、通常の方法である混合、顆粒化またはコーティング方法により製剤化することができる。
【００２８】
また、本発明のストレプトニグリンおよび／またはラパマイシンの人体に対する投与量は、患者の年齢、体重、性別、投与形態、健康状態および疾患程度によって変わることができ、体重が６０ｋｇである成人患者を基準とするとき、一般的に０．００１〜１，０００ｍｇ／日であり、好ましくは０．０１〜５００ｍｇ／日であり、医師または薬剤師の判断によって一定の時間間隔で１日１回〜数回に分割投与することもできる。
【００２９】
また、本発明は、ストレプトニグリンおよびラパマイシン、またはこれらの薬学的に許容可能な塩、水和物または溶媒化物を有効成分として含む、経口投与製剤を提供することができる。
【００３０】
本発明の経口投与製剤は、ストレプトニグリンおよびラパマイシンを６０日以上の相乗的治療効果を示すことができる。具体的に、ストレプトニグリンまたはラパマイシンを単独投与したときには、その薬理効果の持続期間が短くて、反復的投与を通した抗癌効果を期待しなければならない反面、ストレプトニグリンおよびラパマイシンを併用投与する場合には、前記単独投与時に比べて腫瘍成長抑制および癌治療効果を持続的に示すことができて、反復的な薬物投与に比べて効果的でありうる。
【００３１】
本発明の経口投与製剤は、徐放性または制御放出性製剤でありうる。徐放性製剤の場合には、ストレプトニグリンおよびラパマイシンが同時放出され得、制御放出性製剤の場合には、ストレプトニグリンおよびラパマイシン、またはラパマイシンおよびストレプトニグリンが順次に放出され得るように調節され得る。
【００３２】
また、本発明は、ストレプトニグリンおよびラパマイシンを癌患者に投与する段階を含む癌の治療方法を提供する。
【００３３】
前記ストレプトニグリンおよびラパマイシンは、前記癌の予防または治療用薬学的組成物に使用されるものと同一であるので、説明は前記記載に代わる。
【００３４】
前記癌は、前記癌の予防または治療用薬学的組成物が予防または治療しようとする癌と同一であるので、説明は前記記載に代わる。
【００３５】
前記投与は、前記癌の予防または治療用薬学的組成物を投与する方法乃至剤形と同一に行われ得るので、説明は前記記載に代わる。
【００３６】
また、本発明は、ストレプトニグリンおよびラパマイシンを含む組成物の抗癌剤の製造時に使用するための用途を提供する。
【００３７】
前記ストレプトニグリンおよびラパマイシンは、前記癌の予防または治療用薬学的組成物に使用されたものと同一であるので、説明は前記記載に代わる。
【００３８】
前記抗癌剤は、癌を予防または治療したり、転移を抑制する製剤を全部含む意味である。
【００３９】
前記癌は、前記癌の予防または治療用薬学的組成物が予防または治療しようとする癌と同一であるので、説明は前記記載に代わる。
【００４０】
また、本発明は、癌の予防または治療に使用するための、ストレプトニグリンおよびラパマイシンを含む組成物を提供する。
【００４１】
前記ストレプトニグリンおよびラパマイシンは、前記癌の予防または治療用薬学的組成物に使用されたものと同一であるので、説明は前記記載に代わる。
【００４２】
前記癌は、前記癌の予防または治療用薬学的組成物が予防または治療しようとする癌と同一であるので、説明は前記記載に代わる。
【００４３】
また、本発明は、ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抑制剤を有効成分として含む、血管新生抑制用組成物を提供する。
【００４４】
また、本発明は、前記血管新生抑制用組成物を含む、癌の予防、治療または転移抑制用薬学的組成物を提供する。
【００４５】
本発明の薬学的組成物において、前記「ＶＥＧＦ抑制剤」は、パゾパニブ（ｐａｚｏｐａｎｉｂ）がより好ましいが、これに限定されず、新生血管誘導因子であるＶＥＧＦの発現または活性を抑制して血管新生を抑制するものと当業界に知られた薬物であれば、当業者の裁量によって変更適用され得る。
【００４６】
本発明の薬学的組成物において、前記「ストレプトニグリン」および「ＶＥＧＦ抑制剤」を併用投与することを通じて、腫瘍組織周辺の血管新生を効果的に抑制することができ、これに伴う癌細胞増殖抑制および死滅誘導効果において有意的なシナジー効果を得ることができる。この際、ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ抑制剤は、１：１×１０−５〜１：１×１０５のモル比率で混合されることが好ましく、具体的に１：１×１０−４〜１：１×１０４のモル比率で混合されることがより好ましい。本発明の薬学的組成物を通じて少ない濃度の抗癌剤を使用して有意的に血管新生抑制効果および抗癌効果を得ようとする観点から、前記ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ抑制剤は、１：２×１０−４〜１：５×１０３のモル比率で混合されることがより好ましい。
【００４７】
本発明の薬学的組成物において、前記「癌」は、ｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性が誘発される癌腫でありうる。具体的に、本発明において対象とする癌腫は、腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上であり得、より具体的には、腎臓癌であることが最も好ましいが、これに限定されない。
【００４８】
また、本発明は、ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抑制剤を処理する段階を含む血管新生抑制方法を提供する。
【００４９】
前記ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ抑制剤は、前記血管新生抑制用組成物に使用されたものと同一であるので、説明は前記記載に代わる。
【００５０】
前記処理は、牛、豚、羊、鶏、犬、ヒトなどを含む哺乳動物、鳥類など血管新生抑制が必要な個体を対象として行われ得、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏと関係なく行われ得る。
【００５１】
前記血管新生は、血管細胞増殖乃至血管新生に関連した疾患を意味し、具体的に；眼血管新生、例えば網膜病症（糖尿病性網膜病症を含む）、加齢黄斑変性、乾癬、毛細血管腫、血管腫、冠状動脈硬化症、炎症疾患、例えばリウマトイド（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ）またはリウマチ性（ｒｈｅｕｍａｔｉｃ）炎症疾患、特に関節炎（リウマトイド関節炎を含む）、またはその他慢性炎症障害、例えば慢性喘息、動脈または移植後冠状動脈硬化症、子宮内膜症、および新生物疾患、例えばいわゆる固形腫瘍および液状（または造血）腫瘍（例：白血病およびリンパ腫）などの癌を含み、これに制限されない。ただし、好ましくは癌であり得、前記癌は、前記癌の予防、治療または転移抑制用薬学的組成物が対象とする癌と同一であるので、説明は前記記載に代わる。
【００５２】
また、本発明は、ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抑制剤を利用した血管新生抑制用薬剤の製造時に使用するための用途；および癌の予防または治療に使用するための組成物を提供する。
【００５３】
前記ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ抑制剤は、前記血管新生抑制用組成物に使用されたものと同一であるので、説明は前記記載に代わる。
【００５４】
前記血管新生は、前記血管新生抑制方法において対象とする血管新生と同一であるので、説明は前記記載に代わる。
【００５５】
本発明の具体的な実施例において、本発明者らは、ＴＧａｓｅ２の発現乃至活性を抑制する場合、腫瘍血管の生成を抑制することができるかを確認した結果、ＴＧａｓｅ２に対するｓｉＲＮＡまたはストレプトニグリンでＴＧａｓｅ２の発現乃至活性を抑制したとき、血管細胞の発達乃至癌細胞周辺の血管生成が抑制されることを確認した（図４〜図７）。また、ストレプトニグリンとＶＥＧＦ抑制剤であるパゾパニブを併用して処理する場合、腎臓癌細胞株に対する死滅効果がそれぞれ単独で処理する場合に比べて有意的に増加することを確認することができた（図８）。
【００５６】
したがって、本発明のストレプトニグリンは、腫瘍組織の血管新生を有意的に抑制することができ、これに伴い、ＶＥＧＦ抑制剤とともに混合する場合、よりシナジー効果を示すと共に、腫瘍組織の血管新生を抑制し、癌の治療および転移抑制効果を示すことができる。したがって、ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ抑制剤を含む本発明の薬学的組成物は、血管新生抑制、癌の予防、癌の治療または癌の転移抑制のために有用に使用され得る。
【課題を解決するための手段】
【００５７】
前記目的を達成するために、本発明は、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）およびラパマイシン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）を有効成分として含む、癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００５８】
また、本発明は、前記薬学的組成物に抗癌剤を追加にさらに含む、癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。
【００５９】
本発明の好ましい一実施例において、前記ストレプトニグリンおよびラパマイシンは、１：０．０１〜１：１００のモル比率で混合されるものでありうる。
【００６０】
本発明の好ましい一実施例において、前記癌は、ｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性が誘発される癌腫であり得、具体的に腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上でありうる。
【００６１】
また、本発明は、ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抑制剤を有効成分として含む、血管新生抑制用組成物を提供する。
【００６２】
また、本発明は、前記血管新生抑制用組成物を含む、癌の予防、治療または転移抑制用薬学的組成物を提供する。
【００６３】
本発明の好ましい一実施例において、前記ＶＥＧＦ抑制剤は、パゾパニブでありうる。
【００６４】
本発明のさらに他の好ましい一実施例において、前記ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ抑制剤は、１：１×１０−５〜１：１×１０５のモル比率で混合されるものでありうる。
【００６５】
本発明のさらに他の好ましい一実施例において、前記癌は、腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上でありうる。
【００６６】
また、本発明は、ストレプトニグリンおよびラパマイシンを利用した癌の治療方法、抗癌剤の製造時に使用するための用途および癌の予防または治療に使用するための組成物を提供する。
【００６７】
本発明の好ましい一実施例において、前記ストレプトニグリンおよびラパマイシンは、１：０．０１〜１：１００のモル比率で混合されるものでありうる。
【００６８】
本発明の好ましい一実施例において、前記癌は、ｍＴＯＲ抑制剤に対して耐性が誘発される癌腫であり得、具体的に腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上でありうる。
【００６９】
また、本発明は、ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）抑制剤を利用した血管新生抑制方法、血管新生抑制用薬剤の製造時に使用するための用途および血管新生抑制に使用するための組成物を提供する。
【００７０】
本発明の好ましい一実施例において、前記ＶＥＧＦ抑制剤は、パゾパニブでありうる。
【００７１】
本発明の他の好ましい一実施例において、前記ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ抑制剤は、１：１×１０−５〜１：１×１０５のモル比率で混合されるものでありうる。
【００７２】
本発明のさらに他の好ましい一実施例において、前記血管新生は、癌であり得、具体的に腎臓癌、乳癌、大腸癌および黒色腫よりなる群から選ばれるいずれか一つ以上でありうる。
【発明の効果】
【００７３】
本発明では、ＴＧａｓｅ２抑制剤であるストレプトニグリンをｍＴＯＲ抑制剤であるラパマイシンと共に腎臓癌細胞株に併用処理したとき、有意的な癌細胞死滅効果を示すことができることを確認し、これは、ストレプトニグリンおよびラパマイシンをそれぞれ単独で癌細胞に処理する場合より上昇された癌細胞死滅効果を示すことができることを確認した。また、ＴＧａｓｅ２が過発現した乳癌細胞株においてｍＴＯＲ抑制剤に対する耐性を示すが、ストレプトニグリンおよびラパマイシンを併用処理したとき、ラパマイシンに対する耐性を克服して有意的な癌細胞死滅効果を示すことができることを確認した。
【００７４】
しかも、本発明では、ＴＧａｓｅ２抑制剤であるストレプトニグリンが腫瘍組織周辺の新生血管形成を抑制することができることを確認し、これをＶＥＧＦ抑制剤とともに併用処理したとき、それぞれ単独で処理する場合より上昇された血管新生抑制効果および癌細胞死滅効果を示すことを確認した。
【００７５】
したがって、本発明は、ＴＧａｓｅ２抑制剤であるストレプトニグリンおよびｍＴＯＲ抑制剤であるラパマイシンを含む癌の予防または治療用薬学的組成物を提供する。また、本発明は、ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ抑制剤を含む血管新生抑制用組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、ｍＴＯＲ抵抗性を有する腎臓癌細胞においてラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）の処理時間または濃度によるＴＧａｓｅ２（ＴＧ２）および関連因子の発現水準を確認した結果を示す。ラパマイシンを処理する時間または濃度が増加するほどＴＧ２および関連因子の発現もやはり増加することを確認することができ、ウェスタンブロットの発色時間を長く（ｌｏｎｇ）するほどＴＧ２バンドが強く現れた。
【図２】図２は、腎臓癌細胞株においてストレプトニグリン（Ｓｔｒｅｐｔｏｎｉｇｒｉｎ）またはラパマイシンの処理による癌細胞死滅効果を確認した結果を示す。ストレプトニグリンまたはラパマイシンをそれぞれ単独で処理する場合に比べて併用して処理する場合、腎臓癌細胞株の死滅が有意的に増加したことを確認することができ、特にＡＣＨＮ腎臓癌細胞株に対する効果が有意的に増加した。
【図３】図３は、ドキシサイクリン（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ；Ｄｏｘ）を処理してＴＧａｓｅ２（ＴＧ２）を過発現させることによって、ラパマイシン抵抗性が誘発された乳癌細胞株に、ストレプトニグリンまたはラパマイシンの処理による抗癌活性のシナジー効果を確認した結果である。Ｄｏｘを処理しない場合に比べてＤｏｘを処理した場合、ストレプトニグリンまたはラパマイシンをそれぞれ単独で処理する場合に比べて併用して処理する場合、乳癌細胞株の死滅が有意的に増加したことを確認することができた。
【図４】図４は、ＴＧａｓｅ２発現の抑制による血管生成の抑制効果を示す。ｓｉＴＧ２を処理する場合、血管細胞（ヒト臍静脈上皮細胞）の増殖および移住が抑制され、血管の生成もやはり有意的に抑制されることを確認することができ、これは、血管生長促進因子であるＶＥＧＦを処理しても同一に現れた。
【図５】図５は、ｓｉＣＴＬ、ｓｉＴＧ２またはＶＥＧＦの処理による血管細胞（ヒト臍静脈上皮細胞）の移住（Ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）を示す。ｓｉＴＧ２を処理する場合、血管細胞の移住が有意的に抑制され、これは、血管生長促進因子であるＶＥＧＦを処理しても同一に現れた。
【図６】図６は、ｓｉＣＴＬ、ｓｉＴＧ２またはＶＥＧＦの処理による血管生成を示す。ｓｉＴＧ２を処理する場合、血管生成が有意的に抑制され、これは、血管生長促進因子であるＶＥＧＦを処理しても同一に現れた。
【図７】図７は、ＴＧａｓｅ２抑制剤であるストレプトニグリン処理による腫瘍血管生成抑制効果を確認した結果である。腎臓癌細胞株（ＣＡＫＩ−１）を異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）したマウスにストレプトニグリンを処理する場合、濃度依存的に血管特異的標識子であるＣＤ３１陽性細胞の発現が有意的に減少したことを確認することができた。
【図８】図８は、腎臓癌細胞株においてストレプトニグリンまたはパゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）の処理による癌細胞死滅効果を示す。ストレプトニグリンまたはパゾパニブをそれぞれ単独で処理する場合に比べて併用して処理する場合、腎臓癌細胞株の死滅効果が有意的に増加することを確認することができた。
【図９】図９は、腎臓癌細胞株（ＣＡＫＩ−１）を異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）したマウスにストレプトニグリンまたはラパマイシンを処理する場合、腫瘍の成長抑制効果を示す。ストレプトニグリンまたはラパマイシンをそれぞれ単独で処理する場合に比べて併用して処理する場合、腫瘍の体積および重量が有意的に減少することを確認することができた。
【発明を実施するための形態】
【００７７】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明しようとする。これらの実施例は、ただ本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により制限されるものと解されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明だろう。
【００７８】
（実施例１．ＴＧａｓｅ２およびｍＴＯＲ耐性癌との関係確認）
本発明者らは、先行研究を通じてＴＧａｓｅ２の過発現が癌の成長を促進し、抗癌剤および放射線治療に対する耐性を誘発し、癌血管生成を促進し、癌細胞の死滅を抑制することを確認し、これに伴い、ＴＧａｓｅ２の活性を抑制する抑制剤が癌の再発を抑制することができることを確認した（特許文献１）。また、多様な抗癌剤耐性がｍＴＯＲＣ２およびＮＦ−κＢの活性化により誘発され得るので、本発明では、ｍＴＯＲ抑制剤と知られたラパマイシンを癌細胞に処理したとき、ＴＧａｓｅ２（ＴＧ２）の発現および活性化水準が変化するか否かを確認した。
【００７９】
具体的に、腎臓癌（ｒｅｎａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ，ＲＣＣ）細胞株であるＡＣＨＮ細胞およびＣＡＫＩ−１細胞（国立癌センター提供）をそれぞれ１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に接種して培養した後、ラパマイシンを処理した後、追加に培養した。この際、ラパマイシンの処理時間によるＴＧａｓｅ２の変化を確認するためには、１０ｎＭ濃度のラパマイシン処理開始後０、３、６、１２および２４時間にそれぞれの細胞を収得し；ラパマイシンの処理濃度によるＴＧａｓｅ２の変化を確認するために、０、１、１０および１００ｎＭの濃度でそれぞれ処理し、追加に２４時間培養した後、細胞を収得した。前記収得したそれぞれの細胞を破砕して収得した上澄み液をタンパク質抽出物として収得した後、ウェスタンブロットを行って、目的タンパク質の発現水準を確認した。ウェスタンブロットを行うための１次抗体として、抗ｐ−ｍＴＯＲ（Ｓｅｒ２４４８）抗体、抗−ｍＴＯＲ抗体、抗−ｐ−ｐ７０  Ｓ６ｋ（Ｔｈｒ３８９）抗体、抗−ｐ７０  Ｓ６ｋ抗体、抗−ｐ−ＡＫＴ（Ｓｅｒ４７３）抗体、抗−ｐ−ＡＫＴ抗体、抗−ｐ−ｐ６５（Ｓｅｒ２７６）抗体、抗−ｐ６５抗体、抗−ＴＧａｓｅ２抗体および抗−β−ａｃｔｉｎ抗体をそれぞれ使用して目的タンパク質の発現を確認した。
【００８０】
その結果、図１に示されたように、腎臓癌細胞においてラパマイシン処理時間によってｍＴＯＲ関連因子の活性水準が変化することを確認した。ラパマイシンを処理してｐ−ｍＴＯＲが減少し、ｐ−ｐ７０  Ｓ６ｋが抑制される反面、ｐ−ＡＫＴおよびｐ−ｐ６５は増加して活性化することを確認した。これと共に、ラパマイシンを処理するにつれてｐ−ｐ６５（ＮＦ−κＢ）が活性化し、ＴＧ２も増加することを確認した。また、ラパマイシンの処理濃度に依存的にＴＧ２の発現乃至活性が増加することを確認することができ、ウェスタンブロット過程で発色時間を長くするほどＴＧ２バンドが濃く発色された。これを通じて、ＴＧａｓｅ２は、ｍＴＯＲ抵抗性を誘発する原因となり得ることが分かる。
【００８１】
（実施例２．ＴＧａｓｅ２抑制剤およびｍＴＯＲ抑制剤の併用処理による癌細胞株死滅効果の確認）
＜２−１＞ストレプトニグリンおよびラパマイシンの併用処理による腎臓癌細胞株死滅効果確認
ＴＧａｓｅ２が癌細胞においてｍＴＯＲ抵抗性を誘発する原因となり得ることを確認して、ＴＧａｓｅ２抑制剤およびｍＴＯＲ抑制剤を併用処理したとき、抗癌効果が増加することができるかを確認するために、ＴＧａｓｅ２抑制剤であるストレプトニグリンおよびｍＴＯＲ抑制剤であるラパマイシンを混合して、癌細胞に処理した。
【００８２】
具体的に、腎臓癌細胞株であるＡＣＨＮ細胞およびＣＡＫＩ−１細胞（国立癌センター提供）をそれぞれ１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に接種して培養した後、１０ｎＭラパマイシンおよび／または１０ｎＭストレプトニグリンを単独または併用で処理した後、追加に４８時間の間培養した。培養後、それぞれの細胞に０．４％トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ  ｂｌｕｅ）を処理して細胞を染色して、生存細胞と死滅細胞を分類および計数した。計数した細胞の数は、ラパマイシンおよびストレプトニグリンを処理しない未処理対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）の生存細胞数を基準として相対的な生存細胞数の比率を計算した。
【００８３】
その結果、図２に示されたように、ストレプトニグリンおよびラパマイシンを混合して併用処理した腎臓癌細胞において有意的に増加した癌細胞死滅水準を確認した。抗癌剤を処理しない未処理対照群に比べて、ラパマイシンを単独で処理した腎臓癌細胞株は、９０％以上の細胞生存率を示し、ストレプトニグリンを単独で処理した腎臓癌細胞株は、６５％以上の細胞生存率を示すことを確認した。これに対し、ラパマイシンおよびストレプトニグリンを併用処理したとき、ＣＡＫＩ−１細胞およびＡＣＨＮ細胞においてそれぞれ約３５％および約３０％の細胞生存率を示して、ラパマイシンおよびストレプトニグリンを単独で投与した実験群に比べて顕著に増加した細胞死滅効果を示すことを確認した。
【００８４】
＜２−２＞ラパマイシン抵抗性誘発癌細胞株に対するストレプトニグリンとのシナジー抗癌効果確認
腎臓癌細胞株には、ＴＧａｓｅ２が他の細胞に比べて高い水準に発現していると知られており、このような腎臓癌細胞株においてストレプトニグリンおよびラパマイシンを併用投与したとき、抗癌活性のシナジー効果を示すことができることを確認した。これより、ｍＴＯＲ耐性によってラパマイシン抵抗性が誘発された癌細胞株においてＴＧａｓｅ２抑制剤の処理による抗癌効果の変化を示すことができるかを確認した。
【００８５】
具体的に、乳癌細胞株であるＭＣＦ７細胞（国立癌センター提供）を１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に接種して培養した後、１０ｎＭドキシサイクリン（Ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅ，Ｄｏｘ）を処理してＴＧａｓｅ２の過発現を誘導した。ＴＧａｓｅ２の過発現は、抗−ＴＧａｓｅ２抗体を利用したウェスタンブロットを行って、Ｄｏｘ処理の有無によるＴＧａｓｅ２過発現を確認した。その後、ＴＧａｓｅ２過発現が誘導されたＭＣＦ７細胞とＤｏｘを処理しないＭＣＦ７細胞に１０ｎＭラパマイシンおよび／または１０  ｎＭストレプトニグリンを単独または併用で処理した後、追加に４８時間の間培養した。培養後、それぞれの細胞に０．４％トリパンブルーを処理して細胞を染色して、生存細胞と死滅細胞を分類および計数した。計数した細胞の数は、ラパマイシンおよびストレプトニグリンを処理しない未処理対照群（ｃｏｎｔｒｏｌ）の生存細胞数を基準として相対的な生存細胞数の比率を計算した。
【００８６】
その結果、図３に示されたように、Ｄｏｘを処理した乳癌細胞株（ＭＣＦ７  ｃｅｌｌ）においてＴＧａｓｅ２が有意的に過発現することを確認した。まず、Ｄｏｘを処理しないＭＣＦ７細胞において単独でラパマイシンを処理したとき、有意的な癌細胞死滅効果を示す反面、Ｄｏｘを処理したＭＣＦ７細胞においては、ＴＧａｓｅ２の過発現とともに、ラパマイシンに対する耐性が誘発されて、ラパマイシンを処理したとき、有意的に癌細胞死滅効果を示さなかった。ストレプトニグリンを単独投与する場合には、Ｄｏｘの処理有無と関係なく、類似した水準の細胞死滅効果を示すことを確認して、ＴＧａｓｅ２の過発現の有無と関係なく類似した水準を示すことを確認した。これに対し、ラパマイシンおよびストレプトニグリンを併用投与する場合、ＴＧａｓｅ２過発現を誘導しない（Ｄｏｘを処理しない）ＭＣＦ７細胞群よりＴＧａｓｅ２過発現誘導を通じてラパマイシン抵抗性ができたＭＣＦ７細胞群において顕著に増加した癌細胞死滅効果を示すことを確認した。
【００８７】
すなわち、Ｄｏｘを処理してＴＧａｓｅ２過発現が誘導された乳癌細胞株では、ラパマイシンに対する抵抗性が誘発されたにもかかわらず、ラパマイシンおよびストレプトニグリンを併用投与したとき、抗癌活性のシナジー効果を示して、癌細胞死滅効果が顕著に増加することを確認した。
【００８８】
（実施例３．ＴＧａｓｅ２抑制剤およびＶＥＧＦ抑制剤の併用処理による腫瘍血管生成抑制効果確認）
＜３−１＞  ＴＧａｓｅ２発現抑制による血管生成抑制の有無確認
報告された研究によれば、ＴＧａｓｅ２は、血管生成を促進して腫瘍の成長および転移を促進できる役割をすることができる（非特許文献１）。これより、本発明者らは、本発明のＴＧａｓｅ２抑制剤が腫瘍血管の生成を抑制する役割をすることができるか否かを確認するために、まずＴＧａｓｅ２発現抑制による血管生成抑制の有無を確認しようとした。
【００８９】
具体的に、ヒト臍静脈上皮細胞（ｈｕｍａｎ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｖｅｉｎ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ，ＨＵＶＥＣ）を培地に接種して培養した後、ｓｉＣＴＬまたはｓｉＴＧａｓｅ２（ｓｉＴＧ２）のｓｉＲＮＡおよび血管生長促進因子としてＶＥＧＦを培地に処理した後、追加培養した。ｓｉＲＮＡおよびＶＥＧＦを処理した細胞を培養した後、培地にさらにブロモデオキシウリジン（Ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ，ＢｕｄＵｒｄ）を処理し、ＢｒｄＵｒｄ標識分析（ＢｒｄＵｒｄ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ａｓｓａｙ）を行った。定量のために、培地に増殖した細胞のうちＢｒｄＵｒｄ陽性細胞を計数した。計数した細胞は、ｓｉＣＴＬ処理およびＶＥＧＦ未処理群のＢｒｄＵｒｄ陽性細胞数を基準として、それぞれの実験群のＢｒｄＵｒｄ細胞数を相対的百分率で求めた。
【００９０】
これと共に、血管生成分析を共に行った。ＨＵＶＥＣ細胞をマトリゲル（Ｍａｔｒｉｇｅｌ）−コーティングウェルに接種して細胞をウェルの表面に付着させて培養した。培地にＶＥＧＦおよびそれぞれのｓｉＲＮＡを添加して追加培養した後、血管生成分析キット（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ）を使用して形成された管セグメントを計数した。
【００９１】
その結果、図４〜図６に示されたように、対照群として使用されたｓｉＣＴＬ処理細胞の場合、血管新生誘導因子であるＶＥＧＦを共に処理したとき、細胞の増殖、移住および血管生成程度が全部急増した。反面、ｓｉＴＧ２を処理した細胞では、対照群に比べて細胞の増殖、移住および血管生成程度が有意的に減少し、特にＶＥＧＦ処理によって細胞の増殖、移住および血管生成が増加した程度が対照群に比べて５０％以上減少したことを確認することができた。前記データは、ＴＧａｓｅ２の発現を抑制する場合、細胞群において血管生成を抑制することができることを示す。
【００９２】
＜３−２＞ストレプトニグリン処理による腫瘍血管生成抑制効果の確認
ＴＧａｓｅ２の発現を抑制したとき、血管生成が抑制され得ることを確認して、ＴＧａｓｅ２抑制剤であるストレプトニグリンを処理したとき、癌細胞周辺の血管生成が抑制され得るかを確認した。
【００９３】
具体的に、腎臓癌細胞株であるＣＡＫＩ−１細胞株をマウスに異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）してマウスモデルを製造した。その後、マウスモデルにストレプトニグリンを０．１ｍｇ／ｋｇまたは０．２ｍｇ／ｋｇの投与量で投与し、マウスを飼育して腫瘍の形成を観察した。異種移植後、腫瘍部位を切除して生検組織試料を収得し、試料を免疫組織化学染色して血管特異的標識子であるＣＤ３１陽性細胞の発現数を確認した。
【００９４】
その結果、図７に示されたように、ストレプトニグリンの投与量が増加するにつれてＣＤ３１陽性細胞数の水準が減少し、０．２ｍｇ／ｋｇ投与量でストレプトニグリンを投与した実験群においてストレプトニグリン未投与対照群に比べてＣＤ３１陽性細胞の水準が約２０％で現れることを確認した。これを通じて、ストレプトニグリンを処理してＴＧａｓｅ２の活性が抑制されるにつれて、腎臓癌組織で有意的に抗新生血管効果を示すことができることを確認した。
【００９５】
＜３−３＞ストレプトニグリンおよびパゾパニブの併用処理による腫瘍血管生成抑制効果の確認
前記実施例＜３−２＞でＴＧａｓｅ２の抑制剤であるストレプトニグリンを処理する場合、癌細胞周辺の血管生成が抑制されることを確認した。これより、ＶＥＧＦ抑制剤、その中でパゾパニブ（Ｐａｚｏｐａｎｉｂ）を併用して処理する場合、血管生成抑制効果が増加するか否かを確認しようとした。
【００９６】
具体的に、パゾパニブ５μＭおよびストレプトニグリン２ｎＭを利用して前記実施例＜２−１＞と同じ方法で相対的な生存細胞数の比率を計算した。
【００９７】
その結果、図８に示されたように、パゾパニブまたはストレプトニグリンをそれぞれ単独で処理する場合に比べて両者を併用して処理する場合、腎臓癌細胞株の死滅効果が有意的に増加することを確認することができ、特にＡＣＨＮ腎臓癌細胞株において有意的に増加した。
【００９８】
（実施例４．ＴＧａｓｅ２抑制剤およびｍＴＯＲ抑制剤の併用処理による腫瘍成長抑制効果確認）
前記実施例２で確認したように、ＴＧａｓｅ２抑制剤であるストレプトニグリンとｍＴＯＲ抑制剤であるラパマイシンを併用して癌細胞に処理する場合、その死滅効果が有意的に増加した。これより、ストレプトニグリンとラパマイシンを併用して腫瘍に処理する場合、その成長が抑制されるか否かを確認しようとした。
【００９９】
具体的に、特定の病原菌がない６週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃ−ヌードマウス（城南、韓国）の頭に皮下接種でＣＡＫＩ−１腎臓癌細胞株（５×１０６）を異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）した。腫瘍の大きさが１００ｍｍ２に到達すると、前記マウスにラパマイシン０．５ｍｇ／ｋｇ（腹腔注射、１日１回、５日／１週）および／またはストレプトニグリン０．０５ｍｇ／ｋｇ（経口投与、１日１回、５日／１週）を処理して飼育した。対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）としては、溶媒を使用した。初期腫瘍の体積は、キャリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）を使用して３〜４日間隔で測定し、腫瘍の重量は、Ｖ＝（Ａ×Ｂ２）／２の式で計算した（Ｖ＝体積（ｍｍ２）、Ａ＝長い直径（ｍｍ）、Ｂ＝短い直径（ｍｍ））。マウスは、７．５％ＣＯ２チャンバーで犠牲にさせて腫瘍を収得し、収得した腫瘍の写真を撮った。
【０１００】
その結果、図９に示されたように、ラパマイシンまたはストレプトニグリンをそれぞれ単独で処理する場合に比べて併用して処理する場合、腎臓癌腫瘍の体積および重量が有意的に減少することを確認することができた。これは、ラパマイシンとストレプトニグリンの併用処理は、腫瘍の成長を有意的に抑制することを意味する。
【産業上の利用可能性】
【０１０１】
本発明は、ＴＧａｓｅ２抑制剤であるストレプトニグリンおよびｍＴＯＲ抑制剤であるラパマイシンを利用する癌の予防または治療用薬学的組成物、癌の治療方法、抗癌剤の製造時に使用するための用途および癌の予防または治療に使用するための組成物を提供する。また、本発明は、ストレプトニグリンおよびＶＥＧＦ抑制剤を利用する血管新生抑制用組成物、血管新生抑制方法、血管新生抑制用薬剤の製造時に使用するための用途および血管新生抑制に使用するための組成物を提供する。したがって、本発明は、癌治療剤乃至血管新生抑制剤を開発するのに寄与することができるので、産業上の利用可能性が大きい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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