(57)【要約】本開示は、標的粒子を選別する方法および装置を提供する。様々な態様において、本開示は、標的粒子を選別するためのカセット、標的粒子を選別するための方法、試料物質の生存能力を維持するためにマイクロチャネルに装填する方法、試料物質を定量する方法、およびレーザスキャン式粒子選別のための光学装置を提供する。2020514732.tif 000003
2020514732.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む、標的粒子を検出し、かつ選別するためのカセット：
第一の表面および第二の表面ならびに該第一の表面から該第二の表面まで延びる複数のマイクロチャネルを有する基板；
該基板から放出された標的粒子を受けるための内面を含む、該基板を受けるように構成された第一のハウジング；
該第一のハウジングといっしょに該基板を封入するやり方で該第一のハウジングに結合された第二のハウジングであって、該第一または第二のハウジングが第一のフィルポートをさらに含む、第二のハウジング；および
該第一のハウジングおよび該第二のハウジングの一方またはそれぞれの中に位置する、カセットの外側から該基板への電磁放射線の伝送を可能にする透過性部分。
【請求項２】
透過性部分が、約250nm〜1600nmの範囲の波長に対して少なくとも部分的に透過性である、請求項1記載のカセット。
【請求項３】
透過性部分が第一のハウジング中に位置する、請求項1または2記載のカセット。
【請求項４】
透過性部分が第二のハウジング中に位置する、請求項1〜3のいずれか一項記載のカセット。
【請求項５】
第一のフィルポートが、試料物質混合物をカセットの中に受けるように構成されている、請求項1〜4のいずれか一項記載のカセット。
【請求項６】
第一のハウジングが第一のフィルポートを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のカセット。
【請求項７】
第二のハウジングが第一のフィルポートを含む、請求項1〜5のいずれか一項記載のカセット。
【請求項８】
第一または第二のハウジングがリリースポートをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項記載のカセット。
【請求項９】
リリースポートが、カセット中の該リリースポートの外への標的粒子の移送を可能にするために、内面と流体連通している、請求項8記載のカセット。
【請求項１０】
第一のハウジングがリリースポートを含む、請求項8または9記載のカセット。
【請求項１１】
第二のハウジングがリリースポートを含む、請求項8または9記載のカセット。
【請求項１２】
第二のハウジングが第一のハウジングの上に配置されている、請求項1〜11のいずれか一項記載のカセット。
【請求項１３】
第一のハウジングが第二のハウジングに対して実質的に平行な平面に配置されている、請求項1〜12のいずれか一項記載のカセット。
【請求項１４】
第一の表面および第二の表面ならびに該第一の表面から該第二の表面まで延びる複数のマイクロチャネルを有する基板；
該基板から放出された標的粒子を受けるための内面を含む、該基板を受けるように構成された第一のハウジング；
該第一のハウジングといっしょに該基板を封入するやり方で該第一のハウジングに結合された第二のハウジング
を含み、
該第一または第二のハウジングが、標的粒子混合物をカセットに導入するための第一のフィルポートをさらに含み、
該第一または第二のハウジングが、該カセットから標的粒子を放出するためのリリースポートをさらに含む、
標的粒子を検出し、かつ選別するためのカセット。
【請求項１５】
第一のハウジングが第一のフィルポートを含む、請求項14記載のカセット。
【請求項１６】
第二のハウジングが第一のフィルポートを含む、請求項14記載のカセット。
【請求項１７】
第一のハウジングがリリースポートを含む、請求項14〜16のいずれか一項記載のカセット。
【請求項１８】
第二のハウジングがリリースポートを含む、請求項14〜16のいずれか一項記載のカセット。
【請求項１９】
第一のハウジングおよび第二のハウジングの1つまたはそれぞれの中に位置する、該カセットの外側から基板への電磁放射線の伝送を可能にする透過性部分
をさらに含む、請求項14〜18のいずれか一項記載のカセット。
【請求項２０】
透過性部分が、約250nm〜1600nmの範囲の波長に対して少なくとも部分的に透過性である、請求項19記載のカセット。
【請求項２１】
第二のハウジングが第一のハウジングの上に配置されている、請求項14〜20のいずれか一項記載のカセット。
【請求項２２】
第一のハウジングが第二のハウジングに対して実質的に平行な平面に配置されている、請求項14〜21のいずれか一項記載のカセット。
【請求項２３】
第一のハウジングと第二のハウジングとが1つのハウジングユニットとして不可逆的に結合されている、請求項1〜22のいずれか一項記載のカセット。
【請求項２４】
第一および第二のハウジングが可逆的なやり方で互いに結合されている、請求項1〜22のいずれか一項記載のカセット。
【請求項２５】
基板がガラスを含む、請求項1〜24のいずれか一項記載のカセット。
【請求項２６】
複数のマイクロチャネルが互いに対して実質的に平行に配置されている、請求項1〜25のいずれか一項記載のカセット。
【請求項２７】
複数のマイクロチャネルが約100万〜約1000億のマイクロチャネルである、請求項1〜26のいずれか一項記載のカセット。
【請求項２８】
複数のマイクロチャネルが約50nm〜約500μmの平均内径を有する、請求項1〜27のいずれか一項記載のカセット。
【請求項２９】
基板の第一の表面から第二の表面までの距離が平均で約10μm〜約1mmである、請求項1〜28のいずれか一項記載のカセット。
【請求項３０】
基板が、
基板の第一の表面の周囲から垂直に延びる、該基板の該第一の表面上への流体の封じ込めを可能にする縁取り要素
をさらに含む、請求項1〜29のいずれか一項記載のカセット。
【請求項３１】
第一のフィルポートと流体連通した試料ウェルをさらに含み、
該試料ウェルが、試料物質混合物を前記基板のマイクロチャネルの中に装填するように構成されている、
請求項1〜30のいずれか一項記載のカセット。
【請求項３２】
試料ウェルが基板の第一の表面と接触している、請求項31記載のカセット。
【請求項３３】
試料ウェルが基板の第一の表面を横切って移動可能である、請求項31または32記載のカセット。
【請求項３４】
試料ウェルが手動的、機械的または電子式に移動可能である、請求項33記載のカセット。
【請求項３５】
第一または第二のハウジングが第二のフィルポートをさらに含む、請求項1〜34のいずれか一項記載のカセット。
【請求項３６】
第一または第二のフィルポートが第一のハウジングの内面と流体連通している、請求項35記載のカセット。
【請求項３７】
第一または第二のハウジングが第三のフィルポートをさらに含む、請求項1〜36のいずれか一項記載のカセット。
【請求項３８】
基板と接触するように配置された、または該基板に隣接して配置された水分補給膜
をさらに含む、請求項1〜37のいずれか一項記載のカセット。
【請求項３９】
第一、第二または第三のフィルポートが水分補給膜と流体連通している、請求項38記載のカセット。
【請求項４０】
第一および第二のハウジングがカセットへの汚染物質侵入を防ぐ、請求項1〜39のいずれか一項記載のカセット。
【請求項４１】
内面が収集ウェルをさらに含む、請求項1〜40のいずれか一項記載のカセット。
【請求項４２】
収集ウェルがリリースポートと流体連通している、請求項41記載のカセット。
【請求項４３】
第一または第二のハウジングが、
第一または第二のハウジングおよび基板の第一または第二の表面に取り付けられて該基板の表面に張力を加える金属フレーム
をさらに含む、請求項1〜42のいずれか一項記載のカセット。
【請求項４４】
基板が第一端、第二端および中間部分を含み、該第一端、該第二端および該中間部分がすべて実質的に同じ平面内にある、請求項1〜43のいずれか一項記載のカセット。
【請求項４５】
標的粒子が細胞を含む、請求項1〜44のいずれか一項記載のカセット。
【請求項４６】
使用前に滅菌される、請求項1〜45のいずれか一項記載のカセット。
【請求項４７】
基板が3mm×3mm×0.3mm〜5000mm×15000mm×1000mmの寸法を有する、請求項1〜46のいずれか一項記載のカセット。
【請求項４８】
基板が3mm×3mm×0.3mm〜10000mm×10000mm×100mmの寸法を有する、請求項1〜47のいずれか一項記載のカセット。
【請求項４９】
カセットの1つまたは複数の構成要素と接触している接触型探触子
をさらに含む、請求項1〜48のいずれか一項記載のカセット。
【請求項５０】
第一の表面および第二の表面ならびに該第一の表面から該第二の表面まで延びる複数のマイクロチャネル
を含む、基板であって、
該マイクロチャネルが標的粒子および不透明な材料を含み、
該標的粒子の少なくとも約50％が、透明なゲルまたは透明な固体またはそれらの組み合わせを含むスペーサにより、該不透明な材料から少なくとも約1μm離されている、基板。
【請求項５１】
標的粒子の少なくとも約50％が、透明なゲルまたは透明な固体を含むスペーサにより、不透明な材料から少なくとも約1μm離されている、請求項50記載の基板。
【請求項５２】
透明なゲルまたは固体が、アガロース、コラーゲン、マトリゲル、アルギネートおよびそれらの組み合わせを含む、請求項50または51記載の基板。
【請求項５３】
請求項1〜53のいずれか一項記載のカセットと、標的粒子の検出および選別におけるその使用のための指示書とを含む、キット。
【請求項５４】
以下の工程を含む、標的粒子を検出し、かつ選別する方法：
試料物質混合物を請求項1〜53のいずれか一項記載のカセットの中に加える工程；
該試料物質混合物を前記基板のマイクロチャネルの中に装填する工程；
該マイクロチャネルの内容物をスキャンする工程であって、1つまたは複数の標的粒子を含むマイクロチャネルを検出する、工程；および
該標的粒子を該基板から内面へ放出する工程。
【請求項５５】
試料物質混合物が第一のフィルポートを通してカセットの中に加えられる、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
試料物質混合物が試料ウェルに加えられる、請求項54または55記載の方法。
【請求項５７】
試料物質混合物が基板に加えられる、請求項54または55記載の方法。
【請求項５８】
試料物質混合物が細胞懸濁液を含む、請求項54〜57のいずれか一項記載の方法。
【請求項５９】
試料物質混合物が約1×106〜約100×109個の細胞を含む、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
試料ウェルが、ほぼ等しい量の試料物質混合物を基板の各マイクロチャネルの中に装填する、請求項54〜59のいずれか一項記載の方法。
【請求項６１】
マイクロチャネルをスキャンする工程が、第一の波長によるマイクロチャネルの照射および該マイクロチャネルからの第二の波長の検出を含み、該第二の波長が標的粒子と対応する、請求項54〜60のいずれか一項記載の方法。
【請求項６２】
マイクロチャネルの内容物をスキャンする工程が、複数の異なる波長によるマイクロチャネルの照射および該マイクロチャネルからの発光の検出を含み、
該発光が1つまたは複数の標的粒子と対応する、
請求項54〜60のいずれか一項記載の方法。
【請求項６３】
マイクロチャネルの内容物をスキャンする工程が、1つの波長によるマイクロチャネルの照射および該マイクロチャネルからの複数の発光の検出を含み、
該複数の発光が1つまたは複数の標的粒子と対応する、
請求項54〜60のいずれか一項記載の方法。
【請求項６４】
マイクロチャネルの内容物をスキャンする工程が、複数の異なる波長によるマイクロチャネルの照射および該マイクロチャネルからの複数の発光の検出を含み、
該発光の1つまたは複数が1つまたは複数の標的粒子と対応する、
請求項54〜60のいずれか一項記載の方法。
【請求項６５】
第一および第二の波長が独立して約200nm〜約1.5mmから選択される、請求項64記載の方法。
【請求項６６】
標的粒子が第三の波長からのエネルギーによって基板から内面へ放出される、請求項54〜65のいずれか一項記載の方法。
【請求項６７】
第三の波長が約200nm〜約1.5mmから選択される、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
第三の波長が約350nm〜約1200nmから選択される、請求項67記載の方法。
【請求項６９】
標的粒子が細胞である、請求項54〜68のいずれか一項記載の方法。
【請求項７０】
放出する工程ののち、標的粒子を内面からリリースポートへ移す工程をさらに含む、請求項54〜69のいずれか一項記載の方法。
【請求項７１】
標的粒子を内面からリリースポートへ移す工程が、第一または第二のフィルポートに溶液を加えて該標的粒子を該リリースポートへ移すことを含む、請求項70記載の方法。
【請求項７２】
溶液が緩衝液である、請求項71記載の方法。
【請求項７３】
基板を音波処理する工程をさらに含み、
該音波処理する工程がスキャンする工程の前に実施される、
請求項54〜72のいずれか一項記載の方法。
【請求項７４】
音波処理する工程が、装填する工程の前に、それと同時並行に、またはその後に、あるいはそれらの組み合わせで実施される、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
音波処理する工程が、基板を接触型探触子と接触させることを含む、請求項74記載の方法。
【請求項７６】
透明な溶液と複数の不透明な粒子とを含む第一の混合物を基板のマイクロチャネルに加える工程；および
試料成分と水溶液とを含む第二の混合物を基板のマイクロチャネルに加える工程
を含む、複数のマイクロチャネルを含む基板のマイクロチャネルの中に混合物を装填する方法。
【請求項７７】
透明な溶液がゲル化剤を含む、請求項76記載の方法。
【請求項７８】
ゲル化剤が、天然ガム、デンプン、ペクチン、寒天、ゼラチンまたはそれらの組み合わせを含む、請求項77記載の方法。
【請求項７９】
第二の混合物の添加の前に第一の混合物を固化させる工程をさらに含む、請求項76〜78のいずれか一項記載の方法。
【請求項８０】
マイクロチャネルへの第一の混合物の添加の後かつ該マイクロチャネルへの第二の混合物の添加の前に、試薬を加えて該第一の混合物の一部分を該マイクロチャネルから取り出す工程をさらに含む、請求項79記載の方法。
【請求項８１】
試料成分が細胞である、請求項76〜80のいずれか一項記載の方法。
【請求項８２】
複数の不透明な粒子が第四の波長の放射線を吸収する、請求項76〜81のいずれか一項記載の方法。
【請求項８３】
第四の波長が約250nm〜約1.5mmから選択される、請求項82記載の方法。
【請求項８４】
複数の不透明な粒子の90％以上がマイクロチャネル中の試料成分と接触しない、請求項76〜83のいずれか一項記載の方法。
【請求項８５】
複数の不透明な粒子が、マイクロチャネル中、試料成分から少なくとも約1μm以上の距離だけ離されている、請求項76〜83のいずれか一項記載の方法。
【請求項８６】
試料成分と、不透明なコアおよび該コアを包囲するシェルを含む粒子とを基板のマイクロチャネルに加える工程を含む、複数のマイクロチャネルを含む基板のマイクロチャネルの中に混合物を装填する方法。
【請求項８７】
シェルが透明な材料を含む、請求項86記載の方法。
【請求項８８】
透明な材料がゲルを含む、請求項87記載の方法。
【請求項８９】
試料成分が細胞を含む、請求項76〜88のいずれか一項記載の方法。
【請求項９０】
試料成分および粒子が順次に基板のマイクロチャネルに加えられる、請求項86〜89のいずれか一項記載の方法。
【請求項９１】
試料成分および粒子が同時に基板のマイクロチャネルに加えられる、請求項86〜89のいずれか一項記載の方法。
【請求項９２】
不透明なコアが磁性ビーズを含む、請求項86〜91のいずれか一項記載の方法。
【請求項９３】
第一に、試料成分と、波長X1を吸収しない複数の第一の粒子とをマイクロチャネルに加える工程；および
第二に、該マイクロチャネルに、波長X1を吸収する複数の第二の粒子を該マイクロチャネルに加える工程
を含む、複数のマイクロチャネルを含む基板のマイクロチャネルの中に混合物を装填する方法。
【請求項９４】
複数の第二の不透明な粒子が磁性ビーズを含む、請求項93記載の方法。
【請求項９５】
標的粒子と、複数の磁性粒子と、複数の非磁性粒子とを含む試料物質混合物をマイクロチャネルに加える工程；および
該複数のマイクロチャネルの上または下から磁力を加えて該磁性粒子を引き寄せて、該非磁性粒子の上または下に層を形成する工程
を含む、複数のマイクロチャネルを含む基板のマイクロチャネルの中に試料混合物を装填する方法。
【請求項９６】
磁力を加えたのち、磁性粒子の50％以上が標的粒子と接触しない、請求項95記載の方法。
【請求項９７】
磁力を加えたのち、磁性粒子の50％以上が試料成分から少なくとも約1μm以上離されている、請求項95または96記載の方法。
【請求項９８】
非磁性粒子が、シリカ、アガロース、ポリスチレンまたはそれらの組み合わせを含む粒子から選択される、請求項95〜97のいずれか一項記載の方法。
【請求項９９】
標的粒子が無傷細胞または溶解細胞を含む、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
試料物質混合物中の磁性粒子：非磁性粒子の重量比が約1：0.5〜約1：10である、請求項95〜99のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０１】
試料物質混合物中の磁性粒子の濃度が約1mg/mL〜約30mg/mLである、請求項95〜100のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０２】
試料物質混合物中の非磁性粒子の濃度が約1mg/mL〜約100mg/mLである、請求項95〜101のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０３】
まず、試料混合物を基板のマイクロチャネルに加える工程；
該試料混合物を加えたのち、蛍光物質で標識された粒子を該基板の該マイクロチャネルに加える工程；および
該マイクロチャネル中の標的粒子の数を定量する工程
を含む、基板のマイクロチャネル中の標的粒子の数を定量する方法。
【請求項１０４】
マイクロチャネル中の標的粒子の数を定量する工程が、顕微鏡検査法を使用して実施される、請求項103記載の方法。
【請求項１０５】
粒子が不透明なビーズである、請求項103または104記載の方法。
【請求項１０６】
不透明なビーズがDynabead、AgaroseおよびProMagから選択される、請求項105記載の方法。
【請求項１０７】
試料混合物がマイクロチャネルに加えられてから約5分以上後に粒子が加えられる、請求項103〜106のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０８】
標的粒子が細胞を含む、請求項103〜107のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０９】
以下の工程を含む、基板のマイクロチャネル中の標的粒子の数を定量する方法：
標的粒子を含む試料混合物を基板のマイクロチャネルの中に加える工程；
蛍光物質を該基板の該マイクロチャネルに加える工程；および
該マイクロチャネルから放出された蛍光を検出することによって該マイクロチャネル中の標的粒子の数を定量する工程であって、該放出された蛍光の強度が標的粒子計数に相関する、工程。
【請求項１１０】
蛍光物質が溶解状態にある、請求項109記載の方法。
【請求項１１１】
試料混合物および蛍光物質が同時並行的にマイクロチャネルに加えられる、請求項109または110記載の方法。
【請求項１１２】
蛍光物質が標的粒子と会合する、請求項109記載の方法。
【請求項１１３】
放出される高い蛍光が低い標的粒子計数またはゼロ標的粒子計数と相関し、放出される低い蛍光が高い標的粒子計数と相関する、請求項109〜112のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１４】
標的粒子が細胞である、請求項109〜113のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１５】
以下を含む、標的粒子を検出し、かつ選別するためのカセット：
第一の表面および第二の表面を有する基板であって、該第二の表面が、試料物質混合物を該第二の表面に付着させるように構成されている、基板；
該基板から放出された標的粒子を受けるための内面を含む、該基板を受けるように構成された第一のハウジング；
該第一のハウジングといっしょに該基板を封入するやり方で該第一のハウジングに結合された第二のハウジングであって、該第一または第二のハウジングが第一のフィルポートをさらに含む、第二のハウジング；および
該第一のハウジングおよび該第二のハウジングの一方またはそれぞれの中に位置する、カセットの外側から該基板への電磁放射線の伝送を可能にする透過性部分。
【請求項１１６】
第二の表面への試料物質混合物の付着を高めるために、基板の該第二の表面が少なくとも部分的にコートされている、請求項115記載のカセット。
【請求項１１７】
第二の表面への標的粒子の付着を高めるために、基板の該第二の表面が少なくとも部分的にコートされている、請求項115または116記載のカセット。
【請求項１１８】
基板がガラスを含む、請求項115〜117のいずれか一項記載のカセット。
【請求項１１９】
表面上または複数のチャネル中に位置する標的粒子から蛍光を生成するための励起ビームを放出するための励起光源；
該標的粒子から蛍光を受けるための検出器；
該表面または複数のチャネルから標的粒子を取り出すための抽出ビームを提供するための抽出レーザ；
該表面または複数のチャネルへの該励起ビームおよび該抽出ビームをスキャンするための、該抽出ビームに結合されたスキャナ；および
該表面またはチャネルから検出された蛍光に応答して標的粒子を選択的に取り出すための、該検出器および該抽出ビームに結合された回路
を含む、毎秒約5,000〜約100,000,000個の標的粒子の範囲内の速度で該表面または複数のチャネルを処理するように構成されている、標的粒子を選別するための装置。
【請求項１２０】
表面上に位置する標的粒子から蛍光を生成するための励起ビームを放出するための励起光源；
該標的粒子から蛍光を受けるための検出器；
該表面から標的粒子を取り出すための抽出ビームを提供するための抽出レーザ；
該表面への該励起ビームおよび該抽出ビームをスキャンするための、該抽出ビームに結合されたスキャナ；
該表面から検出された蛍光に応答して標的粒子を選択的に取り出すための、該検出器および該抽出ビームに結合された回路
を含む、毎秒約5,000〜約100,000,000個の標的粒子の範囲内の速度で該表面を処理するように構成されている、請求項119記載の装置。
【請求項１２１】
複数のチャネル中に位置する標的粒子から蛍光を生成するための励起ビームを放出するための励起光源；
該標的粒子から蛍光を受けるための検出器；
複数のチャネルから標的粒子を取り出すための抽出ビームを提供するための抽出レーザ；
複数のチャネルへの該励起ビームおよび該抽出ビームをスキャンするための、該抽出ビームに結合されたスキャナ；および
該チャネルから検出された蛍光に応答して標的粒子を選択的に取り出すための、該検出器および該抽出ビームに結合された回路
を含む、毎秒約5,000〜約100,000,000個の標的粒子の範囲内の速度で該複数のチャネルを処理するように構成されている、請求項119記載の装置。
【請求項１２２】
回路、抽出レーザおよび検出器が、毎秒約25,000〜約20,000,000個の標的粒子の範囲内の速度で表面または複数のチャネルを処理するように構成されている、請求項119記載の装置。
【請求項１２３】
スキャナが、表面または複数のチャネルに沿って励起ビームおよび抽出ビームをいっしょにスキャンするために、該励起ビームおよび該抽出ビームに光学的に結合されている、請求項119または120記載の装置。
【請求項１２４】
スキャナ、励起ビームおよび抽出ビームが、表面または複数のチャネルへの励起ビームおよび抽出ビームをスキャンするために、光学素子と整列し、該励起ビームが該抽出ビームから離れている、請求項123記載の装置。
【請求項１２５】
スキャナおよび複数の抽出ビームが、表面または複数のチャネルへの抽出ビームをスキャンするために、光学素子と整列し、該抽出ビームが互いから離れ、独立して変調される、請求項123記載の装置。
【請求項１２６】
光学素子が、励起ビームを表面上の第一の位置または複数のチャネルの第一のチャネルに集束させると同時に抽出ビームを該表面上の第二の位置または該複数のチャネルの第二のチャネルに集束させるように構成され、該第一の位置が該第二の位置から約100μm〜約5mmの範囲内の距離だけ離れ、任意で、該距離が約250μm〜約1mmの範囲内である、請求項124記載の装置。
【請求項１２７】
スキャナ、光学素子、励起ビームおよび抽出ビームが、該励起ビームを表面上の第一の位置または複数のチャネルの第一のチャネルに集束させると同時に該抽出ビームを該表面上の第二の位置または該複数のチャネルの第二のチャネルに集束させるように配置され、該第一の位置が該第二の位置から約100μm〜約1mmの範囲内の距離だけ離れている、請求項124記載の装置。
【請求項１２８】
スキャナが1つまたは複数の実質的に平坦な鏡面を含み、励起ビームおよび抽出ビームが、該複数の実質的に平坦な鏡面それぞれからいっしょに反射するように配置されている、請求項123記載の装置。
【請求項１２９】
スキャナが、励起ビームを反射させかつスキャンするための第一のスキャナと、抽出ビームを反射させかつスキャンするための第二のスキャナとを含み、表面または複数のチャネルから標的粒子を選択的に取り出すために、アレイに沿って、該第一のスキャナによる該励起ビームのスキャンと該第二のスキャナによる該抽出ビームのスキャンとを同調させるように回路が構成されている、請求項123記載の装置。
【請求項１３０】
第一のスキャナおよび第二のスキャナが、表面または複数のチャネルを画定する基板の1つの側に位置する、請求項129記載の装置。
【請求項１３１】
第一のスキャナおよび第二のスキャナが、表面または複数のチャネルを画定する支持体の両側に位置する、請求項129記載の装置。
【請求項１３２】
第一のスキャナおよび第二のスキャナが、独立して、ポリゴンスキャナ、ガルバノメータスキャナ、音響光学変調器、デジタル光処理システム（DLPS）およびレゾナントスキャナからなる群より選択される、請求項129記載の装置。
【請求項１３３】
スキャナが、ポリゴンスキャナ、ガルバノメータスキャナおよび音響光学変調器からなる群より選択される、請求項129記載の装置。
【請求項１３４】
回路および検出器が、表面の各位置または複数のチャネルの各チャネルにおける閾値量よりも高い標的粒子の蛍光を検出し、蛍光応答に基づいて、該表面の各位置または該複数のチャネルの各チャネルを選択的に照射するように構成され、該蛍光と該照射との間の経過時間の長さが約10ns〜約100μsの範囲内、任意で約100ns〜約10μsの範囲内にある、請求項119記載の装置。
【請求項１３５】
励起光源、抽出レーザおよび回路が共通のクロックに対して同期化される、請求項119記載の装置。
【請求項１３６】
励起光源が、複数の波長を放出するように構成され、該複数の波長それぞれが、該複数の波長の他のピークから離れたピークを含む、請求項119記載の装置。
【請求項１３７】
励起光源が、LEDおよびレーザからなる群より選択される、請求項119記載の装置。
【請求項１３８】
光学素子が対物レンズを含み、励起光源、該対物レンズおよび検出器が共焦点配置に整列している、請求項119記載の装置。
【請求項１３９】
対物レンズがFシータ光学素子を含む、請求項138記載の装置。
【請求項１４０】
スキャナがミラーを含み、
共焦点配置で表面上の複数の位置への励起ビームをスキャンし、かつ該表面上の該複数の位置からの蛍光を計測するために、光学素子が、
該励起ビームを、該ミラーによって第一の角度で対物レンズに通して該表面の該位置に集束させ、該表面の該位置における第一の標的粒子からの第一の蛍光を、該ミラーによって該第一の角度で該対物レンズに通して検出器に伝送するように配置され、
該励起ビームを、該ミラーによって第二の角度で該対物レンズに通して該表面の第二の位置に集束させ、該表面の該第二の位置における第二の標的粒子からの蛍光を、該ミラーによって該第二の角度で該対物レンズに通して該検出器に伝送するように配置されている、
請求項138記載の装置。
【請求項１４１】
スキャナがミラーを含み
共焦点配置で複数のチャネルへの励起ビームをスキャンし、かつ該複数のチャネルからの蛍光を計測するために、光学素子が、
該励起ビームを、該ミラーによって第一の角度で対物レンズに通して該複数のチャネルの第一のチャネルに集束させ、該複数のチャネルの該第一のチャネル中の第一の標的粒子からの第一の蛍光を、該ミラーによって該第一の角度で該対物レンズに通して検出器に伝送するように配置され、
該励起ビームを、該ミラーによって第二の角度で該対物レンズに通して該複数のチャネルの第二のチャネルに集束させ、該複数のチャネルの該第二のチャネル中の第二の標的粒子からの蛍光を、該ミラーによって該第二の角度で該対物レンズに通して該検出器に伝送するように配置されている、
請求項138記載の装置。
【請求項１４２】
光学素子が、励起ビームを、検出器の視野と同軸に、対物レンズに通して伝送するように配置されている、請求項138記載の装置。
【請求項１４３】
励起ビームが表面のある位置または複数のチャネルのうちあるチャネルに集束するとき、検出器の視野が、該表面または該複数のチャネルを画定する基板の表面に沿って約100mm以下であり、任意で、該ビームが、拡散無限共役励起光を利用するように構成されている、請求項138記載の装置。
【請求項１４４】
検出器が、表面または複数のチャネルにおける視野を含み、該表面または複該数のチャネルにおけるビームの半値全幅断面サイズが該表面または該複数のチャネルにおける該視野以下であり、任意で、該半値全幅断面サイズが該視野の約半分以下である、請求項138記載の装置。
【請求項１４５】
検出器の視野が、アパーチャ、アパーチャを横切る寸法、ピンホール、ミラー、およびミラーを横切る反射面を横切る最大寸法からなる群より選択される光学構造によって画定される、請求項144記載の装置。
【請求項１４６】
検出器が複数の検出器を含み、該複数の検出器それぞれの視野が励起ビームと共焦点配置に整列している、請求項138記載の装置。
【請求項１４７】
励起ビームが複数の重なり合う励起ビームを含み、該複数の励起ビームそれぞれが検出器と共焦点配置に整列している、請求項138記載の装置。
【請求項１４８】
励起ビームが第一の励起ビームおよび第二の励起ビームを含み、第一の検出器の第一の視野が該第一の励起ビームと共焦点であり、第二の検出器の第二の視野が該第二の励起ビームと共焦点である、請求項138記載の装置。
【請求項１４９】
1つの標的粒子を含むために、複数のチャネルそれぞれの最大断面寸法が約10μm〜約100μmの範囲内である、請求項119記載の装置。
【請求項１５０】
標的粒子の蛍光に応答して、表面またはチャネルから標的粒子を抽出するのに十分な量のエネルギーで抽出ビームをパルシングし、標的粒子の生存を可能にするように回路が構成され、任意で、該標的粒子を抽出するためのエネルギーの量が約0.1μJ〜約1000μJの範囲内である、請求項119記載の装置。
【請求項１５１】
複数の標的粒子を抽出するための複数のパルスを生成するように回路が構成され、各抽出される標的粒子への抽出エネルギーの量が約1μJ〜約50μJの範囲内であり、各抽出される標的粒子への該抽出エネルギーの持続時間が約0.1ns〜約1000nsの範囲内であり、複数の抽出される標的粒子それぞれへのピーク抽出パワーが約0.1W〜約107Wの範囲内である、請求項150記載の装置。
【請求項１５２】
標的粒子を含むようにサイズ設定された複数のチャネルに光を向けるための対物レンズ；
該複数のチャネルに含まれた該標的粒子から蛍光を生成するために該対物レンズに光学的に結合された、励起ビームを生成するための光源；
該標的粒子から蛍光を受けるための、該対物レンズに光学的に結合された二次元アレイ検出器；
該複数のチャネルから標的粒子を取り出すための抽出ビームを生成するためのレーザ；および
該複数のチャネルへの該抽出ビームをスキャンするための、該抽出ビームに光学的に結合されたスキャナ
を含む、標的粒子を選別するための装置。
【請求項１５３】
対物レンズが、表面または複数のチャネルに向かう該レンズの第一の側に第一の光路を画定し、該表面または該複数のチャネルから離れている該対物レンズの第二の側に第二の光路を画定し、抽出ビーム、励起ビームおよび二次元アレイ検出器が該第二の光路の少なくとも一部分に沿って該対物レンズに光学的に結合している、請求項152記載の装置。
【請求項１５４】
抽出ビームを対物レンズに結合するための第一のビームスプリッタと、励起ビームを該対物レンズに結合し、二次元アレイ検出器を該対物レンズに結合するための第二のビームスプリッタとをさらに含む、請求項152記載の装置。
【請求項１５５】
第一のビームスプリッタが、抽出ビームを対物レンズに向けて反射するための、該対物レンズに向けられた該第一のビームスプリッタの表面に位置するダイクロイックコーティングを含み、第二のビームスプリッタが、励起ビームを該対物レンズに向けて反射させ、該対物レンズを通過する標的粒子からの蛍光を二次元アレイ検出器に伝送するように構成されたダイクロイックビームスプリッタを含む、請求項154記載の装置。
【請求項１５６】
スキャナからの抽出ビームを対物レンズに結合するためのFシータリレーレンズをさらに含む、請求項156記載の装置。
【請求項１５７】
スキャナからの抽出ビームを対物レンズに結合するためのFシータリレーレンズ対をさらに含む、請求項156記載の装置。
【請求項１５８】
ビームスプリッタと励起光源との間で励起ビームを濾波するための、励起ビームに結合された波長セレクタをさらに含み、
任意で、該波長セレクタが、複数のフィルタを含むフィルタホイール、プリズムおよび格子からなる群より選択される、
請求項152記載の装置。
【請求項１５９】
複数の標的粒子を含む試料物質混合物を含む複数のマイクロチャネルを有する基板を提供する工程；
励起ビームによって該マイクロチャネルの内容物をスキャンする工程；
マイクロチャネル中の該標的粒子の存在を示す、該マイクロチャネルから放出された蛍光シグナルを検出する工程；および
抽出ビームによってマイクロチャネルから該標的粒子を抽出する工程
を含み、1つのマイクロチャネルから該蛍光を検出する工程と該標的粒子を抽出する工程との間の経過時間の長さが約10ns〜約100μsである、標的粒子を検出し、かつ選別する方法。
【請求項１６０】
複数の標的粒子を含む試料物質混合物を含む複数のマイクロチャネルを有する基板を提供する工程；
励起ビームによって該マイクロチャネルの内容物をスキャンする工程；
マイクロチャネル中の該標的粒子の存在を示す、該マイクロチャネルから放出された蛍光シグナルを検出する工程；および
抽出ビームによって該マイクロチャネルから該標的粒子を抽出する工程
を含み、励起ビームによって該マイクロチャネルをスキャンする工程が、毎秒1,000,000マイクロチャネルを超える、毎秒2,000,000マイクロチャネルを超える、または毎秒3,000,000マイクロチャネルを超える速度で起こる、標的粒子を検出し、かつ選別する方法。
【請求項１６１】
複数の標的粒子を含む試料物質混合物を含む複数のマイクロチャネルを有する基板を提供する工程；
励起ビームによって該マイクロチャネルの内容物をスキャンする工程；
マイクロチャネル中の該標的粒子の存在を示す、該マイクロチャネルから放出された蛍光シグナルを検出する工程；および
抽出ビームによってマイクロチャネルから該標的粒子を抽出する工程
を含み、抽出ビームによって該マイクロチャネルから該標的粒子を抽出する工程が、毎秒500,000マイクロチャネルを超える、毎秒600,000マイクロチャネルを超える、毎秒700,000マイクロチャネルを超える、毎秒800,000マイクロチャネルを超える、毎秒900,000マイクロチャネルを超える、または毎秒1,000,000マイクロチャネルを超える速度で起こる、標的粒子を検出し、かつ選別する方法。
【請求項１６２】
複数の標的粒子を含む試料物質混合物を含む複数のマイクロチャネルを有する基板を提供する工程；
励起ビームによって該マイクロチャネルの内容物をスキャンする工程；
マイクロチャネル中の該標的粒子の存在を示す、該マイクロチャネルから放出された蛍光シグナルを検出する工程；および
抽出ビームによってマイクロチャネルから該標的粒子を抽出する工程
を含み、該マイクロチャネルから該標的粒子を抽出する工程が、90％を超える、95％を超える、または99％を超える純度で粒子の収集を生じさせる、標的粒子を検出し、かつ選別する方法。
【請求項１６３】
a. 蛍光励起光を試料に向け、該試料から放出された蛍光の放出を誘発するように構成された蛍光励起光源；
b. 該試料から放出された蛍光を受けるように構成された対物レンズ；および
c. 該対物レンズによって受けられた放出された蛍光を検出するように構成された光検出器
を含み、該蛍光励起光源が、該蛍光励起光が該対物レンズを通過しないよう、蛍該光励起光を該試料に向けるように構成されている、蛍光顕微鏡。
【請求項１６４】
蛍光励起光が対物レンズを通過しないよう該蛍光励起光を試料に向けることが、光検出器によって検出されるバックグラウンド蛍光を減らす、請求項163記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１６５】
蛍光励起光が対物レンズを通過しないよう該蛍光励起光を試料に向けることが、光検出によって検出されるスペックルノイズを減らす、請求項163記載の蛍光顕微鏡。
【請求項１６６】
細胞性物質をスクリーニングして所望の表現型の細胞を同定する工程を含む、細胞を選別する方法であって、
該細胞性物質が、毎秒100,000細胞以上の速度でスクリーニングされる、方法。
【請求項１６７】
細胞性物質が、毎秒500,000細胞以上の速度でスクリーニングされる、請求項166記載の方法。
【請求項１６８】
細胞性物質が、毎秒1,000,000細胞以上の速度でスクリーニングされる、請求項167記載の方法。
【請求項１６９】
所望の表現型の細胞を、細胞性物質から毎秒100,000細胞以上の速度で抽出する工程をさらに含む、請求項166〜168のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７０】
所望の表現型の細胞が、毎秒300,000細胞以上の速度で抽出される、請求項169記載の方法。
【請求項１７１】
細胞性物質が、スルーホールを有するアレイ中でスクリーニングされる、請求項166〜170のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７２】
所望の表現型の細胞がアレイから抽出される、請求項171記載の方法。
【請求項１７３】
前記抽出工程が、電磁放射線を使用して所望の表現型の細胞を解放することを含む、請求項171〜172のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７４】
アレイの各スルーホールが0〜約5個の細胞を含み、該アレイの該スルーホールの少なくとも30％が少なくとも1つの細胞を含む、請求項173記載の方法。
【請求項１７５】
細胞性物質が、ヒト対象から得られる、および／または、5％未満のHSCおよびHSPCを含む、請求項166〜174のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７６】
抽出される細胞の95％超がHSCおよび／またはHSPCである、請求項169〜175のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７７】
抽出される細胞の95％超が所望の表現型の細胞である、請求項169〜176のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７８】
前記抽出工程から5時間以内に該細胞を評価することにより決定した場合に、抽出される細胞の95％超が生存可能である、請求項169〜177のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７９】
抽出された細胞が、さらなる滅菌工程を要することなく、治療用途に適している、請求項169〜178のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８０】
抽出された細胞が本質的に病原体フリーである、請求項169〜179のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８１】
抽出された細胞が0.1％未満の病原体を含む、請求項169〜179のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８２】
請求項169〜181のいずれか一項記載の方法によって得られる、抽出された細胞。
【請求項１８３】
請求項182記載の抽出された細胞を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、内容が参照により本明細書に組み入れられる、2016年11月14日に出願された米国特許仮出願第62/421,979号への優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
従来技術を通して、生物学的物質は、生物学的成分、たとえば細胞、抗体、タンパク質、ペプチドおよび核酸に関してスクリーニングされ得る。しかし、生物学的成分の同定、分離および特性評価には多くの難題がなおも残る。たとえば、一部の装置および方法は、時間を要する複数の選択工程を必要とする。加えて、一部の装置および方法は、試料汚染を防ぐことができず、複数の陽性シグナルを正確に検出することができず、生細胞を分離することができず、細胞を検出することができず、複数の細胞から1つの細胞を区別することができない。一部の装置および方法はまた、都合よくスクリーニングすることができる細胞の数が限られる。
【０００３】
したがって、当技術分野においては、生物学的物質、特に細胞性物質を同定し、分離し、選別し、特性評価するための新たな方法および装置の必要性が今もある。本開示は、生存可能な細胞性物質および他の標的粒子を選別するための新たな方法および装置によってこの不足に対処する。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、生存可能な細胞性物質およびその産物を含む標的粒子を選別するための新たな方法および装置を提供する。
【０００５】
いくつかの局面において、本開示は、第一の表面および第二の表面ならびに第一の表面から第二の表面まで延びる複数のマイクロチャネルを有する基板；基板から放出された標的粒子を受けるための内面を含む、基板を受けるように構成された第一のハウジング；第一のハウジングといっしょに基板を封入するやり方で第一のハウジングに結合された第二のハウジング（第一または第二のハウジングは第一のフィルポートをさらに含む）；第一のハウジングおよび第二のハウジングの一方またはそれぞれの中に位置する、カセットの外側から基板への電磁放射線の伝送を可能にする透過性部分、を含む、標的粒子を検出し、かつ選別するためのカセットを提供する。
【０００６】
特定の態様において、透過性部分は、約250nm〜1600nmの範囲の波長に対して少なくとも部分的に透過性である。特定の態様において、透過性部分は第一のハウジング中に位置する。いくつかの態様において、透過性部分は第二のハウジング中に位置する。
【０００７】
特定の態様において、第一のフィルポートは、試料物質混合物をカセットの中に受けるように構成されている。特定の態様においては、第一のハウジングが第一のフィルポートを含む。いくつかの態様においては、第二のハウジングが第一のフィルポートを含む。
【０００８】
特定の態様において、第一または第二のハウジングはリリースポートをさらに含む。特定の態様において、リリースポートは、リリースポートからカセット中への標的粒子の移送を可能にするために、内面と流体連通している。特定の態様においては、第一のハウジングがリリースポートを含む。いくつかの態様においては、第二のハウジングがリリースポートを含む。
【０００９】
特定の態様において、第二のハウジングは第一のハウジングの上に配置されている。特定の態様において、第一のハウジングは第二のハウジングに対して実質的に平行な平面に配置されている。
【００１０】
いくつかの局面において、本開示は、第一の表面および第二の表面ならびに第一の表面から第二の表面まで延びる複数のマイクロチャネルを有する基板；基板から放出された標的粒子を受けるための内面を含む、基板を受けるように構成された第一のハウジング；第一のハウジングといっしょに基板を封入するやり方で第一のハウジングに結合された第二のハウジング、を含み、第一または第二のハウジングが、標的粒子混合物をカセットに導入するための第一のフィルポートをさらに含み、第一または第二のハウジングが、カセットから標的粒子を放出するためのリリースポートをさらに含む、標的粒子を検出し、かつ選別するためのカセットを提供する。
【００１１】
特定の態様においては、第一のハウジングが第一のフィルポートを含む。いくつかの態様においては、第二のハウジングが第一のフィルポートを含む。
【００１２】
特定の態様においては、第一のハウジングがリリースポートを含む。いくつかの態様においては、第二のハウジングがリリースポートを含む。
【００１３】
特定の態様において、カセットは、第一のハウジングおよび第二のハウジングの1つまたはそれぞれの中に位置する、カセットの外側から基板への電磁放射線の伝送を可能にする透過性部分をさらに含む。特定の態様において、透過性部分は、約250nm〜1600nmの範囲の波長に対して少なくとも部分的に透過性である。
【００１４】
特定の態様において、第二のハウジングは第一のハウジングの上に配置されている。特定の態様において、第一のハウジングは第二のハウジングに対して実質的に平行な平面に配置されている。様々な態様において、第一のハウジングと第二のハウジングは1つのハウジングユニットとして不可逆的に結合されている。いくつかの態様において、第一および第二のハウジングは可逆的なやり方で互いに結合されている。
【００１５】
特定の態様において、基板はガラスを含む。特定の態様において、複数のマイクロチャネルは互いに対して実質的に平行に配置されている。特定の態様において、複数のマイクロチャネルは約100万〜約1000億のマイクロチャネルである。特定の態様において、複数のマイクロチャネルは約50nm〜約500μmの平均内径を有する。特定の態様において、基板の第一の表面から第二の表面までの距離は平均で約10μm〜約1mmである。特定の態様において、基板は、基板の第一の表面の周囲から垂直に延びる、基板の第一の表面上への流体の封じ込めを可能にする縁取り要素をさらに含む。
【００１６】
特定の態様において、カセットは、第一のフィルポートと流体連通した試料ウェルをさらに含み、試料ウェルは、試料物質混合物を基板のマイクロチャネルの中に装填するように構成されている。試料ウェルは基板の第一の表面と接触し得る。試料ウェルは基板の第一の表面を横切って移動可能であり得る。特定の態様において、試料ウェルは手動式、機械式または電子式に移動可能である。
【００１７】
特定の態様において、第一または第二のハウジングは第二のフィルポートをさらに含む。第一または第二のフィルポートは第一のハウジングの内面と流体連通し得る。特定の態様において、第一または第二のハウジングは第三のフィルポートをさらに含む。特定の態様において、カセットは、基板と接触するように配置された、または基板に隣接して配置された水分補給膜をさらに含む。第一、第二または第三のフィルポートは水分補給膜と流体連通し得る。特定の態様において、第一および第二のハウジングはカセットへの汚染物質侵入を防ぐ。特定の態様において、内面は収集ウェルをさらに含む。収集ウェルはリリースポートと流体連通し得る。
【００１８】
特定の態様において、第一または第二のハウジングは、第一または第二のハウジングおよび基板の第一または第二の表面に取り付けられて基板の表面に張力を加える金属フレームをさらに含む。特定の態様において、基板は第一端、第二端および中間部分を含み、第一端、第二端および中間部分はすべて実質的に同じ平面内にある。
【００１９】
特定の態様において、標的粒子は細胞を含む。特定の態様において、カセットは使用前に滅菌される。
【００２０】
特定の態様において、基板は3mm×3mm×0.3mm〜5000mm×15000mm×1000mmの寸法を有する。特定の態様において、基板は3mm×3mm×0.3mm〜10000mm×10000mm×100mmの寸法を有する。
【００２１】
特定の態様において、カセットは、カセットの1つまたは複数の構成要素と接触している接触型探触子をさらに含む。
【００２２】
いくつかの局面において、本開示は、第一の表面および第二の表面ならびに第一の表面から第二の表面まで延びる複数のマイクロチャネルを含む基板であって、マイクロチャネルが標的粒子および不透明な材料を含み、標的粒子の少なくとも約50％が、透明なゲルまたは透明な固体またはそれらの組み合わせを含むスペーサにより、不透明な材料から少なくとも約1μm離されている、基板、を提供する。特定の態様において、標的粒子の少なくとも約50％が、透明なゲルまたは透明な固体、たとえばアガロース、コラーゲン、マトリゲル、アルギネートおよびそれらの組み合わせを含むスペーサにより、不透明な材料から少なくとも約1μm離されている。
【００２３】
いくつかの局面において、本開示は、本開示のカセットと、標的粒子の検出および選別におけるその使用のための指示書とを含む、キット、を含む。
【００２４】
いくつかの局面において、本開示は、以下の工程を含む、標的粒子を検出し、かつ選別する方法を提供する：試料物質混合物を本開示のカセットの中に加える工程；試料物質混合物を基板のマイクロチャネルの中に装填する工程；マイクロチャネルの内容物をスキャンする工程であって、1つまたは複数の標的粒子を含むマイクロチャネルを検出する、工程；および標的粒子を基板から内面へ放出する工程。
【００２５】
特定の態様において、試料物質混合物は第一のフィルポートを通してカセットの中に加えられる。試料物質混合物は試料ウェルに加えられ得る。いくつかの態様において、試料物質混合物は基板に加えられる。特定の態様において、試料物質混合物は細胞懸濁液を含む。試料物質混合物は約1×106〜約100×109個の細胞を含む。試料ウェルは、ほぼ等しい量の試料物質混合物を基板の各マイクロチャネルの中に装填し得る。
【００２６】
特定の態様において、マイクロチャネルをスキャンする工程は、第一の波長によるマイクロチャネルの照射およびマイクロチャネルからの第二の波長の検出を含み、第二の波長が標的粒子と対応する。マイクロチャネルの内容物をスキャンする工程は、複数の異なる波長によるマイクロチャネルの照射およびマイクロチャネルからの発光の検出を含み、発光が1つまたは複数の標的粒子と対応する。特定の態様において、マイクロチャネルの内容物をスキャンする工程は、1つの波長によるマイクロチャネルの照射およびマイクロチャネルからの複数の発光の検出を含み、複数の発光が1つまたは複数の標的粒子と対応する。いくつかの態様において、マイクロチャネルの内容物をスキャンする工程は、複数の異なる波長によるマイクロチャネルの照射およびマイクロチャネルからの複数の発光の検出を含み、発光の1つまたは複数が1つまたは複数の標的粒子と対応する。特定の態様において、第一および第二の波長は独立して約200nm〜約1.5mmから選択される。
【００２７】
特定の態様において、標的粒子は第三の波長からのエネルギーによって基板から内面へ放出される。特定の態様において、第三の波長は約200nm〜約1.5mm、たとえば約350nm〜約1200nmから選択される。特定の態様において、標的粒子は細胞である。
【００２８】
特定の態様において、放出工程ののち、方法は、標的粒子を内面からリリースポートへ移す工程をさらに含む。特定の態様において、標的粒子を内面からリリースポートへ移す工程は、第一または第二のフィルポートに溶液を加えて標的粒子をリリースポートへ移すことを含む。溶液は緩衝液であり得る。
【００２９】
特定の態様において、方法は、基板を音波処理する工程をさらに含み、音波処理工程はスキャン工程の前に実施される。音波処理工程は、装填工程の前に、それと同時並行に、またはその後に、あるいはそれらの組み合わせで実施され得る。特定の態様において、音波処理工程は、基板を接触型探触子と接触させることを含む。
【００３０】
いくつかの局面において、本開示は、透明な溶液と複数の不透明な粒子とを含む第一の混合物を基板のマイクロチャネルに加える工程、および試料成分と水溶液とを含む第二の混合物を基板のマイクロチャネルに加える工程を含む、複数のマイクロチャネルを含む基板のマイクロチャネルの中に混合物を装填する方法を提供する。
【００３１】
特定の態様において、透明な溶液はゲル化剤、たとえば天然ガム、デンプン、ペクチン、寒天、ゼラチンまたはそれらの組み合わせを含む。特定の態様において、方法は、第二の混合物の添加の前に第一の混合物を固化させる工程をさらに含む。特定の態様において、方法は、マイクロチャネルへの第一の混合物の添加の後かつマイクロチャネルへの第二の混合物の添加の前に、試薬を加えて第一の混合物の一部分をマイクロチャネルから取り出す工程をさらに含む。
【００３２】
特定の態様において、試料成分は細胞である。特定の態様において、複数の不透明な粒子は第四の波長の放射線を吸収する。特定の態様において、第四の波長は約250nm〜約1.5mmから選択される。特定の態様において、複数の不透明な粒子の90％以上はマイクロチャネル中の試料成分と接触しない。特定の態様において、複数の不透明な粒子は、マイクロチャネル中、試料成分から少なくとも約1μm以上の距離だけ離されている。
【００３３】
いくつかの局面において、本開示は、試料成分と、不透明なコアおよびこのコアを包囲するシェルを含む粒子とを基板のマイクロチャネルに加える工程を含む、複数のマイクロチャネルを含む基板のマイクロチャネルの中に混合物を装填する方法を提供する。
【００３４】
特定の態様において、シェルは、ゲルなどの透明な材料を含む。特定の態様において、試料成分は細胞を含む。特定の態様において、試料成分および粒子は順次に基板のマイクロチャネルに加えられる。いくつかの態様において、試料成分および粒子は同時に基板のマイクロチャネルに加えられる。特定の態様において、不透明なコアは磁性ビーズを含む。
【００３５】
いくつかの局面において、本開示は、第一に、試料成分と、波長X1を吸収しない複数の第一の粒子とをマイクロチャネルに加える工程、および第二に、波長X1を吸収する複数の第二の粒子をマイクロチャネルに加える工程を含む、複数のマイクロチャネルを含む基板のマイクロチャネルの中に混合物を装填する方法を提供する。特定の態様において、複数の第二の不透明な粒子は磁性ビーズを含む。
【００３６】
いくつかの局面において、本開示は、標的粒子と、複数の磁性粒子と、複数の非磁性粒子とを含む試料物質混合物をマイクロチャネルに加える工程、および複数のマイクロチャネルの上または下から磁力を加えて磁性粒子を引き寄せて、非磁性粒子の上または下に層を形成する工程を含む、複数のマイクロチャネルを含む基板のマイクロチャネルの中に試料混合物を装填する方法を提供する。
【００３７】
特定の態様において、磁力を加えたのち、磁性粒子の50％以上は標的粒子と接触しない。特定の態様において、磁力を加えたのち、磁性粒子の50％以上は試料成分から少なくとも約1μm以上離されている。
【００３８】
特定の態様において、非磁性粒子は、シリカ、アガロース、ポリスチレンまたはそれらの組み合わせを含む粒子から選択される。特定の態様において、標的粒子は無傷細胞または溶解細胞を含む。特定の態様において、試料物質混合物中の磁性粒子：非磁性粒子の重量比は約1：0.5〜約1：10である。特定の態様において、試料物質混合物中の磁性粒子の濃度は約1mg/mL〜約30mg/mLである。特定の態様において、試料物質混合物中の非磁性粒子の濃度は約1mg/mL〜約100mg/mLである。
【００３９】
いくつかの局面において、本開示は、まず、試料混合物を基板のマイクロチャネルに加える工程、試料混合物を加えたのち、蛍光物質で標識された粒子を基板のマイクロチャネルに加える工程、およびマイクロチャネル中の標的粒子の数を定量する工程を含む、基板のマイクロチャネル中の標的粒子の数を定量する方法を提供する。
【００４０】
特定の態様において、マイクロチャネル中の標的粒子の数を定量する工程は、顕微鏡検査法を使用して実施される。特定の態様において、粒子は不透明なビーズである。不透明なビーズはDynabead、AgaroseおよびProMagから選択され得る。特定の態様においては、試料混合物がマイクロチャネルに加えられてから約5分以上後に粒子が加えられる。特定の態様において、標的粒子は細胞を含む。
【００４１】
いくつかの局面において、本開示は、以下の工程を含む、基板のマイクロチャネル中の標的粒子の数を定量する方法を提供する：標的粒子を含む試料混合物を基板のマイクロチャネルの中に加える工程；蛍光物質を基板のマイクロチャネルに加える工程；およびマイクロチャネルから放出された蛍光を検出することによってマイクロチャネル中の標的粒子の数を定量する工程であって、放出された蛍光の強度が標的粒子計数に相関する、工程。
【００４２】
特定の態様において、蛍光物質は溶解状態にある。特定の態様において、試料混合物および蛍光物質は同時並行的にマイクロチャネルに加えられる。蛍光物質は標的粒子と会合し得る。特定の態様において、放出される高い蛍光は低い標的粒子計数またはゼロ標的粒子計数と相関し、放出される低い蛍光は高い標的粒子計数と相関する。特定の態様において、標的粒子は細胞である。
【００４３】
いくつかの局面において、本開示は、第一の表面および第二の表面を有する基板（第二の表面は、試料物質混合物を第二の表面に付着させるように構成されている）；基板から放出された標的粒子を受けるための内面を含む、基板を受けるように構成された第一のハウジング；第一のハウジングといっしょに基板を封入するやり方で第一のハウジングに結合された第二のハウジング（第一または第二のハウジングは第一のフィルポートをさらに含む）；および第一のハウジングおよび第二のハウジングの一方またはそれぞれの中に位置する、カセットの外側から基板への電磁放射線の伝送を可能にする透過性部分、を含む、標的粒子を検出し、かつ選別するためのカセットを提供する。
【００４４】
特定の態様において、第二の表面への試料物質混合物の付着を高めるために、基板の第二の表面は少なくとも部分的にコートされている。特定の態様において、第二の表面への標的粒子の付着を高めるために、基板の第二の表面は少なくとも部分的にコートされている。特定の態様において、基板はガラスを含む。
【００４５】
いくつかの局面において、本開示は、表面上または複数のチャネル中に位置する標的粒子から蛍光を生成するための励起ビームを放出するための励起光源、標的粒子から蛍光を受けるための検出器、表面または複数のチャネルから標的粒子を取り出すための抽出ビームを提供するための抽出レーザ、表面または複数のチャネルへの励起ビームおよび抽出ビームをスキャンするための、抽出ビームに結合されたスキャナ、および表面またはチャネルから検出された蛍光に応答して標的粒子を選択的に取り出すための、検出器および抽出ビームに結合された回路を含む、毎秒約5,000〜約100,000,000個の標的粒子の範囲内の速度で表面または複数のチャネルを処理するように構成されている、標的粒子を選別するための装置を提供する。
【００４６】
特定の態様において、表面上に位置する標的粒子から蛍光を生成するための励起ビームを放出するための励起光源、標的粒子から蛍光を受けるための検出器、表面から標的粒子を取り出すための抽出ビームを提供するための抽出レーザ、表面への励起ビームおよび抽出ビームをスキャンするための、抽出ビームに結合されたスキャナ、および表面から検出された蛍光に応答して標的粒子を選択的に取り出すための、検出器および抽出ビームに結合された回路を含む、毎秒約5,000〜約100,000,000個の標的粒子の範囲内の速度で表面を処理するように構成されている装置。
【００４７】
特定の態様において、複数のチャネル中に位置する標的粒子から蛍光を生成するための励起ビームを放出するための励起光源、標的粒子から蛍光を受けるための検出器、複数のチャネルから標的粒子を取り出すための抽出ビームを提供するための抽出レーザ、複数のチャネルへの励起ビームおよび抽出ビームをスキャンするための、抽出ビームに結合されたスキャナ、およびチャネルから検出された蛍光に応答して標的粒子を選択的に取り出すための、検出器および抽出ビームに結合された回路を含む、毎秒約5,000〜約100,000,000個の標的粒子の範囲内の速度で複数のチャネルを処理するように構成されている装置。
【００４８】
特定の態様において、回路、抽出レーザおよび検出器は、毎秒約25,000〜約20,000,000個の標的粒子の範囲内の速度で表面または複数のチャネルを処理するように構成されている。スキャナは、表面または複数のチャネルに沿って励起ビームおよび抽出ビームをいっしょにスキャンするために、励起ビームおよび抽出ビームに光学的に結合され得る。
【００４９】
特定の態様において、スキャナ、励起ビームおよび抽出ビームは、表面または複数のチャネルへの励起ビームおよび抽出ビームをスキャンするために、光学素子と整列し、励起ビームは抽出ビームから離れている。いくつかの態様において、スキャナおよび複数の抽出ビームは、表面または複数のチャネルへの抽出ビームをスキャンするために、光学素子と整列し、抽出ビームは互いから離れ、独立して変調される。特定の態様において、光学素子は、励起ビームを表面上の第一の位置または複数のチャネルの第一のチャネルに集束させると同時に抽出ビームを表面上の第二の位置または複数のチャネルの第二のチャネルに集束させるように構成され、第一の位置は第二の位置から約100μm〜約5mmの範囲内の距離だけ離れ、任意で、距離は約250μm〜約1mmの範囲内である。特定の態様において、スキャナ、光学素子、励起ビームおよび抽出ビームは、励起ビームを表面上の第一の位置または複数のチャネルの第一のチャネルに集束させると同時に抽出ビームを表面上の第二の位置または複数のチャネルの第二のチャネルに集束させるように配置され、第一の位置は第二の位置から約100μm〜約1mmの範囲内の距離だけ離れている。
【００５０】
特定の態様において、スキャナは1つまたは複数の実質的に平坦な鏡面を含み、励起ビームおよび抽出ビームは、複数の実質的に平坦な鏡面それぞれからいっしょに反射するように配置されている。
【００５１】
特定の態様において、スキャナは、励起ビームを反射させかつスキャンするための第一のスキャナと、抽出ビームを反射させかつスキャンするための第二のスキャナとを含み、表面または複数のチャネルから標的粒子を選択的に取り出すために、アレイに沿って、第一のスキャナによる励起ビームのスキャンと第二のスキャナによる抽出ビームのスキャンとを同調させるように、回路が構成されている。
【００５２】
特定の態様において、第一のスキャナおよび第二のスキャナは、表面または複数のチャネルを画定する基板の1つの側に位置する。いくつかの態様において、第一のスキャナおよび第二のスキャナは、表面または複数のチャネルを画定する支持体の両側に位置する。特定の態様において、第一のスキャナおよび第二のスキャナは、独立して、ポリゴンスキャナ、ガルバノメータスキャナ、音響光学変調器、デジタル光処理システム（DLPS）およびレゾナントスキャナからなる群より選択される。特定の態様において、スキャナは、ポリゴンスキャナ、ガルバノメータスキャナおよび音響光学変調器からなる群より選択される。
【００５３】
特定の態様において、回路および検出器は、表面の各位置または複数のチャネルの各チャネルにおける閾値量よりも高い標的粒子の蛍光を検出し、蛍光応答に基づいて、表面の各位置または複数のチャネルの各チャネルを選択的に照射するように構成され、蛍光と照射との間の経過時間の長さは約10ns〜約100μsの範囲内、任意で、約100ns〜約10μsの範囲内にある。特定の態様において、励起光源、抽出レーザおよび回路は共通のクロックに対して同期化されている。特定の態様において、励起光源は、複数の波長を放出するように構成され、複数の波長それぞれは、複数の波長の他のピークから離れたピークを含む。励起光源は、LEDおよびレーザからなる群より選択され得る。特定の態様において、光学素子は対物レンズを含み、励起光源、対物レンズおよび検出器は共焦点配置に整列している。
【００５４】
特定の態様において、対物レンズはFシータ光学素子を含む。特定の態様において、スキャナはミラーを含み、共焦点配置で表面上の複数の位置への励起ビームをスキャンし、表面上の複数の位置からの蛍光を計測するために、光学素子は、励起ビームを、ミラーによって第一の角度で対物レンズに通して表面のある位置に集束させ、表面のこの位置における第一の標的粒子からの第一の蛍光を、ミラーによって第一の角度で対物レンズに通して検出器に伝送するように配置され、励起ビームを、ミラーによって第二の角度で対物レンズに通して表面の第二の位置に集束させ、表面の第二位置における第二の標的粒子からの蛍光を、ミラーによって第二の角度で対物レンズに通して検出器に伝送するように配置されている。
【００５５】
特定の態様において、スキャナはミラーを含み、共焦点配置で複数のチャネルへの励起ビームをスキャンし、複数のチャネルからの蛍光を計測するために、光学素子は、励起ビームを、ミラーによって第一の角度で対物レンズに通して複数のチャネルの第一のチャネルに集束させ、複数のチャネルの第一のチャネル中の第一の標的粒子からの第一の蛍光を、ミラーによって第一の角度で対物レンズに通して検出器に伝送するように配置され、励起ビームを、ミラーによって第二の角度で対物レンズに通して複数のチャネルの第二のチャネルに集束させ、複数のチャネルの第二のチャネル中の第二の標的粒子からの蛍光を、ミラーによって第二の角度で対物レンズに通して検出器に伝送するように配置されている。
【００５６】
特定の態様において、光学素子は、励起ビームを、検出器の視野と同軸に、対物レンズに通して伝送するように配置されている。特定の態様において、励起ビームが表面のある位置または複数のチャネルのうちあるチャネルに集束するとき、検出器の視野は表面または複数のチャネルを画定する基板の表面に沿って約100mm以下であり、任意で、ビームは、拡散無限共役励起光を利用するように構成されている。特定の態様において、検出器は、表面または複数のチャネルにおける視野を含み、表面または複数のチャネルにおけるビームの半値全幅断面サイズは表面または複数のチャネルにおける視野以下であり、任意で、半値全幅断面サイズは視野の約半分以下である。特定の態様において、検出器の視野は、アパーチャ、アパーチャを横切る寸法、ピンホール、ミラー、およびミラーを横切る反射面を横切る最大寸法からなる群より選択される光学構造によって画定される。
【００５７】
特定の態様において、検出器は複数の検出器を含み、複数の検出器それぞれの視野は励起ビームと共焦点配置に整列している。特定の態様において、励起ビームは複数の重なり合う励起ビームを含み、複数の励起ビームそれぞれは検出器と共焦点配置に整列している。特定の態様において、励起ビームは第一の励起ビームおよび第二の励起ビームを含み、第一の検出器の第一の視野が第一の励起ビームと共焦点であり、第二の検出器の第二の視野が第二の励起ビームと共焦点である。
【００５８】
特定の態様において、1つの標的粒子を含むために、複数のチャネルそれぞれの最大断面寸法は約10μm〜約100μmの範囲内である。特定の態様において、標的粒子の蛍光に応答して、表面またはチャネルから標的粒子を抽出するのに十分な量のエネルギーで抽出ビームをパルシングし、標的粒子の生存を可能にするように回路が構成され、任意で、標的粒子を抽出するためのエネルギーの量は約0.1μJ〜約1000μJの範囲内である。特定の態様において、複数の標的粒子を抽出するための複数のパルスを生成するように回路が構成され、各抽出される標的粒子への抽出エネルギーの量は約1μJ〜約50μJの範囲内であり、各抽出される標的粒子への抽出エネルギーの持続時間は約0.1ns〜約1000nsの範囲内であり、複数の抽出される標的粒子それぞれへのピーク抽出パワーは約0.1W〜約107Wの範囲内である。
【００５９】
いくつかの局面において、本開示は、標的粒子を含むようにサイズ設定された複数のチャネルに光を向けるための対物レンズ、複数のチャネルに含まれた標的粒子から蛍光を生成するために対物レンズに光学的に結合された、励起ビームを生成するための光源、標的粒子から蛍光を受けるための、対物レンズに光学的に結合された二次元アレイ検出器、複数のチャネルから標的粒子を取り出すための抽出ビームを生成するためのレーザ、および複数のチャネルへの抽出ビームをスキャンするための、抽出ビームに光学的に結合されたスキャナを含む、標的粒子を選別するための装置を提供する。
【００６０】
特定の態様において、対物レンズは、表面または複数のチャネルに向かうレンズの第一の側に第一の光路を画定し、表面または複数のチャネルから離れているレンズの第二の側に第二の光路を画定し、抽出ビーム、励起ビームおよび二次元アレイ検出器は第二の光路の少なくとも一部分に沿って対物レンズに光学的に結合している。特定の態様において、装置は、抽出ビームを対物レンズに結合するための第一のビームスプリッタと、励起ビームを対物レンズに結合し、二次元アレイ検出器を対物レンズに結合するための第二のビームスプリッタとをさらに含む。特定の態様において、第一のビームスプリッタは、抽出ビームを対物レンズに向けて反射するための、対物レンズに向けられた第一のビームスプリッタの表面に位置するダイクロイックコーティングを含み、第二のビームスプリッタは、励起ビームを対物レンズに向けて反射させ、対物レンズを通過する標的粒子からの蛍光を二次元アレイ検出器に伝送するように構成されたダイクロイックビームスプリッタを含む。
【００６１】
特定の態様において、装置は、スキャナからの抽出ビームを対物レンズに結合するためのFシータリレーレンズをさらに含む。特定の態様において、装置は、スキャナからの抽出ビームを対物レンズに結合するためのFシータリレーレンズ対をさらに含む。
【００６２】
特定の態様において、装置は、ビームスプリッタと励起光源との間で励起ビームを濾波するための、励起ビームに結合された波長セレクタをさらに含み、任意で、波長セレクタは、複数のフィルタを含むフィルタホイール、プリズムおよび格子からなる群より選択される。
【００６３】
いくつかの局面において、本開示は、複数の標的粒子を含む試料物質混合物を含む複数のマイクロチャネルを有する基板を提供する工程、励起ビームによってマイクロチャネルの内容物をスキャンする工程、マイクロチャネル中の標的粒子の存在を示す、マイクロチャネルから放出された蛍光シグナルを検出する工程、および抽出ビームによってマイクロチャネルから標的粒子を抽出する工程を含み、1つのマイクロチャネルからの前記蛍光を検出する工程と前記標的粒子を抽出する工程との間の前記経過時間の長さが約10ns〜約100μsである、標的粒子を検出し、かつ選別する方法を提供する。
【００６４】
いくつかの局面において、本開示は、複数の標的粒子を含む試料物質混合物を含む複数のマイクロチャネルを有する基板を提供する工程、励起ビームによってマイクロチャネルの内容物をスキャンする工程、マイクロチャネル中の標的粒子の存在を示す、マイクロチャネルから放出された蛍光シグナルを検出する工程、および抽出ビームによってマイクロチャネルから標的粒子を抽出する工程を含み、励起ビームによって前記マイクロチャネルをスキャンする工程が、毎秒1,000,000マイクロチャネルを超える、毎秒2,000,000マイクロチャネルを超える、または毎秒3,000,000マイクロチャネルを超える速度で起こる、標的粒子を検出し、かつ選別する方法を提供する。
【００６５】
いくつかの局面において、本開示は、複数の標的粒子を含む試料物質混合物を含む複数のマイクロチャネルを有する基板を提供する工程、励起ビームによってマイクロチャネルの内容物をスキャンする工程、マイクロチャネル中の標的粒子の存在を示す、マイクロチャネルから放出された蛍光シグナルを検出する工程、および抽出ビームによってマイクロチャネルから標的粒子を抽出する工程を含み、抽出ビームによってマイクロチャネルから標的粒子を抽出する工程が、毎秒500,000マイクロチャネルを超える、毎秒600,000マイクロチャネルを超える、毎秒700,000マイクロチャネルを超える、毎秒800,000マイクロチャネルを超える、毎秒900,000マイクロチャネルを超える、または毎秒1,000,000マイクロチャネルを超える速度で起こる、標的粒子を検出し、かつ選別する方法を提供する。
【００６６】
いくつかの局面において、本開示は、複数の標的粒子を含む試料物質混合物を含む複数のマイクロチャネルを有する基板を提供する工程、励起ビームによってマイクロチャネルの内容物をスキャンする工程、マイクロチャネル中の標的粒子の存在を示す、マイクロチャネルから放出された蛍光シグナルを検出する工程、および抽出ビームによってマイクロチャネルから標的粒子を抽出する工程を含み、前記マイクロチャネルから標的粒子を抽出する工程が、90％を超える、95％を超える、または99％を超える純度で粒子の収集を生じさせる、標的粒子を検出し、かつ選別する方法を提供する。
【００６７】
いくつかの局面において、本開示は、蛍光励起光を試料に向け、試料から放出された蛍光の放出を誘発するように構成された蛍光励起光源；試料から放出された蛍光を受けるように構成された対物レンズ；および対物レンズによって受けられた放出された蛍光を検出するように構成された光検出器を含む蛍光顕微鏡を提供する。蛍光励起光源は、蛍光励起光が対物レンズを通過しないよう、蛍光励起光を試料に向けるように構成され得る。蛍光励起光が対物レンズを通過しないよう蛍光励起光を試料に向けることが、光検出器によって検出されるバックグラウンド蛍光を減らし得る。蛍光励起光が対物レンズを通過しないよう蛍光励起光を試料に向けることが、光検出によって検出されるスペックルノイズを減らし得る。
【００６８】
本開示は、細胞性物質をスクリーニングして所望の表現型の細胞を同定する工程を含む、細胞性物質が毎秒100,000細胞以上の速度でスクリーニングされる、細胞を選別する方法を提供する。特定の態様において、細胞性物質は毎秒500,000細胞以上の速度、たとえば毎秒1,000,000細胞以上の速度でスクリーニングされる。特定の態様において、方法は、前記所望の表現型の細胞を前記細胞性物質から毎秒100,000個以上の速度、たとえば毎秒300,000個以上の速度で抽出する工程をさらに含む。前記細胞性物質は、スルーホールを有するアレイ中でスクリーニングされ得、前記所望の表現型の細胞は前記アレイから抽出され得る。特定の態様において、抽出する工程は、電磁放射線を使用して前記所望の表現型の細胞を解放することを含む。特定の態様において、前記アレイの各スルーホールは0〜約5個の細胞を含み、アレイのスルーホールの少なくとも30％が少なくとも1つの細胞を含む。
【００６９】
特定の態様において、前記方法の細胞性物質は、ヒト対象から得られる、および／または5％未満のHSCおよびHSPCを含む。特定の態様においては、抽出される細胞の95％超がHSCおよび／またはHSPCである。特定の態様においては、抽出される細胞の95％超が前記所望の表現型の細胞である。特定の態様においては、前記抽出する工程から5時間以内に細胞を評価することにより決定した場合に、抽出される細胞の95％超が生存可能である。特定の態様において、抽出された細胞は、さらなる滅菌工程を要することなく、治療用途に適している。抽出された細胞は本質的に病原体フリーであり得る。抽出された細胞は0.1％未満の病原体を含み得る。特定の態様において、本開示は、本明細書における方法のいずれかによって得られる抽出された細胞およびその医薬組成物を提供する。
【００７０】
参照による組み入れ
本明細書において挙げられるすべての刊行物、特許および特許出願は、各個の刊行物、特許または特許出願が参照により組み入れられることが明確かつ個別に示される場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み入れられる。
【００７１】
本発明の特徴は以下の特許請求の範囲の中で詳細に述べられる。本発明の原理が利用されている例示的態様を記す以下の詳細な説明および添付図面を参照することにより、本発明の特徴および利点のより良い理解が得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】本発明の例示的態様の、標的粒子を選別するためのカセットである。
【図２】標的粒子を選別するためのカセットの外観を示す。
【図３】標的粒子を選別するためのカセットのいくつかの外部および内部構成要素を示す。
【図４Ａ】試料物質混合物を試料ウェルに添加または装填する1つの態様を示す。
【図４Ｂ】試料物質混合物を試料ウェルから複数のマイクロチャネルを含む基板に添加または装填する1つの態様を示す。試料ウェルは、試料物質混合物を基板に添加または装填するために、基板に対して平行に移動する。試料ウェルは、試料物質混合物を基板に添加または装填するために、基板の第一端から基板の第二端へと移動し得る。
【図４Ｃ】カセットのトップカバー上の水分補給ポートを通して溶液をカセットの水分補給膜に添加または装填する1つの態様を示す。
【図４Ｄ】水分補給膜を含むフレームを外部磁力によって基板の表面に配置する1つの態様を示す。
【図４Ｅ】カセットのボトムカバーのボトムウィンドウを通して標的粒子をスキャンする1つの態様を示す。
【図４Ｆ】抽出された標的粒子をボトムカバーの内面から収集ウェルへと洗い流す1つの態様を示す。
【図４Ｇ】抽出された細胞を洗い流し、リリースポートから回収する1つの態様を示す。
【図５Ａ】基板、シールおよび金属フレームを含む、カセットのいくつかの内部構成要素を示す。
【図５Ｂ】シールを介して金属フレームに取り付けられた基板を示す。これによって、加熱条件下で基板のたるみが減少する。
【図６】試料物質混合物を基板のマイクロチャネルの中に装填する1つの態様を示す。マイクロチャネルは第一の混合物および第二の混合物を含む。第一の混合物は透明な溶液および複数の不透明な粒子を含む。第二の混合物は細胞成分および水溶液を含む。
【図７Ａ】細胞成分および複数の不透明な粒子を装填されている基板のマイクロチャネルを示す。
【図７Ｂ】細胞成分と、不透明なコアおよびこのコアを包囲するシェルを含む複数の不透明な粒子とを装填されている基板のマイクロチャネルを示す。
【図７Ｃ】不透明な粒子または不透明なコアとそのコアを包囲するシェルとを含む粒子のいずれかを独立して装填された、細胞の抽出効率のグラフ表示である。グラフ表示は、不透明な粒子を含む細胞が、不透明なコアとそのコアを包囲するシェルとを含む粒子を含む細胞よりも低い効率で抽出されたことを示す。
【図７Ｄ】不透明な粒子または不透明なコアとそのコアを包囲するシェルとを含む粒子のいずれかを独立して装填された、細胞の生存率のグラフ表示である。グラフ表示は、不透明な粒子を含む細胞が、不透明なコアとそのコアを包囲するシェルとを含む粒子を含む細胞よりも低い生存能力を有したことを示す。
【図８Ａ】細胞成分、複数の磁性粒子および複数の非磁性粒子を含む混合物を装填されている基板のマイクロチャネルを示す。
【図８Ｂ】異なる量の非磁性粒子および一定量の磁性粒子を装填された細胞の抽出効率および生存率のグラフ表示である。
【図９Ａ】順次装填法の例示的態様を示す。
【図９Ｂ】基板の1マイクロチャネルあたりの細胞数のグラフ表示である。細胞は、Dynabeads（登録商標）との混合バッチとして複数のマイクロチャネルを含む基板に装填した。
【図９Ｃ】基板の1マイクロチャネルあたりの細胞数のグラフ表示である。細胞は、Dynabeads（登録商標）と、順次に複数のマイクロチャネルを含む基板に装填した。
【図９Ｄ】基板の1マイクロチャネルあたりの細胞数のグラフ表示である。細胞は、アガロースとの混合バッチとして複数のマイクロチャネルを含む基板に装填した。
【図９Ｅ】基板の1マイクロチャネルあたりの細胞数のグラフ表示である。細胞は、アガロースと、順次に複数のマイクロチャネルを含む基板に装填した。
【図９Ｆ】基板の1マイクロチャネルあたりの細胞数のグラフ表示である。細胞は、ProMag（登録商標）との混合バッチとして複数のマイクロチャネルを含む基板に装填した。
【図９Ｇ】基板の1マイクロチャネルあたりの細胞数のグラフ表示である。細胞は、ProMag（登録商標）と、順次に複数のマイクロチャネルを含む基板に装填した。
【図９Ｈ】基板の1マイクロチャネルあたりの細胞数のグラフ表示である。細胞は、不透明な粒子を有しない複数のマイクロチャネルを含む基板に装填した。
【図１０Ａ】蛍光物質および細胞を装填された基板のマイクロチャネルを示す。蛍光物質は細胞の存在下で置換される。マイクロチャネル中の細胞の数は蛍光置換の量によって定量される。蛍光シグナルは、低い細胞数のチャネル中でより強く、高い細胞数のチャネル中では強くない。
【図１０Ｂ】細胞の存在または非存在によって検出または視覚化される様々な蛍光強度レベルを示す。基板のマイクロチャネルはフルオレセインイソチオシアネート（FITC）チャネル中に蛍光物質を含む。相対的に暗い領域は、基板のマイクロチャネル中の1つまたは複数の細胞の存在を示す。相対的に明るい領域は、基板のマイクロチャネル中の細胞の非存在を示す。
【図１０Ｃ】細胞の存在または非存在によって検出または視覚化される様々な蛍光強度レベルを示す。基板のマイクロチャネルはフルオレセインイソチオシアネート（FITC）チャネル中に蛍光物質を含む。相対的に暗い領域は、基板のマイクロチャネル中の1つまたは複数の細胞の存在を示す。相対的に明るい領域は、基板のマイクロチャネル中の細胞の非存在を示す。細胞を含む領域は円で囲まれている。
【図１０Ｄ】基板のマイクロチャネル中、CellTracker Far Red色素で染色された細胞を含む領域を識別する。色素蛍光を含むマイクロチャネルは相対的に明るい領域に対応する。
【図１０Ｅ】基板のマイクロチャネル中、CellTracker Far Redで染色された細胞を含む領域を識別する。CellTracker Far Redを含むマイクロチャネルは相対的に明るい領域に対応する。残りの領域は、蛍光物質を含むが、細胞を含まないマイクロチャネルに対応する。
【図１０Ｆ】細胞の存在および細胞の非存在における蛍光強度のグラフ表示である。平均蛍光強度は、細胞の非存在におけるよりも細胞の存在において低かった。
【図１１】回転ポリゴンミラーを利用する、レーザスキャン式細胞選別のための光学装置の略図である。
【図１２】2つの回転ポリゴンミラーを利用する、レーザスキャン式細胞選別のための光学装置の略図である。
【図１３】2つの回転ポリゴンミラーおよび共焦点検出技術を利用する、レーザスキャン式細胞選別のための光学装置の略図である。
【図１４】ガルバノメータスキャン機構を利用する、レーザスキャン式細胞選別のための光学装置の略図である。
【図１５】マイクロチャネルアレイからの細胞のレーザ抽出に最適なパルスパワー設定を示す。
【図１６】レーザスキャン式細胞選別装置を作動させるようにプログラムまたは他のやり方で構成された例示的なデジタル処理装置を示す。
【図１７】代替蛍光検出システムの略図である。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
発明の詳細な説明
概要において、本開示の態様は、標的粒子を選別する方法および装置を提供する。様々な態様において、本開示は、標的粒子を簡単で速やかで効率的で費用効果的なやり方でスクリーニング、抽出および選別する方法および装置を提供する。加えて、様々な態様において、本開示は、標的粒子を無菌条件下でスクリーニング、抽出および選別する方法および装置を提供する。例示的態様において、本開示は、生存可能な細胞性物質を選別する方法および装置を提供する。
【００７４】
本開示は、標的粒子が広い範囲の粒子、たとえば有機および無機粒子、天然および合成粒子ならびにそれらの組み合わせを含むと想定する。本明細書において提示される標的粒子は、標的粒子の例示的態様であり、本明細書に記載される粒子に限定されない。様々な態様において、標的粒子は、質量が約20ダルトン〜約200キロダルトンである任意の粒子を含み得る。いくつかの態様において、標的粒子は蛍光を通して識別可能であり得る。いくつかの態様において、標的粒子は無機粒子、たとえば金属ビーズおよびシリカビーズを含み得る。たとえば、金属ビーズは、アルミナ（たとえばガンマアルミナ）を含むビーズを含み得る。いくつかの態様において、標的粒子はシリカビーズを含み得る。標的粒子はポリマー、たとえばポリスチレン、ポリエチレン、ポリ（ビニルピロリドン）、アクリルアミドプロピル-PEGおよびそれらの誘導体を含み得る。特定の態様において、標的粒子は、Merrifield樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、Wang樹脂、アミノメチル樹脂、SASRIN樹脂、TentaGel S AC樹脂、TentaGel PHB樹脂、TentaGel S NH2樹脂またはそれらの組み合わせを含む。標的粒子はまた、炭素ナノチューブおよびフラーレンを含み得る。特定の態様において、標的粒子は、スプリットプール合成に使用される粒子を含む。いくつかの態様において、標的粒子は、細胞性物質、たとえば全細胞、溶解細胞、細胞成分、細胞外マトリックス、生物学的組織およびそれらの部分を含む。いくつかの態様において、標的粒子は、生体分子、たとえばタンパク質、ペプチド、抗体、炭水化物、脂質、核酸、ヌクレオチド、一次代謝産物、二次代謝産物および天然物を含む。標的粒子はまた、小分子（合成および天然の小分子）、たとえば質量1000ダルトン未満の分子を含み得る。いくつかの態様において、標的粒子はウイルスを含み得る。
【００７５】
特定の態様において、標的粒子は細胞性物質、たとえば全細胞または溶解細胞を含む。細胞は、ヒト、動物、真菌、微生物、昆虫を含む生物に由来する任意の細胞およびそれらの修飾細胞であり得る。特定の態様において、標的粒子は細胞性物質混合物中で識別される。特定の態様において、細胞性物質混合物は、細胞性物質、水溶液および任意で不透明な粒子を含む。水溶液の例は媒体、緩衝液および水を含む。特定の態様において、本開示は、細胞性物質混合物から標的細胞を分離するためのシステムおよび方法であって、前記標的細胞が特定のタンパク質、炭水化物、酵素、ペプチド、ホルモン、受容体またはそれらの組み合わせを発現または生成する、システムおよび方法を提供する。特定の態様において、本開示は、特定の抗体を産生する標的細胞を細胞性物質混合物から分離するためのシステムおよび方法を提供する。特定の態様において、本開示は、特に遺伝子改変細胞または活性化細胞である標的細胞を細胞性物質混合物から分離するためのシステムおよび方法を提供する。
【００７６】
本明細書に記載される語「不透明」とは、物質が電磁スペクトルの少なくとも一部分を吸収することをいう。不透明な物質は、少なくとも部分的に、その物質への可視光の通過を可能にし得ない。不透明な物質は、約390nm〜約700nmの範囲である1つまたは複数の波長の通過を可能にし得ない。たとえば、そのような物質は、約450nm〜約495nmの範囲である1つまたは複数の波長の通過を可能にしない。
【００７７】
1つの局面において、本開示は、標的粒子を選別するためのカセットに関する。いくつかの態様において、カセットは、滅菌条件下で標的粒子の選別を可能にする密封系である。カセットは使用前に滅菌され得る。カセットは、試料完全性を損なうことなく、たとえば試料を発熱性物質または他の汚染物質に曝露することなく、ユーザが試料物質混合物および任意で他の溶液をカセットに導入することを可能にする1つまたは複数のフィルポートを含み得る。いくつかの態様において、カセットは、1回のみ使用するためのもの、たとえば使用後に廃棄可能であり得る。たとえば、カセットは、1つの患者試料から細胞性物質を選別するために使用され、使用後に廃棄処分され得る。加えて、カセットは、標的粒子の選別を容易にするために、様々な装置および機械によって受けられるように構成され得る。別の態様において、カセットは、カセットの使用方法に関する指示情報とともに利用可能であり得る。
【００７８】
別の局面において、本開示は、本開示のカセットを使用して標的粒子を選別する方法を提供する。様々な態様において、試料物質混合物は、標的粒子をスキャンし、抽出するためのカセットの基板のマイクロチャネルの中に装填され得る。例示的態様において、細胞性物質混合物が、細胞性物質をスキャンし、抽出するためのカセットの基板のマイクロチャネルの中に装填され得る。特定の態様において、試料物質混合物は、スキャンおよび抽出のための基板の第一の表面に装填され得る。特定の態様においては、1つまたは複数のタイプの細胞、たとえば特定の細胞表面マーカを有する細胞が細胞性物質混合物から抽出され得る。特定の態様においては、特定のタンパク質または関心対象の他の生体分子を分泌する1つまたは複数のタイプの細胞が細胞性物質混合物から抽出され得る。特定の態様においては、特定の細胞内タンパク質または関心対象の他の生体分子を発現する1つまたは複数のタイプの細胞が細胞性物質混合物から抽出され得る。特定の態様においては、特定の細胞小器官または他の細胞内局在性を標的とする特定の細胞内タンパク質または関心対象の他の生体分子を発現する1つまたは複数のタイプの細胞が細胞性物質混合物から抽出され得る。特定の態様においては、前述の属性の組み合わせを発現する1つまたは複数のタイプの細胞が細胞性物質混合物から抽出され得る。特定の態様において、1つまたは複数のタイプの細胞の抽出は無菌条件下で実施され得る。
【００７９】
特定の態様において、基板のマイクロチャネルは不透明な粒子を含み得る。不透明な粒子は、不透明な粒子が電磁放射線を吸収し、水性媒体の一部分を気化させ、それにより、マイクロチャネル中の細胞性物質をマイクロチャネルから放出させるプロセスに関与し得る。特定の態様において、前記プロセスから放出されるエネルギーは、細胞性物質の細胞生存能力を損なうおそれがある。細胞性物質の生存能力を保護するために、不透明な粒子が、細胞性物質の細胞生存能力を前記プロセスから保護し、保存するやり方でマイクロチャネルに加えられ得る。特定の態様において、細胞性物質の生存能力は、不透明な粒子をマイクロチャネル中の細胞から一定距離だけ離すことによって維持される。1つの態様において、方法は、基板のマイクロチャネルへの2つの混合物層の添加を含み、第一の混合物層は、透明な溶液中の不透明な粒子、たとえばゲル中に懸濁した不透明な粒子を含み、第二の混合物は水溶液中の細胞性物質を含む。特定の態様において、基板のマイクロチャネルに装填する方法は、不透明なコアと、透明な材料の絶縁性外側シェル（細胞と不透明なコアとの接触または近接を防ぐ）とを含む粒子の添加を含む。特定の態様において、基板のマイクロチャネルに装填する方法は、不透明な微粒子および透明な微粒子の添加を含み、透明な微粒子が細胞と不透明な微粒子との接触または近接を防ぐ。
【００８０】
加えて、本開示は、細胞を不透明な粒子よりもマイクロチャネルの開口部に近く配置する方法を提供する。いくつかの態様において、細胞は、マイクロチャネルの1つの開口部を通して観察され、それは、不透明な粒子を観察面から細胞に対して末端側に配置する既存の方法よりも有利である。不透明な粒子のそのような配置は、マイクロチャネルに装填された細胞の数に対し、より多数の細胞の観察を可能にし得る。特定の態様において、基板のマイクロチャネルに装填する方法は、細胞性物質混合物および不透明な粒子の順次添加を含む。
【００８１】
加えて、本開示は、マイクロチャネル内の細胞および不透明な物質の配置を制御する方法を提供する。いくつかの態様において、細胞は、音波処理または超音波処理を使用してマイクロチャネルの一端に向けて支援される。いくつかの態様において、不透明な物質は、音波処理または超音波処理を使用してマイクロチャネルの一端に向けて支援される。いくつかの態様において、これらのプロセスは順次に実施される。特定の態様において、本開示のカセットは、接触型探触子または類似の装置をさらに含み、接触型探触子は、カセット上の任意の機能的位置、たとえばハウジング内で基板と接触する位置またはハウジングの外面上の位置に配置され得る。特定の態様において、接触型探触子は、本明細書に記載されるカセットの1つまたは複数の構成要素と接触し得る。
【００８２】
加えて、本開示は、基板のマイクロチャネル中に配置された複数の細胞から1つの細胞を識別する方法を提供する。特定の態様において、方法は、観察面から細胞に対して末端側に配置された蛍光物質の使用を含む。続いて蛍光物質の蛍光を計測し得る。特定の態様において、方法は、細胞性物質の中での蛍光物質の分散を含み、細胞の存在または非存在における蛍光物質の置換を使用して細胞性物質を定量する。
【００８３】
加えて、本開示は、レーザスキャン式細胞選別のための光学装置を提供する。
【００８４】
1つの態様において、本開示は、回転ポリゴンミラーを利用する光学装置を提供する。さらなる態様において、前記装置は、リニアステージ、XYステージまたはガルバノメータと組み合わされる。
【００８５】
別の態様において、本開示は、2つの回転ポリゴンミラーを利用する光学装置を提供する。さらなる態様において、前記装置は、1つまたは複数のリニアステージ、XYステージ、ガルバノメータ、デジタル光処理システムまたはレゾナントスキャナと組み合わされる。
【００８６】
別の態様において、本開示は、2つの回転ポリゴンミラーと、共焦点検出技術とを利用する光学装置を提供する。さらなる態様において、前記装置は、リニアステージ、XYステージまたはガルバノメータと組み合わされる。
【００８７】
別の態様において、本開示は、ガルバノメータスキャン機構を利用する光学装置を提供する。さらなる態様において、前記装置は、リニアステージ、XYステージまたはガルバノメータと組み合わされる。
【００８８】
いくつかの局面において、本開示の方法は、造血幹細胞（HSC）および／または造血幹前駆細胞（HSPC）の医薬組成物の調製を前例のない無菌性、純度および生存能力をもって可能にする。特に、本開示は、以下：（a）細胞性物質を、毎秒100,000細胞以上の速度、たとえば毎秒200,000細胞以上、たとえば毎秒300,000細胞以上の速度でスクリーニングする工程；（b）細胞をスキャンする工程（元々の細胞性物質の10％未満がHSCおよび／またはHSPCを含む）；（c）所望の表現型の細胞を毎秒100,000個以上、たとえば200,000個以上、たとえば300,000個以上の速度で抽出する工程；（d）細胞を抽出し、それによって細胞抽出物を生成する工程（前記細胞抽出物の95％以上がHSCおよび／またはHSPCである）；（e）細胞を抽出し、それによって細胞抽出物を生成する工程（抽出されたHSCおよび／またはHSPCの95％以上、たとえば95％以上または98％以上が所望の表現型を有する）；（f）細胞を抽出し、それによって細胞抽出物を生成する工程（細胞抽出物は95％以上の生存率を有する）；および（g）細胞を抽出し、それによって細胞抽出物を生成する工程（細胞抽出物のHSCおよび／またはHSPCは、さらなる精製または滅菌を要することなく臨床使用に適する）、のうち1つまたは複数を含む、細胞、たとえば対象から得られた細胞を選別する方法を提供する。
【００８９】
いくつかの局面において、本開示は、以下の特徴：（a）組成物は、約1％未満の病原体および他の汚染物質、たとえば無視しうる量の病原体および他の汚染物質しか含まない；（b）組成物のHSCおよび／またはHSPCの95％以上、たとえば95％以上または98％以上が所望の表現型を有する；（c）組成物の細胞の95％以上が生存可能である；（d）組成物は0.01％未満のナイーブなT細胞を含む；および（e）組成物は治療用途に適している、のうち1つまたは複数を有するHSCおよび／またはHSPCの医薬組成物を提供する。
【００９０】
定義
本明細書において使用される用語は、特定の態様を説明するためだけのものであり、限定的であることを意図したものではないことが理解されよう。
【００９１】
別段定義されない限り、本明細書において使用される科学技術用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。いくつかの用語の拡張および明確化が本明細書に提供される。別段指示されない限り、本明細書において挙げられるすべての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は参照により明示的に組み入れられる。
【００９２】
本明細書において使用される名詞の単数形は、文脈が別段の定めを明確に指示しない限り、複数の指示対象をも含む。
【００９３】
本明細書において使用される用語「水分補給」は、流体バランスを回復または維持することを指す。
【００９４】
本明細書において使用される用語「無菌」および「滅菌」は、汚染物質、細菌、病原体または他の望まれない生物の存在を減らすことを指す。
【００９５】
本明細書において提示される図中、類似の符番の要素は類似の構成要素を指す。
【００９６】
カセット
例示的態様において、図1は、標的粒子を選別するためのカセットを示す。本開示は、標的粒子が広い範囲の粒子、たとえば有機および無機粒子、天然および合成粒子ならびにそれらの組み合わせを含むと想定する。本明細書において提示される標的粒子は、標的粒子の例示的態様であり、例示的態様によって限定されない。様々な態様において、標的粒子は、質量が約20ダルトン〜約200キロダルトンである任意の粒子を含み得る。いくつかの態様において、標的粒子は蛍光を通して識別可能であり得る。いくつかの態様において、標的粒子は無機粒子、たとえば金属ビーズおよびシリカビーズを含み得る。たとえば、金属ビーズは、アルミナ（たとえばガンマアルミナ）を含むビーズを含み得る。いくつかの態様において、標的粒子はシリカビーズを含み得る。標的粒子はポリマー、たとえばポリスチレン、ポリエチレン、ポリ（ビニルピロリドン）、アクリルアミドプロピル-PEGおよびそれらの誘導体を含み得る。たとえば、ポリマーは、Merrifield樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、Wang樹脂、アミノメチル樹脂、SASRIN樹脂、TentaGel S AC樹脂、TentaGel PHB樹脂またはTentaGel S NH2樹脂であり得る。標的粒子はまた、炭素ナノチューブおよびフラーレンを含み得る。そのような標的粒子は、スプリットプール合成に使用される粒子を含み得る。加えて、いくつかの態様において、標的粒子は細胞性物質を含み得る。細胞性物質は、全細胞、溶解細胞、細胞成分、細胞外マトリックス、生物学的組織およびそれらの部分を含み得る。いくつかの態様において、標的粒子はまた、タンパク質、ペプチド、抗体、炭水化物、脂質、核酸、ヌクレオチド、一次代謝産物、二次代謝産物および天然物をはじめとする生体分子を含み得る。標的粒子はまた、質量1000ダルトン未満の小分子（合成および天然の小分子）を含み得る。いくつかの態様において、標的粒子はウイルスを含み得る。細胞性物質は細胞懸濁液を含み得る。細胞は、ヒト、動物、真菌、微生物、昆虫を含む生物に由来する任意の細胞およびそれらの修飾細胞であり得る。細胞性物質混合物は細胞性物質、不透明な粒子および水溶液を含む。水溶液の例は媒体、緩衝液および水を含む。本開示の装置は、タンパク質、炭水化物、酵素、ペプチド、ホルモン、受容体を差次的に発現または産生する細胞ならびにさらには抗体を産生する細胞、遺伝子改変細胞および活性化細胞を分離するために使用され得る。例示的態様において、図2および3にしたがって、カセット100は、トップカバー110、ボトムカバー120、基板130、試料ウェル140およびフレーム150を含む。図2に示すように、トップカバー110は、ボトムカバー120の上に配置され、ボトムカバー120と、実質的に平行な平面に配置される。カセット100は密封系であり得る。
【００９７】
図2に示すような、標的粒子を選別するためのカセットの1つの態様において、トップカバー110は、溶液をカセット100の中に受けるための1つまたは複数のフィルポートを含み得る。いくつかの態様において、トップカバーは、カセットから溶液を抜くための1つまたは複数のアウトレットポートを含み得る。1つまたは複数のフィルポートは、溶液をカセット100に導入するように構成され得る。そのような溶液は、膜に水分補給する、試料物質混合物を基板に装填するために試料物質混合物を受ける、試料物質混合物を試料ウェルの中に受ける、および／または試料粒子、たとえば細胞性物質をカセットから抜くための緩衝液を受けるために導入され得る。
【００９８】
特定の態様において、トップカバーは、溶液をカセットの中に受けるように構成された1つのフィルポートを含む。図2に示すような例示的態様において、トップカバー110のフィルポートは、補助材料ポート112、水分補給ポート113および試料ポート114を含む。補助材料ポート112、水分補給ポート113および試料ポート114は、溶液を受けるように構成され得る。試料ポート114は、試料ウェル140の中に装填するための試料物質混合物を受けるように構成され得る。試料ポート114は試料ウェル140と流体連通し得る。別の態様において、試料ポートは、基板上および基板のマイクロチャネルの中へ直接装填するための試料物質混合物を受けるように構成され得る。いくつかの態様において、約1×106〜100×109個の細胞がカセット100の中に装填される。水分補給ポート113は、水分補給膜151に水分補給するための溶液を受けるように構成され得る。水分補給ポート113は水分補給膜151と流体連通し得る。補助材料ポート112は、カセット100から標的粒子を収集するための水溶液を受けるように構成され得る。いくつかの態様において、水溶液は緩衝液である。補助材料ポート112はボトムカバー120の内面、収集ウェル122および／または受けポート123と流体連通し得る。加えて、収集ウェル122は受けポート123と流体連通し得る。特定の態様において、本明細書に記載される任意の基板のマイクロチャネルに装填する方法は音波処理工程を伴い得る。音波処理工程は、試料物質混合物の標的粒子、不透明な粒子または他の成分がマイクロチャネルの中に留まることを可能にし得る。特定の態様において、音波処理工程は、マイクロチャネルのスキャンの前に実施され得る。たとえば、音波処理工程は、前記装填工程の前に、それと同時並行に、またはその後に、もしくはそれらの組み合わせで実施され得る。特定の態様において、音波処理工程は、マイクロチャネルの装填の前およびそれと同時並行に実施される。特定の態様において、音波処理工程は、マイクロチャネルへの装填と同時並行およびその後に実施される。
【００９９】
特定の態様において、ボトムカバーは、溶液をカセットの中に受けるための1つまたは複数のフィルポートを含み得る。いくつかの態様において、ボトムカバーは、カセットから溶液を抜くための1つまたは複数のアウトレットポートを含み得る。1つまたは複数のフィルポートは、溶液をカセットに導入するように構成され得る。そのような溶液は、膜に水分補給する、試料物質混合物を基板に装填するために試料物質混合物を受ける、試料物質混合物を試料ウェルの中に装填するために試料物質混合物を受ける、および／または試料粒子、たとえば細胞性物質をカセットから抜くための緩衝液を受けるために導入され得る。特定の態様において、ボトムカバーは、溶液をカセットの中に受けるように構成された1つのフィルポートを含む。別の態様において、ボトムカバーのフィルポートは、補助材料ポート、水分補給ポートおよび試料ポートを含む。試料ポートは、試料ウェルの中に装填するための試料物質混合物を受けるように構成され得る。試料ポートは試料ウェルと流体連通し得る。別の態様において、試料ポートは、基板上および基板のマイクロチャネルの中へ直接装填するための試料物質混合物を受けるように構成され得る。いくつかの態様において、約1×106〜100×109個の細胞がカセットの中に装填される。水分補給ポートは、水分補給膜に水分補給するための溶液を受けるように構成され得る。水分補給ポートは水分補給膜と流体連通し得る。補助材料ポートは、カセットから標的粒子を収集するための水溶液を受けるように構成され得る。いくつかの態様において、水溶液は緩衝液である。補助材料ポートは、ボトムカバーの内面、収集ウェルおよび／または受けポートと流体連通し得る。加えて、収集ウェルは受けポートと流体連通し得る。
【０１００】
様々な態様において、カセットは、電磁放射線の特定の波長に対して少なくとも部分的に透過性である透過性部分を含み得る。ある態様において、透過性部分は、250nm〜1600nmの範囲の波長に対して少なくとも部分的に透過性である。透過性部分は、ある位置から別の位置への1つまたは複数の電磁波の伝送を少なくとも部分的に可能にする材料を含む。たとえば、透過性部分は、ガラス、石英、プラスチックまたはそれらの組み合わせを含み得るが、それらに限定されない。様々な態様において、透過性部分は透過性ウィンドウである。図3に示すようないくつかの態様において、トップカバーはトップウィンドウ111を含み得る。トップウィンドウ111は透過性ウィンドウであり得る。別の態様において、トップウィンドウ111は非透過性ウィンドウであり得る。非透過性ウィンドウは、ある位置から別の位置への電磁放射線の伝送を可能にしない材料を含む。図3に示すような、標的粒子を選別するためのカセットの例示的態様において、ボトムカバー120はボトムウィンドウ121を含み得る。別の態様において、ボトムウィンドウ121は透過性ウィンドウであり得る。ボトムウィンドウ121は非透過性ウィンドウであり得る。特定の態様においては、トップウィンドウ111が非透過性ウィンドウであり、ボトムウィンドウが透過性ウィンドウであることもできる。
【０１０１】
図3によって示すような、標的粒子を選別するためのカセットの態様において、カセット100は、基板130をカセット100内に受けるように構成されている。基板はトップカバー110とボトムカバー120との間に位置する。図1に示すように、基板はカセット100のハウジングユニットによって封入される。標的粒子の選別中、基板は汚染から保護される。
【０１０２】
特定の態様において、カセットは、当技術分野において公知の任意のやり方で互いに結合される第一のハウジングおよび第二のハウジングを含む。たとえば、第一のハウジングおよび第二のハウジングは、カセットの中身を露出させるためにハウジングの開放を可能にするヒンジを介して互いに結合される2つの別々の構成要素であり得る。特定の態様において、第一および第二のハウジングは、可逆的なやり方で互いに結合される、たとえば相補的な近接する要素によっていっしょにインタロックされる2つの別々の構成要素であり、たとえば、第一のハウジングのインタフェースが受け要素、たとえば凹部を含み、第二のハウジングのインタフェースが供与要素、たとえば凸部を含み、凹要素および凸要素が互いと可逆的にインタロックする。特定の態様において、第一のハウジングおよび第二のハウジングは、永久的なやり方で、たとえば接着剤または融合によって互いに取り付けられる。特定の態様において、第一のハウジングおよび第二のハウジングは、それらが1つのハウジングになるやり方で、たとえば第一のハウジングおよび第二のハウジングが複数の構成要素の取り付けによって形成されない、または層の積み重ね、たとえば3D印刷によって成形または形成され、不可逆的に結合される、たとえば第一のハウジングを第二のハウジングから分離させるための継目またはヒンジを含まないやり方で結合される。
【０１０３】
本明細書に記載される基材の封入とは、基板全体をカセットのハウジング内に配置することをいう。
【０１０４】
特定の態様において、基板は第一の表面および第二の表面を含む。基板は約3mm×3mm×0.3mm〜約5000mm×15000mm×1000mmの寸法を有し得る。基板の第一の表面から第二の表面までの距離は約10μm〜約1000mmである。いくつかの態様において、基板は長方形、八角形または円形であり得る。いくつかの態様において、基板はガラス板であり得る。
【０１０５】
特定の態様において、基板の第一の表面は吸収性材料の第一の表面に結合されている。基板の第一の表面は、基板の接着性を高めるために改質されてもよい。たとえば、基板の第一の表面は、1つまたは複数のジアミノプロピルシラン基でコートされてもよい。吸収性材料は不透明な粒子を含み得る。吸収性材料は金属を含み得る。いくつかの態様において、吸収性材料の第二の表面は透明な層の第一の表面に結合され得る。透明な層は、アガロース、コラーゲン、マトリゲル、アルギネートおよびそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの態様においては、試料物質混合物が透明な層の第二の表面に結合され得る。いくつかの態様において、基板は、抽出された標的粒子を受けるように構成されているチャネルに結合され得る。たとえば、チャネルはフローセルチューブであり得る。
【０１０６】
特定の態様において、本開示は、本明細書に記載したような、複数のマイクロチャネルを有する基板であって、基板のマイクロチャネルが標的粒子および不透明な材料を含み、前記標的粒子と不透明な材料とが、透明なゲルまたは透明な固体を含むスペーサによって離れている基板を提供する。特定の態様において、不透明な材料は粒子またはコーティングを含む。特定の態様において、不透明な材料は標的粒子から少なくとも約1μm以上離れている。
【０１０７】
様々な態様において、基板はガラスミクロ細孔アレイであり得る。特定の態様において、基板は、第一の表面および第二の表面から延びる複数のマイクロチャネルをさらに含む。本明細書に記載される基板のマイクロチャネルは互いに対して実質的に平行に配置され得る。基板は約100万〜約3000億のマイクロチャネルを含み得る。特定の態様において、本明細書に記載される基板のマイクロチャネルは約50nm〜約500μmの平均内径を有する。特定の態様において、本明細書に記載される基板のマイクロチャネルは約50nm〜約10ミクロンの平均内径を有する。特定の態様において、本明細書に記載される基板のマイクロチャネルは約50ミクロン〜約500ミクロンの平均内径を有する。
【０１０８】
特定の態様において、本明細書に記載される基板のマイクロチャネルは、開口部の少なくとも1つが蓋をされている、または覆われている。特定の態様において、基板のマイクロチャネルは、基板の表面の1つ、たとえば基板の第一の表面または第二の表面に開口を有しない。基板のマイクロチャネルは材料で蓋をされ得る、または覆われ得る。たとえば、そのような材料は、アガロース系、ガラス系、金属系、ゼラチン系および／またはプラスチック系であり得る。
【０１０９】
特定の態様において、基板のマイクロチャネルは、試料ポートから試料物質混合物を受けるように構成されている。別の態様において、基板130のマイクロチャネルは、試料ウェルから試料物質混合物を受けるように構成されている。マイクロチャネルの内容物は静水力によって定位置に保持され得る。
【０１１０】
図2に示すような、標的粒子を選別するためのカセットの態様において、カセット100は、カセット100内にフレーム150を受けるように構成されている。特定の態様において、フレーム150は、フレーム内150に水分補給膜151をさらに含み得る。水分補給膜151を含むフレーム150は、細胞性物質混合物を基板130に添加または装填したのち基板130の上に配置され得る。水分補給膜151は、マイクロチャネル中に水分含量または一定濃度の溶解した固体を維持するために、基板130の上面をシールし得る。細胞性物質を基板130に添加したのち、1つまたは複数の実質的に気体透過性および／または不透過性の水分補給膜を使用して基板の表面130をシールし得る。水分補給膜151は、水分を保持することができる固体であることができる。たとえば、水分補給膜151は、ペーパタオル、キムワイプ（登録商標）、アガロース、ニトロセルロースまたはプラスチック、たとえばポリフッ化ビニリデン（PVDF）であり得る。いくつかの態様においては、水分補給膜の代わりに、またはそれとともに、水溶液でできた水分補給層を使用してもよい。ある態様において、水分補給膜は、リザーバからの水がマイクロチャネル中の液体の上液層とで平衡することを可能にし、それが、蒸発によって失われる水を減らすのに役立つことができる。たとえば、基板130の上面と接触する状態に配置された水分補給膜151は、水が膜の上に配置されると、マイクロチャネルの内容物を各個々のマイクロチャネル内に閉じ込めるが、水または媒体がマイクロチャネルの中へ流れることを可能にするであろう。水分補給膜はニトロセルロースおよびNAFION（登録商標）膜であり得る。任意の細胞をマイクロチャネル中に閉じ込めるが、水、媒体および他の試薬がマイクロチャネルの中へ通過することを可能にするであろう、非常に小さな穴（たとえば10〜100nm）を有する多孔形態のポリテトラフルオロエチレン膜（たとえばGORE-TEX（登録商標）布）を用いて類似の構造を得ることもできる。
【０１１１】
図2に示すような、標的粒子を選別するためのカセットの態様において、カセットは試料ウェル140を含む。試料ウェル140は、1つまたは複数のフィルポートから溶液を受けるように構成されている。図4Aに示すように、1つの態様において、試料ウェル140は、試料ポート114から試料物質混合物を受けるように構成されている。試料ウェルは、磁化され得る材料を含む、含有する、またはそれに接続され得る。そのような材料は、鉄、ニッケル、コバルト、レアメタルのいくつかの合金、いくつかの天然鉱物およびそれらの組成物を含む。図4Bに示すような1つの態様において、試料ウェル140は、基板130の表面と接触するように構成され得る。特定の態様において、試料ウェル140は、基板130の表面を横切って動くように構成され得る。試料ウェル140は、手動式、機械式または電子式に動くように構成され得る。いくつかの態様において、試料ウェルは、ホイールまたは他のボールベアリングに接続され得、それらが他方で、トップカバーに取り付けられた滑らかな軌道と接触している。様々な態様において、試料ウェルはギヤに接続され得、それらが他方で、トップカバーに接続されているグローブに接続される。軌道に対して平行に力が加えられると、試料ウェルは軌道の方向に案内される。力は、モータに接続されている取り付けられたケーブルの張力によって加えられ得る。モータは、カセットに対して内部または外部にあり得、クランクによって手動式に駆動されてもよいし、バッテリまたは他の電圧源によって電子式に駆動されてもよい。特定の態様において、試料ウェルの動きは磁気的に制御されてもよい。試料ウェルは、カセットの外、たとえば本開示の粒子選別装置内に位置する磁力によって外部的に制御されてもよい。特定の態様においては、磁石が、トップカバーの内壁に近接するところで試料ウェルに取り付けられる。そして、カセットに対して外部の磁場を試料ウェル上の内部磁石と密接に接触させながら操作する。外部磁場の動きが、カセット内部の磁石に対する力を発生させ、試料ウェルをトップカバーの内部の軌道に沿って移動させる。磁石は、ネオジムのような希土類磁石または電磁石であり得る。図4Bに示すような特定の態様において、試料ウェル140は、トップカバー110がボトムカバー120に付いたままである間に動かされ得る。1つの態様において、試料ウェルは、細胞性物質を基板のマイクロチャネルの中に添加または装填するように構成され得る。1つの態様において、試料ウェルは、試料ウェルの下面に位置する延展手段をさらに含む。延展手段は基板と接触して、細胞性物質をマイクロチャネルの中へ分散させ得る。延展手段は、スクイージー、フォイルまたはポリスマンに類似し得る。延展手段は、ゴム、プラスチック、金属または他の液体不浸透性の生体適合性材料から作られ得る。
【０１１２】
図1の態様は、図5Aおよび図5Bに示すようなシール510および金属フレーム520をさらに含む。図5Aおよび図5Bに示すように、1つの態様において、シール510は、基板130と金属フレーム520との間に配置される。シール510は接着剤であり得る。たとえば、シール510は、木材、金属、ガラス、石およびプラスチックのための接着剤として使用することができる、ポリウレタン、アクリル樹脂およびシアノアクリレートを含むエポキシ接着剤であり得る。エポキシ接着剤は、柔軟または硬質、透明または不透明、速硬性または徐硬性に作ることができる。図5Bに示すように、基板130および金属フレーム520はシール510と接触している。1つの態様において、基板130、シール510および金属フレーム520は15℃以下の温度でアセンブルされ得る。たとえば、基板130、シール510および金属フレーム520は5℃の温度でアセンブルされ得る。図5Bに示すように、基板130、シール510および金属フレーム520は動作中にアセンブルされる。基板130、シール510および金属フレーム520の温度は、カセット100の動作中に上昇し得る。温度が上昇すると、基板130、シール510および金属フレーム520は膨張し得る。いくつかの態様においては、温度が上昇すると、金属フレームの膨張が基板の膨張を超え、それにより、基板の表面に張力が加わる。基板の表面にかかるそのような張力は、基板のたるみを減らし、それにより、基板の平坦さを維持し得る。いくつかの態様において、基板は第一端、第二橋および中間部分を含み、第一端、第二端および中間部分は実質的に同じ平面にある。
【０１１３】
図2に示すような、標的粒子を選別するためのカセットの態様において、ボトムカバー120はまた、標的粒子を収集するための内面を含み得る。1つの態様において、内面は捕獲面を含み得る。捕獲面は、取り外し可能であってもよいし、カセットに取り付けられてもよい。たとえば、捕獲面は、皿、プレート、湾曲面または平坦面であり得る。図2に示すようないくつかの態様において、ボトムカバー120の内面は収集ウェル122および受けポート123を含み得る。ボトムカバー120の内面は、トップカバー110から1つまたは複数のフィルポートから溶液を受けるように構成され得る。ボトムカバーは、標的粒子および水溶液を抜くための1つまたは複数のアウトレットポートを含み得る。図4Fに示すような本開示の態様において、ボトムカバー120の内面は、補助材料ポート112から水溶液を受けるように構成されている。水溶液は、ボトムカバー120の内面から収集ウェル122への標的粒子の輸送を支援し得る。水溶液はまた、収集ウェル122から受けポート123への標的粒子の輸送を支援し得る。1つの態様において、標的粒子は受けポート123から回収され得る。
【０１１４】
別の態様において、ボトムカバーの内面は、ボトムカバーから1つまたは複数のフィルポートから溶液を受けるように構成されている。ボトムカバーは、標的粒子および水溶液を抜くための1つまたは複数のアウトレットポートを含み得る。1つの態様において、ボトムカバーの内面は、フィルポートから水溶液を受けるように構成されている。水溶液は、ボトムカバーの内面から収集ウェルへの標的粒子の輸送を支援し得る。水溶液はまた、収集ウェルから受けポートへの標的粒子の輸送を支援し得る。特定の態様において、標的粒子は受けポートから回収され得る。
【０１１５】
図1に示すような、標的粒子を選別するためのカセットの態様において、トップカバー110をボトムカバー120に取り付け得る。先に述べたように、カセット100は密封系であり得る。密封系は細胞性物質を汚染物質から保護する。カセットは、細胞性物質を基板130に添加または装填する前に滅菌され得る。カセット100の内部は別々に滅菌され得、カセット100は無菌条件下でアセンブルされ得る。トップカバー110およびボトムカバー120は、カセット100の中への汚染物質侵入を防ぎ得る。トップカバー110およびボトムカバー120は、細菌、カビ、酵母、ウイルスおよびマイコプラズマを含む汚染から標的粒子を保護し得る。カセット100の密封性はまた、物質を選別するときオペレータを任意の潜在的病原体から保護し、各試料を別の試料からの汚染から保護する。
【０１１６】
標的粒子を選別する方法
様々な態様において、本開示は、標的粒子を選別する方法を提供する。図4Aおよび4Bに示すような、標的粒子を選別する方法の様々な態様においては、トップカバー110に位置する試料ポート114を介して試料物質混合物をカセット100の中に添加または装填する。いくつかの態様においては、約1×106〜100×109個の細胞をカセット100の中に装填する。様々な態様においては、試料物質混合物を基板に直接添加または装填する。いくつかの態様においては、基板を試料物質混合物であふれさせてもよい。試料物質混合物は、毛管作用によって基板のマイクロチャネルの中に移動し得る。いくつかの態様においては、マイクロチャネルの直径が約10nm〜約100μmの範囲であるとき、基板を試料物質混合物であふれさせてもよい。特定の態様において、本明細書に記載される任意の基板は、基板の上面の周囲から垂直に延び、前記基板の上面への流体の封じ込めを可能にする縁取り要素をさらに含み得る。前記基板を一定量の試料物質混合物であふれさせる特定の態様において、前記縁取り要素は、前記試料物質混合物を封じ込め、前記混合物が前記カセットの他の部分を汚染することを防ぐ。特定の態様において、基板は、約10ミクロン〜約10cmの垂直寸法を有する縁取り要素を含み得る。特定の態様において、基板のマイクロチャネルの平均直径は縁取り要素の高さに比例し、小さい平均直径、たとえば約50nm〜約10ミクロンのマイクロチャネルを有する基板は、約100ミクロン〜約3mmの垂直寸法を有する縁取り要素を有し、より大きい平均直径、たとえば約50ミクロン〜約500ミクロンのマイクロチャネルを有する基板は、約1mm〜約10cmの垂直寸法を有する縁取り要素を有するようになる。
【０１１７】
別の態様において、基板のマイクロチャネルは、トップカバーからの懸滴をマイクロチャネルの上の位置に配置することにより、試料物質混合物で満たされ得る。いくつかの態様において、懸滴はマイクロチャネルと接触し得る。いくつかの態様において、懸滴は量が約10μL〜約900mLの範囲であり得る。試料物質混合物は、毛管作用によって基板のマイクロチャネルの中に移動し得る。別の態様において、試料物質混合物は試料ウェル140によって受けられ得る。図4Bに示すような例示的態様において、試料ウェル140は、基板130の上面を基板の一端から反対側端まで横切って動き得る。試料ウェル140は試料物質混合物を基板130および基板のマイクロチャネルに装填または添加し得る。試料ウェル140は、ほぼ等しい量の試料物質混合物を基板の各マイクロチャネルの中に装填し得る。いくつかの態様において、マイクロチャネルの直径が約100μm〜約500μmの範囲であるとき、試料物質混合物は試料ウェル140に装填され得る。いくつかの態様において、試料ウェル140は、試料ウェル140の下面に延展手段を含み得る。延展手段は基板130と接触して、試料物質混合物をマイクロチャネルの中へ、および基板の表面から分散させ得る。延展手段は、基板130の一端から反対側端へと動いて、試料物質混合物を基板のマイクロチャネルの中へ分散させ得る。1つの態様において、本開示の方法は、細胞1〜1000個、細胞1〜500個、細胞1〜100個、細胞1〜50個または細胞約1〜5個であり得る細胞性物質の、基板のマイクロチャネルの中への分散を考慮する。
【０１１８】
別の態様においては、ボトムカバー110に位置するフィルポートを通して試料物質混合物をカセットの中に添加または装填する。いくつかの態様においては、約1×106〜100×109個の細胞をカセット100の中に装填する。様々な態様においては、試料物質混合物を基板に直接添加または装填する。いくつかの態様においては、基板を試料物質混合物であふれさせてもよい。試料物質混合物は、毛管作用によって基板のマイクロチャネルの中に移動し得る。いくつかの態様においては、マイクロチャネルの直径が約10nm〜約100μmの範囲であるとき、基板を試料物質混合物であふれさせてもよい。別の態様において、基板のマイクロチャネルは、ボトムカバーからの懸滴をマイクロチャネルの上の位置に配置することにより、試料物質混合物で満たされ得る。いくつかの態様において、懸滴はマイクロチャネルと接触し得る。いくつかの態様において、懸滴は量が約10μL〜約900mLの範囲であり得る。試料物質混合物は、毛管作用によって基板のマイクロチャネルの中に移動し得る。別の態様において、試料物質混合物は試料ウェルによって受けられ得る。試料ウェルは、基板の上面を基板の一端から反対側端まで横切って動き得る。試料ウェルは試料物質混合物を基板および基板のマイクロチャネルに装填または添加し得る。試料ウェルは、ほぼ等しい量の試料物質混合物を基板の各マイクロチャネルの中に装填し得る。いくつかの態様においては、マイクロチャネルの直径が約100μm〜約500μmの範囲であるとき、試料物質混合物は試料ウェルに装填され得る。いくつかの態様において、試料ウェルは、試料ウェルの下面に延展手段を含み得る。延展手段は基板と接触して、試料物質をマイクロチャネルの中へ分散させ得る。延展手段は、基板の一端から反対側端へと動いて、試料物質混合物を基板のマイクロチャネルの中へ、および基板の表面から分散させ得る。特定の態様において、本開示の方法は、細胞1〜1000個、細胞1〜500個、細胞1〜100個、細胞1〜50個および細胞約1〜5個であり得る細胞性物質の、基板のマイクロチャネルの少なくとも1つ中への分散を考慮する。
【０１１９】
試料物質混合物を基板100のマイクロチャネルの中または基板の第一の表面に装填したのち、図4Eに示すように、基板のマイクロチャネルおよび第一の表面をスキャンして、1つまたは複数の粒子を検出する。スキャンは、特定の波長（第一の波長）または特定の波長のセットでマイクロチャネルを照射し、特定の波長（第二の波長）または特定の波長のセットで標的粒子を検出することを含む。たとえば、特定の波長は、約200nm〜約1.5mmの範囲である波長を含む。照射のための特定の波長と検出のための特定の波長とは同じであってもよいし異なってもよい。本明細書において参照される任意の波長、たとえば第一の波長、第二の波長、第三の波長、第四の波長および波長X1は、独立して、紫外から赤外までに及ぶ電磁スペクトルの範囲内の少なくとも1つの波長から選択され得る。第一、第二、第三および第四の波長ならびに波長X1は、独立して、約200nm〜約1.5mmの範囲である1つまたは複数の波長から選択される。いくつかの態様において、第一、第二、第三および第四の波長ならびに波長X1は、独立して、約400nm〜約700nmの範囲である波長から選択される。たとえば、照射波長は、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）を照射する場合の350nm〜400nm；BV421（商標）、シアン蛍光タンパク質（CFP）、AmCyanおよびPacific Blue（商標）などの色素を励起する場合の400nm〜450nm；緑蛍光タンパク質（GFP）、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（PerCP）およびPerCP-Cy（商標）5.5などの色素を励起する場合の450nm〜500nm；R-フィコエリスリン（PE）、PE-Texas Red（登録商標）、Texas Red（登録商標）、7-アミノアクチノマイシンD（7-AAD）、PE-Cy（商標）5、PE-Cy（商標）5.5、PE-Cy（商標）7およびPE-Dazzle（商標）などの色素を照射する場合の500nm〜600nm；アロフィコシアン（APC）、Alexa Fluor（登録商標）647、Alexa Fluor（登録商標）700、Alexa Fluor（登録商標）780およびAPC-Cy（商標）7などの色素を励起する場合の600nm〜700nm；ならびにAG2SE量子ドットまたは単層炭素ナノチューブ（SWNT）を照射する場合の800nm〜1200nmを含み得る。検出波長は、BV421（商標）などの色素を検出する場合の350nm〜400nmおよび400〜500nm；緑蛍光タンパク質（GFP）およびペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（PerCP）などの色素を検出する場合の500nm〜600nm；単層炭素ナノチューブ（SWNT）およびAG2SE量子ドットを検出する場合の600nm〜700nm、800nm〜900nm、900nm〜1100nmおよび1100nm〜1300nm；ならびにAG2SE量子ドットおよび単層炭素ナノチューブ（SWNT）を検出する場合の1300nm〜1500nmを含み得る。加えて、電磁放射線源は、レーザ光源におけるように1つの波長を照射してもよいし、LED光源におけるように波長のバンドを照射してもよい。電磁放射線源は単独で使用されてもよいし、複数の波長または複数のパワーを同時に含む光路が生成されてもよい。異なる波長またはパワーが時間的に分離されてもよい。すなわち、所与の時点では1つの波長またはパワーだけが光学列を占有するが、複数の異なる波長またはパワーを交換することができる。照射時間は10フェムト秒〜5秒の範囲であることができる。光源はまた、空間的に分離されてもよい。すなわち、異なる波長またはパワーの光が同時にカセットに入り得るが、異なる位置で入り得る。光源はまた、空間的かつ時間的に分離されてもよい。光源は、異な���物質および標識の異なる吸収性を受け入れるために、複数の波長を放出することができる。特定の態様において、望まれる特異度は1マイクロチャネルあたり細胞1個であろう。いくつかの態様において、電磁放射線は、光源からカセット中の透過性部分を通して基板に伝達される。各マイクロチャネルからのシグナルがスキャンされて、関心対象のマイクロチャネルの位置が特定される。1つの態様において、マイクロチャネルは、各キャビティ中の標識から発される電磁シグナルを検出することによってスクリーニングされる。
【０１２０】
標的粒子は、ユニークな発光プロファイルによって同定され得る。いくつかの態様においては、複数の異なる波長でマイクロチャネルを照射し、マイクロチャネルから発光を検出することが、1つまたは複数の標的粒子からの発光に対応する。別の態様においては、1つの波長でマイクロチャネルを照射し、マイクロチャネルから複数の発光を検出することが、1つまたは複数の標的粒子からの発光に対応する。別の態様においては、複数の波長でマイクロチャネルを照射し、マイクロチャネルからの複数の発光を検出することが、1つまたは複数の標的粒子からの発光に対応する。
【０１２１】
関心対象の粒子を検出すると、図4Eに示すように、その関心対象の粒子を基板130から抽出し得る。関心対象の粒子を含む個々のマイクロチャネルは、多様な方法を使用して抽出することができる。1つの態様において、方法は加圧注入を含む。たとえば、基板をプラスチックフィルムによって覆う。方法は、プラスチックフィルムに穴を開け、それにより、空間的にアドレス指定されるマイクロチャネルを露出させることができるレーザをさらに提供する。続いて、圧力源（たとえば空気圧）への曝露が、空間的にアドレス指定されるマイクロチャネルから内容物を放出する。別の態様において、抽出法は、電磁放射線を基板のマイクロチャネルに集束させて、不透明な物質によって吸収させる工程を含む。入射放射線のエネルギーが、水溶液の一部分の気化熱に変わり、標的粒子の膨張または蒸発を発生させ、それが標的粒子の少なくとも一部を基板のマイクロチャネルから放出させる。
【０１２２】
特定の態様において、基板のマイクロチャネルからの抽出は、励起エネルギーを粒子に集束させる、基板のマイクロチャネル中の1つまたは複数の粒子、たとえば不透明な粒子の励起によって達成される。したがって、いくつかの態様は、キャビティ中のエネルギー吸収性粒子と、基板の各マイクロチャネル中の粒子の電磁放射線を印加することができる電磁放射線源とを用いる。マイクロチャネル中の粒子の励起は、マイクロチャネルから溶液または混合物を分裂させ、解放するエネルギーの放出を生じさせ得る。特定の態様において、エネルギーは、マイクロチャネル内の溶液または混合物の温度をほとんどまたは全く高めることなく粒子に伝達される。特定の局面において、パルスのシーケンスがマイクロチャネル中の磁性ビーズを繰り返し撹拌してメニスカスを破壊し、それが標的細胞性物質を基板から放出する。特定の局面において、抽出された細胞性物質はボトムカバーの内面に放出される。
【０１２３】
標的粒子は、200nm〜約1.5mmの範囲である選択される波長であり得る特定の波長（第三の波長）でマイクロチャネルから抽出される。いくつかの態様において、標的粒子は、約350nm〜約1200nmの範囲である選択される波長であり得る特定の波長（第三の波長）でマイクロチャネルから抽出される。抽出のための特定の波長は、標的粒子を照射し、検出するために使用される波長と同じであってもよいし異なってもよい。本明細書において参照される第一、第二および第三の波長は、独立して、約200nm〜約1.5mmの範囲である波長から選択される。加えて、電磁放射線源は、標的粒子を照射し、検出するために使用される光源と同じであってもよいし異なってもよい。光源は、異なる物質および標識の異なる吸収スペクトルを受け入れるために、複数の波長を放出することができる。加えて、照射、検出および抽出に使用される電磁放射線源は、互いに同じであってもよいし異なってもよい。
【０１２４】
前述のように、抽出された標的粒子はボトムカバー120の内面上に集まり得る。図4Fに示すように、溶液は、トップカバー上に位置するフィルポートを通してカセット100に加えられ得る。別の態様においては、水溶液は、ボトムカバー上に位置するフィルポートを通してカセット100に加えられ得る。1つの態様において、溶液は緩衝液である。1つの態様において、緩衝液は、トップカバー110上に位置する補助材料ポート112に加えられ得る。図4Fに示すように、緩衝液は、抽出された標的粒子をボトムカバーの内面から収集ウェル122へと移動させ得る。加えて、図4Gに示すように、抽出された標的粒子は、受けポート123を通してカセット100から取り出され得る。抽出された標的粒子は、事前に滅菌された容器の中に回収され得る。抽出された標的粒子は無菌条件下で回収され得る。抽出された標的粒子は汚染物質フリーであり得る。
【０１２５】
医薬組成物およびその調製
いくつかの局面において、本開示の装置および方法は、細胞、たとえば造血幹細胞（HSC）および／または造血幹前駆細胞（HSPC）の医薬組成物の調製を前例のない無菌性、純度および生存能力をもって可能にする。本発明の医薬組成物は、細胞性物質をスクリーニングし、所望の表現型の細胞を抽出することによって調製され得る。
【０１２６】
特に、本開示は、細胞性物質、たとえば対象から得られた細胞を選別する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、細胞性物質を、たとえば本明細書に記載されるスキャナシステムおよび方法により、毎秒約100,000細胞以上の速度でスクリーニングする工程を含む。方法は、細胞性物質を、毎秒約150,000細胞以上、毎秒約200,000細胞以上、毎秒約250,000細胞以上、毎秒約300,000細胞以上、毎秒約350,000細胞以上、毎秒約400,000細胞以上、毎秒約450,000細胞以上、毎秒約500,000細胞以上、毎秒約550,000細胞以上、毎秒約600,000細胞以上、毎秒約650,000細胞以上、毎秒約700,000細胞以上、毎秒約750,000細胞以上、毎秒約800,000細胞以上、毎秒約850,000細胞以上、毎秒約900,000細胞以上または毎秒約950,000細胞以上の速度でスクリーニングして、所望の表現型の細胞を同定する工程を含み得る。特定の態様において、方法は、細胞性物質を、毎秒約1,000,000細胞以上、毎秒約1,500,000細胞以上、毎秒約2,000,000細胞以上、毎秒約2,500,000細胞以上、毎秒約3,000,000細胞以上、毎秒約3,500,000細胞以上、毎秒約4,000,000細胞以上、毎秒約4,500,000細胞以上または毎秒約5,000,000細胞以上の速度でスクリーニングして、所望の表現型の細胞を同定する工程を含む。特定の態様において、方法は、細胞性物質を毎秒約100,000細胞〜毎秒約2,000,000細胞の速度でスクリーニングして、所望の表現型の細胞を同定する工程を含む。
【０１２７】
本開示は、細胞性物質を、たとえば本明細書に記載されるスキャナシステムおよび方法によってスクリーニングして、所望の表現型のHSCおよび／またはHSPCを同定する方法を提供する。いくつかの態様において、方法は、元々の細胞性物質の10％未満がHSCおよび／またはHSPCを含む、たとえば元々の細胞性物質の9％未満、8％未満、7％未満、6％未満、5％未満、4％未満、3％未満、2％未満または1％未満がHSCおよび／またはHSPCを含む、細胞性物質をスクリーニングする工程を含む。
【０１２８】
いくつかの局面において、本開示は、元々の細胞性物質からの細胞、たとえばヒト対象から得られた細胞を抽出する方法であって、抽出される細胞が毎秒100,000個以上の速度で所望の表現型である方法を提供する。方法は、細胞性物質から所望の表現型の細胞を、毎秒約150,000個以上、毎秒約200,000個以上、毎秒約250,000個以上、毎秒約300,000個以上、毎秒約350,000個以上、毎秒約400,000個以上、毎秒約450,000個以上、毎秒約500,000個以上、毎秒約550,000個以上、毎秒約600,000個以上、毎秒約650,000個以上、毎秒約700,000個以上、毎秒約750,000個以上、毎秒約800,000個以上、毎秒約850,000個以上、毎秒約900,000個以上または毎秒約950,000個以上の速度で抽出する工程を含み得る。特定の態様において、方法は、所望の表現型の細胞を、毎秒約1,000,000個以上、毎秒約1,500,000個以上、毎秒約2,000,000個以上、毎秒約2,500,000個以上、毎秒約3,000,000個以上、毎秒約3,500,000個以上、毎秒約4,000,000個以上、毎秒約4,500,000個以上または毎秒約5,000,000個以上の速度で抽出する工程を含み得る。方法は、細胞性物質から所望の表現型の細胞を毎秒約150,000個〜毎秒約2,000,000個の速度で抽出する工程を含み得る。特定の態様において、抽出された細胞の90％超、92％超、95％超、98％超または99％超がHSCおよび／またはHSPCである。
【０１２９】
いくつかの態様において、方法は、所望の表現型の細胞を抽出する工程を含み、得られる抽出物は、前記所望の表現型に関して非常に高い純度を有する。細胞を抽出する工程は細胞抽出物を生成し得、細胞抽出物の約95％以上が所望の表現型の細胞である。方法は、細胞を抽出する工程を含み得、細胞抽出物の約96％以上、細胞抽出物の約97％以上、細胞抽出物の約98％以上、細胞抽出物の約99％以上が所望の表現型の細胞である。抽出された細胞、たとえば抽出されたHSCおよび／またはHSPCは、所望の表現型を有する細胞を含み得、たとえば、細胞抽出物の95％以上が所望の表現型を有する。特定の態様において、細胞抽出物の96％以上、細胞抽出物の97％以上、細胞抽出物の98％以上または細胞抽出物の99％以上が所望の表現型の細胞である。
【０１３０】
いくつかの態様において、方法は、所望の表現型の細胞を抽出する工程を含み、細胞抽出物は非常に高い生存能力を有する。細胞の生存能力は、細胞を抽出した後の細胞生存に関して計測され得る。細胞を抽出したのち、細胞を抽出してから約1分後〜約5時間後、細胞の生存を計測する工程を含み得る。いくつかの態様において、方法は、細胞を抽出し、それにより、細胞抽出物を生成する工程を含み、細胞抽出物は約95％よりも高い生存率を有する。特定の態様において、細胞抽出物は、96％よりも高い、97％よりも高い、98％よりも高い、99％よりも高い生存率を有する。本開示の方法は、所望の表現型の細胞の抽出を生じさせ得、細胞抽出物は、さらなる滅菌処置を要することなく、治療用途に適した無菌性を有する。細胞抽出物は、病原体および他の汚染物質フリーであり得、たとえば、細胞抽出物は、1％未満の病原体、0.05％未満の病原体、0.01％未満の病原体または0.005％未満の病原体しか有しない。特定の態様において、本開示の方法は、改善された治療特性を有する、たとえば移植片対宿主病が無視しうる程度である細胞抽出物の調製を可能にする。
【０１３１】
いくつかの局面において、本開示は、以下の特徴：（a）細胞抽出物の細胞の90％超、95％超または99％超がHSCおよび／またはHSPCである；（b）細胞抽出物は本質的に病原体フリーである、たとえば病原体を1％未満、0.5％未満、0.05％未満または0.01％未満しか含まない；（c）細胞抽出物は、抽出物中の細胞の95％を超える、96％を超える、97％を超える、98％を超える、または99％を超える、所望の表現型の細胞に関する純度を有する；（d）抽出物は、さらなる滅菌処置なしで治療用途に適する；および（e）抽出後に測定して、細胞抽出物の90％超が生存可能である（たとえば抽出から2時間以内に計測された生存率）、のうち1つまたは複数を有する細胞抽出物を含む医薬組成物を提供する。
【０１３２】
本開示は、細胞を含む治療組成物であって、組成物の細胞の95％超がHSCおよび／またはHSPCであり、細胞の95％超が所望の表現型である治療組成物を提供する。本開示は、細胞を含む治療組成物であって、組成物の細胞の95％超がHSCおよび／またはHSPCであり、細胞の95％超が所望の表現型であり、無視しうる量の病原体、たとえば0.1％未満、0.05％未満または0.001％未満の病原体しか含まない治療組成物を提供する。本開示は、細胞を含む治療組成物であって、組成物の細胞の95％超がHSCおよび／またはHSPCであり、細胞の95％超が所望の表現型であり、細胞の0.009％未満、0.008％未満、0.007％未満、0.006％未満、0.005％未満、0.004％未満、0.003％未満、0.002％未満または0.001％未満がナイーブなT細胞である、治療組成物を提供する。本開示は、細胞を含む治療組成物であって、組成物の細胞の95％超がHSCおよび／またはHSPCであり、細胞の95％超が所望の表現型であり、細胞の96％以上、97％以上、98％以上または99％以上が生存可能である、治療組成物を提供する。
【０１３３】
キット
別の局面において、本開示は、標的粒子を選別するためのキットに関する。1つの態様において、キットは、標的粒子を選別するためのカセットを含む。特定の態様において、カセットは、密封されたハウジングユニット、透過性部分、密封されたハウジングユニットに封入された基板および1つまたは複数のフィルポートを含む。特定の態様において、カセットは、試料物質混合物の添加の前に滅菌される。
【０１３４】
1つの態様において、キットはまた、標的粒子を選別するためのカセットの使用を提供する指示（すなわちプロトコル）を含む指示資料を含み得る。指示資料は一般的には書き物または印刷物を含むが、そのように限定されない。そのような指示を記憶し、エンドユーザに伝達することができる任意の媒体が本開示によって考慮される。そのような媒体は、電子記憶媒体（たとえば磁気ディスク、テープ、カートリッジ、チップ）、光学媒体（たとえばCD ROM）などを含むが、それらに限定されない。そのような媒体は、そのような指示資料を提供するインタネットサイトへのアドレスを含むものでもよい。
【０１３５】
マクロゲル分離
基板130のマイクロチャネル610は、標的粒子の完全性を維持するための特定の方法で装填される。図6に示すような1つの態様において、基板130のマイクロチャネル610は、粒子混合物および試料成分混合物を装填される。
【０１３６】
図6に示すように、粒子混合物は、不透明な粒子620と透明な溶液630との不均一混合物を含み得る。いくつかの態様において、透明な溶液は不透明な粒子を試料成分から分離する。1つの態様において、不透明な粒子と試料成分は1μm以上の平均距離だけ離されている。透明な溶液は、不透明な粒子から放出されるエネルギーから試料成分への保護を提供する。不透明な粒子は、少なくとも部分的に電磁放射線を吸収し、少なくとも部分的にエネルギーを透明な溶液に伝達する。いくつかの態様において、透明な溶液へのエネルギーの伝達は周囲の透明な溶液の気化を生じさせる。1つの態様において、不透明な粒子は試料成分と接触しない。いくつかの態様において、透明な溶液はまた、粘稠な溶液である。たとえば、透明な溶液は、アガロース、コラーゲン、マトリゲルまたはアルギネートであり得る。いくつかの態様において、不透明な粒子は光散乱特性を有し得る。不透明な粒子は、抽出中、試料成分を電磁放射線から保護し得る。不透明な粒子は特定の波長の電磁放射線を吸収し得る。たとえば、特定の波長は、約200nm〜約1.5mmの範囲である波長を含む。図6に示すように、試料成分混合物は試料成分650および水溶液640を含む。試料成分は細胞を含み得る。水溶液は、水、緩衝液、媒体および血清を含み得る。いくつかの態様において、粒子混合物と試料成分混合物とは別々の層にある。
【０１３７】
様々な態様において、粒子混合物は、試料成分混合物の添加の前にマイクロチャネルに投入される。粒子混合物は、試料成分混合物の添加の前に固化し得る。いくつかの態様において、粒子混合物が基板のマイクロチャネルに加えられたのち、試料成分混合物が基板のマイクロチャネルに加えられる。特定の態様においては、試料成分混合物の添加の前にエッチング溶液がマイクロチャネルに加えられる。エッチング溶液は粒子混合物を少なくとも部分的に溶解し得る。エッチング溶液は、フッ化水素酸、強酸、たとえば塩酸、硝酸もしくは硫酸、強塩基、たとえば水酸化ナトリウムもしくは水酸化カリウムまたは当業者に公知の任意の他のエッチング剤を含み得る。試料成分は、電磁放射線によるスキャンおよび抽出の後でも生存可能なままである。
【０１３８】
ミクロゲル分離
図7Bに示すようないくつかの態様において、試料物質と、シェルを含む粒子710は、基板のマイクロチャネルの中に同時に装填される。粒子は不透明なコアを含み得る。不透明なコアは磁性ビーズまたは非磁性ビーズを含み得る。1つの態様において、不透明なコアは磁性ビーズである。別の局面において、シェルは透明な材料を含む。透明な材料は、アガロース、コラーゲン、細胞外マトリックス、アルギネート、流体を充填された生物学的膜、ミセル、流体を充填された脂質または脂肪酸小胞であり得る。特定の態様において、シェルを含まない粒子は直径約20nm〜約200μmであり得る。特定の態様において、シェルを含む粒子は直径約520nm〜約400μmであり得る。試料物質は細胞であり得る。これらの態様において、試料物質は、電磁放射線によるスキャンおよび抽出ののち、生存能力を維持し得る。いくつかの態様において、試料物質は少なくとも10％生存可能である。たとえば、シェルを含む粒子を装填された細胞は、図7Cに示すように、90％を超える抽出効率で抽出され、図7Dに示すように、100％の細胞生存率で抽出された。
【０１３９】
別の態様において、試料物質と、シェルを含む粒子は、基板のマイクロチャネルの中に順次に装填される。1つの態様においては、まず試料物質が装填され、次いでシェルを含む粒子が装填される。粒子は不透明なコアを含み得る。不透明なコアは磁性ビーズまたは非磁性ビーズを含み得る。1つの態様において、不透明なコアは非磁性ビーズである。別の局面において、シェルは透明な材料を含む。透明な材料は、アガロース、コラーゲン、細胞外マトリックス、アルギネート、流体を充填された生物学的膜、ミセル、流体を充填された脂質または脂肪酸小胞であり得る。特定の態様において、シェルを含まない粒子は直径約20nm〜約200μmであり得る。特定の態様において、シェルを含む粒子は直径約520nm〜約400μmであり得る。試料物質は細胞であり得る。これらの態様において、細胞性物質は、電磁放射線によるスキャンおよび抽出ののち、生存能力を維持し得る。いくつかの態様において、試料物質は少なくとも10％生存可能である。
【０１４０】
対照的に、シェルを有しない粒子を装填された試料物質は生存能力を維持し得ない。いくつかの態様において、シェルを有しない粒子を装填された試料物質の生存率は約9％以下であり得る。たとえば、図7Aに示すような、シェルを有しない粒子を装填された細胞の場合、図7Cに示すように、抽出効率は100％であったが、図7Dに示すように、細胞生存率は0％であった。
【０１４１】
細孔内スペーサ
基板130のマイクロチャネル610は、試料成分の完全性を維持するための特定の方法で装填される。図8Aに示すようないくつかの態様において、試料成分は磁性粒子710および非磁性粒子810を装填され得る。いくつかの態様において、混合物は、約1：0.5〜1：10の重量比の磁性粒子710および非磁性粒子からなる。1つの態様において、マイクロチャネル中の磁性粒子の濃度は約1mg/mLまたは約30mg/mLである。マイクロチャネル中の非磁性粒子の濃度は約1mg/mL〜約100mg/mLである。いくつかの態様において、試料成分は無傷細胞または溶解細胞である。非磁性粒子810は、電磁放射線によって励起されたとき細胞を損傷しない材料を含む。たとえば、非磁性粒子はシリカ、プラスチック、アガロースまたはアルギネートを含み得る。いくつかの態様においては、図8Aに示すように、磁性粒子710を引き寄せて非磁性粒子810の上に層を形成するために、マイクロチャネルの上から磁力が加えられる。磁性粒子710は非磁性粒子810の上に位置する。別の態様においては、磁性粒子を引き寄せて非磁性粒子の下に層を形成するために、マイクロチャネルの下から磁力が加えられる。磁性粒子710は試料物質から少なくとも1μm以上離されている。
【０１４２】
磁性粒子710と非磁性粒子810との比率が細胞性物質の抽出効率および細胞生存能力において役割を演じる。たとえば、図8Bに示すように、磁性粒子710を15mg/mLで一定に保持したとき、抽出効率および細胞生存率は、非磁性粒子の濃度に依存して変化した。特に、非磁性粒子5mg/mLでは、抽出効率は約57％であり、細胞生存率は0％であり；非磁性粒子10mg/mLでは、抽出効率は約100％であり、細胞生存率は0％であり；非磁性粒子20mg/mLでは、抽出効率は約73％であり、細胞生存率は約63％であり；非磁性粒子40mg/mLでは、抽出効率は約80％であり、細胞生存率は約25％であった。
【０１４３】
別の局面において、試料成分は、不透明な粒子と順次に装填され得る。まず、試料成分と、特定の波長を吸収しない複数の不透明な粒子が、基板のマイクロチャネルに装填される。特定の波長は、約200nm〜約1.5mmの範囲である波長を含む。次いで、特定の波長を吸収する不透明な粒子がマイクロチャネルに装填される。1つの態様において、不透明な粒子は磁性粒子および非磁性粒子を含む。1つの態様において、不透明な粒子は磁性粒子を含む。
【０１４４】
順次装填
基板のマイクロチャネル中の試料物質の数を定量する方法の様々な態様においては、基板130のマイクロチャネル610に順次に装填して、試料可視性を高め得る。特定の態様において、試料物質は細胞を含み得る。図9Aに示すような例示的態様においては、まず、試料混合物を基板のマイクロチャネルに加え、次いで粒子を基板のマイクロチャネルに加える。そして、マイクロチャネル中の試料物質の数を定量し得る。様々な態様において、粒子は不透明なビーズである。たとえば、不透明なビーズはDynabead（登録商標）、アガロースおよびProMag（登録商標）を含む。いくつかの態様において、粒子は、試料混合物の添加から約5分以上ののち、基板のマイクロチャネルに加えられる。特定の態様において、粒子は、試料混合物の添加から約10分後、基板のマイクロチャネルに加えられる。1つの態様において、試料物質の量は顕微鏡検査法によって定量され得る。特定の態様においては、細胞の量が顕微鏡検査法によって定量され得る。いくつかの態様において、そのような順次装填は、細胞がビーズによって見えにくくなることを防ぐ。たとえば、図9B〜9Gに示すように、3つのタイプの粒子（すなわちDynabead（登録商標）、アガロースおよびProMag（登録商標））を、順次に、および細胞性物質との混合バッチとして、基板のマイクロチャネルに加えた。図9Bおよび9CではDynabead（登録商標）を使用し、図9Dおよび9Eではアガロースを使用し、図9Fおよび9GではProMag（登録商標）を使用した。加えて、図9Hは、粒子を含まない対照のグラフ表示を示す。順次装填法および混合バッチ法を利用したときの各マイクロチャネル中の細胞数の精度を図9Hの対照と比較した。図9B〜9Gに示すように、順次装填法で装填されたマイクロチャネル（図9C、9Eおよび9G）は、混合バッチ法で装填されたマイクロチャネル（図9B、9Dおよび9F）よりも対照（図9H）中の細胞数を近似した。
【０１４５】
蛍光置換
特定の態様において、基板130のマイクロチャネル610は、試料可視性を高めるために蛍光物質を装填される。図10に示すような例示的態様において、試料物質および蛍光物質がマイクロチャネルに装填され、その後、試料物質が定量される。特定の態様において、試料物質は細胞性物質を含み得る。特定の態様において、細胞性物質は細胞を含み得る。基板130の各マイクロチャネルは蛍光物質をほぼ均一に装填される。蛍光物質は、溶解状態であってもよいし、不透明なビーズなどの固体に付着した状態であってもよい。たとえば、蛍光物質は、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、Alexa Fluor（登録商標）、Alexa Fluor（登録商標）594、Alexa Fluor（登録商標）647、Alexa Fluor（登録商標）700、Brilliant Violet（商標）421、R-フィコエリスリン（PE）、PE-Cy（登録商標）5、アロフィコシアン（APC）、PE Texas Red（登録商標）、緑蛍光タンパク質（GFP）および黄蛍光タンパク質（YFP）を含み得る。1つまたは複数の細胞の存在がマイクロチャネルからの蛍光シグナルを低下させる。細胞の存在は、蛍光強度を、最大値の少なくとも5％かつ最大値の95％以下、低下させる。この態様において、マイクロチャネル中の高い蛍光強度はマイクロチャネル中のゼロ細胞数または低い細胞数と相関する。低い蛍光強度はマイクロチャネル中の高い細胞数と相関する。たとえば、図10Cおよび10Dに見られるように、蛍光物質を装填され、細胞を含まない基板のマイクロチャネル、対応する領域は、細胞を含む領域よりも明るい。図10D中、細胞を含む領域は円で囲まれている。加えて、図10Eおよび10Fは、APC細胞の使用による細胞を含む領域およびその対応する明るい領域を示す。図10Gは、細胞を有しないマイクロチャネルの平均蛍光強度が、細胞を有するマイクロチャネルの平均蛍光強度よりも高いことを示す。
【０１４６】
超高速ソータ
レーザスキャン式細胞選別のための光学装置の1つの態様において、図11は、回転ポリゴンミラーを利用する光学装置を示す。装置1100は、第一の蛍光励起光源1110および第二の蛍光励起光源1112を含む。場合によっては、装置は複数の蛍光励起光源を含み得る。場合によっては、複数の励起光源は重なり合い得る。場合によっては、複数の励起光源は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または12よりも多い蛍光励起光源を含み得る。複数の蛍光励起光源の1つまたは複数はレーザ光源を含み得る。励起光源の1つまたは複数は発光ダイオード（LED）光源を含み得る。場合によっては、複数の蛍光励起光源の1つまたは複数は、特定のフルオロフォアの蛍光励起波長に対応する波長の光を放出し得る。場合によっては、励起光源の1つまたは複数は、複数の波長の光を放出するように構成され得る。場合によっては、励起光源の1つまたは複数は、複数の波長それぞれが、複数の波長の他のピークから離れたピークを含むような複数の波長の光を放出するように構成され得る。複数の蛍光励起光源の1つまたは複数は、自己蛍光を励起するために細胞に対して内在性であるフルオロフォアの励起波長に対応する波長の光を放出し得る。たとえば、複数の蛍光励起光源の1つまたは複数は、自己蛍光分子、たとえばニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）、クロロフィル、コラーゲン、レチノール、リボフラビン、コレカルシフェロール、葉酸、ピリドキシン、チロシン、ジチロシン、インドールアミン、リポフスチン、ポリフェノール、トリプトファン、フラビンまたはメラニンの励起波長にチューニングされ得る。励起光源の1つまたは複数は、任意の自己蛍光分子の励起波長に対応する波長の光を放出し得る。
【０１４７】
複数の蛍光励起光源の1つまたは複数は、細胞に対して外在性であるフルオロフォアの励起波長に対応する波長の光を放出し得る。たとえば、複数の蛍光励起光源の1つまたは複数は、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、Alexa fluor、アミノクマリン、Cy2、カルボキシフルオレセイン（FAM）、Alexa fluor 488、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、Alexa fluor 430、Alexa fluor 532、6-カルボキシ-2,4,4,5,7,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、Cy3、テトラメチルローダミン（TRITC）、Alexa fluor 546、Alexa fluor 555、R-フィコエリスリン、Rhodamine Red-X、Tamara、Cy3.5 581、Rox、Alexa fluor 568、Red 613、Texas Red、Alexa fluor 594、Alexa fluor 633、アロフィコシアン、Alexa fluor 647、Cy5、Alexa fluor 660、Cy5.5、TruRed、Alexa fluor 680、Cy7または当業者に公知の任意の他のフルオロフォアの励起波長にチューニングされ得る。
【０１４８】
蛍光励起光源からの光は、ダイクロイックミラー1120に向けられ、ビームエキスパンダ1122に送られる。場合によっては、2つよりも多い励起光源をビームエキスパンダに向けるために複数のダイクロイックミラーが利用される。装置は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または12よりも多いダイクロイックミラーを含み得る。ビームエキスパンダ中でビームが拡大すると、蛍光励起光源からの光はミラー1124に向けられる。場合によっては、ミラー1124はガルバノメータを含む。ミラーは光を回転ポリゴンミラー1140に向ける。場合によっては、ポリゴンミラーに代えてレゾナントスキャニングミラーを用いてもよい。
【０１４９】
特定の態様においては、ポリゴンミラーに代えてデジタル光処理システム（DLPS）を用いてもよい。DLPSは、複数の独立してアドレス指定可能なマイクロミラーを含み得る。DLPSは光源によって照射され得る。複数のマイクロミラーそれぞれは、光を特定の位置に向ける、または光が特定の位置に達することを防ぐように独立して配置され得る。各マイクロミラーは、電子的にアドレス指定され得る。
【０１５０】
回転ポリゴンミラーは、ポリゴンミラーの回転軸に対して垂直な湾曲した焦点面に沿って蛍光励起光源からの光を高速でスキャンする。Fシータレンズ1150が、実質的に平坦である焦点面を形成する。回転ポリゴンミラーの表面からの反射およびFシータレンズを通しての屈折ののち、励起光源からの光はカセット100に向けられる。Fシータレンズは、複数の励起ビームをカセット中のマイクロチャネルに集束させるように構成され得る。回転ポリゴンミラーが回転すると、励起光源からの光は、カセット中のマイクロチャネルの線にかけてスキャンされる。1つの線のスキャンののち、カセットを動かして新たな線のスキャンを可能にし得る。場合によっては、動きは1つの線のスキャンに時間調整される。時間調整は、たとえば、同期クロックシグナルを介してカセットの動きと光のスキャンとを同調させることによって達成され得る。
【０１５１】
励起光源からの光を受けると、マイクロチャネル中の1つまたは複数の細胞は蛍光を発し、蛍光を刺激した励起光源の波長よりも高い波長の光を放出し得る。蛍光は、細胞内または細胞上に位置する内在性フルオロフォアの存在により得る。蛍光は外在性フルオロフォアの存在による場合もある。放出された光は光ガイド1160によって受けられ、案内される。光ガイドは光ファイバを含み得る。光ガイドは光ファイバ束を含み得る。光ガイドは1つまたは複数のミラーを含み得る。1つまたは複数のミラーは平面鏡を含み得る。1つまたは複数のミラーはダイクロイック平面鏡を含み得る。1つまたは複数のミラーは凹面鏡を含み得る。1つまたは複数のミラーは球面鏡を含み得る。放出された光は、結合光学素子1162のセットおよびビームスプリッタ1164に向けられる。ビームスプリッタは、放出された光の1つの波長が第一の検出器1172に通過することを可能にし、放出された光の別の波長を第二の検出器1174に方向転換させる。場合によっては、装置は複数のビームスプリッタを含み得る。場合によっては、装置は複数の検出器を含み得る。場合によっては、複数のビームスプリッタは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または12よりも多いビームスプリッタを含み得る。場合によっては、複数の検出器は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または12よりも多い検出器を含み得る。複数のビームスプリッタの各ビームスプリッタは、放出された光の1つまたは複数の波長が通過することを可能にし、放出された光の他の波長を方向転換させ得る。複数の検出器の各検出器は、フォトダイオード、光電子増倍管または当業者に公知の任意の他の光検出器であり得る。
【０１５２】
各検出器は、特定の波長を有する放出された光の強度に対応するシグナルを登録する。各検出器における光強度は電子的にサンプリングされ、数値化され、電子回路（図示せず）に送られる。電子回路は、特定のマイクロチャネルが、マイクロチャネルから取り出されるべきである細胞を含むかどうかに関する決定を下すために、各検出器からのシグナルを処理する。場合によっては、電子回路は、複数の検出器それぞれによって検出された放出された光の強度が閾値を超えるかどうかを決定するように作用する。場合によっては、電子回路は、複数の検出器それぞれによって検出された放出された光の強度が数値の範囲内に入るかどうかを決定するように作用する。場合によっては、数値の範囲は検出器ごとに異なり得る。複数の検出器それぞれによって検出された放出された光の強度が数値範囲内にあるならば、電子回路は、対応する細胞を所与のマイクロチャネルから取り出すためのシグナルを送出する。場合によっては、回路はファームウェアとして実現される。場合によっては、回路はフィールドプログラマブルゲートアレイ（FPGA）として実現される。
【０１５３】
いくつかの例において、検出器ごとの数値範囲はスキャン処置の開始時には未知であり得る。たとえば、数値範囲は細胞型（たとえば赤血球、白血球など）に依存し得る。数値範囲は、システムの動作パラメータ（たとえば光学部品の経年劣化）に依存し得る。したがって、新たなカセットをシステム中に受けたとき、許容可能な数値範囲を決定することが有利であるといえる。たとえば、そのような範囲は、試料細胞集団全体で複数の励起光源をスキャンし、細胞集団に関して各検出器における強度を測定することによって決定され得る。細胞集団は、1,000を超える、10,000を超える、100,000を超える、または1,000,000を超える細胞を含み得る。細胞集団は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内にあり得る。数値範囲は、試料集団からの細胞の亜集団だけが、数値範囲内に入る蛍光強度を生じさせるように選択され得る。たとえば、検出器ごとの数値範囲は、細胞の1％未満、5％未満、10％未満、20％未満または50％未満が、各検出器において数値範囲内に入る蛍光強度を生じさせるように選択され得る。数値範囲は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内にあるように選択され得る。そして、数値範囲を使用して、カセット全体のスキャン中に所与の細胞を所与のマイクロチャネルから取り出すべきであるかどうかを決定し得る。
【０１５４】
電子回路が、所与のマイクロチャネル中の所与の細胞がマイクロチャネルからの取り出しの基準を満たすという決定を下すと、抽出レーザ光源1130からの光をマイクロチャネルに向けるためのシグナルが送出され得る。場合によっては、抽出レーザおよび回路は共通のクロックに同期化され得る。抽出レーザ光源は、マイクロチャネルからの細胞の抽出を可能にする波長の光を放出し得る。たとえば、本明細書に記載されるように、抽出レーザ光源は、マイクロチャネル中の粒子によって吸収される波長の光を放出し得る。抽出レーザ光源は、電磁スペクトルの紫外、可視または近赤外領域の波長の光を放出し得る。抽出レーザ光源は約200nm〜約2000nmの波長範囲の光を放出し得る。抽出レーザ光源は持続波レーザ光源を含み得る。抽出光源は準持続波レーザ光源を含み得る。抽出光源はパルスレーザ光源を含み得る。パルスレーザ光源は、10fsよりも短い、100fsよりも短い、1psよりも短い、10psよりも短い、100psよりも短い、1nsよりも短い、10nsよりも短い、100nsよりも短い、1μsよりも短い、10μsよりも短い、100μsよりも短い、または1msよりも短い持続時間を有するレーザパルスを放出し得る。パルスレーザ光源は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内にある持続時間を有するレーザパルスを放出し得る。場合によっては、パルスレーザ光源は、約1fs〜約100μsの範囲内の持続時間を有するレーザパルスを放出し得る。場合によっては、パルスレーザ光源は、約100ns〜約10μsの範囲内の持続時間を有するレーザパルスを放出し得る。パルスレーザ光源は、調節可能な持続時間を有するレーザパルスを放出し得る。
【０１５５】
パルスレーザ光源は、1kHz未満、10kHz未満、100kHz未満、1MHz未満、10MHz未満、100MHz未満または1GHz未満の繰り返し率でレーザパルスを放出し得る。パルスレーザ光源は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内にある繰り返し率でレーザパルスを放出し得る。場合によっては、パルスレーザ光源は、約10KHz〜約1MHzの範囲内の繰り返し率でパルスを放出し得る。場合によっては、各パルスは、1nJ未満、10nJ未満、100nJ未満、1μJ未満、10μJ未満、100μJ未満または1mJ未満のエネルギーを生成し得る。各パルスは、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲にあるエネルギーを生成し得る。場合によっては、各パルスは、約1μJ〜約50μJの範囲にあるエネルギーを生成し得る。パルスレーザ光源は、0.1W〜107Wの範囲のピークパワーを放出し得る。
【０１５６】
パルスレーザ光源はファイバレーザ光源であり得る。パルスレーザ光源はパルスオンデマンドファイバレーザ光源であり得る。パルスレーザ光源は主発振器ファイバ増幅器（MOPA）レーザ光源であり得る。パルスレーザ光源は、ドープされたファイバレーザ光源であり得る。パルスレーザ光源は、希土類イオンドープされたファイバレーザ光源であり得る。パルスレーザ光源は、イッテルビウムドープされたファイバレーザ光源であり得る。パルスレーザ光源は、ドープされた結晶利得媒質を利用するレーザであり得る。パルスレーザ光源は、ネオジムドープされた結晶利得媒質を利用するレーザであり得る。パルスレーザ光源はNd：YAGレーザであり得る。パルスレーザ光源はNd：YVO4レーザであり得る。パルスレーザ光源は半導体レーザであり得る。パルスレーザ光源はダイオードレーザであり得る。パルスレーザ光源は垂直共振面発光レーザ（VCSEL）であり得る。パルスレーザ光源はVCSELアレイであり得る。パルスレーザ光源はガスレーザであり得る。パルスレーザ光源はC02レーザであり得る。パルスレーザ光源はエキシマレーザであり得る。パルスレーザ光源はQスイッチングを用い得る。パルスレーザ光源はモード同期を用い得る。パルスレーザ光源は、当業者に公知である任意のパルスレーザ光源であり得る。
【０１５７】
パルスレーザ光源は、複数の検出器それぞれにおける光検出器の強度に応答する電子回路からのシグナルに応答してレーザパルスをマイクロチャネルに向け得る。パルスは、音響光学変調器（AOM）、電気光学変調器（EOM）または当業者に公知であり得る任意の変調装置を使用してマイクロチャネルに向けられ得る。たとえば、変調装置は、抽出レーザがマイクロチャネルから細胞を取り出すべきであるというシグナルに応答したときだけゼロ次回折ビームを通過させるように構成され得る。他のすべての場合、変調装置は、一次回折ビームまたは高次回折ビームを通過させるように構成され得る。場合によっては、パルスレーザは、抽出レーザがマイクロチャネルから細胞を取り出すべきであるというシグナルに応答したときだけパルスを生成し得る。たとえば、ドープされたファイバレーザは、パルスをマイクロチャネルに向けるためのシグナルを受けるまでは、逆方向バイアス形態で作動し得る。パルスをマイクロチャネルに向けるためのシグナルを受けると、ドープされたファイバレーザは、順方向バイアス形態で作動し得る。
【０１５８】
抽出レーザは、ミラー1132によって回転ポリゴンミラーに向けられ得る。回転ポリゴンミラーは、ポリゴンミラーの回転軸に対して垂直な湾曲した焦点面に沿って抽出レーザからの光を高速でスキャンする。Fシータレンズが、実質的に平坦である焦点面を形成する。回転ポリゴンミラーの表面からの反射およびFシータレンズを通しての屈折ののち、抽出レーザからの光はカセット100に向けられる。Fシータレンズは、複数の励起ビームをカセット中のマイクロチャネルに集束させるように構成され得る。抽出レーザがマイクロチャネルに向けられると、レーザからの光が、細胞が懸濁している液体試料のキャビテーションを生じさせる。これがマイクロチャネルからの細胞の取り出しを生じさせる。
【０１５９】
システムは、複数の蛍光励起ビームおよび抽出ビームの両方をスキャンするように構成され得る。場合によっては、システムは、抽出ビームが複数の蛍光励起ビームから離れるように抽出ビームをスキャンするように構成され得る。場合によっては、システムは、複数の励起光源を第一のマイクロチャネルに集束させると同時に抽出レーザを第二のマイクロチャネルに集束させるように構成され得る。場合によっては、抽出ビームは、複数の蛍光励起ビームから1μm、5μm、10μm未満、50μm未満、100μm未満、500μm未満、1mm未満、5mm未満または10mm未満の距離だけ離され得る。場合によっては、抽出ビームは、複数の蛍光励起ビームから前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内にある距離だけ離され得る。場合によっては、励起ビームは、複数の蛍光励起ビームから約100μm〜約5mmの範囲内の距離だけ離され得る。場合によっては、励起ビームは、複数の蛍光励起ビームから約100μm〜約1mmの範囲内の距離だけ離され得る。場合によっては、複数の蛍光励起ビームから約10μm〜約1000mmの範囲内の距離だけ離され得る。複数の励起光源と抽出ビームとはカセットの同じ側に位置してもよい。複数の励起光源と抽出ビームとはカセットの反対側に位置してもよい。
【０１６０】
場合によっては、システムは、毎秒10,000チャネルを超える、毎秒50,000チャネルを超える、毎秒100,000チャネルを超える、毎秒500,000チャネルを超える、毎秒1,000,000チャネルを超える、毎秒5,000,000チャネルを超える、毎秒10,000,000チャネルを超える、毎秒50,000,000チャネルを超える、または毎秒100,000,000チャネルを超える速度でマイクロチャネルをスキャンするように構成され得る。システムは、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内にある速度でマイクロチャネルをスキャンするように構成され得る。場合によっては、システムは、毎秒約3,000〜約300,000,000チャネルの範囲内の速度でマイクロチャネルをスキャンするように構成され得る。
【０１６１】
システム1100は、毎秒1,000,000マイクロチャネルを超える、毎秒2,000,000マイクロチャネルを超える、または毎秒3,000,000マイクロチャネルを超える速度で基板をスキャンし得る。システム1100は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内である速度で基板をスキャンし得る。システム1100は、毎秒500,000マイクロチャネルを超える、毎秒600,000マイクロチャネルを超える、毎秒700,000マイクロチャネルを超える、毎秒800,000マイクロチャネルを超える、毎秒900,000マイクロチャネルを超える、または毎秒1,000,000マイクロチャネルを超える速度で基板から標的粒子を抽出し得る。システム1100は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内である速度で標的粒子を抽出し得る。システム1100は、抽出される標的粒子の集合体が90％を超える、95％を超える、または99％を超える純度を有するように標的粒子を抽出し得る。システム1100は、抽出される標的粒子の集合体が前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内である純度を有するように標的粒子を抽出し得る。
【０１６２】
図11には1つの装置を形成するものとして示されるが、システム1100は、蛍光サブシステム（要素1110、1112、1120、1122、1124、1140、1150、1160、1162、1164、1170および1172を含む）が蛍光装置として配置され、抽出サブシステム（要素1130、1132、1140および1150を含む）が抽出装置として配置されるように構成されてもよい。そのような配置において、基板100は、蛍光装置を使用して、本明細書に記載されるような蛍光分析に処され得る。蛍光分析ののち、基板は、蛍光分析中に識別された基板上の関心対象の位置の抽出のために抽出装置に移され得る。蛍光装置および抽出装置それぞれにおける基板の正しい整合は、基板上の1つまたは複数の基準マーカを参照することによって達成され得る。場合によっては、システム1100を2つの装置上に配置することは、システム1100の1つまたは複数の要素の複製を要し得る。たとえば、要素1140および1150は、蛍光装置および抽出装置の両方で必要とされ得る。
【０１６３】
レーザスキャン式細胞選別のための光学装置の別の態様において、図12は、2つの回転ポリゴンミラーを利用する光学装置を示す。装置1200は図11の装置1100の要素をすべて含む。装置は、複数の励起光源1110および1112、ダイクロイックミラー1120、ビームエキスパンダ1122、励起光ミラー1124、抽出レーザ1130、抽出レーザミラー1132、回転ポリゴンミラー1140、Fシータレンズ1150、光ガイド1160、結合光学素子1162、複数のビームスプリッタ1164ならびに複数の検出器1170および1172を含む。
【０１６４】
加えて、装置1200は、第二の回転ポリゴンミラー1142および第二のFシータレンズ1152を含む。場合によっては、第二のポリゴンミラーに代えてレゾナントスキャニングミラーを用いてもよい。システムは、第一の回転ポリゴンミラー1140および第一のFシータレンズ1150によって複数の励起光源がカセット100に向けられ、第二の回転ポリゴンミラー1142および第二のFシータレンズ1152によって抽出レーザがカセットに向けられるように構成され得る。複数の励起光源と抽出ビームとはカセットの同じ側に位置してもよい。複数の励起光源と抽出ビームとはカセットの反対側に位置してもよい。
【０１６５】
第一の回転ポリゴンミラーは、ポリゴンミラーの回転軸に対して垂直な湾曲した焦点面に沿って蛍光励起光源からの光を高速でスキャンする。第一のFシータレンズが、実質的に平坦である焦点面を形成する。第一の回転ポリゴンミラーの表面からの反射および第一のFシータレンズを通しての屈折ののち、励起光源からの光はカセット100に向けられる。第一のFシータレンズは、複数の励起ビームをカセット中のマイクロチャネルに集束させるように構成され得る。第一の回転ポリゴンミラーが回転すると、励起光源からの光は、カセット中のマイクロチャネルの線にかけてスキャンされる。
【０１６６】
第二の回転ポリゴンミラーは、ポリゴンミラーの回転軸に対して垂直な湾曲した焦点面に沿って励起レーザからの光を高速でスキャンする。第二のFシータレンズが、実質的に平坦である焦点面を形成する。第二の回転ポリゴンミラーの表面からの反射および第二のFシータレンズを通しての屈折ののち、抽出レーザからの光はカセット100に向けられる。第二のFシータレンズは、抽出レーザをカセット中のマイクロチャネルに集束させるように構成され得る。第二の回転ポリゴンミラーが回転すると、抽出レーザからの光は、カセット中のマイクロチャネルの線にかけてスキャンされる。
【０１６７】
システムは、第一の回転ポリゴンミラーを使用して複数の蛍光励起ビームをスキャンし、第二の回転ポリゴンミラーを使用して抽出ビームをスキャンするように構成され得る。場合によっては、システムは、抽出ビームが複数の蛍光励起ビームから離れるように抽出ビームをスキャンするように構成され得る。場合によっては、システムは、複数の励起光源を第一のマイクロチャネルに集束させると同時に抽出レーザを第二のマイクロチャネルに集束させるように構成され得る。場合によっては、抽出ビームは、複数の蛍光励起ビームから1μm、5μm、10μm未満、50μm未満、100μm未満、500μm未満、1mm未満、5mm未満または10mm未満の距離だけ離され得る。場合によっては、抽出ビームは、複数の蛍光励起ビームから前記数値のいずれか2つによって画定される範囲にある距離だけ離され得る。場合によっては、励起ビームは、複数の蛍光励起ビームから約100μm〜約5mmの範囲内の距離だけ離され得る。場合によっては、抽出ビームは、複数の蛍光励起ビームから約100μm〜約1mmの範囲内の距離だけ離され得る。場合によっては、抽出ビームは、複数の蛍光励起ビームから約10μm〜約1000mmの範囲内の距離だけ離され得る。場合によっては、複数の励起光源のスキャンと励起レーザのスキャンとは同期化される。場合によっては、同期化は同期クロックシグナルを介して達成される。複数の励起光源と抽出ビームとはカセットの同じ側に位置してもよい。複数の励起光源と抽出ビームとはカセットの反対側に位置してもよい。
【０１６８】
場合によっては、システムは、毎秒10,000チャネルを超える、毎秒50,000チャネルを超える、毎秒100,000チャネルを超える、毎秒500,000チャネルを超える、毎秒1,000,000チャネルを超える、毎秒5,000,000チャネルを超える、毎秒10,000,000チャネルを超える、毎秒50,000,000チャネルを超える、または毎秒100,000,000チャネルを超える速度でマイクロチャネルをスキャンするように構成され得る。システムは、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲にある速度でマイクロチャネルをスキャンするように構成され得る。場合によっては、システムは、毎秒約3,000〜約300,000,000チャネルの速度でマイクロチャネルをスキャンするように構成され得る。
【０１６９】
システム1200は、毎秒1,000,000マイクロチャネルを超える、毎秒2,000,000マイクロチャネルを超える、または毎秒3,000,000マイクロチャネルを超える速度で基板をスキャンし得る。システム1200は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内である速度で基板をスキャンし得る。システム1200は、毎秒500,000マイクロチャネルを超える、毎秒600,000マイクロチャネルを超える、毎秒700,000マイクロチャネルを超える、毎秒800,000マイクロチャネルを超える、毎秒900,000マイクロチャネルを超える、または毎秒1,000,000マイクロチャネルを超える速度で基板から標的粒子を抽出し得る。システム1200は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内である速度で標的粒子を抽出し得る。システム1200は、抽出される標的粒子の集合体が90％を超える、95％を超える、または99％を超える純度を有するように標的粒子を抽出し得る。システム1200は、抽出される標的粒子の集合体が前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内である純度を有するように標的粒子を抽出し得る。
【０１７０】
図12には1つの装置を形成するものとして示されるが、システム1200は、蛍光サブシステム（要素1110、1112、1120、1122、1124、1140、1150、1160、1162、1164、1170および1172を含む）が蛍光装置として配置され、抽出サブシステム（要素1130、1132、1142および1152を含む）が抽出装置として配置されるように構成されてもよい。そのような配置において、基板100は、蛍光装置を使用して、本明細書に記載されるような蛍光分析に処され得る。蛍光分析ののち、基板は、蛍光分析中に識別された基板上の関心対象の位置の抽出のために抽出装置に移され得る。蛍光装置および抽出装置それぞれにおける基板の正しい整合は、基板上の1つまたは複数の基準マーカを参照することによって達成され得る。
【０１７１】
レーザスキャン式細胞選別のための光学装置の別の態様において、図13は、2つの回転ポリゴンミラーおよび共焦点検出技術を利用する光学装置を示す。装置1300は図11の装置1100の要素の多くを含む。装置は、複数の励起光源1110および1112、ダイクロイックミラー1120、ビームエキスパンダ1122、励起光ミラー1124、抽出レーザ1130、抽出レーザミラー1132、回転ポリゴンミラー1140、Ｆシータレンズ1150、結合光学素子1162、複数のビームスプリッタ1164ならびに複数の検出器1170および1172を含む。
【０１７２】
加えて、装置1300は、第二の回転ポリゴンミラー1142および第二のFシータレンズ1152を含み得る。システムは、第一の回転ポリゴンミラー1140および第一のFシータレンズ1150によって複数の励起光源がカセット100に向けられ、第二の回転ポリゴンミラー1142および第二のFシータレンズ1152によって抽出レーザがカセットに向けられるように構成され得る。複数の励起光源と抽出ビームとはカセットの同じ側に位置してもよい。複数の励起光源と抽出ビームとはカセットの反対側に位置してもよい。
【０１７３】
光ガイドの代わりに、装置1300は、光を1つまたは複数の検出器に向けるためのミラーのセットをさらに含む。励起光ミラー1124はダイクロイックミラーであり得る。共焦点検出キャビティはミラー1166および1168を含み得る。ミラーは平面鏡であり得る。ミラーは凹面鏡であり得る。ミラーは球面鏡であり得る。ミラーは共焦点配置に整列され得る。
【０１７４】
システム1300は、毎秒1,000,000マイクロチャネルを超える、毎秒2,000,000マイクロチャネルを超える、または毎秒3,000,000マイクロチャネルを超える速度で基板をスキャンし得る。システム1300は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内である速度で基板をスキャンし得る。システム1300は、毎秒500,000マイクロチャネルを超える、毎秒600,000マイクロチャネルを超える、毎秒700,000マイクロチャネルを超える、毎秒800,000マイクロチャネルを超える、毎秒900,000マイクロチャネルを超える、または毎秒1,000,000マイクロチャネルを超える速度で基板から標的粒子を抽出し得る。システム1300は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内である速度で標的粒子を抽出し得る。システム1300は、抽出される標的粒子の集合体が90％を超える、95％を超える、または99％を超える純度を有するように標的粒子を抽出し得る。システム1300は、抽出される標的粒子の集合体が前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内である純度を有するように標的粒子を抽出し得る。
【０１７５】
図13には1つの装置を形成するものとして示されるが、システム1300は、蛍光サブシステム（要素1110、1112、1120、1122、1124、1140、1150、1164、1166、1168、1170および1172を含む）が蛍光装置として配置され、抽出サブシステム（要素1130、1132、1142および1152を含む）が抽出装置として配置されるように構成されてもよい。そのような配置において、基板100は、蛍光装置を使用して、本明細書に記載されるような蛍光分析に処され得る。蛍光分析ののち、基板は、蛍光分析中に識別された基板上の関心対象の位置の抽出のために抽出装置に移され得る。蛍光装置および抽出装置それぞれにおける基板の正しい整合は、基板上の1つまたは複数の基準マーカを参照することによって達成され得る。
【０１７６】
レーザスキャン式細胞選別のための光学装置の別の態様において、図14は、ガルバノメータスキャン機構を利用する光学装置を示す。装置1400は蛍光励起光源1410を含む。場合によっては、装置は複数の蛍光励起光源を含み得る。場合によっては、複数の励起光源は重なり合い得る。場合によっては、複数の励起光源は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または12よりも多い蛍光励起光源を含み得る。複数の蛍光励起光源の1つまたは複数はレーザ光源を含み得る。励起光源の1つまたは複数は発光ダイオード（LED）光源を含み得る。場合によっては、複数の蛍光励起光源の1つまたは複数は、特定のフルオロフォアの蛍光励起波長に対応する波長の光を放出し得る。場合によっては、励起光源の1つまたは複数は、複数の波長の光を放出するように構成され得る。場合によっては、励起光源の1つまたは複数は、複数の波長それぞれが、複数の波長の他のピークから離れたピークを含むような複数の波長の光を放出するように構成され得る。複数の蛍光励起光源の1つまたは複数は、自己蛍光を励起するために細胞に対して内在性であるフルオロフォアの励起波長に対応する波長の光を放出し得る。たとえば、複数の蛍光励起光源の1つまたは複数は、自己蛍光分子、たとえばニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADPH）、クロロフィル、コラーゲン、レチノール、リボフラビン、コレカルシフェロール、葉酸、ピリドキシン、チロシン、ジチロシン、インドールアミン、リポフスチン、ポリフェノール、トリプトファン、フラビンまたはメラニンの励起波長にチューニングされ得る。励起光源の1つまたは複数は、任意の自己蛍光分子の励起波長に対応する波長の光を放出し得る。
【０１７７】
複数の蛍光励起光源の1つまたは複数は、細胞に対して外在性であるフルオロフォアの励起波長に対応する波長の光を放出し得る。たとえば、複数の蛍光励起光源の1つまたは複数は、ヒドロキシクマリン、メトキシクマリン、Alexa fluor、アミノクマリン、Cy2、カルボキシフルオレセイン（FAM）、Alexa fluor 488、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）、Alexa fluor 430、Alexa fluor 532、6-カルボキシ-2,4,4,5,7,7-ヘキサクロロフルオレセイン（HEX）、Cy3、テトラメチルローダミン（TRITC）、Alexa fluor 546、Alexa fluor 555、R-フィコエリスリン、Rhodamine Red-X、Tamara、Cy3.5 581、Rox、Alexa fluor 568、Red 613、Texas Red、Alexa fluor 594、Alexa fluor 633、アロフィコシアン、Alexa fluor 647、Cy5、Alexa fluor 660、Cy5.5、TruRed、Alexa fluor 680、Cy7または当業者に公知の任意の他のフルオロフォアの励起波長にチューニングされ得る。
【０１７８】
蛍光励起光源からの光はコンディショニング光学素子のセットに向けられる。コンディショニング光学素子は第一のレンズ1420および第二のレンズ1424を含み得る。2つのレンズは、励起光のビームウエストを拡大する、励起光のビームウエストを縮小する、および／または励起光を平行化するように作用し得る。コンディショニング光学素子はフィルタホイール1422をさらに含み得る。
【０１７９】
次いで、励起光はダイクロイックミラー1480に送られる。場合によっては、2つよりも多い励起光源からの光をビームエキスパンダに向けるために複数のダイクロイックミラーが利用される。装置は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または12よりも多いダイクロイックミラーを含み得る。場合によっては、装置はマルチエッジダイクロイックキューブを含み得る。
【０１８０】
励起光はダイクロイックミラー1460に向けられる。ダイクロイックミラー1460は、電磁スペクトルの紫外または可視領域の波長を有する光を通過させ、電磁スペクトルの赤外領域の波長を有する光を反射するように構成されたダイクロイックミラーであり得る。励起光は対物レンズ1470に向けられる。対物レンズは、1×、2×、5×、10×、20×、50×、100×、200×、500×、1000×よりも高い倍率を有し得る。対物レンズは、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲の倍率を有し得る。対物レンズは無限遠補正対物レンズであり得る。対物レンズは大きな励起場および大きな視野を提供する。これは、励起光源のスキャンを要することなく、励起光源がカセット100の大きな区域を照射することを可能にする。場合によっては、装置は、複数の視野を有する複数の対物レンズを含み得る。
【０１８１】
場合によっては、装置は、励起光を対物レンズの視野と同軸に伝送するように構成されている。場合によっては、励起光は拡散励起光を含む。場合によっては、励起光は拡散無限遠補正励起光を含む。励起光は、1mm未満、5mm未満、10mm未満、50mm未満または100mm未満の励起場にかけて蛍光を励起し得る。励起光は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲にある励起場にかけて蛍光を励起し得る。対物レンズは、1mm未満、5mm未満、10mm未満、50mm未満または100mm未満の視野を有し得る。対物レンズは、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲にある視野を有し得る。場合によっては、視野は光学構造で画定される。光学構造はアパーチャであり得る。光学構造は、アパーチャを横切る寸法であり得る。光学構造はピンホールであり得る。光学構造はミラーであり得る。光学構造は、ミラーの反射面を横切る寸法であり得る。
【０１８２】
励起光源からの光を受けると、マイクロチャネル中の1つまたは複数の細胞が蛍光を発し、蛍光を刺激した励起光源の波長よりも高い波長の光を放出し得る。蛍光は、細胞内または細胞上に位置する内在性フルオロフォアの存在により得る。蛍光は外在性フルオロフォアの存在により得る。放出された光は、所望の光の波長を選択するための波長セレクタ1482に向けられる。場合によっては、波長セレクタは濾波された光を生成する。濾波された光は、レンズ1484を使用して二次元アレイ検出器1490に向けられる。場合によっては、二次元アレイ検出器はカメラを含む。場合によっては、レンズ1484はチューブレンズを含む。カメラは、その視野内に位置する細胞の蛍光イメージを生成する。
【０１８３】
波長セレクタはフィルタを含み得る。フィルタは発光フィルタを含み得る。フィルタは発光フィルタホイールを含み得る。発光フィルタホイールは複数のフィルタを含み得る。場合によっては、装置は複数の波長選択フィルタを含み得る。波長セレクタはダイクロイックミラーを含み得る。波長セレクタはプリズムを含み得る。波長セレクタは回折格子を含み得る。装置は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または12よりも多い波長セレクタを含み得る。場合によっては、装置は複数のカメラを含み得る。装置は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12または12よりも多いカメラを含み得る。複数の波長セレクタの各フィルタは、放出された光の1つまたは複数の波長が複数のカメラの1つまたは複数に通過することを可能にし得、放出された光の他の波長を方向転換させ得る、または吸収し得る。複数のカメラの各カメラは、電荷結合素子（CCD）カメラ、相補型金属酸化膜半導体（CMOS）カメラまたは当業者に公知の任意の他のカメラであり得る。
【０１８４】
各カメラは、特定の波長を有する放出された光の強度に対応するイメージを登録する。各カメラにおける光強度は電子的にサンプリングされ、数値化され、電子回路（図示せず）に送られる。電子回路は、特定のマイクロチャネルが、マイクロチャネルから取り出されるべきである細胞を含むかどうかに関する決定を下すために、各カメラからのシグナルを処理する。場合によっては、電子回路は、複数のカメラそれぞれによって検出された各画素における放出された光の強度が閾値を超えるかどうかを決定するように作用する。場合によっては、電子回路は、複数のカメラそれぞれによって検出された各画素における放出された光の強度が数値範囲内に入るかどうかを決定するように作用する。場合によっては、数値範囲はカメラごとに異なり得る。複数のカメラそれぞれによって検出された放出された光の強度が所与の画素の数値範囲内にあるならば、電子回路は、対応する細胞を所与のマイクロチャネルから取り出すためのシグナルを送出する。場合によっては、回路はファームウェアとして実現される。場合によっては、回路はフィールドプログラマブルゲートアレイ（FPGA）として実現される。
【０１８５】
いくつかの例において、検出器ごとの数値範囲はスキャン処置の開始時には未知であり得る。たとえば、数値範囲は細胞型（たとえば赤血球、白血球など）に依存し得る。数値範囲は、システムの動作パラメータ（たとえば光学部品の経年劣化）に依存し得る。したがって、新たなカセットをシステム中に受けたとき、許容可能な数値範囲を決定することが有利であるといえる。たとえば、そのような範囲は、試料細胞集団全体で複数の励起光源をスキャンし、細胞集団に関して各カメラの画素における強度を測定することによって決定され得る。細胞集団は、1,000を超える、10,000を超える、100,000を超える、または1,000,000を超える細胞を含み得る。細胞集団は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲にあり得る。数値範囲は、試料集団からの細胞の亜集団だけが、数値範囲内に入る蛍光強度を生じさせるように選択され得る。たとえば、各カメラの画素ごとの数値範囲は、細胞の1％未満、5％未満、10％未満、20％未満または50％未満が、数値範囲内に入る各カメラの各画素における蛍光強度を生じさせるように選択され得る。数値範囲は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内にあるように選択され得る。そして、数値範囲を使用して、カセット全体のスキャン中に所与の細胞を所与のマイクロチャネルから取り出すべきであるかどうかを決定し得る。
【０１８６】
電子回路が、所与のマイクロチャネル中の所与の細胞がマイクロチャネルからの取り出しの基準を満たすという決定を下すと、抽出レーザ光源1430からの光をマイクロチャネルに向けるためのシグナルが送出され得る。場合によっては、抽出レーザおよび回路は共通のクロックに同期化され得る。抽出レーザ光源は、マイクロチャネルからの細胞の取り出しを可能にする波長の光を放出し得る。たとえば、本明細書に記載されるように、抽出レーザ光源は、マイクロチャネル中の粒子によって吸収される波長の光を放出し得る。抽出レーザ光源は、電磁スペクトルの紫外、可視または近赤外領域の波長の光を放出し得る。抽出レーザ光源は、約200nm〜約2000nmの波長範囲の光を放出し得る。抽出レーザ光源は持続波レーザ光源を含み得る。抽出光源は準持続波レーザ光源を含み得る。抽出光源はパルスレーザ光源を含み得る。パルスレーザ光源は、10fsよりも短い、100fsよりも短い、1psよりも短い、10psよりも短い、100psよりも短い、1nsよりも短い、10nsよりも短い、100nsよりも短い、1μsよりも短い、10μsよりも短い、100μsよりも短い、または1msよりも短い持続時間を有するレーザパルスを放出し得る。パルスレーザ光源は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲にある持続時間を有するレーザパルスを放出し得る。場合によっては、パルスレーザ光源は、約1fs〜約100μsの範囲内の持続時間を有するレーザパルスを放出し得る。場合によっては、パルスレーザ光源は、約100ns〜約10μsの範囲内の持続時間を有するレーザパルスを放出し得る。パルスレーザ光源は、調節可能な持続時間を有するレーザパルスを放出し得る。
【０１８７】
パルスレーザ光源は、1kHz未満、10kHz未満、100kHz未満、1MHz未満、10MHz未満、100MHz未満または1GHz未満の繰り返し率でレーザパルスを放出し得る。パルスレーザ光源は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲にある繰り返し率でレーザパルスを放出し得る。場合によっては、パルスレーザ光源は、約10KHz〜約1MHzの範囲内の繰り返し率でパルスを放出し得る。場合によっては、各パルスは、1nJ未満、10nJ未満、100nJ未満、1μJ未満、10μJ未満、100μJ未満、1mJ未満または10mJ未満のエネルギーを生成し得る。各パルスは、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲にあるエネルギーを生成し得る。場合によっては、各パルスは、約100nJ〜約1mJの範囲にあるエネルギーを生成し得る。パルスレーザ光源は、0.1W〜107Wの範囲のピークパワーを放出し得る。
【０１８８】
パルスレーザ光源はファイバレーザ光源であり得る。パルスレーザ光源はパルスオンデマンドファイバレーザ光源であり得る。パルスレーザ光源は主発振器ファイバ増幅器（MOPA）レーザ光源であり得る。パルスレーザ光源は、ドープされたファイバレーザ光源であり得る。パルスレーザ光源は、希土類イオンドープされたファイバレーザ光源であり得る。パルスレーザ光源は、イッテルビウムドープされたファイバレーザ光源であり得る。パルスレーザ光源は、ドープされた結晶利得媒質を利用するレーザであり得る。パルスレーザ光源は、ネオジムドープされた結晶利得媒質を利用するレーザであり得る。パルスレーザ光源はNd：YAGレーザであり得る。パルスレーザ光源はNd：YVO4レーザであり得る。パルスレーザ光源は半導体レーザであり得る。パルスレーザ光源はダイオードレーザであり得る。パルスレーザ光源は垂直共振面発光レーザ（VCSEL）であり得る。パルスレーザ光源はVCSELアレイであり得る。パルスレーザ光源はガスレーザであり得る。パルスレーザ光源はC02レーザであり得る。パルスレーザ光源はエキシマレーザであり得る。パルスレーザ光源はQスイッチングを用い得る。パルスレーザ光源はモード同期を用い得る。パルスレーザ光源は、当業者に公知である任意のパルスレーザ光源であり得る。
【０１８９】
パルスレーザ光源は、複数の検出器それぞれにおける光検出器の強度に応答する電子回路からのシグナルに応答してレーザパルスをマイクロチャネルに向け得る。パルスは、音響光学変調器（AOM）、電気光学変調器（EOM）または当業者に公知であり得る任意の変調装置を使用してマイクロチャネルに向けられ得る。たとえば、変調装置は、抽出レーザがマイクロチャネルから細胞を取り出すべきであるというシグナルに応答したときだけゼロ次回折ビームを通過させるように構成され得る。他のすべての場合、変調装置は、一次回折ビームまたは高次回折ビームを通過させるように構成され得る。場合によっては、パルスレーザは、抽出レーザがマイクロチャネルから細胞を取り出すべきであるというシグナルに応答したときだけパルスを生成し得る。たとえば、ドープされたファイバレーザは、パルスをマイクロチャネルに向けるためのシグナルを受けるまでは、逆方向バイアス形態で作動し得る。パルスをマイクロチャネルに向けるためのシグナルを受けると、ドープされたファイバレーザは、順方向バイアス形態で作動し得る。
【０１９０】
抽出レーザはガルバノメータスキャナブロック1440に向けられ得る。ガルバノメータスキャナブロックは、その回転軸に対して垂直な湾曲した焦点面に沿って抽出レーザからの光を高速でスキャンするように構成され得る。ガルバノメータは、所望の発火位置でレーザパルスを発火するためのシグナルを回路から受けるまで、スキャンされ得る。ガルバノメータスキャナブロックは、抽出レーザを所望の発火位置に向ける前に、回路からのシグナルを待つように構成され得る。ガルバノメータスキャナブロックによる抽出ビームの指向ののち、Fシータリレーレンズ1450および1452が、実質的に平坦である焦点面を形成する。ガルバノメータスキャナブロックからの反射およびFシータレンズを通しての屈折ののち、抽出レーザからの光はカセット100に向けられる。Fシータレンズは、複数の抽出ビームをカセット中のマイクロチャネルに集束させるように構成され得る。抽出レーザがマイクロチャネルに向けられると、レーザからのエネルギーが、細胞が懸濁している液体試料のキャビテーションを生じさせる。これがマイクロチャネルからの細胞の取り出しを生じさせる。
【０１９１】
システムは、抽出ビームをスキャンするように構成され得る。場合によっては、システムは、毎秒10,000チャネルを超える、毎秒50,000チャネルを超える、毎秒100,000チャネルを超える、毎秒500,000チャネルを超える、毎秒1,000,000チャネルを超える、毎秒5,000,000チャネルを超える、毎秒10,000,000チャネルを超える、毎秒50,000,000チャネルを超える、または毎秒100,000,000チャネルを超える速度でマイクロチャネルをスキャンするように構成され得る。システムは、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲にある速度でマイクロチャネルをスキャンするように構成され得る。場合によっては、システムは、毎秒約3,000〜約300,000,000チャネルの範囲内の速度でマイクロチャネルをスキャンするように構成され得る。
【０１９２】
システム1400は、毎秒1,000,000マイクロチャネルを超える、毎秒2,000,000マイクロチャネルを超える、または毎秒3,000,000マイクロチャネルを超える速度で基板をスキャンし得る。システム1400は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内である速度で基板をスキャンし得る。システム1400は、毎秒500,000マイクロチャネルを超える、毎秒600,000マイクロチャネルを超える、毎秒700,000マイクロチャネルを超える、毎秒800,000マイクロチャネルを超える、毎秒900,000マイクロチャネルを超える、または毎秒1,000,000マイクロチャネルを超える速度で基板から標的粒子を抽出し得る。システム1400は、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内である速度で標的粒子を抽出し得る。システム1100は、抽出される標的粒子の集合体が90％を超える、95％を超える、または99％を超える純度を有するように標的粒子を抽出し得る。システム1400は、抽出される標的粒子の集合体が前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内である純度を有するように標的粒子を抽出し得る。
【０１９３】
図14には1つの装置を形成するものとして示されるが、システム1400は、蛍光サブシステム（要素1410、1420、1422、1424、1460、1470、1480、1482、1484および1490を含む）が蛍光装置として配置され、抽出サブシステム（要素1430、1440、1450、1452、1460および1470を含む）が抽出装置として配置されるように構成されてもよい。そのような配置において、基板100は、蛍光装置を使用して、本明細書に記載される蛍光分析に処され得る。蛍光分析ののち、基板は、蛍光分析中に識別された基板上の関心対象の位置の抽出のために抽出装置に移され得る。蛍光装置および抽出装置それぞれにおける基板の正しい整合は、基板上の1つまたは複数の基準マーカを参照することによって達成され得る。場合によっては、システム1400を2つの装置上に配置することは、システム1400の1つまたは複数の要素の複製を要し得る。たとえば、要素1460および1470は、蛍光装置および抽出装置の両方で必要とされ得る。
【０１９４】
代替蛍光検出システム
図17は代替蛍光検出システム1700の略図を示す。システム1700は、本明細書に記載される任意の他の蛍光検出システムの代わりに使用され得る。たとえば、システム1700は、図11の構成要素1110、1112、1120、1122、1124、1132、1150、1160、1162、1164、1170および1172のセットの任意のサブセット、図12の構成要素1110、1112、1120、1122、1124、1140、1150、1160、1162、1174、1170および1172のセットの任意のサブセット、図13の構成要素1110、1112、1120、1122、1124、1140、1150、1164、1166、1168、1170および1172のセットの任意のサブセットまたは図14の構成要素1410、1420、1422、1424、1460、1470、1480、1482、1484および1490のセットの任意のサブセットの代わりに使用され得る。
【０１９５】
特定の落射蛍光顕微鏡システムとは対照的に、システム1700は、対物レンズを通過しない光路に沿って励起光を送り、放出された蛍光を対物レンズに通して集光することによって作動し得る。システム1700は励起光源1710を含み得る。励起光源は、本明細書に記載される任意の励起光源であり得る。たとえば、励起光源は、本明細書に記載される任意の励起レーザ光源であり得る。励起光源は、本明細書に記載される任意の波長の光を生成し得る。
【０１９６】
システム1700は、励起光源からの光をビームエキスパンダ1730に向けるための1つまたは複数のミラーを含み得る。たとえば、システムはミラー1720a、1720bおよび1720cを含み得る。図17には3つのミラーを含むものとして示されるが、システムは、光をビームエキスパンダに向けるための任意の数のミラー、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または10よりも多いミラーを含み得る。ミラーは、反射率を高めるための1つまたは複数のコーティング、たとえば、当業者に公知である1つまたは複数の誘電体コーティングを含み得る。
【０１９７】
ビームエキスパンダ1730は、励起光のビームウエストを1、2、5または10倍拡大し得る。ビームエキスパンダは、励起光のビームウエストを、前記数値のいずれか2つによって画定される範囲内にある倍だけ拡大し得る。
【０１９８】
ビームエキスパンダは、拡大された励起光をスキャン機構1740に向け得る。スキャン機構は、本明細書に記載される任意のスキャン機構に類似し得る。たとえば、スキャン機構は、本明細書に記載されるポリゴンミラーを含み得る。スキャン機構は、本明細書に記載されるガルバノメータを含み得る。スキャン機構は、励起光を基板100上の1つまたは複数の位置に向け得る。基板は、本明細書に記載される任意の基板（たとえば、本明細書に記載されるマイクロチャネルアレイ上の1つまたは複数のマイクロチャネル）であり得る。
【０１９９】
スキャン機構は、励起光を、励起光が対物レンズ1750を通過しないような基板上の1つまたは複数の位置に向け得る。スキャン機構は、励起光を、励起光が基板上の1つまたは複数の位置に法線に対して斜めに当たるような基板上の1つまたは複数の位置に向け得る。このようなやり方でシステムを構成すると、蛍光システムと関連するノイズを減らし得る。たとえば、このような構成は、スペックルノイズまたは対物レンズの自己蛍光と関連するノイズを減らし得る。いくつかの態様において、そのような構成は、バックグラウンド蛍光を20％以上減らす。構成は、バックグラウンド蛍光を30％以上、40％以上、50％以上、60％以上または70％以上、減らし得る。例示的態様において、そのような構成はバックグラウンド蛍光を60％以上減らす。このようなやり方でシステムを構成すると、光検出器によって検出されるスペックルノイズを30％以上、40％以上、50％以上、60％以上または70％以上、減らし得る。例示的態様において、構成は、光検出器によって検出されるスペックルノイズを50％以上減らす。
【０２００】
励起光は、本明細書に記載されるように、基板上の位置と相互作用して蛍光を発生させ得る。
【０２０１】
対物レンズ1750は蛍光を集光し得る。対物レンズは、本明細書に記載される任意の対物レンズを含み得る。対物レンズは、蛍光を1つまたは複数のビームスプリッタ1760a、1760bおよび1760c、1つまたは複数のフィルタ1770a、1770bおよび1770c、1つまたは複数のレンズ（たとえば1つまたは複数のチューブレンズ）1780a、1780b、1780cならびに1つまたは複数の光検出器（たとえばフォトダイオード、CCDカメラまたはCMOSカメラ）1790a、1790bおよび1790cに向け得る。図17には3つのビームスプリッタ、3つのフィルタ、3つのレンズおよび3つの光検出器を含むものとして示されるが、蛍光検出システム1700は、任意の数のビームスプリッタ、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または10よりも多いビームスプリッタ、任意の数のフィルタ、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または10よりも多いフィルタ、任意の数のレンズ、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または10よりも多いレンズおよび任意の数の光検出器、たとえば1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または10よりも多い光検出器を含み得る。ビームスプリッタは、本明細書に記載される任意のビームスプリッタを含み得る。フィルタは、本明細書に記載される任意のフィルタを含み得る。レンズは、本明細書に記載される任意のレンズを含み得る。光検出器は、本明細書に記載される任意の光検出器を含み得る。
【０２０２】
デジタル処理装置
いくつかの態様において、本明細書に記載されるプラットフォーム、システム、媒体および方法はデジタル処理装置または同装置の使用を含む。さらなる態様において、デジタル処理装置は、装置の機能を実行する1つまたは複数のハードウェア中央処理ユニット（CPU）、汎用グラフィックス処理ユニット（GPGPU）またはフィールドプログラマブルゲートアレイ（FPGA）を含む。なおさらなる態様において、デジタル処理装置は、実行可能な命令を実行するように構成されたオペレーティングシステムをさらに含む。いくつかの態様において、デジタル処理装置は任意でコンピュータネットワークに接続される。さらなる態様において、デジタル処理装置は、任意で、ワールドワイドウェブにアクセスするよう、インタネットに接続される。なおさらなる態様において、デジタル処理装置は任意でクラウドコンピューティングインフラストラクチャに接続される。他の態様において、デジタル処理装置は任意でイントラネットに接続される。他の態様において、デジタル処理装置は任意でデータ記憶装置に接続される。
【０２０３】
本明細書における記載にしたがって、適当なデジタル処理装置は、非限定的な例として、サーバコンピュータ、デスクトップコンピュータ、ラップトップコンピュータ、ノートブックコンピュータ、サブノートブックコンピュータ、ネットブックコンピュータ、ネットパッドコンピュータ、セットトップコンピュータ、メディアストリーミング装置、ハンドヘルドコンピュータ、インターネット家電、モバイルスマートフォン、タブレットコンピュータ、パーソナルデジタルアシスト、ビデオゲームコンソールおよび乗り物を含む。当業者は、多くのスマートフォンが、本明細書に記載されるシステムにおける使用に適することを認識するであろう。当業者はまた、任意選択のコンピュータネットワーク接続性を有する選りすぐりのテレビ、ビデオプレーヤおよびデジタル音楽プレーヤが、本明細書に記載されるシステムにおける使用に適することを認識するであろう。適当なタブレットコンピュータは、当業者に公知の、ブックレット、スレートおよびコンバーチブル構成を有するものを含む。
【０２０４】
いくつかの態様において、デジタル処理装置は、実行可能な命令を実行するように構成されたオペレーティングシステムを含む。オペレーティングシステムは、たとえば、装置のハードウェアを管理し、アプリケーションの実行のためのサービスを提供する、プログラムおよびデータを含むソフトウェアである。当業者は、適当なサーバオペレーティングシステムが、非限定的な例として、FreeBSD、OpenBSD、NetBSD（登録商標）、Linux、Apple（登録商標）Mac OS X Server（登録商標）、Oracle（登録商標）Solaris（登録商標）、Windows Server（登録商標）およびNovell（登録商標）NetWare（登録商標）を含むことを認識するであろう。当業者は、適当なパーソナルコンピュータオペレーティングシステムが、非限定的な例として、Microsoft（登録商標）Windows（登録商標）、Apple（登録商標）Mac OS X（登録商標）、UNIX（登録商標）およびUNIX様オペレーティングシステム、たとえばGNU/Linux（登録商標）を含むことを認識するであろう。いくつかの態様において、オペレーティングシステムはクラウドコンピューティングによって提供される。当業者はまた、適当なモバイルスマートフォンオペレーティングシステムが、非限定的な例として、Nokia（登録商標）Symbian（登録商標）OS、Apple（登録商標）iOS（登録商標）、Research In Motion（登録商標）BlackBerry OS（登録商標）、Google（登録商標）Android（登録商標）、Microsoft（登録商標）Windows Phone（登録商標）OS、Microsoft（登録商標）Windows Mobile（登録商標）OS、Linux（登録商標）およびPalm（登録商標）WebOS（登録商標）を含むことを認識するであろう。当業者はまた、適当なメディアストリーミング装置オペレーティングシステムが、非限定的な例として、Apple TV（登録商標）、Roku（登録商標）、Boxee（登録商標）、Google TV（登録商標）、Google Chromecast（登録商標）、Amazon Fire（登録商標）およびSamsung（登録商標）HomeSync（登録商標）を含むことを認識するであろう。当業者はまた、適当なビデオゲームコンソールオペレーティングシステムが、非限定的な例として、Sony（登録商標）PS3（登録商標）、Sony（登録商標）PS4（登録商標）、Microsoft（登録商標）Xbox 360（登録商標）、Microsoft Xbox One、Nintendo（登録商標）Wii（登録商標）、Nintendo（登録商標）Wii U（登録商標）およびOuya（登録商標）を含むことを認識するであろう。
【０２０５】
いくつかの態様において、装置は記憶装置および／またはメモリ装置を含む。記憶装置および／またはメモリ装置は、データまたはプログラムを一時的または永久的に記憶するために使用される1つまたは複数の物理的装置である。いくつかの態様において、装置は揮発性メモリであり、記憶された情報を維持するためにパワーを要する。いくつかの態様において、装置は不揮発性メモリであり、デジタル処理装置がパワーを受けていないときでも、記憶された情報を保持する。さらなる態様において、不揮発性メモリはフラッシュメモリを含む。いくつかの態様において、不揮発性メモリはダイナミックランダムアクセスメモリ（DRAM）を含む。いくつかの態様において、不揮発性メモリは強誘電体ランダムアクセスメモリ（FRAM）を含む。いくつかの態様において、不揮発性メモリは相変化ランダムアクセスメモリ（PRAM）を含む。他の態様において、装置は、非限定的な例としてCD-ROM、DVD、フラッシュメモリ装置、磁気ディスク装置、磁気テープ装置、光ディスク装置およびクラウドコンピューティングベースの記憶装置を含む記憶装置である。さらなる態様において、記憶装置および／またはメモリ装置は、本明細書に記載されるような装置の組み合わせである。
【０２０６】
いくつかの態様において、デジタル処理装置は、視覚情報をユーザに送るためのディスプレイを含む。いくつかの態様において、ディスプレイは陰極線管（CRT）である。いくつかの態様において、ディスプレイは液晶ディスプレイ（LCD）である。さらなる態様において、ディスプレイは薄膜トランジスタ液晶ディスプレイ（TFT-LCD）である。いくつかの態様において、ディスプレイは有機発光ダイオード（OLED）ディスプレイである。様々なさらなる態様において、OLEDディスプレイはパッシブマトリックスOLED（PMOLED）またはアクティブマトリックスOLED（AMOLED）ディスプレイである。いくつかの態様において、ディスプレイはプラズマディスプレイである。他の態様において、ディスプレイはビデオプロジェクタである。なおさらなる態様において、ディスプレイは、本明細書に開示されるような装置の組み合わせである。
【０２０７】
いくつかの態様において、デジタル処理装置は、ユーザから情報を受けるための入力装置を含む。いくつかの態様において、入力装置はキーボードである。いくつかの態様において、入力装置は、非限定的な例としてマウス、トラックボール、トラックパッド、ジョイスティック、ゲームコントローラまたはスタイラスを含むポインティング装置である。いくつかの態様において、入力装置はタッチスクリーンまたはマルチタッチスクリーンである。他の態様において、入力装置は、声または他のサウンド入力を捕獲するためのマイクである。他の態様において、入力装置は、動きまたは視覚的入力を捕獲するためのビデオカメラまたは他のセンサである。さらなる態様において、入力装置はKinect、Leap Motionなどである。なおさらなる態様において、入力装置は、本明細書に開示される装置の組み合わせである。
【０２０８】
図16を参照すると、特定の態様において、例示的なデジタル処理装置1601は、レーザスキャン式細胞選別装置を作動させるようにプログラムまたは他のやり方で構成されている。装置1601は、本開示のレーザスキャン式細胞選別の様々な局面を調節する、たとえば処理工程を実行することができる。この態様において、デジタル処理装置1601は、シングルコアまたはマルチコアプロセッサであることもできるし、並列処理のための複数のプロセッサであることもできる、中央処理ユニット（CPU、本明細書においては「プロセッサ」および「コンピュータプロセッサとも呼ばれる）1605を含む。デジタル処理装置1601はまた、メモリまたは記憶場所1610（たとえばランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、フラッシュメモリ）、電子的記憶ユニット1615（たとえばハードディスク）、1つまたは複数の他のシステムと通信するための通信インタフェース1620（たとえばネットワークアダプタ）ならびに周辺装置1625、たとえばキャッシュ、他のメモリ、データ記憶装置および／または電子ディスプレイアダプタを含む。メモリ1610、記憶ユニット1615、インタフェース1620および周辺装置1625は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してCPU1605と通信する。記憶ユニット1615は、データを記憶するためのデータ記憶ユニット（またはデータリポジトリ）であることができる。デジタル処理装置1601は、通信インターフェース1620を援用してコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）1630に機能的に結合されることができる。ネットワーク1630は、インタネット、インタネットおよび／またはエクストラネットもしくはインタネットと通信するイントラネットおよび／またはエクストラネットであることができる。ネットワーク1630は、場合によっては、電気通信および／またはデータネットワークである。ネットワーク1630は、クラウドコンピューティングなどの分散コンピューティングを可能にすることができる1つまたは複数のコンピュータサーバを含むことができる。ネットワーク1630は、場合によっては、装置1601を援用して、装置1601に結合された装置がクライアントまたはサーバとして振る舞うことを可能にし得るピアツーピアネットワークを実現することができる。
【０２０９】
続けて図16を参照すると、CPU1605は、プログラムまたはソフトウェアとして具現化されることができる機械可読命令のシーケンスを実行することができる。命令は、メモリ1610などの記憶場所に記憶され得る。命令はCPU1605に向けられることができ、その後、本開示の方法を実現するようにCPU1605をプログラムまたは他のやり方で構成することができる。CPU1605によって実行される動作の例は、フェッチ、デコード、実行およびライトバックを含むことができる。CPU1605は、集積回路などの回路の一部であることができる。装置1601の1つまたは複数の他の構成要素が回路に含まれることができる。場合によっては、回路は特定用途向け集積回路（ASIC）またはフィールドプログラマブルゲートアレイ（FPGA）である。
【０２１０】
続けて図16を参照すると、記憶ユニット1615は、ファイル、たとえばドライバ、ライブラリおよび保存されたプログラムを記憶することができる。記憶ユニット1615は、ユーザデータ、たとえばユーザ選好およびユーザプログラムを記憶することができる。デジタル処理装置1601は、場合によっては、外部にある、たとえばイントラネットまたはインタネットを介して通信するリモートサーバに位置する1つまたは複数のさらなるデータ記憶ユニットを含むことができる。
【０２１１】
続けて図16を参照すると、デジタル処理装置1601は、ネットワーク1630を介して1つまたは複数のリモートコンピュータシステムと通信することができる。たとえば、装置1601は、ユーザのリモートコンピュータシステムと通信することができる。リモートコンピュータシステムの例は、パーソナルコンピュータ（たとえばポータブルPC）、スレートまたはタブレットPC（たとえばApple（登録商標）iPad、Samsung（登録商標）Galaxy Tab）、電話、スマートフォン（たとえばApple（登録商標）iPhone、Android有効化デバイス、Blackberry（登録商標））またはパーソナルデジタルアシスタントを含む。
【０２１２】
本明細書に記載される方法は、デジタル処理装置1601の電子的記憶場所、たとえばメモリ1610または電子的記憶ユニット1615に記憶された機械（たとえばコンピュータプロセッサ）実行可能コードによって実現されることができる。機械実行可能または機械可読コードはソフトウェアの形態で提供されることができる。使用中、コードはプロセッサ1605によって実行されることができる。場合によっては、コードは、プロセッサ1605による容易なアクセスに備えて、記憶ユニット1615から取り出され、メモリ1610に記憶されることもできる。状況によっては、電子的記憶ユニット1315を除くことができ、機械実行可能命令はメモリ1610に記憶される。
【０２１３】
非一時的コンピュータ可読記憶媒体
いくつかの態様において、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体および方法は、任意でネットワーク化されたデジタル処理装置のオペレーティングシステムによって実行可能な命令を含むプログラムでコード化された1つまたは複数の非一時的コンピュータ可読記憶媒体を含む。さらなる態様において、コンピュータ可読記憶媒体はデジタル処理装置の有形構成要素である。なおさらなる態様において、コンピュータ可読記憶媒体は任意でデジタル処理装置から取り外し可能である。いくつかの態様において、コンピュータ可読記憶媒体は、非限定的な例として、CD-ROM、DVD、フラッシュメモリ装置、固体メモリ、磁気ディスクドライブ、磁気テープドライブ、光ディスクドライブ、クラウドコンピューティングシステムおよびサービスなどを含む。場合によっては、プログラムおよび命令は、永久的、実質的に永久的、半永久的または非一時的に媒体上にコード化される。
【０２１４】
コンピュータプログラム
いくつかの態様において、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体および方法は少なくとも1つのコンピュータプログラムまたは同プログラムの使用を含む。コンピュータプログラムは、指定されたタスクを実行するように書かれた、デジタル処理装置のCPUにおいて実行可能な命令のシーケンスを含む。コンピュータ可読命令は、特定のタスクを実行する、または特定の抽象データ型を実現するプログラムモジュール、たとえば関数、オブジェクト、アプリケーションプログラミングインタフェース（API）、データ構造などとして実現され得る。本明細書に提供される開示を考慮すると、当業者は、コンピュータプログラムが様々な言語の様々なバージョンで書かれ得ることを認識するであろう。
【０２１５】
コンピュータ可読命令の機能性は、所望により、様々な環境で組み合わされてもよいし、分散されてもよい。いくつかの態様において、コンピュータプログラムは1つの命令シーケンスを含む。いくつかの態様において、コンピュータプログラムは複数の命令シーケンスを含む。いくつかの態様において、コンピュータプログラムは1つの場所から提供される。他の態様において、コンピュータプログラムは複数の場所から提供される。様々な態様において、コンピュータプログラムは1つまたは複数のソフトウェアモジュールを含む。様々な態様において、コンピュータプログラムは、部分的または全体的に、1つまたは複数のウェブアプリケーション、1つまたは複数のモバイルアプリケーション、1つまたは複数の独立型アプリケーション、1つまたは複数のウェブブラウザプラグイン、拡張、アドインまたはアドオンもしくはそれらの組み合わせを含む。
【０２１６】
ウェブアプリケーション
いくつかの態様において、コンピュータプログラムはウェブアプリケーションを含む。本明細書に提供される開示を考慮すると、当業者は、ウェブアプリケーションが、様々な態様において、1つまたは複数のソフトウェアフレームワークおよび1つまたは複数のデータベースシステムを利用することを認識するであろう。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、Microsoft（登録商標）.NETまたはRuby on Rails（RoR）などのソフトウェアフレームワーク上で作成される。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、非限定的な例としてリレーショナル、非リレーショナル、オブジェクト指向、連想およびXMLデータベースシステムを含む1つまたは複数のデータベースシステムを利用する。さらなる態様において、適当なリレーショナルデータベースシステムは、非限定的な例として、Microsoft（登録商標）SQL Server、mySQL（商標）およびOracle（登録商標）を含む。当業者はまた、ウェブアプリケーションが、様々な態様において、1つまたは複数の言語の1つまたは複数のバージョンで書かれることを認識するであろう。ウェブアプリケーションは、1つまたは複数のマークアップ言語、プレゼンテーション定義言語、クライアント側スクリプト言語、サーバ側コーディング言語、データベース問い合わせ言語またはそれらの組み合わせで書かれ得る。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、ある程度、Hypertext Markup Language（HTML）、Extensible Hypertext Markup Language（XHTML）またはeXtensible Markup Language（XML）などのマークアップ言語で書かれる。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、ある程度、Cascading Style Sheets（CSS）などのプレゼンテーション定義言語で書かれる。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、ある程度、Asynchronous Javascript and XML（AJAX）、Flash（登録商標）Actionscript、JavascriptまたはSilverlight（登録商標）などのクライアント側スクリプト言語で書かれる。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、ある程度、Active Server Pages（ASP）、ColdFusion（登録商標）、Perl、Java（商標）、JavaServer Pages（JSP）、Hypertext Preprocessor（PHP）、Python（商標）、Ruby、Tcl、Smalltalk、WebDNA（登録商標）またはGroovyなどのサーバ側コーディング言語で書かれる。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、ある程度、Structured Query Language（SQL）などのデータベース問い合わせ言語で書かれる。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションは、IBM（登録商標）Lotus Domino（登録商標）などの企業サーバ製品を統合する。いくつかの態様において、ウェブアプリケーションはメディアプレーヤ要素を含む。様々なさらなる態様において、メディアプレーヤ要素は、非限定的な例としてAdobe（登録商標）Flash（登録商標）、HTML 5、Apple（登録商標）QuickTime（登録商標）、Microsoft（登録商標）Silverlight（登録商標）、Java（商標）およびUnity（登録商標）を含む多くの適当なマルチメディア技術のうち1つまたは複数を利用する。
【０２１７】
モバイルアプリケーション
いくつかの態様において、コンピュータプログラムは、モバイルデジタル処理装置に提供されたモバイルアプリケーションを含む。いくつかの態様において、モバイルアプリケーションは、モバイルデジタル処理装置が製造されるときモバイルデジタル処理装置に提供される。他の態様において、モバイルアプリケーションは、本明細書に記載されるコンピュータネットワークを介してモバイルデジタル処理装置に提供される。
【０２１８】
本明細書に提供される開示を考慮すると、モバイルアプリケーションは、当業者に公知の技術により、当技術分野に公知のハードウェア、言語および開発環境を使用して作成される。当業者は、モバイルアプリケーションがいくつかの言語で書かれることを認識するであろう。適当なプログラミング言語は、非限定的な例として、C、C++、C#、Objective-C、Java（商標）、Javascript、Pascal、Object Pascal、Python（商標）、Ruby、VB.NET、WMLおよびXHTML/HTML（CSSを用いる、または用いない）またはそれらの組み合わせを含む。
【０２１９】
適当なモバイルアプリケーション開発環境がいくつかのソースから利用可能である。市販の開発環境は、非限定的な例として、AirplaySDK、alcheMo、Appcelerator（登録商標）、Celsius、Bedrock、Flash Lite、.NET Compact Framework、RhomobileおよびWorkLight Mobile Platformを含む。非限定的な例としてLazarus、MobiFlex、MoSyncおよびPhonegapを含む他の開発環境がコストなしで利用可能である。また、モバイル装置製造者が、非限定的な例としてiPhoneおよびiPad（iOS）SDK、Android（商標）SDK、BlackBerry（登録商標）SDK、BREW SDK、Palm（登録商標）OS SDK、Symbian SDK、webOS SDKおよびWindows（登録商標）Mobile SDKを含むソフトウェア開発キットを頒布している。
【０２２０】
当業者は、非限定的な例としてApple（登録商標）App Store、Google（登録商標）Play、Chrome WebStore、BlackBerry（登録商標）App World、App Store for Palm devices、App Catalog for webOS、Windows（登録商標）Marketplace for Mobile、Ovi Store for Nokia（登録商標）devices、Samsung（登録商標）AppsおよびNintendo（登録商標）DSi Shopを含む、モバイルアプリケーションの頒布のためのいくつかの商取引の場が利用可能であることを認識するであろう。
【０２２１】
独立型アプリケーション
いくつかの態様において、コンピュータプログラムは、既存のプロセスへのアドオンとしてではなく、たとえばプラグインとしてではなく、独立したコンピュータプロセスとして実行されるプログラムである独立型アプリケーションを含む。当業者は、独立型アプリケーションが多くの場合、コンパイルされることを認識するであろう。コンパイラとは、プログラミング言語で書かれたソースコードをバイナリオブジェクトコード、たとえばアセンブリ言語または機械コードに変換するコンピュータプログラムである。適当なコンパイルされたプログラミング言語は、非限定的な例として、C、C++、Objective-C、COBOL、Delphi、Eiffel、Java（商標）、Lisp、Python（商標）、Visual BasicおよびVB .NETまたはそれらの組み合わせを含む。コンパイルは、多くの場合、少なくとも部分的に、実行可能なプログラムを作成するために実行される。いくつかの態様において、コンピュータプログラムは、1つまたは複数の実行可能なコンパイルされたアプリケーションを含む。
【０２２２】
ウェブブラウザプラグイン
いくつかの態様において、コンピュータプログラムはウェブブラウザプラグイン（たとえば拡張など）を含む。コンピューティングにおいて、プラグインとは、より大きなソフトウェアアプリケーションに特定の機能性を加える1つまたは複数のソフトウェア構成要素である。ソフトウェアアプリケーションの作者は、第三者開発者が、アプリケーションを拡張する能力を作り、新たな機能を容易に加え、アプリケーションのサイズを縮小することを可能にするためのプラグインをサポートしている。サポートを受けると、プラグインは、ソフトウェアアプリケーションの機能性のカスタマイズを可能にする。たとえば、プラグインは一般に、ビデオを再生し、対話能力を生成し、ウイルスをスキャンし、特定のファイルタイプを表示するためにウェブブラウザにおいて使用される。当業者は、Adobe（登録商標）Flash（登録商標）Player、Microsoft（登録商標）Silverlight（登録商標）およびApple（登録商標）QuickTime（登録商標）を含むいくつかのウェブブラウザプラグインをよく知るであろう。いくつかの態様において、ツールバーは、1つまたは複数のウェブブラウザ拡張、アドインまたはアドオンを含む。いくつかの態様において、ツールバーは、1つまたは複数のエクスプローラバー、ツールバンドまたはデスクバンドを含む。
【０２２３】
本明細書に提供される開示を考慮すると、当業者は、非限定的な例としてC++、Delphi、Java（商標）、PHP、Python（商標）およびVB .NETまたはそれらの組み合わせを含む様々なプログラミング言語におけるプラグインの開発を可能にするいくつかのプラグインフレームワークが利用可能であることを認識するであろう。
【０２２４】
ウェブブラウザ（インタネットブラウザとも呼ばれる）とは、ワールドワイドウェブ上の情報リソースを検索し、表示し、トラバースするために、ネットワーク接続されたデジタル処理装置と使用するために設計されたソフトウェアアプリケーションである。適当なウェブブラウザは、非限定的な例として、Microsoft（登録商標）Internet Explorer（登録商標）、Mozilla（登録商標）Firefox（登録商標）、Google（登録商標）Chrome、Apple（登録商標）Safari（登録商標）、Opera Software（登録商標）Opera（登録商標）およびKDE Konquerorを含む。いくつかの態様において、ウェブブラウザはモバイルウェブブラウザである。モバイルウェブブラウザ（マイクロブラウザ、ミニブラウザおよびワイヤレスブラウザとも呼ばれる）は、非限定的な例としてハンドヘルドコンピュータ、タブレット、ノートブックコンピュータ、サブノートブックコンピュータ、スマートフォン、音楽プレーヤ、パーソナルデジタルアシスタント（PDA）およびハンドヘルドビデオゲームシステムを含むモバイルデジタル処理装置上での使用のために設計されている。適当なモバイルウェブブラウザは、非限定的な例として、Google（登録商標）Android（登録商標）ブラウザ、RIM BlackBerry（登録商標）ブラウザ、Apple（登録商標）Safari（登録商標）、Palm（登録商標）Blazer、Palm（登録商標）WebOS（登録商標）ブラウザ、Mozilla（登録商標）Firefox（登録商標）for mobile、Microsoft（登録商標）Internet Explorer（登録商標）Mobile、Amazon（登録商標）Kindle（登録商標）Basic Web、Nokia（登録商標）ブラウザ、Opera Software（登録商標）Opera（登録商標）MobileおよびSony（登録商標）PSP（商標）ブラウザを含む。
【０２２５】
ソフトウェアモジュール
いくつかの態様において、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体および方法は、ソフトウェア、サーバおよび／またはデータベースモジュールもしくはそれらの使用を含む。本明細書に提供される開示を考慮すると、ソフトウェアモジュールは、当業者に公知の技術により、当技術分野に公知の機械、ソフトウェアおよび言語を使用して作成される。本明細書に開示されるソフトウェアモジュールは数多くの方法で実現される。様々な態様において、ソフトウェアモジュールは、ファイル、コードの一部、プログラミングオブジェクト、プログラミング構造またはそれらの組み合わせを含む。さらなる様々な態様において、ソフトウェアモジュールは、複数のファイル、複数のコードの部分、複数のプログラミングオブジェクト、複数のプログラミング構造またはそれらの組み合わせを含む。様々な態様において、1つまたは複数のソフトウェアモジュールは、非限定的な例として、ウェブアプリケーション、モバイルアプリケーションおよび独立型アプリケーションを含む。いくつかの態様において、ソフトウェアモジュールは1つのコンピュータプログラムまたはアプリケーションの中にある。他の態様において、ソフトウェアモジュールは、1つよりも多いコンピュータプログラムまたはアプリケーションの中にある。いくつかの態様において、ソフトウェアモジュールは1つの機械上にホストされている。他の態様において、ソフトウェアモジュールは、1つよりも多い機械上にホストされている。さらなる態様において、ソフトウェアモジュールはクラウドコンピューティングプラットフォーム上にホストされている。いくつかの態様において、ソフトウェアモジュールは、1つの場所にある1つまたは複数の機械上にホストされている。他の態様において、ソフトウェアモジュールは、1つよりも多い場所にある1つまたは複数の機械上にホストされている。
【０２２６】
データベース
いくつかの態様において、本明細書に開示されるプラットフォーム、システム、媒体および方法は1つまたは複数のデータベースまたは同データベースの使用を含む。本明細書に提供される開示を考慮すると、当業者は、多くのデータベースが情報の記憶および検索に適していることを認識するであろう。様々な態様において、適当なデータベースは、非限定的な例として、リレーショナルデータベース、非リレーショナルデータベース、オブジェクト指向データベース、オブジェクトデータベース、実体関連モデルデータベース、連想データベースおよびXMLデータベースを含む。さらなる非限定的な例は、SQL、PostgreSQL、MySQL、Oracle、DB2およびSybaseを含む。いくつかの態様において、データベースはインタネットベースである。さらなる態様において、データベースはウェブベースである。なおさらなる態様において、データベースはクラウドコンピューティングベースである。他の態様において、データベースは1つまたは複数のローカルコンピュータ記憶装置に基づく。
【実施例】
【０２２７】
実施例1：マクロゲル分離
図6に示すように、抽出中に電磁放射線から細胞を保護するために、基板のマイクロチャネル中で不透明な粒子と細胞とを分離し得る。まず、アガロース（Sigma-Aldrich, Cat No: A9539）約1gを蒸留水約100mLに加えた。混合物をマイクロ波オーブン中で加熱し、混合物を断続的に撹拌してアガロースを溶解させた。不透明なビーズ（Dynabeads M-270 Epoxy, Thermo Fisher, Cat No: 14301）を混合物に加え、ビーズを混合して均一な分散系を作製した。混合物をミクロ細孔アレイの表面に塗布し、表面張力によって細孔に入らせた。細孔中の混合物を室温で少なくとも約20分間冷まし、細孔の中で硬化させて、ゲル注入ミクロ細孔アレイを作製した。ゲル注入ミクロ細孔アレイは、将来の使用に備え、約4℃で貯蔵してもよい。次いで、ゲル注入ミクロ細孔アレイの片側にリザーバを設け、緩衝液QG（QIAGEN, Cat No: 19063）を加えた。緩衝液QGを静置し、細孔の片側のアガロースの一部分を約5分間溶解させた。QG緩衝液をPBS（Thermo Fisher, Cat No: 10010023）および2％ BSA（VWR, Cat No. 97063-626）で洗い流し、この工程を2回繰り返した。細胞懸濁液を、溶解させた（エッチアウトした）細孔の側に加えた。細胞懸濁液を約10分間静置し、細胞を細孔中に留めさせた。ミクロ細孔アレイをPBSおよび2％ BSAの溶液で2回洗浄して、細孔の表面に付着した余分な細胞を除去した。細孔を反転させ、約10分間静置した。細胞は重力によってメニスカスに留まる。
【０２２８】
実施例2：ミクロゲル分離
図7Bに示すように、抽出中に電磁放射線から細胞を保護するために、基板のマイクロチャネル中で不透明な粒子と細胞とを分離し得る。まず、PBSおよび2％BSA中の細胞を、細胞懸濁液50μLあたり50％（V/V）約20μLの量で、磁気コアおよびアガロースシェルを有するビーズ（Cube-BioTech）に加えた。懸濁液をミクロ細孔アレイに装填し、毛管作用によって細孔に入らせた。磁性ビーズをメニスカス上部に留めるために、強力なネオジム磁石（円柱形、直径6.5mm、長さ25mm、強度N52）をアレイの上に約5分間適用した。次いで、磁石を取り除いた。細胞およびビーズを約10分間留めさせ、別々に、細胞層をメニスカス下部に留めさせ、ビーズ層をメニスカス上部に留めさせた。
【０２２９】
実施例3：細孔内スペーサ
図8Aに示すように、抽出中に電磁放射線から細胞を保護するために、基板のマイクロチャネル中で磁性粒子と細胞を分離し得る。まず、PBSおよび2％BSA中の細胞を、透明なシリカ（Bangs Laboratories, Inc., Cat No: SS05N、サイズ3.48μm）100μL中0.25×109ビーズ/mL、約10μL、および不透明な磁性ビーズ（Dynabeads（登録商標）M-270 Epoxy, Thermo Fisher, CAT No: 14301）100μL中2×109ビーズ/mL、約2μLに加えた。懸濁液をミクロ細孔アレイに装填し、毛管作用によって細孔に入らせた。磁性ビーズをメニスカス上部に留めるために、強力なネオジム磁石（円柱形、直径6.5mm、長さ25mm、強度N52）をアレイの上に約5分間適用した。次いで、磁石を取り除いた。細胞およびビーズを約10分間留めさせ、別々に、細胞および透明なシリカの層をメニスカス下部に留めさせ、ビーズ層をメニスカス上部に留めさせた。
【０２３０】
実施例4：順次装填
図9Aに示すように、細胞を定量するために、細胞は、不透明なビーズと順次にアレイに装填してもよいし、混合バッチとして装填してもよい。まず、PBSおよび2％FBS中に懸濁させた細胞をミクロ細孔アレイに装填する。細胞を10分間留めさせる。次いで、ビーズを1mLあたり10億〜20億個の濃度でミクロ細孔アレイに加える。ミクロアレイの内容物を少なくとも10分間静置して、ビーズを細孔中に留めさせ、細胞上に静止させる。
【０２３１】
実施例5：懸滴ビーズ
清浄なガラススライドの底に細胞懸濁液60μLを付け、この小滴を反転させる。引力を相殺する親水性および表面張力のせいで、小滴はその場に付いたままになる。小滴を10分間留めさせる。ミクロ細孔アレイを懸滴に適用する。ミクロ細孔アレイは、Z移動ステージを用いて、または手で適用し得る。ミクロ細孔アレイの第一端、中間部分および第二端は、懸滴に適用されたとき、実質的に同じ平面にあり、平坦であるべきである。毛管作用によって細胞懸濁液をミクロ細孔アレイに入らせる。懸滴に触れる側にPDMSリザーバを置く。水分補給のために、リザーバを緩衝液100μLで満たす。10分間留めさせたのち画像処理する。
【０２３２】
実施例6：フラッディング
PDMSリザーバ（直径7mm、高さ3mm）をミクロ細孔ガラスアレイの上に固定した。細胞懸濁液（様々な濃度の）約60μmをミクロ細孔ガラスアレイの上に加えた。細胞懸濁液約10μLをミクロ細孔ガラスアレイの上から取り出した。PDMSリザーバを緩衝液約100μLで満たして、細孔を含水状態に維持した。約10分間留めさせたのち、画像処理した。
【０２３３】
実施例7：音波処理
緩衝液（PBS＋0.2％BSA）約100μLを20μmガラスマイクロチップに加えた。PDMSリザーバから緩衝液約20μLを取り出した。再懸濁させたビーズ約15μLを既知の濃度で加えた。約10分待った。顕微鏡検査法によって画像処理した。Tideソニケータ（ソニケータ周波数40KHz）をチップの側面に適用した。約10分待った。顕微鏡検査法によって画像処理した。強いネオジム磁石をチップの底に適用してビーズを底に引き寄せた。顕微鏡検査法によって画像処理した。
【０２３４】
実施例8：蛍光置換
PBSおよび2％ FBS中に懸濁させた細胞およびCOMPEL（商標）ビーズ（細胞懸濁液100μL中0.6×109個の5μL、Bangs Laboratories, Inc., Cat No: UMC3F、サイズ2.85μm、蛍光発光：緑）をミクロ細孔アレイに装填した。強いネオジム磁石（円柱形、直径6.5mm、長さ25mm、強度N52）をアレイの上に約5分間適用して、磁性ビーズをメニスカス上部に留めさせた。磁石を取り除き、細胞およびビーズを約10分間留めさせた。メニスカス下部に留めさせた細胞を画像処理した。
【０２３５】
実施例9：抽出
図15は、マイクロチャネルアレイからの細胞のレーザ抽出に最適なパルスパワー設定を示す。マイクロチャネルアレイ内の所望のウェルからの流体の排除を可能にする抽出レーザ設定を決定するための実験を実施した。実験は、IPG Photonics YLPN-1-1x120-100-M、調節可能パルス持続時間ナノ秒イッテルビウムドープファイバレーザを使用して実施した。レーザを6.55μmのビーム直径に集束させ、SCANLab hurrySCAN II 14ガルバノメータスキャナを使用してマイクロチャネルにかけてスキャンした。焦点距離163mmのLinos F-Theta-Ronarレンズを使用して抽出光を平面上に集束させた。IPG Photonicsレーザ拡張ボードを内蔵したLanmark Maestro 3000 LEC-1 Ethernetスマートコントローラを使用して抽出レーザパルスの方向を制御した。コントローラは、Lanmark WinLase LAN v 5.1.9.17ソフトウェアを使用してプログラムしたものであった。パルス持続時間は任意で4nsに設定した。パルス繰り返し率は100kHzに設定した。
【０２３６】
異なるレベルの平均レーザパワーで試験を実施した。図15の左の窓に示すように、2.0Wの平均レーザパワーは、所望のマイクロチャネルからの流体のごくわずかな排除を生じさせた（マイクロチャネルのアレイ中の明るい点）。右の窓に示すように、3.3Wの平均レーザパワーは、所望のマイクロチャネルからの流体の完全な排除を生じさせた。中央の窓に示すように、最適な平均レーザパワーは、各レーザパルスで23μJのエネルギーに相当する2.3Wであると決定された。
【０２３７】
本発明の好ましい態様が本明細書に示され、説明されたが、そのような態様は例としてのみ提供されることが当業者には明らかであろう。当業者には、本発明を逸脱することなく、数多くの変形、変更および置換が思い付くであろう。本発明を実施する際、本明細書に記載された発明の態様に対する様々な代替を用い得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が発明の範囲を画定し、特許請求の範囲内の方法および構造ならびにそれらの等価物が特許請求の範囲によって包含されることが意図される。
【図１】
2020514732.tif 000004
【図２】
2020514732.tif 000005
【図３】
2020514732.tif 000006
【図４Ａ】
2020514732.tif 000007
【図４Ｂ】
2020514732.tif 000008
【図４Ｃ】
2020514732.tif 000009
【図４Ｄ】
2020514732.tif 000010
【図４Ｅ】
2020514732.tif 000011
【図４Ｆ】
2020514732.tif 000012
【図４Ｇ】
2020514732.tif 000013
【図５Ａ】
2020514732.tif 000014
【図５Ｂ】
2020514732.tif 000015
【図６】
2020514732.tif 000016
【図７Ａ】
2020514732.tif 000017
【図７Ｂ】
2020514732.tif 000018
【図７Ｃ】
2020514732.tif 000019
【図７Ｄ】
2020514732.tif 000020
【図８Ａ】
2020514732.tif 000021
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
2020514732.tif 000023
【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図９Ｇ】
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【図９Ｈ】
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【図１０Ａ】
2020514732.tif 000031
【図１０Ｂ】
2020514732.tif 000032
【図１０Ｃ】
2020514732.tif 000033
【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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