(57)【要約】  本発明は、Ｂ細胞成熟抗原指向性ナノ粒子を含む組成物およびその組成物を使用するための方法に関する。【選択図】図１Ｂ
2020523383.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノ粒子と、
リンカーと、
抗Ｂ細胞成熟（ＢＣＭＡ）抗体と
を含む、標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項２】
前記標的化ナノ粒子コンジュゲートの前記ナノ粒子が、１０ｎｍ未満のサイズである、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項３】
前記ナノ粒子が、ガドリニウムナノ粒子であり、任意選択的にシリカ主体型のガドリニウムナノ粒子（ＳｉＧｄＮＰ）である、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項４】
前記標的化ナノ粒子コンジュゲートの前記ナノ粒子が、３０ｎｍ以上のサイズである、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項５】
前記ナノ粒子が、ポリマーブラシナノ粒子、または、クラスター化して規則的にスペーサー配列が入った短いパリンドローム構造のリピート配列（ＣＲＩＳＰＲ：ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）による機構（すなわち、ｓｇＲＮＡガイドおよび／またはＣａｓ９  ｍＲＮＡ）を用いる型の作用物質を含むナノ粒子である、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項６】
前記ナノ粒子が、ポリマーナノ粒子であり、任意選択的に、前記標的化ナノ粒子コンジュゲートが、薬物をさらに含む、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項７】
前記ナノ粒子が、無機ナノ粒子である、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項８】
前記標的化ナノ粒子コンジュゲートが、約６〜１５ｎｍのサイズ、任意選択的に約８〜１２ｎｍのサイズであり、任意選択的に、前記標的化ナノ粒子コンジュゲートの前記サイズが、長期にわたって安定であり、任意選択的に、前記標的化ナノ粒子コンジュゲートの前記サイズが、１５分以上の期間にわたって安定であり、任意選択的に、前記標的化ナノ粒子コンジュゲートの前記サイズが、３０分以上の期間にわたって安定である、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項９】
前記標的化ナノ粒子コンジュゲートが、約１５〜６０ｎｍのサイズ、任意選択的に約３０〜５０ｎｍのサイズであり、任意選択的に、前記標的化ナノ粒子コンジュゲートの前記サイズが、長期にわたって安定であり、任意選択的に、前記標的化ナノ粒子コンジュゲートの前記サイズが、１５分以上の期間にわたって安定であり、任意選択的に、前記標的化ナノ粒子コンジュゲートの前記サイズが、３０分以上の期間にわたって安定である、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１０】
前記リンカーが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−ＮＨＳリンカー、ＮＨＳ−ハロアセチル、ＮＨＳ−マレイミド、およびＮＨＳ−ピリジルジチオールリンカーからなる群より選択される、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１１】
前記抗ＢＣＭＡ抗体が、モノクローナル抗体またはそのフラグメント、任意選択的に、ヒトモノクローナル抗体またはそのフラグメントである、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１２】
前記抗ＢＣＭＡ抗体が、任意選択的にＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体からなる群より選択される抗ＢＣＭＡ抗体フラグメントである、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１３】
前記抗ＢＣＭＡ抗体が、標識されており、任意選択的に、前記抗ＢＣＭＡ抗体が、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）／Ｃｙ５．５によって標識されている、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１４】
前記標的化ナノ粒子コンジュゲートが、遊離ＮＨＳ基によって修飾されたナノ粒子核を含み、任意選択的に、前記ＮＨＳ基が、ビススルホスクシンイミジルスベレート架橋剤を介して前記抗ＢＣＭＡ抗体の前記表面に共役している、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１５】
薬物部分をさらに含む、請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲートであって、任意選択的に、前記薬物部分が、抗ＣＳ１剤または抗ＢＣＭＡ剤である、標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【請求項１６】
請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲートを含む、製剤。
【請求項１７】
前記標的化ナノ粒子コンジュゲートが、ＳｉＧｄＮＰ１グラム当たり０．１〜１ｍｇ／ｇに相当する用量、任意選択的に、ＳｉＧｄＮＰ１グラム当たり約０．２５ｍｇ／ｇに相当する用量で存在する、請求項１４に記載の製剤。
【請求項１８】
請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。
【請求項１９】
対象における多発性骨髄腫（ＭＭ）および／または最小残存病変（ＭＲＤ）の存在および／または局在化を検出する方法であって、
請求項１に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲートを前記対象に投与することと、
前記対象における前記標的化ナノ粒子コンジュゲートの存在および／または局在化を検出することと、
これにより、前記対象におけるＭＭおよび／またはＭＲＤの存在および／または局在化を検出することと
を含む、方法。
【請求項２０】
前記投与するステップが、注射によって、任意選択的に静脈内注射および／または腹腔内注射によって実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出するステップが、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によるスキャンの利用を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記標的化ナノ粒子コンジュゲートが、前記対象におけるＭＭ細胞および／またはＭＲＤの検出のためのイメージングバイオマーカーとして作用する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記標的化ナノ粒子コンジュゲートが、適切な非標的化ＮＰ対照に比較して、少なくとも５倍、任意選択的に少なくとも１０倍、任意選択的に約１２倍以上改善されたコントラストをもたらす、請求項２２に記載の方法であって、任意選択的に信号対雑音比（ＳＮＲ）および正規化されたＳＮＲが、式（１）および（２）：（１）ＳＮＲ＝強度／ノイズ、（２）正規化されたＳＮＲ（ｉ）＝ＳＮＲ（ｉ）／ＳＮＲｂａｓｅｌｉｎｅ
に従って計算される、方法。
【請求項２４】
前記標的化ナノ粒子コンジュゲートが、対象１個体当たり１００，０００個以下の形質細胞、任意選択的に対象１個体当たり５０，０００個以下の形質細胞、任意選択的に対象１個体当たり３０，０００個以下の形質細胞、任意選択的に対象１個体当たり２０，０００個以下の形質細胞、任意選択的に対象１個体当たり１０，０００個以下の形質細胞、任意選択的に対象１個体当たり８，０００個以下の形質細胞、任意選択的に対象１個体当たり６，０００個以下の形質細胞、任意選択的に対象１個体当たり５，０００個以下の形質細胞、任意選択的に対象１個体当たり４，０００個以下の形質細胞任意選択的に対象１個体当たり３，０００個以下の形質細胞であることも可能であり、任意選択的に対象１個体当たり約２，２００個の形質細胞である、ＭＲＤのＭＲＩ検出閾値を有する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記検出するステップが、前記標的化ナノ粒子コンジュゲートを投与する前記ステップの約１時間以内に実施され、任意選択的に、前記標的化ナノ粒子コンジュゲートを投与する前記ステップの約３０分以内に実施される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記標的化ナノ粒子コンジュゲートが、前記標的化ナノ粒子コンジュゲートを投与する前記ステップの３０分後に、約７０％のＭＭ細胞に結合している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記標的化ナノ粒子コンジュゲートが、脊椎、大腿骨、他の骨および／または脾臓で検出される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記標的化ナノ粒子コンジュゲートの腫瘍取込みが、適切な対照非標的化ナノ粒子に比べて向上している、請求項１９記載の方法。
【請求項２９】
前記対象におけるＭＭおよび／またはＭＲＤの存在および／または局在化を検出することが、ＭＭ療法、任意選択的に、抗ＣＳ１剤または抗ＢＣＭＡ剤の投与を含む療法を査定するために使用される、請求項１９に記載の方法であって、前記標的化ナノ粒子コンジュゲートが、ＭＭ療法と組み合わせて投与される、方法。
【請求項３０】
前記対象が、ヒトである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記対象が、ネズミである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が、ＭＲＤモデルマウスであり、任意選択的に、前記ＭＲＤモデルマウスが、ボルテゾミブおよびメルファランの投与によって誘導される、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
異種移植片由来のＭＭが、ＳＣＩＤ／ベージュマウスにおいて検出される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象におけるＭＭおよび／またはＭＲＤの存在および／または局在化を検出することが、ＭＧＵＳからＳＭＭへの疾患進行を検出すること、ならびに／または、早期腫瘍および／もしくは髄外ＭＭ疾患を検出することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３５】
前記検出するステップが、ガドリニウムを検出すること、任意選択的に、Ｇｄ１５５の濃度を検出することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３６】
複数の共役部位を含むナノ粒子と、
抗ＢＣＭＡ抗体と
を含む、標的化ナノ粒子コンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
【０００２】
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）項により、２０１７年６月１４日に出願された米国仮出願第６２／５１９，６４３号および２０１７年６月２６日に出願された米国仮特許出願第６２／５２４，９５２号の優先権の利益を主張するものであり、これらの米国仮特許出願のそれぞれは、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【０００３】
本発明は、一般に、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）標的化組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
最小残存病変（ＭＲＤ）の効果的な診断は、がんの管理と治療反応のモニタリングにおいて決定的な役割を担うものである。多発性骨髄腫（ＭＭ）患者のＭＲＤのレベルは、治療に対する反応の程度と、長期的なアウトカムとの両方に直接関連付けられている。本明細書において記述されている本発明に先立って、改善されたＭＭの検出および治療、特に、ＭＭ患者におけるＭＲＤの存在という観点において改善されたＭＭの検出および治療を可能にする改良型の造影剤の開発が切実に必要とされていた。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、既存のナノ粒子に比較して向上したイメージング効果を有するＢＣＭＡ標的化ナノ粒子を含むＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）標的化組成物を包含するＢ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）標的化組成物に関し、さらには、ＢＣＭＡ標的化組成物が有用となる特徴、疾患および状態（例、多発性骨髄腫）の研究、診断、および治療の方法にも関する。
【０００６】
本発明は少なくとも部分的に、形質細胞の細胞表面受容体を特異的に標的とする非侵襲性イメージング用組成物および技法を特定したことに基づく。このような組成物および技法は、（バイオマーカー式検出によって）ＭＲＤを検出するのに特に有用であり、治療の進行および／またはアウトカムの迅速で無痛の評価も可能にし、同時に、使用者が、疾患に典型的な空間的不均一性を、例えば骨髄サンプリング、フローサイトメトリーおよび／または分子研究によって査定することが難しい場合において、当該の空間的不均一性を説明できるようにもする。本明細書においては、モノクローナル抗Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）に共役したシリカ主体型ガドリニウムナノ粒子（ＮＰ）を含む、細胞表面ターゲティング組成物の識別が記述される。ＮＰは、細胞、組織または対象におけるＭＭ治療に対する治療反応をモニタリングし、細胞、組織および／またはＭＭ対象における最小残存病変ＭＲＤの存在を査定するのに有用なバイオマーカーである、ＢＣＭＡ細胞表面受容体のインビボ磁気共鳴映像法のために使用される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
厳密には、本明細書においては、ナノ粒子と、リンカーと、抗ＢＣＭＡ抗体、例えば抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体とを含む、標的化ナノ粒子コンジュゲートが、記述されている。特定の実施形態において、標的化ナノ粒子コンジュゲートのナノ粒子は、１０ｎｍ未満、例えば９ｎｍ未満、８ｎｍ未満、７ｎｍ未満、６ｎｍ未満、５ｎｍ未満、４ｎｍ未満、３ｎｍ未満、２ｎｍ未満または１ｎｍ未満のサイズである。例示的なナノ粒子は、ガドリニウムナノ粒子を含む。例えば、ナノ粒子は、シリカ主体型ガドリニウムナノ粒子（ＳｉＧｄＮＰ）を含む。場合によっては、例えば、コンジュゲートが、ポリマーブラシナノ粒子、または、クラスター化して規則的にスペーサー配列が入ったパリンドローム構造のリピート配列（ＣＲＩＳＰＲ：ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ  ｓｈｏｒｔ  ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  ｒｅｐｅａｔ）による機構（すなわち、ｓｇＲＮＡガイドおよび／またはＣａｓ９  ｍＲＮＡ）を用いる型の作用物質を含むナノ粒子を含む、実施形態においては、ナノ粒子は、３０ｎｍ以上（例えば、５０ｎｍ以下、４０ｎｍ以下、３５ｎｍ以下、３４ｎｍ以下、３３ｎｍ以下、３２ｎｍ以下、３１ｎｍ以下、３０ｎｍ以下、１０〜５０ｎｍ、１５〜４５ｎｍ、２０〜４０ｎｍ、２５〜３５ｎｍ、２０〜３０ｎｍ等）のサイズにまで及び得る。より大きなナノ粒子は分解し、これにより、毒性が最小化されると考えられている。
【０００８】
一態様において、ナノ粒子は、ポリマーナノ粒子を含む。任意選択的に、標的化ナノ粒子コンジュゲートは、薬物をさらに含む。代替的には、ナノ粒子は、無機ナノ粒子を含む。場合によっては、標的化ナノ粒子コンジュゲートは、約６〜１５ｎｍのサイズであり、任意選択的に約８〜１２ｎｍのサイズであり、任意選択的に、標的化ナノ粒子コンジュゲートのサイズは、長期間にわたって安定であり、任意選択的に、標的化ナノ粒子コンジュゲートのサイズは、１５分以上、３０分以上、１時間以上、２時間以上、４時間以上、８時間以上、１日以上、２日以上、３日以上または１週間以上の期間にわたって安定である。他の実施形態において、標的化ナノ粒子コンジュゲートは、約１５〜６０ｎｍのサイズであり、任意選択的に約２０〜５０ｎｍのサイズであり、任意選択的に約３０〜５０ｎｍのサイズであり、任意選択的に約３５〜４５ｎｍのサイズであり、任意選択的に４０ｎｍのサイズであり、任意選択的に、標的化ナノ粒子コンジュゲートのサイズは、長期間にわたって安定であり、任意選択的に、標的化ナノ粒子コンジュゲートのサイズは、１５分以上、３０分以上、１時間以上、２時間以上、４時間以上、８時間以上、１日以上、２日以上、３日以上または１週間以上の期間にわたって安定である。
【０００９】
例示的なリンカーには、ホモ二官能性アミン−アミンリンカー（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）−ＮＨＳ）リンカーと、ヘテロ二官能性アミン−スルフィドリル（ＮＨＳ−ハロアセチル、ＮＨＳ−マレイミド、ＮＨＳ−ピリジルジチオール）リンカーとが挙げられる。理論に拘束されることを望むわけではないが、特定の実施形態において、ＮＨＳリンカーは、本開示のポリマーおよび／またはＮＰに共役し、次に、ＮＨＳリンカーは、本開示の抗体にも結合し、このとき、この後に挙げた方の結合は、例えば、ＮＨＳ、チオール、マレイミドまたはハロアセチルを介して起きる。適切な抗ＢＣＭＡ抗体は、モノクローナル抗体またはモノクローナル抗体のフラグメントを含む。例えば、抗ＢＣＭＡ抗体は、ヒトモノクローナル抗体またはヒトモノクローナル抗体のフラグメントを含む。例示的な抗ＢＣＭＡ抗体フラグメントには、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）および抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体が挙げられる。
【００１０】
場合によっては、抗ＢＣＭＡ抗体は、標識されている。例えば、抗ＢＣＭＡ抗体は、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体（ＰｅｒＣＰ）／Ｃｙ５．５で標識されている。
【００１１】
一態様において、標的化ナノ粒子コンジュゲートは、遊離ＮＨＳ基で修飾されたナノ粒子核を含む。任意選択的に、ＮＨＳ基は、ビススルホスクシンイミジルスベレート架橋剤を介して抗ＢＣＭＡ抗体の表面に共役している。
【００１２】
場合によっては、ナノ粒子コンジュゲートは、薬物部分をさらに含む。例えば、薬物部分は、抗ＣＳ１抗体もしくは抗ＣＳ１薬（例えば、エロツザマブ）または抗ＣＤ３８抗体もしくは抗ＣＤ３８薬（例えば、ダラツムマブ）である。
【００１３】
本明細書に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲートを含む製剤も、提供される。好ましくは、標的化ナノ粒子コンジュゲートは、ＳｉＧｄＮＰ１グラム当たり０．１〜１ｍｇに相当する用量、例えば、ＳｉＧｄＮＰ１グラム当たり約０．２ｍｇ、約０．３ｍｇ、約０．４ｍｇ、約０．５ｍｇ、約０．６ｍｇ、約０．７ｍｇ、約０．８ｍｇまたは約０．９ｍｇに相当する用量で存在する。例えば、標的化ナノ粒子コンジュゲートは、ＳｉＧｄＮＰ１グラム当たり約０．２５ｍｇ／ｇに相当する用量で存在する。
【００１４】
本明細書に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲートおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物も、提供される。
【００１５】
対象における多発性骨髄腫（ＭＭ）および／または最小残存病変（ＭＲＤ）の存在および／または局在化を検出するための方法は、本明細書に記載の標的化ナノ粒子コンジュゲートを対象に投与することと、対象における標的化ナノ粒子コンジュゲートの存在および／または局在化を検出することと、これにより、対象におけるＭＭおよび／またはＭＲＤの存在および／または局在化を検出することとによって実施される。特定の実施形態において、投与するステップは、注射によって実施され、任意選択的に、静脈内注射または腹腔内注射によって実施される。
【００１６】
例えば、検出するステップは、磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）によるスキャンの利用を含む。一態様において、標的化ナノ粒子コンジュゲートは、対象におけるＭＭ細胞および／またはＭＲＤの検出のためのイメージングバイオマーカーとして作用する。場合によっては、標的化ナノ粒子コンジュゲート、例えばＢＣＭＡ標的ＮＰは、適切な非ナノ粒子、例えばＢＣＭＡ標的化されていないＮＰに比較して、少なくとも５倍、任意選択的に少なくとも１０倍、任意選択的に約１２倍以上改善されたコントラストをもたらす。例えば、標的化ナノ粒子コンジュゲートは、適切な非標的化ＮＰ対照に比較して、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも１１倍、少なくとも１２倍、少なくとも１３倍、少なくとも１４倍、少なくとも１５倍、少なくとも１６倍、少なくとも１７倍、少なくとも１８倍、少なくとも１９倍または少なくとも２０倍以上改善されたコントラストをもたらす。場合によっては、信号対雑音比（ＳＮＲ）および正規化されたＳＮＲは、式（１）および（２）に従って計算される。（１）ＳＮＲ＝強度／ノイズ。（２）正規化されたＳＮＲ（ｉ）＝ＳＮＲ（ｉ）／ＳＮＲｂａｓｅｌｉｎｅ。理論に拘束されることを望むわけではないが、本開示の標的化ＮＰの向上した造影属性は、本明細書に記載の抗ＢＣＭＡ抗体の堅牢な細胞標的化効果に起因すると考えられている。非標的および／または受動的標的化ＮＰは大抵の場合血管新生によって腫瘍細胞を対象とするが、このような非標的および／または受動的標的化ＮＰは、形質細胞を標的とせず、これにより、対象にある健康な組織内に「ノイズ」（例えば、より拡散しやすいイメージングシグナル）を生成する。
【００１７】
特定の実施形態において、標的化ナノ粒子コンジュゲートは、対象１個体当たり１００，０００個以下の形質細胞であることが可能であり、任意選択的に対象１個体当たり５０，０００個以下の形質細胞、任意選択的に対象１個体当たり３０，０００個以下の形質細胞、任意選択的に対象１個体当たり２０，０００個以下の形質細胞、対象１個体当たり１０，０００個以下の形質細胞、対象１個体当たり８，０００個以下の形質細胞、対象１個体当たり６，０００個以下の形質細胞、対象１個体当たり５，０００個以下の形質細胞、対象１個体当たり４，０００個以下の形質細胞、対象１個体当たり３，０００個以下の形質細胞であることも可能であり、任意選択的に対象１個体当たり約２，２００個の形質細胞であることも可能であり、例えば、任意選択的に（対象がマウスである場合において）対象１個体当たり２，２００±４５０個の形質細胞であることも可能である、ＭＲＤのＭＲＩ検出閾値を有する。
【００１８】
場合によっては、検出するステップは、標的化ナノ粒子コンジュゲートを投与するステップの約１時間以内に実施され、任意選択的に標的化ナノ粒子コンジュゲートを投与するステップの約３０分以内に実施される。他の場合において、検出のステップは、標的化ナノ粒子コンジュゲートを投与するステップから５分以内、１０分以内、１５分以内、２０分以内、２５分以内、３０分以内、３５分以内、４０分以内、４５分以内、５０分以内、５５分以内、６０分以内、６５分以内、７０分以内、７５分以内、８０分以内、８５分以内、または９０分以内に実施される。
【００１９】
特定の他の実施形態では、検出するステップは、標的化ナノ粒子コンジュゲートを投与するステップから約１２〜４８時間以内に実施され、任意選択的に、標的化ナノ粒子コンジュゲートを投与するステップから約３６時間以内に実施され、任意選択的に、標的化ナノ粒子コンジュゲートを投与するステップから約３５時間以内、約３４時間以内、約３３時間以内、約３２時間以内、約３１時間以内、約３０時間以内、約２９時間以内、約２８時間以内、約２７時間以内、約２６時間以内、約２５時間以内、約２４時間以内、約２３時間以内、約２２時間以内、約２１時間以内、約２０時間以内、約１９時間以内、約１８時間以内、約１７時間以内、約１６時間以内、約１５時間以内、約１４時間以内、約１３時間以内、約１２時間以内、約１１時間以内、約１０時間以内、約９時間以内、約８時間以内、約７時間以内、約６時間以内、約５時間以内、約４時間以内、約３時間以内または約２時間以内に実施される。
【００２０】
一態様において、標的化ナノ粒子コンジュゲートは、標的化ナノ粒子コンジュゲートを投与するステップから３０分後に、ＭＭ細胞の約７０％に結合している。別の態様において、標的化ナノ粒子コンジュゲートは、ＭＭ細胞の少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％に結合している。
【００２１】
任意選択的に、標的化ナノ粒子コンジュゲートは、脊椎、大腿骨、他の骨および／または脾臓で検出される。
【００２２】
好ましくは、本明細書において、標的化ナノ粒子コンジュゲートの腫瘍取込みは、適切な対照非標的化ナノ粒子に比べて向上している。
【００２３】
一態様において、対象におけるＭＭおよび／またはＭＲＤの存在および／または局在化の検出は、ＭＭ療法を査定するために使用される。例えば、治療は、抗ＣＳ１抗体または抗ＣＳ１薬（例えば、エロツザマブ）または抗ＣＤ３８抗体または抗ＣＤ３８薬（例えば、ダラツムマブ）の投与を含む。別の例において、標的化ナノ粒子コンジュゲートは、ＭＭ療法と組み合わせて投与される。
【００２４】
好ましくは、対象は、ヒトである。代替的には、対象は、ネズミである。例えば、対象は、ＭＲＤモデルマウスです。任意選択的に、ＭＲＤモデルマウスは、ボルテゾミブとメルファランの投与によって誘導される。一態様において、異種移植片に由来したＭＭは、重傷複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）／ベージュマウスで検出されます。
【００２５】
場合によっては、対象におけるＭＭおよび／またはＭＲＤの存在および／または局在化を検出することは、意義不明の単クローン性ガンマグロブリン血症（ＭＧＵＳ）からくすぶり型多発性骨髄腫（ＳＭＭ）への疾患の進行を検出すること、ならびに／または、早期腫瘍および／または髄外ＭＭ疾患を検出することを含む。
【００２６】
一態様において、検出するステップは、ガドリニウムを検出することを含む。例えば、検出ステップは、Ｇｄ１５５濃度を検出することを含む。
【００２７】
複数の共役部位を含むナノ粒子と、抗ＢＣＭＡ抗体とを含む、標的化ナノ粒子結合体も提供される。
定義
【００２８】
本明細書において使用されているとき、明示的に記載されていない限り、または文脈から明らかでない限り、「約」という用語は、当技術分野において通常の許容差の範囲に収まるものとして解されており、例えば、平均に対して２つある標準偏差に収まるものとして解される。「約」は、記載された値に対して１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、０．５％以内、０．１％以内、０．０５％以内または０．０１％以内と解することができる。そうではないことが文脈から明らかでない限り、本明細書において提供されているすべての数値は、「約」という用語によって修飾されている。
【００２９】
「作用物質」は、何らかの小さな化合物、抗体、核酸分子もしくはポリペプチドまたはこれらのフラグメントを意味する。
【００３０】
本明細書において使用されている「抗体」（Ａｂ）という用語は、所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）および抗体フラグメントを含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書においては、「抗体」と互換的に使用される。本明細書において使用されている「抗体」という用語は、免疫学的に特異的な種々のタンパク質を指し得る。「抗体分子」という用語の範囲には含まれないが、本発明は、「抗体アナログ」、他の非抗体分子タンパク質を主体とした足場、例えば、特異的な抗原結合をもたらすにＣＤＲを使用する改変結合タンパク質、融合タンパク質および／または免疫複合体も含む。「抗体」という用語は、合成および遺伝子操作された変異体も含む。
【００３１】
「単離抗体」は、その自然環境の成分から分離および／または回収されたものである。その自然環境の汚染物質成分は、抗体の診断的または治療的な使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性溶質がを含み得る。好ましい実施形態では、抗体は、（１）ローリー法によって判定したときに抗体に対して９５重量％超、最も好ましくは９９重量％超に精製され；（２）スピニングカップシーケネーターの使用によって、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度に精製され；または、（３）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用して、還元条件または非還元条件下において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。単離された抗体は、抗体の自然環境にある少なくとも１種の成分が存在しないため、組換え細胞内に、インサイチューで抗体を含む。しかしながら、通例では、単離された抗体は、少なくとも１つの精製ステップによって調製される。
【００３２】
基本的な４鎖抗体ユニットは、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、ヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、５つの基本的なヘテロ四量体ユニット、およびＪ鎖と呼ばれるさらなるポリペプチドからなり、したがって、１０個の抗原結合部位を含むが、分泌されたＩｇＡ抗体を重合して、Ｊ鎖と一緒になった２〜５個の基本的な４鎖ユニットを含む多価集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは、一般に、約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１個の共有ジスルフィド結合によってＨ鎖に結合されており、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて、１個以上のジスルフィド結合によって互いに結合されている。各Ｈ鎖およびＬ鎖には、規則的に間隔を空けられた、鎖内ジスルフィド架橋もある。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に、可変ドメイン（ＶＨ）を有し、後続して、α鎖およびγ鎖のそれぞれに３つの定常ドメイン（ＣＨ）を有し、μアイソタイプおよびεアイソタイプに４つのＣＨドメインがあります。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、後続して、他方の端部にある定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬはＶＨとアラインされ、ＣＬは、重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）とアラインされている。特定のアミノ酸残基は、軽鎖の可変ドメインと重鎖の可変ドメインとの間に界面を形成すると考えられています。ＶＨとＶＬが一緒になってペアを形成することにより、単一の抗原結合部位が形成される。異なるクラスの抗体の構造と特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ  Ｉ．Ｔｅｒｒ  ａｎｄ  Ｔｒｉｓｔｒａｍ  Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（ｅｄｓ．），Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，ｐａｇｅ  ７１，ａｎｄ  Ｃｈａｐｔｅｒ  ６を参照されたい。
【００３３】
脊椎動物種のＬ鎖には、その定常ドメイン（ＣＬ）のアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる種類のうちの一方を割り当てることができる。重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンには、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンには、それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と呼ばれる重鎖を有する、５つのクラスの免疫グロブリン、すなわち、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在する。γクラスおよびαクラスは、ＣＨの配列および機能が相対的にわずかに異なることに基づいて、サブクラスにさらに分割されており、例えば、ヒトは、次のサブクラスを表す：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２。
【００３４】
「可変」という用語は、Ｖドメインに属する特定のセグメントの配列が、抗体ごとに大幅に異なることを指す。Ｖドメインは、抗原結合を仲介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を規定する。しかしながら、可変性は、可変ドメインにある１１０個のアミノ酸スパンに均一に分配されていない。実際、Ｖ領域は、それぞれがアミノ酸９〜１２個分の長さである「超可変領域」と呼ばれる極端な可変性を有する短い領域で区切られている１５〜３０個のアミノ酸からできた、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の区間からなる。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、４つのＦＲを含み、大抵の場合においては、３つの超可変領域によって連結されたβシート構成になっており、これらの３つの超可変領域は、βシート構造を連結し、場合よっては、βシートの一部分を形成する。各鎖中の超可変領域は、ＦＲによって、近接した状態で一緒に保持されており、他方の鎖の超可変領域と一緒になって、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい。）。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与等、様々なエフェクター機能を示す。
【００３５】
本明細書において使用されている「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」のアミノ酸残基を含み（例えば、Ｋａｂａｔ付番体系に従って番号付けした場合において、ＶＬでは、おおよそ残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）の辺り、ならびに、ＶＨでは、おおよそ残基３１〜３５（Ｈ１）、残基５０〜６５（Ｈ２）および残基９５〜１０２（Ｈ３）の辺り；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））；ならびに／または、「超可変ループ」の残基（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ付番体系に従って番号付けした場合において、ＶＬでは、残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）、ならびに、ＶＨでは、残基２６〜３２（Ｈ１）、５２〜５６（Ｈ２）および９５〜１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含み；ならびに／または、「超可変ループ」／ＣＤＲの残基（例えば、ＩＭＧＴ付番体系に従って番号付けした場合において、ＶＬでは、残基２７〜３８（Ｌ１）、５６−６５（Ｌ２）および１０５〜１２０（Ｌ３）、ならびに、ＶＨでは、残基２７〜３８（Ｈ１）、５６〜６５（Ｈ２）および１０５〜１２０（Ｈ３）；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２７：２０９−２１２（１９９９），Ｒｕｉｚ、Ｍ．ｅ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２１９−２２１（２０００））を含む。任意選択的に、抗体には、ＡＨｏ；Ｈｏｎｎｅｇｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｐｌｕｎｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０９：６５７−６７０（２００１））に従って番号付けした場合において、ＶＬ中におけるポイント２８、３６（Ｌ１）、６３、７４〜７５（Ｌ２）および１２３（Ｌ３）、ならびに、ＶＨ中におけるポイント２８、３６（Ｈ１）、６３、７４−の７５（Ｈ２）および１２３（Ｈ３）のうちの１つ以上に、対称的な挿入がある。
【００３６】
本明細書において使用されている「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の母集団から得られた抗体を指しており、つまりは、母集団を構成する個々の抗体は、少量存在してもよい自然発生的で可能性としてはあり得る変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、特異性が高いものであり、単一の抗原部位を対象とする。さらに、異なる決定基（エピトープ）を対象とした異なる抗体を含むポリクローナル抗体の調製とは著しく異なり、各モノクローナル抗体は、抗原にある単一の決定基を対象とする。特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体に汚染されることなく合成できるという点でも有利である。「モノクローナル」という修飾語は、何らかの特定の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈すべきでない。例えば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ法によって調製することもできるし、または、細菌、真核生物もしくは植物の細胞における組換えＤＮＡ法を使用して作製することもできる（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい。）。「モノクローナル抗体」は、例えばＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）において記述された技法を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００３７】
モノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部分は、特定の種に由来した抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中にある対応配列と同一または相同であるが、鎖の残り部分は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来した抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、およびこのような抗体のフラグメント中にある対応配列と同一または相同である、「キメラ」抗体を含む（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。ヒト抗体に由来した可変ドメイン抗原結合配列も用意される。したがって、本明細書において主に着目するキメラ抗体は、１つ以上のヒト抗原結合配列（例えばＣＤＲ）を有し、非ヒト抗体に由来した１つ以上の配列、例えばＦＲまたはＣ領域配列を含有する、抗体を含む。さらに、本明細書において主に着目するキメラ抗体は、１つの抗体クラスまたはサブクラスに属するヒト可変ドメイン抗原結合配列と、別の抗体クラスまたはサブクラスに由来した別の配列、例えばＦＲまたはＣ領域配列を含むものを含む。本明細書において着目するキメラ抗体は、本明細書に記載の配列に関連付けられた可変ドメイン抗原結合配列を含有するキメラ抗体、または非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿等）等の異なる種に由来した可変ドメイン抗原結合配列を含むものも含まれる。キメラ抗体は、霊長類化抗体およびヒト化抗体も包含する。さらに、キメラ抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体に見受けられない残基を含んでもよい。これらの改質は、抗体の性能をさらに改良するために実施される。さらなる詳細に関しては、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００３８】
一般に、「ヒト化抗体」は、非ヒト型の供給源から１個以上のアミノ酸残基が導入されたヒト抗体であると考えられる。これらの非ヒトアミノ酸残基は「移入」残基と呼ばれることが多く、「移入」残基は、一般的に、「移入」可変ドメインから取り出される。慣例的に、ヒト化は、Ｗｉｎｔｅｒ  ａｎｄ  ｃｏ−ｗｏｒｋｅｒｓ（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従って、ヒト抗体の対応する配列を移入超可変領域配列に置き換えることによって、実施される。したがって、このような「ヒト化」抗体は、完全な状態のヒト可変ドメインの場合におけるものより大幅に少ないものが、非ヒト型の種に由来した対応する配列によって置換されている、キメラ抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）である。
【００３９】
「ヒト抗体」は、ヒトによって自然に産生された抗体中に存在する配列のみを含有する、抗体である。しかしながら、本明細書において使用されているとき、ヒト抗体は、本明細書において記述された修飾および変異体配列を含む、天然に存在するヒト抗体には見受けられない残基または修飾を含んでもよい。これらは、一般的には、抗体の性能をさらに改良または向上するために実施される。
【００４０】
抗体の「機能的フラグメントまたは類似体」という語句は、完全長抗体と共通する定性的な生物学的活性を有する化合物である。例えば、抗ＩｇＥ抗体の機能的フラグメントまたは類似体は、当該分子が高親和性受容体ＦｃεＲＩに結合する能力を有することが可能な度合いをなくし、または大幅に低下させるような方法で、ＩｇＥ免疫グロブリンに結合できるものである。
【００４１】
「抗体フラグメント」という用語は、完全な状態の抗体が結合することになる抗原（例えば、ＢＣＭＡ）を拘束する完全な状態の抗体の一部分を構成する、完全な状態の抗体以外の分子を意味する。抗体フラグメントの例には、限定されるわけではないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）および抗体フラグメントが挙げられる。
【００４２】
本方法において使用される抗体は、抗体結合部分（例えば、蛍光および／または色素標識、例えばＣｙ５）の検出によって、または免疫学的に検出することができる。すなわち、試料中における抗体の存在は、間接ＥＬＩＳＡに見受けられ得る様式で標識された抗ＩｇＧ抗体等の抗−抗体、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）によって検出することができる。他の酵素も同様に使用することができる。これらの他の酵素には、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼおよびカタラーゼが挙げられる。幅広く選択される基質を、ＨＲＰまたはＡＰコンジュゲートを用いてＥＬＩＳＡを実施するために利用することができる。基質の選択は、必要なアッセイ感受性と、信号検出に使用可能な計装（分光光度計、蛍光光度計または照度計）とに依存する。
【００４３】
特定の実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、そうではないと記載されていない限り、または文脈から明らかでない限り、記載された基準値に対していずれの方向（基準値より大きい方向または基準値より小さい方向）にも２５％以下、２０％以下、１９％以下、１８％以下、１７％以下、１６％以下、１５％以下、１４％以下、１３％以下、１２％以下、１１％以下、１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下または１％以下に収まるある範囲の値を指す（このような数が、可能な値に対して１００％を超えることになる場合は除く）。
【００４４】
「投与」という用語は、物質を対象に導入することを指す。一般に、例えば、非経口投与（例えば、静脈内投与）、経口投与、局所投与、皮下投与、経腹膜投与、動脈内投与、吸入、経膣投与、径直腸投与、経鼻投与、脳脊髄液への導入または体内の区画への点滴を包含する任意の投与経路が利用され得る。一部の実施形態において、投与は経口投与である。さらにはまたは代替的には、一部の実施形態において、投与は、非経口投与である。一部の実施形態において、投与は静脈内投与である。
【００４５】
「対照」または「参考」とは、比較標準を意味する。一態様において、本明細書で使用されているとき、「対照に比較して変化した」試料または対象は、通常の試料、未処理の試料または対照試料からの試料と統計的に異なるレベルを有するものだと解される。対照試料は、例えば、培養中の細胞、１匹以上の試験用実験動物または１人以上の人間の対象を含む。対照試料を選択および試験する方法は、当業者の能力に含まれる。分析物は、細胞または生物によってによって特徴的に発現または生成される自然発生物質（例えば抗体、タンパク質）であってもよいし、または、レポーターコンストラクトによって生成される物質（βガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼ等）であってもよい。検出のために使用される方法に応じて、変化の量および測定値は変化させることができる。統計的有意性、例えば、陽性結果を構成する平均からの標準偏差の数の決定は、当業者の能力の範囲に含まれる。
【００４６】
「検出する」とは、検出すべき薬剤（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）等の核酸分子）の存在、非存在、または量を確認することを指す。
【００４７】
「検出ステップ」は、核酸（例えば、メチル化ＤＮＡ）またはポリペプチドの存在を検出するための、様々な公知の方法のいずれを使用してもよい。プローブを使用できる種類の検出法には、ウエスタンブロット、サザンブロット、ドットまたはスロットブロットおよびノーザンブロットが挙げられる。
【００４８】
本明細書において使用されている「診断」という用語は、病状または症状の分類、病状の重症度（例えば、グレードまたはステージ）の判定、病状進行のモニタリング、病状のアウトカムの予測、および／または回復の見通しの決定を指す。
【００４９】
「フラグメント」は、ある一部分、例えば、ポリペプチドまたは核酸分子の一部分を意味する。この部分は好ましくは、基準用の核酸分子またはポリペプチドの全長に対して少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を含有する。例えば、フラグメントは、１０個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個、２００個、３００個、４００個、５００個、６００個、７００個、８００個、９００個もしくは１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有することができる。しかしながら、本発明は、当該ポリペプチドおよび核酸フラグメントが、完全長のポリペプチドおよび完全長の核酸のそれぞれに関して所望される生物学的活性を示す限り、ポリペプチドおよび核酸フラグメントも含む。ほとんどすべての長さの核酸フラグメントが使用される。例えば、数多くの本発明の実施実装には、全長が塩基対約１０，０００個分、約５０００個分、約３０００個分、約２，０００個分、約１，０００個分、約５００個分、約２００個分、約１００個分または約５０個分の長さ（中間にあるすべての長さを含める）である、例示的なポリヌクレオチドセグメントが含まれる。同様に、ほとんどすべての長さのポリペプチドフラグメントが使用される。例えば、数多くの本発明の実施実装には、全長がアミノ酸約１０，０００個分、約５，０００個分、約３，０００個分、約２，０００個分、約１，０００個分、約５，０００個分、約１，０００個分、約５００個分、約２００個分、約１００個分または約５０個分の長さ（中間にあるすべての長さを含める）である、例示的なポリペプチドセグメントが含まれる。
【００５０】
本明細書において使用されている「インビトロ」という用語は、多細胞生物内ではなく、人工的な環境下において起きる事象、例えば、細胞培養等のときに、多細胞生物の内部ではなく、試験管または反応容器の中で起きる事象を指す。
【００５１】
本明細書において使用されているとき、「インビボ」は、ヒトおよびヒト以外の動物等の多細胞生物の内部で起きる事象を指す。細胞をベースとした系との関連においては、この「インビボ」という用語は、（例えば、インビトロ系とは対照的に）生細胞内で起きる事象を指すために使用されることもある。
【００５２】
本明細書において使用されている「造影剤」という用語は、当該要素、分子、官能基、化合物、これらのフラグメントまたは部分が結合している作用物質（例えば多糖ナノ粒子）の検出を容易にする、任意の要素、分子、官能基、化合物、これらのフラグメントまたは部分を指す。造影剤の例には、限定されるわけではないが、ガドリニウム、例えばＧｄ１５５、様々なリガンド、放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１８Ｆ、１９Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１３５１、１２５Ｉ、１２３Ｉ、６４Ｃｕ、１８７Ｒｅ、ｍＩｎ、９０Ｙ、９９ｍＴｃ、１７７Ｌｕ、８９Ｚｒ等）が含まれるが、これらに限定されない、蛍光色素、化学発光剤（例えば、アクリジニウムエステルおよび安定化ジオキセタン等）、生物発光剤、スペクトル分解可能な無機蛍光半導体ナノ結晶（すなわち、量子ドット）、金属ナノ粒子（例えば、金、銀、銅、白金等）ナノクラスター、常磁性金属イオン、酵素（酵素の具体例については、下記を参照されたい。）、比色ラベル（例えば、染料およびコロイド金等）、ビオチン、ジオキシゲニン、ハプテン、および、抗血清またはモノクローナル抗体が利用可能なタンパク質が挙げられる。
【００５３】
「単離される」、「精製される」または「生物学的に純粋」という用語は、本来の状態で見られる通常それに付随する成分から様々な度合いで遊離した、物質を指す。「分離」は、元々の発生源または周囲のものからの分離の度合いを表す。「精製」は、単離よりも高い分離の度合いを表す。
【００５４】
「マーカー」は、疾患または障害に関連付けられた発現レベルまたは活性の変化を変える、任意のタンパク質またはポリヌクレオチドを意味する。
【００５５】
本明細書において使用されている「ナノ粒子」という用語は、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の直径を有する粒子を指す。一部の実施形態において、ナノ粒子は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎによって規定されたように、３００ｎｍ未満の直径を有する。一部の実施形態において、ナノ粒子は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって規定されたように、１００ｎｍ未満の直径を有する。任意選択的に、ナノ粒子は、５０ｎｍ未満、任意選択的に２５ｎｍ未満、任意選択的に２０ｎｍ未満、任意選択的に１５ｎｍ未満、任意選択的に１０ｎｍ未満および任意選択的に約５ｎｍ以下の直径を有する。一部の実施形態において、ナノ粒子は、典型的には空間またはコンパートメントを取り囲んで密閉する（例えば、ルーメンを画定する）両親媒性実体から構成されるミセル膜によってバルク溶液から分離された密閉コンパートメントを含むという点で、ミセルである。一部の実施形態において、ミセル膜は、例えば生体適合性および／または生分解性ポリマー等の少なくとも１種のポリマーから構成される。
【００５６】
本明細書において使用されている「対象」という用語は、ヒトおよびほ乳類（例えば、マウス、ラット、ブタ、ネコ、イヌおよびウマ）を含む。数多くの実施形態において、対象は、ほ乳類、特に霊長類、特にヒトである。一部の実施形態において、対象は、畜牛、ヒツジ、ヤギ、雌牛およびブタ類等の家畜、ニワトリ、アヒル、ガチョウおよびシチメンチョウ等の家禽ならびに家畜化された動物、特にイヌおよびネコ等のペットである。一部の実施形態において（特定すると、例えば研究の文脈において）、対象ほ乳類は、例えば、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、ウサギ、霊長類または近交系のブタ等のブタ類である。
【００５７】
本明細書において使用されているとき、明示的に記載されていない限り、または文脈から明らかでない限り、「または」という用語は、包括的なものであると解される。本明細書において使用されているとき、明示的に記載されていない限り、または文脈から明らかでない限り、「１つの」、「一」、および「前記」という用語は、単数または複数であると解される。
【００５８】
「薬学的に許容される担体」という語句は、当技術分野で認識されており、本発明の化合物をほ乳類に投与するのに適した薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを含む。担体は、ある器官または身体の一部分から別の器官または身体の一部への対象薬剤の運搬または輸送に関与する液体または固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料を含む。各担体は、製剤の他の成分と適合し、患者にとって有害でないという意味で「許容される」ものでなければなりません。薬学的に許容される担体として機能し得る材料のいくつかの例には、次のものが挙げられる：ラクトース、グルコースおよびスクロース等の糖；コーンスターチおよびポテトスターチ等のスターチ；セルロースならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース等のセルロース誘導体；粉末トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；カカオバターや座薬ワックス等の賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、大豆油等の油；プロピレングリコール等のグリコール；グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール等のポリオール；エチルオレエートおよびエチルラウレート等のエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム等の緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；ならびに医薬製剤に使用される他の非毒性適合物質。
【００５９】
本明細書において、範囲は、「約」が付いた特定の１つの値を起点にし、および／または「約」が付いた別の特定の値に至るまでのものとして表され得る。このような範囲が表されている場合、別の態様は、特定の１つの値を起点にし、および／または他の特定の値に至るまでを含む。同様に、「約」という先行詞を使用して値が近似値として表されている場合、特定の値は、別の態様を形成すると解される。さらに、各範囲の終点は、他の終点との関係で重要であるとも解されるし、他の終点とは無関係に重要であるとも解される。さらに、本明細書においてはいくつかの値が開示されており、各値は、その値自体に加えて、「約」が付いた当該の特定の値としても本明細書において開示されていると解される。さらに、本出願の全体を通して、データは、いくつかの相異なる形式で提供されており、このデータは、データポイントの任意の組み合わせに関する終点、開始点およびの範囲を表すと解される。例えば、特定のデータポイント「１０」および特定のデータポイント「１５」が開示されている場合、１０〜１５に加えて、１０超および１５超、１０以上および１５以上、１０未満および１５未満、１０以下および１５以下ならびに１０および１５も開示されていると考えられる。特定の２つの単位の間にあるそれぞれの単位も、同様に開示されていると解される。例えば、１０と１５が開示されている場合、１１、１２、１３および１４も同様に開示されている。
【００６０】
本明細書において提示された範囲は、当該範囲に含まれるすべての値の簡略表記であると解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０、ならびに、例えば１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８および１．９等、前述の整数の間に介在するすべての少数の値からなる群のうちの任意の数、数の組み合わせまたは部分範囲を含むと解される。部分範囲に関しては、範囲のいずれかの終点から広がって行く「入れ子の関係にある部分」が明確に想定される。例えば、１〜５０の例示的な範囲の入れ子の関係にある部分範囲は、一方の方向に向かって、１〜１０、１〜２０、１〜３０および１〜４０を含み得、または、他方の方向に向かって、５０〜４０、５０〜３０、５０〜２０および５０〜１０を含み得る。
【００６１】
本明細書において使用されている「治療」（同様に「治療する」または「治療している」）という用語は、特定の疾患、障害および／もしくは状態に関する１種以上の症状特徴、および／または原因の発生を、部分的にまたは完全に緩和、改善、回復、阻害、発症の遅延、重症度の軽減、および／または軽減する、何らかの物質の投与を指す。このような治療は、関係のある疾患、障害および／もしくは状態に関する徴候を示さない対象の治療であってもよいし、ならびに／または、疾患、障害および／または状態に関する初期の徴候のみを示す対象の治療であってもよい。代替的にはまたはさらには、このような治療は、関係のある疾患、障害および／または状態に関する１種以上の所定の徴候を呈する対象に対するものであり得る。一部の実施形態において、治療は、関連する疾患、障害および／または状態に罹患していると診断された対象の治療であり得る。一部の実施形態において、治療は、関連する疾患、障害および／または状態に関する発症リスクの増加と統計学的に相関する、１種以上の感受性因子を有することが知られた対象に対するものであり得る。
【００６２】
「包含する」、「含む」または「によって特徴付けられる」と同義である「備える」という移行句は、包括的または非制限的なものであり、言及されていないさらなる要素または方法ステップを排除しない。対照的に、「からなる」という移行句は、請求項において指定されていないあらゆる要素、ステップまたは原材料を排除する。「から本質的になる」という移行句は、クレームの範囲を、クレームされた発明の「基本的かつ新規な特性に実質的に影響を与えない」特定の材料またはステップに限定する。
【００６３】
本発明の他の特徴および利点は、好ましい実施形態に関する下記の説明および特許請求の範囲から明らかになる。そうではないと規定されていない限り、本明細書において使用されているすべての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記述されたものと類似または等価な方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料は、下記に記述されている。本明細書において引用したすべての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に引用されたアクセス番号によって示されたＧｅｎｂａｎｋおよびＮＣＢＩによる提出物は、参照により本明細書に組み込む。本明細書において引用した他のすべての公開された参考文献、文書、原稿および科学文献も、参照により本明細書に組み込む。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は説明用のものにすぎず、限定を加えるものとして意図されていない。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】図１Ａから図１Ｊ。ＭＭ用として有用な標的化イメージング造影剤（バイオマーカー）の合理的な選択および設計を導き出した採用プロセスおよび得られた結果を示す。図１Ａは、分析したアキレスデータセット（Ａｃｈｉｌｌｅｓ  ｄａｔａｓｅｔ）から引き出した、患者の病期（それぞれＭＧＵＳ、ＳＭＭ、ＭＭおよび再発）に応じたＢＣＭＡおよびシグナル伝達リンパ球活性化分子Ｆ７（ＳＬＡＭＦ７）の発現レベルを比較したボルケーノプロットを示している。図１Ｂは、悪性形質細胞（例えば、ＢＣＭＡを細胞表面バイオマーカーとして発現する細胞）を標的とするモノクローナル抗体に対するガドリニウム主体型シリカナノ粒子（Ｇｄ−ＮＰ）のＮＨＳの化学反応を用いた、ホモ二官能性リンカー（緑色で表されている）を介した共役の概略図を示している。図１Ｃは、非共役形態であるナノ粒子（ＮＰ）、ならびに、Ｇｄ−ＮＰ（ＮＰ）と抗ＳＬＡＭＦ７抗体とのナノ粒子−抗体複合体（ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７）およびＧｄ−ＮＰ（ＮＰ）と抗ＢＣＭＡ抗体とのナノ粒子−抗体複合体（ＮＰ−ＢＣＭＡ）の状態であるナノ粒子（ＮＰ）を対象にして観察された、流体力学的サイズを示している（トレースは、左側から右側に向かっている。）。図１Ｄは、７Ｔ  ＭＲＩ装置を使用して査定された、各ＮＰ含有組成物を対象にして観察された対応する緩和度（ｒ１）の値を示している。図１Ｅは、フローサイトメトリーによって査定された、Ｃｙ５．５共役抗ＢＣＭＡ抗体と、Ｇｄ−ＮＰ（ＮＰ）またはＮＰ−ＢＣＭＡとを用いるＭＭ１．Ｓ細胞の競合標識を示しており、これにより、ＮＰコンジュゲートとしての抗ＢＣＭＡ抗体の組入れが、ＭＭ１．Ｓ細胞へのＳｉＧｄＮＰの結合を促進することが実証された。図１Ｆは、ＮＰ抗ＢＣＭＡコンジュゲートを投与したＤＡＰＩ染色形質細胞の表面における抗ＢＣＭＡ抗体（ＡＦ４８８シグナル）およびＧｄ−ＮＰ（Ｃｙ５結合シグナル）の共局在化が確認されており、したがって、このコンジュゲート組成物（ナノ粒子と共役した抗ＢＣＭＡを含む）が形質細胞核に対して効果的に標的化されたことも確認されている、蛍光共焦点イメージングを示している。バースケール＝５μｍ。図１Ｇは、移植および様々な造影剤の投与から１９日後における、ＭＲＩによるマウス中のＧＦＰ＋／Ｌｕｃ＋ＭＭ１．Ｓ細胞（矢印）のイメージングを示している（ｎ＝５匹マウス／群）。厳密には、画像は、最初にＭＭ１．ＳＧＦＰ＋／Ｌｕｃ＋細胞を静脈内注射して１９日間播種したマウスに関するものである。その後、ｎ＝５匹／群は、それぞれＭａｇｎｅｖｉｓｔ、ＮＰまたはモノクローナル抗体（抗ＳＬＡＭＦ７または抗ＢＣＭＡ）に共役したＮＰを用いてイメージングされた。矢印は、このようなマウスの脊椎へのＮＰモノクローナル抗体コンジュゲートの標的化を指し示している。図１Ｈは、骨髄中の形質細胞の存在を確認するために使用されたヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色、ならびに、ガドリニウム（Ｇｄ。矢印で強調されている）の存在を示したプルシアン染色を示している。スケールバー＝５０ｎｍ。図１Ｉは、ベースライン取得レベルに正規化された場合において、治療されたマウスの脊椎を対象にして経時的に観察された、正規化された信号対雑音比（ＳＮＲ）を示している。図１Ｊは、ＩＣＰ−ＭＳ（ｎ＝５／時点）による経時的なガドリニウム濃度の定量化（様々な臓器における、グラム当たりＧｄ注入用量の百分率（％ＩＤ／ｇ））によって査定されたときの、腫瘍を有さないマウスにおけるＮＰ−ＢＣＭＡの生体内分布の研究に関する結果を示している。図１Ｊの部分画像は、健康な各動物の脊椎および大腿骨において（遊離ＮＰから）観察されたガドリニウム（Ｇｄ）の量を示している。＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００５、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２】図２Ａから図２Ｌ。ＭＲＤ検出のための抗ＢＣＭＡ標的化イメージングバイオマーカー（ＮＰ−抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体コンジュゲート）の検証を示し、ＮＰ−ＢＣＭＡコンジュゲートのＭＲＩは、このような新規性のあるバイオマーカーとしての有用性を実証している。図２Ａから図２Ｃにおいては、動物には、ＭＭ１．ＳＧＦＰ＋／ＬＵＣ＋を静脈内注射し、生物発光イメージング（図２Ａ）、ＮＰ−ＢＣＭＡ注射から３０分後のＭＲＩ（図２Ｂ）またはＣＴスキャン（図２Ｃ）によって週に１回イメージングして、腫瘍負荷を可視化した（矢印）。２１日後（腫瘍細胞移植後２１日目）には、ボルテゾミブ（３×０．５ｍｇ／ｋｇ）およびメルファラン（５．５ｍｇ／ｋｇ）の治療を施行して、最小残存病変（ＭＲＤ）のモデルを誘導したが、ＭＲＤモデルは、２５日目に確立された。その後、マウスには、疾病負荷（ＭＲＤの実情）を追跡するために週に１回のイメージングを継続した。図２Ｄは、観察されたＢＬＩ信号強度の変化を示している。図２Ｅは、観察されたＭＲＩの信号対雑音比の変化を示している。図２Ｆは、ＣＴによる定量化および腫瘍の存在に関する査定の結果を示しており、具体的には、ＣＴ  ＳＮＲの変化を定量化して、腫瘍細胞の検出を査定した。図２Ｇは、イムノアッセイによってラムダ軽鎖レベルを定量化したときに得られた結果を示している。シャドーイングにより、９０％の信頼区間を区分けしている（ｎ＝５／群）。図２Ｈは、５週目に観察された受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を示しており、ＭＲＤの存在を検出するための４種のモダリティの感受性と特異性を比較している。破線は、識別能のない診断モダリティを表している（ＡＵＣ＝０．５０）。図２Ｉは、治療の経過にわたって観察された曲線下面積（ＡＵＣ）の比較、具体的には、４種の検出モダリティの感受性および特異性の比較を示している。図２Ｊは、各時点における、合計での形質細胞（ＧＦＰシグナル）およびＮＰ−ＢＣＭＡ結合形質細胞（Ｃｙ５．５シグナル）の百分率を描写した、フローサイトメトリーのヒストグラムを示している。図２Ｋは、指し示された時点において列挙および比較された（ｎ＝１群当たり３匹のマウス）、形質細胞の合計百分率を示している。図２Ｌは、指し示された時点で列挙および比較された（ｎ＝１群当たり３匹のマウス）、骨髄中におけるＮＰ−ＢＣＭＡ結合形質細胞の百分率を示している。
【図３】図３Ａから図３Ｄ。モノクローナル抗体へのガドリニウム主体型ナノ粒子の共役を示す。図３Ａは、精製懸濁液中における、ガドリニウム主体型ナノ粒子への共役前の抗ＢＣＭＡ抗体（左側：遊離ＮＰ）、およびガドリニウム主体型ナノ粒子への共役後の抗ＢＣＭＡ抗体（Ｇｄ−ＮＰ。右側：ＮＰ−ＢＣＭＡ）の存在を確認した、ＨＰＬＣ測定値を示しています。図３Ｂは、Ｇｄ−ＮＰへの抗ＢＣＭＡ抗体の結合を確認した、ＰＡＣＥ実験を示している。図３Ｃおよび図３Ｄは、共役後に長期間にわたって酸性条件下で安定したナノ粒子サイズを実証した、ＤＬＳ測定を示している。特に、抗ＢＣＭＡ抗体または抗ＳＬＡＭＦ７への共役前（Ｇｄ−ＮＰ）、および抗ＢＣＭＡ抗体への共役後（図３Ｃ）または抗ＳＬＡＭＦ７への共役後（図３Ｄ）における、酸性ｐＨ条件での、長期間にわたる様々なナノ粒子懸濁液の安定性が、確認された。
【図４】図４Ａおよび図４Ｂ。悪性形質細胞への様々なＮＰ抗体複合体（ＮＰ抗ＢＣＭＡコンジュゲートおよびＮＰ抗ＳＬＡＭＦ７コンジュゲートを含む）のインビトロ結合効率を示す。図４Ａは、ＮＰ−抗ＢＣＭＡコンジュゲートが、ＭＭ１．Ｓ細胞にあるＢＣＭＡ抗原を標的化したことを示す、ＦＡＣＳデータを示している。具体的には、蛍光標識済みのナノ粒子単独（ＮＰ）、または、抗ＢＣＭＡ抗体にさらに共役した後の蛍光標識済みのナノ粒子（ＮＰ−ＢＣＭＡ）のフローサイトメトリーによって測定される、蛍光標識済みのＭＭ１．Ｓ細胞の百分率を判定した。図４Ｂは、３０分間のインキュベーション後のＩＣＰ−ＭＳによるガドリニウムの取込みに関する研究を示している。具体的には、無修飾のナノ粒子（ＮＰ）、抗ＳＬＡＭＦ７抗体共役ナノ粒子（ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７）または抗ＢＣＭＡ抗体共役ナノ粒子（ＮＰ−ＢＣＭＡ）と一緒にして３０分間インキュベーションした後で実施する細胞溶解液のＩＣＰ−ＭＳによって判定されたときの、様々なＭＭ細胞株によるガドリニウム（Ｇｄ）の取込みを査定した。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂ。本開示のナノ粒子の非毒性を実証した、細胞生存アッセイを示す。相異なるＭＭ細胞株の細胞生存能力の査定によって、ナノ粒子−抗体複合体の相対的インビトロ毒性を判定しており、この細胞生存能力は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙにより、濃度を上昇させて行くモノクローナル抗体単独（抗ＳＬＡＭＦ７、抗ＢＣＭＡ）、ガドリニウム主体型ナノ粒子（Ｇｄ−ＮＰ）単独またはナノ粒子−抗体複合体（ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７またはＮＰ−ＢＣＭＡ）を一緒にした状態でのインキュベーションに応じるものとして、検査された。具体的には、図５Ａは、単独の場合における２種のモノクローナル抗体およびガドリニウムナノ粒子単独の毒性評価を示している。図５Ｂは、ナノ粒子−抗体複合体（ＮＰ−ＢＣＭＡおよびＮＰ−ＳＬＡＭＦ７ナノ粒子コンジュゲート）の毒性評価を示している。すべての実験は、ナノ粒子と一緒にした状態でのインキュベーションの７２時間後に実施された。
【図６】生物発光イメージング（ＢＬＩ）によるＭＭ１．Ｓ腫瘍の播種を明示しており、具体的には、多発性骨髄腫の同所性細胞株異種移植モデルにおける形質細胞腫の成長を示す。ヒトＧＦＰ＋／ＬＵＣ＋ＭＭ１．Ｓ細胞をＩＶ播種によって４匹のマウスに導入し、この導入より後の様々な日にＢＬＩを実施した。ＭＲＩのよる研究のために、モデルが同様に確立され、マウスは、腫瘍細胞の移植後１９日目に研究に組み入れられた。この腫瘍細胞の移植後１９日目は、大腿骨および脊椎の腫瘍負荷を容易に区別できるようになった時点だった。
【図７】腫瘍細胞移植後１９日目のＭＭ１．Ｓ保有マウスの大腿骨部位におけるナノ粒子の取込みを示す。左側では、ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７（上側）またはＮＰ−ＢＣＭＡ（下側）のいずれかのＩＶ投与後に５匹のマウスをイメージングした。右側では、ナノ粒子−抗体複合体の注入後の様々な時点において、大腿骨のノイズ対比（ＣＮＲ）比を判定した。＊ｐ値＜０．０５、＊＊＊ｐ値＜０．００１、両側ｔ検定。
【図８】図８Ａおよび図８Ｂ。ＮＰ−抗ＢＣＭＡコンジュゲートを注射したマウスの脊椎（図８Ａ）および大腿骨（図８Ｂ）における、Ｈ＆Ｅによる腫瘍負荷の組織学的査定（左側）と、プルシアンブルー染色によって判定されたナノ粒子−抗体複合体の位置（ナノ粒子の取込み）（右側）とを示す。
【図９】図９Ａから図９Ｆ。異なるナノ粒子（ガドリニウム主体型ナノ粒子およびその抗体複合体）の生体内分布、薬物動態および毒性評価を示す。図９Ａは、腫瘍を有さない（健康な）マウスにおけるＮＰ（非共役Ｇｄ主体型ナノ粒子（ＮＰ）、抗ＳＬＡＭＦ７抗体共役Ｇｄ主体型ナノ粒子（ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７）および抗ＢＣＭＡ抗体共役Ｇｄ主体型ナノ粒子（ＮＰ−ＢＣＭＡ））の生体内分布（組織分布）を示している。様々な臓器へのグラム当たりＧｄ注入用量の百分率（％ＩＤ／ｇ）の定量化を、ＩＣＭ−ＭＳによって経時的に判定した（ｎ＝５／時点）。図９Ｂは、ＩＣＭ−ＭＳ（ｎ＝５／時点）によって測定されたときの、同じ動物から抜き出した連続血液試料を対象にして実施された薬物動態研究を示しており、これにより、ＮＰ、ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７またはＮＰ−ＢＣＭＡを投与された健康なマウスの血液中におけるＧｄ濃度の変化が示された。図９Ｃは、経時的に観察された体重変化に対するナノ粒子の影響を示している（ｎ＝５マウス／時点）。様々な主体型造影剤の単回用量を投与した後の時間に応じた、健康なマウスの体重の変化が観察された。図９Ｄは、基本代謝プロファイルを示しており（ｎ＝１群当たり２匹のマウス）、図９Ｅは、全血球計算を示しており、図９Ｆは、ＮＰ−抗ＢＣＭＡコンジュゲートの注射後９６時間のときの、対照群（ｎ＝３匹のマウス）と実験群（ｎ＝３匹のマウス）との間で行われた、健康なマウスによる化学パネルの比較（白血球分画）を示している。
【図１０】ＮＰ−ＢＣＭＡの単回用量の投与後の様々な時点において屠殺した健康なマウスの臓器のＨ＆Ｅ染色を示す。このＨ＆Ｅ染色を使用して、ＮＰ−抗ＢＣＭＡコンジュゲートの毒性を経時的に査定した。Ｈ＆Ｅスライドから毒性は観察されておらず、これにより、ＮＰ−抗ＢＣＭＡコンジュゲートの安全性プロファイルが確認された。
【発明を実施するための形態】
【００６５】
本開示は、細胞表面受容体を標的とするナノ粒子−抗体コンジュゲートを少なくとも部分的に対象としており、このナノ粒子−抗体コンジュゲートは、標的化されたものであるという性質のため、細胞株および／または対象における多発性骨髄腫および／またはＭＲＤの存在を検出および局在化するための造影剤としての能力が向上されたコンジュゲートである。特定の実施形態において、本開示の抗体−ナノ粒子コンジュゲートのナノ粒子部分は、ガドリニウムを主体としたものであり、任意選択的に、このようなコンジュゲート組成物が、リンカー（例えば、ＮＨＳリンカー部分）を介して標的化部分（例えば、抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体）に共役していたときでさえ、腎排泄により、毒性のある影響を伴うことなく、対象における循環から比較的迅速に除去されるほどに小さなサイズのものである（例えば、５ｎｍ未満のＮＰ）。したがって、本明細書に記載のナノ粒子−抗体コンジュゲートは、改善されたイメージングコントラストをもたらし、ＭＲＤのモニタリングの向上および／またはＭＭに関する治療目的での予測を可能にする。
【００６６】
ＭＭを対象にした数多くの新たな治療法が現在臨床試験中であり、このような組成物は、このような治療の評価と有効性を改善することを目標として、ＭＲＤのモニタリング用の特異的なイメージングバイオマーカーの必要性が増していることから、最近、急速に開発されてきた。大部分のＭＭ患者は、Ｍスパイク／遊離軽鎖（ＦＬＣ）比のレベルの急速な変化、ならびに／または、例えばカルシウムレートの上昇、腎不全、貧血および／もしくは骨病変によって指し示される最終的な臓器の損傷を理由にして、ＭＲＤ陽性だと診断される（ＣＲＡＢ基準；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １７：ｅ３２８−３４６）。Ｍスパイク／ＦＬＣレベルの比が上昇した場合、患者は、骨病変を検出するために、全身Ｘ線によってイメージングされる。しかしながら、このイメージング技術は、感受性が不足している。新しいＭＭ療法が利用可能になったため、ＭＭの早期確認により、患者のアウトカムを有意に改善することができる。
【００６７】
最小残存病変（ＭＲＤ）は、多発性骨髄腫患者の治療反応の持続期間の短縮化と、長期的な生存アウトカムの悪化との両方に直接的に関連付けられている（ＭＭ；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １７：ｅ３２８−３４６；Ｎｉｓｈｉｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｍａｌｉｇ  Ｒｅｐ  １１：１１８−１２６；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，ｄｏｉ：１０．１１５８／１０７８−０４３２．ＣＣＲ−１６−２８９５）。血清学的な研究および／または骨髄検査を利用する現在の診断法は、腫瘍微小環境の空間的な不均一性を考慮しておらず、これらの診断法は、残留形質細胞を診断するために、侵襲性の連続サンプリングを必要とする。利用可能な診断用イメージングモダリティは、悪性形質細胞の検出に対して感受性も特異性も有さず（Ｌａｐａ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ６：２５４−２６１）、頻繁な検査を妨げる電離放射線に依存することが多い（Ｆａｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６１：８４９−８５７）。
【００６８】
ＭＲＤの検出のためのイメージング法の確立は、ＭＭ患者のケアに変革をもたらす影響を与えると予測されており、非侵襲的な反復検査により、早期の時点において、通常であれば検出をできないようにする限局的な分布パターンで残留形質細胞が存在する場合においてさえ、残留形質細胞の発見を可能にする。
【００６９】
磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）スキャンおよびポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）に比較して、疾病負荷と予後を査定するため、および治療法に対する反応をモニタリングするためのより信頼性の高い方法を提供することが公知である（Ｓｐｉｎｎａｔｏ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｒａｄｉｏｌ．２０１２  ８１（１２）：４０１３−８）。従来のＦＤＡ承認済みの作用物質を用いる磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）のための技法は開発が続いているが、高精度の疾患の予測を可能にするため（Ｄｉｍｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ３３：６５７−６６４）、およびＭＭ患者の治療反応を追跡するために、疾病負荷（Ｐａｗｌｙｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ３０：１４４６−１４４８）を査定する場合において、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、単光子放射コンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）またはポジトロン放射断層撮影（ＰＥＴ；Ｓｐｉｎｎａｔｏ  ｅｔ．ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｒａｄｉｏｌ  ８１：４０１３〜４０１８）に比較して、より信頼性の高いものであることが示されてきた。ＭＲＩには、骨髄浸潤の早期検出に加えて、良性の溶骨性領域と悪性の溶骨性領域とを区別するという利点がある（Ｓｈｏｒｔｔ  ｅｔ  ａｌ．ＡＪＲ  Ａｍ  Ｊ  Ｒｏｅｎｔｇｅｎｏｌ  １９２：９８０−９８６）。しかしながら、ＭＲＩの実子に使用されている現在のプロトコル、すなわち、脂肪−水イメージング、拡散強調イメージング、コントラストの向上は、時間がかかり、高価であり、腫瘍微小環境内の非標的造影剤の受動的な蓄積に依存しており（Ｍａｔｓｕｍｕｒａ  ａｎｄ  Ｍａｅｄａ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ４６：６３８７−６３９２）、この結果として、これまでは、検出の特異性と感受性との両方が制限されていた。ＣＴスキャンは、骨破壊のみは検出することができるが、骨髄腫の活動は検出することができず、ＰＥＴイメージングは、活発な代謝を示す画像化された細胞に依拠する。しかしながら、ＰＥＴイメージングは、緩やかな増殖活性を示す残留ＭＭ細胞を可視化するのに十分な感受性を有さない（Ｆｒｅｅｄｅｎｂｅｒｇ  ＭＩ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｈｙｓ  Ｍｅｄ  ２０１４  ３０（１）：１０４−１０）。ＳＰＥＣＴおよびフルオロデオキシグルコースに基づいた（１８Ｆ−ＦＤＧ−）ＰＥＴは、形質細胞母集団を高精度で識別することができるが（Ｃａｖｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｏｎｃｏｌ  １８：ｅ２０６−ｅ２１７）、短い間隔での反復検査を妨げる電離放射線を利用する。１８Ｆ−ＦＤＧ−ＰＥＴは、より緩やかに増殖するものである、ＭＲＤの状態にある悪性形質細胞に対しては、不十分な検出感度を示す。
【００７０】
本明細書において記述されている本発明に先立って、既存のイメージング技法を上回る明確な利点を提供するものである、ＭＲＩ取得に基づいたＭＭ用のイメージングバイオマーカーが切実に必要とされていた。ＭＭにおいては、より厳密には、ＭＲＤの診断に関しては、現在のＭＲＩ造影剤（ガドリニウムキレート）は、受動的標的化経路（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ  Ｒｅｖ  Ｎａｎｏｍｅｄ  Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  ５（１）：１−１８）（ＥＰＲ効果）に依存しており、この結果として、検出されるのに十分なほど特異的なコントラストシグナルの生成することができない。ナノメディシンにおいては、細胞表面受容体の標的化を目的とした抗体の使用が提案されている。しかしながら、このような標的化用作用物質を対象にして実施された最近の概念実証研究では、最善を下回る結果が示されている。実際にも、このような研究では、ＮＰ循環の半減期の時間が劇的に低下し、この結果、これらの複合体のサイズが大きいことを理由にして、インビボ結合親和性が低くなることが観察されており、イメージングは、抗体が標的とした細胞表面受容体を標的とするという目的でＮＰが脈管構造から脱出することができないことによって、さらに妨げられた。この結果、ＮＰの受動的標的化形態と能動的標的化形態との間には差異が観察されておらず、効果的で特異的な造影剤としての用途が制限されていた。以下で詳細に記述されているように、改良型のイメージングバイオマーカーを開発するという目的で、対処すべき主要な課題が、複雑な「ナノ粒子−フル抗体」の最終的なサイズであるという点に留意するときには、比較的小さなモノクローナル抗体の場合と同様にして、高いＭＲＩ特性を有する超微細な５ｎｍ未満のＮＰを選択した。本開示は、ショートＭＲＩシーケンスを使用して、空間的にかなりの程度まで局在化した腫瘍細胞の母集団を識別することができる新規性のあるＭＭ標的造影剤を生成することに着目している。本開示の主要な目標は、ＭＲＤの早期検出を向上するという目的で、形質細胞を特異的に標的とすることができる、ガドリニウム（Ｇｄ）主体型ナノ粒子（Ｇｄ−ＮＰ）を作製することだった。細胞表面に過剰発現する受容体を拘束することにより、腫瘍に対してナノ粒子を標的化するためには、抗体の使用が昔から提案されてきた（Ｕｌｂｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ  １１６：５３３８〜５４３１；Ｍｕｌｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ  ８：７６３−７７１）。これらの典型的なナノ粒子−抗体複合体（直径５０〜２００ｎｍ。Ａｒｒｕｅｂｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｎａｎｏｍａｔｅｒ，ｄｏｉ：１０．１１５５／２００９／４３９３８９（２００９））のサイズは、完全なモノクローナル抗体または完全なモノクローナル抗体の分子結合体のサイズ（長さ１０〜１５ｎｍ、直径３〜５ｎｍ。Ｒｅｔｈ，Ｍ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４：７６５−７６７）より格段に大きいため、これらのナノ粒子−抗体複合体の薬理は、抗体ではなくナノ粒子によって大きく左右されてきた。さらに、このような作用物質を用いて実施された大部分の前臨床試験は、自然の腫瘍微小環境に見受けられる血管パターンを��現していない（Ｍａｃｋ  ａｎｄ  Ｍａｒｓｈａｌｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２８：２１４−２２９）、皮下異種移植モデルにおいて実施されてきた（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１７．５７（２０１７）；Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２６：８３−９０）。したがって、これらの報告されたコンストラクトの多くは、腫瘍の局在化を達成するとき、標的化されていない場合の対応物に関しては、差異を示しておらず（Ｋｕｎｊａｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １４：９７２−９８１）、このことが、これらのコンストラクトのさらなる橋渡し開発（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）が妨げられてきた。
【００７１】
最初に、２種の特異的な抗原（Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）およびシグナル伝達リンパ球活性化分子Ｆ７（ＳＬＡＭＦ７）受容体）に対するモノクローナル抗体の標的化効率を比較した。両方の標的は、ほとんど非悪性Ｂ細胞の細胞表面上にのみ存在する、十分に確立された抗原である（Ｌｏｎｉａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７３：６２１−６３１；Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １０３：６８９−６９４）。ＳＬＡＭＦ７とは区別されるＢＣＭＡは、Ｂ細胞の成熟と形質細胞への分化とにおいて重要な役割を担う、非常に特異的な形質細胞抗原である（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ  ＲＯ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１３  １９（１８）：２０４８−６０）。ＢＣＭＡの高い有病率および発現レベルは、ＭＭ進行が進むのに伴って上昇し（図１Ａ）、これにより、ＢＣＭＡは、ＭＭのモニタリングに理想的な細胞表面受容体になる。本明細書においては、シリカ主体型ガドリニウムＮＰである、５ｎｍ以下のＮＰのコンジュゲート（Ｄｅｔａｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ  １７：１７３３−１７４０；Ｄｅｔａｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２３８：１０３−１１３において記述されているようなもの）の開発が記述されている。このコンジュゲートは、形質細胞の細胞表面受容体を特異的に標的とし、これにより、ＭＭ疾患の進行、および／または新たに開発されたＭＭ療法を含むＭＭ治療法のアウトカムのより効率的で特異的な予測（特異性および感受性の向上）を可能にする。
【００７２】
本明細書においては、モノクローナル抗体に共役した超小型のガドリニウム主体型ナノ粒子の磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）を利用して、骨髄微小環境下におけるクローン形質細胞の迅速な検出を可能にした。本開示は、治療目的での投与後におけるＭＲＤの早期検出を改善するために非侵襲的で安全な造影剤を利用する、最初の例に相当すると考えられている。
【００７３】
本開示の特定の標的化ナノ粒子コンジュゲートは、対象（例えば、ほ乳類対象）中のＭＭ細胞を検出する感受性を向上することができる。例えば、本開示の標的化ナノ粒子は、非標的化ＮＰに比べて感受性を少なくとも１．５倍改善することができる。任意選択的に、感受性は、非標的化ＮＰに比べて少なくとも２倍に改善される。任意選択的に、感受性は、非標的化ＮＰに比べて少なくとも３倍に改善される。任意選択的に、感受性は、非標的化ＮＰに比べて少なくとも５倍に改善される。任意選択的に、感受性は、非標的化ＮＰに比べて少なくとも１０倍に改善される。
【００７４】
さらにはおよび／または代替的には、本開示の特定の標的化ナノ粒子コンジュゲートは、対象（例えば、ほ乳類対象）中のＭＭ細胞を検出する特異性を向上することができる。例えば、本開示の標的化ナノ粒子は、非標的化ＮＰに比べて特異性を少なくとも１．５倍改善することができる。任意選択的に、特異性は、非標的化ＮＰに比べて少なくとも２倍に改善される。任意選択的に、特異性は、非標的化ＮＰに比べて少なくとも３倍に改善される。任意選択的に、特異性は、非標的化ＮＰに比べて少なくとも５倍に改善される。任意選択的に、特異性は、非標的化ＮＰに比べて少なくとも１０倍に改善される。
【００７５】
特定の実施形態において、本開示の標的化ナノ粒子コンジュゲートは、非標的化ナノ粒子の場合より低いＭＲＤのＭＲＩ検出閾値を有し得る。例えば、本開示の特定の標的化ナノ粒子の場合における、ある対象のＭＲＤのＭＲＩ検出閾値は、対象１個体当たり１００，０００個以下の形質細胞であることが可能であり、任意選択的に対象１個体当たり５０，０００個以下の形質細胞、任意選択的に対象１個体当たり３０，０００個以下の形質細胞、任意選択的に対象１個体当たり２０，０００個以下の形質細胞、対象１個体当たり１０，０００個以下の形質細胞、対象１個体当たり８，０００個以下の形質細胞、対象１個体当たり６，０００個以下の形質細胞、対象１個体当たり５，０００個以下の形質細胞、対象１個体当たり４，０００個以下の形質細胞、対象１個体当たり３，０００個以下の形質細胞であることも可能であり、任意選択的に対象１個体当たり約２，２００個の形質細胞であることも可能であり、例えば、任意選択的に（対象がマウスである場合において）対象１個体当たり２，２００±４５０個の形質細胞であることも可能である。
抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体
【００７６】
Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）のメンバー１７である。ＢＣＭＡの天然型リガンドは、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ。ＢＬγＳまたはＴＡＬＬ−１、ＴＮＦＳＦ１３Ｂとも呼ばれる）および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ、ＴＮＦＳＦ１３、ＣＤ２５６）（Ｍａｃｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：２３１−２６４）であり、これらの天然型リガンドは、最終的には、（さらなるリガンドとの相互作用によって）液性免疫、Ｂ細胞発生および恒常性の様々な態様の調節に関与することになる。ＢＡＦＦに対する親和性は、低いマイクロモル範囲に留まるが、ＡＰＲＩＬは、ほぼ１００倍密にＢＣＭＡに結合する（Ｂｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：２６３−２７５）。ＢＣＭＡの発現は、Ｂ細胞系統に限定されており、このとき、ＢＣＭＡは、主に形質芽細胞および形質細胞で発現しているが、ナイーブＢ細胞、胚中心Ｂ細胞および記憶Ｂ細胞には存在しない（Ｄａｒｃｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７９：７２７６−７２８６；Ｂｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８０：３６５５〜３６５９；Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８２：８９０−９０１）。
【００７７】
ＢＣＭＡの発現は、骨髄における長命定着形質細胞の生存に関して重要である（Ｏ’Ｃｏｎｎｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９：９１−９８）。この結果、ＢＣＭＡ欠損マウスは、骨髄においては、低減された形質細胞の数を示すが、脾臓の形質細胞レベルは影響を受けていない（Ｐｅｐｅｒｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ［Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｆｅｂ  ０３、１０．１０３８／ｎｉ．２５２７］）。形質細胞への成熟Ｂ細胞の分化は、ＢＣＭＡノックアウトマウスにおいては、正常である（Ｓｃｈｉｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：２１１１−２１１４；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２１：４０６７〜４０７４）。ＢＣＭＡへのＢＡＦＦまたはＡＰＲＩＬの結合は、ＮＦ−κΒの活性化を誘起し（Ｈａｔｚｏｇｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６５：１３２２−１３３０）、これにより、Ｂｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−２およびＭｃｌ−１等の抗アポトーシスＢｃｌ−２メンバーのアップレギュレーションを誘導が誘導される（Ｐｅｐｅｒｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ［Ｅｐｕｂ  ２０１３  Ｆｅｂ  ０３、１０．１０３８／ｎｉ．２５２７］）。
【００７８】
ＢＣＭＡは、例えば骨髄のＢ細胞非ホジキンリンパ腫である多発性骨髄腫（ＭＭ）、およびＭＭより侵襲性が強いものであり、形質細胞障害の全症例のうちの約４％を占める、形質細胞白血病（ＰＣＬ）等、悪性形質細胞においてもかなり発現する。ＭＭおよびＰＣＬに加えて、ＢＣＭＡは、ホジキンリンパ腫に罹患している患者のホジキンおよびリード−ステルンベルグ細胞においても検出されてきた（Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １０９：７２９−７３９）。形質細胞における機能と同様に、ＢＣＭＡへのリガンド結合は、ＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫細胞の成長および生存を調節することが示されてきた（Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｌｏｏｄ  １０３：６８９−６９４）。ＢＣＭＡを介したＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬのシグナル伝達は、悪性形質細胞の生存促進因子であると考えられている。したがって、ＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞の枯渇および／またはリガンド−受容体相互作用の破壊は、多発性骨髄腫および自己抗体依存性自己免疫疾患の治療アウトカムを改善するはずである。現在、多発性骨髄腫の治療に利用できる様々なアプローチが存在する（Ｒａａｂ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｌａｎｃｅｔ  ３７４：３２４−３３９）。大部分の対象においては、化学療法は、多発性骨髄腫の部分的な抑制にしかつながらず、化学療法が完全寛解につながることはほとんどまれである。したがって、大抵の場合においては、一般的にデキサメタゾンおよびプレドニゾン等のコルチコステロイドの追加投与を含む、組み合わせアプローチが適用される。しかしながら、コルチコステロイドには、骨密度の低下等の副作用がつきまとう。自身の幹細胞を使用する幹細胞移植（自家移植）または近縁者または血縁関係のない適合ドナーからの細胞を使用する幹細胞移植（同種移植）も提案されている。多発性骨髄腫において、大部分の移植は、自家移植方式のものである。このような移植は、治癒効果のあるものではないが、選択された患者の寿命を延ばすことが示されてきた（Ｓｕｚｕｋｉ（２０１３）Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ４３：１１６−１２４）。代替的には、最近、サリドマイドおよびその誘導体が治療に適用されてきているが、最善を下回る成功率および高いコストも付随する。より最近では、プロテアソーム阻害剤のボルテゾミブ（ＰＳ−３４１）が再発性および難治性のＭＭの治療用として承認されており、数多くの臨床試験において単独で、または有望な臨床アウトカムをもたらす確立された薬物と組み合わせて使用された（Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３４８：２６０９−２６１７；Ｋａｐｏｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｓｅｍｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ４９：２２８−２４２）。大抵の場合、複数の治療アプローチが組み合わされる。このような併用治療のコストは相応に高く、成功率には、依然として改善の余地が大きく残っている。複数の医薬品が同時に使用される場合、副作用が累積するため、治療オプションの組み合わせも理想的なものではない。
【００７９】
形質細胞を特異的に標的とする能力は、自己免疫疾患の治療に関しても大いに有益なものである。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）およびリウマチ性関節炎（ＲＡ）等、自己反応性抗体が疾患の病態にとって決定的に重要である、自己免疫に関する状態を対象にした従来の治療法は、症状の重症度および患者の状況に依存する（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｌａｎｃｅｔ  ３７６：１０９４−１１０８，Ｄ’Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｌａｎｃｅｔ  ３６９，５８７−５９６）。一般に、軽度の病型は最初に、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）または疾患修飾性抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）によって治療される。活動性疾患による臓器不全を包含する、より重症な形態のＳＬＥは通常、循環細胞を標的とする細胞傷害性作用物質であるシクロホスファミド等の強力な免疫抑制剤と組み合わせた、ステロイドによって治療される。ごく最近では、自己免疫疾患を患っている患者の血清中に高いレベルで見受けられるサイトカインＢＡＦＦを標的とする抗体であるベリムマブが、ＳＬＥでの使用にＦｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）による承認を受けた。しかしながら、新たに形成されたＢ細胞は、ヒトにおける生存に関しては、ＢＡＦＦに依存しているにすぎず、一方で、メモリーＢ細胞および形質細胞は、選択的ＢＡＦＦ阻害の影響を受けにくくなっている（Ｊａｃｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ６２：２０１−２１０）。関節リウマチに関しては、ＴＮＦ阻害剤は、最初に認可された生物学的製剤であり、その後には、アバタセプト、リツキシマブ、トシリズマブ等が続いて認可された。これらは、関節の炎症および破壊に関与する主要な炎症経路を抑制するが、これにより、相対的免疫抑制に起因する感染リスクの上昇が引き換えとされる（Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １０：３０１−３１６，Ｋｅｙｓｅｒ（２０１１）Ｃｕｒｒ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ  Ｒｅｖ  ７：７７−８７）。これらの生物学的製剤の承認にもかかわらず、ＲＡおよびＳＬＥに罹患している患者は、自己免疫マーカーの持続を示すことが多い。大抵の場合、この自己免疫マーカーの持続は、例えばリツキシマブならびに高用量のグルココルチコイドおよびシクロホスファミドを用いる型の療法によるＣＤ２０が媒介する剥離に抵抗する、骨髄における長命定着形質細胞の存在に関連付けられている。ＳＬＥの現在の戦略には、免疫能剥奪および自家幹細胞移植による免疫系の「リセット」が含まれるが、移植に関連する死亡のリスクは、深刻な懸念事項のままである（Ｆａｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９５：２８４−２９２）。ボルテゾミブ等のプロテアソーム阻害剤の使用は、形質細胞の枯渇のための代替的な戦略になる可能性があり、形質細胞は、タンパク質合成の速度が高いこと、およびタンパク質分解能力が限られていることを理由にして、プロテアソーム阻害剤に対して極度に鋭敏である。ボルテゾミブは、再発性多発性骨髄腫の治療用に最近承認されており、ループス様疾患を患っているマウスにおける最近の研究により、ボルテゾミブは形質細胞を枯渇させ、ループス様疾患を患っているマウスを腎炎から保護することが示された（Ｎｅｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４：７４８−７５５）。しかしながら、プロテアソーム阻害剤は、形質細胞に特異的に作用せず、末梢神経障害等の悪影響の発生率が高い（Ａｒａｓｔｕ−Ｋａｐｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １７：２７３４−２７４３）。
【００８０】
治療用抗体は、標的に結合すると、いくつかの機構によって作用し得る。結合自体がシグナル伝達を誘起することができ、これにより、プログラムされた細胞死を起こすことができる（Ｃｈａｖｅｚ−Ｇａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ。（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：１５−２５）。さらに、結合自体は、受容体またはリガンドへの結合により、受容体とそのリガンドとの相互作用を遮断することもできる。この中断は、生存に重要な信号が影響を受ける場合にはアポトーシスを引き起こす可能性がある（Ｃｈｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｂｌｏｏｄ  １０９：７２９−７３９）。細胞枯渇に関しては、２種の主要なエフェクター機構が公知である。第１の主要なエフェクター機構は、標的細胞に対する補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）です。３種の異なる経路が公知である。しかしながら、抗体の場合、ＣＤＣに関して重要な経路は、ＩｇＧまたはＩｇＭの定常領域へのＣ１  ｑの結合によって開始される古典的経路である（Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ（２００８）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ８：７５９−７６８）。
【００８１】
第２の主要なエフェクター機構は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれている。このエフェクター機能は、抗体の各アイソタイプに対するＦｃ受容体を発現する免疫細胞の動員を特徴とする。主として、ＡＤＣＣは、ＩｇＧ分子に単独でまたは免疫複合体の状態で結合することができるＦｃ−γ受容体（ＦｃｙＲ）の活性化によって媒介される。マウスは、Ｆｃｙ受容体を活性化する３種（ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩＩおよびＦｃｙＲＩＶ）を示し、ヒトは、Ｆｃｙ受容体を活性化する５種（ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩＡ、ＦｃｙＲＩＩＣ、ＦｃｙＲＩＩＩＡおよびＦｃｙＲＩＩＩＢ）を示す。これらの受容体は、顆粒球、単球、マクロファージ、樹状細胞およびナチュラルキラー細胞等の自然免疫細胞に発現し、したがって、自然免疫を適応免疫系と関連付ける。
【００８２】
細胞の種類に応じて、抗体によってマーキングされた標的細胞が認識されたときのＦｃｇＲ含有細胞の作用には、いくつかのモードがある。顆粒球は、一般に血管作用性および細胞傷害性物質または化学走性誘因物質を放出するが、貪食作用を及ぼすことも可能である。単球およびマクロファージは、貪食作用、酸化的バースト、細胞毒性または炎症性サイトカインの放出に応答するが、ナチュラルキラー細胞は、グランザイムとパーフォリンを放出し、標的細胞のＦＡＳおよびそのＦａｓリガンドとの相互作用によって細胞死を誘起することもできる（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ  ａｎｄ  Ｒａｖｅｔｃｈ（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：３４−４７；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｅｒ（２００８）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ  ８：７５９−７６８；Ｃｈａｖｅｚ−Ｇａｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６：１５−２５）。
【００８３】
ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）を拘束する抗体、および、Ｂ細胞に関連付けられた様々な医学的障害の治療におけるこれらの抗体の使用は、当技術分野において記述されている。Ｒｙａｎ  ｅｔ  ａｌ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２００７  ６（１１）、３００９）は、ＢＣＭＡタンパク質のアミノ酸５〜５４のペプチドを使用して、ラットのワクチン接種によって得られた抗ＢＣＭＡ抗体を記述している。その中で記述されている抗体は、ＢＣＭＡを拘束し、ＡＰＲＩＬ依存性ＮＦ−ＫＢ活性化を遮断し、ＡＤＣＣを誘導する。抗体の特異的なエピトープに関する詳細は、提供されていない。国際公開２０１２／１６３８０５は、キメラ抗体およびヒト化抗体等のＢＣＭＡ結合タンパク質、ＢＣＭＡとＢＡＦＦおよび／またはＡＰＲＩＬとの相互作用を遮断するためのこれらのＢＣＭＡ結合タンパク質の使用、ならびに、多発性骨髄腫等の形質細胞悪性腫瘍の治療におけるこれらのＢＣＭＡ結合タンパク質の有望な使用を記述している。国際公開２０１２／１６３８０５の中で開示されている抗体は、ＢＣＭＡタンパク質のアミノ酸４〜５３の組換えペプチドを使用して、マウスのワクチン接種によって得られた。さらに、国際公開２０１０／１０４９４９は、好ましくはＢＣＭＡの細胞外ドメインに結合する様々な抗体、ならびに、Ｂ細胞が媒介する医学的な状態および障害の治療におけるこれらの抗体の使用を記載している。抗体の特異的なエピトープに関する詳細は、提供されていない。
【００８４】
国際公開２００２／０６６５１６は、ＢＣＭＡとＴＡＣＩとの両方に結合する二価抗体、ならびに、自己免疫疾患およびＢ細胞がんの治療におけるこれらの二価抗体の有望な使用を記載している。ＢＣＭＡの未定義の細胞外ドメインを使用して、国際公開２００２／０６６５１６の中で記述されている抗体の抗ＢＣＭＡ部分を生成する。国際公開２０１２／０６６０５８は、ＢＣＭＡとＣＤ３との両方に結合する二価抗体、および、Ｂ細胞に関連する医学的障害の治療におけるこれらの二価抗体の有望な使用を開示している。抗体の結合特性および特異的なエピトープに関する詳細は、いずれの刊行物にも提供されていない。
【００８５】
国際公開２０１２／１４３４９８は、抗ＢＣＭＡ抗体の使用を含む、多発性骨髄腫患者の層別化のための方法を記述している。好ましい抗体は、「Ｖｉｃｋｙ−１」（ＧｅｎｅＴｅｘのＩｇＧ１サブタイプ）および「Ｍａｂ１９３」（Ｒ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓのＩｇＧ２ａサブタイプ）として公知の抗体である。抗体の結合特性および特異的なエピトープに関する詳細は、提供されていない。
【００８６】
国際公開２０１４／０６８０７９は、多発性骨髄腫（ＭＭ）および自己免疫疾患等の形質細胞疾患の治療における使用に適すると評価された、抗ＢＣＭＡ抗体を記述している。国際公開２０１４／０６８０７９は、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）、特に、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）の細胞外ドメインのエピトープに結合する、単離された抗体または抗体フラグメントを提供する。したがって、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）に結合する単離された抗体または抗体フラグメントが提供されており、抗体は、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）の残基１３〜３２のうちの１個以上のアミノ酸を含むエピトープに結合する。
【００８７】
抗ＢＣＭＡ抗体を産生するために、ＣＤ２６９の細胞外ドメインを含む抗原が、抗ＢＣＭＡ抗体の結合特異性を生成するためという目的でのワクチン接種に使用された。抗体生成における抗原として、ＣＤ２６９タンパク質全体、または、膜結合ドメインもしくは細胞内ドメインを含むＣＤ２６９タンパク質のフラグメントを使用することにより、ＣＤ２６９の隠蔽ドメインまたは細胞内ドメインに結合する抗体を生成することが可能になっており、これにより、このような薬剤は、治療用途に適さないまたは不利なものになる。したがって、国際公開第２０１４／０６８０７９号に記載の抗体は、ＣＤ２６９の細胞外部分への結合によって定義された。細胞外ドメイン内の特異的なエピトープは、やはり、国際公開２０１４／０６８０７９公報の好ましい新規で予想外の特性を伴う特徴に相当していた。
【００８８】
国際迂回２０１４／０６８０７９の一実施形態から調製されたＦａｂフラグメントは、精製されたＢＣＭＡ細胞外ドメインと複合して結晶化しており、複合体構造が解明された。構造解析により、国際公開２０１４／０６８０７９の抗ＢＣＭＡ抗体のエピトープに関する詳細な情報およびその生物学的関連性が明らかになった。国際公開２０１４／０６８０７９号の抗体による細胞外ドメインのＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）の残基１３〜３２のうちの１つ以上のアミノ酸を含むエピトープの結合は、この領域が、ＣＤ２６９の２種の天然リガンドであるＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの結合部位との有意なオーバーラップを示したため、有利な特性として認識された。当該技術分野においてこれまでに記述されたどの抗ＣＤ２６９抗体も、このようなＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬ結合部位との包括的なオーバーラップを示していなかった。
【００８９】
本明細書において記述された特定の抗ＢＣＭＡ抗体または抗体フラグメントは、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）のアミノ酸１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２６、２７または３２の１個以上を含むエピトープに結合することができる。任意選択的に、単離された抗ＢＣＭＡ抗体または抗体フラグメントは、抗体が、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）のアミノ酸１３、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２２、２３、２６、２７および３２からなるエピトープに結合することを特徴とし得る。これらの残基は、国際公開２０１４／０６８０７９に提示の結晶構造データによって識別されるように、抗ＢＣＭＡ抗体と直接相互作用するアミノ酸を表している。これらの残基の番号付けは、ＣＤ２６９のＮ末端配列との関連で実施された。
【００９０】
特定の実施形態において、抗ＢＣＭＡ抗体は、ＣＤ２６９（ＢＣＭＡ）に結合し、ＢＡＦＦ−ＣＤ２６９および／またはＡＰＲＩＬ−ＣＤ２６９の相互作用を乱す。ＢＡＦＦまたはＡＰＲＩＬとＣＤ２６９との相互作用は、それぞれ細胞内において、抗アポトーシスシグナルおよび増殖シグナルを誘起すると考えられている（Ｍａｃｋａｙ、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：２３１−２６４；Ｂｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ（２００６）Ｓｅｍｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：２６３−２７５）。
【００９１】
抗ＢＣＭＡ抗体Ｊ２２．９−ｘｉの例示的なヒト化。Ｊ２２．９−ｘｉ抗体は、シーケンスアライメントおよび結晶構造から得られたデータに基づいて、ヒト化された。可変領域の配列は、ＩｇＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ）を使用して、それぞれのヒト相同体にアラインした。提案された各変異は、改変前の構造の目視検査によって評価された。ＢＣＭＡへの変異体の結合は、フローサイトメトリーを使用して試験することができる。親和性は、表面プラズモン共鳴（ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６；Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して測定された。ヒト化配列の結合特性の予備的な査定により、Ｊ２２．９−ｘｉ結合との関連で記述されたものと同じエピトープに対する特異性および親和性に関しては、有望な結果が示された。
【００９２】
ＢＣＭＡ結合抗体を得るために、標準的なハイブリドーマ技術を使用することができる。例えば、初期抗ＢＣＭＡ抗体の産生のために、４匹のＢＬ／６匹の野生型マウスを、不完全フロイドアジュバントと、Ｃ末端がグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）に融合したヒトＢＣＭＡの細胞外ドメイン３０μｇとによって、６回免疫化した）。細胞融合および後続のスクリーニング期間の後、Ｊ２２．９ハイブリドーマは、抗ＢＣＭＡ抗体を分泌することが示された。
リンカー
【００９３】
任意の数の当技術分野において認知されたリンカー部分を使用して、抗ＢＣＭＡ抗体を、向上したイメージング特性を有するナノ粒子と連結し、これにより、本明細書に記載のコンジュゲートの範囲に含まれる抗ＢＣＭＡ抗体−ナノ粒子組成物を形成することができる。例示的な実施形態において、組成物の表面上にある反応性アミン基は、アミン基とのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（例えば、ＮＨＳ）反応によって、ヘテロ二官能性リンカー分子（例えば、「アンカーポイント」）を生じさせる。一部の実施形態において、ヘテロ二官能性アンカーリンカー（例えば、二官能性ＰＥＧマクロマー）は、一方の端部にあるアミン反応性ＮＨＳエステル、短い（例えば、約２キロダルトン（ｋＤａ））ＰＥＧ鎖、および、他方の端部にあるアクリレート基を含み得る。特定の実施形態において、ヘテロ二官能性リンカー（例えば、二官能性ＰＥＧマクロマー）は、一方の端部にあるアミン反応性ＮＨＳエステル、短いＰＥＧ鎖、および、他方の端部にあるチオール基を含み得る。短いＰＥＧリンカーは、末端のアクリレート基またはチオール基にさらなる自由度ももたらし、これにより、２番目の反応においては、ヒドロゲルコーティングへの結合がより容易になる。本開示の特定の実施形態において、ＮＰを抗ＢＣＭＡ抗体に共役させるために、ビススルホスクシンイミジルスベレート（ＢＳ３）リンカーが使用される。代替的なリンカー（例えば、本明細書に記載の特定のＮＨＳ−ＮＨＳホモ二官能性リンカーに比べて指向性がより高い官能基を有するもの）もまた、明示的に想定されている。
【００９４】
抗体へのＮＰの共役は、外部リンカーを使用して、ＮＰに共役させ、これによって、抗体への結合を生成することを包含する、いくつかの方法によって実施することが可能であると想定されている（この場合においては、２つの異なる官能基を選択し、同じリンカー、例えば、ＮＨＳリンカー（アミンに対して反応性）またはマレイミド（チオールに対して反応性）内で混ぜ合わせることが可能である）。アルキン−アジドリンカー（銅を触媒とする型のクリック化学によって反応させたもの）、シクロオクチンアジド（銅を用いない型のクリック化学）、ＴＣＯ−テトラジン等を包含する、いくつかの他のリンカーも同様に使用可能である。本開示のＮＰはアミンを有するため、リンカーの一方の端部は、ＮＨＳであることが多いが、リンカーの他方の端部の組成は、抗体の取扱いに応じて変更することができる。チオール修飾／官能化抗体は、ＮＨＳ−マレイミドリンカーおよび／またはＮＨＳ−マレイミドカプロイリンカーを効果的に使用することが可能な状況を作り出す。さらにはおよび／または代替的には、余分なアーム部をポリマー自体に作り出し、これにより、２つの部分（ＮＰと抗体）を架橋するためのリンカーを必要とすることなく抗体へのＮＰの直接共役を可能にする、チオール基を有する遊離アミンを生成することができる。
ナノ粒子
【００９５】
一様なサイズおよび形状のナノ粒子（例えば、直径３〜５ｎｍ）は、バイオイメージング用として効果的なツールであると証明されている。ナノ粒子は、高い面積対体積比を有し、非常に反応性が高い良好な触媒であり、生体分子に付着する。ナノ粒子材料の１つがシリコンであり、理由としては、シリコンが、不活性で、非毒性で、豊富に存在し、経済的なものであるという点が挙げられる。シリコン表面は、官能化されていてもよい。シリコンナノ粒子は、電磁スペクトルの可視部分において効率的な光ルミネセンスを示し、生体不活性でありながら、化学的に安定である。同様の生体適合性を持つ材料の１つが、多孔性シリコンである。１００ｎｍより小さい粒子は、腫瘍における亢進した透過性および滞留性による効果（ＥＰＲ効果：ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔ）を示し、このＥＰＲ効果は、重要な非特異的標的化効果である。シリコン量子ドットとしても公知のシリコンナノ粒子は、イメージング技術に使用することが可能であるが、ＬＥＤ、光起電装置、リチウムイオン電池、トランジスタ、ポリマー、または二光子吸収にも使用することができる。
【００９６】
本明細書に記載の例示的なシリカ主体型ガドリニウムＮＰ、ならびに、例えば、ＵＳ９，３８１，２５３（有機ＭＲＩコントラスト用のポリマーブラシナノ粒子）において開示されたもの等のポリマーＮＰ、および、インビボＣＲＩＳＰＲ修飾のための例示的なポリマーナノ粒子（国際公開２０１７／００４５０９に記載）を包含する、いくつかのナノ粒子が、本開示のコンジュゲート組成物中には使用可能である。
磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）
【００９７】
ＭＲＩは、医療診断に最もよく使用される手法の１つであり、非侵襲的で、迅速で、患者に危険がないという利点を併せ持っている。ＭＲＩは、磁場（重要な磁場Ｂ０および無線周波数場）、パルスシーケンス、生物に含まれる水の環境等に直接依存する、水のプロトンの緩和の観察に基づく。後で、ＭＲＩ画像の解釈により、大部分の組織の識別が可能になる。コントラストは、陽性Ｔ１型造影剤および陰性Ｔ２型造影剤という、２種類の作用物質によって高めることができる。水と造影剤との接触として画像を明るくすることができる陽性造影剤、すなわち、Ｔ１は、縦緩和時間：Ｔ１の短縮を可能にする。Ｇｄ（ＩＩＩ）ＤＴＰＡまたはＧｄ（ＩＩＩ）ＤＯＴＡは、臨床診療で使用されており、本開示において想定または採用される、Ｔ１型造影剤の例である。
【００９８】
当該分野において公知で本明細書において使用される特定のナノ粒子は特に、イメージング（例えば、ＭＲＩ）および／もしくは他の診断技術における造影剤として有用であり、ならびに／または、同じ種類の公知のナノ粒子より良好な性能を与えるものであり、小さなサイズ（例えば２０ｎｍ未満）と、高い金属（例えば、希土類）の充填量との両方を兼ね備えるものであり、特にイメージング（例えばＭＲＩ等）において高い周波数で強い増感および正しい応答（上昇した緩和度）を有するようになっている、治療薬として有用である。
【００９９】
１〜２０ｎｍの直径ｄ１を有する、本開示による例示的なナノ粒子のそれぞれは、任意選択的にドーピングカチオンを伴うガドリニウムカチオンを含むポリオルガノシロキサン（ＰＯＳ）マトリックス；−Ｓｉ−Ｃ−共有結合によってＰＯＳマトリックスに結合しており、すべてのガドリニウムカチオンを錯体化するのに十分な量で存在する、キレート化グラフトＣ１  ＤＴＰＡＢＡ（ジエチレントリアミン五酢酸二無水物）；ならびに場合により、−Ｓｉ−Ｃ−共有結合によってＰＯＳマトリックスに結合した別の官能化グラフトＧｆ＊（この場合においては、Ｇｆ＊は、親水性化合物（ＰＥＧ）、有効成分ＰＡ１を有する化合物、標的化化合物および／または発光化合物（フルオレセイン）に由来し得る）を含むことができる。
投与
【０１００】
本開示のナノ粒子−抗ＢＣＭＡ抗体コンジュゲートは、皮下投与、静脈内投与、くも膜下腔内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、経口投与、経皮投与、非経口投与、吸入または脳室内投与を含むがこれらに限定されない、いくつかの投与経路を介して投与することができる。
【０１０１】
本明細書において使用されている「注射」または「注射可能」という用語は、ボーラス注射（体液中の濃度を上昇させるための、ある個別量の作用物質の投与）、数分間にわたる緩やかなボーラス注射、または長期間にわたる点滴、または、間隔を空けて実施される連続する数回の注射もしくは点滴を指す。
【０１０２】
本開示の一部の実施形態において、本明細書において規定された製剤は、ボーラス投与によって対象に投与される。
【０１０３】
ナノ粒子複合体は、熟練の臨床医によって効果的であると決定された濃度を、所望のイメージング（および／または、例えばある薬物または他の薬物が投与された場合における、治療）の部位にもたらすのに十分な量で、例えば、概算で約１×１０−８〜約１×１０−１モル／リットルの濃度をもたらすのに十分な量で、対象に投与される。本発明の一部の実施形態において、ナノ粒子コンジュゲートは、少なくとも年に１回投与される。本発明の他の実施形態において、ナノ粒子コンジュゲートは、少なくとも１日に１回投与される。本発明の他の実施形態において、ナノ粒子コンジュゲートは少なくとも週に１回投与される。本発明の一部の実施形態において、ナノ粒子コンジュゲートは、少なくとも月に１回投与される。
【０１０４】
本開示のナノ粒子コンジュゲートを対象に投与するための例示的な用量には、限定されるわけではないが、次のもの、すなわち、１〜２０ｍｇ／ｋｇ／日、２〜１５ｍｇ／ｋｇ／日、５〜１２ｍｇ／ｋｇ／日、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、２〜２５０ｍｇ／ｋｇ／日、５〜１５０ｍｇ／ｋｇ／日、２０〜１２５ｍｇ／ｋｇ／日、５０〜１２０ｍｇ／ｋｇ／日、１００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１０μｇ／ｋｇ／日、少なくとも１００μｇ／ｋｇ／日、少なくとも２５０μｇ／ｋｇ／日、少なくとも５００μｇ／ｋｇ／日、少なくとも１ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも２ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも２０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも５０ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも７５ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも２００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも５００ｍｇ／ｋｇ／日、少なくとも１ｇ／ｋｇ／日が挙げられ、５００ｍｇ／ｋｇ／日未満、２００ｍｇ／ｋｇ／日未満、１００ｍｇ／ｋｇ／日未満、５０ｍｇ／ｋｇ／日未満、２０ｍｇ／ｋｇ／未満の治療有効量日、１０ｍｇ／ｋｇ／日未満、５ｍｇ／ｋｇ／日未満、２ｍｇ／ｋｇ／日未満、１ｍｇ／ｋｇ／日未満、５００μｇ／ｋｇ／日未満および未満５００μｇ／ｋｇ／日であるイメージング用としておよび／または治療的に有効な用量も挙げられる。
【０１０５】
本発明の一部の実施形態において、ナノ粒子コンジュゲートとは異なる治療薬は、本開示のナノ粒子コンジュゲートのイメージングおよび／または治療有効量の投与の前に、投与と同時に、または投与後に投与される。一部の実施形態において、第２の治療薬は、化学療法薬、抗酸化剤、抗炎症剤、抗菌薬、ステロイド等からなる群より選択される。
【０１０６】
そうではないと指摘されていない限り、本発明の実施は、当技術分野における技能に含まされる、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、細胞培養およびトランスジェニック生物学の従来技術を使用する。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ）；Ｇｌｏｖｅｒ，１９８５，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）；Ａｎａｎｄ，１９９２；Ｇｕｔｈｒｉｅ  ａｎｄ  Ｆｉｎｋ，１９９１；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）；Ｊａｋｏｂｙ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，１９７９；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ��Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｒｉｏｔｔ，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８８；Ｈｏｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）；Ｗｅｓｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｍ．，Ｔｈｅ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ  ｂｏｏｋ．Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｚｅｂｒａｆｉｓｈ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ），（４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｕｎｉｖ．ｏｆ  Ｏｒｅｇｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，２０００）を参照されたい。
【０１０７】
そうではないと規定されていない限り、本明細書において使用されているすべての専門用語および科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記述されたものと類似または等価な方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料は、下記に記述されている。本明細書において言及されたすべての出版物、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体を参照により組み込む。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が優先される。さらに、材料、方法、および例は説明用のものにすぎず、限定を加えるものとして意図されていない。
【実施例】
【０１０８】
下記の実施例への参照により本発明を記述するが、これらの実施例は説明のために提供されるものであり、いかなる形でも本発明を限定することを意図するものではない。当技術分野において周知の標準的な技術または下記において具体的に記述されている技術を利用した。
【実施例１】
【０１０９】
材料および方法
細胞株
【０１１０】
ヒトＭＭ細胞株ＭＭ．１Ｓを、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、アメリカ）から購入した。ｐＧＣ−ＧＦＰ／Ｌｕｃベクターを使用したレトロウイルス形質導入によって、ＭＭ．１Ｓ  ＧＦＰ＋Ｌｕｃ＋細胞株を作製した。細胞は、ショートタンデムリピートＤＮＡプロファイリングによって鑑定した。１０％ウシ胎児血清（Ｓｉｇｍａ、アメリカ）、１％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ）および１％グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ）を添加したＲＰＭＩ培地（ＲＰＭＩ−１６４０培地、Ｓｉｇｍａ、アメリカ）中で、ＭＭ．１Ｓ細胞、ＯＰＭ２細胞およびＫＭＳ１１細胞を培養した。加湿インキュベーター内においては、３７℃と５％ＣＯ２の最適条件を維持した。
抗体ベースのガドリニウム主体型ナノ粒子（Ｇｄ−ＮＰ）の合成を含む、シリカ主体型ガドリニウムナノ粒子の合成
【０１１１】
超小型のシリカ含有Ｇｄ−ＮＰは、ＮＨ  Ｔｈｅｒａｇｕｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｖｉｌｌｅｕｒｂａｎｎｅ、フランス）から調達し、既報の手順に従って合成もした（Ｄｅｔａｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２３８：１０３−１１３；Ｄｅｔａｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ６：３４０４０）。このようなナノ粒子は、例えば、ＵＳ  ２０１３／０１９５７６６においても記述されている。
【０１１２】
既報のホモ二官能性リンカー化学反応（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ａｎｄ  Ｒｏｂｉｎｓｏｎ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ９：２２２４−２２３６）を使用して、ＮＰコンストラクトをマウス−抗ヒトＳＬＡＭＦ７およびＢＣＭＡモノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）と共役させた。簡単に言うと、最終的な濃度が５０ｎＭになるようにＧｄ−ＮＰを超純水で希釈した。１：１０のモル比のビススルホスクシンイミジルスベレート（ＢＳ３）リンカーをＧｄ−ＮＰと３０分間室温で混合して、リンカー結合ナノ粒子の生成を促進した。次に、これらの表面修飾されたＧｄ−ＮＰを、１：１００のモル比でモノクローナル抗体と組み合わせ、懸濁液を室温で１時間撹拌した。５，０００ｒｐｍで回転する分子量のカットオフが５０ｋＤａの膜（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）を装着したろ過装置を使用して、ナノ粒子−抗体複合体を遠心ろ過によって精製した。続いて、遠心濃縮を行った後、ナノ粒子−抗体複合体を１Ｍ  ＰＢＳに再懸濁させた。このプロセスを全く同じ方法で３回繰り返して、すべての過剰な遊離抗体がろ液に取り込まれて確実に除去されるようにし、純粋なＮＰ−ＳＬＡＭＦ７およびＮＰ−ＢＣＭＡの懸濁液を濃縮した。ナノ粒子−抗体複合体の最終的な濃度は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ７９００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）を使用してＩＣＰ−ＭＳによって判定した。
ＭＭ細胞を拘束するナノ粒子抗体複合体の特異性を判定する、インビトロアッセイ
【０１１３】
様々なナノ粒子−抗体複合体によって処理されたＭＭ細胞株のフローサイトメトリー分析を実施した。細胞は、最初にＧｄ−ＮＰ、ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７またはＮＰ−ＢＣＭＡ（０．５ｍＭ）の懸濁液と３０分混合し、新しい培地によって洗浄し、溶液（１×１０６個の細胞／ｍＬ）に再懸濁させた。次に、処理済みの細胞を、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識抗ヒトＢＣＭＡ抗体と一緒にして３７℃で１時間インキュベートしたが、このＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識抗ヒトＢＣＭＡ抗体は、ＮＰ−ＢＣＭＡに競合する標識として機能した（このＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５標識抗ヒトＢＣＭＡ抗体の結合は、このＮＰ−ＢＣＭＡという試薬による蛍光標識を減少させた。）。続いて、Ｃｙ５．５標識細胞の母集団をフローサイトメトリーによって検出した。結果を相互検証するために、ＩＣＰ−ＭＳを利用して、細胞１個当たりの結合したＧｄの量を定量化した。後に挙げたこのＩＣＰ−ＭＳという実験を実施するために、処理済みのＭＭ細胞株を、０．３％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００溶液によって溶解させた後、ＩＣＰ−ＭＳを使用して、各試料中におけるＧｄの量を正確に列挙した。ナノ粒子抗体複合体のＭＭ細胞への共役を検証する第３の方法として、共焦点顕微鏡法を実施して、ＭＭ細胞の表面上における蛍光標識済みの抗体と、別の蛍光色素によって標識されたナノ粒子抗体複合体との共局在化を可視化した。これらの実験に関しては、最初に、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応を使用して、蛍光色素のナノ粒子に対するモル比が１：１０００になるようにＧｄ−ＮＰをＣｙ５−ＮＨＳと共役させた。前述したナノ粒子コンジュゲーション（上記を参照されたい。）の前には、モノクローナル抗体もＡＦ４８８−ＮＨＳ（蛍光体の抗体に対するモル比は、１：１０００である。）によって同様に標識しておいた。ＭＭ細胞株を、二重蛍光色素共役ナノ粒子−抗体複合体と一緒にして３０分間インキュベートし、氷冷メタノールで固定し、Ｄａｐｉ  Ｆｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ−Ｇ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）によってコーティングしたカバーガラスにマウントした。次に、細胞表面に点状に分布する２種の蛍光色素が一緒になって配置されていることを確認するために、共焦点顕微鏡法（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＦＶ１２０００、オリンパス社）を続けて行った。
動物モデル
【０１１４】
ＧＦＰ＋／Ｌｕｃ＋ＭＭ１．Ｓ細胞を、ＩＶ播種によってＳＣＩＤ／ベージュマウスに投与して（５×１０６細胞／マウス。ｎ＝１群当たり５匹のマウス）、ＭＭの同所性ネズミ異種移植モデルを確立した。腫瘍の成長は、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍという生物発光および蛍光を用いる型のイメージングシステム（Ｐｅｒｋｉｎｓ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって毎週モニタリングした。これらのマウスをボルテゾミブ（１日に０．５ｍｇ／ｋｇ×３の用量）によって処理し、続いて、メルファラン（１日に５．５ｍｇ／ｋｇ×１の用量）によって処理することによって、ＭＲＤのネズミモデルをさらに確立した。
イメージング研究
【０１１５】
前臨床用の７−Ｔｅｓｌａ  ＢｉｏＳｐｅｃ７０／２０  ＭＲＩというスキャナー（Ｂｒｕｋｅｒ  ＢｉｏＳｐｉｎ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）によって、ＭＲ画像を取得した。イメージングの前に、各マウスには、８０μｇ／ｍＬの抗ＢＣＭＡ抗体に共役したＧｄ−ＮＰ０．２５ｍｇ／ｇに相当する用量をＩＶ注射によって投与した。８７ｍｓの繰返し時間、３．９ｍｓのエコー時間および６０°のフリップ角を用いるＴ１  ＧＲＥシーケンスを、イメージングのために利用した。収集マトリックスのサイズおよび再構成マトリックスは、２５６×２５６ピクセルであり、スライス厚は、５ｍｍだった。異なるＧｄ主体型造影剤によって得られたイメージングパラメータを比較する場合は、造影剤投与後に様々な時間間隔でＭＲＩを実行し、結果をベースライン画像と比較した。早期診断およびＭＲＤ定量化を研究するために、ＩＶ注射から３０分後にＭＲＩを実施した。ＣＴの取得は、５０ｋＶｐの線源を装着した前臨床用のＩｎｖｅｏｎというＣＴスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ）によって実施したが、画像の解像度は、１０．２ピクセル／ｍｍであり、０．１ｍｍのスライス厚を利用した。各イメージングモダリティによって検出された相異なる疾病負荷のＳＮＲの変化を比較するという目的で、各ＭＲ造影剤の注射前に様々な時間間隔でＣＴイメージングを実施した（下記を参照されたい。）。
イメージングモダリティの定量的比較
【０１１６】
相異なる時点におけるおよび／または相異なるイメージングモダリティを用いる形質細胞の相対的な検出感度の評価を、取得した各画像の信号対雑音比（ＳＮＲ）を計算することによって実施した。これらのＳＮＲ値は、最初にＦｉＪｉというフリーウェア（ｈｔｔｐｓ：／／ｆｉｊｉ．ｓｃ／）を使用して各動物の脊椎および大腿骨の３Ｄセグメンテーションを実行した後で取得された。各画像を同じ強度レベルに正規化し、検査された臓器全体（すなわち、脊椎または大腿骨）を含む関心領域（ＲＯＩ）をセグメント化した。ＲＯＩの信号強度は記録しておき、各スキャンで測定されたバックグラウンドレベルと比較した。ＳＮＲの値および正規化されたＳＮＲの値を、式（１）および（２）に従って計算した。（１）ＳＮＲ＝強度／ノイズ。（２）正規化されたＳＮＲ（ｉ）＝ＳＮＲ（ｉ）／ＳＮＲｂａｓｅｌｉｎｅ。ＩＣＰ−ＭＳ（Ａｇｉｌｅｎｔ  ７９００）を使用して、前述のプロトコルに従って、様々なＧｄ主体型造影剤の取込みの絶対定量化を判定した。簡単に言えば、造影剤注入から３０分後に動物を屠殺し、切除した臓器を７０％ＨＣｌ溶液に溶解させ、各臓器のＧｄ含量を判定した。
ラムダ軽鎖の定量化
【０１１７】
マウスは、週に１回、イメージングの直前に採血した。血清を血液試料から分離し、研究が終了するまで−８０℃で凍結しておいた。血清試料は、ＰＢＳを用いて、ｖ：ｖにより１：１０になるように希釈し、Ｂｒｉｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｏｍｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）の病理学中核施設で定期的に実施する臨床グレードの免疫測定法を使用して、各試料中に存在するラムダ軽鎖の量を定量化した。
受診者操作特性の比較
【０１１８】
ＲＯＣ曲線を使用して、ＳＮＲが腫瘍細胞の有無を判別することができる度合いを表した。腫瘍細胞移植から５週間後のＳＮＲは、様々なイメージングモダリティのうちのイメージングモダリティごとに列挙し、これらのイメージングモダリティの検出感度を比較するための指標として役立てた。各時点に関しては、次の方法を使用してクラスを定義した。腫瘍細胞の移植前のベースライン測定値を対照として役立て（Ｃｔ０＝０）、この腫瘍細胞の移植後には腫瘍細胞が常に存在すると仮定した上で、後続の時点（Ｃｔ＝１）に対して比較した。予測がランダムでないことを確定させるために、両側ウィルコクソン順位和検定が採用した。０．０５未満のｐ値は、ある所与のクラスのＳＮＲ値が、別のクラスのＳＮＲ値と有意に異なっていたことを示している。
統計学的分析
【０１１９】
すべてのインビトロ統計学的分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍというソフトウェア（バージョン７．１）を使用して実施した。異なる複数の医療用イメージング技法のそれぞれを使用してＭＲＤの存在の識別は、Ｒバージョン３．３．３を使用して可能にした。
【実施例２】
【０１２０】
抗体に共役した超小型のガドリニウム主体型ナノ粒子の開発：ＮＰ−抗ＢＣＭＡコンジュゲートにより、細胞株およびマウスにおけるＭＭの存在および進行を検出した。
【０１２１】
図１Ａに示されているように、ＢＣＭＡレベルは、ＭＭ進行が進むのに伴って増加するため、ＢＣＭＡは、ＭＭの進行、治療薬への反応および／またはＭＲＤの実情をモニタリングするのに有用な興味深い細胞表面受容体バイオマーカーになる。上述した５ｎｍ未満のシリカ主体型ガドリニウムＮＰと抗ＢＣＭＡモノクローナル抗体とのコンジュゲート（または代替的には、５ｎｍ未満のシリカ主体型ガドリニウムＮＰと抗ＳＬＡＭＦ７モノクローナル抗体とのコンジュゲート）は、遊離Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）基によって修飾されたＮＰ核が、ビススルホスクシンイミジルスベレート架橋剤を介して抗体表面のＮＨＳ基に共役するように設計した（図１Ｂ）。ＳＬＡＭＦ７とＢＣＭＡ抗原との両方が大いに発現するが、ほとんどＢ細胞の表面上にのみする（Ｌｏｎｉａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７３：６２１−６３１；Ｎｏｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １０３：６８９−６９４）。さらに、ＢＣＭＡは、形質細胞の形質転換およびＭＭの進行においても重要な役割を担うため（Ｎｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：１６０−１７１。図１Ａ）、ＭＲＤ検出用として興味深い特異的なバイオマーカーになる。上記のように、本開示のＭＭ標的造影剤を作製するという目的で、使用されるＧｄ−ＮＰの表面は、遊離ＮＨＳ基によって修飾されており、ビススルホスクシンイミジルスベレートクロスリンカーを介して抗ＳＬＡＭＦ７抗体および抗ＢＣＭＡ抗体のＮＨＳ修飾アミノ基に共役していた（図１Ｂ）。続いて、このようなナノ粒子−抗体複合体の標的化効率をインビトロとインビボとの両方で評価した後、他の診断モダリティに関するＭＲＤの検出能力を判定する比較研究を実施した。それぞれがＮＰ−ＳＬＡＭＦ７コンストラクトおよびＮＰ−ＢＣＭＡコンストラクトを生成することになる、Ｇｄ−ＮＰへのマウス抗ヒトＳＬＡＭＦ７およびＢＣＭＡ抗体の化学的な連結が、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学反応を使用して実施された。ＮＰへの抗体の共役は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および炭水化物ゲル電気泳動を使用した多糖分析（図３Ａおよび図３Ｂ）によって、各ＮＰ抗体コンストラクトを対象にして検証した。予想のとおり、ＮＰへの抗体の共役は、各抗体−ＮＰ複合体のサイズを４．４±１．４ｎｍから１０．０１±２．０３ｎｍ（ＮＰ−ＢＣＭＡ）または１２．９±２．３ｎｍ（ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７）に増大させた（図１Ｃ）。前述のサイズの結果は、平均流体力学的直径の動的光散乱（ＤＬＳ）の測定値を反映したものであり、これにより、ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７とＮＰ−ＢＣＭＡとの両方が未修飾のＧｄ−ＮＰに比べてわずかに大きいことが実際に確認された。これらのナノ粒子−抗体複合体およびこれらの複合体のサイズは、酸性懸濁液条件下においてさえ、長期にわたって安定した状態のままだった（図３Ｃおよび図３Ｄ）。ＮＰのコントラスト特性のわずかな低下が（無修飾のＧｄ−ＮＰに比較した緩和係数のわずかな低下の観察によって査定したときに）観察された。理論に拘束されることを望むわけではないが、このコントラスト特性のわずかな低下は、抗体がガドリニウム原子の表面に配置されており、これにより、共役抗体に��って表面上のＧｄ原子が遮蔽され、この結果として、Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（商標）のｒ１値に類似したｒ１値（ＮＰ、ＮＰ−ＢＣＭＡ、ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７およびＭａｇｎｅｖｉｓｔ（商標）のそれぞれにおいて、ｒ１＝５．９０、５．４９、５．３３および４．７３である。図１Ｄ）が生じることが原因であると考えられた。
【０１２２】
続いて、ＮＰ−ＢＣＭＡのインビトロ標的化効率の向上を、ヒトＭＭ細胞株（ＭＭ１．Ｓ）を用いて検証した。図４Ａに示されているように、ＮＰ−ＢＣＭＡは、インキュベーションから３０分後には、ＭＭ１．Ｓ細胞表面の７４．１±２．９％に結合したが（ＮＰ−ＢＣＭＡ複合体による細胞標識を検出するフローサイトメトリー分析によって確認した）、同一条件下では、２０±４．９％の細胞のみが遊離ＮＰ（Ｇｄ−ＮＰ）によって拘束された（ｐ＜０．００１。図１Ｅ、図４Ａ）。誘導結合プラズマ質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）によって測定された（最終的な細胞懸濁液に含まれる）細胞の表面におけるガドリニウム原子の濃度により、相異なる３種のＭＭ細胞株（ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２、およびＫＭＳ１１）の標識は、ＮＰ−ＢＣＭＡの使用により、無修飾のＧｄ−ＮＰに比較して細胞表面ターゲティング戦略の効率を確認すると、ほぼ２倍上昇したことが確認されており（図４Ｂ）、加えて、蛍光色素標識済みの抗ＢＣＭＡ抗体が、別個の蛍光標識と独立に共役したＧｄ−ＮＰに結合している状況下において、ＮＰ−ＢＣＭＡ複合体と一緒にインキュベートした細胞の蛍光顕微鏡法を実施し、ＭＭ細胞の表面上における抗体種およびナノ粒子の共局在を確認した（図１Ｆ）。培養ＭＭ細胞株（ＭＭ１．Ｓ、ＯＰＭ２およびＫＭＳ１１）のインビトロ細胞生存能力アッセイにより、無修飾のＧｄ−ＮＰも、遊離抗体（抗ＳＬＡＭＦ７または抗ＢＣＭＡ）も、ナノ粒子−抗体複合体も、静脈内（ＩＶ）投与後の血流中で予想されるタンパク質濃度およびＧｄ−ＮＰ濃度に比べて１２５倍高いタンパク質濃度（１０，０００μｇ／ｍＬ）および４倍高いＧｄ−ＮＰ濃度（１μｇ／ｍＬ）においては、いかなるインビトロ毒性ももたらさなかったことも確認した（図５Ａおよび図５Ｂ）。
【実施例３】
【０１２３】
ナノ粒子−抗体複合体を使用した形質細胞のインビボ標的化
【０１２４】
次に、異なるＮＰ組成物の標的化効率（ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７およびＮＰ−ＢＣＭＡ、ならびに、形質細胞を検出するＮＰ−ＳＬＡＭＦ７およびＮＰ−ＢＣＭＡの能力）が、ＭＭ１．Ｓ細胞をＩＶ播種し、続いて、免疫不全ＳＣＩＤベージュマウスの骨髄にＭＭ１．Ｓ細胞を生着させることによって確立した、ＭＭのネズミモデルで評価された。腫瘍負荷（腫瘍播種）の後には、細胞（ＭＭ１．Ｓ）異種移植（注射。図６）から１９日目に開始して２週間に１回の間隔で、生物発光イメージング（ＢＬＩ）を行った。ＭＲＩ研究を実施して、様々なナノ粒子コンストラクト（Ｇｄ−ＮＰ、ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７、およびＮＰ−ＢＣＭＡ）の効率を比較し、これによって、ＭＭ用としてＦｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）に承認された造影剤であるＦＤＡ承認済みの造影剤Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（商標）との比較で、同一の形質細胞の負荷を識別した。７Ｔ  Ｂｒｕｋｅｒ  Ｂｉｏｓｐｉｎ  ＭＲＩスキャンを使用した上で、Ｔ１グラジエントエコー（ＧＲＥ）シーケンスを採用することによって、動物の脊椎および大腿骨中へのガドリニウム（Ｇｄ）の取込みを可視化した（図１Ｇおよび図７）。
【０１２５】
標的ＭＭ細胞に対する投与された各造影剤の特異性（腫瘍領域中にガドリニウム原子が存在するかどうかの確認）は、ＭＲＩ直後に動物を屠殺して確認した。各動物の大腿骨および脊椎組織を、Ｈ＆Ｅおよびプルシアンブルーで染色した後で組織学的査定のために採取すると、これにより、Ｇｄ標識済みの骨髄に浸潤した形質細胞のシートが示された（図１Ｈ、図８Ａおよび図８Ｂ）。
【０１２６】
ＭＲＩ感度の定量的な比較を目的として、異なるＧｄ主体型造影剤投与後の様々な時点で撮影した各画像中には、形質細胞母集団の検出に関するインビボＳ／Ｎ比（ＳＮＲ）を列挙した。動物の脊椎および大腿骨を３Ｄセグメンテーションした後で、信号強度を定量化した（図１Ｉ、図９Ａ〜図９Ｆ）。具体的には、脊椎と大腿骨の３Ｄセグメンテーション後に信号強度を定量化した。ＳＮＲ定量化により、形質細胞母集団を検出するために、受動的標的化用作用物質Ｇｄ−ＮＰおよびＭａｇｎｅｖｉｓｔ（商標）に比較して、ＮＰ−ＢＣＭＡおよびＮＰ−ＳＬＡＭＦ７コンジュゲートの感受性が向上していることが実証された。ナノ粒子−抗体複合体のｉ．ｖ注射後３０分経過するやいなや、ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７を投与された動物は、脊椎における形質細胞腫のＳＮＲが約３．８倍増加したが、ＮＰ−ＢＣＭＡを投与された動物は、約１２倍の向上を示した。有意な点として、ＮＰ−ＢＣＭＡコンジュゲートは、ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７（ｐ＝０．００４５。対応のある片側ｔ検定）より良好な腫瘍の集積を実証した。理論に拘束されることを望むわけではないが、これは、ＭＭ細胞１個当たりの表面ＢＣＭＡ抗原の数がより多いことに起因すると考えられた。ナノ粒子主体型造影剤（Ｇｄ−ＮＰ、ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７またはＮＰ−ＢＣＭＡ。図９Ａ）の投与から４８時間後、肝臓、腎臓、肺または他の臓器においては、ガドリニウムの残留痕跡が観察されなかった。
【０１２７】
ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７およびＮＰ−ＢＣＭＡの薬物動態プロファイルは類似しており（図９Ｂ）、ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７およびＮＰ−ＢＣＭＡの循環半減期は、無修飾のＧｄ−ＮＰの循環半減期より長かった（Ｇｄ−ＮＰ、ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７およびＮＰ−ＢＣＭＡのそれぞれにおいて、ｔ１／２＝１６．１分、２５．２分および３０．３分）。理論に拘束されることを望むわけではいが、こうした血管での持続性の向上は、ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７およびＮＰ−ＢＣＭＡのサイズの方がわずかにより大きいことと、選択された抗体の固有特性とに起因していた。ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７およびＮＰ−ＢＣＭＡは、急速な腎クリアランスを示すことが判明しており（おそらくは、本開示のＮＰ−抗体コンジュゲートでさえサイズが１５ｎｍ未満のサイズであったことが理由）、この急速な腎クリアランスにより、健康な臓器が長期間にわたってＮＰ−ＳＬＡＭＦ７およびＮＰ−ＢＣＭＡに晒されることが抑制される（これにより、ガドリニウムと健康な臓器とが長期間にわたって接触することが抑制される）。単回用量のＩＶ投与後の２週間にわたって安定した動物の体重によって立証されているように、コンストラクトは、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいては耐容性がよかった（図９Ｃ。体重の減少が観察されなかった。）。この観察期間の終了時点においては、終末期血液の検査により、通常の基本代謝パネル（ＢＭＰ。図９Ｄ）、全血球計算（ＣＢＣ。図９Ｅ。図９Ｅでは、差異が観察されなかった。）および白血球分画（図９Ｆ。図９Ｆでは、化学パネルが変化しなかった。）を確認した。切除された組織のＨ＆Ｅ染色によっても、微細構造に歪みがある根拠は実証されなかった（図１０。図１０では、差異が観察されなかった。）。したがって、ナノ粒子−抗体コンジュゲートは、急性毒性を示さないと考えられた。様々な時点において屠殺したＭＭ１．Ｓ腫瘍保有ＳＣＩＤベージュマウスから取り出された切除臓器のＩＣＰ−ＭＳにより、注射後から３０分後には、
脊椎においては、４．２±０．４％のグラム当たり注入用量（ＩＤ／ｇ）が形質細胞に局在化しているが、大腿骨においては、２．０１±０．１％のＩＤ／ｇが形質細胞中に見受けられることが確認された（図１Ｉおよび図１Ｊ）。
【実施例４】
【０１２８】
最小残留疾患を検出するための従来の方法に関するＢＣＭＡ標的化ナノ粒子抗体複合体の感受性および特異性の比較により、ＮＰ−抗ＢＣＭＡコンジュゲートが、ほ乳類対象のＭＲＤを検出することが明らかにされた
【０１２９】
（ＩＣＰ−ＭＳによって定量化した場合において）注射から３０分後に固形腫瘍を対象とするほぼ理想的な標的化効率（すなわち、上記のように、脊椎においては４．２±０．４％のＩＤ／ｇ、大腿骨においては２．０１±０．１％のＩＤ／ｇ）を有することを理由にして、ＮＰ−抗ＢＣＭＡコンジュゲートを検査して、この薬剤が、ＭＲＩスキャンと組み合わせたときに、ＭＲＤ検出用のイメージングバイオマーカーとして使用可能であるかどうかを判定した。臨床学的なＭＲＤ診断のために現在利用可能な方法において、ＮＰ−ＢＣＭＡの感受性および特異性の比較を実施した。ＭＭの治療においては、昨今、重要な進歩がなされているが、これは、少なくとも部分的には、ＭＭ疾患の病因に関する網羅的な理解が最近深まっていることによるものである。特に、ＭＭの治療の治療選択肢が広がっており、例えば、２０１５年には、エロツズマブおよびダラツムマブが承認されている。しかしながら、ＭＭ患者の生存率が２倍になったとはいっても、ＭＭ患者の早期治療により、生存率をさらに高めることができることも実証されている。対照的に、ＭＲＤ陰性の状態を達成している場合、患者は、ＭＲＤ陽性の患者との比較で、再発しない可能性がより高くなっていることもＭＭ治療が終了時に実証された。したがって、ＮＰ−ＢＣＭＡコンジュゲートが、ＭＭの早期予測因子と、ＭＲＤバイオマーカー型作用物質との両方を提供し得るかどうかを評価した。
【０１３０】
ＭＲＤは、最もＭＭに関連付けられているバイオマーカーの１つとして確立されたが、実際にも、大部分のＭＭ患者の再発は、ＭＲＤ陽性シグナルの存在を原因とするものとして認識されてきた。ＭＲＤは、将来の治療上の決定に関する評価を可能にしながらも、ＭＭ治療剤の直接的な治療有効性を査定するために使用され得ることが実証された。しかしながら、ＭＲＤの検出は、簡単なものではない。マルチパラメータフローサイトメトリーおよび対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドＰＣＲ等、ＭＲＤ陽性状態の存在を評価する現在の手法は、侵襲的プロセスに基づいたものであり、定性的なものであり、骨髄試料に依存するものであり、試料を破壊するものであり、ならびに／または、施行および評価に多大な時間を要するものである。ＭＭの治療およびイメージングにおいて一般的な不具合は、慣例的な治療法では、腫瘍形成能を有するＢ細胞が骨においてホーミングしているところに到達して対処することが可能ではないことである。したがって、標的細胞への効果的な細胞内作用物質の標的化送達が必要とされてきたが、やはり、標的化送達も困難な障害をもたらしてきた。悪性形質細胞に特異的な親和性を有さないビスホスホネートを主体としたナノ粒子の使用による、骨微小環境の標的化は可能であると実証されているが、本開示により、ＭＭ細胞を特異的に標的とする新しい手法が特定された。
【０１３１】
少なくとも上記の理由から、ＮＰ−ＢＣＭＡコンジュゲートを、ＭＲＤのイメージングバイオマーカーとして評価した。この評価を実施するために、ＧＦＰおよびルシフェラーゼを発現したＭＭ１．Ｓ細胞（ＧＦＰ＋／Ｌｕｃ＋ＭＭ１．Ｓ）を血管内播種し、続いて２１後に、３回分の用量のボルテゾミブ（０．５ｍｇ／ｋｇ）および１回分の用量のメルファラン（５．５ｍｇ／ｋｇ）を使用して治療目的でのデバルキングを行うことによって、ＭＲＤのネズミモデルを確立した。腫瘍の成長は、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって週に１回モニタリングしたが、このとき、腫瘍細胞播種法を前臨床モニタリングするためのゴールドスタンダードであるＢＬＩ（図２Ａ）と、全身ＭＲＩ（図２Ｂ）および全身ＣＴスキャン（図２Ｃ）とによって週に１回モニタリングすることにより、細胞播種（ＭＭ１．ＳＧＦＰ＋／Ｌｕｃ＋）を追跡した。ＭＲＤモデルは、治療目的での投与の完了に対応する治療の２５日目に、負のＢＬＩシグナルを取得することによって検証した（図２Ｄ）。続いて、脊椎のＳＮＲの経時的な変化を評価し、各イメージング時点においてＮＰ−ＢＣＭＡの投与から３０分後に実施するＭＲＩによって疾患の再拡大を追跡するために使用した（図２Ｅ）。結果は、ＣＴスキャンで得られた結果と比較した（図２Ｆ）。さらに、λ軽鎖のレベルの上昇は、ＭＭ１．ｓ細胞がλ軽鎖発現体であることを理由にして（ＭＭ１．Ｓ細胞は、λ軽鎖のみを発現し、κ軽鎖もＭタンパク質も発現しない（Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ  ４：ｅ１９１））、（患者を診断するための標準的な方法として）経時的に追跡された。具体的には、同じ時点において、血清λ軽鎖のレベルを測定した（図１Ｇ）。
【０１３２】
ＢＬＩ、ＭＲＩ、ＣＴおよび血清λ軽鎖アッセイによって得られた結果を、治療目的でのバルキングの１週間後（すなわち、最初の腫瘍細胞の移植から５週間後）に比較した。受信者操作特性（ＲＯＣ）曲線を作成して、ＭＲＤの存在を検出するために４種の診断モダリティそれぞれの感受性および特異性を査定し、ＮＰ−ＢＣＭＡを使用するＭＲＩの優位性を確認した（図２Ｈ）。各モダリティによって、実験の全期間（すなわち、最初の腫瘍細胞の移植から、治療目的でのバルキングを経て、最終的には、腫瘍の再成長による動物の死亡に至るまで）にわたって検出されたＳＮＲの曲線下面積（ＡＵＣ）の比較により、これらの発見がさらに裏付けられた（図２Ｉ）。ＮＰ−ＢＣＭＡを使用したＭＲＩの分析感受性を判定するために、腫瘍細胞の移植後２５日目（腫瘍デバルキングの直後）、２８日目および３０日目に追加のマウスを屠殺したが、これらは、ＭＲＩによって形質細胞が視認可能になった最初の時点に対応していた。骨髄吸引液のフローサイトメトリー実験を実施し（図２Ｊ）、結果を列挙して、ＮＰ−ＢＣＭＡを使用したＭＲＩには、マウス１匹当たり２２００±４５０個の形質細胞という、ＭＲＤの検出閾値があることを確認した。予想のとおり、骨髄の総母集団中における形質細胞の百分率（図２Ｋ）およびＮＰ−ＢＣＭＡ結合形質細胞の百分率（図２Ｌ）は、時間に伴って上昇したが、これは、腫瘍の再成長によるものだった。
【０１３３】
Ｔ１シグナルの向上に起因する特異性と使いやすさは、ＭＭ疾患（ＭＲＤを含む）の迅速で優先的な検出を可能にするものであり、より網羅的な患者の診断を実施する前、例えば、次世代のシーケンスを実施する前に、予測手段として臨床的に用いられ得る。実際、５週目（すなわち、治療法から１週後）から得られた結果（図２Ｈ）と、実験全体の経過にわたって得られた関連する曲線下面積の計算（図２Ｉ）とにより、ナノ粒子によって推進される型の効果的なモノクローナル抗体は、ＭＭ用のイメージングバイオマーカーとして作用することが可能であり、より具体的には、利用可能な他のイメージングモダリティおよび軽鎖の定量化に比べてさえも感受性および特異性がより高くなるような様式で、治療アウトカムを予測するように作用することが可能であるという、初めての概念実証がなされた。したがって、本明細書においてＭＭ療法との関連で開示したとおり、ＭＭおよびＭＲＤを対象にした細胞表面受容体としての抗原ＢＣＭＡの選択は、ＢＣＭＡの高い有病率、および、ＭＧＵＳからＳＭＭへのＭＭ疾患の進行中における発現レベルの上昇によって左右された。さらに、このマーカーは、ＭＭ細胞の成長、生存率および薬物耐性の促進因子である形質細胞様樹状細胞にも発現したが、ＢＣＭＡは、ナイーブな大部分の記憶Ｂ細胞および健常な組織細胞には発現しておらず、これにより、この標的が、一意的に定まる受容体になっていた。したがって、ＮＰ−ＢＣＭＡは、早期腫瘍および骨髄外ＭＭ疾患の検出を可能にしており、これにより、ＭＲＤの非侵襲的定量化による新しいＭＭ治療薬のモニタリングが実現可能になっている。
【０１３４】
要約すると、本明細書においては、超小型のＧｄ主体型ナノ粒子抗体コンジュゲートのシリアルＭＲＩによって得られるＳＮＲの変化が、ＭＲＤを検出するためのイメージングバイオマーカーとして使用された、概念実証の最初の例であると考えられるものが、実証されている。重要な点として、本明細書に記載の新たに開示された作用物質は、第一世代の抗体標的化ナノ粒子見受けられる難点を回避して、自然な微小環境下での悪性形質細胞の精密な局在化を達成することが可能だった。本明細書において開示されたコンストラクトは、すべてのＧｄ主体型造影剤に関する十分に確立されたリスク（Ｂａｒｒｅｔｔ  ａｎｄ  Ｐａｒｆｒｅｙ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３５４：３７９−３８６）を考慮すると、進行性腎不全の患者には適さないこともあり得るが、そうでない場合においては、これらのコンストラクトは、有効でない治療法の早期中断、および／または、長期間にわたるＭＭの寛解後の治療再開を促すのに役立てることができる。ＭＭ療法への細胞表面標的化作用物質の利用が増えるにつれて（例えば、エロツズマブ（Ｌｏｎｉａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７３：６２１−６３１）、ＢＣＭＡ標的キメラ抗原受容体Ｔ細胞（Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １２８：１６８８−１７００；ＣＡＲ−Ｔ）およびダラツムマブ（Ｌｏｋｈｏｒｓｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７３：１２０７−１２１９））、ＮＰ−ＳＬＡＭＦ７、ＮＰ−ＢＣＭＡおよびＧｄ−ＮＰ−抗ＣＤ３８抗体コンジュゲートの将来の製剤により、ＭＲＩは、患者に特異的な治療薬の選択を導き出すことができるようになり得る。好結果を伴うこれらの応用は、を改善するためのナノメディシンの全潜在能力をがん患者のケアおよび生存率の改善につなげるのに役立てることができる、他の標的化コンストラクトの作製に関する洞察も与え得る。
【０１３５】
本明細書において言及されているすべての特許および刊行物は、本開示が関する分野の当業者の技能水準を示唆している。本開示において引用したすべての参考文献は、それぞれの参考文献の全体を参照により個別に組み込むかのようにして、参照により組み込む。
【０１３６】
当業者ならば、本開示が目的を実行し、言及された目的および利点、ならびにそれらに固有の目的および利点を得るのによく適合していることを容易に理解されよう。好ましい実施形態を現時点において代表する、本明細書において記述されている方法および組成物は、例示的なものであり、本開示の範囲を限定するものとして意図されていない。本開示の趣旨に包含され、特許請求の範囲によって規定された、これらの方法および組成物における変更ならびに他の使用も、当業者ならば想到する。
【０１３７】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループまたは代替物から構成される他のグループ化に関して記述されている場合、当業者ならば、これにより、本開示がマーカッシュ群または他の群に属する任意の個別的なメンバーまたは複数のメンバーから構成される部分群に関しても記述されることを認識されよう。
【０１３８】
本開示を記述する文脈における（特に、下記の特許請求の範囲における）「１つの」および「一」ならびに「前記」という用語ならびに類似の指示対象の使用は、そうではないと本明細書において指摘されていない限り、または明らかに文脈と矛盾しない限り、単数および複数の両方を網羅すると解釈すべきである。「備える」、「有する」、「包含する」および「含む」という用語は、そうではないと述べられていない限り、非制限的な用語（つまりは、「含むが、これに限定されるわけではない」という意味）として解釈すべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、そうではないと本明細書において指摘されていない限り、単にその範囲内に含まれる別個の各値を個別に指す、簡便な方法とし機能することを意図されており、別個の各値は、本明細書において個別に言及されたかのようにして、本明細書に組み込む。
【０１３９】
そうではないと本明細書において指摘されていない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本明細書において記述されたすべての方法は、任意の適切な順番で実行することができる。本明細書において提示されたいずれかの例およびすべての例、または例示的な文言（例えば、「等」）の使用は、単に本開示をより良く明らかにすることを意図しているにすぎず、そうではないと主張されていない限り、本開示の範囲を限定しない。本明細書に含まれる言語は、クレームされていない要素が本開示の実施に不可欠なものであることを示していると解釈すべきでない。
【０１４０】
本明細書においては、開示された本発明を実施するために発明者に知られた最良の形態を含めて、本開示の実施形態が記述されている。これらの実施形態の変形形態は、前述の説明を読めば、当業者には明らかになり得る。
【０１４１】
本明細書において例示的に記載された開示は、本明細書において明示的に開示されていない任意の１種以上の要素または１種以上の限定がない場合であっても、実施することが可能である。したがって、例えば、本明細書の各例において、「含む」、「から本質的になる」、および「からなる」という用語のいずれかは、他の２つの用語のいずれかに置き換えることができる。使用されている用語と表現は、限定ではなく記述に関する用語として使用されており、このような用語および表現の使用においては、提示および記述された特徴の何らかの均等物またはその一部分を排除する意図はなく、クレームされた本発明の範囲内で様々な修正が可能であることを認識されよう。したがって、本開示は好ましい実施形態を提供しているが、本明細書に開示された概念に関する任意選択的な特徴、修正および変形は、当業者ならばなすことが可能であり、このような修正および変形は、本明細書および添付の特許請求の範囲によって規定される本開示の範囲に含まれると考えられることを理解すべきである。
【０１４２】
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示された本発明に対して様々な置き変えおよび修正を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。したがって、このような追加の実施形態は、本開示および添付の特許請求の範囲に含まれる。本開示は、改善されたコントラスト、診断活性および／またはイメージング活性を有する複合体を作製するために、本明細書において記述された化学的な修飾の様々な組み合わせおよび／または置き換えを試験することを、当業者に教示している。したがって、本明細書に記載の特定の実施形態は限定をするものではなく、当業者ならば、本明細書に記載の修飾の特定の組み合わせが、改善されたコントラスト、診断および／またはイメージング活性を有するコンジュゲートを特定すべく、過度の実験なしに試験できることを容易に理解されよう。
【０１４３】
本発明者らは、当業者がこのような変形形態を適宜使用することも予想しており、本発明者は、本開示が、本明細書において明示的に記述されたもの以外の方法で実施されることも意図している。したがって、本開示は、適用法によって許可されているとおり、本明細書に添付された特許請求の範囲において記載された主題に関するすべての修正および均等物を含む。さらに、その可能なすべての変形形態における上記要素の任意の組み合わせは、そうではないと本明細書において指摘されていない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、本開示によって包含される。当業者は、日常的なものを超えない実験を用いて、本明細書に記載の本開示の特定の実施形態の多くの同等物を認識し、または確認することができる。このような均等物は、下記の特許請求の範囲に包含されるように意図されている。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図２Ｇ】
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【図２Ｈ】
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【図２Ｉ】
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【図２Ｊ】
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【図２Ｋ】
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【図２Ｌ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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