(57)【要約】  本発明は、各々が、重鎖可変領域であるＶＨと、軽鎖可変領域であるＶＬとを伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの結合性ドメインが、ＶＨＡ内のＣＤＲＨ３がＲＹＹＳＡＭＰＦＡＹ（配列番号１２９）以外であるという条件で、５位におけるバリン、１３位におけるリシン、２４位におけるアラニン、及び９６位におけるトレオニンを含むフレームワークを有する、重鎖可変領域であるＶＨＡと、１１位におけるロイシン、及び１０３位におけるグルタミンを含むフレームワークを有する、軽鎖可変領域であるＶＬＡとを含むことを特徴とする上記多特異性抗体分子を提供する。
2020502181.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
各々が、重鎖可変領域であるＶＨと、軽鎖可変領域であるＶＬとを伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの結合性ドメインが、ＶＨＡ内のＣＤＲＨ３がＲＹＹＳＡＭＰＦＡＹ（配列番号１２９）以外であるという条件で、５位におけるバリン、１３位におけるリシン、２４位におけるアラニン、及び９６位におけるトレオニンを含むフレームワークを有する、重鎖可変領域であるＶＨＡと、１１位におけるロイシン、及び１０３位におけるグルタミンを含むフレームワークを有する、軽鎖可変領域であるＶＬＡとを含むことを特徴とする上記多特異性抗体分子。
【請求項２】
少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、４８位におけるバリン、７８位におけるロイシン、８６位におけるリシン、８７位におけるトレオニン、及び９７位におけるトレオニンのうちの１又は複数をさらに含むフレームワークを有する、請求項１に記載の多特異性抗体分子。
【請求項３】
少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡが、１位におけるアラニン及び４位におけるロイシンのうちの１又は複数をさらに含むフレームワークを有する、請求項１又は請求項２に記載の多特異性抗体分子。
【請求項４】
少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、７１位におけるバリン、７４位におけるアラニン、７７位におけるセリン、及び７８位におけるアラニンのうちの１又は複数をさらに含むフレームワークを有する、請求項１に記載の多特異性抗体分子。
【請求項５】
少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡが、４４位におけるバリン、６６位におけるトレオニン、７２位におけるチロシン、８４位におけるバリン、８８位におけるフェニルアラニン、及び１０７位におけるロイシンのうちの１又は複数をさらに含むフレームワークを有する、請求項１又は請求項２に記載の多特異性抗体分子。
【請求項６】
少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号１４１［配列中、Ｘ９は、Ｖ又はＩである］、ＦＲ３についての配列番号１４２［配列中、Ｘ１０は、Ｒ又はＶであり、Ｘ１１は、Ｄ又はＫであり、Ｘ１２は、Ｓ又はＡであり、Ｘ１３は、Ｔ又はＳであり、Ｘ１４は、Ｌ又はＡであり、Ｘ１５は、Ｋ又はＲであり、Ｘ１６は、Ｔ又はＡであり、Ｘ１７は、Ｔ又はＲである］、及びＦＲ４についての配列番号５を含むフレームワークを有する、請求項１に記載の多特異性抗体分子。
【請求項７】
ＶＨＡが、ＶＬＡと対合し、ＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号１３７［配列中、Ｘ１は、Ａ又はＤであり、Ｘ２は、Ｌ又はＭである］、ＦＲ２についての配列番号１３８［配列中、Ｘ３は、Ａ又はＶである］、ＦＲ３についての配列番号１３９［配列中、Ｘ４は、Ｓ又はＴであり、Ｘ５は、Ｆ又はＹであり、Ｘ６は、Ｆ又はＶであり、Ｘ７は、Ｙ又はＦである］、及びＦＲ４についての配列番号１４０［配列中、Ｘ８は、Ｖ又はＬである］を含むフレームワークを有する、請求項６に記載の多特異性抗体分子。
【請求項８】
少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号２若しくは３、ＦＲ３についての配列番号４、及びＦＲ４についての配列番号５、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのいずれか１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有する、請求項１に記載の多特異性抗体分子。
【請求項９】
ＶＨＡが、ＶＬＡと対合し、ＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９又は１０を含むフレームワークを有する、請求項８に記載の多特異性抗体分子。
【請求項１０】
少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９若しくは１０、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのいずれか１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有する、請求項１に記載の多特異性抗体分子。
【請求項１１】
ＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９又は１０を含むフレームワークを有する、請求項１０に記載の多特異性抗体分子。
【請求項１２】
ＶＬＡが、配列番号９８を含み、ＶＨＡが、配列番号１００を含むか、又はＶＬＡが、配列番号９９を含み、ＶＨＡが、配列番号１０１を含む、請求項８から１２までのいずれか一項に記載の多特異性抗体分子。
【請求項１３】
１つの結合性ドメインが、配列番号１０６を含む、請求項１２に記載の多特異性抗体分子。
【請求項１４】
少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、ＦＲ１についての配列番号１６、ＦＲ２についての配列番号１７若しくは１８、ＦＲ３についての配列番号１９、及びＦＲ４についての配列番号２０、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのいずれか１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有する、請求項１に記載の多特異性抗体分子。
【請求項１５】
ＶＨＡが、ＶＬＡと対合し、ＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４又は１５を含むフレームワークを有する、請求項１４に記載の多特異性抗体分子。
【請求項１６】
少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４若しくは１５、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのいずれか１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有する、請求項１に記載の多特異性抗体分子。
【請求項１７】
ＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４又は１５を含むフレームワークを有する、請求項１６に記載の多特異性抗体分子。
【請求項１８】
ＶＨＡが、ＣＤＲＨ１についての配列番号１４３、ＣＤＲＨ２についての配列番号１４４、及びＣＤＲＨ３についての配列番号１４５において与えられる配列を有する、３つの重鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載の多特異性抗体分子。
【請求項１９】
ＶＬＡが、ＣＤＲＬ１についての配列番号１４６、ＣＤＲＬ２についての配列番号１４７、及びＣＤＲＬについての配列番号１４８において与えられる配列を有する、３つの軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１から１８までのいずれか一項に記載の多特異性抗体分子。
【請求項２０】
ＶＬＡが、配列番号１０２を含み、ＶＨＡが、配列番号１０４を含むか、又はＶＬＡが、配列番号１０３を含み、ＶＨＡが、配列番号１０５を含む、請求項１４から１９までのいずれか一項に記載の多特異性抗体分子。
【請求項２１】
１つの結合性ドメインが、配列番号１１１を含む、請求項２０に記載の多特異性抗体分子。
【請求項２２】
ＣＤＲが、ヒト以外の由来である、請求項１から２１までのいずれか一項に記載の多特異性抗体分子。
【請求項２３】
抗体分子が、二特異性など、二特異性又は三特異性である、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の多特異性抗体分子。
【請求項２４】
抗体分子フォーマットが、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ又はＦａｂ−（ｄｓｓｃＦｖ）２である、請求項２３に記載の多特異性抗体分子。
【請求項２５】
多特異性抗体における凝集を最小化するためのアクセプターフレームワークであって、配列番号２１及び配列番号２３又は配列番号２２及び２４を含み、ＣＤＲ位置の各々におけるＸＸＸが、独立に、１〜３５アミノ酸を表す、上記アクセプターフレームワーク。
【請求項２６】
各可変領域が、フレームワークと、３つずつのＣＤＲとを有する、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも１つの結合性ドメインを有する抗体分子の単量体発現のレベルを改善する方法であって、可変領域のフレームワークを、
ｉ）ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号２又は３、ＦＲ３についての配列番号４、及びＦＲ４についての配列番号５を含むフレームワーク（ＶＨ領域のフレームワークなど）；
ｉｉ）ＦＲ１についての配列番号１６、ＦＲ２についての配列番号１７又は１８、ＦＲ３についての配列番号１９、及びＦＲ４についての配列番号２０を含むフレームワーク（ＶＨ領域のフレームワークなど）；
ｉｉｉ）ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９又は１０を含むフレームワーク（ＶＬ領域のフレームワークなど）；
ｉｖ）ＶＬ１、ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４又は１５を含むフレームワーク（ＶＬ領域のフレームワークなど）；
ｖ）これらの組合せ；並びに
ｖｉ）全フレームワーク内の、１、２、３、４、又は５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのいずれか１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらのうちのいずれか１つの誘導体
を含むか、又はこれらからなる群から選択されるフレームワークへと変化させるステップを含む、上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、凝集への傾向を低減したフレームワークを含む抗体分子、及びこれを作出するための方法に関する。本開示はまた、本開示の抗体分子を含む医薬組成物、及びこれらのうちのいずれか１つの、処置における使用も関する。本開示はさらに、方法から得られる抗体分子にも拡張される。
【背景技術】
【０００２】
２つの抗原に同時に結合することによって、二特異性抗体は、新規の生物学的過程を惹起することが可能であり、薬物ターゲティングの改善を介して、臨床的有効性の増強をもたらしうる。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、多種多様なフォーマットで多特異性を付与するために、Ｆａｂ又はＩｇＧによる足場への融合が行われてきた個別の抗原結合性ドメイン（Ｓｐｉｅｓｓら、２０１５において総説されている）である。ｖＨと、ｖＬとの間のポリペプチドリンカーの導入を介する、Ｆｖの、ｓｃＦｖへの転換は、当初は、比較的脆弱なｖＨ−ｖＬ間界面を安定化させるために実行されたが、近接するｓｃＦｖ単量体の間の動的ドメイン交換（「ブリージング」）は、様々なレベルの単量体、二量体、及び高次多量体を結果としてもたらしうる（Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌら、２０１２）。したがって、タンパク質発現時における、高レベルの多量体の形成は、最終的に、全体的な治療用タンパク質収率の低下を結果としてもたらすであろう。
【０００３】
ｓｃＦｖの、ｖＨとｖＬとの間のジスルフィド（ｄｓ）結合の形成は、精製ｓｃＦｖ内の、可変ドメインの「ブリージング」を防止し、したがって、単量体：多量体比を固定して、単量体生成物の精製を可能とする（Ｗｅａｔｈｅｒｉｌｌら、２０１２）。ｖＨ−ｖＬジスルフィド結合の導入は、発現／精製時に、全ての多量体形態を、不可逆的に固定し、したがって、精製による、所望される（単量体の）分子種の、所望されない（多量体の）分子種からの分離を容易とする。したがって、ジスルフィド結合の存在は、発現する単量体の量を最適化するのではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
しかしながら、当技術分野では、多特異性抗体の単量体収率を改善するための、新たな手段を提供することが、引き続き必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、各々が、重鎖可変領域であるＶＨと、軽鎖可変領域であるＶＬとを伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの結合性ドメインが、ＶＨＡ内のＣＤＲＨ３がＲＹＹＳＡＭＰＦＡＹ（配列番号１２９）以外であるという条件で、５位におけるバリン、１３位におけるリシン、２４位におけるアラニン、及び９６位におけるトレオニンを含むフレームワークを有する、重鎖可変領域であるＶＨＡと、１１位におけるロイシン、及び１０３位におけるグルタミンを含むフレームワークを有する、軽鎖可変領域であるＶＬＡとを含むことを特徴とする上記多特異性抗体分子を提示する。一実施形態では、ＶＨＡ内のＣＤＲＨ３はまた、ＰＰＱＹＹＥＧＳＩＹＲＬＷＦＡＨ（配列番号１１７）以外のＣＤＲＨ３でもある。一実施形態では、ＶＬＡ内のＣＤＲＬ３は、ＱＱＮＹＤＦＰＬＴ（配列番号１３６）又はＱＱＴＷＳＤＰＷＴ（配列番号１２０）以外である。
【０００６】
本開示は、以下の段落にまとめられる。
１．各々が、重鎖可変領域であるＶＨと、軽鎖可変領域であるＶＬとを伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの結合性ドメインが、ＶＨＡ内のＣＤＲＨ３がＲＹＹＳＡＭＰＦＡＹ（配列番号１２９）以外であるという条件で、５位におけるバリン、１３位におけるリシン、２４位におけるアラニン、及び９６位におけるトレオニンを含むフレームワークを有する、重鎖可変領域であるＶＨＡと、１１位におけるロイシン、及び１０３位におけるグルタミンを含むフレームワークを有する、軽鎖可変領域であるＶＬＡとを含むことを特徴とする上記多特異性抗体分子。
２．少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、４８位におけるバリン、７８位におけるロイシン、８６位におけるリシン、８７位におけるトレオニン、及び９７位におけるトレオニンのうちの１又は複数をさらに含むフレームワークを有する、段落１に従う多特異性抗体分子。
３．少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡが、１位におけるアラニン及び４位におけるロイシンのうちの１又は複数をさらに含むフレームワークを有する、段落１又は段落２に従う多特異性抗体分子。
４．少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、７１位におけるバリン、７４位におけるアラニン、７７位におけるセリン、及び７８位におけるアラニンのうちの１又は複数をさらに含むフレームワークを有する、段落１に従う多特異性抗体分子。
５．少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡが、４４位におけるバリン、６６位におけるトレオニン、７２位におけるチロシン、８４位におけるバリン、８８位におけるフェニルアラニン、及び１０７位におけるロイシンのうちの１又は複数をさらに含むフレームワークを有する、段落１又は段落２に従う多特異性抗体分子。
６．少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号１４１［配列中、Ｘ９は、Ｖ又はＩである］、ＦＲ３についての配列番号１４２［配列中、Ｘ１０は、Ｒ又はＶであり、Ｘ１１は、Ｄ又はＫであり、Ｘ１２は、Ｓ又はＡであり、Ｘ１３は、Ｔ又はＳであり、Ｘ１４は、Ｌ又はＡであり、Ｘ１５は、Ｋ又はＲであり、Ｘ１６は、Ｔ又はＡであり、Ｘ１７は、Ｔ又はＲである］、及びＦＲ４についての配列番号５を含むフレームワークを有する、段落１に従う多特異性抗体分子。
７．ＶＨＡが、ＶＬＡと対合し、ＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号１３７［配列中、Ｘ１は、Ａ又はＤであり、Ｘ２は、Ｌ又はＭである］、ＦＲ２についての配列番号１３８［配列中、Ｘ３は、Ａ又はＶである］、ＦＲ３についての配列番号１３９［配列中、Ｘ４は、Ｓ又はＴであり、Ｘ５は、Ｆ又はＹであり、Ｘ６は、Ｆ又はＶであり、Ｘ７は、Ｙ又はＦである］、及びＦＲ４についての配列番号１４０［配列中、Ｘ８は、Ｖ又はＬである］を含むフレームワークを有する、段落６に従う多特異性抗体分子。
８．少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号２若しくは３、ＦＲ３についての配列番号４、及びＦＲ４についての配列番号５、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有する、段落１に従う多特異性抗体分子。
９．ＶＨＡが、ＶＬＡと対合し、ＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９又は１０を含むフレームワークを有する、段落８に従う多特異性抗体分子。
１０．少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９若しくは１０、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有する、段落１に従う多特異性抗体分子。
１１．ＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９又は１０を含むフレームワークを有する、段落１０に従う多特異性抗体分子。
１２．ＶＬＡが、配列番号９８を含み、ＶＨＡが、配列番号１００を含むか、又はＶＬＡが、配列番号９９を含み、ＶＨＡが、配列番号１０１を含む、段落８から１２までのいずれかに従う多特異性抗体分子。
１３．１つの結合性ドメインが、配列番号１０６を含む、段落１２に従う多特異性抗体分子。
１４．少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、ＦＲ１についての配列番号１６、ＦＲ２についての配列番号１７若しくは１８、ＦＲ３についての配列番号１９、及びＦＲ４についての配列番号２０、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有する、段落１に従う多特異性抗体分子。
１５．ＶＨＡが、ＶＬＡと対合し、ＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４又は１５を含むフレームワークを有する、段落１４に従う多特異性抗体分子。
１６．少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４若しくは１５、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有する、段落１に従う多特異性抗体分子。
１７．ＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４又は１５を含むフレームワークを有する、段落１６に従う多特異性抗体分子。
１８．ＶＨＡが、ＣＤＲＨ１についての配列番号１４３、ＣＤＲＨ２についての配列番号１４４、及びＣＤＲＨ３についての配列番号１４５において与えられる配列を有する、３つの重鎖ＣＤＲを含む、段落１から１７までのいずれかに従う多特異性抗体分子。
１９．ＶＬＡが、ＣＤＲＬ１についての配列番号１４６、ＣＤＲＬ２についての配列番号１４７、及びＣＤＲＬについての配列番号１４８において与えられる配列を有する、３つの軽鎖ＣＤＲを含む、段落１から１８までのいずれかに従う多特異性抗体分子。
２０．ＶＬＡが、配列番号１０２を含み、ＶＨＡが、配列番号１０４を含むか、又はＶＬＡが、配列番号１０３を含み、ＶＨＡが、配列番号１０５を含む、段落１４から１９までのいずれかに従う多特異性抗体分子。
２１．１つの結合性ドメインが、配列番号１１１を含む、段落２０に従う多特異性抗体分子。
２２．ＣＤＲが、ヒト以外の由来である、段落１から２１までのいずれかに従う多特異性抗体分子。
２３．抗体分子が、二特異性など、二特異性又は三特異性である、段落１から２２までのいずれかに従う多特異性抗体分子。
２４．抗体分子フォーマットが、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ又はＦａｂ−（ｄｓｓｃＦｖ）２である、段落２３に従う多特異性抗体分子。
２５．多特異性抗体における凝集を最小化するためのアクセプターフレームワークであって、配列番号２１及び配列番号２３又は配列番号２２及び２４を含み、ＣＤＲ位置の各々におけるＸＸＸが、独立に、１〜３５アミノ酸を表す、上記アクセプターフレームワーク。
２６．各可変領域が、フレームワークと、３つずつのＣＤＲとを有する、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも１つの結合性ドメインを有する抗体分子の単量体発現のレベルを改善する方法であって、可変領域のフレームワークを、
ｉ）ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号２又は３、ＦＲ３についての配列番号４、及びＦＲ４についての配列番号５を含むフレームワーク（ＶＨ領域のフレームワークなど）；
ｉｉ）ＦＲ１についての配列番号１６、ＦＲ２についての配列番号１７又は１８、ＦＲ３についての配列番号１９、及びＦＲ４についての配列番号２０を含むフレームワーク（ＶＨ領域のフレームワークなど）；
ｉｉｉ）ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９又は１０を含むフレームワーク（ＶＬ領域のフレームワークなど）；
ｉｖ）ＶＬ１、ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４又は１５を含むフレームワーク（ＶＬ領域のフレームワークなど）；
ｖ）これらの組合せ；並びに
ｖｉ）全フレームワーク内の、１、２、３、４、又は５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらのうちのいずれか１つの誘導体
を含むか、又はこれらからなる群から選択されるフレームワークへと変化させるステップを含む上記方法。
２７．ＶＨフレームワークを、ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号２又は３、ＦＲ３についての配列番号４、及びＦＲ４についての配列番号５を含むフレームワークへと変化させる、段落２６に従う方法。
２８．ＶＨフレームワークを、ＦＲ１についての配列番号１６、ＦＲ２についての配列番号１７又は１８、ＦＲ３についての配列番号１９、及びＦＲ４４についての配列番号２０を含むフレームワークへと変化させる、段落２６に従う方法。
２９．ＶＬフレームワークを、ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９又は１０を含むフレームワークへと変化させる、段落２６から２８までのいずれか１つに従う方法。
３０．ＶＬフレームワークを、ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４又は１５を含むフレームワークへと変化させる、段落２６から２８までのいずれか１つに従う方法。
３１．抗体分子の単量体のレベルを、フレームワーク（単数又は複数）を変化させる前に解析する、段落２６から２８までのいずれか１つに従う方法。
３２．抗体分子の単量体のレベルを、フレームワーク（単数又は複数）を変化させた後で解析する、段落２６から２８までのいずれか１つに従う方法。
３３．抗体分子が、二特異性抗体分子など、多特異性抗体分子である、段落２６から３２までのいずれか１つに従う方法。
３４．多特異性抗体分子が、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ又はＦａｂ−（ｄｓｓｃＦｖ）２である、段落２９に従う方法。
３５．フレームワーク（単数又は複数）が、それらのうちのいずれか１つがｓｃＦｖ又はＦｖ内におけるものであり、二特異性抗体分子などの多特異性抗体分子の一部である場合を含む、段落２６から３４までのいずれか１つに従う方法。
３６．多特異性抗体分子が、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、方法が、抗体分子内の結合性ドメインの相対位置を変化させる、さらなるステップを含む、段落３３から３５までのいずれか１つに従う方法。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】「セット１」に含まれるフォーマットを明示する表である。
【図２ａ】本発明に従う配列を明示する図である。
【図２ｂ】本発明に従う配列を明示する図である。
【図３】セット１：ＥｘｐｉＨＥＫ細胞（ｎ＝２）内で発現させた、Ｆａｂ及びＢＹｂｅ（コグネイトフレームワーク）の発現力価を示す図である。
【図４】セット１のＦａｂ及びＢＹｂｅ（コグネイト対）の単量体％を示す図である。
【図５】セット１のＦａｂ：全長Ｆａｂ（ａ）、並びに軽鎖及び重鎖（ｂ）についてのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図６】セット１のＢＹｂｅについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す図である。
【図７】Ｆａｂ−ｄｓＦｖフォーマット及びＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖフォーマット並びに単量体形態及び二量体形態を示す図である。
【図８】Ｆａｂ−２×ｄｓｓｃＦｖフォーマット及びＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖフォーマットを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
本発明者らは、ある範囲の、Ｆｖ  ＦＷ／ＣＤＲを「スワッピング」した、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖのグラフティングを介して、ｄｓｓｃＦｖのフレームワーク（ＦＷ）残基及びＣＤＲ残基による、多量体化に対する影響について探索した。驚くべきことに、本発明者らは、ある特定のフレームワークが、達成される単量体レベルに対して、ポジティブな影響を及ぼしうることを見出した。
【０００９】
本開示は、各々が、重鎖可変領域であるＶＨと、軽鎖可変領域であるＶＬとを伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの結合性ドメインが、ＶＨＡ内のＣＤＲＨ３がＲＹＹＳＡＭＰＦＡＹ（配列番号１２９）以外であるという条件で、５位におけるバリン、１３位におけるリシン、２４位におけるアラニン、及び９６位におけるトレオニンを含むフレームワークを有する、重鎖可変領域であるＶＨＡと、１１位におけるロイシン、及び１０３位におけるグルタミンを含むフレームワークを有する、軽鎖可変領域であるＶＬＡとを含むことを特徴とする上記多特異性抗体分子を提示する。一実施形態では、ＶＨＡ内のＣＤＲＨ３はまた、ＰＰＱＹＹＥＧＳＩＹＲＬＷＦＡＨ（配列番号１１７）以外のＣＤＲＨ３でもある。一実施形態では、ＶＬＡ内のＣＤＲＬ３は、ＱＱＮＹＤＦＰＬＴ（配列番号１３６）又はＱＱＴＷＳＤＰＷＴ（配列番号１２０）以外である。
【００１０】
一実施形態では、少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡは、４８位におけるバリン、７８位におけるロイシン、８６位におけるリシン、８７位におけるトレオニン、及び９７位におけるトレオニンのうちの１又は複数をさらに含むフレームワークを有する。
【００１１】
本発明の一実施形態では、少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡは、１位におけるアラニン及び４位におけるロイシンのうちの１又は複数をさらに含むフレームワークを有する。
【００１２】
したがって、本発明は、表１における、４９７フレームワーク残基の、以下：
【表１】
2020502181.tif 000003
の組合せのうちの１つを有する、ＶＨＡ可変領域及びＶＬＡ可変領域を含む多特異性抗体を提供する。
【００１３】
代替的実施形態では、少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡは、７１位におけるバリン、７４位におけるアラニン、７７位におけるセリン、及び７８位におけるアラニンのうちの１又は複数をさらに含むフレームワークを有する。
【００１４】
一実施形態では、少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡは、４４位におけるバリン、６６位におけるトレオニン、７２位におけるチロシン、８４位におけるバリン、８８位におけるフェニルアラニン、及び１０７位におけるロイシンのうちの１又は複数をさらに含むフレームワークを有する。
【００１５】
したがって、本発明は、表２における、２１０９フレームワーク残基の、以下：
【表２】
2020502181.tif 000004
の組合せのうちの１つを有する、ＶＨＡ可変領域及びＶＬＡ可変領域を含む多特異性抗体を提供する。
【００１６】
本発明のさらなる実施形態では、少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、ＶＨＡ内のＣＤＲＨ３がＲＹＹＳＡＭＰＦＡＹ（配列番号１２９）以外であるという条件で、ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号１４１［配列中、Ｘ９は、Ｖ又はＩである］、ＦＲ３についての配列番号１４２［配列中、Ｘ１０は、Ｒ又はＶであり、Ｘ１１は、Ｄ又はＫであり、Ｘ１２は、Ｓ又はＡであり、Ｘ１３は、Ｔ又はＳであり、Ｘ１４は、Ｌ又はＡであり、Ｘ１５は、Ｋ又はＲであり、Ｘ１６は、Ｔ又はＡであり、Ｘ１７は、Ｔ又はＲである］、及びＦＲ４についての配列番号５を含むフレームワークを有する多特異性抗体が提示される。
【００１７】
この態様の一実施形態では、ＶＨＡが、ＶＬＡと対合し、ＶＬＡは、ＦＲ１についての配列番号１３７［配列中、Ｘ１は、Ａ又はＤであり、Ｘ２は、Ｌ又はＭである］、ＦＲ２についての配列番号１３８［配列中、Ｘ３は、Ａ又はＶである］、ＦＲ３についての配列番号１３９［配列中、Ｘ４は、Ｓ又はＴであり、Ｘ５は、Ｆ又はＹであり、Ｘ６は、Ｆ又はＶであり、Ｘ７は、Ｙ又はＦである］、及びＦＲ４についての配列番号１４０［配列中、Ｘ８は、Ｖ又はＬである］を含むフレームワークを有する。一実施形態では、ＶＬＡ内のＣＤＲＨ３は、ＱＱＮＹＤＦＰＬＴ（配列番号１３６）又はＱＱＴＷＳＤＰＷＴ（配列番号１２０）以外である。
【００１８】
本発明において記載される、ＶＨＡフレームワーク及びＶＬＡフレームワークの残基及び配列を有する多特異性抗体分子は、任意の適切なＣＤＲ残基を含みうる。一実施形態では、多特異性抗体分子は、ＣＤＲＨ１についての配列番号１４３、ＣＤＲＨ２についての配列番号１４４、及びＣＤＲＨ３についての配列番号１４５において与えられる配列を有する、ＶＨＡ内の、３つの重鎖ＣＤＲを含む。さらなる実施形態では、多特異性抗体分子は、ＣＤＲＬ１についての配列番号１４６、ＣＤＲＬ２についての配列番号１４７、及びＣＤＲＬ３についての配列番号１４８において与えられる配列を有する、ＶＬＡ内の、３つの軽鎖ＣＤＲを含む。一実施形態では、多特異性抗体分子は、ＣＤＲＨ１についての配列番号１４３、ＣＤＲＨ２についての配列番号１４４、及びＣＤＲＨ３についての配列番号１４５において与えられる配列を有する、ＶＨＡ内の、３つの重鎖ＣＤＲと、ＣＤＲＬ１についての配列番号１４６、ＣＤＲＬ２についての配列番号１４７、及びＣＤＲＬ３についての配列番号１４８において与えられる配列を有する、ＶＬＡ内の、３つの軽鎖ＣＤＲとを含む。
【００１９】
本発明のさらなる実施形態では、多特異性抗体は、４９７フレームワーク配列を含む。
【００２０】
したがって、本開示は、各々が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号２若しくは３、ＦＲ３についての配列番号４、及びＦＲ４についての配列番号５、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有することを特徴とする上記多特異性抗体分子を提示する。一実施形態では、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も１カ所を超えない。
【００２１】
一実施形態では、各々が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号２又は３、ＦＲ３についての配列番号４、及びＦＲ４についての配列番号５を含むフレームワークを有することを特徴とする上記多特異性抗体分子が提供される。
【００２２】
一実施形態では、ＶＨＡが、ＶＬＡと対合し、ＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９又は１０を含むフレームワークを有する、本開示に従う多特異性抗体分子が提供される。
【００２３】
一実施形態では、各々が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９若しくは１０、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有することを特徴とする上記多特異性抗体分子が提供される。一実施形態では、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も１カ所を超えない。
【００２４】
一実施形態では、ＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９又は１０を含むフレームワークを有する、本開示に従う多特異性抗体分子が提供される。
【００２５】
一実施形態では、ＶＨＡが、ＶＬＡと対合し、ＶＨＡが、配列番号２１を含むフレームワークを有し、且つ、ＶＬＡが、配列番号２３を含むフレームワークを有するか、又はＶＨＡが、配列番号２２を含むフレームワークを有し、且つ、ＶＬＡが、配列番号２４を含むフレームワークを有し、ＣＤＲ位置の各々におけるＸＸＸが、独立に、例えば、ｓｃＦｖ又はこれを含む分子における使用のための、１〜３５アミノ酸を表す、本開示に従う多特異性抗体分子が提供される。
【００２６】
本開示の一実施形態では、凝集を最小化するためのアクセプターフレームワークであって、配列番号２１及び配列番号２３又は配列番号２２及び配列番号２４を含み、ＣＤＲ位置の各々におけるＸＸＸが、独立に、例えば、ｓｃＦｖ又はこれを含む分子における使用のための、１〜３５アミノ酸を表す、上記アクセプターフレームワークが提示される。
【００２７】
本開示の一実施形態では、各々が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、１つの可変領域であるＶＨＡが、可変領域であるＶＬＡと対合し、表３における、ＶＨＡのアミノ酸配列及びＶＬＡのアミノ酸配列の、以下：
【表３】
2020502181.tif 000005
の組合せのうちの１つを有することを特徴とする上記多特異性抗体分子が提示される。
【００２８】
独立の態様では、本開示は、配列番号１０６又は配列番号１０７を含むｓｃＦｖ抗体を提示する。一実施形態では、ｓｃＦｖ抗体は、ＢＹｂｅ又はＴｒＹｂｅなど、多特異性抗体の一部である。
【００２９】
本発明の代替的実施形態では、下記で記載される、２１０９フレームワーク配列を含む、重鎖可変領域であるＶＨＡと、軽鎖可変領域であるＶＬＡとを伴う、少なくとも１つの結合性ドメインが提示される。
【００３０】
本発明のこの態様についての、さらなる実施形態では、多特異性抗体は、２１０９フレームワーク配列を含む。したがって、本発明は、各々が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、ＶＨＡ内のＣＤＲＨ３がＲＹＹＳＡＭＰＦＡＹ（配列番号１２９）又はＰＰＱＹＹＥＧＳＩＹＲＬＷＦＡＨ（配列番号１１７）以外であるという条件で、ＦＲ１についての配列番号１６、ＦＲ２についての配列番号１７若しくは１８、ＦＲ３についての配列番号１９、及びＦＲ４についての配列番号２０、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有することを特徴とする上記多特異性抗体分子を提供する。一実施形態では、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も１カ所を超えない。
【００３１】
本開示は、各々が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、ＶＨＡ内のＣＤＲＨ３がＲＹＹＳＡＭＰＦＡＹ（配列番号１２９）又はＰＰＱＹＹＥＧＳＩＹＲＬＷＦＡＨ（配列番号１１７）以外であるという条件で、ＦＲ１についての配列番号１６、ＦＲ２についての配列番号１７又は１８、ＦＲ３についての配列番号１９、及びＦＲ４についての配列番号２０を含むフレームワークを有することを特徴とする上記多特異性抗体分子を提示する。
【００３２】
一実施形態では、ＶＨＡが、ＶＬＡと対合し、ＶＬＡが、ＶＬＡ内のＣＤＲＨ３がＱＱＮＹＤＦＰＬＴ（配列番号１３６）又はＱＱＴＷＳＤＰＷＴ（配列番号１２０）以外であるという条件で、ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４又は１５を含むフレームワークを有する、本開示に従う多特異性抗体分子が提供される。
【００３３】
一実施形態では、各々が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡが、ＶＬＡ内のＣＤＲＬ３がＱＱＮＹＤＦＰＬＴ（配列番号１３６）又はＱＱＴＷＳＤＰＷＴ（配列番号１２０）以外であるという条件で、ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４若しくは１５、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有することを特徴とする上記多特異性抗体分子が提供される。一実施形態では、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も１カ所を超えない。
【００３４】
一実施形態では、各々が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡが、ＶＬＡ内のＣＤＲＬ３がＱＱＮＹＤＦＰＬＴ（配列番号１３６）又はＱＱＴＷＳＤＰＷＴ（配列番号１２０）以外であるという条件で、ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４又は１５を含むフレームワークを有することを特徴とする上記多特異性抗体分子が提供される。
【００３５】
一実施形態では、ＶＨＡが、ＶＬＡと対合し、ＶＨＡが、配列番号２７を含むフレームワークを有し、且つ、ＶＬＡが、配列番号２５を含むフレームワークを有するか、又はＶＨＡが、配列番号２８を含むフレームワークを有し、且つ、ＶＬＡが、配列番号２６を含むフレームワークを有し、ＣＤＲ位置の各々におけるＸＸＸが、独立に、例えば、ｓｃＦｖ又はこれを含む分子における使用のための、１〜３５アミノ酸を表す本開示に従う多特異性抗体分子が提供される。
【００３６】
一実施形態では、本開示は、凝集を最小化するためのアクセプターフレームワークであって、配列番号２５及び配列番号２７又は配列番号２６及び２８を含み、ＣＤＲ位置の各々におけるＸＸＸが、独立に、例えば、ｓｃＦｖ又はこれを含む分子における使用のための、１〜３５アミノ酸を表す、上記アクセプターフレームワークを提示する。
【００３７】
第２の態様の実施形態では、本開示は、各々が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、１つの可変領域であるＶＨＡが、可変領域であるＶＬＡと対合し、ＶＨＡのアミノ酸配列及びＶＬＡのアミノ酸配列の、以下：
【表４】
2020502181.tif 000006
の組合せのうちの１つを有することを特徴とする上記多特異性抗体分子を提示する。
【００３８】
独立の態様では、本開示は、配列番号１１１又は配列番号１１２を含むｓｃＦｖ抗体を提示する。一実施形態では、ｓｃＦｖ抗体は、ＢＹｂｅ又はＴｒＹｂｅなど、多特異性抗体の一部である。
【００３９】
本発明の多特異性抗体は、２つなど、１又は複数の結合性ドメインにおける、上記で規定した、４９７フレームワーク残基又は４９７フレームワーク配列を含有しうる。本発明の多特異性抗体は、２つなど、１又は複数の結合性ドメインにおける、上記で規定した、２１０９フレームワーク残基又は２１０９フレームワーク配列を含有しうる。本発明の多特異性抗体は、１つの結合性ドメインにおける、上記で規定した、４９７フレームワーク残基又は４９７フレームワーク配列と、別の結合性ドメインにおける、上記で規定した、２１０９フレームワーク残基又は２１０９フレームワーク配列とを含有しうる。
【００４０】
したがって、本発明は、２つ又はこれを超える結合性ドメインを含む多特異性抗体のための、本発明の第１の態様及び第２の態様で規定される、以下の、表５におけるフレームワークの組合せを提供する。
【表５】
2020502181.tif 000007
【００４１】
本開示の上記の、第１の態様及び第２の態様のうちのいずれかについての、任意の実施形態では、本開示の可変領域は、抗体１の、以下のＣＤＲ：
ＣＤＲＨ１：ＧＦＴＦＳＤＹＮＭＡ（配列番号１１５）
ＣＤＲＨ２：ＴＩＴＹＥＧＲＮＴＹＹＲＤＳＶＫＧ（配列番号１１６）
ＣＤＲＨ３：ＰＰＱＹＹＥＧＳＩＹＲＬＷＦＡＨ（配列番号１１７）
ＣＤＲＬ１：ＲＡＤＥＳＶＲＴＬＭＨ（配列番号１１８）
ＣＤＲＬ２：ＬＶＳＮＳＥＩ（配列番号１１９）
ＣＤＲＬ３：ＱＱＴＷＳＤＰＷＴ（配列番号１２０）
の全てなど、１又は複数を含まない。
【００４２】
本開示の上記の、第１の態様及び第２の態様のうちのいずれかについての、一実施形態では、本開示の可変領域は、抗体２の、以下のＣＤＲ：
ＣＤＲＨ１：ＧＶＩＦＳＤＹＹＭＡ（配列番号１２１）
ＣＤＲＨ２：ＳＩＮＦＮＡＤＩＳＹＹＲＥＳＶＫＧ（配列番号１２２）
ＣＤＲＨ３：ＤＡＮＲＱＮＹＤＷＦＡＹ（配列番号１２３）
ＣＤＲＬ１：ＫＡＳＥＳＶＳＳＳＭＹＳＹＭＨ（配列番号１２４）
ＣＤＲＬ２：ＲＡＳＮＬＥＳ（配列番号１２５）
ＣＤＲＬ３：ＱＱＳＷＴＡＰＲＴ（配列番号１２６）
の全てなど、１又は複数を含まない。
【００４３】
本開示の上記の、第１の態様及び第２の態様のうちのいずれかについての、一実施形態では、本開示の可変領域は、抗体３の、以下のＣＤＲ：
ＣＤＲＨ１：ＧＹＴＦＴＤＮＹＩＨ（配列番号１２７）
ＣＤＲＨ２：ＹＩＮＰＳＳＡＹＡＨＹＮＥＫＦＫＴ（配列番号１２８）
ＣＤＲＨ３：ＲＹＹＳＡＭＰＦＡＹ（配列番号１２９）
ＣＤＲＬ１：ＲＡＳＥＤＩＹＳＧＬＡ（配列番号１３０）又は
ＲＡＳＥＤＩＹＮＧＬＡ（配列番号１３１）
ＣＤＲＬ２：ＤＳＳＴＬＨＴ（配列番号１３２）、又は
ＮＳＮＴＬＨＴ（配列番号１３３）、又は
ＮＳＳＴＬＨＴ（配列番号１３４）、又はＤＳＮＴＬＨＴ（配列番号１３５）
ＣＤＲＬ３：ＱＱＮＹＤＦＰＬＴ（配列番号１３６）
の全てなど、１又は複数を含まない。
【００４４】
一実施形態では、本開示に従う可変ドメインは、配列番号１４９に示される配列を有さない。
【００４５】
一実施形態では、本開示に従う可変ドメインは、配列番号１５０に示される配列を有さない。
【００４６】
一実施形態では、本開示に従う可変ドメインは、配列番号１５１に示される配列を有さない。
【００４７】
一実施形態では、本開示に従う可変ドメインは、配列番号１５２に示される配列を有さない。
【００４８】
一実施形態では、本開示に従う可変ドメインは、配列番号１５３に示される配列を有さない。
【００４９】
本発明に従う多特異性抗体の一実施形態では、可変領域は、上記で規定した抗体１のＣＤＲ、上記で規定した抗体２のＣＤＲ、又は上記で規定した抗体３のＣＤＲを含まない。
【００５０】
一実施形態では、多特異性抗体分子における１つの結合性ドメインなど、少なくとも１つの結合性ドメインは、本開示のフレームワークを含まない。
【００５１】
例えば、ブリージングと称する動的過程を介して凝集しやすい可変領域内の、本開示のフレームワーク配列の使用は、単量体の収率の改善及び／又は凝集しようとする傾向の低減をもたらしうるので有利である。
【００５２】
本発明はまた、各可変領域が、フレームワークと、３つずつのＣＤＲとを有する、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも１つの結合性ドメインを有する抗体分子の単量体発現のレベルを改善する方法であって、可変領域のフレームワークを、
ｉ）ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号２又は３、ＦＲ３についての配列番号４、及びＦＲ４についての配列番号５を含むフレームワーク（ＶＨ領域のフレームワークなど）；
ｉｉ）ＦＲ１についての配列番号１６、ＦＲ２についての配列番号１７又は１８、ＦＲ３についての配列番号１９、及びＦＲ４についての配列番号２０を含むフレームワーク（ＶＨ領域のフレームワークなど）；
ｉｉｉ）ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９又は１０を含むフレームワーク（ＶＬ領域のフレームワークなど）；
ｉｖ）ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４又は１５を含むフレームワーク（ＶＬ領域のフレームワークなど）；
ｖ）これらのＶＨフレームワーク及びＶＬフレームワークの組合せ；並びに
ｖｉ）全フレームワーク内の、１、２、３、４、又は５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのいずれか１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらのうちのいずれか１つの誘導体
を含むか、又はこれらからなる群から選択されるフレームワークへと変化させるステップを含む上記方法も提供する。
【００５３】
一実施形態では、ＶＨフレームワークを、ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号２又は３、ＦＲ３についての配列番号４、及びＦＲ４についての配列番号５を含むフレームワークへと変化させる、本開示に従う方法が提供される。
【００５４】
一実施形態では、ＶＨフレームワークを、ＦＲ１についての配列番号１６、ＦＲ２についての配列番号１７又は１８、ＦＲ３についての配列番号１９、及びＦＲ４４についての配列番号２０を含むフレームワークへと変化させる、本開示に従う方法が提供される。
【００５５】
一実施形態では、ＶＬフレームワークを、ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９又は１０を含むフレームワークへと変化させる、本開示に従う方法が提供される。
【００５６】
一実施形態では、ＶＬフレームワークを、ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４又は１５を含むフレームワークへと変化させる、本開示に従う方法が提供される。
【００５７】
一実施形態では、抗体分子の単量体のレベルを、フレームワーク（単数又は複数）を変化させる前に解析する、本開示に従う方法が提供される。
【００５８】
一実施形態では、抗体分子が、多特異性抗体分子、例えば二特異性又は三特異性抗体分子、例えば二特異性抗体分子である、本開示に従う方法が提供される。
【００５９】
一実施形態では、多特異性抗体分子が、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、方法が、抗体分子内の結合性ドメインの相対位置を変化させる、さらなるステップを含む、本開示に従う方法が提供される。
【００６０】
一実施形態では、多特異性抗体の、少なくとも１つの結合性ドメインは、本明細書で開示される、凝集する傾向を低減したフレームワークを用いない。
【００６１】
一態様では、本開示の方法から得られるか、又は得ることが可能な抗体分子が提供される。
【００６２】
本発明はまた、抗体分子の単量体のレベルを改善するための、
ｉ）ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号２又は３、ＦＲ３についての配列番号４、及びＦＲ４についての配列番号５を含むフレームワーク（ＶＨ領域のフレームワークなど）；
ｉｉ）ＦＲ１についての配列番号１６、ＦＲ２についての配列番号１７又は１８、ＦＲ３についての配列番号１９、及びＦＲ４についての配列番号２０を含むフレームワーク（ＶＨ領域のフレームワークなど）；
ｉｉｉ）ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９又は１０を含むフレームワーク（ＶＬ領域のフレームワークなど）；
ｉｖ）ＦＲ１についての配列番号１１、ＦＲ２についての配列番号１２、ＦＲ３についての配列番号１３、及びＦＲ４についての配列番号１４又は１５を含むフレームワーク（ＶＬ領域のフレームワークなど）；
ｖ）これらの組合せ；並びに
ｖｉ）全フレームワーク内の、１、２、３、４、又は５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのいずれか１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらのうちのいずれか１つの誘導体
を含むか、又はこれらからなる群から選択されるフレームワークの使用も提供する。
【００６３】
一態様では、本発明は、各々が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの可変領域であるＶＨＡが、ＦＲ１についての配列番号１、ＦＲ２についての配列番号２若しくは３、ＦＲ３についての配列番号４、及びＦＲ４についての配列番号５、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有することを特徴とする上記多特異性抗体分子を提供する。ＶＨＡが、ＶＬＡと対合する、一実施形態では、ＶＬＡは、ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９又は１０を含むフレームワークを有する。
【００６４】
さらなる態様では、本発明は、各々が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を伴う、少なくとも２つの結合性ドメインを含み、各結合性ドメインが、抗原に特異的であり、６つのＣＤＲを含む、多特異性抗体分子であって、少なくとも１つの可変領域であるＶＬＡが、ＦＲ１についての配列番号６、ＦＲ２についての配列番号７、ＦＲ３についての配列番号８、及びＦＲ４についての配列番号９若しくは１０、又は全フレームワーク内の、１、２、３、４、若しくは５カ所の変化を伴い、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４のうちのどの１つにおけるアミノ酸変化も２カ所を超えない、これらの誘導体を含むフレームワークを有することを特徴とする上記多特異性抗体分子を提供する。
【００６５】
一実施形態では、本開示で用いられる、重鎖生殖細胞系列アクセプター配列は、一般に、ヒトＪＨ４  ＶＨ３１−Ｕ３−１５（ＶＢＡＳＥ、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）であり、選択された軽鎖生殖細胞系列アクセプター配列は、ヒトＪＫ１、又はヒト４ＶＫ１  ２−１−（１）Ｌ４、同Ｌ１８、同Ｏ２、若しくは同Ｏ１２（ＶＢＡＳＥ、ｈｔｔｐ：／／ｖｂａｓｅ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／）であった。
【００６６】
一実施形態では、ドナー配列から、アクセプター配列へとグラフトされるＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａ／Ｋａｂａｔの組合せ定義が使用されるＣＤＲ−Ｈ１を例外として、Ｋａｂａｔにより規定される通りである。
【００６７】
この番号付けシステムは、Ｋａｂａｔら、１９８７、「免疫学的に重要なタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡ（本明細書の下記では、「Ｋａｂａｔら（前出）」と称する）において明示されている。そうでないことが指し示される場合を除き、本明細書では、この番号付けシステムを使用する。
【００６８】
Ｋａｂａｔによる残基の表示は、常に、アミノ酸残基の直線的な番号付けと直接対応するわけではない。実際の直線的なアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔによる厳密な番号付けより少数のアミノ酸を含有する場合もあり、さらなるアミノ酸を含有する場合もあり、基本的な可変ドメイン構造の、フレームワークであれ、相補性決定領域（ＣＤＲ）であれ、構造的構成要素の短縮、又はこれへの挿入に対応する。与えられた抗体についての、残基に対する、Ｋａｂａｔによる適正な番号付けは、抗体の配列内の、Ｋａｂａｔにより番号付けされた「標準」配列との相同性を有する残基のアライメントにより決定することができる。
【００６９】
重鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムに従う、残基３１〜３５（ＣＤＲ−Ｈ１）、残基５０〜６５（ＣＤＲ−Ｈ２）、及び残基９５〜１０２（ＣＤＲ−Ｈ３）に位置する。しかし、Ｃｈｏｔｈｉａ（Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．及びＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６、９０１〜９１７（１９８７））に従うと、ＣＤＲ−Ｈ１に相当するループは、残基２６〜残基３２にわたる。したがって、本明細書で使用される「ＣＤＲ−Ｈ１」は、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムと、Ｃｈｏｔｈｉａによるトポロジカルなループ定義との組合せにより記載される通り、残基２６〜３５を含む。
【００７０】
軽鎖可変ドメインのＣＤＲは、Ｋａｂａｔによる番号付けシステムに従う、残基２４〜３４（ＣＤＲ−Ｌ１）、残基５０〜５６（ＣＤＲ−Ｌ２）、及び残基８９〜９７（ＣＤＲ−Ｌ３）に位置する。
【００７１】
本明細書で用いられる「多特異性抗体」とは、２つ又はこれを超える結合性ドメイン、例えば、２つ又は３つの結合性ドメインを有する、本明細書で記載される抗体分子を指す。一実施形態では、本開示の多特異性抗体分子は、２つの抗原結合性部位だけを有する。
【００７２】
一実施形態では、構築物は、二特異性抗体である。本明細書で用いられる「二特異性分子」とは、同じ抗原に結合する場合もあり、異なる抗原に結合する場合もある、２つの抗原結合性部位を伴う分子を指す。一実施形態では、二特異性分子は、２つの異なる抗原に結合する。一実施形態では、ドメインは全て、同じ抗原に結合し、これは、抗原上の同じエピトープへの結合又は同じ抗原上の異なるエピトープへの結合を含む。
【００７３】
本明細書で用いられる「抗原結合性部位」とは、標的抗原と特異的に相互作用する、可変領域の対、特に、コグネイト対を含む、分子の部分、すなわち、別のタンパク質／ポリペプチドにおける領域、形状、帯域、エピトープを、特異的に認識する、分子の部分を指す。
【００７４】
本明細書で用いられる「特異的に」とは、それが特異的である抗原だけを認識する結合性部位、又はそれが特異的である抗原に対して、それが非特異的である抗原に対して有する親和性と比較して、著明に大きな結合親和性、例えば、５、６、７、８、９、１０倍の結合親和性を有する結合性部位を指すことを意図する。
【００７５】
結合親和性は、標準的なアッセイ、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅなどの表面プラズモン共鳴により測定することができる。
【００７６】
一実施形態では、抗体分子が、二特異性など、二特異性又は三特異性である、本開示に従う多特異性抗体分子が提供される。
【００７７】
一実施形態では、多価フォーマットは、分子フォーマットが、下記でより詳細に論じられる、ダイアボディー、ｓｃダイアボディー、トリアボディー、テトラボディー、タンデムｓｃＦｖ、ＦａｂＦｖ、Ｆａｂ’Ｆｖ、ＦａｂｄｓＦｖ、Ｆａｂ−ｄｓｓｃＦｖ（ＢＹｂｅともまた称する）、Ｆａｂ−（ｄｓｓｃＦｖ）２Ｆａｂ−ｓｃＦｖ、ｄｉＦａｂ、ｄｉＦａｂ’、タンデムｓｃＦｖ−Ｆｃ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖ、ｓｃダイアボディー−Ｆｃ、ｓｃダイアボディー−ＣＨ３、Ｉｇ−ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｉｇ、Ｖ−Ｉｇ、Ｉｇ−Ｖ、及びＤＶＤＩｇを含むか、又はこれらからなる群から選択される多価フォーマットなど、当技術分野で公知の多価フォーマット、及び本明細書で記載される（本明細書の定義節における開示を含む）多価フォーマットを含む。ＦａｂｄｓＦｖ及びＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ（ＢＹｂｅ））はまた、図７にも示される。一実施形態では、多特異性抗体は、ＦａｂｄｓＦｖでないか、又はｄｓＦｖを含有しない。Ｆａｂ−（ｄｓｓｃＦｖ）２フォーマット及びＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ−ｄｓＦｖフォーマットはまた、図８にも示され、また、ＴｒＹｂｅフォーマットとしても公知である。
【００７８】
一実施形態では、本発明において記載されるフレームワーク残基又はフレームワーク配列を有するＶＨＡ領域及びＶＬＡ領域は、ｓｃＦｖ内又はｄｓｓｃＦｖ内に存在する。ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖは、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖを、Ｆａｂなど、別の抗原結合性ドメインへと連結しうる、多特異性抗体分子の部分である。具体例は、ｓｃＦｖ又はｄｓｓｃＦｖが、ＢＹｂｅ抗体分子又はＴｒＹｂｅ抗体分子の部分である場合である。
【００７９】
したがって、本発明の一態様では、多特異性抗体分子は、
ａ）式（Ｉ）のポリペプチド鎖：
ＶＨ−ＣＨ１−Ｘ−（Ｖ１）ｐ；
ｂ）式（ＩＩ）のポリペプチド鎖：
ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−（Ｖ２）ｑ；
［式中、
ＶＨは、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し；
Ｘは、結合又はリンカーを表し；
Ｙは、結合又はリンカーを表し；
Ｖ１は、ｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬは、可変ドメイン、例えば、軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬは、定常領域、例えば、Ｃカッパなど、軽鎖定常領域ドメインに由来するドメインを表し；
Ｖ２は、ｄｓｓｃＦｖを表し；
ｐは、０又は１であり；
ｑは、０又は１であり；及び
ｐが、１の場合、ｑは、０であり、ｑが、１の場合、ｐは、０である］
を含むか、又はこれらからなる。
【００８０】
一実施形態では、多特異性抗体分子は、
ａ）式（Ｉａ）のポリペプチド鎖：
ＶＨ−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１；
ｂ）式（ＩＩａ）のポリペプチド鎖：
ＶＬ−ＣＬ；
［式中、ＶＨ、ＣＨ１、Ｘ、ＶＬ、ＣＬ、及びＶ１は、上記で規定した通りである］
を含むか、又はこれらからなる。
【００８１】
一実施形態では、
ａ）式（Ｉｂ）のポリペプチド鎖：
ＶＨ−ＣＨ１；
ｂ）式（ＩＩｂ）のポリペプチド鎖：
ＶＬ−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２；
［式中、ＶＨ、ＣＨ１、Ｘ、ＶＬ、ＣＬ、及びＶ２は、上記で規定した通りである］
を含むか、又はこれらからなる多特異性抗体分子が提供される。
【００８２】
一実施形態では、本開示に従う多特異性抗体分子は、ＢＹｂｅ（すなわち、図７においてもまた示される、式（Ｉａ及びＩＩａ）又は式（Ｉｂ及びＩＩｂ）の抗体分子）である。
【００８３】
本発明に従う方法では、一実施形態では、挿入される／置きかえられるフレームワーク（単数又は複数）は、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓｓｃＦｖ、又はｄｓＦｖを含む、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓｓｃＦｖ、又はｄｓＦｖ内におけるものであり、これらのうちのいずれか１つが、ＢＹｂｅなどの多特異性抗体分子の部分である場合を含む。
【００８４】
一実施形態では、挿入されるフレームワークは、ＢＹｂｅなど、本開示の抗体分子のｓｃＦｖ構成要素内に挿入される。一実施形態では、挿入されるフレームワークは、ＢＹｂｅなど、本開示の抗体分子のｄｓｓｃＦｖ構成要素内に挿入される。
【００８５】
一実施形態では、本開示に従う多特異性抗体分子は、
・式（Ｉ）及び（ＩＩ）のそれぞれ［式中、ＶＨ−ＣＨ１部分が、ＶＬ−ＣＬ部分と一体に、機能的なＦａｂ断片又はＦａｂ’断片を形成する］；又は
・式（Ｉａ）及び（ＩＩａ）のそれぞれ［式中、ＶＨ−ＣＨ１部分が、ＶＬ−ＣＬ部分と一体に、機能的なＦａｂ断片又はＦａｂ’断片を形成する］；又は
・式（Ｉｂ）及び（ＩＩｂ）のそれぞれ［式中、ＶＨ−ＣＨ１部分が、ＶＬ−ＣＬ部分と一体に、機能的なＦａｂ断片又はＦａｂ’断片を形成する］
の重鎖及び軽鎖（本明細書では、一体となった１対を、「単量体」と称する）の二量体として提供される。
【００８６】
本発明の一態様では、多特異性抗体分子は、
ａ）式（Ｉ）のポリペプチド鎖：
ＶＨ１−ＣＨ１−Ｘ−Ｖ１；及び
ｂ）式（ＩＩ）のポリペプチド鎖：
ＶＬ１−ＣＬ−Ｙ−Ｖ２；
［式中、
ＶＨ１は、重鎖可変ドメインを表し；
ＣＨ１は、重鎖定常領域のドメイン、例えば、そのドメイン１を表し；
Ｘは、結合又はリンカーを表し；
Ｙは、結合又はリンカーを表し；
Ｖ１は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、又はｄｓｓｃＦｖを表し；
ＶＬ１は、軽鎖可変ドメインを表し；
ＣＬは、Ｃカッパなど、軽鎖定常領域に由来するドメインを表し；
Ｖ２は、ｄｓＦｖ、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、又はｄｓｓｃＦｖを表す］
を含むか、又はこれらからなる二量体として提供される。
【００８７】
一実施形態では、Ｖ１は、ｄｓｓｃＦｖであり、Ｖ２は、ｄｓｓｃＦｖであり、これらはまた、Ｆａｂ−（ｄｓｓｃＦｖ）２とも称する。Ｖ１及び／又はＶ２は、本発明に従うＶＨＡフレームワーク配列及びＶＬＡフレームワーク配列を含有しうる。
【００８８】
ＶＨは、可変ドメインを表す。一実施形態では、ＶＨは、重鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、ＶＨは、キメラ可変ドメインである、すなわち、ＶＨは、少なくとも２つの種に由来する構成要素、例えば、ヒトフレームワーク及び非ヒトＣＤＲを含む。一実施形態では、ＶＨをヒト化する。一実施形態では、ＶＨは、完全ヒトＶＨである。
【００８９】
ＶＬは、可変ドメインを表す。一実施形態では、ＶＬは、軽鎖可変ドメインを表す。一実施形態では、ＶＬは、キメラ可変ドメインである、すなわち、ＶＬは、少なくとも２つの種に由来する構成要素、例えば、ヒトフレームワーク及び非ヒトＣＤＲを含む。一実施形態では、ＶＬをヒト化する。一実施形態では、ＶＬは、完全ヒトＶＬである。
【００９０】
一般に、ＶＨ及びＶＬは一体に、抗原結合性ドメインを形成する。一実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、コグネイト対を形成する。
【００９１】
本明細書で用いられる「コグネイト対」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて発生した、単一の抗体に由来する可変ドメインの対、すなわち、宿主から単離された、可変ドメインの天然における対合を指す。したがって、コグネイト対は、ＶＨとＶＬとの対である。一例では、コグネイト対は、抗原に協同作用的に結合する。宿主では、抗原に対する親和性の成熟が生じ、高度な最適化が可能であり、前記抗原に極めて特異的であるため、コグネイト対は、有利であることが多い。
【００９２】
本明細書で用いられる「可変領域」とは、３つのＣＤＲと、適切なフレームワークとを含む、抗体鎖内の領域を指す。本開示における使用のための可変領域は、一般に、当技術分野で公知の任意の方法により作出されうる抗体（宿主から単離された抗体など）に由来するであろう。
【００９３】
本明細書で用いられる「〜に由来する」とは、用いられる配列、又は用いられる配列と高度に類似する配列が、抗体の軽鎖又は重鎖など、元の遺伝子素材から得られたという事実を指す。
【００９４】
本明細書で用いられる「高度に類似する」とは、その全長にわたり、９６、９７、９８、又は９９％類似するなど、９５％又はこれを超えて類似するアミノ酸配列を指すことを意図する。
【００９５】
一実施形態では、ＶＨ及びＶＬにより形成される結合性ドメインは、第１の抗原に特異的である。
【００９６】
一実施形態では、ＣＨ１ドメインとは、重鎖に由来する天然におけるドメイン１、又はこれらの誘導体、例えば、配列番号１０８に提示されるＩｇＧ１  ＣＨ１配列、又は配列番号１０９に提示されるＩｇＧ４  ＣＨ１配列である。
【００９７】
一実施形態では、軽鎖内のＣＬ断片とは、定常カッパ配列若しくは定常ラムダ配列、又はこれらのいずれかの誘導体、例えば、配列番号１１０に提示されるカッパ配列である。
【００９８】
本明細書で用いられる、天然におけるドメインの誘導体とは、天然における配列内の、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのアミノ酸を、置きかえるか、又は欠失させて、例えば、所望されない特性を消失させることなど、ドメインの特性を最適化させるが、ドメインの特徴的な特色（単数又は複数）は保持した誘導体を指すことを意図する。
【００９９】
一実施形態では、フレームワークの誘導体は、代替的アミノ酸、例えば、ドナー残基で置きかえられた、１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸を有しうる。
【０１００】
一実施形態では、機能的なＦａｂ断片内又はＦａｂ’断片内には、１又は複数の、天然であるか、又は操作された、鎖間（すなわち、軽鎖と重鎖との間の）ジスルフィド結合が存在する。
【０１０１】
一実施形態では、「天然」ジスルフィド結合は、本開示の構築物、例えば、式（Ｉ）及び（ＩＩ）；又は式（Ｉａ）及び（ＩＩａ）；又は式（Ｉｂ）及び（ＩＩｂ）のポリペプチド鎖内の、ＣＨ１とＣＬとの間に存在する。
【０１０２】
ＣＬドメインが、カッパ鎖又はラムダ鎖に由来する場合、結合を形成するシステインの天然の位置は、ヒトｃカッパ鎖内及びｃラムダ鎖内の２１４である（Ｋａｂａｔによる番号付け、４版、１９８７）。
【０１０３】
ＣＨ１内の、ジスルフィド結合を形成するシステインの正確な位置は、実際に用いられる、特定のドメインに依存する。したがって、例えば、ヒトガンマ１では、ジスルフィド結合の天然の位置は、２３３位に位置する（Ｋａｂａｔによる番号付け、４版、１９８７）。ガンマ２、ガンマ３、ガンマ４、ＩｇＭ、及びＩｇＤなど、他のヒトアイソタイプについての、結合を形成するシステインの位置も公知であり、例えば、ヒトのＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４では、１２７位であり、ヒトのＩｇＤ及びＩｇＡ２Ｂの重鎖では、１２８位である。
【０１０４】
ＶＨと、ＶＬとの可変ドメイン対の間のジスルフィド結合に加えて、分子の定常領域内のジスルフィド結合（単数又は複数）も存在しうる。
【０１０５】
一実施形態では、本開示に従う多特異性抗体は、位置ＣＨ１とＣＬとの間における、天然におけるジスルフィド結合と同等な位置、又はこれに対応する位置において、ジスルフィド結合を有する。
【０１０６】
一実施形態では、ＣＨ１を含む定常領域、及びＣＬなどの定常領域は、天然におけるものではない位置にあるジスルフィド結合を有する。これは、システイン（単数又は複数）を、必要とされる位置（単数又は複数）において、アミノ酸鎖へと導入することにより、分子へと操作することができる。この非天然のジスルフィド結合は、ＣＨ１と、ＣＬとの間に存在する天然のジスルフィド結合に加えたジスルフィド結合であるか、又はこれへの代替物としてのジスルフィド結合である。
【０１０７】
操作システインの導入は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施することができる。これらの方法は、オーバーラップエクステンションＰＣＲによる突然変異誘発、部位指向突然変異誘発、又はカセット突然変異誘発（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；Ａｕｓｂｅｌら、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＆  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９９３を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。部位指向突然変異誘発キットは、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が市販されている。カセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら、１９８５、Ｇｅｎｅ、３４：３１５〜３２３に基づき実施することができる。代替的に、突然変異体は、アニーリング、ライゲーション、及びＰＣＲ増幅、並びに重複するオリゴヌクレオチドのクローニングを介する、全遺伝子合成により作ることができる。
【０１０８】
一実施形態では、ＣＨ１とＣＬとの間のジスルフィド結合は、全く存在しない、例えば、鎖間システインは、セリンなど、別のアミノ酸で置きかえることができる。したがって、分子の機能的なＦａｂ断片内には、鎖間ジスルフィド結合は存在しない。参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２００５／００３１７０などの開示は、どのようにして、鎖間ジスルフィド結合を伴わないＦａｂ断片をもたらすのかについて記載している。
【０１０９】
一実施形態では、Ｖ１は、ｄｓｓｃＦｖを表す。一実施形態では、Ｖ２は、ｄｓｓｃＦｖを表す。しかし、Ｖ１及びＶ２の両方が、同時に、ｄｓｓｃＦｖを表すことはない（すなわち、１つだけが、与えられた構築物中に存在する）。
【０１１０】
一実施形態では、ｐは、１であり、ｑは、０である。一実施形態では、ｐは、０であり、ｑは、１である。
【０１１１】
本明細書で用いられる「単鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」とは、ＶＨ可変ドメインと、ＶＬ可変ドメインとの間のペプチドリンカーにより安定化させた単鎖可変断片を指す。
【０１１２】
本明細書で用いられる「ジスルフィドにより安定化させた単鎖可変断片」又は「ｄｓｓｃＦｖ」とは、ＶＨ可変ドメインと、ＶＬ可変ドメインとの間のペプチドリンカーにより安定化させた単鎖可変断片を指し、また、ＶＨとＶＬとの間の、ドメイン間ジスルフィド結合も含む。
【０１１３】
一実施形態では、Ｖ１又はＶ２の可変ドメインであるＶＨとＶＬとの間のジスルフィド結合は、下記で列挙される残基のうちの２つの間に存在する（文脈により、そうでないことが指し示されない限りにおいて、下記の一覧では、Ｋａｂａｔによる番号付けを用いる）。Ｋａｂａｔによる番号付けに言及する場合、関与する参考文献は、Ｋａｂａｔら、１９８７、「免疫学的に重要なタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）」、ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ、ＵＳＡである。
【０１１４】
一実施形態では、ジスルフィド結合は、
・ＶＨ３７＋ＶＬ９５Ｃ（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６、７８１〜７８８、Ｚｈｕら（１９９７）を参照されたい）；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１００（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３、５４５１〜５４５９、Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４）；又はＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２６９巻、２８号、１８３２７〜１８３３１頁、Ｒｅｉｔｅｒら（１９９４）；又はＰｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、１０巻、１２号、１４５３〜１４５９頁、Ｒａｊａｇｏｐａｌら（１９９７）を参照されたい）；
・ＶＨ４４＋ＶＬ１０５（例えば、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１１８、８２５〜８３１、Ｌｕｏら（１９９５）を参照されたい）；
・ＶＨ４５＋ＶＬ８７（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６、７８１〜７８８、Ｚｈｕら（１９９７）を参照されたい）；
・ＶＨ５５＋ＶＬ１０１（例えば、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３７７、１３５−１３９、Ｙｏｕｎｇら（１９９５）を参照されたい）；
・ＶＨ１００＋ＶＬ５０（例えば、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２９、１３６２〜１３６７、Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら（１９９０）を参照されたい）；
・ＶＨ１００ｂ＋ＶＬ４９；
・ＶＨ９８＋ＶＬ４６（例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、６、７８１〜７８８、Ｚｈｕら（１９９７）を参照されたい）；
・ＶＨ１０１＋ＶＬ４６；
・ＶＨ１０５＋ＶＬ４３（例えば、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、７５３８〜７５４２頁、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら（１９９３）；又はＰｒｏｔｅｉｎｓ、１９、３５〜４７、Ｊｕｎｇら（１９９４）を参照されたい）；
・ＶＨ１０６＋ＶＬ５７（例えば、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、３７７、１３５〜１３９、Ｙｏｕｎｇら（１９９５）を参照されたい）；
及び分子内に位置する可変領域対内の、これらに対応する位置（単数又は複数）を含む群から選択される位置にある。
【０１１５】
一実施形態では、ジスルフィド結合は、ＶＨ４４位と、ＶＬ１００位との間に形成される。
【０１１６】
ジスルフィド結合が形成されうるように、上記で列挙したアミノ酸対は、システインによる置きかえに資する位置にある。システインは、公知の技法により、これらの所望の位置へと操作されうる。一実施形態では、したがって、本開示に従う、操作システインとは、所与のアミノ酸位置における天然における残基が、システイン残基で置きかえられた場合を指す。
【０１１７】
操作システインの導入は、当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施することができる。これらの方法は、オーバーラップエクステンションＰＣＲによる突然変異誘発、部位指向突然変異誘発、又はカセット突然変異誘発（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；Ａｕｓｂｅｌら、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＆  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ＮＹ、１９９３を参照されたい）を含むがこれらに限定されない。部位指向突然変異誘発キットは、例えば、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓキット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）が市販されている。カセット突然変異誘発は、Ｗｅｌｌｓら、１９８５、Ｇｅｎｅ、３４：３１５〜３２３に基づき実施することができる。代替的に、突然変異体は、アニーリング、ライゲーション、及びＰＣＲ増幅、並びに重複するオリゴヌクレオチドのクローニングを介する、全遺伝子合成により作ることができる。
【０１１８】
したがって、一実施形態では、Ｖ１又はＶ２の可変ドメインであるＶＨとＶＬとを、２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合により連結することができ、この場合、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ１００ｂ及びＶＬ４９、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０１及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３及びＶＨ１０６及びＶＬ５７を含むか、又はこれらからなる群から選択される。
【０１１９】
一実施形態では、Ｖ１又はＶ２の可変ドメインであるＶＨとＶＬとを、ＣＤＲの外部にある、ＶＨ内の１つ及びＶＬ内の１つである、２つのシステイン残基の間のジスルフィド結合により連結することができ、この場合、例えば、システイン残基の対の位置は、ＶＨ３７及びＶＬ９５、ＶＨ４４及びＶＬ１００、ＶＨ４４及びＶＬ１０５、ＶＨ４５及びＶＬ８７、ＶＨ１００及びＶＬ５０、ＶＨ９８及びＶＬ４６、ＶＨ１０５及びＶＬ４３及びＶＨ１０６及びＶＬ５７からなる群から選択される。
【０１２０】
一実施形態では、Ｖ１の可変ドメインであるＶＨとＶＬとを、一方をＶＨ４４位とし、他方をＶＬ１００位とする、２つの操作システイン残基の間のジスルフィド結合により連結する。
【０１２１】
一実施形態では、Ｖ２の可変ドメインであるＶＨとＶＬとを、一方をＶＨ４４位とし、他方をＶＬ１００位とする、２つの操作システイン残基の間のジスルフィド結合により連結する。
【０１２２】
一実施形態では、ｄｓｓｃＦｖ  Ｖ１の重鎖可変ドメインを、Ｘへと接合させるか、又はｄｓｓｃＦｖ  Ｖ２の重鎖可変ドメインを、Ｙへと接合させる。
【０１２３】
一実施形態では、ｄｓｓｃＦｖ  Ｖ１の軽鎖可変ドメインを、Ｘへと接合させるか、又はｄｓｓｃＦｖ  Ｖ２の軽鎖可変ドメインを、Ｙへと接合させる。
【０１２４】
一実施形態では、Ｖ１のＶＨドメインを、Ｘへと接合させる、例えば、ＣＨ１へと接合させる。一実施形態では、Ｖ１のＶＬドメインを、Ｘへと接合させる、例えば、ＣＨ１へと接合させる。一実施形態では、Ｖ２のＶＨドメインを、Ｙへと接合させる、例えば、Ｃカッパへと接合させる。一実施形態では、Ｖ２のＶＬドメインを、Ｙへと接合させる、例えば、Ｃカッパへと接合させる。一実施形態では、Ｘは、結合である。一実施形態では、Ｙは、結合である。一実施形態では、Ｘ及びＹのいずれも、結合である。明らかに、ｐが、０であり、且つ、Ｘが、結合である場合、鎖は、ＣＨ１で終結するため、本質的に、Ｘは、存在しない。明らかに、ｑが、０であり、且つ、Ｙが、結合である場合、鎖は、ＣＬで終結するため、本質的に、Ｙは、存在しない。
【０１２５】
一実施形態では、Ｘは、リンカー、例えば、部分ＣＨ１と部分Ｖ１とを接続するのに適するペプチドである。一実施形態では、Ｙは、リンカー、例えば、部分ＣＬと部分Ｖ２とを接続するのに適するペプチドである。一実施形態では、Ｘ及びＹのいずれも、リンカーである。
【０１２６】
一実施形態では、ｐは、１であり、Ｘは、リンカーであり、ｑは、０であり、Ｙは、存在しない。
【０１２７】
一実施形態では、ｑは、１であり、Ｙは、リンカーであり、ｐは、０であり、Ｘは、存在しない。
【０１２８】
一実施形態では、ペプチドリンカーは、５０アミノ酸の長さ又はこれ未満の長さ、例えば、１９、１０、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１アミノ酸など、２０アミノ酸又はこれ未満の長さである。
【０１２９】
一実施形態では、リンカーは、Ｇ４Ｓ（すなわち、ＧＧＧＧＳ；配列番号４２）の反復単位、例えば、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４５）など、この、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの単位に基づく。本開示の構築物中で用いられるリンカーが、配列番号４６に示される配列を有する実施形態では、例えば、配列は、Ｘ又はＹが、リンカーである場合に用いることができる。
【０１３０】
当然ながら、本開示の構築物中のＸ、Ｙ、及びｓｃＦｖ構成要素には、リンカーのための、少なくとも３つの可能な位置が存在する。
【０１３１】
一実施形態では、リンカーは、本明細書で示される配列、例えば、配列番号２９〜９７から選択される。一実施形態では、リンカーは、配列番号２９又は配列番号３０に示される配列から選択される。一実施形態では、Ｘは、配列番号２９に示される配列を有する。一実施形態では、Ｙは、配列番号３０に示される配列を有する。ヒンジ配列を、配列番号３１〜３９に示す。可撓性リンカー配列を、配列番号４０〜８０［配列番号４２〜４７の配列中、（Ｓ）は、任意選択である］に示す。
【表６】
2020502181.tif 000008
【０１３２】
非可撓性リンカーの例は、配列番号８１、配列番号８２に示されるペプチド配列、及びＰＰＰを含む。
【０１３３】
一実施形態では、ペプチドリンカーは、アルブミン結合性ペプチドである。
【０１３４】
アルブミン結合性ペプチドの例は、ＷＯ２００７／１０６１２０に提示されており、配列番号８３〜９６におけるリンカーを含む。
【０１３５】
アルブミン結合性ペプチドの、リンカーとしての使用は、二特異性抗体分子の半減期を延長しうるので、有利である。
【０１３６】
一実施形態では、Ｖ１の可変ドメインであるＶＨとＶＬとを接続する（すなわち、ＶＨとＶＬとの間の）リンカー（例えば、適切なペプチドリンカー）が存在する。一実施形態では、Ｖ２の可変ドメインであるＶＨとＶＬとを接続する（すなわち、ＶＨとＶＬとの間の）リンカー（例えば、適切なペプチドリンカー）が存在する。
【０１３７】
一実施形態では、Ｖ１の可変ドメインであるＶＨとＶＬとを接続するリンカーは、配列であるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９７）を有する。
【０１３８】
一実施形態では、Ｖ２の可変ドメインであるＶＨとＶＬとを接続するリンカーは、配列であるＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号９７）を有する。
【０１３９】
本明細書で使用される「Ｆａｂ断片」という用語は、ＶＬ（可変軽鎖）ドメイン及び軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）を含む軽鎖断片と、ＶＨ（可変重鎖）ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む重鎖断片とを含む抗体断片を指す。
【０１４０】
Ｆｖとは、２つの可変ドメイン、例えば、コグネイト対又は親和性成熟可変ドメイン、すなわち、ＶＨとＶＬとの対など、協同作用的可変ドメインを指す。
【０１４１】
本明細書で用いられる、協同作用的可変ドメインとは、互いに補完し合い、且つ／又はいずれも、Ｆｖを、目的の抗原に特異的とする抗原結合性に寄与する可変ドメインである。
【０１４２】
本明細書で使用される「単鎖Ｆｖ」という用語又は「ｓｃＦｖ」と略記される用語は、単一のポリペプチド鎖を形成するように連結された（例えば、ペプチドリンカーにより）、ＶＨ抗体ドメイン及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片を指す。このフォーマットでは、重鎖及び軽鎖の定常領域は、除外される。
【０１４３】
本明細書で使用される「単一ドメイン抗体」という用語は、単一の単量体である、抗体の可変ドメインからなる抗体断片を指す。単一ドメイン抗体の例は、ＶＨ若しくはＶＬ又はＶＨＨを含む。本明細書では、これらの用語を、互換的に使用する。
【０１４４】
本明細書で用いられるダイアボディーとは、ＶＨ／ＶＬ対と、さらなるＶＨ／ＶＬ対とによる、２つのＦｖ対であって、第１のＦｖのＶＨが、第２のＦｖのＶＬへと連結され、第１のＦｖのＶＬが、第２のＦｖのＶＨへと連結されるように、２つのＦｖ間リンカーを有する、上記２つのＦｖ対を指す。
【０１４５】
本明細書で用いられるトリアボディーとは、ダイアボディーと同様のフォーマットであって、３つのＦｖと、３つのＦｖ間リンカーとを含む、上記フォーマットを指す。
【０１４６】
本明細書で用いられるテトラボディーとは、ダイアボディーと同様のフォーマットであって、４つのＦｖと、４つのＦｖ間リンカーとを含む、上記フォーマットを指す。
【０１４７】
本明細書で用いられるタンデムｓｃＦｖとは、単一のＦｖ間リンカーが存在するように、単一のリンカーを介して連結された、２つのｓｃＦｖを指す。
【０１４８】
本明細書で用いられるタンデムｓｃＦｖ−Ｆｃとは、１つずつのタンデムｓｃＦｖが、例えば、定常領域断片である−ＣＨ２ＣＨ３のヒンジを介して、ＣＨ２ドメインのＮ末端へと付加された、２つのタンデムｓｃＦｖを指す。
【０１４９】
本明細書で用いられるＦａｂＦｖとは、可変領域が、以下：重鎖のＣＨ１及び軽鎖のＣＬの各々のＣ末端へと付加されたＦｖ断片を指す。フォーマットは、このＰＥＧ化形としてもたらされうる。
【０１５０】
本明細書で用いられるＦａｂ’Ｆｖは、Ｆａｂ部分が、Ｆａｂ’で置きかえられた、ＦａｂＦｖと同様である。フォーマットは、このＰＥＧ化形としてもたらされうる。
【０１５１】
本明細書で用いられるＦａｂｄｓＦｖとは、Ｆｖ間ジスルフィド結合が、付加されたＣ末端の可変領域を安定化させるＦａｂＦｖを指す。フォーマットは、このＰＥＧ化形としてもたらされうる。
【０１５２】
本明細書で用いられるＦａｂ−ｓｃＦｖとは、ｓｃＦｖが、軽鎖又は重鎖のＣ末端上に付加されたＦａｂ分子である。
【０１５３】
本明細書で用いられるＦａｂ’−ｓｃＦｖとは、ｓｃＦｖが、軽鎖又は重鎖のＣ末端上に付加されたＦａｂ’分子である。
【０１５４】
本明細書で用いられるｄｉＦａｂとは、それらの重鎖のＣ末端を介して連結された、２つのＦａｂ分子を指す。
【０１５５】
本明細書で用いられるｄｉＦａｂ’とは、これらのヒンジ領域内の、１又は複数のジスルフィド結合を介して連結された、２つのＦａｂ’分子を指す。
【０１５６】
本明細書で用いられるｓｃダイアボディーとは、分子が、３つのリンカーを含み、そのＶＨ末端及びＶＬ末端が各々、さらなるＦｖ対の可変領域のうちの１つへと連結された、通常のｓｃＦｖを形成するように、Ｆｖ内リンカーを含むダイアボディーである。
【０１５７】
本明細書で用いられるｓｃダイアボディー−Ｆｃとは、１つずつが、例えば、定常領域断片である−ＣＨ２ＣＨ３のヒンジを介して、ＣＨ２ドメインのＮ末端へと付加された、２つのｓｃダイアボディーである。
【０１５８】
本明細書で用いられるｓｃＦｖ−Ｆｃ−ｓｃＦｖとは、１つずつが、−ＣＨ２ＣＨ３断片の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端及びＣ末端へと付加された、４つのｓｃＦｖを指す。
【０１５９】
本明細書で用いられるｓｃダイアボディー−ＣＨ３とは、各々が、例えば、ヒンジを介して、ＣＨ３ドメインへと連結された、２つのｓｃダイアボディー分子を指す。
【０１６０】
本明細書で用いられるＩｇＧ−ｓｃＦｖとは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＣ末端上に、ｓｃＦｖを伴う全長抗体である。
【０１６１】
本明細書で用いられるｓｃＦｖ−ＩｇＧとは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＮ末端上に、ｓｃＦｖを伴う全長抗体である。
【０１６２】
本明細書で用いられるＶ−ＩｇＧとは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＮ末端上に、可変ドメインを伴う全長抗体である。
【０１６３】
本明細書で用いられるＩｇＧ−Ｖとは、重鎖の各々又は軽鎖の各々のＣ末端上に、可変ドメインを伴う全長抗体である。
【０１６４】
ＤＶＤ−Ｉｇ（二重ＶドメインＩｇＧとしてもまた公知である）とは、各重鎖及び各軽鎖のＮ末端上に１つずつの、４つのさらなる可変ドメインを伴う全長抗体である。
【０１６５】
本開示はまた、本明細書で開示される配列と、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％類似する配列も提供する。
【０１６６】
本明細書で使用される「同一性」とは、アライメントされた配列内の、任意の特定の位置において、アミノ酸残基が、配列間で同一であることを指し示す。
【０１６７】
本明細書で使用される「類似性」とは、アライメントされた配列内の、任意の特定の位置において、アミノ酸残基が、配列間で同種であることを指し示す。例えば、ロイシンで、イソロイシン又はバリンを置換することができる。互いを置換し合いうることが多い、他のアミノ酸は、
・フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）；
・リシン、アルギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）；
・アスパラギン酸及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）；
・アスパラギン及びグルタミン（アミド側鎖を有するアミノ酸）；及び
・システイン及びメチオニン（硫黄含有側鎖を有するアミノ酸）
を含むがこれらに限定されない。
【０１６８】
同一性及び類似性の程度は、たやすく計算することができる（「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８；「生物計算：イフォマティクス及びゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ．Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９３；「コンピュータによる配列データの解析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」、第１部、Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．及びＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ、１９９４；「分子生物学における配列解析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、１９８７；「配列解析プライマー（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．及びＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編、Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９１；ＮＣＢＩから市販されているＢＬＡＳＴ（商標）ソフトウェア（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３〜４１０；Ｇｉｓｈ，Ｗ．及びＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、３：２６６〜２７２；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら、１９９６、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６：１３１〜１４１；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５：３３８９〜３４０２；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．及びＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．、１９９７、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７：６４９〜６５６）。
【０１６９】
一実施形態では、ＣＤＲが、ヒト以外の由来、特に、哺乳動物、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ラクダ科動物、ヒツジ、ヤギなどの由来である、本開示に従う多特異性抗体分子が提供される。一実施形態では、ＣＤＲは、ヒトである。
【０１７０】
動物の免疫化が必要である場合、周知で規定のプロトコールを使用して、ポリペプチドを、動物、好ましくは、非ヒト動物へと投与することにより、抗原ポリペプチドに対して発生する抗体を得ることができる（例えば、「実験免疫学ハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ（編）、４巻、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ、１９８６）を参照されたい）。ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ウシ、ラクダ、又はブタなど、多くの温血動物も、免疫化することができる。しかし、マウス、ウサギ、ブタ、及びラットが、一般に、最も適する。
【０１７１】
ヒト抗体レパートリーを、ヒトから単離するための方法、例えば、末梢血試料からの単離が公知であり、この場合、試料は、問題の抗原（病原体など）へと、既に曝露された者に由来する。
【０１７２】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５〜４９７）、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Ｋｏｚｂｏｒら、１９８３、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、４：７２）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（Ｃｏｌｅら、「モノクローナル抗体とがん治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、７７〜９６頁、Ａｌａｎ  ＲＬｉｓｓ，Ｉｎｃ．、１９８５）など、当技術分野で公知の任意の方法により調製することができる。
【０１７３】
抗体はまた、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら、１９９６、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３（１５）：７８４３〜７８４８；ＷＯ９２／０２５５１；ＷＯ２００４／０５１２６８及びＷＯ２００４／１０６３７７により記載されている方法により、特異的抗体の作製のために選択された、単一のリンパ球から作出された、免疫グロブリン可変領域のｃＤＮＡをクローニングし、発現させることを介する、単一のリンパ球抗体法を使用して作出することもできる。
【０１７４】
本開示における使用のための抗体はまた、当技術分野で公知の、多様なファージディスプレイ法を使用しても作出することができ、Ｂｒｉｎｋｍａｎら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８２：４１〜５０）、Ａｍｅｓら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９５、１８４：１７７〜１８６）、Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９４、２４：９５２〜９５８）、Ｐｅｒｓｉｃら（Ｇｅｎｅ、１９９７、１８７９〜１８）、Ｂｕｒｔｏｎら（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９４、５７：１９１〜２８０）；並びにＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９３／１１２３６；ＷＯ９５／１５９８２；ＷＯ９５／２０４０１；及びＵＳ５，６９８，４２６；ＵＳ５，２２３，４０９；ＵＳ５，４０３，４８４；ＵＳ５，５８０，７１７；ＵＳ５，４２７，９０８；ＵＳ５，７５０，７５３；ＵＳ５，８２１，０４７；ＵＳ５，５７１，６９８；ＵＳ５，４２７，９０８；ＵＳ５，５１６，６３７；ＵＳ５，７８０，２２５；ＵＳ５，６５８，７２７；ＵＳ５，７３３，７４３；ＵＳ５，９６９，１０８；及びＷＯ２０１１／３０３０５により開示される抗体を含む。
【０１７５】
一実施形態では、本開示に従う多特異性分子をヒト化する（１つ、２つ、又は全ての結合性ドメインをヒト化する）。
【０１７６】
本明細書で用いられるヒト化（ＣＤＲグラフト抗体を含む）とは、非ヒト種に由来する、１又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）と、ヒト免疫グロブリン分子に由来するフレームワーク領域とを有する分子（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）を指す。全ＣＤＲではなく、ＣＤＲの特異性決定基を移植することだけが必要でありうることが理解されるであろう（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５〜３４を参照されたい）。ヒト化抗体は、任意選択で、ＣＤＲが由来する非ヒト種に由来する、１又は複数のフレームワーク残基をさらに含みうる。
【０１７７】
本明細書で使用される「ヒト化抗体分子」という用語は、重鎖及び／又は軽鎖が、ドナー抗体（例えば、マウスのモノクローナル抗体）に由来する、１又は複数のＣＤＲ（所望の場合、１又は複数の改変ＣＤＲを含む）であって、アクセプター抗体（例えば、ヒト抗体）の重鎖可変領域及び／又は軽鎖可変領域のフレームワークへとグラフトされた、上記ＣＤＲを含有する抗体分子（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９；ＷＯ９１／０９９６７を参照されたい）を指す。総説については、Ｖａｕｇｈａｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１６、５３５〜５３９、１９９８を参照されたい。一実施形態では、全ＣＤＲを移植するのではなく、本明細書の上記で記載したＣＤＲのうちのいずれか１つに由来する特異性決定基のうちの１又は複数だけを、ヒト抗体フレームワークへと移植する（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉら、２００５、Ｍｅｔｈｏｄｓ、３６、２５〜３４を参照されたい）。一実施形態では、本明細書の上記で記載したＣＤＲのうちの１又は複数に由来する特異性決定基だけを、ヒト抗体フレームワークへと移植する。別の実施形態では、本明細書の上記で記載したＣＤＲの各々に由来する特異性決定基だけを、ヒト抗体フレームワークへと移植する。
【０１７８】
一実施形態では、本開示に従う多特異性分子をヒト化する。
【０１７９】
ＣＤＲ又は特異性決定基をグラフトする場合、ＣＤＲが由来するドナー抗体のクラス／種類を考慮して、マウス、霊長動物、及びヒトのフレームワーク領域を含む、任意の適切なアクセプターの、可変領域フレームワーク配列を使用することができる。本発明に従うヒト化抗体は、ヒトアクセプターフレームワーク領域のほか、ドナー抗体からもたらされるＣＤＲ又は本明細書で開示されるＣＤＲのうちの１又は複数を含む可変ドメインを有すると適切である。
【０１８０】
本発明のヒト化抗体では、フレームワーク領域は、アクセプター抗体のフレームワーク領域と、正確に同じ配列を有する必要がない。例えば、希少な残基を、このアクセプター鎖のクラス又は種類に、より高頻度で発生する残基へと変化させることができる。代替的に、アクセプターフレームワーク領域内で選択された残基は、それらが、ドナー抗体内の同じ位置に見出される残基に対応するように変化させることもできる（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２４を参照されたい）。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復する最小限の必要に保たれるべきである。変化させることが必要でありうる、アクセプターフレームワーク領域内の残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７において明示されている。
【０１８１】
本明細書で用いられるドナー抗体とは、宿主から単離されるか、又はライブラリー内で同定された、元の抗体を指す。
【０１８２】
本明細書で用いられるドナー残基とは、ＣＤＲを供与した抗体内で見出される残基である。一般に、ドナー抗体は、非ヒト抗体であるので、ドナー残基は、非ヒト抗体に由来するであろう。一実施形態では、ドナー残基は、ヒト化抗体内で置きかえられる残基の位置と同じであるか、又はこれと対応する、ドナー抗体内の位置における残基である。
【０１８３】
本開示で使用されうるヒトフレームワークの例は、ＫＯＬ、ＮＥＷＭ、ＲＥＩ、ＥＵ、ＴＵＲ、ＴＥＩ、ＬＡＹ、及びＰＯＭ（Ｋａｂａｔら、前出）である。例えば、ＫＯＬ及びＮＥＷＭを、重鎖に使用することができ、ＲＥＩを、軽鎖に使用することができ、ＥＵ、ＬＡＹ、及びＰＯＭを、重鎖及び軽鎖の両方に使用することができる。代替的に、ヒト生殖細胞系列の配列を使用することができ、これらは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ−ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／ｌｉｓｔ２．ｐｈｐにおいて利用可能である。
【０１８４】
本開示のヒト化抗体分子では、アクセプターの重鎖及び軽鎖は、必ずしも、同じ抗体に由来する必要がなく、所望の場合、異なる鎖に由来するフレームワーク領域を有する複合鎖を含みうる。
【０１８５】
フレームワーク領域は、アクセプター抗体のフレームワーク領域と、正確に同じ配列を有する必要がない。例えば、希少な残基を、このアクセプター鎖のクラス又は種類に、より高頻度で発生する残基へと変化させることができる。代替的に、アクセプターフレームワーク領域内で選択された残基は、それらが、ドナー抗体内の同じ位置に見出される残基に対応するように変化させることもできる（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、１９９８、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３〜３２４を参照されたい）。このような変化は、ドナー抗体の親和性を回復する最小限の必要に保たれるべきである。変化させることが必要でありうる、アクセプターフレームワーク領域内の残基を選択するためのプロトコールは、ＷＯ９１／０９９６７において明示されている。
【０１８６】
ドナー残基は、ドナー抗体、すなわち、ＣＤＲが、本来由来する抗体に由来する残基である。ドナー残基、例えば、マウス、ラット、又はウサギの残基は、ヒト受容体フレームワーク（アクセプター残基）に由来する、適切な残基で置きかえることができる。
【０１８７】
一実施形態では、本開示の多特異性抗体は、完全ヒト抗体であり、特に、可変ドメインのうちの１又は複数は、完全ヒトドメインである。
【０１８８】
完全ヒト分子とは、重鎖及び軽鎖の両方の可変領域及び定常領域（存在する場合）が全て、ヒト由来であるか、又は、必ずしも、同じ抗体に由来するわけではないが、ヒト由来の配列と実質的に同一である分子である。完全ヒト抗体の例は、例えば、上記で記載したファージディスプレイ法により作製された抗体並びにマウスにより作製される抗体であって、例えば、一般に、ＥＰ０５４６０７３；ＵＳ５，５４５，８０６；ＵＳ５，５６９，８２５；ＵＳ５，６２５，１２６；ＵＳ５，６３３，４２５；ＵＳ５，６６１，０１６；ＵＳ５，７７０，４２９；ＥＰ０４３８４７４；及びＥＰ０４６３１５１において記載されている通り、抗体マウスの免疫グロブリンの可変領域遺伝子と、任意選択で、定常領域遺伝子とを、それらのヒト対応物で置きかえた、上記抗体を含みうる。
【０１８９】
一実施形態では、本開示の多特異性抗体分子は、２つ、３つ、又はこれを超える、異なる、目的の抗原に、選択的に結合することが可能である。
【０１９０】
一実施形態では、ＶＨ／ＶＬ、又はＶ１若しくはＶ２により形成される抗原結合性ドメインが結合する、目的の抗原は、細胞会合タンパク質、例えば、細菌細胞、酵母細胞、Ｔ細胞、内皮細胞又は腫瘍細胞、及び可溶性タンパク質などの細胞上の、細胞表面タンパク質から独立に選択される。
【０１９１】
目的の抗原はまた、疾患時又は感染時に上方調節されるタンパク質、例えば、受容体及び／又はそれらの対応するリガンドなど、任意の医学的関連性があるタンパク質でもありうる。細胞表面タンパク質の特定の例は、接着分子、例えば、β１インテグリン、例えば、ＶＬＡ−４、Ｅ−セレクチン、Ｐセレクチン、又はＬ−セレクチンなどのインテグリン、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤＷ５２、ＣＤ６９、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＩＣＯＳ、ＢＣＭＰ７、ＣＤ１３７、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤＣＰ１、ＤＰＣＲ１、ＤＰＣＲ１、ｄｕｄｕｌｉｎ２、ＦＬＪ２０５８４、ＦＬＪ４０７８７、ＨＥＫ２、ＫＩＡＡ０６３４、ＫＩＡＡ０６５９、ＫＩＡＡ１２４６、ＫＩＡＡ１４５５、ＬＴＢＰ２、ＬＴＫ、ＭＡＬ２、ＭＲＰ２、ネクチン様２、ＮＫＣＣ１、ＰＴＫ７、ＲＡＩＧ１、ＴＣＡＭ１、ＳＣ６、ＢＣＭＰ１０１、ＢＣＭＰ８４、ＢＣＭＰ１１、ＤＴＤ、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ヒト乳脂肪グロブリン（ＨＭＦＧ１及び２）、ＭＨＣクラスＩ抗原及びＭＨＣクラスＩＩ抗原、並びにＶＥＧＦ、並びに、該当する場合、これらの受容体を含む。
【０１９２】
可溶性抗原は、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１６、ＩＬ−２３などのインターロイキン、ウイルス抗原、例えば、ＲＳ（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス又はサイトメガロウイルスの抗原、ＩｇＥなどの免疫グロブリン、インターフェロンα、インターフェロンβ、又はインターフェロンγなどのインターフェロン、Ｇ−ＣＳＦ又はＧＭ−ＣＳＦなどのコロニー刺激因子、及びＰＤＧＦ−α及びＰＤＧＦ−βなどの血小板由来増殖因子、並びに、該当する場合、これらの受容体を含む。他の抗原は、細菌の細胞表面抗原、細菌毒素、インフルエンザ、ＥＢＶ、ＨｅｐＡ、ＨｅｐＢ、及びＨｅｐＣなどのウイルス、生物テロ剤、放射性核種、及び重金属、並びにヘビ及びクモの毒及び毒素を含む。
【０１９３】
一実施形態では、本開示の抗体分子を使用して、目的の抗原の活性を、機能的に変更することができる。例えば、抗体分子は、前記抗原の活性を、直接的に、又は間接的に、中和する場合もあり、アンタゴナイズする場合もあり、アゴナイズする場合もある。
【０１９４】
一実施形態では、Ｖ１は、ヒト血清アルブミンに特異的である。
【０１９５】
一実施形態では、Ｖ２は、ヒト血清アルブミンに特異的である。
【０１９６】
一実施形態では、Ｖ１又はＶ２及びＶＨ／ＶＬは、２つの異なる抗原に特異的である。一実施形態では、Ｖ１又はＶ２及びＶＨ／ＶＬは、同じ抗原に特異的である、例えば、この中の、同じエピトープ又は異なるエピトープに結合する。
【０１９７】
一実施形態では、ＶＨ／ＶＬ及び／又はＶ１若しくはＶ２が結合する目的の抗原は、補体経路の活性化及び／又はエフェクター細胞の動員など、エフェクター機能を動員する能力をもたらす。
【０１９８】
エフェクター機能の動員は、エフェクター機能が、その表面上に動員分子を保有する細胞と関連するという点で、直接的でありうる。間接的動員は、本開示に従う分子内の抗原結合性ドメイン（Ｖ１又はＶ２など）に対する抗原の、動員ポリペプチドへの結合が、例えば、因子の放出を引き起こし、これが、エフェクター機能を、直接的又は間接的に動員する場合に生じる場合もあり、シグナル伝達経路の活性化を介して生じる場合もある。例は、ＩＬ２、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＦＮγ、ヒスタミン、Ｃ１ｑ、オプソニン、及びＣ２、Ｃ４、Ｃ３コンベルターゼ、及びＣ５〜Ｃ９など、古典的な補体活性化カスケード及び代替的な補体活性化カスケードの他のメンバーを含む。
【０１９９】
本明細書で使用される「動員ポリペプチド」は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩなどのＦｃγＲ、Ｃ１ｑ及びＣ３などであるがこれらに限定されない、補体経路タンパク質、ＣＤ６８、ＣＤ１１５、ＣＤ１６、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ５６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、及びＣＤ２２などであるがこれらに限定されない、ＣＤマーカータンパク質（Ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎマーカー）を含む。ＣＤマーカータンパク質である、さらなる動員ポリペプチドは、ＣＤ１、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４６、ＣＤ４９、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤ６１、ＣＤ６２、Ｄ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６８、ＣＤ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９８、ＣＤ１０６、ＣＤ１１４、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１２０、ＣＤ１２２、ＣＤ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１６２、ＣＤ１６４、ＣＤ１６９、ＣＤ１８４、ＣＤ２０６、ＣＤ２０９、ＣＤ２５７、ＣＤ２７８、ＣＤ２８１、ＣＤ２８２、ＣＤ２８３及びＣＤ３０４、又は細胞媒介性エフェクター機能を、直接的に、又は間接的に動員する能力を保持する、これらの任意の断片を含む。動員ポリペプチドはまた、エフェクター機能を有する、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ、及びＩｇＡなどの免疫グロブリン分子も含む。
【０２００】
一実施形態では、本開示に従う多特異性抗体分子内の抗原結合性ドメイン（Ｖ１又はＶ２など）は、補体経路タンパク質、例えば、Ｃ１ｑに対する特異性を有する。
【０２０１】
さらに、本開示の多特異性抗体分子を使用して、核種キレータータンパク質に結合する抗体又は断片により、放射性核種をキレート化することができる。このような融合タンパク質は、イメージング又は治療のための放射性核種ターゲティング法において有用である。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ａｌｔａｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ、２０１３年６月１９日：２４（６）１１０２〜９を参照されたい。
【０２０２】
一実施形態では、本開示に従う分子内の抗原結合性ドメイン（Ｖ１又はＶ２など）は、ＣＤ６８、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ６４、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８  ＣＤ４５、ＣＤ１６、及びＣＤ３５を含む群から選択される、ＣＤマーカータンパク質に対する特異性を有する。
【０２０３】
一実施形態では、本開示に従う分子内の抗原結合性ドメイン（Ｖ１又はＶ２など）は、例えば、前記血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１に結合することにより、前記目的の抗原に対する特異性を伴う抗体断片に、半減期の延長をもたらすために、血清担体タンパク質、循環免疫グロブリン分子、又はＣＤ３５／ＣＲ１に対する特異性を有する。
【０２０４】
本明細書で使用される「血清担体タンパク質」は、チロレキシン結合性タンパク質、トランスサイレチン、α１−酸糖タンパク質、トランスフェリン、フィブリノーゲン、及びアルブミン、又はこれらのうちのいずれかの断片を含む。
【０２０５】
本明細書で使用される「循環免疫グロブリン分子」は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ｓＩｇＡ、ＩｇＭ、及びＩｇＤ、又はこれらのうちのいずれかの断片を含む。
【０２０６】
ＣＤ３５／ＣＲ１とは、３６日間の半減期（２８〜４７日間の正常範囲；Ｌａｎａｒｏら、１９７１、Ｃａｎｃｅｒ、２８（３）：６５８〜６６１）を有する、赤血球上に存在するタンパク質である。
【０２０７】
一実施形態では、ＶＨ／ＶＬが特異性を有する、目的の抗原は、アルブミン、特に、ヒト血清アルブミンなど、ヒト血清担体などの血清担体タンパク質である。
【０２０８】
一実施形態では、Ｖ１が特異性を有する、目的の抗原は、アルブミン、特に、ヒト血清アルブミンなど、ヒト血清担体などの血清担体タンパク質である。
【０２０９】
一実施形態では、Ｖ２が特異性を有する、目的の抗原は、アルブミン、特に、ヒト血清アルブミンなど、ヒト血清担体などの血清担体タンパク質である。
【０２１０】
一般に、Ｖ１又はＶ２及びＶＨ／ＶＬのいずれもが、血清担体タンパク質に対する特異性を有するわけではない。
【０２１１】
一実施形態では、本開示の多特異性抗体分子は、標的抗原（単数又は複数）に対する親和性の改善をもたらすように加工される。このような変異体は、ＣＤＲの突然変異（Ｙａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５４、３９２〜４０３、１９９５）、鎖シャッフリング（Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１０、７７９〜７８３、１９９２）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の突然変異株の使用（Ｌｏｗら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５０、３５９〜３６８、１９９６）、ＤＮＡシャッフリング（Ｐａｔｔｅｎら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、８、７２４〜７３３、１９９７）、ファージディスプレイ（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２５６、７７〜８８、１９９６）、及びセクシャルＰＣＲ（Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３９１、２８８〜２９１、１９９８）を含む、多数の親和性成熟プロトコールにより得ることができる。Ｖａｕｇｈａｎら（前出）は、これらの親和性成熟法について論じている。
【０２１２】
この文脈における、本明細書で用いられる、親和性の改善とは、出発分子に対する改善を指す。
【０２１３】
所望の場合、本開示における使用のための抗体分子を、１又は複数のエフェクター分子（単数又は複数）へとコンジュゲートさせることができる。エフェクター分子は、本発明の抗体へと接合させうる、単一の部分を形成するように連結された、単一のエフェクター分子、又は２つ若しくはこれを超えるこのような分子を含みうることが理解されるであろう。エフェクター分子へと連結された抗体断片を得ることが所望され場合、これは、抗体断片を、直接、又はカップリング剤を介して、エフェクター分子へと連結する、標準的な化学的手順又は組換えＤＮＡ手順により調製することができる。当技術分野では、このようなエフェクター分子を、抗体へとコンジュゲートするための技法が周知である（Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「制御薬物送達（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編、１９８７、６２３〜５３頁；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２：１１９〜５８；及びＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９、「薬理学と治療剤（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）」、８３、６７〜１２３を参照されたい）。特定の化学的手順は、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６、及びＷＯ０３／０３１５８１において記載されている手順を含む。代替的に、エフェクター分子が、タンパク質又はポリペプチドである場合、連結は、例えば、ＷＯ８６／０１５３３及びＥＰ０３９２７４５に記載されている、組換えＤＮＡ手順を使用して達成することもできる。
【０２１４】
本明細書で使用される「エフェクター分子」という用語は、例えば、生物学的に活性のタンパク質、例えば、酵素、他の抗体又は抗体断片、合成ポリマー又は天然におけるポリマー、核酸及びこの断片、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びこれらの断片、放射性核種、特に、放射性核種、放射性同位体、キレート化金属、ナノ粒子、及び蛍光化合物、又はＮＭＲ若しくはＥＳＲ分光光度法により検出されうる化合物などのレポーター基を含む。
【０２１５】
他のエフェクター分子は、１１１Ｉｎ及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリフォルニウム２５２、イリジウム１９２、及びタングステン１８８／レニウム１８８などのキレート化放射性核種；又はアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼ阻害剤、トキソイド、及びスラミンなどであるがこれらに限定されない薬物を含みうる。
【０２１６】
他のエフェクター分子は、タンパク質、ペプチド、及び酵素を含む。目的の酵素はタンパク質分解性酵素、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼを含むがこれらに限定されない。目的のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドは免疫グロブリン、アブリン、リシンＡ、シュードモナス外毒素、若しくはジフテリア毒素などの毒素、インスリン、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来増殖因子、若しくは組織プラスミノーゲン活性化因子などのタンパク質、抗血栓剤若しくは抗血管新生剤、例えば、アンギオスタチン若しくはエンドスタチン、又はリンホカイン、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）などの生物学的応答修飾剤、或いは他の増殖因子及び免疫グロブリンを含むがこれらに限定されない。
【０２１７】
他のエフェクター分子は、例えば、診断において有用な、検出用物質を含みうる。検出用物質の例は、多様な酵素、補欠分子群、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性核種、ポジトロン放射金属（ポジトロン断層法における使用のための）、及び非放射性常磁性金属イオンを含む。一般に、診断剤としての使用のための抗体へとコンジュゲートさせうる金属イオンについては、ＵＳ４，７４１，９００を参照されたい。適切な酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼを含み；適切な補欠分子群は、ストレプトアビジン、アビジン、及びビオチンを含み；適切な蛍光材料は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、イソチオシアン酸フルオレセイン、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ｄｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉａｚｙｎｙｌａｍｉｎｅ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ）、ダンシルクロリド、及びフィコエリトリンを含み；適切な発光材料は、ルミノールを含み；適切な生物発光材料は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンを含み；適切な放射性核種は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９Ｔｃを含む。
【０２１８】
別の実施形態では、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける抗体の半減期を延長する場合もあり、且つ／又は抗体の免疫原性を低減する場合もあり、且つ／又は抗体の、上皮障壁を越える、免疫系への送達を増強する場合もある。この種類の、適切なエフェクター分子の例は、ポリマー、アルブミン、アルブミン結合性タンパク質、又はＷＯ０５／１１７９８４において記載されている、アルブミン結合性化合物などのアルブミン結合性化合物を含む。
【０２１９】
エフェクター分子が、ポリマーである場合、エフェクター分子は一般に、合成ポリマー又は天然におけるポリマー、例えば、任意選択で置換された直鎖状鎖又は分枝状鎖である、ポリアルキレン、ポリアルケニレン又はポリオキシアルキレンポリマーの場合もあり、分枝状多糖又は非分枝状多糖、例えば、ホモ多糖又はヘテロ多糖の場合もある。
【０２２０】
上述の合成ポリマー上に存在しうる、具体的な、任意選択の置換基は、１又は複数の、ヒドロキシ基、メチル基、又はメトキシ基を含む。
【０２２１】
合成ポリマーの具体例は、任意選択で、置換された直鎖状鎖又は分枝状鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（ビニルアルコール）、又はこれらの誘導体、とりわけ、任意選択で、メトキシポリ（エチレングリコール）などの置換ポリ（エチレングリコール）、又はこれらの誘導体を含む。
【０２２２】
具体的な、天然におけるポリマーは、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、又はこれらの誘導体を含む。
【０２２３】
本明細書で使用される「誘導体」とは、反応性の誘導体、例えば、マレイミドなど、チオール選択的な反応性基を含むことを意図する。反応性基は、ポリマーへと、直接連結することもでき、リンカーセグメントを介して連結することもできる。このような基を有する残基は、場合によって、抗体断片とポリマーとの間の連結基として、生成物の部分を形成することが理解されるであろう。
【０２２４】
ポリマーのサイズは、所望に応じて、変動させうるが、一般に、５００Ｄａ〜５００００Ｄａ、例えば、２００００〜４００００Ｄａ５０００〜４００００Ｄａの範囲の平均分子量であろう。ポリマーサイズは、特に、生成物の意図される使用、例えば、腫瘍など、ある特定の組織に局在化する能力、又は循環半減期を延長する能力（総説については、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４、５３１〜５４５を参照されたい）に基づき選択することができる。したがって、例えば、生成物が、例えば、腫瘍の処置における使用のために、循環を離れ、組織に浸透することが意図される場合、例えば、分子量を、約５０００Ｄａとする、低分子量ポリマーを使用することが有利でありうる。生成物が循環内に滞留する適用のためには、例えば、２００００Ｄａ〜４００００Ｄａの範囲の分子量を有する、高分子量ポリマーを使用することが有利でありうる。
【０２２５】
適切なポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、若しくは、とりわけ、メトキシポリ（エチレングリコール）、又はこれらの誘導体などのポリアルキレンポリマーを含み、とりわけ、分子量を、約１５０００Ｄａ〜約４００００Ｄａの範囲とする。
【０２２６】
一実施形態では、本開示における使用のための抗体を、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分へと接合させる。特定の一例では、抗体は、抗体断片であり、ＰＥＧ分子は、抗体断片内に位置する、任意の利用可能なアミノ酸側鎖、又は末端のアミノ酸官能基、例えば、任意の遊離アミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基を介して接合させることができる。このようなアミノ酸は、抗体断片内で、天然において存在する場合もあり、組換えＤＮＡ方法を使用して、断片へと操作される場合もある（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６；ＵＳ５，６６７，４２５；ＷＯ９８／２５９７１、ＷＯ２００８／０３８０２４を参照されたい）。一実施形態では、本発明の抗体分子は、修飾Ｆａｂ断片であり、この場合、修飾は、エフェクター分子への接合を可能とする、１又は複数のアミノ酸の、その重鎖のＣ末端への付加である。さらなるアミノ酸は、エフェクター分子を接合させうる、１又は複数のシステイン残基を含有する、修飾ヒンジ領域を形成すると適切である。複数の部位を使用して、２つ又はこれを超えるＰＥＧ分子を接合させることができる。
【０２２７】
ＰＥＧ分子は、抗体断片内に位置する、少なくとも１つのシステイン残基のチオール基を介して、共有結合的に連結されると適切である。修飾抗体断片へと接合させた各ポリマー分子は、断片内に位置するシステイン残基の硫黄原子へと、共有結合的に連結することができる。共有結合的連結は、一般に、ジスルフィド結合であるか、又は、特に、硫黄−炭素結合であろう。チオール基を、適切に活性化したエフェクター分子の接合点として使用する場合、例えば、マレイミド及びシステイン誘導体など、チオール選択的誘導体を使用することができる。活性化ポリマーを、上記で記載した、ポリマー修飾された抗体断片の調製における出発材料として使用することができる。活性化ポリマーは、α−ハロカルボン酸又はα−ハロカルボン酸エステルなど、チオール反応性基を含有する任意のポリマー、例えば、ヨードアセトアミド、イミド、例えば、マレイミド、ビニルスルホン、又はジスルフィドでありうる。このような出発材料は、市販品（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、旧称：Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、ＡＬ、ＵＳＡ製の）を得ることもでき、従来の化学的手順を使用して、市販の出発材料から調製することもできる。特定のＰＥＧ分子は、２０Ｋのメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、旧称：Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから市販されている；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；且つ、ＳｕｎＢｉｏからも市販されている）、及びＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、旧称：Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから市販されている）を含む。
【０２２８】
一実施形態では、本開示の構築物中のＦａｂ又はＦａｂ’は、ＰＥＧ化される、すなわち、例えば、ＥＰ０９４８５４４又はＥＰ１０９００３７［また、「ポリ（エチレングリコール）の化学、生物工学的応用、及び生物医学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９２、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；「ポリ（エチレングリコール）の化学及び生物学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９７、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ；並びに「生物医科学のためのバイオコンジュゲーションによるタンパク質カップリング法（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９８、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．、２００２、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００２、５４：５３１〜５４５も参照されたい］において開示されている方法に従い、これへと、ＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を共有結合的に接合させている。一実施形態では、ＰＥＧを、ヒンジ領域内のシステインへと接合させる。一例では、ＰＥＧ修飾Ｆａｂ断片は、修飾ヒンジ領域内の単一のチオール基へと共有結合的に連結されたマレイミド基を有する。リシン残基を、マレイミド基へと、共有結合的に連結することができ、リシン残基上のアミン基の各々へと、約２０，０００Ｄａの分子量を有する、メトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーを接合させることができる。したがって、Ｆａｂ断片へと接合させるＰＥＧの全分子量は、約４０，０００Ｄａでありうる。
【０２２９】
特定のＰＥＧ分子は、ＰＥＧ２ＭＡＬ４０Ｋ（Ｎｅｋｔａｒ、旧称：Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒから市販されている）としてもまた公知の、Ｎ，Ｎ’−ビス（メトキシポリ（エチレングリコール））（ＭＷ２０，０００）の、２−［３−（Ｎ−マレイミド）プロピオンアミド］エチルアミドで修飾されたリシンを含む。
【０２３０】
ＰＥＧリンカーの代替的な供給元は、ＧＬ２−４００ＭＡ２（この場合、下記の構造におけるｍは、５であり、ｎは、約４５０である）及びＧＬ２−４００ＭＡ（この場合、ｍは、２であり、ｎは、約４５０である）：
【化１】
2020502181.tif 000009
を供給するＮＯＦを含む。
【０２３１】
すなわち、各ＰＥＧは、約２０，０００Ｄａである。
【０２３２】
以下の種類：
【化２】
2020502181.tif 000010
の、さらなる代替的なＰＥＧエフェクター分子は、Ｄｒ  Ｒｅｄｄｙ、ＮＯＦ、及びＪｅｎｋｅｍから市販されている。
【０２３３】
一実施形態では、ＰＥＧ化された（例えば、本明細書で記載されるＰＥＧにより）、本開示の抗体分子であって、残基鎖内のアミノ酸２２６、例えば、重鎖のアミノ酸２２６（連番による番号付け）におけるシステインアミノ酸、又はこの近傍のシステインアミノ酸残基を介して接合させた、上記本開示の抗体分子が提供される。
【０２３４】
一実施形態では、ＤＮＡ配列など、本開示の分子をコードするポリヌクレオチド配列が提供される。一実施形態では、式（Ｉ）、（Ｉａ）、又は（Ｉｂ）のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列が提供される。一実施形態では、式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、又は（ＩＩｂ）のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列が提供される。一実施形態では、本開示の分子の、２つ又はこれを超えるポリペプチド構成要素など、１又は複数のポリペプチド構成要素をコードするポリヌクレオチド配列が提供され、例えば、式（Ｉ）及び（ＩＩ）、又は（Ｉａ）及び（ＩＩａ）、又は（Ｉｂ）及び（ＩＩｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列が提供される。
【０２３５】
一実施形態では、ＤＮＡなどのポリヌクレオチドは、ベクター内に含まれる。
【０２３６】
一実施形態では、ベクターは、式（Ｉ）、（Ｉａ）、又は（Ｉｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、例えば、ＤＮＡは、式（Ｉ）、（ＩＩａ）、及び／又は（ＩＩｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列へと直接的につながれたり、接続されたりしていない。
【０２３７】
一実施形態では、ベクターは、式（ＩＩ）、（ＩＩａ）、又は（ＩＩｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、例えば、ＤＮＡは、式（Ｉ）、（Ｉａ）、及び／又は（Ｉｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列へと直接的につながれたり、接続されたりしていない。
【０２３８】
一実施形態では、重鎖及び軽鎖をコードするＤＮＡが、１つのプラスミド上に与えられるベクター、又は重鎖が、１つのプラスミド／ベクター上に与えられ、軽鎖が、異なるプラスミド／ベクター上に与えられるベクターなど、ベクターは、本開示に従う抗体構築物の重鎖配列及び軽鎖配列をコードするＤＮＡを、例えば、同じＤＮＡ鎖上又は異なるＤＮＡ鎖上（すなわち、接続されたＤＮＡ又は個別のＤＮＡ）に含む。
【０２３９】
当業者には、ベクターを構築しうる、一般的な方法、トランスフェクション法、及び培養法が周知である。この点で、「分子生物学における最新プロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９９９、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（編）、Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；及びＣｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇにより刊行されている、Ｍａｎｉａｔｉｓによるマニュアルが参照される。
【０２４０】
また、本開示の抗体をコードする、本明細書で記載される、１又は複数のＤＮＡ配列を含む、１又は複数のクローニングベクター又は発現ベクターを含む宿主細胞も提供される。任意の適切な宿主細胞／ベクター系を、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡ配列を発現させるために使用することができる。細菌系、例えば、大腸菌系、及び他の微生物系を使用することもでき、真核細胞発現系、例えば、哺乳動物の宿主細胞発現系もまた、使用することができる。適切な哺乳動物の宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、骨髄腫細胞、又はハイブリドーマ細胞を含む。
【０２４１】
本開示はまた、本開示に従う抗体分子を作製するためのプロセスであって、本発明の抗体分子をコードするＤＮＡからの、タンパク質の発現をもたらすのに適する条件下で、本発明のベクターを含有する宿主細胞を培養するステップと、抗体分子を単離するステップとを含む上記プロセスも提供する。
【０２４２】
重鎖及び軽鎖の両方を含む生成物を作製するために、細胞系に、第１のベクターが、軽鎖ポリペプチドをコードし、第２のベクターが、重鎖ポリペプチドをコードする、２つのベクターをトランスフェクトすることができる。代替的に、例えば、本明細書で記載される、軽鎖ポリペプチド及び重鎖ポリペプチドをコードする配列を含む、単一のベクターを使用することができる。一例では、細胞系に、各々が、本発明の抗体分子のポリペプチド鎖をコードする、３つのベクターをトランスフェクトすることができる。
【０２４３】
一実施形態では、細胞に、１つずつが、例えば、同じベクター上、又は異なるベクター上に与えられる、本開示の異なるポリペプチドをコードする、２つのベクターをトランスフェクトする。一実施形態では、細胞（細胞系）は、式（Ｉａ）のポリペプチド及び式（ＩＩａ）のポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、例えば、この場合、各ポリペプチドをコードするＤＮＡは、同じベクター上、又は異なるベクター上にある。一実施形態では、細胞（細胞系）は、式（Ｉｂ）のポリペプチド及び式（ＩＩｂ）のポリペプチドをコードするＤＮＡを含み、例えば、この場合、各ポリペプチドをコードするＤＮＡは、同じベクター上、又は異なるベクター上にある。
【０２４４】
多特異性抗体生成物の発現を最適化するために、宿主細胞へとトランスフェクトされる各ベクターの比を変動させうることが理解されるであろう。一実施形態では、ベクターの比は、１：１である。当業者は、トランスフェクション後における、タンパク質の発現レベルについての規定の試験により、最適の比を見出すことが可能であることが理解されるであろう。
【０２４５】
また、ポリペプチド構成要素のうちの、２つ又はこれを超える構成要素が、単一のベクター内のポリヌクレオチドによりコードされる場合、本開示のポリペプチド構成要素をコードする、各ポリヌクレオチドのために、異なるプロモーターを用いることにより、各ポリペプチド構成要素の相対的発現を変動させうることも理解されるであろう。
【０２４６】
本開示に従う抗体及び断片は、宿主細胞から、良好なレベルで発現する。したがって、抗体及び／又は断片の特性は、市販品の加工に資すると考えられる。
【０２４７】
本開示の抗体は、例えば、病理学的状態の処置及び／又は予防において、有用である。
【０２４８】
本開示はまた、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体のうちの１又は複数と組み合わせて、本開示の抗体分子を含む、医薬組成物又は診断用組成物も提供する。したがって、本開示の抗体又はこれを含む組成物の、処置及び医薬の製造における使用のための使用が提供される。
【０２４９】
組成物は通例、薬学的に許容される担体を通常含む、滅菌医薬組成物の部分として供給される。
【０２５０】
本開示はまた、医薬組成物又は診断用組成物を調製するためのプロセスであって、本開示の抗体分子を添加し、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、又は担体のうちの１又は複数と併せて混合するステップを含む上記プロセスも提供する。
【０２５１】
抗体分子は、医薬組成物又は診断用組成物中の、唯一の有効成分の場合もあり、他の抗体成分、例えば、抗ＩＬ−１β抗体、抗Ｔ細胞抗体、抗ＩＦＮγ抗体、若しくは抗ＬＰＳ抗体、又はキサンチンなどの非抗体成分を含む、他の有効成分を伴う場合もある。他の適切な有効成分は、免疫学的寛容を誘導することが可能な抗体、例えば、抗ＣＤ３抗体又は抗ＣＤ４抗体を含む。
【０２５２】
さらなる実施形態では、本開示に従う抗体分子又は組成物を、さらなる、薬学的に活性の薬剤、例えば、コルチコステロイド（フルチカゾンプロピオン酸エステルなど）及び／若しくはベータ−２−アゴニスト（サルブタモール、サルメテロール、又はフォルモテロールなど）、又は細胞増殖（ｃｅｌｌ  ｇｒｗｏｔｈ及びｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）の阻害剤（ラパマイシン、シクロホスファミド、メトトレキサートなど）、又は、代替的に、ＣＤ２８及び／若しくはＣＤ４０阻害剤と組み合わせて用いる。一実施形態では、阻害剤は、低分子である。別の実施形態では、阻害剤は、生物学的治療剤又は生物学的診断剤、例えば、標的に特異的な抗体である。
【０２５３】
医薬組成物は、治療有効量の、本発明の抗体を含むと適切である。本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、標的の疾患若しくは状態を処置、改善、若しくは防止するか、又は検出可能な治療効果若しくは防止効果を呈するのに必要とされる、治療剤の量を指す。任意の抗体について、治療有効量は、まず、細胞培養物アッセイ、又は通例、齧歯動物、ウサギ、イヌ、ブタ、若しくは霊長動物における動物モデルにおいて推定することができる。動物モデルはまた、適切な濃度範囲投与経路を決定するのにも使用することができる。次いで、このような情報を使用して、ヒトにおける投与に有用な用量及び経路を決定することができる。
【０２５４】
ヒト対象のための、正確な治療有効量は、対象の疾患状態の重症度、一般的な健康状態、対象の年齢、重量、及び性別、食餌、投与の時期及び頻度、薬物の組合せ（単数又は複数）、治療に対する反応感受性及び忍容性／応答に依存するであろう。この量は、規定の実験により決定することができ、医師の判断の範囲内にある。一般に、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇであろう。代替的に、用量は、１日当たり１０〜１００、２００、３００、又は４００ｍｇなど、１日当たり１〜５００ｍｇ１日当たりでありうる。医薬組成物は、所定量の、本発明の活性薬剤を含有する単位剤形で存在すると好都合でありうる。
【０２５５】
組成物は、患者へと、個別に投与することもでき、他の薬剤、薬物、又はホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、逐次的に、又は別個に）投与することもできる。
【０２５６】
一実施形態では、本開示の抗体又は組成物を、組合せ治療、例えば、がんを処置する組合せ治療において、特に、治療が、化学療法剤の投与及び／又は放射線療法の投与を含む場合に、用いる。
【０２５７】
本開示の抗体分子が投与される用量は、処置される状態の性格、存在する炎症の広がり、及び抗体分子が、予防的に使用されるのか、既存の状態を処置するのに使用されるのかに依存する。
【０２５８】
投与頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続に依存するであろう。抗体分子の半減期が短い（例えば、２〜１０時間である）場合、１日当たり１又は複数回の投与を施すことが必要でありうる。代替的に、抗体分子の半減期が長い（例えば、２〜１５日間である）場合、毎日１回、毎週１回、なお又は１又は２カ月ごとに１回の投与を施しさえすればよい場合もある。
【０２５９】
薬学的に許容される担体それ自体は、組成物を施される個体に有害な抗体の産生を誘導すべきではなく、毒性であるべきではない。適切な担体は、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、アミノ酸ポリマー、アミノ酸コポリマー、及び不活性のウイルス粒子など、大型で、代謝が緩徐な高分子でありうる。
【０２６０】
薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩などの無機酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩などの有機酸塩を使用することができる。
【０２６１】
治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、加えて、水、生理食塩液、グリセロール、及びエタノールなどの液体を含有しうる。加えて、保湿剤又は乳化剤又はｐＨ緩衝物質などの補助物質も、このような組成物中に存在しうる。このような担体は、医薬組成物が、患者による服用のための、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー、及び懸濁液として製剤化されることを可能とする。
【０２６２】
投与に適する形態は、例えば、ボーラス注射又は連続注入による、例えば、注射又は注入による非経口投与に適する形態を含む。生成物は、注射又は注入のための生成物である場合、油性媒体中又は水性媒体中の、懸濁液、溶液、又はエマルジョンの形態を取ることが可能であり、懸濁剤、保存剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの製剤化剤を含有しうる。代替的に、抗体分子は、適切な滅菌液体を伴う使用の前における復元のための乾燥形態でありうる。
【０２６３】
製剤化したら、本発明の組成物は、対象へと直接投与することができる。処置される対象は、動物でありうる。しかし、１又は複数の実施形態では、組成物を、ヒト対象への投与に適合させる。
【０２６４】
一実施形態では、本開示に従う製剤中では、最終製剤のｐＨは、抗体又は断片の等電点の値に類似しないが、これは、製剤のｐＨが７であれば、８〜９又はこれを上回るｐＩが適切でありうるからである。理論に束縛されることを望まずに述べると、これは、最終製剤に、安定性の改善をもたらしうる、例えば、抗体又は断片は、溶液中に滞留すると考えられる。
【０２６５】
本開示の医薬組成物は、経口経路、静脈内経路、筋内経路、動脈内経路、髄内経路、髄腔内経路、脳室内経路、皮内経路、経皮経路（例えば、ＷＯ９８／２０７３４を参照されたい）、皮下経路、腹腔内経路、鼻腔内経路、腸内経路、局所経路、舌下経路、膣内経路、又は直腸内経路を含むがこれらに限定されない、任意の数の経路により投与することができる。皮下噴射器もまた、本発明の医薬組成物を投与するのに使用することができる。治療用組成物は、溶液又は懸濁液としての注射剤として調製しうることが典型的である。注射の前における、液体媒体中の溶解又は懸濁に適する固体形態もまた、調製することができる。一実施形態では、本発明の抗体分子を、皮下投与する。
【０２６６】
一実施形態では、本開示に従う抗体又は組成物を、例えば、自己投与に適するフォーマットで、シリンジへとあらかじめ充填して提供する。
【０２６７】
組成物の直接的送達は一般に、皮下、腹腔内、静脈内、若しくは筋内において、注射により達せられるか、又は組織の間質腔へと送達される。組成物はまた、目的の特異的組織へも投与することができる。投薬治療は、単回の投与スケジュールの場合もあり、複数回の投与スケジュールの場合もある。
【０２６８】
組成物中の有効成分は、本開示の抗体分子であることが理解されるであろう。組成物中の有効成分は、したがって、消化管内の分解を受けやすいであろう。したがって、組成物を、消化管を使用する経路により投与する場合、組成物は、抗体を分解から保護するが、消化管から吸収されたら、抗体を放出する、薬剤を含有する必要があるであろう。
【０２６９】
薬学的に許容される担体についての完全な考察は、「レミントン薬学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．、１９９１）において入手可能である。
【０２７０】
一実施形態では、製剤は、吸入を含む局所投与のための製剤として提供される。
【０２７１】
適切な吸入用調製物は、吸入用粉末、高圧ガスを含有する計量型エアゾール、又は高圧ガスを含有しない吸入用溶液（噴霧用溶液又は懸濁液など）を含む。活性物質を含有する、本開示に従う吸入用粉末は、上述の活性物質だけからなる場合もあり、上述の活性物質の、生理学的に許容される賦形剤との混合物からなる場合もある。
【０２７２】
これらの吸入用粉末は、単糖（例えば、グルコース又はアラビノース）、二糖（例えば、ラクトース、サッカロース、マルトース）、オリゴ糖及び多糖（例えば、デキストラン）、ポリアルコール（例えば、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸カルシウム）、又はこれらの、互いとの混合物を含みうる。単糖又は二糖を使用することが適切であるが、特に、ラクトース又はグルコースの使用が適切であるが、必ずしも、それらの水和物の形態における使用が適切なわけではない。
【０２７３】
肺内沈着のための粒子は、１〜９ミクロン、例えば、０．１〜５μｍ、特に、１〜５μｍなど、１０ミクロン未満の粒子サイズを必要とする。活性薬剤（抗体又は抗体断片など）の粒子サイズは、非常に重要である。
【０２７４】
当技術分野では、吸入用エアゾールを調製するのに使用しうる高圧ガスが公知である。適切な高圧ガスは、ｎ−プロパン、ｎ−ブタン、又はイソブタンなどの炭化水素、並びにメタン、エタン、プロパン、ブタン、シクロプロパン、又はシクロブタンの塩素化誘導体及び／又はフッ素化誘導体などのハロ炭化水素から選択される。上述の高圧ガスは、それら自体で使用することもでき、これらの混合物中で使用することもできる。
【０２７５】
特に、適切な高圧ガスは、ＴＧ１１、ＴＧ１２、ＴＧ１３４ａ、及びＴＧ２２７から選択されるハロゲン化アルカン誘導体である。上述のハロゲン化炭化水素のうち、ＴＧ１３４ａ（１，１，１，２−テトラフルオロエタン）及びＴＧ２２７（１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン）並びにこれらの混合物が、特に適する。
【０２７６】
高圧ガス含有吸入用エアゾールはまた、共溶媒、安定化剤、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ−ａｃｔｉｖｅ  ａｇｅｎｔ（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ））、抗酸化剤、滑沢剤、及びｐＨを調整するための手段など、他の成分も含有しうる。当技術分野では、これらの成分全てが公知である。
【０２７７】
本発明に従う高圧ガス含有吸入用エアゾールは、重量で最大５％の活性物質を含有しうる。本発明に従うエアゾールは、例えば、重量で０．００２〜５％、重量で０．０１〜３％、重量で０．０１５〜２％、重量で０．１〜２％、重量で０．５〜２％、又は重量で０．５〜１％の活性物質を含有する。
【０２７８】
代替的に、肺への局所投与はまた、例えば、噴霧器、例えば、コンプレッサーへと接続された噴霧器（例えば、Ｐａｒｉ  Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ，Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｖａ．製の、Ｐａｒｉ  Ｍａｓｔｅｒ（登録商標）コンプレッサーへと接続されたＰａｒｉ  ＬＣ−Ｊｅｔ  Ｐｌｕｓ（登録商標）噴霧器）などのデバイスを用いる、溶液製剤又は懸濁液製剤の投与による局所投与でもありうる。
【０２７９】
一実施形態では、製剤は、噴霧化による送達のための単位用量を含有する、個別のアンプルとして提供される。
【０２８０】
一実施形態では、抗体は、復元のための凍結乾燥形態、又は、代替的に、懸濁液製剤としての凍結乾燥形態で供給される。
【０２８１】
本開示の抗体は、例えば、溶液又は懸濁液の形態で、溶媒中に分散させて送達することができる。本開示の抗体は、適切な生理学的溶液中、例えば、生理学的生理食塩液中、薬理学的に許容可能な溶媒中、又は緩衝液中に懸濁させることができる。当技術分野で公知の緩衝液は、約４．０〜５．０のｐＨを達成するように、水１ｍｌ当たり、０．０５ｍｇ〜０．１５ｍｇのエデト酸二ナトリウム、８．０ｍｇ〜９．０ｍｇのＮａＣｌ、０．１５ｍｇ〜０．２５ｍｇのポオリソルバート、０．２５ｍｇ〜０．３０ｍｇの無水クエン酸、及び０．４５ｍｇ〜０．５５ｍｇのクエン酸ナトリウムを含有しうる。前述の通り、懸濁液は、例えば、凍結乾燥抗体から作ることができる。
【０２８２】
治療用の懸濁液又は溶液による製剤はまた、１又は複数の賦形剤も含有しうる。当技術分野では、賦形剤が周知であり、緩衝液（例えば、クエン酸緩衝液、リン酸緩衝液、酢酸緩衝液、及び重炭酸緩衝液）、アミノ酸、尿素、アルコール、アスコルビン酸、リン脂質、タンパク質（例えば、血清アルブミン）、ＥＤＴＡ、塩化ナトリウム、リポソーム、マンニトール、ソルビトール、及びグリセロールを含む。溶液又は懸濁液は、リポソーム内又は生体分解性マイクロスフェア内に封入することができる。製剤は、一般に、滅菌製造工程を用いて、実質的な滅菌形態で提供されるであろう。
【０２８３】
これは、滅菌緩衝溶媒による溶液中の、抗体の無菌懸濁液である製剤に使用される、緩衝溶媒溶液の濾過と、当業者が精通している方法による、製剤の、滅菌容器への分注とによる、作製及び滅菌処理を含みうる。
【０２８４】
本開示に従う噴霧用製剤は、例えば、フォイル製の包装材料内に包装された、単回投与単位（例えば、密封されたプラスチック製容器又はバイアル）として提供されうる。各バイアルは、ある容量、例えば、２ｍｌの溶媒／溶液用緩衝液中に、単位用量を含有する。
【０２８５】
本開示の抗体は、噴霧化を介する送達に適すると考えられる。
【０２８６】
また、本開示に従う多特異性抗体分子と、賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む医薬組成物も提供される。
【０２８７】
本開示はまた、処置における使用のための、特に、感染症（ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、及び寄生虫性感染症）、感染と関連する内毒性ショック、関節リウマチなどの関節炎、重度の喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣洞、腹膜炎、乾癬、血管炎、術後癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、ループス（全身性エリテマトーデスなど）、及びギラン−バレー症候群など、中枢神経系及び末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫障害、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主病、移植片拒絶、心筋梗塞のほか、アテローム性動脈硬化、血管内凝固などの虚血性心疾患を含む心疾患、骨吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周病、低塩酸症、がん、例えば、上皮がんからなる群から選択される、状態又は障害の処置における使用のための、本開示に従う多特異性抗体分子又は医薬組成物へも拡張される。
【０２８８】
したがって、感染症（ウイルス性感染症、細菌性感染症、真菌性感染症、及び寄生虫性感染症）、感染と関連する内毒性ショック、関節リウマチなどの関節炎、重度の喘息などの喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、骨盤内炎症性疾患、アルツハイマー病、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ペロニー病、セリアック病、胆嚢疾患、毛巣洞、腹膜炎、乾癬、血管炎、術後癒着、脳卒中、Ｉ型糖尿病、ライム病、髄膜脳炎、自己免疫性ブドウ膜炎、多発性硬化症、ループス（全身性エリテマトーデスなど）、及びギラン−バレー症候群など、中枢神経系及び末梢神経系の免疫媒介性炎症性障害、アトピー性皮膚炎、自己免疫性肝炎、線維化性肺胞炎、グレーブス病、ＩｇＡ腎症、特発性血小板減少性紫斑病、メニエール病、天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、サルコイドーシス、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、他の自己免疫障害、膵炎、外傷（手術）、移植片対宿主病、移植片拒絶、心筋梗塞のほか、アテローム性動脈硬化、血管内凝固などの虚血性心疾患を含む心疾患、骨吸収、骨粗鬆症、骨関節炎、歯周病、低塩酸症、がん、例えば、上皮がんからなる群から選択される、状態又は障害の処置のための医薬の製造のための、本開示の多特異性抗体分子又は医薬組成物の使用が提示される。
【０２８９】
本明細書で、本明細書の文脈において使用される「〜を含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「〜を含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」として解釈されるべきである。
【０２９０】
実施形態及び優先形態は、技術的に適切である限りにおいて、組み合わせることができる。
【０２９１】
本開示は、本明細書において、ある特定の整数を含む実施形態について記載する。本開示また、前記整数からなるか、又はこれらから本質的になる、同じ実施形態へも拡張される。
【０２９２】
特許文献を含む参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９３】
本明細書で引用される、実証的な実施形態は、免責事項の基盤として用いられうる。
【０２９４】
本出願は、参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｇ１６２１５９１．５による優先権を主張する。本開示に対する補正は、本開示、特に、前記優先権の文献において開示された配列に基づきうる。
【実施例】
【０２９５】
（例１）
６４５  ＣＤＲを、Ｆａｂ内及びＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ内の、４９７フレームワーク又は２１０９フレームワークへとグラフトした、６４５変異体についての解析
Ｆａｂを、ヒンジを伴わないＦａｂ（Ｆａｂ）フォーマットとしてデザインし、全てのＦａｂ−ｄｓｓｃＦｖ抗体（ＢＹｂｅともまた称する）は、Ｇ４Ｓベースのリンカー（ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号４３）を介して、Ｆａｂ重鎖（ＨＣ）を、ジスルフィドで安定化させたｓｃＦｖ（ｄｓ  ＨＬ；すなわち、ＶＨ−リンカー−ＶＬ；リンカー＝ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ；配列番号９７）へと連結したＨＣ  ＢＹｂｅとして構築した。ＨＣ  ＢＹｂｅは、６４５  ＣＤＲを、４９７フレームワーク又は２１０９フレームワークへとグラフトした、親６４５グラフト（ｇＬ４ｇＨ５）及びその６４５変異体を使用して構築した。６４５変異体は、ｓｃＦｖ位において、ｄｓ  ＨＬとして、又はジスルフィドで安定化させたｓｃＦｖとして、Ａ２６と共に、Ｆａｂ位において使用した。図１に示される抗体を構築したが、ここで、ＦＷとは、フレームワークを意味する。
【０２９６】
方法
一過性のｅｘｐｉＨＥＫ発現
製造元（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により推奨される通りに、５０ｍｌのスケール、二連で、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）法により、比を１：１とする、軽鎖プラスミド及び重鎖プラスミドを、ＥｘｐｉＨＥＫ細胞へとトランスフェクトした。トランスフェクションを、３７℃、１４０ｒｐｍ、及び８％のＣＯ２で振盪しながら、インキュベートした。７日後、上清を採取し、０．２２μｍのフィルターを介して濾過し、発現収率は、特許権のあるＦａｂを、標準物質として使用するプロテインＧ  ＨＰＬＣにより決定した。
【０２９７】
タンパク質の精製
ＭＷＣＯを１０ｋＤとするＣｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮器を使用して、上清を、４０倍に濃縮し、その後、ＨｉＴｒａｐ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードした。カラムを、ＰＢＳ  ｐＨ７．４で洗浄するのに続き、結合した材料を、０．１ＭのグリシンｐＨ２．７で溶出させた。溶出物を、２Ｍのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）で中和してから、ＰＢＳ  ｐＨ７．４へと緩衝液交換した。溶出させたタンパク質を、２８０ｎｍの吸光度で定量化し、ＰＢＳ  ｐＨ７．４中１ｍｇ／ｍｌへと希釈し、さらなる解析の前に、４℃で、少なくとも１６時間にわたり保管した。
【０２９８】
サイズ除外（ＳＥ）ＨＰＬＣ
Ｇ３０００におけるＳＥ  ＨＰＬＣのために、精製されたタンパク質試料（約２０μｇ）を、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷ，１０μｍ，７．５ｍｍ  ＩＤ×３００ｍｍカラム（東ソー株式会社）へとロードし、０．２Ｍリン酸ｐＨ７の定組成勾配により、１ｍＬ／分で展開した。連続検出を、２８０ｎｍの吸光度で行った。
【０２９９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
精製タンパク質（２μｇ）試料を、製造元の推奨（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に従い、４〜２０％、非還元及び還元の、Ｎｏｖｅｘアクリルアミドトリス／グリシンＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによる分離のために調製した。非還元ゲルでは、１００ｍＭのＮ−エチルマレイミドもまた、試料へと添加した。試料を、ゲルへとロードし、トリス／グリシンランニング緩衝液中、１２５Ｖの一定電圧で、約２００分間にわたり分離した。ＳｅｅＢｌｕｅ２（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）タンパク質ラダーを、標準物質として使用した。ゲルを、Ｉｎｓｔａｎｔ  Ｂｌｕｅ（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）で染色し、蒸留水を何回かにわたり交換することにより脱染色した。
【０３００】
熱安定性
Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒアッセイを使用して、精製されたタンパク質の熱安定性をモニタリングした。反応ミックスは、５０００倍濃度の原液から水で希釈された、３０倍濃度のＳＹＰＲＯ（登録商標）Ｏｒａｎｇｅ色素５μｌと、ＰＢＳｐＨ７．４中に０．１１ｍｇ／ｍＬの精製タンパク質試料４５μｌとを含有した。混合物のアリコート（１０μｌ）を、３８４ＰＣＲ用光学ウェルプレートへと、四連で分注し、７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｇｉｌｅｎｔ）にかけた。ペルチエベースのサーマルサイクリングシステムを、温度傾斜率を１．１℃／分とする、２０℃〜９９℃に設定した。電荷結合素子（ＣＣＤ）により、ウェル内の蛍光変化をモニタリングした。蛍光強度の増大をプロットし、傾きの屈曲点（単数又は複数）を使用して、熱安定性の遷移中心点（Ｔｍ）を得た。
【０３０１】
表面プラズモン共鳴／二重親和性アッセイ
抗体の相互作用についての結合親和性及び反応速度についてのパラメータは、ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｂｉｏ−Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ）及びＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．０５％ｖ／ｖの界面活性剤Ｐ２０）ランニング緩衝液を使用して、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００又はＢｉａｃｏｒｅ  ３０００上で行われる、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定した。全ての実験は、２５℃で実施した。ヒトＦ（ａｂ’）２特異的ヤギＦａｂ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）、又は社内で作出された抗ヒトＣＨ１モノクローナル抗体を使用して、抗体試料を、センサーチップ表面へと捕捉した。捕捉抗体の共有結合による固定化は、６０００〜７０００応答単位（ＲＵ）のレベルまでの、標準的なアミンカップリング化学反応により達成した。
【０３０２】
ヒトアルブミンである、ＣｈｒｏｍＰｕｒｅ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、５０ｎＭから、捕捉抗体により滴定した。各アッセイサイクルは、３分間にわたる抗原（ヒトアルブミン）の注射からなる会合相の前に、１分間にわたる注射を使用して、抗体試料を捕捉し、この後で、１０分間にわたり、解離をモニタリングすることからなった。各サイクルの後で、捕捉表面を再生させた。使用される流速は、捕捉には、１０μｌ／分、会合相及び解離相には、３０μｌ／分であり、再生には、１０μｌ／分であった。リガンド（二特異性抗体）を、センサーチップ表面へと捕捉することにより、二特異性抗体が、ヒト血清アルブミン及びＴ細胞受容体リガンド（リガンド抗原）の両方に同時に結合する潜在的可能性を評価してから、３分間にわたる、５μＭのヒト血清アルブミン：５０ｎＭのリガンド抗原；又は５μＭのヒト血清アルブミン及び５０ｎＭのリガンド抗原の両方の混合溶液の個別の注入を実施した。
【０３０３】
反応速度アッセイのために、抗原の滴定（ヒト血清アルブミンについては、６２．５ｎＭ〜２μＭが典型的である）を実施し、ブランクのフローセルを、基準を差し引くために使用し、装置によるノイズ及びドリフトを差し引くために、緩衝液によるブランク注入を含めた。
【０３０４】
反応速度パラメータは、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ２．０．１、又はＢｉａｃｏｒｅ  ３０００  Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｖ３．２を使用して、結果として得られるセンサーグラムを、標準的な１：１の結合モデルに、同時にグローバルフィッティングすることにより決定した。
【０３０５】
結果
Ｆａｂ及びＢＹｂｅの一過性の発現
図３：４９７フレームワーク又は２１０９フレームワークを伴うＦａｂの発現収率（図３；２〜３）は、親６４５  Ｆａｂ（図１；１）と同等であった。ジスルフィドで連結されたＨＬ  ｓｃＦｖとしての、６４５を伴うＨＣ  ＢＹｂｅでは、親６４５グラフトのフレームワークを、４９７フレームワーク又は２１０９フレームワークで置換したところ、発現の２倍の増大が観察された（図１；７〜９）。６４５を、ＨＣ  ＢＹｂｅフォーマット内のＦａｂ位に置いたところ、親６４５と、４９７フレームワーク又は２１０９フレームワークを伴う変異体ＢＹｂｅとの間で、発現の著明な変化は、観察されなかった（図３；１０〜１２）。
【０３０６】
Ｆａｂ及びＢＹｂｅについての生物物理的解析
サイズ除外ＨＰＬＣ
図４：全てのＦａｂは、フレームワークのアイソタイプ又はＣＤＲに関わらず、高度に単量体であった（図４；１〜６）。ｓｃＦｖ（ｄｓ  ＨＬ）位に６４５を伴うＨＣ  ＢＹｂｅとしての、親６４５ＢＹｂｅ（図４；７）が、５９単量体％であるのに対し、６４５  ＣＤＲを、２１０９フレームワーク（図４；９）又は４９７フレームワーク（図４；８）へとグラフトしたところ、単量体％は、それぞれ、８０％及び９３％へと増大したことから、フレームワーク残基は、多量体化に、著明に影響を及ぼすことが確認される。他方、ＨＣ  ＢＹｂｅフォーマットのＦａｂ位に６４５を伴う場合、４９７フレームワークは、効果を及ぼさず、親６４５及びこの変異体のいずれも、高度に単量体であった（図４；１０〜１１）。２０１９フレームワーク（図４；１２）を伴う場合、フレームワーク残基は、Ｆａｂとしてであっても、多量体化に影響を及ぼすと考えられ、ＣＤＲとフレームワークとのこの組合せ、及び親２１０９（図４；３、６）は、いずれも、高度に単量体である。
【０３０７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
図５：非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上及び還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上では、全長Ｆａｂ（図５；ａ）並びに軽鎖及び重鎖（図５；ｂ）は、それらの予測Ｍｒである、それぞれ、約４９ｋＤａ及び約２４〜２６ｋＤａへと泳動された（図５；１〜６）。
【０３０８】
図６：非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、全長ＢＹｂｅ生成物（図６；ａ）は、その予測Ｍｒ（約７９ｋＤａ）より大きい、約８９ｋＤａへと泳動されることが観察された。全てのレーンの、このバンドの、それぞれ、上方及び下方において、多量体分子種並びに遊離軽鎖及び遊離重鎖を表す副次的なバンドを観察することができる。還元ゲル上では、重鎖（図６；ｂ）及び軽鎖（図６；ｃ）は、それらの予測分子量へと泳動された。
【表７】
2020502181.tif 000011
【０３０９】
親６４５  Ｆａｂ、４９７  Ｆａｂ、及び２１０９  ＦａｂのＴｍは、それぞれ、８３．１℃、７１．４℃、及び７０．８℃であった（表９；１；５〜６）。６４５  ＣＤＲの、４９７フレームワーク又は２０１９フレームワークへのグラフティングは、それぞれ、８０．２℃及び７９．２℃のＴｍを結果としてもたらしたことから、熱安定性の決定における、ＣＤＲ残基の重要性が確認される。しかし、６４５変異体を、Ａ２６  Ｆａｂ重鎖へと連結したジスルフィド安定化ｓｃＦｖとしたＨＣ  ＢＹｂｅでは、６４５  ＣＤＲ／４９７  ＦＷ及び６４５  ＣＤＲ／２１０９  ＦＷのＴｍでは、それぞれ、１５及び１８℃の著明な低減が生じた（表９；７〜９）。６４５変異体を、ＨＣ  ＢＹｂｅのＦａｂ位に置いたところ、Ｔｍは、それほど大きな影響を受けず、６４５  ＣＤＲ／２１０９  ＦＷは、親６４５と同程度に安定性であると考えられた（表９；１０〜１２）。
【０３１０】
ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に対する親和性
【表８】
2020502181.tif 000012
桁数の点で、被験の組合せにおける、フォーマットのＨＳＡに対する、オン速度及びオフ速度、並びに親和性は、親フォーマットと同等である。
【表９】
2020502181.tif 000013
【配列表フリーテキスト】
【０３１１】
配列番号２１〜２２：＜２２３＞ｄｓ４９７  ＶＨフレームワーク
＜２２３＞Ｘａａは、ＣＤＲを挿入するためのスペースを表す
＜２２３＞Ｘａａは、ＣＤＲを挿入するためのスペースを表す
＜２２３＞Ｘａａは、ＣＤＲを挿入するためのスペースを表す
配列番号２３〜２４：＜２２３＞ｄｓ４９７  ＶＬフレームワーク
＜２２３＞Ｘａａは、ＣＤＲを挿入するためのスペースを表す
＜２２３＞Ｘａａは、ＣＤＲを挿入するためのスペースを表す
＜２２３＞Ｘａａは、ＣＤＲを挿入するためのスペースを表す
配列番号２５〜２６：＜２２３＞２１０９  ＶＬフレームワーク
＜２２３＞Ｘａａは、ＣＤＲを挿入するためのスペースを表す
＜２２３＞Ｘａａは、ＣＤＲを挿入するためのスペースを表す
＜２２３＞Ｘａａは、ＣＤＲを挿入するためのスペースを表す
配列番号２７〜２８：＜２２３＞２１０９  ＶＨフレームワーク
＜２２３＞Ｘａａは、ＣＤＲを挿入するためのスペースを表す
＜２２３＞Ｘａａは、ＣＤＲを挿入するためのスペースを表す
＜２２３＞Ｘａａは、ＣＤＲを挿入するためのスペースを表す
配列番号２９〜３０：＜２２３＞リンカー
配列番号３１〜３９：＜２２３＞ヒンジリンカー配列
配列番号４０〜４１：＜２２３＞可撓性リンカー配列
配列番号４２〜４５：＜２２３＞可撓性リンカー配列
＜２２３＞Ｓｅｒは、任意選択である
配列番号４６：＜２２３＞可撓性リンカー配列
配列番号４７：＜２２３＞可撓性リンカー配列
＜２２３＞Ｓｅｒは、任意選択である
配列番号４８：＜２２３＞可撓性リンカー配列
配列番号４９：＜２２３＞可撓性リンカー配列
＜２２３＞Ｘａａは、任意の天然におけるアミノ酸でありうる
＜２２３＞可撓性リンカー配列
＜２２３＞Ｘａａは、任意の天然におけるアミノ酸でありうる
＜２２３＞Ｘａａは、任意の天然におけるアミノ酸でありうる
配列番号５０〜５１：＜２２３＞可撓性リンカー配列
＜２２３＞Ｘａａは、任意の天然におけるアミノ酸でありうる
＜２２３＞Ｘａａは、任意の天然におけるアミノ酸でありうる
＜２２３＞Ｘａａは、任意の天然におけるアミノ酸でありうる
配列番号５２：＜２２３＞可撓性リンカー配列
＜２２３＞Ｘａａは、任意の天然におけるアミノ酸でありうる
＜２２３＞Ｘａａは、任意の天然におけるアミノ酸でありうる
＜２２３＞Ｘａａは、任意の天然におけるアミノ酸でありうる
＜２２３＞Ｘａａは、任意の天然におけるアミノ酸でありうる
配列番号５３：＜２２３＞可撓性リンカー配列
＜２２３＞Ｘａａは、任意の天然におけるアミノ酸でありうる
配列番号５４〜８０：＜２２３＞可撓性リンカー配列
配列番号８１〜８２：＜２２３＞非可撓性リンカー
配列番号８３〜９６：＜２２３＞アルブミン結合性ペプチド
配列番号９７：＜２２３＞リンカー
配列番号９８〜９９：＜２２３＞配列番号６、７、８を含む、４９７  ＶＬフレームワークを伴う、６４５  Ｌ  ＣＤＲ
配列番号１００：＜２２３＞配列番号１、２、４を含む、４９７  ＶＨフレームワークを伴う、６４５  Ｈ  ＣＤＲ
配列番号１０１：＜２２３＞配列番号１、３、４を含む、ｄｓ４９７  ＶＨフレームワークを伴う、６４５  Ｈ  ＣＤＲ
配列番号１０２：＜２２３＞配列番号１１、１２を含む、２１０９  ＶＬフレームワークを伴う、６４５  Ｌ  ＣＤＲ
配列番号１０３：＜２２３＞配列番号１１、１２を含む、ｄｓ２１０９  ＶＬフレームワークを伴う、６４５  Ｌ  ＣＤＲ
配列番号１０４：＜２２３＞配列番号１６、１７を含む、２１０９  ＶＨフレームワークを伴う、６４５  Ｈ  ＣＤＲ
配列番号１０５：＜２２３＞配列番号１６、１８を含む、ｄｓ２１０９  ＶＨフレームワークを伴う、６４５  Ｈ  ＣＤＲ
配列番号１０７：＜２２３＞リンカー−ｓｃＦｖ  ６４５  ＣＤＲ／４９７  ＦＷ  ｄｓ  ＨＬ
配列番号１０８：＜２２３＞野生型ＩｇＧ１のＣＨ１
＜２２３＞Ａｌａは、任意選択である
配列番号１０９：＜２２３＞野生型ＩｇＧ４のＣＨ１
＜２２３＞Ａｌａは、任意選択である
配列番号１１０：＜２２３＞野生型Ｉｇのカッパ定常軽鎖
配列番号１１２：＜２２３＞リンカー−ｓｃＦｖ  ６４５  ＣＤＲ／２１０９  ＦＷ  ｄｓ  ＨＬ
配列番号１３７：＜２２３＞Ｘａａは、Ａ又はＤである
＜２２３＞Ｘａａは、Ｌ又はＭである
配列番号１３８：＜２２３＞Ｘａａは、Ａ又はＶである
配列番号１３９：＜２２３＞Ｘａａは、Ｓ又はＴである
＜２２３＞Ｘａａは、Ｆ又はＹである
＜２２３＞Ｘａａは、Ｆ又はＶである
＜２２３＞Ｘａａは、Ｙ又はＦである
配列番号１４０：＜２２３＞Ｘａａは、Ｖ又はＬである
配列番号１４１：＜２２３＞Ｘａａは、Ｖ又はＩである
配列番号１４２：＜２２３＞Ｘａａは、Ｒ又はＶである
＜２２３＞Ｘａａは、Ｄ又はＫである
＜２２３＞Ｘａａは、Ｓ又はＡである
＜２２３＞Ｘａａは、Ｔ又はＳである
＜２２３＞Ｘａａは、Ｌ又はＡである
＜２２３＞Ｘａａは、Ｋ又はＲである
＜２２３＞Ｘａａは、Ｔ又はＡである
＜２２３＞Ｘａａは、Ｔ又はＲである
配列番号１４９〜１５１：＜２２３＞可変重鎖配列
配列番号１５２：＜２２３＞可変軽鎖配列
配列番号１５３：＜２２３＞可変重鎖配列
【図１】
2020502181.tif 000014
【図２ａ−１】
2020502181.tif 000015
【図２ａ−２】
2020502181.tif 000016
【図２ａ−３】
2020502181.tif 000017
【図２ａ−４】
2020502181.tif 000018
【図２ａ−５】
2020502181.tif 000019
【図２ｂ】
2020502181.tif 000020
【図３】
2020502181.tif 000021
【図４】
2020502181.tif 000022
【図５】
2020502181.tif 000023
【図６】
2020502181.tif 000024
【図７】
2020502181.tif 000025
【図８】
2020502181.tif 000026
【配列表】
2020502181000001.app
【国際調査報告】
2020502181.tif 000027
2020502181.tif 000028
2020502181.tif 000029
2020502181.tif 000030