(57)【要約】  患者のガストリン関連の腫瘍及び/又は癌を体液性及び細胞性免疫応答の誘導因子に対して感作する方法が提供される。いくつかの実施態様において、この方法は、抗ガストリン抗体、ガストリンペプチド、及び／又はガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸を有する組成物を患者に投与することに関する。また、腫瘍及び／又は癌に関連する線維症の形成を予防し、軽減し、及び／又は排除する方法、並びに、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌を治療するための方法であって、それを必要とする患者に、患者の抗ガストリン体液性又は細胞性免疫応答を提供する及び／又は誘導する第１の薬剤、並びにこの腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答の１又はそれ以上刺激因子を含む第２の薬剤を投与することを含む方法が提供される。  【選択図】    図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（i）ガストリンペプチド及び／又はＣＣＫ−Ｂ受容体に対する能動的及び／又は受動的な体液性免疫応答を誘導及び／又は提供する第１の薬剤、並びに（ii）免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記第１の薬剤が、ガストリンペプチド、抗ガストリン抗体、及び抗ＣＣＫ−Ｒ抗体から成る群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記第１の薬剤が、ガストリンペプチド（任意に、該ガストリンペプチドが、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれのみから成る。）を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ガストリンペプチドが、（任意に、リンカーを介して）免疫原性担体に結合している、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記免疫原性担体が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンから成る群から選択される、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記リンカーがε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む、請求項４記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記リンカーと前記ガストリンペプチドが、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）、請求項４又は６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記医薬組成物が、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）から成る群から選択される標的ポリペプチドの生物活性を阻害する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、アベルマブ及びデュルバルマブから成る群から選択される、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記ガストリン関連の腫瘍及び/又は癌が膵臓癌である、請求項１記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記第１の薬剤が、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれのみから成るガストリンペプチドを、抗ガストリン液性応答を誘導するのに有効な量を含み、前記第２の薬剤が、ガストリン関連の腫瘍又は癌を持つ患者に投与されたときに.ガストリン関連の腫瘍又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導又は増強するのに有効な量の免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記第１の薬剤が、１又はそれ以上の抗CCK-B受容体抗体を含み、ガストリン関連の腫瘍又は癌を有する患者に投与した場合にガストリン関連の腫瘍又は癌に存在するCCK-B受容体を介したガストリンシグナル伝達を低減又は阻害するのに十分な量で医薬組成物中に存在する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
ガストリン関連の腫瘍又は癌を治療するための薬剤の製造に使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
ガストリン関連の腫瘍又は癌の治療に使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
患者のガストリン関連の腫瘍又は癌を治療する方法であって、（i）ガストリンペプチド及び／又はＣＣＫ−Ｂ受容体に対する能動的及び／又は受動的な体液性免疫応答を誘導及び／又は提供する第１の薬剤、並びに（ii）ガストリン関連の腫瘍又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導及び/又は提供する第２の薬剤、を含む医薬組成物の有効量を患者に投与する段階を含む方法。
【請求項１７】
前記第１の薬剤が、ガストリンペプチド、抗ガストリン抗体、及び抗ＣＣＫ−Ｒ抗体から成る群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第１の薬剤が、ガストリンペプチド（任意に、該ガストリンペプチドが、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれのみから成る。）を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ガストリンペプチドが、（任意に、リンカーを介して）免疫原性担体に結合している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫原性担体が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンから成る群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記リンカーがε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
前記リンカー及び前記ガストリンペプチドが、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）、請求項１９又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記医薬組成物が、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記ガストリン関連の腫瘍又は癌に対する細胞性免疫応答の誘導因子が、免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項２５】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）から成る群から選択される標的ポリペプチドの生物活性を阻害する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、アベルマブ及びデュルバルマブから成る群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ガストリン関連の腫瘍及び/又は癌が膵臓癌である、請求項１６記載の方法。
【請求項２８】
前記組成物が、膵臓癌に関連する線維症の発症を、低下させ及び／又は予防する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物が、約50μg〜約1000μg、約50μg〜約500μg、約100μg〜約1000μg、約200μg〜約1000μg、及び約250μg〜約500μgから成る群から選択される用量で投与される（任意に、該用量が1回、2回又は3回繰り返され、任意に、該2回目の用量が1回目の用量の1週間後に投与され、3回目の用量が投与されるならば、それが2回目の投与の1又は2週間後に投与される。）、請求項１６記載の方法。
【請求項３０】
ガストリン関連の腫瘍及び/又は癌を治療する方法であって、それを必要とする患者に、該腫瘍及び/又は癌におけるガストリンの１又はそれ以上の生物学的活性を直接又は間接的に阻害する第１の薬剤、及び該腫瘍及び/又は癌に対する細胞性免疫応答の刺激因子を含む第２の薬剤、を投与することを含む方法。
【請求項３１】
前記第1の薬剤が、
(i) ガストリンペプチドに対する液性免疫応答を提供及び/又は誘導することにより、前記腫瘍及び/又は癌におけるガストリンの１又はそれ以上の生物学的活性を直接的又は間接的に阻害する（任意に、該薬剤が、抗ガストリン抗体、患者に中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチドからなる群から選択される。）、及び／又は
(ii) ガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗ガストリン抗体が、ガストリン-17（G17）内に存在するエピトープに対する抗体である、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記エピトープが、アミノ酸配列EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、又はEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）内に存在する、請求項３０記載の方法。
【請求項３４】
前記第１の薬剤が、免疫原性担体に結合している、ガストリンペプチドを含む、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ガストリンペプチドが、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記免疫原性担体が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンから成る群から選択される、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記ガストリンペプチドがリンカーを介して前記免疫原性担体に結合している、請求項３４記載の方法。
【請求項３８】
前記リンカーがε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記リンカーと前記ガストリンペプチドが、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）、請求項３７又は３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１の薬剤が、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む、請求項３０〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記第２の薬剤が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項３０〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）から成る群から選択される標的ポリペプチドの生物活性を阻害する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、及びアベルマブから成る群から選択される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ガストリン関連の腫瘍及び/又は癌が膵臓癌である、請求項３０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記第１の薬剤が、膵臓癌に関連する線維症の発症を、低下させ及び／又は予防する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
患者におけるガストリン関連の腫瘍及び/又は癌の成長を阻害する方法であって、患者に組成物を投与することを含み、該組成物が、ガストリン免疫原、1又はそれ以上の抗ガストリン抗体、1又はそれ以上の抗CCK-B受容体抗体、又はそれらの任意の組み合わせを含む第１の薬剤、及び免疫チェックポイント阻害剤を含む第２の薬剤を含む方法。
【請求項４７】
前記第１の薬剤が、ガストリンペプチド、抗ガストリン抗体、及び抗ＣＣＫ−Ｒ抗体から成る群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記第１の薬剤が、ガストリンペプチド（任意に、該ガストリンペプチドが、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれのみから成る。）を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
前記ガストリンペプチドが、（任意に、リンカーを介して）免疫原性担体に結合している、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記免疫原性担体が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンから成る群から選択される、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記リンカーがε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
前記リンカーと前記ガストリンペプチドが、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）、請求項４９又は５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記組成物が、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記ガストリン関連の腫瘍又は癌に対する細胞性免疫応答の誘導因子が、免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項４６記載の方法。
【請求項５５】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）から成る群から選択される標的ポリペプチドの生物活性を阻害する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、アベルマブ及びデュルバルマブから成る群から選択される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ガストリン関連の腫瘍及び/又は癌が膵臓癌である、請求項４６記載の方法。
【請求項５８】
前記組成物が、膵臓癌に関連する線維症の発症を、低下させ及び／又は予防する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記組成物が、約50μg〜約1000μg、約50μg〜約500μg、約100μg〜約1000μg、約200μg〜約1000μg、及び約250μg〜約500μgから成る群から選択される用量で投与される（任意に、該用量が1回、2回又は3回繰り返され、任意に、該2回目の用量が1回目の用量の1週間後に投与され、3回目の用量が投与されるならば、それが2回目の投与の1又は2週間後に投与される。）、請求項４６記載の方法。
【請求項６０】
患者におけるガストリン関連の腫瘍又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導及び/又は増強する方法であって、ガストリン関連の腫瘍又は癌を有する患者に、ガストリン関連の腫瘍又は癌に存在するCCK-B受容体を介したガストリンシグナル伝達を低減又は阻害する薬剤を含む十分な量の組成物を、投与することを含む、方法。
【請求項６１】
前記薬剤が、ガストリンペプチド、抗ガストリン抗体、抗ＣＣＫ−Ｒ抗体、又はこれらの組み合わせを含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記ガストリンペプチドが、ガストリン-17（G17）ペプチド又はその免疫原性断片を含む、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記ガストリンペプチド又はその免疫原性断片が、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれのみから成る、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記薬剤が、免疫原性担体に結合しているガストリンペプチドを含む（任意に、該免疫原性担体が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される。）、請求項６１に記載の方法。
【請求項６５】
前記ガストリンペプチドが、リンカーを介して前記免疫原性担体に結合している（任意に、該リンカーがε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む。）、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記リンカーと前記ガストリンペプチドが、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記組成物が、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
患者におけるガストリン及び/又はCCK-B受容体シグナル伝達に関連する腫瘍及び/又は癌を、この腫瘍及び/又は癌に対する細胞性免疫応答の誘導因子に感作する方法であって、以下を含む組成物を患者に投与する段階を含む方法。
（a）ガストリンペプチドに対する能動的及び／又は受動的体液性免疫応答を誘導及び／又は提供する第１の薬剤、及び該腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は提供する第２の薬剤、又はこれらの組み合わせ（任意に、該第１の薬剤及び該第２の薬剤は、患者の細胞性免疫応答を促進し又は中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチド及び／又はその断片及び／又はその誘導体、並びに中和抗ガストリン抗体及び／又はその断片及び／又はその誘導体から成る群から個別に選択される。）、及び／又は
（b）ガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸を含む組成物、及び/又は
（c）CCK-B受容体においてガストリンの生物学的機能を遮断する薬剤を含む組成物。
【請求項６９】
前記抗ガストリン抗体が、ガストリン-17（G17）内に存在するエピトープに対する抗体である、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
前記エピトープが、アミノ酸配列EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、又はEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）内に存在する、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記組成物が、免疫原性担体に結合している、ガストリンペプチドを含む、請求項６８〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記ガストリンペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記免疫原性担体が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンから成る群から選択される、請求項７１記載の方法。
【請求項７４】
前記ガストリンペプチドがリンカーを介して前記免疫原性担体に結合している、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
前記リンカーがε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記リンカーと前記ガストリンペプチドが、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）、請求項７４又は７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記組成物が、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む、請求項６８〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
ガストリン関連の腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答の誘導因子が、免疫チェックポイント阻害剤を含む、請求項６８〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）から成る群から選択される標的ポリペプチドの生物活性を阻害する、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、アベルマブ及びデュルバルマブから成る群から選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記ガストリン関連の腫瘍及び/又は癌が膵臓癌である、請求項６８記載の方法。
【請求項８２】
前記組成物が、膵臓癌に関連する線維症の発症を、低下させ及び／又は予防する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記組成物が、約50μg〜約1000μg、約50μg〜約500μg、約100μg〜約1000μg、約200μg〜約1000μg、及び約250μg〜約500μgから成る群から選択される用量で投与される（任意に、該用量が1回、2回又は3回繰り返され、任意に、該2回目の用量が1回目の用量の1週間後に投与され、3回目の用量が投与されるならば、それが2回目の投与の1又は2週間後に投与される。）、請求項６８記載の方法。
【請求項８４】
腫瘍及び/又は癌に関連する線維症の形成を予防し、低減し、及び/又は排除する方法であって、該腫瘍及び/又は癌の細胞を、該腫瘍及び/又は癌における１又はそれ以上のガストリンの生物学的活性を直接又は間接的に阻害する薬剤と接触させる段階を含む方法。
【請求項８５】
前記薬剤が、
(i) ガストリンペプチドに対する液性免疫応答を提供及び/又は誘導する（任意に、該薬剤が、抗ガストリン抗体、患者に中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチドからなる群から選択される。）、及び／又は
(ii) ガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸を含み、
(iii) ガストリンホルモンの機能をブロックする小分子化合物を含む、
請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記抗ガストリン抗体が、ガストリン-17（G17）内に存在するエピトープに対する抗体である、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
前記エピトープが、アミノ酸配列EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、又はEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）内に存在する、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
前記薬剤が、免疫原性担体に結合している、中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチドを含む、請求項８４〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記ガストリンペプチドが、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記免疫原性担体が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンから成る群から選択される、請求項８８記載の方法。
【請求項９１】
前記ガストリンペプチドがリンカーを介して前記免疫原性担体に結合している、請求項８８記載の方法。
【請求項９２】
前記リンカーがε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
前記リンカーと前記ガストリンペプチドが、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）、請求項９１又は９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記薬剤が、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む、請求項８４〜９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
更に、前記腫瘍及び/又は癌を、該腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答の刺激因子を含む第２の薬剤と接触させる段階を含む、請求項８４〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記第２の薬剤が免疫チェックポイント阻害剤である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）から成る群から選択される標的ポリペプチドの生物活性を阻害する、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、及びアベルマブから成る群から選択される、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記腫瘍及び/又は癌が膵臓癌である、請求項８４〜９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
患者の該ガストリン関連腫瘍又は癌に反応するＣＤ４−／ＣＤ８−TEMRA細胞の数を増強するのに十分な量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、ガストリン関連腫瘍又は癌を有する患者に投与することにより、ガストリン関連腫瘍又は癌の転移を予防し、軽減し、及び/又は排除するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０１】
ガストリン関連の腫瘍又は癌に応答する、患者のＴＥＭＲＡ細胞の数を増加させるための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０２】
ガストリン関連の腫瘍又は癌を治療するための免疫チェックポイント阻害剤及びガストリン免疫原を含む組成物の使用。
【請求項１０３】
ガストリン関連の腫瘍又は癌を治療するための医薬品を製造するための、免疫チェックポイント阻害剤及びガストリン免疫原を含む組成物の使用。
【請求項１０４】
ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球の数を増強するのに十分な量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、ガストリン関連腫瘍又は癌を有する患者に投与することにより、ガストリン関連腫瘍又は癌の転移を予防し、軽減し、及び/又は排除するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１０５】
前記投与が、医薬組成物が投与されなかった場合に発生するであろうものと比較して、患者の生存率の改善、腫瘍成長の低減、及び/又は患者における化学療法剤及び/又は免疫チェックポイント療法の有効性の向上をもたらす、請求項１０４に記載の使用。
【請求項１０６】
ＦｏｘＰ３＋阻害性Ｔ調節細胞の数を減少させるのに十分な量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、ガストリン関連腫瘍又は癌を有する患者に投与することにより、ガストリン関連腫瘍又は癌の転移を予防し、軽減し、及び/又は排除するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本発明は、2017年6月15日に出願された米国仮特許出願第62/520,267号の優先権/利益を主張し、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
この発明は、腫瘍及び癌に対する体液性及び細胞性免疫の両方を誘導するための組成物及び方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、それを必要とする患者に、ガストリンペプチドに対する体液性又は細胞性免疫応答の治療的誘導因子を、及び/又は腫瘍若しくは癌に対する細胞性免疫応答の誘導因子と組み合わせて投与することに関する。
【背景技術】
【０００３】
一般に膵管腺癌（PDAC）と呼ばれる膵臓癌は、いくつかの細胞増殖調節経路に遺伝的変異が連続して蓄積する複雑な疾患である。膵上皮内腫瘍の比較的良性の病変として始まるもの(膵上皮内腫瘍性病変（PanIN）; Hruban et al., 2008)は、異常な遺伝子発現パターン、ゲノム不安定性、そして最終的には治療に抵抗性の浸潤性癌に多様に進行する。
膵管腺癌（PDAC）は、組織学的には、一般に、腺房管化生、免疫抑制性炎症細胞の存在、細胞傷害性T細胞の欠如、そして、密な線維性間質の存在、によって区別され定義される。これらの症状は程度が大きく異なり、明白な臨床症状なしに発生する可能性があり、膵管腺癌（PDAC）の早期診断はまれである。膵管腺癌（PDAC）腫瘍間質は、線維芽細胞や膵星細胞（PSC）などの間葉系細胞、細胞外マトリックスタンパク質、腫瘍周囲神経線維、内皮細胞、免疫細胞で構成される。間質細胞に影響を与えて豊富な線維形成効果をもたらす特定のメカニズムには、成長因子の活性化、コラーゲン及び細胞外マトリックスの合成と分泌（Zhang et al.,2007）、ならびに血管及びサイトカイン媒介プロセスの多数のレギュレーターの発現が含まれる（Hidalgo et al.,2012）。間質細胞に影響を与えて豊富な線維形成抑制効果を生み出す特定のメカニズムには、成長因子の活性化、コラーゲン及び細胞外マトリックスの合成と分泌(Zhang et al., 2007)、並びに血管及びサイトカイン媒介プロセスの多数の調節因子の発現(Hidalgo et al., 2012)が含まれる。
【０００４】
浸潤性膵管腺癌（PDAC）は、管系の癌腫の大部分を構成する（＞85％）。膵管腺癌（PDAC）の特徴は、制御されない浸潤と早期転移である。乳管腺癌の推定前駆体は、管内増殖性変化を受ける膵上皮内腫瘍性病変（PanIN）の顕微鏡的病変であり、最終的にはPanIN-1AからPanIN-3への一連の腫瘍性形質転換及び完全な悪性癌腫である。
膵管腺癌（PDAC）の重要な特徴は、腫瘍細胞の表面でのガストリン/コレシストキニン受容体（CCK-B）の異常な発現(Smith et al., 1994)と腫瘍による高レベルのガストリンの発現(Prasad et al., 2005)である。ガストリン(Smith, 1995) とコレシストキニン(Smith et al., 1990; Smith et al., 1991)の両方のタンパク質は、オートクリンメカニズム(Smith et al., 1996a; Smith et al., 1998b)を通じて膵臓腫瘍の成長を刺激し、いずれかのガストリン発現の抑制(Matters et al., 2009)又はCCK-B受容体機能の遮断(Fino et al., 2012; Smith & Solomon, 2014）は、がんの成長を抑制する。
【０００５】
長年にわたって多くの癌の治療で目覚ましい成功があったが、悲しいことに、膵管腺癌（PDAC）の画期的な治療薬の市場承認はほとんど又はまったく成功しておらず(Hidalgo, 2010; Ryan et al., 2014)、それはすべての胃腸の悪性腫瘍の良くない予後をもたらしている(Siegel et al., 2016)。現在、膵管腺癌（PDAC）の5年生存率は約6％であり、これはどの癌よりも低い(Siegel et al., 2016)。
このような膵管腺癌（PDAC）の悪い結果は過去30年間変化していない。集学的診断とそれに続く手術、化学療法及び放射線療法が第一選択の治療アプローチである。しかし、小分子化学療法薬のゲムシタビンと5-フルオロウラシルに基づく治療は満足のいく結果を生み出しておらず、このような治療による平均生存率は1年未満のままである(Hoff et al., 2011, Conroy et al., 2011)。
【０００６】
この低い生存率の要因には、初期段階でこの疾患を診断できないこと、細胞及び解剖学的腫瘍細胞の不均一性、高い転移率、及び薬物の浸透と暴露を阻害する高密度の線維性微小環境の存在が含まれる (Neesse et al., 2013)。腫瘍に近づくことができないことは、膵管腺癌（PDAC）に標準的な化学療法及び免疫療法剤に対する相対的耐性をもたらし(Templeton & Brentnall, 2013)、この致命的な疾患の予後不良の一因となっている。
宿主の免疫応答は、膵管腺癌（PDAC）の扱いにくく攻撃的な性質に寄与するもう1つの重要な要因である。膵管腺癌（PDAC）の微小環境で非常に顕著な免疫細胞は、抗腫瘍免疫をサポートしておらず (Zheng et al., 2013)、むしろ、これらの細胞（マクロファージ、T調節（Treg）細胞、及び好中球を含む）は、実際に腫瘍の成長と浸潤を促進する。実際、膵管腺癌（PDAC）の特徴の1つは、免疫破壊を回避する能力である(Hanahan & Weinberg, 2011)。
【０００７】
膵管腺癌（PDAC）を含む癌は、患者の免疫系からの攻撃を回避及び/又は無効にするために多くの手段を持っている(Pardoll, 2012; Weiner & Lotze, 2012)。腫瘍代謝環境の成分が、これらの反応を調節することが示されている(Feig et al., 2012; Quante et al., 2013)。がん治療法の大きなブレークスルーは、免疫抵抗性のメカニズムとして腫瘍細胞によってしばしば制御される免疫チェックポイント経路の発見にあった(Leach et al., 1996)。チェックポイント経路のタンパク質（例えば、細胞傷害性Tリンパ球関連抗原4（CTLA-4）、プログラム細胞死タンパク質1（PD-1）、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）など）を標的とする抗体が開発されており、臨床的に一部の癌（例えば、メラノーマ、非小細胞肺癌（NSCLC）、腎癌など）の免疫抵抗性を逆転させるのに有効であることが示されている(Pardoll, 2012)。しかし、膵管腺癌（PDAC）は、免疫抑制T調節（Treg）細胞が優勢で、CD8+腫瘍浸潤エフェクターT細胞がなく(Feig et al., 2012; Vonderheide & Bayne, 2013; Zheng et al., 2013)、血管新生が不十分である腫瘍微小環境を特徴としている。高密度間質環境の線維性の性質及び血流を介するアクセシビリティの欠如は、膵管腺癌（PDAC）が抗PD-1及び抗PD-L1抗体に対してせいぜい控えめにしか反応しないという観察を部分的に説明している(Brahmer et al., 2012, Zhang, 2018)。
【０００８】
膵管腺癌（PDAC）細胞の表面上のチェックポイントリガンドであるプログラム細胞死リガンド1（PD-L1）の発現レベルは、免疫チェックポイント阻害剤免疫療法に対する反応のもう一つの決定因子であると考えられている(Zheng, 2017)。いくつかの研究は、低レベルのPD-L1発現が免疫チェックポイント阻害剤に対する反応の欠如と相関していることを示唆しており(Soares et al., 2015)、PD-1又はPD-L1発現の刺激が、抗チェックポイントタンパク質抗体の有効性の促進に役立つ可能性がある (Lu et al., 2017)。膵管腺癌（PDAC）の他の研究では、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）が大多数の腫瘍細胞と多くの腫瘍サンプルで高度に発現していることが判明した(Lu et al., 2017)。従って、免疫チェックポイント阻害剤療法の有効性は、腫瘍内のPD-L1の状態を考慮し、膵管腺癌（PDAC）標的療法に伴うPD-L1発現の調節方法を模索することで潜在的に高めることができる。
【０００９】
現在、膵管腺癌（PDAC）の治療に関する臨床試験には、抗体免疫チェックポイント阻害剤と、化学療法、放射線、ケモカインの不活性化（Olaptesed)、サイクリン依存性キナーゼ阻害（アベマシクリブ）、TGF-β受容体Iキナーゼ阻害剤（ガルニセルチブ）、焦点接着キナーゼ阻害剤（デファクチニブ）、CSF1R阻害剤（ペキシダルチニブ）、ビタミンD、及びポリADPリボースポリメラーゼ阻害剤（ニラパリブ）との併用が含まれる。これらの研究は、膵管腺癌（PDAC）腫瘍微小環境への物理的浸透及び/又は免疫細胞の存在を改善する可能性のある複数の薬剤を組み合わせて、免疫チェックポイント阻害剤治療の有効性を改善することを目的としている。最近の報告によれば(Smith et al., 2018)、CCK-B受容体機能の阻害により、膵管腺癌（PDAC）線維症が減少し、抗PD-1抗体（Ab）と抗CTLA-4 Abを使用した抗体療法の有効性が改善された。
膵管腺癌（PDAC）腫瘍の複雑さを考えると、患者の異質性全体で膵管腺癌（PDAC）微小環境の免疫表現型を修正し、化学療法と免疫療法の両方に対して腫瘍の反応性を高めるために、新規戦略をどのように使用できるかについて、より深い理解が必要である。
【００１０】
胃癌も壊滅的な癌であり、特に胃腺癌はすべての癌の中で最悪の予後不良の1つであり、5年生存率は最大30％である(Ferlay et al., 2013)。この悪性腫瘍の早期発見は難しく、一般的に利用されていない意図的なスクリーニングの実践を必要とする。診断がうまく行ってもほとんどはすでに進行した状態であり、生存期間の中央値は9〜10ヶ月である(Wagner et al., 2010; Ajani et al., 2017)。現在の胃がんの標準治療には、適切な場合には手術し、5-フルオロウラシルなどのDNA合成阻害剤及び/又はシス白金などのDNA損傷剤による放射線療法及び/又は化学療法がそれに続く。
また、いくつかの胃癌の治療のために標的療法が出現し始めている。ヒト上皮成長因子受容体2（EGFR2）を発現する腫瘍は、トラスツズマブ(HERCEPTIN(R)の商標で Genentech, Inc.(South San Francisco, California, USA)により販売されている）用いて化学療法と組み合わせて治療できる。また、いくつかの胃癌は、ラムシルマブ（CYRAMZA(R)の商標でEli Lilly and Company(Indianapolis, Indiana, USA)により販売されている）などの抗血管新生薬にも反応する。この一般的な悪性腫瘍の陰気な予後を改善するために、この他の標的療法が緊急に必要である。
【００１１】
胃腺癌は、通常、ガストリン及びCCK-B受容体と呼ばれるガストリンの受容体を過剰発現し(Smith et al., 1998a; McWilliams et al., 1998)、CCK-Bへの結合時のガストリンを介した増殖効果は、これらの腫瘍における制御不能のオートクリンサイクルの成長と発現をもたらす。この癌の治療手段としてのガストリンの機能をブロックすることは、長年の研究の焦点であった（Rai et al., 2012のレビュー）。標的療法の候補の中で、ガストリンワクチンのポリクローナル抗体刺激因子(PAS)は、胃癌のフェーズ2の臨床試験と膵臓癌のフェーズ2及び3の臨床試験の生存率向上に大きな期待を示している。ガストリンに対する中和抗体の産生によって示されるように、ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)ワクチン接種は体液性免疫応答を誘発することが示されている。このワクチンは、ガストリンを排除することにより、腫瘍の成長を遅らせ、長期的な腫瘍殺傷活性を提供する可能性がある。
【００１２】
特定の腫瘍抗原に対する免疫応答を引き起こす癌ワクチンは、標的抗原の免疫介在性の固定化又は不活性化が体内に有害な影響を及ぼさない場合、魅力的な治療戦略である。ペプチドワクチンには、免疫応答の特異性を狭めるという潜在的な利点があるが、しばしば免疫原性が弱いという欠点がある。確実な応答を保証し、所望の免疫経路の誘導を開始するために、ペプチド組成を慎重に選択し、アジュバント分子及び送達システムを組み込むことが、必要になることがある。9〜11アミノ酸の短いペプチドは、エピトープ内の1つのアミノ酸の変化でさえも応答を妨げることになるが、特異的なCD8+T細胞媒介性応答を生成できる(Gershoni et al., 2007)。
ペプチド上の含められるエピトープの選択には、CD4+ヘルパーT細胞を誘導するMHCクラスIIエピトープ、及びヘルパーT細胞及びCD8+細胞傷害性Tリンパ球を誘導するMHCクラスI CD8エピトープを含む、望ましい免疫応答のタイプを考慮する必要がある(Li et al., 2014)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
免疫チェックポイント阻害剤とポリクローナル抗体刺激因子(PAS)などのガストリンペプチドワクチンとの組み合わせは、ガストリンペプチドホルモンによる成長刺激を受けやすい癌の結果を改善するための新しいアプローチである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本明細書においては、本発明のいくつかの実施態様を列挙し、多くの場合、これらの実施態様のバリエーション及び置換を列挙する。これらは、多数のさまざまな実施態様の単なる例示である。所与の実施態様の１又はそれ以上の代表的な特徴の言及も同様に例示的である。そのような実施態様は、典型的には、言及された特徴の有無にかかわらず存在し得る。同様に、これらの特徴は、この明細書に挙げられているかどうかにかかわらず、本発明の他の実施態様に適用することができる。過度の繰り返しを避けるため、この概要では、このような機能のすべての可能な組み合わせをリスト又は提案していない。
【００１５】
いくつかの実施態様において、本発明は、（i）ガストリンペプチド及び／又はＣＣＫ−Ｂ受容体に対する能動的及び／又は受動的な体液性免疫応答を誘導及び／又は提供する第１の薬剤、並びに（ii）免疫チェックポイント阻害剤を含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施態様において、前記第１の薬剤は、ガストリンペプチド、抗ガストリン抗体、及び抗ＣＣＫ−Ｒ抗体から成る群から選択される。いくつかの実施態様において、前記第１の薬剤は、ガストリンペプチド（任意に、該ガストリンペプチドが、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれのみから成る。）を含む。いくつかの実施態様において、配列番号１〜４のいずれかの１番目のアミノ酸におけるグルタミン酸残基はピログルタメート残基である。
【００１６】
いくつかの実施態様において、前記ガストリンペプチドは、（任意に、リンカーを介して）免疫原性担体に結合している。いくつかの実施態様において、前記免疫原性担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、前記リンカーはε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む。
いくつかの実施態様において、前記リンカーと前記ガストリンペプチドは、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）。
いくつかの実施態様において、前記医薬組成物は、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む。
いくつかの実施態様において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）から成る群から選択される標的ポリペプチドの生物活性を阻害する。いくつかの実施態様において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、アベルマブ及びデュルバルマブから成る群から選択される。
【００１７】
いくつかの実施態様において、前記ガストリン関連の腫瘍及び/又は癌は膵臓癌である。
いくつかの実施態様において前記第１の薬剤は、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれのみから成るガストリンペプチドを、抗ガストリン液性応答を誘導するのに有効な量を含み、前記第２の薬剤が、ガストリン関連の腫瘍又は癌を持つ患者に投与されたときに.ガストリン関連の腫瘍又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導又は増強するのに有効な量の免疫チェックポイント阻害剤を含む。いくつかの実施態様において、配列番号１〜４のいずれかの１番目のアミノ酸におけるグルタミン酸残基はピログルタメート残基である。
いくつかの実施態様において、前記第１の薬剤は、１又はそれ以上の抗CCK-B受容体抗体を含み、ガストリン関連の腫瘍又は癌を有する患者に投与した場合にガストリン関連の腫瘍又は癌に存在するCCK-B受容体を介したガストリンシグナル伝達を低減又は阻害するのに十分な量で医薬組成物中に存在する。
【００１８】
いくつかの実施態様において、本発明は、患者のガストリン関連の腫瘍又は癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、（i）ガストリンペプチド及び／又はＣＣＫ−Ｂ受容体に対する能動的及び／又は受動的な体液性免疫応答を誘導及び／又は提供する第１の薬剤、並びに（ii）ガストリン関連の腫瘍又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導及び/又は提供する第２の薬剤、を含む医薬組成物の有効量を患者に投与する段階を含む。いくつかの実施態様において、前記第１の薬剤は、ガストリンペプチド、抗ガストリン抗体、及び抗ＣＣＫ−Ｒ抗体から成る群から選択される。いくつかの実施態様において、前記第１の薬剤は、ガストリンペプチド（任意に、該ガストリンペプチドが、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれのみから成る。）を含む。いくつかの実施態様において、配列番号１〜４のいずれかの１番目のアミノ酸におけるグルタミン酸残基はピログルタメート残基である。いくつかの実施態様において、前記ガストリンペプチドは、（任意に、リンカーを介して）免疫原性担体に結合しており、前記免疫原性担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンから成る群から選択されてもよい。いくつかの実施態様において、前記リンカーはε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む。いくつかの実施態様において、前記リンカー及び前記ガストリンペプチドは、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）。いくつかの実施態様において、前記医薬組成物は、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む。いくつかの実施態様において、前記ガストリン関連の腫瘍又は癌に対する細胞性免疫応答の誘導因子は、免疫チェックポイント阻害剤を含む。いくつかの実施態様において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）から成る群から選択される標的ポリペプチドの生物活性を阻害する。いくつかの実施態様において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、アベルマブ及びデュルバルマブから成る群から選択される。
【００１９】
いくつかの実施態様において、前記ガストリン関連の腫瘍及び/又は癌は、膵臓癌である。いくつかの実施態様において、前記組成物は、膵臓癌に関連する線維症の発症を、低下させ及び／又は予防する。いくつかの実施態様において、前記組成物は、約50μg〜約1000μg、約50μg〜約500μg、約100μg〜約1000μg、約200μg〜約1000μg、及び約250μg〜約500μgから成る群から選択される用量で投与される（任意に、該用量が1回、2回又は3回繰り返され、任意に、該2回目の用量が1回目の用量の1週間後に投与され、3回目の用量が投与されるならば、それが2回目の投与の1又は2週間後に投与される。）。
【００２０】
いくつかの実施態様において、本発明は、ガストリン関連の腫瘍及び/又は癌を治療する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、それを必要とする患者に、該腫瘍及び/又は癌におけるガストリンの１又はそれ以上の生物学的活性を直接又は間接的に阻害する第１の薬剤、及び該腫瘍及び/又は癌に対する細胞性免疫応答の刺激因子を含む第２の薬剤、を投与することを含む。いくつかの実施態様において、前記第1の薬剤は、(i) ガストリンペプチドに対する液性免疫応答を提供及び/又は誘導することにより、前記腫瘍及び/又は癌におけるガストリンの１又はそれ以上の生物学的活性を直接的又は間接的に阻害する（任意に、該薬剤が、抗ガストリン抗体、患者に中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチドからなる群から選択される。）、及び／又は(ii) ガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸を含む。いくつかの実施態様において、前記抗ガストリン抗体は、ガストリン-17（G17）内に存在するエピトープに対する抗体である。いくつかの実施態様において、前記エピトープは、アミノ酸配列EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、又はEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）内に存在する。いくつかの実施態様において、前記ガストリンペプチドは、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、配列番号１〜４のいずれかの１番目のアミノ酸におけるグルタミン酸残基はピログルタメート残基である。いくつかの実施態様において、前記第１の薬剤は、免疫原性担体に結合している、ガストリンペプチドを含み、任意に、前記免疫原性担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、前記ガストリンペプチドはリンカーを介して前記免疫原性担体に結合しており、任意に、前記リンカーはε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む。いくつかの実施態様において、前記リンカーと前記ガストリンペプチドは、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）。いくつかの実施態様において、前記第１の薬剤は、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む。いくつかの実施態様において、前記第２の薬剤は免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施態様において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）から成る群から選択される標的ポリペプチドの生物活性を阻害する。いくつかの実施態様において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、アベルマブ及びデュルバルマブから成る群から選択される。
【００２１】
いくつかの実施態様において、前記ガストリン関連の腫瘍及び/又は癌は、膵臓癌である。いくつかの実施態様において、前記第１の薬剤は、膵臓癌に関連する線維症の発症を、低下させ及び／又は予防する。
いくつかの実施態様において、本発明は、患者におけるガストリン関連の腫瘍及び/又は癌の成長を阻害する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、患者に組成物を投与することを含み、該組成物が、ガストリン免疫原、1又はそれ以上の抗ガストリン抗体、1又はそれ以上の抗CCK-B受容体抗体、又はそれらの任意の組み合わせを含む第１の薬剤、及び免疫チェックポイント阻害剤を含む第２の薬剤を含む。いくつかの実施態様において、前記第１の薬剤は、ガストリンペプチド、抗ガストリン抗体、及び抗ＣＣＫ−Ｒ抗体から成る群から選択される。いくつかの実施態様において、前記第１の薬剤は、ガストリンペプチド（任意に、該ガストリンペプチドが、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれのみから成る。）を含む。いくつかの実施態様において、配列番号１〜４のいずれかの１番目のアミノ酸におけるグルタミン酸残基はピログルタメート残基である。いくつかの実施態様において、前記ガストリンペプチドは、免疫原性担体に結合しており、任意に、前記免疫原性担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、前記ガストリンペプチドは、リンカーを介して免疫原性担体に結合しており、任意に、前記リンカーはε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む。いくつかの実施態様において、前記リンカーと前記ガストリンペプチドは、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）。いくつかの実施態様において、この方法は化合物を採用し、前記組成物は、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む。いくつかの実施態様において、前記ガストリン関連の腫瘍又は癌に対する細胞性免疫応答の誘導因子は、免疫チェックポイント阻害剤を含む。いくつかの実施態様において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）から成る群から選択される標的ポリペプチドの生物活性を阻害する。いくつかの実施態様において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、アベルマブ及びデュルバルマブから成る群から選択される。
【００２２】
いくつかの実施態様において、前記ガストリン関連の腫瘍及び/又は癌は、膵臓癌である。いくつかの実施態様において、本願発明の方法に従って採用された組成物は、膵臓癌に関連する線維症の発症を、低下させ及び／又は予防する。いくつかの実施態様において、前記組成物は、約50μg〜約1000μg、約50μg〜約500μg、約100μg〜約1000μg、約200μg〜約1000μg、及び約250μg〜約500μgから成る群から選択される用量で投与される（任意に、該用量が1回、2回又は3回繰り返され、任意に、該2回目の用量が1回目の用量の1週間後に投与され、3回目の用量が投与されるならば、それが2回目の投与の1又は2週間後に投与される。）。
【００２３】
また、本願発明は、患者におけるガストリン関連の腫瘍又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導及び/又は増強する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、ガストリン関連の腫瘍又は癌を有する患者に、ガストリン関連の腫瘍又は癌に存在するCCK-B受容体を介したガストリンシグナル伝達を低減又は阻害する薬剤を含む十分な量の組成物を、投与することを含む。いくつかの実施態様において、前記薬剤は、ガストリンペプチド、抗ガストリン抗体、抗ＣＣＫ−Ｒ抗体、又はこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施態様において、前記ガストリンペプチドは、ガストリン-17（G17）ペプチド又はその免疫原性断片を含む。いくつかの実施態様において、前記ガストリンペプチド又はその免疫原性断片は、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む、本質的にそれから成る、又はそれのみから成る。いくつかの実施態様において、配列番号１〜４のいずれかの１番目のアミノ酸におけるグルタミン酸残基はピログルタメート残基である。いくつかの実施態様において、前記薬剤は、免疫原性担体に結合しているガストリンペプチドを含む（任意に、該免疫原性担体が、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される。）。いくつかの実施態様において、前記ガストリンペプチドは、リンカーを介して前記免疫原性担体に結合している（任意に、該リンカーがε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む。）。いくつかの実施態様において、前記リンカーと前記ガストリンペプチドは、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）。いくつかの実施態様において、前記組成物は、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む、請求項６０に記載の方法。
【００２４】
いくつかの実施態様において、本発明は、患者におけるガストリン及び/又はCCK-B受容体シグナル伝達に関連する腫瘍及び/又は癌を、この腫瘍及び/又は癌に対する細胞性免疫応答の誘導因子に感作する方法を提供する。いくつかの実施態様において、この方法は、以下を含む組成物を患者に投与する段階を含む。（a）ガストリンペプチドに対する能動的及び／又は受動的体液性免疫応答を誘導及び／又は提供する第１の薬剤、及び該腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は提供する第２の薬剤、又はこれらの組み合わせ（任意に、該第１の薬剤及び該第２の薬剤は、患者の細胞性免疫応答を促進し又は中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチド及び／又はその断片及び／又はその誘導体、並びに中和抗ガストリン抗体及び／又はその断片及び／又はその誘導体から成る群から個別に選択される。）、及び／又は（b）ガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸を含む組成物、及び/又は（c）CCK-B受容体においてガストリンの生物学的機能を遮断する薬剤を含む。
いくつかの実施態様において、前記抗ガストリン抗体は、ガストリン-17（G17）内に存在するエピトープに対する抗体である。いくつかの実施態様において、前記エピトープは、アミノ酸配列EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、又はEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）内に存在する。いくつかの実施態様において、配列番号１〜４のいずれかの１番目のアミノ酸におけるグルタミン酸残基はピログルタメート残基である。いくつかの実施態様において、前記組成物は、免疫原性担体に結合している、ガストリンペプチドを含む。いくつかの実施態様において、前記ガストリンペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、前記免疫原性担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、前記ガストリンペプチドは、リンカーを介して前記免疫原性担体に結合している。いくつかの実施態様において、前記リンカーは、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む。いくつかの実施態様において、前記リンカーと前記ガストリンペプチドは、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）。いくつかの実施態様において、本発明の方法に採用される組成物は、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む。いくつかの実施態様において、ガストリン関連の腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答の誘導因子は、免疫チェックポイント阻害剤を含む。いくつかの実施態様において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）から成る群から選択される標的ポリペプチドの生物活性を阻害する。いくつかの実施態様において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、アベルマブ及びデュルバルマブから成る群から選択される。
【００２５】
本発明のいくつかの実施態様において、前記ガストリン関連の腫瘍及び/又は癌は、膵臓癌である。いくつかの実施態様において、前記組成物は、膵臓癌に関連する線維症の発症を、低下させ及び／又は予防する。いくつかの実施態様において、前記組成物は、約50μg〜約1000μg、約50μg〜約500μg、約100μg〜約1000μg、約200μg〜約1000μg、及び約250μg〜約500μgから成る群から選択される用量で投与される（任意に、該用量が1回、2回又は3回繰り返され、任意に、該2回目の用量が1回目の用量の1週間後に投与され、3回目の用量が投与されるならば、それが2回目の投与の1又は2週間後に投与される。）。
【００２６】
また本発明は、腫瘍及び/又は癌に関連する線維症の形成を予防し、低減し、及び/又は排除する方法を提供する。この方法は、該腫瘍及び/又は癌の細胞を、該腫瘍及び/又は癌における１又はそれ以上のガストリンの生物学的活性を直接又は間接的に阻害する薬剤と接触させる段階を含む。いくつかの実施態様において、前記薬剤は、(i) ガストリンペプチドに対する液性免疫応答を提供及び/又は誘導する（任意に、該薬剤が、抗ガストリン抗体、患者に中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチドからなる群から選択される。）、及び／又は(ii) ガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸を含み、(iii) ガストリンホルモンの機能をブロックする小分子化合物を含む。いくつかの実施態様において、前記抗ガストリン抗体は、ガストリン-17（G17）内に存在するエピトープに対する抗体である。いくつかの実施態様において、前記エピトープは、アミノ酸配列EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、又はEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）内に存在する。いくつかの実施態様において、配列番号１〜４のいずれかの１番目のアミノ酸におけるグルタミン酸残基はピログルタメート残基である。いくつかの実施態様において、前記薬剤は、免疫原性担体に結合している、中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチドを含む。いくつかの実施態様において、前記ガストリンペプチドは、EGPWLEEEEE（配列番号１）、EGPWLEEEE（配列番号２）、EGPWLEEEEEAY（配列番号３）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号４）から成る群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施態様において、配列番号１〜４のいずれかの１番目のアミノ酸におけるグルタミン酸残基はピログルタメート残基である。いくつかの実施態様において、前記免疫原性担体は、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、前記ガストリンペプチドがリンカーを介して前記免疫原性担体に結合し、任意に、前記リンカーはε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルを含む。いくつかの実施態様において、前記リンカーと前記ガストリンペプチドは、アミノ酸スペーサーにより分離される（任意に、該アミノ酸スペーサーの長さが、１〜１０アミノ酸であり、さらに任意に該アミノ酸スペーサーの長さが７アミノ酸である。）。いくつかの実施態様において、前記薬剤は、更にアジュバント（任意に、油性アジュバント）を含む。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、更に、前記腫瘍及び/又は癌を、該腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答の刺激因子を含む第２の薬剤と接触させる段階を含む。いくつかの実施態様において、前記第２の薬剤は、免疫チェックポイント阻害剤である。即ち、前記免疫チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）から成る群から選択される標的ポリペプチドの生物活性を阻害する。いくつかの実施態様において、前記免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、及びアベルマブから成る群から選択される。いくつかの実施態様において、前記腫瘍及び/又は癌は膵臓癌である。
【００２７】
また、本発明は、いくつかの実施態様において、ガストリン関連の腫瘍又は癌を治療するための医薬品を製造するための、本発明の組成物の使用を提供する。
また、本発明は、いくつかの実施態様において、ガストリン関連の腫瘍又は癌を治療するための本発明の医薬組成物の使用を提供する。
また、本発明は、いくつかの実施態様において、患者の該ガストリン関連腫瘍又は癌に反応するＣＤ４−／ＣＤ８−ＴＥＭＲＡ細胞の数を増強するのに十分な量の本発明の医薬組成物を、ガストリン関連腫瘍又は癌を有する患者に投与することにより、ガストリン関連腫瘍又は癌の転移を予防し、軽減し、及び/又は排除するための、本発明の医薬組成物の使用を提供する。
また、本発明は、いくつかの実施態様において、ガストリン関連の腫瘍又は癌に応答する、患者のＴＥＭＲＡ細胞の数を増加させるための、本発明の医薬組成物の使用を提供する。
また、本発明は、いくつかの実施態様において、ガストリン関連の腫瘍又は癌を治療するための免疫チェックポイント阻害剤及びガストリン免疫原を含む組成物の使用を提供する。
【００２８】
また、本発明は、いくつかの実施態様において、ガストリン関連の腫瘍又は癌を治療するための医薬品を製造するための、免疫チェックポイント阻害剤及びガストリン免疫原を含む組成物の使用を提供する。
また、本発明は、いくつかの実施態様において、ガストリン関連腫瘍又は癌の転移を予防し、軽減し、及び/又は排除するための、本発明の医薬組成物の使用を提供する。いくつかの実施態様において、本発明は、ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球の数を増強するのに十分な量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物を、ガストリン関連腫瘍又は癌を有する患者に投与することに関する。
また、本発明は、いくつかの実施態様において、前記使用は、本発明の医薬組成物を受けなかった患者に見られるものと比較して。患者の生存率の改善、腫瘍成長の低減、及び/又は患者における化学療法剤及び/又は免疫チェックポイント療法の有効性の向上をもたらす。
また、本発明は、ＦｏｘＰ３＋阻害性Ｔ調節細胞の数を減少させるのに十分な量の本発明の医薬組成物を、ガストリン関連腫瘍又は癌を有する患者に投与することにより、ガストリン関連腫瘍又は癌の転移を予防し、軽減し、及び/又は排除するための、本発明の医薬組成物の使用を提供する。
【００２９】
従って、本発明の目的は、ガストリン関連の又はCCK-B受容体含有の腫瘍及び/又は癌を治療する方法を提供することである。
上記の本発明の目的は、本明細書中に開示される組成物及び方法によって全体的に又は部分的に達成され、他の目的は、最もよく説明される添付の図面に関連して説明が進むにつれて明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明が、免疫チェックポイント阻害剤を有する場合と有しない場合で、マウスの膵臓細胞腫瘍の成長に影響を与える能力を試験するための例示的な実験戦略の概略図である。特定の実施態様において、治療の約１週間前に、C57BL/6マウス（C57BL/6はmT3細胞と同系）に５×１０５のネズミｍＴ３膵臓癌細胞を注射することにより皮下腫瘍を生成した。10匹のマウスの複数のグループ（合計40匹）を、t = 0、1、及び3週間目にポリクローナル抗体刺激因子(PAS)で、及び/又はt = 0、4、8、15、及び21日に抗PD-1抗体(PD1-1 Ab; Bio X cell, West Lebanon, New Hampshire, USA)で処理した。これらの処理の間で、腫瘍体積を測定した。この研究は終了し、脾臓から脾臓末梢血単核細胞(PBMC)が採取され、マウスから腫瘍が切除されて分析された
【図２】対照（PBS：リン酸緩衝生理食塩水のみ）、ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)単独（PAS100：一投与あたり100μg）、PD-1 Ab単独（PD-1：一投与あたり150μg）、又はポリクローナル抗体刺激因子(PAS)（一投与あたり100μg）とPD 1 Ab（投与あたり150μg）との組み合わせ（PAS100+PD-1）による処理後のmT3保有マウスの平均腫瘍重量をグラムで示す棒グラフである。NS：p>0.05（つまり、有意ではない）；* PBS及びPAS100と比較してp<0.05；＃ PD-1と比較してp =0.0017。エラーバーは±SEMである。
【図３】対照（PBS：リン酸緩衝生理食塩水のみ）、PD-1 Ab単独（PD-1：一投与あたり150μg）、ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)単独（PAS：一投与あたり100μg）、又はポリクローナル抗体刺激因子(PAS)（一投与あたり100μg）とPD1 Ab（投与あたり150μg）との組み合わせ（PAS/PD-1）による処理後の、CD3最終分化T細胞に存在するCD4-/CD8-及びCD4-/CD8-TEMRA細胞の一連のプロットである。図３Ａは、さまざまな処理を受けたマウスのCD3+/CD4-/CD8-及びCD3+/CD4-/CD8-/CD44-/CD62L-（即ちTEMRA）細胞の割合(%)を示す。図３Ｂは、CD3+/CD4-/CD8-/CD44-/CD62L- TEMRA細胞であったCD3+/CD4-/CD8-細胞の部分を示す。この細胞の割合は、CD3+/CD4-/CD8-リンパ球の割合(%)に、CD4+/CD8-リンパ球/1000中のCD3+/CD4-/CD8-/CD44-/CD62L-TEMRA細胞の割合(%)を乗じて計算し、CD3+T細胞画分中のCD4-/CD8-/CD44-/CD62L-TEMRA細胞の割合を計算した（図３Ｂを参照）。* p <0.05; ** p <0.01。エラーバーは±1標準偏差である。
【図４】PAS100による処理の後で、ガストリンによる再刺激しない場合（図４Ａ）、ガストリンによる再刺激した場合（図４Ｂ）の、さまざまなＴ細胞亜集団におけるTNFα、グランザイムB、パーフォリン、及びINFγについてのサイトカイン活性化アッセイをまとめた一連の棒グラフである。図４Ａは、PAS100で処理したマウスの脾臓から単離されたT細胞が実際に活性化されたことを示す。これらと同じ細胞を培養中にガストリンで6時間再刺激すると（図４Ｂ）、再刺激され、各サイトカインがさらに放出された。黒バー：INFγ。明るい灰色バー：グランザイムB。暗い灰色バー：パーフォリン。斜め線の灰色バー：TNFα。
【図５】PAS100単独（図５Ａ）又はPAS100+PD-1併用（図５Ｂ）で処理された、CD4-/CD8-（各図の左のグループ）、CD8+（各図の中央のグループ）、及びCD4+（各図の右のグループ）のT細胞亜集団における、TNFα、グランザイムB、パーフォリン、及びINFγについてサイトカイン放出を比較する一連の棒グラフである。PBS処理マウスのリンパ球と比較して、活性化されたTリンパ球のサイトカインの放出は増加した。併用処理マウスのリンパ球は著しく高いレベルのサイトカインを放出し、併用処理は活性化T細胞の刺激において優れていることを示唆する。特にTNFαは、ポリクローナル抗体刺激因子(PAS) + PD-1 Ab併用処理により２倍以上増加した。黒バー：INFγ、明るい灰色バー：グランザイムB、暗い灰色バー：パーフォリン、斜め線の灰色バー：TNFα。
【図６】マウスのmT3膵臓癌細胞腫瘍の線維化の進展に対する、PBS対照、PD-1単独処理、PAS100単独処理、及びPAS100とPD-1の併用処理の結果を示す。図６Ａは、マッソンのトリクローム染色で染色されたmT3腫瘍を示す。この染色は、コラーゲンブルーを染色し、線維症の指標となる。図６Ｂは、図６Ａに示した染色の結果をまとめた棒グラフである。注目すべきは、PD-1単独及びPAS100単独で処理された腫瘍の統合密度は、陰性対照PBS処理とはあまり異なっていなかったが、ポリクローナル抗体刺激因子(PAS) + PD-1 Ab併用処理は、密度（従って線維症）の低下をもたらし、それはPBS単独（p <0.005）及びPAS100単独（p <0.001）と比較して統計的に有意であった。*** PBSと比較してp <0.005、PAS100と比較してp <0.001であった。黒バー：PBS、明るい灰色バー：PD-1単独、白いバー：PAS100単独、斜め線の灰色バー：PAS100+PD-1。
【図７】マウスのmT3膵臓癌細胞腫瘍への浸潤に対する、PBS対照、PD-1単独処理、PAS100単独処理、及びPAS100とPD-1の併用処理の結果を示す。図７Ａは、マウスのmT3膵臓癌細胞腫瘍へのCD8細胞の浸潤についてPBS、PD-1 Ab（PD-1）単独、PAS100単独（特許出願）、及びPAS100とPD-1の併用による処理後の、CD8に結合する抗体で染色された例示的なmT3腫瘍を示す。図７Ｂは、図７Ａで示したデータを要約した棒グラフである。PD-1（PD-1 Ab）単独処理又はPAS100単独処理は、陰性対照PBS処理と比較して、腫瘍内のCD8+細胞のレベルが有意に高かった（それぞれp=0.0019及びp=0.0026）。PAS+PD-1 Abの併用処理は、PBS単独（p=4.7 x 10-5）、PD-1単独（p=0.042）、及びPAS100単独（p=0.039）と比較しても、腫瘍内のCD8+細胞のレベルは高かった。PAS100単独とPD-1単独とは有意差はなかった（p> 0.05）。** PBSと比較して p=0.0026、*** PBSと比較してp=0.0019、**** PBSと比較してp=4.7 x 10-5。エラーバーは±SEMである。
【図８】mT3腫瘍におけるFoxp3+細胞の分析を示す。図８Ａは、TregsのマーカーであるFoxp3タンパク質に結合する抗体で染色された例示的なｍＴ３腫瘍を示す。PBS（左上のパネル）、PD-1単独処理（右上のパネル）、又はPAS100単独処理（左下のパネル）と比較して、PAS100とPD-1の併用処理により、腫瘍内Tregが減少した。これは、PAS100 + PD-1併用処理が、各単独処理と比較して、腫瘍内環境を、腫瘍内微小環境がTregベースの免疫抑制の程度が低いことにより特徴付けられる程度に変更する可能性があることを示唆する。図８Ｂは、図８Ａで示したデータをまとめた棒グラフである。PD-1単独又はPAS100単独で処理された腫瘍のFoxp3+細胞の数は、PBSと有意には異ならなかった。PAS100+PD-1 Ab併用処理で処理された腫瘍は、陰性対照よりもFoxp3+細胞が有意に少なかった。* p=0.038、黒バー：PBS、明るい灰色バー：PD-1 Ab単独、白バー：PAS100単独、斜め線の灰色バー：PAS100+PD-1 Ab。エラーバーは±SEMである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
以下の見出しは、特定のセクションの参照と検索を支援するためにここに含まれている。これらの見出しは、その中に記載されている概念の範囲を制限することを意図したものではなく、これらの概念は、説明全体を通して他のセクションで適用可能である。
【００３２】
Ｉ．一般的考察事項
本発明は、いくつかの実施態様において、体液性免疫抗腫瘍効果と細胞性免疫抗腫瘍効果の両方を一緒に奏する、複数の治療や処理の組み合わせを使用して、ヒトや動物の癌を治療する方法及びシステムに関する。本発明は、より具体的には、いくつかの実施態様において、以下の複数の薬物の特定の組み合わせの使用に関する。即ち、この薬剤は、（1）腫瘍及び/又は循環腫瘍の成長因子に対する抗体を生成する免疫学的液性B細胞応答を誘導し、かつ(2）細胞傷害性Tリンパ球応答を誘発するために、腫瘍に対する免疫学的細胞T細胞応答を誘導又は強化する。本発明は、より具体的には、いくつかの実施態様において、抗ガストリン癌ワクチンを、免疫チェックポイント遮断を引き起こす第２の薬剤と組み合わせて、使用してヒト癌を治療する方法及びシステムに関する。さらに本発明は、より具体的には、いくつかの実施態様において、活性型の成長因子ガストリンに対するＢ細胞抗体応答を誘発するように設計された１又はそれ以上の癌ワクチンにより特定のヒト癌を治療することに関する。本明細書で初めて開示するように、いくつかの実施態様において、抗ガストリンワクチンは、ヒト腫瘍が、免疫チェックポイント阻害剤による治療に反応するようになり、その結果、全体的な抗腫瘍効果を高める予想外の相加的又は相乗的な併用治療効果を生み出す、可能性がある。
【００３３】
また、本発明は、いくつかの実施態様において、液性抗体免疫応答（ガストリン癌ワクチン）及び細胞T細胞免疫応答（免疫チェックポイント封鎖）の両方を生成する複数の方法の組み合わせを使用して、腫瘍及び/又は癌を治療する方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、ヒト及び動物の胃腸腫瘍の治療において、体液性免疫抗腫瘍効果と細胞性免疫抗腫瘍効果の両方をもたらす複数のクラスの薬物を斬新でユニークな組み合わせで使用して、新規で、予想外で、相加的で、及び/又は相乗的な効果をもたらす組成物及び方法に関する。いくつかの実施態様において、本発明は、複数の薬物の特定の組み合わせの使用に関し、この薬剤は、(1)腫瘍成長因子及び／又は循環腫瘍成長因子に対する免疫学的体液性Ｂ細胞応答を誘導し、かつ(2)細胞傷害性Tリンパ球応答を誘発するために、腫瘍に対する免疫学的細胞T細胞応答を引き起こす及び/又は強化する。いくつかの実施態様において、本発明は、本発明のガストリン癌ワクチンと免疫チェックポイント遮断を引き起こす１又はそれ以上の第２の薬物との組み合わせを使用して、ヒト及び動物の癌を治療する方法及びシステムに関する。いくつかの実施態様において、本発明は、活性型の成長因子ガストリンに対するB細胞抗体応答を誘発するように設計された1つ又は複数の癌ワクチンで特定のヒト癌を治療することに関し、それは、本明細書に開示されているように、予想外に、ヒト腫瘍は、免疫チェックポイント阻害剤による治療に対してより反応するようになり、その結果、予想外の、相加的な、又は相乗的な併用療法効果を生み出し、抗腫瘍効果を高める。従って、いくつかの実施態様において、本発明は、免疫チェックポイント阻害剤とともにポリクローナル抗体刺激因子(PAS)を使用することに関する。いくつかの実施態様において、本発明は、体液性及び細胞性免疫応答の両方を誘導するための癌ワクチンとしてのポリクローナル抗体刺激因子(PAS)の使用に関する。
【００３４】
ＩＩ．定義
本明細書で使用する用語は、特定の実施態様のみを説明するためのものであり、本発明を限定することを意図したものではない。
本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、以下に別途定義されない限り、当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有することを意図したものである。本明細書で採用される技術への言及は、当業者にとって明らかなこれらの技術の変形又は同等の技術の置換を含む、当技術分野で一般に理解されている技術へ言及したものである。
以下の用語は、当業者によってよく理解されると考えられるが、以下の定義は、本発明の説明を促進するために説明される。
本発明を説明するにあたり、多くの技術及び段階が開示されることが理解されるであろう。これらの各々は個々の利益を有し、それぞれは、他に開示された技術の１又はそれ以上又は任意に全てと共に使用することもできる。
従って、明瞭化のために、この説明では、不必要に個々の段階の可能な組み合わせのすべて繰り返すことを控える。にもかかわらず、明細書及び特許請求の範囲は、そのような組み合わせが完全に本発明の範囲及び特許請求の範囲内にあることを理解して読まれるべきである。
【００３５】
長年の特許法慣習に従って、特許請求の範囲を含む本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その」は、使用される場合、「１つ以上」を指す。例えば、「阻害剤」というフレーズは、複数の同じ阻害剤を含む、１又はそれ以上の阻害剤を指す。同様に、「少なくとも１つの」というフレーズは、実体を指すために本明細書で使用される場合、例えば、その実体の1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100又はそれ以上を含み、1〜100及び100より大きいの整数値を含むが、これに限定されない。
【００３６】
別段示されない限り、本明細書及び特許請求の範囲で使用される、成分、反応条件などの量を表す全ての数は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。質量、重量、時間、容量、濃度又は割合(%)のような測定可能な値を指すとき、本明細書で使用される「約」という用語は、明記される値から、いくつかの実施態様において±20％、いくつかの実施態様において±10％、いくつかの実施態様において±5％、いくつかの実施態様において±1％、いくつかの実施態様において±0.5％、ある実施態様では±0.1％の変動を含み、これらの変動は開示された方法を実施するために適当なものである。従って、反対であることを示されない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、本発明によって得られることが求められる所望の特性に応じて変化し得る近似値である。
本明細書で使用される場合、実体を列挙する文脈で使用される時、「及び／又は」という用語は、単独又は組み合わせで存在する実体を指す。従って、例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、及び／又はＤ」という語句は、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤを個々に含むが、また、Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤの任意ならびに全ての組み合わせ及び部分組み合わせも含む。
【００３７】
本明細書で使用される用語「抗体」及び「複数の抗体」は、免疫グロブリン遺伝子又はその断片によって実質的にコードされる１又はそれ以上のポリペプチドを含むタンパク質を指す。免疫グロブリン遺伝子には通常、カッパ（κ）、ラムダ（λ）、アルファ（α）、ガンマ（γ）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）及びミュー（μ）不変領域遺伝子、並びに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖は、κ又はλに分類される。哺乳動物において、重鎖はγ、μ、α、δ、又はεに分類され、それぞれ免疫グロブリンのクラス、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgEを定義する。他の種は、他の軽鎖及び重鎖遺伝子を有し（例えば、特定の鳥類は、鶏が卵の卵黄に沈着する免疫グロブリン型であるIgYと称されるものを産生する。）、これらも同様に本発明に含まれる。いくつかの実施態様において、用語「抗体」は、ガストリン遺伝子産物上に存在するエピトープに特異的に結合する抗体を指し、それは、配列番号１〜４で示されるアミノ酸配列内に存在するエピトープを含むがこれに限定されない。
【００３８】
典型的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含むことが知られている。各四量体はポリペプチド鎖の2つの同一のペアで構成され、各ペアは1つの「軽」鎖（平均分子量約25 kDa）と1つの「重」鎖（平均分子量約50〜70 kDa）を持つ。ポリペプチド鎖の2つの同一ペアは、重鎖領域内に存在するジスルフィド結合によって二量体の形で共に保持される。各鎖のN末端は、抗原認識に主として関与する約100〜110又はそれ以上のアミノ酸の可変領域を画定する。可変軽鎖（VL）及び可変重鎖（VH）という用語は、それぞれこれらの軽鎖及び重鎖を指す。抗体は、典型的には、無傷の免疫グロブリンとして、又はさまざまなペプチダーゼによる消化によって生成されうる十分に特徴付けられた多くの断片として、存在する。例えば、ある抗体分子をパパインで消化すると、ジスルフィド結合のN末端の位置で抗体が切断される。これにより、3つの断片が生成される。即ち、軽鎖と重鎖のN末端を持つ2つの同一の「Fab」断片と、ジスルフィド結合で結合した重鎖のC末端を含む一つの「Fc」断片である。一方、ペプシンは、抗体をヒンジ領域のジスルフィド結合のC末端で消化して、「F(ab)'2」断片として知られる一つの断片を生成する。これは、ジスルフィド結合で結合された２つのFab断片の二量体である。このF(ab)'2断片は穏やかな条件下で還元され、ヒンジ領域のジスルフィド結合を破壊し、F(ab')2二量体を2つのFab'単量体に変換する。このFab'単量体は、本質的に、このヒンジ領域の一部を有するFab断片である（他の抗体断片のより詳細な説明については、例えば、Paul, 1993を参照されたい。）。これらの様々な断片に関して、Fab、F(ab)'2及びFab断片は、少なくとも1つの無傷の抗原結合ドメインを含み、従って抗原に結合することができる。
【００３９】
無傷の抗体の消化に関してさまざまな抗体断片が定義されているが、当業者は、これらのさまざまな断片（Fab'断片を含むがこれらに限定されない）が化学的に、又は組換えDNA法を利用して新規に合成できることを理解するであろう。従って、本明細書で使用される用語「抗体」は、抗体全体の修飾によって産生された抗体断片と、組換えDNA法を使用して新たに合成された抗体断片の両方を含む。いくつかの実施態様において、この用語「抗体」は、少なくとも1つの抗原結合ドメインを有する断片を含む。
抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもよい。本明細書で使用する場合、用語「ポリクローナル」は、複数の異なる抗体産生細胞（例えば、B細胞）に由来する抗体を指し、複数の抗体の所定の集合として共に存在する。例示的なポリクローナル抗体には、特定の一つの抗原に結合するこれらの抗体が含まれ、これは、その動物が抗原に対する免疫応答を生じた後に動物の血液中に見出されるが、これらに限定されない。しかし、抗体のポリクローナル調製物は、少なくとも同一でない２つの抗体を混合することにより人工的に調製することもできるものと理解されている。従って、ポリクローナル抗体には、典型的に、任意の抗原の複数の異なるエピトープ（「抗原決定基」又は単に「決定基」と呼ばれることもある）に向けられた（結合する）複数の異なる抗体が含まれる。
【００４０】
本明細書で使用される用語「モノクローナル」は、単一の抗体種及び/又は単一の抗体種の実質的に均一な集団を指す。別の言い方をすれば、「モノクローナル」とは、個々の抗体又は個々の抗体の集団のことであり、これらの抗体は、自然発生する可能性のある突然変異、又は微量存在する翻訳後修飾を除き、特異性と親和性が同一である。典型的には、モノクローナル抗体（mAb）は、単一のB細胞又はその子孫細胞によって生成される（ただし、本発明は、本明細書に記載の分子生物学的技術によって産生される「モノクローナル」抗体も包含する。）。モノクローナル抗体（mAbs）は、高度に特異的であり、典型的には単一のエピトープに向けられる。さらに、所定のモノクローナル抗体（mAbs）は、典型的には、ポリクローナル抗体調製物とは対照的に、その抗原上の単一のエピトープに向けられる。
モノクローナル抗体（mAbs）は、その特異性に加えて、他の抗体に汚染されずに合成できるという点で、いくつかの目的に有利である。しかし、「モノクローナル」という修飾語は、特定の方法による抗体の製法を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、いくつかの実施態様において、本発明のモノクローナル抗体（mAbs）は、Kohler et al., 1975によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して調製されるが、いくつかの実施態様において、細菌又は真核動物又は植物細胞における組換えDNA法を使用して作製される（例えば、米国特許第4,816,567号を参照されたい。その内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。）。また、モノクローナル抗体（mAbs）は、例えば、Clackson et al., 1991 及び Marks et al., 1991に記載されている技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００４１】
また、本発明の抗体、断片及び誘導体は、キメラ抗体を含むことができる。本明細書において抗体の文脈で使用される用語「キメラ」とその文法的変形は、ある種の抗体不変領域に実質的に又は排他的に由来する不変領域と、これとは他の種の可変領域に実質的に又は排他的に由来する可変領域とを有する抗体誘導体を指す。特定の種類のキメラ抗体は「ヒト化」抗体であり、この抗体は、そのヒト抗体の決定部位（CDR）を、例えば、マウス抗体の相補性決定部位（CDR）に置き換えることにより抗体が産生される（例えば、国際公開WO 1992/22653を参照されたい。）。従って、いくつかの実施態様において、ヒト化抗体は、対応するヒト抗体領域に実質的又は排他的に由来する決定部位（CDR）ではない不変領域と可変領域を持ち、ヒト以外の哺乳動物に実質的又は排他的に由来する決定部位（CDR）を持つ。
本発明の抗体、断片及び誘導体は、単鎖抗体及び単鎖抗体断片であってもよい。単鎖抗体断片は、本明細書に記載の抗体全体の可変領域及び/又は決定部位（CDR）の少なくとも1つを有するアミノ酸配列を含むが、それらの抗体の不変ドメインの一部又は全てを欠く。これらの不変ドメインは、抗原結合に必要ではないが、抗体全体の構造の大部分を構成している。
【００４２】
単鎖抗体断片は、不変ドメインの一部又は全部を含む抗体の使用に関連する問題のいくつかを克服することができる。例えば、単鎖抗体断片には、生体分子と重鎖不変領域との間の望ましくない相互作用や、この他の望ましくない生物活性がない、という傾向がある。さらに、一本鎖抗体断片は、抗体全体よりもかなり小さく、抗体全体よりも毛細血管透過性が高いため、より効率的に局在化して、標的抗原結合部位に結合することができる。また、抗体断片は、原核細胞で比較的大規模に産生されるため、その製造が促進される。さらに、単鎖抗体断片のサイズは比較的小さいため、抗体全体よりもレシピエントで免疫応答を引き起こす可能性が低い。本発明の単鎖抗体断片として、タンデムdi-scFv、タンデムtri-scFv、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、及びミニボディなどの、一本鎖抗体（scFv）及びその誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
Fv断片は、免疫グロブリンの重鎖と軽鎖のN末端の可変断片に対応する。Fv断片は、これら2つの鎖の相互作用エネルギーが、Fab断片よりも低いようである。可変軽鎖（VL）及び可変重鎖（VH）ドメインの結合を安定させるために、ペプチド(Bird et al., 1988; Huston et al., 1988)、ジスルフィド結合(Glockshuber et al., 1990)、及び「ノブ・イン・ホール(knob in hole)」変異(Zhu et al., 1997)とリンクされている。一本鎖抗体（scFv）断片は、当業者に周知の方法により生成され得る（例えば、Whitlow et al., 1991 及び Huston et al., 1993.を参照されたい。）。
【００４３】
一本鎖抗体（scFv）は、大腸菌などの細菌細胞や真核細胞で産生される。一本鎖抗体（scFv）の潜在的な不利な点の1つは、その生成物の一価性である。これは、多価結合とその短い半減期による高い結合力を妨げる可能性がある。これらの問題を克服する試みには、化学結合による(Adams et al., 1993; McCartney et al., 1995)又は不対C末端システイン残基を含むscFvの自発的部位特異的二量化による(see Kipriyanov et al., 1995)、追加のC末端システインを含むscFvから生成された二価(scFv')2が含まれる。
あるいは、ペプチドリンカーを3〜12残基に短縮して「ダイアボディ」を形成することにより、一本鎖抗体（scFv）に強制的に多量体を形成させることができる(Holliger et al., 1993)。リンカーをさらに減らすと、scFv三量体（「トリアボディ」Kortt et al., 1997)や四量体（「テトラボディ」Le Gall et al., 1999)を生じることができる。二価の一本鎖抗体（scFv）分子の構築は、タンパク質二量体化モチーフを用いた遺伝子融合により達成され、「ミニ抗体」(Pack et al., 1992)や「ミニボディ」(Hu et al., 1996)を形成することもできる。scFv-scFvタンデム（(scFv)2)は、2つのscFvユニットを3番目のペプチドリンカーで連結することで生成できる(Kurucz et al., 1995)。
【００４４】
二重特異性ダイアボディは、短いリンカーによって別の抗体のＶＬドメインに接続されたある抗体のＶＨドメインで構成される２つの単鎖融合産物を非共有結合することにより生成される(Kipriyanov et al., 1998)。このような二重特異性ダイアボディの安定性は、上記のジスルフィド架橋若しくは「ノブ・イン・ホール(knob in hole)」変異の導入により、又は２つのハイブリッドscFv断片がペプチドリンカーを介して接続されている単鎖ダイアボディ（scDb）の形成により、高めることができる (Kontermann et al., 1999)。
四価二重特異性分子は、例えば、一本鎖抗体（scFv）断片をヒンジ領域を介してIgG分子のCH3ドメイン又はFab断片に融合することにより産生されることができる(Coloma et al., 1997)。あるいは、四価二重特異性分子は、複数の二重特異性単鎖ダイアボディの融合によって作成される(see Alt et al., 1999)。また、より小さな四価の二重特異性分子は、ヘリックス-ループ-ヘリックスモチーフを含むリンカーを用いたscFv-scFvタンデムの二量化(DiBi ミニ抗体；Muller et al., 1998)により、又は分子内ペアリングを妨げる方向の４つの抗体可変ドメイン（ＶＨ及びＶＬ）を含む単鎖分子(タンデムダイアボディ；Kipriyanov et al., 1999)により、形成できる。
二重特異性F(ab')2断片は、Fab'断片の化学カップリング又はロイシンジッパーによるヘテロ二量体化によって作成できる(Shalaby et al., 1992; Kostelny et al., 1992)。また、単離されたＶＨ及びＶＬドメインも利用可能である（米国特許第6,172,197号、同6,248,516号及び同6,291,158号）。
【００４５】
本発明は、また抗ガストリン抗体の機能的同等物を含む。本明細書で使用する場合、抗体に関して用いられる用語「機能的同等物」は、所定の抗体の結合特性と同等の結合特性を有する分子を指す。いくつかの実施態様において、キメラ化抗体、ヒト化抗体及び一本鎖抗体、ならびにそれらの断片は、それらが基づく対応する抗体の機能的同等物と考えられる。
機能的等価物には、また、本発明の抗体の可変又は超可変領域のアミノ酸配列と実質的に同じアミノ酸配列を有するポリペプチドも含まれる。アミノ酸配列に関して本明細書で使用される場合、語句「実質的に同じ」は、別のアミノ酸配列と、いくつかの実施態様において少なくとも80％、いくつかの実施態様において少なくとも85％、いくつかの実施態様において少なくとも約90％、いくつかでは実施態様において少なくとも91％、いくつかの実施態様において少なくとも92％、いくつかの実施態様において少なくとも93％、いくつかの実施態様において少なくとも94％、いくつかの実施態様において少なくとも95％、いくつかの実施態様において少なくとも96％、いくつかの実施態様において少なくとも97％、いくつかの実施態様において少なくとも98％、いくつかの実施態様において少なくとも約99％の、Pearson & Lipman, 1988に記載されているようなFASTA検索方法によって決定された、配列同一性を持つ配列を指す。いくつかの実施態様において、この同一性割合(%)の計算は、本発明の抗体のアミノ酸配列の全長にわたって行われる。
【００４６】
機能的同等物は、更に、本発明の抗体全体の結合特性と同じ又は同等の結合特性を有する抗体の断片を含む。このような断片には、Fab断片のうちの一つ又は両方、F(ab')2断片、F(ab')断片、Fv断片、又は少なくとも1つの抗原結合ドメインを含む他の断片が含まれる。いくつかの実施態様において、抗体断片は、本発明の抗体全体の6つのCDRすべてを含むが、3つ、4つ又は5つのCDRなど、そのような領域のすべてより少ない部分を含む断片も本明細書で定義される機能的等価物である。さらに、機能的同等物は、IgG、IgM、IgA、IgD及びIgE、並びにそれらのサブクラス、ならびに非哺乳類患者に適している可能性のある他のサブクラス、のいずれかの免疫グロブリンクラスのメンバーであるか、又はそれらのいずれかの組み合わせ、であってもよい（例えば、ニワトリ及び他の鳥類種のIgY）。
機能的等価物には、本発明のタンパク質全体の特性と同じ又は同等の特性を有するペプチドが含まれる。このようなペプチドは、このタンパク質全体の１又はそれ以上の抗原を含むことができ、それは、治療対象の患者において免疫応答を誘発することがある。
また、機能的同等物には、アプタマー及び他の非抗体分子も、そのような分子が、本発明の抗体全体と同じ又は同等の結合特性を有することを条件として、含まれる。
【００４７】
「を含む（including）」、「を含有する」、又は「によって特徴付けられる」と同義である「を含む（comprising）」という用語は、包括的又は無制限であり、引用されない追加の要素及び/又は方法ステップを除外しない。「を含む」は、特許請求の言語で使用される専門用語であり、名前を挙げた要素及び/又はステップが存在するが、他の要素及び/又はステップが追加されても依然として特許請求の範囲内である。
本明細書で使用される場合、「のみからなる」という語句は、特許請求の範囲内に明記されないいかなる要素、ステップ、又は成分も除外する。「のみからなる」という語句が、前文の直後ではなく、特許請求の範囲の本文の条項に出現する場合、それは、その条項内に説明される要素のみを限定し、他の要素は特許請求の範囲全体からは除外されない。
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という語句は、特許請求の範囲を、明記される材料及び/又はステップ、ならびに開示内容やクレームの基本的及び新規の特徴（複数可）に実質的に影響を与えないものの範囲に限定する。例えば、医薬組成物は、一つの医薬活性剤又は複数の医薬活性剤から「本質的に成る」ことができ、これは、言及された一つ又は複数の医薬活性剤が、該医薬組成物中に存在する唯一の一つ又は複数の医薬活性剤であることを意味する。しかし、このような医薬組成物中には、担体、賦形剤、及び/又は他の不活性剤も存在してもよく、このことは、「本質的に〜から成る」という語句の性質に含まれている。
【００４８】
「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」という用語に関して、これら３つの用語のうちの１つが本明細書で使用される場合、本開示の主張される主題は、その他の２つの用語のいずれかの使用を含むことができる。例えば、いくつかの実施態様において、本発明は、抗体を含む組成物に関する。従って、当業者は、本開示を検討した後、本発明は、本質的に本発明の抗体から成る組成物、ならびに本発明の抗体のみから成る組成物を包含することを理解するであろう。
【００４９】
本明細書で使用される用語「免疫細胞」は、抗原提示細胞、Ｂ細胞、好塩基球、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、白血球、リンパ球、マクロファージ、マスト細胞、記憶細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、食細胞、形質細胞及びＴ細胞。などの哺乳動物の免疫系の細胞を指すが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語「免疫応答」は、自然免疫、液性免疫、細胞性免疫、免疫、炎症反応、後天性（適応）免疫、自己免疫、及び/又は過活動免疫などの免疫を含むが、これらに限定されない。
本明細書で使用する用語「ガストリン関連癌」は、ガストリン遺伝子産物が、腫瘍細胞及び/又は癌細胞に外因的に適用された場合、及びインビボでオートクリン及びパラクリンのメカニズムを介して適用された場合の両方で、その中で、腫瘍及び/又は癌細胞の成長を刺激する栄養ホルモンとして機能する、腫瘍若しくは癌又はそれからの細胞である。例示的なガストリン関連癌には、膵臓癌、胃癌、胃食道癌、及び結腸直腸癌が含まれる。
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、小核ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、短核小体ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、及び／又はｔＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語「単鎖可変断片」、「単鎖抗体可変断片」及び「一本鎖抗体（scFv）」は、リンカーペプチドによって接続された重鎖及び軽鎖のみの可変領域を含む形態の抗体を指す。
【００５０】
本明細書で使用される用語「患者」は、無脊椎動物又は脊椎動物種のメンバーを指す。従って、用語「患者」は、いくつかの実施態様において、動物界の任意のメンバーを包含することを意図しており、それは、脊索動物門（例えば。骨魚類（硬骨魚）、両生類（両生類）、爬虫類（爬虫類）、鳥類（鳥）及び哺乳類（哺乳動物））を含むがこれらに限定されない。
本発明の組成物と方法は、温血脊椎動物に特に有用である。従って、いくつかの実施態様において、本発明は、哺乳類及び鳥類に関する。より具体的には、哺乳動物に由来する及び/又は哺乳動物で使用するための組成物及び方法が提供され、この哺乳動物には、人間や他の霊長類、絶滅の危機にあるため重要な哺乳類（シベリアトラなど）、人間にとって経済的重要性（人間が消費するために農場で飼育された動物）及び/又は社会的重要性（ペット又は動物園で飼われている動物）のある哺乳類、例えば、人間以外の肉食動物（猫や犬など）、スワイン（ブタ、食用ブタ、及びイノシシ）、反芻動物（ウシ、雄牛、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン、及びラクダなど）、げっ歯類（マウス、ラット、ウサギなど）、有袋類及び馬などが挙げられる。また、開示された方法及び組成物の鳥に対する使用も提供され、この鳥には、絶滅の危機にある鳥や動物園で飼われている鳥が含まれ、同様に、家禽、特に飼いならされた家禽も含まれ、例えば、七面鳥、鶏、アヒル、ガチョウ、ホロホロ鳥などの家禽が含まれ、これらは人間にとって経済的にも重要である。従って、本発明の方法及び組成物の、家畜用ブタ（ブタ及び食用ブタ）、反芻動物、馬、家禽などを含むがこれらに限定されない家畜に対する使用も提供される。
【００５１】
本明細書で使用される用語「Ｔ細胞」及び「Ｔリンパ球」は互換性があり、同義語として使用される。その例には、ナイーブT細胞、中央記憶T細胞、エフェクター記憶T細胞、細胞傷害性T細胞、T調節細胞、ヘルパーT細胞及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される用語「治療薬」は、例えば、ガストリン関連の腫瘍及び/又は癌（但し、これらに限定されない）を、治療、阻害、予防、緩和し、その重症度を軽減し、その進展の可能性を減らし、その進行を遅くする、ために使用される及び/又は治療する薬剤を指す。
本明細書で使用される用語「治療」及び「治療する」は、治療的治療及び予防的又は妨害的手段の両方を指し、その目的は、たとえ治療が最終的に失敗したとしても、標的の病的状態を予防又は減速（軽減）し、病的状態を防ぎ、有益な結果を追求又は取得する、及び/又は個人が状態、病気、又は障害を発症する可能性を低くすることである。治療を必要とする人には、すでに病気にかかっている人、同様に、その症状、病気、又は障害になりやすい、又はかかりやすい人、又はその症状が予防されるべき人が含まれる。
【００５２】
本明細書で使用する用語「腫瘍」は、悪性又は良性を問わず、ガストリンのオートクリン及び/又はパラクリン作用によって直接的又は間接的に影響を受ける、腫瘍細胞の成長及び/又は増殖、すべての前癌性及び癌性の細胞及び組織の開始、進行、成長、維持、転移に関する。用語「癌」及び「腫瘍」は、本明細書で互換的に使用され、患者の任意の組織における原発性及び転移性の両方の固形腫瘍及び癌腫を指すことができ、これは、膵臓癌、胃癌、胃食道癌、及び大腸がんを含むが、これらに限定されない（これらは、本明細書では集合的に「ガストリン関連」腫瘍及び/又は癌と呼ばれる）。本明細書で使用される場合、用語「癌及び「腫瘍」は、多細胞腫瘍ならびに個々の新生細胞又は前新生細胞も指すことが意図されている。いくつかの実施態様において、癌又は腫瘍は、上皮組織の癌又は腫瘍を含み、例えば、癌腫など（但し、これに限定されない）である。いくつかの実施態様において、腫瘍は腺癌であり、これは、いくつかの実施形態では、膵臓、肝臓、胃、食道、結腸、又は直腸の腺癌、及び/又はそれらに由来する転移細胞である。いくつかの実施態様において、腫瘍及び/又は癌は、線維症に関連しており、これは、腫瘍及び/又は癌の発生の直接的又は間接的な結果として、線維症の1つ又は複数の領域が、通常、腫瘍及び/又は癌の領域に発生することを意味する。
【００５３】
本明細書に開示されるすべての遺伝子、遺伝子名、及び遺伝子産物は、本明細書に開示される組成物及び方法が適用可能な任意の種のホモログ及び/又はオーソログに対応することを意図する。従って、これらの用語には、ヒト及びマウスの遺伝子及び遺伝子産物が含まれるが、これらに限定されない。特定の種に由来する遺伝子又は遺伝子産物が開示された場合、この開示は例示のみを意図し、それが現れる文脈が明確に示さない限り、限定として解釈されるべきではないことを理解されたい。従って、例えば、GENBANK(R)バイオシーケンスデータベースアクセッション番号：NP_000796.1に記載されているガストリン遺伝子産物について、開示されているヒトアミノ酸配列は、同種及びオーソロガスのガストリン遺伝子及び他の動物(他の哺乳類、魚、両生類、爬虫類、鳥類を含むが、これらに限定されない。）に由来する遺伝子産物を包含することを意図している。また、対応するGENBANK(R)エントリに開示されているもの（即ち、それぞれNP_000796.1とNM_000805.4）を含む（但し、これらに限定されない）開示されたアミノ酸配列をコードするありとあらゆるヌクレオチド配列も含まれる。
【００５４】
ＩＩＩ．抗ガストリンワクチンの開発
腫瘍関連抗原ベースのワクチンへの一つのユニークなアプローチは、膵臓癌(PC)及び他の胃腸癌の主要なオートクリン及びパラクリン成長因子としてのガストリンの関与を活用することにより行われる。このアプローチは、「ポリクローナル抗体刺激因子」又はＰＡＳと呼ばれる化合物を用いて、ガストリン17（G17）に対する能動体液性免疫を介してガストリンの栄養効果を中和することを含む。ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)は、マウス及びヒトで同一であり、リンカー分子を介してジフテリアトキソイド（DT）に結合したガストリン17（G17）のＮ末端配列に由来する９アミノ酸ガストリンエピトープを含む。この化合物は、ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)を作成するためにオイルベースのアジュバントに配合されている。ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)は特異的かつ高親和性のポリクローナル抗G17抗体の産生を刺激するが、ジフテリアトキソイド（DT）単独ではその効果はなかった(Watson et al., 1996)。ガストリン反応性の胃腸（GI）癌を持ついくつかの動物モデルで、前臨床研究が実施された。この癌には、結腸癌(Singh et al., 1986; Smith & Solomon, 1988; Upp et al., 1989; Smith et al., 1996b)、胃癌 (Smith et al., 1998a; Watson et al., 1989)、肺癌 (Rehfeld et al., 1989)及び膵臓癌 (Smith et al., 1990; Smith et al., 1991; Smith et al., 1995; Segal et al., 2014)が含まれる。
動物において、ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)によって生成した抗G17抗体が、胃腸腫瘍の成長と転移を減少させることが示されている(Watson et al., 1995; Watson et al., 1996; Watson et al., 1999)。PASによる能動免疫及びPASによって生成した抗G17抗体による受動免疫(Watson et al., 1999)の両方とも、胃腸（GI）癌の動物モデルで腫瘍成長を阻害することが示されている(Watson et al., 1998; Watson et al., 1999)。
【００５５】
進行した膵臓癌の治療のためのポリクローナル抗体刺激因子(PAS)の前向き無作為化二重盲検プラセボ対照群順次試験が、進行した膵臓癌のヒト患者で実施された。この研究の主な目的は、プラセボに対するPAS単剤治療の、患者の生存率に対する効果を比較することであった。全体として、患者の65％がPASに対する抗体反応を示した。PAS治療群の患者は、プラセボ群よりも長く生存した（それぞれ平均150日対84日、p=0.016）。しかし、患者を、PASに対する免疫応答を生成したか（PASレスポンダー）、又は免疫応答を生成しなかったか（PAS非レスポンダー）に基づいて層別化した場合、レスポンダーの生存率は大幅に高かった（p=0.003）。
現在までに、469人の膵管腺癌（PDAC）患者が、臨床試験でポリクローナル抗体刺激因子(PAS)によって治療されている。これらの患者の約90％が防御抗体価を誘発した。4つの研究（PC1、PC2、PC3及びPC6；Brett et al., 2002; Gilliam et al., 2012)から得られてプールされたデータによれば、レスポンダーの患者は、レスポンダーの患者（106日; p = 0.0003）と比較して、生存期間の中央値（191日）が顕著に増加した。重要なことに、これらの患者はいずれも、ガストリンの正常レベルと機能にマイナスの影響を与える自己免疫型反応のいかなる証拠も示さなかった。
ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)は、ガストリンに対する中和抗体の生成によりB細胞応答を誘発することが知られている。しかし、臨床研究によれば、長期生存者もいることが示されており、このことは抗腫瘍免疫の追加的メカニズムも関与している可能性があることを示唆する。
【００５６】
ＩＶ．ＰＡＳ＋チェックポイント阻害剤との併用治療
ＩＶ．Ａ．一般論
ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)の投与は、膵管腺癌（PDAC）で不適切に発現する（即ち、過剰発現する）癌胎児性タンパク質ガストリンに対する体液性抗体応答及び細胞性免疫応答を引き起こす。膵管腺癌（PDAC）におけるこの不適切なガストリン発現は、オートクリン及びパラクリンの成長促進効果を引き起こす。その後にガストリンに対する液性抗体の生成を伴うPAS投与は、この病理学的な成長促進効果を排除するのに役立つ。さらに、PASを介したガストリンに対する体液性免疫応答は、血管新生の促進、アポトーシスの回避、細胞移動の増加、及び不適切なガストリン発現に関連する侵襲的酵素発現の増加、を逆転させるのにも役立つ(Watson et al., 2006)。
【００５７】
ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)は3つのサブユニットを含む。第１サブユニットはガストリンエピトープであり、いくつかの実施態様において、これはシステイン残基で終わるカルボキシ末端７アミノ酸スペーサー配列を有するヒトＧ１７のアミノ末端アミノ酸残基１〜９を含むペプチドである。この第１サブユニットの例示的な配列は、EGPWLEEEE（配列番号２）である。
PASの第2サブユニットは、第１サブユニットを第3サブユニットに共有結合するリンカーである。このリンカーは、いくつかの実施態様において、ε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステル（eMCS）であるが、この目的に、ポリエチレングリコールリンカーなどの非ペプチドリンカーなどの任意のリンカーを使用することもできる。
PASの第3サブユニットはジフテリアトキソイドであり、これは第１サブユニットに対する体液性応答（特に、胃のエピトープに対する体液性応答）を強化するキャリアタンパク質として使用される。しかし、いくつかの実施態様において、破傷風トキソイドやウシ血清アルブミンなど（但し、これらに限定されない。）のジフテリアトキソイド以外のキャリアタンパク質を使用できることに留意されたい。
【００５８】
いくつかの実施態様において、この３つのサブユニットは、筋肉内（すなわち）注射用に製剤化され、この製剤は優れた物理的、化学的及び薬学的特性を有する。また、ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)は、ガストリンに対する中和抗体の生成によりB細胞応答を誘発する。ガストリンは細胞増殖を促進し、血管新生を促進し、アポトーシスの回避を促進し、細胞移動を促進し、侵襲的酵素発現を増加させ、膵管腺癌（PDAC）の微小環境の線維症に関連するため、これは膵管腺癌（PDAC）に関連する。本発明のいくつかの観点によれば、ガストリンの作用がブロックされると、CD8+リンパ球が膵管腺癌（PDAC）に流入し、免疫チェックポイント治療に反応する可能性が高くなる（たとえば、Ｔ細胞媒介反応）。本明細書に開示されているように、PASは、T細胞応答とCD8+細胞も誘発して、ガストリン刺激に応答してサイトカインを産生する。
ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)は、治療用ワクチン又は免疫治療薬として設計できる。PAS誘導性液性抗体は非常に特異的であり、通常はG17及びGly-G17に対する高い親和性によって特徴付けられる。
ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)は、ホルモンG17とその前駆体G17-Glyに対する抗体の治療上有効なレベルを一貫して誘導した。合計1,542人の患者について、22件の臨床研究が完了した。重要なことに、PASによる治療は、優れた安全性と忍容性のプロファイルを示し、さらに結腸直腸癌、胃癌、及び膵臓癌の患者の生存上の利点をもたらした。PASは単剤治療として使用され、例示的な用量及び投与スケジュールは、0、1及び3週間目に、250μg/0.2mlの投与であった。
【００５９】
まとめると、22の研究とポリクローナル抗体刺激因子(PAS)で治療された1,500人以上の患者から得られた結論は次のとおりである：
（a）非臨床データは、ヒト膵臓癌モデルを含むさまざまな癌モデルにおいて、インビトロ及びインビボの両方で、幅広い治療指数で、抗G17抗体の抗腫瘍効果を示した。
（b）ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)は、非常に安全で忍容性の高い用量で投与でき、有害反応や負の自己免疫効果の誘発なしに、ガストリンに対してB細胞抗体反応を効果的に引き起こすことができる。
（c）多数の臨床研究により、膵臓癌を含む消化管腫瘍全体の高い生存率、及び抗G17抗体反応の発生と生存率の改善との間に相関関係があること示された。
しかし、臨床研究において長期生存者が存在することも実証されており、ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)投与により追加の治療効果も得られることが示唆された。特定の理論に拘束されることは望まないが、PAS治療は、これらの患者において細胞傷害性T細胞及び記憶細胞の活性化を特徴とするT細胞免疫応答も誘発した可能性がある。
【００６０】
膵管腺癌（PDAC）におけるチェックポイント阻害剤の使用は制限されており、控えめな結果が実証されているに過ぎない。CTLA-4、PD-1及びPD-L1阻害剤は、多くの臨床試験において、局所進行又は転移膵管腺癌（PDAC）を持つ患者で調べられている(Royal et al., 2010; Brahmer et al., 2012; Segal et al., 2014)。デュルバルマブ（MEDI 4736）は、予備分析で8％の部分奏効率を示し、それは2014年に米国臨床腫瘍学会で発表された(Segal et al., 2014)。
膵臓腫瘍が、チェックポイント阻害剤を標的とするモノクローナル抗体（mAb）ベースの免疫治療に対して比較的耐性を示した理由は、よく分かっていない。抗免疫チェックポイント阻害剤の免疫治療の失敗は、実際に抗腫瘍免疫応答を抑制する可能性がある、免疫抑制性白血球の大量浸潤に関連している可能性がある。これは、膵臓腫瘍の微小環境で免疫特権を確立するのに役立つ炎症プログラムを推進する、RAS癌遺伝子の発現に関連している可能性がある(Zheng et al., 2013)。
【００６１】
ＩＶ．Ｂ．チェックポイント阻害剤は細胞傷害性T細胞応答を起こす
免疫系は、自己（すなわち「正常」細胞）と、感染した細菌、腫瘍及び／又は癌で見られる変異あるいは形質転換した細胞などの「非自己」又は「外来」細胞とを区別する上で重要な中心的役割を果たす。免疫系は「自己」と認識すれば「オフ」となり正常な体細胞には自己免疫反応を起こさず、外来又は形質転換細胞と認識すれば「オン」となる絶妙な制御が必要である。実際、細胞の形質転換は比較的良く起こる現象だが、免疫系はこれを効率的かつ効果的に監視し、外来及び形質転換細胞を効果的かつ効率的に排除する。形質転換細胞が正常な免疫系チェックポイントを破壊する仕組（免疫系が形質転換したと認識せず、例えば細胞傷害性Tリンパ球の形質転換された腫瘍細胞への接着による免疫攻撃を無効にする等）を作ることは非常に稀であるため、腫瘍形成や癌は比較的稀な出来事なのである。
プログラム細胞死タンパク質1（PD-1、別名CD279）はT細胞表面でチェックポイント（検問所）として機能する細胞表面受容体である。PD-1は「オフスイッチ」として働きT細胞に体内の正常細胞に対し細胞傷害性Tリンパ球攻撃を開始させない。ヒトPD-1は288アミノ酸から成る前駆体タンパク質として産生され、そのアミノ酸配列はGENBANKアクセション番号NP_005009.2（GENBANKアクセション番号NM_005018.2の遺伝子にコードされる）で提供される。288アミノ酸から成る前駆体タンパク質には、GENBANKアクセション番号NP_005009.2のアミノ酸配列1-20のシグナルペプチドが含まれるが、成熟タンパク質（GENBANKアクセッション番号NP_005009.2のアミノ酸配列21-288 ）形成で除去される。GENBANKに存在するヒトPD-1の他種の相同遺伝子のアミノ酸配列として、アクセッション番号NP_032824.1（Mus musculus）、NP_001100397.1（Rattus norvegicus）、NP_001301026 .1（Canis lupus familiaris）、NP_001138982.1（Felis catus）、NP_001076975.1（Bos taurus）、XP_004033550.1（Gorilla gorilla gorilla）、NP_001107830.1（Macaca mulatta）、NP_001271065.1（Macaca fascicularis）、XP_003776178.1（Pongo abelii）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６２】
PD-1受容体のリガンドはプログラム死リガンド1（PD-L1）である。CD274あるいはB7ホモログ1（B7-H1）としても知られている。ヒトには複数のPD-L1タンパク質アイソフォームがあり、そのうち最も大きなアイソフォームaは290アミノ酸からなる前駆体タンパク質として生成される。ヒトPD-L1前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、GENBANKアクセション番号NP_054862.1（GENBANKアクセション番号NM_014143.3の遺伝子にコードされる）として提供される。290アミノ酸から成る前駆体タンパク質には、GENBANKアクセション番号NP_054862.1のアミノ酸配列1-18のシグナルペプチドが含まれるが、成熟タンパク質形成で除去される（GENBANKアクセション番号No. NP_054862.1のアミノ酸配列19-290）。GENBANKにあるヒトPD-L1の他種の相同遺伝子のアミノ酸配列には、アクセション番号NP_068693.1（Mus musculus）、NP_001178883.1（Rattus norvegicus）、NP_001278901.1（Canis lupus familiaris）、XP_006939101.1（Felis catus）、NP_001156884.1（Bos taurus）、XP_018889139.1（Gorilla gorilla gorilla）、NP_001077358.1（Macaca mulatta）、XP_015292694.1（Macaca fascicularis）、及びXP_009454557.1（Pongo troglodytes）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
PD-L1は主に正常細胞に存在し、PD-1発現T細胞がPD-L1発現正常細胞に結合すると、T細胞に正常細胞（すなわち「自己」）であると伝え、（正常）細胞に対する細胞傷害性T細胞応答は抑制される。ほとんどの形質転換細胞は通常PD-L1を発現していないので常に排除される、つまりPD-1発現T細胞はPD-L1を発現してない細胞に遭遇すると「停止」どころか「活性化」して形質転換細胞を排除する。しかし、まれに形質転換細胞がPD-L1リガンドを発現していると、その形質転換細胞に対するT細胞応答は停止する。すると、PD-L1発現形質転換細胞は細胞傷害性T細胞応答を回避できてしまう。これが（一旦）起きると、認識されなかった形質転換細胞は増幅し、更なる変異を獲得して、悪性の転移性腫瘍へと成長する。
PD-1/PD-L1チェックポイントの阻害（「免疫チェックポイント阻害剤」と言う）は、PD-1 /PD-L1の結合を阻害し、Tリンパ球に腫瘍及び／又は癌細胞を非自己として認識させ、腫瘍及び／又は癌細胞に対し細胞傷害性Tリンパ球応答を誘起させる。これは、T細胞上のPD-1あるいは腫瘍や癌細胞上のPD-L1を標的としてPD-1/PD-L1結合を効果的にブロックする薬物によって達成できる。このプロセスには少なくとも2つの必要条件がある。１つは、免疫チェックポイント阻害剤は腫瘍及び／又は癌の部位に到達してPD-1とPD-L1の如何なる相互作用も遮断しなければならぬこと。第二は、腫瘍及び／又は癌細胞自体が細胞傷害性T細胞に感受性がなければならぬことである。
【００６４】
別のチェックポイントタンパク質として細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4;別名CD152）タンパク質がある。PD-1と同じく、CTLA-4も免疫応答を抑制できる細胞表面受容体である。活性化T細胞と同様にTregs細胞にはCTLA-4が発現している。CTLA-4受容体が抗原提示細胞（APC）表面のCD80又はCD86に結合すると、PD-1と同じく免疫応答で「オフスイッチ」として作用する。
ヒトCTLA4-TMアイソフォームは、GENBANKアクセション番号NP_005205.2（GENBANKアクセション番号NM_005214.4遺伝子にコードされる）に記載されている223アミノ酸から成る前駆体タンパク質である。このタンパク質には35アミノ酸のシグナルペプチドが含まれているが、除去して188アミノ酸から成る成熟タンパク質が形成される。GENBANKに存在するヒトCTLA-4の他種の相同遺伝子のアミノ酸配列には、アクセション番号NP_033973.2（Mus musculus）、NP_113862.1（Rattus norvegicus）、NP_001003106.1（Canis lupus familiaris）、NP_001009236.1（Felis catus）、NP_776722.1（Bos taurus）、XP_004033133.1（Gorilla gorilla gorilla）、XP_009181095.2（Macaca mulatta）、XP_005574073.1（Macaca fascicularis）、及び XP_526000.1（Pan troglodytes）が含まれるが、これらに限定されない。
【００６５】
従って、いくつかの実施態様において、本発明は、1つ又は複数の免疫チェックポイント阻害剤とともにPASを投与することに関する。より詳細には、いくつかの実施態様において、本発明は、CTLA-4、PD-1、及び／又はPD-L1を標的とする免疫チェックポイント阻害剤の使用に関する。これらの免疫チェックポイント阻害剤を阻害する例示的な化合物には、以下が含まれる。CTLA-4の場合：イピリムマブ（YERVOY(R)ブランド;ブリストル-マイヤーズスクイブ、ニューヨーク）及びトレメリムマブ（以前のチシリムマブ; メディミュン社、ゲーサーズバーグ、メリーランド)。PD-1の場合：ニボルマブ（OPDIVO(R)ブランド;ブリストル-マイヤーズスクイブ、ニューヨーク）、ピジリズマブ（メディベイション、サンフランシスコ、カリフォルニア）、ペンブロリズマブ（KEYTRUDA(R)ブランド;メルク社、ケニルワース、ニュージャージー）、MEDI0680（AMP514;メディミュン、ゲーサーズバーグ、メリーランド）、及びAUNP-12（オリジーンディスカバリーテクノロジー社/ラボラトリーズ ピエールファブレ社）。PD-L1の場合：BMS-936559/MDX-1105（ブリストル-マイヤーズスクイブ、ニューヨーク）、アテゾリズマブ（TECENTRIQ(R)ブランド、ジェネンテック/ロシュ、サウスサンフランシスコ、カリフォルニア）、デュルバルマブ（MEDI4736;メディミュン社、ゲーサーズバーグ、メリーランド）、及びアベルマブ（BAVENCIO(R)ブランド; EMD セロノ社、ロックランド、メリーランド、ファイザー社、ニューヨーク） 。
【００６６】
PD-1阻害剤とPD-L1阻害剤を比較すると、効能と毒性に関しては相違よりも共通性があることが強く示唆されている。実際、クロストライアルメタタイプ分析では、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、アベルマブ、アテゾリズマブ及びMDX1105は、毒性と効能に関して非常に類似した（しかし同一ではない）プロファイルが示されている。親和性と現在の投与方式は、種々のPD-1阻害剤とPD-L1阻害剤で異なる場合があるが、一般的にはすべてに非常に幅広い治療域がある。この幅広い治療域に関連して、これらのチェックポイント阻害剤のほとんどがフェーズIで失敗せず、多くの臨床開発計画が計量投与ではなく均一投与に移行している。
PD-1とPD-L1を標的とする薬物には、類似した作用機序、有効性プロファイル及び毒性プロファイルがあるが、一般にそれらの間には若干の微妙な違いがある。アベルマブは、本願由来のB細胞応答を抗体依存性細胞介在性細胞障害（ADDC）応答で補完する能力により、他のPD-L1標的薬よりもいくらか利点があるかもしれない。また、アベルマブはネイティブなFc受容体を持っているため、「正常な」ADCC応答を引き出すことができるのに対し、アテゾリズマブはFc領域を改変しているため、ADCC応答の緩和が予期できる（少なくともヒトでは）。更に様々なPD-1及びPD-L1を標的とする薬物を比較する際に注意すべき点は、一部はヒト化モノクローナル抗体だが他は完全なヒトモノクローナル抗体という事実である。ヒト化モノクローナル抗体はヒトに投与した場合、完全なヒトモノクローナル抗体と比べ「アレルギー」タイプの反応を誘発する可能性を高める特性があると想定される。
【００６７】
Ｖ．組成物
Ｖ．Ａ．医薬組成物
いくつかの実施態様において、本発明は、本明細書で開示される方法で用いることができる医薬組成物を提供する。
ここで使われる「医薬組成物」とは、医薬組成物がそれを必要とする患者に投与される治療又は他の方法の一部として使用される組成物を指す。いくつかの実施態様において、それを必要とする患者は、少なくとも1つの症状として、特徴として、又は結果的に医薬組成物の生物活性が腫瘍及び／又は癌及び／又はそれに関連する細胞に直接及び／又は間接的に作用することにより少なくとも部分的に改善すると予想される腫瘍及び／又は癌を有する患者である。
医薬組成物を調製する技術は当技術分野で知られており、いくつかの実施態様において、医薬組成物は、医薬組成物が投与される患者に基づいて製剤化される。例えば、いくつかの実施態様において、医薬組成物は、ヒト患者に用いるために製剤化される。従って、いくつかの実施態様において、医薬組成物はヒトでの使用に医薬的に許容されたものである。
【００６８】
いくつかの実施態様における本発明の医薬組成物は、ガストリンペプチド及び／又はCCK-B受容体に対する能動的及び／又は受動的に体液性免疫応答を誘導及び／又は提供する第１の薬剤と、免疫チェックポイント阻害剤である。いくつかの実施態様において、第１の薬剤はガストリンペプチド、抗ガストリン抗体、及び抗CCK-R抗体からなる群から選択される。いくつかの実施態様において、第１の薬剤は、ガストリンペプチドであり、任意にEGPWLEEEEE（配列番号1）、EGPWLEEEE（配列番号2）、EGPWLEEEEEAY（配列番号3）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号4）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、あるいは本質的にこれらから成る、ガストリンペプチドである。
いくつかの実施態様において、配列番号1〜4のいずれかのアミノ酸残基1番のグルタミン酸残基はピログルタミン酸残基である。いくつかの実施態様において、ガストリンペプチドは免疫原性担体に結合され、任意に免疫原性担体はジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペット（スモシ貝）ヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、ガストリンペプチドは、リンカーを介して免疫原性担体に結合され、好ましくはリンカーはε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルである。
【００６９】
いくつかの実施態様において、リンカー及びガストリンペプチドはアミノ酸スペーサーでつながれ、通常アミノ酸スペーサーの長さは1〜10アミノ酸であり、より好ましくは、アミノ酸スペーサーの長さは7アミノ酸である。
体液性免疫応答を誘発するように設計された本発明の医薬組成物は、いくつかの実施態様において通常はアジュバント、より好ましくは油性アジュバントを含むことができる。代表的なアジュバントには以下が含まれるが、これに限定されない。モンタニドISA-51（セピック社.）QS-21（アクイラ  ファーマチューティカル社）;アラセルA;オレイン酸;破傷風ヘルパーペプチド;GM-CSF;シクロホスアミド;カルメット・ゲラン菌（BCG）;コリネバクテリウム・パルバム;レバミゾール、アジメゾン;イソプリニゾン;ジニトロクロロベネゼン（DNCB）;フロイントアジュバントを含むキーホールリンペットヘモシアニン（KLH）（完全及び不完全）;鉱物性ゲル;水酸化アルミニウム（ミョウバン）;リゾレシチン;プルロニックポリオール;ポリアニオン;ペプチド;油乳剤;核酸（dsRNAなど）ジニトロフェノール;ジフテリア毒素（DT）;トール様受容体（TLR）（TLR3、TLR4、TLR7、TLR8、TLR9など）アゴニスト（リポポリサッカライド（LPS）などのエンドトキシン、モノホスホリルリピドA（MPL）、ポリイノシン-ポリシチジル酸（poly-ICLC /HILTONOL(R); Oncovir社、ワシントンDC、USA）; IMO-2055、グルコピラノシルリピドA（GLA）、QS-21 - 石鹸皮木又はソウプバークとしても知られるキラヤの樹皮から抽出されたサポニン;レシキモド（TLR7/8アゴニスト）、CDX-1401−NY-ESO-1腫瘍抗原に結合した樹状細胞受容体DEC-205特異的完全長ヒトモノクローナル抗体からなる融合タンパク質;ジュバリス陽イオン性脂質-DNA複合体、ヴァックスフェクチン、及びそれらの組み合わせ。
【００７０】
本発明の医薬組成物は、いくつかの実施態様において、免疫チェックポイント阻害剤である。免疫チェックポイント阻害剤は、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死1受容体（PD-1）、及びプログラム細胞死１受容体リガンド（PD-L1)からなる群から選択される標的ポリペプチドの生物活性を阻害する化合物群である。いくつかの実施態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、アベルマブ及びデュルバルマブからなる群から選択される。
本発明の医薬組成物のいくつかの実施態様において、第１の薬剤は、抗ガストリン体液性応答を誘導するのに有効なEGPWLEEEEE（配列番号1）、EGPWLEEEE（配列番号2）、EGPWLEEEEEAY（配列番号3）及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号4）からなる群から選択されるアミノ酸配列から成る、本質的にそれから成る、一定量のガストリンペプチドである。第２の薬剤は、ガストリン関連腫瘍又は癌を有する患者に投与した時、ガストリン関連腫瘍又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導又は強化する有効な量のチェックポイント阻害剤である。
本開示の医薬組成物のいくつかの実施態様において、第１の薬剤は1つ又は複数の抗CCK-B受容体抗体であり、ガストリン関連腫瘍又は癌を有する患者に投与した時、ガストリンに存在するCCK-B受容体を介したガストリンシグナル伝達を抑制又は阻害するのに十分な量の医薬組成物である。
本発明の医薬組成物は、いくつかの実施態様において、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌を治療するために使用される。いくつかの実施態様において、本開示の患者の医薬組成物は、膵臓癌の治療を意図する。
【００７１】
Ｖ．Ｂ．核酸
「RNA」という用語は、少なくとも1個のリボヌクレオチド残基を含む分子を指す。「リボヌクレオチド」とは、α-D-リボフラノース部の2'位に水酸基を有するヌクレオチドを意味する。この用語は、二本鎖RNA、一本鎖RNA、二本鎖及び一本鎖領域の両方を含むRNA、部分精製RNAなどの単離RNA、本質的に精製されたRNA、合成RNA、組換えにより産生されたRNAのみならず、改変RNA又はアナログRNAも包括する。改変RNA又はアナログRNAは、1個又は複数のヌクレオチドが付加、削除、置換、及び／又は改変され、天然に存在するRNAとは異なっている。このような改変には、siRNAの末端又は内部に、例えばRNAの1個又は複数のヌクレオチドに、非ヌクレオチド材を付加することができる。本開示の患者のRNA分子中のヌクレオチドは、非天然ヌクレオチド、化学合成ヌクレオチド又はデオキシヌクレオチドなどの非標準的ヌクレオチドも含むことができる。これらの改変RNAはアナログ又は天然に存在するRNAのアナログと称される。
【００７２】
「低分子(small)干渉RNA」、「短分子(short)干渉RNA」、「低分子ヘアピンRNA」、「siRNA」、及びshRNAという用語は互換的に使用され、RNA干渉（RNAi）又は遺伝子サイレンシング（発現抑制）を媒介できる任意の核酸分子を指す。例参照：Bass、Nature 411：428-429、2001; Elbashir等、Nature 411：494-498、2001a;及びPCT国際公開WO 00/44895、WO 01/36646、WO 99/32619、WO 00/01846、WO 01/29058、WO 99/07409、及びWO 00/44914。一実施態様において、siRNAは、相補的センス及びアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であり、アンチセンス領域は標的核酸分子（例えば、ガストリン遺伝子産物をコードする核酸分子）の領域に相補的な配列である。別の実施態様において、siRNAは自己相補的センス及びアンチセンス領域を有する一本鎖ポリヌクレオチドであり、アンチセンス領域は標的核酸分子の領域に相補的配列である。また別の実施態様において、siRNAは１個又は複数のループ構造を有する一本鎖ポリヌクレオチドと、自己相補的センス及びアンチセンス領域を含むステム（柄）であり、アンチセンス領域には標的核酸分子の領域に相補的配列があり、そこでポリヌクレオチドはin vivo又はin vitroでRNAiを介在して活性化siRNAが生成される。本発明で使用されるとき、siRNA分子は、RNAのみを含む分子に限定される必要はなく、化学的に改変されたヌクレオチドや非ヌクレオチドも包括される。
【００７３】
本発明は、細胞内遺伝子の発現抑制、RNA干渉と呼ばれるプロセスを引き起こすために、短い二本鎖RNA分子の能力を利用することにある。本発明で使用される「RNA干渉」は、低分子干渉RNA（siRNA）を介した配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングのプロセスを指す。総論はFire et al、Nature 391：806-811、1998を参照されたい。転写後遺伝子サイレンシングのプロセスは、外来遺伝子の発現を防ぐために進化してきた進化的に保存された細胞防御メカニズムと考えられている（Fire、Trends Genet 15 ：358-363、1999）。
RNAiは、特定のウイルス（特に二本鎖RNAウイルス又はライフサイクルに二本鎖RNA中間体が含まれるウイルス）の感染に起因する二本鎖RNA（dsRNA）分子の産生、又は一本鎖RNA又は二本鎖RNA種に相同なウイルスゲノムRNAを特異的に分解するメカニズムを介したトランスポゾン因子の宿主ゲノムへのランダムな挿入から細胞及び生物を保護するために進化してきた可能性がある。
【００７４】
細胞内に長鎖dsRNAが存在するとリボヌクレアーゼIIIである酵素ダイサーの活性が刺激される。ダイサーはdsRNAを低分子干渉RNA（siRNA)(Bernstein et al、Nature 409：363-366、2001）と呼ばれる短鎖dsRNAへの分解を触媒する。ダイサーによって分解され生じる低分子干渉RNAは、一般に長さ約21〜23ヌクレオチドであり、約19塩基対の二重鎖を含む。分解後、siRNAはRNA誘導サイレンシング複合体（RISC）と呼ばれるエンドヌクレアーゼ複合体に取り込まれる。RISCはsiRNA二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な細胞内に存在する一本鎖RNAの切断を媒介できる。Elbashir等によると、標的RNAの切断は、siRNA二重鎖のアンチセンス鎖に相補的な一本鎖RNA領域の中央付近で起こる（Elbashir et al、Genes Dev 15：188-200、2001b ）。
RNAiはいくつかの細胞と生物で記述されている。Fire等1998では線虫のRNAiを記載。Wianny＆Zernicka-Goetz、Nature Cell Biol 2：70-75、1999では、マウス胚におけるdsRNAを介したRNAiを明示。Hammond等Nature 404：293-296、2000では、dsRNAをショウジョウバエ細胞に導入することによりRNAiを誘導できた。Elbashir等Nature 411：494-498、2001aでは、合成21ヌクレオチド二重鎖RNAの導入によりヒト胎児腎臓及びHeLa細胞を含む培養哺乳動物細胞でRNAiの存在を実証した。
【００７５】
他の研究で、siRNA二重鎖の標的相補鎖上の5'-リン酸がsiRNA活性を促進し、ATPがsiRNA上の5'-リン酸部分を維持するために使われることが示されている（Nykanen等、Cell 107：309-321、2001）。siRNA分子に導入された場合に許容される可能性のある他の修飾には、糖リン酸骨格の修飾又は窒素又は硫黄ヘテロ原子の少なくとも1個とヌクレオシドの置換（PCT国際公開WO 00/44914及びWO 01/68836）と、二本鎖RNA依存性プロテインキナーゼ（PKR）、特に2'-アミノ又は2'-O-メチルヌクレオチド、及び2'-O又は4'-Cメチレン架橋を含むヌクレオチドの活性化を阻害する可能性がある特定のヌクレオチド修飾（カナダ特許出願第2,359,180号）が含まれる。
dsRNA及びRNAiの使用を開示している他の参考文献には、PCT国際公開WO 01/75164（ショウジョウバエの細胞を使用するin vitro RNAi系、及び特定の機能的ゲノム的な特定の治療用途のための特異的siRNA分子の使用;WO 01/36646（dsRNA分子を用いて哺乳動物細胞の特定遺伝子の発現を阻害する方法;WO 99/32619（遺伝子発現を阻害するためにdsRNA分子を細胞に導入する方法）; WO 01/92513（RNAiを強化する因子を用いて遺伝子（発現）を抑制させる方法）; WO 02/44321（合成siRNA構築）; WO 00/63364及びWO 01/04313（ポリヌクレオチド配列の機能を阻害するための方法及び組成物;及びWO 02/055692及びWO 02/055693（RNAiを用いた遺伝子発現の阻害方法）。
【００７６】
本発明のいくつかの実施態様は、少なくとも１個のガストリン遺伝子産物の発現の少なくとも部分的に阻害するためにRNAiを利用する。阻害は、通常の発現量の少なくとも約10％であることが好ましい。いくつかの実施態様における方法は、ガストリン遺伝子産物の発現を阻害するのに十分な量のRNA（このRNAには目的の遺伝子のコード鎖に対応するリボヌクレオチド配列を含む）を標的細胞に導入することを含む。いくつかの実施態様において、標的細胞は患者に含まれ、RNAは患者に導入される。
RNAは、標的タンパク質（例えば、ガストリン遺伝子産物）をコードする遺伝子のコード鎖に対応するリボヌクレオチド配列を含むコード鎖と、第一鎖に相補的なリボヌクレオチド配列を含む第２鎖を含む二本鎖領域を有することができる。第1鎖と第2鎖は互いにハイブリダイズして二本鎖分子を形成する。二本鎖領域は、少なくとも15塩基対の長さであり得、いくつかの実施態様において、15〜50塩基対の長さであり得、いくつかの実施態様において、二本鎖領域は15〜30塩基対の長さであり得る。
いくつかの態様においては、RNAは少なくとも19塩基にわたって好ましくは相補的であり分子内自己ハイブリダイゼーションにより二本鎖領域を形成する1本の鎖から成る。いくつかの実施態様において、RNAは少なくとも１９塩基にわたって相補的で分子間ハイブリダイゼーションにより二本鎖領域を形成する２本の別々の鎖から成る。
【００７７】
当業者は、多くの適切な一般的技術をRNAの標的細胞への導入に使えることを承知している。いくつかの実施態様において、RNAをコードしているベクターを標的細胞に導入する。例えば、RNAをコードするベクターを標的細胞に導入し、RNAは細胞内ポリメラーゼによって転写される。
いくつかの態様においては、RNAをコードする核酸を含む組換えウイルスの産生である。標的細胞へのRNAの導入は従って、標的細胞に組換えウイルスを感染させることである。細胞内ポリメラーゼがRNAに転写し、標的細胞内でRNAは発現される。組換えウイルスの操作は、当業者には周知である。当業者は、本明細書でさらに詳細に議論する必要なく、本発明で使用するための組換えウイルス産生を最適化するのに必要な適切なウイルス及びベクター構成の選択に関する複数の要素を熟知している。非限定的な１例として、siRNAをコードするDNAを含む組換えアデノウイルスの構築がある。ウイルスは細胞が組換えアデノウイルスに感染し、siRNAが転写され、感染した標的細胞で一過性に発現できるが、複製はできないように構築できる。組換えウイルスの産生及び使用の詳細は、PCT国際公開WO 2003/006477に見出せるが、その全容は本明細書に組み込まれる。あるいは、例えばpSILENCER ADENO 1.0-CMV SYSTEMTMブランドのウイルス産生キット（Ambion、オースティン、テキサス州、USA）などの組換えウイルスを生産する市販キットを使用できる。
【００７８】
Ｖ．Ｃ．ゲノム編集
遺伝子産物の抑制は、Zhangの米国特許第8,945,839号と、そこで引用されている文献Al-Attar等2011: Makarova等2011; Le Cong等2013; Seung Woo Cho等2013a、b: Carroll2012; Gasiunas 等2012; Hale等2012;及びJinek等2012に記載されているCRISPR-Casゲノム編集システムを用いても達成できる。これら全文献も本明細書に組み込まれる。いくつかの実施態様において、CRISPR-Casゲノム編集システムで使われる方法及び組成物は、いくつかの実施態様において腫瘍及び／又は癌細胞のガストリン遺伝子配列であるガストリン遺伝子配列を標的とする核酸である。
【００７９】
Ｖ．Ｄ．製剤
本発明の組成物は、いくつかの実施態様において、薬学的に許容しうる担体を含む組成物を含有する。適切な製剤には、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、殺菌性抗生物質、及び製剤を患者レシピエントの体液と等張にする溶質を含む水性及び非水性滅菌注射液を含む。水性及び非水性の滅菌懸濁液は、懸濁化剤及び増粘剤を含むことができる。いくつかの実施態様において、本発明の製剤は、アジュバントあるいは油性アジュバントである。
本方法で使用される組成物は、油性又は水性溶媒中の懸濁液、溶液、又は乳濁液などの形態をとることができ、懸濁化剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの調合剤を含むことができる。本方法で使用される組成物は、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、及び腫瘍内製剤を含むがこれらに限定されない形態をとれる。代替的又は追加的に、有効成分は、使用前に適切な溶媒（例えば、発熱物質を含まない滅菌水）と共に飲用する粉末状態でありうる。
製剤は、例えば密封アンプルや瓶などの単位用量又は複数用量の容器で提供でき、使用直前に滅菌液体を加えるだけでよい凍結又は凍結乾燥状態で保管できる。
【００８０】
経口投与の場合、組成物は、例えば、結合剤（例えば、アルファ化トウモロコシ澱粉、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）;充填剤（例えば、乳糖、微結晶セルロース、リン酸水素カルシウム）;潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク（滑石）又はシリカ（ケイ土））;崩壊剤（例えば、ジャガイモ澱粉又は澱粉グリコール酸ナトリウム）;又は湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容される賦形剤を用いて従来の技術によって調製された錠剤又はカプセルの形態とする。錠剤は、当該分野で公知の方法によりコーティングできる。例えば、神経活性ステロイドは、ヒドロクロロチアジドと組み合わせて、結腸に到達するまで神経活性ステロイドを保護する腸溶性又は放出遅延するコーティングを有するpH安定化体として製剤化できる。
経口投与用の液体製剤は、例えば、溶液、シロップ又は懸濁液の形をとることができ、あるいは使用前に水又は他の適切な溶媒と共に服用する乾燥製品として提供できる。このような液体調製物は、懸濁化剤（例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体又は水素化（硬化）食用脂肪）；乳化剤（例えばレシチンやアカシア）;非水性溶媒（例えば、アーモンド油、油性エステル、エチルアルコール又は分画植物油）;及び防腐剤（例えば、メチル又はプロピル-p-ヒドロキシ安息香酸又はソルビン酸）などの薬学的に許容される添加物を用いて従来の技術によって調製できる。調製物は、必要に応じて、緩衝塩、香料、着色料、及び甘味料も含むことができる。経口投与のための製剤は、有効成分を制御放出させるため適切に製剤化することができる。口腔内投与の場合、組成物は、従来の方法で製剤化された錠剤又はトローチの形をとることができる。
【００８１】
化合物は、移植又は注射用の製剤として製剤化することもできる。従って、例えば、化合物は、適切な高分子材料又は疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）又はイオン交換樹脂、又は難溶性誘導体（例えば、難溶性塩）として製剤化することができる。
化合物は、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、又は水中油中水型エマルジョンとして投与される油中に製剤化できる。
化合物はまた、直腸組成物（例えば、ココアバター又は他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を含む座薬又は停留浣腸）、クリーム又はローション、又は経皮パッチに製剤化できる。
いくつかの実施態様において、本発明は、ヒトでの使用に薬学的に許容される組成物を使用する。当業者は、ヒトでの使用に薬学的に許容される組成物に存在し得る成分の性質、及びヒトでの使用に薬学的に許容される組成物から除外される成分も理解している。
【００８２】
Ｖ．Ｅ．投与量
本発明の使用で、「処理（又は治療）有効量」、「治療的有効量」、「処理（又は治療）量」、及び「有効量」という語句は互換的に使用され、測定可能な応答（例えば、治療中の患者の生物学的又は臨床的反応）を生じる十分な治療組成物の量を指す。本発明の医薬組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、特定の患者の所望する治療応答を達成するのに有効な量の活性化合物を投与するように変えることができる。選択された用量レベルは、治療組成物の活性、投与経路、他の薬物又は治療との組み合わせ、治療している病状の重症度、治療している患者の状態及び以前の病歴などに依存し得る。所望の治療効果を達成するのに必要なレベルよりも低い化合物の用量で開始し、所望の効果が達成されるまで用量を徐々に増加させることは、当該技術の範囲内である。
治療用組成物の効力は変動する可能性があり、従って「治療的有効量」は変動する可能性がある。しかしながら、当業者は、本発明の候補モジュレーターの効能及び効力を容易に評価し、それに応じて治療計画を調整できる。
【００８３】
当業者は、本発明の開示を読んだ後、特定の製剤、組成物とともに使用される投与方法、及び他の要因を考慮して、個々の患者に用量を調整することができる。さらなる容量計算では、患者の身長と体重、疾患の重症度と段階、及び追加的な有害な身体状態の存在を考慮する。そのような調整又は変動、ならびにそのような調整又は変動をいつどのように行うかの評価は、医療当業者にはよく知られている。
従って、いくつかの実施態様において、本発明で使われる用語「有効量」は、ガストリンペプチドに対する液性又は細胞性免疫応答を供給及び／又は誘導する薬剤、及び／又はガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸、測定可能な抗腫瘍及び／又は抗癌生物活性を生じるのに十分な、その薬学的に許容される塩、その誘導体、又はその組み合わせからなる組成物の量を指す。本発明の組成物中の有効成分の実際の投与量レベルは、特定の患者及び／又は用途に対して所望の応答を達成するのに有効な量の活性化合物を投与するように変更できる。選択された用量レベルは、組成物の活性、製剤、投与経路、他の薬物又は治療との組み合わせ、治療中の病状の重症度、及び治療中の患者の体調及び過去の病歴を含む様々な要因に依存し得る。いくつかの実施態様において、最小用量が投与され、用量制限毒性がない場合、用量は最小有効量まで漸増される。有効用量の決定及び調整、ならびにそのような調整を行う時期及び方法の評価は、当業者は熟知している。
【００８４】
本発明の組成物を投与するため、マウス動物モデルに投与される用量に基づいてヒト用量を外挿する従来の方法は、当業者に周知の手法で行うことができる。薬物用量は体重ではなく、特定の代謝及び排泄機能との良好な相関関係を達成するため、体表面積1平方メートル当たりのミリグラムで与えることもできる。さらに、Freireich等1966に記載されているように、体表面積は成人及び小児のみならず異なる動物種においても薬物投与量の公分母として使用できる。要約すると、特定の種のmg/kg用量を同等のmg/m2用量として表現するには、用量に適切なkm係数を掛ける。成人では、100 mg/kgは100 mg/kg×37 kg/m2 = 3700 mg/m2に相当する。製剤及び用量に関する更なる手引については、米国特許第5,326,902号；第5,234,933号；PCT国際公開WO 93/25521;Remington等、1975; Goodman等、1996; Berkow等、1997; Speight等、1997;Ebadi、1998; Duch等、1998; Katzung、2001; Gerbino、2005年を参照されたい。
【００８５】
Ｖ．Ｆ．投与経路
本発明の組成物は、任意の形状及び／又は任意の投与経路で患者に投与できる。いくつかの実施態様において、製剤は、持続放出製剤、制御放出製剤、又は持続放出と制御放出の両方のために設計された製剤である。本発明を使用するとき、用語「持続放出」は、ほぼ一定量の活性薬剤が経時的に患者に供給できる活性薬剤の放出を指す。「制御放出」という語句はより広範であり、活性薬剤の放出が一定レベルであろうがなかろうが活性薬剤の経時的な放出を指す。特に、「制御放出」は、有効成分が必ずしも定量的に放出されるわけではないが、経時的な放出の増加、経時的な放出の減少、及び／又は1回又はそれ以上の放出の増加、放出の減少、又はその組み合わせの期間を伴う定量的放出の状態と製剤である。従って、「持続放出」は「制御放出」の一形態であるが、後者には、異なる時間に送達される活性薬剤の量の変化を捉える送達様式も含まれる。
【００８６】
いくつかの実施態様において、持続放出製剤、制御放出性製剤、又はそれらの組み合わせは、経口(oral)製剤、経口(peroral)製剤、口腔内製剤、腸内製剤、肺製剤、直腸製剤、膣製剤、鼻製剤、舌製剤、舌下製剤、静脈内製剤、動脈内製剤、心臓内製剤、筋肉内製剤、腹腔内製剤、経皮製剤、頭蓋内製剤、皮内製剤、皮下製剤、エアロゾル化製剤、眼製剤、移植可能な製剤、デポ（蓄積）注射製剤、経皮製剤及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施態様において、投与経路は、経口(oral)、経口(peroral)、口腔内、腸内、肺、直腸、膣、鼻、舌、舌下、静脈内、動脈内、心臓内、筋肉内、腹腔内、経皮、頭蓋内、皮内からなる群から選択される、皮下、眼、移植片を通した、デポ（蓄積）注射を介した経路からなる群から選択される。該当する場合、連続注入は、標的部位での薬物の蓄積を強化できる（例えば、米国特許第6,180,082号参照）。米国特許第3,598,122号；第5,016,652;第5,935,975;第6,106,856; 第6,162,459;第6,495,605;及び第6,582,724;経皮製剤及び組成物の送達方法に関する米国特許出願公開第2006/0188558号も参照。いくつかの実施態様において、投与は、経口、静脈内、腹腔内、吸入、及び腫瘍内からなる群から選択される経路を介する。
本発明の方法に従って使用される本開示の主題の組成物の特定の投与様式は、使用される製剤、治療中の病態の重症度、組成物（例えば、PAS）中の活性薬剤が局所的又は全身的に作用するかどうか、及び投与後の活性薬剤の代謝又は除去のメカニズムなど様々な要因に依存し得るが、これらに限定されない。
【００８７】
ＶＩ．方法と用途
いくつかの実施態様において、本発明は、以下の様々な方法及び／又は使用における医薬組成物の使用に関する。ガストリン関連腫瘍及び／又は癌の治療、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌の治療用薬剤の製造、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌の増殖の阻害、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌に対する体液性及び／又は細胞性免疫応答の誘導及び／又は強化、腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答の誘導因子に応じてガストリン及び／又はCCK-B受容体シグナル伝達に関連する腫瘍及び／又は癌の感作、腫瘍及び／又は癌に関連する線維症の形成を予防、軽減及び／又は排除、特に膵臓癌においてガストリン関連腫瘍及び／又は癌の転移の予防、軽減及び／又は排除；腫瘍及び／又は癌における腫瘍浸潤CD8 +リンパ球の増加；腫瘍及び／又は癌に存在するFoxP3陽性阻害性T調節細胞数の減少；ガストリン関連腫瘍及び／又は癌に反応する患者のTEMRA細胞の増加、に関する。これらの方法及び／又は使用のそれぞれは、本明細書で以下に詳細に説明する。
【００８８】
ＶＩ．Ａ．ガストリン関連腫瘍及び／又は癌の治療法
いくつかの実施態様において、本発明は、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌を治療する方法に関する。いくつかの実施態様において、この方法は、それを必要とする患者（例えば、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌の患者）に、ガストリンペプチド及び／又はCCK-B受容体に対する能動的及び／又は受動的体液性免疫応答を誘導及び／又は提供する第１の薬剤からなる有効な量の組成物を投与することに関する。及び、ガストリン関連腫瘍又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は提供する第２の薬剤に関する。従って、いくつかの実施態様で本発明の方法は、2つの異なる免疫療法活性、すなわちガストリンペプチド及び／又はCCK-B受容体に対する能動的及び／又は受動的体液性免疫応答の提供及び／又は誘導、ならびにガストリン関連腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答の誘導及び／又は提供、を同時に提供する1つ又はそれ以上の活性薬剤からなる医薬組成物の使用に依存する。
【００８９】
ガストリンペプチド及び／又はCCK-B受容体に対する能動的及び／又は受動的体液性免疫応答の提供及び／又は誘導に関して、本発明の医薬組成物に存在する第１の薬剤は、ガストリンに対する能動的体液性応答を誘導するように設計されたガストリンペプチド、及び／又はガストリン及び／又はCCK-B受容体、いくつかの実施態様において、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌に存在するCCK-B受容体に対する受動的な体液性応答を提供するように設計された抗ガストリン抗体及び／又は抗CCK-R抗体からなる群から選択される。特定の作用理論に縛られることを望まないが、ガストリンペプチド及び／又はCCK-B受容体に対する能動的及び／又は受動的体液性免疫応答は、患者に循環しているガストリンの量を減らすことでガストリンのCCK-B受容体への結合を減少させることにより、及び／又は中和及び／又はブロッキング抗体でガストリンのCCK-B受容体への結合を阻害することにより、CCK-B受容体を介したガストリン関連腫瘍及び／又は癌におけるガストリンのシグナル伝達を部分的又は完全に阻害するように設計される。
【００９０】
従って、いくつかの実施態様において、第１の薬剤は、任意選択でEGPWLEEEE（配列番号1）、EGPWLEEEE（配列番号2）、EGPWLEEEEEAY (配列番号3)、EGPWLEEEEEAYGWMDF (配列番号4)からなる群から選択されるアミノ酸配列からなる、本質的にそれからなる、ガストリンペプチドである。ここで、配列番号１〜４のいずれかのアミノ酸番号１のグルタミン酸残基はピログルタミン酸残基である。いくつかの実施態様において、ガストリンペプチドは、医薬組成物において、任意選択でリンカーさらに任意選択でε-マレイミドカプロン酸N-ヒドロキシスクシンアミドエステルからなるリンカーを介して、免疫原性キャリアーに結合される。免疫原性キャリアーの非限定的な例として、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペット（スカシ貝）ヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンがある。第１の薬剤の構造は本明細書に前述したが、いくつかの実施態様において、リンカー及びガストリンペプチドは、アミノ酸スペーサーで結合され、アミノ酸スペーサーの長さは好ましくは1から10アミノ酸であり、さらに好ましくはアミノ酸スペーサーの長さは7アミノ酸である。
本開示を見れば当業者には分かることだが、いくつかの実施態様において、医薬組成物は、高い抗ガストリン体液性免疫応答を望む場合、ガストリンペプチド及び／又はガストリンペプチド結合体の免疫原性を高めるために、アジュバント好ましくは油性アジュバントをさらに含む。
【００９１】
ガストリン関連腫瘍又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導するために、本発明の方法は、1つ又は複数のチェックポイント阻害剤からなる医薬組成物を使用する。知られているように、チェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイント活性を有する標的ポリペプチドの1つ又は複数の生物学的活性を阻害する。そのようなポリペプチドの代表例には、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）ポリペプチド、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）ポリペプチド、及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1）ポリペプチドがある。いくつかの実施態様において、チェックポイント阻害剤は、PD-1ポリペプチドとPD-L1ポリペプチドの相互作用を阻害又は防止することにより、T細胞と腫瘍細胞の相互作用に結合及び／又は妨害する抗体又は小分子である。そのような抗体及び小分子の代表例には、イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、アベルマブ及びデュルバルマブがあるが、これらに限定されない。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、患者に体液性応答及び細胞性応答の両方が誘導及び／又は提供される様々な量の第１及び第２の薬剤に関する。ならびに医薬組成物は、治療の有効性を最大化し、及び／又はその望ましくない副作用を最小化するために調整することができる第１及び第２の薬剤に関する。しかしながら、いくつかの実施態様において、本発明の医薬組成物は、約50μg〜約1000μg、約50μg〜約500μg、約100μg〜約1000μg、約200μgから約1000μg、及び約250μgから約500μgからなる群から選択される用量を投与する。場合によっては、服用は1回、2回又は3回と繰り返し、場合によっては、2回目の服用を1回目の服用１週間後に投与し、3回目の服用を投与するなら2回目の投与の1週間後又は2週間後に投与する。
いくつかの実施態様において、本発明のガストリン関連腫瘍及び／又は癌を治療する方法は、腫瘍及び／又は癌細胞のガストリンの1つ又は複数の生物学的活性を直接又は間接的に阻害する第１の薬剤及び腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答の刺激剤である第2の薬剤を必要とする患者に投与することである。従って、いくつかの実施態様において、第１の薬剤は、ガストリンペプチドに対する体液性免疫応答を提供及び／又は誘導することにより、腫瘍及び／又は癌におけるガストリンの1つ又は複数の生物活性を直接又は間接的に阻害する。任意選択で、その薬剤は、抗ガストリン抗体、及び患者に中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチド、及び／又はガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸からなる群から選択される。ガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸は、本開示を見れば当業者には分かることであり、例は前述の通りである。
【００９３】
抗ガストリン抗体は当技術分野で知られており、米国特許第5,607,676号;第5,609,870号;第5,622,702号;第5,785,970号;第5,866,128号;及び第6,861,510号に記載されている。PCT国際公開WO 2003/005955及びWO 2005/095459も参照。これらの米国特許及びPCT国際公開のそれぞれの内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施態様において、抗ガストリン抗体は、ガストリン-17（G17）内に存在するエピトープに対する抗体である。いくつかの実施態様において、エピトープは、アミノ酸配列EGPWLEEEEE（配列番号1）、EGPWLEEEE（配列番号2）、EGPWLEEEEEAY（配列番号3）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号4）の1つ又は複数内に存在する。
いくつかの実施態様において、本発明の医薬組成物の患者への投与は、膵臓癌に関連する線維症の発症を削減及び／又は予防に誘導する。
【００９４】
いくつかの実施態様において、本発明の治療方法は、患者におけるガストリン関連腫瘍及び／又は癌の増大及び／又は残存を阻害するように設計される。従って、いくつかの実施態様において、本発明は、ガストリン免疫原、1つ以上の抗ガストリン抗体、1つ以上の抗CCK-B受容体抗体、又はそれらの任意の組み合わせからなる第１の薬剤と、チェックポイント阻害剤からなる第２の薬剤からなる組成物を患者への投与に関する。
従って、いくつかの実施態様において、本発明は、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌を治療するための医薬品の調製のための本発明の医薬組成物の使用、ならびにガストリン関連腫瘍及び／又は癌を治療するための医薬組成物の使用に関する。
いくつかの実施態様において、本発明の多剤医薬組成物は、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌に対し、同様の患者を個々の薬剤で個別に治療するより、強化した、より効き目のある、及び／又はより好結果の治療を提供する。
【００９５】
ＶＩ．Ｂ．ガストリン関連腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は強化する方法
本発明は、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌の患者に対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は強化する方法も提供する。いくつかの実施態様において、本発明の方法は、ガストリン関連腫瘍又は癌の患者に、ガストリン関連腫瘍又は癌に存在するCCK-B受容体を介したガストリンのシグナル伝達を低減又は阻害する薬剤からなる組成物を有効量投与する。それにより、患者のガストリン関連腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は強化する。本発明で使用される「ガストリン関連腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答の誘導及び／又は強化」という語句及びその文法上の変形は、ガストリン関連腫瘍又は癌に存在するCCK-B受容体を介したガストリンのシグナル伝達を低減又は阻害する薬剤からなる組成物の有効量を、ガストリン関連腫瘍又は癌の患者へ投与した結果としての状況を指す。この患者における投与後の妥当な時間のT細胞ベースの免疫応答レベルは、このような治療をしてない患者よりも高い。ガストリン関連腫瘍又は癌に存在するCCK-B受容体を介したガストリンのシグナル伝達を低減又は阻害する薬剤には、ガストリンペプチドとCCK-B受容体の相互作用を妨害できる本発明の薬剤が含まれるが、これらに限定されない。また、ガストリンペプチド及び／又は免疫原、抗ガストリン抗体、抗CCK-B受容体抗体、ガストリン/CCK-Bシグナル伝達の小分子阻害剤、及びそれらの組み合わせも含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
ＶＩ．Ｃ．腫瘍及び／又は癌を細胞性免疫応答の誘導因子に感作する方法
いくつかの実施態様において、本発明は、腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答の誘導因子に対する患者のガストリン及び／又はCCK-B受容体シグナル伝達に関連する腫瘍及び／又は癌を感作する方法も提供する。本発明で使用する「患者におけるガストリン及び／又はCCK-B受容体シグナル伝達に関連する腫瘍及び／又は癌を細胞性免疫応答の誘導因子に感作する」という語句は、この治療してない患者に1つ又は複数の誘導因子を投与した時の患者の細胞性免疫応答のレベルと比較して、1つ又は複数の細胞性免疫応答の誘導因子を患者に投与した時の患者の細胞性免疫応答のレベルをもたらす治療を指す。
【００９７】
いくつかの実施態様において、この方法は、ガストリンペプチドに対する能動的及び／又は受動的体液性免疫応答を誘導及び／又は提供する第１の薬剤、及び腫瘍及び／又は癌細胞に対し細胞性免疫を誘導及び／又は提供する第２の薬剤、又はそれらの組み合わせからなる組成物を患者に投与することである。場合により、第１及び第２の薬剤は、患者に細胞性免疫応答又は中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチド及び／又はその断片及び／又はその誘導体、及び中和抗ガストリン抗体及び／又はその断片及び／又はその誘導体、及び／又はガストリン遺伝子産物の発現を阻害する核酸からなる組成物、及び／又はCCK-B受容体でのガストリンの生物学的機能を遮断する薬剤からなる組成物からなる群より個々に選択される。いくつかの実施態様において、抗ガストリン抗体は、ガストリン-17（G17）内に存在するエピトープに対する抗体である。
従って、いくつかの実施態様において、患者にガストリン及び／又はCCK-B受容体シグナル伝達に関連する腫瘍及び／又は癌を細胞性免疫応答の誘導物質に感作させる即席の方法は、患者にガストリンペプチドに対する能動的及び／又は受動的体液性免疫応答の両方を誘導及び／又は提供すると共に、腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答を誘導及び／又は提供する本発明の医薬組成物を患者へ投与することである。
【００９８】
ＶＩ．Ｄ．腫瘍及び／又は癌に関連する線維症を予防、軽減、及び／又は除去する方法
膵臓癌(PC)はまた、血管新生の促進を助け、膵臓腫瘍部位への化学療法薬及び免疫療法薬の浸透を阻害しうる物理的障壁を作る（Templeton＆Brentnall、2013）高密度線維症環境によって特徴付けられる（Neesse等、2011）。本明細書では、任意選択で1つ又は複数の免疫チェックポイント阻害剤と組み合わせたポリクローナル抗体刺激因子(PAS)投与により、PC線維症の特質である線維症の症状を削減できるという予想外の驚くべき観察結果を開示する。いかなる特定の動作理論に縛られることを望まないが、線維症の縮小は、チェックポイントモノクローナル抗体のような高分子を含むがこれに限定されない他の薬物のより効果的な浸透を促進することができる。これは、おそらくチェックポイントモノクローナル抗体がPDAC細胞に浸透しないため、これまでにチェックポイント阻害剤が非常に控えめな効能によって特徴付けられていた理由が説明できる。従って、本発明の特徴は、ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)と免疫チェックポイント阻害剤は、単剤治療として投与された場合には個々に抗PDAC腫瘍活性を示すが、本明細書で開示された併用療法として投与された場合には、はるかに高い活性を示すことである。
【００９９】
本発明に従って、多様であるが相補的あるいは相乗的でさえある作用メカニズムのある新規かつ革新的な薬物の組み合わせが、PDACの本質的に線維症状に対処し、抗免疫チェックポイント阻害剤モノクローナル抗体など（ただし、これに限定されない）の大きなモノクローナル抗体を腫瘍環境へ接近し易くするために、提供される。特定の動作理論に縛られることを望まないが、ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)と免疫チェックポイント阻害薬を併用療法の一部として同時に投与すれば、PDACに関連する線維症を縮小させることにより、腫瘍を化学療法薬及び免疫チェックポイント阻害薬により接近しやすくする相乗効果をもたらすことができる。これにより、抗腫瘍治療薬は、ガストリン関連腫瘍に対する細胞性免疫応答を誘導するために、PD-1とPD-L1の相互作用を標的にできる。
【０１００】
ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)による処理（治療）は、自己分泌（オートクライン）及び傍分泌（パラクライン）の腫瘍/癌増殖因子ガストリンに対する体液性免疫学的応答（すなわち、抗体応答）をもたらす。そうすることで、ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)は細胞増殖、アポトーシス、血管新生、浸潤、及び転移に作用することにより、腫瘍/癌（PDACなど）の表現型に影響を及ぼす。本発明で開示されているように、ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)はPDACに関連する線維症の縮小にも効力がある。特定の動作理論に縛られることを望まないが、これは、免疫チェックポイント阻害的モノクローナル抗体（ただしこれに限定されない）などの大きな分子が膵臓腫瘍部位へより接近し易くする能力を強化すると考えられ、その結果はるかに大きな細胞性免疫効果の助長が期待される。ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)は、ガストリンに対する細胞性免疫反応ももたらす。従って、本発明は、腫瘍へ効果を発揮するために接近する必要のある治療薬に抵抗するPDACの固有の線維症的及び難治性症状に対処するため、抗PD-1、抗PD-L1、及び／又は抗CTLA-4モノクローナル抗体などの免疫チェックポイント阻害剤の投与と組み合わせたポリクローナル抗体刺激因子(PAS)の投与により腫瘍及び／又は癌を治療する方法に関する。
【０１０１】
従って、いくつかの実施態様において、本発明は、腫瘍及び／又は癌のガストリンの１つ又は複数の生物学的活性を直接又は間接的に阻害する薬剤と、腫瘍及び／又は癌の細胞と接触させることにより、腫瘍及び／又は癌、任意選択で膵臓癌に関連する線維症の形成を予防、削減及び／又は排除する方法を提供する。
ガストリンの1つ又は複数の生物学的活性を直接又は間接的に阻害する薬剤は本明細書に前述されているが、ガストリンペプチドに対する体液性免疫応答を提供及び／又は誘導する薬剤（抗ガストリン抗体及び／又はその断片及び／又はその誘導体などであるが、これらに限定されない）、及び患者に中和抗ガストリン抗体の産生を誘導するガストリンペプチド;ガストリン遺伝子産物の発現を阻害する阻害性核酸;ガストリンホルモンの機能を阻害する小分子化合物、及びそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施態様において、抗ガストリン抗体は、ガストリン-17（G17）内に存在するエピトープに対する抗体であり、このエピトープは、いくつかの実施態様において、EGPWLEEEEE（配列番号1）、EGPWLEEEE（配列番号2）、EGPWLEEEEEAY（配列番号3）、及びEGPWLEEEEEAYGWMDF（配列番号4）の1つ又は複数のアミノ酸配列中に存在する。
【０１０２】
本発明のガストリン及びガストリンペプチドの他の免疫原性形と同様に、いくつかの実施態様において、ガストリンペプチドは免疫原性担体、任意選択でジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド、キーホールリンペットヘモシアニン、及びウシ血清アルブミンからなる群から選択される免疫原性担体に結合される。
いくつかの実施態様において、腫瘍及び／又は癌、任意に膵臓癌に関連する線維症の形成を予防、削減、及び／又は排除する方法は、腫瘍及び／又は癌に対する細胞性免疫応答の刺激剤からなる第２の薬剤を腫瘍及び／又は癌に接触させることである。細胞性免疫応答の代表的な刺激剤には、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA4）、プログラム細胞死-1受容体（PD-1）、及びプログラム細胞死1受容体リガンド（PD-L1)、からなる群から選択される標的ポリペプチドの生物学的活性を阻害する免疫チェックポイント阻害剤である。イピリムマブ、トレメリムマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、ペンブロリズマブ、AMP514、AUNP12、BMS-936559/MDX-1105、アテゾリズマブ、MPDL3280A、RG7446、RO5541267、MEDI4736、及びアベルマブが含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施態様において、その線維症の形成を予防、削減、及び／又は排除する腫瘍及び／又は癌は膵臓癌である。
【０１０３】
ＶＩ．Ｅ．患者及び腫瘍に存在するＴ細胞亜集団を調整する方法
本明細書で開示されるように、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌の患者に対する本発明の医薬組成物の投与は、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌を治療した患者に存在する循環T細胞亜集団と、腫瘍及び／又は癌自体に存在するT細胞亜集団の両方を改変することが分かった。
いくつかの実施態様において、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌の患者への本発明の医薬組成物の投与は、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌に存在するCD8陽性腫瘍浸潤リンパ球（TIL）の数を増大させる。当技術分野では、TILが抗腫瘍及び抗癌活性を有し、従って腫瘍及び／又は癌におけるTILの数を増大させると、本発明の医薬組成物単独又は他の最前線及び／又は二次治療を組み合わせた様々な治療戦略の抗腫瘍及び／又は抗癌効力がより大きくなることが知られている。
【０１０４】
いくつかの実施態様において、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌の患者への本発明の医薬組成物の投与は、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌に存在するFoxP3陽性阻害性T調節細胞（Tregs細胞）の数の減少をもたらす。当該技術分野では、Tregs細胞は免疫抑制活性、特に腫瘍及び癌特異的免疫抑制活性を有し、従って腫瘍及び／又は癌におけるFoxP3陽性阻害性Tregs細胞数を減らすと、本発明の医薬組成物を単独で、又は他の最前線及び／又は二次治療と組み合わせた、様々な治療戦略のより大きな抗腫瘍及び／又は抗癌効果をもたらず。いくつかの実施態様において、腫瘍及び／又は癌におけるFoxP3陽性阻害性Tregs細胞数を減らすと、最前線の化学療法薬の有効性を高めることができる。
【０１０５】
いくつかの実施態様において、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌の患者への本発明の医薬組成物の投与は、患者に抗ガストリンTEMRA細胞の増加をもたらす。TEMRA細胞は、末梢循環及び組織に見られるエフェクターメモリーT細胞である。TEMRA細胞は、転移を感知する見張り役をしていると思われる。そのため、患者の抗ガストリンTEMRA細胞の増加は、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌に関連する転移を予防、削減、及び／又は排除する可能性がある。従って、いくつかの実施態様において、本発明は、ここで開示される医薬組成物で患者を治療することにより、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌抗原及びそれを発現する細胞を認識するTEMRA細胞を増加させる方法に関する。
手短に言うと、いくつかの実施態様において、本発明は、最先端療法として単独で、他の最先端療法と組み合わせで、又はガストリン関連腫瘍及び／又は癌の患者に適切ないかなる他の最先端医療と組み合わせで、ガストリン関連腫瘍及び／又は癌を治療する免疫チェックポイント阻害剤とガストリン免疫原からなる組成物に関する。
【０１０６】
ＶＩＩ．結論
従って本発明は、いくつかの実施態様において、体液性抗体免疫応答（例えば、ガストリン癌ワクチンポリクローナル抗体刺激因子(PAS)を使用）と細胞性T細胞免疫応答（例えば、ガストリン癌ワクチンPAS又は免疫チェックポイント阻害剤を使用）の両方を個々に又は同時に生じる方法の組み合わせを用いた癌治療のための併用療法に関する。より具体的には、体液性及び細胞性免疫抗腫瘍応答を細胞性免疫抗腫瘍効果と組み合わせて生じる薬剤類の即記された組み合わせを使用した、ヒト及び動物の胃腸腫瘍治療での予想外の相加的及び／又は相乗的効果に関する。
より具体的には、本発明は、いくつかの実施態様において、（ｉ）腫瘍増殖因子又は循環性腫瘍増殖因子に対し体液性B細胞免疫応答を誘導する薬剤、（ii）腫瘍及び／又は癌に対し、細胞傷害性Tリンパ球応答を誘発するために、細胞性免疫応答（すなわち、抗腫瘍及び／又は癌T細胞応答）を誘導及び／又は強化する薬剤、の特定の組み合わせを使用することに関する。
【０１０７】
かくして、本発明のいくつかの実施態様は、ガストリン癌ワクチンと免疫チェックポイント障害を克服する第２の薬剤とを組み合わせて使用する、ヒト及び動物の腫瘍及び癌を治療する方法である。従って、いくつかの実施態様において、本発明は、B細胞及び／又は抗体免疫応答及び増殖因子ガストリンの活性型に反応する細胞性免疫応答を誘発することを目的とする癌ワクチンで特定ヒト癌を治療することに関する。このワクチン治療で癌は免疫チェックポイント阻害剤による治療に敏感になる想定外の結果を得られ、その結果、抗腫瘍効果を増大させる、想定外の、相加的な、又は相乗的でさえある併用治療効果を引き起こす。
さらに、本発明の医薬組成物は、ＣＤ８陽性腫瘍浸潤リンパ球の数を増大させるのに十分な請求項１〜１３のいずれか１項に記載の量の医薬組成物をガストリン関連腫瘍又は癌の患者に投与することにより、ガストリン関連腫瘍又は癌の転移を予防、削減、及び／又は除去するために使用できる。
請求項１０４の使用により、その投与は、医薬組成物が投与されなかった場合に発生するであろうものと比較して、患者の生存率の改善、腫瘍成長の低減、及び/又は患者における化学療法剤及び/又は免疫チェックポイント療法の有効性の向上をもたらす。
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物の使用により、ＦｏｘＰ３＋阻害性Ｔ調節細胞の数を減少させるのに十分な量の請求項１〜１３のいずれか一項に記載の医薬組成物は、ガストリン関連腫瘍又は癌を有する患者に投与することにより、ガストリン関連腫瘍又は癌の転移を予防し、軽減し、及び/又は排除する。
【実施例】
【０１０８】
以下の実施例は、例示的な実施態様を示す。本開示及び当業者の一般的なレベルに照らして、当業者は、以下の実施例は例示のみを意図するものであり、多くの変更、修正、及び代替を本発明の範囲から逸脱することなく採用できることを認識する。
【０１０９】
実施例のための材料と方法
細胞株：マウスmT3膵臓癌細胞は、David Tuveson博士の研究室から入手した（Cold Spring Harbor Laboratories、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、USA；Bojet等、2015も参照）。これらの細胞はCCK-B受容体を発現し、ガストリンを産生することが示されており、腫瘍モデルとして使用した。これらの細胞は、同系のC57BL/6マウスで腫瘍を形成する（Smith等、2018）。
【０１１０】
研究デザイン：すべての動物研究は、ジョージタウン大学（ワシントンD.C.、USA）の施設内動物管理使用委員会（IACUC）によって承認されたプロトコルの下で、倫理的な手法で行われた。40匹の雄（6週齢）C57BL-6マウスの脇腹に500,000個の細胞を皮下注射した。接種後6日目に、100％のマウスに触知可能な腫瘍があり、それぞれマウスを１０匹づつ4つのグループに振り分け、腫瘍体積の基礎量をすべてのグループで等しくした。グループは次のとおり。
1. PBS対照（PBSと表記）
2. PAS 100μg（PAS100と表記）
3. PD-1抗体 150μg（PD-1と表記）
4. PD-1抗体（150μg）+ PAS 100μg（PD-1+PAS100と表記）
mT3細胞を注射してから1週間（7日）後、非対照群のマウスは以下のように本願のもの及び／又はPD-1抗体を投与した：ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)を投与するグループのマウスには、PASをランダム化（ベースライン時間= 0）の時点から100μl腹腔内投与し、１週間後、３週間後に再度投与する。PD-1抗体（Bio X cell社、ウエストレバノン、ニューハンプシャー州、USA）は150μgの用量で該当マウスに腹腔内投与した（実験中t=0、4、8、15、及び21日目に5回）。対照マウスには、PAS投与した同じ日にPBSを投与した。腫瘍体積はノギスで毎週測定し、L x (w)2 x 0.5として計算した。
【０１１１】
組織学的検査：マウスは31日間飼育後、炭酸ガス窒息と頸部脱臼で安楽死させた。マウスの体重を測定し、膵臓腫瘍を切除し秤量した。腫瘍を分割し、腫瘍の半分は組織学のために4％パラフィンを含むホルムアルデヒドで固定し、残り半分は液体窒素で瞬間凍結した。腫瘍関連線維症は、マッソン(Masson）の三重染色法で評価した。マッソンの三重染色法の解析は、ImageJ画像処理及び分析ソフトウェア（アメリカ合衆国国立衛生研究所（NIH）、ベセスダ、メリーランド州、USAのWayne Rasbandによって開発され、NIHサイトから入手可能）を用いて治療に盲検な技術者によって行われた。
免疫組織化学的検査のために、腫瘍組織はパラフィン包埋ブロックから薄片に切り分け（10μm）、スライドに固定した。腫瘍切片は抗CD8抗体（1:75力価;EBIOSCIENCE(TR)、サンディエゴ、カリフォルニア州、USA）、又は抗Foxp3抗体（1:30力価; EBIOSCIENCE(TR)）で染色した。免疫染色した細胞は手動でカウントした。
【０１１２】
脾臓T細胞の分離：各マウスから脾臓を取り出し秤量し、RPMI1640培地5 ml入り60 mmディッシュに入れた。脾臓はかみそりの刃を使って機械的に刻んだ。脾臓組織入り培地は100μMのセルストレーナーを通して50 mlチューブにろ過し、最終容量が40 mlになるまで培地で数回すすいだ。それから脾臓組織は再度40μMセルストレーナーを通して50 mlチューブにろ過し、1500 rpm、4℃で5分間遠心分離して細胞をペレット化した。上清を除去し、細胞ペレットを40mlPBSに再懸濁後、1500rpm、4℃で5分間遠心分離して細胞を再ペレット化した。上清を捨て、細胞ペレットを3 mlの洗浄液（2 mM EDTA及び0.5％ウシ血清アルブミンを含むPBS）に再懸濁し、15 mlチューブ中の5 ml Ficoll培地の上にゆっくりと加えた。減速を0に設定して2100 rpmで20分間遠心分離後、リンパ球を洗浄液とフィコール液の間の白濁層から回収した。リンパ球はさらに2回洗浄し、培地に再懸濁し、カウントした。
【０１１３】
フローサイトメトリー：100万個のリンパ球を5 mlの透明チューブ（カタログ番号352054; BD Falcon、ベッドフォード、マサチューセッツ州、USA）に加え、PBSで体積を均等化し、1500 rpmで5分間遠心分離し細胞をペレット化した。PBSで洗浄した後、50μlのあらかじめ希釈したZOMBIE NIR(TM)ブランドの固定可能な生存率解析用溶液（BIOLEGEND(R)、サンディエゴ、カリフォルニア州、USA）を細胞に添加し、室温の暗所で20分間インキュベートした。細胞を洗浄後、5 μlの精製ラット坑マウスCD16/CD32（Mouse BD Fc BLOCK(TM)ブランド試薬; BD Biosciences、サンノゼ、カリフォルニア州、USA）を添加し、20分間インキュベートしてブロックした。
【０１１４】
表１に記載されている抗体をリンパ球と反応させ、FACSARIA(TM) IIuブランドのセルソーター（BD Biosciences）を使用して375 nm、405 nm、488 nm及び633 nmレーザーでフローサイトメトリー解析した。
【表１】
2020528449.tif 000003
【０１１５】
再刺激用:100万個又は200万個の単離し洗浄されたリンパ球を２枚の複製6穴プレート各ウェルに加え、それぞれ同じ容量（2又は3 ml）にした。ブレフェルジンA溶液（BIOLEGEND(R)、1000倍濃度、カタログ番号420601）を各ウェルに1 μl/mlで添加した。1μMのガストリン-14（シグマアルドリッチ社、カタログ番号SCP0152、アミノ酸配列pEGPWLEEEEEAYGW；配列番号5）を1ウェルあたり1μl/ mlで添加し、最終ガストリン濃度1nMとした。もう1つの複製プレートにはガストリン-14を添加せず、対照とした。6穴プレートは細胞培養インキュベーターに37℃6時間置いた。次に細胞を取り出し、洗浄し、Intracellular Fixation＆Permeabilization Buffer Set（細胞内蛋白質固定と細胞膜透過処理溶液セット）（EBIOSCIENCE(TR)、カタログ番号88-8824-00）を使用して透過処理した。表2に示す4つの抗体を含むサイトカイン抗体マスターミックス（8サンプルに対して4抗体、従ってマスターミックスを作成する各抗体10μl）を加え、4℃で一晩インキュベートした。
【０１１６】
【表２】
2020528449.tif 000004
ガストリン又はPBSで再刺激した細胞中のサイトカインをフローサイトメトリーで解析した。フローサイトメトリーのデータ解析は、FCSExpress-6ソフトウェア（De Novo Software社、グレンデール、カリフォルニア州、USA）を用いて行われた。
【０１１７】
実施例１
マウスでの腫瘍形成
ポリクローナル抗体刺激因子(PAS)処理が体液性及び細胞性免疫応答の両方を誘導し、免疫チェックポイント抗体処理に相乗的効果をもたらすかどうかを判断するために、免疫能力のあるマウス（たとえば、マウスmT3膵臓癌細胞と同系のC57BL/6マウス）に0.1 ml PBS中に5 x 105のマウスmT3膵臓癌細胞を脇腹に皮下投与し腫瘍を形成させた。腫瘍が定着するまで1週間待った後、図1に示すように、マウスをPASと1つ又は複数の免疫チェックポイント阻害剤で処理した。
mT3膵臓癌細胞接種の1週間後にマウスの処理を開始した。この時間枠で、実験中のすべてのマウスが触知可能な皮下腫瘍を有し、処理が腫瘍の発症を妨げないことが保証される。主要エンドポイントは、腫瘍の増殖と残存である。腫瘍の増殖はノギスで毎週測定し、腫瘍体積はL x W2 x 0.5として計算した。腫瘍を切除し、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）及びT調節細胞（Tregs細胞）を含むがこれらに限定されない免疫細胞の免疫組織化学的解析により組織学的に調べた。腫瘍はPDACに通常関連する線維症の発症の有無と程度についても調べた。脾臓を摘出し、T細胞を単離してガストリンで再刺激した。細胞は、関連する一連のサイトカイン抗体で標識し、フローサイトメトリーで解析した。
【０１１８】
各実験では40匹のマウスを使用し（1グループあたり10匹、n =10；図1参照）、5 x 105個の膵臓癌細胞を移植した。mT3マウス膵臓腫瘍を有する免疫適格な同系マウスのグループを、PBS（ネガティブ対照）、PAS単剤処理（腫瘍細胞接種から0、1、2、及び3週間後に１投与あたり100μg）、免疫チェックポイント阻害剤として（最初のPASワクチン接種から0、4、8、15、及び21日後に１投与あたり150 μg）抗PD-1抗体（PD1-1抗体;Bio X cell社、ウエストレバノン、ニューハンプシャー州、USA）投与、又は、PASワクチン接種（腫瘍細胞接種から0、1、2、及び3週間後に１投与あたり100 μg）と免疫チェックポイント阻害剤（最初のPASワクチン接種から0、4、8、15、及び21日後に１投与あたり150 μg）の組み合わせで処理された。プログラム細胞死タンパク質1に特異的な免疫チェックポイント遮断抗体（PD1-1抗体；Bio X cell社、ウェストレバノン、ニューハンプシャー州、USA）を腹腔内投与した。データを以下の表3と図2にまとめる。
【０１１９】
【表３】
2020528449.tif 000005
PBS対照マウスとPD-1及びPAS100処理グループの両方のマウスからの腫瘍重量との間のグラムでの最終腫瘍重量に統計的差異はなかった。それに対し、PD-1とPAS100の組み合わせで処理したマウスは、PBS（p=0.014）及びPD-1対照（p=0.0017）と比較して、腫瘍が有意に小さかった。さらに、PD-1とPAS100の併用処理では、PAS100単独処理よりも腫瘍は有意に小さかった（p <0.05）。
【０１２０】
実施例２
CD3最終分化したT細胞亜集団におけるTEMRA CD4陰性CD8陰性細胞の解析
実施例１に記載したように、マウスに腫瘍を誘発した。Tリンパ球を、PBS、PD-1抗体、PAS100、又はPAS100＋PD-1抗体で処理したマウスから単離した脾臓末梢血単核細胞（PBCM）から単離した。様々なT細胞亜集団は、表1に記載された抗体を用いたフローサイトメトリー解析で同定した。特に、CD3陽性CD4陰性CD8陰性細胞を最初のT細胞亜集団として単離し、この亜集団からさらにCD3陽性CD4陰性CD8陰性CD44陰性CD62L陰性細胞をTEMRA細胞としての亜集団として単離した。PBS、PD-1抗体、PAS100、又はPAS100＋PD-1抗体で処理したマウスに存在するこれら様々な亜集団の割合(%)と比率を決定し、その結果を図3A及び3Bに示す。
図3Aは、PBS、PD-1抗体、PAS100、又はPAS100＋PD-1抗体で処理したマウスのCD3 陽性T細胞中のTEMRA細胞（CD3陽性CD4陰性CD8陰性CD44陰性CD62L陰性）のパーセントを示す。図3Bは、各々処理したCD3陽性CD4陰性CD8陰性細胞中のTEMRA細胞の比率を示す。
処理グループ間で最も重要な違いは、PAS100＋PD-1抗体処理ではPBS処理と比較してCD4陰性CD8陰性TEMRA細胞数は同様であったが、PAS100処理ではPBS処理よりCD4陰性CD8陰性TEMRA細胞が少なかったことである。PAS100＋PD-1抗体で処理したマウスのT細胞中のTEMRA細胞（CD3陽性CD4陰性D8陰性CD44陰性CD62L陰性）の比率は、PBS又はPAS100のみで処理したマウスの比率の2倍以上あり、これはTEMRA細胞（CD3陽性CD4陰性CD8陰性CD44陰性CD62L陰性）がガストリン関連腫瘍及び癌からの防御に相応しいことを示唆する。
【０１２１】
実施例３
PAS100によるサイトカイン活性化アッセイ
PAS100で処理されたマウスから単離された脾臓末梢血単核細胞（PBMC）からTリンパ球を単離した。これらの細胞はフローサイトメトリーで解析し、インターフェロン-γ（INFγ）、グランザイム-B（グランザイム）、パーフォリン、及び腫瘍壊死因子-α（TNFα）へのサイトカイン活性化によって実際に活性化されたT細胞であるかどうか判定した。その結果を図4A及び4Bに示す。
図4Aでは、PAS100で処理されたマウスから単離されたT細胞が実際に活性化されたことを示す。これら同じ細胞をガストリン存在下で6時間培養して再刺激すると（図4B参照）、細胞が再刺激され、より多くのサイトカインが放出されたことで、PAS100ワクチン接種がT細胞を刺激し、さらにこれらのT細胞がガストリンに特異的に反応したことが確認できた。
【０１２２】
実施例４
PAS100とPAS＋PD-1抗体の併用処理との比較
PAS100又はPAS100及びPD-1抗体の組み合わせで処理されたマウスから単離された脾臓PBMCからTリンパ球を単離した。細胞をフローサイトメトリーで解析し、インターフェロン-γ（INFγ）、グランザイム-B（グランザイム）、パーフォリン、腫瘍壊死因子-α（TNFα）へのサイトカイン活性化によって実際に活性化されたT細胞であるかどうか判定した。結果を図5A及び5Bに示す。
PAS100のみで処理したマウスの活性化Tリンパ球は、PBS処理マウスのリンパ球と比較してサイトカイン放出を増大させた（図5A参照）。しかし、併用処理マウスのリンパ球は著しく多くのサイトカインを放出した（図5B参照）ことから、併用処理は活性化T細胞をより刺激することを示唆した。特にTNFαは、PAS100単独処理と比較して、PAS100＋PD-1抗体の併用処理で2倍以上に増加した（図5Aと5Bを比較されたい）。
【０１２３】
実施例５
線維症に対するPD-1抗体単独処理、PAS100単独処理、PD-1抗体＋PAS100併用処理による効果の解析
PBS、PD-1抗体のみ、PAS100、又はPAS100＋PD-1抗体で処理したマウスの腫瘍を4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、8μm厚切片を作成しスライドに固定した。組織切片は、線維症を観察するためマッソンの三重染色法で染色した。
マッソンの三重染色で染色された代表的な切片を図6Aに示す。線維症の定量的スコアは、ImageJ画像処理及び分析ソフトウェアを用いたコンピュータープログラムで解析し、図6Bにその結果を示す。注目すべきは、PD-1抗体単独処理及びPAS100単独処理された腫瘍の輝度の総和はネガティブ対照PBS処理とはわずかに異なっていたが、PAS＋PD-1抗体併用処理は密度の低下（従って線維症）をもたらし、PBS単独（p <0.005）及びPAS100単独（p <0.001）と比較して統計的に有意であった。
【０１２４】
実施例６
CD8陽性T細胞浸潤に対するPD-1抗体単独処理、PAS100単独処理、及びPD-1抗体＋PAS100併用処理による効果の解析
腫瘍は4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、8μm厚切片を作成しスライドに固定した。CD8陽性リンパ球は、CD8抗体（1:75力価；EBIOCIENCE社、サンディエゴ、カリフォルニア州、USA）で腫瘍微小環境を染色し、CD8陽性細胞は盲検式に手動でカウントした。図7A及び7Bにその結果を示す。
図7A及び7Bに示すように、CD8陽性腫瘍浸潤リンパ球（TIL）はPAS100単独及びPD-1抗体単独で増加したが、その併用処理では著しく増加した。PAS100＋PD-1抗体の組み合せでは、CD8陽性細胞数は、PD-1抗体単独（p=0.042）よりも有意に多く、PAS100単独（p=0.039）よりも多かった。
【０１２５】
実施例７
Foxp3陽性Tregs細胞浸潤に対するPD-1抗体単独処理、PAS100単独処理、及びPD-1抗体＋PAS100併用処理の効果の解析
腫瘍を4％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィン包埋し、8μm厚切片を作成してスライドに固定した。腫瘍は抗Foxp3抗体（1:30力価;EBIOSCIENCE(TR)）と反応させ、免疫染色された細胞はImageJソフトウェアを用いて手動でカウントした。その結果を図8A及び8Bに示す。
図8Aに、Tregs細胞のマーカーであるFoxp3タンパク質に結合する抗体で染色された例示的なmT3腫瘍を示す。PBS（左上パネル）、PD-1抗体単剤処理（右上パネル）、又はPAS100単剤処理（左下パネル）と比較して、PAS100とPD-1の併用療法により、腫瘍内Tregs細胞の存在の減少をもたらす。これはPAS100＋PD-1抗体併用処理が、腫瘍内微小環境を、いずれかの単独処理と比較して、Tregs細胞を介した免疫抑制が低下することを特徴づけられる程度まで腫瘍内環境を変更しうることを示唆する。
図8Bは、図8Aで例示したデータをまとめた棒グラフである。PBSと比較して、PD-1抗体単独処理又はPAS100単独処理された腫瘍のFoxp3陽性細胞数に有意な違いはなかった。PAS100＋PD-1抗体併用処理された腫瘍は、ネガティブ対照よりもFoxp3陽性細胞が有意に少なかった。
【０１２６】
参考文献
すべての特許、特許出願及びその出版物、科学雑誌記事、及びデータベースエントリ（GENBANK(R)バイオシーケンスデータベースエントリを含むが、これらに限定されず、利用可能なすべての注釈を含む）を含むがこれらに限定されない、本明細書にリストされるすべての参考文献は、それらが本明細書で使用される方法論、技術、及び/又は組成物を補足、説明、背景提供、及び/又は教示する程度において、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。これら参考文献の説明は、その著者が行った主張を要約することのみを目的としている。参考文献（又はその一部）が関連する先行技術であることを認めるものではない。出願人は、引用された参考文献の正確性と適切性に挑戦する権利を留保する。
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本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の様々な詳細点を変更できることは理解されたい。さらに、上記本明細書の記載は、例示のみを目的とするものであり、本発明を限定することを目的とするものではない。
【０１２７】
【図１】
2020528449.tif 000006
【図２】
2020528449.tif 000007
【図３Ａ】
2020528449.tif 000008
【図３Ｂ】
2020528449.tif 000009
【図４】
2020528449.tif 000010
【図５】
2020528449.tif 000011
【図６Ａ】
2020528449.tif 000012
【図６Ｂ】
2020528449.tif 000013
【図７Ａ】
2020528449.tif 000014
【図７Ｂ】
2020528449.tif 000015
【図８Ａ】
2020528449.tif 000016
【図８Ｂ】
2020528449.tif 000017
【配列表】
2020528449000001.app
【国際調査報告】
2020528449.tif 000018
2020528449.tif 000019
2020528449.tif 000020