(57)【要約】  本発明は、２次元ゲル電気泳動における熱安定性変化に基づいた蛍光差を用いた標的タンパク質の識別方法に関し、より具体的には、特定の薬物、好ましくは生理活性分子がその標的タンパク質と結合した時に現れるタンパク質の熱安定性変化を２次元ゲル電気泳動の蛍光差を通じて分析することによって、特定の薬物の標的になるタンパク質を識別（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）する方法に関する。  本発明に係るＴＳ−ＦＩＴＧＥを用いた標的タンパク質の同定方法を用いる場合、極端な化学構造を有する生理活性天然物、すなわち、合成が難しい複雑な構造の天然物と、化学的修飾のための空間が不足した小さくて単純な天然物にプローブを標識しなくてもその標的タンパク質を容易に探し出すことができ、これは革新的な新薬および治療法の開発に非常に効率的である。また、既存の熱安定性アッセイがＦＩＴＧＥ技術と結合されることによって、タンパク質の熱安定性変化による融解温度の変化が微小であるかまたは融解曲線の傾きが激しい場合にも、特定温度における顕著な色変化を通じてタンパク質の熱安定性変化を容易に検出できるという長所がある。【選択図】図１【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含む、薬物分子の標的タンパク質を同定する方法：
（ａ）細胞溶解物またはヒト由来細胞が含まれた混合物Ａを製造するステップ、
（ｂ）細胞溶解物またはヒト由来細胞と、薬物分子とが混合されて含まれた混合物Ｂを製造するステップ、
（ｃ）前記混合物Ａと前記混合物Ｂを同一な特定温度に変化させるステップ、
（ｄ）前記（ｃ）ステップで得られた特定温度の混合物Ａおよび混合物Ｂに互いに異なる波長の蛍光物質を各々混合して、混合物Ａおよび混合物Ｂの溶液部分に存在するタンパク質に前記互いに異なる波長の蛍光物質を各々標識するステップ、
（ｅ）前記（ｄ）ステップで得られた混合物Ａおよび混合物Ｂを混合して混合物Ｃを製造するステップ、
（ｆ）前記混合物Ｃを電気泳動するステップ、および
（ｇ）前記（ｆ）ステップの電気泳動によりゲルに現れるタンパク質スポットに対する蛍光波長を分析して、前記（ｃ）ステップにより熱安定性変化（ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ）が現れたタンパク質を確認するステップ。
【請求項２】
前記（ｃ）ステップの特定温度は３７〜７０℃の範囲にあることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（ｇ）ステップの各タンパク質スポットに対する融解曲線グラフをプロッティング（ｐｌｏｔｔｉｎｇ）するステップをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（ｂ）ステップの薬物分子は生理活性分子であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記（ｇ）ステップで得られたタンパク質は膜固定（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ）タンパク質であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記（ｇ）ステップの熱安定性変化は、前記混合物Ｂに存在するタンパク質が前記薬物分子と結合することによって熱安定化されることであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記タンパク質はヌクレオホスミン（ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ、ＮＰＭ）であり、前記薬物分子は生理活性分子であるホルデニン（ｈｏｒｄｅｎｉｎｅ）であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記（ｇ）ステップの熱安定性変化は、前記混合物Ｂに存在するタンパク質が前記薬物分子と結合することによって熱不安定化されることであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質はＰＫＣα（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃα）であり、前記薬物分子は生理活性分子であるブリオスタチン１（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ  １）であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記（ｄ）ステップの蛍光物質は、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８、Ｒ６Ｇ、ＨＥＸ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３２、ＴＡＭＲＡ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６、ＥｔＢｒ、ＳＹＰＲＯ  ＲｕｂｙおよびＢｌｕｅ  ＦＡＭからなる群より選択されるいずれか一つ以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記（ｄ）ステップの混合物Ａに混合される蛍光物質はＣｙ３であり、混合物Ｂに混合される蛍光物質はＣｙ５であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｃｙ３およびＣｙ５はアミン−反応性官能基がさらに結合されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記（ｇ）ステップの蛍光波長分析は、前記混合物Ａの溶液部分に存在するタンパク質に標識される蛍光物質から発生する蛍光波長と、前記混合物Ｂの溶液部分に存在するタンパク質に標識される蛍光物質から発生する蛍光波長の比率を分析することによって行われることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記（ｆ）ステップの電気泳動は２次元ゲル電気泳動であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、２次元ゲル電気泳動における熱安定性変化に基づいた蛍光差を用いた標的タンパク質の識別方法に関し、より具体的には、特定の薬物、好ましくは生理活性分子がその標的タンパク質と結合した時に現れるタンパク質の熱安定性変化を２次元ゲル電気泳動の蛍光差を通じて分析することによって、特定の薬物の標的になるタンパク質を識別（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
低分子物質がその生理活性を示すためには、それらの生体分子的パートナーと結合しなければならない。このような現象を標的結合（ｔａｒｇｅｔ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）と言い、薬物の発見と化学生物学的研究において重要な分野である。形質スクリーニングを介した伝統的な天然物またはヒット化合物（ｈｉｔ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）の標的タンパク質は大半の場合は知られていなかったため、標的タンパク質は生理活性低分子物質の活性メカニズムを定めるために識別されなければならず、これは新規な治療剤または生物医学科学分野のリサーチツールの発展のために重要である。
【０００３】
標的の識別に最も一般に用いられる接近方式には、親和性クロマトグラフィ−プルダウンアッセイがある（Ｓｃｈｅｎｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３．，９，ｐｐ．２３２−２４０）。生理活性化合物がアガロースビーズに固定されることによって、細胞溶解物がビーズと共に培養され、変形されたビーズと結合された標的タンパク質は結合されていない他のタンパク質から分離される。化学的プロテオミクスにおいて最近の二つの接近法は、（ｉ）タンパク質クラスの酵素活性を用いた活性ベースのプロテオームプロファイリングとして、活性部位への共有結合ラベリングを用いたもの（Ｓｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３．，９，ｐｐ．２００−２０５）、および（ｉｉ）非酵素タンパク質の結合相互作用を用いた親和性ベースのプロテオームプロファイリングとして、光親和性ベースの共有結合性架橋（ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ）を用いたもの（Ｐａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｄ．Ｒｅｐ．２０１５．８．２４．，ｄｏｉ：１０．１０３９／ｃ５ｎｐ００１０１ｃ）を含む。このような接近法は、化学的プロテオミクスの範囲を確実に拡張させたものの、酵素反応に必要な求電子剤、クリックケミストリーにおけるアルキン部分（ｍｏｉｅｔｙ）、標的タンパク質への共有結合性架橋結合のための光親和性官能基などの機能部位（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈａｎｄｌｅｓ）を導入するために本来の生理活性化合物に化学的修飾を加えなければならない。そこで、機能変化の最小化、光親和性官能基の最適化、分子構造および大きさを含む立体的な要素（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｆａｃｔｏｒｓ）の考慮などを通じて、標的の識別のためのプローブを発展させるための持続的な努力があった。例えば、韓国登録特許第１０−１４２７３２８号においては、タンパク質と結合が可能な特定の光反応官能基および蛍光物質標識用官能基を含むプローブを、生理活性分子に共有結合により標識することによって標的タンパク質を同定しようとした。
【０００４】
しかし、機能化のための設計および合成は、標的の識別において大きな障害物にならざるを得ない。多くの類似物質を合成しそれらの構造−活性関係を探索することは、相当に多くの努力を必要とする。仮に標的識別プローブが生理活性をそのとおりに維持できるように合成されたとしても、化学的修飾されたプローブが細胞のプロテオームと非特異的相互作用をするのは依然として避けることができない。複雑な天然物の全体的な合成の制限、またはこれらを天然供給源から十分な量で抽出し出すことの制限により化学的修飾を実行し難いだけでなく、若干の修飾だけで本来のヒット化合物が有する生物学的活性を失いうる。例えば、ブリオスタチン１（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ  １）という化合物の場合、５８段階の合成段階を経なければならないほど合成するのが難しいだけでなく（Ｋｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３３，７４４−７４７（２０１１））、その化学構造式が非常に複雑であるため（図７ａ）、従来の標的識別方法を用いる場合、好適に機能するプローブを製作するのが難しい。また、ホルデニン（ｈｏｒｄｅｎｉｎｅ）の場合、その逆に非常に単純な構造になっており（図１３ａ）、プローブを標識するための化学的変化が不可能な代表的な天然生理活性低分子物質である。したがって、どのような構造的な変化も必要としない非標識標的識別方法が必要な実情である。
【０００５】
最近報告されたＣＥＴＳＡ（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｓｓａｙ；ＣＥＴＳＡ）では、標識がない方式の標的結合（ｔａｒｇｅｔ  ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）が無傷の細胞および組織内で観察された（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｍｏｌｉｎａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１３．，３４１，ｐｐ．８４−８７）。熱変性後のウェスタンブロットにより、溶液部分に存在する標的タンパク質の量が測定された。生理活性リガンドの結合が標的タンパク質を熱変性に対して安定化させ、タンパク質の融解温度Ｔｍを増加させた。このようなＣＥＴＳＡの堅固性と効率性のため、ＣＥＴＳＡは多くの研究員に採択されて標的結合の確認のために用いられた。例えば、国際公開公報ＷＯ２０１５／１４５１５１号においてもＣＥＴＳＡと定量的質量分析法を用いて薬物抵抗性を有した患者からバイオマーカーを探そうとし、韓国公開特許公報第１０−２０１４−００３３３６６号においてもタンパク質の熱的変化を用いて標的タンパク質に結合するリガンドを探そうとした。しかし、前記二つの特許は、いずれにしてもリガンドと標的タンパク質の結合による融解温度の変化が大きくなく微小な場合には、リガンドと標的タンパク質の結合可否を容易に検出できないという短所がある。それのみならず、ＣＥＴＳＡは非偏向的な（ｕｎｂｉａｓｅｄ）プロテオーム−ワイド標的の識別に好適ではなく、その理由は該方法が使用可能抗体を用いた仮説に基づいた（ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ  ｄｒｉｖｅｎ）候補タンパク質にのみ適用可能であるためである。その反面、非偏向的標的の識別は、成功的な形質スクリーニングのための必須条件であり、革新新薬治療法の開発に率いる。
【０００６】
ＬＣ−ＭＳテクニックの速い発展により、最近ゲル−フリー（ｇｅｌ−ｆｒｅｅ）プロテオミクスが好まれているにもかかわらず、２次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）は費用、堅固性、および解像度の側面で依然として効果的なプロテオミクス接近法として残っている。本発明者らは、熱安定性アッセイを２次元ゲル電気泳動に基づくＦＩＴＧＥ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）技術と結合すれば、単にＣｙ３シグナルとＣｙ５シグナル間の蛍光差による赤色スポットまたは緑色スポットを他の黄色スポットと区別することによって、熱安定性変化が発生したタンパク質スポットを効果的に探せるということに着目した。
【０００７】
そこで、本発明者らは、２次元ゲル電気泳動における熱安定性変化に基づいた蛍光差（ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ−ｂａｓｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＴＳ−ＦＩＴＧＥ）を用いた、プロテオーム−ワイド標的の識別のための非標識方法を用いて、極端な化学構造を有する生理活性天然物、すなわち、合成が難しい複雑な構造の天然物と、化学的修飾のための空間が不足した小さくて単純な天然物の標的を識別し、それを通じてＴＳ−ＦＩＴＧＥ方法の堅固性と実用性を立証しようとした。二つの蛍光シグナルは熱的に安定化または不安定化されたタンパク質スポットを可視化するのに用いられ、各々の様々な温度におけるゲルの定量イメージ分析を通じて各タンパク質スポットに対する融解曲線をプロッティング（ｐｌｏｔｔｉｎｇ）した。
【０００８】
その結果、ＴＳ−ＦＩＴＧＥ方法は、成功的にメトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）およびブリオスタチン１の知られた標的タンパク質を明らかにし、特に膜固定タンパク質の識別に該方法が適用できることを確認した。さらには、ホルデニンの知られていない標的タンパク質として、インビトロ（ｉｎ−ｖｉｔｒｏ）タンパク質調節因子である単純天然物を識別し、その機能を検証した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、薬物分子、好ましくは生理活性分子の標的タンパク質を同定する方法であって、２次元ゲル電気泳動における熱安定性変化に基づいた蛍光差（ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ−ｂａｓｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｔｗｏ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＴＳ−ＦＩＴＧＥ）を用いた同定方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
前記目的を達成するために、本発明は、次のステップを含む、薬物分子、好ましくは生理活性分子の標的タンパク質を同定する方法を提供する：
（ａ）細胞溶解物またはヒト由来細胞が含まれた混合物Ａを製造するステップ、
（ｂ）細胞溶解物またはヒト由来細胞と、薬物分子とが混合されて含まれた混合物Ｂを製造するステップ、
（ｃ）前記混合物Ａと前記混合物Ｂを同一な特定温度に変化させるステップ、
（ｄ）前記（ｃ）ステップで得られた特定温度の混合物Ａおよび混合物Ｂに互いに異なる波長の蛍光物質を各々混合して、混合物Ａおよび混合物Ｂの溶液部分に存在するタンパク質に前記互いに異なる波長の蛍光物質を各々標識するステップ、
（ｅ）前記（ｄ）ステップで得られた混合物Ａおよび混合物Ｂを混合して混合物Ｃを製造するステップ、
（ｆ）前記混合物Ｃを電気泳動するステップ、および
（ｇ）前記（ｆ）ステップの電気泳動によりゲルに現れるタンパク質スポットに対する蛍光波長を分析して、前記（ｃ）ステップにより熱安定性変化（ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ）が現れたタンパク質を確認するステップ。
【発明の効果】
【００１１】
本発明に係るＴＳ−ＦＩＴＧＥを用いた標的タンパク質の同定方法を用いる場合、極端な化学構造を有する生理活性天然物、すなわち、合成が難しい複雑な構造の天然物と、化学的修飾のための空間が不足した小さくて単純な天然物にプローブを標識しなくてもその標的タンパク質を容易に探し出すことができ、これは革新的な新薬および治療法の開発に非常に効率的である。また、既存の熱安定性アッセイがＦＩＴＧＥ技術と結合されることによって、タンパク質の熱安定性変化による融解温度の変化が微小であるかまたは融解曲線の傾きが激しい場合にも、特定温度における顕著な色変化を通じてタンパク質の熱安定性変化を容易に検出できるという長所がある（図１６参照）。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＴＳ−ＦＩＴＧＥ実験の模式図である。マイクロチューブ内の黄色は標的タンパク質を意味し、十字模様は薬物を意味する。
【図２】三つの蛍光染料（Ｃｙ３−ＮＨＳエステル、Ｃｙ５−ＮＨＳエステル、およびＣｙ２−ＮＨＳエステル）の化学構造式、化学式、および分子量を示す。
【図３】三つの他の染料と各々コンジュゲーションされたプロテオームの同一な移動性を示す代表イメージである。（ａ）Ｃｙ２、Ｃｙ３、およびＣｙ５シグナルは３７℃ゲルにおいて重畳し、大部分のスポットは白色を示した。（ｂ）５７℃において、熱的に不安定なタンパク質は沈殿し、溶液部分から除去された。したがって、このようなスポットは、加熱されていないＣｙ２−標識された内部標準によって青色を示した。
【図４】メトトレキサート（ＭＴＸ）の標的タンパク質の非偏向識別を示す。（ａ）ＴＳ−ＦＩＴＧＥ実験の代表的なイメージ。Ｃｙ３チャネル（緑色、ＤＭＳＯ処理されたプロテオーム）とＣｙ５チャネル（赤色、ＭＴＸ処理されたプロテオーム）のイメージが重畳した。（ｂ）５３℃ゲルにおいて各スポットのＣｙ５／Ｃｙ３蛍光比率の分布を示すボックスプロット（ｂｏｘ  ｐｌｏｔ）。ウィスカー（ｗｈｉｓｋｅｒｓ）は１−９９百分位を示す。（ａ）にある三角形で示されたスポットは赤い矢印で示された。（ｃ）（ｂ）に示されたスポットの変性パターンを示す融解曲線。（ｄ）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）抗体を用いた細胞熱的変化アッセイからの免疫ブロット。
【図５】メトトレキサート（ＭＴＸ）を用いたＴＳ−ＦＩＴＧＥ実験から得られた全体ゲルイメージである。
【図６】メトトレキサート（ＭＴＸ）の他の標的タンパク質としてチミジル酸合成酵素の識別を示す。（ａ）メトトレキサート（ＭＴＸ）を用いたＴＳ−ＦＩＴＧＥ実験から得られた全体ゲルイメージ。塩基性ｐＨ範囲でのより良い解像度のためにｐＨ６〜９勾配（ｇｒａｄｉｅｎｔ）のストリップゲルが用いられた。（ｂ）（ａ）で白色ボックスで示された部分の拡大イメージ。（ｃ）４８℃ゲルにおいて各々のスポットに対するＣｙ５／Ｃｙ３シグナル比率の分布を示すボックスプロット。ウィスカーは１−９９百分位を示す。（ｂ）で三角形で示されたスポットは赤い矢印１によって示される。赤い矢印２はジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）のスポットである。（ｄ）（ｃ）で矢印で示されたスポット１の変性パターンを示す融解曲線。（ｅ）チミジル酸合成酵素（ＴＹＭＳ）抗体を用いた細胞熱的変化アッセイからの免疫ブロット。
【図７】ブリオスタチン１（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ  １）の膜固定された標的タンパク質の熱不安定性を示す。（ａ）ブリオスタチン１（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ  １）の化学構造。（ｂ）ブリオスタチン１（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ  １）によるＰＫＣアイソザイムの電位およびＰＫＣの可溶化に対するＩＧＥＰＡＬＣＡ−６３０の効果。（ｃ）ブリオスタチン１を処理するＴＳ−ＦＩＴＧＥ実験の代表イメージ。（ｄ）４７℃ゲルにおいて各々のスポットに対するＣｙ５／Ｃｙ３シグナル比率の分布を示すボックスプロット。ウィスカー（ｗｈｉｓｋｅｒｓ）は１−９９百分位を示す。（ｅ）（ｄ）に示されたスポットの変性パターンを示す融解曲線。（ｆ）ＰＫＣα抗体を用いた細胞熱移動分析からの免疫ブロット。（ｇ）ブリオスタチン１（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ  １）によるＰＫＣαの熱不安定性を確認する等温（４８℃）容量−反応曲線。
【図８】ＰＫＣの可溶化における界面活性剤の効果を示すものである。（ａ）初期スクリーニングのためにＰＫＣαを代表的なＰＫＣとして用いて溶解バッファの界面活性剤条件を最適化。ブリオスタチン１で１時間処理した後、溶液部分においてＰＫＣαの量がウェスタンブロットにより測定された。ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０はＰＫＣαを最も効果的に可溶化した。ＰＫＣα可溶化のために、０．４％（ｖ／ｖ）が０．０５％より良く、１％とは類似した。（ｂ）１時間のプリオスタンティン１の処理によるＰＫＣμおよびＰＫＣζの移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）およびそれらの可溶化のための０．４％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０の効果。
【図９】熱変性がない場合のブリオスタチン１による赤色および緑色スポットの発現を示す。（ａ）ブリオスタチン１を７５分間処理するＴＳ−ＦＩＴＧＥ実験の代表イメージ。（ｂ）（ａ）で白色ボックスで示された部分の拡大イメージ。
【図１０】タンパク質スポット変化に対する処理時間の効果を示す。（ａ）熱変性がない場合のブリオスタチン１の処理による色変化の２Ｄゲル分析。処理時間が減少するにつれて、タンパク質ｅは無くなり、タンパク質ｃおよびｄは黄色になった。（ｂ）タンパク質ｄのＣｙ３に対するＣｙ５の量的な比率。（ｃ）ＰＫＣαの総量を比較するための、ＰＫＣα抗体を用いた１Ｄゲル上での免疫ブロット。ＰＫＣαの総量は３７℃において処理時間に関係なく同一であった。（ｄ）ＰＫＣα抗体を用いた２Ｄゲル上での免疫ブロット。７５分間の処理は更なるＰＫＣαスポットの発現を誘導した。更なるスポットは赤色を示し、残りのスポットは蛍光イメージにおいて緑色になった。
【図１１】ブリオスタチン１で２０分間処理した後のＴＳ−ＦＩＴＧＥ実験から得られた全体ゲルイメージである。
【図１２】ＰＫＣアイソザイムに対するＣＥＴＳＡ分析を示す。ＰＫＣβおよびＰＫＣθは熱不安定化を示したが、他のものはそうでなかった。
【図１３】ホルデニンの新規な標的タンパク質の識別を示す。（ａ）ホルデニンの化学構造（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｙｒａｍｉｎｅ、ＨＤＮ）。（ｂ）ルシフェラーゼレポーター遺伝子産物によって測定された、ＨＤＮがインビトロ翻訳アッセイに与える上方調節効果。データは平均（ｍｅａｎ）±ＳＥＭ（ｎ＝２）で示された。（ｃ）ＴＳ−ＦＩＴＧＥ実験の代表的イメージ。Ｃｙ３チャネル（緑色、ＤＭＳＯ処理されたプロテオーム）とＣｙ５チャネル（赤色、ＨＤＮ処理されたプロテオーム）のイメージが重畳した。（ｄ）５３℃ゲルにおいて各スポットのＣｙ５／Ｃｙ３蛍光比率を示すボックスプロット。ウィスカーは１−９９百分位を示す。（ｃ）で三角形で示されたスポットは赤色の矢印で示された。（ｅ）（ｄ）に示されたスポットの変性パターンを示す融解曲線。（ｆ）ＨＤＮ抗体を用いた細胞熱的変化アッセイからの免疫ブロット。データは平均（ｍｅａｎ）±ＳＥＭ（ｎ＝４）で示された。（ｇ）固定化されたヌクレオホスミン（ＮＰＭ）に対するＨＤＮ（１．５６−３７．５μＭ）の結合キネティクス（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｋｉｎｅｔｉｃｓ）を示す、表面プラズモン共鳴アッセイのセンサグラム。右側上段の挿図は様々な濃度のＨＤＮに対する定常状態（ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ）の反応を示す。（ｈ）タンパク質Ｇビーズに結合された抗−ＮＰＭによるＮＰＭの枯渇を示す、ＮＰＭ抗体を用いた免疫ブロット。（ｉ）ＮＰＭ枯渇後の翻訳上方調節に対するＮＰＭの低下した効果。データは平均（ｍｅａｎ）±ＳＥＭ（ｎ＝３）で示された。＊ｐａｉｒｅｄ  Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ  ｔ−ｔｅｓｔによるＰ＜０．０５。
【図１４】ホルデニンで処理した後のＴＳ−ＦＩＴＧＥ実験から得られた全体ゲルイメージである。
【図１５】熱安定化を示す標的タンパク質を確認するための免疫ブロット分析を示す。（ａ）ＳＥＴ、ＲＰＳＡ、およびＥＥＦ１ｄを対照タンパク質、ＧＡＰＤＨ、およびβ−チューブリンと比較した細胞熱変化アッセイ。（ｂ）５３℃におけるＮＰＭおよびβ−チューブリンの等温容量反応分析。ＮＰＭタンパク質はＨＤＮによって容量依存的な熱安定化を示した。
【図１６】ＴＳ−ＦＩＴＧＥにおける分析手続きを示す。ＴＳ−ＦＩＴＧＥにおいて各温度での蛍光差が直接に比較されることによって、Ｔｍ変化が微小であっても特定温度において顕著な色変化が検出されることができる。このような特定温度ポイントはゲル数を増加させることによって捕らえることができる。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
本明細書において、「熱安定性変化（ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ）」という概念は、薬物分子とその標的タンパク質の結合により、標的タンパク質が（ｉ）熱的安定化（ｔｈｅｒｍａｌｌｙ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）されて標的タンパク質本来の融解温度Ｔｍより高い融解温度値を有するようになるか、（ｉｉ）熱的不安定化（ｔｈｅｒｍａｌｌｙ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚｅｄ）されて標的タンパク質本来の融解温度より低い融解温度値を有するようになることを意味する。
【００１４】
本発明は、一つの観点において、（ａ）細胞溶解物またはヒト由来細胞が含まれた混合物Ａを製造するステップ、（ｂ）細胞溶解物またはヒト由来細胞と、薬物分子とが混合されて含まれた混合物Ｂを製造するステップ、（ｃ）前記混合物Ａと前記混合物Ｂを同一な特定温度に変化させるステップ、（ｄ）前記（ｃ）ステップで得られた特定温度の混合物Ａおよび混合物Ｂに互いに異なる波長の蛍光物質を各々混合して、混合物Ａおよび混合物Ｂの溶液部分に存在するタンパク質に前記互いに異なる波長の蛍光物質を各々標識するステップ、（ｅ）前記（ｄ）ステップで得られた混合物Ａおよび混合物Ｂを混合して混合物Ｃを製造するステップ、（ｆ）前記混合物Ｃを電気泳動するステップ、および（ｇ）前記（ｆ）ステップの電気泳動によりゲルに現れるタンパク質スポットに対する蛍光波長を分析して、前記（ｃ）ステップにより熱安定性変化（ｔｈｅｒｍａｌ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ）が現れたタンパク質を確認するステップを含む、薬物分子の標的タンパク質を同定する方法に関するものである。
【００１５】
前記「ヒト由来細胞」は、尿、糞、胎盤、毛髪、爪など人間から排出されたもの、または血液、皮膚、腫瘍、組織など人間から採取されたものから由来する細胞を意味する。
【００１６】
本発明において、前記（ｃ）ステップの特定温度は３７〜７０℃の範囲にあることを特徴とし、前記方法は前記（ｇ）ステップの各タンパク質スポットに対する融解曲線グラフをプロッティング（ｐｌｏｔｔｉｎｇ）するステップをさらに含むことを特徴とする。
【００１７】
前記融解曲線はＳ字状曲線（ｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｃｕｒｖｅ）であり、薬物分子とその標的タンパク質が結合してタンパク質が熱的に安定化された場合にはＳ字状曲線がグラフ上で右側に移動し、熱的に不安定化された場合にはＳ字状曲線がグラフ上で左側に移動する。本発明の一実施例において、生理活性分子であるホルデニンが標的タンパク質であるヌクレオホスミンと結合してタンパク質の融解温度が増加、すなわち、熱的に安定化されることを確認することができ、他の実施例において、他の生理活性分子であるブリオスタチン１が標的タンパク質であるＰＫＣαと結合してタンパク質の融解温度が減少、すなわち、熱的に不安定化されることを確認することができた。
【００１８】
したがって、本発明において、前記（ｇ）ステップの熱安定性変化は、前記混合物Ｂに存在するタンパク質が前記薬物分子と結合することによって熱安定化されることを特徴とする。例えば、生理活性分子であるホルデニン（ｈｏｒｄｅｎｉｎｅ）が標的タンパク質であるヌクレオホスミン（ｎｕｃｌｅｏｐｈｏｓｍｉｎ、ＮＰＭ）と結合する場合、ヌクレオホスミンは熱安定化される。また、前記（ｇ）ステップの熱安定性変化は、前記混合物Ｂに存在するタンパク質が前記薬物分子と結合することによって熱不安定化されることを特徴とする。例えば、生理活性分子であるブリオスタチン１（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ  １）が標的タンパク質であるＰＫＣα（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃα）と結合する場合、ＰＫＣαは熱不安定化される。
【００１９】
また、前記（ｂ）ステップの薬物分子は好ましくは生理活性分子であり、前記（ｇ）ステップで得られた標的タンパク質の種類は特に限定されるものではないが、膜固定（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ）タンパク質であってもよい。
【００２０】
なお、本発明において、前記（ｄ）ステップの蛍光物質は特に制限されるものではないが、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５、ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ４８８、Ｒ６Ｇ、ＨＥＸ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ３２、ＴＡＭＲＡ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５４６、ＥｔＢｒ、ＳＹＰＲＯ  ＲｕｂｙおよびＢｌｕｅ  ＦＡＭからなる群より選択されるいずれか一つ以上であってもよく、好ましくは、前記（ｄ）ステップの混合物Ａに混合される蛍光物質はＣｙ３、混合物Ｂに混合される蛍光物質はＣｙ５であることを特徴とする。また、好ましくは、前記Ｃｙ３およびＣｙ５に各々下記のアミン−反応性官能基がさらに結合されてもよい。好ましくは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｎ−ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｅ（ＮＨＳ）ｅｓｔｅｒ）がさらに結合されてもよい。
＜アミン−反応性官能基＞
【００２１】
【化１】
2020502480.tif 000002
【００２２】
また、本発明において、前記（ｇ）ステップの蛍光波長（シグナル）分析は、前記混合物Ａの溶液部分に存在するタンパク質に標識される蛍光物質から発生する蛍光波長と、前記混合物Ｂの溶液部分に存在するタンパク質に標識される蛍光物質から発生する蛍光波長の比率を分析することによって行われる。前記比率は、本発明が属した技術分野で一般的に用いられる２Ｄゲル蛍光測定装置、好ましくは、ＤｅＣｙｄｅｒ  ２Ｄソフトウェアを用いて計算することができる。
【００２３】
なお、本発明において、前記（ｆ）ステップの電気泳動は、２次元（２Ｄ）ゲル電気泳動であることを特徴とする。既存の１次元（１Ｄ）電気泳動の場合、１方向に電気泳動して分子量別にタンパク質が分けられる。この場合、標的タンパク質と同一または類似した分子量のタンパク質が生理活性分子と結合するのを区分し難い場合が多い。したがって、２方向に分子量および電荷量に応じてタンパク質が分離されるため、前記のような問題を解決し標的タンパク質を同定することができる。
【実施例】
【００２４】
以下では実施例を通じて本発明をより詳しく説明することにする。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは当業界で通常の知識を有する者にとって明らかなことである。よって、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。
【００２５】
熱安定性変化を用いたプロテオーム−ワイド標的の識別
ＣＥＴＳＡは指定された抗体を用いて知られた候補タンパク質に適用させることができ、それにより、熱安定性変化を本発明者らが開発したＦＩＴＧＥ技術に適用させてプロテオーム−ワイド標的の識別をしようとした。図１に示すように、細胞は、薬物の存在または不存在下で、３分間熱変性が誘導される温度範囲内で加熱された。その次に、細胞をＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）溶液において凍結−融解サイクルを通じて洗浄および溶解させ、遠心分離を通じて変成されたタンパク質を沈殿させた。大部分のタンパク質は薬物の存在または不存在下で同一な変性パターンを示した反面、熱安定性に変化があった標的タンパク質は薬物との結合により溶液部分に存在する量の差を示した。溶液部分の全てのタンパク質はＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルを含む二つの互いに異なる染料、すなわち、陰性対照群としてキャリアのみ処理されたグループにはＣｙ３−ＮＨＳが、薬物処理されたグループにはＣｙ５−ＮＨＳがコンジュゲーションされた。染料がコンジュゲーションされた二つのグループのプロテオームは混合された後に２次元ゲル電気泳動（２−ＤＥ）により分離され、各タンパク質スポットのＣｙ３蛍光シグナルに対するＣｙ５蛍光シグナルの比率が自動イメージ分析によって定量された。
【００２６】
薬物による熱安定性変化が起こっていないタンパク質は黄色スポットを示した反面（Ｃｙ３とＣｙ５の合成シグナル）、薬物結合によって熱的に安定化または不安定化されたタンパク質は各々赤色スポットと緑色スポットを示した。また、加熱されていないプロテオームはＣｙ２−ＮＨＳとコンジュゲーションされ、同量のＣｙ２−コンジュゲーションされたプロテオームが各々のゲルサンプルに添加されてインター−ゲル定量の内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ）になるようにした。それにより、各タンパク質スポットの融解曲線が得られた（図１）。
【００２７】
ＴＳ−ＦＩＴＧＥにおいて熱的変化したスポットは潜在的な標的タンパク質とみなされ、質量分析法による識別のために切除（ｅｘｃｉｓｉｏｎ）された。
【００２８】
実施例１：同一な電気泳動的流動性（ｍｏｂｉｌｉｔｙ）のための三つの蛍光染料の準備
２次元ゲルにおいてＣｙ２−、Ｃｙ３−、Ｃｙ５−コンジュゲーションされたタンパク質の移動性の偏差を最小化するために、電荷と（ｃｈａｒｇｅ−ｍａｔｃｈｅｄ）質量が（ｍａｓｓ−ｍａｔｃｈｅｄ）一致する染料を準備した。各染料の合成過程は以下のとおりである。
Ｃｙ２の合成
【００２９】
【化２】
2020502480.tif 000003
【００３０】
試薬および条件：（ａ）１，２−ジクロロベンゼン（１０ｍＬ）内でｎ−プロピルブロミド（０．１ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ．）および２−メチルベンゾオキサゾール（０．１ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ．）の溶液が２４時間１１０℃で攪拌された。反応混合物はエーテルと共に粉末化され、前記沈殿物は得ようとする生成物３を白色の結晶として得るためにエーテルで洗浄された。（ｂ）酢酸無水物（１０ｍＬ）内で３の溶液（０．１ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ．）およびＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン（０．１ｍｍｏｌ、１．２ｅｑｕｉｖ．）の溶液が３０分間１２０℃で攪拌された。溶媒は減少した圧力下で除去され、残余物は得ようとする生成物４を黄色の結晶として得るためにフラッシュカラムクロマトグラフィによりジクロロメタン／メタノールで精製された。（ｃ）１，２−ジクロロベンゼン（１０ｍＬ）内で４−（ブロモメチル）フェニル酢酸（０．１ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ．）溶液および２−メチルベンゾオキサゾール（０．１ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ．）の溶液が２４時間１１０℃で攪拌された。反応混合物はエーテルと共に粉末化され、前記沈殿物は得ようとする生成物５を黄色の結晶として得るためにエーテルで洗浄された。（ｄ）エタノール（１０ｍＬ）内で４（０．１ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ．）および５（０．１ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ）の溶液にトリエチルアミンを添加し、３０分間８０℃で攪拌された。溶媒は減少した圧力下で除去され、残余物は得ようとする生成物Ｃｙ２を濃い黄色の結晶として得るためにフラッシュカラムクロマトグラフィによりジクロロメタン／メタノールで精製された。
Ｃｙ３の合成
【００３１】
【化３】
2020502480.tif 000004
【００３２】
試薬および条件：（ａ）ニトロメタン（１０ｍＬ）内でｎ−プロピルブロミド（０．１ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ．）および２，３，３−トリメチルインドレニン（０．１ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ．）の溶液が６時間８０℃で攪拌された。反応混合物はエーテルと共に粉末化され、前記沈殿物は得ようとする生成物６をピンク色の結晶として得るためにエーテルで洗浄された。（ｂ）ニトロメタン（１０ｍＬ）内で５−ブロモ吉草酸（０．１ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ．）および２，３，３−トリメチルインドレニン（０．１ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ．）の溶液が６時間８０℃で攪拌された。反応混合物はエーテルと共に粉末化され、前記沈殿物は得ようとする生成物７を紫色の結晶として得るためにエーテルで洗浄された。（ｃ）酢酸無水物（１０ｍＬ）内で７（０．１ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ．）およびＮ，Ｎ’−ジフェニルホルムアミジン（０．１２ｍｍｏｌ、１．２ｅｑｕｉｖ．）の溶液が３０分間１２０℃で攪拌された。反応混合物は室温で冷却された。その後、ピリジン（１０ｍＬ）内に６の溶液が添加された。混合物は１２時間室温で攪拌された。溶液はクロロホルム内に濃縮および溶解され、水および１Ｎ  ＨＣｌ水溶液で洗浄された。有機層はその後ＭｇＳＯ4と共に乾燥され、Ｃｙ３を濃いピンク色の結晶として得るためにフラッシュカラムクロマトグラフィによりジクロロメタン／メタノールで濾過、蒸発、および精製された。
Ｃｙ５の合成
【００３３】
【化４】
2020502480.tif 000005
【００３４】
試薬および条件：（ａ）ヨードメタン、ニトロメタン、ｒ．ｔ．，１２ｈ。（ｂ）前記Ｃｙ３の合成過程中の（ｂ）と同一。（ｃ）酢酸無水物（１０ｍＬ）内で７（０．１ｍｍｏｌ、１ｅｑｕｉｖ．）およびマロンジアルデヒドビス（フェニルイミン）モノヒドロクロリド（０．１２ｍｍｏｌ、１．２ｅｑｕｉｖ．）の溶液が３０分間１２０℃で攪拌された。反応混合物は室温で冷却された。その後、ピリジン（１０ｍＬ）内に８の溶液が添加された。混合物は１２時間室温で攪拌された。溶液はクロロホルム内に濃縮および溶解され、水および１Ｎ  ＨＣｌ水溶液で洗浄された。有機層はその後ＭｇＳＯ4と共に乾燥され、Ｃｙ５を濃い青色の結晶として得るためにフラッシュカラムクロマトグラフィによりジクロロメタン／メタノールで濾過、蒸発、および精製された。
Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５−ＮＨＳエステルの合成
【００３５】
【化５】
2020502480.tif 000006
【００３６】
試薬および条件：（ａ）ＤＭＦ（５ｍＬ）内でＣｙ２、Ｃｙ３、またはＣｙ５（０．１ｍｍｏｌ、１．０ｅｑｕｉｖ．）の溶液にピリジン（０．２ｍＬ）および炭酸Ｎ，Ｎ−ジスクシンイミジル（ＤＳＣ、０．１５ｍｍｏｌ、１．５ｅｑｕｉｖ．）が添加された。混合物は２時間６０℃で攪拌された。前記溶媒は減少した圧力下で除去され、残余物は各々得ようとする生成物Ｃｙ２−ＮＨＳエステル、Ｃｙ３−ＮＨＳエステルまたはＣｙ５−ＮＨＳエステルを得るためにフラッシュカラムクロマトグラフィによりジクロロメタン／メタノールで精製された。
【００３７】
前記全ての染料は＋１の電荷を帯び、互いに２Ｄａだけの差のみ示した（図２）。Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ５とコンジュゲーションされたタンパク質が同じ移動性を有することによって、３７℃ゲル内の大部分のタンパク質スポットが融合（ｍｅｒｇｉｎｇ）後に白色を示した（図３）。さらに高い温度において、熱的に不安定なタンパク質（Ｃｙ３−およびＣｙ５−コンジュゲーションされたタンパク質）は変成するかまたは無くなった。したがって、このスポットは、加熱されていないＣｙ２染料と結合した内部標準（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｓｔａｎｄａｒｄ）により青色を示した（図３ｂ）。
【００３８】
実施例２：メトトレキサート（Ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）に対する概念実証（ｐｒｏｏｆ−ｏｆ−ｃｏｎｃｅｐｔ）標的識別研究
メトトレキサートは、主標的タンパク質であるジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ、ＤＨＦＲ）が１６℃の顕著に大きいＴm移動があると知られているため（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｍｏｌｉｎａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．３４１，８４−８７（２０１３））、概念実証研究のために選択された。様々な変性温度の２次元ゲルシリーズ中、３７℃ゲルのほぼ全てのタンパク質スポットが黄色を示したが、５３℃ゲルにおいては明らかな赤色スポットが発見された（図４ａと図５）。定量分析のために、５３℃ゲルにあった全てのタンパク質スポットにおいてＣｙ３に対するＣｙ５シグナルの比率を計算してボックスプロット（ｂｏｘ  ｐｌｏｔ）に示した（図４ｂ）。
【００３９】
予想したとおりに、図４ａに示された赤色スポットは最も高い比率を示し（図４ｂに矢印で表示）、このスポットには顕著に異なるＣｙ５およびＣｙ３蛍光シグナルがあることを提示した。このスポットの融解曲線はＣｙ２シグナルを内部標準として用いて一定温度の範囲内で描かれ、Ｓ字状曲線の移動を示し、メトトレキサートの潜在的な標的タンパク質のＴm増加を示した（図４ｃ）。
【００４０】
最後に、このスポットを切除してＬＣ−ＭＳ／ＭＳを通じて分析した結果、ＤＨＦＲが標的タンパク質であることを知ることができた（表１）。単クローンＤＨＦＲ抗体を用いたウェスタンブロット分析を通じてＴＳ−ＦＩＴＧＥによって出たパターンと類似した熱的変化パターンであることを知ることができた。
【００４１】
また、チミジル酸合成酵素（メトトレキサートの他の標的タンパク質）も４８℃ゲルにおいて明らかな赤色を示す熱−安定スポットに確認され、このスポットにおいてチミジル酸合成酵素の量的蛍光差がＤＨＦＲスポットに先立ち最も大きく現れた（図６および表１）。
【００４２】
それにより、熱安定性変化に基づいたＴＳ−ＦＩＴＧＥが実現可能であり、生きている細胞内で非偏向（ｕｎｂｉａｓｅｄ）標的の識別のための効率的な方法であることを確認した。
【００４３】
質量分析法による２次元電気泳動スポットのタンパク質の識別。１００より大きいＭａｓｃｏｔスコアを有したタンパク質は再現可能な結果を示したのでリストされた。
【表１】
2020502480.tif 000007
2020502480.tif 000008
2020502480.tif 000009
実施例３：ブリオスタチン１の膜固定（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ａｎｃｈｏｒｅｄ）標的タンパク質の識別
ＴＳ−ＦＩＴＧＥの有用性を確認するために、複雑な天然物であるブリオスタチン１の標的タンパク質を識別した。ブリオスタチンは、海洋生物であるフサコケムシ（Ｂｕｇｕｌａ  ｎｅｒｉｔｉｎａ）から初めて抽出され、強い坑癌活性、相乗的な化学療法（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）活性、記憶力の向上活性を示した（Ｒｕａｎｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９，２６５２−２６６４（２０１２））。１９８２年、ブリオスタチン１の構造が正確に明らかになった後、２０１１年５８段階の総合成が記録された（Ｋｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３３，７４４−７４７（２０１１））。したがって、ブリオスタチン１は、他の標的識別方法のために好適に機能するプローブを作り難い複雑な天然物の例である（図７ａ）。また、ブリオスタチンは、プロテインキナーゼＣ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  Ｃｓ、ＰＫＣｓ）を調節して原形質膜に移動させて固定させることが知られており、細胞シグナル過程に重要な役割をする基質タンパク質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をリン酸化する（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＮＳ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖ．１２，１−８（２００６））。
【００４４】
細胞膜に固定されたタンパク質が本発明のＴＳ−ＦＩＴＧＥ方法に好適であるかを研究するために、先ず、ウェスタンブロットを通じてＰＫＣを可溶化することにおける界面活性剤の効果を確認し、種々の界面活性剤のうち（図８ａ）非イオン性、非変性界面活性剤である０．４％（ｖ／ｖ）のＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０を含むリン酸緩衝生理食塩水における溶解（ｌｙｓｉｓ）条件を最適化した。図７ｂに示すように、ＰＫＣαはブリオスタチン処理前に主に溶液部分に存在したが、弱い界面活性剤が含まれていない溶解バッファにおいてはブリオスタチン処理後に不溶性部分に移動した。しかし、０．４％のＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０が存在する場合、ブリオスタチン処理後にもＰＫＣαは溶液部分に存在した。ＰＫＣδの位置はブリオスタチンに影響を受けなかったが、両方とも可溶化のために非イオン性界面活性剤が必ず必要であった（図７ｂ）。他のＰＫＣアイソザイムの可溶化は、ブリオスタチンと界面活性剤の影響を受けなかった（図８ｂ）。したがって、０．４％のＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０は、ＰＫＣを全体的に可溶化し、溶液部分の熱安定性変化を検知するために必要であることが分かる。
【００４５】
その次に、最適化された溶解条件をもって細胞プロテオームの熱変性パターンを観察するために、ブリオスタチンに対するＴＳ−ＦＩＴＧＥ実験を行った。興味深くに、幾つかのスポットが、加熱されたサンプルだけでなく加熱されていないサンプル（３７℃）においても赤色または緑色を示し、このスポットの色差は熱的変化によるものではないことを示す（図７ｃ、タンパク質ａおよびｂ；図９、タンパク質ｃ、ｄ、ｅ、ｆ、ｇ、ｈ、Ｉおよびｊ）。また、大部分の赤色と緑色スポットが水平に相互の横に対の配列に現れた。この現象は、２次元電気泳動から観察される典型的な翻訳後修飾（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ＰＴＭ）パターンである。したがって、これらのスポットは、熱的変化した標的タンパク質でない、３７℃において薬物の結合後に翻訳後修飾になったダウンストリーム基質にみなした。ＰＴＭによって発生した赤色と緑色タンパク質スポットは、ＰＴＭが起こる時間が充分でないように薬物処理の時間を減らすことによって減少させることができる。予想したとおりに、処理時間が減ることにつれてｅを含む赤色スポットは無くなったが、緑色スポットｃとｄは３７℃において黄色系列になった（図１０ａおよび１０ｂ）。タンパク質スポットｃ、ｄ、ｅがＰＫＣαにより識別された後（表１）、ＰＫＣα抗体を用いてウェスタンブロットを行った。３７℃におけるＰＫＣαの総量は１次元ゲルと同一であったが、増加したブリオスタチン１の処理時間を適用した２次元ゲルにおいてはＰＫＣαが水平の赤色と緑色スポットに分離された（図１０ｃおよび１０ｄ）。この結果は、全て３７℃において赤色と緑色スポットがＰＴＭによって発生するという解釈と一貫した。
【００４６】
２０分間のブリオスタチン１の処理後、加熱されたサンプルにおいては明らかな緑色スポットが観察されたが、加熱されていないサンプルにおいては観察されておらず、これは標的結合に応じた熱不安定化を示す（図７ｃ、タンパク質ｃおよびｄ；図１１）。このスポットは４７℃ゲルにおいて最も低いＣｙ３に対するＣｙ５シグナルの比率を示し、これは顕著な熱不安定化が発生したことを示す（図７ｄ）。加熱されていないゲルにおいてもスポットが赤色を示し、よって、シグナル差が熱安定性変化によって発生したものではなくＰＴＭによって発生したものであるため、最も高いＣｙ５／Ｃｙ３シグナル比率を示したスポットは除外された。スポットｃとｄの両方とも温度依存的な熱不安定化パターンを示し、タンパク質ｄの融解曲線は図７ｅに示す。質量分析を通じて、スポットｃとｄのタンパク質は全てブリオスタチン１の標的であるＰＫＣαであることが示された（表１）。一般に、標的タンパク質は、薬物結合によって熱安定化になると知られている（Ｎｉｅｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２，２２１２−２２２１（２００７））。ブリオスタチン１によるＰＫＣαの熱不安定化を確認するためにＣＥＴＳＡを実行し、これはＰＫＣαの熱不安定化を確実に示す（図７ｆ）。また、４８℃における等温容量−反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ）曲線はＰＫＣαの容量依存的な熱不安定化を示し（図７ｇ）、前述した内容を裏づけした。ブリオスタチン１は他のアイソザイムとも結合することが知られているため（Ｋａｚａｎｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４６，３７４−３７９（１９９４））、他のアイソザイムにもＣＥＴＳＡを実行した。ＰＫＣβＩ、ＰＫＣδとＰＫＣεは特別な熱安定性変化を示さなかったが、ＰＫＣβＩＩとＰＫＣθは熱不安定化を示し、予想されたＰＫＣγ、ＰＫＣμ、ＰＫＣζバンドは発見できなかった（図８ｂおよび図１２）。
【００４７】
実施例４：ＴＳ−ＦＩＴＧＥを用いたホルデニンの新規な標的タンパク質の識別
最後に、単純な構造になっていて化学的変化が不可能な天然生理活性低分子物質にＴＳ−ＦＩＴＧＥ方法を適用した。ホルデニン（Ｎ，Ｎ−ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｙｒａｍｉｎｅ、図１３ａ）は幾つかの植物、特に芽が出ている麦から発見できるアルカロイドである（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．１６，９−１８（１９７７））。ホルデニンは、ネズミにおけるガストリン分泌の刺激、精管からノルエピネフリンの吸収阻害や、馬の血管に注射された時の呼吸率と心拍率の増加など幾つかの生理活性を有している（Ｆｒａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｑｕｉｎｅ  Ｖｅｔ．Ｊ．２２，４３７−４４１（１９９１））。
【００４８】
インビトロタンパク質翻訳に影響を与える化合物を確認するために、小型分子ライブラリーをスクリーニングした結果、ホルデニンがルシフェラーゼレポーター遺伝子の翻訳を増進させることが明らかになった（図１３ｂ）。しかし、ホルデニンの生物学的活性とそのタンパク質翻訳に連関した結合パートナーを分析した以前の研究結果は探すことができなかった。
【００４９】
ホルデニンの標的識別のために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を用いてＴＳ−ＦＩＴＧＥを実行し、５４℃ゲルにおいて最も高いＣｙ５／Ｃｙ３比率を示した（図１３ｄ）赤い系列のスポット（図１３ｃおよび図１４）を検出した。このスポットはＳ字状融解曲線を描くために一定の温度範囲で定量され（図１３ｅ）、そのスポットは標的候補リストを得るためのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために切除された（表１）。結合パートナーを決定するために、タンパク質翻訳と連関しているヌクレオホスミン（ＮＰＭ）、伸長因子１−ｄｅｌｔａ（ＥＥＦ１Ｄ）、タンパク質ＳＥＴ（ＳＥＴ）、４０Ｓリボソームタンパク質ＳＡ（ＲＰＳＡ）に対してＣＥＴＳＡを実行した（図１３ｆおよび図１５ａ）。
【００５０】
ＮＰＭは他の候補タンパク質とは異なり、β−チューブリンとＧＡＰＤＨに比べて顕著な熱安定化を示した。ホルデニンによるＮＰＭの容量依存的な熱安定化は５３℃、７．６ｍＭのＥＣ50値において等温容量反応グラフによって確認された（図１５ｂ）。ホルデニンのＮＰＭとの直接的な結合を確認するために表面プラズモン共鳴分析を実行し、これは１３．６ｍＭのＫD値を有する一般的な１対１結合パターンの濃度依存的な反応を明らかに示した（図１３ｇ）。
【００５１】
インビトロタンパク質翻訳の上方調節（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）がホルデニンによるＮＰＭの機能的調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）によって発生したことであるか調べるために、ＮＰＭをインビトロ翻訳システムから枯渇させることによって機能喪失研究（ｌｏｓｓ−ｏｆ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ）を通じて機能的検証（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）を行った。要約すれば、アガロースビーズにあるタンパク質Ｇに結合されたＮＰＭ抗体は、ＮＰＭを除去するためにインビトロ翻訳システムと共に培養された。ウェスタンブロットの結果から観察されたことのように、アガロースビーズを除去した後には、溶液に残っていたＮＰＭが減少した（図１３ｈ）。ＮＰＭ減少後、ルシフェラーゼ遺伝子翻訳に対するホルデニン本来の上方調節効果は７２．７％が減少し（図１３ｉ）、これはホルデニンが直接にＮＰＭを調節し、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のインビトロタンパク質翻訳を上方調節したことを検証した。
【００５２】
実施例で用いられた方法
化学物質および試薬：メトトレキサート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）、ブリオスタチン１（ｂｒｙｏｓｔａｔｉｎ  １）、ホルデニン（ｈｏｒｄｅｎｉｎｅ）、および分枝のオクチルフェノキシポリ（エチレンオキシ）エタノール（ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０）を含む全ての化学物質をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。培地、牛胎児血清（ＦＢＳ）、および抗生剤−抗真菌剤溶液を含む細胞培養試薬はＧｉｂｃｏ［Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ］から購入した。ＤＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）はＷｅｌｇｅｎｅから購入し、完全プロテアーゼ阻害剤カクテル（ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ）はＲｏｃｈｅから購入した。
【００５３】
細胞培養：ＨＥＫ２９３ＴおよびＪｕｒｋａｔクローンＥ６−１細胞を韓国細胞株銀行から購入した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１％（ｖ／ｖ）抗生剤−抗真菌剤溶液が補充されたＤＭＥＭで培養された。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳおよび１％（ｖ／ｖ）抗生剤−抗真菌剤溶液が補充されたＲＰＭＩ  １６４０培地で培養された。細胞は、湿度がある５％  ＣＯ2インキュベータで３７℃に維持された。
【００５４】
細胞抽出液の準備：Ｊｕｒｋａｔ細胞はブリオスタチン１のために用いられ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞はメトトレキサートおよびホルデニンをために用いられた。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液により得られた後に化合物の処理前に円すい管内に再分散（ｒｅｓｕｓｐｅｎｄｅｄ）された。メトトレキサートは１０μＭの濃度で３時間ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と共に培養され、ホルデニンは２０μＭの濃度で３時間ＨＥＫ２９３Ｔ細胞と共に培養された。前記化合物の処理後に、細胞は部分標本化（ａｌｉｑｕｏｔｅｄ）され、３分間特定温度の範囲内の各温度に加熱され、再び３分間２５℃で冷却された。加熱された細胞を得た後、ＰＢＳで洗浄し、溶解バッファ（プロテアーゼ阻害剤カクテルが補充されたＰＢＳ）に再分散された。細胞分散液は、細胞溶解のために液体窒素と共に３回凍結−融解させた。溶液部分は２０，０００ｇとして２０分間４℃で遠心分離させることで細胞溶解物から分離された。等温容量−反応（ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ  ｄｏｓｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ、ＩＴＤＲ）分析のための手続きは、細胞が様々な濃度の化合物で処理され固定された温度で加熱されることを除いては、前述した手続きと同様に実行された。
【００５５】
ウェスタンブロット：溶液部分は、５×Ｌａｅｍｍｌｉバッファと混合された後、９５℃で５分間加熱された。タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、ＰＶＤＦメンブレインに移された。メンブレインは、２％  ＢＳＡが含まれたＴＢＳＴ（ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  Ｔｗｅｅｎ−２０）において１時間４℃の温度で、１次抗体（抗−ＤＨＦＲ［ａｂ１３３５４６、ａｂｃａｍ］、ａｎｔｉ−ＴＹＭＳ［３７６６、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ］、抗−ＰＫＣα［２０５６、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ］、抗−ＰＫＣβＩ［ａｂ１９５０３９、ａｂｃａｍ］、抗−ＰＫＣβＩＩ［ａｂ３２０２６、ａｂｃａｍ］、抗−ＰＫＣγ［４０２  ａｂ１３１２２２、ａｂｃａｍ］、抗−ＰＫＣδ［９６１６、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ］、抗−ＰＫＣε［ａｂ１２４８０６、ａｂｃａｍ］、抗−ＰＫＣμ［２０５２、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ］、抗−ＰＫＣθ［ａｂ１１０７２８、ａｂｃａｍ］、抗−ＰＫＣζ［９３６８、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ］、抗−ＮＰＭ［ａｂ５２６４４、ａｂｃａｍ］、抗−ＲＰＳＡ［ａｂ１３３６４５、ａｂｃａｍ］、抗−ＳＥＴ［ａｂ１７６５６７、ａｂｃａｍ］、抗−ＥＥＦ１Ｄ［ａｂ８８８６８、ａｂｃａｍ］、抗−ＧＡＰＤＨ［２１１８、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ］、ａｎｄ抗−β−ｔｕｂｕｌｉｎ［２１４６、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ］）と共に一晩中培養された。その次に、メンブレインは、ＴＢＳＴで洗浄され、２次抗体（抗−ウサギＩｇＧ、ＨＲＰ−ｌｉｎｋｅｄ［７０７４、Ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ］）と共に常温で一時間培養された。前記メンブレインは、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）ＥＣＬプライムウェスタンブロッティング検出試薬［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］により強化（ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ）され、ＣｈｅｍｉＤｏｃ［Ｂｉｏ−Ｒａｄ］により検出された。ＣＥＴＳＡ曲線の場合、薬物処理されたグループおよび対照群グループにおいて、各々３７℃における相対的なバンド強度が計算された。ＩＴＤＲ曲線の場合、ＤＭＳＯグループとの相対的なバンド強度が計算された。データ分析およびＳ字状曲線フィッティング（ｓｉｇｍｏｉｄａｌ  ｃｕｒｖｅ  ｆｉｔｔｉｎｇ）がＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５により実行された。
【００５６】
２Ｄゲル電気泳動：細胞抽出液の溶液部分のタンパク質濃度がＢｉｏ−Ｒａｄタンパク質アッセイによって定量された。アセトンが５０μｇのタンパク質に添加され、−２０℃で１時間培養された。前記混合物を２０，０００ｇをもって２０分間４℃で遠心分離させた。上層液は捨て、ペレット（ｐｅｌｌｅｔ）は冷たいアセトンで２回洗浄した。残余ペレットは、１０μｌのコンジュゲーションバッファ（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．６）、２Ｍチオ尿素、７Ｍ尿素、４％  ＣＨＡＰＳ（ｗ／ｖ））に再分散させるために超音波による分解（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）をした。１μｌの０．４ｍＭ  Ｃｙ３−ＮＨＳまたはＣｙ５−ＮＨＳは、再分散されたタンパク質と混合され、４℃で５０分間培養された。内部標準のための３２０μｇの加熱されていないサンプルを沈殿させ、６４μｌのコンジュゲーションバッファに再分散させ、６．４μｌのＣｙ２−ＮＨＳと混合した。コンジュゲーション後、冷たいアセトンを添加し、−２０℃で１時間培養した。前記混合物を２０，０００ｇをもって２０分間４℃で遠心分離させた。上層液は捨て、ペレットは冷たいアセトンで２回洗浄した。加熱されたサンプルは、５０μｌの再水和バッファ（７Ｍ尿素、２Ｍチオ尿素、２％  ＣＨＡＰＳ（ｗ／ｖ）、４０ｍＭ  ＤＴＴ、および１％  ＩＰＧバッファ）および標準サンプル３２０μｌに再分散させるために超音波による分解をした。５０μｌの化合物処理されたグループ（Ｃｙ５とコンジュゲーションされる）およびＤＭＳＯ処理されたグループ（Ｃｙ３とコンジュゲーションされる）を混合した。その次に、５０μｌの加熱されていないサンプル（Ｃｙ２とコンジュゲーションされる）を内部標準として添加した。総１５０μｇ（Ｃｙ２、Ｃｙ３、およびＣｙ５各々５０μｇずつ）のタンパク質が１０時間再水和された２４−ｃｍ  Ｉｍｍｍｏｂｉｌｉｎｅ  Ｄｒｙｓｔｒｉｐ  ｇｅｌ［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］にロードされ、Ｅｔｔａｎ  ＩＰＧｐｈｏｒ  ３［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］によって等電点電気泳動が実行された。ストリップゲル内のタンパク質はＥｔｔａｎ  ＤＡＬＴｓｉｘ電気泳動システム［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］によって分離され、ゲルはＴｙｐｈｏｏｎ  Ｔｒｉｏ［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］によってスキャンされた。
【００５７】
ゲルイメージ分析：Ｃｙ２、Ｃｙ３およびＣｙ５からの蛍光シグナルはＤｅＣｙｄｅｒ  ２Ｄソフトウェアバージョン７．２［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］によって定量された。Ｃｙ３に対するＣｙ５のシグナル比率値は正規化され、前記比率のログ値のｍｏｄａｌ  ｐｅａｋが０になるように設定された。データは箱ひげ図（ｂｏｘ−ａｎｄ−ｗｈｉｓｋｅｒ  ｄｉａｇｒａｍ）に示し、異常点（ｏｕｔｌｉｅｒｓ）は熱的に移動したスポットにみなされた。インター−ゲル分析の内部標準として用いられたＣｙ２シグナルは全てのゲルをひっくるめてスポットの位置が一致し、Ｃｙ２に対するＣｙ３およびＣｙ５シグナルの相対的な量は融解曲線をプロッティングするために計算された。データ分析およびＳ字状曲線フィッティングが、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５によって実行された。
【００５８】
質量分析法：銀−染色されたゲルから得られたタンパク質スポットは切除されて脱色された後、イン−ゲルトリプシン消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）された。抽出物は、ＳｐｅｅｄＶａｃにより蒸発された後、０．１％ギ酸を含有する１０％アセトニトリルに溶解された。その結果物として得られたタンパク質は、トラップカラム（内部直径１８０μｍ×２０ｍｍ、Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８）カートリッジによって脱塩され、ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦ／ＭＳ［ＳＹＮＡＰＴ  Ｇ２−Ｓｉ  ＨＤＭＳ、Ｗａｔｅｒｓ］を用いる統合エレクトロスプレーイオン化（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ）ＰｉｃｏＴｉｐ（±１０μｍ内部直径、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ）と共に、Ｃ１８逆相７５μｍ内部直径×２００ｍｍ分析カラム（１．７μｍ粒子大きさ、ＢＥＨ１３０  Ｃ１８、Ｗａｔｅｒｓ）において分離された。得られたデータは、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｒｖｅｒを介して．ｐｋｌファイルに変換され、ＭＡＳＣＯＴ検索を利用してＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースをクエリー（ｑｕｅｒｙ）するのに用いられた。
【００５９】
インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）タンパク質翻訳：ＴＮＴクイック結合型転写／翻訳システム［Ｐｒｏｍｅｇａ］が、インビトロ翻訳のために用いられた。ＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  ＭｉｘとＴ７ルシフェラーゼコントロールＤＮＡが製造者のプロトコルに従って混合され、化合物と共に３０℃で１時間培養された。ルシフェラーゼアッセイ試薬［Ｐｒｏｍｅｇａ］の添加後に、タンパク質翻訳に対する化合物の効果を測定するためにＳｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ［ＢｉｏＴｅｋ］を用いて対照ルシフェラーゼ商品の発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を分析した。
【００６０】
機能的検証（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）のためのヌクレオホスミンの枯渇（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）：プロテインＧセファロースビーズ［Ｓｉｇｍａ］をＰＢＳで洗浄し、抗−ＮＰＭ抗体と共に４℃で２時間培養された。結合されていない抗体は洗い出され、抗−ＮＰＭ抗体と結合されたプロテインＧビーズはＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘと混合された後に４℃で２時間培養された。遠心分離によって前記ビーズは除去され、上層液はＴ７ルシフェラーゼコントロールＤＮＡおよび１０μＭのホルデニンと共に３０℃で１時間培養された。ルシフェラーゼアッセイ試薬を添加した後に発光を分析した。
【００６１】
表面プラズモン共鳴分析（Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ａｓｓａｙ）：結合力学がＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００装置［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］によってモニターされた。ヒトヌクレオホスミン全長タンパク質［ａｂ１２６６６４、ａｂｃａｍ］のバッファコンディションが１０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎウルトラ遠心濾過器［Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ］によってＰＢＳに交換された。ＣＭ５チップ表面のカルボキシル基は、ＮＨＳとＥＤＣの混合物がフローセル（ｆｌｏｗ  ｃｅｌｌｓ）１および２の全てに注入されることによって活性化された。アセテートバッファ（ｐＨ４．０）に含まれたヌクレオホスミンタンパク質（３６μｇ／ｍＬ）は、フローセル２に５５０秒間５μｌ／ｍｉｎの流量で注入された。エタノールアミン−ＨＣｌは、フローセル１および２の全てに消光（ｑｕｅｎｃｈｉｎｇ）のために注入された。最終固定レベルは二つの独立した実験において各々９，４００  ＲＵおよび１２，８００  ＲＵに達した。結合研究のために、様々な濃度（１．５６μＭ〜３７．５μＭ）のホルデニンが６０秒間３０μｌ／ｍｉｎの流量で注入され、ランニングバッファ（０．００５％  Ｐ２０および２％  ＤＭＳＯが補充されたＰＢＳ）の４００秒間の注入によって（結合が）分離された。データはＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｓｏｆｔｗａｒｅ［ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ］によって分析され、センサグラムは１：１結合モデルに合わせた。
【００６２】
以上、本発明に係る内容の特定部分について詳細に記述したが、当業界で通常の知識を有した者であれば、このような具体的な記述は単に好ましい実施態様に過ぎず、それによって本発明の範囲が制限されるものではないことは明らかなことである。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された請求項とそれらの等価物によって定義されると言える。
【図１】
2020502480.tif 000010
【図２】
2020502480.tif 000011
【図３】
2020502480.tif 000012
【図４】
2020502480.tif 000013
【図５】
2020502480.tif 000014
【図６】
2020502480.tif 000015
【図７】
2020502480.tif 000016
【図８】
2020502480.tif 000017
【図９ａ】
2020502480.tif 000018
【図９ｂ】
2020502480.tif 000019
【図１０】
2020502480.tif 000020
【図１１】
2020502480.tif 000021
【図１２】
2020502480.tif 000022
【図１３】
2020502480.tif 000023
【図１４】
2020502480.tif 000024
【図１５】
2020502480.tif 000025
【図１６】
2020502480.tif 000026
【国際調査報告】
2020502480.tif 000027
2020502480.tif 000028
2020502480.tif 000029
2020502480.tif 000030