(57)【要約】本開示は、改変されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体の組成物および方法に関するものであり、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、少なくとも２個のＦｃドメインと少なくとも１個の抗原結合ドメインとを含む。【選択図】図１
2020514301.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
強化されたエフェクター機能を備えたＦｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
抗原結合ドメイン、およびリンカーにより第二のＦｃドメインに結合された第一のＦｃドメインを含み、
抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２】
抗原結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；および任意の、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
ポリペプチド。
【請求項３】
前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２個または４個の逆電荷変異を含み、前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２個または４個の逆電荷変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が２個または４個の逆電荷変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のＩｇＧ１ドメイン単量体が２個または４個の逆電荷変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第一のＩｇＧ１ドメイン単量体が２個または４個の逆電荷変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
改変された突起を形成する変異を含む前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、１個、２個または３個の逆電荷変異をさらに含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
改変された突起を形成する前記変異、および前記逆電荷変異が、ＣＨ３ドメインにある、請求項２〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記変異が、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記変異が、単一アミノ酸変化である、請求項２〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、
2020514301.tif 000138
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、グリシンスペーサーである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０または１２〜３０個のグリシン残基からなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、２０個のグリシン残基からなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、ＫａｂａｔのＩ２５３位で単一アミノ酸変異を含む、請求項２〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ＫａｂａｔのＩ２５３位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
Ｉ２５３位の各アミノ酸変異が、Ｉ２５３Ａである、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、ＫａｂａｔのＲ２９２位で単一アミノ酸変異を含む、請求項２〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
ＫａｂａｔのＲ２９２位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２ＴおよびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
Ｒ２９２位の各アミノ酸変異が、Ｒ２９２Ｐである、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、
2020514301.tif 000139
からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、請求項２〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000140
を有する、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記第一のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000141
を有する、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記第一のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000142
を有し、前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000143
を有する、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインが独立して、２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下：
2020514301.tif 000144
のアミノ酸配列を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインが同一であり、２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下：
2020514301.tif 000145
のアミノ酸配列を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインが同一であり、２個以下の単一アミノ酸の置換を伴う以下：
2020514301.tif 000146
のアミノ酸配列を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインが同一であり、以下：
2020514301.tif 000147
のアミノ酸配列を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインが独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000148
のアミノ酸配列を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインが独立して、８個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000149
のアミノ酸配列を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインが独立して、６個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000150
のアミノ酸配列を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインが独立して、５個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000151
のアミノ酸配列を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記単一アミノ酸置換が、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｋからなる群から選択される、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが独立して、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および最大で１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４５のアミノ酸配列を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記単一アミノ酸置換のうちの最大で６個が、ＣＨ３ドメインにおける逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
前記単一アミノ酸置換が、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記２個または４個の逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｋから選択される、請求項５、６および９〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項２〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む、請求項２〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記抗原結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記ＶＨドメインが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記ＶＨドメインが、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、
前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、前記ＶＨ配列が、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、
請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記ＶＨドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
前記抗原結合ドメインが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
前記抗原結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
前記抗原結合ドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、および表２に記載の抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、
ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
前記抗原結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
前記抗原結合ドメインが、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインを含む、請求項２〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、かつＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合してＦａｂを形成することができる、請求項２〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
第一または第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、請求項２〜５６のいずれか一項に記載のポリペプチドを２コピー含有するポリペプチド複合体。
【請求項５８】
ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドに結合されている、請求項２〜５６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第二のポリペプチドが、前記ポリペプチドの第一、第二、または第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン内、および前記第二のポリペプチドのヒンジドメイン内の、システイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、ポリペプチド複合体。
【請求項５９】
前記第二のポリペプチド単量体が、改変された空洞を形成する変異を含む、請求項５８に記載のポリペプチド複合体。
【請求項６０】
前記改変された空洞を形成する変異が、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３６４Ｈ／Ｆ４０５Ａからなる群から選択される、請求項５９に記載のポリペプチド複合体。
【請求項６１】
前記第二のポリペプチドが、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および最大で１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４５のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
【請求項６２】
抗原結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；および任意の、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのＦｃドメイン単量体が、１個、２個、または３個の逆電荷アミノ酸変異を含む、
ポリペプチド。
【請求項６３】
前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
前記抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表５に記載のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６に記載のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含み、
前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含み、
前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表５に記載のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６に記載のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含み、
前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表５に記載のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６に記載のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含み、
前記第二のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表５に記載のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６に記載のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含み、
前記第一のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表５に記載のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６に記載のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含む前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、同一のＣＨ３ドメインを有する、請求項６２〜７１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
表４から選択される１個、２個、または３個の逆電荷アミノ酸変異が、ＣＨ３ドメインにある、請求項６２〜７２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
前記変異が、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある、請求項７３に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
前記変異がそれぞれ、単一アミノ酸変化である、請求項６２〜７３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、
2020514301.tif 000152
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、請求項７２に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、グリシンスペーサーである、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０または１２〜３０個のグリシン残基からなる、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、２０個のグリシン残基からなる、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、ＫａｂａｔのＩ２５３位で単一アミノ酸変異を含む、請求項６２〜７９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
ＫａｂａｔのＩ２５３位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から独立して選択される、請求項８０に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
Ｉ２５３位の各アミノ酸変異が、Ｉ２５３Ａである、請求項７１に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、ＫａｂａｔのＲ２９２位で単一アミノ酸変異を含む、請求項６２〜８２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
ＫａｂａｔのＲ２９２位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２ＴおよびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項８３に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
Ｒ２９２位の各アミノ酸変異が、Ｒ２９２Ｐである、請求項８４に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、
2020514301.tif 000153
からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、請求項６２〜８５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000154
を有する、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
前記第一のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000155
を有する、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
前記第一のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000156
を有し、前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000157
を有する、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインが独立して、２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下：
2020514301.tif 000158
のアミノ酸配列を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインが同一であり、２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下：
2020514301.tif 000159
のアミノ酸配列を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９２】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインが同一であり、２個以下の単一アミノ酸の置換を伴う以下：
2020514301.tif 000160
のアミノ酸配列を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９３】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインが同一であり、以下：
2020514301.tif 000161
のアミノ酸配列を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９４】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインが独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000162
のアミノ酸配列を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９５】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインが独立して、８個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000163
のアミノ酸配列を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９６】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインが独立して、６個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000164
のアミノ酸配列を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９７】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインが独立して、５個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000165
のアミノ酸配列を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９８】
前記単一アミノ酸の置換が、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｋからなる群から選択される、請求項９０〜９７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９９】
前記Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが独立して、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および最大で１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４５のアミノ酸配列を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１００】
前記単一アミノ酸置換のうちの最大で６個が、ＣＨ３ドメインにおける逆電荷変異である、請求項９９に記載のポリペプチド。
【請求項１０１】
前記単一アミノ酸置換が、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある、請求項９９に記載のポリペプチド。
【請求項１０２】
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項１０３】
前記２個または４個の逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｋから選択される、請求項６５、６６および６９〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０４】
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項６２〜１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０５】
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む、請求項６２〜１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０６】
前記抗原結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、請求項１０３に記載のポリペプチド。
【請求項１０７】
前記ＶＨドメインが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１０８】
前記ＶＨドメインが、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１０９】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、
前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、前記ＶＨ配列が、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、
請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１０】
前記ＶＨドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１１】
前記抗原結合ドメインが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１２】
前記抗原結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１３】
前記抗原結合ドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、および表２に記載の抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、
ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、
請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１４】
前記抗原結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１５】
前記抗原結合ドメインが、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインを含む、請求項６２〜１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１６】
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、かつＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合してＦａｂを形成することができる、請求項６２〜１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１７】
第一または第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、請求項２〜５６のいずれか一項に記載のポリペプチドを２コピー含有するポリペプチド複合体。
【請求項１１８】
ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドに結合されている、請求項６２〜１１６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含むポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第二のポリペプチドが、前記ポリペプチドの第一、第二、または第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン内、および前記第二のポリペプチドのヒンジドメイン内の、システイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、ポリペプチド複合体。
【請求項１１９】
前記第二のポリペプチド単量体が、１個、２個、または３個の逆電荷変異を含む、請求項１１８に記載のポリペプチド複合体。
【請求項１２０】
前記第二のポリペプチド単量体が、表４から選択される逆電荷変異を１、２または３個含み、かつ前記ポリペプチド中の、表４から選択される１個、２個、または３個の逆電荷変異に対し相補的である、請求項１２９に記載のポリペプチド複合体。
【請求項１２１】
前記第二のポリペプチドが、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および最大で１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４５のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１１８〜１２０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
【請求項１２２】
ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；および任意の、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
ポリペプチド。
【請求項１２３】
前記第一のＩｇＧ１単量体のアミノ末端側に、抗体重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインをさらに含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２４】
前記第一のＩｇＧ１単量体のアミノ末端側に、ｓｃＦｖをさらに含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２５】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２個または４個の逆電荷変異を含み、前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２６】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２個または４個の逆電荷変異を含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２７】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２８】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１２９】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が２個または４個の逆電荷変異を含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１３０】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のＩｇＧ１ドメイン単量体が２個または４個の逆電荷変異を含む、
請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１３１】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第一のＩｇＧ１ドメイン単量体が２個または４個の逆電荷変異を含む、
請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１３２】
改変された突起を形成する変異を含む前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、１個、２個または３個の逆電荷変異をさらに含む、請求項１２２〜１３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３３】
改変された突起を形成する前記変異、および前記逆電荷変異が、ＣＨ３ドメインにある、請求項１２２〜１３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３４】
ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；および任意の、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
少なくとも一つのＦｃドメイン単量体が、１個、２個、または３個の逆電荷アミノ酸変異を含む、
ポリペプチド。
【請求項１３５】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端側に、抗体重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインをさらに含む、請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１３６】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端側に、ｓｃＦｖをさらに含む、請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１３７】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表５に記載のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６に記載のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含み、
前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１３８】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含み、
前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表５に記載のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６に記載のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１３９】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含む、請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４０】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４１】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含み、
前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表５に記載のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６に記載のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４２】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含み、
前記第二のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表５に記載のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６に記載のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４３】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含み、
前記第一のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表５に記載のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６に記載のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４４】
表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含む前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、同一のＣＨ３ドメインを有する、請求項１３４〜１４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４５】
表４から選択される１個、２個、または３個の逆電荷アミノ酸変異が、ＣＨ３ドメインにある、請求項１３４〜１４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４６】
前記変異が、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４７】
前記変異がそれぞれ、単一アミノ酸変化である、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４８】
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、
2020514301.tif 000166
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４９】
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０または１２〜３０個のグリシン残基からなる、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５０】
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、２０個のグリシン残基からなる、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５１】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、ＫａｂａｔのＩ２５３位で単一アミノ酸変異を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５２】
ＫａｂａｔのＩ２５３位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から独立して選択される、請求項１５１に記載のポリペプチド。
【請求項１５３】
Ｉ２５３位の各アミノ酸変異が、Ｉ２５３Ａである、請求項１５２に記載のポリペプチド。
【請求項１５４】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、ＫａｂａｔのＲ２９２位で単一アミノ酸変異を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５５】
ＫａｂａｔのＲ２９２位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２ＴおよびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項１５４に記載のポリペプチド。
【請求項１５６】
Ｒ２９２位の各アミノ酸変異が、Ｒ２９２Ｐである、請求項１５５に記載のポリペプチド。
【請求項１５７】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、
2020514301.tif 000167
からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５８】
前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000168
を有する、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５９】
前記第一のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000169
を有する、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６０】
前記第一のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000170
を有し、前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000171
を有する、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６１】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインが独立して、２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下：
2020514301.tif 000172
のアミノ酸配列を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６２】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインが同一であり、２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下：
2020514301.tif 000173
のアミノ酸配列を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６５】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインが同一であり、２個以下の単一アミノ酸の置換を伴う以下：
2020514301.tif 000174
のアミノ酸配列を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６６】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインが同一であり、以下：
2020514301.tif 000175
のアミノ酸配列を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６７】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインが独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000176
のアミノ酸配列を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６８】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインが独立して、８個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000177
のアミノ酸配列を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６９】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインが独立して、６個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000178
のアミノ酸配列を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７０】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインが独立して、５個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000179
のアミノ酸配列を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７１】
前記単一アミノ酸の置換が、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｋからなる群から選択される、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７２】
前記Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが独立して、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および最大で１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４５のアミノ酸配列を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７３】
前記単一アミノ酸置換のうちの最大で６個が、ＣＨ３ドメインにおける逆電荷変異である、請求項９９に記載のポリペプチド。
【請求項１７４】
前記単一アミノ酸置換が、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある、請求項１７３に記載のポリペプチド。
【請求項１７５】
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つは、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７６】
前記２個または４個の逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｋから選択される、請求項１２２〜１４５のいずれ一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７８】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含む、請求項１２３、１２４、１３５および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７９】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項１２３、１２４、１３５および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８０】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、
前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、前記ＶＨ配列が、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、請求項１２３、１２４、１３５および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８１】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む、請求項１２３、１２４、１３５および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８２】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む、請求項１２３、１２４、１３５および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８３】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む、請求項１２３、１２４、１３５および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８４】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、および表２に記載の抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、
ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、請求項１２３、１２４、１３５および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８５】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項１２３、１２４、１３５および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８６】
ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインをさらに含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８７】
請求項２〜１８７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１８８】
請求項１８７に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１８９】
請求項１８７の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１９０】
請求項１８８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１９１】
請求項１８９または請求項１９０に記載の宿主細胞を、ポリペプチドを発現する条件下で培養する工程を含む、請求項２〜１８７のいずれか一項に記載のポリペプチドを製造する方法。
【請求項１９２】
抗体ＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１８９に記載の宿主細胞。
【請求項１９３】
抗体ＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１９０に記載の宿主細胞。
【請求項１９４】
抗体ＶＬドメインおよび抗体ＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１８９に記載の宿主細胞。
【請求項１９５】
抗体ＶＬドメインおよび抗体ＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１９０に記載の宿主細胞。
【請求項１９６】
１０個以下の単一アミノ酸変異を有するＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１８９に記載の宿主細胞。
【請求項１９７】
１０個以下の単一アミノ酸変異を有するＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１９０に記載の宿主細胞。
【請求項１９９】
前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、ＣＨ３ドメイン中に１０、８、６または４個以下の単一アミノ酸変異を有する配列番号４２、４３、４５および４７のいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１９６または１９７に記載の宿主細胞。
【請求項２００】
請求項２から１８６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、医薬組成物。
【請求項２０１】
前記ポリペプチドの４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％未満が、Ｆｃドメイン単量体上で少なくとも１個のフコース改変を有する、請求項２００に記載の医薬組成物。
【請求項２０２】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成する、
請求項１に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２０３】
前記単一Ｆｃドメイン構築体が、抗体である、請求項１または２０２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２０４】
実質的に均質なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成する、
組成物。
【請求項２０５】
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチドと、前記第二のポリペプチドもしくは前記第三のポリペプチドに結合されているか、または前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドに結合されている、請求項２０４に記載の組成物。
【請求項２０６】
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチドおよび前記第三のポリペプチドに結合されている、請求項２０４に記載の組成物。
【請求項２０７】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２０８】
前記生物活性が、Ｆｃ受容体介在性エフェクター機能である、請求項２０７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２０９】
前記Ｆｃ受容体介在性エフェクター機能が、ＡＤＣＣ活性、ならびにＡＤＣＰ活性および／またはＣＤＣ活性である、請求項２０８に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１０】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド、および
(ｄ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメイン
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１１】
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチドと、前記第二のポリペプチドもしくは前記第三のポリペプチドに結合されているか、または前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドに結合されている、請求項２０２、２０７、または２１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１２】
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチド、および前記第三のポリペプチドに結合されている、請求項２０２、２０７、または２１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１３】
前記抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、請求項１および２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１４】
前記抗原結合ドメインが、前記第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、請求項２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１５】
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項２１４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１６】
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、
前記ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインが、前記第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、
請求項２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１７】
前記抗原結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１８】
ＶＬドメインを含む第四のポリペプチドを含む、請求項２１７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１９】
前記ＶＨドメインが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含む、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２０】
前記ＶＨドメインが、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２１】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、
前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、前記ＶＨ配列が、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％同一である、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２２】
前記ＶＨドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２３】
前記抗原結合ドメインが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む、請求項１および２０２〜２１５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２４】
前記抗原結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む、請求項１および２０２〜２１５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２５】
前記抗原結合ドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、および表２に記載の抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、
ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一である、請求項１および２０２〜２１５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２６】
前記抗原結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項１および２０２〜２１５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２７】
ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインをさらに含み、
前記ＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインが、リンカーを介して前記第一のポリペプチドまたは前記第二のポリペプチドのＮ末端に付加される、
請求項１および２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２８】
前記第一のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体が、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、請求項２０２〜２２７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２９】
前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第四のＦｃドメイン単量体が、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、請求項２０２〜２２８のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３０】
前記第二のポリペプチドおよび前記第三のポリペプチドが、同じアミノ酸配列を有する、請求項２０２から２２８のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３１】
前記二量体形成選択モジュールが、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つのＣＨ３ドメイン内に改変された空洞と、前記Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３ドメイン内に改変された突起とを含み、
前記改変された空洞および前記改変された突起が、Ｆｃドメイン単量体の空洞に突起が挿入された対を形成するよう配置されている、
請求項２２８または２２９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３２】
前記改変された突起が、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４ＦおよびＦ４０５Ｗからなる群から選択される改変を少なくとも１個含み、前記改変された空洞が、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、およびＴ３９４Ｓからなる群から選択される改変を少なくとも１個含む、請求項２３１に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３３】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの一つがＹ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含み、前記Ｆｃドメイン単量体の他方がＴ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含む、請求項２２８または２２９のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３４】
前記二量体形成選択モジュールが、ドメイン単量体のうちの１つのＣＨ３ドメイン内に負電荷をもつアミノ酸と、Ｆｃドメイン単量体のうちの他方のＣＨ３ドメイン内に正電荷をもつアミノ酸とを含み、
前記負電荷をもつアミノ酸および前記正電荷をもつアミノ酸が、Ｆｃドメインの形成を促進するよう配置されている、
請求項２２８または２２９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３５】
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｄ３９９Ｋ、およびＫ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅのいずれかを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３６】
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｋ３９２ＤおよびＤ３９９Ｋを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３７】
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｅを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３８】
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｄを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３９】
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｋ３９２ＥおよびＤ３９９Ｋを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４０】
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４１】
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｅを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４２】
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４３】
前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体がそれぞれ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４４】
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体がそれぞれ、Ｅ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４５】
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体が、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Ｅ３５７Ｋまたは３５７Ｒを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４６】
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体がそれぞれ、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４７】
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体が、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４８】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１個または複数のリンカーが、結合である、請求項１および２０２〜２４７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４９】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１個または複数のリンカーが、スペーサーである、請求項１および２０２〜２４７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５０】
前記スペーサーが、以下：
2020514301.tif 000180
の配列を有するポリペプチドを含む、請求項２４９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５１】
前記スペーサーが、グリシンスペーサーである、請求項２４９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５２】
前記スペーサーが、４〜３０、８〜３０、または１２〜３０個のグリシン残基からなる、請求項２５１に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５３】
前記スペーサーが、２０個のグリシン残基からなる、請求項２５２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５４】
前記抗原結合ドメイン構築体が、リンカーにより前記Ｆｃドメイン単量体に結合されている、請求項１および２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５５】
前記リンカーが、スペーサーである、請求項２５４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５６】
前記Ｆｃドメインのうちの少なくとも１個が、Ｉ２５３位にアミノ酸改変を少なくとも１個含む、請求項１および２０２〜２５５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５７】
Ｉ２５３位の前記アミノ酸改変が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される、請求項２５６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５８】
Ｉ２５３位の各アミノ酸改変が、Ｉ２５３Ａである、請求項２５７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５９】
前記Ｆｃドメインのうちの少なくとも１個が、Ｒ２９２位にアミノ酸改変を少なくとも１個含む、請求項１および２０２〜２５８のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６０】
Ｒ２９２位の各アミノ酸改変が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項２５９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６１】
Ｒ２９２位の各アミノ酸改変が、Ｒ２９２Ｐである、請求項２６０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６２】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの１個または複数が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む、請求項１および２０２〜２６１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６３】
前記Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む、請求項２６２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６４】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプのＩｇＧである、請求項２６２または２６３に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６５】
前記第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのそれぞれにおけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異されている、請求項１および２０２〜２６４のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６６】
前記第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのうちの１個または複数が、Ｃ末端リジンを欠く、請求項１および２０２〜２６５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６７】
前記第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リジンを欠く、請求項２６６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６８】
前記ポリペプチドのうちの１個もしくは複数のＮ末端またはＣ末端にリンカーにより結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む、請求項１および２０２〜２６７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成する、
細胞培養培地。
【請求項２７０】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも７５％が、前記第一のＦｃドメイン、前記第二のＦｃドメイン、および前記抗原結合ドメインを含む、請求項２６９に記載の細胞培養培地。
【請求項２７１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が、構造的に同一であり、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、
細胞培養培地。
【請求項２７２】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも７５％が、構造的に同一である、請求項２７１に記載の細胞培養培地。
【請求項２７３】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、請求項２６９〜２７２のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項２７４】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも１００ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、請求項２６９〜２７３のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項２７５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(ａ）
（１）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
（２）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
（３）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
（４）抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチド、または前記第三のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、
細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が構造的に同一である、工程、および
(ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
【請求項２７６】
実質的に均質なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
組成物。
【請求項２７７】
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
請求項２７６に記載の組成物。
【請求項２７８】
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含み、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｋ３７０ＤおよびＥ３５７Ｋを含む、請求項２７７に記載の組成物。
【請求項２７９】
実質的に均質なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(ｆ）前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
組成物。
【請求項２８０】
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
請求項２７９に記載の組成物。
【請求項２８１】
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含み、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｋ３７０ＤおよびＥ３５７Ｋを含む、請求項２８０に記載の組成物。
【請求項２８２】
実質的に均質なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合している抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成する、
組成物。
【請求項２８３】
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四のＦｃドメイン単量体および前記第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
請求項２８２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２８４】
実質的に均質なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成する、
組成物。
【請求項２８５】
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体および前記第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三のＦｃドメイン単量体および前記第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
請求項２８４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２８６】
実質的に均質なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｉｖ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、および
(ｖ）前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｖｉ）第四のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、
(ｉｘ）前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、および
(ｘ）前記第五のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(ｇ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインを形成する、組成物。
【請求項２８７】
前記第二のＦｃドメイン単量体および第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一および第七のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第七のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四および第八のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第八のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三および第九のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第九のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第六および第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第六のＦｃドメイン単量体と前記第十のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
請求項２８６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２８８】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２８９】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９０】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
細胞培養培地。
【請求項２９２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(ａ）
（１）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
（２）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
（３）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
（４）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメインと、
（５）第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が構造的に同一である、工程、および
(ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
【請求項２９３】
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
請求項２８８、２８９、２９０、２９１、または２９２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９４】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(ｆ）前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９５】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(ｆ）前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一、第二、および第三の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９６】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(ｆ）前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９７】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(ｆ）前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
細胞培養培地。
【請求項２９８】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(ａ）
（１）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
（２）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
（３）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
（４）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメインと、
（５）第二のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメインと、
（６）第三のポリペプチドに結合された第三の抗原結合ドメインと、
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が構造的に同一である、工程、および
(ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
【請求項２９９】
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
請求項２９４、２９５、２９６、２９７または２９８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３００】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０１】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、
単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０２】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０３】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成する、
細胞培養培地。
【請求項３０４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(ａ）
（１）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
（２）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
（３）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
（４）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
（５）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、
細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が構造的に同一である、工程、および
(ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
【請求項３０５】
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四のＦｃドメイン単量体および前記第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
請求項３００、３０１、３０２、３０３、または３０４のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０６】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０７】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、
単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０８】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成する、細胞培養培地。
【請求項３１０】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(ａ）
（１）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
（２）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
（３）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
（４）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
（５）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が構造的に同一である、工程、および
(ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
【請求項３１１】
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体および前記第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三のＦｃドメイン単量体および前記第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
請求項３０６、３０７、３０８、３０９、または３１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３１２】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｉｖ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、および
(ｖ）前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｖｉｉ）第四のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、
(ｉｘ）前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、および
(ｘ）前記第五のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(ｇ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインを形成し、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３１３】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｉｖ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、および
(ｖ）前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｖｉ）第四のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、
(ｉｘ）前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、および
(ｘ）前記第五のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(ｇ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインを形成し、
単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３１４】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｉｖ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、および
(ｖ）前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｖｉ）第四のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、
(ｉｘ）前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のスペーサー、および
(ｘ）前記第五のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(ｇ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３１５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｉｖ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、および
(ｖ）前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｖｉ）第四のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、
(ｉｘ）前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のスペーサー、および
(ｘ）前記第五のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(ｇ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインを形成する、
細胞培養培地。
【請求項３１６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(ａ）
（１）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｉｖ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、および
(ｖ）前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
（２）以下：
(ｖｉ）第四のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、
(ｉｘ）前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のスペーサー、および
(ｘ）前記第五のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
（３）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
（４）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
（５）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
（６）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
（７）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が構造的に同一である、工程、および
(ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
【請求項３１７】
前記第二および第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一および第七のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第七のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四および第八のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第八のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三および第九のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第九のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第六および第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第六のＦｃドメイン単量体と前記第十のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
請求項３１２、３１３、３１４、３１５、または３１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年１月６日に出願された米国仮出願第６２／４４３，５２３号の出願日の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの治療用抗体は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）、および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）など、Ｆｃドメインのエフェクター機能を介して自然免疫系の因子をリクルートすることにより機能する。治療用タンパク質の改善に対するニーズは未だ存在する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、少なくとも２個のＦｃドメインを伴う抗原結合ドメインの標的特異性を組み合わせて、固有の生物活性を有する新たな治療法を生み出すための組成物および方法を特徴とする。
【０００４】
一部の例では、本開示は、公知の単一Ｆｃドメインを含有する治療剤、例えば公知の治療用抗体などの抗原結合ドメインと、少なくとも２個のＦｃドメインを組み合わせて、公知のＦｃドメイン含有治療用抗体を越える生物活性を有する新規の治療剤を作製することを企図するものである。そのような構築体を作製するために、本開示は、少なくとも２個、例えば複数のＦｃドメインを有する構築体を組み立てるための様々な方法を提供するものであり、それにより、それらのホモ二量体形成およびヘテロ二量体形成が制御され、限られた数のポリペプチド鎖からの異なるサイズの分子の組み立てが行われる。これらのポリペプチドもまた本開示の対象である。これらの構築体の特性により、実質的に均質な医薬組成物の効率的な生成が可能となる。医薬組成物の安全性、有効性、均一性、および信頼性を確実にするためには、医薬組成物においてそのような均質性があることが望ましい。
【０００５】
第一の態様において、本開示は、強化されたエフェクター機能を含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴とし、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、抗原結合ドメインと、リンカーにより第二のＦｃドメインに結合された第一のＦｃドメインとを含み、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている。
【０００６】
第二の態様において、本開示は、抗原結合ドメインと、リンカーにより第二のＦｃドメインに結合された第一のＦｃドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む組成物を特徴とする。
【０００７】
第三の態様において、本開示は、抗原結合ドメインと、リンカーにより第二のＦｃドメインに結合された第一のＦｃドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む。
【０００８】
第四の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む組成物を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；およびｄ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成される。
【０００９】
第四の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、第一のポリペプチドと、第二のポリペプチドもしくは第三のポリペプチドに結合されているか、または第二のポリペプチドと第三のポリペプチドに結合されており、あるいは抗原結合ドメインは、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、および第三のポリペプチドに結合されている。
【００１０】
第五の態様において、本開示は、エフェクター機能が強化されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；およびｄ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている。
【００１１】
第五の態様の一部の実施形態において、単一のＦｃドメイン構築体は、抗体である。
【００１２】
第六の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；およびｄ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む。
【００１３】
第六の態様の一部の実施形態において、生物活性は、例えばＡＤＣＣ活性、ＡＤＣＰ活性および／またはＣＤＣ活性（例えば、ＡＤＣＣ活性およびＡＤＣＰ活性、ＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性、ＡＤＣＰ活性およびＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ活性、ＡＤＣＰ活性およびＣＤＣ活性など）のＦｃ受容体介在型エフェクター機能である。
【００１４】
第七の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるスペーサー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；およびｄ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成される。
【００１５】
本開示の第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、第一のポリペプチドと、第二のポリペプチドもしくは第三のポリペプチドに結合されているか、または第二のポリペプチドと第三のポリペプチドに結合されており、あるいは抗原結合ドメインは、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、および第三のポリペプチドに結合されている。
【００１６】
本開示の第一、第二、第三、および第四の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。
【００１７】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部であり、一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【００１８】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインとを含み、当該ＶＨドメインとＣＨ１ドメインは、第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である。一部の実施形態において、抗原結合ドメインはさらにＶＬドメインを含み、ここで一部の実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＶＬドメインを含む第四のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含み、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を除き、ＶＨ配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、またはＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む。
【００１９】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、および表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、当該ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、または抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列のセットを含む。
【００２０】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインをさらに含み、ここで当該ＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインは、リンカーにより第一のポリペプチドまたは第二のポリペプチドのＮ末端に結合されている。
【００２１】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体は、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む。
【００２２】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体は、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む。
【００２３】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、二量体形成選択モジュールは、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つのＣＨ３ドメイン内に改変された空洞と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３ドメイン内に改変された突起とを含み、ここで当該改変された空洞および当該改変された突起は、Ｆｃドメイン単量体の空洞に突起が挿入された対を形成するよう配置される。一部の実施形態において、改変された突起は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｆ、およびＦ４０５Ｗから選択される改変を少なくとも一つ含み、改変された空洞は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、およびＴ３９４Ｓから選択される改変を少なくとも一つ含む。一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つは、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含み、Ｆｃドメイン単量体のうちの他方は、Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含む。
【００２４】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、二量体形成選択モジュールは、ドメイン単量体のうちの１つのＣＨ３ドメイン内に負電荷をもつアミノ酸と、Ｆｃドメイン単量体のうちの他方のＣＨ３ドメイン内に正電荷をもつアミノ酸を含み、ここで当該負電荷をもつアミノ酸および当該正電荷をもつアミノ酸は、Ｆｃドメインの形成を促進するよう配置される。一部の実施形態において、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３９９Ｋと、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅのいずれかを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３９２ＤとＤ３９９Ｋを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｅを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３５６ＫとＫ４３９Ｄを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３９２ＥとＤ３９９Ｋを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｄを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３５６ＫとＫ４３９Ｅを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｓ３５４ＣとＴ３６６Ｗを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第三と第四のポリペプチドの各々は、Ｓ３５４ＣとＴ３６６Ｗを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体は各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｅ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｅ３５７Ｋまたは３５７Ｒを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含み、第三および第四のポリペプチドは各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、または第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含む。
【００２５】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、第二のポリペプチドと第三のポリペプチドは、同一のアミノ酸配列を有する。
【００２６】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つまたは複数のリンカーは、結合である。
【００２７】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つまたは複数のリンカーは、スペーサーである。一部の実施形態において、スペーサーは、以下：
2020514301.tif 000003
の配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば４〜３０、８〜３０、または１２〜３０個のグリシン残基からなるスペーサー、例えば２０個のグリシン残基からなるスペーサーである。
【００２８】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、リンカーによりＦｃドメイン単量体に結合されている。一部の実施形態において、リンカーは、スペーサーである。
【００２９】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメインのうちの少なくとも一つは、Ｉ２５３位に少なくとも一つのアミノ酸改変を含む。一部の実施形態において、Ｉ２５３位の各アミノ酸改変は、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙから独立して選択される。一部の実施形態において、Ｉ２５３位の各アミノ酸改変は、Ｉ２５３Ａである。
【００３０】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメインのうちの少なくとも一つは、Ｒ２９２位に少なくとも一つのアミノ酸改変を含む。一部の実施形態において、Ｒ２９２位の各アミノ酸改変は、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙから独立して選択される。一部の実施形態において、Ｒ２９２位の各アミノ酸改変は、Ｒ２９２Ｐである。
【００３１】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つまたは複数が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプのものである。
【００３２】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、当該第四、第五、第六、および第七のポリペプチドのそれぞれのＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異されている。
【００３３】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、当該第四、第五、第六、および第七のポリペプチドのうちの１つまたは複数が、Ｃ末端リジンを欠く。一部の実施形態では、第四、第五、第六、および第七のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リジンを欠く。
【００３４】
本開示の第四、第五、第六、および第七の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ポリペプチドのうちの一つもしくは複数のＮ末端またはＣ末端にリンカーにより結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む。
【００３５】
第八の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地を特徴とするものであり、ここで、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が、構造的に同一であり、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ、または１００ｍｇ／Ｌの濃度で当該培養培地中に存在する。
【００３６】
本開示の第八の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも７５％、少なくとも８５％、または少なくとも９５％が、構造的に同一である。
【００３７】
第九の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地を特徴としており、ここで当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；およびｄ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成される。
【００３８】
本開示の第九の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも７５％、少なくとも８５％、または少なくとも９５％が、第一のＦｃドメイン、第二のＦｃドメイン、および抗原結合ドメインを含む。
【００３９】
第十の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法を特徴としており、当該方法は、ａ）（１）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド、（２）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド、（３）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド、および（４）抗原結合ドメイン、を発現する宿主細胞を培養する工程であって、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、当該抗原結合ドメインは、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体が形成され、細胞培養上清中の当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が構造的に同一である、工程；およびｂ）当該細胞培養上清から当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程、を含む。
【００４０】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、第一のポリペプチドと、第二のポリペプチドもしくは第三のポリペプチドに結合されているか、または第二のポリペプチドと第三のポリペプチドに結合されており、あるいは抗原結合ドメインは、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、および第三のポリペプチドに結合されている。
【００４１】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。
【００４２】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部であり、一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【００４３】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインを含み、当該ＶＨドメインとＣＨ１ドメインは、第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である。一部の実施形態において、抗原結合ドメインはさらにＶＬドメインを含み、ここで一部の実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＶＬドメインを含む第四のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含み、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨ配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を除き、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、またはＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む。
【００４４】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、および表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、当該ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、または抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列のセットを含む。
【００４５】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインをさらに含み、ここで当該ＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインは、リンカーにより第一のポリペプチドまたは第二のポリペプチドのＮ末端に結合されている。
【００４６】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体は、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む。
【００４７】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体は、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む。
【００４８】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、二量体形成選択モジュールが、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つのＣＨ３ドメイン内に改変された空洞と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３ドメイン内に改変された突起とを含み、ここで当該改変された空洞および当該改変された突起は、Ｆｃドメイン単量体の空洞に突起が挿入された対を形成するよう配置される。一部の実施形態において、改変された突起は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｆ、およびＦ４０５Ｗから選択される改変を少なくとも一つ含み、改変された空洞は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、およびＴ３９４Ｓから選択される改変を少なくとも一つ含む。一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つは、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含み、Ｆｃドメイン単量体のうちの他方は、Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含む。
【００４９】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、二量体形成選択モジュールは、ドメイン単量体のうちの１つのＣＨ３ドメイン内に負電荷をもつアミノ酸と、Ｆｃドメイン単量体のうちの他方のＣＨ３ドメイン内に正電荷をもつアミノ酸を含み、ここで当該負電荷をもつアミノ酸および当該正電荷をもつアミノ酸は、Ｆｃドメインの形成を促進するよう配置される。一部の実施形態において、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３９９Ｋと、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅのいずれかを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３９２ＤとＤ３９９Ｋを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｅを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３５６ＫとＫ４３９Ｄを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３９２ＥとＤ３９９Ｋを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｄを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３５６ＫとＫ４３９Ｅを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｓ３５４ＣとＴ３６６Ｗを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第三と第四のポリペプチドの各々は、Ｓ３５４ＣとＴ３６６Ｗを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体は各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｅ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｅ３５７Ｋまたは３５７Ｒを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含み、第三および第四のポリペプチドは各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、または第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含む。
【００５０】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、第二のポリペプチドと第三のポリペプチドは、同一のアミノ酸配列を有する。
【００５１】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つまたは複数のリンカーは、結合である。
【００５２】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つまたは複数のリンカーは、スペーサーである。一部の実施形態において、スペーサーは、以下：
2020514301.tif 000004
の配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば４〜３０、８〜３０、または１２〜３０個のグリシン残基からなるスペーサー、例えば２０個のグリシン残基からなるスペーサーである。
【００５３】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、リンカーによりＦｃドメイン単量体に結合されている。一部の実施形態において、リンカーは、スペーサーである。
【００５４】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメインのうちの少なくとも一つは、Ｉ２５３位に少なくとも一つのアミノ酸改変を含む。一部の実施形態において、Ｉ２５３位の各アミノ酸改変は、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙから独立して選択される。一部の実施形態において、Ｉ２５３位の各アミノ酸改変は、Ｉ２５３Ａである。
【００５５】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメインのうちの少なくとも一つは、Ｒ２９２位に少なくとも一つのアミノ酸改変を含む。一部の実施形態において、Ｒ２９２位の各アミノ酸改変は、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙから独立して選択される。一部の実施形態において、Ｒ２９２位の各アミノ酸改変は、Ｒ２９２Ｐである。
【００５６】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つまたは複数が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプのものである。
【００５７】
本開示の第九および第十の態様の一部の実施形態において、第一、第二、第三および第四のポリペプチドのそれぞれにおけるＮ末端Ａｓｐは、Ｇｌｎに変異されている。
【００５８】
本開示の第九および第十の態様の一部の実施形態において、第一、第二、第三および第四のポリペプチドのうちの一つまたは複数が、Ｃ末端リジンを欠く。一部の実施形態では、第一、第二、第三および第四のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リジンを欠く。
【００５９】
本開示の第九、および第十の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ポリペプチドのうちの一つもしくは複数のＮ末端またはＣ末端にリンカーにより結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む。
【００６０】
第十一の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む組成物を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン；およびｅ）第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第一および第二の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合する。
【００６１】
本開示の第十一の態様の一部の実施形態では、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体は、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、ここで第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体は、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第二のポリペプチドと第三のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する。
【００６２】
本開示の第十一の態様の一部の実施形態において、第一の抗原結合ドメインは、第一のポリペプチドに結合され、第二の抗原結合ドメインは、第二のポリペプチドと第三のポリペプチドに結合されている。
【００６３】
本開示の第十一の態様の一部の実施形態において、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれは、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｄを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれは、Ｋ３７０ＤとＥ３５７Ｋを含む。
【００６４】
第十二の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む組成物を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン；ｅ）第二のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン；およびｆ）第三のポリペプチドに結合された第三の抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第一、第二および第三の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合する。
【００６５】
本開示の第十二の態様の一部の実施形態では、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体は、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、ここで第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体は、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第二のポリペプチドと第三のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する。
【００６６】
本開示の第十二の態様の一部の実施形態において、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれは、Ｄ３９９ＫとＫ４０９Ｄを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれは、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｄを含む。
【００６７】
本開示の第十一と第十二の態様の一部の実施形態において、第一または第二の抗原結合は、Ｆａｂである。本開示の第十一と第十二の態様の一部の実施形態において、第一および第二の抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。本開示の第九の態様の一部の実施形態において、第一、第二、および第三の抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。
【００６８】
本開示の第十一と第十二の態様の一部の実施形態において、第一または第二の抗原結合は、ｓｃＦｖである。本開示の第十一と第十二の態様の一部の実施形態において、第一および第二の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。本開示の第九の態様の一部の実施形態において、第一、第二、および第三の抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【００６９】
本開示の第十一の態様の一部の実施形態において、第一または第二の抗原結合ドメインは、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインを含み、当該ＶＨドメインとＣＨ１ドメインは、第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である。一部の実施形態において、抗原結合ドメインはさらにＶＬドメインを含み、ここで一部の実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＶＬドメインを含む第四のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含み、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を除き、ＶＨ配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、またはＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む。
【００７０】
本開示の第十二の態様の一部の実施形態において、第一、第二または第三の抗原結合ドメインは、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインを含み、当該ＶＨドメインとＣＨ１ドメインは、第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である。一部の実施形態において、抗原結合ドメインはさらにＶＬドメインを含み、ここで一部の実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＶＬドメインを含む第四のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含み、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を除き、ＶＨ配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、またはＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む。
【００７１】
本開示の第十一の態様の一部の実施形態において、第一、または第二の抗原結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、および表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、当該ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、または抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列のセットを含む。
【００７２】
本開示の第十二の態様の一部の実施形態において、第一、第二、または第三の抗原結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、および表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、当該ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、または抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列のセットを含む。
【００７３】
本開示の第十一、および第十二の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインをさらに含み、ここで当該ＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインは、リンカーにより第一のポリペプチドまたは第二のポリペプチドのＮ末端に結合されている。
【００７４】
本開示の第十一、および第十二の態様の一部の実施形態において、第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体は、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む。
【００７５】
本開示の第十一、および第十二の態様の一部の実施形態において、第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体は、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の間での二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む。
【００７６】
本開示の第十一、および第十二の態様の一部の実施形態において、二量体形成選択モジュールが、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つのＣＨ３ドメイン内に改変された空洞と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３ドメイン内に改変された突起とを含み、ここで当該改変された空洞および当該改変された突起は、Ｆｃドメイン単量体の空洞に突起が挿入された対を形成するよう配置される。一部の実施形態において、改変された突起は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｆ、およびＦ４０５Ｗから選択される改変を少なくとも一つ含み、改変された空洞は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、およびＴ３９４Ｓから選択される改変を少なくとも一つ含む。一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つは、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含み、Ｆｃドメイン単量体のうちの他方は、Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含む。
【００７７】
本開示の第十一、および第十二の態様の一部の実施形態において、二量体形成選択モジュールは、ドメイン単量体のうちの１つのＣＨ３ドメイン内に負電荷をもつアミノ酸と、Ｆｃドメイン単量体のうちの他方のＣＨ３ドメイン内に正電荷をもつアミノ酸を含み、ここで当該負電荷をもつアミノ酸および当該正電荷をもつアミノ酸は、Ｆｃドメインの形成を促進するよう配置される。一部の実施形態において、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３９９Ｋと、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅのいずれかを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３９２ＤとＤ３９９Ｋを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｅを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３５６ＫとＫ４３９Ｄを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３９２ＥとＤ３９９Ｋを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｄを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３５６ＫとＫ４３９Ｅを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｓ３５４ＣとＴ３６６Ｗを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第三と第四のポリペプチドの各々は、Ｓ３５４ＣとＴ３６６Ｗを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体は各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｅ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｅ３５７Ｋまたは３５７Ｒを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含み、第三および第四のポリペプチドは各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、または第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含む。
【００７８】
本開示の第十一、および第十二の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つまたは複数のリンカーは、結合である。
【００７９】
本開示の第十一、および第十二の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つまたは複数のリンカーは、スペーサーである。一部の実施形態において、スペーサーは、以下：
2020514301.tif 000005
の配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば４〜３０、８〜３０、または１２〜３０個のグリシン残基からなるスペーサー、例えば２０個のグリシン残基からなるスペーサーである。
【００８０】
本開示の第十一、および第十二の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインのうちの一つまたは複数は、リンカーによりＦｃドメイン単量体に結合されている。一部の実施形態において、リンカーは、スペーサーである。
【００８１】
本開示の第十一、および第十二の態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメインのうちの少なくとも一つは、Ｉ２５３位に少なくとも一つのアミノ酸改変を含む。一部の実施形態において、Ｉ２５３位の各アミノ酸改変は、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙから独立して選択される。一部の実施形態において、Ｉ２５３位の各アミノ酸改変は、Ｉ２５３Ａである。
【００８２】
本開示の第十一、および第十二の態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメインのうちの少なくとも一つは、Ｒ２９２位に少なくとも一つのアミノ酸改変を含む。一部の実施形態において、Ｒ２９２位の各アミノ酸改変は、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙから独立して選択される。一部の実施形態において、Ｒ２９２位の各アミノ酸改変は、Ｒ２９２Ｐである。
【００８３】
本開示の第十一、および第十二の態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つまたは複数が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプのものである。
【００８４】
本開示の第十一および第十二の態様の一部の実施形態において、第一、第二、第三および第四のポリペプチドのそれぞれにおけるＮ末端Ａｓｐは、Ｇｌｎに変異されている。
【００８５】
本開示の第十一および第十二の態様の一部の実施形態において、第一、第二、第三および第四のポリペプチドのうちの一つまたは複数が、Ｃ末端リジンを欠く。一部の実施形態では、第一、第二、第三および第四のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リジンを欠く。
【００８６】
本開示の第十一、および第十二の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ポリペプチドのうちの一つもしくは複数のＮ末端またはＣ末端にリンカーにより結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む。
【００８７】
第十三の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む組成物を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）ｉ）第三のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第四のＦｃドメイン単量体、およびｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第二のポリペプチド；およびｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；およびｄ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第四のＦｃドメイン単量体と当該第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成される。
【００８８】
本開示の第十三の態様の一部の実施形態では、第一および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第二および第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第四および第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第四のＦｃドメイン単量体と第六のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む。
【００８９】
第十四の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む組成物を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）ｉ）第三のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第四のＦｃドメイン単量体、およびｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第二のポリペプチド；およびｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；およびｅ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第三のＦｃドメイン単量体と当該第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成される。
【００９０】
本開示の第十四の態様の一部の実施形態では、第二および第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第一および第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第三および第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第三のＦｃドメイン単量体と第六のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む。
【００９１】
第十五の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む組成物を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、ｉｖ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、およびｖ）第二のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）ｉ）第四のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、ｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、ｉｖ）第四のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、およびｖ）第五のＦｃドメイン単量体と第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のリンカー、を含む第二のポリペプチド；ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチド；ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチド；およびｇ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第四のＦｃドメイン単量体と当該第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成され、当該第三のＦｃドメイン単量体と当該第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインが形成され、当該第六のＦｃドメイン単量体と当該第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインが形成される。
【００９２】
本開示の第十五の態様の一部の実施形態では、第二および第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第一および第七のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体と第七のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第四および第八のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第四のＦｃドメイン単量体と第八のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第三および第九のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第三のＦｃドメイン単量体と第九のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第六および第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第六のＦｃドメイン単量体と第十のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む。
【００９３】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、Ｆａｂである。
【００９４】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ポリペプチドうちの一つまたは複数のアミノ酸配列の一部であり、一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【００９５】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、当該ＶＨドメインとＣＨ１ドメインは、第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である。一部の実施形態において、抗原結合ドメインはさらにＶＬドメインを含み、ここで一部の実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＶＬドメインを含む第四のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含み、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を除き、ＶＨ配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、またはＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む。
【００９６】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み、抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、および表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、当該ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、または抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列のセットを含む。
【００９７】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインをさらに含み、ここで当該ＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインは、リンカーにより第一のポリペプチドまたは第二のポリペプチドのＮ末端に結合されている。
【００９８】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、二量体形成選択モジュールが、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つのＣＨ３ドメイン内に改変された空洞と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３ドメイン内に改変された突起とを含み、ここで当該改変された空洞および当該改変された突起は、Ｆｃドメイン単量体の空洞に突起が挿入された対を形成するよう配置される。一部の実施形態において、改変された突起は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｆ、およびＦ４０５Ｗから選択される改変を少なくとも一つ含み、改変された空洞は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、およびＴ３９４Ｓから選択される改変を少なくとも一つ含む。一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つは、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含み、Ｆｃドメイン単量体のうちの他方は、Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含む。
【００９９】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、二量体形成選択モジュールは、ドメイン単量体のうちの１つのＣＨ３ドメイン内に負電荷をもつアミノ酸と、Ｆｃドメイン単量体のうちの他方のＣＨ３ドメイン内に正電荷をもつアミノ酸を含み、ここで当該負電荷をもつアミノ酸および当該正電荷をもつアミノ酸は、Ｆｃドメインの形成を促進するよう配置される。一部の実施形態において、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３９９Ｋと、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅのいずれかを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３９２ＤとＤ３９９Ｋを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｅを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３５６ＫとＫ４３９Ｄを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３９２ＥとＤ３９９Ｋを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｄを含み、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３５６ＫとＫ４３９Ｅを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｓ３５４ＣとＴ３６６Ｗを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第三と第四のポリペプチドの各々は、Ｓ３５４ＣとＴ３６６Ｗを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体は各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｅ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｅ３５７Ｋまたは３５７Ｒを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含み、第三および第四のポリペプチドは各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、または第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、第三と第四のポリペプチドは各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含む。
【０１００】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つまたは複数のリンカーは、結合である。
【０１０１】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つまたは複数のリンカーは、スペーサーである。一部の実施形態において、スペーサーは、以下：
2020514301.tif 000006
の配列を有するポリペプチドを含む。一部の実施形態において、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば４〜３０、８〜３０、または１２〜３０個のグリシン残基からなるスペーサー、例えば２０個のグリシン残基からなるスペーサーである。
【０１０２】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、リンカーによりＦｃドメイン単量体に結合されている。一部の実施形態において、リンカーは、スペーサーである。
【０１０３】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメインのうちの少なくとも一つは、Ｉ２５３位に少なくとも一つのアミノ酸改変を含む。一部の実施形態において、Ｉ２５３位の各アミノ酸改変は、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙから独立して選択される。一部の実施形態において、Ｉ２５３位の各アミノ酸改変は、Ｉ２５３Ａである。
【０１０４】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメインのうちの少なくとも一つは、Ｒ２９２位に少なくとも一つのアミノ酸改変を含む。一部の実施形態において、Ｒ２９２位の各アミノ酸改変は、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙから独立して選択される。一部の実施形態において、Ｒ２９２位の各アミノ酸改変は、Ｒ２９２Ｐである。
【０１０５】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つまたは複数が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。一部の実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプのものである。
【０１０６】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、各ポリペプチドのＮ末端Ａｓｐは、Ｇｌｎに変異されている。
【０１０７】
本開示の第十三、第十四および第十五の態様の一部の実施形態において、ポリペプチドのうちの一つまたは複数が、Ｃ末端リジンを欠く。一部の実施形態では、各ポリペプチドは、Ｃ末端リジンを欠く。
【０１０８】
本開示の第十三、第十四、および第十五の態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ポリペプチドのうちの一つもしくは複数のＮ末端またはＣ末端にリンカーにより結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む。
【０１０９】
第十六の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；およびｄ）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン；およびｅ）第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第一および第二の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、エフェクター機能が強化されている。
【０１１０】
第十七の態様において、本開示は、以下を含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴とする：
ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン；およびｅ）第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第一および第二の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む。
【０１１１】
第十八の態様において、本開示は、以下を含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴とする：
ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるスペーサー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；およびｄ）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン；およびｅ）第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第一および第二の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合する。
【０１１２】
第十九の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地を特徴としており、モルベースで当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の少なくとも５０％が、以下：ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；およびｄ）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン；およびｅ）第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第一および第二の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合する。
【０１１３】
第二十の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法を特徴としており、当該方法は、ａ）（１）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド、（２）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド、（３）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド、（４）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン、および（５）第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン、を発現する宿主細胞を培養する工程であって、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、当該抗原結合ドメインは、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体が形成され、当該第一および第二の抗原結合ドメインは異なる抗原に結合し、細胞培養上清中の当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が構造的に同一である、工程；およびｂ）当該細胞培養上清から当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程、を含む。
【０１１４】
本開示の第十六、第十七、第十八、第十九、および第二十の態様の一部の実施形態では、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体は、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体は、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第二のポリペプチドと第三のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する。
【０１１５】
第二十一の態様において、本開示は、以下を含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴とする：
ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン；ｅ）第二のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン；およびｆ）第三のポリペプチドに結合された第三の抗原結合ドメインであって、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第一、第二、および第三の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、エフェクター機能が強化されている。
【０１１６】
第二十二の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン；ｅ）第二のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン；およびｆ）第三のポリペプチドに結合された第三の抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第一、第二および第三の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合し、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む。
【０１１７】
第二十三の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるスペーサー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン；ｅ）第二のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン；およびｆ）第三のポリペプチドに結合された第三の抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第一、第二および第三の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合する。
【０１１８】
第二十四の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地を特徴としており、モルベースで当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の少なくとも５０％が、以下：ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド；ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン；ｅ）第二のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン；およびｆ）第三のポリペプチドに結合された第三の抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第一、第二および第三の抗原結合ドメインは、異なる抗原に結合する。
【０１１９】
第二十五の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法を特徴としており、当該方法は、ａ）（１）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む第一のポリペプチド、（２）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド、（３）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド、（４）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメイン、（５）第二のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメイン、および（６）第三のポリペプチドに結合された第三の抗原結合ドメイン、を発現する宿主細胞を培養する工程であって、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、当該抗原結合ドメインは、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体が形成され、当該第一および第二の抗原結合ドメインは異なる抗原に結合し、細胞培養上清中の当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が構造的に同一である、工程；およびｂ）当該細胞培養上清から当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程、を含む。
【０１２０】
本開示の第二十一、第二十二、第二十三、第二十四、および第二十五の態様の一部の実施形態では、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体は、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体は、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第二のポリペプチドと第三のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する。
【０１２１】
第二十六の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、を含む第一のポリペプチド；ならびにｂ）ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、およびｖｉ）第三のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第二のポリペプチド；ならびにｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；ならびにｄ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第四のＦｃドメイン単量体と当該第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成され、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、エフェクター機能が強化されている。
【０１２２】
第二十七の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、およびｖｉ）第三のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第二のポリペプチド；およびｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；およびｅ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第四のＦｃドメイン単量体と当該第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成され、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む。
【０１２３】
第二十八の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、およびｖｉ）第三のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー、を含む第二のポリペプチド；およびｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；およびｅ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第四のＦｃドメイン単量体と当該第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成される。
【０１２４】
第二十九の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地を特徴としており、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、およびｖｉ）第三のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第二のポリペプチド；およびｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；およびｅ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第四のＦｃドメイン単量体と当該第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成される。
【０１２５】
第三十の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法を特徴としており、当該方法は、ａ）（１）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、を含む第一のポリペプチド、（２）ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、およびｖｉ）第三のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第二のポリペプチド、および（３）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド、（４）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド、および（５）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を発現する宿主細胞を培養する工程であって、ここで当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第四のＦｃドメイン単量体と当該第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成され、細胞培養上清中のＦｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が構造的に同一である、工程；およびｂ）当該細胞培養上清から当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程、を含む。
【０１２６】
本開示の第二十六、第二十七、第二十八、第二十九、および第三十の態様の一部の実施形態では、第一および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第二および第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第四および第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第四のＦｃドメイン単量体と第六のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む。
【０１２７】
第三十一の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、を含む第一のポリペプチド；ならびにｂ）ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、およびｖｉ）第三のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第二のポリペプチド；ならびにｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；ならびにｅ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第三のＦｃドメイン単量体と当該第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成され、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、エフェクター機能が強化されている。
【０１２８】
第三十二の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、およびｖｉ）第三のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第二のポリペプチド；およびｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；およびｅ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第三のＦｃドメイン単量体と当該第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成され、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む。
【０１２９】
第三十三の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、およびｖｉ）第三のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー、を含む第二のポリペプチド；およびｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；およびｅ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第三のＦｃドメイン単量体と当該第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成される。
【０１３０】
第三十四の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地を特徴としており、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、およびｖｉ）第三のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第二のポリペプチド；およびｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；およびｅ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第三のＦｃドメイン単量体と当該第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成される。
【０１３１】
第三十五の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法を特徴としており、当該方法は、ａ）（１）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、およびｉｉｉ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、を含む第一のポリペプチド、（２）ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、およびｖｉ）第三のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第二のポリペプチド、および（３）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド、（４）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド、および（５）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を発現する宿主細胞を培養する工程であって、ここで当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第三のＦｃドメイン単量体と当該第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成され、細胞培養上清中のＦｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が構造的に同一である、工程；およびｂ）当該細胞培養上清から当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程、を含む。
【０１３２】
本開示の第三十一、第三十二、第三十三、第三十四、または第三十五の態様の一部の実施形態では、第二および第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体と第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第一および第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第三および第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第三のＦｃドメイン単量体と第六のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む。
【０１３３】
第三十六の態様において、本開示は、以下を含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴とする：
ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、ｉｖ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、およびｖ）第二のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）ｖｉ）第四のＦｃドメイン単量体、ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、ｖｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、ｉｘ）第四のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、およびｘ）第五のＦｃドメイン単量体と第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のリンカー、を含む第二のポリペプチド；ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチド；ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチド；およびｇ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第四のＦｃドメイン単量体と当該第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成され、当該第三のＦｃドメイン単量体と当該第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインが形成され、当該第六のＦｃドメイン単量体と当該第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインが形成され、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、エフェクター機能が強化されている。
【０１３４】
第三十七の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、ｉｖ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、およびｖ）第二のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）ｖｉ）第四のＦｃドメイン単量体、ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、ｖｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、ｉｘ）第四のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、およびｘ）第五のＦｃドメイン単量体と第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のリンカー、を含む第二のポリペプチド；ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチド；ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチド；およびｇ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第四のＦｃドメイン単量体と当該第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成され、当該第三のＦｃドメイン単量体と当該第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインが形成され、当該第六のＦｃドメイン単量体と当該第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインが形成され、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む。
【０１３５】
第三十八の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、当該構築体は、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、ｉｖ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、およびｖ）第二のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）ｖｉ）第四のＦｃドメイン単量体、ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、ｖｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、ｉｘ）第四のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のスペーサー、およびｘ）第五のＦｃドメイン単量体と第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のスペーサー、を含む第二のポリペプチド；ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチド；ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチド；およびｇ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第四のＦｃドメイン単量体と当該第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成され、当該第三のＦｃドメイン単量体と当該第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインが形成され、当該第六のＦｃドメイン単量体と当該第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインが形成される。
【０１３６】
第三十九の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地を特徴としており、当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が、ａ）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、ｉｖ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、およびｖ）第二のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー、を含む第一のポリペプチド；ｂ）ｖｉ）第四のＦｃドメイン単量体、ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、ｖｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、ｉｘ）第四のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のスペーサー、およびｘ）第五のＦｃドメイン単量体と第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のスペーサー、を含む第二のポリペプチド；ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド；ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド；ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチド；ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチド；およびｇ）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を含み、ここで当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第四のＦｃドメイン単量体と当該第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成され、当該第三のＦｃドメイン単量体と当該第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインが形成され、当該第六のＦｃドメイン単量体と当該第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインが形成される。
【０１３７】
第四十の態様において、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法を特徴としており、当該方法は、ａ）（１）ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、ｉｖ）第一のＦｃドメイン単量体と第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー、およびｖ）第二のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー、を含む第一のポリペプチド、（２）ｖｉ）第四のＦｃドメイン単量体、ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、ｖｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、ｉｘ）第四のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のスペーサー、およびｘ）第五のＦｃドメイン単量体と第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のスペーサー、を含む第二のポリペプチド、（３）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド、（４）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチド、（５）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチド、（６）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチド、および（７）第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合された抗原結合ドメイン、を発現する宿主細胞を培養する工程であって、ここで当該第二のＦｃドメイン単量体と当該第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインが形成され、当該第一のＦｃドメイン単量体と当該第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインが形成され、当該第四のＦｃドメイン単量体と当該第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインが形成され、当該第三のＦｃドメイン単量体と当該第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインが形成され、当該第六のＦｃドメイン単量体と当該第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインが形成され、細胞培養上清中のＦｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも５０％が、構造的に同一である、工程；およびｂ）当該細胞培養上清から当該Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程、を含む。
【０１３８】
本開示の第三十六、第三十七、第三十八、第三十九、および第四十の態様の一部の実施形態では、第二および第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第二のＦｃドメイン単量体と第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第一および第七のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第一のＦｃドメイン単量体と第七のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第四および第八のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第四のＦｃドメイン単量体と第八のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第三および第九のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第三のＦｃドメイン単量体と第九のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、第六および第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、第六のＦｃドメイン単量体と第十のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む。
【０１３９】
本開示の全態様の一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、フコシル化が減少している。ゆえに一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を含む組成物中のＦｃドメイン単量体の４０％、３０％、２０％、１５％、１０％または５％未満が、フコシル化される。
【０１４０】
本開示の全態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体は、ＣＨ３ドメイン中に最大で１０個（９、８、７、６、５、４、３、２または１個）の単一アミノ酸変化を伴う、図５３Ａ（配列番号４３）のアミノ酸配列を含む。
【０１４１】
本開示の全態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体は、ＣＨ３ドメイン中に最大で１０個（９、８、７、６、５、４、３、２または１個）の単一アミノ酸変化を伴う、図５３Ｂ（配列番号４５）のアミノ酸配列を含む。
【０１４２】
本開示の全態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体は、ＣＨ３ドメイン中に最大で１０個（９、８、７、６、５、４、３、２または１個）の単一アミノ酸変化を伴う、図５３Ｃ（配列番号４７）のアミノ酸配列を含む。
【０１４３】
本開示の全態様の一部の実施形態において、Ｆｃドメイン単量体は、ＣＨ３ドメイン中に最大で１０個（９、８、７、６、５、４、３、２または１個）の単一アミノ酸変化を伴う、図５３Ｄ（配列番号４２）のアミノ酸配列を含む。
【０１４４】
本開示の全態様の一部の実施形態において、例えばＦｃドメイン単量体がポリペプチドのカルボキシ末端にあるとき、当該Ｆｃドメイン単量体は、Ｋ４４７を含まない。他の実施形態において、例えばＦｃドメイン単量体がポリペプチドのカルボキシ末端にあるとき、当該Ｆｃドメイン単量体は、Ｋ４４７を含む。
【０１４５】
本開示の全態様の一部の実施形態において、例えばＦｃドメイン単量体がリンカーに対してアミノ末端であるとき、Ｆｃドメイン単量体は、両端を含むＥ２１６〜Ｃ２２０のヒンジ部分を含まないが、両端を含むＤ２２１〜Ｌ２３５のヒンジ部分を含む。他の実施形態において、例えばＦｃドメイン単量体がＣＨ１ドメインに対しカルボキシ末端であるとき、当該Ｆｃドメイン単量体は、両端を含むＥ２１６〜Ｌ２３５のヒンジ部分を含む。本開示の全態様の一部の実施形態において、例えばポリペプチドのアミノ末端のヒンジドメインなどのヒンジドメインは、Ｋａｂａｔの２２１位でＡｓｐからＧｌｎへの変異を有する。
【０１４６】
上述のとおり、本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、２個以上のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドを含むポリペプチドから組立られ、そのようなポリペプチドは本開示の一つの態様である。
【０１４７】
第四十一の態様において、本開示は、抗原結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；および任意の、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、を含むポリペプチドを特徴としており、少なくとも１個のＦｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含む。
【０１４８】
ｆ第四十一の様々な実施形態において：抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変ドメインを含む；抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメインを含む；第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は２個または４個の逆電荷変異を含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含む；第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、２個または４個の逆電荷変異を含む；第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第二のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む；ポリペプチドは、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、当該第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ改変された突起を形成する変異を含む；ポリペプチドは、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、当該第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が２個または４個の逆電荷変異を含む；ポリペプチドは、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、当該第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが改変された突起を形成する変異を含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は２個または４個の逆電荷変異を含む；ポリペプチドは、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、当該第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と当該第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ突起を形成する変異を含み、当該第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は２個または４個の逆電荷変異を含む。
【０１４９】
第四十一の態様の様々な実施形態において：改変された突起を形成する変異を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体はさらに、１個、２個、または３個の逆電荷変異を含む；改変された突起を形成する変異、および逆電荷変異は、ＣＨ３ドメインにある；変異は、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある；変異は、単一アミノ酸変化である；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる：
2020514301.tif 000007
；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、グリシンスペーサーである；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０または１２〜３０個のグリシン残基からなる；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、２０個のグリシン残基からなる；少なくとも１個のＦｃドメイン単量体は、ＫａｂａｔのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含み、ＫａｂａｔのＩ２５３位の各アミノ酸変異は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される；Ｉ２５３位の各アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａである；少なくとも１個のＦｃドメイン単量体は、ＫａｂａｔのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含む；ＫａｂａｔのＲ２９２位の各アミノ酸変異は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される；Ｒ２９２位の各アミノ酸変異は、Ｒ２９２Ｐである；各Ｆｃドメイン単量体は独立して、
2020514301.tif 000008
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる；第二のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、
2020514301.tif 000009
のアミノ酸配列を有する；第一のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、
2020514301.tif 000010
のアミノ酸配列を有する；第一のＦｃドメインのヒンジ部分は、
2020514301.tif 000011
の配列を有し、第二のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、
2020514301.tif 000012
のアミノ酸配列を有する；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
2020514301.tif 000013
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む：２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
2020514301.tif 000014
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む：２個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000015
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む：
2020514301.tif 000016
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：１０個以下の単一アミノ酸の置換を伴う
2020514301.tif 000017
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：８個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000018
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：６個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000019
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：５個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000020
；単一アミノ酸置換は、以下からなる群から選択される：Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｋ；Ｆｃドメイン単量体のそれぞれは独立して、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および最大で１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４５のいずれかのアミノ酸配列を含む；単一アミノ酸置換のうちの最大で６個が、ＣＨ３ドメイン中の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である；単一アミノ酸置換は、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある；改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される；２個または４個の逆電荷変異は、以下から選択される：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｋ；抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである；抗原結合ドメインは、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインを含む；抗原結合ドメインはさらに、ＶＬドメインを含む；ＶＨドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３のセットを含む；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、ＶＨ配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む；抗原結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む；抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列とＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む；抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、当該ＶＨドメイン配列とＶＬドメイン配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列とＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である；抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列とＶＬ配列のセットを含む；抗原結合ドメインは、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインを含む；抗原結合ドメインは、ＶＨドメイン��よびＣＨ１ドメインを含み、ＶＬドメインとＣＬドメインを含むポリペプチドに結合して、Ｆａｂを形成することができる。
【０１５０】
また、第一または第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、２コピーの上述のポリペプチドを含むポリペプチド複合体が記載される。
【０１５１】
また、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドに結合されている、上述のポリペプチドを含むポリペプチド複合体も記載され、当該ポリペプチドと第二のポリペプチドは、当該ポリペプチドの第一、第二、または第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン内、および第二のポリペプチドのヒンジドメイン内の、システイン残基間のジスルフィド結合により結合されている。
【０１５２】
複合体の様々な実施形態において：第二のポリペプチド単量体は、改変された空洞を形成する変異を含む；改変された空洞を形成する変異は、以下からなる群から選択される：Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３６４Ｈ／Ｆ４０５Ａ；第二のポリペプチドは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および最大で１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４５のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【０１５３】
第四十二の態様において、本開示は、抗原結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；および任意の、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、を含むポリペプチドを特徴としており、少なくとも１個のＦｃドメイン単量体は、１、２または３個の逆電荷アミノ酸変異を含む。
【０１５４】
第四十二の態様の様々な実施形態において：抗原結合ドメインは、抗体重鎖可変ドメインを含む；抗原結合ドメインは、抗体軽鎖改変ドメインを含む；第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表５のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含む；第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表５のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む；第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第二のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含む；ポリペプチドはさらに、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体はそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含む；ポリペプチドはさらに、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含み、第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表５のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む；ポリペプチドはさらに、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表５のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む；ポリペプチドはさらに、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含み、第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表５のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む；表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、同一のＣＨ３ドメインを有する；表４から選択される１個、２個または３個の逆電荷アミノ酸変異は、ＣＨ３ドメイン中にある；変異は、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある；変異はそれぞれ、単一アミノ酸の変化である；変異は、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４６位の配列内にある；変異は、単一アミノ酸の変化である；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれら���らなる：
2020514301.tif 000021
；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、グリシンスペーサーである；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０または１２〜３０個のグリシン残基からなる；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは２０個のグリシン残基からなる；少なくとも一つのＦｃドメイン単量体は、ＫａｂａｔのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含み、ＫａｂａｔのＩ２５３位の各アミノ酸変異は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される；Ｉ２５３位の各アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａである；Ｆｃドメイン単量体の少なくとも一つは、ＫａｂａｔのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含む；ＫａｂａｔのＲ２９２位の各アミノ酸変異は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される；Ｒ２９２位の各アミノ酸変異は、Ｒ２９２Ｐである；各Ｆｃドメイン単量体は独立して、
2020514301.tif 000022
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる；第二のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、
2020514301.tif 000023
のアミノ酸配列を有する；第一のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、
2020514301.tif 000024
のアミノ酸配列を有する；第一のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、
2020514301.tif 000025
のアミノ酸配列を有し、第二のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、
2020514301.tif 000026
のアミノ酸配列を有する；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
2020514301.tif 000027
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む：２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
2020514301.tif 000028
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む：２個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000029
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む：
2020514301.tif 000030
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000031
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：８個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000032
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：６個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000033
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：５個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000034
；単一アミノ酸置換は、以下からなる群から選択される：Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｋ；Ｆｃドメイン単量体のそれぞれは独立して、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および最大で１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４５のいずれかのアミノ酸配列を含む；単一アミノ酸置換のうちの最大で６個が、ＣＨ３ドメイン中の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である；単一アミノ酸置換は、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある；改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される；２個または４個の逆電荷変異は、以下から選択される：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｋ；抗原結合ドメインは、ｓｃＦｖである；抗原結合ドメインは、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインを含む；抗原結合ドメインはさらに、ＶＬドメインを含む；ＶＨドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３のセットを含む；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、ＶＨ配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む；抗原結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む；抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列とＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む；抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、当該ＶＨドメイン配列とＶＬドメイン配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列とＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である；抗原結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列とＶＬ配列のセットを含む；抗原結合ドメインは、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインを含む；抗原結合ドメインは、ＶＨドメイン��よびＣＨ１ドメインを含み、ＶＬドメインとＣＬドメインを含むポリペプチドに結合して、Ｆａｂを形成することができる。
【０１５５】
また、第一または第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、上述のポリペプチドのいずれかの２コピーを含むポリペプチド複合体が記載される。
【０１５６】
また、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドに結合されている、上述のポリペプチドを含むポリペプチド複合体も記載され、当該ポリペプチドと第二のポリペプチドは、当該ポリペプチドの第一、第二、または第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン内、および第二のポリペプチドのヒンジドメイン内の、システイン残基間のジスルフィド結合により結合されている。様々な実施形態において：第二のポリペプチド単量体は、１、２または３個の逆電荷変異を含む；第二のポリペプチド単量体は、表４から選択される逆電荷変異を１個、２個、または３個含み、ポリペプチド中の、表４から選択される１個、２個または３個の逆電荷変異に対し相補的である；第二のポリペプチドは、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および最大で１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４５のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【０１５７】
第四十三の態様において、本開示は、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；ならびに任意のヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、を含むポリペプチドを特徴としており、少なくとも１個のＦｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含む。
【０１５８】
第四十三の様々な実施形態において：ポリペプチドはさらに以下を含む：第一のＩｇＧ１単量体に対しアミノ末端の抗体重鎖可変ドメインとＣＨ１ドメイン、または第一のＩｇＧ１単量体に対しアミノ末端のｓｃＦｖ；第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は２個または４個の逆電荷変異を含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含む；第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、２個または４個の逆電荷変異を含む；第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第二のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含み；ポリペプチドは、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、当該第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ改変された突起を形成する変異を含む；ポリペプチドは、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、当該第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が２個または４個の逆電荷変異を含む；ポリペプチドは、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、、当該第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが改変された突起を形成する変異を含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は２個または４個の逆電荷変異を含む；ポリペプチドは、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、当該第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と当該第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ突起を形成する変異を含み、当該第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は２個または４個の逆電荷変異を含む。
【０１５９】
第四十三の態様の様々な実施形態において：改変された突起を形成する変異を含むＩｇＧ１Ｆｃドメイン単量体はさらに、１個、２個または３個の逆電荷変異を含む；
改変された突起を形成する変異、および逆電荷変異は、ＣＨ３ドメインにある；変異は、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある；変異は、単一アミノ酸変化である；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる：
2020514301.tif 000035
；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、グリシンスペーサーである；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０または１２〜３０個のグリシン残基からなる；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、２０個のグリシン残基からなる；少なくとも１個のＦｃドメイン単量体は、ＫａｂａｔのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含み、ＫａｂａｔのＩ２５３位の各アミノ酸変異は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される；Ｉ２５３位の各アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａである；少なくとも１個のＦｃドメイン単量体は、ＫａｂａｔのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含む；ＫａｂａｔのＲ２９２位の各アミノ酸変異は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される；Ｒ２９２位の各アミノ酸変異は、Ｒ２９２Ｐである；各Ｆｃドメイン単量体は独立して、
2020514301.tif 000036
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる；第二のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、
2020514301.tif 000037
のアミノ酸配列を有する；第一のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、
2020514301.tif 000038
のアミノ酸配列を有する；第一のＦｃドメインのヒンジ部分は、
2020514301.tif 000039
の配列を有し、第二のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、
2020514301.tif 000040
のアミノ酸配列を有する；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
2020514301.tif 000041
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む：２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
2020514301.tif 000042
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む：２個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000043
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む：
2020514301.tif 000044
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000045
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：８個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000046
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：６個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000047
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：５個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000048
；単一アミノ酸置換は、以下からなる群から選択される：Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｋ；Ｆｃドメイン単量体のそれぞれは独立して、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および最大で１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４５のいずれかのアミノ酸配列を含む；単一アミノ酸置換のうちの最大で６個が、ＣＨ３ドメイン中の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である；単一アミノ酸置換は、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある；改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される；２個または４個の逆電荷変異は、以下から選択される：Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｋ。
【０１６０】
第四十四の態様において、本開示は、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；ならびに任意の、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、を含むポリペプチドを特徴としており、少なくとも１個のＦｃドメイン単量体は、１、２または３個の逆電荷アミノ酸変異を含む。
【０１６１】
第四十四の態様の様々な実施形態において：ポリペプチドはさらに、第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体に対しアミノ末端の抗体重鎖可変ドメインとＣＨ１ドメイン、または第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体に対しアミノ末端のｓｃＦｖを含む；第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表５のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含む；第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表５のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む；第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第二のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含む；ポリペプチドはさらに、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体はそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含む；ポリペプチドはさらに、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含み、第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表５のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む；ポリペプチドはさらに、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表５のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む；ポリペプチドはさらに、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含み、第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表５のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含む；表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個または３個含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、同一のＣＨ３ドメインを有する；表４から選択される１個、２個または３個の逆電荷アミノ酸変異は、ＣＨ３ドメイン中にある；変異は、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある；変異はそれぞれ、単一アミノ酸の変化である；変異は、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４６位の配列内にある；変異は、単一アミノ酸の変化である；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる：
2020514301.tif 000049
；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、グリシンスペーサーである；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０または１２〜３０個のグリシン残基からなる；第二のリンカーと任意の第三のリンカーは、２０個のグリシン残基からなる；少なくとも１個のＦｃドメイン単量体は、ＫａｂａｔのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含み、ＫａｂａｔのＩ２５３位の各アミノ酸変異は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される；Ｉ２５３位の各アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａである；少なくとも１個のＦｃドメイン単量体は、ＫａｂａｔのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含む；ＫａｂａｔのＲ２９２位の各アミノ酸変異は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される；Ｒ２９２位の各アミノ酸変異は、Ｒ２９２Ｐである；各Ｆｃドメイン単量体は独立して、
2020514301.tif 000050
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる；第二のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、
2020514301.tif 000051
のアミノ酸配列を有する；第一のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、
2020514301.tif 000052
のアミノ酸配列を有する；第一のＦｃドメインのヒンジ部分は、
2020514301.tif 000053
の配列を有し、第二のＦｃドメイン単量体と第三のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、
2020514301.tif 000054
のアミノ酸配列を有する；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
2020514301.tif 000055
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む：２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う
2020514301.tif 000056
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む：２個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000057
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、以下のアミノ酸配列を含む：
2020514301.tif 000058
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000059
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：８個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000060
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：６個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000061
；各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、以下のアミノ酸配列を含む：５個以下の単一アミノ酸置換を伴う
2020514301.tif 000062
；単一アミノ酸置換は、以下からなる群から選択される：Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｋ；Ｆｃドメイン単量体のそれぞれは独立して、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および最大で１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４５のいずれかのアミノ酸配列を含む；単一アミノ酸置換のうちの最大で６個が、ＣＨ３ドメイン中の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である；単一アミノ酸置換は、両端を含むＫａｂａｔのＧ３４１位〜ＫａｂａｔのＫ４４７位の配列内にある；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３のセットを含む；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含む；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、ＶＨ配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含む；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体のＶＨ配列とＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、当該ＶＨドメイン配列とＶＬドメイン配列は、表２に記載される抗体のＶＨ配列とＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体のＶＨ配列とＶＬ配列のセットを含む。
【０１６２】
また、第四十一、第四十二、第四十三、および第四十四の態様の前述のポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子が記載される。
【０１６３】
また、以下も記載される：前述のポリペプチドのいずれかをコードする核酸を含む発現ベクター；当該核酸または発現ベクターを含有する宿主細胞；抗体ＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子（例えば抗体ＶＬドメインと抗体ＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子）をさらに含有する宿主細胞；抗体ＶＬドメインと抗体ＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含有する宿主細胞；１０個以下の単一アミノ酸変異を有するＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含有する宿主細胞；１０個以下の単一アミノ酸変異を有するＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含有する宿主細胞。様々な実施形態において：ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、ＣＨ３ドメイン中に１０、８、６または４個以下の単一アミノ酸変異を有する配列番号４２、４３、４５および４７のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
また、本明細書に記載されるポリペプチドまたはポリペプチド複合体のいずれかを含む医薬組成物も記載される。様々な実施形態において、ポリペプチドの４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％未満が、少なくとも１個のフコースを有する。
【０１６５】
本開示の第四十一、第四十二、第四十三、および第四十四の態様のポリペプチドは、本明細書に記載される様々なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の構成要素として有用である。ゆえに、第一〜第四十の態様のいずれかのポリペプチド、例えば抗原結合ドメインを含み得るもの、は、本開示の第四十一、第四十二、第四十三、および第四十四の態様のいずれかのポリペプチドを含み得る、またはこれらからなり得る。
【０１６６】
本開示の全態様における使用に対し、有用な他のポリペプチドとしては、空洞を形成する変異（例えば、Ｙ４０７Ｔ  Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ：Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ：Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ：Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｔ、Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ：Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３６４Ｈ：Ｆ４０５Ａから選択される）を１、２または３個有する、Ｆｃドメイン単量体（例えば、８、６、５、４、または３個以下の単一アミノ酸置換を伴う配列番号４２、４３、４５および４７のいずれかのアミノ酸配列を含むか、またはこれらからなる）を含むポリペプチドが挙げられる。これらポリペプチドは任意で、表４または表５からの逆電荷変異を１、２または３個含み得る。
【０１６７】
定義：
本明細書に記載される場合、「Ｆｃドメイン単量体」という用語は、少なくともヒンジドメイン、ならびに第二および第三の抗体定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）、またはそれらの機能性断片（例えば、少なくともヒンジドメインまたはその機能性断片、ＣＨ２ドメインまたはその機能性断片、およびＣＨ３ドメインまたはその機能性断片）（例えば、（ｉ）別のＦｃドメイン単量体と二量体形成してＦｃドメインを形成し、（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合することができる断片）を含むポリペプチド鎖を指す。Ｆｃドメイン単量体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＤを含む、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプとすることが可能である（例えば、ＩｇＧ）。さらに、Ｆｃドメイン単量体は、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）とすることが可能である（例えば、ＩｇＧ１）。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、本明細書に記載される実施例において使用される。ヒトＩｇＧ１のヒンジドメインは、ＫａｂａｔのＤ２２１〜Ｌ２３５にわたり、ＣＨ２ドメインは、Ｇ２３６〜Ｋ３４０にわたり、ＣＨ３ドメインは、Ｇ３４１〜Ｋ４４７にわたる。本明細書の多くの実施例において、ＣＨ３ドメインはＫ３４７を含まない。ゆえにＣＨ３ドメインは、Ｇ３４１〜Ｇ４４６であってもよい。本明細書の多くの実施例において、ヒンジドメインは、Ｅ２１６〜Ｌ２３５を含み得る。これは、例えば、ヒンジがＣＨ１ドメインまたは抗原結合ドメインに対してアミノ末端であるときに当てはまる。例えばヒンジがポリペプチドのアミノ末端であるときなどの一部の例において、Ｋａｂａｔの２２１のＡｓｐは、Ｇｌｎに変異されている。Ｆｃドメイン単量体は、抗原認識領域、例えば可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として機能することが可能である、免疫グロブリンの部分を何も含まない。Ｆｃドメイン単量体は、野生型Ｆｃドメイン単量体配列からの変更を１０個程度（例えば、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４個のアミノ酸置換、付加または欠失）含有することが可能であり、該変更は、ＦｃドメインとＦｃ受容体間の相互作用を変える。Ｆｃドメイン単量体は、野生型Ｆｃドメイン単量体配列からの変更（例えば、単一アミノ酸置換）を１０個程度含有することが可能であり（例えば、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４個のアミノ酸置換、付加または欠失）、当該変更は、Ｆｃドメイン単量体間の相互作用を変える。特定の実施形態において、以下のヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン配列と比較して、ＣＨ３ドメイン上に、最大で１０、８、６または５個の単一アミノ酸置換が存在する：
2020514301.tif 000063
適切な変化の例は、当分野に公知である。
【０１６８】
本明細書において、「Ｆｃドメイン」という語は、Ｆｃ受容体を結合することが可能である二つのＦｃドメイン単量体による二量体を指す。野生型Ｆｃドメインでは、二つのＦｃドメイン単量体が二つのＣＨ３抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体形成するのみならず、二量体形成している二つのＦｃドメイン単量体のヒンジドメイン間に、一つまたは複数のジスルフィド結合を形成する。
【０１６９】
本開示において、「Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体」という用語は、本明細書に記載のＦｃドメインを少なくとも２個形成し、少なくとも１個の「抗原結合ドメイン」を含む会合したポリペプチド鎖を指す。本明細書に記載されるＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、同一または異なる配列を有するＦｃドメイン単量体を含むことが可能である。例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、三つのＦｃドメインを有することが可能であり、そのうちの二つがＩｇＧ１またはＩｇＧ１に由来するＦｃドメイン単量体を含み、三つ目がＩｇＧ２またはＩｇＧ２に由来するＦｃドメイン単量体を含む。別の例では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は三つのＦｃドメインを有することが可能であり、そのうちの二つが「空洞に突起が挿入された対（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ  ｐａｉｒ）」を含み、三つ目は「空洞に突起が挿入された対」を含まない。Ｆｃドメインは、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、またはＦｃγＲＩＶであるＦｃ受容体と結合する最小限の構造を形成する。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」という用語は、標的分子に特異的に結合することができるペプチド、ポリペプチド、または会合したポリペプチドのセットを指す。一部の実施形態では、「抗原結合ドメイン」は、抗体により結合される抗原に、特異性をもって結合する抗体の最小配列である。当技術分野で公知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）または様々な免疫アッセイ（例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ）を使用して、抗原に対する抗体の特異性を評価することができる。一部の実施形態において、「抗原結合ドメイン」は、抗体の可変ドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ：Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ）、例えば表１に記載の抗体のＣＤＲを一つ以上、表２に記載の抗体のＣＤＲを一つ以上、または表２に記載の抗体のＶＨドメインおよび／またはＶＬドメインを含む。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを、任意でＶＬドメインとともに含み得る。他の実施形態において、抗原結合ドメインは、抗体のＦａｂ断片またはｓｃＦｖである。抗原結合ドメインは、例えばフィブロネクチン系の結合タンパク質（例えば、フィブロネクチンのＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディなど）などの標的に特異的に結合する合成的に改変されたペプチドであってもよい。
【０１７１】
本明細書において使用される場合、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、抗体の可変ドメインのアミノ酸残基を指し、その存在は抗原結合に必須である。各可変ドメインは通常、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３、ならびにＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３として識別される三つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔにより規定される場合の「相補性決定領域」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中のおよそ２４〜３４残基（ＣＤＲ−Ｌ１）、５０〜５６残基（ＣＤＲ−Ｌ２）、および８９〜９７残基（ＣＤＲ−Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５残基（ＣＤＲ−Ｈ１）、５０〜６５残基（ＣＤＲ−Ｈ２）、および９５〜１０２残基（ＣＤＲ−Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、および／または「超可変ループ（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐ）」からのそれら残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中のおよそ２６〜３２残基（ＣＤＲ−Ｌ１）、５０〜５２残基（ＣＤＲ−Ｌ２）、および９１〜９６残基（ＣＤＲ−Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６〜３２残基（ＣＤＲ−Ｈ１）、５３−５５残基（ＣＤＲ−Ｈ２）、および９６〜１０１残基（ＣＤＲ−Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含んでもよい。一部の例では、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔに従い規定されるＣＤＲ領域と、超可変ループの両方からのアミノ酸を含み得る。
【０１７２】
「フレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎｓ）」（以下、ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外のそれら可変ドメイン残基である。各可変ドメインは通常、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４として識別される四つのＦＲを有する。ＣＤＲがＫａｂａｔに従い規定される場合、軽鎖ＦＲ残基はおよそ１〜２３残基（ＬＣＦＲ１）、３５〜４９残基（ＬＣＦＲ２）、５７〜８８残基（ＬＣＦＲ３）、および９８〜１０７残基（ＬＣＦＲ４）に位置付けられ、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基中、およそ１〜３０残基（ＨＣＦＲ１）、３６〜４９残基（ＨＣＦＲ２）、６６〜９４残基（ＨＣＦＲ３）、および１０３〜１１３残基（ＨＣＦＲ４）に位置付けられる。ＣＤＲが超可変ループ由来のアミノ酸残基を含む場合、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖中、およそ１〜２５残基（ＬＣＦＲ１）、３３〜４９残基（ＬＣＦＲ２）、５３〜９０残基（ＬＣＦＲ３）、および９７〜１０７残基（ＬＣＦＲ４）に位置付けられ、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基中、およそ１〜２５残基（ＨＣＦＲ１）、３３〜５２残基（ＨＣＦＲ２）、５６〜９５残基（ＨＣＦＲ３）、および１０２〜１１３残基（ＨＣＦＲ４）に位置付けられる。一部の例では、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔに規定されるＣＤＲと、超可変ループの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基は、適切に調整されるであろう。
【０１７３】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合の部位を含有する抗体断片である。この領域は、緊密に会合した一つの重鎖可変ドメインと一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなり、例えばｓｃＦｖにおいては共有結合性であり得る。この構造において、各可変ドメインの３個のＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体表面上の抗原結合部位を規定する。
【０１７４】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変ドメインと定常ドメイン、および重鎖の可変ドメインと第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ’）２  抗体断片は、一般的にヒンジシステインによりそのカルボキシ末端近傍で共有結合されているＦａｂ断片の対を含む。
【０１７５】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、単一ポリペプチド鎖中に抗体のＶＨドメインとＶＬドメインを含む。一般的に、ｓｃＦｖは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによりｓｃＦｖは所望の抗原結合のための構造を形成することができるようになる。
【０１７６】
本明細書において、「抗体定常ドメイン」という語は、抗体の定常領域ドメイン（例えば、ＣＬ抗体定常ドメイン、ＣＨ１抗体定常ドメイン、ＣＨ２抗体定常ドメイン、またはＣＨ３抗体定常ドメイン）に相当するポリペプチドを指す。
【０１７７】
本明細書において、「促進する」という語は、例えば他の別個のＦｃドメイン単量体に対するよりも、互いに高い結合親和性を有する二つのＦｃドメイン単量体でＦｃドメインを形成することを支持するといったように、促すことおよび支持することを意味する。本明細書に記載されるように、結合してＦｃドメインを形成する二つのＦｃドメイン単量体は、それらの各ＣＨ３抗体定常ドメインの界面において適合可能なアミノ酸改変（例えば、改変された突起および改変された空洞、ならびに／または静電的ステアリング変異）を有することが可能である。適合可能なアミノ酸改変は、こうしたアミノ酸改変を有さない、または適合しないアミノ酸改変をもつ他のＦｃドメイン単量体よりも、こうしたＦｃドメイン単量体同士での選択的な相互作用を促進するまたは支持する。これは、相互作用する二つのＣＨ３抗体定常ドメインの界面におけるアミノ酸改変に起因して、Ｆｃドメイン単量体が、アミノ酸改変を有さない他のＦｃドメイン単量体に対するよりも互いに対して高い親和性を有することを理由に起こる。
【０１７８】
本明細書において「二量体形成選択モジュール」という語は、二つのＦｃドメイン単量体間の好都合な対形成を促進するＦｃドメイン単量体の配列を指す。「相補的」な二量体形成選択モジュールは、二つのＦｃドメイン単量体の互いに対する選択的な相互作用を促進するまたは支持する二量体形成選択モジュールである。相補的な二量体形成選択モジュールは、同一の配列または異なる配列を有することが可能である。例示的な相補的な二量体形成選択モジュールを本明細書に記載している。
【０１７９】
本明細書において「改変された空洞（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃａｖｉｔｙ）」という語は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸残基のうちの少なくとも一つが、本来のアミノ酸残基よりも低分子量の側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換されることによって、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に形成された三次元の空洞を指す。「本来のアミノ酸残基」という語は、野生型のＣＨ３抗体定常ドメインの遺伝コードによってコードされた天然のアミノ酸残基を指す。
【０１８０】
本明細書において「改変された突起（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ）」という語は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸残基のうちの少なくとも一つが、本来のアミノ酸残基よりも高分子量の側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換されることによって、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に形成された三次元の突起を指す。「本来のアミノ酸残基」という語は、野生型のＣＨ３抗体定常ドメインの遺伝コードによってコードされた天然のアミノ酸残基を指す。
【０１８１】
「空洞に突起が挿入された対」という語は、第一のＦｃドメイン単量体がそのＣＨ３抗体定常ドメイン内に改変された空洞を含む一方で、第二のＦｃドメイン単量体がそのＣＨ３抗体定常ドメイン内に改変された突起を含むものである二つのＦｃドメイン単量体を含んだＦｃドメインを説明するものである。空洞に突起が挿入された対においては、第一のＦｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内の改変された突起は、該突起が第二のＦｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内の改変された空洞と、ＣＨ３抗体定常ドメイン間の界面における二量体の正常な会合を有意に邪魔することなく相互作用するように配置される。
【０１８２】
本明細書において、「ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」という語は、二つのＦｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、該二つのＦｃドメイン単量体は、これら二つのＦｃドメイン単量体の好ましい形成を促進する異なる逆電荷の変異（例えば、表４の変異を参照）を含有する。三つのＦｃドメイン、すなわち一つのカルボキシル末端の「幹」Ｆｃドメインと、二つのアミノ末端の「枝」Ｆｃドメインとを有するＦｃ構築体において、アミノ末端の「枝」Ｆｃドメインのそれぞれが、ヘテロ二量体のＦｃドメイン（「枝ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」とも称される）であってもよい。
【０１８３】
本明細書において使用される場合、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群に関連する「構造的に同一」という用語は、同じポリペプチド配列が同じ比率および構成で組み立てられた構築体を指し、例えばグリコシル化などのいずれの翻訳後修飾も指していない。
【０１８４】
本明細書において「ホモ二量体Ｆｃドメイン」という語は、二つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、当該二つのＦｃドメイン単量体は、同一の逆電荷の変異（例えば、表５および６の変異を参照）を含有する。三つのＦｃドメイン、すなわち一つのカルボキシル末端の「幹」Ｆｃドメインと、二つのアミノ末端の「枝」Ｆｃドメインとを有するＦｃ構築体において、カルボキシ末端の「幹」Ｆｃドメインは、ホモ二量体のＦｃドメイン（「幹ホモ二量体Ｆｃドメイン」とも称される）であってもよい。
【０１８５】
本明細書において「ヘテロ二量体形成選択モジュール」という語は、適合するヘテロ二量体形成選択モジュールを有する二つのＦｃドメイン単量体の好ましいヘテロ二量体形成を促進するために、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内に作製することが可能である、改変された突起、改変された空洞および特定の逆電荷のアミノ酸置換を指す。ヘテロ二量体形成選択モジュールを含有するＦｃドメイン単量体が結合して、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成し得る。ヘテロ二量体形成選択モジュールの例を、表３および４に示している。
【０１８６】
本明細書において「ホモ二量体形成選択モジュール」という語は、Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成を促進してホモ二量体Ｆｃドメインを形成するＣＨ３ドメイン間の界面において電荷をもつ残基の環の範囲内の少なくとも二つの位置におけるＦｃドメイン単量体内の逆電荷の変異を指す。ホモ二量体形成選択モジュールの例を、表４および５に示している。
【０１８７】
本明細書において、「連結する」という語は、化学的複合体化、組換え手段ならびに例えばペプチド結合、ジスルフィド結合およびアミド結合である化学結合を含む手段によって、２以上の成分、要素、成分または例えばポリペプチドであるタンパク質ドメインを組み合わせるまたは付加することを説明するために用いる。例えば、二つの単一ポリペプチドを結合して、化学的複合体化、化学結合、ペプチドリンカーまたはその他の共有結合手段を介して、一つの隣接し合うタンパク質構造を形成することが可能である。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは、抗原結合ドメインとＦｃドメイン単量体の両方をコードする連続的な核酸配列から発現されることにより、Ｆｃドメイン単量体に結合される。他の実施形態では、抗原結合ドメインは、ペプチドリンカーを介してＦｃドメイン単量体に結合され、当該ペプチドリンカーのＮ末端は、例えばペプチド結合などの化学結合を介して、抗原結合ドメインのＣ末端に結合され、ペプチドリンカーのＣ末端は、例えばペプチド結合などの化学結合を介して、Ｆｃドメイン単量体のＮ末端に結合される。
【０１８８】
本明細書において使用される場合、「会合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」という用語は、ポリペプチド（または１つの単一ポリペプチド内の配列）が、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）を形成するように配置されるような、例えば水素結合、疎水性相互作用またはイオン性相互作用などのポリペプチド（または一つの単一ポリペプチド内の配列）間の相互作用を記載するために使用される。例えば、一部の実施形態では、例えば二つのＦｃドメイン単量体をそれぞれ含む二つのポリペプチドと、一つのＦｃドメイン単量体をそれぞれ含む二つのポリペプチドの四つのポリペプチドが会合して、三つのＦｃドメインを有するＦｃ構築体が形成される（例えば、図５０および５１に図示するとおり）。四つのポリペプチドは、それらの各Ｆｃドメイン単量体を介して会合することが可能である。ポリペプチド間の会合は、共有結合相互作用を含まない。
【０１８９】
本明細書において「リンカー」という語は、二つの要素間、例えばタンパク質ドメイン間の結合を指す。リンカーは、共有結合またはスペーサーとすることが可能である。「結合」という語は、化学結合、例えばアミド結合もしくはジスルフィド結合、または、例えば化学的複合体化である化学反応により形成される任意の種類の結合を指す。「スペーサー」という用語は、二つのポリペプチドもしくはポリペプチドドメインドメイン間に空間および／または柔軟性をもたらす二つのポリペプチドまたはポリペプチドドメイン間に生じる部分（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー）またはアミノ酸配列（例えば３〜２００アミノ酸、３〜１５０アミノ酸、または３〜１００アミノ酸の配列）を指す。アミノ酸スペーサーは、ポリペプチドの一次配列の一部（例えば、ポリペプチド骨格を介して、離間したポリペプチドまたはポリペプチドドメインに連結されるような）である。例えばＦｃドメインを形成する二つのヒンジ領域または二つのＦｃドメイン単量体の間におけるジスルフィド結合の形成は、リンカーとは考えない。
【０１９０】
本明細書において「グリシンスペーサー」という語は、二つのＦｃドメイン単量体を直列に連結する、グリシンのみを含有するリンカーを指す。グリシンスペーサーは、少なくとも４、８、または１２個のグリシン（例えば、４〜３０、８〜３０、または１２〜３０個のグリシン、例えば、１２〜３０個、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のグリシン）を含有し得る。一部の実施形態において、グリシンスペーサーは、以下：
2020514301.tif 000064
の配列を有する。
【０１９１】
本明細書において、「アルブミン結合ペプチド」という語は、血清アルブミンに対する親和性および血清アルブミンを結合する機能を有する１２〜１６アミノ酸のアミノ酸配列を指す。アルブミン結合ペプチドは、例えばヒト、マウスまたはラットである様々な起源のものとすることが可能である。本開示の一部の実施形態では、アルブミン結合ペプチドが、Ｆｃドメイン単量体のＣ末端に融合され、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の血清半減期が増加する。アルブミン結合ペプチドは、直接またはリンカーを介して、Ｆｃドメイン単量体のＮ末端またはＣ末端と融合することが可能である。
【０１９２】
本明細書において、「精製用ペプチド」という語は、ポリペプチドの精製、単離または同定に用いることが可能である任意の長さのペプチドを指す。精製用ペプチドは、ポリペプチドに連結させて、例えば細胞溶解混合物からの、ポリペプチドの精製および／またはポリペプチドの単離を支援し得る。一部の実施形態では、精製用ペプチドは、精製用ペプチドに対して特異的な親和性を有する別の部分と結合している。一部の実施形態では、精製用ペプチドと特異的に結合するこうした部分は、基剤、樹脂またはアガロースビーズ等の固相支持体に付加されている。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に結合され得るペプチドの精製例を、本明細書においてさらに詳細に記載する。
【０１９３】
本明細書において使用される場合、「多量体」という用語は、本明細書に記載の会合したＦｃ構築体またはＦｃ抗原結合ドメイン構築体を少なくとも２個含む分子を指す。
【０１９４】
本明細書において「ポリヌクレオチド」という語は、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド、およびその断片または部分を指し、またゲノム由来または合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、それは一本鎖または二本鎖であり、センス鎖またはアンチセンス鎖を表し得る。単一のポリヌクレオチドが、単一のポリペプチドに翻訳される。
【０１９５】
本明細書において「ポリペプチド」という語は、モノマーがアミド結合を介して共に連結するアミノ酸残基であるような単一のポリマーを説明している。ポリペプチドは、天然、組換えまたは合成的に産生される、のいずれかである任意のアミノ酸配列を包含することを意図する。
【０１９６】
本明細書において「アミノ酸位置」という語は、タンパク質またはタンパク質ドメイン内のアミノ酸の位置番号を指す。抗体またはＦｃ抗原結合ドメイン構築体のアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔのナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ｅｄ  ５，１９９１）を使用して番号づけられる。
【０１９７】
図５３Ａ〜５３Ｄは、Ｋａｂａｔのナンバリングシステムを使用して番号付けされたヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを示す。
【０１９８】
本明細書において使用される場合、「アミノ酸改変」という語は、参照配列（例えば、野生型の、非変異の、または改変されていないＦｃ配列）と比較して、Ｆｃ構築体の薬物動態（ＰＫ）および／または薬力学（ＰＤ）の性質、血中半減期、エフェクター機能（例えば、細胞溶解（例えば、抗体依存性細胞介在性障害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存細胞障害活性（ＣＤＣ））、貪食（例えば、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣＣ））、免疫活性化およびＴ細胞活性化）、Ｆｃ受容体（例えば、Ｆｃ−ガンマ受容体（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）および／またはＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ））、Ｆｃ−アルファ受容体（ＦｃａＲ）、Ｆｃ−イプシロン受容体（ＦｃεＲ）および／または胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ））に対するアフィニティー、補体カスケードに関与するタンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に対するアフィニティー、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、シアリル化）、凝集性（例えば、二量体（例えば、ホモ二量体および／またはヘテロ二量体）および／または多量体を形成する能力）、および生物物理学的性質（例えば、ＣＨ１およびＣＬ間の相互作用を変える、安定性を変える、ならびに／または、温度および／もしくはｐＨに対する感度を変える）に対して効果を発揮し、免疫学的疾患および炎症性疾患の治療有効性の改善を促進し得る、Ｆｃドメインのポリペプチド配列の変更を指す。アミノ酸改変は、アミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む。一部の実施形態では、アミノ酸改変は、１つのアミノ酸の改変である。他の実施形態では、アミノ酸改変は、複数（例えば２つ以上）のアミノ酸の改変である。アミノ酸改変は、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入の組み合わせを含み得る。アミノ酸改変の説明には、Ｆｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の点変異（例えば、一つのヌクレオチドを別のヌクレオチドと交換）、挿入および欠失（例えば一つまたは複数のヌクレオチドの付加および／または除去）などの、遺伝的（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）変更が含まれる。
【０１９９】
特定の実施形態において、Ｆｃ構築体内またはＦｃ抗原結合ドメイン構築体内の少なくとも１個（例えば、少なくとも１、２または３個）のＦｃドメインがアミノ酸改変を含む。一部の例では、少なくとも一つのＦｃドメインが、一つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または２０またはそれ以上）のアミノ酸改変を含む。
【０２００】
本明細書において「パーセント（％）同一性」という語は、以下の百分率を指すものである：候補配列、例えば本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体中のＦｃドメイン単量体の配列のアミノ酸（または核酸）残基であって、配列を整列させて、必要であれば最大のパーセント同一性を達成するようにしてギャップを導入した後で（すなわち、最適なアラインメントのために候補配列および参照配列の一方または両方においてギャップを導入することが可能であり、比較目的のために非相同の配列は無視することが可能である）、野生型のＦｃドメイン単量体の配列等の参照配列のアミノ酸（または核酸）残基に対して一致している、候補配列のアミノ酸（または核酸）残基の百分率。パーセント同一性の決定のためのアラインメントは、この分野の技術の範囲内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公に利用可能であるコンピュータソフトウェアを用いて達成することが可能である。当業者は、比較している配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメント測定用の適切なパラメータを決定することが可能である。一部の実施形態では、所与の参照配列との、該参照配列でのまたは該参照配列に対する、所与の候補配列のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性（あるいは、所与の参照配列との、該参照配列でのまたは該参照配列に対する、特定のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性を有するまたは含む、所与の候補配列と表すことがある）は、以下のとおりに計算される：
１００×（Ａのフラクション／Ｂ）
式中、Ａは候補配列および参照配列のアラインメント内で同一として採点されたアミノ酸（または核酸）残基の数であり、Ｂは参照配列内のアミノ酸（または核酸）残基の総数である。候補配列の長さが参照配列の長さと等しくない場合の一部の実施形態では、参照配列に対する候補配列のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性は、候補配列に対する参照配列のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性と等しくないはずである。
【０２０１】
特定の実施形態では、候補配列の全長にわたってまたは候補配列の連続的なアミノ酸（または核酸）残基の選択された部分にわたって、候補配列が５０％〜１００％の同一性（例えば、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、９０％〜１００％、９２％〜１００％、９５％〜１００％、９７％〜１００％、９９％〜１００％または９９．５％〜１００％の同一性）をみせるということを、候補配列との比較のために整列した参照配列が示し得る。比較の目的のために整列された候補配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％である。候補配列内のある位置が参照配列内の対応する位置と同じアミノ酸（または核酸）残基で占有されている場合であれば、分子同士はその位置において一致している。
【０２０２】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＦｃ構築体（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）中のＦｃドメイン単量体は、野生型のＦｃドメイン単量体の配列（配列番号４２）と、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％または９９．５％同一）である配列を有することができる。一部の実施形態において、本明細書に記載のＦｃ構築体（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）中のＦｃドメイン単量体は、配列番号４４、４６、４８および５０〜５３のいずれか１個の配列に対し、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有することができる。特定の実施形態では、Ｆｃ構築体中のＦｃドメイン単量体は、配列番号４８、５２および５３の配列に対し、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有することができる。
【０２０３】
一部の実施形態において、二つのＦｃドメイン単量体の間のスペーサーは、本明細書でさらに記載される配列番号１〜３６（例えば、配列番号１７、１８、２６および２７）のうちのいずれか一つの配列と、少なくとも７５％同一（例えば、７５％、７７％、７９％、８１％、８３％、８５％、８７％、８９％、９１％、９３％、９５％、９７％、９９％、９９．５％または１００％同一）である配列を有することができる。
【０２０４】
本明細書において「宿主細胞」という語は、タンパク質をそれらの対応する核酸から発現するのに必要であるような、例えばオルガネラである、必要な細胞成分を含む媒介物を指す。核酸は典型的に、この技術分野で公知の従来の技術（形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接の微量注入等）によって宿主細胞内に導入されることが可能である核酸ベクター中に含まれる。宿主細胞は、例えば細菌細胞である原核細胞、または、例えば哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）である真核細胞とすることができる。本明細書において記載される場合、宿主細胞は、所望のドメインをコードするポリペプチドを一つ以上発現させるために使用され、それらポリペプチドはその後組み合わされて、所望のＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成させることができる。
【０２０５】
本明細書において「医薬組成物」という語は、活性成分のみならず、活性成分を投与方法に好適であるようにさせることが可能である一つまたは複数の賦形剤および希釈剤を含有する、薬用製剤または医薬製剤を指す。本開示の医薬組成物は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体と適合可能な薬剤的に許容可能な成分を含む。該医薬組成物は典型的に、静脈投与または皮下投与のために水性形態である。
【０２０６】
本明細書においてポリペプチドまたはＦｃ構築体の「実質的に均質な群」は、組成物（例えば、細胞培養培地または医薬組成物）中のポリペプチドまたはＦｃ構築体のうちの少なくとも５０％が、非還元ＳＤＳゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーにより決定された場合に、同数のＦｃドメインを有する群である。ポリペプチド、またはＦｃ構築体の実質的に均質な群は、精製前、または、プロテインＡもしくはプロテインＧ精製後、または、任意のＦａｂもしくはＦｃ特異的なアフィニティークロマトグラフィー単独の後で、得ることができる。種々の実施形態では、組成物中のポリペプチドまたはＦｃ構築体のうちの少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％が、同数のＦｃドメインを有する。他の実施形態では、組成物中のポリペプチドのまたはＦｃ構築体のうちの最大で８５％、９０％、９２％または９５％が、同数のＦｃドメインを有する。
【０２０７】
本明細書において使用される場合、「薬剤的に許容可能な担体」という用語は、医薬組成物中の賦形剤または希釈剤を指す。薬学的に許容可能な担体は、製剤の他の成分と適合可能でなければならず、レシピエントに対し有害であってはならない。本開示において、薬剤的に許容できる担体は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に対し、十分な薬剤的安定性を与えなければならない。担体の性質は、投与形態によって異なる。例えば、経口投与では、固形担体が好ましく、静脈内投与では概して、水溶液担体（例えば、ＷＦＩおよび／または緩衝液）が用いられる。
【０２０８】
本明細書において「治療有効量」は、例えば薬剤投与量である、対象もしくは患者において所望の生物学的な効果の誘導に、または、本明細書に記載の状態または障害を有する患者の治療に有効である、量を指す。本明細書においては、「治療有効量」が、単回投与または任意の投薬もしくは経路での摂取、単独でまたは他の治療薬剤と組み合わせての摂取のいずれでも、所望の治療効果をもたらす量として解釈できるということも理解されたい。
【０２０９】
本明細書において使用される場合、断片という用語、および部分という用語は、相互交換可能に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０２１０】
【図１】図１は、２個のＦｃドメインと抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１）の説明図である。各Ｆｃドメインは、２個のＦｃドメイン単量体の二量体である。Ｆｃドメイン単量体のうちの２個（１０６および１０８）が、そのＣＨ３抗体定常ドメイン中に突起を含有し、一方でその他の２個のＦｃドメイン単量体（１１２および１１４）が、そのＣＨ３抗体定常ドメイン中の隣接する位置に空洞を含有する。構築体は、３個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（１０２）は、２個の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１０６および１０８）を含有し、それらはＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１１０）へ直列に連続して、Ｎ末端上でスペーサーにより連結されている。ＶＬ含有ドメイン（１０４）は、ＶＨドメインに結合されている。第二および第三のポリペプチド（１１２および１１４）のそれぞれは、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。
【図２】図２は、３個のＦｃドメインと抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（２０２）は、３個の突起含有Ｆｃドメイン（２０６、２０８および２１０）を含有し、それらはＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（２１２）へ直列に連続して、Ｎ末端上でスペーサーにより連結されている。ＶＬ含有ドメイン（２０４）は、ＶＨドメインに結合されている。第二、第三および第四のポリペプチド（２１４、２１６および２１８）のそれぞれは、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。
【図３】図３は、２個のＦｃドメインと２個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体３）の説明図である。構築体は、３個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（３０２）は、２個の突起含有Ｆｃドメイン単量体（３０４および３０６）を含有し、それらは直列に連続してスペーサーにより連結されている。第二および第三のポリペプチド（３２０および３２２）のそれぞれは、空洞を含有するＦｃドメイン単量体（３１０および３１４）を含有し、それらはＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（３１６および３１８）へ直列にＮ末端上で結合されている。ＶＬ含有ドメイン（３０８および３１２）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図４】図４は、３個のＦｃドメインと３個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体４）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（４０２）は、３個の突起含有Ｆｃドメイン単量体（４０４、４０６および４０８）を含有し、それらは直列に連続してスペーサーにより連結されている。第二、第三、および第四のポリペプチド（４２８、４３０および４３２）のそれぞれは、空洞を含有するＦｃドメイン単量体（４２６、４２０および４１４）を含有し、それらはＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（４２２、４１６および４１０）へ直列にＮ末端上で結合されている。ＶＬ含有ドメイン（４２４、４１８および４１２）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図５】図５は、２個のＦｃドメインと３個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体５）の説明図である。構築体は、３個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（５０２）は、２個の突起含有Ｆｃドメイン単量体（５０８および５０６）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（５１０）とともに直列に連続して、スペーサーにより連結されている。第二および第三のポリペプチド（５２４および５２６）のそれぞれは、空洞を含有するＦｃドメイン単量体（５１６および５２２）を含有し、それらはＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（５１２および５１８）へ直列にＮ末端上で結合されている。ＶＬ含有ドメイン（５０４、５１４および５２０）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図６】図６は、３個のＦｃドメインと４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体６）の説明図である。構築体は、４個のＦｃ単量体を含有するポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（６０２）は、３個の突起含有Ｆｃドメイン単量体（６０６、６０８および６１０）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（６１２）とともに直列に連続して、スペーサーにより連結されている。第二、第三、および第四のポリペプチド（６３２、６３４および６３６）のそれぞれは、空洞を含有するＦｃドメイン単量体（６１８、６２４および６３０）を含有し、それらはＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（６１６、６２２および６２８）へ直列にＮ末端上で結合されている。ＶＬ含有ドメイン（６０４、６１６、６２２、および６２８）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図７】図７は、３個のＦｃドメインと２個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体７）の説明図である。このＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、２個のＦｃドメイン単量体（７０６および７１８）の二量体を含み、Ｆｃドメイン単量体の両方が、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をそのＣＨ３−ＣＨ３の接合面に含有し、それにより当該２個のＦｃドメイン単量体間で好適な静電的相互作用が促進される。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（７０２および７２４）のそれぞれが、突起含有Ｆｃドメイン単量体（７１０および７２０）を含有し、それらは、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をそのＣＨ３−ＣＨ３の接合面に含有するＦｃドメイン単量体（７０６および７１８）、およびＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（７１２および７１４）へと直列に連続してスペーサーによりＮ末端上で連結されている。第三のポリペプチドおよび第四のポリペプチド（７０８および７２２）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。ＶＬ含有ドメイン（７０４および７１６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図８】図８は、３個のＦｃドメインと２個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体８）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（８０２および８２８）のそれぞれが、突起含有Ｆｃドメイン単量体（８１４および８２０）を含有し、それら単量体は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をそのＣＨ３−ＣＨ３の接合面に含有するＦｃドメイン単量体（８１０および８１６）へ直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三および第四のポリペプチド（８０４および８２６）のそれぞれは、空洞を含有するＦｃドメイン単量体（８０８および８２４）を含有し、それらはＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（８１２および８１８）へ直列にＮ末端上で結合されている。ＶＬ含有ドメイン（８０６および８２２）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図９】図９は、３個のＦｃドメインと４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体９）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（９０２および９３６）のそれぞれが、突起含有Ｆｃドメイン単量体（９１８および９２８）を含有し、それらは、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をそのＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（９１０および９２４）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（９０８および９２０）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三および第四のポリペプチド（９０４および９３４）は、空洞を含有するＦｃドメイン単量体（９１６および９３２）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（９１２および９２６）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（９０６、９１４、９２２、および９３０）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図１０】図１０は、５個のＦｃドメインと２個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１０）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（１００２および１０３２）のそれぞれが、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１０１６および１０３０）を含有し、それらは、別の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１０１４および１０２８）、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（１００８および１０２２）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１００６および１０１８）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三、第四、第五、および第六のポリペプチド（１０１２、１０１０、１０２６、および１０２４）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。ＶＬ含有ドメイン（１００４および１０２０）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図１１】図１１は、５個のＦｃドメインと４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１１）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（１１０２および１１４８）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１１１８および１１３２）を含有し、それらは、別の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１１２０および１１３０）、およびＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（１１２４および１１２６）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三、第四、第五、および第六のポリペプチド（１１０６、１１０４、１１４４、および１１４６）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（１１１６、１１１０、１１３４、および１１４０）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１１１２、１１２２、１１３８、および１１２８）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（１１０８、１１１４、１１３５、および１１４２）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図１２】図１２は、５個のＦｃドメインと６個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１２）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（１２０２および１２５６）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１２２４および１２３０）を含有し、それらは、別の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１２２６および１２２８）、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（１２１０および１２４４）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１２５０および１２４８）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三、第四、第五、および第六のポリペプチド（１２０６、１２０４、１２５４、および１２５２）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（１２２２、１２１６、１２３２、および１２３８）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１２１８、１２１２、１２３６、および１２４２）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（１２０８、１２１４、１２２０、１２３４、１２４０、および１２４６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図１３】図１３は、３個のＦｃドメインと２個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１３）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（１３０２および１３２４）は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（１３０８および１３１８）を含有し、それらは突起含有Ｆｃドメイン単量体（１３１２および１３１６）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１３１０および１３１４）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三のポリペプチドおよび第四のポリペプチド（１３０６および１３２０）は、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。ＶＬ含有ドメイン（１３０４および１３２２）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図１４】図１４は、３個のＦｃドメインと２個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１４）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（１４０４および１４２６）は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面に含有するＦｃドメイン単量体（１３０８および１３１８）を含有し、それらは突起含有Ｆｃドメイン単量体（１４１４および１４１８）へ直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三および第四のポリペプチド（１４０２および１４２８）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（１４１０および１４２２）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１４０８および１４１６）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（１４０６および１４２４）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図１５】図１５は、３個のＦｃドメインと４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１５）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（１５０２および１５３６）は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（１５１２および１５２４）を含有し、それらは突起含有Ｆｃドメイン単量体（１５１８および１５２２）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１５１４および１５３２）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三および第四のポリペプチド（１５０４および１５３４）は、空洞を含有するＦｃドメイン単量体（１５１０および１５２６）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１５０８および１５３０）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（１５０６、１５１６、１５２０、および１５２８）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図１６】図１６は、５個のＦｃドメインと２個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１６）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（１６０２および１６３２）は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（１６１０および１６２４）を含有し、それらは突起含有Ｆｃドメイン単量体（１６１２および１６２２）、第二の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１６１４および１６２０）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１６１６および１６１８）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三、第四、第五、および第六のポリペプチド（１６０８、１６０６、１６２６、および１６２８）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。ＶＬ含有ドメイン（１６０４および１６３０）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図１７】図１７は、５個のＦｃドメインと４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１７）の説明図である。構築体は、６個のＦｃ単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（１７０２および１７４８）は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（１７１８および１７３２）を含有し、それらは突起含有Ｆｃドメイン単量体（１７２０および１７３０）、およびＮ末端の、第二の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１７２２および１７２８）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三、第四、第五、および第六のポリペプチド（１７０６、１７０４、１７４６、および１７４４）は、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（１７１６、１７１０、１７３４、および１７４０）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１７１２、１７２４、１７３８、および１７２６）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（１７０８、１７１４、１７３６、および１７４２）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図１８】図１８は、５個のＦｃドメインと６個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１８）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（１８０２および１８５６）は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（１８１８および１８３８）を含有し、それらは突起含有Ｆｃドメイン単量体（１８２０および１８３６）、第二の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１８２２および１８３４）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１８２６および１８３０）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三、第四、第五、および第六のポリペプチド（１８０６、１８０４、１８５４、および１８５２）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（１８１６、１８１０、１８４０、および１８４６）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１８１２、１８２８、１８４４および１８５０）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（１８０８、１８１４、１８２４、１８３２、１８４２、および１８４８）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図１９】図１９は、５個のＦｃドメインと２個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１９）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（１９０２および１９３２）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１９１２および１９３０）を含有し、それらは、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（１９０８および１９２６）、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１９１６および１９１８）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（１９１４および１９２０）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三および第四のポリペプチド（１９１０および１９２８）は、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有し、第五および第六のポリペプチド（１９０６および１９２４）は、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。ＶＬ含有ドメイン（１９０４および１９２２）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図２０】図２０は、５個のＦｃドメインと４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２０）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（２００２および２０４８）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（２０２０および２０２２）を含有し、それらは、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（２０１２および２０３０）、Ｎ末端の、突起含有Ｆｃドメイン単量体（２０４０および２０３８）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三、第四、第五、および第六のポリペプチド（２００６、２００４、２０４６および２０４４）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（２０１８、２０１０、２０２４および２０３２）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（２０１４、２０４２、２０２８および２０３６）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（２００８、２０１６、２０２６、および２０３４）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図２１】図２１は、５個のＦｃドメインと６個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２１）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（２１０２および２１５６）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（２１２０および２１２２）を含有し、それらは、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（２１１２および２１３０）、別の突起含有Ｆｃドメイン単量体（２１４４および２１４２）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（２１４８および２１３８）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三、第四、第五、および第六のポリペプチド（２１０６、２１０４、２１５４、および２１５２）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（２１１８、２１１０、２１２４、および２１３２）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する抗原結合ドメイン（２１１４、２１５０、２１２８、および２１３６）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（２１０８、２１１６、２１２６、２１３４、２１４０、および２１４６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図２２】図２２は、２個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性を伴う３個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２２）の説明図である。構築体は、３個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（２２０２）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（２２０８）を含有し、この単量体は、別の突起含有Ｆｃドメイン単量体（２２０６）、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（２２２２）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第二および第三のポリペプチド（２２２６および２２２４）はそれぞれ、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（２２１０および２２１６）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（２２１４および２２２０）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（２２０４、２２１２および２２１８）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図２３】図２３は、３個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性を伴う４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２３）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（２３０２）は、３個の突起含有Ｆｃドメイン単量体（２３１０、２３０８および２３０６）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（２３３０）とともに直列に連続して、スペーサーにより連結されている。第二、第三および第四のポリペプチド（２３３６、２３３４および２３３２）は、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（２３１２、２３１８および２３２４）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（２３１６、２３２２および２３２８）とともに直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（２３０４、２３１４、２３２０、および２３２６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図２４】図２４は、３個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性を伴う４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２４）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（２４０２および２４３６）は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（２４１０および２４１２）を含有し、それらは突起含有Ｆｃドメイン単量体（２４２６および２４２４）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（２４３０および２４２０）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三および第四のポリペプチド（２４０４および２４３４）は、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（２４０８および２４１４）を含有し、それらはＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（２４３２および２４１８）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（２４０６、２４１６、２４２２、および２４２８）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図２５】図２５は、３個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性を伴う４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２５）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（２５０２および２５３６）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（２５１６および２５１８）を含有し、この単量体は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（２５０８および２５２６）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（２５３２および２５３０）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第二および第三のポリペプチド（２５０４および２５３４）は、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（２５１４および２５２０）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（２５１０および２５２４）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（２５０６、２５１２、２５２２、および２５２８）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図２６】図２６は、５個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性を伴う６個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２６）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（２６０２および２６５６）は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（２６１８および２６２０）を含有し、それらは突起含有Ｆｃドメイン単量体（２６４２および２６４０）、第二の突起含有Ｆｃドメイン単量体（２６４４および２６３８）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（２６４８および２６３４）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三、第四、第五、および第六のポリペプチド（２６０６、２６０４、２６５４および２６５２）は、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（２６１６、２６１０、２６２２、および２６２８）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（２６１２、２６５０、２６２６および２６３２）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（２６０８、２６１４、２６２４、２６３０、２６３６、および２６４６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図２７】図２７は、５個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性を伴う６個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２７）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（２７０２および２７５６）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（２７２０および２７２２）を含有し、それらは、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（２７１２および２７３０）、突起含有Ｆｃドメイン単量体（２７４４および２７４２）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（２７４８および２７３８）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三、第四、第五、および第六のポリペプチド（２７０６、２７０４、２７５４および２７５２）は、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（２７１８、２７２４、２７１０および２７３２）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（２７１４、２７２８、２７５０および２７３６）へと直列に結合されている。ＶＬ含有ドメイン（２７０８、２７１６、２７２６、２７４３、２７４０、および２７４６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図２８】図２８は、５個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性を伴う６個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２８）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（２８０２および２８５６）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（２８２４および２８３０）を含有し、それらは、第二の突起含有Ｆｃドメイン単量体（２８２６および２８２８）、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（２８１０および２８４４）、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（２８５０および２８４８）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三、第四、第五、および第六のポリペプチド（２８０６、２８０４、２８５４および２８５２）は、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（２８２２、２８１６、２８３２および２８３８）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（２８１８、２８１２、２８３６および２８４２）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（２８０８、２８１４、２８２０、２８３４、２８４０、および２８４６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図２９】図２９は、２個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性を伴う２個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２９）の説明図である。構築体は、３個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（２９０２）は、２個の突起含有Ｆｃドメイン単量体（２９０８および２９０６）を含有し、それらは異なるセットのヘテロ二量体形成変異を伴い、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（２９１８）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第二のポリペプチド（２９２０）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（２９１０）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（２９１４）へと直列に連続して結合されている。第三のポリペプチド（２９１６）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。ＶＬ含有ドメイン（２９０４および２９１２）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図３０】図３０は、２個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性を伴う３個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体３０）の説明図である。構築体は、３個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（３００２）は、２個の突起含有Ｆｃドメイン単量体（３００８および３００６）を含有し、それらは異なるセットのヘテロ二量体形成変異を伴い、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３０２２）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第二のポリペプチド（３０２４）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３０１０）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（３０１４）へと直列に連続して結合されている。第三のポリペプチド（３０２６）は、第一第二のヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３０１６）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３０２０）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（３００４、３０１２および３０１８）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図３１】図３１は、２個のＦｃドメインと、三つの異なる特異性を伴う３個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体３１）の説明図である。構築体は、３個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（３１０２）は、２個の突起含有Ｆｃドメイン単量体（３１０８および３１０６）を含有し、それらは異なるセットのヘテロ二量体形成変異を伴い、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３１２２）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第二のポリペプチド（３１２６）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３１１０）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（３１１４）へと直列に連続して結合されている。第三のポリペプチド（３１２４）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３１１６）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第三の特異性の抗原結合ドメイン（３１２０）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（３１０４、３１１２および３１１８）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図３２】図３２は、３個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性を伴う３個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体３２）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（３２０２）は、３個の突起含有Ｆｃドメイン単量体（３２１０、３２０８および３２０６）を含有し、第三の単量体は最初の二つの単量体とは異なるセットのヘテロ二量体形成変異を伴い、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３２２６）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第二および第三のポリペプチド（３２３０および３２２８）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３２１２および３２１８）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（３２１６および３２２２）へと直列に連続して結合されている。第四のポリペプチド（３２２４）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。ＶＬ含有ドメイン（３２０４、３２１４および３２２０）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図３３】図３３は、３個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性を伴う４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体３３）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（３３０２）は、３個の突起含有Ｆｃドメイン単量体（３３１０、３３０８および３３０６）を含有し、第三の単量体は最初の二つの単量体とは異なるセットのヘテロ二量体形成変異を伴い、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３３３０）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第二および第三のポリペプチド（３３３６および３３３４）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３３１２および３３１８）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（３３１６および３３２２）へと直列に連続して結合されている。第四のポリペプチド（３３２２）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３３２４）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３３２８）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（３３０４、３３１４、３３２０、および３３２６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図３４】図３４は、３個のＦｃドメインと、三つの異なる特異性を伴う４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体３４）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（３４０２）は、３個の突起含有Ｆｃドメイン単量体（３４１０、３４０８および３４０６）を含有し、第三の単量体は最初の二つの単量体とは異なるセットのヘテロ二量体形成変異を伴い、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３４３０）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第二および第三のポリペプチド（３４３６および３４３４）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３４１２および３４１８）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（３４１６および３４２２）へと直列に連続して結合されている。第四のポリペプチド（３４３２）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３４２４）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第三の特異性の抗原結合ドメイン（３４２８）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（３４０４、３４１４、３４２０、および３４２６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図３５】図３５は、３個のＦｃドメインと、三つの異なる特異性を伴う４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体３５）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（３５０２）は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（３５１０）を含有し、それらは第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う突起含有Ｆｃドメイン単量体（３５２６）、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３５３０）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第二のポリペプチド（３５３６）は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（３５１２）を含有し、それらは第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う突起含有Ｆｃドメイン単量体（３５２４）、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３５２０）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三のポリペプチド（３５０４）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３５０８）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（３５３２）へと直列に連続して結合されている。第四のポリペプチド（３５３４）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３５１４）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第三の特異性の抗原結合ドメイン（３５１８）へと直列に連続してで結合されている。ＶＬ含有ドメイン（３５０６、３５１６、３５２２、および３５２８）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図３６】図３６は、５個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性を伴う４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体３６）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（３６０２および３６４４）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う、突起含有Ｆｃドメイン単量体（３６１４および３６１６）を含有し、それらはＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（３６１０および３６２０）、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う別の突起含有Ｆｃドメイン単量体（３６３４および３６３２）、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３６３８および３６２８）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三および第四のポリペプチド（３６１２および３６１８）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。第五および第六のポリペプチド（３６０４および３６４２）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３６０８および３６２２）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（３６４０および３６２６）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（３６０６、３６２４、３６３０、および３６３６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図３７】図３７は、５個のＦｃドメインと、三つの異なる特異性を伴う６個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体３７）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（３７０２および３７５６）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う、空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３７２０および３７２２）を含有し、それらはＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（３７１２および３７３０）、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う別の突起含有Ｆｃドメイン単量体（３７４４および３７４２）、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３７４８および３７３８）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三および第四のポリペプチド（３７０６および３７５４）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３７１８および３７２４）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（３７１４および３７２８）へと直列に連続してで結合されている。第五および第六のポリペプチド（３７０４および３７５２）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３７１０および３７３２）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第三の特異性の抗原結合ドメイン（３７５０および３７３６）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（３７０８、３７１６、３７２６、３２３４、３７４０、および３７４６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図３８】図３８は、３個のＦｃドメインと、三つの異なる特異性を伴う４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体３８）の説明図である。構築体は、４個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。第一のポリペプチド（３８０２）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う突起含有Ｆｃドメイン単量体（３８１６）を含有し、この単量体は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（３８０８）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３８３２）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第二のポリペプチド（３８３６）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う突起含有Ｆｃドメイン単量体（３８１８）を含有し、この単量体は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（３８２６）、およびＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３８３０）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三のポリペプチド（３８０４）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３８１４）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（３８１０）へと直列に連続して結合されている。第四のポリペプチド（３８３４）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３８２０）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第三の特異性の抗原結合ドメイン（３８２４）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（３８０６、３８１２、３８２２、および３８２８）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図３９】図３９は、５個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性の４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体３９）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（３９０２および３９４４）は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（３９１２および３９１４）を含有し、この単量体は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う突起含有Ｆｃドメイン単量体（３９３２および３９３０）、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う第二の突起含有Ｆｃドメイン単量体（３９３４および３９２８）、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（３９３８および３９２４）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三および第四のポリペプチド（３９１０および３９１６）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。第五および第六のポリペプチド（３９０４および３９４２）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３９０８および３９１８）を含有し、この単量体は、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（３９４０および３９２２）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（３９０６、３９２０、３９２６、および３９３６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図４０】図４０は、５個のＦｃドメインと、三つの異なる特異性の６個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体４０）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（４００２および４０５６）は、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（４０１８および４０２０）を含有し、この単量体は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う突起含有Ｆｃドメイン単量体（４０４２および４０４０）、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う第二の突起含有Ｆｃドメイン単量体（４０４４および４０３８）、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（４０４８および４０３４）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三および第四のポリペプチド（４００６および４０５４）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（４０１６および４０２２）を含有し、それらは、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（４０１２および４０２６）へと直列に連続して結合されている。第五および第六のポリペプチド（４００４および４０５２）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（４０１０および４０２８）を含有し、この単量体は、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第三の特異性の抗原結合ドメイン（４０５０および４０３２）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（４００８、４０１４、４０２４、４０３０、４０３６、および４０４６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図４１】図４１は、５個のＦｃドメインと、二つの異なる特異性の４個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体４１）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（４１０２および４１４４）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う、突起含有Ｆｃドメイン単量体（４１１８および４１２４）を含有し、この単量体は第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う第二の突起含有Ｆｃドメイン単量体（４１２０および４１２２）、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（４１０８および４１３４）、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（４１４０および４１３８）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三および第四のポリペプチド（４１０４および４１４２）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（４１１６および４１２６）を含有し、それらは、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（４１１２および４１３０）へと直列に連続して結合されている。第五および第六のポリペプチド（４１１０および４１３２）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。ＶＬ含有ドメイン（４１０６、４１１４、４１２８、および４１３６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図４２】図４２は、５個のＦｃドメインと、三つの異なる特異性の６個の抗原結合ドメインを含有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体４２）の説明図である。構築体は、６個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２個のポリペプチド（４２０２および４２５６）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う、突起含有Ｆｃドメイン単量体（４２２４および４２３０）を含有し、この単量体は第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う第二の突起含有Ｆｃドメイン単量体（４２２６および４２２８）、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含有するＦｃドメイン単量体（４２１０および４２４４）、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第一の特異性の抗原結合ドメイン（４２５０および４２４８）へと直列に連続してスペーサーにより連結されている。第三および第四のポリペプチド（４２０６および４２５４）は、第一のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（４２２２および４２３２）を含有し、それらはＮ末端の、ＶＨドメインを含有する第二の特異性の抗原結合ドメイン（４２１８および４２３６）へと直列に連続して結合されている。第五および第六のポリペプチド（４２０４および４２５２）は、第二のセットのヘテロ二量体形成変異を伴う空洞含有Ｆｃドメイン単量体（４２１６および４２３８）を含有し、それらは、Ｎ末端の、ＶＨドメインを含有する第三の特異性の抗原結合ドメイン（４２１２および４２４２）へと直列に連続して結合されている。ＶＬ含有ドメイン（４２０８、４２１４、４２２０、４２３４、４２４０、および４２４６）は、各ＶＨドメインに結合されている。
【図４３】図４３は、リツキシマブ（Ｒｔｘｎ）、抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１  ｍＡＢ、および構築体７、１３、１９および１の発現および純度を示す非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの図である。
【図４４】図４４は、様々なＦｃ−抗原結合ドメイン構築体の発現を示すゲルである。最初の３レーンは、様々な比率の３種の別個のポリペプチドのＦｃ−抗原結合ドメイン構築体の発現を示す。４番目のレーンは、ＳＩＦ３構築体（抗原結合ドメインを含まない三つのＦｃドメインを有する構築体）の発現を示し、５番目のレーンは、抗原結合ドメインを含まない五つのＦｃドメインを有する構築体の発現を示す。６番目のレーンは分子量マーカーである。
【図４５】図４５は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイの結果を示す二つのグラフである。左側のグラフでは、結果から、Ｆｃ３Ｙ−ＳＩＦ体（構築体１３（図１３）の構造を有する構築体）が、対応する親モノクローナル抗体（ｍＡｂ）よりもずっと強くＣＴＬＡ−４標的に結合すること、一方で、Ｆｃ３Ｉ−ＳＩＦ体（構築体７の構造を有する構築体（図７））は、親ｍＡｂと同じような結合アフィニティーを有することが示される。右側のグラフでは、結果から、抗体の脱フコシル化により、細胞表面ＦｃγＲＩＩＩａ結合が約１０倍増加する一方で、様々なＦｃ抗原結合ドメインを使用することで、構築体は約３００〜８００倍に結合を強化させることが示される。
【図４６】図４６は、二つの細胞表面ＦｃγＲ結合アッセイの結果を示す二つのグラフを示す。左側のグラフは、ＦｃγＲＩＩＩａへの様々な構築体による結合アフィニティーを示す。市販の抗ＣＤ２０抗体であるガザイバ（Ｇａｚｙｖａ）と同じＣＤＲを有するｍＡｂの脱フコシル化を行うことで約１０倍に結合が強化される一方で、全てのＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、親ｍＡｂよりも１００倍超の結合強化を示す。右側のグラフは、ＦｃγＲＩＩａへの様々な構築体による結合アフィニティーを示す。ｍＡｂの脱フコシル化は結合に対する効果を有さないが、全てのＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、親ｍＡｂよりも１００倍超の結合強化を示す。
【図４７】図４７は、Ｂ細胞を標的とする様々な抗ＣＤ２０構築体を用いたＣＤＣアッセイ、ＡＤＣＰアッセイ、およびＡＤＣＣアッセイの結果を示す三つのグラフである。第一のグラフは、Ｓ３Ｙ  Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体が、ＣＤＣを介在し得ることを示す。中央のグラフは、ＳＡＩおよびＳ３Ｙ  Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体の両方が、ＡＤＣＰ  ＦｃγＲＩＩａレポーターアッセイにおいて１００倍超強化された有効性を呈することを示している。３番目のグラフは、ＳＡＩおよびＳ３Ｙ  Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体が、フコシル化ｍＡｂと比較してＡＤＣＣ活性の強化を呈すること、および脱フコシル化ｍＡｂと類似した活性を呈することを示す。
【図４８】図４８は、ＣＴＬＡ−４トランスフェクトＨＥＫ細胞を標的とする様々な抗ＣＴＬＡ−４構築体を用いたＣＤＣアッセイ、ＡＤＣＰアッセイ、およびＡＤＣＣアッセイの結果を示す三つのグラフである。最初のグラフは、ＳＡＩ構築体（図７に示される構造を有するＦｃ−抗原結合ドメイン構築体）とＳ３Ｙ構築体（図１３に示される構造を有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）が、強化されたＣＤＣを介在することを示す。２番目のグラフは、ＳＡＩ構築体とＳ３Ｙ構築体が、強化されたＡＤＣＰを介在することを示し、３番目のグラフは、ＳＡＩおよびＳ３ＹのＦｃ−抗原結合ドメイン構築体の両方が、フコシル化ｍＡｂと比較してＡＤＣＣ活性の強化を呈すること、および脱フコシル化ｍＡｂと同等の活性を呈することを示す。
【図４９】図４９は、ＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＨＥＫ細胞を標的とする様々な抗ＰＤ−Ｌ１構築体を用いたＡＤＣＣアッセイ、ＡＤＣＰアッセイ、およびＣＤＣアッセイの結果を示す三つのグラフである。最初のグラフは、ＳＡＩ（Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体７（図７）の構造を有する構築体）とＳ３Ｙ（Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１３（図１３）の構造を有する構築体）のＦｃ抗原結合ドメイン構築体の両方が、フコシル化ｍＡｂおよび脱フコシル化ｍＡｂと比較して、同等のＡＤＣＣ活性を呈することを示す。２番目のグラフは、ＳＡＩ構築体およびＳ３Ｙ構築体が、強化されたＡＤＣＰを介在することを示し、３番目のグラフは、Ｓ３Ｙ構築体がＣＤＣを介在し得ることを示す。
【図５０】図５０は、未精製培地中のＦｃ構築体ＡおよびＦｃ構築体Ｂの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるサイズ分布を示す。
【図５１】図５１は、Ｆｃ構築体Ａと、三つのＦｃドメインを有するが「幹」サブユニット中に静電的ステアリング変異が無い別のＦｃ構築体の発現および組立を示す。
【図５２】図５２は、抗原結合ドメインがＦｃ構築体のＦｃドメインに結合され得る三つの例示的な方法の略図である。パネルＡは、抗原結合ドメインの重鎖構成要素を、Ｆｃ鎖の融合タンパク質として発現され得ること、および軽鎖構成要素を、別個のポリペプチドとして発現され得ることを示す。パネルＢは、長いＦｃ鎖の融合タンパク質として発現されるｓｃＦｖを示す。パネルＣは、重鎖構成要素と軽鎖構成要素が別個に発現され、外因的に付加され、化学結合でＦｃ抗原結合ドメイン構築体に結合されていることを示す。
【図５３】図５３Ａは、Ｋａｂａｔナンバリングを用いたヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（配列番号４３）を示す。ヒンジ領域は二重下線によって示され、ＣＨ２ドメインは下線が無く、ＣＨ３領域は下線付きである。図５３Ｂは、Ｋａｂａｔナンバリングを用いたヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（配列番号４５）を示す。Ｅ２１６〜Ｃ２２０（両端を含む）を欠いたヒンジ領域は二重下線によって示され、ＣＨ２ドメインは下線が無く、ＣＨ３領域は下線付きであり、Ｋ４４７を欠く。図５３Ｃは、Ｋａｂａｔナンバリングを用いたヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（配列番号４７）を示す。ヒンジ領域は二重下線によって示され、ＣＨ２ドメインは下線が無く、ＣＨ３領域は下線付きであり、４４７Ｋを欠く。図５３Ｄは、Ｋａｂａｔナンバリングを用いたヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（配列番号４２）を示す。Ｅ２１６〜Ｃ２２０（両端を含む）を欠いたヒンジ領域は二重下線によって示され、ＣＨ２ドメインは下線が無く、ＣＨ３領域は下線付きである。
【図５４】図５４は、抗ＣＤ２０構築体７、抗ＣＤ２０構築体１３、Ｇａｚｙｖａ、およびフコシル化抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１抗体（オビヌツズマブ）による、Ｄａｕｄｉ細胞における補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）の誘導を示すグラフである。
【図５５】図５５は、ＡＤＣＰレポーターアッセイにおける、抗ＣＤ２０構築体７、抗ＣＤ２０構築体１３、ならびにフコシル化および脱フコシル化抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１抗体（オビヌツズマブ）による、ＦｃγＲＩＩａシグナル伝達の誘導（発光量）を示すグラフである。
【図５６】図５６は、ＡＤＣＣレポーターアッセイにおける、抗ＣＤ２０構築体７、抗ＣＤ２０構築体１３、ならびにフコシル化および脱フコシル化抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１抗体（オビヌツズマブ）による、ＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達の誘導（発光量）を示すグラフである。
【図５７】図５７は、フコシル化および脱フコシル化抗ＣＤ２０構築体１３、ならびにフコシル化および脱フコシル化オビヌツズマブモノクローナル抗体による、ヒト全血中のＣＤ１９＋Ｂ細胞の枯渇を示すグラフである。
【図５８】図５８は、抗ＣＤ２０構築体１３、フコシル化オビヌツズマブモノクローナル抗体、またはデラツムマブモノクローナル抗体の単回投与を用いた注入後、または抗ＣＤ２０構築体１３の複数回投与を用いた注入後の、マウスリンパ腫モデルにおける腫瘍増殖の減少を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０２１１】
詳細な説明
多くの治療用抗体は、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）、および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）など、Ｆｃドメインのエフェクター機能を介して自然免疫系の因子をリクルートすることにより機能する。一部の例では、本開示は、公知の単一Ｆｃドメインを含有する例えば公知の治療用抗体などの治療用抗体の抗原結合ドメインと、少なくとも二つのＦｃドメインを組み合わせて、固有の生物活性を有する新規の治療用抗体を作製することを企図するものである。一部の例において、本明細書に開示される新規治療剤は、例えば公知の治療用抗体などの公知のＦｃドメイン含有治療剤を越える生物活性を有する。少なくとも２個のＦｃドメインの存在により、エフェクター機能を強化することができ、例えばＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣと組み合わされたＡＤＣＣなどの複数のエフェクター機能が活性化され、それにより治療用分子の有効性が上昇する。一貫性のある生物学的機能を有する製品を作製するためには、Ｆｃドメインの数を制御することが必須である。本開示は、Ｆｃドメインをコードするペプチドのホモ二量体形成およびヘテロ二量体形成を制御して、限定された数のポリペプチド鎖から個別サイズの分子を組み立てるＦｃ改変ツールのセットを特徴とする。国際特許出願公開ＷＯ／２０１５／１６８６４３、ＷＯ２０１７／１５１９７１、ＷＯ２０１７／２０５４３６、およびＷＯ２０１７／２０５４３４は、２個以上のＦｃドメインを有する分子を組み立てるためのＦｃ改変ツールおよび方法を開示しており、それらは参照によりその全体が本明細書に援用される。改変ツールには、製造結果を大きく改善させる構造特性（例えばグリシンリンカー）が含まれる。これらの構築体の特性により、実質的に均質な医薬組成物の効率的な生成が可能となる。医薬組成物の安全性、有効性、均一性、および信頼性を確実にするためには、医薬組成物においてそのような均質性があることが望ましい。また医薬組成物に高度な均質性を持たせることで、望ましくない物質（例えば分解産物、および／もしくは凝集産物または多量体）によって引き起こされる医薬品の凝集または分解の可能性を最小限にし、ならびに望ましくない物質によって引き起こされる有害なオフターゲットの副作用を限定化させる。
【０２１２】
本明細書に詳述されるように、本発明者らは、二つのＦｃドメイン単量体を直列に連続して結合させるために、グリシン残基のみを含むスペーサーを使用すること、末端リジン残基が取り除かれたポリペプチド配列を使用すること、および以下のヘテロ二量体形成選択モジュールを２セット使用すること、を含む方法を使用して、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のＦｃドメイン構成要素を改変することにより、組成物の均質性を改善した：（ｉ）異なる逆電荷の変異を有するヘテロ二量体形成選択モジュール、および、（ｉｉ）改変された空洞および突起を有するヘテロ二量体形成選択モジュール。
【０２１３】
本発明者らは、リンカーにより隔てられた複数のＦｃ配列を含有する一つの長いペプチド鎖と、単一のＦｃ配列を含有する複数コピーの短鎖を使用することで、Ｆｃドメインが直列に接続された一連のＦｃ抗原結合ドメイン構築体を設計した（Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１〜６；図１〜図６）。ヘテロ二量体形成変異を各Ｆｃ配列に導入することで、より短い、またはより大きな複合体の形成が最小限である、所望の直列構造への組み立てが確実となった。任意の数のＦｃドメインをこの方法で直列に接続することができ、それにより、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＦｃドメインを有する構築体の作製が可能となった。Ｎ個のＦｃドメインを有するペプチドに関しては、抗原結合ドメインがそれぞれ長ペプチド鎖、短いペプチド鎖、またはその両方に導入されるかどうかに応じて、１〜Ｎ＋１個の抗原結合ドメインを有する構築体を調製することができる。
【０２１４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１〜６（図１〜図６）において、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメイン間の一つの分岐点で接続されている。これらの構築体は、リンカーによって隔てられた複数のＦｃ配列を含有する長ペプチド鎖を２コピー含み、その中で分岐Ｆｃ配列はホモ二量体形成変異を含み、非分岐Ｆｃドメインはヘテロ二量体形成変異を含む。長鎖中のヘテロ二量体形成変異に対して相補的な変異を有する単一Ｆｃ配列を含む短鎖の複数コピーを使用して、多量体のＦｃの足場を完成させる。ヘテロ二量体形成Ｆｃドメインは、分岐ＦｃドメインのＣ末端（例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体７〜１２；図７〜図１２）、Ｎ末端（例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１３〜１８；図１３〜図１８）、またはその両方（例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１９〜２１；図１９〜図２１）に連結されることができる。直列にある複数のＦｃドメインは、分岐Ｆｃドメインのいずれの末端に連結されてもよい。抗原結合ドメインは、長ペプチド鎖に導入されてもよく、それにより組み立てられたタンパク質分子一つ当たり、二つの抗原結合ドメインが生じる。あるいは抗原結合ドメインは、短ペプチド鎖に導入されてもよく、それにより組み立てられたタンパク質分子一つ当たり、Ｎ−１個の抗原結合ドメインが生じる。Ｎは、組み立てられたタンパク質分子中のＦｃドメインの数である。抗原結合ドメインが、短ペプチド鎖と長ペプチド鎖の両方に導入された場合、その結果得られる組立タンパク質分子は、Ｎ＋１個の抗原結合ドメインを含有する。
【０２１５】
二特異性構築体は、二つの異なる抗原結合配列が直列に連結されている抗原結合ドメインを使用して上記の設計のいずれかから作製されてもよい。あるいは二特異性構築体は、長鎖が一つの抗原結合ドメインをコードし、一方で短鎖が異なる抗原結合ドメインをコードしている上記のＦｃ足場から作製されてもよい。異なる抗原結合ドメインは、異なる軽鎖を使用してもよく、または共通軽鎖を使用してもよく、またはｓｃＦｖドメインからなることもできる。この概念の例示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２２〜２８（図２２〜図２８）である。
【０２１６】
二特異性構築体および三特異性構築体も、二つの異なるセットのヘテロ二量体形成変異を使用することで作製され得る（例えばＦｃ抗原結合ドメイン構築体２９〜４２；図２９〜図４２）。このようなヘテロ二量体形成配列は、他のヘテロ二量体形成配列との会合が不利となるように設計される必要がある。そのような設計は、本明細書に記載の２セットのヘテロ二量体形成変異の間で異なる静電的ステアリング変異を使用することで実現させることができる。直交性（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）の静電的ステアリング変異の一例は、第一のノブ（ｋｎｏｂ）Ｆｃ中のＥ３５７Ｋ、第一のホール（ｈｏｌｅ）Ｆｃ中のＫ３７０Ｄ、第二のノブＦｃ中のＤ３９９Ｋ、および第二のホールＦｃ中のＫ４０９Ｄである。
【０２１７】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）とＦｃドメインに対し、過去に行われた改変の試みは、Ｆｃドメイン中に変異を作製してＦｃγＲＩＩＩａへの結合を強化し、それにより抗体依存性細胞介在細胞障害（ＡＤＣＣ）反応を増強させること、およびＦｃドメインを脱フコシル化してＦｃγＲＩＩＩａへの結合を強化し、それによりＡＤＣＣ反応を増強させることであった。
【０２１８】
ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を強化するためにＦｃドメイン中に変異を有する抗体、またはＦｃドメインの脱フコシル化を有する抗体と比較して、本開示に開示されるＦｃ抗原結合ドメイン構築体は予想外にも、複数クラスのＦｃγ受容体への結合を強化し、複数の細胞障害経路の活性を増強させることが明らかとなった。本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、対応するフコシル化、および脱フコシル化された親モノクローナル抗体と比較して、ＦｃγＲＩＩａとＦｃγＲＩＩＩａの両方に対する結合を強化させることができる（実施例４６を参照のこと）。さらには、本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は予想外にも、ＡＤＣＣ経路反応の増強に加えて、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）経路、および／または抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）経路を介在する能力が明らかとなった（実施例４７を参照のこと）。
【０２１９】
Ｉ．Ｆｃドメイン単量体
Ｆｃドメイン単量体は、ヒンジドメイン、ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＣＨ３抗体定常ドメインを含む。Ｆｃドメイン単量体は、免疫グロブリン抗体アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＤのものとすることが可能である。Ｆｃドメイン単量体はまた、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のものとしてもよい。Ｆｃドメイン単量体はまた複合型であってもよく、例えば、ヒンジおよびＩｇＧ１からのＣＨ２およびＩｇＡからのＣＨ３による複合型、または、ヒンジおよびＩｇＧ１からのＣＨ２であるがＩｇＧ３からのＣＨ３による複合型であってもよい。Ｆｃドメイン単量体の二量体は、白血球表面上にある受容体である、例えばＦｃγＲＩＩＩａであるＦｃ受容体と結合することが可能なＦｃドメイン（本明細書でさらに規定される）である。本開示では、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３抗体定常ドメインの界面におけるアミノ酸置換を含有して、それらの相互による会合を促進し得る。他の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、例えばアルブミン結合ペプチドまたは精製用ペプチドである、Ｎ末端またはＣ末端に付加するさらなる部分を含む。および本開示では、Ｆｃドメイン単量体は、例えばＶＨ、ＶＬ、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）である、いずれの種類の抗体可変領域も含有しない。
【０２２０】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）中のＦｃドメイン単量体は、配列番号４２の配列に対し、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有し得る。一部の実施形態において、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）中のＦｃドメイン単量体は、配列番号４４、４６、４８、および５０〜５３のいずれか一つの配列に対し、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有し得る。特定の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中のＦｃドメイン単量体は、配列番号４８、５２および５３のいずれか一つの配列に対し、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有し得る。
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【０２２１】
ＩＩ．Ｆｃドメイン
本明細書で規定するように、Ｆｃドメインは、ＣＨ３抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体形成する二つのＦｃドメイン単量体を含む。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、例えばＦｃ−ガンマ受容体（すなわち、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ））、Ｆｃ−アルファ受容体（すなわち、Ｆｃα受容体（ＦｃαＲ））、Ｆｃ−イプシロン受容体（すなわち、Ｆｃε受容体（ＦｃεＲ））および／または胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する最小限の構造を形成する。一部の実施形態では、本開示のＦｃドメインは、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ））および／またはＦｃγＲＩＶおよび／または胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する。
【０２２２】
ＩＩＩ．抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、標的分子に特異的に結合するペプチドまたはポリペプチドを１個または複数含む。抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合ドメインを含み得る。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体または抗体構築体の断片、例えば、標的抗原に結合する抗体の最小部分であってもよい。抗原結合ドメインは、例えばフィブロネクチン系の結合タンパク質（例えば、ＦＮ３モノボディ）などの標的に特異的に結合する合成的に改変されたペプチドであってもよい。断片の抗原結合（Ｆａｂ）断片は、標的抗原に結合する抗体上の領域である。この領域は、重鎖および軽鎖それぞれの一つの定常ドメインと一つの可変ドメインから構成される。Ｆａｂ断片は、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１およびＣＬドメインを含む。可変ドメインのＶＨおよびＶＬはそれぞれ、単量体のアミノ末端で、相補性決定領域（ＣＤＲ）が３個の１セットを含有する。Ｆａｂ断片は、免疫グロブリン抗体アイソタイプのＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＤのものであり得る。またＦａｂ断片単量体は、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のものであってもよい。一部の実施形態において、Ｆａｂ断片は、免疫グロブリンのプロテアーゼ処置（例えばペプシン）後の第二の同一Ｆａｂ断片に共有結合的に付加され、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成してもよい。一部の実施形態において、Ｆａｂは、例えばドメイン間のリンカーを用いて融合される可変ドメインと定常ドメインの両方を含む単一ポリペプチドとして発現されてもよい。
【０２２３】
一部の実施形態において、Ｆａｂ断片の一部のみが抗原結合ドメインとして使用される場合がある。一部の実施形態において、Ｆａｂの軽鎖構成要素（ＶＬ＋ＣＬ）のみ、またはＦａｂの重鎖構成要素（ＶＨ＋ＣＨ）のみが使用される場合がある。一部の実施形態において、Ｆａｂ可変領域のＶＨ鎖とＶＬ鎖の融合タンパク質である一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が使用される場合がある。他の実施形態において、直列のＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む直線状抗体が使用される場合があり、このセグメントは、相補的な軽鎖ポリペプチドとともに抗原結合領域の対を形成する。
【０２２４】
一部の実施形態において、本開示の抗原結合ドメインは、表１に列記される標的または抗原に対して、以下の表１にさらに詳細に提示されるように、当該列記される標的または抗原に関して表１に列記されるＣＤＲ配列のうちの一つ、二つ、三つ、四つ、五つまたは六つすべてを含む。
【０２２５】
（表１）
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【０２２６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１の抗原結合ドメイン（図１の１１０／１０４）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２２７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２の抗原結合ドメイン（図２の２１２／２０４）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２２８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３の抗原結合ドメイン（図３の３０８／３１６および３１２／３１８）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２２９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４の抗原結合ドメイン（図４の４１０／４１２、４１６／４１８および４２２／４２４）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体５の抗原結合ドメイン（図５の５１０／５０４、５１２／５１４および５１８／５２０）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体６の抗原結合ドメイン（図６の６１２／６０４、６１４／６１６、６２０／６２２および６２６／６２８）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体７の抗原結合ドメイン（図７の７１２／７１４および７１４／７１６）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体８の抗原結合ドメイン（図８の８１２／８０６および８１８／８２２）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体９の抗原結合ドメイン（図９の９０８／９０６、９２０／９２２、９１２／９１４および９２６／９３０）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１０の抗原結合ドメイン（図１０の１００６／１００４および１０１８／１０２０）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１１の抗原結合ドメイン（図１１の１１１２／１１１４、１１２２／１１０８、１１２８／１１４２および１１３８／１１３６）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１２の抗原結合ドメイン（図１２の１２１８／１２２０、１２１２／１２１４、１２５０／１２０８、１２４８／１２４６、１２４２／１２４０および１２３６／１２３４）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１３の抗原結合ドメイン（図１３の１３１０／１３０４および１３１４／１３２２）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１４の抗原結合ドメイン（図１４の１４０８／１４０６および１４１６／１４２４）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２４０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１５の抗原結合ドメイン（図１５の１５０８／１５０６、１５１４／１５１６、１５３２／１５２０および１５３０／１５２８）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２４１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１６の抗原結合ドメイン（図１６の１６１６／１６０４および１６１８／１６３０）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２４２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１７の抗原結合ドメイン（図１７の１７１２／１７１４、１７２４／１７０８、１７２６／１７４２、および１７３８／１７３６）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２４３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１８の抗原結合ドメイン（図１８の１８１２／１８１４、１８２８／１８０８、１８２６／１８２４、１８３０／１８３２、１８５０／１８４８および１８４４／１８４２）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２４４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１９の抗原結合ドメイン（図１９の１９１４／１９０４および１９２０／１９２２）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２４５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２０の抗原結合ドメイン（図２０の２０１４／２０１６、２０４２／２００８、２０３６／２０３４、２０２８／２０２６）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２４６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２１の抗原結合ドメイン（図２１の２１１４／２１１６、２１５０／２１０８、２１４８／２１４６、２１３８／２１４０、２１３６／２１３４および２１２８／２１２６）は各々、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２４７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２２の抗原結合ドメイン（図２２の２２０４／２２２２）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２４８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２２の抗原結合ドメイン（図２２の２２１８／２２２０および２２１２／２２１４の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２４９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２３の抗原結合ドメイン（図２３の２３３０／２３０４）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２５０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２３の抗原結合ドメイン（図２３の２３２８／２３２６、２３２２／２３２０および２３１６／２３１４の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２５１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２４の抗原結合ドメイン（図２４の２４３０／２４２８および２４２０／２４２２の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２５２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２４の抗原結合ドメイン（図２４の２４３２／２４０６および２４１８／２４１６の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２５３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２５の抗原結合ドメイン（図２５の２５３２／２５０６および２５３０／２５２８の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２５４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２５の抗原結合ドメイン（図２５の２５１０／２５１２および２５２４／２５２２の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２５５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２６の抗原結合ドメイン（図２６の２６４８／２６４６および２６３４／２６３６の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２５６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２６の抗原結合ドメイン（図２６の２６１２／２６１４、２６５０／２６０８、２６３２／２６３０および２６２６／２６２４の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２５７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２７の抗原結合ドメイン（図２７の２７４８／２７４６および２７３８／２７４０の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２５８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２７の抗原結合ドメイン（図２７の２７１４／２７１６、２７５０／２７０８、２７３６／２７３４および２７２８／２７２６の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２５９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２８の抗原結合ドメイン（図２７の２８５０／２８０８および２８４８／２８４６の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２６０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２８の抗原結合ドメイン（図２８の２８１８／２８２０、２８１２／２８１４、２８４２／２８４０および２８３６／２８３４の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２６１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２９の抗原結合ドメイン（図２９の２９１８／２９０４）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２６２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２９の抗原結合ドメイン（図２９の２９１４／２９１２）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２６３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３０の抗原結合ドメイン（図３０の３０２２／３００４および３０２０／３０１８の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２６４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３０の抗原結合ドメイン（図３０の３０１４／３０１２）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２６５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３１の抗原結合ドメイン（図３１の３１２２／３１０４）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２６６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３１の抗原結合ドメイン（図３１の３１２０／３１１８）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２６７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３１の抗原結合ドメイン（図３１の３１１４／３１１２）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２６８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３２の抗原結合ドメイン（図３２の３２２６／３２０４）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２６９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３２の抗原結合ドメイン（図３２の３２２２／３２２０および３２１６／３２１４の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２７０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３３の抗原結合ドメイン（図３３の３３３０／３３０４および３３２８／３３２６の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２７１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３３の抗原結合ドメイン（図３３の３３２２／３３２０および３３１６／３３１４の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２７２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３４の抗原結合ドメイン（図３４の３４３０／３４０４）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２７３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３４の抗原結合ドメイン（図３４の３４２８／３４２６）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２７４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３４の抗原結合ドメイン（図３４の３４２２／３４２０および３４１６／３４１４の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２７５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３５の抗原結合ドメイン（図３５の３５３０／３５２８および３５２０／３５２２の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２７６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３５の抗原結合ドメイン（図３５の３５３２／３５０６）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２７７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３５の抗原結合ドメイン（図３５の３５１８／３５１６）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２７８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３６の抗原結合ドメイン（図３６の３６３８／３６３６および３６２８／３６２０の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２７９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３６の抗原結合ドメイン（図３６の３６４０／３６０６および３６２６／３６２４の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２８０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３７の抗原結合ドメイン（図３７の３７４８／３７４６および３７３８／３７４０の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２８１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３７の抗原結合ドメイン（図３７の３７５０／３７０８および３７３６／３７３４の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２８２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３７の抗原結合ドメイン（図３７の３７１４／３７１６および３７２８／３７２６の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２８３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３８の抗原結合ドメイン（図３８の３８３２／３８０６および３８３０／３８２２の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２８４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３８の抗原結合ドメイン（図３８の３８１０／３８１２）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２８５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３８の抗原結合ドメイン（図３８の３８２４／３８２２）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２８６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３９の抗原結合ドメイン（図３９の３９３８／３９３６および３９２４／３９２６の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２８７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３９の抗原結合ドメイン（図３９の３９４０／３９０６および３９２２／３９２０の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２８８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４０の抗原結合ドメイン（図４０の４０４８／４０４６および４０３４／４０３６の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２８９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４０の抗原結合ドメイン（図４０の４０５０／４００８および４０３２／４０３０の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２９０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４０の抗原結合ドメイン（図４０の４０１２／４０１４および４０２６／４０２４の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２９１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４１の抗原結合ドメイン（図４１の４１４０／４１０６および４１３８／４１３６の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２９２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４１の抗原結合ドメイン（図４１の４１１２／４１１４および４１３０／４１２８の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２９３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４２の抗原結合ドメイン（図４２の４２５０／４２０８および４２４８／４２４６の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２９４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４２の抗原結合ドメイン（図４２の４２１８／４２２０および４２３６／４２３４の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２９５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４２の抗原結合ドメイン（図４２の４２１２／４２１４および４２４２／４２４０の各々）は、表１に列記される抗体のいずれか一つの３個の重鎖および３個の軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２９６】
一部の実施形態において、抗原結合ドメイン（例えばＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、表２に列記される抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。一部の実施形態において、Ｆａｂは、表２に列記される抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖に含有されるＣＤＲを含む。一部の実施形態において、Ｆａｂは、表２に列記される抗体のＶＨ鎖およびＶＬ鎖に含有されるＣＤＲを含み、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２の抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０２９７】
（表２）
2020514301.tif 000072
【０２９８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１の抗原結合ドメイン（図１の１１０／１０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０２９９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２の抗原結合ドメイン（図２の２１２／２０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３００】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３の抗原結合ドメイン（図３の３０８／３１６および３１２／３１８）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３０１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４の抗原結合ドメイン（図４の４１０／４１２、４１６／４１８および４２２／４２４）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３０２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体５の抗原結合ドメイン（図５の５１０／５０４、５１２／５１４および５１８／５２０）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３０３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体６の抗原結合ドメイン（図６の６１２／６０４、６１４／６１６、６２０／６２２および６２６／６２８）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３０４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体７の抗原結合ドメイン（図７の７１２／７１４および７１４／７１６）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３０５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体８の抗原結合ドメイン（図８の８１２／８０６および８１８／８２２）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３０６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体９の抗原結合ドメイン（図９の９０８／９０６、９２０／９２２、９１２／９１４および９２６／９３０）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３０７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１０の抗原結合ドメイン（図１０の１００６／１００４および１０１８／１０２０）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３０８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１１の抗原結合ドメイン（図１１の１１１２／１１１４、１１２２／１１０８、１１２８／１１４２および１１３８／１１３６）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３０９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１２の抗原結合ドメイン（図１２の１２１８／１２２０、１２１２／１２１４、１２５０／１２０８、１２４８／１２４６、１２４２／１２４０および１２３６／１２３４）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３１０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１３の抗原結合ドメイン（図１３の１３１０／１３０４および１３１４／１３２２）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３１１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１４の抗原結合ドメイン（図１４の１４０８／１４０６および１４１６／１４２４）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３１２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１５の抗原結合ドメイン（図１５の１５０８／１５０６、１５１４／１５１６、１５３２／１５２０および１５３０／１５２８）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３１３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１６の抗原結合ドメイン（図１６の１６１６／１６０４および１６１８／１６３０）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３１４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１７の抗原結合ドメイン（図１７の１７１２／１７１４、１７２４／１７０８、１７２６／１７４２および１７３８／１７３６）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３１５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１８の抗原結合ドメイン（図１８の１８１２／１８１４、１８２８／１８０８、１８２６／１８２４、１８３０／１８３２、１８５０／１８４８および１８４４／１８４２）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３１６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１９の抗原結合ドメイン（図１９の１９１４／１９０４および１９２０／１９２２）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３１７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２０の抗原結合ドメイン（図２０の２０１４／２０１６、２０４２／２００８、２０３６／２０３４および２０２８／２０２６）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３１８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２１の抗原結合ドメイン（図２１の２１１４／２１１６、２１５０／２１０８、２１４８／２１４６、２１３８／２１４０、２１３６／２１３４および２１２８／２１２６）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３１９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２２の抗原結合ドメイン（図２２の２２０４／２２２２）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３２０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２２の抗原結合ドメイン（図２２の２２１８／２２２０および２２１２／２２１４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３２１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２３の抗原結合ドメイン（図２３の２３３０／２３０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３２２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２３の抗原結合ドメイン（図２３の２３２８／２３２６、２３２２／２３２０および２３１６／２３１４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３２３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２４の抗原結合ドメイン（図２４の２４３０／２４２８および２４２０／２４２２の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３２４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２４の抗原結合ドメイン（図２４の２４３２／２４０６および２４１８／２４１６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３２５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２５の抗原結合ドメイン（図２５の２５３２／２５０６および２５３０／２５２８の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３２６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２５の抗原結合ドメイン（図２５の２５１０／２５１２および２５２４／２５２２の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３２７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２６の抗原結合ドメイン（図２６の２６４８／２６４６および２６３４／２６３６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３２８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２６の抗原結合ドメイン（図２６の２６１２／２６１４、２６５０／２６０８、２６３２／２６３０および２６２６／２６２４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３２９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２７の抗原結合ドメイン（図２７の２７４８／２７４６および２７３８／２７４０の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３３０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２７の抗原結合ドメイン（図２７の２７１４／２７１６、２７５０／２７０８、２７３６／２７３４および２７２８／２７２６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３３１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２８の抗原結合ドメイン（図２７の２８５０／２８０８および２８４８／２８４６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３３２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２８の抗原結合ドメイン（図２８の２８１８／２８２０、２８１２／２８１４、２８４２／２８４０および２８３６／２８３４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３３３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２９の抗原結合ドメイン（図２９の２９１８／２９０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３３４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２９の抗原結合ドメイン（図２９の２９１４／２９１２）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３３５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３０の抗原結合ドメイン（図３０の３０２２／３００４および３０２０／３０１８の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３３６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３０の抗原結合ドメイン（図３０の３０１４／３０１２）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３３７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３１の抗原結合ドメイン（図３１の３１２２／３１０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３３８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３１の抗原結合ドメイン（図３１の３１２０／３１１８）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３３９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３１の抗原結合ドメイン（図３１の３１１４／３１１２）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３４０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３２の抗原結合ドメイン（図３２の３２２６／３２０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３４１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３２の抗原結合ドメイン（図３２の３２２２／３２２０および３２１６／３２１４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３４２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３３の抗原結合ドメイン（図３３の３３３０／３３０４および３３２８／３３２６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３４３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３３の抗原結合ドメイン（図３３の３３２２／３３２０および３３１６／３３１４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３４４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３４の抗原結合ドメイン（図３４の３４３０／３４０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３４５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３４の抗原結合ドメイン（図３４の３４２８／３４２６）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３４６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３４の抗原結合ドメイン（図３４の３４２２／３４２０および３４１６／３４１４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３４７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３５の抗原結合ドメイン（図３５の３５３０／３５２８および３５２０／３５２２の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３４８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３５の抗原結合ドメイン（図３５の３５３２／３５０６）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３４９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３５の抗原結合ドメイン（図３５の３５１８／３５１６）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３５０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３６の抗原結合ドメイン（図３６の３６３８／３６３６および３６２８／３６２０の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３５１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３６の抗原結合ドメイン（図３６の３６４０／３６０６および３６２６／３６２４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３５２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３７の抗原結合ドメイン（図３７の３７４８／３７４６および３７３８／３７４０の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３５３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３７の抗原結合ドメイン（図３７の３７５０／３７０８および３７３６／３７３４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３５４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３７の抗原結合ドメイン（図３７の３７１４／３７１６および３７２８／３７２６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３５５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３８の抗原結合ドメイン（図３８の３８３２／３８０６および３８３０／３８２２の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３５６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３８の抗原結合ドメイン（図３８の３８１０／３８１２）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３５７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３８の抗原結合ドメイン（図３８の３８２４／３８２２）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３５８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３９の抗原結合ドメイン（図３９の３９３８／３９３６および３９２４／３９２６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３５９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３９の抗原結合ドメイン（図３９の３９４０／３９０６および３９２２／３９２０の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３６０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４０の抗原結合ドメイン（図４０の４０４８／４０４６および４０３４／４０３６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３６１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４０の抗原結合ドメイン（図４０の４０５０／４００８および４０３２／４０３０の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３６２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４０の抗原結合ドメイン（図４０の４０１２／４０１４および４０２６／４０２４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３６３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４１の抗原結合ドメイン（図４１の４１４０／４１０６および４１３８／４１３６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３６４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４１の抗原結合ドメイン（図４１の４１１２／４１１４および４１３０／４１２８の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３６５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４２の抗原結合ドメイン（図４２の４２５０／４２０８および４２４８／４２４６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３６６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４２の抗原結合ドメイン（図４２の４２１８／４２２０および４２３６／４２３４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３６７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４２の抗原結合ドメイン（図４２の４２１２／４２１４および４２４２／４２４０の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列を含み得る。
【０３６８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１の抗原結合ドメイン（図１の１１０／１０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含有されるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３６９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２の抗原結合ドメイン（図２の２１２／２０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含有されるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３７０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３の抗原結合ドメイン（図３の３０８／３１６および３１２／３１８）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３７１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４の抗原結合ドメイン（図４の４１０／４１２、４１６／４１８および４２２／４２４）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３７２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体５の抗原結合ドメイン（図５の５１０／５０４、５１２／５１４および５１８／５２０）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３７３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体６の抗原結合ドメイン（図６の６１２／６０４、６１４／６１６、６２０／６２２および６２６／６２８）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３７４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体７の抗原結合ドメイン（図７の７１２／７１４および７１４／７１６）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３７５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体８の抗原結合ドメイン（図８の８１２／８０６および８１８／８２２）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３７６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体９の抗原結合ドメイン（図９の９０８／９０６、９２０／９２２、９１２／９１４および９２６／９３０）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３７７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１０の抗原結合ドメイン（図１０の１００６／１００４および１０１８／１０２０）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３７８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１１の抗原結合ドメイン（図１１の１１１２／１１１４、１１２２／１１０８、１１２８／１１４２および１１３８／１１３６）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３７９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１２の抗原結合ドメイン（図１２の１２１８／１２２０、１２１２／１２１４、１２５０／１２０８、１２４８／１２４６、１２４２／１２４０および１２３６／１２３４）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３８０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１３の抗原結合ドメイン（図１３の１３１０／１３０４および１３１４／１３２２）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３８１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１４の抗原結合ドメイン（図１４の１４０８／１４０６および１４１６／１４２４）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３８２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１５の抗原結合ドメイン（図１５の１５０８／１５０６、１５１４／１５１６、１５３２／１５２０および１５３０／１５２８）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３８３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１６の抗原結合ドメイン（図１６の１６１６／１６０４および１６１８／１６３０）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３８４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１７の抗原結合ドメイン（図１７の１７１２／１７１４、１７２４／１７０８、１７２６／１７４２および１７３８／１７３６）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３８５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１８の抗原結合ドメイン（図１８の１８１２／１８１４、１８２８／１８０８、１８２６／１８２４、１８３０／１８３２、１８５０／１８４８および１８４４／１８４２）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３８６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１９の抗原結合ドメイン（図１９の１９１４／１９０４および１９２０／１９２２）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３８７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２０の抗原結合ドメイン（図２０の２０１４／２０１６、２０４２／２００８、２０３６／２０３４および２０２８／２０２６）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３８８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２１の抗原結合ドメイン（図２１の２１１４／２１１６、２１５０／２１０８、２１４８／２１４６、２１３８／２１４０、２１３６／２１３４および２１２８／２１２６）はそれぞれ、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３８９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２２の抗原結合ドメイン（図２２の２２０４／２２２２）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３９０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２２の抗原結合ドメイン（図２２の２２１８／２２２０および２２１２／２２１４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３９１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２３の抗原結合ドメイン（図２３の２３３０／２３０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３９２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２３の抗原結合ドメイン（図２３の２３２８／２３２６、２３２２／２３２０および２３１６／２３１４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３９３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２４の抗原結合ドメイン（図２４の２４３０／２４２８および２４２０／２４２２の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３９４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２４の抗原結合ドメイン（図２４の２４３２／２４０６および２４１８／２４１６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３９５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２５の抗原結合ドメイン（図２５の２５３２／２５０６および２５３０／２５２８の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３９６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２５の抗原結合ドメイン（図２５の２５１０／２５１２および２５２４／２５２２の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３９７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２６の抗原結合ドメイン（図２６の２６４８／２６４６および２６３４／２６３６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３９８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２６の抗原結合ドメイン（図２６の２６１２／２６１４、２６５０／２６０８、２６３２／２６３０および２６２６／２６２４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０３９９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２７の抗原結合ドメイン（図２７の２７４８／２７４６および２７３８／２７４０の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４００】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２７の抗原結合ドメイン（図２７の２７１４／２７１６、２７５０／２７０８、２７３６／２７３４および２７２８／２７２６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４０１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２８の抗原結合ドメイン（図２７の２８５０／２８０８および２８４８／２８４６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４０２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２８の抗原結合ドメイン（図２８の２８１８／２８２０、２８１２／２８１４、２８４２／２８４０および２８３６／２８３４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４０３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２９の抗原結合ドメイン（図２９の２９１８／２９０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４０４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２９の抗原結合ドメイン（図２９の２９１４／２９１２）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４０５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３０の抗原結合ドメイン（図３０の３０２２／３００４および３０２０／３０１８の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４０６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３０の抗原結合ドメイン（図３０の３０１４／３０１２）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４０７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３１の抗原結合ドメイン（図３１の３１２２／３１０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４０８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３１の抗原結合ドメイン（図３１の３１２０／３１１８）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４０９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３１の抗原結合ドメイン（図３１の３１１４／３１１２）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４１０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３２の抗原結合ドメイン（図３２の３２２６／３２０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４１１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３２の抗原結合ドメイン（図３２の３２２２／３２２０および３２１６／３２１４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４１２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３３の抗原結合ドメイン（図３３の３３３０／３３０４および３３２８／３３２６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４１３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３３の抗原結合ドメイン（図３３の３３２２／３３２０および３３１６／３３１４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４１４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３４の抗原結合ドメイン（図３４の３４３０／３４０４）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４１５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３４の抗原結合ドメイン（図３４の３４２８／３４２６）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４１６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３４の抗原結合ドメイン（図３４の３４２２／３４２０および３４１６／３４１４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４１７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３５の抗原結合ドメイン（図３５の３５３０／３５２８および３５２０／３５２２の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４１８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３５の抗原結合ドメイン（図３５の３５３２／３５０６）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４１９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３５の抗原結合ドメイン（図３５の３５１８／３５１６）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４２０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３６の抗原結合ドメイン（図３６の３６３８／３６３６および３６２８／３６２０の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４２１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３６の抗原結合ドメイン（図３６の３６４０／３６０６および３６２６／３６２４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４２２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３７の抗原結合ドメイン（図３７の３７４８／３７４６および３７３８／３７４０の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４２３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３７の抗原結合ドメイン（図３７の３７５０／３７０８および３７３６／３７３４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４２４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３７の抗原結合ドメイン（図３７の３７１４／３７１６および３７２８／３７２６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４２５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３８の抗原結合ドメイン（図３８の３８３２／３８０６および３８３０／３８２２の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４２６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３８の抗原結合ドメイン（図３８の３８１０／３８１２）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４２７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３８の抗原結合ドメイン（図３８の３８２４／３８２２）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４２８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３９の抗原結合ドメイン（図３９の３９３８／３９３６および３９２４／３９２６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４２９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３９の抗原結合ドメイン（図３９の３９４０／３９０６および３９２２／３９２０の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４３０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４０の抗原結合ドメイン（図４０の４０４８／４０４６および４０３４／４０３６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４３１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４０の抗原結合ドメイン（図４０の４０５０／４００８および４０３２／４０３０の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４３２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４０の抗原結合ドメイン（図４０の４０１２／４０１４および４０２６／４０２４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４３３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４１の抗原結合ドメイン（図４１の４１４０／４１０６および４１３８／４１３６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４３４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４１の抗原結合ドメイン（図４１の４１１２／４１１４および４１３０／４１２８の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４３５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４２の抗原結合ドメイン（図４２の４２５０／４２０８および４２４８／４２４６の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４３６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４２の抗原結合ドメイン（図４２の４２１８／４２２０および４２３６／４２３４の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４３７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４２の抗原結合ドメイン（図４２の４２１２／４２１４および４２４２／４２４０の各々）は、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得る。
【０４３８】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１の抗原結合ドメイン（図１の１１０／１０４）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４３９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２の抗原結合ドメイン（図２の２１２／２０４）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４４０】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３の抗原結合ドメイン（図３の３０８／３１６および３１２／３１８）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４４１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４の抗原結合ドメイン（図４の４１０／４１２、４１６／４１８および４２２／４２４）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４４２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体５の抗原結合ドメイン（図５の５１０／５０４、５１２／５１４および５１８／５２０）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４４３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体６の抗原結合ドメイン（図６の６１２／６０４、６１４／６１６、６２０／６２２および６２６／６２８）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４４４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体７の抗原結合ドメイン（図７の７１２／７１４および７１４／７１６）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４４５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体８の抗原結合ドメイン（図８の８１２／８０６および８１８／８２２）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４４６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体９の抗原結合ドメイン（図９の９０８／９０６、９２０／９２２、９１２／９１４および９２６／９３０）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４４７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１０の抗原結合ドメイン（図１０の１００６／１００４および１０１８／１０２０）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４４８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１１の抗原結合ドメイン（図１１の１１１２／１１１４、１１２２／１１０８、１１２８／１１４２および１１３８／１１３６）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４４９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１２の抗原結合ドメイン（図１２の１２１８／１２２０、１２１２／１２１４、１２５０／１２０８、１２４８／１２４６、１２４２／１２４０および１２３６／１２３４）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４５０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１３の抗原結合ドメイン（図１３の１３１０／１３０４および１３１４／１３２２）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４５１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１４の抗原結合ドメイン（図１４の１４０８／１４０６および１４１６／１４２４）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４５２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１５の抗原結合ドメイン（図１５の１５０８／１５０６、１５１４／１５１６、１５３２／１５２０および１５３０／１５２８）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４５３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１６の抗原結合ドメイン（図１６の１６１６／１６０４および１６１８／１６３０）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４５４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１７の抗原結合ドメイン（図１７の１７１２／１７１４、１７２４／１７０８、１７２６／１７４２および１７３８／１７３６）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４５５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１８の抗原結合ドメイン（図１８の１８１２／１８１４、１８２８／１８０８、１８２６／１８２４、１８３０／１８３２、１８５０／１８４８および１８４４／１８４２）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４５６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１９の抗原結合ドメイン（図１９の１９１４／１９０４および１９２０／１９２２）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４５７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２０の抗原結合ドメイン（図２０の２０１４／２０１６、２０４２／２００８、２０３６／２０３４および２０２８／２０２６）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４５８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２１の抗原結合ドメイン（図２１の２１１４／２１１６、２１５０／２１０８、２１４８／２１４６、２１３８／２１４０、２１３６／２１３４および２１２８／２１２６）はそれぞれ、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４５９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２２の抗原結合ドメイン（図２２の２２０４／２２２２）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４６０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２２の抗原結合ドメイン（図２２の２２１８／２２２０および２２１２／２２１４の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４６１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２３の抗原結合ドメイン（図２３の２３３０／２３０４）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４６２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２３の抗原結合ドメイン（図２３の２３２８／２３２６、２３２２／２３２０および２３１６／２３１４の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４６３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２４の抗原結合ドメイン（図２４の２４３０／２４２８および２４２０／２４２２の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４６４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２４の抗原結合ドメイン（図２４の２４３２／２４０６および２４１８／２４１６の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４６５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２５の抗原結合ドメイン（図２５の２５３２／２５０６および２５３０／２５２８の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４６６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２５の抗原結合ドメイン（図２５の２５１０／２５１２および２５２４／２５２２の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４６７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２６の抗原結合ドメイン（図２６の２６４８／２６４６および２６３４／２６３６の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４６８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２６の抗原結合ドメイン（図２６の２６１２／２６１４、２６５０／２６０８、２６３２／２６３０および２６２６／２６２４の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４６９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２７の抗原結合ドメイン（図２７の２７４８／２７４６および２７３８／２７４０の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４７０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２７の抗原結合ドメイン（図２７の２７１４／２７１６、２７５０／２７０８、２７３６／２７３４および２７２８／２７２６の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４７１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２８の抗原結合ドメイン（図２７の２８５０／２８０８および２８４８／２８４６の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４７２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２８の抗原結合ドメイン（図２８の２８１８／２８２０、２８１２／２８１４、２８４２／２８４０および２８３６／２８３４の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４７３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２９の抗原結合ドメイン（図２９の２９１８／２９０４）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４７４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体２９の抗原結合ドメイン（図２９の２９１４／２９１２）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４７５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３０の抗原結合ドメイン（図３０の３０２２／３００４および３０２０／３０１８の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４７６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３０の抗原結合ドメイン（図３０の３０１４／３０１２）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４７７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３１の抗原結合ドメイン（図３１の３１２２／３１０４）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４７８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３１の抗原結合ドメイン（図３１の３１２０／３１１８）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４７９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３１の抗原結合ドメイン（図３１の３１１４／３１１２）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４８０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３２の抗原結合ドメイン（図３２の３２２６／３２０４）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４８１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３２の抗原結合ドメイン（図３２の３２２２／３２２０および３２１６／３２１４の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４８２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３３の抗原結合ドメイン（図３３の３３３０／３３０４および３３２８／３３２６の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４８３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３３の抗原結合ドメイン（図３３の３３２２／３３２０および３３１６／３３１４の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４８４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３４の抗原結合ドメイン（図３４の３４３０／３４０４）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４８５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３４の抗原結合ドメイン（図３４の３４２８／３４２６）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４８６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３４の抗原結合ドメイン（図３４の３４２２／３４２０および３４１６／３４１４の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４８７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３５の抗原結合ドメイン（図３５の３５３０／３５２８および３５２０／３５２２の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４８８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３５の抗原結合ドメイン（図３５の３５３２／３５０６）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４８９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３５の抗原結合ドメイン（図３５の３５１８／３５１６）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４９０】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３６の抗原結合ドメイン（図３６の３６３８／３６３６および３６２８／３６２０の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４９１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３６の抗原結合ドメイン（図３６の３６４０／３６０６および３６２６／３６２４の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４９２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３７の抗原結合ドメイン（図３７の３７４８／３７４６および３７３８／３７４０の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４９３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３７の抗原結合ドメイン（図３７の３７５０／３７０８および３７３６／３７３４の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４９４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３７の抗原結合ドメイン（図３７の３７１４／３７１６および３７２８／３７２６の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４９５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３８の抗原結合ドメイン（図３８の３８３２／３８０６および３８３０／３８２２の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４９６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３８の抗原結合ドメイン（図３８の３８１０／３８１２）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４９７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３８の抗原結合ドメイン（図３８の３８２４／３８２２）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４９８】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３９の抗原結合ドメイン（図３９の３９３８／３９３６および３９２４／３９２６の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０４９９】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体３９の抗原結合ドメイン（図３９の３９４０／３９０６および３９２２／３９２０の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０５００】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４０の抗原結合ドメイン（図４０の４０４８／４０４６および４０３４／４０３６の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０５０１】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４０の抗原結合ドメイン（図４０の４０５０／４００８および４０３２／４０３０の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０５０２】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４０の抗原結合ドメイン（図４０の４０１２／４０１４および４０２６／４０２４の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０５０３】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４１の抗原結合ドメイン（図４１の４１４０／４１０６および４１３８／４１３６の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０５０４】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４１の抗原結合ドメイン（図４１の４１１２／４１１４および４１３０／４１２８の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０５０５】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４２の抗原結合ドメイン（図４２の４２５０／４２０８および４２４８／４２４６の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０５０６】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４２の抗原結合ドメイン（図４２の４２１８／４２２０および４２３６／４２３４の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０５０７】
Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体４２の抗原結合ドメイン（図４２の４２１２／４２１４および４２４２／４２４０の各々）は、ＶＨ配列およびＶＬ配列に含まれるＣＤＲ配列を含み得、ＶＨ配列およびＶＬ配列の残りは、表２に列記される抗体のいずれか一つのＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一である。
【０５０８】
ＩＶ．二量体形成選択モジュール
本開示において、二量体形成選択モジュールは、二つのＦｃドメイン単量体の好ましい対形成を促進してＦｃドメインを形成する、Ｆｃドメイン単量体内の構成要素または選択アミノ酸を含む。詳細には、二量体形成選択モジュールは、二つのＦｃドメイン単量体の相互作用するＣＨ３抗体定常ドメイン間の界面に位置するアミノ酸置換を含む、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインの部分である。二量体形成選択モジュールにおいては、アミノ酸置換が、それら置換に選択されたアミノ酸の適合性の結果として、二つのＣＨ３抗体定常ドメインの好ましい二量体形成を行う。好ましいＦｃドメインの最終形態は、二量体形成選択モジュールをもたないＦｃドメイン単量体で、または二量体形成選択モジュール内に適合しないアミノ酸置換をもつＦｃドメイン単量体で形成される他のＦｃドメインに対して選択的である。この種のアミノ酸置換は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ等のこの技術分野で周知の従来の分子クローニング技術を用いて行うことが可能である。
【０５０９】
一部の実施形態では、二量体形成選択モジュールは、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に改変された空洞（本明細書でさらに説明する）を含む。他の実施形態では、二量体形成選択モジュールは、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に改変された突起（本明細書でさらに説明する）を含む。選択的にＦｃドメインを形成するために、適合可能な二量体形成選択モジュールをもつ二つのＦｃドメイン単量体、例えば改変された空洞を含む一方のＣＨ３抗体定常ドメインと、改変された突起を含むもう一方のＣＨ３抗体定常ドメインとを結合して、Ｆｃドメイン単量体の空洞に突起が挿入された対を形成する。改変された突起および改変された空洞は、ヘテロ二量体形成選択モジュールの例であり、それらは、適合するヘテロ二量体形成選択モジュールを有する二つのＦｃドメイン単量体の好ましいヘテロ二量体形成を促進するために、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内に作製することが可能である。
【０５１０】
他の実施形態では、正電荷をもつアミノ酸置換を含有する二量体形成選択モジュールをもつＦｃドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換を含有する二量体形成選択モジュールをもつＦｃドメイン単量体とを選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリング（本明細書においてさらに説明する）を経てＦｃドメインを形成することができる。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、以下の正電荷をもつアミノ酸置換および負電荷をもつアミノ酸置換のうちの一つを含み得る：Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅ。一実施例では、正電荷をもつアミノ酸置換、例えばＤ３５６ＫまたはＥ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換、例えばＫ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。別の実施例では、Ｅ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、Ｋ３７０Ｄを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。一部の実施形態では、逆電荷のアミノ酸置換を、ヘテロ二量体形成選択モジュールとして用い得るものであって、異なるが適合する逆電荷のアミノ酸置換を含有する二つのＦｃドメイン単量体が結合して、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成する。特定の二量体形成選択モジュールを、さらに以下に説明される表３および４にさらに列記しているが、これらに限定されない。
【０５１１】
他の実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体が、ＣＨ３ドメイン間の界面における電荷をもつ残基の環内の少なくとも二つの位置において、同一の逆電荷の変異を含有するホモ二量体形成選択モジュールを含む。ホモ二量体形成選択モジュールは、Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成を促進してホモ二量体Ｆｃドメインを形成する、逆電荷のアミノ酸置換である。二つのＦｃドメイン単量体内の残基の２以上の相補的な対の両要素の電荷が反転していることによって、変異したＦｃドメイン単量体は同じ変異の配列のＦｃドメイン単量体に対して相補性を維持するが、こうした変異なしではＦｃドメイン単量体に対する相補性はより小さい。一実施形態では、Ｆｃドメインは、二重変異体である、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３５６Ｋ／Ｋ４３９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｅ／Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０ＤまたはＤ３５６Ｋ／Ｋ４３９Ｅを含むＦｃ単量体を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、例えばＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｅである、二重変異体の任意の対を結合した四重変異体を含むＦｃドメイン単量体を含む。ホモ二量体形成選択モジュールの例を、表５および６にさらに示している。
【０５１２】
さらなる実施形態では、（ｉ）少なくとも一つの逆電荷の変異と、（ｉｉ）少なくとも一つの改変された空洞または少なくとも一つの改変された突起とを含有するＦｃドメイン単量体を、（ｉ）少なくとも一つの逆電荷の変異と、（ｉｉ）少なくとも一つの改変された突起または少なくとも一つの改変された空洞とを含有する他のＦｃドメイン単量体と選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成することができる。例えば、反転した電荷の変異Ｋ３７０Ｄと、改変された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖとを含有するＦｃドメイン単量体と、反転した電荷の変異Ｅ３５７Ｋと、改変された突起Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗとを含有する他のＦｃドメイン単量体とを選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成する。
【０５１３】
こうしたＦｃドメインの形成は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内の適合するアミノ酸置換によって促される。ＣＨ３−ＣＨ３界面において、二つの二量体形成選択モジュールが適合しないアミノ酸置換を含有する場合、例えば、改変された空洞を両方が含有する、改変された突起を両方が含有する、または、同じ電荷をもつアミノ酸を両方が含有する場合は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成は促されない。
【０５１４】
さらに、確定されたＦｃドメイン単量体によるＦｃドメインの形成を促進するために用いる他の方法には、ヘテロ二量体の形成を可能にする、ロイシンジッパーの単量体α−へリックスのＦｃドメイン単量体それぞれに対するＣ末端融合を含むＬＵＺ−Ｙアプローチ（米国特許出願公開公報第ＷＯ２０１１０３４６０５号）のみならず、ＩｇＡおよびＩｇＧ  ＣＨ３配列の交互セグメントをそれぞれが含むヘテロ二量体のＦｃドメイン単量体によりＦｃドメインを生成する、ストランド交換改変ドメイン（ＳＥＥＤ（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ））体のアプローチ（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２３：１９５−２０２，２０１０）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５１５】
Ｖ．改変された空洞および改変された突起
改変された空洞および改変された突起の使用（すなわち、「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」ストラテジー）は、Ｃａｒｔｅｒおよびその協同研究者（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：６１７−６１２，１９９６；Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２７０：２６−３５，１９９７；Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６７７−６８１，１９９８）によって記述されている。ノブとホールとの相互作用は、ヘテロ二量体形成を支持するが、一方、ノブ間およびホール間の相互作用は、立体的な不一致および好ましい相互作用の損失に起因してホモ二量体形成を妨げる。「ノブイントゥホール」技術は、米国特許第５，７３１，１６８号にも開示されている。
【０５１６】
本開示では、改変された空洞および改変された突起は、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体の調製に使用される。改変された空洞は、あるタンパク質中の本来のアミノ酸が、より低分子量の側鎖をもつ異なるアミノ酸で置換されたときに形成される空隙である。改変された突起は、あるタンパク質中の本来のアミノ酸が、より高分子量の側鎖をもつ異なるアミノ酸で置換されたときに形成される突起である。詳細には、置換されようとするアミノ酸は、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内にあり、二つのＦｃドメイン単量体の二量体形成に関与する。一部の実施形態では、一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の改変された空洞は、もう一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の改変された突起を収納するように形成されるため、両ＣＨ３抗体定常ドメインが、二つのＦｃドメイン単量体の二量体形成を促進するまたは支持する二量体形成選択モジュール（例えば、ヘテロ二量体形成選択モジュール）（上記に記載した）として機能する。他の実施形態では、一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の改変された空洞は、もう一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸をより良好に収納するように形成されている。さらに他の実施形態では、一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の改変された突起は、もう一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸とのさらなる相互作用を形成するように形成されている。
【０５１７】
改変された空洞は、チロシンまたはトリプトファン等のより長い側鎖を含有するアミノ酸を、アラニン、バリンまたはトレオニン等のより短い側鎖を含有するアミノ酸で置換することによって構築することが可能である。詳細には、一部の二量体形成選択モジュール（例えば、ヘテロ二量体形成選択モジュール）（上記でさらに記載した）は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内にＹ４０７Ｖ変異等の改変された空洞を含有する。同様に、改変された突起は、より短い側鎖を含有するアミノ酸を、より長い側鎖を含有するアミノ酸で置換することによって構築することが可能である。詳細には、一部の二量体形成選択モジュール（例えば、ヘテロ二量体形成選択モジュール）（上記でさらに記載した）は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内にＴ３６６Ｗ変異等の改変された突起を含有する。本開示では、改変された空洞および改変された突起はまた、ヘテロ二量体形成を促進する、ＣＨ３ドメイン間のジスルフィド結合改変と組み合わされる。一実施例では、改変された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含有するＦｃドメイン単量体は、改変された突起Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含有する他のＦｃドメイン単量体と選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成することができる。別の実施例では、Ｙ３４９Ｃを追加することで改変された空洞を含有するＦｃドメイン単量体と、Ｓ３５４Ｃを追加することで改変された突起を含有するＦｃドメイン単量体が選択的に組み合わされて、Ｆｃドメインを形成してもよい。ジスルフィド結合改変または構造的計算のいずれかと組み合わせた（ＨＡ−ＴＦ混合）、他の改変された空洞および改変された突起を表３に示すが、これらに限定されない。
【０５１８】
（表３）
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【０５１９】
ＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することは、本来のアミノ酸残基をコードする核酸を変更することによって達成することが可能である。置換することが可能である本来のアミノ酸残基の数の上限は、界面における十分な相互作用を維持したままにすることを考えれば、ＣＨ３抗体定常ドメインの界面における残基の総数である。
【０５２０】
改変された空洞と改変された突起を、静電的ステアリングを用いて組み合わせる
静電的ステアリングを、ノブ−イン−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）技術と組み合わせて、例えば二つの異なるポリペプチド中のＦｃドメイン単量体間でのヘテロ二量体形成を有利にすることができる。以下にさらに詳細に記載するが、静電的ステアリングは、より高次のタンパク質分子の形成を制御する、ペプチド、タンパク質ドメインおよびタンパク質内の反対の電荷をもつアミノ酸間の有益な静電的相互作用の利用である。静電的ステアリングを使用して、ホモ二量体形成またはヘテロ二量体形成のいずれかを促進することができ、後者の場合にはノブ−イン−ホール技術と組み合わせることが有益な場合がある。ヘテロ二量体形成の場合、異なっているが、適合性のある変異を、ヘテロ二量体化されるＦｃドメイン単量体の各々に導入する。ゆえに、Ｆｃドメイン単量体を改変して、以下の正電荷をもつアミノ酸置換、および負電荷をもつアミノ酸置換のうちの一つを含ませることができる：Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅ。例えば一つのＦｃドメイン単量体、例えば空洞（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ）を有するＦｃドメイン単量体も、Ｋ３７０Ｄ変異を含むことができ、他のＦｃドメイン単量体、例えば突起（Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ）を有するＦｃドメイン単量体もＥ３５７Ｋを含むことができる。
【０５２１】
より一般的には、以下の空洞変異のいずれか（または変異の組み合わせ）：Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ：Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ：Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ：Ｙ３４９Ｃ、およびＳ３３６４Ｈ：Ｆ４０５を、表４の変異と組み合わせることができる。以下の突起変異のいずれか（または変異の組み合わせ）：Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３６６Ｙ：Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ：Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ：Ｓ３５４Ｃ、およびＹ３４９Ｔ：Ｔ３９４Ｆを、表４の変異と組み合わせることができ、これを空洞変異（または変異の組み合わせ）と組み合わせて使用される表４の変異と対形成させる。
【０５２２】
ＶＩ．静電的ステアリング
静電的ステアリングは、より高次のタンパク質分子の形成を制御する、ペプチド、タンパク質ドメインおよびタンパク質内の反対の電荷をもつアミノ酸間の好ましい静電的相互作用の利用である。静電的ステアリングの効果を用いて、二重特異性抗体の生成の際のヘテロ二量体形成に有利に、ホモ二量体の形成を低減するように抗体ドメインの相互作用を変える方法が、米国特許出願公開公報第２０１４−００２４１１１号に開示されている。
【０５２３】
本開示では、静電的ステアリングを用いて、Ｆｃドメイン単量体の二量体形成およびＦｃ抗原結合ドメイン構築体の形成を制御する。特に、静電的ステアリングを用いてＦｃドメイン単量体の二量体形成を制御することは、ＣＨ３−ＣＨ３界面を形成する一つまたは複数のアミノ酸残基が、正電荷をもつかまたは負電荷をもつアミノ酸残基で置換されるため、導入された特定の電荷をもつアミノ酸に応じて、相互作用は静電的に好ましくなるかまたは好ましくないものとなる。一部の実施形態では、リジン、アルギニンまたはヒスチジン等、界面における正電荷をもつアミノ酸が、アスパラギン酸またはグルタミン酸等の負電荷をもつアミノ酸で置換される。他の実施形態では、界面における負電荷をもつアミノ酸が、正電荷をもつアミノ酸で置換される。電荷をもつアミノ酸は、相互作用するＣＨ３抗体定常ドメインの一方または両方に導入され得る。相互作用するＣＨ３抗体定常ドメインに電荷をもつアミノ酸を導入することによって、二量体形成選択モジュール（上記においてさらに説明した）が形成されるが、それは電荷をもつアミノ酸間の相互作用の結果としての静電的ステアリング効果で制御されるとおりに、Ｆｃドメイン単量体の二量体を選択的に形成することが可能である。
【０５２４】
一部の実施形態では、静電的ステアリング効果で制御されるとおりにＦｃドメイン単量体の二量体を選択的に形成することが可能である、反転した電荷を含む二量体形成選択モジュールを形成するために、二つのＦｃドメイン単量体は、ヘテロ二量体形成またはホモ二量体形成を経て選択的に形成され得る。
【０５２５】
Ｆｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成
Ｆｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成は、限定するものではないが表４に含むような電荷残基対などである、二つのＦｃドメイン単量体内に異なるものであるが適合する変異を導入することによって促進することが可能である。一部の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、以下の正電荷をもつアミノ酸置換および負電荷をもつアミノ酸置換のうちの一つを含み得る：Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅ。一実施例では、正電荷をもつアミノ酸置換、例えばＤ３５６ＫまたはＥ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換、例えばＫ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。別の実施例では、Ｅ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、Ｋ３７０Ｄを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。
【０５２６】
例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体では、三つのうち二つのＦｃドメインは、静電的ステアリング効果によって促進されるように、二つのＦｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成によって形成され得る。「ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」という語は、二つのＦｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、該二つのＦｃドメイン単量体は、これら二つのＦｃドメイン単量体の好ましい形成を促進する異なる逆電荷の変異（ヘテロ二量体形成選択モジュール）（例えば、表４の変異を参照）を含有する。三つのＦｃドメイン、つまり一つのカルボキシル末端「幹」Ｆｃドメインと、二つのアミノ末端「枝」Ｆｃドメインとを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体において、アミノ末端「枝」Ｆｃドメインのそれぞれが、ヘテロ二量体のＦｃドメイン（「枝ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」とも称する）となり得る（例えば、図１において、Ｆｃドメイン単量体１０６および１１４、またはＦｃドメイン単量体１１２および１１６によって形成されるヘテロ二量体Ｆｃドメイン、図２において、Ｆｃドメイン単量体２０６および２１４またはＦｃドメイン単量体２１２および２１６によって形成されるヘテロ二量体Ｆｃドメイン）。枝へテロ二量体Ｆｃドメインは、Ｅ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、Ｋ３７０Ｄを含有する他のＦｃドメイン単量体とによって形成され得る。
【０５２７】
（表４）
2020514301.tif 000074
【０５２８】
Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成
Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成は、対称的であるように両Ｆｃドメイン単量体内に、同一の静電的ステアリング変異（ホモ二量体形成選択モジュール）を導入することによって、促進することが可能である。一部の実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体が、ＣＨ３ドメイン間の界面における電荷をもつ残基の環内の少なくとも二つの位置において、同一の逆電荷の変異を含有するホモ二量体形成選択モジュールを含む。二つのＦｃドメイン単量体内の残基の２以上の相補的な対の両要素の電荷が反転していることによって、変異したＦｃドメイン単量体は同じ変異の配列のＦｃドメイン単量体に対して相補性を維持するが、こうした変異なしではＦｃドメイン単量体に対する相補性はより小さい。Ｆｃドメイン単量体に導入されて、そのホモ二量体形成を促進し得る静電的ステアリング変異を、表５および６に示しているが、これらに限定されない。一実施形態では、Ｆｃドメインは、例えばＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋである二重の逆電荷の変異体（表５）をそれぞれ含む、二つのＦｃドメイン単量体を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、例えばＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ／Ｋ３７０Ｄ／Ｅ３５７Ｋである四重の逆電荷の変異体（表６）をそれぞれ含む、二つのＦｃドメイン単量体を含む。
【０５２９】
例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体において、三つのうち一つのＦｃドメインは、静電的ステアリング効果により促進される場合、二つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体形成によって形成され得る。「ホモ二量体Ｆｃドメイン」という語は、二つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、当該二つのＦｃドメイン単量体は、同一の逆電荷の変異（例えば、表５および６の変異を参照）を含有する。三つのＦｃドメイン、すなわち一つのカルボキシル末端の「幹」Ｆｃドメインと、二つのアミノ末端の「枝」Ｆｃドメインとを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体において、カルボキシ末端の「幹」Ｆｃドメインは、ホモ二量体のＦｃドメイン（「幹ホモ二量体Ｆｃドメイン」とも称される）となり得る。幹ホモ二量体Ｆｃドメインは、二重変異体Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋをそれぞれ含有する二つのＦｃドメイン単量体によって形成され得る。
【０５３０】
（表５）
2020514301.tif 000075
【０５３１】
（表６）
2020514301.tif 000076
2020514301.tif 000077
【０５３２】
ＶＩＩ．リンカー
本開示では、ポリペプチドまたはタンパク質ドメインおよび／または会合する非タンパク質部分間における結合または接続を説明するために、リンカーを用いる。一部の実施形態では、リンカーは、少なくとも二つのＦｃドメイン単量体間の結合または接続であり、それに対してリンカーが、第一のＦｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインのＣ末端を、第二のＦｃドメイン単量体のヒンジドメインのＮ末端に対して、二つのＦｃドメイン単量体が互いに直列に連結するように接続するものである。他の実施形態では、リンカーは、Ｆｃドメイン単量体とそれに付加されるその他のタンパク質ドメインとの間の結合である。例えばリンカーは、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインのＣ末端を、アルブミン結合ペプチドのＮ末端に付加させることが可能である。
【０５３３】
リンカーは、例えばペプチド結合である単純な共有結合、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーである合成ポリマー、または、例えば化学的複合体化である化学反応で形成した任意の種類の結合とすることが可能である。リンカーがペプチド結合である場合は、一方のタンパク質ドメインのＣ末端におけるカルボン酸基が、縮合反応でもう一方のタンパク質ドメインのＮ末端におけるアミノ酸と反応して、ペプチド結合を形成することが可能である。詳細には、ペプチド結合は、この技術分野で周知の従来の有機化学反応を経る合成手段により、または、宿主細胞からの自然な産生により形成することが可能であり、例えば二つのＦｃドメイン単量体である、直列にしたタンパク質両方のＤＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド配列を、宿主細胞内の、例えばＤＮＡポリメラーゼおよびリボソームである必要な分子機械（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）によって、両方のタンパク質をコードする連続したポリペプチドへと、直接転写または翻訳されることが可能である。
【０５３４】
リンカーが合成ポリマー、例えばＰＥＧポリマーである場合は、該ポリマーは、各端部が反応性の化学官能基で官能化されて、二つのタンパク質の接続端にある末端アミノ酸と反応することが可能である。
【０５３５】
リンカー（上記に示したペプチド結合は除く）が化学反応により形成される場合は、例えばアミン、カルボン酸、エステル、アジドまたはこの技術分野で通常用いられる他の官能基である化学官能基が、一方のタンパク質のＣ末端と、もう一方のタンパク質のＮ末端とのそれぞれに対して合成的に付加することが可能である。この二つの官能基はその後、合成化学手段を経て反応して化学結合を形成することによって、二つのタンパク質をひとつに接続することが可能である。こうした化学的複合体化の手順は、当業者にとってルーチンである。
【０５３６】
スペーサー
本開示では、二つのＦｃドメイン単量体間のリンカーは、３〜２００のアミノ酸（例えば、３〜２００、３〜１８０、３〜１６０、３〜１４０、３〜１２０、３〜１００、３〜９０、３〜８０、３〜７０、３〜６０、３〜５０、３〜４５、３〜４０、３〜３５、３〜３０、３〜２５、３〜２０、３〜１５、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜２００、５〜２００、６〜２００、７〜２００、８〜２００、９〜２００、１０〜２００、１５〜２００、２０〜２００、２５〜２００、３０〜２００、３５〜２００、４０〜２００、４５〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００または１８０〜２００のアミノ酸）を含むアミノ酸スペーサーとすることが可能である。一部の実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体間のリンカーは、少なくとも１２のアミノ酸、例えば、１２〜２００のアミノ酸（例えば、１２〜２００、１２〜１８０、１２〜１６０、１２〜１４０、１２〜１２０、１２〜１００、１２〜９０、１２〜８０、１２〜７０、１２〜６０、１２〜５０、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４または１２〜１３のアミノ酸）（例えば、１４〜２００、１６〜２００、１８〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、１８０〜２００または１９０〜２００のアミノ酸）を含有するアミノ酸スペーサーである。一部の実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体間のリンカーは、１２〜３０のアミノ酸（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のアミノ酸）を含有するアミノ酸スペーサーである。好適なペプチドスペーサーはこの分野において公知であり、例えば、グリシンおよびセリン等のフレキシブルなアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを含む。或る実施形態では、スペーサーは、例えばＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ（配列番号１）、ＧＧＳＧ（配列番号２）またはＳＧＧＧ（配列番号３）の、複数のモチーフまたは繰り返しモチーフであるモチーフを含有することが可能である。或る実施形態では、スペーサーは、例えば
2020514301.tif 000078
である、ＧＳのモチーフを含む２〜１２のアミノ酸を含有することが可能である。他の或る実施形態では、スペーサーは、例えば
2020514301.tif 000079
である、ＧＧＳのモチーフを含む３〜１２のアミノ酸を含有することが可能である。さらに他の実施形態では、スペーサーは、例えば
2020514301.tif 000080
である、ＧＧＳＧ（配列番号２）のモチーフを含む４〜２０のアミノ酸を含有することが可能である。他の実施形態では、スペーサーは、例えば
2020514301.tif 000081
である、ＧＧＧＧＳ（配列番号１）のモチーフを含有することが可能である。或る実施形態では、スペーサーは、
2020514301.tif 000082
である。
【０５３７】
一部の実施形態では、二つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、グリシン残基のみを含有し、例えば、少なくとも四つのグリシン残基（例えば、４〜２００、４〜１８０、４〜１６０、４〜１４０、４〜４０、４〜１００、４〜９０、４〜８０、４〜７０、４〜６０、４〜５０、４〜４０、４〜３０、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６または４〜５のグリシン残基）（例えば、４〜２００、６〜２００、８〜２００、１０〜２００、１２〜２００、１４〜２００、１６〜２００、１８〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、１８０〜２００、または１９０〜２００のグリシン残基）を含有する。或る実施形態では、スペーサーは、４〜３０のグリシン残基（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のグリシン残基）を有する。一部の実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、グリコシル化（例えば、Ｏ−結合型グリコシル化、Ｏ−グリコシル化とも称する）されていないものであり得るか、または、例えば一つまたは複数のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、
2020514301.tif 000083
）と比較して、低減されたレベルのグリコシル化（例えば、低減されたレベルのＯ−グリコシル化）（例えば、キシロース、マンノース、シアル酸、フコース（Ｆｕｃ）および／またはガラクトース（Ｇａｌ）等のグリカン（例えば、キシロース）による低減したレベルのＯ−グリコシル化）を有し得る。
【０５３８】
一部の実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、Ｏ−グリコシル化（例えば、Ｏ−キシロシル化）されていないものであり得るか、または、例えば一つまたは複数のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、
2020514301.tif 000084
）と比較して、低減されたレベルのＯ−グリコシル化（例えば、低減されたレベルのＯ−キシロシル化）を有し得る。
【０５３９】
一部の実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、タンパク質分解を受けないものであり得るか、または、例えば一つまたは複数のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、
2020514301.tif 000085
）と比較して、低減されたタンパク質分解速度を有し得る。
【０５４０】
或る実施形態では、スペーサーは、例えば
2020514301.tif 000086
である、ＧＧＧＧ（配列番号１９）のモチーフを含有することが可能である。或る実施形態では、スペーサーは、例えば
2020514301.tif 000087
である、ＧＧＧＧＧ（配列番号２４）のモチーフを含有することが可能である。或る実施形態では、スペーサーは、
2020514301.tif 000088
である。
【０５４１】
他の実施形態では、スペーサーはまた、グリシンおよびセリン以外のアミノ酸を含有すること、例えば
2020514301.tif 000089
を含有することも可能である。
【０５４２】
本開示における或る実施形態では、１２アミノ酸ペプチドスペーサーまたは２０アミノ酸ペプチドスペーサーを用いて、二つのＦｃドメイン単量体、それぞれ配列
2020514301.tif 000090
からなる１２アミノ酸ペプチドスペーサーおよび２０アミノ酸ペプチドスペーサーが直列に接続される。他の実施形態では、配列
2020514301.tif 000091
からなる１８アミノ酸ペプチドスペーサーを用いることができる。
【０５４３】
一部の実施形態において、二つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、上述の配列番号１〜３６のいずれか一つの配列に対し、少なくとも７５％同一（例えば、少なくとも７７％、７９％、８１％、８３％、８５％、８７％、８９％、９１％、９３％、９５％、９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有し得る。特定の実施形態において、二つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、配列番号１７、１８、２６、および２７のいずれか一つの配列に対し、少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有し得る。特定の実施形態において、二つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、配列番号１８または２７の配列に対し、少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、または９９．５％）である配列を有し得る。
【０５４４】
ＶＩＩ．血清タンパク質結合ペプチド
血清タンパク質をペプチドに結合することで、タンパク質薬剤の薬物動態を向上させることが可能であり、特にここに記載するＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、血清タンパク質結合ペプチドと融合し得る。
【０５４５】
一例として、ここに記載の方法および組成物に用いることが可能であるアルブミン結合ペプチドは、概して、この技術分野において公知である。一実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列：
2020514301.tif 000092
を含む。一部の実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列番号３７の配列と、少なくとも８０％同一（例えば、８０％、９０％または１００％同一）である配列を有する。
【０５４６】
本開示では、アルブミン結合ペプチドは、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体内の特定のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。１つの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、抗原結合ドメインを含有するＦｃ構築体中の１つまたは複数のポリペプチドのＣ末端に付加され得る。別の実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、抗原結合ドメインを含有するＦｃ構築体中で直列に連続して連結された二つのＦｃドメイン単量体をコードするポリペプチドのＣ末端に融合されることが可能である。さらに別の実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、直列に接続した二つのＦｃドメイン単量体をコードするポリペプチド内の第二のＦｃドメイン単量体と連結するＦｃドメイン単量体Ｃ末端（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１１４および１１６、図２のＦｃドメイン単量体２１４および２１６）に付加することが可能である。アルブミン結合ペプチドは、例えば化学的複合体化である化学的手段を介して、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体と遺伝的に融合、または、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に付加されることが可能である。所望であれば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体とアルブミン結合ペプチドとの間にスペーサーを挿入することが可能である。学説には拘束されないが、本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体中にアルブミン結合ペプチドが含まれることで、血清アルブミンと治療用タンパク質との結合を介して、治療用タンパク質の滞留延長がもたらされ得ることが期待される。
【０５４７】
ＶＩＩＩ．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体
概して、本開示は、２〜１０個のＦｃドメインと、１個または複数の抗原結合ドメインが付加されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴とする。これらは、Ｆｃ受容体の一つの野生型Ｆｃドメイン（例えばＦｃγＲＩＩＩａ）よりも高い結合アフィニティーおよび／またはアビディティーを有し得る。本開示は、Ｆｃドメインの二つのＦｃドメイン単量体が互いと二量体を選択的に形成して、それによって望まない多量体または凝集の形成を回避するように、相互作用する二つのＣＨ３抗体定常ドメインの界面においてアミノ酸を改変する方法を開示する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、偶数のＦｃドメイン単量体を含み、Ｆｃドメイン単量体の各対がＦｃドメインを形成する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は最小で二つの機能性Ｆｃドメインと一つの抗原結合ドメインを含み、Ｆｃドメインは、四つのＦｃドメイン単量体の二量体から形成される。抗原結合ドメインは、例えばリンカー、スペーサー、ペプチド結合、化学結合または化学的部分で、Ｆｃドメインに結合され得る。
【０５４８】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、多くの方法で組み立てることができる。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、非対称に直列したＦｃドメインから組み立てることができる（図１〜６）。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単独分岐したＦｃドメインから組み立てることができ、この分岐点は、Ｎ末端Ｆｃドメインである（図７〜１２）。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単独分岐したＦｃドメインから組み立てることができ、この分岐点は、Ｃ末端Ｆｃドメインである（図１３〜１８）。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単独分岐したＦｃドメインから組み立てることができ、この分岐点は、Ｎ末端ＦｃドメインでもＣ末端Ｆｃドメインでもない（図１９〜２１）。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を、異なる抗原結合ドメイン配列を有する長鎖と短鎖を使用して組み立てて、二特異性構築体を形成させることができる（図２２〜２８）。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を、異なるヘテロ二量体形成変異のセット（図１９〜４２）と、異なる抗原結合ドメイン配列を有する鎖を使用して組み立てて、二特異性および三特異性の構築体を形成させることができる。二特異性Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、二つの異なる抗原結合ドメインを含む。三特異性Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、三つの異なる抗原結合ドメインを含む。
【０５４９】
抗原結合ドメインは、多くの方法でＦｃ抗原結合ドメイン構築体に結合され得る。抗原結合ドメインは、Ｆｃ鎖の融合タンパク質として発現されることができる。抗原の重鎖構成要素は、Ｆｃ鎖の融合タンパク質として発現されることができ、軽鎖構成要素は、別個のポリペプチドとして発現されることができる（図５０、パネルＡ）。一部の実施形態において、ｓｃＦｖは、抗原結合ドメインとして使用される。ｓｃＦｖは、Ｆｃ長鎖の融合タンパク質として発現されることができる（図５０、パネルＢ）。一部の実施形態において、長鎖構成要素と軽鎖構成要素は、別個に発現され、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に外因的に付加される。一部の実施形態において、抗原結合ドメインは別個に発現され、後に化学結合を用いてＦｃ抗原結合ドメイン構築体に結合される（図５０、パネルＣ）。
【０５５０】
一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の一つまたは複数のＦｃポリペプチドは、Ｃ末端リジン残基を欠く。一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中のすべてのＦｃポリペプチドは、Ｃ末端リジン残基を欠く。一部の実施形態において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の一つまたは複数のＦｃポリペプチドのＣ末端リジンの非存在は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば三つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）の群の均質性を向上させ得る。例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の均質性を有する三つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群。
【０５５１】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体中の第一、第二、第三、第四、第五、または第六のポリペプチド（例えば、図１のポリペプチド１０２、１１２および１１４、図２の２０２、２１４、２１６  および２１８、図３の３０２、３２０および３２２、図４の４０２、４２８、４３０および４３２、図５の５０２、５２４および５２６、図６の６０２、６３２、６３４および６３６、図７の７０２、７０８、７２２および７２４、図８の８０２、８０４、８２６および８２８、図９の９０２、９０４、９３４および９３６、図１０の１００２、１０１０、１０１２、１０２４、１０２６および１０３２、図１１の１１０２、１１０４、１１０６、１１４４、１１４６および１１４８、図１２の１２０２、１２０４、１２０６、１２５２、１２５４および１２５６、図１３の１３０２、１３０６、１３２０および１３２４、図１４の１４０２、１４０４、１４２６および１４２８、図１５の１５０２、１５０４、１５３４および１５３６、図１６の１６０２、１６０６、１６０８、１６２６、１６２８および１６３２、図１７の１７０２、１７０４、１７０６、１７４４、１７４６、および１７４８、図１８の１８０２、１８０４、１８０６、１８５２、１８５４、および１８５６、図１９の１９０２、１９０６、１９１０、１９２４、１９２８、および１９３２、図２０の２００２、２００４、２００６、２０４４、２０４６、および２０４８、図２１の２１０２、２１０４、２１０６、２１５２、２１５４、および２１５６、図２２の２２０２、２２２２、および２２２４、図２３の２３０２、２３３２、２３３４および２３３６、図２４の２４０２、２４０４、２４３４、および２４３６、図２５の２５０２、２５０４、２５３４、および２５３６、図２６の２６０２、２６０４、２６０６、２６５２、２６５４、および２６５６、図２７の２７０２、２７０４、２７０６、２７５２、２７５４、および２７５６、図２８の２８０２、２８０４、２８０６、２８５２、２８５４、および２８５６、図２９の２９０２、２９１６、および２９２０、図３０の３００２、３０２４  および３０２６、図３１の３１０２、３１２、および３１２６、図３２の３２０２、３２２４、３２２８、および３２３０、図３３の３３０２、３３３２、３３３４、および３３３６、図３４の３４０２、３４３２、３４３４、および３４３６、図３５の３５０２、３５０４、３５３４、および３５３６、図３６の３６０２、３６０４、３６１２、３６１８、３６４２、および３６４４、図３７の３７０２、３７０４、３７０６、３７５２、３７５４、および３７５６、図３８の３８０２、３８０４、３８３４、および３８３６、図３９の３９０２、３９０４、３９１０、３９１６、３９４２、および３９４４、図４０の４００２、４００４、４００６、４０５２、４０５４、および４０５６、図４１の４１０２、４１０４、４１１０、４１３２、４１４２、および４１４４、図４２の４２０２、４２０４、４２０６、４２５２、４２５４、および４２５６）のうちの一つまたは複数において、Ｎ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異され得る。
【０５５２】
本明細書の実施例に記載される例示的Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に関し、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１〜２８は、それぞれ、ノブおよびホールサブユニットにおいて、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｄの電荷対を含有し得る。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２９〜４２は、Ｅ３５７ＫとＫ３７０Ｄの対が含有され得る直交性の静電的ステアリング変異を使用することができ、追加のステアリング変異を含む場合もある。直交性のノブアンドホール（ｋｎｏｂｓ  ａｎｄ  ｈｏｌｅｓ）を有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体２９〜４２について、静電的ステアリング変異は、一つを除くすべての直交性の対に必要であり、すべての直交性の対に含まれ得る。
【０５５３】
一部の実施形態において、二つの直交性のノブアンドホールが必要とされる場合、ノブ１に対する静電的ステアリング変異はＥ３５７Ｋであってもよく、ホール１に対する静電的ステアリング変異はＫ３７０Ｄであってもよく、ノブ２に対する静電的ステアリング変異はＫ３７０Ｄであってもよく、ホール２に対する静電的ステアリング変異は、Ｅ３５７Ｋであってもよい。第三の直交性のノブアンドホールが必要な場合（例えば三特異性抗体）、静電的ステアリング変異のＥ３５７ＫとＤ３９９Ｋがノブ３に付加されて、静電的ステアリング変異のＫ３７０ＤとＫ４０９Ｄがホール３に付加されてもよく、または静電的ステアリング変異のＫ３７０ＤとＫ４０９Ｄがノブ３に付加されて、静電的ステアリング変異のＥ３５７ＫとＤ３９９Ｋがホール３に付加されてもよい。
【０５５４】
本明細書に記載される例示的Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体（例えばＦｃ抗原結合ドメイン構築体１〜４２）のいずれか一つは、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能を強化することができ、または単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含むことができる。
【０５５５】
ＩＸ．宿主細胞およびタンパク質の産生
本開示では、宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチドまたは構築体を、それらの対応する核酸から発現するのに必要であるような、例えばオルガネラである、必要な細胞成分を含む担体を指す。核酸は、この技術分野で公知の従来の技術（形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接の微量注入等）によって宿主細胞内に導入されることが可能である核酸ベクター中に含まれ得る。宿主細胞は、哺乳動物起源、細菌起源、真菌起源または昆虫起源のものとすることが可能である。哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ（またはＣＨＯ由来細胞株、例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１  ＣＨＯ−ＤＧ４４）、マウス宿主細胞（例えば、ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ＶＥＲＹ、ＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７Ｏ３ＯならびにＨｓＳ７８Ｂｓｔの細胞が含まれるが、これらに限定されない。また、タンパク質構築体の発現を調節する、または所望の特定の手法でタンパク質産物を修飾およびプロセシングする、宿主細胞を選択することが可能である。様々な宿主細胞が、タンパク質産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関する特性および特異的な機序を有する。適切な株化細胞または宿主系を選択して、発現されたタンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にすることが可能である。
【０５５６】
タンパク質産物の、それらの対応するＤＮＡプラスミド構築体からの発現および分泌のために、宿主細胞が、プロモータ、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位および選択可能な標識を含む、この技術分野で公知である適切な発現制御要素によって制御されるＤＮＡで、トランスフェクトまたは形質転換され得る。治療用タンパク質の発現方法は、この技術分野で公知である。例えば、Ｐａｕｌｉｎａ  Ｂａｌｂａｓ，Ａｒｇｅｌｉａ  Ｌｏｒｅｎｃｅ（ｅｄｓ．）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ  ｅｄ．２００４  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ  ２０，２００４）；Ｖｌａｄｉｍｉｒ  Ｖｏｙｎｏｖ  ａｎｄ  Ｊｕｓｔｉｎ  Ａ．Ｃａｒａｖｅｌｌａ（ｅｄｓ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ  ｅｄ．２０１２  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｎｅ  ２８，２０１２）を参照されたい。
【０５５７】
Ｘ．精製
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、タンパク質精製分野において公知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー（例えばプロテインＡアフィニティー）およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製に関するその他の標準技術によって、精製することが可能である。例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、プロテインＡカラム等のアフィニティーカラムを、適切に選択し、クロマトグラフィーカラム、ろ過、限外ろ過、塩析および透析手順と組み合わせることとによって、単離および精製することが可能である（例えば、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｕｗｅ  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ（ｅｄ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００９；ａｎｄ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ（ｅｄ．）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ−Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００４）を参照）。
【０５５８】
一部の例では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を、一つまたは複数の精製用ペプチドに連結して、例えば全細胞溶解混合物からの、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の精製および単離を促進することが可能である。一部の実施形態では、精製用ペプチドは、精製用ペプチドに対して特異的な親和性を有する別の部分と結合する。一部の実施形態では、精製用ペプチドと特異的に結合するこうした部分は、基剤、樹脂またはアガロースビーズ等の固相支持体に付加する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に結合され得る精製用ペプチドの例としては、ヘキサヒスチジンペプチド、ＦＬＡＧペプチド、ｍｙｃペプチドおよび赤血球凝集素（ＨＡ）ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ヘキサヒスチジンペプチド（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号３８））は、マイクロモル親和性をもつニッケル官能性アガロースアフィニティーカラムと結合する。一部の実施形態では、ＦＬＡＧペプチドは、配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３９）を含む。一部の実施形態では、ＦＬＡＧペプチドは、直列にした、整数倍の配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ、例えば３×ＤＹＫＤＤＤＤＫを含む。一部の実施形態では、ｍｙｃペプチドは、配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号４０）を含む。一部の実施形態では、ｍｙｃペプチドは、直列にした、整数倍の配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、例えば３×ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを含む。一部の実施形態では、ＨＡペプチドは、配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号４１）を含む。一部の実施形態では、ＨＡペプチドは、直列にした、整数倍の配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、例えば３×ＹＰＹＤＶＰＤＹＡを含む。ＦＬＡＧ、ｍｙｃまたはＨＡの精製用ペプチドに対して特異的に認識かつ結合する抗体は、この技術分野で周知であり、しばしば市販されている。これらの抗体により機能化された固相支持体（例えば、基剤、樹脂またはアガロースビーズ）を用いて、ＦＬＡＧ、ｍｙｃまたはＨＡ  ペプチドを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することができる。
【０５５９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に関し、精製方法としてプロテインＡカラムクロマトグラフィーを採用することができる。プロテインＡリガンドは、Ｆｃ領域を介してＦｃ抗原結合ドメイン構築体と相互作用する。このために、プロテインＡクロマトグラフィーは、大半の宿主細胞タンパク質を除去することができる高度に選択的な捕捉方法となる。本開示では、実施例２に記載するようにプロテインＡカラムクロマトグラフィーを用いて、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製してもよい。
【０５６０】
ＸＩ．医薬組成物／製剤
本開示は、本明細書に記載の一つまたは複数のＦｃ抗原結合ドメイン構築体を含む医薬組成物を特徴とする。一つの実施形態において、医薬組成物は、構造が同一または実質的に同一であるＦｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む。様々な例において、医薬組成物は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１〜４２のいずれか一つの実質的に均質な群を含む。
【０５６１】
例えば本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば、三つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）などの本開示の治療用タンパク質構築体を、医薬組成物内に組み込むことが可能である。治療用タンパク質を含む医薬組成物は、当業者に公知である方法によって調製することが可能である。医薬組成物は、水または他の薬剤的に許容できる液体の滅菌溶液または懸濁液を含む注射製剤で非経口投与することが可能である。例えば医薬組成物は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）、生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、サーファクタント、安定剤、希釈剤、結合剤、賦形剤等の薬剤的に許容できる担体または溶媒とＦｃ抗原結合ドメイン構築体とを好適に組み合わせて、次いで通常許容される薬学的実施で求められる単位用量形態で混合することによって、調製することが可能である。医薬製剤に含まれる活性成分の量は、指定される範囲内で好適な用量が与えられるようなものとする。
【０５６２】
注射用の滅菌組成物は、従来の薬学的実施に従って、担体として注射用蒸留水を用いて調製することが可能である。例えば、グルコースと、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウム等の他の添加とを含有する生理食塩水または等張液を、任意で、好適な可溶化剤、例えばこの技術分野で通常知られる、エタノール等のアルコールおよびプロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等のポリアルコール、およびポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０等の非イオン性界面活性剤と組み合わせて、注射用水溶液として用いることができる。治療用タンパク質産物の調製方法は、この技術分野で公知であり、例えば、Ｂａｎｇａ（ｅｄ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  （２ｎｄ  ｅｄ．）Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００６）を参照されたい。
【０５６３】
ＸＩＩ．用量
医薬組成物は、投与形態と互換性のある手法で、治療効果があるような量で投与されて、症状の改善または治療をもたらす。医薬組成物は、例えば静脈内投与形態、皮下投与形態、摂取可能な溶液、薬剤放出カプセル等の経口投与形態である、種々の投与形態で投与される。個々の対象に適切な用量は、治療目的、投与経路、および患者の状態に依存する。概して、組換えタンパク質は、１〜２００ｍｇ／ｋｇ、例えば１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば２０〜１００ｍｇ／ｋｇで投与される。したがって、最適な治療効果を得るために求められるとおりに、医療提供者が、用量を誂えて、決定し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を調整することが必要となる。
【０５６４】
ＸＩＩＩ．補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）
本開示に記載されるＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、様々なＦｃ受容体介在性エフェクター機能を活性化することができる。免疫系の構成要素の一つは、補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）システムである。これは自然免疫系の一部であり、抗体と貪食細胞の能力を強化し、外来性病原体を除去する。古典的補体経路、副補体経路、レクチン経路の三つの生化学的経路が、補体系を活性化する。それら経路すべてが、複雑な活性化とシグナル伝達カスケードのセットを伴っている。
【０５６５】
古典的補体経路では、ＩｇＧまたはＩｇＭが補体活性化のトリガーを引く。抗原に抗体が結合した後、それら抗体にＣ１ｑタンパク質が結合し、Ｃ１複合体を形成させる。この複合体がＣ１ｓエステラーゼを生成し、これがＣ４およびＣ２タンパク質を、Ｃ４ａとＣ４ｂ、およびＣ２ａとＣ２ｂに切断して、活性化する。次いで、Ｃ２ａ断片とＣ４ｂ断片が、Ｃ３転換酵素と呼ばれるタンパク質複合体を形成し、Ｃ３をＣ３ａとＣ３ｂに切断して、シグナルを増幅させ、細胞膜障害複合体を形成させる。
【０５６６】
本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、免疫系によるＣＤＣ活性を強化することができる。
【０５６７】
ＣＤＣは比色分析アッセイを使用して評価されてもよく、このアッセイでは、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ）が、連続希釈された抗体、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体、またはＩＶＩｇでコーティングされる。全てのウェルにヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ社）を２５％ｖ／ｖで添加し、３７℃で２時間インキュベートしてもよい。細胞を、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を添加した後で、３７℃で１２時間インキュベートしてもよい。次いでプレートを振とう機に２分間置き、４５０ｎｍの吸光度を測定してもよい。
【０５６８】
ＸＩＶ．抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）
本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、免疫系による抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）活性を強化することもできる。ＡＤＣＣは能動免疫系の一部であり、抗体は外来病原体の表面抗原に結合し、それらを死に至らしめる。ＡＤＣＣには、抗体によるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化が含まれる。ＮＫ細胞はＦｃ受容体を発現し、これが例えばＩｇＧおよびＩｇＭなどの抗体のＦｃ部分に結合する。抗体が病原体に感染した標的細胞の表面に結合すると、その後に引き続いてＮＫ細胞に結合し、活性化させる。ＮＫ細胞は、例えばＩＦＮ−γなどのサイトカイン、例えばパーフォリンおよびグランザイムなどのタンパク質を放出する。パーフォリンは、カルシウムの存在下で多量体化する孔形成サイトリシンである。グランザイムは、標的細胞中でプログラム化細胞死を誘導するセリンプロテアーゼである。ＮＫ細胞に加えて、マクロファージ、好中球、および好酸球もＡＤＣＣを介在することができる。
【０５６９】
ＡＤＣＣは、発光アッセイを使用して評価してもよい。ヒト初代ＮＫエフェクター細胞（Ｈｅｍａｃａｒｅ社）を解凍し、５ｘ１０５／ｍＬで、リンパ球増殖培地−３（Ｌｏｎｚａ社）中、３７℃で一晩、そのままの状態にしておく。次の日、ヒトリンパ芽球様細胞株のＲａｊｉ標的細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８６）を回収し、アッセイ培地（フェノールレッドフリーのＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳΔ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標））中に再懸濁し、様々な濃度の関心対象の各プローブの存在下で播種し、３７℃で３０分間置く。次いで休ませたＮＫ細胞を回収し、アッセイ培地中に再懸濁し、抗ＣＤ２０をコートしたＲａｊｉ細胞を含有するプレートに添加する。エフェクター細胞と標的細胞の最終比率を５：１（５ｘ１０４ＮＫ細胞：１ｘ１０４  Ｒａｊｉ細胞）として、３７℃で６時間、プレートをインキュベートする。
【０５７０】
ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）細胞障害アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、ＡＤＣＣ活性を決定する。ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）アッセイは、発光性ペプチド基質を使用して、膜の完全性が失われた細胞、例えば溶解したＲａｊｉ細胞によって放出される死細胞プロテアーゼ活性を測定する。６時間のインキュベーション期間後、調製された試薬（基質）をプレートの各ウェルに加え、室温で１５分間オービタルプレート振盪機上に置く。発光は、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  Ｆ５プレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ社）を使用して測定される。データは、対照条件（ＮＫ細胞＋Ｒａｊｉのみ）からの読み取り値を、試験条件からの読み取り値から差し引いて、バックグラウンドを除去した後に分析される。
【０５７１】
ＸＶ．抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）
本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、免疫系による抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性を強化することもできる。ＡＤＣＰは抗体オプソニン化としても知られており、このプロセスによって、病原体は、貪食細胞による摂食と除去の目印を付けられる。貪食細胞は、有害な外来病原体と、死んだ細胞または死にゆく細胞を摂食することによって身体を保護する細胞である。このプロセスは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）によって活性化され、ＮＦ−ｋＢの活性化へと繋がっていく。次いで例えばＣ３ｂと抗体などのオプソニンが標的病原体に付加され得る。標的がオプソニンでコーティングされると、Ｆｃドメインは、そのＦｃ受容体を介して貪食細胞を引き付ける。次いで貪食細胞がその細胞を包み込み、摂食された物質のファゴソームが、リソソームと融合する。次いで、結果として出来たファゴリソソームが、細胞物質をタンパク質分解的に消化する。
【０５７２】
ＡＤＣＰは、生物発光アッセイを使用して評価してもよい。抗体依存性細胞介在性貪食（ＡＤＣＰ）は、治療用抗体の重要な作用機序である。ＡＤＣＰは、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、およびＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）を介して、単球、マクロファージ、好中球および樹状細胞により介在されることができる。三つすべての受容体が、ＡＤＣＰを生じさせる抗体認識、免疫受容体のクラスタリングおよびシグナル伝達事象に関与し得る。しかし、阻害実験から、ＦｃγＲＩＩａがこのプロセスに関与する主要Ｆｃγ受容体であることが示唆されている。
【０５７３】
ＦｃγＲＩＩａ−Ｈ  ＡＤＣＰレポーターバイオアッセイは、生物発光細胞系アッセイであり、これを使用して、ＦｃγＲＩＩａに特異的に結合し活性化する抗体、ならびにＦｃドメインを有する他の生物物質の有効性と安定性を測定することができる。アッセイは、アミノ酸１３１位でヒスチジン（Ｈ）を含有する、高アフィニティーヒトＦｃγＲＩＩａ−Ｈバリアント、およびＮＦＡＴ−応答要素（ＮＦＡＴ−ＲＥ）により駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子改変Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株からなる。
【０５７４】
標的細胞と関連抗体を共培養したとき、ＦｃγＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞が抗体のＦｃドメインに結合し、ＦｃγＲＩＩａシグナル伝達とＮＦＡＴ−ＲＥ−介在性ルシフェラーゼ活性が生じる。生物発光シグナルを検出し、ルシフェラーゼアッセイおよび標準光度計を用いて定量する。
【実施例】
【０５７５】
以下の実施例は、本明細書において特許請求される方法および化合物をどのように実施するか、作製するか、評価するかについて、当分野の当業者に完全な開示と解説を提供する目的で提示されており、本発明者らが、その開示とみなす範囲を限定する意図はない。
【０５７６】
実施例１  抗ＣＤ２０抗原結合ドメインまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体７の設計および精製
タンパク質発現
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、フォールディング効率を上昇させ、望ましくない高分子量オリゴマーおよび多量体を生成し得るサブユニットの非制御的な会合を最小化させるよう設計され、実質的に均質な（例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％均質な）医薬用途用組成物が作製されるように設計される。これら目標を念頭に、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｎ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体７（ＣＤ２０）および構築体７（ＰＤ−Ｌ１）は各々、２種の別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（抗ＣＤ２０長鎖Ｆｃ（配列番号６２）または抗ＰＤ−Ｌ１長鎖Ｆｃ（配列番号５４）のいずれか２コピー、および短鎖Ｆｃ（配列番号６３）を２コピー）、および抗ＣＤ２０軽鎖ポリペプチド（配列番号６１）または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）のいずれか２コピーをそれぞれ含有する。長鎖Ｆｃは、Ｅ３５７Ｋ電荷変異、ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの突起形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体を、電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）Ｆｃドメイン単量体（ホモ二量体形成を促進する）とともに直列で連続して含有し、Ｎ末端の、抗ＣＤ２０ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体７（ＣＤ２０））、またはＮ末端の、抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体７（ＰＤ−Ｌ１））のいずれかを含有する。短鎖のＦｃ鎖は、Ｋ３７０Ｄ電荷変異、ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖの空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体を含有する。抗ＣＤ２０軽鎖または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖はまた、ｓｃＦｖの一部として長鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現されることもできる。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。表７のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド（一つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは長鎖Ｆｃ（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは短鎖Ｆｃをコードする）によりコードされた。
【０５７７】
（表７）構築体７（ＣＤ２０）および構築体７（ＰＤ−Ｌ１）の配列
2020514301.tif 000093
2020514301.tif 000094
【０５７８】
発現されたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用したプロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。捕捉されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、リン酸緩衝食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離させた。溶離液を、１ＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．４を添加することによって素早く中和して、０．２μｍフィルター通して滅菌ろ過した。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取した。カラムは、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６（緩衝液Ａ）で予め平衡化され、溶離緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６（緩衝液Ｂ）を使用した段階勾配でサンプルを溶離させた。イオン交換の後、標的の画分は、接線流ろ過システム上で、１０ｋＤａをカットオフするポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用して、ＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換された。サンプルをおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮して、０．２μｍフィルターを通して滅菌ろ過した。
【０５７９】
非還元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させた。サンプルを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行った。Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体７（ＣＤ２０）が純粋であることを示した（図４３、レーン４）。
【０５８０】
実施例２  抗ＣＤ２０抗原結合ドメインまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体１３の設計および精製
タンパク質発現
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｃ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１３（ＣＤ２０）および構築体１３（ＰＤ−Ｌ１）は各々、２種の別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（抗ＣＤ２０長鎖Ｆｃ（配列番号６４および６７〜６９のいずれか一つ）または抗ＰＤ−Ｌ１長鎖Ｆｃ（配列番号５８、５９、６０および６５のいずれか一つ）のいずれか２コピー、および短鎖Ｆｃ（配列番号６３）を２コピー）、および抗ＣＤ２０軽鎖ポリペプチド（配列番号６１）または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）のいずれか２コピーをそれぞれ含有する。長鎖Ｆｃは、電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）Ｆｃドメイン単量体（ホモ二量体形成を促進する）を、Ｅ３５７Ｋ電荷変異ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体とともに、直列に連続して含有し、Ｎ末端の、抗ＣＤ２０  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体１３（ＣＤ２０））、またはＮ末端の、抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体１３（ＰＤ−Ｌ１））のいずれかを含有する。短鎖のＦｃ鎖は、Ｋ３７０Ｄ電荷変異、ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖの空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体を含有する。抗ＣＤ２０軽鎖または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖も、ｓｃＦｖの一部として長鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現されることができる。四つの型の構築体１３が、抗ＣＤ２０重鎖、および抗ＰＤ−Ｌ１重鎖とともに作製された。各型は、長鎖Ｆｃポリペプチド中のＦｃドメイン単量体間に異なる大きさのグリシンスペーサー（Ｇ４、Ｇ１０、Ｇ１５またはＧ２０リンカー）を保有した。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。以下の構築体のそれぞれのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド（一つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは長鎖Ｆｃ（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは短鎖Ｆｃをコードする）によりコードされた。
【０５８１】
（表８）構築体１３（ＣＤ２０）および構築体１３（ＰＤ−Ｌ１）の配列
2020514301.tif 000095
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2020514301.tif 000101
【０５８２】
発現されたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用したプロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。捕捉されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、リン酸緩衝食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離させた。溶離液を、１ＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．４を添加することによって素早く中和して、０．２μｍフィルター通して滅菌ろ過した。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取した。カラムは、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６（緩衝液Ａ）で予め平衡化され、溶離緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６（緩衝液Ｂ）を使用した段階勾配でサンプルを溶離させた。イオン交換の後、標的の画分は、接線流ろ過システム上で、１０ｋＤａをカットオフするポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用して、ＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換された。サンプルをおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮して、０．２μｍフィルターを通して滅菌ろ過した。
【０５８３】
非還元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させた。サンプルを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行った。Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体１３（ＣＤ２０）が純粋であることを示した（図４３、レーン５）。
【０５８４】
実施例３  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１の設計および精製
非対称直列Ｆｃドメインから形成された非分岐構築体は以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１（図１）は、２種の別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃと、２コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、２個のＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを直列に連続して含有し、各Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）（ヘテロ二量体形成を促進する）導入することで作製される改変突起を有する。抗原結合ドメインは、長鎖Ｆｃと同じアミノ酸配列の一部として発現されてもよい（例えば、ｓｃＦｖを形成するため）。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、任意で表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）（ヘテロ二量体形成を促進する）を導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体を含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。本実施例において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２〜４２に関する以下の実施例のそれぞれにおいて、細胞は、抗体可変軽鎖を発現する第三のプラスミドを含有してもよい。
【０５８５】
発現されたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用したプロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製する。捕捉されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、リン酸緩衝食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離させる。溶離液を、１ＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．４を添加することによって素早く中和して、０．２μｍフィルター通して滅菌ろ過する。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取する。カラムは、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６（緩衝液Ａ）で予め平衡化され、溶離緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６（緩衝液Ｂ）を使用した段階勾配でサンプルを溶離させる。イオン交換の後、標的の画分は、接線流ろ過システム上で、１０ｋＤａをカットオフするポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用して、ＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換される。サンプルをおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮して、０．２μｍフィルターを通して滅菌ろ過する。
【０５８６】
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させる。サンプルを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかける。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクーマシーブルー染色で可視化する。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化する。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行う。
【０５８７】
実施例４  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２の設計および精製
非対称直列Ｆｃドメインから形成された非分岐構築体は以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２（図２）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃと、３コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、３個のＦｃドメイン単量体を、Ｎ末端の抗原結合ドメインとともに直列に連続して含有し、各Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体を含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０５８８】
実施例５  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３の設計および精製
非対称直列Ｆｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３（図３）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃと、２コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、２個のＦｃドメイン単量体を直列に連続して含有し、各Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０５８９】
実施例６  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４の設計および精製
非対称直列Ｆｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製された。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４（図４）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃと、３コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、３個のＦｃドメイン単量体を直列に連続して含有し、各Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製された。
【０５９０】
実施例７  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体５の設計および精製
非対称直列Ｆｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体５（図５）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃと、２コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、２個のＦｃドメイン単量体を、Ｎ末端の抗原結合ドメインとともに直列に連続して含有し、各Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０５９１】
実施例８  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体６の設計および精製
非対称直列Ｆｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体６（図６）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃと、３コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、３個のＦｃドメイン単量体を、Ｎ末端の抗原結合ドメインとともに直列に連続して含有し、各Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０５９２】
実施例９  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体７の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｎ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体７（図７）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有するＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体を含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製された。
【０５９３】
実施例１０  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体８の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｎ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体８（図８）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有するＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体とともに直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製された。
【０５９４】
実施例１１  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体９の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｎ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体９（図９）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有するＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製された。
【０５９５】
実施例１２  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１０の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｎ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１０（図１０）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、４コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、直列に連続した２個のＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有し、当該直列に連続したＦｃドメイン単量体の各々は、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有している。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体を含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製された。
【０５９６】
実施例１３  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１１の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｎ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１１（図１１）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、４コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、直列に連続した２個のＦｃドメイン単量体と、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＮ末端のＦｃドメイン単量体を、直列に連続して含有し、当該直列に連続したＦｃドメイン単量体の各々は、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有している。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０５９７】
実施例１４  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１２の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｎ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１２（図１２）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、４コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、直列に連続した２個のＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の抗原結合ドメインとともに直列に連続して含有し、当該直列に連続したＦｃドメイン単量体の各々は、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有している。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０５９８】
実施例１５  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１３の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｃ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１３（図１３）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体を、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体を含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製された。
【０５９９】
実施例１６  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１４の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｃ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１４（図１４）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体と、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有するＮ末端のＦｃドメイン単量体を、直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６００】
実施例１７  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１５の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｃ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１５（図１５）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体を、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６０１】
実施例１８  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１６の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｃ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１６（図１６）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、４コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体を、２個のＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有し、当該２個のＦｃドメイン単量体はそれぞれ、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体を含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製された。
【０６０２】
実施例１９  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１７の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｃ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１７（図１７）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、４コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体を、Ｎ末端の、２個のＦｃドメイン単量体とともに直列に連続して含有し、当該２個のＦｃドメイン単量体はそれぞれ、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６０３】
実施例２０  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１８の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｃ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１８（図１８）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、４コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体を、２個のＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有し、当該２個のＦｃドメイン単量体はそれぞれ、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６０４】
実施例２１  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１９の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｎ末端ＦｃドメインまたはＣ末端Ｆｃドメインのいずれにもない。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１９（図１９）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、４コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有するＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、および表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する別のＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体を含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされた。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製された。
【０６０５】
実施例２２  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２０の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｃ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２０（図２０）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、４コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有するＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、および表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する、Ｎ末端の、別のＦｃドメイン単量体とともに、直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６０６】
実施例２３  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２１の設計および精製
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｃ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２１（図２１）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、４コピーの短鎖Ｆｃ）と、軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有するＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する別のＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の抗原結合ドメインとを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６０７】
実施例２４  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２２の設計および精製
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２２（図２２）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃと、２コピーの短鎖Ｆｃ）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、２個のＦｃドメイン単量体を直列に連続して含有し、Ｎ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該２個のＦｃドメイン単量体はそれぞれ、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６０８】
実施例２５  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２３の設計および精製
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２３（図２３）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃと、３コピーの短鎖Ｆｃ）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、３個のＦｃドメイン単量体を直列に連続して含有し、Ｎ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該３個のＦｃドメイン単量体はそれぞれ、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６０９】
実施例２６  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２４の設計および精製
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２４（図２４）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２コピーの短鎖Ｆｃ）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体を、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６１０】
実施例２７  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２５の設計および精製
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２５（図２５）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２コピーの短鎖Ｆｃ）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有するＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６１１】
実施例２８  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２６の設計および精製
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２６（図２６）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、４コピーの短鎖Ｆｃ）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体を、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を各々が有する２個のＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６１２】
実施例２９  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２７の設計および精製
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２７（図２７）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、４コピーの短鎖Ｆｃ）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有するＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を有する別の突起含有Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６１３】
実施例３０  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２８の設計および精製
異なる抗原結合ドメインを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２８（図２８）は、２種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、４コピーの短鎖Ｆｃ）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表３から選択される突起形成変異を少なくとも１個（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数（例えばＥ３５７Ｋ）導入することで作製される改変突起を各々が有する２個のＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）を少なくとも１個、および任意で、表４から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を１個または複数、導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、二つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６１４】
実施例３１  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２９の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２９（図２９）は、３種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃと、２種の別個の短鎖Ｆｃ）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、２個のＦｃドメイン単量体を、Ｎ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに直列で連続して含有し、当該２個のＦｃドメイン単量体はそれぞれ、表３から選択される突起形成変異の異なるセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第一の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異の第一のセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第二の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体を含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６１５】
実施例３２  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３０の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３０（図３０）は、３種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃと、２種の別個の短鎖Ｆｃ）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、２個のＦｃドメイン単量体を、Ｎ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに直列で連続して含有し、当該２個のＦｃドメイン単量体はそれぞれ、表３から選択される突起形成変異の異なるセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第一の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異の第一のセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第二の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６１６】
実施例３３  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３１の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３１（図３１）は、３種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃと、２種の別個の短鎖Ｆｃ）と、３種もしくは２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、２個のＦｃドメイン単量体を、Ｎ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに直列で連続して含有し、当該２個のＦｃドメイン単量体はそれぞれ、表３から選択される突起形成変異の異なるセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第一の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異の第一のセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第二の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。アミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃに対するものである。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６１７】
実施例３４  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３２の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３２（図３２）は、３種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃと、２コピーの第一短鎖Ｆｃ、および１コピーの第二短鎖Ｆｃ）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、３個のＦｃドメイン単量体を、Ｎ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに直列で連続して含有し、当該３個のＦｃドメイン単量体はそれぞれ、表３から選択される突起形成変異のセット（ヘテロ二量体形成変異）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する（第三のＦｃドメイン単量体は、最初の二つとは異なるヘテロ二量体形成変異のセットを有する）。第一の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異の第一のセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第二の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体を含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６１８】
実施例３５  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３３の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３３（図３３）は、３種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃ、および２コピーの第一短鎖Ｆｃ、および１コピーの第二短鎖Ｆｃ）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、３個のＦｃドメイン単量体を、Ｎ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに直列で連続して含有し、当該３個のＦｃドメイン単量体はそれぞれ、表３から選択される突起形成変異のセット（ヘテロ二量体形成変異）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する（第三のＦｃドメイン単量体は、最初の二つとは異なるヘテロ二量体形成変異のセットを有する）。第一の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異の第一のセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第二の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６１９】
実施例３６  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３４の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３４（図３４）は、３種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃ、２コピーの第一短鎖Ｆｃ、および１コピーの第二短鎖Ｆｃ）と、３種もしくは２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、３個のＦｃドメイン単量体を、Ｎ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに直列で連続して含有し、当該３個のＦｃドメイン単量体はそれぞれ、表３から選択される突起形成変異のセット（ヘテロ二量体形成変異）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する（第三のＦｃドメイン単量体は、最初の二つとは異なるヘテロ二量体形成変異のセットを有する）。第一の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異の第一のセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第二の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６２０】
実施例３７  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３５の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３５（図３５）は、４種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２種の別個の長鎖Ｆｃ、および２種の別個の短鎖Ｆｃ）と、３種もしくは２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。第一の長鎖Ｆｃは、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体を、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第一のセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第二の長鎖Ｆｃは、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体を、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の、第一の長鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第一の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第一のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第二の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、四つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６２１】
実施例３８  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３６の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３６（図３６）は、３種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２種の別個の短鎖Ｆｃのそれぞれ２コピー）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第一のセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有するＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第二のセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する第二のＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第一の短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第一のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有するＦｃドメイン単量体を含有する。第二の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６２２】
実施例３９  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３７の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３７（図３７）は、３種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２種の別個の短鎖Ｆｃのそれぞれ２コピー）と、３種もしくは２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第一のセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有するＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第二のセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する第二のＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第一の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異の第一のセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第二の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６２３】
実施例４０  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３８の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３８（図３８）は、４種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２種の別個の長鎖Ｆｃ、および２種の別個の短鎖Ｆｃ）と、３種もしくは２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。第一の長鎖Ｆｃは、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第一のセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有するＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第二の長鎖Ｆｃは、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の、第一の長鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有するＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第一の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異の第一のセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第二の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、四つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６２４】
実施例４１  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３９の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３９（図３９）は、３種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２種の別個の短鎖Ｆｃのそれぞれ２コピー）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体を、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第一のセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有するＦｃドメイン単量体、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第二のセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する第二のＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第一の短鎖Ｆｃは、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第一のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有するＦｃドメイン単量体を含有する。第二の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６２５】
実施例４２  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４０の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４０（図４０）は、３種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２種の別個の短鎖Ｆｃのそれぞれ２コピー）と、３種もしくは２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体を、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第一のセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有するＦｃドメイン単量体、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第二のセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する第二のＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有する。第一の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異の第一のセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第二の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６２６】
実施例４３  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４１の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された二特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４１（図４１）は、３種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２種の別個の短鎖Ｆｃのそれぞれ２コピー）と、２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、２個のＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有し、当該２個のＦｃドメイン単量体はそれぞれ、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の異なるセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第一の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異の第一のセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第二の短鎖Ｆｃは、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６２７】
実施例４４  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４２の設計および精製
異なる抗原結合ドメインと、ヘテロ二量体形成変異の２個の異なるセットを有する長鎖Ｆｃと短鎖Ｆｃを使用して形成された三特異性構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４２（図４２）は、３種の別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃと、２種の別個の短鎖Ｆｃのそれぞれ２コピー）と、３種もしくは２種の別個の軽鎖ポリペプチドのいずれかまたは共通軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、２個のＦｃドメイン単量体を、表４または表５から選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、およびＮ末端の第一の特異性の抗原結合ドメインとともに、直列に連続して含有し、当該２個のＦｃドメイン単量体はそれぞれ、表３から選択される突起形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の異なるセット、および任意で、表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第一の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第二の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される空洞形成変異の第一のセット（ヘテロ二量体形成を促進する）、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。第二の短鎖Ｆｃは、Ｆｃドメイン単量体、およびＮ末端の第三の特異性の抗原結合ドメインを含有し、当該Ｆｃドメイン単量体は、第一の短鎖Ｆｃ中の変異の第一のセットとは異なる、表３から選択される空洞形成変異（ヘテロ二量体形成変異）の第二のセット、および任意で表４から選択される逆電荷変異を１個または複数、有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされる。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミドにコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０６２８】
実施例４５  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の発現
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、３個のＦｃドメインと、Ｎ末端のＣＴＬＡ４  Ｆａｂドメインを有して設計された。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。発現されたタンパク質は、実施例１にあるように精製された。タンパク質は、非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動された（図４４）。Ｓ３ＩおよびＳ３Ｙ  ＳＩＦ−体タンパク質は、各々が異なるプラスミドから発現された三つの異なるタンパク質を含むヘキサマーである。レーン上の数字は、発現用細胞にトランスフェクトされたプラスミドＤＮＡの比率を表す。２：１：１の比率は、０．５ｍｇのＳＩＦ−体長鎖プラスミド、０．２５ｍｇのＳＩＦ短鎖プラスミド、および０．２５ｍｇのＦａｂ軽鎖が、細胞１リットルへのトランスフェクトのために使用された混合液中に存在したことを示す。１：１：１の比率では、０．３３ｍｇの各プラスミドが使用された。４：１：１の比率では、０．６７ｍｇの長鎖、０．１６７ｍｇの短鎖、０．１６７ｍｇの軽鎖が使用された。
【０６２９】
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させた。サンプルを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。構築体は親抗体と類似した発現を示し、ＳＩＦ３と同じような技術を用いて最小不純物で精製された。
【０６３０】
実施例４６  標的、およびＦｃγ受容体へのＦｃ結合を測定するためのＳＰＲアッセイ
抗ＣＴＬＡ−４抗原結合ドメインを含有する２個の構築体を、構築体７および１３の設計に基づいて生成した。親ｍＡｂと、両Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の抗原結合ドメインが、イピリムマブ由来のＣＤＲを含有する。ＣＴＬＡ−４への標的結合を測定するために、ＳＰＲアッセイを実施した（図４５）。左のパネルにおいて、親ｍＡＢ、Ｆｃ３Ｙ−  Ｆｃ−抗原結合ドメイン構築体（イピリムマブ抗原結合ドメインを用いた構築物１３の改変型）、およびＦｃ３Ｉ−Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体（イピリムマブ抗原結合ドメインを用いた構築体７の改変型）の解離定数を測定した。Ｆｃ３Ｙ−Ｆｃは、親ｍＡｂと比較してＣＴＬＡ−４標的結合の強化を示した。一方で、Ｆｃ３Ｉ−Ｆｃは親ｍＡｂと類似したＣＴＬＡ−４標的結合を示した。右のパネルにおいて、異なるＦｃ抗原結合ドメイン構築体のＦｃγＲＩＩＩａ結合を測定するために使用された別のＳＰＲアッセイの結果を示す。三つのイピリムマブ型が試験され、脱フコシル化が結合を約１０倍強化することが判明した。ＳＩＦ３Ｉ、ＳＩＦ３Ｙ、およびイピリムマブＣＤＲを含有する、その対応する抗原結合ドメインを有する両構築体の四つのＦｃ抗原結合ドメイン構築体が試験された。四つの構築体すべてが、親ｍＡｂと比較して約３００〜８００倍強化されたＦｃγＲＩＩＩａ結合を示した。
【０６３１】
抗ＣＤ２０抗原結合ドメインを含有する２個の構築体を、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体７および１３の設計に基づいて生成した。親ｍＡｂと、両Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の抗原結合ドメインが、Ｇａｚｙｖａ（オビヌツズマブ）由来のＣＤＲを含有する。ＦｃγＩＩＩａおよびＦｃγＩＩａの両方に対する結合を測定するために、ＳＰＲアッセイを実施した（図４６）。左のパネルにおいて、ｍＡｂと比較して、脱フコシル化がＦｃγＩＩＩａに対する結合を約１０倍強化した一方で、すべてのＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＦｃγＩＩＩａに対し、１００倍超強化された結合を示した。右のパネルにおいて、ｍＡｂと比較して、脱フコシル化はＦｃγＩＩａに対する結合に対してほとんど効果が無かったが、すべてのＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＦｃγＩＩａに対し、１００倍超強化された結合を示した。
【０６３２】
実施例４７  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体によるＣＤＣ、ＡＤＣＰ、およびＡＤＣＣの活性化
親ｍＡｂおよび様々なＦｃ抗原結合ドメイン構築体による、ＣＤＣ、ＡＤＣＰおよびＡＤＣＣ経路の活性化を検証するために三つのアッセイを使用した。抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるＧａｚｙｖａ（オビヌツズマブ）由来のＣＤＲを含有する四つの構築体を作製した。フコシル化ｍＡｂおよび脱フコシル化ｍＡｂの両方を作製し、ならびにＳ３Ｙ（実施例２に記載されるように、構築体１３、図１３の構造）およびＳＡＩ（実施例１に記載されるように、構築体７、図７の構造）のＦｃ抗原結合ドメイン構築体が作製された。ＣＤＣアッセイを以下のとおり実施した：
１．抗ＣＤ２０  ＣＤＣアッセイにおいて使用された標的細胞は、Ｒａｊｉリンパ芽球様ヒトＢ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８６）である。Ｒａｊｉ細胞を遠心により懸濁培養液から取り出し、６ｘ１０５細胞／ｍｌでＸ−ＶＩＶＯ  １５培地中に再懸濁した。
２．Ｒａｊｉ細胞を、９６ウェルの平底アッセイプレートに、１ウェル当たり１００μｌ（６ｘ１０４細胞／ウェル）の量で移した。
３．抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびＳＩＦ体の各々を、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５培地中で３．３３μＭに希釈した。次いで、１．５ｍｌポリプロピレンチューブ中で、抗ＣＤ２０  ｍＡｂおよびＳＩＦ体の各々を用いて、連続１：３希釈を行い、１１点の希釈シリーズを得た。
４．抗ＣＤ２０  ｍＡｂおよびＳＩＦ体の各希釈を、アッセイプレート中の適切なウェルに、５０μｌ／ウェルで移した。
５．抗ＣＤ２０  ｍＡｂおよびＳＩＦ体を移した後ただちに、５０μｌの正常なヒト血清補体をアッセイプレート中の各ウェルに移した。
６．アッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。
７．２時間インキュベーションした後、２０μｌのＷＳＴ−１増殖試薬をアッセイプレートの各ウェルに添加した。
８．プレートを３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターへと１４時間戻した。
９．１４時間のインキュベーション後、プレートを、プレート振盪器上で１分間振盪し、分光光度計を使用して、６００ｎｍの補正を用いて、４５０ｎｍで直ちにウェルの吸光度を決定した。
【０６３３】
標的細胞がＲａｊｉ（図４７、左のパネル）であるＣＤＣアッセイにおいて、Ｓ３Ｙ（構築体１３（ＣＤ２０））構築体は、細胞障害を介在することができたが、他の構築体は介在しなかった。
【０６３４】
ＡＤＣＰアッセイを以下のとおり実施した：
ＦｃγＲＩＩａ−Ｈ  ＡＤＣＰレポーターバイオアッセイのＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社、カタログ番号Ｇ９９０１）は、生物発光細胞系アッセイであり、これを使用して、ＦｃγＲＩＩａに特異的に結合および活性化する抗体、ならびにＦｃドメインを有する他の生物物質の有効性と安定性を測定することができる。アッセイは、アミノ酸１３１位でヒスチジン（Ｈ）を含有する高アフィニティーヒトＦｃｇＲＩＩａ−Ｈバリアント、およびＮＦＡＴ−応答要素（ＮＦＡＴ−ＲＥ）により駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子改変Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株からなる。標的細胞と関連抗体を共培養したとき、ＦｃγＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞が抗体のＦｃドメインに結合し、ＦｃγＲＩＩａのシグナル伝達とＮＦＡＴ−ＲＥ−介在性のルシフェラーゼ活性が生じる。生体発光シグナル信号を検出し、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムおよび標準蛍光度計を使用して定量した。抗ＣＤ２０  ＡｂｓおよびＳＩＦ体（構築体７（ＣＤ２０）または構築体１３（ＣＤ２０））の濃度を上げてＲａｊｉ（ＣＤ２０＋）標的細胞およびＦｃと共にインキュベートした。抗ＣＤ２０  ＡｂｓおよびＳＩＦ体の濃度を上げて、図４７の中央のパネルで指定される濃度で、Ｒａｊｉ（ＣＤ２０＋）標的細胞およびＦｃγＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞とともにインキュベートした（２：１  Ｅ：Ｔ比。およそ３５，０００個のエフェクター細胞：１５，０００個の標的細胞）。６時間、３７℃でインキュベーションを進行させた。Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）。試薬を添加し、発光をＰＨＥＲＡｓｔａｒのＦＳ測定器で測定した。データは、図４７の中央のパネルにおいて指定された濃度のＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞（２：１  Ｅ：Ｔ比、およそ３５，０００個のエフェクター細胞：１５，０００個の標的細胞）、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して４ＰＬ曲線に適合させた。６時間、３７℃でインキュベーションを進行させた。Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）試薬を添加し、発光を、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳ測定器で測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、データを４ＰＬ曲線に適合させた（図４７、中央のパネル）。ＳＡＩ構築体（構築体７（ＣＤ２０））およびＳ３Ｙ構築体（構築体１３（ＣＤ２０））の両方が、ｍＡｂと比較して１００倍超の有効性の上昇を示した。
【０６３５】
ＡＤＣＣアッセイを以下のとおり実施した：
ヒト初代ＮＫエフェクター細胞（Ｈｅｍａｃａｒｅ社）を解凍し、５ｘ１０５／ｍＬで、リンパ球増殖培地−３（Ｌｏｎｚａ社）中、３７℃で一晩、そのままの状態にさせた。次の日、ヒトリンパ芽球様細胞株のＲａｊｉ標的細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８６）を回収し、アッセイ培地（フェノールレッドフリーのＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳΔ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標））中に再懸濁させ、様々な濃度の関心対象の各プローブの存在下で３０分間、３７℃で播種した。次いで休ませたＮＫ細胞を回収し、アッセイ培地中に再懸濁させ、抗ＣＤ２０をコートしたＲａｊｉ細胞を含有するプレートに添加した。エフェクター細胞と標的細胞の最終比率を５：１（５ｘ１０４ＮＫ細胞：１ｘ１０４  Ｒａｊｉ細胞）として、３７℃で６時間、プレートをインキュベートした。
【０６３６】
ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）細胞障害アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、ＡＤＣＣ活性を決定した。ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）アッセイは、発光性ペプチド基質を使用して、膜の完全性が失われた細胞、例えば溶解したＲａｊｉ細胞によって放出される死細胞プロテアーゼ活性を測定する。６時間のインキュベーション期間後、調製された試薬（基質）をプレートの各ウェルに加え、室温で１５分間オービタルプレート振盪機上に置いた。発光は、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  Ｆ５プレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ社）を使用して測定された。データは、対照条件（ＮＫ細胞＋Ｒａｊｉのみ）からの読み取り値を、試験条件からの読み取り値から差し引いて、バックグラウンドを除去した後に分析された。（図４７、右パネル）。ＳＡＩ構築体（構築体７（ＣＤ２０））およびＳ３Ｙ構築体（構築体１３（ＣＤ２０））の両方が、フコシル化ｍＡｂと比較して細胞障害の上昇を示し、脱フコシル化ｍＡｂと同様の細胞障害を示した。
【０６３７】
イピリムマブ抗体系の構築体を使用して、同様のアッセイセットを実施した。抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体であるイピリムマブ由来のＣＤＲを含有する四つの構築体を作製した。フコシル化ｍＡｂおよび脱フコシル化ｍＡｂの両方を作製し、ならびにＳ３Ｙ（構築体１３（ＣＴＬＡ−４））およびＳＡＩ（構築体７（ＣＴＬＡ−４））のＦｃ抗原結合ドメイン構築体が作製された。標的細胞がＣＴＬＡ−４トランスフェクトＨＥＫ細胞であるＣＤＣアッセイにおいて（図４８、左パネル）、ＳＡＩ構築体（構築体７（ＣＴＬＡ−４））およびＳ３Ｙ構築体（構築体１３（ＣＴＬＡ−４））は、２種のｍＡｂと比較して細胞障害の上昇を示した。ＡＤＣＰ活性化は、ＣＴＬＡ−４トランスフェクトＨＥＫ細胞を標的とするアッセイを用いて検証された（図４８、中央のパネル）。ＳＡＩ構築体（構築体７（ＣＴＬＡ−４））およびＳ３Ｙ構築体（構築体１３（ＣＴＬＡ−４））の両方が、２種のｍＡｂと比較して貪食の上昇を示した。ＣＴＬＡ−４トランスフェクトＨＥＫ標的細胞を使用してＡＤＣＣを評価した（図４８、右パネル）。ＳＡＩ構築体（構築体７（ＣＴＬＡ−４））およびＳ３Ｙ構築体（構築体１３（ＣＴＬＡ−４））の両方が、フコシル化ｍＡｂと比較して細胞障害の上昇を示し、脱フコシル化ｍＡｂと同様の細胞障害を示した。
【０６３８】
抗体系の構築体を使用して、同様のアッセイセットを実施した。抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体由来のＣＤＲを含有する四つの構築体を作製した。フコシル化ｍＡｂおよび脱フコシル化ｍＡｂの両方を作製し、ならびにＳ３Ｙ（構築体１３（ＰＤ−Ｌ１））およびＳＡＩ（構築体７（ＰＤ−Ｌ１））のＦｃ抗原結合ドメイン構築体が作製された。ＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＨＥＫ標的細胞を使用してＡＤＣＣを評価した（図４９、左パネル）。ＳＡＩ構築体（構築体７（ＰＤ−Ｌ１））およびＳ３Ｙ構築体（構築体１３（ＰＤ−Ｌ１））の両方が、フコシル化ｍＡｂおよび脱フコシル化ｍＡｂの両方と同様の細胞障害を示した。ＡＤＣＰ活性化は、ＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＨＥＫ細胞を標的とするアッセイを用いて検証された（図４９、中央のパネル）。ＳＡＩ構築体（構築体７（ＰＤ−Ｌ１））およびＳ３Ｙ構築体（構築体１３（ＰＤ−Ｌ１））の両方ともが貪食を活性化した一方で、ｍＡｂはいずれも活性化しなかった。ＰＤ−Ｌ１トランスフェクトＨＥＫ細胞を標的とするＣＤＣアッセイにおいて（図４９、右パネル）、Ｓ３Ｙ構築体（構築体１３（ＰＤ−Ｌ１））は、細胞障害を介在することができた一方で、他の構築体は介在しなかった。
【０６３９】
実施例４８  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴解析するために使用される実験的アッセイ
ペプチドおよびグリコペプチドの液体クロマトグラフィー−ＭＳ／ＭＳ
タンパク質は、６Ｍのグアニジン（Ｓｉｇｍａ社）中で１μｇ／μＬに希釈した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を濃度１０ｍＭまで加えて、６５℃で３０分間、変性条件下でジスルフィド結合を減らした。氷冷後、サンプルを、暗闇中で１時間、３０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）と共にインキュベートして、遊離チオールをアルキル化（カルバミドメチル化（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｅ））した。その後タンパク質を、１０ｋＤａ膜を介して２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．８）中に透析し、ＩＡＭ、ＤＴＴおよびグアニジンを除去した。タンパク質は、Ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒ（ＮＥＰ  ２３２０、Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中で、トリプシンで消化した。圧力は、３７℃で、２０，０００ｐｓｉと周囲圧力との間を１時間に合計３０サイクルで循環させた。ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００（Ｄｉｏｎｅｘ）クロマトグラフィーシステムとＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）質量分析計とで行った。ペプチドは、移動相として０．１％ＦＡ水溶液および０．１％ＦＡアセトニトリル溶液を用いて、ＢＥＨ  ＰｅｐＭａｐ（Ｗａｔｅｒｓ社）カラムで分離した。四重極型の分離幅（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｗｉｄｔｈ）±１．５Ｄａで、２価イオン（ｚ＝２）ｍ／ｚ  ８４２．５に基づいて、一つずつキシロシル化されたリンカーペプチドをターゲットとした。
【０６４０】
インタクト質量分析
タンパク質は、７８．９８％の水、２０％のアセトニトリル、１％のギ酸（ＦＡ）および０．０２％のトリフルオロ酢酸からなる移動緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）中で、２μｇ／μＬの濃度に希釈した。サイズ排除クロマトグラフィー分離は、合計カラム長７００ｍｍに直列にした二つのＺｅｎｉｘ−Ｃ  ＳＥＣ−３００（Ｓｅｐａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、デラウェア州ニューアーク）２．１×３５０ｍｍで行った。タンパク質は、８０μＬ／分の流量で、上記した移動緩衝液を用いてＳＥＣカラムから溶出した。質量スペクトルは、ポジティブモードで動作させたＱＳＴＡＲ  Ｅｌｉｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）Ｑ−ＴｏＦ質量分光計で取得した。それぞれのサイズのフラクション下の中性質量を、クロマトグラフィーピークの全幅にわたってスペクトルを合計することによって、ベイズのピークデコンボリューション（Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｐｅａｋ  ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を用いてデコンボリュートした。
【０６４１】
キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）アッセイ
サンプルを１ｍｇ／ｍＬに希釈して、ＨＴタンパク質発現変性緩衝液（ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）社）と混合した。混合物を４０℃で２０分間インキュベートした。サンプルを７０μＬの水で希釈して、９６ウェルプレートに移した。サンプルは、ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ（パーキンエルマー社）を備えたＣａｌｉｐｅｒ  ＧＸＩＩ機器（パーキンエルマー社）で分析した。蛍光強度を用いて、各サイズの変異体の相対存在度を計算した。
【０６４２】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させた。サンプルを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行った。
【０６４３】
相補依存細胞毒性（ＣＤＣ）
ＣＤＣは、連続希釈されたリツキシマブ、Ｆｃ構築体４またはＩＶＩｇでＲａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ）がコーティングされた、比色分析アッセイで評価した。全てのウェルにヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ社）を２５％ｖ／ｖで添加し、３７℃で２時間インキュベートした。細胞は、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を添加した後で、３７℃で１２時間インキュベートした。プレートを振とう機に２分間移し、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
【０６４４】
実施例４９  ノブイントゥホール（Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ）技術によるヘテロ二量体形成の最適化
３個のＦｃドメイン、および２個の「分岐」サブユニット内にノブイントゥホール変異を有するＦｃ構築体の長鎖ポリペプチドおよび短鎖ポリペプチドを発現するプラスミド（Ｆｃ構築体Ａ）、または３個のＦｃドメイン、ならびに２個の「分岐」サブユニット内にノブイントゥホール変異および静電的ステアリング変異を有するＦｃ構築体の長鎖ポリペプチドおよび短鎖ポリペプチドを発現するプラスミド（Ｆｃ構築体Ｂ）を、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。培養７日後に、遠心分離で細胞を除き、生培地上清を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した（図１０）。可視化させたタンパク質バンドの濃度測定分析で、３個のＦｃドメインを有するＦｃ構築体Ａと、３個のＦｃドメインを有するＦｃ構築体Ｂが、同レベルで発現されている（Ｆｃ３）ことが明らかになった。しかしながら、Ｆｃ構築体Ａの構築体は、混入状態の二量体（Ｆｃ２）種を有意に高いレベルで発現した（図５１）。両セットの構築体は、単量体の種（Ｆｃ１）を同様のレベルで発現した。画像中に存在するさらなるバンドは、偽トランスフェクト対照（ｍｏｃｋ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ）中に存在している培地成分を表す。
【０６４５】
これらの結果は、ヘテロ二量体形成を促進する静電的ステアリング変異と、「枝」サブユニット内のヘテロ二量体形成を促進するノブイントゥホール変異の両方を有することが、Ｆｃ構築体中のヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成を強化し、三つのＦｃドメインを有するＦｃ構築体の組み立てを最適化させて、Ｆｃ構築体を含有する組成物の均質性を向上させることを示唆する。
【０６４６】
実施例５０  ホモ二量体形成を制御するための静電的ステアリング
望ましくない高分子量オリゴマーおよび多量体を生成するサブユニットの見当違い（ｏｆｆ−ｒｅｇｉｓｔｅｒ）な会合を最小化するために、ヘテロ二量体形成に有利に働く変異（例えば、ノブアンドホール）を「枝」サブユニット内に導入した。これらのアミノ酸置換は、ノブのサブユニットとホールのカウンターパートの呼び合いを持続させ、それと同時にノブサブユニット間の会合を妨害する。ノブ変異は野生型のＦｃ配列との組立も抑制するため、「幹」Ｆｃサブユニットと、ノブおよびホールの「枝」サブユニットの親和性をさらに減少させるための追加的変異を含ませる必要性は疑問視される。この疑問に対処するため、カルボキシル末端「幹」サブユニット内に野生型Ｆｃドメイン単量体配列と、アミノ末端「枝」サブユニット内にノブ変異をもつＦｃドメイン単量体とを含有する、Ｆｃ構築体の長ポリペプチドを生成した。対応する短ポリペプチドは、ホール変異をもつＦｃドメイン単量体とした。このＦｃ構築体は、Ｆｃ構築体Ａ内のポリペプチド配列に基づいているが、長鎖ポリペプチドそれぞれのカルボキシ末端の「幹」サブユニット中には野生型のＦｃドメイン単量体配列がある。
【０６４７】
ＨＥＫ２９３細胞に、Ｆｃ構築体Ａ（長鎖ポリペプチドそれぞれのカルボキシル末端の「幹」サブユニット中のＦｃドメイン単量体に、ホモ二量体形成静電的ステアリング変異を有する）を発現するプラスミドを用いて、または長鎖ポリペプチドそれぞれのカルボキシ末端の「幹」サブユニット中のＦｃドメイン単量体が野生型Ｆｃドメイン単量体配列（配列番号４２）と置き換えられたＦｃ構築体Ａに基づいたＦｃ構築体を用いて、共トランスフェクトを行った。培養７日後に、遠心分離で細胞を除き、生培地上清を非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。染色タンパク質の画像化から、「幹」サブユニット中に静電的ステアリング変異を有さないＦｃ構築体（図５２において「静電的ステアリングなし」と印されたもの（レーン１〜３））は、Ｆｃ構築体Ａのカウンターパート（図５２において「静電的ステアリングあり」と印されたもの（レーン４および５））よりも、はるかに高レベルの単量体（Ｆｃ１）および二量体（Ｆｃ２）を含有したことが明らかになった。さらに、三量体よりも大きい分子量のバンドが、はるかに数多く検出され得た（図５２のレーン１〜３）。
【０６４８】
これらの結果から、「幹」サブユニット中に二量体形成を促進する静電的ステアリング変異を有することで、Ｆｃ構築体中のホモ二量体Ｆｃドメインの形成がさらに増強され、三つのＦｃドメインを有するＦｃ構築体のアセンブリが最適化され、Ｆｃ構築体を含有する組成物の均質性が向上することが確認される。
【０６４９】
実施例５１  抗ＣＤ２０抗原結合ドメインまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体４の設計および精製
タンパク質発現
非対称直列Ｆｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製された。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４（ＣＤ２０）および構築体４（ＰＤ−Ｌ１）は各々、２種の別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃ（配列番号６６）、および抗ＣＤ２０短鎖Ｆｃ（配列番号６７）または抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ鎖（配列番号６８）のいずれか３コピー）、および抗ＣＤ２０軽鎖ポリペプチド（配列番号６１）または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）のいずれか３コピーをそれぞれ含有する。長鎖Ｆｃは、３個のＦｃドメイン単量体を直列に連続して含有し、ここで各Ｆｃドメイン単量体は、Ｅ３５７Ｋ電荷変異、ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有する。短鎖Ｆｃは、Ｋ３７０Ｄ電荷変異ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体、ならびにＮ末端の、抗ＣＤ２０  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体４（ＣＤ２０））、またはＮ末端の、抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体４（ＰＤ−Ｌ１））のいずれかを含有する。抗ＣＤ２０軽鎖または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖も、ｓｃＦｖの一部として短鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現されることができる。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。表９の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド（一つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは長鎖Ｆｃをコードし、一つのプラスミドは短鎖Ｆｃ（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードする）によりコードされた。
【０６５０】
（表９）構築体４（ＣＤ２０）および構築体４（ＰＤ−Ｌ１）の配列
2020514301.tif 000102
2020514301.tif 000103
【０６５１】
発現されたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用したプロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。捕捉されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、リン酸緩衝食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離させた。溶離液を、１ＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．４を添加することによって素早く中和して、０．２μｍフィルター通して滅菌ろ過した。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取した。カラムは、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６（緩衝液Ａ）で予め平衡化され、溶離緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６（緩衝液Ｂ）を使用した段階勾配でサンプルを溶離させた。イオン交換の後、標的の画分は、接線流ろ過システム上で、１０ｋＤａをカットオフするポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用して、ＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換された。サンプルをおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮して、０．２μｍフィルターを通して滅菌ろ過した。
【０６５２】
非還元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させた。サンプルを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行った。
【０６５３】
実施例５２  抗ＣＤ２０抗原結合ドメインまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体８の設計および精製
タンパク質発現
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｎ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体８（ＣＤ２０）および構築体８（ＰＤ−Ｌ１）は各々、２種の別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（２コピーの長鎖Ｆｃ（配列番号６９）、および抗ＣＤ２０短鎖Ｆｃ（配列番号６７）または抗ＰＤ−Ｌ１  短鎖Ｆｃ（配列番号６８）のいずれか２コピー）、および抗ＣＤ２０軽鎖ポリペプチド（配列番号６１）または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）のいずれかコピーをそれぞれ含有する。長鎖Ｆｃは、Ｅ３５７Ｋ電荷変異、ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの突起形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体を、逆電荷変異Ｋ４０９ＤおよびＤ３９９Ｋ（ホモ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体とともに直列に連続して含有する。短鎖Ｆｃは、Ｋ３７０Ｄ電荷変異ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体、ならびにＮ末端の抗ＣＤ２０  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体８（ＣＤ２０））、またはＮ末端の抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体８（ＰＤ−Ｌ１））のいずれかを含有する。抗ＣＤ２０軽鎖または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖も、ｓｃＦｖの一部として短鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現されることができる。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。表１０の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド（一つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは長鎖Ｆｃをコードし、一つのプラスミドは短鎖Ｆｃ（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードする）によりコードされた。
【０６５４】
（表１０）構築体８（ＣＤ２０）および構築体８（ＰＤ−Ｌ１）の配列
2020514301.tif 000104
2020514301.tif 000105
【０６５５】
発現されたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用したプロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。捕捉されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、リン酸緩衝食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離させた。溶離液を、１ＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．４を添加することによって素早く中和して、０．２μｍフィルター通して滅菌ろ過した。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取した。カラムは、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６（緩衝液Ａ）で予め平衡化され、溶離緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６（緩衝液Ｂ）を使用した段階勾配でサンプルを溶離させた。イオン交換の後、標的の画分は、接線流ろ過システム上で、１０ｋＤａをカットオフするポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用して、ＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換された。サンプルをおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮して、０．２μｍフィルターを通して滅菌ろ過した。
【０６５６】
非還元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させた。サンプルを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行った。
【０６５７】
実施例５３  抗ＣＤ２０抗原結合ドメインまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体９の設計および精製
タンパク質発現
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｎ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体９（ＣＤ２０）および構築体９（ＰＤ−Ｌ１）は各々、２種の別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（抗ＣＤ２０長鎖Ｆｃ（配列番号６２）または抗ＰＤ−Ｌ１長鎖Ｆｃ（配列番号５４）のいずれか２コピー、および抗ＣＤ２０短鎖Ｆｃ（配列番号６７）または抗ＰＤ−Ｌ１  短鎖Ｆｃ（配列番号６８）のいずれか２コピー）、および抗ＣＤ２０軽鎖ポリペプチド（配列番号６１）または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）のいずれかコピーをそれぞれ含有する。長鎖Ｆｃは、Ｅ３５７Ｋ電荷変異、ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの突起形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体を、逆電荷変異のＫ４０９ＤおよびＤ３９９Ｋ（ホモ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体とともに直列で連続して含有し、Ｎ末端の抗ＣＤ２０ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体９（ＣＤ２０））、またはＮ末端の抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体９（ＰＤ−Ｌ１））のいずれかを含有する。短鎖Ｆｃは、Ｋ３７０Ｄの電荷変異ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖの空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体、ならびにＮ末端の抗ＣＤ２０重鎖（構築体９（ＣＤ２０））またはＮ末端の抗ＰＤ−Ｌ１重鎖（構築体９（ＰＤ−Ｌ１））を含有する。抗ＣＤ２０軽鎖または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖も、ｓｃＦｖの一部として長鎖Ｆｃおよび／または短鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現されることができる。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。表１１の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド（一つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは長鎖Ｆｃ（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは短鎖Ｆｃ（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードする）によりコードされた。
【０６５８】
（表１１）構築体９（ＣＤ２０）および構築体９（ＰＤ−Ｌ１）の配列
2020514301.tif 000106
2020514301.tif 000107
2020514301.tif 000108
【０６５９】
発現されたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用したプロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。捕捉されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、リン酸緩衝食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離させた。溶離液を、１ＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．４を添加することによって素早く中和して、０．２μｍフィルター通して滅菌ろ過した。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取した。カラムは、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６（緩衝液Ａ）で予め平衡化され、溶離緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６（緩衝液Ｂ）を使用した段階勾配でサンプルを溶離させた。イオン交換の後、標的の画分は、接線流ろ過システム上で、１０ｋＤａをカットオフするポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用して、ＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換された。サンプルをおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮して、０．２μｍフィルターを通して滅菌ろ過した。
【０６６０】
非還元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させた。サンプルを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行った。
【０６６１】
実施例５４  抗ＣＤ２０抗原結合ドメインまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体１０の設計および精製
タンパク質発現
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｎ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１０（ＣＤ２０）および構築体１０（ＰＤ−Ｌ１）は各々、２種の別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（抗ＣＤ２０長鎖Ｆｃ（配列番号７０）または抗ＰＤ−Ｌ１長鎖Ｆｃ（配列番号７１）のいずれか２コピー、および４コピーの短鎖Ｆｃ（配列番号６３）、および抗ＣＤ２０軽鎖ポリペプチド（配列番号６１）または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）のいずれかコピーをそれぞれ含有する。長鎖Ｆｃは２個のＦｃドメイン単量体を直列に連続して含有し、ここで各Ｆｃドメイン単量体は、Ｅ３５７Ｋ電荷変異、ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの突起形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有し、逆電荷変異のＫ４０９ＤおよびＤ３９９Ｋ（ホモ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体とともに直列で連続して含有し、Ｎ末端の抗ＣＤ２０ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体１０（ＣＤ２０））、またはＮ末端の抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体１０（ＰＤ−Ｌ１））のいずれかを含有する。短鎖のＦｃ鎖は、Ｋ３７０Ｄ電荷変異、ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖの空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体を含有する。抗ＣＤ２０軽鎖または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖も、ｓｃＦｖの一部として長鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現されることができる。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。表１２の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド（一つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは長鎖Ｆｃ（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは短鎖Ｆｃをコードする）によりコードされた。
【０６６２】
（表１２）構築体１０（ＣＤ２０）および構築体１０（ＰＤ−Ｌ１）の配列
2020514301.tif 000109
2020514301.tif 000110
2020514301.tif 000111
2020514301.tif 000112
【０６６３】
発現されたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用したプロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。捕捉されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、リン酸緩衝食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離させた。溶離液を、１ＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．４を添加することによって素早く中和して、０．２μｍフィルター通して滅菌ろ過した。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取した。カラムは、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６（緩衝液Ａ）で予め平衡化され、溶離緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６（緩衝液Ｂ）を使用した段階勾配でサンプルを溶離させた。イオン交換の後、標的の画分は、接線流ろ過システム上で、１０ｋＤａをカットオフするポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用して、ＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換された。サンプルをおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮して、０．２μｍフィルターを通して滅菌ろ過した。
【０６６４】
非還元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させた。サンプルを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行った。
【０６６５】
実施例５５  抗ＣＤ２０抗原結合ドメインまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体１６の設計および精製
タンパク質発現
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｃ末端Ｆｃドメインにある。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１６（ＣＤ２０）および構築体４（ＰＤ−Ｌ１）は各々、２種の別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（抗ＣＤ２０長鎖Ｆｃ（配列番号７２）または抗ＰＤ−Ｌ１長鎖Ｆｃ（配列番号７３）のいずれか２コピー、および４コピーの短鎖Ｆｃ（配列番号６３）、および抗ＣＤ２０軽鎖ポリペプチド（配列番号６１）または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）のいずれか３コピーをそれぞれ含有する。長鎖Ｆｃは、逆電荷変異のＫ４０９ＤおよびＤ３９９Ｋ変異（ホモ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体を、２個のＦｃドメイン単量体とともに直列に連続して含有し、その各単量体は、Ｅ３５７Ｋ電荷変異ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの突起形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有し、Ｎ末端の抗ＣＤ２０  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体１０（ＣＤ２０））、またはＮ末端の抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体１０（ＰＤ−Ｌ１））のいずれかを含有する。短鎖のＦｃ鎖は、Ｋ３７０Ｄ電荷変異、ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖの空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体を含有する。抗ＣＤ２０軽鎖または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖も、ｓｃＦｖの一部として長鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現されることができる。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。表１３の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド（一つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは長鎖Ｆｃ（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは短鎖Ｆｃをコードする）によりコードされた。
【０６６６】
（表１３）構築体１６（ＣＤ２０）および構築体１６（ＰＤ−Ｌ１）の配列
2020514301.tif 000113
2020514301.tif 000114
2020514301.tif 000115
【０６６７】
発現されたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用したプロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。捕捉されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、リン酸緩衝食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離させた。溶離液を、１ＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．４を添加することによって素早く中和して、０．２μｍフィルター通して滅菌ろ過した。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取した。カラムは、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６（緩衝液Ａ）で予め平衡化され、溶離緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６（緩衝液Ｂ）を使用した段階勾配でサンプルを溶離させた。イオン交換の後、標的の画分は、接線流ろ過システム上で、１０ｋＤａをカットオフするポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用して、ＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換された。サンプルをおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮して、０．２μｍフィルターを通して滅菌ろ過した。
【０６６８】
非還元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させた。サンプルを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行った。
【０６６９】
実施例５６  抗ＣＤ２０抗原結合ドメインまたは抗ＰＤ−Ｌ１抗原結合ドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体１９の設計および精製
タンパク質発現
単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は以下に記載されるように作製され、その分岐点は、Ｎ末端ＦｃドメインまたはＣ末端Ｆｃドメインのいずれにもない。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１９（ＣＤ２０）および構築体１９（ＰＤ−Ｌ１）は各々、２種の別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（抗ＣＤ２０長鎖Ｆｃ（配列番号７４）または抗ＰＤ−Ｌ１長鎖Ｆｃ（配列番号７５）のいずれか２コピー、および４コピーの短鎖Ｆｃ（配列番号６３）、および抗ＣＤ２０軽鎖ポリペプチド（配列番号６１）または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）のいずれかコピーをそれぞれ含有する。長鎖Ｆｃは、Ｅ３５７Ｋの電荷変異、ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの突起形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体を、逆電荷変異のＫ４０９ＤおよびＤ３９９Ｋ（ホモ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体とともに直列で連続して含有し、Ｅ３５７Ｋの電荷変異ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗの突起形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体とともに直列に連続して含有し、Ｎ末端の抗ＣＤ２０ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体１９（ＣＤ２０））、またはＮ末端の抗ＰＤ−Ｌ１  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（Ｋａｂａｔの１〜２２０位）（構築体１９（ＰＤ−Ｌ１））のいずれかを含有する。短鎖のＦｃ鎖は、Ｋ３７０Ｄ電荷変異、ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖの空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進する）を有するＦｃドメイン単量体を含有する。抗ＣＤ２０軽鎖または抗ＰＤ−Ｌ１軽鎖はまた、ｓｃＦｖの一部として長鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現されることもできる。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。表１４の各構築体に対する以下のアミノ酸配列は、三つの別個のプラスミド（一つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは長鎖Ｆｃ（抗ＣＤ２０または抗ＰＤ−Ｌ１）をコードし、一つのプラスミドは短鎖Ｆｃをコードする）によりコードされた。
【０６７０】
（表１４）構築体１９（ＣＤ２０）および構築体１９（ＰＤ−Ｌ１）の配列
2020514301.tif 000116
2020514301.tif 000117
2020514301.tif 000118
【０６７１】
発現されたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用したプロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。捕捉されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、リン酸緩衝食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離させた。溶離液を、１ＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．４を添加することによって素早く中和して、０．２μｍフィルター通して滅菌ろ過した。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取した。カラムは、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６（緩衝液Ａ）で予め平衡化され、溶離緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６（緩衝液Ｂ）を使用した段階勾配でサンプルを溶離させた。イオン交換の後、標的の画分は、接線流ろ過システム上で、１０ｋＤａをカットオフするポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用して、ＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換された。サンプルをおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮して、０．２μｍフィルターを通して滅菌ろ過した。
【０６７２】
非還元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
サンプルを、Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）中で、９５℃で１０分間、変性させた。サンプルを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）で電気泳動にかけた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクーマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行った。
【０６７３】
実施例５７  抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体による補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性化
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるオビヌツズマブと比較して、抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体が、ＣＤＣ活性を強化する度合いを検証するためのＣＤＣアッセイを開発した。ＧａｚｙｖａのＣＤＲを有する抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体４、７、８、９、１０、１３および１９は、実施例１、２および５１〜５６に記載されるように作製した。四つの型の構築体１３（ＣＤ２０）を作製した。それらは長鎖の長鎖Ｆｃ単量体の間のグリシンスペーサーのサイズのみが異なっている（Ｇ４、Ｇ１０、Ｇ１５およびＧ２０リンカー）。それぞれの抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体、およびオビヌツズマブモノクローナル抗体は、以下のように実施されるＣＤＣ  アッセイにおいて検証された：
１０％の熱非働化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させたＤａｕｄｉ細胞を沈殿させ、氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、１ｍＬ当たり１．０ｘ１０６個の生細胞の濃度で、０．１％ＢＳＡ含有ＲＰＭＩ−１６４０中に再懸濁させた。この細胞懸濁液５０マイクロリットルを、９６ウェルプレートのすべてのウェル（プレートの端を除く）に加えた。プレートは、すべての添加が済むまで氷上に保持された。被験物質を、ＲＰＭＩ−１６４０＋ＢＳＡ中で、４５０ｎＭの開始濃度から４倍連続希釈した。各被験物質に対し、総数で１０段階の濃度を検証した。播種されたＤａｕｄｉ細胞に対し、それぞれ５０マイクロリットルを加えた。正常またはＣ１ｑ枯渇ヒト補体血清（Ｑｕｉｄｅｌ社、カリフォルニア州サンディエゴ）を、ＲＰＭＩ−１６４０＋ＢＳＡ中、１：５に希釈した。播種されたＤａｕｄｉ細胞に対し、それぞれ５０マイクロリットルを加えた。６個の正常血清対照ウェルには、細胞、培地のみ（処置無し）、および１／５正常血清（正常バックグラウンド）を入れた。これらウェルのうち３個には、１６．５μＬのＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００（Ｐｒｏｍｅｇａ社、ウィスコンシン州マディソン）（正常溶解対照）も入れた。Ｃ１ｑ枯渇バックグラウンドおよび溶解対照も同様に調製した。ＰＢＳをすべてのプレート端のウェルに入れた。２時間、３７℃でプレートをインキュベートした。２時間後、予め温めたＡｌａｍａｒブルー（Ｔｈｅｒｍｏ社、マサチューセッツ州ウォルサム）５０μＬを全ウェルに加えた（プレート端を除く）。プレートをインキュベーターに一晩戻した（１８時間、３７℃）。１８時間後、蛍光を、ＦｌｅｘＳｔａｔｉｏｎ３で測定した。プレートは、５４４／５９０  Ｅｘ／Ｅｍフィルターおよび自動カットオフを使用して最高点を読み取った。正常なバックグラウンド、正常な溶解対照、Ｃ１ｑ枯渇バックグラウンド、およびＣ１ｑ枯渇溶解対照のウェルに対し、平均値が算出された。細胞溶解の百分率を以下のように計算した：
細胞溶解％＝（ＲＦＵ試験−ＲＦＵバックグラウンド）／（ＲＦＵ溶解対照−ＲＦＵバックグラウンド）×１００
各構築体に対して、ＥＣ５０（ｎＭ）が決定された。
【０６７４】
表１５に示されるように、抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体は、Ｄａｕｄｉ細胞においてＣＤＣを誘導し、ＥＣ５０値が低いことから証されるように、オビヌツズマブモノクローナル抗体と比較して細胞障害を強化する能力が高いことが示された。図５４は、抗ＣＤ２０構築体７および抗ＣＤ２０構築体１３の結果を示しており、各Ｆｃ構築体が、フコシル化抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１抗体およびＧａｚｙｖａ対照の両方と比較して、より低濃度でより高い細胞溶解を誘導することを示している。
【０６７５】
（表１５）Ｄａｕｄｉ細胞における、ＣＤＣを誘導する抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体の能力
2020514301.tif 000119
2020514301.tif 000120
2020514301.tif 000121
1別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
２構築体は自然発生的なＥ３８８Ｄ変異を含有した。
【０６７６】
実施例５８  抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体による補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）活性化
抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体であるアベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）（バベンチオ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ））と比較して、抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体が、ＣＤＣ活性を強化する度合いを検証するためのＣＤＣアッセイを開発した。アベルマブのＣＤＲを有する抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体７、８、１０、１３および１９は、実施例１、２および５１〜５６に記載されるように作製した。四つの型の構築体１３（ＰＤ−Ｌ１）を作製した。それらは長鎖の長鎖Ｆｃ単量体の間のグリシンスペーサーのサイズのみが異なっている（Ｇ４、Ｇ１０、Ｇ１５およびＧ２０リンカー）。それぞれの抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体、およびアベルマブモノクローナル抗体は、以下のように実施されるＣＤＣ  アッセイにおいて検証された：
ヒトＰＤ−Ｌ１遺伝子を安定的に発現するようトランスフェクトされたヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞株（ＣｒｏｗｎＢｉｏ社）を、ＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ、および選択マーカーとして２μｇ／ｍＬのピューロマイシン）において培養した。細胞を回収し、ゲネテシン（ｇｅｎｅｔｅｃｉｎ）またはフェノールレッドを含まないＸ−Ｖｉｖｏ−１５培地（Ｌｏｎｚａ社）において希釈した。６ｘ１０５細胞／ｍＬのＨＥＫ−ＰＤ−Ｌ１細胞１００μｌを、９６ウェルの組織培養処理平底プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ社）に播種した。Ｆｃ構築体および抗体に、Ｘ−ＶＩＶＯ−１５培地中で１：３の連続希釈を行った。希釈された構築体５０μＬを、ウェルへ、標的細胞の上部に添加した。５０μｌの非希釈のヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、各ウェルに添加した。次いで、アッセイプレートを３７℃で２時間インキュベートした。２時間インキュベートした後、２０μＬのＷＳＴ−１細胞増殖試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ）を各ウェルに加え、３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、アッセイプレートをプレート振とう器上に２〜５分間置いた。吸光度は、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｍ２）上、６００ｎｍで補正を行い、４５０ｎｍで測定した。各構築体に対して、ＥＣ５０（ｎＭ）が決定された。
【０６７７】
表１６に示されるように、抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体の一部が、ヒトＰＤ−Ｌ１を発現するＨＥＫ細胞においてＣＤＣを誘導した。
【０６７８】
（表１６）ＰＤ−Ｌ１発現ＨＥＫ細胞においてＣＤＣを誘導する抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体の能力
2020514301.tif 000122
2020514301.tif 000123
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
２構築体は自然発生的なＥ３８８Ｄ変異を含有した。
３構築体は、アッセイ条件下で測定可能なＣＤＣを発生させなかった。
【０６７９】
実施例５９  抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体による抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性化
ＡＤＣＰレポーターアッセイ
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）と比較して、抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体が、ＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を活性化し、それによりＡＤＣＰ活性を強化する度合いを検証するためのＡＤＣＰレポーターアッセイを開発した。ＧａｚｙｖａのＣＤＲを有する抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体４、７、８、９、１０、１３および１９は、実施例１、２および５１〜５６に記載されるように作製した。四つの型の構築体１３（ＣＤ２０）を検証した。それら構築体は、長鎖Ｆｃ単量体の間のグリシンスペーサーのサイズが異なっている（Ｇ４、Ｇ１０、Ｇ１５およびＧ２０リンカー）。各抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたオビヌツズマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたＡＤＣＣレポーターアッセイにおいて検証した：
Ｒａｊｉ標的細胞（１．５ｘ１０４細胞／ウェル）およびＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（３．５ｘ１０４細胞／ウェル）を、４％低ＩｇＧ血清（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁し、連続希釈した抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体を含む９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ２中、３７℃、６時間のインキュベーションを行った後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳ照度計（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して発光を測定した。
【０６８０】
表１７に示されるように、抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体は、ＡＤＣＰレポーターアッセイにおいてＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を誘導し、低いＥＣ５０値によって明らかであるように、オビヌツズマブモノクローナル抗体と比較し、ＡＤＣＰ活性の増強において高い能力を示した。図５５は、抗ＣＤ２０構築体７および抗ＣＤ２０構築体１３の結果を示しており、各Ｆｃ構築体が、フコシル化および脱フコシル化の両方の抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１抗体対照と比較して、より低濃度でより高いＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を誘導することを示している。
【０６８１】
（表１７）ＡＤＣＰレポーターアッセイにおける、抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体のＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を誘導する能力
2020514301.tif 000124
2020514301.tif 000125
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
２構築体は自然発生的なＥ３８８Ｄ変異を含有した。
【０６８２】
ＡＤＣＰ二次アッセイ
抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体７、８、９、１３（Ｇ２０リンカー）および１９を、追加のＡＤＣＰアッセイにおいて検証し、ＡＤＣＰレポーターアッセイの結果を確認した。各抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたオビヌツズマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたＡＤＣＣアッセイにおいて検証した：
単球を凍結ＰＢＭＣから精製し、Ｍ−ＣＳＦの存在下、バッグ中で培養した。ＩＬ−１０を培養バッグに添加し、２日後に分化したＭ２ｃマクロファージをＡＤＣＰアッセイにおいて使用した。単球／マクロファージの合計培養時間は８日であった。抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体を１０倍連続希釈して、ＫＩＬＲ  Ｒａｊｉ細胞とともに３０分間インキュベートした。マクロファージを、Ｈｙｃｌｏｎｅ社の１０％Ｓｕｐｅｒ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  ＦＢＳ（熱不動化）を含有するフェノールレッドフリーのＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）のアッセイ培地中に再懸濁し、８：１の（Ｍ２ｃ）エフェクター：標的比で、コートされたＫＩＬＲ  Ｒａｊｉ細胞を含有するプレートに播種し、２４時間インキュベートした。インキュベーション後、ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ（登録商標）ＰｒｏＬａｂｅｌ（登録商標）／ＰｒｏＬｉｎｋ（商標）検出キット試薬をプレートに添加し、室温で６０分のインキュベーションの後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳ照度計（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ社）上で読み取った。
【０６８３】
表１８に提示される結果から、抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体が、二次ＡＤＣＰアッセイにおいてＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を誘導したこと、および低いＥＣ５０値から明らかであるように、フコシル化または脱フコシル化されたオビヌツズマブモノクローナル抗体と比較して、ＡＤＣＰ活性の増強において高い能力を有したことが示される。二次ＡＤＣＰアッセイの結果は、ＡＤＣＰレポーターアッセイの結果と一致した。
【０６８４】
（表１８）ＫＩＬＲ  Ｒａｊｉ細胞においてＡＤＣＰを誘導する抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体の能力
2020514301.tif 000126
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
２構築体は自然発生的なＥ３８８Ｄ変異を含有した。
【０６８５】
実施例６０  抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体による抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性化
ＡＤＣＰレポーターアッセイ
抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体が、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体のアベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）（バベンシオ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ））と比較して、ＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を活性化し、それによりＡＤＣＰ活性を強化する度合いを検証するためのＡＤＣＰレポーターアッセイを開発した。アベルマブのＣＤＲを有する抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体４、７、８、９、１０、１３、１６および１９は、実施例１、２および５１〜５６に記載されるように作製した。四つの型の構築体１３（ＰＤ−Ｌ１）を検証した。それら構築体は、長鎖Ｆｃ単量体の間のグリシンスペーサーのサイズが異なっている（Ｇ４、Ｇ１０、Ｇ１５およびＧ２０リンカー）。各抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたアベルマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたＡＤＣＣレポーターアッセイにおいて検証した：
標的ＨＥＫ−ＰＤ−Ｌ１細胞（１．５ｘ１０４細胞／ウェル）およびＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（３．５ｘ１０４細胞／ウェル）を、４％低ＩｇＧ血清（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁し、連続希釈した抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体を含む９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ２中、３７℃、６時間のインキュベーションを行った後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳ照度計（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して発光を測定した。
【０６８６】
表１９に提示されるように、抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体は、ＡＤＣＰレポーターアッセイにおいてＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を誘導した。
【０６８７】
（表１９）ＡＤＣＰレポーターアッセイにおける、抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体のＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を誘導する能力
2020514301.tif 000127
2020514301.tif 000128
2020514301.tif 000129
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
２構築体は自然発生的なＥ３８８Ｄ変異を含有した。
３構築体は、アッセイ条件下で測定可能なＦｃγＲＩＩａシグナル伝達を誘導しなかった。
【０６８８】
ＡＤＣＰ二次アッセイ
抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体８、９、および１３（Ｇ２０リンカー）を、追加のＡＤＣＰアッセイにおいて検証し、ＡＤＣＰレポーターアッセイの結果を確認した。各抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体、およびフコシル化アベルマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたＡＤＣＣアッセイにおいて検証した：
Ｍ２ｃマクロファージを、１ウェル当たり２ｘ１０５細胞で、９６ウェルのＵ底の超低結合プレート（Ｃｏｓｔａｒ社、７００７）に播種し、少なくとも１時間、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターに平衡化させた。ＨＥＫ２９３  ＰＤ−Ｌ１細胞を、カルセイン−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ｃ−３１００）を用いてメーカーのプロトコールに従い染色し、６．７ｎＭから５倍希釈された抗ＰＤ−Ｌ１構築体とともに１５分間、室温で前インキュベーションを行った。次いでそれらを３：１のエフェクター：標的比でマクロファージと混ぜ合わせ、２時間、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターでインキュベートした。染色用のＶ底９６ウェルプレートに細胞を移し、次いでＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ＋２％  ＦＢＳ）を用いて洗浄した。集めた細胞を、Ｆｃブロック（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、４２２３０２）を使用してブロッキングし、抗ＣＤ１１ｂ−ＡＰＣ  Ａｂ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、３０１３１０）を用いて４℃、１時間で染色した。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、ＢＤ  ＦＡＣＳ  Ｖｅｒｓｅで読み取った。ＦｌｏｗＪｏを使用して解析を行った。ダブレットは、ＦＳＣ−Ｈ対ＦＳＣ−Ａのプロットによる算出から取り除いた。カルセイン−ＡＭおよびＣＤ１１ｂが陽性の細胞は、貪食事象として、または二重陽性マクロファージ（ＤＰ）としてみなされた。貪食の百分率は、（ＤＰ細胞数／総標的細胞数）＊１００を計算することにより算出された。
【０６８９】
表２０に提示される結果から、抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体が二次アッセイにおいてＡＤＣＰを誘導したこと、および低ＥＣ５０値により明らかなように、フコシル化アベルマブモノクローナル抗体と比較して、ＡＤＣＰ活性の増強において高い能力を有したことが示される。二次ＡＤＣＰアッセイの結果は、ＡＤＣＰレポーターアッセイの結果と一致した。
【０６９０】
（表２０）ＨＥＫ−ＰＤ−Ｌ１細胞およびＭ２ｃマクロファージを用いたＦＡＣＳ系アッセイにおける、抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体のＡＤＣＰを誘導する能力
2020514301.tif 000130
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
２構築体は自然発生的なＥ３８８Ｄ変異を含有した。
【０６９１】
実施例６１  抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体による抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）の活性化
ＡＤＣＣレポーターアッセイ
抗ＣＤ２０モノクローナル抗体のオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）と比較して、抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体が、ＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導し、ＡＤＣＣ活性を強化する度合いを検証するためのＡＤＣＣレポーターアッセイを開発した。ＧａｚｙｖａのＣＤＲを有する抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体４、７、８、９、１０、１３および１９は、実施例１、２および５１〜５６に記載されるように作製した。四つの型の構築体１３（ＣＤ２０）を検証した。それら構築体は、長鎖Ｆｃ単量体の間のグリシンスペーサーのサイズが異なっている（Ｇ４、Ｇ１０、Ｇ１５およびＧ２０リンカー）。各抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたオビヌツズマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたＡＤＣＣレポーターアッセイにおいて検証した：
Ｒａｊｉ標的細胞（１．２５ｘ１０４細胞／ウェル）およびＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａ−Ｈエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（７．４５ｘ１０４細胞／ウェル）を、４％低ＩｇＧ血清（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁し、連続希釈した抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体を含む９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ２中、３７℃、６時間のインキュベーションを行った後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳ照度計（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して発光を測定した。
【０６９２】
表２１に示されるように、抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体は、ＡＤＣＣレポーターアッセイにおいてＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導し、低いＥＣ５０値によって明らかであるように、フコシル化オビヌツズマブモノクローナル抗体と比較し、ＡＤＣＣ活性の増強において高い能力を示した。図５６は、抗ＣＤ２０構築体７および抗ＣＤ２０構築体１３の結果を示しており、各Ｆｃ構築体が、フコシル化抗ＣＤ２０抗体と比較して、より低い濃度でより高いＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導したが、脱フコシル化抗ＣＤ２０抗体ほどは有効ではなかったことを示している。
【０６９３】
（表２１）ＡＤＣＣレポーターアッセイにおける、抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体のＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導する能力
2020514301.tif 000131
2020514301.tif 000132
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
２構築体は自然発生的なＥ３８８Ｄ変異を含有した。
【０６９４】
ＡＤＣＣ二次アッセイ
抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体７、８、９、１３（Ｇ２０リンカー）および１９を、追加のＡＤＣＣアッセイにおいて検証し、ＡＤＣＣレポーターアッセイの結果を確認した。各抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体、およびフコシル化Ｇａｚｙｖａモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたＡＤＣＣアッセイにおいて検証した：
ＮＫ細胞を解凍し、Ｌｏｎｚａ社のＬＧＭ培地中、２５０，０００細胞／ｍｌで再懸濁し、一晩培養した。プローブを連続希釈（１０倍）し、５：１のエフェクター：標的比（５０，０００：１０，０００または２５，０００：５，０００、ドナーに依存する）でＫＩＬＲ  Ｒａｊｉ細胞とともに３０分間インキュベートした。ＮＫ細胞を計数し、Ｈｙｃｌｏｎｅ社の１０％Ｓｕｐｅｒ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ  Ｄｅｆｉｎｅｄ  ＦＢＳ（熱不動化）を含有するフェノールレッドフリーのＲＰＭＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社）のアッセイ培地中に再懸濁し、コートされたＫＩＬＲ  Ｒａｊｉ細胞を含有するプレートに播種した。５時間３０分後、ＫＩＬＲ検出試薬を混合し、プレートに添加した。プレートは、室温で３０分のインキュベーションの後に、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳ照度計（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ社）上で読み取られた。
【０６９５】
表２２に提示される結果から、抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体が、二次ＡＤＣＣアッセイにおいてＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導したこと、および低いＥＣ５０値から明らかであるように、フコシル化されたＧａｚｙｖａモノクローナル抗体と比較して、ＡＤＣＣ活性の増強において高い能力を有したことが示される。二次ＡＤＣＣアッセイの結果は、ＡＤＣＣレポーターアッセイの結果と一致する。
【０６９６】
（表２２）ＫＩＬＲ  Ｒａｊｉ細胞においてＡＤＣＣを誘導する抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体の能力
2020514301.tif 000133
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
２構築体は自然発生的なＥ３８８Ｄ変異を含有した。
【０６９７】
実施例６２  抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体による抗体依存性細胞介在性細胞障害（ＡＤＣＣ）の活性化
ＡＤＣＣレポーターアッセイ
抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナル抗体のアベルマブ（ａｖｅｌｕｍａｂ）（バベンシオ（Ｂａｖｅｎｃｉｏ））と比較して、抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体が、ＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導し、ＡＤＣＣ活性を強化する度合いを検証するためのＡＤＣＣレポーターアッセイを開発した。アベルマブのＣＤＲを有する抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体４、７、８、１０、１３、１６および１９は、実施例１、２および５１〜５６に記載されるように作製した。四つの型の構築体１３（ＰＤ−Ｌ１）を検証した。それら構築体は、長鎖Ｆｃ単量体の間のグリシンスペーサーのサイズが異なっていた（Ｇ４、Ｇ１０、Ｇ１５およびＧ２０リンカー）。各抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体、およびフコシル化されたアベルマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたＡＤＣＣレポーターアッセイにおいて検証した：
標的ＨＥＫ−ＰＤ−Ｌ１細胞（１．２５ｘ１０４細胞／ウェル）およびＪｕｒｋａｔ／ＦｃγＲＩＩＩａエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ社）（７．４５ｘ１０４細胞／ウェル）を、４％低ＩｇＧ血清（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中に再懸濁し、連続希釈した抗ＰＤ−Ｌ１構築体を含む９６ウェルプレートに播種した。５％ＣＯ２中、３７℃、６時間のインキュベーションを行った後、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳ照度計（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ社）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して発光を測定した。
【０６９８】
表２３に提示されるように、抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体は、ＡＤＣＣレポーターアッセイにおいてＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導した。
【０６９９】
（表２３）ＡＤＣＣレポーターアッセイにおける、抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体のＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導する能力
2020514301.tif 000134
2020514301.tif 000135
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
２構築体は自然発生的なＥ３８８Ｄ変異を含有した。
【０７００】
ＡＤＣＣ二次アッセイ
抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体８、９、１３（Ｇ２０リンカー）および１９を、追加のＡＤＣＣアッセイにおいて検証し、ＡＤＣＣレポーターアッセイの結果を確認した。各抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体、ならびにフコシル化および脱フコシル化されたアベルマブモノクローナル抗体を、以下のとおり実施されたＡＤＣＣアッセイにおいて検証した：
ＡＤＣＣ  Ａ５４９−ＫＩＬＲアッセイを、メーカーの指示（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ社）に従い実施した。Ａ５４９−ＫＩＬＲ細胞株を、ＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｋｉｔ−１０５を使用して、組織培養フラスコ中で増殖させた。ＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ試薬を使用して細胞を採取し、２ｘ１０５細胞／ｍＬに、ＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｐｌａｔｉｎｇ  ３９試薬を用いて調節し、５０μＬ／ウェル（１ｘ１０４細胞）で、９６ウェルの白色底組織培養処理済プレート内に分散させた。ＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｐｌａｔｉｎｇ  ３９試薬中で抗ＰＤ−Ｌ１構築体を１１ｎＭに希釈し、直後に連続希釈（１：４）を行った。希釈された構築体を、１０μＬ／ウェルでウェルに添加し、アッセイプレートを３０分間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。凍結ＮＫ細胞（Ｈｅｍａｃａｒｅ社）を解凍し、１ｘ１０６細胞／ｍＬで、ＡｓｓａｙＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｐｌａｔｉｎｇ  ３９試薬を使用して再懸濁した。３０分間のインキュベーション後、ＮＫ細胞を、５０μＬ／ウェル（５ｘ１０４細胞／ウェル）でアッセイプレートに加えた。脱フコシル化抗ＰＤ−Ｌ１  ＩｇＧ１抗体を使用した陽性対照、および抗体非存在下でＡ５４９−ＫＩＬＲ細胞と共培養されたＮＫ細胞からなる陰性対照も、含ませた。次いでアッセイプレートを３７℃、５％ＣＯ２で３時間インキュベートした。インキュベーション直後に、１００μＬ／ウェルのＫＩＬＲ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（４：１：１の体積比で混合されたＫＩＬＲ検出試薬１、２および３から構成される）を各ウェルに加えた。続いてアッセイプレートを室温で３０分間インキュベートし、その後、発光レベルを、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳ照度計（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ社）を使用して決定した。
【０７０１】
表２４に提示される結果から、抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体は、二次ＡＤＣＣアッセイにおいてＦｃγＲＩＩＩａシグナル伝達を誘導したことが示される。二次ＡＤＣＣアッセイの結果は、ＡＤＣＣレポーターアッセイの結果と一致した。
【０７０２】
（表２４）ＫＩＬＲ−Ａ５４９細胞においてＡＤＣＣを誘導する抗ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃ構築体の能力
2020514301.tif 000136
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
２構築体は自然発生的なＥ３８８Ｄ変異を含有した。
【０７０３】
実施例６３  抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体による、ヒト血液中のＣＤ１９＋Ｂ細胞の枯渇
全血末梢血単核細胞（ＰＭＢＣ）枯渇アッセイを使用して、抗ＣＤ２０構築体１３のフコシル化型および脱フコシル化型において、オビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）由来ＣＤＲを含有する抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体を使用してＣＤ１９＋Ｂ細胞を枯渇させ得るかどうかを決定した。ＣＤ１９は、Ｂ細胞特異的な表面抗原であり、ならびにＢ細胞に由来する白血病およびリンパ腫もＣＤ１９を発現する。ヒト全血をＥＤＴＡ管で採取し、１００μＬを、２．９６μＭ〜０．３ｐＭの範囲で連続希釈した、ＶｉｖｏＴａｇ６４５−標識抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体とともに１０分間、３７℃でインキュベートした。フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）抗ＩｇＤ、フィコエリトリン（ＰＥ）抗ＣＤ１１ｃ、アロフィコシアニン−Ｈ７（ＡＰＣ／Ｈ７）抗ＣＤ１４  、ＰｅｒＣｐ  Ｃｙ５．５抗ＣＤ１９、フィコエリトリン−シアニン７（ＰＥ／Ｃｙ７）抗ＣＤ５６、およびパシフィックブルー（Ｐａｃ  Ｂｌｕｅ）抗ＣＤ３の抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ社）を含有する免疫細胞特異的抗体のカクテルを血液細胞に添加して、さらに３０分間、３７℃で染色した。染色後、赤血球（ＲＢＣ）を、塩化アンモニウム溶液（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）を用いて２回、室温（ＲＴ）で１０分間溶解させ、細胞をＰＢＳで洗浄した。２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳ含有ＰＢＳ）中に細胞を再懸濁させ、サンプルをＦＡＣＳＶｅｒｓｅＴＭ機器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）で取得した。白血球のゲートは、フォワードスキャッター（ＦＳＣ）とサイドスキャッター（ＳＳＣ）を使用して設定し、Ｂ細胞は、ＳＳＣｌｏｗ、ＦＳＣｉｎｔ、ＣＤ１１ｃ−、ＣＤ１４−、ＣＤ５６−、ＣＤ３−、およびＣＤ１９＋、ＩｇＤ＋として特徴解析した。
【０７０４】
図５７は、フコシル化および脱フコシル化の構築体１３（抗ＣＤ２０）の両方が、フコシル化および脱フコシル化の抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１モノクローナル抗体（オビヌツズマブ）よりも低い濃度（ｎＭ）でＣＤ１９＋Ｂ細胞（％  ＩｇＤ＋細胞）を枯渇させたことを示す。脱フコシル化された抗ＣＤ２０構築体１３は、フコシル化された抗ＣＤ２０構築体１３よりも効率的にＣＤ１９＋Ｂ細胞を枯渇させた。同様に、脱フコシル化された抗ＣＤ２０モノクローナル抗体は、フコシル化された抗体よりも効率的にＣＤ１９＋Ｂ細胞を枯渇させた。
【０７０５】
実施例６４  マウスリンパ腫モデルにおける、抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体による腫瘍増殖の低下
ヒトリンパ腫のマウス播種性腫瘍モデルを使用して、疾患進行および治療反応性に対する抗ＣＤ２０  Ｆｃ構築体（抗ＣＤ２０構築体１３）の単回投与または複数回投与の効果を、生体発光イメージングにより検証した。ＣＢ１７−重症複合型免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（メス、６〜７週齢で、平均体重は２０グラム、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓの系統２３６）を４８時間、実験動物ケア施設中に飼育して、その後、ＩＡＣＵＣプロトコールに従い使用した。水と食物は不断に与えた。全ての実験は、機関の実験動物倫理委員会により承認された。マウスは毎日、不快感の兆候および全身外観をチェックされた。腫瘍異種移植片モデルについては、５ｘ１０６個のルシフェラーゼ発現ヒトバーキットリンパ腫Ｄａｕｄｉ細胞（Ｄａｕｄｉ−Ｌｕｃ）を、尾静脈を通して静脈内注入した。注入前、Ｄａｕｄｉ−ｌｕｃ細胞は、ＣＤ２０およびＣＤ３８の細胞表面発現を示した。生体発光シグナルに基づき様々な処置群（７匹のマウス／群）に無作為化するため、腫瘍細胞移植後１時間で、マウスを段階分けした（そのような早期の時点では多くは肺に集中していた）。腫瘍注入の５時間後、各群のマウスは、臨床的投与範囲と同様の剤の単回投与（１８ｍｇ／ｋｇのダラツムマブ（抗ＣＤ３８モノクローナル抗体）、１８ｍｇ／ｋｇのオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ、抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１モノクローナル抗体）、３０ｍｇ／ｋｇの抗ＣＤ２０構築体１３、ＩｇＧ１用量のモル等量）を用いて腹腔内注入で処置された。生理食塩水を陰性対照としてマウス群に投与した。別の群では、抗ＣＤ２０構築体１３は、３０ｍｇ／ｋｇで２日に１回、合計で６回投与が行われた（すなわち、マウスは、腫瘍注入後、１、３、５、７、９および１１日目に抗ＣＤ２０構築体１３で処置された）。腫瘍増殖の時間的変化は、ＩＶＩＳ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）での生体発光イメージングにより決定された。イメージングを行うために、マウスに麻酔をかけ、次いでＤ−ルシフェリン注射を行った（１５ｍｇ／ｍＬのストック溶液を１５０μｌ／マウス）。次いで電荷結合素子検出器を用いたイメージングのためにマウスを遮光ボックス内に置いた。マウス内のルシフェラーゼ発現細胞から発せられた光子を、曝露期間にわたり計数した。総流束（光子／秒）としての放射輝度の生データが算出され、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社）を使用して定量的な画像解析が行われた。照明の下で、関心対象領域の描画のための解剖学的参照用の白黒画像が取得された。背面および前面から採取された光の放射は、個々のマウスの総体表面積上で積分され、腫瘍質量発達の尺度として時間でプロットされた。腫瘍量を表す積分生体発光強度が測定され、データは平均±ＳＥＭとして表されている（７匹のマウス／群）。
【０７０６】
図５８は、抗ＣＤ２０構築体１３が、播種性リンパ腫モデルにおいて腫瘍の発達を大きく制限することを示している。抗ＣＤ２０構築物１３の単回投与は、腫瘍細胞移植後の２１日間にわたる腫瘍増殖の低下において、ダラツムマブおよびオビヌツズマブ（Ｇａｚｙｖａ）と同様の有効性があった。生理食塩水群の
2020514301.tif 000137
でラベリングされた点は、対応する処置群と比較して＜０．０００１のｐ値を有した。抗ＣＤ２０構築物１３の複数回投与は、このモデルアッセイにおいて、当該構築物の単回投与とほぼ同等の有効性であった。マウスは構築体１３の複数回投与に耐容し、目に見える副作用は示さなかった（データは示さず）。
【０７０７】
他の実施形態
この明細書中に記載した全ての公開公報、特許および特許出願は、あたかも独立の公開公報または特許出願それぞれが特別にかつ個別に示されて参照によって組み入れられるかのように、同じ程度まで参照することによってここに組み入れるものとする。
【０７０８】
本開示について、その特定の実施形態に関連して説明したが、さらなる変形が可能であることと、本出願は、概して本開示の原則に従い、かつ、本開示が関係する技術分野の範囲内で公知または通例である範囲にあり、先に述べた本質的な特徴に応用することができるような、本開示からの逸脱を含んだ、本開示の任意のバリエーション、使用または適応を網羅することを意図し、請求項の範囲に従うものであることとが理解されるであろう。
【０７０９】
他の実施形態は、特許請求の範囲の範囲内とする。
【図１】
2020514301.tif 000181
【図２】
2020514301.tif 000182
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020514301.tif 000190
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2020514301.tif 000194
【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
2020514301.tif 000198
【図１９】
2020514301.tif 000199
【図２０】
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【図２１】
2020514301.tif 000201
【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
2020514301.tif 000211
【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
2020514301.tif 000221
【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
2020514301.tif 000226
【図４７】
2020514301.tif 000227
【図４８】
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【図４９】
2020514301.tif 000229
【図５０】
2020514301.tif 000230
【図５１】
2020514301.tif 000231
【図５２】
2020514301.tif 000232
【図５３】
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【図５４】
2020514301.tif 000234
【図５５】
2020514301.tif 000235
【図５６】
2020514301.tif 000236
【図５７】
2020514301.tif 000237
【図５８】
2020514301.tif 000238
【配列表】
2020514301000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和1年9月26日(2019.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
強化されたエフェクター機能を備えたＦｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
抗原結合ドメイン、およびリンカーにより第二のＦｃドメインに結合された第一のＦｃドメインを含み、
抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２】
抗原結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；および任意の、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
ポリペプチド。
【請求項３】
前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２個または４個の逆電荷変異を含み、前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２個または４個の逆電荷変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が２個または４個の逆電荷変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のＩｇＧ１ドメイン単量体が２個または４個の逆電荷変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第一のＩｇＧ１ドメイン単量体が２個または４個の逆電荷変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
改変された突起を形成する変異を含む前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、１個、２個または３個の逆電荷変異をさらに含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインが独立して、２個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下：
2020514301.tif 000239
のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインが独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000240
のアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記抗原結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ＶＨドメインが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列のセットを含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ＶＨドメインが、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項１５に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
抗原結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；および任意の、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのＦｃドメイン単量体が、１個、２個、または３個の逆電荷アミノ酸変異を含む、
ポリペプチド。
【請求項２０】
前記第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表５に記載のものから選択される２個の逆電荷変異のセット、または表６に記載のものから選択される４個の逆電荷変異のセットを含み、
前記第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４から選択される逆電荷アミノ酸変異を１個、２個、または３個含む、
請求項１９に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；および任意の、ヒンジドメインとＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインとを含む第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
少なくとも一つのＦｃドメイン単量体が、１個、２個、または３個の逆電荷アミノ酸変異を含む、
ポリペプチド。
【請求項２２】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド、および
(ｄ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメイン
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６】
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０９】
本明細書において使用される場合、断片という用語、および部分という用語は、相互交換可能に使用され得る。
[本発明1001]
強化されたエフェクター機能を備えたＦｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
抗原結合ドメイン、およびリンカーにより第二のＦｃドメインに結合された第一のＦｃドメインを含み、
抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1002]
抗原結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含む第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含む第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；および任意の、ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含む第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
ポリペプチド。
[本発明1003]
前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1004]
前記抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1005]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、2個または4個の逆電荷変異を含み、前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1006]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、2個または4個の逆電荷変異を含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1007]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1008]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、および前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1009]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1010]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のＩｇＧ1ドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1011]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第一のＩｇＧ1ドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1012]
改変された突起を形成する変異を含む前記ＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、1個、2個または3個の逆電荷変異をさらに含む、本発明1002〜1011のいずれかのポリペプチド。
[本発明1013]
改変された突起を形成する前記変異、および前記逆電荷変異が、ＣＨ3ドメインにある、本発明1002〜1012のいずれかのポリペプチド。
[本発明1014]
前記変異が、両端を含むＫａｂａｔのＧ341位〜ＫａｂａｔのＫ447位の配列内にある、本発明1013のポリペプチド。
[本発明1015]
前記変異が、単一アミノ酸変化である、本発明1002〜1013のいずれかのポリペプチド。
[本発明1016]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、
2020514301.tif 000241
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1017]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、グリシンスペーサーである、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1018]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1019]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1020]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、ＫａｂａｔのＩ253位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1002〜1019のいずれかのポリペプチド。
[本発明1021]
ＫａｂａｔのＩ253位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ253Ａ、Ｉ253Ｃ、Ｉ253Ｄ、Ｉ253Ｅ、Ｉ253Ｆ、Ｉ253Ｇ、Ｉ253Ｈ、Ｉ253Ｉ、Ｉ253Ｋ、Ｉ253Ｌ、Ｉ253Ｍ、Ｉ253Ｎ、Ｉ253Ｐ、Ｉ253Ｑ、Ｉ253Ｒ、Ｉ253Ｓ、Ｉ253Ｔ、Ｉ253Ｖ、Ｉ253Ｗ、およびＩ253Ｙからなる群から選択される、本発明1020のポリペプチド。
[本発明1022]
Ｉ253位の各アミノ酸変異が、Ｉ253Ａである、本発明1021のポリペプチド。
[本発明1023]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、ＫａｂａｔのＲ292位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1002〜1022のいずれかのポリペプチド。
[本発明1024]
ＫａｂａｔのＲ292位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ292Ｄ、Ｒ292Ｅ、Ｒ292Ｌ、Ｒ292Ｐ、Ｒ292Ｑ、Ｒ292Ｒ、Ｒ292ＴおよびＲ292Ｙからなる群から選択される、本発明1023のポリペプチド。
[本発明1025]
Ｒ292位の各アミノ酸変異が、Ｒ292Ｐである、本発明1024のポリペプチド。
[本発明1026]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、
2020514301.tif 000242
からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、本発明1002〜1025のいずれかのポリペプチド。
[本発明1027]
前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000243
を有する、本発明1026のポリペプチド。
[本発明1028]
前記第一のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000244
を有する、本発明1026のポリペプチド。
[本発明1029]
前記第一のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000245
を有し、前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000246
を有する、本発明1026のポリペプチド。
[本発明1030]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ2ドメインが独立して、2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下：
2020514301.tif 000247
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1031]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下：
2020514301.tif 000248
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1032]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸の置換を伴う以下：
2020514301.tif 000249
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1033]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ2ドメインが同一であり、以下：
2020514301.tif 000250
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1034]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ3ドメインが独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000251
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1035]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ3ドメインが独立して、8個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000252
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1036]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ3ドメインが独立して、6個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000253
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1037]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ3ドメインが独立して、5個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000254
のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1038]
前記単一アミノ酸置換が、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｆ405Ａ、Ｙ407Ａ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、Ｔ394Ｆ、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、Ｄ356Ｋ、およびＤ356Ｋからなる群から選択される、本発明1030〜1037のいずれかのポリペプチド。
[本発明1039]
前記Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが独立して、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1040]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大で6個が、ＣＨ3ドメインにおける逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、本発明1039のポリペプチド。
[本発明1041]
前記単一アミノ酸置換が、両端を含むＫａｂａｔのＧ341位〜ＫａｂａｔのＫ447位の配列内にある、本発明1039のポリペプチド。
[本発明1042]
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｆ405Ａ、Ｙ407Ａ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、およびＴ394Ｆからなる群から選択される、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1043]
前記2個または4個の逆電荷変異が、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、Ｄ356Ｋ、およびＤ356Ｋから選択される、本発明1005、1006および1009〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1044]
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1045]
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含む、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1046]
前記抗原結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1047]
前記ＶＨドメインが、表1に記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列のセットを含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1048]
前記ＶＨドメインが、表2に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1049]
前記ＶＨドメインが、表2に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含み、
前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列を除き、前記ＶＨ配列が、表2に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも95％または98％同一である、
本発明1045のポリペプチド。
[本発明1050]
前記ＶＨドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列を含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1051]
前記抗原結合ドメインが、表1に記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列のセットを含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1052]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1053]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含むＶＨドメイン、および表2に記載の抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3を含むＶＬドメインを含み、
ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を除き、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも95％または98％同一である、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1054]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1055]
前記抗原結合ドメインが、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ1抗体定常ドメインを含む、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1056]
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含み、かつＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合してＦａｂを形成することができる、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1057]
第一または第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体のヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、本発明1002〜1056のいずれかのポリペプチドを2コピー含有するポリペプチド複合体。
[本発明1058]
ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含むＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドに結合されている、本発明1002〜1056のいずれかのポリペプチドを含むポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第二のポリペプチドが、前記ポリペプチドの第一、第二、または第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン内、および前記第二のポリペプチドのヒンジドメイン内の、システイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、ポリペプチド複合体。
[本発明1059]
前記第二のポリペプチド単量体が、改変された空洞を形成する変異を含む、本発明1058のポリペプチド複合体。
[本発明1060]
前記改変された空洞を形成する変異が、Ｙ407Ｔ、Ｙ407Ａ、Ｆ405Ａ、Ｔ394Ｓ、Ｔ394Ｗ／Ｙ407Ａ、Ｔ366Ｗ／Ｔ394Ｓ、Ｔ366Ｓ／Ｌ368Ａ／Ｙ407Ｖ／Ｙ349Ｃ、Ｓ364Ｈ／Ｆ405Ａからなる群から選択される、本発明1059のポリペプチド複合体。
[本発明1061]
前記第二のポリペプチドが、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1058〜1060のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1062]
抗原結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含む第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含む第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；および任意の、ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含む第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのＦｃドメイン単量体が、1個、2個、または3個の逆電荷アミノ酸変異を含む、
ポリペプチド。
[本発明1063]
前記抗原結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1064]
前記抗原結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1065]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含み、
前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1066]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1067]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1068]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、および前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1069]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1070]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第二のＩｇＧ1ドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1071]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第一のＩｇＧ1ドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1072]
表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む前記ＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、同一のＣＨ3ドメインを有する、本発明1062〜1071のいずれかのポリペプチド。
[本発明1073]
表4から選択される1個、2個、または3個の逆電荷アミノ酸変異が、ＣＨ3ドメインにある、本発明1062〜1072のいずれかのポリペプチド。
[本発明1074]
前記変異が、両端を含むＫａｂａｔのＧ341位〜ＫａｂａｔのＫ447位の配列内にある、本発明1073のポリペプチド。
[本発明1075]
前記変異がそれぞれ、単一アミノ酸変化である、本発明1062〜1073のいずれかのポリペプチド。
[本発明1076]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、
2020514301.tif 000255
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、本発明1072のポリペプチド。
[本発明1077]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、グリシンスペーサーである、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1078]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1079]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1080]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、ＫａｂａｔのＩ253位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1062〜1079のいずれかのポリペプチド。
[本発明1081]
ＫａｂａｔのＩ253位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ253Ａ、Ｉ253Ｃ、Ｉ253Ｄ、Ｉ253Ｅ、Ｉ253Ｆ、Ｉ253Ｇ、Ｉ253Ｈ、Ｉ253Ｉ、Ｉ253Ｋ、Ｉ253Ｌ、Ｉ253Ｍ、Ｉ253Ｎ、Ｉ253Ｐ、Ｉ253Ｑ、Ｉ253Ｒ、Ｉ253Ｓ、Ｉ253Ｔ、Ｉ253Ｖ、Ｉ253Ｗ、およびＩ253Ｙからなる群から独立して選択される、本発明1080のポリペプチド。
[本発明1082]
Ｉ253位の各アミノ酸変異が、Ｉ253Ａである、本発明1071のポリペプチド。
[本発明1083]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、ＫａｂａｔのＲ292位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1062〜1082のいずれかのポリペプチド。
[本発明1084]
ＫａｂａｔのＲ292位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ292Ｄ、Ｒ292Ｅ、Ｒ292Ｌ、Ｒ292Ｐ、Ｒ292Ｑ、Ｒ292Ｒ、Ｒ292ＴおよびＲ292Ｙからなる群から選択される、本発明1083のポリペプチド。
[本発明1085]
Ｒ292位の各アミノ酸変異が、Ｒ292Ｐである、本発明1084のポリペプチド。
[本発明1086]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、
2020514301.tif 000256
からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、本発明1062〜1085のいずれかのポリペプチド。
[本発明1087]
前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000257
を有する、本発明1086のポリペプチド。
[本発明1088]
前記第一のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000258
を有する、本発明1086のポリペプチド。
[本発明1089]
前記第一のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000259
を有し、前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000260
を有する、本発明1086のポリペプチド。
[本発明1090]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ2ドメインが独立して、2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下：
2020514301.tif 000261
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1091]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下：
2020514301.tif 000262
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1092]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸の置換を伴う以下：
2020514301.tif 000263
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1093]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ2ドメインが同一であり、以下：
2020514301.tif 000264
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1094]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ3ドメインが独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000265
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1095]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ3ドメインが独立して、8個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000266
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1096]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ3ドメインが独立して、6個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000267
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1097]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ3ドメインが独立して、5個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000268
のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1098]
前記単一アミノ酸の置換が、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｆ405Ａ、Ｙ407Ａ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、Ｔ394Ｆ、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、Ｄ356Ｋ、およびＤ356Ｋからなる群から選択される、本発明1090〜1097のいずれかのポリペプチド。
[本発明1099]
前記Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが独立して、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1100]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大で6個が、ＣＨ3ドメインにおける逆電荷変異である、本発明1099のポリペプチド。
[本発明1101]
前記単一アミノ酸置換が、両端を含むＫａｂａｔのＧ341位〜ＫａｂａｔのＫ447位の配列内にある、本発明1099のポリペプチド。
[本発明1102]
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つが、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｆ405Ａ、Ｙ407Ａ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、およびＴ394Ｆからなる群から選択される、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1103]
前記2個または4個の逆電荷変異が、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、Ｄ356Ｋ、およびＤ356Ｋから選択される、本発明1065、1066および1069〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1104]
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1105]
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含む、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1106]
前記抗原結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、本発明1103のポリペプチド。
[本発明1107]
前記ＶＨドメインが、表1に記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列のセットを含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1108]
前記ＶＨドメインが、表2に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1109]
前記ＶＨドメインが、表2に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含み、
前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列を除き、前記ＶＨ配列が、表2に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも95％または98％同一である、
本発明1105のポリペプチド。
[本発明1110]
前記ＶＨドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列を含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1111]
前記抗原結合ドメインが、表1に記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列のセットを含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1112]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1113]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含むＶＨドメイン、および表2に記載の抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3を含むＶＬドメインを含み、
ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を除き、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも95％または98％同一である、
本発明1105のポリペプチド。
[本発明1114]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1115]
前記抗原結合ドメインが、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ1抗体定常ドメインを含む、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1116]
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含み、かつＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合してＦａｂを形成することができる、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1117]
第一または第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体のヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、本発明1002〜1056のいずれかのポリペプチドを2コピー含有するポリペプチド複合体。
[本発明1118]
ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含むＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドに結合されている、本発明1062〜1116のいずれかのポリペプチドを含むポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第二のポリペプチドが、前記ポリペプチドの第一、第二、または第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン内、および前記第二のポリペプチドのヒンジドメイン内の、システイン残基間のジスルフィド結合により結合されている、ポリペプチド複合体。
[本発明1119]
前記第二のポリペプチド単量体が、1個、2個、または3個の逆電荷変異を含む、本発明1118のポリペプチド複合体。
[本発明1120]
前記第二のポリペプチド単量体が、表4から選択される逆電荷変異を1、2または3個含み、かつ前記ポリペプチド中の、表4から選択される1個、2個、または3個の逆電荷変異に対し相補的である、本発明1129のポリペプチド複合体。
[本発明1121]
前記第二のポリペプチドが、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1118〜1120のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1122]
ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含む第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含む第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；および任意の、ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含む第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
前記少なくとも一つのＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、
ポリペプチド。
[本発明1123]
前記第一のＩｇＧ1単量体のアミノ末端側に、抗体重鎖可変ドメインおよびＣＨ1ドメインをさらに含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1124]
前記第一のＩｇＧ1単量体のアミノ末端側に、ｓｃＦｖをさらに含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1125]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、2個または4個の逆電荷変異を含み、前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1126]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、2個または4個の逆電荷変異を含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1127]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1128]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、および前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1129]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1130]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第二のＩｇＧ1ドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
本発明1122のポリペプチド。
[本発明1131]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、前記第一のＩｇＧ1ドメイン単量体が2個または4個の逆電荷変異を含む、
本発明1122のポリペプチド。
[本発明1132]
改変された突起を形成する変異を含む前記ＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、1個、2個または3個の逆電荷変異をさらに含む、本発明1122〜1131のいずれかのポリペプチド。
[本発明1133]
改変された突起を形成する前記変異、および前記逆電荷変異が、ＣＨ3ドメインにある、本発明1122〜1131のいずれかのポリペプチド。
[本発明1134]
ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含む第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体；第二のリンカー；ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含む第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体；任意の第三のリンカー；および任意の、ヒンジドメインとＣＨ2ドメインとＣＨ3ドメインとを含む第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体
を含むポリペプチドであって、
少なくとも一つのＦｃドメイン単量体が、1個、2個、または3個の逆電荷アミノ酸変異を含む、
ポリペプチド。
[本発明1135]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端側に、抗体重鎖可変ドメインおよびＣＨ1ドメインをさらに含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1136]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端側に、ｓｃＦｖをさらに含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1137]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含み、
前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1138]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1139]
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1140]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、および前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1141]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1142]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第一のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第二のＩｇＧ1ドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1143]
第三のリンカーおよび第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含み、
前記第二のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第三のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方がそれぞれ、表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含み、
前記第一のＩｇＧ1ドメイン単量体が、表5に記載のものから選択される2個の逆電荷変異のセット、または表6に記載のものから選択される4個の逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1144]
表4から選択される逆電荷アミノ酸変異を1個、2個、または3個含む前記ＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、同一のＣＨ3ドメインを有する、本発明1134〜1143のいずれかのポリペプチド。
[本発明1145]
表4から選択される1個、2個、または3個の逆電荷アミノ酸変異が、ＣＨ3ドメインにある、本発明1134〜1143のいずれかのポリペプチド。
[本発明1146]
前記変異が、両端を含むＫａｂａｔのＧ341位〜ＫａｂａｔのＫ447位の配列内にある、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1147]
前記変異がそれぞれ、単一アミノ酸変化である、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1148]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、
2020514301.tif 000269
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1149]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1150]
前記第二のリンカーおよび前記任意の第三のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1151]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、ＫａｂａｔのＩ253位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1152]
ＫａｂａｔのＩ253位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ253Ａ、Ｉ253Ｃ、Ｉ253Ｄ、Ｉ253Ｅ、Ｉ253Ｆ、Ｉ253Ｇ、Ｉ253Ｈ、Ｉ253Ｉ、Ｉ253Ｋ、Ｉ253Ｌ、Ｉ253Ｍ、Ｉ253Ｎ、Ｉ253Ｐ、Ｉ253Ｑ、Ｉ253Ｒ、Ｉ253Ｓ、Ｉ253Ｔ、Ｉ253Ｖ、Ｉ253Ｗ、およびＩ253Ｙからなる群から独立して選択される、本発明1151のポリペプチド。
[本発明1153]
Ｉ253位の各アミノ酸変異が、Ｉ253Ａである、本発明1152のポリペプチド。
[本発明1154]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも一つが、ＫａｂａｔのＲ292位で単一アミノ酸変異を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1155]
ＫａｂａｔのＲ292位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ292Ｄ、Ｒ292Ｅ、Ｒ292Ｌ、Ｒ292Ｐ、Ｒ292Ｑ、Ｒ292Ｒ、Ｒ292ＴおよびＲ292Ｙからなる群から選択される、本発明1154のポリペプチド。
[本発明1156]
Ｒ292位の各アミノ酸変異が、Ｒ292Ｐである、本発明1155のポリペプチド。
[本発明1157]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、
2020514301.tif 000270
からなる群から選択される、アミノ酸配列を含む、またはこれらからなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1158]
前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000271
を有する、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1159]
前記第一のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000272
を有する、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1160]
前記第一のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000273
を有し、前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列：
2020514301.tif 000274
を有する、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1161]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ2ドメインが独立して、2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下：
2020514301.tif 000275
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1162]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う以下：
2020514301.tif 000276
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1165]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ2ドメインが同一であり、2個以下の単一アミノ酸の置換を伴う以下：
2020514301.tif 000277
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1166]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ2ドメインが同一であり、以下：
2020514301.tif 000278
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1167]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ3ドメインが独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000279
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1168]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ3ドメインが独立して、8個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000280
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1169]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ3ドメインが独立して、6個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000281
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1170]
各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ3ドメインが独立して、5個以下の単一アミノ酸置換を伴う以下：
2020514301.tif 000282
のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1171]
前記単一アミノ酸の置換が、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｆ405Ａ、Ｙ407Ａ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、Ｔ394Ｆ、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、Ｄ356Ｋ、およびＤ356Ｋからなる群から選択される、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1172]
前記Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが独立して、配列番号42、配列番号43、配列番号45、および最大で10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号45のアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1173]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大で6個が、ＣＨ3ドメインにおける逆電荷変異である、本発明1099のポリペプチド。
[本発明1174]
前記単一アミノ酸置換が、両端を含むＫａｂａｔのＧ341位〜ＫａｂａｔのＫ447位の配列内にある、本発明1173のポリペプチド。
[本発明1175]
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも一つは、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｆ405Ａ、Ｙ407Ａ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、およびＴ394Ｆからなる群から選択される、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1176]
前記2個または4個の逆電荷変異が、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、Ｄ356Ｋ、およびＤ356Ｋから選択される、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1178]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表1に記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列のセットを含む、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1179]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表2に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含む、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1180]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表2に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含み、
前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列を除き、前記ＶＨ配列が、表2に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも95％または98％同一である、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1181]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表2に記載される抗体のＶＨ配列を含む、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1182]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表1に記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列のセットを含む、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1183]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を含む、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1184]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表2に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含むＶＨドメイン、および表2に記載の抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3を含むＶＬドメインを含み、
ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を除き、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも95％または98％同一である、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1185]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、本発明1123、1124、1135および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1186]
ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ1抗体定常ドメインをさらに含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1187]
本発明1002〜1187のいずれかのポリペプチドをコードする、核酸分子。
[本発明1188]
本発明1187の核酸分子を含む、発現ベクター。
[本発明1189]
本発明1187の核酸分子を含む、宿主細胞。
[本発明1190]
本発明1188の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1191]
本発明1189または本発明1190の宿主細胞を、ポリペプチドを発現する条件下で培養する工程を含む、本発明1002〜1187のいずれかのポリペプチドを製造する方法。
[本発明1192]
抗体ＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1189の宿主細胞。
[本発明1193]
抗体ＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1190の宿主細胞。
[本発明1194]
抗体ＶＬドメインおよび抗体ＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1189の宿主細胞。
[本発明1195]
抗体ＶＬドメインおよび抗体ＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1190の宿主細胞。
[本発明1196]
10個以下の単一アミノ酸変異を有するＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1189の宿主細胞。
[本発明1197]
10個以下の単一アミノ酸変異を有するＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1190の宿主細胞。
[本発明1199]
前記ＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、ＣＨ3ドメイン中に10、8、6または4個以下の単一アミノ酸変異を有する配列番号42、43、45および47のいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1196または1197の宿主細胞。
[本発明1200]
本発明1002から1186のいずれかのポリペプチドを含む、医薬組成物。
[本発明1201]
前記ポリペプチドの40％、30％、20％、10％、5％、2％未満が、Ｆｃドメイン単量体上で少なくとも1個のフコース改変を有する、本発明1200の医薬組成物。
[本発明1202]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成する、
本発明1001のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1203]
前記単一Ｆｃドメイン構築体が、抗体である、本発明1001または1202のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1204]
実質的に均質なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成する、
組成物。
[本発明1205]
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチドと、前記第二のポリペプチドもしくは前記第三のポリペプチドに結合されているか、または前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドに結合されている、本発明1204の組成物。
[本発明1206]
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチドおよび前記第三のポリペプチドに結合されている、本発明1204の組成物。
[本発明1207]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1208]
前記生物活性が、Ｆｃ受容体介在性エフェクター機能である、本発明1207のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1209]
前記Ｆｃ受容体介在性エフェクター機能が、ＡＤＣＣ活性、ならびにＡＤＣＰ活性および／またはＣＤＣ活性である、本発明1208のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1210]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチド、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチド、および
(ｄ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメイン
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1211]
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチドと、前記第二のポリペプチドもしくは前記第三のポリペプチドに結合されているか、または前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドに結合されている、本発明1202、1207、または1210のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1212]
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチド、および前記第三のポリペプチドに結合されている、本発明1202、1207、または1210のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1213]
前記抗原結合ドメインが、Ｆａｂである、本発明1001および1202〜1212のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1214]
前記抗原結合ドメインが、前記第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、本発明1202〜1212のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1215]
前記抗原結合ドメインが、ｓｃＦｖである、本発明1214のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1216]
前記抗原結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含み、
前記ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインが、前記第一、第二、または第三のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、
本発明1202〜1212のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1217]
前記抗原結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、本発明1216のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1218]
ＶＬドメインを含む第四のポリペプチドを含む、本発明1217のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1219]
前記ＶＨドメインが、表1に記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列のセットを含む、本発明1216のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1220]
前記ＶＨドメインが、表2に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含む、本発明1216のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1221]
前記ＶＨドメインが、表2に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含み、
前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列を除き、前記ＶＨ配列が、表2に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも95％同一である、本発明1216のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1222]
前記ＶＨドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列を含む、本発明1216のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1223]
前記抗原結合ドメインが、表1に記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列のセットを含む、本発明1001および1202〜1215のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1224]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を含む、本発明1001および1202〜1215のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1225]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含むＶＨドメイン、および表2に記載の抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3を含むＶＬドメインを含み、
ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を除き、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも95％同一である、本発明1001および1202〜1215のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1226]
前記抗原結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、本発明1001および1202〜1215のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1227]
ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ1抗体定常ドメインをさらに含み、
前記ＩｇＧ  ＣＨ1抗体定常ドメインが、リンカーを介して前記第一のポリペプチドまたは前記第二のポリペプチドのＮ末端に付加される、
本発明1001および1202〜1212のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1228]
前記第一のＦｃドメイン単量体および前記第三のＦｃドメイン単量体が、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、本発明1202〜1227のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1229]
前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第四のＦｃドメイン単量体が、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、本発明1202〜1228のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1230]
前記第二のポリペプチドおよび前記第三のポリペプチドが、同じアミノ酸配列を有する、本発明1202から1228のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1231]
前記二量体形成選択モジュールが、Ｆｃドメイン単量体のうちの一つのＣＨ3ドメイン内に改変された空洞と、前記Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ3ドメイン内に改変された突起とを含み、
前記改変された空洞および前記改変された突起が、Ｆｃドメイン単量体の空洞に突起が挿入された対を形成するよう配置されている、
本発明1228または1229のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1232]
前記改変された突起が、Ｓ354Ｃ、Ｔ366Ｗ、Ｔ366Ｙ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394ＦおよびＦ405Ｗからなる群から選択される改変を少なくとも1個含み、前記改変された空洞が、Ｙ349Ｃ、Ｔ366Ｓ、Ｌ368Ａ、Ｙ407Ｖ、Ｙ407Ｔ、Ｙ407Ａ、Ｆ405Ａ、およびＴ394Ｓからなる群から選択される改変を少なくとも1個含む、本発明1231のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1233]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの一つがＹ407ＶおよびＹ349Ｃを含み、前記Ｆｃドメイン単量体の他方がＴ366ＷおよびＳ354Ｃを含む、本発明1228または1229のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1234]
前記二量体形成選択モジュールが、ドメイン単量体のうちの1つのＣＨ3ドメイン内に負電荷をもつアミノ酸と、Ｆｃドメイン単量体のうちの他方のＣＨ3ドメイン内に正電荷をもつアミノ酸とを含み、
前記負電荷をもつアミノ酸および前記正電荷をもつアミノ酸が、Ｆｃドメインの形成を促進するよう配置されている、
本発明1228または1229のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1235]
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｄ399Ｋ、およびＫ409ＤまたはＫ409Ｅのいずれかを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1236]
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｋ392ＤおよびＤ399Ｋを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1237]
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｅ357ＫおよびＫ370Ｅを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1238]
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｄ356ＫおよびＫ439Ｄを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1239]
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｋ392ＥおよびＤ399Ｋを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1240]
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｅ357ＫおよびＫ370Ｄを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1241]
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｄ356ＫおよびＫ439Ｅを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1242]
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｓ354ＣおよびＴ366Ｗを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Ｙ349Ｃ、Ｔ366Ｓ、Ｌ368Ａ、およびＹ407Ｖを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1243]
前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Ｓ354ＣおよびＴ366Ｗを含み、前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体がそれぞれ、Ｙ349Ｃ、Ｔ366Ｓ、Ｌ368Ａ、およびＹ407Ｖを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1244]
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体がそれぞれ、Ｅ357ＫまたはＥ357Ｒを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Ｋ370ＤまたはＫ370Ｅを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1245]
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体が、Ｋ370ＤまたはＫ370Ｅを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Ｅ357Ｋまたは357Ｒを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1246]
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体がそれぞれ、Ｋ409ＤまたはＫ409Ｅを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Ｄ399ＫまたはＤ399Ｒを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1247]
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体が、Ｄ399ＫまたはＤ399Ｒを含み、前記第三および第四のポリペプチドがそれぞれ、Ｋ409ＤまたはＫ409Ｅを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1248]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の1個または複数のリンカーが、結合である、本発明1001および1202〜1247のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1249]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の1個または複数のリンカーが、スペーサーである、本発明1001および1202〜1247のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1250]
前記スペーサーが、以下：
2020514301.tif 000283
の配列を有するポリペプチドを含む、本発明1249のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1251]
前記スペーサーが、グリシンスペーサーである、本発明1249のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1252]
前記スペーサーが、4〜30、8〜30、または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1251のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1253]
前記スペーサーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1252のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1254]
前記抗原結合ドメイン構築体が、リンカーにより前記Ｆｃドメイン単量体に結合されている、本発明1001および1202〜1212のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1255]
前記リンカーが、スペーサーである、本発明1254のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1256]
前記Ｆｃドメインのうちの少なくとも1個が、Ｉ253位にアミノ酸改変を少なくとも1個含む、本発明1001および1202〜1255のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1257]
Ｉ253位の前記アミノ酸改変が独立して、Ｉ253Ａ、Ｉ253Ｃ、Ｉ253Ｄ、Ｉ253Ｅ、Ｉ253Ｆ、Ｉ253Ｇ、Ｉ253Ｈ、Ｉ253Ｉ、Ｉ253Ｋ、Ｉ253Ｌ、Ｉ253Ｍ、Ｉ253Ｎ、Ｉ253Ｐ、Ｉ253Ｑ、Ｉ253Ｒ、Ｉ253Ｓ、Ｉ253Ｔ、Ｉ253Ｖ、Ｉ253Ｗ、およびＩ253Ｙからなる群から選択される、本発明1256のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1258]
Ｉ253位の各アミノ酸改変が、Ｉ253Ａである、本発明1257のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1259]
前記Ｆｃドメインのうちの少なくとも1個が、Ｒ292位にアミノ酸改変を少なくとも1個含む、本発明1001および1202〜1258のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1260]
Ｒ292位の各アミノ酸改変が独立して、Ｒ292Ｄ、Ｒ292Ｅ、Ｒ292Ｌ、Ｒ292Ｐ、Ｒ292Ｑ、Ｒ292Ｒ、Ｒ292Ｔ、およびＲ292Ｙからなる群から選択される、本発明1259のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1261]
Ｒ292位の各アミノ酸改変が、Ｒ292Ｐである、本発明1260のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1262]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの1個または複数が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ2抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ3抗体定常ドメインを含む、本発明1001および1202〜1261のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1263]
前記Ｆｃドメイン単量体のそれぞれが、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ2抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ3抗体定常ドメインを含む、本発明1262のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1264]
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2ａ、ＩｇＧ2ｂ、ＩｇＧ3およびＩｇＧ4からなる群から選択されるサブタイプのＩｇＧである、本発明1262または1263のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1265]
前記第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのそれぞれにおけるＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異されている、本発明1001および1202〜1264のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1266]
前記第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのうちの1個または複数が、Ｃ末端リジンを欠く、本発明1001および1202〜1265のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1267]
前記第一、第二、第三、および第四のポリペプチドのそれぞれが、Ｃ末端リジンを欠く、本発明1266のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1268]
前記ポリペプチドのうちの1個もしくは複数のＮ末端またはＣ末端にリンカーにより結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む、本発明1001および1202〜1267のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1269]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50％が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合されている抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成する、
細胞培養培地。
[本発明1270]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも75％が、前記第一のＦｃドメイン、前記第二のＦｃドメイン、および前記抗原結合ドメインを含む、本発明1269の細胞培養培地。
[本発明1271]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50％が、構造的に同一であり、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも0．1ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、
細胞培養培地。
[本発明1272]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも75％が、構造的に同一である、本発明1271の細胞培養培地。
[本発明1273]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも10ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、本発明1269〜1272のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1274]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも100ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、本発明1269〜1273のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1275]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(ａ）
（1）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
（2）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
（3）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
（4）抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、前記第一のポリペプチド、前記第二のポリペプチド、または前記第三のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、
細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50％が構造的に同一である、工程、および
(ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1276]
実質的に均質なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
組成物。
[本発明1277]
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
本発明1276の組成物。
[本発明1278]
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｅ357ＫおよびＫ370Ｄを含み、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｋ370ＤおよびＥ357Ｋを含む、本発明1277の組成物。
[本発明1279]
実質的に均質なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(ｆ）前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
組成物。
[本発明1280]
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
本発明1279の組成物。
[本発明1281]
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｅ357ＫおよびＫ370Ｄを含み、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、Ｋ370ＤおよびＥ357Ｋを含む、本発明1280の組成物。
[本発明1282]
実質的に均質なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合している抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成する、
組成物。
[本発明1283]
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四のＦｃドメイン単量体および前記第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
本発明1282のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1284]
実質的に均質なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成する、
組成物。
[本発明1285]
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体および前記第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三のＦｃドメイン単量体および前記第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
本発明1284のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1286]
実質的に均質なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む組成物であって、
前記構築体が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｉｖ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、および
(ｖ）前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｖｉ）第四のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、
(ｉｘ）前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、および
(ｘ）前記第五のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(ｇ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインを形成する、組成物。
[本発明1287]
前記第二のＦｃドメイン単量体および第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一および第七のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第七のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四および第八のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第八のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三および第九のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第九のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第六および第十のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第六のＦｃドメイン単量体と前記第十のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
本発明1286のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1288]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1289]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1290]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1291]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50％が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
細胞培養培地。
[本発明1292]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(ａ）
（1）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
（2）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
（3）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
（4）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメインと、
（5）第二のポリペプチドおよび／または第三のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50％が構造的に同一である、工程、および
(ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1293]
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
本発明1288、1289、1290、1291、または1292のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1294]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(ｆ）前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1295]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(ｆ）前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一、第二、および第三の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1296]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(ｆ）前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1297]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50％が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
(ｃ）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）前記第一のポリペプチドに結合した第一の抗原結合ドメインと、
(ｅ）前記第二のポリペプチドに結合した第二の抗原結合ドメインと、
(ｆ）前記第三のポリペプチドに結合した第三の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記第一、第二および第三の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合する、
細胞培養培地。
[本発明1298]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(ａ）
（1）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
（2）第三のＦｃドメイン単量体を含む第二のポリペプチドと、
（3）第四のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
（4）第一のポリペプチドに結合された第一の抗原結合ドメインと、
（5）第二のポリペプチドに結合された第二の抗原結合ドメインと、
（6）第三のポリペプチドに結合された第三の抗原結合ドメインと、
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、
前記抗原結合ドメインが、第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、または第三のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、
前記第一および第二の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合し、
細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50％が構造的に同一である、工程、および
(ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1299]
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のポリペプチドと前記第三のポリペプチドが、異なるアミノ酸配列を有する、
本発明1294、1295、1296、1297または1298のいずれかの組成物。
[本発明1300]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1301]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、
単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1302]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1303]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50％が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成する、
細胞培養培地。
[本発明1304]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(ａ）
（1）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
（2）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
（3）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
（4）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
（5）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、
細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50％が構造的に同一である、工程、および
(ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1305]
前記第一のＦｃドメイン単量体および第三のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体および前記第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第四のＦｃドメイン単量体および前記第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
本発明1300、1301、1302、1303、または1304のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1306]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1307]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、
単一のＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1308]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のスペーサー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のスペーサー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成する、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1309]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地であって、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50％が、
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成する、細胞培養培地。
[本発明1310]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を作製する方法であって、以下の工程を含む、方法：
(ａ）
（1）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、および
(ｉｉｉ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
（2）以下：
(ｉｖ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｖ）第四のＦｃドメイン単量体、および
(ｖｉ）前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
（3）第五のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
（4）第六のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
（5）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、または第四のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養する工程であって、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモルベースで少なくとも50％が構造的に同一である、工程、および
(ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製する工程。
[本発明1311]
前記第二のＦｃドメイン単量体および第四のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第四のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第一のＦｃドメイン単量体および前記第五のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含み、
前記第三のＦｃドメイン単量体および前記第六のＦｃドメイン単量体のそれぞれが、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体の間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択モジュールを含む、
本発明1306、1307、1308、1309、または1310のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1312]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｉｖ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、および
(ｖ）前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｖｉｉ）第四のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉｉ）第六のＦｃドメイン単量体、
(ｉｘ）前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体を結合させる第三のリンカー、および
(ｘ）前記第五のＦｃドメイン単量体と前記第六のＦｃドメイン単量体を結合させる第四のリンカー
を含む、第二のポリペプチドと、
(ｃ）第七のＦｃドメイン単量体を含む第三のポリペプチドと、
(ｄ）第八のＦｃドメイン単量体を含む第四のポリペプチドと、
(ｅ）第九のＦｃドメイン単量体を含む第五のポリペプチドと、
(ｆ）第十のＦｃドメイン単量体を含む第六のポリペプチドと、
(ｇ）前記第一のポリペプチド、第二のポリペプチド、第三のポリペプチド、第四のポリペプチド、第五のポリペプチド、または第六のポリペプチドに結合した抗原結合ドメインと
を含み、
前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第五のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第一のＦｃドメインを形成し、前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第七のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第二のＦｃドメインを形成し、前記第四のＦｃドメイン単量体と前記第八のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第三のＦｃドメインを形成し、前記第三のＦｃドメイン単量体と前記第九のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第四のＦｃドメインを形成し、前記第六の単量体と前記第十のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第五のＦｃドメインを形成し、
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、一つのＦｃドメインおよび抗原結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1313]
(ａ）以下：
(ｉ）第一のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉ）第二のＦｃドメイン単量体、
(ｉｉｉ）第三のＦｃドメイン単量体、
(ｉｖ）前記第一のＦｃドメイン単量体と前記第二のＦｃドメイン単量体を結合させる第一のリンカー、および
(ｖ）前記第二のＦｃドメイン単量体と前記第三のＦｃドメイン単量体を結合させる第二のリンカー
を含む、第一のポリペプチドと、
(ｂ）以下：
(ｖｉ）第四のＦｃドメイン単量体、
(ｖｉｉ）第五のＦｃドメイン単量体、