(57)【要約】本発明は、非サル細胞、通常はブタ細胞であり、ブタＣＤ１６３受容体を発現するような細胞で、常に培養、維持、及び／または弱毒化されている欧州型ＰＲＲＳ改変生ウイルス（組換えの有無は問わない）であって、それによって、そのようなウイルスから調製されたワクチンが安全かつ有効であり、通常は生後１日という早期にブタへの離乳前の単回投与ワクチン接種が可能になるものを提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ブタ動物をＰＲＲＳウイルスによる感染から防御するためのワクチンであって、前記ワクチンは、（ａ）配列番号５のポリヌクレオチド分子、もしくは高度にストリンジェントな条件下、すなわち、６５℃で、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４．７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中にて、フィルター結合したＤＮＡとハイブリダイズさせ、６８℃で、０．１倍ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄することで、それとハイブリダイズされる任意のポリヌクレオチドによってコードされる欧州型ＰＲＲＳウイルス；（ｂ）前記コードするポリヌクレオチド分子；（ｃ）プラスミド形態である前記ポリヌクレオチド分子；または（ｄ）前記ポリヌクレオチド分子を含むウイルスベクターを、
感染に対して免疫防御を生じさせる有効量で含み、さらに獣医学的用途に適した担体を含んでおり、早ければ子ブタが生後１日齢以下であるときに早期かつ安全なワクチン接種を提供し、最大６か月の免疫持続期間をもたらす、前記ワクチン。
【請求項２】
前記ワクチンが、約８〜１２時間齢の子ブタに投与された場合に感染からの防御をもたらす、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
免疫の開始がワクチン接種後２週間で始まる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
免疫の開始がワクチン接種後２４〜２８日で始まる、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
ブタ動物に欧州型ＰＲＲＳウイルスによる感染に対するワクチン接種をする方法であって、生後約１２時間〜３週齢の離乳前の前記動物に前記ワクチンを投与することを含み、前記ワクチンは、
（ａ）欧州型ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離ポリヌクレオチド分子、
（ｂ）欧州型ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子、
（ｃ）プラスミド形態である前記ポリヌクレオチド分子（ａ）、
（ｄ）感染性ＲＮＡ分子（ｂ）を含むウイルスベクター、または
（ｅ）欧州型ＰＲＲＳウイルス
を含み、前記ワクチンウイルスが、前記ワクチンウイルスをブタ動物に投与する前に、ブタ細胞、またはブタＣＤ１６３受容体を発現するブタ以外の哺乳動物細胞で増殖するように適合されている、前記方法。
【請求項６】
防御免疫がワクチン接種後約２８日以内に生じる、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
提供される防御免疫の期間が最大６か月である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、性別を問わない全年齢のブタを、豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスの欧州株から防御するワクチンを提供する。本発明は特に、生後間もなく（すなわち、わずか約１日齢以下）から３週齢を含む、離乳前の子ブタへの安全で早期なワクチン接種に対応するものであり、いつでも必要に応じて、多価混合ブタワクチン、例えば２価のＰＲＲＳＶ／Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（Ｍ．ｈｙｏ）ワクチン、２価のＰＲＲＳＶ／ブタシルコウイルス２型（ＰＣＶ２）ワクチン、及び３価のＰＲＲＳＶ／Ｍ．ｈｙｏ／ＰＣＶ２ワクチンとの組み合わせ、または単に１価ＰＲＲＳＶワクチンとして接種され、ＰＲＲＳワクチンの成分は一般に、対応するその遺伝子型（及び当該遺伝子型の亜種）が、西欧、地中海地域、スカンジナビア地域、ならびにロシア、トルコ、及びウクライナなどの東欧のいずれをも含む欧州大陸において循環が確認されているものである。
【０００２】
本発明は、改変された生の形態で、ワクチンとして最若年の動物に与えた場合でも著しく安全かつ有効であり、極めて長期間の免疫を与える新規クラスの弱毒化欧州型ＰＲＲＳ株を広く対象とする。
【背景技術】
【０００３】
豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）は、雌ブタ及び未経産ブタにおける流産、死産、及び他の繁殖上の問題、ならびに若いブタにおける呼吸器疾患を特徴とする。その病原体は、アルテリウイルス科ニドウイルス目のメンバーであるＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）である。ニドウイルスは、一本鎖のプラス極性ＲＮＡからなるゲノムを有するエンベロープウイルスである。プラス鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡは、遺伝子情報の保存と発現両方の二役を果たす。ニドウイルスの複製または転写にＤＮＡは関与しない。非構造タンパク質は、ニドウイルスのゲノムＲＮＡから大きいポリタンパク質として直接翻訳された後、ウイルスプロテアーゼによって個別の機能タンパク質に切断される。サブゲノムＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の３’共通末端の入れ子セットが、ゲノムから合成され、構造タンパク質を翻訳するためのメッセンジャーＲＮＡとして使用される。したがって、ニドウイルスのゲノムＲＮＡの複製は、ゲノム複製とｓｇＲＮＡ合成が複合された過程である。
【０００４】
１９８０年代後半、このウイルスの２つの異なった遺伝子型が、一方は北米で、他方は欧州で、ほぼ同時に出現した。ＰＲＲＳウイルスは、今やほぼすべての養豚国家において風土性となっており、全世界の養豚産業に影響が及ぶ最も経済的に重要な疾患の一つと考えられる。加えて、中国及び周辺国で強毒性の遺伝子型が単離されており、このような遺伝子型は一般に北米型遺伝子型と近縁である。
【０００５】
ＰＲＲＳＶの生物学の理解が著しく進歩しているにもかかわらず、ウイルスの制御は依然として困難である。この分野では動物のワクチン接種が、ほとんど無効であることが証明されている。ＰＲＲＳは通常、免疫化された群れに再出現し、ほとんどの農場でのＰＲＲＳＶワクチン接種活動は、最終的に疾病の制御に失敗している。
【０００６】
理論に束縛されるものではないが、野生型ＰＲＲＳＶによるブタの感染、またはこの病原体の生の弱毒化形態によるワクチン接種は、残念ながら非中和抗体の過剰増殖性の産生を誘発するだけである。この時間間隔の間は、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）−γ分泌細胞が限られた量しか産生されない。したがって、ＰＲＲＳＶは、恒常的に豊富な体液性（抗体による）免疫によって識別される不均衡な免疫反応、及び可変的かつ限定的ではあるが、潜在的に防御性のＴヘルパー（Ｔｈ）１様ＩＦＮ−γ反応を、本質的に刺激すると思われる。獲得免疫の不均衡な発生に寄与する可能性が最も高いＰＲＲＳＶ感染の一つの特徴は、十分な自然免疫反応の欠如である。通常、ウイルスに感染した細胞は、Ｉ型インターフェロン「ＩＦＮ」（ＩＦＮ−α及びＩＦＮ−βを含む）を分泌し、それによって隣接細胞を感染から保護する。さらに、放出されたＩ型ＩＦＮが、ナイーブＴ細胞のサブセットと相互作用して、自身のウイルス特異的ＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ−γ）分泌細胞への転換を促進する。対照的に、ＰＲＲＳＶに曝露したブタにはＩＦＮ−α反応はほとんど存在しない。ＩＦＮ−αは、ＩＦＮ−γ遺伝子の発現を上方制御するため、病原体によってＩＦＮ−α産生の刺激がそのように非効率になると、宿主の獲得免疫反応の性質に重大な影響を及ぼすと予測される。したがって、サイトカインＩＦＮ−αは、獲得免疫の発生を促進する主要な経路、すなわちＴ細胞介在性のＩＦＮ−γ反応及び抗ウイルス免疫防御のピークを制御している可能性が高い。
【０００７】
これに関して、ウイルス感染時の自然免疫と獲得免疫とに推定される関係が、特殊な型の樹状細胞によって起こることが明らかになった。この樹状細胞は、大量のＩ型インターフェロンを産生する能力を有し、Ｔ細胞機能の分化において重要な役割を果たす。具体的には、稀ではあるが注目すべき樹状細胞型であるこの形質細胞様樹状細胞（ＰＤＣ）は、天然のＩＦＮ−α／β産生細胞としても知られ、ナイーブＴ細胞をＩＦＮ−γ分泌細胞へと分化させる能力によって抗ウイルス免疫に重要な役割を果たす。稀ではあるが、ＰＤＣは、ＩＦＮ−αの非常に強力な産生源であり、ウイルスに反応して細胞あたり３〜１０ｐｇのＩＦＮ−αを産生することが可能である。対照的に、単球が産生するＩＦＮ−αは１細胞単位あたり５分の１〜１０分の１である。ブタＰＤＣの表現型及びいくつかの生物学的特性が記載されている（Ｓｕｍｍｅｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１０：４４０）。最近の研究では、ＰＲＲＳＶが、ＩＦＮ−αを分泌させるブタＰＤＣを刺激しないことが解明されている（Ｃａｌｚａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １３５：２０）。
【０００８】
この事実は、ワクチン接種時に外因的に加えられたＩＦＮ−αが、ＰＲＲＳＶ特異的ＩＦＮ−γ反応の強度を改善することを見出した観測結果（Ｗ．Ａ．Ｍｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈ．１０２，ｐｐ  ２９９−３１４，２００４）と合わせ、このウイルスによるブタの感染時にＩＦＮ−αが果たす重要な役割を強調するものである。防御免疫の発生にＩＦＮ−αが果たす重要な役割の明白性を考慮すれば、ＩＦＮ−αの産生を刺激及び／または阻害する種々のＰＲＲＳウイルス株の能力を解明することは重要である。その結果、ＰＲＲＳに対する防御性をもつ新規の及び改善された改変生ワクチンの必要性が高まっている。
【０００９】
欧州型ＰＲＲＳは一般に「１型」と呼ばれ、遠縁である北米型すなわち「２型」ＰＲＲＳとは区別される。２つの型は、全ヌクレオチドレベルで約６０％しか同一性がない。初めて明確に定義された欧州型ＰＲＲＳＶ分離株は、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔらによってレリスタッド作用物質として開示された（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｉｓｏｌａｔｅ  １１０２、ならびに米国特許第５，６２０，６９１号及び第６，１９７，３１０号ならびにそれらの国際特許を参照のこと）。欧州型ＰＲＲＳの種々の亜型（本発明のすべての態様において、そのすべてから防御することができる）は、Ｍ．Ｐ．Ｍｕｒｔａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ  １５４，ｐｐ．１８−３０，２０１０；及びＭ．Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ  １５４  ｐｐ．７−１７，２０１０にさらに詳述されている。初期の北米型ＰＲＲＳ分離株は、米国特許第５，４７６，７７８号及び同第５，８４０，５６３号に開示されている。
【００１０】
本発明者らは、最若年の動物に与えたときの安全性及び有効性の両方が証明され、かつ、他の多くの現在利用可能なＰＲＲＳワクチンとは異なり、上述したような動物の免疫応答機構の多くの側面を無効化しないことにより、さらに安全性及び有効性に寄与する、弱毒化形態の欧州型ＰＲＲＳ株を提供できることを発見した。当技術分野では周知されているが、ＰＲＲＳウイルスの培養は非常に困難であることが証明されている。歴史的に、市販のＰＲＲＳＶ改変生ワクチンの増殖及び弱毒化には、ほとんどサル腎臓細胞株ＭＡ−１０４及びその誘導体のみが使用されてきたが、なぜそのような細胞がこの目的に機能的であるかは知られていなかった（米国特許第５，４７６，７７８号を参照）。
【００１１】
ＰＲＲＳウイルスが哺乳動物細胞に侵入する際に、自然界では哺乳動物細胞表面タンパク質「ＣＤ１６３」が使用されているという発見（例えば、米国特許第９，１０２，９１２号を参照）によって、新たなＰＲＲＳＶ感受性細胞株の開発が可能になった。驚くべきことに、このような新規の細胞株での弱毒化は、既存のワクチンとは異なる特性を有するワクチンウイルスを生じさせる（米国特許第９，５６６，３２４号及び米国出願公開第２０１３−０３０９２６３号を参照）。
【００１２】
その結果、驚くべきことに、（１）ブタ細胞または（２）ブタＣＤ１６３受容体を組み込んだ非ブタ細胞（米国特許第７，７５４，４６４号を参照）のいずれでの培養にも適合する欧州型ＰＲＲＳウイルスは、従来法で培養されたワクチンウイルスによって提供されるものよりもブタ動物にとって有意性のある安全かつ有効なプロファイルを保持し、さらに若年期のワクチン接種であっても防御免疫を獲得できることが発見された。したがって、サル腎臓細胞株ＭＡ−１０４（この細胞はヘモグロビン捕捉機能との関係でおそらくはサルＣＤ１６３を異常発現し、また当該サルＣＤ１６３はブタＣＤ１６３に対する同一性が約８５％のみである）での培養にＰＲＲＳを慣例的に適用すると、生物学的な妥当性が低く、最適ではない安全性／有効性プロファイルをもたらすと思われる。ブタＣＤ１６３の代表例は、米国特許第７，７５４，４６４号ならびにその関連ファミリーメンバーである米国特許第８，０５８，０５０号；同第８，４８６，６８５号；及び同第９，１０２，９１２号に記載されている（例えば、文献中の配列番号１４及び配列番号２を参照）。本発明の実施に適用可能であるこのパテントファミリーにさらに記載されているように、ＣＤ１６３ポリペプチドが、膜内に固定されるための膜貫通ドメインを有し、その表面露出ドメインを発現する限り、組換え発現細胞は全長ＣＤ１６３を発現する必要はなく、したがってＣ末端ドメインが存在しないかまたは短縮されていてもよい。
【００１３】
さらに、本発明のワクチンは宿主のインターフェロン応答を下方制御しないと予測されるが、サル細胞中での培養に適合させた（サルＣＤ１６３のみを受容体として提供する）Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶのような先行技術のワクチン（ＵＳ５，４７６，７７８及び５，８４６，８０５を参照）は一般に、宿主ＩＦＮ−α応答に対して強力な阻害効果を示す（ＵＳ９，５６６，３２４の実施例５全般、及び図４を参照）。
【００１４】
ＰＲＲＳウイルスは通常、最若年の動物に最も重篤な症状を引き起こす。したがって、わずか１日齢の子ブタに対して安全かつ有効なワクチン接種を提供できることは、例えば、若い子ブタの死亡率を低下させることによってのみならず、離乳後できるだけ早期に動物の施設間の移動を可能にすることによって、実質的に畜産産業に大きく寄与する。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、該当するブタ細胞（例えば、以下のＰＫ−９細胞の考察を参照）またはブタＣＤ１６３を発現する非ブタ細胞のいずれでも増殖するように基本ウイルスを再適合させることによって、ワクチンが概ねより安全なものになる結果、現在の欧州サル細胞によるワクチンを改善することができ、かなり若年期に頑強で永続的な免疫反応を安全に誘発することができるという認識を示す。それによって、サル細胞で調製された従来のワクチンに通常は付随する安全性及び有効性の条件（すなわち、そのようなワクチンを約３週齢以降にのみ投与するという条件）を、性能の改善によって不要にし、１日齢という早期でも有効性を達成することができる。また、それによって、ＰＲＲＳＶの型、亜型、及び株が多種多様であったとしても、本発明の方法を使用して、既存の多くのＰＲＲＳ生ワクチンの現在の適合性及び有効性を改善することもできる。
【００１６】
２型（北米型）ＰＲＲＳワクチンは、離乳前に投与したとき安全かつ有効であり得るということが、ＰＲＲＳの北米／アジア株（例えば、ＷＯ２０１３／１７３４４３、実施例９及び１０を参照）に関して、特に北米型ＰＲＲＳウイルスの「Ｐ１２９株」（例えば、文献中の配列番号６、ならびにＰＣＴ／ＩＢ２０１１／０５５００３及びＵＳ６，５００，６６２も参照）の弱毒化を参照して以前に報告されている。しかしながら、欧州型と北米型とではＰＲＲＳウイルスのヌクレオチドレベルで約６０％しか同一性がなく、動物のクラス（年齢、性別など）が異なると、見られる病状の種類に応じて、ある程度異なる方法で挙動する。
【００１７】
本明細書では、ワクチンとして優れた特性をもつ遺伝子型１型（欧州型）ＰＲＲＳＶ株を弱毒化及び選別するためのブタＣＤ１６３発現細胞株の使用について説明する。
【発明の概要】
【００１８】
第１の実施形態では、本発明は、ブタ動物においてＰＲＲＳウイルスに対する有効な免疫防御反応をワクチンとして誘発するように遺伝子改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離ポリヌクレオチド分子を提供する。ある特定の態様では、本発明は、配列番号５を含む本明細書に記載されるＤＮＡ配列を備える。以下に記載されるように、当該分離株を他の株または前駆体株と区別する種々の重要な変異をもたらす限り、配列番号５と少なくとも８０％同一である（より好ましくは配列番号５に対して８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する）コード配列もまた本発明の実施において機能的である。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態は、上述のＤＮＡポリヌクレオチドに対応し、それを発現することができるＲＮＡ配列、及びそのような発現によりアセンブルされ得る実際のウイルスを含む。本発明の実施に有用な追加の弱毒化欧州型ＰＲＲＳウイルスは、高度にストリンジェントな条件下で、配列番号５のＤＮＡ配列の相補鎖にハイブリダイズするＤＮＡ配列によってコードされるものを含む。条件には、６５℃で、０．５Ｍ  ＮａＨＰｏ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中にて、フィルター結合したＤＮＡとハイブリダイズさせ、６８℃で、０．１  ＳＳＣ／０／１％ＳＤＳで洗浄することを含む。
【００２０】
本発明の目的では、「対応する」とは、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９，ｐｐ．１０９１５−１０９１９，１９９２に記載されるようなＢＬＯＳＵＭアルゴリズムを使用して、相対配列を最適にアライメントできることを意味する。
【００２１】
ある特定の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される単離ポリヌクレオチド分子と、好適な宿主細胞内のポリヌクレオチド分子を転写することができるプロモーターとを含むプラスミドを提供する。別の実施形態では、本明細書のプラスミドの欧州型ＰＲＲＳコード配列はさらに、１つ以上の検出可能な異種抗原エピトープをコードする。本発明は、本明細書に記載されるプラスミドを含むトランスフェクト宿主細胞を提供する。
【００２２】
別の態様では、本発明は、ブタ動物をＰＲＲＳウイルスによる感染から防御するためのワクチンを提供する。ワクチンには、感染性ＲＮＡ分子によってコードされる欧州型ＰＲＲＳウイルス、この感染性ＲＮＡ分子を含んでもよく、それぞれが本明細書に記載される単離ポリヌクレオチド分子によってコードされる。さらに別の態様では、ワクチンは、本明細書のポリヌクレオチドを含むプラスミドまたはウイルスベクターを含む。本明細書に記載のワクチンは、獣医学的用途に許容されるワクチン担体を場合により含んでもよい。重要な一態様では、ワクチンは、野生型欧州型ウイルス及び他の利用可能なワクチンと比較して減少したインターフェロンα阻害効果を有する。
【００２３】
一実施形態では、本発明は、ＰＲＲＳウイルスの野外株に自然感染したブタ動物と、本明細書に記載の改変生ワクチンをワクチン接種したブタ動物とを区別するポリヌクレオチド分子を含む診断キット（いわゆるＤＩＶＡ試験）を提供する。
【００２４】
他の実施形態では、本発明は、ブタ動物をＰＲＲＳウイルス株による感染から防御する方法であって、本明細書に記載の請求項の免疫原性防御量のワクチンを動物に投与することを含む方法を提供する。
【００２５】
本発明はまた、好適な宿主細胞に直接トランスフェクトし、そのようにトランスフェクトされた好適な宿主細胞から豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）を発現させることができるプラスミドであって、（ａ）ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列、及び（ｂ）当該感染性ＲＮＡ分子を転写することができるプロモーターを含むプラスミドを提供する。
【００２６】
さらに好ましい実施形態では、当該プラスミドは、標的真核細胞でのＤＮＡの駆動を可能にすることができる真核生物プロモーター、またはプラスミドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を誘導することができる原核生物もしくはファージプロモーターといったプロモーターを含む。本発明は同様に、ＰＲＲＳウイルスを産生する方法であって、好適な宿主細胞に適切なプラスミドをトランスフェクトし、そのトランスフェクト細胞によって産生されるＰＲＲＳウイルスを得ることを含む方法を提供する。
【００２７】
本発明はまた、ポリヌクレオチド分子をトランスフェクトされた宿主細胞を提供し、ブタ動物をＰＲＲＳウイルスによる感染から防御するためのワクチンを提供する。そのワクチンは、（ａ）上述のようなポリヌクレオチド分子によりコードされる遺伝子改変欧州型ＰＲＲＳウイルス、または（ｂ）当該感染性分子、または（ｃ）プラスミド形態である当該ポリヌクレオチド分子、または（ｄ）当該ポリヌクレオチド分子を含むウイルスベクターであり、ＰＲＲＳウイルスが、感染に対して免疫防御を生じさせる有効量で、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する有効な免疫防御反応を誘発できるもの、及び獣医学的用途に適した担体を含む。
【００２８】
特に、本発明は、欧州型豚繁殖・呼吸障害症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスを産生するための方法を含み、その方法には、
（ａ）（１）欧州型ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列であって、当該コードＤＮＡ配列は配列番号５であるか、または配列番号５と少なくとも８５％同一であるコードＤＮＡ配列、及び（２）当該好適な宿主細胞において当該感染性ＲＮＡ分子をコードする当該ＤＮＡ配列の転写を誘導することができるプロモーターを含む、プラスミド；ならびに
（ｂ）感染性ＰＲＲＳ  ＲＮＡ分子であって、欧州型ＰＲＲＳウイルスをコードする当該感染性ＰＲＲＳ  ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により産生され、プラスミドの当該コードＤＮＡ配列は配列番号５であるか、または配列番号５と少なくとも８５％同一であるコードＤＮＡ配列である、感染性ＰＲＲＳ  ＲＮＡ分子からなる群から選択され、
（ａ）及び（ｂ）の場合に、配列番号５と少なくとも８５％同一であり、参照配列と比較して１つ以上の特有の変異を含んでいるコード配列が使用される組成物を好適な真核宿主細胞にトランスフェクトすることを含む。
【００２９】
好ましい例では、防御的かつ安全なワクチン接種を、生後８〜１６時間などの１日齢未満から、子ブタが約２〜３週齢の任意の時点で離乳される場合があることを考慮して、２週齢または３週齢までの子ブタ（性別問わず）に単回投与で提供することができる。したがって、本発明は一般に単回投与による早期ワクチン接種に適用可能であり、これは生後１日目（誕生から２４時間齢まで）、同様に２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、１〜１０日目、１〜１４日目、及び１〜２１日目のいずれかの時点、すなわち簡潔には概算の離乳日より早く行われるワクチン接種を意味する。場合により２回以上の投与を利用してもよい。
【００３０】
そのような条件下での豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（ＰＲＲＳＶ）に対する早期ワクチン接種（通常は筋肉内または鼻腔内経路による）により、例えば約１〜８週齢まで、またはワクチン接種後約２〜６週間；及び一般的にワクチン接種後約２８日までに防御免疫の早期開始も可能にする。
【００３１】
本発明の実施によるワクチン接種は通常、約２３〜２８週、通常は少なくとも約２６週である免疫持続期間（これは市販ブタの全予想寿命である）を子ブタにもたらす。したがって、本発明によって、最も感染しやすく最も取り扱いがしやすい時期に子ブタを防御するワクチンプログラムが可能になる。そのようなワクチン接種はまた、離乳子ブタを雌ブタから離す時期に合わせた免疫の開始を可能にし、さらにＰＲＲＳＶによるさらなる感染リスクが存在する可能性がある他の施設に輸送できるようにする。本発明のワクチンはまた、雄ブタ；ならびに雌ブタ及び未経産ブタの防御、ひいては間接的に後代の子孫の防御にも極めて有効である。好ましくは筋肉内及び鼻腔内ワクチン接種が企図されるが、他の経路にも適用可能である。
【００３２】
本発明のさらなる例では、あまり好ましくはないが、欧州型ＰＲＲＳウイルスが培養される（そしてそれによりブタ動物での感染及び増殖に予め適合する）組換え細胞によって発現されるＣＤ１６３ポリペプチドは、ブタＣＤ１６３ではないが、ブタ配列に比較的近い、例えばＵＳ７，７５４，４６４の配列番号２または１４と少なくとも９０％同一であるようなアミノ酸配列を有する哺乳動物ＣＤ１６３である。より好ましくは、このアミノ酸同一性は、９２％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％である。
【００３３】
本発明はまた、ＰＲＲＳウイルスの野外株に自然感染したブタ動物と、本発明のワクチンをワクチン接種したブタ動物とを区別するポリヌクレオチド分子を含む診断キットを提供する。その場合のワクチン（ウイルス）は、野生型と比較して減少したインターフェロンα阻害効果を示すことが好ましい。
【００３４】
本発明はさらに、欧州型（ベルギー）ＰＲＲＳＶ分離株９６Ｖ１９８に由来するＰＲＲＳＶの代表的な全ゲノム配列を提供する。分離株９６Ｖ１９８自体は、１９９６年にベルギーのゲント大学Ｈａｎｓ  Ｎａｕｗｙｎｃｋ教授により、呼吸障害徴候のある若いブタの肺から得られた（したがって、継代０は、感染したブタの血清から回収された（配列番号１））。
【００３５】
継代１（配列番号２）は、初代ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）での単回継代の結果である。以降の継代はすべてＢＨＫ２１−Ｃ１２−２６細胞株で行った。継代９（配列番号３）は、３回の限界希釈によるウイルスの生物学的クローニングの直前である。継代１４（配列番号４）はクローン１である（試験され評価された６つのクローン）。クローン１は、継代４４でマスターシードウイルスになるまで持続し、ＭＳＶ＋５継代は継代４９でＳｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶ産物になった（配列番号５）。すべてのゲノムは１５，０９２ｎｔ長である。ゲノムはすべて互いに少なくとも９９．５％同一であり、レリスタッドウイルスと約９２％同一である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】図１は、Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶ産物の継代４９分離株である全長ヌクレオチド配列（１５，０９２塩基）、配列番号５を示す。
【図１Ｂ】図１は、Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶ産物の継代４９分離株である全長ヌクレオチド配列（１５，０９２塩基）、配列番号５を示す。
【図１Ｃ】図１は、Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶ産物の継代４９分離株である全長ヌクレオチド配列（１５，０９２塩基）、配列番号５を示す。
【図１Ｄ】図１は、Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶ産物の継代４９分離株である全長ヌクレオチド配列（１５，０９２塩基）、配列番号５を示す。
【図１Ｅ】図１は、Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶ産物の継代４９分離株である全長ヌクレオチド配列（１５，０９２塩基）、配列番号５を示す。
【図１Ｆ】図１は、Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶ産物の継代４９分離株である全長ヌクレオチド配列（１５，０９２塩基）、配列番号５を示す。
【図１Ｇ】図１は、Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶ産物の継代４９分離株である全長ヌクレオチド配列（１５，０９２塩基）、配列番号５を示す。
【図１Ｈ】図１は、Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶ産物の継代４９分離株である全長ヌクレオチド配列（１５，０９２塩基）、配列番号５を示す。
【図１Ｉ】図１は、Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶ産物の継代４９分離株である全長ヌクレオチド配列（１５，０９２塩基）、配列番号５を示す。
【図１Ｊ】図１は、Ｓｕｖａｘｙｎ（登録商標）ＰＲＲＳ  ＭＬＶ産物の継代４９分離株である全長ヌクレオチド配列（１５，０９２塩基）、配列番号５を示す。  配列表の簡単な説明  配列番号１は、ＰＲＲＳＶ分離株９６Ｖ１９８の継代０を示す。  配列番号２は、ＰＲＲＳＶ分離株９６Ｖ１９８の継代１を示す。  配列番号３は、ＰＲＲＳＶ分離株９６Ｖ１９８の継代９を示す。  配列番号４は、ＰＲＲＳＶ分離株９６Ｖ１９８の継代１４を示す。  配列番号５は、ＰＲＲＳＶ分離株９６Ｖ１９８の継代４９を示す。  配列番号６〜８は、ＰＣＲプライマー配列を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
発明の詳細な説明
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈によって特に明示されない限り、複数の指示対象物を包含する。したがって、例えば、「方法」への言及は、本開示などを読めば当業者には明らかであろう本明細書に記載の種類の１つ以上の方法及び／または工程を含む。
【００３８】
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解されているものと同じ意味を有する。好ましい方法及び材料を後述するが、本明細書に記載するものと同様または同等であるいかなる方法及び材料も本発明の実施または試験に使用することができる。
【００３９】
本発明の実施には、特にこれに反する記載のない限り、当技術分野の範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、及び組換えＤＮＡ技術の従来法を使用し、その多くは例示を目的として以下に記載される。そのような技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照のこと。
【００４０】
「北米型ＰＲＲＳウイルス」とは、北米型ＰＲＲＳウイルス分離株と関連する遺伝的特徴をもつ、あらゆるＰＲＲＳウイルスを意味し、例えば、限定はされないが、１９９０年代初頭頃に米国で最初に単離されたＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．４：１１７−１２６を参照）；北米型ＰＲＲＳウイルス分離株ＭＮ−１ｂ（Ｋｗａｎｇ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６：２９３−２９６）；ＰＲＲＳのＱｕｅｂｅｃ  ＬＡＦ−ｅｘｐ９１株（Ｍａｒｄａｓｓｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４０：１４０５−１４１８）；及び北米型ＰＲＲＳウイルス分離株ＶＲ２３８５（Ｍｅｎｇ，Ｘ．−Ｊ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１７９５−１８０１）などがある。遺伝的特徴とは、北米型ＰＲＲＳウイルス株が共有するゲノムヌクレオチド配列類似性及びアミノ酸配列類似性を指す。アジア型ＰＲＲＳウイルス株は一般に、北米株と約８０〜９５％のヌクレオチド配列同一性が証明されており（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．、ＬａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアスイートのＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムに使用されているデフォルト値を参照）、同様に北米株は互いに約８５％〜１００％同一である。
【００４１】
「欧州型ＰＲＲＳウイルス」（ＰＲＲＳＶ−１、または正式にはＰＲＲＳＶ１型）とは、１９９１年頃に欧州で初めて単離された、ＰＲＲＳウイルスに関連する遺伝的特徴を有するＰＲＲＳウイルスのいずれかの株を指す（例えば、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｖｅｔ．Ｑ．１３：１２１−１３０，ｔｈｅ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ  ｖｉｒｕｓを参照。また米国特許第５，６２０，６９１号及び同第６，１９７，３１０号も参照）。欧州型ＰＲＲＳウイルスはまた、一般に、レリスタッド分離株に対して約８０％以上同一である全長ヌクレオチド配列を有するウイルスを指す。留意点として、ＰＲＲＳＶ−１のうち、亜型が同定されるようになり、それによってレリスタッドウイルスが亜型１のプロトタイプと称され、レナウイルス（Ｕ．Ｋａｒｎｉｙｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＭＣ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１０，Ｖｏｌ  ６，Ｎｏ．３０）が亜型３のプロトタイプと称されるようになった。この２種類のウイルスは、ほぼＰＲＲＳＶ−１の最大最新の分岐にまたがり、したがって、例えば、ＯＲＦ５を使用した場合、レリスタッド及びレナはヌクレオチドレベルで約８２．８％同一であり、全ゲノムを使用した場合レリスタッド及びレナはヌクレオチドレベルで約８０．７％同一である。アライメントの最適化は、アルゴリズムのパラメーターに応じて多少異なるが、読者は一般にＬａｓｅｒｇｅｎｅソフトウェアスイート（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．）のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムのデフォルト値を参照のこと。
【００４２】
欧州型ＰＲＲＳ株は一般に、北米株及びアジア（中国）株のいずれとも、約６０％しか同一ではない。例えば、ＯＲＦ５ヌクレオチド配列を使用した場合（全ゲノムが未知である場合に、かなり正しい全ゲノムの概算値が得られる傾向がある）、ＰＲＲＳＶ−１プロトタイプのレリスタッドウイルス及び北米プロトタイプＶＲ２３３２株はヌクレオチドレベルで約６５．０％同一である。全ゲノムヌクレオチド配列を使用した場合、プロトタイプのレリスタッドウイルスとプロトタイプのＶＲ２３３２ウイルスは、ヌクレオチドレベルで約５８．６％同一である。ここでも、引用したＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムのデフォルト値を使用している。
【００４３】
本発明の目的では、「有効な免疫防御反応」、「免疫防御」などの用語は、ワクチン接種された動物において病原体による感染から防御するように、病原体の１つ以上の抗原エピトープに誘導される免疫反応を意味する。本発明の目的では、病原体による感染からの防御には、感染の絶対的な予防のみならず、ワクチン接種を受けていない感染動物と比較した場合の、ワクチン接種された動物における、病原体による感染の程度もしくは速度の検出可能な低減、または病原体による感染から生じる疾患の重症度もしくは何らかの症状もしくは病態の検出可能な緩和を含む。病原体に以前に感染したことがない動物及び／またはワクチン接種時に病原体に感染していない動物に、有効な免疫防御反応を誘導することができる。ワクチン接種時にすでに病原体に感染している動物に、有効な免疫防御反応を誘導することもできる。
【００４４】
遺伝子改変ＰＲＲＳウイルスが、未改変の親株よりも病原性が低い場合、そのウイルスは「弱毒化されている」。疾患の重症度を決定する１つ以上のパラメーターにおいて統計的に有意な減少を示す場合、株は「病原性が低い」。そのようなパラメーターには、ウイルス血症のレベル、熱、呼吸困難の重症度、繁殖障害症状の重症度、または肺病変の数もしくは重症度などを含み得る。
【００４５】
「ＰＲＲＳウイルス複製を維持できる宿主細胞」とは、本発明のウイルスに感染したときに感染性ＰＲＲＳを産生できる細胞を意味する。そのような細胞には、ブタ肺胞マクロファージ細胞及び誘導体などの単球／マクロファージ系統のブタ細胞、ＭＡＲＣ−１４５細胞などのＭＡ−１０４サル腎臓細胞及び誘導体、ＰＲＲＳウイルスに対する受容体をコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞が含まれる（哺乳動物ＣＤ１６３表面タンパク質の正常なＰＲＲＳウイルス細胞受容体への割り当てについては米国特許第９，１０２，９１２号を参照）。用語「ＰＲＲＳウイルス複製を維持できる宿主細胞」には、生きたブタの体内の細胞も含み得る。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」とは、介在する終止コドンのない、特定のＰＲＲＳウイルスタンパク質をコードするのに必要とされる最小ヌクレオチド配列を意味する。
【００４７】
「ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）」及び「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」は本明細書で同義に使用され、例えばブタ（ｐｉｇ）などの、Ｓｕｉｄａｅ科のメンバーである任意の動物を指す。本発明のワクチン及び方法プロトコールは、あらゆる年齢の雄、または雌ブタ及び未経産ブタを含むあらゆる年齢の雌を問わず、すべてのブタに適用可能であり、そのような方法はまた、母ブタに防御を施すことによって雄及び雌の子ブタを間接的に防御することができる。本明細書で使用される場合、用語「ＰＲＲＳウイルス」は、特に明記しない限り、北米、アジア、または欧州いずれのＰＲＲＳウイルス株をも意味する。
【００４８】
「ＰＲＲＳ」は、ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）感染によって引き起こされるブタの疾患症状を包含する。そのような症状の例として、発熱、妊娠中の雌の流産、呼吸困難、肺損傷、食欲不振、及び若いブタの死が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「ＰＲＲＳを産生不能な」ＰＲＲＳウイルスとは、ブタに感染することはできるが、ブタでのＰＲＲＳ感染に通常は伴う何らかの疾患症状を引き起こさないウイルスを指す。
【００４９】
「トランスフェクト宿主細胞」とは、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡをトランスフェクトされたときに、少なくとも最初のラウンドのＰＲＲＳビリオンを産生することができる実質的にあらゆる宿主細胞を意味する。
【００５０】
本発明の目的では、「感染性ＤＮＡ分子」は、好適な宿主細胞から機能的ビリオンへの複製、転写、及び翻訳を維持させるのに必要な要素をコードするＤＮＡ分子である。
【００５１】
同様に、「単離ポリヌクレオチド分子」とは、該当する場合、自然界に存在する状態から、任意の検出可能な程度に精製または調節された本発明のポリヌクレオチド分子を含む組成物を指す。
【００５２】
本発明の目的では、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列（ＲＮＡまたはＤＮＡのいずれか）は、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して「相同」であるか、または当該第１のポリヌクレオチド分子に対して「同一性」を有し、ここで、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、遺伝コードの縮重に基づくとき、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列と同じポリアミノ酸をコードするか、または本発明を実施するのに有用であるように、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列によってコードされるポリアミノ酸と十分に類似するポリアミノ酸をコードする。相同なポリヌクレオチド配列とはまた、センス鎖及びアンチセンス鎖を指し、すべての場合において、そのような鎖のいずれかの相補鎖を指す。本発明の目的では、ポリヌクレオチド分子は本発明を実施するのに有用であり、したがって相同であるか、または同一性を有しており、感染したブタの体液または組織試料中のＰＲＲＳウイルスまたはウイルスポリヌクレオチドの存在を、例えば、標準的なハイブリダイゼーションまたは増幅技術によって検出するための診断プローブとして使用することができる。一般に、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、ＢＬＡＳＴＮアルゴリズム（米国国立衛生研究所の国立生物工学情報センター、別称ＮＣＢＩ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ））に基づいて第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列に対して少なくとも約７０％のヌクレオチド配列同一性を有する場合、第１のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列と相同である。本発明の実施による計算の具体例では、ＢＬＡＳＴＰ２．２．６［Ｔａｔｕｓｏｖａ  ＴＡ  ａｎｄ  ＴＬ  Ｍａｄｄｅｎ，“ＢＬＡＳＴ  ２  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ−ａ  ｎｅｗ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｃｏｍｐａｒｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．”（１９９９）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０］を参照している。簡潔には、２つのアミノ酸配列をアライメントして、ギャップ開始ペナルティ１０、ギャップ伸張ペナルティ０．１、及びＨｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆの「ｂｌｏｓｕｍ６２」スコアリングマトリックス（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９．１９９２）を用いて、アライメントスコアを最適化する。さらに同一性パーセントは、次のように算出する：同一性マッチの総数×１００／長い方の配列長さ＋２つの配列をアライメントするために長い方の配列に導入されたギャップ数で除算。
【００５３】
好ましくは、相同なヌクレオチド配列は、少なくとも約７５％のヌクレオチド配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％のヌクレオチド配列同一性を有する。遺伝コードは縮重しているので、相同なヌクレオチド配列は任意の数の「サイレント」塩基変化、すなわち置換されても同じアミノ酸をコードするヌクレオチド置換を含み得る。
【００５４】
相同なヌクレオチド配列は、その配列が第１のヌクレオチド配列によってコードされるポリアミノ酸と少なくとも約７０％同一であるか、またはそれ以外の方法で本発明の実施に有用である限り、コードされるポリアミノ酸にアミノ酸の相違をもたらす非サイレント変異、すなわち塩基の置換、欠失、または付加をさらに含んでもよい。
【００５５】
これに関して、全体的なタンパク質機能を不活化しないと通常は認識される、特定の保存的なアミノ酸置換がなされてもよく、例えば、正荷電アミノ酸、リジン、アルギニン、及びヒスチジン（またその逆も同様）に関するもの；負荷電アミノ酸、アスパラギン酸及びグルタミン酸（またその逆も同様）に関するもの；ならびに中性荷電アミノ酸の特定の群、（１）アラニン及びセリン、（２）アスパラギン、グルタミン、及びヒスチジン、（３）システイン及びセリン、（４）グリシン及びプロリン、（５）イソロイシン、ロイシン、及びバリン、（６）メチオニン、ロイシン、及びイソロイシン、（７）フェニルアラニン、メチオニン、ロイシン、及びチロシン、（８）セリン及びスレオニン、（９）トリプトファン及びチロシン、（１０）ならびに例えば、チロシン、トリプトファン及びフェニルアラニン（またすべての場合において、ここでもその逆も同様）に関するものである。アミノ酸は、物理的性質ならびに２次及び３次タンパク質構造への寄与に従って分類することができる。保存的置換は、当技術分野において、あるアミノ酸の、類似する特性を有する別のアミノ酸への置換であると理解されている。例示的な保存的置換は、１９９７年３月１３日公開のＷＯ９７／０９４３３、ページ１０（１９９６年９月６日出願ＰＣＴ／ＧＢ９６／０２１９７）で参照することができる。あるいは、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ：ＮＹ（１９７５），ｐｐ．７１−７７）に記載されるように保存的アミノ酸を分類することができる。その他の好適な保存的変更及びその適用を以下に記載する。
【００５６】
相同なヌクレオチド配列は、例えば上記のＢＬＡＳＴＮを使用してヌクレオチド配列を比較することにより決定することができる。あるいは、相同なヌクレオチド配列は、選択された条件下でのハイブリダイゼーションによって決定することができる。例えば、第２のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列は、中度にストリンジェントな条件下、例えば、６５℃で、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中にて、フィルター結合したＤＮＡとハイブリダイズさせ、４２℃で、０．２倍ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄する（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  ｅｄｉｔｏｒｓ，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９４，ｐｐ．６．０．３〜６．４．１０を参照）、またはそれ以外の以下に規定するようなＰＲＲＳウイルスをコードする配列のハイブリダイゼーションを生じさせる条件下で、配列番号５の相補鎖にハイブリダイズする場合、配列番号５（または任意の他の特定のポリヌクレオチド配列）と相同である。ハイブリダイゼーション条件の変更は、プローブのグアノシン／シトシン（ＧＣ）塩基対形成の長さ及び比率に基づいて実験的に決定するかまたは正確に計算することができる。ハイブリダイゼーション条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｅｄｓ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９），ｐｐ．９．４７〜９．５１に記載されるように算出することができる。
【００５７】
別の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、高度にストリンジェントな条件下、例えば、６５℃で、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中にて、フィルター結合したＤＮＡとハイブリダイズさせ、６８℃で、０．１倍ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄すると（Ａｕｓｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９）、配列番号５の相補鎖にハイブリダイズする場合、配列番号５（または任意の他の本発明の配列）と相同である。
【００５８】
さらに、本発明の単離ポリヌクレオチド分子及び単離ＲＮＡ分子には、合成分子、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏクローニング及び転写などによる組換え技術によって得られた分子のいずれをも含むものと理解される。
【００５９】
ポリヌクレオチド分子は、当技術分野で知られているように、部位特異的変異誘発によるもの、または化学的変異原もしくは放射線への曝露などによるランダム変異誘発によるものを含む、当業者に公知の組換え技術を用いて遺伝子変異されていてもよい。変異は、当技術分野で公知の標準的な方法、例えば、記載されているような感染性コピー（例えば、Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．，１９９８，４４０：１９９−２０６）の部位特異的変異誘発（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照）によって施すことができる。
【００６０】
離乳前の子ブタに投与したときに安全かつ有効である好ましい欧州型ＰＲＲＳウイルス配列の提供に関連して、修飾され得るアミノ酸位置には以下が含まれる。これらの特異的変異を特定する際には、当然ながら、こうした好ましいアミノ酸残基に対して、直前に定義したような保存的置換を使用してもよいことに留意されたい。好ましいコードされるアミノ酸を特定する際には、９６Ｖ１９８株の野生型分離株の対応する／元のアミノ酸も括弧内に示されているので、それによって継代０（配列番号１）を継代４９（好ましいワクチン材料、配列番号５）と比較する。したがって、ＯＲＦ１ａからコードされるアミノ酸配列では、アミノ酸位置１９のＳ（Ｎ）；アミノ酸位置２４のＹ（Ｆ）；アミノ酸位置１５６のＡ（Ｔ）；アミノ酸位置１５７のＹ（Ｈ）；アミノ酸位置２６８のＤ（Ｎ）；アミノ酸位置２９４のＨ（Ｙ）；アミノ酸位置４１６のＹ（Ｃ）；アミノ酸位置７４２のＳ（Ｐ）；アミノ酸位置８８４のＬ（Ｆ）；アミノ酸位置９０８のＰ（Ｓ）；アミノ酸位置９１６のＫ（Ｅ）；アミノ酸位置９７７のＫ（Ｅ）；アミノ酸位置１１３８のＳ（Ｐ）；アミノ酸位置１１６０のＦ（Ｌ）；アミノ酸位置１５００のＳ（Ｐ）；アミノ酸位置２０９４のＲ（Ｑ）；アミノ酸位置２２５４のＰ（Ｓ）；及びアミノ酸位置２２９０のＬ（Ｆ）である。ＯＲＦ１ｂからコードされるアミノ酸配列では、アミノ酸位置５６７のＳ（Ｎ）；及びアミノ酸位置９１２のＨ（Ｑ）である。ＯＲＦ２ａからコードされるアミノ酸配列では、アミノ酸位置２２のＬ（Ｓ）；アミノ酸位置８８のＦ（Ｖ）；アミノ酸位置９４のＭ（Ｉ）；及びアミノ酸位置９５のＦ（Ｌ）である。ＯＲＦ２ｂからコードされるアミノ酸配列では、アミノ酸位置４７のＬ（Ｆ）である。ＯＲＦ３からコードされるアミノ酸配列では、アミノ酸位置５２のＳ（Ｔ）である。ＯＲＦ４からコードされるアミノ酸配列では、アミノ酸位置１５１のＴ（Ｉ）である。ＯＲＦ５からコードされるアミノ酸配列では、アミノ酸位置２０のＦ（Ｌ）；及びアミノ酸位置３７のＤ（Ｎ）である。ＯＲＦ５ａからコードされるアミノ酸配列では、アミノ酸位置１８のＶ（Ａ）；及びアミノ酸位置３５のＲ（Ｑ）である。
【００６１】
したがって、本発明はさらに、遺伝子改変された欧州型ＰＲＲＳウイルスを作製する方法であって、上記のようなＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を変異させること、及び好適な発現系を用いて遺伝子改変ＰＲＲＳウイルスを発現することを含む方法を提供する。遺伝子改変ＰＲＲＳウイルスは、当技術分野において一般に公知である、本出願に例が記載されている好適な発現系を用いて、単離ポリヌクレオチド分子から発現させることができる。例えば、単離ポリヌクレオチド分子は、以下にさらに詳細に記載されるように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの好適な宿主細胞中で、コードウイルスを発現させることができるプラスミド形態であり得る。
【００６２】
北米型ＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質配列は高度に保存されており、報告された配列は互いに約９３〜１００％の同一性を有する。北米型及び欧州型のＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質は、約５７〜５９％同一であり、共通の構造モチーフを共有している。一般に、特異的ヌクレオチドまたはコードされるアミノ酸に関して異なる番号が付されている場合があるＰＲＲＳコード配列及び分離株を比較するとき、目的とするＰＲＲＳ株の保存された特徴的なアミノ酸を特定し、それを参照株とアライメントすることによって、適切な領域の特定が容易になる。
【００６３】
組換えＤＮＡ技術には、ＤＮＡレベルで核酸を修飾することを目的とした非常に多様で強力な分子生物学技術が含まれており、分子レベルでゲノムを解析して修飾することが可能である。これに関して、ＰＲＲＳウイルスのようなウイルスは、そのゲノムサイズが比較的小さいため、このような操作に特に適している。しかしながら、非レトロウイルス系のＲＮＡウイルスは、複製時にＤＮＡの中間段階を包含しないため、組換えＤＮＡ技術を直に適用することはできない。そのようなウイルスの場合、感染性ｃＤＮＡクローンを開発した後、それらのゲノムに組換えＤＮＡ技術を適用して改変ウイルスを産生できるようにしなければならない。研究中のウイルスの全長（ゲノム長）ｃＤＮＡ（本明細書では、厳密な意味のｍＲＮＡのＤＮＡコピーに限らず、広義の意味でのＲＮＡのＤＮＡコピーに使用される）の構築によって感染性クローンを誘導することができる。その後、全長ｃＤＮＡをトランスフェクトした細胞中で感染性転写産物がｉｎ  ｖｉｖｏで合成されるが、転写カクテルの存在下で原核生物プロモーターを有するプラスミド中での全長ｃＤＮＡからのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって、または全ウイルスゲノムを含むライゲートされた部分長ｃＤＮＡ断片を使用して同じくｉｎ  ｖｉｔｒｏで感染性転写産物を得ることもできる。いずれの場合も、転写されたＲＮＡはｃＤＮＡに導入されたすべての修飾を保有しており、これを使用して、このように改変されたウイルスをさらに継代することができる。
【００６４】
欧州型ＰＲＲＳウイルス分離株またはレリスタッドウイルスの感染性クローンの調製は、米国特許第６，２６８，１９９号に記載されており、参照により全体が本明細書に組み込まれる。Ｐ１２９と命名された北米型ＰＲＲＳウイルス分離株の感染性ｃＤＮＡクローンの調製（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｙｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）は、米国特許第６，５００，６６２号に記載されており、参照により全体が本明細書に組み込まれる。Ｐ１２９のｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ４９４０４２及び米国特許第６，５００，６６２号に開示されている。以下の本発明者らの研究は、プラスミドに関連してＣＭＶ最初期プロモーターによって発現され、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９と命名された、米国特許第６，５００，６６２号にも開示されている、そのような感染性クローンを利用している。米国特許第６，５００，６６２号に記載されているように、本明細書での使用に適した他のプラスミド及びプロモーターがある。
【００６５】
対象となる任意のオープンリーディングフレームの完全な配列及び対象となるアミノ酸残基の位置が与えられれば、望ましい特定の位置に変更を設計する際に、当業者は単にコドン表を調べるだけでよい。
【００６６】
コドンは、ｍＲＮＡ及びその対応するｃＤＮＡ分子のヌクレオチドのトリプレット配列を構成する。コドンは、ｍＲＮＡ分子に存在するときには塩基ウラシル（Ｕ）、ＤＮＡに存在するときには塩基チミジン（Ｔ）を特徴とする。ポリヌクレオチド内の同じアミノ酸残基に対するコドンが変化するだけでは、コードされるポリペプチドの配列または構造は変化しない。特定の３つのヌクレオチド配列が任意の特定のアミノ酸を「コードする」ことを示す語句がある場合、当業者であれば、上記の表が、問題の特定のヌクレオチドを特定する手段となることを理解していることは明らかである。例として、特定の３つのヌクレオチド配列がリジンをコードする場合、上記の表から、２つの可能性のあるトリプレット配列がＡＡＡ及びＡＡＧであることが明らかである。グリシンはＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＴ（ＲＮＡの場合はＧＧＵ）、及びＧＧＧによってコードされる。コードタンパク質内のリジン残基をグリシン残基に変更するには、コードする核酸内のＡＡＡまたはＡＡＧトリプレットをＧＧＡ及びＧＧＣ、ＧＧＴまたはＧＧＧのいずれかで置換するとよい。
【００６７】
ＰＲＲＳウイルスの免疫生物学に関する研究は、ＰＲＲＳウイルスとＰＤＣとの相互作用が考察に値することを示唆している。この細胞型は、ヒト、マウス、ラット、ブタ、及びサルの末梢血単核細胞の０．２％〜０．８％を占める。その希少性にもかかわらず、この細胞は自然免疫系の重要な構成要素であり、ウイルス刺激に続いて大量のＩＦＮ−αを分泌することができる。ＰＤＣはナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、及びＴ細胞の機能を促進することから、ＰＤＣが抗ウイルス性の自然免疫及び獲得免疫の制御に重要な役割を果たすのは、ＩＦＮ−αの分泌を通してである。さらに、ＰＤＣにより分泌されるＩＦＮ−αによって、ブタ単球由来樹状細胞（ＭｏＤＣ）の成熟が促進され、その結果、ＭｏＤＣが抗原を提示しＴ細胞を活性化する能力が増強する。ウイルス感染の後期に、ＰＤＣは、Ｔ細胞の機能を直接制御し、ＩＦＮ−γを分泌可能な細胞へとＴ細胞を分化誘導する、独特な種類の成熟樹状細胞に分化する。これは、ＰＲＲＳウイルスを含むウイルスに対する抗ウイルス免疫の主要なメディエーターである。ＰＤＣがＩＦＮ−αを分泌する能力を抑制することが知られている呼吸器合胞体ウイルス及び麻疹ウイルスなどのヒトウイルスが存在することは意外ではない。この阻害効果は、これらのウイルス感染の結果として観察される体液性免疫反応の優位性及び関連する免疫病理学、ならびに二次的な細菌感染及びウイルス感染に対する宿主の感受性の増加に関与すると考えられている。
【００６８】
上述のように、欧州型、北米型、及び中国型ＰＲＲＳの多数の公知の株及び分離株が存在し、さらに新規株が進化し続けている、または単離され続けている。これらのすべての株の間には高レベルのアミノ酸配列相同性が存在するが、ある程度の変異が存在しており、すべてのワクチン株の表現型特性をさらに改善するためにこれらの相違及び類似性を実際に利点として利用できることを当業者はすぐに理解できるであろう。
【００６９】
第一に、下記に指定したような配列番号によって規定されるすべてのアミノ酸モチーフに関して、進化の結果として任意の他の欧州型ＰＲＲＳにさらなる変化が起こり、置換及び／または欠失または付加を引き起こしたとしても、そのような他の株の対応する発現タンパク質配列を調べて、対応するアミノ酸モチーフを見出すことは一般に可能である。したがって、例えば、その中のバリンがイソロイシンもしくはロイシン、または任意の他の残基で置換されている場合、あるいは残基が単に欠失しているかまたは追加の残基が付加されている場合、別のＰＲＲＳ株に相当するモチーフを容易に特定できるはずである。アライメントを特定し、それによってポリペプチド配列モチーフが対応するかどうかを決定するための多数のコンピュータープログラム、例えばいわゆるＢｌｏｓｕｍ行列（所与のレベルの同一性パーセントに基づく）が存在する。Ｓ．Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．“Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｍａｔｒｉｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋｓ”，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ，ＵＳＡ，８９（２２），ｐｐ．１０９１５−１０９１９，Ｎｏｖ  １５，１９９２．を参照のこと。また、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００５，ＭａｃＭｉｌｌａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎも参照のこと。合計５つの群への分類に基づいた保存的アミノ酸変化もまた認識されている。各群は、スルフヒドリル（Ｃｙｓ）；芳香族（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、及びＴｒｐ）；塩基性（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）；脂肪族（Ｖａｌ、Ｉｌｅｕ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ）及び親水性（Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ及びＴｈｒ）である。したがって、指定された位置に隣接する１つ以上の他のアミノ酸が付加、欠失、または置換されていても、適切かつ対応する位置に、配列番号５に示されるアミノ酸変化のいずれかを組み込むための、いかなる欧州型ＰＲＲＳコードヌクレオチド配列の変更も本発明の実施の範囲内である。そのようなアミノ酸変化は、当然ながら、部位特異的変異誘発、ＰＣＲ、及び当技術分野において周知の他の技術によってウイルスの対応するコードヌクレオチド配列に導入することができる。
【００７０】
弱毒化の一般的な測定法
特定の遺伝子改変株が弱毒化されていることを実証するには、以下に記載される実験を用いることができる。
【００７１】
各試験には１群あたり少なくとも１０頭の、ＰＲＲＳＶのない農場から入手した未経産ブタが含まれている。ＰＲＲＳウイルス特異的血清抗体を含まず、ＰＲＲＳＶ陰性である動物を試験する。試験に含めた動物はすべて、起源及び品種が同じものである。各群への動物の割り付けは無作為である。
【００７２】
妊娠９０日目に、鼻孔あたり１０５  ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳＶ  １ｍｌを鼻腔内投与して攻撃接種を実施する。各試験設定には少なくとも次の３つの群がある：野生型ウイルス群１つ；弱毒化されている可能性のあるウイルスによる攻撃接種のための試験群１つ；及び厳重な対照群１つ。
【００７３】
厳重な対照が試験期間にわたってＰＲＲＳＶ陰性のままであり、野生型の攻撃接種群で、出生した健康な子ブタの生存率が厳重な対照と比較して少なくとも２５％低い場合に、この試験が有効であるとみなされる。
【００７４】
弱毒化、言い換えれば病原性の低下とは、繁殖能力または他の総体的症状を決定する１つ以上のパラメーターの統計的に有意な変化であると定義される。
【００７５】
未改変親株に感染した群と比較して、以下のパラメーターのうち少なくとも１つが試験群（弱毒化の可能性があるウイルス）で有意に減少していることが、弱毒化の指標となる：
ａ）死産の頻度
ｂ）妊娠１１２日目またはそれ以前の流産
ｃ）ミイラ化した子ブタの数
ｄ）あまり元気がなく、弱った子ブタの数
ｅ）離乳前の死。
【００７６】
さらに、未改変親株に感染した群と比較して、以下のパラメーターのうち少なくとも１つが試験群で有意に増加することが好ましい：
ｆ）雌ブタ１頭あたりの離乳子ブタ数
ｇ）雌ブタ１頭あたりに出生した健康な子ブタの生存数。
【００７７】
あるいは、呼吸障害症状及び他のＰＲＲＳＶ感染症状を調べて弱毒化を確定することができる。
【００７８】
弱毒化株はワクチンの製剤化にとって有益である。本発明のワクチンは、ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを防御する場合に有効である。１頭以上の非罹患ブタへのワクチンの投与後、引き続き生物学的に純粋なウイルス分離株（例えば、任意の欧州野生型）で攻撃接種した結果、何らかの全体的変化または病理組織学的変化（例えば肺の病変）及び／または疾患の症状の重症度が、その分離株によって未防御の類似ブタに通常引き起こされる、そうした変化または症状と比較して（すなわち、適切な対照と比較して）低下する場合、ワクチンはＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを防御している。より具体的には、本発明のワクチンは、それを必要とする１頭以上の適したブタにワクチンを投与した後、適切な期間経過後（例えば４週間）、生物学的に純粋なＰＲＲＳＶ分離株の多量試料（１０（３−７）ＴＣＩＤ（５０））により攻撃接種することによって有効性を示し得る。さらに、約１週間後、攻撃接種したブタから血液試料を採取し、次いで血液試料からウイルスを単離する操作を実施する。単離されるウイルスが多量である場合、ワクチンが有効ではない可能性があることを示し、対して単離されるウイルスの量が減少している（またはウイルスがない）場合、ワクチンが有効である可能性があることを示す。
【００７９】
このように、本発明のワクチンの有効性を、定量的に（すなわち、適切な対照群と比較した、癒合肺組織の比率の減少）、または定性的に（例えば、血液からのＰＲＲＳＶの単離、イムノアッセイによる肺、扁桃腺またはリンパ節組織試料におけるＰＲＲＳＶ抗原の検出）評価することができる。ブタの生殖器及び呼吸器疾患の症状は、定量的（例えば体温／熱）または半定量的に（例えば、チアノーゼ、肺炎、肺病変などの、１つ以上の症状の有無または１つ以上の症状の重症度の緩和）評価することができる。
【００８０】
非罹患ブタとは、ブタの生殖器及び呼吸器疾患の感染因子に曝露されていないか、またはブタの生殖器及び呼吸器疾患の感染因子に曝露されているが疾患の症状を示していないブタである。罹患ブタとは、ＰＲＲＳの症状を示しているか、またはブタからＰＲＲＳＶが単離できるものである。
【００８１】
本発明のワクチンは、許容される慣例に従って製剤化し、標準的な緩衝液、安定剤、希釈液、防腐剤、及び／または可溶化剤などの、ヒト（該当する場合）を含む動物に許容される担体を加えることができ、また持続放出性を促進するように製剤化することができる。希釈液として、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが挙げられる。等張性のための添加剤として、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースが挙げられる。安定剤として、とりわけアルブミンが挙げられる。改変生ワクチンの製剤化において特に有用であるものを含む他の好適なワクチンビヒクル及び添加剤は公知であるか、または当業者に明らかであろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８ｔｈ  ｅｄ．，１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇを参照のこと。
【００８２】
本発明のワクチンは、例えば、とりわけアジュバントまたはサイトカインなどの１つ以上の追加の免疫賦活成分をさらに含むことができる。本発明のワクチンに使用することができるアジュバントの非限定的な例として、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．，Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｍｏｎｔ．）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルなどの鉱物ゲル、水中油型乳剤、例えばフロイント完全及び不完全アジュバントなどの油中水型乳剤、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ，Ａｔｌａｎｔａ，Ｇａ．）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｍａｓｓ．）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  Ｃａｌｉｆ．）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａまたは他のサポニン分画、モノホスホリル脂質Ａ、及びＡｖｒｉｄｉｎｅ脂質−アミンアジュバントが挙げられる。本発明のワクチンに有用な水中油型乳剤の非限定的な例として、変性ＳＥＡＭ６２及びＳＥＡＭ１／２製剤が挙げられる。変性ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン（Ｓｉｇｍａ）、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗剤（ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、０．７％（ｖ／ｖ）のＴＷＥＥＮ（登録商標）８０洗剤（ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、２００ｐｇ／ｍｌのＱｕｉｌ  Ａ、１００［ｍｇｒ］ｇ／ｍｌのコレステロール、及び０．５％（ｖ／ｖ）のレシチンを含有する水中油型乳剤である。変性ＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）のスクアレン、１％（ｖ／ｖ）のＳＰＡＮ（登録商標）８５洗剤、０．７％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ８０洗剤、２．５％（ｖ／ｖ）のエタノール、１００．ｍｕ．ｇ／ｍｌのＱｕｉｌ  Ａ、及び５０．ｍｕ．ｇ／ｍｌのコレステロールを含む水中油型乳剤である。ワクチンに含めることができる他の免疫賦活剤として、例えば、１種以上のインターロイキン、インターフェロン、または他の公知のサイトカインが挙げられる。
【００８３】
本発明のワクチンは、必要に応じて、本発明のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターを持続放出させるように製剤化することができる。そのような持続放出製剤の例として、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−グリコール酸共重合体）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどの生体適合性ポリマーの複合材料と組み合わせたウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターが挙げられる。薬物送達ビヒクル中の分解性ポリマーの構造、選択、及び使用については、複数の文献に概説されており、それには、参照により本明細書に組み込まれるＡ．Ｄｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３：２７９−２９２が含まれる。医薬製剤でのポリマーの選択及び使用に関するさらに別の手引きは、当技術分野で公知の教科書、例えば、Ｍ．Ｃｈａｓｉｎ  ａｎｄ  Ｒ．Ｌａｎｇｅｒ（ｅｄｓ），１９９０，”Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ”  ｉｎ：Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ．４５，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．で参照することができる。本書はまた、参照により本明細書に組み込まれる。その代わりに、またはそれに加えて、ウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターをマイクロカプセル化することで、投与及び効能を改善することができる。抗原をマイクロカプセル化するための方法は当技術分野で周知されており、例えば、米国特許第３，１３７，６３１号；米国特許第３，９５９，４５７号；米国特許第４，２０５，０６０号；米国特許第４，６０６，９４０号；米国特許第４，７４４，９３３号；米国特許第５，１３２，１１７号；及び国際特許公開ＷＯ９５／２８２２７に記載されている技術を含む。各文献はすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【００８４】
ウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターの持続放出をもたらすために、リポソームを使用することもできる。リポソーム製剤を製造及び使用する方法に関する詳細は、特に米国特許第４，０１６，１００号；米国特許第４，４５２，７４７号；米国特許第４，９２１，７０６号；米国特許第４，９２７，６３７号；米国特許第４，９４４，９４８号；米国特許第５，００８，０５０号；及び米国特許第５，００９，９５６号で参照することができ、各文献はすべて参照により本明細書に組み込まれる。
【００８５】
上記ワクチンのいずれかの有効量は、低用量のウイルス、ウイルスタンパク質プラスミド、またはウイルスベクターから始めて、その後、効果を観察しながら投与量を増やすという従来手段によって決定することができる。ワクチンの単回投与後またはワクチンの複数回投与後の有効量を求めることができる。動物あたりの至適用量を決定する際には、公知の要因が考慮される可能性がある。これには、動物の種、大きさ、年齢、及び全身状態、動物中の他の薬物の存在などが含まれる。実際の投与量は、他の動物試験から得た結果を考慮して選択するのが好ましい（以下の実施例３〜７参照）。
【００８６】
適切な免疫反応が得られたかどうかを検出する一つの方法は、ワクチン接種後の動物において抗体陽転及び抗体価を決定することである。ワクチン接種のタイミング、及び該当する場合には追加免疫の回数は、関連するすべての要因（そのいくつかは上記の通り）の分析に基づいて医師または獣医師によって決定されることが好ましいであろう。
【００８７】
本発明のウイルス、タンパク質、感染性ＤＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターの有効用量は、ワクチン接種を受ける動物の体重など、当業者が判断できる要因を考慮して、公知の技術を使用して決定することができる。本発明のワクチン中の本発明のウイルスの投与量は、好ましくは約１０１〜約１０９ｐｆｕ（プラーク形成単位）、より好ましくは約１０２〜約１０８ｐｆｕ、及び最も好ましくは約１０３〜約１０７ｐｆｕの範囲である。本発明のワクチン中の本発明のプラスミドの投与量は、好ましくは約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、より好ましくは約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、さらにより好ましくは約１０ｍｇ〜約１ｍｇの範囲である。本発明のワクチン中の本発明の感染性ＤＮＡ分子の投与量は、好ましくは約０．１ｍｇ〜約１００ｍｇ、より好ましくは約１ｍｇ〜約１０ｍｇ、さらにより好ましくは約１０ｍｇ〜約１ｍｇの範囲である。本発明のワクチン中の本発明のウイルスベクターの投与量は、好ましくは約１０１ｐｆｕ〜約１０９ｐｆｕ、より好ましくは約１０２ｐｆｕ〜約１０８ｐｆｕ、及びさらにより好ましくは約１０３〜約１０７ｐｆｕの範囲である。好適な投与量規模は、約０．５ｍｌ〜約１０ｍｌ、及びより好ましくは約１ｍｌ〜約５ｍｌの範囲である。
【００８８】
本発明の実施によるウイルスタンパク質またはペプチドワクチンに適した用量は一般に、標準的な方法によって決定することができる、投与あたり１〜５０マイクログラム以上の量の範囲であり、アジュバントが、そのような各材料に関して認められた方法で決定される量で含まれる。ブタのワクチン接種に関する本発明の好ましい例では、動物の至適対象年齢は約１〜２１日であり、これは離乳前で、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅまたはＰＣＶなどの他の予定されたワクチン接種の時期とも対応し得る。さらに、繁殖雌ブタにとって好ましいワクチン接種スケジュールには、年間の再接種スケジュールでの同様の投与を含むと考えられる。
【００８９】
適切な免疫反応が得られたかどうかを検出する一つの方法は、ワクチン接種後の動物において抗体陽転及び抗体価を決定することである。ワクチン接種のタイミング、及び該当する場合には追加免疫の回数は、関連するすべての要因（そのいくつかは上記の通り）の分析に基づいて医師または獣医師によって決定されることが好ましいであろう。
【００９０】
本発明のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターの有効用量は、ワクチン接種を受ける動物の体重など、当業者が判断できる要因を考慮して、公知の技術を使用して決定することができる。例として、ワクチンは、経口的、非経口的、皮内、皮下、筋肉内、鼻腔内、または静脈内に送達することができる。経口送達は、例えば、動物の食餌または飲料への組成物の添加を包含し得る。ワクチン投与量に影響する要因には、例えば、ブタの体重及び年齢が含まれる。
【００９１】
本発明はさらに、本明細書に記載のＰＲＲＳウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターを含むワクチンを調製する方法を提供し、その方法には、有効量の本発明のＰＲＲＳウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターのうち１つを、医薬用途または獣医学的用途に許容される担体と組み合わせることを含む。
【００９２】
加えて、本発明の弱毒化生ワクチンは、米国特許第６，５００，６６２号に記載されるように、公知の組換え技術を用いてＰＲＲＳウイルスゲノムに挿入される異種抗原エピトープをコードするように改変することができる。その全体が参照により組み込まれる、米国特許第７，１３２，１０６号も参照のこと。本発明の異種抗原エピトープとして有用な抗原エピトープには、ＰＲＲＳウイルス以外のブタ病原体からの抗原エピトープが含まれ、それには、ブタパルボウイルス、ブタサーコウイルス、ブタロタウイルス、ブタインフルエンザ、偽狂犬病ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、従来型ブタ熱ウイルス、アフリカブタ熱ウイルス、脳心筋炎ウイルス、ブタパラミクソウイルス、トルクテノウイルス、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉ、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｂｒｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｅｔａｎｉ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｓｕｉｓ、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐｐ．、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｍｉｌｉｓ、及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｕｉｓからなる群から選択されるブタ病原体からの抗原エピトープが含まれるがこれらに限定されない。上述のブタ病原体からの抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で公知であり、（米国）国立生物工学情報センターのＧｅｎｂａｎｋなど、ワールドワイドウェブ上の公共遺伝子データベースから入手することができる。
【００９３】
本発明のさらなる特徴及び変形例は、詳細な説明を含め、本出願全体から当業者には明らかであり、そのような特徴はすべて本発明の態様であることが意図される。同様に、本明細書に記載の本発明の特徴を再度組み合わせて追加実施形態にすることができるが、その追加実施形態も、特徴の組み合わせが本発明の態様または実施形態として具体的に上述されているかどうかにかかわらず、本発明の態様であることが意図される。また、本発明にとって重要であると本明細書に記載されているそのような限定のみがそのようにみなされるべきであり、本明細書に重要であると記載されていない限定を欠く本発明の変形例は、本発明の態様であると意図される。本発明は、上記の説明及び実施例に具体的に記載されたものとは別の方法で実施され得ることは明らかであろう。
【００９４】
したがって、配列番号５のウイルスに基づくＰＲＲＳワクチンは、生後１日目という早期でさえ子ブタのワクチン接種に成功し、約６か月齢に至るまで長期の免疫を保つという著しい改善をもたらす安全性及び有効性プロファイルを有するものの代表とみなされることになる。そのような従来にないワクチン性能の改善が、驚くべきことに、ブタの生物学での妥当性を最大限に高める細胞培養環境でウイルスを培養し弱毒化することによってもたらされる。それには、必要な宿主免疫反応を下方制御することなく、ブタ宿主においてウイルスを適切かつ安全に複製可能にすることを含む。子ブタ、雄ブタ、雌ブタ、及び未経産ブタ（妊娠前及び妊娠中）に、そのような利益が与えられ、かつ、いずれの場合にも、ワクチン接種時に動物が血清陽性であるか血清陰性であるかを問わない。
【００９５】
また、本発明の培養の改善は、組換え手段によって操作される、操作された、または操作されることになる欧州型ＰＲＲＳウイルスにも、または主として非組換え手段によって単離、操作、または培養され、適合されただけの欧州型ＰＲＲＳウイルスにも同等に適用でき、いずれの場合にも、使用される任意の培養細胞自体が組換え体であるか否かも問わない。
【００９６】
上記の教示に照らして、本発明の多数の改変及び変形が可能であり、したがってこれらは本発明の範囲内である。
【００９７】
以下の実施例は、例示を意図するものであり、本発明を限定するものではない。
【実施例】
【００９８】
実施例１−ＢＨＫ２１−Ｃ１２−２６細胞株の作製
これらの試験で使用されたＢＨＫ２１−Ｃ１２−２６細胞株の親であるＢＨＫ２１−Ｃ１２細胞株の作製は、ＵＳ９，１０２，９１２に以前に記載された。この特許では、ＢＨＫ２１−Ｃ１２細胞株を実施例１４及び図６においてＢＨＫ／ＣＭＶ／ｖ１＃１２と呼んでいる。簡潔には、一般的に使用されているベビーハムスター腎臓細胞株ＢＨＫ−２１にプラスミドｐＣＭＶ−ｓｕｓＣＤ１６３ｖ１をトランスフェクトした。このプラスミドは、ＣＭＶプロモーターの制御下にある、ブタ（ｓｕｓ）ＣＤ１６３  ＰＲＲＳＶ受容体遺伝子の短縮型変異体（ｖ１）を含んでいる。このプラスミドはまた、それぞれＥ．ｃｏｌｉ及び哺乳動物細胞の選抜に用いる、原核生物／真核生物の二重プロモーターの制御下にあるカナマイシン／ネオマイシン耐性遺伝子を含む。トランスフェクション後、９６ウェルプレート中でＧ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ、ネオマイシン類似体）を用いた同時選抜及び単一細胞クローニングを細胞に施した。得られたクローンから、先で使用する１つ（＃１２、すなわち「Ｃ１２」）を選択し、ＢＨＫ２１−Ｃ１２と命名した。
【００９９】
ＢＨＫ２１−Ｃ１２細胞株をＧ４１８で選抜しながら６５回連続継代し、ＰＲＲＳＶを許容する表現型を保持した。６４継代目までには、ＰＲＲＳウイルスへの感染により生存した細胞が少数であることが観察され、初期段階の表現型の不安定性を示した。さらに単一細胞クローニングを実施し、多数の新たなクローンを、ＰＲＲＳＶを許容する表現型及び一般的な増殖特性について評価した。そのうち、他のクローン及び親ＢＨＫ２１−Ｃ１２細胞株よりも優れているものとして、クローン＃２６を選択した。クローン＃２６をＢＨＫ２１−Ｃ１２−２６と命名し、ＰＲＲＳウイルス９６Ｖ１９８の弱毒化に使用した。
【０１００】
実施例２−生後１日目のワクチン接種のためなどの、幼年齢期に安全かつ有効であるウイルスの適合及び培養に適した追加細胞
ＰＫ−９細胞は、ブタＣＤ１６３遺伝子の欠失型及びネオマイシン耐性遺伝子をコードするプラスミドをＰＫ０８０９ブタ腎臓細胞株に安定的にトランスフェクトすることによって誘導されるトランスジェニック細胞株である。ＰＫ−９細胞株の構築及び特性決定の詳細は以前に記載されている（米国特許第９，１０２，９１２号を参照）。
【０１０１】
ＰＡＭ細胞からの第１継代ウイルスをＰＫ−９細胞上での増殖に適合させることは困難な場合があり、複数の並行系統で複数回試行する必要があったことに留意すべきである。この場合、ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質に特異的なＦＩＴＣコンジュゲートモノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７（Ｒｕｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ，Ｂｒｏｏｋｉｎｇｓ  Ｓｏｕｔｈ  Ｄａｋｏｔａ）を使用して、複製ウェルの免疫蛍光によって感染をモニターすることができる。初期の継代では、数個の小さな病巣は生じるが、新たな単層の感染を開始するのに十分な無細胞ウイルス粒子は生成されない可能性がある。それでもなお、これらの継代は、感染した単層をＡｃｃｕｔａｓｅ（トリプシン代替物）で処理して、非感染のＰＫ−９細胞を添加してまたは添加せずに、新鮮培地を加えた複数のウェルに細胞を再播種することによって行うことができる。数回のそのような継代の後、系統によっては、蛍光病巣の頻度及び大きさに明らかな増加を示すはずである。これらのうちのいくつかは、無細胞ウイルス液を使用して継代される能力を獲得しているはずである。一般に、適切な継代は、アルファインターフェロンを阻害する能力の低下を証明することが予測される。
【０１０２】
本発明の欧州型ＰＲＲＳワクチンの安全性及び有効性を、直後に続く実施例３〜７に含まれる実験プロトコール及びデータによってさらに証明する。
【０１０３】
実施例３−１日齢の子ブタに欧州型ＰＲＲＳ  ＭＬＶを投与し、続いてワクチン接種後約２６週でさらに欧州型ＰＲＲＳＶ分離株により攻撃接種することにより得られる免疫持続期間
本試験の目的は、１日齢で筋肉内経路（ＩＭ、群Ｔ０２）または鼻腔内経路（ＩＮ、群Ｔ０３）によりワクチン接種を受け、続いてワクチン接種後２６週で別の欧州型のＰＲＲＳＶ分離株により呼吸器に攻撃接種されたブタにおいて、欧州型ＰＲＲＳ改変生ワクチン（配列番号５によりコードされるウイルス）の免疫持続期間（ＤＯＩ）を評価することであった。有効性を決定する際の主要変数は、Ｔ０１ブタと比較した処置群Ｔ０２及びＴ０３の血清中のウイルス量（ウイルス血症）であった。副次変数として肺病変、直腸温、排菌、臨床徴候、及び体重を比較した。
【０１０４】
１日齢で、群Ｔ０２及びＴ０３のブタに、筋肉内（Ｔ０２）または鼻腔内（Ｔ０３）経路を介して単回投与量２ｍＬのＩＶＰを投与した。対照群（Ｔ０１）のブタには、生理食塩水溶液を筋肉内に２ｍｌ、及び鼻腔内に２ｍｌ投与した。ワクチン接種後２６週（１８２日）目に、呼吸器への攻撃接種として、ＥＵ  ＰＲＲＳＶ分離株Ｏｌｏｔ／９１（Ｄｕｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅｓ，ｖｏｌ  １４  Ｎｏ．１．，１９９７，ｐｐ  １９−２９及びＺ．Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，ｖｏｌ  １１，Ｎｏ  ４２，２０１４を参照）をブタに鼻腔内接種した。攻撃期の間、血液試料、鼻腔及び口腔のスワブ、臨床所見、ならびに直腸温を剖検日まで３〜４日ごとに収集した。ワクチン接種前、攻撃接種前、及び剖検時にブタを計量した。攻撃接種の９日後または１０日後に、ブタを安楽死させ、剖検した。剖検時に、ＰＲＲＳＶ病変の存在について肺を評価し、スコアを記録した。Ｔ０１ブタはすべて、ワクチン接種期間を通してＰＲＲＳＶウイルス陰性のままであり、交絡疾患因子が検出されなかったため、この試験は有効であった。
【０１０５】
群間の血清中のウイルス量を比較すると、ＩＭワクチン接種とＩＮワクチン接種の両方に防御効果が観察された。ＩＶＰをワクチン接種した両群（Ｔ０２及びＴ０３）は、攻撃接種後のすべてのサンプリング日（３、６、８及び９／１０。試験日１８５、１８８、１９０、及び１９１／１９２に対応）において対照群と比較して有意（Ｐ≦０．０５）に低いウイルス力価を有した。剖検時のＰＲＲＳＶ関連肺病変の有意な減少、ならびに対照群と比較した両方のワクチン接種群における鼻腔及び口腔の排菌の有意な減少によっても有効性が裏付けられた。
【０１０６】
ワクチン接種群間の比較では、攻撃接種後３日目に、ＩＮ経路によってワクチン接種された群（Ｔ０３）が、ＩＭ経路によってワクチン接種された群（Ｔ０２）と比較して有意に低いウイルス血症、鼻腔排菌、及び口腔排菌を有することが明らかであった。これらの結果は、本試験の条件下で、ＩＮワクチン接種後に得られた防御がＩＭワクチン接種後よりも強力であったことを示している。
【０１０７】
ワクチン接種は、ワクチン接種後２８日以内にＰＲＲＳＶ特異的抗体の発生を誘導した。ワクチン接種ブタはすべて、攻撃接種時（ワクチン接種後２６週）にＰＲＲＳ抗体に対して血清陽性であり、どちらの投与経路もワクチン接種に対して強力で防御的な抗体反応を誘発できたことを示している。しかしながら、攻撃接種時に検出された抗体価のレベルは、筋肉内にワクチン接種された群と比較して、ＩＮ経路によるワクチン接種群の方が有意に高かった。この事実は、攻撃接種後３日目のＩＭ群と比較して、ＩＮ群において、血清及び排出経路の両方で検出されたウイルス量が有意に減少したことの説明となる。
【０１０８】
結論として、本試験の結果は、２．５ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ５０の用量を含有するＥＵ  ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶワクチン（配列番号５）を１日齢のブタに筋肉内経路または鼻腔内経路で単回投与すると、６．５か月（２６週）の免疫防御期間が付与されることを実証した。
【０１０９】
実施例３〜７で使用される略語として、以下が挙げられる：ＡＡＡＬＡＣ、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｃｃｒｅｄｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ；ＡＥ、有害事象；ＣＣＩＤ５０、細胞培養物５０％感染用量；ＣＰ、対照品；ＤＣ、攻撃接種日；ＤＣＦ、データ取得形態；ＤＲＡＣ、動物ケア日報（Ｄａｉｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ）；ＩＤ、識別番号；ＩＦ、免疫蛍光；ＩＭ、筋肉内；ＩＮ、鼻腔内；ＩＶ、静脈内；ＩＶＰ、治験用獣医学品；ＭＤＡ、母体由来抗体；ＭＬＶ、改変生ワクチン；ＭＳＦ、マスター試験ファイル；ＭＳＶ、マスターシードウイルス；ＮＡ、該当なし；ＰＡＭ、ブタ肺胞マクロファージ；ＰＲＲＳＶ、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＲＴ−ｑＰＣＲ、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応；ＳＡＲＴ、病気の動物の報告と治療；ＳＯＰ、標準業務手順；Ｓ／Ｐ、試料対陽性；及びＴＢＤ、未決定。
【表１−１】
2020502158.tif 000002
【０１１０】
１日齢で、２ｍＬ用量（ＩＭ経路）及び２ｍＬ用量（ＩＮ経路）のＣＰをＴ０１子ブタに投与した。また、２．０ｍＬ用量のＩＶＰを、ＩＭ経路によってＴ０２子ブタに、ＩＮ経路によってＴ０３子ブタに投与した。ワクチン接種の２６週後、ＰＲＲＳＶ  Ｏｌｏｔ／９１をブタに攻撃接種し、攻撃接種後９〜１０日の時点でブタを安楽死させて剖検した。０日＝ワクチン接種日。
【０１１１】
無作為化
出生直後、子ブタを無作為化し、可能な限り均等にすべての雌ブタにまたがるように子ブタを交叉哺育した。離乳時に雌ブタを離し、子ブタを供給元農場の畜舎に収容した（１つの処置につき１畜舎）。
動物に関する特定のパラメーターは以下の通りである。
【表１−２】
2020502158.tif 000003
【０１１２】
１２頭の妊娠雌ブタを用いて、合計１１７頭の子ブタを得た。分娩予定日の前日に、クロプロステノール（Ｃｙｃｌｉｘ（登録商標）Ｐｏｒｃｉｎｏ、Ｖｉｒｂａｃ）の筋肉内注射で分娩を誘発した。すべての雌ブタが翌日（Ｄ−１）に子を産んだ。分娩の持続時間と死産の子ブタの数を減らすために、２頭（すでに分娩を終えた７１及び７８）を除くすべての雌ブタにオキシトシン（Ｐａｒｔｏｖｅｔ（登録商標）ＤＦＶ）を注射した。
【０１１３】
ワクチン接種期間に、死亡したか、または安楽死させなければならなかった子ブタは８頭であった。残りの１０９頭の子ブタのうち、５５頭を本試験用とした。
【０１１４】
年長時の雄ブタの攻撃行動及び性的行動を減らすために、部位特異的な動物福祉手順に従って子ブタを６日齢で去勢した。３頭の子ブタ（２３２、２８４、及び２８６）は陰嚢ヘルニアであったため去勢できなかった。
【０１１５】
ワクチン接種後の約１か月で、同一の病理学的所見があった２頭が突然死した。床には白い染みがあった。また、尿路に影響を及ぼす細菌感染が示唆される白い尿が排尿過程の最後に見られたブタもいた。処置に対して全動物が良好に反応し、残りのワクチン接種期間（攻撃接種するまでの次の３か月）に、他の症例が現れなかったため、この過程が試験結果に影響を与えたとは考えられなかった。動物の健康及び結果の評価に影響を及ぼし得る、試験手順とは無関係な損傷または臨床的疾患をもつ動物がいれば、研究者の判断で試験から除外してもよい。治験用獣医学品（ＩＶＰ）は、凍結乾燥画分を２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／ＭＬで生理食塩水溶液に再懸濁して得た（配列番号５のウイルス）。
【０１１６】
再構成
０日目に、目標力価（２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／２ｍＬ）になるように、ＩＶＰをワクチン希釈液（ロットＴ２２０１９）で希釈した。１アリコートのＩＶＰを採集してＢＨＫ−２１−Ｃ１２−２６細胞に滴定し、投与量を確定した。追加のＩＶＰ試料は凍結し（−８０±１０℃）、保持試料として保存した。現地の標準手順に従って、ＢＨＫ−２１−Ｃ１２−２６細胞に滴定を実施した。再構成され希釈されたワクチンの力価は１０１．９ＣＣＩＤ５０／ｍｌであり、これは１０２．２ＣＣＩＤ５０／２ｍＬ（２．２ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／２ｍｌ）に相当する。０日目に、目標力価（２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／２ｍＬ）になるように、ＩＶＰをワクチン希釈液（ロットＴ２２０１９）で希釈した。１アリコートのＩＶＰを採集してＢＨＫ−２１−Ｃ１２−２６細胞に滴定し、投与量を確定した。追加のＩＶＰ試料は凍結し（−８０±１０℃）、保持試料として保存した。現地の標準手順に従って、ＢＨＫ−２１−Ｃ１２−２６細胞に滴定を実施した。再構成され希釈されたワクチンの力価は１０１．９ＣＣＩＤ５０／ｍｌであり、これは１０２．２ＣＣＩＤ５０／２ｍＬ（２．２ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／２ｍｌ）に相当する。対照品（ＣＰ）をワクチン希釈液（生理食塩水溶液）で希釈し、４．０ｍＬ（２．０ｍＬ  ＩＭ＋２．０ｍＬ  ＩＮ）にして投与した。
【０１１７】
０日目に、記載のようなＩＶＰまたはＣＰを子ブタにワクチン接種した。Ｔ０１群及びＴ０２群の子ブタの首の右側に筋肉内注射した。Ｔ０１群及びＴ０３群の子ブタの両鼻孔に１．０ｍＬずつを送達して、鼻腔内投与した。
【０１１８】
攻撃投与
力価１０５．７ＣＣＩＤ５０／２ｍＬのＯｌｏｔ／９１ウイルスを含む攻撃接種物質を両鼻孔に１．０ｍＬずつ注入することにより、全ブタに総攻撃量２．０ｍＬで鼻腔内（ＩＮ）攻撃接種した。
【０１１９】
結果−ウイルス血症
ワクチン接種前（Ｄ０）及び攻撃前（Ｄ１８１）、全ブタの血清はＲＴ−ｑＰＣＲでＰＲＲＳＶ陰性であった。攻撃接種後、Ｔ０１群のブタの１００％が１８５日目にウイルス血症になり（攻撃接種後３日、ＤＣ＋３）、試験終了時まで陽性のままであった。ワクチン接種群では、ブタの１００％（Ｔ０２群）及び８８％（Ｔ０３）が同じくＤＣ＋３で陽性であった。しかしながら、両方のワクチン接種群における陽性ブタの比率は時間とともに減少し、ＤＣ＋８及び剖検日（ＤＮ）には対照群Ｔ０１と比較して有意に低くなった。
【０１２０】
両方のワクチン接種群において、血清中に検出されたウイルス負荷量もまた、攻撃接種後の全サンプリング日でＴ０１群と比較して有意に減少した。１８５日目（ＤＣ＋３）には、Ｔ０２群と比較してＴ０３群にウイルス力価の有意な減少も観察された。攻撃接種後１０日間のウイルス血症の結果を表１にまとめている。
【表１−３】
2020502158.tif 000004
【０１２１】
鼻腔排菌
攻撃接種前（Ｄ１８１）に、全ブタの鼻腔スワブはＲＴ−ｑＰＣＲでＰＲＲＳＶ陰性であった。攻撃接種後、Ｔ０１のブタはすべて鼻腔排菌者になっていた。ワクチン接種群では、鼻腔経路でこれまで排菌したブタの比率は９４％（Ｔ０２群）及び８８％（Ｔ０３群）であった。Ｔ０１群との比較では、Ｔ０３群に１８５、１８８、及び１９１／１９２日目（ＤＣ＋３、ＤＣ＋６、及びＤＮ）で、Ｔ０２群に１９１／１９２日目（ＤＮ）で鼻腔排菌者の比率に有意な減少が観察された。ワクチン接種群間で鼻腔排菌者の比率に有意差は検出されなかった。鼻腔経路によって排菌されたウイルス量は、ＤＣ＋６及びＤＮのＴ０２群と比較して、及びＤＣ＋３、ＤＣ＋６、及びＤＮのＴ０３群と比較して、Ｔ０１群で有意に多かった。ワクチン接種群間の比較から、ＤＣ＋３で、Ｔ０３と比較してＴ０２群に有意に高いウイルス力価が認められた。攻撃接種後１０日間の鼻腔排菌の結果を表２にまとめている。
【表２】
2020502158.tif 000005
【０１２２】
口腔排菌
攻撃接種前（Ｄ１８１）に、全ブタの口腔スワブはＲＴ−ｑＰＣＲでＰＲＲＳＶ陰性であった。攻撃後、口腔経路でこれまで排菌したブタの比率は、Ｔ０１群、Ｔ０２群、及びＴ０３群でそれぞれ９／２０（４５％）、８／１８（４４％）、及び７／１７（４１％）であった。試験終了時までに、Ｔ０２群の全ブタと、Ｔ０３群の１頭を除くすべてのブタが口腔スワブで陰性であった。対照群Ｔ０１では、その時点で５／２０がまだ陽性であった。Ｔ０１とＴ０２との間の口腔排菌者の比率には、試験終了時（ＤＮ）に統計的有意差があった。口腔経路によって排菌されたウイルス量は、剖検日（攻撃接種後９／１０日に相当）でＴ０３群と比較してＴ０１群において有意に高かった。１８５日目（ＤＣ＋３）のウイルス量はまた、Ｔ０１及びＴ０３の両方と比較してＴ０２群で有意に高かった。攻撃接種後１０日間の口腔排菌の結果を表３にまとめている。
【表３】
2020502158.tif 000006
【０１２３】
臨床所見
攻撃接種後の全期間で、いずれのブタも異常な全身状態、抑うつ状態、呼吸困難、咳、またはくしゃみを示さなかった。
【０１２４】
直腸温
攻撃接種後の期間の直腸温の結果を表４にまとめている。Ｔ０１群では、５／２０のブタ（２５％）が攻撃接種後の期間に少なくとも１回は発熱（ＲＴ≧４０．５）した。ワクチン接種群Ｔ０２及びＴ０３において、攻撃後に発熱したブタの比率はそれぞれ８／１８（４４％）及び１２／１７（７１％）であった。１８５日目（ＤＣ＋３）には、ワクチン接種群Ｔ０２及びＴ０３の両方でＴ０１群と比較して直腸温が有意に高かった。
【表４】
2020502158.tif 000007
【０１２５】
肺病変
処置群ごとの病変のある肺の比率を表５に示す。肺の視覚的スコアを表６に示す。剖検時、対照群Ｔ０１のうち１８／２０のブタ（９０％）は、ＰＲＲＳＶ攻撃が肺病変の誘発に成功したことを示す、陽性の肺の視覚的スコアを有した。Ｔ０２群及びＴ０３群では、１２／１７（７１％）及び７／１６（４４％）のブタが同様に陽性と採点された。Ｔ０３群のうち１頭のブタ（＃３００）は、右肺葉の１０〜７０％、左肺葉の２〜３０％、及び副葉の７０％に、それによって何らかの潜在的なＰＲＲＳＶ関連病変の存在をマスクするカタル性化膿性胸膜肺炎の罹患を示していた。このブタからのデータは分析から区別した（ＭＳＦの目印のある報告を参照）。剖検時に病変が観察される肺の比率は、ワクチン接種群Ｔ０２及びＴ０３と比較して対照群Ｔ０１において有意に高かった。ワクチン接種群間に差は検出されなかった。
【表５】
2020502158.tif 000008
【表６】
2020502158.tif 000009
【０１２６】
血清検査（ＥＬＩＳＡ）の結果
血清検査結果の概要を表７に示す。ワクチン接種段階の期間に月１回の間隔で採取した試料から得られたＥＬＩＳＡの結果の概要のみ、記述統計量（幾何平均及び標準偏差）で示す。実験単位の反復はなかった（処置を混合しなかった）ため、群間の差は評価できなかった。群間の差は、攻撃接種段階で動物を混合した後の１８１日目の試験日にのみ試験した。ワクチン接種前、全ブタはＥＬＩＳＡ陰性であった（ＩＤＥＸＸ  Ｓ／Ｐ比＜０．４）。対照群Ｔ０１のブタは、攻撃接種まで陰性のままであった。ワクチン接種の１か月後（２８日目）、Ｔ０２群及びＴ０３群のブタはすべて、既にＰＲＲＳＶに対する抗体が発生しており、それらのすべてが攻撃接種時（ワクチン接種の６．５か月後）に引き続き陽性であった。１８１日目（ＤＣ−１）の群間比較から、Ｔ０２群と比較してＴ０３群に有意に高い最小二乗平均抗体価が認められた。
【表７−１】
2020502158.tif 000010
【０１２７】
ウイルス血症及び排菌
統計解析の前に、適切な対数変換を用いてＲＴ−ｑＰＣＲを変換した。変換されたデータを一般線形反復測定の混合モデルを用いて分析した。処置効果または処置と時点の交互作用効果が有意である場合（Ｐ≦０．０５）、各時点で処置間のペアワイズ処置比較を行った。処置の最小二乗平均及び９５％信頼区間を逆変換して表した。動物のウイルス血症／排菌者の比率も算出した。ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡコピー／ｍＬが５０超（１．７ｌｏｇ１０  ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡコピー／ｍＬ）の場合に、各試料を陽性であると判定した。これは、この技術の検出限界（１００  ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡコピー／ｍＬ）の半分に相当する。ＤＣ以前（攻撃接種前に相当）及びＤＣ後（攻撃接種後）、これまでウイルス血症であったか、または排菌したかも測定した。時点ごとに、また攻撃接種前の期間及び攻撃接種後の期間に、動物がこれまでウイルス血症であったかどうかに応じて、ウイルス血症状態に関する頻度表を算出した。
【０１２８】
直腸温
直腸温は、一般線形反復測定の混合モデル分析を用いて分析した。処置効果または処置と時点の交互作用効果が有意である場合（Ｐ≦０．０５）、各時点で処置間のペアワイズ比較を行った。処置の最小二乗平均、９５％信頼区間、最小値及び最大値を時点ごとに算出した。記述的統計、平均、標準偏差、及び範囲は、処置ごとに、及び攻撃接種前の試験日ごとに算出した。発熱（直腸温４０．５℃超）を伴う動物の頻度分布を処置ごとに算出し、時点のデータを収集する。ＤＣ以前の期間及びＤＣ後の期間に、動物がこれまで発熱したかどうかを判定した。動物がこれまで発熱したかどうかについての頻度表を、ＤＣ以前及びＤＣ後の期間ごとに算出した。
【０１２９】
血清検査（ＥＬＩＳＡ）
統計解析の前に、必要な場合は、適切な対数変換を用いて血清値を変換した。変換された血清検査データを、一般線形反復測定の混合モデルを用いて分析した。処置効果または処置と時点の交互作用効果が有意である場合（Ｐ≦０．０５）、各時点で処置間のペアワイズ比較を行った。処置の最小二乗平均及び９５％信頼区間を逆変換して表した。さらに、陽性／陰性結果の頻度分布を各時点で処置ごとに算出した。また、試験期間の任意の時点で、各動物が抗体陽転（Ｓ／Ｐ比０．４以上）したかどうかを判定した。動物が抗体陽転したかどうかの頻度分布を処置ごとに算出した。記述的統計、平均、標準偏差、及び範囲は、処置ごとに、攻撃接種前に算出した。
【０１３０】
臨床所見
攻撃接種前の臨床徴候及び攻撃接種後の臨床徴候の頻度分布を、処置ごとに個別に算出し、時点のデータを収集した。動物がこれまで臨床徴候があったかどうかについての頻度分布を、段階（ＤＣ以前及びＤＣ後）で処置ごとに算出した。
【０１３１】
体重
体重は、一般線形反復測定の混合モデルを用いて分析した。最小二乗平均、標準誤差、９５％信頼区間、最小値及び最大値を各時点で処置ごとに算出した。処置効果及び／または処置と時点の交互作用が有意であった場合、各時点で処置同士の処置間ペアワイズ比較を行った。推定値の標準誤差及び９５％信頼区間を算出した。記述的統計、平均、標準偏差、及び範囲は、処置ごとに、攻撃接種前に算出した。モデルからのパラメーター推定値を用いて、１日増加量の平均推定値及び比較を算出した。
【０１３２】
肺病変
肺全体の病変率を以下の式を用いて算出した：肺全体の病変率＝（０．１０×左上葉）＋（０．１０×左中葉）＋（０．２５×左下葉）＋（０．１０×右上葉）＋（０．１０）×右中葉）＋（０．２５×右下葉）＋（０．１０×副葉）。分析前に、逆正弦平方根変換を、肺全体の病変率に適用した。変換された肺病変を、一般線形混合モデルを用いて分析した。治療効果が有意であった場合、処置群間でペアワイズ比較を行った。肺全体の病変率の逆変換最小二乗平均、その標準誤差及び９５％信頼区間を、最小値及び最大値とともに算出した。
【０１３３】
肺病変の評価スコア
肺病変の評価スコアの頻度分布を処置ごとに算出した。正常または正常でないスコアを、二項データの一般線形混合モデルを用いて分析した。一般線形混合モデルが収束しなかった場合、フィッシャーの正確検定を使用してデータを分析した。処置の主たる効果が有意であれば、処置間のペアワイズ比較を行った。
【０１３４】
分析モデル
変換した肺全体の病変率を、固定効果である処置、ならびにランダム効果である畜舎及び畜舎内の区画による一般線形混合モデルで分析した。有意な（Ｐ≦０．０５）処置効果について試験した後、パラメーター推定値の線形結合を事前比較に使用した。処置間で比較を行った。５％の有意水準（Ｐ≦０．０５）を用いて統計的差異を評価した。最小二乗平均（逆変換）、標準誤差、平均の９５％信頼区間、及び範囲を処置ごとに算出した。
【０１３５】
ウイルス血症状態を、固定効果（処置、時点、及び処置と時点の交互作用）及び動物の条件であるランダム効果（畜舎、畜舎内の区画、ならびに区画内、畜舎内、及び処置内の動物）を含むロジットリンクによる一般線形反復測定の混合モデルで分析した。有意な（Ｐ≦０．０５）処置効果または処置と時点の交互作用について試験した後、パラメーター推定値の線形結合を事前比較に使用した。各時点で処置間の比較を行った。５％の有意水準（Ｐ≦０．０５）を用いて統計的差異を評価した。最小二乗平均（逆変換）、標準誤差、及び平均の９５％信頼区間を処置及び時点ごとに算出した。このモデルが収束しなかった場合、フィッシャーの正確検定を使用して分析した。
【０１３６】
肺の評価スコア、正常／非正常、及びもしあればウイルス血症を、ＧＬＩＭＭＩＸによって、固定効果である処置、及びランダム効果である畜舎及び畜舎内の区画による一般線形混合モデルで分析した。処置の主たる効果が有意であれば、処置間のペアワイズ比較を行った。ＧＬＩＭＭＩＸが収束しなかった場合、フィッシャーの正確検定を分析に使用した。
【０１３７】
ウイルス量、血清検査、体重、及び直腸温を、固定効果（処置、時点、及び処置と時点の交互作用）及び動物の条件であるランダム効果（畜舎、畜舎内の区画、ならびに区画内、畜舎内、及び処置内の動物）による一般線形反復測定の混合モデルで分析した。有意な（Ｐ≦０．０５）処置効果または処置と時点の交互作用について試験した後、パラメーター推定値の線形結合を事前比較に使用した。各時点で処置間の比較を行った。５％の有意水準（Ｐ≦０．０５）を用いて統計的差異を評価した。最小二乗平均（ウイルス量及び血清検査の逆変換）、標準誤差、平均の９５％信頼区間、及び範囲を処置及び時点ごとに算出した。仮説検定はすべて、有意水準０．０５で両側検定を用いて実施した。
【０１３８】
考察
このように、本試験の目的は、１日齢で筋肉内経路（ＩＭ、群Ｔ０２）または鼻腔内経路（ＩＮ、群Ｔ０３）によりワクチン接種を受け、ワクチン接種後２６週で遺伝子型Ｉ型のＰＲＲＳ分離株により呼吸器に攻撃接種されたブタにおいて、ＥＵ  ＰＲＲＳ改変生ワクチン（配列番号５）の免疫持続期間（ＤＯＩ）を評価することであった。有効性を決定する際の主要変数は、Ｔ０１ブタと比較した処置群Ｔ０２及びＴ０３の血清中のウイルス量（ウイルス血症）であった。副次変数として肺病変、直腸温、排菌、臨床徴候、及び体重を比較した。
【０１３９】
Ｔ０１ブタはすべて、ワクチン接種期間を通してＰＲＲＳＶウイルス陰性のままであり、交絡疾患因子が検出されなかったため、この試験は有効であった。群間の血清中のウイルス量を比較すると、ＩＭワクチン接種とＩＮワクチン接種の両方に防御効果が観察された。対照群Ｔ０１は、攻撃接種後のすべてのサンプリング日で、ワクチン接種群Ｔ０２及びＴ０３と比較してウイルス力価が有意に高かった。さらに、攻撃接種後８日目及び９／１０日目には、両方のワクチン接種群で対照群と比較してウイルス血症ブタの比率も有意に減少した。ワクチン接種群を比較したところ、筋肉内にワクチン接種された群（Ｔ０２）と比較して、ＩＮ経路（Ｔ０３）でワクチン接種された群の方が、１８５日目（ＤＣ＋３）に検出されたウイルス力価が有意に低かった。両方のワクチン接種群で、鼻腔経路によって排菌されるウイルス量に加え、鼻腔排菌者の比率に有意な減少が観察されたことで、ＩＭ及びＩＮ両方のワクチン接種群がウイルス複製に与える利点も裏付けられた。さらに、対照群と比較した、ウイルス量（Ｔ０３群）または口腔スワブの陽性ブタの比率（Ｔ０２群）の有意な減少によって決定されるように、攻撃接種の９／１０日後の口腔排菌にワクチン接種が与える陽性効果も観察された。
【０１４０】
攻撃接種後のＤＣ＋３には、両方のワクチン接種群で対照群と比較して直腸温が有意に高かった。その時点で、ＩＭ及びＩＮ経路によりＩＶＰをワクチン接種された群で発熱（ＲＴ≧４０．５℃）しているブタの比率は、それぞれ６／１８（３３％）及び９／１７（５３％）であった。対照群では、ＤＣ＋３で発熱したのは１／２０（５％）のみであった。しかしながら、言及しておくべき点として、その時点（ＤＣ＋３）で、血清中に検出されたウイルス量が実際には両方のワクチン接種群で対照群と比較して有意に減少しており、したがって、攻撃接種直後のワクチン接種ブタで直腸温の上昇が観察された背景は、おそらくＰＲＲＳＶの複製だけが理由ではないことを示唆した。また、その時点以降、ワクチン接種したブタの直腸温は低下し、攻撃接種後８日目までには、すべての群の平均直腸温が既に４０℃を下回っていた。
【０１４１】
攻撃接種後の全期間で、どの群のブタも直腸温の上昇以外に、ＰＲＲＳＶと適合する臨床徴候（異常な体調、抑うつ状態、呼吸困難、咳、またはくしゃみ）を示さなかった。さらに、体重または平均１日体重増加量に、群間で差は検出されなかった。
【０１４２】
剖検時、対照群Ｔ０１のうち１８／２０のブタ（９０％）は、ＰＲＲＳＶ攻撃が肺病変の誘発に成功したことを示す、陽性の肺の視覚的スコアを有した。Ｔ０２群及びＴ０３群では、１２／１７（７１％）及び７／１６（４４％）のブタも同様に陽性と採点された。処置群間の比較では、ワクチン接種群よりも対照群の方が、肺病変率が有意に高いことを示し、投与経路にかかわらず、ＰＲＲＳＶ関連肺病変の減少に対するワクチン接種の効果を実証した。
【０１４３】
血清検査データから、ＩＭ経路またはＩＮ経路いずれかでのＩＶＰによるワクチン接種が、ワクチン接種後２８日以内にＰＲＲＳＶ特異的抗体の発生を誘導することが実証された。ワクチン接種ブタはすべて、攻撃接種時（ワクチン接種後６．５か月）にＰＲＲＳＶ抗体に対して血清陽性であり、どちらの投与経路もワクチン接種に対して強力で防御的な抗体反応を誘発できたことを示している。しかしながら、ワクチン接種群間の比較では、ＩＮ経路によってワクチン接種された群の方が、ＩＭ経路によってワクチン接種された群と比較して有意に高い抗体価を示した。
【０１４４】
ＩＮ及びＩＭ経路の両方によるワクチン接種は、ワクチン接種の２６週後にＰＲＲＳＶ攻撃に対して明らかな防御を与えたが、群間の比較では、攻撃接種後３日目に、ＩＮ経路によってワクチン接種された群（Ｔ０３）の方が、筋肉内経路によってワクチン接種された群（Ｔ０２）と比較して有意に低いウイルス血症、鼻腔排菌、及び口腔排菌を有することが明らかであった。これらの結果は、本試験の条件下で、ＩＮワクチン接種後に得られた防御がＩＭワクチン接種後よりも強力であったことを示している。これらのウイルス学的転帰の差は、ＩＭでワクチン接種された群（Ｓ／Ｐ比範囲：０．４７７〜１．９５９）と比較して、ＩＮでワクチン接種された群（Ｓ／Ｐ比範囲：０．６６５〜２．４２２）の方が、攻撃接種前のＥＬＩＳＡによって検出された抗体価が有意に高かったことで説明されると考えられる。
【０１４５】
２．５ｌｏｇ１０  ＣＣＩＤ５０の用量を含有するＥＵ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶワクチン（配列番号５）を１日齢の血清陰性ブタにＩＭ経路またはＩＮ経路で単回投与によりワクチン接種すると、ワクチン接種後２６週での病原性ＥＵ  ＰＲＲＳＶ株による攻撃接種後の血清に検出されたウイルス量の有意な減少に見られるように、２６週間の免疫持続期間が付与された。剖検時の肺病変率の有意な減少、ならびに鼻腔及び口腔の排菌の有意な減少によっても有効性が裏付けられた。
【０１４６】
実験方法
ＲＴ  ｑＰＣＲに関しては、ワクチン接種前（Ｄ−１）、攻撃接種前（Ｄ６２）、及び攻撃接種後３、５、７、及び１０日目（Ｄ６６、Ｄ６８、Ｄ７０、及びＤ７３）に採取した血清試料に対して現地のＳＯＰに従って実施した逆転写（ＲＴ）ｑＰＣＲによって、ウイルス血症（血清中のＰＲＲＳＶ量）及び排菌（スワブ材料中のＰＲＲＳＶ量）を測定した。簡潔には、精製したウイルスＲＮＡを鋳型として使用し、５０℃で３０分間逆転写し、９５℃で５分間変性させた。ＰＣＲの反応プログラムは、９５℃で２０秒間の変性と５３℃で４０秒間のアニーリングの４０サイクルで構成される。ｑＲＴ−ＰＣＲは７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍサーマルサイクラーで実施した。以下の通り、レリスタッドウイルスに適したプライマー及びプローブを選択した：
フォワードプライマー（レリスタッドＦ）：５’−ＧＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＡＧＡＣ−３’（配列番号６、最終濃度０．５マイクロモル）。
リバースプライマー（レリスタッドＲ）：５’−ＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＴ−３’（配列番号７、最終濃度０．５マイクロモル）。
プローブ（レリスタッドＳ）：５’−６−ＦＡＭ−ＣＣＴＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＴＣＧＡＴＣＣＡＧＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号８、最終濃度０．６マイクロモル）。
【０１４７】
血清検査（ＥＬＩＳＡ）
ワクチン接種前（Ｄ０）、攻撃接種前（Ｄ６７）、及び剖検時（Ｄ７７）に採取した血清を、ＩＤＥＸＸ  ＰＲＲＳ  Ｘ３  ＥＬＩＳＡを使用して製造業者の指示に従い、ＰＲＲＳＶに対する抗体について試験した。簡潔には、組換えＰＲＲＳＶ抗原でコーティングした９６ウェルプレート中で、血清試料を１：４０に希釈し、１８〜２６℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、抗ブタ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを添加し、プレートを１８〜２６℃でさらに３０分間インキュベートした。未結合コンジュゲートを洗い流し、ＴＭＢ基質をウェルに加えた。６５０ｎｍでの顕色を測定した。試料ごとにＳ／Ｐ値を記録した。Ｓ／Ｐ比が０．４以上であれば、試料をＰＲＲＳ抗体に対して陽性に分類した。Ｓ／Ｐ比が０．４未満であれば、試料を陰性に分類した。ＥＬＩＳＡの説明書は試験ファイルに含まれている。
【０１４８】
実施例４−ワクチン接種後４週目の欧州型ＰＲＲＳ分離株による攻撃接種に対する、２週齢のブタに投与されたＥＵ  ＰＲＲＳＶ改変生ワクチンの免疫開始（ＯＯＩ）
本試験の目的は、ワクチン接種の４週間後にＰＲＲＳＶにより誘発される呼吸器疾患を予防するために２週齢のブタに投与される実験用ＥＵ  ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶワクチン（配列番号５ウイルス）の免疫開始（ＯＯＩ）を評価することであった。疾患の予防を判断する際の主要変数は、Ｔ０１（対照品をワクチン接種）と比較した処置群Ｔ０２（試験品目をワクチン接種）の血清中ウイルス量であった。これは、肺病変、口腔及び鼻腔の排菌、臨床所見、直腸温、ならびに体重によって裏付けられた。
【０１４９】
１４〜１５日齢の時点で、２．０ｍＬの単回用量の対照品（ＣＰ）または試験品目（ＴＩ、配列番号５のウイルス）を各動物に筋肉内注射として投与した。ワクチン接種の４週間後、呼吸器への攻撃接種としてＥＵ  ＰＲＲＳＶ分離株Ｏｌｏｔ／９１をブタに鼻腔内投与した。攻撃期の間、血液試料、鼻腔及び口腔のスワブ、臨床所見、ならびに直腸温を剖検日まで２〜３日ごとに収集した。ワクチン接種前日、攻撃接種前日、及び剖検日にブタを計量した。攻撃接種の１０日後に、ブタに麻酔をかけて安楽死させ、剖検した。剖検時に、ＰＲＲＳＶ病変の存在について肺を評価し、スコアを記録した。Ｔ０１ブタは、ワクチン接種期間を通してＰＲＲＳＶ血清陰性及びウイルス陰性のままであり、交絡疾患因子が検出されなかったため、本試験は有効であった。
【０１５０】
群間の血清中のウイルス量を比較すると、ワクチン接種の防御効果が観察された。ＴＩをワクチン接種した群（Ｔ０２）は、攻撃接種後のすべてのサンプリング日で、対照群と比較してウイルス力価が有意に低かった。
【０１５１】
剖検時（攻撃接種の１０日後）の肺病変率の有意な減少、鼻腔及び口腔の排菌の減少、ならびに攻撃接種７日後の直腸温の低下によっても有効性が裏付けられた。体重に差は検出されなかった。ワクチン接種は、ワクチン接種後４週間以内にＰＲＲＳＶ特異的抗体の発生を誘導した。攻撃接種の１０日後、Ｔ０２群では、対照（Ｔ０１）のものと比較して抗体価が有意に高いままである。結論として、１４〜１５日齢のブタ（ＰＲＲＳＶに対して血清陰性）への２．０ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０の用量を含有する実験用ＥＵ  ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶワクチンの単回筋肉内投与により、ワクチン接種後４週間目の病原性ＥＵ  ＰＲＲＳ株による攻撃接種後に誘発される呼吸器疾患を予防した。実験計画は以下のとおりである。
【表７−２】
2020502158.tif 000011
【０１５２】
２７日目に、ブタを再収容した後、２ｍｌの攻撃接種株Ｏｌｏｔ／９１を鼻腔内（ＩＮ）経路により全動物に攻撃接種した。攻撃接種物質を両鼻孔に１．０ｍＬずつ注入することにより、総攻撃量２．０ｍＬでブタに攻撃接種した。攻撃接種後、数秒間は頭を上げた位置にブタを保持した。
【０１５３】
臨床所見及び直腸温
＊＊に指定された日に、直腸温及び臨床所見を記録した。臨床所見には、全身状態、抑うつ状態、くしゃみ、咳、及び呼吸困難が含まれていた。直腸温は現地の標準手順に従って測定した。完全な臨床検査が実施されなかった日（ワクチン接種／攻撃接種の前日及び翌日）には、標準的なＳＯＰに従って、ブタの全身健康状態を観察し、動物ケア日報（ＤＲＡＣ）のフォームに記録した。
【０１５４】
剖検及び肺スコア
剖検時に、以下の方法を用いて肺病変を採点した：１）各葉（左上葉、左中葉、左下葉、右上葉、右中葉、右下葉、及び副葉）の硬化の比率を、病変が観察された葉の比率、及び２）視覚的数値スコア（０、１、２、３）で採点し、記録する。
【０１５５】
ＲＴ  ｑＰＣＲ
標準手順に従って実施した逆転写（ＲＴ）ｑＰＣＲによって、ウイルス血症（血清中のＰＲＲＳＶ量）及び排菌（鼻腔及び口腔スワブ中のＰＲＲＳＶ量）を測定した。簡潔には、精製したウイルスＲＮＡを鋳型として使用し、５０℃で３０分間逆転写し、９５℃で５分間変性させた。ＰＣＲの反応プログラムは、９５℃で２０秒間の変性と５３℃で４０秒間のアニーリングの４０サイクルで構成される。ｑＲＴ−ＰＣＲは７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍサーマルサイクラーで実施した。結果をＲＮＡコピー／ｍｌとして表した。
【０１５６】
血清検査
ワクチン接種前、攻撃接種前、及び剖検時に採取した血清を、ＩＤＥＸＸ  ＰＲＲＳ  Ｘ３  ＥＬＩＳＡを使用して製造業者の指示に従い、ＰＲＲＳＶに対する抗体について試験した。簡潔には、組換えＰＲＲＳＶ抗原でコーティングした９６ウェルプレート中で血清試料を１：４０に希釈し、１８〜２６℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、抗ブタ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを添加し、プレートを１８〜２６℃でさらに３０分間インキュベートした。未結合コンジュゲートを洗い流し、ＴＭＢ基質をウェルに加えた。６５０ｎｍでの顕色を測定した。試料ごとにＳ／Ｐ値を記録した。Ｓ／Ｐ比が０．４以上であれば、試料をＰＲＲＳ抗体に対して陽性に分類した。Ｓ／Ｐ比が０．４未満であれば、試料を陰性に分類した。ＥＬＩＳＡの説明書は試験ファイルに含まれている。試験は３７日目に終了した（安楽死）。
【０１５７】
ウイルス血症及び排菌
統計解析の前に、適切な対数変換を用いてＲＴ−ｑＰＣＲデータを変換した。変換されたデータを一般線形反復測定の混合モデルを用いて分析した。処置効果または処置と時点の交互作用効果が有意である場合（Ｐ≦０．０５）、各時点で処置間のペアワイズ比較を行った。処置の最小二乗平均及び９５％信頼区間を逆変換して表した。ウイルス血症／排菌日数の比率も算出した。ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡコピー／ｍＬが２５０超の場合に、各試料を陽性であると判定した。これは、この技術の検出限界（試料の５００  ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡコピー／ｍＬ）の半分に相当する。２７日以前（攻撃接種前に相当）及び２７日より後（攻撃接種後）に、これまでウイルス血症であったか、またはこれまで排菌したかも測定した。
【０１５８】
肺病変
肺全体の病変率を以下の式を用いて算出した：肺全体の病変率＝（０．１０×左上葉）＋（０．１０×左中葉）＋（０．２５×左下葉）＋（０．１０×右上葉）＋（０．１０×右中葉）＋（０．２５×右下葉）＋（０．１０×副葉）。分析前に、逆正弦平方根変換を、肺全体の病変率に適用した。変換された肺病変を一般線形混合モデルによって分析した。治療効果が有意であった場合、処置群間でペアワイズ比較を行った。肺全体の病変率の逆変換最小二乗平均、その標準誤差及び９５％信頼区間を、最小値及び最大値とともに算出した。肺病変の評価スコアの頻度分布を処置ごとに算出した。正常または正常でないスコアを、二項データの一般線形混合線形モデルを用いて分析した。一般線形混合モデルが収束しなかった場合、フィッシャーの正確検定を使用してデータを分析した。処置の主たる効果が有意であれば、処置間のペアワイズ比較を行った。
【０１５９】
肺のスコア評価
処置群ごとの病変のある肺の比率を表８に示す。肺の視覚的スコアを表９に示す。剖検時、対照群Ｔ０１のうち１７／１８のブタ（９４．４％）は、ＰＲＲＳＶ攻撃が肺病変の誘発に成功したことを示す、陽性の肺の視覚的スコアを有した。Ｔ０２群では、１４／１９（７３．７％）のブタが同様に陽性と採点された。対照群Ｔ０１は、Ｔ０２群と比較して肺病変率のＬＳ平均が有意に高かった。肺全体の視覚的スコアに関して、すべてのＴ０２ブタの肺を、０（病変なし）または１（軽度の病変）のいずれかで採点した。Ｔ０１対照群では、７／１８（３８．９％）のブタが視覚的スコア２（中程度の病変）と評価された。どの群の肺も視覚的スコア３（重度の病変）と評価されなかった。
【表８】
2020502158.tif 000012
【表９】
2020502158.tif 000013
【０１６０】
ＲＴ−ｑＰＣＲの結果、ウイルス血症（血清中のＰＲＲＳＶ量）
全ブタが、０日目に血液のＲＴ−ｑＰＣＲでＰＲＲＳＶ陰性であることが見出された。攻撃接種時（２７日目）に、ＴＩをワクチン接種したブタ（Ｔ０２群）の１００％にＰＲＲＳＶ  ＲＮＡを検出することができた。その時点まで、すべてのＴ０１ブタは引き続きＰＲＲＳＶ陰性であった。対照ブタでは、ウイルス血症は２９日目（攻撃接種後２日目）に最初に検出され、試験終了時までブタはＰＲＲＳＶ陽性のままであった。攻撃接種後のすべてのサンプリング日において、対照Ｔ０１群に検出されたウイルス量は、Ｔ０２群に検出されたものより有意に高かった。２７日目（攻撃接種の日）から３６日目までのウイルス血症の結果を表１０にまとめている。最小二乗平均及び群間のＬＳ平均の差の概要を表１１に示す。
【表１０】
2020502158.tif 000014
【表１１】
2020502158.tif 000015
【０１６１】
鼻腔及び口腔の排菌
全ブタが、０日目に鼻腔及び口腔スワブのＲＴ−ｑＰＣＲでＰＲＲＳＶ陰性であることが見出された。攻撃接種時（２７日目）に、ＴＩをワクチン接種したブタ（Ｔ０２群）の７０％及び８５％が、それぞれ鼻腔及び口腔スワブにＰＲＲＳＶ  ＲＮＡが検出可能であった。その時点でＴ０１群のブタはどれも排菌していなかった。攻撃接種後の期間、Ｔ０１群の鼻腔排菌者の比率は８５％（３４日目）〜１００％（２９日目）の範囲であった。Ｔ０２群の鼻腔排菌者の比率は４２％（３６日目）〜９０％（２９日目）の範囲であった。口腔排菌に関しては、陽性ブタの比率はＴ０１群で９５〜１００％、Ｔ０２群で７３．７〜１００％の範囲であった。ＬＳＭを群間で比較すると、鼻腔スワブについては３４日目、口腔スワブについては３１日目及び３６日目を除く、すべての攻撃接種後の日でＴ０１群に有意に高いウイルス量が認められた。
【０１６２】
２７日目（攻撃接種の日）から３６日目までの鼻腔及び口腔の排菌の結果をそれぞれ表１２及び表５４にまとめている。ＬＳＭ及び群間のＬＳ平均の差の概要を表１３及び表１５に示す。
【表１２】
2020502158.tif 000016
【表１３】
2020502158.tif 000017
【表１４】
2020502158.tif 000018
【表１５】
2020502158.tif 000019
血清検査
ワクチン接種前、全ブタが血清学的にＰＲＲＳＶ陰性であった（ＩＤＥＸＸ  Ｓ／Ｐ比＜０．４）。攻撃接種時（ワクチン接種後４週間）、すべての対照ブタは引き続き血清陰性であったが、ＴＩをワクチン接種したブタの９０％はＰＲＲＳＶに対して抗体陽転した（ＩＤＥＸＸ  Ｓ／Ｐ比＞０．４）。３６日目（攻撃接種後９日目）には、全ブタがＰＲＲＳＶに対して血清陽性であった。群Ｔ０２のブタは、対照群Ｔ０１と比較して有意に高いＬＳ平均抗体価を有した。ＥＬＩＳＡによって得た血清学的結果を表７６にまとめている。
【表１６】
2020502158.tif 000020
考察
本試験では、１４〜１５日齢でワクチン接種したブタにおいて、ワクチン接種後４週間目に呼吸器への攻撃接種として病原性遺伝子型Ｉ型ＰＲＲＳＶ分離株を接種したときの、ＰＲＲＳＶ改変生ワクチンの免疫開始（ＯＯＩ）を評価した。Ｔ０１ブタはすべて、ワクチン接種期間を通してＰＲＲＳＶ血清陰性及びウイルス陰性のままであり、交絡疾患因子が検出されなかったため、この試験は有効であった。
【０１６３】
有効性を決定する際の主要変数は、Ｔ０１ブタと比較した処置群Ｔ０２の血清中のウイルス量であった。副次変数として肺病変、直腸温、排菌、臨床徴候、及び体重を比較した。
【０１６４】
Ｔ０１群とＴ０２群間の血清中のウイルス量を比較すると、ワクチン接種の防御効果が観察された。ＴＩをワクチン接種した群は、攻撃接種後のすべてのサンプリング日で、対照群Ｔ０１と比較してウイルス力価が有意に低かった。
【０１６５】
攻撃接種後、処置群にかかわらず、すべてのブタで口腔及び鼻腔の排菌を検出することができた。しかしながら、鼻腔スワブについては３４日目、口腔スワブについては３１日目及び３６日目を除く、すべての日でＴ０１群に有意に高いウイルス量が検出された。
【０１６６】
肺病変に関しては、群間の肺病変率の逆変換した最小二乗平均を比較すると、Ｔ０２ブタにはワクチンの防御効果もまた観察された。加えて、剖検時に視覚的スコアが陽性と評価された１４頭のＴ０２ブタはすべて、１（軽度の病変）と採点された。対照的に、同様に陽性と評価されたＴ０１群の１７頭のブタの肺は、１０頭がスコア１（軽度の病変）、７頭がスコア２（中程度の病変）と採点された。
【０１６７】
攻撃接種後の期間では、攻撃接種後７日目に、ＴＩをワクチン接種されたブタにおいて直腸温が有意に低かった。その時点でＴ０１のブタの２０％が発熱していたが、Ｔ０２群のブタはまったく発熱していなかった。攻撃接種前のＴ０２群の直腸温もまた、Ｔ０１と比較して有意に低かった。しかしながら、どのブタも発熱しておらず、その群において直腸温の上昇を誘発した可能性のある臨床状態は明らかにならなかった。直腸温の上昇以外に、ＰＲＲＳと適合するその他の臨床所見（抑うつ状態、呼吸困難、咳、またはくしゃみ）は全期間にわたり、どのブタにも観察されなかった。さらに、どの時点でも群間に体重の差は検出できなかった。
【０１６８】
血清学的データから、ＴＩによるワクチン接種（Ｔ０２群）が、ワクチン接種後４週間以内にＰＲＲＳＶ特異的抗体の発生を誘導したことが実証された。Ｔ０２群の抗体価は試験終了時まで増加し、ワクチン接種を受けていない攻撃接種群Ｔ０１にその時点までに検出された力価よりも有意に高かった。
【０１６９】
１４〜１５日齢のブタへの２．０ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０の用量を含有する実験用ＥＵ  ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶワクチンの単回筋肉内投与によるワクチン接種は、ワクチン接種後４週間目の病原性ＥＵ  ＰＲＲＳ株による攻撃接種後の血清に検出されるウイルス量の有意な減少に見られるように、ＰＲＲＳＶに対して防御的であった。剖検時（攻撃接種の１０日後）の肺病変率、鼻腔及び口腔の排菌の減少、ならびに攻撃接種７日後の直腸温の低下で観察された防御効果によっても有効性が裏付けられた。
【０１７０】
実施例５−欧州型ＰＲＲＳＶ分離株による攻撃接種に対する、１日齢の血清陽性ブタに投与されたＥＵ  ＰＲＲＳＶ改変生ワクチンの有効性に母体由来抗体が与える潜在的影響の評価
本試験の目的は、筋肉内（ＩＭ、群Ｔ０２）または鼻腔内（ＩＮ、群Ｔ０３）経路により１日齢の子ブタに投与したときの、ＥＵ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶ（配列番号５から発現されるウイルス）の有効性に母体由来抗体（ＭＤＡ）が与える影響を評価することであった。
【０１７１】
本試験は、ＥＭＡ／ＣＶＭＰ／ＷＰ／４３９４６７／２００７：“Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｐａｐｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｍａｔｅｒｎａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ａｎｉｍａｌｓ”及び欧州薬局方（Ｐｈ．Ｅｕｒ．）０４／２００８：５０２０７条：“Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｒａ”の勧告に基づいて計画した。両文献では、受動的に獲得された抗体及び母体由来の抗体がワクチンの有効性に及ぼす影響を適切に評価しなければならない旨が勧告されている。さらに、ＥＭＡ／ＣＶＭＰ／ＷＰ／４３９４６７／２００７には、ＭＤＡの存在下でワクチン接種された動物でのワクチンの有効性は、通常の生物学的変動にかかわらず、同年齢だが、ＭＤＡの不在下でワクチン接種された動物で得られたものと同等であるはずであると指摘されている。
【０１７２】
上記の規格に基づいて、１日齢でワクチン接種（ＩＭ及びＩＮ経路）された血清陽性ブタにおいて、呼吸器への攻撃接種として病原性遺伝子型Ｉ型ＰＲＲＳＶ分離株を接種したときの、ＥＵ  ＰＲＲＳＶ改変生ワクチンの防御免疫開始（ＯＯＩ）を評価した。血清中和試験（ＳＮＴ）によって対照群（Ｔ０１）に検出されたＭＤＡのレベルが検出不能になった時点で動物に攻撃接種した。攻撃接種に対する防御を実証するために、血清陰性動物に実施された以前の試験で評価されたものと同じパラメーターを評価した（血清中のウイルス量、肺病変、直腸温、排菌、臨床徴候、及び体重）。
【０１７３】
対照ブタ（Ｔ０１群）はすべて、ワクチン接種期間を通してＰＲＲＳＶウイルス陰性のままであり、交絡疾患因子が検出されなかったため、この試験は有効であった。
【０１７４】
ＥＵ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶをＩＭ経路で投与すると、対照群と比較した血清中のウイルス量の有意な減少によって見られるように、ワクチン接種の防御効果が観察された。鼻腔及び口腔の排菌の有意な減少、ならびに直腸温の有意な低下によっても有効性が裏付けられた。肺病変率の平均の差は、ほぼ有意であった（ｐ＝０．０９２）。本試験においてＩＭ投与後に観察された有効性は、血清陰性動物において有効性を評価した以前の試験で得られたものと同様である。いずれの試験でも、ワクチン接種の有意な影響が主要変数（ウイルス血症の減少）に観察され、また鼻腔の排菌及び直腸温の低下によっても裏付けられた。
【０１７５】
ＥＵ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶをＩＮ経路で投与したとき、評価されたパラメーターのいずれにも有意差がないことからわかるように、ＰＲＲＳＶの攻撃からの防御は達成されなかった。
【０１７６】
結論として、本試験の結果は、１日齢の子ブタにワクチンを筋肉内投与した場合、母体由来抗体とワクチンの有効性との干渉が存在しないことを実証している。しかしながら、ワクチンをＩＮ経路で投与した場合、おそらくＭＤＡによるワクチンの中和によって、ワクチン接種後のほとんどのブタに免疫反応が生じなかった。ＰＲＲＳＶ  ＭＤＡ陽性の子ブタを得るために、妊娠前期（妊娠４５日目）の６頭の妊娠した雌ブタにＥＵ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶワクチン、ロットＶＭＲＤ１３−０１５（５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／２ｍＬ）をワクチン接種した。分娩予定日の前日に、クロプロステノール（Ｃｙｃｌｉｘ（登録商標）Ｐｏｒｃｉｎｏ、Ｖｉｒｂａｃ）の筋肉内注射で分娩を誘発した。すべての雌ブタが翌日に子を産んだ。雌ブタはすべて、０日目にＰＲＲＳに対して血清陽性であった。結果を示す。
【０１７７】
ワクチンウイルスは、６．０ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／ｍｌの効力で与えられた。０日目に、目標力価（２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／２ｍＬ）になるように、ＩＶＰをワクチン希釈液（ロットＴ２２０１９）で希釈した。１アリコートのＩＶＰを採集してＢＨＫ−２１−Ｃ１２−２６細胞に滴定し、投与量を確定した。追加のＩＶＰ試料は凍結し（−８０±１０℃）、保持試料として保存した。現地の標準手順に従って、ＢＨＫ−２１−Ｃ１２−２６細胞に滴定を実施した。再構成され希釈されたワクチンの力価は１０１．８ＣＣＩＤ５０／ｍｌであり、これは１０２．１ＣＣＩＤ５０／２ｍＬ（２．１ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０／２ｍｌ）に相当する。
【０１７８】
０日目に、セクション４に記載されるようなＩＶＰまたはＣＰを子ブタにワクチン接種した。Ｔ０１群及びＴ０２群の子ブタの首の右側に筋肉内注射した。Ｔ０１群及びＴ０３群の子ブタの両鼻孔に１．０ｍＬずつを送達して、鼻腔内投与した。攻撃接種材料は、ブタ肺胞マクロファージ（ＰＡＭ）中で増殖させた、遺伝子型１型のスペインＰＲＲＳＶ分離株Ｏｌｏｔ／９１であった。この株は１９９１年に雌ブタの後期流産症例から単離された。
【０１７９】
ウイルス血症
ワクチン接種前（Ｄ０）、全ブタの血清はＲＴ−ｑＰＣＲでＰＲＲＳＶ陰性であり、さらにＴ０１群のブタはすべて、攻撃接種されるまで陰性のままであった。対照的に、Ｔ０２群（ＩＭワクチン接種）のうち８／１６（５０％）の子ブタ及びＴ０３群（ＩＮワクチン接種）のうち１／１９（５．３％）の子ブタは、攻撃接種時（ワクチン接種後６７日目）にＲＴ−ｑＰＣＲでＰＲＲＳＶ陽性であった。
【０１８０】
攻撃接種後、Ｔ０１群のブタの１００％がＤ７０（攻撃接種後３日目）にウイルス血症になり、試験終了時（ＤＣ＋１０）まで陽性のままであった。ワクチン接種群（Ｔ０２及びＴ０３）では、すべてのブタが少なくとも１回ＰＲＲＳＶ陽性と認められたが、試験終了時（ＤＣ＋１０）には１１／１６のＴ０２ブタ（６８．８％）のみが引き続きウイルス血症であった。対照的に、１頭を除くすべてのＴ０３ブタが、攻撃接種後のすべてのサンプリング時点で陽性であった。
【０１８１】
Ｔ０２群のブタは、攻撃接種後の全サンプリング日において、Ｔ０１対照群のブタよりも血清中のウイルス量が有意に低かった。ＤＣ＋３及びＤＣ＋１０では、Ｔ０２群のウイルス量はまた、Ｔ０３群よりも有意に低かった。Ｔ０１群とＴ０３群の間に有意差は検出されなかった。
攻撃接種後１０日間のウイルス血症の結果を表７にまとめている。
【表１７】
2020502158.tif 000021
【０１８２】
ウイルス血症及び排菌
統計解析の前に、適切な対数変換を用いてＲＴ−ｑＰＣＲデータを変換した。変換されたデータを一般線形反復測定の混合モデルを用いて分析した。処置効果または処置と時点の交互作用効果が有意である場合（Ｐ≦０．０５）、各時点で処置間のペアワイズ比較を行った。処置の最小二乗平均及び９５％信頼区間を逆変換して表した。ウイルス血症／排菌日数の比率も算出した。ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡコピー／ｍＬが５０超の場合に、各試料を陽性であると判定した。これは、この技術の検出限界（１００  ＰＲＲＳＶ  ＲＮＡコピー／ｍＬ）の半分に相当する。ＤＣ以前（攻撃接種前に相当）及びＤＣ後（攻撃接種後）、これまでウイルス血症であったか、または排菌したかも測定した。
【０１８３】
本試験の目的は、筋肉内（ＩＭ、群Ｔ０２）または鼻腔内（ＩＮ、群Ｔ０３）経路により１日齢の子ブタに投与したときの、ＥＵ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶの有効性に母体由来抗体（ＭＤＡ）が与える影響を評価することであった。１日齢でワクチン接種された血清陽性ブタにおいて、呼吸器への攻撃接種として病原性遺伝子型Ｉ型ＰＲＲＳＶ分離株を接種したときの有効性を評価した。ＳＮＴによってＴ０１群に検出されたＭＤＡのレベルが検出不能になった時点（６７日目）で動物に攻撃接種した。
【０１８４】
有効性を決定する際の主要変数は、Ｔ０１ブタと比較した処置群Ｔ０２及びＴ０３の血清中のウイルス量（ウイルス血症）であった。副次変数として肺病変、直腸温、排菌、臨床徴候、及び体重を比較した。
【０１８５】
Ｔ０１ブタはすべて、ワクチン接種期間を通してＰＲＲＳＶウイルス陰性のままであり、交絡疾患因子が検出されなかったため、この試験は有効であった。
【０１８６】
Ｔ０１群とＴ０２群間の血清中のウイルス量を比較すると、ＩＭワクチン接種の防御効果が観察された。ＩＶＰをＩＭ経由でワクチン接種した群は、攻撃接種後のすべてのサンプリング日で、対照群Ｔ０１と比較してウイルス力価が有意に低かった。Ｔ０１群とＴ０３群との間にウイルス力価の差は検出されず、攻撃接種後のウイルス量に対するＩＮワクチン接種の防御効果がないことを示した。Ｔ０３群で有効性がないことは、攻撃接種後３日目及び１０日目のＴ０２群と比較して、Ｔ０３群に観察されるウイルス量が有意に高いことによっても証明された。
【０１８７】
ＩＭワクチン接種後（Ｔ０２群）に付与される防御は、Ｔ０２群の鼻腔排菌者、ならびに鼻腔及び口腔の分泌物に検出されたウイルス量が対照群Ｔ０１と比較して有意に減少したことによって裏付けられた。ウイルス血症について観察されたものと同様に、Ｔ０１群とＴ０３群との間に差が検出されなかったため、ＩＶＰをＩＮ経路で投与した場合（Ｔ０３群）、ウイルス排菌にワクチン接種の陽性効果は観察されなかった。実際、Ｔ０３群で検出された鼻腔経路及び口腔経路の両方によって排菌されるウイルス量は、Ｔ０２のものよりも有意に多かった。
【０１８８】
ＩＭ経路によるワクチン接種はまた、直腸温に良好な効果を与えた。攻撃接種前（Ｄ６７）には、Ｔ０１群及びＴ０３群と比較してＴ０２群の平均直腸温は有意に低かったが、その時点ではどの群のブタも発熱（ＲＴ≧４０．５）しておらず、攻撃接種段階で動物を混合する前にＤ６７の直腸温を測定したため、この差はおそらく、最初に評価された動物のストレスが原因であると結論付けることができる。攻撃接種後の期間に、少なくとも１回は発熱したブタの比率は、Ｔ０１群、Ｔ０２群、及びＴ０３群においてそれぞれ６１％、３１％、及び４２％であった。７０日目（攻撃接種後３日目）には、対照ブタ（Ｔ０１）が、ＩＶＰをワクチン接種したブタ（Ｔ０２群及びＴ０３群）よりも有意に高い直腸温を有したが、ＤＣ＋１０には、Ｔ０３群の直腸温がＴ０１群及びＴ０２群よりも有意に高かった。直腸温の上昇以外に、ＰＲＲＳＶ感染に適合する他の臨床徴候は観察されなかった。体重に関しては、群間の有意差がないことからわかるように、ワクチン接種の影響は観察されなかった。
【０１８９】
剖検時に、対照群Ｔ０１のうち１３／１８のブタ（７２％）が、陽性の肺の視覚的スコアを有した。Ｔ０２群及びＴ０３群では、７／１６（４４％）及び１３／１９（６８％）のブタが同様に陽性と採点された。処置群間の比較は、肺病変率に有意差を示さなかった。しかしながら、対照群Ｔ０１とＩＭ経路によりＩＶＰをワクチン接種した群（Ｔ０２）との間に観察された差はほぼ有意であった（ｐ＝０．０９２）。
【０１９０】
ＥＬＩＳＡにより測定したところ、全ブタがワクチン接種前にＰＲＲＳＶ特異的抗体の存在を有していた（Ｓ／Ｐ比≧０．４）。よって、これは包含基準に適合していた。攻撃接種前（ワクチン接種後６７日目）に、対照群のブタの３９％は引き続き血清陽性であり、その時点で残存ＭＤＡの存在を示した（平均Ｓ／Ｐ比：０．２７９）。しかしながら、対照群のすべてのブタが攻撃接種後にウイルス血症を発症し、１３／１８は剖検時に陽性の肺スコアも示したという事実は、ＥＬＩＳＡによって検出された残存ＭＤＡが攻撃接種の取り込みを阻害しなかったことを示している。実際、それらのブタにおいてＰＲＲＳＶ特異的中和抗体のレベルをＳＮＴによって決定したとき、攻撃接種前（５２日目）には、すべてのＴ０１ブタに陰性結果が検出された。ＩＭ経路でＩＶＰをワクチン接種した群では、９／１６のブタが、ワクチン接種の日からワクチン接種後６７日目まで、ＥＬＩＳＡによって検出される抗体レベルの増加を示し、そのすべてが攻撃接種前に血清陽性であった（平均Ｓ／Ｐ比：１．８０３）。これは、ＭＤＡが存在する場合でもＩＭのワクチン接種以降に抗体反応が発生することを示す。対照的に、ＩＮ経路でＩＶＰをワクチン接種したブタの２／１９のみが、ワクチン接種から攻撃接種までにＰＲＲＳ抗体が増加し、３２％のみがＤ６７で血清陽性であった（平均Ｓ／Ｐ比：０．３２８）。これは、ＭＤＡによるワクチンの中和によって、他の１７頭のブタには体液性免疫反応が誘発されなかったことを示す。攻撃接種後（Ｄ７７）には、処置群にかかわらず、すべてのブタが血清陽性であり、群間にはＥＬＩＳＡ力価の有意差は検出されなかった。
【０１９１】
ＥＭＡ／ＣＶＭＰ／ＷＰ／４３９４６７／２００７ガイドライン「Ｒｅｆｌｅｃｔｉｏｎ  ｐａｐｅｒ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｍａｔｅｒｎａｌｌｙ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｏｎ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｙｏｕｎｇ  ａｎｉｍａｌｓ」には、ＭＤＡの存在下でワクチン接種された動物でのワクチンの有効性は、正常な生物学的変動にかかわらず、同年齢だが、ＭＤＡの不在下でワクチン接種された動物で得られたものと同等であるはずであると指摘されている。この規格に基づいて、本試験で観察された有効性は、ＩＮ及びＩＭ経路によって１日齢でワクチン接種された血清陰性動物においてＯＯＩを評価した以前の試験（Ｃ／３９４／１３）で得られたものと同等であるはずである。
【０１９２】
ＥＵ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶをＩＭ経路で投与した場合、両方の試験でウイルス血症（主要変数）に有意な減少が観察されたので、ブタの血清学的状態にかかわらず有効性を実証することができた。ＩＭによるワクチン接種の防御効果は、いずれの場合でも鼻腔排菌と直腸温についても実証された。さらに、ＭＤＡ＋ブタのＩＭワクチン接種後、口腔排菌もまた有意に減少し、肺病変率の差はほぼ有意であった。総合すると、これらのデータは、１日齢の子ブタにＩＭ経由でワクチンを投与した場合、ＭＤＡとワクチンの有効性との干渉が存在しないことを明らかに実証している。
【０１９３】
ＥＵ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶがＩＮ経路によって投与された場合、血清陰性動物において観察されたウイルス血症及び鼻腔排菌の有意な減少に見られるように、ＭＤＡの不在下でのみ有効性を実証することができた。ＭＤＡ＋ブタでは、評価されたパラメーターのいずれにも有意差がないことからわかるように、ＩＮによるワクチン接種が防御を誘導しなかった。
【０１９４】
したがって、１日齢の血清陽性ブタへの２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０の用量を含有するＥＵ  ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶワクチンのＩＭ経路での単回投与によるワクチン接種は、ワクチン接種後６７日目（９．６週）の病原性ＥＵ  ＰＲＲＳ株による攻撃接種後の血清に検出されるウイルス量の有意な減少に見られるように、ＰＲＲＳＶに対して防御的であった。攻撃接種後の、鼻腔及び口腔の排菌ならびに直腸温の有意な低下によっても有効性が裏付けられた。さらに、肺病変率の平均の差は、ほぼ有意であった（ｐ＝０．０９）。１日齢の血清陽性ブタへの２．５ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０の用量を含有するＥＵ  ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶワクチンのＩＮ経路での単回投与によるワクチン接種は、ＰＲＲＳＶ攻撃接種に対して防御的ではなかった。本試験の結果は、１日齢にワクチンを筋肉内投与した場合、母体由来抗体とワクチンの有効性との干渉が存在しないことを実証している。ワクチンをＩＮ経路で投与した場合、大部分のブタ（１７／１９）に、ＥＬＩＳＡによって測定される、ワクチン接種後の免疫反応が生じなかった。これは、ＭＤＡによりワクチンが中和され、群れレベルでワクチンの有効性を損なう可能性があることを示している。
【０１９５】
実施例６−ＥＵ  ＰＲＲＳＶ改変生ワクチン９６Ｖ１９８クローン１  ＭＳＶ＋３の１回投与、反復投与、及び過剰投与による１日齢のブタへの投与の伝播、拡散、及び安全性
本試験の目的は、１日齢のブタにＩＭ及びＩＮ経路で投与されるＰＲＲＳＶ改変生ワクチン９６Ｖ１９８クローン１の反復投与及び過剰投与の安全性、ならびに１回投与の伝播、拡散、及び安全性を評価することであった。本試験は、ワクチンのバッチに存在する、最小弱毒化継代レベルであるＭＳＶ＋３（８ページを参照、ＭＳＶ＋５は標準継代４９）を用いて実施した。
【０１９６】
欧州の現行法規によれば、販売承認を得るにはワクチンの安全性を証明することが義務付けられている。この場合、欧州薬局方；指令２００９／９／ＥＣ及びＶＩＣＨ  ＧＬ４４ガイドラインを考慮して、１日齢の子ブタにおけるＩＮ経路及びＩＭ経路（本ワクチンが意図する提案経路及び動物分類である）による１回投与、反復投与、及び過剰投与の安全性を実証するためのプロトコールを作成した。
【０１９７】
安全性は、獣医学的用途のワクチンに関する欧州薬局方の勧告、すなわち接種後少なくとも１４日までの直腸温ならびに局所反応及び全身反応の評価に従って評価した。ワクチン接種（１回投与）したブタからワクチン未接種の歩哨ブタへのワクチン株の拡散を評価し、ワクチン接種された動物（１回投与）の組織中での排菌（鼻粘膜、口腔液、及び糞便）及び伝播も調べた。
【０１９８】
優良試験所基準（ＧＬＰ）規制に従い、対応するＯＣＤＥガイドラインに基づいて、欧州薬局方７．７  ０４／２０１３：５０２０６（動物用ワクチン及び免疫血清の安全性評価）の要件に準拠して試験を実施した。
【０１９９】
試験品は、２ＬのＩＮまたはＩＭ投与での最大排出力価が１０５．２ＴＣＩＤ５０／２ｍｌである最小弱毒化継代レベル（ＭＳＶ＋３）のＥＵ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶ（９６Ｖ１９８クローン１）であった。これは、安全性指標が良好であるとして選択された低継代の（弱毒化の少ない）ものである。試験系では、欧州薬局方；指令２００９／９／ＥＣ及びＶＩＣＨ  ＧＬ４４ガイドラインを考慮して、１日齢の子ブタにおけるＩＮ経路及びＩＭ経路（本ワクチンが意図する動物の提案分類である）による１回投与、反復投与、及び過剰投与の安全性を実証するためのプロトコールを作成した。
【０２００】
試験の実施に必要な子ブタ（少なくともｎ＝８０）を得るために、十分な数の雌ブタ（ｎ＝１１）を使用した。ＩＭ及びＩＮの両方の経路についてワクチンの安全性、伝播、及び排菌を適切に記述できるように計画を適用した。雌ブタはＰＲＲＳＶ陰性の農場から実験農場に到着した（付属書Ｉ）。雌ブタを施設内の１１個の隔離された箱に入れた。実験農場では、分娩前に雌ブタから採血し、市販のＥＬＩＳＡ（ＰＲＲＳ  Ｘ３  Ａｂ  Ｔｅｓｔ：Ｒｅｆ．９９−４０９５、ＩＤＥＸＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；）を使用してＰＲＲＳＶ特異的抗体の存在について再度分析した（付属書Ｉ）。雌ブタへのセフチオフルナトリウム（１３ｍｌ／雌ブタ）のＩＭ投与を予防処置として実施した。
【０２０１】
雌ブタの分娩は、授精の約１１１日後〜１１３日後に（分娩と同期して）１ｍｌのＤ−クロプロステノール（Ｇａｌａｐａｎ、ＩＮＶＥＳＡ；）（付属書ＸＶＩ）を投与して同期化した。それから４０時間以内（４月９日及び１０日）に子ブタが生まれた。ワクチン接種の開始は１０日に行った。この時点で、すべての子ブタの年齢は約２４時間以下（１日齢）であった。
【０２０２】
同腹仔のバランスをとり、同腹仔を均質化するために、分娩後の初日（ワクチン接種前）に交配を行った。最終的には、各群の子ブタの総数が、欧州薬局方に定められた安全性試験を実施するための最小試料規模と同数かそれ以上となるように１０頭の雌ブタを使用した。子ブタの総数は８０頭で、ＩＮ及びＩＭの経路に４０頭ずつとした（２８頭に実験用品を１回投与、反復投与、及び過剰投与によりワクチン接種し、動物８頭を対照、及び４頭を歩哨とした）。
【０２０３】
子ブタの死亡または放逐により、一部の群が必要最小数の子ブタに到達しなかった場合のみ試験に組み入れるため、予備としてＴ０１〜Ｔ１２までの全群に３０頭の追加子ブタを分配した（付属書ＩＩ及び付属書ＸＩＶ；改訂２版）。これらの子ブタの生データは、（Ｓ）の印が付いた生データ追加ノート（番号１３〜２４までのノート）に記録した。最終的に、１０頭の雌ブタを使用し、それぞれが１１頭の子ブタを宿した。
【０２０４】
実験仮説
本試験は、実験条件下での１日齢のブタにおけるワクチンＥＵ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶ（９６Ｖ１９８クローン１）の安全性を、以下に記載するすべてのパラメーターについて、ワクチン希釈液を接種した対照群（陰性対照）と比較することにより実証するように計画した。ただし、体温は、ワクチン接種前の各子ブタの基礎体温を対照値とみなして分析した。原因がワクチンに起因する重度の局所反応または全身反応が観察されず、ワクチン接種群のすべてのブタの平均体温上昇が、ワクチン接種前の基礎平均気温と比較して１．５℃を超えず、かつ、実験群のどの子ブタもワクチン接種前の各子ブタの基礎温度と比較して２℃を超える体温上昇を示さなかった場合、ワクチンを安全とみなした。ワクチン株の拡散及び伝搬は、歩哨ブタでのワクチン株の存在を調べて評価した。ワクチン接種された動物での伝播は、血液、鼻、口、及び直腸の試料中及び組織中のウイルス量を調べて評価した。
【０２０５】
直腸温−鼻腔内及び筋肉内経路。
体温に関しては、得られた結果が獣医学用途のワクチンに対する欧州薬局方の勧告を達成しているため、評価したプロトコールすべて（経路、力価、及び投与回数）において、このワクチンが安全であると結論付けることができる。
【０２０６】
局所反応
鼻腔内経路。局所反応は観察されなかった。
【０２０７】
筋肉内経路。
剖検時に、Ｔ１２（ＩＭ経路による力価が最大）の２頭の子ブタだけが肉眼でわかる軽度の病変を有していた。顕微鏡では、Ｔ１０群のうち４頭のブタにのみ病変が観察され、病変は、ごく軽度の限局性または多巣性の単核炎症性細胞浸潤物の存在を特徴とした。
【０２０８】
全身反応及び有害事象
鼻腔内経路：ワクチン接種に伴う全身反応及び臨床徴候がないことは、ワクチンが安全であることを示している。
【０２０９】
筋肉内経路。
ワクチン投与後の有害事象は、ＩＭ経路により得られる力価が最大であった群（最大排出力価の１０倍）に属する８頭の子ブタのうち２頭にのみ観察された（Ｔ１２群）。この事象は４時間以内には消失し、子ブタは完全に回復した。毎日の臨床評価に関しては、対照群の子ブタにも跛行が観察されており、跛行の症例がワクチン投与に伴う現象であるとみなすことはできなかった。試験期間に観察された唯一の死亡が生じた原因は、圧死によるものであるため、この死はワクチン投与とは無関係であったとみなすべきである。要約すると、ＩＭ経路によるワクチン株９６Ｖ１９８クローン１は、最大力価（×１０）について記載した有害事象を除いて完全に安全であるとみなされるべきである。
【０２１０】
体重
鼻腔内経路。
体重増加の平均を比較すると、０日目から１４日目までで、Ｔ０７は対応する対照（Ｔ０２）よりも低い値を示した（ｐ＜０．０５）。しかしながら、１４日目から２８日目までの体重増加を比較したところ、特に０日目から２８日目までの全試験を考慮した場合、差は見られなくなった。したがって、鼻腔内経路でワクチン接種した子ブタの体重増加に影響はなく、受けた投与とは無関係であった。
【０２１１】
筋肉内経路。
同様に、０日目から１４日目までで、Ｔ１１は対応する対照（Ｔ０４）よりも低い値を示した（ｐ＜０．０５）。１４日目から２８日目までの期間を分析すると、差は見られなくなったが、０日目から２８日目までの全試験をみると再び差が生じた。Ｔ１１の３頭の子ブタの体重増加が、品目、力価、または投与経路に関係なく、２８日目に剖検されたすべての子ブタ（Ｔ０２、Ｔ０４、Ｔ０７、及びＴ１１を意味する）を含め、最も低かったことから、この差は説明できた。０日目から２８日目までの個々の体重増加はすべて、上述の３頭の子ブタ（それぞれ体重増加が４．０８ｋｇ、２．８９ｋｇ、及び３．０５ｋｇであった番号１９９、２０２、及び２０５の子ブタ）を除いて、５．５ｋｇ以上であった。注目すべきは、この３頭の子ブタが最も長期間、跛行を患っていたことである。結論として、Ｔ０４とＴ１１の体重増加に観察された差が、跛行事象またはワクチン接種によるものであるかどうかを区別することはできない。
【０２１２】
伝播
鼻腔内及び筋肉内経路。使用された経路とは無関係に、ワクチン接種動物において評価したほぼすべての組織にワクチン株が存在したことで、ウイルスの伝播が実証された。肺、扁桃腺、及び気管気管支リンパ節だけでなく、脾臓及び腸間膜リンパ節でも高いとみなすことができる力価で、９６Ｖ１９８クローン１株が存在することは、ワクチン株の完全な生体伝搬を示唆する。
【０２１３】
拡散
鼻腔内及び筋肉内経路。口腔液及び直腸スワブ中のワクチン株の検出は、ワクチン接種された子ブタからは不定であったが、鼻腔スワブ中では一定して高かった。ワクチン株検出の頻度分布は時間とともに減少した。すべての歩哨ブタからの血液試料中のワクチン株の検出と合わせ、これらの結果は、９６Ｖ１９８クローン１がワクチン接種後早期に活性になり、かつ継続的に排菌されたことを実証している。また、歩哨子ブタからの組織及び血液試料中にワクチン株が存在したことは、ワクチン接種された子ブタから拡散したウイルスが活性であることを示していた。すなわち、この株は、歩哨動物を感染させることができ、体内で複製することができた。さらには、Ｔ０９のうち１頭のＩＭ歩哨ブタは、ＰＲＲＳに適合する肺病変に加え、ＩＨＣに対する陽性結果も示していた。結論として、上記の結果は、９６Ｖ１９８クローン１が、少なくともワクチン接種後の早期に、ワクチン接種された子ブタからワクチン接種していない子ブタへと、一貫して伝染し得ることを示している。
【０２１４】
肺病変
鼻腔内及び筋肉内経路。ＰＲＲＳに適合する巨視的及び微視的病変（間質性肺炎）を有し、さらにＰＲＲＳＶ  ＩＨＣに陽性の結果を示した９頭のブタはすべてＩＭ群のものであった。したがって、ＩＮ経路は安全であるが、ＩＭ経路は少なくとも各群（Ｔ０９〜Ｔ１２から）の１頭のブタにおいてＰＲＲＳＶに適合する肺病変を誘発する可能性があると結論づけることができる。
【０２１５】
実施例７−ＰＲＲＳｖ血清陽性の妊娠雌ブタに投与した場合の、単回用量のＥＵ  ＰＲＲＳｖ改変生ワクチンの反復投与の安全性
本試験は、妊娠後期（妊娠８７日目）である血清陽性の雌ブタに、単回用量のＥＵ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶを反復投与した場合の安全性を実証するように計画した。１回目または２回目の投与後にワクチン接種後の全身反応は観察されなかった。さらに、全観察期間を通して、いずれの雌ブタにも臨床所見は記録されなかった。
【０２１６】
直腸温に関しては、ワクチン接種後のどの時点でも雌ブタは発熱（ＲＴ≧４０．１℃）を示さなかった。また、ワクチン接種後の平均直腸温は、ワクチン接種前の平均直腸温プラス１．５℃を超えず、また自身の直腸温がワクチン接種前プラス２℃を超えた雌ブタはいなかった。
【０２１７】
１回目と２回目の投与で、試験品目をワクチン接種された雌ブタのそれぞれ６３％と５０％に、注射箇所に局所反応が観察された。反応は、触知可能な及び／または目視可能な腫脹（直径０．４〜２．８ｃｍ）からなり、これは１〜６日の間に消失した。どの投与後にも、注射箇所に発赤、局所的な発熱、または疼痛を示した雌ブタはいなかった。
【０２１８】
繁殖能力に関しては、流産または早産は記録されなかった。加えて、死産、ミイラ化、生存能力の低い子ブタ、及び離乳前の死亡の数にワクチン接種が与える明らかな影響は観察されなかった。出生時及び離乳時に子ブタから採取された血清試料に、ＲＴ−ｑＰＣＲで陰性結果が検出されたことからわかるように、ワクチン接種は経胎盤感染を誘発しなかった。結論として、ワクチンの反復投与は妊娠後期の血清陽性の雌ブタに安全である。
【０２１９】
本明細書で使用される略語は以下の通りである：ＢＨＫ−２１、ベビーハムスター腎臓クローン２１；ＢＲＰ、バッチリリースプロトコール；ＣＣＩＤ５０、細胞培養物５０％感染用量；ＣＰ、対照品；Ｄ、日；ＤＲＡＣ、動物ケア日報；ＩＤ、識別番号；ＧＬＰ、優良試験所基準；ＩＦ、免疫蛍光；ＩＶ、静脈内；ＭＬＶ、改変生ワクチン；ＭＳＶ、マスターシードウイルス；ＮＡ、該当なし；Ｐ、継代；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＰＩ、接種後；ＰＲＲＳＶ、豚繁殖・呼吸障害症候群ウイルス；ＲＴ、直腸温；ＲＴ−ｑＰＣＲ、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応；ＳＯＰ、標準業務手順；Ｓ／Ｐ、試料対陽性；ＴＢＤ、未決定；ＴＩ、試験品目；及びＶＩＣＨ、Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎ。
【０２２０】
試験の目的と根拠
ＥＵ  ＰＲＲＳＶ改変生ワクチン（ＭＬＶ）は、ＰＲＲＳ汚染環境での未経産ブタ及び雌ブタの能動的な予防接種により、ＰＲＲＳウイルスの欧州株への感染を原因とするウイルス血症、経胎盤感染症、及び流産を減少させることを目的としている。現行法規によれば、販売承認を得るにはワクチンの安全性を証明することが義務付けられている。本試験は、欧州薬局方７．７：０４／２０１３／５０２０６−動物用ワクチン及び免疫血清の安全性評価、及びＶＩＣＨ  ＧＬ４４−動物用生ワクチン及び不活化ワクチンの対象動物安全性というガイドラインに従って計画された。本試験の目的は、妊娠後期である血清陽性の雌ブタにおいて、ＥＵ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶの反復投与（１回＋１回）の安全性を評価することである。試験した物質は、６．６ｌｏｇ１０ＣＣＤ５０／バイアルのＥＵ  ＰＲＲＳＶ、９６ｖ１９８ｃ１株、（ＭＳＶ＋３）であり、１回に５．２ｌｏｇ１０ＣＣＩＤ５０を２ｍＬにして筋肉内投与した。ＲＴ  ｑＰＣＲ
【０２２１】
標準手順に従って実施した逆転写（ＲＴ）ｑＰＣＲによって、ウイルス血症（血清中のＰＲＲＳＶ量）を測定した。簡潔には、精製したウイルスＲＮＡを鋳型として使用し、５０℃で３０分間逆転写し、９５℃で５分間変性させた。ＰＣＲの反応プログラムは、９５℃で２０秒間の変性と５３℃で４０秒間のアニーリングの４０サイクルで構成される。ｑＲＴ−ＰＣＲは７５００  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍサーマルサイクラーで実施した。
【０２２２】
プライマー及びプローブの配列は以下の通りである（配列番号６〜８、連番）：
フォワードプライマー（レリスタッドＦ）：５’−ＧＣＡＣＣＡＣＣＴＣＡＣＣＣＡＧＡＣ−３’（最終濃度０．５μＭ）。
リバースプライマー（レリスタッドＲ）：５’−ＣＡＧＴＴＣＣＴＧＣＧＣＣＴＴＧＡＴ−３’（最終濃度０．５μＭ）。
プローブ（レリスタッドＳ）：５’−６−ＦＡＭ−ＣＣＴＣＴＧＣＴＴＧＣＡＡＴＣＧＡＴＣＣＡＧＡＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（最終濃度０．６μＭ）。
【０２２３】
血清検査
ワクチン接種前に採取した雌ブタの血清を、製造業者の指示に従って、ＩＤＥＸＸ  ＰＲＲＳ  Ｘ３  ＥＬＩＳＡを使用してＰＲＲＳＶに対する抗体について試験した。簡潔には、組換えＰＲＲＳＶ抗原でコーティングした９６ウェルプレート中で血清試料を１：４０に希釈し、１８〜２６℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、抗ブタ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを添加し、プレートを１８〜２６℃でさらに３０分間インキュベートした。未結合コンジュゲートを洗い流し、ＴＭＢ基質をウェルに加えた。６５０ｎｍでの顕色を測定した。試料ごとにＳ／Ｐ値を記録した。Ｓ／Ｐ比が０．４以上であれば、試料をＰＲＲＳ抗体に対して陽性に分類した。Ｓ／Ｐ比が０．４未満であれば、試料を陰性に分類した。ＥＬＩＳＡの説明書は試験ファイルに含まれている。
【０２２４】
臨床所見
ワクチン接種後の期間（Ｄ０〜Ｄ２８）に、どの雌ブタにも異常な臨床所見は記録されなかった。
【０２２５】
直腸温
ワクチン接種前及び以降の４日間に得た、各群の平均直腸温（ＲＴ）を＊＊及び＊＊に示す。直腸温の個別データは＊＊に示されている。
【０２２６】
直腸温を試験する際には、次の２つの基準に従った：
ａ）群全体のワクチン接種後の平均直腸温が、ワクチン接種前の平均直腸温プラス１．５℃を超えてはならない。
１回目のワクチン接種：ワクチン接種後（Ｄ０＋４時間、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、またはＤ４のいずれか）の平均直腸温≦［ワクチン接種前の平均直腸温（Ｄ−１／Ｄ０の平均値）］＋１．５℃
２回目のワクチン接種：ワクチン接種後（Ｄ１４＋４時間、Ｄ１５、Ｄ１６、Ｄ１７、またはＤ１８のいずれか）の平均直腸温≦［ワクチン接種前の平均直腸温（Ｄ１３／Ｄ１４の平均値）］＋１．５℃
ｂ）各雌ブタのワクチン接種後の個々の直腸温が、ワクチン接種前の直腸温（Ｐｒｅ−ｖａｃ）プラス２℃を超えてはならない。
１回目のワクチン接種：ワクチン接種後（Ｄ０＋４時間、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、またはＤ４のいずれか）の個々の直腸温≦［ワクチン接種前の個々の直腸温（Ｄ−１／Ｄ０の個々の平均値）］＋２．０℃
２回目のワクチン接種：ワクチン接種後（Ｄ１４＋４時間、Ｄ１５、Ｄ１６、Ｄ１７、またはＤ１８のいずれか）の個々の直腸温≦［ワクチン接種前の個々の直腸温（Ｄ１３／Ｄ１４の個々の平均値）］＋２．０℃
【０２２７】
Ｔ０１群とＴ０２群のいずれも、ワクチン接種後の平均ＲＴが、ワクチン接種前の平均値プラス１．５℃を超えなかった。さらに、Ｔ０１群またはＴ０２群のどの雌ブタでも、各ブタのワクチン接種後のＲＴが、同じ雌ブタのワクチン接種前の直腸温プラス２℃を超えなかった。初回投与後のＲＴの最大増加は、Ｔ０１群では０．８１℃（２日目）、Ｔ０２群では０．７６℃（０日目＋４時間）であった。２回目の投与後の最大増加は、Ｔ０１群（０．８１℃）及びＴ０２群（０．４７℃）の両方で１７日目に観察された。Ｔ０１群またはＴ０２群のどの雌ブタも、ワクチン接種後のどの時点でも直腸温の上昇（≧４０．１℃）を示さなかった。
【０２２８】
ワクチン接種後の全身反応
Ｔ０１群またはＴ０２群のどの雌ブタにも、ワクチン接種後の全身反応は観察されなかった。
【０２２９】
注射部位での局所反応
ワクチン接種前に、注射部位での局所反応の評価を妨げる可能性がある、以前の接種によって引き起こされた頸部領域の局所反応が存在しないか、すべての雌ブタを検査した。以前の接種により、３頭の雌ブタの右頸部に古い反応が見られ、うち２頭がＴ０１群（１８０２及び２２５９）、１頭がＴ０２（１６６３）であった。しかしながら、これらの反応はすべて下方に位置し、それぞれの接種箇所からは離れていた。２回目のワクチン接種の前に左頸部を検査したところ、４頭の雌ブタに古い反応が観察され、うち２頭がＴ０１群（３１６及び１８０２）、２頭がＴ０２群（２５４７及び２８４２）であった。右頸部での観察と同様、これらの反応は接種箇所より下に位置していた。いずれの場合（左右両方の頸部）にも、古い反応がワクチン接種後の局所反応の評価を妨げる可能性があるとは考えられなかった。ＣＰを接種した雌ブタ（Ｔ０１群）はいずれも、ワクチン接種後のどの時点でも注射部位に局所反応を示さなかった。ワクチン接種後にＴ０２群に観察された局所反応を１７にまとめる。
【０２３０】
１回目のワクチン接種後、Ｔ０２雌ブタの６３％（５／８）は、右頸部の注射部位に目視可能な及び／または触知可能な腫脹を示した。観察された最大の腫脹は、６日間持続する直径２．８ｃｍ（スコア３に相当）の反応であった。注射箇所に発赤、局所的な発熱、または疼痛を示した雌ブタはいなかった。
【０２３１】
２回目のワクチン接種後、目視及び触知可能な腫脹（左頸部）が、Ｔ０２雌ブタの５０％（４／８）に観察された。観察された反応はすべて、スコア１または２（最大直径１ｃｍ）と評価され、最大５日間持続した。初回ワクチン接種後の観察と同様、注射箇所に発赤、局所的な発熱、または疼痛を示した雌ブタはいなかった。
【表１８】
2020502158.tif 000022
【０２３２】
注射部位の死後検査
肉眼的検査では、両群の数頭の雌ブタが頸部筋肉に病変を有することが観察された。病変は主に、頸部領域全体に広がる乾酪性物質の多発性結節からなるものであった。この病変は注射時点では検出されなかったため、古い注射に起因するものであった。
【０２３３】
Ｔ０２雌ブタの接種箇所を検査したところ、右頸部では１／８に、左頸部では３／８に目視可能な反応が存在した。Ｔ０１群でも、１頭の雌ブタ（１／７）が、初回接種箇所（右頸部）に目視可能な反応を示した。反応はすべて、白い筋線維の存在を特徴とし、ほとんどの場合、明らかに針痕に沿っており、測定可能なほどではなかった。さらに、２頭のＴ０２雌ブタ（左接種箇所）に多発性結節が観察された。
【０２３４】
繁殖能力
どの処置群にも中絶または早産は記録されなかった。妊娠期間の長さは、Ｔ０１群で１１４〜１１７日、Ｔ０２群で１１４〜１１９日の範囲であった。出生した健康な子ブタを雌ブタごとに耳札で識別し、飼育した。
【０２３５】
本試験では、血清陽性の雌ブタの妊娠後期（妊娠８７日目）に、単回用量のＥＵ  ＰＲＲＳ  ＭＬＶを反復投与した場合の安全性を評価した。安全性パラメーターには、ワクチン接種に対する全身反応、ワクチン接種後の直腸温、臨床所見、注射部位での局所反応、繁殖能力、及び注射部位の死後検査が含まれた。
【０２３６】
１回目または２回目の投与後にワクチン接種後の全身反応は観察されなかった。さらに、全試験期間を通して、いずれの雌ブタにも一般的な臨床所見は記録されなかった。
【０２３７】
直腸温に関しては、ワクチン接種後のどの時点でも雌ブタは発熱（ＲＴ≧４０．１℃）を示さなかった。また、ワクチン接種後の平均直腸温は、ワクチン接種前の平均直腸温プラス１．５℃を超えず、また自身の直腸温がワクチン接種前プラス２℃を超えた雌ブタはいなかった。
【０２３８】
１回目と２回目のワクチン接種で、Ｔ０２雌ブタのそれぞれ６３％と５０％に、注射箇所に局所反応が観察された。１回目のワクチン接種後、観察された最大の腫脹は、最大６日間持続する直径２．８ｃｍの反応であった。２回目のワクチン接種後、最大腫脹は直径１ｃｍであり、最大持続期間は５日間であった。どの投与後にも、注射箇所に発赤、局所的な発熱、または疼痛を示した雌ブタはいなかった。
【０２３９】
死後検査では、ワクチン接種された雌ブタの３／８にのみ、接種箇所に目視可能な反応が観察された。そのうちの２頭（１５及び１６６３）は、局所反応の評価で最も高い腫脹スコア（それぞれ２及び３）を得たものに対応していた。肉眼的には、その病変は針痕に沿った白い筋線維を特徴として示し、筋線維が関与する中等度の肉芽腫性筋炎であると診断された。雌ブタ１５の場合、病変の内部にワクチン滴が観察され、この病変が試験品目の投与の結果として誘発されたという事実を裏付けた。目視可能な反応を示した他方のＴ０２雌ブタ（２５４７）についても、病変は針痕に沿った白い線維を特徴として示したが、この場合は、乾酪性物質を含む多発性結節も伴った。組織病理学的分析で、この病変は、巣状だが広範囲の壊死が存在する重度の肉芽腫性筋炎であると診断された。頸部領域には多発性結節が存在するが、特に接種箇所には存在しないことが、Ｔ０２雌ブタの８／８、及びＴ０１雌ブタの５／７にも観察されたことから、雌ブタ２５４７に観察された病変は試験品目によってではなく、以前の注射によって引き起こされた可能性がある。このことは、局所反応のｉｎ  ｖｉｖｏ評価時に、この雌ブタが５日間持続した直径０．５ｃｍ未満の腫脹しか有さなかったという事実によって裏付けられると考えられる。
【０２４０】
ＰＲＲＳＶに伴う繁殖障害は、早産、後期流産、死産または生存能力の低い子ブタ、及びミイラ化した胎児の増加を特徴とする。本試験では、流産または早産は記録されなかった。加えて、死産、ミイラ化、または生存能力の低い子ブタの数にワクチン接種が与える明らかな影響は観察されなかった。ＰＲＲＳＶ感染はまた、離乳前の死亡率を増加させる可能性もある。本試験では、平均の離乳前死亡率が、Ｔ０１群とＴ０２群でそれぞれ６．０と５．３であり、子ブタの生存にワクチン接種の影響がないことを示した。
【０２４１】
最後に、Ｔ０１及びＴ０２両方の雌ブタから生まれた子ブタから出生時または離乳時に採取した血清試料はすべてＲＴ−ｑＰＣＲでＰＲＲＳＶ陰性であり、ワクチン接種後の経胎盤感染が存在しないことを示した。
【０２４２】
したがって、妊娠８７日目のＰＲＲＳＶ血清陽性雌ブタへの単回用量のＥＵ  ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶの反復投与は、異常な全身反応（アナフィラキシーショック、嘔吐）を誘発せず、ワクチン接種後の１４日間に臨床所見を何も誘発せず、ワクチン接種後に異常な直腸温を誘発せず、１回目と２回目のワクチン接種後、雌ブタのそれぞれ６３％と５０％で注射部位に局所反応（そのような反応は、触知可能な及び／または目視可能な腫脹（直径０．４〜２．８ｃｍ）からなる）を引き起こしたが、１〜６日の間に消失し、繁殖パラメーターに影響を及ぼさず、かつ、経胎盤感染を引き起こさなかった。
【図１Ａ】
2020502158.tif 000023
【図１Ｂ】
2020502158.tif 000024
【図１Ｃ】
2020502158.tif 000025
【図１Ｄ】
2020502158.tif 000026
【図１Ｅ】
2020502158.tif 000027
【図１Ｆ】
2020502158.tif 000028
【図１Ｇ】
2020502158.tif 000029
【図１Ｈ】
2020502158.tif 000030
【図１Ｉ】
2020502158.tif 000031
【図１Ｊ】
2020502158.tif 000032
【配列表】
2020502158000001.app
【国際調査報告】
2020502158.tif 000033
2020502158.tif 000034
2020502158.tif 000035
2020502158.tif 000036
2020502158.tif 000037
2020502158.tif 000038