(57)【要約】  本明細書に開示されるのは、遺伝子改変微生物ならびにオリゴ糖の利用向上及びオリゴ糖の代謝から得られる化合物の産生力改善のための関連方法である。本明細書に記載される微生物は、原形質膜ＡＴＰａｓｅタンパク質（ＰＭＡ１）及び／または１つ以上の細胞外グルコースセンサー、すなわち、スクロース非発酵タンパク質（ＳＮＦ３）、グルコース輸送回復タンパク質（ＲＧＴ２）、及びＧタンパク質共役受容体１タンパク質（ＧＰＲ１）の変化した活性を有する。これらの遺伝子改変は、微生物に、オリゴ糖を利用して、目的の化合物、特にタガトース、２’−フコシルラクトース、及びプシコースを産生する向上した能力をもたらす。そのようなオリゴ糖の存在下で微生物を培養し、目的の産物を産生する方法も提供される。【選択図】図１
2020526229.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微生物であって、
ｉ）親微生物中のＰＭＡ１活性と比較して、前記微生物中のＰＭＡ１の活性を増加させる遺伝子改変、
ｉｉ）前記親微生物中のＳＮＦ３活性と比較して、前記微生物中のＳＮＦ３の活性を低減させる遺伝子改変、
ｉｉｉ）前記親微生物中のＲＧＴ２活性と比較して、前記微生物中のＲＧＴ２の活性を低減させる遺伝子改変、及び
ｉｖ）前記親微生物中のＧＰＲ１活性と比較して、前記微生物中のＧＰＲ１の活性を低減させる遺伝子改変
から選択される１つ以上の遺伝子改変を含む、前記微生物。
【請求項２】
ｉ）ＰＭＡ１の前記活性を増加させる前記遺伝子改変が、原形質膜ＡＴＰａｓｅ遺伝子（ｐｍａ１）に対する遺伝子改変である、
ｉｉ）ＳＮＦ３の活性を低減させる前記遺伝子改変が、スクロース非発酵遺伝子（ｓｎｆ３）に対する遺伝子改変である、
ｉｉｉ）ＲＧＴ２の活性を低減させる前記遺伝子改変が、グルコース輸送回復遺伝子（ｒｇｔ２）に対する遺伝子改変である、かつ
ｉｖ）ＧＰＲ１の活性を低減させる前記遺伝子改変が、Ｇタンパク質共役受容体１遺伝子（ｇｐｒ１）に対する遺伝子改変である、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
ｉ）ＰＭＡ１が、配列番号１の配列または配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する、
ｉｉ）ＳＮＦ３が、配列番号２の配列または配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する、
ｉｉｉ）ＲＧＴ２が、配列番号３の配列または配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する、
ｉｖ）ＧＰＲ１が、配列番号４の配列または配列番号４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する、請求項１または２に記載の微生物。
【請求項４】
前記親微生物中のＰＭＡ１活性と比較して、前記微生物中のＰＭＡ１の活性を増加させるｐｍａ１の前記遺伝子改変が、ａ）内因性プロモーターと、前記内因性ｐｍａ１に機能的に連結される外因性プロモーターとの置換え、ｂ）染色体外遺伝物質を介するｐｍａ１の発現、ｃ）前記微生物のゲノム中への１つ以上のｐｍａ１のコピーの組込み、ｄ）構成的活性ＰＭＡ１もしくは非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１をコードする改変ｐｍａ１を生成するための、前記内因性ｐｍａ１に対する改変、ｅ）前記微生物中への、構成的活性ＰＭＡ１もしくは対応する野生型ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１をコードするｐｍａ１を含む染色体外遺伝物質の導入、またはｆ）前記微生物のゲノム中への、構成的活性ＰＭＡ１もしくは対応する野生型ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１をコードする１つ以上のｐｍａ１のコピーの組込み、あるいは前記改変ａ）〜ｆ）の任意の組合せのうち１つ以上である、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項５】
ｐｍａ１の前記内因性プロモーターが、前記内因性プロモーターよりも高いレベルでｐｍａ１の発現を誘導する外因性プロモーターで置き換えられる、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
前記外因性プロモーターが、前記内因性プロモーターが前記外因性プロモーターと置き換えられている前記微生物に特異的である、請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
前記内因性ｐｍａ１に対する前記改変によって構成的活性ＰＭＡ１をコードする改変ｐｍａ１が生成され、このＰＭＡ１が、対応する野生型ＰＭＡ１と比較した場合、Ｃ末端から少なくとも２〜約３０アミノ酸を欠いているＰＭＡ１である、請求項４に記載の微生物。
【請求項８】
前記微生物が、配列番号１のＰＭＡ１をコードする内因性ｐｍａ１を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅであり、これが配列番号１の前記Ｃ末端から少なくとも２〜約３０アミノ酸を欠いている切断型ＰＭＡ１をコードする改変ｐｍａ１を生成するように遺伝子改変される、請求項７に記載の微生物。
【請求項９】
ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の活性を低減させる前記遺伝子改変が、ａ）ｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１の不活性化であって、前記不活性化したｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１が、ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１をコードしない、前記不活性化、ｂ）ｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１の変異であって、前記変異したｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１が、前記親微生物中の対応するタンパク質の活性と比較して全く活性のない、または減少した活性を有する前記ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１についてコードする、前記変異、ｃ）ｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１のプロモーターの変異であって、前記変異したプロモーターが、前記親微生物中の対応するタンパク質の発現と比較してＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の減少した発現を引き起こす、前記変異、ｄ）ｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１からの内因性プロモーターと、前記内因性ｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１のコード領域に機能的に連結される外因性プロモーターとの置換えであって、前記外因性プロモーターが、前記親微生物中の対応するタンパク質の発現と比較してＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１を全く発現しない、または減少した発現を引き起こす、前記置換え、ｅ）前記ａ）〜ｄ）の任意の組合せのうち１つ以上を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
ｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１の前記不活性化が、ａ）コード領域の完全なまたは部分的な欠失、ｂ）コード領域内でのフレームシフト変異の導入、ｃ）ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の活性を妨害するような１つ以上のヌクレオチドの挿入、ｄ）コード領域中への終止コドンの導入、あるいはｅ）ａ）〜ｄ）の任意の組合せのうち１つ以上によって達成される、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１１】
以下に列挙される遺伝子改変または遺伝子改変の組合せを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物：
１）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変及びｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
２）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変及びｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
３）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
４）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
５）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
６）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
７）ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変及びｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
８）ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
９）ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１０）ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１１）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１２）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１の前記Ｃ末端に、少なくとも２〜約３０、特に少なくとも３〜約３０アミノ酸の切断を有する構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１３）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１の前記Ｃ末端に、少なくとも２〜約３０、特に少なくとも３〜約３０アミノ酸の切断を有する構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１４）前記対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１の前記Ｃ末端に、少なくとも２〜約３０、特に少なくとも３〜約３０アミノ酸の切断を有する構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１５）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１の前記Ｃ末端に、少なくとも２〜約３０、特に少なくとも３〜約３０アミノ酸の切断を有する構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１６）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１の前記Ｃ末端に、２もしくは３アミノ酸の切断を有する構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１７）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１の前記Ｃ末端に、少なくとも２もしくは３アミノ酸の切断を有する構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１８）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１の前記Ｃ末端に、少なくとも２もしくは３アミノ酸の切断を有する構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１９）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１の前記Ｃ末端に、少なくとも２もしくは３アミノ酸の切断を有する構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
２０）前記対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１の前記Ｃ末端に、少なくとも２もしくは３アミノ酸の切断を有する構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
２１）前記対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１の前記Ｃ末端に、少なくとも２もしくは３アミノ酸の切断を有する構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
２２）前記対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号１の配列もしくは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１の前記Ｃ末端に、少なくとも２〜約３０、特に少なくとも３〜約３０アミノ酸の切断を有する構成的活性ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
あるいは遺伝子改変の組合せを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１２】
ｉ）親微生物中のＳＮＦ３活性と比較して、前記微生物中のＳＮＦ３の活性を低減させる遺伝子改変、
ｉｉ）親微生物中のＲＧＴ２活性と比較して、前記微生物中のＲＧＴ２の活性を低減させる遺伝子改変
を含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１３】
ｉ）ＳＮＦ３の活性を低減させる前記遺伝子改変が、スクロース非発酵遺伝子（ｓｎｆ３）に対する遺伝子改変であり、かつ
ｉｉ）ＲＧＴ２の活性を低減させる前記遺伝子改変が、グルコース輸送回復遺伝子（ｒｇｔ２）に対する遺伝子改変である、請求項１２に記載の微生物。
【請求項１４】
ｉ）ＳＮＦ３が、配列番号２の前記配列または配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有し、かつ
ｉｉ）ＲＧＴ２が、配列番号３の前記配列または配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する、請求項１２または１３に記載の微生物。
【請求項１５】
ＳＮＦ３、及び／またはＲＧＴ２の活性を低減させる前記遺伝子改変が、ａ）ｓｎｆ３、及び／またはｒｇｔ２の不活性化であって、前記不活性化したｓｎｆ３、及び／またはｒｇｔ２が、ＳＮＦ３、及び／またはＲＧＴ２をコードしない、前記不活性化、ｂ）ｓｎｆ３、及び／またはｒｇｔ２の変異であって、前記変異したｓｎｆ３、及び／またはｒｇｔ２が、親微生物中の対応するタンパク質の活性と比較して全く活性のない、または減少した活性を有する前記ＳＮＦ３、及び／またはＲＧＴ２についてコードする、前記変異、ｃ）ｓｎｆ３、及び／またはｒｇｔ２の前記プロモーターの変異であって、前記変異したプロモーターが、親微生物中の対応するタンパク質の発現と比較してＳＮＦ３、及び／またはＲＧＴ２の減少した発現を引き起こす、前記変異、ｄ）ｓｎｆ３、及び／またはｒｇｔ２からの内因性プロモーターと、前記内因性ｓｎｆ３、及び／またはｒｇｔ２のコード領域に機能的に連結される外因性プロモーターとの置換えであって、前記外因性プロモーターが、親微生物中の対応するタンパク質の発現と比較してＳＮＦ３、及び／またはＲＧＴ２を全く発現しない、または減少した発現を引き起こす、前記置換え、ｅ）前記ａ）〜ｄ）の任意の組合せのうち１つ以上を含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１６】
ｓｎｆ３、及び／またはｒｇｔ２の前記不活性化が、ａ）コード領域の完全なまたは部分的な欠失、ｂ）コード領域内でのフレームシフト変異の導入、ｃ）ＳＮＦ３、及び／またはＲＧＴ２の活性を妨害するような１つ以上のヌクレオチドの挿入、ｄ）コード領域中への終止コドンの導入、あるいはｅ）ａ）〜ｄ）の任意の組合せのうち１つ以上によって達成される、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１７】
親微生物中のＰＭＡ１活性と比較して、前記微生物中のＰＭＡ１の活性を増加させる遺伝子改変をさらに含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１８】
親微生物中のＧＰＲ１活性と比較して、前記微生物中のＧＰＲ１の活性を低減させる遺伝子改変をさらに含む、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１９】
前記微生物が、シャペロニンをコードする外因性ヌクレオチド配列をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２０】
前記シャペロニンがＧｒｏＥＳＬである、請求項１９に記載の微生物。
【請求項２１】
前記微生物が、細菌または真菌である、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２２】
前記真菌が、糸状菌または酵母である、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２３】
前記微生物が、Ｓａｃｈｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｓ．ｂｅｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｓ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ、Ｓ．ｂａｙ  ａｎｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓ．ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ、Ｓ．ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｉｌｉｉ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｎｔｅｒ  ｍｅｄｉｕｓ、Ｂ．ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｏｍａｌｕｓ、Ｂ．ｃｕｓｔｅｒｓｉａｎｕｓ、Ｂ．ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎａｎｕｓ、Ｄｅｋｋｅｒａ  ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｄ．ａｎｏｍａｌａ、Ｍｅｔｓｃｈｍｋｏｗｉａ種、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ  ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ  ａｐｉｃｕｌａｔｅ、またはＡｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ  ｐｕｌｌｕｌａｎｓである、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２４】
前記微生物が、親微生物と比較して、スクロース、ラクトース、マルトース、イソマルトース、イソマルツロース、トレハロース、トレハルロース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、またはセロヘキサオースを利用するより高い能力を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２５】
前記微生物が、親微生物と比較して、ラクトースを２’−ＦＬに変換するより高い能力を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２６】
前記微生物が、親微生物と比較して、ラクトースをタガトースに変換するより高い能力を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２７】
前記微生物が、親微生物と比較して、スクロースをプシコースに変換するより高い能力を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２８】
前記遺伝子改変前の内因性ＰＭＡ１が、配列番号１の配列または配列番号１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２９】
前記遺伝子改変前の内因性ＳＮＦ３が、配列番号２の配列または配列番号２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３０】
前記遺伝子改変前の内因性ＲＧＴ２が、配列番号３の配列または配列番号３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３１】
前記遺伝子改変前の内因性ＧＰＲ１が、配列番号４の配列または配列番号４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％の配列同一性を有する配列を有する、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３２】
目的の産物の産生方法であって、オリゴ糖を含有する培養培地中で先行請求項のいずれか１項に記載の微生物を培養することと、前記目的の産物を回収することとを含む、前記方法。
【請求項３３】
前記目的の産物がタガトースであり、前記オリゴ糖がラクトースである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記目的の産物が２’−ＦＬであり、前記オリゴ糖がラクトースである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記目的の産物がプシコースであり、前記オリゴ糖がスクロースである、請求項３２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年６月３０日出願の米国仮特許出願第６２／５２７，１８２号明細書に対する優先権を主張し、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明はオリゴ糖の使用向上のために操作された微生物に関する。
【背景技術】
【０００３】
オリゴ糖は低分子量の炭水化物であり、重合度（ＤＰ）が２〜１０の糖部分を含有する。オリゴ糖は天然源から得られる場合があり、また合成される場合もある。一部の微生物は、オリゴ糖を自然に消費し、それらのエネルギー源としてオリゴ糖を利用する。オリゴ糖の様々な天然源としては、ミルク、ハチミツ、サトウキビ汁、ライ麦、大麦、小麦、ダイズ、レンズマメ、マスタード、果物、ならびに野菜、例えば、タマネギ、アスパラガス、テンサイ、アーティチョーク、チコリ、リーキ、ニンニク、バナナ、ヤーコン、トマト、及びタケノコなどが挙げられる。一般的なオリゴ糖の製造方法としては、多糖の加水分解、二糖または単糖基質からの化学、及び酵素重合が挙げられる。多糖の酸、アルカリ、及び酵素加水分解は、所望の構造及び機能特性を持つオリゴ糖を生成する。一般に、酵素的方法は、それらの高選択性及び高収率、ならびに環境に配慮した性質ゆえにオリゴ糖合成に好ましい。他のオリゴ糖は、外来遺伝子を導入することによって操作されて、オリゴ糖の消費を可能にする場合がある。
【０００４】
機能性オリゴ糖は、食品及び栄養補助食品の有益な成分として誕生した。結腸微生物による消化及び発酵に対するそれらの抵抗性によって、オリゴ糖は栄養上有益となっている。食物繊維、甘味料、及び保湿剤のような意味合いだけでなく、オリゴ糖はプレバイオティクスとして認められている。それらの有益な効果は、抗酸化、抗炎症、免疫調節、抗高血圧、及び抗アレルギーから抗がん、神経保護、ならびに皮膚のバリア機能及び水和の改善にまで広がっている。生物活性オリゴ糖の人気が上昇することによって、新規の持続可能な供給源からのそれらの生成に関する探索が加速している。
【０００５】
オリゴ糖は、所望の産物を産生するために使用される遺伝子改変微生物において、発酵または他の代謝プロセスの燃料となるために炭素源または供給原料として頻繁に使用される。しかしながら、このプロセスの効率は、提供される炭素源を効率的に利用する遺伝子改変微生物の能力によって限定される。加えて、天然及び従来の遺伝子操作オリゴ糖の利用システムは全て、オリゴ糖の微生物中への移動中に、またはオリゴ糖の切断中にエネルギーを失う。このエネルギー損失は、微生物の化学物質産生効率を減少させ、それにより産生の費用及び時間を増加させる。したがって、化学物質を産生する時間及び費用を減少させるために微生物のオリゴ糖利用を最適化する組成物及び方法が所望される。
【発明の概要】
【０００６】
オリゴ糖の利用増加を示す微生物が提供される。特定の実施形態では、微生物は、ｉ）原形質膜ＡＴＰａｓｅ（ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ＡＴＰａｓｅ）タンパク質（ＰＭＡ１）の活性を増加させる、及び／またはｉｉ）スクロース非発酵（ｓｕｃｒｏｓｅ  ｎｏｎ−ｆｅｒｍｅｎｔｉｎｇ）タンパク質（ＳＮＦ３）の活性を低減させる、及び／またはｉｉｉ）グルコース輸送回復（ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）タンパク質（ＲＧＴ２）の活性を低減させる、及び／またはｉｖ）Ｇタンパク質共役受容体（Ｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）１タンパク質（ＧＰＲ１）の活性を低減させる１つ以上の遺伝子改変を含む。特定の実施形態では、ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）及びｉｖ）をもたらすこれらの遺伝子改変は、それぞれ原形質膜ＡＴＰａｓｅ遺伝子（Ｐｍａ１）、スクロース非発酵遺伝子（Ｓｎｆ３）、グルコース輸送遺伝子（Ｒｇｔ２）、及びＧタンパク質共役受容体１遺伝子（Ｇｐｒ１）で生成される。
【０００７】
親微生物と比較して、本明細書に記載される微生物は、オリゴ糖を利用して、それらのオリゴ糖の代謝から目的の産物を産生する向上した能力を有する。したがって、オリゴ糖を含有する培地中で本開示の微生物を培養することによって目的の産物を産生する方法及び培地から目的の産物を得る方法が提供される。
【０００８】
いくつかの実施形態では、微生物は、細菌または真菌、例えば、糸状菌または酵母である。特定の実施形態では、微生物は酵母、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】構成的活性化Ｐｍａ１の導入が、細胞外グルコースの不存在下におけるオリゴ糖利用を改善することを示す。
【図２】細胞外グルコースセンサーＳｎｆ３及びＲｇｔ２の破壊が、細胞外グルコースの不存在下におけるオリゴ糖利用を改善することを示す。
【図３】構成的活性化Ｐｍａ１とＳｎｆ３  Ｒｇｔ２細胞外グルコースセンサーの破壊との組合せが、細胞外グルコースの不存在下におけるオリゴ糖利用を相乗的に改善することを示す。
【図４】望ましい産物の一例として、タガトースの、Ｓｎｆ３及びＲｇｔ２の破壊を伴う株における産生力の増加を示す。
【図５】配列番号．１の配列を示す。
【図６】配列番号．２の配列を示す。
【図７】配列番号．３の配列を示す。
【図８】配列番号．４の配列を示す。
【図９】望ましい産物の一例として、２ＦＬの、Ｓｎｆ３及びＲｇｔ２の破壊を伴う株における産生力の増加を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
便宜上、本明細書、実施例、及び添付の特許請求の範囲に用いられる特定の用語が、ここにまとめられている。
【００１１】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、その内容に別段の明確な指示がない限り、複数形を同様に含むことを意図する。
【００１２】
「約」という用語は、当業者によって決定されるような特定値の許容される誤差範囲内を意味し、これは値が測定または決定される方法、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存することになる。「約」または「およそ」という用語が、成分量を含有する組成物または温度などの条件との関連において使用される場合、これらの値は、値の前後０〜１０％（Ｘ±１０％）で変動する記載値を含む。
【００１３】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｗｉｔｈ）」という用語、またはそれらの変化形は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語に類似した方法で包括的である。「なる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」という用語及びなる（ｃｏｎｓｉｓｔ）の文法上の変化形は、列挙されている要素に限定され、他の要素を全て除外する実施形態を包含する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という語句は、特定の材料またはステップを含有する実施形態ならびに実施形態の基本的かつ新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼすことのない材料及びステップを含む実施形態を包含する。
【００１４】
範囲は、長々と羅列しなければならないこと及びその範囲内における各々全ての値を記載しなければならないことを避けるために省略して記載される。したがって、値について範囲が記載される場合、その範囲内における任意の適切な値が選択され得、これらの値はその範囲の上限値及び下限値を含む。例えば、２〜３０という範囲は、２及び３０という末端の値に加えて、２〜３０の間の中間値を表し、全ての中間値範囲、例えば、２〜５、２〜８、２〜１０などが２〜３０内に包含される。
【００１５】
「遺伝子改変」という用語は、本明細書で使用される場合、微生物中のゲノムＤＮＡを変化させることを指す。典型的には、遺伝子改変は、変化した遺伝子によってコードされるタンパク質の発現及び／または活性を変化させる。
【００１６】
「オリゴ糖」という用語は異なる長さの単糖ポリマーを指し、これらとしては、スクロース（１つのグルコースモノマー及び１つのフルクトースモノマー）、ラクトース（１つのグルコースモノマー及び１つのガラクトースモノマー）、マルトース（１つのグルコースモノマー及び１つのグルコースモノマー）、イソマルトース（２つのグルコースモノマー）、イソマルツロース（１つのグルコースモノマー及び１つのフルクトースモノマー）、トレハロース（２つのグルコースモノマー）、トレハルロース（１つのグルコースモノマー及び１つのフルクトースモノマー）、セロビオース（２つのグルコースモノマー）、セロトリオース（３つのグルコースモノマー）、セロテトラオース（４つのグルコースモノマー）、セロペンタオース（５つのグルコースモノマー）、ならびにセロヘキサオース（６つのグルコースモノマー）が挙げられる。
【００１７】
「微生物」という用語は、改変の有無にかかわらず、オリゴ糖消費または利用ができる原核または真核微生物を指す。
【００１８】
「利用向上」という用語は、親微生物と比較した微生物によるオリゴ糖消費の改善を指し、特にオリゴ糖消費率の増加、オリゴ糖消費が始まる前の初期時間の低減、生成される産物と消費される出発物質との比として定義される収率の増加、及び／または微生物が所定量のオリゴ糖を消費するのにかかる時間全体の低減を指す。
【００１９】
「親微生物」という用語は、遺伝子改変微生物を作製するために操作される微生物を指す。例えば、遺伝子が１つ以上の遺伝子改変によって微生物中で変異される場合、改変されている微生物は、１つ以上の遺伝子改変を持つ微生物の親微生物である。
【００２０】
「消費率」という用語は、所与の培養体積中に所与の細胞密度を有する微生物によって所与の期間中に消費されるオリゴ糖の量を指す。
【００２１】
「所望の化合物」という用語は、改変の有無にかかわらず、微生物によってオリゴ糖から産生される化合物を指す。オリゴ糖消費を可能にするのに必要な改変以外の改変が、所望の化合物の産生に必要な場合がある。所望の化合物としては、タガトース、２’−フコシルラクトース、ヒトミルクオリゴ糖、及びプシコースが挙げられる。
【００２２】
「産生率」という用語は、所与の培養体積中に所与の細胞密度を有する微生物によって所与の期間中に産生される所望の化合物の量を指す。
【００２３】
「遺伝子」という用語は、遺伝子のコード領域に加えて上流及び下流の調節領域を含む。上流の調節領域は、遺伝子のプロモーター領域と呼ばれている。下流の調節領域は、ターミネーター領域と呼ばれている。遺伝子は、本明細書中において遺伝子の名称を小文字で表されるのに対して、タンパク質は、タンパク質の名称を全て大文字で表される。例えば、ｐｍａ１がＰＭＡ１タンパク質をコードする遺伝子を表すのに対して、ＰＭＡ１（全て大文字）は、ＰＭＡ１タンパク質を表す。
【００２４】
参照配列に対する少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムなどの当該技術分野において既知のアルゴリズムを使用して、２つの配列間で行われた比較を指す。
【００２５】
「バリアント」は、参照遺伝子またはタンパク質から逸脱する遺伝子またはタンパク質配列である。「アイソフォーム」、「アイソタイプ」、及び「アナログ」という用語も、遺伝子またはタンパク質の「バリアント」型を指す。バリアントは「保存的」変化を有してよく、置換アミノ酸は類似した構造的または化学的特性、例えば、ロイシンとイソロイシンとの置換えを有する。バリアントは「非保存的」変化、例えば、グリシンとトリプトファンとの置換えを有してよい。類似の軽微な変化としては、アミノ酸欠失もしくは挿入、またはその両方を挙げてもよい。どのアミノ酸残基が置換、挿入、または欠失されてよいかを決定する時の指針は、当該技術分野において周知のコンピュータプログラムを使用して見出されてよい。
【００２６】
「外因性核酸」は、核酸、ＤＮＡ、またはＲＮＡを指し、これは人為的に細胞中に導入されている。そのような外因性核酸は、それが導入された細胞中で天然に見出される配列またはその断片のコピーであってよい、またはコピーでなくともよい。
【００２７】
「内因性核酸」は、微生物中に天然に存在する核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、またはｃＤＮＡ分子を指す。内因性配列は、微生物には「天然」の、すなわち、「常在」のものである。
【００２８】
「変異」という用語は、遺伝子に対する遺伝子改変を指し、オープンリーディングフレーム、上流の調節領域、及び下流の調節領域に対する改変を含む。
【００２９】
核酸配列のための異種宿主細胞は、その核酸配列を天然には含有しない細胞を指す。
【００３０】
「キメラ核酸」は、第２ヌクレオチド配列に連結される第１ヌクレオチド配列を含み、第２ヌクレオチド配列は、第１ヌクレオチド配列が天然に存在している細胞中において第１ヌクレオチド配列と関連する配列とは異なる。
【００３１】
構成的プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼホロ酵素が利用可能な場合、機能的に連結される遺伝子を発現する。構成的プロモーターの制御下における遺伝子の発現は、誘導物質の存在に依存しない。
【００３２】
誘導性プロモーターは、誘導物質の存在下でのみ、機能的に連結される遺伝子を発現する。誘導物質は、誘導性プロモーターに機能的に連結される遺伝子の発現を誘導する転写装置を活性化する。
【００３３】
特定の態様では、本明細書に開示されるのは、オリゴ糖を目的の産物に変換することができる遺伝子操作微生物である。例えば、本明細書に記載される微生物は、ラクトースを、タガトースもしくはヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、例えば、２’−フコシルラクトース（２−ＦＬ）及びラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）などに変換し得る、またはスクロースをプシコースに変換し得る。また、本明細書に開示されるのは、適切なオリゴ糖の存在下で本明細書に記載される微生物を培養することによって目的の産物を産生する方法及び目的の産物を回収する方法である。
【００３４】
本開示の特定の実施形態は、
ｉ）親微生物中のＰＭＡ１活性と比較して、微生物中のＰＭＡ１の活性を増加させる遺伝子改変、
ｉｉ）親微生物中のＳＮＦ３活性と比較して、微生物中のＳＮＦ３の活性を低減させる遺伝子改変、
ｉｉｉ）親微生物中のＲＧＴ２活性と比較して、微生物中のＲＧＴ２の活性を低減させる遺伝子改変、及び
ｉｖ）親微生物中のＧＰＲ１活性と比較して、微生物中のＧＰＲ１の活性を低減させる遺伝子改変
から選択される１つ以上の遺伝子改変を含む微生物を提供する。
【００３５】
特定の実施形態では、ｉ）ＰＭＡ１の活性を増加させる遺伝子改変は、原形質膜ＡＴＰａｓｅ遺伝子（ｐｍａ１）に対する遺伝子改変である、ｉｉ）ＳＮＦ３の活性を低減させる遺伝子改変は、スクロース非発酵遺伝子（ｓｎｆ３）に対する遺伝子改変である、ｉｉｉ）ＲＧＴ２の活性を低減させる遺伝子改変は、グルコース輸送遺伝子（ｒｇｔ２）に対する遺伝子改変である、かつｉｖ）ＧＰＲ１の活性を低減させる遺伝子改変は、Ｇタンパク質共役受容体１遺伝子（ｇｐｒ１）に対する遺伝子改変である。
【００３６】
ＰＭＡ１の一例が、配列番号：１の配列によって提供され、これはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＰＭＡ１である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の微生物からの、特に酵母からのＰＭＡ１のホモログが、本開示の微生物及び方法に使用され得る。本開示に有用なＰＭＡ１のホモログの非限定的な例は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー：Ａ０Ａ１Ｕ８Ｉ９Ｇ６、Ａ０Ａ１Ｕ８Ｈ４Ｃ１、Ａ０Ａ０９３Ｖ０７６、Ａ０Ａ１Ｕ８ＦＣＹ１、Ｑ０８４３５、Ａ０Ａ１Ｕ７Ｙ４８２、Ａ０Ａ１Ｕ８ＧＬＵ７、Ｐ２２１８０、Ａ０Ａ１Ｕ８Ｇ６Ｃ０、Ａ０Ａ１Ｕ８ＩＡＶ５、Ａ０Ａ１Ｕ８ＦＱ８９、Ｐ０９６２７、Ａ０Ａ１９９ＶＮＨ３、Ｐ０５０３０、Ｐ２８８７７、Ａ０Ａ１Ｕ８Ｉ３Ｕ０、Ｑ０ＥＸＬ８、Ａ０Ａ１Ｕ８Ｉ３Ｖ７、Ｐ４９３８０、Ｑ０７４２１、Ａ０Ａ１Ｄ８ＰＪ０１、Ｐ５４２１１、Ｐ３７３６７、Ｐ０７０３８、Ｑ０Ｑ５Ｆ２、Ｇ８ＢＧＳ３、Ａ０Ａ１６７Ｆ９５７、Ｍ５ＥＮＥ２、Ａ０Ａ１Ｂ８ＧＱＴ５、Ｏ７４２４２、Ｑ９ＧＶ９７、Ｑ６ＶＡＵ４、Ａ０Ａ１７７ＡＫＮ９、Ａ０Ａ１Ｊ６ＫＢ２９、Ａ０Ａ２Ｈ９ＺＹＪ６、Ａ０Ａ２５１ＵＩＭ１、Ａ０Ａ２５１ＵＳＭ２、Ｄ２ＤＶＷ３、Ｍ５ＢＸ７３、Ｑ６ＦＸＵ５、Ａ３ＬＰ３６、Ｇ３ＡＲＩ４、９ＮＳＰ９、Ａ０Ａ１６７Ｃ７１２、Ｇ２ＷＥ８５、Ｆ２ＱＮＭ０、Ａ６ＺＵＹ５、Ｃ７ＧＫ６５、Ａ０Ａ１４２ＧＲＪ４、Ｗ０Ｔ７Ｋ４、Ｂ３ＬＤＴ４、Ａ０Ａ０Ｈ５ＢＹ１６、Ａ０Ａ１Ｂ２Ｊ５Ｔ９、Ｅ７ＤＢ８３、Ｑ９ＵＲ２０、Ｆ４ＮＡ０３、Ｑ９６ＴＨ７、Ｆ４ＮＡ０２、Ｉ２Ｇ７Ｐ２、Ｃ４ＰＧＬ３、Ｆ４ＮＡ００、Ｆ４Ｎ９Ｚ６、Ｑ７Ｚ８Ｂ７、Ｆ４Ｎ９Ｚ９、Ａ０Ａ１Ｌ４ＡＡＰ４、Ｏ９４１９５、Ａ０Ａ１Ｄ１ＹＫＴ６、Ａ０Ａ０Ｕ１ＹＬＲ０、Ａ０Ａ０Ｆ８ＤＢＲ８、Ａ０Ａ１Ｃ７Ｎ６Ｎ１、Ａ０Ａ２Ｎ６Ｐ２Ｌ５、Ａ０Ａ２Ｃ５ＷＹ０３、Ｏ１４４３７、Ｔ１ＶＹＷ７、Ｔ１ＶＹ７１、Ａ１ＫＡＢ０、Ｃ０ＱＥ１２、Ｋ０ＮＡＧ７、Ａ０Ａ０Ｈ３Ｊ１Ｉ１、Ａ０Ａ１Ｑ９Ｄ８１７、Ａ０Ａ０６８ＭＺＰ７、Ｄ１ＪＥＤ６、Ａ０Ａ２Ｋ８ＷＲＥ９、Ａ０Ａ１Ａ８ＹＦＤ７、Ａ０Ａ１Ａ８ＹＧ８９、Ｉ２Ｇ７Ｐ８、Ｄ９ＰＮ３６、Ｄ１ＪＩ１９、Ｂ６ＩＵＪ９、Ｂ１ＸＰ５４、Ｈ８Ｗ７Ｇ４、Ｈ６ＳＬ１８、Ｇ８ＬＣＷ３、Ｌ８ＡＪＰ６、Ｑ５ＺＦＲ６、Ａ０Ａ１Ｄ７ＱＳＲ３、Ａ０Ａ１Ｑ２ＴＹＧ８、Ｆ４Ｎ０５４、Ａ０Ａ１Ｑ９ＣＴＢ２、Ａ０Ａ１Ｑ９ＥＪＶ５、Ａ０Ａ１Ｄ１ＸＥＥ３、Ａ０Ａ０Ｆ７ＧＡＥ０、Ｄ２ＤＶＷ４、Ａ０Ａ０Ａ９ＹＸ２３、Ａ０Ａ１Ｑ９ＥＬＷ６で表される。本明細書に列挙されるＵｎｉｐｒｏｔエントリーは、その全体が参照によって組み込まれる。
【００３７】
ＰＭＡ１の追加のホモログが当該技術分野において既知であり、そのような実施形態は本開示の範囲内である。例えば、ＰＭＡ１のホモログは、配列番号：１と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。
【００３８】
ＳＮＦ３の一例が、配列番号：２の配列によって提供され、これはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＳＮＦ３である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の微生物からの、特に酵母からのＳＮＦ３のホモログが、本開示の微生物及び方法に使用され得る。本開示に有用なＳＮＦ３のホモログの非限定的な例は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー：Ｗ０ＴＦＨ８、Ｑ６ＦＮＵ３、Ａ０Ａ０Ｗ０ＣＥＸ１、Ｇ２ＷＢＸ２、Ａ６ＺＸＤ８、Ｊ６ＥＧＸ９、Ｐ１０８７０、Ｃ７ＧＶ５６、Ｂ３ＬＨ７６、Ａ０Ａ０Ｌ８ＲＬ８７、Ａ０Ａ０Ｋ３Ｃ９Ｌ０、Ｍ７ＷＳＸ８、Ａ０Ａ１Ｕ８ＨＥＱ５、Ｇ５ＥＢＮ９、Ａ８Ｘ３Ｇ５、Ａ３ＬＺＳ０、Ｇ３ＡＱ６７、Ａ０Ａ１Ｅ４ＲＧＴ４、Ａ０Ａ１Ｂ２Ｊ９Ｂ３、Ｆ２ＱＰ２７、Ｅ３ＭＤＬ０、Ａ０Ａ２Ｃ５Ｘ０４５、Ｇ０ＮＷＥ１、Ａ０Ａ０Ｈ５Ｓ３Ｚ１、Ａ０Ａ２Ｇ５ＶＣＧ９、Ａ０Ａ１６７ＥＲ１９、Ａ０Ａ１６７ＤＤＵ９、Ａ０Ａ１６７ＣＹ６０、Ａ０Ａ１６７ＣＥＷ８、Ａ０Ａ１６７ＥＲ４３、Ａ０Ａ１６７Ｆ８Ｘ４、Ａ０Ａ１Ｂ８ＧＣ６８、Ａ０Ａ１７７Ａ９Ｂ０、Ｅ３ＥＩＳ７、Ｅ３Ｅ８Ｂ６、Ａ０Ａ０Ａ９Ｚ０Ｑ２で表される。本明細書に列挙されるＵｎｉｐｒｏｔエントリーは、その全体が参照によって組み込まれる。
【００３９】
ＳＮＦ３の追加のホモログが当該技術分野において既知であり、そのような実施形態は本開示の範囲内である。例えば、ＳＮＦ３のホモログは、配列番号：２と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。
【００４０】
ＲＧＴ２の一例が、配列番号：３の配列によって提供され、これはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＲＧＴ２である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の生物からの、特に酵母からのＲＧＴ２のホモログが、本開示の微生物及び方法に使用され得る。ＲＧＴ２のホモログの非限定的な例は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー：Ａ０Ａ０Ｕ１ＭＡＪ７、Ｎ４ＴＧ４８、Ａ０Ａ１Ｑ８ＲＰＹ１、Ｎ４Ｕ７Ｉ０、Ａ０Ａ１Ｌ７ＳＳＱ２、Ａ０Ａ１Ｌ７ＶＢ１５、Ａ０Ａ０Ｃ４Ｅ４９７、Ａ０Ａ１Ｌ７ＵＡＮ６、Ａ０Ａ０Ｊ０ＣＵ１７、Ａ０Ａ１Ｌ７ＶＭＡ９、Ｓ０ＥＤ２２、Ａ０Ａ１Ｌ７ＳＤ４８、Ｎ１Ｒ８Ｌ８、Ａ０Ａ１Ｌ７Ｖ０Ｎ４、Ｓ３ＢＹＤ３、Ｅ４ＵＵＵ６、Ｎ４ＵＰＴ５、Ｎ４Ｕ０３０、Ａ０Ａ０Ｉ９ＹＫ８３、Ｓ０ＤＪＳ４、Ａ０Ａ０Ｕ１ＬＷＨ９、Ａ０Ａ０Ｋ６ＦＳＪ２、Ｎ１Ｓ６Ｋ７、Ａ０Ａ０Ｊ６Ｆ３Ｅ５、Ａ０Ａ１Ｅ４ＲＳ５１、Ｎ４ＵＴＮ２、Ａ０Ａ０Ｇ２Ｅ６Ｄ５、Ａ０Ａ１Ｊ９Ｒ９１４、Ａ０Ａ０Ｆ４ＧＱＸ７、Ａ０Ａ１Ｓ９ＲＬＢ９、Ａ３Ｍ０Ｎ３、Ｊ９ＰＦ５４、Ａ０Ａ０７４ＷＣ５２、Ａ０Ａ０Ｋ６ＧＩ６６、Ｎ１ＱＨＳ４、Ｇ２ＷＸＫ０、Ｂ２ＶＶＬ４、Ｂ２ＷＤＫ７、Ａ０Ａ１Ｊ９Ｓ６Ａ１、Ｇ４Ｎ０Ｅ９、Ｌ７ＪＥＵ７、Ｌ７ＩＮＡ５、Ａ０Ａ０Ｌ１ＨＥ９９、Ａ０Ａ０Ｊ８ＱＬ３６、Ａ０Ａ０Ｈ５ＣＫＷ２、Ａ０Ａ０Ｊ６Ｙ４Ｅ２、Ｗ０ＶＭＧ０、Ｇ２ＷＱＤ８、Ａ０Ａ１Ｃ１ＷＶ６１、Ａ０Ａ１Ｓ９ＲＬ３３、Ｃ９ＳＢＡ９、Ａ０Ａ０Ｇ２ＨＹ７５、Ｊ３Ｐ２４４、Ｎ１ＱＫ０４、Ａ０Ａ０Ｎ０ＮＱＲ９、Ａ０Ａ１Ｓ７ＵＪ１９、Ｇ２ＸＦＥ７、Ｃ９ＳＷＺ３、Ｒ８ＢＵＹ９、Ｍ７ＳＹＨ１、Ａ０Ａ１Ｅ１ＭＩＶ２、Ａ０Ａ１Ｅ１ＬＬＫ３、Ａ０Ａ１Ｅ１ＬＪＥ１、Ｌ７Ｊ４Ｙ３、Ｌ７Ｉ３０４、Ａ０Ａ１Ｌ７ＸＵ２９、Ａ０Ａ１３６ＪＣＹ３、Ａ０Ａ０Ｊ８ＲＧ８１、Ａ０Ａ１７７ＤＷ３３、Ａ０Ａ１Ｌ７Ｘ７９２、Ｗ９Ｃ８Ｕ１、Ｂ２ＶＸＬ１、Ａ０Ａ０Ｌ１ＨＭＧ８、Ａ０Ａ１７８ＤＱＷ４、Ａ０Ａ１６７Ｖ６Ｆ７、Ａ０Ａ１６６ＷＲ６０、Ａ０Ａ１６２ＫＬＴ６、Ａ０Ａ１Ｌ７Ｘ３Ｄ１、Ｇ３ＪＱＸ８，Ｑ７Ｓ９Ｕ８、Ｅ９Ｆ７Ａ６、Ａ０Ａ１Ｓ７ＨＰＸ９、Ａ０Ａ０Ｇ２Ｇ５６４、Ａ０Ａ０Ｗ０Ｄ０Ｂ３、Ａ６ＺＸＩ９、Ｑ１２３００、Ｃ７ＧＫＺ０、Ｇ２ＷＣ２３、Ａ０Ａ０Ｈ５ＣＡＴ９、Ｊ４Ｕ３Ｙ８、Ａ０Ａ０Ｌ８ＲＬ５４で表される。本明細書に列挙されるＵｎｉｐｒｏｔエントリーは、その全体が参照によって組み込まれる。
【００４１】
ＲＧＴ２の追加のホモログが当該技術分野において既知であり、そのような実施形態は本開示の範囲内である。例えば、ＲＧＴ２のホモログは、配列番号：３と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。
【００４２】
ＧＰＲ１の一例が、配列番号：４の配列によって提供され、これはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅからのＧＰＲ１である。Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ以外の微生物からの、特に酵母からのＧＰＲ１のホモログが、本開示の微生物及び方法に使用され得る。ＧＰＲ１のホモログの非限定的な例は、Ｕｎｉｐｒｏｔエントリー：Ａ０Ａ１Ｓ３ＡＬＦ０、Ａ０Ａ０Ｑ３ＭＤ２５、Ａ０Ａ１４６ＲＢＱ８、Ａ０Ａ０Ｐ５ＳＨＡ９、Ａ２ＡＲＩ４、Ｑ９ＢＸＢ１、Ｑ９Ｚ２Ｈ４、Ｆ１ＭＬＸ５、Ｕ３ＤＱＤ９、Ｉ２ＣＶＴ９、Ｉ０ＦＩ４４、Ｋ７Ｄ６６３、Ｋ７ＡＳＺ６、Ａ０Ａ１Ｕ７Ｑ７６９、Ｕ３ＥＳＩ５、Ｔ１Ｅ５Ｂ８、Ａ０Ａ０Ｆ７ＺＡ０１、Ｊ３ＲＺＷ５、Ａ０Ａ０９４ＺＨＣ９、Ｗ６ＵＬ９０、Ａ０Ａ０Ｐ６Ｊ７Ｑ８、Ｌ５ＫＹＣ３、Ｂ７Ｐ６Ｎ０、Ｂ０ＢＬＷ３、Ａ２ＡＨＱ２、Ａ０Ａ１５１Ｎ８Ｗ７、Ａ０Ａ１４６ＲＣＷ３、Ａ０Ａ０Ｘ３ＮＹＢ９、Ａ０Ａ０Ｐ５Ｙ３Ｇ９、Ｗ５ＵＡＢ２、Ａ０Ａ０Ｐ５ＩＣ４４、Ａ０Ａ０９０ＸＦ５１、Ａ０Ａ１４６ＮＲＶ７、Ａ０Ａ０Ｘ３Ｑ０Ｒ０、Ａ０Ａ０Ｐ６ＩＲＤ７、Ｌ９ＪＦＢ７、Ａ０Ａ１４６ＹＧＧ２、Ａ０Ａ１４６ＷＧ８８、Ｑ１２３６１、Ｂ３ＬＧＴ６、Ａ０Ａ０Ｎ８Ａ６Ｆ９、Ｐ０ＤＭ４４、Ｗ６ＪＭ２９、Ａ０Ａ１Ａ８ＬＣ８０、Ａ０Ａ０Ｎ８Ａ４Ｄ４、Ｑ７Ｚ７Ｍ１、Ａ０Ａ１Ｓ３Ｇ１Ｑ８、Ａ０Ａ１Ｕ７ＱＧＨ１、Ａ６ＺＸＴ８、Ａ０Ａ１Ｕ８Ｃ０Ｆ６、Ｄ３ＺＪＵ９、Ａ０Ａ１Ｓ３ＫＧＬ３、Ｇ５Ｂ３８５、Ｌ９ＫＮＹ９、Ａ０Ａ１Ｓ３ＡＱＭ３、Ａ０Ａ０８７ＵＸＸ９、Ａ０Ａ０Ｌ８ＶＷ２４、Ａ０Ａ０Ｐ６ＡＲ０８、Ｑ９ＨＢＸ８、Ｑ３ＵＶＤ５、Ａ０Ａ１Ｕ７ＵＥＦ２、Ａ０Ａ１４６ＸＭＦ９、Ａ０Ａ１４６ＱＴＶ１、Ａ０Ａ１Ｓ３ＩＤ４５、Ｌ５ＫＴＵ９、Ａ０Ａ１Ａ８ＥＬＴ４、Ａ０Ａ０Ｎ７ＺＭＸ８、Ａ０Ａ０Ｐ５Ｑ３Ｔ８、Ａ０Ａ１Ａ８Ｎ９Ｚ４、Ａ０Ａ１Ａ８Ｄ８０７、Ａ０Ａ１Ａ８ＣＶＧ１、Ａ０Ａ１Ａ８ＵＭＢ１、Ａ０Ａ１Ａ８ＪＱ０７、Ａ０Ａ１Ａ８Ｐ７Ｎ２、Ａ０Ａ１Ａ８ＨＬ３８、Ｅ７ＦＥ１３、Ａ０Ａ１Ｓ３ＦＺＬ３、Ａ０Ａ０Ｐ７ＷＬＱ９、Ｈ２ＫＱＮ３、Ａ０Ａ１Ｓ３ＷＪＡ９、Ａ０Ａ１４６ＰＫＡ１、Ｌ５ＬＬＱ３、Ｆ１Ｑ９８９、Ａ０Ａ０Ｆ８ＡＫＹ３、Ａ０Ａ０Ｐ７ＶＲ９５、Ａ０Ａ１Ｕ８Ｃ８Ｉ３、Ａ０Ａ０３４ＶＩＭ３、Ａ０Ａ０Ｎ８ＢＦＤ４、Ａ０Ａ１４６ＸＭＪ１、Ａ０Ａ０Ｎ８ＢＤＭ１、Ａ０Ａ１Ａ８ＫＴＪ１、Ａ０Ａ１Ａ７Ｘ７０６、Ａ０Ａ０Ｒ４ＩＴＥ３、Ａ０Ａ１Ｕ７Ｓ４Ｈ０、Ａ０Ａ１Ｓ３ＡＱ９４、Ａ０Ａ１Ｕ７ＵＣＰ２、Ｌ８ＨＭＡ８、Ａ０Ａ０Ｑ３Ｐ３Ｖ６、Ａ０Ａ１Ａ８ＣＤＧ３、Ｄ６Ｗ７Ｎ２、Ａ０Ａ１Ｅ１ＸＭＹ８、Ａ０Ａ１Ａ８ＡＣＬ５、Ａ０Ａ１Ｓ３ＷＮＶ２、Ｔ０ＭＨＹ５、Ａ０Ａ１Ｓ３Ｇ１１３、Ｖ８Ｐ２Ｘ５、Ａ０Ａ１Ｓ３ＫＶ５１、Ａ０Ａ１Ｓ３Ｇ０１８、Ａ０Ａ１Ｓ３ＰＵＰ５、Ａ０Ａ１Ｕ８Ｃ７Ｘ５、Ｓ９ＷＰ１８、Ａ０Ａ１Ｓ３ＡＱＬ８、Ａ０Ａ０Ｎ８ＥＮＦ１、Ｋ７ＣＩＧ０、Ａ０Ａ１４７ＢＦＹ７、Ａ０Ａ１Ｓ３ＦＺＫ９、Ａ０Ａ１Ｕ７ＴＵＨ０、Ａ０Ａ１Ｕ８ＢＸ９３、Ａ０Ａ０９１ＤＫＮ５、Ａ０Ａ１４６Ｗ９１９、Ａ０Ａ１４７Ｂ２Ｋ７、Ａ０Ａ１４６ＸＮＬ４、Ａ０Ａ０９１ＤＴＸ９、Ａ０Ａ０Ｑ３ＵＱＢ０、Ａ０Ａ１４６ＷＨ３７、Ｅ９ＱＤＤ１、Ｑ５８Ｙ７５、Ａ０Ａ０９６ＭＫＩ０、Ａ０Ａ１Ｓ３Ｓ９０１、Ｑ１４ＢＨ６、Ａ０Ａ１Ｓ３ＡＱ４２、Ａ０Ａ０Ｐ５ＳＶ４９、Ａ０Ａ０Ｐ５Ｐ２９９、Ａ０Ａ０Ｐ５ＷＣＲ４、Ｋ７ＣＨＴ８、Ａ０Ａ１Ｕ７Ｕ０Ｑ５、Ａ０Ａ１Ｓ３ＥＸＤ４、Ａ０Ａ１４６Ｙ６Ｇ０、Ａ０Ａ０６１ＨＸＱ０、Ａ０Ａ１Ｓ３ＡＱ８４、Ａ０Ａ１Ｓ２ＺＮＱ３、Ａ０Ａ１Ｕ７ＵＥＥ６、Ａ０Ａ１Ｓ３Ｇ０１３、Ａ０Ａ１Ｕ７ＱＪＧ４、Ｓ７Ｎ７Ｍ１、Ａ０Ａ１Ｓ３Ｇ１０８、Ａ０Ａ１Ｕ８Ｃ８Ｈ８、及びＡ０Ａ１Ｕ８Ｃ７Ｘ０で表される。
【００４３】
ＧＰＲ１の追加のホモログが当該技術分野において既知であり、そのような実施形態は本開示の範囲内である。例えば、ＧＰＲ１のホモログは、配列番号：４と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％の配列同一性を有する。
【００４４】
特定の実施形態では、本開示の微生物は、親微生物中のＰＭＡ１活性と比較して、微生物中のＰＭＡ１の活性を増加させる遺伝子改変を含む。
【００４５】
ＰＭＡ１タンパク質はＨ＋−ＡＴＰａｓｅであり、細胞外へプロトンを放出し、糖、アミノ酸、及び他の栄養素の取込みに使用される膜電位を形成する。ＰＭＡ１は、１０の膜貫通ドメイン及び３つの細胞質ドメインを有する。ＰＭＡ１のＮ末端及びＣ末端の両方とも、細胞質内に位置している。酵母ＰＭＡ１は細長い細胞質尾部を有し、これはグルコース飢餓中にＨ＋−ＡＴＰａｓｅ活性を阻害する。構成的活性化ＰＭＡ１は、グルコース飢餓中のＨ＋−ＡＴＰａｓｅ活性の阻害を欠いている。したがって、構成的活性化ＰＭＡ１は、グルコースの存在下に加えてグルコースの不存在下でも活性である。
【００４６】
本開示の特定の実施形態では、微生物は、親微生物中のＰＭＡ１活性と比較して、微生物中のＰＭＡ１の活性を増加させるｐｍａ１の遺伝子改変を含む。親微生物中のＰＭＡ１活性と比較して、微生物中のＰＭＡ１の活性を増加させるｐｍａ１に対する遺伝子改変の非限定的な例としては、ａ）内因性プロモーターと、内因性ｐｍａ１に機能的に連結される外因性プロモーターとの置換え、ｂ）染色体外遺伝物質を介するｐｍａ１の発現、ｃ）微生物のゲノム中への１つ以上のｐｍａ１のコピーの組込み、ｄ）構成的活性化ＰＭＡ１もしくは非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１をコードする改変ｐｍａ１を生成するための、内因性ｐｍａ１に対する改変、ｅ）微生物中への、構成的活性化ＰＭＡ１もしくは対応する野生型ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１をコードするｐｍａ１を含む染色体外遺伝物質の導入、またはｆ）微生物のゲノム中への、構成的活性化ＰＭＡ１もしくは対応する野生型ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１をコードする１つ以上のｐｍａ１のコピーの組込みのうち１つ以上が挙げられる。本段落に記載される変異ａ）〜ｆ）のいずれの組合せも、想定されている。
【００４７】
いくつかの実施形態では、内因性プロモーターは、内因性プロモーターよりも高いレベルでｐｍａ１の発現を誘導する外因性プロモーターで置き換えられる。特定の実施形態では、外因性プロモーターは、内因性プロモーターが外因性プロモーターと置き換えられている微生物に特異的である。例えば、酵母特異的外因性プロモーターは、改変されている微生物が酵母である場合に使用され得る。外因性プロモーターは、構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターであり得る。
【００４８】
構成的な酵母特異的プロモーターの非限定的な例としては、ｐＣｙｃ、ｐＡｄｈ、ｐＳｔｅ５、酵母ＡＤＨ１、ｃｙｃ１００最小、ｃｙｃ７０最小、ｃｙｃ４３最小、ｃｙｃ２８最小、ｃｙｃ１６最小、ｐＰＧＫ１、ｐＣＹＣ、またはｐＧＰＤが挙げられる。酵母からの構成的プロモーターに関する追加の例及び酵母以外の微生物からの構成的プロモーターに関する例は、当業者には既知であり、そのような実施形態は本開示の範囲内である。
【００４９】
誘導性酵母特異的プロモーターの非限定的な例としては、Ｇａｌ１、ＭＦＡ１、ＭＦＡ２、Ｓｔｅ３、ＵＲＡ３、ＦＩＧ１、ＥＮＯ２、ＤＬＤ、ＪＥＮ１、ｍＣＹＣ、及びＳｔｅ２が挙げられる。酵母からの誘導性プロモーターに関する追加の例及び酵母以外の微生物からの誘導性プロモーターに関する例は、当業者には既知であり、そのような実施形態は本開示の範囲内である。
【００５０】
いくつかの実施形態では、ＰＭＡ１の活性を増加させる遺伝子改変は、ｐｍａ１を含む染色体外遺伝物質を介して微生物中でＰＭＡ１を発現させることを含む。ｐｍａ１を含み、ＰＭＡ１をコードする染色体外遺伝物質は通常、ｐｍａ１を介するＰＭＡ１の発現を制御するプロモーターを含有する。加えて、染色体外遺伝物質は、選択マーカー遺伝子及び複製起点も含有し得る。
【００５１】
使用される微生物の種類に応じて、染色体外遺伝物質は、線状もしくは環状プラスミド、酵母人工染色体、または２μサークルであり得る。本開示での使用に好適な染色体外遺伝物質の追加の例は、当該技術分野において周知であり、そのような実施形態は本開示の範囲内である。
【００５２】
特定の実施形態では、１つ以上のｐｍａ１のコピーが、微生物のゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、１つ以上のｐｍａ１のコピーは、微生物中の内因性ｐｍａ１と同一の配列を有し得る。他の実施形態では、１つ以上のｐｍａ１のコピーは、微生物中の内因性ｐｍａ１とは異なる配列を有し得る。
【００５３】
追加の実施形態では、微生物中の内因性ｐｍａ１は不活性化されていて、構成的活性化ＰＭＡ１をコードするｐｍａ１が、染色体外遺伝物質として、または微生物のゲノム中に組み込まれるいずれかの方法で微生物中に導入される。
【００５４】
特定の実施形態では、微生物は、構成的活性化ＰＭＡ１をコードする改変ｐｍａ１を生成するための内因性ｐｍａ１に対する改変を含む。いくつかの実施形態では、内因性ｐｍａ１に対する改変によって、Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４），Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  １３：４３−５２によって記載された変異を含む、構成的活性化ＰＭＡ１をコードする改変ｐｍａ１が生成される。Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．の参考文献、特に図１及び図２は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５５】
したがって、特定の実施形態では、内因性ｐｍａ１に対する改変によって構成的活性化ＰＭＡ１をコードする改変ｐｍａ１が生成され、このＰＭＡ１は、対応する野生型ＰＭＡ１と比較した場合、Ｃ末端から少なくとも２〜約３０、好ましくは、少なくとも３〜約３０アミノ酸を欠いているＰＭＡ１である。特定の実施形態では、配列番号：１のＰＭＡ１をコードする内因性ｐｍａ１を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、配列番号：１のＣ末端から少なくとも２〜約３０、好ましくは、少なくとも３〜約３０アミノ酸を欠いている切断型ＰＭＡ１をコードする改変ｐｍａ１を生成するように遺伝子改変される。
【００５６】
いくつかの実施形態では、配列番号：１のＰＭＡ１をコードする内因性ｐｍａ１を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、増加した活性を有する改変ＰＭＡ１を産生するように遺伝子改変され、改変ＰＭＡ１は、配列番号：１の９１１位にアスパラギン酸に変異したセリン及び／または配列番号：１の９１２位にアスパラギン酸に変異したトレオニンを有する。特定の実施形態では、配列番号：１のＰＭＡ１をコードする内因性ｐｍａ１を有するＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅは、ワールドワイドウェブサイト：ｄｘ．ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１１０１／０７６３６４で利用可能な、Ｃｈｏｍｖｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、ＢｉｏＲｘｉｖプレプリントに記載されているように遺伝子改変される。Ｃｈｏｍｖｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．の参考文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５７】
いくつかの実施形態では、ＰＭＡ１の活性を増加させる改変は、ｔｏｒｃ１、ｆｐｒ１、及び／またはｓｉｔ４のうち１つ以上に対して１つ以上の改変を含む。ＰＭＡ１の活性を増加させる、ｔｏｒｃ１、ｆｐｒ１、及び／またはｓｉｔ４の変異は、Ｍａｈｍｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，ｄｏｉ：１０．１００２／１８７３−３４６８．１２６７３に記載されている変異を含む。Ｍａｈｍｏｕｄ  ｅｔ  ａｌ．の参考文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００５８】
いくつかの実施形態では、構成的活性化ＰＭＡ１をコードする１つ以上のｐｍａ１のコピーを含む染色体外遺伝物質が、微生物中に導入される。構成的活性化ＰＭＡ１をコードするｐｍａ１を含む染色体外遺伝物質は、構成的または誘導性プロモーターの制御下にあり得る。先に記載される構成的または誘導性プロモーターが、そのような実施形態で使用され得る。
【００５９】
さらなる実施形態では、構成的活性化ＰＭＡ１をコードする１つ以上のｐｍａ１のコピーが、微生物のゲノム中に組み込まれる。構成的活性化ＰＭＡ１をコードし、微生物のゲノム中に組み込まれるｐｍａ１は、構成的または誘導性プロモーターの制御下にあり得る。先に記載される構成的または誘導性プロモーターが、そのような実施形態で使用され得る。
【００６０】
特定の実施形態では、本開示の微生物は、微生物中のＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の活性を、親微生物中の対応するタンパク質の活性と比較して低減または排除する遺伝子改変を含む。
【００６１】
ＳＮＦ３タンパク質は、グルコース輸送を調節する原形質膜低グルコースセンサーである。これは、１２の予測膜貫通セグメント及びヘキソース輸送体の誘導に必要な長いＣ末端尾部を含有する高親和性センサーである。ＳＮＦ３は、フルクトース及びマンノースも感知する。
【００６２】
ＲＧＴ２は、グルコース輸送を調節する原形質膜高グルコースセンサーである。これは、１２の予測膜貫通セグメント及びヘキソース輸送体誘導に必要な長いＣ末端尾部を含有する低親和性センサーである。Ｙｃｋ１ｐ／Ｙｃｋ２ｐによる尾部のリン酸化によって、ＨＸＴコリプレッサーのＭｔｈ１ｐ及びＳｔｄ１ｐへの結合が促進される。
【００６３】
ＧＰＲ１は、Ｇｐａ２ｐ及びＰｌｃ１ｐタンパク質と相互作用し、ｃＡＭＰ及びＰＫＡ経路を介する炭素及び窒素栄養シグナル伝達を統合するＧタンパク質共役受容体である。
【００６４】
特定の実施形態では、微生物中のＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の活性を、親微生物中の対応するタンパク質の活性と比較して低減または排除する遺伝子改変は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のヌクレオチド結合アルファサブユニット（ＧＰＡ２）の活性を不活性化または排除する、ＧＰＡ２に対する１つ以上の遺伝子改変を含む。ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の活性を減少または排除し得るＧＰＡ２の変異の例は、Ｎａｚａｒｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００８），Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔ．；３２（５）：５０２−４で提供されている。Ｎａｚａｒｋｏ  ｅｔ  ａｌ．の参考文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６５】
いくつかの実施形態では、微生物中のＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の活性を、親微生物中の対応するタンパク質の活性と比較して低減または排除する遺伝子改変は、ヘテロ三量体Ｇタンパク質のヌクレオチド結合アルファサブユニット（ＧＰＡ２）の活性を不活性化または排除する、ＧＰＡ２に対する１つ以上の遺伝子改変を含み、ＨＴＲ１、ＭＴＨ１、及び／またはＲＧＴ１タンパク質をコードする遺伝子に１つ以上の変異を含む。ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の活性を減少または排除し得るＨＴＲ１、ＭＴＨ１、及び／またはＲＧＴ１タンパク質の変異の例は、Ｓｃｈｕｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．；１８２（２）：５４０−２で提供されている。Ｓｃｈｕｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．の参考文献は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００６６】
微生物中のＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の活性を、親微生物中の対応するタンパク質の活性と比較して低減または排除する追加の変異は、当該技術分野において既知であり、そのような実施形態は本開示の範囲内である。
【００６７】
特定の実施形態では、本開示の微生物は、微生物中のＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の活性を、親微生物中の対応するタンパク質の活性と比較して低減または排除するｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１の遺伝子改変を含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の活性を低減または排除する遺伝子改変は、ａ）ｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１の不活性化であって、不活性化したｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１が、ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１をコードしない、不活性化、ｂ）ｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１の変異であって、変異したｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１が、親微生物中の対応するタンパク質の活性と比較して全く活性のない、または減少した活性を有するＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１についてコードする、変異、ｃ）ｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１のプロモーターの変異であって、変異したプロモーターが、親微生物中の対応するタンパク質の発現と比較してＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の減少した発現を引き起こす、変異、ｄ）ｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１からの内因性プロモーターと、内因性ｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１のコード領域に機能的に連結される外因性プロモーターとの置換えであって、外因性プロモーターが、親微生物中の対応するタンパク質の発現と比較してＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１を全く発現しない、または減少した発現を引き起こす、置換え、のうち１つ以上を含む。本段落に記載される変異ａ）〜ｄ）のいずれの組合せも、想定されている。
【００６９】
ｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１の不活性化は、ａ）コード領域の完全なまたは部分的な欠失、ｂ）コード領域内でのフレームシフト変異の導入、ｃ）ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の活性を妨害する方法による１つ以上のヌクレオチドの挿入、ｄ）コード領域中への終止コドンの導入、あるいは本段落に記載されるａ）〜ｄ）の任意の組合せのうち１つ以上によって達成され得る。いくつかの実施形態では、内因性ｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１は、ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１をコードしない変異したｓｎｆ３、ｒｇｔ２、及び／またはｇｐｒ１で置き換えられ得る。
【００７０】
特定の実施形態では、本開示は、微生物、好ましくは酵母、より好ましくはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、さらにより好ましくはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを提供し、微生物は、以下に列挙される遺伝子改変または遺伝子改変の組合せを含む：
１）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変及びｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
２）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変及びｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
３）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
４）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
５）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
６）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
７）ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変及びｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
８）ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
９）ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１０）ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１１）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１２）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号：１の配列もしくは配列番号：１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１のＣ末端に、少なくとも２〜約３０、特に少なくとも３〜約３０アミノ酸の切断を有する構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１３）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号：１の配列もしくは配列番号：１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１のＣ末端に、少なくとも２〜約３０、特に少なくとも３〜約３０アミノ酸の切断を有する構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１４）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号：１の配列もしくは配列番号：１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１のＣ末端に、少なくとも２〜約３０、特に少なくとも３〜約３０アミノ酸の切断を有する構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１５）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号：１の配列もしくは配列番号：１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１のＣ末端に、少なくとも２〜約３０、特に少なくとも３〜約３０アミノ酸の切断を有する構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１６）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号：１の配列もしくは配列番号：１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１のＣ末端に、２もしくは３アミノ酸の切断を有する構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１７）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号：１の配列もしくは配列番号：１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１のＣ末端に、少なくとも２もしくは３アミノ酸の切断を有する構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１８）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号：１の配列もしくは配列番号：１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１のＣ末端に、少なくとも２もしくは３アミノ酸の切断を有する構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
１９）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号：１の配列もしくは配列番号：１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１のＣ末端に、少なくとも２もしくは３アミノ酸の切断を有する構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
２０）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号：１の配列もしくは配列番号：１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１のＣ末端に、少なくとも２もしくは３アミノ酸の切断を有する構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｓｎｆ３の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
２１）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号：１の配列もしくは配列番号：１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１のＣ末端に、少なくとも２もしくは３アミノ酸の切断を有する構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、ｒｇｔ２の不活性化を引き起こす遺伝子改変、
２２）対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１または配列番号：１の配列もしくは配列番号：１と少なくとも９０％、好ましくは、少なくとも９５％の配列同一性を有するそのホモログを有するＰＭＡ１のＣ末端に、少なくとも２〜約３０、特に少なくとも３〜約３０アミノ酸の切断を有する構成的活性化ＰＭＡ１を産生する遺伝子改変、及びｇｐｒ１の不活性化を引き起こす遺伝子改変。
【００７１】
いくつかの実施形態では、遺伝子操作微生物は、シャペロニンをコードする外因性ヌクレオチド配列をさらに含む。好ましい実施形態では、シャペロニンはＧｒｏＥＳＬである。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される遺伝子改変微生物は、ＰＭＡ１活性の変化を含んでよい。好ましい実施形態では、変化は、対応する非改変ＰＭＡ１と比較して増加した活性を有するＰＭＡ１またはＰＭＡ１の構成的活性及び細胞外グルコースの存在の有無にかかわらず、改善したオリゴ糖利用をもたらす。例えば、ｐｍａ１の終止コドン前の、最後の３アミノ酸は、オリゴ糖消費改善のために排除されてよい（ｐｍａ１−９１６Δ）（例えば、図１を参照のこと）。
【００７３】
さらなる実施形態では、本明細書で開示される遺伝子操作微生物は、細胞外グルコースセンサー活性の変化を含んでよい。好ましい実施形態では、変化は、細胞外グルコースの存在の有無にかかわらず、オリゴ糖利用改善のための細胞外グルコースセンシングの排除または減少をもたらす。例えば、ｓｎｆ３及びｒｇｔ２のコード配列は、オリゴ糖消費改善のために排除されてよい（ｓｎｆ３Δｒｇｔ２Δ）（例えば、図２を参照のこと）。
【００７４】
特定の実施形態では、本明細書で開示される遺伝子操作微生物は、ＰＭＡ１活性の変化及び細胞外グルコースセンサー活性の排除または減少を含んでよい。例えば、ｐｍａ１の終止コドン前の、最後の３アミノ酸は排除されてよく、ｓｎｆ３及びｒｇｔ２のコード配列（ＰＭＡ１−９１６Δ  ｓｎｆ３Δｒｇｔ２Δ）は、オリゴ糖消費改善のために微生物で不活性化されている（例えば、図３を参照のこと）。
【００７５】
特定の実施形態では、本明細書に開示される遺伝子操作微生物は、所望の化合物（例えば、タガトース、２’−フコシルラクトース、プシコース、ヒトミルクオリゴ糖）の産生を改善するための、ＰＭＡ１活性及び／または細胞外グルコースセンサー活性の変化を含んでよい。例えば、ｓｎｆ３Δｒｇｔ２Δを伴う微生物、すなわち、曲線下面積から算出されるようなタガトースの産生力は、５２％改善される（例えば、図４を参照のこと）。
【００７６】
本明細書に記載される遺伝子改変微生物を作製するために使用される微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ、Ｓ．ｂｅｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉ、Ｓ．ｐａｒａｄｏｘｕｓ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ及びＳ．ｂａｙａｎｕｓなど、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、例えば、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｓ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ、Ｓ．ｏｃｔｏｓｐｏｒｕｓ及びＳ．ｃｒｙｏｐｈｉｌｕｓなど、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ種、例えば、Ｔ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉなど、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ種、例えば、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓなど、Ｐｉｃｈｉａ種、例えば、Ｐ．ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓまたはＰ．ａｎｇｕｓｔａなど、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種、例えば、Ｚ．ｂａｉｌｉｉなど、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ種、例えば、Ｂ．ｉｎｔｅｒ  ｍｅｄｉｕｓ、Ｂ．ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｏｍａｌｕｓ、Ｂ．ｃｕｓｔｅｒｓｉａｎｕｓ、Ｂ．ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓ、Ｂ．ｎａｎｕｓなど、Ｄｅｋｋｅｒａ種、例えば、Ｄ．ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ及びＤ．ａｎｏｍａｌａなど、Ｍｅｔｓｃｈｍｋｏｗｉａ種、Ｉｓｓａｔｃｈｅｎｋｉａ種、例えば、Ｉ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓなど、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ種、例えば、Ｋ．ａｐｉｃｕｌａｔａなど、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ種、例えば、Ａ．ｐｕｌｌｕｌａｎｓなどから選択されてよい。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＰＭＡ１、ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及び／またはＧＰＲ１の変化をもたらす遺伝子改変に加えて、本明細書に記載される微生物は、ＧＤＰ−Ｌ−フコース生合成経路の調節、α−１，２フコシルトランスフェラーゼをコードする外因性ポリヌクレオチドの導入、及び／または弱β−ガラクトシダーゼ活性をさらに含む。
【００７８】
ＧＤＰ−Ｌ−フコース合成経路は、ＧＤＰ−ｏ−マンノース生合成の増加、ＮＡＤＰＨの再生、及びグアノシンヌクレオチド生合成経路の操作のうち少なくとも１つによって調節され得る。外因性α−１，２フコシルトランスフェラーゼは、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ、またはＨｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓに由来し得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、微生物は、２段階の酸化還元経路を含む。２段階の酸化還元経路は、アルドースレダクターゼ及びガラクチトール−２−デヒドロゲナーゼを含み得る。
【００８０】
ＰＭＡ１、ＳＮＦ３、ＲＧＴ２、及びＧＰＲ１の変化をもたらす遺伝子改変に加えて、本明細書に記載される微生物は、米国特許第８，４３１，３６０号明細書、同第８，７６５，４１０号明細書、同第９，０１２，１７７号明細書及び米国特許出願公開２０１７０１５２５３８号明細書に記載されている遺伝子改変をさらに含み、その全て全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００８１】
本開示の微生物は、オリゴ糖、例えば、スクロース、ラクトース、マルトース、イソマルトース、イソマルツロース、トレハロース、トレハルロース、セロビオース、セロトリオース、セロテトラオース、セロペンタオース、またはセロヘキサオースを利用することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される微生物は、親微生物と比較して、オリゴ糖を利用するより高い能力を有する。特定の実施形態では、オリゴ糖の利用は、微生物のサイトゾル中で行われる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される微生物は、ラクトースをタガトースに変換することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される微生物は、親微生物と比較して、ラクトースをタガトースに変換するより高い能力を有する。特定の実施形態では、ラクトースのタガトースへの変換は、微生物のサイトゾル中で行われる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される微生物は、ラクトースを２’−ＦＬに変換することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される微生物は、親微生物と比較して、ラクトースを２’−ＦＬに変換するより高い能力を有する（例えば、図９を参照のこと）。特定の実施形態では、ラクトースの２’−ＦＬへの変換は、微生物のサイトゾル中で行われる。
【００８４】
いくつかの実施形態では、微生物は、スクロースをプシコースに変換することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される微生物は、親微生物と比較して、スクロースをプシコースに変換するより高い能力を有する。特定の実施形態では、スクロースのプシコースへの変換は、微生物のサイトゾル中で行われる。
【００８５】
したがって、本開示のさらなる実施形態は、適切な条件下で適切な期間、適切なオリゴ糖を含有する適切な培地中で本明細書に記載される微生物を培養することによって目的の産物を産生する方法及び培養培地から目的の産物を回収する方法を提供する。
【００８６】
特定の実施形態では、本開示は、適切な条件下で適切な期間、ラクトースを含有する培養培地中で本明細書に記載される微生物を培養することによってタガトースを産生する方法及び培養培地からタガトースを回収する方法を提供する。
【００８７】
特定の実施形態では、本開示は、適切な条件下で適切な期間、ラクトースを含有する培養培地中で本明細書に記載される微生物を培養することによって２’−ＦＬを産生する方法及び培養培地から２’−ＦＬを回収する方法を提供する。
【００８８】
特定の実施形態では、本開示は、適切な条件下で適切な期間、スクロースを含有する培養培地中で本明細書に記載される微生物を培養することによってプシコースを産生する方法及び培養培地からプシコースを回収する方法を提供する。
【００８９】
好ましい実施形態では、微生物は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種に属する。より一層好ましい実施形態では、微生物はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである。
【００９０】
特定の実施形態では、培地は、約１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、及び約４０ｇ／Ｌのオリゴ糖、特にラクトースまたはスクロースを含有する。特定の実施形態では、微生物、特に酵母は、３０℃で増殖する。
【００９１】
微生物を培養するのに適切な追加の培養培地、条件、及び培養培地から目的の産物を回収する方法は、当該技術分野において周知であり、そのような実施形態は本開示の範囲内である。
【実施例】
【００９２】
株及び培地
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅを、ＹＰＤ培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、２０ｇ／Ｌのグルコース）上において３０℃で増殖させて維持した。全ての遺伝子が染色体で発現した。オリゴ糖利用株は、セロビオース輸送体（ＣＤＴ−１）及びベータ−グルコシダーゼ（ＧＨ１−１）を含有する。タガトース産生株は、ＣＤＴ−１、ＧＨ１−１及びキシロースレダクターゼ（ＸＲ）、ガラクチトール−２−デヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ））を含有する。ｐｍａ１−９１６Δ変異は、Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌによって記載されるようなｃ末端切断を有した。ｓｎｆ３及びｒｇｔ２のコード領域を、ｓｎｆ３Δｒｇｔ２Δ株中で排除した。実験を、ＹＰＬ培地（１０ｇ／Ｌの酵母抽出物、２０ｇ／Ｌのペプトン、４０ｇ／Ｌのラクトース）中において３０℃で実施した。
【００９３】
発酵及び代謝産物分析
３連の単一コロニーを、２０ｍＬのＹＰＤ中に３０℃で一晩播種した。細胞を遠心分離し、滅菌水で２回洗浄した。最終発酵体積は、ＹＰＬ培地中で５ｍＬであった。６００ｎｍでの初期光学濃度は２０であった。細胞を３０℃及び２５０ｒｐｍでインキュベートした。ラクトース濃度を、Ｒｅｚｅｘ  ＲＦＱ−ＦａｓｔＡｃｉｄ  Ｈ  １０×７．８ｍｍカラムを備えたＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣ（Ｓｈｉｍａｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）上での高速液体クロマトグラフィーによって決定した。カラムを、０．０１Ｎの硫酸を用いて１ｍＬ／分の流量、５５℃で溶出した。タガトース濃度を、ＣａｒｂｏＰａｃ  ＰＡ２０カラムを備えたＩＣＳ−３０００イオンクロマトグラフィーシステム（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して決定した。カラムを、ＫＯＨグラジエントを用いて０．４ｍＬ／分の流量、３０℃で溶出した。
【００９４】
構成的活性化Ｐｍａ１の導入は、細胞外グルコースの不存在下におけるオリゴ糖利用を改善する（例えば、図１）。ｐｍａ１の終止コドン前の、最後の３アミノ酸を、オリゴ糖消費改善のために排除した（ｐｍａ１−９１６Δ）。
【００９５】
ｓｎｆ３及びｒｇｔ２の排除または減少は、細胞外グルコースの存在の有無にかかわらず、オリゴ糖利用を改善した（例えば、図２を参照のこと）。ｓｎｆ３及びｒｇｔ２のコード配列を、オリゴ糖消費改善のために排除した（ｓｎｆ３Δｒｇｔ２Δ）。遺伝子改変を、所望の化合物（例えば、タガトース、２’−フコシルラクトース、プシコース、ヒトミルクオリゴ糖）の産生を改善するために実施した。例えば、ｓｎｆ３Δｒｇｔ２Δを伴う微生物、すなわち、曲線下面積から算出されるようなタガトースの産生力は、５２％改善される（例えば、図４を参照のこと）。ｓｎｆ３Δｒｇｔ２Δを伴う微生物は、ラクトースを２’−ＦＬに変換することができる。ｓｎｆ３Δｒｇｔ２Δを伴う微生物は、親微生物と比較して、ラクトースを２’−ＦＬに変換するより高い能力を有する（例えば、図９を参照のこと）。
【００９６】
構成的活性化Ｐｍａ１の導入とｓｎｆ３及びｒｇｔ２の排除または減少との組合せは、細胞外グルコースの不存在下におけるオリゴ糖利用を相乗的に改善した（例えば、図３を参照のこと）。ｐｍａ１の終止コドン前の、最後の３アミノ酸を排除し、ｓｎｆ３及びｒｇｔ２のコード配列（ＰＭＡ１−９１６Δ  ｓｎｆ３Δｒｇｔ２Δ）を、オリゴ糖消費改善のために微生物で不活性化した。
【００９７】
参照による引用
本明細書で引用される特許、公開特許出願、及び非特許参考文献の各々は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【００９８】
均等論
当業者は、単に日常的な実験を使用して、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態について多くの等価物を認識する、または確認することができることになる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることを意図する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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