(57)【要約】  【解決手段】  本出願は、糖尿病の治療、体重減量、および／または心血管リスクの低減に有用な化合物を開示している。化合物は二機能性であり、したがってＧＬＰ−１受容体作動薬およびＰＣＳＫ９阻害剤の両方による治療から利益を得ることのできる患者に対する単純な治療に好適である。  【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物であって、
ｉ．前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号１３７によって特定されるＧＬＰ−１（７−３７）の類似体であり、
ｉｉ．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１によって特定されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体である。
【請求項２】
前記化合物が二機能性である、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記化合物が、前記ＧＬＰ−１類似体および前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を含む融合ポリペプチドを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項４】
前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端に前記ＧＬＰ−１類似体を、Ｃ末端に前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を含む、請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
前記融合ポリペプチドがペプチドスペーサー、例えば配列番号１１５〜１３６によって定義されるスペーサーの群から選択されるスペーサーを含む、請求項３または請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物が１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号１３８〜１８７、例えば配列番号１３９〜１４６、１５５〜１６２、および１６４〜１７３、例えば配列番号１３９〜１４２、１５５〜１６２、および１６４〜１７３、例えば配列番号１３９、１４２、１５５〜１６２、および１６４〜１７３、例えば配列番号１３９、１５５〜１６２および１６４〜１７３、例えば配列番号１５５〜１６２および１６４〜１７３、例えば配列番号１３９および１６４、または例えば配列番号１３９もしくは１６４により定義されるＧＬＰ−１類似体の群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が配列番号２〜１１４、例えば配列番号２〜４、６〜１９、２１〜４４、４６、４７、４９〜５３、５５、および５８〜１１４、例えば配列番号１９、２１、７３、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３および１１４、例えば配列番号１０７および１０８、または例えば配列番号１０８により定義されるＥＧＦ（Ａ）類似体の群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
前記融合ポリペプチドが、配列番号１８８〜３８４および配列番号３８７〜３８８により定義される配列の群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記化合物が少なくとも１つの半減期を延長させる置換基を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記化合物が、脂肪酸基およびリンカーを含む少なくとも１つの置換基を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの置換基がＬｙｓ残基を介して付着された、請求項１１または請求項１２に記載の化合物。
【請求項１３】
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１、＃４８、＃６９および＃３０６、例えば＃３０６および＃６９、または例えば＃３０６もしくは＃６９として定義される化合物の群から選択される化合物。
【請求項１４】
糖尿病、過体重および／または心血管疾患を治療する方法で使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれかに記載の化合物を必要とする患者に対し、前記化合物の薬学的に有効な投与量を投与することを含む、糖尿病、過体重および／または心血管疾患の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＳＫ９を阻害し、ＧＬＰ−１受容体刺激する二機能性化合物、およびその製薬学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
高ＬＤＬ−Ｃ（低密度リポタンパク質コレステロール）レベルおよび脂質異常症は心血管疾患のよく知られた要因である。
【０００３】
脂質異常症の治療についてはスタチンが２５年間にわたり承認されている。このクラスは心血管イベントの大幅かつ一貫した減少を実証し、安全性プロファイルも許容可能なものである。最も良く売れているスタチンであるアトルバスタチン（リピトール（商標））は、常に世界で最も良く売れている薬であり、１９９６年から２０１２年までの売上は１２５０億万ドル以上にのぼった。
【０００４】
スタチンおよびその他の脂質低下薬の利用可能性および広範囲の使用にもかかわらず、多くの患者は目標とするＬＤＬ−Ｃレベルに達せず、心血管疾患の発症リスクが依然として高い。ＰＣＳＫ９（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型）は、肝臓でのＬＤＬ−Ｒ（ＬＤＬ受容体）分解を促進し、それによって肝臓でのＬＤＬ−Ｒ表面発現を減少させ、その結果としてＬＤＬ粒子のクリアランスを低下させる。逆に、ＰＣＳＫ９の阻害は、ＬＤＬ−Ｃおよび他の動脈硬化惹起性リポタンパク質のクリアランスを増加させる。実際に、ＬＤＬ受容体は、ＬＤＬ以外の動脈硬化惹起性リポタンパク質、例えば中間密度リポタンパク質およびレムナント粒子などのクリアランスに寄与する。中間密度リポタンパク質およびレムナント粒子のクリアランスの増加は、ＬＤＬ低下が提供する治療効果を超えた治療効果をもたらしうる。
【０００５】
スタチンは、ＳＲＥＢＰ２転写因子を介してＬＤＬ−ＲとＰＣＳＫ９の両方の発現を増加させる。ＰＣＳＫ９の発現増加は、血液からのＬＤＬ−Ｃのクリアランスに対するスタチンの効果を減少させる場合がある。ＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒへの結合を阻害し、それによってＬＤＬ−Ｒの低下を防ぐことで、スタチンの有効性が強化される。総合すると、ＰＣＳＫ９の阻害は新しい脂質管理アプローチを提供する。
【０００６】
ＬＤＬ−Ｒ（ＬＤＬ−Ｒ−（２９３−３３２））のＥＧＦ（Ａ）（上皮成長因子様ドメインＡ）配列（４０つのアミノ酸）は、ＰＣＳＫ９結合の部位としてよく知られている。単離された野生型ＥＧＦ（Ａ）ペプチドはＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒへの結合を阻害することが示され、ＩＣ５０は低μＭ範囲である（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３７５（２００８）６９−７３）。この弱い効力では、ＥＧＦ（Ａ）ペプチドの実用的な製薬学的使用は妨げられる。さらに、こうしたペプチドの半減期は治療用途にとっては短すぎると予想されるだろう。
【０００７】
国際公開第２０１２／１７７７４１号およびＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）４２２，６８５−６９６は、ＥＧＦ（Ａ）類似体およびそのＦｃ融合体を開示している。
【０００８】
２種の抗ＰＣＳＫ９抗体、アリロクマブ／プラルエント（登録商標）およびエボロクマブ／レパーサ（登録商標）は、高ＬＤＬ−Ｃレベルの治療について最近承認された。これらは、１ｍＬを２週間ごとに皮下注射で投与する。
【０００９】
国際公開第２０１５／１２７２７３号では、抗ＰＣＳＫ９抗体とＧＬＰ−１作動薬の融合が検討され、ＧＬＰ−１と抗ＰＣＳＫ９抗体の機能を組み合わせることに努めている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１７７７４１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１５／１２７２７３号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）４２２，６８５−６９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
糖尿病および心血管疾患の治療に対しては複数の治療が利用できるが、複数の薬剤の組み合わせは必ずしも魅力的であるとは限らず、治療、例えば有効性、服薬遵守および利便性を改善するには、両方の病態に対処する１つの分子が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒへの結合を阻害し、それによってＬＤＬコレステロールを低下させる能力を有するＥＧＦ（Ａ）類似体に関する。このような分子をＧＬＰ−１受容体作動薬と組み合わせて二機能性分子を形成し、１つの薬剤で糖尿病および心血管疾患の両方に対処する治療選択肢をさらに提供することができる。本発明は、一態様においてＧＬＰ−１作動薬およびＰＣＳＫ９阻害剤を含む化合物に関する。
【００１４】
本発明の一態様は、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物に関し、
ｉ．前記ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３７によって特定されるＧＬＰ−１（７−３７）の類似体であり、
ｉｉ．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１によって特定されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体である。
【００１５】
こうした化合物は、一実施形態では、２つの類似体の間に挿入されるスペーサーペプチドによって任意選択的に結合される２つの類似体を含む融合ポリペプチドを含んでもよい。
【００１６】
化合物は、半減期延長部分をさらに含んでもよく、これをＧＬＰ−１類似体、ＥＧＦ（Ａ）類似体またはスペーサーのうちの１つのアミノ酸残基に付着された置換基と呼ぶことができる。一実施形態では、化合物は、融合ポリペプチドの異なるアミノ酸残基に付着された１つまたは２つの置換基を含む。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、本発明の化合物を含む医薬組成物、および本発明の化合物の医学的使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ＧＬＰ−１受容体を刺激しＰＣＳＫ９を阻害する二機能性化合物に関する。製薬学的に妥当な化合物を調製するには、機能性を改善しかつ簡便な投与を可能にするために、野生型ペプチドの修飾が必要である。
【００１９】
本発明の一態様は、ＧＬＰ−１受容体作動薬およびＰＣＳＫ９阻害剤を含む化合物に関する。いくつかのＧＬＰ−１受容体作動薬は当該技術分野で周知であり、様々なＰＣＳＫ９阻害剤と組み合わせてもよい。本明細書に記載するように、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１３７）、または例えばＧＬＰ−１受容体作動薬として機能することが知られているエクセンジン４およびその類似体などでもよい。
【００２０】
ＰＣＳＫ９阻害剤は抗体の形態で知られているが、本出願は主に、ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体の形態でのＰＣＳＫ９阻害剤に関する。
【００２１】
本発明の一態様は、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物に関し、前記ＧＬＰ−１類似体はＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１３７）の類似体であり、前記ＥＧＦ（Ａ）類似体はＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体である。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「化合物」という用語は分子実体を意味するために使用され、「化合物」はそれぞれの化合物または化合物群に対して定義された最小要素以外の異なる構造要素を有してもよい。当然ながら、化合物が定義された構造要素および／または機能要素を含む限り、化合物はポリペプチドまたはその誘導体でありうる。
【００２３】
「化合物」という用語はまた、本明細書に記載の製薬学的に妥当な形態を網羅するよう意図されている、すなわち、本発明は、本明細書に定義される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、アミド、またはエステルに関連する。
【００２４】
「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、例えば、本発明の文脈で使用されるように、アミド（またはペプチド）結合によって相互接続された一連のアミノ酸を含む化合物を指す。特定の実施形態では、ペプチドは、ペプチド結合によって相互接続されたアミノ酸からなる。
【００２５】
「融合」および「融合された」という用語は、ペプチド結合またはペプチドスペーサー（同様にペプチド結合によって結合される）によって結合される、個別に定義された２つのペプチド配列を含むポリペプチドに関連して使用される。したがって、融合ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基の連続的な延長である。
【００２６】
「類似体」という用語は一般的に、参照アミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸変化を配列に有するペプチドを指す。一定の特定の変化を「含む」類似体は、参照配列と比較してさらなる変化を含みうる。特定の実施形態では、類似体は特定の変化を「有する」または「含む」。他の特定の実施形態では、類似体は変化「からなる」。「なる」または「からなる」という用語が類似体、例えば特定のアミノ酸置換の群からなる類似体に関して使用される場合は、当然のことながら、指定されたアミノ酸置換は類似体の唯一のアミノ酸置換である。対照的に、特定のアミノ酸置換の群を「含む」類似体は、追加的な置換を有してもよい。「類似体」はまた、Ｎ末端位置および／もしくはＣ末端位置におけるアミノ酸伸長、ならびに／またはＮ末端位置および／もしくはＣ末端位置における切断を含みうる。
【００２７】
一般的に、アミノ酸残基は、その完全な名称、１文字のコード、および／または３文字のコードによって特定されうる。これらの３つの方法は完全に均等である。
【００２８】
アミノ酸は、アミノ基およびカルボン酸基、ならびに任意選択で側鎖と呼ばれることの多い１つ以上の追加的な基を含有する分子である。
【００２９】
「アミノ酸」という用語は、（２０種類あるといわれる標準アミノ酸の中の）タンパク質原性（または天然の）アミノ酸、および非タンパク質原性（または非天然の）アミノ酸を含む。タンパク質原性アミノ酸は、タンパク質の中に天然に組み込まれているアミノ酸である。標準アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたアミノ酸である。非タンパク質原性アミノ酸は、タンパク質内に見出されないか、標準的な細胞機構によって生成されない（例えば、翻訳後修飾の対象となっていた場合がある）。非タンパク質原性アミノ酸の非限定的な例は、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸または２−アミノイソ酪酸）、ノルロイシン、ノルバリンおよびタンパク質原性アミノ酸のＤ異性体である。
【００３０】
以下では、光学異性体が記載されていない本発明のペプチドの各アミノ酸は、（別段の指定がない限り）Ｌ異性体を意味すると理解されるべきである。
【００３１】
《ＧＬＰ−１類似体》
本発明は、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）類似体を含む化合物に関する。「ＧＬＰ−１類似体」という用語は本明細書で使用される場合、ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１（７−３７））の類似体（または変異体）を指し、その配列は配列番号１３７として配列リストに含まれる。配列番号１３７の配列を有するペプチドは、「天然」または野生型ＧＬＰ−１と指定されてもよい。
【００３２】
本発明のＧＬＰ−１類似体におけるアミノ酸残基（例えば「位置８」）の番号付けは、天然ＧＬＰ−１について当該技術分野で確立された慣行に従い、すなわち、最初の（Ｎ末端）アミノ酸残基が位置７と番号付けられるか番号を与えられ、下流にあるその後のアミノ酸残基はＣ末端に向かって８、９、１０などと、最後の（Ｃ末端）アミノ酸残基まで番号付けられる。天然ＧＬＰ−１ではＣ末端アミノ酸残基はＧｌｙであり、数字は３７である。
【００３３】
番号付けは配列リストでは異なる方法で行われ、配列番号１３７（Ｈｉｓ）の最初のアミノ酸残基は番号１が与えられ、最後のアミノ酸残基（Ｇｌｙ）には番号３１が与えられる。しかしながら、本明細書では、上述のように、当該技術分野において確立された番号付けの慣行に従う。
【００３４】
ＧＬＰ−１類似体は当該技術分野で周知であり、いくつかのＧＬＰ−１類似体が２型糖尿病および肥満の治療のために市場に供給されている。ＧＬＰ−１類似体は、上述のように、野生型ヒトＧＬＰ−１配列の変異体であり、それゆえ配列番号１３７と比較して１つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または追加を含む。
【００３５】
それぞれのＧＬＰ−１類似体は、ｉ）変化したアミノ酸残基（すなわち、天然ＧＬＰ−１内の対応する位置）に対応する天然ＧＬＰ−１（７−３７）内のアミノ酸残基の番号、およびｉｉ）実際の変化を参照することにより説明されうる。
【００３６】
言い換えると、本発明のＧＬＰ−１類似体は、天然ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド、すなわち、天然ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１３７）と比較してアミノ酸残基の数が変化した変異体として記述されうる。
【００３７】
これらの変化は、独立して、１つ以上のアミノ酸置換、付加、および／または欠失を表し得る。
【００３８】
以下は、適切な類似体命名法の非限定的な例である。ＧＬＰ−１類似体＃２（配列番号１３９）として組み込まれ、化合物＃１に含まれるＧＬＰ−１類似体は、（８Ａｉｂ、３４Ｒ）ＧＬＰ−１（７−３７）と呼んでもよい。
【００３９】
この類似体が天然ＧＬＰ−１とアラインメントされるとき、天然ＧＬＰ−１のアライメントに応じた位置８に対応する類似体内の位置のアミノ酸はＡｉｂであり、天然ＧＬＰ−１の位置３４に対応する類似体内の位置のアミノ酸はＲであり、この類似体におけるすべてのその他のアミノ酸は天然ＧＬＰ−１の対応するアミノ酸と同一である。
【００４０】
一定の特定の変化を「含む」類似体は、野生型ＧＬＰ−１（配列番号１３７）と比較してさらなる変化を含みうる。対照的に、「からなる」という用語は特定の実施形態に言及するために使用される。この場合、類似体は特定の変化を有するのみであり、すなわち、野生型ＧＬＰ−１（配列番号１３７）と比較してＧＬＰ−１類似体にそれ以上の変化はない。上記の例を再び参照すると、ＧＬＰ−１類似体＃２（配列番号１３９）は、ＧＬＰ−１類似体であると呼んでもよく、置換は８Ａｉｂおよび３４Ｒからなり、または略して８Ａｉｂおよび３４ＲからなるＧＬＰ−１類似体と呼んでもよい。
【００４１】
「〜に等しい位置」または「対応する位置」という表現は、本明細書において、天然ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１３７）などの参照配列を参照して変異体ＧＬＰ−１（７−３７）配列の変化部位を特徴付けるために使用される。等しい位置または対応する位置、および変化の数も、例えば、単純な手書きおよび目視検査によって容易に推定でき、かつ／またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムに基づく「アラインメント」などの標準タンパク質アラインメントプログラムまたはペプチドアラインメントプログラムを使用してもよい。このアルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．，（１９７０）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３−４５３、ならびにＭｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ、「Ｏｐｔｉｍａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｓｐａｃｅ」ＣＡＢＩＯＳ（ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１９８８）４：１１−１７によるアラインメントプログラムに説明されている。アラインメントのために、デフォルトのスコアマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２およびデフォルトの同一性マトリックスを使用してもよく、またギャップの第一の残基に対するペナルティは−１２、好ましくは−１０に設定されてもよく、そしてギャップにおける追加的な残基に対するペナルティは−２、好ましくは−０．５に設定されてもよい。
【００４２】
このようなアラインメントの例は、配列番号１３７の天然ＧＬＰ−１および配列番号１３９によって特定されるその類似体の下に挿入される。
＃＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
＃  Ａｌｉｇｎｅｄ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  ２
＃  １：  ＳＥＱ＿ＩＤ＿ＮＯ＿１３７
＃  ２：  ＳＥＱ＿ＩＤ＿ＮＯ＿１３９
＃  Ｍａｔｒｉｘ：  ＥＢＬＯＳＵＭ６２
＃  Ｇａｐ＿ｐｅｎａｌｔｙ：  １０．０
＃  Ｅｘｔｅｎｄ＿ｐｅｎａｌｔｙ：  ０．５
＃
＃  Ｌｅｎｇｔｈ：  ３１
＃  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ：            ２９／３１  （９３．５％）
＃  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ：        ３０／３１  （９６．８％）
＃  Ｇａｐｓ：                      ０／３１  （  ０．０％）
＃  Ｓｃｏｒｅ：  １５４．０
＃＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
ＳＥＱ＿ＩＤ＿ＮＯ＿１３７      １  ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ  ３１
｜．｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜．｜｜｜
ＳＥＱ＿ＩＤ＿ＮＯ＿１３９    １  ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ  ３１
【００４３】
このアラインメントに示された位置番号（例えば、配列番号１３７の「１」と「３１」に）に６を追加すると、本明細書で使用される位置番号が得られる。例えば、野生型ＧＬＰ−１（配列番号１３７と同一）において、Ｎ末端アミノ酸（Ｈ）は位置番号７を有し、Ｃ末端アミノ酸（Ｇ）は番号３７を有する。ＧＬＰ−１類似体＃２（配列番号１３９）に関して、Ｎ末端アミノ酸（Ｈ）は番号７を有し、Ｃ末端アミノ酸（Ｇ）は野生型ＧＬＰ−１に関しては番号３７を有し、残基２および２８が置換され、それぞれ８および３４と番号付けられる。
【００４４】
一文字コドンを持たない特定のアミノ酸残基等（例えば２−アミノ−２−メチルプロパン酸（Ａｉｂ））が配列に含まれる場合、これらは、アラインメント目的のために、例えばＸで置き換えてもよい。希望する場合、Ｘは後ほど手作業により修正することができる。
【００４５】
以下は、上記のアラインメントから推定できる、非限定的な例である。
【００４６】
一例として、配列２は、配列１と比較して（すなわち、アラインメントに終止符（「．」）、コロン（「：」）、または水平ハイフン（「−」）が示されているすべての位置において）２つのアミノ酸変化を有すると推定することができる。
【００４７】
以下では、光学異性体について述べられていない本発明のＧＬＰ−１類似体のすべてのアミノ酸は、（特に明記されない限り）Ｌ異性体を意味すると理解されるべきである。
【００４８】
一実施形態では、本発明のＧＬＰ−１類似体は、２６〜３６のアミノ酸残基からなるＧＬＰ−１（７−３７）の類似体である。
【００４９】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）と比較して最大で１０のアミノ酸置換を有する。さらなる実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）と比較して、最大で８、例えば最大で７、６、５、４、３または２つのアミノ酸置換を有する。
【００５０】
多数のＧＬＰ−１類似体、そしてＧＬＰ−１受容体作動薬としてのその機能もこれまでに説明されてきた。
【００５１】
配列番号１３７の野生型ＧＬＰ−１ペプチドは、２つのＬｙｓ残基を位置２６および３４に含む。本明細書の以下で述べるように、Ｌｙｓ残基は、Ｌｙｓ残基を介して付着された置換基を含む化合物が調製される場合に特に関連性がある。
【００５２】
一実施形態では、本発明によるＧＬＰ−１類似体は、０、１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、アミノ酸置換によってＧＬＰ−１類似体に導入されたＬｙｓ残基および野生型残基から選択される、１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む。アミノ酸置換によって導入されたＬｙｓ残基は、追加のＬｙｓ残基と呼ぶことができる。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は追加のＬｙｓ残基を含む。追加のＬｙｓは、位置１２、２１、２３、２４、２５、２７、３０、３１、３２、３３および３６Ｋから選択される１つ以上の位置など、ＧＬＰ−１類似体の様々な位置に導入されてもよい。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、および３６Ｋの群から選択される追加のＬｙｓを含む。
【００５３】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、３４Ｋ、および３６Ｋからなる群から選択される１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む。
【００５４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、および３４Ｋからなる群から選択される１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む。
【００５５】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、３４Ｋ、および３６Ｋからなる群から選択される厳密に２つのＬｙｓ残基を含む。
【００５６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、および３４Ｋからなる群から選択される厳密に２つのＬｙｓ残基を含む。
【００５７】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、以下の対から選択される、厳密に２つのＬｙｓ残基を含む：
ａ）２１Ｋおよび２６Ｋ
ｂ）２３Ｋおよび２６Ｋ
ｃ）２４Ｋおよび２６Ｋ
ｄ）２５Ｋおよび２６Ｋ
ｅ）２７Ｋおよび２６Ｋ
ｆ）３０Ｋおよび２６Ｋ
ｇ）３１Ｋおよび２６Ｋ
ｈ）３２Ｋおよび２６Ｋ
ｉ）３３Ｋおよび２６Ｋ
ｊ）３４Ｋおよび２６Ｋ。
【００５８】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体はＬｙｓ残基２６Ｋおよび３４Ｋを含む。
【００５９】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、３４Ｋ、および３６Ｋから選択される厳密に１つのＬｙｓ残基を含む。
【００６０】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、および３４Ｋから選択される厳密に１つのＬｙｓ残基を含む。
【００６１】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋから選択される厳密に１つのＬｙｓ残基を含む。
【００６２】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、２６Ｋである厳密に１つのＬｙｓ残基を含む。
【００６３】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、２６Ｋおよび３４Ｋのうちの１つまたは両方の置換または欠失を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は２６Ｋを含まない。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は２６Ｋの欠失を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は２６Ｋのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は２６Ｒを含む。
【００６４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は３４Ｋを含まない。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は３４Ｋの欠失を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、３４Ｋのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は３４Ｒまたは３４Ｑを含む。
【００６５】
上述の通り、本発明によるＧＬＰ−１類似体の長さは野生型ＧＬＰ−１の長さと類似している。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、少なくとも２６、例えば少なくとも２８または少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、少なくとも３１、例えば少なくとも３２または少なくとも３３のアミノ酸残基を含む。
【００６６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、Ｃ末端に１〜５つのアミノ酸の欠失を有する。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、ＡＡ３５−３７、ＡＡ３４−３７またはＡＡ３３−３７の欠失を含む。
【００６７】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は３３Ｌを含む。
【００６８】
上述のように、ＧＬＰ−１類似体は、野生型ＧＬＰ−１と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、例えば最大で５つのアミノ酸置換、例えば最大で４つのアミノ酸置換、例えば最大で３つのアミノ酸置換を含んでもよい。
【００６９】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、切断がない場合に、それぞれ配列番号１に対して、最大７、６、４、３、および１つのアミノ酸置換に対応する配列番号１２７と、少なくとも７５％の同一性、例えば８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。
【００７０】
アミノ酸置換によって導入される追加のＬｙｓ残基に加えて、またはその代替として、ＧＬＰ−１類似体は、１つ以上のアミノ酸置換を含んで、異なるアミノ酸残基で野生型残基を置換してもよい。
【００７１】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、８Ａのアミノ酸置換、例えば８Ａの８Ｇまたは８Ｗへの置換を含み、これはＡ８ＧおよびＡ８Ｗとも呼ばれうる。
【００７２】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、８Ａのアミノ酸置換、例えばタンパク質を構成しないアミノ酸残基（Ａｉｂなど）への８Ａの置換を含む。
【００７３】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、８ＡからＧ、Ｗまたはタンパク質を構成しないアミノ酸残基Ａｉｂへのアミノ酸置換を含む。
【００７４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、位置８、１２、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３２、３３、３４および３６のアミノ酸置換から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００７５】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、位置８、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３２、３３および３４のアミノ酸置換から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００７６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、位置８、２１、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３１、３２または３３のアミノ酸置換から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、位置８、２１、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３１、３２または３３の野生型アミノ酸残基は、Ｇ、Ｖ、Ａ、Ｔ、ＬまたはＩ残基によって置換される。
【００７７】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は８Ａおよび３４Ｋの置換を含む。
【００７８】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は８Ａｉｂおよび３４Ｒを含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、８Ａｉｂおよび３４Ｒと、位置２１、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３１、３２および３３から選択される位置での置換を含む。
【００７９】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は８Ａｉｂおよび３４Ｒを含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、８Ａｉｂおよび３４Ｒと、位置２１、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３１、３２および３３から選択される位置での置換を含み、位置２１、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３１、３２または３３での置換はＧ、Ｖ、Ａ、Ｔ、ＬまたはＩ残基である。
【００８０】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、１つまたは２つのＬｙｓ残基、および以下から選択される置換の群を含む。
【表１】
2020528049.tif 000002
【００８１】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、１つまたは２つのＬｙｓ残基、および以下から選択される置換の群を含む。
【表２】
2020528049.tif 000003
【００８２】
一実施形態では、このようなＧＬＰ−１類似体は、本明細書で上述するように１つまたは２つのＬｙｓ残基、例えば２６Ｋおよび／もしくは３４Ｋ、または例えば２６Ｋおよび／もしくはＫ３４Ｒとともに置換により導入されるＬｙｓを含む。
【００８３】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は配列番号１８７：Ｈ−Ｘ８−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｘ１２−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｘ２１−Ｇ−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｆ−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７によって定義される配列を有し、ここで、
Ｘ８はＡ、Ｇ、ＷまたはＡｉｂであり、
Ｘ１２はＦまたはＫであり、
Ｘ２１はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２３はＱ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２４はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２５はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２６はＫまたはＲであり、
Ｘ２７はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２９はＩ、ＡまたはＶであり、
Ｘ３０はＡ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３１はＷ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３２はＬ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、ＩまたはＫであり、
Ｘ３３はＶ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３４はＫ、Ｒ、Ｑであるか、または不在であり、
Ｘ３５はＧであるか、または不在であり、
Ｘ３６はＲ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３７はＧであるか、または不在である。
【００８４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は配列番号１８７：Ｈ−Ｘ８−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｘ１２−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｘ２１−Ｇ−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｆ−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７によって定義される配列を有し、ここで、
Ｘ８はＡ、Ｇ、ＷまたはＡｉｂであり、
Ｘ１２はＦまたはＫであり、
Ｘ２１はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２３はＱ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２４はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２５はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２６はＫまたはＲであり、
Ｘ２７はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２９はＩまたはＶであり、
Ｘ３０はＡ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３１はＷ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３２はＬ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、ＩまたはＫであり、
Ｘ３３はＶ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３４はＫ、Ｒ、Ｑであるか、または不在であり、
Ｘ３５はＧであるか、または不在であり、
Ｘ３６はＲ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３７はＧであるか、または不在である。
【００８５】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は配列番号１８７：Ｈ−Ｘ８−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｘ１２−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｘ２１−Ｇ−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｆ−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７によって定義される配列を有し、ここで、
Ｘ８はＡ、Ｇ、ＷまたはＡｉｂであり、
Ｘ１２はＦまたはＫであり、
Ｘ２１はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２３はＱ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２４はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２５はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２６はＫまたはＲであり、
Ｘ２７はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２９はＩ、ＡまたはＶであり、
Ｘ３０はＡ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３１はＷ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３２はＬ、Ｔ、Ｖ、ＩまたはＫであり、
Ｘ３３はＶ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３４はＫ、Ｒ、Ｑであるか、または不在であり、
Ｘ３５はＧであるか、または不在であり、
Ｘ３６はＲ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３７はＧであるか、または不在である。
【００８６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は配列番号１８７：Ｈ−Ｘ８−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｘ１２−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｘ２１−Ｇ−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｆ−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７によって定義される配列を有し、ここで、
Ｘ８はＡ、Ｇ、ＷまたはＡｉｂであり、
Ｘ１２はＦまたはＫであり、
Ｘ２１はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２３はＱ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２４はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２５はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２６はＫまたはＲであり、
Ｘ２７はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２９はＩまたはＶであり、
Ｘ３０はＡ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３１はＷ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３２はＬ、Ｖ、ＩまたはＫである
Ｘ３３はＶ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３４はＫ、Ｒ、Ｑであるか、または不在であり、
Ｘ３５はＧであるか、または不在であり、
Ｘ３６はＲ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３７はＧであるか、または不在である。
【００８７】
図示するように、本明細書の実施例は４０以上のＧＬＰ−１類似体を含むが、これはＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体の両方を含む化合物の状況においても想定される。これらの類似体は以下の表で特定され、（本明細書で上述するように）野生型残基と比較したアミノ酸の変化が、類似体中に存在するＬｙｓ残基と共に示されている。
【表３】
2020528049.tif 000004
【表３−１】
2020528049.tif 000005
【００８８】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３８〜１８６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００８９】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３８〜１４２および１４４〜１８６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９０】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３８〜１４２および配列番号１４４〜１６６、１６８、１６９〜１８６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９１】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３８〜１４２および１４４〜１６１、１６３〜１６６、１６８、１６９〜１８６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９２】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３８〜１４２および１４５〜１６１、１６３〜１６６、１６８、１６９〜１８６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９３】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３９および１４７〜１５４によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３８および１７４〜１８２および１８４〜１８６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９５】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１６６〜１７０によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１６３〜１６６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９７】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１６４によって定義される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９８】
《ＥＧＦ（Ａ）類似体》
「ＥＧＦ（Ａ）類似体」という用語は、本明細書ではＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの変異体を指す。本明細書の上記でＧＬＰ−１類似体について記載されたように、類似の命名法がＥＧＦ（Ａ）類似体にも適用される。
【００９９】
「ＬＤＬ−ＲのＥＧＦ（Ａ）ドメイン」、「ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）」、「天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）」、「ＥＧＦ（Ａ）（２９３−３３２）」、「野生型ＥＧＦ（Ａ）」、または「天然ＥＧＦ（Ａ）」という用語は、本明細書において使用される場合、配列番号１からなるペプチドを意味する。
【０１００】
配列番号１は、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕである。
【０１０１】
本出願において、アミノ酸残基の番号付けは、ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの番号付けに従い、最初の（Ｎ末端）アミノ酸残基は位置２９３と番号付けられるか番号を与えられ、その後のアミノ酸残基はＣ末端に向かって２９４、２９５、２９６などと、最後の（Ｃ末端）アミノ酸残基まで番号付けられ、これはＬＤＬ−ＲのＥＧＦ（Ａ）ドメインにおいてはＧｌｕであり、番号は３３２である。
【０１０２】
番号付けは配列リストでは異なる方法で行われ、配列番号１の最初のアミノ酸残基（Ｇｌｙ）には番号１が与えられ、最後のアミノ酸残基（Ｇｌｕ）には番号４０が与えられる。同じ配列表の他の配列に対しても同様であり、すなわち、ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）を参照することによりアミノ酸残基を置換する２９３Ｇｌｙまたは２９３に対するその位置決めに関係なく、Ｎ末端アミノ酸には番号１が割り当てられる。しかしながら、本明細書では、アミノ酸位置の番号付けは、上述した通り、ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）を参照して行う。
【０１０３】
配列番号１との同一性レベルは、配列番号１に対して変化しないアミノ酸の数を求めることによって算出できる。配列番号１は、４０つのアミノ酸残基からなり、３つのアミノ酸置換が導入される場合、同一性レベルは３７／４０％＝９２．５％となる。５つのアミノ酸残基が変化する場合、同一性レベルは８７．５％である。ペプチドがＮ末端またはＣ末端伸長である場合、その部分は通常は比較に含まれないが、１つ以上のアミノ酸の欠失はコンパレータを短縮する。例えば、上記の例では、Ｎ末端アミノ酸が欠失すると、同一性レベルはそれぞれ３６／３９×１００％および３４／３９×１００％にわずかに低下する。誘導体のバックボーン配列の同一性について論じる場合、置換基のアミノ酸残基（例えば、置換基が付着された残基であり、置換基のアミノ酸残基とも呼ばれる）は、野生型（ｗｔ）または置換アミノ酸のいずれかであってもよい。置換基のアミノ酸残基が野生型残基、例えば３１２Ｋである場合、この残基は同一性レベルの計算に含まれるが、位置２９３〜３３２の任意の他の位置におけるＬｙｓはアミノ酸置換であり、配列番号１に対するアミノ酸の同一性を計算する場合に含まれない。
【０１０４】
本発明の各ＥＧＦ（Ａ）類似体は、ｉ）変化したアミノ酸残基（すなわち、天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）内の対応する位置）に対応する天然ＥＧＦ（Ａ）（ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２））内のアミノ酸残基の番号、およびｉｉ）実際の変化を参照することにより説明されうる。
【０１０５】
言い換えると、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）ペプチドを参照して、すなわち、天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）（配列番号１）と比較してアミノ酸残基の数が変化した変異体として記述されうる。これらの変化は、独立して、１つ以上のアミノ酸置換を表し得る。
【０１０６】
以下は、適切な類似体命名法の非限定的な例である。
【０１０７】
本明細書のＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む誘導体の化合物例＃１に組み込まれたＥＧＦ（Ａ）類似体を、以下のＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）類似体と呼ぶことができる：（３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕ、３２１Ｇｌｕ）ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）、または（Ｌｅｕ３０１、Ａｒｇ３０９、Ｇｌｕ３１２、Ｇｌｕ３２１）−ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）または（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）または（Ｌ３０１、Ｒ３０９、Ｅ３１２、Ｅ３２１）ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）。これは、この類似体が天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）とアラインメントした時に、ｉ）類似体内の、天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）の位置３０１にアラインメントにより対応する位置にＬｅｕを有し、ｉｉ）類似体内の天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）の位置３０９に対応する位置にＡｒｇを有し、ｉｉｉ）類似体の天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）の位置３１２に対応する位置にＧｌｕを有し、ｉｖ）類似体の天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）の位置３２１に対応する位置にＧｌｕを有することを意味する。
【０１０８】
「〜に等しい位置」または「対応する位置」という表現は、参照配列の天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）（配列番号１）を参照して変異体ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）配列の変化部位を特徴付けるために使用されうる。
【０１０９】
等しいまたは対応する位置だけでなく、変化の数も、例えば、単純な計算によって容易に推定でき、かつ／またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムに基づく「アラインメント」などの標準タンパク質アラインメントプログラムまたはペプチドアラインメントプログラムを使用してもよい。
【０１１０】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して１〜１５のアミノ酸置換を有する。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して１〜１０のアミノ酸置換を有する。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して、１〜８のアミノ酸置換、例えば１〜７、１〜６、１〜５のアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、最大７つのアミノ酸置換が存在してもよく、例えば、最大６、５、４、３、２または１つのアミノ酸置換がＥＧＦ（Ａ）類似体に存在してもよい。
【０１１１】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１に対して少なくとも７５％の同一性、例えば８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一実施形態では、欠失／切断がない場合、これは配列番号１に対してそれぞれ最大１０、８、６、４および２つのアミノ酸置換に対応する。
【０１１２】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性、例えば９２％、９４％、９６％、または９８％の同一性を有する。
【０１１３】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、少なくとも３５、例えば３６、３７、３８、３９または少なくとも４０のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、３６、例えば３８または４０のアミノ酸から構成される。追加的な特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、３５、３６、３７、３８、３９または４０つのアミノ酸からなる。
【０１１４】
本明細書においてＮ末端およびＣ末端伸長と呼ばれるアミノ酸添加が存在する場合、ＥＧＦ（Ａ）類似体は最大６０つのアミノ酸を含みうる。特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３５〜６０、３８〜５５、４０〜５０、４０〜４５、４０〜４２または４０〜４１のアミノ酸を含む。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、４０または４１のアミノ酸残基からなる。
【０１１５】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、アミノ酸残基３０１のＡｓｎからＬｅｕへのアミノ酸置換を含み、これはＡｓｎ３０１Ｌｅｕまたは単に３０１Ｌｅｕとも呼ばれる。特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は置換３０１Ｌｅｕを含む。
【０１１６】
加えて、または別の方法として、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、アミノ酸残基２９７Ｃｙｓ、３０４Ｃｙｓ、３０８Ｃｙｓ、３１７Ｃｙｓ、３１９Ｃｙｓ、および３３１Ｃｙｓを含む。これらのＣｙｓ残基はジスルフィド架橋、例えば２９７Ｃｙｓと３０８Ｃｙｓの間、３０４Ｃｙｓと３１７Ｃｙｓの間、３１９Ｃｙｓと３３１Ｃｙｓとの間のジスルフィド架橋に関与しうる野生型残基である。
【０１１７】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、以下に記載するように３０１Ｌｅｕおよび多数のさらなるアミノ酸置換を含む。
【０１１８】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０１Ｌｅｕ、３１０Ａｓｐ、および３１２Ｌｙｓのアミノ酸置換を含む。
【０１１９】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０１Ｌｅｕおよび３１０Ａｓｐを含み、類似体は２９９ＡｓｐのＧｌｕ、ＶａｌまたはＨｉｓへの置換を有していない。
【０１２０】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３１２Ｇｌｕを含む。
【０１２１】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕおよび３２１Ｇｌｕを含む。
【０１２２】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０１Ｌｅｕおよび３０９Ａｒｇを含むが、類似体は３１０Ａｓｐの３１０Ｌｙｓへの置換を有さないことを条件とする。
【０１２３】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０１Ｌｅｕおよび３０９Ａｒｇを含むが、類似体は２９９ＡｓｐのＧｌｕ、ＶａｌまたはＨｉｓへの置換を有さないことを条件とする。
【０１２４】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、置換Ｄ３１０Ｋ、Ｄ３１０Ｎ、Ｄ３１０Ｑ、Ｄ３１０Ｑ、Ｄ３１０ＲおよびＤ３１０Ａ、またはさらには３１０Ａｓｐへの置換を持たない。
【０１２５】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９５Ａｓｎ、２９６Ｇｌｕ、２９８Ｌｅｕおよび３０２Ｇｌｙのうち１つ、２つ、３つまたは４つすべての野生型残基を含む。
【０１２６】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９５Ａｓｎ、２９６Ｇｌｕ、２９８Ｌｅｕ、３０２Ｇｌｙおよび３１０Ａｓｐのうち１つ、２つ、３つ、４つまたは５つすべての野生型残基を含む。
【０１２７】
一実施形態では、ペプチドは２９５Ａｓｎを有する。
【０１２８】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は２９６Ｇｌｕを有する。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は２９８Ｌｅｕを有する。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０２Ｇｌｙを有する。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３１０Ａｓｐを有する。
【０１２９】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、３１０Ａｓｐ、２９５Ａｓｎおよび２９６Ｇｌｕのうちの２つ以上を有する。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、３１０Ａｓｐ、２９５Ａｓｎおよび２９６Ｇｌｕの３つすべてを有する。
【０１３０】
ＥＧＦ（Ａ）類似体は、本明細書に記載するようにさらなるアミノ酸置換を含んでいてもよい。一実施形態では、類似体は、位置２９３、２９４、２９６、２９９、３００、３０３、３０５、３０６、３０９、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１８、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２８、３２９、３３０および３３２の群から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換をさらに含んでもよい。
【０１３１】
一実施形態では、類似体は、位置２９３、２９４、２９９、３００、３０３、３０５、３０６、３０９、３１１、３１２、３１３、３１４、３１６、３１８、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２８、３２９、３３０、３３１および３３２の群から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換をさらに含んでもよい。
【０１３２】
一実施形態では、類似体は、位置２９４、２９９、３００、３０３、３０９、３１２、３１３、３１４、３１６、３１８、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２８、３２９、３３０および３３２の群から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換をさらに含んでもよい。
【０１３３】
一実施形態では、類似体は、位置２９９、３００、３０９、３１３、３１６、３１８、３２１、３２２、３２３、３２４、３２６、３２８、３２９、３３０および３３２の群から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換をさらに含んでもよい。
【０１３４】
一実施形態では、類似体は、位置３０９、３１２、３１３、３２１、３２４、３２８および３３２の群から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換をさらに含んでもよい。
【０１３５】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、本明細書の上記で明記したアミノ酸残基に加え、特定の位置において、野生型アミノ酸残基または異なる残基（すなわち、アミノ酸置換）のいずれかを含む。
【０１３６】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置２９３にアミノ酸残基Ｇｌｙ（Ｇ）またはＡｓｎ（Ｎ）を含む。
【０１３７】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置２９４にアミノ酸残基Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｈｒ（Ｔ）またはＧｌｙ（Ｇ）を含む。
【０１３８】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置２９９にアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）またはＴｒｐ（Ｗ）を含む。
【０１３９】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置２９９にアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｅ（Ｙ）、及びＴｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｅ（Ｙ）、またはＴｒｐ（Ｗ）を含む。
【０１４０】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置２９９にアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｌｙｓ（Ｋ）またはＴｙｒ（Ｙ）を含む。
【０１４１】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置２９９にアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）またはＡｌａ（Ａ）を含む。
【０１４２】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３００にアミノ酸残基Ｈｉｓ（Ｈ）またはＡｓｎ（Ｎ）を含む。
【０１４３】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０７にアミノ酸残基Ｖａｌ（Ｖ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）またはＩｌｅ（Ｉ）を含む。
【０１４４】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０７にアミノ酸残基Ｖａｌ（Ｖ）またはＩｌｅ（Ｉ）を含む。
【０１４５】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０７にＳｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）またはＩｌｅ（Ｉ）を含む。
【０１４６】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０７にＩｌｅ（Ｉ）を含む。
【０１４７】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０９にアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＬｙｓ（Ｋ）を含む。
【０１４８】
こうした一実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０９にアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＬｙｓ（Ｋ）を含む。
【０１４９】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０９にアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｒｇ（Ｒ）またはＳｅｒ（Ｓ）を含む。
【０１５０】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０９にアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）またはＡｒｇ（Ｒ）を含む。
【０１５１】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０９にアミノ酸残基Ｌｙｓ（Ｋ）またはＡｒｇ（Ｒ）を含む。
【０１５２】
ＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９９Ａｌａ、３０７Ｉｌｅおよび３２１Ｇｌｕの群から選択される１つ以上のアミノ酸置換など、本明細書に記載するようにいくつかのアミノ酸置換を含みうる。
【０１５３】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３２１にアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）またはＧｌｕ（Ｅ）を含む。
【０１５４】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３２１にアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）を含む。
【０１５５】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３２１にアミノ酸残基Ｇｌｕ（Ｅ）を含む。
【０１５６】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３２４にアミノ酸残基Ｇｌｎ（Ｑ）またはＧｌｙ（Ｇ）を含む。
【０１５７】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３２９にアミノ酸残基Ａｒｇ（Ｒ）またはＨｉｓ（Ｈ）を含む。
【０１５８】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、３００Ａｓｎ（Ｎ）のＰｒｏ（Ｐ）への置換を有さない。
【０１５９】
ＬＤＬ−ＲのＥＧＦ（Ａ）ドメインは、本明細書に記載するように置換にとって有用でありうるリジンを位置３１２に含む。置換基の３１２への付着が望まれない実施形態では、本明細書に記載するように、別のアミノ酸によって３１２Ｌｙｓを置換してもよい。
【０１６０】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体はＬｙｓ残基を含まない。
【０１６１】
一実施形態では、位置３１２におけるＬｙｓは、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＴｙｒから選択されるアミノ酸残基で置換される。一実施形態では、位置３１２におけるＬｙｓは、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅおよびＴｙｒから選択されるアミノ酸残基で置換される。一実施形態では、位置３１２におけるＬｙｓは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅおよびＴｙｒから選択されるアミノ酸残基で置換される。一実施形態では、３１２Ｌｙｓは、３１２Ａｓｐ、３１２Ｇｌｕ、３１２Ｔｈｒ、３１２Ａｓｎ、３１２Ｉｌｅ、または３１２Ｐｈｅで置換される。一実施形態では、３１２Ｌｙｓは、３１２Ｇｌｕ、３１２Ａｓｐ、３１２Ｇｌｎまたは３１２Ａｒｇで置換される。
【０１６２】
一実施形態では、３１２Ｌｙｓは、３１２Ｇｌｕ、３１２Ｔｈｒ、３１２Ａｓｎ、３１２Ｉｌｅ、３１２Ｐｈｅまたは３１２Ｔｙｒで置換される。一実施形態では、３１２Ｌｙｓは３１２Ｇｌｕ、３１２Ａｓｎまたは３１２Ｉｌｅで置換される。
【０１６３】
一実施形態では、３１２Ｌｙｓは３１２Ｇｌｕまたは３１２Ａｒｇで置換される。一実施形態では、３１２Ｌｙｓは３１２Ａｒｇで置換される。一実施形態では、３１２Ｌｙｓは３１２Ｇｌｕで置換される。
【０１６４】
様々な位置で置換基を付着するオプション（以下を参照）を含むために、配列番号１の野生型残基のアミノ酸置換によって、または配列番号１のペプチド伸長、例えば２９２Ｌｙｓもしくは３３３Ｌｙｓなどによって、Ｌｙｓを導入してもよい。
【０１６５】
複数の置換基が望ましい場合、１つ目は３１２Ｌｙｓを介して、２つ目は配列番号１におけるペプチド伸長または置換によって導入されたＬｙｓを介して行うことができる。
【０１６６】
一実施形態では、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９６Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓおよび３３３Ｌｙｓの群から選択される位置において、少なくとも１つのＬｙｓ残基を含む。
【０１６７】
一実施形態では、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓおよび３３３Ｌｙｓの群から選択される位置において、少なくとも１つのＬｙｓ残基を含む。
【０１６８】
一実施形態では、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓおよび３３３Ｌｙｓの群から選択される位置において、少なくとも１つのＬｙｓ残基を含む。
【０１６９】
一実施形態では、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓおよび３３３Ｌｙｓの群から選択される位置において、少なくとも１つのＬｙｓ残基を含む。
【０１７０】
一実施形態では、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓおよび３３３Ｌｙｓの群から選択される位置において、少なくとも１つのＬｙｓ残基を含む。
【０１７１】
加えて、または別の方法として、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９５Ｌｙｓ、２９６Ｌｙｓ、２９８Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０１Ｌｙｓ、３０２Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０７Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１０Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７２】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９５Ｌｙｓ、２９６Ｌｙｓ、２９８Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０２Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０７Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７３】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９５Ｌｙｓ、２９６Ｌｙｓ、２９８Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７４】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９５Ｌｙｓ、２９６Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７５】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体ペプチドは、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９６Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７６】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７７】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７８】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３１０Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７９】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１０Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１８０】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３１０Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は２９６Ｋ、２９８Ｋ、３０１Ｋ、３０２Ｋおよび３０７Ｋの置換のいずれも含まない。
【０１８１】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は２９６Ｋ、２９８Ｋ、３０１Ｋ、３０２Ｋ、３０７Ｋおよび３１０Ｋの置換のいずれかを含む。
【０１８２】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は２９６Ｋ、２９８Ｋ、３０１Ｋ、３０２Ｋ、３０７Ｋおよび２９５Ｋの置換のいずれかを含む。
【０１８３】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は２９６Ｋ、２９８Ｋ、３０１Ｋ、３０２Ｋ、３０７Ｋおよび２９５Ｄの置換のいずれかを含む。
【０１８４】
特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、かかるＬｙｓ置換の１つまたは２つを含む。
【０１８５】
加えて、または別の方法として、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３１２Ｌｙｓを含みうる。
【０１８６】
一実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は２つのＬｙｓ残基を含む。一実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、以下からなる対から選択される２つのＬｙｓ残基を含む。
【表４】
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【０１８７】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して以下に示されるＩ〜ＸＸＩＶの群のいずれかによって特定される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。
【０１８８】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、以下に示されるＩ〜ＸＸＩＶの群のいずれかによって特定されるアミノ酸置換からなる。
【０１８９】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して以下に示されるＩ〜ＸＶＩの群のいずれかによって特定される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。
【０１９０】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、以下に示されるＩ〜ＸＶＩの群のいずれかによって特定されるアミノ酸置換からなる：
Ｉ．３０１Ｌｅｕおよび３０９Ａｒｇ
ＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕ
ＩＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅおよび３０９Ａｒｇ
ＩＶ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇおよび３１２Ｇｌｕ
Ｖ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３２１Ｇｌｕ
ＶＩ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３２１Ｇｌｕおよび３１２Ｇｌｕ
ＶＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇおよび２９９Ａｌａ
ＶＩＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇ、２９９Ａｌａおよび３１２Ｇｌｕ
ＩＸ．３０１Ｌｅｕおよび３０９Ａｒｇ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換
Ｘ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換
ＸＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換
ＸＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇおよび３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換
ＸＩＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３２１Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換
ＸＩＶ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３２１Ｇｌｕおよび３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換
ＸＶ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇおよび２９９Ａｌａ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換、または
ＸＶＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇ、２９９Ａｌａおよび３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換。
【０１９１】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体は、以下のいずれかにより特定されるアミノ酸置換を含む、またはそれからなる：
Ｖ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３２１Ｇｌｕ
ＶＩ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３２１Ｇｌｕおよび３１２Ｇｌｕ
ＸＩＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換、または
ＸＩＶ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３２１Ｇｌｕおよび３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換。
【０１９２】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して以下に示されるＸＶＩＩ〜ＸＸの群のいずれかによって特定される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。
【０１９３】
なおもさらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して以下に示すようにＸＶＩＩ〜ＸＸの群のいずれかによって特定されるアミノ酸置換からなる：
ＸＶＩＩ．３０１Ｌｅｕおよび３０９Ｌｙｓ
ＸＶＩＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ｌｙｓおよび３１２Ｇｌｕ
ＸＩＸ．３０１Ｌｅｕおよび３０９Ｌｙｓ、ならびに少なくとも１つのさらなるＬｙｓ置換
ＸＸ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ｌｙｓおよび３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのさらなるＬｙｓ置換。
【０１９４】
さらなる実施形態では、本発明によるＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して、以下に示されるＸＸＩ〜ＸＸＩＶの群のいずれかによって特定される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。
【０１９５】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して、以下のＸＸＩ〜ＸＸＩＶの群のいずれかによって特定されるアミノ酸置換からなる：
ＸＸＩ．３０１Ｌｅｕおよび３０７Ｉｌｅ
ＸＸＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅおよび３１２Ｇｌｕ
ＸＸＩＩＩ．３０１Ｌｅｕおよび３０７Ｉｌｅ、ならびに少なくとも１つのさらなるＬｙｓ置換、および
ＸＸＩＶ．３０１Ｌｅｕ、３３０７Ｉｌｅおよび３１２Ｇｌｕ、ならびに少なくとも１つのさらなるＬｙｓ置換。
【０１９６】
さらなる特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１〜１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０１９７】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号２〜１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０１９８】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号２〜４７および４９〜１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０１９９】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号２〜４４、４６、４７および４９〜１１４のいずれかによって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０２００】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号２〜４４、４６、４７、４９〜５３、５５、５８〜１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０２０１】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号２〜４、６〜４４、４６、４７、４９〜５３、５５、５８〜１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０２０２】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号２〜４、６〜１９、２１〜４４、４６、４７、４９〜５３、５５、５８〜１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０２０３】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１９、２１、７３、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０２０４】
一実施形態では、上述のＥＧＦ（Ａ）類似体はＬｙｓ残基を含まず、従ってＥＧＦ（Ａ）類似体は配列番号５、６、２３、２６、４９、５０、１０７〜１１１によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含むか、またはそれからなる。
【０２０５】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号５、６、２３、２６、４９、５０または１０７によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０２０６】
１つの好ましい実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、３１２Ｋ残基の突然変異、３２１Ｄ残基の両方を含み、Ｌｙｓ残基を有さず、例えばＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１０８、１０９、１１０または１１１によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含むか、またはそれからなる。
【０２０７】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１０８によって特定されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
【０２０８】
本明細書の例は、様々なＥＧＦ（Ａ）類似体を提供しており、これらを、アミノ酸置換、Ｌｙｓ残基、および配列番号に関する情報を含めて以下の表に記載する。
【表５】
2020528049.tif 000007
【表５−１】
2020528049.tif 000008
【表５−２】
2020528049.tif 000009
【表５−３】
2020528049.tif 000010
【表５−４】
2020528049.tif 000011
【表５−５】
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【表５−６】
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【表５−７】
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【０２０９】
《融合ポリペプチド》
【０２１０】
一態様では、本発明は、ＧＬＰ−１類似体のアミノ酸配列およびＥＧＦ（Ａ）類似体のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドに関する。本明細書において前述したように、ＧＬＰ−１の類似体は、（７−３７）（配列番号１３７）の変異体を指し、ＥＧＦ（Ａ）の類似体は、ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメイン（配列番号１）の変異体を指す。
【０２１１】
融合ポリペプチドは、本明細書の以下で述べるように誘導体の調製のためにさらに考慮され介在してもよい。本発明の誘導体を参照するとき、融合ポリペプチドはバックボーンまたはペプチドバックボーンと呼ぶことができる。
【０２１２】
融合タンパク質または融合ポリペプチドの調製は、当該技術分野で周知である。共通の一般知識に従って異種発現により、融合タンパク質を産生するために、適切な宿主内での融合ポリペプチドを発現するための組み換えベクターを調製および使用してもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）。別の方法として、より短いポリペプチドを固相ペプチド合成によって頻繁に生成し、延長された長さのペプチドを合成的に生成することができる。ペプチド要素を別個に生成し、その後で天然化学ライゲーションに供して完全な融合ポリペプチドを生成することもできる。
【０２１３】
２つのペプチド断片を融合させる場合、その順序は結果得られる融合ポリペプチドの機能およびそれを含む化合物に影響を与える場合がある。
【０２１４】
本発明による一実施形態では、Ｎ末端から始まるＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体の順序は、ＧＬＰ−１類似体の後に任意選択的にスペーサーペプチドによって分離されたＥＧＦ（Ａ）類似体が続く（以下参照）。ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１類似体のＣ末端を介してＥＧＦ（Ａ）類似体と融合すること言うこともできる。
【０２１５】
別の実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、ＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端を介してＥＧＦ（Ａ）類似体と融合され、Ｎ末端にＥＧＦ（Ａ）類似体を配置する。結果得られた融合ポリペプチドは、「バックボーン」または「ペプチドバックボーン」という用語で呼ぶことができ、以下に記載するように、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体の両方、ならびに任意選択的にスペーサーペプチドを含むポリペプチド鎖を定義する。
【０２１６】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、配列番号１３８〜１８７によって定義される類似体のいずれかを含め、本明細書の上記で定義されるＧＬＰ−１類似体を含む。
【０２１７】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、配列番号２〜１１４によって定義される類似体のいずれかを含め、本明細書の上記で定義されるＥＧＦ（Ａ）類似体を含む。
【０２１８】
《スペーサー》
融合ポリペプチドは、２つのペプチドの末端に存在する任意の機能が他のペプチドが近くにあることによって妨げられないようにスペーサーを含むことが多い。一実施形態では、スペーサーはペプチドであり、本明細書ではスペーサーペプチドまたはペプチドスペーサーと呼ばれる。様々なスペーサーペプチドが当該技術分野で周知であり、融合ポリペプチドを得るためにＧＬＰ−１類似体とＥＧＦ（Ａ）類似体との間に配置されてもよい。上述のように、結果得られる融合ポリペプチド（スペーサーを含む）は、合成的または異種発現によって生成されうる。
【０２１９】
スペーサーペプチドは、４〜８０のアミノ酸の通常のペプチド断片である。
【０２２０】
本明細書で使用されるこのようなペプチドの例を以下に記載する。
【表６】
2020528049.tif 000015
【０２２１】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、ペプチドスペーサーを含み、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１３６によって特定されるペプチドから選択される配列を含む。
【０２２２】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、配列番号１１５〜１３６によって特定されるペプチドスペーサーの群から選択されるペプチドスペーサーを含む。
【０２２３】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、１つ以上のＧＱＡＰの断片、例えば１〜２０、例えば１〜１０、例えば１〜６、例えば１、２、３、４または５つのＧＱＡＰ断片を含むペプチドスペーサーを含む。
【０２２４】
一実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１２８によって特定されるペプチドの群から選択されるペプチドスペーサーを含む。
【０２２５】
一実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１２８によって特定される配列から選択される。
【０２２６】
一実施形態では、ペプチドスペーサーはＬｙｓ残基を含まない。
【０２２７】
一実施形態では、ペプチドスペーサーはＬｙｓ残基を含む。
【０２２８】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、１つ以上のＧＱＡＰの断片を含むペプチドスペーサーを含み、Ｌｙｓ残基はアミノ酸置換によって導入される。さらなるこうした実施形態では、スペーサーは、配列番号１２１〜１２８によって特定される配列の群から選択されうる。
【０２２９】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、グリシンが豊富なペプチドスペーサー、例えば、アミノ酸残基の少なくとも半分がＧｌｙ、アミノ酸残基の少なくとも３／４がＧｌｙであるペプチドスペーサーなどを含む。このような実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１３０〜１３６によって特定されるペプチドから選択されてもよい。
【０２３０】
さらなる実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１１７および１２１〜１３６によって特定されるペプチドの群から選択される。
【０２３１】
さらなる実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１１７および１２１〜１２８によって特定されるペプチドの群から選択される。
【０２３２】
一実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１２８によって特定される配列から選択される。
【０２３３】
さらなる実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１１７によって特定されるペプチドの群から選択される。さらなる実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１６によって特定される。
【０２３４】
本発明による融合ポリペプチド（ペプチドバックボーン）の複数の例が実施例で提供されており、すべての要素、すなわち、ＧＬＰ−１類似体、ＥＧＦ（Ａ）類似体およびペプチドスペーサーの多様性を示す。
【０２３５】
一実施形態では、本発明の誘導体の融合ポリペプチドまたはバックボーン配列は、本明細書に定義されるようにＧＬＰ−１類似体、ＥＧＦ（Ａ）類似体およびペプチドスペーサーからなる。
【０２３６】
出願の実施例は、ペプチドバックボーンなどのこのような融合ポリペプチドを含め、複数のこのような融合ポリペプチドおよび誘導体を含む。融合ポリペプチドの同一性は、個別の要素、すなわち、融合ポリペプチドを共に形成するＧＬＰ−１類似体、ＥＧＦ（Ａ）類似体、およびペプチドスペーサーの配列から推定することができ、これらには以下の表に従って個別に配列番号が割り当てられている。
【表７】
2020528049.tif 000016
【表７−１】
2020528049.tif 000017
【表７−２】
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【表７−３】
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【表７−４】
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【表７−５】
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【表７−６】
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【表７−７】
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【表７−８】
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【表７−９】
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【表７−１０】
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【表７−１１】
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【表７−１２】
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【表７−１３】
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【表７−１４】
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【０２３７】
ＧＬＰ−１類似体のＣ末端がＥＧＦ（Ａ）類似体にある例
【表８】
2020528049.tif 000031
【０２３８】
一実施形態では、本発明は、配列番号１８８〜３８４、３８６〜３８７によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２３９】
一実施形態では、本発明は、配列番号１８８〜３８４によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４０】
一実施形態では、本発明は、配列番号１９３、２２６〜２３３および３８１〜３８４によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４１】
一実施形態では、本発明は、配列番号３７９〜３８０によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４２】
一実施形態では、本発明は、配列番号１９３、２１９および２２０によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４３】
一実施形態では、本発明は、配列番号１８９、１９３、２００〜２０３および２１２〜２１８によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４４】
一実施形態では、本発明は、配列番号２２２〜２２５によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４５】
一実施形態では、本発明は、配列番号２２４〜２２５によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４６】
一実施形態では、本発明は、配列番号１９２〜１９６によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４７】
一実施形態では、本発明は、配列番号２２１、２３６、２５０、２６４、２７６、２７９、２９１、２９４、３０６、３０７、３１０、３２４、３３６、３３９、３５１、３５２、３５３、３５６、３６８および３６９によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４８】
一実施形態では、本発明は、配列番号２２１、２５０、２７６、２７９、２９１、２９４、３０６、３０７、３１０、３２４、３３６、３５１、３５３、３５６、３６８および３６９によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４９】
一実施形態では、本発明は、配列番号２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、３１０および３８６によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１７、２１８、２２１、３１０および３８６によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１７、２１８、３１０および３８６によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２２１、３１０および３８６によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３１０および３８６によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３１０によって定義される融合ポリペプチドに関する。
【０２５０】
一実施形態では、本発明は、配列番号１８８および３７０〜３７８によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２５１】
一実施形態では、本発明は、配列番号１９０、１９１、１９７、１９８および１９９によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２５２】
一実施形態では、本発明は、配列番号２０４〜２１１によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２５３】
一実施形態では、本発明は、配列番号２４０〜２４７、２５４〜２６１、２６８〜２７５、２８３〜２９０、２９８〜３０５、３１４〜３２１、３２８〜３３５、３４３〜３５０および３６０〜３６７によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２５４】
一実施形態では、本発明は、配列番号２３４〜２３５、２３７〜２３９、２４８〜２４９、２５１〜２５３、２６２〜２６３、２６５〜２６７、２７７〜２７８、２８０〜２８２、２９２〜２９３、２９５〜２９７、３０８〜３０９、３１１〜３１３、３２２〜３２３、３２５〜３２７、３３７〜３３８、３４０〜３４２、３５４〜３５５および３５７〜３５９によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２５５】
一実施形態では、本発明は、厳密に１つのＬｙｓ残基を含む融合ポリペプチドに関する。
【０２５６】
一実施形態では、本発明は、最大２つのＬｙｓ残基を含む融合ポリペプチドに関する。
【０２５７】
一実施形態では、本発明は、２つのＬｙｓ残基を含む融合ポリペプチドに関する。
【０２５８】
一実施形態では、本発明は、本明細書の以下でさらに述べるように、配列番号１８８〜３８４で定義される融合ポリペプチドまたはペプチドバックボーン、または上記で定義された融合ポリペプチドによって定義されるいずれかを含む誘導体に関する。
【０２５９】
《ＧＬＰ−１機能》
受容体作動薬は、受容体に結合し天然リガンドの典型的な応答を引き出す類似体として定義されうる。完全な作動薬は、天然リガンドと同じ度合いの応答を引き出す作動薬と定義されうる（例えば、『Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』ＡＬ  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ＤＬ  Ｎｅｌｓｏｎ，ＭＭ  Ｃｏｘ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９３，７６３ページを参照）。
【０２６０】
従って、例えば、「ＧＬＰ−１受容体作動薬」は、ＧＬＰ−１受容体に結合する能力があり、かつＧＬＰ−１受容体を活性化する能力がある化合物と定義されうる。
【０２６１】
また、「完全な」ＧＬＰ−１受容体作動薬は、天然ＧＬＰ−１に類似する度合いのＧＬＰ−１受容体応答を引き出す能力があるＧＬＰ−１受容体作動薬と定義されうる。
【０２６２】
一実施形態では、本発明のＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１受容体作動薬である。一部の実施形態では、本発明のＧＬＰ−１類似体は、完全なＧＬＰ−１受容体作動薬である。一部の実施形態では、本発明の二機能性化合物は、ＧＬＰ−１受容体作動薬である。一部の実施形態では、本発明の二機能性化合物は、完全なＧＬＰ−１受容体作動薬である。一部の実施形態では、本発明の誘導体は、ＧＬＰ−１受容体作動薬である。一部の実施形態では、本発明の誘導体は、完全なＧＬＰ−１受容体作動薬である。
【０２６３】
当然ながら、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、化合物、すなわち、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物がＧＬＰ−１受容体に結合してシグナル伝達経路を開始し、当該技術分野で周知のインスリン分泌促進作用またはその他の生理学的効果を生むことのできる能力を意味する「ＧＬＰ−１活性」を示すべきである。例えば、本明細書の方法セクションＣに記載するＧＬＰ−１効力アッセイを使用して、ＧＬＰ−１活性について、ＧＬＰ−１類似体、二機能性化合物およびその誘導体を試験することができる。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物、すなわち、ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）融合ポリペプチドおよびその誘導体を含む化合物は、ＧＬＰ−１活性を有する。
【０２６４】
５０％最大有効濃度（ＥＣ５０）という用語は、一般的に、用量反応曲線をベースラインして、ベースラインと最大の中間にあたる反応を導く濃度を意味する。ＥＣ５０は化合物の効力の尺度として使用され、最大効果の５０％が観察される濃度を表す。
【０２６５】
ＧＬＰ−１類似体およびＧＬＰ−１類似体を含む化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を、上述のように決定してもよく、またＥＣ５０により決定してもよい。ＥＣ５０の数値が低いほど、効力が高い。
【０２６６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物は、Ｃ１（ＨＳＡなし）に記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて、最高で５０ｐＭ、５０〜１００ｐＭ、１００〜２５０ｐＭまたは２５０〜１０００ｐＭのＧＬＰ−１のＥＣ５０を有する。一実施形態では、ＥＣ５０は最大で５００ｐＭ、例えば最大で３００ｐＭ、例えば最大で２００ｐＭである。一実施形態では、ＥＣ５０はヒトＧＬＰ−１（７−３７）と同等であり、例えば最大で５０ｐＭである。さらなる実施形態では、ＥＣ５０は最大で４０ｐＭ、例えば最大で３０ｐＭ、例えば最大で２０ｐＭ、例えば最大で１０ｐＭである。ＥＣ５０が約１０ｐＭの化合物の高い効力は、セマグルチド分子の効力と同等である。
【０２６７】
本明細書の他の箇所で述べるように、ＧＬＰ−１の効力は、ＥＧＦ（Ａ）類似体の効力と釣り合わせる必要があり、そのため、一部の実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の効力が、セマグルチドと比較して少なくとも２倍、例えばセマグルチドと比較して少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、セマグルチドと比較して少なくとも１００倍減少するように、セマグルチドの効力よりも低いＧＬＰ−１効力を提供するＧＬＰ−１類似体を含むことが好ましい場合がある。野生型ＧＬＰ−１と比較して効力を減少させることが好ましい場合がある。
【０２６８】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ１に記載する通り測定された）ＥＣ５０は、少なくとも２５ｐＭ、例えば少なくとも５０ｐＭ、例えば少なくとも７５ｐＭ、例えば少なくとも１００ｐＭ、例えば少なくとも２５０ｐＭ、または例えば少なくとも５００ｐＭである。
【０２６９】
このような実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ１）に記載する通り測定されたＥＣ５０は最大で５００ｐＭ、例えば最大で４００ｐＭ、例えば最大で３００ｐＭ、例えば最大で２００ｐＭ、例えば最大で１００ｐＭ、例えば最大で５０ｐＭである。
【０２７０】
さらなる実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ１に記載する通り測定された）ＥＣ５０は２０〜１０００ｐＭ、例えば５０〜５００ｐＭ、例えば１００〜２５０ｐＭ、例えば７５〜１００ｐＭである。
【０２７１】
さらなる実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ１に記載する通り測定された）ＥＣ５０は２０〜８００ｐＭ、例えば２０〜６００ｐＭ、例えば２０〜４００ｐＭ、例えば２０〜２００ｐＭ、または例えば２０〜１００ｐＭである。
【０２７２】
別の方法として、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ１に記載する通り測定された）ＥＣ５０は２００〜１０００ｐＭ、例えば３００〜８００ｐＭ、または例えば４００〜６００ｐＭ、または例えば２５０〜７５０ｐＭ、または例えば３００〜５００ｐＭである。
【０２７３】
上記の効力についての検討は、ＨＳＡが存在する中で効力を評価する場合も妥当性がある。
【０２７４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（１％のＨＳＡを用いてＣ１に述べるように測定された）ＥＣ５０は少なくとも５００ｐＭ、例えば少なくとも７５０ｐＭ、例えば少なくとも１０００ｐＭ、例えば少なくとも１５００ｐＭ、例えば少なくとも２０００ｐＭである。
【０２７５】
このような実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（１％ＨＳＡを用いてＣ１で述べるように測定された）ＥＣ５０は最大で２５００ｐＭ、例えば最大で２０００ｐＭ、例えば最大で１５００ｐＭ、例えば最大で１２５０ｐＭ、例えば最大で１０００ｐＭである。
【０２７６】
さらなる実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（１％ＨＳＡを用いてＣ１に述べるように測定された）ＥＣ５０は５００〜２５００ｐＭ、例えば５００〜２０００ｐＭ、例えば５００〜１５００ｐＭ、例えば５００〜１０００ｐＭである。
【０２７７】
さらなる実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（１％ＨＳＡを用いてＣ１に述べるように測定された）ＥＣ５０は７５０〜２５００ｐＭ、例えば１０００〜２５００ｐＭ、１５００〜２５００ｐＭ、２０００〜２５００ｐＭ、または１８００〜２５００ｐＭである。
【０２７８】
別の方法として、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（１％ＨＳＡを用いてＣ１で述べるように測定された）ＥＣ５０は５００〜２５００ｐＭ、例えば７５０〜２０００ｐＭ、または例えば１０００〜２０００ｐＭ、または例えば１５００〜２０００ｐＭである。ＧＬＰ−１の効力は、例えば限定するわけではないが吐き気などのＧＬＰ−１関連の副作用を減少させつつ、ＰＣＳＫ９への完全な結合を可能にするために減少させることができる。
【０２７９】
ＧＬＰ−１類似体およびＧＬＰ−１類似体を含む化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性を、別の方法として、Ｃ２で説明するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイで試験してもよく、または野生型ＧＬＰ−１またはセマグルチドと同等の機能性を有する化合物の親和性は、低ＨＳＡの存在下で試験した場合には１ｎＭ前後である。
【０２８０】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおけるＩＣ５０は、最大で２００ｎＭであり、さらなる実施形態では、ＩＣ５０は最大で１００ｎＭ、例えば最大で７５ｎＭ、例えば最大で５０ｎＭ、例えば最大で２５ｎＭ、例えば最大で１０ｎＭ、例えば最大で５ｎＭである。一部の実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の結合を、セマグルチドと比較して少なくとも５倍、例えばセマグルチドと比較して少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍減少させるように、セマグルチドの結合よりも低い結合を有することが好ましい場合がある。野生型ＧＬＰ−１と比較して結合親和性を減少させることが好ましい場合さえもある。
【０２８１】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしでＣ２に述べるように測定された）ＩＣ５０は少なくとも１ｎＭ、例えば少なくとも５ｎＭ、例えば少なくとも１０ｎＭ、例えば少なくとも２５ｎＭ、例えば少なくとも５０ｎＭ、例えば少なくとも１００ｎＭである。
【０２８２】
このような実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ２に記載する通り測定された）ＩＣ５０は最大で２００ｎＭ、例えば最大で１００ｎＭ、例えば最大で７５ｎＭ、例えば最大で５０ｎＭ、例えば最大で２５ｎＭ、例えば最大で１５ｎＭ、例えば最大で１０ｎＭ、例えば最大で５ｎＭである。
【０２８３】
さらなる実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ２に記載する通り測定された）ＩＣ５０は０．１〜２００ｎＭ、例えば１〜１００ｎＭ、例えば５〜７５ｎＭ、例えば５〜５０ｎＭである。
【０２８４】
上記の検討は、ＨＳＡが存在しない中で結合を評価する場合に妥当性がある。ＧＬＰ−１結合は、例えば限定するわけではないが吐き気などのＧＬＰ−１関連の副作用を減少させつつ、ＰＣＳＫ９への完全な結合を可能にするために減少させることができる。
【０２８５】
ＧＬＰ−１の効果は、別の方法として、または追加的に、血糖および／または体重に対するＧＬＰ−１類似体およびＧＬＰ−１類似体を含む化合物の効果を測定することによってｉｎ  ｖｉｖｏで測定することができる。血糖および／または体重の減少は、例えばＣ７で説明するｄｂ／ｄｂマウスおよびＣ８で説明するＤＩＯラットなどの適切なモデルで測定することができる。
【０２８６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物は、本明細書のＣ７に述べるように、ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖を低下させる能力を有する。効果は、０〜２４時間のデルタ血糖に対する曲線下面積（ＡＵＣΔＢＧ２４ｈ）およびＡＵＣΔＢＧ２４ｈについて算定される５０％有効量（ＥＤ５０、ベースラインと最大効果の中間にあたる反応を提供するＧＬＰ−１誘導体の用量）に基づいて推定できる。
【０２８７】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物は、１５ｎｍｏｌ／ｋｇ未満のＥＣ５０  ＡＵＣΔＢＧ２４ｈを有することが好ましい。一実施形態では、ＥＣ５０  ＡＵＣΔＢＧ２４ｈは１〜１５ｎｍｏｌ／ｋｇ、例えば２〜１２ｎｍｏｌ／ｋｇ、または例えば５〜１０ｎｍｏｌ／ｋｇである。
【０２８８】
同様に、体重を減少させる能力も、Ｃ８に述べるようにＤＩＯラットを用いて評価することができる。
【０２８９】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物は、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し、２１日後に測定した場合、体重をベースラインＢＷの少なくとも９５％に低減する能力を有する。
【０２９０】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物は、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し、２１日後に測定した場合、体重をベースラインＢＷの少なくとも９０％に低減する能力を有する。
【０２９１】
《ＥＧＦ（Ａ）機能−（ＰＣＳＫ９ｉ）》
本明細書に記載するように、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１によって定義されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）ペプチドの変異体である。ＥＧＦ（Ａ）類似体は、本明細書において配列番号１の類似体であるアミノ酸配列を含むペプチドとして定義される。
【０２９２】
こうしたＥＧＦ（Ａ）類似体は、ＰＣＳＫ９に結合する能力を有することが好ましい。特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、例えば、天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）（天然ＥＧＦ（Ａ））または他のＰＣＳＫ９結合化合物と比較して、ＰＣＳＫ９に結合する改善された能力を有する。
【０２９３】
ＥＧＦ（Ａ）類似体は、ＬＤＬ−Ｒに対するＰＣＳＫ９結合を阻害する能力をさらに有してもよい。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体はＰＣＳＫ９阻害剤である。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、ヒト低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）へのＰＣＳＫ９結合を阻害する。
【０２９４】
このような結合を、本明細書のセクションＣ３に記載するアッセイを使用して評価することができ、これは試験化合物がヒトＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を競合的に阻害する能力を測定する。ＬＤＬ−ＲとＰＣＳＫ９との相互作用を阻害する能力により、こうした化合物はＰＣＳＫ９阻害剤と呼ばれる。
【０２９５】
一実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体（融合ポリペプチドまたは誘導体）を含む化合物は、ＰＣＳＫ９阻害剤化合物または単にＰＣＳＫ９阻害剤である。一実施形態では、本発明は、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物に関し、類似体はヒト低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）へのＰＣＳＫ９結合を阻害する能力を有する。
【０２９６】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含むＥＧＦ（Ａ）の化合物は、ＥＧＦ（Ａ）ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）（配列番号１）と比較して、ＰＣＳＫ９に結合する改善された能力を有する。野生型の配列は阻害機能が比較的劣るため、ＥＧＦ（Ａ）類似体についても比較を行うことができる。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体（および前記類似体を含む化合物）は、配列番号２によって定義される［２９９Ａ、３０１Ｌ、３０７Ｉ、３０９Ｒ、３１０Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）と比較して、ＰＣＳＫ９に結合する改善された能力を有する。ＥＬＩＳＡアッセイで測定される効力は、ＥＧＦ（Ａ）類似体またはＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物に対する見掛けの親和性をＫｉとして、またＣ３に記載するように提供し、低いＫｉは強い阻害機能を有する化合物に特徴的である。
【０２９７】
一実施形態では、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒを結合する競合ＥＬＩＳＡアッセイ（セクションＣ３）で測定されたＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含む化合物のＫｉは５０ｎＭ未満、例えば２５ｎＭ未満、または例えば１０ｎＭ未満である。さらなる実施形態では、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒを結合する競合ＥＬＩＳＡアッセイ（セクションＣ３）で測定されたＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含む化合物のＫｉは８．０ｎＭ未満、例えば５．０ｎＭ未満、例えば２．５ｎＭ未満、またはさらには２．０ｎＭ未満である。一実施形態では、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒを結合する競合ＥＬＩＳＡアッセイ（セクションＣ３）で測定されたＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含む化合物のＫｉは０．１〜１０．０ｎＭ、例えば０．１〜８．０ｎＭまたは０．１〜５．０ｎＭである。
【０２９８】
ＥＧＦ（Ａ）類似体およびこれらを含む化合物の機能性は、本明細書のセクションＣ４に記載するようなＬＤＬ取り込みを改善する能力によってさらに特徴づけられうる。
【０２９９】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含む化合物は、ＰＣＳＫ９の存在下でのＬＤＬ取り込みを増加させる。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含む化合物は、ＰＣＳＫ９が介在したＬＤＬ取り込みの減少を覆すまたは減少させる能力がある。
【０３００】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含む化合物のＬＤＬ取り込みアッセイで測定されるＥＣ５０は、１５００ｎＭ未満、例えば１０００ｎＭ未満または５００ｎＭ未満である。
【０３０１】
ＥＧＦ（Ａ）類似体および類似体を含む化合物が血中コレステロールに与える効果は、本明細書のセクションＣ８に記載するＤＩＯラットの試験などの適切なモデルで評価されうる。試験には試験化合物の数回の投与が関与し、したがってその効果は投与量および投与頻度に依存する。本試験では、低用量、高用量および非常に高用量の効果を２１日後に評価した。
【０３０２】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体またはＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物は、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも０．５ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する。さらなる実施形態では、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロール値は少なくとも０．６ｍｍｏｌ／Ｌ、または例えば０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少する。
【０３０３】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体またはＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物は、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する。さらなる実施形態では、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロール値は少なくとも１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、または例えば１．２ｍｍｏｌ／Ｌ減少する。
【０３０４】
《二機能性》
本明細書で上述するように、異なる機能性は２つの類似体、すなわちＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体と関連付けられる。本発明の化合物においてこの２つの類似体を組み合わせるとき、各類似体の機能性は維持されることが好ましい、すなわち、ＧＬＰ−１類似体はＧＬＰ−１受容体を刺激する能力を持ち、ＥＧＦ（Ａ）類似体はＰＣＳＫ９を競合的に結合する能力を有し、さらに、両方の類似体を含む化合物は両方の機能性を有することが好ましい。こうした化合物の機能性は、ＧＬＰ−１およびＥＧＦ（Ａ）の機能性試験に関して本明細書に記載するアッセイで試験されうる。
【０３０５】
一実施形態では、化合物は二機能性分子と呼ばれる。
【０３０６】
治療用途に適した化合物を得るために、機能性はＰＣＳＫ９阻害剤およびＧＬＰ−１受容体作動薬の両方の望ましいレベルの活性を得ることができるよう釣り合っている必要がある。一実施形態では、化合物は本明細書で上述するようにＧＬＰ−１受容体作動薬である。一実施形態では、化合物は本明細書で上述するようにＰＣＳＫ９阻害剤である。ＧＬＰ−１受容体の効力の測定はセクションＣ１に、ＧＬＰ−１類似体の結合親和性についてはセクションＣ２に記載されており、これらの機能要件はＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物にとって同様の妥当性がある。
【０３０７】
同様に、ＥＧＦ（Ａ）類似体の機能は、ＥＧＦ（Ａ）機能に関するセクションに記載されており、アッセイは本明細書のセクションＣ３、Ｃ４、およびＣ６に記載されている。
【０３０８】
ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む本発明による化合物は、各類似体に関しては一価である、すなわち、化合物は１つのＥＧＦ（Ａ）類似体および１つのＧＬＰ−１類似体を含む。ＧＬＰ−１受容体作動薬の機能とＰＣＳＫ９阻害剤の機能の釣り合いを取るために、類似体を個別に選択して両方の活性の適切なレベルを得ることができる。ＧＬＰ−１受容体作動薬の高用量の投与は吐き気などの副作用をきたしうることが周知であり、したがって、同じ血漿濃度で両方の活性の適切なバランスを得るために、良好なＰＣＳＫ９阻害機能を維持しつつＧＬＰ−１の効力を低下させることが好ましい。
【０３０９】
一実施形態では、本明細書で上述するように、ＧＬＰ−１の効力は、ＧＬＰ−１（３−３７）またはセマグルチドと比較して減少される。このような実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｒｅ  ｌｕｃアッセイ（セクションＣ１、ＨＳＡなし）によって測定したＥＣ５０は、少なくとも１０ｐＭである。
【０３１０】
一実施形態では、競合ＥＬＩＳＡ（セクションＣ３）によって測定される見掛けのＫｉは５０ｎＭ未満である。
【０３１１】
一実施形態では、見掛けのＥＧＦ（Ａ）Ｋｉ（Ｃ３）：ＧＬＰ−１効力（Ｃ１、ＨＳＡなし）の比率は最大で５０００、例えば最大で４０００、例えば最大で３０００、例えば最大で２０００、例えば最大で１０００である。
【０３１２】
一実施形態では、見掛けのＥＧＦ（Ａ）Ｋｉ（Ｃ３）：ＧＬＰ−１効力（Ｃ１、ＨＳＡなし）の比率は最大で１０００、例えば最大で８００、例えば最大で６００、例えば最大で４００、例えば最大で２００である。
【０３１３】
一実施形態では、見掛けのＥＧＦ（Ａ）Ｋｉ（Ｃ３）：ＧＬＰ−１効力（Ｃ１、ＨＳＡなし）の比率は最大で２００、例えば最大で１５０、例えば最大で１００、例えば最大で５０である。
【０３１４】
化合物が真に二機能性を有することを確認するために、機能性を評価することが好ましく、これは、本明細書に記載するように、本明細書のセクションＣ８に記載するようにＤＩＯラットにおいて行うことができ、体重およびコレステロールの両方に対する効果を測定できる。
【０３１５】
一実施形態では、化合物は、本明細書のセクションＣ８に記載するｉｎ  ｖｉｖｏラット試験において、ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１と少なくとも等しくコレステロールおよび体重を減少させる能力を有する。
【０３１６】
一実施形態では、化合物は、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも０．５ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する。
【０３１７】
さらなる実施形態では、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロール値は少なくとも０．６ｍｍｏｌ／Ｌ、または例えば０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少する。
【０３１８】
一実施形態では、化合物は、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する。
【０３１９】
さらなる実施形態では、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロール値は少なくとも１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、または例えば１．２ｍｍｏｌ／Ｌ減少する。
【０３２０】
一実施形態では、化合物は、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し、２１日後に測定した場合、体重をベースラインＢＷの少なくとも９５％に低減する能力を有する。
【０３２１】
一実施形態では、化合物は、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し、２１日後に測定した場合、体重をベースラインＢＷの少なくとも９０％に低減する能力を有する。
【０３２２】
《誘導体》
「誘導体」という用語は、本明細書において二機能性化合物の文脈で使用される場合、１つ以上の置換基が化合物に共有結合している化学修飾された二機能性化合物を意味する。
【０３２３】
本明細書で上述するように、置換基は化合物に共有結合している。置換基をポリペプチドに付着する多数の方法、例えばＮ末端、Ｃ末端または内部のアミノ酸残基を介して置換基を付着することなどが知られている。
【０３２４】
一実施形態では、化合物は１つ以上の置換基を含むことができる。一実施形態では、化合物は１つまたは２つの置換基を含む。一実施形態では、化合物は１つまたは２つの置換基を有する。一実施形態では、化合物は１つの置換基を有する。一実施形態では、化合物は２つの置換基を有する。
【０３２５】
化合物が２つの置換基を有する実施形態では、２つの置換基が同一であることが好ましい。
【０３２６】
一実施形態では、１つまたは２つの置換基がペプチドバックボーンの窒素原子に付着される。一実施形態では、１つまたは２つの置換基がペプチドバックボーンのアミノ基に付着される。一実施形態では、１つまたは２つの置換基が１つまたは２つのＬｙｓ残基のイプシロン窒素に付着される。
【０３２７】
一実施形態では、２つの置換基がペプチドバックボーンの別のＬｙｓ残基に付着される。一実施形態では、２つの置換基がペプチドバックボーンの別のＬｙｓ残基のイプシロン窒素に付着される。
【０３２８】
本明細書で上述するように、ＧＬＰ−１類似体、ペプチドスペーサー、およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む、またはそれからなる誘導体の融合ポリペプチドまたはペプチドバックボーンは、１つ以上のＬｙｓ残基を有してもよい。異なる数のＬｙｓ残基を有するＧＬＰ−１類似体、ペプチドスペーサー、およびＥＧＦ（Ａ）類似体の様々な例について本明細書の上記で記載してきたが、このような配列は、厳密に１つまたは２つのＬｙｓ残基を有する融合ポリペプチドまたはペプチドバックボーンを得るために組み合わせてもよい。
【０３２９】
一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つまたは２つのＬｙｓ残基を有する。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つのＬｙｓ残基のみを含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは厳密に２つのＬｙｓ残基を含む。
【０３３０】
一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つまたは２つのＬｙｓ残基を含むＧＬＰ−１類似体を含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つのＬｙｓ残基のみを含むＧＬＰ−１類似体を含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、厳密に２つの残基を含むＧＬＰ−１類似体を含む。
【０３３１】
一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つまたは２つのＬｙｓ残基を含むＥＧＦ（Ａ）類似体を含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つのＬｙｓ残基のみを含むＥＧＦ（Ａ）類似体を含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、厳密に２つのＬｙｓ残基を含むＥＧＦ（Ａ）類似体を含む。
【０３３２】
一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つまたは２つのＬｙｓ残基を含むペプチドスペーサーを含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つのＬｙｓ残基のみを含むペプチドスペーサーを含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、厳密に２つの残基を含むペプチドスペーサーを含む。
【０３３３】
一実施形態では、置換基はペプチドの機能性を改善することを目的とする。
【０３３４】
一実施形態では、ペプチドバックボーンを含む誘導体の血漿半減期および置換基の血漿半減期が、本明細書で図示するペプチドバックボーンの半減期と比較して増加するように、置換基は化合物の半減期を増加させる（セクションＣ５、表５）。
【０３３５】
異なる種における半減期を決定する方法は当該技術分野で周知であり、本明細書ではミニブタについて例証している（セクションＣ５）。
【０３３６】
一実施形態では、本発明による誘導体は１２時間を超える半減期を有する。
【０３３７】
一実施形態では、本発明による誘導体は、ミニブタにおいて皮下投与または静脈内投与した後に測定した場合、２４時間を超える半減期、例えば３６時間を超えるまたは４８時間を超える半減期を有する。
【０３３８】
《置換基》
「置換基」という用語は、通常は同じ位置に存在する原子を置換することによってアミノ酸残基を介してポリペプチドに付着された部分を指す。置換基は、水素原子、例えばアミノ基の水素（−ＮＨ２）などを置換することが多い。したがって、置換基はペプチドまたはポリペプチドに共有結合した部分である。本発明によると、この部分、例えば置換基は、安定性の増加や半減期の増加などの他の有益な特性を追加する一方で、ペプチドの機能性に対しては効果が全くないか最小限の効果を有することが好ましい。
【０３３９】
一実施形態では、半減期を延長させる置換基はタンパク質部分である。さらなるこのような実施形態では、タンパク質部分は、ヒトアルブミン、Ｆｃドメインまたは非構造化タンパク質伸長を含みうる。さらなる実施形態では、タンパク質部分は、類似体の１つに融合されてもよい。さらなる実施形態では、タンパク質部分はＦｃドメインであり、ＦｃドメインはＧＬＰ−１類似体またはＥＧＦ（Ａ）類似体に融合されている。Ｆｃ融合が調製されると、２つのＦｃ−ポリペプチドが１つのＦｃドメインを形成するため、結果得られる化合物は通常は二価である。
【０３４０】
一実施形態では、置換基はタンパク質部分ではない。
【０３４１】
一実施形態では、置換基はペプチドバックボーンに融合されたタンパク質部分ではない。
【０３４２】
別の実施形態では、置換基は非タンパク質部分である。
【０３４３】
特定の実施形態では、置換基は、アルブミンと非共有複合体を形成する能力を有し、それによって誘導体の血流内循環を促進し、誘導体の作用時間を延長させる効果も有する。特定の実施形態では、置換基は、ＰＣＳＫ９および／またはＧＬＰ−１受容体への結合能力を実質的に減少させることなく、誘導体の作用時間を延長させる能力を有する。
【０３４４】
一実施形態では、誘導体は半減期を延長させる置換基を含む。様々な半減期を延長させる置換基が当該技術分野で周知であり、特に以下でさらに説明するような脂肪酸基を含む特定のアルブミン結合剤を含み、このようなアルブミン結合剤は非タンパク質置換基である。
【０３４５】
置換基は少なくとも１つの脂肪酸基を含む。
【０３４６】
特定の実施形態では、脂肪酸基は、少なくとも８つの連続するＣＨ２−基を含む炭素鎖を含む。一実施形態では、脂肪酸基は少なくとも１０の連続する−ＣＨ２−基、例えば最低１２の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１４の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１６の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１８の連続する−ＣＨ２−基を含む。
【０３４７】
一実施形態では、脂肪酸基は８〜２０の連続する−ＣＨ２−基を含む。一実施形態では、脂肪酸基は１０〜１８の連続する−ＣＨ２−基を含む。一実施形態では、脂肪酸基は１２〜１８の連続する−ＣＨ２−基を含む。一実施形態では、脂肪酸基は１４〜１８の連続する−ＣＨ２−基を含む。
【０３４８】
誘導体が２つの置換基を含む状況では、より短い脂肪酸基を用いて半減期の増加を得ることができ、したがって、誘導体が２つの置換基を含む実施形態では、脂肪酸基は少なくとも８つの連続する−ＣＨ２−基、例えば少なくとも１０の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１２の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１４の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１６の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１８の連続する−ＣＨ２−基を含みうる。
【０３４９】
誘導体が２つの置換基を含むさらなる実施形態では、置換基はそれぞれ８〜１８の連続する−ＣＨ２−基を含む脂肪酸基を含む。さらにこのような実施形態では、脂肪酸基は１０〜１８の連続する−ＣＨ２−基、例えば１２〜１８の連続する−ＣＨ２−基、１４〜１８つの連続する−ＣＨ２−基を含む。
【０３５０】
「脂肪酸基」という用語は、本明細書で使用される場合、ブレンステッド‐ローリーの酸塩基理論に基づく酸でありｐＫａが＜７である官能基を少なくとも１つ含む化学基を意味する場合がある。
【０３５１】
一実施形態では、置換基は少なくとも８つの連続する−ＣＨ２−基およびｐＫａが＜７の少なくとも１つの官能基（ＦＧ）を含む。ブレンステッド‐ローリーの酸塩基理論に基づく酸であるこのような官能基の非限定的な例には、カルボン酸（カルボキシフェノキシも含む）を含む。
【０３５２】
一実施形態では、脂肪酸基は官能基（酸）の反対側の端にカルボニルを含み、このような脂肪酸基は二酸と呼ぶこともできる。
【０３５３】
一実施形態では、「延長部」という用語は、化合物の半減期を延長する置換基の末端部分である脂肪酸基を説明するために使用することができる。
【０３５４】
一実施形態では、延長部は以下により定義されうる：
化学式１：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−＊（式中、ｎは８〜２０の整数であり、これはＣ（ｎ＋２）二酸と呼ぶことができる）、または化学式１ｂ：
【化１】
2020528049.tif 000032
【０３５５】
（式中、ｎは８〜２０の整数である）。
【０３５６】
一実施形態では、延長部は以下により定義されうる：
化学式２：ＨＯＯＣ−（Ｃ６Ｈ４）−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−＊（式中、ｍは８〜１１の整数である）、または化学式２ｂ：
【化２】
2020528049.tif 000033
（式中、カルボキシ基は、化学式３の（Ｃ６Ｈ４）基の位置２、３または４にあり、ｍは８〜１１の整数である）。
【０３５７】
一実施形態では、延長部は、上記に定義される化学式１、化学式１ｂ、化学式２、または化学式２ｂによって定義されうる。
【０３５８】
一実施形態では、本発明による置換基は１つ以上のリンカー要素を含む。リンカー要素はアミド結合によって相互におよび延長部に連結されてもよく、「Ｚ」と呼ぶことができる（以下をさらに参照）。
【０３５９】
本明細書の以下でさらに定義するように、リンカー要素の数は、最大で６でもよく、−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−と呼ぶことができ、ここでＺ１は延長部（Ｐｒｏ−）と結合され、最後のＺ要素はペプチドと結合され、その場合、置換基はＰｒｏ−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−と呼ぶことができる。したがって、上記の記号＊はＺ１に対する付着点を示し、これはアミド結合を介して結合されたときには窒素である。一実施形態では、Ｚ１が結合であり（下記参照）、記号＊は窒素の隣接するＺ要素への付着点を示す。
【０３６０】
一実施形態では、置換基はＰｒｏ−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−により定義され、式中、Ｐｒｏ−は化学式１、化学式１ｂ、化学式２および化学式２ｂから選択され、ｎは８〜２０の整数であり、ｍは８〜１１の範囲の整数である。
【０３６１】
特定の実施形態では、化学式１または１ｂにおいてｎは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり、ｍは８、９、１０または１１である。
【０３６２】
「結合」という用語が本明細書で使用される場合は、共有結合を意味する。Ｚ１〜Ｚ６のリンカー要素が結合として定義される場合は、当該構成要素が存在しない状況と同等である。本明細書の以下でＺ１〜Ｚ６のいずれかが結合であると示されることは、Ｚ１〜Ｚ６のいずれかが存在しないこととも読み取られうる。論理的に、「結合」が「結合」の後に続くことはできない。そのため、ここでの「結合」とは、前のＺ要素が「結合」ではない次のＺ要素に共有結合されている（または存在しない）ことを意味する。
【０３６３】
リンカー要素Ｚ１〜Ｚ６は、アミノ酸様の部分、例えばＧｌｕ、γＧｌｕ（ガンマＧｌｕまたはｇＧｌｕとも呼ばれ、＊−ＮＨ−ＣＨ−（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−＊によって定義される）、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｄｏ、Ａｅｅｐ、およびＡｅｅｅｐ、ならびに以下に記載するさらなる部分を含む、アミド結合を形成する能力がある化学部分から個別に選択される。
【０３６４】
一実施形態では、Ｚ１要素は任意選択であり、このような実施形態では、Ｚ１は以下から選択される：
化学式３：＊−ＮＨ−ＣＨ２−（Ｃ６Ｈ１０）−ＣＯ−＊または
化学式３ｂ：
【化３】
2020528049.tif 000034
および
結合。
【０３６５】
化学式３はまた、トラネキサム酸トランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（Ｔｒｘ）と呼ぶことができ、ここで化学式３はｏ−（１，２）、ｍ−（１，３）およびｐ−（１，４）の形態を網羅し、化学式３ｂはｐ−（１，４）の形態を網羅する。
【０３６６】
一実施形態では、Ｚ２は、γＧｌｕ、Ｇｌｕ、または結合から選択される。一実施形態では、Ｚ２はγＧｌｕである。
【０３６７】
一実施形態では、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、相互に独立して、Ｇｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｄｏ、Ａｅｅｐ、およびＡｅｅｅｐ、ならびに結合から選択される。
【０３６８】
Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒは、当該技術分野で周知のアミノ酸残基である。
γＧｌｕは化学式４：＊−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−＊により定義され、これは化学式４ｂ：
【化４】
2020528049.tif 000035
と同一であり、γＧｌｕと呼ぶこともできる。
【０３６９】
Ａｄｏは化学式５：＊−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−＊により定義され、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸と呼ぶことができ、化学式５ｂ：
【化５】
2020528049.tif 000036
と同一である。
【０３７０】
Ａｅｅｐは、化学式６：＊ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ＊により定義され、化学式６ｂ：
【化６】
2020528049.tif 000037
と呼ぶこともできる。
【０３７１】
Ａｅｅｅｐは化学式７：＊ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ＊により定義され、化学式７ｂ：
【化７】
2020528049.tif 000038
と呼ぶこともできる。
【０３７２】
一実施形態では、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、相互に独立して、Ｇｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｄｏ、Ａｅｅｐ、およびＡｅｅｅｐ、ならびに結合から選択される。
【０３７３】
一実施形態では、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、相互に独立して、Ｇｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｄｏ、および結合から選択される。
【０３７４】
一実施形態では、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、相互に独立して、Ｇｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｄｏ、および結合から選択される。
【０３７５】
一実施形態では、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、互いに独立して、γＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｄｏ、および結合から選択される。
【０３７６】
一実施形態では、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、互いに独立して、γＧｌｕ、Ａｄｏ、および結合から選択される。
【０３７７】
一実施形態では、置換基は以下の＃１〜＃１４により定義される置換基の群から選択される。
【表９】
2020528049.tif 000039
【０３７８】
置換基＃１は化学式６：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄ−＊により定義され、化学式６ｂ：
【化８】
2020528049.tif 000040
と同一である。
【０３７９】
置換基＃２は化学式７：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式７ｂ：
【化９】
2020528049.tif 000041
と同一である。
【０３８０】
置換基＃３は化学式８：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ＊により定義され、化学式８ｂ：
【化１０】
2020528049.tif 000042
と同一である。
【０３８１】
置換基＃４は化学式９：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−＊により定義され、化学式９ｂ：
【化１１】
2020528049.tif 000043
と同一である。
【０３８２】
置換基＃５は化学式１０：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１０ｂ：
【化１２】
2020528049.tif 000044
と同一である。
【０３８３】
置換基＃６は化学式１１：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１１ｂ：
【化１３】
2020528049.tif 000045
として特定される。
【０３８４】
置換基＃７は化学式１２：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−γＧｌｕ−γＧｌｕ−γＧｌｕ−＊により定義され、化学式１２ｂ：
【化１４】
2020528049.tif 000046
として特定される。
【０３８５】
置換基＃８は化学式１３：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１３ｂ：
【化１５】
2020528049.tif 000047
として特定される。
【０３８６】
置換基＃９は化学式１４：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−γＧｌｕ−＊により定義され、化学式１４ｂ：
【化１６】
2020528049.tif 000048
として特定される。
【０３８７】
置換基＃１０は化学式１５：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１５ｂ：
【化１７】
2020528049.tif 000049
として特定される。
【０３８８】
置換基＃１１は化学式１６：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１６ｂ：
【化１８】
2020528049.tif 000050
として特定される。
【０３８９】
置換基＃１２は化学式１７：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−＊により定義され、化学式１７ｂ：
【化１９】
2020528049.tif 000051
として特定される。
【０３９０】
置換基＃１３は化学式１８：４−ＣＯＯＨ−ＰｈＯ−Ｃ１１−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１８ｂ：
【化２０】
2020528049.tif 000052
として特定される。
【０３９１】
置換基＃１４は化学式１９：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１４−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１９ｂ：
【化２１】
2020528049.tif 000053
として特定される。
【０３９２】
《二機能性化合物》
複数の融合化合物が本明細書に記載され、またその他の箇所でも記載されているように、両方の機能性が維持されバランスが取れているようにすることが課題である。開示された化合物は、ＥＧＦ（Ａ）類似体、スペーサーおよびＧＬＰ−１類似体の変形、ならびに要素の順序の変動を含む。
【０３９３】
一実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端にＧＬＰ−１類似体を、Ｃ末端にＥＧＦ（Ａ）類似体を含むが、これはＧＬＰ−１の機能性を維持する上で重要であることが分かった。
【０３９４】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体の配列は、少なくとも３０１Ｌの突然変異を含み、本明細書に詳細に記載されるように、配列番号１０７および１０８によって特定されるＥＧＦ（Ａ）類似体の配列によって例示され、野生型リジンを除去するために３１２Ｅ突然変異を含む場合もある、３０９Ｒおよび３０９Ｉのうちの１つ以上を含むことが好ましい。
【０３９５】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、本明細書で上述するように、突然変異、例えば残基８の８Ａｉｂ、８Ｇまたは８Ｗへの突然変異、および残基３４の例えば３４Ｒへの突然変異を含み、これにより置換基をＫ２６に付着することが可能となる。３０Ｇなどのさらなる突然変異は、ＧＬＰ−１類似体の効力を低減するために好適でありうる。
【０３９６】
このような実施形態では、化合物はＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、
ｉ）前記ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３９、１４０、１４１、１４２または１６４によって特定され、
ｉｉ）前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１０７、１０８、１０９によって特定される。
【０３９７】
一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、
ｉ）前記ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３９または１６４により特定され、
ｉｉ）前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１０７または１０８によって特定される。
【０３９８】
一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、
ｉ）前記ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１６４によって特定され、
ｉｉ）前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１０８によって特定される。
【０３９９】
一実施形態では、化合物は任意のＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１〜７４および７６〜３１４である。
【０４００】
一実施形態では、化合物は、ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１〜７４、７６〜３１４として定義される化合物の群から選択される。
【０４０１】
一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃６９および／または＃３０６である。一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃６９である。一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃３０６である。
【０４０２】
一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１および／または＃４８である。一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１である。一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４８である。
【０４０３】
〈調製方法〉
本明細書に記載される化合物は、よく知られている一般的な知識を使用して調製されうる。バックボーンまたは融合ポリペプチドは、化学合成（方法のセクションＡ１に記載）または異種発現によって提供されうる。融合ポリペプチドをコードする発現ベクターは、通常の分子生物学によって調製されてもよく、適切な宿主を選択することができる。また、方法を組み合わせて、バックボーンの一部分を合成的に調製し、その一方でバックボーンの別の一部分を組み換え型技術によって調製してもよい。置換基は、化学合成中にペプチドバックボーンに付着されてもよく、またはその後のバックボーンまたはその一部との反応中にペプチドバックボーンに付着されてもよい。調製方法とは独立して、化合物は、その要素、例えば、融合ポリペプチド（ペプチドバックボーン）および１つ以上の置換基によって定義される。
【０４０４】
本発明の一態様は、本明細書に記載するように、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む融合ポリペプチドを調製する方法に関する。
【０４０５】
本発明の一態様は、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む融合ポリペプチドの誘導体を調製する方法に関し、誘導体は融合ポリペプチドに共有結合した１つ以上の置換基をさらに含む。
【０４０６】
〈医薬組成物〉
本発明はまた、本発明の化合物（またはその薬学的に許容可能な塩、アミド、もしくはエステル）および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。こうした組成物は、当該技術分野で周知のように調製されてもよい。
【０４０７】
「賦形剤」という用語は、広く、活性治療成分以外の任意の成分を指す。賦形剤は、非活性物質、不活性物質、および／または医薬的に活性でない物質であり得る。賦形剤は、様々な目的、例えば、担体、ビヒクル、希釈剤、錠剤補助剤として、ならびに／または活性物質の投与および／もしくは吸収の改善などを果たすように機能し得る。賦形剤の非限定的な例は、溶媒、希釈剤、緩衝液、保存剤、張性調節剤、キレート剤、および安定剤である。様々な賦形剤を伴う薬物学的活性成分の製剤化は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（例：第１９版（１９９５年）およびその後の版）を参照されたい。
【０４０８】
本発明の組成物は、液剤の形態、すなわち水を含む水性製剤としうる。液剤は、溶液または懸濁液であってもよい。別の方法として、組成物は固形製剤、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥された組成物であってもよい。
【０４０９】
本発明の組成物は、非経口投与であってもよく、例えば、投与は、注射器、任意選択的にペン式の注射器、または注入ポンプという手段により、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内への注射によって行うことができる。
【０４１０】
本発明の医薬組成物は、併用療法の場合に投与を簡略化しうる治療剤などの第二の活性成分をさらに含みうる。
【０４１１】
製剤の例には、液剤、すなわち水を含む水性製剤が含まれる。液剤は、溶液または懸濁液であってもよい。水性製剤は一般に、少なくとも５０％ｗ／ｗの水、または少なくとも６０％、７０％、８０％、またはさらに少なくとも９０％の水を含む。
【０４１２】
別の方法として、医薬組成物は、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥された組成物などの固形製剤であってもよく、これはそのまま使用できるか、使用前に医師または患者が溶媒および／または希釈剤を添加する。
【０４１３】
水性製剤のｐＨはｐＨ３〜ｐＨ１０、例えば約７．０〜約９．５、または約３．０〜約７．０、例えば７．０〜９．５、または３．０〜７．０でありうる。
【０４１４】
医薬組成物は緩衝液を含みうる。緩衝液は、例えば、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸およびアスパラギン酸、およびその混合物から選択されうる。
【０４１５】
医薬組成物は保存剤を含みうる。保存剤は、例えば、フェノール、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、２−フェノキシエタノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチル、２−フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、チオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ−ヒドロオキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウムおよびクロルフェネシン（３−（４−クロロフェノキシ）プロパン−１，２−ジオール）、ならびにその混合物から選択されうる。保存剤は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在することができる。
【０４１６】
医薬組成物は等張剤を含みうる。等張剤は、例えば、塩（例えば、塩化ナトリウム）、糖または糖アルコール、アミノ酸（例えば、グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン）、アルジトール（例えば、グリセロール（グリセリン）、１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）およびそれらの混合物から選択されうる。例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファおよびベータＨＰＣＤ、可溶性殿粉、ヒドロキシエチル殿粉、およびカルボキシメチルセルロース−ナトリウムを含む、例えば、単糖類、二糖類もしくは多糖類、または水溶性グルカンなどの任意の糖が使用されうる。糖アルコールは、少なくとも１つの−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８の炭化水素として定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールを含む。一実施形態では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。
【０４１７】
医薬組成物はキレート剤を含んでもよい。キレート剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、およびアスパラギン酸の塩、およびそれらの混合物から選択されうる。
【０４１８】
医薬組成物は安定剤を含みうる。安定剤は、例えば、１つ以上の酸化阻害剤、凝集阻害剤、界面活性剤、および／または１つ以上のプロテアーゼ阻害剤であってもよい。医薬組成物は、高分子量ポリマーまたは低分子化合物から選択される安定剤を含みうる。安定剤は、例えば、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ  ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ−／ヒドロキシセルロースおよびその誘導体（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、ＨＰＣ−Ｌ、ＨＰＭＣ）、シクロデキストリン、硫黄含有物質（モノチオグリセロール、チオグリコール酸および２−メチルチオエタノールなど）、および異なる塩（例えば、塩化ナトリウム）から選択されうる。
【０４１９】
医薬組成物は、メチオニン酸化からポリペプチドを保護するメチオニンおよびＥＤＴＡ、および凍結溶解または機械的分断に関連する凝集からポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤を含むがこれに限定されない、追加の安定化剤を含みうる。
【０４２０】
医薬組成物は、１つ以上の界面活性剤を含みうる。「界面活性剤」という用語は、水溶性（親水性）部分および脂溶性（親油性）部分からなる任意の分子またはイオンを意味する。界面活性剤は、例えば、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および／または両性イオン界面活性剤から選択されうる。
【０４２１】
医薬組成物は、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、および／またはベンズアミジニンＨＣｌなど、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤を含みうる。
【０４２２】
医薬組成物の追加的な任意選択の成分には、例えば、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、金属イオン、油性の媒体、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン）、および／または双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジンまたはヒスチジンなどのアミノ酸）が含まれうる。
【０４２３】
誘導体または類似体は、医薬組成物の形態で投与してもよい。当該技術分野で周知の様々な経路によって、医薬組成物を必要とする患者に投与することができる。投与経路は、例えば、非経口、表皮、真皮、経皮、結膜、泌尿器、膣部、直腸内、および／または眼、舌、舌下、頬、口腔、経口、腹部、胃腸内、鼻腔、細気管支や肺胞を介して肺から、またはその組み合わせであってもよい。
【０４２４】
組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、マイクロエマルジョン、多層乳剤、泡、軟膏、ペースト、石膏、膏薬、タブレット、コーティング錠、チューイングガム、リンス、カプセル（例えば、ハードゼラチンカプセルまたはソフトゼラチンカプセル）、座薬、直腸カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、粉末、エアロゾル、吸入薬、点眼剤、眼軟膏、洗眼薬、ペッサリー、膣リング、膣軟膏、注射液、原位置変換溶液（例えば、原位置ゲル化、原位置凝固、原位置沈殿または原位置結晶化）、輸液またはインプラントなど、複数の投与形態で投与しうる。
【０４２５】
組成物は、例えば、安定性、バイオアベイラビリティ、および／または溶解性を改善するために、薬物担体または薬物送達システムにおいてさらに混合されうる。組成物は、制御的、持続的、延長的、遅延した、および／または徐放性の薬物送達システムの製剤にも使用されうる。
【０４２６】
〈医学的使用〉
一態様では、本発明は、薬剤の製造において使用するための本発明による化合物の使用に関する。
【０４２７】
本発明はまた、薬剤としてまたは薬剤の製造において使用するための本発明の化合物またはその医薬組成物に関する。
【０４２８】
一実施形態では、本発明の化合物またはその組成物は、心血管疾患および／または心血管リスクの治療または予防に使用されうる。
【０４２９】
一実施形態では、本発明の化合物またはその組成物は、以下に対して使用されうる：
ｉ．脂質パラメータの改善、例えば、脂質異常症の予防および／または治療、総血中脂質の低下、ＬＤＬ−Ｃの低下、ＨＤＬの増加、小型高密度ＬＤＬの低下、ＶＬＤＬの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿中濃度の低下、アポリポタンパク質Ａ（ａｐｏ（Ａ））の発生の阻害、
ｉｉ．心血管疾患の治療および／もしくは予防、例えば、心臓症候群Ｘ、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈心疾患、再かん流傷害、脳卒中、脳虚血、早期心血管または早期心血管疾患、左心室肥大、冠動脈疾患、高血圧、本態性高血圧症、急性高血圧緊急症、心筋症、心不全、運動不耐性、急性および／もしくは慢性心不全、不整脈、心不整脈、失神、狭心症、心臓バイパスおよび／もしくはステント再閉塞、間欠性跛行（動脈硬化性閉塞）、拡張機能障害、および／もしくは収縮機能障害など、ならびに／または血圧低下（収縮期血圧の低下など）、心血管疾患の治療。
【０４３０】
本発明はまた、心血管疾患および／または心血管リスクの治療または予防方法に関する。
【０４３１】
本発明は、（ｉ）脂質パラメータの改善（脂質異常症の予防および／または治療、総血中脂質の低下、ＨＤＬ−Ｃの増加、ＬＤＬ−Ｃの低下、小型高密度ＬＤＬ−Ｃの低下、ＶＬＤＬ−Ｃの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿中濃度の低下、アポリポタンパク質（ａｐｏ（Ａ））の発生の阻害など）、（ｉｉ）心血管疾患の治療および／または予防（心臓症候群Ｘ、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈心疾患、再かん流傷害、脳卒中、脳虚血、早期心血管または早期心血管疾患、左心室肥大、冠動脈疾患、高血圧、本態性高血圧症、急性高血圧緊急症、心筋症、心不全、運動不耐性、急性および／または慢性心不全、不整脈、心不整脈、失神、狭心症、心臓バイパスおよび／またはステント再閉塞、間欠性跛行（動脈硬化性閉塞）、拡張機能障害、および／または収縮機能障害など）、および／または血圧低下（収縮期血圧の低下など）、心血管疾患の治療などの方法にさらに関し、本発明による薬学的に活性な量の化合物が投与される。
【０４３２】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、以下の医学的処置に使用されうる：
ｉ．例えば、高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、ＭＯＤＹ（若年発症成人型糖尿病）、妊娠糖尿病、および／またはＨｂＡ１ｃの減少などの、すべての形態の糖尿病の予防および／または治療、
ｉｉ．２型糖尿病の進行などの糖尿病疾患の進行の遅延または予防、耐糖能障害（ＩＧＴ）からインスリンを必要とする２型糖尿病への進行の遅延、インスリン耐性の遅延または予防、および／またはインスリンを必要としない２型糖尿病からインスリンを必要とする２型糖尿病への進行の遅延、
ｉｉｉ．β細胞機能の改善、例えばβ細胞アポトーシスの減少、β細胞機能および／またはβ細胞量の増加、および／またはβ細胞に対するグルコース感受性の回復など、
ｉｖ．アルツハイマー病、パーキンソン病、および／または多発性硬化症などの、認知障害および／または神経変性疾患の予防および／または治療、
ｖ．肥満などの摂食障害（例えば、食事量の減少、体重減少、食欲の抑制、満腹感の誘導などによる）の予防および／もしくは治療、過食性障害、神経性大食症、および／もしくは抗精神病薬もしくはステロイドの投与によって誘発された肥満の予防または治療、胃の運動の減少、胃内容排出の遅延、身体可動性の増加、および／または骨関節炎および／または尿失禁などの肥満の併発疾患の予防および／または治療、
ｖｉ．糖尿病性合併症、例えば、血管症、末梢神経障害を含む神経障害、腎症、および／または網膜症などの予防および／または治療、
ｖｉｉ．脂質パラメータの改善、例えば、脂質異常症の予防および／または治療、総血清脂質の低下、ＨＤＬの増加、小型高密度ＬＤＬの低下、ＶＬＤＬの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、ヒト中リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿中濃度の低下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでのアポリポタンパク質Ａ（ａｐｏ（Ａ））の発生の阻害など、
ｖｉｉｉ．心臓症候群Ｘ、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈心疾患、再かん流傷害、脳卒中、脳虚血、早期心血管または早期心血管疾患、左心室肥大、冠動脈疾患、高血圧、本態性高血圧症、急性高血圧緊急症、心筋症、心不全、運動不耐性、急性および／もしくは慢性心不全、不整脈、心不整脈、失神、狭心症、心臓バイパスおよび／もしくはステント再閉塞、間欠性跛行（動脈硬化性閉塞）、拡張機能障害、および／もしくは収縮機能障害などの心血管疾患の治療および／もしくは予防、ならびに／または収縮期血圧の低下などの血圧低下、
ｉｘ．胃腸疾患、例えば、炎症性腸疾患、短腸症候群、またはクローン病または大腸炎、消化障害、および／または胃潰瘍等などの予防および／または治療、ならびに／または炎症、例えば、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、および／または全身性エリテマトーデスなどの予防および／または治療、
ｘ．重症疾患患者、重症疾患ポリ腎症（ＣＩＰＮＰ）患者、および／または潜在的なＣＩＰＮＰ患者の治療などの重症疾患の予防および／または治療、重症疾患またはＣＩＰＮＰの発症の予防、患者における全身性炎症性反応症候群（ＳＩＲＳ）の予防、治療および／または治癒、入院中に菌血症、敗血症および／または敗血性ショックにかかる患者の確率の予防または減少、および／または急性疾患のため集中治療室に入室した患者における血糖、インスリンバランスおよび任意選択的には代謝の安定化、
ｘｉ．多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）の予防および／または治療、
ｘｉｉ．脳虚血、脳出血、および／または外傷性脳損傷などの脳疾患の予防および／または治療、
ｘｉｉｉ．睡眠時無呼吸の予防および／または治療、ならびに／または
ｘｉｖ．アルコール乱用および／または薬物乱用などの乱用の予防および／または治療。
【０４３３】
一部の実施形態では、適応は（ｉ）〜（ｘｉｖ）、例えば適応（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）、（ｘ）〜（ｘｉｉｉ）、および／または（ｘｉｖ）からなる群から選択され、何らかの形で糖尿病に関連する。
【０４３４】
いくつかの実施形態では、適応は（ｉ）〜（ｉｉｉ）および（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）、例えば適応（ｉ）、（ｉｉ）および／もしくは（ｉｉｉ）、または、適応（ｖ）、適応（ｖｉ）、適応（ｖｉｉ）、および／または適応（ｖｉｉｉ）などの群から選択される。
【０４３５】
一部の実施形態では、適応は（ｉ）である。さらなる特定の実施形態では、適応は（ｖ）である。なおさらなる特定の実施形態において、適応は（ｖｉｉｉ）である。
【０４３６】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、および／もしくは多嚢胞性卵巣症候群を含むすべての形態の糖尿病の治療および／もしくは予防、ならびに／または脂質パラメータの改善、β細胞機能の改善、および／もしくは糖尿病性疾患の進行の遅延または予防に使用されうる。２型糖尿病および／または肥満への適応が特に好ましい。いくつかの実施形態では本発明は、体重を管理するための方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、食欲を低下させるための方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、食物摂取量を減少させるための方法に関する。
【０４３７】
一般に、肥満である患者のすべては、過体重でもあると考えられる。いくつかの実施形態では、本発明は、肥満を治療または予防するための方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、肥満を治療または予防するために本発明の誘導体または類似体を使用することに関する。いくつかの実施形態では、肥満の患者は、成人のヒトまたは小児のヒト（幼児、小児、および青年を含む）などのヒトである。ボディマス指数（ＢＭＩ）は、身長および体重に基づく体脂肪の尺度である。計算式は、ＢＭＩ＝体重（キログラム）／身長（メートル）２である。肥満のヒト患者はＢＭＩが３０以上である可能性があり、またＢＭＩが３０以上である場合を肥満と呼ぶことができる。一部の実施形態では、肥満のヒト対象は、３５以上のＢＭＩを有するか、または３０以上〜４０未満の範囲のＢＭＩを有している場合がある。一部の実施形態では、肥満は、ヒト対象がＢＭＩ４０以上を有する場合に重度肥満または病的肥満である。
【０４３８】
一部の実施形態では、本発明は、任意選択的に少なくとも１つの体重に関連する併存疾患の存在下における、過体重の治療または予防のための方法に関する。
【０４３９】
一部の実施形態では、本発明は、任意選択的に少なくとも１つの体重に関連する併存疾患の存在下における、過体重の治療または予防のための本発明の化合物の使用に関する。いくつかの実施形態では、過体重の患者は、成人のヒトまたは小児のヒト（幼児、小児、および青年を含む）などのヒトである。一部の実施形態では、過体重のヒト患者は、ＢＭＩ２５以上（ＢＭＩ２７以上など）を有しうる。いくつかの実施形態では、過体重のヒト患者は、２５〜３０未満の範囲または２７〜３０未満の範囲のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、体重関連の併存疾患は、高血圧、糖尿病（例えば２型糖尿病）、脂質異常症、高コレステロール、および閉塞性睡眠時無呼吸からなる群から選択される。
【０４４０】
いくつかの実施形態では、本発明は、体重を減少させるための方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、体重減少のための本発明の化合物の使用に関する。本発明による体重の減少を享受するヒトは、ＢＭＩ２５以上（ＢＭＩ２７以上またはＢＭＩ３０以上など）を有しうる。一部の実施形態では、本発明による体重減少を享受するヒトは、ＢＭＩ３５以上またはＢＭＩ４０以上を有しうる。「体重減少」という用語は、肥満および／または過体重の治療または予防を含みうる。
【０４４１】
さらなる実施形態では、本発明は、上述したように、糖尿病および心血管疾患または心血管リスクの治療または予防における本発明による化合物の使用に関し、１つの薬剤により２つの疾患または障害に対処する。
【０４４２】
一実施形態では、本発明は、本発明による化合物を必要とする患者に対し、この化合物の治療的な有効薬量を投与する工程を含む、上述の治療方法に関する。
【０４４３】
投与量は個別に決定することができ、選択された特定の薬物化合物および投与レジメンに応じて、週５０ｍｇ未満、例えば週１０〜１５ｍｇ、または月７０〜１００ｍｇでありうる。
【０４４４】
本明細書では本発明のある特定の特徴を例示および説明してきたが、数多くの修正、置換、変更、および均等物が当業者には思い浮かぶであろう。したがって、添付の実施形態の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのようなすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【実施例】
【０４４５】
《実施形態》
１．ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物であって、
ｉ．前記ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３７によって特定されるＧＬＰ−１（７−３７）の類似体であり、
ｉｉ．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１によって特定されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体である。
２．前記化合物が少なくとも１つのＬｙｓ残基を有する、実施形態１に記載の化合物。
３．前記化合物が少なくとも２つのＬｙｓ残基を有する、実施形態１に記載の化合物。
４．前記化合物が厳密に１つまたは２つのＬｙｓ残基を有する、実施形態１に記載の化合物。
５．前記化合物が厳密に１つのＬｙｓ残基を有する、実施形態１に記載の化合物。
６．前記化合物が厳密に２つのＬｙｓ残基を有する、実施形態１に記載の化合物。
７．前記化合物が融合ポリペプチドを含む、実施形態１に記載の化合物。
８．前記融合ポリペプチドがＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む、実施形態７に記載の化合物。
９．前記ＧＬＰ−１類似体が、当該ＧＬＰ−１類似体のＣ末端アミノ酸残基を介してＥＧＦ（Ａ）類似体に融合されている、実施形態８に記載の化合物。
１０．前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端に前記ＧＬＰ−１類似体を、Ｃ末端に前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を含む、実施形態８に記載の化合物。
１１．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、前記ＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端アミノ酸残基を介してＧＬＰ−１類似体に融合されている、実施形態８に記載の化合物。
１２．前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端に前記ＥＧＦ（Ａ）類似体およびＣ末端に前記ＧＬＰ−１類似体を含む、実施形態８に記載の化合物。
１３．前記融合ポリペプチドがペプチドスペーサーを含む、実施形態７〜１２のいずれかに記載の化合物。
１４．前記ペプチドスペーサーが４〜８０のアミノ酸残基からなる、実施形態１３に記載の化合物。
１５．前記ペプチドスペーサーが４〜２０のアミノ酸残基からなる、実施形態１４に記載の化合物。
１６．前記ペプチドスペーサーがＬｙｓ残基を含む、実施形態１４に記載の化合物。
１７．前記ペプチドスペーサーがＬｙｓ残基を含まない、実施形態１４に記載の化合物。
１８．前記ペプチドスペーサーが、配列番号１１５〜１２６によって特定されるペプチドの群から選択される、実施形態１４に記載の化合物。
１９．前記ペプチドスペーサーが、配列番号１１５〜１３６によって特定されるペプチドの群から選択される、実施形態１４に記載の化合物。
２０．前記ＧＬＰ−１類似体がＧＬＰ−１受容体作動薬である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２１．前記ＧＬＰ−１類似体のＣ１（ＨＳＡなし）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおけるＥＣ５０が、１〜５０ｐＭ、１０〜１００ｐＭ、５０〜１００ｐＭ、１００〜２５０ｐＭまたは２５０〜１０００ｐＭである、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２２．前記ＧＬＰ−１類似体が完全ＧＬＰ−１受容体作動薬である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２３．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ１（ＨＳＡなし）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて野生型ＧＬＰ−１と同等のＥＣ５０を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２４．前記ＧＬＰ−１類似体が、最大で５０ｐＭのＥＣ５０を有する、実施形態２３に記載の化合物。
２５．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ１（ＨＳＡなし）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいてセマグルチドと同等のＥＣ５０を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２６．前記ＧＬＰ−１類似体が５〜１５ｐＭのＥＣ５０を有する、実施形態２５に記載の化合物。
２７．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ１（１％ＨＳＡ）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて最大で２５００ｐＭのＥＣ５０を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２８．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ１（１％ＨＳＡ）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて少なくとも５００ｐＭのＥＣ５０を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２９．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ７に記載されたｄｂ／ｄｂマウスにおいて血糖を低下させる能力を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３０．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ７に記載されたｄｂ／ｄｂマウスにおいて血糖を低下させる能力を有し、ＥＣ５０ＡＵＣΔＢＧ２４ｈが１５ｎｍｏｌ／ｋｇ未満である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３１．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ８に記載されたＤＩＯラットにおいて体重を減少させる能力を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３２．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ８に記載されたＤＩＯラットにおいて体重を減少させる能力を有し、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合に、前記ＧＬＰ−１類似体がベースラインＢＷの少なくとも９５％に体重を減少させる能力を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３３．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ８に記載されたＤＩＯラットにおいて体重を減少させる能力を有し、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合に、前記ＧＬＰ−１類似体がベースラインＢＷの少なくとも９０％に体重を減少させる能力を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３４．前記ＧＬＰ−１類似体の配列番号１３７に対する同一性が、少なくとも８０％、例えば８５％、９０％、９５％である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３５．前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号１３７と比較して最大で６つのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３６．前記ＧＬＰ−１類似体が８Ａのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３７．前記ＧＬＰ−１類似体が、８ＡからＧまたはＷへのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３８．前記ＧＬＰ−１類似体が、位置８にタンパク質を構成しないアミノ酸残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３９．前記ＧＬＰ−１類似体が、位置８にタンパク質を構成しないアミノ酸残基Ａｉｂを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４０．前記ＧＬＰ−１類似体が、８ＡからＧ、Ｗまたはタンパク質を構成しないアミノ酸残基Ａｉｂへのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４１．前記ＧＬＰ−１類似体が８Ａｉｂを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４２．前記ＧＬＰ−１類似体が、０、１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４３．前記ＧＬＰ−１類似体が、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、３４Ｋおよび３６Ｋからなる群から選択される１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４４．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｌｙｓ残基２６Ｋおよび３４Ｋを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４５．前記ＧＬＰ−１類似体が、２６Ｋおよび３４Ｋのうち一方または両方の置換または欠失を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４６．前記ＧＬＰ−１類似体が２６Ｋを含まない、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４７．前記ＧＬＰ−１類似体が２６Ｋの欠失を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４８．前記ＧＬＰ−１類似体が２６Ｋのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４９．前記ＧＬＰ−１類似体が２６Ｒを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５０．前記ＧＬＰ−１類似体が追加的なＬｙｓ残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５１．前記ＧＬＰ−１類似体が、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋおよび３６Ｋからなる群から選択される追加のＬｙｓ残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５２．前記ＧＬＰ−１類似体が、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、３４Ｋおよび３６Ｋから選択される厳密に１つのＬｙｓ残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５３．前記ＧＬＰ−１類似体が、以下の対から選択される厳密に２つのＬｙｓ残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物：
k）２１Ｋおよび２６Ｋ
l）２３Ｋおよび２６Ｋ
m）２４Ｋおよび２６Ｋ
n）２５Ｋおよび２６Ｋ
o）２７Ｋおよび２６Ｋ
p）３０Ｋおよび２６Ｋ
q）３１Ｋおよび２６Ｋ
r）３２Ｋおよび２６Ｋ
s）３３Ｋおよび２６Ｋ
t）３４Ｋおよび２６Ｋ。
５４．前記ＧＬＰ−１類似体が３４Ｋを含まない、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５５．前記ＧＬＰ−１類似体が３４Ｋの欠失を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５６．前記ＧＬＰ−１類似体が３４Ｋのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５７．前記ＧＬＰ−１類似体が３４Ｒまたは３４Ｑを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５８．前記ＧＬＰ−１類似体が、アミノ酸残基３５〜３７、３４〜３７または３３〜３７の欠失を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５９．前記ＧＬＰ−１類似体が３３Ｌを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６０．前記ＧＬＰ−１類似体が、少なくとも２６、例えば少なくとも２７または少なくとも２８のアミノ酸残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６１．ＧＬＰ−１類似体が、アミノ酸残基２１、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３１、３２および３３つのうちの１つのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６２．前述の実施形態のいずれかに記載の化合物であって、前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｈ−Ｘ８−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｘ１２−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｘ２１−Ｇ−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｆ−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７（配列番号１８７）によって定義される配列を有し、
Ｘ８はＡ、Ｇ、ＷまたはＡｉｂであり、
Ｘ１２はＦまたはＫであり、
Ｘ２１はＥ、Ｇ、またはＫであり、
Ｘ２３はＱ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２４はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２５はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２６はＫまたはＲであり、
Ｘ２７はＥ、Ｇ、またはＫであり、
Ｘ２９はＩ、Ａ、またはＶであり、
Ｘ３０はＡ、Ｇ、またはＫであり、
Ｘ３１はＷ、Ｇ、またはＫであり、
Ｘ３２はＬ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、またはＫであり、
Ｘ３３はＶ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３４はＫ、Ｒ、Ｑであるか、または不在であり、
Ｘ３５はＧであるか、または不在であり、
Ｘ３６はＲ、Ｋであるか、または不在であり、および
Ｘ３７はＧであるか、または不在である。
６３．前記ＧＬＰ−１類似体が配列番号１３８〜１８６、例えば配列番号１３９〜１４６、１５５〜１６２、１６４〜１７３、例えば配列番号１３９〜１４２、１５５〜１６２、１６４〜１７３、例えば配列番号１３９、１４２、１５５〜１６２、１６４〜１７３、例えば配列番号１３９、１５５〜１６２、１６４〜１７３、例えば配列番号１５５〜１６２、１６４〜１７３、または例えば配列番号１３９および１６４により特定されるＧＬＰ−１類似体の群から選択される、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６４．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体がＰＣＳＫ９阻害剤である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６５．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１によって特定されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインと比較して、ヒトＰＣＳＫ９への結合親和性を増加させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６６．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、セクションＣ３に記載されるＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ結合に関する競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定された場合、５０ｎＭ未満のＫｉ、例えば２５ｎＭ未満または例えば１０ｎＭ未満でＰＣＳＫ９に結合する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６７．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、セクションＣ３に記載されるＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ結合に関する前記競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定された場合、５ｎＭ未満のＫｉでＰＣＳＫ９に結合する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６８．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体がＬＤＬ取り込みを増加させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６９．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、ヒトＰＣＳＫ９の存在下でのＬＤＬ取り込みを増加させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７０．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、セクションＣ４に記載されるＬＤＬ取り込みアッセイで測定された場合、１０００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７１．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、セクションＣ４に記載される前記ＬＤＬ取り込みアッセイで測定された場合、５００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７２．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が血中コレステロールを減少させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７３．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、セクションＣ８に記載されるように評価された場合にＤＩＯラットにおける血中コレステロールを減少させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７４．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、血中コレステロールを少なくとも０．５ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７５．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、血中コレステロールを少なくとも０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７６．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体の配列番号１に対する同一性が、少なくとも８０％、８５％、９０％、または例えば９５％である、前述の実施形態のいずれかによる化合物。
７７．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して１〜１５のアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７８．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０１Ｌを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７９．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０１Ｌおよび３０９Ｒを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８０．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、（野生型）アミノ酸残基２９５Ｎ（Ａｓｎ）、２９６Ｅ（Ｇｌｕ）、２９８Ｌ（Ｌｅｕ）、３０２Ｇ（Ｇｌｙ）および３１０Ｄ（Ａｓｐ）のうちの１つ以上を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８１．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体がいずれのＫ残基を含まない、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８２．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３１２Ｋを含まない、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８３．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３１２Ｅ、３１２Ｄ、３１２Ｑまたは３１２Ｒを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８４．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０１Ｌ、３０９Ｒ、および３１２Ｋのアミノ酸置換、例えば３１２Ｅを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８５．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０１Ｌ、３１０Ｄ、および３１２Ｋのアミノ酸置換、例えば３１２Ｅを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８６．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０１Ｌおよび３１０Ｄを含み、前記ペプチドが２９９ＤからＧ、ＶまたはＨへの置換を持たない、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８７．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３２１Ｄまたは３２１Ｅを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８８．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅおよび３２１Ｅを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８９．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体の配列が、配列番号１９、２１、７３、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、および１１４、例えば配列番号１０７、１０８、１０９、１１０および１１１、例えば配列番号１０７および１０８のいずれかによって定義される、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
９０．前記融合ポリペプチドがＧＬＰ−１類似体、スペーサーペプチド、およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む、前述の実施形態７〜８９のいずれかに記載の化合物。
９１．前記ＧＬＰ−１類似体が、実施形態２０〜６３のいずれかで定義される、実施形態９０に記載の化合物。
９２．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、実施形態６４〜８９のいずれかで定義される、実施形態９０または実施形態９１に記載の化合物。
９３．前記スペーサーペプチドが、実施形態１４〜１９のいずれかで定義される、実施形態９０、９１または９２に記載の化合物。
９４．前記融合ポリペプチドが、配列番号１８８〜３８４によって特定される配列の群から選択される、実施形態９０に記載の化合物。
９５．前記融合ポリペプチドが最大２つのリジン残基を含む、実施形態９０〜９４のいずれかに記載の化合物。
９６．前記化合物が最大２つの置換基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
９７．前記化合物が最大２つの半減期を延長させる置換基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
９８．前記化合物が、ペプチドバックボーンを含む誘導体であり、前記誘導体に付着された最大２つの置換基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
９９．前記ペプチドバックボーンが、実施形態７〜９４のいずれかで定義される融合ペプチドである、実施形態９８に記載の化合物。
１００．少なくとも１つの置換基が、前記ＧＬＰ−１類似体、前記ＥＧＦ（Ａ）類似体、および／または前記スペーサーに付着された、前述の実施形態９６〜９９のいずれかに記載の化合物。
１０１．少なくとも１つの置換基が前記ＧＬＰ−１類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０２．少なくとも１つの置換基が前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０３．少なくとも１つの置換基が前記スペーサーに付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０４．少なくとも１つの置換基がＬｙｓ／Ｋアミノ酸残基を介して付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０５．少なくとも１つの置換基がＬｙｓ／Ｋアミノ酸残基を介して前記ＧＬＰ−１類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０６．少なくとも１つの置換基が、１２Ｋ、２１Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋおよび３６Ｋからなる群から選択されるＬｙｓ／Ｋアミノ酸残基を介して前記ＧＬＰ−１類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０７．少なくとも１つの置換基が、２６Ｋを介して前記ＧＬＰ−１類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０８．少なくとも１つの置換基が前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０９．少なくとも１つの置換基が、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓまたは３３３Ｌｙｓを介して前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１０．少なくとも１つの置換基が、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓまたは３３３Ｌｙｓを介して前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１１．少なくとも１つの置換基が、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓまたは３３３Ｌｙｓを介して前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１２．少なくとも１つの置換基が、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓまたは３３３Ｌｙｓを介して前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１３．少なくとも１つの置換基が、３１３Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、または３３３Ｌｙｓを介して前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１４．少なくとも１つの置換基が前記ペプチドスペーサーに付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１５．少なくとも１つの置換基が、Ｌｙｓ残基を介して前記ペプチドスペーサーに付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１６．少なくとも１つの置換基が、Ｌｙｓ残基を介して前記ペプチドスペーサーに付着され、前記スペーサーが、位置１、２、３、４、５、６、７または８の位置にＬｙｓを有する配列番号１１６の変異体である、実施形態１００に記載の化合物。
１１７．前記化合物が、前記融合ペプチドに付着された厳密に２つの置換基を含む、実施形態９６〜１１６のいずれか１つに記載の化合物。
１１８．１つの置換基が、実施形態１０５〜１０７に定義される前記ＧＬＰ−１類似体を介して付着され、１つの置換基が、実施形態１１５〜１１６のいずれか１つに定義される前記スペーサーに付着された、実施形態１１７に記載の化合物。
１１９．１つの置換基が、実施形態１０９〜１１３のいずれか１つに定義される前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を介して付着され、１つの置換基が、実施形態１１５〜１１６のいずれか１つに定義される前記ペプチドスペーサーに付着された、実施形態１１７に記載の化合物。
１２０．１つの置換基が、実施形態１０５〜１０７のいずれか１つに定義される前記ＧＬＰ−１類似体を介して付着され、１つの置換基が、実施形態１０９〜１１３のいずれか１つに定義される前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１１７に記載の化合物。
１２１．２つの置換基が、実施形態１０５〜１０８のいずれか１つで定義される前記ＧＬＰ−１類似体を介して付着された、実施形態１１７に記載の化合物。
１２２．２つの置換基が、実施形態１０９〜１１３のいずれか１つで定義される前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を介して付着された、実施形態１１７に記載の化合物。
１２３．前記置換基が脂肪酸基（ＡＢ）を含む、前述の実施形態９６〜１２２のいずれかに記載の化合物。
１２４．前記置換基が、化学式１：−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（式中、ｎは８〜２０の整数）および化学式２：−ＨＯＯＣ−（Ｃ６Ｈ４）−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−＊（式中、ｍは８〜１１の整数）からなる群から選択される脂肪酸基を含む、実施形態１２３に記載の化合物。
１２５．前記置換基が、二酸−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（式中、ｎは１４〜２０）から選択される脂肪酸基を含む、実施形態１２３に記載の化合物。
１２６．前記置換基が、二酸（−ＨＯＯＣ−（Ｃ６Ｈ４）−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−＊）（式中、ｍは８〜１１の整数）から選択される脂肪酸基を含む、実施形態１２３に記載の化合物。
１２７．前記少なくとも１つの置換基が少なくとも１つのリンカー要素をさらに含む、実施形態１２３〜１２６のいずれかに記載の化合物。
１２８．少なくとも１つの置換基が、−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−と呼ばれる最大で６つのリンカー要素をさらに含む、実施形態１２３〜１２６のいずれかに記載の化合物。
１２９．前記少なくとも１つの置換基が、−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−と呼ばれる最大で６つのリンカー要素をさらに含み、Ｚ１が前記脂肪酸基に結合され、最後のＺ要素が前記ペプチドバックボーンに結合されている、実施形態１２３〜１２６のいずれかに記載の化合物。
１３０．−Ｚ１が＊−ＮＨ−ＣＨ２−（Ｃ６Ｈ１０）−ＣＯ−＊または結合である、実施形態１２８および１２９のいずれかに記載の化合物。
１３１．−Ｚ２−がγＧｌｕ、Ｇｌｕ、または結合である、実施形態１２８および１３０のいずれかに記載の化合物。
１３２．−Ｚ２−がγＧｌｕである、実施形態１２８および１３０のいずれかに記載の化合物。
１３３．Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、相互に独立して、Ｇｌｕ、γＧｌｕ、Ａｄｏ、および結合から選択される、実施形態１２８および１３２のいずれかに記載の化合物。
１３４．Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、互いに独立して、γＧｌｕ、Ａｄｏ、および結合から選択される、実施形態１２８および１３２のいずれかに記載の化合物。
１３５．前記少なくとも１つの置換基が、−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−を含むリンカーを含む、実施形態１２３〜１３４のいずれかに記載の化合物。
１３６．前記少なくとも１つの置換基が、置換基＃１〜１３、例えば置換基＃１〜４、＃５〜１２、＃６〜１２、または置換基＃１、＃５および＃６からなる置換基の群から選択される、実施形態１２３に記載の化合物。
１３７．前記化合物が二機能性である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
１３８．前記化合物がＧＬＰ−１受容体作動薬である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
１３９．前記化合物が、Ｃ１（ＨＳＡなし）で記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて１〜５０ｐＭ、１０〜１００ｐＭ、５０〜１００ｐＭ、１００〜２５０ｐＭまたは２５０〜１０００ｐＭのＥＣ５０を有する、実施形態１３７または実施形態１３８に記載の化合物。
１４０．前記化合物が完全ＧＬＰ−１受容体作動薬である、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４１．前記化合物が、Ｃ１（ＨＳＡなし）で記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて野生型ＧＬＰ−１と同等のＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４２．前記化合物が、Ｃ１（ＨＳＡなし）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて最大で５０ｐＭのＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４３．前記化合物が、Ｃ１（ＨＳＡなし）で記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいてセマグルチドと同等のＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４４．前記化合物が、Ｃ１（ＨＳＡなし）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて５〜１５ｐＭのＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４５．前記化合物が、Ｃ１（１％ＨＳＡ）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて最大で２５００ｐＭのＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４６．前記化合物が、Ｃ１（１％ＨＳＡ）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて少なくとも５００ｐＭのＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４７．前記化合物が、Ｃ７に記載されたｄｂ／ｄｂマウスにおいて血糖を低下させる能力を有する、前述の実施形態１３７〜１４６のいずれかに記載の化合物。
１４８．前記化合物が、Ｃ７に記載されたｄｂ／ｄｂマウスにおいて血糖を低下させる能力を有し、ＥＣ５０  ＡＵＣΔＢＧ２４ｈが１５ｎｍｏｌ／ｋｇ未満である、前述の実施形態１３７〜１４６のいずれかに記載の化合物。
１４９．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ８に記載されるようにＤＩＯラットの体重を減少させる能力を有する、前述の実施形態１３７〜１４６のいずれかに記載の化合物。
１５０．前記化合物が、Ｃ８に記載されたＤＩＯラットにおいて体重を減少させる能力を有し、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、前記ＧＬＰ−１類似体がベースラインＢＷの少なくとも９５％に体重を減少される能力を有する、前述の実施形態１３７〜１４６のいずれかに記載の化合物。
１５１．前記化合物が、Ｃ８に記載されたＤＩＯラットにおいて体重を減少させる能力を有し、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、前記ＧＬＰ−１類似体がベースラインＢＷの少なくとも９０％に体重を減少される能力を有する、前述の実施形態１３７〜１４６のいずれかに記載の化合物。
１５２．化合物がＰＣＳＫ９阻害剤である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
１５３．前記化合物が、配列番号１によって特定されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインと比較して、増加したヒトＰＣＳＫ９への結合親和性を増加させる、前述の実施形態１３７〜１４５のいずれかに記載の化合物。
１５４．前記化合物が、セクションＣ３に記載されるＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ結合に関する競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定された場合、５０ｎＭ未満のＫｉ、例えば２５ｎＭ未満、または例えば１０ｎＭ未満でＰＣＳＫ９に結合する、前述の実施形態１３７〜１４５のいずれかに記載の化合物。
１５５．前記化合物が、セクションＣ３に記載されるＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ結合に関する競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定された場合、５ｎＭ未満のＫｉでＰＣＳＫ９に結合する、前述の実施形態１３７〜１４５のいずれかに記載の化合物。
１５６．前記化合物がＬＤＬ取り込みを増加させる、前述の実施形態１３７〜１４５のいずれかに記載の化合物。
１５７．前記化合物がヒトＰＣＳＫ９の存在下でのＬＤＬ取り込みを増加させる、前述の実施形態１３７〜１４５のいずれかに記載の化合物。
１５８．前記化合物が、セクションＣ４に記載されるＬＤＬ取り込みアッセイで測定された場合、１０００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１５２のいずれかに記載の化合物。
１５９．前記化合物が、セクションＣ４に記載されるＬＤＬ取り込みアッセイで測定された場合、５００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１４５のいずれかに記載の化合物。
１６０．前記化合物が、セクションＣ８に記載されるように評価された場合にＤＩＯラットにおける血中コレステロールを減少させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
１６１．前記化合物が、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、血中コレステロールを少なくとも０．５ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる、実施形態１６０に記載の化合物。
１６２．前記化合物が、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、血中コレステロールを少なくとも０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる、実施形態１６０に記載の化合物。
１６３．前記化合物が、前述の実施形態１３９〜１４４のいずれか１つで定義されるＧＬＰ−１受容体作動薬、および実施形態１５３〜１５９のいずれか１つで定義されるＰＣＳＫ９阻害剤である、実施形態のいずれかに記載の化合物。
１６４．前記化合物の見掛けのＥＧＦ（Ａ）Ｋｉ（Ｃ３）：ＧＬＰ−１効力（Ｃ１、ＨＳＡなし）の比率が、最大で５０００、例えば最大で４０００、例えば最大で３０００、例えば最大で２０００、または例えば最大で１０００である、実施形態１６０に記載の化合物。
１６５．前記化合物の見掛けのＥＧＦ（Ａ）Ｋｉ（Ｃ３）：ＧＬＰ−１効力（Ｃ１、ＨＳＡなし）の比率が、最大で１０００、例えば最大で８００、例えば最大で６００、例えば最大で４００、または例えば最大で２００である、実施形態１６０に記載の化合物。
１６６．前記化合物の見掛けのＥＧＦ（Ａ）Ｋｉ（Ｃ３）：ＧＬＰ−１効力（Ｃ１、ＨＳＡなし）の比率が、最大で２００、例えば最大で１５０、例えば最大で１００、例えば最大で５０、２５、１０である、実施形態１６０に記載の化合物。
１６７．前記化合物が、本明細書のセクションＣ８に記載されるｉｎ  ｖｉｖｏラット試験において、ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１と少なくとも等しい、コレステロールおよび体重を減少させる能力を有する、前述の実施形態１３７〜１６６のいずれかに記載の化合物。
１６８．前記化合物が、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、少なくとも０．５ｍｍｏｌ／Ｌのコレステロールを減少させる能力を有する、実施形態１６７に記載の化合物。
１６９．前記化合物が、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも０．６ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば０．７ｍｍｏｌ／Ｌ、または例えば０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する、実施形態１６７に記載の化合物。
１７０．前記化合物が、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する、実施形態１６７に記載の化合物。
１７１．前記化合物が、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば１．２ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する、実施形態１６７に記載の化合物。
１７２．前記化合物が、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、ベースラインＢＷの少なくとも９５％に体重を減少させる能力を有する、実施形態１６７〜１７１に記載の化合物。
１７３．前記化合物が、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し、２１日後に測定した場合、ベースラインＢＷの少なくとも９０％に体重を減少させる能力を有する、実施形態１６７〜１７１に記載の化合物。
１７４．前記化合物が、ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１〜３１４として定義される化合物の群から選択される、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
１７５．ＧＬＰ−１受容体作動薬およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１によって特定されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体である、化合物。
１７６．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、前述の実施形態６４〜８９のいずれかで定義される、実施形態１７５に記載の化合物。
１７７．ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１〜３０５として定義される化合物の群から選択される化合物。
１７８．ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１〜３１４として定義される化合物の群から選択される化合物。
１７９．ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１、２、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２９、３２、４１、４８、５１、５２、５３、５４、６９、８２、８６、２２１、２３０、２８７、２９８および３０６として定義される化合物の群から選択される化合物。
１８０．ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１、２、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２９、３２、２４８、５２、５３、５４、６９および３０６として定義される化合物の群から選択される化合物。
１８１．ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１、＃４８、＃６９および＃３０６、例えば＃３０６および＃６９、または例えば＃３０６もしくは＃６９として定義される化合物の群から選択される化合物。
１８２．前述の実施形態のいずれかによる化合物の、薬剤の調製のための使用。
１８３．薬剤の調製に使用するための、前述の実施形態１〜１８１のいずれかに記載の化合物。
１８４．治療方法で使用するための、前述の実施形態１〜１８１のいずれかに記載の化合物。
１８５．糖尿病および／または過体重を治療する方法で使用するための、前述の実施形態１〜１８１のいずれかに記載の化合物。
１８６．心血管疾患および／または心血管リスクを治療または予防する方法で使用するための、前述の実施形態１〜１８１のいずれかに記載の化合物。
１８７．脂質パラメータを改善するための治療方法で使用するための、前述の実施形態１〜１８１のいずれかに記載の化合物。
１８８．糖尿病および心血管疾患を治療する方法で使用するための、前述の実施形態１〜１８１のいずれかに記載の化合物。
１８９．糖尿病および／または過体重を治療する方法であって、前記方法が、必要とする患者に対し、薬学的に活性な量の前述の実施形態１〜１８１のいずれかによる化合物を投与する工程を含む、方法。
１９０．心血管疾患および／または心血管リスクを治療または予防する方法であって、前記方法が、必要とする患者に対し、薬学的に活性な量の前述の実施形態１〜１８１のいずれかによる化合物を投与する工程を含む、方法。
１９１．脂質パラメータを改善するための治療方法であって、前記方法が、必要とする患者に対し、薬学的に活性な量の前述の実施形態１〜１８１のいずれかによる化合物を投与することを含む、方法。
１９２．糖尿病および心血管疾患を治療する方法であって、前記方法が、必要とする患者に対し、薬学的に活性な量の前述の実施形態１〜１８１のいずれかによる化合物を投与する工程を含む、方法。
【０４４６】
《方法および例》
〈略語リスト〉
Ａｉｂ：α−アミノイソ酪酸（２−アミノイソ酪酸）
ＡｃＯＨ：酢酸
Ａｄｏ：８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸
ＡＰＩ：活性医薬品成分
ＡＵＣ：曲線下面積
ＢＧ：血糖
ＢＨＫ：ベビーハムスター腎臓細胞
ＢＷ：体重
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
Ｂｚｌ：ベンジル
ＣＡＳ：化学情報検索サービス機関
Ｃｌｔ：２−クロロトリチル
コリジン：２，４，６−トリメチルピリジン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
Ｄｄｅ：１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル
ＤｅｓＨ：ｄｅｓ−アミノヒスチジン（イミダゾプロピオン酸または３−（イミダゾール−５−ｙｌ）プロパン酸）、Ｉｍｐ）
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）
ＤｏｏＡｓｕｃ：８−アミノ−３，６−ジオキサオクチルスクナミン酸
ＤＴＴ：１，４−ジチオスレイトール
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＦ：上皮成長因子様
ＥＧＦ（Ａ）：上皮成長因子様ドメインＡ
ＥＧＴＡ：エチレングリコールテトラ酢酸
ＦＣＳ：ウシ胎児血清
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＡＴＵ：（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）
ＨＢＴＵ：（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）
ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
ＨＦＩＰ：１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール
ＨＯＡＴ：１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ｈＰＣＳＫ９：ヒトＰＣＳＫ９
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン
ＩＢＭＸ：３−イソブチル−１−メチルキサンチン
ＩＣ５０：５０％阻害濃度
Ｉｍｐ：イミダゾプロピオン酸または３−（イミダゾール−５−イル）プロパン酸）（ｄｅｓ−アミノヒスチジン（ＤｅｓＨ）とも呼ばれる）
Ｉｎｐ：イソニペコチン酸
ｉ．ｖ．：静脈内
ｉｖＤｄｅ：１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル
ＩＶＧＴＴ：静脈内ブドウ糖負荷試験
ＬＣＭＳ：液体クロマトグラフィー質量分析
ＬＤＬ−ＲまたはＬＤＬｒ：ＬＤＬ受容体
ＬＤＬ：低密度リポタンパク質
ＬＤＬ−Ｃ：ＬＤＬコレステロール
ＬＹＤ：ランドレース種／大ヨークシャー種／デュロック種豚
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを参照
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間質量分析計
ＭｅＯＨ：メタノール
Ｍｍｔ：４−メトキシトリチル
ＭＲＴ：平均滞留時間
Ｍｔｔ：４−メチルトリチル
ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン
ＮＤ：未決定
ＯＢｚ：ベンゾイルエステル
ＯＥＧ：８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（Ａｄｏとも呼ばれる）
ＯＰｆｐ：ペンタフルオロフェノキシ
ＯＰｎｐ：パラ−ニトロフェノキシ
ＯＳｕ：Ｏ−スクシンイミジルエステル（ヒドロキシスクリンイミドエステル）
ＯｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチルエステル
Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ（登録商標）：シアノ−ヒドロキシイミノ−酢酸エチルエステル
Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＤ：薬力学
Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ：ペニシリン／ストレプトマイシン
ＰＫ：薬物動態
ＱＣ：品質管理
ＲＰ：逆位相
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆位相高性能液体クロマトグラフィー
ＲＴ：室温
Ｒｔ：保持時間
ｓ．ｃ．：皮下
ＳＤ：標準偏差
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ：サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー
ＳＥＭ：標準誤差
ＳＰＡ：シンチレーション近接アッセイ
ＳＰＰＳ：固相ペプチド合成
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ．ブチル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＩＳまたはＴＩＰＳ：トリイソプロピルシラン
Ｔｏｓ：トシラート（またはパラ−トルエンスルホニル）
ＴｏｔａＧｌｙｃ：１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカルジグリコラミン酸
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、または２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール
Ｔｒｔ：トリフェニルメチル（トリチル）
Ｔｒｘ：トラネキサム酸
ＴｔｄＳｕｃ：１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカルスクナミン酸
ＵＰＬＣ：超高速液体クロマトグラフィー
【０４４７】
〈特殊材料〉
エイコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル
ドコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル
４−（１０−カルボキシデシルオキシ）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸
Ｆｍｏｃ−トラネキサム酸
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ
Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ
【０４４８】
エイコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ドコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、および４−（１０−カルボキシデシルオキシ）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの調製は、下記のセクション２に記載され、最後に述べる５つの材料は市販されている。
【０４４９】
《方法》
このセクションは３部構成であり、本発明の化合物の一般的な調製方法に関連するセクションＡと、本発明の多数の特定の化合物調製に関連するセクションＢと、多数の特定の化合物例の結果も含めた本発明の化合物の特性評価方法に関連するセクションＣとを含む。
【０４５０】
《Ａ１．調製の一般的な方法》
このセクションは、固相ペプチド合成方法（アミノ酸の脱保護方法、樹脂からペプチドを切断する方法、およびその精製方法を含むＳＰＰＳ法）、ならびに結果得られるペプチドを検出して特徴付ける方法（ＬＣＭＳ法およびＵＰＬＣ法）に関する。
【０４５１】
ペプチドの固相合成は、一部の場合において、２−Ｆｍｏｃ−オキシ−４−メトキシベンジル、または２，４，６−トリメトキシベンジルなど（これに限定されない）の酸性条件下で開裂されうる基とのジペプチドアミド結合上で保護されたジペプチドの使用によって改善されうる。セリンまたはスレオニンがペプチド中に存在する場合、疑似プロリンジペプチドを使用してもよい（例えば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから入手可能、Ｗ．Ｒ．Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９９），Ｊ．Ｐｅｐ．Ｓｃｉ．５，４０３も参照のこと）。使用されるＦｍｏｃ保護アミノ酸誘導体は、標準的に推奨される以下のものである：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、または、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨなどで、例えば、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、またはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから供給される。他に何も指定されていない場合は、アミノ酸の天然Ｌ形態が使用される。Ｎ末端アミノ酸は、アルファアミノ基（例えば、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、またはＮ末端にＨｉｓのあるペプチドではＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）でＢｏｃ保護されている。ＳＰＰＳを使用したモジュール型のアルブミン結合部分付着の場合には、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、Ｆｍｏｃ−トラネキサム酸酸、Ｆｍｏｃ−イソニペコチン酸、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕおよびヘキサデカン酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルなどを含むがこれらに限定されない適切に保護された構成ブロックが、例えば、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、またはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから供給される。エイコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ドコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、および４−（１０−カルボキシデシルオキシ）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルは、以下に記載するように調製することができる。以下に記載されるすべての作業は、４００−μｍｏｌまたは４５０−μｍｏｌの合成スケールで行われる。
【０４５２】
〈１．樹脂結合型保護ペプチドヒドラジドの合成〉
方法：ＳＰＰＳ＿Ｐ
樹脂負荷に比べて５倍多い（例えば、０．４９ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ−ヒドラゾノ−ピルビル−アミノメチルポリスチレン樹脂（ＰＹＶ１０００、ドイツ・マルクトレドヴィッツ市、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ95615））Ｆｍｏｃアミノ酸（３００ｍＭ、Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ（登録商標）を添加したＤＭＦ中３００ｍＭ）を用いて、４００μｍｏｌまたは４５０μｍｏｌスケールで、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国アリゾナ州ツーソン市85714）のＰｒｅｌｕｄｅまたはＳｙｍｐｈｏｎｙＸ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで、ＳＰＰＳ＿Ｐを実施する。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中２０％ピペリジン、または０．１Ｍ  Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ（登録商標）を添加したＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用して行う。結合は、ＤＭＦ中のアミノ酸／ＯＸＹＭＡ  Ｐｕｒｅ（登録商標）／ＤＩＣ／コリジンの割合を５：５：５：５として実施する。ＤＭＦ上部洗浄（９ｍＬの６サイクル）を、脱保護工程と結合工程の間で実施する。結合時間は概して１２０分である。Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、またはＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを含むがこれに限定されない一部のアミノ酸は「二重結合」されるが、これは、第一の結合（例えば、６０分）の後、樹脂が排出され、試薬がさらに加えられ（アミノ酸、Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ（登録商標）、ＤＩＣ、およびコリジン）、混合物の反応を再び許容する（例えば、６０分）ことを意味する。
【０４５３】
〈２．樹脂結合型保護ペプチドヒドラジドの合成〉
ＳＰＰＳ＿Ｐを、同じ結合手順を使用し、低負荷Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｗａｎｇ（０．３２ｍｍｏｌ／ｇ）樹脂を使用して上述のように実施する。
【０４５４】
〈３．アルブミン結合剤の合成〉
エイコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルは、例えば、国際公開第２０１０／１０２８８６号に記載されるように当該技術分野で周知のとおりに調製できる。
【０４５５】
ドコサン二酸モノｔｅｒｔ−ブチルエステルは、例えば、国際公開第２０１５／０００９４２号に記載されるように当該技術分野で周知のとおりに調製できる。
【０４５６】
４−（１０−カルボキシデシルオキシ）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルは、例えば、国際公開第２００６／０８２２０４号に記載されるように当該技術分野で周知のとおりに調製できる。
【０４５７】
〈４．樹脂結合型保護ペプチドバックボーンへの側鎖の付着〉
リジンの側鎖にアシル化が存在する場合、アシル化されるリジンのεアミノ基はＭｔｔで保護される。Ｍｔｔの除去は、ヘキサフルオロイソプロパノール／ＤＣＭ（７５：２５、３×１０ｍＬ、それぞれ５分、２５分、および２５分）を用いて行い、その後、ＤＣＭ（４×１０ｍＬ）、ＤＭＦ（２ｘ９ｍＬ）、Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ（登録商標）０．１Ｍを添加したＤＭＦ中２０％ピペリジン（１×９ｍＬ）、ＤＭＦ（４×９ｍＬ）を用いて樹脂を洗浄する。延長部分および／またはリンカーは、樹脂結合ペプチドのアシル化によって、または保護されていないペプチドの溶液中でのアシル化によって、ペプチドに付着されうる（国際公開第２０１０／０２９１５９号に記載）。延長部分および／またはリンカーを保護されたペプチジル樹脂に付着する場合、付着はＳＰＰＳおよび適切に保護された構成ブロックを使用したモジュールでもよい。
方法：ＳＣ＿Ｐ
【０４５８】
Ｎ−ε−リジン保護基は上述のように除去され、リジンの化学修飾は、適切に保護された構成ブロックを使用して、ＰｒｅｌｕｄｅまたはＳｙｍｐｈｏｎｙＸペプチド合成装置上で１つ以上の自動化工程によって上述のように実施される。ＳＰＰＳ＿Ｐに記載するように、二重結合は結合あたり１時間、または一重結合は結合あたり２時間で実施される。
〈５．付着された側鎖がある場合／ない場合の樹脂結合ペプチドの切断および精製〉
方法：ＣＰ＿Ｍ１
【０４５９】
合成後、樹脂をＤＣＭで洗浄し、ＴＦＡ／ＴＩＳ／水／ＤＴＴ（９２．５／２．５／２．５／２．５または９０／５／２．５／２．５）を用いて２〜３時間処理してペプチドを樹脂から切断し、その後ジエチルエーテルで析出する。ペプチドを適切な溶媒（例えば、水／アセトニトリル）に溶解し、Ｃ１８、５μｍカラム上で、標準ＲＰ−ＨＰＬＣによってアセトニトリル／水／ＴＦＡを用いて精製する。ＵＰＬＣおよびＬＣＭＳを組み合わせた方法で画分を分析し、適切な画分をプールし冷凍乾燥する。
【０４６０】
望ましい場合は、当該技術分野で周知の方法を使用して、ペプチドの対イオンをナトリウムと交換することができる。一例として、５グラムのＳｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８カラムを５０ｍＬの２−プロパノール、５０ｍＬのアセトニトリル、５０ｍＬの水で洗浄する。２１ｍＬ、５０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中のおよそ７０ｍｇタンパク質溶液をＳｅｐ−ｐａｋカラムにロードし、これを５０ｍＬの水、５０ｍＬ、０．１Ｍ塩化ナトリウム（水溶液）および５０ｍＬ水で洗浄する。タンパク質のナトリウム塩を、１００ｍＬの水／アセトニトリル（３０：７０）で溶離させ、凍結乾燥させる。
【０４６１】
〈６．Ｃｙｓ−ペプチドによるペプチドヒドラジドの天然化学ライゲーションおよび精製〉
方法：ＮＣＬ＿Ｍ１
ペプチドヒドラジド（１．０当量）を０．２Ｍリン酸二ナトリウム／６．０Ｍグアニジン塩酸塩（水溶液、ｐＨ３．０）に溶解して最終濃度４．０ｍＭを得て、−１０℃に冷却する。亜硝酸ナトリウム（０．２Ｍ水中、５当量）を加え、−１０℃で２０分間攪拌する。０．２Ｍリン酸二ナトリウム／６．０Ｍグアニジン塩酸塩（ｐＨは７．０に調整）中０．２Ｍの４−メルカプトフェニル酢酸（５０当量）溶液をこの溶液に加え、その後、Ｃｙｓ−ペプチド（１．１当量）を加える。水酸化ナトリウム（１．０Ｍ、水溶液）で溶液のｐＨを６．７に調整し、混合物を２５℃で１６時間攪拌する。反応混合物に１，４−ジチオスレイトール（１００当量）を加え、濃塩酸（水溶液）でｐＨを３．０に調整する前に３０分間攪拌する。反応混合物は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国マサチューセッツ州ビレリカ市）のＵｌｔｒａｃｅｌ−３膜を用い、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニットを使用して、限外ろ過によって濃縮する。濃縮液を０．０５Ｍリン酸二ナトリウム／６．０Ｍグアニジン塩酸塩（水溶液、ｐＨ３．０）で希釈し、再び限外ろ過により濃縮する。４−メルカプトフェニル酢酸の濃度が０．１ｍＭ未満（＞１０００倍の希釈に相当）となるまでこれを繰り返す。濃縮液を５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、５ｍＭ塩化カルシウム、３ｍＭシステイン、０．３ｍＭシスチン、（水溶液、ｐＨ８．２）の攪拌液に滴下して加え、結果としておよそ０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。溶液を２５℃で１６時間攪拌する。折り畳み混合物のｐＨは、アセトニトリル／水／ＴＦＡを使用してＣ１８、５μｍカラム上で標準ＲＰ−ＨＰＬＣで精製される前に、濃塩酸（水溶液）でおよそ３に調整する。ＵＰＬＣおよびＬＣＭＳを組み合わせた方法で画分を分析し、適切な画分をプールし冷凍乾燥する。
【０４６２】
〈７．融合タンパク質の組換発現〉
対象の融合タンパク質を、適切な宿主を使用して異種発現によって提供する。発現プラスミドは周知の技術を使用して構築され、当業者に周知の方法によって融合タンパク質を発現・精製する。短細胞を採取し、細胞粉砕器によって、ｐＨ７で１Ｘ  ＰＢＳ緩衝液中で溶解する。融合タンパク質を含む不溶性画分を収集し、同じ緩衝液（６，０００ｇ／２０分）で２回洗浄する。次いで２０ｍＭエタノールアミン、２Ｍ尿素、ｐＨ１０．５を使用して、室温（２２〜２６℃）で封入体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度に可溶化する。１時間後、溶液を脱塩水により３回希釈し、ｐＨを８．５に調整する。エンテロキナーゼ切断を、１：１，０００の比で、同じ温度で２０時間実施する。その後、リフォールディングのために最終濃度１０ｍＭのＣａｃｌ２および５ｍＭシステインを加える。ｐＨを３．０に調整した後、タンパク質をＳＰ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗセファロースから捕捉する。捕捉された試料を、ｐＨ７．５で逆相ＦｅＦカラムに供する。最終研磨工程として、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｑカラム（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＣａｃｌ２、ｐＨ９．０）を選択した。
【０４６３】
〈８．組み換え型タンパク質におけるタンパク質を構成しないアミノ酸の組み込み〉
Ｎ末端Ｈｉｓ−Ａｉｂジペプチドを、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−ＯＨ溶液中でアシル化により導入し、次いでＦｍｏｃ保護基によって除去することができる（国際公開第２０１３／０９８１９１号に記載）。
【０４６４】
《Ａ２．検出および特性評価のための一般的方法》
〈１．ＬＣ−ＭＳ法〉
【０４６５】
方法：ＬＣＭＳ０１
Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムおよびＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）から構成される装置において、ＬＣＭＳ０１を実施する。溶離液：Ａ：水中０．１％ギ酸、Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸。分析は、ＡおよびＢのグラジエントで溶出されたカラムに適切な量（２〜１０μＬが好ましい）の試料を注入することによって室温にて実施する。ＵＰＬＣの条件、検出器の設定、質量分析計の設定は以下のとおりである。カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ、Ｃ−１８、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ。グラジエント：０．４ｍＬ／分での４．０分（あるいは８．０分）間での直線的な５％〜９５％アセトニトリル。検出：２１４ｎｍ（ＴＵＶ（チューナブルＵＶ検出器）からのアナログ出力）、ＭＳイオン化モード：ＡＰＩ−ＥＳ。スキャン：１００〜２０００ａｍｕ（代替的に５００〜２０００ａｍｕ）、ステップ０．１ａｍｕ。
【０４６６】
方法：ＬＣＭＳ３４
Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムおよびＸｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ質量分析計からなる装置において、ＬＣＭＳ３４を実施する。溶離液：Ａ：水中０．１％ギ酸、Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸。分析は、ＡおよびＢのグラジエントで溶出されたカラムに適切な量（２〜１０μＬが好ましい）の試料を注入することによって、室温で実施する。ＵＰＬＣの条件、検出器の設定、質量分析計の設定は以下のとおりである。カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ、Ｃ−１８、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ。グラジエント：０．４ｍＬ／分での４．０分（あるいは８．０分）間での直線的な５％〜９５％アセトニトリル。検出：２１４ｎｍ（ＴＵＶ（チューナブルＵＶ検出器）からのアナログ出力）、ＭＳイオン化モード：ＡＰＩ−ＥＳ。スキャン：１００〜２０００ａｍｕ（代替的に５００〜２０００ａｍｕ）、ステップ０．１ａｍｕ。
方法：ＬＣＭＳ２７
【０４６７】
Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  ＩｎｆｉｎｉｔｙシリーズおよびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＬＣ／ＭＳＤ  ＴＯＦ  ６２３０（Ｇ６２３０Ａ）検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｊｅｔ  Ｓｔｒｅａｍソースイオン化を併用）からなる装置において、ＬＣＭＳ２７を実施する。溶離液：Ａ：水中０．０２％ＴＦＡ、Ｂ：アセトニトリル中０．０２％ＴＦＡ。分析は、ＡおよびＢのグラジエントで溶出されたカラムに適切な量（２〜１０μＬが好ましい）の試料を注入することによって、室温で実施する。ＵＰＬＣの条件、検出器の設定、質量分析計の設定は以下のとおりである。カラム：Ａｅｒｉｓ  Ｗｉｄｅｐｏｒｅ、Ｃ−１８、３．６μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ。グラジエント：０．４ｍＬ／分での４．０分間での直線的な５％〜９５％アセトニトリル。検出：２１４ｎｍ（ＴＵＶ（チューナブルＵＶ検出器）からのアナログ出力）。スキャン：１００〜３２００ａｍｕ。
【０４６８】
〈２．ＵＰＬＣ法〉
方法：ＵＰＬＣ０１
デュアルバンド検出器を取り付けたＷａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣシステムを使用してＲＰ分析を実施する。ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ１３０、Ｃ１８、１３０オングストローム、１．７ｕｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍカラムを用いて、４０℃で、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍでのＵＶ検出値を収集する。ＵＰＬＣシステムを、Ａ：９９．９５％Ｈ２Ｏ、０．０５％ＴＦＡおよびＢ：９９．９５％ＣＨ３ＣＮ、０．０５％ＴＦＡを含む２つの溶離液貯蔵部Ａ、Ｂに接続する。以下の線形グラジエントを使用する：流量０．４０ｍＬ／分で、１６分にわたり、Ａ９５％、Ｂ５％からＡ４０％、Ｂ６０％。
【０４６９】
方法：ＵＰＬＣ０２
デュアルバンド検出器を取り付けたＷａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣシステムを使用してＲＰ分析を実施する。ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ１３０、Ｃ１８、１３０オングストローム、１．７ｕｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍカラムを用いて、４０℃で、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍでのＵＶ検出値を収集する。ＵＰＬＣシステムを、Ａ：９９．９５％Ｈ２Ｏ、０．０５％ＴＦＡおよびＢ：９９．９５％ＣＨ３ＣＮ、０．０５％ＴＦＡを含む２つの溶離液貯蔵部Ａ、Ｂに接続する。以下の線形グラジエントを使用する：流量０．４０ｍＬ／分で、１６分にわたり、Ａ９５％、Ｂ５％からＡ5％、Ｂ95％。
【０４７０】
《Ａ３．選択された中間体の特性評価》
ペプチドヒドラジド：
【化２２】
2020528049.tif 000054
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有する［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ］ＥＧＦ（Ａ）（２９３−３０３）ヒドラジド。
【０４７１】
調製方法：ＳＰＰＳ＿Ｐ、ＣＰ＿Ｍ１
ＬＣＭＳ３４：ｍ／３＝１９７０．３、ｍ／４＝１４７８．０、ｍ／５＝１１８２．６
ＵＰＬＣ０２：Ｒｔ＝９．３分
【０４７２】
Ｃｙｓ−ペプチド：
【化２３】
2020528049.tif 000055
［３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）（３０４−３３２）
【０４７３】
調製方法：ＳＰＰＳ＿Ｐ、ＣＰ＿Ｍ１
ＬＣＭＳ０１：ｍ／３＝１１１９．８、ｍ／４＝８４０．１、ｍ／５＝６７２．３
ＵＰＬＣ０２：Ｒｔ＝８．４分
【０４７４】
《Ｂ１．特定の化合物−ＥＧＦ（Ａ）類似体および誘導体》
〈ＥＧＦ（Ａ）類似体および誘導体の概要表（ＥＧＦ（Ａ）化合物１〜１５９）〉
【表１０】
2020528049.tif 000056
【表１０−１】
2020528049.tif 000057
【表１０−２】
2020528049.tif 000058
【表１０−３】
2020528049.tif 000059
【表１０−４】
2020528049.tif 000060
【表１０−５】
2020528049.tif 000061
【表１０−６】
2020528049.tif 000062
【表１０−７】
2020528049.tif 000063
【表１０−８】
2020528049.tif 000064
【表１０−９】
2020528049.tif 000065
【表１０−１０】
2020528049.tif 000066
【表１０−１１】
2020528049.tif 000067
【表１０−１２】
2020528049.tif 000068
【０４７５】
《Ｂ２．特定の化合物−ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物》
上述のように、化合物の調製を実施した。化合物の同一性は、本明細書の他の箇所に記載する各要素のアミノ酸の配列、置換基、および１つまたは２つの置換基の特定の付着点を参照することにより提供される。以下に一例を示し、概要表を以下に提供する。
【０４７６】
〈ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１〉
【化２４】
2020528049.tif 000069
【０４７７】
次のように記載することもできる：
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１
【化２４−１】
2020528049.tif 000070
を有するもの、
または
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）であって、（［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号１９３であって、配列番号１９３の位置２０のリジン（Ｋ）（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１を有するもの（［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋに等しい）。
【０４７８】
〈ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃２３〉
【化２５】
2020528049.tif 000071
【０４７９】
次のように記載することもできる：
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃６
【化２５−１】
2020528049.tif 000072
を有するもの、
または
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃６（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号１９３であって、配列番号１９３の位置２０のリジン（Ｋ）を介して付着された置換基＃６を有するもの。
【０４８０】
〈ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１〉
【化２６】
2020528049.tif 000073
【０４８１】
次のように記載することもできる：
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１の２６Ｋ（のイプシロン窒素）および［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３３３Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）の３３３Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１
【化２６−１】
2020528049.tif 000074
を有するもの、
または
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３３３Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１の２６Ｋ（のイプシロン窒素）および［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３３３Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）の３３３Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号１９０であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１の２６Ｋ（のイプシロン窒素）および［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３３３ＫＥＧＦ（Ａ）］の３３３Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号１９０であって、位置２０および８０のＬｙｓを介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの。
【０４８２】
〈ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４２〉
【化２７】
2020528049.tif 000075
【０４８３】
次のように記載することができる：
［８Ａｂ、２６Ｒ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３１３Ｋ、３２１Ｋ置換基＃１３のあるＥＧＦ（Ａ）［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３１３Ｋ、３２１Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）の３１３Ｋおよび３２１Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１３
【化２７−１】
2020528049.tif 000076
を有するもの、
または
［８Ａｉｂ、２６Ｒ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３１３Ｋ、３２１Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）であって、［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３１３Ｋ、３２１Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）の３１３Ｋおよび３２１Ｋ（の（イプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１３（４−ＣＯＯＨ−ＰｈＯ−Ｃ１１−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号３８０であって、［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３１３Ｋ、３２１Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）の３１３Ｋおよび３２１Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１３（４−ＣＯＯＨ−ＰｈＯ−Ｃ１１−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号３８０であって、配列番号３８０の位置６０および６８のＬｙｓを介して付着された置換基＃１３を有するもの。
【０４８４】
〈ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃７５〉
【化２８】
2020528049.tif 000077
【０４８５】
次のように記載することもできる：
［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１
【化２８−１】
2020528049.tif 000078
を有するもの、
または
［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）であって、（［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号３８６であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号３８６であって、配列番号３８６（７−３７）の位置６８のＬｙｓを介して付着された置換基＃１を有するもの。
【０４８６】
さらなる化合物の同一性は、本明細書の他の箇所に記載する各要素のアミノ酸の配列、置換基、および１つまたは２つの置換基の特定の付着点を参照することにより提供される。
【０４８７】
〈ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む誘導体（ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物）の概要表〉
置換基の付着は、それぞれＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を参照することにより示される。上述のように、２６ＫはＧＬＰ−１（７−３７）配列における位置２０に等しく、ＥＧＦ（Ａ）類似体の３２４Ｋは、ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインにおける位置３２のアミノ置換である。その他の付着点の特定の位置を、類似の方法で推定することができる。ペプチドバックボーンに関連した置換基の特定の位置は、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体のスペーサーの長さおよび可能な切断に左右される。
〈Ｃ末端にＥＧＦ（Ａ）類似体を有する化合物〉
【表１１】
2020528049.tif 000079
【表１１−１】
2020528049.tif 000080
【表１１−２】
2020528049.tif 000081
【表１１−３】
2020528049.tif 000082
【表１１−４】
2020528049.tif 000083
【表１１−５】
2020528049.tif 000084
【表１１−６】
2020528049.tif 000085
【表１１−７】
2020528049.tif 000086
【表１１−８】
2020528049.tif 000087
【表１１−９】
2020528049.tif 000088
【表１１−１０】
2020528049.tif 000089
【表１１−１１】
2020528049.tif 000090
【表１１−１２】
2020528049.tif 000091
【表１１−１３】
2020528049.tif 000092
【表１１−１４】
2020528049.tif 000093
【表１１−１５】
2020528049.tif 000094
【表１１−１６】
2020528049.tif 000095
【表１１−１７】
2020528049.tif 000096
【表１１−１８】
2020528049.tif 000097
〈Ｎ末端にＥＧＦ（Ａ）類似体を有する化合物〉
【表１２】
2020528049.tif 000098
【０４８８】
化合物の選択のための分析データを以下の表に提供する。
〈ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物に関する分析データを含む表〉
【表１３】
2020528049.tif 000099
【表１３−１】
2020528049.tif 000100
【表１３−２】
2020528049.tif 000101
【表１３−３】
2020528049.tif 000102
【表１３−４】
2020528049.tif 000103
【表１３−５】
2020528049.tif 000104
【表１３−６】
2020528049.tif 000105
【表１３−７】
2020528049.tif 000106
【表１３−８】
2020528049.tif 000107
【表１３−９】
2020528049.tif 000108
【表１３−１０】
2020528049.tif 000109
【表１３−１１】
2020528049.tif 000110
【０４８９】
《Ｃ．特性評価の一般的な方法》
化合物の特性評価を行うため、様々なアッセイで機能性を試験することができる。
〈Ｃ１−ＧＬＰ−１  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ効力〉
【０４９０】
このアッセイの目的は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＧＬＰ−１類似体を含む誘導体などの化合物のＧＬＰ−１活性（または効力）を試験することである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力は、全細胞アッセイにおけるヒトＧＬＰ−１受容体活性化の尺度である。
【０４９１】
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物の誘導体の効力は、以下に記載するように決定し、ＧＬＰ−１（７−３７）およびセマグルチドのデータを比較のために含めた。
【０４９２】
〈原則〉
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力は、レポーター遺伝子アッセイにおけるヒトＧＬＰ−１受容体の応答を測定することによって決定される。アッセイは、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現し、ホタルルシフェラーゼ（ＣＲＥルシフェラーゼ）のためのプロモーターと遺伝子に結合されたｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）のＤＮＡを含む、ＢＨＫ安定発現細胞株で実施する。ヒトＧＬＰ−１受容体が活性化されるとｃＡＭＰの産生が生じ、これによりルシフェラーゼタンパク質が発現される。アッセイの培養が完了したらルシフェラーゼ基質（ルシフェリン）を加え、酵素がルシフェリンをオキシルアルシフェリンに変換して生物発光を生成する。発光をアッセイの読取値として測定する。
【０４９３】
〈細胞培養および調製〉
このアッセイで使用される細胞（クローンＦＣＷ４６７−１２Ａ／ＫＺ１０−１）は、ＢＨＫＴＳ１３を親細胞株とするＢＨＫ細胞である。細胞は、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現するクローン（ＦＣＷ４６７−１２Ａ）から由来し、現在のクローンを得るためのＣＲＥルシフェラーゼによるさらなる発現によって確立される。
【０４９４】
細胞は細胞培養培地中の５％ＣＯ２で培養される。これらは分離され、液体窒素に保存される。各アッセイ前に、アリコートを取り出しＰＢＳ中で２回洗浄してから、アッセイ固有の緩衝液中で所望の濃度で懸濁する。９６ウェルプレートについて、最終濃度が５×１０３細胞／ウェルとなるように懸濁液を作成する。
【０４９５】
〈材料〉
以下の化学物質をアッセイで使用する：プルロニックＦ−６８（１０％）（Ｇｉｂｃｏ２４０４）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ａ９５１１）、オボアルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａ５５０３）、フェノールレッドなしのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ１１８８０−０２８）、１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ１５６３０）、Ｇｌｕｔａｍａｘ１００ｘ（Ｇｉｂｃｏ３５０５０）およびｓｔｅａｄｙｌｉｔｅ  ｐｌｕｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ６０１６７５７）。
【０４９６】
〈緩衝液〉
細胞培養培地は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１６１４０−０７１）、１ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１５１４０−１２２）、２４０ｎＭ  ＭＴＸ（メトトレキサート、Ｓｉｇｍａ  Ｍ９９２９）および１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１５１４０−１２２）を有するＤＭＥＭ培地である。
【０４９７】
アッセイ培地は、フェノールレッドなし、１０ｍＭのＨｅｐｅｓおよび１×ＧｌｕｔａｍａｘのＤＭＥＭである。アッセイ緩衝液は、アッセイ培地中の２％オボアルブミンおよび０．２％プルロニックＦ−６８から構成された。
【０４９８】
〈手順〉
１）細胞ストックを３７℃の水槽で解凍する。
２）細胞をＰＢＳで３回洗浄する。
３）細胞を計数し、アッセイ培地で５×１０３細胞／５０μＬ（１×１０５細胞／ｍＬ）に調整する。細胞の５０μＬアリコートを、アッセイプレート内の各ウェルに移す。
４）試験化合物および基準化合物のストックを、アッセイ緩衝液中で０．２μＭの濃度に希釈する。化合物を１０倍希釈して以下の濃度を得る：２×１０−７Ｍ、２×１０−８Ｍ、２×１０−９Ｍ、２×１０−１０Ｍ、２×１０−１１Ｍ、２×１０−１２Ｍ、２×１０−１３Ｍ、および２×１０−１４Ｍ。
５）化合物またはブランクの５０μＬアリコートを、希釈プレートからアッセイプレートに移す。化合物を以下の最終濃度で試験する：１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍ、１×１０−１４Ｍ。
６）アッセイプレートを、５％ＣＯ２インキュベーターで３時間、３７℃で培養する。
７）アッセイプレートをインキュベーターから取り外し、室温で１５分間留置する。
８）ｓｔｅａｄｙｌｉｔｅ  ｐｌｕｓ試薬の１００μＬアリコートをアッセイプレートの各ウェルに加える（試薬は光感応性である）。
９）各アッセイプレートをアルミ箔で覆って光から保護し、室温で３０分間振動する。
１０）各アッセイプレートを、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ計器で読み取る。
【０４９９】
〈計算と結果〉
上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイを、ＨＳＡを含む／含まない一連の化合物で実施した。ＴｏｐＣｏｕｎｔ計器からのデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアに転送される。ソフトウェアは、非線形回帰（ｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）ｖｓ反応）分析を実施する。ソフトウェアによって計算しｐＭ単位で報告したＥＣ５０値を以下の表１に示す。
【０５００】
各試料について、最低限でも２つの複製を測定した。報告された値は複製の平均である。
表１：ＧＬＰ−Ｉ／ＥＧＦ（Ａ）化合物（すなわち、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む誘導体）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力
【表１４】
2020528049.tif 000111
【表１４−１】
2020528049.tif 000112
【表１４−２】
2020528049.tif 000113
【表１４−３】
2020528049.tif 000114
【表１４−４】
2020528049.tif 000115
【表１４−５】
2020528049.tif 000116
【０５０１】
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物の大部分はＧＬＰ−１活性を示す。特定の効力（ＨＳＡがある／ない場合の両方）は、類似体におけるアミノ酸の変動およびスペーサーの同一性、ならびに置換基に影響を受ける。上記のデータは、ＧＬＰ−１（７−３７）およびセマグルチドと比較して同等または低減された効力を有する化合物を得られることを示す。
【０５０２】
さらに、ＥＧＦ（Ａ）類似体が、ＧＬＰ−１類似体のＣ末端（化合物１、配列番号１９３）の代わりにＧＬＰ−１類似体のＮ末端（化合物７５、配列番号３８６）に付着される場合は、ＧＬＰ−１効力の著しい損失が観察される。
【０５０３】
〈Ｃ２−ＧＬＰ−１−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受容体結合〉
この例の目的は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＬＰ−１誘導体の受容体結合を試験することである。受容体結合は、誘導体のヒトＧＬＰ−１受容体に対する親和性の尺度である。
【０５０４】
〈原則〉
ヒトＧＬＰ−１受容体に対する受容体結合は、競合結合アッセイで測定される。このタイプのアッセイでは、標識リガンド（この場合は１２５Ｉ−ＧＬＰ−１）が受容体に結合される。ヒトＧＬＰ−１受容体を含む単離膜に対して一連の濃度での各誘導体／化合物を加え、標識リガンドの変位をモニターする。受容体結合は、標識リガンドの５０％が受容体から変位する濃度として報告される（ＩＣ５０値）。ＧＬＰ−１（７−３７）およびセマグルチドを、比較化合物として含む。
【０５０５】
〈材料〉
以下の化学物質をアッセイで使用する：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ａ１６５３）、ＤＭＥＭフェノールレッドなし（Ｇｉｂｃｏ１１８８０−０２８）、Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１５１４０−１２２）、Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１０１３１−０２７）、１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ１５６３０）、ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５５７５−０３８）、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１４１９０−０９４）、ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１６１４０−０７１）、ＥＧＴＡ、ＭｇＣｌ２（Ｍｅｒｃｋ  １．０５８３２．１０００）、Ｔｗｅｅｎ２０（Ａｍｒｅｓｃｏ０８５０Ｃ３３５）、ＳＰＡ粒子（小麦胚細胞凝集素（ＷＧＡ）ＳＰＡビーズ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＲＰＮＱ０００１）、［１２５Ｉ］−ＧＬＰ−１］−（７−３６）ＮＨ２（社内生産）、ＯｐｔｉＰｌａｔｅＴＭ−９６（Ｐａｃｋａｒｄ６００５２９０）。
【０５０６】
緩衝液１は、２０ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ＋１０ｍＭのＥＤＴＡからなり、ｐＨは７．４に調整される。緩衝液２は、２０ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ＋０．１ｍＭのＥＤＴＡからなり、ｐＨは７．４に調整される。アッセイ緩衝液は、５ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０で補充された５０ｍＭのＨＥＰＥＳからなり、ｐＨは７．４に調整される。８％アルブミン株は、アッセイ緩衝液中に８％（ｗ／ｖ）で溶解したＨＳＡからなる。０．０２％アルブミン株は、アッセイ緩衝液中で０．０２％（ｗ／ｖ）で溶解されたＨＳＡからなる。
【０５０７】
〈細胞培養および膜の調製〉
このアッセイで使用される細胞（クローンＦＣＷ４６７−１２Ａ）は、ＢＨＫＴＳ１３を親細胞株とするＢＨＫ細胞である。細胞はヒトＧＬＰ−１受容体を発現する。
【０５０８】
細胞をＤＭＥＭ中５％ＣＯ２、１０％ウシ胎児血清、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン）および１．０ｍｇ／ｍＬの選択マーカーＧ４１８で培養する。膜を調製するために、細胞を約８０％コンフルエントまで増殖させる。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、採取する。短時間の遠心分離を使用して細胞をペレット化し、細胞ペレットを氷上で保存する。適切な量の緩衝液１（例えば、１０ｍＬ）中で２０〜３０秒間、ＵＬＴＲＡ−ＴＨＵＲＲＡＸ（商標）分散機で細胞ペレットを均質化する。ホモジネートを１５分間遠心分離する。ペレットを１０ｍＬ緩衝液２中で再懸濁し（均質化）、遠心分離する。この工程をもう一度繰り返す。結果得られたペレットを緩衝液２中で再懸濁し、タンパク質濃度を決定する。膜をアリコート化し、−８０℃で保存する。
【０５０９】
〈手順〉
１）低ＨＳＡ（０．００５％）の存在下での受容体結合アッセイについては、アッセイプレートの各ウェルにアッセイ緩衝液５０μＬを加える。
２）試験化合物は連続希釈して以下の濃度を得る：８×１０−７Ｍ、８×１０−８Ｍ、８×１０−９Ｍ、８×１０−１０Ｍ、８×１０−１１Ｍ、８×１０−１２Ｍ、８×１０−１３Ｍ。アッセイプレートの適切なウェルに２５μＬを加える。
３）細胞膜アリコートを解凍し、作業濃度に希釈する。アッセイプレートの各ウェルに５０μＬを加える。
４）ＷＧＡ  ＳＰＡビーズを、２０ｍｇ／ｍＬでアッセイ緩衝液中に懸濁させる。懸濁液を、アッセイプレートに加える直前にアッセイ緩衝液中で１０ｍｇ／ｍＬに希釈する。アッセイプレートの各ウェルに５０μＬを加える。
５）［１２５Ｉ］−ＧＬＰ−１］−（７−３６）ＮＨ２の４８０ｐＭ溶液２５μＬをアッセイプレートのそれぞれのウェルに加えることで、培養を開始する。２５μＬアリコートを、総計数／ウェルの測定用に保存する。
６）アッセイプレートを３０℃で２時間培養する。
７）アッセイプレートを１０分間遠心分離する。
８）アッセイプレートを、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ計器で読み取る。
【０５１０】
〈計算〉
ＴｏｐＣｏｕｎｔ計器からのデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアに転送される。ソフトウェアは非線形回帰分析を実施した。ソフトウェアはＩＣ５０値を計算し、ｎＭ単位で報告する。
【０５１１】
〈結果〉
以下の結果が得られた：
表２：ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物のＧＬＰ−１受容体結合
【表１５】
2020528049.tif 000117
【表１５−１】
2020528049.tif 000118
【表１５−２】
2020528049.tif 000119
【０５１２】
上記のデータは、ＧＬＰ−１結合が特定の配列および置換基に依存し、ＧＬＰ−１（７−３７）またはセマグルチドに対して同等または低減された受容体結合を有する化合物を調製するために様々なレベルのＧＬＰ−１結合活性を得ることができることを示す。再び、ＥＧＦ（Ａ）類似体が、ＧＬＰ−１類似体のＣ末端（化合物１、配列番号１９３）の代わりに、ＧＬＰ−１類似体のＮ末端（化合物７５、配列番号３８６）に付着された場合は、ＧＬＰ−１結合の著しい損失が観察された。
【０５１３】
〈Ｃ３−ＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ結合−競合（ＥＬＩＳＡ）〉
このアッセイは、ＬＤＬ−Ｒと競合するＰＣＳＫ９への見掛けの結合親和性を測定する。特に、アッセイは、ＥＧＦ（Ａ）類似体、およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物、例えばＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物のＰＣＳＫ９への見掛けの結合親和性を評価するために使用される。
【０５１４】
アッセイを以下のように実施する。実験前日、組換えヒト低密度リポタンパク質受容体（ｒｈＬＤＬ−Ｒ；ＮＳＯ由来、Ｒ＆Ｄシステム＃２１４８−ＬＤ）をｐＨ９．６の５０ｍＭ炭酸ナトリウム中に１μｇ／ｍＬで溶解し、その後、１００μＬの溶液をアッセイプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６、ＮＵＮＣ＃４３９４５４）の各ウェルに添加し、４℃で一晩被覆する。実験当日に、ビオチン化ＰＣＳＫ９（０．５ｕｇ／ｍＬ、ＢｉｏＳｉｔｅ／ＢＰＳＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｃａｔ＃７１３０４）を含むＥＧＦ（Ａ）化合物の８点濃度曲線を複製で作成する。試験化合物およびビオチン化ＰＣＳＫ９混合物を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２（１５６３０−０５６、１００ｍＬ、１Ｍ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ（Ｅｍｓｕｒｅ１．０６４０４．１０００）、１％ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ１８８７−２５Ｇ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ６５５２０５）、２ｍＭのＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ２２３５０６−５００Ｇ）を含むアッセイ緩衝液中で調製し、室温で１時間培養する。次いで、被覆されたアッセイプレートを２００μＬアッセイ緩衝液中で４回洗浄し、次いで試験化合物とビオチン化ＰＣＳＫ９の混合物１００μＬをプレートに加え、室温で２時間培養する。プレートを２００μＬアッセイ緩衝液中で４回洗浄し、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（２５ｎｇ／ｍＬ、ＶＷＲ＃１４−３０−００）により室温で１時間培養する。５０μＬのＴＭＢ−ｏｎ（ＫＥＭ−ＥＮ−ＴＥＣ）を加え、暗所で１０分間培養することにより反応を検出する。その後、５０μＬ、４ＭのＨ３ＰＯ４を混合物に添加して反応を停止させ、添加は電子マルチピペットを用いて行う。次いで、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘにおいて４５０ｎｍおよび６２０ｎｍで１時間以内にプレートを読み取る。６２０ｎｍの読取値をバックグラウンド除去に使用する。非線形回帰ログ（阻害剤）ｖｓ．反応可変勾配（４つのパラメータ）によりＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてＩＣ５０値を算定し、以下の式を用いてＫｉ値に変換する：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（ビオチン−ＰＣＳＫ９）／（ｋｄ（ビオチン−ＰＣＳＫ９）））。式中、ビオチン−ＰＣＳＫ９のＫｄは１．０９６７２７７１４μｇ／ｍＬ、および［Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＣＳＫ９］＝０．５（μｇ／ｍＬ）である。
【０５１５】
結果を以下の表３．１〜表３．６に示す。Ｋｉ値が高いことはＰＣＳＫ９に対する見掛けの結合親和性が低いことを示し、その逆もしかりである。ＥＧＦ６６の測定値よりも大幅に高いＫｉ、例えば５００ｎＭを越える値を示す化合物は数少ないことが分かるが、これは観察された結合が特異的ではないことを示す。ペプチドのアミノ酸置換および／または１つ以上の側鎖誘導化はどちらも、ＬＤＬ−Ｒへの結合の損失に寄与する場合がある。一般的に、試験されたＥＧＦ（Ａ）化合物の多くが、ｈＬＤＬ−Ｒへの結合においてＰＣＳＫ９を阻害する能力を示した。
【０５１６】
〈ＰＣＳＫ９阻害剤〉
最初に、様々なアミノ酸置換を含むＥＧＦ（Ａ）類似体の群を上述のとおり試験した。結果を表３．１に示す。
〈表３．１−選択されたＥＧＦ（Ａ）類似体の見掛けの結合親和性（Ｋｉ）〉
【表１６】
2020528049.tif 000120
【０５１７】
国際公開第２０１２／１７７７４１号で最も効力の高いペプチド変異体として特定されたＥＧＦ６６（ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４８）は、５つの突然変異を有する。これらの突然変異のいくつかは、Ｃ３に記載したアッセイで決定されたＫｉ値にとって大きな重要性を持たないことが見出された。特に、位置３１０に野生型残基Ａｓｐ（Ｄ）を含む化合物は、３１０Ｋを有する化合物よりも高い効力を有することが見出された。また、重要なアミノ置換は３０１Ｌであり、好ましくは３０９Ｒと組み合わせた３０１Ｌであることが示された。最後に、３０７Ｉおよび２９９Ａは、ＥＧＦ（Ａ）類似体の親和性への寄与がわずかであった。
【０５１８】
〈置換基のＮ末端付着〉
その後の実験で、半減期延長部の付着、例えばペプチドへの置換基の付着が、Ｃ３で記載するアッセイにより決定されるＫｉに影響を与えるかどうかを試験した。本明細書に記載するように、異なる技術によって置換基を付着させることができ、最初はアシル化またはアルキル化によってペプチドのＮ末端アミノ酸の窒素原子に置換基を付着した。
【０５１９】
表３．２に示すように、試験された化合物すべてのＫｉ値は３．０ｎＭ未満であり、様々な延長部およびリンカー要素が良好な忍容性を有することが示唆される。ＧＬＰ−１などのペプチドで過去に観察されたように、効力は通常、側鎖の付着によってマイナスの影響を受けるため、この点は珍しい。
表３．２−Ｎ末端置換ＥＧＦ（Ａ）類似体の見掛けのＫｉ
【表１７】
2020528049.tif 000121
【０５２０】
〈置換基のＬｙｓ付着〉
置換基のＰＣＳＫ９阻害剤ペプチドへの結合について別の位置を評価するために、一連の化合物を調製した。ＥＧＦ（Ａ）化合物＃５８、２９および４を除き、様々な位置でのＬｙｓ置換との組み合わせで、３つのアミノ酸置換（Ｎ３０１Ｌ、Ｎ３０９ＲおよびＫ３１２Ｅ）を含むバックボーンペプチドを使用した。試験した化合物すべてが、通常はシステインジスルフィド架橋に関与する位置２９７、３０４、３０８、３１７、３１９、３３１に６つのシステインアミノ酸を含んでいた。野生型３１２Ｋへの付着が得られるＥＧＦ（Ａ）化合物＃４を除き、部位特異的な置換を確実にするために３１２Ｅを含めた。１つのＬｙｓによるペプチドの延長についても試験した（ＥＧＦ（Ａ）化合物＃７５および＃３）。Ｃ１８二酸延長部およびγＧｌｕ−２ｘＡｄｏリンカーを含め、上述に記載したのと同じ置換基をすべての化合物で使用し、アシル化を介して付着させた。結果を表３．３に記載する。
表３．３−Ｌｙｓ残基を介して付着された置換基を有するＥＧＦ（Ａ）類似体の見掛けのＫｉ
【表１８】
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【表１８−１】
2020528049.tif 000123
【０５２１】
分析は、ＰＣＳＫ９阻害剤ペプチドの大部分が機能性を維持することを示した。例外は、位置２９８、３０１、３０２、３０７のいずれかでのＬｙｓ置換および誘導であり、この場合は機能しないペプチドが生じた。また、位置２９６、２９９、３１５および３２０ＫでのＬｙｓの導入および置換は見掛けの親和性を低減させることも観察された。
【０５２２】
したがって、データは表３．１の結果も確認し、Ａｓｎ（Ｎ）３０１のＬｅｕ（Ｌ）へのアミノ酸置換が結合に必要不可欠なことを示す。
【０５２３】
位置２９５および３１０でのＬｙｓの導入および置換について、データは観察されなかった。上述のように、位置３１０でのＡｓｐの維持は３１０Ｋ置換よりも好ましいことが過去に見出された。以下に示すように、位置２９５でのＡｓｐ（Ｄ）の導入よって結合が停止することも見出された（ＥＧＦ（Ａ）の例では化合物７０）。
【０５２４】
要約すると、ＰＣＳＫ９ペプチドの位置２９５、２９８、３０２、３０７および３１０のいずれか、または位置２９５、２９６、２９８、２９９、３０２、３０７、３１０、３１５および３２０のいずれかに付着された置換基を含まない化合物は一般的に機能的であるという結論が下された。さらに、位置２９５、２９８、３０２、および３１０のいずれかでのアミノ酸置換は一般的に魅力的ではないという結論が導かれた。表３．１および３．２から、それでもＶ３０７Ｉ突然変異は、３０１Ｌｅｕと組み合わせた場合には許容可能または魅力的でさえあると考えられる。
【０５２５】
位置２９５、２９６、２９８、３０２、３１０のうちの１つでアミノ酸置換を有するペプチドは機能性がより低い可能性が高く、位置２９９、３１５および３２０での置換は機能性をわずかに低下させるとさらに考えられる。これは、他方では、Ｌｙｓ置換および側鎖の付着は大半の他のアミノ酸置換と同じ程度にペプチドに影響を与えることから、残りのアミノ酸残基に高いレベルの柔軟性が存在しうることも示唆する。
【０５２６】
〈２つの置換基を有するＰＣＳＫ９阻害剤〉
２つの置換基を有する一連の化合物を調製した。Ｎ末端またはＬｙｓ（Ｋ）残基でのアシル化、アルキル化、または組み合わせによって、二重置換を得ることができる。繰り返すが、Ｎ末端は、アミノ酸２９３Ｇまたは変異体アミノ酸残基、例えば２９２Ａ、２９３Ｇ、２９３Ｋおよび２９４Ｔ（２９３Ｇが欠失している場合）であってもよい。化合物を異なる置換基で調製したが、個別の化合物中の２つの置換基は同一である。本試験で使用されるバックボーンには再び、Ｎ３０９Ｒと組み合わせたＮ３０１Ｌアミノ酸置換、および特定のアシル化／アルキル化を得るために必要な様々なＮ末端および／またはＬｙｓ置換を含めた。
表３．４−二重置換ＥＧＦ（Ａ）類似体の見掛けのＫｉ
【表１９】
2020528049.tif 000124
【表１９−１】
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【表１９−２】
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【表１９−３】
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【表１９−４】
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【０５２７】
再び発明者らは、置換基は様々な位置および組み合わせで非常に良好な忍容性があると結論付けた。
【０５２８】
〈さらなるＥＧＦ（Ａ）誘導体〉
ＥＧＦ（Ａ）配列における様々なアミノ酸置換のさらなる役割を調べるために、表３．５に示すように、さらなる化合物を調製し試験した。すべての化合物は、アミノ酸置換または３３３Ｋによる延長によって導入されたＬｙｓ残基を介して付着された１つの置換基を含む。バックボーンペプチドはすべて、Ｎ３０１Ｌアミノ酸置換および任意選択的に１つ以上のＮ３０９ＲおよびＩ３１２Ｅを含む。置換基はすべて、１６〜２０の炭素原子を含む脂肪二酸と、γＧｌｕ単独またはＡｄｏ−Ａｄｏおよび／またはトラネキサム酸（Ｔｒｘ）部分により延長されたリンカーを含む。
表３．５−Ｌｙｓ残基を介して付着された置換基を有するさらなるＥＧＦ（Ａ）類似体の見掛けのＫｉ
【表２０】
2020528049.tif 000129
【表２０−１】
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【０５２９】
上記の表３．５における結果は、位置３１２の内部野生型リジンを、Ｇｌｕ（Ｅ）、およびＧｌｎ（Ｑ）、Ａｒｇ（Ｒ）またはＡｓｐ（Ｄ）で置換できることを示す。この変動に基づき、ペプチドの阻害機能を妨げることなく、広範囲のアミノ酸残基を位置３１２で忍容することができると考えられる。
【０５３０】
Ｇ２９３Ｎ、Ｔ２９４Ｇ、Ｄ２９９Ａ、Ｎ３００Ｈ、Ｈ３０６Ｙ、Ｈ３０６Ｄ、Ｎ３０９Ｓ、Ｑ３２４Ｇ、およびＲ３２９Ｈを含む他のいくつかのアミノ酸置換もまた忍容性が良好なことが証明されたが、上述のようにＮ２９５ＤおよびＮ３００Ｐは魅力のないアミノ置換である。
ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物のＰＣＳＫ９結合
【０５３１】
ＰＣＳＫ９結合機能をＧＬＰ−１受容体作動薬活性と組み合わせることができるかどうかをさらに探るために、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物を同じアッセイで試験し、結果を以下の表３．６に含めた。
表３．６−ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物の見掛けのＫｉ
【表２１】
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【表２１−１】
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【表２１−２】
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【０５３２】
データは、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物が、化合物のＥＧＦ（Ａ）類似体と関連付けられるＰＣＳＫ９結合活性を維持することを示す。データは、変動が非常にわずかであり、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体の配向がＰＣＳＫ９結合に影響を与えないことも示す。
【０５３３】
〈Ｃ４−ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ取り込みアッセイ〉
ＰＣＳＫ９ペプチドおよびその誘導体の阻害効力を決定するための別のアッセイは、ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬの取り込みを測定することである。
【０５３４】
アッセイの原則：
ＬＤＬ取り込みは主に内因性発現したｈＬＤＬＲによって媒介され、したがってＬＤＬ取り込み能力はＬＤＬＲ発現の間接的尺度といえる。ｈＬＤＬＲは、外因性ＰＣＳＫ９での培養によって用量依存的に下方制御することができる。したがって、ＰＣＳＫ９培養は、ＬＤＬ分子を取り込む細胞の能力を減少させる。次いで、ＬＤＬ取り込みのこの下方制御は、ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ結合を中和または阻害する化合物の添加によって拮抗させることができる。その結果、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９の存在下でＬＤＬ取り込みを増加させる能力、例えば、ＰＣＳＫ９媒介性ｈＬＤＬＲの下方制御に対抗できる能力に基づき特性評価することができる。
【０５３５】
アッセイは、１０％リポタンパク質欠損胎児ウシ血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｓ５３９４）で培養したＨｅｐＧ２細胞（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ＥＣＡＣＣ：Ａｃｃ  ｎｏ．８５０１１４３０）を使用して行い、ＢＯＤＩＰＹで蛍光標識したＬＤＬ粒子（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＢＶ＃Ｌ３４８３）を取り込む細胞の能力を測定する。
【０５３６】
アッセイプロトコル：
９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＶｉｅｗＰｌａｔｅ−９６  Ｂｌａｃｋ＃６０００５１８２）を、３７℃で１時間、インキュベーターで、ポリ−Ｄ−リジン（１０ｍｇ／Ｌ、ＰＢＳ  Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０−０９４に溶解したＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｐ６４０７）で被覆する。次いで、プレートを１００μＬ  ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０−０９４）中で２回洗浄する。ＥＧＦ（Ａ）化合物の８点濃度曲線に使用する試験組成物をすべて、アッセイ培地（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃３１９６６−０２１）、１０％リポタンパク質欠損胎児ウシ血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｓ５３９４）および１％Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ（Ｃａｍｂｒｅｘ＃ＤＥ１７−６０２Ｅ）で希釈したＰＣＳＫ９（１０μｇ／ｍＬ）を含むように調製し、５０μＬ／ウェルの量でプレートに添加した。
【０５３７】
３０〜６０分後、アッセイ培地で希釈した５０．０００ＨｅｐＧ２細胞（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ：ＥＣＡＣＣ：ＡＴＣＣ  ｎｏ．８５０１１４３０、ロット：１３Ｂ０２３）を、５０ｕｌ／ウェルの量でプレートに添加し、プレートをＣＯ２透過性プラスチックバッグ（Ａｎｔａｌｉｓ  Ｔｅａｍ、ＬＤＰＥバッグ１２０／３５×３００×０．０２５ｍｍ＃２８１６０４）中で２０時間（３７℃、５％ＣＯ２）培養する。その後プレートを空にし、その直後にアッセイ培地中濃度１０μｇ／ｍＬで５０μＬ  ＦＬ−ＬＤＬ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＢＶ＃Ｌ３４８３）を各ウェルに添加し、光から保護するために蓋部分の黒色カバーを使用して、ＣＯ２透過性プラスチックバッグで２時間（３７°Ｃ、５％ＣＯ２）プレートを培養する。プレートを空にし、１００μＬ  ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０−０９４）で２回洗浄する。次いで、１００μＬ  ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０−０９４）を添加し、その後１５分以内に、ＳｐｅｃｋｔｒａＭａｘ  Ｍ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上でＥｘ（５１５ｎＭ）／Ｅｍ（５２０ｎＭ）のフィルターを使用してプレートを読み取る（底部の読取値）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、非線形回帰分析曲線の適用、Ｓ字状用量反応（可変グラジエント）を使用して、ＥＣ５０値を計算する。
結果
【０５３８】
一連の化合物について、ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ取り込みアッセイを上述のように実施した。
【０５３９】
結果を以下の表４．１に示す。ＥＣ５０値が低いことは、ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９媒介性下方制御を逆転させる能力がより高いことを反映し、逆に、ＥＣ５０値が高いことは化合物のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９媒介性下方制御を阻害できる能力が低いことを示唆する。
【０５４０】
分かるように、大半の化合物はＬＤＬ取り込みアッセイで１００〜５００ｎＭのＥＣ５０を示すが、これは化合物がＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９媒介性下方制御を逆転させる能力が高いこと、すなわちＬＤＬ取り込みを増加させることを示唆する。
表４．１  ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ取り込みデータ（ＥＣ５０）−（ＥＧＦ（Ａ）類似体および誘導体
【表２２】
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【表２２−１】
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【０５４１】
ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含むＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物についてＬＤＬ取り込みをさらに評価し、ＧＬＰ−１類似体との結合がＥＧＦ（Ａ）類似体の機能性を妨げなかったことを再び確認した（表４．２参照）。
表４．２  ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物のＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ取り込みデータ（ＥＣ５０）
【表２３】
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【０５４２】
〈Ｃ５−ミニブタにおける薬物動態（ＰＫ）〉
本試験の目的は、ミニブタへの静脈内投与後のＧＬＰ−１誘導体のｉｎ  ｖｉｖｏでの延長、すなわち、誘導体の体内滞留時間の延長を決定することであり、それにより作用時間を決定することである。これは薬物動態（ＰＫ）試験で行われ、対称の誘導体の終末相半減期が決定される。終末相半減期とは、終末消失相において特定の血漿濃度が半減するまでの所要時間を意味する。
【０５４３】
雌のＧoeｔｔｉｎｇｅｎミニブタをＥｌｌｅｇａａｒｄ  Ｇoeｔｔｉｎｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｉｇｓ（デンマーク、ダルモーセ市）から取得し、月齢およそ８〜１２カ月かつ体重およそ２０〜３０ｋｇのものを試験で使用する。ミニブタ（永久的カテーテルが埋め込まれたブタ）を小屋の中で個別に収容し、寝床として藁を与え、Ａｌｔｒｏｍｉｎ９０３０ミニブタ飼料（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  Ｓｐｅｚｉａｌｆｕｔｔｅｒ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）を１日１回、制限的に給餌する。
【０５４４】
３週間の順化後、各動物の大静脈尾に２つの永久的な中心静脈カテーテルを埋め込む。動物を手術後１週間回復させ、次いで連続投与の間に適切なウォッシュアウト期間を設けて、反復的な薬物動態試験に使用する。
【０５４５】
５０ｍＭリン酸塩、７０ｎＭ塩化ナトリウム、および０．０５％ポリソルベート８０、ｐＨ７．４を含む緩衝液中に誘導体を溶解する。
【０５４６】
誘導体の静脈内注射（量は０．０５ｍＬ／ｋｇおよび用量２ｎｍｏｌ／ｋｇに相当）を１つのカテーテルを通して与え、投与から最長１４日後まで所定の時点で血液試料を（好ましくは他のカテーテルから）採取する。
【０５４７】
血液試料（例えば、０．８ｍＬ）をＥＤＴＡ（８ｍＭ）被覆チューブ内に採取し、次いで４℃および１９４２ｇで１０分間遠心分離する。
【０５４８】
血漿をドライアイス上のＭｉｃｒｏｎｉｃチューブの中にピペットで入れ、ＬＯＣＩを使用して誘導体の血漿濃度を分析するまで−２０℃で保存する。個別の血漿濃度−時間プロファイルを、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｖ．６．４（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州マウンテンビュー市）において薬物動態の非区画法によって分析し、結果得られる終末相半減期（調和平均）を決定する。
【０５４９】
〈結果〉
上述の通りミニブタを使用して薬物動態試験を行った。
【０５５０】
終末相半減期について以下の結果が得られた。
表５：ミニブタにおける薬物動態試験（ｉ．ｖ．）
【表２４】
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【０５５１】
試験された化合物はすべて、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）と比較して終末相半減期が高い。
【０５５２】
位置８にＧを有するＧＬＰ−１類似体を含む化合物２１は終末相半減期が２時間であり、これは、非天然アミノ酸Ａｉｂを位置８に有する他の化合物の半減期の１０分の１から２５分の１である。
【０５５３】
〈Ｃ６−ｈＰＣＳＫ９チャレンジモデル〉
本試験の目的は、本明細書に記載するＥＧＦ（Ａ）類似体またはＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物により静脈内注射されたｈＰＣＳＫ９の作用を阻害することに反応した、マウス肝臓内のＬＤＬ受容体発現レベルの変化を示すことである。
【０５５４】
〈方法〉
健康な雄のＢａｌＢＣまたはＮＭＲＩマウス（ドイツ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）において、ｈＰＣＳＫ９（中国、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｃｏｉｌｓ社）を０．４ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈に静脈内注射する１５〜１２０分前に、ＥＧＦ（Ａ）類似体（またはＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物）を皮下注射または静脈内注射する。ｈＰＣＳＫ９注射から６０分後、マウスをイソフルランで麻酔し、頸椎脱臼により安楽死させる。次いで、肝臓を素早く切除し、液体窒素中にスナップ凍結させる。分析するまで肝臓を−８０℃に保つ。
【０５５５】
ＬＤＬ−Ｒウェスタンブロッティング：
ホスファターゼ阻害剤カクテル、ＰｈｏｓＳｔｏｐ（Ｒｏｃｈｅ、０４  ９０６  ８３７  ００１）、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル、ｃｏｍｐｅｌａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ、０４  ６９３  １５９  ００１）を含む５００μＬ溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＦＮＮ００１１）中で肝組織試料（１００ｍｇ）を均質化する。１つのスチールビーズを添加した後、組織を３０Ｈｚで２．５分間均質化する。５０００ｘｇで５分間遠心分離した後、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、２３２２５）を使用して総タンパク質含有量を決定する。試料緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＰ０００７）中の等量のタンパク質（６０μｇ）を１０分間煮沸し、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離してから、Ｃｒｉｔｅｉｏｎ  ＸＴ３−８％Ｔｒｉｓ−アセテートゲル（ＢｉＯｒａｄ＃３４５−０１３１）にロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに晒す。メーカー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の指示説明に従って、タンパク質をニトロセルロース膜（ｉＢｌｏｔ  ２  ＮＣ  Ｒｅｇｕｌａｒ  ｓｔａｃｋ、ｎｏｖｅｘ＃ＩＢ２３００１）に移す。膜のＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７１７０）染色によって等量のタンパク質の移動を確認し、膜はブロッキング緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ、２％Ｔｗｅｅｎ）中でさらに阻害される。一次ウサギ抗ＬＤＬｒ抗体（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ＃１００１２４２２）によりＬＤＬ−ｒタンパク質を検出し、一方で、一次ウサギ抗βアクチン抗体（ａｂｃａｍ＃ａｂ６２７６）を使用してβアクチンタンパク質を検出する。ＷｅｓｔｅｒＮｂｒｉｇｈｔ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｅｍ（Ａｄｖａｎｓｔａ＃Ｋ−１２０４２−Ｄ１０）を使用してペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｂｉｏｒａｄ＃１７０−６５１６）により両方のタンパク質をさらに可視化し、ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ３０００、ＦｕｊｉＦｉｌｍ社）を使用して撮像する。ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅソフトウェア（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）により、ウェスタンブロットからの化学発光信号の定量分析を行う。
【０５５６】
〈結果〉
ウェスタンブロットによってＬＤＬ−Ｒ発現レベルを測定し、発現レベルを比較した。発現は「ビヒクル−ｈＰＣＳＫ９」によって減少するが、これはｈＰＣＳＫ９のみを注射された群を表す。「ＥＧＦ（Ａ）化合物−ｈＰＣＳＫ９」を注射された群ではＬＤＬ−Ｒの発現が正常化し、発現が少なくとも９０％に戻ることを示した。
【０５５７】
結果は、ｈＰＣＳＫ９によりＬＤＬ−Ｒの発現レベルが減少し、この効果が試験したＥＧＦ（Ａ）化合物によって阻害されることを示す。表６．１および６．２に要約したデータは、健康な対照群動物のベースラインレベル（１００％に設定）とｈＰＣＳＫ９のみによる下方制御後のレベル（０％に設定）間の期間に関連した変化率を示している。試験された６つのＥＧＦ（Ａ）化合物は、ｈＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒ発現レベルに対する作用を阻害することができ、観察された阻害レベルは、対照群の分子アリロクマブを使用した場合に観察された阻害レベルと類似している。
表６．１
【表２５】
2020528049.tif 000138
表６．２
【表２６】
2020528049.tif 000139
【０５５８】
〈結論〉
いくつかの化合物の例は、ｈＰＣＳＫ９によるＬＤＬ−Ｒ発現レベルの下方制御の阻害に有効性を示した。
【０５５９】
〈Ｃ７−ｄｂ／ｄｂマウスにおける薬力学的試験〉
このアッセイの目的は、糖尿病環境における血糖値（ＢＧ）および体重（ＢＷ）への急性効果を検証することである。
【０５６０】
以下に記載するように、肥満かつ糖尿病のマウスモデル（ｄｂ／ｄｂマウス）における単回投与試験で化合物を試験する。誘導体を異なる用量で、すなわち、０．３、１．０、３．０、１０、３０、１００ｎｍｏｌ／ｋｇまたは１．０、３．０、１０、３０、１００、３００ｎｍｏｌ／ｋｇで試験する。誕生時から飼料ＮＩＨ３１（ＮＩＨ３１Ｍげっ歯類用食餌、米国Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃ．から市販、ｗｗｗ．ｔａｃｏｎｉｃ．ｃｏｍを参照）を与えられたマウス（デンマーク、Ｔａｃｏｎｉｃ社）を、およそ週齢１０週で試験に登録する。動物棟に到着後、マウスに標準的な飼料（例えば、Ａｌｔｒｏｍｉｎ１３２４、デンマーク／ゲントフテ市、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ社）および水道水を自由摂取させ、２４℃に保つ。１〜２週間の順化後、基礎血糖を１日に２回評価する。ベースライン血糖値が１５ｍＭ以上のマウスのみを含める。マウスは、一致する血糖値と体重に基づき治療群に割り当てられる（群当たりＮ＝５〜７）。
【０５６１】
動物はグループ化され、以下のとおり治療を受ける：ビヒクル、皮下またはＧＬＰ−１／ＰＣＳＫ９ｉ誘導体（０．３、１．０、３．０、１０、３０または１００ｎｍｏｌ／ｋｇまたは１．０、３．０、１０、３０、１００、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、皮下、ここでビヒクルは５０ｍＭリン酸ナトリウム、７０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％ポリソルベート８０、ｐＨ７．４である。
【０５６２】
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物をビヒクル中に溶解して、０．０５、０．１７、０．５、１．７、５．０または１７ｎｍｏｌ／ｍＬまたは０．１７、０．５、１．７、５．０、１７または５０ｎｍｏｌ／ｍＬの投与濃度を得る。実験開始時に、動物に６ｍＬ／ｋｇで１回皮下投与する（すなわち、マウス５０ｇあたり３００μＬ）。
【０５６３】
投与日の午前に、投与時間の３０分前に血糖を評価し、その後にマウスを計量する。ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物をおよそ時間０に投与する。投与日に、投与から１、２、４、８時間後に血糖を評価する。
【０５６４】
翌日に、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間目に血糖を評価する。毎日、血糖のサンプリング後にマウスを計量する。
【０５６５】
マウスはデジタル計量スケールで個別に計量する。
【０５６６】
血糖測定のための試料は、覚醒マウスの尾部毛細管から取得される。ヘパリン添加したキャピラリーに血液５μＬを集め、２５０μＬグルコース緩衝液（ＥＫＦシステム溶液、ドイツ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）に移す。グルコース濃度を、グルコースオキシダーゼ法（グルコース分析計、Ｂｉｏｓｅｎ  ５０４０、ＥＫＦ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，ＧｍｂＨ、ドイツ／バルレーベン市）を使用して測定する。試料は、分析するまで室温で最大１時間、または４℃で最大２４時間保存する。
【０５６７】
マウスのベースラインから減算した血糖およびベースラインから減算した体重を計算する。
【０５６８】
〈結果〉
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物１、２、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２９および３２を、上述の単回投与試験で試験した。誘導体を異なる用量、すなわち、０．３、１．０、３．０、１０、３０、１００ｎｍｏｌ／ｋｇ（化合物２、２１、２２、２３、２５および２６）または１．０、３．０、１０、３０、１００、および３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（化合物１、２７、２９および３２）で試験した。
【０５６９】
表７．１は、投与から２４時間後の最高用量のデルタ血糖およびデルタ体重に対する最大効果（Ｅｍａｘ）の概要を示す。２つの最高用量レベルで類似する効果が得られなかった場合は、真のＥｍａｘに達していない可能性があるため、値には星印（＊）を付けている。
表７．１  ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖および体重に対する効果のＥｍａｘ値
【表２７】
2020528049.tif 000140
【０５７０】
血糖および体重に対するＧＬＰ−１／ＰＣＳＫ９ｉ誘導体の効果についての指標を得るため、０〜２４時間のデルタ血糖の曲線下面積（ＡＵＣΔＢＧ２４ｈ）および投与２４時間後のデルタ体重増加量（ΔＢＷ２４ｈ）を計算した。これらのパラメータの用量反応曲線に基づき、ＡＵＣΔＢＧ２４ｈおよびΔＢＷ２４ｈについて、５０％有効量（ＥＤ５０、ベースラインと最大効果の中間にあたる反応を提供するＧＬＰ−１誘導体の用量）を計算した。ＥＤ５０は、ＧＬＰ−１／ＰＣＳＫ９ｉ誘導体の効力の推定値として使用できる。以下の結果が得られた（個々のすべての決定の平均値）。
表７．２  ｄｂ／ｄｂマウスの血糖および体重に対する効果のＥＤ５０値
【表２８】
2020528049.tif 000141
【０５７１】
試験された化合物は、用量依存的に血糖と体重を減少させる効果をｉｎ  ｖｉｖｏで示した。
【０５７２】
本明細書では本発明のある特定の特徴を例示および説明してきたが、数多くの修正、置換、変更、および均等物が当業者には思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのようなすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【０５７３】
〈Ｃ８−ＤＩＯラットの薬力学的試験〉
このアッセイの目的は、肥満環境での体重（ＢＷ）および総コレステロール値に対する亜慢性効果を検証することである。以下に記載するとおり、食餌性肥満（ＤＩＯ）ラットモデルにおける２１日間の亜慢性的用量試験で化合物を試験する。誘導体を異なる用量、すなわち３０ｎｍｏｌ／ｋｇおよび３００ｎｍｏｌ／ｋｇで試験し、一部の例では提示期間にわたりより高い用量の９００ｎｍｏｌ／ｋｇを３００ｎｍｏｌ／ｋｇ群に与えた。
【０５７４】
週齢６週から６０％高脂肪飼料（Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，  Ｉｎｃから市販）を与えられたＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社、フランス）は、週齢２２週に動物棟に到着する。動物棟に到着後、ラットに４５％高脂肪食事（Ｄ１２４５１、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃから市販）と水道水を自由摂取させ、照明（１２時間：１２時間の光／暗サイクル、６時００分〜１８時００分に照明あり）および温度（２２±２℃）が制御された条件下にラットを置く。２〜３週間の順化後、一致する体重と脂肪率に基づいてラットを治療群に割り当てる（Ｎ＝１０／群）。
【０５７５】
動物はグループ化され、以下のとおり治療を受ける：ビヒクル、皮下またはＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物（３０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、一部の場合、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ群のラットには提示日数にわたり９００ｎｍｏｌ／ｋｇを投与）、皮下、ここでビヒクルは５０ｍｍリン酸塩、７０ｍＭ塩化ナトリウム、０．００７％ポリソルベート２０、ｐＨ７．４である。ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物をビヒクル中に溶解し、１５ｎｍｏｌ／ｍＬ（用量漸増用）、５０ｎｍｏｌ／ｍＬ（用量漸増用）、１５０ｎｍｏｌ／ｍＬ、５００ｎｍｏｌ／ｍＬ（用量漸増用）または１５００ｎｍｏｌ／ｍＬの投与濃度を得る。
【０５７６】
動物に、１日１回午前中に０．２ｍＬ／ｋｇの投与量で２２日間皮下投与する。用量を徐々に漸増し、ラットに１日目に３ｎｍｏｌ／ｋｇ、２日目に１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、３日目に３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、また該当する場合は４日目に１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、５日目に３００ｎｍｏｌ／ｋｇを投与する。３０ｎｍｏｌ／ｋｇ群には、３日目から実験終了まで完全用量を投与する。３００ｎｍｏｌ／ｋｇ群には、５日目から実験終了まで完全用量を投与する。３００ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物４１を投与したラットには、１６日目から実験終了まで９００ｎｍｏｌ／ｋｇを投与する。３００ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物４８を投与したラットには、２０日目から実験終了まで９００ｎｍｏｌ／ｋｇを投与する。９００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量は、１５００ｎｍｏｌ／ｍＬ溶液の投与量を０．６ｍＬ／ｋｇに増加させることによって達成される。
【０５７７】
ラットを、投与直前にデジタル計量スケールで毎日計量する。食器の重量も毎日計算して、食餌の消費量を計算する。体内組成物を、投与開始の３〜４日前および２０日目または２１日目に、ＭＲ走査により評価する（Ｅｃｈｏ  ＭＲＩ７００、米国テキサス州ヒューストン市）。投与開始の５日前、および試験終了時に、舌下血液試料を覚醒ラットから採取する。血液試料をＥＤＴＡ採血管に収集し、転倒混合で完全に混和させる。ＥＤＴＡ採血管は、収集直後に氷上に置く。ＥＤＴＡ血液試料を４℃かつ６０００Ｇで５分間遠心分離し、分析まで血漿試料を−８０℃で保存する。試料について、Ｃｏｂａｓ分析器（Ｃｏｂａｓ６０００、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｉｓｔｉｃｓ社、米国）で総コレステロール値を分析する。
【０５７８】
各ラットについてベースラインから減算した体重およびベースラインから減算した総コレステロール値を計算し、群ごとに平均化する。
【０５７９】
〈結果〉
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物４１、４８および６９を、上述のように亜慢性用量試験で試験した。誘導体を異なる用量、すなわち３０ｎｍｏｌ／ｋｇおよび３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物６９）または３０ｎｍｏｌ／ｋｇおよび３００ｎｍｏｌ／ｋｇで試験し、最後の２日間に（ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物４１）または最後の７日間に（ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物４８）用量を９００ｎｍｏｌ／ｋｇに増加させた。
【０５８０】
表８．１は、ベースライン体重（平均±ＳＥＭ）と比較した平均体重（％）、および群あたりのベースライン値（平均±ＳＥＭ）と比較した血漿総コレステロール値の平均デルタの概略を示す。
表８．１  ベースライン体重と比較した平均体重（％）および２１日後のベースライン値と比較した血漿総コレステロール値の平均変化
【表２９】
2020528049.tif 000142
【０５８１】
〈Ｃ９−化学的安定性〉
３２１Ｄが３２１Ｅで置換されたＥＧＦ（Ａ）類似体の潜在的な安定効果（異性体形成の減少）を調べるために、ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物６９および３１３の製剤を調製する。化合物の濃度は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１８．４ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、０．４３ｍＭ  ＣａＣｌ２からなる製剤中で２ｍｇ／ｍＬである。製剤は、Ｔｒｉｓ、プロピレングリコール、およびＣａｃｌ２を含むＭＱ水に凍結乾燥した材料を最終濃度で可溶化することによって調製する。ｐＨは０．１Ｎ  ＨＣｌ（水溶液）および０．１Ｎ  ＮａＯＨ（水溶液）を使用して調節される。各製剤を滅菌濾過し、ＨＰＬＣガラスバイアル上に充填し、３７℃に温度制御されたキャビネットで静止保存する。選択された時点（時間０、１週、２週、４週）で試料がＨＰＬＣバイアルから引き出され、その後のＵＰＬＣ−ＭＳ分析のために凍結される。
【０５８２】
ＢＥＨ  Ｃ４カラム（３００オングストローム、１．７ｕｍ、１．０ｘ１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）および水中０．１％ギ酸（溶離液Ａ）／アセトニトリル中０．１％ギ酸（溶離液Ｂ）溶媒システムに基づく安定性を示す純度方法を使用して、熱ストレスを受けた製剤の純度損失を評価する。以下の条件を使用する：カラム温度：５０℃、流量：０．３０ｍＬ／分、ＵＶ検出器の波長：２１５ｎｍ。グラジエントは、４１分間にわたり３１％〜３９％Ｂである。ＬＣ流量は、正イオンモードで動作する電気スプレーインターフェースを備えるＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に注入されたオンライン配線である。純度方法は前述の製剤と互換性があることが示され、内容／類似体の損失は観察されない。形成される異性体の量は、様々な試料、すなわち時間０、および３７℃で２週間および４週間培養された試料の全イオンクロマトグラム上での質量ベースの抽出から決定され、各試料の異性体の割合は、異性体のピーク面積を主ピーク（ＡＰＩ）面積に統合させて算出される。
表９．１  全イオンクロマトグラムの質量ベースの抽出によって決定された製剤試料中の異性体の量
【表３０】
2020528049.tif 000143
【０５８３】
表９．１における結果は、３２１Ｄの３２１Ｄによる置換が、３７℃での培養から４週間後に、異性体形成の量を２０．２％から４．２％へと有意に低下させることを示す。
【０５８４】
本明細書では本発明のある特定の特徴を例示および説明してきたが、数多くの修正、置換、変更、および均等物が当業者には思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのようなすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【配列表】
2020528049000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月18日(2019.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物であって、      ｉ．前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号１３７によって特定されたＧＬＰ−１（７−３７）と比較して最大で６つのアミノ酸置換を有し、      ｉｉ．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１によって特定されたＬＤＬ−Ｒ（２９３〜３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインと比較して１〜８つのアミノ酸置換を有し、かつ３０１Ｌｅｕを含み、 前記化合物がＧＬＰ−１作動薬であり、セクションＣ３に記載するようにＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ結合に関する競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した場合に８ｎＭ未満のＫｉを有する、化合物。
【請求項２】
前記化合物が、前記ＧＬＰ−１類似体および前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を含む融合ポリペプチドを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端に前記ＧＬＰ−１類似体を有し、Ｃ末端に前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ＧＬＰ−１類似体が、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、３４Ｋ、および３６Ｋからなる群から選択される１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号１３８〜１８７によって定義されるＧＬＰ−１類似体の群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物が、前記ＧＬＰ−１において、Ｃ１に記載されるＨＳＡなしのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイで最大で１００ｐＭのＥＣ５０を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記ＧＬＰ−１類似体が８Ａｉｂを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＧＬＰ−１類似体が３４Ｒまたは３４Ｑを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
ＧＬＰ−１類似体が８Ａｉｂおよび３４Ｒを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号１３９、１４７〜１５４、および１８４〜１８６によって定義されるＧＬＰ−１類似体の群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記ＧＬＰ−１類似体が配列番号１３９によって定義される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０９Ｒを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３２１Ｄまたは３２１Ｅを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３１２Ｅ、３１２Ｄ、３１２Ｑまたは３１２Ｒを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１９、２１、７３、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、および１１４、例えば配列番号１０７および１０８によって定義されるＥＧＦ（Ａ）類似体の群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が配列番号１０８によって定義される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記融合ポリペプチドが、ペプチドスペーサー、例えば配列番号１１５〜１３６、例えば配列番号１１６および１１９によって定義されるスペーサーの群から選択されるスペーサーなどを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｃ３に記載するように測定した見かけＥＧＦ（Ａ）Ｋｉと、Ｃ１に記載したＨＳＡなしの前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて前記ＥＣ５０として測定されたＧＬＰ−１効力との比率が最大で２００である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記化合物が、少なくとも１つの半減期を延長させる置換基、例えば以下からなる置換基の群から選択される置換基を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物：   化学式６ｂによって定義される置換基＃１【化１】
2020528049.tif 000144
化学式６ｂ、   化学式７ｂによって定義される置換基＃２
【化２】
2020528049.tif 000145
化学式７ｂ、   化学式８ｂによって定義される置換基＃３
【化３】
2020528049.tif 000146
化学式８ｂ、   化学式９ｂによって定義される置換基＃４
【化４】
2020528049.tif 000147
化学式９ｂ、   化学式１０ｂによって定義される置換基＃５
【化５】
2020528049.tif 000148
化学式１０ｂ、   化学式１１ｂによって定義される置換基＃６
【化６】
2020528049.tif 000149
化学式１１ｂ、   化学式１２ｂによって定義される置換基＃７
【化７】
2020528049.tif 000150
化学式１２ｂ、   化学式１３ｂによって定義される置換基＃８
【化８】
2020528049.tif 000151
化学式１３ｂ、   化学式１４ｂによって定義される置換基＃９
【化９】
2020528049.tif 000152
化学式１４ｂ、   化学式１５ｂによって定義される置換基＃１０
【化１０】
2020528049.tif 000153
化学式１５ｂ、   化学式１６ｂによって定義される置換基＃１１
【化１１】
2020528049.tif 000154
化学式１６ｂ、   化学式１７ｂによって定義される置換基＃１２
【化１２】
2020528049.tif 000155
化学式１７ｂ、   化学式１８ｂによって定義される置換基＃１３
【化１３】
2020528049.tif 000156
化学式１８ｂ、および   化学式１９ｂによって定義される置換基＃１４
【化１４】
2020528049.tif 000157
化学式１９ｂ。
【請求項２０】
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１、＃４８、＃６９および＃３０６、例えば＃３０６および＃６９、または例えば＃３０６もしくは＃６９として定義される化合物の群から選択される化合物であって、   化合物＃４１が、配列番号１３９によって定義される前記ＧＬＰ−１類似体［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）、配列番号１１６によって定義される前記スペーサー、および配列番号１９によって定義される前記ＥＧＦ（Ａ）類似体［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３３３Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）、ならびに   化学式６ｂ【化１５】
2020528049.tif 000158
化学式６ｂ によって定義され、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸残基２６Ｋおよび［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３３３Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）のアミノ酸残基３３３Ｋに付着された２つの置換基からなる、配列番号１９０によって定義される融合ペプチドを含み、   化合物＃４８が、配列番号１３９によって定義される前記ＧＬＰ−１類似体［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）、配列番号１１９によって定義される前記スペーサー、および配列番号１０８によって定義される前記ＥＧＦ（Ａ）類似体、ならびに   化学式１１ｂ
【化１６】
2020528049.tif 000159
化学式１１ｂ によって定義され、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸残基２６Ｋに付着された１つの置換基からなる、配列番号２０２によって定義される融合ペプチドを含み、   化合物＃６９が、配列番号１６４によって定義される前記ＧＬＰ−１類似体［８Ａｉｂ、３０Ｇ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）、配列番号１１６によって定義される前記スペーサー、および配列番号１０８によって定義される前記ＥＧＦ（Ａ）類似体、ならびに   化学式１１ｂ
【化１７】
2020528049.tif 000160
化学式１１ｂ によって定義され、［８Ａｉｂ、３０Ｇ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸２６Ｋに付着された１つの置換基からなる、配列番号３１０によって定義される融合ペプチドを含み、 化合物＃３０６が、配列番号１６４によって定義される前記ＧＬＰ−１類似体［８Ａｉｂ、３０Ｇ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）、配列番号１１６によって定義される前記スペーサー、および配列番号１０８によって定義される前記ＥＧＦ（Ａ）類似体、ならびに   化学式１０ｂ
【化１８】
2020528049.tif 000161
化学式１０ｂ によって定義され、［８Ａｉｂ、３０Ｇ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸２６Ｋに付着された１つの置換基からなる、配列番号３１０によって定義される融合ペプチドを含む、化合物。
【請求項２１】
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物である請求項１に記載の化合物であって、前記ＧＬＰ−１類似体が配列番号１３９によって定義され、前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が配列番号１０８によって定義される、化合物。
【請求項２２】
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物であって、前記化合物が、配列番号１９３によって定義される融合ペプチド、および   化学式６ｂ【化１９】
2020528049.tif 000162
化学式６ｂ によって定義され、配列番号１９３の位置２０のリジン（Ｋ）（［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸２６Ｋに等しい）を介して付着された１つの置換基を含む、化合物。
【請求項２３】
糖尿病、過体重および／または心血管疾患を治療する方法で使用するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の化合物を必要とする患者に対し、前記化合物の薬学的に有効な投与量を投与することを含む、糖尿病、過体重および／または心血管疾患の治療方法。
【手続補正書】
【提出日】令和2年3月9日(2020.3.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＰＣＳＫ９を阻害し、ＧＬＰ−１受容体刺激する二機能性化合物、およびその製薬学的使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
高ＬＤＬ−Ｃ（低密度リポタンパク質コレステロール）レベルおよび脂質異常症は心血管疾患のよく知られた要因である。
【０００３】
脂質異常症の治療についてはスタチンが２５年間にわたり承認されている。このクラスは心血管イベントの大幅かつ一貫した減少を実証し、安全性プロファイルも許容可能なものである。最も良く売れているスタチンであるアトルバスタチン（リピトール（商標））は、常に世界で最も良く売れている薬であり、１９９６年から２０１２年までの売上は１２５０億万ドル以上にのぼった。
【０００４】
スタチンおよびその他の脂質低下薬の利用可能性および広範囲の使用にもかかわらず、多くの患者は目標とするＬＤＬ−Ｃレベルに達せず、心血管疾患の発症リスクが依然として高い。ＰＣＳＫ９（プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型）は、肝臓でのＬＤＬ−Ｒ（ＬＤＬ受容体）分解を促進し、それによって肝臓でのＬＤＬ−Ｒ表面発現を減少させ、その結果としてＬＤＬ粒子のクリアランスを低下させる。逆に、ＰＣＳＫ９の阻害は、ＬＤＬ−Ｃおよび他の動脈硬化惹起性リポタンパク質のクリアランスを増加させる。実際に、ＬＤＬ受容体は、ＬＤＬ以外の動脈硬化惹起性リポタンパク質、例えば中間密度リポタンパク質およびレムナント粒子などのクリアランスに寄与する。中間密度リポタンパク質およびレムナント粒子のクリアランスの増加は、ＬＤＬ低下が提供する治療効果を超えた治療効果をもたらしうる。
【０００５】
スタチンは、ＳＲＥＢＰ２転写因子を介してＬＤＬ−ＲとＰＣＳＫ９の両方の発現を増加させる。ＰＣＳＫ９の発現増加は、血液からのＬＤＬ−Ｃのクリアランスに対するスタチンの効果を減少させる場合がある。ＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒへの結合を阻害し、それによってＬＤＬ−Ｒの低下を防ぐことで、スタチンの有効性が強化される。総合すると、ＰＣＳＫ９の阻害は新しい脂質管理アプローチを提供する。
【０００６】
ＬＤＬ−Ｒ（ＬＤＬ−Ｒ−（２９３−３３２））のＥＧＦ（Ａ）（上皮成長因子様ドメインＡ）配列（４０つのアミノ酸）は、ＰＣＳＫ９結合の部位としてよく知られている。単離された野生型ＥＧＦ（Ａ）ペプチドはＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒへの結合を阻害することが示され、ＩＣ５０は低μＭ範囲である（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ３７５（２００８）６９−７３）。この弱い効力では、ＥＧＦ（Ａ）ペプチドの実用的な製薬学的使用は妨げられる。さらに、こうしたペプチドの半減期は治療用途にとっては短すぎると予想されるだろう。
【０００７】
国際公開第２０１２／１７７７４１号およびＪ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）４２２，６８５−６９６は、ＥＧＦ（Ａ）類似体およびそのＦｃ融合体を開示している。
【０００８】
２種の抗ＰＣＳＫ９抗体、アリロクマブ／プラルエント（登録商標）およびエボロクマブ／レパーサ（登録商標）は、高ＬＤＬ−Ｃレベルの治療について最近承認された。これらは、１ｍＬを２週間ごとに皮下注射で投与する。
【０００９】
国際公開第２０１５／１２７２７３号では、抗ＰＣＳＫ９抗体とＧＬＰ−１作動薬の融合が検討され、ＧＬＰ−１と抗ＰＣＳＫ９抗体の機能を組み合わせることに努めている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開第２０１２／１７７７４１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２０１５／１２７２７３号パンフレット
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０１２）４２２，６８５−６９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
糖尿病および心血管疾患の治療に対しては複数の治療が利用できるが、複数の薬剤の組み合わせは必ずしも魅力的であるとは限らず、治療、例えば有効性、服薬遵守および利便性を改善するには、両方の病態に対処する１つの分子が望ましい。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒへの結合を阻害し、それによってＬＤＬコレステロールを低下させる能力を有するＥＧＦ（Ａ）類似体に関する。このような分子をＧＬＰ−１受容体作動薬と組み合わせて二機能性分子を形成し、１つの薬剤で糖尿病および心血管疾患の両方に対処する治療選択肢をさらに提供することができる。本発明は、一態様においてＧＬＰ−１作動薬およびＰＣＳＫ９阻害剤を含む化合物に関する。
【００１４】
本発明の一態様は、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物に関し、
ｉ．前記ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３７によって特定されるＧＬＰ−１（７−３７）の類似体であり、
ｉｉ．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１によって特定されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体である。
【００１５】
こうした化合物は、一実施形態では、２つの類似体の間に挿入されるスペーサーペプチドによって任意選択的に結合される２つの類似体を含む融合ポリペプチドを含んでもよい。
【００１６】
化合物は、半減期延長部分をさらに含んでもよく、これをＧＬＰ−１類似体、ＥＧＦ（Ａ）類似体またはスペーサーのうちの１つのアミノ酸残基に付着された置換基と呼ぶことができる。一実施形態では、化合物は、融合ポリペプチドの異なるアミノ酸残基に付着された１つまたは２つの置換基を含む。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、本発明の化合物を含む医薬組成物、および本発明の化合物の医学的使用に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明は、ＧＬＰ−１受容体を刺激しＰＣＳＫ９を阻害する二機能性化合物に関する。製薬学的に妥当な化合物を調製するには、機能性を改善しかつ簡便な投与を可能にするために、野生型ペプチドの修飾が必要である。
【００１９】
本発明の一態様は、ＧＬＰ−１受容体作動薬およびＰＣＳＫ９阻害剤を含む化合物に関する。いくつかのＧＬＰ−１受容体作動薬は当該技術分野で周知であり、様々なＰＣＳＫ９阻害剤と組み合わせてもよい。本明細書に記載するように、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１３７）、または例えばＧＬＰ−１受容体作動薬として機能することが知られているエクセンジン４およびその類似体などでもよい。
【００２０】
ＰＣＳＫ９阻害剤は抗体の形態で知られているが、本出願は主に、ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体の形態でのＰＣＳＫ９阻害剤に関する。
【００２１】
本発明の一態様は、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物に関し、前記ＧＬＰ−１類似体はＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１３７）の類似体であり、前記ＥＧＦ（Ａ）類似体はＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体である。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「化合物」という用語は分子実体を意味するために使用され、「化合物」はそれぞれの化合物または化合物群に対して定義された最小要素以外の異なる構造要素を有してもよい。当然ながら、化合物が定義された構造要素および／または機能要素を含む限り、化合物はポリペプチドまたはその誘導体でありうる。
【００２３】
「化合物」という用語はまた、本明細書に記載の製薬学的に妥当な形態を網羅するよう意図されている、すなわち、本発明は、本明細書に定義される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩、アミド、またはエステルに関連する。
【００２４】
「ペプチド」または「ポリペプチド」という用語は、例えば、本発明の文脈で使用されるように、アミド（またはペプチド）結合によって相互接続された一連のアミノ酸を含む化合物を指す。特定の実施形態では、ペプチドは、ペプチド結合によって相互接続されたアミノ酸からなる。
【００２５】
「融合」および「融合された」という用語は、ペプチド結合またはペプチドスペーサー（同様にペプチド結合によって結合される）によって結合される、個別に定義された２つのペプチド配列を含むポリペプチドに関連して使用される。したがって、融合ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基の連続的な延長である。
【００２６】
「類似体」という用語は一般的に、参照アミノ酸配列と比較して１つ以上のアミノ酸変化を配列に有するペプチドを指す。一定の特定の変化を「含む」類似体は、参照配列と比較してさらなる変化を含みうる。特定の実施形態では、類似体は特定の変化を「有する」または「含む」。他の特定の実施形態では、類似体は変化「からなる」。「なる」または「からなる」という用語が類似体、例えば特定のアミノ酸置換の群からなる類似体に関して使用される場合は、当然のことながら、指定されたアミノ酸置換は類似体の唯一のアミノ酸置換である。対照的に、特定のアミノ酸置換の群を「含む」類似体は、追加的な置換を有してもよい。「類似体」はまた、Ｎ末端位置および／もしくはＣ末端位置におけるアミノ酸伸長、ならびに／またはＮ末端位置および／もしくはＣ末端位置における切断を含みうる。
【００２７】
一般的に、アミノ酸残基は、その完全な名称、１文字のコード、および／または３文字のコードによって特定されうる。これらの３つの方法は完全に均等である。
【００２８】
アミノ酸は、アミノ基およびカルボン酸基、ならびに任意選択で側鎖と呼ばれることの多い１つ以上の追加的な基を含有する分子である。
【００２９】
「アミノ酸」という用語は、（２０種類あるといわれる標準アミノ酸の中の）タンパク質原性（または天然の）アミノ酸、および非タンパク質原性（または非天然の）アミノ酸を含む。タンパク質原性アミノ酸は、タンパク質の中に天然に組み込まれているアミノ酸である。標準アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされたアミノ酸である。非タンパク質原性アミノ酸は、タンパク質内に見出されないか、標準的な細胞機構によって生成されない（例えば、翻訳後修飾の対象となっていた場合がある）。非タンパク質原性アミノ酸の非限定的な例は、Ａｉｂ（α−アミノイソ酪酸または２−アミノイソ酪酸）、ノルロイシン、ノルバリンおよびタンパク質原性アミノ酸のＤ異性体である。
【００３０】
以下では、光学異性体が記載されていない本発明のペプチドの各アミノ酸は、（別段の指定がない限り）Ｌ異性体を意味すると理解されるべきである。
【００３１】
《ＧＬＰ−１類似体》
本発明は、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）類似体を含む化合物に関する。「ＧＬＰ−１類似体」という用語は本明細書で使用される場合、ヒトグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１（７−３７））の類似体（または変異体）を指し、その配列は配列番号１３７として配列リストに含まれる。配列番号１３７の配列を有するペプチドは、「天然」または野生型ＧＬＰ−１と指定されてもよい。
【００３２】
本発明のＧＬＰ−１類似体におけるアミノ酸残基（例えば「位置８」）の番号付けは、天然ＧＬＰ−１について当該技術分野で確立された慣行に従い、すなわち、最初の（Ｎ末端）アミノ酸残基が位置７と番号付けられるか番号を与えられ、下流にあるその後のアミノ酸残基はＣ末端に向かって８、９、１０などと、最後の（Ｃ末端）アミノ酸残基まで番号付けられる。天然ＧＬＰ−１ではＣ末端アミノ酸残基はＧｌｙであり、数字は３７である。
【００３３】
番号付けは配列リストでは異なる方法で行われ、配列番号１３７（Ｈｉｓ）の最初のアミノ酸残基は番号１が与えられ、最後のアミノ酸残基（Ｇｌｙ）には番号３１が与えられる。しかしながら、本明細書では、上述のように、当該技術分野において確立された番号付けの慣行に従う。
【００３４】
ＧＬＰ−１類似体は当該技術分野で周知であり、いくつかのＧＬＰ−１類似体が２型糖尿病および肥満の治療のために市場に供給されている。ＧＬＰ−１類似体は、上述のように、野生型ヒトＧＬＰ−１配列の変異体であり、それゆえ配列番号１３７と比較して１つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または追加を含む。
【００３５】
それぞれのＧＬＰ−１類似体は、ｉ）変化したアミノ酸残基（すなわち、天然ＧＬＰ−１内の対応する位置）に対応する天然ＧＬＰ−１（７−３７）内のアミノ酸残基の番号、およびｉｉ）実際の変化を参照することにより説明されうる。
【００３６】
言い換えると、本発明のＧＬＰ−１類似体は、天然ＧＬＰ−１（７−３７）ペプチド、すなわち、天然ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１３７）と比較してアミノ酸残基の数が変化した変異体として記述されうる。
【００３７】
これらの変化は、独立して、１つ以上のアミノ酸置換、付加、および／または欠失を表し得る。
【００３８】
以下は、適切な類似体命名法の非限定的な例である。ＧＬＰ−１類似体＃２（配列番号１３９）として組み込まれ、化合物＃１に含まれるＧＬＰ−１類似体は、（８Ａｉｂ、３４Ｒ）ＧＬＰ−１（７−３７）と呼んでもよい。
【００３９】
この類似体が天然ＧＬＰ−１とアラインメントされるとき、天然ＧＬＰ−１のアライメントに応じた位置８に対応する類似体内の位置のアミノ酸はＡｉｂであり、天然ＧＬＰ−１の位置３４に対応する類似体内の位置のアミノ酸はＲであり、この類似体におけるすべてのその他のアミノ酸は天然ＧＬＰ−１の対応するアミノ酸と同一である。
【００４０】
一定の特定の変化を「含む」類似体は、野生型ＧＬＰ−１（配列番号１３７）と比較してさらなる変化を含みうる。対照的に、「からなる」という用語は特定の実施形態に言及するために使用される。この場合、類似体は特定の変化を有するのみであり、すなわち、野生型ＧＬＰ−１（配列番号１３７）と比較してＧＬＰ−１類似体にそれ以上の変化はない。上記の例を再び参照すると、ＧＬＰ−１類似体＃２（配列番号１３９）は、ＧＬＰ−１類似体であると呼んでもよく、置換は８Ａｉｂおよび３４Ｒからなり、または略して８Ａｉｂおよび３４ＲからなるＧＬＰ−１類似体と呼んでもよい。
【００４１】
「〜に等しい位置」または「対応する位置」という表現は、本明細書において、天然ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号１３７）などの参照配列を参照して変異体ＧＬＰ−１（７−３７）配列の変化部位を特徴付けるために使用される。等しい位置または対応する位置、および変化の数も、例えば、単純な手書きおよび目視検査によって容易に推定でき、かつ／またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムに基づく「アラインメント」などの標準タンパク質アラインメントプログラムまたはペプチドアラインメントプログラムを使用してもよい。このアルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．およびＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．，（１９７０）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４８：４４３−４５３、ならびにＭｙｅｒｓおよびＷ．  Ｍｉｌｌｅｒ、「Ｏｐｔｉｍａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｓｐａｃｅ」ＣＡＢＩＯＳ（ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１９８８）４：１１−１７によるアラインメントプログラムに説明されている。アラインメントのために、デフォルトのスコアマトリックスＢＬＯＳＵＭ６２およびデフォルトの同一性マトリックスを使用してもよく、またギャップの第一の残基に対するペナルティは−１２、好ましくは−１０に設定されてもよく、そしてギャップにおける追加的な残基に対するペナルティは−２、好ましくは−０．５に設定されてもよい。
【００４２】
このようなアラインメントの例は、配列番号１３７の天然ＧＬＰ−１および配列番号１３９によって特定されるその類似体の下に挿入される。
＃＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
＃  Ａｌｉｇｎｅｄ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：  ２
＃  １：  ＳＥＱ＿ＩＤ＿ＮＯ＿１３７
＃  ２：  ＳＥＱ＿ＩＤ＿ＮＯ＿１３９
＃  Ｍａｔｒｉｘ：  ＥＢＬＯＳＵＭ６２
＃  Ｇａｐ＿ｐｅｎａｌｔｙ：  １０．０
＃  Ｅｘｔｅｎｄ＿ｐｅｎａｌｔｙ：  ０．５
＃
＃  Ｌｅｎｇｔｈ：  ３１
＃  Ｉｄｅｎｔｉｔｙ：            ２９／３１  （９３．５％）
＃  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ：        ３０／３１  （９６．８％）
＃  Ｇａｐｓ：                      ０／３１  （  ０．０％）
＃  Ｓｃｏｒｅ：  １５４．０
＃＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝
ＳＥＱ＿ＩＤ＿ＮＯ＿１３７      １  ＨＡＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ  ３１
｜．｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜｜．｜｜｜
ＳＥＱ＿ＩＤ＿ＮＯ＿１３９    １  ＨＸＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＧＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＲＧＲＧ  ３１
【００４３】
このアラインメントに示された位置番号（例えば、配列番号１３７の「１」と「３１」に）に６を追加すると、本明細書で使用される位置番号が得られる。例えば、野生型ＧＬＰ−１（配列番号１３７と同一）において、Ｎ末端アミノ酸（Ｈ）は位置番号７を有し、Ｃ末端アミノ酸（Ｇ）は番号３７を有する。ＧＬＰ−１類似体＃２（配列番号１３９）に関して、Ｎ末端アミノ酸（Ｈ）は番号７を有し、Ｃ末端アミノ酸（Ｇ）は野生型ＧＬＰ−１に関しては番号３７を有し、残基２および２８が置換され、それぞれ８および３４と番号付けられる。
【００４４】
一文字コドンを持たない特定のアミノ酸残基等（例えば２−アミノ−２−メチルプロパン酸（Ａｉｂ））が配列に含まれる場合、これらは、アラインメント目的のために、例えばＸで置き換えてもよい。希望する場合、Ｘは後ほど手作業により修正することができる。
【００４５】
以下は、上記のアラインメントから推定できる、非限定的な例である。
【００４６】
一例として、配列２は、配列１と比較して（すなわち、アラインメントに終止符（「．」）、コロン（「：」）、または水平ハイフン（「−」）が示されているすべての位置において）２つのアミノ酸変化を有すると推定することができる。
【００４７】
以下では、光学異性体について述べられていない本発明のＧＬＰ−１類似体のすべてのアミノ酸は、（特に明記されない限り）Ｌ異性体を意味すると理解されるべきである。
【００４８】
一実施形態では、本発明のＧＬＰ−１類似体は、２６〜３６のアミノ酸残基からなるＧＬＰ−１（７−３７）の類似体である。
【００４９】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）と比較して最大で１０のアミノ酸置換を有する。さらなる実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）と比較して、最大で８、例えば最大で７、６、５、４、３または２つのアミノ酸置換を有する。
【００５０】
多数のＧＬＰ−１類似体、そしてＧＬＰ−１受容体作動薬としてのその機能もこれまでに説明されてきた。
【００５１】
配列番号１３７の野生型ＧＬＰ−１ペプチドは、２つのＬｙｓ残基を位置２６および３４に含む。本明細書の以下で述べるように、Ｌｙｓ残基は、Ｌｙｓ残基を介して付着された置換基を含む化合物が調製される場合に特に関連性がある。
【００５２】
一実施形態では、本発明によるＧＬＰ−１類似体は、０、１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、アミノ酸置換によってＧＬＰ−１類似体に導入されたＬｙｓ残基および野生型残基から選択される、１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む。アミノ酸置換によって導入されたＬｙｓ残基は、追加のＬｙｓ残基と呼ぶことができる。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は追加のＬｙｓ残基を含む。追加のＬｙｓは、位置１２、２１、２３、２４、２５、２７、３０、３１、３２、３３および３６Ｋから選択される１つ以上の位置など、ＧＬＰ−１類似体の様々な位置に導入されてもよい。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、および３６Ｋの群から選択される追加のＬｙｓを含む。
【００５３】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、３４Ｋ、および３６Ｋからなる群から選択される１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む。
【００５４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、および３４Ｋからなる群から選択される１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む。
【００５５】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、３４Ｋ、および３６Ｋからなる群から選択される厳密に２つのＬｙｓ残基を含む。
【００５６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、および３４Ｋからなる群から選択される厳密に２つのＬｙｓ残基を含む。
【００５７】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、以下の対から選択される、厳密に２つのＬｙｓ残基を含む：
ａ）２１Ｋおよび２６Ｋ
ｂ）２３Ｋおよび２６Ｋ
ｃ）２４Ｋおよび２６Ｋ
ｄ）２５Ｋおよび２６Ｋ
ｅ）２７Ｋおよび２６Ｋ
ｆ）３０Ｋおよび２６Ｋ
ｇ）３１Ｋおよび２６Ｋ
ｈ）３２Ｋおよび２６Ｋ
ｉ）３３Ｋおよび２６Ｋ
ｊ）３４Ｋおよび２６Ｋ。
【００５８】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体はＬｙｓ残基２６Ｋおよび３４Ｋを含む。
【００５９】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、３４Ｋ、および３６Ｋから選択される厳密に１つのＬｙｓ残基を含む。
【００６０】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、および３４Ｋから選択される厳密に１つのＬｙｓ残基を含む。
【００６１】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋから選択される厳密に１つのＬｙｓ残基を含む。
【００６２】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、２６Ｋである厳密に１つのＬｙｓ残基を含む。
【００６３】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、２６Ｋおよび３４Ｋのうちの１つまたは両方の置換または欠失を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は２６Ｋを含まない。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は２６Ｋの欠失を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は２６Ｋのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は２６Ｒを含む。
【００６４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は３４Ｋを含まない。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は３４Ｋの欠失を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、３４Ｋのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は３４Ｒまたは３４Ｑを含む。
【００６５】
上述の通り、本発明によるＧＬＰ−１類似体の長さは野生型ＧＬＰ−１の長さと類似している。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、少なくとも２６、例えば少なくとも２８または少なくとも３０のアミノ酸残基を含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、少なくとも３１、例えば少なくとも３２または少なくとも３３のアミノ酸残基を含む。
【００６６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、Ｃ末端に１〜５つのアミノ酸の欠失を有する。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、ＡＡ３５−３７、ＡＡ３４−３７またはＡＡ３３−３７の欠失を含む。
【００６７】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は３３Ｌを含む。
【００６８】
上述のように、ＧＬＰ−１類似体は、野生型ＧＬＰ−１と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、例えば最大で５つのアミノ酸置換、例えば最大で４つのアミノ酸置換、例えば最大で３つのアミノ酸置換を含んでもよい。
【００６９】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、切断がない場合に、それぞれ配列番号１に対して、最大７、６、４、３、および１つのアミノ酸置換に対応する配列番号１２７と、少なくとも７５％の同一性、例えば８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。
【００７０】
アミノ酸置換によって導入される追加のＬｙｓ残基に加えて、またはその代替として、ＧＬＰ−１類似体は、１つ以上のアミノ酸置換を含んで、異なるアミノ酸残基で野生型残基を置換してもよい。
【００７１】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、８Ａのアミノ酸置換、例えば８Ａの８Ｇまたは８Ｗへの置換を含み、これはＡ８ＧおよびＡ８Ｗとも呼ばれうる。
【００７２】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、８Ａのアミノ酸置換、例えばタンパク質を構成しないアミノ酸残基（Ａｉｂなど）への８Ａの置換を含む。
【００７３】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、８ＡからＧ、Ｗまたはタンパク質を構成しないアミノ酸残基Ａｉｂへのアミノ酸置換を含む。
【００７４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、位置８、１２、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３２、３３、３４および３６のアミノ酸置換から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００７５】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、位置８、２１、２３、２４、２５、２６、２７、２９、３０、３１、３２、３３および３４のアミノ酸置換から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００７６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、位置８、２１、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３１、３２または３３のアミノ酸置換から選択される１つ以上のアミノ酸置換を含む。一実施形態では、位置８、２１、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３１、３２または３３の野生型アミノ酸残基は、Ｇ、Ｖ、Ａ、Ｔ、ＬまたはＩ残基によって置換される。
【００７７】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は８Ａおよび３４Ｋの置換を含む。
【００７８】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は８Ａｉｂおよび３４Ｒを含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、８Ａｉｂおよび３４Ｒと、位置２１、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３１、３２および３３から選択される位置での置換を含む。
【００７９】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は８Ａｉｂおよび３４Ｒを含む。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、８Ａｉｂおよび３４Ｒと、位置２１、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３１、３２および３３から選択される位置での置換を含み、位置２１、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３１、３２または３３での置換はＧ、Ｖ、Ａ、Ｔ、ＬまたはＩ残基である。
【００８０】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、１つまたは２つのＬｙｓ残基、および以下から選択される置換の群を含む。
【表１】
2020528049.tif 000163
【００８１】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、１つまたは２つのＬｙｓ残基、および以下から選択される置換の群を含む。
【表２】
2020528049.tif 000164
【００８２】
一実施形態では、このようなＧＬＰ−１類似体は、本明細書で上述するように１つまたは２つのＬｙｓ残基、例えば２６Ｋおよび／もしくは３４Ｋ、または例えば２６Ｋおよび／もしくはＫ３４Ｒとともに置換により導入されるＬｙｓを含む。
【００８３】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は配列番号１８７：Ｈ−Ｘ８−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｘ１２−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｘ２１−Ｇ−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｆ−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７によって定義される配列を有し、ここで、
Ｘ８はＡ、Ｇ、ＷまたはＡｉｂであり、
Ｘ１２はＦまたはＫであり、
Ｘ２１はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２３はＱ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２４はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２５はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２６はＫまたはＲであり、
Ｘ２７はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２９はＩ、ＡまたはＶであり、
Ｘ３０はＡ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３１はＷ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３２はＬ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、ＩまたはＫであり、
Ｘ３３はＶ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３４はＫ、Ｒ、Ｑであるか、または不在であり、
Ｘ３５はＧであるか、または不在であり、
Ｘ３６はＲ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３７はＧであるか、または不在である。
【００８４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は配列番号１８７：Ｈ−Ｘ８−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｘ１２−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｘ２１−Ｇ−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｆ−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７によって定義される配列を有し、ここで、
Ｘ８はＡ、Ｇ、ＷまたはＡｉｂであり、
Ｘ１２はＦまたはＫであり、
Ｘ２１はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２３はＱ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２４はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２５はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２６はＫまたはＲであり、
Ｘ２７はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２９はＩまたはＶであり、
Ｘ３０はＡ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３１はＷ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３２はＬ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、ＩまたはＫであり、
Ｘ３３はＶ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３４はＫ、Ｒ、Ｑであるか、または不在であり、
Ｘ３５はＧであるか、または不在であり、
Ｘ３６はＲ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３７はＧであるか、または不在である。
【００８５】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は配列番号１８７：Ｈ−Ｘ８−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｘ１２−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｘ２１−Ｇ−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｆ−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７によって定義される配列を有し、ここで、
Ｘ８はＡ、Ｇ、ＷまたはＡｉｂであり、
Ｘ１２はＦまたはＫであり、
Ｘ２１はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２３はＱ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２４はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２５はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２６はＫまたはＲであり、
Ｘ２７はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２９はＩ、ＡまたはＶであり、
Ｘ３０はＡ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３１はＷ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３２はＬ、Ｔ、Ｖ、ＩまたはＫであり、
Ｘ３３はＶ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３４はＫ、Ｒ、Ｑであるか、または不在であり、
Ｘ３５はＧであるか、または不在であり、
Ｘ３６はＲ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３７はＧであるか、または不在である。
【００８６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は配列番号１８７：Ｈ−Ｘ８−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｘ１２−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｘ２１−Ｇ−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｆ−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７によって定義される配列を有し、ここで、
Ｘ８はＡ、Ｇ、ＷまたはＡｉｂであり、
Ｘ１２はＦまたはＫであり、
Ｘ２１はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２３はＱ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２４はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２５はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２６はＫまたはＲであり、
Ｘ２７はＥ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２９はＩまたはＶであり、
Ｘ３０はＡ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３１はＷ、ＧまたはＫであり、
Ｘ３２はＬ、Ｖ、ＩまたはＫである
Ｘ３３はＶ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３４はＫ、Ｒ、Ｑであるか、または不在であり、
Ｘ３５はＧであるか、または不在であり、
Ｘ３６はＲ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３７はＧであるか、または不在である。
【００８７】
図示するように、本明細書の実施例は４０以上のＧＬＰ−１類似体を含むが、これはＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体の両方を含む化合物の状況においても想定される。これらの類似体は以下の表で特定され、（本明細書で上述するように）野生型残基と比較したアミノ酸の変化が、類似体中に存在するＬｙｓ残基と共に示されている。
【表３】
2020528049.tif 000165
【表３−１】
2020528049.tif 000166
【００８８】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３８〜１８６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００８９】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３８〜１４２および１４４〜１８６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９０】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３８〜１４２および配列番号１４４〜１６６、１６８、１６９〜１８６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９１】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３８〜１４２および１４４〜１６１、１６３〜１６６、１６８、１６９〜１８６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９２】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３８〜１４２および１４５〜１６１、１６３〜１６６、１６８、１６９〜１８６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９３】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３９および１４７〜１５４によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３８および１７４〜１８２および１８４〜１８６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９５】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１６６〜１７０によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１６３〜１６６によって定義される類似体の群から選択される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９７】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１６４によって定義される類似体を含む、またはそれからなる。
【００９８】
《ＥＧＦ（Ａ）類似体》
「ＥＧＦ（Ａ）類似体」という用語は、本明細書ではＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）（配列番号１）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの変異体を指す。本明細書の上記でＧＬＰ−１類似体について記載されたように、類似の命名法がＥＧＦ（Ａ）類似体にも適用される。
【００９９】
「ＬＤＬ−ＲのＥＧＦ（Ａ）ドメイン」、「ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）」、「天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）」、「ＥＧＦ（Ａ）（２９３−３３２）」、「野生型ＥＧＦ（Ａ）」、または「天然ＥＧＦ（Ａ）」という用語は、本明細書において使用される場合、配列番号１からなるペプチドを意味する。
【０１００】
配列番号１は、Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｃｙｓ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｃｙｓ−Ｇｌｕである。
【０１０１】
本出願において、アミノ酸残基の番号付けは、ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの番号付けに従い、最初の（Ｎ末端）アミノ酸残基は位置２９３と番号付けられるか番号を与えられ、その後のアミノ酸残基はＣ末端に向かって２９４、２９５、２９６などと、最後の（Ｃ末端）アミノ酸残基まで番号付けられ、これはＬＤＬ−ＲのＥＧＦ（Ａ）ドメインにおいてはＧｌｕであり、番号は３３２である。
【０１０２】
番号付けは配列リストでは異なる方法で行われ、配列番号１の最初のアミノ酸残基（Ｇｌｙ）には番号１が与えられ、最後のアミノ酸残基（Ｇｌｕ）には番号４０が与えられる。同じ配列表の他の配列に対しても同様であり、すなわち、ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）を参照することによりアミノ酸残基を置換する２９３Ｇｌｙまたは２９３に対するその位置決めに関係なく、Ｎ末端アミノ酸には番号１が割り当てられる。しかしながら、本明細書では、アミノ酸位置の番号付けは、上述した通り、ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）を参照して行う。
【０１０３】
配列番号１との同一性レベルは、配列番号１に対して変化しないアミノ酸の数を求めることによって算出できる。配列番号１は、４０つのアミノ酸残基からなり、３つのアミノ酸置換が導入される場合、同一性レベルは３７／４０％＝９２．５％となる。５つのアミノ酸残基が変化する場合、同一性レベルは８７．５％である。ペプチドがＮ末端またはＣ末端伸長である場合、その部分は通常は比較に含まれないが、１つ以上のアミノ酸の欠失はコンパレータを短縮する。例えば、上記の例では、Ｎ末端アミノ酸が欠失すると、同一性レベルはそれぞれ３６／３９×１００％および３４／３９×１００％にわずかに低下する。誘導体のバックボーン配列の同一性について論じる場合、置換基のアミノ酸残基（例えば、置換基が付着された残基であり、置換基のアミノ酸残基とも呼ばれる）は、野生型（ｗｔ）または置換アミノ酸のいずれかであってもよい。置換基のアミノ酸残基が野生型残基、例えば３１２Ｋである場合、この残基は同一性レベルの計算に含まれるが、位置２９３〜３３２の任意の他の位置におけるＬｙｓはアミノ酸置換であり、配列番号１に対するアミノ酸の同一性を計算する場合に含まれない。
【０１０４】
本発明の各ＥＧＦ（Ａ）類似体は、ｉ）変化したアミノ酸残基（すなわち、天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）内の対応する位置）に対応する天然ＥＧＦ（Ａ）（ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２））内のアミノ酸残基の番号、およびｉｉ）実際の変化を参照することにより説明されうる。
【０１０５】
言い換えると、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）ペプチドを参照して、すなわち、天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）（配列番号１）と比較してアミノ酸残基の数が変化した変異体として記述されうる。これらの変化は、独立して、１つ以上のアミノ酸置換を表し得る。
【０１０６】
以下は、適切な類似体命名法の非限定的な例である。
【０１０７】
本明細書のＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む誘導体の化合物例＃１に組み込まれたＥＧＦ（Ａ）類似体を、以下のＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）類似体と呼ぶことができる：（３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕ、３２１Ｇｌｕ）ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）、または（Ｌｅｕ３０１、Ａｒｇ３０９、Ｇｌｕ３１２、Ｇｌｕ３２１）−ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）または（３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ）ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）または（Ｌ３０１、Ｒ３０９、Ｅ３１２、Ｅ３２１）ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）。これは、この類似体が天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）とアラインメントした時に、ｉ）類似体内の、天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）の位置３０１にアラインメントにより対応する位置にＬｅｕを有し、ｉｉ）類似体内の天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）の位置３０９に対応する位置にＡｒｇを有し、ｉｉｉ）類似体の天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）の位置３１２に対応する位置にＧｌｕを有し、ｉｖ）類似体の天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）の位置３２１に対応する位置にＧｌｕを有することを意味する。
【０１０８】
「〜に等しい位置」または「対応する位置」という表現は、参照配列の天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）（配列番号１）を参照して変異体ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）配列の変化部位を特徴付けるために使用されうる。
【０１０９】
等しいまたは対応する位置だけでなく、変化の数も、例えば、単純な計算によって容易に推定でき、かつ／またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムに基づく「アラインメント」などの標準タンパク質アラインメントプログラムまたはペプチドアラインメントプログラムを使用してもよい。
【０１１０】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して１〜１５のアミノ酸置換を有する。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して１〜１０のアミノ酸置換を有する。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して、１〜８のアミノ酸置換、例えば１〜７、１〜６、１〜５のアミノ酸置換を有する。特定の実施形態では、最大７つのアミノ酸置換が存在してもよく、例えば、最大６、５、４、３、２または１つのアミノ酸置換がＥＧＦ（Ａ）類似体に存在してもよい。
【０１１１】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１に対して少なくとも７５％の同一性、例えば８０％、８５％、９０％、または９５％の同一性を有する。一実施形態では、欠失／切断がない場合、これは配列番号１に対してそれぞれ最大１０、８、６、４および２つのアミノ酸置換に対応する。
【０１１２】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１に対して少なくとも９０％の同一性、例えば９２％、９４％、９６％、または９８％の同一性を有する。
【０１１３】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、少なくとも３５、例えば３６、３７、３８、３９または少なくとも４０のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、３６、例えば３８または４０のアミノ酸から構成される。追加的な特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、３５、３６、３７、３８、３９または４０つのアミノ酸からなる。
【０１１４】
本明細書においてＮ末端およびＣ末端伸長と呼ばれるアミノ酸添加が存在する場合、ＥＧＦ（Ａ）類似体は最大６０つのアミノ酸を含みうる。特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３５〜６０、３８〜５５、４０〜５０、４０〜４５、４０〜４２または４０〜４１のアミノ酸を含む。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、４０または４１のアミノ酸残基からなる。
【０１１５】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、アミノ酸残基３０１のＡｓｎからＬｅｕへのアミノ酸置換を含み、これはＡｓｎ３０１Ｌｅｕまたは単に３０１Ｌｅｕとも呼ばれる。特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は置換３０１Ｌｅｕを含む。
【０１１６】
加えて、または別の方法として、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、アミノ酸残基２９７Ｃｙｓ、３０４Ｃｙｓ、３０８Ｃｙｓ、３１７Ｃｙｓ、３１９Ｃｙｓ、および３３１Ｃｙｓを含む。これらのＣｙｓ残基はジスルフィド架橋、例えば２９７Ｃｙｓと３０８Ｃｙｓの間、３０４Ｃｙｓと３１７Ｃｙｓの間、３１９Ｃｙｓと３３１Ｃｙｓとの間のジスルフィド架橋に関与しうる野生型残基である。
【０１１７】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、以下に記載するように３０１Ｌｅｕおよび多数のさらなるアミノ酸置換を含む。
【０１１８】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０１Ｌｅｕ、３１０Ａｓｐ、および３１２Ｌｙｓのアミノ酸置換を含む。
【０１１９】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０１Ｌｅｕおよび３１０Ａｓｐを含み、類似体は２９９ＡｓｐのＧｌｕ、ＶａｌまたはＨｉｓへの置換を有していない。
【０１２０】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３１２Ｇｌｕを含む。
【０１２１】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕおよび３２１Ｇｌｕを含む。
【０１２２】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０１Ｌｅｕおよび３０９Ａｒｇを含むが、類似体は３１０Ａｓｐの３１０Ｌｙｓへの置換を有さないことを条件とする。
【０１２３】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０１Ｌｅｕおよび３０９Ａｒｇを含むが、類似体は２９９ＡｓｐのＧｌｕ、ＶａｌまたはＨｉｓへの置換を有さないことを条件とする。
【０１２４】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、置換Ｄ３１０Ｋ、Ｄ３１０Ｎ、Ｄ３１０Ｑ、Ｄ３１０Ｑ、Ｄ３１０ＲおよびＤ３１０Ａ、またはさらには３１０Ａｓｐへの置換を持たない。
【０１２５】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９５Ａｓｎ、２９６Ｇｌｕ、２９８Ｌｅｕおよび３０２Ｇｌｙのうち１つ、２つ、３つまたは４つすべての野生型残基を含む。
【０１２６】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９５Ａｓｎ、２９６Ｇｌｕ、２９８Ｌｅｕ、３０２Ｇｌｙおよび３１０Ａｓｐのうち１つ、２つ、３つ、４つまたは５つすべての野生型残基を含む。
【０１２７】
一実施形態では、ペプチドは２９５Ａｓｎを有する。
【０１２８】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は２９６Ｇｌｕを有する。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は２９８Ｌｅｕを有する。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３０２Ｇｌｙを有する。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３１０Ａｓｐを有する。
【０１２９】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、３１０Ａｓｐ、２９５Ａｓｎおよび２９６Ｇｌｕのうちの２つ以上を有する。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、３１０Ａｓｐ、２９５Ａｓｎおよび２９６Ｇｌｕの３つすべてを有する。
【０１３０】
ＥＧＦ（Ａ）類似体は、本明細書に記載するようにさらなるアミノ酸置換を含んでいてもよい。一実施形態では、類似体は、位置２９３、２９４、２９６、２９９、３００、３０３、３０５、３０６、３０９、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１８、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２８、３２９、３３０および３３２の群から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換をさらに含んでもよい。
【０１３１】
一実施形態では、類似体は、位置２９３、２９４、２９９、３００、３０３、３０５、３０６、３０９、３１１、３１２、３１３、３１４、３１６、３１８、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２８、３２９、３３０、３３１および３３２の群から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換をさらに含んでもよい。
【０１３２】
一実施形態では、類似体は、位置２９４、２９９、３００、３０３、３０９、３１２、３１３、３１４、３１６、３１８、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２８、３２９、３３０および３３２の群から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換をさらに含んでもよい。
【０１３３】
一実施形態では、類似体は、位置２９９、３００、３０９、３１３、３１６、３１８、３２１、３２２、３２３、３２４、３２６、３２８、３２９、３３０および３３２の群から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換をさらに含んでもよい。
【０１３４】
一実施形態では、類似体は、位置３０９、３１２、３１３、３２１、３２４、３２８および３３２の群から選択される位置における１つ以上のアミノ酸置換をさらに含んでもよい。
【０１３５】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、本明細書の上記で明記したアミノ酸残基に加え、特定の位置において、野生型アミノ酸残基または異なる残基（すなわち、アミノ酸置換）のいずれかを含む。
【０１３６】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置２９３にアミノ酸残基Ｇｌｙ（Ｇ）またはＡｓｎ（Ｎ）を含む。
【０１３７】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置２９４にアミノ酸残基Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｈｒ（Ｔ）またはＧｌｙ（Ｇ）を含む。
【０１３８】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置２９９にアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｒ（Ｙ）またはＴｒｐ（Ｗ）を含む。
【０１３９】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置２９９にアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｙｅ（Ｙ）、及びＴｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｅ（Ｙ）、またはＴｒｐ（Ｗ）を含む。
【０１４０】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置２９９にアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｌｙｓ（Ｋ）またはＴｙｒ（Ｙ）を含む。
【０１４１】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置２９９にアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）またはＡｌａ（Ａ）を含む。
【０１４２】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３００にアミノ酸残基Ｈｉｓ（Ｈ）またはＡｓｎ（Ｎ）を含む。
【０１４３】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０７にアミノ酸残基Ｖａｌ（Ｖ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）またはＩｌｅ（Ｉ）を含む。
【０１４４】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０７にアミノ酸残基Ｖａｌ（Ｖ）またはＩｌｅ（Ｉ）を含む。
【０１４５】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０７にＳｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）またはＩｌｅ（Ｉ）を含む。
【０１４６】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０７にＩｌｅ（Ｉ）を含む。
【０１４７】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０９にアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＬｙｓ（Ｋ）を含む。
【０１４８】
こうした一実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０９にアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｓｅｒ（Ｓ）またはＬｙｓ（Ｋ）を含む。
【０１４９】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０９にアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｒｇ（Ｒ）またはＳｅｒ（Ｓ）を含む。
【０１５０】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０９にアミノ酸残基Ａｓｎ（Ｎ）またはＡｒｇ（Ｒ）を含む。
【０１５１】
こうした一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３０９にアミノ酸残基Ｌｙｓ（Ｋ）またはＡｒｇ（Ｒ）を含む。
【０１５２】
ＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９９Ａｌａ、３０７Ｉｌｅおよび３２１Ｇｌｕの群から選択される１つ以上のアミノ酸置換など、本明細書に記載するようにいくつかのアミノ酸置換を含みうる。
【０１５３】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３２１にアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌｙｓ（Ｋ）またはＧｌｕ（Ｅ）を含む。
【０１５４】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３２１にアミノ酸残基Ａｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）を含む。
【０１５５】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３２１にアミノ酸残基Ｇｌｕ（Ｅ）を含む。
【０１５６】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３２４にアミノ酸残基Ｇｌｎ（Ｑ）またはＧｌｙ（Ｇ）を含む。
【０１５７】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、位置３２９にアミノ酸残基Ａｒｇ（Ｒ）またはＨｉｓ（Ｈ）を含む。
【０１５８】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、３００Ａｓｎ（Ｎ）のＰｒｏ（Ｐ）への置換を有さない。
【０１５９】
ＬＤＬ−ＲのＥＧＦ（Ａ）ドメインは、本明細書に記載するように置換にとって有用でありうるリジンを位置３１２に含む。置換基の３１２への付着が望まれない実施形態では、本明細書に記載するように、別のアミノ酸によって３１２Ｌｙｓを置換してもよい。
【０１６０】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体はＬｙｓ残基を含まない。
【０１６１】
一実施形態では、位置３１２におけるＬｙｓは、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、ＰｈｅおよびＴｙｒから選択されるアミノ酸残基で置換される。一実施形態では、位置３１２におけるＬｙｓは、Ｇｌｙ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅおよびＴｙｒから選択されるアミノ酸残基で置換される。一実施形態では、位置３１２におけるＬｙｓは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅおよびＴｙｒから選択されるアミノ酸残基で置換される。一実施形態では、３１２Ｌｙｓは、３１２Ａｓｐ、３１２Ｇｌｕ、３１２Ｔｈｒ、３１２Ａｓｎ、３１２Ｉｌｅ、または３１２Ｐｈｅで置換される。一実施形態では、３１２Ｌｙｓは、３１２Ｇｌｕ、３１２Ａｓｐ、３１２Ｇｌｎまたは３１２Ａｒｇで置換される。
【０１６２】
一実施形態では、３１２Ｌｙｓは、３１２Ｇｌｕ、３１２Ｔｈｒ、３１２Ａｓｎ、３１２Ｉｌｅ、３１２Ｐｈｅまたは３１２Ｔｙｒで置換される。一実施形態では、３１２Ｌｙｓは３１２Ｇｌｕ、３１２Ａｓｎまたは３１２Ｉｌｅで置換される。
【０１６３】
一実施形態では、３１２Ｌｙｓは３１２Ｇｌｕまたは３１２Ａｒｇで置換される。一実施形態では、３１２Ｌｙｓは３１２Ａｒｇで置換される。一実施形態では、３１２Ｌｙｓは３１２Ｇｌｕで置換される。
【０１６４】
様々な位置で置換基を付着するオプション（以下を参照）を含むために、配列番号１の野生型残基のアミノ酸置換によって、または配列番号１のペプチド伸長、例えば２９２Ｌｙｓもしくは３３３Ｌｙｓなどによって、Ｌｙｓを導入してもよい。
【０１６５】
複数の置換基が望ましい場合、１つ目は３１２Ｌｙｓを介して、２つ目は配列番号１におけるペプチド伸長または置換によって導入されたＬｙｓを介して行うことができる。
【０１６６】
一実施形態では、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９６Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓおよび３３３Ｌｙｓの群から選択される位置において、少なくとも１つのＬｙｓ残基を含む。
【０１６７】
一実施形態では、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓおよび３３３Ｌｙｓの群から選択される位置において、少なくとも１つのＬｙｓ残基を含む。
【０１６８】
一実施形態では、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓおよび３３３Ｌｙｓの群から選択される位置において、少なくとも１つのＬｙｓ残基を含む。
【０１６９】
一実施形態では、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓおよび３３３Ｌｙｓの群から選択される位置において、少なくとも１つのＬｙｓ残基を含む。
【０１７０】
一実施形態では、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓおよび３３３Ｌｙｓの群から選択される位置において、少なくとも１つのＬｙｓ残基を含む。
【０１７１】
加えて、または別の方法として、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９５Ｌｙｓ、２９６Ｌｙｓ、２９８Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０１Ｌｙｓ、３０２Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０７Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１０Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７２】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９５Ｌｙｓ、２９６Ｌｙｓ、２９８Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０２Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０７Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７３】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９５Ｌｙｓ、２９６Ｌｙｓ、２９８Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７４】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９５Ｌｙｓ、２９６Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７５】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体ペプチドは、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９６Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７６】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７７】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７８】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３１０Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１７９】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１０Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。
【０１８０】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３１０Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓ、および３３３Ｌｙｓから選択される、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む。一実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は２９６Ｋ、２９８Ｋ、３０１Ｋ、３０２Ｋおよび３０７Ｋの置換のいずれも含まない。
【０１８１】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は２９６Ｋ、２９８Ｋ、３０１Ｋ、３０２Ｋ、３０７Ｋおよび３１０Ｋの置換のいずれかを含む。
【０１８２】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は２９６Ｋ、２９８Ｋ、３０１Ｋ、３０２Ｋ、３０７Ｋおよび２９５Ｋの置換のいずれかを含む。
【０１８３】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は２９６Ｋ、２９８Ｋ、３０１Ｋ、３０２Ｋ、３０７Ｋおよび２９５Ｄの置換のいずれかを含む。
【０１８４】
特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、かかるＬｙｓ置換の１つまたは２つを含む。
【０１８５】
加えて、または別の方法として、ＥＧＦ（Ａ）類似体は３１２Ｌｙｓを含みうる。
【０１８６】
一実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は２つのＬｙｓ残基を含む。一実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、以下からなる対から選択される２つのＬｙｓ残基を含む。
【表４】
2020528049.tif 000167
【０１８７】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して以下に示されるＩ〜ＸＸＩＶの群のいずれかによって特定される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。
【０１８８】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、以下に示されるＩ〜ＸＸＩＶの群のいずれかによって特定されるアミノ酸置換からなる。
【０１８９】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して以下に示されるＩ〜ＸＶＩの群のいずれかによって特定される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。
【０１９０】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、以下に示されるＩ〜ＸＶＩの群のいずれかによって特定されるアミノ酸置換からなる：
Ｉ．３０１Ｌｅｕおよび３０９Ａｒｇ
ＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕ
ＩＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅおよび３０９Ａｒｇ
ＩＶ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇおよび３１２Ｇｌｕ
Ｖ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３２１Ｇｌｕ
ＶＩ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３２１Ｇｌｕおよび３１２Ｇｌｕ
ＶＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇおよび２９９Ａｌａ
ＶＩＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇ、２９９Ａｌａおよび３１２Ｇｌｕ
ＩＸ．３０１Ｌｅｕおよび３０９Ａｒｇ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換
Ｘ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換
ＸＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換
ＸＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇおよび３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換
ＸＩＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３２１Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換
ＸＩＶ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３２１Ｇｌｕおよび３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換
ＸＶ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇおよび２９９Ａｌａ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換、または
ＸＶＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅ、３０９Ａｒｇ、２９９Ａｌａおよび３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換。
【０１９１】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）ペプチド類似体は、以下のいずれかにより特定されるアミノ酸置換を含む、またはそれからなる：
Ｖ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇおよび３２１Ｇｌｕ
ＶＩ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３２１Ｇｌｕおよび３１２Ｇｌｕ
ＸＩＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換、または
ＸＩＶ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ａｒｇ、３２１Ｇｌｕおよび３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのＬｙｓ置換。
【０１９２】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して以下に示されるＸＶＩＩ〜ＸＸの群のいずれかによって特定される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。
【０１９３】
なおもさらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して以下に示すようにＸＶＩＩ〜ＸＸの群のいずれかによって特定されるアミノ酸置換からなる：
ＸＶＩＩ．３０１Ｌｅｕおよび３０９Ｌｙｓ
ＸＶＩＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ｌｙｓおよび３１２Ｇｌｕ
ＸＩＸ．３０１Ｌｅｕおよび３０９Ｌｙｓ、ならびに少なくとも１つのさらなるＬｙｓ置換
ＸＸ．３０１Ｌｅｕ、３０９Ｌｙｓおよび３１２Ｇｌｕ、および少なくとも１つのさらなるＬｙｓ置換。
【０１９４】
さらなる実施形態では、本発明によるＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して、以下に示されるＸＸＩ〜ＸＸＩＶの群のいずれかによって特定される少なくとも２つのアミノ酸置換を含む。
【０１９５】
さらなる実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１と比較して、以下のＸＸＩ〜ＸＸＩＶの群のいずれかによって特定されるアミノ酸置換からなる：
ＸＸＩ．３０１Ｌｅｕおよび３０７Ｉｌｅ
ＸＸＩＩ．３０１Ｌｅｕ、３０７Ｉｌｅおよび３１２Ｇｌｕ
ＸＸＩＩＩ．３０１Ｌｅｕおよび３０７Ｉｌｅ、ならびに少なくとも１つのさらなるＬｙｓ置換、および
ＸＸＩＶ．３０１Ｌｅｕ、３３０７Ｉｌｅおよび３１２Ｇｌｕ、ならびに少なくとも１つのさらなるＬｙｓ置換。
【０１９６】
さらなる特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１〜１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０１９７】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号２〜１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０１９８】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号２〜４７および４９〜１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０１９９】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号２〜４４、４６、４７および４９〜１１４のいずれかによって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０２００】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号２〜４４、４６、４７、４９〜５３、５５、５８〜１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０２０１】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号２〜４、６〜４４、４６、４７、４９〜５３、５５、５８〜１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０２０２】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号２〜４、６〜１９、２１〜４４、４６、４７、４９〜５３、５５、５８〜１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０２０３】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１９、２１、７３、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０２０４】
一実施形態では、上述のＥＧＦ（Ａ）類似体はＬｙｓ残基を含まず、従ってＥＧＦ（Ａ）類似体は配列番号５、６、２３、２６、４９、５０、１０７〜１１１によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含むか、またはそれからなる。
【０２０５】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号５、６、２３、２６、４９、５０または１０７によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含む、またはそれからなる。
【０２０６】
１つの好ましい実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、３１２Ｋ残基の突然変異、３２１Ｄ残基の両方を含み、Ｌｙｓ残基を有さず、例えばＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１０８、１０９、１１０または１１１によって特定されるアミノ酸配列のいずれかを含むか、またはそれからなる。
【０２０７】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１０８によって特定されるアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
【０２０８】
本明細書の例は、様々なＥＧＦ（Ａ）類似体を提供しており、これらを、アミノ酸置換、Ｌｙｓ残基、および配列番号に関する情報を含めて以下の表に記載する。
【表５】
2020528049.tif 000168
【表５−１】
2020528049.tif 000169
【表５−２】
2020528049.tif 000170
【表５−３】
2020528049.tif 000171
【表５−４】
2020528049.tif 000172
【表５−５】
2020528049.tif 000173
【表５−６】
2020528049.tif 000174
【表５−７】
2020528049.tif 000175
【０２０９】
《融合ポリペプチド》
【０２１０】
一態様では、本発明は、ＧＬＰ−１類似体のアミノ酸配列およびＥＧＦ（Ａ）類似体のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドに関する。本明細書において前述したように、ＧＬＰ−１の類似体は、（７−３７）（配列番号１３７）の変異体を指し、ＥＧＦ（Ａ）の類似体は、ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメイン（配列番号１）の変異体を指す。
【０２１１】
融合ポリペプチドは、本明細書の以下で述べるように誘導体の調製のためにさらに考慮され介在してもよい。本発明の誘導体を参照するとき、融合ポリペプチドはバックボーンまたはペプチドバックボーンと呼ぶことができる。
【０２１２】
融合タンパク質または融合ポリペプチドの調製は、当該技術分野で周知である。共通の一般知識に従って異種発現により、融合タンパク質を産生するために、適切な宿主内での融合ポリペプチドを発現するための組み換えベクターを調製および使用してもよい（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、１９８９、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）。別の方法として、より短いポリペプチドを固相ペプチド合成によって頻繁に生成し、延長された長さのペプチドを合成的に生成することができる。ペプチド要素を別個に生成し、その後で天然化学ライゲーションに供して完全な融合ポリペプチドを生成することもできる。
【０２１３】
２つのペプチド断片を融合させる場合、その順序は結果得られる融合ポリペプチドの機能およびそれを含む化合物に影響を与える場合がある。
【０２１４】
本発明による一実施形態では、Ｎ末端から始まるＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体の順序は、ＧＬＰ−１類似体の後に任意選択的にスペーサーペプチドによって分離されたＥＧＦ（Ａ）類似体が続く（以下参照）。ＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１類似体のＣ末端を介してＥＧＦ（Ａ）類似体と融合すること言うこともできる。
【０２１５】
別の実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、ＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端を介してＥＧＦ（Ａ）類似体と融合され、Ｎ末端にＥＧＦ（Ａ）類似体を配置する。結果得られた融合ポリペプチドは、「バックボーン」または「ペプチドバックボーン」という用語で呼ぶことができ、以下に記載するように、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体の両方、ならびに任意選択的にスペーサーペプチドを含むポリペプチド鎖を定義する。
【０２１６】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、配列番号１３８〜１８７によって定義される類似体のいずれかを含め、本明細書の上記で定義されるＧＬＰ−１類似体を含む。
【０２１７】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、配列番号２〜１１４によって定義される類似体のいずれかを含め、本明細書の上記で定義されるＥＧＦ（Ａ）類似体を含む。
【０２１８】
《スペーサー》
融合ポリペプチドは、２つのペプチドの末端に存在する任意の機能が他のペプチドが近くにあることによって妨げられないようにスペーサーを含むことが多い。一実施形態では、スペーサーはペプチドであり、本明細書ではスペーサーペプチドまたはペプチドスペーサーと呼ばれる。様々なスペーサーペプチドが当該技術分野で周知であり、融合ポリペプチドを得るためにＧＬＰ−１類似体とＥＧＦ（Ａ）類似体との間に配置されてもよい。上述のように、結果得られる融合ポリペプチド（スペーサーを含む）は、合成的または異種発現によって生成されうる。
【０２１９】
スペーサーペプチドは、４〜８０のアミノ酸の通常のペプチド断片である。
【０２２０】
本明細書で使用されるこのようなペプチドの例を以下に記載する。
【表６】
2020528049.tif 000176
【０２２１】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、ペプチドスペーサーを含み、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１３６によって特定されるペプチドから選択される配列を含む。
【０２２２】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、配列番号１１５〜１３６によって特定されるペプチドスペーサーの群から選択されるペプチドスペーサーを含む。
【０２２３】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、１つ以上のＧＱＡＰの断片、例えば１〜２０、例えば１〜１０、例えば１〜６、例えば１、２、３、４または５つのＧＱＡＰ断片を含むペプチドスペーサーを含む。
【０２２４】
一実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１２８によって特定されるペプチドの群から選択されるペプチドスペーサーを含む。
【０２２５】
一実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１２８によって特定される配列から選択される。
【０２２６】
一実施形態では、ペプチドスペーサーはＬｙｓ残基を含まない。
【０２２７】
一実施形態では、ペプチドスペーサーはＬｙｓ残基を含む。
【０２２８】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、１つ以上のＧＱＡＰの断片を含むペプチドスペーサーを含み、Ｌｙｓ残基はアミノ酸置換によって導入される。さらなるこうした実施形態では、スペーサーは、配列番号１２１〜１２８によって特定される配列の群から選択されうる。
【０２２９】
一実施形態では、本発明の化合物、融合ポリペプチドおよびその誘導体は、グリシンが豊富なペプチドスペーサー、例えば、アミノ酸残基の少なくとも半分がＧｌｙ、アミノ酸残基の少なくとも３／４がＧｌｙであるペプチドスペーサーなどを含む。このような実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１３０〜１３６によって特定されるペプチドから選択されてもよい。
【０２３０】
さらなる実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１１７および１２１〜１３６によって特定されるペプチドの群から選択される。
【０２３１】
さらなる実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１１７および１２１〜１２８によって特定されるペプチドの群から選択される。
【０２３２】
一実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１２８によって特定される配列から選択される。
【０２３３】
さらなる実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１５〜１１７によって特定されるペプチドの群から選択される。さらなる実施形態では、ペプチドスペーサーは、配列番号１１６によって特定される。
【０２３４】
本発明による融合ポリペプチド（ペプチドバックボーン）の複数の例が実施例で提供されており、すべての要素、すなわち、ＧＬＰ−１類似体、ＥＧＦ（Ａ）類似体およびペプチドスペーサーの多様性を示す。
【０２３５】
一実施形態では、本発明の誘導体の融合ポリペプチドまたはバックボーン配列は、本明細書に定義されるようにＧＬＰ−１類似体、ＥＧＦ（Ａ）類似体およびペプチドスペーサーからなる。
【０２３６】
出願の実施例は、ペプチドバックボーンなどのこのような融合ポリペプチドを含め、複数のこのような融合ポリペプチドおよび誘導体を含む。融合ポリペプチドの同一性は、個別の要素、すなわち、融合ポリペプチドを共に形成するＧＬＰ−１類似体、ＥＧＦ（Ａ）類似体、およびペプチドスペーサーの配列から推定することができ、これらには以下の表に従って個別に配列番号が割り当てられている。
【表７】
2020528049.tif 000177
【表７−１】
2020528049.tif 000178
【表７−２】
2020528049.tif 000179
【表７−３】
2020528049.tif 000180
【表７−４】
2020528049.tif 000181
【表７−５】
2020528049.tif 000182
【表７−６】
2020528049.tif 000183
【表７−７】
2020528049.tif 000184
【表７−８】
2020528049.tif 000185
【表７−９】
2020528049.tif 000186
【表７−１０】
2020528049.tif 000187
【表７−１１】
2020528049.tif 000188
【表７−１２】
2020528049.tif 000189
【表７−１３】
2020528049.tif 000190
【表７−１４】
2020528049.tif 000191
【０２３７】
ＧＬＰ−１類似体のＣ末端がＥＧＦ（Ａ）類似体にある例
【表８】
2020528049.tif 000192
【０２３８】
一実施形態では、本発明は、配列番号１８８〜３８４、３８６〜３８７によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２３９】
一実施形態では、本発明は、配列番号１８８〜３８４によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４０】
一実施形態では、本発明は、配列番号１９３、２２６〜２３３および３８１〜３８４によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４１】
一実施形態では、本発明は、配列番号３７９〜３８０によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４２】
一実施形態では、本発明は、配列番号１９３、２１９および２２０によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４３】
一実施形態では、本発明は、配列番号１８９、１９３、２００〜２０３および２１２〜２１８によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４４】
一実施形態では、本発明は、配列番号２２２〜２２５によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４５】
一実施形態では、本発明は、配列番号２２４〜２２５によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４６】
一実施形態では、本発明は、配列番号１９２〜１９６によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４７】
一実施形態では、本発明は、配列番号２２１、２３６、２５０、２６４、２７６、２７９、２９１、２９４、３０６、３０７、３１０、３２４、３３６、３３９、３５１、３５２、３５３、３５６、３６８および３６９によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４８】
一実施形態では、本発明は、配列番号２２１、２５０、２７６、２７９、２９１、２９４、３０６、３０７、３１０、３２４、３３６、３５１、３５３、３５６、３６８および３６９によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２４９】
一実施形態では、本発明は、配列番号２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、３１０および３８６によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１７、２１８、２２１、３１０および３８６によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２１７、２１８、３１０および３８６によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、配列番号２２１、３１０および３８６によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３１０および３８６によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。一実施形態では、本発明は、配列番号３１０によって定義される融合ポリペプチドに関する。
【０２５０】
一実施形態では、本発明は、配列番号１８８および３７０〜３７８によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２５１】
一実施形態では、本発明は、配列番号１９０、１９１、１９７、１９８および１９９によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２５２】
一実施形態では、本発明は、配列番号２０４〜２１１によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２５３】
一実施形態では、本発明は、配列番号２４０〜２４７、２５４〜２６１、２６８〜２７５、２８３〜２９０、２９８〜３０５、３１４〜３２１、３２８〜３３５、３４３〜３５０および３６０〜３６７によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２５４】
一実施形態では、本発明は、配列番号２３４〜２３５、２３７〜２３９、２４８〜２４９、２５１〜２５３、２６２〜２６３、２６５〜２６７、２７７〜２７８、２８０〜２８２、２９２〜２９３、２９５〜２９７、３０８〜３０９、３１１〜３１３、３２２〜３２３、３２５〜３２７、３３７〜３３８、３４０〜３４２、３５４〜３５５および３５７〜３５９によって定義される融合ポリペプチドの群から選択される融合ポリペプチドに関する。
【０２５５】
一実施形態では、本発明は、厳密に１つのＬｙｓ残基を含む融合ポリペプチドに関する。
【０２５６】
一実施形態では、本発明は、最大２つのＬｙｓ残基を含む融合ポリペプチドに関する。
【０２５７】
一実施形態では、本発明は、２つのＬｙｓ残基を含む融合ポリペプチドに関する。
【０２５８】
一実施形態では、本発明は、本明細書の以下でさらに述べるように、配列番号１８８〜３８４で定義される融合ポリペプチドまたはペプチドバックボーン、または上記で定義された融合ポリペプチドによって定義されるいずれかを含む誘導体に関する。
【０２５９】
《ＧＬＰ−１機能》
受容体作動薬は、受容体に結合し天然リガンドの典型的な応答を引き出す類似体として定義されうる。完全な作動薬は、天然リガンドと同じ度合いの応答を引き出す作動薬と定義されうる（例えば、『Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ』ＡＬ  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，ＤＬ  Ｎｅｌｓｏｎ，ＭＭ  Ｃｏｘ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９３，７６３ページを参照）。
【０２６０】
従って、例えば、「ＧＬＰ−１受容体作動薬」は、ＧＬＰ−１受容体に結合する能力があり、かつＧＬＰ−１受容体を活性化する能力がある化合物と定義されうる。
【０２６１】
また、「完全な」ＧＬＰ−１受容体作動薬は、天然ＧＬＰ−１に類似する度合いのＧＬＰ−１受容体応答を引き出す能力があるＧＬＰ−１受容体作動薬と定義されうる。
【０２６２】
一実施形態では、本発明のＧＬＰ−１類似体は、ＧＬＰ−１受容体作動薬である。一部の実施形態では、本発明のＧＬＰ−１類似体は、完全なＧＬＰ−１受容体作動薬である。一部の実施形態では、本発明の二機能性化合物は、ＧＬＰ−１受容体作動薬である。一部の実施形態では、本発明の二機能性化合物は、完全なＧＬＰ−１受容体作動薬である。一部の実施形態では、本発明の誘導体は、ＧＬＰ−１受容体作動薬である。一部の実施形態では、本発明の誘導体は、完全なＧＬＰ−１受容体作動薬である。
【０２６３】
当然ながら、ＧＬＰ−１受容体作動薬は、化合物、すなわち、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物がＧＬＰ−１受容体に結合してシグナル伝達経路を開始し、当該技術分野で周知のインスリン分泌促進作用またはその他の生理学的効果を生むことのできる能力を意味する「ＧＬＰ−１活性」を示すべきである。例えば、本明細書の方法セクションＣに記載するＧＬＰ−１効力アッセイを使用して、ＧＬＰ−１活性について、ＧＬＰ−１類似体、二機能性化合物およびその誘導体を試験することができる。一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物、すなわち、ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）融合ポリペプチドおよびその誘導体を含む化合物は、ＧＬＰ−１活性を有する。
【０２６４】
５０％最大有効濃度（ＥＣ５０）という用語は、一般的に、用量反応曲線をベースラインして、ベースラインと最大の中間にあたる反応を導く濃度を意味する。ＥＣ５０は化合物の効力の尺度として使用され、最大効果の５０％が観察される濃度を表す。
【０２６５】
ＧＬＰ−１類似体およびＧＬＰ−１類似体を含む化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を、上述のように決定してもよく、またＥＣ５０により決定してもよい。ＥＣ５０の数値が低いほど、効力が高い。
【０２６６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物は、Ｃ１（ＨＳＡなし）に記載するｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて、最高で５０ｐＭ、５０〜１００ｐＭ、１００〜２５０ｐＭまたは２５０〜１０００ｐＭのＧＬＰ−１のＥＣ５０を有する。一実施形態では、ＥＣ５０は最大で５００ｐＭ、例えば最大で３００ｐＭ、例えば最大で２００ｐＭである。一実施形態では、ＥＣ５０はヒトＧＬＰ−１（７−３７）と同等であり、例えば最大で５０ｐＭである。さらなる実施形態では、ＥＣ５０は最大で４０ｐＭ、例えば最大で３０ｐＭ、例えば最大で２０ｐＭ、例えば最大で１０ｐＭである。ＥＣ５０が約１０ｐＭの化合物の高い効力は、セマグルチド分子の効力と同等である。
【０２６７】
本明細書の他の箇所で述べるように、ＧＬＰ−１の効力は、ＥＧＦ（Ａ）類似体の効力と釣り合わせる必要があり、そのため、一部の実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の効力が、セマグルチドと比較して少なくとも２倍、例えばセマグルチドと比較して少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、セマグルチドと比較して少なくとも１００倍減少するように、セマグルチドの効力よりも低いＧＬＰ−１効力を提供するＧＬＰ−１類似体を含むことが好ましい場合がある。野生型ＧＬＰ−１と比較して効力を減少させることが好ましい場合がある。
【０２６８】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ１に記載する通り測定された）ＥＣ５０は、少なくとも２５ｐＭ、例えば少なくとも５０ｐＭ、例えば少なくとも７５ｐＭ、例えば少なくとも１００ｐＭ、例えば少なくとも２５０ｐＭ、または例えば少なくとも５００ｐＭである。
【０２６９】
このような実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ１）に記載する通り測定されたＥＣ５０は最大で５００ｐＭ、例えば最大で４００ｐＭ、例えば最大で３００ｐＭ、例えば最大で２００ｐＭ、例えば最大で１００ｐＭ、例えば最大で５０ｐＭである。
【０２７０】
さらなる実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ１に記載する通り測定された）ＥＣ５０は２０〜１０００ｐＭ、例えば５０〜５００ｐＭ、例えば１００〜２５０ｐＭ、例えば７５〜１００ｐＭである。
【０２７１】
さらなる実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ１に記載する通り測定された）ＥＣ５０は２０〜８００ｐＭ、例えば２０〜６００ｐＭ、例えば２０〜４００ｐＭ、例えば２０〜２００ｐＭ、または例えば２０〜１００ｐＭである。
【０２７２】
別の方法として、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ１に記載する通り測定された）ＥＣ５０は２００〜１０００ｐＭ、例えば３００〜８００ｐＭ、または例えば４００〜６００ｐＭ、または例えば２５０〜７５０ｐＭ、または例えば３００〜５００ｐＭである。
【０２７３】
上記の効力についての検討は、ＨＳＡが存在する中で効力を評価する場合も妥当性がある。
【０２７４】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（１％のＨＳＡを用いてＣ１に述べるように測定された）ＥＣ５０は少なくとも５００ｐＭ、例えば少なくとも７５０ｐＭ、例えば少なくとも１０００ｐＭ、例えば少なくとも１５００ｐＭ、例えば少なくとも２０００ｐＭである。
【０２７５】
このような実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（１％ＨＳＡを用いてＣ１で述べるように測定された）ＥＣ５０は最大で２５００ｐＭ、例えば最大で２０００ｐＭ、例えば最大で１５００ｐＭ、例えば最大で１２５０ｐＭ、例えば最大で１０００ｐＭである。
【０２７６】
さらなる実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（１％ＨＳＡを用いてＣ１に述べるように測定された）ＥＣ５０は５００〜２５００ｐＭ、例えば５００〜２０００ｐＭ、例えば５００〜１５００ｐＭ、例えば５００〜１０００ｐＭである。
【０２７７】
さらなる実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（１％ＨＳＡを用いてＣ１に述べるように測定された）ＥＣ５０は７５０〜２５００ｐＭ、例えば１０００〜２５００ｐＭ、１５００〜２５００ｐＭ、２０００〜２５００ｐＭ、または１８００〜２５００ｐＭである。
【０２７８】
別の方法として、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（１％ＨＳＡを用いてＣ１で述べるように測定された）ＥＣ５０は５００〜２５００ｐＭ、例えば７５０〜２０００ｐＭ、または例えば１０００〜２０００ｐＭ、または例えば１５００〜２０００ｐＭである。ＧＬＰ−１の効力は、例えば限定するわけではないが吐き気などのＧＬＰ−１関連の副作用を減少させつつ、ＰＣＳＫ９への完全な結合を可能にするために減少させることができる。
【０２７９】
ＧＬＰ−１類似体およびＧＬＰ−１類似体を含む化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合親和性を、別の方法として、Ｃ２で説明するようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイで試験してもよく、または野生型ＧＬＰ−１またはセマグルチドと同等の機能性を有する化合物の親和性は、低ＨＳＡの存在下で試験した場合には１ｎＭ前後である。
【０２８０】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ結合アッセイにおけるＩＣ５０は、最大で２００ｎＭであり、さらなる実施形態では、ＩＣ５０は最大で１００ｎＭ、例えば最大で７５ｎＭ、例えば最大で５０ｎＭ、例えば最大で２５ｎＭ、例えば最大で１０ｎＭ、例えば最大で５ｎＭである。一部の実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の結合を、セマグルチドと比較して少なくとも５倍、例えばセマグルチドと比較して少なくとも１０倍、少なくとも２５倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍減少させるように、セマグルチドの結合よりも低い結合を有することが好ましい場合がある。野生型ＧＬＰ−１と比較して結合親和性を減少させることが好ましい場合さえもある。
【０２８１】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしでＣ２に述べるように測定された）ＩＣ５０は少なくとも１ｎＭ、例えば少なくとも５ｎＭ、例えば少なくとも１０ｎＭ、例えば少なくとも２５ｎＭ、例えば少なくとも５０ｎＭ、例えば少なくとも１００ｎＭである。
【０２８２】
このような実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ２に記載する通り測定された）ＩＣ５０は最大で２００ｎＭ、例えば最大で１００ｎＭ、例えば最大で７５ｎＭ、例えば最大で５０ｎＭ、例えば最大で２５ｎＭ、例えば最大で１５ｎＭ、例えば最大で１０ｎＭ、例えば最大で５ｎＭである。
【０２８３】
さらなる実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物の（ＨＳＡなしのＣ２に記載する通り測定された）ＩＣ５０は０．１〜２００ｎＭ、例えば１〜１００ｎＭ、例えば５〜７５ｎＭ、例えば５〜５０ｎＭである。
【０２８４】
上記の検討は、ＨＳＡが存在しない中で結合を評価する場合に妥当性がある。ＧＬＰ−１結合は、例えば限定するわけではないが吐き気などのＧＬＰ−１関連の副作用を減少させつつ、ＰＣＳＫ９への完全な結合を可能にするために減少させることができる。
【０２８５】
ＧＬＰ−１の効果は、別の方法として、または追加的に、血糖および／または体重に対するＧＬＰ−１類似体およびＧＬＰ−１類似体を含む化合物の効果を測定することによってｉｎ  ｖｉｖｏで測定することができる。血糖および／または体重の減少は、例えばＣ７で説明するｄｂ／ｄｂマウスおよびＣ８で説明するＤＩＯラットなどの適切なモデルで測定することができる。
【０２８６】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物は、本明細書のＣ７に述べるように、ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖を低下させる能力を有する。効果は、０〜２４時間のデルタ血糖に対する曲線下面積（ＡＵＣΔＢＧ２４ｈ）およびＡＵＣΔＢＧ２４ｈについて算定される５０％有効量（ＥＤ５０、ベースラインと最大効果の中間にあたる反応を提供するＧＬＰ−１誘導体の用量）に基づいて推定できる。
【０２８７】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物は、１５ｎｍｏｌ／ｋｇ未満のＥＣ５０  ＡＵＣΔＢＧ２４ｈを有することが好ましい。一実施形態では、ＥＣ５０  ＡＵＣΔＢＧ２４ｈは１〜１５ｎｍｏｌ／ｋｇ、例えば２〜１２ｎｍｏｌ／ｋｇ、または例えば５〜１０ｎｍｏｌ／ｋｇである。
【０２８８】
同様に、体重を減少させる能力も、Ｃ８に述べるようにＤＩＯラットを用いて評価することができる。
【０２８９】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物は、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し、２１日後に測定した場合、体重をベースラインＢＷの少なくとも９５％に低減する能力を有する。
【０２９０】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体またはＧＬＰ−１類似体を含む化合物は、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し、２１日後に測定した場合、体重をベースラインＢＷの少なくとも９０％に低減する能力を有する。
【０２９１】
《ＥＧＦ（Ａ）機能−（ＰＣＳＫ９ｉ）》
本明細書に記載するように、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１によって定義されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）ＥＧＦ（Ａ）ペプチドの変異体である。ＥＧＦ（Ａ）類似体は、本明細書において配列番号１の類似体であるアミノ酸配列を含むペプチドとして定義される。
【０２９２】
こうしたＥＧＦ（Ａ）類似体は、ＰＣＳＫ９に結合する能力を有することが好ましい。特定の実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、例えば、天然ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）（天然ＥＧＦ（Ａ））または他のＰＣＳＫ９結合化合物と比較して、ＰＣＳＫ９に結合する改善された能力を有する。
【０２９３】
ＥＧＦ（Ａ）類似体は、ＬＤＬ−Ｒに対するＰＣＳＫ９結合を阻害する能力をさらに有してもよい。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体はＰＣＳＫ９阻害剤である。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体は、ヒト低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）へのＰＣＳＫ９結合を阻害する。
【０２９４】
このような結合を、本明細書のセクションＣ３に記載するアッセイを使用して評価することができ、これは試験化合物がヒトＬＤＬＲへのＰＣＳＫ９の結合を競合的に阻害する能力を測定する。ＬＤＬ−ＲとＰＣＳＫ９との相互作用を阻害する能力により、こうした化合物はＰＣＳＫ９阻害剤と呼ばれる。
【０２９５】
一実施形態では、本発明のＥＧＦ（Ａ）類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体（融合ポリペプチドまたは誘導体）を含む化合物は、ＰＣＳＫ９阻害剤化合物または単にＰＣＳＫ９阻害剤である。一実施形態では、本発明は、配列番号１のＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物に関し、類似体はヒト低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）へのＰＣＳＫ９結合を阻害する能力を有する。
【０２９６】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含むＥＧＦ（Ａ）の化合物は、ＥＧＦ（Ａ）ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）（配列番号１）と比較して、ＰＣＳＫ９に結合する改善された能力を有する。野生型の配列は阻害機能が比較的劣るため、ＥＧＦ（Ａ）類似体についても比較を行うことができる。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体（および前記類似体を含む化合物）は、配列番号２によって定義される［２９９Ａ、３０１Ｌ、３０７Ｉ、３０９Ｒ、３１０Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）と比較して、ＰＣＳＫ９に結合する改善された能力を有する。ＥＬＩＳＡアッセイで測定される効力は、ＥＧＦ（Ａ）類似体またはＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物に対する見掛けの親和性をＫｉとして、またＣ３に記載するように提供し、低いＫｉは強い阻害機能を有する化合物に特徴的である。
【０２９７】
一実施形態では、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒを結合する競合ＥＬＩＳＡアッセイ（セクションＣ３）で測定されたＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含む化合物のＫｉは５０ｎＭ未満、例えば２５ｎＭ未満、または例えば１０ｎＭ未満である。さらなる実施形態では、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒを結合する競合ＥＬＩＳＡアッセイ（セクションＣ３）で測定されたＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含む化合物のＫｉは８．０ｎＭ未満、例えば５．０ｎＭ未満、例えば２．５ｎＭ未満、またはさらには２．０ｎＭ未満である。一実施形態では、ＰＣＳＫ９とＬＤＬ−Ｒを結合する競合ＥＬＩＳＡアッセイ（セクションＣ３）で測定されたＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含む化合物のＫｉは０．１〜１０．０ｎＭ、例えば０．１〜８．０ｎＭまたは０．１〜５．０ｎＭである。
【０２９８】
ＥＧＦ（Ａ）類似体およびこれらを含む化合物の機能性は、本明細書のセクションＣ４に記載するようなＬＤＬ取り込みを改善する能力によってさらに特徴づけられうる。
【０２９９】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含む化合物は、ＰＣＳＫ９の存在下でのＬＤＬ取り込みを増加させる。一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含む化合物は、ＰＣＳＫ９が介在したＬＤＬ取り込みの減少を覆すまたは減少させる能力がある。
【０３００】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体および当該類似体を含む化合物のＬＤＬ取り込みアッセイで測定されるＥＣ５０は、１５００ｎＭ未満、例えば１０００ｎＭ未満または５００ｎＭ未満である。
【０３０１】
ＥＧＦ（Ａ）類似体および類似体を含む化合物が血中コレステロールに与える効果は、本明細書のセクションＣ８に記載するＤＩＯラットの試験などの適切なモデルで評価されうる。試験には試験化合物の数回の投与が関与し、したがってその効果は投与量および投与頻度に依存する。本試験では、低用量、高用量および非常に高用量の効果を２１日後に評価した。
【０３０２】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体またはＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物は、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも０．５ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する。さらなる実施形態では、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロール値は少なくとも０．６ｍｍｏｌ／Ｌ、または例えば０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少する。
【０３０３】
一実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体またはＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物は、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する。さらなる実施形態では、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロール値は少なくとも１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、または例えば１．２ｍｍｏｌ／Ｌ減少する。
【０３０４】
《二機能性》
本明細書で上述するように、異なる機能性は２つの類似体、すなわちＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体と関連付けられる。本発明の化合物においてこの２つの類似体を組み合わせるとき、各類似体の機能性は維持されることが好ましい、すなわち、ＧＬＰ−１類似体はＧＬＰ−１受容体を刺激する能力を持ち、ＥＧＦ（Ａ）類似体はＰＣＳＫ９を競合的に結合する能力を有し、さらに、両方の類似体を含む化合物は両方の機能性を有することが好ましい。こうした化合物の機能性は、ＧＬＰ−１およびＥＧＦ（Ａ）の機能性試験に関して本明細書に記載するアッセイで試験されうる。
【０３０５】
一実施形態では、化合物は二機能性分子と呼ばれる。
【０３０６】
治療用途に適した化合物を得るために、機能性はＰＣＳＫ９阻害剤およびＧＬＰ−１受容体作動薬の両方の望ましいレベルの活性を得ることができるよう釣り合っている必要がある。一実施形態では、化合物は本明細書で上述するようにＧＬＰ−１受容体作動薬である。一実施形態では、化合物は本明細書で上述するようにＰＣＳＫ９阻害剤である。ＧＬＰ−１受容体の効力の測定はセクションＣ１に、ＧＬＰ−１類似体の結合親和性についてはセクションＣ２に記載されており、これらの機能要件はＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物にとって同様の妥当性がある。
【０３０７】
同様に、ＥＧＦ（Ａ）類似体の機能は、ＥＧＦ（Ａ）機能に関するセクションに記載されており、アッセイは本明細書のセクションＣ３、Ｃ４、およびＣ６に記載されている。
【０３０８】
ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む本発明による化合物は、各類似体に関しては一価である、すなわち、化合物は１つのＥＧＦ（Ａ）類似体および１つのＧＬＰ−１類似体を含む。ＧＬＰ−１受容体作動薬の機能とＰＣＳＫ９阻害剤の機能の釣り合いを取るために、類似体を個別に選択して両方の活性の適切なレベルを得ることができる。ＧＬＰ−１受容体作動薬の高用量の投与は吐き気などの副作用をきたしうることが周知であり、したがって、同じ血漿濃度で両方の活性の適切なバランスを得るために、良好なＰＣＳＫ９阻害機能を維持しつつＧＬＰ−１の効力を低下させることが好ましい。
【０３０９】
一実施形態では、本明細書で上述するように、ＧＬＰ−１の効力は、ＧＬＰ−１（３−３７）またはセマグルチドと比較して減少される。このような実施形態では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｒｅ  ｌｕｃアッセイ（セクションＣ１、ＨＳＡなし）によって測定したＥＣ５０は、少なくとも１０ｐＭである。
【０３１０】
一実施形態では、競合ＥＬＩＳＡ（セクションＣ３）によって測定される見掛けのＫｉは５０ｎＭ未満である。
【０３１１】
一実施形態では、見掛けのＥＧＦ（Ａ）Ｋｉ（Ｃ３）：ＧＬＰ−１効力（Ｃ１、ＨＳＡなし）の比率は最大で５０００、例えば最大で４０００、例えば最大で３０００、例えば最大で２０００、例えば最大で１０００である。
【０３１２】
一実施形態では、見掛けのＥＧＦ（Ａ）Ｋｉ（Ｃ３）：ＧＬＰ−１効力（Ｃ１、ＨＳＡなし）の比率は最大で１０００、例えば最大で８００、例えば最大で６００、例えば最大で４００、例えば最大で２００である。
【０３１３】
一実施形態では、見掛けのＥＧＦ（Ａ）Ｋｉ（Ｃ３）：ＧＬＰ−１効力（Ｃ１、ＨＳＡなし）の比率は最大で２００、例えば最大で１５０、例えば最大で１００、例えば最大で５０である。
【０３１４】
化合物が真に二機能性を有することを確認するために、機能性を評価することが好ましく、これは、本明細書に記載するように、本明細書のセクションＣ８に記載するようにＤＩＯラットにおいて行うことができ、体重およびコレステロールの両方に対する効果を測定できる。
【０３１５】
一実施形態では、化合物は、本明細書のセクションＣ８に記載するｉｎ  ｖｉｖｏラット試験において、ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１と少なくとも等しくコレステロールおよび体重を減少させる能力を有する。
【０３１６】
一実施形態では、化合物は、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも０．５ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する。
【０３１７】
さらなる実施形態では、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロール値は少なくとも０．６ｍｍｏｌ／Ｌ、または例えば０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少する。
【０３１８】
一実施形態では、化合物は、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する。
【０３１９】
さらなる実施形態では、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロール値は少なくとも１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、または例えば１．２ｍｍｏｌ／Ｌ減少する。
【０３２０】
一実施形態では、化合物は、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し、２１日後に測定した場合、体重をベースラインＢＷの少なくとも９５％に低減する能力を有する。
【０３２１】
一実施形態では、化合物は、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し、２１日後に測定した場合、体重をベースラインＢＷの少なくとも９０％に低減する能力を有する。
【０３２２】
《誘導体》
「誘導体」という用語は、本明細書において二機能性化合物の文脈で使用される場合、１つ以上の置換基が化合物に共有結合している化学修飾された二機能性化合物を意味する。
【０３２３】
本明細書で上述するように、置換基は化合物に共有結合している。置換基をポリペプチドに付着する多数の方法、例えばＮ末端、Ｃ末端または内部のアミノ酸残基を介して置換基を付着することなどが知られている。
【０３２４】
一実施形態では、化合物は１つ以上の置換基を含むことができる。一実施形態では、化合物は１つまたは２つの置換基を含む。一実施形態では、化合物は１つまたは２つの置換基を有する。一実施形態では、化合物は１つの置換基を有する。一実施形態では、化合物は２つの置換基を有する。
【０３２５】
化合物が２つの置換基を有する実施形態では、２つの置換基が同一であることが好ましい。
【０３２６】
一実施形態では、１つまたは２つの置換基がペプチドバックボーンの窒素原子に付着される。一実施形態では、１つまたは２つの置換基がペプチドバックボーンのアミノ基に付着される。一実施形態では、１つまたは２つの置換基が１つまたは２つのＬｙｓ残基のイプシロン窒素に付着される。
【０３２７】
一実施形態では、２つの置換基がペプチドバックボーンの別のＬｙｓ残基に付着される。一実施形態では、２つの置換基がペプチドバックボーンの別のＬｙｓ残基のイプシロン窒素に付着される。
【０３２８】
本明細書で上述するように、ＧＬＰ−１類似体、ペプチドスペーサー、およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む、またはそれからなる誘導体の融合ポリペプチドまたはペプチドバックボーンは、１つ以上のＬｙｓ残基を有してもよい。異なる数のＬｙｓ残基を有するＧＬＰ−１類似体、ペプチドスペーサー、およびＥＧＦ（Ａ）類似体の様々な例について本明細書の上記で記載してきたが、このような配列は、厳密に１つまたは２つのＬｙｓ残基を有する融合ポリペプチドまたはペプチドバックボーンを得るために組み合わせてもよい。
【０３２９】
一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つまたは２つのＬｙｓ残基を有する。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つのＬｙｓ残基のみを含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは厳密に２つのＬｙｓ残基を含む。
【０３３０】
一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つまたは２つのＬｙｓ残基を含むＧＬＰ−１類似体を含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つのＬｙｓ残基のみを含むＧＬＰ−１類似体を含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、厳密に２つの残基を含むＧＬＰ−１類似体を含む。
【０３３１】
一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つまたは２つのＬｙｓ残基を含むＥＧＦ（Ａ）類似体を含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つのＬｙｓ残基のみを含むＥＧＦ（Ａ）類似体を含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、厳密に２つのＬｙｓ残基を含むＥＧＦ（Ａ）類似体を含む。
【０３３２】
一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つまたは２つのＬｙｓ残基を含むペプチドスペーサーを含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、１つのＬｙｓ残基のみを含むペプチドスペーサーを含む。一実施形態では、ペプチドバックボーンは、厳密に２つの残基を含むペプチドスペーサーを含む。
【０３３３】
一実施形態では、置換基はペプチドの機能性を改善することを目的とする。
【０３３４】
一実施形態では、ペプチドバックボーンを含む誘導体の血漿半減期および置換基の血漿半減期が、本明細書で図示するペプチドバックボーンの半減期と比較して増加するように、置換基は化合物の半減期を増加させる（セクションＣ５、表５）。
【０３３５】
異なる種における半減期を決定する方法は当該技術分野で周知であり、本明細書ではミニブタについて例証している（セクションＣ５）。
【０３３６】
一実施形態では、本発明による誘導体は１２時間を超える半減期を有する。
【０３３７】
一実施形態では、本発明による誘導体は、ミニブタにおいて皮下投与または静脈内投与した後に測定した場合、２４時間を超える半減期、例えば３６時間を超えるまたは４８時間を超える半減期を有する。
【０３３８】
《置換基》
「置換基」という用語は、通常は同じ位置に存在する原子を置換することによってアミノ酸残基を介してポリペプチドに付着された部分を指す。置換基は、水素原子、例えばアミノ基の水素（−ＮＨ２）などを置換することが多い。したがって、置換基はペプチドまたはポリペプチドに共有結合した部分である。本発明によると、この部分、例えば置換基は、安定性の増加や半減期の増加などの他の有益な特性を追加する一方で、ペプチドの機能性に対しては効果が全くないか最小限の効果を有することが好ましい。
【０３３９】
一実施形態では、半減期を延長させる置換基はタンパク質部分である。さらなるこのような実施形態では、タンパク質部分は、ヒトアルブミン、Ｆｃドメインまたは非構造化タンパク質伸長を含みうる。さらなる実施形態では、タンパク質部分は、類似体の１つに融合されてもよい。さらなる実施形態では、タンパク質部分はＦｃドメインであり、ＦｃドメインはＧＬＰ−１類似体またはＥＧＦ（Ａ）類似体に融合されている。Ｆｃ融合が調製されると、２つのＦｃ−ポリペプチドが１つのＦｃドメインを形成するため、結果得られる化合物は通常は二価である。
【０３４０】
一実施形態では、置換基はタンパク質部分ではない。
【０３４１】
一実施形態では、置換基はペプチドバックボーンに融合されたタンパク質部分ではない。
【０３４２】
別の実施形態では、置換基は非タンパク質部分である。
【０３４３】
特定の実施形態では、置換基は、アルブミンと非共有複合体を形成する能力を有し、それによって誘導体の血流内循環を促進し、誘導体の作用時間を延長させる効果も有する。特定の実施形態では、置換基は、ＰＣＳＫ９および／またはＧＬＰ−１受容体への結合能力を実質的に減少させることなく、誘導体の作用時間を延長させる能力を有する。
【０３４４】
一実施形態では、誘導体は半減期を延長させる置換基を含む。様々な半減期を延長させる置換基が当該技術分野で周知であり、特に以下でさらに説明するような脂肪酸基を含む特定のアルブミン結合剤を含み、このようなアルブミン結合剤は非タンパク質置換基である。
【０３４５】
置換基は少なくとも１つの脂肪酸基を含む。
【０３４６】
特定の実施形態では、脂肪酸基は、少なくとも８つの連続するＣＨ２−基を含む炭素鎖を含む。一実施形態では、脂肪酸基は少なくとも１０の連続する−ＣＨ２−基、例えば最低１２の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１４の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１６の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１８の連続する−ＣＨ２−基を含む。
【０３４７】
一実施形態では、脂肪酸基は８〜２０の連続する−ＣＨ２−基を含む。一実施形態では、脂肪酸基は１０〜１８の連続する−ＣＨ２−基を含む。一実施形態では、脂肪酸基は１２〜１８の連続する−ＣＨ２−基を含む。一実施形態では、脂肪酸基は１４〜１８の連続する−ＣＨ２−基を含む。
【０３４８】
誘導体が２つの置換基を含む状況では、より短い脂肪酸基を用いて半減期の増加を得ることができ、したがって、誘導体が２つの置換基を含む実施形態では、脂肪酸基は少なくとも８つの連続する−ＣＨ２−基、例えば少なくとも１０の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１２の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１４の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１６の連続する−ＣＨ２−基、少なくとも１８の連続する−ＣＨ２−基を含みうる。
【０３４９】
誘導体が２つの置換基を含むさらなる実施形態では、置換基はそれぞれ８〜１８の連続する−ＣＨ２−基を含む脂肪酸基を含む。さらにこのような実施形態では、脂肪酸基は１０〜１８の連続する−ＣＨ２−基、例えば１２〜１８の連続する−ＣＨ２−基、１４〜１８つの連続する−ＣＨ２−基を含む。
【０３５０】
「脂肪酸基」という用語は、本明細書で使用される場合、ブレンステッド‐ローリーの酸塩基理論に基づく酸でありｐＫａが＜７である官能基を少なくとも１つ含む化学基を意味する場合がある。
【０３５１】
一実施形態では、置換基は少なくとも８つの連続する−ＣＨ２−基およびｐＫａが＜７の少なくとも１つの官能基（ＦＧ）を含む。ブレンステッド‐ローリーの酸塩基理論に基づく酸であるこのような官能基の非限定的な例には、カルボン酸（カルボキシフェノキシも含む）を含む。
【０３５２】
一実施形態では、脂肪酸基は官能基（酸）の反対側の端にカルボニルを含み、このような脂肪酸基は二酸と呼ぶこともできる。
【０３５３】
一実施形態では、「延長部」という用語は、化合物の半減期を延長する置換基の末端部分である脂肪酸基を説明するために使用することができる。
【０３５４】
一実施形態では、延長部は以下により定義されうる：
化学式１：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯ−＊（式中、ｎは８〜２０の整数であり、これはＣ（ｎ＋２）二酸と呼ぶことができる）、または化学式１ｂ：
【化１】
2020528049.tif 000193
【０３５５】
（式中、ｎは８〜２０の整数である）。
【０３５６】
一実施形態では、延長部は以下により定義されうる：
化学式２：ＨＯＯＣ−（Ｃ６Ｈ４）−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−＊（式中、ｍは８〜１１の整数である）、または化学式２ｂ：
【化２】
2020528049.tif 000194
（式中、カルボキシ基は、化学式３の（Ｃ６Ｈ４）基の位置２、３または４にあり、ｍは８〜１１の整数である）。
【０３５７】
一実施形態では、延長部は、上記に定義される化学式１、化学式１ｂ、化学式２、または化学式２ｂによって定義されうる。
【０３５８】
一実施形態では、本発明による置換基は１つ以上のリンカー要素を含む。リンカー要素はアミド結合によって相互におよび延長部に連結されてもよく、「Ｚ」と呼ぶことができる（以下をさらに参照）。
【０３５９】
本明細書の以下でさらに定義するように、リンカー要素の数は、最大で６でもよく、−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−と呼ぶことができ、ここでＺ１は延長部（Ｐｒｏ−）と結合され、最後のＺ要素はペプチドと結合され、その場合、置換基はＰｒｏ−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−と呼ぶことができる。したがって、上記の記号＊はＺ１に対する付着点を示し、これはアミド結合を介して結合されたときには窒素である。一実施形態では、Ｚ１が結合であり（下記参照）、記号＊は窒素の隣接するＺ要素への付着点を示す。
【０３６０】
一実施形態では、置換基はＰｒｏ−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−により定義され、式中、Ｐｒｏ−は化学式１、化学式１ｂ、化学式２および化学式２ｂから選択され、ｎは８〜２０の整数であり、ｍは８〜１１の範囲の整数である。
【０３６１】
特定の実施形態では、化学式１または１ｂにおいてｎは８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０であり、ｍは８、９、１０または１１である。
【０３６２】
「結合」という用語が本明細書で使用される場合は、共有結合を意味する。Ｚ１〜Ｚ６のリンカー要素が結合として定義される場合は、当該構成要素が存在しない状況と同等である。本明細書の以下でＺ１〜Ｚ６のいずれかが結合であると示されることは、Ｚ１〜Ｚ６のいずれかが存在しないこととも読み取られうる。論理的に、「結合」が「結合」の後に続くことはできない。そのため、ここでの「結合」とは、前のＺ要素が「結合」ではない次のＺ要素に共有結合されている（または存在しない）ことを意味する。
【０３６３】
リンカー要素Ｚ１〜Ｚ６は、アミノ酸様の部分、例えばＧｌｕ、γＧｌｕ（ガンマＧｌｕまたはｇＧｌｕとも呼ばれ、＊−ＮＨ−ＣＨ−（ＣＯＯＨ）−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＯ−＊によって定義される）、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｄｏ、Ａｅｅｐ、およびＡｅｅｅｐ、ならびに以下に記載するさらなる部分を含む、アミド結合を形成する能力がある化学部分から個別に選択される。
【０３６４】
一実施形態では、Ｚ１要素は任意選択であり、このような実施形態では、Ｚ１は以下から選択される：
化学式３：＊−ＮＨ−ＣＨ２−（Ｃ６Ｈ１０）−ＣＯ−＊または
化学式３ｂ：
【化３】
2020528049.tif 000195
および
結合。
【０３６５】
化学式３はまた、トラネキサム酸トランス−４−（アミノメチル）シクロヘキサンカルボン酸（Ｔｒｘ）と呼ぶことができ、ここで化学式３はｏ−（１，２）、ｍ−（１，３）およびｐ−（１，４）の形態を網羅し、化学式３ｂはｐ−（１，４）の形態を網羅する。
【０３６６】
一実施形態では、Ｚ２は、γＧｌｕ、Ｇｌｕ、または結合から選択される。一実施形態では、Ｚ２はγＧｌｕである。
【０３６７】
一実施形態では、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、相互に独立して、Ｇｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ａｄｏ、Ａｅｅｐ、およびＡｅｅｅｐ、ならびに結合から選択される。
【０３６８】
Ｇｌｕ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｔｈｒは、当該技術分野で周知のアミノ酸残基である。
γＧｌｕは化学式４：＊−ＮＨ−ＣＨ（ＣＯＯＨ）−（ＣＨ２）２−ＣＯ−＊により定義され、これは化学式４ｂ：
【化４】
2020528049.tif 000196
と同一であり、γＧｌｕと呼ぶこともできる。
【０３６９】
Ａｄｏは化学式５：＊−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ−＊により定義され、８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸と呼ぶことができ、化学式５ｂ：
【化５】
2020528049.tif 000197
と同一である。
【０３７０】
Ａｅｅｐは、化学式６：＊ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ＊により定義され、化学式６ｂ：
【化６】
2020528049.tif 000198
と呼ぶこともできる。
【０３７１】
Ａｅｅｅｐは化学式７：＊ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＯ＊により定義され、化学式７ｂ：
【化７】
2020528049.tif 000199
と呼ぶこともできる。
【０３７２】
一実施形態では、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、相互に独立して、Ｇｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｄｏ、Ａｅｅｐ、およびＡｅｅｅｐ、ならびに結合から選択される。
【０３７３】
一実施形態では、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、相互に独立して、Ｇｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｄｏ、および結合から選択される。
【０３７４】
一実施形態では、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、相互に独立して、Ｇｌｕ、γＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｄｏ、および結合から選択される。
【０３７５】
一実施形態では、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、互いに独立して、γＧｌｕ、Ｇｌｙ、Ａｄｏ、および結合から選択される。
【０３７６】
一実施形態では、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、互いに独立して、γＧｌｕ、Ａｄｏ、および結合から選択される。
【０３７７】
一実施形態では、置換基は以下の＃１〜＃１４により定義される置換基の群から選択される。
【表９】
2020528049.tif 000200
【０３７８】
置換基＃１は化学式６：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄ−＊により定義され、化学式６ｂ：
【化８】
2020528049.tif 000201
と同一である。
【０３７９】
置換基＃２は化学式７：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式７ｂ：
【化９】
2020528049.tif 000202
と同一である。
【０３８０】
置換基＃３は化学式８：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ＊により定義され、化学式８ｂ：
【化１０】
2020528049.tif 000203
と同一である。
【０３８１】
置換基＃４は化学式９：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−＊により定義され、化学式９ｂ：
【化１１】
2020528049.tif 000204
と同一である。
【０３８２】
置換基＃５は化学式１０：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１０ｂ：
【化１２】
2020528049.tif 000205
と同一である。
【０３８３】
置換基＃６は化学式１１：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１１ｂ：
【化１３】
2020528049.tif 000206
として特定される。
【０３８４】
置換基＃７は化学式１２：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−γＧｌｕ−γＧｌｕ−γＧｌｕ−＊により定義され、化学式１２ｂ：
【化１４】
2020528049.tif 000207
として特定される。
【０３８５】
置換基＃８は化学式１３：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１３ｂ：
【化１５】
2020528049.tif 000208
として特定される。
【０３８６】
置換基＃９は化学式１４：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−γＧｌｕ−＊により定義され、化学式１４ｂ：
【化１６】
2020528049.tif 000209
として特定される。
【０３８７】
置換基＃１０は化学式１５：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１５ｂ：
【化１７】
2020528049.tif 000210
として特定される。
【０３８８】
置換基＃１１は化学式１６：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１６ｂ：
【化１８】
2020528049.tif 000211
として特定される。
【０３８９】
置換基＃１２は化学式１７：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−＊により定義され、化学式１７ｂ：
【化１９】
2020528049.tif 000212
として特定される。
【０３９０】
置換基＃１３は化学式１８：４−ＣＯＯＨ−ＰｈＯ−Ｃ１１−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１８ｂ：
【化２０】
2020528049.tif 000213
として特定される。
【０３９１】
置換基＃１４は化学式１９：ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１４−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−＊により定義され、化学式１９ｂ：
【化２１】
2020528049.tif 000214
として特定される。
【０３９２】
《二機能性化合物》
複数の融合化合物が本明細書に記載され、またその他の箇所でも記載されているように、両方の機能性が維持されバランスが取れているようにすることが課題である。開示された化合物は、ＥＧＦ（Ａ）類似体、スペーサーおよびＧＬＰ−１類似体の変形、ならびに要素の順序の変動を含む。
【０３９３】
一実施形態では、融合ポリペプチドは、Ｎ末端にＧＬＰ−１類似体を、Ｃ末端にＥＧＦ（Ａ）類似体を含むが、これはＧＬＰ−１の機能性を維持する上で重要であることが分かった。
【０３９４】
さらなる実施形態では、ＥＧＦ（Ａ）類似体の配列は、少なくとも３０１Ｌの突然変異を含み、本明細書に詳細に記載されるように、配列番号１０７および１０８によって特定されるＥＧＦ（Ａ）類似体の配列によって例示され、野生型リジンを除去するために３１２Ｅ突然変異を含む場合もある、３０９Ｒおよび３０９Ｉのうちの１つ以上を含むことが好ましい。
【０３９５】
一実施形態では、ＧＬＰ−１類似体は、本明細書で上述するように、突然変異、例えば残基８の８Ａｉｂ、８Ｇまたは８Ｗへの突然変異、および残基３４の例えば３４Ｒへの突然変異を含み、これにより置換基をＫ２６に付着することが可能となる。３０Ｇなどのさらなる突然変異は、ＧＬＰ−１類似体の効力を低減するために好適でありうる。
【０３９６】
このような実施形態では、化合物はＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、
ｉ）前記ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３９、１４０、１４１、１４２または１６４によって特定され、
ｉｉ）前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１０７、１０８、１０９によって特定される。
【０３９７】
一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、
ｉ）前記ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３９または１６４により特定され、
ｉｉ）前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１０７または１０８によって特定される。
【０３９８】
一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、
ｉ）前記ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１６４によって特定され、
ｉｉ）前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１０８によって特定される。
【０３９９】
一実施形態では、化合物は任意のＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１〜７４および７６〜３１４である。
【０４００】
一実施形態では、化合物は、ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１〜７４、７６〜３１４として定義される化合物の群から選択される。
【０４０１】
一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃６９および／または＃３０６である。一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃６９である。一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃３０６である。
【０４０２】
一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１および／または＃４８である。一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１である。一実施形態では、化合物はＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４８である。
【０４０３】
《調製方法》
本明細書に記載される化合物は、よく知られている一般的な知識を使用して調製されうる。バックボーンまたは融合ポリペプチドは、化学合成（方法のセクションＡ１に記載）または異種発現によって提供されうる。融合ポリペプチドをコードする発現ベクターは、通常の分子生物学によって調製されてもよく、適切な宿主を選択することができる。また、方法を組み合わせて、バックボーンの一部分を合成的に調製し、その一方でバックボーンの別の一部分を組み換え型技術によって調製してもよい。置換基は、化学合成中にペプチドバックボーンに付着されてもよく、またはその後のバックボーンまたはその一部との反応中にペプチドバックボーンに付着されてもよい。調製方法とは独立して、化合物は、その要素、例えば、融合ポリペプチド（ペプチドバックボーン）および１つ以上の置換基によって定義される。
【０４０４】
本発明の一態様は、本明細書に記載するように、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む融合ポリペプチドを調製する方法に関する。
【０４０５】
本発明の一態様は、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む融合ポリペプチドの誘導体を調製する方法に関し、誘導体は融合ポリペプチドに共有結合した１つ以上の置換基をさらに含む。
【０４０６】
《医薬組成物》
本発明はまた、本発明の化合物（またはその薬学的に許容可能な塩、アミド、もしくはエステル）および薬学的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物に関する。こうした組成物は、当該技術分野で周知のように調製されてもよい。
【０４０７】
「賦形剤」という用語は、広く、活性治療成分以外の任意の成分を指す。賦形剤は、非活性物質、不活性物質、および／または医薬的に活性でない物質であり得る。賦形剤は、様々な目的、例えば、担体、ビヒクル、希釈剤、錠剤補助剤として、ならびに／または活性物質の投与および／もしくは吸収の改善などを果たすように機能し得る。賦形剤の非限定的な例は、溶媒、希釈剤、緩衝液、保存剤、張性調節剤、キレート剤、および安定剤である。様々な賦形剤を伴う薬物学的活性成分の製剤化は当該技術分野で周知であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（例：第１９版（１９９５年）およびその後の版）を参照されたい。
【０４０８】
本発明の組成物は、液剤の形態、すなわち水を含む水性製剤としうる。液剤は、溶液または懸濁液であってもよい。別の方法として、組成物は固形製剤、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥された組成物であってもよい。
【０４０９】
本発明の組成物は、非経口投与であってもよく、例えば、投与は、注射器、任意選択的にペン式の注射器、または注入ポンプという手段により、皮下、筋肉内、腹腔内、または静脈内への注射によって行うことができる。
【０４１０】
本発明の医薬組成物は、併用療法の場合に投与を簡略化しうる治療剤などの第二の活性成分をさらに含みうる。
【０４１１】
製剤の例には、液剤、すなわち水を含む水性製剤が含まれる。液剤は、溶液または懸濁液であってもよい。水性製剤は一般に、少なくとも５０％ｗ／ｗの水、または少なくとも６０％、７０％、８０％、またはさらに少なくとも９０％の水を含む。
【０４１２】
別の方法として、医薬組成物は、例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥された組成物などの固形製剤であってもよく、これはそのまま使用できるか、使用前に医師または患者が溶媒および／または希釈剤を添加する。
【０４１３】
水性製剤のｐＨはｐＨ３〜ｐＨ１０、例えば約７．０〜約９．５、または約３．０〜約７．０、例えば７．０〜９．５、または３．０〜７．０でありうる。
【０４１４】
医薬組成物は緩衝液を含みうる。緩衝液は、例えば、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸およびアスパラギン酸、およびその混合物から選択されうる。
【０４１５】
医薬組成物は保存剤を含みうる。保存剤は、例えば、フェノール、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、２−フェノキシエタノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチル、２−フェノキシエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、チオメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロルヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ−ヒドロオキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウムおよびクロルフェネシン（３−（４−クロロフェノキシ）プロパン−１，２−ジオール）、ならびにその混合物から選択されうる。保存剤は、０．１ｍｇ／ｍＬ〜２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在することができる。
【０４１６】
医薬組成物は等張剤を含みうる。等張剤は、例えば、塩（例えば、塩化ナトリウム）、糖または糖アルコール、アミノ酸（例えば、グリシン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン）、アルジトール（例えば、グリセロール（グリセリン）、１，２−プロパンジオール（プロピレングリコール）、１，３−プロパンジオール、１，３−ブタンジオール）、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ４００）およびそれらの混合物から選択されうる。例えば、フルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、アルファおよびベータＨＰＣＤ、可溶性殿粉、ヒドロキシエチル殿粉、およびカルボキシメチルセルロース−ナトリウムを含む、例えば、単糖類、二糖類もしくは多糖類、または水溶性グルカンなどの任意の糖が使用されうる。糖アルコールは、少なくとも１つの−ＯＨ基を有するＣ４〜Ｃ８の炭化水素として定義され、例えば、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールを含む。一実施形態では、糖アルコール添加剤はマンニトールである。
【０４１７】
医薬組成物はキレート剤を含んでもよい。キレート剤は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、クエン酸、およびアスパラギン酸の塩、およびそれらの混合物から選択されうる。
【０４１８】
医薬組成物は安定剤を含みうる。安定剤は、例えば、１つ以上の酸化阻害剤、凝集阻害剤、界面活性剤、および／または１つ以上のプロテアーゼ阻害剤であってもよい。医薬組成物は、高分子量ポリマーまたは低分子化合物から選択される安定剤を含みうる。安定剤は、例えば、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ  ３３５０）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ−／ヒドロキシセルロースおよびその誘導体（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、ＨＰＣ−Ｌ、ＨＰＭＣ）、シクロデキストリン、硫黄含有物質（モノチオグリセロール、チオグリコール酸および２−メチルチオエタノールなど）、および異なる塩（例えば、塩化ナトリウム）から選択されうる。
【０４１９】
医薬組成物は、メチオニン酸化からポリペプチドを保護するメチオニンおよびＥＤＴＡ、および凍結溶解または機械的分断に関連する凝集からポリペプチドを保護する非イオン性界面活性剤を含むがこれに限定されない、追加の安定化剤を含みうる。
【０４２０】
医薬組成物は、１つ以上の界面活性剤を含みうる。「界面活性剤」という用語は、水溶性（親水性）部分および脂溶性（親油性）部分からなる任意の分子またはイオンを意味する。界面活性剤は、例えば、陰イオン界面活性剤、陽イオン界面活性剤、非イオン性界面活性剤、および／または両性イオン界面活性剤から選択されうる。
【０４２１】
医薬組成物は、例えば、ＥＤＴＡ（エチレンジアミンテトラ酢酸）、および／またはベンズアミジニンＨＣｌなど、１つ以上のプロテアーゼ阻害剤を含みうる。
【０４２２】
医薬組成物の追加的な任意選択の成分には、例えば、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、金属イオン、油性の媒体、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン）、および／または双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジンまたはヒスチジンなどのアミノ酸）が含まれうる。
【０４２３】
誘導体または類似体は、医薬組成物の形態で投与してもよい。当該技術分野で周知の様々な経路によって、医薬組成物を必要とする患者に投与することができる。投与経路は、例えば、非経口、表皮、真皮、経皮、結膜、泌尿器、膣部、直腸内、および／または眼、舌、舌下、頬、口腔、経口、腹部、胃腸内、鼻腔、細気管支や肺胞を介して肺から、またはその組み合わせであってもよい。
【０４２４】
組成物は、例えば、溶液、懸濁液、乳濁液、マイクロエマルジョン、多層乳剤、泡、軟膏、ペースト、石膏、膏薬、タブレット、コーティング錠、チューイングガム、リンス、カプセル（例えば、ハードゼラチンカプセルまたはソフトゼラチンカプセル）、座薬、直腸カプセル、ドロップ、ゲル、スプレー、粉末、エアロゾル、吸入薬、点眼剤、眼軟膏、洗眼薬、ペッサリー、膣リング、膣軟膏、注射液、原位置変換溶液（例えば、原位置ゲル化、原位置凝固、原位置沈殿または原位置結晶化）、輸液またはインプラントなど、複数の投与形態で投与しうる。
【０４２５】
組成物は、例えば、安定性、バイオアベイラビリティ、および／または溶解性を改善するために、薬物担体または薬物送達システムにおいてさらに混合されうる。組成物は、制御的、持続的、延長的、遅延した、および／または徐放性の薬物送達システムの製剤にも使用されうる。
【０４２６】
《医学的使用》
一態様では、本発明は、薬剤の製造において使用するための本発明による化合物の使用に関する。
【０４２７】
本発明はまた、薬剤としてまたは薬剤の製造において使用するための本発明の化合物またはその医薬組成物に関する。
【０４２８】
一実施形態では、本発明の化合物またはその組成物は、心血管疾患および／または心血管リスクの治療または予防に使用されうる。
【０４２９】
一実施形態では、本発明の化合物またはその組成物は、以下に対して使用されうる：
ｉ．脂質パラメータの改善、例えば、脂質異常症の予防および／または治療、総血中脂質の低下、ＬＤＬ−Ｃの低下、ＨＤＬの増加、小型高密度ＬＤＬの低下、ＶＬＤＬの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿中濃度の低下、アポリポタンパク質Ａ（ａｐｏ（Ａ））の発生の阻害、
ｉｉ．心血管疾患の治療および／もしくは予防、例えば、心臓症候群Ｘ、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈心疾患、再かん流傷害、脳卒中、脳虚血、早期心血管または早期心血管疾患、左心室肥大、冠動脈疾患、高血圧、本態性高血圧症、急性高血圧緊急症、心筋症、心不全、運動不耐性、急性および／もしくは慢性心不全、不整脈、心不整脈、失神、狭心症、心臓バイパスおよび／もしくはステント再閉塞、間欠性跛行（動脈硬化性閉塞）、拡張機能障害、および／もしくは収縮機能障害など、ならびに／または血圧低下（収縮期血圧の低下など）、心血管疾患の治療。
【０４３０】
本発明はまた、心血管疾患および／または心血管リスクの治療または予防方法に関する。
【０４３１】
本発明は、（ｉ）脂質パラメータの改善（脂質異常症の予防および／または治療、総血中脂質の低下、ＨＤＬ−Ｃの増加、ＬＤＬ−Ｃの低下、小型高密度ＬＤＬ−Ｃの低下、ＶＬＤＬ−Ｃの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿中濃度の低下、アポリポタンパク質（ａｐｏ（Ａ））の発生の阻害など）、（ｉｉ）心血管疾患の治療および／または予防（心臓症候群Ｘ、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈心疾患、再かん流傷害、脳卒中、脳虚血、早期心血管または早期心血管疾患、左心室肥大、冠動脈疾患、高血圧、本態性高血圧症、急性高血圧緊急症、心筋症、心不全、運動不耐性、急性および／または慢性心不全、不整脈、心不整脈、失神、狭心症、心臓バイパスおよび／またはステント再閉塞、間欠性跛行（動脈硬化性閉塞）、拡張機能障害、および／または収縮機能障害など）、および／または血圧低下（収縮期血圧の低下など）、心血管疾患の治療などの方法にさらに関し、本発明による薬学的に活性な量の化合物が投与される。
【０４３２】
特定の実施形態では、本発明の化合物は、以下の医学的処置に使用されうる：
ｉ．例えば、高血糖症、２型糖尿病、耐糖能障害、１型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、ＭＯＤＹ（若年発症成人型糖尿病）、妊娠糖尿病、および／またはＨｂＡ１ｃの減少などの、すべての形態の糖尿病の予防および／または治療、
ｉｉ．２型糖尿病の進行などの糖尿病疾患の進行の遅延または予防、耐糖能障害（ＩＧＴ）からインスリンを必要とする２型糖尿病への進行の遅延、インスリン耐性の遅延または予防、および／またはインスリンを必要としない２型糖尿病からインスリンを必要とする２型糖尿病への進行の遅延、
ｉｉｉ．β細胞機能の改善、例えばβ細胞アポトーシスの減少、β細胞機能および／またはβ細胞量の増加、および／またはβ細胞に対するグルコース感受性の回復など、
ｉｖ．アルツハイマー病、パーキンソン病、および／または多発性硬化症などの、認知障害および／または神経変性疾患の予防および／または治療、
ｖ．肥満などの摂食障害（例えば、食事量の減少、体重減少、食欲の抑制、満腹感の誘導などによる）の予防および／もしくは治療、過食性障害、神経性大食症、および／もしくは抗精神病薬もしくはステロイドの投与によって誘発された肥満の予防または治療、胃の運動の減少、胃内容排出の遅延、身体可動性の増加、および／または骨関節炎および／または尿失禁などの肥満の併発疾患の予防および／または治療、
ｖｉ．糖尿病性合併症、例えば、血管症、末梢神経障害を含む神経障害、腎症、および／または網膜症などの予防および／または治療、
ｖｉｉ．脂質パラメータの改善、例えば、脂質異常症の予防および／または治療、総血清脂質の低下、ＨＤＬの増加、小型高密度ＬＤＬの低下、ＶＬＤＬの低下、トリグリセリドの低下、コレステロールの低下、ヒト中リポタンパク質ａ（Ｌｐ（ａ））の血漿中濃度の低下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでのアポリポタンパク質Ａ（ａｐｏ（Ａ））の発生の阻害など、
ｖｉｉｉ．心臓症候群Ｘ、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、冠動脈心疾患、再かん流傷害、脳卒中、脳虚血、早期心血管または早期心血管疾患、左心室肥大、冠動脈疾患、高血圧、本態性高血圧症、急性高血圧緊急症、心筋症、心不全、運動不耐性、急性および／もしくは慢性心不全、不整脈、心不整脈、失神、狭心症、心臓バイパスおよび／もしくはステント再閉塞、間欠性跛行（動脈硬化性閉塞）、拡張機能障害、および／もしくは収縮機能障害などの心血管疾患の治療および／もしくは予防、ならびに／または収縮期血圧の低下などの血圧低下、
ｉｘ．胃腸疾患、例えば、炎症性腸疾患、短腸症候群、またはクローン病または大腸炎、消化障害、および／または胃潰瘍等などの予防および／または治療、ならびに／または炎症、例えば、乾癬、乾癬性関節炎、関節リウマチ、および／または全身性エリテマトーデスなどの予防および／または治療、
ｘ．重症疾患患者、重症疾患ポリ腎症（ＣＩＰＮＰ）患者、および／または潜在的なＣＩＰＮＰ患者の治療などの重症疾患の予防および／または治療、重症疾患またはＣＩＰＮＰの発症の予防、患者における全身性炎症性反応症候群（ＳＩＲＳ）の予防、治療および／または治癒、入院中に菌血症、敗血症および／または敗血性ショックにかかる患者の確率の予防または減少、および／または急性疾患のため集中治療室に入室した患者における血糖、インスリンバランスおよび任意選択的には代謝の安定化、
ｘｉ．多嚢胞性卵巣症候群（ＰＣＯＳ）の予防および／または治療、
ｘｉｉ．脳虚血、脳出血、および／または外傷性脳損傷などの脳疾患の予防および／または治療、
ｘｉｉｉ．睡眠時無呼吸の予防および／または治療、ならびに／または
ｘｉｖ．アルコール乱用および／または薬物乱用などの乱用の予防および／または治療。
【０４３３】
一部の実施形態では、適応は（ｉ）〜（ｘｉｖ）、例えば適応（ｉ）〜（ｖｉｉｉ）、（ｘ）〜（ｘｉｉｉ）、および／または（ｘｉｖ）からなる群から選択され、何らかの形で糖尿病に関連する。
【０４３４】
いくつかの実施形態では、適応は（ｉ）〜（ｉｉｉ）および（ｖ）〜（ｖｉｉｉ）、例えば適応（ｉ）、（ｉｉ）および／もしくは（ｉｉｉ）、または、適応（ｖ）、適応（ｖｉ）、適応（ｖｉｉ）、および／または適応（ｖｉｉｉ）などの群から選択される。
【０４３５】
一部の実施形態では、適応は（ｉ）である。さらなる特定の実施形態では、適応は（ｖ）である。なおさらなる特定の実施形態において、適応は（ｖｉｉｉ）である。
【０４３６】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、摂食障害、心血管疾患、胃腸疾患、糖尿病性合併症、および／もしくは多嚢胞性卵巣症候群を含むすべての形態の糖尿病の治療および／もしくは予防、ならびに／または脂質パラメータの改善、β細胞機能の改善、および／もしくは糖尿病性疾患の進行の遅延または予防に使用されうる。２型糖尿病および／または肥満への適応が特に好ましい。いくつかの実施形態では本発明は、体重を管理するための方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、食欲を低下させるための方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、食物摂取量を減少させるための方法に関する。
【０４３７】
一般に、肥満である患者のすべては、過体重でもあると考えられる。いくつかの実施形態では、本発明は、肥満を治療または予防するための方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、肥満を治療または予防するために本発明の誘導体または類似体を使用することに関する。いくつかの実施形態では、肥満の患者は、成人のヒトまたは小児のヒト（幼児、小児、および青年を含む）などのヒトである。ボディマス指数（ＢＭＩ）は、身長および体重に基づく体脂肪の尺度である。計算式は、ＢＭＩ＝体重（キログラム）／身長（メートル）２である。肥満のヒト患者はＢＭＩが３０以上である可能性があり、またＢＭＩが３０以上である場合を肥満と呼ぶことができる。一部の実施形態では、肥満のヒト対象は、３５以上のＢＭＩを有するか、または３０以上〜４０未満の範囲のＢＭＩを有している場合がある。一部の実施形態では、肥満は、ヒト対象がＢＭＩ４０以上を有する場合に重度肥満または病的肥満である。
【０４３８】
一部の実施形態では、本発明は、任意選択的に少なくとも１つの体重に関連する併存疾患の存在下における、過体重の治療または予防のための方法に関する。
【０４３９】
一部の実施形態では、本発明は、任意選択的に少なくとも１つの体重に関連する併存疾患の存在下における、過体重の治療または予防のための本発明の化合物の使用に関する。いくつかの実施形態では、過体重の患者は、成人のヒトまたは小児のヒト（幼児、小児、および青年を含む）などのヒトである。一部の実施形態では、過体重のヒト患者は、ＢＭＩ２５以上（ＢＭＩ２７以上など）を有しうる。いくつかの実施形態では、過体重のヒト患者は、２５〜３０未満の範囲または２７〜３０未満の範囲のＢＭＩを有する。一部の実施形態では、体重関連の併存疾患は、高血圧、糖尿病（例えば２型糖尿病）、脂質異常症、高コレステロール、および閉塞性睡眠時無呼吸からなる群から選択される。
【０４４０】
いくつかの実施形態では、本発明は、体重を減少させるための方法に関する。一部の実施形態では、本発明は、体重減少のための本発明の化合物の使用に関する。本発明による体重の減少を享受するヒトは、ＢＭＩ２５以上（ＢＭＩ２７以上またはＢＭＩ３０以上など）を有しうる。一部の実施形態では、本発明による体重減少を享受するヒトは、ＢＭＩ３５以上またはＢＭＩ４０以上を有しうる。「体重減少」という用語は、肥満および／または過体重の治療または予防を含みうる。
【０４４１】
さらなる実施形態では、本発明は、上述したように、糖尿病および心血管疾患または心血管リスクの治療または予防における本発明による化合物の使用に関し、１つの薬剤により２つの疾患または障害に対処する。
【０４４２】
一実施形態では、本発明は、本発明による化合物を必要とする患者に対し、この化合物の治療的な有効薬量を投与する工程を含む、上述の治療方法に関する。
【０４４３】
投与量は個別に決定することができ、選択された特定の薬物化合物および投与レジメンに応じて、週５０ｍｇ未満、例えば週１０〜１５ｍｇ、または月７０〜１００ｍｇでありうる。
【０４４４】
本明細書では本発明のある特定の特徴を例示および説明してきたが、数多くの修正、置換、変更、および均等物が当業者には思い浮かぶであろう。したがって、添付の実施形態の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのようなすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【実施例】
【０４４５】
《実施形態》
１．ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物であって、
ｉ．前記ＧＬＰ−１類似体は、配列番号１３７によって特定されるＧＬＰ−１（７−３７）の類似体であり、
ｉｉ．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１によって特定されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体である。
２．前記化合物が少なくとも１つのＬｙｓ残基を有する、実施形態１に記載の化合物。
３．前記化合物が少なくとも２つのＬｙｓ残基を有する、実施形態１に記載の化合物。
４．前記化合物が厳密に１つまたは２つのＬｙｓ残基を有する、実施形態１に記載の化合物。
５．前記化合物が厳密に１つのＬｙｓ残基を有する、実施形態１に記載の化合物。
６．前記化合物が厳密に２つのＬｙｓ残基を有する、実施形態１に記載の化合物。
７．前記化合物が融合ポリペプチドを含む、実施形態１に記載の化合物。
８．前記融合ポリペプチドがＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む、実施形態７に記載の化合物。
９．前記ＧＬＰ−１類似体が、当該ＧＬＰ−１類似体のＣ末端アミノ酸残基を介してＥＧＦ（Ａ）類似体に融合されている、実施形態８に記載の化合物。
１０．前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端に前記ＧＬＰ−１類似体を、Ｃ末端に前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を含む、実施形態８に記載の化合物。
１１．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、前記ＥＧＦ（Ａ）類似体のＣ末端アミノ酸残基を介してＧＬＰ−１類似体に融合されている、実施形態８に記載の化合物。
１２．前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端に前記ＥＧＦ（Ａ）類似体およびＣ末端に前記ＧＬＰ−１類似体を含む、実施形態８に記載の化合物。
１３．前記融合ポリペプチドがペプチドスペーサーを含む、実施形態７〜１２のいずれかに記載の化合物。
１４．前記ペプチドスペーサーが４〜８０のアミノ酸残基からなる、実施形態１３に記載の化合物。
１５．前記ペプチドスペーサーが４〜２０のアミノ酸残基からなる、実施形態１４に記載の化合物。
１６．前記ペプチドスペーサーがＬｙｓ残基を含む、実施形態１４に記載の化合物。
１７．前記ペプチドスペーサーがＬｙｓ残基を含まない、実施形態１４に記載の化合物。
１８．前記ペプチドスペーサーが、配列番号１１５〜１２６によって特定されるペプチドの群から選択される、実施形態１４に記載の化合物。
１９．前記ペプチドスペーサーが、配列番号１１５〜１３６によって特定されるペプチドの群から選択される、実施形態１４に記載の化合物。
２０．前記ＧＬＰ−１類似体がＧＬＰ−１受容体作動薬である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２１．前記ＧＬＰ−１類似体のＣ１（ＨＳＡなし）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおけるＥＣ５０が、１〜５０ｐＭ、１０〜１００ｐＭ、５０〜１００ｐＭ、１００〜２５０ｐＭまたは２５０〜１０００ｐＭである、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２２．前記ＧＬＰ−１類似体が完全ＧＬＰ−１受容体作動薬である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２３．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ１（ＨＳＡなし）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて野生型ＧＬＰ−１と同等のＥＣ５０を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２４．前記ＧＬＰ−１類似体が、最大で５０ｐＭのＥＣ５０を有する、実施形態２３に記載の化合物。
２５．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ１（ＨＳＡなし）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいてセマグルチドと同等のＥＣ５０を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２６．前記ＧＬＰ−１類似体が５〜１５ｐＭのＥＣ５０を有する、実施形態２５に記載の化合物。
２７．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ１（１％ＨＳＡ）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて最大で２５００ｐＭのＥＣ５０を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２８．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ１（１％ＨＳＡ）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて少なくとも５００ｐＭのＥＣ５０を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
２９．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ７に記載されたｄｂ／ｄｂマウスにおいて血糖を低下させる能力を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３０．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ７に記載されたｄｂ／ｄｂマウスにおいて血糖を低下させる能力を有し、ＥＣ５０ＡＵＣΔＢＧ２４ｈが１５ｎｍｏｌ／ｋｇ未満である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３１．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ８に記載されたＤＩＯラットにおいて体重を減少させる能力を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３２．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ８に記載されたＤＩＯラットにおいて体重を減少させる能力を有し、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合に、前記ＧＬＰ−１類似体がベースラインＢＷの少なくとも９５％に体重を減少させる能力を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３３．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ８に記載されたＤＩＯラットにおいて体重を減少させる能力を有し、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合に、前記ＧＬＰ−１類似体がベースラインＢＷの少なくとも９０％に体重を減少させる能力を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３４．前記ＧＬＰ−１類似体の配列番号１３７に対する同一性が、少なくとも８０％、例えば８５％、９０％、９５％である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３５．前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号１３７と比較して最大で６つのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３６．前記ＧＬＰ−１類似体が８Ａのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３７．前記ＧＬＰ−１類似体が、８ＡからＧまたはＷへのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３８．前記ＧＬＰ−１類似体が、位置８にタンパク質を構成しないアミノ酸残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
３９．前記ＧＬＰ−１類似体が、位置８にタンパク質を構成しないアミノ酸残基Ａｉｂを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４０．前記ＧＬＰ−１類似体が、８ＡからＧ、Ｗまたはタンパク質を構成しないアミノ酸残基Ａｉｂへのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４１．前記ＧＬＰ−１類似体が８Ａｉｂを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４２．前記ＧＬＰ−１類似体が、０、１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４３．前記ＧＬＰ−１類似体が、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、３４Ｋおよび３６Ｋからなる群から選択される１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４４．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｌｙｓ残基２６Ｋおよび３４Ｋを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４５．前記ＧＬＰ−１類似体が、２６Ｋおよび３４Ｋのうち一方または両方の置換または欠失を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４６．前記ＧＬＰ−１類似体が２６Ｋを含まない、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４７．前記ＧＬＰ−１類似体が２６Ｋの欠失を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４８．前記ＧＬＰ−１類似体が２６Ｋのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
４９．前記ＧＬＰ−１類似体が２６Ｒを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５０．前記ＧＬＰ−１類似体が追加的なＬｙｓ残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５１．前記ＧＬＰ−１類似体が、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋおよび３６Ｋからなる群から選択される追加のＬｙｓ残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５２．前記ＧＬＰ−１類似体が、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、３４Ｋおよび３６Ｋから選択される厳密に１つのＬｙｓ残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５３．前記ＧＬＰ−１類似体が、以下の対から選択される厳密に２つのＬｙｓ残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物：
ｋ）２１Ｋおよび２６Ｋ
ｌ）２３Ｋおよび２６Ｋ
ｍ）２４Ｋおよび２６Ｋ
ｎ）２５Ｋおよび２６Ｋ
ｏ）２７Ｋおよび２６Ｋ
ｐ）３０Ｋおよび２６Ｋ
ｑ）３１Ｋおよび２６Ｋ
ｒ）３２Ｋおよび２６Ｋ
ｓ）３３Ｋおよび２６Ｋ
ｔ）３４Ｋおよび２６Ｋ。
５４．前記ＧＬＰ−１類似体が３４Ｋを含まない、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５５．前記ＧＬＰ−１類似体が３４Ｋの欠失を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５６．前記ＧＬＰ−１類似体が３４Ｋのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５７．前記ＧＬＰ−１類似体が３４Ｒまたは３４Ｑを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５８．前記ＧＬＰ−１類似体が、アミノ酸残基３５〜３７、３４〜３７または３３〜３７の欠失を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
５９．前記ＧＬＰ−１類似体が３３Ｌを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６０．前記ＧＬＰ−１類似体が、少なくとも２６、例えば少なくとも２７または少なくとも２８のアミノ酸残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６１．ＧＬＰ−１類似体が、アミノ酸残基２１、２３、２４、２５、２７、２９、３０、３１、３２および３３つのうちの１つのアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６２．前述の実施形態のいずれかに記載の化合物であって、前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｈ−Ｘ８−Ｅ−Ｇ−Ｔ−Ｘ１２−Ｔ−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ｘ２１−Ｇ−Ｘ２３−Ｘ２４−Ｘ２５−Ｘ２６−Ｘ２７−Ｆ−Ｘ２９−Ｘ３０−Ｘ３１−Ｘ３２−Ｘ３３−Ｘ３４−Ｘ３５−Ｘ３６−Ｘ３７（配列番号１８７）によって定義される配列を有し、
Ｘ８はＡ、Ｇ、ＷまたはＡｉｂであり、
Ｘ１２はＦまたはＫであり、
Ｘ２１はＥ、Ｇ、またはＫであり、
Ｘ２３はＱ、ＧまたはＫであり、
Ｘ２４はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２５はＡ、Ｇ、ＶまたはＫであり、
Ｘ２６はＫまたはＲであり、
Ｘ２７はＥ、Ｇ、またはＫであり、
Ｘ２９はＩ、Ａ、またはＶであり、
Ｘ３０はＡ、Ｇ、またはＫであり、
Ｘ３１はＷ、Ｇ、またはＫであり、
Ｘ３２はＬ、Ｇ、Ｔ、Ｖ、Ｉ、またはＫであり、
Ｘ３３はＶ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、Ｋであるか、または不在であり、
Ｘ３４はＫ、Ｒ、Ｑであるか、または不在であり、
Ｘ３５はＧであるか、または不在であり、
Ｘ３６はＲ、Ｋであるか、または不在であり、および
Ｘ３７はＧであるか、または不在である。
６３．前記ＧＬＰ−１類似体が配列番号１３８〜１８６、例えば配列番号１３９〜１４６、１５５〜１６２、１６４〜１７３、例えば配列番号１３９〜１４２、１５５〜１６２、１６４〜１７３、例えば配列番号１３９、１４２、１５５〜１６２、１６４〜１７３、例えば配列番号１３９、１５５〜１６２、１６４〜１７３、例えば配列番号１５５〜１６２、１６４〜１７３、または例えば配列番号１３９および１６４により特定されるＧＬＰ−１類似体の群から選択される、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６４．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体がＰＣＳＫ９阻害剤である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６５．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１によって特定されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインと比較して、ヒトＰＣＳＫ９への結合親和性を増加させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６６．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、セクションＣ３に記載されるＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ結合に関する競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定された場合、５０ｎＭ未満のＫｉ、例えば２５ｎＭ未満または例えば１０ｎＭ未満でＰＣＳＫ９に結合する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６７．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、セクションＣ３に記載されるＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ結合に関する前記競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定された場合、５ｎＭ未満のＫｉでＰＣＳＫ９に結合する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６８．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体がＬＤＬ取り込みを増加させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
６９．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、ヒトＰＣＳＫ９の存在下でのＬＤＬ取り込みを増加させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７０．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、セクションＣ４に記載されるＬＤＬ取り込みアッセイで測定された場合、１０００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７１．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、セクションＣ４に記載される前記ＬＤＬ取り込みアッセイで測定された場合、５００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７２．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が血中コレステロールを減少させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７３．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、セクションＣ８に記載されるように評価された場合にＤＩＯラットにおける血中コレステロールを減少させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７４．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、血中コレステロールを少なくとも０．５ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７５．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、血中コレステロールを少なくとも０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７６．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体の配列番号１に対する同一性が、少なくとも８０％、８５％、９０％、または例えば９５％である、前述の実施形態のいずれかによる化合物。
７７．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１と比較して１〜１５のアミノ酸置換を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７８．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０１Ｌを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７９．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０１Ｌおよび３０９Ｒを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８０．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、（野生型）アミノ酸残基２９５Ｎ（Ａｓｎ）、２９６Ｅ（Ｇｌｕ）、２９８Ｌ（Ｌｅｕ）、３０２Ｇ（Ｇｌｙ）および３１０Ｄ（Ａｓｐ）のうちの１つ以上を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８１．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体がいずれのＫ残基を含まない、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８２．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３１２Ｋを含まない、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８３．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３１２Ｅ、３１２Ｄ、３１２Ｑまたは３１２Ｒを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８４．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０１Ｌ、３０９Ｒ、および３１２Ｋのアミノ酸置換、例えば３１２Ｅを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８５．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０１Ｌ、３１０Ｄ、および３１２Ｋのアミノ酸置換、例えば３１２Ｅを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８６．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０１Ｌおよび３１０Ｄを含み、前記ペプチドが２９９ＤからＧ、ＶまたはＨへの置換を持たない、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８７．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３２１Ｄまたは３２１Ｅを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８８．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅおよび３２１Ｅを含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８９．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体の配列が、配列番号１９、２１、７３、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、および１１４、例えば配列番号１０７、１０８、１０９、１１０および１１１、例えば配列番号１０７および１０８のいずれかによって定義される、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
９０．前記融合ポリペプチドがＧＬＰ−１類似体、スペーサーペプチド、およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む、前述の実施形態７〜８９のいずれかに記載の化合物。
９１．前記ＧＬＰ−１類似体が、実施形態２０〜６３のいずれかで定義される、実施形態９０に記載の化合物。
９２．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、実施形態６４〜８９のいずれかで定義される、実施形態９０または実施形態９１に記載の化合物。
９３．前記スペーサーペプチドが、実施形態１４〜１９のいずれかで定義される、実施形態９０、９１または９２に記載の化合物。
９４．前記融合ポリペプチドが、配列番号１８８〜３８４によって特定される配列の群から選択される、実施形態９０に記載の化合物。
９５．前記融合ポリペプチドが最大２つのリジン残基を含む、実施形態９０〜９４のいずれかに記載の化合物。
９６．前記化合物が最大２つの置換基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
９７．前記化合物が最大２つの半減期を延長させる置換基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
９８．前記化合物が、ペプチドバックボーンを含む誘導体であり、前記誘導体に付着された最大２つの置換基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
９９．前記ペプチドバックボーンが、実施形態７〜９４のいずれかで定義される融合ペプチドである、実施形態９８に記載の化合物。
１００．少なくとも１つの置換基が、前記ＧＬＰ−１類似体、前記ＥＧＦ（Ａ）類似体、および／または前記スペーサーに付着された、前述の実施形態９６〜９９のいずれかに記載の化合物。
１０１．少なくとも１つの置換基が前記ＧＬＰ−１類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０２．少なくとも１つの置換基が前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０３．少なくとも１つの置換基が前記スペーサーに付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０４．少なくとも１つの置換基がＬｙｓ／Ｋアミノ酸残基を介して付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０５．少なくとも１つの置換基がＬｙｓ／Ｋアミノ酸残基を介して前記ＧＬＰ−１類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０６．少なくとも１つの置換基が、１２Ｋ、２１Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋおよび３６Ｋからなる群から選択されるＬｙｓ／Ｋアミノ酸残基を介して前記ＧＬＰ−１類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０７．少なくとも１つの置換基が、２６Ｋを介して前記ＧＬＰ−１類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０８．少なくとも１つの置換基が前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１０９．少なくとも１つの置換基が、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、２９９Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１５Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２０Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓまたは３３３Ｌｙｓを介して前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１０．少なくとも１つの置換基が、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３０９Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓまたは３３３Ｌｙｓを介して前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１１．少なくとも１つの置換基が、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１２Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓまたは３３３Ｌｙｓを介して前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１２．少なくとも１つの置換基が、２９２Ｌｙｓ、２９３Ｌｙｓ、２９４Ｌｙｓ、３００Ｌｙｓ、３０３Ｌｙｓ、３０５Ｌｙｓ、３０６Ｌｙｓ、３１１Ｌｙｓ、３１３Ｌｙｓ、３１４Ｌｙｓ、３１６Ｌｙｓ、３１８Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２２Ｌｙｓ、３２３Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２５Ｌｙｓ、３２６Ｌｙｓ、３２７Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、３２９Ｌｙｓ、３３０Ｌｙｓ、３３２Ｌｙｓまたは３３３Ｌｙｓを介して前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１３．少なくとも１つの置換基が、３１３Ｌｙｓ、３２１Ｌｙｓ、３２４Ｌｙｓ、３２８Ｌｙｓ、または３３３Ｌｙｓを介して前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１４．少なくとも１つの置換基が前記ペプチドスペーサーに付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１５．少なくとも１つの置換基が、Ｌｙｓ残基を介して前記ペプチドスペーサーに付着された、実施形態１００に記載の化合物。
１１６．少なくとも１つの置換基が、Ｌｙｓ残基を介して前記ペプチドスペーサーに付着され、前記スペーサーが、位置１、２、３、４、５、６、７または８の位置にＬｙｓを有する配列番号１１６の変異体である、実施形態１００に記載の化合物。
１１７．前記化合物が、前記融合ペプチドに付着された厳密に２つの置換基を含む、実施形態９６〜１１６のいずれか１つに記載の化合物。
１１８．１つの置換基が、実施形態１０５〜１０７に定義される前記ＧＬＰ−１類似体を介して付着され、１つの置換基が、実施形態１１５〜１１６のいずれか１つに定義される前記スペーサーに付着された、実施形態１１７に記載の化合物。
１１９．１つの置換基が、実施形態１０９〜１１３のいずれか１つに定義される前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を介して付着され、１つの置換基が、実施形態１１５〜１１６のいずれか１つに定義される前記ペプチドスペーサーに付着された、実施形態１１７に記載の化合物。
１２０．１つの置換基が、実施形態１０５〜１０７のいずれか１つに定義される前記ＧＬＰ−１類似体を介して付着され、１つの置換基が、実施形態１０９〜１１３のいずれか１つに定義される前記ＥＧＦ（Ａ）類似体に付着された、実施形態１１７に記載の化合物。
１２１．２つの置換基が、実施形態１０５〜１０８のいずれか１つで定義される前記ＧＬＰ−１類似体を介して付着された、実施形態１１７に記載の化合物。
１２２．２つの置換基が、実施形態１０９〜１１３のいずれか１つで定義される前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を介して付着された、実施形態１１７に記載の化合物。
１２３．前記置換基が脂肪酸基（ＡＢ）を含む、前述の実施形態９６〜１２２のいずれかに記載の化合物。
１２４．前記置換基が、化学式１：−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（式中、ｎは８〜２０の整数）および化学式２：−ＨＯＯＣ−（Ｃ６Ｈ４）−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−＊（式中、ｍは８〜１１の整数）からなる群から選択される脂肪酸基を含む、実施形態１２３に記載の化合物。
１２５．前記置換基が、二酸−Ｃ（＝Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−ＣＯＯＨ（式中、ｎは１４〜２０）から選択される脂肪酸基を含む、実施形態１２３に記載の化合物。
１２６．前記置換基が、二酸（−ＨＯＯＣ−（Ｃ６Ｈ４）−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＣＯ−＊）（式中、ｍは８〜１１の整数）から選択される脂肪酸基を含む、実施形態１２３に記載の化合物。
１２７．前記少なくとも１つの置換基が少なくとも１つのリンカー要素をさらに含む、実施形態１２３〜１２６のいずれかに記載の化合物。
１２８．少なくとも１つの置換基が、−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−と呼ばれる最大で６つのリンカー要素をさらに含む、実施形態１２３〜１２６のいずれかに記載の化合物。
１２９．前記少なくとも１つの置換基が、−Ｚ１−Ｚ２−Ｚ３−Ｚ４−Ｚ５−Ｚ６−と呼ばれる最大で６つのリンカー要素をさらに含み、Ｚ１が前記脂肪酸基に結合され、最後のＺ要素が前記ペプチドバックボーンに結合されている、実施形態１２３〜１２６のいずれかに記載の化合物。
１３０．−Ｚ１が＊−ＮＨ−ＣＨ２−（Ｃ６Ｈ１０）−ＣＯ−＊または結合である、実施形態１２８および１２９のいずれかに記載の化合物。
１３１．−Ｚ２−がγＧｌｕ、Ｇｌｕ、または結合である、実施形態１２８および１３０のいずれかに記載の化合物。
１３２．−Ｚ２−がγＧｌｕである、実施形態１２８および１３０のいずれかに記載の化合物。
１３３．Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、相互に独立して、Ｇｌｕ、γＧｌｕ、Ａｄｏ、および結合から選択される、実施形態１２８および１３２のいずれかに記載の化合物。
１３４．Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５およびＺ６は、互いに独立して、γＧｌｕ、Ａｄｏ、および結合から選択される、実施形態１２８および１３２のいずれかに記載の化合物。
１３５．前記少なくとも１つの置換基が、−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ−を含むリンカーを含む、実施形態１２３〜１３４のいずれかに記載の化合物。
１３６．前記少なくとも１つの置換基が、置換基＃１〜１３、例えば置換基＃１〜４、＃５〜１２、＃６〜１２、または置換基＃１、＃５および＃６からなる置換基の群から選択される、実施形態１２３に記載の化合物。
１３７．前記化合物が二機能性である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
１３８．前記化合物がＧＬＰ−１受容体作動薬である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
１３９．前記化合物が、Ｃ１（ＨＳＡなし）で記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて１〜５０ｐＭ、１０〜１００ｐＭ、５０〜１００ｐＭ、１００〜２５０ｐＭまたは２５０〜１０００ｐＭのＥＣ５０を有する、実施形態１３７または実施形態１３８に記載の化合物。
１４０．前記化合物が完全ＧＬＰ−１受容体作動薬である、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４１．前記化合物が、Ｃ１（ＨＳＡなし）で記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて野生型ＧＬＰ−１と同等のＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４２．前記化合物が、Ｃ１（ＨＳＡなし）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて最大で５０ｐＭのＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４３．前記化合物が、Ｃ１（ＨＳＡなし）で記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいてセマグルチドと同等のＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４４．前記化合物が、Ｃ１（ＨＳＡなし）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて５〜１５ｐＭのＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４５．前記化合物が、Ｃ１（１％ＨＳＡ）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて最大で２５００ｐＭのＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４６．前記化合物が、Ｃ１（１％ＨＳＡ）に記載されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて少なくとも５００ｐＭのＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１３９のいずれかに記載の化合物。
１４７．前記化合物が、Ｃ７に記載されたｄｂ／ｄｂマウスにおいて血糖を低下させる能力を有する、前述の実施形態１３７〜１４６のいずれかに記載の化合物。
１４８．前記化合物が、Ｃ７に記載されたｄｂ／ｄｂマウスにおいて血糖を低下させる能力を有し、ＥＣ５０  ＡＵＣΔＢＧ２４ｈが１５ｎｍｏｌ／ｋｇ未満である、前述の実施形態１３７〜１４６のいずれかに記載の化合物。
１４９．前記ＧＬＰ−１類似体が、Ｃ８に記載されるようにＤＩＯラットの体重を減少させる能力を有する、前述の実施形態１３７〜１４６のいずれかに記載の化合物。
１５０．前記化合物が、Ｃ８に記載されたＤＩＯラットにおいて体重を減少させる能力を有し、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、前記ＧＬＰ−１類似体がベースラインＢＷの少なくとも９５％に体重を減少される能力を有する、前述の実施形態１３７〜１４６のいずれかに記載の化合物。
１５１．前記化合物が、Ｃ８に記載されたＤＩＯラットにおいて体重を減少させる能力を有し、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、前記ＧＬＰ−１類似体がベースラインＢＷの少なくとも９０％に体重を減少される能力を有する、前述の実施形態１３７〜１４６のいずれかに記載の化合物。
１５２．化合物がＰＣＳＫ９阻害剤である、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
１５３．前記化合物が、配列番号１によって特定されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインと比較して、増加したヒトＰＣＳＫ９への結合親和性を増加させる、前述の実施形態１３７〜１４５のいずれかに記載の化合物。
１５４．前記化合物が、セクションＣ３に記載されるＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ結合に関する競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定された場合、５０ｎＭ未満のＫｉ、例えば２５ｎＭ未満、または例えば１０ｎＭ未満でＰＣＳＫ９に結合する、前述の実施形態１３７〜１４５のいずれかに記載の化合物。
１５５．前記化合物が、セクションＣ３に記載されるＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ結合に関する競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定された場合、５ｎＭ未満のＫｉでＰＣＳＫ９に結合する、前述の実施形態１３７〜１４５のいずれかに記載の化合物。
１５６．前記化合物がＬＤＬ取り込みを増加させる、前述の実施形態１３７〜１４５のいずれかに記載の化合物。
１５７．前記化合物がヒトＰＣＳＫ９の存在下でのＬＤＬ取り込みを増加させる、前述の実施形態１３７〜１４５のいずれかに記載の化合物。
１５８．前記化合物が、セクションＣ４に記載されるＬＤＬ取り込みアッセイで測定された場合、１０００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１５２のいずれかに記載の化合物。
１５９．前記化合物が、セクションＣ４に記載されるＬＤＬ取り込みアッセイで測定された場合、５００ｎＭ未満のＥＣ５０を有する、前述の実施形態１３７〜１４５のいずれかに記載の化合物。
１６０．前記化合物が、セクションＣ８に記載されるように評価された場合にＤＩＯラットにおける血中コレステロールを減少させる、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
１６１．前記化合物が、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、血中コレステロールを少なくとも０．５ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる、実施形態１６０に記載の化合物。
１６２．前記化合物が、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、血中コレステロールを少なくとも０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる、実施形態１６０に記載の化合物。
１６３．前記化合物が、前述の実施形態１３９〜１４４のいずれか１つで定義されるＧＬＰ−１受容体作動薬、および実施形態１５３〜１５９のいずれか１つで定義されるＰＣＳＫ９阻害剤である、実施形態のいずれかに記載の化合物。
１６４．前記化合物の見掛けのＥＧＦ（Ａ）Ｋｉ（Ｃ３）：ＧＬＰ−１効力（Ｃ１、ＨＳＡなし）の比率が、最大で５０００、例えば最大で４０００、例えば最大で３０００、例えば最大で２０００、または例えば最大で１０００である、実施形態１６０に記載の化合物。
１６５．前記化合物の見掛けのＥＧＦ（Ａ）Ｋｉ（Ｃ３）：ＧＬＰ−１効力（Ｃ１、ＨＳＡなし）の比率が、最大で１０００、例えば最大で８００、例えば最大で６００、例えば最大で４００、または例えば最大で２００である、実施形態１６０に記載の化合物。
１６６．前記化合物の見掛けのＥＧＦ（Ａ）Ｋｉ（Ｃ３）：ＧＬＰ−１効力（Ｃ１、ＨＳＡなし）の比率が、最大で２００、例えば最大で１５０、例えば最大で１００、例えば最大で５０、２５、１０である、実施形態１６０に記載の化合物。
１６７．前記化合物が、本明細書のセクションＣ８に記載されるｉｎ  ｖｉｖｏラット試験において、ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１と少なくとも等しい、コレステロールおよび体重を減少させる能力を有する、前述の実施形態１３７〜１６６のいずれかに記載の化合物。
１６８．前記化合物が、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、少なくとも０．５ｍｍｏｌ／Ｌのコレステロールを減少させる能力を有する、実施形態１６７に記載の化合物。
１６９．前記化合物が、３０ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも０．６ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば０．７ｍｍｏｌ／Ｌ、または例えば０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する、実施形態１６７に記載の化合物。
１７０．前記化合物が、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも０．８ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する、実施形態１６７に記載の化合物。
１７１．前記化合物が、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、コレステロールを少なくとも１．０ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば１．２ｍｍｏｌ／Ｌ減少させる能力を有する、実施形態１６７に記載の化合物。
１７２．前記化合物が、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し２１日後に測定した場合、ベースラインＢＷの少なくとも９５％に体重を減少させる能力を有する、実施形態１６７〜１７１に記載の化合物。
１７３．前記化合物が、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ／日で投与し、２１日後に測定した場合、ベースラインＢＷの少なくとも９０％に体重を減少させる能力を有する、実施形態１６７〜１７１に記載の化合物。
１７４．前記化合物が、ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１〜３１４として定義される化合物の群から選択される、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
１７５．ＧＬＰ−１受容体作動薬およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含み、前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１によって特定されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体である、化合物。
１７６．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、前述の実施形態６４〜８９のいずれかで定義される、実施形態１７５に記載の化合物。
１７７．ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１〜３０５として定義される化合物の群から選択される化合物。
１７８．ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１〜３１４として定義される化合物の群から選択される化合物。
１７９．ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１、２、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２９、３２、４１、４８、５１、５２、５３、５４、６９、８２、８６、２２１、２３０、２８７、２９８および３０６として定義される化合物の群から選択される化合物。
１８０．ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１、２、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２９、３２、２４８、５２、５３、５４、６９および３０６として定義される化合物の群から選択される化合物。
１８１．ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１、＃４８、＃６９および＃３０６、例えば＃３０６および＃６９、または例えば＃３０６もしくは＃６９として定義される化合物の群から選択される化合物。
１８２．前述の実施形態のいずれかによる化合物の、薬剤の調製のための使用。
１８３．薬剤の調製に使用するための、前述の実施形態１〜１８１のいずれかに記載の化合物。
１８４．治療方法で使用するための、前述の実施形態１〜１８１のいずれかに記載の化合物。
１８５．糖尿病および／または過体重を治療する方法で使用するための、前述の実施形態１〜１８１のいずれかに記載の化合物。
１８６．心血管疾患および／または心血管リスクを治療または予防する方法で使用するための、前述の実施形態１〜１８１のいずれかに記載の化合物。
１８７．脂質パラメータを改善するための治療方法で使用するための、前述の実施形態１〜１８１のいずれかに記載の化合物。
１８８．糖尿病および心血管疾患を治療する方法で使用するための、前述の実施形態１〜１８１のいずれかに記載の化合物。
１８９．糖尿病および／または過体重を治療する方法であって、前記方法が、必要とする患者に対し、薬学的に活性な量の前述の実施形態１〜１８１のいずれかによる化合物を投与する工程を含む、方法。
１９０．心血管疾患および／または心血管リスクを治療または予防する方法であって、前記方法が、必要とする患者に対し、薬学的に活性な量の前述の実施形態１〜１８１のいずれかによる化合物を投与する工程を含む、方法。
１９１．脂質パラメータを改善するための治療方法であって、前記方法が、必要とする患者に対し、薬学的に活性な量の前述の実施形態１〜１８１のいずれかによる化合物を投与することを含む、方法。
１９２．糖尿病および心血管疾患を治療する方法であって、前記方法が、必要とする患者に対し、薬学的に活性な量の前述の実施形態１〜１８１のいずれかによる化合物を投与する工程を含む、方法。
【０４４６】
〈さらなる実施形態〉
１．ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物であって、
ｉ．前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号１３７によって特定されるＧＬＰ−１（７−３７）の類似体であり、
ｉｉ．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１によって特定されるＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインの類似体である、化合物。
２．前記化合物が二機能性である、実施形態１に記載の化合物。
３．前記化合物が、前記ＧＬＰ−１類似体および前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を含む融合ポリペプチドを含む、実施形態１に記載の化合物。
４．前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端に前記ＧＬＰ−１類似体を、Ｃ末端に前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を含む、実施形態３に記載の化合物。
５．融合ポリペプチドが、ペプチドスペーサー、例えば配列番号１１５〜１３６によって定義されるスペーサーの群から選択されるスペーサーを含む、実施形態３または実施形態４に記載の化合物。
６．前記化合物が１つまたは２つのＬＹＳ残基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
７．前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号１３８〜１８７、例えば配列番号１３９〜１４６、１５５〜１６２、１６４〜１７３、例えば配列番号１３９〜１４２、１５５〜１６２、１６４〜１７３、例えば配列番号１３９、１４２、１５５〜１６２、１６４〜１７３、例えば配列番号１５５〜１６２および１６４〜１７３、例えば配列番号１５５〜１６２および１６４〜１７３、例えば配列番号１３９および１６４、または例えば配列番号１３９もしくは１６４により定義されるＧＬＰ−１類似体の群から選択される、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
８．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が配列番号２〜１１４、例えば配列番号２〜４、６〜１９、２１〜４４、４６、４７、４９〜５３、５５、５８〜１１４、例えば配列番号１９、２１、７３、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３および１１４、例えば配列番号１０７および１０８、または例えば配列番号１０８により定義されるＥＧＦ（Ａ）類似体の群から選択される、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
９．前記融合ポリペプチドが、配列番号１８８〜３８４および３８７〜３８８によって定義される配列の群から選択される、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
１０．前記化合物が少なくとも１つの半減期を延長させる置換基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
１１．前記化合物が、脂肪酸基およびリンカーを含む少なくとも１つの置換基を含む、前述の実施形態のいずれかに記載の化合物。
１２．少なくとも１つの置換基がＬＹＳ残基を介して結合される、実施形態１１または実施形態１２に記載の化合物。
１３．ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１、＃４８、＃６９および＃３０６、例えば＃３０６および＃６９、または例えば＃３０６もしくは＃６９として定義される化合物の群から選択される化合物。
１４．糖尿病、過体重および／または心血管疾患を治療する方法で使用するための、前述の実施形態のいずれかによる化合物。
１５．実施形態１〜１４のいずれかに記載の化合物を必要とする患者に対し、前記化合物の薬学的に有効な投与量を投与することを含む、糖尿病、過体重および／または心血管疾患の治療方法。
【０４４７】
《方法および例》
〈略語リスト〉
Ａｉｂ：α−アミノイソ酪酸（２−アミノイソ酪酸）
ＡｃＯＨ：酢酸
Ａｄｏ：８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸
ＡＰＩ：活性医薬品成分
ＡＵＣ：曲線下面積
ＢＧ：血糖
ＢＨＫ：ベビーハムスター腎臓細胞
ＢＷ：体重
Ｂｏｃ：ｔ−ブチルオキシカルボニル
ＢＳＡ：ウシ血清アルブミン
Ｂｚｌ：ベンジル
ＣＡＳ：化学情報検索サービス機関
Ｃｌｔ：２−クロロトリチル
コリジン：２，４，６−トリメチルピリジン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
Ｄｄｅ：１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）エチル
ＤｅｓＨ：ｄｅｓ−アミノヒスチジン（イミダゾプロピオン酸または３−（イミダゾール−５−ｙｌ）プロパン酸）、Ｉｍｐ）
ＤＩＣ：ジイソプロピルカルボジイミド
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチルアミン
ＤＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）
ＤｏｏＡｓｕｃ：８−アミノ−３，６−ジオキサオクチルスクナミン酸
ＤＴＴ：１，４−ジチオスレイトール
ＥＤＴＡ：エチレンジアミン四酢酸
ＥＧＦ：上皮成長因子様
ＥＧＦ（Ａ）：上皮成長因子様ドメインＡ
ＥＧＴＡ：エチレングリコールテトラ酢酸
ＦＣＳ：ウシ胎児血清
Ｆｍｏｃ：９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
ＨＡＴＵ：（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）
ＨＢＴＵ：（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩）
ＨＥＰＥＳ：４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸
ＨＦＩＰ：１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール
ＨＯＡＴ：１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール
ＨＯＢｔ：１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
ｈＰＣＳＫ９：ヒトＰＣＳＫ９
ＨＰＬＣ：高速液体クロマトグラフィー
ＨＳＡ：ヒト血清アルブミン
ＩＢＭＸ：３−イソブチル−１−メチルキサンチン
ＩＣ５０：５０％阻害濃度
Ｉｍｐ：イミダゾプロピオン酸または３−（イミダゾール−５−イル）プロパン酸）（ｄｅｓ−アミノヒスチジン（ＤｅｓＨ）とも呼ばれる）
Ｉｎｐ：イソニペコチン酸
ｉ．ｖ．：静脈内
ｉｖＤｄｅ：１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキソシクロヘキシリデン）−３−メチルブチル
ＩＶＧＴＴ：静脈内ブドウ糖負荷試験
ＬＣＭＳ：液体クロマトグラフィー質量分析
ＬＤＬ−ＲまたはＬＤＬｒ：ＬＤＬ受容体
ＬＤＬ：低密度リポタンパク質
ＬＤＬ−Ｃ：ＬＤＬコレステロール
ＬＹＤ：ランドレース種／大ヨークシャー種／デュロック種豚
ＭＡＬＤＩ−ＭＳ：ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳを参照
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ：マトリックス支援レーザー脱離イオン化法飛行時間質量分析計
ＭｅＯＨ：メタノール
Ｍｍｔ：４−メトキシトリチル
ＭＲＴ：平均滞留時間
Ｍｔｔ：４−メチルトリチル
ＮＭＰ：Ｎ−メチルピロリドン
ＮＤ：未決定
ＯＢｚ：ベンゾイルエステル
ＯＥＧ：８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸（Ａｄｏとも呼ばれる）
ＯＰｆｐ：ペンタフルオロフェノキシ
ＯＰｎｐ：パラ−ニトロフェノキシ
ＯＳｕ：Ｏ−スクシンイミジルエステル（ヒドロキシスクリンイミドエステル）
ＯｔＢｕ：ｔｅｒｔ−ブチルエステル
Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ（登録商標）：シアノ−ヒドロキシイミノ−酢酸エチルエステル
Ｐｂｆ：２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル
ＰＢＳ：リン酸緩衝生理食塩水
ＰＤ：薬力学
Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ：ペニシリン／ストレプトマイシン
ＰＫ：薬物動態
ＱＣ：品質管理
ＲＰ：逆位相
ＲＰ−ＨＰＬＣ：逆位相高性能液体クロマトグラフィー
ＲＴ：室温
Ｒｔ：保持時間
ｓ．ｃ．：皮下
ＳＤ：標準偏差
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ：サイズ排除高性能液体クロマトグラフィー
ＳＥＭ：標準誤差
ＳＰＡ：シンチレーション近接アッセイ
ＳＰＰＳ：固相ペプチド合成
ｔＢｕ：ｔｅｒｔ．ブチル
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＩＳまたはＴＩＰＳ：トリイソプロピルシラン
Ｔｏｓ：トシラート（またはパラ−トルエンスルホニル）
ＴｏｔａＧｌｙｃ：１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカルジグリコラミン酸
Ｔｒｉｓ：トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、または２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−プロパン−１，３−ジオール
Ｔｒｔ：トリフェニルメチル（トリチル）
Ｔｒｘ：トラネキサム酸
ＴｔｄＳｕｃ：１３−アミノ−４，７，１０−トリオキサトリデカルスクナミン酸
ＵＰＬＣ：超高速液体クロマトグラフィー
【０４４８】
〈特殊材料〉
エイコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル
ドコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル
４−（１０−カルボキシデシルオキシ）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル
Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸
Ｆｍｏｃ−トラネキサム酸
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨ
Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ
Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ
【０４４９】
エイコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ドコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、および４−（１０−カルボキシデシルオキシ）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルの調製は、下記のセクション２に記載され、最後に述べる５つの材料は市販されている。
【０４５０】
《方法》
このセクションは３部構成であり、本発明の化合物の一般的な調製方法に関連するセクションＡと、本発明の多数の特定の化合物調製に関連するセクションＢと、多数の特定の化合物例の結果も含めた本発明の化合物の特性評価方法に関連するセクションＣとを含む。
【０４５１】
《Ａ１．調製の一般的な方法》
このセクションは、固相ペプチド合成方法（アミノ酸の脱保護方法、樹脂からペプチドを切断する方法、およびその精製方法を含むＳＰＰＳ法）、ならびに結果得られるペプチドを検出して特徴付ける方法（ＬＣＭＳ法およびＵＰＬＣ法）に関する。
【０４５２】
ペプチドの固相合成は、一部の場合において、２−Ｆｍｏｃ−オキシ−４−メトキシベンジル、または２，４，６−トリメトキシベンジルなど（これに限定されない）の酸性条件下で開裂されうる基とのジペプチドアミド結合上で保護されたジペプチドの使用によって改善されうる。セリンまたはスレオニンがペプチド中に存在する場合、疑似プロリンジペプチドを使用してもよい（例えば、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから入手可能、Ｗ．Ｒ．Ｓａｍｐｓｏｎ（１９９９），Ｊ．Ｐｅｐ．Ｓｃｉ．５，４０３も参照のこと）。使用されるＦｍｏｃ保護アミノ酸誘導体は、標準的に推奨される以下のものである：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｉｌｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｍｅｔ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ、または、Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨなどで、例えば、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、またはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから供給される。他に何も指定されていない場合は、アミノ酸の天然Ｌ形態が使用される。Ｎ末端アミノ酸は、アルファアミノ基（例えば、Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ、またはＮ末端にＨｉｓのあるペプチドではＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ）でＢｏｃ保護されている。ＳＰＰＳを使用したモジュール型のアルブミン結合部分付着の場合には、Ｆｍｏｃ−８−アミノ−３，６−ジオキサオクタン酸、Ｆｍｏｃ−トラネキサム酸酸、Ｆｍｏｃ−イソニペコチン酸、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ−ＯｔＢｕおよびヘキサデカン酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルなどを含むがこれらに限定されない適切に保護された構成ブロックが、例えば、Ａｎａｓｐｅｃ、Ｂａｃｈｅｍ、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、またはＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから供給される。エイコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、ドコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステル、および４−（１０−カルボキシデシルオキシ）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルは、以下に記載するように調製することができる。以下に記載されるすべての作業は、４００−μｍｏｌまたは４５０−μｍｏｌの合成スケールで行われる。
【０４５３】
〈１．樹脂結合型保護ペプチドヒドラジドの合成〉
方法：ＳＰＰＳ＿Ｐ
樹脂負荷に比べて５倍多い（例えば、０．４９ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ−ヒドラゾノ−ピルビル−アミノメチルポリスチレン樹脂（ＰＹＶ１０００、ドイツ・マルクトレドヴィッツ市、Ｉｒｉｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈ９５６１５））Ｆｍｏｃアミノ酸（３００ｍＭ、Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ（登録商標）を添加したＤＭＦ中３００ｍＭ）を用いて、４００μｍｏｌまたは４５０μｍｏｌスケールで、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（米国アリゾナ州ツーソン市８５７１４）のＰｒｅｌｕｄｅまたはＳｙｍｐｈｏｎｙＸ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒで、ＳＰＰＳ＿Ｐを実施する。Ｆｍｏｃ脱保護は、ＤＭＦ中２０％ピペリジン、または０．１Ｍ  Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ（登録商標）を添加したＤＭＦ中２０％ピペリジンを使用して行う。結合は、ＤＭＦ中のアミノ酸／ＯＸＹＭＡ  Ｐｕｒｅ（登録商標）／ＤＩＣ／コリジンの割合を５：５：５：５として実施する。ＤＭＦ上部洗浄（９ｍＬの６サイクル）を、脱保護工程と結合工程の間で実施する。結合時間は概して１２０分である。Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、またはＢｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨを含むがこれに限定されない一部のアミノ酸は「二重結合」されるが、これは、第一の結合（例えば、６０分）の後、樹脂が排出され、試薬がさらに加えられ（アミノ酸、Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ（登録商標）、ＤＩＣ、およびコリジン）、混合物の反応を再び許容する（例えば、６０分）ことを意味する。
【０４５４】
〈２．樹脂結合型保護ペプチドヒドラジドの合成〉
ＳＰＰＳ＿Ｐを、同じ結合手順を使用し、低負荷Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｗａｎｇ（０．３２ｍｍｏｌ／ｇ）樹脂を使用して上述のように実施する。
【０４５５】
〈３．アルブミン結合剤の合成〉
エイコサン二酸モノ−ｔｅｒｔ−ブチルエステルは、例えば、国際公開第２０１０／１０２８８６号に記載されるように当該技術分野で周知のとおりに調製できる。
【０４５６】
ドコサン二酸モノｔｅｒｔ−ブチルエステルは、例えば、国際公開第２０１５／０００９４２号に記載されるように当該技術分野で周知のとおりに調製できる。
【０４５７】
４−（１０−カルボキシデシルオキシ）安息香酸ｔｅｒｔ−ブチルエステルは、例えば、国際公開第２００６／０８２２０４号に記載されるように当該技術分野で周知のとおりに調製できる。
【０４５８】
〈４．樹脂結合型保護ペプチドバックボーンへの側鎖の付着〉
リジンの側鎖にアシル化が存在する場合、アシル化されるリジンのεアミノ基はＭｔｔで保護される。Ｍｔｔの除去は、ヘキサフルオロイソプロパノール／ＤＣＭ（７５：２５、３×１０ｍＬ、それぞれ５分、２５分、および２５分）を用いて行い、その後、ＤＣＭ（４×１０ｍＬ）、ＤＭＦ（２ｘ９ｍＬ）、Ｏｘｙｍａ  Ｐｕｒｅ（登録商標）０．１Ｍを添加したＤＭＦ中２０％ピペリジン（１×９ｍＬ）、ＤＭＦ（４×９ｍＬ）を用いて樹脂を洗浄する。延長部分および／またはリンカーは、樹脂結合ペプチドのアシル化によって、または保護されていないペプチドの溶液中でのアシル化によって、ペプチドに付着されうる（国際公開第２０１０／０２９１５９号に記載）。延長部分および／またはリンカーを保護されたペプチジル樹脂に付着する場合、付着はＳＰＰＳおよび適切に保護された構成ブロックを使用したモジュールでもよい。
方法：ＳＣ＿Ｐ
【０４５９】
Ｎ−ε−リジン保護基は上述のように除去され、リジンの化学修飾は、適切に保護された構成ブロックを使用して、ＰｒｅｌｕｄｅまたはＳｙｍｐｈｏｎｙＸペプチド合成装置上で１つ以上の自動化工程によって上述のように実施される。ＳＰＰＳ＿Ｐに記載するように、二重結合は結合あたり１時間、または一重結合は結合あたり２時間で実施される。
〈５．付着された側鎖がある場合／ない場合の樹脂結合ペプチドの切断および精製〉
方法：ＣＰ＿Ｍ１
【０４６０】
合成後、樹脂をＤＣＭで洗浄し、ＴＦＡ／ＴＩＳ／水／ＤＴＴ（９２．５／２．５／２．５／２．５または９０／５／２．５／２．５）を用いて２〜３時間処理してペプチドを樹脂から切断し、その後ジエチルエーテルで析出する。ペプチドを適切な溶媒（例えば、水／アセトニトリル）に溶解し、Ｃ１８、５μｍカラム上で、標準ＲＰ−ＨＰＬＣによってアセトニトリル／水／ＴＦＡを用いて精製する。ＵＰＬＣおよびＬＣＭＳを組み合わせた方法で画分を分析し、適切な画分をプールし冷凍乾燥する。
【０４６１】
望ましい場合は、当該技術分野で周知の方法を使用して、ペプチドの対イオンをナトリウムと交換することができる。一例として、５グラムのＳｅｐ−ｐａｋ  Ｃ１８カラムを５０ｍＬの２−プロパノール、５０ｍＬのアセトニトリル、５０ｍＬの水で洗浄する。２１ｍＬ、５０ｍＭ、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）中のおよそ７０ｍｇタンパク質溶液をＳｅｐ−ｐａｋカラムにロードし、これを５０ｍＬの水、５０ｍＬ、０．１Ｍ塩化ナトリウム（水溶液）および５０ｍＬ水で洗浄する。タンパク質のナトリウム塩を、１００ｍＬの水／アセトニトリル（３０：７０）で溶離させ、凍結乾燥させる。
【０４６２】
〈６．Ｃｙｓ−ペプチドによるペプチドヒドラジドの天然化学ライゲーションおよび精製〉
方法：ＮＣＬ＿Ｍ１
ペプチドヒドラジド（１．０当量）を０．２Ｍリン酸二ナトリウム／６．０Ｍグアニジン塩酸塩（水溶液、ｐＨ３．０）に溶解して最終濃度４．０ｍＭを得て、−１０℃に冷却する。亜硝酸ナトリウム（０．２Ｍ水中、５当量）を加え、−１０℃で２０分間攪拌する。０．２Ｍリン酸二ナトリウム／６．０Ｍグアニジン塩酸塩（ｐＨは７．０に調整）中０．２Ｍの４−メルカプトフェニル酢酸（５０当量）溶液をこの溶液に加え、その後、Ｃｙｓ−ペプチド（１．１当量）を加える。水酸化ナトリウム（１．０Ｍ、水溶液）で溶液のｐＨを６．７に調整し、混合物を２５℃で１６時間攪拌する。反応混合物に１，４−ジチオスレイトール（１００当量）を加え、濃塩酸（水溶液）でｐＨを３．０に調整する前に３０分間攪拌する。反応混合物は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（米国マサチューセッツ州ビレリカ市）のＵｌｔｒａｃｅｌ−３膜を用い、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニットを使用して、限外ろ過によって濃縮する。濃縮液を０．０５Ｍリン酸二ナトリウム／６．０Ｍグアニジン塩酸塩（水溶液、ｐＨ３．０）で希釈し、再び限外ろ過により濃縮する。４−メルカプトフェニル酢酸の濃度が０．１ｍＭ未満（＞１０００倍の希釈に相当）となるまでこれを繰り返す。濃縮液を５０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、５ｍＭ塩化カルシウム、３ｍＭシステイン、０．３ｍＭシスチン、（水溶液、ｐＨ８．２）の攪拌液に滴下して加え、結果としておよそ０．１ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を得る。溶液を２５℃で１６時間攪拌する。折り畳み混合物のｐＨは、アセトニトリル／水／ＴＦＡを使用してＣ１８、５μｍカラム上で標準ＲＰ−ＨＰＬＣで精製される前に、濃塩酸（水溶液）でおよそ３に調整する。ＵＰＬＣおよびＬＣＭＳを組み合わせた方法で画分を分析し、適切な画分をプールし冷凍乾燥する。
【０４６３】
〈７．融合タンパク質の組換発現〉
対象の融合タンパク質を、適切な宿主を使用して異種発現によって提供する。発現プラスミドは周知の技術を使用して構築され、当業者に周知の方法によって融合タンパク質を発現・精製する。短細胞を採取し、細胞粉砕器によって、ｐＨ７で１Ｘ  ＰＢＳ緩衝液中で溶解する。融合タンパク質を含む不溶性画分を収集し、同じ緩衝液（６，０００ｇ／２０分）で２回洗浄する。次いで２０ｍＭエタノールアミン、２Ｍ尿素、ｐＨ１０．５を使用して、室温（２２〜２６℃）で封入体を１０ｍｇ／ｍＬの濃度に可溶化する。１時間後、溶液を脱塩水により３回希釈し、ｐＨを８．５に調整する。エンテロキナーゼ切断を、１：１，０００の比で、同じ温度で２０時間実施する。その後、リフォールディングのために最終濃度１０ｍＭのＣａｃｌ２および５ｍＭシステインを加える。ｐＨを３．０に調整した後、タンパク質をＳＰ  ｆａｓｔ  ｆｌｏｗセファロースから捕捉する。捕捉された試料を、ｐＨ７．５で逆相ＦｅＦカラムに供する。最終研磨工程として、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｑカラム（２０ｍＭのＴｒｉｓ、５ｍＭのＣａｃｌ２、ｐＨ９．０）を選択した。
【０４６４】
〈８．組み換え型タンパク質におけるタンパク質を構成しないアミノ酸の組み込み〉
Ｎ末端Ｈｉｓ−Ａｉｂジペプチドを、Ｆｍｏｃ−Ｈｉｓ−Ａｉｂ−ＯＨ溶液中でアシル化により導入し、次いでＦｍｏｃ保護基によって除去することができる（国際公開第２０１３／０９８１９１号に記載）。
【０４６５】
《Ａ２．検出および特性評価のための一般的方法》
〈１．ＬＣ−ＭＳ法〉
【０４６６】
方法：ＬＣＭＳ０１
Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムおよびＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ  ＸＥ質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ社）から構成される装置において、ＬＣＭＳ０１を実施する。溶離液：Ａ：水中０．１％ギ酸、Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸。分析は、ＡおよびＢのグラジエントで溶出されたカラムに適切な量（２〜１０μＬが好ましい）の試料を注入することによって室温にて実施する。ＵＰＬＣの条件、検出器の設定、質量分析計の設定は以下のとおりである。カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ、Ｃ−１８、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ。グラジエント：０．４ｍＬ／分での４．０分（あるいは８．０分）間での直線的な５％〜９５％アセトニトリル。検出：２１４ｎｍ（ＴＵＶ（チューナブルＵＶ検出器）からのアナログ出力）、ＭＳイオン化モード：ＡＰＩ−ＥＳ。スキャン：１００〜２０００ａｍｕ（代替的に５００〜２０００ａｍｕ）、ステップ０．１ａｍｕ。
【０４６７】
方法：ＬＣＭＳ３４
Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムおよびＸｅｖｏ  Ｇ２−ＸＳ質量分析計からなる装置において、ＬＣＭＳ３４を実施する。溶離液：Ａ：水中０．１％ギ酸、Ｂ：アセトニトリル中０．１％ギ酸。分析は、ＡおよびＢのグラジエントで溶出されたカラムに適切な量（２〜１０μＬが好ましい）の試料を注入することによって、室温で実施する。ＵＰＬＣの条件、検出器の設定、質量分析計の設定は以下のとおりである。カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ、Ｃ−１８、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ。グラジエント：０．４ｍＬ／分での４．０分（あるいは８．０分）間での直線的な５％〜９５％アセトニトリル。検出：２１４ｎｍ（ＴＵＶ（チューナブルＵＶ検出器）からのアナログ出力）、ＭＳイオン化モード：ＡＰＩ−ＥＳ。スキャン：１００〜２０００ａｍｕ（代替的に５００〜２０００ａｍｕ）、ステップ０．１ａｍｕ。
方法：ＬＣＭＳ２７
【０４６８】
Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  ＩｎｆｉｎｉｔｙシリーズおよびＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ＬＣ／ＭＳＤ  ＴＯＦ  ６２３０（Ｇ６２３０Ａ）検出器（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｊｅｔ  Ｓｔｒｅａｍソースイオン化を併用）からなる装置において、ＬＣＭＳ２７を実施する。溶離液：Ａ：水中０．０２％ＴＦＡ、Ｂ：アセトニトリル中０．０２％ＴＦＡ。分析は、ＡおよびＢのグラジエントで溶出されたカラムに適切な量（２〜１０μＬが好ましい）の試料を注入することによって、室温で実施する。ＵＰＬＣの条件、検出器の設定、質量分析計の設定は以下のとおりである。カラム：Ａｅｒｉｓ  Ｗｉｄｅｐｏｒｅ、Ｃ−１８、３．６μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ。グラジエント：０．４ｍＬ／分での４．０分間での直線的な５％〜９５％アセトニトリル。検出：２１４ｎｍ（ＴＵＶ（チューナブルＵＶ検出器）からのアナログ出力）。スキャン：１００〜３２００ａｍｕ。
【０４６９】
〈２．ＵＰＬＣ法〉
方法：ＵＰＬＣ０１
デュアルバンド検出器を取り付けたＷａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣシステムを使用してＲＰ分析を実施する。ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ１３０、Ｃ１８、１３０オングストローム、１．７ｕｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍカラムを用いて、４０℃で、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍでのＵＶ検出値を収集する。ＵＰＬＣシステムを、Ａ：９９．９５％Ｈ２Ｏ、０．０５％ＴＦＡおよびＢ：９９．９５％ＣＨ３ＣＮ、０．０５％ＴＦＡを含む２つの溶離液貯蔵部Ａ、Ｂに接続する。以下の線形グラジエントを使用する：流量０．４０ｍＬ／分で、１６分にわたり、Ａ９５％、Ｂ５％からＡ４０％、Ｂ６０％。
【０４７０】
方法：ＵＰＬＣ０２
デュアルバンド検出器を取り付けたＷａｔｅｒｓ  ＵＰＬＣシステムを使用してＲＰ分析を実施する。ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ１３０、Ｃ１８、１３０オングストローム、１．７ｕｍ、２．１ｍｍ×１５０ｍｍカラムを用いて、４０℃で、２１４ｎｍおよび２５４ｎｍでのＵＶ検出値を収集する。ＵＰＬＣシステムを、Ａ：９９．９５％Ｈ２Ｏ、０．０５％ＴＦＡおよびＢ：９９．９５％ＣＨ３ＣＮ、０．０５％ＴＦＡを含む２つの溶離液貯蔵部Ａ、Ｂに接続する。以下の線形グラジエントを使用する：流量０．４０ｍＬ／分で、１６分にわたり、Ａ９５％、Ｂ５％からＡ５％、Ｂ９５％。
【０４７１】
《Ａ３．選択された中間体の特性評価》
ペプチドヒドラジド：
【化２２】
2020528049.tif 000215
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有する［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ］ＥＧＦ（Ａ）（２９３−３０３）ヒドラジド。
【０４７２】
調製方法：ＳＰＰＳ＿Ｐ、ＣＰ＿Ｍ１
ＬＣＭＳ３４：ｍ／３＝１９７０．３、ｍ／４＝１４７８．０、ｍ／５＝１１８２．６
ＵＰＬＣ０２：Ｒｔ＝９．３分
【０４７３】
Ｃｙｓ−ペプチド：
【化２３】
2020528049.tif 000216
［３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）（３０４−３３２）
【０４７４】
調製方法：ＳＰＰＳ＿Ｐ、ＣＰ＿Ｍ１
ＬＣＭＳ０１：ｍ／３＝１１１９．８、ｍ／４＝８４０．１、ｍ／５＝６７２．３
ＵＰＬＣ０２：Ｒｔ＝８．４分
【０４７５】
《Ｂ１．特定の化合物−ＥＧＦ（Ａ）類似体および誘導体》
〈ＥＧＦ（Ａ）類似体および誘導体の概要表（ＥＧＦ（Ａ）化合物１〜１５９）〉
【表１０】
2020528049.tif 000217
【表１０−１】
2020528049.tif 000218
【表１０−２】
2020528049.tif 000219
【表１０−３】
2020528049.tif 000220
【表１０−４】
2020528049.tif 000221
【表１０−５】
2020528049.tif 000222
【表１０−６】
2020528049.tif 000223
【表１０−７】
2020528049.tif 000224
【表１０−８】
2020528049.tif 000225
【表１０−９】
2020528049.tif 000226
【表１０−１０】
2020528049.tif 000227
【表１０−１１】
2020528049.tif 000228
【表１０−１２】
2020528049.tif 000229
【０４７６】
《Ｂ２．特定の化合物−ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物》
上述のように、化合物の調製を実施した。化合物の同一性は、本明細書の他の箇所に記載する各要素のアミノ酸の配列、置換基、および１つまたは２つの置換基の特定の付着点を参照することにより提供される。以下に一例を示し、概要表を以下に提供する。
【０４７７】
〈ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃１〉
【化２４】
2020528049.tif 000230
【０４７８】
次のように記載することもできる：
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１
【化２４−１】
2020528049.tif 000231
を有するもの、
または
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）であって、（［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号１９３であって、配列番号１９３の位置２０のリジン（Ｋ）（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１を有するもの（［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋに等しい）。
【０４７９】
〈ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃２３〉
【化２５】
2020528049.tif 000232
【０４８０】
次のように記載することもできる：
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃６
【化２５−１】
2020528049.tif 000233
を有するもの、
または
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃６（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１８−ＣＯ−Ｔｒｘ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号１９３であって、配列番号１９３の位置２０のリジン（Ｋ）を介して付着された置換基＃６を有するもの。
【０４８１】
〈ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１〉
【化２６】
2020528049.tif 000234
【０４８２】
次のように記載することもできる：
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１の２６Ｋ（のイプシロン窒素）および［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３３３Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）の３３３Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１
【化２６−１】
2020528049.tif 000235
を有するもの、
または
［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３３３Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１の２６Ｋ（のイプシロン窒素）および［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３３３Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）の３３３Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号１９０であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１の２６Ｋ（のイプシロン窒素）および［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３３３ＫＥＧＦ（Ａ）］の３３３Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号１９０であって、位置２０および８０のＬｙｓを介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの。
【０４８３】
〈ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４２〉
【化２７】
2020528049.tif 000236
【０４８４】
次のように記載することができる：
［８Ａｂ、２６Ｒ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３１３Ｋ、３２１Ｋ置換基＃１３のあるＥＧＦ（Ａ）［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３１３Ｋ、３２１Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）の３１３Ｋおよび３２１Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１３
【化２７−１】
2020528049.tif 000237
を有するもの、
または
［８Ａｉｂ、２６Ｒ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３１３Ｋ、３２１Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）であって、［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３１３Ｋ、３２１Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）の３１３Ｋおよび３２１Ｋ（の（イプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１３（４−ＣＯＯＨ−ＰｈＯ−Ｃ１１−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号３８０であって、［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３１３Ｋ、３２１Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）の３１３Ｋおよび３２１Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１３（４−ＣＯＯＨ−ＰｈＯ−Ｃ１１−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号３８０であって、配列番号３８０の位置６０および６８のＬｙｓを介して付着された置換基＃１３を有するもの。
【０４８５】
〈ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃７５〉
【化２８】
2020528049.tif 000238
【０４８６】
次のように記載することもできる：
［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１
【化２８−１】
2020528049.tif 000239
を有するもの、
または
［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ］ＥＧＦ（Ａ）−ＧＱＡＰＧＱＡＰ−［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）であって、（［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号３８６であって、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）の２６Ｋ（のイプシロン窒素）を介して付着された置換基＃１（ＨＯＯＣ−（ＣＨ２）１６−ＣＯ−γＧｌｕ−Ａｄｏ−Ａｄｏ）を有するもの、
または
配列番号３８６であって、配列番号３８６（７−３７）の位置６８のＬｙｓを介して付着された置換基＃１を有するもの。
【０４８７】
さらなる化合物の同一性は、本明細書の他の箇所に記載する各要素のアミノ酸の配列、置換基、および１つまたは２つの置換基の特定の付着点を参照することにより提供される。
【０４８８】
〈ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む誘導体（ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物）の概要表〉
置換基の付着は、それぞれＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を参照することにより示される。上述のように、２６ＫはＧＬＰ−１（７−３７）配列における位置２０に等しく、ＥＧＦ（Ａ）類似体の３２４Ｋは、ＬＤＬ−Ｒ（２９３−３３２）類似体のＥＧＦ（Ａ）ドメインにおける位置３２のアミノ置換である。その他の付着点の特定の位置を、類似の方法で推定することができる。ペプチドバックボーンに関連した置換基の特定の位置は、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体のスペーサーの長さおよび可能な切断に左右される。
〈Ｃ末端にＥＧＦ（Ａ）類似体を有する化合物〉
【表１１】
2020528049.tif 000240
【表１１−１】
2020528049.tif 000241
【表１１−２】
2020528049.tif 000242
【表１１−３】
2020528049.tif 000243
【表１１−４】
2020528049.tif 000244
【表１１−５】
2020528049.tif 000245
【表１１−６】
2020528049.tif 000246
【表１１−７】
2020528049.tif 000247
【表１１−８】
2020528049.tif 000248
【表１１−９】
2020528049.tif 000249
【表１１−１０】
2020528049.tif 000250
【表１１−１１】
2020528049.tif 000251
【表１１−１２】
2020528049.tif 000252
【表１１−１３】
2020528049.tif 000253
【表１１−１４】
2020528049.tif 000254
【表１１−１５】
2020528049.tif 000255
【表１１−１６】
2020528049.tif 000256
【表１１−１７】
2020528049.tif 000257
【表１１−１８】
2020528049.tif 000258
〈Ｎ末端にＥＧＦ（Ａ）類似体を有する化合物〉
【表１２】
2020528049.tif 000259
【０４８９】
化合物の選択のための分析データを以下の表に提供する。
〈ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物に関する分析データを含む表〉
【表１３】
2020528049.tif 000260
【表１３−１】
2020528049.tif 000261
【表１３−２】
2020528049.tif 000262
【表１３−３】
2020528049.tif 000263
【表１３−４】
2020528049.tif 000264
【表１３−５】
2020528049.tif 000265
【表１３−６】
2020528049.tif 000266
【表１３−７】
2020528049.tif 000267
【表１３−８】
2020528049.tif 000268
【表１３−９】
2020528049.tif 000269
【表１３−１０】
2020528049.tif 000270
【表１３−１１】
2020528049.tif 000271
【０４９０】
《Ｃ．特性評価の一般的な方法》
化合物の特性評価を行うため、様々なアッセイで機能性を試験することができる。
〈Ｃ１−ＧＬＰ−１  ｉｎ−ｖｉｔｒｏ効力〉
【０４９１】
このアッセイの目的は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＧＬＰ−１類似体を含む誘導体などの化合物のＧＬＰ−１活性（または効力）を試験することである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力は、全細胞アッセイにおけるヒトＧＬＰ−１受容体活性化の尺度である。
【０４９２】
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物の誘導体の効力は、以下に記載するように決定し、ＧＬＰ−１（７−３７）およびセマグルチドのデータを比較のために含めた。
【０４９３】
〈原則〉
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力は、レポーター遺伝子アッセイにおけるヒトＧＬＰ−１受容体の応答を測定することによって決定される。アッセイは、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現し、ホタルルシフェラーゼ（ＣＲＥルシフェラーゼ）のためのプロモーターと遺伝子に結合されたｃＡＭＰ応答配列（ＣＲＥ）のＤＮＡを含む、ＢＨＫ安定発現細胞株で実施する。ヒトＧＬＰ−１受容体が活性化されるとｃＡＭＰの産生が生じ、これによりルシフェラーゼタンパク質が発現される。アッセイの培養が完了したらルシフェラーゼ基質（ルシフェリン）を加え、酵素がルシフェリンをオキシルアルシフェリンに変換して生物発光を生成する。発光をアッセイの読取値として測定する。
【０４９４】
〈細胞培養および調製〉
このアッセイで使用される細胞（クローンＦＣＷ４６７−１２Ａ／ＫＺ１０−１）は、ＢＨＫＴＳ１３を親細胞株とするＢＨＫ細胞である。細胞は、ヒトＧＬＰ−１受容体を発現するクローン（ＦＣＷ４６７−１２Ａ）から由来し、現在のクローンを得るためのＣＲＥルシフェラーゼによるさらなる発現によって確立される。
【０４９５】
細胞は細胞培養培地中の５％ＣＯ２で培養される。これらは分離され、液体窒素に保存される。各アッセイ前に、アリコートを取り出しＰＢＳ中で２回洗浄してから、アッセイ固有の緩衝液中で所望の濃度で懸濁する。９６ウェルプレートについて、最終濃度が５×１０３細胞／ウェルとなるように懸濁液を作成する。
【０４９６】
〈材料〉
以下の化学物質をアッセイで使用する：プルロニックＦ−６８（１０％）（Ｇｉｂｃｏ２４０４）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ａ９５１１）、オボアルブミン（Ｓｉｇｍａ  Ａ５５０３）、フェノールレッドなしのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ１１８８０−０２８）、１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ１５６３０）、Ｇｌｕｔａｍａｘ１００ｘ（Ｇｉｂｃｏ３５０５０）およびｓｔｅａｄｙｌｉｔｅ  ｐｌｕｓ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ６０１６７５７）。
【０４９７】
〈緩衝液〉
細胞培養培地は、１０％ＦＢＳ（ウシ胎児血清、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１６１４０−０７１）、１ｍｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１５１４０−１２２）、２４０ｎＭ  ＭＴＸ（メトトレキサート、Ｓｉｇｍａ  Ｍ９９２９）および１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１５１４０−１２２）を有するＤＭＥＭ培地である。
【０４９８】
アッセイ培地は、フェノールレッドなし、１０ｍＭのＨｅｐｅｓおよび１×ＧｌｕｔａｍａｘのＤＭＥＭである。アッセイ緩衝液は、アッセイ培地中の２％オボアルブミンおよび０．２％プルロニックＦ−６８から構成された。
【０４９９】
〈手順〉
１）細胞ストックを３７℃の水槽で解凍する。
２）細胞をＰＢＳで３回洗浄する。
３）細胞を計数し、アッセイ培地で５×１０３細胞／５０μＬ（１×１０５細胞／ｍＬ）に調整する。細胞の５０μＬアリコートを、アッセイプレート内の各ウェルに移す。
４）試験化合物および基準化合物のストックを、アッセイ緩衝液中で０．２μＭの濃度に希釈する。化合物を１０倍希釈して以下の濃度を得る：２×１０−７Ｍ、２×１０−８Ｍ、２×１０−９Ｍ、２×１０−１０Ｍ、２×１０−１１Ｍ、２×１０−１２Ｍ、２×１０−１３Ｍ、および２×１０−１４Ｍ。
５）化合物またはブランクの５０μＬアリコートを、希釈プレートからアッセイプレートに移す。化合物を以下の最終濃度で試験する：１×１０−７Ｍ、１×１０−８Ｍ、１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、１×１０−１１Ｍ、１×１０−１２Ｍ、１×１０−１３Ｍ、１×１０−１４Ｍ。
６）アッセイプレートを、５％ＣＯ２インキュベーターで３時間、３７℃で培養する。
７）アッセイプレートをインキュベーターから取り外し、室温で１５分間留置する。
８）ｓｔｅａｄｙｌｉｔｅ  ｐｌｕｓ試薬の１００μＬアリコートをアッセイプレートの各ウェルに加える（試薬は光感応性である）。
９）各アッセイプレートをアルミ箔で覆って光から保護し、室温で３０分間振動する。
１０）各アッセイプレートを、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ計器で読み取る。
【０５００】
〈計算と結果〉
上述のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイを、ＨＳＡを含む／含まない一連の化合物で実施した。ＴｏｐＣｏｕｎｔ計器からのデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアに転送される。ソフトウェアは、非線形回帰（ｌｏｇ（ａｇｏｎｉｓｔ）ｖｓ反応）分析を実施する。ソフトウェアによって計算しｐＭ単位で報告したＥＣ５０値を以下の表１に示す。
【０５０１】
各試料について、最低限でも２つの複製を測定した。報告された値は複製の平均である。
表１：ＧＬＰ−Ｉ／ＥＧＦ（Ａ）化合物（すなわち、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む誘導体）のｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力
【表１４】
2020528049.tif 000272
【表１４−１】
2020528049.tif 000273
【表１４−２】
2020528049.tif 000274
【表１４−３】
2020528049.tif 000275
【表１４−４】
2020528049.tif 000276
【表１４−５】
2020528049.tif 000277
【０５０２】
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物の大部分はＧＬＰ−１活性を示す。特定の効力（ＨＳＡがある／ない場合の両方）は、類似体におけるアミノ酸の変動およびスペーサーの同一性、ならびに置換基に影響を受ける。上記のデータは、ＧＬＰ−１（７−３７）およびセマグルチドと比較して同等または低減された効力を有する化合物を得られることを示す。
【０５０３】
さらに、ＥＧＦ（Ａ）類似体が、ＧＬＰ−１類似体のＣ末端（化合物１、配列番号１９３）の代わりにＧＬＰ−１類似体のＮ末端（化合物７５、配列番号３８６）に付着される場合は、ＧＬＰ−１効力の著しい損失が観察される。
【０５０４】
〈Ｃ２−ＧＬＰ−１−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ受容体結合〉
この例の目的は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＬＰ−１誘導体の受容体結合を試験することである。受容体結合は、誘導体のヒトＧＬＰ−１受容体に対する親和性の尺度である。
【０５０５】
〈原則〉
ヒトＧＬＰ−１受容体に対する受容体結合は、競合結合アッセイで測定される。このタイプのアッセイでは、標識リガンド（この場合は１２５Ｉ−ＧＬＰ−１）が受容体に結合される。ヒトＧＬＰ−１受容体を含む単離膜に対して一連の濃度での各誘導体／化合物を加え、標識リガンドの変位をモニターする。受容体結合は、標識リガンドの５０％が受容体から変位する濃度として報告される（ＩＣ５０値）。ＧＬＰ−１（７−３７）およびセマグルチドを、比較化合物として含む。
【０５０６】
〈材料〉
以下の化学物質をアッセイで使用する：ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）（Ｓｉｇｍａ  Ａ１６５３）、ＤＭＥＭフェノールレッドなし（Ｇｉｂｃｏ１１８８０−０２８）、Ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１５１４０−１２２）、Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１０１３１−０２７）、１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（Ｇｉｂｃｏ１５６３０）、ＥＤＴＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  １５５７５−０３８）、ＰＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１４１９０−０９４）、ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ１６１４０−０７１）、ＥＧＴＡ、ＭｇＣｌ２（Ｍｅｒｃｋ  １．０５８３２．１０００）、Ｔｗｅｅｎ２０（Ａｍｒｅｓｃｏ０８５０Ｃ３３５）、ＳＰＡ粒子（小麦胚細胞凝集素（ＷＧＡ）ＳＰＡビーズ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＲＰＮＱ０００１）、［１２５Ｉ］−ＧＬＰ−１］−（７−３６）ＮＨ２（社内生産）、ＯｐｔｉＰｌａｔｅＴＭ−９６（Ｐａｃｋａｒｄ６００５２９０）。
【０５０７】
緩衝液１は、２０ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ＋１０ｍＭのＥＤＴＡからなり、ｐＨは７．４に調整される。緩衝液２は、２０ｍＭのＮａ−ＨＥＰＥＳ＋０．１ｍＭのＥＤＴＡからなり、ｐＨは７．４に調整される。アッセイ緩衝液は、５ｍＭのＥＧＴＡ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０で補充された５０ｍＭのＨＥＰＥＳからなり、ｐＨは７．４に調整される。８％アルブミン株は、アッセイ緩衝液中に８％（ｗ／ｖ）で溶解したＨＳＡからなる。０．０２％アルブミン株は、アッセイ緩衝液中で０．０２％（ｗ／ｖ）で溶解されたＨＳＡからなる。
【０５０８】
〈細胞培養および膜の調製〉
このアッセイで使用される細胞（クローンＦＣＷ４６７−１２Ａ）は、ＢＨＫＴＳ１３を親細胞株とするＢＨＫ細胞である。細胞はヒトＧＬＰ−１受容体を発現する。
【０５０９】
細胞をＤＭＥＭ中５％ＣＯ２、１０％ウシ胎児血清、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（ペニシリン／ストレプトマイシン）および１．０ｍｇ／ｍＬの選択マーカーＧ４１８で培養する。膜を調製するために、細胞を約８０％コンフルエントまで増殖させる。細胞をリン酸緩衝生理食塩水で２回洗浄し、採取する。短時間の遠心分離を使用して細胞をペレット化し、細胞ペレットを氷上で保存する。適切な量の緩衝液１（例えば、１０ｍＬ）中で２０〜３０秒間、ＵＬＴＲＡ−ＴＨＵＲＲＡＸ（商標）分散機で細胞ペレットを均質化する。ホモジネートを１５分間遠心分離する。ペレットを１０ｍＬ緩衝液２中で再懸濁し（均質化）、遠心分離する。この工程をもう一度繰り返す。結果得られたペレットを緩衝液２中で再懸濁し、タンパク質濃度を決定する。膜をアリコート化し、−８０℃で保存する。
【０５１０】
〈手順〉
１）低ＨＳＡ（０．００５％）の存在下での受容体結合アッセイについては、アッセイプレートの各ウェルにアッセイ緩衝液５０μＬを加える。
２）試験化合物は連続希釈して以下の濃度を得る：８×１０−７Ｍ、８×１０−８Ｍ、８×１０−９Ｍ、８×１０−１０Ｍ、８×１０−１１Ｍ、８×１０−１２Ｍ、８×１０−１３Ｍ。アッセイプレートの適切なウェルに２５μＬを加える。
３）細胞膜アリコートを解凍し、作業濃度に希釈する。アッセイプレートの各ウェルに５０μＬを加える。
４）ＷＧＡ  ＳＰＡビーズを、２０ｍｇ／ｍＬでアッセイ緩衝液中に懸濁させる。懸濁液を、アッセイプレートに加える直前にアッセイ緩衝液中で１０ｍｇ／ｍＬに希釈する。アッセイプレートの各ウェルに５０μＬを加える。
５）［１２５Ｉ］−ＧＬＰ−１］−（７−３６）ＮＨ２の４８０ｐＭ溶液２５μＬをアッセイプレートのそれぞれのウェルに加えることで、培養を開始する。２５μＬアリコートを、総計数／ウェルの測定用に保存する。
６）アッセイプレートを３０℃で２時間培養する。
７）アッセイプレートを１０分間遠心分離する。
８）アッセイプレートを、Ｐａｃｋａｒｄ  ＴｏｐＣｏｕｎｔ  ＮＸＴ計器で読み取る。
【０５１１】
〈計算〉
ＴｏｐＣｏｕｎｔ計器からのデータは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアに転送される。ソフトウェアは非線形回帰分析を実施した。ソフトウェアはＩＣ５０値を計算し、ｎＭ単位で報告する。
【０５１２】
〈結果〉
以下の結果が得られた：
表２：ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物のＧＬＰ−１受容体結合
【表１５】
2020528049.tif 000278
【表１５−１】
2020528049.tif 000279
【表１５−２】
2020528049.tif 000280
【０５１３】
上記のデータは、ＧＬＰ−１結合が特定の配列および置換基に依存し、ＧＬＰ−１（７−３７）またはセマグルチドに対して同等または低減された受容体結合を有する化合物を調製するために様々なレベルのＧＬＰ−１結合活性を得ることができることを示す。再び、ＥＧＦ（Ａ）類似体が、ＧＬＰ−１類似体のＣ末端（化合物１、配列番号１９３）の代わりに、ＧＬＰ−１類似体のＮ末端（化合物７５、配列番号３８６）に付着された場合は、ＧＬＰ−１結合の著しい損失が観察された。
【０５１４】
〈Ｃ３−ＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ結合−競合（ＥＬＩＳＡ）〉
このアッセイは、ＬＤＬ−Ｒと競合するＰＣＳＫ９への見掛けの結合親和性を測定する。特に、アッセイは、ＥＧＦ（Ａ）類似体、およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物、例えばＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物のＰＣＳＫ９への見掛けの結合親和性を評価するために使用される。
【０５１５】
アッセイを以下のように実施する。実験前日、組換えヒト低密度リポタンパク質受容体（ｒｈＬＤＬ−Ｒ；ＮＳＯ由来、Ｒ＆Ｄシステム＃２１４８−ＬＤ）をｐＨ９．６の５０ｍＭ炭酸ナトリウム中に１μｇ／ｍＬで溶解し、その後、１００μＬの溶液をアッセイプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｐ９６、ＮＵＮＣ＃４３９４５４）の各ウェルに添加し、４℃で一晩被覆する。実験当日に、ビオチン化ＰＣＳＫ９（０．５ｕｇ／ｍＬ、ＢｉｏＳｉｔｅ／ＢＰＳＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ｃａｔ＃７１３０４）を含むＥＧＦ（Ａ）化合物の８点濃度曲線を複製で作成する。試験化合物およびビオチン化ＰＣＳＫ９混合物を、２５ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．２（１５６３０−０５６、１００ｍＬ、１Ｍ）、１５０ｍＭのＮａＣｌ（Ｅｍｓｕｒｅ１．０６４０４．１０００）、１％ＨＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ａ１８８７−２５Ｇ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ６５５２０５）、２ｍＭのＣａＣｌ２（Ｓｉｇｍａ２２３５０６−５００Ｇ）を含むアッセイ緩衝液中で調製し、室温で１時間培養する。次いで、被覆されたアッセイプレートを２００μＬアッセイ緩衝液中で４回洗浄し、次いで試験化合物とビオチン化ＰＣＳＫ９の混合物１００μＬをプレートに加え、室温で２時間培養する。プレートを２００μＬアッセイ緩衝液中で４回洗浄し、次いでストレプトアビジン−ＨＲＰ（２５ｎｇ／ｍＬ、ＶＷＲ＃１４−３０−００）により室温で１時間培養する。５０μＬのＴＭＢ−ｏｎ（ＫＥＭ−ＥＮ−ＴＥＣ）を加え、暗所で１０分間培養することにより反応を検出する。その後、５０μＬ、４ＭのＨ３ＰＯ４を混合物に添加して反応を停止させ、添加は電子マルチピペットを用いて行う。次いで、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘにおいて４５０ｎｍおよび６２０ｎｍで１時間以内にプレートを読み取る。６２０ｎｍの読取値をバックグラウンド除去に使用する。非線形回帰ログ（阻害剤）ｖｓ．反応可変勾配（４つのパラメータ）によりＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いてＩＣ５０値を算定し、以下の式を用いてＫｉ値に変換する：Ｋｉ＝ＩＣ５０／（１＋（ビオチン−ＰＣＳＫ９）／（ｋｄ（ビオチン−ＰＣＳＫ９）））。式中、ビオチン−ＰＣＳＫ９のＫｄは１．０９６７２７７１４μｇ／ｍＬ、および［Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＣＳＫ９］＝０．５（μｇ／ｍＬ）である。
【０５１６】
結果を以下の表３．１〜表３．６に示す。Ｋｉ値が高いことはＰＣＳＫ９に対する見掛けの結合親和性が低いことを示し、その逆もしかりである。ＥＧＦ６６の測定値よりも大幅に高いＫｉ、例えば５００ｎＭを越える値を示す化合物は数少ないことが分かるが、これは観察された結合が特異的ではないことを示す。ペプチドのアミノ酸置換および／または１つ以上の側鎖誘導化はどちらも、ＬＤＬ−Ｒへの結合の損失に寄与する場合がある。一般的に、試験されたＥＧＦ（Ａ）化合物の多くが、ｈＬＤＬ−Ｒへの結合においてＰＣＳＫ９を阻害する能力を示した。
【０５１７】
〈ＰＣＳＫ９阻害剤〉
最初に、様々なアミノ酸置換を含むＥＧＦ（Ａ）類似体の群を上述のとおり試験した。結果を表３．１に示す。
表３．１−選択されたＥＧＦ（Ａ）類似体の見掛けの結合親和性（Ｋｉ）
【表１６】
2020528049.tif 000281
【０５１８】
国際公開第２０１２／１７７７４１号で最も効力の高いペプチド変異体として特定されたＥＧＦ６６（ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４８）は、５つの突然変異を有する。これらの突然変異のいくつかは、Ｃ３に記載したアッセイで決定されたＫｉ値にとって大きな重要性を持たないことが見出された。特に、位置３１０に野生型残基Ａｓｐ（Ｄ）を含む化合物は、３１０Ｋを有する化合物よりも高い効力を有することが見出された。また、重要なアミノ置換は３０１Ｌであり、好ましくは３０９Ｒと組み合わせた３０１Ｌであることが示された。最後に、３０７Ｉおよび２９９Ａは、ＥＧＦ（Ａ）類似体の親和性への寄与がわずかであった。
【０５１９】
〈置換基のＮ末端付着〉
その後の実験で、半減期延長部の付着、例えばペプチドへの置換基の付着が、Ｃ３で記載するアッセイにより決定されるＫｉに影響を与えるかどうかを試験した。本明細書に記載するように、異なる技術によって置換基を付着させることができ、最初はアシル化またはアルキル化によってペプチドのＮ末端アミノ酸の窒素原子に置換基を付着した。
【０５２０】
表３．２に示すように、試験された化合物すべてのＫｉ値は３．０ｎＭ未満であり、様々な延長部およびリンカー要素が良好な忍容性を有することが示唆される。ＧＬＰ−１などのペプチドで過去に観察されたように、効力は通常、側鎖の付着によってマイナスの影響を受けるため、この点は珍しい。
表３．２−Ｎ末端置換ＥＧＦ（Ａ）類似体の見掛けのＫｉ
【表１７】
2020528049.tif 000282
【０５２１】
〈置換基のＬｙｓ付着〉
置換基のＰＣＳＫ９阻害剤ペプチドへの結合について別の位置を評価するために、一連の化合物を調製した。ＥＧＦ（Ａ）化合物＃５８、２９および４を除き、様々な位置でのＬｙｓ置換との組み合わせで、３つのアミノ酸置換（Ｎ３０１Ｌ、Ｎ３０９ＲおよびＫ３１２Ｅ）を含むバックボーンペプチドを使用した。試験した化合物すべてが、通常はシステインジスルフィド架橋に関与する位置２９７、３０４、３０８、３１７、３１９、３３１に６つのシステインアミノ酸を含んでいた。野生型３１２Ｋへの付着が得られるＥＧＦ（Ａ）化合物＃４を除き、部位特異的な置換を確実にするために３１２Ｅを含めた。１つのＬｙｓによるペプチドの延長についても試験した（ＥＧＦ（Ａ）化合物＃７５および＃３）。Ｃ１８二酸延長部およびγＧｌｕ−２ｘＡｄｏリンカーを含め、上述に記載したのと同じ置換基をすべての化合物で使用し、アシル化を介して付着させた。結果を表３．３に記載する。
表３．３−Ｌｙｓ残基を介して付着された置換基を有するＥＧＦ（Ａ）類似体の見掛けのＫｉ
【表１８】
2020528049.tif 000283
【表１８−１】
2020528049.tif 000284
【０５２２】
分析は、ＰＣＳＫ９阻害剤ペプチドの大部分が機能性を維持することを示した。例外は、位置２９８、３０１、３０２、３０７のいずれかでのＬｙｓ置換および誘導であり、この場合は機能しないペプチドが生じた。また、位置２９６、２９９、３１５および３２０ＫでのＬｙｓの導入および置換は見掛けの親和性を低減させることも観察された。
【０５２３】
したがって、データは表３．１の結果も確認し、Ａｓｎ（Ｎ）３０１のＬｅｕ（Ｌ）へのアミノ酸置換が結合に必要不可欠なことを示す。
【０５２４】
位置２９５および３１０でのＬｙｓの導入および置換について、データは観察されなかった。上述のように、位置３１０でのＡｓｐの維持は３１０Ｋ置換よりも好ましいことが過去に見出された。以下に示すように、位置２９５でのＡｓｐ（Ｄ）の導入よって結合が停止することも見出された（ＥＧＦ（Ａ）の例では化合物７０）。
【０５２５】
要約すると、ＰＣＳＫ９ペプチドの位置２９５、２９８、３０２、３０７および３１０のいずれか、または位置２９５、２９６、２９８、２９９、３０２、３０７、３１０、３１５および３２０のいずれかに付着された置換基を含まない化合物は一般的に機能的であるという結論が下された。さらに、位置２９５、２９８、３０２、および３１０のいずれかでのアミノ酸置換は一般的に魅力的ではないという結論が導かれた。表３．１および３．２から、それでもＶ３０７Ｉ突然変異は、３０１Ｌｅｕと組み合わせた場合には許容可能または魅力的でさえあると考えられる。
【０５２６】
位置２９５、２９６、２９８、３０２、３１０のうちの１つでアミノ酸置換を有するペプチドは機能性がより低い可能性が高く、位置２９９、３１５および３２０での置換は機能性をわずかに低下させるとさらに考えられる。これは、他方では、Ｌｙｓ置換および側鎖の付着は大半の他のアミノ酸置換と同じ程度にペプチドに影響を与えることから、残りのアミノ酸残基に高いレベルの柔軟性が存在しうることも示唆する。
【０５２７】
〈２つの置換基を有するＰＣＳＫ９阻害剤〉
２つの置換基を有する一連の化合物を調製した。Ｎ末端またはＬｙｓ（Ｋ）残基でのアシル化、アルキル化、または組み合わせによって、二重置換を得ることができる。繰り返すが、Ｎ末端は、アミノ酸２９３Ｇまたは変異体アミノ酸残基、例えば２９２Ａ、２９３Ｇ、２９３Ｋおよび２９４Ｔ（２９３Ｇが欠失している場合）であってもよい。化合物を異なる置換基で調製したが、個別の化合物中の２つの置換基は同一である。本試験で使用されるバックボーンには再び、Ｎ３０９Ｒと組み合わせたＮ３０１Ｌアミノ酸置換、および特定のアシル化／アルキル化を得るために必要な様々なＮ末端および／またはＬｙｓ置換を含めた。
表３．４−二重置換ＥＧＦ（Ａ）類似体の見掛けのＫｉ
【表１９】
2020528049.tif 000285
【表１９−１】
2020528049.tif 000286
【表１９−２】
2020528049.tif 000287
【表１９−３】
2020528049.tif 000288
【表１９−４】
2020528049.tif 000289
【０５２８】
再び発明者らは、置換基は様々な位置および組み合わせで非常に良好な忍容性があると結論付けた。
【０５２９】
〈さらなるＥＧＦ（Ａ）誘導体〉
ＥＧＦ（Ａ）配列における様々なアミノ酸置換のさらなる役割を調べるために、表３．５に示すように、さらなる化合物を調製し試験した。すべての化合物は、アミノ酸置換または３３３Ｋによる延長によって導入されたＬｙｓ残基を介して付着された１つの置換基を含む。バックボーンペプチドはすべて、Ｎ３０１Ｌアミノ酸置換および任意選択的に１つ以上のＮ３０９ＲおよびＩ３１２Ｅを含む。置換基はすべて、１６〜２０の炭素原子を含む脂肪二酸と、γＧｌｕ単独またはＡｄｏ−Ａｄｏおよび／またはトラネキサム酸（Ｔｒｘ）部分により延長されたリンカーを含む。
表３．５−Ｌｙｓ残基を介して付着された置換基を有するさらなるＥＧＦ（Ａ）類似体の見掛けのＫｉ
【表２０】
2020528049.tif 000290
【表２０−１】
2020528049.tif 000291
【０５３０】
上記の表３．５における結果は、位置３１２の内部野生型リジンを、Ｇｌｕ（Ｅ）、およびＧｌｎ（Ｑ）、Ａｒｇ（Ｒ）またはＡｓｐ（Ｄ）で置換できることを示す。この変動に基づき、ペプチドの阻害機能を妨げることなく、広範囲のアミノ酸残基を位置３１２で忍容することができると考えられる。
【０５３１】
Ｇ２９３Ｎ、Ｔ２９４Ｇ、Ｄ２９９Ａ、Ｎ３００Ｈ、Ｈ３０６Ｙ、Ｈ３０６Ｄ、Ｎ３０９Ｓ、Ｑ３２４Ｇ、およびＲ３２９Ｈを含む他のいくつかのアミノ酸置換もまた忍容性が良好なことが証明されたが、上述のようにＮ２９５ＤおよびＮ３００Ｐは魅力のないアミノ置換である。
ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物のＰＣＳＫ９結合
【０５３２】
ＰＣＳＫ９結合機能をＧＬＰ−１受容体作動薬活性と組み合わせることができるかどうかをさらに探るために、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物を同じアッセイで試験し、結果を以下の表３．６に含めた。
表３．６−ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物の見掛けのＫｉ
【表２１】
2020528049.tif 000292
【表２１−１】
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【表２１−２】
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【０５３３】
データは、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物が、化合物のＥＧＦ（Ａ）類似体と関連付けられるＰＣＳＫ９結合活性を維持することを示す。データは、変動が非常にわずかであり、ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体の配向がＰＣＳＫ９結合に影響を与えないことも示す。
【０５３４】
〈Ｃ４−ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ取り込みアッセイ〉
ＰＣＳＫ９ペプチドおよびその誘導体の阻害効力を決定するための別のアッセイは、ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬの取り込みを測定することである。
【０５３５】
アッセイの原則：ＬＤＬ取り込みは主に内因性発現したｈＬＤＬＲによって媒介され、したがってＬＤＬ取り込み能力はＬＤＬＲ発現の間接的尺度といえる。ｈＬＤＬＲは、外因性ＰＣＳＫ９での培養によって用量依存的に下方制御することができる。したがって、ＰＣＳＫ９培養は、ＬＤＬ分子を取り込む細胞の能力を減少させる。次いで、ＬＤＬ取り込みのこの下方制御は、ＰＣＳＫ９／ＬＤＬＲ結合を中和または阻害する化合物の添加によって拮抗させることができる。その結果、ＰＣＳＫ９阻害剤は、ＰＣＳＫ９の存在下でＬＤＬ取り込みを増加させる能力、例えば、ＰＣＳＫ９媒介性ｈＬＤＬＲの下方制御に対抗できる能力に基づき特性評価することができる。
【０５３６】
アッセイは、１０％リポタンパク質欠損胎児ウシ血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｓ５３９４）で培養したＨｅｐＧ２細胞（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  ＥＣＡＣＣ：Ａｃｃ  ｎｏ．８５０１１４３０）を使用して行い、ＢＯＤＩＰＹで蛍光標識したＬＤＬ粒子（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＢＶ＃Ｌ３４８３）を取り込む細胞の能力を測定する。
【０５３７】
アッセイプロトコル：９６ウェルプレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、ＶｉｅｗＰｌａｔｅ−９６  Ｂｌａｃｋ＃６０００５１８２）を、３７℃で１時間、インキュベーターで、ポリ−Ｄ−リジン（１０ｍｇ／Ｌ、ＰＢＳ  Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０−０９４に溶解したＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｐ６４０７）で被覆する。次いで、プレートを１００μＬ  ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０−０９４）中で２回洗浄する。ＥＧＦ（Ａ）化合物の８点濃度曲線に使用する試験組成物をすべて、アッセイ培地（ＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ＃３１９６６−０２１）、１０％リポタンパク質欠損胎児ウシ血清（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ｓ５３９４）および１％Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ（Ｃａｍｂｒｅｘ＃ＤＥ１７−６０２Ｅ）で希釈したＰＣＳＫ９（１０μｇ／ｍＬ）を含むように調製し、５０μＬ／ウェルの量でプレートに添加した。
【０５３８】
３０〜６０分後、アッセイ培地で希釈した５０．０００ＨｅｐＧ２細胞（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ：ＥＣＡＣＣ：ＡＴＣＣ  ｎｏ．８５０１１４３０、ロット：１３Ｂ０２３）を、５０ｕｌ／ウェルの量でプレートに添加し、プレートをＣＯ２透過性プラスチックバッグ（Ａｎｔａｌｉｓ  Ｔｅａｍ、ＬＤＰＥバッグ１２０／３５×３００×０．０２５ｍｍ＃２８１６０４）中で２０時間（３７℃、５％ＣＯ２）培養する。その後プレートを空にし、その直後にアッセイ培地中濃度１０μｇ／ｍＬで５０μＬ  ＦＬ−ＬＤＬ（Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＢＶ＃Ｌ３４８３）を各ウェルに添加し、光から保護するために蓋部分の黒色カバーを使用して、ＣＯ２透過性プラスチックバッグで２時間（３７°Ｃ、５％ＣＯ２）プレートを培養する。プレートを空にし、１００μＬ  ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０−０９４）で２回洗浄する。次いで、１００μＬ  ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ＃１４１９０−０９４）を添加し、その後１５分以内に、ＳｐｅｃｋｔｒａＭａｘ  Ｍ４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上でＥｘ（５１５ｎＭ）／Ｅｍ（５２０ｎＭ）のフィルターを使用してプレートを読み取る（底部の読取値）。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ、非線形回帰分析曲線の適用、Ｓ字状用量反応（可変グラジエント）を使用して、ＥＣ５０値を計算する。
【０５３９】
〈結果〉
一連の化合物について、ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ取り込みアッセイを上述のように実施した。
【０５４０】
結果を以下の表４．１に示す。ＥＣ５０値が低いことは、ＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９媒介性下方制御を逆転させる能力がより高いことを反映し、逆に、ＥＣ５０値が高いことは化合物のＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９媒介性下方制御を阻害できる能力が低いことを示唆する。
【０５４１】
分かるように、大半の化合物はＬＤＬ取り込みアッセイで１００〜５００ｎＭのＥＣ５０を示すが、これは化合物がＬＤＬ取り込みのＰＣＳＫ９媒介性下方制御を逆転させる能力が高いこと、すなわちＬＤＬ取り込みを増加させることを示唆する。
表４．１  ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ取り込みデータ（ＥＣ５０）−（ＥＧＦ（Ａ）類似体および誘導体
【表２２】
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【表２２−１】
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【０５４２】
ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含むＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物についてＬＤＬ取り込みをさらに評価し、ＧＬＰ−１類似体との結合がＥＧＦ（Ａ）類似体の機能性を妨げなかったことを再び確認した（表４．２参照）。
表４．２  ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物のＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ取り込みデータ（ＥＣ５０）
【表２３】
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【０５４３】
〈Ｃ５−ミニブタにおける薬物動態（ＰＫ）〉
本試験の目的は、ミニブタへの静脈内投与後のＧＬＰ−１誘導体のｉｎ  ｖｉｖｏでの延長、すなわち、誘導体の体内滞留時間の延長を決定することであり、それにより作用時間を決定することである。これは薬物動態（ＰＫ）試験で行われ、対称の誘導体の終末相半減期が決定される。終末相半減期とは、終末消失相において特定の血漿濃度が半減するまでの所要時間を意味する。
【０５４４】
雌のＧｏｅｔｔｉｎｇｅｎミニブタをＥｌｌｅｇａａｒｄ  Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｉｇｓ（デンマーク、ダルモーセ市）から取得し、月齢およそ８〜１２カ月かつ体重およそ２０〜３０ｋｇのものを試験で使用する。ミニブタ（永久的カテーテルが埋め込まれたブタ）を小屋の中で個別に収容し、寝床として藁を与え、Ａｌｔｒｏｍｉｎ９０３０ミニブタ飼料（Ａｌｔｒｏｍｉｎ  Ｓｐｅｚｉａｌｆｕｔｔｅｒ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）を１日１回、制限的に給餌する。
【０５４５】
３週間の順化後、各動物の大静脈尾に２つの永久的な中心静脈カテーテルを埋め込む。動物を手術後１週間回復させ、次いで連続投与の間に適切なウォッシュアウト期間を設けて、反復的な薬物動態試験に使用する。
【０５４６】
５０ｍＭリン酸塩、７０ｎＭ塩化ナトリウム、および０．０５％ポリソルベート８０、ｐＨ７．４を含む緩衝液中に誘導体を溶解する。
【０５４７】
誘導体の静脈内注射（量は０．０５ｍＬ／ｋｇおよび用量２ｎｍｏｌ／ｋｇに相当）を１つのカテーテルを通して与え、投与から最長１４日後まで所定の時点で血液試料を（好ましくは他のカテーテルから）採取する。
【０５４８】
血液試料（例えば、０．８ｍＬ）をＥＤＴＡ（８ｍＭ）被覆チューブ内に採取し、次いで４℃および１９４２ｇで１０分間遠心分離する。
【０５４９】
血漿をドライアイス上のＭｉｃｒｏｎｉｃチューブの中にピペットで入れ、ＬＯＣＩを使用して誘導体の血漿濃度を分析するまで−２０℃で保存する。個別の血漿濃度−時間プロファイルを、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ｖ．６．４（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州マウンテンビュー市）において薬物動態の非区画法によって分析し、結果得られる終末相半減期（調和平均）を決定する。
【０５５０】
〈結果〉
上述の通りミニブタを使用して薬物動態試験を行った。
【０５５１】
終末相半減期について以下の結果が得られた。
表５：ミニブタにおける薬物動態試験（ｉ．ｖ．）
【表２４】
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【０５５２】
試験された化合物はすべて、ヒトＧＬＰ−１（７−３７）と比較して終末相半減期が高い。
【０５５３】
位置８にＧを有するＧＬＰ−１類似体を含む化合物２１は終末相半減期が２時間であり、これは、非天然アミノ酸Ａｉｂを位置８に有する他の化合物の半減期の１０分の１から２５分の１である。
【０５５４】
〈Ｃ６−ｈＰＣＳＫ９チャレンジモデル〉
本試験の目的は、本明細書に記載するＥＧＦ（Ａ）類似体またはＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物により静脈内注射されたｈＰＣＳＫ９の作用を阻害することに反応した、マウス肝臓内のＬＤＬ受容体発現レベルの変化を示すことである。
【０５５５】
〈方法〉
健康な雄のＢａｌＢＣまたはＮＭＲＩマウス（ドイツ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社）において、ｈＰＣＳＫ９（中国、Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｃｏｉｌｓ社）を０．４ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈に静脈内注射する１５〜１２０分前に、ＥＧＦ（Ａ）類似体（またはＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物）を皮下注射または静脈内注射する。ｈＰＣＳＫ９注射から６０分後、マウスをイソフルランで麻酔し、頸椎脱臼により安楽死させる。次いで、肝臓を素早く切除し、液体窒素中にスナップ凍結させる。分析するまで肝臓を−８０℃に保つ。
【０５５６】
ＬＤＬ−Ｒウェスタンブロッティング：
ホスファターゼ阻害剤カクテル、ＰｈｏｓＳｔｏｐ（Ｒｏｃｈｅ、０４  ９０６  ８３７  ００１）、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル、ｃｏｍｐｅｌａｔｅ（Ｒｏｃｈｅ、０４  ６９３  １５９  ００１）を含む５００μＬ溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＦＮＮ００１１）中で肝組織試料（１００ｍｇ）を均質化する。１つのスチールビーズを添加した後、組織を３０Ｈｚで２．５分間均質化する。５０００ｘｇで５分間遠心分離した後、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、２３２２５）を使用して総タンパク質含有量を決定する。試料緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＰ０００７）中の等量のタンパク質（６０μｇ）を１０分間煮沸し、１４０００ｒｐｍで２分間遠心分離してから、Ｃｒｉｔｅｉｏｎ  ＸＴ３−８％Ｔｒｉｓ−アセテートゲル（ＢｉＯｒａｄ＃３４５−０１３１）にロードし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに晒す。メーカー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）の指示説明に従って、タンパク質をニトロセルロース膜（ｉＢｌｏｔ  ２  ＮＣ  Ｒｅｇｕｌａｒ  ｓｔａｃｋ、ｎｏｖｅｘ＃ＩＢ２３００１）に移す。膜のＰｏｎｃｅａｕ  Ｓ（Ｓｉｇｍａ、Ｐ７１７０）染色によって等量のタンパク質の移動を確認し、膜はブロッキング緩衝液（ＴＢＳ−Ｔ、２％Ｔｗｅｅｎ）中でさらに阻害される。一次ウサギ抗ＬＤＬｒ抗体（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ＃１００１２４２２）によりＬＤＬ−ｒタンパク質を検出し、一方で、一次ウサギ抗βアクチン抗体（ａｂｃａｍ＃ａｂ６２７６）を使用してβアクチンタンパク質を検出する。ＷｅｓｔｅｒＮｂｒｉｇｈｔ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｓｅｍ（Ａｄｖａｎｓｔａ＃Ｋ−１２０４２−Ｄ１０）を使用してペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｂｉｏｒａｄ＃１７０−６５１６）により両方のタンパク質をさらに可視化し、ＣＣＤカメラ（ＬＡＳ３０００、ＦｕｊｉＦｉｌｍ社）を使用して撮像する。ＭｕｌｔｉＧａｕｇｅソフトウェア（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）により、ウェスタンブロットからの化学発光信号の定量分析を行う。
【０５５７】
〈結果〉
ウェスタンブロットによってＬＤＬ−Ｒ発現レベルを測定し、発現レベルを比較した。発現は「ビヒクル−ｈＰＣＳＫ９」によって減少するが、これはｈＰＣＳＫ９のみを注射された群を表す。「ＥＧＦ（Ａ）化合物−ｈＰＣＳＫ９」を注射された群ではＬＤＬ−Ｒの発現が正常化し、発現が少なくとも９０％に戻ることを示した。
【０５５８】
結果は、ｈＰＣＳＫ９によりＬＤＬ−Ｒの発現レベルが減少し、この効果が試験したＥＧＦ（Ａ）化合物によって阻害されることを示す。表６．１および６．２に要約したデータは、健康な対照群動物のベースラインレベル（１００％に設定）とｈＰＣＳＫ９のみによる下方制御後のレベル（０％に設定）間の期間に関連した変化率を示している。試験された６つのＥＧＦ（Ａ）化合物は、ｈＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒ発現レベルに対する作用を阻害することができ、観察された阻害レベルは、対照群の分子アリロクマブを使用した場合に観察された阻害レベルと類似している。
表６．１
【表２５】
2020528049.tif 000299
表６．２
【表２６】
2020528049.tif 000300
【０５５９】
〈結論〉
いくつかの化合物の例は、ｈＰＣＳＫ９によるＬＤＬ−Ｒ発現レベルの下方制御の阻害に有効性を示した。
【０５６０】
〈Ｃ７−ｄｂ／ｄｂマウスにおける薬力学的試験〉
このアッセイの目的は、糖尿病環境における血糖値（ＢＧ）および体重（ＢＷ）への急性効果を検証することである。
【０５６１】
以下に記載するように、肥満かつ糖尿病のマウスモデル（ｄｂ／ｄｂマウス）における単回投与試験で化合物を試験する。誘導体を異なる用量で、すなわち、０．３、１．０、３．０、１０、３０、１００ｎｍｏｌ／ｋｇまたは１．０、３．０、１０、３０、１００、３００ｎｍｏｌ／ｋｇで試験する。誕生時から飼料ＮＩＨ３１（ＮＩＨ３１Ｍげっ歯類用食餌、米国Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ，Ｉｎｃ．から市販、ｗｗｗ．ｔａｃｏｎｉｃ．ｃｏｍを参照）を与えられたマウス（デンマーク、Ｔａｃｏｎｉｃ社）を、およそ週齢１０週で試験に登録する。動物棟に到着後、マウスに標準的な飼料（例えば、Ａｌｔｒｏｍｉｎ１３２４、デンマーク／ゲントフテ市、Ｂｒｏｇａａｒｄｅｎ社）および水道水を自由摂取させ、２４℃に保つ。１〜２週間の順化後、基礎血糖を１日に２回評価する。ベースライン血糖値が１５ｍＭ以上のマウスのみを含める。マウスは、一致する血糖値と体重に基づき治療群に割り当てられる（群当たりＮ＝５〜７）。
【０５６２】
動物はグループ化され、以下のとおり治療を受ける：ビヒクル、皮下またはＧＬＰ−１／ＰＣＳＫ９ｉ誘導体（０．３、１．０、３．０、１０、３０または１００ｎｍｏｌ／ｋｇまたは１．０、３．０、１０、３０、１００、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ）、皮下、ここでビヒクルは５０ｍＭリン酸ナトリウム、７０ｍＭ塩化ナトリウム、０．０５％ポリソルベート８０、ｐＨ７．４である。
【０５６３】
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物をビヒクル中に溶解して、０．０５、０．１７、０．５、１．７、５．０または１７ｎｍｏｌ／ｍＬまたは０．１７、０．５、１．７、５．０、１７または５０ｎｍｏｌ／ｍＬの投与濃度を得る。実験開始時に、動物に６ｍＬ／ｋｇで１回皮下投与する（すなわち、マウス５０ｇあたり３００μＬ）。
【０５６４】
投与日の午前に、投与時間の３０分前に血糖を評価し、その後にマウスを計量する。ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物をおよそ時間０に投与する。投与日に、投与から１、２、４、８時間後に血糖を評価する。
【０５６５】
翌日に、２４時間、４８時間、７２時間、および９６時間目に血糖を評価する。毎日、血糖のサンプリング後にマウスを計量する。
【０５６６】
マウスはデジタル計量スケールで個別に計量する。
【０５６７】
血糖測定のための試料は、覚醒マウスの尾部毛細管から取得される。ヘパリン添加したキャピラリーに血液５μＬを集め、２５０μＬグルコース緩衝液（ＥＫＦシステム溶液、ドイツ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ社）に移す。グルコース濃度を、グルコースオキシダーゼ法（グルコース分析計、Ｂｉｏｓｅｎ  ５０４０、ＥＫＦ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，ＧｍｂＨ、ドイツ／バルレーベン市）を使用して測定する。試料は、分析するまで室温で最大１時間、または４℃で最大２４時間保存する。
【０５６８】
マウスのベースラインから減算した血糖およびベースラインから減算した体重を計算する。
【０５６９】
〈結果〉
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物１、２、２１、２２、２３、２５、２６、２７、２９および３２を、上述の単回投与試験で試験した。誘導体を異なる用量、すなわち、０．３、１．０、３．０、１０、３０、１００ｎｍｏｌ／ｋｇ（化合物２、２１、２２、２３、２５および２６）または１．０、３．０、１０、３０、１００、および３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（化合物１、２７、２９および３２）で試験した。
【０５７０】
表７．１は、投与から２４時間後の最高用量のデルタ血糖およびデルタ体重に対する最大効果（Ｅｍａｘ）の概要を示す。２つの最高用量レベルで類似する効果が得られなかった場合は、真のＥｍａｘに達していない可能性があるため、値には星印（＊）を付けている。
表７．１  ｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖および体重に対する効果のＥｍａｘ値
【表２７】
2020528049.tif 000301
【０５７１】
血糖および体重に対するＧＬＰ−１／ＰＣＳＫ９ｉ誘導体の効果についての指標を得るため、０〜２４時間のデルタ血糖の曲線下面積（ＡＵＣΔＢＧ２４ｈ）および投与２４時間後のデルタ体重増加量（ΔＢＷ２４ｈ）を計算した。これらのパラメータの用量反応曲線に基づき、ＡＵＣΔＢＧ２４ｈおよびΔＢＷ２４ｈについて、５０％有効量（ＥＤ５０、ベースラインと最大効果の中間にあたる反応を提供するＧＬＰ−１誘導体の用量）を計算した。ＥＤ５０は、ＧＬＰ−１／ＰＣＳＫ９ｉ誘導体の効力の推定値として使用できる。以下の結果が得られた（個々のすべての決定の平均値）。
表７．２  ｄｂ／ｄｂマウスの血糖および体重に対する効果のＥＤ５０値
【表２８】
2020528049.tif 000302
【０５７２】
試験された化合物は、用量依存的に血糖と体重を減少させる効果をｉｎ  ｖｉｖｏで示した。
【０５７３】
本明細書では本発明のある特定の特徴を例示および説明してきたが、数多くの修正、置換、変更、および均等物が当業者には思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのようなすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【０５７４】
〈Ｃ８−ＤＩＯラットの薬力学的試験〉
このアッセイの目的は、肥満環境での体重（ＢＷ）および総コレステロール値に対する亜慢性効果を検証することである。以下に記載するとおり、食餌性肥満（ＤＩＯ）ラットモデルにおける２１日間の亜慢性的用量試験で化合物を試験する。誘導体を異なる用量、すなわち３０ｎｍｏｌ／ｋｇおよび３００ｎｍｏｌ／ｋｇで試験し、一部の例では提示期間にわたりより高い用量の９００ｎｍｏｌ／ｋｇを３００ｎｍｏｌ／ｋｇ群に与えた。
【０５７５】
週齢６週から６０％高脂肪飼料（Ｄ１２４９２、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，  Ｉｎｃから市販）を与えられたＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ社、フランス）は、週齢２２週に動物棟に到着する。動物棟に到着後、ラットに４５％高脂肪食事（Ｄ１２４５１、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ，Ｉｎｃから市販）と水道水を自由摂取させ、照明（１２時間：１２時間の光／暗サイクル、６時００分〜１８時００分に照明あり）および温度（２２±２℃）が制御された条件下にラットを置く。２〜３週間の順化後、一致する体重と脂肪率に基づいてラットを治療群に割り当てる（Ｎ＝１０／群）。
【０５７６】
動物はグループ化され、以下のとおり治療を受ける：ビヒクル、皮下またはＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物（３０ｎｍｏｌ／ｋｇまたは３００ｎｍｏｌ／ｋｇ、一部の場合、３００ｎｍｏｌ／ｋｇ群のラットには提示日数にわたり９００ｎｍｏｌ／ｋｇを投与）、皮下、ここでビヒクルは５０ｍｍリン酸塩、７０ｍＭ塩化ナトリウム、０．００７％ポリソルベート２０、ｐＨ７．４である。ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物をビヒクル中に溶解し、１５ｎｍｏｌ／ｍＬ（用量漸増用）、５０ｎｍｏｌ／ｍＬ（用量漸増用）、１５０ｎｍｏｌ／ｍＬ、５００ｎｍｏｌ／ｍＬ（用量漸増用）または１５００ｎｍｏｌ／ｍＬの投与濃度を得る。
【０５７７】
動物に、１日１回午前中に０．２ｍＬ／ｋｇの投与量で２２日間皮下投与する。用量を徐々に漸増し、ラットに１日目に３ｎｍｏｌ／ｋｇ、２日目に１０ｎｍｏｌ／ｋｇ、３日目に３０ｎｍｏｌ／ｋｇ、また該当する場合は４日目に１００ｎｍｏｌ／ｋｇ、５日目に３００ｎｍｏｌ／ｋｇを投与する。３０ｎｍｏｌ／ｋｇ群には、３日目から実験終了まで完全用量を投与する。３００ｎｍｏｌ／ｋｇ群には、５日目から実験終了まで完全用量を投与する。３００ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物４１を投与したラットには、１６日目から実験終了まで９００ｎｍｏｌ／ｋｇを投与する。３００ｎｍｏｌ／ｋｇのＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物４８を投与したラットには、２０日目から実験終了まで９００ｎｍｏｌ／ｋｇを投与する。９００ｎｍｏｌ／ｋｇの用量は、１５００ｎｍｏｌ／ｍＬ溶液の投与量を０．６ｍＬ／ｋｇに増加させることによって達成される。
【０５７８】
ラットを、投与直前にデジタル計量スケールで毎日計量する。食器の重量も毎日計算して、食餌の消費量を計算する。体内組成物を、投与開始の３〜４日前および２０日目または２１日目に、ＭＲ走査により評価する（Ｅｃｈｏ  ＭＲＩ７００、米国テキサス州ヒューストン市）。投与開始の５日前、および試験終了時に、舌下血液試料を覚醒ラットから採取する。血液試料をＥＤＴＡ採血管に収集し、転倒混合で完全に混和させる。ＥＤＴＡ採血管は、収集直後に氷上に置く。ＥＤＴＡ血液試料を４℃かつ６０００Ｇで５分間遠心分離し、分析まで血漿試料を−８０℃で保存する。試料について、Ｃｏｂａｓ分析器（Ｃｏｂａｓ６０００、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｉｓｔｉｃｓ社、米国）で総コレステロール値を分析する。
【０５７９】
各ラットについてベースラインから減算した体重およびベースラインから減算した総コレステロール値を計算し、群ごとに平均化する。
【０５８０】
〈結果〉
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物４１、４８および６９を、上述のように亜慢性用量試験で試験した。誘導体を異なる用量、すなわち３０ｎｍｏｌ／ｋｇおよび３００ｎｍｏｌ／ｋｇ（ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物６９）または３０ｎｍｏｌ／ｋｇおよび３００ｎｍｏｌ／ｋｇで試験し、最後の２日間に（ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物４１）または最後の７日間に（ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物４８）用量を９００ｎｍｏｌ／ｋｇに増加させた。
【０５８１】
表８．１は、ベースライン体重（平均±ＳＥＭ）と比較した平均体重（％）、および群あたりのベースライン値（平均±ＳＥＭ）と比較した血漿総コレステロール値の平均デルタの概略を示す。
表８．１  ベースライン体重と比較した平均体重（％）および２１日後のベースライン値と比較した血漿総コレステロール値の平均変化
【表２９】
2020528049.tif 000303
【０５８２】
〈Ｃ９−化学的安定性〉
３２１Ｄが３２１Ｅで置換されたＥＧＦ（Ａ）類似体の潜在的な安定効果（異性体形成の減少）を調べるために、ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物６９および３１３の製剤を調製する。化合物の濃度は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１８．４ｍｇ／ｍＬプロピレングリコール、０．４３ｍＭ  ＣａＣｌ２からなる製剤中で２ｍｇ／ｍＬである。製剤は、Ｔｒｉｓ、プロピレングリコール、およびＣａｃｌ２を含むＭＱ水に凍結乾燥した材料を最終濃度で可溶化することによって調製する。ｐＨは０．１Ｎ  ＨＣｌ（水溶液）および０．１Ｎ  ＮａＯＨ（水溶液）を使用して調節される。各製剤を滅菌濾過し、ＨＰＬＣガラスバイアル上に充填し、３７℃に温度制御されたキャビネットで静止保存する。選択された時点（時間０、１週、２週、４週）で試料がＨＰＬＣバイアルから引き出され、その後のＵＰＬＣ−ＭＳ分析のために凍結される。
【０５８３】
ＢＥＨ  Ｃ４カラム（３００オングストローム、１．７ｕｍ、１．０ｘ１５０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ）および水中０．１％ギ酸（溶離液Ａ）／アセトニトリル中０．１％ギ酸（溶離液Ｂ）溶媒システムに基づく安定性を示す純度方法を使用して、熱ストレスを受けた製剤の純度損失を評価する。以下の条件を使用する：カラム温度：５０℃、流量：０．３０ｍＬ／分、ＵＶ検出器の波長：２１５ｎｍ。グラジエントは、４１分間にわたり３１％〜３９％Ｂである。ＬＣ流量は、正イオンモードで動作する電気スプレーインターフェースを備えるＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に注入されたオンライン配線である。純度方法は前述の製剤と互換性があることが示され、内容／類似体の損失は観察されない。形成される異性体の量は、様々な試料、すなわち時間０、および３７℃で２週間および４週間培養された試料の全イオンクロマトグラム上での質量ベースの抽出から決定され、各試料の異性体の割合は、異性体のピーク面積を主ピーク（ＡＰＩ）面積に統合させて算出される。
表９．１  全イオンクロマトグラムの質量ベースの抽出によって決定された製剤試料中の異性体の量
【表３０】
2020528049.tif 000304
【０５８４】
表９．１における結果は、３２１Ｄの３２１Ｄによる置換が、３７℃での培養から４週間後に、異性体形成の量を２０．２％から４．２％へと有意に低下させることを示す。
【０５８５】
本明細書では本発明のある特定の特徴を例示および説明してきたが、数多くの修正、置換、変更、および均等物が当業者には思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲が、本発明の真の趣旨の範囲内にあるそのようなすべての修正および変更を網羅することを意図していることが理解されるべきである。
【手続補正書】
【提出日】令和2年4月3日(2020.4.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＰ−１類似体およびＥＧＦ（Ａ）類似体を含む化合物であって、
ｉ．前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号１３７によって特定されたＧＬＰ−１（７−３７）と比較して最大で６つのアミノ酸置換を有し、
ｉｉ．前記ＥＧＦ（Ａ）類似体は、配列番号１によって特定されたＬＤＬ−Ｒ（２９３〜３３２）のＥＧＦ（Ａ）ドメインと比較して１〜８つのアミノ酸置換を有し、かつ３０１Ｌｅｕを含み、
前記化合物がＧＬＰ−１作動薬であり、セクションＣ３に記載するようにＰＣＳＫ９−ＬＤＬ−Ｒ結合に関する競合ＥＬＩＳＡアッセイで測定した場合に８ｎＭ未満のＫｉを有する、化合物。
【請求項２】
前記化合物が、前記ＧＬＰ−１類似体および前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を含む融合ポリペプチドを含む、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端に前記ＧＬＰ−１類似体を有し、Ｃ末端に前記ＥＧＦ（Ａ）類似体を含む、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ＧＬＰ−１類似体が、１２Ｋ、２１Ｋ、２３Ｋ、２４Ｋ、２５Ｋ、２６Ｋ、２７Ｋ、３０Ｋ、３１Ｋ、３２Ｋ、３３Ｋ、３４Ｋ、および３６Ｋからなる群から選択される１つまたは２つのＬｙｓ残基を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号１３８〜１８７によって定義されるＧＬＰ−１類似体の群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記化合物が、ＨＳＡなしの、Ｃ１に記載されるＧＬＰ−１  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイで最大で１００ｐＭのＥＣ５０を有する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記ＧＬＰ−１類似体が８Ａｉｂを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記ＧＬＰ−１類似体が３４Ｒまたは３４Ｑを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
ＧＬＰ−１類似体が８Ａｉｂおよび３４Ｒを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
前記ＧＬＰ−１類似体が、配列番号１３９、１４７〜１５４、および１８４〜１８６によって定義されるＧＬＰ−１類似体の群から選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記ＧＬＰ−１類似体が配列番号１３９によって定義される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３０９Ｒを含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３２１Ｄまたは３２１Ｅを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１４】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が３１２Ｅ、３１２Ｄ、３１２Ｑまたは３１２Ｒを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１５】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が、配列番号１９、２１、７３、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、および１１４、例えば配列番号１０７および１０８によって定義されるＥＧＦ（Ａ）類似体の群から選択される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が配列番号１０８によって定義される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記融合ポリペプチドが、ペプチドスペーサー、例えば配列番号１１５〜１３６、例えば配列番号１１６および１１９によって定義されるスペーサーの群から選択されるスペーサーを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１８】
Ｃ３に記載するように測定した見かけＥＧＦ（Ａ）Ｋｉと、ＨＳＡなしの、Ｃ１に記載した前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力アッセイにおいて前記ＥＣ５０として測定されたＧＬＰ−１効力との比率が最大で２００である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１９】
前記化合物が、少なくとも１つの半減期を延長させる置換基、例えば以下からなる置換基の群から選択される置換基を含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の化合物：
化学式６ｂによって定義される置換基＃１
【化１】
2020528049.tif 000305
化学式６ｂ、
化学式７ｂによって定義される置換基＃２
【化２】
2020528049.tif 000306
化学式７ｂ、
化学式８ｂによって定義される置換基＃３
【化３】
2020528049.tif 000307
化学式８ｂ、
化学式９ｂによって定義される置換基＃４
【化４】
2020528049.tif 000308
化学式９ｂ、
化学式１０ｂによって定義される置換基＃５
【化５】
2020528049.tif 000309
化学式１０ｂ、
化学式１１ｂによって定義される置換基＃６
【化６】
2020528049.tif 000310
化学式１１ｂ、
化学式１２ｂによって定義される置換基＃７
【化７】
2020528049.tif 000311
化学式１２ｂ、
化学式１３ｂによって定義される置換基＃８
【化８】
2020528049.tif 000312
化学式１３ｂ、
化学式１４ｂによって定義される置換基＃９
【化９】
2020528049.tif 000313
化学式１４ｂ、
化学式１５ｂによって定義される置換基＃１０
【化１０】
2020528049.tif 000314
化学式１５ｂ、
化学式１６ｂによって定義される置換基＃１１
【化１１】
2020528049.tif 000315
化学式１６ｂ、
化学式１７ｂによって定義される置換基＃１２
【化１２】
2020528049.tif 000316
化学式１７ｂ、
化学式１８ｂによって定義される置換基＃１３
【化１３】
2020528049.tif 000317
化学式１８ｂ、および
化学式１９ｂによって定義される置換基＃１４
【化１４】
2020528049.tif 000318
化学式１９ｂ。
【請求項２０】
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物＃４１、＃４８、＃６９および＃３０６、例えば＃３０６および＃６９、または例えば＃３０６もしくは＃６９として定義される化合物の群から選択される化合物であって、
化合物＃４１が、配列番号１３９によって定義されるＧＬＰ−１類似体［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）、配列番号１１６によって定義されるスペーサー、および配列番号１９によって定義されるＥＧＦ（Ａ）類似体［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３３３Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）、ならびに
化学式６ｂ
【化１５】
2020528049.tif 000319
化学式６ｂ
によって定義され、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸残基２６Ｋおよび［３０１Ｌ、３０９Ｒ、３１２Ｅ、３２１Ｅ、３３３Ｋ］ＥＧＦ（Ａ）のアミノ酸残基３３３Ｋに付着された２つの置換基からなる、配列番号１９０によって定義される融合ペプチドを含み、
化合物＃４８が、配列番号１３９によって定義されるＧＬＰ−１類似体［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）、配列番号１１９によって定義されるスペーサー、および配列番号１０８によって定義されるＥＧＦ（Ａ）類似体、ならびに
化学式１１ｂ
【化１６】
2020528049.tif 000320
化学式１１ｂ
によって定義され、［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸残基２６Ｋに付着された１つの置換基からなる、配列番号２０２によって定義される融合ペプチドを含み、
化合物＃６９が、配列番号１６４によって定義されるＧＬＰ−１類似体［８Ａｉｂ、３０Ｇ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）、配列番号１１６によって定義されるスペーサー、および配列番号１０８によって定義されるＥＧＦ（Ａ）類似体、ならびに
化学式１１ｂ
【化１７】
2020528049.tif 000321
化学式１１ｂ
によって定義され、［８Ａｉｂ、３０Ｇ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸２６Ｋに付着された１つの置換基からなる、配列番号３１０によって定義される融合ペプチドを含み、
化合物＃３０６が、配列番号１６４によって定義されるＧＬＰ−１類似体［８Ａｉｂ、３０Ｇ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）、配列番号１１６によって定義されるスペーサー、および配列番号１０８によって定義されるＥＧＦ（Ａ）類似体、ならびに
化学式１０ｂ
【化１８】
2020528049.tif 000322
化学式１０ｂ
によって定義され、［８Ａｉｂ、３０Ｇ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸２６Ｋに付着された１つの置換基からなる、配列番号３１０によって定義される融合ペプチドを含む、化合物。
【請求項２１】
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物である請求項１に記載の化合物であって、前記ＧＬＰ−１類似体が配列番号１３９によって定義され、前記ＥＧＦ（Ａ）類似体が配列番号１０８によって定義される、化合物。
【請求項２２】
ＧＬＰ−１／ＥＧＦ（Ａ）化合物であって、前記化合物が、配列番号１９３によって定義される融合ペプチド、および
化学式６ｂ
【化１９】
2020528049.tif 000323
化学式６ｂ
によって定義され、配列番号１９３の位置２０のリジン（Ｋ）（［８Ａｉｂ、３４Ｒ］ＧＬＰ−１（７−３７）のアミノ酸２６Ｋに等しい）を介して付着された１つの置換基を含む、化合物。
【請求項２３】
糖尿病、過体重および／または心血管疾患を治療する方法で使用するための、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項２４】
請求項１〜２３のいずれかに記載の化合物を必要とする患者に対し、前記化合物の薬学的に有効な投与量を投与することを含む、糖尿病、過体重および／または心血管疾患の治療方法。
【国際調査報告】
2020528049.tif 000324
2020528049.tif 000325
2020528049.tif 000326