(57)【要約】  例えば、アルツハイマー病、進行性核上性麻痺などのタウオパチーを有する患者の試料からミスフォールドタウタンパク質を増幅および検出するための方法およびキットが提供される。
2020523556.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定する方法であって、
第１のタンパク質ミスフォールディングサイクリック増幅（ＰＭＣＡ）手順を実施するステップを含み、前記第１のＰＭＣＡ手順は：
前記試料の第１の部分を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成し、前記第１の基質タンパク質は４Ｒタウを含むことと；
第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルは：
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第１の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第１のインキュベーション混合物を破壊することと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について前記第１のインキュベーション混合物を分析することによって、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含むことと
を含み、
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体は前記第１の基質タンパク質を含み、前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は前記第１の基質タンパク質を含む、
方法。
【請求項２】
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在を決定するステップを含み、前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体がミスフォールド４Ｒタウ凝集体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料中の少なくとも第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記試料の第２の部分を第２の基質タンパク質と接触させることによって第２のインキュベーション混合物を形成し、前記第２の基質タンパク質がインビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体を形成することと；
第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第２の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第２のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第２のインキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について前記第２のインキュベーション混合物を分析することによって、前記試料中の前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含み、
前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体が前記第２の基質タンパク質を含み、前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体が前記第２の基質タンパク質を含む、
少なくとも第２のＰＭＣＡ手順を実施して、前記試料中の少なくとも前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の基質タンパク質が、アミロイドベータ（Ａβ）、αシヌクレインおよび３Ｒタウのうちの１つを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の基質タンパク質が３Ｒタウを含み、約１：９９〜約９９：１の前記試料中の前記４Ｒタウと前記３Ｒタウの比を決定するステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体および前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在を決定するステップを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記試料中の少なくとも第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記試料の第３の部分を第３の基質タンパク質と接触させることによって第３のインキュベーション混合物を形成し、前記第３の基質タンパク質がインビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体を形成することと；
第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第３の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第３のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第３のインキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について前記第３のインキュベーション混合物を分析することによって、前記試料中の前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含み、
前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体が前記第３の基質タンパク質を含み、前記第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体が前記第３の基質タンパク質を含む、
少なくとも第３のＰＭＣＡ手順を実施して、前記試料中の少なくとも前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の基質タンパク質が４Ｒタウを含み、前記第２の基質タンパク質がＡβを含み、前記第３の基質タンパク質がαシヌクレインを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体、前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体および前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在を決定するステップを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料中の少なくとも第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記試料の第４の部分を第４の基質タンパク質と接触させることによって第４のインキュベーション混合物を形成し、前記第４の基質タンパク質がインビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、前記第４のミスフォールドタンパク質凝集体を形成することと；
第４の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第４のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第４の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第４のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第４の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第４のインキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第４の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について前記第４のインキュベーション混合物を分析することによって、前記試料中の前記第４のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含み、
前記第４のミスフォールドタンパク質凝集体が前記第４の基質タンパク質を含み、前記第４の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体が前記第４の基質タンパク質を含む、
少なくとも第４のＰＭＣＡ手順を実施して、前記試料中の少なくとも前記第４のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の基質タンパク質が４Ｒタウを含み、前記第２の基質タンパク質がＡβを含み、前記第３の基質タンパク質がαシヌクレインを含み、前記第４の基質タンパク質が３Ｒタウを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料が対象から採取され、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定または診断するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料の第２の部分を第２の基質タンパク質と接触させることによって第２のインキュベーション混合物を形成し、前記第２の基質タンパク質がインビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体を形成することと；
第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第２の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第２のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第２のインキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について前記第２のインキュベーション混合物を分析することによって、前記試料中の前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含み、
前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体が前記第２の基質タンパク質を含み、前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体が前記第２の基質タンパク質を含む、
少なくとも第２のＰＭＣＡ手順を実施して、前記試料中の第２の基質タンパク質を含むミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップ
をさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が前記タウオパチーを含み、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在；および前記試料中の前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象における前記タウオパチーの素性を特徴付けるステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の基質タンパク質が、アミロイドベータ（Ａβ）、αシヌクレインおよび３Ｒタウのうちの１つを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料の第３の部分を第３の基質タンパク質と接触させることによって第３のインキュベーション混合物を形成し、前記第３の基質タンパク質がインビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体を形成することと；
第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第３の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第３のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第３のインキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について前記第３のインキュベーション混合物を分析することによって、前記試料中の前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含み、
前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体が前記第３の基質タンパク質を含み、前記第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体が前記第３の基質タンパク質を含む、
少なくとも第３のＰＭＣＡ手順を実施して、前記試料中の第３の基質タンパク質を含むミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップ
をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料の第４の部分を第４の基質タンパク質と接触させることによって第４のインキュベーション混合物を形成し、前記第４の基質タンパク質がインビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、前記第４のミスフォールドタンパク質凝集体を形成することと；
第４の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第４のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第４の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第４のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第４の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第４のインキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第４の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について前記第４のインキュベーション混合物を分析することによって、前記試料中の前記第４のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含み、
前記第４のミスフォールドタンパク質凝集体が前記第４の基質タンパク質を含み、前記第４の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体が前記第４の基質タンパク質を含む、
少なくとも第４のＰＭＣＡ手順を実施して、前記試料中の第４の基質タンパク質を含むミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップ
をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記タウオパチーが原発性タウオパチーまたは続発性タウオパチーを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
前記タウオパチーが、４Ｒタウタンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を少なくとも部分的に特徴とする、請求項１５に記載の方法。
【請求項２３】
前記第２の基質タンパク質が３Ｒタウを含み、前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体と前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の比によって前記タウオパチーを特徴付けるステップと、既知のタウオパチーに特徴的な４Ｒタウタンパク質と３Ｒタウタンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集の既知の比に従って、前記タウオパチーが前記既知のタウオパチーに相当することを決定するステップとをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、嗜銀顆粒病（ＡｇＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）およびパンチドランカー（ＤＰ）のうちの少なくとも１つのサインについて、前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体またはその１つもしくは複数の対応するＰＭＣＡ動態パラメータを分析することによって、前記タウオパチーの素性を特徴付けるステップをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記タウオパチーの素性を特徴付けることが、遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数を含む１つまたは複数の対応するＰＭＣＡ動態パラメータを決定するステップと；
前記１つまたは複数の対応するＰＭＣＡ動態パラメータを、前記タウオパチーの素性に特徴的な１つまたは複数の対応する所定の対応するＰＭＣＡ動態パラメータと比較して前記タウオパチーの素性を特徴付けるのに有効な類似性または差異を決定するステップと
を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記タウオパチーの素性を特徴付けることが、タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的な抗体；タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体に選択的な指示薬；タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体に特徴的なスペクトル；タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体のタンパク質分解耐性；およびタウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体の変性に対する安定性のうちの１つまたは複数を使用することを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記タウオパチーがピック病を除外する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定または診断することが、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を、対照の対象から採取した対照試料と比較することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２９】
前記検出が、対象から採取された前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を検出することを含み、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を所定の閾値量と比較することによって、前記対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定または診断するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が認知検査による認知症の臨床徴候を示さない対象から採取されたものであり、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定または診断するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料が造影撮像による皮質斑ももつれも示さない対象から採取されたものであり、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定または診断するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料が認知検査による認知症の臨床徴候を示す対象から採取されたものであり、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象における認知症の前記臨床徴候への寄与因子としてのタウオパチーの存在または非存在を決定または診断するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料が認知検査による認知症の臨床徴候を示さない対象および遺伝子検査による認知症の素因を示す対象から採取されたものであり、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定または診断するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
約２０μＭ未満の前記第１の基質タンパク質；
約７５μＭ未満のヘパリン；
約１９０ｍＭ未満のＮａＣｌ；および
約９．５μＭ未満のチオフラビンＴ
のうちの少なくとも１つの濃度を特徴とする前記第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
約０．００１μＭ〜約２０００μＭの濃度の前記第１の基質タンパク質を含む前記第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
約０．００１μＭ〜約７５μＭの濃度のヘパリンを特徴とする前記第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳのうちの１つまたは複数の緩衝液組成物を含む前記第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
約１μＭ〜約１Ｍの総濃度の前記緩衝液組成物を含む前記第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
約１μＭ〜約１Ｍの総濃度の塩組成物を含む前記第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
前記塩組成物がＮａＣｌおよびＫＣｌのうちの１つまたは複数を含む、請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
約５〜約９のｐＨで前記第１のインキュベーション混合物を調製または維持するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４２】
約１ｎＭ〜約１ｍＭの総濃度の指示薬を含む前記第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記インキュベートが、前記第１のインキュベーション混合物を約５℃〜約６０℃の温度で加熱または維持することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４４】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬を前記第１のインキュベーション混合物に接触させるステップであって、前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記指示薬が、前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下の指示状態および前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の非存在下の非指示状態を特徴とするステップをさらに含み；
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在の前記決定が、前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記指示薬の前記指示状態を検出することを含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項４５】
前記指示薬の前記指示状態および前記指示薬の前記非指示状態が蛍光の違いを特徴とし、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在の前記決定が、前記蛍光の違いを検出することを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
モル過剰の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記指示薬を前記第１のインキュベーション混合物に接触させるステップを含み、前記モル過剰が前記第１のインキュベーション混合物中の前記第１の基質タンパク質および前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれるタンパク質モノマーの総モル量より大きい、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記指示薬が、チオフラビン、コンゴレッド、ｍ−Ｉ−スチルベン、クリサミンＧ、ＰＩＢ、ＢＦ−２２７、Ｘ−３４、ＴＺＤＭ、ＦＤＤＮＰ、ＭｅＯ−ＸＯ４、ＩＭＰＹ、ＮＩＡＤ−４、発光共役ポリチオフェン、蛍光タンパク質およびこれらの誘導体のうちの１つまたは複数を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在の前記決定が、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４９】
少なくとも約７０％の感度で前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を検出するステップを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を約１００ｎｍｏｌ未満で検出するステップを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記試料に含まれる前記第１の基質タンパク質に対するモル比で前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を検出するステップを含み、前記モル比が約１：１００未満である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
対照試料と比較した前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を決定するステップを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体を少なくとも約７０％の特異性で検出するステップを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記検出が、ウエスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光タンパク質／ペプチド結合アッセイ、チオフラビン結合アッセイ、コンゴレッド結合アッセイ、沈降アッセイ、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、表面プラズモン共鳴および分光法のうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＥＬＩＳＡが両面サンドイッチＥＬＩＳＡを含む、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記分光法が、準光散乱分光法、マルチスペクトル紫外線分光法、共焦点二色蛍光相関分光法、フーリエ変換赤外分光法、分光検出付きキャピラリー電気泳動、電子スピン共鳴分光法、核磁気共鳴分光法および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分光法のうちの１つまたは複数を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記検出が：
前記第１のインキュベーション混合物をプロテアーゼと接触させることと；
ウエスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイおよびＥＬＩＳＡのうちの１つまたは複数で、抗ミスフォールドタンパク質抗体またはミスフォールドタウ凝集体に特異的な抗体を使用して前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体を検出することと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５８】
標識化形態の前記第１の基質タンパク質を提供するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５９】
標識化形態の前記第１の基質タンパク質が、共有結合的に組み込まれた放射性アミノ酸、共有結合的に組み込まれた、同位体標識されたアミノ酸、および共有結合的に組み込まれたフルオロフォアのうちの１つまたは複数を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記検出が、前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体に組み込まれた標識化形態の前記第１の基質タンパク質を検出することを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記試料が、羊水；胆汁；血液；脳脊髄液；耳垢；皮膚；滲出液；糞便；胃液；リンパ液；乳汁；粘液；粘膜；腹水；血漿；胸水；膿；唾液；皮脂；精液；汗；滑液；涙；および尿のうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６２】
前記試料が、皮膚、脳、心臓、肝臓、膵臓、肺、腎臓、胃腸、神経、粘膜、血球、腺および筋肉のうちの１つまたは複数の細胞または組織に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項６３】
前記試料の各部分が約１μＬ〜約１０００μＬの体積を特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６４】
前記試料の各部分が、約１０μＬ〜約８０μＬの体積を特徴とするＣＳＦを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６５】
前記試料の各部分が：
約２５０μＬ〜約７５０μＬの体積を特徴とする血漿；および
約２００μＬ〜約１０００μＬの体積を特徴とする血液
のうちの１つを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６６】
対象から前記試料を得るステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象が、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、シカ、ヘラジカ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびヒト以外の霊長類のうちの１つである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記対象が、タウオパチーのリスクがある、前記タウオパチーを有する、および前記タウオパチーの治療中のうちの１つまたは複数である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記試料が対象から採取され、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を、前記試料と比較して異なる時間に前記対象から採取された比較試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量と比較することによって、前記対象におけるタウオパチーの進行または恒常性を決定するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７０】
前記対象がタウオパチー調節療法で治療され、
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を、比較試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量と比較するステップであって、前記試料および前記比較試料が、前記タウオパチー調節療法の下で、一定期間にわたる異なる時間に前記対象から採取されるステップと；
前記対象が、前記一定期間にわたる前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の変化により前記タウオパチー調節療法に反応性である、または前記一定期間にわたる前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の恒常性により前記タウオパチー調節療法に非反応性であるの一方であることを決定するステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７１】
前記タウオパチー調節療法に反応性であると決定された前記対象を前記タウオパチー調節療法で治療するステップをさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記試料が対象から採取され、前記対象をタウオパチー調節療法で治療して、前記第１の基質タンパク質の産生を阻害する、または前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の凝集を阻害する、請求項１に記載の方法。
【請求項７３】
前記試料および前記第１のインキュベーション混合物のうちの１つまたは複数で前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体を選択的に濃縮するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７４】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記選択的濃縮が、前記第１のインキュベーション混合物を形成する前に前記試料を前処理することを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記選択的濃縮が、前記第１のインキュベーション混合物をインキュベートする前に前記第１のインキュベーション混合物を前処理することを含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記選択的濃縮が、前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体に結合することができる１つまたは複数の抗体を接触させて捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体を形成することを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７７】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体に結合することができる前記１つまたは複数の抗体が、前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体のアミノ酸エピトープ配列に特異的な抗体および前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体のコンフォメーションに特異的な抗体のうちの１つまたは複数を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体のコンフォメーションに特異的な前記抗体が、タウオパチーに特異的なミスフォールドタウ凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的である、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体に結合することができる前記１つまたは複数の１つまたは複数の抗体が、固相に結合される、請求項７７に記載の方法。
【請求項８０】
前記固相が、磁気ビーズおよびマルチウェルプレートのうちの１つまたは複数を含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記試料を前記第１の基質タンパク質と接触させて前記第１のインキュベーション混合物を形成することが、モル過剰の前記第１の基質タンパク質を、前記捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体を含む前記試料に接触させることを含み、前記モル過剰の前記第１の基質タンパク質が、前記捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれるタンパク質モノマーの総モル量より大きい、請求項７６に記載の方法。
【請求項８２】
前記第１のインキュベーション混合物の前記インキュベーションが、前記捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第１の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こして、前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記第１のインキュベーション混合物の前記破壊が、超音波処理、攪拌、振盪、凍結／解凍、レーザー照射、オートクレーブインキュベーション、高圧および均質化のうちの１つまたは複数を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８４】
前記第１のインキュベーション混合物の前記破壊がサイクリック攪拌を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８５】
前記サイクリック攪拌が、約５０毎分回転数（ＲＰＭ）〜１００００ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ〜約２０００ＲＰＭ、および約５００ＲＰＭのうちの１つまたは複数で行われる、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記第１のインキュベーション混合物の前記破壊が、約５秒〜約１０分、約３０秒〜約１分、約４５秒〜約１分、および約１分のうちの１つまたは複数で各インキュベーションサイクルで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８７】
前記第１のインキュベーション混合物の前記インキュベーションが、約１分〜約５時間、約５分〜約５時間、約１０分〜約２時間、約１５分〜約１時間、および約２５分〜約４５分間のうちの１つまたは複数で、各インキュベーションサイクルで独立に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項８８】
各インキュベーションサイクルが、約１分〜約５時間のインキュベーションと約５秒〜約１０分間の破壊；約５分〜約５時間のインキュベートと約５秒〜約１０分間の破壊；約１０分〜約２時間のインキュベーションと約３０秒〜約１分間の破壊；約１５分〜約１時間のインキュベーションと約４５秒〜約１分間の破壊；約２５分〜約４５分間のインキュベーションと約４５秒〜約９０秒間の破壊；約２９分間および約１分間のインキュベーション；および約１分間のインキュベーションと約１分間の破壊のうちの１つまたは複数で、前記第１のインキュベーション混合物を独立にインキュベートおよび破壊することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８９】
前記インキュベーションサイクルの前記実行が、約２回〜約１０００回、約５回〜約５００回、約５０回〜約５００回、および約１５０回〜約２５０回のうちの１つまたは複数、繰り返される、請求項１に記載の方法。
【請求項９０】
前記試料を前記第１の基質タンパク質と接触させて前記第１のインキュベーション混合物を形成することが、生理学的条件下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項９１】
前記試料をモル過剰の前記第１の基質タンパク質と接触させて前記第１のインキュベーション混合物を形成するステップを含み、前記モル過剰が前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれるタンパク質モノマーの総モル量より大きい、請求項１に記載の方法。
【請求項９２】
前記試料をチオフラビンおよびモル過剰の前記第１の基質タンパク質と接触させて、前記第１のインキュベーション混合物を形成するステップであって、前記モル過剰が前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれる前記第１の基質タンパク質の量より大きいステップと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記インキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第１のインキュベーション混合物を振盪することと
を含むステップと；
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体に対応する前記チオフラビンの蛍光を検出することによって、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在を決定するステップと
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９３】
前記第１の基質タンパク質が、化学合成、組換え産生、および非組換え生体試料からの抽出のうちの１つによって産生される、請求項１に記載の方法。
【請求項９４】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体が、可溶性の第１のミスフォールドタンパク質凝集体および不溶性の第１のミスフォールドタンパク質凝集体のうちの１つまたは複数を含み；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体が可溶性部分および不溶性部分のうちの１つまたは複数を含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項９５】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体が、実質的に前記可溶性の第１のミスフォールドタンパク質凝集体である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記試料がタウ原線維を除外する、請求項１記載の方法。
【請求項９７】
対象における第１のミスフォールドタンパク質凝集体に対応するタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、
前記対象から試料を得るステップと；
少なくとも第１のタンパク質ミスフォールディングサイクリック増幅（ＰＭＣＡ）手順を実施し、前記第１のＰＭＣＡ手順が：
前記試料の第１の部分を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成し、第１の基質タンパク質前記第１の基質タンパク質がタウアイソフォームを含み、前記第１の基質タンパク質がインビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体を形成することと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第１の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第１のインキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと
を含むステップと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について前記第１のインキュベーション混合物を分析することによって、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップと；
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象における前記タウオパチーの存在または非存在を決定するステップと
を含み、
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体が前記第１の基質タンパク質を含み、前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体が前記第１の基質タンパク質を含み、
但し、前記第１の基質タンパク質がモノマー３Ｒタウからなる場合、前記タウオパチーがピック病を除外する、
方法。
【請求項９８】
前記試料の第２の部分を第２の基質タンパク質と接触させることによって第２のインキュベーション混合物を形成し、前記第２の基質タンパク質がインビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体を形成することと；
第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第２の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第２のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第２のインキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について前記第２のインキュベーション混合物を分析することによって、前記試料中の前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含み、
前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体が前記第２の基質タンパク質を含み、前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体が前記第２の基質タンパク質を含む、
少なくとも第２のＰＭＣＡ手順を実施して、前記試料中の少なくとも前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップ
をさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記第２の基質タンパク質が前記第１の基質タンパク質とは異なり、前記第２の基質タンパク質がアミロイドベータ（Ａβ）、αシヌクレイン、３Ｒタウおよび４Ｒタウのうちの１つを含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記第１の基質タンパク質が４Ｒタウを含む、請求項９８記載の方法。
【請求項１０１】
前記試料の第３の部分を第３の基質タンパク質と接触させることによって第３のインキュベーション混合物を形成し、前記第３の基質タンパク質がインビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体を形成することと；
第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第３の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第３のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第３のインキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について前記第３のインキュベーション混合物を分析することによって、前記試料中の前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含み、
前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体が前記第３の基質タンパク質を含み、前記第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体が前記第３の基質タンパク質を含む、
少なくとも第３のＰＭＣＡ手順を実施して、前記試料中の少なくとも前記第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップ
をさらに含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記タウオパチーが前記対象に存在し、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在；および前記試料中の前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象における前記タウオパチーの素性を特徴付けるステップをさらに含む、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記タウオパチーが、３Ｒタウタンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を主に特徴としない、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０４】
前記試料をチオフラビンおよびモル過剰の前記第１の基質タンパク質と接触させて、前記第１のインキュベーション混合物を形成するステップであって、前記モル過剰が前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれるタンパク質モノマーの量より大きいステップと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記インキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第１の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第１のインキュベーション混合物を振盪することと
を含むステップと；
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体に対応する前記チオフラビンの蛍光を検出することによって、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップと
を含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０５】
捕捉を使用して試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定する方法であって、
前記試料から前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体を捕捉して、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体を形成するステップと；
少なくとも第１のタンパク質ミスフォールディングサイクリック増幅（ＰＭＣＡ）手順を実施し、前記第１のＰＭＣＡ手順が：
前記捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体をモル過剰の第１の基質タンパク質と接触させることによって、第１のインキュベーション混合物を形成し、前記第１の基質タンパク質がインビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体を形成し；
前記モル過剰が、前記捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれるタンパク質モノマーの量より大きいことと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第１の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第１のインキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の少なくとも一部を検出することによって、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含むステップと
を含み、
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体が前記第１の基質タンパク質を含み、前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体が前記第１の基質タンパク質を含む、
方法。
【請求項１０６】
前記試料から前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体を捕捉して、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体を形成するステップが、前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体のアミノ酸エピトープ配列に特異的な抗体および前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体のコンフォメーションに特異的な抗体のうちの１つまたは複数を含む、前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体に特異的な１つまたは複数の抗体を使用して行われる、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体のコンフォメーションに特異的な前記抗体が、タウオパチーに特異的な第１のミスフォールドタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記コンフォメーションに特異的な前記抗体が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、嗜銀顆粒病（ＡｇＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）およびパンチドランカー（ＤＰ）のうちの１つに対応する、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体に特異的な前記１つまたは複数の抗体が、固相に結合される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１０】
前記固相が、磁気ビーズおよびマルチウェルプレートのうちの１つまたは複数を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
前記試料を前記第１の基質タンパク質と接触させて前記第１のインキュベーション混合物を形成することが、モル過剰の前記第１の基質タンパク質を前記試料に接触させることを含み、前記モル過剰の前記第１の基質タンパク質が、前記捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれるタンパク質モノマーの総モル量より大きい、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１２】
前記第１のインキュベーション混合物の前記インキュベーションが、前記捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第１の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こして、前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１３】
前記第１の基質タンパク質が４Ｒタウタンパク質を含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１４】
対象における、アルツハイマー病（ＡＤ）を含むタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、
対象を用意するステップと；
前記対象から生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含む試料を得るステップと；
少なくとも第１のタンパク質ミスフォールディングサイクリック増幅（ＰＭＣＡ）手順を実施し、前記第１のＰＭＣＡ手順が：
前記試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成し、前記第１の基質タンパク質が４Ｒタウを含むことと；
第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第１の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記インキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第１のインキュベーション混合物中の前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含むステップと；
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象におけるＡＤの存在または非存在を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１１５】
前記対象におけるＡＤの存在または非存在を決定するステップが、遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数のＡＤに特異的な対応するＰＭＣＡ動態パラメータ；ＡＤタウタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用したアッセイ；ＡＤタウタンパク質凝集体に選択的な指示薬；およびＡＤタウタンパク質凝集体に特徴的なスペクトルのうちの１つまたは複数を含むＡＤタウタンパク質凝集体のサインを決定することによって１つまたは複数の追加のタウオパチーからＡＤを区別することをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
対象における、パーキンソン病（ＰＤ）を含むタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、
対象を用意するステップと；
前記対象から生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含む試料を得るステップと；
前記試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成し、前記第１の基質タンパク質が４Ｒタウを含むことと；
第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第１の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記インキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第１のインキュベーション混合物中の前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含む
少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップと；
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象におけるＰＤの存在または非存在を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１１７】
前記対象におけるＰＤの存在または非存在を決定するステップが、遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数のＰＤに特異的な対応するＰＭＣＡ動態パラメータ；ＰＤタウタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用したアッセイ；ＰＤタウタンパク質凝集体に選択的な指示薬；およびＰＤタウタンパク質凝集体に特徴的なスペクトルのうちの１つまたは複数を含むＰＤタウタンパク質凝集体のサインを決定することによって１つまたは複数の追加のタウオパチーからＰＤを区別することをさらに含む、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
対象における、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）を含むタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、
対象を用意するステップと；
前記対象から生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含む試料を得るステップと；
前記試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成し、前記第１の基質タンパク質が４Ｒタウを含むことと；
第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第１の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記インキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第１のインキュベーション混合物中の前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含む
少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップと；
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象におけるＰＳＰの存在または非存在を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１１９】
前記対象におけるＰＳＰの存在または非存在を決定するステップが、遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数のＰＳＰに特異的な対応するＰＭＣＡ動態パラメータ；ＰＳＰタウタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用したアッセイ；ＰＳＰタウタンパク質凝集体に選択的な指示薬；およびＰＳＰタウタンパク質凝集体に特徴的なスペクトルのうちの１つまたは複数を含むＰＳＰタウタンパク質凝集体のサインを決定することによって１つまたは複数の追加のタウオパチーからＰＳＰを区別することをさらに含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
対象における、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を含むタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、
対象を用意するステップと；
前記対象から生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含む試料を得るステップと；
前記試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成し、前記第１の基質タンパク質が４Ｒタウを含むことと；
第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第１の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記インキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第１のインキュベーション混合物中の前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含む
少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップと；
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象におけるＦＴＤの存在または非存在を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１２１】
前記対象におけるＦＴＤの存在または非存在を決定するステップが、遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数のＦＴＤに特異的な対応するＰＭＣＡ動態パラメータ；ＦＴＤタウタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用したアッセイ；ＦＴＤタウタンパク質凝集体に選択的な指示薬；およびＦＴＤタウタンパク質凝集体に特徴的なスペクトルのうちの１つまたは複数を含むＦＴＤタウタンパク質凝集体のサインを決定することによって１つまたは複数の追加のタウオパチーからＦＴＤを区別することをさらに含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
対象における、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含むタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、
対象を用意するステップと；
前記対象から生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含む試料を得るステップと；
少なくとも第１のタンパク質ミスフォールディングサイクリック増幅（ＰＭＣＡ）手順を実施し、前記第１のＰＭＣＡ手順が：
前記試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成し、前記第１の基質タンパク質が４Ｒタウを含むことと；
第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第１の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記インキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第１のインキュベーション混合物中の前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含むステップと；
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象におけるＣＢＤの存在または非存在を決定するステップと
を含む方法。
【請求項１２３】
前記対象におけるＣＢＤの存在または非存在を決定するステップが、遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数のＣＢＤに特異的な対応するＰＭＣＡ動態パラメータ；ＣＢＤタウタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用したアッセイ；ＣＢＤタウタンパク質凝集体に選択的な指示薬；およびＣＢＤタウタンパク質凝集体に特徴的なスペクトルのうちの１つまたは複数を含むＣＢＤタウタンパク質凝集体のサインを決定することによって１つまたは複数の追加のタウオパチーからＣＢＤを区別することをさらに含む、請求項１２２に記載の方法。
【請求項１２４】
前記試料の第２の部分を第２の基質タンパク質と接触させることによって第２のインキュベーション混合物を形成し、前記第２の基質タンパク質が病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けることと；
第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第２の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第２のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記第２のインキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと；
前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について前記第２のインキュベーション混合物を分析することによって、前記試料中の前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することと
を含み、
前記タウオパチーが前記対象に存在する、
少なくとも第２のＰＭＣＡ手順を実施して、前記試料中の少なくとも第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップをさらに含み；
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在；および前記試料中の前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象における前記タウオパチーの素性を特徴付けるステップをさらに含み、
前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体が前記第２の基質タンパク質を含み、
前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体が前記第２の基質タンパク質を含み、
前記第２の基質タンパク質が前記第１の基質タンパク質とは異なり、前記第２の基質タンパク質がアミロイドベータ（Ａβ）、αシヌクレインおよび３Ｒタウのうちの１つを含む、
請求項１１４、１１６、１１８、１２０および１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記対象における各タウオパチーの存在または非存在を決定することが、それぞれＡβ、αシヌクレインおよび３Ｒタウのうちの１つに対応する１つまたは複数のミスフォールド凝集体の少なくとも１つのサインを分析することによって、各タウオパチーを１つまたは複数の追加のタウオパチーから区別することをさらに含み、各サインが前記１つまたは複数のミスフォールド凝集体のいずれかのコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用するアッセイ；１つまたは複数のミスフォールド凝集体のいずれかのコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用するアッセイ；遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数を含む、１つまたは複数のミスフォールド凝集体の１つまたは複数のＰＭＣＡ動態パラメータ；１つまたは複数のミスフォールド凝集体のいずれかに選択的な指示薬；および１つまたは複数のミスフォールド凝集体のいずれかに特徴的なスペクトルのうちの１つまたは複数に対応する、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するためのキットであって、
４Ｒタウを含む第１の基質タンパク質と；
前記第１の基質タンパク質を含み、タウオパチーに対応する前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬と；
緩衝液と；
ヘパリンと；
塩と；
使用者に：
前記試料を得て；
前記試料の第１の部分を前記第１の基質タンパク質、前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記指示薬、前記緩衝液、前記ヘパリン、および前記塩と接触させることによって、第１のインキュベーション混合物を形成し、前記第１のインキュベーション混合物は、約２０μＭ未満の前記第１の基質タンパク質；約７５μＭ未満の前記ヘパリン；約１９０ｍＭ未満のＮａＣｌとしての前記塩；および約９．５μＭ未満のチオフラビンＴとしての前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記指示薬のうちの１つまたは複数の濃度で形成され；
第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルは：
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記インキュベーション混合物を破壊すること
とを含む、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施し；
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記指示薬に従って、前記第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について前記第１のインキュベーション混合物を分析することによって、前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定する
よう指示する説明書と
を含むキット。
【請求項１２７】
前記説明書が前記使用者に対象から前記試料を得るよう指示し、前記試料が生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含み、前記説明書が前記使用者に前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、前記対象のタウオパチーを決定または診断するよう指示する、請求項１２６に記載のキット。
【請求項１２８】
第２の基質タンパク質および第２のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬をさらに含み、前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体が前記第２の基質タンパク質を含み、前記第２の基質タンパク質が前記第１の基質タンパク質とは異なり、前記第２の基質タンパク質がアミロイドベータ（Ａβ）、αシヌクレイン、３Ｒタウおよび４Ｒタウのうちの１つを含み；
前記説明書が前記使用者に：
前記試料の第２の部分を前記第２の基質タンパク質および前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の前記指示薬と接触させることによって第２のインキュベーション混合物を形成することと；
第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行い、各インキュベーションサイクルが：
前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で前記第２の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な前記第２のインキュベーション混合物をインキュベートすることと；
前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な前記インキュベーション混合物を破壊することと
を含むことと
を含む少なくとも第２のＰＭＣＡ手順を実施し；
前記第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について前記第２のインキュベーション混合物を分析することによって、前記試料中の前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定し；
前記試料中の前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在；および前記試料中の前記第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、タウオパチーの素性について前記試料を特徴付ける
ようさらに指示する、
請求項１２６に記載のキット。
【請求項１２９】
多層マイクロタイタープレート；マイクロ流体プレート；振盪装置；分光計；およびインキュベーターのうちの１つまたは複数を含むＰＭＣＡ装置をさらに含む、請求項１２６に記載のキット。
【請求項１３０】
前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記コンフォメーションに特異的な前記抗体が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、嗜銀顆粒病（ＡｇＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）およびパンチドランカー（ＤＰ）のうちの１つに対応し、前記説明書が、前記第１のミスフォールドタンパク質凝集体の前記コンフォメーションに特異的な前記抗体を使用した結合アッセイに従って、前記対象におけるＡＤ、ＰＤ、ＰＳＰ、ＦＴＤ、ＣＢＤ、ＭＣＩ、ＡｇＤ、ＴＢＩ、ＣＴＥおよびＤＰのうちの１つの存在または非存在を決定することを含む、請求項１２６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年５月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／５０７１６６号に基づく優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００２】
タウオパチーには、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、嗜銀顆粒病（ＡｇＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）およびパンチドランカー（ＤＰ）などが含まれ得る。ミスフォールドタウ凝集体および原線維が形成され、核形成および成長を介して蓄積する場合がある。ミスフォールドタウ凝集体は、数ある効果の中でも特に、細胞機能障害および組織損傷を誘発する可能性がある。
【０００３】
リアルタイム震え誘導変換（ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ｑｕａｋｉｎｇ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）（ＲＴ−ＱｕｉＣ）は、ピック病対象から採取した脳ホモジネートおよび脳脊髄液試料からの３リピート（３Ｒ）タウアイソフォームの複製を引き起こし、この希少疾患の高感度検出および他のタウオパチーからの識別を可能にすることが示されている。しかしながら、驚くべきことに、４Ｒタウのミスフォールディングを含む臨床的に重要なより一般的なタウオパチーでは、ＲＴ−ＱｕｉＣの有効性が３〜５桁低下し、臨床および実験室での使用に非効果的および非実用的となっている。このような悪い結果は、ＣＢＤ、ＡｇＤ、およびＦＴＤＰ−１７、およびＰＳＰ、ならびにＡＤ、４Ｒ＋３Ｒタウオパチーの症例の優勢な４リピート（４Ｒ）タウ凝集体を含有する脳試料で種をまくことによって得られた。一部のＡＤおよびＰＳＰ試料は、検出限界を上回るシグナルを与えたが、シグナルは外れ値であり、ピック病脳試料と比較してはるかに弱かった。さらに、弱い応答を生成したＡＤおよびＰＳＰ試料は汚染について分析されなかった。４Ｒまたは４Ｒ＋３ＲタウオパチーのＲＴ−ＱｕｉＣ分析は、一般に、免疫組織学的にタウ病態が検出されていない疾患対象を使用した対照と有意に異なるように見えない。このような対照には、老人性変化（ＳＣ）、脳血管疾患（ＣＶＤ）、びまん性レビー小体病（ＤＬＢＤ）、ＴＤＰ−４３を伴う前頭側頭型認知症（ＦＴＤ−ＴＤＰ）、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の診断が含まれた。要約すると、ＲＴ−ＱｕｉＣ分析は、４Ｒ優性および４Ｒ＋３Ｒ混合タウオパチーを含む４Ｒタウオパチーに対して一般に無効であり、実用的でないことが示された。
【０００４】
本出願は、例えば関連疾患の診断のためのミスフォールドタウタンパク質の検出が困難な努力であり得ることを認識する。
【発明の概要】
【０００５】
一実施形態では、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定する方法が提供される。この方法は、第１のタンパク質ミスフォールディングサイクリック増幅（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＰＭＣＡ）手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料の第１の部分を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウタンパク質を含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体として形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第１のインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第１のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。
【０００６】
別の実施形態では、対象における第１のミスフォールドタンパク質凝集体に対応するタウオパチーの存在または非存在を決定する方法が提供される。この方法は、対象から試料を得るステップを含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料の第１の部分を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質はタウアイソフォームを含み得る。第１の基質タンパク質は、インビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、第１のミスフォールドタンパク質凝集体を形成し得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第１のインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第１のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定することを含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。この方法は、第１の基質タンパク質がモノマー３Ｒタウからなる場合、タウオパチーがピック病を除外することを提供し得る。
【０００７】
一実施形態では、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するために捕捉を使用する方法が提供される。この方法は、試料から第１のミスフォールドタンパク質凝集体を捕捉して、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体を形成するステップを含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体をモル過剰の第１の基質タンパク質と接触させることによって、第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は、インビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、第１のミスフォールドタンパク質凝集体を形成し得る。モル過剰は、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれるタンパク質モノマーの量より大きくてもよい。この方法は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第１のインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。
【０００８】
別の実施形態では、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、タウオパチーがアルツハイマー病（ＡＤ）を含む方法が提供される。この方法は、対象を用意するステップを含み得る。この方法は、対象から試料を得るステップを含み得る。試料は、生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１のインキュベーション混合物中の第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるＡＤの存在または非存在を決定するステップを含み得る。
【０００９】
一実施形態では、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、タウオパチーがパーキンソン病（ＰＤ）を含む方法が提供される。この方法は、対象を用意するステップを含み得る。この方法は、対象から試料を得るステップを含み得る。試料は、生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１のインキュベーション混合物中の第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるＰＤの存在または非存在を決定するステップを含み得る。
【００１０】
別の実施形態では、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、タウオパチーが進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）を含む方法が提供される。この方法は、対象を用意するステップを含み得る。この方法は、対象から試料を得るステップを含み得る。試料は、生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１のインキュベーション混合物中の第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるＰＳＰの存在または非存在を決定するステップを含み得る。
【００１１】
一実施形態では、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、タウオパチーが前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を含む方法が提供される。この方法は、対象を用意するステップを含み得る。この方法は、対象から試料を得るステップを含み得る。試料は、生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１のインキュベーション混合物中の第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるＦＴＤの存在または非存在を決定するステップを含み得る。
【００１２】
別の実施形態では、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、タウオパチーが皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む方法が提供される。この方法は、対象を用意するステップを含み得る。この方法は、対象から試料を得るステップを含み得る。試料は、生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１のインキュベーション混合物中の第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるＣＢＤの存在または非存在を決定するステップを含み得る。
【００１３】
一実施形態では、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するためのキットが提供される。キットは、４Ｒタウを含み得る第１の基質タンパク質を含み得る。キットは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬を含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体は、タウオパチーに対応し得る。キットは緩衝液を含み得る。キットはヘパリンを含み得る。キットは塩を含み得る。キットは説明書を含み得る。説明書は、使用者に試料を得るよう指示し得る。説明書は、使用者に少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するよう指示し得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料の第１の部分を第１の基質タンパク質、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬、緩衝液、ヘパリン、および塩と接触させることによって、第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１のインキュベーション混合物は、約２０μＭ未満の第１の基質タンパク質；約７５μＭ未満のヘパリン；約１９０ｍＭ未満のＮａＣｌとしての塩；および約９．５μＭ未満のチオフラビンＴとしての第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬のうちの１つまたは複数の濃度で形成され得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。説明書は、使用者に、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬に従って、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第１のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するよう指示し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
明細書に組み込まれ、その一部を構成する添付の図面は、例示的方法および結果を示し、例示的実施形態を示すためにのみ使用される。
【００１５】
【図１Ａ】０時間、５時間、１０時間および２４時間のインキュベーションで撮影された電子顕微鏡写真を示す図である。
【００１６】
【図１Ｂ】可溶性オリゴマーＡβタンパク質凝集体のウエスタンブロットを示す図である。
【００１７】
【図２Ａ】種々の濃度の例１の合成可溶性オリゴマーＡβタンパク質によって種をまかれた時間の関数としてのＴｈＴ蛍光によって測定された非増幅アミロイド形成を示すグラフである。
【００１８】
【図２Ｂ】種々の濃度の例１の合成可溶性オリゴマーＡβタンパク質によって種をまかれた時間の関数としてのＴｈＴ蛍光によって測定された増幅サイクル加速アミロイド形成を示すグラフである。
【００１９】
【図３Ａ】ＡＤ、ＮＮＤおよびＮＡＮＤ群の５つの代表的な試料からのＣＳＦによって種をまかれたＡβ凝集の平均動態を示す、ＴｈＴ蛍光標識の関数として測定されたアミロイド形成対時間のグラフである。
【００２０】
【図３Ｂ】ＡＤ、ＮＮＤおよびＮＡＮＤ群の試料の存在下でのＡβ凝集についての遅滞期時間（時間）のグラフである。
【００２１】
【図３Ｃ】ＡＤ、ＮＮＤおよびＮＡＮＤ患者のＣＳＦ試料の存在下での１８０回のＡβ−ＰＭＣＡサイクル、例えば９０時間のインキュベーション（Ｐ９０）後に得られたアミロイド形成の程度を示すグラフである。
【００２２】
【図４Ａ】ＡＤ対ＮＡＮＤについての図３Ｂに示される遅滞期値を使用した様々なカットオフポイントについての偽陽性率（特異性）の関数としての真陽性率（感度）のプロットである。
【図４Ｂ】ＡＤ対ＮＮＤについての図３Ｂに示される遅滞期値を使用した様々なカットオフポイントについての偽陽性率（特異性）の関数としての真陽性率（感度）のプロットである。
【図４Ｃ】ＡＤ対全対照試料についての図３Ｂに示される遅滞期値を使用した様々なカットオフポイントについての偽陽性率（特異性）の関数としての真陽性率（感度）のプロットである。
【図４Ｄ】異なる群比較セットについての最も信頼できるカットオフポイントを推定する図である。
【００２３】
【図５】表１は、遅滞期数を使用して計算されたＡβ−ＰＭＣＡ試験の感度、特異性および予測値の推定を示す表である。
【００２４】
【図６】ＡＤおよび対照群のＣＳＦ試料の存在下での３００回のＡβ−ＰＭＣＡサイクル、例えば１５０時間のインキュベーション（Ｐ９０）後に得られた試料についての遅滞期時間（時間）のグラフである。
【００２５】
【図７Ａ】ヒトＣＳＦに添加された合成的に調製されたＡβオリゴマーを使用した免疫枯渇の結果を示すウエスタンブロットである。
【００２６】
【図７Ｂ】対照および免疫枯渇ＣＳＦ試料によって種をまかれたＡβ凝集の動態を示すグラフである。
【００２７】
【図７Ｃ】対照および免疫枯渇ＣＳＦ試料によって種をまかれ、Ａ１１コンフォメーション抗体のみで枯渇したＡβ凝集の動態を示すグラフである。
【００２８】
【図８Ａ】複雑な生体試料からＡβオリゴマーを捕捉するために使用されるＥＬＩＳＡ固相法の概略図である。
【００２９】
【図８Ｂ】複雑な生体試料からＡβオリゴマーを捕捉するために使用される磁気ビーズ固相法の概略図である。
【００３０】
【図９】表２は、特異抗体がＡβオリゴマーを捕捉する能力を示す表である。
【００３１】
【図１０】ヒト血漿中に添加された様々な量の合成オリゴマーの存在によるＡβ凝集の加速を示すアミロイド形成対時間のグラフである。
【００３２】
【図１１】ＡＤ患者および対照の血漿試料の存在下でのＡβ−ＰＭＣＡアッセイで５０％凝集に到達する時間を示すグラフである。
【００３３】
【図１２】プロテアーゼ消化後にウエスタンブロットによって監視された異なる量の合成Ａβオリゴマーの存在下でのインキュベーション／超音波処理のサイクルによるＡβ凝集の増幅の結果を示すウエスタンブロットである。
【００３４】
【図１３Ａ】ＰＤ−ＰＭＣＡによるαＳ種の検出を示す、チオフラビンＴ蛍光対時間のグラフである。
【００３５】
【図１３Ｂ】指示される量のαＳ種の関数としてプロットされる５０％凝集に到達する時間のグラフである。
【００３６】
【図１４】アルツハイマー病（ＡＤ）または非神経変性疾患（ＮＮＤ）を有する対照と比較した、ＰＤ−ＰＭＣＡによるヒトＰＤ患者のＣＳＦ試料中のαＳ種の検出を示す図である。
【００３７】
【図１５】表３は、様々な配列またはコンフォメーション抗体がαＳオリゴマーを捕捉する能力を示す表である。
【００３８】
【図１６Ａ】αＳオリゴマーを捕捉するために使用されるＥＬＩＳＡ固相法の概略図である。
【００３９】
【図１６Ｂ】αＳオリゴマーを捕捉するために使用される磁気ビーズ固相法の概略図である。
【００４０】
【図１７】図１７Ａ、図１７Ｂおよび図１７Ｃは、３つの異なるα−シヌクレイン抗体を使用した、ヒト血漿からのα−シヌクレインオリゴマーの免疫沈降／凝集の結果を示す一連のグラフである。図１７Ａは抗体Ｎ−１９での結果を示すグラフである。図１７Ｂは抗体２１１での結果を示すグラフである。図１７Ｃは抗体Ｃ−２０での結果を示すグラフである。
【００４１】
【図１８】図１８Ａ、図１８Ｂおよび図１８Ｃは、ＣＳＦ試料中のαＳ種の検出の結果を示す一連のグラフである。図１８Ａは対照試料の結果を示すグラフである。図１８ＢはＰＤ患者の結果を示すグラフである。図１８Ｃは多系統萎縮症（ＭＳＡ）の患者の結果を示すグラフである。
【００４２】
【図１９】組換え完全長４Ｒタウタンパク質の調製および精製を示すフローチャートである。
【００４３】
【図２０Ａ】種々の初期量のタウ種および対照についてのＴｈＴ蛍光による凝集（％）のグラフである。図２０Ａの値は２連の平均であり、エラーバーは標準偏差を示す。
【００４４】
【図２０Ｂ】Ｔ５０、ＴｈＴ蛍光によって測定される５０％凝集までの時間対オリゴマータウ種の量の対数（ｆｍｏｌ）のグラフである。
【００４５】
【図２０Ｃ】ＴｈＴ蛍光が経時的に続く凝集のグラフである。
【００４６】
【図２０Ｄ】タウオリゴマーの量とタウ−ＰＭＣＡシグナル（５０％凝集に到達する時間）との間の関係のグラフである。
【００４７】
【図２０Ｅ−Ｌ】図２０Ｅ〜図２０Ｌは、凍結および解凍に供したまたは供していない、緩衝液またはＣＳＦの存在下の試料についての４つの異なる時点（０、７、１４および３０日目）を含む、８つの試験した条件のＴｈＴ蛍光に基づく凝集結果を示す一連のグラフである。
【００４８】
図２０Ｅは０日目の第１の種調製物のＴｈＴ蛍光に基づく凝集のグラフである。
【００４９】
図２０Ｆは７日目の第１の種調製物のＴｈＴ蛍光に基づく凝集のグラフである。
【００５０】
図２０Ｇは１４日目の第１の種調製物のＴｈＴ蛍光に基づく凝集のグラフである。
【００５１】
図２０Ｈは３０日目の第１の種調製物のＴｈＴ蛍光に基づく凝集のグラフである。
【００５２】
図２０Ｉは０日目の第２の種調製物のＴｈＴ蛍光に基づく凝集のグラフである。
【００５３】
図２０Ｊは７日目の第２の種調製物のＴｈＴ蛍光に基づく凝集のグラフである。
【００５４】
図２０Ｋは１４日目の第２の種調製物のＴｈＴ蛍光に基づく凝集のグラフである。
【００５５】
図２０Ｌは３０日目の第２の種調製物のＴｈＴ蛍光に基づく凝集のグラフである。
【００５６】
【図２０Ｍ】１６の異なる条件にわたる再現性を示すＴ５０値の表である。
【００５７】
【図２０Ｎ】１ｐｍのタウ、Ａβ４０、ＡＢ４２、Ｈｉｓ  αＳｙｎ、Ｈｕ  αＳｙｎおよび種なしの対照で種をまかれたタウアッセイについてのＴｈＴ蛍光対時間のグラフである。
【００５８】
【図２１Ａ】ＡＤ患者、ＭＣＩ患者、他のタウオパチー患者、合成タウオリゴマー（１２．５ｆｍｏｌ）を添加した健康なＣＳＦの試料を使用した陽性対照、タウ種を有さない健康なＣＳＦの試料の陰性対照；および他の神経疾患を有する対照患者についての４４７時間のインキュベーションでのＴｈＴ蛍光を示すグラフである。
【００５９】
【図２１Ｂ】組換えタウオリゴマーを含有する試料で観察されるものに匹敵する、タウ−ＰＭＣＡについてのＡＤまたは他のタウオパチーを有する患者の試料の蛍光シグナルを示す図である。
【００６０】
【図２２】ＡＤ、ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）、ＣＢＤ（皮質基底核変性症）およびＰＳＰ（進行性核上性麻痺）に罹患した患者対対照の代表的なＣＳＦ試料についてのＴｈＴに基づく凝集（％）対時間を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
試料を採取した対象のタウオパチーの決定または診断を含む、試料中のミスフォールドタウタンパク質の検出または特徴付けのための方法およびキットが提供される。タウタンパク質のミスフォールド凝集体が形成され、蓄積する可能性がある。ミスフォールド凝集体は、数ある効果の中でも特に、細胞機能障害および組織損傷を誘発する可能性がある。例えば、タウオパチーには、主に４Ｒのミスフォールディング、または４Ｒと３Ｒの混合物のミスフォールディングに関するもの：アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、嗜銀顆粒病（ＡｇＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、パンチドランカー（ＤＰ）などが含まれ得る。
【００６２】
いくつかの実施形態では、本明細書のタウオパチーがピック病を除外し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるタウオパチーが、主に３Ｒタウミスフォールディングに関するもの、例えばピック病を除外し得る。
【００６３】
本方法は、インビトロでのミスフォールディングおよび凝集過程の人工的加速および増幅を通して、タウなどのミスフォールドタンパク質凝集体の超高感度検出を提供し得る、タンパク質ミスフォールディングサイクリック増幅（ＰＭＣＡ）を含み得る。ＰＭＣＡの基本概念は、プリオンについて（その各々が全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｏｔｏら、国際公開第２００２／０４９５４号パンフレット；Ｅｓｔｒａｄａら、米国特許出願公開第２００８０１１８９３８号明細書）および他のタンパク質ミスフォールディング、例えばアルツハイマー病の「Ａβ」または「βアミロイド」およびパーキンソン病のαシヌクレインについて（全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｏｔｏら、国際公開第２０１６／０４０９０７号パンフレット）以前に実験的に実証されている。しかしながら、本文書の出願日より前に、主に４Ｒのミスフォールディングに関するもしくは４Ｒタウの存在下での３Ｒタウのミスフォールディングに関する任意のタウオパチーに対応するミスフォールドタウタンパク質の増幅および検出について、またはピック病以外のタウオパチーについてＰＣＭＡを記載している参考文献はない。この文書は、ＰＭＣＡ技術がミスフォールドタウ凝集体の存在または非存在を検出することを可能にする具体例および詳細を開示しており、種々の実施形態では、アルツハイマー病のミスフォールドＡβおよびパーキンソン病のαシヌクレインなどの他のミスフォールドタンパク質を検出するための１つまたは複数の追加のＰＭＣＡ手順を開示している。このような１つまたは複数の追加のＰＭＣＡ手順は、例えば、ＡＤおよびＰＤを互いに、およびＰＳＰ、ＦＴＤ、ＣＢＤ、ＭＣＩ、ＡｇＤ、ＴＢＩ、ＣＴＥ、ＤＰなどと区別するために、種々のタウオパチー間の識別を提供し得る。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「Ａβ」または「ベータアミロイド」は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の連続切断を介して形成されたペプチドを指す。種々のＡβアイソフォームは、３８〜４３個のアミノ酸残基を含み得る。Ａβタンパク質は、ＡＰＰが任意の組み合わせのβセクレターゼおよび／またはγセクレターゼによって処理されると形成され得る。Ａβは、ＡＤに罹患しているまたはＡＤを有する疑いのある個体の脳のアミロイド斑の構成成分であり得る。種々のＡβアイソフォームには、Ａβ４０およびＡβ４２が含まれ得るが、これらに限定されない。種々のＡβペプチドが、ＡＤに関連するニューロン損傷に関連し得る。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「αＳ」または「α−シヌクレイン」は、完全長の１４０アミノ酸のα−シヌクレインタンパク質、例えば「αＳ−１４０」を指す。他のアイソフォームまたはフラグメントには、例えば、エクソン３の喪失のために残基４１〜５４を欠く「αＳ−１２６」、α−シヌクレイン−１２６；および例えば、エクソン５の喪失のために残基１０３〜１３０を欠く「αＳ−１１２」、α−シヌクレイン−１１２が含まれ得る。αＳは、ＰＤに罹患しているまたはＰＤを有する疑いのある個体の脳に存在し得る。種々のαＳアイソフォームには、αＳ−１４０、αＳ−１２６およびαＳ−１１２が含まれ得るが、これらに限定されない。種々のαＳペプチドが、ＰＤに関連するニューロン損傷に関連し得る。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「タウ」は、単一遺伝子からの選択的スプライシングの産物、例えば、ヒトにおけるＭＡＰＴ（微小管関連タンパク質タウ）を指す。タウタンパク質には、タウのアイソフォームのいずれかの完全長までおよび切断型が含まれる。種々のアイソフォームには、それだけに限らないが、タウ遺伝子のエクソン２、３および１０の選択的スプライシングに対応する、ヒト脳組織に存在することが知られている６つのタウアイソフォームが含まれる。３つのアイソフォームには３つの結合ドメインがあり、他の３つのアイソフォームには４つの結合ドメインがある。ミスフォールドタウは、ＡＤに罹患しているもしくはＡＤを有する疑いのある、またはＡＤのように、４Ｒタウアイソフォームと３Ｒタウアイソフォームの両方の存在下でのミスフォールディングに関する他のタウオパチーに罹患しているもしくはこれを有する疑いのある個体の脳に存在し得る。ミスフォールドタウはまた、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、タウ依存性前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、嗜銀顆粒病（ＡｇＤ）などの主に４Ｒタウアイソフォームのミスフォールディングに関する疾患に存在し得る。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ミスフォールドタンパク質凝集体」は、生物系内のその典型的な非病原性の正常機能に関与する場合に存在する構造コンフォメーションとは異なるタンパク質の構造コンフォメーションを部分的または完全に含むタンパク質である。ミスフォールドタンパク質は凝集し得る。ミスフォールドタンパク質はタンパク質凝集体に局在し得る。ミスフォールドタンパク質は非機能的タンパク質であり得る。ミスフォールドタンパク質はタンパク質の病原性コンフォーマーであり得る。モノマータンパク質組成物は、種（ＰＭＣＡ条件下でミスフォールディングを触媒することができるミスフォールドタンパク質オリゴマー）に関連するミスフォールディング、オリゴマー化および凝集の触媒活性なしに、天然の非病原性コンフォメーションで提供され得る。モノマータンパク質組成物は、種のない形態で提供され得る。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「モノマータンパク質」とは、単一のタンパク質分子を指す。「可溶性の凝集したミスフォールドタンパク質」とは、溶液中に残っているモノマータンパク質のオリゴマーまたは凝集体を指す。可溶性ミスフォールドタンパク質の例は、ミスフォールドタンパク質が可溶性のままである限り、任意の数のタンパク質モノマーを含み得る。例えば、可溶性ミスフォールドタンパク質は、モノマータンパク質のモノマーまたは２〜約５０単位の凝集体を含み得る。
【００６９】
モノマーおよび／または可溶性ミスフォールドタンパク質が凝集して、不溶性凝集体、より高次のオリゴマーおよび／またはタウ原線維を形成し得る。例えば、Ａβまたはタウタンパク質の凝集は、前原線維、原線維、および最終的にＡＤまたはタウオパチー対象で観察され得るミスフォールド斑またはもつれをもたらし得る。「種」または「核」とは、ミスフォールドタンパク質または短い断片化された原線維、特にさらなるミスフォールディング、オリゴマー化および凝集のための触媒活性を有する可溶性ミスフォールドタンパク質を指す。このような核形成依存性凝集は、凝集核が形成し、その後さらなる凝集体ならびにより大きなオリゴマーおよびポリマーの急速な形成を触媒し得る遅い遅滞期を特徴とし得る。遅滞期は、事前に形成された核または種を添加することによって最小化または除去することができる。モノマータンパク質組成物は、ミスフォールド種に関連するミスフォールディングおよび凝集のための触媒活性なしで提供され得る。モノマータンパク質組成物は、種のない形態で提供され得る。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「可溶性」種は、生理学的条件下で体液中溶液を形成し得るが、「不溶性」種は、生理学的条件下でこのような体液中に沈殿、原線維、堆積物、もつれまたは他の非溶解形態として存在し得る。このような体液には、液体、例えば、羊水；胆汁；血液；脳脊髄液；耳垢；皮膚；滲出液；糞便；胃液；リンパ液；乳汁；粘液、例えば鼻汁；粘膜、例えば鼻粘膜；腹水；血漿；胸水；膿；唾液；皮脂；精液；汗；滑液；涙；尿；などのうちの１つまたは複数から表される液体が含まれ得る。不溶性種には、例えば、Ａβ、αＳ、４Ｒタウ、３Ｒタウ、３Ｒタウ＋４Ｒタウなどのこれらの組み合わせなどの原線維が含まれ得る。生理学的条件下で非体液に溶解するが、上記の体液のいずれにも溶解しない種は、不溶性とみなされ得る。例えば、Ａβ、αＳ、４Ｒタウ、３Ｒタウ、３Ｒタウ＋４Ｒタウなどのこれらの組み合わせなどの原線維は、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤の水溶液に溶解することができるが、生理学的条件下で、言及される体液の１つまたは複数に依然として不溶性であり得る。
【００７１】
いくつかの実施形態では、試料が、沈殿、原線維、堆積物、もつれ、斑または生理学的条件下で、記載される体液の１つもしくは複数に不溶性であり得る他の形態としてのＡβ、αＳ、４Ｒタウ、３Ｒタウ、３Ｒタウ＋４Ｒタウなどのこれらの組み合わせなどのミスフォールドタンパク質の不溶性種を除外し得る。
【００７２】
例えば、いくつかの実施形態では、試料が原線維形態のタウを除外し得る。試料は、不溶性形態のミスフォールドタウタンパク質を除外し得る、例えば、試料は、沈殿、原線維、堆積物、もつれ、斑または他の不溶性形態としての、例えば原線維形態のミスフォールドタウタンパク質を除外し得る。本明細書に記載される方法は、不溶性形態のミスフォールドタンパク質を除外することによって、例えば、沈殿、原線維、堆積物、もつれ、斑または他の不溶性形態としての、例えば原線維形態のミスフォールドタウタンパク質を試料から除外することによって、試料を調製するステップを含み得る。本明細書に記載されるキットは、使用者に沈殿、原線維、堆積物、もつれ、斑または他の不溶性形態としての、例えば原線維形態のミスフォールドタウタンパク質を試料から除外することによって試料を調製するよう指示する説明書を含み得る。このような不溶性形態の記載されるミスフォールドタンパク質の試料からの除外は、実質的または完全であり得る。
【００７３】
本明細書で使用される場合、ミスフォールドタンパク質の凝集体は、可溶性ミスフォールドタンパク質を含むタンパク質の非共有結合的会合を指す。ミスフォールドタンパク質の凝集体は、「脱凝集」、または破壊されて、可溶性ミスフォールドタンパク質を分離させるまたは放出し得る。可溶性ミスフォールドタンパク質種のコレクションの触媒活性は、混合物中のこのような種の数に少なくとも部分的に比例し得る。したがって、混合物中のミスフォールドタンパク質の凝集体が破壊されて、ミスフォールドタンパク質種が放出されると、モノマータンパク質のオリゴマー化または凝集のための触媒活性が増加し得る。
【００７４】
種々の実施形態では、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定する方法が提供される。この方法は、第１のタンパク質ミスフォールディングサイクリック増幅（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍｉｓｆｏｌｄｉｎｇ  ｃｙｃｌｉｃ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＰＭＣＡ）手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料の第１の部分を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウタンパク質を含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体として形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第１のインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第１のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。
【００７５】
種々の実施形態では、対象における第１のミスフォールドタンパク質凝集体に対応するタウオパチーの存在または非存在を決定する方法が提供される。この方法は、対象から試料を得るステップを含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料の第１の部分を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質はタウアイソフォームを含み得る。第１の基質タンパク質は、インビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、第１のミスフォールドタンパク質凝集体を形成し得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第１のインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第１のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定することを含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。この方法は、第１の基質タンパク質がモノマー３Ｒタウからなる場合、タウオパチーがピック病を除外することを提供し得る。
【００７６】
種々の実施形態では、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するために捕捉を使用する方法が提供される。この方法は、試料から第１のミスフォールドタンパク質凝集体を捕捉して、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体を形成するステップを含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体をモル過剰の第１の基質タンパク質と接触させることによって、第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は、インビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、第１のミスフォールドタンパク質凝集体を形成し得る。モル過剰は、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれるタンパク質モノマーの量より大きくてもよい。この方法は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第１のインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。
【００７７】
種々の実施形態では、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、タウオパチーがアルツハイマー病（ＡＤ）を含む方法が提供される。この方法は、対象を用意するステップを含み得る。この方法は、対象から試料を得るステップを含み得る。試料は、生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１のインキュベーション混合物中の第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるＡＤの存在または非存在を決定するステップを含み得る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、対象におけるＡＤの存在または非存在の決定が、ＡＤタウタンパク質凝集体のサインを決定することによって、１つまたは複数の追加のタウオパチーからＡＤを区別することを含み得る。ＡＤタウタンパク質凝集体のサインは、遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数のＡＤに特異的な対応するＰＭＣＡ動態パラメータ；ＡＤタウタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用したアッセイ；ＡＤタウタンパク質凝集体に選択的な指示薬；およびＡＤタウタンパク質凝集体に特徴的なスペクトルのうちの１つまたは複数を含み得る。
【００７９】
種々の実施形態では、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、タウオパチーがパーキンソン病（ＰＤ）を含む方法が提供される。この方法は、対象を用意するステップを含み得る。この方法は、対象から試料を得るステップを含み得る。試料は、生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１のインキュベーション混合物中の第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるＰＤの存在または非存在を決定するステップを含み得る。
【００８０】
いくつかの実施形態では、対象におけるＰＤの存在または非存在の決定が、ＰＤタウタンパク質凝集体のサインを決定することによって、１つまたは複数の追加のタウオパチーからＰＤを区別することを含み得る。ＰＤタウタンパク質凝集体のサインは、遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数のＰＤに特異的な対応するＰＭＣＡ動態パラメータ；ＰＤタウタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用したアッセイ；ＰＤタウタンパク質凝集体に選択的な指示薬；およびＰＤタウタンパク質凝集体に特徴的なスペクトルのうちの１つまたは複数を含み得る。
【００８１】
種々の実施形態では、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、タウオパチーが進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）を含む方法が提供される。この方法は、対象を用意するステップを含み得る。この方法は、対象から試料を得るステップを含み得る。試料は、生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１のインキュベーション混合物中の第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるＰＳＰの存在または非存在を決定するステップを含み得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、対象におけるＰＳＰの存在または非存在の決定が、ＰＳＰタウタンパク質凝集体のサインを決定することによって、１つまたは複数の追加のタウオパチーからＰＳＰを区別することを含み得る。ＰＳＰタウタンパク質凝集体のサインは、遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数のＰＳＰに特異的な対応するＰＭＣＡ動態パラメータ；ＰＳＰタウタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用したアッセイ；ＰＳＰタウタンパク質凝集体に選択的な指示薬；およびＰＳＰタウタンパク質凝集体に特徴的なスペクトルのうちの１つまたは複数を含み得る。
【００８３】
種々の実施形態では、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、タウオパチーが前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を含む方法が提供される。この方法は、対象を用意するステップを含み得る。この方法は、対象から試料を得るステップを含み得る。試料は、生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１のインキュベーション混合物中の第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるＦＴＤの存在または非存在を決定するステップを含み得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、対象におけるＦＴＤの存在または非存在の決定が、ＦＴＤタウタンパク質凝集体のサインを決定することによって、１つまたは複数の追加のタウオパチーからＦＴＤを区別することを含み得る。ＦＴＤタウタンパク質凝集体のサインは、遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数のＦＴＤに特異的な対応するＰＭＣＡ動態パラメータ；ＦＴＤタウタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用したアッセイ；ＦＴＤタウタンパク質凝集体に選択的な指示薬；およびＦＴＤタウタンパク質凝集体に特徴的なスペクトルのうちの１つまたは複数を含み得る。
【００８５】
種々の実施形態では、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定する方法であって、タウオパチーが皮質基底核変性症（ＣＢＤ）を含む方法が提供される。この方法は、対象を用意するステップを含み得る。この方法は、対象から試料を得るステップを含み得る。試料は、生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含み得る。この方法は、少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するステップを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料を第１の基質タンパク質と接触させることによって第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１のインキュベーション混合物中の第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるＣＢＤの存在または非存在を決定するステップを含み得る。
【００８６】
いくつかの実施形態では、対象におけるＣＢＤの存在または非存在の決定が、ＣＢＤタウタンパク質凝集体のサインを決定することによって、１つまたは複数の追加のタウオパチーからＣＢＤを区別することを含み得る。ＣＢＤタウタンパク質凝集体のサインは、遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数のＣＢＤに特異的な対応するＰＭＣＡ動態パラメータ；ＣＢＤタウタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用したアッセイ；ＣＢＤタウタンパク質凝集体に選択的な指示薬；およびＣＢＤタウタンパク質凝集体に特徴的なスペクトルのうちの１つまたは複数を含み得る。
【００８７】
さらなる実施形態では、本明細書で上に記載される方法の各々が、以下の特徴の１つまたは複数を組み込むことができる。特に、任意のタンパク質基質、ミスフォールドタンパク質凝集体、増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体、インキュベーション混合物、ＰＭＣＡ手順、試料の一部などに関して記載される各特徴は、種々の他の実施形態で独立に選択されて、任意の他のタンパク質基質、ミスフォールドタンパク質凝集体、増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体、インキュベーション混合物、ＰＭＣＡ手順、試料の一部などを記載すると理解されるべきである。例えば、いくつかの実施形態では、「第１の」タンパク質基質について記載される特徴が、「第２の」タンパク質基質を記載するために独立に選択されてもよく；「第１の」ミスフォールドタンパク質凝集体について記載される特徴も、「第２の」ミスフォールドタンパク質凝集体を記載するために独立に選択されてもよく；「第１の」インキュベーション混合物について記載される特徴も、「第２の」インキュベーション混合物を記載するために独立に選択されてもよく；「第１の」ＰＭＣＡ手順について記載される特徴も、「第２の」ＰＭＣＡ手順を記載するために独立に選択されてもよい等である。さらに、例えば、「各」タンパク質基質、ミスフォールドタンパク質凝集体、増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体、インキュベーション混合物、ＰＭＣＡ手順、試料の一部などに関して記載される特徴は、種々の他の実施形態で独立に選択されて、タンパク質基質、ミスフォールドタンパク質凝集体、増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体、インキュベーション混合物、ＰＭＣＡ手順、試料の一部などに適用される任意の他の列挙される要素、例えば「第１の」、「第２の」、「第３の」などを記載すると理解されるべきである。例えば、「各基質タンパク質」に関する記載は、「第１の基質タンパク質」、「第２の基質タンパク質」、「第３の基質タンパク質」などの列挙を記載および支持するために独立に選択され得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、列挙または指定された要素、例えば「第１」、「第２」、「各」などについて一般的に記載される特徴が、同一または別個であるように独立に選択され得る。例えば、いくつかの実施形態では、第１の基質タンパク質が４Ｒタウを含んでよく、第２の基質タンパク質がＡβを含んでよく；温度などの条件が、第１および第２のＰＭＣＡ手順などについて独立に選択され得る。いくつかの実施形態では、このような第１および第２の要素について一般的に記載されるいくつかの特徴が、同じまたは重複するように選択されてもよく、このような第１および第２の要素について一般的に記載される他の特徴が別個となるように選択されてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、試料の第１および第２の部分が同じまたは組み合わされてもよく、第１および第２のインキュベーション混合物が同じまたは組み合わされてもよい一方で、対応する第１および第２のＰＭＣＡ手順が、異なる第１および第２の基質タンパク質、例えば４ＲタウおよびＡβを使用した組み合わされたインキュベーション混合物で並行してまたは連続して行われてもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態では、各タンパク質基質、ミスフォールドタンパク質凝集体、増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体、インキュベーション混合物、ＰＭＣＡ手順、試料の一部などについて、１つ、２つまたはそれ以上の例が独立に選択され得る。例えば、種々の方法の実施形態は、第１の基質タンパク質として４Ｒタウを使用する第１のＰＭＣＡ手順、第２の基質タンパク質としてＡβを使用する第２のＰＭＣＡ手順、第３の基質タンパク質としてαシヌクレインを使用する第３のＰＭＣＡ手順、第４の基質タンパク質として３Ｒタウを使用する第４のＰＭＣＡ手順などを含み得る。このような複数のＰＭＣＡ手順を、試料、例えば実験室サンプル、またはタウオパチーを有する対象などの対象から採取された試料に実施することができる。このような複数のＰＭＣＡ手順を、例えば以下のように、各タンパク質基質、ミスフォールドタンパク質凝集体、増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体、インキュベーション混合物、ＰＭＣＡ手順、試料の一部などについて並行して実施することができる。
【００９０】
種々の実施形態では、この方法が、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在を決定するステップを含み得る。この方法は、少なくとも第２のＰＭＣＡ手順を実施して、試料中の少なくとも第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップを含み得る。第２のＰＭＣＡ手順は、試料の第２の部分を第２の基質タンパク質と接触させることによって第２のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第２の基質タンパク質は、インビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、第２のミスフォールドタンパク質凝集体を形成し得る。第２のＰＭＣＡ手順は、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第２の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第２のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第２のインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第２のＰＭＣＡ手順は、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第２のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。第２のミスフォールドタンパク質凝集体は、第２の基質タンパク質を含み得る。第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、第２の基質タンパク質を含み得る。
【００９１】
いくつかの実施形態では、この方法が、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体および第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在を決定するステップを含み得る。この方法は、少なくとも第３のＰＭＣＡ手順を実施して、試料中の少なくとも第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップを含み得る。第３のＰＭＣＡ手順は、試料の第３の部分を第３の基質タンパク質と接触させることによって第３のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第３の基質タンパク質は、インビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、第３のミスフォールドタンパク質凝集体を形成し得る。第３のＰＭＣＡ手順は、第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第３の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第３のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第３のインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第３のＰＭＣＡ手順は、第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第３のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第３のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。第３のミスフォールドタンパク質凝集体は、第３の基質タンパク質を含み得る。第３の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、第３の基質タンパク質を含み得る。
【００９２】
いくつかの実施形態では、この方法が、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体、第２のミスフォールドタンパク質凝集体および第４のミスフォールドタンパク質凝集体の存在を決定するステップを含み得る。この方法は、少なくとも第４のＰＭＣＡ手順を実施して、試料中の第４のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップを含み得る。第４のＰＭＣＡ手順は、試料の第４の部分を第４の基質タンパク質と接触させることによって第４のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第４の基質タンパク質は、インビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、第４のミスフォールドタンパク質凝集体を形成し得る。第４のＰＭＣＡ手順は、第４の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第４のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第４の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第４のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第４の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第４のインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第４のＰＭＣＡ手順は、第４の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第４のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第４のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。第４のミスフォールドタンパク質凝集体は、第４の基質タンパク質を含み得る。第４の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、第４の基質タンパク質を含み得る。
【００９３】
種々の実施形態では、第１の基質タンパク質が、独立に、タウアイソフォーム、例えば、３Ｒタウ、４Ｒタウなどを含み得る。いくつかの実施形態では、第１の基質タンパク質が４Ｒタウを含み得る。第１の基質タンパク質は３Ｒタウを含み得る。例えば、試料がピック病に対応している場合、またはピック病を有する対象から採取された場合、第１の基質タンパク質が３Ｒタウを除外してもよい。第１の基質タンパク質は可溶性であり得る。第１の基質タンパク質はモノマーであり得る。第１の基質タンパク質は、天然のインビボコンフォメーション、例えば折り畳まれていてもよい。第１の基質タンパク質は、他の各基質タンパク質と異なっていてもよい。
【００９４】
種々の実施形態では、第２の基質タンパク質が、独立に、タウアイソフォーム、例えば３Ｒタウ、４Ｒタウなど；Ａβ、αシヌクレインなどのうちの１つを含み得る。第２の基質タンパク質は、３Ｒタウ、Ａβ、αシヌクレインなどのうちの１つを含み得る。第２の基質タンパク質は３Ｒタウを含み得る。第２の基質タンパク質はＡβを含み得る。第２の基質タンパク質はαシヌクレインを含み得る。第２の基質タンパク質は、３Ｒタウ、４Ｒタウ、Ａβまたはαシヌクレインのうちの１つから本質的になる、またはからなってもよい。第２の基質タンパク質は可溶性であり得る。第２の基質タンパク質はモノマーであり得る。第２の基質タンパク質は、天然のインビボコンフォメーション、例えば折り畳まれていてもよい。第２の基質タンパク質は、他の各基質タンパク質と異なっていてもよい。
【００９５】
種々の実施形態では、第３の基質タンパク質が、独立に、タウアイソフォーム、例えば３Ｒタウ、４Ｒタウなど；Ａβ、αシヌクレインなどのうちの１つを含み得る。第３の基質タンパク質は、３Ｒタウ、Ａβ、αシヌクレインなどのうちの１つを含み得る。第３の基質タンパク質は３Ｒタウを含み得る。第３の基質タンパク質はＡβを含み得る。第３の基質タンパク質はαシヌクレインを含み得る。第３の基質タンパク質は、３Ｒタウ、４Ｒタウ、Ａβまたはαシヌクレインのうちの１つから本質的になる、またはからなってもよい。第３の基質タンパク質は可溶性であり得る。第３の基質タンパク質はモノマーであり得る。第３の基質タンパク質は、天然のインビボコンフォメーション、例えば折り畳まれていてもよい。第３の基質タンパク質は、他の各基質タンパク質と異なっていてもよい。
【００９６】
種々の実施形態では、第４の基質タンパク質が、独立に、タウアイソフォーム、例えば３Ｒタウ、４Ｒタウなど；Ａβ、αシヌクレインなどのうちの１つを含み得る。第４の基質タンパク質は、３Ｒタウ、Ａβ、αシヌクレインなどのうちの１つを含み得る。第４の基質タンパク質は３Ｒタウを含み得る。第４の基質タンパク質はＡβを含み得る。第４の基質タンパク質はαシヌクレインを含み得る。第４の基質タンパク質は、３Ｒタウ、４Ｒタウ、Ａβまたはαシヌクレインのうちの１つから本質的になる、またはからなってもよい。第４の基質タンパク質は可溶性であり得る。第４の基質タンパク質はモノマーであり得る。第４の基質タンパク質は、天然のインビボコンフォメーション、例えば折り畳まれていてもよい。第４の基質タンパク質は、他の各基質タンパク質と異なっていてもよい。
【００９７】
いくつかの実施形態では、試料が対象から採取され得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定または診断するステップを含み得る。
【００９８】
いくつかの実施形態では、この方法が、少なくとも第２のＰＭＣＡ手順を実施して、試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体、例えば第２の基質タンパク質を含むミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップを含み得る。第２のＰＭＣＡ手順は、試料の第２の部分を第２の基質タンパク質と接触させることによって第２のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第２の基質タンパク質は、インビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、第２のミスフォールドタンパク質凝集体を形成し得る。この方法は、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第２のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップを含み得る。第２のミスフォールドタンパク質凝集体は、第２の基質タンパク質を含み得る。第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、第２の基質タンパク質を含み得る。第２の基質タンパク質は、アミロイドベータ（Ａβ）、αシヌクレインおよび３Ｒタウのうちの１つを含み得る。
【００９９】
いくつかの実施形態では、試料が対象から採取され得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定または診断するステップを含み得る。この方法は、少なくとも第２のＰＭＣＡ手順を実施して、試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップを含み得る。第２のＰＭＣＡ手順は、試料の第２の部分を第２の基質タンパク質と接触させることによって第２のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第２の基質タンパク質は、インビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、第２のミスフォールドタンパク質凝集体を形成し得る。第２のＰＭＣＡ手順は、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第２の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第２のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第２のインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第２のＰＭＣＡ手順は、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第２のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。第２のミスフォールドタンパク質凝集体は、第２の基質タンパク質を含み得る。第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、第２の基質タンパク質を含み得る。
【０１００】
種々の実施形態では、対象がタウオパチーを有し得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在；および試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるタウオパチーの素性を特徴付けるステップを含み得る：第２の基質タンパク質は、アミロイドベータ（Ａβ）、αシヌクレインおよび３Ｒタウのうちの１つを含み得る。例えば、第１のミスフォールドタンパク質凝集体としてのミスフォールド４Ｒタウ凝集体および第２のミスフォールドタンパク質凝集体としてのＡβの存在は、対象のタウオパチーがＡＤであることを示し得る；第１のミスフォールドタンパク質凝集体としてのミスフォールド４Ｒタウ凝集体および第２のミスフォールドタンパク質凝集体としてのαシヌクレインの存在は、対象のタウオパチーがＰＤであることを示し得る；第１のミスフォールドタンパク質凝集体としてのミスフォールド４Ｒタウ凝集体の存在およびＡβ、αシヌクレインまたは３Ｒを含む第２のミスフォールドタンパク質凝集体の非存在は、ＰＳＰ、ＣＢＤ、ＡＧＤなどの４Ｒタウオパチーを示し得る。
【０１０１】
種々の実施形態では、タウオパチーが、原発性タウオパチーまたは続発性タウオパチーを含み得る。タウオパチーは、４Ｒタウタンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を少なくとも部分的に特徴とし得る。タウオパチーは、４Ｒタウタンパク質および３Ｒタウタンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を少なくとも部分的に特徴とし得る。タウオパチーは、約１：９９、５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：５および９９：１のうちの１つ、または前記の比の任意の２つの間の範囲、例えば１：９９〜９９：１のミスフォールドおよび／または凝集３Ｒタウタンパク質に対する比のミスフォールドおよび／または凝集４Ｒタウタンパク質を少なくとも部分的に特徴とし得る。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、この方法が、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、嗜銀顆粒病（ＡｇＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）およびパンチドランカー（ＤＰ）のうちの少なくとも１つのサインについて、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体またはその１つもしくは複数の対応するＰＭＣＡ動態パラメータを分析することによって、タウオパチーの素性を特徴付けるステップを含み得る。例えば、タウオパチーの素性を特徴付けることは、遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数を含む１つまたは複数の対応するＰＭＣＡ動態パラメータを決定することを含み得る。タウオパチーの素性を特徴付けることは、１つまたは複数の対応するＰＭＣＡ動態パラメータを、タウオパチーの素性に特徴的な１つまたは複数の対応する所定の対応するＰＭＣＡ動態パラメータと比較してタウオパチーの素性を特徴付けるのに有効な類似性または差異を決定することを含み得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、この方法が、タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用してタウオパチーの素性を特徴付けるステップを含み得る。この方法は、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体に選択的な指示薬を使用してタウオパチーの素性を特徴付けるステップを含み得る。各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体に選択的な指示薬には、小分子、ペプチド、またはＤＮＡもしくはＲＮＡアプタマーが含まれ得る。この方法は、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体に特徴的なスペクトルを使用してタウオパチーの素性を特徴付けるステップを含み得る。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、この方法が、例えば、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体のタンパク質分解耐性を分析することによってタウオパチーの素性を特徴付けるステップを含み得る。例えば、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体を、２０℃〜１２０℃の種々の温度で、種々の時間、例えば１分間〜４時間、０．１〜５０００μｇ／ｍＬのプロテイナーゼ濃度のプロテイナーゼ、例えばプロテイナーゼＫ、トリプシン、キモトリプシンなどと接触させることができる。各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体のタンパク質分解耐性を特徴付け、使用して、種々のタウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体を区別することができる。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、この方法が、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体の変性に対する安定性を分析することによってタウオパチーの素性を特徴付けるステップを含み得る。例えば、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体を、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体のタンパク質変性を誘導するのに十分な高温でグアニジニウムまたは尿素で処理することができる。グアニジニウムまたは尿素の濃度は０．１Ｍ〜８Ｍに及び得る。温度範囲は２０℃〜１２０℃に及び得る。各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体の安定性を特徴付け、使用して、種々のタウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体を区別することができる。
【０１０６】
この方法は、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体の沈降を含み得る。この方法は、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体のサイズを特徴付けるゲルクロマトグラフィーを含み得る。この方法は、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体の円二色性分光法を含み得る。この方法は、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体の二次構造を分析するフーリエ変換赤外分光法を含み得る。この方法は、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体の構造を分析する核磁気共鳴分光法を含み得る。この方法は、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体の二次および三次構造を分析する質量分析、例えば、断片化および衝突誘起解離を含み得る。この方法は、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体の形態を分析する顕微鏡法、例えば、原子間力顕微鏡法、低温電子顕微鏡法などを含み得る。これらの方法の各々を、異なる質量、磁気特性および／または同位体安定性の原子同位体を使用した置換と連結して方法を補完することができる；例えば、核磁気共鳴分光法を、各タウオパチーに特異的なミスフォールドタウタンパク質凝集体における重水素交換と連結して、構造情報を得ることができる。
【０１０７】
種々の実施形態では、タウオパチーがピック病を特に除外するような方法が提供される。種々の実施形態では、ピック病の除外が、ピック複合の疾患の残りを包含しない。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、この方法が、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を、対照の対象から採取した対照試料と比較することを含む、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定または診断することを含み得る。検出は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を検出することを含み得る。試料は対象から採取され得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を所定の閾値量と比較することによって、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定または診断するステップを含み得る。試料は、認知検査による認知症の臨床徴候を示さない対象から採取され得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定または診断するステップを含み得る。試料は、造影撮像による皮質斑ももつれも示さない対象から採取され得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定または診断するステップを含み得る。試料は、認知検査による認知症の臨床徴候を示す対象から採取され得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象における認知症の臨床徴候への寄与因子としてのタウオパチーの存在または非存在を決定または診断するステップを含み得る。試料は、認知検査による認知症の臨床徴候を示さない対象から採取され得る。対象は、遺伝子検査による認知症の素因を示し得る。遺伝子検査は、例えば、ＡｐｏＥ４対立遺伝子の１コピーまたは２コピー、ＡＡ６６位のバリンがメチオニンによって置き換えられているｖａｌ６６ｍｅｔ対立遺伝子などの脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）遺伝子の変異体によるタウオパチーのリスク増加を示し得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるタウオパチーの存在または非存在を決定または診断するステップを含み得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、この方法が、約２０μＭ未満の第１の基質タンパク質；約７５μＭ未満のヘパリン；約１９０ｍＭ未満のＮａＣｌ；および約９．５μＭ未満のチオフラビンＴのうちの少なくとも１つの濃度を特徴とする第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含み得る。
【０１１０】
種々の実施形態では、この方法が、約０．００１、０．０１、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１，５、１．７５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２５、５０、７０、１００、１５０、２００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００もしくは２０００のうちの１つもしくは複数の濃度（μＭ）、または前記の値の任意の２つの間の範囲、例えば約０．００１μＭ〜約２０００μＭの第１の基質タンパク質を含む第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含み得る。この方法は、約０．００１、０．０１、０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、１．２５、１，５、１．７５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１２．５、１５、１７．５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０および７５のうちの１つもしくは複数の濃度（μＭ）、または前記の値の任意の２つの間の範囲、例えば約０．００１μＭ〜約７５μＭのヘパリンを特徴とする第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含み得る。この方法は、Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ、ＰＢＳ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳおよびＨＥＰＥＳのうちの１つまたは複数の緩衝液組成物を含む第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含み得る。この方法は、約１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、７５０μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭおよび１Ｍのうちの１つもしくは複数、または前記の値の任意の２つの間の範囲、例えば、約１μＭ〜約１Ｍの総濃度の緩衝液組成物を含む第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含み得る。この方法は、１μＭ、１０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、７５０μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、７５０ｍＭおよび１Ｍの１つもしくは複数、または前記の値の任意の２つの間の範囲、例えば、約１μＭ〜約１Ｍの総濃度の塩組成物を含む第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含み得る。塩組成物は、ＮａＣｌおよびＫＣｌのうちの１つまたは複数を含み得る。
【０１１１】
種々の実施形態では、この方法が、約５、５．５、６、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５もしくは９のうちの１つもしくは複数のｐＨ、または前記の値の任意の２つの間の範囲、例えば、約ｐＨ５〜約ｐＨ９で第１のインキュベーション混合物を調製または維持するステップを含み得る。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、この方法が、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、２５０ｎＭ、５００ｎＭ、７５０ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、９．５μＭ、１０μＭ、２５μＭ、５０μＭ、１００μＭ、２５０μＭ、５００μＭ、７５０μＭ、１ｍＭの１つもしくは複数、または前記の値の任意の２つの間の範囲、例えば、約１ｎＭ〜約１ｍＭの総濃度の指示薬を含む第１のインキュベーション混合物を調製するステップを含み得る。
【０１１３】
本方法のいくつかの実施形態では、インキュベーションが、５、１０、１５、２０、２２．５、２５、２７．５、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、５０、５５、６０のうちの１つの温度（℃）、または前記の値の任意の２つの間の範囲、例えば、約５℃〜約６０℃で第１のインキュベーション混合物を加熱または維持することを含み得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、この方法が、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬を第１のインキュベーション混合物に接触させるステップを含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬は、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下の指示状態および第１のミスフォールドタンパク質凝集体の非存在下の非指示状態を特徴とし得る。試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在を決定することは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬の指示状態を検出することを含み得る。指示薬の指示状態と指示薬の非指示状態は、蛍光の違いを特徴とし得る。試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在を決定することは、蛍光の違いを検出することを含み得る。この方法は、モル過剰の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬を第１のインキュベーション混合物に接触させるステップを含み得る。モル過剰は、第１のインキュベーション混合物中の第１の基質タンパク質および第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれるタンパク質モノマーの総モル量より大きくなり得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬は、チオフラビン、例えば、チオフラビンＴまたはチオフラビンＳ；コンゴレッド、ｍ−Ｉ−スチルベン、クリサミンＧ、ＰＩＢ、ＢＦ−２２７、Ｘ−３４、ＴＺＤＭ、ＦＤＤＮＰ、ＭｅＯ−Ｘ−０４、ＩＭＰＹ、ＮＩＡＤ−４、発光共役ポリチオフェン、緑色蛍光タンパク質および黄色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質との融合体、これらの誘導体などのうちの１つまたは複数を含み得る。
【０１１５】
種々の実施形態では、この方法が、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を決定するステップを含み得る。例えば、既知の量のインビトロ合成ミスフォールドタンパク質凝集体種を、健康な患者の体液の種々の部分、例えばＣＳＦに添加することができる。その後、ＰＭＣＡを種々の部分で実施することができる。種々の部分の各々に、ミスフォールドタンパク質凝集体の蛍光指示薬を添加し、蛍光を、例えばＰＭＣＡサイクルの数の関数として測定して、種々のＰＭＣＡ動態パラメータ、例えば最大蛍光シグナルまでのＰＭＣＡサイクルの数、最大蛍光シグナルの５０％までのＰＭＣＡサイクルの数、蛍光シグナルの増加における遅滞期、ＰＭＣＡサイクルに対する蛍光シグナルの増加率などを決定することができる。添加した合成種の濃度とＰＭＣＡ動態パラメータの関係を示す検量線。未知の試料について動態パラメータを測定し、検量線と比較して、特定の試料中に存在する種の予想量を決定することができる。あるいは、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を、一連の既知の試料の希釈および各系列希釈のＰＭＣＡによって決定して、第１のミスフォールドタンパク質凝集体を特定の希釈で検出することができるかどうかを決定することができる。非希釈試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を、ＰＭＣＡによる第１のミスフォールドタンパク質凝集体の検出をもたらさない既知の希釈に基づいて推定することができる。別の例では、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を、一連の既知の試料の希釈およびＰＭＣＡによって決定して、各系列希釈における検出シグナルを決定することができる。系列希釈で収集された検出シグナルを、例えば最小二乗法を介して当てはめて、特定の希釈で第１のミスフォールドタンパク質凝集体を検出することができるかどうかを決定することができる。別の例では、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を、第１のミスフォールドタンパク質凝集体に対する抗体の既知の量によって決定することができる。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、この方法が、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％のうちの１つまたは複数、例えば少なくとも約７０％の感度で検出するステップを含み得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を、約６２５、６２．５、６．２５、６３０μｇ、６３μｇ、６．３μｇ、６３０ｎｇ、６３ｎｇ、６．３ｎｇ、６３０ｐｇ、２００ｐｇ、６３ｐｇ、６．３ｐｇ、６３０ｆｇ、３００ｆｇ、２００ｆｇ、１２５ｆｇ、６３ｆｇ、５０ｆｇ、３０ｆｇ、１５ｆｇ、１２．５ｆｇ、１０ｆｇ、５ｆｇまたは２．５ｆｇのうちの１つまたは複数未満で検出するステップを含み得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を約１００ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌ、１ｎｍｏｌ、１００ｐｍｏｌ、１０ｐｍｏｌ、１ｐｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、１０ｆｍｏｌ、３ｆｍｏｌ、１ｆｍｏｌ、１００ａｔｔｏｍｏｌ、１０ａｔｔｏｍｏｌ、５ａｔｔｏｍｏｌ、２ａｔｔｏｍｏｌ、１ａｔｔｏｍｏｌ、０．７５ａｔｔｏｍｏｌ、０．５ａｔｔｏｍｏｌ、０．２５ａｔｔｏｍｏｌ、０．２ａｔｔｏｍｏｌ、０．１５ａｔｔｏｍｏｌ、０．１ａｔｔｏｍｏｌおよび０．０５ａｔｔｏｍｏｌのうちの１つまたは複数未満、例えば、約１００ｎｍｏｌ未満で検出するステップを含み得る。この方法は、試料に含まれる第１の基質タンパク質に対するモル比で試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を検出するステップを含み得る。モル比は、約１：１００、１：１００００、１：１０００００および１：１００００００のうちの１つまたは複数未満、例えば約１：１００未満であり得る。この方法は、対照試料と比較した試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を決定するステップを含み得る。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、この方法が、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体を、少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％および１００％のうちの１つまたは複数、例えば少なくとも約７０％の特異性で検出するステップを含み得る。この方法は、ウエスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光タンパク質／ペプチド結合アッセイ、チオフラビン結合アッセイ、コンゴレッド結合アッセイ、沈降アッセイ、電子顕微鏡法、原子間力顕微鏡法、表面プラズモン共鳴および分光法のうちの１つまたは複数を含む、第１のミスフォールドタンパク質凝集体を検出するステップを含み得る。ＥＬＩＳＡは、両面サンドイッチＥＬＩＳＡを含み得る。分光法は、準光散乱分光法、マルチスペクトル紫外線分光法、共焦点二色蛍光相関分光法、フーリエ変換赤外分光法、分光検出付きキャピラリー電気泳動、電子スピン共鳴分光法、核磁気共鳴分光法および蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分光法のうちの１つまたは複数を含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体の検出は、第１のインキュベーション混合物をプロテアーゼと接触させることと；ウエスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイおよびＥＬＩＳＡのうちの１つまたは複数で、抗ミスフォールドタンパク質抗体またはミスフォールドタウ凝集体に特異的な抗体を使用して第１のミスフォールドタンパク質凝集体を検出することとを含み得る。
【０１１８】
種々の実施形態では、この方法が、標識化形態の第１の基質タンパク質を提供するステップを含み得る。標識化形態の第１の基質タンパク質は、共有結合的に組み込まれた放射性アミノ酸、共有結合的に組み込まれた、同位体標識されたアミノ酸、および共有結合的に組み込まれたフルオロフォアのうちの１つまたは複数を含み得る。この方法は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体に組み込まれた標識化形態の第１の基質タンパク質を検出するステップを含み得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、試料が、生物流体、例えば、血液、生体材料、例えば、耳垢、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含み得る。試料は、羊水；胆汁；血液；脳脊髄液；耳垢；皮膚；滲出液；糞便；胃液；リンパ液；乳汁；粘液；粘膜；腹水；血漿；胸水；膿；唾液；皮脂；精液；汗；滑液；涙；および尿のうちの１つまたは複数を含み得る。試料は、皮膚、脳、心臓、肝臓、膵臓、肺、腎臓、胃腸、神経、粘膜、血球、腺および筋肉のうちの１つまたは複数の細胞または組織に由来し得る。この方法は、生物流体または生体材料を引き抜く、組織生検を実施することなどによって、対象から試料を得るステップを含み得る。特定のＰＭＣＡ反応に添加される試料の各部分の体積は、例えば、流体または均質化形態で、約５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、９００、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０、２００、１５０、１２５、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５、１０、５もしくは１のうちの１つの体積（μＬ）、または前記の値の任意の２つの間の範囲、例えば、約１μＬ〜約１０００μＬであり得る。いくつかの実施形態では、試料がＣＳＦである場合、特定のＰＭＣＡ反応に添加される各部分の量が、前記のいずれか、例えば、約８０、７０、６０、５０、４０、３０、２５、２０、１５もしくは１０のうちの１つの体積（μＬ）、または前記の値の任意の２つの間の範囲、例えば、例えば約１０μＬ〜約８０μＬ、例えば、約４０μＬであり得る。いくつかの実施形態では、試料が血漿である場合、特定のＰＭＣＡ反応に添加される各部分の量が、前記のいずれか、例えば約７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０のうちの１つの体積（μＬ）、または前記の値の任意の２つの間の範囲、例えば、例えば約２５０μＬ〜約７５０μＬ、例えば約５００μＬであり得る。いくつかの実施形態では、試料が血液である場合、特定のＰＭＣＡ反応に添加される各部分の量が、前記のいずれか、例えば約５０００、４０００、３０００、２０００、１０００、９００、８００、７５０、７００、６５０、６００、５５０、５００、４５０、４００、３５０、３００、２５０もしくは２００のうちの１つの体積（μＬ）、または前記値の任意の２つの間の範囲、例えば、約２００μＬ〜約１０００μＬであり得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、対象が、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、シカ、ヘラジカ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびヒト以外の霊長類のうちの１つであり得る。対象は、タウオパチーのリスクがある、タウオパチーを有する、およびタウオパチーの治療中のうちの１つまたは複数であり得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を、試料と比較して異なる時間に対象から採取された比較試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量と比較することによって、対象におけるタウオパチーの進行または恒常性を決定するステップを含み得る。対象は、タウオパチー調節療法で治療され得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量を、比較試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の量と比較するステップを含み得る。試料および比較試料は、タウオパチー調節療法の下で、一定期間にわたる異なる時間に対象から採取され得る。この方法は、対象が、一定期間にわたる第１のミスフォールドタンパク質凝集体の変化によりタウオパチー調節療法に反応性である、または一定期間にわたる第１のミスフォールドタンパク質凝集体の恒常性によりタウオパチー調節療法に非反応性であるの一方であることを決定するステップを含み得る。この方法は、タウオパチー調節療法に反応性であると決定された対象をタウオパチー調節療法で治療するステップを含み得る。この方法は、対象をタウオパチー調節療法で治療して、第１の基質タンパク質の産生を阻害する、または第１のミスフォールドタンパク質凝集体の凝集を阻害するステップを含み得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、対象が、タンパク質ミスフォールディング障害（ＰＭＤ）調節療法で治療され得る。この方法は、試料中の各ミスフォールドタンパク質凝集体の量を、比較試料中の各ミスフォールドタンパク質凝集体の量と比較するステップを含み得る。試料および比較試料は、各ミスフォールドタンパク質凝集体調節療法の下で、一定期間にわたる異なる時間に対象から採取され得る。この方法は、対象が、一定期間にわたる各ミスフォールドタンパク質凝集体の変化により各ミスフォールドタンパク質凝集体調節療法に反応性である、または一定期間にわたる各ミスフォールドタンパク質凝集体の恒常性により各ミスフォールドタンパク質凝集体調節療法に非反応性であるの一方であることを決定または診断するステップを含み得る。この方法は、各ミスフォールドタンパク質凝集体調節療法に反応性であると決定された対象を各ミスフォールドタンパク質凝集体調節療法で治療するステップを含み得る。ＡＤについては、例えば、ＰＭＤ調節療法が、ＢＡＣＥ１（β−セクレターゼ１）の阻害剤；γ−セクレターゼの阻害剤；およびＡβ恒常性の調節剤、例えば、Ａβ恒常性の免疫療法調節剤のうちの１つまたは複数の投与を含み得る。Ａβ調節療法は、Ｅ２６０９；ＭＫ−８９３１；ＬＹ２８８６７２１；ＡＺＤ３２９３；セマガセスタット（ｓｅｍａｇａｃｅｓｔａｔ）（ＬＹ−４５０１３９）；アバガセスタット（ａｖａｇａｃｅｓｔａｔ）（ＢＭＳ−７０８１６３）；ソラネズマブ；クレネズマブ；バピネズマブ；ＢＩＩＢ０３７；ＣＡＤ１０６；８Ｆ５もしくは５５９８、または例えばその教示全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂａｒｇｈｏｒｎら、「Ｇｌｏｂｕｌａｒ  ａｍｙｌｏｉｄ  β−ｐｅｐｔｉｄｅ１−４２  ｏｌｉｇｏｍｅｒ−−ａ  ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ」  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．、２００５、９５、８３４〜８４７によって記載されるＡβグロブロマー（ｇｌｏｂｕｌｏｍｅｒ）に対して生じる他の抗体；ＡＣＣ−００１；Ｖ９５０；Ａｆｆｉｔｒｏｐｅ  ＡＤ０２などのうちの１つまたは複数の投与を含み得る。
【０１２２】
ＰＤについては、例えば、ＰＭＤ調節療法が、ＰＤ０１Ａ＋またはＰＤ０３Ａ＋などの能動免疫、ＰＲＸ００２などの受動免疫などを含み得る。ＰＭＤ調節療法はまた、ＧＤＮＦ（グリア細胞株由来神経栄養因子）、イノシン、カルシウムチャネル遮断薬、具体的にはイスラジピン、ニコチンおよびニコチン受容体アゴニストなどのＣａｖ１．３チャネル遮断薬、ＧＭ−ＣＳＦ、グルタチオン、ピオグリタゾンなどのＰＰＡＲ−γアゴニスト、およびＤ２／Ｄ３ドーパミン受容体アゴニストを含むドーパミン受容体アゴニスト、およびＬＲＲＫ２（ロイシンリッチリピートキナーゼ２）阻害剤による治療を含み得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、ＰＭＣＡを使用して、患者からの試料でミスフォールドタンパク質の量が測定され得る。ミスフォールドタンパク質測定値が高い患者を、ＰＭＤの疾患修飾療法で治療することができる。正常なミスフォールドタンパク質測定値の患者は治療されない場合がある。疾患修飾療法に対する患者の反応を追跡することができる。例えば、治療的介入の開始時に患者試料でミスフォールドタンパク質レベルを測定することができる。臨床的に意味のある期間の患者の治療後、別の患者試料を得て、ミスフォールドタンパク質レベルを測定することができる。治療的介入後にミスフォールドタンパク質レベルの変化を示す患者は、治療に反応するとみなすことができる。変化しないミスフォールドタンパク質レベルを示す患者は、非反応性とみなすことができる。この方法は、ＰＭＣＡ反応を妨害し得る構成要素を含有する患者試料中のミスフォールドタンパク質凝集体の検出を含み得る。
【０１２４】
種々の実施形態では、この方法が、試料および第１のインキュベーション混合物のうちの１つまたは複数で第１のミスフォールドタンパク質凝集体を選択的に濃縮するステップを含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体を選択的に濃縮することは、第１のインキュベーション混合物を形成する前に試料を前処理することを含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体を選択的に濃縮することは、第１のインキュベーション混合物をインキュベートする前に第１のインキュベーション混合物を前処理することを含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体を選択的に濃縮することは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体に結合することができる１つまたは複数の抗体を接触させて捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体を形成することを含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体に結合することができる１つまたは複数の抗体は、第１のミスフォールドタンパク質凝集体のアミノ酸エピトープ配列に特異的な抗体および第１のミスフォールドタンパク質凝集体のコンフォメーションに特異的な抗体のうちの１つまたは複数を含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体のコンフォメーションに特異的な抗体は、タウオパチーに特異的なミスフォールドタウ凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的であり得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体に結合することができる１つまたは複数の１つまたは複数の抗体は、固相に結合され得る。固相は、磁気ビーズおよびマルチウェルプレートのうちの１つまたは複数を含み得る。
【０１２５】
例えば、ＥＬＩＳＡプレートを、患者試料から第１のミスフォールドタンパク質凝集体を捕捉するために使用される抗体でコーティングすることができる。抗体でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを患者試料とインキュベートし、未結合材料を洗い流し、ＰＭＣＡ反応を実施することができる。抗体をビーズに結合させることもできる。ビーズを患者試料とインキュベートし、これを使用して第１のミスフォールドタンパク質凝集体−抗体複合体を患者試料の残りから分離することができる。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、試料を第１の基質タンパク質と接触させて第１のインキュベーション混合物を形成することが、モル過剰の第１の基質タンパク質を捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体を含む試料に接触させることを含み得る。モル過剰の第１の基質タンパク質は、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれるタンパク質モノマーの総モル量より大きくなり得る。第１のインキュベーション混合物のインキュベーションは、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こして、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効であり得る。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、第１のインキュベーション混合物を破壊することが、物理的に破壊することおよび／または熱的に破壊することを含み得る。例えば、破壊は、超音波処理、攪拌、振盪、凍結／解凍、レーザー照射、オートクレーブインキュベーション、高圧および均質化のうちの１つまたは複数を含み得る。第１のインキュベーション混合物の破壊は、サイクリック攪拌を含み得る。サイクリック攪拌は、約５０毎分回転数（ＲＰＭ）〜１００００ＲＰＭ、約２００ＲＰＭ〜約２０００ＲＰＭ、および約５００ＲＰＭのうちの１つまたは複数で行われ得る。第１のインキュベーション混合物の破壊は、約５秒〜約１０分、約３０秒〜約１分、約４５秒〜約１分、および約１分のうちの１つまたは複数で各インキュベーションサイクルで行われ得る。第１のインキュベーション混合物のインキュベーションは、約１分〜約５時間、約５分〜約５時間、約１０分〜約２時間、約１５分〜約１時間、および約２５分〜約４５分間のうちの１つまたは複数で、各インキュベーションサイクルで独立に行われ得る。各インキュベーションサイクルは、約１分〜約５時間のインキュベーションと約５秒〜約１０分間の破壊；約５分〜約５時間インキュベートと約５秒〜約１０分間の破壊；約１０分〜約２時間インキュベーションと約３０秒〜約１分間の破壊；約１５分〜約１時間のインキュベーションと約４５秒〜約１分間の破壊；約２５分〜約４５分間のインキュベーションと約４５秒〜約９０秒間の破壊；約２９分間および約１分間のインキュベーション；および約１分間のインキュベーションと約１分間の破壊のうちの１つまたは複数で、第１のインキュベーション混合物を独立にインキュベートおよび破壊することを含み得る。インキュベーションサイクルを行うことは、約２回〜約１０００回、約５回〜約５００回、約５０回〜約５００回、および約１５０回〜約２５０回のうちの１つまたは複数、繰り返され得る。
【０１２８】
種々の実施形態では、試料を第１の基質タンパク質と接触させて第１のインキュベーション混合物を形成することが、生理学的条件下で行われ得る。この方法は、試料をモル過剰の第１の基質タンパク質と接触させて第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。モル過剰は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれるタンパク質モノマーの総モル量より大きくてもよい。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、この方法が、試料をチオフラビン、例えばチオフラビンＴまたはチオフラビンＳ、およびモル過剰の第１の基質タンパク質と接触させて、第１のインキュベーション混合物を形成するステップを含み得る。モル過剰は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれる第１の基質タンパク質の量より大きくてもよい。この方法は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第１のインキュベーション混合物を振盪することを含み得る。この方法は、第１のミスフォールドタンパク質凝集体に対応するチオフラビンの蛍光を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在を決定するステップを含み得る。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、第１の基質タンパク質が、化学合成、組換え産生、および非組換え生体試料からの抽出のうちの１つによって産生され得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体は、可溶性の第１のミスフォールドタンパク質凝集体および不溶性の第１のミスフォールドタンパク質凝集体のうちの１つまたは複数を含み得る。第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、可溶性部分および不溶性部分のうちの１つまたは複数を含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体は、実質的に可溶性の第１のミスフォールドタンパク質凝集体であり得る。いくつかの実施形態では、この方法が、試料がタウ原線維を除外することを提供し得る。例えば、試料を濾過または遠心分離してタウ原線維を除去することができる。
【０１３１】
種々の実施形態では、第２の基質タンパク質が、第１の基質タンパク質とは異なり得る。第２の基質タンパク質は、アミロイドベータ（Ａβ）、αシヌクレイン、３Ｒタウおよび４Ｒタウのうちの１つを含み得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウを含み得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、この方法が、少なくとも第２のＰＭＣＡ手順を実施して、試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップを含み得る。第２のＰＭＣＡ手順は、試料の第２の部分を第２の基質タンパク質と接触させることによって第２のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第２の基質タンパク質は、インビボで病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受けて、第２のミスフォールドタンパク質凝集体を形成し得る。第２のＰＭＣＡ手順は、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第２の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第２のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第２のインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第２のＰＭＣＡ手順は、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第２のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。第２のミスフォールドタンパク質凝集体は、第２の基質タンパク質を含み得る。第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、第２の基質タンパク質を含み得る。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、タウオパチーが対象に存在し得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在に従って、対象におけるタウオパチーの素性を特徴付けるステップを含み得る。この方法は、試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるタウオパチーの素性を特徴付けるステップを含み得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、この方法が、タウオパチーが、３Ｒタウタンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を主に特徴としないことを提供し得る。例えば、タウオパチーは、約１：９９、５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：５および９９：１のうちの１つ、または前記の比の任意の２つの間の範囲、例えば１：９９〜９９：１のミスフォールドおよび／または凝集３Ｒタウタンパク質に対する比のミスフォールドおよび／または凝集４Ｒタウタンパク質を少なくとも部分的に特徴とし得る。
【０１３５】
種々の実施形態では、この方法が、試料をチオフラビン、例えばチオフラビンＳまたはチオフラビンＴ、およびモル過剰の第１の基質タンパク質と接触させて、第１のインキュベーション混合物を形成するステップを含み得る。モル過剰は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれるタンパク質モノマーの量より大きくてもよい。この方法は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質の少なくとも一部のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第１のインキュベーション混合物を振盪することを含み得る。この方法は、第１のミスフォールドタンパク質凝集体に対応するチオフラビンの蛍光を検出することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップを含み得る。
【０１３６】
この方法のいくつかの実施形態では、試料から第１のミスフォールドタンパク質凝集体を捕捉して、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体を形成することが、第１のミスフォールドタンパク質凝集体に特異的な１つまたは複数の抗体を使用して行われ得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体に特異的な１つまたは複数の抗体は、第１のミスフォールドタンパク質凝集体のアミノ酸エピトープ配列に特異的な抗体および第１のミスフォールドタンパク質凝集体のコンフォメーションに特異的な抗体のうちの１つまたは複数を含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体のコンフォメーションに特異的な抗体は、タウオパチーに特異的な第１のミスフォールドタンパク質凝集体のコンフォメーションエピトープに選択的であり得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体のコンフォメーションに特異的な抗体は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、嗜銀顆粒病（ＡｇＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）およびパンチドランカー（ＤＰ）のうちの１つに対応し得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体に特異的な１つまたは複数の抗体は、固相に結合され得る。固相は、磁気ビーズおよびマルチウェルプレートのうちの１つまたは複数を含み得る。試料を第１の基質タンパク質と接触させて第１のインキュベーション混合物を形成することは、モル過剰の第１の基質タンパク質を試料に接触させることを含み得る。モル過剰の第１の基質タンパク質は、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体に含まれるタンパク質モノマーの総モル量より大きくなり得る。第１のインキュベーション混合物のインキュベーションは、捕捉された第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こして、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効であり得る。第１の基質タンパク質は４Ｒタウタンパク質を含み得る。
【０１３７】
種々の実施形態では、この方法が、少なくとも第２のＰＭＣＡ手順を実施して、試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するステップを含み得る。第２のＰＭＣＡ手順は、試料の第２の部分を第２の基質タンパク質と接触させることによって第２のインキュベーション混合物を形成することを含み、第２の基質タンパク質は病理学的ミスフォールディングおよび／または凝集を受け得る。第２のＰＭＣＡ手順は、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な条件下でインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第２の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第２のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効な第２のインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第２のＰＭＣＡ手順は、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第２のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。タウオパチーは対象に存在し得る。この方法は、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在；および試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象におけるタウオパチーの素性を特徴付けるステップを含み得る：第２のミスフォールドタンパク質凝集体は、第２の基質タンパク質を含み得る。第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体は、第２の基質タンパク質を含み得る。第２の基質タンパク質は、第１の基質タンパク質とは異なり得る。第２の基質タンパク質は、アミロイドベータ（Ａβ）、αシヌクレインおよび３Ｒタウのうちの１つを含み得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、この方法が、それぞれＡβ、αシヌクレインおよび３Ｒタウのうちの１つに対応する１つまたは複数のミスフォールド凝集体の少なくとも１つのサインを分析することによって、各タウオパチーを１つまたは複数の追加のタウオパチーから区別するステップを含み得る。各サインは、１つまたは複数のミスフォールド凝集体のいずれかのコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用するアッセイ；１つまたは複数のミスフォールド凝集体のいずれかのコンフォメーションエピトープに選択的な抗体を使用するアッセイ；遅滞期、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度のうちの１つまたは複数を含む、１つまたは複数のミスフォールド凝集体の１つまたは複数のＰＭＣＡ動態パラメータ；１つまたは複数のミスフォールド凝集体のいずれかに選択的な指示薬；および１つまたは複数のミスフォールド凝集体のいずれかに特徴的なスペクトルのうちの１つまたは複数に対応し得る。
【０１３９】
さらに、例えば、特異抗体を、第２のミスフォールドタンパク質凝集体に使用してもよい。例えば、ＡＤの場合、アミロイド抗体が、６Ｅ１０、４Ｇ８、８２Ｅ１、Ａ１１、Ｘ−４０／４２、１６ＡＤＶなどのうちの１つまたは複数を含み得る。このような抗体は、以下のように得ることができる：６Ｅ１０および４Ｇ８（Ｃｏｖａｎｃｅ、Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ、ＮＪ）；８２Ｅ１（ＩＢＬ  Ａｍｅｒｉｃａ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）；Ａ１１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）；Ｘ−４０／４２（ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ，  Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）；および１６ＡＤＶ（Ａｃｕｍｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ）。
【０１４０】
さらに、例えば、ＰＤの場合、１つまたは複数のシヌクレイン特異抗体が、α／β−シヌクレインＮ−１９；α−シヌクレインＣ−２０−Ｒ；α−シヌクレイン２１１；α−シヌクレインＳｙｎ  ２０４；α−シヌクレイン２Ｂ２Ｄ１；α−シヌクレインＬＢ  ５０９；α−シヌクレインＳＰＭ４５１；α−シヌクレイン３Ｇ２８２；α−シヌクレイン３Ｈ２８９７；α／β−シヌクレインＳｙｎ  ２０２；α／β−シヌクレイン３Ｂ６；α／β／γ−シヌクレインＦＬ−１４０などのうちの１つまたは複数を含むＰＤ特異抗体を含み得る。いくつかの例では、１つまたは複数の特異抗体が、α／β−シヌクレインＮ−１９；α−シヌクレインＣ−２０−Ｒ；α−シヌクレイン２１１；α−シヌクレインＳｙｎ  ２０４などのうちの１つまたは複数を含み得る。このような抗体は、以下のように得ることができる：α／β−シヌクレインＮ−１９（カタログ番号ＳＣ−７０１２、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）；α−シヌクレインＣ−２０−Ｒ（ＳＣ−７０１１−Ｒ）；α−シヌクレイン２１１（ＳＣ−１２７６７）；α−シヌクレインＳｙｎ  ２０４（ＳＣ−３２２８０）；α−シヌクレイン２Ｂ２Ｄ１（ＳＣ−５３９５５）；α−シヌクレインＬＢ  ５０９（ＳＣ−５８４８０）；α−シヌクレインＳＰＭ４５１（ＳＣ−５２９７９）；α−シヌクレイン３Ｇ２８２（ＳＣ−６９９７８）；α−シヌクレイン３Ｈ２８９７（ＳＣ−６９９７７）；α／β−シヌクレインＳｙｎ  ２０２（ＳＣ−３２２８１）；α／β−シヌクレイン３Ｂ６（ＳＣ−６９６９９）；またはα／β／γ−シヌクレインＦＬ−１４０（ＳＣ−１０７１７）。
【０１４１】
種々の実施形態では、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するキットが提供される。キットは、４Ｒタウを含み得る第１の基質タンパク質を含み得る。キットは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬を含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体は、第１の基質タンパク質を含み得る。第１のミスフォールドタンパク質凝集体は、タウオパチーに対応し得る。キットは緩衝液を含み得る。キットはヘパリンを含み得る。キットは塩を含み得る。キットは説明書を含み得る。説明書は、使用者に試料を得るよう指示し得る。説明書は、使用者に少なくとも第１のＰＭＣＡ手順を実施するよう指示し得る。第１のＰＭＣＡ手順は、試料の第１の部分を第１の基質タンパク質、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬、緩衝液、ヘパリン、および塩と接触させることによって、第１のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第１のインキュベーション混合物は、約２０μＭ未満の第１の基質タンパク質；約７５μＭ未満のヘパリン；約１９０ｍＭ未満のＮａＣｌとしての塩；および約９．５μＭ未満のチオフラビンＴとしての第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬のうちの１つまたは複数の濃度で形成され得る。第１のＰＭＣＡ手順は、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第１の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第１のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。説明書は、使用者に、第１のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬に従って、第１の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第１のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定するよう指示し得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、キットが、本明細書に記載される方法の任意の要素を含み得る。さらに、キットは、使用者に本明細書に記載される方法のステップのいずれかを行うよう指示する説明書を含み得る。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、例えば、説明書が、使用者に対象から試料を得るよう指示することを含み得る。試料は、生物流体、生体材料、均質化組織および細胞溶解物のうちの１つまたは複数を含み得る。使用者に試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、対象のタウオパチーを決定または診断するよう指示する説明書。
【０１４４】
種々の実施形態では、キットが、第２の基質タンパク質と、第２のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬とを含み得る。第２のミスフォールドタンパク質凝集体は、第２の基質タンパク質を含み得る。第２の基質タンパク質は、第１の基質タンパク質とは異なり得る。第２の基質タンパク質は、アミロイドベータ（Ａβ）、αシヌクレイン、３Ｒタウおよび４Ｒタウのうちの１つを含み得る。説明書は、使用者に少なくとも第２のＰＭＣＡ手順を実施するよう指示し得る。第２のＰＭＣＡ手順は、試料の第２の部分を第２の基質タンパク質および第２のミスフォールドタンパク質凝集体の指示薬と接触させることによって第２のインキュベーション混合物を形成することを含み得る。第２のＰＭＣＡ手順は、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーションサイクルを２回以上行うことを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在下で第２の基質タンパク質のミスフォールディングおよび／または凝集を引き起こすのに有効な第２のインキュベーション混合物をインキュベートすることを含み得る。各インキュベーションサイクルは、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体を形成するのに有効なインキュベーション混合物を破壊することを含み得る。第２のＰＭＣＡ手順は、第２の増幅されたミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在について第２のインキュベーション混合物を分析することによって、試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在を決定することを含み得る。説明書はまた、使用者に試料中の第１のミスフォールドタンパク質凝集体の存在；および試料中の第２のミスフォールドタンパク質凝集体の存在または非存在に従って、タウオパチーの素性について試料を特徴付けるよう指示し得る。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、キットがＰＭＣＡ装置を含み得る。ＰＭＣＡ装置は、多層マイクロタイタープレート；マイクロ流体プレート；振盪装置；分光計；およびインキュベーターのうちの１つまたは複数を含み得る。装置は、１つまたは複数の個々のプレートまたは装置として、組み合わせ装置などとして含まれ得る。例えば、振盪マイクロプレートリーダーを使用して、インキュベーションと振盪のサイクルを実施し、実験経過中にＴｈＴ蛍光発光を自動的に測定することができる（例えば、ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ、ＢＭＧ  ＬＡＢＴＥＣＨ  Ｉｎｃ．、Ｃａｒｙ、ＮＣ）。
【０１４６】
第１のミスフォールドタンパク質凝集体のコンフォメーションに特異的な抗体は、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性症（ＣＢＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、嗜銀顆粒病（ＡｇＤ）、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）およびパンチドランカー（ＤＰ）のうちの１つに対応し得る。説明書は、第１のミスフォールドタンパク質凝集体のコンフォメーションに特異的な抗体を使用した結合アッセイに従って、対象におけるＡＤ、ＰＤ、ＰＳＰ、ＦＴＤ、ＣＢＤ、ＭＣＩ、ＡｇＤ、ＴＢＩ、ＣＴＥおよびＤＰのうちの１つの存在または非存在を決定することを含み得る。
【実施例】
【０１４７】
例１：合成Ａβオリゴマーの調製
Ａβ１−４２は、エール大学のＷ．  Ｋｅｃｋ施設で固相Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル化学を使用して合成し、逆相ＨＰＬＣによって精製した。最終生成物を凍結乾燥し、アミノ酸分析および質量分析によって特徴付けた。凝集したミスフォールドＡβタンパク質を含まないストック溶液を調製するために、凝集物を高ｐＨで溶解し、３０ｋＤａカットオフフィルタを通して濾過して、残っている凝集体を除去した。様々な種類の凝集体を調製するために、種なしのＡβ１−４２の溶液（１０μＭ）を、攪拌しながら０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で、２５℃で様々な時間インキュベートした。この調製物は、Ａβモノマーの混合物、ならびに原線維、前原線維および可溶性ミスフォールドＡβタンパク質を、インキュベーション時間に応じて異なる割合で含有していた。凝集の程度を、ＴｈＴ蛍光発光、ネガティブ染色後の電子顕微鏡法、Ａ１１コンフォメーション抗体によるドットブロット試験、および４Ｇ８抗Ａβ抗体を使用したゲル電気泳動後のウエスタンブロットによって特徴付けた。
【０１４８】
原線維形成の過程中に、異なるサイズのＡβオリゴマーの混合物が生成された。具体的には、モノマー合成Ａβ１−４２（１０μＭ）を攪拌しながら２５℃でインキュベートすることによって、可溶性ミスフォールドＡβタンパク質を調製した。５時間のインキュベーション後、ネガティブ染色後の電子顕微鏡法により、多くの外観が球状の多量の可溶性ミスフォールドＡβタンパク質が観察され、少量の前原線維および原線維しか観察されなかった。１０時間では、大部分前原線維が存在し、２４時間では多量の長い原線維が観察される。図１Ａは、０時間、５時間、１０時間および２４時間のインキュベーションで撮影された電子顕微鏡写真を示す。
【０１４９】
Ｋａｙｅｄら「Ｃｏｍｍｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ａｍｙｌｏｉｄ  ｏｌｉｇｏｍｅｒｓ  ｉｍｐｌｉｅｓ  ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００３、３００、４８６〜４８９の方法に従って、Ａ１１抗オリゴマー特異的抗体を使用して、可溶性ミスフォールドＡβタンパク質凝集体が陽性であると試験した。さらなるインキュベーション後、１０時間および２４時間で、前原線維および原線維構造が観察された。凝集体のサイズを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分離後、定義された孔径のフィルタを介した濾過およびウエスタンブロット法によって決定した。５時間のインキュベーションによって形成された可溶性ミスフォールドＡβタンパク質は、３０ｋＤａカットオフのフィルタに保持され、１０００ｋＤａカットオフフィルタを通過した。図１Ｂは、可溶性ミスフォールドＡβタンパク質凝集体のウエスタンブロットである。この可溶性ミスフォールドＡβタンパク質の電気泳動分離により、材料の大部分が約１７０ｋＤａのＳＤＳ耐性凝集体として移動し、１７ｋＤａにマイナーバンドが存在することが示された。
【０１５０】
例２：Ａβ−ＰＭＣＡは合成Ａβオリゴマーを検出する
例２Ａ．Ａβ凝集の種まきを、様々な量の合成可溶性ミスフォールドＡβタンパク質を用いてまたは用いないで（対照（Ａβオリゴマーなし）；または合成可溶性ミスフォールドＡβタンパク質３、８０、３００および８４００フェムトモル濃度）、チオフラビンＴの存在下で、種なしＡβ１−４２の溶液をインキュベーションすることによって試験した。Ａβ−ＰＭＣＡの一般的な手順：０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４（総体積２００μＬ）中２μＭ凝集体を含まないＡβ１−４２の溶液を不透明な９６ウェルプレートに入れ、単独でまたは合成Ａβ凝集体（例１に記載されるように５時間にわたるインキュベーションによって調製）もしくは４０μＬのＣＳＦアリコートの存在下でインキュベートした。試料を５μＭチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の存在下でインキュベートし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを使用して、２２℃の一定温度でサイクリック攪拌（５００ｒｐｍで１分間、引き続いて振盪なしで２９分間）に供した。種々の時点で、プレート分光蛍光光度計を使用して４３５ｎｍで励起した後、４８５ｎｍでプレートのＴｈＴ蛍光を測定した。図２Ａは、指示されるフェムトモル濃度の合成可溶性ミスフォールドＡβタンパク質種を使用して、チオフラビンＴ蛍光によって測定されるアミロイド形成（サイクリック増幅なし）対時間のグラフである。ペプチド濃度、温度および緩衝液のｐＨを監視して、遅滞期の程度および実験間の再現性を制御した。これらの条件下では、実験を実施した時間（１２５時間）中に自発的なＡβ凝集は検出されなかった。モノマーＡβ１−４２タンパク質の凝集が、０．３〜８．４ｆｍｏｌの例１の合成可溶性ミスフォールドＡβタンパク質の存在下で観察された。
【０１５１】
例２Ｂ：インキュベーションと物理的破壊の段階を組み合わせた増幅サイクルを使用した。図２Ａと同じ試料をサイクリック攪拌しながらインキュベートした（５００ｒｐｍで１分間攪拌、引き続いて振盪なしで２９分間）。プレート分光蛍光光度計（励起：４３５；発光：４８５ｎｍ）を使用して、アミロイド原線維に結合するチオフラビンＴ（ＴｈＴ）によって凝集を経時的に測定した。グラフは、３連の平均および標準誤差を示す。１７０ｋＤａの平均分子量を想定して、Ａβオリゴマーの濃度を推定した。図２Ｂは、種々の濃度の例１の合成可溶性ミスフォールドＡβタンパク質についての時間の関数としてのＴｈＴ蛍光によって測定された増幅サイクル加速アミロイド形成を示すグラフである。これらの条件下で、８４００、３００、８０および３ｆｍｏｌの合成可溶性ミスフォールドＡβタンパク質によって誘導されるモノマーＡβ１−４２タンパク質の凝集は、明らかに速く、合成可溶性ミスフォールドＡβタンパク質の非存在下で観察されるものと容易に区別された。この結果は、これらの条件下での検出限界が、所与の試料中３ｆｍｏｌ以下の可溶性ミスフォールドＡβタンパク質であることを示している。
【０１５２】
例３：Ａβ−ＰＭＣＡは、ＡＤ患者の脳脊髄液中のミスフォールドＡβを検出する
ＣＳＦのアリコートを、５０人のＡＤ患者、３９人の非変性神経疾患（ＮＮＤ）に罹患した認知正常個体、および３７人の他の形態の認知症（ＮＡＮＤ）を含む非ＡＤ神経変性疾患に罹患した患者から得た。試験ＣＳＦ試料を、ＤＳＭ−ＩＶおよびＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＡガイドライン（ＭｃＫｈａｎｎら、１９８４）によって定義される可能性の高いＡＤと診断された５０人の患者から得て、定期的な健康診断、神経学的評価、神経心理学的評価、磁気共鳴画像法、ならびにＡβ１−４２のＣＳＦレベル、総タウおよびホスホ−タウの測定を含む種々の試験を使用して決定した。試料収集時のＡＤ患者の平均年齢は７１．０±８．１歳（範囲４９〜８４歳）であった。対照ＣＳＦ試料を、１２症例の正常圧水頭症、７人の末梢神経障害患者、７人の多様な形態の脳腫瘍、２人のＩＣＴＵＳ、１人の重度の頭痛、３人の脳炎、１人の高血圧および６人の不明瞭な診断を含む非変性神経疾患（ＮＮＤ）に罹患した３９人の患者から得た。この群の患者からＣＳＦ試料を採取した平均年齢は６４．６±１４．７歳（範囲３１〜８３歳）であった。対照ＣＳＦ試料を、１０症例の前頭側頭型認知症（５症例の行動変形および５症例の言語変形）、６人のパーキンソン病患者（認知症を伴う４人および運動ニューロン疾患を伴う１人を含む）、６人の進行性核上性麻痺、６人の脊髄小脳失調症（１人は認知症を伴う）、４人の筋萎縮性側索硬化症、２人のハンチントン病、１人のＭＥＬＡＳ、１人のレビー小体病および１人の血管性認知症を含む非ＡＤ神経変性疾患（ＮＡＮＤ）に罹患した３７人の個体からも採取した。この群の試料収集時の平均年齢は６３．８±１１．１歳（範囲４１〜８０歳）であった。ＣＳＦ試料を、一晩絶食した後、無外傷性針でＬ４／Ｌ５またはＬ３／Ｌ４の隙間に腰椎穿刺した後、ポリプロピレンチューブに採取した。試料を４℃で３分間、３０００ｇで遠心分離し、分注し、分析まで−８０℃で保存した。ＣＳＦ細胞数、グルコースおよびタンパク質濃度を決定した。アルブミンを、比濁法によって測定した。血液脳関門および髄腔内ＩｇＧ産生の完全性を評価するために、アルブミン商（ＣＳＦアルブミン／血清アルブミン）Ｘ１０３およびＩｇＧ指数（ＣＳＦアルブミン／血清アルブミン）／（ＣＳＦ  ＩｇＧ／血清ＩｇＧ）を計算した。この試験は、ヘルシンキ宣言の規定に従って行われ、倫理委員会によって承認された。
【０１５３】
実験ならびに分析の最初の部分は盲検で行った。図３Ａは、ＡＤ、ＮＮＤおよびＮＡＮＤ群の５つの代表的な試料のＡβ凝集の平均動態を示す、ＴｈＴ蛍光標識の関数として測定されたアミロイド形成対時間のグラフである。
【０１５４】
結果は、ＡＤ患者のＣＳＦが、対照ＣＳＦと比較してＡβ凝集を有意に加速することを示している（Ｐ＜０．００１）。ヒトＣＳＦ試料の存在下でのＡβ凝集動態の差の有意性を、一元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてテューキーの多重比較検定によって分析した。有意水準をＰ＜０．０５に設定した。ＡＤと他の２つの群の試料との差は、Ｐ＜０．００１（＊＊＊）で極めて有意であった。
【０１５５】
図３Ｂは、ＡＤ、ＮＮＤおよびＮＡＮＤ群の試料についての遅滞期時間（時間）のグラフである。Ａβ凝集に対する個々の試料の効果を決定するために、対照緩衝液試料の減算後の４０任意単位よりも大きいＴｈＴ蛍光までの時間として定義される、遅滞期を推定した。この値は、対照緩衝液試料の読み取り値の約５倍に相当することを考慮して選択した。
【０１５６】
図３Ｃは、１８０回のＡβ−ＰＭＣＡサイクル、例えば９０時間のインキュベーション（Ｐ９０）後に得られたアミロイド形成の程度を示すグラフである。実験群間での遅滞期およびＰ９０の比較により、ＡＤと非変性神経疾患または非ＡＤ神経変性疾患の個体の対照試料との有意な差が明らかになる。さらに、凝集パラメータとＡＤ患者の年齢との間に相関は検出されず、これは、マーカーのレベルが患者年齢ではなく、患者ＣＳＦ中の凝集Ａβタンパク質に対応することを示している。
【０１５７】
図５、表１は、遅滞期数を使用して計算されたＡβ−ＰＭＣＡ試験の感度、特異性および予測値の推定値を示している。
【０１５８】
再現性を調べるために、Ａβ−ＰＭＣＡの基質として異なる試料、試薬およびＡβペプチドの新しいバッチを使用して、図３Ａ〜図３Ｃに示されるものと同様の実験を独立に行った。３００回のＡβ−ＰＭＣＡサイクル、例えば１５０時間のインキュベーション（Ｐ１５０）後に得られたアミロイド形成の程度を各患者で測定した。対照群は、他の神経変性疾患に罹患している人と神経学的に病気でない患者の両方を含む。各試料についてのデータは、２連チューブの平均を表す。統計学的差を、スチューデントｔ検定によって分析した。図６は、３００回のＡβ−ＰＭＣＡサイクル、例えば１５０時間のインキュベーション（Ｐ９０）後に得られた試料についての遅滞期時間（時間）のグラフである。
【０１５９】
試験の経過中、高濃度の合成オリゴマーを添加した後でさえも、第４の位置から来るＣＳＦ試料のセット全体が全く凝集しなかった。試料収集中の試薬汚染がアッセイを妨害したと予想される。
【０１６０】
異なる試料間の凝集動態の差を、遅滞期、Ａ５０およびＰ９０を含む種々の異なる動態パラメータの推定によって評価した。遅滞期は、緩衝液のみのバックグラウンド値の５倍を超えるＴｈＴ蛍光に到達するのに必要な時間として定義される。Ａ５０は、最大凝集の５０％に到達する時間に相当する。Ｐ９０は、９０時間での凝集の程度（ＴｈＴ蛍光として測定される）に相当する。感度、特異性および予測値を、ＭｅｄＣａｌｃソフトウェア（ＭｅｄＣａｌｃ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｏｓｔｅｎｄ、ベルギー）を使用して、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析によって決定されたカットオフ閾値で、このデータを使用して決定した。
【０１６１】
例４：ＣＳＦにおけるＡＤのＡβ−ＰＭＣＡ検出のためのミスフォールドＡβの閾値の決定
図５、表１の支持で、感度、特異性および予測値を、ＭｅｄＣａｌｃソフトウェア（バージョン１２．２．１．０、ＭｅｄＣａｌｃ、ベルギー）を使用して、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線分析によって決定されたカットオフ閾値で、遅滞期データを使用して決定した。図５の表１に示されるように、非変性神経疾患の年齢一致個体からなる対照群について、９０．０％の感度および８４．２％の特異性が推定された。対照的に、他の形態の認知症を含む他の神経変性疾患からの臨床的に関連性の高いＡＤの区別については、１００％の感度および９４．６％の特異性が推定された。Ａβ−ＰＭＣＡがＡＤを他の形態の神経変性疾患と区別するこの能力は臨床的に有意である。全ての対照個体を考慮した全体的な感度および特異性は、それぞれ９０％および９２％であった。
【０１６２】
ＡＤ患者と対照を区別するためのＡβ−ＰＭＣＡ試験の性能を評価するために、真陽性率（感度）を、様々なカットオフポイントについての偽陽性率（特異性）の関数としてプロットした。この分析のために、ＡＤ対ＮＡＮＤ（図４Ａ）、ＡＤ対ＮＮＤ（図４Ｂ）およびＡＤ対全ての対照試料（図４Ｃ）についての遅滞期値を使用した。ＡＤとＮＡＮＤ、ＮＮＤおよび全ての対照との比較について、曲線下面積として推定される試験の性能は、それぞれ０．９９６±０．００３３、０．９５±０．０２０および０．９７±０．０１１であった。ＭｅｄＣａｌｃ  ＲＯＣ曲線分析ソフトウェア（バージョン１２．２．１．０）を使用して統計分析を行ったところ、結果は、この試験がＰ＜０．０００１でＡＤを対照と区別することができることを示した。異なるセットの群比較について最も信頼性の高いカットオフポイントを推定するために、各カットオフ値について感度（青線）および特異性（赤線）をプロットした（図４Ｄ）。グラフは、ＡＤ対全ての対照試料（ＮＡＮＤおよびＮＮＤ群を含む）についての曲線および９５％信頼区間を示す。これらのカットオフ値を使用して、図５、表１の感度、特異性および予測値を推定した。
【０１６３】
例５：Ａβ−オリゴマー免疫枯渇は、ヒト脳脊髄液のＡβ種を除去し、Ａβ−ＰＭＣＡがＡＤ  ＣＳＦ中の可溶性ミスフォールドＡβタンパク質を検出することを確認する
免疫枯渇実験を実施して、Ａβ−ＰＭＣＡがＣＳＦ中に存在する可溶性ミスフォールドＡβタンパク質に関連する種活性を検出することを確認した。可溶性ミスフォールドＡβタンパク質の効率的な免疫枯渇の方法論を、合成的に調製された可溶性ミスフォールドＡβタンパク質を使用することによって最初に最適化した。免疫枯渇を、Ａβ（４Ｇ８）およびコンフォメーション（Ａ１１）抗体の配列を特異的に認識する抗体の混合物とコンジュゲートしたダイナビーズとのインキュベーションによって実施した。図７Ａは、ヒトＣＳＦに添加された合成的に調製されたＡβオリゴマーを使用した免疫枯渇の結果を示すウエスタンブロットである。可溶性ミスフォールドＡβタンパク質は、この免疫枯渇によって効率的に除去された。
【０１６４】
図７Ａおよび図７Ｂは、チオフラビンＴ蛍光によって測定されるアミロイド形成対時間のグラフであり、ＡＤ  ＣＳＦにおける種活性が可溶性ミスフォールドＡβタンパク質免疫枯渇によって除去されることを実証している。４Ｇ８およびＡ１１抗体による免疫枯渇の前後のＡＤ  ＣＳＦの試料を使用して、Ａβ−ＰＭＣＡアッセイでＡβ凝集を種まきした。３つのＡＤ  ＣＳＦに免疫枯渇を適用した。図７Ｂは、対照および免疫枯渇ＣＳＦ試料の動態を示すグラフである。図７Ｂは、免疫枯渇ＡＤ  ＣＳＦについて、Ａβ−ＰＭＣＡ反応におけるＡβ凝集の動態が対照ＣＳＦ試料で観察されたものと同等であり、共に免疫枯渇前のＡＤ  ＣＳＦで観察された凝集と有意に異なっていたことを示している。図７Ｃは、Ａ１１コンフォメーション抗体のみで枯渇した、対照および免疫枯渇ＣＳＦ試料の動態、およびＡβ−ＰＭＣＡアッセイによって監視した凝集を示すグラフである。図７Ｃは、ミスドールドＡβを特異的に認識するＡ１１コンフォメーション抗体を使用して免疫枯渇したＡＤ  ＣＳＦを使用して得られた同様の結果を示す。これらの結果は、Ａβ−ＰＭＣＡがＡＤ  ＣＳＦ中の可溶性ミスフォールドβタンパク質を検出することを裏付けている。
【０１６５】
例６：固相免疫捕捉
図８Ａおよび図８Ｂは、血漿などの複雑な試料から可溶性ミスフォールドＡβタンパク質を捕捉するために使用される２つの固相法の概略図である。戦略１は、ＥＬＩＳＡプレート上の固相に結合した特異抗体で事前にコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用した。プレートを洗浄した後、同じプレートでＡβ−ＰＭＣＡ反応を行った。戦略２は、特異抗体でコーティングされた固相として磁気ビーズを使用した。このアプローチにより、試料が濃縮された。
【０１６６】
例７：免疫捕捉の特異性
図９は、特異抗体がＡβオリゴマーを捕捉する能力を示す表２を示す。上のパネルは、この試験で使用した多様な配列抗体のＡβタンパク質上のエピトープ認識部位の概略図を示す。図９の表２は、様々な配列またはコンフォメーション抗体がＡβオリゴマーを捕捉する効率を示している。オリゴマーを捕捉する能力を、健康なヒト血漿中の合成Ａβオリゴマーを添加し、Ａβ−ＰＭＣＡで検出することによって測定した。記号は、様々な抗体を使用した検出限界以下であることを示している：＜１２ｆｍｏｌ（＋＋＋）；１０〜１００ｆｍｏｌ（＋＋）；＞１ｐｍｏｌ（＋）および捕捉試薬なしの場合よりも有意に高くない（−）。
【０１６７】
例８：ヒト血漿に添加されたＡβオリゴマーの検出
図１０は、ヒト血漿に添加された可溶性ミスフォールドＡβタンパク質の検出を示す、チオフラビンＴ蛍光によって測定されるアミロイド形成対時間のグラフである。プロテインＧで事前にコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを、抗コンフォメーション抗体（Ａｃｕｍｅｎ製の１６ＡＤＶ）でコーティングした。その後、プレートを、ヒト血漿（１００μｌ）自体（対照）と共に、または様々な濃度の合成可溶性ミスフォールドＡβタンパク質を添加してインキュベートした。インキュベーション後、プレートをＡβ４０モノマー（２μＭ）およびＴｈＴ（５μＭ）の存在下でＡβ−ＰＭＣＡ（２９分間のインキュベーションおよび３０秒間の振盪）に供した。アミロイド形成を、チオフラビン蛍光によって測定した。図１０は、同様に機能する３つの異なる抗体を用いて行われたいくつかの実験を表す。
【０１６８】
例９：ＡＤ患者試料対対照からの可溶性ミスフォールドＡβの捕捉
図１１は、ＡＤ患者および対照の血漿試料におけるＡβ−ＰＭＣＡアッセイで５０％凝集に到達する時間を示すグラフである。ＡＤ、非ＡＤ神経変性疾患（ＮＡＤ）に罹患した患者および健康な対照の血漿試料を、抗Ａβ抗体（８２Ｅ１）コーティングビーズと共にインキュベートした。Ａβ−ＰＭＣＡを、例２に記載されるように行った。５０％凝集に到達するのに必要な時間を、各群の個々の患者で記録した。一元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてテューキーの事後検定によって差を分析した。このデータのＲＯＣ分析は、対照からのＡＤ患者の正しい識別について８２％の感度および１００％の特異性を示した。
【０１６９】
例１０：超音波処理および振盪は種々の検出方法で有効である
図１２は、凝集体を断片化するための手段として振盪の代わりに超音波処理を使用することによるＡβ凝集の増幅の結果を示すウエスタンブロットである。異なる量の合成Ａβオリゴマーの存在下で実験を行った。１０μｇ／ｍｌの種なしモノマーＡβ１−４２の試料を、単独で（１レーン）、または３００（２レーン）、３０（３レーン）および３（４レーン）ｆｍｏｌのミスフォールドＡβとインキュベートした。試料を、増幅せずに凍結した（増幅なし）、または９６回のＰＭＣＡサイクル（増幅）に供し、それぞれ３０分間のインキュベーション、引き続いて２０秒間の超音波処理を行った。試料をプロテイナーゼＫ（ＰＫ）で処理した後、抗Ａβ抗体を使用してウエスタンブロットによって、凝集Ａβを検出した。本発明者らの実験では、チオフラビンＴ蛍光を使用した検出は超音波処理と互換性がないが、物理的破壊方法としての振盪により非常にうまく機能することが観察された。図１２は、Ａβ凝集体の異なる検出方法、この場合はウエスタンブロット法を使用して、超音波処理が振盪と同様に機能することを示している。
【０１７０】
例１１：ＰＭＣＡ基質としてのモノマーＡβの産生
種なしモノマーＡβを、サイズ排除クロマトグラフィーによって得た。手短に言えば、ジメチルスルホキシド中に調製した１ｍｇ／ｍＬペプチド溶液のアリコートを、ｐＨ７．５の１０ｍＭリン酸ナトリウムにより０．５ｍＬ／分で溶出するＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５カラムを使用して分画した。２２０ｎｍのＵＶ吸収によってピークを検出する。Ａβのモノマー／ダイマーを含有する４〜１０ｋＤａ分子量に対応するピークを収集し、アミノ酸分析によって濃度を決定した。試料を−８０℃で凍結乾燥して保存した。
【０１７１】
例１２：Ａβの産生および精製
ｐＥＴ２８  ＧｒｏＥＳ−Ｕｂ−Ａβ４２プラスミドを保持する大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）細胞を、３７℃のルリアブロス（ＬＢ）で増殖させ、０．４ｍＭ  ＩＰＴＧで発現を誘導した。４時間後、細胞を回収し、溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  β−メルカプトエタノール）に溶解し、１８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。封入体を、６Ｍ尿素を含有する再懸濁緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１ｍＭ  ＤＴＴ）に再懸濁した。１８０００ｒｐｍで３０分間遠心分離することによって、不溶性タンパク質を除去した。ＧｒｏＥＳ−Ｕｂ−Ａβ４２融合タンパク質を含有する上清を回収する。融合タンパク質からＡβ４２を切断するために、融合タンパク質を再懸濁緩衝液で２倍希釈し、組換え脱ユビキチン化酵素（Ｕｓｐ２ｃｃ）１：１００酵素対基質モル比で、３７℃で２時間処理した。その後、試料をＣ１８カラム（２５ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｇｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ、米国）にロードした。Ａβ４２を、溶媒系緩衝液１（３０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ１０、２％アセトニトリル）および緩衝液２（７０％アセトニトリル）で、１０ｍＬ／分の流量で、緩衝液２の２０〜４０％線形勾配を使用して３５分間にわたって精製した。精製したＡβ４２を凍結乾燥し、使用するまで−８０℃で保存した。
【０１７２】
例１３：ＰＤ−ＰＭＣＡによるαＳ種の検出
例１３Ａ：様々な量の合成可溶性オリゴマーαＳタンパク質を用いてまたは用いないで、チオフラビンＴの存在下で、種なしαＳの溶液をインキュベートすることによって、αＳ凝集の種まきを試験した：対照（αＳオリゴマーなし）；または１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬの合成可溶性オリゴマーαＳタンパク質種。αＳ−ＰＭＣＡの一般的手順：ＰＢＳ、ｐＨ７．４中１００μｇ／ｍＬのαＳ種なしαＳ溶液（総体積２００μＬ）を、不透明な９６ウェルプレートに入れ、単独でまたは指示される濃度の合成αＳ凝集体もしくは４０μＬのＣＳＦアリコートの存在下でインキュベートした。試料を５μＭチオフラビンＴ（ＴｈＴ）の存在下でインキュベートし、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆサーモミキサーを使用して、２２℃の一定温度でサイクリック攪拌（５００ｒｐｍで１分間、引き続いて振盪なしで２９分間）に供した。種々の時点で、プレート分光蛍光光度計を使用して４３５ｎｍで励起した後、４８５ｎｍでプレートのＴｈＴ蛍光を測定した。図１３Ａは、指示される濃度の合成可溶性オリゴマーαＳタンパク質種を使用した、ＰＤ−ＰＭＣＡによるαＳ種の検出を示す、時間の関数としてのチオフラビンＴ蛍光のグラフである。ペプチド濃度、温度および緩衝液のｐＨを監視して、遅滞期の程度および実験間の再現性を制御した。１ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬおよび１μｇ／ｍＬ  αＳの合成可溶性オリゴマーαＳタンパク質種の存在下で、モノマーαＳタンパク質の凝集を観察した。
【０１７３】
例１３Ｂ：例１Ａの試料を使用して、添加されたαＳ種の量の関数としての５０％凝集に到達する時間を決定した。図１３Ｂは、添加されたαＳ種の量の関数としてプロットされる５０％凝集に到達する時間を示すグラフである。
【０１７４】
例１４：αＳ−ＰＭＣＡはＰＤ患者の脳脊髄液中のオリゴマーαＳを検出する
対照およびＰＤ患者のヒトＣＳＦ試料における種活性の検出を、ＰＤ−ＰＭＣＡによって実施した。ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の精製した種なしαシヌクレイン（１００μｇ／ｍＬ）を、ＰＤ、ＡＤまたは非神経変性神経疾患（ＮＮＤ）が確認されたヒト患者のＣＳＦの存在下で、５００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で凝集させた。プレート分光蛍光光度計を使用して４３５ｎｍで励起した後、４８５ｎｍでのチオフラビン蛍光によって凝集の拡大を監視した。
【０１７５】
ＣＳＦのアリコートは、ＰＤ患者、非変性神経疾患（ＮＮＤ）に罹患した認知正常個体、およびアルツハイマー病（ＡＤ）に罹患した患者から得た。試験ＣＳＦ試料を、ＤＳＭ−ＩＶによって定義される可能性の高いＰＤと診断された患者から得て、定期的な健康診断、神経学的評価、神経心理学的評価および磁気共鳴画像法を含む種々の試験を使用して決定した。ＣＳＦ試料を、一晩絶食した後、無外傷性針でＬ４／Ｌ５またはＬ３／Ｌ４の隙間に腰椎穿刺した後、ポリプロピレンチューブに採取した。試料を４℃で３分間、３０００ｇで遠心分離し、分注し、分析まで−８０℃で保存した。ＣＳＦ細胞数、グルコースおよびタンパク質濃度を決定した。アルブミンを、比濁法によって測定した。血液脳関門および髄腔内ＩｇＧ産生の完全性を評価するために、アルブミン商（ＣＳＦアルブミン／血清アルブミン）Ｘ１０３およびＩｇＧ指数（ＣＳＦアルブミン／血清アルブミン）／（ＣＳＦ  ＩｇＧ／血清ＩｇＧ）を計算した。この試験は、ヘルシンキ宣言の規定に従って行われ、倫理委員会によって承認された。
【０１７６】
実験ならびに分析の最初の部分は盲検で行った。図１４は、ＰＤ、ＡＤおよびＮＮＤ群の代表的な試料のαＳ凝集の平均動態を示す、ＴｈＴ蛍光標識の関数として測定されたαＳオリゴマー化対時間のグラフである。
【０１７７】
結果は、ＰＤ患者のＣＳＦが、対照ＣＳＦと比較してαＳ凝集を有意に加速することを示している（Ｐ＜０．００１）。ヒトＣＳＦ試料の存在下でのαＳ凝集動態の差の有意性を、一元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてテューキーの多重比較検定によって分析した。有意水準をＰ＜０．０５に設定した。ＰＤと他の２つの群の試料との差は、Ｐ＜０．００１（＊＊＊）で極めて有意であった。
【０１７８】
例１５：免疫捕捉の特異性
図１５は、様々な配列またはコンフォメーション抗体がαＳオリゴマーを捕捉する能力を示す表３を示す。オリゴマーを捕捉する能力を、健康なヒト血漿中の合成αＳオリゴマーを添加し、αＳ−ＰＭＣＡで検出することによって測定した。１列目は、試験した種々の抗体と対応する商業的供給源を示している。２列目は、この試験で使用した多様な配列抗体のαＳタンパク質上のエピトープ認識部位を列挙している。３列目は、特異抗体がαＳオリゴマーを捕捉する観察された能力を示している。記号は、様々な抗体を使用した検出限界以下であることを示している：＜１２ｆｍｏｌ（＋＋＋）；１０〜１００ｆｍｏｌ（＋＋）；＞１ｐｍｏｌ（＋）および捕捉試薬なしの場合よりも有意に高くない（−）。α／βシヌクレイン抗体Ｎ−１９（Ｎ末端エピトープ）およびα−シヌクレイン抗体Ｃ−２０−Ｒ（Ｃ末端エピトープ）が最良の結果を示し；α−シヌクレイン抗体２１１（エピトープ：アミノ酸１２１〜１２５）は非常に良い結果を示し；α−シヌクレイン抗体２０４（エピトープ：フラグメント１〜１３０）は良い結果を示し；１６ＡＤＶマウスＩｇＧ１（コンフォメーションエピトープ）は結果を示さなかった。
【０１７９】
例１６：固相免疫捕捉
図１６Ａおよび図１６Ｂは、血漿などの複雑な試料から可溶性ミスフォールドαＳタンパク質を捕捉するために使用される２つの固相法の概略図である。戦略１は、ＥＬＩＳＡプレート上の固相に結合した特異抗体で事前にコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを使用した。プレートを洗浄した後、同じプレートでαＳ−ＰＭＣＡ反応を行った。戦略２は、特異抗体でコーティングされた固相として磁気ビーズを使用した。このアプローチにより、試料が濃縮された。
【０１８０】
例１７：ヒト血漿に添加されたα−シヌクレインオリゴマーを検出するためのαＳ−ＰＭＣＡ
ヒト血漿からのα−シヌクレインオリゴマーの免疫沈降を、抗α−シヌクレイン抗体コーティングビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ）および、検出のためのチオフラビン−Ｔとともに種基質としてα−シヌクレインモノマーを使用した種凝集アッセイによって実施した。抗α−シヌクレインコーティングビーズ（１ｘ１０７ビーズ）を、α−シヌクレイン種を用いて（＋０．２μｇ種）およびα−シヌクレイン種を用いないで（−種）、ヒト血漿（５００μＬ）とインキュベートした。免疫沈降後、ビーズを２０μＬの反応緩衝液（１ＸＰＢＳ）に再懸濁し、９６ウェルプレートの各ウェルに１０μＬのビーズを添加した。α−シヌクレインモノマー（２００μｇ／ｍＬ）およびチオフラビンＴ（５μＭ）を添加して凝集アッセイを実施した。４３５ｎｍの励起および４８５ｎｍの発光を使用して蛍光光度計によって蛍光の増加を監視した。図１７Ａは、種を用いたおよび用いない血漿中のＮ−１９抗体による免疫沈降／凝集結果を示す。図１７Ｂは、種を用いたおよび用いない血漿中の２１１抗体による免疫沈降／凝集結果を示す。図１７Ｃは、種を用いたおよび用いない血漿中のＣ−２０抗体による免疫沈降／凝集結果を示す。
【０１８１】
例１８：αＳ−ＰＭＣＡは、高感度および特異性で、ＰＤおよび多系統萎縮症に罹患した患者の脳脊髄液中のオリゴマーαＳを検出する。
ＰＤおよび多系統萎縮症（ＭＳＡ）などの関連するα−シヌクレイノパチーの生化学的診断についてのαＳ−ＰＭＣＡの効率を試験するために、これらの疾患に罹患した多くの患者ならびに他の疾患に罹患した対照のＣＳＦで試験を実施した。図１８Ａ、図１８Ｂおよび図１８Ｃは、それぞれ、αＳ−ＰＭＣＡを使用した、対照ならびにＰＤおよびＭＳＡに罹患した患者のヒトＣＳＦ試料における種活性の検出を示す。緩衝液ＭＥＳ、ｐＨ  ６．０中の精製した種なしα−ヌクレイン（１００μｇ／ｍＬ）を、ヒト患者および対照のＣＳＦの存在下で、５００ｒｐｍで振盪しながら３７℃で凝集させた。プレート分光蛍光光度計を使用して４３５ｎｍで励起した後、４８５ｎｍでのチオフラビンＴ蛍光によって凝集の程度を監視した。
【０１８２】
試験ＣＳＦ試料を、ＤＳＭ−ＩＶによって定義される可能性の高いＰＤおよびＭＳＡと診断された患者から得て、定期的な健康診断、神経学的評価、神経心理学的評価および磁気共鳴画像法を含む種々の試験を使用して決定した。ＣＳＦ試料を、一晩絶食した後、無外傷性針でＬ４／Ｌ５またはＬ３／Ｌ４の隙間に腰椎穿刺した後、ポリプロピレンチューブに採取した。試料を４℃で３分間、３０００ｇで遠心分離し、分注し、分析まで−８０℃で保存した。ＣＳＦ細胞数、グルコースおよびタンパク質濃度を決定した。アルブミンを、比濁法によって測定した。この試験は、ヘルシンキ宣言の規定に従って行われ、倫理委員会によって承認された。
【０１８３】
実験ならびに分析の最初の部分は盲検で行った。図１８Ａ、図１８Ｂおよび図１８Ｃは、それぞれ対照ならびにＰＤおよびＭＳＡ群の２つの代表的な試料についてのαＳ凝集の平均動態を示す、ＴｈＴ蛍光標識の関数として測定されたαＳ凝集対時間のグラフである。
【０１８４】
結果は、ＰＤ患者のＣＳＦが、対照ＣＳＦと比較してαＳ凝集を有意に加速することを示している（Ｐ＜０．００１）。ヒトＣＳＦ試料の存在下でのαＳ凝集動態の差の有意性を、一元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてテューキーの多重比較検定によって分析した。有意水準をＰ＜０．０５に設定した。ＰＤと他の２つの群の試料との差は、Ｐ＜０．００１（＊＊＊）で極めて有意であった。
【０１８５】
２９個のＰＤまたはＭＳＡ試料と４１個の対照のセット全体の結果は、２９個のＰＤまたはＭＳＡ試料のうちの２６個が陽性であったのに対し、４１個の対照試料のうち３個が陽性であり、感度９０％および特異性９３％に相当するというものであった。
【０１８６】
例１９：完全長４Ｒタウタンパク質および種の合成
図１９は、組換え完全長４Ｒタウタンパク質の調製および精製を示すフローチャートである。ｈＴａｕ４０の遺伝子を大腸菌にトランスフェクトし、標準条件下でインキュベートしてｈＴａｕ４０を発現させた。増殖期間後、大腸菌細胞を打ち、溶解し、熱処理し、硫酸アンモニウムで沈殿させて粗生成物を生成した。粗生成物を陽イオン交換クロマトグラフィー、透析に供し、次いで濃縮し、緩衝液を交換した。１００ｋＤａの質量でのカットオフ濾過を使用してｈＴａｕ４０をさらに精製した。精製したｈＴａｕ  ４０の収量は２０ｍｇ／Ｌ細菌培養物であった。次いで、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中１２．５μＭヘパリンとｈＴａｕ  ４０モノマーを３７℃で３日間、サイクリック攪拌（５００ｒｐｍで１分間振盪、引き続いて振盪なしで２９分間）を使用してインキュベートすることによって、完全長４Ｒタウ種を調製した。
【０１８７】
例２０Ａ：タウＰＭＣＡ
１２．５μＭタウモノマー、１．２５μＭヘパリン、５μＭチオフラビンＴを使用して、サイクリック攪拌（５００ｒｐｍで１分間振盪、引き続いて振盪なしで２９分間）を使用して、９６ウェルプレートでタウ−ＰＭＣＡアッセイを実施した。１２．５ｐｍｏｌ、１．２５ｐｍｏｌ、１２５ｆｍｏｌ、１２．５ｆｍｏｌおよび１．２５ｆｍｏｌの量で種をウェルに添加した。種なしで対照を実施した。プレート分光蛍光光度計（励起：４３５；発光：４８５）を使用して、ＴｈＴ蛍光によって、経時的に凝集を追跡した。図２０Ａは、種々の初期量の種および対照についての凝集（％）のグラフである。図２０Ａの値は２連の平均であり、エラーバーは標準偏差を示す。図２０Ｂは、Ｔ５０、ＴｈＴ蛍光によって測定される５０％凝集までの時間対オリゴマータウ種の量の対数（ｆｍｏｌ）のグラフである。
【０１８８】
例２０Ｂ：タウＰＭＣＡ
タウ−ＰＭＣＡアッセイの最適化のために、４つの不完全なタンデム微小管結合リピート（４Ｒ）を含む完全長ヒトタウ４０。３７℃で３日間、ヘパリン（１２．５μＭ）の存在下で完全長タウ（５０μＭ）をインキュベーションすることによって、タウオリゴマーを生成した。種を、タウ凝集を種まきする能力、チオフラビンＴとの結合、ウエスタンブロットおよび電子顕微鏡法によって特徴付けた。事前に形成された凝集体を使用して、核形成をし、タウの凝集を誘導した。アッセイのために、様々な量の合成種の非存在下または存在下で、３μＭのヘパリンを含有する１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中種なしモノマータウ（１５μＭ）を、２０℃で２９．５分間インキュベートし、引き続いて５００ｒｐｍで３０秒間振盪することによるタウ−ＰＭＣＡのサイクルに供した。これらの条件下で、タウは事前に形成された種の存在下でのみ凝集することが観察され、凝集の動態は添加された種の量に依存していた。重要なことに、ＰＭＣＡシグナルは、反応に添加された種の量に正比例することが観察された。このアッセイは、０．１２５ｐｇのオリゴマータウの検出閾値に対応していた。この検出閾値は、タウモノマーの分子量に基づいて−２アトモル、または平均オリゴマーサイズの代理としての１２−ｍｅｒオリゴマーの分子量に基づいて０．１５アトモルに対応する。
【０１８９】
例２０Ｃ：タウＰＭＣＡ
１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中１２．５μＭヘパリンとＴａｕモノマーを３７℃で３日間、振盪しながらインキュベートすることによって調製した完全長タウ種を使用してさらなるタウ−ＰＭＣＡアッセイを実施した。１２．５μＭタウモノマー、１．２５μＭヘパリンおよび５μＭチオフラビンＴを使用して、サイクリック攪拌（５００ｒｐｍで１分間振盪、引き続いて振盪なしで２９分間）を使用して、９６ウェルプレートでアッセイを実施した。図２０Ｃは、プレート分光蛍光光度計（励起：４３５；発光：４８５）を使用して、ＴｈＴ蛍光によって経時的に追跡した凝集のグラフである。図２０Ｃは、２連の平均およびＳＤを示す。図２０Ｄは、タウオリゴマーの量とタウ−ＰＭＣＡシグナル（５０％凝集に到達する時間）との間の関係のグラフである。
【０１９０】
例２０Ｄ：タウＰＭＣＡは再現性がある
【０１９１】
大規模実験を実施して、凍結／解凍を行ってまたは行わないで、４つの異なる時間（０、１４、２８および３０日）の性能を分析するためのタウ−ＰＭＣＡアッセイの堅牢性および再現性を評価した。２つの異なる合成種セットと５つの異なる濃度の合成種（１２５０、１２５、１２．５、１．２５および０．１２５ｐｇの種）を使用し、緩衝液または対照ＣＳＦに添加した。各試料を３連で実行した。実験は、全ての実験を実施するために必要な量のタウの大規模発現および精製、生成した材料の品質管理、合成タウオリゴマー種の生成および特徴付け、ならびに緩衝液および生体マトリックス（ＣＳＦ）におけるアッセイ精度および再現性を調査するためのタウ−ＰＭＣＡ実験を含む、いくつかのステップを包含していた。全体で、実験は３２の異なる条件（２つの異なる種×４つの時点×２の希釈様式（凍結または凍結なし）×２つの異なるマトリックス（緩衝液またはＣＳＦ））を使用した。５つの異なる濃度のオリゴマー種で全ての条件を試験し、それぞれを３連で行ったので、実験全体で４８０のウェルを伴った。タンパク質濃度、緩衝液およびＰＭＣＡ条件は、例２０Ｂと同じであった。試験した３２の条件のうち、１つだけが他とわずかに有意に異なる結果を与え、高い精度および再現性を示した。図２０Ｅ〜図２０Ｌは、凍結および解凍に供したまたは供していない、緩衝液またはＣＳＦの存在下の試料、および２つの異なる種調製物についての４つの異なる時点（０、７、１４および３０日目）を含む、８つの試験した条件のＴｈＴ蛍光に基づく凝集結果を示す一連のグラフである（図２０Ｅ〜図２０Ｈおよび図２０Ｉ〜図２０Ｌ）。図２０Ｅ〜図２０Ｌは、得られた結果が３連、異なる時点および異なる種の間で非常に類似していることを実証している。データは、３連試料の平均±標準誤差に対応する。種の非存在下のタウ基質は、実験が行われた時間内でいかなる条件下でも凝集することが観察されなかった。
【０１９２】
アッセイの再現性を分析するために、１２５０ｐｇのタウ種の存在下での実験のＴ５０値（５０％凝集に到達する時間）。２つの種調製物ＡまたはＢの一方を使用し、新鮮または凍結した種を使用して、様々な日に行った実験についてのＴ５０値は、統計学的に有意な差を示さず、７１．５±１．８時間の平均Ｔ５０が得られた。他の全ての種濃度の存在下で行われた試験でも、緩衝液で行われた実験でも、同様の有意でない差が観察された。図２０Ｍは、１６の異なる条件にわたる再現性を示すＴ５０値の表である。全ての値を、一元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてテューキーの多重比較検定によって分析した。
【０１９３】
例２０Ｅ：タウＰＭＣＡは特異的である
【０１９４】
タウＰＭＣＡアッセイを、特異性、特に他のアミロイド形成タンパク質で構成される凝集体を検出する能力について調査した。ＡβおよびαＳｙｎオリゴマー種を調製し、モノマータウをクロスシードする（ｃｒｏｓｓ−ｓｅｅｄ）ために使用した。図２０Ｎは、１ｐｍのタウ、Ａβ４０、ＡＢ４２、Ｈｉｓ  αＳｙｎ、Ｈｕ  αＳｙｎおよび種なしで種をまかれたタウアッセイについてのＴｈＴ蛍光対時間のグラフである。図２０Ｎは、ＡβまたはαＳｙｎ種の存在下では有意なシグナルが検出されず、これらの粒子の濃度が比較的高かった場合（２ｎｇのタウ種に相当）でさえも、約１００時間前にシグナルは検出されなかったことを示している。これらのＡβおよびαＳｙｎ種は、前記の例に記載されているそれぞれのＡβ−またはαＳｙｎ−ＰＭＣＡアッセイで凝集を誘導するのに非常に効率的である。これらの結果は、使用された条件および濃度では、他のタンパク質凝集体のクロスシードがなく、タウ−ＰＭＣＡがタウオリゴマーの検出に特異的であることを示している。
【０１９５】
例２１Ａ：タウＰＭＣＡはヒトＣＳＦ中のタウを検出する
ＡＤ患者（７症例）、５人の他のタウオパチー（１ＦＴＤ、２ＰＳＰ、２ＣＢＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）に罹患した人、および他の神経疾患に罹患した対照（７つの試料）のヒトＣＳＦ試料をタウ−ＰＭＣＡによって分析した。図２１Ａは、ほとんどの試料が最大蛍光に到達した、４４７時間のインキュベーションでのＴｈＴ蛍光を示すグラフである。陽性対照は、合成タウオリゴマー（１２．５ｆｍｏｌ）を添加した健康なＣＳＦの試料を使用した。陰性対照は、タウ種を含まない健康なＣＳＦの試料に対応する。図２１Ａは、ＡＤ、他のタウオパチーおよびＭＣＩを有する患者が、陰性対照を有意に上回り、陽性対照と一致するタウ凝集を示したことを示している。他の神経疾患を有する７人の対照患者のうちの６人が、陰性対照と一致した。他の神経疾患群の１人の対照患者は、タウオパチーと一致する最大蛍光を示した。これは、その患者の診断されていないタウオパチー、または不注意による汚染を示し得る。
【０１９６】
例２１Ｂ：タウＰＭＣＡはヒトＣＳＦ中のタウを検出する
１１人のＡＤに罹患した患者、１１人の他のタウオパチー（４人のＰＳＰ、１人のＦＴＤ、５人のＣＢＤおよび１人のＣＴＥ）および７人の無関係の神経障害に罹患した対照のヒトＣＳＦ試料を調査した。陽性対照は、ＣＳＦに２０ｎｇの組換えタウオリゴマーを添加することによって調製した。陰性対照はタウ種なしの健康なＣＳＦであった。図２１Ｂは、組換えタウオリゴマーを含有する試料で観察されるものに匹敵する、ＡＤまたはタウ−ＰＭＣＡの他のタウオパチーを有する患者の試料の蛍光シグナルのグラフである。結果として、ＡＤまたは他のタウオパチーの患者の試料は、タウ凝集を加速することができた。逆に、７つのうちの６つの対照がタウ−ＰＭＣＡで低いシグナルを生成し、種なしのＣＳＦで観察された値と同等の値であった。標本サイズが小さいにもかかわらず、対照と患者の差は統計学的に有意であった。これらの肯定的な結果は、タウ−ＰＭＣＡが患者のＣＳＦ中のタウ凝集体を検出できることを示している。図２１Ｂは、任意単位として表される最大ＴｈＴ蛍光を示す。一元配置ＡＮＯＶＡ、引き続いてテューキーの多重比較検定によって差を分析した。＊＊Ｐ＜０．０１。
【０１９７】
例２２：タウＰＭＣＡはヒトＣＳＦ中のタウを検出する
タウ−ＰＭＣＡアッセイの性能を、対照、ならびにＡＤ、ＦＴＤ（前頭側頭型認知症）、ＣＢＤ（皮質基底核変性症）およびＰＳＰ（進行性核上性麻痺）に罹患した患者の代表的なＣＳＦ試料の存在下で調査した。１２．５μＭタウモノマー、１．２５μＭヘパリン、５μＭチオフラビンＴを使用して、サイクリック攪拌（５００ｒｐｍで１分間振盪、引き続いて振盪なしで２９分間）を使用して、９６ウェルプレートでタウ−ＰＭＣＡアッセイを実施した。プレート分光蛍光光度計（励起：４３５；発光：４８５）を使用して、ＴｈＴ蛍光によって、経時的に凝集を追跡した。図２２は、ＴｈＴ対時間に基づく凝集％を示すグラフである。種々のタウオパチーは、Ｔ５０、増幅率および増幅の程度が異なっていました。例えば、ＰＳＰおよびＡＤ試料のＴ５０は１５０時間でほぼ同じであったが、ＰＳＰ試料は、ＡＤと比較して短い遅滞期、低い増幅率および低い増幅の程度を有するように見えた。ＣＢＤは、ＡＤとＰＳＰの両方と比較して、増幅率が低く、増幅の程度が低く、約１７５時間のＴ５０を有するように見えた。ＦＴＤは、ＡＤ、ＰＳＰおよびＣＢＤの各々と比較して、増幅率が高く、増幅の程度が低く、約２１０時間のＴ５０を有するように見えた。対照ＣＳＦ試料は、ＦＴＤと比較して同等のＴ５０および増幅率を有し、増幅の程度ははるかに低かった。対照ＣＳＦ試料の増幅は、自発的（種なし）増幅、不注意による汚染、またはＦＴＤとやや類似した動態を有する未診断のタウオパチーによるものであり得る。
【０１９８】
考察
本タウ−ＰＭＣＡは、種々の利点を提供し得る。例えば、本発明の実施形態は、非病原性バイオマーカー、その小さな画分のみがシナプス毒性（ｓｙｎａｐｔｏ−ｔｏｘｉｃ）オリゴマー凝集体を形成するタウの全プールの測定、またはタウの種々のリン酸化種の測定などの既知の間接的測定とは対照的に、タウミスフォールドタンパク質を直接検出することができる。種々の実施形態では、本発明が、タウミスフォールディングを種まきし、疾患中の脳の損傷の拡大に寄与すると考えられているミスフォールドタウオリゴマーを検出する。
【０１９９】
「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」または「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語が明細書または特許請求の範囲で使用される限り、これは「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語が特許請求の範囲で転換語として使用される場合に解釈されるのと同様に包括的であることを意図している。さらに、「または（ｏｒ）」という用語が使用される限り（例えば、ＡまたはＢ）、これは「ＡまたはＢまたは両方」を意味することを意図している。出願人が「両方ではなくＡまたはＢのみ」を示すことを意図する場合には、「両方ではなくＡまたはＢのみ」という用語が使用される。したがって、本明細書における「または（ｏｒ）」という用語の使用は包括的であり、排他的使用ではない。Ｂｒｙａｎ  Ａ．Ｇａｒｎｅｒ、Ａ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｌｅｇａｌ  Ｕｓａｇｅ  ６２４（第２版１９９５）を参照されたい。また、「中に（ｉｎ）」または「中に（ｉｎｔｏ）」という用語が明細書または特許請求の範囲で使用される限り、これは「上に（ｏｎ）」または「上に（ｏｎｔｏ）」をさらに意味することを意図している。「選択的に（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ）」という用語が明細書または特許請求の範囲で使用される限り、これは、装置の使用者が、装置に使用において必要に応じてまたは所望により、構成要素の特徴または機能を活性化または不活性化することができる構成要素の状態を指すことを意図している。「作動可能に接続された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）」という用語が明細書または特許請求の範囲で使用される限り、これは、特定された構成要素が指定された機能を実施する方法で接続されることを意味することを意図している。「実質的に（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ）」という用語が明細書または特許請求の範囲で使用される限り、これは、特定された構成要素が、本業界で許容される程度の誤差で示される関係または品質を有することを意味することを意図している。
【０２００】
明細書および特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、単数形が明示的に指定されない限り、複数形を含む。例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」への言及は、２つ以上の化合物の混合物、ならびに単一の化合物を含み得る。
【０２０１】
本明細書で使用される場合、ある数字と合わせた「約」という用語は、その数字の±１０％を含むことを意図している。換言すれば、「約１０」は９〜１１を意味し得る。
【０２０２】
本明細書で使用される場合、「任意の（ｏｐｔｉｏｎａｌ）」および「場合により（ｏｐｔｉｏｎａｌｌｙ）」という用語は、後に記載される状況が発生し得るまたは発生し得ないことを意味するので、この記載は状況が発生する場合および発生しない場合を含む。
【０２０３】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュ群に関して記載されている場合、当業者であれば、それにより、本開示がマーカッシュ群の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関しても記載されていると認識するだろう。当業者によって理解されるように、書面による説明を提供するなどのありとあらゆる目的のために、本明細書に開示される全ての範囲は、ありとあらゆる可能な部分範囲およびその部分範囲の組み合わせも包含する。列挙された範囲は、同範囲を十分に記載し、これを少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解できるようにするものとして容易に認識され得る。非限定的な例として、本明細書に論じられる各範囲は、下３分の１、中３分の１および上３分の１などに容易に分解することができる。また、当業者によって理解されるように、「〜まで（ｕｐ  ｔｏ）」、「少なくとも（ａｔ  ｌｅａｓｔ）」、「超（ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｈａｎ）」、「未満（ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ）」などの全ての言語は、列挙された数を含み、後に上に論じられる部分範囲に分解することができる範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は各個々のメンバーを含む。例えば、１〜３個の細胞を有する群は１、２または３個の細胞を有する群を指す。同様に、１〜５個の細胞を有する群は、１、２、３、４または５個の細胞を有する群を指すなどである。種々の態様および実施形態が本明細書で開示されているが、他の態様および実施形態が当業者には明らかであろう。
【０２０４】
上記のように、本出願はその実施形態の説明によって例示され、実施形態はかなり詳細に記載されているが、添付の特許請求の範囲をこのような詳細に制限するまたは何らかの方法で限定することは出願人の意図ではない。本出願の利益を有する追加の利点および修正が、当業者には容易に明らかになるであろう。したがって、本出願は、そのより広い態様において、特定の詳細、示される例示的な例、または言及される任意の装置に限定されない。一般的な発明概念の精神または範囲から逸脱することなく、このような詳細、例および装置から出発することができる。
【０２０５】
本明細書に開示される種々の態様および実施形態は、例示を目的とするものであり、限定することを意図するものではなく、真の範囲および精神は添付の特許請求の範囲によって示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２０Ｅ−Ｌ】
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【図２０Ｍ】
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【図２０Ｎ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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