(57)【要約】本発明は、天然に存在する野生型ケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素と比較して改善された特性を有する操作されたケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素、ならびに操作されたケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、ならびに操作されたケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素を使用して、抗ウイルス化合物、例えば、ヌクレオシド阻害剤の合成において使用されるキラル触媒を合成する方法を提供する。本発明は、操作された酵素を使用して、ワンポット多酵素系においてキラルアルコールを脱ラセミ化する方法をさらに提供する。
2020517284.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、１１２、１２４、および／または１３８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作されたケトレダクターゼバリアント。
【請求項２】
配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置３７、３７／２１１、３７／２１１／２２９、３７／２２９、４５、５２、５２／５７／１１０／２７２／２９６、５２／５７／２７２、５２／５７／２７２／２７４／２７９／２９６、５２／５７／２７２／２７９／２９６、５５／５７／２７６、５６、５７、５７／１０４／１１４、５７／１０４／１１４／２２９、５７／２８６、７９／８３／２７５／２７６、８３、８３／２７５／２７６、８３／２７６、１０４、１１０、１１４、１３８／１４６／２５８／２８９、２１１、２１１／２２９、２２８、２２９、２６３、２６８、２７２、２７４、２７５／２７６、２７６、２７９、および３０９から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、前記位置が、配列番号２に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。
【請求項３】
配列番号１１２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに２４／１０６／１３６／２２０／２５８／２６０／３１４／３１５、２４／１０６／２１４／２５０／２５８／２６０／３１４／３１５、２４／２２０／３１４／３１５、１２２／１５９／３１６／３１８、１３５、１３９／２０７、１５９／２５１／２７２／２７７／３１６／３１８／３３０、および２０７から選択される少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、前記位置が、配列番号１１２に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。
【請求項４】
配列番号１２４と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに２／１０１／１７９／１８２／２２８／２３８／２８２、３／９５、３／９５／２２８／３１４、２４／９５／２２８、９５、９５／１３５／１３９／２０７、および１５９／２２８／３０９／３３０から選択される位置における少なくとも１つの置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、前記位置が、配列番号１２４に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。
【請求項５】
配列番号１３８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに１９、２４／４３／４７／４９／６７／６８／７０／９１／２２０、２４／６８／９１／２１８／２２０、６７、７２、７４／７５／７８／１０８、７５／７８／９９／１０８／２１５／２２４、７８／１０７、９５、９６、および１１４から選択される位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、前記位置が、配列番号１３８に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアント。
【請求項６】
配列番号２、１１２、１２４、および／または１３８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１から５のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。
【請求項７】
配列番号２、１１２、１２４、および／または１３８と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１から６のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。
【請求項８】
配列番号２、１１２、１２４、または１３８に示されるポリペプチド配列を含む、請求項１から７のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。
【請求項９】
前記操作されたケトレダクターゼが、表５．１、６．１、７．１、および／または８．１に与えられるバリアントをコードするポリペプチド配列を含む、請求項１から８のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。
【請求項１０】
前記操作されたケトレダクターゼが、配列番号４から１７０に示される偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項１から９のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアント。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアントをコードする操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１２】
配列番号３から１６９に示される奇数番号の配列から選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
請求項１１および／または１２に記載の操作されたポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１４】
少なくとも１つの制御配列をさらに含む、請求項１３に記載のベクター。
【請求項１５】
請求項１３および／または１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１から１０のいずれかに記載の操作されたケトレダクターゼバリアントを生成するための方法であって、前記操作されたケトレダクターゼバリアントが前記宿主細胞によって産生される条件下で、請求項１５に記載の前記宿主細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞によって産生される前記操作されたケトレダクターゼバリアントを回収するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項１から１７のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたケトレダクターゼバリアントを含む組成物。
【請求項１９】
配列番号１７２および／または２０８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアント。
【請求項２０】
配列番号１７２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置１０／７３／７８／１３７／３２３／３２５、１０／７３／７８／２３３／３２３、１０／７３／１３７、１３／４１／６３／１３２／１９３／１９５、１８／４４／１１９／１２４／１３２／１３７／１４５／１５８／１７５／１７７／２９３／３１７／３２３、１８／４４／１１９／１２４／１３２／１３７／１４５／１５８／１７７／２９３／３２３、１８／４４／１１９／１２４／１３２／１３７／１４５／２９３／３２３／３３４／３３６、３２／４４／１３２／１３７／１４５／１８６／２３３／２９３／３２３／３３６、４１／４４／８８／１９３／１９５、４４／６９／１２０／１３２／１３７／１４５／１７５／１９５／２９３／３２３、４４／１１３／１３２／１４５、４４／１１９／１３２／１３７／１４５／１５８／１７５／１７７／２９３／３１７／３２３、４４／１３２／１３５／１３６／１３７／１４５／２９３、４４／１３２／１３６／１３７／１４５／２９３、４４／１３２／１３７／１４５／２３３／３０８／３２３、４４／１３２／１３７／１４５／２９３／３２３、４４／１３２／１４５、４４／１３２／１４５／１９５／２９３／３２３、１３７／２３３／３０３／３２３、および２６６から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントであって、前記位置が、配列番号１７２に関して番号付けされている、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアント。
【請求項２１】
配列番号２０８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置３２／５９／１２４／１７７／１９１／３２７、７８／１５０／１９８／３２７／３２８、８３／２６６、９５／２１１／２１３／３２２、１０４、１７８／１９４／２１１／２１３／３２２、２０６、２１１／２１３／３２２、２１５、２６２、２６６、および３２３から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントであって、前記位置が、配列番号２０８に関して番号付けされている、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアント。
【請求項２２】
配列番号１７２および／または２０８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１９から２１のいずれかに記載の操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアント。
【請求項２３】
配列番号１７２および／または２０８と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１９から２２のいずれかに記載の操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアント。
【請求項２４】
配列番号１７２または２０８に示されるポリペプチド配列を含む、請求項１９から２３のいずれかに記載の操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアント。
【請求項２５】
表９．１、１０．１、および／または１１．１に与えられるバリアントをコードするポリペプチド配列を含む、請求項１９から２４のいずれかに記載の操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアント。
【請求項２６】
配列番号１７２から２６０に示される偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項１９から２５のいずれかに記載の操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアント。
【請求項２７】
請求項１８から２６に示される少なくとも１つの亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントを含む組成物。
【請求項２８】
請求項１９から２６のいずれかに記載の操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントをコードする操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項２９】
配列番号１７１から２５９に示される奇数番号の配列から選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるポリヌクレオチド配列を含む、請求項２８に記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３０】
請求項２８および／または２９に記載の操作されたポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項３１】
少なくとも１つの制御配列をさらに含む、請求項３０に記載のベクター。
【請求項３２】
請求項３０および／または３１に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３３】
請求項１９から２５のいずれかに記載の操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントを生成するための方法であって、前記操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントが前記宿主細胞によって産生される条件下で、請求項３２に記載の前記宿主細胞を培養するステップを含む、方法。
【請求項３４】
前記宿主細胞によって産生される前記操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントを回収するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
キラルアルコールを脱ラセミ化するための方法であって、請求項１から１７のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたケトレダクターゼバリアントを含み、キラルアルコールが脱ラセミ化される条件下で、請求項１９から２５のいずれかに記載の少なくとも１つの操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアント、少なくとも１つのキラルアルコール、および少なくとも１つの補因子を含む、方法。
【請求項３６】
ワンポット反応において行われる、請求項３５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年４月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／４９１，１６１号に対する優先権を主張し、その全体は、全ての目的のために、本明細書に参照により援用される。
配列表、表またはコンピュータープログラムの参照
【０００２】
ファイル名ＣＸ２−１６６ＵＳＰ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔとして、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して、コンピューター可読形態（ＣＲＦ）で、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１により本明細書と同時に提出した配列表は、参照により本明細書に組み込まれる。この配列表の電子コピーは、２０１７年４月２５日に作成され、ファイルサイズは５４４キロバイトであった。
【０００３】
本発明は、天然に存在する野生型ケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素と比較して改善された特性を有する操作されたケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素、ならびに操作されたケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、ならびに操作されたケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素を使用して、抗ウイルス化合物、例えば、ヌクレオシド阻害剤の合成において使用されるキラル触媒を合成する方法を提供する。本発明は、操作された酵素を使用して、ワンポット多酵素系（ｏｎｅ−ｐｏｔ，ｍｕｌｔｉ−ｅｎｚｙｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ）においてキラルアルコールを脱ラセミ化する方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００４】
ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）またはカルボニルレダクターゼクラス（ＥＣ１．１．１．１８４）に属する酵素は、対応するプロキラルケトン基質からの、および対応するラセミ体アルデヒド基質の立体選択的還元による光学活性アルコールの合成に有用である。ＫＲＥＤは、典型的には、ケトンおよびアルデヒド基質を対応するアルコール生成物に変換するが、逆反応、すなわちアルコール基質の対応するケトン／アルデヒド生成物への酸化も触媒し得る。ＫＲＥＤなどの酵素によるケトンおよびアルデヒドの還元ならびにアルコールの酸化は、補因子、最も一般的には還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、および酸化反応にはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ）を必要とする。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、電子供与体としての役割を果たし、その一方でＮＡＤおよびＮＡＤＰは、電子受容体としての役割を果たす。ケトレダクターゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼが、リン酸化された補因子またはリン酸化されていない補因子のいずれか（その酸化および還元状態）を受容することが観察されることが多いが、両方の補因子を受容することが観察されることはほとんどない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
重要な化合物の生産のための多くの化学合成手順を回避するために、異なるケトおよびアルデヒド基質のキラルアルコール生成物への酵素変換にケトレダクターゼが用いられることが増えている。これらの用途は、ケトレダクターゼを発現する全細胞を、生体触媒的ケトンおよびアルデヒド還元もしくは生体触媒的アルコール酸化に用いることができ、または全細胞中の多数のケトレダクターゼの存在が所望の生成物の立体純度および収量に悪影響を及ぼす場合には、精製された酵素の使用によって用いることができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの用途には、補因子（ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ）再生酵素、例えば、グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）、ギ酸デヒドロゲナーゼ、亜リン酸デヒドロゲナーゼなどが、ケトレダクターゼと併用され得る。種々のケト基質の対応するキラルアルコール生成物への変換または種々のアルコール基質の対応するケトン生成物への変換を行うために使用することができる他のケトレダクターゼ酵素を同定することが望ましい。
【０００６】
本発明は、天然に存在する野生型ケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素と比較して改善された特性を有する操作されたケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素、ならびに操作されたケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、ならびに操作されたケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素を使用して、抗ウイルス化合物、例えば、ヌクレオシド阻害剤の合成において使用されるキラル触媒を合成する方法を提供する。本発明は、操作された酵素を使用して、ワンポット多酵素系においてキラルアルコールを脱ラセミ化する方法をさらに提供する。
【０００７】
さらに、本発明は、天然に存在する野生型亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素と比較して改善された特性を有する操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素、ならびに操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、および操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素を使用して、ワンポット多酵素系においてキラルアルコールを脱ラセミ化する方法を提供する。
【０００８】
本発明は、ワンポット多酵素系においてラセミ体アルコール基質を光学的に純粋なアルコール生成物へと立体選択的に脱ラセミ化し、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（配列番号２）から得られる、天然に存在する野生型ケトレダクターゼ（「ＫＲＥＤ」）酵素、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ（配列番号１１２）から得られる野生型ＫＲＥＤ酵素と比較した場合、または他の操作されたケトレダクターゼ酵素と比較した場合に改善された特性を有することができる操作されたＫＲＥＤ酵素を提供する。さらに、本発明は、同一のワンポット多酵素系においてＮＡＤＰＨを優先的にリサイクルすることができる、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼ（「ＰＤＨ」）酵素を提供する。
【０００９】
一部のさらなる実施形態では、操作された酵素は、変更された酵素活性に加えて、１つまたは複数の改善された特性を有する。例えば、一部の実施形態では、基質を生成物に還元するためおよび／または（Ｓ）エナンチオマーを優先的に酸化させるために、野生型ケトレダクターゼ酵素と比較して、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは立体選択性が増加している。酵素特性の改善には、これらに限定されないが、熱安定性、溶剤安定性の増加、および／または低減された生成物阻害が挙げられる。
【００１０】
本発明は、配列番号２、１１２、１２４、および／または１３８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。
【００１１】
本発明はまた、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置３７、３７／２１１、３７／２１１／２２９、３７／２２９、４５、５２、５２／５７／１１０／２７２／２９６、５２／５７／２７２、５２／５７／２７２／２７４／２７９／２９６、５２／５７／２７２／２７９／２９６、５５／５７／２７６、５６、５７、５７／１０４／１１４、５７／１０４／１１４／２２９、５７／２８６、７９／８３／２７５／２７６、８３、８３／２７５／２７６、８３／２７６、１０４、１１０、１１４、１３８／１４６／２５８／２８９、２１１、２１１／２２９、２２８、２２９、２６３、２６８、２７２、２７４、２７５／２７６、２７６、２７９、および３０９から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号２に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、３７Ｒ、３７Ｒ／２１１Ｒ、３７Ｒ／２１１Ｒ／２２９Ｒ、３７Ｒ／２２９Ｒ、４５Ｒ、５２Ｄ、５２Ｄ／５７Ｌ／２７２Ｈ、５２Ｓ、５２Ｓ／５７Ｌ／１１０Ｔ／２７２Ｈ／２９６Ｆ、５２Ｓ／５７Ｌ／２７２Ｈ／２７９Ｈ／２９６Ｆ、５２Ｓ／５７Ｌ／２７２Ｈ／２７４Ｖ／２７９Ｈ／２９６Ｆ、５５Ｆ／５７Ａ／２７６Ｍ、５６Ｌ、５７Ｉ、５７Ｉ／１０４Ｇ／１１４Ｈ、５７Ｌ、５７Ｌ／１０４Ｇ／１１４Ｈ／２２９Ｒ、５７Ｘ／２８６Ｘ、７９Ｔ／８３Ｓ／２７５Ｎ／２７６Ｍ、８３Ｉ、８３Ｓ／２７５Ｎ／２７６Ｍ、８３Ｓ／２７６Ｍ、１０４Ｇ、１１０Ｔ、１１４Ｈ／Ｋ／Ｍ、１３８Ｖ／１４６Ｓ／２５８Ｖ／２８９Ｓ、２１１Ｒ、２１１Ｒ／２２９Ｒ、２２８Ｓ、２２９Ｒ、２６３Ｈ／Ｙ、２６８Ｍ／Ｗ、２７２Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、２７４Ｉ／Ｖ、２７５Ｎ／２７６Ｍ、２７６／Ｍ、２７９Ｈ／Ｑ／Ｒおよび３０９Ｆから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号２に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｋ３７Ｒ、Ｋ３７Ｒ／Ｋ２１１Ｒ、Ｋ３７Ｒ／Ｋ２１１Ｒ／Ｇ２２９Ｒ、Ｋ３７Ｒ／Ｇ２２９Ｒ、Ｈ４５Ｒ、Ｙ５２Ｄ、Ｙ５２Ｄ／Ｃ５７Ｌ／Ｇ２７２Ｈ、Ｙ５２Ｓ、Ｙ５２Ｓ／Ｃ５７Ｌ／Ｋ１１０Ｔ／Ｇ２７２Ｈ／Ｌ２９６Ｆ、Ｙ５２Ｓ／Ｃ５７Ｌ／Ｇ２７２Ｈ＼／Ｉ２７９Ｈ／Ｌ２９６Ｆ、Ｙ５２Ｓ／Ｃ５７Ｌ／Ｇ２７２Ｈ／Ｌ２７４Ｖ／Ｉ２７９Ｈ／Ｌ２９６Ｆ、Ｌ５５Ｆ／Ｃ５７Ａ／Ｌ２７６Ｍ、Ｄ５６Ｌ、Ｃ５７Ｉ、Ｃ５７Ｉ／Ａ１０４Ｇ／Ｇ１１４Ｈ、Ｃ５７Ｌ、Ｃ５７Ｌ／Ａ１０４Ｇ／Ｇ１１４Ｈ／Ｇ２２９Ｒ、Ｃ５７Ｘ／Ｗ２８６Ｘ、Ｉ７９Ｔ／Ｖ８３Ｓ／Ａ２７５Ｎ／Ｌ２７６Ｍ、Ｖ８３Ｉ、Ｖ８３Ｓ／Ａ２７５Ｎ／Ｌ２７６Ｍ、Ｖ８３Ｓ／Ｌ２７６Ｍ、Ａ１０４Ｇ、Ｋ１１０Ｔ、Ｇ１１４Ｈ／Ｋ／Ｍ、Ｓ１３８Ｖ／Ａ１４６Ｓ／Ｍ２５８Ｖ／Ｔ２８９Ｓ、Ｋ２１１Ｒ、Ｋ２１１Ｒ／Ｇ２２９Ｒ、Ｐ２２８Ｓ、Ｇ２２９Ｒ、Ｇ２６３Ｈ／Ｙ、Ｓ２６８Ｍ／Ｗ、Ｇ２７２Ｈ／Ｉ／Ｌ／Ｐ／Ｑ／Ｓ／Ｔ／Ｖ／Ｗ、Ｌ２７４Ｉ／Ｖ、Ａ２７５Ｎ／Ｌ２７６Ｍ、Ｌ２７６Ｆ／Ｍ、Ｉ２７９Ｈ／Ｑ／Ｒ、およびＲ３０９Ｆから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号２に関して番号付けされている。
【００１２】
本発明はまた、配列番号１１２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置２４／１０６／１３６／２２０／２５８／２６０／３１４／３１５、２４／１０６／２１４／２５０／２５８／２６０／３１４／３１５、２４／２２０／３１４／３１５、１２２／１５９／３１６／３１８、１３５、１３９／２０７、１５９／２５１／２７２／２７７／３１６／３１８／３３０、および２０７から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号１１２に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、２４Ｉ／１０６Ｐ／１３６Ａ／２２０Ｇ／２５８Ｖ／２６０Ａ／３１４Ｒ／３１５Ａ、２４Ｉ／１０６Ｐ／２１４Ｌ／２５０Ｖ／２５８Ｖ／２６０Ａ／３１４Ｒ／３１５Ａ、２４Ｉ／２２０Ｇ／３１４Ｒ／３１５Ａ、１２２Ｅ／１５９Ｖ／３１６Ｅ／３１８Ｌ、１３５Ｆ、１３９Ｖ／２０７Ｓ、１５９Ｖ／２５１Ｑ／２７２Ｆ／２７７Ｐ／３１６Ｅ／３１８Ｌ／３３０Ｌ、および２０７Ｇから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１１２に関して番号付けされている。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｖ２４Ｉ／Ｔ１０６Ｐ／Ｓ１３６Ａ／Ｓ２２０Ｇ／Ｌ２５８Ｖ／Ｃ２６０Ａ／Ｐ３１４Ｒ／Ｓ３１５Ａ、Ｖ２４Ｉ／Ｔ１０６Ｐ／Ｆ２１４Ｌ／Ａ２５０Ｖ／Ｌ２５８Ｖ／Ｃ２６０Ａ／Ｐ３１４Ｒ／Ｓ３１５Ａ、Ｖ２４Ｉ／Ｓ２２０Ｇ／Ｐ３１４Ｒ／Ｓ３１５Ａ、Ｔ１２２Ｅ／Ｉ１５９Ｖ／Ｌ３１６Ｅ／Ｉ３１８Ｌ、Ｖ１３５Ｆ、Ｉ１３９Ｖ／Ｎ２０７Ｓ、Ｉ１５９Ｖ／Ｖ２５１Ｑ／Ｙ２７２Ｆ／Ｔ２７７Ｐ／Ｌ３１６Ｅ／Ｉ３１８Ｌ／Ｉ３３０Ｌ、およびＮ２０７Ｇから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１１２に関して番号付けされている。
【００１３】
本発明はまた、配列番号１２４と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置２／１０１／１７９／１８２／２２８／２３８／２８２、３／９５、３／９５／２２８／３１４、２４／９５／２２８、９５、９５／１３５／１３９／２０７、および１５９／２２８／３０９／３３０から選択される少なくとも１つの置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号１２４に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、２Ｔ／１０１Ｐ／１７９Ｌ／１８２Ｍ／２２８Ｒ／２３８Ｌ／２８２Ｅ、３Ｙ／９５Ｔ、３Ｙ／９５Ｔ／２２８Ｔ／３１４Ｒ、２４Ｉ／９５Ｔ／２２８Ｔ、９５Ｔ、９５Ｔ／１３５Ｆ／１３９Ｖ／２０７Ｎ、および１５９Ｖ／２２８Ｌ／３０９Ｑ／３３０Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１２４に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ａ２Ｔ／Ｙ１０１Ｐ／Ａ１７９Ｌ／Ｔ１８２Ｍ／Ｍ２２８Ｒ／Ａ２３８Ｌ／Ｔ２８２Ｅ、Ｋ３Ｙ／Ｖ９５Ｔ、Ｋ３Ｙ／Ｖ９５Ｔ／Ｍ２２８Ｔ／Ｐ３１４Ｒ、Ｖ２４Ｉ／Ｖ９５Ｔ／Ｍ２２８Ｔ、Ｖ９５Ｔ、Ｖ９５Ｔ／Ｖ１３５Ｆ／Ｉ１３９Ｖ／Ｇ２０７Ｎ、およびＩ１５９Ｖ／Ｍ２２８Ｌ／Ｋ３０９Ｑ／Ｉ３３０Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１２４に関して番号付けされている。
【００１４】
本発明はまた、配列番号１３８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置１９、２４／４３／４７／４９／６７／６８／７０／９１／２２０、２４／６８／９１／２１８／２２０、６７、７２、７４／７５／７８／１０８、７５／７８／９９／１０８／２１５／２２４、７８／１０７、９５、９６、および１１４から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作されたケトレダクターゼバリアントであって、位置が、配列番号１３８に関して番号付けされている、操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、１９Ｓ、２４Ｉ／４３Ｖ／４７Ｅ／４９Ｎ／６７Ｖ／６８Ｅ／７０Ｐ／９１Ｖ／２２０Ｇ、２４Ｉ／６８Ｅ／９１Ｖ／２１８Ｎ／２２０Ｇ、６７Ｗ、７２Ｑ、７４Ａ／７５Ｅ／７８Ｆ／１０８Ｖ、７５Ｅ／７８Ｆ／９９Ｐ／１０８Ｖ／２１５Ｓ／２２４Ａ、７８Ｆ／１０７Ｇ、９５Ｃ、９６Ｇ、および１１４Ｖから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１３８に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、Ｇ１９Ｓ、Ｖ２４Ｉ／Ａ４３Ｖ／Ｓ４７Ｅ／Ｌ４９Ｎ／Ａ６７Ｖ／Ｖ６８Ｅ／Ｅ７０Ｐ／Ｉ９１Ｖ／Ｓ２２０Ｇ、Ｖ２４Ｉ／Ｖ６８Ｅ／Ｉ９１Ｖ／Ｔ２１８Ｎ／Ｓ２２０Ｇ、Ａ６７Ｗ、Ｍ７２Ｑ、Ｋ７４Ａ／Ｑ７５Ｅ／Ｙ７８Ｆ／Ａ１０８Ｖ、Ｑ７５Ｅ／Ｙ７８Ｆ／Ｎ９９Ｐ／Ａ１０８Ｖ／Ｄ２１５Ｓ／Ｓ２２４Ａ、Ｙ７８Ｆ／Ｐ１０７Ｇ、Ｔ９５Ｃ、Ｓ９６Ｇ、およびＮ１１４Ｖから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１３８に関して番号付けされている。
【００１５】
本発明はまた、配列番号２、１１２、１２４、および／または１３８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、配列番号２、１１２、１２４、および／または１３８と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、配列番号２、１１２、１２４、または１３８に示されるポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、表５．１、６．１、７．１、および／または８．１に与えられるバリアントをコードするポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたケトレダクターゼバリアントは、配列番号４から１７０に示される偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む。
【００１６】
本発明はまた、本明細書において提供される操作されたケトレダクターゼバリアントをコードする操作されたポリヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号３から１６９に示される奇数番号の配列から選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるポリヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、本明細書において提供される操作されたケトレダクターゼバリアントをコードする操作されたポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの制御配列をさらに含む。
【００１７】
本発明はまた、本明細書において提供される操作されたケトレダクターゼバリアントをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１８】
本発明はまた、本明細書において提供される操作されたケトレダクターゼバリアントを生成する方法であって、操作されたケトレダクターゼバリアントが宿主細胞によって産生される条件下で、本明細書において提供される宿主細胞を培養するステップを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、宿主細胞によって産生される操作されたケトレダクターゼバリアントを回収するステップをさらに含む。
【００１９】
本発明はまた、固定された操作されたケトレダクターゼバリアントを提供する。
【００２０】
本発明は、少なくとも１つの、本明細書において提供される操作されたケトレダクターゼバリアントを含む組成物をさらに提供する。一部の実施形態では、組成物は、本明細書において提供される少なくとも１つの固定された操作されたケトレダクターゼバリアントを含む。
【００２１】
本発明はまた、配列番号１７２および／または２０８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントを提供する。
【００２２】
本発明はまた、配列番号１７２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置１０／７３／７８／１３７／３２３／３２５、１０／７３／７８／２３３／３２３、１０／７３／１３７、１３／４１／６３／１３２／１９３／１９５、１８／４４／１１９／１２４／１３２／１３７／１４５／１５８／１７５／１７７／２９３／３１７／３２３、１８／４４／１１９／１２４／１３２／１３７／１４５／１５８／１７７／２９３／３２３、１８／４４／１１９／１２４／１３２／１３７／１４５／２９３／３２３／３３４／３３６、３２／４４／１３２／１３７／１４５／１８６／２３３／２９３／３２３／３３６、４１／４４／８８／１９３／１９５、４４／６９／１２０／１３２／１３７／１４５／１７５／１９５／２９３／３２３、４４／１１３／１３２／１４５、４４／１１９／１３２／１３７／１４５／１５８／１７５／１７７／２９３／３１７／３２３、４４／１３２／１３５／１３６／１３７／１４５／２９３、４４／１３２／１３６／１３７／１４５／２９３、４４／１３２／１３７／１４５／２３３／３０８／３２３、４４／１３２／１３７／１４５／２９３／３２３、４４／１３２／１４５、４４／１３２／１４５／１９５／２９３／３２３、１３７／２３３／３０３／３２３、および２６６から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントであって、位置が、配列番号１７２に関して番号付けされている、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントを提供する。一部の実施形態では、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントは、１０Ｋ／７３Ａ／７８Ｙ／１３７Ｑ／３２３Ｄ／３２５Ａ、１０Ｋ／７３Ａ／７８Ｙ／２３３Ｉ／３２３Ｄ、１０Ｋ／７３Ａ／１３７Ｑ、１３Ｄ／４１Ａ／６３Ａ／１３２Ｑ／１９３Ｓ／１９５Ｅ、１８Ｍ／４４Ａ／１１９Ｆ／１２４Ｅ／１３２Ｑ／１３７Ｉ／１４５Ｇ／１５８Ｋ／１７５Ｓ／１７７Ｔ／２９３Ｌ／３１７Ｒ／３２３Ｄ、１８Ｍ／４４Ａ／１１９Ｆ／１２４Ｅ／１３２Ｑ／１３７Ｉ／１４５Ｇ／１５８Ｋ／１７７Ｔ／２９３Ｌ／３２３Ｄ、１８Ｍ／４４Ａ／１１９Ｆ／１２４Ｅ／１３２Ｑ／１３７Ｉ／１４５Ｇ／２９３Ｌ／３２３Ｄ／３３４Ｋ／３３６Ｒ、３２Ｖ／４４Ａ／１３２Ｑ／１３７Ｉ／１４５Ｇ／１８６Ｔ／２３３Ｉ／２９３Ｌ／３２３Ｄ／３３６Ｓ、４１Ａ／４４Ａ／８８Ｒ／１９３Ｓ／１９５Ｅ、４４Ａ／６９Ｋ／１２０Ｖ／１３２Ｑ／１３７Ｉ／１４５Ｇ／１７５Ｔ／１９５Ｅ／２９３Ｌ／３２３Ｄ、４４Ａ／１１３Ｓ／１３２Ｑ／１４５Ｇ、４４Ａ／１１９Ｆ／１３２Ｑ／１３７Ｉ／１４５Ｇ／１５８Ｋ／１７５Ｓ／１７７Ｔ／２９３Ｌ／３１７Ｒ／３２３Ｄ、４４Ａ／１３２Ｑ／１３５Ａ／１３６Ｄ／１３７Ｉ／１４５Ｇ／２９３Ｌ、４４Ａ／１３２Ｑ／１３６Ｄ／１３７Ｑ／１４５Ｇ／２９３Ｌ、４４Ａ／１３２Ｑ／１３７Ｉ／１４５Ｇ／２３３Ｉ／３０８Ｖ／３２３Ｄ、４４Ａ／１３２Ｑ／１３７Ｉ／１４５Ｇ／２９３Ｌ／３２３Ｄ、４４Ａ／１３２Ｑ／１４５Ｇ、４４Ａ／１３２Ｑ／１４５Ｇ／１９５Ｅ／２９３Ｌ／３２３Ｄ、１３７Ｑ／２３３Ｉ／３０３Ａ／３２３Ｄ、および２６６Ｓ／Ｖ／Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１７２に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントは、Ｒ１０Ｋ／Ｃ７３Ａ／Ｆ７８Ｙ／Ｒ１３７Ｑ／Ｎ３２３Ｄ／Ｖ３２５Ａ、Ｒ１０Ｋ／Ｃ７３Ａ／Ｆ７８Ｙ／Ｖ２３３Ｉ／Ｎ３２３Ｄ、Ｒ１０Ｋ／Ｃ７３Ａ／Ｒ１３７Ｑ、Ｅ１３Ｄ／Ｒ４１Ａ／Ｑ６３Ａ／Ｒ１３２Ｑ／Ａ１９３Ｓ／Ｓ１９５Ｅ、Ｌ１８Ｍ／Ｒ４４Ａ／Ｌ１１９Ｆ／Ａ１２４Ｅ／Ｒ１３２Ｑ／Ｒ１３７Ｉ／Ｎ１４５Ｇ／Ｌ１５８Ｋ／Ａ１７５Ｓ／Ｋ１７７Ｔ／Ｉ２９３Ｌ／Ａ３１７Ｒ／Ｎ３２３Ｄ、Ｌ１８Ｍ／Ｒ４４Ａ／Ｌ１１９Ｆ／Ａ１２４Ｅ／Ｒ１３２Ｑ／Ｒ１３７Ｉ／Ｎ１４５Ｇ／Ｌ１５８Ｋ／Ｋ１７７Ｔ／Ｉ２９３Ｌ／Ｎ３２３Ｄ、Ｌ１８Ｍ／Ｒ４４Ａ／Ｌ１１９Ｆ／Ａ１２４Ｅ／Ｒ１３２Ｑ／Ｒ１３７Ｉ／Ｎ１４５Ｇ／Ｉ２９３Ｌ／Ｎ３２３Ｄ／Ａ３３４Ｋ／Ｃ３３６Ｒ、Ｓ３２Ｖ／Ｒ４４Ａ／Ｒ１３２Ｑ／Ｒ１３７Ｉ／Ｎ１４５Ｇ／Ｒ１８６Ｔ／Ｖ２３３Ｉ／Ｉ２９３Ｌ／Ｎ３２３Ｄ／Ｃ３３６Ｓ、Ｒ４１Ａ／Ｒ４４Ａ／Ａ８８Ｒ／Ａ１９３Ｓ／Ｓ１９５Ｅ、Ｒ４４Ａ／Ｒ６９Ｋ／Ｒ１２０Ｖ／Ｒ１３２Ｑ／Ｒ１３７Ｉ／Ｎ１４５Ｇ／Ａ１７５Ｔ／Ｓ１９５Ｅ／Ｉ２９３Ｌ／Ｎ３２３Ｄ、Ｒ４４Ａ／Ｖ１１３Ｓ／Ｒ１３２Ｑ／Ｎ１４５Ｇ、Ｒ４４Ａ／Ｌ１１９Ｆ／Ｒ１３２Ｑ／Ｒ１３７Ｉ／Ｎ１４５Ｇ／Ｌ１５８Ｋ／Ａ１７５Ｓ／Ｋ１７７Ｔ／Ｉ２９３Ｌ／Ａ３１７Ｒ／Ｎ３２３Ｄ、Ｒ４４Ａ／Ｒ１３２Ｑ／Ｑ１３５Ａ／Ｐ１３６Ｄ／Ｒ１３７Ｉ／Ｎ１４５Ｇ／Ｉ２９３Ｌ、Ｒ４４Ａ／Ｒ１３２Ｑ／Ｐ１３６Ｄ／Ｒ１３７Ｑ／Ｎ１４５Ｇ／Ｉ２９３Ｌ、Ｒ４４Ａ／Ｒ１３２Ｑ／Ｒ１３７Ｉ／Ｎ１４５Ｇ／Ｖ２３３Ｉ／Ａ３０８Ｖ／Ｎ３２３Ｄ、Ｒ４４Ａ／Ｒ１３２Ｑ／Ｒ１３７Ｉ／Ｎ１４５Ｇ／Ｉ２９３Ｌ／Ｎ３２３Ｄ、Ｒ４４Ａ／Ｒ１３２Ｑ／Ｎ１４５Ｇ、Ｒ４４Ａ／Ｒ１３２Ｑ／Ｎ１４５Ｇ／Ｓ１９５Ｅ／Ｉ２９３Ｌ／Ｎ３２３Ｄ、Ｒ１３７Ｑ／Ｖ２３３Ｉ／Ｅ３０３Ａ／Ｎ３２３Ｄ、およびＥ２６６Ｓ／Ｖ／Ｗから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号１７２に関して番号付けされている。
【００２３】
本発明はまた、配列番号２０８と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性、ならびに位置３２／５９／１２４／１７７／１９１／３２７、７８／１５０／１９８／３２７／３２８、８３／２６６、９５／２１１／２１３／３２２、１０４、１７８／１９４／２１１／２１３／３２２、２０６、２１１／２１３／３２２、２１５、２６２、２６６、および３２３から選択される１つまたは複数の位置における少なくとも１つの置換または置換セットを有する操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントであって、位置が、配列番号２０８に関して番号付けされている、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントを提供する。一部の実施形態では、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントは、３２Ｖ／５９Ｍ／１２４Ｅ／１７７Ｓ／１９１Ｈ／３２７Ｄ、７８Ｙ／１５０Ｉ／１９８Ｌ／３２７Ｓ／３２８Ｐ、８３Ａ／２６６Ａ、９５Ｉ／２１１Ａ／２１３Ｑ／３２２Ｍ、１０４Ｆ／Ｌ、１７８Ｐ／１９４Ｌ／２１１Ａ／２１３Ｑ／３２２Ｑ、２０６Ｎ、２１１Ａ／２１３Ｑ／３２２Ｑ、２１５Ｐ、２６２Ｄ／Ｐ、２６６Ｓ、および３２３Ｎから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号２０８に関して番号付けされている。一部のさらなる実施形態では、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントは、Ｓ３２Ｖ／Ａ５９Ｍ／Ａ１２４Ｅ／Ｔ１７７Ｓ／Ｑ１９１Ｈ／Ｒ３２７Ｄ、Ｆ７８Ｙ／Ｆ１５０Ｉ／Ｆ１９８Ｌ／Ｒ３２７Ｓ／Ｌ３２８Ｐ、Ｖ８３Ａ／Ｅ２６６Ａ、Ｆ９５Ｉ／Ｎ２１１Ａ／Ｄ２１３Ｑ／Ｉ３２２Ｍ、Ｔ１０４Ｆ／Ｌ、Ａ１７８Ｐ／Ｃ１９４Ｌ／Ｎ２１１Ａ／Ｄ２１３Ｑ／Ｉ３２２Ｑ、Ｌ２０６Ｎ、Ｎ２１１Ａ／Ｄ２１３Ｑ／Ｉ３２２Ｑ、Ｌ２１５Ｐ、Ｖ２６２Ｄ／Ｐ、Ｅ２６６Ｓ、およびＤ３２３Ｎから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、位置は、配列番号２０８に関して番号付けされている。
【００２４】
本発明はまた、配列番号１７２および／または２０８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントを提供する。一部の実施形態では、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントは、配列番号１７２および／または２０８と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントは、配列番号１７２または２０８に示されるポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントは、表９．１、１０．１、および／または１１．１に与えられるバリアントをコードするポリペプチド配列を含む。さらに一部の追加の実施形態では、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントは、配列番号１７４から２６０に示される偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む。
【００２５】
本発明はまた、固定された操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントを提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書において提供される少なくとも１つの固定された操作されたケトレダクターゼバリアントと本明細書において提供される少なくとも１つの操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントとの混合物を提供する。
【００２６】
本発明はまた、本明細書において提供される少なくとも１つの亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントを含む組成物を提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書において提供される少なくとも１つの操作されたケトレダクターゼバリアントと本明細書において提供される少なくとも１つの操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼとの混合物を含む組成物をさらに提供する。
【００２７】
本発明はまた、本明細書において提供される操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントをコードする操作されたポリヌクレオチド配列を提供する。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号３から１６９に示される奇数番号の配列から選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一であるポリヌクレオチド配列を含む。
【００２８】
本発明はまた、本明細書において提供される操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントをコードする操作されたポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの制御配列をさらに含む。さらに一部のさらなる実施形態では、ベクターは、本明細書において提供される操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントをコードする少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチド配列と本明細書において提供される操作されたケトレダクターゼバリアントをコードする少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチド配列とを含む。本発明はまた、本明細書において提供されるベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００２９】
本発明はまた、本明細書において提供される操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントを生成するための方法であって、操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントが宿主細胞によって産生される条件下で、本発明の少なくとも１つの操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼをコードする少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む宿主細胞を培養するステップを含む、方法が提供される。一部の実施形態では、宿主細胞は、本明細書において提供される少なくとも１つの操作されたケトレダクターゼと少なくとも１つの操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼとを含むポリヌクレオチド配列を含むベクターを含む。一部の追加の実施形態では、宿主細胞は、本明細書において提供されていない少なくとも１つのケトレダクターゼを含むが、本明細書において提供される少なくとも１つの操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントを含む。一部のさらなる実施形態では、宿主細胞は、本明細書において提供されていない少なくとも１つの亜リン酸デヒドロゲナーゼを含むが、本明細書において提供される少なくとも１つの操作されたケトレダクターゼバリアントを含む。一部の実施形態では、方法は、宿主細胞によって産生される操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアントを回収するステップをさらに含む。少なくとも１つのケトレダクターゼおよび少なくとも１つの亜リン酸デヒドロゲナーゼを産生する宿主細胞に関する実施形態では、一部の方法は、宿主細胞によって産生されるケトレダクターゼおよび／または亜リン酸デヒドロゲナーゼを回収するステップをさらに含む。
【００３０】
本発明はまた、キラルアルコールを脱ラセミ化する方法であって、本明細書において提供される少なくとも１つの操作されたケトレダクターゼバリアントを提供するステップと、キラルアルコールが脱ラセミ化される条件下で、本明細書において提供される少なくとも１つの操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼバリアント、少なくとも１つのキラルアルコール、および少なくとも１つの補因子を提供するステップとを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、ワンポット反応で行われるが、一部の代替の実施形態では、複数の反応ベッセルが使用される。  
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】図１は、本発明によって取り組まれた反応スキームを提供する。
【００３２】
【図２】図２は、基質および生成物異性体の構造を提供する。
【００３３】
【図３】図３は、ワンポット多酵素反応スキームを提供する。
【００３４】
【図４】図４は、補因子競合アッセイのスキームを提供する。
【図５】図５は、補因子競合アッセイのスキームを提供する。
【００３５】
【図６】図６は、ワンポット多酵素反応で得られた生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを提供する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明は、天然に存在する野生型ケトレダクターゼおよび亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素と比較して改善された特性を有する操作されたケトレダクターゼ酵素および操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素、ならびに操作されたケトレダクターゼ酵素および操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチド、操作されたケトレダクターゼ酵素および操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素を発現することができる宿主細胞、ならびに操作されたケトレダクターゼ酵素および操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素を使用して、ワンポット多酵素系においてラセミ体アルコールを脱ラセミ化する方法を提供する。
定義
【００３７】
本発明に関して、この明細書で使用される技術用語および科学用語は、別段具体的に定義されていなければ、当業者によって通常理解される意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有することを意図する。本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は、このような特許および刊行物に開示されるすべての配列も含めて、参照により明示的に組み込まれる。別段示されていなければ、本発明の実践は、当業者に公知の分子生物学、発酵、微生物学、および関連する分野で通常使用されている従来の技法に関与する。本明細書で別段定義されていなければ、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様のまたは同等の任意の方法および材料は、本発明の実践または試験において使用することができるが、好ましい方法および材料が記載されている。実際に、本発明は、これらが、使用される文脈に応じて変化し得るため、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されるものではないことが意図される。本明細書で与えられる見出しは、本発明の種々の態様または実施形態の限定ではない。
【００３８】
それにもかかわらず、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。数値範囲は、範囲を定義する数値を包括する。よって、本明細書に開示されるすべての数値範囲は、すべてのより狭い数値範囲がすべて本明細書に明示的に記載されているかのように、このようなより広い数値範囲内になるこのようなすべてのより狭い数値範囲を包含することを意図する。本明細書に開示されるすべての最大（または最小）の数値限定は、このようなすべてのより小さい（またはより大きい）数値限定が本明細書に明示的に記載されているかのように、このようなより小さい（または大きい）数値限定を含むことも意図する。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびその同族言語は、これらの包括的意味（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同族言語に等価な意味）において使用される。
【００４０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈において別段明確に示されていなければ、複数の対象を含む。よって、例えば、「宿主細胞」への言及は、複数のこのような宿主細胞を含む。
【００４１】
別段示されていなければ、それぞれ、核酸は、５’から３’の方向に左から右に記載され、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向に左から右に記載されている。
【００４２】
本明細書で与えられる見出しは、全体として本明細書を参照して有され得る、本発明の種々の態様または実施形態の限定ではない。よって、以下に定義される用語は、全体として本明細書を参照してより十分に定義される。
【００４３】
「ケトレダクターゼ」および「ＫＲＥＤ」は、カルボニル基をその対応するアルコールに還元する酵素能力を有するポリペプチドを指すために、本明細書で互換的に使用される。より具体的には、本発明のケトレダクターゼポリペプチドは、スキーム１に示されるように、ワンポット多酵素系において式（Ｉ）のアルコールを式（ＩＩ）の対応する生成物に立体選択的に脱ラセミ化することができる（図１を参照のこと）。
【００４４】
亜リン酸デヒドロゲナーゼおよび「ＰＤＨ」は、ＮＡＤＰＨ補因子を再生する酵素能力を有するポリペプチドを指すために、本明細書で互換的に使用される。
【００４５】
本明細書で使用する場合、「ワンポット反応」という用語は、１つの反応ベッセル中で多数の酵素（すなわち、ＫＲＥＤおよびＰＤＨ）を使用する出発材料由来の生成物の生成を指す。
【００４６】
本明細書で使用する場合、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために、本明細書で互換的に使用される。Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物は、この定義に含まれる。
【００４７】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合的に一緒に連結された２つまたはそれより多いヌクレオシドを指す。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオシドから完全に構成され得るか（すなわち、ＲＮＡ）、２’デオキシリボヌクレオチドから完全に構成され得るか（すなわち、ＤＮＡ）、またはリボヌクレオシドと２’デオキシリボヌクレオシドとの混合物であり得る。ヌクレオシドは、典型的には、標準的なホスホジエステル連結を介して一緒に連結されるが、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準的な連結を含み得る。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または一本鎖領域と二本鎖領域の両方を含んでもよい。さらに、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミン、およびシトシン）から構成されるが、１つまたは複数の改変核酸塩基および／または合成核酸塩基（例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど）を含み得る。好ましくは、このような改変核酸塩基または合成核酸塩基は、コード核酸塩基である。
【００４８】
本明細書で使用する場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「天然に存在する」または「野生型」は、天然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在するかまたは野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、生物中に存在する配列であって、天然の供給源から単離することができ、人為的操作によって意図的に改変されていない配列である。
【００５０】
本明細書で使用する場合、「天然に存在しない」または「操作された」または「組換え」は、（例えば、細胞、核酸、またはポリペプチド）に関して本発明において使用される場合、普通なら天然に存在しない様式で改変されたか、またはそれと同一であるが合成材料からおよび／もしくは組換え技法を使用する操作によって生産もしくは導出された、材料またはその材料の天然の形態もしくはネイティブな形態に対応する材料を指す。非限定的な例として、とりわけ、ネイティブな（非組換え）形態の細胞内に見られない遺伝子を発現するかまたは普通なら異なるレベルで発現されるネイティブな遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
【００５１】
本明細書で使用する場合、「配列同一性のパーセンテージ」、「パーセント同一性」および「パーセント同一な」は、ポリヌクレオチド配列間またはポリペプチド配列間の比較を指し、比較ウインドウにわたって最適にアライメントされた２つの配列を比較することによって決定され、比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントの参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。両配列において同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基のいずれかが生じるかまたは核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップと共にアラインメントされる位置の数を決定し、マッチ位置の数を得て、マッチ位置の数を比較のウインドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって、このパーセンテージを計算することができる。最適なアラインメントおよびパーセント配列同一性の決定は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを使用して実施される（例えば、Altschulら、J.  Mol.  Biol.２１５巻：４０３〜４１０頁［１９９０年］；およびAltschulら、Nucleic  Acids  Res.３３８９〜３４０２頁［１９７７年］を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通じて公的に利用可能である。
【００５２】
簡潔に言えば、ＢＬＡＳＴ分析は、データベース配列内の同じ長さのワードとアラインメントした場合に、ある正の値の閾値スコアＴとマッチするかまたはそれを満たす、クエリ配列中の長さＷの短いワードを特定することによって、高いスコアになる配列の対（ＨＳＰ）を最初に特定することに関与する。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschulら、上掲）。これらの初期の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つける検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、そのワードヒットをそれぞれの配列に沿って両方向に伸長する。累積スコアは、ヌクレオチド配列については、パラメーターＭ（１対のマッチ残基に対する報酬スコア；常に、＞０）およびＮ（ミスマッチ残基に対するペナルティスコア；常に、＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、スコアリング行列を使用して、累積スコアを計算する。それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ落ちるか；累積スコアが１つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因してゼロまたはそれ未満になるか；またはいずれかの配列の末端に達する場合に、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸによって、アラインメントの感度および速度が決定される。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列について、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する（例えば、HenikoffおよびHenikoff、Proc  Natl  Acad  Sci  USA、８９巻：１０９１５頁［１９８９年］を参照のこと）。
【００５３】
２つの配列に対してパーセント同一性を与える際に、ＢＬＡＳＴと同様に機能する多数の他のアルゴリズムが利用可能であり、当技術分野で公知である。比較のための配列の最適なアライメントは、当技術分野で公知の任意の好適な方法を使用するか（例えば、SmithおよびWaterman、Adv.  Appl.  Math.２巻：４８２頁［１９８１年］の局所相同性アルゴリズムによる；NeedlemanおよびWunsch、J.  Mol.  Biol.４８巻：４４３頁［１９７０年］の相同性アライメントアルゴリズムによる；PearsonおよびLipman、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、８５巻：２４４４頁［１９８８年］の類似性調査法による；ならびに／またはこれらのアルゴリズムのコンピューター制御による実行による［ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ］）、または当技術分野で一般に公知の方法を使用して、視覚的な検査によって行うことができる。さらに、配列アラインメントおよびパーセント配列同一性の決定は、提供されたデフォルトのパラメーターを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「参照配列」は、別の配列が比較される規定の配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般的に、参照配列は、長さが少なくとも２０のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基、長さが少なくとも２５残基、長さが少なくとも５０残基、または核酸もしくはポリペプチドの全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ、（１）２つの配列間で類似している配列（すなわち、完全な配列の部分）を含むことができ、（２）２つの配列間で非常に異なる配列をさらに含むことができるので、典型的には、比較ウインドウにわたる２つのポリヌクレオチドの配列を比較して、局所領域の配列類似性を同定および比較することによって、２つの（またはそれより多い）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の配列比較を実施する。「参照配列」という用語は、野生型配列に限定されることを意図するものではなく、操作されたかまたは変更された配列を含むことができる。例えば、一部の実施形態では、「参照配列」は、前もって操作されたかまたは変更されたアミノ酸配列であり得る。
【００５５】
本明細書で使用する場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０の連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントを指し、配列は、少なくとも２０の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウインドウ中の配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントに関して、参照配列（付加も欠失も含まない）と比較した場合に、２０パーセントまたはそれより低い付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウは、２０より長い連続した残基であり得、必要に応じて３０、４０、５０、１００またはそれより長いウインドウを含む。
【００５６】
本明細書で使用する場合、「に対応する」、「を参照して」または「に対して」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けとの関連で使用される場合、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合の、指定の参照配列の残基の番号付けを指す。換言すれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的な位置によってではなく、参照配列に対して指定される。例えば、操作されたケトレダクターゼのアミノ酸配列などの所与のアミノ酸配列は、２つの配列間の残基マッチを最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列に対してアライメントさせることができる。これらの場合には、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列における残基の番号付けは、この配列がアライメントされている参照配列に対してなされる。本明細書で使用する場合、以下でさらに記載されるように、「Ｘｎ」などの残基位置への言及は、別段具体的に表示されていなければ、「に対応する残基」に言及するものとして解釈されるべきである。よって、例えば、「Ｘ９４」は、ポリペプチド配列の位置９４における任意のアミノ酸を指す。
【００５７】
本明細書で使用する場合、「立体選択性」は、化学反応または酵素反応における１つの立体異性体の別の立体異性体または別の立体異性体のセットに勝る優先的形成を指す。立体選択性は、立体異性体の形成が別のものより好ましい場合には部分的である場合があり、または１つの立体異性体しか形成されない場合には完全である場合がある。立体異性体がエナンチオマーである場合、その立体選択性はエナンチオ選択性と称され、一方のエナンチオマーの両方のエナンチオマーの合計中の分率である（典型的には、パーセンテージとして報告される）。これは、当技術分野では、通常、代替的に、式［主エナンチオマー−副エナンチオマー］／［主エナンチオマー＋副エナンチオマー］に従ってそれから算出されるエナンチオマー過剰率（ｅ．ｅ．）として（典型的には、パーセンテージとして）報告される。立体異性体が、ジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、ジアステレオ選択性とも称され、２つのジアステレオマーの混合物中の１つのジアステレオマーの分率であり（典型的には、パーセンテージとして報告される）、通常、代替的に、ジアステレオマー過剰率（ｄ．ｅ．）として報告される。エナンチオマー過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率の種類である。立体選択性が、単一の立体異性体に限定されないことおよび立体異性体のセットについて記載され得ることも理解されるべきである。
【００５８】
本明細書で使用する場合、「高立体選択的」は、少なくとも約７５％の立体異性体過剰率で、基質をその対応するキラルアルコール生成物に変換することができる化学反応または酵素反応を指す。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「増加した酵素活性」および「増加した活性」は、操作された酵素の改善された特性を指し、参照酵素と比較して比活性（例えば、生成される生成物／時間／タンパク質重量）の増加または基質の生成物への変換パーセント（例えば、指定量のケトレダクターゼを使用する指定時間内の生成物への基質の出発量の変換パーセント）の増加がその代表であり得る。酵素活性を判定するための例示的な方法を、実施例に提供する。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的酵素特性を含む、その変化によって酵素活性の増加が導かれ得る、酵素活性に関する任意の特性が影響を受ける可能性がある。ケトレダクターゼ活性は、ケトレダクターゼを測定するために使用される標準的なアッセイのいずれか１つ、例えば、基質もしくは生成物の濃度の変化、または補因子（補因子再生系が存在しない場合）の濃度の変化によって、測定することができる。酵素活性の比較は、本明細書中で詳細にさらに説明するような、酵素の規定された調製、設定条件下での規定されたアッセイ、および１つまたは複数の規定された基質を使用してなされる。一般的に、細胞溶解物中の酵素を比較する場合、宿主細胞によって産生され、溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小にするために同一の発現系および同一の宿主細胞を使用するのと同様に、アッセイされる細胞の数およびタンパク質の量を決定する。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「変換」は、基質の対応する生成物への酵素的形質転換を指す。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「変換パーセント」は、ある期間内に、指定の条件下で、生成物に変換される基質のパーセントを指す。よって、例えば、ケトレダクターゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換パーセント」として表すことができる。
【００６２】
本明細書で使用する場合、「熱安定性」または「熱安定性の」は、未処理の酵素と比較して、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）、温度条件のセット（例えば、４０〜８０℃）に曝露した際に不活性化に耐性であり、よって、高温への曝露後にある特定のレベルの残りの活性（例として、６０％を超えて、例えば８０％まで）を保持するポリペプチドを指す。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「溶媒安定性」は、様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒への曝露後に、未処理の酵素と比較して同様の活性（例として、例えば６０％を超えて、８０％まで）を維持するポリペプチドの能力を指す。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「アミノ酸差異」または「残基差異」は、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基に対するポリペプチド配列の位置でのアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸差異の位置は、一般的に、本明細書では「Ｘｎ」（ｎは、残基差異が基づく参照配列における対応する位置を指す）と称される。例えば、「配列番号２と比較した位置Ｘ４０の残基差異」は、配列番号２の位置４０に対応するポリペプチド位置のアミノ酸残基の差異を指す。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが位置４０でヒスチジンを有する場合、「配列番号２と比較した位置Ｘ４０の残基差異」は、配列番号２の位置４０に対応するポリペプチドの位置でのヒスチジン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書のほとんどの場合には、ある位置における特定のアミノ酸残基差異は、「ＸｎＹ」（「Ｘｎ」は、上記のように対応する位置を指定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドに見られるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中と異なる残基）の一文字識別子である）として示される。一部の場合には、本発明はまた、従来の表記「ＡｎＢ」（Ａは、参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である）によって表される特定のアミノ酸差異を提供する。一部の場合には、本発明のポリペプチドは、参照配列に対する１つまたは複数のアミノ酸残基差異を含むことができ、これは、残基差異が参照配列に対して存在する指定の位置のリストによって示される。一部の実施形態では、ポリペプチドの特定の残基位置に１つより多くのアミノ酸を使用することができる場合、使用することができる種々のアミノ酸残基は、「／」によって区切られる（例えば、Ｘ１９２Ａ／Ｇ）。本発明は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換のいずれかまたは両方を含む１つまたは複数のアミノ酸差異を含む操作されたポリペプチド配列を包含する。本発明の配列表に含まれる特定の組換え炭酸脱水酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、開始メチオニン（Ｍ）残基を含む（すなわち、Ｍは残基位置１を表す）。しかし、この開始メチオニン残基は、開始メチオニン残基を欠くが他の点では酵素の特性を保持する成熟タンパク質を生成するために、例えば宿主細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳系においてなど、生物学的プロセシング機構によって除去することができることが当業者に理解される。結果として、「位置Ｘｎにおける配列番号２に対するアミノ酸残基差異」という用語は、本明細書で使用する場合、開始メチオニンを欠くようにプロセシングされた参照配列内の位置「Ｘｎ」または対応する位置（例えば、位置（Ｘ−１）ｎ）を指す場合がある。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「保存的アミノ酸置換」というフレーズは、類似側鎖を有する残基の互換性を指し、よって、典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸を、同一または類似の規定アミノ酸クラス内のアミノ酸で置換することに関与する。一例として限定されないが、一部の実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）で置換され；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）と置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジン）と置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）と置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）と置換され；および／または、疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性もしくは親水性アミノ酸と置き換えられる。例示的な保存的置換を表１に提供する。
【表１−１】
2020517284.tif 000003
【表１−２】
2020517284.tif 000004
【００６６】
本明細書で使用する場合、「非保存的置換」というフレーズは、ポリペプチド中のアミノ酸を、側鎖特性が顕著に異なるアミノ酸に置換することを指す。非保存的置換は、規定のグループ内ではなく規定のグループ間のアミノ酸を使用してもよく、（ａ）置換（例えば、グリシンからプロリン）の領域内のペプチド骨格の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖のバルクに影響を及ぼす。一例として限定されないが、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸と置換された酸性アミノ酸；小さいアミノ酸と置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸と置換された親水性アミノ酸であり得る。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「欠失」は、参照ポリペプチドから１つまたは複数のアミノ酸を除去することによる、ポリペプチドの改変を指す。欠失は、酵素活性を保持し、および／または操作された酵素の改善された特性を保持する一方で、１もしくはそれより多いアミノ酸、２もしくはそれより多いアミノ酸、５もしくはそれより多いアミノ酸、１０もしくはそれより多いアミノ酸、１５もしくはそれより多いアミノ酸または２０もしくはそれより多いアミノ酸の除去であって、ポリペプチドを構成する全アミノ酸数の１０％まで、またはその全アミノ酸数の２０％までの除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とするものであり得る。種々の実施形態では、欠失は連続的なセグメントを含み得るか、または不連続であり得る。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「挿入」は、参照ポリペプチドへと１つまたは複数のアミノ酸を付加することによる、ポリペプチドの改変を指す。一部の実施形態では、改善された操作されたケトレダクターゼ酵素は、天然に存在するケトレダクターゼポリペプチドへの１または複数のアミノ酸の挿入、および操作されたケトレダクターゼポリペプチドへの１または複数のアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部部分にあり得るか、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に対するものであり得る。当技術分野で公知であるように、本明細書で使用される挿入は、融合タンパク質を含む。天然に存在するポリペプチドにおいて、挿入は、連続的なアミノ酸セグメントであり得るか、または１つもしくは複数のアミノ酸によって隔てられ得る。
【００６９】
「アミノ酸置換セット」または「置換セット」という用語は、参照配列と比較した、ポリペプチド配列内のアミノ酸置換の群を指す。置換セットは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、またはそれを超えるアミノ酸置換を有し得る。一部の実施形態では、置換セットは、実施例において提供される表に列挙されているバリアントＫＲＥＤのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、配列中の対応する位置と同一である、ポリペプチドを指す。断片は、典型的には、全長ケトレダクターゼポリペプチド、例えば、配列番号４のポリペプチドの約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％を有し得る。一部の実施形態では、断片は、「生物学的に活性」である（すなわち、全長配列と同一の酵素活性を示す）。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「単離されたポリペプチド」は、天然でそれに付随する他の夾雑物、例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチドから実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成）から除去または精製されたポリペプチドを包含する。改善されたケトレダクターゼ酵素は、細胞内に存在し得るか、細胞培地中に存在し得るか、または種々の形態、例えば、溶解物または単離された調製物中で調製され得る。したがって、一部の実施形態では、本発明の操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、そのポリペプチド種が存在する優勢種である（すなわち、モルまたは重量基準で、これが、組成物中の任意の他の個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般的に、目的種が、存在する高分子種の少なくとも約５０モルパーセントまたは約５０重量％を占める場合、実質的に精製された組成物である。一般的に、実質的に純粋な操作されたケトレダクターゼポリペプチド組成物は、この組成物中に存在するすべての高分子種の約６０モル％もしくは６０重量％またはそれを超える割合、約７０モル％もしくは７０重量％またはそれを超える割合、約８０モル％もしくは８０重量％またはそれを超える割合、約９０モル％もしくは９０重量％またはそれを超える割合、約９１モル％もしくは９１重量％またはそれを超える割合、約９２モル％もしくは９２重量％またはそれを超える割合、約９３モル％もしくは９３重量％またはそれを超える割合、約９４モル％もしくは９４重量％またはそれを超える割合、約９５モル％もしくは９５重量％またはそれを超える割合、約９６モル％もしくは９６重量％またはそれを超える割合、約９７モル％もしくは９７重量％またはそれを超える割合、約９８モル％もしくは９８重量％またはそれを超える割合、あるいは約９９モル％もしくは９９重量％を占めることになる。溶媒種、小分子（５００ダルトン未満）、および元素イオン種は、高分子種と見なされない。一部の実施形態では、単離された改善されたケトレダクターゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００７３】
本明細書で使用する場合、核酸またはポリペプチドに関して使用される場合、「異種」という用語は、生物（例えば、野生型生物）によって通常発現および分泌されない配列を指す。一部の実施形態では、この用語は、通常天然に見られるものと互いに同じ関係では見られない、あるいは組換え操作されており、その結果、発現のレベル、または細胞内の他の核酸もしくは他の分子との物理的関係、または構造が通常天然に見られない、２つまたはそれを超える部分配列を含む配列を包含する。例えば、異種核酸は、典型的には、組換えによって生成され、天然に見られない様式で配置された無関係の遺伝子に由来する２つまたはそれを超える配列を有する（例えば、ベクターなどの発現カセットに挿入されたプロモーター配列に作動的に連結した本発明の核酸オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））。一部の実施形態では、「異種ポリヌクレオチド」は、実験室での技法によって宿主細胞中に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、宿主細胞から取り出され、実験室操作に供され、次いで、宿主細胞中に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が目的の生物内で効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンが、特定の生物内で優先的に使用されるものへと変化することを指す。一部の実施形態では、ケトレダクターゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化することができる。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「制御配列」は、本明細書では、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利なすべての成分を含むように定義される。各制御配列は、目的のポリヌクレオチドにとってネイティブのものであっても、外来のものであってもよい。このような制御配列として、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「作動可能に連結した」は、本明細書では、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対してある位置で適切に配置され（すなわち、機能的な関係で）、その結果、制御配列が、目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指示または調節する構成として定義される。
【００７７】
本明細書で使用する場合、「補因子再生系」および「補因子リサイクル系」というフレーズは、補因子の酸化形態を還元する反応（例えば、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨ）に関与する１セットの反応物を指す。ケト基質のケトレダクターゼ触媒還元によって酸化された補因子は、補因子再生系によって還元形態に再生される。補因子再生系は、還元性水素等価物の源であり、かつ、その補因子の酸化形態を還元することができる、化学量論量の還元剤を含む。補因子再生系は、還元剤による補因子の酸化形態の還元を触媒する触媒、例えば、酵素触媒をさらに含んでもよい。それぞれ、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生するための補因子再生系は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載の方法において使用することができる。
【００７８】
本明細書で使用する場合、「好適な反応条件」は、本発明のケトレダクターゼポリペプチドが基質化合物を生成物化合物に立体選択的に脱ラセミ化することができる下での生体触媒反応溶液の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。例示的な「好適な反応条件」は本発明において提供されており、実施例によって例示されている。
【００７９】
本明細書で使用する場合、「化合物負荷」、「酵素負荷」、または「補因子負荷」などの「負荷」は、反応開始時における反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
【００８０】
本明細書で使用する場合、生体触媒媒介プロセスとの関連における「基質」は、生体触媒が作用する化合物または分子を指す。例えば、本明細書に開示されるプロセスにおけるケトレダクターゼ生体触媒の例示的な基質は、化合物（１）である。
【００８１】
本明細書で使用する場合、生体触媒媒介プロセスとの関連における「生成物」は、生体触媒が作用した結果生じる化合物または分子を指す。
【００８２】
本明細書で使用する場合、本明細書で使用される「平衡」は、化学反応または酵素反応の順方向速度定数および逆方向速度定数によって決定される、立体異性体の相互変換を含む化学反応または酵素反応（例えば、２つの種ＡおよびＢの相互変換）において化学種の定常状態の濃度をもたらすプロセスを指す。
【００８３】
本明細書で使用する場合、「オキソ」は＝Ｏを指す。
【００８４】
本明細書で使用する場合、「オキシ」は、エーテルおよびエステルを含む、異なるオキシ基を形成するための種々の置換を有してもよい、二価の基−Ｏ−を指す。
【００８５】
本明細書で使用する場合、「カルボキシ」は、−ＣＯＯＨを指す。
【００８６】
本明細書で使用する場合、「カルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）−を指し、これは、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステル、およびケトンを含む異なるカルボニル基を形成するための様々な置換基を有してもよい。
【００８７】
本明細書で使用する場合、「ヒドロキシ」は、−ＯＨを指す。
【００８８】
本明細書で使用する場合、「必要に応じた（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」および「必要に応じて（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」は、次に記載される事象または状況が起こっても起こらなくてもよく、本明細書には、事象または状況が起こる場合および起こらない場合が含まれることを意味する。当業者は、１つまたは複数の必要に応じた置換基を含有することが記載された任意の分子に対して、立体的に実践されるおよび／または合成により実行できる化合物のみが含まれることを意味することを理解するであろう。
【００８９】
本明細書で使用する場合、「必要に応じて置換された」は、化学基という用語または一連の化学基において、すべての次の修飾形態を指す。例えば、「必要に応じて置換されたアリールアルキル」という用語において、分子の「アルキル」部分と「アリール」部分は置換されていても置換されていなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」では、アルキル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール基は、他のものと独立して、置換されていても置換されていなくてもよい。
操作された酵素ポリペプチド
【００９０】
ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）またはカルボニルレダクターゼ生体触媒（ＥＣ１．１．１．１８４）は、アルデヒドおよびケトンからのアルコール、ならびに対応するプロ立体異性体ケトン基質からの光学活性第二級アルコールの合成に有用である。ＫＲＥＤは、逆反応（すなわち、アルコール基質の対応するアルデヒド／ケトン生成物への酸化）も触媒し得る。ＫＲＥＤによるアルデヒドおよびケトンの還元ならびにアルコールの酸化には、補因子、最も一般的には、還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、および酸化反応にはニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）またはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰ＋）が使用される。ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨは、電子供与体としての役割を果たし、その一方でＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋は、電子受容体としての役割を果たす。
【００９１】
ＫＲＥＤは、当技術分野で公知のように、広範にわたる細菌および酵母において見られ得る（例えば、HummelおよびKula、Eur.  J.  Biochem.、１８４巻：１〜１３頁［１９８９年］を参照のこと）。Ｃａｎｄｉｄａ  ｍａｇｎｏｌｉａｅ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＪＣ７３３８；ＧＩ：１１３６０５３８）；Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＢＡＡ２４５２８．１；ＧＩ：２８１５４０９）、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＦ１６０７９９；ＧＩ：６５３９７３４）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＡＡＰ９４０２９．１；ＧＩ：３３１１２０５６）、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号１ＮＸＱ＿Ａ；ＧＩ：３０７４９７８２）、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｂｒｏｃｋｉｉ（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号Ｐ１４９４１；ＧＩ：１７７１７９０）のものを含む、多数のＫＲＥＤ遺伝子および酵素配列が報告されている。
【００９２】
ケトレダクターゼの立体選択性は、重要な薬学的ビルディングブロックの調製に適用されてきた（例えば、Broussyら、Org.  Lett.、１１巻：３０５〜３０８頁［２００９年］を参照のこと）。有用な化学化合物を生成するための生体触媒プロセスにおける天然に存在するＫＲＥＤまたは操作されたＫＲＥＤの具体的適用は、４−クロロアセトアセテートエステルの還元（例えば、Zhou、J.  Am.  Chem.  Soc.、１０５巻：５９２５〜５９２６頁［１９８３年］；Santaniello、J.  Chem.  Res.、（Ｓ）１３２〜１３３頁［１９８４年］；米国特許第５，５５９，０３０号；米国特許第５，７００，６７０号；および米国特許第５，８９１，６８５号を参照のこと）、ジオキソカルボン酸の還元（例えば、米国特許第６，３９９，３３９号を参照のこと）、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｓ）−クロロ−５−ヒドロキシ−３−オキソヘキサノエートの還元（例えば、米国特許第６，６４５，７４６号；およびＷＯ０１／４０４５０を参照のこと）、ピロロトリアジン系化合物の還元（例えば、米国出願公開第２００６／０２８６６４６号を参照のこと）；置換アセトフェノンの還元（例えば、米国特許第６，８００，４７７号および同第８，７４８，１４３号を参照のこと）；およびケトチオランの還元（ＷＯ２００５／０５４４９１）に関して実証されてきた。
【００９３】
本発明は、以下の反応および図１に示されるワンポット多酵素系において基質化合物（１）、（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ａ］イミダゾール−７−オール）を脱ラセミ化することができる操作されたケトレダクターゼを提供する。
【化１】
2020517284.tif 000005
【化２】
2020517284.tif 000006
【００９４】
本発明は、改善されたケトレダクターゼ酵素および改善された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素、ならびにワンポット多酵素系においてキラル化合物を脱ラセミ化するために操作されたケトレダクターゼ酵素および亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素を使用するための方法をさらに提供する。
【００９５】
酸化反応および還元反応が、直交性、適合性かつ非相互作用性である場合にのみ、所望の生成物をワンポット、ワンステップ、多酵素系において得ることができることに留意することが重要である。これらの条件は、酸化ケトレダクターゼおよびその対応するリサイクル酵素が１つの補因子（例えば、ＮＡＤ＋）を排他的に使用し、還元ケトレダクターゼおよびその対応するリサイクル酵素が逆の補因子（すなわち、ＮＡＤＰＨ）を排他的に使用する場合にのみ満たされる。
【００９６】
化合物（１）は、１つのキラル中心を有し、２つの異なるジアステレオマー形態（１ａおよび１ｂ）で存在し得る。タンデムのケトレダクターゼによる脱ラセミ化反応は、図２および以下に示すように、２つの異なるエナンチオマー生成物（１ａ〜１ｂ）を生じ得る。
【化３】
2020517284.tif 000007
【００９７】
しかし、（１ａ）は、唯一の所望の生成物である。本発明の開発において使用された発展プログラムは、ラセミ混合物中でＳ−アルコールを酸化するＳ選択的ケトレダクターゼの活性を改善し、Ｒ選択的ケトレダクターゼに対するケトン基質を生成するために設計された。さらに、発展プログラムは、Ｒ選択的ケトレダクターゼの選択性、活性および補因子優先性を改善するために設計された。発展は、亜リン酸デヒドロゲナーゼの活性、安定性および補因子優先性を改善し、ワンポット、ワンステップ、多酵素プロセスにおいて最小量のケトンおよび（１ｂ）で、基質（１）の生成物（１ａ）への脱ラセミ化を可能にするためにも設計された。
【００９８】
配列番号２のケトレダクターゼポリペプチドは、本発明によって提供される改善されたＳ選択的酵素を開発するための初期骨格として選択された。この酵素は、ケトン（２）が（１ａ）を残して（１ｂ）のみの酸化によって生成されるため、出発骨格として選択された。配列番号２のケトレダクターゼポリペプチドは、ＮＡＤＰ＋に対して２００：１を超える効率で補因子としてＮＡＤ＋を使用し、市販のＮＡＤＨオキシダーゼに連結して、補因子をリサイクルすることができる。
【００９９】
配列番号２のケトレダクターゼポリペプチドは、Ｒ選択的酵素の開発のための初期骨格として選択され、ケトンを還元して、９２．７％ｅ．ｅ．の初期選択性を有する生成物（１ａ）を生じた。エナンチオ選択性の値は、以下に与えられる等式（１）に従って、本明細書において計算される。
（１）  ｛［（１ａの量）−（１ｂの量）］／［（１ａの量）＋（１ｂの量）］｝×１００
【０１００】
実際に、天然に存在しない、本発明のケトレダクターゼポリペプチドは、配列番号２の天然に存在するケトレダクターゼと比較して改善された特性を有するように操作されたケトレダクターゼである。
【０１０１】
亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、改善されたＰＤＨ酵素の開発のための初期骨格として選択された。この酵素は、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの両方をリサイクルするのに等しく効率的である。
【０１０２】
一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、好適な反応条件下で、基質化合物を、配列番号２の参照ポリペプチドの活性に対して少なくとも約１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、または１００倍増加した活性を有する生成物に変換することができる。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼポリペプチドは、好適な反応条件下で、約４８時間、約３６時間、約２４時間、またはさらに短い時間の反応時間で、基質化合物を、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％の変換パーセントを有する生成物に変換することができる。
【０１０３】
一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼおよび亜リン酸デヒドロゲナーゼは、ワンポット、ワンステップ、多酵素系において化合物（１ｂ）に対してエナンチオマー過剰で、基質化合物（１）を生成物化合物（１ａ）に変換することができる。一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼおよび亜リン酸デヒドロゲナーゼは、好適な反応条件下で、化合物（１ｂ）に対してジアステレオマー過剰で、化合物（１）を化合物（１ａ）に変換することができる。
【０１０４】
当業者によって認識されるように、上記で定義したカテゴリーの一部は、特段指定されていなければ、相互に排他的ではない。よって、２つまたはそれより多い物理化学特性を示す側鎖を有するアミノ酸は、複数のカテゴリーに含まれ得る。任意のアミノ酸または残基の適切な分類は、特に、本明細書で提供される詳細な発明を鑑みて、当業者に明らかであろう。
【０１０５】
一部の実施形態では、改善された、操作されたケトレダクターゼ酵素および操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素は、天然に存在するケトレダクターゼポリペプチドもしくは亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基の欠失または他の操作されたケトレダクターゼポリペプチドもしくは亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドにおけるアミノ酸残基の欠失を含む。よって、本発明の一部の実施形態では、欠失は、ケトレダクターゼ活性または亜リン酸デヒドロゲナーゼ活性の機能的活性が維持される限り、１個または複数のアミノ酸、２個もしくはそれより多いアミノ酸、３個もしくはそれより多いアミノ酸、４個もしくはそれより多いアミノ酸、５個もしくはそれより多いアミノ酸、６個もしくはそれより多いアミノ酸、８個もしくはそれより多いアミノ酸、１０個もしくはそれより多いアミノ酸、１５個もしくはそれより多いアミノ酸、または２０個もしくはそれより多いアミノ酸、ケトレダクターゼポリペプチドのアミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大１０％、アミノ酸の総数の最大２０％またはアミノ酸の総数の最大３０％を含む。一部の実施形態では、欠失は、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、１〜１１、１〜１２、１〜１４、１〜１５、１〜１６、１〜１８、１〜２０、１〜２２、１〜２４、１〜２５、１〜３０、１〜３５または約１〜４０個のアミノ酸残基を含み得る。一部の実施形態では、欠失の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２４、２６、３０、３５または約４０アミノ酸であり得る。一部の実施形態では、欠失は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、または２０個のアミノ酸残基の欠失を含み得る。
【０１０６】
本明細書に記載されているように、本発明のケトレダクターゼポリペプチドまたは亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、ケトレダクターゼポリペプチドまたは亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドが、他のポリペプチド、例えば、抗体タグ（例えば、ｍｙｃエピトープ）または精製配列（例えば、Ｈｉｓタグ）に融合した融合ポリペプチドの形態であり得る。よって、一部の実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドおよび／または亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、他のポリペプチドとの融合の有無にかかわらず、使用される。
【０１０７】
一部の実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、遺伝子コード化されたアミノ酸に限定されない。遺伝子コード化されたアミノ酸に加えて、本明細書に記載のポリペプチドは、全部または一部、天然に存在するおよび／または合成の非コード化アミノ酸から構成され得る。本明細書に記載のポリペプチドを構成し得る、ある特定の一般に見かける非コード化アミノ酸として、これらに限定されないが、以下のものが挙げられる：遺伝子コード化されたアミノ酸のＤ−立体異性体；２，３−ジアミノプロピオン酸（Ｄｐｒ）；α−アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）；ε−アミノヘキサン酸（Ａｈａ）；δ−アミノ吉草酸（Ａｖａ）；Ｎ−メチルグリシンまたはサルコシン（ＭｅＧｌｙまたはＳａｒ）；オルニチン（Ｏｒｎ）；シトルリン（Ｃｉｔ）；ｔ−ブチルアラニン（Ｂｕａ）；ｔ−ブチルグリシン（Ｂｕｇ）；Ｎ−メチルイソロイシン（ＭｅＩｌｅ）；フェニルグリシン（Ｐｈｇ）；シクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）；ノルロイシン（Ｎｌｅ）；ナフチルアラニン（Ｎａｌ）；２−クロロフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−クロロフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−クロロフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−フルオロフェニルアラニン（Ｏｆｆ）；３−フルオロフェニルアラニン（Ｍｆｆ）；４−フルオロフェニルアラニン（Ｐｆｆ）；２−ブロモフェニルアラニン（Ｏｂｆ）；３−ブロモフェニルアラニン（Ｍｂｆ）；４−ブロモフェニルアラニン（Ｐｂｆ）；２−メチルフェニルアラニン（Ｏｍｆ）；３−チルフェニルアラニン（Ｍｍｆ）；４−メチルフェニルアラニン（Ｐｍｆ）；２−ニトロフェニルアラニン（Ｏｎｆ）；３−ニトロフェニルアラニン（Ｍｎｆ）；４−ニトロフェニルアラニン（Ｐｎｆ）；２−シアノフェニルアラニン（Ｏｃｆ）；３−シアノフェニルアラニン（Ｍｃｆ）；４−シアノフェニルアラニン（Ｐｃｆ）；２−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｏｔｆ）；３−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｍｔｆ）；４−トリフルオロメチルフェニルアラニン（Ｐｔｆ）；４−アミノフェニルアラニン（Ｐａｆ）；４−ヨードフェニルアラニン（Ｐｉｆ）；４−アミノメチルフェニルアラニン（Ｐａｍｆ）；２，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｏｐｅｆ）；３，４−ジクロロフェニルアラニン（Ｍｐｃｆ）；２，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｏｐｆｆ）；３，４−ジフルオロフェニルアラニン（Ｍｐｆｆ）；ピリド−２−イルアラニン（２ｐＡｌａ）；ピリド−３−イルアラニン（３ｐＡｌａ）；ピリド−４−イルアラニン（４ｐＡｌａ）；ナフト−１−イルアラニン（１ｎＡｌａ）；ナフト−２−イルアラニン（２ｎＡｌａ）；チアゾリルアラニン（ｔａＡｌａ）；ベンゾチエニルアラニン（ｂＡｌａ）；チエニルアラニン（ｔＡｌａ）；フリルアラニン（ｆＡｌａ）；ホモフェニルアラニン（ｈＰｈｅ）；ホモチロシン（ｈＴｙｒ）；ホモトリプトファン（ｈＴｒｐ）；ペンタフルオロフェニルアラニン（５ｆｆ）；スチリルカラニン（ｓＡｌａ）；オーソリルアラニン（ａＡｌａ）；３，３−ジフェニルアラニン（Ｄｆａ）；３−アミノ−５−フェニルペンタン酸（Ａｆｐ）；ペニシラミン（Ｐｅｎ）；１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸（Ｔｉｃ）；β−２−チエニルアラニン（Ｔｈｉ）；メチオニンスルホキシド（Ｍｓｏ）；Ｎ（ｗ）−ニトロアルギニン（ｎＡｒｇ）；ホモリシン（ｈＬｙｓ）；ホスホノメチルフェニルアラニン（ｐｍＰｈｅ）；ホスホセリン（ｐＳｅｒ）；ホスホトレオニン（ｐＴｈｒ）；ホモアスパラギン酸（ｈＡｓｐ）；ホモグルタミン酸（homoglutanic  acid）（ｈＧｌｕ）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸（ＰＡ）；アゼチジン−３−カルボン酸（ＡＣＡ）；１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸；アリルグリシン（ａＯｌｙ）；プロパルギルグリシン（ｐｇＧｌｙ）；ホモアラニン（ｈＡｌａ）；ノルバリン（ｎＶａｌ）；ホモロイシン（ｈＬｅｕ）；ホモバリン（ｈＶａｌ）；ホモイソロイシン（ｈＩｌｅ）；ホモアルギニン（ｈＡｒｇ）；Ｎ−アセチルリシン（ＡｃＬｙｓ）；２，４−ジアミノ酪酸（Ｄｂｕ）；２，３−ジアミノ酪酸（Ｄａｂ）；Ｎ−メチルバリン（ＭｅＶａｌ）；ホモシステイン（ｈＣｙｓ）；ホモセリン（ｈＳｅｒ）；ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）およびホモプロリン（ｈＰｒｏ）。本明細書に記載のポリペプチドを構成し得る追加の非コード化アミノ酸は、当業者に明らかである。これらのアミノ酸は、Ｌ立体配置またはＤ立体配置のいずれかであり得る。
【０１０８】
側鎖保護基を有するアミノ酸または残基はまた、本明細書に記載のポリペプチドを構成する場合があることは、当業者に理解される。このような保護アミノ酸（この場合、これらは芳香族カテゴリーに属する）の非限定的な例として、これらに限定されないが、以下（括弧内に保護基を列挙する）が挙げられる：Ａｒｇ（ｔｏｓ）、Ｃｙｓ（メチルベンジル）、Ｃｙｓ（ニトロピリジンスルフェニル）、Ｇｌｕ（δ−ベンジルエステル）、Ｇｌｎ（キサンチル）、Ａｓｎ（Ｎ−δ−キサンチル）、Ｈｉｓ（ｂｏｍ）、Ｈｉｓ（ベンジル）、Ｈｉｓ（ｔｏｓ）、Ｌｙｓ（ｆｍｏｃ）、Ｌｙｓ（ｔｏｓ）、Ｓｅｒ（Ｏ−ベンジル）、Ｔｈｒ（Ｏ−ベンジル）およびＴｙｒ（Ｏ−ベンジル）。
【０１０９】
本明細書に記載のポリペプチドを構成し得る、配座的に拘束されている非コード化アミノ酸として、これらに限定されないが、Ｎ−メチルアミノ酸（Ｌ立体配置）；１−アミノシクロペンタ−（２または３）−エン−４−カルボン酸；ピペコリン酸；アゼチジン−３−カルボン酸；ホモプロリン（ｈＰｒｏ）；および１−アミノシクロペンタン−３−カルボン酸が挙げられる。
【０１１０】
上記のように、操作されたケトレダクターゼ酵素および操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素を生成するために天然に存在するポリペプチドに導入された種々の改変は、酵素の特定の特性を標的にし得る。
操作された酵素をコードするポリヌクレオチド
【０１１１】
別の態様では、本発明は、操作されたケトレダクターゼ酵素および操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを生じさせるために遺伝子発現を制御する１つまたは複数の異種調節配列に作動的に連結させることができる。操作されたケトレダクターゼおよび操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するケトレダクターゼポリペプチドまたは亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドを発現させることができる。
【０１１２】
種々のアミノ酸に対応するコドンが知られているため、タンパク質配列を利用できることで、対象をコードできるすべてのポリヌクレオチドの説明が得られる。同じアミノ酸が代替または同義コドンによってコードされる遺伝子コードの縮重は、極めて多数の核酸（これらのすべてが、本明細書に開示されている改善されたケトレダクターゼ酵素および／または改善された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素をコードする）の作製を可能にする。よって、特定のアミノ酸配列が同定されていれば、当業者は、そのタンパク質のアミノ酸配列を変えないような方法で１つまたは複数のコドンの配列を単に改変することによって、任意の数の異なる核酸を作製することができる。これに関して、本発明は、可能なコドン選択肢に基づいて組合せを選択することによって作製することができるポリヌクレオチドのそれぞれおよびすべての可能なバリエーションを具体的に企図しており、すべてのこのようなバリエーションは、表および実施例に提示するアミノ酸配列を含む本明細書に開示されている任意のポリペプチドについても具体的に開示されていると考えられるべきである。種々の実施形態では、好ましくは、コドンは、タンパク質が産生されている宿主細胞に合うように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンを使用し、細菌において遺伝子を発現させ；酵母において使用される好ましいコドンを酵母での発現に使用し；哺乳動物において使用される好ましいコドンを哺乳動物細胞での発現に使用する。
【０１１３】
一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼの配列または亜リン酸デヒドロゲナーゼの配列は、実施例に記載されているように、有益であると特定された位置を含む配列を含む。
【０１１４】
一部の実施形態では、改善されたケトレダクターゼポリペプチドまたは亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを、そのポリペプチドの改善された発現および／または産生をもたらすために、様々な方法で操作する。使用される発現ベクターによって、ベクターへと挿入する前に単離されたポリヌクレオチドを操作することが望ましいかまたは必要である場合がある。組換えＤＮＡ方法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技法は、当技術分野において周知である。
【０１１５】
細菌宿主細胞のための、本発明の核酸構築物の転写の指示に好適なプロモーターとして、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成性アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核性ベータ−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（例えば、Villa-Kamaroffら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、７５巻：３７２７〜３７３１頁［１９７８年］を参照のこと）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、DeBoerら、Proc.  Natl  Acad.  Sci.  USA、８０巻：２１〜２５頁［１９８３年］を参照のこと）が挙げられる。追加の好適なプロモーターは、当業者に公知である。
【０１１６】
糸状菌宿主細胞のための、本発明の核酸構築物の転写の指示に好適なプロモーターとして、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（ＷＯ９６／００７８７）についての遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼについての遺伝子からのプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの突然変異プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられる。
【０１１７】
酵母宿主において、有用なプロモーターとして、これらに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセレートキナーゼについての遺伝子からのもの、ならびに酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターが挙げられる（例えば、Romanosら、Yeast、８巻：４２３〜４８８頁［１９９２年］を参照のこと）。
【０１１８】
制御配列は、好適な転写終結因子配列、すなわち、宿主細胞によって認識されて転写を終結させる配列である場合もある。ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端にその終結因子配列を作動可能に連結させる。選択された宿主細胞において機能できる任意の終結因子を本発明において使用することができる。
【０１１９】
例えば、糸状菌宿主細胞のための例示的な転写終結因子は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼについての遺伝子から得ることができる。
【０１２０】
酵母宿主細胞のための例示的な終結因子は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼについての遺伝子から得ることができ、さらに当技術分野で公知の酵母宿主細胞のための他の有用な終結因子であり得る（例えば、Romanosら、上掲を参照のこと）。
【０１２１】
制御配列は、好適なリーダー配列、すなわち、宿主細胞による翻訳のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域である場合もある。ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端にそのリーダー配列を作動可能に連結させる。選択された宿主細胞において機能できる任意のリーダー配列を使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼについての遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための好適なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセレートキナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）についての遺伝子から得られる。
【０１２２】
制御配列は、ポリアデニル化配列、すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結した配列であって、転写されると宿主細胞にシグナルとして認識されて、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加させる配列である場合もある。本発明では、選択された宿主細胞において機能できる任意のポリアデニル化配列を使用することができる。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼについての遺伝子からのもの、ならびに当技術分野で公知の酵母宿主細胞のための追加の有用なポリアデニル化配列であり得る（例えば、Guoら、Mol.  Cell.  Biol.、１５巻：５９８３〜５９９０頁［１９９５年］を参照のこと）。
【０１２３】
制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、そのコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に向ける、シグナルペプチドコード領域であってもよい。核酸配列のコード配列の５’末端は、翻訳リーディングフレーム内に元々連結されているシグナルペプチドコード領域を固有に含有してもよく、そのコード領域のセグメントが分泌されるポリペプチドをコードする。あるいは、コード配列の５’末端は、そのコード配列にとって異種であるシグナルペプチドコード領域を含有してもよい。異種シグナルペプチドコード領域は、コード配列がシグナルペプチドコード領域を元々含有しない場合に必要とされ得る。
【０１２４】
あるいは、異種シグナルペプチドコード領域で、天然シグナルペプチドコード領域を単に置き換えて、そのポリペプチドの分泌を増強することができる。しかし、発現されたポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路へと向ける任意のシグナルペプチドコード領域を本発明において使用することができる。
【０１２５】
細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ  １１８３７マルトース生成性アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡについての遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域、ならびに当技術分野で公知の追加のシグナルペプチドである（例えば、Simonenら、Microbiol.  Rev.、５７巻：１０９〜１３７頁［１９９３年］を参照のこと）。
【０１２６】
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域として、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼについての遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ転化酵素についての遺伝子からのもの、ならびに追加の有用なシグナルペプチドコード領域であり得る（例えば、Romanosら、１９９２年、上掲を参照のこと）。
【０１２７】
制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であってもよい。結果として得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（または一部の場合には酵素原）として公知である。プロポリペプチドは、一般的に、不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的開裂によって成熟活性ポリペプチドへと変換され得る。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼ（ＷＯ９５／３３８３６）についての遺伝子から得ることができる。
【０１２８】
シグナルペプチド領域とプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端のすぐ隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端のすぐ隣に位置する。
【０１２９】
宿主細胞の増殖に対してポリペプチドの発現を調節することを可能にする調節配列を付加させることが望ましい場合もある。調節系の例は、調節化合物の存在を含めて、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオンまたはオフにさせるものである。原核宿主細胞では、好適な調節配列として、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞では、好適な調節系として、例として、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌では、好適な調節配列として、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【０１３０】
調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核系では、これらとして、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合には、本発明のＫＲＥＤポリペプチドまたは本発明のＰＤＨポリペプチドをコードする核酸配列をその調節配列に作動可能に連結させることとなる。
【０１３１】
よって、一部の実施形態では、本発明は、組換え発現ベクターが導入されることとなる宿主のタイプに応じて、操作されたケトレダクターゼポリペプチドもしくはそのバリアント、または操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドもしくはそのバリアントをコードするポリヌクレオチド、ならびに１つまたは複数の発現調節領域、例えば、プロモーターおよび終結因子、複製起点などを含む、組換え発現ベクターも対象とする。上記の種々の核酸および制御配列を互いに接合させて、組換え発現ベクター（これは、１つまたは複数の好都合な制限部位を含んで、ポリペプチドをコードする核酸配列のそのような部位での挿入または置換を可能にする場合がある）を生じさせ得る。あるいは、本発明の核酸配列を、発現のための適切なベクターに核酸配列またはこの配列を含む核酸構築物を挿入することによって、発現させることができる。発現ベクターを作製する場合には、コード配列をそのベクター内に配置して、そのコード配列を発現のための適切な制御配列と作動可能に連結させる。
【０１３２】
組換え発現ベクターは、好都合に、組換えＤＮＡ手順に供することができ、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であってもよい。ベクターの選択は、典型的には、そのベクターを導入することとなる宿主細胞とそのベクターの適合性に依存する。ベクターは、線状プラスミドであっても、閉環状プラスミドであってもよい。
【０１３３】
発現ベクターは、自律複製ベクター（すなわち、染色体外エンティティーとして存在するベクター）であって、その複製が染色体の複製に依存しないベクター（例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）であってもよい。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有してもよい。あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入された場合に、そのゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるものであってもよい。さらに、単一のベクターもしくはプラスミドまたは２つもしくはそれより多いベクターもしくはプラスミド（これらは、一緒に、宿主細胞のゲノムに導入されるべき全ＤＮＡを含有する）、あるいはトランスポゾンを使用してもよい。
【０１３４】
本発明の発現ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つまたは複数の選択マーカーを好ましくは含有する。選択マーカーは、その生成物が、殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養などをもたらす遺伝子であり得る。細菌選択マーカーの例は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのｄａｌ遺伝子、または抗生物質耐性、例えばアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、もしくはテトラサイクリン耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための好適なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。
【０１３５】
糸状菌宿主細胞において使用するための選択マーカーとして、これらに限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノスリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ヒグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの等価物が挙げられる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ細胞において使用するための実施形態として、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子が挙げられる。
【０１３６】
本発明の発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへのベクターの組込みを可能にするかまたはそのゲノムとは無関係に細胞におけるベクターの自律複製を可能にするエレメント（複数可）を含有し得る。宿主細胞ゲノムへの組込みのために、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列に依存する場合もあり、または相同もしくは非相同組換えによるベクターのゲノムへの組込みのためにベクターの任意の他のエレメントに依存する場合もある。
【０１３７】
あるいは、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組込みを指示するための追加の核酸配列を含有してもよい。これらの追加の核酸配列は、宿主細胞ゲノムのその（それらの）染色体（複数可）内の正確な位置（複数可）にベクターを組み込むことができる。正確な位置での組込みの尤度を増加させるために、組込みエレメントは、対応する標的配列と高相同性である核酸の、相同組換えの確率を増すために十分な数、例えば、１００から１０，０００塩基対、好ましくは４００から１０，０００塩基対、最も好ましくは８００から１０，０００塩基対を好ましくは含有すべきである。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム内の標的配列と相同性である任意の配列であってもよい。さらに、組込みエレメントは、非コード化核酸配列またはコード化核酸配列であってもよい。一方、ベクターを非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込んでもよい。
【０１３８】
自律複製のために、ベクターは、問題の宿主細胞におけるベクターの自律複製を可能にする複製起点をさらに含んでもよい。細菌の複製起点の例は、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉまたはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣ１７７（このプラスミドはＰ１５Ａ  ｏｒｉを有する）、もしくはｐＡＣＹＣ１８４の複製起点、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０もしくはｐＡＭβ１の複製起点である。酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組合せ、およびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組合せである。複製起点は、宿主細胞におけるその機能化を温度感受性にする突然変異を有するものであってもよい（例えば、Ehrlich、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA、７５巻：１４３３頁［１９７８年］を参照のこと）。
【０１３９】
本発明の核酸配列の１つより多くのコピーを宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の産生を増加させてもよい。核酸配列のコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞のゲノムに組み込むことによって達成することができるか、または増幅可能な選択マーカー遺伝子をその核酸配列と共に含めることによって達成することができる（この場合、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有し、その結果、追加の核酸配列コピーを含有する細胞は、細胞を適切な選択作用因子の存在下で培養することによって選択することができる）。
【０１４０】
本発明において使用するための発現ベクターの多くは市販されている。好適な市販の発現ベクターとして、これらに限定されないが、ＣＭＶプロモーターと、哺乳動物宿主細胞における発現のためのｈＧＨポリアデニル化部位と、ｐＢＲ３２２複製起点と、Ｅ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのアンピシリン耐性マーカーとを含む、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が挙げられる。他の市販の好適な発現ベクターとして、これらに限定されないが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙから誘導されるプラスミドが挙げられる（Latheら、Gene、５７巻：１９３〜２０１頁［１９８７年］を参照のこと）。
操作されたポリペプチドの発現のための宿主細胞
【０１４１】
本発明はまた、本発明の改善されたケトレダクターゼポリペプチドまたは改善された亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ポリヌクレオチドが、宿主細胞におけるケトレダクターゼ酵素または亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素の発現のために１つまたは複数の制御配列に作動的に連結されている宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによってコードされるＫＲＥＤポリペプチドまたは本発明の発現ベクターによってコードされるＰＤＨポリペプチドを発現させる際に使用される宿主細胞は、当技術分野において周知であり、これらとして、これらに限定されないが、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｉｎｏｒ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３、およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。上記宿主細胞のための適切な培養培地および増殖条件は、当技術分野において周知である。
【０１４２】
ケトレダクターゼまたは亜リン酸デヒドロゲナーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の種々の方法によって細胞に導入されてもよい。技法として、とりわけ、エレクトロポレーション、遺伝子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。細胞にポリヌクレオチドを導入するための種々の方法は、当業者に明らかであろう。
【０１４３】
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０は、本発明がこの特定の宿主株に限定されることを意図するものではないが、本発明における使用が見出される宿主株である。ｌａｃＩリプレッサーの制御下で、ｌａｃプロモーターに作動的に連結したプラスミドｐＣＫ１１０９００に、改善された酵素をコードするポリヌクレオチドを作動的に連結させることによって、発現ベクターを作製した。この発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０中の対象ポリヌクレオチドを含有する細胞は、細胞をクロラムフェニコール選択に供することによって単離され得る。
操作されたケトレダクターゼポリペプチドおよび操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの生成方法。
【０１４４】
一部の実施形態では、本発明の改善されたＫＲＥＤポリヌクレオチドおよびポリペプチドを作製するために、還元反応を触媒する天然に存在するケトレダクターゼ酵素を、Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｓｉｌｏｓｉｓまたはＳｐｏｒｏｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒから得る（または誘導する）。一部の実施形態では、親ポリヌクレオチド配列をコドン最適化して、指定宿主細胞におけるケトレダクターゼの発現を増強させる。実例として、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースから入手できるＳｐｏｒｏｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒ  ＫＲＥＤ配列の公知ポリペプチド配列に基づいて調製したオリゴヌクレオチドから、Ｓｐｏｒｏｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒの野生型ＫＲＥＤポリペプチドをコードする親ポリヌクレオチド配列を構築した。親ポリヌクレオチド配列をＥ．ｃｏｌｉでの発現のためにコドン最適化し、コドン最適化されたポリヌクレオチドを発現ベクターへとクローニングし、ｌａｃプロモーターおよびｌａｃＩリプレッサー遺伝子の制御下でケトレダクターゼ遺伝子を発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉにおいて活性ケトレダクターゼを発現するクローンを同定し、遺伝子をシークエンシングして、それらの素性を確認した。
【０１４５】
一部の実施形態では、操作されたケトレダクターゼは、上で論じたように、天然に存在するケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを突然変異誘発および／または定方向進化方法に供することによって得られる。突然変異誘発は、ランダム突然変異誘発および部位特異的突然変異誘発を含む、当技術分野で公知の技法のいずれかに従って実施することができる。定方向進化法は、シャッフリングを含む、改善されたプロモーターバリアントについてスクリーニングするための当技術分野で公知の技法のいずれかを用いて実施することができる。突然変異誘発および定方向進化方法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２６５，２０１号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３３７，１８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８３，０１１号、同第６，４８４，１０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５００，６１７号、同第６，５００，６３９号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１８，０６５号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６０５，４３０号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，６８６，５１５号、同第６，７０３，２４０号、同第６，７１６，６３１号、同第６，８２５，００１号、同第６，９０２，９２２号、同第６，９１７，８８２号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２２０，５６６号、同第７，２８８，３７５号、同第７，３８４，３８７号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，４６２，４６９号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，８７３，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９８１，６１４号、同第８，０１４，９６１号、同第８，０２９，９８８号、同第８，０４８，６７４号、同第８，０５８，００１号、同第８，０７６，１３８号、同第８，１０８，１５０号、同第８，１７０，８０６号、同第８，２２４，５８０号、同第８，３７７，６８１号、同第８，３８３，３４６号、同第８，４５７，９０３号、同第８，５０４，４９８号、同第８，５８９，０８５号、同第８，７６２，０６６号、同第８，７６８，８７１号、同第９，５９３，３２６号およびすべての関連する米国以外の対応特許；Lingら、Anal.  Biochem.、２５４巻（２号）：１５７〜７８頁［１９９７年］；Daleら、Meth.  Mol.  Biol.、５７巻：３６９〜７４頁［１９９６年］；Smith、Ann.  Rev.  Genet.、１９巻：４２３〜４６２頁［１９８５年］；Botsteinら、Science、２２９巻：１１９３〜１２０１頁［１９８５年］；Carter、Biochem.  J.、２３７巻：１〜７頁［１９８６年］；Kramerら、Cell、３８巻：８７９〜８８７頁［１９８４年］；Wellsら、Gene、３４巻：３１５〜３２３頁［１９８５年］；Minshullら、Curr.  Op.  Chem.  Biol.、３巻：２８４〜２９０頁［１９９９年］；Christiansら、Nat.  Biotechnol.、１７巻：２５９〜２６４頁［１９９９年］；Crameriら、Nature、３９１巻：２８８〜２９１頁［１９９８年］；Crameriら、Nat.  Biotechnol.、１５巻：４３６〜４３８頁［１９９７年］；Zhangら、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  U.S.A.、９４巻：４５０４〜４５０９頁［１９９７年］；Crameriら、Nat.  Biotechnol.、１４巻：３１５〜３１９頁［１９９６年］；Stemmer、Nature、３７０巻：３８９〜３９１頁［１９９４年］、Stemmer、Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁［１９９４年］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７；およびＷＯ２００９／１５２３３６（これらのすべては参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１４６】
突然変異誘発処理後に得られたクローンを、所望の改善された酵素特性を有する操作されたケトレダクターゼについてスクリーニングする。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋に変換されるにつれて、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ濃度が減少する率を（吸光度または蛍光の減少によって）モニタリングする標準的な生化学技法を使用して実施することができる。この反応では、ケトレダクターゼがケトン基質を対応するヒドロキシル基に還元するにつれて、そのケトレダクターゼによってＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨが消費（酸化）される。単位時間当たりの、吸光度または蛍光の減少によって測定されるような、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨ濃度の減少率は、固定量の溶解物（またはそれから作製された凍結乾燥粉末）中のＫＲＥＤポリペプチドの相対（酵素）活性を示す。生成物の立体化学は、種々の公知の技法によって、および実施例に提供されるように、確認することができる。所望される改善された酵素特性が熱安定性である場合、酵素活性は、酵素調製物を規定された温度に供し、熱処理後に残存する酵素活性の量を測定した後、測定することができる。次いで、ケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを単離し、シークエンシングして（もしあれば）ヌクレオチド配列の変化を特定し、これらを使用して宿主細胞においてその酵素を発現させる。
【０１４７】
その操作されたポリペプチドの配列が知られている場合、公知の合成方法に従って、標準的な固相方法により、酵素をコードするポリヌクレオチドを調製することができる。一部の実施形態では、約１００塩基までの断片を個々に合成し、次いで、（例えば、酵素的もしくは化学的ライゲーション方法、またはポリメラーゼ媒介方法によって）接合させて、任意の所望される連続配列を形成することができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、化学合成により（例えば、Beaucageら、Tet.  Lett.、２２巻：１８５９〜６９頁［１９８１年］により説明された古典的ホスホルアミダイト方法、または、それを、典型的には、自動合成方法で実施する場合には、Matthesら、EMBO  J.、３巻：８０１〜０５頁［１９８４年］により説明された方法を使用して）調製することができる。ホスホルアミダイト方法によれば、オリゴヌクレオチドが合成され（例えば、自動ＤＮＡ合成装置で）、精製され、アニールされ、ライゲーションされ、適切なベクターにクローニングされる。さらに、本質的に、様々な市場の供給業者（例えば、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｍｉｄｌａｎｄ、ＴＸ；Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒａｍｏｎａ、ＣＡ；ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ；Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡおよび多くの他の業者）のいずれかから任意の核酸を入手することができる。
【０１４８】
宿主細胞において発現された操作されたケトレダクターゼ酵素および操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素は、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含む、周知のタンパク質精製技法のいずれか１つまたは複数を使用して、細胞およびまたは培養培地から回収することができる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌からのタンパク質の溶解および高効率抽出に好適な溶液は、商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で市販されている。
【０１４９】
ケトレダクターゼポリペプチドおよび／または亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフ技法として、とりわけ、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動法、およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、実効電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などの因子に部分的に依存し、当業者に明らかであろう。
【０１５０】
一部の実施形態では、アフィニティー技法を使用して、改善されたケトレダクターゼ酵素および／または改善された亜リン酸デヒドロゲナーゼ酵素を単離する。アフィニティークロマトグラフィー精製には、ケトレダクターゼポリペプチドまたは亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用することができる。抗体の産生のために、ケトレダクターゼまたは亜リン酸デヒドロゲナーゼを注射することによって、ウサギ、マウス、ラットなどが挙げられるが、これらに限定されない種々の宿主動物を免疫することができる。ケトレダクターゼポリペプチドは、側鎖官能基または側鎖官能基に付着されたリンカーによって、ＢＳＡなどの好適な担体に付着させてもよい。宿主種に応じて、フロイント（完全または不完全）アジュバント、鉱物ゲル、例えば、水酸化アルミニウム、界面活性物質、例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびに潜在的に有用なヒトアジュバント、例えば、ＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍが挙げられるが、これらに限定されない種々のアジュバントを使用してその免疫応答を増加させることができる。
【０１５１】
ケトレダクターゼおよび／または亜リン酸デヒドロゲナーゼは、酵素を発現する細胞の形態で、粗抽出物として、または単離されたかもしくは精製された調製物として、調製され、使用されてもよい。ケトレダクターゼおよび／または亜リン酸デヒドロゲナーゼは、粉末の形態（例えば、アセトン粉末）での凍結乾燥物として調製されるか、または酵素溶液として調製されてもよい。一部の実施形態では、ケトレダクターゼまたは亜リン酸デヒドロゲナーゼは、実質的に純粋な調製物の形態であり得る。
【０１５２】
一部の実施形態では、ケトレダクターゼポリペプチドおよび／または亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドは、固体基質に付着され得る。この基質は、固相、表面、および／または膜であり得る。固体支持体は、有機ポリマー、例えば、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシ、およびポリアクリルアミド、ならびにそのコポリマーおよびグラフトから構成され得る。固体支持体はまた、無機、例えば、ガラス、シリカ、コントロールドポアガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｐｏｒｅ  ｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金もしくは白金などの金属でもあり得る。基質の外形は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または表面の形態であり得る。表面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨張または非膨張の特徴を有し得る。固体支持体は、ウェル、くぼみ、もしくは他の容器の形態、ベッセル、特色、または位置で構成され得る。複数の支持体が、試薬のロボット送達のためにアドレス指定できる種々の位置に、または検出方法および／もしくは検出装置によって種々の位置に、整列して構成され得る。
【０１５３】
当業者に公知であるように、ケトレダクターゼ触媒還元反応は、典型的には、補因子を必要とする。操作されたケトレダクターゼの多くの実施形態は、野生型ケトレダクターゼ酵素により触媒される反応よりも補因子を必要とすることははるかに少ないが、本明細書に記載の操作されたケトレダクターゼ酵素によって触媒される還元反応はまた、典型的には、補因子を必要とする。本明細書で使用する場合、「補因子」という用語は、ケトレダクターゼ酵素との組合せで動作する非タンパク質化合物を指す。本明細書に記載の操作されたケトレダクターゼ酵素と共に使用するために好適な補因子として、これらに限定されないが、ＮＡＤＰ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸）、ＮＡＤＰＨ（ＮＡＤＰ＋の還元形態）、ＮＡＤ＋（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド）およびＮＡＤＨ（ＮＡＤ＋の還元形態）が挙げられる。一般的に、補因子の還元形態を反応混合物に添加する。還元ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ形態は、必要に応じて、補因子再生系を使用してその酸化ＮＡＤ（Ｐ）＋形態から再生させることができる。「補因子再生系」という用語は、補因子の酸化形態を還元する反応（例えば、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨ）に関与する１セットの反応物を指す。ケト基質のケトレダクターゼ触媒還元によって酸化された補因子は、補因子再生系によって還元形態に再生される。補因子再生系は、還元性水素等価物の供給源であり、その補因子の酸化形態を還元できる、化学量論量の還元剤を含む。補因子再生系は、還元剤による補因子の酸化形態の還元を触媒する触媒、例えば、酵素触媒をさらに含んでもよい。それぞれ、ＮＡＤ＋またはＮＡＤＰ＋からＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを再生するための補因子再生系は、当技術分野において公知であり、本明細書に記載の方法において使用することができる。
【実施例】
【０１５４】
本発明の種々の特色および実施形態は以下の代表的な実施例において例証され、これらは、例証を意図するものであり、限定を意図するものではない。
【０１５５】
以下の実験的開示では、以下の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（１分当たりの回転数）；℃（摂氏度）；ＲＴ（室温）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する改善倍率）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＬＢ（ルリアブロス）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｐ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｄａｉｃｅｌ（Ｄａｉｃｅｌ、Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ、ＰＡ）；Ｇｅｎｅｔｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．、Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ、ＯＲ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．の一部門、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）、Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部門、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）；およびＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）。
（実施例１）
ケトレダクターゼおよび亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の構築および発現ベクター
【０１５６】
野生型Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｉｓケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）をコードする遺伝子をゲノムＤＮＡから増幅させ、ｌａｃプロモーターの制御下で発現ベクターｐＣＫ１１  ０９００（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号の図３を参照のこと）へとクローニングした。この発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有した。野生型ケトレダクターゼの活性を、ＷＯ２００８／０４２８７６に記載されているように確認した。本発明の操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドも同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１  ０での発現のためにベクターｐＣＫ１１  ０９００へとクローニングした。ＫＲＥＤ遺伝子の定方向進化法を、最初に、親遺伝子（すなわち、配列番号２、６、１０４）を選択し、その後の、ある特定の構造的特色に関連する位置を突然変異誘発に供したバリアント遺伝子のライブラリー構築によって実行した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させて、実施例２、５および１２に記載されているＨＴＰアッセイを使用してスクリーニングした。
【０１５７】
野生型Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ  ｓａｌｍｏｎｉｃｏｌｏｒケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）をコードする遺伝子を、ケトレダクターゼの報告されているアミノ酸配列と、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２００８／０４２８７６の実施例１に記載されているようなコドン最適化アルゴリズムとに基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために合成した。遺伝子を、４２ヌクレオチドから構成されるオリゴヌクレオチドを使用して合成し、ｌａｃプロモーターの制御下で発現ベクターｐＣＫ１１  ０９００（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号の図３を参照のこと）へとクローニングした。この発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有した。野生型ケトレダクターゼの活性を、ＷＯ２００８／０４２８７６に記載されているように確認した。本発明の操作されたケトレダクターゼをコードするポリヌクレオチドも同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１  ０での発現のためにベクターｐＣＫ１１  ０９００へとクローニングした。ＫＲＥＤ遺伝子の定方向進化法を、最初に、親遺伝子（すなわち、配列番号１１２、１２４、１３８）を選択し、その後の、ある特定の構造的特色に関連する位置を突然変異誘発に供したバリアント遺伝子のライブラリー構築によって実行した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させて、実施例３、６、７、８および１２に記載されているＨＴＰアッセイを使用してスクリーニングした。
【０１５８】
野生型Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ亜リン酸デヒドロゲナーゼ（ＰＤＨ）をコードする遺伝子のバリアントを、ｌａｃプロモーターの制御下で発現ベクターｐＣＫ１１  ０９００（参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号の図３を参照のこと）へとクローニングした。この発現ベクターは、Ｐ１５ａ複製起点およびクロラムフェニコール耐性遺伝子も含有した。亜リン酸デヒドロゲナーゼの活性を、ＷＯ２００８／０４２８７６に記載されているように確認した。
【０１５９】
本発明の操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドも同様に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１  ０での発現のためにベクターｐＣＫ１１  ０９００へとクローニングした。ＰＤＨ遺伝子の定方向進化法を、最初に、親遺伝子（すなわち、配列番号１７２、１８２、２００、２０８、２６０）を選択し、その後の、ある特定の構造的特色に関連する位置を突然変異誘発に供したバリアント遺伝子のライブラリー構築によって実行した。次いで、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させて、実施例４、および９から１２に記載されているＨＴＰアッセイを使用してスクリーニングした。
（実施例２）
酸化のために操作されたＫＲＥＤポリペプチドの産生および分析
【０１６０】
定方向進化法によって得て、進化したケトレダクターゼ遺伝子を含有するプラスミドライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０へと形質転換し、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地に置いた。３０℃で少なくとも１６時間のインキュベーション後、コロニーを、Ｑ−ｂｏｔ（登録商標）ロボテックコロニーピッカー（ｒｏｂｏｔｉｃ  ｃｏｌｏｎｙ  ｐｉｃｋｅｒ）（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を使用して、ＬＢ、１％のグルコース、および３０μｇ／ｍｌのＣＡＭ  ２００μＬを含有する９６ウェルシャローウェルマイクロタイタープレート中に選び取った。細胞を、２００ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で１８〜２０時間増殖させた。次いで、この培養物２０μＬを、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）、１ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＺｎＳＯ４および３０μｇ／ｍｌのＣＡＭ  ３６０μＬに移した。ディープウェルプレートを、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で２．５時間インキュベートした後（ＯＤ６００  ０．６〜０．８）、組換え遺伝子発現を、最終濃度を１ｍＭにしたイソプロピルチオグリコシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。次いで、プレートを、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で１８〜２１時間インキュベートした。
【０１６１】
細胞培養物を、３５００×ｇで２０分間ペレット化させ、それらの上清を廃棄した。細胞ペレットを、室温で２時間振盪させることによって、１ｇ／Ｌのリゾチームおよび０．５ｇ／Ｌの硫酸ポリミキシンＢを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ、２ｍＭのＺｎＳＯ４、１ｍＭのＭｇＣｌ２  ３００μＬ（ｐＨ７．５）中に溶解させた。試料を３５００×ｇで２０分間遠心分離し、細胞デブリを清澄化し、上清を使用して、実施例５および１２に記載の形質転換を実行した。
（実施例３）
還元のために操作されたＫＲＥＤポリペプチドの産生および分析
【０１６２】
定方向進化法によって得て、進化したケトレダクターゼ遺伝子を含有するプラスミドライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０へと形質転換し、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地に置いた。３０℃で少なくとも１６時間のインキュベーション後、コロニーを、Ｑ−ｂｏｔ（登録商標）ロボテックコロニーピッカー（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を使用して、ＬＢ、１％のグルコース、および３０μｇ／ｍｌのＣＡＭ  ２００μＬを含有する９６ウェルシャローウェルマイクロタイタープレート中に選び取った。細胞を、２００ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で１８〜２０時間増殖させた。次いで、この培養物２０μＬを、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）、１ｍＭのＭｇＳＯ４、および３０μｇ／ｍｌのＣＡＭ  ３６０μＬに移した。ディープウェルプレートを、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で２．５時間インキュベートした後（ＯＤ６００  ０．６〜０．８）、組換え遺伝子発現を、最終濃度を１ｍＭにしたイソプロピルチオグリコシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。次いで、プレートを、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で１８〜２１時間インキュベートした。
【０１６３】
細胞培養物を、３５００×ｇで２０分間ペレット化させ、それらの上清を廃棄した。細胞ペレットを、室温で２時間振盪させることによって、１ｇ／Ｌのリゾチームおよび０．５ｇ／Ｌの硫酸ポリミキシンＢを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭのＭｇＳＯ４  ３００μＬ（ｐＨ７．５）中に溶解させた。試料を３５００×ｇで２０分間遠心分離し、細胞デブリを清澄化し、上清を使用して、実施例６から８、および実施例１２に記載の形質転換を実行した。
（実施例４）
操作された亜リン酸デヒドロゲナーゼポリペプチドの産生および分析
【０１６４】
定方向進化法によって得て、進化した亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するプラスミドライブラリーを、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０へと形質転換し、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地に置いた。３０℃で少なくとも１６時間のインキュベーション後、コロニーを、Ｑ−ｂｏｔ（登録商標）ロボテックコロニーピッカー（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を使用して、ＬＢ、１％のグルコース、および３０μｇ／ｍｌのＣＡＭ  ２００μＬを含有する９６ウェルシャローウェルマイクロタイタープレート中に選び取った。細胞を、２００ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で１８〜２０時間増殖させた。次いで、この培養物２０μＬを、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）および３０μｇ／ｍｌのＣＡＭ  ３６０μＬに移した。ディープウェルプレートを、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で２．５時間インキュベートした後（ＯＤ６００  ０．６〜０．８）、組換え遺伝子発現を、最終濃度を１ｍＭにしたイソプロピルチオグリコシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。次いで、プレートを、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で１８〜２１時間インキュベートした。
【０１６５】
細胞培養物を、３５００×ｇで２０分間ペレット化させ、それらの上清を廃棄した。細胞ペレットを、室温で２時間振盪させることによって、１ｇ／Ｌのリゾチームおよび０．５ｇ／Ｌの硫酸ポリミキシンＢを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ  ３００μＬ（ｐＨ７．５）中に溶解させた。試料を３５００×ｇで２０分間遠心分離し、細胞デブリを清澄化し、上清を使用して、実施例９から１２に記載の形質転換を実行した。
（実施例５）
配列番号２のＫＲＥＤバリアント
【０１６６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＫＲＥＤバリアントを実施例１に記載したように生成した。バリアントの活性を分析するために、実施例２に記載したように生成した上清２０μＬを、１００ｍＭの亜リン酸ナトリウム（ｐＨ８．０）中に４ｇ／ＬのＮＡＤ＋、１０ｇ／Ｌの市販のＮＡＤＨオキシダーゼ（ＮＯｘ−９）および１００ｍＭのＦＡＤを含むラセミアルコール基質（５０ｇ／Ｌ）１８０μＬの混合物に添加した。反応物を３０℃で１６〜１８時間インキュベートし、１ＭのＨＣｌ  ２００μＬの添加によってクエンチした。クエンチした混合物を試料に添加し、簡単に混合した。反応試料をＵＰＬＣによって分析し、残留基質および生成物を上述のように定量した。有意に改善されたバリアントを、以下の表５．１に与える。
【表５．１−１】
2020517284.tif 000008
【表５．１−２】
2020517284.tif 000009
【表５．１−３】
2020517284.tif 000010
（実施例６）
配列番号１１２のＫＲＥＤバリアント
【０１６７】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＫＲＥＤバリアントを実施例１に記載したように生成した。バリアントの活性を分析するために、実施例３に記載したように生成した上清５μＬを、０．２５ｍＭのＮＡＤＰＨを含有する０．３Ｍの亜リン酸緩衝液（ｐＨ７．９）；１９ｇ／Ｌのケトン基質および５ｇ／ＬのＰＤＨ  ９５μＬに添加した。反応物を、穏やかに振盪させながら、室温で１６〜１８時間インキュベートした。反応物を、１ＭのＨＣｌ  １００μＬの添加によってクエンチした。クエンチした混合物（１０μＬ）を水１９０μＬ中に希釈した。反応試料（１０μＬ）をＨＰＬＣによって分析し、残留基質および生成物を上述のように定量した。有意に改善されたバリアントを、以下の表６．１に与える。
【表６．１】
2020517284.tif 000011
（実施例７）
配列番号１２４のＫＲＥＤバリアント
【０１６８】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＫＲＥＤバリアントを実施例１に記載したように生成した。バリアントの活性を分析するために、実施例３に記載したように生成した上清７．５μＬを、０．２５ｍＭのＮＡＤＰＨを含有する０．３Ｍの亜リン酸緩衝液（ｐＨ７．９）；５０ｇ／Ｌのケトン基質および５ｇ／ＬのＰＤＨ  １９２．５μＬに添加した。反応物を、穏やかに振盪させながら、室温で１６〜１８時間インキュベートした。反応物を、１ＭのＨＣｌ  １００μＬの添加によってクエンチした。クエンチした混合物（１０μＬ）を水１９０μＬ中に希釈した。反応試料（１０μＬ）をＨＰＬＣによって分析し、残留基質および生成物を上述のように定量した。有意に改善されたバリアントを、以下の表７．１に与える。
【表７．１】
2020517284.tif 000012
（実施例８）
配列番号１３８のＫＲＥＤバリアント
【０１６９】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＫＲＥＤバリアントを実施例１に記載したように生成した。バリアントの補因子優先性を分析するために、４つの別々のアッセイを利用した。第１に、実施例３に記載したように生成した上清１０μＬを、１ｇ／Ｌのケトンおよび１ｇ／ＬのＮＡＤＰＨを含有する０．２Ｍの亜リン酸緩衝液（ｐＨ７．９）９０μＬに添加した。試料のＮＡＤＰＨの初期消費速度をＥｘ  λ＝３３０ｎｍ  Ｅｍ  λ＝４４５ｎｍを有する蛍光によって分析し、２１秒毎に１８０秒間得た。
【０１７０】
第２に、実施例３に記載したように生成した上清２０μＬを、１ｇ／Ｌのラセミアルコールおよび２ｇ／ＬのＮＡＤ＋を含有する０．２Ｍの亜リン酸緩衝液（ｐＨ７．９）１９０μＬに添加した。ＮＡＤ＋の初期消費速度をＵＶ３４０ｎｍにおける動態読み取りによって分析し、データを９秒毎に５分間得た。
【０１７１】
第３に、実施例３に記載したように生成した上清２０μＬを、２ｇ／Ｌのイミダゾールケトンおよび１６．４ｍＭのＮＡＤＰＨを含有する５００ｍＭの亜リン酸ナトリウム１８０μＬに添加し、試料を、３００ｒｐｍで振盪させながら、室温で２時間インキュベートした。反応物を、ＭｅＣＮ  ２００μＬの添加によってクエンチした。５分間振盪させた後、クエンチした反応物１００μＬを、水１００μＬを含有するｃｏ−ｓｔａｒ丸底プレートを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅのフィルタープレート（４５ミクロンの孔径）に移し、濾液を採取し、混合物を４０００ｒｐｍで２分間スピンさせた。反応試料（１０μＬ）をＨＰＬＣによって分析し、残留基質および生成物を上述のように定量した。
【０１７２】
第４に、実施例３に記載したように生成した上清２０μＬを、２ｇ／Ｌのイミダゾールケトンおよび１６．４ｍＭのＮＡＤＰＨを含有する５００ｍＭの亜リン酸ナトリウム１８０μＬに添加し、試料を、３００ｒｐｍで振盪させながら、室温で２時間インキュベートした。反応物をＭｅＣＮ  ２００μＬの添加によってクエンチした。５分間振盪させた後、クエンチした反応物１００μＬを、水１００μＬを含有するｃｏ−ｓｔａｒ丸底プレートを有するＭｉｌｌｉｐｏｒｅのフィルタープレート（４５ミクロンの孔径）に移し、濾液を採取し、混合物を４０００ｒｐｍで２分間スピンさせた。反応試料（１０μＬ）をＨＰＬＣによって分析し、残留基質および生成物を上述のように定量した。補因子の特異性を以下のように計算した。
（ＮＡＤＰＨを用いて生成した生成物の量）／（ＮＡＤＨを用いて生成した生成物の量）
有意に改善されたバリアントを、以下の表８．１に与える。
【表８．１】
2020517284.tif 000013
（実施例９）
配列番号１７２のＰＤＨバリアント
【０１７３】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＤＨバリアントを実施例１に記載したように生成した。バリアントの活性を分析するために、実施例３に記載したように生成した上清５μＬを、０．２５ｍＭのＮＡＤＰＨを含有する０．５Ｍの亜リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．９）；５０ｇ／Ｌのケトン基質および２ｇ／Ｌの配列番号１３８のＫＲＥＤ  ９５μＬに添加した。反応物を、穏やかに振盪させながら、２５℃で１６〜１８時間インキュベートした。反応物を、１ＭのＨＣｌ  １００μＬの添加によってクエンチした。クエンチした混合物（１０μＬ）を水１９０μＬ中に希釈した。反応試料（１０μＬ）をＨＰＬＣによって分析し、残留基質および生成物を上述のように定量した。有意に改善されたバリアントを、以下の表９．１に与える。
【表９．１】
2020517284.tif 000014
（実施例１０）
配列番号２０８のＰＤＨバリアント
【０１７４】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＤＨバリアントを実施例１に記載したように生成した。バリアントの補因子優先性を分析するために、実施例３に記載したように生成した上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で４倍希釈した。希釈した溶解物２０μＬを、０．１Ｍの亜リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．９）１８０μＬに添加し、終夜インキュベートして、溶解物中に存在する残留するＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋を消費した。次いで、バリアントを３つの別々のアッセイにおいてスクリーニングして、これらの補因子特異性を分析した。第１に、初期速度ＮＡＤＰ＋アッセイのために、０．１Ｍの亜リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．９）中の０．２ｍＭのＮＡＤＰ＋を添加し、２分かけて蛍光アッセイによって初期速度を測定した。第２に、初期速度ＮＡＤ＋アッセイのために、０．１Ｍの亜リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．９）中の０．２ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、２分かけて蛍光アッセイによって初期速度を測定した。第３に、補因子競合アッセイを実施した。このアッセイのために、１００ｕＭのＮＡＤＰ、１ｍＭのＮＡＤおよび１ｇ／ＬのＮＡＤＨオキシダーゼＮＯｘ−９を含有する１００ｍＭの亜リン酸塩（ｐＨ７．９）を反応物に添加した。ＮＯｘ−９は、すべてのＮＡＤＨを直ちに消費し、ＮＡＤＰＨシグナルのみを放出し、ＮＡＤＰ＋とＮＡＤ＋の間の競合によって低減した。反応物を、１ＭのＨＣｌ  １００μＬの添加によってクエンチした。クエンチした混合物（１０μＬ）を水１９０μＬ中に希釈した。希釈した反応試料（１０μＬ）をＨＰＬＣによって分析し、残留基質および生成物を上述のように定量した。有意に改善されたバリアントを、以下の表１０．１に与える。
【表１０．１−１】
2020517284.tif 000015
【表１０．１−２】
2020517284.tif 000016
（実施例１１）
配列番号２０８の追加のＰＤＨバリアント
【０１７５】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＤＨバリアントを実施例１に記載したように生成した。バリアントの補因子優先性を分析するために、実施例３に記載したように生成した上清を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）で４倍希釈した。希釈した溶解物２０μＬを、０．１Ｍの亜リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．９）１８０μＬに添加し、終夜インキュベートして、溶解物中に存在する残留するＮＡＤ＋およびＮＡＤＰ＋を消費した。次いで、バリアントを３つの別々のアッセイにおいてスクリーニングして、これらの補因子特異性を分析した。第１に、初期速度ＮＡＤＰ＋アッセイのために、０．１Ｍの亜リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．９）中の０．２ｍＭのＮＡＤＰ＋を添加し、２分かけて蛍光アッセイによって初期速度を測定した。第２に、初期速度ＮＡＤ＋アッセイのために、０．１Ｍの亜リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．９）中の０．２ｍＭのＮＡＤ＋を添加し、２分かけて蛍光アッセイによって初期速度を測定した。第３に、補因子競合アッセイを実施した。このアッセイのために、プレインキュベートした溶解物３μＬを、２ｍＭのＮＡＤ、０．２ｍＭのＮＡＤＰ、２ｇ／Ｌの配列番号１３８のＫＲＥＤ、４ｇ／Ｌの配列番号１０４のＫＲＥＤおよび１０ｇ／Ｌのケトン（２）を含有する２００ｍＭの亜リン酸塩（ｐＨ７．９）９７μＬに添加した。反応物を、１ＭのＨＣｌ  １００μＬの添加によってクエンチした。クエンチした混合物（１０μＬ）を水１９０μＬ中に希釈した。希釈した反応試料（１０μＬ）を逆相ＨＰＬＣによって分析し、残留基質および生成物の両エナンチオマーを上述のように定量した。有意に改善されたバリアントを、以下の表１１．１に与える。
【表１１．１】
2020517284.tif 000017
（実施例１２）
操作されたポリペプチドの産生および性能評価
【０１７６】
配列番号２のＫＲＥＤの定方向進化法によって得て、進化したケトレダクターゼ遺伝子を含有するバリアントを含むプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０へと形質転換し、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地に置いた。３０℃で少なくとも１６時間のインキュベーション後、単一のコロニーを、ＬＢ、１％のグルコース、および３０μｇ／ｍｌのＣＡＭ  ５ｍＬ中に選び取った。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で１８〜２０時間増殖させた。次いで、この培養物を、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）、２ｍＭのＺｎＳＯ４、１ｍＭのＭｇＳＯ４、および３０μｇ／ｍｌのＣＡＭ中に移し、最終ＯＤ６００が約０．０２および最終体積が２５０ｍＬとした。２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で３．５時間、フラスコをインキュベートした後（ＯＤ６００  ０．６〜０．８）、組換え遺伝子発現を、最終濃度を１ｍＭにしたイソプロピルチオグリコシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。次いで、フラスコを、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で１８〜２１時間インキュベートした。細胞を、３５００×ｇで２０分間ペレット化させ、上清を廃棄した。細胞ペレットを、２ｍＭのＺｎＳＯ４および１ｍＭのＭｇＳＯ４を含有する氷冷した５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）５０ｍＬ中で洗浄し、同一の緩衝液３０ｍｌに再懸濁させ、１８〜２０ｋｐｓｉで、細胞ディスラプターを使用して溶解させた。溶解物を、１００００×ｇで６０分間清澄化し、清澄化した上清を凍結乾燥してオフホワイト色の粉末にした。
【０１７７】
配列番号１１２および１３８のＫＲＥＤの定方向進化法によって得て、進化したケトレダクターゼ遺伝子を含有するバリアントを含むプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０へと形質転換し、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地に置いた。３０℃で少なくとも１６時間のインキュベーション後、単一のコロニーを、ＬＢ、１％のグルコース、および３０μｇ／ｍｌのＣＡＭ  ５ｍＬ中に選び取った。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で１８〜２０時間増殖させた。次いで、この培養物を、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）、および３０μｇ／ｍｌのＣＡＭ中に移し、最終ＯＤ６００が約０．０２および最終体積が２５０ｍＬとした。２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で３．５時間、フラスコをインキュベートした後（ＯＤ６００  ０．６〜０．８）、組換え遺伝子発現を、最終濃度を１ｍＭにしたイソプロピルチオグリコシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。次いで、フラスコを、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で１８〜２１時間インキュベートした。細胞を、３５００×ｇで２０分間ペレット化させ、上清を廃棄した。細胞ペレットを、氷冷した５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）５０ｍＬ中で洗浄し、同一の緩衝液３０ｍｌに再懸濁させ、１８〜２０ｋｐｓｉで、細胞ディスラプターを使用して溶解させた。溶解物を、１００００×ｇで６０分間清澄化し、清澄化した上清を凍結乾燥してオフホワイト色の粉末にした。
【０１７８】
配列番号１７２および２０８のＰＤＨの定方向進化法によって得て、進化した亜リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子を含有するバリアントを含むプラスミドを、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０へと形質転換し、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培地に置いた。３０℃で少なくとも１６時間のインキュベーション後、単一のコロニーを、ＬＢ、１％のグルコース、および３０μｇ／ｍｌのＣＡＭ  ５ｍＬ中に選び取った。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で１８〜２０時間増殖させた。次いで、この培養物を、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）、および３０μｇ／ｍｌのＣＡＭ中に移し、最終ＯＤ６００が約０．０２および最終体積が２５０ｍＬとした。２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で３．５時間、フラスコをインキュベートした後（ＯＤ６００  ０．６〜０．８）、組換え遺伝子発現を、最終濃度を１ｍＭにしたイソプロピルチオグリコシド（ＩＰＴＧ）によって誘導した。次いで、フラスコを、２５０ｒｐｍで振盪させながら、３０℃で１８〜２１時間インキュベートした。細胞を、３５００×ｇで２０分間ペレット化させ、上清を廃棄した。細胞ペレットを、氷冷した５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）５０ｍＬ中で洗浄し、同一の緩衝液３０ｍｌに再懸濁させ、１８〜２０ｋｐｓｉで、細胞ディスラプターを使用して溶解させた。溶解物を、１００００×ｇで６０分間清澄化し、清澄化した上清を凍結乾燥してオフホワイト色の粉末にした。
【０１７９】
プロセスと同様の条件下で最終化合物を評価するために、５００ｍＭの亜リン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．９）中の５０ｇ／Ｌのラセミアルコール基質、０．１ｇ／ＬのＮＡＤ、０．１ｇ／ＬのＮＡＤＰ、２．５ｇ／Ｌの配列番号１０４のＫＲＥＤ、１０ｇ／Ｌの市販のＮＡＤＨオキシダーゼＮＯｘ−９、２．５ｇ／Ｌの配列番号１５４のＫＲＥＤ、１０ｇ／Ｌの配列番号２５０のＰＤＨを、１％ｖ／ｖの消泡剤を含む酸素気流下で、室温で２４時間撹拌したところ、基質の９３％の変換および（Ｒ）−アルコール１ａの９９．５％エナンチオマー過剰を生じた。反応試料を逆相ＨＰＬＣによって分析し、残留基質および生成物を上述のように定量した。
【０１８０】
種々の具体的実施形態を例証し記載したが、種々の変更が、本発明の精神および範囲を逸脱することなくなされ得ることが認識される。
【０１８１】
この出願で引用されるすべての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書が、すべての目的のために参照により組み込まれることを個別に示されているのと同程度に、すべての目的のためにそれらの全体として、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2020517284.tif 000018
【図２】
2020517284.tif 000019
【図３】
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【図４】
2020517284.tif 000021
【図５】
2020517284.tif 000022
【図６】
2020517284.tif 000023
【配列表】
2020517284000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年12月27日(2019.12.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2020517284000001.app
【国際調査報告】
2020517284.tif 000024
2020517284.tif 000025
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