(57)【要約】  本発明は、合成イヌ抗体ライブラリ、加えてポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、及びこれらのライブラリと関連した方法を提供する。本発明はまた、このようなライブラリから単離される抗体を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
合成イヌ抗体ライブラリにおいて、前記ライブラリが以下の生殖細胞系列ＶＨ１領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）のうちの少なくとも１種のメンバーを含むことを特徴とするライブラリ。
【請求項２】
請求項１に記載のライブラリにおいて、前記ライブラリが以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）のうちの少なくとも１種を含むことを特徴とするライブラリ。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のライブラリにおいて、翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位が、前記生殖細胞系列ＶＨ領域又は前記生殖細胞系列ＶＬ領域のうちの１種以上から除去されることを特徴とするライブラリ。
【請求項４】
請求項１乃至３の何れか１項に記載のライブラリにおいて、前記ライブラリが前記ＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）、及びＶｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、並びにＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）、及びＶｓ３６５（λ）（配列番号１３）を含むことを特徴とするライブラリ。
【請求項５】
請求項１乃至４の何れか１項に記載のライブラリにおいて、前記ライブラリが前記ＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）、Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）、及びＶｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、並びにＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）を含むことを特徴とするライブラリ。
【請求項６】
請求項１乃至５の何れか１項に記載のライブラリにおいて、前記ライブラリが以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域ＶＳ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの１種以上を含むことを特徴とするライブラリ。
【請求項７】
請求項１乃至６の何れか１項に記載のライブラリにおいて、前記ライブラリの本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、１ファージ当たり少なくとも０．５Ｆａｂのディスプレイ比で、効率的にディスプレイされることを特徴とするライブラリ。
【請求項８】
請求項１乃至７の何れか１項に記載のライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、Ｆａｂフォーマットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現される場合に、少なくとも８５％のモノマー含有量を有することを特徴とするライブラリ。
【請求項９】
請求項１乃至８の何れか１項に記載のライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、ＩｇＧフォーマットの哺乳類系で発現される場合に、少なくとも９０％のモノマー含有量を有することを特徴とするライブラリ。
【請求項１０】
請求項１乃至９の何れか１項に記載のライブラリにおいて、全てのＶＨ／ＶＬ組合せが熱的に安定であることを特徴とするライブラリ。
【請求項１１】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載のライブラリメンバーをコードすることを特徴とする核酸分子のコレクション。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸分子をコードすることを特徴とするベクター。
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸分子又は請求項１２に記載のベクターを含むことを特徴とする組換え宿主細胞。
【請求項１４】
抗原に特異的な抗体を単離するための方法において、上記方法が：
（ａ）請求項１乃至１０の何れか１項に記載のライブラリを抗原と接触させるステップと；
（ｂ）前記抗原に結合しない前記ライブラリのメンバーを除去するステップと、
（ｃ）前記抗原に結合している前記ライブラリのメンバーを回収するステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１乃至１０の何れか１項に記載のライブラリから単離される、又は請求項１４に記載の方法により単離されることを特徴とする抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、完全イヌ抗体の選択に好適な、イヌライブラリ、例えば、合成抗体ライブラリなどに関する。本発明はまた、イヌ抗体の個々又はコレクションをコードする合成核酸配列、すなわちイヌ抗体ライブラリをコードする核酸配列に関する。このようなライブラリを生成及び使用する方法が提供される。特に、本発明は、特定の生物物理学的特性を有する完全イヌ抗体のライブラリを生成するための、合成生殖細胞系列配列の使用による完全イヌ抗体のライブラリの調製に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリン、例えば抗体などは、製薬産業にとって関心が継続し、高まっている。２０００年以来、モノクローナル抗体に関する治療市場は指数関数的に成長しており、２００７年には、米国で最も売れている２０のバイオテクノロジー薬のうちの８つが治療用モノクローナル抗体であり、その各々の治療薬の世界年間売上高は、５０億米ドルを超えている。治療用抗体は、多くの疾患の治療を向上させ、最も重篤で困難な疾患であっても、患者の生活の質をますます向上させる。
【０００３】
犬などのコンパニオンアニマルは、ヒトに内在する類似又は更には同じ生物学的メカニズム及び障害と同様の疾患を発症する。一例として、リンパ腫は、イヌ血液リンパ系の最も一般的な腫瘍である。これは、全てのイヌの腫瘍のおよそ４．５％及び全ての悪性腫瘍の１５％に相当する。イヌリンパ腫（ＣＬ）は、通常、急速に致命的であり、診断後１〜３か月以内に死に至る（Ｓｑｕｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，１９７３；Ｓｔｅｖｅｎ  Ｅ．Ｃｒｏｗ，  ２００８）。更に、米国では成犬の５匹に１匹が関節炎を患っており、犬がヒトの関節疾患、例えば変形性関節症、前十字靭帯の破壊及び半月板の損傷のモデルとして使用されていると推定される。
【０００４】
したがって、治療用モノクローナル抗体は、ヒトの治療のためだけでなく、犬の治療のためにも非常に有望な薬物クラスを提供する。
【０００５】
犬の治療に抗体を使用する試みはすでに存在している。米国食品医薬品局（ＦＤＡ）がヒトのがんの治療のための最初のモノクローナル抗体を承認する前でも、１９９２年に米国農務省（ＵＳＤＡ）はモノクローナル抗体ＭＡｂ  ２３１をリンパ腫を有する犬に使用することを承認した。ＭＡｂ  ２３１は、１９７５年にＫｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによって開発されたハイブリドーマ技術を使用して生成され、イヌリンパ腫細胞株１７−７１に特異的に結合するマウス由来のモノクローナル抗体である（例えば：米国特許第５１６９７７５Ａ号明細書参照）。ＭＡｂ  ２３１は、正常細胞ではなく腫瘍細胞に結合することが実証されており、細胞毒性を媒介する治療上望ましいマウスアイソタイプＩｇＧ２ａのものであった。
【０００６】
一方、抗体を「イヌ化」する方法、したがってイヌ抗体を模倣する方法が使用されている。例えば、Ｇｅａｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（ＢＭＣ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２０１３，９：２２６）は、発現されたイヌ免疫グロブリン配列に基づくアルゴリズムを使用して、既存のラット抗ＮＧＦモノクローナル抗体を組換えイヌ化抗ＮＧＦ  ｍＡｂに変換することによる「完全イヌ化」抗ＮＧＦモノクローナル抗体の生成を開示している。
【０００７】
本発明者らの知る限り、完全合成イヌ抗体ライブラリも、事前定義された多様なＶＨ／ＶＬ組成を有する他の信頼できるイヌ抗体ライブラリも以前に開示されていない。本発明において、天然のイヌ抗体配列の合理的な分析及びライブラリの洗練された設計により、生物医学研究に広く有用な最初の完全合成イヌ抗体ライブラリがもたらされた。ライブラリのメンバーも、高いモノマー含有量及び高い熱安定性などの有利な特性のために選択された。
【０００８】
合成イヌ抗体ライブラリをスクリーニングする方法に関しては、ファージ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、酵母などでのディスプレイを使用することができる。好ましいファージディスプレイでは、例えば、抗体は、バクテリオファージ表面タンパク質上の融合ポリペプチドとして提示される。抗体ディスプレイされたファージ粒子を対象となる標的分子（例えば、固相（例えば、マイクロタイタープレート、磁気ビーズなど）又は溶液中に固定化）と接触させて、それにより親和性選択を行う。標的分子と親和性を有する抗体を発現するファージが選択され、標的分子に結合しない抗体を有するファージは、選択ラウンド中に洗い流され、一般に「（バイオ）パニング」と呼ばれる。ファージディスプレイでは、選択されたファージ上で提示された抗体は、それをコードする遺伝子と１対１で対応するため、対象となる抗体を簡単に特定することができる。更に、抗体をコードする遺伝子は、容易に増幅できるため、ファージディスプレイは、大きなライブラリから抗体をスクリーニング及び単離する方法として広く使用されている。
【発明の概要】
【０００９】
イヌ生殖細胞系列配列によってコードされる免疫グロブリン配列は、犬では免疫原性がないと予想されるため、本発明者らは最も豊富なイヌ抗体のクラスを表す生殖細胞系列免疫グロブリン配列を探索した。
【００１０】
Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １３７  （２０１０）  ６４−７５）によれば、イヌ抗体ＶＨ遺伝子レパートリは、８０種のＶＨセグメント（その中の４１種は機能性であり、３９種は偽遺伝子である）、６種のＤＨセグメント、及び３種のＪＨセグメントを含む。ＶＨ遺伝子は、上記ＶＨ遺伝子レパートリからの異なるＶ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントの組合せにより形成され、ＶＤ及びＶＪジョイントにて短いコード配列の付加又は欠失により結合されて抗体の多様性を高める。胚中心エントリーに先立って生じるＶＤＪ組換えは完全にランダムではないが、特定のＶＨ遺伝子は他の遺伝子よりも頻繁に使用される。
【００１１】
イヌでは、１−ＶＨ６２（Ｖｓ６２４）及び１−ＶＨ４４（Ｖｓ６３５）が、脾臓Ｂ細胞で最も頻繁に使用されるＶＨセグメントであることが確認され、１−ＶＨ６２で２７％、１−ＶＨ４４で２３．４％が生じる（Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。残りの全てのＶＨは、１１％未満の頻度で使用された。イヌでは、３種のＶＨファミリー（ＶＨ１、ＶＨ２、及びＶＨ３）が存在し、その大半はＶＨ１ファミリーに属し、２−ＶＨ５１、２−ＶＨ６４、及び２−ＶＨ６６はＶＨ２ファミリーに属し、３−ＶＨ８０のみがＶＨ３ファミリーメンバーを表す。
【００１２】
イヌの抗体軽鎖はまた、Ｖ及びＪ遺伝子セグメントによってコードされた可変領域並びにκ及びλ遺伝子によってコードされた定常領域に基づいている。カニス・ファミリアス（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）の免疫グロブリンλ配列は、４つのＶＬλ鎖ファミリー［Ｖ−Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ８４５３００）、Ｖ−ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ５４３５１９）、Ｖ−ＩＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ８４４１８８）、及びＶ−ＩＶ  （ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＭ８４４２３７）］にグループ化できる。Ｃ．ファミリアス（Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）の免疫グロブリンκ配列もまた、４つのＶＬκ鎖ファミリーＶ−Ｉ（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ８４９６２１）、Ｖ−ＩＩ（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ８４４８７４）、Ｖ−ＩＩＩ（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ８４９６２９）、及びＶ−ＩＶ（Ｇｅｎ  Ｂａｎｋアクセッション番号ＸＭ８４９６６８）配列にグループ化できる（Ｂｒａｇａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １３９  （２０１１）  ２７−４０）。犬は９０％のλ軽鎖及びわずか１０％のκ軽鎖を発現することがわかった（Ｂｒａｇａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １３９  （２０１１）  ２７−４０）。しかし、これまでのところ、イヌの特定の軽鎖の分布及び配置、並びにイヌで発生するＶＨ／ＶＬ組合せはほとんど特徴付けられていない。
【００１３】
文献及び配列類似性分析に記載されているＶＨ遺伝子の分布に基づいて、特定のＶＨ遺伝子が合成イヌ抗体ライブラリ用に選択された。ＶＬ遺伝子については、Ｂｒａｇａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１で提供される情報、並びにｈｔｔｐ：／／ｖｇｅｎｅｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．ｏｒｇで入手可能な８６種のλ軽鎖生殖細胞系列配列及び２９種のκ軽鎖生殖細胞系列配列に基づく共通配列を使用して、合成イヌ抗体ライブラリ用の特定の軽鎖生殖細胞系列配列を選択した。
【００１４】
５種の代表的なイヌＶＨ生殖細胞系列配列及び６種の代表的なイヌＶＬ生殖細胞系列配列を試験した（４種のλＶＬ、２種のκＶＬ）。３０の可能なＶＨ／ＶＬの組合せから、本発明者らは、次の有利な特性を示す６種の組み合わせを特定した：（ｉ）それらは、Ｆａｂフォーマットの糸状ファージの先端で高いディスプレイ率を示し、（ｉｉ）それらは、Ｆａｂフォーマットで高いモノマー含有量を有する可溶性形態で発現し、（ｉｉｉ）ＩｇＧフォーマットで高いモノマー含有量で表される。
【００１５】
フレームワークの選択は、好ましい生物物理学的特性を有し、ｉｎ−ｖｉｖｏでの成熟を受けていない合成ライブラリに由来する抗体の不足がない抗体を得る機会を最適化するために選択された。このような好ましくて所望の生物物理学的特性には、例えば、本明細書に例示されるように、より高い安定性及び凝集傾向の低さが含まれる。
【００１６】
６種の最も好ましいＶＨ／ＶＬ組合せに関して、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ３領域は、それぞれ非常に多様化されたＬ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ３ライブラリカセットに置き換えられ、それにより、５×１０９超のメンバーの全体的なライブラリサイズを実現する。それぞれの制限部位が導入され、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ３ライブラリカセット挿入が可能になった。
【００１７】
加えて、望ましくない翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位を、特定の生殖細胞系列配列から除去し、それぞれのＶＨ又はＶＬ遺伝子及び対応するタンパク質の発現及び生物物理学的特性を更に最適化した。
【００１８】
治療用途の抗体製剤で生じる翻訳後修飾に注意することが重要である。ＰＴＭは、最初のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特性評価のために作成された抗体サンプルでは必ずしも発生しないが、ＰＴＭは、高濃度の抗体サンプル及び長期保存条件下で発生する可能性があり、ｉｎ  ｖｉｖｏでも発生する場合がある。それにより、ＰＴＭは抗体の安定性及び／又は均一性を妨げる可能性があり、抗体機能の喪失につながり得る。ＰＴＭの例としては、酸化（Ｍｅｔ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ）、脱アミド化（Ａｓｎ、Ｇｌｎ）、異性化（Ａｓｐ）、又はＮ−結合型グリコシル化（Ａｓｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
本開示は、合成イヌ抗体ライブラリ、好ましくは、少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＨ１領域及び少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＬ領域のメンバーを含むライブラリを提供する。
【００２０】
一態様では、本明細書で提供される上記ライブラリは、少なくとも２種の生殖細胞系列ＶＨ１領域及び少なくとも２種の生殖細胞系列ＶＬ領域のメンバーを含む。
【００２１】
一態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが以下の生殖細胞系列ＶＨ１領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、及びＶｓ６３５（配列番号２）のうちの少なくとも１種のメンバーを含むライブラリが本明細書で提供される。
【００２２】
一態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが以下の生殖細胞系列ＶＨ１領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、及びＶｓ６３５（配列番号２）のうちの少なくとも２種のメンバーを含むライブラリが本明細書で提供される。別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが少なくとも２種の生殖細胞系列ＶＬ領域のメンバーを更に含むライブラリが本明細書で提供される。
【００２３】
一態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、及びＶｓ３６５（λ）（配列番号１３）のうちの少なくとも１種を含むライブラリが本明細書で提供される。本開示の一実施形態では、上記生殖細胞系列ＶＬ領域は、以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、及びＶｓ３６５（λ）（配列番号１３）から選択される。
【００２４】
一態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが生殖細胞系列ＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、及びＶｓ６３５（配列番号２）のうちの少なくとも２種、並びに以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、及びＶｓ３６５（λ）（配列番号１３）のうちの少なくとも２種を含むライブラリが本明細書で提供される。
【００２５】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが生殖細胞系列ＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、及びＶｓ６３５（配列番号２）、並びに以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、及びＶｓ３６５（λ）（配列番号１３）を含むライブラリが本明細書で提供される。
【００２６】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが生殖細胞系列ＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、及びＶｓ６３５（配列番号２）のうちの少なくとも１種、並びに以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、及びＶｓ３６５（λ）（配列番号１３）のうちの少なくとも１種からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００２７】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが生殖細胞系列ＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、及びＶｓ６３５（配列番号２）のうちの少なくとも２種、並びに以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、及びＶｓ３６５（λ）（配列番号１３）のうちの少なくとも２種からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００２８】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが生殖細胞系列ＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、及びＶｓ６３５（配列番号２）、並びに以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、及びＶｓ３６５（λ）（配列番号１３）からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００２９】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位が、生殖細胞系列ＶＨ領域又は生殖細胞系列ＶＬ領域のうちの１種以上から除去されるライブラリが本明細書で提供される。
【００３０】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリがＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）、及びＶｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、並びにＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）、及びＶｓ３６５（λ）（配列番号１３）を含むライブラリが本明細書で提供される。
【００３１】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリがＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せを含むライブラリが本明細書で提供される。
【００３２】
一態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが以下の生殖細胞系列ＶＨ１領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）のうちの少なくとも２つのメンバーを含むライブラリが本明細書で提供される。別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが少なくとも２つの生殖細胞系列ＶＬ領域のメンバーを更に含むライブラリが本明細書で提供される。
【００３３】
一態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）のうちの少なくとも１種を含むライブラリが本明細書で提供される。
【００３４】
本開示の一実施形態では、上記生殖細胞系列ＶＬ領域は、以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）から選択される。
【００３５】
一態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが生殖細胞系列ＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）のうちの少なくとも２種、並びに以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）のうちの少なくとも２種を含むライブラリが本明細書で提供される。
【００３６】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが生殖細胞系列ＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）、並びに以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）を含むライブラリが本明細書で提供される。
【００３７】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが生殖細胞系列ＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）のうちの少なくとも１種、並びに以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）のうちの少なくとも１種からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００３８】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが生殖細胞系列ＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）のうちの少なくとも２種、並びに以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）のうちの少なくとも２種からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００３９】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが生殖細胞系列ＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）、並びに以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００４０】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位が、生殖細胞系列ＶＨ領域又は生殖細胞系列ＶＬ領域のうちの１種以上から除去されるライブラリが本明細書で提供される。
【００４１】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリがＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）、Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）、及びＶｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、並びにＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）を含むライブラリが本明細書で提供される。
【００４２】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域ＶＳ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの１種以上を含むライブラリが本明細書で提供される。
【００４３】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、本明細書で開示されるＶＨ／ＶＬ組合せのうちの１種以上を含むライブラリが本明細書で提供される。
【００４４】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの１種以上を含むライブラリが本明細書で提供される。
【００４５】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの１種以上からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００４６】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、本明細書で開示されるＶＨ／ＶＬ組合せのうちの１種以上からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００４７】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種を含むライブラリが本明細書で提供される。
【００４８】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００４９】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、本明細書で開示されるＶＨ／ＶＬ組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００５０】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域ＶＳ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの１種以上からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００５１】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも５０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域ＶＳ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの１種以上を含むライブラリが本明細書で提供される。
【００５２】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域ＶＳ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、少なくとも１４種、少なくとも１６種からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００５３】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも５０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域ＶＳ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも８種、少なくとも１０種、少なくとも１２種、少なくとも１４種、少なくとも１６種からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００５４】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも８０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域ＶＳ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの１種以上を含むライブラリが本明細書で提供される。
【００５５】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも５０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域ＶＳ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの１種以上からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００５６】
別の態様では、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも８０％の抗体又は機能性断片が、可変重鎖及び可変軽鎖の組合せを含み、上記可変重鎖及び可変軽鎖の組合せのフレームワーク領域が、以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域ＶＳ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの１種以上からなるライブラリが本明細書で提供される。
【００５７】
一態様では、好ましくは少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＨ１領域及び／又は少なくとも２種の生殖細胞系列ＶＬ領域を含むライブラリのような、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリの本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、効率的にＦａｂフォーマットでディスプレイされるライブラリが本明細書で提供される。
【００５８】
一態様では、上記ライブラリの上記ＶＨ／ＶＬ組合せはＦａｂフォーマットでディスプレイされ、１ファージ当たり少なくとも０．５Ｆａｂのディスプレイ比を有する。
【００５９】
一態様では、好ましくは少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＨ１領域及び／又は少なくとも２種の生殖細胞系列ＶＬ領域を含むライブラリのような、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、Ｆａｂフォーマットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されるライブラリが本明細書で提供される。一実施形態では、Ｆａｂフォーマットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現される上記ＶＨ／ＶＬ組合せは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のモノマー含有量を有する。
【００６０】
一態様では、好ましくは少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＨ１領域及び／又は少なくとも２種の生殖細胞系列ＶＬ領域を含むライブラリのような、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、ＩｇＧフォーマットの哺乳類系で発現されるライブラリが本明細書で提供される。一実施形態では、ＩｇＧフォーマットの哺乳類系で発現される上記ＶＨ／ＶＬ組合せは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のモノマー含有量を有する。
【００６１】
一態様では、好ましくは少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＨ１領域及び／又は少なくとも２種の生殖細胞系列ＶＬ領域を含むライブラリのような、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、熱的に安定であるライブラリが本明細書で提供される。
【００６２】
本開示はまた、上記合成イヌ抗体ライブラリの抗体をコードする核酸分子のコレクションを提供する。
【００６３】
本開示はまた、上記核酸分子をコードするベクターを提供する。
【００６４】
本開示はまた、上記核酸分子又はベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。
【００６５】
本開示はまた、抗原に特異的な抗体を単離するための方法において、上記方法が：
（ａ）本開示の合成イヌ抗体ライブラリを抗原と接触させるステップと、
（ｂ）抗原に結合しない（又は抗原に特異的ではない）ライブラリのメンバーを除去するステップと、
（ｃ）抗原に結合している（又は抗原に特異的な）ライブラリのメンバーを回収するステップと、
を含む方法を提供する。
【００６６】
本開示はまた、上述のライブラリ又は上述の方法から単離される抗体を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、４１種のイヌＶＨ遺伝子の同一性表分析が、アライメントに含まれる配列に関する全ての可能な配列対の距離値を示す。配列対間の距離スコア（すなわち、１００から同一性スコアを差し引いたもの）が示される。配列対間の同一性スコアは、対間の全てのアンギャップド（ｕｎｇａｐｐｅｄ）位置間の同一残基の割合である。
【図２】図２は、２９種のイヌＶκ遺伝子の同一性表分析が、アライメントに含まれる配列に関する全ての可能な配列対の距離値を示す。配列対間の距離スコア（すなわち、１００から同一性スコアを差し引いたもの）が示される。配列対間の同一性スコアは、対間の全てのアンギャップド位置間の同一残基の割合である。
【図３】図３は、８６種のイヌＶλ遺伝子の同一性表分析が、アライメントに含まれる配列に関する全ての可能な配列対の距離値を示す。配列対間の距離スコア（すなわち、１００から同一性スコアを差し引いたもの）が示される。配列対間の同一性スコアは、対間の全てのアンギャップド位置間の同一残基の割合である。
【図４】図４は、Ｆａｂ−ディスプレイ比を評価するためのＶＨ／ＶＬコンストラクトのサブセットのウェスタンブロット分析である。
【図５】図５は、効率的なファージディスプレイに好適なディスプレイ比（典型的には、０．５〜２Ｆａｂ／ファージ）を示す、図４に示されるブロットの密度測定分析である。
【図６】図６は、３０種のＶＨ／ＶＬ組合せを、ＥＬＩＳＡにより細菌細胞溶解物における相対的Ｆａｂ発現について分析し、各ＶＨ／ＶＬ対の発現レベルを参照Ｆａｂ対照の発現と比較して決定した。本質的に、全ての試験されたＦａｂ  ＶＨ／ＶＬ対は、対照の少なくとも０．５の相対発現を示した。λクローンは、平均して、最高の相対的なＦａｂ発現レベルを有した。サンプル番号は表３に体系化されている。
【図７】図７は、３０種のＶＨ／ＶＬ組合せのＦａｂ発現収量（棒として示される；左軸）及びモノマー含有量（点として示される；右軸）である。サンプル番号は表３に体系化されている。
【図８】図８は、３０種のＶＨ／ＶＬ組合せの研究規模のＩｇＧ発現収量（棒として示される；左軸）及びモノマー含有量（点として示される；右軸）である。サンプル番号は表３に体系化されている。
【図９】図９は、関連する固有の制限部位を含むファージディスプレイベクターｐＣａＤｉｓの必須部分を示す。
【図１０】図１０は、関連する固有の制限部位を含む細菌Ｆａｂ発現ベクターｐＣａＢｘの必須部分を示す。
【図１１】図１１は、ライブラリの組成ごとに予想されるＶＨマスター遺伝子の分布が示すとおりの、イヌ抗体ライブラリの高品質及び正確性である。
【図１２】図１２は、例示的な軽鎖ＣＤＲに関するライブラリの対応する位置で得られたアミノ酸（右側の棒）と比較した設計されたアミノ酸分布（左側の棒）が、合成ライブラリの正確且つ正しい組成を確認する。
【図１３】図１３は、約７９０万配列のＭｉＳｅｑ  ＮＧＳ品質管理後に得られたＣＤＲ−Ｈ３の長さ分布（暗い棒）と比較したＣＤＲ−Ｈ３の設計の長さ分布（白い棒）である。
【図１４】図１４は、Ｆａｂスクリーニング結果のドットブロットの可視化である。ｅＧＦＰへの特異的結合のバックグラウンド値を超えるシグナルをｘ軸に示し（直接ＥＬＩＳＡ）、Ｆａｂ発現の結果をｙ軸に示す（Ｆａｂ捕捉ＥＬＩＳＡのバックグラウンドを超えるシグナル）。ドットの形は、それぞれのパニングサブコードを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
別段の定めがない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００６９】
数値及び範囲の文脈における用語「約」又は「およそ」は、当業者であれば本明細書に含まれている教示から明らかなように、所望の数又は割合の配列相同性を有することなど、本発明を意図されているとおりに実施することができるような、提示されている値又は範囲に近似するか又はそれに近い数値又は範囲を指す。これは、少なくとも部分的には、培養条件の変動及び生物系の変異性による。したがって、これらの用語は、系統誤差から生じる誤差を超える値を包含する。これらの用語は、暗示的なものを明示的にする。
【００７０】
本明細書において本発明の概要及び説明に示されている全ての範囲は、範囲の数値の付近にある又はその間にある全ての数又は値を含む。本発明の範囲は、その範囲にある全ての整数値、小数値、及び分数値を明示的に表記及び表示する。用語「約」は、範囲を記述するために使用することができる。
【００７１】
用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、抗体全体及び抗原結合断片（すなわち、「抗原結合部部分」）又それらの単鎖を含む。天然「抗体」は、ジスルフィド結合により相互に結合された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）及び重鎖定常領域で構成されている。ＩｇＧ、ＩｇＡ、又はＩｇＤ抗体の重鎖定常領域は、３種のドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３で構成されているが、ＩｇＭ及びＩｇＥ抗体の重鎖は、４種のドメインＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ＣＨ４で構成されている。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）及び軽鎖定常領域で構成されている。軽鎖定常領域は１種のドメインＣＬで構成されている。ＶＨ領域及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域に更に細分化することができ、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存されている領域が点在している。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成されている。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクタ細胞）及び古典的な補体系の第１成分（Ｃｌｑ）等の宿主組織又は宿主因子への免疫グロブリン結合を媒介し得る。フレームワーク領域及びＣＤＲの長さは、正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，９１５−９２０．；Ｃｈｏｔｈｉａ  ＆  Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７−８８３；Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７３：９２７−９４８を参照されたい）。抗体のフレームワーク領域、すなわち、構成する軽鎖及び重鎖の組み合わされたフレームワーク領域は、主に抗原への結合に関与するＣＤＲの配置及び整列に役立つ。
【００７２】
抗体の「抗原結合部分」又は「断片」という用語は、本出願において、同じ意味で用いられる。これらの用語は、所与の抗原に特異的に結合する能力を保持するインタクト抗体の１種以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、インタクト抗体の断片により実施することができる。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例としては、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ）２断片；ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；抗体の単一アームのＶＬドメイン及びＶＨドメインからなるＦｖ断片；ＶＨドメインからなる単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９  Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；並びに単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。好ましい抗体の抗原結合部分又は断片は、Ｆａｂ断片である。
【００７３】
更に、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によりコードされるが、これらＶＬ及びＶＨを、ＶＬ領域及びＶＨ領域が対形成して一価の分子（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）として既知である）を形成する単一タンパク質鎖として作製することが可能な人工ペプチドリンカーにより、これらＶＬ及びＶＨを組換え法を使用して連結することができる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。そのような単鎖抗体は、抗体の１つ以上の「抗原結合部分」を含む。これらの抗体断片は当業者に既知の従来の技術を使用して得られ、断片は、インタクト抗体と同じ方法で有用性に関してスクリーニングされる。また、抗原結合部分を単一ドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ｖ−ＮＡＲ及びｂｉｓ−ｓｃＦｖに組み込むことができる（例えばＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕｄｓｏｎ，（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３，９，１１２６−１１３６を参照されたい）。抗体の抗原結合部分は、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）などのポリペプチドをベースとするスキャホールドに移植することができる（米国特許第６，７０３，１９９号明細書を参照、この明細書は、フィブロネクチンポリペプチドモノボディについて記載する）。抗体結合部分は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｖセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む単鎖分子中に組み込むことができる（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：１０５７−１０６２；及び米国特許第５，６４１，８７０号明細書）。
【００７４】
用語「イヌ抗体」は、本明細書で使用する場合、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方が、イヌ起源の配列から誘導される可変領域を有する抗体を指す。例えば、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域は両方とも、イヌ起源の配列から誘導されてもよい。更に、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域はまた、このようなイヌ配列、例えばイヌ生殖細胞系列配列又はイヌ生殖細胞系列配列の変異型から誘導される。本発明のイヌ抗体は、イヌ配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発、又はｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞突然変異により導入された突然変異）を含んでもよい。
【００７５】
用語「ナイーブイヌ免疫レパートリ」は、犬の免疫系に由来する抗原未経験Ｂ細胞から単離された核酸のレパートリを意味し、ここで、これらの機能性断片の抗体をコードする核酸は、体細胞超突然変異を受けていないため、生殖細胞系遺伝子の核酸を含み、Ｖ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメント再編成が発生していると考えられる。レパートリは、個体のもの又は集団のものであってもよい。好ましくは、免疫レパートリは、サンプルバイアスを回避するために複数の個体から入手される。
【００７６】
用語「イヌ免疫レパートリ」は、イヌの免疫系からのＢ細胞から単離される核酸のレパートリを意味する。レパートリは、個体のもの又は集団のものであってもよく、ナイーブＢ細胞及び／又は抗原経験済Ｂ細胞由来のものであってもよい。好ましくは、免疫レパートリは、サンプルバイアスを回避するために複数の個体から入手される。
【００７７】
用語「単離された抗体」は、異なる抗原結合特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。しかしながら、抗原と特異的に結合する単離された抗体は、他の抗原と交差反応し得る。更に、単離された抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まない場合がある。
【００７８】
用語「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子により提供される抗体クラス（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、ＩｇＧ、例えばＩｇＧ１又はＩｇＧ４）を指す。イヌにおいては、４つのＩｇＧサブクラス：ＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｂ、ＩｇＧ−Ｃ、及びＩｇＧ−Ｄ（Ｌ．Ｍ．  Ｂｅｒｇｅｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １５７  （２０１４）  ３１−４１）が存在する。アイソタイプはまた、これらクラスのうちの１つの修飾型を含み、修飾は、Ｆｃ機能を変更して、例えばエフェクター機能又はＦｃ受容体に対する結合を増強又は低減するようになされる。
【００７９】
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」という用語は、単一分子組成物の抗体分子の調製を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定エピトープの単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００８０】
用語「ライブラリ」は、典型的には、１０３超、１０４超、１０５超、１０６超、１０７超、１０８超、１０９超、又は更には１０１０超のメンバーを含む、異なる分子のコレクションを指す。本発明の文脈におけるライブラリは、異種ポリペプチド又は核酸の混合物である。ライブラリは、各々が単一ポリペプチド又は核酸配列を有するメンバーで構成される。ライブラリメンバー間の配列の違いは、ライブラリに存在する多様性を担う。ライブラリは、ポリペプチド又は核酸の単純な混合物の形態をとってもよいか、又は核酸のライブラリで形質転換された生物若しくは細胞、例えば細菌、ウイルス、ファージ、動物若しくは植物細胞の形態であってもよい。好ましくは、各個々の生物又は細胞には、１種又は限られた数のライブラリメンバーが含まれる。有利には、核酸によってコードされるポリペプチドの発現を可能にするために、核酸は発現ベクター中に組み込まれる。特定の態様では、ライブラリは、宿主生物の集団の形態をとってもよく、各生物は、発現してその対応するポリペプチドメンバーを生成することができる核酸形態のライブラリの単一メンバーを含有する発現ベクターの１つ以上のコピーを含有する。そのため、宿主生物の集団は、遺伝的に多様なポリペプチド変異体の大きなレパートリをコードする可能性を有する。用語「コレクション」は、本質的に、用語「ライブラリ」と同じ意味で用いられる。
【００８１】
抗体ライブラリは、免疫動物又は自然免疫若しくは感染したヒトに存在する特定の特異性に偏っている、免疫グロブリン又はこれらの断片から誘導することができる。或いは、抗体ライブラリは、ナイーブ免疫グロブリン又はこれらの断片、すなわち、免疫系で見られる特異性に偏りがない免疫グロブリンから誘導することができる。このようなライブラリは、「偏りがない（ｕｎｂｉａｓｅｄ）」ライブラリと称される。好ましい実施形態では、本開示は、偏りがない抗体ライブラリ、すなわち、対象となる抗原に事前にさらされていないライブラリを提供する。バイアスがないため、このようなライブラリは、対象となる任意の潜在的な標的抗原に結合する抗体を含む。
【００８２】
典型的には、免疫抗体ライブラリは、ＰＣＲ系（又は関連する）クローニング技術によりソースＢ細胞からクローニングされるＶＨ及びＶＬ遺伝子プールで構築される。同じ方法で、偏りがないナイーブ抗体ライブラリを生成することも可能である。しかしながら、偏りがないナイーブ抗体ライブラリは、ライブラリ全体が完全にｉｎ  ｖｉｔｒｏで構築される合成方法で生成することもできる。天然抗体レパートリの自然な偏り及び冗長性を模倣するために、組換えＤＮＡ技術が用いられ、使用される場合がある。このような抗体ライブラリは、「合成」抗体ライブラリと称される。用語「完全合成」ライブラリは、ＤＮＡ合成、例えば、全遺伝子合成、ＰＣＲ系の方法、又は関連するＤＮＡ技術により完璧に、すなわち完全に、ｄｅ  ｎｏｖｏに構築される抗体ライブラリを指す。このようなライブラリでは、ＤＮＡ全体、すなわち、ＣＤＲをコードする部分、並びにライブラリの抗体のＣＤＲ周辺部分をコードする部分（例えば、フレームワーク領域）が、ｄｅ  ｎｏｖｏに構築される。したがって、用語「合成」及び「完全合成」は、ＤＮＡのｄｅ  ｎｏｖｏな起源を指す。対照的に、「半合成」抗体ライブラリでは、ライブラリの抗体の一部のみがｄｅ  ｎｏｖｏに構築されるが、他の部分、例えば特定のＣＤＲ領域は、自然源に由来する（この問題に関する多数のレビューが存在し、例えばＳｉｄｈｕ  ｅｔ  ａｌ．；Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  （２００６），２，６８２−８を参照のこと）。特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリを提供する。好ましい態様では、本開示は、完全合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【００８３】
用語「完全生殖細胞系列」は、生殖細胞を介して親から子孫に受け継がれる、抗体遺伝子及び遺伝子セグメントの核酸配列を指す。生殖細胞系列配列は、Ｂ細胞成熟の過程で組換え及び超突然変異事象により変化した成熟Ｂ細胞の抗体をコードするヌクレオチド配列とは区別される。用語「生殖細胞系列」は、完全生殖細胞系列配列、加えて例えば、望ましくない翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位の除去、望ましくないシステインの除去、抗体の最適化（例えば、親和性、半減期）若しくは所望の制限部位の導入、又は合成、増幅若しくはクローニングのエラーから生じる修飾の目的などで、アミノ酸配列にわずかな変異を加えて修飾又は操作された生殖細胞系列配列を指す。
【００８４】
用語「翻訳後修飾」又は「ＰＴＭ」は、タンパク質生合成中又はタンパク質生合成後のタンパク質の一般的な酵素的修飾を指す。翻訳後修飾は、アミノ酸側鎖又はタンパク質のＣ若しくはＮ末端で起こる。これらは、リン酸、酢酸、アミド基、又はメチル基などの新しい官能基を導入することにより、２０種類の標準アミノ酸の化学的レパートリを延長することができる。多くの真核生物タンパク質にはまた、グリコシル化と呼ばれるプロセスでそれらに炭水化物分子が付着しているため、タンパク質フォールディングを促進し、安定性を高めることに加えて、調節機能を果たすことができる。修飾は、具体的には、Ｎ−結合型グリコシル化部位（ＮｘＳ又はＮｘＴ）又は化学修飾、例えばＡｓｐ開裂（多くの場合にＤＰにおける）、Ａｓｐ異性化（ＤＳ、ＤＧ）、アミド分解（ＮＳ、ＮＧ）を含む、いわゆる翻訳後修飾部位（すなわち既定のアミノ酸モチーフ）の部位で起こる。メチオニンは、溶媒にさらされると酸化され得る。修飾は、ｉｎ  ｖｉｖｏ（血清中）又は製剤バッファー中での保存時に起こり、抗体結合の減少につながり得る。
【００８５】
用語「生殖細胞系列可変領域」は：
ａ）生殖細胞系列遺伝子によりコードされた抗体若しくはその機能的断片の可変領域の核酸配列若しくはアミノ酸配列、
ｂ）生殖細胞系列遺伝子によりコードされた抗体若しくはその機能的断片の可変領域の核酸配列若しくはアミノ酸配列であって、核酸配列が、例えばコドン最適化、所望の制限部位の付加、ＧＣ含有量の最適化、望ましくない翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位の除去、望ましくないｍＲＮＡスプライス部位の除去、若しくはｍＲＮＡ不安定化モチーフの除去により修飾されている核酸配列若しくはアミノ酸配列、又は
ｃ）生殖細胞系列遺伝子によりコードされた抗体若しくはその機能的断片の可変領域の核酸配列若しくはアミノ酸配列であるが、望ましくない翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位の除去、望ましくないシステインの除去、若しくは所望の制限部位の導入、若しくは合成、増幅若しくはクローニングのエラーから生じる修飾の目的などでアミノ酸配列にわずかな変異が加えられた核酸配列若しくはアミノ酸配列を意味する。
【００８６】
本開示の意味では、「生殖細胞系列可変領域」は、「生殖細胞系列ＶＨ領域」又は「生殖細胞系列ＶＬ領域」である。イヌ「生殖細胞系列可変領域」の例を、表１に示す。
【００８７】
用語「可変重鎖及び可変軽鎖組合せ」又は「ＶＨ／ＶＬ組合せ」は、１つの可変重鎖及び１つの可変軽鎖の組合せ（対）を意味する。抗体及び機能的断片、例えばＦａｂは、可変軽鎖に結合した少なくとも１つの可変重鎖を含み、これが抗原結合領域を形成する。
【００８８】
本明細書において用語「核酸」は、用語「ポリヌクレオチド」と同じ意味で用いられ、一本鎖形態又は二本鎖形態のいずれかにおけるデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマーを指す。この用語は、公知のヌクレオチド類似体又は修飾された骨格残基又は結合を含有する核酸であって、参照核酸と同様の結合特性を有し、参照ヌクレオチドと同様の様式で代謝される合成、天然及び非天然の核酸を包含する。このような類似体の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
特に指示がない限り、特定の核酸配列は、保存的に修飾されたその変型（例えば、縮重コドン置換物）及び相補的配列、並びに明白に指示された配列も暗に包含する。特に、下記のように、縮重コドンの置換は、１種以上の選択された（又は全ての）コドンのうちの第三位を混合塩基残基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１，１９９１；Ｏｈｔｓｕｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８，１９８５；  ａｎｄ  Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８，１９９４）。
【００９０】
本明細書で使用する場合、用語「最適化」は、ヌクレオチド配列を変更して、産生細胞又は生物、一般に、真核細胞、例えば、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）の細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又はヒト細胞中で優先されるコドンを使用してアミノ酸配列をコードすることを意味する。最適化されたヌクレオチド配列は、「親」配列としてもまた公知である出発ヌクレオチド配列により元々コードされていたアミノ酸配列を完全に又は可能な限り保持するように操作されている。本明細書の最適化された配列は、哺乳動物細胞で好ましいコドンを有するように操作されている。しかしながら、他の真核細胞又は原核細胞におけるこれらの配列の最適化された発現も、本明細書で想定される。最適化されたヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列も、最適化されているという。
【００９１】
用語「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸及び合成アミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸ミメティック（模倣物質）を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によりコードされたもの、並びに後に修飾されたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造、すなわち、水素、カルボキシル基、アミノ基、及びＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾Ｒ基（例えば、ノルロイシン）又は修飾変ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造を保持する。アミノ酸ミメティックは、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化学的化合物を指す。
【００９２】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書では同じ意味で用いられ、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１種以上のアミノ酸残基が、対応する、天然に存在するアミノ酸の人工化学的ミメティックであるアミノ酸ポリマー、並びに、天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在しないアミノ酸ポリマーであるアミノ酸ポリマーに適用される。特に指示がない限り、特定のポリペプチド配列は、その保存的に修飾された変異体も暗に包含する。
【００９３】
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における用語「同一の」又はパーセント「同一性」は、同じである２つ以上の配列又は部分配列を指す。以下の配列比較アルゴリズムのうちの１つを使用して、又は手作業によるアラインメント及び目視検査により測定して、比較窓又は指定領域にわたって対応が最大になるように比較及びアラインした際に、２つの配列が、同一（すなわち、具体化された領域にわたって、又は具体化されていない場合は配列全体にわたって６０％の同一性、任意選択的に、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は９９％の同一性）である具体化された割合のアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する場合、２つの配列は「実質的に同一」である。任意選択的に、同一性は、長さが少なくとも約５０個のヌクレオチド（又は１０個のアミノ酸）である領域にわたって、又はより好ましくは長さが１００〜５００個の若しくは１０００個以上のヌクレオチド（又は２０、５０、２００個以上アミノ酸）である領域にわたって存在する。
【００９４】
配列比較の場合、典型的には、１つの配列が基準配列としての役割を果たし、それが試験配列と比較される。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列及び基準配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定のプログラムパラメータを使用してもよく、又は代替的パラメータを指定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムパラメータに基づいて、基準配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算出する。
【００９５】
用語「組換え抗体」は、本明細書で使用する場合、組換え手段によって調製、発現、生成、又は単離される全ての抗体、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子について遺伝子導入若しくは染色体導入された動物（例えばマウス）又はそれから調製されたハイブリドーマから単離される抗体、げっ歯類、ヒト又はイヌ抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えば、トランスフェクトーマ（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｏｍａ）から単離される抗体、組換え体から単離される抗体、組合せイヌ抗体ライブラリ、及び全て又は一部のヒト免疫グロブリン遺伝子配列の、他のＤＮＡ配列へのスプライジングを伴う他のあらゆる手段によって調製、発現、生成、又は単離される抗体を含む。このような組換えイヌ抗体は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域がイヌ生殖細胞系列免疫グロブリン配列から誘導される可変領域を有する。しかし、特定の実施形態において、このような組換えイヌ抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ突然変異誘発（又は、イヌＩｇ配列について遺伝子導入した動物が用いられる場合、ｉｎ  ｖｉｖｏ体細胞突然変異誘発）を受けてよいので、組換え抗体のＶＨ領域及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、イヌ生殖細胞系列ＶＨ及びＶＬ配列から誘導され、これに関連する一方で、生殖細胞系列イヌ抗体レパートリ内にｉｎ  ｖｉｖｏで本来存在し得ない配列である。
【００９６】
用語「組換え宿主細胞」（又は単に「宿主細胞」）は、組換え発現ベクターが導入されている細胞を指す。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の子孫も指すことが意図されていることを理解すべきである。変異又は環境の影響のいずれかにより、特定の修飾は後の世代に起こり得るため、このような後代は事実上親細胞と同一ではない可能性があるが、本明細書で使用する場合の用語「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。
【００９７】
用語「ベクター」は、ポリヌクレオチド分子において、このポリヌクレオチド分子が連結されている別のポリヌクレオチドの輸送が可能なポリヌクレオチド分子を指す。ベクターの１つのタイプである「プラスミド」は、環状二本鎖ＤＮＡループを指し、追加のＤＮＡセグメントがこれに連結され得る。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、このウイルスベクターでは、追加のＤＮＡセグメントがウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、このベクターが導入された宿主細胞中での自律複製が可能である（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時にこの宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それにより宿主のゲノムと一緒に複製される。更に、特定のベクターは、それらが作用可能に連結されている遺伝子の発現を指図することができる。このようなベクターは、本明細書においては、「組換え発現ベクター」（又は単に「発現ベクター」）と称される。一般的に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、プラスミドの形態をしていることが多い。本明細書では、「プラスミド」及び「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的に用いられている形態であるため、同じ意味で用いられてもよい。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たすウイルスベクターなどの（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、及びアデノ随伴ウイルス）、発現ベクターのそのような他の形態を含むことが意図されている。
【００９８】
「ディスプレイベクター」は、このディスプレイベクターで形質転換された宿主細胞（例えば細菌宿主細胞）中において染色体外で組換えＤＮＡ分子の複製及び維持を指示する能力を有するＤＮＡ配列を含む。このようなＤＮＡ配列は当分野で公知である。ディスプレイベクターは、例えば、ｆｄ、Ｍ１３又はｆｌ繊維状バクテリオファージのクラスに由来するファージベクター又はファージミドベクターであり得る。このようなベクターは、タンパク質（例えば結合タンパク質又はその断片）の繊維状バクテリオファージの表面上でのディスプレイを容易にすることができる。ファージ上での、リボソーム上での、ＤＮＡ上での、細菌細胞上での、又は真核細胞（例えば酵母細胞若しくは哺乳動物細胞）上でのディスプレイに好適なディスプレイベクターも当該分野で公知であり、例えばウイルスベクター又はキメラタンパク質をコードするベクターである。
【００９９】
「固有」の制限部位とは、所与の核酸分子に１つだけ存在するか又は１回だけ出現する制限部位である。典型的には、そのような核酸分子は、本発明のライブラリメンバーをコードするベクターである。
【０１００】
用語「位置依存性アミノ酸使用頻度」は、ポリペプチドの所与の位置における特定のアミノ酸配列の出現可能性を指す。本発明では、位置依存性アミノ酸使用頻度は、個々の生殖細胞系遺伝子により分類された再編成アミノ酸配列について決定した。これにより、その天然生殖細胞系の状況内でＣＤＲを個々に正確に設計することが可能になる。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、用語「本質的に全て」は、参照する構成要素が多かれ少なかれ純粋であることを意味する。少量又は他の異なる構成要素のみが、構成要素の有利な特性を制限又は影響しない出口をもたらす。構成要素の性質に応じて、本質的に全てが、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の構成要素を指してもよい。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、用語「ＰＴＭ−低」は、潜在的な翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位を除去するために、ＫａｂａｔのＨ−ＣＤＲ１及び／又はＨ−ＣＤＲ２内で修飾されている、抗体生殖細胞系列ＶＨ及び／又はＶＬアミノ酸配列を指す。好ましくは、フレームワーク領域ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の潜在的なＰＴＭモチーフは、修飾されない。
【０１０３】
重鎖の、κ軽鎖の、及びλ軽鎖のＦＲ４についてのＪ領域アミノ酸配列は、それぞれ、表２で示されるように、ＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号３７）、ＦＧＡＧＴＫＶＥＬＫ（配列番号３８）、及びＦＧＧＧＴＱＬＴＶＬ（配列番号３９）である。
【０１０４】
発明の実施形態
特定の態様では、本開示は、少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＨ１領域のメンバーを含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。他の態様では、上記ライブラリは、少なくとも２種又は少なくとも３種又は少なくとも４種の生殖細胞系列ＶＨ１領域のメンバーを含む。
【０１０５】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域は、Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）から選択される。
【０１０６】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域は、Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）の最適化変異体から選択される。
【０１０７】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域は、Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）から選択される生殖細胞系列ＶＨ１領域と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性で同一である。
【０１０８】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域は、Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）から選択され、ここで翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位は除去されている。
【０１０９】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域は、Ｖｓ６１８−ＰＴＭ−低（配列番号９）、Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）、Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）、及びＶｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）から選択される。
【０１１０】
特定の態様では、本明細書で開示される合成イヌ抗体ライブラリは、偏りがない。特定の態様では、本明細書で開示される合成イヌ抗体ライブラリは、完全合成イヌ抗体ライブラリである。
【０１１１】
特定の態様では、本開示は、５０％超の天然イヌＶＨレパートリを含む、合成イヌ抗体ライブラリを提供する。他の態様では、上記ライブラリは、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、又は９５％超の天然イヌＶＨレパートリを含む。
【０１１２】
特定の態様では、本開示は、少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＬ領域のメンバーを含む合成イヌ抗体を提供する。
【０１１３】
他の態様では、上記ライブラリは、少なくとも２種又は少なくとも３種又は少なくとも４種又は少なくとも５種の生殖細胞系列ＶＬ領域のメンバーを含む。
【０１１４】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＬ領域は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（配列番号１５）から選択される。
【０１１５】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＬ領域は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（配列番号１５）の最適化変異体から選択される。
【０１１６】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＬ領域は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（配列番号１５）から選択される生殖細胞系列ＶＬ領域と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性で同一である。
【０１１７】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＬ領域は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（配列番号１５）から選択され、ここで翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位は除去されている。
【０１１８】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＬ領域は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）から選択される。
【０１１９】
特定の態様では、本開示は、５０％超の天然イヌＶＬレパートリを含む、合成イヌ抗体ライブラリを提供する。他の態様では、上記ライブラリは、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、又は９５％超の天然イヌＶＬレパートリを含む。
【０１２０】
特定の態様では、本開示は、少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＨ１領域及び少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＬ領域のメンバーを含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１２１】
他の態様では、上記ライブラリは、少なくとも２種又は少なくとも３種又は少なくとも４種の生殖細胞系列ＶＨ１領域、及び少なくとも２種又は少なくとも３種又は少なくとも４種又は少なくとも５種の生殖細胞系列ＶＬ領域のメンバーを含む。
【０１２２】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域及び生殖細胞系列ＶＬ領域のうちの１種以上は、最適化変異体生殖細胞系列ＶＨ１領域又は生殖細胞系列ＶＬ領域である。
【０１２３】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域は、Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）から選択され、上記生殖細胞系列ＶＬ領域は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）から選択される。
【０１２４】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域は、Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）から選択され、上記生殖細胞系列ＶＬ領域は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）から選択され、ここで翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位は除去されている。
【０１２５】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域は、Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）から選択される生殖細胞系列ＶＨ１領域と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性で同一であり、上記生殖細胞系列ＶＬ領域は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）から選択される生殖細胞系列ＶＬ領域と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性で同一である。
【０１２６】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域は、Ｖｓ６１８−ＰＴＭ−低（配列番号９）、Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）、Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）、及びＶｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、並びにＶｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶＳ８４３（λ）（配列番号１５）から選択される。
【０１２７】
特定の態様では、本開示は、少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＨ１領域、及び少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＬ領域のＶＨ／ＶＬ組合せを含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１２８】
他の態様では、上記ライブラリは、少なくとも２種又は少なくとも３種又は少なくとも４種の生殖細胞系列ＶＨ１領域、及び少なくとも２種又は少なくとも３種又は少なくとも４種又は少なくとも５種の生殖細胞系列ＶＬ領域のＶＨ／ＶＬ組合せを含む。
【０１２９】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域は、Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）  及びＶｓ６３５（配列番号２）から選択され、上記生殖細胞系列ＶＬ領域は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）から選択される。
【０１３０】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域は、Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）から選択され、上記生殖細胞系列ＶＬ領域は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）から選択され、ここで翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位は除去されている。
【０１３１】
特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域は、Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、及びＶｓ６３５（配列番号２）から選択される生殖細胞系列ＶＨ１領域と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性で同一であり、上記生殖細胞系列ＶＬ領域は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４），Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）から選択される生殖細胞系列ＶＬ領域と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性で同一である。特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域は、Ｖｓ６１８−ＰＴＭ−低（配列番号９）、Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）、Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）、及びＶｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）から、並びにＶｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）から選択される。
【０１３２】
特定の態様では、本開示は、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びに生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域ＶＳ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せから選択される１種以上のＶＨ／ＶＬ組合せを含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１３３】
本開示の特定の態様では、上記ＶＨ／ＶＬ組合せは、配列番号４、配列番号１、配列番号２、配列番号１２、配列番号１６、配列番号１４、配列番号１５、及び配列番号１３による生殖細胞系列ＶＨ１領域及び／又は生殖細胞系列ＶＬ領域と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性で同一である生殖細胞系列ＶＨ１又は生殖細胞系列ＶＬ領域を含む。
【０１３４】
特定の態様では、本開示は、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びに生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せから選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、又は少なくとも９種のＶＨ／ＶＬ組合せを含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１３５】
特定の態様では、本開示は、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びに生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せから選択される少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、又は少なくとも９種のＶＨ／ＶＬ組合せからなる合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１３６】
特定の態様では、本開示は、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びに生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せからなる合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１３７】
特定の実施形態では、本開示は、イヌＨ−ＣＤＲ３レパートリの天然のＨ−ＣＤＲ３の５０％超をカバーするＨ−ＣＤＲ３を含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。他の態様では、上記ライブラリは、６０％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超、又は９５％超の天然Ｈ−ＣＤＲ３長のイヌＨ−ＣＤＲ３レパートリを含む。
【０１３８】
特定の実施形態では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、ライブラリの本質的に全てのメンバーのＨ−ＣＤＲ３領域が、固有の制限部位に隣接しているライブラリを提供する。
【０１３９】
特定の態様では、本開示は、Ｋａｂａｔ長５〜１６のアミノ酸のＨ−ＣＤＲ３を含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。他の態様では、本開示は、Ｋａｂａｔ長５のアミノ酸、及び／又は６のアミノ酸、及び／又は７のアミノ酸、及び／又は８のアミノ酸、及び／又は９のアミノ酸、及び／又は１０のアミノ酸、及び／又は１１のアミノ酸、及び／又は１２のアミノ酸、及び／又は１３のアミノ酸、及び／又は１４のアミノ酸、及び／又は１５のアミノ酸、及び／又は１６のアミノ酸のＨ−ＣＤＲ３を含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１４０】
特定の態様では、本開示は、表４〜１５にて示すようなＨ−ＣＤＲ３設計を含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１４１】
特定の態様では、本開示は、Ｈ−ＣＤＲ３領域が少なくとも１．０＊１０９の多様性を有する合成イヌ抗体ライブラリを提供する。他の態様では、本開示は、Ｈ−ＣＤＲ３領域が少なくとも１．０＊１０１０、少なくとも１．０＊１０１１、少なくとも１．０＊１０１２、又は少なくとも１．０＊１０１３の多様性を有する合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１４２】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、ライブラリの本質的に全てのメンバーのＬ−ＣＤＲ３領域が、固有の制限部位に隣接しているライブラリを提供する。
【０１４３】
特定の態様では、本開示は、イヌＬ−ＣＤＲ３レパートリの天然のＬ−ＣＤＲ３の８０％超をカバーするＬ−ＣＤＲ３を含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。他の態様では、上記ライブラリは、８５％超、９０％超、又は９５％超の天然Ｌ−ＣＤＲ３長のイヌＬ−ＣＤＲ３レパートリを含む。
【０１４４】
特定の態様では、本開示は、長さ９のアミノ酸のＶκについてのＫａｂａｔ  Ｌ−ＣＤＲ３を含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。特定の態様では、本発明は、ライブラリの本質的に全てのＶκメンバーのＬ−ＣＤＲ３が、Ｋａｂａｔ長９のアミノ酸のものである合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１４５】
特定の態様では、本開示は、Ｋａｂａｔ長１０及び／又は１１のアミノ酸のＶλについてのＬ−ＣＤＲ３を含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。特定の態様では、本発明は、ライブラリの本質的に全てのＶλメンバーのＬ−ＣＤＲ３が、長さ１０及び／又は１１のアミノ酸のものである合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１４６】
特定の態様では、本開示は、表１６にて示すようなＶκＬ−ＣＤＲ３設計を含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１４７】
特定の態様では、本開示は、表１７〜１８にて示すようなＶλＬ−ＣＤＲ３設計を含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１４８】
特定の態様では、本開示は、Ｌ−ＣＤＲ３領域が少なくとも１．０＊１０４の多様性を有する合成イヌ抗体ライブラリを提供する。他の態様では、本発明は、Ｌ−ＣＤＲ３領域が少なくとも１．０＊１０５、少なくとも１．０＊１０６、少なくとも１．０＊１０７、又は少なくとも１．０＊１０８の多様性を有する合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１４９】
特定の態様では、本開示は、表４〜１５にて示すようなＨ−ＣＤＲ３設計並びに表１６及び表１７〜１８にて示すようなＬ−ＣＤＲ３設計を含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１５０】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、ファージ粒子上に効率的にディスプレイされるライブラリを提供する。
【０１５１】
更なる他の態様では、本開示は、少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＨ領域、及び少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＬ領域を含む合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリ中に含まれるＶＨ／ＶＬ組合せの各々が、効率的にディスプレイされるライブラリを提供する。ディスプレイの効率は、本明細書の実施例２．６で記載されるとおり、サンドイッチファージＥＬＩＳＡによって測定することができる。他の態様では、本開示は、少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＨ領域、及び少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＬ領域を含む合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリ中に含まれるＶＨ／ＶＬ組合せの各々が効率的にディスプレイされ、１ファージ当たり少なくとも０．５Ｆａｂのディスプレイ比を有するライブラリを提供する。更なる実施形態では、ディスプレイ比は、１ファージ当たり少なくとも０．６、少なくとも０．７、少なくとも０．８、少なくとも０．９、少なくとも１、少なくとも１．１、少なくとも１．２、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも１．６、少なくとも１．７、少なくとも１．８、少なくとも１．９、少なくとも２、少なくとも２．１、少なくとも２．２、少なくとも２．３、少なくとも２．４、少なくとも２．５、少なくとも２．６、少なくとも２．７、少なくとも２．８、少なくとも２．９、少なくとも３．０、少なくとも３．１、少なくとも３．２、少なくとも３．３、少なくとも３．４、少なくとも３．５、少なくとも３．６、少なくとも３．７、少なくとも３．８、少なくとも３．９、又は少なくとも４Ｆａｂである。
【０１５２】
更なる他の態様では、本開示は、少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＨ領域、及び少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＬ領域を含む合成イヌ抗体ライブラリにおいて、Ｆａｂフォーマットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現される本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のモノマー含有量を有するライブラリを提供する。更なる他の態様では、本開示は、少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＨ領域、及び少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＬ領域を含む合成イヌ抗体ライブラリにおいて、Ｆａｂフォーマットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現される上記ライブラリ中に含まれるＶＨ／ＶＬ組合せの各々が、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％のモノマー含有量を有するライブラリを提供する。
【０１５３】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、Ｆａｂフォーマットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されるライブラリを提供する。更なる他の態様では、本開示は、少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＨ領域、及び少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＬ領域を含む合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリ中に含まれるＶＨ／ＶＬ組合せの各々が、Ｆａｂフォーマットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でよく発現されるライブラリを提供する。Ｆａｂフォーマットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）での発現は、定量化することができる。
【０１５４】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、細菌培養において１ｍｇ／Ｌ超のレベルで発現されるライブラリを提供する。
【０１５５】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、細菌培養において５ｍｇ／Ｌ超のレベルで発現されるライブラリを提供する。
【０１５６】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、ほとんどのＶＨ／ＶＬ組合せが、細菌培養において１０ｍｇ／Ｌ超のレベルで発現されるライブラリを提供する。
【０１５７】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、又は少なくとも５種のＶＨ／ＶＬ組合せが、細菌培養において１ｍｇ／Ｌ超のレベルで発現されるライブラリを提供する。
【０１５８】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、ＩｇＧフォーマットの哺乳類系でよく発現されるライブラリを提供する。更なる他の態様では、本開示は、少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＨ領域、及び少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＬ領域を含む合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリ中に含まれるＶＨ／ＶＬ組合せの各々が、ＩｇＧフォーマットの哺乳類系でよく発現されるライブラリを提供する。ＩｇＧフォーマットの哺乳類系での発現は、定量化することができる。特定の態様では、上記哺乳類系は、哺乳類懸濁培養物である。他の態様では、上記哺乳類系は、哺乳類接着性細胞培養物である。特定の態様では、上記ＩｇＧフォーマットは、イヌＩｇＧ−Ｂフォーマットである。他の態様では、上記ＩｇＧフォーマットは、イヌＩｇＧ−Ａ、ＩｇＧ−Ｃ、又はＩｇＧ−Ｄフォーマットである。特定の態様では、上記哺乳類系は、ＨＫＢ１１細胞を含む。他の態様では、上記哺乳類系は、ＰＥＲＣ．６細胞を含む。更に他の態様では、上記哺乳類系は、ＣＨＯ細胞を含む。特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、ＩｇＧフォーマットの哺乳類系で５ｍｇ／Ｌ超のレベルで発現されるライブラリを提供する。特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、ＩｇＧフォーマットの哺乳類系で１０ｍｇ／Ｌ超のレベルで発現されるライブラリを提供する。特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、ほとんどのＶＨ／ＶＬ組合せが、ＩｇＧフォーマットの哺乳類系で１５ｍｇ／Ｌ超のレベルで発現されるライブラリを提供する。特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、又は少なくとも６種のＶＨ／ＶＬ組合せが、ＩｇＧフォーマットの哺乳類系で２０ｍｇ／Ｌ超のレベルで発現されるライブラリを提供する。
【０１５９】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリのメンバーの全て又は実質的に全てが、３０％（ｖ／ｖ）の濃度のイソプロアノール（ｉｓｏｐｒｏａｎｏｌ）で安定であるライブラリを提供する。安定したフレームワークの全てのＣＤＲ誘導体は、試験されたＶＨ／ＶＬ対のように動作することを前提としている。
【０１６０】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、全て又は実質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、熱的に安定であるライブラリを提供する。熱安定性は、本出願にて記載したように測定され得る。特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、６２℃超のＴｍを有するライブラリを提供する。他の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、６４℃超のＴｍを有するライブラリを提供する。更に他の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、６６℃超のＴｍを有するライブラリを提供する。更に他の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、ほとんどのＶＨ／ＶＬ組合せが、６８℃超のＴｍを有するライブラリを提供する。更に他の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、多くのＶＨ／ＶＬ組合せが、７０℃超のＴｍを有するライブラリを提供する。特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、全て又は実質的に全てのＶＨ１−組合せが、７０℃超のＴｍを有するライブラリを提供する。
【０１６１】
特定の態様では、本開示は、本明細書にて開示したようなライブラリをコードする核酸分子のコレクションを提供する。
【０１６２】
特定の態様では、本開示は、少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＨ１領域、及び少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＬ領域のメンバーを含む合成イヌ抗体ライブラリをコードする核酸分子のコレクションを提供する。他の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリをコードする核酸分子のコレクションにおいて、上記ライブラリが、少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＨ１領域、及び少なくとも２種又は少なくとも３種の生殖細胞系列ＶＬ領域のメンバーを含むコレクションを提供する。他の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリをコードする核酸分子のコレクションにおいて、上記ライブラリが、少なくとも２種又は少なくとも３種又は少なくとも４種の生殖細胞系列ＶＨ１領域、及び少なくとも２種又は少なくとも３種又は少なくとも４種の生殖細胞系列ＶＬ領域のメンバーを含み、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域をコードする上記核酸分子が、Ｖｓ６１８（配列番号２２）、Ｖｓ６２４（配列番号１９）、Ｖｓ６２８（配列番号２３）、及びＶｓ６３５（配列番号２０）から選択され、上記生殖細胞系列ＶＬ領域をコードする上記核酸分子が、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号３０）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号３２）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号３４）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）、及びＶｓ８３４（λ）（配列番号３３）から選択されるコレクションを提供する。特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域をコードする上記核酸分子は、Ｖｓ６１８（配列番号２２）、Ｖｓ６２４（配列番号１９）、Ｖｓ６２８（配列番号２３）、及びＶｓ６３５（配列番号２０）から選択され、上記生殖細胞系列ＶＬ領域をコードする上記核酸分子は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号３０）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号３２）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号３４）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）、及びＶｓ８３４（λ）（配列番号３３）から選択され、ここで翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位は除去されている。特定の態様では、上記核酸分子は、Ｖｓ６１８−ＰＴＭ−低（配列番号２２）、Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号２４）、Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号２８）、及びＶｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号２５）から、並びにＶｓ２３６（κ）（配列番号３０）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号３２）、Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号３６）、ＶＳ８４３（λ）（配列番号３３）、及びＶｓ３６５（λ）（配列番号３１）から選択される。
【０１６３】
特定の態様では、本開示は、少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＨ１領域、及び少なくとも１種の生殖細胞系列ＶＬ領域のＶＨ／ＶＬ組合せを含む合成イヌ抗体ライブラリをコードする核酸分子のコレクションを提供する。他の態様では、本開示は、少なくとも２種又は少なくとも３種又は少なくとも４種の生殖細胞系列ＶＨ１領域、及び少なくとも２種又は少なくとも３種又は少なくとも４種又は少なくとも５種の生殖細胞系列ＶＬ領域のＶＨ／ＶＬ組合せを含む合成イヌ抗体ライブラリをコードする核酸分子のコレクションを提供する。特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域をコードする上記核酸分子は、Ｖｓ６１８（配列番号２２）、Ｖｓ６２４（配列番号１９）、及びＶｓ６３５（配列番号２０）から選択され、上記生殖細胞系列ＶＬ領域をコードする上記核酸分子は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号３０）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号３４）、及びＶｓ３６５（λ）（配列番号３１）から選択される。特定の態様では、上記生殖細胞系列ＶＨ１領域をコードする上記核酸分子は、Ｖｓ６１８（配列番号２２）、Ｖｓ６２４（配列番号１９）、Ｖｓ６２８（配列番号２３）、及びＶｓ６３５（配列番号２０）から選択され、上記生殖細胞系列ＶＬ領域をコードする上記核酸分子は、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号３０）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号３２）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号３４）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号３３）から選択され、ここで翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位は除去されている。特定の態様では、上記核酸分子は、Ｖｓ６１８−ＰＴＭ−低（配列番号２２）、Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号２４）、及びＶｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号２５）から、並びにＶｓ２３６（κ）（配列番号３０）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号３２）、Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号３６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号３３）から選択される。
【０１６４】
特定の態様では、本開示は、Ｖｓ６１８（配列番号２２）、Ｖｓ６２４（配列番号１９）、Ｖｓ６２８（配列番号２３）、及びＶｓ６３５（配列番号２０）から選択される生殖細胞系列ＶＨ１領域をコードする核酸分子、並びにＶｓ２３６（κ）（配列番号３０）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号３２）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号３４）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号３３）から選択される生殖細胞系列ＶＬ領域をコードする核酸分子によってコードされるＶＨ／ＶＬ組合せから選択されるＶＨ／ＶＬ組合せを含む合成イヌ抗体ライブラリをコードする核酸分子のコレクションを提供する。本開示の特定の態様では、合成イヌ抗体ライブラリをコードする上記核酸分子は、Ｖｓ６１８（配列番号２２）、Ｖｓ６２４（配列番号１９）、Ｖｓ６２８（配列番号２３）、及びＶｓ６３５（配列番号２０）、Ｖｓ２３６（κ）（配列番号３０）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号３２）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号３４）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）、及び／又はＶｓ８４３（λ）（配列番号３３）から選択される核酸分子と、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％の同一性で同一である。
【０１６５】
特定の態様では、本開示は、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号２２）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号３０）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１９）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号３０）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２０）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３２３（λ）（配列番号３４）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号２２）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１９）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）をコードする核酸分子、並びに生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２０）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１））をコードする核酸分子によってコードされる、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、又は少なくとも９種のＶＨ／ＶＬ組合せを含む合成イヌ抗体ライブラリをコードする核酸分子のコレクションを提供する。特定の態様では、核酸は、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号２２）、生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号３０）、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１９）、生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号３０）、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２０）、生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３２３（λ）（配列番号３４）、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号２２）、生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１９）、生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２０）、及び／又は生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）をコードする核酸のうちの１種以上の最適化変異体である。特定の態様では、核酸は、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号２２）、生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号３０）、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１９）、生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号３０）、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２０）、生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３２３（λ）（配列番号３４）、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号２２）、生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４（配列番号１９）、生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５（配列番号２０）、及び／又は生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）をコードする核酸のうちの１種以上のＰＴＭ−低の変異体である。
【０１６６】
特定の態様では、本開示は、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８−ＰＴＭ−低（配列番号２７）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号３０）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号２４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号３０）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号２５）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号３６）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８−ＰＴＭ−低（配列番号２７）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号２４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）をコードする核酸分子、並びに生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号２５）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号３１）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号２２）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号３３）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号２４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号３３）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号２５）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号３３）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号２２）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号３６）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号２４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号３６）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号２２）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号３２）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号２４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号３２）をコードする核酸分子、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号２５）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号３２）をコードする核酸分子によってコードされる、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種、少なくとも６種、少なくとも７種、少なくとも８種、又は少なくとも９種のＶＨ／ＶＬ組合せを含む合成イヌ抗体ライブラリをコードする核酸分子のコレクションを提供する。
【０１６７】
特定の態様では、本開示は、本開示の実施形態で開示される核酸分子をコードするベクターを提供する。
【０１６８】
特定の態様では、本開示は、本開示の実施形態で開示される核酸分子を含む組換え宿主細胞を提供する。
【０１６９】
一態様では、本開示は、抗原に特異的な抗体を単離するための方法において、上記方法が：
（ａ）本明細書で開示される実施形態の何れか１つに記載のライブラリを抗原と接触させるステップと、
（ｂ）抗原に結合しないライブラリのメンバーを除去するステップと、
（ｃ）抗原に結合しているライブラリのメンバーを回収するステップと、
を含む方法を提供する。
【０１７０】
特定の態様では、本開示は、好ましい生物物理学的特性を有するイヌ抗体を提供する。このような抗体は、ｉｎ−ｖｉｖｏでの成熟を受けていない合成ライブラリに由来する抗体の不足がない。このような好ましい所望の生物物理学的特性には、より高い安定性、より高い発現レベル、及び凝集傾向の低さが含まれる。
【０１７１】
特定の態様では、本開示は、本開示によって検討されるイヌライブラリから単離される抗体を提供する。特定の態様では、上記抗体は、本開示によって検討されるイヌライブラリから単離される抗体の修飾又は、変異抗体であってもよい。
【０１７２】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１７３】
特定の態様では、本開示は、以下の生殖細胞系列ＶＨ１領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４（配列番号１）、Ｖｓ６２８（配列番号５）、及びＶｓ６３５（配列番号２）のうちの少なくとも１種のメンバーを含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１７４】
特定の態様では、本開示は、以下の生殖細胞系列ＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３（λ）（配列番号１６）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８３４（λ）（配列番号１５）のうちの少なくとも１種を含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１７５】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位が、生殖細胞系列ＶＨ領域又は生殖細胞系列ＶＬ領域のうちの１種以上から除去されるライブラリを提供する。
【０１７６】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリがＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）、Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）、及びＶｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、並びにＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８３４（λ）（配列番号１５）を含むライブラリを提供する。
【０１７７】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが以下のＶＨ／ＶＬ組合せ：ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及び  ＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域ＶＳ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せのうちの１種以上を含むライブラリを提供する。
【０１７８】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリの本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、１ファージ当たり少なくとも０．５Ｆａｂのディスプレイ比で、効率的にディスプレイされるライブラリを提供する。
【０１７９】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、Ｆａｂフォーマットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現される場合に、少なくとも８５％のモノマー含有量を有するライブラリを提供する。
【０１８０】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、ＩｇＧフォーマットの哺乳類系で発現される場合に、少なくとも９０％のモノマー含有量を有するライブラリを提供する。
【０１８１】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、熱的に安定であるライブラリを提供する。特定の態様では、本開示は、上述のライブラリのメンバーをコードする核酸分子のコレクションを提供する。
【０１８２】
特定の態様では、本開示は、上述の核酸分子をコードするベクターを提供する。
【０１８３】
特定の態様では、本開示は、上述の核酸分子又は上述のベクターを含む組換え宿主細胞を提供する。
【０１８４】
特定の態様では、本開示は、抗原に特異的な抗体を単離するための方法において、上記方法が：
（ａ）上述のライブラリを抗原と接触させるステップと、
（ｂ）抗原に結合しないライブラリのメンバーを除去するステップと、
（ｃ）抗原に結合しているライブラリのメンバーを回収するステップと、
を含む方法を提供する。
【０１８５】
特定の態様では、本開示は、上述のライブラリから単離されるか、又は上述の方法により単離される抗体を提供する。
【０１８６】
特定の態様では、本開示は、ＶＨ１から選択される生殖細胞系列ＶＨ領域のメンバーを含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１８７】
特定の態様では、本開示は、以下のＶＨ１領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）、Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）、及びＶｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）のうちの少なくとも１種のメンバーを含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１８８】
特定の態様では、本開示は、κＶ−ＩＩＩ、λＶ−Ｉ、及びλＶ−ＩＩＩから選択される生殖細胞系列ＶＬ領域のメンバーを含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１８９】
特定の態様では、本開示は、以下のＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）のうちの少なくとも１種を含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１９０】
特定の態様では、本開示は、ＶＨ領域：Ｖｓ６１８（配列番号４）、Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）、Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）、及びＶｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）、並びにＶＬ領域：Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）、Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）、Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）、Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）、及びＶｓ８４３（λ）（配列番号１５）を含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。特定の態様では、本開示は、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及び  ＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、生殖細胞系列ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及び生殖細胞系列ＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２３−ＰＴＭ−低（λ）（配列番号１８）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６１８（配列番号４）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２４−ＰＴＭ−低（配列番号６）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ３２１（λ）（配列番号１４）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６３５−ＰＴＭ−低（配列番号７）及びＶＬ領域Ｖｓ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域ＶＳ２３６（κ）（配列番号１２）のＶＨ／ＶＬ組合せ、ＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ３６５（λ）（配列番号１３）のＶＨ／ＶＬ組合せ、並びにＶＨ１領域Ｖｓ６２８−ＰＴＭ−低（配列番号１０）及びＶＬ領域Ｖｓ８４３（λ）（配列番号１５）のＶＨ／ＶＬ組合せから選択されるＶＨ／ＶＬ組合せを含む合成イヌ抗体ライブラリを提供する。
【０１９１】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリがイヌＨ−ＣＤＲ３レパートリの天然のＨ−ＣＤＲ３長の５０％超をカバーするＨ−ＣＤＲ３を含むライブラリを提供する。
【０１９２】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリがＫａｂａｔ長５〜１６のアミノ酸のＨ−ＣＤＲ３を含むライブラリを提供する。
【０１９３】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが表４〜表１５にて示すようなＨ−ＣＤＲ３設計を有するライブラリを提供する。
【０１９４】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリがＨ−ＣＤＲ３領域において、少なくとも５Ｅ＋０９の多様性を有するライブラリを提供する。
【０１９５】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、ライブラリのＬ−ＣＤＲ３がＫａｂａｔ長８のアミノ酸（κ）並びにＫａｂａｔ長１０及び１１のアミノ酸（λ）のものであるライブラリを提供する。
【０１９６】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが表１６及び表１７〜表１８にて示すようなＬ−ＣＤＲ３設計を有するライブラリを提供する。
【０１９７】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリがＬ−ＣＤＲ３領域において、少なくとも１Ｅ＋０４の多様性を有するライブラリを提供する。
【０１９８】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリの本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、効率的にディスプレイされるライブラリを提供する。
【０１９９】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリの本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、効率的にディスプレイされ、１ファージ当たり少なくとも０．５Ｆａｂのディスプレイ比を有するライブラリを提供する。
【０２００】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、Ｆａｂフォーマットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されるライブラリを提供する。
【０２０１】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、Ｆａｂフォーマットの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現される本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、少なくとも８５％のモノマー含有量を有するライブラリを提供する。
【０２０２】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、ＩｇＧフォーマットの哺乳類系で発現されるライブラリを提供する。
【０２０３】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、ＩｇＧフォーマットの哺乳類系で発現される本質的に全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、少なくとも９０％のモノマー含有量を有するライブラリを提供する。
【０２０４】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、全てのＶＨ／ＶＬ組合せが、熱的に安定であるライブラリを提供する。
【０２０５】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、ライブラリの本質的に全てのメンバーのＨ−ＣＤＲ３領域が、固有の制限部位に隣接しているライブラリを提供する。
【０２０６】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、ライブラリの本質的に全てのメンバーのＬ−ＣＤＲ３領域が、固有の制限部位に隣接しているライブラリを提供する。
【０２０７】
特定の態様では、本開示は、合成イヌ抗体ライブラリにおいて、上記ライブラリが偏りがないライブラリであるライブラリを提供する。
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【実施例】
【０２０８】
実施例１：合成イヌ抗体ライブラリの生成
本開示は、イヌ免疫レパートリ中に存在するイヌＶＨ及びＶＬ遺伝子対を含む抗体候補のコレクション又はライブラリにおいて、望ましくない翻訳後修飾（ＰＴＭ）部位を除去して、抗体発現及び生物物理学的特性を更に最適化するために、各メンバーが生殖細胞系列遺伝子配列又は修飾された生殖細胞系列配列（ＰＴＭ−低と称される）を含むコレクション又はライブラリを提供する。ライブラリに組み込むために選択されたＶＨ及びＶＬ対は、ライブラリから選択された抗体の各々が都合よく開発可能である可能性を高める有利な生物物理学的特性を含む。ライブラリの組成を決定するために、複数の基準を評価する必要があった。以下の実施例は、評価された基準、評価方法、及び結果について記載する。
【０２０９】
実施例１．１：候補となるＶＬ−及びＶＨ−生殖細胞系列配列の選択
第１ステップでは、イヌ免疫レパートリからの優勢ＶＨ及びＶＬ生殖細胞系列遺伝子を、文献（Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２０１０  Ｓｅｐ  １５；１３７  （１−２）：６４−７５；Ｓｔｅｉｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４  Ｍａｙ；５９（１）：７１−８）から、及びＢａｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２０１０  Ｓｅｐ；１３７（１−２）：６４−７５）、Ｂｒａｇａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖｅｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ．２０１１  Ｊａｎ；１３９（１）：２７−４０）、Ｖｇｅｎｅｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ．ｏｒｇ  ａｎｄ  ＡｂＹｓｉｓ  （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｙｓｉｓ２．７／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）から入手可能な再配列されたイヌ抗体配列の分析により同定した。全体で、３００超の再配列されたイヌＶＨ、１００Ｖκより大きい、及び１５０より大きいＶλ配列を分析した。効率的な抗原−抗体相互作用のために、広いコンフォメーション−空間が有益である可能性があることが認識されているため、最終選択に構造的に異なる配列を含めるように注意した。したがって、第２ステップでは、イヌ生殖細胞系列レパートリからの構造的に多様なＶＨ及びＶＬ（Ｖκ及びＶλ）遺伝子を、距離分析により同定した。結果を図１、図２、及び図３に示す。
【０２１０】
制限酵素についてフランキング部位を有するＶ領域は、ｈｕ４Ｄ５−８抗体のＣＤＲ−Ｈ３（ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ）（配列番号４３）、及びκＣＤＲ−Ｌ３（ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ）（配列番号４４）、並びにλ様ＣＤＲ−Ｌ３（ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＶＶ）（配列番号４５）配列、並びにイヌＪＨ、Ｊκ、及びＪλ生殖細胞系列タンパク質配列（表２参照）をそれぞれ用いてＧｅｎｅＡｒｔによって合成した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現に関するコドン使用最適化（まれなヒトコドンの回避）、非常に高い（＞８０％）又は非常に低い（＜３０％）ＧＣ含有量の領域の回避、並びにＲＮＡ不安定化モチーフなどの潜在的なシス作用配列モチーフ、並びに潜在的なスプライスドナー部位及び受容体部位の除去を、ＧｅｎｅＡｒｔにより実施した。合成されたＩｇＶ領域重鎖遺伝子は、ＶからＣ領域の境界に位置するＸｈｏＩの固有の３’制限部位に対するＭｆｅＩの固有の５’制限部位を含有する第１アミノ酸からの完全配列（ＥＶＱＬ）（配列番号４６）をカバーした。ＣＤＲ−Ｈ３の上流に、ＢｓｓＨＩＩのための制限部位を組み込み、後続のＣＤＲ−Ｈ３ライブラリ挿入を可能にした。ＩｇＶκ及びＶλ領域軽鎖遺伝子配列は、修飾ｏｍｐＡリーダー配列に位置するＮｄｅＩの第１の固有の５’制限部位から、フレームワーク領域（ＦＲ４）のＡｃｃ６５Ｉ／ＫｐｎＩの３’制限部位までの範囲であった。ＣＤＲ−Ｌ３の上流に、ＢｂｓＩの制限部位を組み込み、後続のＣＤＲ−Ｌ３ライブラリ挿入を可能にした。次いで、５種の選択されたＶＨ、４種のＶλ、及び２種のＶκ遺伝子からＶＨ／ＶＬ遺伝子対を組み合わせて、３０種のＶＨ／ＶＬ組合せを作製した。標準的な分子生物学の技術を使用して、５種のＶＨ領域コンストラクト（コンストラクトＡ〜Ｅ）を、２種のＶκ領域コンストラクト（＃１〜＃２）又は４のＶλ領域コンストラクト（＃３〜＃６）と共に、ファージディスプレイベクターｐＣａＤｉｓ１８（ｇＩＩＩ−Ｆａｂ遺伝子融合）（図９参照）及び細菌Ｆａｂ発現ベクターｐＣａＢｘ＿ＦＨ（図１０参照）中にクローニングした。保持された全ての組合せを、配列検証した。最後に、これらの３０種のＶＨ／ＶＬ対を実験的に比較して、好ましい生物物理学的特性を有するＶＨ／ＶＬ遺伝子対のサブセットを同定した。少なくとも以下の特性を評価した：１）ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ分析：ａ）ＣＤＲ１＋ＣＤＲ２の長さ；ｂ）翻訳後修飾（ＰＴＭ）モチーフ；ｃ）ＣＤＲ中のメチオニンの存在；ｄ）システインの存在；２）Ｆａｂディスプレイ比；３）Ｆａｂ及びＩｇＧ発現比及び収率；４）Ｆａｂ及びＩｇＧモノマー含有量。
【０２１１】
実施例１．２：イヌＨ−ＣＤＲ３の設計
抗体と抗原の最も近い接触部位は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）である。Ｈ−ＣＤＲ３及びＬ−ＣＤＲ３は、抗原結合に主要な役割を果たしているため、これら２つのＣＤＲに主に変動性が導入された。全ての他のＣＤＲについて、生殖細胞系列配列又はＰＴＭモチーフが除去された修飾生殖細胞系列配列を使用した。
【０２１２】
システイン残基は、バインダをパニング標的と共有結合させるジスルフィド結合の形成、又は抗体ホモダイマーの形成に関与する可能性があるため、一般に、ＣＤＲ３の設計においては、システイン残基を回避した。このようなバインダは、標的選択的である可能性は低い。
【０２１３】
イヌＣＤＲ３の設計のために、再配列された抗体−配列をコンパイルし、Ｈ−ＣＤＲ３及びＬ−ＣＤＲ３を分析した。Ｈ−ＣＤＲ３はＤセグメント及びＪセグメントによってＶＨに依存せずにコードされるため、Ｈ−ＣＤＲ３の分析は、ＶＨ生殖細胞系列ファミリーに関係なく、全ての再配列された配列に対して行われた。
【０２１４】
記述されているとおり、本発明のアミノ酸分布分析により、イヌＶＨ  ＣＤＲ３における最も頻繁なアミノ酸モチーフが、ＩＭＧＴ位置１０４〜１０６（Ｃｈｏｔｈｉａ位置９２〜９４）でのＣＡＲ／ＣＡＫであり、ＩＭＧＴ位置１１５〜１１７（Ｃｈｏｔｈｉａ位置１００ｘ〜９４）についてはＦＤＹモチーフ（Ｓｔｅｉｎｉｇｅｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５９  （２０１４）  ７１−７８）であることを確認した。
【０２１５】
例えば、システインの完全な回避、トリプトファン使用量の削減、及びグリコシル化部位（ＮｘＳ、ＮｘＴ）の回避によって、観察されたアミノ酸分布をわずかに修飾し、ライブラリ中のＨ−ＣＤＲ３の長さが５〜１６のアミノ酸の設計を完成させた（表４〜表１５参照）。
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【０２１６】
実施例１．３．：Ｌ−ＣＤＲ３の設計
Ｌ−ＣＤＲ３はＪセグメントによって生殖細胞系列に依存せずに部分的にコードされるため、Ｌ−ＣＤＲ３の分析は、ＶＬ生殖細胞系列ファミリーに関係なく、全ての再配列された配列に対して行われた。イヌの再配列されたＶκ配列の分析に基づき、Ｋａｂａｔ  Ｌ−ＣＤＲ３の長さが９のアミノ酸が、全てのＶκ配列の約８５％中に発生する。したがって、ライブラリ中のＶκ領域についてのＫａｂａｔ  Ｌ−ＣＤＲ３の長さは、長さ９のアミノ酸に設定した（表１６参照）。Ｖλ配列について、最も頻繁なＫａｂａｔ  Ｌ−ＣＤＲ３の長さは、１１ａａ（６０％）、続いて１０ａａ（３０％）である。したがって、ライブラリ中のＶλ領域についてのＫａｂａｔ  Ｌ−ＣＤＲ３の長さは、長さ１０及び１１のアミノ酸に設定した（表１７及び表１８参照）。例えば、システインの完全な回避、及びグリコシル化部位（ＮｘＳ、ＮｘＴ）の回避によって、観察されたアミノ酸分布をわずかに修飾し、ライブラリ中のＬ−ＣＤＲ３の設計を完成させた。
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【０２１７】
実施例１．４：イヌライブラリの多様化
本実験で生成されたイヌ抗体ライブラリは、多様化したＬ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ３領域を含む。システイン及び停止コドンの導入を防ぐＣＤＲ３−カセットへの望ましいコドンのみの制御された組み込みを可能にするＳｌｏｎｏｍｉｃｓ技術によって、ＣＤＲ３ライブラリカセットを生成した（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｕｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．２００８  Ｓｅｐ；４５（３）：３４０−３）。ライブラリ生成後の非選択クローンのシーケンシングにより、Ｌ−ＣＤＲ３及びＨ−ＣＤＲ３カセットの望ましくないＤＮＡ変異、欠失、挿入、及びフレームシフトの全体的な発生率が低いことが示された。
【０２１８】
本発明者らは、ＶＨ及びＶＬドメインの生化学的及び生物物理学的特性は、それぞれＨ−ＣＤＲ３及びＬ−ＣＤＲ３配列にも依存すると推論したため、ＶＨ／ＶＬ比較の目的で、特定のＨ−ＣＤＲ３、κＬ−ＣＤＲ３、及びλＬ−ＣＤＲ３配列をそれぞれ選択されたイヌＶＨ、Ｖκ、及びＶλ遺伝子に導入することを決定した。Ｈ−ＣＤＲ３（ＷＧＧＤＧＦＹＡＭＤＹ）（配列番号４３）及びκＬ−ＣＤＲ３配列（ＱＱＨＹＴＴＰＰＴ）（配列番号４４）は、抗体ｈｕ４Ｄ５−８から誘導され（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９２；８９：４２８５−９；）、全てがヒトのマスター遺伝子の評価に以前に適用されたλ様Ｌ−ＣＤＲ−３（ＱＳＹＤＳＳＬＳＧＶＶ）（配列番号４５）が使用された（Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９６，５７−８６，Ｅｗｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００３；３２５：５３１−５３）。
【０２１９】
実施例１．５  ディスプレイ及び発現ベクター
ｐＭＯＲＰＨ１８（Ｒａｕｃｈｅｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｏｃｔ  ３；２７８  （４０）：３８１９４−２０５）及びｐＭＯＲＰＨｘ３０（Ｐｒａｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１１  Ｏｃｔ  １４；４１３（１）：２６１−７８）ベクターを、それぞれ、新しいＦａｂディスプレイｐＣａＤｉｓ１８及びＦａｂ発現ベクターｐＣａＢｘを生成するためのテンプレートとして、以下の修飾を加えて使用した。両ベクターについて、Ｉｇ軽鎖コード配列の上流のｏｍｐＡリーダー配列を、Ｃ末端で修飾し、それぞれ制限部位ＮｄｅＩを導入して、ＶＬ及びＶＨタンパク質配列の本物のＮ末端を確保し、ｐＣａＭｘ  ＩｇＧベクターへのＦａｂ断片の好都合なサブクローニングを可能にした。加えて、哺乳類ＩｇＧ発現ベクターセットを構築した。ＧｅｎｅＡｒｔ（Ｈ．サピエンスコドン最適化）により、イヌＩｇＧ  ＣＨ１及びＣλ及びＣκ配列を合成した。ＣＨコンストラクトを、Ｋａｎ  ｓｔｕｆｆｅｒ  （ｐＣａＭｘ＿Ｓｔｕｆｆｅｒ）を含有するｐＭ４＿ベクター中にクローニングした。２つのコドン最適化Ｃλ及びＣκ配列を、一般的なＧｅｎｅａｒｔベクター中にクローニングした（ｐＭＡ−Ｔ＿ＣａＭｉｎ  κ  ｐＭＡ−Ｔ＿ＣａＭｉｎ  λ）。最先端の分子生物学の方法を使用して、ＩｇＧ変換を実施した。
【０２２０】
実施例２．イヌＶＨ／ＶＬ対の生物物理学的特性評価
以下の実施例は、イヌＶＨ／ＶＬ対の生物物理学的特性評価の方法及び結果を記載する。
【０２２１】
実施例２．１  ファージの調製
実施例１．１で合成された抗体組合せを、機能性試験用にＦａｂディスプレイベクターｐＣａＤｉｓ中にクローニングした。ベクターには５種のＶＨ及び６種のＶＬマスター遺伝子の組合せが含まれ、３０種の可能な組合せを得た。２ｘＹＴ／Ｃａｍ／１％グルコース培地でウェルの各々を満たし、それらを３０種の生成された抗体コンストラクトからのシングルクローンとともに接種することによりマスタープレートを生成した。プレートを振盪しながら３７℃で一晩インキュベートした。翌日、マスタープレートを最終濃度１５％グリセロールで保存し、−８０℃で凍結した。ファージ調製物について、２ｘＹＴ／Ｃａｍ／１％グルコースに、マスタープレート由来のグリセロストック（ｇｌｙｃｅｒｏｓｔｏｃｋｓ）を接種し、ＯＤ６００ｎｍが０．５に達するまで、４００ｒｐｍにて振盪しながらインキュベートした。次いで、細胞にＶＣＳＭ  １３ヘルパーファージを感染させ、振盪することなく３７℃で３０分間、次いで、４００ｒｐｍにて振盪しながら更に３０分間インキュベートした。細菌を遠心分離にかけ、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール、５０μｇ／ｍｌのカナマイシン及び０．２５ｍＭのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを含む２ｘＹＴ培地（２ｘＹＴ／Ｃａｍ／Ｋａｎ／ＩＰＴＧ）中に再懸濁させ、ファージ生成のために更に２２℃で１８〜２０時間インキュベートした。Ｆａｂ提示ファージを含有する上清を新しいチューブに移し、上清量の１／５のＰＥＧ／ＮａＣｌ（２０％のＰＥＧ６０００、ｄｄＨ２Ｏ中２．５ＭのＮａＣｌ）を使用してファージを沈殿させた。遠心分離及び上清の除去後、ファージペレットを滅菌ＰＢＳ中に再懸濁させた。ＯＤ２６８ｎｍでの吸光度測定（Ｎａｎｏｄｒｏｐ，ｐｅｑｌａｂ）により、ファージ力価を決定し、ＬＢ／Ｃａｍ／Ｇｌｕｃプレート上の感染大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＴＧ１Ｆ＋細胞の限界希釈プレーティングによって確認した。
【０２２２】
実施例２．２  ウェスタンブロットによるＦａｂファージディスプレイ比
実施例２．１のように調製したファージ上清を使用して、ウェスタンブロット技術を用いて、ファージ粒子上のファージディスプレイ比を決定した。
【０２２３】
総容量１０μｌの約１Ｅ＋０９ファージを４×ＬＤＳローディング色素と混合し、８０℃で１０分間加熱した。ゲル（ＮＵＰＡＧＥ  ４〜１２％のＢｉｓ−Ｔｒｉｓ−ゲル、１．０ｍｍ×１２ウェル、Ｎｏｖｅｘ、カタログＮＰ０３２２Ｂｏｘ）を、ランニングチャンバに入れ、チャンバに１×ＭＥＳランニングバッファー（ＮＵＰＡＧＥ  ＭＥＳ  ＳＤＳランニングバッファー、２０×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから調製した）を充填した。サンプル及びマーカーをゲル上にロードし、電気泳動を２００Ｖで３５分間実施した。ゲルを除去し、ｄｄＨ２０で洗浄し、タンパク質のウェスタンブロットメンブレンへの転写を、ｉＢｌｏｔの開口で実施した。その後、メンブレンを室温で１．５時間、ＴＢＳ−Ｔ中の１０％粉乳でブロックした。メンブレンを素早くＴＢＳ−Ｔで洗浄し、抗−ｐＩＩＩ抗体（マウス抗−ｐＩＩＩ、ＭｏＢｉＴｅｃ、カタログ：ＰＳＫＡＮ３；ＴＢＳ−Ｔ中１：１０００  ３％ＭＰ）とともに室温で１時間インキュベートした。３×５分の洗浄ステップ後、メンブレンを抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｐ９）、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、コード１１５−０３６−０６２；ＴＢＳ−Ｔ中１：１０’０００、３％ＭＰ）とともに室温で１時間インキュベートした。メンブレンをＴＢＳ−Ｔで３×５分洗浄し、ＨＲＰ基質（イモビロンウェスタンＨＲＰ気質、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，カタログＷＢＫＬＳ０５００）の添加後に、Ｂｉｏｒａｄ  Ｉｍａｇｅｒ（プログラム：タンパク質マーカーを示すための「ブロット比色分析」、及びＨＲＰ検出を示すための「ブロット化学」）で化学発光を記録した。抗−ｐＩＩＩウェスタンブロットで、ｐＩＩＩ（ｆｌ）及びｐＩＩＩ（ｃｔ）−Ｆｄの相対量を決定した。結果を図４に示す。
【０２２４】
ファージ粒子上のライブラリメンバーの効率的なディスプレイは、ファージディスプレイの選択を成功させるための必要条件である。本発明者らは、ＦａｂフォーマットのイヌＶＨ／ＶＬ組合せのディスプレイ効率を決定するために、ウェスタンブロットを使用した。それらのデータは、本質的に全ての試験されたイヌＶＨ／ＶＬ組合せがファージ上にディスプレイされることを示した。結果を図５に示す。
【０２２５】
実施例２．３  相対的なＦａｂ発現  ＥＬＩＳＡ
ｐＣａＢｘ中にクローニングされた３０種のＶＨ／ＶＬ組合せのクローンを、成長培地（２ｘＹＴ／Ｃａｍ／ＩＰＴＧ／０．１％グルコース）に接種し、培地がわずかに濁るまで４００ｒｐｍで約３時間振盪しながら３７℃でインキュベートした。続いて、培養物を２２℃で振盪しながら一晩インキュベートした後、ＢＥＬバッファー（２４．７ｍｇ／ｍｌのホウ酸、１８．７ｍｇ／ｍｌのＮａＣｌ、１．４８ｍｇ／ｍｌのＥＤＴＡ、２．５  ｍｇ／ｍｌのリゾチーム、１０ＭのＮａＯＨでｐＨ８．０に調整されている）を使用して細胞を溶解し、ＰＢＳ中の１０％粉乳でブロックした。抗−イヌＦ（ａｂ’）２断片特異的捕捉抗体（ウサギ抗−犬ＩｇＧ  Ｆａｂ’２抗体  非コンジュゲート；ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，  ＬＳ−Ｃ６９７２９）、及びＡＰ−コンジュゲート抗−犬ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２断片検出抗体（ヤギ抗−犬ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−アルカリホスファターゼ抗体、Ｓｉｇｍａ  ＳＡＢ３７０００９７）を  ＡｔｔｏＰｈｏｓ（Ｒｏｃｈｅ）とともに使用して、ＥＬＩＳＡによりＦａｂ発現を決定した。相対的なＦａｂ発現レベルは、それぞれのＦａｂ  ＶＨ／ＶＬ対のシグナルから参照ヒト／イヌキメラ抗体のシグナルを除算することにより計算された。８５％超の試験されたＦａｂ  ＶＨ／ＶＬ対は、対照の少なくとも０．５の相対発現を示した。λクローンは、平均して、最も高い相対的Ｆａｂ発現レベルを有した。結果を図６に示す。
【０２２６】
実施例２．４  Ｈｉｓ−タグ付きＦａｂ断片の実験的スケールでの生成
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ−１  Ｆ細胞における細菌発現ベクターによってコードされたＦａｂ断片の発現を、０．１％グルコース及び３４μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを追加した５００ｍｌの２ｘＹＴ培地を使用して振盪フラスコ培養で実施した。ＯＤ６００が０．５の値に達するまで、培養物を振盪させた。ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）を添加して、更に２０時間培養することにより、Ｆａｂ発現を誘導した。細胞を回収し、リゾチームを使用して破壊した。Ｈｉｓ６タグ付き（配列番号４７）Ｆａｂ断片をＩＭＡＣ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により単離し、イミダゾールを使用して溶離した。「ＰＤ１０」カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１×ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．２）とのバッファー交換を実施した。サンプルを無菌濾過した（０．２μｍ）。タンパク質濃度を、ＵＶ分光測定法により決定した。サンプルの純度を、変性、非還元１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。３０種のイヌＶＨ／ＶＬ対の各々を表す精製Ｆａｂ断片の％モノマーを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定した。ＳＥＣを、ＡｅＫＴＡ精製システム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施した。分離には、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５  ＨＲ  １０／３０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。各サンプルについて、１０μｌのタンパク質をカラムにロードし、０．０５ｍＬ／分の流量で分離を実施し、２６０及び２８０ｎｍでのＵＶ吸収を記録、分析した。ランニングバッファーは、Ｇｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＳＡ）で構成された。結果を図７に示す。
【０２２７】
図６及び図７にて示すように、全ての試験されたイヌＶＨ／ＶＬ組合せは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現され、精製されたＦａｂの発現率は、０．２ｍｇ／Ｌ〜８ｍｇ／Ｌの細菌培養物（棒、左のｙ軸）の範囲であった。更に、単離された材料の特性評価により、精製されたイヌＦａｂＶＨ／ＶＬの大部分が８５％超のモノマー形態であることが明らかとなった。これは、ライブラリを使用したイヌ抗体の開発に対する有用性を示している。
【０２２８】
実施例２．５  ＩｇＧの探索的スケールの生成及びモノマー含有量の決定
真核生物ＨＫＢ１１細胞に、ＩｇＧの重鎖及び軽鎖の両方をコードするｐＣａＭｘ哺乳類発現ベクターＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション後３又は６日目に細胞培養上清を回収し、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳＵＲＥ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に供した。１×ダルベッコＰＢＳ（ｐＨ７．２）でバッファー交換を実施し、サンプルを無菌濾過した（０．２μｍ孔径）。
【０２２９】
タンパク質濃度を、ＵＶ分光測定法により測定し、ＩｇＧの純度をＣＥ−ＳＤＳ（ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、変性、還元、及び非還元条件下で分析した。３０種のイヌＶＨ／ＶＬ対の各々を表す精製ＩｇＧ１の％モノマーを、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）により決定した。Ｗｙａｔｔ  ｍｉｎｉＤＡＷＮ  Ｔｒｅｏｓ及びＷｙａｔｔ  Ｏｐｔｉｌａｂ  ｒＥＸ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｄｅｒｎｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と組み合わせたＤｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００チタンＨＰＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｇｅｒｍｅｒｉｎｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、ＨＰ−ＳＥＣを実施した。分離には、Ｔｏｓｏｈ  ＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。各サンプルについて、１５μｇのタンパク質をカラムにロードし、０．５ｍｌ／分の流量で分離を実施し、２８０ｎｍでのＵＶ吸収を記録分析した。ランニングバッファーは、Ｇｉｂｃｏ  Ｄ−ＰＢＳ、ｐＨ７．４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｐａｉｓｌｅｙ，ＵＳＡ）で構成された。結果を図８に示す（点、右のＹ軸）。十分な発現率を有するコンストラクトは、＞９５％の優れたモノマー含有量を示した。ライブラリクローニング及びＣＤＲ３多様化のスキャホールドとして使用されるＶＨ／ＶＬ組合せの選択について、Ｆａｂに加えてＩｇＧ生産データの両方が考慮された。
【０２３０】
実施例２．６  相対Ｆａｂファージディスプレイ比  ＥＬＩＳＡ
主要コートタンパク質ｐＶＩＩＩを介したファージを捕捉するために、抗−Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して、及びディスプレイされたＦａｂと結合する抗−Ｆｄ抗体（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ）を使用して、ＥＬＩＳＡによりＭ１３ファージ上のＦａｂディスプレイを測定した。ファージ上清及び参照サンプルの適切な希釈物が、抗−Ｍ１３ペルオキシダーゼコンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びＱｕａｎｔａ  Ｂｌｕ（商標）（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出された。抗−Ｆｄの力価を抗−Ｍ１３の力価で除算することにより、各サンプルについての相対ディスプレイ比の計算を実施した。参照ファージ調製物の検量線から力価を入手した。
【０２３１】
実施例２．７  Ｆａｂ温度安定性  ＥＬＩＳＡ
細菌溶解物の適切な希釈物を、異なる温度（０℃、６０℃、７０℃、及び８０℃）に４５分間さらした。抗−６×Ｈｉｓ（配列番号４７）捕捉抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）及びＡＰ標識抗−イヌＩｇ検出抗体をＡｔｔｏＰｈｏｓ（Ｒｏｃｈｅ）とともに使用して、ＥＬＩＳＡによりインタクトＦａｂ分子を検出した。
【０２３２】
実施例２．８．精製したＩｇＧの熱安定性測定
ＩｇＧの熱安定性を、示差走査型蛍光定量法（ＤＳＦ）によって測定する。ＤＳＦは、対象とするタンパク質の熱的なアンフォールディング（融点）を観察する蛍光色素系技法である。アンフォールディングタンパク質の疎水性アミノ酸側鎖と相互作用する疎水性色素の蛍光の温度勾配に伴う変化が観察される。以下の材料を使用する：Ｓｙｐｒｏオレンジ蛍光色素（Ｓｉｇｍａ，＃Ｓ５６９２）；ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ  ＰＣＲプレート、９６ウェル（Ｂｉｏｒａｄ，＃２２３９４４１）；Ｍｉｃｒｏｓｅａｌ  Ｂ接着シーラー（Ｂｉｏｒａｄ  ＃ＭＳＢ−１００１）；９６ウェル光学パッド（Ｂｉｏｒａｄ，＃ＡＤＲ３２９６）；及びｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ５サーマルサイクラー（Ｂｉｏｒａｄ）。希釈したＳｙｐｒｏオレンジを９６ウェルｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱ  ＰＣＲプレートの各ウェルに添加し、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｌの終濃度でサンプルを試験する。温度を６０℃／時の加熱速度で２０℃から９５℃まで走査し、蛍光遷移の中点を分析することによりアンフォールディングの温度を計算する。
【０２３３】
実施例２．９．等電点（ｐＩ）の計算
各ＩｇＧの等電点を計算する。タンパク質のｐＩの決定方法は、当業者に公知である。例えば、以下のツールを使用することができる：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌ；Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。
【０２３４】
実施例３．抗体選択及び特性評価
ライブラリ設計の有効性を確認するために、ライブラリは様々な抗原に対して試験される。次いで選択された抗体は、開発可能特性、例えば：ａ）Ｆａｂディスプレイ比；ｂ）Ｆａｂ発現収率、ｃ）Ｆａｂ熱安定性；ｄ）Ｆａｂ血清安定性；ｅ）Ｆａｂ  ＳＥＣ％モノマー；ｆ）ＩｇＧ発現収率；ｇ）ＩｇＧ熱安定性；ｈ）ＩｇＧ血清安定性；ｉ）ＩｇＧ  ＳＥＣ％モノマー；ｊ）ＩｇＧ等電点（ｐＩ）；ｋ）示差走査蛍光分析を使用した酸への暴露前後のＦａｂ若しくはＩｇＧフォーマットでの熱安定性；ｌ）酸への暴露前後のＦａｂ若しくはＩｇＧフォーマットでの吸収；ｍ）動的光散乱によって測定された場合の、酸への暴露前後の分子半径及び％多分散度；並びに／又はｎ）Ｆａｂ若しくはＩｇＧフォーマットでの粒子染色などについて、Ｆａｂ及びＩｇＧフォーマットの両方で試験される。加えて、Ｆａｂフォーマットでの抗原に対する親和性を決定した。
【０２３５】
実施例３．１  ファージの調製
ＦａｂフォーマットでのそれぞれのＶＨ／ＶＬ対をディスプレイするファージを、以下のとおり調製した。各ライブラリファージ調製物につき８０ｍｌの２ｘＹＴ／Ｃａｍ／Ｇｌｃ培地に、対応するライブラリグリセロールストック由来の細菌を、ＯＤ６００ｎｍが０．２〜０．３となるように接種した。培養物を、ＯＤ６００ｎｍが０．４５〜０．５５に達するまで、１２０ｒｐｍ及び３７℃にて、３０〜９０分間振盪した。次いでヘルパーファージを感染多重度１０で細菌培養物に添加し、続いて振盪することなく３７℃にて４５分間、次いで１２０ｒｐｍで振盪しながら３７℃にて４５分間インキュベートした。細菌をスピンダウンし、ヘルパーファージ含有上清を廃棄した。ファージ感染細菌を４００ｍＬの２ｘＹＴ／ＣＡＭ／ＫＡＮ／ＩＰＴＧ培地中に再懸濁させ、１２０ｒｐｍで振盪しながら２２℃にて一晩インキュベートした。翌日、一晩培養物からの細菌をペレット状にし、Ｆａｂ提示ファージを含有する上清を回収した。ファージ含有上清に、合計量の１／５の予冷されたＰＥＧ／ＮａＣｌを添加することにより、ファージ沈殿を実施した。沈殿するファージの濁りが見えるようになるまで、サンプルを氷上で少なくとも３０分間インキュベートした。沈殿したファージをスピンダウンし、２０ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させた。サンプルをゆっくり回転させて均質な懸濁液を得て、残留細菌デブリをペレット状にして廃棄した。ＰＥＧ／ＮａＣｌを使用して、ファージ含有上清から再びファージを沈殿させた。最後に、ファージペレットをＰＢＳ中に再懸濁させ、滅菌チューブに移し、ゆっくりと振盪して均質な懸濁液を得た。スポットタイトレーション及びＥＬＩＳＡにより、ファージ力価を決定した。ディスプレイベクターｐＣａＤｉｓ（図９に示される）により発現させ、ファージ上に提示させたＦａｂ断片のファージ力価及びディスプレイレベルを、各個々のファージ調製物ごとにＥＬＩＳＡ及び／又はウェスタンブロット（実施例２．６参照）により評価した。ＥＬＩＳＡに関して、捕捉には２つの異なる抗体を使用した：（１）抗−Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＃２７−９４２０−０１）を使用した。これは主要コートタンパク質ｇ８ｐによりファージ粒子を捕捉する；したがって、ファージ力価を決定することができる。（２）抗−イヌ−Ｆａｂ’２（ＬＳ  Ｂｉｏ，＃ＬＳ−Ｃ６９７２９）を使用した。これはディスプレイされたＦａｂに結合する；したがって、ファージディスプレイＦａｂのみが捕捉された。（１）及び（２）に対し、別個の基準曲線が用いられた。ＨＲＰとコンジュゲートしたモノクローナル抗−Ｍ１３（Ｍ１３ファージの主要コートタンパク質ｇ８ｐに対する）を、検出抗体として使用した。ＥＬＩＳＡデータの評価は、以下のとおり完了した：検量線を作成し、ファージ上清及び対照の力価を計算した。各サンプルについて、抗−Ｆｄに関する力価を抗−Ｍ１３（抗−ｐＶＩＩＩ）に関する力価で除算し、得られた割合が相対ディスプレイ比である。
【０２３６】
実施例３．２．抗体選択
以下に記載されるように又は当業者に公知の別の方法により、ファージディスプレイ選択を行ってもよい。例えば、並行パニング方法（例えば、溶液パニング、Ｆｃ捕捉パニング、直接固相パニング）を実施して、所望の生物物理学的特性を有する多様な結合抗体を同定する可能性を最大化する。様々な可溶性タンパク質を、ライブラリ検証用のモデル抗原として選択することができる（例えば、リゾチーム）。以下に記載されるカルボン酸基へのアミド結合形成による磁気Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｄｙｎａｌ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  製品番号１４３．０６）と共有結合した抗原を用いたビーズ系溶液パニングにおいて、モデル抗原に対するコレクションスクリーニングを実施する。以下に記載のＦｃ捕捉パニング方法を用いて、モデル抗原に対する選択もまた実施することができる。
【０２３７】
実施例３．２．１．ビーズ系溶液パニング
モデル抗原及び対照ＢＳＡでコーティングしたカルボキシルビーズ（Ｄｙｎａｌ）を、室温（ＲＴ）にて２時間、ＰＢＳ中５％粉乳＋０．１％Ｔｗｅｅｎ２０でブロックした後、予め吸収させたファージと共に室温にて２時間インキュベートする。数回の洗浄ステップの後、結合したファージを溶離し、次の選択ラウンドのため、ＴＧ１Ｆ＋細胞を感染させることにより増幅する。３ラウンドの選択の後、ｐＣａＤｉｓ（図９に示される）ファージミドＤＮＡを単離し、Ｆａｂコード断片をＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩによる制限消化により切り出し、発現ベクターｐＣａＢｘ（図１０に示される）に結合して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１Ｆ−に形質転換する。次いで、感染培養物を大型ＬＢ／Ｃａｍ／Ｇｌｕｃプレート上にプレーティングし、３４℃で成長させた。シングルクローンを単離し、Ｆａｂ発現収率及び抗原結合性についてＥＬＩＳＡにより試験する。ウサギ抗−犬ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）’２抗体（ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＬＳ−Ｃ６９７２９）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートでＦａｂ含有細胞抽出物をインキュベートし、続いて、ヤギ抗−犬ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）アルカリホスファターゼ抗体（Ｓｉｇｍａ，ＳＡＢ３７００００９７）を用いて検出することにより、Ｆａｂ発現を検出する。例えば、ビーズ系アッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ８２００細胞検出システム／ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）用の蛍光定量的なマイクロボリュームアッセイ技術（ＦＭＡＴ（登録商標））によってモデル抗原結合カルボキシルビーズ及びＢＳＡ結合カルボキシルビーズ（Ｄｙｎａｌ）でＦａｂ含有細胞抽出物をスクリーニングすることにより、抗原特異性を試験する。一次ヒットは、２００の値に設定されたバックグラウンドを少なくとも５倍上回るＦＭＡＴ平均蛍光シグナルをもたらすＦａｂとして定義する。モデル抗原に対する特異性を、同種抗原としてモデル抗原及び陰性対照抗原として無関連抗原を用いた二次ＥＬＩＳＡで確認する。各試験されたサブライブラリ、サブライブラリミックス、又は全ライブラリについての約５０〜１００個のクローンを、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域のシーケンシング用に選択し、モデル抗原結合抗体の配列多様性を推定する。シーケンシング結果は、構築されたライブラリがモデル抗原バインダの多様なレパートリを含むことを示す。ＥＬＩＳＡによる結合特性評価は、単離された抗体が、対象とする同種のモデル抗原に非常に特異的であり、無関連対照抗原と交差反応しないため、生物医学研究及び高度に特異的な治療抗体の生成のためのライブラリの有用性を証明することを示す。
【０２３８】
実施例３．２．２．Ｆｃ−捕捉パニング
ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）上のヤギ抗ヒト−ＩｇＧ  Ｆｃ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ；カタログ１０９−００５−０９８）又はマウス抗−ヒト−ＩｇＧ  Ｆｃ特異的（Ｊａｃｋｓｏｎ；カタログ２０９−００５−０９８）を用いて捕捉することにより固定化した組換えヒトＦｃタグ付きモデルタンパク質を用いて、３ラウンドの固相Ｆｃ捕捉パニングを実施する。各選択ラウンドの前に、ファージを０．１ｍｇ／ｍｌのＰＢＳ／５％ミルク、／５％ＢＳＡ／０．１％Ｔｗｅｅｎ中ヒト、ヤギ及びマウス免疫グロブリンで、室温にて２時間ブロックする。数回の洗浄ステップの後、結合したファージを溶離し、次の選択ラウンドのため、ＴＧ１Ｆ＋細胞を感染させることにより増幅する。選択を３ラウンド行った後、ｐＣａＤｉｓ（図９に示される）ファージミドＤＮＡを単離し、Ｆａｂコード断片をＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩによる制限消化により切り出し、発現ベクターｐＣａＢｘ（図１０に示される）に結合して、ＴＧ１Ｆ−に形質転換する。次いで、感染培養物を大型ＬＢ／Ｃａｍ／Ｇｌｕｃプレート上にプレーティングし、３４℃で成長させた。シングルクローンを単離し、Ｆａｂ発現収率及び抗原結合性についてＥＬＩＳＡにより試験する。Ｆａｂ発現は、上記のように検出する。ＭａｘｉＳｏｒｐプレートにコーティングしたヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ；カタログ１０９−００５−０９８）により捕捉されたモデルタンパク質＿Ｆｃ抗原でのＦａｂ含有細胞抽出物によるＥＬＩＳＡスクリーニングによって、抗原特異性を試験する。一次ヒットは、バックグラウンドを少なくとも５倍上回るＥＬＩＳＡシグナルをもたらすＦａｂとして定義する。モデルタンパク質＿Ｆｃに対する特異性を、同種抗原としてモデル抗原＿Ｆｃ及び陰性対照抗原として無関連タンパク質＿Ｆｃを用いた二次Ｆｃ捕捉ＥＬＩＳＡで確認する。
【０２３９】
約５０〜１００個のクローンを、重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域のシーケンシング用に選択し、モデル抗原＿Ｆｃ結合抗体の配列多様性を推定する。シーケンシング結果は、構築されたライブラリがバインダの多様なレパートリを含むことを確認する。ＥＬＩＳＡによる結合特性評価は、単離された抗体が、対象とする同種のモデル抗原に非常に特異的であり、無関連対照抗原と交差反応しないため、生物医学研究及び高度に特異的な治療抗体の生成のためのライブラリの有用性を証明することを示す。
【０２４０】
実施例３．３．開発可能性試験
開発可能特性、例えば、Ｆａｂフォーマットでの熱安定性、Ｆａｂフォーマットでの親和性、ＩｇＧフォーマットでのｐＩ、ＩｇＧフォーマットでの発現収率、ＩｇＧフォーマットでの熱安定性、及びＳＥＣにより測定する場合のＩｇＧフォーマットでの％モノマーについて、本明細書で開示される方法により又は当業者に公知の他の方法により、抗原に特異的な抗体又は断片をＦａｂ及びＩｇＧ１の両フォーマットで試験する。Ｆａｂ及びＩｇＧフォーマットでの熱安定性試験は、実施例２．７及び２．８に記載されるとおり完了する。ＩｇＧフォーマットでのｐＩの決定は、実施例２．９に記載されるとおり完了する。ＩｇＧフォーマットでの発現収率は、実施例２．５に記載されるとおり完了する。ＳＥＣにより決定する場合のＩｇＧフォーマットでの％モノマーは、実施例２．５に記載されるとおり完了する。
【０２４１】
実施例３．４．Ｆａｂフォーマットでの抗原捕捉セットアップによるＢｉａｃｏｒｅ  ＫＤ（親和性）測定
モノマーＦａｂ画分の結合（分析的ＳＥＣにより分析；Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の抗原の捕捉を、以下のとおり分析する：ＣＭ５チップ（Ｂｉａｃｏｒｅ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上で、適切な抗−抗原タグ捕捉抗体を、ＥＤＣ／ＮＨＳケミストリーを用いて共有結合的に固定化する。抗原を捕捉し、続いて６つの異なるＦａｂ濃度（２ｎ段階希釈）を注入することにより、動態計測を行う。各サイクル終了後に、センサーチップを再生する。二重参照のため、ランニングバッファーのブランク注入を用いる。全てのセンサグラムを、ＢＩＡ評価ソフトウェア３．２（Ｂｉａｃｏｒｅ／ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いてフィッティングして、ｋｏｎ及びｋｏｆｆ速度定数を決定し、これを用いてＫＤを計算する。
【０２４２】
親和性はまた、Ｈａｅｎｅｌ  ｅｔ  ａｌ（２００５）  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３９（１）：１８２−１８４に記載されているような溶液平衡滴定によって測定してもよい。
【０２４３】
単離された抗体は、サブナノモルから１桁のナノモルＫＤまでの親和性値を示し、対象となるモデル抗原に対する強力な結合抗体をライブラリから簡単に単離できることを確認する。
【０２４４】
実施例４．ＮＧＳによるライブラリ冗長性分析及びＱＣ
製造元が提供するマニュアルに従って、ＭｉＳｅｑ機器（Ｉｌｌｕｍｉｎａ  １つのＶＬ／ＶＨサンプルあたり約１００万配列）を使用した高い処理量のアンプリコンシーケンシングによって、ライブラリの品質を評価した。
【０２４５】
実施例４．１．アンプリコン生成
簡潔には、個々のサンプルのＶＬ又はＶＨアンプリコン（例えば：クローンライブラリ由来のプラスミドＤＮＡ）を、ＰＣＲ（１分間９８℃、１５秒間９８℃の１５サイクル、１５秒間６０℃及び１５秒間７２℃、５分間７２℃、１５ｎｇのテンプレートＤＮＡ、０．４μＭの各プライマー、２００μＭのｄＮＴＰ、及び１ＵのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ（ＮＥＢ））により生成した。
【０２４６】
実施例４．２．修飾されたＴｒｕＳｅｑ／Ｎｅｘｔｅｒａ  ＸＴ  プロトコルを使用したＮＧＳ
ユニバーサルＮｅｘｔｅｒａアダプタを含有するアンプリコンを上記のようにＰＣＲ増幅し（第１ステップ−アダプタＰＣＲ）、アガロースゲルを精製して定量した。第２ＰＣＲステップ（インデックスＰＣＲ）では、固有のインデックスの組み合わせ（ｉ５／ｉ７インデックス）を、各サンプルの５’末端及び３’末端に並行して添加した（１分間９８℃、１５秒間９８℃の１０サイクル、１５秒間６０℃及び６０秒間７２℃、５分間７２℃、１ｎｇのテンプレート、０．４μＭのプライマー、２００μＭのｄＮＴＰ、及び０．５ＵのＰｈｕｓｉｏｎポリメラーゼ）。
【０２４７】
ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してＰＣＲ産物を精製し、ＳｅｑｕａｌＰｒｅｐ  Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｌａｔｅ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して標準化し、等モルプール化した。プールされたＤＮＡを０．２ＮのＮａＯＨで変性させ、最終的に８〜１０ｐＭの濃度まで希釈した。対照ライブラリ（ＰｈｉＸ）をサンプルプール（５〜１０％）に追加的にスパイクし、シーケンシングのためにプールをフローセル上にロードした。ＭｉＳｅｑシステムユーザーガイド及びＭｉＳｅｑ試薬キットｖ３（６００サイクル）用シーケンシングマニュアルに従って、対になった末端シーケンシングランを実施した。
【０２４８】
提供されたＭｉＳｅｑソフトウェアパッケージ（ＳＡＶ１．８，ＭｉＳｅｑ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）を使用して、シーケンシング結果を直接処理し、多重分離化（ｄｅｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ）し、スティッチ（ｓｔｉｃｈｅｄ）して、ｆａｓｔｑファイルを作成した。
【０２４９】
実施例４．３．配列分析
大規模なシーケンシングデータセットの処理及び分析用に社内で開発されたソフトウェアを使用して、品質フィルタリングされた配列を更に分析した。配列を多重分離化し、ライブラリ固有の配列機能、例えば、Ｖ遺伝子型、ＨＣＤＲ３の長さ及びアミノ酸分布を評価した。簡潔には、ＶＨ及びＶＬ分布は、それぞれ、予想どおりであり、設計と所望の位置で得られたアミノ酸との間に非常に良好な相関関係がある（図１１、図１２、及び図１３）。
【０２５０】
実施例５．ファージディスプレイ抗体選択
ｅＧＦＰ（高感度緑色蛍光タンパク質）を、ライブラリ検証用のモデル抗原として選択した。固相パニング、続いて直接コーティングＥＬＩＳＡにおけるスクリーニングを実施して、ライブラリからｅＧＦＰ特異的バインダを単離した。マイクロタイタープレート上に直接固定化されたｅＧＦＰを使用して、固相パニングを実施した。各選択ラウンドの前に、ファージをＰＢＳ中１０％スキムミルク粉末でブロックした。ファージのインキュベーションに続いて、ＰＢＳＴで数回の洗浄ステップを実施して、非常に弱い／非特異的なバインダを除去した。結合したファージを低−ｐＨ溶離バッファーで溶離し、次の選択ラウンドのため、ＴＧ１Ｆ＋細胞を感染させることにより増幅した。最終選択ラウンド後に、ｐＣａＤｉｓファージミドＤＮＡを単離し、Ｆａｂコード断片をＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩによる制限消化により切り出し、発現ベクターｐＣａＢｘ（図１０）に結合させ、ＴＧ１Ｆ−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。次いで、感染培養物をＬＢ／Ｃａｍ／Ｇｌｕｃプレート上にプレーティングし、一晩成長させた。シングルクローンを単離し、Ｆａｂ発現収率及び抗原結合性についてＥＬＩＳＡにより試験した。ウサギ−抗−犬−ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２  （ＬＳＢｉｏ，カタログＬＳ−Ｃ６９７２９）でコーティングしたＥＬＩＳＡプレートでＦａｂ含有細胞抽出物をインキュベートし、続いて、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ，ＳＡＢ３７００００９７）とコンジュゲートしたウサギ抗−犬ＩｇＧ  ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２特異的抗体を用いて検出することにより、Ｆａｂ発現を検出した。ＭａｘｉＳｏｒｐプレート上にコーティングされたｅＧＦＰ上のＦａｂ含有細胞抽出物を用いたＥＬＩＳＡスクリーニングにより、抗原特異性を試験した。一次ヒットは、バックグラウンドを少なくとも５倍上回るＥＬＩＳＡシグナルをもたらすＦａｂとして定義した。ｅＧＦＰに対する特異性を、陰性対照抗原（乳タンパク質のみでコーティングされたプレート）上の二次ＥＬＩＳＡで確認した。
【０２５１】
２Ａ／２Ｄ、３Ａ／３Ｄ、及び３Ｂ／６Ｂサブライブラリについて、それぞれ、２９個、８個、及び５８個のクローンの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域をシーケンシングし、ｅＧＦＰ結合抗体の配列多様性を推定した。スクリーニング及びシーケンシングデータを表１９にまとめる。図１３は、スクリーニング結果のドットブロット視覚化を示す。
2020528736.tif 000023
【０２５２】
実施例６．Ｆａｂ  ＥＬＩＳＡ
パニング選択後に得られた個々のクローンの結合を比較するために、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ，ＳＡＢ３７００００９７）とコンジュゲートしたウサギ抗−犬ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２−特異的検出抗体を用いて、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングされたｅＧＦＰでＦａｂフォーマットの精製抗体を滴定して、試験した。予めＨｕＣＡＬライブラリから単離された抗−ＧＦＰ抗体（ＭＯＲ０６３９１）を、参照として含んだ。図１５に示すように、ライブラリから直接単離された抗体は、６／９の候補が参照抗体と同様又はより良好な結合特性を示す多様な結合強度を示す。
【０２５３】
実施例７．ＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ
実施例５に記載されているように、モデル抗原としてのｅＧＦＰに対するパニングを実施した。抗体選択後に得られた特異的Ｆａｂヒットは、最先端の分子生物学的方法を使用してＩｇＧフォーマットに変換され、ＩｇＧタンパク質は実施例２．５に記載のように産生された。標準固相ＥＬＩＳＡによりｅＧＦＰに対するＩｇＧ反応性を確認した（図１６）。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）（Ｓｉｇｍａ，ＳＡＢ３７００００９７）とコンジュゲートしたウサギ抗−犬ＩｇＧ  Ｆ（ａｂ）２−特異的検出抗体を用いて、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上にコーティングされたｅＧＦＰに結合するＩｇＧの検出を実施した。予めＨｕＣＡＬライブラリから単離された抗−ＧＦＰ抗体（ＭＯＲ０６３９１）を、参照として含んだ。
【図１】
2020528736.tif 000024
【図１ａ】
2020528736.tif 000025
【図１ｂ】
2020528736.tif 000026
【図１ｃ】
2020528736.tif 000027
【図１ｄ】
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【図２】
2020528736.tif 000029
【図３】
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【図４】
2020528736.tif 000031
【図５】
2020528736.tif 000032
【図６】
2020528736.tif 000033
【図７】
2020528736.tif 000034
【図８】
2020528736.tif 000035
【図９】
2020528736.tif 000036
【図１０】
2020528736.tif 000037
【図１１】
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【図１２】
2020528736.tif 000039
【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020528736.tif 000042
【図１６】
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【配列表】
2020528736000001.app
【国際調査報告】
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