(57)【要約】  可溶性組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）を生産する方法、前記方法で取得される組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）、および、前記組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）をコードする変異核酸分子を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
可溶性組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）を生産する方法であって、変異核酸分子を含む宿主細胞を培養すること、ｒｈ−ｂＦＧＦの発現に適した条件で宿主細胞中にｒｈ−ｂＦＧＦを発現させること、および、精製によりｒｈ−ｂＦＧＦを回収することを含む方法。
【請求項２】
前記変異核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３から選択される配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記変異核酸分子の配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記宿主細胞が大腸菌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法で得られる、組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）。
【請求項６】
組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子をコードする変異核酸分子であって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３から選択される配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む、変異核酸分子。
【請求項７】
配列が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３である、請求項６に記載の変異核酸分子。
【請求項８】
請求項６または７に記載の変異核酸分子を含むベクター。
【請求項９】
前記ベクターがｐＥＴ−３０ａ（＋）である、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項５に記載のヒト塩基性線維芽細胞増殖因子と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含有する、医薬組成物。
【請求項１１】
請求項１０に記載の医薬組成物の治療上の有効量を治療を必要とする患者に対して投与することを含む、眼球乾燥症の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＮＡ組み換えおよびバイオ医薬品の分野に関する。より具体的に、本発明は、可溶性組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ−ｂａｓｉｃ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ｒｈ−ｂＦＧＦ）を生産する方法、前記方法で取得される組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）、および、前記組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）をコードする変異核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維芽細胞増殖因子（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ，ＦＧＦｓ）とは、類似した構造かつおよび類似した生物学的機能を持つ、ヘパリン結合性タンパク質の分類である。現在のところ、２３種類のＦＧＦが発見されており、そのうち、ＦＧＦ−１（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）およびＦＧＦ−７（ＫＧＦ）については研究が比較的進んでいる。ｂＦＧＦは、哺乳動物およびヒトにおける非常に微量の活性物質であり、その幅広い生理学的機能や重要な臨床応用価値から大変重視されている。ｂＦＧＦは、新生血管の形成を刺激できるだけでなく、傷の癒合や組織再生にも関与し、胚組織の発達や分化等を促進する。近年、組み換えｂＦＧＦは、臨床において傷、潰瘍および神経系等の疾病治療に応用されている。
【０００３】
現在、市場に存在するｂＦＧＦは、大部分が遺伝子工学的手法によって大腸菌内で生産されている。しかし、大腸菌の可溶性ｂＦＧＦは発現量が少なく、大部分の発現産物は生物活性を有さない封入体を形成しやすい。封入体は精製後に再生成させる必要があるため、生成物の回収率や活性に影響を及ぼす。しかも、処理過程で二量体や三量体といった不純物が形成される可能性もある。このほか、ｂＦＧＦには２対のシステインを有しており、容易に分子間ジスルフィド結合を形成する。よって、適切に保存しなければ、二量体や三量体が一定の割合を占めることになり、タンパク質の純度に影響を及ぼす。
【０００４】
そこで、安定的かつ高発現量の可溶性ｂＦＧＦを生産するための新たな方法が必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
一の局面において、本発明は、可溶性組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）を生産する方法であって、変異核酸分子を含む宿主細胞を培養すること、ｒｈ−ｂＦＧＦの発現に適した条件で宿主細胞中にｒｈ−ｂＦＧＦを発現させること、および、精製によりｒｈ−ｂＦＧＦを回収することを含む方法を提供する。
【０００６】
一の局面において、本発明は、上記の方法で取得される組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）を提供する。
【０００７】
一の局面において、本発明は、前記組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）をコードする変異核酸分子を提供する。
【０００８】
一の局面において、本発明は、前記組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含有する医薬組成物提供する。
【０００９】
一の局面において、本発明は、眼球乾燥症の治療方法を提供し、前記方法は、前記医薬組成物の治療上の有効量を治療を必要とする患者に対して投与することを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、ｐＥＴ−３０ａ（＋）プラスミドの構造図である。
【図２】図２は、ｒｈ−ｂＦＧＦのウエスタンブロットの結果である。
【図３】図３は、高速液体クロマトグラフィーにより検出したｒｈ−ｂＦＧＦの純度を示す。
【図４】図４は、ｒｈ−ｂＦＧＦにおけるインタクトタンパク質の分子量のスペクトル図を示す。
【図５】図５は、天然ヒトｂＦＧＦのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列、ならびに変異ヒトｂＦＧＦのアミノ酸配列を示す。
【図６】図６は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性でのｒｈ−ｂＦＧＦの分析における４つのパラメータの回帰曲線であり、ＣがＥＣ５０値を示す。
【図７】図７は、熱ストレス条件下におけるｒｈ−ｂＦＧＦの純度変化に対するヒスチジン、グリシン、アルギニンを含む各種アミノ酸とツイーンの影響を示す。図中の９５％ＬＩＮＥはｒｈ−ｂＦＧＦ原液の純度品質基準を示しており、原液の純度が９５％未満のものは純度不合格を意味する。
【図８】図８は、熱ストレス条件下におけるｒｈ−ｂＦＧＦの純度変化に対するＨＳＡの影響を示す。
【図９】図９は、アルカリ熱傷ニュージーランドラビットの眼球乾燥症モデルにおける涙液分泌に対する各種濃度のｒｈ−ｂＦＧＦ点眼液の影響を示す。符号「＊」または「＊＊」は有意差を表す（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１）。
【図１０】図１０は、アルカリ熱傷ニュージーランドラビットの眼球乾燥症モデルにおける涙膜破壊時間に対する各種濃度のｒｈ−ｂＦＧＦ点眼液の影響を示す。符号「＊」または「＊＊」は有意差を表す（ｐ＜０．０５またはｐ＜０．０１）。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、変異核酸分子により可溶性組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）を生産する新たな方法を開発した。
【００１２】
核酸分子を変異させ、原核生物発現系を構築することで、本発明は、可溶性形態および高発現レベルにおけるｂＦＧＦの効率的かつ均一な発現を予想外に達成することができた。当該方法は、ヒトｂＦＧＦを効率的に発現することで、組み換えヒトｂＦＧＦタンパク質の回収率を向上させつつ、天然のヒトｂＦＧＦにおける生物活性も保持した。
【００１３】
一の局面において、本発明は、可溶性組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）を生産する方法であって、変異核酸分子を含む宿主細胞を培養すること、ｒｈ−ｂＦＧＦの発現に適した条件で宿主細胞中にｒｈ−ｂＦＧＦを発現させること、および、精製によりｒｈ−ｂＦＧＦを回収することを含む方法を提供する。
【００１４】
一の局面において、前記変異核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３から選択される配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９０％、少なくとも９５％の同一性を有する配列、例えば少なくとも９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。
【００１５】
一の局面において、前記変異核酸分子の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３である。
【００１６】
一の局面において、本発明は、前記核酸分子を含むベクターを提供する。好ましくは、ベクターは原核生物発現ベクターであり、特に大腸菌における発現誘導に適した発現ベクターであって、例えば、ｐＥＴ−３０ａ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）、ｐＥＴ−２３ｃ（＋）、ｐＥＴ−１５ｂを含むが、これらに限られない。特に好ましくは、ｐＥＴ−３０ａ（＋）である。
【００１７】
一の局面において、本発明は、前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。好ましくは、宿主細胞は大腸菌であり、特に好ましくは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【００１８】
一の具体的局面において、前記変異核酸分子を含む原核生物発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、菌体の培養温度、誘導温度、ｐＨ範囲、グルコース濃度および誘導剤濃度を調節することで、可溶性ヒトｂＦＧＦを発現誘導する。これを中空糸でろ過し、菌体を収集したあと、高圧でホモジネーションしつつ、低温を維持して発酵した菌体を破砕する。そして、適量の非イオン表面活性剤を添加してから、低温で高速遠心分離して上清液を収集し、ペレットを除去する。
【００１９】
一の具体的局面において、弱カチオン交換、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィー等の方法で精製を行う。精製過程では、メルカプトエタノールやＤＴＴ等の保護剤を適量添加する。
【００２０】
一の具体的局面において、可溶性ヒトｂＦＧＦを発現誘導するための具体的パラメータは次の通りである。
槽投入前ＯＤ６００：約０．５〜４．５
菌体培養温度：約２５〜４５℃
菌体誘導温度：約２０〜５０℃
ｐＨ範囲：約６．８〜８．５
グルコース濃度：約０．０６〜０．４６％
誘導剤濃度：約０．０１２５〜０．０９２５ｇ／Ｌ
誘導前のＯＤ６００の範囲：約１０〜４５
誘導時間：約２〜９時間
【００２１】
一の具体的局面において、精製は以下のようにして行う。
【００２２】
即ち、発酵液を中空糸で堰き止めて、洗浄およびろ過する。緩衝液は、ｐＨが約７．０であるＮａＣｌを含むＰＢ溶液である。
【００２３】
次に、高圧でホモジネーションしつつ、低温を維持し、発酵した菌体を破砕する。そして、適量のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）を添加してから、低温で高速遠心分離して上清液を収集し、ペレットを除去する。
【００２４】
一の局面において、本発明は、上記の方法で取得される組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）を提供する。また、一の局面において、前記組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５である。
【００２５】
一の局面において、本発明は、組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子をコードする変異核酸分子を提供する。当該核酸分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３から選択される配列、または、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２もしくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の同一性を有する配列を含む。
【００２６】
一の局面において、前記変異核酸分子の配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３である。
【００２７】
一の局面において、本発明は、前記組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含有する医薬組成物提供する。また、一の局面において、前記賦形剤は、緩衝系、増粘剤、安定剤、中和剤、保湿剤等を含むが、これらに限られない。
【００２８】
一の局面において、本発明は、前記組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｒｈ−ｂＦＧＦ）と、グリシン、ヒスチジン、アルギニン、ヘパリンナトリウムまたはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）から選択される少なくとも１つの安定剤とを含有する医薬組成物を提供する。
【００２９】
一の局面においては、前記組成物は、ｐＨ約６．０〜８．０まで緩衝されている。例えば、ｐＨ６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９もしくは８．０、または、これらの間の任意の範囲に規定されるｐＨまで緩衝されている。
【００３０】
一の局面において、本発明は、眼球乾燥症の治療方法を提供する。前記方法は、前記医薬組成物の治療上の有効量を、治療を必要とする患者に対して投与することを含む。
【００３１】
一の局面において、本発明は、眼球乾燥症を治療するための前記医薬組成物を提供する。
【００３２】
一の局面において、本発明は、眼球乾燥症を治療するための薬物の調製における前記組成物の使用をさらに提供する。
【００３３】
一の局面において、本発明の医薬組成物は、眼用医薬組成物である。特に、本発明の医薬組成物は、点眼液またはゲル形態である。
【００３４】
本発明で記載する方法は、可溶性形態および高発現レベルにおけるｂＦＧＦの効率的かつ均一な発現が達成されるとの利点を有する。上記の方法は、ヒトｂＦＧＦを効率的に発現することで、組み換えヒトｂＦＧＦタンパク質の回収率を向上させつつ、天然のヒトｂＦＧＦにおける生物活性も保持する。
【００３５】
以下、限定を意図しない実施例を参照して、本発明についてさらに述べる。
【実施例】
【００３６】
実施例１：核酸の変異
タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく、天然のヒトｂＦＧＦをコードするｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を変異させ、３種類の変異ｃＤＮＡ配列を設計および合成した（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示す、変異ｃＤＮＡ配列１、変異ｃＤＮＡ配列２および変異ｃＤＮＡ配列３）。
【００３７】
変異ｃＤＮＡ配列１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）
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【００３８】
変異ｃＤＮＡ配列２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）
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【００３９】
変異ｃＤＮＡ配列３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）
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【００４０】
実施例２：原核生物発現およびタンパク質の特性評価
２．１  発現および精製
使用する発現ベクターは、ｐＥＴ−３０ａ（＋）（図１参照）とし、メルク社（Ｍｅｒｋ  ＫｇｓＡ）から購入した（Ｃａｔ．Ｎｏ．６９９０９−３）。当該ベクターは、Ｔ７プロモーター、Ｔ７転写開始部位、Ｈｉｓタグ、コード配列、Ｓタグコード配列、マルチクローニングサイト（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ，ＭＣＳ）、Ｔ７ターミネーター、ラクトースコード配列、ｋａｎ耐性コード配列、ならびに、ｐＢＲ３２２レプリコンおよびｆ１レプリコンを有する。また、当該ＭＣＳは、酵素切断部位ＸｈｏＩ、ＮｏｔＩ、ＥａｇＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ、ＳａｃＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＶ、ＮｃｏＩ、ＫｐｎＩ、ＢｇｌＩＩ、ＮｓｐＶ、ＮｄｅＩを有する。
【００４１】
クローニングの便宜上、配列１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の開始コドンの上流に酵素切断部位ＮｄｅＩを設計し、ターミネーター付近に酵素切断部位ＨｉｎｄＩＩＩを設計した。４８０ｂｐｓの当該配列は、化学的手法で人工的に遺伝子合成した。次に、この配列をＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化（Ｄｏｕｂｌｅ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）したあと、同様に二重消化した発現ベクターｐＥＴ−３０ａ（＋）に挿入し、５７２４ｂｐｓの組み換えプラスミドを取得した。これを熱ショック法によりＤＨ５α（ＴａＫａＲａ，９０５７）に形質転換し、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含有するＬＢ培地で培養した。続いて、単一クローンを選択し、ＮｄｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化して正しい形質転換体をスクリーニングした。形質転換体の正確性は、シーケンシングにより改めて検証した。
【００４２】
他の実施例では、ｐＥＴ−２８ａ（＋）、ｐＥＴ−２３ｃ（＋）またはｐＥＴ−１５ｂ等を上記のｐＥＴ−３０ａ（＋）ベクターの代わりに用いてもよい。
【００４３】
前記配列１を含む原核生物発現ベクターを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入し、培養することで、可溶性ヒトｂＦＧＦを発現誘導した。具体的なパラメータは次の通りである。
槽投入前ＯＤ６００：０．５〜４．５
菌体培養温度：２５〜４５℃
菌体誘導温度：２０〜５０℃
ｐＨ範囲：６．８〜８．５
グルコース濃度：０．０６〜０．４６％
誘導剤濃度：０．０１２５〜０．０９２５ｇ／Ｌ
誘導前のＯＤ６００の範囲：１０〜４５
誘導時間：２〜９時間
【００４４】
次に、洗浄および中空糸を用いたろ過により菌体を収集した。発酵液は５００ＫＤの中空糸で堰き止めてろ過した。洗浄緩衝液は、ｐＨが７．０のＮａＣｌを含む２５ｍＭのＰＢ溶液とした。
【００４５】
続いて、高圧でホモジネーションしつつ、低温を維持し、発酵した菌体を破砕した。そして、適量のトリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）を添加してから、低温で高速遠心分離して上清液を収集し、ペレットを除去した。
【００４６】
また、弱カチオン交換を適用し、精製過程で適量のＤＴＴを添加した。まず、塩化ナトリウムを含む２５ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）でＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗイオン交換カラムを平衡化した。次に、上清液をカラムに通し、０．０５Ｍ、０．１２Ｍ、０．４Ｍの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）を用いてグラジエント勾配（３勾配）で溶出して、３番目の溶出ピーク（０．４Ｍの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭのリン酸塩緩衝液による溶出）を収集した。
【００４７】
さらに、ヘパリンアフィニティクロマトグラフィーを適用し、精製過程で適量のＤＴＴを添加した。まず、塩化ナトリウムを含む２５ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）で、Ｈｅｐａｒｉｎ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＣＬ−６Ｂアフィニティクロマトグラフィーカラムを平衡化した。次に、イオン交換クロマトグラフィーの３番目の溶出ピーク溶液をカラムに通し、０．４Ｍ、１．０Ｍ、１．８Ｍの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０）でグラジエント勾配（３勾配）で溶出して、３番目の溶出ピーク（１．８Ｍの塩化ナトリウムを含む２５ｍＭのリン酸塩緩衝液による溶出）を収集した。
【００４８】
サンプルを上記の手順で精製したところ、純度は９５％以上に達した。実験の結果、菌体１００ｇあたり約６００ｍｇの組み換えヒトｂＦＧＦタンパク質を調製可能であり、非常に効率的な発現が実現されることが証明された。
【００４９】
２．２  純度・分子量検出およびシーケンシング
１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動の結果、取得したヒトｂＦＧＦタンパク質は約１８．５ＫＤの単一のバンドを示した（図２参照）。また、Ｃ８逆相カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーによる検出結果から、本発明で取得したヒトｂＦＧＦの純度は９５％を超えることが分かった（図３参照）。
【００５０】
また、「超高分解能、超高精度、超高感度」のＥｘａｃｔｉｖｅ  Ｐｌｕｓ  ＥＭＲを用いて精密分子量測定を行ったところ、ｒｈ−ｂＦＧＦ原液の４つのバッチ（ｂａｔｃｈ）で６つの成分が検出された（成分１，４，５の割合はほぼ＞１０％であった。表１参照）。このうち、成分４が主成分であり、分子量の平均値は１７１２１．０２Ｄａであった。また、バッチ間のＲＳＤ％は０．０００７、理論値との偏差は≦４１ｐｐｍ、相対比（ピーク強度で計算）は７０．７〜７９．０％であった。
【００５１】
【表１】
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【００５２】
他方、組み換えにより調製されたｂＦＧＦタンパク質についてアミノ酸配列を分析したところ、天然のヒトｂＦＧＦとアミノ酸配列が一致することが証明された（図５参照）。
【００５３】
２．３  生物活性の測定
ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞を使用し、サンプルについてｉｎ  ｖｉｔｒｏでの活性検査を行った。また、ＭＴＴ法で細胞増殖の状況を判断した。その結果、取得したヒトｂＦＧＦは、ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞に対する増殖促進作用がｂＦＧＦ活性標準品（ＮＩＳＣＢ）と一致することが分かった（図６参照）。
【００５４】
実施例３：医薬組成物の調製
医薬組成物１：
組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子  ２５００〜１００００ＩＵ
ヒト血清アルブミン  ０．０２５〜０．３７５ｍｇ／ｍＬ
増粘剤  ５．０〜１５．０ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム  ５．０〜１２．５ｍｇ／ｍＬ
ヘパリンナトリウム  ０．２５〜５．０μｇ／ｍＬ
リン酸二水素ナトリウム  ０．２５〜１．２５ｍｇ／ｍＬ
リン酸水素二ナトリウム  １．２５〜３．７５ｍｇ／ｍＬ
【００５５】
１．緩衝系は、リン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素二ナトリウムとしてもよいし、ホウ酸−ホウ砂緩衝系や、クエン酸−リン酸水素二ナトリウム緩衝系等としてもよい。医薬組成物のｐＨ値は６．５〜７．５であることが好ましい。
【００５６】
２．増粘剤は、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポロキサマー等であり、ポリビニルアルコールであることが好ましい。
【００５７】
３．調製方法：
（１）ポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、１２１℃下において３０分間高圧滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
（２）組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト血清アルブミン、ヘパリンナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムを適量の注射用水に溶解し、０．２２μｍのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
（３）ステップ（１）およびステップ（２）で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、注射用滅菌水で定容した。
（４）吹き込み（ブローイング）、充填（フィリング）、密封（シーリング）を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量０．４ｍＬで一体的に充填し、完成品を取得した。
【００５８】
医薬組成物２：
組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子  ２５００〜１００００ＩＵ
ヒト血清アルブミン  ０．１〜０．３７５ｍｇ／ｍＬ
ヘパリンナトリウム  ２５．０〜７５．０μｇ／ｍＬ
カルボマー  １．２５〜１２．５ｍｇ／ｍＬ
中和剤  １．２５〜１２．５ｍｇ／ｍＬ
グリセリン  １２．５〜５０ｍｇ／ｍＬ
【００５９】
１．カルボマーは、カルボマー９４０、カルボマー９３４、カルボマー９７４、カルボマー９８０等の系列であり、好ましくはカルボマー９８０系列である。
【００６０】
２．中和剤は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸水素カリウム、ホウ砂およびトリエタノールアミンであり、好ましくはトリエタノールアミンである。
【００６１】
３．調製方法：
（１）カルボマーを適量の注射用水中に分散し、均一に撹拌したあと一晩膨潤させて準備した。
（２）カルボマー分散液にトリエタノールアミンを添加し、透明かつ均一なゲル基質となるまで攪拌した。これを１２１℃下において３０分間高圧滅菌し、滅菌完了後に室温まで冷まして準備した。
（３）室温の注射用水を適量取り、グリセリン、ヒト血清アルブミン、ヘパリンナトリウム、組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子を添加した。これを均一に攪拌したあと、無菌条件下で０．２２μｍのろ過膜に通し、ステップ（２）のゲル基質と混合してから定量して、均一に攪拌した。
（４）吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌ゲルを充填量０．４ｇで一体的に充填し、完成品を取得した。
【００６２】
医薬組成物３：
組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子  １０００〜９０００ＩＵ
ヒト血清アルブミン  ０．０１〜５．０ｍｇ／ｍＬ
増粘剤  ０．１〜２０．０ｍｇ／ｍＬ
リン酸二水素ナトリウム  ０．２〜２．５ｍｇ／ｍＬ
リン酸水素二ナトリウム  ０．５〜５．０ｍｇ／ｍＬ
塩化ナトリウム  １．０〜５．０ｍｇ／ｍＬ
保湿剤  ０．１〜５０．０ｍｇ／ｍＬ
【００６３】
１．緩衝系は、前記リン酸二水素ナトリウムおよびリン酸水素二ナトリウムとしてもよいし、ホウ酸−ホウ砂緩衝系や、クエン酸−リン酸水素二ナトリウム緩衝系等としてもよい。好ましくは、前記ｐＨ値は６．５〜７．５であることが好ましい。
【００６４】
２．増粘剤は、ポリビニルアルコール、ヒアルロン酸ナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポロキサマー等であり、ポリビニルアルコールであることが好ましい。保湿剤は、グリセリン、プロパンジオールまたはその混合物である。
【００６５】
３．調製方法：
（１）増粘剤、塩化ナトリウムを適量の注射用水に分散・溶解させて、１２１℃下において３０分間高圧滅菌した。
（２）組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヒト血清アルブミン、保湿剤、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウムを適量の注射用水に溶解した。
（３）ステップ（２）の薬液を０．２２μｍの微孔性ろ過膜でろ過したあと、ステップ（１）で得た薬液と混合し、注射用水を用いて１ｍＬとなるよう定容した。
（４）ステップ（３）で得た薬液を、静菌剤を含有しない包装容器に充填した。容器の容積範囲は０．４ｇ／個とし、完成品を取得した。
【００６６】
他方、以下の医薬組成物をさらに調製した（表２参照）。なお、点眼液はいずれも１００ｍｌで調製し、外用ゲル剤はいずれも１００ｇで調製した。
【００６７】
【表２】
2020533014.tif 000003
【００６８】
調製実施例１：
（１）１．０ｇのポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、高圧で滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
（２）組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子５０００００ＩＵ、ヒト血清アルブミン２５ｍｇ、ヘパリンナトリウム２．５ｍｇ、塩化ナトリウム８００ｍｇ、リン酸二水素ナトリウム４２．５ｍｇ、リン酸水素二ナトリウム２５０ｍｇを適量の注射用水に溶解し、０．２２μｍのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
（３）ステップ（１）およびステップ（２）で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、滅菌注射用水で１００ｍＬとなるよう定容した。
（４）吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量０．４ｍＬで一体的に充填し、完成品を取得した。
【００６９】
調製実施例２：
（１）０．５ｇのポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、高圧で滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
（２）組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子５０００００ＩＵ、ヒト血清アルブミン２０ｍｇ、ヘパリンナトリウム２．０ｍｇ、塩化ナトリウム８００ｍｇ、リン酸二水素ナトリウム４２．５ｍｇ、リン酸水素二ナトリウム２５０ｍｇを適量の注射用水に溶解し、０．２２μｍのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
（３）ステップ（１）およびステップ（２）で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、滅菌注射用水で１００ｍＬとなるよう定容した。
（４）吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量０．４ｍＬで一体的に充填し、完成品を取得した。
【００７０】
調製実施例３：
（１）１．０ｇのポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、高圧で滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
（２）組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子４２００００ＩＵ、ヒト血清アルブミン２０ｍｇ、ヘパリンナトリウム２．０ｍｇ、塩化ナトリウム８００ｍｇ、リン酸二水素ナトリウム４２．５ｍｇ、リン酸水素二ナトリウム２５０ｍｇを適量の注射用水に溶解し、０．２２μｍのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
（３）ステップ（１）およびステップ（２）で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、滅菌注射用水で１００ｍＬとなるよう定容した。
（４）吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量０．４ｍＬで一体的に充填し、完成品を取得した。
【００７１】
調製実施例４：
（１）１．５ｇのポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、高圧で滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
（２）組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子４２００００ＩＵ、ヒト血清アルブミン１０ｍｇ、ヘパリンナトリウム１．０ｍｇ、塩化ナトリウム８００ｍｇ、リン酸二水素ナトリウム４２．５ｍｇ、リン酸水素二ナトリウム２５０ｍｇを適量の注射用水に溶解し、０．２２μｍのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
（３）ステップ（１）およびステップ（２）で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、滅菌注射用水で１００ｍＬとなるよう定容した。
（４）吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量０．４ｍＬで一体的に充填し、完成品を取得した。
【００７２】
調製実施例５：
（１）１．０ｇのポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、高圧で滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
（２）組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子４２００００ＩＵ、ヒト血清アルブミン２０ｍｇ、ヘパリンナトリウム２．０ｍｇ、塩化ナトリウム８００ｍｇ、クエン酸３７０．６ｍｇ、リン酸水素二ナトリウム５．９ｇを適量の注射用水に溶解し、０．２２μｍのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
（３）ステップ（１）およびステップ（２）で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、滅菌注射用水で１００ｍＬとなるよう定容した。
（４）吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量０．４ｍＬで一体的に充填し、完成品を取得した。
【００７３】
調製実施例６：
（１）１．０ｇのポリビニルアルコールを適量の注射用水に分散・溶解し、高圧で滅菌してから、室温まで冷却して準備した。
（２）組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子５０００００ＩＵ、ヒト血清アルブミン２５ｍｇ、ヘパリンナトリウム２．５ｍｇ、塩化ナトリウム８００ｍｇ、クエン酸３７０．６ｍｇ、リン酸水素二ナトリウム５．９ｇを適量の注射用水に溶解し、０．２２μｍのろ過膜を用いて滅菌ろ過した。
（３）ステップ（１）およびステップ（２）で取得した溶液を無菌条件下で均一に混合し、滅菌注射用水で１００ｍＬとなるよう定容した。
（４）吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌溶液を充填量０．４ｍＬで一体的に充填し、完成品を取得した。
【００７４】
調製実施例７：
（１）０．８０ｇのカルボマー９４０を計量し、適量の室温の注射用水に分散した。そして、６０〜１２０ｍｉｎ攪拌し、一晩膨潤させて準備した。
（２）カルボマー９４０分散液にトリエタノールアミン０．６０ｇを添加し、透明かつ均一なゲル基質となるまで攪拌した。次に、これを湿熱滅菌（１２１℃、３０分間）し、滅菌完了後に室温まで冷まして準備した。
（３）室温の注射用水を適量取り、グリセリン２．５０ｇ、ヒト血清アルブミン３０．０ｍｇ、ヘパリンナトリウム７．０ｍｇ、組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子４５００００ＩＵを添加した。これを均一に攪拌したあと、無菌条件下で０．２２μｍのろ過膜に通し、ステップ（２）のゲル基質と混合してから定量して、均一に攪拌した。
（４）吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌ゲルを充填量０．４ｇで一体的に充填し、完成品を取得した。
【００７５】
調製実施例８：
（１）０．６０ｇのカルボマー９４０を計量し、適量の室温の注射用水に分散した。そして、６０〜１２０分間攪拌し、一晩膨潤させて準備した。
（２）カルボマー９４０分散液にトリエタノールアミン０．５０ｇを添加し、透明かつ均一なゲル基質となるまで攪拌した。次に、これを湿熱滅菌（１２１℃、３０分間）し、滅菌完了後に室温まで冷まして準備した。
（３）室温の注射用水を適量取り、グリセリン２．５０ｇ、ヒト血清アルブミン３０．０ｍｇ、ヘパリンナトリウム７．０ｍｇ、組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子４２００００ＩＵを添加した。これを均一に攪拌したあと、無菌条件下で０．２２μｍのろ過膜に通し、ステップ（２）のゲル基質と混合してから定量して、均一に攪拌した。
（４）吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌ゲルを充填量０．４ｇで一体的に充填し、完成品を取得した。
【００７６】
調製実施例９：
（１）０．６０ｇのカルボマー９７４を計量し、適量の室温の注射用水に分散した。そして、６０〜１２０分間攪拌し、一晩膨潤させて準備した。
（２）カルボマー９７４分散液にトリエタノールアミン０．５０ｇを添加し、透明かつ均一なゲル基質となるまで攪拌した。次に、これを湿熱滅菌（１２１℃、３０分間）し、滅菌完了後に室温まで冷まして準備した。
（３）室温の注射用水を適量取り、グリセリン２．５０ｇ、ヒト血清アルブミン３０．０ｍｇ、ヘパリンナトリウム７．０ｍｇ、組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子４５００００ＩＵを添加した。これを均一に攪拌したあと、無菌条件下で０．２２μｍのろ過膜に通し、ステップ（２）のゲル基質と混合してから定量して、均一に攪拌した。
（４）吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌ゲルを充填量０．４ｇで一体的に充填し、完成品を取得した。
【００７７】
調製実施例１０：
（１）０．５０ｇのカルボマー９７４を計量し、適量の室温の注射用水に分散した。そして、６０〜１２０ｍｉｎ攪拌し、一晩膨潤させて準備した。
（２）カルボマー９７４分散液にトリエタノールアミン０．５０ｇを添加し、透明かつ均一なゲル基質となるまで攪拌した。次に、これを湿熱滅菌（１２１℃、３０ｍｉｎ）し、滅菌完了後に室温まで冷まして準備した。
（３）室温の注射用水を適量取り、グリセリン２．５０ｇ、ヒト血清アルブミン２０．０ｍｇ、ヘパリンナトリウム５．０ｍｇ、組み換えヒト塩基性線維芽細胞増殖因子４２００００ＩＵを添加した。これを均一に攪拌したあと、無菌条件下で０．２２μｍのろ過膜に通し、ステップ（２）のゲル基質と混合してから定量して、均一に攪拌した。
（４）吹き込み、充填、密封を行うスリーインワン充填機を使用して、滅菌ゲルを充填量０．４ｇで一体的に充填し、完成品を取得した。
【００７８】
実施例４：安定性研究
１）ｒｈ−ｂＦＧＦ原液の安定性に対するアミノ酸の影響研究
ｒｈ−ｂＦＧＦ原液自体は性質が不安定なため、室温下で重合および沈殿が発生しやすい。そこで、異なる安定剤を用い、原液の安定性につきスクリーニングを行った。５％および２％のマンニトール、５％および２％のグリシン、ならびに２％のデキストランを用い、２５℃環境下で１７日間放置した。そして、０日目、７日目および１７日目にそれぞれタンパク質濃度を検査した。結果を表３に示す。
【００７９】
【表３】
2020533014.tif 000004
【００８０】
結果から明らかなように、５％グリシンの場合にタンパク質の沈殿を効果的に回避可能であり、１７日間熱破壊条件下で放置した場合でも、８６．２６％のタンパク質を維持可能であった。１７日後のグリシンの効果は、マンニトールおよびデキストランと比べて明らかに良好であった。また、安定剤を加えなかったタンパク質は１３．６％しか残留しなかった。
【００８１】
２）ｒｈ−ｂＦＧＦ原液の安定性に対するヒスチジンの影響研究
さらに、異なるアミノ酸（グリシン、ヒスチジン、アルギニン）とツイーン２０を用い、原液の安定性について更なるスクリーニングを行った。２５℃環境下で１８時間放置した結果を図７に示す。
【００８２】
結果から明らかなように、濃度５％のグリシンと比較して、３％のヒスチジンおよび０．０３％のツイーン２０は、ｒｈ−ｂＦＧＦ原液の安定性に対する効果がより良好であり、１８時間熱破壊条件下で放置した場合でもタンパク質を８５％以上維持可能であった。よって、ｒｈ−ｂＦＧＦに対するヒスチジンおよびツイーン２０の保護作用はグリシンよりも良好であった。
【００８３】
３）ｒｈ−ｂＦＧＦ原液の安定性に対するＨＳＡの影響研究
ＨＳＡはタンパク質含有量の測定に干渉するため、ＨＳＡ含有または非含有の原液を２５℃環境下で１８時間放置し、熱破壊されたタンパク質の純度変化を高分解能クロマトグラフィーで検出した。結果を図８に示す。
【００８４】
結果から明らかなように、ＨＳＡはｒｈ−ｂＦＧＦの安定性を明らかに改善可能であった。９５％純度変化率を指標とした場合、ＨＳＡ非含有サンプルはストレス条件下で４時間しか維持できなかったが、ＨＳＡを加えた場合には１５時間まで延長可能であった。これより、ｂＦＧＦにとって、ＨＳＡが優秀なタンパク質保護剤であることが証明された。
【００８５】
実施例５：動物の眼球乾燥症モデルにおける薬効研究
本研究では、ニュージーランドラビットの眼球乾燥症モデルを用い、モデルの臨床指標（涙液分泌、涙膜破壊時間）を観察して、眼球乾燥症に対する薬物の臨床治療効果を評価した。ニュージーランドラビットを、陰性対照群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ，未処置）、モデル対照群（Ｍｏｄｅｌ，アルカリ熱傷処置を施すが点眼液は一切投与しない）、ヒアルロン酸ナトリウム点眼液治療群（ＨＡ  ｇｒｏｕｐ）、および、使用する調製実施例３におけるｒｈ−ｂＦＧＦ点眼液の濃度に基づき分類した群Ｄ（４．０μｇ／ｍＬ）、Ｅ（８．０μｇ／ｍＬ）、Ｆ（１６．０μｇ／ｍＬ）、Ｇ（３２．０μｇ／ｍＬ）に分けた。陰性対照群は１群あたり７２羽とし、残りの群はいずれも１群あたり８羽とした。また、投与量は３００μｌ／目（片目）／日とした。
【００８６】
（１）涙液分泌量（両目）の測定方法（フェノールレッド綿糸の湿潤長さ）：
シルマーＩテスト（Ｓｃｈｉｒｍｅｒ  Ｉ  ｔｅｓｔ）によって、ニュージーランドラビットの涙液分泌を測定した。即ち、眼科用ピンセットでフェノールレッド綿糸を固定し、ニュージーランドラビットの外眼角部に置いた。そして、６０秒後に取り出して、フェノールレッド綿糸の湿潤長さを測定した。フェノールレッド綿糸は湿潤することで赤色に変化するため、湿潤長さに基づいて目の湿潤状況を判定した。実験結果を図９に示す。
【００８７】
図９に示すように、陰性対照群と比較して、モデル対照群におけるフェノールレッド綿糸の湿潤長さは明らかに短かった。また、モデル対照群と比較して、投与１０日目のｒｈ−ｂＦＧＦ点眼液群Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇにおけるフェノールレッド綿糸の湿潤長さはいずれも明らかに長く、有意な統計学的差異があった。
【００８８】
（２）涙膜破壊時間（両目）の測定方法：
調節可能ピペットを用い、ニュージーランドラビットの目の下の結膜嚢に２μｌの０．５％フルオレセインナトリウム溶液を滴下した。次に、手を用いて一定の力で数回まばたきさせたあと、一定の力で目を開かせ、細隙灯顕微鏡を用いてコバルトブルー光により角膜を観察した。そして、角膜の緑色の膜に黒い部分が現れたとき、涙膜が破壊されたとみなした。連続３回測定し、平均値を取った。涙膜破壊時間が１０秒未満の場合には、涙膜が不安定であることを意味した。即ち、このことは涙液中のムチン不足に起因するＫＣＳの明らかな特徴であり、結膜の杯細胞が深刻な損傷を受けたか喪失しており、眼球乾燥症が生じやすいことを意味した。図１０に実験結果を示す。
【００８９】
図１０に示すように、投与１０日目におけるモデル対照群の涙膜破壊時間はいずれも陰性対照群よりも明らかに短かった。また、モデル対照群と比較して、投与１０日目のｒｈ−ｂＦＧＦ点眼液群Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇにおける涙膜破壊時間はいずれも明らかに長く、有意な統計学的差異があった。
【００９０】
以上述べたように、フェノールレッド綿糸による涙液分泌テストの結果、本発明の点眼液はモデル動物の涙液分泌量を改善可能なことが分かった（図９参照）。また、涙膜破壊時間テストの結果、眼球乾燥症モデルの涙膜破壊時間について明らかな改善作用を奏することが分かった（図１０参照）。また、ｒｈ−ｂＦＧＦ点眼液は、投与量が増加するほど、アルカリ熱傷ニュージーランドラビットの眼球乾燥症モデルに対し明らかな改善作用を奏した。
【００９１】
本文では、本発明のいくつかの特徴について詳細に説明および記載したが、当業者であれば、多くの修正や置き換え、変更および等価物を想到し得る。従って、添付の特許請求の範囲は、本発明の本質の範囲内におけるこの種の全ての修正および変更を包括するものと解釈すべきである。
【図１】
2020533014.tif 000005
【図２】
2020533014.tif 000006
【図３】
2020533014.tif 000007
【図４】
2020533014.tif 000008
【図５】
2020533014.tif 000009
【図６】
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【図７】
2020533014.tif 000011
【図８】
2020533014.tif 000012
【図９】
2020533014.tif 000013
【図１０】
2020533014.tif 000014
【配列表】
2020533014000001.app
【国際調査報告】
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