(57)【要約】本開示は、ポジオチニブまたはアファチニブなどの第３世代チロシンキナーゼ阻害剤を投与することによる、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２のエクソン２０変異（例えば、挿入変異）を有すると判定された患者においてがんを治療する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象においてがんを治療する方法であって、前記対象に有効量のポジオチニブを投与することを含み、前記対象が１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異を有すると判定されている、前記方法。
【請求項２】
前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、ＥＧＦＲ２０挿入変異としてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、アミノ酸７６３〜７７８の間の３〜１８個のヌクレオチドの点変異、挿入、および／または欠失を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記対象が、２、３、または４個のＥＧＦＲエクソン２０変異を有すると判定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、およびＨ７７３からなる群より選択される１つ以上の残基にある、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記対象が、Ｃ７９７残基においてＥＧＦＲ変異を有さないと判定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上のエクソン２０変異が、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨ、およびＮ７７１ｄｕｐＮＰＨからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記エクソン２０変異が、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記対象が、前記患者由来のゲノム試料を分析することにより、ＥＧＦＲエクソン２０変異を有すると判定されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ゲノム試料が、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１１】
ＥＧＦＲエクソン２０変異の存在が、核酸配列決定またはＰＣＲ分析により判定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
さらなる抗がん療法を施すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記さらなる抗がん療法が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、または免疫療法である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポジオチニブおよび／または抗がん療法が、静脈内、皮下、骨内、経口、経皮、持続型放出にて、制御型放出にて、遅延型放出にて、坐剤として、または舌下に、投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポジオチニブを投与することおよび／または抗がん療法を施すことが、局所、局部、または全身投与を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポジオチニブおよび／または抗がん療法が、２回以上投与される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記がんが、口腔がん、口腔咽頭がん、上咽頭がん、呼吸器がん、泌尿生殖器がん、消化器がん、中枢もしくは末梢神経系組織のがん、内分泌もしくは神経内分泌がんまたは造血系のがん、神経膠腫、肉腫、がん腫、リンパ腫、黒色腫、線維腫、髄膜腫、脳がん、口腔咽頭がん、上咽頭がん、腎臓がん、胆道がん、褐色細胞腫、膵島細胞がん、リー・フラウメニ腫瘍、甲状腺がん、副甲状腺がん、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、骨肉腫、多発性神経内分泌腫瘍Ｉ型およびＩＩ型、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記がんが、非小細胞肺がんである、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異を有すると判定された対象において使用するための、ポジオチニブを含む薬学的組成物。
【請求項２１】
前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、ＥＧＦＲ２０挿入変異としてさらに定義される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、アミノ酸７６３〜７７８の間の３〜１８個のヌクレオチドの点変異、挿入、および／または欠失を含む、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２３】
前記対象が、２、３、または４個のＥＧＦＲエクソン２０変異を有すると判定されている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２４】
前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０挿入変異が、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、およびＨ７７３からなる群より選択される１つ以上の残基にある、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記対象が、Ｃ７９７残基においてＥＧＦＲ変異を有さないと判定されている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２６】
前記１つ以上のエクソン２０変異が、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨ、およびＮ７７１ｄｕｐＮＰＨからなる群より選択される、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２７】
前記対象が、抗がん療法によって治療されている、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２８】
がんを有する対象におけるポジオチニブ単独または第２の抗がん療法との組み合わせに対する応答性を予測する方法であって、前記患者から得られたゲノム試料におけるＥＧＦＲエクソン２０変異を検出することを含み、前記試料が前記ＥＧＦＲエクソン２０変異の存在について陽性である場合に、前記患者は前記ポジオチニブ単独または抗がん療法との組み合わせに対して好ましい応答性を有すると予測される、前記方法。
【請求項２９】
前記ＥＧＦＲエクソン２０変異が、エクソン２０挿入変異としてさらに定義される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ゲノム試料が、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＥＧＦＲエクソン２０変異の存在が、核酸配列決定またはＰＣＲ分析により判定される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＥＧＦＲエクソン２０変異が、アミノ酸７６３〜７７８の間の３〜１８個のヌクレオチドの点変異、挿入、および／または欠失を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＥＧＦＲエクソン２０変異が、Ａ７６３、Ｈ７７３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、および／またはＤ７７３残基にある、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＥＧＦＲエクソン２０変異が、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨ、およびＮ７７１ｄｕｐＮＰＨからなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
ポジオチニブ単独または抗がん療法との組み合わせに対する好ましい応答性が、腫瘍の大きさもしくは腫瘍量の減少、腫瘍成長の阻害、腫瘍関連疼痛の軽減、がん関連病態の軽減、がん関連症状の軽減、がんの非進行、無病期間の延長、進行までの期間の延長、寛解の誘導、転移の減少、または患者の生存性の向上を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
好ましい応答性を有すると予測された前記患者にポジオチニブを単独でまたは第２の抗がん療法と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
対象においてがんを治療する方法であって、前記対象に有効量のポジオチニブまたはアファチニブを投与することを含み、前記対象が、Ａ７７５ｉｎｓＶ  Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＣ、およびＰ７８０ｉｎｓＧＳＰからなる群より選択される１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異を有すると判定されている、前記方法。
【請求項３８】
前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、アミノ酸７７０〜７８５の間の３〜１８個のヌクレオチドの１つ以上の点変異、挿入、および／または欠失をさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｓ７７９、および／またはＰ７８０残基にある、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＨＥＲエクソン２０変異が、ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異としてさらに定義される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＨＥＲエクソン２０挿入変異が、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
ｍＴＯＲ阻害剤を投与することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
前記ｍＴＯＲ阻害剤が、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、またはＭＬＮ４９２４である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｍＴＯＲ阻害剤が、エベロリムスである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記ポジオチニブもしくはアファチニブおよび／またはｍＴＯＲ阻害剤が、静脈内、皮下、骨内、経口、経皮、持続型放出にて、制御型放出にて、遅延型放出にて、坐剤として、または舌下に、投与される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記対象が、前記患者由来のゲノム試料を分析することにより、ＨＥＲ２エクソン２０変異を有すると判定されている、請求項３７に記載の方法。
【請求項４７】
前記ゲノム試料が、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
ＨＥＲ２エクソン２０変異の存在が、核酸配列決定またはＰＣＲ分析により判定される、請求項３７に記載の方法。
【請求項４９】
さらなる抗がん療法を施すことをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項５０】
前記さらなる抗がん療法が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、または免疫療法である、請求項３７に記載の方法。
【請求項５１】
前記がんが、口腔がん、口腔咽頭がん、上咽頭がん、呼吸器がん、泌尿生殖器がん、消化器がん、中枢もしくは末梢神経系組織のがん、内分泌もしくは神経内分泌のがんまたは造血系のがん、神経膠腫、肉腫、がん腫、リンパ腫、黒色腫、線維腫、髄膜腫、脳がん、口腔咽頭がん、上咽頭がん、腎臓がん、胆道がん、褐色細胞腫、膵島細胞がん、リー・フラウメニ腫瘍、甲状腺がん、副甲状腺がん、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、骨肉腫、多発性神経内分泌腫瘍Ｉ型およびＩＩ型、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである、請求項３７に記載の方法。
【請求項５２】
前記がんが、非小細胞肺がんである、請求項３７に記載の方法。
【請求項５３】
前記対象が、ヒトである、請求項３７に記載の方法。
【請求項５４】
Ａ７７５ｉｎｓＶ  Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＣ、およびＰ７８０ｉｎｓＧＳＰからなる群より選択される１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異を有すると判定された対象において使用するための、ポジオチニブまたはアファチニブを含む薬学的組成物。
【請求項５５】
前記ＨＥＲ２エクソン２０変異が、ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異としてさらに定義される、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ＨＥＲ２エクソン２０変異が、アミノ酸７７０〜７８５の間の３〜１８個のヌクレオチドの１つ以上の点変異、挿入、および／または欠失をさらに含む、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｓ７７９、および／またはＰ７８０残基にある、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記患者が、抗がん療法によって治療されている、請求項４９に記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
がんを有する対象におけるポジオチニブもしくはアファチニブ単独または抗がん療法との組み合わせに対する応答性を予測する方法であって、前記対象から得られたゲノム試料における、Ａ７７５ｉｎｓＶ  Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＣ、およびＰ７８０ｉｎｓＧＳＰからなる群より選択されるＨＥＲ２エクソン２０変異を検出することを含み、前記試料が前記ＨＥＲ２エクソン２０変異の存在について陽性である場合に、前記患者は前記ポジオチニブもしくはアファチニブ単独または抗がん療法との組み合わせに対して好ましい応答性を有すると予測される、前記方法。
【請求項６０】
前記ＨＥＲ２エクソン２０変異が、ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異としてさらに定義される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記ゲノム試料が、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記ＨＥＲ２エクソン２０変異の存在が、核酸配列決定またはＰＣＲ分析により判定される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記抗がん療法が、ｍＴＯＲ阻害剤である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
ポジオチニブもしくはアファチニブ阻害剤単独または抗がん療法との組み合わせに対する好ましい応答性が、腫瘍の大きさもしくは腫瘍量の減少、腫瘍成長の阻害、腫瘍関連疼痛の軽減、がん関連病態の軽減、がん関連症状の軽減、がんの非進行、無病期間の延長、進行までの期間の延長、寛解の誘導、転移の減少、または患者の生存性の向上を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
好ましい応答性を有すると予測された前記対象にポジオチニブもしくはアファチニブを単独でまたは第２の抗がん療法と組み合わせて投与することをさらに含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６６】
（ａ）ヒトがん細胞から単離された核酸；および
（ｂ）ヒトＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のコード配列のエクソン２０の少なくとも第１の部分を増幅することができるプライマー対
を含む、組成物。
【請求項６７】
前記配列中に変異が存在する場合に前記ヒトＥＧＦＲまたはＨＥＲのコード配列のエクソン２０の前記第１の部分に特異的にハイブリダイズすることができる標識されたプローブ分子をさらに含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６９】
ｄＮＴＰをさらに含む、請求項６６に記載の組成物。
【請求項７０】
Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨ、およびＮ７７１ｄｕｐＮＰＨからなる群より選択される変異が存在する場合に、前記標識されたプローブが、前記ヒトＥＧＦＲコード配列のエクソン２０の前記第１の部分にハイブリダイズする、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７１】
Ａ７７５ｉｎｓＶ  Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＣ、およびＰ７８０ｉｎｓＧＳＰからなる群より選択される変異が存在する場合に、前記標識されたプローブが、前記ヒトＨＥＲ２コード配列のエクソン２０の前記第１の部分にハイブリダイズする、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７２】
変異ＥＧＦＲタンパク質をコードする単離された核酸であって、前記変異タンパク質が、アミノ酸７６３〜７７８の間の３〜１８個のヌクレオチドの点変異、挿入、および／または欠失を含む１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異だけ野生型ヒトＥＧＦＲと異なる、前記単離された核酸。
【請求項７３】
前記１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異が、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、およびＨ７７３からなる群より選択される１つ以上の残基にある、請求項７２に記載の単離された核酸。
【請求項７４】
前記１つ以上のエクソン２０変異が、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨ、およびＮ７７１ｄｕｐＮＰＨからなる群より選択される、請求項７２に記載の単離された核酸。
【請求項７５】
前記核酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、９、１０、１１、または１２の配列を含む、請求項７２に記載の単離された核酸。
【請求項７６】
変異ＨＥＲ２タンパク質をコードする単離された核酸であって、前記変異タンパク質が、アミノ酸７７０〜７８５の間の３〜１８個のヌクレオチドの１つ以上の点変異、挿入、および／または欠失を含む１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異だけ野生型ヒトＨＥＲ２と異なる、前記単離された核酸。
【請求項７７】
前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｓ７７９、および／またはＰ７８０残基にある、請求項７６に記載の単離された核酸。
【請求項７８】
前記１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異が、Ａ７７５ｉｎｓＶ  Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＣ、およびＰ７８０ｉｎｓＧＳＰからなる群より選択される、請求項７６に記載の単離された核酸。
【請求項７９】
前記核酸が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１５、１６、１７、または１８の配列を含む、請求項７６に記載の単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１６年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／４２３，７３２号、２０１６年１１月２９日に出願された米国仮出願第６２／４２７，６９２号、および２０１７年１０月１６日に出願された米国仮出願第６２／５７２，７１６号の優先権を主張するものであり、その各々の全体的内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
「ＵＴＦＣＰ１３０６ＷＯ．ｔｘｔ」という名称のファイル中に収容され、４ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓにより計算された場合）であり、２０１７年１１月１７日に作成された配列表は、本明細書と共に、電子的に提出されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
背景
本発明は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈにより授与された認可番号ＣＡ１９０６２８の下、政府支援の下で行われた。政府は、本発明の一定の権利を有する。
【０００４】
１．本発明の分野
本発明は、全体として分子生物学および医学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２のエクソン２０の変異（例えば、挿入変異）を有する患者を治療する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
２．関連技術の説明
約１０〜１５％のＮＳＣＬＣは、活性化ＥＧＦＲ変異を有する。「古典的な」感受性変異（Ｌ８５８Ｒおよびエクソン１９欠失）を有する腫瘍を有するこれらの患者の大部分について、ゲフィチニブおよびエルロチニブなどのＴＫＩは、劇的な臨床的利益をもたらし、化学療法単独と比較して、その約７０％が、客観的応答（ＯＲ）を経験し、無増悪生存（ＰＦＳ）が改善され、生活の質が改善された（Ｍａｅｍｏｎｄｏら、２０１０）。しかし、約１０〜１２％のＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣ腫瘍は、ＥＧＦＲのエクソン２０内にインフレーム挿入を有し（Ａｒｃｉｌａら、２０１２）、一般的に、ＥＧＦＲ  ＴＫＩに耐性がある。加えて、ＮＳＣＬＣのＨＥＲ２変異の９０％は、エクソン２０変異である（Ｍａｚｉｅｒｅｓら、２０１３）。さらに、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のエクソン２０変異は、ＮＳＣＬＣ患者の約４％を構成する。アファチニブで処置したＨＥＲ２マウスモデルにおいてある前臨床活性が観察されている（Ｐｅｒｅｒａら、２００９）が、これまでのデータは、ＨＥＲ２の利用可能なＴＫＩ（アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、ダコミチニブ）は、ＨＥＲ２変異腫瘍を有する患者において、限定的な活性を有することを示しており、多くの研究では４０％を下回るＯＲ率が報告されている（Ｋｏｓａｋａら、２０１７）。
【０００６】
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のエクソン２０は、２つの主要な領域、ｃヘリックス（ＥＧＦＲの７６２〜７６６番目の残基およびＨＥＲ２の７７０〜７７４番目の残基）およびｃヘリックスの後のループ（ＥＧＦＲの７６７〜７７４番目の残基およびＨＥＲ２の７７５〜７８３番目の残基）を含む。ＥＧＦＲエクソン２０挿入Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧの結晶学は、７６４番目の残基の後の挿入において第一世代ＴＫＩに対する耐性を誘導する、安定化した、かつうね状の活性型立体構造を明らかにした。しかし、ＥＧＦＲ  Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡのモデリングは、７６４番目の残基の前の挿入は、この効果を示さず、薬物耐性を誘導しないことを実証した（Ｙａｓｕｄａら、２０１３）。さらに、挿入がｃヘリックスの後のループ中にある（ＥＧＦＲ  Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ）ＥＧＦＲエクソン２０が引き起こすＮＳＣＬＣの患者に由来する異種移植片（ＰＤＸ）モデルにおいて、第３世代ＥＧＦＲ  ＴＫＩであるオシメルチニブ（ＡＺＤ９２９１）およびロシレチニブ（ＣＯ−１６９６）は、最小限の活性を有することが見出された（Ｙａｎｇら、２０１６）。稀なＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のエクソン２０変異の最近の研究において、著者らは、ダコミチニブおよびアファチニブなどの共有結合性キナゾリン系第２世代阻害剤に対する異種応答を見出した；しかし、より一般的なエクソン２０挿入変異体を標的とするのに必要な濃度は、臨床的に達成可能な濃度を超えていた（Ｋｏｓａｋａら、２０１７）。したがって、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２中にエクソン２０変異（特に、挿入変異）を有するＮＳＣＬＣ腫瘍の先天的な薬物耐性を克服するための新規療法を同定することには、重大な臨床的必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本開示は、エクソン２０挿入変異などのＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２のエクソン２０変異を有する患者においてがんを治療するための方法および組成物を提供する。一実施形態では、対象においてがんを治療する方法であって、該対象に有効量のポジオチニブを投与することを含み、該対象が１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異（例えば、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０挿入変異）を有すると判定されている、方法が提供される。特定の態様では、対象はヒトである。
【０００８】
特定の態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異は、アミノ酸７６３〜７７８の間の３〜１８個のヌクレオチドの１つ以上の点変異、挿入、および／または欠失をさらに含む。いくつかの態様では、対象は、２、３、または４個のＥＧＦＲエクソン２０変異を有すると判定されている。いくつかの態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異は、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、およびＨ７７３からなる群より選択される１つ以上の残基にある。特定の態様では、対象は、Ｃ７９７残基においてＥＧＦＲ変異を有さないと判定されている。いくつかの態様では、１つ以上のエクソン２０変異は、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨ、およびＮ７７１ｄｕｐＮＰＨからなる群より選択される。
【０００９】
特定の態様では、対象は、対象由来のゲノム試料を分析することにより、ＥＧＦＲエクソン２０変異（例えば、挿入変異）を有すると判定されている。いくつかの態様では、ゲノム試料は、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される。特定の態様では、ＥＧＦＲエクソン２０変異の存在は、核酸配列決定（例えば、腫瘍組織または血漿由来循環フリーＤＮＡのＤＮＡ配列決定）またはＰＣＲ分析により判定される。
【００１０】
特定の態様では、本方法は、さらなる抗がん療法を施すことをさらに含む。いくつかの態様では、抗がん療法は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、または免疫療法である。特定の態様では、ポジオチニブおよび／または抗がん療法は、静脈内、皮下、骨内、経口、経皮、持続型放出にて、制御型放出にて、遅延型放出にて、坐剤として、または舌下に、投与される。いくつかの態様では、ポジオチニブを投与することおよび／または抗がん療法を施すことは、局所、局部、または全身投与を含む。特定の態様では、ポジオチニブおよび／または抗がん療法は、２回以上、例えば、毎日、１日おきに、または毎週、投与される。
【００１１】
いくつかの態様では、がんは、口腔がん、口腔咽頭がん、上咽頭がん、呼吸器がん、泌尿生殖器がん、消化器がん、中枢もしくは末梢神経系組織のがん、内分泌もしくは神経内分泌がんまたは造血系のがん、神経膠腫、肉腫、がん腫、リンパ腫、黒色腫、線維腫、髄膜腫、脳がん、口腔咽頭がん、上咽頭がん、腎臓がん、胆道がん、褐色細胞腫、膵島細胞がん、リー・フラウメニ腫瘍、甲状腺がん、副甲状腺がん、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、骨肉腫、多発性神経内分泌腫瘍Ｉ型およびＩＩ型、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである。特定の態様では、がんは、非小細胞肺がんである。
別の実施形態では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異、例えば、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０挿入変異を有すると判定された患者のための、ポジオチニブを含む薬学的組成物が提供される。特定の態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異は、アミノ酸７６３〜７７８の間の３〜１８個のヌクレオチドの点変異、挿入、および／または欠失を含む。特定の態様では、対象は、２、３、または４個のＥＧＦＲエクソン２０変異を有すると判定されている。
いくつかの態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０挿入変異は、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、およびＨ７７３からなる群より選択される１つ以上の残基にある。特定の態様では、対象は、Ｃ７９７残基においてＥＧＦＲ変異を有さないと判定されている。特定の態様では、１つ以上のエクソン２０変異は、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨ、およびＮ７７１ｄｕｐＮＰＨからなる群より選択される。いくつかの態様では、患者は、抗がん療法によって治療されている。
【００１２】
さらなる別の実施形態では、がんを有する対象におけるポジオチニブ単独または抗がん療法との組み合わせに対する応答性を予測する方法であって、患者から得られたゲノム試料におけるＥＧＦＲエクソン２０変異（例えば、ＥＧＦＲエクソン２０挿入変異）を検出することを含み、試料がＥＧＦＲエクソン２０変異の存在について陽性である場合に、患者はポジオチニブ単独または抗がん療法との組み合わせに対して好ましい応答性を有すると予測される、方法が提供される。いくつかの態様では、ゲノム試料は、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される。特定の態様では、ＥＧＦＲエクソン２０変異の存在は、核酸配列決定またはＰＣＲ分析により判定される。特定の態様では、ＥＧＦＲエクソン２０変異は、アミノ酸７６３〜７７８の間の３〜１８個のヌクレオチドの１つ以上の点変異、挿入、および／または欠失をさらに含む。いくつかの態様では、ＥＧＦＲエクソン２０変異は、Ａ７６３、Ｈ７７３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、および／またはＤ７７３残基にある。いくつかの態様では、ＥＧＦＲエクソン２０変異は、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨ、およびＮ７７１ｄｕｐＮＰＨからなる群より選択される。特定の態様では、ポジオチニブ阻害剤単独または抗がん療法との組み合わせに対する好ましい応答性は、腫瘍の大きさもしくは腫瘍量の減少、腫瘍成長の阻害、腫瘍関連疼痛の軽減、がん関連病態の軽減、がん関連症状の軽減、がんの非進行、無病期間の延長、進行までの期間の延長、寛解の誘導、転移の減少、または患者の生存性の向上を含む。さらなる態様では、好ましい応答性を有すると予測された患者は、ポジオチニブを単独でまたは第２の抗がん療法と組み合わせて投与される。
【００１３】
さらなる一実施形態は、患者においてがんを治療する方法であって、有効量のポジオチニブまたはアファチニブを対象に投与することを含み、該対象が、Ａ７７５ｉｎｓＶ  Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＣ、およびＰ７８０ｉｎｓＧＳＰからなる群より選択される１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異を有すると判定されている、方法を提供する。いくつかの態様では、１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、アミノ酸７７０〜７８５の間の３〜１８個のヌクレオチドの１つ以上の点変異、挿入、および／または欠失をさらに含む。いくつかの態様では、１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｓ７７９、および／またはＰ７８０残基にある。特定の態様では、対象はヒトである。
【００１４】
いくつかの態様では、本方法は、ｍＴＯＲ阻害剤の投与をさらに含む。特定の態様では、ｍＴＯＲ阻害剤は、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、またはＭＬＮ４９２４である。特定の態様では、ｍＴＯＲ阻害剤は、エベロリムスである。
【００１５】
特定の態様では、ポジオチニブもしくはアファチニブおよび／またはｍＴＯＲ阻害剤は、静脈内、皮下、骨内、経口、経皮、持続型放出にて、制御型放出にて、遅延型放出にて、坐剤として、または舌下に、投与される。いくつかの態様では、患者は、患者由来のゲノム試料を分析することにより、ＨＥＲ２エクソン２０変異を有すると判定されている。特定の態様では、ゲノム試料は、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される。いくつかの態様では、ＨＥＲ２エクソン２０変異の存在は、核酸配列決定またはＰＣＲ分析により判定される。
【００１６】
さらなる態様では、本方法は、さらなる抗がん療法を施すことをさらに含む。いくつかの態様では、抗がん療法は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法、または免疫療法である。
【００１７】
いくつかの態様では、がんは、口腔がん、口腔咽頭がん、上咽頭がん、呼吸器がん、泌尿生殖器がん、消化器がん、中枢もしくは末梢神経系組織のがん、内分泌もしくは神経内分泌がんまたは造血系のがん、神経膠腫、肉腫、がん腫、リンパ腫、黒色腫、線維腫、髄膜腫、脳がん、口腔咽頭がん、上咽頭がん、腎臓がん、胆道がん、褐色細胞腫、膵島細胞がん、リー・フラウメニ腫瘍、甲状腺がん、副甲状腺がん、下垂体腫瘍、副腎腫瘍、骨肉腫、多発性神経内分泌腫瘍Ｉ型およびＩＩ型、乳がん、肺がん、頭頸部がん、前立腺がん、食道がん、気管がん、肝臓がん、膀胱がん、胃がん、膵臓がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、精巣がん、結腸がん、直腸がん、または皮膚がんである。特定の態様では、がんは、非小細胞肺がんである。
【００１８】
別の実施形態では、Ａ７７５ｉｎｓＶ  Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＣ、およびＰ７８０ｉｎｓＧＳＰからなる群より選択される１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異を有すると判定された患者のための、ポジオチニブまたはアファチニブを含む薬学的組成物が提供される。いくつかの態様では、ＨＥＲ２エクソン２０変異は、アミノ酸７７０〜７８５の間の３〜１８個のヌクレオチドの１つ以上の点変異、挿入、および／または欠失をさらに含む。いくつかの態様では、ＨＥＲ２エクソン２０変異は、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｓ７７９、および／またはＰ７８０残基にある。いくつかの態様では、患者は、抗がん療法によって治療されている。
【００１９】
さらなる別の実施形態では、がんを有する患者におけるポジオチニブもしくはアファチニブ単独または抗がん療法との組み合わせに対する応答性を予測する方法であって、患者から得られたゲノム試料におけるＡ７７５ｉｎｓＶ  Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＣ、およびＰ７８０ｉｎｓＧＳＰからなる群より選択されるＨＥＲ２エクソン２０変異（例えば、ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異）を検出することを含み、試料がＨＥＲ２エクソン２０変異の存在について陽性である場合に、患者はポジオチニブもしくはアファチニブ単独または抗がん療法との組み合わせに対して好ましい応答性を有すると予測される、方法が提供される。いくつかの態様では、ＨＥＲ２エクソン２０変異は、アミノ酸７７０〜７８５の間の３〜１８個のヌクレオチドの１つ以上の点変異、挿入、および／または欠失をさらに含む。特定の態様では、ＨＥＲ２エクソン２０変異は、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｓ７７９、および／またはＰ７８０残基にある。
【００２０】
いくつかの態様では、ゲノム試料は、唾液、血液、尿、正常組織、または腫瘍組織から単離される。特定の態様では、ＨＥＲ２エクソン２０変異の存在は、核酸配列決定またはＰＣＲ分析により判定される。特定の態様では、抗がん療法は、ｍＴＯＲ阻害剤である。いくつかの態様では、ポジオチニブもしくはアファチニブ阻害剤単独または抗がん療法との組み合わせに対する好ましい応答性は、腫瘍の大きさもしくは腫瘍量の減少、腫瘍成長の阻害、腫瘍関連疼痛の軽減、がん関連病態の軽減、がん関連症状の軽減、がんの非進行、無病期間の延長、進行までの期間の延長、寛解の誘導、転移の減少、または患者の生存性の向上を含む。さらなる態様では、好ましい応答性を有すると予測された患者は、ポジオチニブを単独でまたは第２の抗がん療法と組み合わせて投与される。
【００２１】
本明細書では、ヒトがん細胞から単離された核酸と、ヒトＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のコード配列のエクソン２０の少なくとも第１の部分を増幅することができるプライマー対と、を含む組成物も提供される。いくつかの態様では、組成物は、配列中に変異が存在する場合にヒトＥＧＦＲまたはＨＥＲのコード配列のエクソン２０の第１の部分に特異的にハイブリダイズすることができる標識されたプローブ分子をさらに含む。特定の態様では、組成物は、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む。いくつかの態様では、組成物はｄＮＴＰをさらに含む。いくつかの態様では、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨ、およびＮ７７１ｄｕｐＮＰＨからなる群より選択される変異が存在する場合、標識されたプローブは、ヒトＥＧＦＲコード配列のエクソン２０の第１の部分にハイブリダイズする。特定の態様では、Ａ７７５ｉｎｓＶ  Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＣ、およびＰ７８０ｉｎｓＧＳＰからなる群より選択される変異が存在する場合、標識されたプローブは、ヒトＨＥＲ２コード配列のエクソン２０の第１の部分にハイブリダイズする。
【００２２】
別の実施形態では、変異ＥＧＦＲタンパク質をコードする単離された核酸であって、該変異タンパク質が、アミノ酸７６３〜７７８の３〜１８個のヌクレオチドの点変異、挿入、および／または欠失を含む１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異だけ野生型ヒトＥＧＦＲと異なる、単離された核酸が提供される。いくつかの態様では、１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異は、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、およびＨ７７３からなる群より選択される１つ以上の残基にある。特定の態様では、１つ以上のエクソン２０変異は、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨ、およびＮ７７１ｄｕｐＮＰＨからなる群より選択される。特定の態様では、核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８、９、１０、１１、または１２の配列を含む。
【００２３】
さらなる別の実施形態では、変異ＨＥＲ２タンパク質をコードする単離された核酸であって、その変異タンパク質が、アミノ酸７７０〜７８５の間の３〜１８個のヌクレオチドの１つ以上の点変異、挿入、および／または欠失を含む１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異だけ野生型ヒトＨＥＲ２と異なる、単離された核酸が提供される。いくつかの態様では、１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｓ７７９、および／またはＰ７８０残基にある。特定の態様では、１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、Ａ７７５ｉｎｓＶ  Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＣ、およびＰ７８０ｉｎｓＧＳＰからなる群より選択される。特定の態様では、核酸は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４、１５、１６、１７、または１８の配列を含む。
【００２４】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるだろう。しかし、本明細書の詳細な説明から、本発明の精神および範囲内での様々な変更および修飾が当業者には明らかとなるので、詳細な説明および特定の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すものではあるが、例示のみを目的としていることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
以下の図は、本明細書の一部を形成するものであり、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、本明細書において提示される特定の実施形態の詳細な記載と組み合わせて、これらの図の１つ以上を参照することにより、さらに理解され得る。
【００２６】
【図１】図１Ａ〜１Ｊ：エクソン２０挿入変異は、共有結合性および非共有結合性のＴＫＩに対して新たな耐性を誘導する。（図１Ａ）古典的変異およびエクソン２０ＥＧＦＲ変異を有する患者の無増悪生存（ＰＦＳ）は、第一選択療法に対して耐性を示す。エクソン２０挿入を有する患者の生存率（％）はより低かった。（図１Ｂ）安定なＢａ／Ｆ３モデルにおいて作製されたＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入変異のスキーム。第１、第２、および第３世代ＴＫＩを用いて７２時間処置された、ＥＧＦＲ（図１Ｃ〜Ｅ）およびＨＥＲ２（図１Ｆ〜Ｈ）のエクソン２０挿入変異体を発現するＢａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。（図１Ｃ〜Ｈ）６個の細胞株の平均値±ＳＥＭを各濃度についてプロットしている（ｎ＝３）。（図１Ｉ）ＥＧＦＲ  Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧおよびＴ７９０Ｍの３Ｄモデリング。Ｐループおよびα−ｃヘリックスの結合ポケット内へのシフトは、立体障害を引き起こし、ＡＺＤ９２９１を結合ポケットから押し出す。（図１Ｊ）ＨＥＲ２  Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡおよびＷＴの３Ｄモデリング。Ｐループおよびα−ｃヘリックスの結合ポケット内への全体的なシフトは、結合ポケットのサイズの全体的な減少をもたらす。
【図２】図２Ａ〜２Ｇ：ポジオチニブは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入変異体を強力に阻害する。ポジオチニブを用いて７２時間処置された、ＥＧＦＲ（図２Ａ）およびＨＥＲ２（図２Ｂ）エクソン２０挿入変異体を発現するＢａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。個々の細胞株それぞれの平均値±ＳＥＭを各濃度についてプロットしている（ｎ＝３）。（図２Ｃ）ポジオチニブ処置の２時間後のＢａ／Ｆ３細胞株におけるｐ−ＥＧＦＲおよびｐ−ＨＥＲ２の阻害がウェスタンブロッティングによって確認される（ｎ＝２）。（図２Ｄ）Ｂａ／Ｆ３  ＥＧＦＲエクソン２０挿入位置とアミノ酸位置との相関性（ｎ＝２）。Ｐｅａｒｓｏｎ相関性およびｐ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを用いて決定した。ポジオチニブまたはアファチニブを用いて７２時間処置した（ｎ＝３）、ＥＧＦＲ  Ａ７６７ｄｕｐＡＳＶを発現する患者由来細胞株ＣＵＴＯ１４（図２Ｅ）およびＥＧＦＲ  Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨを発現するＹＵＬ００１９（図２Ｆ）の細胞生存率の用量反応曲線。（図２Ｇ）アファチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、またはポジオチニブを用いて７２時間インキュベーションした後の、Ｂａ／Ｆ３  ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ細胞株のＩＣ５０値に対して正規化したＥＧＦＲ変異Ｂａ／Ｆ３細胞のＩＣ５０値（ｎ＝３）。バーは、代表的な平均値±ＳＥＭである。１より大きい値は、Ｔ７９０Ｍと比較して強力ではない阻害の指標であり、一方、１未満の値は、Ｔ７９０Ｍと比較して強力な、エクソン２０挿入体の阻害の指標である。
【図３】図３Ａ〜３Ｈ：ポジオチニブは、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入変異マウスモデルにおいて、腫瘍量を減少させる。ＥＧＦＲ  Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ（図３Ａ）またはＨＥＲ２  Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ（図３Ｂ）マウスを毎日、ビヒクル（ＥＧＦＲ  ｎ＝５およびＨＥＲ２  ｎ＝４）、２０ｍｇ／ｋｇのアファチニブ（ＥＧＦＲ  ｎ＝４）、または１０ｍｇ／ｋｇのポジオチニブ（ＥＧＦＲ  ｎ＝５およびＨＥＲ２  ｎ＝６）を用いて４週間処置した。ＭＲＩにより測定される腫瘍体積変化のＷａｔｅｒｆａｌｌプロットは、ＥＧＦＲ  ＧＥＭＭおよびＨＥＲ２  ＧＥＭＭにおける４週間のポジオチニブによる、それぞれ８５％および６０％の腫瘍阻害を示す。（図３Ａ〜Ｂ）両側ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を用いて、ｐ値を計算した。ポジオチニブ処置の前および処置の４週間後の、ＥＧＦＲ  ＧＥＭＭ（図３Ｃ）およびＨＥＲ２  ＧＥＭＭ（図３Ｄ）の代表的なＭＲＩイメージは、頑強な腫瘍退縮を示す。１０ｍｇ／ｋｇのポジオチニブを用いて１２週間にわたって１週間に５日間処置された、ＥＧＦＲ  Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ（図３Ｅ）（ｎ＝４）およびＨＥＲ２  Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ（図３Ｆ）（ｎ＝６）の腫瘍体積のプロットは、マウスがポジオチニブ治療に対して継続的に応答することを示す。（図３Ｇ）アファチニブまたはポジオチニブで処置されたＹＵＬ−００１９（ＥＧＦＲ  Ｎ７７１ｄｅｌｉｎｓＦＨ）細胞。１０ｍｇ／ｋｇのポジオチニブで処置された細胞は、最も少ない腫瘍体積を有し、５ｍｇ／ｋｇのものは、２番目に少ない腫瘍体積を有した。（図３Ｈ）ＥＧＦＲ  Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ  ＰＤＸマウスは、ビヒクル対照（ｎ＝６）、５ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝６）または１０ｍｇ／ｋｇ（ｎ＝３）のポジオチニブを用いて処置された。ポジオチニブを用いて処置されたマウスは、腫瘍体積が減少した。Ｗａｔｅｒｆａｌｌプロットは、全てのポジオチニブ処置マウスにおいて腫瘍量が８５％を上回って減少したこと、９匹のポジオチニブ処置マウスのうちの８匹において、異種移植片が残留塊まで完全に減少したこと、を示す。一元ＡＮＯＶＡ分析をＴｕｋｅｙ試験と組み合わせて用いて、統計的有意性、＊＊＊、ｐ＜０．０００１を決定した。
【図４】図４Ａ〜４Ｃ：ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入変異は、活性化変異である。（図４Ａ）ＥＧＦＲエクソン２０挿入を有する個々の患者のＷａｔｅｒｆａｌｌプロットは、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはアファチニブに対する新たな耐性を示す。患者の変異は、各代表的バーの下に記載されている。（図４Ｂ）ＥＧＦＲエクソン２０挿入変異体を発現する安定なＢａ／Ｆ３細胞株は、Ｂａ／Ｆ３空ベクター発現細胞またはＥＧＦＲ  ＷＴ発現Ｂａ／Ｆ３細胞とは異なり、ＩＬ−３非依存条件において生存可能であり、これは、ＥＧＦＲエクソン２０挿入が活性化変異であることを示している。（図４Ｃ）異なるＨＥＲ２変異を発現する１１種の安定なＢａ／Ｆ３細胞株のＩＬ−３非依存的な増殖は、ＨＥＲ２活性化変異の大多数がＨＥＲ２のエクソン２０内にあることを示している。Ｌ７５５Ｐは例外であるが、全ての活性化変異は、ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異であった。（図４Ｂ〜Ｃ）細胞生存率を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイにより測定した。平均値±ＳＥＭを、各細胞株についてプロットした（ｎ＝３）。
【図５】第１、第２、および第３世代ＴＫＩを用いて７２時間処置された、ＥＧＦＲエクソン２０挿入変異体を発現するＢａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。平均値±ＳＥＭを、各濃度についてプロットした（ｎ＝３）。
【図６】第１、第２、および第３世代ＴＫＩを用いて７２時間処置された、ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異体を発現する個々のＢａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。平均値±ＳＥＭを、各濃度についてプロットした（ｎ＝３）。
【図７】図７Ａ〜７Ｄ：Ａ７６３残基より後ろにおけるＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入変異は、第１および第３世代ＴＫＩに対して耐性がある。ＥＧＦＲエクソン２０挿入体を有するＢａ／Ｆ３細胞を、１時間血清飢餓状態とし、次いで、表示されている用量の（図７Ａ）エルロチニブまたは（図７Ｃ）オシメルチニブを用いて２時間処置した（Ｎ＝２）。（図７Ｂ）エルロチニブ処置および（図７Ｄ）オシメルチニブ処置後のｐ−ＥＧＦＲおよびｐ−ＨＥＲ２レベルを、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて定量化した。値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにてプロットし、バーは、代表的な平均値±ＳＥＭである。（Ｎ＝２）ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）またはｐ＜０．００１（＊＊＊）。
【図８】図８Ａ〜８Ｅ：ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入変異体は、インビトロでポジオチニブに感受性がある。（図８Ａ）表示されているＢａ／Ｆ３細胞株におけるポジオチニブ処置の２時間後のｐ−ＥＧＦＲおよびｐ−ＨＥＲ２のウェスタンブロットを、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを用いて定量化した。値は、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍにてプロットし、バーは、代表的な平均値±ＳＥＭである。（Ｎ＝２）（図８Ｂ）表示されている用量のアファチニブまたはポジオチニブの３時間後のＣＵＴＯ−１４患者由来細胞株のウェスタンブロット（Ｎ＝３）。（図８Ｃ）ＣＵＴＯ−１４細胞株における、表示されている用量のアファチニブまたはポジオチニブの３時間後のウェスタンブロットからのｐ−ＥＧＦＲの定量化。ポジオチニブ処置は、ｐ−ＥＧＦＲの減少をもたらした。（図８Ｄ）Ｂａ／Ｆ３細胞株のＩＣ５０値対相対的発現の線形回帰プロットは、発現とポジオチニブに対する感受性との間には相関性がないことを実証した（ｎ＝２）。（図８Ｅ）ＩＣ５０値対ＨＥＲ２受容体内の変異位置の線形回帰プロットは、ＨＥＲ２変異Ｂａ／Ｆ３細胞株において位置とポジオチニブに対する感受性との間には相関性がないことを実証した（ｎ＝２）。Ｐｅａｒｓｏｎ相関性およびｐ値を、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍを用いて計算した。ｐ＜０．０５（＊）、ｐ＜０．０１（＊＊）またはｐ＜０．００１（＊＊＊）。
【図９】Ｃ７９７ＳおよびＥＭＴは、インビトロでのポジオチニブ耐性の２つの異なる機序である。ポジオチニブを用いて７２時間処置したＥＧＦＲ変異Ｂａ／Ｆ３細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。平均値±ＳＥＭを、各濃度についてプロットした（ｎ＝３）。
【図１０】表示されているＴＫＩで処置したＭＣＦ１０Ａ  ＨＥＲ２  Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＣ細胞株の細胞生存率の用量反応曲線。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
例示的な実施形態の説明
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）変異非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）の活性化変異の大多数は、利用可能なＥＧＦＲチロシンキナーゼ阻害剤（ＴＫＩ）に感受性があるが、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のエクソン２０に変化を有するサブセットは、本質的に耐性がある。本研究は、これらのエクソン２０変異により誘導される構造変化をモデル化して、効果的な阻害剤を同定するために、インシリコ、インビトロ、およびインビボ試験を利用した。３Ｄモデリングは、薬物結合ポケットの大きさを制限する（それにより、大きく柔軟性のない阻害剤の結合を強いる）有意な変化を明らかにした。ポジオチニブは、その小さなサイズおよび柔軟性により、これらの立体変化を回避することができ、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２エクソン２０変異タンパク質の強力かつ相対的に選択的な阻害剤であることが見出された。ポジオチニブはまた、変異エクソン２０ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２  ＮＳＣＬＣ患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルおよび遺伝子操作されたマウスモデルにおいて強力な活性を有する。故に、これらのデータは、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２エクソン２０変異体の強力で臨床的に活性のある阻害剤としてポジオチニブを同定し、これらの挿入により誘導された立体変化を回避し得るキナーゼ阻害剤の分子的特徴を解明する。
【００２８】
したがって、本開示の特定の実施形態は、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２のエクソン２０変異（例えば、エクソン２０挿入）を有するがん患者を治療するための方法を提供する。特に、本方法は、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲエクソン２０挿入変異を有することが同定された患者へのポジオチニブ（ＨＭ７８１−３６Ｂとしても知られている）またはアファチニブの投与を含む。ポジオチニブの大きさおよび柔軟性は、立体障害を克服し、低いナノモル濃度でＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０変異体を阻害する。故に、ポジオチニブまたはアファチニブおよび構造的に同様の阻害剤は、不可逆的第２世代および第３世代ＴＫＩに耐性のあるＥＦＧＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入体を標的とするために使用することのできる、強力なＥＧＦＲまたはＨＥＲ２阻害剤である。
【００２９】
Ｉ．定義
本明細書において用いられるとき、「ａ」または「ａｎ」は、１つまたは複数を含み得る。本明細書の請求項において用いられるとき、「含む」という語と併せて使用されるとき、「ａ」または「ａｎ」という語は、１つまたは複数を意味し得る。
【００３０】
本開示は代替物のみならびに「および／または」を指す定義を支持しているが、代替物のみを指すかまたは代替物が相互に排他的であると明確に示されていない限り、特許請求の範囲における用語「または」の使用は「および／または」を意味するために使用される。本明細書において用いられるとき、「別の」は、少なくとも第２のもの、またはそれ以上のものを意味し得る。
【００３１】
本明細書を通して、用語「約」は、値を測定するために使用されるデバイス、方法についての誤差の固有の変動量、または研究の対象間に存在する変動量を含む値を示すために使用される。
【００３２】
「治療」または「治療する」は、（１）疾患の病態もしくは総体症状を経験するもしくは示す対象もしくは患者において疾患を阻害すること（例えば、病態および／または総体症状のさらなる進行を阻止すること）、（２）疾患の病態もしくは総体症状を経験するもしくは示す対象もしくは患者において疾患を改善すること（例えば、病態および／または総体症状を後退させること）、および／または（３）疾患の病態もしくは総体症状を経験するもしくは示す対象もしくは患者において任意の測定可能な疾患の減少に作用すること、を含む。例えば、治療は、有効量のポジオチニブまたはアファチニブの投与を含むことができる。
【００３３】
「予防」または「予防する」は、（１）疾患の危険性を有するか、および／または疾患に罹りやすい可能性があるが、まだ疾患の病態もしくは総体症状のいずれかもしくは全てを経験していないもしくは示していない対象もしくは患者において疾患の開始を阻害すること、および／または（２）疾患の危険性を有するか、および／または疾患に罹りやすい可能性があるが、まだ疾患の病態もしくは総体症状のいずれかもしくは全てを経験していないもしくは示していない対象もしくは患者において、疾患の病態もしくは総体症状の開始を遅らせること、を含む。
【００３４】
本明細書において用いられるとき、用語「患者」または「対象」は、生存している哺乳類生物、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、またはそれらの遺伝子組み換え種を指す。特定の実施形態では、患者または対象は、霊長類である。ヒト患者の非限定的な例は、成人、未成年、幼児、および胎児である。
【００３５】
用語「有効な」は、この用語が本明細書および／または請求項で使用されるとき、所望の、期待された、または意図された結果を達成するために十分であることを意味する。化合物を用いて患者もしくは対象を治療するという文脈において使用されるとき、「有効量」、「治療有効量」、または「薬学的有効量」は、化合物の量が、疾患を治療もしくは予防するために対象もしくは患者に投与されたときに、疾患のかかる治療もしくは予防に作用するのに十分な量であることを意味する。
【００３６】
本明細書において用いられるとき、用語「ＩＣ５０」は、得られた最大応答の５０％である、阻害的用量を指す。この定量的測定は、特定の生物学的、生化学的、もしくは化学的プロセス（またはプロセスの構成要素、すなわち、酵素、細胞、細胞受容体、もしくは微生物）を半分阻害するのにどの程度の量の特定の薬物、または他の物質（阻害剤）が必要であるかを示す。
【００３７】
「抗がん」剤は、例えば、がん細胞の殺傷を促進し、がん細胞のアポトーシスを誘導し、がん細胞の増殖速度を低減し、転移の発生率もしくは数を低減し、腫瘍の大きさを縮小し、腫瘍の成長を阻害し、腫瘍もしくはがん細胞への血液供給を削減し、がん細胞もしくは腫瘍に対する免疫応答を促進し、がんの進行を予防もしくは阻害し、またはがんを有する対象の生存期間を延長することにより、対象におけるがん細胞／腫瘍に負の影響を与えることができる。
【００３８】
用語「挿入」または「挿入変異」は、１つ以上のヌクレオチド塩基対のＤＮＡ配列中への付加を指す。例えば、ＥＧＦＲのエクソン２０の挿入変異は、アミノ酸７６７〜７７４の間に、約２〜２１塩基対で存在し得る。別の例において、ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異は、アミノ酸７７０〜７８５の間の３〜１８個のヌクレオチドの１つ以上の挿入を含む。例示的なＥＧＦＲおよびＨＥＲエクソン２０挿入変異は、本開示の図１に示される。
【００３９】
「ハイブリダイズする」または「ハイブリダイゼーション」は、核酸の間の結合を指す。ハイブリダイゼーションのための条件は、結合される核酸の配列相同性に応じて様々であり得る。故に、対象の核酸の間の配列相同性が高い場合、ストリンジェント条件が用いられる。配列相同性が低い場合、中程度の条件が用いられる。ハイブリダイゼーション条件がストリンジェントである場合、ハイブリダイゼーション特異性は増大し、ハイブリダイゼーション特異性のこの増大は、非特異的ハイブリダイゼーション産物の産生を減少させる。しかし、中程度のハイブリダイゼーション条件下では、ハイブリダイゼーション特異性は低下し、ハイブリダイゼーション特異性におけるこの低下は、非特異的ハイブリダイゼーション産物の産生を増大させる。
【００４０】
「プローブ」は、少なくとも８個のヌクレオチドの長さであり、かつプローブ中の少なくとも１つの配列と標的領域中の配列との相補性のために標的配列と共にハイブリッド構造を形成するポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡで構成され得る。プローブは、特定の実施形態では、検出可能に標識される。プローブの大きさは有意に異なり得る。一般的に、プローブは、例えば、少なくとも８〜１５個のヌクレオチドの長さである。他のプローブは、例えば、少なくとも２０、３０、または４０個のヌクレオチドの長さである。さらなる他のプローブは、幾分かより長く、少なくとも、例えば、５０、６０、７０、８０、または９０個のヌクレオチドの長さである。プローブはまた、前記範囲内に含まれる任意の長さであり得る。好ましくは、プローブは、ポリメラーゼ連鎖反応中に標的配列のためのプライムとして使用される配列に相補的な配列を含まない。
【００４１】
「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、非修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡまたは修飾ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る、一本鎖または二本鎖デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのポリマーを指す。
【００４２】
「修飾リボヌクレオチド」またはデオキシリボヌクレオチドは、核酸において天然塩基の代わりに使用することができる分子を指し、修飾プリンおよびピリミジン、マイナー塩基、コンバーチブルヌクレオシド、プリンおよびピリミジンの構造的アナログ、標識された、誘導体化された、および修飾されたヌクレオシドおよびヌクレオチド、コンジュゲートされたヌクレオシドおよびヌクレオチド、配列修飾、末端修飾、スペーサー修飾、ならびにリボース修飾ヌクレオチド、ホスフォラミダート、ホスホロチオエート、ホスフォナミジト、メチルホスフォナート、メチルホスフォラミジト、メチルホスフォナミジト、５′−β−シアノエチルホスフォラミジト、メチレンホスフォナート、ホスフォロジチオエート、ペプチド核酸、光学不活性および中性ヌクレオチド間結合を含むがこれに限定されない、骨格修飾されたヌクレオチド、を含むが、これらに限定されない。
【００４３】
「バリアント」は、１つ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の交換、欠失、または挿入によりそれぞれの個々の集団における野生型または最も普及している形態とは異なるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。変更、欠失または挿入されるヌクレオチドまたはアミノ酸の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個、またはそれ以上、例えば、２５、３０、３５、４０、４５、または５０個であり得る。
【００４４】
「プライマー」または「プライマー配列」は、核酸合成反応を助長するために標的核酸配列（例えば、増幅されるべきＤＮＡ鋳型）にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、ＤＮＡオリゴヌクレオチド、ＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはキメラ配列であり得る。プライマーは、天然、合成、または修飾ヌクレオチドを含み得る。プライマーの長さの上限および下限は共に、経験的に決定される。プライマーの長さの下限は、ハイブリダイゼーション時に核酸増幅反応条件下で標的核酸と共に安定な二本鎖を形成するのに必要とされる最低限の長さである。非常に短いプライマー（通常、３〜４個未満のヌクレオチドの長さ）は、かかるハイブリダイゼーション条件下で、熱力学的に安定な二本鎖を標的核酸と共に形成しない。上限は、多くの場合、標的核酸中の予め決定された核酸配列以外の領域において二本鎖形成を有する可能性により決定される。一般的に、好適なプライマーの長さは、約１０〜約４０個のヌクレオチドの長さの範囲である。特定の実施形態では、例えば、プライマーは、１０〜４０、１５〜３０、または１０〜２０個のヌクレオチドの長さであり得る。プライマーは、適切な条件下に置かれたときに、ポリヌクレオチド配列上の合成開始点として作用することができる。
【００４５】
「検出」、「検出可能な」、およびそれらの文法的等価物は、標的核酸配列の存在、および／または量、および／または相同性を決定する方法を指す。いくつかの実施形態では、検出は、標的核酸配列の増幅を生じる。他の実施形態では、標的核酸の配列決定は、標的核酸を「検出する」ことを特徴とすることができる。プローブに結合した標識は、例えば、化学的もしくは物理的手段により検出可能である、当技術分野において周知である多種多様な標識の任意のものを含み得る。プローブに結合させることが可能である標識は、例えば、蛍光および発光材料を含む。
【００４６】
「増幅する」、「増幅」、およびそれらの文法的等価物は、直線的もしくは指数関数的のいずれかで核酸配列を増幅するための広範な技法を含むがこれらに限定されない、鋳型依存的な様式で標的核酸配列の少なくとも一部を複製する任意の方法を指す。増幅工程を実施するための例示的な手段は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、リガーゼ検出反応（ＬＤＲ）、Ｑ−レプリカーゼ増幅が後に続くライゲーション、ＰＣＲ、プライマー伸長、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、ハイパーブランチ鎖置換増幅、複数置換増幅（ＭＤＡ）、核酸鎖に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、２工程多重増幅、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、リコンビナーゼ−ポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）（ＴｗｉｓｔＤｘ、Ｃａｍｂｒｉｄｇ、ＵＫ）、および自立配列複製（３ＳＲ）、ならびにそれらの多重バージョンまたは組み合わせ、例えば、ＯＬＡ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＯＬＡ、ＬＤＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＰＣＲ／ＬＤＲ、ＬＣＲ／ＰＣＲ、ＰＣＲ／ＬＣＲ（複合連鎖反応−ＣＣＲとしても知られる）を含むがこれらに限定されないもの、などを含む。かかる技法の説明は、他の場所、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）において見出され得る。
【００４７】
「ＥＧＦＲ」または「上皮増殖因子受容体」または「ＥＧＦＲ」は、チロシンキナーゼ細胞表面受容体を指し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＭ＿００５２２８．３、ＮＭ＿２０１２８２．１、ＮＭ＿２０１２８３．１、およびＮＭ＿２０１２８４．１として表示される４つの代替的な転写物のうちの１つによりコードされる。ＥＧＦＲのバリアントは、エクソン２０に挿入を含む。
【００４８】
「ＨＥＲ２」または「ＥＲＢＢ２」は、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢファミリーのメンバーであり、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＭ＿００４４４８．２として表示される。ＨＥＲ２のバリアントは、エクソン２０に挿入を含む。
【００４９】
一般的に本明細書にて使用されるとき、「薬学的に許容される」は、合理的な利益／リスクの比率を伴い、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴うことのない、健全な医学的判断の範疇において、ヒトおよび動物の組織、器官、および／または体液と接触させて使用するのに好適な化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指す。
【００５０】
「薬学的に許容される塩」は、上記のような薬学的に許容され、所望の薬理活性を有する、本発明の化合物の塩を意味する。かかる塩の非限定的な例は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、およびリン酸などの無機酸を用いて形成された酸付加塩；または１，２−エタンジスルホン酸、２−ヒドロキシエタンスルホン酸、２−ナフタレンスルホン酸、３−フェニルプロピオン酸、４，４′−メチレンビス（３−ヒドロキシ−２−エン−１−カルボン酸）、４−メチルビシクロ［２．２．２］オクタ−２−エン−１−カルボン酸、酢酸、脂肪族モノ−およびジカルボン酸、脂肪族硫酸、芳香族硫酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファ−スルホン酸、炭酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクロペンタンプロピオン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコヘプトン酸、グルコン酸、グルタミン酸、グリコール酸、ヘプタン酸、ヘキサン酸、ヒドロキシナフトエ酸、乳酸、ラウリル硫酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムコン酸、ｏ−（４−ヒドロキシベンゾイル）安息香酸、シュウ酸、ｐ−クロロベンゼンスルホン酸、フェニル−置換アルカン酸、プロピオン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、ピルビン酸、サリチル酸、ステアリン酸、コハク酸、酒石酸、第３級ブチル酢酸、およびトリメチル酢酸などの有機酸を用いて形成された酸付加塩を含む。薬学的に許容される塩は、存在する酸性プロトンが無機または有機塩基と反応可能である場合に形成され得る塩基付加塩も含む。許容される無機塩基は、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アルミニウム、および水酸化カルシウムを含む。許容される有機塩基の非限定的な例は、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、およびＮ−メチルグルカミンを含む。本発明の任意の塩の一部を形成する特定のアニオンまたはカチオンは、その塩が全体として薬理学的に許容される限りは、危険ではない、ということが認識されるべきである。薬学的に許容される塩ならびにそれらの調製および使用方法のさらなる例は、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ｕｓｅ（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ＆Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ  ｅｄｓ．、Ｖｅｒｌａｇ  Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ、２００２）において提供される。
【００５１】
ＩＩ．ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のエクソン２０変異
本開示の特定の実施形態は、対象が１つ以上のＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２のエクソン２０変異、例えば、挿入変異、特に、図１に示されるような１つ以上の挿入変異を有するかどうかを判定することに関する。対象は、２、３、４個、またはそれ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異および／またはＨＥＲ２エクソン２０変異を有し得る。変異検出方法は、当技術分野において知られており、ＰＣＲ分析および核酸配列決定、ならびにＦＩＳＨおよびＣＧＨを含む。特定の態様では、エクソン２０変異は、例えば、腫瘍または血漿由来循環フリーＤＮＡのＤＮＡ配列決定により検出される。
【００５２】
ＥＧＦＲエクソン２０変異には、アミノ酸７６３〜７７８の間の３〜１８個のヌクレオチドの１つ以上の点変異、挿入、および／または欠失が含まれ得る。１つ以上のＥＧＦＲエクソン２０変異は、Ａ７６３、Ａ７６７、Ｓ７６８、Ｖ７６９、Ｄ７７０、Ｎ７７１、Ｐ７７２、およびＨ７７３からなる群より選択される１つ以上の残基に位置することができる。
【００５３】
ＥＧＦＲエクソン２０挿入には、Ｈ７７３＿Ｖ７７４ｉｎｓＨ、Ａ７６７＿ｖ７６９ＡＳＶ、Ｎ７７１＿Ｐ７７２ｉｎｓＨ、Ｄ７７０＿Ｎ７７１ｉｎｓＧ、Ｈ７７９＿Ｖ７７４ｉｎｓＨ、Ｎ７７１ｄｅｌｉｎｓＨＨ、Ｓ７６８＿Ｄ７７０ｄｕｐＤＶＤ、Ａ７６７＿Ｖ７６９ｄｕｐＡＳＶ、Ａ７６７＿Ｖ７６９ｄｕｐＡＳＶ、Ｐ７７２＿Ｈ７７３ｄｕｐ、Ｎ７７１＿Ｈ７７３ｄｕｐＮＰＨ、Ｓ７６８＿Ｄ７７０ｄｕｐＳＶＤ、Ｎ７７１ｄｅｌｉｎｓＧＹ、Ｓ７６８＿Ｄ７７０ｄｅｌｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０＿Ｄ７７０ｄｅｌｉｎｓＧＹ、Ａ７６７＿Ｖ７６９ｄｕｐＡＳＶ、および／またはＨ７７３ｄｕｐが含まれ得る。特定の態様では、エクソン２０変異は、Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡ、Ａ７６７ｉｎｓＡＳＶ、Ｓ７６８ｄｕｐＳＶＤ、Ｖ７６９ｉｎｓＡＳＶ、Ｄ７７０ｉｎｓＳＶＤ、Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ、Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＧＹ、Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨ、およびＮ７７１ｄｕｐＮＰＨである。
【００５４】
いくつかの態様では、対象は、ポジオチニブなどのＴＫＩに対する耐性をもたらし得るＥＧＦＲ  Ｃ７９７残基における変異を有するか、または発症し得る。故に、特定の態様では、対象は、ＥＧＦＲ  Ｃ７９７残基において変異を有さないと判定されている。
【００５５】
ＨＥＲ２エクソン２０変異には、アミノ酸７７０〜７８５の間の３〜１８個のヌクレオチドの１つ以上の点変異、挿入、および／または欠失が含まれ得る。１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、Ａ７７５、Ｇ７７６、Ｓ７７９、および／またはＰ７８０残基にあり得る。１つ以上のＨＥＲ２エクソン２０変異は、Ａ７７５ｉｎｓＶ  Ｇ７７６Ｃ、Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ、Ｇ７７６Ｖ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＶ、Ｇ７７６Ｃ  Ｖ７７７ｉｎｓＣ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＶ、Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＣ、および／またはＰ７８０ｉｎｓＧＳＰであり得る。
【００５６】
患者試料は、対象における肺がんに由来する核酸を含む、任意の体の組織または液体であり得る。特定の実施形態では、試料は、循環腫瘍細胞または細胞フリーＤＮＡを含む血液試料である。他の実施形態では、試料は、組織、例えば、肺組織であり得る。肺組織は、腫瘍組織に由来することができ、新鮮凍結、またはホルマリン固定、パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）されてもよい。特定の実施形態では、肺腫瘍ＦＦＰＥ試料が得られる。
【００５７】
本明細書において記載される方法における使用に好適な試料には、遺伝子材料、例えば、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）が含まれる。ゲノムＤＮＡは典型的に、血液、または口腔粘膜の粘膜スクレーピングなどの生物試料から抽出されるが、尿、腫瘍、もしくは去痰薬を含む他の生物試料から抽出することもできる。試料それ自体は、典型的に、正常または腫瘍組織を含む、対象から取り出された有核細胞（例えば、血液もしくは頬側細胞）または組織を含む。試料を入手し、処理し、分析するための方法および試薬は、当技術分野において周知である。いくつかの実施形態では、試料は、医療機関の協力の下、例えば血液を採取することにより、得られる。いくつかの実施形態では、試料は、医療機関の協力を伴わずに得られ、例えば、試料は、頬側綿棒もしくはブラシを用いて得られる頬側細胞を含む試料、または口腔洗浄液試料のように、非侵襲的に得られる。
【００５８】
いくつかの場合において、生物試料は、ＤＮＡ単離のために処理することができる。例えば、細胞または組織試料中のＤＮＡは、試料の他の成分から分離することができる。細胞は、当技術分野において周知の技術を用いて、生物試料から回収することができる。例えば、細胞は、細胞試料を遠心分離し、ペレット化した細胞を再懸濁することにより、回収することができる。細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）などの緩衝液中に再懸濁することができる。細胞懸濁液を遠心分離して、細胞ペレットを得た後、細胞を溶解して、ＤＮＡ、例えば、ｇＤＮＡを抽出することができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（２００３）を参照されたい。試料を濃縮および／または精製して、ＤＮＡを単離することができる。あらゆる種類のさらなる処理に供されるものを含む、対象から得られた全ての試料は、対象から得られたものと考えられる。例えば、フェノール抽出を含む、慣例的な方法を用いて、生物試料からゲノムＤＮＡを抽出することができる。あるいは、ゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）組織キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、Ｃａｌｉｆ．）、およびＷｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）などのキットを用いて抽出することができる。試料の源の非限定的な例は、尿、血液、および組織を含む。
【００５９】
本明細書に記載されるようなＥＧＦＲまたはＨＥＲ２のエクソン２０変異（例えば、エクソン２０挿入変異）の存在または不在は、当技術分野において周知の方法を用いて決定することができる。例えば、ゲル電気泳動、キャピラリ電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィ、配列決定、および／またはアレイを用いて、挿入変異の存在または不在を検出することができる。望ましい場合には、核酸の増幅は、当技術分野において周知の方法、例えば、ＰＣＲを用いて成し遂げることができる。一例において、試料（例えば、ゲノムＤＮＡを含む試料）は、対象から得られる。次いで、試料中のＤＮＡを試験して、本明細書に記載されるような挿入変異の特性を決定する。挿入変異は、本明細書に記載される任意の方法により、例えば、配列決定により、またはゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはｃＤＮＡ中の遺伝子の核酸プローブ、例えば、ＤＮＡプローブ（ｃＤＮＡおよびオリゴヌクレオチドプローブを含む）もしくはＲＮＡプローブに対するハイブリダイゼーションにより、検出することができる。核酸プローブは、特定のバリアントと特異的または優先的にハイブリダイズするように設計することができる。
【００６０】
プローブのセットは、典型的に、本開示の実施可能な推奨治療において用いられる標的遺伝的変異（例えば、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２のエクソン２０変異）を検出するために用いられる、プライマーのセット（通常は、プライマー対）および／または検出可能に標識されたプローブを指す。プライマー対は、前記遺伝子のそれぞれについての標的遺伝的変異についての領域にわたるアンプリコンを定義するために、増幅反応において用いられる。アンプリコンのセットは、マッチしたプローブのセットにより検出される。例示的な実施形態では、本方法は、標的遺伝的変異のセット（例えば、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２のエクソン２０変異）を検出するために、ＴａｑＭａｎ（商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ、Ｃａｌｉｆ．）アッセイを使用することができる。一実施形態では、プローブのセットは、次世代配列決定反応などの核酸配列決定反応により検出されるアンプリコンを産生するために用いられるプライマーのセットである。これらの実施形態では、例えば、ＡｍｐｌｉＳＥＱ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）またはＴｒｕＳＥＱ（商標）（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）技術を利用することができる。
【００６１】
核酸マーカーの分析は、配列分析および電気泳動分析を含むがこれらに限定されない、当技術分野において周知の技術を用いて実施することができる。配列分析の非限定的な例は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ配列決定、Ｓａｎｇｅｒ配列決定、キャピラリアレイＤＮＡ配列決定、サーマルサイクル配列決定（Ｓｅａｒｓら、１９９２）、固相配列決定（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、１９９２）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ；Ｆｕら、１９９８）などの質量分析を伴う配列決定、ならびにハイブリダイゼーションによる配列決定（Ｃｈｅｅら、１９９６；Ｄｒｍａｎａｃら、１９９３；Ｄｒｍａｎａｃら、１９９８）を含む。電気泳動分析の非限定的な例は、スラブゲル電気泳動、例えば、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリ電気泳動、および変性勾配ゲル電気泳動を含む。さらに、次世代配列決定法は、ｔｈｅ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ／Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  ＰＧＭまたはＰｒｏｔｏｎ、ｔｈｅ  Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳＥＱまたはＭｉＳＥＱ、およびｔｈｅ  Ｒｏｃｈｅ／４５４次世代配列決定システムなどの会社から商業的に入手可能なキットおよび装置を用いて実施することができる。
【００６２】
核酸分析の他の方法は、直接手動配列決定（ＣｈｕｒｃｈおよびＧｉｌｂｅｒｔ、１９８８；Ｓａｎｇｅｒら、１９７７；米国特許第５，２８８，６４４号）；自動化蛍光配列決定；一本鎖形態多型アッセイ（ＳＳＣＰ）（Ｓｃｈａｆｅｒら、１９９５）；クランプ変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）；二次元ゲル電気泳動（２ＤＧＥもしくはＴＤＧＥ）；形態感受性ゲル電気泳動（ＣＳＧＥ）；変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄら、１９８９）；変性高速液体クロマトグラフィ（ＤＨＰＬＣ、Ｕｎｄｅｒｈｉｌｌら、１９９７）赤外線マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＩＲ−ＭＡＬＤＩ）質量分析（ＷＯ９９／５７３１８）；移動度シフト分析（Ｏｒｉｔａら、１９８９）；制限酵素分析（Ｆｌａｖｅｌｌら、１９７８；Ｇｅｅｖｅｒら、１９８１）；定量的リアルタイムＰＣＲ（Ｒａｃａら、２００４）；ヘテロ二本鎖分析；化学的ミスマッチ分解（ＣＭＣ）（Ｃｏｔｔｏｎら、１９８５）；ＲＮａｓｅ保護アッセイ（Ｍｙｅｒｓら、１９８５）；ヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチド、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｍｕｔＳタンパク質の使用；アレル特異的ＰＣＲ、ならびにかかる方法の組み合わせを含み得る。例えば、米国特許公開第２００４／００１４０９５を参照されたい。この特許は、参照によりその全てが本明細書に組み込まれる。
【００６３】
一例において、試料におけるＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２変異を同定する方法は、かかる試料に由来する核酸を、変異したＥＧＦＲまたはＨＥＲ２タンパク質をコードする核酸、または変異を含むその断片に特異的にハイブリダイズすることができる核酸プローブと接触させること、およびそのハイブリダイゼーションを検出すること、を含む。特定の一実施形態では、かかるプローブは、例えば、放射性同位体（３Ｈ、３２Ｐ、もしくは３３Ｐ）、蛍光剤（ローダミン、もしくはフルオレセイン）、または発色剤を用いて、検出可能に標識される。特定の一実施形態では、プローブは、アンチセンスオリゴマー、例えば、ＰＮＡ、モルフォリノ−ホスフォラミダート、ＬＮＡ、または２′−アルコキシアルコキシである。プローブは、約８個のヌクレオチド〜約１００個のヌクレオチド、または約１０〜約７５個、または約１５〜約５０個、または約２０〜約３０個であり得る。別の態様では、本開示のかかるプローブは、試料におけるＥＧＦＲまたはＨＥＲ２変異を同定するためのキット中で提供され、かかるキットは、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２遺伝子における変異部位に特異的にハイブリダイズするか、またはそれらに隣接するオリゴヌクレオチドを含む。キットはさらに、キットを用いるハイブリダイゼーション試験の結果に基づいてポジオチニブまたはアファチニブを用いてＥＧＦＲまたはＨＥＲ２挿入変異を含む腫瘍を有する患者を治療するための指示を含む。
【００６４】
別の態様では、試料におけるエクソン２０変異を検出するための方法は、かかるＥＧＦＲ遺伝子もしくはＨＥＲ２のエクソン２０に対応するかかる核酸試料または変異を含むと考えられるその断片を増幅すること、および増幅した核酸の電気泳動移動度を、対応する野生型ＥＧＦＲもしくはＨＥＲ２遺伝子またはその断片の電気泳動移動度と比較すること、を含む。移動度における差異は、増幅した核酸配列における変異の存在を示す。電気泳動の移動度は、ポリアクリルアミドゲル上で測定できる。
【００６５】
あるいは、核酸は、酵素的変異検出（ＥＭＤ）（Ｄｅｌ  Ｔｉｔｏら、１９９８）を用いて変異の検出について分析することができる。ＥＭＤは、点変異、挿入、および欠失に起因する塩基対ミスマッチにより引き起こされる構造ひずみを検出および分解するまで、二本鎖ＤＮＡに沿ってスキャンする、バクテリオファージリゾルバーゼＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩを使用する。リゾルバーゼ分解により、例えば、ゲル電気泳動により形成される２つの短い断片の検出は、変異の存在を示す。ＥＭＤ方法の利点は、ＰＣＲ反応から直接アッセイされ、試料精製の必要性を排除し、ハイブリダイゼーション時間を短縮し、シグナル対ノイズ比を増大させる、点変異、欠失、および挿入を同定するための単一のプロトコルである。通常のＤＮＡの最大２０倍の発現と最大４ｋｂの大きさの断片とを含む混合した試料をアッセイすることができる。しかし、ＥＭＤスキャニングは、変異陽性試料中に生じる特定の塩基変化を同定せず、必要な場合には、変異を同定するためにさらなる配列決定手順が必要となる。米国特許第５，８６９，２４５号において実証されるように、ＣＥＬ  Ｉ酵素をリゾルバーゼＴ４エンドヌクレアーゼＶＩＩと同様に使用することができる。
【００６６】
ＩＩＩ．治療方法
本明細書では、個体におけるがんの進行を治療するまたは遅延させるための方法であって、有効量のポジオチニブ、アファチニブ、または構造的に同様の阻害剤を、その個体、ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２のエクソン２０変異（例えば、エクソン２０挿入）を有すると判定された対象に投与することを含む方法がさらに提供される。対象は、１つ以上のＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲエクソン２０変異を有し得る。
【００６７】
治療のために企図されるがんの例には、肺がん、頭頸部がん、乳がん、膵臓がん、前立腺がん、腎臓がん、骨がん、精巣がん、子宮頸がん、消化器がん、リンパ腫、肺の前腫瘍性病変、結腸がん、黒色腫、および膀胱がんが含まれる。特定の態様では、がんは、非小細胞肺がんである。
【００６８】
いくつかの実施形態では、対象は、哺乳類、例えば、霊長類、好ましくは、高等霊長類、例えば、ヒト（例えば、本明細書に記載された障害を有するか、またはそれらの障害を有する危険性のある患者）である。一実施形態では、対象は、免疫応答を強化する必要がある。特定の実施形態では、対象は、易感染性であるか、その危険性がある。例えば、対象は、化学療法的治療および／または放射線療法を受けているか、または受けたことがある。あるいは、または組み合わせて、対象は、感染の結果として、易感染性であるか、またはその危険性がある。
【００６９】
特定の実施形態は、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２エクソン２０変異（例えば、エクソン２０挿入）を有すると判定された対象に対する、ポジオチニブ（ＨＭ７８１−３６Ｂ、ＨＭ７８１−３６、および１−［４−［４−（３，４−ジクロロ−２−フルオロアニリノ）−７−メトキシキナゾリン−６−イル］オキシピぺリジン−１−イル］プロップ−２−エン−１−オンとしても知られている）の投与に関する。ポジオチニブは、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、およびＨＥＲ４を含むチロシンキナーゼ受容体のＨＥＲファミリーを介するシグナル伝達を不可逆的に阻害する、キナゾリン系ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤である。ポジオチニブまたは構造的に同様の化合物（例えば、米国特許第８，１８８，１０２号および米国特許公開第２０１３／００７１４５２号；参照により本明細書に取り込まれる）も、本方法において使用することができる。
【００７０】
Ｂ．薬学的組成物
本明細書では、ＥＧＦＲまたはＨＥＲ２エクソン２０変異（例えば、エクソン２０挿入）を有すると判定された対象のための、ポジオチニブまたはアファチニブおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物および製剤も提供される。
【００７１】
本明細書に記載される薬学的組成物および製剤は、所望の程度の純度を有する活性成分（例えば、抗体またはポリペプチド）を、凍結乾燥製剤または水溶液の形態の１つ以上の任意の薬学的に許容される担体（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２０１２）と混合することにより、調製することができる。薬学的に許容される担体は、一般的に、使用される用量および濃度において受容者に対して非毒性であり、緩衝液、例えば、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤、例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルもしくはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む、単糖類、二糖類、および他の炭水化物；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトール；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、亜鉛−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含むが、これらに限定されない。本明細書では、例示的な薬学的に許容される担体は、介在性（ｉｎｓｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ）薬剤分散剤、例えば、可溶性中性−活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．）をさらに含む。ｒＨｕＰＨ２０を含む、ある例示的なｓＨＡＳＥＧＰおよび使用方法は、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号および第２００６／０１０４９６８号に記載されている。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ以上のさらなるグルコサミノグリカナーゼ、例えば、コンドロイチナーゼと組み合わされる。
【００７２】
Ｃ．併用療法
特定の実施形態では、本実施形態の組成物および方法は、少なくとも１つのさらなる治療法と組み合わせたポジオチニブまたはアファチニブを含む。さらなる治療法は、放射線療法、手術（例えば、乳腺腫瘍摘出術および乳房切除術）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノセラピー、モノクローナル抗体療法、または前記の組み合わせであり得る。さらなる治療法は、アジュバントまたはネオアジュバント療法の形態であり得る。
【００７３】
いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、小分子酵素阻害剤または転移抑制剤の投与である。いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、副作用を減じた薬剤（例えば、治療の副作用の発生および／または重篤度を減少させることを意図した薬剤、例えば、制吐剤など）の投与である。いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、放射線療法である。いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、手術である。いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、放射線療法と手術との組み合わせである。いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、ガンマ照射である。いくつかの実施形態では、さらなる治療法は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を標的とする治療法、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤、および／または化学予防剤である。さらなる治療法は、当技術分野において周知の１つ以上の化学療法剤であり得る。
【００７４】
ポジオチニブまたはアファチニブは、免疫チェックポイント療法などのさらなるがん治療法の前、その間、その後、またはそれらと種々に組み合わせて、投与され得る。投与は、同時投与から、数分間隔、数日間隔、数週間隔までの範囲であり得る。ポジオチニブまたはアファチニブがさらなる治療剤とは別々に患者に提供される実施形態では、２つの化合物が患者に対してなお有利な併用効果を与えることができるように、一般的に、各送達時間の間に有意期間が終了しないことを確実にする。かかる場合において、互いの約１２〜２４または７２時間以内に、より特定的には、互いの約６〜１２時間以内に、患者に抗体療法および抗がん療法を提供してもよいことが企図される。いくつかの状況において、それぞれの投与の間に数日間（２、３、４、５、６、または７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７、または８）の間隔をもたせ、治療のための期間を有意に延長することが望ましいこともある。
【００７５】
様々な組み合わせが利用され得る。以下の例において、ポジオチニブまたはアファチニブは「Ａ」であり、抗がん療法は「Ｂ」である。
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【００７６】
患者に対する本実施形態の任意の化合物の投与または治療法の実施は、存在する場合には薬剤の毒性を考慮に入れて、かかる化合物の投与のための一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの実施形態では、組み合わせ療法に起因する毒性をモニタリングする工程がある。
【００７７】
１．化学療法
本実施形態に従って、多様な化学療法剤を使用することができる。用語「化学療法」は、がんを治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、がんの治療において投与される化合物または組成物を示すために使用される。これらの薬剤または薬物は、細胞内のそれらの活性モード、例えば、それらが細胞周期に影響するかどうか、およびそれらが細胞周期のどの段階に影響するか、により分類される。あるいは、薬剤は、そのＤＮＡに直接架橋する能力、ＤＮＡ中に介入する能力、または核酸合成に作用することにより染色体および有糸分裂異常を誘導するための能力に基づいて特徴付けられてもよい。
【００７８】
化学療法剤の例には、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド：スルホン酸アルキル、例えば、ブスルファン、インプロスルファン、およびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドーパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスフォラミド、トリエチレンチオホスフォラミド、およびトリメチロロメラミンを含む、エチレンイミンおよびメチラメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カチスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアゾゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンジスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、およびウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、およびラニムヌスチン；抗生剤、例えば、エンジイン抗生剤（例えば、カリチアマイシン、特に、カリチアマイシンガンマｌＩおよびカリチアマイシンオメガＩ１）；ダイネマイシンＡを含む、ダイネマイシン；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラマイシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生剤発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン（ａｕｔｈｒａｒｎｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、およびゾルビシン；抗代謝物質、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、およびトリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、およびチオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモファー、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフフリジン、エノシタビン、およびフロックスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート、エピチオスタノール、メピチオスタン、およびテストラクトン；抗副腎、例えば、ミトタンおよびトリロスタン；葉酸補充物質、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシッド；ガリウムニトレート；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニンメイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサトロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシンン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；プラチナ配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、およびカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトプシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼロダ；イバンドロナート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。
【００７９】
２．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、かつ幅広く用いられている他の因子は、γ線、Ｘ線として知られているもの、および／または腫瘍細胞に対する放射性同位体の指向性送達を含む。ＤＮＡ損傷因子の他の形態も企図され、例えば、電子レンジ、陽子ビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号および第４，８７０，２８７号）、ならびにＵＶ照射が挙げられる。これらの因子の全ては、ＤＮＡに対して、ＤＮＡの前駆体に対して、ＤＮＡの複製および修復に対して、ならびに染色体の集合および維持に対して、広範囲の損傷に影響を与える可能性が高い。Ｘ線についての線量範囲は、長期間（３〜４週間）についての５０〜２００レントゲンの１日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単一線量までの範囲にわたる。放射性同位体についての線量範囲は、広く異なり、同位体の半減期、放出された放射線の強度および種類、ならびに新生物細胞による取込みに依存する。
【００８０】
３．免疫療法
当業者は、さらなる免疫療法が、本実施形態の方法と組み合わせてまたは連動させて用いられ得ることを理解するだろう。がん治療の文脈において、免疫療法は、一般的に、がん細胞を標的化し、それを破壊するために、免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））は、その一例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上にあるいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独を治療法のエフェクターとして使用することもでき、または、抗体が、細胞殺傷に実際に作用する他の細胞を動員してもよい。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）にコンジュゲートされ、標的化剤として機能することができる。あるいは、エフェクターは、直接的または間接的に腫瘍細胞標的と相互作用する表面分子を有するリンパ球であり得る。様々なエフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む
【００８１】
抗体−薬物コンジュゲートは、がん治療の開発において画期的なアプローチとして出現した。がんは、世界中において、主な死因の一つである。抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞を殺傷する薬物に共有結合したモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。このアプローチは、Ｍａｂのそれらの抗原標的に対する高い特異性と、高度に強力な細胞傷害性薬物とを組み合わせており、ペイロード（薬物）を豊富なレベルの抗原と共に腫瘍細胞に送達する「武装した」ＭＡｂｓをもたらす。薬物の標的化送達はまた、正常組織中への薬物の曝露を最小限にし、毒性の軽減および治療指標の改善をもたらす。２つのＡＤＣ薬物の認可、ＦＤＡにより２０１１年に認可されたＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）および２０１３年に認可されたＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ−ＤＭ１）は、このアプローチを確証している。現在、３０種を超えるＡＤＣ薬物候補が、がん治療のための臨床試験の様々な段階にある（Ｌｅａｌら、２０１４）。抗体エンジニアリングおよびリンカー−ペイロード最適化が、益々成熟しているために、新規ＡＤＣの創薬および開発は、このアプローチとＭＡｂ標的化産生とに好適な新規標的の同定および検証に大いに依存する。ＡＤＣ標的についての２つの基準は、腫瘍細胞および頑強な内部移行における、上方制御された／高レベルの発現である。
【００８２】
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的化を施すことのできる、すなわち、他の細胞の大部分において存在しない、いくつかのマーカーを有する必要がある。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれもが、本実施形態の文脈における標的化に好適であり得る。一般的な腫瘍マーカーは、ＣＤ２０、がん胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ、およびｐ１５５を含む。免疫療法の代替的な一態様は、抗がん効果と免疫刺激効果とを組み合わせることである。サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮ、ケモカイン、例えば、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、および増殖因子、例えば、ＦＬＴ３リガンドを含む、免疫刺激分子も存在する。
【００８３】
免疫療法の例には、免疫アジュバント、例えば、マイコバクテリウムボビス、熱帯熱マラリア原虫、ジニトロクロロベンゼン、および芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および第５，７３９，１６９号；ＨｕｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ、１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓら、１９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、およびγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、およびＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉら、１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎら、１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄら、１９９８）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、およびｐ５３（Ｑｉｎら、１９９８；Ａｕｓｔｉｎ−ＷａｒｄおよびＶｉｌｌａｓｅｃａ、１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号および第５，８４６，９４５号）；ならびにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、および抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、２０１２；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉら、１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号）が含まれる。１つ以上の抗がん療法が本明細書に記載の抗体療法と共に使用され得ることが企図される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であり得る。免疫チェックポイントは、シグナル（例えば、共刺激分子）を強くするか、またはシグナルを弱くする。免疫チェックポイント妨害により標的化され得る阻害性免疫チェックポイントは、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られている）、ＢおよびＴリンパ球減衰剤（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔ−リンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても知られている）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ−１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、ならびにＴ細胞活性化のＶドメインＩｇ抑制剤（ＶＩＳＴＡ）を含む。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１系および／またはＣＴＬＡ−４を標的とする。
【００８５】
免疫チェックポイント阻害剤は、薬物、例えば、小分子、リガンドもしくは受容体の組換え形態であることができ、または特に、抗体、例えば、ヒト抗体（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１５／０１６７１８号；Ｐａｒｄｏｌｌ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、１２（４）：２５２−６４、２０１２；両文献は参照により本明細書に取り込まれる）である。免疫チェックポイントタンパク質またはそのアナログの既知の阻害剤が用いられてもよく、特に、キメラ、ヒト化、またはヒト形態の抗体が用いられてもよい。当業者には、代替的および／または等価な名称が、本開示において言及された特定の抗体のために使用されてもよいことが分かるであろう。かかる代替的および／または等価な名称は、本明細書の文脈において互換的である。例えば、ランブロリズマブは、代替的および等価な名称としてＭＫ−３４７５およびペンブロリズマブとしても知られていることが知られている。
【００８６】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のそのリガンド結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。特定の一態様では、ＰＤ−１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２である。別の実施形態では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。特定の一態様では、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ−１および／またはＢ７−１である。別の実施形態では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。特定の一態様では、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ−１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、米国特許第８，７３５，５５３号、第８，３５４，５０９号、および第８，００８，４４９号に記載されており、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。本明細書にて提供される方法において使用するための他のＰＤ−１系アンタゴニストは、当技術分野において周知であり、例えば、米国特許公開第ＵＳ２０１４／０２９４８９８号、第ＵＳ２０１４／０２２０２１号、および第ＵＳ２０１１／０００８３６９号に記載されており、これらの全ては参照により本明細書に組み込まれる。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、およびＣＴ−０１１からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外またはＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ−２２４である。ＭＤＸ−１１０６−０４、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８、およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られているニボルマブは、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載されている抗ＰＤ−１抗体である。ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、およびＳＣＨ−９００４７５としても知られているペンブロリズマブは、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載されている抗ＰＤ−１抗体である。ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ−１としても知られているＣＴ−０１１は、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載されている抗ＰＤ−１抗体である。Ｂ７−ＤＣＩｇとしても知られているＡＭＰ−２２４は、ＷＯ２０１０／０２７８２７およびＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されているＰＤＬ２−Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【００８８】
本明細書において提供される方法において標的化され得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られている、細胞傷害性Ｔ−リンパ球−関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）である。ヒトＣＴＬＡ−４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞の表面上で見出され、抗原−提示細胞の表面上のＣＤ８０またはＣＤ８６に結合されると、「オフ」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面上で発現され、阻害性シグナルをＴ細胞に伝達する、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質、ＣＤ２８に類似しており、両分子は、抗原−提示細胞上のそれぞれＢ７−１およびＢ７−２とも呼ばれるＣＤ８０およびＣＤ８６に結合する。ＣＴＬＡ４は、阻害性シグナルをＴ細胞に伝達し、一方で、ＣＤ２８は、刺激性シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は、調節性Ｔ細胞においても見出され、それらの機能にとって重要であり得る。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８を介するＴ細胞活性化は、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７分子についての阻害性受容体の発現増大に至る。
【００８９】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、もしくはキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、またはオリゴペプチドである。
【００９０】
本方法において使用するのに好適な抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体（またはそれらに由来するＶＨおよび／もしくはＶＬドメイン）は、当該分野において周知の方法を用いて作成することができる。あるいは、当該分野において認識される抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用することができる。例えば、米国特許第８，１１９，１２９号；国際特許公開第ＷＯ０１／１４４２４号、第ＷＯ９８／４２７５２号、および第ＷＯ００／３７５０４号（ＣＰ６７５，２０６、トレメリムマブ；以前のチシリムマブとしても知られている）；米国特許第６，２０７，１５６号；Ｈｕｒｗｉｔｚら、１９９８；Ｃａｍａｃｈｏら、２００４；ならびにＭｏｋｙｒら、１９９８において開示された抗ＣＴＬＡ−４抗体を、本明細書において開示される方法において使用することができる。前記刊行物のそれぞれの教示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。ＣＴＬＡ−４に対する結合について当該分野において認識されるこれらの抗体と競合する抗体を使用することもできる。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ−４抗体は、国際特許出願第ＷＯ２００１／０１４４２４号、および第ＷＯ２０００／０３７５０４号、および米国特許第８，０１７，１１４号に記載されており、これらの全ては、参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１、およびＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても知られている）またはその抗原結合断片およびバリアントである（例えば、ＷＯ０１／１４４２４を参照されたい）。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたはＶＲを含む。したがって、一実施形態では、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメイン、ならびにイピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体は、上記の抗体と同じＣＴＬＡ−４上のエピトープとの結合および／またはそれらへの結合について競合する。別の実施形態では、抗体は、上記の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列相同性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％、または９９％の可変領域相同性）を有する。
【００９２】
ＣＴＬＡ−４を調節するための他の分子は、ＣＴＬＡ−４リガンドおよび受容体、例えば、米国特許第５，８４４，９０５号、第５，８８５，７９６号、および国際特許出願第ＷＯ１９９５／００１９９４号および第ＷＯ１９９８／０４２７５２号に記載のもの；全て参照により本明細書に取り込まれる、ならびにイムノアドヘシン、例えば、米国特許第８，３２９，８６７号に記載のもの、参照により本明細書の取り込まれる、を含む。
【００９３】
４．手術
がんを有する人の約６０％は、予防的、診断的または病期分類的、治療的、および緩和的手術を含む、ある種の手術を受ける。治療的手術は、がん組織の全てまたは一部が物理的に除去されるか、切除されるか、および／または破壊される切除術を含み、また他の治療法、例えば、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、および／または代替的な治療法と併用することができる。腫瘍切除術は、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去を指す。腫瘍切除術に加えて、手術による治療は、レーザー手術、冷凍外科手術、電気手術、および顕微鏡制御された手術（モース手術）を含む。
【００９４】
がん細胞、組織、または腫瘍の一部または全ての切除では、体内に腔が形成されてもよい。治療は、さらなる抗がん療法を用いる領域の灌流、直接注入、または局所適用により成し遂げることができる。かかる治療は、例えば、１、２、３、４、５、６もしくは７日ごとに、または１、２、３、４および５週ごとに、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、もしくは１２ヶ月ごとに繰り返すことができる。これらの治療は、用量を変化させたものであってもよい。
【００９５】
５．他の薬剤
治療の治療効果を改善するために本実施形態の特定の態様と組み合わせて他の薬剤を用いてもよいことが企図される。これらのさらなる薬剤には、細胞表面受容体およびＧＡＰジャンクションの上方制御に作用する薬剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、過剰増殖細胞のアポトーシス誘導剤への感受性を増大させる薬剤、または他の生物学的薬剤が含まれる。ＧＡＰジャンクションの数を高めることによる細胞内シグナリングの増大は、隣接する過剰増殖細胞集団に対する抗過剰増殖効果を増大し得る。他の実施形態では、細胞増殖抑制剤または分化剤は、治療の抗過剰増殖効果を改善するために本実施形態の特定の態様と組み合わせて用いることができる。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の効果を改善するために企図される。細胞接着阻害剤の例は、接着斑キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。抗体ｃ２２５などの過剰増殖細胞のアポトーシスに対する感受性を増大させる他の薬剤が、治療効果を改善するために本実施形態の特定の態様と組み合わせて用いられ得ることがさらに企図される。
【００９６】
ＩＶ．キット
ＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２のエクソン２０変異（例えば、本明細書において開示されるもの）を検出するためのキットも、本開示の範囲内である。かかるキットの一例は、エクソン２０変異に特異的なプライマーのセットを含む。キットはさらに、本明細書に記載される特異的なＥＦＧＲおよび／またはＨＥＲ２エクソン２０変異の存在または不在を検出するためにプライマーを使用するための指示書を含むことができる。キットはさらに、がん患者に由来する試料における本明細書に記載のＥＧＦＲおよび／またはＨＥＲ２のエクソン２０変異の陽性同定が、チロシンキナーゼ阻害剤ポジオチニブもしくはアファチニブまたは構造的に同様の阻害剤に対する感受性の指標となるということを示す、診断目的のための指示書を含んでもよい。キットはさらに、がん患者に由来する試料における本明細書に記載のＥＧＦＲおよび／またはエクソン２０変異の陽性同定が、ポジオチニブ、アファチニブ、または構造的に同様の阻害剤を用いて治療されるべきであることを示す、指示書を含んでもよい。
【実施例】
【００９７】
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。当業者であれば、後に続く本実施例において開示された技術は、本発明の実施において十分に機能することが本発明者により見出された技術であり、それ故に、その実施のための好ましいモードを構成するものとして考慮することができる、ということを理解するべきである。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、本明細書において開示された特定の実施形態において多数の変更を加えることができること、そして本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似する結果を依然として得ることができること、を理解するべきである。
【００９８】
実施例１−ＥＧＦＲまたはＨＥＲエクソン２０挿入を有するがん細胞のための薬剤の同定
臨床的データベースにおいてＥＧＦＲエクソン２０挿入を有する腫瘍を有する患者におけるＴＫＩに対する臨床的応答性を調査した；ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣを有する２８０人の患者のうち、１２９人の患者が古典的なＥＧＦＲ変異（エクソン１９欠失、Ｌ８５８Ｒ、およびＬ８６１Ｑ）を有し、９人の患者がＥＧＦＲエクソン２０挿入を有するとして同定され、単一の薬剤、エルロチニブ、ゲフィチニブ、またはアファチニブを用いて治療された。古典的なＥＧＦＲ変異を有するＮＳＣＬＣ患者のＰＦＳ中央値は１４ヶ月であり、一方、ＥＧＦＲエクソン２０挿入を有する患者のＰＦＳ中央値は、わずか２ヶ月であった（ｐ＜０．０００１、ｌｏｇランク試験；図１Ａ）。９人のＥＧＦＲエクソン２０挿入患者のうち、Ｓ７６８ｄｅｌ−ｉｎｓＩＬ変異を有する、アファチニブを受けた１人の患者のみにおいて、ＯＲが観察された（図４Ａ）。この臨床データは、ＥＧＦＲエクソン２０挿入に起因するＮＳＣＬＣにおける利用可能なＥＧＦＲ  ＴＫＩの限定的な活性を実証し、これらの特定の腫瘍については代替的な治療戦略が必要であることを実証している。
【００９９】
薬物スクリーニングにおける初期工程として、７種のＥＧＦＲ変異体および１１種のＨＥＲ２変異体をＢａ／Ｆ３細胞において発現させた。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０変異の位置を図１Ｂに要約している。ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のエクソン２０変異が活性化変異であるかを評価するために、Ｂａ／Ｆ３細胞株を、ＩＬ−３非依存的生存についてスクリーニングした。試験した全てのＥＧＦＲエクソン２０挿入が活性化変異であり（図４Ｂ）、６種のＨＥＲ２エクソン２０変異およびエクソン１９に位置するＬ７５５Ｐが活性化変異であること（図４Ｃ）が見出された。次に、可逆的（第１世代）、不可逆的（第２世代）、および不可逆的変異特異的ＴＫＩ（第３世代）を含む臨床評価に付されるＥＧＦＲ  ＴＫＩおよびＨＥＲ２  ＴＫＩに対する、エクソン２０挿入体の感受性を試験し、次いで、ＥＧＦＲ  Ｌ８５８Ｒ、古典的な感受性変異体の感受性と比較した。ＥＧＦＲ  Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡは例外であったが、ＥＧＦＲエクソン２０挿入体（ｎ＝６）は、第１世代ＥＧＦＲ  ＴＫＩ（図１Ｃ、ＩＣ５０＝３．３−＞１０μＭ）、第２世代ＥＧＦＲ  ＴＫＩ（図１ｄ、ＩＣ５０＝４０〜１３５ｎＭ）、および第３世代ＥＧＦＲ  ＴＫＩ（図１ｅ、ＩＣ５０＝１０３〜８５０ｎＭ）に耐性があった（図５、表１）。加えて、ＨＥＲ２エクソン２０変異体（ｎ＝６）は、第１世代ＴＫＩ（図１Ｆ、ＩＣ５０＝１．２〜１３μＭ）および第３世代ＴＫＩ（図１Ｈ、ＩＣ５０＝１１４〜５０５ｎＭ）に耐性があった。第２世代ＴＫＩは、Ｂａ／Ｆ３ＨＥＲ２エクソン２０変異細胞株に対して幾分かの活性を有した（図１Ｇ、ＩＣ５０＝１０〜１２ｎＭ、図６、表１）。薬物スクリーニングと一致して、低用量で部分的な阻害を示したＥＧＦＲ  Ａ７６３ｉｎｓＦＱＥＡは例外であったが、ウェスタンブロッティングは、エルロチニブおよびオシメルチニブが、ＥＧＦＲエクソン２０挿入変異体におけるｐ−ＥＧＦＲ２を有意に阻害せず、ＨＥＲ２エクソン２０挿入変異体におけるｐ−ＨＥＲ２を５００ｎＭでのみ有意に阻害したことを実証した（図７Ａ〜Ｄ）。
【０１００】
（表１）ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２  ＴＫＩについてのＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のエクソン２０挿入体のＩＣ５０値。
2020502059.tif 000003
【０１０１】
エクソン２０挿入体が第１世代および第３世代ＥＧＦＲ  ＴＫＩに耐性がある理由を調べるために、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０ＭおよびＥＧＦＲ  ＷＴと共にＥＧＦＲ  Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧの解明された結晶構造について３Ｄモデリングを実施して、薬物結合ポケット内の変化を視覚化した。モデリングは、ゲートキーパーＴ７９０残基のアライメントにおいて、ＥＧＦＲエクソン２０挿入がＴ７９０Ｍ変異と類似することを明らかにし、これは、ＡＴＰに対する親和性の向上をもたらし、第１世代阻害剤の結合を低減し、非共有結合性阻害剤に対するこれらの変異耐性を付与する。加えて、ＨＥＲ２エクソン２０挿入は、構成的活性化型形態を誘導し、非活性形態のＨＥＲ２と結合する非共有結合性ＨＥＲ２阻害剤ラパチニブの結合を防止する。さらに、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０挿入は、薬物結合ポケットに対する劇的な効果を有する。ＥＧＦＲ（図１Ｉ）およびＨＥＲ２（図１Ｊ）エクソン２０挿入のインシリコモデリングは、α−ｃヘリックスのＣ末端にある挿入に起因してα−ｃヘリックスが薬物結合ポケット内へと有意にシフトしていること（矢印）を明らかにし（図１Ｊ）、このシフトによって、α−ｃヘリックスのうね状の配置が内側の活性型位置へと強いられる。加えて、３Ｄモデリングは、Ｐループが両受容体の薬物結合ポケット内へと有意にシフトしていること（図１Ｉ、１Ｊ）を実証した。これらのシフトが合わさって、ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２エクソン２０変異タンパク質の両方において２方向から薬物結合ポケットの立体障害が生じる。上記のインビトロ試験と一致して、３Ｄモデリングは、アファチニブがオシメルチニブよりも効果的にエクソン２０挿入を阻害するという観察を支持する。オシメルチニブは、柔軟性のないピリミジンコアに直接連結した大きな末端１−メチルインドール基を有する。この大きな柔軟性のない基は、Ｃ７９７残基に到達するオシメルチニブの能力を、ＥＧＦＲエクソン２０挿入体（図１Ｉ）におけるアファチニブの場合と同程度に効果的に低減する。一方、アファチニブは、第２級アミン基を介してキナゾリンコアに間接的に連結したより小さな１−クロロ−２−フルオロベンゼン環末端基を有し、それにより、アファチニブは、立体障害型の結合ポケットにフィットすることが可能となる。さらに、立体障害は、ＨＥＲ２  Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡへのオシメルチニブの結合を妨害する。まとめると、インビトロデータおよびインシリコモデリングは、小さな柔軟性のあるキナゾリン誘導体は、ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２エクソン２０挿入体を標的化することが可能であり得ることを示している。
【０１０２】
次に、エクソン２０挿入体に対して増強された活性を有するＴＫＩを同定することが探求された。ポジオチニブもまた、アファチニブと同様に、小さな末端基および柔軟性のあるキナゾリンコアを含む。しかし、ポジオチニブは、アファチニブと比較して、マイケル受容体基をキナゾリンコアに連結するより小さな置換基を有し、アファチニブと比較して、末端ベンゼン環のハロゲン化が増大される。この電子豊富な部分はまた、Ｋ７４５などのＥＧＦＲの塩基性残基と相互作用し、その結合をさらに安定化する。したがって、ポジオチニブを、Ｂａ／Ｆ３系で試験した。インビトロでは、ポジオチニブは、ＥＧＦＲエクソン２０変異Ｂａ／Ｆ３細胞株（図２Ａ）およびＨＥＲ２エクソン２０変異Ｂａ／Ｆ３細胞（図２Ｂ）の増殖を強力に阻害した。ポジオチニブはＥＧＦＲエクソン２０変異Ｂａ／Ｆ３細胞株において１．０ｎＭの平均ＩＣ５０値を有し、それにより、ポジオチニブはインビトロで、オシメルチニブよりも約１００倍強力となり、アファチニブよりも４０倍強力となる。さらに、ポジオチニブはＨＥＲ２エクソン２０変異Ｂａ／Ｆ３細胞株において１．９ｎＭの平均ＩＣ５０値を有し、それにより、ポジオチニブはインビトロで、オシメルチニブよりも２００倍強力となり、アファチニブよりも６倍強力となる。これらの結果は、ポジオチニブがＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のリン酸化を５ｎＭもの低濃度で阻害したウェスタンブロッティングにより確証された（図２Ｃ、８Ａ）。さらに、ポジオチニブ感受性がＥＧＦＲまたはＨＥＲ２変異体の発現レベルに起因するものではないことを確証するために、各変異体の発現をＥＬＩＳＡにより測定し、次いで、ＩＣ５０値に対してプロットした（図８Ｄ）。ＩＣ５０と発現との間には相関性が見出されなかったが（Ｒ＝−０．０５６、ｐ＝０．８５６）、ポジオチニブ感受性とＥＧＦＲ変異位置との間には相関性が見出され（Ｒ＝０．６８７、ｐ＝０．０４４）（図２Ｄ）、これは、挿入がα−ｃヘリックスから遠く離れるにつれ、ＩＣ５０がより高くなることを示唆している。興味深いことに、この相関性は、位置よりもむしろ挿入の大きさに多様性があるＨＥＲ２エクソン２０変異については見出されなかった（図８Ｅ）。この相関性は、変異の位置こそが、薬物結合ポケットに対して種々の効果を有し、観察される薬物応答性の不均質性に寄与していることを示唆している。加えて、ポジオチニブは、患者由来細胞株ＣＵＴＯ１４（ＥＧＦＲ  Ａ７６７ｄｕｐＡＳＶ）およびＹＵＬ００１９（ＥＧＦＲ  Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨ）の増殖を、それぞれ１．８４ｎＭおよび０．３０ｎＭの平均ＩＣ５０値で効果的に阻害し、これらは、ＣＵＴ０１４についてはアファチニブよりも１５倍強力であり、ＹＵＬ００１９についてはアファチニブよりも１００倍超強力であった（図２Ｅ、Ｆ）。ＣＵＴ０１４細胞株のウェスタンブロッティングは、１０ｎＭのポジオチニブ処置によってｐ−ＥＧＦＲの有意な阻害が存在したが、ｐ−ＥＧＦＲは、アファチニブにより１０００ｎＭまでは有意に阻害されなかった（図８Ｂ、Ｃ）ということを決定づけた。
【０１０３】
Ｔ７９０Ｍ変異と比較した、エクソン２０変異体を阻害するためのポジオチニブの特異性を測定するために、エクソン２０変異体におけるアファチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、およびポジオチニブのＩＣ５０値を、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異Ｂａ／Ｆ３細胞株におけるアファチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、およびポジオチニブのＩＣ５０値と比較した。ＩＣ５０値は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ単一変異体に対して正規化されて表示され、ここで、１未満の値は、Ｔ７９０Ｍと比較して、エクソン２０挿入に対する特異性を示す（図２Ｇ）。ＥＧＦＲエクソン２０挿入体は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異体と比較して、ポジオチニブに対する感受性が６５倍高かった。さらに、ＥＧＦＲエクソン２０挿入変異体は、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異体よりも、アファチニブに対する耐性が１．４倍強く、オシメルチニブに対する耐性が５．６倍強く、ロシレチニブに対する耐性が２４倍強かった（図２Ｇ）。
【０１０４】
オシメルチニブなどの第３世代ＴＫＩではなく、何故ポジオチニブが、Ｔ７９０Ｍ変異体と比較してエクソン２０変異体を選択的かつ強力に阻害するのかを調べるために、３Ｄモデリングを実施して、薬物結合ポケットにおける変化がどのように薬物結合に影響を及ぼすのかを決定した。オシメルチニブは、ＥＧＦＲ  Ｔ７９０Ｍ変異受容体の薬物結合ポケットにフィットするが（図２Ｈ）、エクソン２０変異体では、結合ポケット内の大きな変化（図２Ｉ）が、第３世代阻害剤の結合を立体的に障害する。しかし、ポジオチニブはより小さく、より大きな柔軟性を有するので、立体障害型エクソン２０結合ポケット内にフィットすることが可能である（図２Ｉ）。さらに、ポジオチニブおよびアファチニブを用いたＥＧＦＲ  Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧの３Ｄモデリングは、薬物結合ポケット内へのＰループのシフトが、アファチニブよりもポジオチニブをより強固に薬物結合ポケット内に結合させることを示唆している。構造モデリングの計算結果は、ポジオチニブについての結合の自由エネルギー（ロンドンΔＧ）がアファチニブよりも小さいことを示し、ポジオチニブの結合親和性がより強力であることを示している。オシメルチニブを用いたＷＴ  ＨＥＲ２の３Ｄモデリングは、ＷＴ  ＨＥＲ２の結合ポケットが、ＨＥＲ２  Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡの結合ポケットよりも大きいことを示す。故に、ポジオチニブは、ＨＥＲ２  Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡの立体障害型薬物結合ポケット内の深くに強固に結合し、エクソン２０挿入により誘導される構造変化に打ち勝つ。
【０１０５】
ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２のエクソン２０挿入に起因するＮＳＣＬＣのＧＥＭモデルを用いて、ポジオチニブの効力をインビボで試験した。以前に記載されたＥＧＦＲ  Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧ（Ｃｈｏら、２０１３）およびＨＥＲ２  Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ（Ｐｅｒｅｒａら、２００９）マウスにおいて肺腫瘍を誘導し、当該動物に、ポジオチニブ（１０ｍｇ／ｋｇ）または対照としてのビヒクルを４週間毎日、経口投与した。ＭＲＩにより測定されたように、ポジオチニブは、ＥＧＦＲエクソン２０  ＧＥＭＭにおいて腫瘍量を８５％まで減少させ（図３Ａ、Ｃ）、ＨＥＲ２エクソン２０  ＧＥＭＭにおいて腫瘍量を６０％まで減少させ（図３Ｂ、Ｄ）、同様のＧＥＭモデルにおいてアファチニブについて以前に観察されたものよりも３７％高い阻害レベルであった。ポジオチニブの前後の腫瘍の代表的なＭＲＩイメージを、ＥＧＦＲ  ＧＥＭＭおよびＨＥＲ２  ＧＥＭＭの両方について示す（図３Ｃ、Ｄ）。ＥＧＦＲ  ＧＥＭモデルおよびＨＥＲ２  ＧＥＭモデルの両方において、１０ｍｇ／ｋｇのポジオチニブで治療されたマウスは、１２週目で進行の兆候を伴うことなく、耐久性のある退縮を示した（図３Ｅ、Ｆ）。加えて、ポジオチニブ処置（５または１０ｍｇ／ｋｇ）は、ＥＧＦＲエクソン２０挿入ＰＤＸモデルＬＵ０３８７（Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨ）において１４日目までに腫瘍を完全に減少させた（＞８５％阻害）（図３Ｇ）。
【０１０６】
ポジオチニブが他の不可逆的阻害剤と同様にＣ７９７で共有結合するかを決定するために、オシメルチニブ耐性を有する患者の約３０％において観察されるＣ７９７Ｓ変異を用いて、Ｂａ／Ｆ３細胞株を生成した（Ｔｈｒｅｓｓら、２０１５）。Ｃ７９７Ｓ変異がポジオチニブに対する耐性（ＩＣ５０値は＞１０μＭ）を誘導することが見出された。併せて、これらの実験は、ポジオチニブが他の第３世代ＴＫＩと同様の獲得耐性機序に影響を受けやすいことを示唆した。
【０１０７】
上記の知見を確証するために、ＨＥＲ２  Ｇ７７６ｄｅｌ  ｉｎｓＶＣを有する乳がん細胞株ＭＣＦ１０Ａを用いて実験を実施した。当該細胞を様々な用量の異なる阻害剤で処理したところ、当該乳がん細胞株は、試験した他の細胞株でも見られるようにポジオチニブに対して感受性があることが見出された（図１０）。したがって、ポジオチニブは、エクソン２０変異を有する他のがんの治療のためにも使用することができる。
【０１０８】
故に、エクソン２０変異体は、第１、第２、および第３世代ＴＫＩに対する新たな耐性を示すことが見出された。ＥＧＦＲ  Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧおよびＨＥＲ２  Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡの３Ｄモデリングを用いて、ポジオチニブは、エクソン２０中の挿入により誘導される薬物結合ポケット内の変化に打ち勝つことのできる構造特性を有するものとして、同定された。さらに、ポジオチニブの推定された活性は、これらの変異を有する細胞におけるポジオチニブの強力な抗腫瘍活性を示すインビトロおよびインビボモデルを用いて、確認された。
【０１０９】
ポジオチニブは、ＥＧＦＲエクソン２０変異体において、アファチニブよりも約４０倍強力であり、ダコミチニブよりも６５倍強力であることが見出された。さらに、ポジオチニブは、ＨＥＲ２エクソン２０変異体において、インビトロでアファチニブおよびダコミチニブよりも６倍強力であった。まとめると、これらのデータにより、ポジオチニブは類似するキナゾリン骨格をアファチニブおよびダコミチニブと共有するが、キナーゼ阻害剤のさらなる特性が、より一般的なＴ７９０Ｍ変異と比較して、ＥＧＦＲエクソン２０変異体についての増大された活性および相対的特異性をもたらすことが示される。
【０１１０】
３Ｄモデリングは、ポジオチニブのより小さいサイズ、増大されたハロゲン化、および柔軟性により、この阻害剤に、エクソン２０変異ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２の立体障害型の薬物結合ポケット内での競合における優位性が付与されることを示唆している。変異のα−ｃヘリックスからの距離と薬物感受性との間には、負の相関性が観察された。この関係は、変異の位置こそが、ＴＫＩの薬物結合ポケットおよび／または結合親和性に影響を及ぼすことを示唆している。さらに、データは、挿入の大きさも薬物感受性に影響を及ぼすことを示した。さらに、正味１個のみのアミノ酸を得た患者由来細胞株ＹＵＬ００１９（Ｎ７７１ｄｅｌ  ｉｎｓＦＨ）は、より大きなＥＧＦＲエクソン２０挿入を有する細胞株よりも、キナゾリン系ｐａｎ−ＨＥＲ阻害剤に感受性があった。
【０１１１】
実施例２−材料および方法
患者集団および統計分析：将来を見越して収集されたＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｏｏｎ  Ｓｈｏｔ  ＧＥＭＩＮＩデータベースに登録された、ＥＧＦＲ変異ＮＳＣＬＣを有する患者が同定された。慣例的な臨床ケアのために用いられる５０、１３４、または４０９個の遺伝子のパネルのＰＣＲに基づく次世代配列決定の１つを用いて、ＥＧＦＲ変異の状態を決定した。Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ法を用いて、ＰＦＳを計算した。ＰＦＳを、ＥＧＦＲ  ＴＫＩの開始から放射線学的な進行または死までの時間として、定義した。治療中６〜８週間隔でリステージングスキャンを得、これをｔｈｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）、バージョン１．１に従って、過去に照らして評価し、ＥＧＦＲエクソン２０挿入ＮＳＣＬＣを有する患者における応答率を決定した。
【０１１２】
細胞株産生およびＩＬ−３欠乏：Ｂａ／Ｆ３細胞株を、無菌条件下、Ｌ−グルタミン、１０％の熱失活ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）、１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、および１０ｎｇ／ｍｌのマウスＩＬ−３（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を補足した完全ＲＰＭＩ−１６４０（Ｒ８７５８；Ｓｉｇｍａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）培地中で培養した。１２時間のＢａ／Ｆ３細胞株のレトロウイルス形質導入により、安定な細胞株を産生した。リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、表２にまとめたｐＢａｂｅ−Ｐｕｒｏに基づくベクター（ＡｄｄｇｅｎｅおよびＢｉｏｉｎｎｏｖａｔｉｓｅ）をＰｈｏｅｎｉｘ  ２９３Ｔ  ａｍｐｈｏパッキング細胞株（Ｏｒｂｉｇｅｎ）にトランスフェクトすることにより、レトロウイルスを産生した。形質導入の７２時間後、２μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を培地に添加した。選択の５日後、ＦＩＴＣ−ＨＥＲ２（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）またはＰＥ−ＥＧＦＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて細胞を染色し、ＦＡＣＳにより分取した。次いで、ＩＬ−３の不在下で細胞株を１５日間増殖させ、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｇｅｍａ）を用いて細胞生存率を３日ごとに測定した。得られた安定な細胞株を、ＩＬ−３を含まない上記の完全ＲＰＭＩ−１６４０培地中で維持した。ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６肺がん細胞株をＡＴＣＣから入手し、無菌条件下、１０％のＲＰＭＩ培地中で維持した。ＰｏｗｅｒＰｌｅｘ  １．２キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ショートタンデムリピートを介するＤＮＡフィンガープリンティングにより、細胞株相同性を確認した。フィンガープリンティング結果を、細胞株の主な供給元により維持された参照フィンガープリントと比較した。全ての細胞株は、マイコプラズマ不含であった。エルロチニブ耐性細胞株を産生するために、ＨＣＣ８２７およびＨＣＣ４００６（共にＥＧＦＲ変異）細胞を、増大濃度のエルロチニブと共に、耐性バリアントが出現するまで、培養した。
【０１１３】
（表２）安定な細胞株を産生するために用いたベクター。
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【０１１４】
細胞生存率アッセイおよびＩＣ５０推定：細胞生存率を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて決定した。細胞を懸濁培地から回収し、３００ｘｇで５分間遠心沈殿させ、新鮮ＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、Ｃｏｕｎｔｅｓｓ自動セルカウンターおよびトリパンブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてカウントした。１ウェルあたり１５００個の細胞を、３８４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）中、技術的にトリプレットで播種した。細胞を、１ウェルあたり４０μＬの最終体積の、段階３倍希釈したＴＫＩ中の７つの異なる濃度の阻害剤またはビヒクル単独で処理した。７２時間後、１１μＬのＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏを各ウェルに添加した。プレートを１０分間振とうし、ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡマルチモードマイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ）を用いて、生物発光を測定した。生物発光の値をＤＭＳＯ処理細胞に対して正規化し、正規化した値を、可変傾斜を用いる正規化データに対する非線形回帰フィットを用いて、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにてプロットした。ＩＣ５０値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにより、５０％阻害にて計算した。指示されない限り、各実験は３回反復した。
【０１１５】
チロシンキナーゼ阻害剤：ラパチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、ＡＺＤ９２９１、ＣＯ−１６８６、ＥＧＦ８１６、イブルチニブ、およびＨＭ７８１−３６Ｂは、Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌから購入した。エルロチニブおよびゲフィチニブは、Ｔｈｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにあるｔｈｅ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ｐｈａｒｍａｃｙから入手した。ＢＩ−６９４は、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍにより提供された。全ての阻害剤は、１０ｍＭの濃度のＤＭＳＯ中に溶解し、−８０℃で貯蔵した。
【０１１６】
３Ｄモデリング：ＥＧＦＲ  Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧタンパク質の構造を取得し（タンパク質データバンクエントリーコード：４ＬＲＭ）、それを鋳型として用いて、本研究のＥＧＦＲ  Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧの分子３Ｄ構造モデルを構築した。Ｓｈｅｎらにおいて以前に公開されたモデルを用いて、ＨＥＲ２  Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡを構築した。ＭＯＤＥＬＬＥＲ  ９ｖ６を用いて、相同性モデルを構築し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔソフトウェアパッケージ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｃａｎａｄａ）を用いて、さらに精力的に最小化した。別記しない限り、デフォルトパラメータを用いるＧＯＬＤソフトウェアを用いて、ＴＫＩのエクソン２０変異ＥＧＦＲおよびＨＥＲ２への分子ドッキングを実施した。ドッキングプロセスにおいて、早期終了は許容されない。受容体と阻害剤との間の共有結合形成をモデル化するために、拘束を用いた。結合ポケット内の残基の柔軟性は、ＧＯＬＤソフトウェアを用いて対処した。ＥＧＦＲ／ＨＥＲ２と阻害剤との間の相互作用を示す図は、ＰＹＭＯＬを用いて視覚化した。
【０１１７】
Ｂａ／Ｆ３変異のウェスタンブロッティング：ウェスタンブロッティングのために、細胞をリン酸緩衝食塩水で洗浄し、タンパク質溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびプロテアーゼ阻害剤カクテルタブレット（Ｒｏｃｈｅ）中に溶解した。タンパク質（３０〜４０μｇ）を、ＢｉｏＲａｄから購入したゲルに充填した。ＢｉｏＲａｄセミドライトランスファーを用い、次いで、ｐＥＧＦＲ（＃２２３４）、ＥＧＦＲ（＃４２６７）、ｐＨＥＲ２（＃２２４７）、ＨＥＲ２（＃４２９０）（１：１０００；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）に対する抗体を用いてプローブを行った。ブロットは、充填対照としてβ−アクチン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ａ２２２８）またはビンクリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｖ４５０５）に対する抗体を用いてプローブを行い、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ化学発光基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＢｉｏＲａｄのＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＴｏｕｃｈイメージングシステムまたはＸ線写真フィルムを用いて曝露した。代表的なイメージを２つの別個のタンパク質単離について示し、ブロットは、二通りで行う。ウェスタンブロッティングの定量化は、Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐにて完了し、（バックグラウンド平均強度−試料平均強度）（ピクセル数）＝バンド強度、として計算した。初め、試料を充填対照（β−アクチンまたはビンクリン）に対して正規化し、次いで、ＤＭＳＯに対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍでグラフ化した。ＤＭＳＯからの有意性を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにおいて計算した。
【０１１８】
Ｂａ／Ｆ３変異のＥＬＩＳＡおよび相関性：親Ｂａ／Ｆ３細胞株からタンパク質を回収したところ、Ｂａ／Ｆ３エクソン２０変異のそれぞれは、上記のように活性化変異であることが見出された。製造元の指示書により記載されるように、全ＥＧＦＲ（Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃７２５０）および全ＨＥＲ２（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、＃７３１０）について、ＥＬＩＳＡを実施した。ＥＬＩＳＡにより測定された相対的発現を、上記のように計算されたＩＣ５０値に対してプロットした。Ｐｅａｒｓｏｎ相関性およびｐ値を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍにより決定した。
【０１１９】
患者由来細胞株の研究：インフォームドコンセントを得た後、以前に記載された培養方法（Ｄａｖｉｅｓら、２０１３）を用いて、肺腺がん腫を有する患者の胸水から、ＣＵＴＯ１４細胞を産生した。細胞株を、指定された用量のアファチニブまたはポジオチニブで７２時間処置し、細胞生存率をＭＴＳアッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ）により測定した。ＩＣ５０を、以前に記載されているように、計算した（ｎ＝３）。患者由来細胞株を用いたウェスタンブロッティングを、以前に記載されているように（Ｈｏｎｇら、２００７）、行った（ｎ＝３）。指定された用量のアファチニブまたはポジオチニブを用いて、細胞を２時間処理した。全てのＥＧＦＲ（ＢＤ形質導入Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）およびＧＡＰＤＨ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）を除き、全ての抗体は、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
【０１２０】
ＩＲＢ認可のプロトコルの下、肺の進行腺がん腫を有する患者から得られた悪性心嚢液から、ＹＵＬ００１９細胞株を構築した。１０％の熱失活胎仔血清（Ａｔｌａｎｔａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）および１％のペニシリン／ストレプトマイシン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を補足したＲＰＭＩ＋Ｌ−グルタミン（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、細胞株を培養した。ＥＧＦＲ変異の存在を確認するために、ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ＃７４１０４）を製造元の指示書に従って使用して、ＲＮＡを細胞ペレットから抽出した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃１８０８０−０５１）を用いてｃＤＮＡを合成し、これをＥＧＦＲを増幅するための鋳型として用いた。ＰＣＲ産物は、以下のプライマーを用いて、Ｓａｎｇｅｒ配列決定により、配列決定された。
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および
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フォワードおよびリバース配列のトレーシングは、手動的に調べた。患者由来細胞株において検出されたバリアントは、位置７７１にあるアミノ酸アスパラギンの、２つのアミノ酸、フェニルアラニンおよびヒスチジンによる置換をもたらす、ＥＧＦＲ（Ｎ７７１ｄｅｌｉｎｓＦＨ）のエクソン２０中の複合的挿入であった。細胞生存率およびＩＣ５０推定は、上記のように実施した。
【０１２１】
患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の研究：ＬＵ０３８７  ＰＤＸ実験をＣｒｏｗｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓにより完了した。簡潔に言うと、腫瘍を発現するＥＧＦＲ  Ｈ７７３ｉｎｓＮＰＨに由来する腫瘍断片を、５〜６週齢のメスｎｕ／ｎｕヌードマウスに接種した。腫瘍が１００〜２００ｍｍ３に達したら、マウスを、５ｍｇ／ｋｇのポジオチニブ、１０ｍｇ／ｋｇのポジオチニブ、またはビヒクル対照（ｄＨ２Ｏ中、２０％のＰＥＧ−４００、３％のＴｗｅｅｎ−８０）の３群に無作為化した。腫瘍体積および体重を週に２回測定した。５ｍｇ／ｋｇのポジオチニブを受けたマウスは、４〜５日間、薬物を受け、次いで、４日間投薬を休止し、次いで、さらに４日間の投与を受けた。次いで、マウスは、投薬をされることなくさらに２日間観察された。１０ｍｇ／ｋｇのポジオチニブを受けたマウスは、３〜４日間、薬物を受け、次いで、投薬をされることなく１０日間観察された。腫瘍量に関係のない事象のために人的に安楽死されたマウスは、最終的な分析から除外された。
【０１２２】
遺伝子操作されたマウスモデル（ＧＥＭＭ）の研究：以前に記載されているように（Ｐｅｒｅｒａら、２００９；Ｃｈｏら、２０１３）、ＥＧＦＲ  Ｄ７７０ｉｎｓＮＰＧおよびＨＥＲ２  Ａ７７５ｉｎｓＹＶＭＡ  ＧＥＭＭを作製した。マウスは、ｔｈｅ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅにより規定されているようなＧｏｏｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓに従って取り扱い、Ｄａｎａ−Ｆａｒｂｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）からの認可を得て実施した。マウスは６週齢からドキシサイクリン食飼を与えられた。以前に記載されているように（Ｐｅｒｅｒａら、２００９；Ｃｈｏら、２０１３）、ＭＲＩにより、腫瘍体積を測定した。ＭＲＩにより明らかな腫瘍形成が決定されると、等しい初期腫瘍体積を有するマウスは、ビヒクルおよび毎日１０ｍｇ／ｋｇのポジオチニブに非盲目的に無作為化された。腫瘍量に関係のない事象のために人的に安楽死されたマウスは、最終的な分析から除外された。
【０１２３】
本明細書において開示され、特許請求される方法の全ては、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく、構築および実施することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書において記載された方法および工程、または方法の工程の順序に変更が適用されてもよいことが、明らかであろう。より具体的には、化学的および生理的に関連する特定の剤が本明細書に記載の剤の代わりに用いられてもよく、それらが同じまたは同様の結果に到達し得ることは、明らかであろう。当業者には明らかである全てのかかる同様の置換および修飾は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の精神、範囲、および概念の範囲内であるとみなされる。
【０１２４】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示された参考文献を補足する例示的な手順的なまたは他の詳細を提供するものであり、参照により本明細書に具体的に取り込まれる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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