(57)【要約】  本発明は、免疫療法の副作用を治療するための方法に関し、該方法は、免疫療法を受けたまたは受けている対象に間葉系幹細胞（MSC）を投与することを含む。また、本発明は、MSCを含む治療用組成物及びMSCまたは治療用組成物を含む容器にも関する。【選択図】図9
2020523400.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫療法の副作用を治療するための方法であって、前記方法は、免疫療法を受けたまたは受けている対象に間葉系幹細胞（MSC）を投与することを含む、方法。
【請求項２】
免疫療法を受けたまたは受けている対象における免疫療法の副作用を治療するための医薬の製造における、間葉系幹細胞（MSC）の使用。
【請求項３】
請求項1に記載の方法または請求項2に記載の使用であって、前記MSCは、CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表現型を有する、方法または使用。
【請求項４】
請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法または使用であって、前記MSCは、miR-145-5p、miR-181b-5p及びmiR-214-3pを発現するが、miR-127-3p及びmiR-299-5pを発現しない、方法または使用。
【請求項５】
請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法または使用であって、治療は、前記対象にkg体重あたり約1×106〜約1×107のMSCを投与することを含む、方法または使用。
【請求項６】
請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法または使用であって、治療は、前記免疫療法の前、その間またはその後に前記MSCを投与することを含む、方法または使用。
【請求項７】
請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法または使用であって、治療は、免疫療法の後に前記MSCを投与することを含む、方法または使用。
【請求項８】
請求項7に記載の方法または使用であって、治療は、免疫療法の副作用の観察後24時間以内に前記MSC投与することを含む、方法または使用。
【請求項９】
請求項7に記載の方法または使用であって、治療は、免疫療法の後24時間〜72時間以内に前記MSC投与することを含む、方法または使用。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法または使用であって、前記副作用は、インターロイキン-6（IL-6）、インターフェロン-γ（IFN-γ）、腫瘍壊死因子（TNF）、IL-2、IL-2-受容体α、IL-8、IL-10もしくは顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF)の放出であってもよいサイトカイン放出症候群（CRS）、マクロファージ活性化症候群（MAS)、B細胞形成不全であってもよい本来の標的のがん以外を標的とする作用、腫瘍溶解症候群（TLS)、脳浮腫であってもよい神経毒性、またはアナフィラキシーである、方法または使用。
【請求項１１】
請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法または使用であって、前記免疫療法が、リンパ腫、白血病、黒色腫、上皮がんまたは肉腫を治療するためである、方法または使用。
【請求項１２】
請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法または使用であって、前記免疫療法が、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL)、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（NHL)、非ホジキンB、TもしくはNK細胞リンパ腫、縦隔原発B細胞リンパ腫（PMBCL)、形質転換濾胞性リンパ腫（TFL)、マントル細胞リンパ腫（MCL)、多発性骨髄腫（MM)、慢性リンパ球性白血病（CLL)、急性骨髄性白血病（AML)または急性リンパ芽球性白血病（ALL)を治療するためである、方法または使用。
【請求項１３】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法または使用であって、前記免疫療法が、チェックポイント阻害剤、二重特異性T細胞誘導抗体、インターフェロン遺伝子刺激因子のアゴニスト、RIG-I様受容体アゴニスト、Toll様受容体アゴニスト、サイトカイン、抗体-サイトカイン融合タンパク質または抗体-薬物複合体である、方法または使用。
【請求項１４】
請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法または使用であって、前記対象が哺乳類であり、ヒトであってもよい、方法または使用。
【請求項１５】
哺乳類の対象における免疫療法の副作用を治療、改善または軽減するための治療用組成物であって、前記治療用組成物は、間葉系幹細胞（MSC）を含み、前記MSCを作製する方法は、
（a）LiCl及びFGF2を含むがPDGFを除く間葉系コロニー形成用培地（M-CFM）において、間葉系コロニーが形成されるのに十分な時間、正常酸素条件下において原始中胚葉細胞を培養することと、
（b）前記（a）の前記間葉系コロニーを接着培養して前記MSCを作製することを含む方法であって、
前記（b）の前記MSCは、miR-145-5p、miR-181b-5p及びmiR-214-3pを発現するが、miR-127-3p及びmiR-299-5pを発現せず、及び／またはCD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表現型を有するものである、
治療用組成物。
【請求項１６】
miR-145-5p、miR-181b-5p及びmiR-214-3pを発現するが、miR-127-3p及びmiR-299-5pを発現せず、及び／またはCD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表現型を有するMSCを含む、容器。
【請求項１７】
請求項15に記載の前記治療用組成物を含む、容器。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本発明は、免疫療法の副作用を治療することに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
免疫療法は、対象本来の免疫系を向上させて疾患と闘えるようにすることを企図した生物学的療法である。多くの場合、「免疫療法」は、がん免疫療法を指している。
【０００３】
確立されたがん免疫療法にはサイトカイン療法等があるが、がん免疫療法の新興領域として、チェックポイント阻害剤、自然免疫刺激剤及び抗体複合体がある。
【０００４】
免疫療法は前臨床試験及び臨床試験において目覚しい成果が実証されており、本分野は急速な拡大を見せている。
【０００５】
しかし、免疫療法は、有望ではあるが必ず副作用と高いリスクが伴う。観察された副作用には、マクロファージ活性化症候群（MAS）に関係し得るサイトカイン放出症候群（CRS）、移植片対宿主病（GVHD）やB細胞形成不全に似た結果をもたらす本来の標的のがん以外を標的とする作用（on-target, off-cancer effects）、腫瘍溶解症候群（TLS）、脳浮腫等の神経毒性及び非ヒト抗原に対する対象のIgG応答が引き起こすアナフィラキシー等がある。
【０００６】
CRSは、ステロイド等の標準的な支持療法で治療されている。しかし、ステロイドは対象におけるT細胞の活性または増殖に影響し得る。CRSの他の療法には、CRSにおいて上昇した炎症性サイトカインに対する阻害剤の投与がある。そして、抗インターロイキン-6（IL-6）受容体抗体のトシリズマブや、腫瘍壊死因子（TNF）阻害剤のエタネルセプトがCRSの治療に使用されている。
【０００７】
B細胞形成不全は抗体産生の減少をもたらすが、その治療には、感染症予防として静注用免疫グロブリンが使用されている。
【０００８】
TLSは、水分補給、利尿、アロプリノールの投与及び遺伝子組換え尿酸オキシダーゼ、また必要に応じて血液透析、といった標準的な支持療法により対処されている。
【０００９】
上記の副作用に対する対処法の成果は様々であるが、いずれも通常生ずる有害事象に対して完全な成功を収めるまでに至っておらず、多くの臨床試験で対象の死亡さえ発生している。
【００１０】
明らかに、免疫療法の副作用のための改善された予防法及び／または治療法が要求されている。
【００１１】
なお、本明細書中において何らかの先行技術文献が参照されていても、そのような参照は、該文献がオーストラリアまたはその他の国において技術常識の一部を形成することの承認とみなされないことが理解されねばならない。
【発明の概要】
【００１２】
概要
第1の側面は、免疫療法の副作用を治療するための方法を提供し、該方法は、免疫療法を受けたまたは受けている対象に間葉系幹細胞（MSC）を投与することを含む。
【００１３】
第1の側面の代替的または追加的な実施態様は、免疫療法を受けたまたは受けている対象における免疫療法の副作用を治療するための医薬の製造における、間葉系幹細胞（MSC）の使用を提供する。
【００１４】
第1の側面の更なる代替的または追加的な実施態様は、免疫療法を受けたまたは受けている対象における免疫療法の副作用の治療における使用のための、間葉系幹細胞（MSC）を提供する。
【００１５】
ある実施態様において、MSCは、CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表現型を有する。
【００１６】
ある実施態様において、MSCは、miR-145-5p、miR-181b-5p及びmiR-214-3pを発現するが、miR-127-3p及びmiR-299-5pを発現しない。
【００１７】
ある実施態様において、治療は、対象にkg体重あたり約1×106〜約1×107のMSCを投与することを含む。
【００１８】
ある実施態様において、治療は、免疫療法の副作用の観察後24時間以内にMSCを投与することを含む。
【００１９】
ある実施態様において、治療は、免疫療法の前、その間またはその後にMSCを投与することを含む。ある実施態様において、治療は、免疫療法の後にMSCを投与することを含む。ある実施態様において、治療は、免疫療法の後24時間〜72時間以内にMSCを投与することを含む。
【００２０】
ある実施態様において、副作用または症状は、IL-6、インターフェロン-γ（IFN-γ）、TNF、IL-2、IL-2-受容体α、IL-8、IL-10もしくは顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF)の放出であってもよいサイトカイン放出症候群（CRS）、マクロファージ活性化症候群（MAS)、B細胞形成不全であってもよい本来の標的のがん以外を標的とする作用、腫瘍溶解症候群（TLS)、脳浮腫であってもよい神経毒性、またはアナフィラキシーである。
【００２１】
ある実施態様において、免疫療法は、リンパ腫、白血病、黒色腫、上皮がんまたは肉腫を治療するためである。
【００２２】
ある実施態様において、免疫療法は、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫（NHL）、非ホジキンB、TもしくはNK細胞リンパ腫、縦隔原発B細胞リンパ腫（PMBCL）、形質転換濾胞性リンパ腫（TFL）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、多発性骨髄腫（MM）、慢性リンパ球性白血病（CLL）、急性骨髄性白血病（AML）または急性リンパ芽球性白血病（ALL）を治療するためである。
【００２３】
ある実施態様において、免疫療法は、チェックポイント阻害剤、二重特異性T細胞誘導抗体、インターフェロン遺伝子刺激因子のアゴニスト、RIG-I様受容体アゴニスト、Toll様受容体アゴニスト、サイトカイン、抗体-サイトカイン融合タンパク質または抗体-薬物複合体である。
【００２４】
ある実施態様において、対象は哺乳類であり、ヒトであってもよい。
【００２５】
第2の側面は、哺乳類の対象における免疫療法の副作用を治療、改善または軽減するための治療用組成物を提供し、該治療用組成物は、間葉系幹細胞（MSC）を含み、該MSCを作製する方法は、
（a）LiCl及びFGF2を含むがPDGFを除く間葉系コロニー形成用培地（M-CFM）において、間葉系コロニーが形成されるのに十分な時間、正常酸素条件下において原始中胚葉細胞を培養することと、
（b）（a）の間葉系コロニーを接着培養してMSCを作製することを含む方法であって、
（b）のMSCは、miR-145-5p、miR-181b-5p及びmiR-214-3pを発現するが、miR-127-3p及びmiR-299-5pを発現せず、及び／またはCD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表現型を有する。
【００２６】
第3の側面は、miR-145-5p、miR-181b-5p及びmiR-214-3pを発現するが、miR-127-3p及びmiR-299-5pを発現せず、及び／またはCD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表現型を有するMSCを含む、容器を提供する。
【００２７】
第4の側面は、第2の側面の治療用組成物を含む、容器を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
図面の簡単な説明
【図１】図1は、実施例14の実験設計を模式的に表した図である。
【図２】図2は、実施例14の対照マウスと実験マウスの直腸温を示すグラフである。
【図３】図3は、実施例14の対照マウスと実験マウスの臨床スコアを示すグラフである。0は正常活動、1は正常活動・立毛・つま先歩行、2は背中を丸め活動減少だが未だ活動的、3は低活動性だが促すと活動、4は活動停止により安楽死させた、を示す。
【図４】図4は、実施例14のマウスの末梢血におけるマウスCD45+細胞の割合、ヒトCD45+細胞の割合、ヒトCD45+細胞の割合としてのCD4+細胞、及びヒトCD45+細胞の割合としてのCD8+細胞を示すグラフ一式である。
【図５】図5は、実施例14のマウスの末梢血におけるヒトCD4+T細胞上のCD69発現を示すグラフ一式である。
【図６】図6は、実施例14のマウスの末梢血におけるヒトCD8+T細胞上のCD69発現を示すグラフ一式である。
【図７】図7は、実施例14のマウスの脾臓におけるマウスCD45+細胞の割合、ヒトCD45+細胞の割合、ヒトCD45+細胞の割合としてのCD4+細胞、及びヒトCD45+細胞の割合としてのCD8+細胞を示すグラフ一式である。
【図８】図8は、実施例14のマウスの脾臓におけるヒトCD4+T細胞上のCD69発現を示すグラフ一式である。
【図９】図9は、実施例14のマウスの脾臓におけるヒトCD8+T細胞上のCD69発現を示すグラフ一式である。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
詳細な説明
本明細書中に特に定義されない限り、本明細書において使用する技術用語及び科学用語の意味は、本発明が属する分野の当業者に通常理解されるもの及び公表された文献を参照することにより通常理解されるものと同じである。
【００３０】
用語「a／an（不定冠詞）」は、1以上を指し、例えば、「a MSC」は、MSCの集団を含む1以上のMSCを表すと理解されることが留意されねばならない。そのようなものとして、用語「a／an（不定冠詞）」、「1以上の」及び「少なくとも1つの」は、本明細書中において互いに交換可能に使用され得る。
【００３１】
発明の詳細な説明において、及びそれに続く特許請求の範囲において、明示的文言または必要的暗示により文脈が他の意味を要求する場合を除き、用語「含む（「comprise」または「comprises」や「comprising」等の派生形）」の使用は、全体の中にそれも含まれているとの意味、即ち、記載した特徴の存在を特定するためであって、本発明の様々な実施態様における更なる特徴の存在または追加を排除するためではない。
【００３２】
本明細書において、用語「約（about）」は、明示した数について、その数の大きさの±25%の数値範囲を意図している。他の実施態様では、用語「約」は、明示した数について、その数の大きさの±20%、±15%、±10%、±5%、±4%、±3%、±2%または±1%の数値範囲を意図している。例えば、ある実施態様において、「約3グラム」は2.7グラム〜3.3グラムの数値（即ち、3グラム±10%）を示す、等である。
【００３３】
同様に、事象の時期や期間にも25%の幅が少なくともあり得る。例えば、ある特定の事象が、ある実施態様において、1日持続する（lasting one day）と開示されている場合、該事象は、1日を超える持続であったり、あるいは1日に満たない持続であり得る。例えば、「1日」は、約18時間〜約30時間の期間を含み得る。他の実施態様において、期間は、その期間の±20%、±15%、±10%、±5%、±4%、±3%、±2%または±1%の幅があり得る。
【００３４】
本明細書において、「免疫療法（immunotherapy）」は、対象をチェックポイント阻害剤、二重特異性T細胞誘導抗体、インターフェロン遺伝子刺激因子、RIG-I様受容体、Toll様受容体、抗体-サイトカイン融合タンパク質、サイトカイン、または抗体-薬物複合体で治療することを含むが、これに限定されない。
【００３５】
免疫療法は、単独で使用する必要はなく、併用してもよい。例えば、ニボルマブとペンブロリズマブ、またはニボルマブとイピリムマブといった2つのチェックポイント阻害剤を併用してもよく、また、チェックポイント阻害剤を放射線療法または化学療法といった既存のがん治療と併用してもよい。
【００３６】
本明細書において、「抗体（antibody）」は、広義に用いられており、抗原結合分子を指す。それゆえ、用語「抗体」は、IgA、IgD、IgE、IgG、IgM、IgYまたはIgW等の免疫グロブリン、Fab、(Fab')2、scFv、scFv-Fc等の断片、ミニボディ、ダイアボディー、シングルドメイン抗体（sdAbまたはナノボディ）、二重特異性抗体、多重特異性抗体、及びアフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマーDARPin、フィノマー、クニッツドメインペプチド及びモノボディ等の抗体ミメティック等を含む。sdAbsは、キャメリド（camelid）抗体及び軟骨魚類の魚由来のIgNARsを含む。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル（mAb）であり得る。抗体は、キメラ、ヒト化またはヒトのものであり得る。
【００３７】
抗体産生は当該分野で周知であり、例えば、ハイブリドーマ、ファージディスプレイ、単一B細胞培養及び単一B細胞増幅技術を含む。キメラ抗体及びヒト化抗体は、組換え技術を用いて作製されてもよい。ヒト抗体は、ファージディスプレイ技術または、市販の専用プラットフォームがあるトランスジェニックマウス等のトランスジェニック動物を使用して作製してもよい。適切な特異性を有する抗体が特定され、その配列が決定されれば、その抗体は、例えば、CHO細胞培養等の当該分野で知られているような細胞培養等によって組換え的に作製することが可能である。
【００３８】
本明細書において、「副作用（side effect）」は「症状（symptom）」を含み、両者とも、質的（即ち、どのような形態であれ望ましくないこと）、または量的（特定のしきい値の望ましくない上または下であること）に決定された、免疫療法の望ましくないまたは有害な影響を指す用語である。また、そのような症状は、免疫療法の必要なまたは所望の効果と区別するために「有害な症状」と呼ぶこともある。また、免疫療法の副作用または症状を「有害事象」、「免疫介在有害事象」、あるいは「免疫関連有害事象」と呼ぶこともある。
【００３９】
チェックポイント阻害剤
チェックポイントは、T細胞免疫応答を負に制御するタンパク質である。これまでに、細胞傷害性Tリンパ球抗原4（CTLA-4、別名CD152）とプログラム細胞死1（PD-1、別名CD279)という2つのチェックポイントが特定されている。PD-1は、プログラム細胞死リガンド1（PD-L1）とプログラム細胞死リガンド2（PD-L2)により活性化される。これらチェックポイントまたはそのリガンドを阻害すると、T細胞の負の制御を無効化し、免疫応答をT細胞活性化に向けさせる。
【００４０】
イピリムマブは、ヒト抗CTLA-4モノクローナル抗体（mAb）である。イピリムマブは、例えば、2週間または3週間毎に3mg/kg、あるいは2週間毎に10mg/kgで投与され得る。イピリムマブは、例えば、黒色腫、非小細胞肺がん（NSCLC）、小細胞肺がん（SCLC）、膀胱がん及び前立腺がんの治療に使用され得るが、イピリムマブをより多くのがんの治療について評価する臨床試験が進行中である。イピリムマブは、例えば、ニボルマブ、バビツキシマブ、ダカルバジン、IL-2またはgp100等の他の薬剤と併用してもよい。
【００４１】
イピリムマブの副作用または症状には、掻痒、発疹、白斑、下痢、大腸炎、ALT上昇、AST上昇、肝炎、甲状腺機能低下、下垂体機能低下、下垂体炎、副腎機能障害、甲状腺ホルモン上昇、副腎皮質刺激ホルモン低下、急性炎症性脱髄性多発性神経炎、上行性運動麻痺及び重症筋無力症等がある。
【００４２】
ニボルマブは、ヒトIgG4抗PD-1モノクローナル抗体（mAb）である。ニボルマブは、例えば、2週間毎に3mg/kgで投与され得る。ニボルマブは、例えば、黒色腫、転移性黒色腫、転移性扁平上皮NSCLC、腎細胞がん及び膀胱がんの治療に使用され得るが、ニボルマブをより多くのがんの治療について評価する臨床試験が進行中である。ニボルマブは、例えば、イピリムマブまたはペンブロリズマブ等の他の薬剤と併用してもよい。
【００４３】
ニボルマブの副作用または症状には、掻痒、発疹、白斑、下痢、大腸炎、ALT上昇、AST上昇、ビリルビン上昇、肺炎、血清クレアチニン上昇、腎不全、甲状腺機能低下、甲状腺機能亢進、TSH上昇、糖尿病、下垂体炎、副腎機能障害及び疲労等がある。
【００４４】
ペンブロリズマブは、ヒト化抗PD-1モノクローナル抗体（mAb）である。ペンブロリズマブは、例えば、2週間または3週間毎に2mg/kgまたは10mg/kg等で投与され得る。ペンブロリズマブは、黒色腫、転移性黒色腫、転移性NSCLC、頭頸部扁平上皮がん（HNSCC）及びホジキンリンパ腫等の治療に使用され得る。ペンブロリズマブを例えば、乳がん、胃がん及び尿路上皮がん等のより多くのがんの治療について評価する臨床試験が進行中である。ペンブロリズマブは、例えば、ニボルマブ、タリモジーン・ラハーパレプベックや、ダブラフェニブとトラメチニブの併用、またはイピリムマブ等の他の薬剤と併用してもよい。
【００４５】
ペンブロリズマブの副作用または症状には、掻痒、発疹、斑点状丘疹、ざ様皮膚炎、下痢、大腸炎、肝炎、ALT上昇、AST上昇、呼吸困難、肺炎、甲状腺機能低下、甲状腺機能亢進、アミラーゼ上昇、膵炎、関節痛、ブドウ膜炎、発熱及び疲労等がある。
【００４６】
開発中の他の抗PD-1抗体にはBGB-A317があるが、抗PD-L1抗体には、アテゾリズマブ、アベルマブ及びドゥルバルマブがある。また、抗PD-L1アフィマーも開発中である。
【００４７】
二重特異性T細胞誘導抗体（BiTE）
二重特異性T細胞誘導抗体（BiTE）は、二重特異性抗体の一種であり、1個のタンパク質中に、T細胞表面抗原（例えば、CD3ε）を標的とするscFvと、がん細胞上の表面抗原を標的とするscFvとを結合させている。BiTEsは、当該分野で既知の組換え技術を用いて製造される。
【００４８】
BiTEクラスの最初はブリナツモマブである。これはCD3ε及びCD19に向けられた二重特異性抗体であり、一般に、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）及び慢性リンパ球性白血病（CLL）等のB細胞悪性腫瘍、縦隔原発B細胞リンパ腫（PMBCL）、形質転換濾胞性リンパ腫（TFL）、多発性骨髄腫（MM）、マントル細胞リンパ腫（MCL）及び急性骨髄性白血病（AML)の治療に使用され得る。ブリナツモマブは、5μg/m2/日〜60μg/m2/日、例えば、5、15または60μg/m2/日で投与され得る。
【００４９】
ブリナツモマブの最も一般的な副作用は、CRS、発熱、疲労、頭痛及び体重変化である。CRSは、大抵のBiTEで予期され得る。
【００５０】
BiTEはプラットフォーム技術であるため、他のがん標的も可能であり、その例として、CD20、CD33、上皮細胞接着分子（EpCAM）、がん胎児性抗原（CEA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、ヒト上皮成長因子受容体2（HER2）、上皮成長因子受容体（EGFR）、エフリンA型受容体2（EphA2）、ムチン1（MUC1）及び黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（MCSP）等が挙げられる。
【００５１】
インターフェロン遺伝子刺激因子（STING）
インターフェロン遺伝子刺激因子（STING、「TMEM173」としても知られる）はシグナル伝達分子であり、DNAの細胞質ゾルへの侵入に応答して生産される環状GMP-AMPや環状di-AMP等の環状ジヌクレオチドを拘束し、またこれらによって活性化される。STINGは、二本鎖DNAも拘束する。活性化されると、STINGは、I型インターフェロン（IFN）及びTNF、IL-1β及びIL-6等の炎症性サイトカインの、IRF3を介した及びNF-κBを介した転写を誘導し、それがさらに細胞死を引き起こし、樹状細胞、NK及びCD8+T細胞の機能を促進する。数ある細胞のうち、STINGは、腫瘍内樹状細胞中に存在する。
【００５２】
環状ジヌクレオチドは、当該分野で知られるように生合成的／酵素的に作製され得るが、天然の環状ジヌクレオチドが使われることの方が多い。あるいは、環状ジヌクレオチドはヌクレオチド環化によって化学的に作製してもよく、また、当該分野で知られるような環状ビス(3'-5')-糖リン酸上への立体特異的塩基の挿入により作成してもよい。液相及び固相の両方の合成法が開発されており、当該分野で知られている。
【００５３】
がんに対する免疫療法として、例えば、合成ジチオ混合結合（mixed-linkage）環状ジヌクレオチド等の環状ジヌクレオチドが開発中である。開発中の薬剤としては、ML RR-S2 CDAとMIW815、及びSB11285がある。環状ジヌクレオチドは、放射線療法、化学療法、チェックポイント阻害剤または致死的放射線照射を受けたGM-CSFを分泌する腫瘍細胞の細胞（STINGVAX)等の他の療法と併用してもよい。
【００５４】
STINGアゴニストは、黒色腫及び結腸がん等の治療に使用し得る。
【００５５】
RIG-I様受容体（RLR)
RIG-I様受容体には、レチノイン酸誘導性遺伝子I（RIG-I、別名DDX58）、メラノーマ分化関連タンパク質5（MDA5、別名IFIH1）及びLaboratory of Genetics and Physiology 2（LGP2、別名DHX58）等があるが、これらは細胞質RNAセンサーである。
【００５６】
RIG-Iは、典型的に、5'三リン酸化RNA（5'-ppp-RNAないし3pRNA）と短い二重鎖RNAを認識し、機能性LGP2に依存的である。MDA5は、典型的には2,000ヌクレオチドより長い二重鎖RNAを認識し、MDA5も機能性LGP2に依存的である。LGP2自体はシグナル伝達を誘発できないが、RIG-Iを介した応答及びMDA5を介した応答には要求される。
【００５７】
活性化されると、RIG-IとMDA5は、IFNや炎症性サイトカインのIRF1-、IRF3-、IRF7-及びNFκBを介した発現を誘発するが、これは、T細胞やNK細胞を活性化すると共に腫瘍細胞に対しても直接に作用し得る。
【００５８】
RLRリガンドは、免疫療法に使用可能で、5'-ppp-siRNAを含んでおり、センダイウイルスエンベロープ（HVJ-E）ベクターやポリイノシン・ポリシチジル酸（ポリI:C)と同様に、RNA干渉（RNAi）経路を介した配列依存的作用だけでなくRLR経路を介して配列独立的にも作用する。
【００５９】
RLR活性化は、黒色腫、膵臓がん、前立腺がん、神経膠腫、悪性胸膜中皮腫（MPM）及び卵巣がん等の治療に使用し得る。
【００６０】
Toll様受容体（TLR)
これまでに、10種類のヒトToll様受容体（TLR）が特定されているが、これらはそれぞれ異なるリガンド特異性を有する。即ち、TLR2はリポタンパク質とペプチドグリカンを認識し、TLR3はウイルス性二重鎖RNAとポリI:Cを認識し、TLR4はリポ多糖類（LPS)を認識し、TLR5は細菌性フラジェリンを認識し、TLR7/8は、一本鎖RNAを認識し、TLR9はCpG含有オリゴデオキシヌクレオチド（CpG-ODN)を認識し、そしてTLR2/6、TLR2及びTLR4は、マトリックスプロテオグリカンのバーシカン（versican）とヒートショックプロテイン（HSP)を認識する。
【００６１】
これらのリガンドの多くががん免疫療法用の承認を受けており、それらには、膀胱がん治療用のTLR2/4アゴニストのカルメット・ゲラン菌（BCG）、子宮頸がん治療用のTLR4アゴニストのモノホスホリルリピドA（MPL）及び乳がん治療用のTLR7アゴニストのイミキモドがある。コーリー毒素とカラマツ抽出物（ELL）も免疫療法用に承認されている。
【００６２】
他のTLRリガンドも免疫療法用に開発中であり、例えば、進行性固形腫瘍や肝がんの治療用のTLR5アゴニストのフラジェリン由来CBLB502（エントリモド）、黒色腫や血液悪性腫瘍の治療用のTLR7アゴニストの852A、及び、謬芽細胞腫をはじめとする複数種のがんの治療用のがんワクチンアジュバントとして、ポリリシンとカルボキシメチルセルロース（poly-ICLC）で安定化させたTLR3アゴニストのポリI:C（ポリイノシン・ポリシチジル酸）及びTLR9アゴニストの合成CpG-ODNがある。
【００６３】
このように、TLRリガンドは、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、謬芽細胞腫、血液悪性腫瘍、肝がん、黒色腫及び固形腫瘍等の治療に使用し得る。
【００６４】
サイトカイン
細胞障害性T細胞の抗がん効果を改善する免疫療法として、IL-2が臨床で使用されている。また、IL-2は、養子細胞移植（ACT)用の生体外T細胞増殖の促進に使用されている。免疫療法用に使用中または開発中の他のサイトカインとして、IL-7、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、IFNα、IFNβ、IFNγ、顆粒球・マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）及びTNF等がある。サイトカインは、当該分野で知られているように組換え的に作製してもよい。
【００６５】
サイトカインは、黒色腫、腎細胞がん、リンパ腫、B細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、有毛細胞白血病、肉腫、B/C型肝炎、慢性肉芽腫性疾患、悪性骨粗しょう症、乳がん、前立腺がん、肉腫、ユーイング肉腫、カポジ肉腫、神経芽細胞腫、菌状息肉腫、頭頸部がん、AML、肺がん、卵巣がん、慢性骨髄性白血病（CML）、CLL及び好中球減少等の治療に使用し得る。
【００６６】
ただし、サイトカインは選択的輸送手段をもたず、かつ、初期血中半減期が非常に短いため（数分〜数時間)、腫瘍部位で治療用濃度に達しないことがしばしば起こる。また、サイトカインには、全身性炎症や血液漏出症候群をはじめとする重篤な副作用がある。他の副作用は、発熱、悪寒、倦怠感、低血圧、臓器機能不全及び血球減少等である。
【００６７】
抗体-サイトカイン融合タンパク質
免疫療法における遊離サイトカインの限界に鑑みて、サイトカインを所望の抗原特異性の抗体に組換え的に融合させることによる改良が行われてきた。そのような抗体は、サイトカインを腫瘍の作用部位に輸送するだけでなく、抗体依存性細胞毒性（ADCC）や補体依存性細胞毒性（CDC)を介して、それ自体の免疫治療効果を発揮し得る。
【００６８】
抗体-サイトカイン融合タンパク質としては、神経芽細胞腫治療用の、ヒト化抗GD2IgGがIL-2に融合されたhu14.18-IL-2、B細胞悪性腫瘍治療用の、脱免疫化変異抗CD20IgGがIL-2に融合されたDI-Leu16-IL2、リンパ腫、転移性黒色腫、腎細胞がん及び固形腫瘍治療用の、高親和性抗フィブロネクチンのエキストラドメインBのダイアボディーがIL-2に融合されたL19-IL2、DLBCL及びMCL治療用の、抗CD20IgGがIL-21に融合された抗CD20-IL-21、悪性黒色腫及びRCC治療用の、抗ヒトフィブロネクチンのアイソフォームB-FN（エキストラドメインB）IgGであるBC1-IL12、黒色腫、固形腫瘍、大腸がん治療用の、抗フィブロネクチンのエキストラドメインBヒトscFvがTNFに融合されたL19-TNFα、B細胞リンパ腫及び白血病治療用の、キメラ抗CD20IgGがIFNαに融合された抗CD20-IFNα、B細胞リンパ腫治療用の、ヒト化抗CD20IgGベルツズマブがIFNα2bの4分子に融合された抗CD20四量体hIFNα（20-2b-2b）、乳がん、肺がん、メルケル細胞がん（MCC）、謬芽細胞腫、AML及び固形腫瘍治療用の、抗テネイシンCエキストラドメインA1ヒトscFvがIL-2に融合されたF16-IL2、固形腫瘍、NHL及びNSCLC治療用の、壊死腫瘍細胞によって放出されるDNAに向けられたマウス-ヒトキメラ抗体がIL-2の2分子に融合されたNHS-IL2LT、腎細胞がん、カポジ肉腫、T細胞リンパ腫及びNHL治療用の、壊死腫瘍細胞によって放出されるDNAに向けられたマウス-ヒトキメラ抗体がIL-12の2分子に融合されたNHS-IL12、造血系がん、B細胞リンパ腫及び白血病、及びMM治療用の、ヒト化抗HLA-DR IgGがIFNα2bの4分子に融合されたC2-2b-2b、及び卵巣がん、前立腺がん、大腸がん及びNSCLC治療用の、抗上皮細胞接着分子（EpCAM、別名KS）IgGがIL-2に融合されたhuKS-IL2、等がある。
【００６９】
hu14.18-IL-2の副作用はIL-2免疫療法のものに似ており、毛細血管漏出、低酸素症、アミノ基転移酵素の上昇、高ビリルビン血症、低血圧及び腎不全等が含まれていた。
【００７０】
抗体-薬物複合体（ADC)
抗がん薬物は、その薬物ががん細胞を特異的に標的するために、抗体に結合されていてもよい。このアプローチが抗がん薬物の輸送に特に有用であるのは、抗がん薬物が標準的化学療法用薬物よりもかなり低い濃度で細胞毒性を発揮し、そのために遊離体で投与するには毒性が高すぎる場合である。代表的なものとして、メイタンシノイド類やオーリスタチン類等の微小管阻害剤がある。代替的に、この薬物は、放射性核種であってもよい。
【００７１】
ADCの抗体は、IgG類、特にIgG1が一般的であるが、必ずしもこれらである必要はない。
【００７２】
薬物（放射性核種を含む）の製造は、当該分野で知られている。
【００７３】
抗体と薬物は、リンカーを用いて結合されていてもよく、結合は切断可能または切断不可能であってもよい。リンカーは、ADCが一旦がん細胞によって取り込まれると切断可能となるが、取込み前の循環においては安定である。ただし、一旦切断されると、薬物が標的細胞から出て非がんバイスタンダー細胞を攻撃しうる。切断不可能なリンカーは、細胞内にADCを保持することを想定している。
【００７４】
結合の方法は当該分野で知られている。切断可能なリンカーの化学特性に、ジスルフィド、ヒドラゾンまたはペプチドを採用してもよく、また、切断不可能なリンカーの化学特性に、チオエーテルを採用してもよい。抗体は、リンカーの化学特性を操作するように改変してよく、例えば、システインアミノ酸残基を操作して、リンカーの化学特性に利用可能なスルフヒドリル基の数及び／または位置を変更してもよい。
【００７５】
2種類のADC、即ち、CD30を標的とするブレンツキシマブ・ベドチンと、HER2を標的とするトラスツズマブ・エムタンシンが臨床用に承認されており、また、開発中のADCも多く、イノツズマブ・オゾガマイシン（CD22）、ゲムツズマブ・オゾガマイシン（抗CD33）、ABT-414（抗EGFR）、グレンバツムマブ・ベドチン（抗gpNMB）、ラベツズマブ・ゴビテカン（抗CEACAM5）、サシツズマブ・ゴビテカン（抗TROP2、EGP1）、リファスツズマブ・ベドチン（抗NaPi2b）、インデュサツマブ・ベドチン（抗GCC）、ポラツズマブ・ベドチン（抗CD79b）、ピナツズマブ・ベドチン（抗CD22）、PSMA ADC（抗PSMA）、コルツキシマブ・ラブタンシン（抗CD19）、BMS-986148（抗MSLN）、インダツキシマブ・ラブタンシン（抗CD138、シンデカン-1）、ミラツズマブ・ドキソルビシン（抗CD74）、MLN2704（抗PSMA）、SAR408701（抗CEACAM5）、ロバルピツズマブ・テシリン（抗DLL3）、ABBV-399、AGS-16C3F（抗ENPP3）、ASG-22ME（抗ネクチン4）、AGS67E（抗CD37）、AMG172（抗CD27）、AMG595（抗EGFRvIII）、AGS-15E（抗SLTRK6）、BAY1129980（抗C4.4a）、BAY1187982（抗FGFR2）、アネツマブ・ラブタンシン（抗メソテリン）、GSK2857916（抗BCMA）、ティソツマブ・ベドチン（抗TF）、IMGN289（抗EGFR）、IMGN529（抗CD37）、ミルベツキシマブ・ソラブタンシン（抗FOLR1）、LOP628（抗c-KIT）、PCA062（抗p-カドヘリン）、BMS936561（抗CD70）、MEDI-547（抗EphA2）、PF-06263507（抗5T4）、PF-06647020、PF-06647263（抗エフリンA）、PF-06664178（抗TROP2）、RG7450（抗STEAP1）、RG7458（抗MUC16）、RG7598、SAR566658（抗CA6）、SGN-CD19A（抗CD19）、SGN-CD33A（抗CD33）、SGN-CD70A（抗CD70）、SGN-LIV1A（抗LIV1）及びトラスツズマブvc-seco（抗HER2)等がある。
【００７６】
放射性核種を含むADCの例として、Y90-イブリツモマブ・チウキセタンやI131-トシツモマブ等がある。
【００７７】
ADCは、血液がんと固形腫瘍の治療に使用され得る。例えば、乳がん、黒色腫、肺がん、SCLC、膵臓がん、大腸がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、前立腺がん、中皮腫、膀胱がん、RCC、肝臓がん、胃がん、NSCLC、謬芽細胞腫、頭頸部がん、食道がん、ホジキンリンパ腫、NHL、未分化大細胞リンパ腫、ALL、DLBCL、多発性骨髄腫、CLL及びAMLである。
【００７８】
ADCは、例えば、0.05mg/kg〜16mg/kgの用量で投与されてもよい。
【００７９】
ADCの副作用としては、血小板減少、好中球減少、眼毒性、発疹、盲腸炎、吐き気、呼吸困難、肝臓毒性、粘膜炎、貧血、神経障害、毛細血管漏出症候群及び下痢等がある。
【００８０】
適応症
免疫療法は、例えば、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性骨髄性白血病（AML）、未分化大細胞リンパ腫、B細胞リンパ腫または白血病、B細胞悪性腫瘍、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、慢性肉芽腫性疾患、慢性リンパ球性白血病（CLL）、慢性骨髄性白血病（CML）、結腸がん、大腸がん、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）、子宮内膜がん、ユーイング肉腫、濾胞性リンパ腫、胃がん、謬芽細胞腫、神経膠腫、血液がん、造血系がん、有毛細胞白血病、頭頸部がん、頭頸部扁平上皮がん、血液系悪性腫瘍、B/C型肝炎、肝がん、ホジキンリンパ腫、カポジ肉腫、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、悪性黒色腫、悪性骨粗しょう症、悪性胸膜中皮腫（MPM）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、メルケル細胞がん（MCC）、黒色腫、中皮腫、多発性骨髄腫（MM）、菌状息肉腫、神経芽細胞腫、好中球減少、非ホジキンリンパ腫（NHL）、非小細胞肺がん（NSCLC）、転移性黒色腫、転移性NSCLC、転移性扁平上皮NSCLC、食道がん、卵巣がん、膵臓がん、縦隔原発B細胞リンパ腫（PMBCL）、腎細胞がん、肉腫、小細胞肺がん（SCLC）、固形腫瘍、T細胞リンパ腫、形質転換濾胞性リンパ腫（TFL）または尿路上皮がん等の治療に使用されてもよい。
【００８１】
副作用及び症状
サイトカイン放出症候群（CRS）は免疫療法の重篤な副作用である。CRSは、IL-6、IFN-γ、TNF、IL-2、IL-2-受容体α、IL-8、IL-10及びGMCSFといった、サイトカインを大量に放出するT細胞の増殖がもたらすと考えられている。
【００８２】
CRSの症状としては、高熱、倦怠感、疲労、筋肉痛、吐き気、拒食症、頻脈/低血圧、毛細血管漏出、心機能障害、腎臓機能障害、肝不全及び播種性血管内凝固症候群等がある。
【００８３】
したがって、CRSにり患した対象は、発熱や、頻脈等の心臓血管系の症状、低血圧、不整脈、心室駆出率低下や、浮腫、低酸素症、呼吸困難及び肺炎等の肺症状や、通常腎かん流の低下が原因となる急性腎損傷、血清アミノ基転移酵素及びビリルビンの上昇、下痢、大腸炎、吐き気及び腹痛等の肝・消化管症状や、グレード3〜4の貧血、血小板減少、白血球減少、好中球減少及びリンパ球減少等の血球減少等の血液症状、プロトロンビン時間及び活性化部分トロンボプラスチン時間（PTT）の延長、Dダイマー上昇、低フィブリノゲン、播種性血管内凝固症候群、マクロファージ活性化症候群（MAS）、出血、B-細胞形成不全及び低ガンマグロブリン血症等の凝固の異常や、菌血、サルモネラ、尿路感染症、インフルエンザ、RSウイルス及び帯状疱疹ウイルス等のウイルス性感染症等の感染性疾患や、クレアチンキナーゼ上昇、筋肉痛及び虚脱感等の筋骨格症状や、精神錯乱、混乱及び発作等の神経症状のうち少なくとも1つを経験する可能性がある。
【００８４】
MASは、肝脾腫大症、リンパ節症、汎血球減少症、肝機能障害、播種性血管内凝固症候群、低フィブリノゲン血症、高フェリチン血症及び高トリグリセリド血症を経験している可能性のある対象について、CRSと臨床的に重複する。CRSと同様、MASを伴う対象は、IFN-γやGMCSF等のサイトカイン量の上昇を示す。
【００８５】
本来の標的のがん以外を標的とする作用は、GVHDやB細胞形成不全に似た結果を生じ得るが、これは、標的がん抗原が他の正常細胞型上に内因性に発現される場合に起こる。
【００８６】
例えば、抗CD19抗体がCD19を発現する正常B細胞も標的とするため、B細胞形成不全が起こる。B細胞形成不全が起こると、低免疫グロブリン血症を発症させ、感染症に対する抵抗力を低下させる。静注による免疫グロブリン補充療法が感染症の予防に利用される。
【００８７】
他の免疫療法の副作用はTLSであり、細胞死を起こす療法の結果として細胞の中身が放出されるときに起こり、多くの場合リンパ腫や白血病を伴う。TLSは、血中のイオンと代謝物の平衡異常と、吐き気、嘔吐、急性尿酸性腎症、急性腎不全、発作、心不整脈及び死亡等の症状を特徴とする。
【００８８】
神経毒性が免疫療法により生ずる場合があり、その症状は、脳浮腫、精神錯乱、幻覚、不全失語症、無動無言証、頭痛、混乱、覚醒状態の変化、運動失調、失行、顔面神経まひ、震え、測定障害及び発作等である。
【００８９】
アナフィラキシーは、免疫療法の一部を形成するマウス由来のタンパク質等の非宿主タンパク質（例えば、キメラまたはヒト化モノクローナル抗体）を原因として発症する場合がある。
【００９０】
本明細書中に開示されるような免疫療法を受けている対象は、貧血、失語症、不整脈、関節痛、腰痛、血液及び骨髄の疾患、血液系及びリンパ系の疾患、心疾患、悪寒、凝固障害、大腸炎、混乱状態、全身症状、咳、食欲減少、下痢、見当識障害、めまい、呼吸困難、脳症、疲労、発熱、胃腸障害、全身性循環器障害、出血、肝疾患、高血糖、低カリウム血症、甲状腺機能低下、ALT上昇、AST上昇、C反応性タンパク質上昇、感染性発熱性好中球減少、白血球減少、倦怠感、異常な代謝の臨床検査結果、代謝・栄養障害、粘膜炎症、筋骨格障害、筋肉痛、吐き気、神経系疾患、神経学的疾患、好中球減少、浮腫、疼痛、手掌足底発赤知覚不全症候群、感覚異常、肺炎、掻痒、肺疾患、発熱、発疹、腎・泌尿生殖器疾患、呼吸器疾患、皮膚及び皮下組織異常、眠気、言語障害、発汗、胸部・縦隔障害、血小板減少、震え、腫瘍フレア、腫瘍溶解症候群、血管障害及び嘔吐等の副作用または症状を少なくとも1つ経験する可能性がある。
【００９１】
また、以上に列挙した副作用または症状はいずれも、例えば、CRS、MAS、TLS、本来の標的のがん以外を標的とする作用、神経毒性、またはアナフィラキシー等の徴候である可能性がある。
【００９２】
副作用の管理
一般に、免疫療法の副作用は、現れた症状についての標準的な支持療法で管理される。しかしながら、免疫療法の結果として起こり得る無数の副作用及び症状を前提とすれば、複数の支持療法が同時に要求され得る。支持療法の中心は、例えば、デキサメタゾン等のステロイドであるが、最近では抗サイトカイン療法がCRSの治療に利用されており、その例として抗TNF分子のエタネルセプトや抗IL-6受容体抗体のトシリズマブが挙げられる。
【００９３】
グレード3またはグレード4の有害事象の徴候が現れたら免疫療法は永久的に中止すべきである、という勧告がされている。
【００９４】
間葉系幹細胞
したがって、本発明は、間葉系幹細胞（MSC)を投与することによって、免疫療法によって生ずる副作用の数、重篤性及び期間を軽減するための改善された療法を提供する。MSCは、その免疫調節特性を通してその効果を発揮するので、多くの副作用及び症状について、MSCは副作用または症状の免疫原性の原因に直接に作用することができる。
【００９５】
MSCは、サイトカイン、ケモカイン及び成長因子等の生物活性分子を分泌し、かつ、免疫系を調節する能力を有する。MSCは、生着に依存せずに免疫系の再生と免疫系に対する作用を促進することが示されている。換言すれば、MSCは、必ずしもそれ自身が宿主に組み込まれる必要がなく、むしろ、MSCはその作用を発揮すると、その後短期間のうちに排除される。ただし、MSCは生着させてもよい。
【００９６】
本明細書において、「間葉系幹細胞」または「MSC」は、骨髄、脂肪組織（脂肪）、胎盤及び臍帯血等の広範な組織から単離され得る、特定の型の幹細胞を指す。代替的に、MSCは多能性幹細胞（PSC)から作製されてもよい。また、MSCは「間葉系間質細胞」としても知られる。代替的にまたは追加的に、MSCは、国際細胞治療学会の間葉系及び組織幹細胞委員会によって定義されるMSCを指し、それは即ち、（1）MSCは、標準的な培養条件で維持されるときプラスチックに接着性を有すること、（2）MSCは、CD105、CD73及びCD90を発現し、かつ、CD45、CD34、CD14またはCD11b、CD79αまたはCD19及びHLA-DR表面分子を発現しないこと、（3）MSCは、インビトロで骨芽細胞、脂肪細胞及び軟骨芽細胞に分化すること、である。
【００９７】
PSC由来のMSCの作製は、相互参照により全体が本明細書に組み込まれる2017年3月14日付出願の国際出願番号PCT/AU2017/050228に記載されるとともに、本明細書実施例1及び2に記載されている。
【００９８】
MSCは、T細胞、B細胞、樹状細胞、マクロファージ及びNK細胞に対する免疫調節活性を発揮することが示されている。理論に拘束されることは望まないが、根底にあるメカニズムは、例えば、酸化窒素、インドールアミン-2,3、ジオキシゲナーゼ、プロスタグランジンE2、腫瘍壊死因子誘導遺伝子6タンパク質、CCL-2及びPD-L1等の免疫調節メディエーターを含んでいてもよい。これらのメディエーターは、例えば、IFNγ、TNF及びIL-17等の炎症性サイトカインによって刺激されるまでは、低レベルで発現している。
【００９９】
ある実施態様において、MSCは、投与前に予め処理されている。前処理は、成長因子で、あるいは遺伝子編集によって行ってもよく、例えば、成長因子の場合は、MSCを刺激し得るし、また、遺伝子編集の場合は、新たなまたは改善された（例えば、より強力な）治療特性をMSCに付与しうる。
【０１００】
本明細書において、「多能性幹細胞」または「PSC」は、自己を無限に複製し、かつ、あらゆる細胞型へと分化する能力を有する細胞を指す。PSCには、主に、胚性幹細胞（ESC）と人工多能性幹細胞（iPSC)の2種類がある。
【０１０１】
本明細書において、「胚性幹細胞」または「ESC」は、体外受精治療を終えて余剰胚を有する対象から同意を得て提供を受けた5〜7日齢の胚から単離された細胞を指す。ESCの使用は、ヒト胚から細胞を抽出することへの倫理的懸念によって幾分妨げられてきた。
【０１０２】
適したヒトPSCは、H1及びH9ヒト胚性幹細胞等である。
【０１０３】
本明細書において、「人工多能性幹細胞」または「iPSC」は、成熟細胞由来のESC-様細胞を指す。iPSCは、ESCに非常によく似た特徴を有するが、iPSCは胚由来ではないため、ESCに伴う倫理的懸念を回避する。それどころか、iPSCは、典型的には、多能性状態に戻す「再プログラム化」を行った完全に分化した成熟細胞に由来する。
【０１０４】
適したヒトiPSCは、繊維芽細胞由来のiPSC19-9-7T、MIRJT6i-mND1-4及びMIRJT7i-mND2-0、及び骨髄単核細胞由来のiPSC BM119-9等であるが、これに限定されない。他の適したiPSCは、米国ウィスコンシン州マディソンのセルラー・ダイナミクス・インターナショナル社（CDI）から入手できる。
【０１０５】
ある実施態様において、本発明に従い使用されるMSCは、原始中胚葉細胞から形成される。原始中胚葉細胞は、間葉系血管芽細胞（MCA）への分化能を有し得る。原始中胚葉細胞は、EMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+表現型を有しうる。ある実施態様において、本発明に従い使用されるMSCは、MCA分化能を有するEMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+の原始中胚葉細胞から形成される。
【０１０６】
原始中胚葉細胞は、PSC（例えばiPSC）から、PSCをFGF2、BMP4、アクチビンA及びLiClを含む分化培地において原始中胚葉細胞を形成するまで約2日間低酸素条件下で培養することによって、分化させてもよい。
【０１０７】
このように、多能性幹細胞（PSC）を間葉系幹細胞（MSC）に分化する方法もまた開示され、該方法は、
（a）原始中胚葉細胞を形成するまで低酸素条件下で約2日間、FGF2、BMP4、アクチビンA及びLiClを含む分化培地においてPSCを培養すること、
（b）（a）の分化培地をLiCl及びFGF2を含むがPDGFを含まない間葉系コロニー形成用培地（M-CFM）と交換すること、
（c）（b）のM-CFMにおいて、間葉系コロニーが形成されるのに十分な時間、正常酸素条件下において（b）の原始中胚葉細胞を培養すること、及び
（d）（c）の間葉系コロニーを接着培養してMSCを作製すること
を含む方法である。
【０１０８】
いくつかの実施態様において、分化培地における濃度は、BMP4が約10ng/mL〜約250mg/mL、FGF2が約5ng/mL〜約50ng/mL、アクチビンAが約1ng/mL〜約15ng/mL、そしてLiClが約1mM〜約2mMである。ある実施態様において、分化培地は、約50ng/mLのBMP4と、約50ng/mLのFGF2と、約1.5ng/mLのアクチビンAと、約2mMのLiClを含む。
【０１０９】
本明細書において、「間葉系血管芽細胞」及び「MCA」は、一般的なまたは両能性間葉系細胞及び内皮細胞前駆体を指す。
【０１１０】
本明細書において、「MCA分化能を有するEMHlin-KDR+APLNR+PDGFRalpha+原始中胚葉細胞」は、典型的な原始線条及び側板/胚外中胚葉遺伝子を発現する細胞を指す。これらの細胞は、繊維芽細胞成長因子2（FGF2)に応答して無血清培地においてMCA及び血管芽細胞コロニーを形成する能力を有する。実施例2に従い培養されると、これらの細胞はMSCとなる。
【０１１１】
用語「EMHlin-」は、CD31VEカドヘリン内皮マーカー、CD73及びCD105間葉系/内皮マーカー、及び、CD43及びCD45造血マーカーの発現がないことを表す。
【０１１２】
ある実施態様において、本発明に従い使用されるMSCは、CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表現型を示す。明示的には示されていないが、この表現型は、国際細胞治療学会の間葉系及び組織幹細胞委員会によるMSCの定義に該当する。
【０１１３】
ある実施態様において、本発明に従い使用されるMSCは、マイクロRNAについて、miR-145-5p、miR-181b-5p及びmiR-214-3pの各々を発現するが、miR-127-3p及びmiR-299-5pを発現しない.
【０１１４】
MSCは、「免疫調節活性」を有し、これは、Tヘルパー（CD4+）リンパ球の増殖を抑制するMSCの能力としてインビトロで評価され得る。免疫調節活性は、例えば、免疫活性アッセイ（ImmunoPotency Assay）を使用して決定する等、インビトロで参照に対して定量化され得る。
【０１１５】
適した免疫活性アッセイは、放射線を照射した試験用MSC（例えば、本明細書中に開示される方法に従い作製されたiPSC-MSC）と放射線を照射した参照試料MSCを使用し、健康なドナーの抹消血から生成された、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルで標識した白血球の濃度を様々に変えて、別々にプレーティングした。参照試料のサブセットを表すTヘルパー（CD4+）リンパ球をCD3及びCD28抗体の添加により刺激した。CD4で標識したT細胞は、フローサイトメトリーを使用してカウントしT細胞増殖を評価した。IC50値は、参照試料の関数として報告した。IC50値が高いほど、Tヘルパー（CD4+）リンパ球の増殖の抑制度が大きいことを示し、したがって、より優れたT細胞免疫調節特性を示す。MSC試料には、このアッセイで使用する前に放射線を照射して、その増殖能の交絡因子を排除した。
【０１１６】
当業者には、対象における免疫療法の副作用または症状を治療するためのMSCの治療的に有効な量を対象に投与する手法そのものは、医療従事者の裁量によることが理解されるであろう。1回用量、他の薬剤との併用、投与の時期と頻度等の投与の方法は、対象の体調と病歴に左右され得る。
【０１１７】
MSCは、治療用組成物として投与され得る。本明細書において、用語「治療用組成物」は、本明細書中に記載のMSCまたはMSCの集団を含む組成物であって、対象への投与用に調剤されたものを指す。MSCは、治療用組成物に調剤されていてもよく、及び／または治療用組成物は、対象へのMSCの投与を容易にする賦形剤、担体、緩衝剤その他の添加物を含んでいてもよい。好ましくは、治療用組成物は、無菌である。ある実施態様において、治療用組成物は、発熱物質を含まない。
【０１１８】
ある実施態様において、本明細書に開示するMSCは、例えば、miR-145-5p、miR-181b-5p及びmiR-214-3pを発現するが、miR-127-3p及びmiR-299-5pを発現しない、及び／またはCD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表現型を有するMSC、または本明細書に開示する治療用組成物は、容器内、好ましくは無菌容器内、好ましくは発熱物質を含まない容器内に提供される。ある実施態様において、容器は、例えば注射器等のボーラス投与に適したものである。他の実施態様において、容器は、例えば輸液バッグ等の点滴に適したものである。
【０１１９】
MSCは、適正な医療実務（good medical practice）に合致する様式で調剤され、調薬され及び投与される。この文脈において考慮されるべき因子としては、治療中の特定の疾患の種類及び予期される副作用または症状、治療中の特定の対象、対象の臨床症状、投与の部位、投与の方法、投与の計画、及び医療従事者に知られた他の因子等がある。投与されるべきMSCの治療的に有効な量は、そのような考慮によって決定される。
【０１２０】
MSCの1回用量は、約103細胞/m2〜約1010細胞/m2の幅があり得る。例えば、約106細胞/m2〜約2×108細胞/m2、または約103細胞/m2、約5×103細胞/m2、約104細胞/m2、約5×104細胞/m2、約105細胞/m2、約5×105細胞/m2、約106細胞/m2、約5×106細胞/m2、約107細胞/m2、約5×107細胞/m2、約108細胞/m2、約5×108細胞/m2、約109細胞/m2、約5×109細胞/m2、約1010細胞/m2若しくは約5×1010細胞/m2である。
【０１２１】
MSCの1回用量は、約103細胞/kg〜約1010細胞/kgの幅があり得る。例えば、約106細胞/kg〜約2×108細胞/kg、または約103細胞/kg、約5×103細胞/kg、約104細胞/kg、約5×104細胞/kg、約105細胞/kg、約5×105細胞/kg、約106細胞/kg、約5×106細胞/kg、約107細胞/kg、約5×107細胞/kg、約108細胞/kg、約5×108細胞/kg、約109細胞/kg、約5×109細胞/kg、約1010細胞/kg若しくは約5×1010細胞/kgである。
【０１２２】
MSCの1回用量は、約103細胞〜約1010細胞の幅があり得る。例えば、約106細胞〜約2×108細胞、または約103細胞、約5×103細胞、約104細胞、約5×104細胞、約105細胞、約5×105細胞、約106細胞、約5×106細胞、約107細胞、約5×107細胞、約108細胞、約5×108細胞、約109細胞、約5×109細胞、約1010細胞若しくは約5×1010細胞である。
【０１２３】
MSCの投与は、1回用量で行っても1回用量を分割してもよく、また、複数の1回用量を投与してもよい。MSCは、1治療サイクルにおいて1回を超えて投与してもよい。
【０１２４】
MSCは、対象に適した方法で全身または抹消に投与され得るが、経路としては、例えば、静脈内（IV）、動脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、頭蓋内、皮下（SC）、関節内、髄液嚢内、くも膜下腔内、冠動脈内、経心内膜、外科的移植、局所的吸入（例えば、肺内）の経路があり得る。最も好ましくは、MSCはIV投与される。MSCは、生体適合性材料の骨格と併用して投与されてもよい。
【０１２５】
MSCは、免疫療法の前、その間またはその後に対象に投与されてもよい。ある実施態様において、MSCは、炎症の間に投与される。したがって、ある実施態様において、MSCは免疫療法が開始された後に投与されるが、炎症が始まった後に投与されてもよく、及び／または炎症性サイトカイン放出が始まった後または対照に比べて（例えば、免疫療法の投与前に比べて）上昇した後に投与されてもよい。理論に拘束されることは望まないが、最大の恩恵は免疫療法の後にMSCを投与することによって得られると考えられている。その理由は、免疫療法が本質的に免疫／炎症性応答である一方で、MSCが免疫調節及び抗炎症性の効果を発揮するからである。それゆえ、免疫療法の前、その間またはその後の早すぎるMSC投与は、免疫療法の効果の発揮を妨げてしまう。このような理論にもかかわらず、本発明は、そのような制限を受けない。
【０１２６】
なお、この明白なパラドックスは当業者に理解され、かつ受け入れられている。例えば、免疫療法により発生したCRSの主な治療法はステロイドの投与であるが、これは非常に免疫抑制的である。MSCの利点は、例えば、ステロイドの「全身免疫抑制」と対照的な「局所免疫調節」であること、体内に長く残存しないこと、ステロイドまたはその他の免疫抑制療法に応答しない対象において更なる防御線を提供すること、ステロイドと対照的な「軽減された毒性と高められた特異性」、そして、ステロイドと対照的な「MSCによる自己制御」等である。軽減された毒性と、高められた特異性と自己制御は関連しており、ここで、「自己制御（self-regulation）」とは、ステロイドが、例えば、治療濃度未満にステロイド濃度が低下する前の半減期を確保した上で医師による中止を要するのと対照的に、MSCは、例えば、免疫療法の副作用または症状である免疫応答が消えゆくに従ってMSCの免疫調節活性を低下させる能力を有すると考えられている、ということを意味する。
【０１２７】
ある実施態様において、治療は、免疫療法の副作用の観察後24時間以内にMSCを投与することを含む。他の実施態様において、MSCは、免疫療法を受ける対象に、免疫療法の副作用を観察した約7日、約6日、約5日、約4日、約72時間、約48時間、約36時間、約24時間、約16時間、約12時間、約8時間、約4時間、約3時間、約2時間、約60分、約45分、約30分、約15分または約5分後に投与され得る。
【０１２８】
したがって、ある実施態様において、MSCは、免疫療法を受ける対象に、免疫療法の約1週間後に投与され得る。他の実施態様において、MSCは、免疫療法を受ける対象に、免疫療法の約5分後に投与され得る。他の実施態様において、MSCは、免疫療法を受ける対象に、免疫療法の約6日、約5日、約4日、約72時間、約48時間、約36時間、約24時間、約16時間、約12時間、約8時間、約4時間、約2時間、約60分、約45分、約30分、約15分または約5分後に投与され得る。ある実施態様において、MSCは、免疫療法を受ける対象に、免疫療法の後約24時間〜約72時間以内に投与され得る。
【０１２９】
ある実施態様において、MSCは、免疫療法を受ける対象に、免疫療法免疫療法の約1週間前に投与され得る。他の実施態様において、MSCは、免疫療法を受ける対象に、免疫療法の約5分前に投与され得る。他の実施態様において、MSCは、免疫療法を受ける対象に、免疫療法の約6日、約5日、約4日、約72時間、約48時間、約36時間、約24時間、約16時間、約12時間、約8時間、約4時間、約2時間、約60分、約45分、約30分または約15分前に投与され得る。
【０１３０】
他の実施態様において、MSCは、免疫療法を受ける対象に、免疫療法とほぼ同時またはその間に投与され得る。
【０１３１】
本明細書において、「免疫療法」が、「前」、「間」、「受けている」、「後」、「受けた」等の文脈で使用されるとき、それは、例えば、チェックポイント阻害剤、二重特異性T細胞誘導抗体、インターフェロン遺伝子刺激因子のアゴニスト、RIG-I様受容体アゴニスト、Toll様受容体アゴニスト、サイトカイン、抗体-サイトカイン融合タンパク質または抗体-薬物複合体等の免疫治療用薬剤の投与の前、その間、それを受けている、その後またはそれを受けたことを意味する。本明細書において、「受けている（undergoing）」は、免疫療法を受ける予定であるが、まだその免疫療法を投与されていない対象を含む。
【０１３２】
用語「治療的に有効な量」とは、対象における免疫療法の副作用または症状を治療するのに有効な量のMSCを指す。
【０１３３】
用語「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」または「治療（treatment）」は、対象における免疫療法の副作用または症状を予防、軽減または改善すること、または対象における免疫療法の副作用または症状の進行を遅らせる（弱める）ことを目的とする、治療的療法及び予防法ないし予防的措置の両方を指す。治療を必要とする対象には、免疫療法の副作用または症状が予防または改善されるべきである者だけでなく、免疫療法の副作用または症状が既に発生している者も含む。
【０１３４】
用語「予防すること（preventing）」、「予防（prevention）」、「予防的（preventative）」または「予防法（prophylactic）」は、免疫療法の副作用または症状を発生させないようにすること、またはその発生を妨げる、その発生から防御する若しくはその発生から保護することを指す。予防を必要とする対象は、免疫療法の副作用または症状を起こす傾向がある者でもよい。
【０１３５】
用語「改善する（ameliorate）」または「改善（amelioration）」は、免疫療法の副作用または症状の減少、軽減または排除を指す。
【０１３６】
免疫療法の副作用または症状は、定量化し得る。免疫療法の副作用または症状は、半定量スケールについて定量化してもよく、例えば0〜5として、0は「なし」を表し、1〜4は特定可能な重篤性の増加を表し、5は重篤性の最大値を表す。臨床試験では、大抵1〜5のスケールを使用し、1は軽度の有害事象（副作用）を表し、2は中程度の有害事象（副作用）を表し、3は重篤な有害事象（副作用）を表し、4は生命の危険があるまたは障害を引き起こす有害事象（副作用）を表し、5は有害事象（副作用）関連死を表す。代替的に、免疫療法の副作用または症状は、2値の事象、即ち、「あり」と「なし」、または「0」と「1」で定量化してもよい。他の半定量スケールは、当業者に容易に明らかであろう。他の実施態様において、免疫療法の副作用または症状は、量的スケールについて定量化し得る。例えば、組織液の体積あたりのサイトカインの質量といった体積当たりの質量、温度、期間、割合、酵素活性、酸素飽和度等である。
【０１３７】
当業者は、免疫療法のいずれの副作用または症状についても、その評価と定量化の方法を容易に理解し、困難や過度の負担なく実施し得るであろう。例えば、当業者は、血漿または血清中のサイトカイン濃度、温度（発熱）、心拍数（頻脈）、血圧（低血圧）、心機能障害、腎臓機能障害、血清または血漿酵素濃度（肝機能）等を測定し得るであろう。
【０１３８】
免疫療法の副作用または症状のいずれの定量化も対照と比較してもよく、対象としては、例えば、免疫療法もMSCのいずれも受けていない健康な対照や、免疫療法を受けているがMSCまたはMSCの集団で治療されていない罹患した対照等が考えられる。
【０１３９】
MSCを投与することにより免疫療法の副作用または症状を治療することは、免疫療法の副作用または症状を約1%減少、約2%減少、約3%減少、約4%減少、約5%減少、約6%減少、約7%減少、約8%減少、約9%減少、約10%減少、約20%減少、約30%減少、約40%減少、約50%減少、約60%減少、約70%減少、約80%減少、約90%減少、約100%以上減少させることであり得る。代替的に、免疫療法の副作用または症状を治療することは、免疫療法の副作用または症状を約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍以上減少させることであり得る。その結果、「重篤度が低く副作用」は、免疫療法の副作用または症状のそのような減少を指す。
【０１４０】
本明細書において、用語「対象」は、哺乳類を指すことがある。哺乳類は、霊長類、特に、人であってもよく、また、家畜や、動物園またはペットの動物であってもよい。本明細書中に開示される方法は、人の医療に適することが特に期待されているが、馬、牛及び羊等の家畜、犬や猫等のペットの動物、またはネコ科、イヌ科、ウシ科及び有蹄類等の動物園の動物の治療を含む、獣医治療にも適用できる。
【０１４１】
以下の実施例は、本発明の説明を補助するものであって、本発明をこれらの実施例に限定するものではない。
【０１４２】
実施例
実施例1.  MSC作製用試薬
【０１４３】
【表１】
2020523400.tif 000003
【０１４４】
表1に列挙する試薬は、当業者に既知であり、IMDM及びハムF12等の一般に受け入れられた組成のものである。GLUTAMAXは、L-alanyl-L-グルタミンジペプチドを含み、通常0.85% NaCl中に200mMで提供されている。GLUTAMAXは、培養された細胞によってジペプチド結合が切断されるとL-グルタミンを放出する。化学的に定義された脂質濃縮物は、アラキドン酸2mg/L、コレステロール220mg/L、酢酸DL-α-トコフェロール70mg/L、リノール酸10mg/L、リノレン酸10mg/L、ミリスチン酸10mg/L、オレイン酸10mg/L、パルミチン酸10mg/L、パルミトレイン酸10mg/L、プルロニックF-68を90g/L、ステアリン酸10mg/L、TWEEN80（登録商標）2.2g/L及びエチルアルコールを含む。H-1152とY27632は、非常に強力かつ細胞透過性の選択的ROCK（Rho関連コイルドコイル形成プロテインセリン／スレオニンキナーゼ）阻害剤である。
【０１４５】
【表２】
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【０１４６】
【表３】
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【０１４７】
【表４】
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【０１４８】
【表５】
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【０１４９】
【表６】
2020523400.tif 000008
【０１５０】
実施例2.  ヒトPSCをMSCへと分化させるためのプロトコル
1.  ビトロネクチンコートした（0.5μg/ckg）プラスチック皿上のE8完全培地（DMEM/F12基本培地＋E8サプリメント）＋1μMのH1152内でiPSCを解凍した。プレーティングしたiPSCを37℃、5% CO2、20% O2（正常酸素)で培養した。
2.  iPSCをビトロネクチンコートした（0.5μg/ckg）プラスチック皿上のE8完全培地（ROCK阻害剤なし）内で3代継代培養して増殖させてから、分化工程を開始させる前に37℃、5% CO2、20% O2（正常酸素）で培養した。
3.  iPSCを回収してコラーゲンIVコートした（0.5μg/ckg）プラスチック皿上のE8完全培地＋10μMのY27632中に単一細胞／小コロニーとして5×103細胞/ckgで播種し、37℃、5% CO2、20% O2（正常酸素）で24時間培養した。
4.  E8完全培地＋10μMのY27632を分化培地と交換し、37℃、5% CO2、5% O2（低酸素）で48時間培養して原始中胚葉細胞を作製した。
5.  コロニー形成用原始中胚葉細胞を単一細胞懸濁液として分化培地接着培養から回収し、M-CFM浮遊培養に移し、37℃、5% CO2、20% O2（正常酸素）で12日間、間葉系コロニーが形成されるまで培養した。
6.  間葉系コロニーを回収しフィブロネクチン/コラーゲンIコートした（0.67μg/ckgフィブロネクチン、1.2μg/ckgコラーゲンI）プラスチック皿上のM-SFEM中に播種し、37℃、5% CO2、20% O2（正常酸素）で3日間培養してMSC（継代0)を作製した。
7.  コロニーを回収し単一細胞（継代1）として1.3×104細胞/ckgでフィブロネクチン/コラーゲン1コートしたプラスチック皿上のM-SFEM中に播種し、37℃、5% CO2、20% O2（正常酸素）で3日間培養した。
8.  回収し単一細胞（継代2）として1.3×104細胞/ckgでフィブロネクチン/コラーゲン1コートしたプラスチック皿上のM-SFEM中に播種し、37℃、5% CO2、20% O2（正常酸素）で3日間培養した。
9.  回収し単一細胞（継代3）として1.3×104細胞/ckgでフィブロネクチン/コラーゲン1コートしたプラスチック皿上のM-SFEM中に播種し、37℃、5% CO2、20% O2（正常酸素）で3日間培養した。
10.  回収し単一細胞（継代4）として1.3×104細胞/ckgでフィブロネクチン/コラーゲン1コートしたプラスチック皿上のM-SFEM中に播種し、37℃、5% CO2、20% O2（正常酸素）で3日間培養した。
11.  回収し単一細胞（継代5）として1.3×104細胞/ckgでフィブロネクチン/コラーゲン1コートしたプラスチック皿上のM-SFEM中に播種し、37℃、5% CO2、20% O2（正常酸素）で3日間培養した。
12.  単一細胞として回収し最終物を凍結させた。
【０１５１】
2種類の実験（TC-A-96及びDAD-V-90）を行い、M-CFMにPDGF-BB（10ng/mL）及び／またはLiCl（1mM）を補充した場合のiPSC-MSCsのT細胞抑制に対する影響を調べた。T細胞抑制の評価をWaisman Biomanufacturing社の免疫活性アッセイ（IPA)を使って作成した。
【０１５２】
表7に示すように、血小板由来成長因子（PDGF）とLiClをPDGF+/LiCl+、PDGF-/LiCl-、PDGF+/LiCl-及びPDGF-/LiCl+の組合せで評価した。ここで留意すべきは、TC-A-96実験では、分化培地（1×AA=15ng/mL及び0.1×AA=1.5ng/mL）における2種類のDneg1播種密度（5×103細胞/ckg及び1×104細胞/ckg）と2種類のアクチビンA（AA）濃度を比較したことである。DAD-V-90実験では、1種類のDneg1播種密度（5×103細胞/ckg）とアクチビンA濃度（1.5ng/mL）を使用した。また、第1のIPA（IPA1）では1種類のleukopak（LPK7）を使用し、また、第2のIPA（IPA2)では2種類のleukopak（LPK7及びLPK8）を使用したことにも留意すべきである。
【０１５３】
このアッセイは、各MSC株がどの程度Tヘルパー（CD4+）リンパ球の増殖を抑制し得るか評価することを意図している。健康な個人の末梢血から精製した凍結保存白血球（Leucopak（LPK)由来の抹消血単核細胞（PBMC）)を使って、凍結保存MSCを試験した。そのようなものとして、個々のドナーの違いによってLPK細胞集団にはばらつきがあることが予期される。試験を研究品質の材料用の1種類のPMBC試料に限定するとのオプション付きで、臨床品質の材料用の2名の個人由来のPMBCに対して、各MSCの試験用試料を試験した。アッセイの完全性/再現性の確保のため及び試験用試料の正規化のために、参照標準のMSC株と共に各MSC試験用試料のアッセイを実行した。このアッセイは、文献（Bloom et al. Cytotherapy、2015、17(2):140-51）に記載されている。
【０１５４】
概略は以下の通りである。試験用MSCを21Gyのガンマ線照射に暴露した。48ウェル組織培養プレートにおいて、4×105、2×105、4×104及び2×104の放射線照射したMSCを個々のウェル内にプレーティングした。PMBCは、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステルで別途標識した。標識したPMBC細胞を上記MSCを含有するウェルに1ウェルあたり4×105細胞でプレーティングした。この結果、滴定されたPBMC:MSCの割合は、1:1、1:0.5、1:0.1及び1:0.05であった。別の1ウェルに刺激したPBMCのみをプレーティングし、また別の1ウェルにMSCのみをプレーティングし、また別の1ウェルに1:0.05の割合で刺激せずにプレーティングして、これら全てを対照として使用する。その後、T細胞刺激性モノクローナル抗体、抗ヒトCD3-epilson及び抗ヒトCD28（R&D Systems, Inc.社、ミネソタ州ミネアポリス）を各ウェルに添加した。
【０１５５】
培養の第4日目に、細胞を個々のウェルから回収した。各ウェルからの細胞は、アロフィコシアニン標識抗ヒトCD4と共に培養した。その後、CD4+細胞について、フローサイトメーターを使用しカルボキシフルオレセイン強度を介して増殖の分析を行った。MSCのみの対照は、共培養ウェルからのMSCのゲートアウトに使用した。PBMCのみの対照は、最大T細胞増殖について、MSCを介した抑制の程度を測定するための陽性対照として使用した。非刺激の1:0.05の割合のウェルは、増殖を測定するための陰性対照ゲートの生成に使用した。
【０１５６】
試験用試料の割合から、ベストフィット曲線を使用してIC50値を生成した。IC50値は、参照標準（IC50 Ref Std/IC50試験用試料)に対して正規化した。この正規化されたIC50において、より強力な（より抑制的な）試料では値が大きくなり、より弱い試料では値が小さくなる。
【０１５７】
結果
表7に示すIC50データは、LiClを補充しPDGFを除いたM-CFM（即ち、PDGF-/LiCl+）がiPSCを分化させて免疫調節性のiPSC-MSCを作製するのに最適であったことを示している。さらに、低濃度のアクチビンAもまた、iPSC-MSCの免疫抑制を向上させた。
【０１５８】
【表７】
2020523400.tif 000009
【０１５９】
この実施例に従い作製したMSCは、CD73+CD105+CD90+CD146+CD44+CD10+CD31-CD45-表現型を示す。
【０１６０】
実施例3.  MSCマイクロRNA分析
実施例2に従い作製したMSCについて、1194のmiRNAsとmiR-127-3p、miR-145-5p、miR-181b-5p、miR-214-3p、miR-299-5pからなる専用miRNAパネルを含むマイクロRNA（miRNA）マイクロアレイに対して分析を行い、71個のMSC試料と94個の非MSC試料に対して検証した。
【０１６１】
実施例2に従い作製したMSCは、miR-145-5p、miR-181b-5p及びmiR-214-3pの各々を発現したが、miR-127-3p及びmiR-299-5pは発現しなかった。
【０１６２】
実施例4.  代替的免疫活性アッセイ1
MSCの免疫活性を以下の手順で評価する。様々なドナーからのヒトPBMCをリン酸緩衝剤生理食塩水中に（免疫応答の個人差によるばらつきを最小化するために）保存し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE、2μM）で15分間37℃の暗中で、2×107PBMC/mLの細胞密度で染色する。反応は、10%ヒト血液型AB血清を補充したRPMI-1640培地を同量添加して停止させる。その後、3×105CFSEで標識したPBMCを10%の保存ヒト血小板溶解物、2IU/mLの保存剤を含まないヘパリン（Biochrom社）、2mMのL-グルタミン、10mMの（4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸）（HEPES、Gibco社）、100IU/mLのペニシリン（Sigma社）及び100μg/mLのストレプトマイシン（Sigma社）を補充したRPMI-1640培地中に再度懸濁させ、96ウェルの平底プレート（Corning社)に、1ウェルあたり3回ずつプレーティングする。T細胞の増殖は、Gallios10カラーフローサイトメーターとKaluzaG1.0ソフトウェア（いずれもCoulter社)を使用して判定する。生存する7-アミノアクチノマイシン-Dを含まない（7-AAD-、BD Pharmingen社）CD3-APC+（eBioscience社）T細胞を4〜7日後に分析する。増殖動態と集団分布をModfit4.1ソフトウェア（Verity社)を使用して分析する。
【０１６３】
実施例5.  代替的免疫活性アッセイ2
MSCの免疫活性を以下の手順で評価する。Tヘルパー（CD4+）リンパ球をCellTrace violet（CTV、Invitrogen社）で製造メーカーの説明書に従い染色し、次いで抗CD3/CD28でコートしたビーズ（Dynabeads、Invitrogen社）で、T-細胞/ビーズの割合を5:1として96ウェルのU型底プレート内で刺激する。その後応答性（responder）CD4T細胞を（100Gyで）放射線照射したKarpas299細胞（K299細胞、Sigma社）を参照標準としてこれと共に、またはMSCと共に培養する。共培養された細胞を37℃、5% CO2でRPMI-1640培地中で72時間培養する。その細胞をAnnexinV結合緩衝液（BD Biosciences社）で洗浄して、アネキシンV-フルオレセインイソシアネートまたはAPC（BD Biosciences社）で15分間、暗中で、室温で染色する。この培養後、細胞をヨウ化プロピジウム（PI）（Molecular Probes社）で染色して、データを直ちにLSRII Fortessa（BD Biosciences社)上に取得する。収集したデータは、FlowJoソフトウェア（バージョン8.8.6、Tree Star社)を使用して分析する。生存率は、AnnexinV陰性かつPI陰性のT細胞の集団により測定する。この生存細胞の割合は、CTVdim（%増殖)について分析する。T細胞の増殖の抑制は、式「%抑制=100-(a/b*100)」（式中、「a」は抑制性細胞の存在下における増殖のパーセンテージを表し、「b」は抑制性細胞の不存在下における増殖のパーセンテージを表す）により計算する。
【０１６４】
実施例6.  MSCは未治療黒色腫に対するチェックポイント阻害剤療法の副作用を治療する
組織学的に確認したステージIII（切除不能）またはステージIVの黒色腫にり患し、かつ、進行性疾患の全身性治療を以前に受けたことがない対象を2グループに無作為に分ける。各グループに、3mg/kgのニボルマブを2週間毎に静注する。患者は、応答（無進行生存）について断続的に監視し、毒性及び副作用について継続的に監視する。
【０１６５】
対象の1グループにおいて、各対象には、その対象にニボルマブを注入した後に副作用を観察してから24時間以内に、kg体重あたり1×106〜1×107のMSCを静注する。
【０１６６】
全対象において、無進行生存は6.9ヵ月（95% CI 4.3〜9.5ヵ月と予想）となると予想され、客観的奏効率は44%（95% CI 38〜50%と予想）となると予想され、そして、完全寛解率は9%となると予想される。
【０１６７】
治療に関連するいずれかのグレードの副作用も、ニボルマブのみを受けているグループの対象の82%において予想され、予想される副作用は、下痢（19%に予期）、疲労（34%に予期）、掻痒（19%に予期）、発疹（26%に予期）、吐き気（13%に予期）、発熱（6%に予期）、食欲減少（11%に予期）、ALT上昇（4%に予期）、AST上昇（4%に予期）、嘔吐（6%に予期）、甲状腺機能低下（9%に予期）、大腸炎（1%に予期）、関節痛（8%に予期）及び呼吸困難（5%に予期)を含む。
【０１６８】
MSCを注入された対象は、MSCで治療されていない対象と比べて、重篤度が低く、かつ、恐らくより少ない副作用を示すと見込まれている。
【０１６９】
実施例7.  MSCは再発性/難治性DLBCLに対する二重特異性T細胞誘導抗体療法の副作用を治療する
再発性/難治性DLBCLにり患した対象を2グループに無作為に分ける。両グループともにブリナツモマブを第1週目は9mg/日、第2週目は28mg/日、これ以降は112mg/日の段階的用量で投与する。ブリナツモマブは、継続的静注点滴で8週間投与され（サイクル1）、4週間は治療を行わず、そして4週間の治療を行う（サイクル2)。
【０１７０】
対象は、応答について断続的に監視し、毒性及び副作用について継続的に監視する。応答は、ブリナツモマブの2サイクルを受けた後第10週目の全奏効率と、完全寛解率、応答の期間、無進行生存、全生存、及び副作用の発生と重篤性を含む。
【０１７１】
全奏効率は、第10週目の造影CT（コンピュータ断層撮影）及びフルオロデオキシグルコース陽電子放出断層撮影法（PET）による第11週目の検査を含み、Chesonによる悪性リンパ腫の見直された応答基準に従い独立中央放射線学的評価（independent central radiologic assessment）によって判断する。
【０１７２】
対象の1グループにおいて、各対象には、その対象にブリナツモマブを注入した後に副作用を観察してから24時間以内に、kg体重あたり1×106〜1×107のMSCを静注する。
【０１７３】
19%の対象に完全寛解が予想される。全対象の全奏効率は、35%になると予想される。難治性疾患にり患した対象はベースライン時で、19%の全奏効率を有すると見込まれる。再発性疾患にり患した対象はベースライン時で、67%の全奏効率を有すると見込まれる。応答の期間の中央値は、全体で11.6ヵ月となると見込まれる。
【０１７４】
全対象において、無進行生存の中央値は3.7ヵ月となり、中央値15.0ヵ月のフォローアップを伴うと予想される。全対象において、全生存の中央値は、5.0ヵ月となり、中央値11.7ヵ月のフォローアップを伴うと予想される。
【０１７５】
MSCを投与されない対象おいて予想される副作用には、震え（48%に予期）、発熱（44%に予期）、疲労（26%に予期）、浮腫（26%に予期）、血小板減少（22%に予期）、肺炎（22%に予期）、下痢（22%に予期）、白血球減少（17%に予期）、C反応性タンパク質上昇（17%に予期）、高血糖（17%に予期）、言語障害（17%に予期）、咳（17%に予期）、腰痛（17%に予期）、低カリウム血症（17%に予期）、めまい（13%に予期）、脳症（13%に予期）、失語症（9%に予期）、眠気（9%に予期）、見当識障害（9%に予期）、混乱状態（9%に予期）及び感覚異常（9%に予期)等がある。
【０１７６】
MSCを注入された対象は、MSCで治療されていない対象と比べて、重篤度が低く、かつ、恐らくより少ない副作用を示すと見込まれている。
【０１７７】
実施例8.  MSCは転移性乳がんに対する抗体-サイトカイン融合療法の副作用を治療する
転移性乳がんにり患した対象を2グループに無作為に分ける。両グループともにドキソルビシン25mg/m2との併用でF16-IL2を25百万国際単位（MIU）静注する。F16-IL2は、F16と呼ばれるテネイシンCのA1ドメインに特異的、かつヒトサイトカインIL2に融合されたヒトscFvである。
【０１７８】
各治療サイクルは、第1日目、第8日目及び第15日目のF16-IL2及びドキソルビシンの投与と、それに続く13日間の休息を含む。腫瘍の評価は、固形がんの治療効果判定基準（RECIST)に従って行う。
【０１７９】
対象は、応答について断続的に監視し、毒性及び副作用について継続的に監視する。応答は、客観的奏効率及び無進行生存を含む。
【０１８０】
対象の1グループにおいて、各対象には、その対象にF16-IL2を投与した後に副作用を観察してから24時間以内に、kg体重あたり1×106〜1×107のMSCを静注する。
【０１８１】
8週間（2つの治療サイクル）後、疾患制御率は、全対象において67%になると見込まれる。全対象において、無進行生存の中央値は125日、また、全生存の中央値は351日と見込まれる。
【０１８２】
MSCを投与されない対象おいて予想される副作用には、血液系及びリンパ系の疾患（少なくとも50%に予期）、心疾患（7%に予期）、胃腸障害（少なくとも67%に予期）、代謝及び栄養障害（14%に予期）、神経系疾患（7%に予期）、腎・泌尿器疾患（7%に予期）、呼吸器、胸部及び縦隔障害（7%に予期）、皮膚及び皮下組織異常（少なくとも20%に予期）及び血管障害（7%に予期)等がある。
【０１８３】
MSCを注入された対象は、MSCで治療されていない対象と比べて、重篤度が低く、かつ、恐らくより少ない副作用を示すと見込まれている。
【０１８４】
実施例9.  MSCは進行性黒色腫に対するサイトカイン療法の副作用を治療する
ステージIVまたは局所進行性ステージIIIの皮膚黒色腫にり患し、かつHLA*A0201（ペプチドワクチンのT細胞への提示を可能にするため）を発現している対象を無作為に2グループに割り当てる。1サイクルあたり1回、対象は、1mgのgp100:209-217(210M)（アミノ酸配列IMDQVPFSV）とフロイントの不完全アジュバント（Montanide ISA-51)（ペプチドワクチン）皮下注射（SC）、続いてIL-2（720,000IU/kg）の静注を投与される。IL-2は、8時間毎にボーラスIVとして投与する。
【０１８５】
各対象は、IL-2で治療し、忍容性があれば、1サイクルあたり最大12回用量まで治療する。各治療サイクルを3週間毎に繰り返し、2サイクルが終わる毎に1週間を追加して応答の評価を行う。
【０１８６】
対象は、応答について断続的に監視し、毒性及び副作用について継続的に監視する。応答は、臨床反応及び無進行生存を含む。
【０１８７】
対象の1グループにおいて、各対象には、その対象にIL2を投与した後に副作用を観察してから24時間以内に、kg体重あたり1×106〜1×107のMSCを静注する。
【０１８８】
両グループにおける反応率は、20%になると予想される。両グループにおける中央検証した全体臨床応答（centrally verified overall cliical response）は、16%になると見込まれる。両グループにおける無進行生存は、2.2ヵ月（予期される95% CI、1.7〜3.9ヵ月)になると見込まれる。両グループにおいて、全生存の中央値は、17.8ヵ月（予期される95% CI、11.9〜25.8ヵ月）になると見込まれる。
【０１８９】
MSCを投与されない対象おいて予想される副作用には、血液または骨髄症状（48%に予期）、一般的な心臓血管症状（36%に予期）、不整脈（19%に予期）、凝固（4%に予期）、全身症状（28%に予期）、皮膚症状（7%に予期）、胃腸症状（21%に予期）、出血（2%に予期）、肝症状（40%に予期）、感染症または発熱性好中球減少（8%に予期）、代謝または臨床検査結果（42%に予期）、筋骨格の症状（7%に予期）、神経学的症状（26%に予期）、肺症状（22%に予期）、疼痛（13%に予期）、腎または泌尿生殖器の症状（19%に予期）及び腫瘍溶解症候群または腫瘍フレア（2%に予期)等がある。
【０１９０】
MSCを注入された対象は、MSCで治療されていない対象と比べて、重篤度が低く、かつ、恐らくより少ない副作用を示すと見込まれている。
【０１９１】
実施例10.  MSCはHER2陽性進行性乳がんに対する抗体-薬物複合体療法の副作用を治療する
HER2陽性進行性（切除不能、局所進行性または転移性の）乳がんにり患した対象を2グループに無作為に分ける。両グループともにトラスツズマブ・エムタンシンの3.6mg/kg静注を21日間毎に受ける。
【０１９２】
対象は、応答について断続的に監視し、毒性及び副作用について継続的に監視する。応答は、無進行生存、全生存及び客観的奏効率を含む。進行を改訂RECISTに従って評価する。
【０１９３】
対象の1グループにおいて、各対象には、その対象にトラスツズマブ・エムタンシンを投与した後に副作用を観察してから24時間以内に、kg体重あたり1×106〜1×107のMSCを静注する。
【０１９４】
両グループにおける、無進行生存の中央値は9.6ヵ月、また、全生存の中央値は30.9ヵ月になると見込まれる。客観的奏効率は44%になると見込まれる。推定1年生存率は85%、また、推定2年生存率は65%になると見込まれる。
【０１９５】
MSCを投与されない対象おいて予想される副作用には、下痢（23%に予期）、手掌足底発赤知覚不全症候群（1%に予期）、嘔吐（19%に予期）、好中球減少（6%に予期）、低カリウム血症（9%に予期）、疲労（35%に予期）、吐き気（39%に予期）、粘膜炎症（7%に予期）、貧血（10%に予期）、ALT上昇（17%に予期）、AST上昇（22%に予期）及び血小板減少（28%に予期)等がある。
【０１９６】
MSCを注入された対象は、MSCで治療されていない対象と比べて、重篤度が低く、かつ、恐らくより少ない副作用を示すと見込まれている。
【０１９７】
実施例11.  MSCは血液悪性腫瘍に対するTLRアゴニスト療法の副作用を治療する
再発性または難治性血液悪性腫瘍にり患した対象を2グループに無作為に分ける。両グループとも小分子イミダゾキノリンであるTLR7アゴニスト852Aの皮下注射（SC）を週2回12週間受ける。対象には、0.6mg/m2の用量で週2回の投与を開始し、忍容性があれば2回用量の投与が終わる毎に、目標用量である1.2mg/m2に達するまで0.2mg/m2ずつ増やす。
【０１９８】
対象は、応答について断続的に監視し、毒性、及び副作用について継続的に監視する。応答は、8回用量毎（急性白血病)または12回用量毎（多発性骨髄腫またはリンパ腫)に評価する。応答は、完全寛解、部分応答、及び病状の安定を含む。
【０１９９】
対象の1グループにおいて、各対象には、その対象に852Aを投与した後に副作用を観察してから24時間以内に、kg体重あたり1×106〜1×107のMSCを静注する。
【０２００】
両グループにおいて見込まれる全奏効率は1年で18%である。両グループにおける生存率の中央値は3.5ヵ月になると見込まれる。6%の完全寛解が見込まれ、また、6%の部分応答が両グループにおいて見込まれる。病状の安定は、両グループにおける対象の12%に見込まれる。
【０２０１】
MSCを投与されない対象おいて予想される副作用には、吐き気（88%に予期）、嘔吐（18%に予期）、呼吸困難（82%に予期）、発熱（71%に予期）、悪寒（82%に予期）、筋肉痛（76%に予期）、発汗（94%に予期）、倦怠感（100%に予期）、浮腫（59%に予期）、咳（47%に予期）及び疼痛（12%に予期)等がある。
【０２０２】
MSCを注入された対象は、MSCで治療されていない対象と比べて、重篤度が低く、かつ、恐らくより少ない副作用を示すと見込まれている。
【０２０３】
実施例12.  MSCは膵臓がんに対するRLRアゴニスト療法の副作用を治療する
膵臓がんにり患した対象を2グループに無作為に分ける。両グループともRIG-I活性化とTGF-β1（ppp-TGF-β）の遺伝子抑制とを組み合わせる2.9mg/kgの二官能性ppp-siRNAの静注を第1日目と第4日目の週2回、6週間受ける。
【０２０４】
対象は、無進行生存について断続的に監視し、毒性及び副作用について継続的に監視するが、ALT上昇と白血球減少を含むと予期される。
【０２０５】
対象の1グループにおいて、各対象には、その対象にppp-TGF-βを投与した後に副作用を観察してから24時間以内に、kg体重あたり1×106〜1×107のMSCを静注する。
【０２０６】
MSCを注入された対象は、MSCで治療されていない対象と比べて、重篤度が低く、かつ、恐らくより少ない副作用を示すと見込まれている。
【０２０７】
実施例13.  MSCは結腸がんに対するSTINGアゴニスト療法の副作用を治療する
結腸がんにり患した対象を2グループに無作為に分ける。両グループとも5mg/kgのcGAMPの静注を第1日目と第4日目の週2回、6週間受ける。
【０２０８】
対象は、無進行生存について断続的に監視し、毒性及び副作用について継続的に監視する。
【０２０９】
対象の1グループにおいて、各対象には、その対象にcGAMPを投与した後に副作用を観察してから24時間以内に、kg体重あたり1×106〜1×107のMSCを静注する。
【０２１０】
MSCを注入された対象は、MSCで治療されていない対象と比べて、重篤度が低く、かつ、恐らくより少ない副作用を示すと見込まれている。
【０２１１】
実施例14.  サイトカイン放出症候群の予防または治療
この実施例は、重篤な免疫不全のNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）マウスを使用するが、これは、マウスの抹消血中及び脾臓中に高い割合のヒトCD4+及びCD8+T細胞をもたらす抹消血単核細胞（PBMC）の生着と分化によってこれらのマウスのヒト化を可能にする。OKT3抗体は、ヒトT細胞に結合し、ヒトサイトカインの強い誘導を起こし、これによりヒトCRSをモデルする。
【０２１２】
第0日目に、8週〜12週齢の雌のNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ（NSG）マウスに20×106ヒトPBMC(huPBMC)を尾静脈経由で静脈内に注射した。実験設計の模式図は図3に示す。
【０２１３】
凍結ヒトPBMCはStemCell Technology社から購入し、NSGマウスはJackson Laboratory社から購入した。
【０２１４】
凍結huPBMC試料を保存し、製造メーカーの説明書に従って解凍した。この手順の概略は次の通り。凍結細胞のバイアルを37℃の水槽中で解凍し、バイアルの外側を70%エタノールで消毒し、予め37℃に温めた10mLのRPMI10% FBSを含む15mL円錐管に細胞を移し、1,500rpmで10分間遠心分離し、10mLのPBSで1回洗浄してからトリパンブルー色素排除による細胞計数のために1mLのPBS中に浮遊させた。150μlのPBS中に20×106のhuPBMCアリコットを調整し、マウスの注射の準備をする間氷の上に置いた。
【０２１５】
マウスをケージの中に入れ、2〜3分間ランプで温めて尾静脈を拡張させた。次いで、マウスをマウス固定器内に置き、尾を70%エタノールで消毒してから、27G針の1ml注射器でマウスに20×106huPBMCを尾静脈経由で注入投与した。注入後、注入した部位を軽く押さえて出血を防止した。マウスは、安楽死の日まで疾患の徴候について毎日監視した。
【０２１６】
huPBMCの生着から10〜12日後、マウスを対照（n=2)コホートまたは試験（n=5）コホートのいずれかに割り当てた。対照コホートには、ムロモナブ-CD3（OKT3）抗体を10μgの用量で腹腔内注射により与えた。OKT3抗体は、臓器移植後の急性拒絶を治療するための免疫抑制剤として使用される抗CD3抗体である。OKT3抗体は、abcam社（カタログ番号ab86883)やThermoFisher Scientific社（カタログ番号14-0037-82)等の販売業者またはウォルター・アンド・エリザ・ホール研究所（Walter and Eliza Hall Institute）の抗体施設等の他の供給者などから購入してもよい。対照コホート及び試験コホートには、huPBMC投与から12時間後に腹腔内注射によりOKT3抗体を投与した。試験コホートには、OKT3投与の5時間前（即ち、huPBMC投与の7時間後)に、2×106MSCを尾静脈注射により投与した。他の実施例において、MSCは、OKT3投与と同時またはOKT3投与の1時間、3時間、5時間または24時間後に投与される（図3)。
【０２１７】
マウスの体温をOKT3抗体の投与から0時間、1時間、3時間、5時間及び24時間後に取得した。体温の取得には、直腸温と表面／皮膚温との間の差を調整するため標準直腸温に対して校正した、非接触型の赤外線放射温度計を使用した。
【０２１８】
OKT3抗体の投与から5時間後、Goldenrodアニマルランセット無菌4mmを使用して頬静脈穿刺により、または尾静脈からの採血により抹消血試料を取得した。
【０２１９】
マウスは、臨床スコアと体温に応じてOKT3投与から5時間または24時間後に犠死させた。抹消血試料は、安楽死後直ちに心臓穿刺により採取し、その後脾臓を回収した。循環系と脾臓で確認したヒトCD45、CD4及びCD8T細胞のパーセント割合は、標準的フローサイトメトリーによる染色と分析により決定した。循環する及び脾臓のCD4及びCD8T細胞上のCD69発現は、表面染色とフローサイトメトリーによる分析により評価した。
【０２２０】
OKT3投与から5時間及び24時間後に採取した血漿試料は、IL-1β、IL-2、IL-6、IFNγ、TNF及びIL-10の発現について評価し、また、IL-4及びIL-5の発現についても評価してもよい。
【０２２１】
このCRSモデルにおいて、試験マウスは対照マウスに比べて高い直腸温を示していた（図4)。また、試験マウスは、このCRSモデルにおける試験マウス（図5）に比べて臨床スコアが低かった。
【０２２２】
対照マウスと試験マウスとの間には、抹消血（図6）または脾臓（図9）中のCD45+細胞の割合に差は全く認められなかった。
【０２２３】
ただし、CD69発現は、抹消血中（図7）と脾臓中（図10）の両方のヒトCD4+細胞、及び抹消血中（図8）と脾臓中（図11)の両方のヒトCD8+細胞において、試験マウスでは、対照マウスに比べて低かった。
【０２２４】
試験マウスのヒトCD4+細胞及びヒトCD8+細胞における、対照マウスに比べて低いCD69発現に照らせば、試験マウスでは、IL-1β、IL-2、IL-6、IFNγ、TNF、IL-10、IL-4及びIL-5のうち1以上の発現が対照マウスに比べて低くなると見込まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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