(57)【要約】  本願は、検体を含む複合体を検出するための方法および装置であって、溶液中のサンプルを、磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体に結びつく第1部分を含むよう機能化された第1タイプの機能化ビーズの集団に接触させることと、サンプル溶液を、適切な条件下で検体に結びつく第2部分を含むよう機能化された第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させることであって、接触は、第1タイプの機能化ビーズの1つ、検体、および第2タイプの機能化ビーズの1つを含む複合体の形成に至る、接触させることと、磁気機能化ビーズによって生成された磁場を検出することにより、かつ複合体内で検体に結びついた第2タイプの機能化ビーズを検出することによって、検体を含む複合体を検出することとを含む、方法および装置を開示する。
2020514709.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光学検出磁気共鳴(ODMR)に基づいて検体を含む複合体を検出するためのビーズに基づいた磁気アッセイシステムであって：
(a)磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体に結びつく第1部分を含むよう機能化された第1タイプの複数の機能化ビーズと；
(b)適切な条件下で前記検体に結びつく第2部分を含むよう機能化された第2タイプの複数の機能化ビーズと；
(c)少なくとも1つのODMR中心を含む基質と；
(d)前記少なくとも1つのODMR中心内で電子を基底状態から励起状態まで励起する入射光を発生するよう構成された光源と；
(e)前記少なくとも1つのODMR中心上に配置された複合体にバイアス磁場を印加する磁石であって、前記複合体は、前記第1タイプの機能化ビーズの1つ、前記検体、および前記第2タイプの機能化ビーズの1つを含む、磁石と、
(f)前記少なくとも1つのODMR中心に入射するマイクロ波場を生成するよう構成されたマイクロ波源とを含み、前記マイクロ波源は、前記少なくとも1つのODMR中心での基底状態遷移に対応した周波数を備えた前記マイクロ波場を生成するようさらに構成されており、ここでは、前記少なくとも1つのODMR中心は、前記入射光によって照らされると放射光を発生し、前記放射光の特性は、前記マイクロ波場によっても、前記複合体内で前記検体に結びついた前記磁気機能化ビーズによっても影響される、マイクロ波源と、
(g)前記少なくとも1つのODMR中心により放射された光を検出する光学式光検出器とを含む、システム。
【請求項２】
前記少なくとも1つのODMR中心は炭化ケイ素格子中のケイ素-空孔中心である、請求項1に記載のシステム。
【請求項３】
前記少なくとも1つのODMR中心はダイヤモンド格子内のケイ素-空孔中心である、請求項1に記載のシステム。
【請求項４】
前記少なくとも1つのODMR中心はダイヤモンド格子内の窒素-空孔中心である、請求項1に記載のシステム。
【請求項５】
前記少なくとも1つのODMR中心は前記基質の上面に形成されている、請求項4に記載のシステム。
【請求項６】
前記少なくとも1つのODMR中心は、前記ダイヤモンド基質の前記上面に形成された複数のODMR中心である、請求項5に記載のシステム。
【請求項７】
前記光学式光検出器は、前記複数のODMR中心からの前記放射光をイメージングするイメージングセンサーを備えた光学イメージングシステムである、請求項6に記載のシステム。
【請求項８】
前記第1および前記第2部分のぞれぞれは、受容体、タンパク質、抗体、細胞、ウイルス、または核酸配列である、請求項1に記載のシステム。
【請求項９】
前記第1タイプの機能化ビーズは、超常磁性材料を含んだ超常磁性機能化ビーズである、請求項1に記載のシステム。
【請求項１０】
前記第1タイプの機能化ビーズは、前記超常磁性材料を封入する非磁性層を含む、請求項9に記載のシステム。
【請求項１１】
前記超常磁性機能化ビーズは酸化鉄粒子を含む、請求項9に記載のシステム。
【請求項１２】
前記第1タイプの機能化ビーズは、ポリマー基質内に配置された磁気ナノ粒子を含む、請求項1に記載のシステム。
【請求項１３】
前記第1タイプの機能化ビーズは、ポリマー基質の表面上に配置された磁気ナノ粒子を含む、請求項1に記載のシステム。
【請求項１４】
前記第2タイプの機能化ビーズは、蛍光機能化ビーズである、請求項1に記載のシステム。
【請求項１５】
前記第2タイプの機能化ビーズは、前記第1タイプの機能化ビーズから区別可能な一定量の磁気材料を含んだ磁気機能化ビーズである、請求項1に記載のシステム。
【請求項１６】
前記第2タイプの機能化ビーズは磁気機能化ビーズであり、前記第2タイプの機能化ビーズは、前記第1タイプの機能化ビーズから区別可能な磁気特性を含んでいる、請求項1に記載のシステム。
【請求項１７】
前記第1タイプの機能化ビーズは、超常磁性材料を含んだ超常磁性機能化ビーズである、請求項16に記載のシステム。
【請求項１８】
前記第1タイプの機能化ビーズは、前記超常磁性材料を封入する非磁性層を含む、請求項17に記載のシステム。
【請求項１９】
前記第2タイプの機能化ビーズは、強磁性材料を含んだ強磁性機能化ビーズである、請求項16に記載のシステム。
【請求項２０】
前記第2タイプの機能化ビーズは、前記強磁性材料を封入する非磁性層を含む、請求項19に記載のシステム。
【請求項２１】
前記第1タイプの機能化ビーズおよび前記第2タイプの機能化ビーズのそれぞれは、50 nmから10 μmまでの範囲の直径を備える、請求項1に記載のシステム。
【請求項２２】
前記第1タイプおよび前記第2タイプの機能化ビーズの直径は、それぞれ0.5 μmから5 μmまでの範囲である、請求項21に記載のシステム。
【請求項２３】
前記第1タイプの機能化ビーズの直径は、前記第2タイプの機能化ビーズの直径に類似している、請求項21に記載のシステム。
【請求項２４】
前記第1タイプの機能化ビーズの直径は、前記第2タイプの機能化ビーズの直径とは少なくとも50%異なる、請求項21に記載のシステム。
【請求項２５】
適切な条件下で少なくとも第2検体に結びつく少なくとも前記第2部分を含むよう機能化された少なくとも第3タイプの複数の機能化ビーズをさらに含む、請求項1に記載のシステム。
【請求項２６】
適切な条件下で前記第2検体に結びつく前記第2部分を含むよう機能化された第4タイプの複数の機能化ビーズをさらに含む、請求項25に記載のシステム。
【請求項２７】
前記第1および/または第2タイプの機能化ビーズは、適切な条件下で前記第2検体に結びつく少なくとも1つの追加部分をさらに含む、請求項25に記載のシステム。
【請求項２８】
適切な条件下で第3検体に結びつく第3部分をさらに含み、前記第1タイプの機能化ビーズは前記第2部分を含むようさらに機能化されており、前記第2タイプの機能化ビーズは前記第3部分を含むようさらに機能化されている、請求項27に記載のシステム。
【請求項２９】
検体を含む複合体を検出する方法であって：
(a)溶液中のサンプルを、磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体と特異的に結びつくことができる第1部分を含むよう機能化された第1タイプの機能化ビーズの集団に接触させる段階と；
(b)当該サンプル溶液を、適切な条件下で前記検体に結びつく第2部分を含むよう機能化された第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させる段階であって、接触は、前記第1タイプの機能化ビーズの1つ、前記検体、および前記第2タイプの機能化ビーズの1つを含む複合体の形成に至る、接触させる段階と；
(c)前記磁気機能化ビーズによって生成された磁場を検出することにより、かつ前記複合体内で前記検体に結びついた前記第2タイプの機能化ビーズを検出することによって、前記検体を含む前記複合体を検出する段階とを含む、方法。
【請求項３０】
前記複合体を含む前記サンプル溶液を、その内部に形成された少なくとも1つの光学検出磁気共鳴(ODMR)中心を含む基質上に配置する段階と；電子を前記少なくとも1つのODMR中心内で基底状態から励起状態まで入射光によって励起する段階と；バイアス磁場を前記複合体に印加する段階と；前記少なくとも1つのODMR中心に入射するマイクロ波場を生成する段階とを含み、前記マイクロ波場は、前記少なくとも1つのODMR中心での基底状態遷移に対応した周波数を含み、前記検体を含む前記複合体の検出は、前記少なくとも1つのODMR中心によって放射された光を分析する段階をさらに含み、前記放射光の特徴は、前記マイクロ波場により影響されかつ前記複合体内で前記検体に結びついた前記磁気機能化ビーズにより影響される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
前記少なくとも1つのODMR中心はダイヤモンド格子内の窒素-空孔中心である、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
前記少なくとも1つのODMR中心は前記基質の上面に形成されている、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
前記少なくとも1つのODMR中心は、前記基質の前記上面に形成された複数のODMR中心である、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
前記複数のODMR中心から放射される光の分析は、当該放射光のイメージングを含む、請求項33に記載の方法。
【請求項３５】
前記サンプルを前記第1タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後に、磁場勾配を前記サンプル溶液に印加する段階をさらに含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３６】
前記磁場勾配を前記サンプル溶液に印加する段階は、前記サンプル溶液を前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後に実行される、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
前記第1タイプの機能化ビーズの前記集団および前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団は、前記サンプル溶液に順次加えられる、請求項29に記載の方法。
【請求項３８】
前記第2タイプの機能化ビーズは蛍光機能化ビーズであり、前記方法は、前記複合体を、前記第2タイプの機能化ビーズ内で蛍光を励起する入射光で照らす段階と、前記複合体の蛍光イメージングを行う段階とをさらに含む、請求項29に記載の方法。
【請求項３９】
前記第2タイプの機能化ビーズは、前記第1タイプの機能化ビーズから区別可能な磁気特性を含む磁気機能化ビーズである、請求項29に記載の方法。
【請求項４０】
前記サンプル溶液を前記第1および第2タイプの機能化ビーズに接触させた後に、磁場勾配を前記サンプル溶液に印加する段階をさらに含む、請求項29に記載の方法。
【請求項４１】
前記サンプル溶液に印加される前記磁場勾配を変動させる段階をさらに含む、請求項40に記載の方法。
【請求項４２】
前記サンプル溶液を前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後に、前記サンプル溶液を濃縮する段階をさらに含む、請求項29に記載の方法。
【請求項４３】
前記サンプル溶液を前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後で、前記複合体を検出する前に、前記第1および第2タイプの複数の機能化ビーズを凝集させる段階をさらに含む、請求項29に記載の方法。
【請求項４４】
前記サンプル溶液を前記ダイヤモンド基質上に配置した後に、前記サンプル溶液を脱水する段階をさらに含む、請求項29に記載の方法。
【請求項４５】
検体を含む複合体を検出するためのビーズに基づいたアッセイシステムであって：
(a)磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体に結びつく第1部分を含むよう機能化された第1タイプの複数の機能化ビーズと；
(b)蛍光機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で前記検体に結びつく非標識部分を含むように機能化された第2タイプの複数の機能化ビーズと；
(c)前記第2タイプの機能化ビーズ内で蛍光を励起させる入射光を発生するよう構成された光源と；
(d)前記第1タイプの機能化ビーズの1つ、前記検体、および前記第2タイプの機能化ビーズの1つを含む複合体内で前記検体に結びついた前記第2タイプの機能化ビーズが放射する蛍光を検出する光学式光検出器とを含む、システム。
【請求項４６】
前記蛍光機能化ビーズは、蛍光物質で含浸されたポリマー基質を含む、請求項45に記載のシステム。
【請求項４７】
前記光学式光検出器は分光光度計を含む、請求項45に記載のシステム。
【請求項４８】
前記光学式蛍光検出器は、前記複合体内で前記検体に結びついた前記第2タイプの機能化ビーズにより放射される前記蛍光をイメージングする光学イメージングセンサーを含む、請求項45に記載のシステム。
【請求項４９】
前記第1タイプの機能化ビーズは、超常磁性機能化ビーズである、請求項45に記載のシステム。
【請求項５０】
前記超常磁性機能化ビーズは酸化鉄粒子を含む、請求項49に記載のシステム。
【請求項５１】
前記第1タイプの機能化ビーズは、前記ポリマー基質内に配置された磁気ナノ粒子を含む、請求項45に記載のシステム。
【請求項５２】
前記第1タイプの機能化ビーズは、前記ポリマー基質の表面上に配置された磁気ナノ粒子を含む、請求項45に記載のシステム。
【請求項５３】
検体を含む複合体を検出する方法であって：
(a)溶液中のサンプルを、磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体に結びつく第1部分を含むよう機能化された第1タイプの機能化ビーズの集団に接触させる段階と；
(b)サンプル溶液を、蛍光物質で含浸されたポリマー基質を含むと共に適切な条件下で前記検体に結びつく非標識部分を含むように機能化された第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させる段階であって、
接触は、前記第1タイプの機能化ビーズの1つ、前記検体、および前記第2タイプの機能化ビーズの1つを含む複合体の形成に至る、接触させる段階と；
(c)前記複合体を、前記第2タイプの機能化ビーズ内で蛍光を励起させる入射光で照らす段階と；
(d)前記複合体内で前記検体に結びついた前記第2タイプの機能化ビーズにより放射される蛍光を分析することによって、前記検体を含む前記複合体を検出する段階とを含む、方法。
【請求項５４】
前記サンプルを前記第1タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後に、磁場勾配を前記サンプル溶液に印加する段階をさらに含む、請求項53に記載の方法。
【請求項５５】
前記磁場勾配を前記サンプル溶液に印加する段階は、前記サンプル溶液を前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後に実行される、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
前記サンプル溶液を前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後で、前記複合体を検出する前に、前記サンプル溶液を濃縮する段階をさらに含む、請求項53に記載の方法。
【請求項５７】
前記サンプル溶液を前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後で、前記複合体を検出する前に、前記第1および第2タイプの複数の機能化ビーズを凝集させる段階をさらに含む、請求項53に記載の方法。
【請求項５８】
前記複合体を検出する前に前記サンプル溶液を脱水する段階をさらに含む、請求項53に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の引用
本出願は、2016年12月23日付けで提出され、「磁気式多ビーズアッセイのための方法および装置」と題された米国仮特許出願第62/438,593号の優先権を主張し、その出願は参照して本明細書に援用する。
【０００２】
政府支援
本発明は、国防総省のアメリカ国防高等研究計画局により与えられた契約番号HR0011-14-C-0020号に基づく政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)は、1960年代のその導入以来、生物学的マトリックスからのタンパク質検体の測定に用いられる産業全体の標準的な研究技法となってきた。その基本的な概念では、単一のタンパク質検体を捕捉するために2つの抗体(免疫グロブリン)が用いられる。酵素およびレポーターバッファーを用いることで、得られた免疫複合体が識別されかつ測定される。この酵素は、典型的には、共有結合を介して抗体の１つと結合する。この酵素は、このレポーターバッファーの存在下でインキュベートされると、基質を、分光測光的手段によって分析的に測定可能な機能的レポーター(functional reporter)に変換する。
【０００４】
最新のELISA関連技術の水準では、プレートに基づいた方式が単一のビーズに基づいた方式に取って代わられつつある。単一のビーズに基づいたELISAは、典型的にはビーズである固体表面に結合した1つの抗体を備え、第2抗体はビオチンで標識化される。捕捉ビーズは、印加される磁場よってそれを容易に操作可能とする材料を含有しており、この操作は、このビーズおよびこのビーズに結合した任意検体をサンプル懸濁液から分離することを含む。磁気分離と呼ばれるこの過程は、本発明の分野では周知であり、標的検体を濃縮し、かつ信号バックグラウンドに寄与する可能性がある望ましくないタンパク質などの非結合物質を除去するために使用できる。従来のELISAと比べると、単一のビーズに基づくELISAは、より低いバックグラウンドかつより短時間で、標的検体への感度を向上できる。
【０００５】
しかしながら、標的検体への感度および特異性を継続して向上させる必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００６】
本明細書で開示されている様々な実施形態は、1つの検体により結合された2つ以上の区別可能なビーズ(すなわち、異なるタイプのビーズ)を含有する複合体を観察することによって、サンプル中のその検体を含む複合体を検出するための方法および装置に関する。1つ以上の実施形態によれば、光学検出磁気共鳴(ODMR)に基づいて検体を含む複合体(complex)を検出するためのビーズに基づいた磁気アッセイシステムは、磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体に結びつく(associate with)第1部分(moiety)を含むよう機能化された第1タイプの複数の機能化ビーズと、適切な条件下で前記検体に結びつく第2部分を含むよう機能化された第2タイプの複数の機能化ビーズと、少なくとも1つのODMR中心を含む基質と、前記少なくとも1つのODMR中心内で電子を基底状態から励起状態まで励起する入射光を発生するよう構成された光源と、前記少なくとも1つのODMR中心上に配置された複合体にバイアス磁場を印加する磁石であって、前記複合体は、前記第1タイプの機能化ビーズの1つ、前記検体、および前記第2タイプの機能化ビーズの1つを含む、磁石とを含む。前記システムは、前記少なくとも1つのODMR中心に入射するマイクロ波場を生成するよう構成されたマイクロ波源であって、前記マイクロ波源は、前記少なくとも1つのODMR中心での基底状態遷移に対応した周波数を備えた前記マイクロ波場を生成するようさらに構成されており、ここでは、前記少なくとも1つのODMR中心は、前記入射光によって照らされると放射光を発生し、この放射光の特性は、前記マイクロ波場によっても、前記複合体内で前記検体に結びついた前記磁気機能化ビーズによっても影響される、マイクロ波源と、前記少なくとも1つのODMR中心により放射された光を検出する光学式光検出器とを含む。幾つかの実施形態では、前記少なくとも1つのODMR中心は炭化ケイ素格子中のケイ素-空孔中心とすることができる。別の実施形態では、前記少なくとも1つのODMR中心はダイヤモンド格子中のケイ素-空孔中心とすることができる。さらに別の実施形態では、前記少なくとも1つのODMR中心はダイヤモンド格子中の窒素-空孔中心とすることができる。特定の実施形態では、前記少なくとも1つのODMR中心は前記基質の上面に形成できる。幾つかの実施形態では、前記少なくとも1つのODMR中心は、前記基質の前記上面に形成された複数のODMR中心でよい。幾つかの実施形態では、前記光学式光検出器は、前記複数のODMR中心からの前記放射光をイメージングするイメージングセンサーを備えた光学イメージングシステムとすることができる。特定の実施形態では、前記第1および前記第2部分のぞれぞれは、受容体、タンパク質、抗体、細胞、ウイルス、または核酸配列とすることができる。幾つかの実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズは、超常磁性材料を含んだ超常磁性機能化ビーズとすることができる。特定の実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズは、前記超常磁性材料を封入する非磁性層を含むことができる。幾つかの実施形態では、前記超常磁性機能化ビーズは酸化鉄粒子を含むことができる。特定の実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズは、ポリマー基質内に配置された磁気ナノ粒子を含むことができる。別の実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズは、ポリマー基質の表面上に配置された磁気ナノ粒子を含むことができる。幾つかの実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズは蛍光機能化ビーズとすることができる。別の実施形態では、前記第2タイプの機能化ビーズは、前記第1タイプの機能化ビーズから区別可能な一定量の磁気材料を含んだ磁気機能化ビーズとすることができる。さらに別の実施形態では、前記第2タイプの機能化ビーズは磁気機能化ビーズでよく、前記第2タイプの機能化ビーズは、前記第1タイプの機能化ビーズから区別可能な磁気特性を含む。幾つかの実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズは、超常磁性材料を含んだ超常磁性機能化ビーズとすることができる。特定の実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズは、前記超常磁性材料を封入する非磁性層を含むことができる。幾つかの実施形態では、前記第2タイプの機能化ビーズは、強磁性材料を含んだ強磁性機能化ビーズであよい。特定の実施形態では、前記第2タイプの機能化ビーズは、前記強磁性材料を封入する非磁性層を含むことができる。幾つかの実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズおよび前記第2タイプの機能化ビーズのそれぞれは、50 nmから10 μmまでの範囲の直径を備えることができる。特定の実施形態では、前記第1タイプおよび前記第2タイプの機能化ビーズの直径は、それぞれ0.5 μmから5 μmまでの範囲とすることができる。幾つかの実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズの直径は、前記第2タイプの機能化ビーズの直径に類似していてもよい。別の実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズの直径は、前記第2タイプの機能化ビーズの直径とは少なくとも50%異なっていてもよい。幾つかの実施形態では、前記システムは、適切な条件下で少なくとも第2検体に結びつく少なくとも前記第2部分を含むよう機能化された少なくとも第3タイプの複数の機能化ビーズをさらに含むことができる。特定の実施形態では、前記システムは、適切な条件下で前記第2検体に結びつく前記第2部分を含むよう機能化された第4タイプの複数の機能化ビーズをさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、前記第1および/または第2タイプの機能化ビーズは、適切な条件下で前記第2検体と結びつくする少なくとも1つの追加部分をさらに含むことができる。特定の実施形態では、前記システムは、適切な条件下で第3検体に結びつく第3部分をさらに含むことができ、前記第1タイプの機能化ビーズは前記第2部分を含むようさらに機能化されており、前記第2タイプの機能化ビーズは前記第3部分を含むようさらに機能化されている。
【０００７】
1つ以上の実施形態によれば、検体を含む複合体を検出する方法は、溶液中のサンプルを、磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体に結びつく第1部分を含むよう機能化された第1タイプの機能化ビーズの集団に接触させる段階と；前記サンプル溶液を、適切な条件下で前記検体に結びつく第2部分を含むよう機能化された第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させる段階であって、接触は、前記第1タイプの機能化ビーズの1つ、前記検体、および前記第2タイプの機能化ビーズの1つを含む複合体の形成に至る、接触させる段階と、前記磁気機能化ビーズによって生成された磁場を検出することにより、かつ前記複合体内で前記検体に結びついた前記第2タイプの機能化ビーズを検出することによって、前記検体を含む前記複合体を検出する段階とを含む。幾つかの実施形態では、前記方法は、前記複合体を含む前記サンプル溶液を、その内部に形成された少なくとも1つの光学検出磁気共鳴(ODMR)中心を含む基質上に配置する段階と；電子を前記少なくとも1つのODMR中心内で基底状態から励起状態まで入射光によって励起する段階と、バイアス磁場を前記複合体に印加する段階と、前記少なくとも1つのODMR中心に入射するマイクロ波場を生成する段階とをさらに含むことができ、前記マイクロ波場は、前記少なくとも1つのODMR中心での基底状態遷移に対応した周波数を含み、前記検体を含む前記複合体の検出は、前記少なくとも1つのODMR中心によって放射された光を分析する段階をさらに含み、前記放射光の特徴は、前記マイクロ波場により影響されかつ前記複合体内で前記検体に結びついた前記磁気機能化ビーズにより影響される。幾つかの実施形態では、前記少なくとも1つのODMR中心はダイヤモンド格子中の窒素-空孔中心とすることができる。特定の実施形態では、前記少なくとも1つのODMR中心は前記基質の上面に形成できる。幾つかの実施形態では、前記少なくとも1つのODMR中心は、前記基質の前記上面に形成された複数のODMR中心でよい。これらの実施形態では、前記複数のODMR中心から放射される光の分析は、当該放射光のイメージングを含む。特定の実施形態では、前記方法は、前記サンプルを前記第1タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後に、磁場勾配を前記サンプル溶液に印加する段階をさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、前記磁場勾配を前記サンプル溶液に印加する段階は、前記サンプル溶液を前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後に実行してもよい。一定の実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズの前記集団および前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団は、前記サンプル溶液に順次加えればよい。幾つかの実施形態では、前記第2タイプの機能化ビーズは蛍光機能化ビーズとすることができ、前記方法は、前記複合体を、前記第2タイプの機能化ビーズ内で蛍光を励起する入射光で照らす段階と、前記複合体の蛍光イメージングを行う段階とをさらに含むことができる。別の実施形態では、前記第2タイプの機能化ビーズは、前記第1タイプの機能化ビーズから区別可能な磁気特性を含んだ磁気機能化ビーズとすることができる。幾つかの実施形態では、前記方法は、前記サンプル溶液を前記第1および第2タイプの機能化ビーズに接触させた後に、磁場勾配を前記サンプ���溶液に印加する段階をさらに含むことができる。一定の実施形態では、前記方法は、前記サンプル溶液に印加される前記磁場勾配を変動させる段階をさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、前記方法は、前記サンプル溶液を前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後に、前記サンプル溶液を濃縮する段階をさらに含むことができる。一定の実施形態では、前記方法は、前記サンプル溶液を前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後で、前記複合体を検出する前に、前記第1および第2タイプの複数の機能化ビーズを凝集させる段階をさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、前記方法は、前記サンプル溶液を前記ダイヤモンド基質上に配置した後に、前記サンプル溶液を脱水する段階をさらに含むことができる。
【０００８】
1つ以上の実施形態によれば、検体を含む複合体を検出するビーズに基づくアッセイシステムは、磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体に結びつく第1部分を含むよう機能化された第1タイプの複数の機能化ビーズと、蛍光機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で前記検体に結びつく非標識部分を含むように機能化された第2タイプの複数の機能化ビーズと、前記第2タイプの機能化ビーズ内で蛍光を励起させる入射光を発生するよう構成された光源と、前記第1タイプの機能化ビーズの1つ、前記検体、および前記第2タイプの機能化ビーズの1つを含む複合体内で前記検体に結びついた前記第2タイプの機能化ビーズが放射する蛍光を検出する光学式蛍光検出器とを含む。一定の実施形態では、前記蛍光機能化ビーズは、蛍光物質で含浸されたポリマー基質を含むことができる。実施形態によっては、前記光学式蛍光検出器は分光光度計を含むことができる。別の実施形態では、前記光学式蛍光検出器は、前記複合体内で前記検体に結びつく前記第2タイプの機能化ビーズにより放射される前記蛍光をイメージングする光学イメージングセンサーを含むことができる。幾つかの実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズは超常磁性機能化ビーズとすることができる。一定の実施形態では、前記超常磁性機能化ビーズは酸化鉄粒子を含むことができる。幾つかの実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズは、前記ポリマー基質内に配置された磁気ナノ粒子を含むことができる。別の実施形態では、前記第1タイプの機能化ビーズは、前記ポリマー基質の表面上に配置された磁気ナノ粒子を含むことができる。
【０００９】
1つ以上の実施形態によれば、検体を含む複合体を検出する方法は、溶液中のサンプルを、磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体に結びつく第1部分を含むよう機能化された第1タイプの機能化ビーズの集団に接触させる段階と、前記サンプル溶液を、蛍光物質で含浸されたポリマー基質を含むと共に適切な条件下で前記検体に結びつく非標識部分を含むように機能化された第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させる段階であって、接触は、前記第1タイプの機能化ビーズの1つ、前記検体、および前記第2タイプの機能化ビーズの1つを含む複合体の形成に至る、接触させる段階と、前記複合体を、前記第2タイプの機能化ビーズ内で蛍光を励起させる入射光で照らす段階と、前記複合体内で前記検体に結びついた前記第2タイプの機能化ビーズにより放射される蛍光を分析することによって、前記検体を含む前記複合体を検出する段階とを含む。幾つかの実施形態では、前記方法は、前記サンプルを前記第1タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後に、磁場勾配を前記サンプル溶液に印加する段階をさらに含むことができる。一定の実施形態では、前記磁場勾配を前記サンプル溶液に印加する段階は、前記サンプル溶液を前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後に実行してもよい。幾つかの実施形態では、前記方法は、前記サンプル溶液を前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後で、前記複合体を検出する前に、前記サンプル溶液を濃縮する段階をさらに含むことができる。一定の実施形態では、前記方法は、前記サンプル溶液を前記第2タイプの機能化ビーズの前記集団に接触させた後で、前記複合体を検出する前に、前記第1および第2タイプの複数の機能化ビーズを凝集させる段階をさらに含むことができる。幾つかの実施形態では、前記方法は、前記複合体を検出する前に前記サンプル溶液を脱水する段階をさらに含むことができる。
【００１０】
磁気式多ビーズアッセイは、免疫複合体のような複合体で結合された標的検体を検出することで、ビーズに基づいたELISAに改良を加える。磁気分離の利便性と簡素さをロバストかつ好感度のビーズ検出を組み合わせることで、磁気式多ビーズアッセイは、簡素で迅速な処理で優れた感度を実現する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
上記事項は、添付した図面で例示されるような代表的な実施形態の以下のさらに具体的な記載から明白となるが、ここでの類似の参照符号は、異なる図にわたって同一部分を参照する。これら図面は必ずしも一定の縮尺ではなく、実施形態を図示することにむしろ重点が置かれている。
【００１２】
【図１】図1Aは、1つ以上の実施形態による第1タイプの機能化ビーズと、第1部分と、第2タイプの機能化ビーズと、第2部分と、検体とを概略的に示す。  図1Bは、1つ以上の実施形態による第1タイプの機能化ビーズの１つと、第1部分と、第2タイプの機能化ビーズの１つと、第2部分と、検体とを含む複合体を概略的に示す。  図1Cは、1つ以上の実施形態による第2タイプの機能化ビーズにより放射される蛍光を検出する分光光度計を含む、複合体を検出するためのビーズに基づくアッセイシステムを概略的に示す。  図1Dは、1つ以上の実施形態による相対蛍光単位(RFU)をPSA (pM)の関数としたグラフを示す。
【図２】図2は、1つ以上の実施形態による検体を含む複合体を検出する方法を示す。
【図３】図3Aは、1つ以上の実施形態による第2タイプの機能化ビーズにより放射される蛍光をイメージングする光学イメージングセンサーを含む、複合体を検出するためのビーズに基づくアッセイシステムを概略的に示す。  図3Bは、1つ以上の実施形態による蛍光画像を示す。  図3Cは、1つ以上の実施形態による、信号をPSA濃度(pM)の関数としたグラフを示す。
【図４】図4は、1つ以上の実施形態による検体を含む複合体を検出する別の方法を示す。
【図５】図5は、1つ以上の実施形態による広視野ダイヤモンド磁気イメージング装置を概略的に示す。
【図６】図6Aは、1つ以上の実施形態による磁気ビーズおよび蛍光ビーズを含む幾つかの複合体を概略的に示す。  図6Bは、1つ以上の実施形態による図6Aに示した複合体の蛍光画像を示す。  図6Cは、1つ以上の実施形態による図6Aに示した複合体の磁気画像を示す。
【図７】図7Aは、1つ以上の実施形態による第1タイプの磁気機能化ビーズと、第2タイプの磁気機能化ビーズと、検体とを概略的に示す。  図7Bは、1つ以上の実施形態による第1および第2タイプの磁気ビーズを含む幾つかの複合体を概略的に示す。  図7Cは、1つ以上の実施形態による図7Bに示した磁気ビーズの陽磁気画像を示す。  図7Dは、1つ以上の実施形態による図7Bに示した磁気ビーズの陰磁気画像を示す。
【図８】図8Aは、1つ以上の実施形態による残留磁化および磁化率に基づいた磁気ビーズの識別を示す。  図8Bは、1つ以上の実施形態による磁化の大きさに基づいた磁気ビーズ識別を示す。  図8Cは、1つ以上の実施形態による磁気異方性に基づいた磁気ビーズの識別を示す。  図8Dは、1つ以上の実施形態による保磁力に基づいた磁気ビーズの識別を示す。  図8Eは、1つ以上の実施形態による交流磁気応答に基づいた磁気ビーズの識別を示す。  図8Fは、1つ以上の実施形態による磁気飽和に基づいた磁気ビーズの識別を示す。
【図９】図9は、1つ以上の実施形態による大きさが異なる2つのビーズの磁気画像を示す。
【図１０】図10A-1、10B-1、および10C-1は、1つ以上の実施形態による3つのビーズBの磁気信号の磁気画像を示す。  図10A-2、10B-2、および10C-2は、1つ以上の実施形態による3つのビーズBの特徴的な信号を減算した後の、差信号の磁気画像を示す。
【図１１】図11A-1、11B-1、および11C-1は、1つ以上の実施形態によるビーズAおよびBの3つの二量体の画像信号の磁気画像を示す。  図11A-2、11B-2、および11C-2は、1つ以上の実施形態による特徴的なビーズB信号を減算した後の、3つの二量体ビーズAおよびBの差信号の磁気画像を示す。
【図１２】図12Aは、1つ以上の実施形態による4つの区別可能なビーズタイプを含む多重化アッセイを概略的に示す。  図12Bは、1つ以上の実施形態による4つの区別可能なビーズタイプを含む複合体を概略的に示す。
【図１３】図13Aは、1つ以上の実施形態による3つの区別可能なビーズタイプを含む多重化アッセイを概略的に示す。  図13Bは、1つ以上の実施形態による3つの区別可能なビーズタイプを含む複合体を概略的に示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
上述のように、本明細書で開示されている様々な実施形態は、1つの検体により結合された2つ以上の区別可能なビーズ(すなわち、異なるタイプのビーズ)を含有する複合体を観察することによって、サンプル中のその検体を含む複合体を検出するための方法および装置に関する。これらのタイプのビーズの少なくとも一方は磁気的であり、印加磁場で掛けられた磁力によって懸濁液中に濃縮させることができる。また、完全な磁気アッセイは、別個の磁気特性を備えた磁気ビーズタイプを区別するダイヤモンド磁気イメージングを用いて実装してもよい。
【００１４】
1つ以上の実施形態によれば、ダイヤモンド中の窒素-空孔(NV)中心を使用する広視野磁気イメージングを用いることで、完全に磁気的であり、サンプルから蛍光を検出する必要をなくした多ビーズアッセイを実現するプラットフォームを提供できる。磁気ビーズは、それらが発生する磁場であって生物学的サンプルマトリックスおよびに汚染物を透過しかつ明確な検出を可能とする磁場によって、強くかつ安定した信号を与える。磁気ビーズをさらに操作して、アッセイ動態を促進し、かつサンプルを迅速に調製できる。この完全に磁気的なアッセイは、フットプリントが小さい機器や少ない量の試薬で実装できるので、低コストで迅速なアッセイの結果を出すことができる。
【００１５】
磁気式多ビーズアッセイ
磁気式多ビーズアッセイは別個のビーズタイプを使用して、検体により結合されたビーズ複合体の形成を検出することによりサンプル中の検体濃度を特定する。あるビーズタイプは、磁場勾配を印加することで、液体中でビーズと結合物質(bound material)をビーズ懸濁液から分離できる。この過程は磁気分離と呼ばれ、細胞、タンパク質、および核酸を含む標的検体を分離または濃縮するために広く用いられている。
【００１６】
この磁気式多ビーズアッセイの感度は、次の3つの特徴に少なくとも部分的には由来する：
(1)このアッセイは少なくとも2つの区別可能なビーズの共存在を測定し、標的検体の検出は、この検体が、少なくとも2つの区別可能なビーズタイプ上の少なくとも2つの別個の抗体に結合することにのみ起因する。このアッセイは、複数抗体の複合特異性(combined specificity)を介して高度な標的特異性を実現でき、それがより優れた感度をもたらす。
(2)標的検体以外のサンプル成分が原因となる信号バックグラウンドのような混乱をもたらす作用は、磁気分離を用いてサンプルを浄化することによって、減少または排除できる。
(3)ビーズは迅速にかつ高度な正確性および精度で検出できる。ビーズ信号はその強度と安定性の増大が可能となり、かつ、蛍光染料および酵素活性の蛍光生成物を含む分子レポーターからビーズ信号をより迅速に検出できる。
【００１７】
複合体形成
多ビーズアッセイにおける標的検体を測定するには、その検体が少なくとも2つの区別可能なビーズに結合して複合体を形成する必要があり、それにより両方のビーズの存在が検出可能となる。ある標的検体の一定の領域に特異的に結合しよってそれに結びつく(associate with)抗体などの本明細書で部分(moiety)とも呼ぶ結合リガンドを、これらビーズに塗布してもよい。多ビーズアッセイの各ビーズには、1つ以上の異なるタイプの結合リガンドを塗布してもよい。この多ビーズアッセイで使用される異なるビーズタイプは、同じ結合リガンドのタイプ、重複する組の結合リガンドのタイプ、または別個の結合リガンドのタイプを備えることができる。最も単純な場合では、以下ビーズAとビーズBと呼ぶ2つの別個のビーズタイプを使用する。(他の実施形態では、3つ以上の別個のビーズタイプを使用できる。)2ビーズの例では、ビーズAおよびビーズBには抗体を塗布し、抗体XがビーズAに、抗体YがビーズBに塗布される。抗体Xは、抗体Yとは異なる標的検体の領域に特異に結合するので、標的検体は両方に同時に結合できる。
【００１８】
免疫複合体のような複合体は、サンプルをビーズAおよびビーズBの懸濁液でインキュベートすることなどによって適切な条件下で形成できる。サンプル中の標的検体は、それらがサンプル内で拡散する際にビーズ表面に遭遇し、それに結合する。この過程を促進するために、このサンプルは混合、振盪、またはそれ以外の方法で撹拌してよい。ビーズもサンプル内を移動する際には、反対のタイプのビーズに結合した検体にも遭遇してこれらの検体にも結合し、A-B、A-B-A、B-A-B、または他の組合せの形状の異質ビーズ複合体を形成する。
【００１９】
これらビーズおよびビーズ複合体は、続いて磁気分離によって一緒に濃縮される。まず、磁気力をビーズAに掛ける磁場勾配が印加される。任意のビーズAおよびビーズAを含むビーズ複合体はサンプルから分離される。幾つかの実施形態では、ビードBも磁気的であり、類似の磁気力の影響を受けて、磁気材料および結合検体の「ペレット」を形成する。「バックグラウンド物質」と本明細書で呼ぶ非結合性サンプル成分は分離されることはないので、ペレットの上に浮かぶ上澄みと共に廃棄できる。次に、磁気勾配を除去し、ビーズを同一または異なるバッファー溶液内に再び懸濁させることができる。この過程を繰り返してバックグラウンド物質の濃度を減少させてもよい。磁気分離は手動で行ってよいし、市販のプレートウォッシャーで自動化してもよい。
【００２０】
あるいは、複合体形成は複数の別個の段階を経て行うこともでき、これにより、標的検体の不存在下でのビーズの複合体への非特異的結合による信号バックグラウンドを減少させることができる。標的検体を捕捉するためビーズAをまずサンプルに付加することができ、続いて、バックグラウンド物質の濃度を減少させるため磁気分離を行うことができる。次に、ビーズBをこの浄化したサンプルに別個に加えることができる。ビーズAおよびビーズBを同時に加えるのか順次に加えるのかは経験的に決定され、さらに、使用する抗体および非特異的結合が、順次結合段階を用いることで有意に減少されるのかに依存する。
【００２１】
ビーズBがビーズAより磁性が低いかまたは非磁性であれば、磁気分離を複合体の形成後に使用して、非結合ビーズBに関連付けられた信号バックグラウンドを減少させることができる。例えば、磁性が低いビーズBはビーズAに比べて低速でサンプル懸濁液から分離されるので、ビーズBの分離が不完全なうちにビーズAが適切にペレット内に分離された時点で、磁気分離を停止させることができる。もしこの時点でペレットの上に浮かぶ上澄みが廃棄される場合は、ビーズBの有意な部分が除去されるが、ビーズAは保持され、これにはビーズAを含有する複合体も含まれる。
【００２２】
1つ以上の実施形態によれば、ビーズAおよびビーズBの直径は、0.5 μmと5 μmとの間などの50 nmから10 μmまでの範囲でよい。ビーズAおよびビーズBは異なる直径を備えるよう選択してもよく、それにより第1タイプの機能化ビーズの直径は第2タイプの機能化ビーズの直径とは少なくとも50%異なり、よってこれら2つのビーズタイプはそれぞれの磁場信号の空間的分布によって区別できる。代替的には、ビーズAおよびビーズBは、50%未満の直径差のような類似の直径を備えるように選択して、類似の表面積を備え、サンプル懸濁液中で類似の運動を行い、検出領域で類似の量の空間を占有し、類似の信号強度を示すようにしてもよい。0.5 μmから5 μmまでのビーズ直径範囲によって、迅速な磁気分離(数秒以内)および各ビーズ上での大量の結合リガンドの存在が可能になる。さらに、この範囲のビーズ直径は、光学顕微鏡または広視野ダイヤモンド磁気イメージングシステムの典型的な回折限界イメージング解像度と似ているか、わずかに大きい。
【００２３】
複合体の検出
免疫複合体のような複合体が一旦形成されると(検体によって結合されたビーズAおよびビーズBを含有する異質ビーズ複合体)、これらは、両方のビーズタイプの共存在を検出することによって測定される。この目的を達成するために実施できる両方のビーズタイプの共存在を検出する幾つかの方法を以下にさらに説明する。
【００２４】
検体を含有する複合体の測定は、検体濃度が既知である一定範囲の複数の較正サンプルを用いて較正でき、複合体の所与の測定値が一定の検体濃度を意味することになる。この範囲の較正サンプルの測定値を全体として較正曲線と呼ぶ。本明細書に記載した方法および装置による複合体の検出は、較正曲線と組み合わせて検体濃度の測定を可能とする。
【００２５】
例A1：プレートリーダーを備えた磁気蛍光アッセイ
ビーズAは超常磁性であり、ポリマー基質内またはその表面上に分散した超常磁性材料の磁気ナノ粒子からなるものと考える。適切な超常磁性材料には、例えば、典型的には5 nmから10 nm範囲にわたる、大きさ約20 nm未満の単結晶ナノ粒子形状の酸化鉄Fe2O3、Fe3O4、マンガンフェライト(MnFe2O4)またはコバルトフェライト(CoFe2O4)が含まれる。これら磁気ナノ粒子は十分小さくなるように構成して、印加磁場の不在下で残留磁気を示さないようにする(超常磁性)。磁場を印加すると、これら粒子は磁場の方向に磁化して、磁気分離に十分なビーズ磁化をもたらす。
【００２６】
ビーズBが、蛍光物質で含浸されたポリマー基質を含んだ蛍光機能化ビーズであると考える。ビーズBは非磁性的であり、非結合ビーズBは磁気分離時に残される。
【００２７】
図1A-1Cに示したように、図1Cに示した検体を含む複合体を検出するための、ビーズに基づくアッセイシステム100は、図1Aに示すように、磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体120に結びつく第1部分Ｘ 115を含むように機能化された第1タイプの複数の機能化ビーズ110(ビーズA)と、蛍光機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体120に結びつく非標識部分Y 135を含むように機能化された第2タイプの複数の機能化ビーズ130(ビーズB)と、第1タイプの機能化ビーズ110、検体120、および第2タイプの機能化ビーズ130を含む、図1Bに示した複合体145における検体120に結びついた第2タイプの機能化ビーズ130が放射する光155を検出する光学式光検出器140とを図1Cに示したように含む。図1Cに示したように、光学式光検出器140は、濾過ランプ150からの光に照らされると蛍光を発する第2タイプの機能化ビーズ130により放射される蛍光155を検出する分光光度計140である。第1および第2部分115、135は、受容体、タンパク質、抗体、細胞(真核または原核)、細胞小器官、ウイルス、または核酸配列でよい。第2部分135は非標識化状態であり、すなわち、蛍光体で標識化されていない。幾つかの実施形態では、これら蛍光機能化ビーズは、蛍光物質で含浸されたポリマー基質を含むことができる。機能化ビーズ130内に含浸された蛍光物質を備えること、および非標識化第2部分135を用いることから幾つかの改良点がもたらされる。まず、このビーズの体積によって、表面付着と比べてかなり多い量の蛍光体を含むこととその測定が可能となるが、その理由は、ビーズの体積がその表面積より有意に大きいからである。二番目に、表面結合部分が蛍光体で標識化されている他の方法では、これら部分が表面全体を覆わないため蛍光体の量はさらに減少し、標識化はさらに減少することになる。三番目としては、蛍光体は、光、温度、pH、塩、および生物アッセイに関連した他の環境条件に敏感である。よって、ビーズ内に含浸された蛍光体は、化学環境から守られかつ保護されており、そのためより明るくロバストな検出が得られる。四番目に、蛍光体が表面に付着した部分に接合または共有結合するには、当該蛍光体は、それらの機能に悪影響を与えかねない、それら自身の状態(三次元構造、電荷、極性)を変更しうる化学反応を必然的に受ける。
【００２８】
捕捉ビーズAの超常磁性のため、最終読み取りにおいて追加ビーズAが含められる。しかし、このビーズは異なる蛍光チャンネル(波長)であり、または全く蛍光ではないので、検出器ビーズBの正信号に悪影響を与えたり、付加的な非特異的(蛍光)バックグラウンドを与えたりしない。
【００２９】
一実施形態では、この磁気式多ビーズアッセイは次のように行われる。複合体の形成の後、磁気を分離する段階、または一連の反復段階を用いて非結合ビーズBの集団を減少させる。磁気分離の後、ビーズBの継続的存在は、標的検体がビーズAおよびビーズBへ成功裏に結合したことを示す。さもなければ、検体またはビーズBも、それら両方も磁気分離時に廃棄されてしまっているはずである。従って、サンプル懸濁液中にビーズBが検出されれば、複合体での両方のビーズの共存在が十分に証明される。
【００３０】
図2に示したように、検体を含む複合体を検出する方法200は、溶液中のサンプルを第1タイプの磁気機能化ビーズの集団に接触させる段階210と、その溶液サンプルを第2タイプの蛍光機能化ビーズの集団に接触させる段階220と、この複合体を、第2タイプの機能化ビーズ内で蛍光を励起させる入射光で照らす段階230と、この蛍光を分析することによって、検体を含む複合体を検出する段階240とを含む。
【００３１】
サンプル懸濁液は、蛍光プレートリーダーまたは分光光度計を用いて各プレートウェルから蛍光を光学的に励起して測定する類似のデバイスを使って分析できる。この懸濁液は、測定前に低蛍光ブラックプレートに移して、プレートが発生する信号バックグラウンドを減少させてもよい。反応をブラックプレートで元々行うことは可能だが、ブラックプラスチックでは利用できない丸底プレート内で実行した方がより効率的となることがある。蛍光測定時に、ビーズBの蛍光を誘起させて、光学帯域フィルターを介して記録できる。ビーズBの滴定およびビーズBを含有しないウェルは別々に測定して、類似バッファー条件下で、観察された蛍光信号を既知のビーズ濃度に較正できる。
【００３２】
ほとんどの市販蛍光プレートリーダーは、標準的な励起および発光ファイバー、ダイクロイックまたは帯域フィルター、および適切なゲイン設置または光増殖管(PMT)調整装置で構成して、サンプルバッファーの自己蛍光を好適に抑制し、かつ蛍光ビーズ全体からの真の蛍光信号を増幅できる。測定された蛍光の波長は、ビーズに組み込まれた蛍光体の選択に依存する。低い蛍光体濃度または弱い蛍光体は蛍光信号を抑制し、アッセイの感度を低下させることに注目すべきである。
【００３３】
図1Dに示したように、0.1 pg/mLのような低い値の前立腺特異抗原(PSA)でも、プレートリーダー条件をほとんど最適化することなく測定できる。わずか250個の蛍光ビーズが最小信号レベルで測定でき、これは、蛍光測定測定バックグラウンド平均値にその標準偏差の3倍を加えたものと考えられる。より長いリード時間、光増殖管(PMT)ゲイン設定の変更または各ウェルの走査領域の調整は、すべて感度の向上に寄与することがある。これらパラメータの最適化は、所与のプレートリーダーの特徴に依存する。
【００３４】
例B2：蛍光イメージングを用いた磁気蛍光アッセイ
ビーズAおよびビーズBが上述の例A1に記載したものと同一タイプであると考える。さらに、例A1と同様に、最終磁気分離段階または一連の段階は、ビーズBの濃度を減少するために実行されると考える。
【００３５】
図3Aに示したようにビーズに基づいたアッセイシステム300を用いる別の実施形態では、ビーズBの蛍光は、分光光度計を使うのでなく蛍光イメージングで測定してもよい。サンプル懸濁液またはその一部は、顕微鏡スライド305の上に分散させてよい。適切な光励起の下で、ビーズBの蛍光は、濾過ランプ150からの励起光を遮断する光学帯域フィルター348を介して顕微鏡システムによってカメラセンサー340へとイメージングできる。得られるビーズBの蛍光像では、この顕微鏡システムの解像度が適切であれば、個別のビーズの解像、識別、および計数が可能である(図3Bに示したように)。それはビーズBの蛍光155が観察されたことは複合体145中の標的検体に結合されたビーズAおよびビーズBの共存在を意味するので、この画像で計数されたビーズBの総数は、サンプル中に存在する検体の数の測定値を与えるものである。
【００３６】
蛍光イメージングは、例A1で上述したプレートリーダー測定を上回る感度の改善をもたらす。この改善は、次を含む混乱をもたらす信号を拒絶する能力に起因する：
(1)光学フィルターリークおよび光学センサノイズに起因するもののような光検知器バックグラウンド；
(2)バッファー成分からの自己蛍光などの散乱蛍光バックグラウンド； 
(3)ビーズB信号からの画像で明確に識別できる塵粒子などの汚染物からの蛍光。
【００３７】
擬似信号の阻止によって、図3Cに示したように信号バックグラウンドを低くすることができ、ここでは、撮像装置340は、プレートリーダー140と比べて同一のPSA濃度に関してより低い信号レベルを生じ、それに対応して、検体が低濃度であることに起因する低い複合体濃度への高い感度がもたらされる。
【００３８】
ビーズBのイメージングは、カバーガラス下の顕微鏡スライド上の液滴などのサンプル懸濁液を用いて、または液体サンプルの代表的な液滴を乾燥させた後に実行できる。乾燥後、蛍光ビードBは明るさを保ち、スライド上でのサンプルの拡散または流動によってそれ以上移動することはなく、これが露光時間を長くし、励起光強度を低くすることができる。バッファー溶液の選択によって、乾燥時に解離しないよう免疫複合体を保存し、乾燥領域全体にビーズを比較的均一に分散させ、かつ溶質結晶またはイメージングを妨害しかねない他の残留物が残るのをを防ぐようにする。
【００３９】
例C3：磁気および蛍光イメージングを用いた磁気蛍光アッセイ
ビーズAおよびビーズBが上述の例A1に記載したものと同一タイプであると考える。さらに、例A1と同様に、最終磁気分離段階または一連の段階は、ビーズBの濃度を減少するために実行され、かつビーズBは蛍光顕微鏡システムを用いてサンプルをイメージングすることにより計数される、と考える。
【００４０】
一つ以上の実施形態によれば、図4に示したように、検体を含む複合体を検出する方法400は、溶液中のサンプルを第1タイプの磁気機能化ビーズの集団に接触させる段階410と、このサンプル溶液を第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させる段階420と、磁気機能化ビーズによって生成された磁場を検出することにより、かつ複合体内で検体に結びついた第2タイプの機能化ビーズを検出することによって、検体を含む複合体を検出する段階430とを含む。幾つかの実施形態では、磁場の検出は、磁力顕微鏡検査法または走査ホールプローブなどの任意の磁気イメージング技術を使用することを含む。幾つかの実施形態では、第2タイプの機能化ビーズの検出は、上述の例A1またはB2で記載した蛍光の検出を含む。
【００４１】
別の実施形態では、顕微鏡システムは、超常磁性であるビーズAのイメージングを可能とする広視野ダイヤモンド磁気イメージングシステムを含むことができる。ダイヤモンド中の窒素-空孔(NV)中心を用いた広視野ダイヤモンド磁気イメージングシステムは、ダイヤモンドセンサーの表面上に配置された磁場を、室温でかつサブミクロン解像度ですばやくイメージングできる。磁気画像は、同一のイメージングシステムを用いて同一の視野に関して得られた従来の光学蛍光または明視野像に互いに位置合わせしてもよい。このイメージングシステムの調節は、光学フィルターの交換または焦点位置の修正など磁気イメージングと光学イメージングとの間で実行し、動作を最適化することができる。
【００４２】
図5に示したように、光学検出磁気共鳴(ODMR)に基づいて検体を含む複合体を検出するためのビーズに基づいた磁気アッセイシステム500は、図1Aに示しかつ上述したように、磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体120に結びつく第1部分115を含むよう機能化された第1タイプの複数の機能化ビーズ110と、適切な条件下で検体120に結びつく第2部分135を含むよう機能化された第2タイプの複数の機能化ビーズ130と、図5に示したように、少なくとも1つのODMR中心540(図5に示した複数のODMR中心540)を含む基質532と、少なくとも1つのODMR中心540内で電子を基底状態から励起状態まで励起する入射光を発生するよう構成された光源536と、少なくとも1つのODMR中心540上に配置された複合体530にバイアス磁場を印加する磁石534であって、複合体530は、第1タイプの機能化ビーズ110の1つ、検体120、および第2タイプの機能化ビーズ130の1つを含む、磁石534と、少なくとも1つのODMR中心540に入射するマイクロ波場を生成するよう構成されたマイクロ波源538とを含み、マイクロ波源538は、少なくとも1つのODMR中心540での基底状態遷移に対応した周波数を備えたマイクロ波場を生成するようさらに構成されており、ここでは、少なくとも1つのODMR中心540は、入射光536によって照らされると放射光542を発生し、放射光542の特性は、マイクロ波場によっても、また、複合体330内の検体120に結びついた磁気機能化ビーズ110によっても影響される。図5に示した実施形態では、複数のODMR中心540は、ダイヤモンド格子内の窒素-空孔(NV)中心であり、ダイヤモンド基質532の上面に形成されている。別の側面では、複数のODMR中心は、炭化ケイ素格子またはダイヤモンド格子内のケイ素-空孔中心でよい。図5に戻ると、光励起536の下で、ダイヤモンド基質532の表面近くにあるODMR中心540の薄層から放射される蛍光542は、電荷結合素子(CCD)または相補型金属酸化膜半導体(CMOS)カメラなどのイメージングセンサーを備えた光学イメージングシステムである光学式光検出器アレイ544へイメージングされる。マイクロ波励起の下でのODMR中心蛍光の変動は、ODMR電子スピン共鳴(ESR)周波数と、従ってODMRスピン部分準位の磁場シフトとを明らかにする。従って、サンプル(すなわち複合体)530によって発生されるダイヤモンド表面での磁場の空間構成は、その特性がマイクロ波場によっても、複合体530内の検体120に結びついた磁気機能化ビーズ110が発生する磁場によっても影響されるODMR中心蛍光542の画像から特定できる。
【００４３】
簡潔に言えば、磁気画像を取得するための処理は次の通りである：
1. イメージングすべき磁気サンプル(すなわち複合体)530を、ダイヤモンド基質532の感知面全体に、その上に、または近くに配置する。中間層(図示しない)をサンプル530とダイヤモンド基質532との間に挿入してもよい。
2. 任意の方向に磁気バイアス場534を印加する。
3. ダイヤモンド中心のODMR中心540を緑色光536 (532 nm付近の波長)で照らす。
4. 源538からのマイクロ波場を、ODMR中心ESR遷移のいずれかに近い周波数で、ダイヤモンドに印加する。
5. 感知面540から放射されたODMR中心蛍光542の画像を、イメージング対物レンズ546および光学フィルター548を介して光検知器アレイ544で取得する。
6. 1つ以上のNV中心ESR遷移付近の1つ以上の範囲にわたる様々なマイクロ波周波数を用いて段階4および5を繰り返す。結果として、それぞれが異なるマイクロ波周波数に対応する画像のスタックが得られる。
7. この画像スタックのイメージングノイズを減少させるため、段階4-6を複数回繰り返し、結果を平均する。
8. この画像スタックにおける各画像ピクセルに関し、そのピクセルの値からESRスペクトルをそのスタック中のすべての画像にわたって構築する。このスペクトルを分析して1つ以上のESR遷移の周波数を特定する。
9. 画像スタック内の各画像ピクセルに関して、磁場を、そのピクセルにおいて観察されたESR遷移の周波数に基づいて計算する。
【００４４】
この広視野ダイヤモンド磁気イメージング装置の動作の付加的詳細は、2017年10月20日付けで提出され、「ダイヤモンド磁気イメージングを用いた磁気微粒子分析のための方法および装置（METHODS AND APPARATUS FOR MAGNETIC PARTICLE ANALYSIS USING DIAMOND MAGNETIC IMAGING）」と題された、参照して本明細書に援用するPCT特許出願第PCT/US2017/057628号に記載されている。
【００４５】
印加された磁場は、ビーズA内の磁化およびそのビーズから関連磁場を誘起する。0.5-10 mT範囲の磁場は、永久磁石または電磁石で発生でき、ダイヤモンドイメージングセンサーの電子スピン共鳴スペクトルの特徴を解像するのに十分である。このダイヤモンド磁気撮像装置はこれら各ビーズ磁場を直接イメージングして、個々のビーズの検出および位置特定を可能とする。似た組成および磁化のビーズは、各ビーズAの位置に対応した磁気画像における特有の特徴542として識別できる類似の磁場パターンを発生する。代表的な画像を図6Cに示した。
【００４６】
画像処理アルゴリズムは、図6Cに示した磁気画像のビーズA特徴542と、図6Bに示した蛍光画像におけるビーズB特徴155との位置を特定できる。付加的な画像をいずれかの検出チャンネル(磁気または蛍光)で獲得して信号忠実度を向上してもよい。すると各検出チャンネルで特定された結果的に得られたビーズ位置は、図6Cに示された、両方のビーズタイプの供存在、すなわち標的検体を包含する複合体145の供存在を特定できる。
【００４７】
ビーズ蛍光チャンネルでのビーズBの検出に加え、ビーズAを検出する磁気イメージングチャンネルを加えると、磁気分離後も残存するか、または、非特異的相互作用により弱く結合されたビーズ複合体から解離しうる非結合ビーズBの特定が可能となる。非結合ビーズBは分析時に除去され、複合体に結びついたビーズBのみが計数される。
【００４８】
例D4：磁気イメージングを用いた完全磁気アッセイ
図7A-7Dに示した別の実施形態では、ビーズA 710およびビーズB 730は両方とも磁性的であるが、区別可能な磁気特性を備えている。単ビーズ空間解像度を備えた磁気イメージングを用いて、例C3に示したようにビーズA 710を識別し、さらにビーズB 730も識別するので、これら2つが区別される。ビーズA 710は、上述した例A1、B2、およびC3のような磁気分離に適した磁気特性を備えている。
【００４９】
ビーズA 710およびB 730は、例えば、ビーズの磁化を印加磁場の関数として記述するそれらの単軸磁化曲線の形状および大きさが異なる。ビーズA 710およびB 730は、それらの磁化曲線のヒステリシスの度合いや、残留磁気および保磁力などの特性が異なるようにしてもよい。ビーズA 710およびB 730は、その非対称性の度合いが異なるようにしてもよく、磁場軸が変化するときに異なる磁化曲線が観察される。ビーズA 710およびB 730は、交番または回転磁場のような時間変動磁場への応答が異なることがある。
【００５０】
ビーズA 710、ビーズB 730、および検体720を含む複合体745を特定しかつ位置を突き止めるために磁気イメージングのみを使用すると、光学蛍光検出チャンネルを除去できるので、このアッセイシステムを有意に単純化できる。さらに、磁気イメージングは、不要な光、検出器のノイズ、蛍光を発し、光を散乱し、または吸収するサンプルの汚染物による信号バックグラウンドに対して特に感度が悪い。磁気信号バックグラウンドは生物学的サンプルでは極めて低く、磁性の程度が低い磁気ビーズを測定する能力を妨げることはない。
【００５１】
磁気イメージングを用いた磁気ビーズタイプの区別
広視野ダイヤモンド磁気イメージングは、広範囲の磁気条件下で磁気ビーズが発生するベクトル磁場を直接的にイメージングする手段を提供する。この汎用ツールを用いて、広い範囲の異なる特性にわたる磁気ビーズタイプを区別できる。
【００５２】
一実施形態では、ビーズA 710およびビーズB 730は、最初にこれらビーズを大きな磁場で磁化させた後に、低印加磁場で磁化率と残留磁気とを測定することによって区別される。ビーズA 710は超常磁性である。例えば、ビーズA 710は、直径が概ね1 μmの球形ポリマー基質内に分散された大きさが5-10 nmである超常磁性の酸化鉄ナノ粒子から構成できる。ビーズA 710は一定量の酸化鉄を含むことができ、4 mTの印加バイアス磁場でのビーズA 710の平均誘導磁気は、3 x 10-15 A m2である。ビーズB 730は強磁性である。一実施形態では、ビーズB 730は、直径が概ね1 μmの球形ポリマー基質の表面に分散された大きさが30 nmである強磁性を有するコバルトフェライトのナノ粒子であって、付加的なポリマー層を備えた表面に付着したコバルトフェライトのナノ粒子から構成できる。ビーズB 730は、50%を上回る残留磁気割合を備えるので、少なくとも300 mTの磁場で磁化された後にその磁化場が除去されると、ビーズB 730はその飽和磁化値の大きな部分を保持する。ビーズB 730は一定量のコバルトフェライトを含むことができ、磁化場が除去された後のビーズB 730の平均残留磁気の大きさは概ね2 x 10-15 A m2である。
【００５３】
標的検体720、ビーズA 710、およびビーズB 730を含有する複合体745を特定するための磁気イメージング手順を後述する。
【００５４】
サンプル懸濁液内で複合体745を形成した後で、このサンプルの代表的部分が、図5に示したダイヤモンド磁気イメージングセンサーの図7Bに示した表面732上に配置され、乾燥される。このセンサーのイメージング面は{100}面であり、この表面は、窒素-空孔(NV)中心に富んだ概ね1-μmの薄層を含有する。図7B-7Dに戻ると、磁気イメージングの後、画像で空間解像されないほど近い場合も含め、互いに近接したビーズA 710およびビーズB 730を特定することで、複合体745が特定される。磁気イメージングに先だって、磁化場は、水平ダイヤモンド面に垂直方向に印加される。数秒間にわたって印加された200 mTを上回る磁化場は、ビーズB内の磁気材料を磁化するのに十分である。次に、乾燥したサンプルは、イメージング面に対して概ね35度の角度に配向されたダイヤモンドセンサーの結晶軸に平行に印加された4 mTのバイアス磁場で磁気的に二度にわたりイメージングされる。この4 mTのイメージング場は、図7Cおよび7Dに示した陽(図7C)および陰(図7D)画像と呼ぶ2つの磁気画像の取得で逆転されており、これらはそれぞれ+4 mTおよび-4 mTイメージング場を示す。これら磁気画像は、イメージング場の軸へのサンプル磁場ベクトルの投影を測定する。
【００５５】
ビーズA 710は超常磁性なので、200 mTを上回る磁化場は、有意な残留磁化をビーズA 710に残存させることはない。陽画像でも陰画像でも、ビーズAの磁化は、4 mTイメージング場によって超常磁性ビーズ内で誘導されるもののみである。ビーズA 710の磁化は両方の場合でイメージング場に平行なので、ビーズA 710は、両方の磁気画像で同じ特徴741を生成する。
【００５６】
対照的に、200 mTより強い磁場は、ビーズB 730を垂直方向に強く磁化し、水平ダイヤモンドセンサー面に対して上方に配向させる。磁化場が一旦除去されると、より弱い4mTのイメージング場はビーズB 730の磁化を大きく変化させないが、それは、同じ軸に沿って以前に磁化されていると、ゼロ磁場近くにおけるビーズB 730の磁化率が低いからである。従って、ビーズB 730は、陽磁気画像と陰磁気画像との間で符号が反転する画像特徴742を生成し、図7B、7C、および7Dに示したように、陽磁場投影は陰磁場投影に変わり、その逆も同様である。
【００５７】
この磁気画像視野で特定されるすべての磁気物体は磁化によって定量化され、ビーズA 710は両方の画像で正値を割り当てられ、ビーズB 730は陽画像および陰画像でそれぞれ正値および負値を与えられる。ビーズ複合体745には、その複合体組成を反映した磁化値が割り当てられる。A-AまたはB-B形状のビーズ二量体は、ビーズAまたはビーズB単量体と同じ符号でより大きな値が割り当てられる。A-B形状またはより大型の異質ビーズ複合体のビーズ二量体745は、陽画像に比べ陰画像でより小さな値が割り当てられ、これは図7Cおよび7Dに示したようにその複合体内の反対磁化ビーズを反映する。
【００５８】
磁気画像内のすべての磁気物体は、その軸が、陽および負画像磁化値のそれぞれ和および差である散布図上で表すことができる。この和および差は、単ビーズ磁化曲線の磁化率および残留磁気と呼ぶこともできるが、それはこれらがこうした特性に概ね比例するからである。図8Aに示したように、ビーズAおよびビーズAのみを含有するビーズ複合体は、磁化率が大きくかつゼロ残留磁気を呈した状態で一方の軸の近くに密集し、ビーズBおよびビーズBのみを含有するビーズ複合体は、残留磁気が大きくかつほぼゼロの磁化率を呈した状態で他方の軸の近くに密集する。ビーズAおよびビーズB両方を含有する複合体は、かなりの磁化率および残留磁気を呈し、これら物体は、散布図における両方の軸から十分に離間した領域にある物体として特定できる。この領域は、ビーズAおよびビーズBのみから、またはA-AまたはB-B形状の複合体などの同質ビーズ複合体からの信号を含有する可能性は低い。
【００５９】
この磁気イメージング空間解像度が複合体内の個別のビーズを解像するのに十分であれば、この複合体は、当該複合体内のビーズを別々に特定することで、かつ、それらの空間分離が結合複合体の空間分離と一致していてビーズ直径よりも有意に大きくはないと判断することで特定される。
【００６０】
ビーズAおよびビーズBが両方とも十分に磁性的であり、ビーズAまたはビーズBのいずれかが強磁性であれば、引力性磁気相互作用(attractive magnetic interactions)のおかげで、A-B二量体は標的検体の不在下でも形成されることがある。こうした磁気相互作用は、各ビーズ中の磁気材料の量を制限することでその強さを制限できる。ビーズ間の磁気相互作用がブラウン運動またはサンプル混合に関連した力を克服するには弱すぎであり、磁気相互作用が何の役割も果たせない場合でも、磁気ビーズ信号は測定できる。
【００６１】
ビーズAおよびビーズB内の磁気材料は、ポリマーまたは他の非磁気基質内またはその表面に配置されたナノ粒子から構成できる。これらナノ粒子が基質内またはその表面に均一に配置されていれば、ビーズ間の磁気相互作用の強度は、凝集されたナノ粒子と比較して低下させることができるが、それは凝集した磁気ナノ粒子の近傍の磁場は強度が増大することがあるからである。基質半径より大幅に小さいナノ粒子を使用すると、より強い局所磁場を生成するより大きいナノ粒子に比べて、より均一な分布が可能になる。
【００６２】
磁気相互作用は、磁気材料を封入する非磁気層を加えることによっても抑制できる。この非磁気層の適切な材料には、ポリエチレン(PE)、ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)、およびポリメタクリル酸メチル(PMMA)などのポリマーが含まれる。磁気相互作用はビーズ間の分離が増大するにつれ急激に弱くなるので、元々のビーズ半径よりかなり薄い非磁気層であっても磁気相互作用による二量体形成を劇的に減少させることができる。
【００６３】
付加的な磁気識別方法
磁気モーメントによる識別
図8Bに示したように、ビーズサイズおよび磁気ビーズの磁気材料の球対称的分布が既知であることを前提として、そのビーズの磁気画像信号を分析することで、ビーズの磁気モーメント(磁気化ｘ体積)を特定できる。似た大きさのビーズAおよびビーズBに関しては、磁気モーメントを利用してビーズAとビーズBとビーズ複合体を区別できる。効果的にするには、各測定が1つの分布と明確に関連付けられるように、各ビーズの磁気モーメント、大きさ、球対称性のばらつきを十分低くしなければならない。A-B複合体は、各個別ビーズよりサイズが大きく、ビーズAおよびビーズBからの信号の和に等しい信号は発生しないことがある。しかし、平均A-B複合体信号がビーズA、ビーズB、A-A複合体、B-B複合体などの信号から異なるように、ビーズAおよびビーズBの磁気モーメントを選択することができる。候補信号間の空間的差異を分解して磁気モーメントによりそれらを区別する必要はない。すなわち、各信号を、例えば特徴的な画像信号での畳み込みの大きさなどの、大きさのみで評価することで十分である。
【００６４】
ビーズAとビーズBのサイズが異なる場合、候補信号の大きさを評価する際のこのサイズの差を無視し、すべての信号に同一の単一パラメータ定量化戦略を適用する、似た区別アプローチを使用できる。これにより、それらの磁気モーメントに比例しないが、明確に異なりかつ正確な区別を可能とするビーズA、ビーズB、および複合体の信号が発生される。
【００６５】
異方性による識別
単一の磁区における一定の結晶軸に沿ったまたは多磁区粒子もしくは多くの粒子を含む複合磁気ビーズのおける一定方向に沿った優先的磁化のおかげで、磁気粒子は、磁場に対して異方性応答を示すことがある。棒状ナノ粒子は、例えば、典型的には棒の軸に沿って容易に磁化できる。配向磁気ナノ棒を含有する球形ビーズを合成すると、ビーズ内で異方性磁化率を発生するはずである。
【００６６】
ビーズの磁気異方性は、多方向の印加磁場を用いて固定化ビーズを複数回イメージングすることによって調べることができる。図8Cに示したように、磁気異方性の測定基準は、異なる配向から得られた磁気信号の差から構成できる。異なる三方向でのイメージングを行えば、粒子配向が予め分かっていなくても、粒子の配向および異方性の程度を十分特定できる。ビーズAおよびビーズBが、それぞれゼロまたは非ゼロ磁気異方性を備えている場合は、異なる方向に回転させたイメージング磁場を使って取得した画像は、ビーズAに付いては同一の信号を発生するが、ビーズBについては異なる信号を発生する。複合信号は非ゼロ異方性を備えるが、ビーズBのそれよりも小さくなる。
【００６７】
保磁力による識別
図8Dに示すように、磁化された強磁性ビーズは、保磁力より大きな磁場を印加することで異なる方向に再度磁化できる。ビーズAとビーズBからなる2つのタイプの強磁性ビーズの識別はこの手順で実行できる：(1)まず、両方のビーズを強い磁場で一方向に磁化し：(2)ビーズの磁化をイメージングし；(3)ビーズAの磁化を逆転するには十分に強いが、ビーズBの磁化を逆転するほどには強くない磁場を反対方向に印加し；(4)磁気ビーズ信号をイメージングし、それらを最初の画像のものと比較する。ビーズA信号は方向を反転する。ビーズB信号は変化したとしても、その変化はわずかである。複合体内の一方のビーズが磁化を逆転する一方で他方は逆転しないので、複合体信号の強度は有意に変化する。
【００６８】
時間依存磁気応答による識別
図8Eに示したように、磁気粒子は、それらの磁化方向を磁場方向の変化に応答して変化させる。所与の磁場強度に関して、粒子が方向を変えるための時間尺度は、粒子組成および大きさに依存し、1 μ秒未満から1秒を大きく上回る広い範囲で変動しうる。定振幅の振動または回転AC磁場が粒子に印加されると、粒子の磁化が応答して振動する。振動磁化の測定は、ODMR中心のパルス光学励起を利用する広視野ODMR中心磁気イメージングシステムまたは時間ゲートカメラ露出などの、AC磁場に対して高感度の磁気イメージング技術により行うことができる。粒子が磁化方向を変化するのに要する時間尺度を振動周期が下回ると、この振動磁化の強さは減少する。遮断周波数は、この応答変化に対応した振動周波数として定義される。
【００６９】
ビーズAおよびビーズBは遮断周波数が異なる磁気材料を含む場合は、多数の振動周波数で振動磁化を測定することで、これらビーズを識別する方法を提供する。ビーズAがビーズBと比べて高い遮断周波数を備える場合は、中間周波数でのイメージングでは、低周波数でのイメージングに比べて弱いビーズB信号が観察されるが、ビーズA信号はほとんど変化しないことが観察される。複合体は、中間周波数においてビーズBのよりも小さい信号減少を示す。識別は、付加的な画像を付加的な周波数で加えることで向上できる。ビーズAおよびビーズBは単一の遮断周波数を備える一方で、複合体は2つの遮断周波数を示す。低振動周波数および2つ以上の中間周波数で得られる信号は、ビーズA、ビーズB、および複合体に関して定性的に異なる挙動を明らかにする。
【００７０】
磁気飽和による識別
図8Fに示したように、超常磁性粒子の磁化Mは、十分に高い磁場Hで飽和する。飽和未満の磁場強度においても、磁化率(磁化曲線の傾き)は低下する。超常磁性のビーズAおよびビーズBの磁化が、異なる磁場強度H1およびH2で飽和する場合、これらのビーズは、一方の磁気強度が当該ビーズの何れかにおける磁気率の変化を観察するのに十分な大きさである、2つの磁気強度でイメージングすることで区別できる。これら2つの画像における信号の比は、ビーズAおよびビーズBに関して有意に異なる複合体は、ビーズAまたはビーズBのものとは異なる中間比を備える。
【００７１】
サイズに基づく磁気ビーズ識別
大きさが異なるが組成が類似した磁気ビーズは、空間尺度によって区別可能な磁気画像信号を発生できる。これによって、ビーズAおよびビーズBが名目上同一の磁気特性をそなえていても、ビーズA、ビーズB、および複合体を区別できることがある。
【００７２】
サンプル懸濁液は表面に配置されると、ほとんどのビーズはその表面に静止し、各ビーズの中心はその半径分だけ表面から離間する。従って、より大型のビーズの中心は、より小型のビーズより感知面からさらに離れることになる。感知面に沿った横方向の同一離間は、空間的に近接したビーズに関してより離れたビーズに比べより大きくなり、その結果として磁場での大きな相対変化になるので、この離間が感知面における磁場の空間尺度を決定する。
【００７３】
図9は、直径が概ね1ミクロン(上)および3ミクロン(下)であり、それらの中心が概ね9ミクロン離間した2つのビーズの画像である。大きい方のビーズは、より広い空間的特徴を備えた磁気信号を発生する。この場合は、この大型ビーズはより高い磁性の材料を含み、より強い信号を発生するが、そうである必要はない。
【００７４】
ビーズAおよびビーズBの大きさが異なるが、それらの磁気特性が類似している場合は、磁気画像信号の空間尺度はそれら2つを区別するだけでなく、A-B複合体を特定するためにも使用できる。複合体は、より短いスケールの空間成分も含む空間的に広い信号を備えている。
【００７５】
複合体を特定するための1つの方法は、まず、すべての広い信号(ビーズBおよび複合体の信号を含む)と、次に、それぞれから特徴的なビーズBの信号(別々にイメージングされた多くのビーズB信号の平均など)を減算する。イメージング正確度およびビーズB磁化の均一性の変動によって、この差がビーズB信号については非ゼロとなるが、この差は一般に広い空間スケールを含むはずである。しかし、複合体信号に関しては、特徴的なビーズB信号を減算するとよりシャープなビーズA信号が残る。これらの場合は、信号差の空間的フィルタリングによって区別できる。
【００７６】
図10A-1、10B-1、および10C-1は、サンプルビーズB画像を示す。特徴的ビーズB信号を減算した後の図10A-2、10B-2、および10C-2に示した差信号画像は、二倍に増幅されたグレースケールを備える。
【００７７】
図11A-1、11B-1、および11C-1は例示的な複合体画像を図示しており、図11A-2、11B-2、および11C-2に示した差信号において丸囲みした鮮明なビーズA信号を示しており、これらも画像信号に比べて二倍に増幅されている。
【００７８】
複合的アプローチ
本明細書に記載したビーズ識別アプローチを組み合わせて、識別性能を向上させ、または、3つ以上のビーズタイプおよびその組合せを識別するようにしてもよい。
【００７９】
付加的なアッセイ特徴
ビーズ密度変動の説明
サンプル懸濁液内に標的検体を含有する所与の数のビーズ複合体に関して、サンプルをイメージングセンサー上に配置した後でイメージング視野内に存在する複合体の数は、サンプルが配置された方法の違いによって変動することがある。例えば、サンプルは、一滴の液滴をセンサー面に加えてそれを乾燥させることによってセンサー上に配置でき、液滴量またはセンサーとの初期接触面積の変動が、センサー面上の乾燥したサンプルのビーズ複合体密度の変動をもたらす。複合体に含有されない非結合ビーズも含んだ視野内のビーズ総数を測定することで、サンプル密度の変動が測定され、その理由の説明にもなる。複合体の数をビーズAの数で除算することによって、サンプル密度変動に対して影響されにくい量が得られ、サンプル中のビーズ複合体の総数および上述のように得られた較正曲線から求められた検体濃度のより正確な測定が可能となる。
【００８０】
促進ビーズ相互作用動態
イムノアッセイは、液体サンプル中の標的検体の検出を可能とするには、それら標的検体が抗体に結合する時間を与えなければならないことは本発明の分野で知られている。試薬濃度およびサンプル条件(例えば、サンプルを撹拌または混合するための温度、粘度、および工程など)によれば、過剰な数の結合部位が使用可能な場合であっても、検体が拡散、能動的揺動、または撹拌によってサンプル中を移動するのに必要な時間のため、ほとんどの検体が結合するのに数分を要することがある。
【００８１】
サンプル懸濁液中の異なるビーズ間の相互作用の割合が多ビーズアッセイ速度を決定することがあり、それは、ビーズ拡散がより小型の分子検体の拡散と比べて一般に遅いからである。ビーズ結合標的検体はビーズ表面積の比較的小さい部分を占めることができるので、検体が結合したビーズが第2ビーズと相互作用するときに、この検体は、結合を促す様態で第2ビーズに暴露されないことがある(例えば、検体が位置した側とは反対の第1ビーズの側で相互作用が起こる)。免疫複合体を形成するのに平均して幾つかのビーズ複合体が必要となることがある。この多ビーズアッセイ時間は、免疫複合体の形成に至るビーズ間の相互作用を誘発する工程を実行することによって短縮でき、拡散または撹拌のみで期待できる以上にビーズ動態を促進する。
【００８２】
一実施形態では、サンプル溶液を第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させた後で、複合体を検出する前に、遠心分離器でサンプル懸濁液を回転させてビーズをサンプルチューブ内でペレットに濃縮することによって、第1および第2タイプの複数の機能化ビーズを凝集させることで、ビーズ間の相互作用が誘発される。この工程は、標準的な卓上遠心分離システムを用いて1分未満で実行できる。ペレット内のビーズは互いに隣接して離間または接触しており、ペレット内で多くのビーズが相互作用する。このペレットは、懸濁液を混合することによって再度懸濁させることができる。標的検体を含有する免疫複合体を形成するのに十分な相互作用がビーズ間で確実に行われるように、必要に応じてこの遠心分離過程を繰り返してもよい。
【００８３】
別の実施形態では、かりにビーズAおよびビーズBが両方とも磁気的であれば、サンプル溶液を第1および第2タイプの複数の機能化ビーズに接触させた後に磁場勾配をサンプル溶液に印加することで、サンプル懸濁液中でビーズペレットを形成しかつビーズ間の相互作用を引き起こすために、磁気分離を使用できる。この遠心分離過程と同様に、ビーズ動態を促進するためのこの磁気アプローチは、1分未満で実行しかつ必要であれば繰り返して、標的検体を含む免疫複合体を形成することができる。この磁気アプローチは、電力消費が最小である簡素、安価、かつコンパクトな工程を実現するため永久磁石で実行できる。電磁石を用いて可動部材なしで磁場を印加してもよい。 
【００８４】
別の実施形態では、サンプル懸濁液の磁気分離により生成されたビーズペレットは、磁場を除去しないで、しかしビーズに対してサンプル溶液に印加された磁場勾配を変動または他の様態で変化させることによって撹拌できる。例えば、ビーズに異なる磁気力を印加するには、磁場強度、方向、または空間的分布を変化または振動させればよい。代替的または付加的に、サンプルチューブを磁場に対して移動させてもよい。例えば、チューブを回転させることによって、ペレットをその平衡位置から移動させることができ、ペレットが磁場勾配によって新たな位置まで引っ張られることになる。これらの変化はペレット内のビーズを互いから移動させることになり、付加的なビーズ相互作用と免疫複合体の形成を引き起こす。
【００８５】
一実施形態では、永久磁石を、複数タイプの磁気ビーズを備えたサンプル懸濁液を含有するチューブに対して移動させればよい。この磁石は固定的な運動パターンを追従すればよい。代表的な場合は、磁石が、それ自身の軸を中心に回転または二点間を揺動しつつ、サンプルチューブの周囲を円形の軌道を描いて回る段階を含む。この運動は連続的としてよく、その場合、ビードペレットはチューブ内を連続的に移動して、ビードには液体、チューブ壁、および他のビードからの剪断力がかかる。この運動およびビーズにかかる関連した力が、ペレットを連続的に撹拌してビーズ間の相互作用を駆動する。別の代表的な場合では、この運動は、静止期間で間隔を開けた期間毎に行えばよく、この間にビーズペレットは連続動作時に達成される、より高いビーズ密度まで濃縮される。これら異なるビーズタイプが永久磁石の磁場に有意に異なるように反応する場合は、静止期間によって、この複数ビーズタイプが連続運動時よりも効果的に共集中(co-localize)できる。
【００８６】
別の実施形態では、複数の永久磁石は1つのプレートの別個ウェル内の複数サンプルに対して移動させることで、各ウェル内のサンプルを実質的に類似した時間および空間の磁場プロフィルに曝す。このアプローチによって、ビーズ間相互作用を複数のサンプルにわたって並行して駆動でき、サンプル調製スループットを向上させる。
【００８７】
サンプル懸濁液内のビーズ動態およびビーズ間相互作用を促進すると、標的検体を検出可能な多ビーズ複合体に結合させるのに必要な時間が短縮される。この方法は迅速なアッセイを実現する。
【００８８】
さらに、この方法は、ビーズ表面上で使用される結合リガンドの量が少なくできるが、それは所与のリガンドが標的検体に結合する可能性が、ビーズ間相互作用の頻度が増大したことによって増加するからである。より少ない数の結合リガンドを使用すると、アッセイのコストをかなり減少できる。
【００８９】
多重化
アッセイでは、単一のサンプルにおける複数の別個の検体の濃度を測定することが、しばしば有用である。多重化アッセイは、別個の信号を各標的に関連付けることで別個の標的検体を測定するので、これら検体信号をアッセイ測定で区別できる。この磁気2種ビーズアッセイは、2つ以上の区別可能なビーズタイプを用いることで多重化多ビーズアッセイに一般化できる。適切な条件下で少なくとも第2検体と特異的に結び付くことができる少なくとも第3部分を含むよう機能化された少なくとも第3タイプの複数の機能化ビーズを含んだ検体特異複合体の形成を観察することによって、異なる検体を特異的に検出できる。
【００９０】
図12Aおよび12Bに示した一実施形態では、適切な条件下で第2検体1250に結びつく少なくとも第3部分1245を含むよう機能化された第3タイプ1240の複数の機能化ビーズと、適切な条件下で第2検体1250に結びつく第4部分1265を含むよう機能化された第4タイプ1260の複数の機能化ビーズとを含み、ビーズA 1210、ビーズB 1230、ビーズC 1240、およびビーズD 1260の4つの区別可能なビーズタイプとなっているものと考える。A-B 1201またはC-D 1202形状の複合体は、2つの別個の検体、すなわち第1検体X 1220および第2検体Y 1250の、各ビーズに塗布された部分への結合を介して形成できる。この場合は、ビーズA 1210およびビーズB 1230には、それぞれ検体X 1220の2つの異なる領域X1およびX2を標的にする部分1215および1235が塗布されており、ビーズC 1240およびビーズD 1260には、それぞれ検体Y 1250の2つの異なる領域Y1およびY2を標的にする部分1245および1265が塗布されている。各ビーズ上の部分はそのビーズに固有である。A-B 1201およびC-D 1202複合体は互いから、そしてそれらの異なる磁気特性からの単量体ビーズから区別できる。
【００９１】
図13Aおよび13Bに示した別の実施形態では、3つの区別可能なビーズタイプ、すなわちビーズA 1310、ビーズB 1320、およびビーズC 1330を考える。A-B 1301、B-C 1302、またはA-C 1303形状の複合体は、3つの別個の検体、すなわち第1検体X 1311、第2検体Y 1312、および第2検体Z 1313の、各ビーズに塗布された部分への結合を介して形成できる。第1タイプA 1310の機能化ビーズは、適切な条件下で第2検体1312に結びつく少なくとも1つの追加部分1316をさらに含む。第2タイプB 1320の機能化ビーズは、適切な条件下で第3検体Z 1313に結びつく部分1326をさらに含む。第3タイプC 1330の機能化ビーズは、部分1335および部分1336を含むよう機能化されており、従って、各ビーズには、2つの異なる検体を標的にする2つの異なる部分のタイプが塗布されており：ビーズA 1310には検体X 1315および検体Y 1316のための部分が塗布され；ビーズB 1320には検体X 1325および検体Z 1326のための部分が塗布され；ビーズC 1330には検体X 1335および検体Z 1336のための部分が塗布されている。各ビーズ上の部分はそのビーズに固有である。A-B 1301、B-C 1302、およびA-C 1303複合体は互いから、さらにそれらの異なる磁気特性からの単量体ビーズから区別できる。
【００９２】
多重化アッセイは、別個の標的検体と関連付けられた信号を識別する手段を備える必要があり、多重化ビーズアッセイの場合は、ビーズを区別可能でなければならないことを意味する。異なる励起および/または発光スペクトラムを備えたビーズタイプを識別するために、ビーズ蛍光を用いることができる。例えば、3つのビーズタイプは、光学フィルタを用いて区別できる青、黄、赤蛍光を発光できる。異なるビーズタイプを異なる強度で蛍光を発するよう調製してもよく、これら異なるタイプは離散的なレベルの輝度によって蛍光画像で区別でき、ここでは、レベル間の差が各ビーズタイプの区分内の変化を上回る。
【００９３】
別個の磁気ビーズタイプは、磁気イメージングにより区別可能な異なる磁気特性を備えたビーズタイプを調製することで区別できる。例示的な場合では、これら別個の磁気ビーズタイプは、各ビーズタイプに個別で区別可能な量の磁気材料を加えることで調製できる。別の例示的な場合では、別個の磁気ビーズタイプは、各ビーズタイプに異なる特性を示す異なる磁気材料を加えることで調製できる。上述した完全に磁気的な多ビーズアッセイは、この方式で2つのビーズタイプを区別する。多重化アッセイは、上述した特定の異なる組合せを用いるさらに区別可能なビーズを加えることで実現できる。例えば、ビーズAは超常磁性とすることができる一方で、ビーズBおよびCは強磁性を有しており、異なる強磁性材料を含むビーズBおよびビーズCから異なる保磁力が得られる。この場合、磁化後に残留磁化を測定し、次に、この残留磁化がビーズBの保磁力を上回る一方でビーズCの保磁力を上回らない反磁場の印加後に、この残留磁化が反転するかを測定することでこれらビーズは区別できる。この場合のこれら3ビーズを使用することで、上述の実施形態を用いて3つの検体用の多重化アッセイを実現できる。
【００９４】
サンプル調製
多ビーズアッセイのサンプル調製に適した条件の一例は、数滴の血液を多ビーズ混合物に混ぜ合わせ、動態混合を促進させることによって数分間保温し、サンプル溶液をダイヤモンド面上に乾燥のため配置して、その後に磁気イメージングを行うものである。このサンプル溶液は、複合体を検出する前に部分的または完全に脱水すればよい。
【００９５】
適切なサンプル調製は次のように行われる。すなわち、血漿または血清を、5 μLのサンプルを45 μLアッセイバッファーに加えることによってアッセイバッファーで10倍希釈し、短時間にわたり渦混合する。この希釈サンプルは、50 μLのビーズ混合物でさらに2倍に希釈して、100 μLの最終物とする。このビーズ混合物は、~100,000の捕捉ビーズと~100,000の検出器ビーズを含む。最終的なアッセイ反応は、サンプルの100 μLでの20倍希釈である。このアッセイ反応は、室温で15分間にわたり渦混合(毎分回転数800回)で保温する。このサンプルは次に遠心分離器内に配置し、3分間にわたり1500 gで回転させ、続いてパルス渦混合する。この遠心分離および混合のサイクルは二回繰り返し、その後、サンプルを永久磁石(磁場~300 mT)に対して30秒にわたり配置して、磁気ビーズを反応チューブの側壁に対してペレット成形する。このアッセイボリュームはピペットで除去し、ビーズペレットを磁石に対して側壁上で完全な状態で残す。このチューブを磁石から取り外し、ペレットを渦混合によって500 μLの洗浄バッファー内に懸濁させる。このチューブは3秒間にわたり1500 gでパルス回転させて流体をキャップから除去し、磁石上に30秒間にわたり置かれる。この洗浄サイクルはさらに2回繰り返され、合計3回の洗浄とする。ペレットは200 μLのイメージングバッファーで一度洗浄され、最終的に~4 μLのイメージングバッファー内で懸濁される。磁気イメージングのため~2 μLをダイヤモンドセンサーに加える。
【００９６】
このサンプルは、全血、血液成分(血漿、血清)、組織培養、細胞培養、体液(脳脊髄液(CSF)、涙液、唾液、母乳、尿、精液、鼻汁)、組織サンプル(咥内綿棒標本、生検、外科切除)、組換えDNA、RNA、もしくはタンパク質、内因性DNA、RNA、もしくはタンパク質、合成核酸、またはタンパク質ペプチドなどの任意の化学または生物学的サンプルでよい。
【００９７】
付加的なサンプル要件としては、0.1 μLから1000 μLまでの量のサンプルタイプを含むことができる。
【００９８】
付加的なサンプル要件としては、サンプルタイプおよび量のアッセイバッファーへの希釈を含むことができる。サンプルタイプの希釈には、10-1,000倍の希釈を含むことができる。アッセイバッファーは、最適信号生成および最小非特異的バックグラウンドまたは任意種類の誤結合(false binding)となるよう、経験的に決定できる。
【００９９】
サンプルは、様々な方法で、例えば、血液採取チューブ、アッセイチューブ、アッセイプレート/ウェル、マイクロ流体デバイス、反応チャンバ、保温チャンバ、側方流動デバイス、血液成分分離デバイス、または他の液体取扱または操作デバイス内の多ビーズ混合物を含むもので組み合わせることができる。
【０１００】
サンプルは、例えば、磁場、遠心力、重力、音誘発、光誘発、電気誘発、イオン相互作用、ファンデルワールス誘発、ブラウン運動、回転、または他の機械的手段を含む、様々な方法で混合できる。
【０１０１】
サンプルは、対象の標的を捕捉するのに必要な例えば1秒から数時間の間、多ビーズ混合物と混合させればよい。
【０１０２】
サンプルは、例えば、ピペット、毛管流チューブまたはデバイス、サンプル取扱デバイス、液体取扱デバイス、総合デバイス、側方流動デバイス、使い捨てまたは再利用可能デバイスを含む様々な方法で、磁気イメージング装置に導入できる。
【０１０３】
サンプルは、例えば、ピペット操作、流し込み、滴下、毛管流、ポンピング、重力誘発流動、磁気誘発流動、イオン誘発流動、音誘発流動、光誘発流動、機械的振動誘発流動、シース流、遠心誘発、および熱誘発流を含む、様々な様式での付加によってダイヤモンド面に配置できる。
【０１０４】
サンプルは、乾燥、脱水(すなわち、部分的に乾燥またはゲル)または湿潤状態で磁気的にイメージングできる。
【０１０５】
さらなる例示的実施形態
例1は、光学検出磁気共鳴(ODMR)に基づいて検体を含む複合体を検出するためのビーズに基づいた磁気アッセイシステムであって、当該システムは：(a)磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体に結びつく第1部分を含むよう機能化された第1タイプの複数の機能化ビーズと、(b)適切な条件下で検体に結びつく第2部分を含むよう機能化された第2タイプの複数の機能化ビーズと、(c)少なくとも1つのODMR中心を含む基質と、(d)少なくとも1つのODMR中心内で電子を基底状態から励起状態まで励起する入射光を発生するよう構成された光源と、(e)少なくとも1つのODMR中心上に配置された複合体にバイアス磁場を印加する磁石であって、複合体は、第1タイプの機能化ビーズの1つ、検体、および第2タイプの機能化ビーズの1つを含む、磁石と、(f)少なくとも1つのODMR中心に入射するマイクロ波場を生成するよう構成されたマイクロ波源であって、マイクロ波源は、少なくとも1つのODMR中心での基底状態遷移に対応した周波数を備えたマイクロ波場を生成するようさらに構成されており、ここでは、少なくとも1つのODMR中心は、入射光によって照らされると放射光を発生し、この放射光の特性は、マイクロ波場によっても、複合体内の検体に結びついた磁気機能化ビーズによっても影響される、マイクロ波源と、少なくとも1つのODMR中心により放射された光を検出する光学式光検出器とを含む。
【０１０６】
例2は例1の主題を含み、少なくとも1つのODMR中心は炭化ケイ素格子中のケイ素-空孔中心である。
【０１０７】
例3は例1の主題を含み、少なくとも1つのODMR中心はダイヤモンド格子中のケイ素-空孔中心である。
【０１０８】
例4は例1の主題を含み、少なくとも1つのODMR中心はダイヤモンド格子中の窒素-空孔中心である。
【０１０９】
例5は例4の主題を含み、少なくとも1つのODMR中心は基質の上面に形成されている。
【０１１０】
例6は例5の主題を含み、少なくとも1つのODMR中心は、ダイヤモンド基質の上面に形成された複数のODMR中心である。
【０１１１】
例7は例6の主題を含み、光学式光検出器は、複数のODMR中心からの放射光をイメージングするイメージングセンサーを備えた光学イメージングシステムである。
【０１１２】
例8は例1-7の何れかの主題を含み、第1および第2部分のぞれぞれは、受容体、タンパク質、抗体、細胞、ウイルス、または核酸配列である。
【０１１３】
例9は例1-8の何れかの主題を含み、第1タイプの機能化ビーズは、超常磁性材料を含む超常磁性機能化ビーズである。
【０１１４】
例10は例9の主題を含み、第1タイプの機能化ビーズは、超常磁性材料を封入する非磁性層を含む。
【０１１５】
例11は例9の主題を含み、超常磁性機能化ビーズは酸化鉄粒子を含む。
【０１１６】
例12は例1-11の何れかの主題を含み、第1タイプの機能化ビーズは、ポリマー基質内に配置された磁気ナノ粒子を含んでいる。
【０１１７】
例13は例1-11の何れかの主題を含み、第1タイプの機能化ビーズは、ポリマー基質の表面上に配置された磁気ナノ粒子を含んでいる。
【０１１８】
例14は例1-13の何れかの主題を含み、第2タイプの機能化ビーズは蛍光機能化ビーズである。
【０１１９】
例15は例1-13の何れかの主題を含み、第2タイプの機能化ビーズは、第1タイプの機能化ビーズから区別可能な一定量の磁気材料を含んだ磁気機能化ビーズである。
【０１２０】
例16は例1-13の何れかの主題を含み、第2タイプの機能化ビーズは磁気機能化ビーズであり、第2タイプの機能化ビーズは、第1タイプの機能化ビーズから区別可能な磁気特性を含んでいる。
【０１２１】
例17は例16の主題を含み、第1タイプの機能化ビーズは、超常磁性材料を含んだ超常磁性機能化ビーズである。
【０１２２】
例18は例17の主題を含み、第1タイプの機能化ビーズは、超常磁性材料を封入する非磁性層を含む。
【０１２３】
例19は例16の主題を含み、第2タイプの機能化ビーズは、強磁性材料を含んだ強磁性機能化ビーズである。
【０１２４】
例20は例19の主題を含み、第2タイプの機能化ビーズは、強磁性材料を封入する非磁性層を含む。
【０１２５】
例21は例1-20の何れかの主題を含み、第1タイプの機能化ビーズおよび第2タイプの機能化ビーズのそれぞれは、50 nmから10 μmまでの範囲の直径を備える。
【０１２６】
例22は例21の主題を含み、第1タイプおよび第2タイプの機能化ビーズの直径は、それぞれ0.5 μmから5 μmまでの範囲である。
【０１２７】
例23は例21の主題を含み、第1タイプの機能化ビーズの直径は、第2タイプの機能化ビーズの直径に類似している。
【０１２８】
例24は例21の主題を含み、第1タイプの機能化ビーズの直径は、第2タイプの機能化ビーズの直径と少なくとも50%は異なる。
【０１２９】
例25は例1-24の何れかの主題を含み、適切な条件下で少なくとも第2検体と特異的に結び付くことができる少なくとも第2部分を含むよう機能化された少なくとも第3タイプの複数の機能化ビーズを含んでいる。
【０１３０】
例26は例25の主題を含み、適切な条件下で第2検体に結びつく第2部分を含むよう機能化された第4タイプの複数の機能化ビーズを含んでいる。
【０１３１】
例27は例25の主題を含み、第1および/または第2タイプの複数の機能化ビーズは、適切な条件下で第2検体に結びつく少なくとも１つの追加部分をさらに含んでいる。
【０１３２】
例28は例27の主題を含み、適切な条件下で第3検体に結びつく第3部分をさらに含み、第1タイプの機能化ビーズは第2部分を含むようさらに機能化されており、第2タイプの機能化ビーズは第3部分を含むようさらに機能化されている。
【０１３３】
例29は、検体を含む複合体を検出する方法であって、当該方法は：(a)溶液中のサンプルを、磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体に結びつく第1部分を含むよう機能化された第1タイプの機能化ビーズの集団に接触させる段階と、(b)サンプル溶液を、適切な条件下で検体に結びつく第2部分を含むよう機能化された第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させる段階であって、接触は、第1タイプの機能化ビーズの1つ、検体、および第2タイプの機能化ビーズの1つを含む複合体の形成に至る、接触させる段階と；(c)磁気機能化ビーズによって生成された磁場を検出することにより、かつ複合体内で検体に結びついた第2タイプの機能化ビーズを検出することによって、検体を含む複合体を検出する段階とを含む。
【０１３４】
例30は例29の主題を含み、複合体を含むサンプル溶液を、その内部に形成された少なくとも1つの光学検出磁気共鳴(ODMR)中心を含む基質上に配置する段階と；電子を少なくとも1つのODMR中心内で基底状態から励起状態まで入射光によって励起する段階と；バイアス磁場を複合体に印加する段階と；少なくとも1つのODMR中心に入射するマイクロ波場を生成する段階とを含み、このマイクロ波場は、少なくとも1つのODMR中心での基底状態遷移に対応した周波数を含み、検体を含む複合体の検出は、少なくとも1つのODMR中心によって放射された光を分析する段階をさらに含み、この放射光の特徴は、マイクロ波場により影響されかつ複合体内で検体に結びついた磁気機能化ビーズにより影響される。
【０１３５】
例31は例30の主題を含み、少なくとも1つのODMR中心はダイヤモンド格子中の窒素-空孔中心である。
【０１３６】
例32は例31の主題を含み、少なくとも1つのODMR中心は基質の上面に形成されている。
【０１３７】
例33は例32の主題を含み、少なくとも1つのODMR中心は、基質の上面に形成された複数のODMR中心である。
【０１３８】
例34は例33の主題を含み、複数のODMR中心から放射される光の分析は、その放射光のイメージングを含む。
【０１３９】
例35は例29-34の何れかの主題を含み、サンプルを第1タイプの機能化ビーズの集団に接触させた後に、磁場勾配をサンプル溶液に印加する段階をさらに含む。
【０１４０】
例36は例35の主題を含み、磁場勾配をサンプル溶液に印加する段階は、サンプル溶液を第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させた後に実行される。
【０１４１】
例37は例29-36の何れかの主題を含み、第1タイプの機能化ビーズの集団および第2タイプの機能化ビーズの集団は、サンプル溶液に順次加えられる。
【０１４２】
例38は例29-37の何れかの主題を含み、第2タイプの機能化ビーズは蛍光機能化ビーズであり、前記方法は、複合体を、第2タイプの機能化ビーズ内で蛍光を励起する入射光で照らす段階と、複合体の蛍光イメージングを行う段階とをさらに含む。
【０１４３】
例39は例29-37の何れかの主題を含み、第2タイプの機能化ビーズは、第1タイプの機能化ビーズから区別可能な磁気特性を含む磁気機能化ビーズである。
【０１４４】
例40は例29-39の何れかの主題を含み、サンプル溶液を第1および第2タイプの機能化ビーズに接触させた後に、磁場勾配をサンプル溶液に印加する段階をさらに含む。
【０１４５】
例41は例40の主題を含み、サンプル溶液に印加される磁場勾配を変動させる段階をさらに含む。
【０１４６】
例42は例29-41の何れかの主題を含み、サンプル溶液を第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させた後に、サンプル溶液を濃縮する段階をさらに含む。
【０１４７】
例43は例29-42の何れかの主題を含み、サンプル溶液を第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させた後で、複合体を検出する前に、第1および第2タイプの複数の機能化ビーズを凝集させる段階をさらに含む。
【０１４８】
例44は例29-43の何れかの主題を含み、サンプル溶液をダイヤモンド基質上に配置した後に、サンプル溶液を脱水する段階をさらに含む。
【０１４９】
例45は、検体を含む複合体を検出するためのビーズに基づいたアッセイシステムであって、当該システムは：(a)磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体に結びつく第1部分を含むよう機能化された第1タイプの複数の機能化ビーズと、(b)蛍光機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体に結びつく非標識部分を含むように機能化された第2タイプの複数の機能化ビーズと、(c)第2タイプの機能化ビーズ内で蛍光を励起させる入射光を発生するよう構成された光源と、(d)第1タイプの機能化ビーズの1つ、検体、および第2タイプの機能化ビーズの1つを含む複合体内で検体に結びついた第2タイプの機能化ビーズが放射する蛍光を検出する光学式光検出器とを含む。
【０１５０】
例46は例45の主題を含み、これら蛍光機能化ビーズは、蛍光物質で含浸されたポリマー基質を含む。
【０１５１】
例47は例45の主題を含み、光学式蛍光検出器は分光光度計である。
【０１５２】
例48は例45の主題を含み、光学式蛍光検出器は、複合体内で検体に結びついた第2タイプの機能化ビーズにより放射される蛍光をイメージングする光学イメージングセンサーである。
【０１５３】
例49は例45-48の何れかの主題を含み、第1タイプの機能化ビーズは、超常磁性機能化ビーズである。
【０１５４】
例50は例49の主題を含み、超常磁性機能化ビーズは酸化鉄粒子を含む。
【０１５５】
例51は例45-50の何れかの主題を含み、第1タイプの機能化ビーズは、ポリマー基質内に配置された磁気ナノ粒子を含んでいる。
【０１５６】
例52は例45-50の何れかの主題を含み、第1タイプの機能化ビーズは、ポリマー基質の表面上に配置された磁気ナノ粒子を含んでいる。
【０１５７】
例53は、検体を含む複合体を検出する方法であって、当該方法は：(a)溶液中のサンプルを、磁気機能化ビーズであり、かつ、適切な条件下で検体に結びつく第1部分を含むよう機能化された第1タイプの機能化ビーズの集団に接触させる段階と、(b)サンプル溶液を、蛍光物質で含浸されたポリマー基質を含むと共に適切な条件下で検体に結びつく非標識部分を含むように機能化された第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させる段階であって、接触は、第1タイプの機能化ビーズの1つ、検体、および第2タイプの機能化ビーズの1つを含む複合体の形成に至る、接触させる段階と、(c)この複合体を、第2タイプの機能化ビーズ内で蛍光を励起させる入射光で照らす段階と、
(d)複合体内で検体に結びついた第2タイプの機能化ビーズにより放射される蛍光を分析することによって、検体を含む複合体を検出する段階とを含む。
【０１５８】
例54は例53の主題を含み、サンプルを第1タイプの機能化ビーズの集団に接触させた後に、磁場勾配をサンプル溶液に印加する段階をさらに含む。
【０１５９】
例55は例54の主題を含み、磁場勾配をサンプル溶液に印加する段階は、サンプル溶液を第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させた後に実行される。
【０１６０】
例56は例53-55の何れかの主題を含み、サンプル溶液を第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させた後で、複合体を検出する前に、サンプル溶液を濃縮する段階をさらに含む。
【０１６１】
例57は例53-56の何れかの主題を含み、サンプル溶液を第2タイプの機能化ビーズの集団に接触させた後で、複合体を検出する前に、第1および第2タイプの複数の機能化ビーズを凝集させる段階をさらに含む。
【０１６２】
例58は例53-57の何れかの主題を含み、複合体を検出する前にサンプル溶液を脱水する段階をさらに含む。
【０１６３】
同等物
これまで幾つかの実施形態を説明してきたが、当業者であれば様々な変更、修正、及び改善を容易に想到できることは理解すべきである。こうした変更、修正、及び改善は本開示の一部を構成することが意図されており、本開示の精神及び範囲に入ることが意図されている。本明細書で示した幾つかの実例は、複数の機能又は構造的要素の具体的な組み合わせを含むが、これら機能及び要素を本開示に従い他の方法で組み合わせて、同一又は異なる目的を達成できることは理解すべきである。具体的には、一実施形態に関連して説明した動作、要素、及び特徴は、他の実施形態における類似又はそれ以外の役割から排除されることを意図したものではない。さらに、本明細書に記載された素子又は構成要素は、同一の機能を実行する付加的な構成要素に更に分割し、或いは結合して同一の機能を実行するより少ない構成要素としてもよい。
【０１６４】
例示的な実施形態の上述の記載は、例証および説明を目的として示されたものである。すべてを網羅すること、または本開示を開示した通りの形式に限定することを意図したものでもない。この教示に照らして、多くの修正及び変更が可能である。従って、本開示の範囲は、この詳細な説明によって限定されるのでなく、添付された特許請求の範囲によって限定されることが意図されている。本願の優先権を主張して将来的に提出される出願は、開示された主題の権利を異なる様態で主張することでき、かつ、概して、本明細書で様々に開示またはそれ以外の方法で例示された1つ以上の限定の任意の組を含むこともできる。
【０１６５】
特許請求の範囲は次の通り：
【図１Ａ】
2020514709.tif 000003
【図１Ｂ】
2020514709.tif 000004
【図１Ｃ】
2020514709.tif 000005
【図１Ｄ】
2020514709.tif 000006
【図２】
2020514709.tif 000007
【図３Ａ】
2020514709.tif 000008
【図３Ｂ】
2020514709.tif 000009
【図３Ｃ】
2020514709.tif 000010
【図４】
2020514709.tif 000011
【図５】
2020514709.tif 000012
【図６】
2020514709.tif 000013
【図７】
2020514709.tif 000014
【図８Ａ】
2020514709.tif 000015
【図８Ｂ】
2020514709.tif 000016
【図８Ｃ】
2020514709.tif 000017
【図８Ｄ】
2020514709.tif 000018
【図８Ｅ】
2020514709.tif 000019
【図８Ｆ】
2020514709.tif 000020
【図９】
2020514709.tif 000021
【図１０】
2020514709.tif 000022
【図１１】
2020514709.tif 000023
【図１２】
2020514709.tif 000024
【図１３】
2020514709.tif 000025
【国際調査報告】
2020514709.tif 000026
2020514709.tif 000027
2020514709.tif 000028
2020514709.tif 000029