(57)【要約】  本発明は、リシルオキシダーゼ様２（ＬＯＸＬ２）のＮ末端に特異的に結合する抗体、および試料中のＬＯＸＬ２を検出または定量化するためのイムノアッセイの方法におけるその使用に関する。方法は、ＬＯＸＬ２関連疾患を評価するために使用することができ、また抗ＬＯＸＬ２治療薬の有効性を評価するためにも使用することができる。
2020514369.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
リシルオキシダーゼ様２（ＬＯＸＬ２）のＮ末端に特異的に結合する、抗体。
【請求項２】
前記抗体が、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ（配列番号１）に特異的に結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体が、前記Ｎ末端アミノ酸配列のＮ拡張伸長バージョンを特異的に認識または結合しない、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１〜３に記載の抗体。
【請求項５】
試料中のＬＯＸＬ２を検出または定量化するためのイムノアッセイの方法であって、前記方法が、前記ＬＯＸＬ２を含む試料を請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体と接触させることと、前記抗体の結合の量を決定することと、を含む、方法。
【請求項６】
前記試料が、生物流体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生物流体が、血清、血漿、尿、または羊水である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記イムノアッセイが、競合イムノアッセイまたはサンドイッチイムノアッセイである、請求項５〜７に記載の方法。
【請求項９】
前記イムノアッセイが、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイである、請求項５〜７に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、前記方法によって決定されるＬＯＸＬ２の量を、既知の疾患重症度の標準ＬＯＸＬ２関連疾患試料と相関させて、前記ＬＯＸＬ２関連疾患の重症度を評価するステップをさらに含む、請求項５〜９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＬＯＸＬ２関連疾患が、線維症または癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＬＯＸＬ２関連疾患が、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、または乳癌である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗ＬＯＸＬ２治療薬の有効性を評価するための方法であって、前記方法が、請求項５〜９のいずれかに記載の方法を使用して、少なくとも２つの試料中のＬＯＸＬ２の量を定量化することを含み、前記試料が、対象から第１の時点および前記対象への前記抗ＬＯＸＬ２治療薬の投与期間中の少なくとも１つのその後の時点で得られており、前記第１の時点から前記抗ＬＯＸＬ２治療薬の前記投与期間中の前記少なくとも１つのその後の時点までの前記ＬＯＸＬ２の量の低減が、有効な抗ＬＯＸＬ２治療薬であることを示す、方法。
【請求項１４】
前記試料が、生物流体である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記生物流体が、血清、血漿、尿、または羊水である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
前記抗ＬＯＸＬ２治療薬が、対象におけるＬＯＸＬ２を標的とし、その量を低減する、小分子ＬＯＸＬ２アンタゴニスト薬またはバイオシミラーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法における使用のためのキットであって、前記キットが、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体と、
−ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート
−前記抗体と反応性であり、ビオチン化ペプチドＨ２Ｎ−ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ−Ｌ−ビオチン（配列番号４）であり得、式中、Ｌが、任意のリンカーである、ペプチド
−サンドイッチイムノアッセイにおける使用のための任意にビオチン化された二次抗体
−Ｎ末端配列Ｈ２Ｎ−ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ．．．（配列番号５）を含むキャリブレータペプチド
−抗体ＨＲＰ標識キット
−抗体放射性標識キット
−アッセイ可視化キットのうちの少なくとも１つと、を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ＬＯＸＬ２抗体、およびＬＯＸＬ２を検出または定量化するためのイムノアッセイの方法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の翻訳後修飾は、タンパク質のＥＣＭ成熟および細胞シグナル伝達特性の重要な態様であり（１）、特にリシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）のファミリーによるコラーゲンおよびエラスチン架橋は、肺領域における線維症につながる疾患において、および癌において、ますます注目を集めている（２）（３）（４）。ＬＯＸＬ２は、ＬＯＸおよびＬＯＸ様タンパク質１〜４（ＬＯＸＬ１、ＬＯＸＬ２、ＬＯＸＬ３、およびＬＯＸＬ４）をコードする哺乳動物ゲノムにおいて５つのＬＯＸファミリー遺伝子が同定されている、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）遺伝子ファミリーのメンバーである（５、６）。ファミリーのフルメンバーは、ＣＯＯＨ末端に位置する保存された触媒ドメインを有するが、ＬＯＸアイソフォームのＮＨ２末端領域は、より分岐しており、各アイソエンザイムの個別の役割および組織分布を決定すると考えられる（７）。ＬＯＸファミリーメンバーは、制御されていない状態で線維性組織において線維素溶解への耐性を促進する、増加した組織剛性をもたらす正常および病理関連架橋の原因であることが知られている（８、９）。ＬＯＸは、特に活性化線維芽細胞によって生成される線維性病変の微小環境において過剰発現し（１０）、ＬＯＸファミリーの９つのメンバーのうち、進行した線維症ステージにおいて最も高度に発現するので、ＬＯＸＬ２が注目されている（８、１１、１２）。ＬＯＸは、リシン由来架橋の形成を介した架橋を誘発する、ＥＣＭの安定化に必須である銅依存性プロ酵素であり、非特異的プロテアーゼによって行われるタンパク質分解に対する本質的な防御を構成し得る。ＬＯＸは、細線維の形態で沈殿したコラーゲンおよびクラスター形態のエラスチンについて最も高い親和性を有する（１３）。
【０００３】
ＬＯＸＬ２活性および発現は、癌増殖および脱分化におけるシグナル伝達の役割、ならびに線維形成中に蓄積するコラーゲンの増加した安定性（１４〜１６）を含む、癌および線維症（９）と関連することが示されている。コラーゲン分子あたりの架橋の数は、健康状態と比較して線維性組織において上昇することが示されている（９）。ＬＯＸは、ほとんどの組織において発現するが、ＬＯＸＬ２は、線維症および癌の影響を受ける組織とより関連していると考えられ、腫瘍グレードおよび線維症ステージの悪化と関連している（１７）。線維症および癌進行の阻害に注目するこの酵素およびその架橋活性を標的とする治療介入は、ヒト化モノクローナル抗体を用いて試験されており（１７）、線維性非アルコール性脂肪性肝炎および原発性硬化性胆管炎を有する患者における臨床研究が進行中である（１８、１９）。ＬＯＸＬ２は、特発性肺線維症（ＩＰＦ）患者からの肺組織試料において、特に活性化線維芽細胞、反応性肺細胞、および線維芽細胞巣の脈管系を有する組織において過剰発現することが見出された（８、１２、１７）。これは肺線維症の発症中のＬＯＸ活性の劇的な増加によって実証された（８）。それにもかかわらず、最近、ＩＰＦ患者を含む第ＩＩＩ相臨床試験において使用されたヒト化モノクローナル抗体の有効性の欠如が報告された（２０）。
【０００４】
新しい抗ＬＯＸＬ２治療薬の有効性を評価および／または監視するために、循環中のＬＯＸＬ２の量を正確に定量化することができるアッセイを提供することが必要である。
【０００５】
循環中のＬＯＸＬ２の定量的評価は、以前に説明されている。Ｃｈｉｅｎら（Ｅｕｒ  ｒｅｓｐｉｒｅ  Ｊ（２０１４）：１４３０−１４３８）は、全長組換えヒトＬＯＸＬ２タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に対するポリクローナル抗体および組換えＣ末端触媒ドメインに対するモノクローナル抗体に基づくサンドイッチアッセイを開発した。同アッセイは、Ｃｈｉｅｎ、ＷＯ２０１２／１６７１８１（両方ともウサギ抗ＬＯＸＬ２  ｐＡｂおよびｍＡｂ  ＡＢ００３０を利用する）に開示されている。ＩＰＦを有するほとんどの対象において上昇したレベルのＬＯＸＬ２が報告された一方で、健康な対象の約９０％は、血清中に検出可能なＬＯＸＬ２を有さず、すなわち、検出下限（ＬＬＯＤ）を下回るＬＯＬＸ２レベルを有した。同様に、ＬＯＸＬ２アッセイは、ＩＰＦに罹患していることが知られる１５人のうちの５人の患者の血清試料においてＬＯＸＬ２の存在を陽性と同定することができなかった。健康なヒト対象において、およびＩＰＦに罹患していることが知られる何人かの対象において、低レベルの循環ＬＯＸＬ２を定量化することができないことは、正常バックグラウンドレベルを上回るＬＯＸＬ２の濃度の増加が非常に小さいものにすぎないことが予想される、早期病理変化を検出できないことを示す。さらに、Ｃｈｉｅｎらにおける結論は、より高いＬＯＸＬ２レベルとＩＰＦ転帰不良の増加したリスクとの間には関係があるが、得られた結果は、血清ＬＯＸＬ２がＩＰＦに適したバイオマーカーではない場合があることを示したと述べている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、循環中のＬＯＸＬ２を正確に定量化し、正常バックグラウンドレベルを上回るＬＯＸＬ２の濃度の増加が非常に小さいものにすぎないことが予想される、ＬＯＸＬ２血清レベルにおける早期病理変化を検出するのに十分に感度のよいアッセイの必要性が残る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
そのようなものとして、本願の発明者らは、循環中の生物化学的変化が非常に小さいことが予想される、疾患の早期にＬＯＸＬ２レベルを定量化することに特に重点を置いた、ＬＯＸＬ２を定量化するためのそのようなアッセイを開発することを目的とした。
【０００８】
これを達成するために、本発明者らは、ＬＯＸＬ２の遊離Ｎ末端を対象とするアッセイを開発した。そのアッセイを用いてヒト対象からの血清において、健康な個体に由来する血清においても、予想外に高レベルの循環ＬＯＸＬ２が検出され、早期病理変化の検出を可能にし得ることを示した。驚くべきことに、通常はサンドイッチイムノアッセイよりも感度が低いとみなされている、ＬＯＸＬ２の遊離Ｎ末端を対象とする競合イムノアッセイでも、健康な対象におけるＬＯＸＬ２の循環レベルを検出および定量化することができ、健康な対象からの全ての試料が、ＬＬＯＤを上回るＬＯＸＬ２レベルを有したことが見出された。したがって、ＬＯＸＬ２の遊離Ｎ末端は、循環ＬＯＸＬ２レベルを評価するための優れたバイオマーカーであると考えられる。
【０００９】
したがって、第１の態様では、本発明は、抗体に関し、その抗体は、ＬＯＸＬ２のＮ末端に特異的に結合する。
【００１０】
好ましくは、抗体は、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ（配列番号１）に含まれるＮ末端エピトープに特異的に結合する。さらに好ましくは、抗体は、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＱＹＤＳＷＰ（配列番号２）に特異的に結合する。
【００１１】
抗体は、好ましくは、モノクローナル抗体である。
【００１２】
好ましくは、抗体は、そのＮ末端アミノ酸配列のＮ拡張伸長バージョンを特異的に認識または結合しない。これに関して、「そのＮ末端アミノ酸配列のＮ拡張伸長バージョン」は、１つ以上のアミノ酸が配列Ｈ２Ｎ−ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ（配列番号１）のＮ末端を越えて拡張することを意味する。例えば、Ｎ末端アミノ酸配列Ｈ２Ｎ−ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ（配列番号１）がアラニン残基によって伸長された場合、対応する「Ｎ拡張伸長バージョン」は、Ｈ２Ｎ−ＡＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ．．．（配列番号３）であろう。
【００１３】
第２の態様では、本発明は、試料中のＬＯＸＬ２を検出または定量化するためのイムノアッセイの方法に関し、その方法は、そのＬＯＸＬ２を含む試料を上に記載される抗体と接触させることと、その抗体の結合の量を決定することと、を含む。
【００１４】
好ましくは、試料は、これらに限定されないが、血清、血漿、尿、または羊水などの生物流体である。
【００１５】
イムノアッセイは、競合アッセイまたはサンドイッチアッセイであり得る。イムノアッセイは、これらに限定されないが、ラジオイムノアッセイまたは酵素結合免疫吸着アッセイであり得る。
【００１６】
イムノアッセイの方法は、その方法によって決定されるＬＯＸＬ２の量を、既知の疾患重症度の標準ＬＯＸＬ２関連疾患試料と相関させて、そのＬＯＸＬ２関連疾患の重症度を評価するステップをさらに含み得る。そのようなＬＯＸＬ２関連疾患は、これらに限定されないが、ＩＰＦもしくは慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの線維症、または非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、結腸癌、黒色腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、もしくは乳癌などの癌であり得る。
【００１７】
イムノアッセイの方法は、新規抗ＬＯＸＬ２治療薬の有効性の評価においても使用され得る。これに関して、方法は、対象から第１の時点および対象への抗ＬＯＸＬ２治療薬の投与期間中の少なくとも１つのその後の時点で得られる少なくとも２つの生物学的試料中のＬＯＸＬ２の量を定量化することをさらに含む。第１の時点から抗ＬＯＸＬ２治療薬の投与期間中の少なくとも１つのその後の時点までのＬＯＸＬ２の量の低減は、有効な抗ＬＯＸＬ２治療薬であることを示す。
【００１８】
これに関して、「抗ＬＯＸＬ２治療薬」は、これらに限定されないが、対象におけるＬＯＸＬ２を標的とし、その量を低減する、小分子ＬＯＸＬ２アンタゴニスト薬またはバイオシミラー（例えば、モノクローナル抗体療法）であり得る。
【００１９】
本発明はさらに、本明細書に記載されるイムノアッセイにおける使用のためのキットを対象とする。キットは、上に記載される抗体と、
−ストレプトアビジン被覆９６ウェルプレート
−その抗体と反応性であり、ビオチン化ペプチドＨ２Ｎ−ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ−Ｌ−ビオチン（配列番号４）であり得、Ｌが、任意のリンカーである、ペプチド
−サンドイッチイムノアッセイにおける使用のための任意にビオチン化された二次抗体
−Ｎ末端配列Ｈ２Ｎ−ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ．．．（配列番号５）を含むキャリブレータペプチド
−抗体ＨＲＰ標識キット
−抗体放射性標識キット
−アッセイ可視化キットのうちの少なくとも１つと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＬＯＸＬ２  ＥＬＩＳＡの特異性：標的ペプチド（ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ、配列番号１）、伸長ペプチド（ＡＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ、配列番号３）、ナンセンスペプチド（ＩＫＡＰＫＬＰＧＧＹ、配列番号６）、およびナンセンスコーティングペプチド（ビオチン−ＩＫＡＰＫＬＰＧＧＹ、配列番号７）に対するＬＯＸＬ２  ＥＬＩＳＡにおいて使用されるモノクローナル抗体の活性。反応性を、４５０ｎｍ（６５０ｎｍのバックグラウンドを引いた）の光学密度（ＯＤ）として、およびペプチド濃度の関数として評価されたゼロ試料（バッファー）シグナルの阻害パーセントとして示した。
【図２】組換えＬＯＸＬ２に対する反応性：組換えＬＯＸＬ２（ｒＬＯＸＬ２）を、指示された濃度でＬＯＸＬ２  ＥＬＩＳＡに添加した。ＬＯＸＬ２  ＥＬＩＳＡデータを、各ｒＬＯＸＬ２濃度についての二重決定の平均として示す。
【図３】ＬＯＸＬ２を、２つの異なるコホートに含まれる患者の血清において評価した。コホート１（図３Ａ）は、乳癌（ｎ＝２０）、結腸癌（ｎ＝７）、胃癌（ｎ＝８）、黒色腫（ｎ＝１９）、ＮＳＣＬＣ（ｎ＝８）、ＳＣＬＳ（ｎ＝７）、卵巣癌（ｎ＝９）、膵臓癌（ｎ＝５）、または前立腺癌（ｎ＝１４）を有する患者を含んだ。データを、ノンパラメトリックデータのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗｉｌｌｉｓ比較検定を用いて比較した。データを、箱ひげ図として示す。有意性レベル：＊＊＊：ｐ＜０．００１および＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。コホート２（図３Ｂ）は、ＩＰＦと診断された患者（ｎ＝１２０）および健康対照（ｎ＝５１）からの血清試料を含んだ。群を、対応のない両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて比較した。データを、箱ひげ図として示す。有意性レベル：＊＊＊：ｐ＜０．００１および＊＊＊＊：ｐ＜０．０００１。
【実施例】
【００２１】
本開示の実施形態は、以下の実施例に記載され、これは、本開示の理解を助けるために記述され、その後に続く特許請求の範囲において定義される本開示の範囲をいずれの方法でも限定するものと解釈されるべきではない。以下の例は、当業者に、記載される実施形態の作製および使用方法の完全な開示および説明を提供するように記述され、本開示の範囲を限定することは意図されず、以下の実験が行われた全てまたは唯一の実験であることを表すことも意図されない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関する精度を確保する努力がなされたが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。特に指示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気またはそれに近い。
【００２２】
以下の例では、以下の材料および方法を使用した。
【００２３】
ペプチドの選択
「Ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ」データベースでは、ＬＯＸＬ２（ヒトＬＯＸＬ２、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ  Ｑ９Ｙ４Ｋ０）からシグナルペプチドを分離するＮ末端切断部位は、アミノ酸位置２５’で予測される。この切断部位（↓）に特異的な抗体を産生するために、シグナルペプチド切断部位に隣接する１０個のアミノ酸の配列を標的として選択した：２６’↓ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ’３５。この配列を、マウスの免疫化に用い、アッセイ開発における標準ペプチドとして用いた。配列を、種相同性および他のヒト分泌細胞外マトリックスタンパク質との相同性について、Ｐｒａｂｉ−Ｌｙｏｎ−Ｇｅｒｌａｎｄ「ＮＰＳ＠：Ｎｅｔｗｏｒｋ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＵｎｉｐｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ｐｒｏｔ  ｄａｔａｂａｓｅ」ソフトウェアをオンラインで使用してＢＬＡＳＴした（４）。
【００２４】
モノクローナル抗体産生およびＥＬＩＳＡアッセイの検証に使用される合成ペプチドは、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（中国）およびＧｅｎｓｃｒｉｐｔ（Ｐｉｃａｔａｗａｙ、ＮＪ、米国）から購入した。ビオチン化ペプチド（ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ−ビオチン）を、ストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレート上のコーティングペプチドとして含めた。抗体の特異性を、標的ペプチド配列のＮ末端に付加された追加のアミノ酸を有する伸長選択ペプチド（ＡＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ、配列番号１）、ならびにナンセンス選択ペプチド（ＩＫＡＰＫＬＰＧＧＹ、配列番号６）およびナンセンスビオチン化コーティングペプチド（ビオチン−ＩＫＡＰＫＬＰＧＧＹ、配列番号７）をアッセイ検証に含めることによって試験した。免疫原性ペプチド（ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ−ＫＬＨ、配列番号８）を、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、ＳＭＣＣ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、米国、カタログ番号２２３３６）を用いて、選択ペプチドをＫｅｙｈｏｌｅ  Ｌｉｍｐｅｔ  Ｈｅｍｐｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ）担体タンパク質と共有結合的に架橋することによって生成した。
【００２５】
モノクローナル抗体産生
４〜６週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、フロイント不完全アジュバント（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）と混合した２００μＬの乳化抗原および５０μｇの免疫原性ペプチド（ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ−ＫＬＨ、配列番号８）の皮下注射によって免疫化した。連続免疫化を、安定な血清力価レベルに到達するまで２週間間隔で行った。４週間安静にした最も高い力価を有するマウスに、１００μＬの０．９％ＮａＣｌ溶液中の５０μｇの免疫原性ペプチドを追加で静脈内注射した。ハイブリドーマ細胞を、以前に記載されるように脾臓細胞をＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合することによって生成した（Ｇｅｆｔｅｒ  ＭＬ，Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ＤＨ，Ｓｃｈａｒｆｆ  ＭＤ．Ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ−ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｍｙｅｌｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．１９７７；３：２３１−６）。得られたハイブリドーマ細胞を９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて培養し、標準限界希釈を用いてモノクローナル成長を確保した。上清を、ビオチン化コーターペプチド（ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ−ビオチン、配列番号９）を用いて、反応性についてスクリーニングした。
【００２６】
クローン特徴分析
モノクローナル抗体の天然反応性およびペプチド親和性を、ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ、カタログ番号１１９４０２７９）上の１０ｎｇ／ｍＬのビオチン化コーティングペプチドおよびモノクローナルハイブリドーマ細胞を生成する抗体からの上清を用いる予備ＥＬＩＳＡにおいて、ヒト血清試料および選択／標準ペプチド（ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ、配列番号１）を用いる置換によって評価した。最良のペプチドおよび天然反応性を有するクローンを、タンパク質Ｇカラムを製造業者の指示（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ、英国、カタログ番号１７−０４０４−０１）に従って用いて精製した。アッセイ開発および検証のためのモノクローナル抗体の最終選択は、選択／標準ペプチド、ヒト血清試料を含む関連天然試料および組換えＬＯＸＬ２、ホモログ２（ＲｎＤ  ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２６３９−ＡＯ）に対する高い反応性に基づいた。
【００２７】
ＬＯＸＬ２  ＥＬＩＳＡプロトコル
最適インキュベーションバッファー、時間、および温度、ならびに抗体およびコーティングペプチドの最適濃度を決定し、完成したＬＯＸＬ２競合ＥＬＩＳＡプロトコルを、以下のプロトコルに発展させた：
９６ウェルストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレートを、アッセイバッファー（２５ｍＭ  ＴＢＳ−ＢＴＢ、４ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で希釈した０．５ｎｇ／ｍＬのビオチン化コーティングペプチドで被覆し、暗所で振盪（３００ｒｐｍ）しながら３０分間２０℃でインキュベートした。２０μＬの標準ペプチド（５００ｎｇ／ｍＬ）または予備希釈血清試料（１：２）を、適切なウェルに添加し、続いてアッセイバッファーに１４ｎｇ／ｍＬの濃度まで溶解した１００μＬのモノクローナル抗体を各ウェルに添加し、暗所で振盪（３００ｒｐｍ）しながら１時間２０℃でインキュベートした。アッセイバッファーで１：５０００に希釈した１００μＬのウサギＰＯＤ共役抗マウスＩｇＧ抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＰＡ、米国、カタログ番号１１９９３６）を、各ウェルに添加し、暗所で振盪（３００ｒｐｍ）しながら１時間２０℃でインキュベートした。全てのインキュベーションステップの後、洗浄バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２）での５回の洗浄を行った。最後に、１００μＬのテトラメチルベンジニジン（ＴＭＢ）（ｃａｔ．４３８０Ｈ、Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、デンマーク）を各ウェルに添加し、プレートを暗所で振盪（３００ｒｐｍ）しながら１５分間２０℃でインキュベートした。酵素反応を、０．１８ＭのＨ２ＳＯ４を添加することによって停止し、吸光度を、６５０ｎｍを参照として４５０ｎｍで測定した。検量線を、４パラメータロジスティック曲線あてはめを用いてプロットした。データを、ＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏ  ｖ．６．３ソフトウェアを用いて分析した。
【００２８】
ＬＯＸＬ２  ＥＬＩＳＡの技術的評価
アッセイ間およびアッセイ内変動を、各ランが試料の二重決定からなる、検出範囲を網羅する８つの品質管理試料および２つの内部管理を含む１０の独立したランによって決定した。５つの品質管理試料は、そのうちの２つに合成特異的ペプチドが添加された４つのヒト血清試料、および合成特異的ペプチドが添加されたバッファーの１つの試料で構成された。アッセイ内変動をプレート内の平均変動係数（ＣＶ％）として計算し、アッセイ間変動を１０の個別ラン間の平均ＣＶ％として計算した。３つのヒト血清試料の２倍希釈物を用いて線形性を計算した。回収パーセンテージを、未希釈、１：２、または１：４試料を参照値として計算した。検出下限（ＬＬＯＤ）をゼロ試料（アッセイバッファー）の２１の測定から決定し、平均＋３つの標準偏差として計算した。検出上限（ＵＬＯＤ）を、最も高い標準ペプチド濃度の１０の独立したランから決定し、平均バックキャリブレーション計算＋３つの標準偏差として計算した。定量下限（ＬＬＯＱ）を、段階希釈した血清試料の３つの独立したランから決定し、３０％未満の変動係数を有する血清中の定量化可能な最も高いＬＯＸＬ２レベルとして計算した。第１に、分析物安定性を、４つの凍結／融解サイクルで３つのヒト血清試料においてＬＯＸＬ２レベルを測定することによる、血清試料の反復凍結／融解の効果によって決定した。凍結／融解回収を、ゼロサイクルを参照として計算した。第２に、分析物安定性を、４℃または２０℃のいずれかでの貯蔵の０、２、４、２４、および４８時間後に３つのヒト血清試料においてＬＯＸＬ２レベルを測定することによって、異なる時点および温度で決定した。回収を、０時間を参照として計算した。干渉を、低／高含有量のヘモグロビン（０．１５５／０．３１０ｍＭ）、血清脂質／脂質（４．８３／１０．９８ｍＭ）、およびビオチン（３０／９０ｎｇ／ｍＬ）を既知の濃度の血清試料に添加することによって決定した。回収パーセンテージを、正常血清試料を参照として計算した。
【００２９】
ＬＯＸＬ２の臨床検証−患者血清試料
コホート１における患者血清試料は、悪性黒色腫、乳癌、結腸癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、および結腸鏡検査陰性対照を含んだ。コホートは、商業的ベンダーＰｒｏｔｅｏｇｅｎｅｘ（Ｃｕｌｖｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ、米国）およびＡｓｔｅｒａｎｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ、英国）から入手した。コホート２は、ＩＰＦと診断された患者からの血清試料（ベースライン試料、ＣＴｇｏｖ  ｒｅｇ．ＮＣＴ００７８６２０１）および商業的ベンダーＶａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ（Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＶＡ、米国）から入手した健康対照血清試料を含んだ。研究の詳細を表１に示す。全ての研究は、患者が提出したインフォームドコンセントを含む適切な施設内審査委員会／独立倫理委員会が承認した試料収集を受けた。
表１．コホート１および２の臨床および患者デモグラフィックの概要．ＳＤ：標準偏差。ＳＣＬＣ：小細胞肺癌、ＮＳＣＬＣ：非ＳＣＬＣ。
【表１】
2020514369.tif 000003
【００３０】
統計分析
血清試料中のＬＯＸＬ２のレベルを、Ｔｕｋｅｙの多重比較検定（パラメトリックデータ）に適合させた一元配置分散分析、Ｄｕｎｎの多重比較検定（ノンパラメトリックデータ）に適合させたＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ、または対応のない両側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定を用いて比較した。診断能力を、受信者動作特性（ＡＵＲＯＣ）下の面積によって調査した。感度および特異性を、ＲＯＣ曲線に基づく最適なカットオフ値について決定した。Ｐ値＜０．０５を有意とみなした。グラフおよび統計分析を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン６（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、ＣＡ、米国）またはおよびＭｅｄＣａｌｃ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅバージョン１２（ＭｅｄＣａｌｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｏｓｔｅｎｄ、ベルギー）を用いて行った。
【００３１】
結果
ＬＯＸＬ２アッセイにおいて利用される抗体の選択および特異性
ヒト血清試料に対する最良の天然反応性および選択ペプチドに対する親和性を有するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマクローンを、ＥＬＩＳＡ最適化および検証のために選択した。
【００３２】
ヒト標的配列のＮ末端部位、↓２６’ＱＹＤＳＷＰＨＹＰＥ’３５を、シグナルペプチド切断として選択した（↓）。配列ブラストは、Ｐｏｎｇｏ  Ａｂｅｌｉｉに対して１００％相同性、ならびにＢｏｓ  Ｔａｕｒｕｓに対してシグナルペプチド切断部位からアミノ酸位置３および６でのミスマッチを含む８０％相同性を示す。タンパク質ブラストは、他の類似する配列が、他のタンパク質において見つけることができ、アッセイにおいて潜在的な交差反応タンパク質として作用することができることを示さなかった。
【００３３】
競合ＬＯＸＬ２  ＥＬＩＳＡアッセイの特異性を、標的（選択）ペプチド、ナンセンスペプチド、伸長ペプチド、およびナンセンスビオチン化コーティングペプチドを使用することに対する反応性を分析することによって評価し、データを図１に示す。抗体は選択ペプチドに対して反応し、５パラメトリック曲線に従った標準曲線を生成した。検出可能なシグナルは、ナンセンスビオチン化コーティングペプチド、伸長ペプチド、またはナンセンスペプチドを用いて観察されなかった。これらのデータは、選択された抗体が、標的エピトープに対して特異的であったことを示す。さらに、シグナルペプチドを含まない組換えＬＯＸＬ２タンパク質の試験は、抗体がこのタンパク質に対して反応することができたことを示した（図２）。
【００３４】
ＬＯＸＬ２  ＥＬＩＳＡアッセイの技術的評価
様々な技術的検証を行って、ＬＯＸＬ２  ＥＬＩＳＡアッセイを評価した。アッセイの測定範囲（ＬＬＯＤ〜ＵＬＯＤ）は５．８〜４０１．５ｎｇ／ｍＬに決定され、定量下限（ＬＬＯＱ）は１２．９ｎｇ／ｍＬであった。アッセイ内およびアッセイ間変動は、それぞれ、８％および１２％であり、アッセイ内変動について＜１０％およびアッセイ間変動について＜１５％の我々の許容基準以内であった。推奨ヒト血清希釈は１：２であり、線形性は＋／−１２０％以内であった。３つの血清における平均分析物回収は、４つの凍結／融解サイクル後に１０６％であり、４℃で２〜４８時間の貯蔵後に回収は８３〜９９％であるか、または２０℃で２〜４８時間では回収は８４〜９７％であった。許容基準は、１００％±２０％以内の回収であった。これらのデータは、血清中の分析物が４および２０℃で高度に安定であることを示す。低または高含有量の脂質またはヘモグロビンのいずれからも干渉は検出されず、回収は８５〜１１２％の範囲内であった。許容基準は、１００％±２０％以内の回収であった。ビオチンについて、高レベルのビオチンはＬＯＸＬ２のレベルを低減したが、低レベル（３０ｎｇ／ｍＬ）ではアッセイに影響を及ぼさなかった。よって、カットオフレベルは、ビオチン３０ｎｇ／ｍＬ未満であるべきである。
表２．ＬＯＸＬ２  ＥＬＩＳＡの技術的詳細の要約
【表２】
2020514369.tif 000004
【００３５】
ＬＯＸＬ２は癌およびＩＰＦを有する患者において上昇する
コホート１における血清ＬＯＸＬ２は、健康対照と比較して、乳癌、結腸癌、ＮＳＣＬＣ、ＳＣＬＳ、卵巣癌、および膵臓癌を有する患者において、それぞれ、２１８、２２７、３７５、２１３、２２５、および３２５％上昇した（ｐ＝０．０５−０．０００１）。さらに、血清ＬＯＸＬ２は、ＩＰＦを有する患者において高度に上昇し、健康対照と比較してＩＰＦ患者において１６３％増加を示した（ｐ＜０．０００１）ことが見出された。ＡＵＣによって評価されるＬＯＸＬ２の診断値は、ＮＳＣＬＳの診断について０．８９（ｐ＜０．０００１）、ならびに前立腺癌（ＰＣａ）および乳癌（ＢＣａ）の診断について、それぞれ、０．７２（ｐ＝０．０２）および０．８１（ｐ＜０．０００１）であった。健康対照に対するＩＰＦの診断についてのＬＯＸＬ２の診断値は、０．７２（ｐ＜０．０００１）のＡＵＣであった（表３）。
表３．ＬＯＸＬ２によるＩＰＦまたは癌の診断のためのＡＵＲＯＣ、ｎ＞１０を有する患者群。
【表３】
2020514369.tif 000005
【００３６】
考察
本発明は、ヒトＬＯＸＬ２のＮ末端ネオエピトープの検出のための新規アッセイを提供する。アッセイは、低い検出限界、許容可能なアッセイ内およびアッセイ間変動および線形性、干渉、ならびに２０−および４℃での分析物安定性で、技術的にロバストであった。この新たに開発されたＬＯＸＬ２アッセイを用いて、ＩＰＦおよび肺癌などの線維症関連疾患においてＬＯＸＬ２レベルがより高かったことも示された。さらに、ＮＣＳＬＣおよびＩＰＦについてのＬＯＸ２の診断値は高く、ＡＵＲＯＣは０．７２〜０．８９の範囲であった。最後に、この新たに開発されたアッセイは、健康な個体においてＬＯＸＬ２を検出することができた。
【００３７】
結論として、本発明は、Ｎ末端部位のＬＯＸＬ２におけるネオエピトープ部位についての技術的にロバストなアッセイを提供し、癌および線維症関連疾患を有する患者においてＬＯＸＬ２のレベルが上昇したことを示した。よって、我々は、この新たに開発されたＬＯＸＬ２アッセイの実現可能性および潜在的な生物学的価値を実証した。
【００３８】
このアッセイは、新規抗ＬＯＸＬ２治療薬の評価における有用なツールであり得ると考察される。
【００３９】
本明細書において、特に明示的に指示されない限り、「または（論理和）」という語は、条件のうちの１つのみが満たされることを必要とする演算子「排他的論理和」とは対照的に、記述される条件の一方または両方が満たされる場合に真の値に戻るという演算子の意味で使用される。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」を意味するものではなく、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で使用される。上記で認識される全ての先行する教示は、本明細書に参照により組み込まれる。本明細書におけるいずれの先行公表文献の認識も、その教示が、これに関する日付でオーストラリアまたは他の場所において共有一般知識であったことを認めるか、または表すものであると解釈されるべきではない。
【００４０】
参考文献
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【図１】
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【図２】
2020514369.tif 000007
【図３Ａ】
2020514369.tif 000008
【図３Ｂ】
2020514369.tif 000009
【配列表】
2020514369000001.app
【国際調査報告】
2020514369.tif 000010
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2020514369.tif 000012