(57)【要約】  ＰＣＳＫ９のＬＤＬ受容体との結合を遮断し、従って、ＬＤＬ−Ｃレベルを低下させることができる、プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）に対するモノクローナル抗体が提供される。開示される抗体は、複数のＣＶＤの処置のための極めて強力な薬剤を提供する。【選択図】図１４
2020502991.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、３、５、１３、１５、１７、２５、２７、２９、３７、３９、４１、４９、５５、５７、５９、６７および６９からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列を含む、単離された抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号７、９、１１、１９、２１、２３、３１、３３、３５、４３、４５、４７、５１、５３、６１、６３、６５および７１からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列を含む、請求項１に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項３】
ａ）配列番号１、配列番号３および／または配列番号５を含む重鎖可変領域、
ｂ）配列番号１３、配列番号１５および／または配列番号１７を含む重鎖可変領域、
ｃ）配列番号２５、配列番号２７および／または配列番号２９を含む重鎖可変領域、
ｄ）配列番号３７、配列番号３９および／または配列番号４１を含む重鎖可変領域、
ｅ）配列番号１３、配列番号４９および／または配列番号１７を含む重鎖可変領域、
ｆ）配列番号５５、配列番号５７および／または配列番号５９を含む重鎖可変領域、ならびに
ｇ）配列番号１、配列番号６７および／または配列番号６９を含む重鎖可変領域
からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項４】
ａ）配列番号７、配列番号９および／または配列番号１１を含む軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号１９、配列番号２１および／または配列番号２３を含む軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号３１、配列番号３３および／または配列番号３５を含む軽鎖可変領域、
ｄ）配列番号４３、配列番号４５および／または配列番号４７を含む軽鎖可変領域、
ｅ）配列番号５１、配列番号５３および／または配列番号２３を含む軽鎖可変領域、
ｆ）配列番号６１、配列番号６３および／または配列番号６５を含む軽鎖可変領域、ならびに
ｇ）配列番号７、配列番号９および／または配列番号７１を含む軽鎖可変領域
からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項５】
ａ）配列番号１、配列番号３および／もしくは配列番号５を含む重鎖可変領域ならびに配列番号７、配列番号９および／もしくは配列番号１１を含む軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号１３、配列番号１５および／もしくは配列番号１７を含む重鎖可変領域ならびに配列番号１９、配列番号２１および／もしくは配列番号２３を含む軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号２５、配列番号２７および／もしくは配列番号２９を含む重鎖可変領域ならびに配列番号３１、配列番号３３および／もしくは配列番号３５を含む軽鎖可変領域、
ｄ）配列番号３７、配列番号３９および／もしくは配列番号４１を含む重鎖可変領域ならびに配列番号４３、配列番号４５および／もしくは配列番号４７を含む軽鎖可変領域、
ｅ）配列番号１３、配列番号４９および／もしくは配列番号１７を含む重鎖可変領域ならびに配列番号５１、配列番号５３および／もしくは配列番号２３を含む軽鎖可変領域、
ｆ）配列番号５５、配列番号５７および／もしくは配列番号５９を含む重鎖可変領域ならびに配列番号６１、配列番号６３および／もしくは配列番号６５を含む軽鎖可変領域、または
ｇ）配列番号１、配列番号６７および／もしくは配列番号６９を含む重鎖可変領域ならびに配列番号７、配列番号９および／もしくは配列番号７１を含む軽鎖可変領域
を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項６】
配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８９、配列番号９３および配列番号９７ならびにそれらの少なくとも８０％配列同一性のある相同配列からなる群から選択される重鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号７５、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９５および配列番号９９ならびにそれらの少なくとも８０％配列同一性のある相同配列からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項８】
ａ）配列番号７３を含む重鎖可変領域および配列番号７５を含む軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号７７を含む重鎖可変領域および配列番号７９を含む軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号８１を含む重鎖可変領域および配列番号８３を含む軽鎖可変領域、
ｄ）配列番号８５を含む重鎖可変領域および配列番号８７を含む軽鎖可変領域、
ｅ）配列番号８９を含む重鎖可変領域および配列番号９１を含む軽鎖可変領域、
ｆ）配列番号９３を含む重鎖可変領域および配列番号９５を含む軽鎖可変領域、
ｇ）配列番号９７を含む重鎖可変領域および配列番号９９を含む軽鎖可変領域、または
ｈ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｄ）、ｆ）もしくはｇ）に対して少なくとも８０％の配列同一性のある重鎖可変領域および軽鎖可変領域
を含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項９】
表面プラズモン共鳴結合アッセイによって測定されるものとして、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下または１０−１０Ｍ以下のＫＤ値でヒトＰＣＳＫ９と特異的に結合可能である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１０】
１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下または１０−１０Ｍ以下のＫＤ値でサルＰＣＳＫ９と結合する、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１１】
２．１ｎＭ以下のＩＣ５０で、ヒトＰＣＳＫ９のそのリガンドとの結合を阻害可能である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１２】
０．１５ｎＭ以下のＥＣ５０でヒトＰＣＳＫ９と結合可能である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１３】
１１５ｎＭ以下、１０６ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７７ｎＭ以下、６６ｎＭ以下または４０ｎＭ以下のＩＣ５０で、細胞性ＬＤＬ取り込みを回復可能である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１４】
血清中で、少なくとも１日または少なくとも１４日安定である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１５】
ＡＤＣＣまたはＣＤＣまたはその両方を媒介しない、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１６】
完全ヒトモノクローナル抗体である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１７】
完全ヒトモノクローナル抗体が、トランスジェニック動物によって生成される、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１８】
動物においてＬＤＬ−コレステロールを最大８４％低減可能である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項１９】
少なくとも１６５時間、少なくとも２５０時間、少なくとも３６０時間、少なくとも３９０時間または少なくとも４５０時間の血清半減期を有する、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２０】
先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片と同一のエピトープについて競合する、抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２１】
ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディー、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓダイアボディー、ナノボディー、ドメイン抗体または二価ドメイン抗体である、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２２】
免疫グロブリン定常領域をさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２３】
コンジュゲートをさらに含む、先行する請求項のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片。
【請求項２４】
請求項１から２２に記載の抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２４に記載の単離されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１から２２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を発現させる方法であって、請求項２６に記載の宿主細胞を、請求項２４に記載のポリヌクレオチドが発現される条件下で培養することを含む、方法。
【請求項２８】
請求項１から２２のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を含むキット。
【請求項２９】
個体においてＰＣＳＫ９によって媒介される疾患または状態を処置する方法であって、個体に、請求項１から２３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片の治療上有効な量を投与することを含む、方法。
【請求項３０】
個体が、ＰＣＳＫ９阻害剤に応答する可能性が高い障害または状態を有すると同定されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
個体が、個体から得られた試験生体サンプルにおける血清ＬＤＬコレステロール、総コレステロールおよび／または非ＨＤＬコレステロールの上方制御されたレベルとして同定されている、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１から２３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片および１種または複数の医薬上許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３３】
免疫応答の上方制御から恩恵を受けるであろう対象における状態を処置する方法であって、対象に、治療上有効な量の、請求項１から２３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
対象が、血清ＬＤＬコレステロール、総コレステロールおよび／または非ＨＤＬコレステロールの上方制御されたレベルを有する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
免疫応答の上方制御から恩恵を受けるであろう状態を処置するための医薬の製造における、請求項１から２３のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合断片の使用。
【請求項３６】
状態が、心血管疾患、炎症性疾患および感染性疾患である、請求項３５に記載の使用。
【請求項３７】
感染性疾患が敗血症である、請求項３６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示内容は、概して、新規抗ＰＣＳＫ９抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
心血管疾患（ＣＶＤ）は、世界的に依然として死亡原因の第１位である（Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ  （ＷＨＯ）、２０１１年  Ｗｏｒｌｄ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）。種々の研究によって、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）を低下させることは、ＣＶＤのリスクを低減することが示されてきた。スタチン、脂質低下剤の現在の第一選択薬を用いる処置にもかかわらず、ＣＶＤのために相当な医学的ニーズがある。患者のかなりの部分は、スタチン療法で、満足な容量を許容できないか、または脂質制御を達成できないかのいずれかである（Ｂａｉｇｅｎｔ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｌａｎｃｅｔ  ２０００，  ３７６（９７５３），  １６７０−１６８１）。
【０００３】
プロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）は、元々、神経アポトーシス調節転換酵素−１として発見された。これは主に、小腸および肝臓において合成される（Ｓｅｉｄａｈ  ＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２００３；１００：９２８−３３）。成熟ＰＣＳＫ９は、そのプロドメインの細胞内自己触媒的切断後に肝臓細胞から分泌される（ＭｃＮｕｔｔ，Ｍ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００７，２０（２８２），２０７９９−２０８０３）。コレステロール代謝の調節におけるＰＣＳＫ９の重要な役割は、常染色体優性高コレステロール血症を有する２つのフランス人家族におけるＰＣＳＫ９中の２種の機能獲得型変異の認識によって最初にわかった（Ａｂｉｆａｄｅｌ  Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２００３；３４：１５４−６）。ＰＣＳＫ９は、肝臓における分解のための主に低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）との結合によってコレステロール代謝を調節する。ＰＣＳＫ９の不在下では、肝臓ＬＤＬＲは、分解のためにＬＤＬ−Ｃをリゾチームに送達した後に再利用されて細胞膜に戻される。ＰＣＳＫ９およびＬＤＬＲの結合は、ＬＤＬＲの正常な再利用を妨げ、代わりにＬＤＬＲ分解を増強する（Ｖｅｒｂｅｅｋ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  ２０１５；Ｌｏ  Ｓｕｒｄｏ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｒｅｐ  ２０１１；１２：１３００−５）。
【０００４】
ＰＣＳＫ９を阻害するためのいくつかの治療的アプローチは、開発中であり、抗体またはペプチドによるＬＤＬＲとのＰＣＳＫ９結合の直接阻害、遺伝子サイレンシング剤によるＰＣＳＫ９合成の阻害および小分子によるＰＣＳＫ９細胞内生成の阻害を含む（Ｍｉｃｈｅｌ  Ｆａｒｎｉｅｒ，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，２０１４，１０７，５８−６６）。最近承認されたモノクローナル抗体アリロクマブおよびエボロクマブは、第ＩＩ相および第ＩＩＩ相臨床研究においてＬＤＬ−Ｃ低減の有望な有効性を示した。現在の証拠は、バックグラウンドスタチン療法と無関係の、ＬＤＬ−Ｃレベルの最大７０％の低減を示している（Ｄｉａｓ，Ｃ．Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１２，６０（１９），１８８８−１８９８、Ｇｉｕｇｌｉａｎｏ，Ｒ．Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ，２０１２，３８０（９８５８），２００７−２０１７、ＭｃＫｅｎｎｅｙ，Ｊ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１２，５９（２５），２３４４−２３５３）。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、新規モノクローナル抗ＰＣＳＫ９抗体（特に、完全ヒト抗体）、それをコードするポリヌクレオチドおよびそれを使用する方法を提供する。
【０００６】
一態様では、本開示は、配列番号１、３、５、１３、１５、１７、２５、２７、２９、３７、３９、４１、４９、５５、５７、５９、６７および６９からなる群から選択される重鎖ＣＤＲ配列を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【０００７】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７、９、１１、１９、２１、２３、３１、３３、３５、４３、４５、４７、５１、５３、６１、６３、６５および７１からなる群から選択される軽鎖ＣＤＲ配列を含む。
【０００８】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号１、配列番号３および／または配列番号５を含む重鎖可変領域、
ｂ）配列番号１３、配列番号１５および／または配列番号１７を含む重鎖可変領域、
ｃ）配列番号２５、配列番号２７、および／または配列番号２９を含む重鎖可変領域、
ｄ）配列番号３７、配列番号３９および／または配列番号４１を含む重鎖可変領域、
ｅ）配列番号１３、配列番号４９および／または配列番号１７を含む重鎖可変領域、
ｆ）配列番号５５、配列番号５７および／または配列番号５９を含む重鎖可変領域、ならびに
ｇ）配列番号１、配列番号６７および／または配列番号６９を含む重鎖可変領域
からなる群から選択される重鎖可変領域を含む。
【０００９】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号７、配列番号９および／または配列番号１１を含む軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号１９、配列番号２１および／または配列番号２３を含む軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号３１、配列番号３３および／または配列番号３５を含む軽鎖可変領域、
ｄ）配列番号４３、配列番号４５および／または配列番号４７を含む  軽鎖可変領域、
ｅ）配列番号５１、配列番号５３および／または配列番号２３を含む軽鎖可変領域、
ｆ）配列番号６１、配列番号６３および／または配列番号６５を含む軽鎖可変領域、ならびに
ｇ）配列番号７、配列番号９および／または配列番号７１を含む軽鎖可変領域
からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む。
【００１０】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号１、配列番号３および／もしくは配列番号５を含む重鎖可変領域ならびに配列番号７、配列番号９および／もしくは配列番号１１を含む軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号１３、配列番号１５および／もしくは配列番号１７を含む重鎖可変領域ならびに配列番号１９、配列番号２１および／もしくは配列番号２３を含む軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号２５、配列番号２７および／もしくは配列番号２９を含む重鎖可変領域ならびに配列番号３１、配列番号３３および／もしくは配列番号３５を含む軽鎖可変領域、
ｄ）配列番号３７、配列番号３９および／もしくは配列番号４１を含む重鎖可変領域ならびに配列番号４３、配列番号４５および／もしくは配列番号４７を含む軽鎖可変領域、
ｅ）配列番号１３、配列番号４９および／もしくは配列番号１７を含む重鎖可変領域ならびに配列番号５１、配列番号５３および／もしくは配列番号２３を含む軽鎖可変領域、
ｆ）配列番号５５、配列番号５７および／もしくは配列番号５９を含む重鎖可変領域ならびに配列番号６１、配列番号６３および／もしくは配列番号６５を含む軽鎖可変領域、または
ｇ）配列番号１、配列番号６７および／もしくは配列番号６９を含む重鎖可変領域ならびに配列番号７、配列番号９および／もしくは配列番号７１を含む軽鎖可変領域
を含む。
【００１１】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７３、配列番号７７、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８９、配列番号９３および配列番号９７ならびにそれらの少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）配列同一性のある相同配列からなる群から選択される重鎖可変領域を含む。
【００１２】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、配列番号７５、配列番号７９、配列番号８３、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９５および配列番号９９ならびにそれらの少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）配列同一性のある相同配列からなる群から選択される軽鎖可変領域を含む。
【００１３】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、
ａ）配列番号７３を含む重鎖可変領域および配列番号７５を含む軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号７７を含む重鎖可変領域および配列番号７９を含む軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号８１を含む重鎖可変領域および配列番号８３を含む軽鎖可変領域、
ｄ）配列番号８５を含む重鎖可変領域および配列番号８７を含む軽鎖可変領域、
ｅ）配列番号８９を含む重鎖可変領域および配列番号９１を含む軽鎖可変領域、
ｆ）配列番号９３を含む重鎖可変領域および配列番号９５を含む軽鎖可変領域、
ｇ）配列番号９７を含む重鎖可変領域および配列番号９９を含む軽鎖可変領域、または
ｈ）ａ）、ｂ）、ｃ）、ｄ）、ｄ）、ｆ）もしくはｇ）に対して少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％）配列同一性のある重鎖可変領域および軽鎖可変領域
を含む。
【００１４】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）結合アッセイ実験によって測定されるものとして、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下または１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下のＫＤ値でヒトＰＣＳＫ９と特異的に結合可能である。
【００１５】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＥＬＩＳＡアッセイによって測定されるものとして、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下のＫＤ値でヒトＰＣＳＫ９と特異的に結合可能である。
【００１６】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、１０−１０Ｍ以下、１０−１１Ｍ以下、１０−１２Ｍ以下のＫＤ値でサルＰＣＳＫ９と結合する。
【００１７】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、２．１ｎＭ以下（例えば、３ｎＭ、２．５ｎＭ、１．８ｎＭ、１．７ｎＭ、１．６ｎＭ、１．５ｎＭ、１．４ｎＭ、１．３ｎＭ、１．２ｎＭまたは１ｎＭ以下）のＩＣ５０で、ヒトＰＣＳＫ９のそのリガンドとの結合を阻害可能である。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、０．１５ｎＭ以下（例えば、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３または０．０２ｎＭ以下）のＥＣ５０で、ヒトＰＣＳＫ９と結合可能である。
【００１８】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、１１５ｎＭ以下、１０６ｎＭ以下、８０ｎＭ以下、７７ｎＭ以下、６６ｎＭ以下または４０ｎＭ以下（例えば、１２０ｎＭ、１１０ｎＭ、１００ｎＭ、９０ｎＭ、８５ｎＭ、８０ｎＭ、７５ｎＭ、７０ｎＭ、６５ｎＭ、６０ｎＭ、５５ｎＭ、５０ｎＭ、４５ｎＭ、４０ｎＭ、３５ｎＭ、３０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭまたは１ｎＭ以下）のＩＣ５０で、細胞性ＬＤＬ取り込みを回復可能である。
【００１９】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、血清中で、少なくとも１日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも１週間、少なくとも２週間または少なくとも１ヶ月間安定である。
【００２０】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＡＤＣＣまたはＣＤＣまたは両方を媒介しない。
【００２１】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、完全ヒトモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、完全ヒトモノクローナル抗体は、宿主細胞またはトランスジェニック動物によって生成される。
【００２２】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、動物においてＬＤＬ−コレステロールを最大１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、７７％、８０％、８４％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上低減可能である。特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ＨＤＬ−コレステロールのレベルを維持可能である。
【００２３】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、少なくとも１６５時間、少なくとも２５０時間、少なくとも３６０時間、少なくとも３９０時間または少なくとも４５０時間（例えば、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも１８０、少なくとも２００、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００または少なくとも５００時間）の血清半減期を有する。
【００２４】
一態様では、本開示は、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片と同一エピトープについて競合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。
【００２５】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、ラクダ化された単一ドメイン抗体、ダイアボディー、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓダイアボディー、ナノボディー、ドメイン抗体または二価ドメイン抗体である。
【００２６】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、免疫グロブリン定常領域をさらに含む。
【００２７】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、コンジュゲートをさらに含む。特定の実施形態では、コンジュゲートは、検出可能な標識、薬物動態修飾部分または精製部分であり得る。
【００２８】
一態様では、本開示は、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドをさらに提供する。本開示は、前記の単離されたポリヌクレオチドを含むベクターをさらに提供する。本開示は、前記ベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。特定の実施形態では、本明細書において提供されるポリヌクレオチドは、ベクター中でＳＶ４０プロモーターなどのプロモーターと作動可能に結合される。特定の実施形態では、本明細書において提供されるベクターを含む宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣細胞または２９３細胞である。
【００２９】
一態様では、本開示は、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片を発現させる方法であって、前記宿主細胞を、前記ポリヌクレオチドが発現される条件下で培養することを含む方法をさらに提供する。
【００３０】
一態様では、本開示は、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片を含むキットをさらに提供する。
【００３１】
一態様では、本開示は、個体においてＰＣＳＫ９によって媒介される疾患または状態を処置する方法であって、個体に本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片の治療上有効な量を投与することを含む方法をさらに提供する。特定の実施形態では、個体は、個体から得た試験生体サンプルにおける、血清ＬＤＬコレステロール、総コレステロールおよび／もしくは非ＨＤＬコレステロールの上方制御されたレベルまたはＬＤＬ受容体の下方制御されたレベルとして同定されている。特定の実施形態では、前記抗体またはその抗原結合断片の投与の際に、ＬＤＬ−Ｃおよび／または総コレステロールのレベルが低減される。
【００３２】
一態様では、本開示は、本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片および１種以上の医薬上許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。これらの実施形態のうち特定のものでは、医薬担体は、例えば、希釈剤、抗酸化剤、アジュバント、賦形剤または非毒性補助物質であり得る。
【００３３】
一態様では、本開示は、免疫応答の上方制御から恩恵を受けるであろう状態を処置する方法であって、対象に本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片の治療上有効な量を投与することを含む方法をさらに提供する。特定の実施形態では、対象は、血清ＬＤＬコレステロール、総コレステロールおよび／もしくは非ＨＤＬコレステロールの上方制御されたレベルまたはＬＤＬ受容体の下方制御されたレベルを有する。
【００３４】
一態様では、本開示は、免疫応答の上方制御から恩恵を受けるであろう状態を処置するための医薬の製造における本明細書において提供される抗体またはその抗原結合断片の使用をさらに提供する。特定の実施形態では、状態は、心血管疾患、炎症性疾患および感染性疾患である。特定の実施形態では、感染性疾患は、敗血症である。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】図１は、１１．４の重鎖のＣＤＲ３中の選択された変異を示す図である。
【図２】図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける完全ヒト抗体１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）の染色を示す図である。Ｍ：タンパク質マーカー、レーン５：１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）、還元されたもの、レーン６：１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）、還元されていないもの。
【図３】図３は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって測定されるような完全ヒト１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）の９９．６％純度を示す図である。
【図４】図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける完全ヒト抗体４０４０９（ｈＩｇＧ４）の染色を示す図である。Ｍ：タンパク質マーカー、レーン１：４０４０９（ｈＩｇＧ４）、還元されたもの、レーン２：４０４０９（ｈＩｇＧ４）、還元されていないもの。
【図５】図５は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって測定されるような完全ヒト４０４０９（ｈＩｇＧ４）の９８％純度を示す図である。
【図６】図６は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける完全ヒト抗体１５．１４．２−ｕＡｂ−ＩｇＧ４Ｌの染色を示す図である。Ｍ：タンパク質マーカー、レーン１：１５．１４．２−ｕＡｂ−ＩｇＧ４Ｌ、還元されたもの、レーン２：１５．１４．２−ｕＡｂ−ＩｇＧ４Ｌ、還元されていないもの。
【図７】図７は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって測定されるような完全ヒト１５．１４．２−ｕＡｂ−ＩｇＧ４Ｌの９９．８％純度を示す図である。
【図８】図８は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける完全ヒト抗体１７．７２．３−ｕＡｂ２−ＩｇＧ４Ｋの染色を示す図である。Ｍ：タンパク質マーカー、レーン１：１７．７２．３−ｕＡｂ２−ＩｇＧ４Ｋ、還元されたもの、レーン２：１７．７２．３−ｕＡｂ２−ＩｇＧ４Ｋ、還元されていないもの。
【図９】図９は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって測定されるような完全ヒト１７．７２．３−ｕＡｂ２−ＩｇＧ４Ｋの９８．９％純度を示す図である。
【図１０】図１０は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける完全ヒト抗体１８．１３６．７−ＩｇＧ４Ｋの染色を示す図である。Ｍ：タンパク質マーカー、レーン１：１８．１３６．７−ＩｇＧ４Ｋ、還元されたもの、レーン２：１８．１３６．７−ＩｇＧ４Ｋ、還元されていないもの。
【図１１】図１１は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって測定されるような完全ヒト１８．１３６．７−ＩｇＧ４Ｋの９９．２％を示す図である。
【図１２】図１２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける完全ヒト抗体１９．３．８−ｕＡｂ１−ＩｇＧ４Ｌの染色を示す図である。Ｍ：タンパク質マーカー、レーン１：１９．３．８−ｕＡｂ１−ＩｇＧ４Ｌ、還元されたもの、レーン２：１９．３．８−ｕＡｂ１−ＩｇＧ４Ｌ、還元されていないもの。
【図１３】図１３は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって測定されるような完全ヒト１９．３．８−ｕＡｂ１−ＩｇＧ４Ｌの９９．９％純度を示す図である。
【図１４】図１４は、ＥＬＩＳＡによって測定されるような完全ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体のヒトＰＣＳＫ９との結合を示す図である。
【図１５】図１５は、ＥＬＩＳＡによって測定されるような、ＰＣＳＫ９のＬＤＬ受容体（ＬＤＬ−Ｒ）との結合に対する完全ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体の遮断を示す図である。
【図１６】図１６は、それぞれ野生型（図１６Ａおよび１６Ｂ）および変異体ＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）（図１６Ｃおよび１６Ｄ）と結合することによる、肝臓の肝細胞癌腫（ＨｅｐＧ２）細胞における、およびＨｕｈ−７細胞における、完全ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体１８．１５６．８の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）取り込みを回復させるアッセイの結果を示す図である。
【図１７】図１７は、野生型（図１７Ａおよび１７Ｂ）および変異体ＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）（図１７Ｃおよび１７Ｄ）の両方を使用する、ＨｅｐＧ２細胞における、およびＨｕｈ−７細胞における、完全ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体４０４０９の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）取り込みを回復させるアッセイの結果を示す図である。
【図１８】図１８は、ＨｅｐＧ２細胞における完全ヒト抗ＰＣＳＫ９抗体１５．１４．２−ｕＡｂ１−ＩｇＧ４Ｌ、１７．７２．３−ｕＡｂ１−ＩｇＧ４Ｋおよび１９．３．８−ｕＡｂ１−ＩｇＧ４Ｌの低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）取り込みを回復させるアッセイの結果を示す図である。
【図１９】図１９は、ＥＬＩＳＡ結合アッセイによって測定される濃度によって示されるような、ヒト血清とともにインキュベートされた完全ヒトＰＣＳＫ９抗体（図１９Ａ：１８．１５６．８、１９Ｂ：Ｂ４Ｇ２、１９Ｃ：１５．１４．２、１９．３．８および１７．７２．３）の安定性を例示する図である。
【図２０】図２０は、抗体１８、１５６．８、４０４０９およびＢＭＫ．１１５処置カニクイザルのＬＤＬ−Ｃ変化パーセンテージを示す図である。図２０Ａは、１０ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示し、図２０Ｂは、３０ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示す。
【図２１】図２１は、抗体１８、１５６．８、４０４０９およびＢＭＫ．１１５処置カニクイザルの高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）変化パーセンテージを示す図である。図２１Ａは、１０ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示し、図２１Ｂは、３０ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示す。
【図２２】図２２は、抗体１５．１４．２、１９．３．８、１７．７２．３、１８．１３６．７およびレパーサ処置カニクイザルのＬＤＬ−Ｃ変化パーセンテージを示す図である。図２２Ａは、３ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示し、図２２Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示す。
【図２３】図２３は、抗体１５．１４．２、１９．３．８、１７．７２．３、１８．１３６．７およびレパーサ処置カニクイザルの高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）変化パーセンテージを示す図である。図２３Ａは、３ｍｇ／ｋｇ  注射の単回用量の結果を示し、図２３Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示す。
【図２４】図２４は、ＥＬＩＳＡによって測定されるような、カニクイザル血清における投与前および投与後の１８．１５６．８、４０４０９またはＢＭＫ．１１５の抗体濃度を示す図である。図２４Ａは、１０ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示し、図２４Ｂは、３０ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示す。
【図２５】図２５は、ＥＬＩＳＡによって測定されるような、カニクイザル血清における投与前および投与後の１５．１４．２（ｈＩｇＧ４）、１９．３．８（ｈＩｇＧ４）、１７．７２．３（ｈＩｇＧ４）、１８．１３６．７（ｈＩｇＧ４）またはレパーサの抗体濃度を示す図である。図２５Ａは、３ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示し、図２５Ｂは、１０ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示す。
【図２６】図２６は、投与前および投与後のカニクイザル血清サンプルにおける１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）、４０４０９（ｈＩｇＧ４）またはＢＭＫ．１１５に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）を示す図である。図２６Ａ、２６Ｃおよび２６Ｅは、１０ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示し、図２６Ｂ、２６Ｄおよび２６Ｆは、３０ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示す。
【図２７】図２７は、投与前および投与後のカニクイザル血清サンプルにおける１５．１４．２、１９．３．８、１７．７２．３、１８．１３６．７またはレパーサに対するＡＤＡを示す図である。図２７Ａ、２７Ｃ、２７Ｅ、２７Ｇおよび２７Ｉは、３ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示し、図２７Ｂ、２７Ｄ、２７Ｆ、２７Ｈおよび２７Ｊは、１０ｍｇ／ｋｇ注射の単回用量の結果を示す。
【図２８】図２８Ａ、２８Ｂおよび２８Ｃは、参照抗体１２Ｈ１１．１および２４Ｂ９．１の生成の結果を示す図である。図２８Ａは、１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４Ｋおよび２４Ｂ９．１．ｕＩｇＧ４ＬのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を示す。Ｍ：タンパク質マーカー、レーン１：２４Ｂ９．１．ｕＩｇＧ４Ｌ、還元されたもの、レーン２：１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４Ｋ、還元されたもの、レーン３：２４Ｂ９．１．ｕＩｇＧ４Ｌ、還元されていないもの、レーン４：１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４Ｋ、還元されていないもの。図２８Ｂおよび２８Ｃは、２４Ｂ９．１．ｕＩｇＧ４Ｌおよび１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４ＫのＨＰＬＣ−ＳＥＣ検出を示す。
【図２９】図２９は、ＥＬＩＳＡによって測定されるような、抗体１８．１５６．８および参照抗体２４Ｂ９．１、１２Ｈ１１．１およびＢＭＫ．１１５のヒトＰＣＳＫ９との結合の比較を示す図である。
【図３０】図３０は、ＥＬＩＳＡによって測定されるような、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲとの結合の遮断における、抗体１８．１５６．８と、参照抗体２４Ｂ９．１、１２Ｈ１１．１およびＢＭＫ．１１５の比較の結果を示す図である。
【図３１】図３１は、抗体１８．１５６．８ならびに参照抗体１２Ｈ１１．１およびＢＭＫ．１１５の、ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ取り込みの回復の能力を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本開示の以下の説明は、単に、本開示の種々の実施形態を例示するよう意図される。そのようなものとして、論じられる特定の改変は、本開示の範囲に対する制限と解釈されてはならない。本開示の範囲から逸脱することなく、種々の等価物、変法および改変が行われ得ることは当業者には明らかであろう、また、このような同等な実施形態は、本明細書に含まれるべきであるということは理解される。刊行物、特許および特許出願を含む本明細書において引用されたすべての参考文献は、参照によりその全文で本明細書に組み込まれる。
【００３７】
―定義―
用語「抗体」は、本明細書において、特異的抗原と結合する任意の免疫グロブリン、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体または二重特異性（二価）抗体を含む。天然の無傷の抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。各重鎖は、可変領域ならびに第１、第２および第３の定常領域からなり、各軽鎖は、可変領域および定常領域からなる。哺乳動物重鎖は、α、δ、ε、γおよびμとして分類され、哺乳動物軽鎖は、λまたはκとして分類される。抗体は、「Ｙ」型を有し、Ｙのステムは、ジスルフィド結合を介して一緒に結合している２つの重鎖の第２および第３の定常領域からなる。Ｙの各アームは、単一軽鎖の可変および定常領域と結合している単一重鎖の可変領域および第１の定常領域を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、抗原結合に関与している。両鎖中の可変領域は、一般に、相補性決定領域（ＣＤＲ）（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を含む軽（Ｌ）鎖ＣＤＲ、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３を含む重（Ｈ）鎖ＣＤＲ）と呼ばれる３つの高度可変ループを含有する。本明細書において開示される抗体および抗原結合断片のＣＤＲ境界は、Ｋａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＡｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉの慣習（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ，Ｂ．、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．、Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２７３巻（４号）、９２７頁（１９９７）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．１２月５日；第１８６巻（３号）：６５１〜６３頁（１９８５年）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．およびＬｅｓｋ，Ａ．Ｍ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第１９６巻、９０１頁（１９８７年）；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．１２月２１〜２８日；第３４２巻（６２５２号）：８７７〜８３頁（１９８９年）；Ｋａｂａｔ  Ｅ．Ａ．ら、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍｄ．（１９９１年））によって定義または同定され得る。３つのＣＤＲは、ＣＤＲよりもより高度に保存され、超可変ループを支持するスキャフォールドを形成するフレームワーク領域（ＦＲ）として知られる、両端に位置するストレッチの間に挿入されている。重鎖および軽鎖の定常領域は、抗原結合に関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。抗体は、その重鎖の定常領域のアミノ酸配列に基づいてクラスに割り当てられる。抗体の５種の主要なクラスまたはアイソタイプとして、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、これらは、α、δ、ε、γおよびμ重鎖それぞれの存在を特徴とする。主要な抗体クラスのうちいくつかは、ＩｇＧ１（γ１重鎖）、ＩｇＧ２（γ２重鎖）、ＩｇＧ３（γ３重鎖）、ＩｇＧ４（γ４重鎖）、ＩｇＡ１（α１重鎖）またはＩｇＡ２（α２重鎖）などのサブクラスに分割される。
【００３８】
用語「抗原結合断片」とは、本明細書において、１つまたは複数のＣＤＲを含む、抗体の一部から形成される抗体断片、または抗原と結合するが無傷の天然抗体構造を含まない任意のその他の抗体断片を指す。抗原結合断片の例として、制限するものではないが、ダイアボディー、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ジスルフィド安定化Ｆｖ断片（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディー（ｄｓダイアボディー）、一本鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディー）、多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディー、ドメイン抗体および二価ドメイン抗体が挙げられる。抗原結合断片は、親抗体が結合する同一抗原と結合可能である。特定の実施形態では、抗原結合断片は、１種または複数の異なるヒト抗体に由来するフレームワーク領域にグラフトされた特定のヒト抗体に由来する１つまたは複数のＣＤＲを含み得る。
【００３９】
抗体に関して「Ｆａｂ」とは、ジスルフィド結合によって単一重鎖の可変領域および第１の定常領域と結合している単一軽鎖（可変および定常領域の両方）からなる抗体の部分を指す。
【００４０】
「Ｆａｂ’」とは、ヒンジ領域の部分を含むＦａｂ断片を指す。
【００４１】
「Ｆ（ａｂ’）２」とは、Ｆａｂ’の二量体を指す。
【００４２】
抗体に関して「Ｆｃ」とは、ジスルフィド結合を介して第２の重鎖の第２および第３の定常領域と結合している、第１の重鎖の第２および第３の定常領域からなる抗体の部分を指す。抗体のＦｃ部分は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣなどの種々のエフェクター機能に関与するが、抗原結合における機能に関与しない。
【００４３】
抗体に関して「Ｆｖ」とは、完全抗原結合部位を有するための抗体の最小断片を指す。Ｆｖ断片は、単一重鎖の可変領域と結合している単一軽鎖の可変領域からなる。
【００４４】
「一本鎖Ｆｖ抗体」または「ｓｃＦｖ」とは、互いに直接またはペプチドリンカー配列を介して接続している軽鎖可変領域および重鎖可変領域からなる遺伝子操作された抗体を指す（Ｈｕｓｔｏｎ  ＪＳら  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第８５巻：５８７９頁（１９８８年））。「一本鎖Ｆｖ−Ｆｃ抗体」または「ｓｃＦｖ−Ｆｃ」とは、抗体のＦｃ領域と接続しているｓｃＦｖからなる遺伝子操作された抗体を指す。
【００４５】
「ラクダ化単一ドメイン抗体」、「重鎖抗体」または「ＨＣＡｂ」とは、２つのＶＨドメインを含有し、軽鎖を含有しない抗体を指す（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｌ．およびＭｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ．、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．１２月１０日；第２３１巻（１−２号）：２５〜３８頁（１９９９年）；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｓ．、Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  Ｊｕｎ；第７４巻（４号）：２７７〜３０２頁（２００１年）；ＷＯ９４／０４６７８；ＷＯ９４／２５５９１；米国特許第６，００５，０７９号）。重鎖抗体は、元々、ラクダ科〔Camelidae〕（ラクダ、ヒトコブラクダおよびラマ）に由来していた。ラクダ化抗体は、軽鎖を欠くが、信頼のおける抗原結合レパートリーを有する（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  Ｃ．ら、Ｎａｔｕｒｅ．６月３日；第３６３巻（６４２８号）：４４６〜８頁（１９９３年）；Ｎｇｕｙｅｎ  ＶＫ．ら「Ｈｅａｖｙ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  Ｃａｍｅｌｉｄａｅ；  ａ  ｃａｓｅ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ」、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ．４月；第５４巻（１号）：３９〜４７頁（２００２年）；Ｎｇｕｙｅｎ  ＶＫ．らＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．５月；第１０９巻（１号）：９３〜１０１頁（２００３年））。重鎖抗体の可変ドメイン（ＶＨＨドメイン）は、適応免疫応答によって生じた最小の既知抗原結合単位に相当する（Ｋｏｃｈ−Ｎｏｌｔｅ  Ｆ．ら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１１月；第２１巻（１３号）：３４９０〜８頁．  Ｅｐｕｂ  ２００７年６月１５日（２００７年））。
【００４６】
「ナノボディー」とは、重鎖抗体に由来するＶＨＨドメインおよび２つの定常ドメイン、ＣＨ２およびＣＨ３からなる抗体断片を指す。
【００４７】
「ダイアボディー」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を含み、この断片は、同一ポリペプチド鎖中でＶＬドメインと接続しているＶＨドメイン（ＶＨ−ＶＬまたはＶＬ−ＶＨ）を含む（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．７月１５日；第９０巻（１４号）：６４４４〜８頁（１９９３年）；ＥＰ４０４０９７；ＷＯ９３／１１１６１を参照のこと）。同一鎖上の２つのドメイン間で対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインが、別の鎖の相補的ドメインと対を形成するようにされ、それによって、２つの抗原結合部位を作製する。抗原結合部位は、異なる抗原（またはエピトープ）の同一のものを標的とし得る。
【００４８】
「ドメイン抗体」とは、重鎖の可変領域または軽鎖の可変領域のみを含有する抗体断片を指す。特定の例では、２つまたはそれ以上のＶＨドメインは、ペプチドリンカーと共有結合によって結合されて、二価または多価ドメイン抗体を作製する。二価ドメイン抗体の２つのＶＨドメインは、同一または異なる抗原を標的とし得る。
【００４９】
特定の実施形態では、「（ｄｓＦｖ）２」は、３つのペプチド鎖：ペプチドリンカーによって連結され、２つのＶＬ部分とジスルフィド橋によって結合されている２つのＶＨ部分を含む。
【００５０】
特定の実施形態では、「二重特異性ｄｓダイアボディー」は、ＶＨ１およびＶＬ１の間のジスルフィド橋を介してＶＬ１−ＶＨ２（同様にペプチドリンカーによって連結された）と結合しているＶＨ１−ＶＬ２（ペプチドリンカーによって連結された）を含む。
【００５１】
特定の実施形態では、「二重特異性ｄｓＦｖ」またはｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’」は、３つのペプチド鎖：重鎖がペプチドリンカー（例えば、長い可動性リンカー）によって連結され、ジスルフィド橋を介してそれぞれ、ＶＬ１およびＶＬ２部分と結合しており、各ジスルフィド対形成された重鎖および軽鎖が異なる抗原特異性を有する、ＶＨ１−ＶＨ２部分を含む。
【００５２】
特定の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、別のＶＨ−ＶＬ部分と二量体化されたＶＨ−ＶＬ（ペプチドリンカーによって連結された）を含み、その結果、一方の部分のＶＨのものが、もう一方の部分のＶＬと協調し、同一抗原（またはエピトープ）または異なる抗原（またはエピトープ）を標的化し得る２つの結合部位を形成する、二価ダイアボディーまたは二価ＳｃＦｖ（ＢｓＦｖ）である。その他の実施形態では、「ｓｃＦｖ二量体」は、ＶＬ１−ＶＨ２（同様にペプチドリンカーによって連結された）と会合しているＶＨ１−ＶＬ２（ペプチドリンカーによって連結された）を含み、その結果、ＶＨ１およびＶＬ１が協調し、ＶＨ２およびＶＬ２が協調し、各協調対が異なる抗原特異性を有する二重特異性ダイアボディーである。
【００５３】
抗体または抗原結合断片に関して用語「完全ヒト」とは、本明細書において、抗体または抗原結合断片が、ヒトもしくはヒト免疫細胞によって生成された、またはヒト抗体レパートリーもしくはその他のヒト抗体をコードする配列を利用するトランスジェニック非ヒト動物などの非ヒト供給源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列（単数または複数）を有する、またはからなることを意味する。特定の実施形態では、完全ヒト抗体は、非ヒト抗体に由来するアミノ酸残基（特に、抗原結合残基）を含まない。
【００５４】
抗体または抗原結合断片に関して用語「ヒト化」とは、本明細書において、抗体または抗原結合断片が、非ヒト動物に由来するＣＤＲ、ヒトに由来するＦＲ領域、適用可能な場合には、ヒトに由来する定常領域を含むことを意味する。ヒト化抗体または抗原結合断片は、特定の実施形態では、ヒトにおいて低減された免疫原性を有するので、ヒト治療薬として有用である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、モルモットまたはハムスターである。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体または抗原結合断片は、非ヒトであるＣＤＲ配列を除く実質的にすべてのヒト配列から構成される。いくつかの実施形態では、ヒトに由来するＦＲ領域は、それが由来するヒト抗体と同一のアミノ酸配列を含み得る、またはいくつかのアミノ酸変更、例えば、例えば、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１つ以下のアミノ酸の変更を含み得る。いくつかの実施形態では、このようなアミノ酸の変更は、重鎖ＦＲ領域中にのみ、軽鎖ＦＲ領域中にのみまたは両方の鎖中に存在し得る。いくつかの好ましい実施形態では、ヒト化抗体は、ヒトＦＲ１−３およびヒトＪＨおよびＪκを含む。
【００５５】
用語「キメラ」とは、本明細書において、ある種に由来する重鎖および／または軽鎖の一部ならびに別の種に由来する重鎖および／または軽鎖の残りを有する抗体または抗原結合断片を意味する。例示的例では、キメラ抗体は、ヒトに由来する定常領域およびマウスなどに由来する非ヒト種に由来する可変領域を含み得る。
【００５６】
「ＰＣＳＫ９」は、本明細書において、分泌スブチラーゼ〔subtilase〕ファミリーのプロテイナーゼＫサブファミリーに属するプロタンパク質転換酵素スブチリシン／ケキシン９型、天然に存在するヒトプロタンパク質転換酵素を指す。ＰＣＳＫ９は、可溶性チモーゲンとして合成され、これが小胞体において自己触媒的分子内プロセシングを受け、プロタンパク質転換酵素として機能すると考えられている。ＰＣＳＫ９は、血液コレステロールレベルの調節において重要な役割を有する。ＰＣＳＫ９の機能獲得型変異（例えば、Ｓ１２７Ｒ、Ｆ２１６ＬおよびＤ３７４Ｙ）は、常染色体優性家族性高コレステロール血症の形態と関連している可能性があり、ＰＣＳＫ９変異体は、ＬＤＬ受容体のレベルを増強する。例えば、Ｂｕｒｎｅｔｔ  ａｎｄ  Ｈｏｏｐｅｒ，Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｒｅｖ（２００８）２９（１）：１１−２６、Ｂｅｎｊａｎｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，（２００４）２７９（４７）：４８８６５−４８８７５およびＦａｓａｎｏ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．（２００９）２０３（１）：１６６−７１を参照のこと。ヒトＰＣＳＫ９の代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＰ＿７７７５９６．２の下で公開されており、ヒトＰＣＳＫ９をコードする代表的なｍＲＮＡ核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＦＪ５２５８８０．１の下で示されている。特定の実施形態では、用語ＰＣＳＫ９は、グリコシル化、ＰＥＧ化ＰＣＳＫ９配列、シグナル配列が切断されているＰＣＳＫ９配列またはプロドメインが触媒ドメインから切断されているが、触媒ドメインから分離されていないＰＣＳＫ９配列などのＰＣＳＫ９アミノ酸配列の翻訳後修飾のＰＣＳＫ９分子を包含する。
【００５７】
「ＬＤＬ−Ｃ」とは、本明細書において、低密度リポタンパク質コレステロールを指し、「ＨＤＬ−Ｃ」とは、高密度リポタンパク質コレステロールを指す。ＬＤＬおよびＨＤＬは、リポタンパク質の５つの主要な群：カイロミクロン、超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）、中密度リポタンパク質（ＩＤＬ）、低密度リポタンパク質および高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）（最大粒子から最も高密度（最小粒子）への順で）内にある。ＬＤＬ（「悪玉」コレステロール含有粒子）は、脂質／ステロール分子、例えば、コレステロール（すなわち、ＬＤＬ−Ｃ）を動脈壁に輸送し、マクロファージを引きつけ、したがって、アテローム性動脈硬化症を引き起こすことができる。対照的に、ＨＤＬ（「善玉」コレステロール含有粒子）は、動脈の壁においてマクロファージから脂質分子、例えば、コレステロール（すなわち、ＨＤＬ−Ｃ）を除去できる。したがって、高レベルのＬＤＬ−Ｃは、末梢動脈疾患、冠動脈疾患（ＣＡＤ、例えば、狭心症および心筋梗塞（一般に心臓発作として知られる）、高脂血症、高コレステロール血症または高トリグリセリド血症）、アテローム性動脈硬化症、卒中、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心不整脈、先天性心疾患、弁膜症性心疾患、心炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、肥満症、胆汁うっ滞性肝臓疾患、ネフローゼ症候群、甲状腺機能低下症および静脈血栓症またはそれらの組合せなどの心血管疾患（ＣＶＤ）の主要なリスクである。
【００５８】
「ＬＤＬ−Ｒ」または「ＬＤＬ受容体」は、ＬＤＬ−Ｃのエンドサイトーシスを媒介し、血液からＬＤＬ−Ｃを除去する８３９個のアミノ酸の（２１個のアミノ酸のシグナルペプチドの除去後の）細胞表面タンパク質である。ヒトＬＤＬ−Ｒの代表的なアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｐ０１１３０．１の下で開示されており、ヒトＬＤＬ−Ｒをコードする代表的なｍＲＮＡ核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＭ＿０００５２７．４の下で示されている。ＰＣＳＫ９がＬＤＬ受容体と結合すると、受容体は分解され、血液からＬＤＬ−Ｃを除去できない。対照的に、ＰＣＳＫ９が遮断されると、より多くのＬＤＬ受容体が肝臓の表面に存在することとなり、血液からより多くのＬＤＬコレステロールを除去することとなる。「抗ＰＣＳＫ９抗体」とは、本明細書において、ＰＣＳＫ９（例えば、ヒトまたはサルＰＣＳＫ９）と、診断的および／または治療的使用のために提供するのに十分である親和性で特異的に結合可能である抗体を指す。
【００５９】
用語「特異的結合」または「特異的に結合する」とは、本明細書において、例えば、抗体および抗原の間などの２つの分子間の非ランダム結合反応を指す。特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片は、ヒトおよび／またはＰＣＳＫ９と、≦１０−６Ｍ（例えば、≦５×１０−７Ｍ、≦２×１０−７Ｍ、≦１０−７Ｍ、≦５×１０−８Ｍ、≦２×１０−８Ｍ、≦１０−８Ｍ、≦５×１０−９Ｍ、≦２×１０−９Ｍ、≦１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ）の結合親和性（ＫＤ）で特異的に結合する。ＫＤとは、本明細書において、結合速度に対する解離速度の割合（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）を指し、表面プラズモン共鳴法を使用して、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅなどの機器を使用して決定され得る。
【００６０】
「結合を遮断する」または「同一エピトープについて競合する」能力とは、本明細書において、抗体または抗原結合断片の、２つの分子（例えば、ヒトＰＣＳＫ９および抗ＰＣＳＫ９抗体）の間の結合相互作用を、任意の検出可能な程度に阻害する能力を指す。特定の実施形態では、２つの分子間の結合を遮断する抗体または抗原結合断片は、２つの分子間の結合相互作用を少なくとも５０％阻害する。特定の実施形態では、この阻害は、６０％超、７０％超、８０％超または９０％超であり得る。
【００６１】
用語「エピトープ」は、本明細書において、抗体が結合する、抗原上の原子またはアミノ酸の特定の群を指す。２種の抗体は、抗原について競合結合を示す場合には、抗原内の同一エピトープと結合し得る。例えば、もしも、本明細書において開示されるような抗体または抗原結合断片が１１．４、１８．１５６．８、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７、１９．３．８、４０４０９などの例示的抗体のヒトＰＣＳＫ９との結合を遮断するならば、そのとき、抗体または抗原結合断片は、例示的抗体と同一のエピトープと結合すると考えられ得る。
【００６２】
本明細書において提供されるような抗体名に使用される種々の記号は、種々の表現のものである：「ｈＩｇＧ４」とは、ＩｇＧ４アイソタイプのヒト定常領域を有する抗体を指し、「ｕＡｂ」とは、ヒト抗体を指し、ｕＡｂ１、ｕＡｂ２などは、ヒト抗体の種々の形を指し、「Ｋ」または「Ｌ」とは、κまたはλ軽鎖を使用する抗体を指す。
【００６３】
「１１．４」とは、本明細書において、配列番号７３の重鎖可変領域および配列番号７５の軽鎖可変領域を有する完全ヒトモノクローナル抗体を指す。抗体「１１．４．１」は、１１．４のサブクローンである。
【００６４】
「１８．１５６．８」とは、本明細書において、配列番号７７の重鎖可変領域および配列番号７９の軽鎖可変領域を有する完全ヒトモノクローナル抗体を指す。「１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）」とは、本明細書において、ＩｇＧ４アイソタイプのヒト定常領域を有する１８．１５６．８の抗体を指す。
【００６５】
「１５．１４．２」とは、本明細書において、配列番号８１の重鎖可変領域および配列番号８３の軽鎖可変領域を有する完全ヒトモノクローナル抗体を指す。「１５．１４．２−ｕＡｂ−ＩｇＧ４Ｌ」とは、本明細書において、ＩｇＧ４アイソタイプのヒト定常領域を有する１５．１４．２の完全ヒトモノクローナル抗体を指す。
【００６６】
「１７．７２．３」とは、本明細書において、配列番号８５の重鎖可変領域および配列番号８７の軽鎖可変領域を有する完全ヒトモノクローナル抗体を指す。「１７．７２．３−ｕＡｂ１−ＩｇＧ４Ｋ」および「１７．７２．３−ｕＡｂ２−ＩｇＧ４Ｋ」とは、本明細書において、ＩｇＧ４アイソタイプのヒト定常領域を有する１７．７２．３の完全ヒトモノクローナルの種々の形を指す。
【００６７】
「１８．１３６．７」とは、本明細書において、配列番号８９の重鎖可変領域および配列番号９１の軽鎖可変領域を有する完全ヒトモノクローナル抗体を指す。「１８．１３６．７−ＩｇＧ４Ｋ」とは、本明細書において、ＩｇＧ４アイソタイプのヒト定常領域を有する１８．１３６．７の完全ヒトモノクローナルを指す。
【００６８】
「１９．３．８」とは、本明細書において、配列番号９３の重鎖可変領域および配列番号９５の軽鎖可変領域を有する完全ヒトモノクローナル抗体を指す。「１９．３．８−ｕＡｂ１−ＩｇＧ４Ｌ」とは、本明細書において、ＩｇＧ４アイソタイプのヒト定常領域を有する１９．３．８の完全ヒトモノクローナルを指す。
【００６９】
「４０４０９」とは、本明細書において、配列番号９７の重鎖可変領域および配列番号９９の軽鎖可変領域を含む１１．４をベースとする遺伝子操作された抗体を指す。４０４０９は、その親抗体１１．４と比較して改善された親和性を有する。「４０４０９（ｈＩｇＧ４）」および「４０４０９（ｈＩｇＧ２）」とは、本明細書において、それぞれＩｇＧ４アイソタイプおよびＩｇＧ２アイソタイプのヒト定常領域を有する４０４０９の完全ヒトモノクローナルを指す。
【００７０】
「保存的置換」とは、アミノ酸配列に関して、アミノ酸残基を、同様の生理化学的特性を有する側鎖を有する異なるアミノ酸残基と置換することを指す。例えば、保存的置換は、疎水性側鎖を有するアミノ酸残基（例えば、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅ）の間で、中性親水性側鎖を有する残基（例えば、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎおよびＧｌｎ）の間で、酸性側鎖を有する残基（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）の間で、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＡｒｇ）の間で、または芳香族側鎖を有する残基（例えば、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＰｈｅ）の間で行われ得る。当技術分野で公知であるように、保存的置換は、通常、タンパク質のコンホメーション構造において重大な変化を引き起こさず、従って、タンパク質の生物活性を保持し得る。
【００７１】
アミノ酸配列（または核酸配列）に関して「配列同一性パーセント（％）」は、最大数の同一アミノ酸（または核酸）を達成するように、配列をアラインし、必要に応じて、ギャップを導入した後の、参照配列中のアミノ酸（または核酸）残基と同一である、候補配列中のアミノ酸（または核酸）残基のパーセンテージとして定義される。アミノ酸残基の保存的置換は、同一残基と考えられる場合も考えられない場合もある。アミノ酸（または核酸）配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴｐ（Ｕ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで入手可能、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  Ｓ．Ｆ．ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２１５巻：４０３〜４１０頁（１９９０年）；Ｓｔｅｐｈｅｎ  Ｆ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、第２５巻：３３８９〜３４０２頁（１９９７年）も参照のこと）、ＣｌｕｓｔａｌＷ２（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅのウェブサイトで入手可能、Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第２６６巻：３８３〜４０２頁（１９９６年）；Ｌａｒｋｉｎ  Ｍ．Ａ．ら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ（Ｏｘｆｏｒｄ、Ｅｎｇｌａｎｄ）、第２３巻（２１号）：２９４７〜８頁（２００７年）も参照のこと）およびＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なツールを使用して達成され得る。当業者は、ツールによって提供されるデフォルトパラメータを使用してもよく、またはアラインメントにとって必要に応じて、例えば、適したアルゴリズムを選択することなどによって、パラメータをカスタマイズしてもよい。
【００７２】
「エフェクター機能」とは、本明細書において、抗体のＦｃ領域の、Ｃ１複合体およびＦｃ受容体などのそのエフェクターとの結合に起因する生物学的活性を指す。例示的エフェクター機能は、抗体およびＣ１複合体上のＣ１ｑの相互作用によって誘導される補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体のＦｃ領域の、エフェクター細胞上のＦｃ受容体との結合によって誘導される抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）、および食作用を含む。
【００７３】
状態を「処置すること」または「処置」とは、本明細書において、状態を予防することまたは軽減すること、状態の発症または発生の速度を減速すること、状態の発生のリスクを低減すること、状態と関連する症状の発生を予防することまたは遅延すること、状態と関連する症状を低減することまたは終了させること、状態の完全なまたは部分的な退縮をもたらすこと、状態を治癒させることまたはそれらのいくつかの組合せを含む。
【００７４】
「単離された」物質は、天然状態から人の手によって変更されている。「単離された」組成物または物質が天然に生じる場合には、元の環境から変化されている、または取り出されている、または両方である。例えば、生存する動物中に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離されて」いないが、同一ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、実質的に純粋な状態で存在するようにその天然状態の共存する材料から十分に分離されている場合には「単離されている」。特定の実施形態では、抗体および抗原結合断片は、電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、キャピラリー電気泳動など）またはクロマトグラフィー法（イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相ＨＰＬＣなど）によって決定されるような、少なくとも９０％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の純度を有する。
【００７５】
用語「ベクター」とは、本明細書において、タンパク質をコードするポリヌクレオチドが、そのタンパク質の発現を引き起こすように作動可能に挿入され得る媒体を指す。ベクターは、宿主細胞内に運ぶ遺伝要素の発現を引き起こすように、宿主細胞を形質転換、形質導入またはトランスフェクトするために使用され得る。ベクターの例として、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）またはＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）などの人工染色体、λファージまたはＭ１３ファージなどのバクテリオファージおよび動物ウイルスが挙げられる。ベクターとして使用される動物ウイルスのカテゴリーとして、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルスおよびパポーバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が挙げられる。ベクターは、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択可能要素およびリポーター遺伝子を含む、発現を制御するための種々の要素を含有し得る。さらに、ベクターは、複製起点を含有し得る。ベクターはまた、限定されるものではないが、ウイルス粒子、リポソームまたはタンパク質コーティングを含む、細胞へのその侵入を補助するための材料を含み得る。
【００７６】
語句「宿主細胞」とは、本明細書において、外因性ポリヌクレオチドおよび／またはベクターが導入されている細胞を指す。
【００７７】
「ＰＣＳＫ９によって媒介される疾患または状態」とは、本明細書において、ＰＣＳＫ９の変化、例えば、発現レベルにおける、活性における変化および／またはＰＣＳＫ９の変異体もしくは変異の存在によって引き起こされる、またはそれを特徴とする疾患または状態を指す。ＰＣＳＫ９によって媒介される疾患または状態の例として、それだけには限らないが、脂質障害、高リポ蛋白血症、高脂血症、脂質代謝異常、高コレステロール血症、心臓発作、卒中、冠動脈心疾患、アテローム性動脈硬化症、末梢血管疾患、跛行、ＩＩ型糖尿病、高血圧症、心血管疾患または状態、炎症性または自己免疫性疾患または状態が挙げられる。上記の疾患または状態の同定／診断方法は、当技術分野で公知である。ＣＶＤ（例えば、急性心筋梗塞（ＡＭＩ）、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）、卒中およびＣＶ死）を処置するための、本明細書において開示される抗体または抗原結合断片の使用に関して、「治療上有効な量」とは、本明細書において、血漿もしくは血清中の脂質（例えば、コレステロール）を低下可能な、ＣＶＤ状態と関連する任意の症状もしくはマーカーを寛解可能な、ＣＶＤ状態の発生を防止もしくは遅延可能な、またはそれらのいくつかの組合せの、抗体または抗原結合断片の投与量または濃度を指す。
【００７８】
用語「医薬上許容される」は、指定された担体、ビヒクル、希釈剤、賦形剤（単数または複数）および／または塩が、一般に、製剤を含むその他の成分と化学的におよび／または物理的に適合しており、そのレシピエントと生理学的に適合していることを示す。
【００７９】
―抗ＰＣＳＫ９抗体―
特定の実施形態では、本開示は、例示的完全ヒトモノクローナル抗体１１．４、１８．１５６．８、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７、１９．３．８、４０４０９を提供し、そのＣＤＲ配列は、以下の表１に示されており、重鎖または軽鎖可変領域配列も以下に示されている。
【００８０】
【表１−１】
2020502991.tif 000003
【表１−２】
2020502991.tif 000004
【表１−３】
2020502991.tif 000005
【００８１】
１１．４−ＶＨ：
【００８２】
アミノ酸配列（配列番号７３）：
【化１】
2020502991.tif 000006
【００８３】
核酸配列（配列番号７４）
【化２】
2020502991.tif 000007
【００８４】
１１．４−ＶＬ：
【００８５】
アミノ酸配列（配列番号７５）：
【化３】
2020502991.tif 000008
【００８６】
核酸配列（配列番号７６）
【化４】
2020502991.tif 000009
【００８７】
１８．１５６．８−ＶＨ
【００８８】
アミノ酸配列（配列番号７７）：
【化５】
2020502991.tif 000010
【００８９】
核酸配列（配列番号７８）
【化６】
2020502991.tif 000011
【００９０】
１８．１５６．８−ＶＬ
【００９１】
アミノ酸配列（配列番号７９）：
【化７】
2020502991.tif 000012
【００９２】
核酸配列（配列番号８０）
【化８】
2020502991.tif 000013
【００９３】
１５．１４．２−ＶＨ
【００９４】
アミノ酸配列（配列番号８１）：
【化９】
2020502991.tif 000014
【００９５】
核酸配列（配列番号８２）
【化１０】
2020502991.tif 000015
【００９６】
１５．１４．２−ＶＬ
【００９７】
アミノ酸配列（配列番号８３）：
【化１１】
2020502991.tif 000016
【００９８】
核酸配列（配列番号８４）
【化１２】
2020502991.tif 000017
【００９９】
１７．７２．３−ＶＨ
【０１００】
アミノ酸配列（配列番号８５）：
【化１３】
2020502991.tif 000018
【０１０１】
核酸配列（配列番号８６）
【化１４】
2020502991.tif 000019
【０１０２】
１７．７２．３−ＶＬ
【０１０３】
アミノ酸配列（配列番号８７）：
【化１５】
2020502991.tif 000020
【０１０４】
核酸配列（配列番号８８）
【化１６】
2020502991.tif 000021
【０１０５】
１８．１３６．７−ＶＨ
【０１０６】
アミノ酸配列（配列番号８９）：
【化１７】
2020502991.tif 000022
【０１０７】
核酸配列（配列番号９０）
【化１８】
2020502991.tif 000023
【０１０８】
１８．１３６．７−ＶＬ
【０１０９】
アミノ酸配列（配列番号９１）：
【化１９】
2020502991.tif 000024
【０１１０】
核酸配列（配列番号９２）
【化２０】
2020502991.tif 000025
【０１１１】
１９．３．８−ＶＨ
【０１１２】
アミノ酸配列（配列番号９３）：
【化２１】
2020502991.tif 000026
【０１１３】
核酸配列（配列番号９４）
【化２２】
2020502991.tif 000027
【０１１４】
１９．３．８−ＶＬ
【０１１５】
アミノ酸配列（配列番号９５）：
【化２３】
2020502991.tif 000028
【０１１６】
核酸配列（配列番号９６）
【化２４】
2020502991.tif 000029
【０１１７】
４０４０９−ＶＨ
【０１１８】
アミノ酸配列（配列番号９７）：
【化２５】
2020502991.tif 000030
【０１１９】
核酸配列（配列番号９８）
【化２６】
2020502991.tif 000031
【０１２０】
４０４０９−ＶＬ
【０１２１】
アミノ酸配列（配列番号９９）：
【化２７】
2020502991.tif 000032
【０１２２】
核酸配列（配列番号１００）
【化２８】
2020502991.tif 000033
【０１２３】
特定の実施形態では、本明細書において提供される１つまたは複数のＣＤＲ配列は、得られる抗体が１つまたは複数の特性において親抗体を上回って改善されるように（例えば、抗原結合の改善、グリコシル化パターンの改善、ＣＤＲ残基でのグリコシル化のリスクの低減、ＣＤＲ残基での脱アミノ化の低減、薬物動態半減期の増大、ｐＨ感受性およびコンジュゲーションに対する適合性）、そうでなければ、親抗体と比較可能である（すなわち、そうでなければ、上記の修飾または変更を除いて、ＣＤＲ配列の同一のセットを有する抗体）、または親抗体の抗原結合特性を少なくとも実質的に保持するように、修飾または変更され得る。
【０１２４】
当業者ならば、表１に提供されるＣＤＲ配列は、ヒトＰＣＳＫ９との結合親和性の改善などの生物活性の改善を提供するように、アミノ酸の１つまたは複数の置換を含有するように修飾され得るということを理解するであろう。例えば、抗体変異体（ＦａｂまたはｓｃＦｖ変異体など）のライブラリーが作製され、ファージディスプレイ技術を用いて発現され、次いで、ヒトＰＣＳＫ９との結合親和性についてスクリーニングされ得る。別の例については、抗体の、ヒトＰＣＳＫ９との結合をコンピュータ上でシミュレートし、結合面を形成する抗体上のアミノ酸残基を同定するためにコンピュータソフトウェアが使用され得る。このような残基は、結合親和性の低下を防ぐために置換において避けられるか、またはより強力な結合を提供するために置換のために標的とされるかのいずれかであり得る。特定の実施形態では、ＣＤＲ配列中の置換（単数または複数）のうち少なくとも１つ（またはすべて）は、保存的置換である。
【０１２５】
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、表１に列挙されるもの（単数または複数）に対して、少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有する、１つまたは複数のＣＤＲ配列を含み、その一方で、対応するＣＤＲ配列が、表１に列挙されるもの（単数または複数）に対して１００％の配列同一性にある場合を除いて、ヒトＰＣＳＫ９に対して、実質的に同一の配列を有するその親抗体と同様またはさらにより高いレベルの結合親和性を保持する。
【０１２６】
特定の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合断片は、完全ヒトである。これらの完全ヒト抗体は、ヒトＰＣＳＫ９に対する結合親和性を、好ましくは、例示的抗体１１．４、１８．１５６．８、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７、１９．３．８、４０４０９のうち１種と同様のレベルで保持する。
【０１２７】
また、同一エピトープについて、本明細書において提供される抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合断片と競合する、抗体および抗原結合断片も本明細書において考慮される。特定の実施形態では、抗体は、１１．４、１８．１５６．８、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７、１９．３．８、４０４０９の、ヒトまたはサルＰＣＳＫ９との結合を、例えば、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−７．５Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−８．５Ｍ未満、１０−９Ｍ未満または１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満または１０−１２Ｍ未満のＩＣ５０値（すなわち、５０％阻害濃度）で遮断する。ＩＣ５０値は、ＥＬＩＳＡアッセイおよび放射性リガンド競合結合アッセイなどの競合アッセイに基づいて決定される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合断片は、表面プラズモン共鳴結合アッセイまたはＥＬＩＳＡによって測定されるものとして、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下または１０−１０Ｍ以下（例えば、≦２．５×１０−８Ｍ、≦２×１０−８Ｍ、≦７．５×１０−９Ｍ、≦３．５×１０−９Ｍ、≦７×１０−１０Ｍ、≦６×１０−１０Ｍ、≦５×１０−１０Ｍ、≦２．５×１０−１０Ｍ、≦２×１０−１０Ｍ、≦１．５×１０−１０Ｍ、≦７．５×１０−１１Ｍ、≦６．５×１０−１１Ｍまたは≦５．５×１０−１１Ｍ）の結合親和性（Ｋｄ）でヒトＰＣＳＫ９および／またはサルと特異的に結合可能である。結合親和性は、抗原および抗原結合分子間の結合が平衡に達する場合に、結合速度に対する解離速度の割合（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）として算出されるＫＤ値によって表され得る。抗原結合親和性（例えば、ＫＤ）は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅなどの機器を使用する表面プラズモン共鳴結合アッセイを含む当技術分野で公知の適した方法を使用して適宜決定され得る（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ、第１９章、１９．１４単元、２００６年を参照のこと）。
【０１２９】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体およびその断片は、ヒトＰＣＳＫ９と、０．０１ｎＭ〜０．２ｎＭ（例えば、０．０２ｎＭ〜０．２ｎＭ、０．０２ｎＭ〜０．１５ｎＭ、０．０２ｎＭ〜０．０５ｎＭ、０．０１ｎＭ〜０．０５ｎＭまたは０．０２ｎＭ〜０．３ｎＭ）のＥＣ５０（すなわち、５０％結合濃度）で結合する。抗体のヒトＰＣＳＫ９との結合は、当技術分野で公知の方法、例えば、ＥＬＩＳＡなどのサンドイッチアッセイ、ウエスタンブロット、その他の結合アッセイによって測定され得る。例示的例では、試験抗体（すなわち、第１の抗体）は、固定化されたヒトＰＣＳＫ９と結合することが可能にされ、結合していない抗体を洗浄除去した後に、結合している第１の抗体と結合でき、その検出を可能にする標識された二次抗体が導入される。検出は、固定化されたＰＣＳＫ９が使用される場合にはマイクロプレートリーダーを用いて実施され得る。
【０１３０】
特定の実施形態では、本明細書において提供される抗体およびその断片は、ヒトＰＣＳＫ９の、ヒトＬＤＬ受容体との結合を、競合アッセイにおいて測定されるような０．５ｎＭ〜３ｎＭ（例えば、０．５ｎＭ〜２．５ｎＭ、１ｎＭ〜２．５ｎＭ、１ｎＭ〜２ｎＭまたは１ｎＭ〜１．５ｎＭ）のＩＣ５０で阻害する。
【０１３１】
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、ヒトＰＣＳＫ９のものと同様の結合親和性でサルＰＣＳＫ９と結合する。例えば、例示的抗体１１．４、１８．１５６．８、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７、１９．３．８、４０４０９のサルＰＣＳＫ９との結合は、ヒトＰＣＳＫ９のものと同様の親和性またはＥＣ５０値で結合する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合断片は、免疫グロブリン定常領域をさらに含む。いくつかの実施形態では、免疫グロブリン定常領域は、重鎖および／または軽鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ１−ＣＨ２またはＣＨ１−ＣＨ３領域を含む。いくつかの実施形態では、定常領域は、所望の特性を付与するように１つまたは複数の修飾をさらに含み得る。例えば、定常領域は、１種もしくは複数のエフェクター機能を低減もしくは枯渇させるように、ＦｃＲｎ受容体結合を改善するように、または１つまたは複数のシステイン残基を導入するように修飾され得る。いくつかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合断片は、エフェクター機能が低減している、または枯渇しているＩｇＧ４アイソタイプの定常領域を有する。種々のアッセイ、例えば、Ｆｃ受容体結合アッセイ、Ｃ１ｑ結合アッセイおよび細胞溶解アッセイが、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を評価すると知られており、当業者によって容易に選択され得る。
【０１３３】
特定の実施形態では、抗体およびその抗原結合断片は、抗体−薬物コンジュゲート、二重特異性または多価抗体の基礎として使用され得る。
【０１３４】
本明細書において提供される抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、二重特異性抗体、標識された抗体、二価抗体または抗イディオタイプ抗体であり得る。組換え抗体は、動物においてではなく組換え法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製される抗体である。二重特異性または二価抗体は、２種の異なるモノクローナル抗体の断片を有し、２種の異なる抗原を結合し得る人工抗体である。「二価」である抗体またはその抗原結合断片は、２つの抗原結合部位を含む。２つの抗原結合部位は、同一抗原と結合する場合も、またはそれらは、異なる抗原と各々結合する場合もあり、その場合には、抗体または抗原結合断片は、「二重特異性」と特性決定される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本明細書において提供される抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、完全ヒト抗体である。特定の実施形態では、完全ヒト抗体は、組換え法を使用して調製される。例えば、マウスなどのトランスジェニック動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の導入遺伝子または導入染色体〔transchromosome〕を運び、従って、ヒトＰＣＳＫ９などの適当な抗原を用いた免疫処置後に完全ヒト抗体を産生可能であるように作製され得る。完全ヒト抗体は、このようなトランスジェニック動物から単離され得る、あるいは、トランスジェニック動物の脾臓細胞を、不死細胞株と融合して、完全ヒト抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を作製することによるハイブリドーマ技術によって作製され得る。例示的トランスジェニック動物として、制限するものではないが、ラット免疫グロブリン遺伝子のその内因性発現が不活性化されており、同時に、機能的組換えヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように遺伝子操作されているＯｍｎｉＲａｔ；マウス免疫グロブリン遺伝子のその内因性発現が不活性化されており、同時に、Ｊ−遺伝子座欠失およびＣ−κ変異を有する組換えヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように遺伝子操作されているＯｍｎｉＭｏｕｓｅ；ラット免疫グロブリン遺伝子のその内因性発現が不活性化されており、同時に、単一の共通の再編成されたＶｋＪｋ軽鎖および機能的重鎖を有する組換えヒト免疫グロブリン遺伝子座を含有するように遺伝子操作されているトランスジェニックラットであるＯｍｎｉＦｌｉｃが挙げられる。詳細な情報は、Ｏｓｂｏｒｎ  Ｍ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１３年、第１９０巻：１４８１〜９０頁；Ｍａ  Ｂ．ら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  第４００〜４０１巻（２０１３年）７８〜８６頁；Ｇｅｕｒｔｓ  Ａ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００９年、第３２５巻：４３３頁；米国特許第８，９０７，１５７号；ＥＰ特許第２１５２８８０Ｂ１号；ＥＰ特許第２３３６３２９Ｂ１号でさらに見い出すことができ、そのすべては、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。その他の適したトランスジェニック動物、例えば、ＨｕＭａｂマウス（詳細については、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎ．らＮａｔｕｒｅ第３６８巻（６４７４号）：８５６  ８５９頁（１９９４年）を参照のこと）、Ｘｅｎｏマウス（ＭｅｎｄｅｚらＮａｔ  Ｇｅｎｅｔ．、１９９７年、第１５巻：１４６〜１５６頁）、ＴｒａｎｓＣｈｒｏｍｏマウス（ＩｓｈｉｄａらＣｌｏｎｉｎｇ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００２年、第４巻：９１〜１０２頁）およびＶｅｌｏｃＩｍｍｕｎｅマウス（ＭｕｒｐｈｙらＰｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、２０１４年、第１１１巻：５１５３〜５１５８頁）、Ｋｙｍｏｕｓｅ（ＬｅｅらＮａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２０１４年、第３２巻：３５６〜３６３頁）およびトランスジェニックウサギ（ＦｌｉｓｉｋｏｗｓｋａらＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、２０１１年、第６巻：ｅ２１０４５）も使用され得る。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合断片は、ラクダ化単一ドメイン抗体、ダイアボディー、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ二量体、ＢｓＦｖ、ｄｓＦｖ、（ｄｓＦｖ）２、ｄｓＦｖ−ｄｓＦｖ’、Ｆｖ断片、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｄｓダイアボディー、ナノボディー、ドメイン抗体または二価ドメイン抗体である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合断片は、コンジュゲートをさらに含む。種々のコンジュゲートは、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片と連結され得るということは考慮される（例えば、「Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ」、Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎｓ  ｔｏ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊ．  Ｍ．  ＣｒｕｓｅおよびＲ．  Ｅ．  Ｌｅｗｉｓ、Ｊｒ．（編）、Ｃａｒｇｅｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、（１９８９年）を参照のこと）。これらのコンジュゲートは、その他の方法の中でも、共有結合、親和性結合、インターカレーション、配位結合、複合体形成、会合、ブレンドまたは付加によって抗体または抗原結合断片と連結され得る。特定の実施形態では、本明細書において開示される抗体および抗原結合断片は、エピトープ結合部分の外側に、１つまたは複数のコンジュゲートとの結合に利用され得る特異的部位を含有するように遺伝子操作され得る。例えば、このような部位は、コンジュゲートとの共有結合を促進するために、例えば、システインまたはヒスチジン残基などの１つまたは複数の反応性アミノ酸残基を含み得る。特定の実施形態では、抗体は、コンジュゲートと間接的に、または別のコンジュゲートを介して連結され得る。例えば、抗体または抗原結合断片は、ビオチンとコンジュゲートされ、次いで、アビジンとコンジュゲートされている第２のコンジュゲートと間接的にコンジュゲートされ得る。コンジュゲートは、検出可能な標識、薬物動態修飾部分、精製部分または細胞傷害性部分であり得る。検出可能な標識の例として、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、ローダミン、ダンシル、フィコエリトリンまたはテキサスレッド）、酵素基質標識（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ルシフェラーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、糖類オキシダーゼまたはβ−Ｄ−ガラクトシダーゼ）、放射性同位元素（例えば、１２３Ｉ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、３Ｈ、１１１Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１４Ｃ、６４Ｃｕ、６７Ｃｕ、８６Ｙ、８８Ｙ、９０Ｙ、１７７Ｌｕ、２１１Ａｔ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１５３Ｓｍ、２１２Ｂｉおよび３２Ｐ、その他のランタニド、発光標識）、発色団部分、ジゴキシゲニン、ビオチン／アビジン、ＤＮＡ分子または検出用金を挙げることができる。特定の実施形態では、コンジュゲートは、抗体の半減期を増大するのに役立つＰＥＧなどの薬物動態修飾部分であり得る。その他の適したポリマーとして、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなど、エチレングリコール／プロピレングリコールのコポリマーなどが挙げられる。特定の実施形態では、コンジュゲートは、磁性ビーズなどの精製部分であり得る。「細胞傷害性部分」は、細胞にとって有害である、または細胞に損傷を与え得る、または死滅させ得る任意の薬剤であり得る。細胞傷害性部分の例として、制限するものではないが、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラセンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピューロマイシンおよびその類似体、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣおよびシスジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前は、ダウノマイシン）およびドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前は、アクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンおよびアントラマイシン（ＡＭＣ））および抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチンおよびビンブラスチン）が挙げられる。
【０１３８】
―ポリヌクレオチドおよび組換え法―
本開示は、抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合断片をコードする単離されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、表１に提供されるＣＤＲ配列をコードする、表１に示されるような１種または複数のヌクレオチド配列を含む。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、重鎖可変領域をコードし、配列番号２６、配列番号３０、配列番号３４および少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するその相同配列からなる群から選択される配列を含む。いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、軽鎖可変領域をコードし、配列番号２８、配列番号３２、配列番号３６および少なくとも８０％（例えば、少なくとも８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％）の配列同一性を有するその相同配列からなる群から選択される配列を含む。特定の実施形態では、同一性パーセンテージは、遺伝暗号縮重に起因し、コードされるタンパク質配列は、変更されないままである。
【０１４０】
抗ＰＣＳＫ９抗体およびその抗原結合断片（例えば、表１中の配列を含む）をコードする単離されたポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の組換え技術を使用してさらなるクローニング（ＤＮＡの増幅）のために、または発現のためにベクター中に挿入され得る。別の実施形態では、抗体は、当技術分野で公知の相同組換えによって生成され得る。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定される。多数のベクターが入手可能である。ベクター成分は、一般に、限定されるものではないが、以下のうち１種または複数を含む：シグナル配列、複製起点、１種または複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ−１α）および転写終結配列。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ベクター系として、哺乳動物、細菌、酵母系などが挙げられ、限定されるものではないが、ｐＡＬＴＥＲ、ｐＢＡＤ、ｐｃＤＮＡ、ｐＣａｌ、ｐＬ、ｐＥＴ、ｐＧＥＭＥＸ、ｐＧＥＸ、ｐＣＩ、ｐＣＭＶ、ｐＥＧＦＰ、ｐＥＧＦＴ、ｐＳＶ２、ｐＦＵＳＥ、ｐＶＩＴＲＯ，ｐＶＩＶＯ、ｐＭＡＬ、ｐＭＯＮＯ、ｐＳＥＬＥＣＴ、ｐＵＮＯ、ｐＤＵＯ、Ｐｓｇ５Ｌ、ｐＢＡＢＥ、ｐＷＰＸＬ、ｐＢＩ、ｐ１５ＴＶ−Ｌ、ｐＰｒｏ１８、ｐＴＤ、ｐＲＳ４２０、ｐＬｅｘＡ、ｐＡＣＴ２．２など、ならびにその他の実験室および市販のベクターなどのプラスミドを含む。適したベクターとして、プラスミドまたはウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を挙げることができる。
【０１４２】
抗体または抗原結合断片をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターは、クローニングまたは遺伝子発現のために宿主細胞に導入され得る。クローニングに適した、本明細書におけるベクター中でＤＮＡを発現する宿主細胞は、上記の原核生物、酵母または高等真核生物細胞である。この目的に適した原核生物として、グラム陰性またはグラム陽性生物などの真正細菌、例えば、エシェリキア属〔Escherichia〕、例えば、大腸菌〔E.coli〕、エンテロバクター属〔Enterobacter〕、エルウィニア属〔Erwinia〕、クレブシエラ属〔Klebsiella〕、プロテウス属〔Proteus〕、サルモネラ属〔Salmonella〕、例えば、サルモネラ・チフィリウム〔Salmonella typhimurium〕、セラチア属〔Serratia〕、例えば、セラチア・マルセッセンス〔Serratia marcescans〕および赤痢菌属〔Shigella〕ならびにＢ．スブチリス〔subtilis〕およびＢ．リケニフォルミス〔licheniformis〕などのバチルス属〔Bacilli〕、Ｐ．エルジノーサ〔aeruginosa〕などのシュードモナス属〔Pseudomonas〕およびストレプトマイセス属〔Streptomyces〕などの腸内細菌科〔Enterobacteriaceae〕が挙げられる。
【０１４３】
原核生物に加えて、糸状菌または酵母などの真核細胞微生物は、抗ＰＣＳＫ９抗体をコードするベクターの適したクローニングまたは発現宿主である。サッカロミセス・セレビシエ〔Saccharomyces cerevisiae〕または一般的なパン酵母は、下等真核細胞宿主微生物の中で最もよく使用されている。しかし、シゾサッカロミセス・ポンベ〔Schizosaccharomyces pombe〕；例えば、Ｋ．ラクチス〔lactis〕、Ｋ．フラギリス〔fragilis〕(ＡＴＣＣ１２，４２４）、Ｋ．ブルガリクス〔bulgaricus〕（ＡＴＣＣ１６，０４５）、Ｋ．ウィッカーアミー〔wickeramii〕（ＡＴＣＣ２４，１７８）、Ｋ．ワルチー〔waltii〕（ＡＴＣＣ５６，５００）、Ｋ．ドロソフィラルム〔drosophilarum〕（ＡＴＣＣ３６，９０６）、Ｋ．サーモトレランス〔thermotolerans〕およびＫ．マーキシアヌス〔marxianus〕などのクリベロミセス属〔Kluyveromyces〕宿主；ヤロウイア属〔yarrowia〕（ＥＰ４０２，２２６）；ピキア・パストリス〔Pichia pastoris〕（ＥＰ１８３，０７０）；カンジダ属〔Candida〕；トリコデルマ・リーゼイ〔Trichoderma reesia〕（ＥＰ２４４，２３４）；アカパンカビ〔Neurospora crassa〕；シュワニオミセス・オクシデンタリス〔Schwanniomyces occidentalis〕などのシュワニオミセス属〔Schwanniomyces〕；および例えば、アカパンカビ属〔Neurospora〕、アオカビ属〔Penicillium〕、トリポクラジウム属〔Tolypocladium〕ならびにＡ．ニデュランス〔A.nidulans〕およびクロコウジカビ〔A.niger〕などのアスペルギルス属〔Aspergillus〕宿主などの糸状菌などの、いくつかのその他の属、種および株が一般に入手可能であり、本明細書において有用である。
【０１４４】
本明細書において提供されるグリコシル化抗体または抗原断片の発現に適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。脊椎動物細胞における例として、植物および昆虫細胞が挙げられる。多数のバキュロウイルス株および変異体ならびにヨトウガ〔Spodoptera frugiperda〕（イモムシ）、ネッタイシマカ〔Aedes aegypti〕（蚊）、ヒトスジシマカ〔Aedes albopictus〕（蚊）、キイロショウジョウバエ〔Drosophila melanogaster〕（ショウジョウバエ〔fruiffly〕）およびカイコ〔Bombyx mori〕などの宿主に由来する対応する許容昆虫宿主細胞が同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカ〔Autographa californica〕ＮＰＶのＬ−１変異体およびカイコ〔Bombyx mori〕ＮＰＶのＢｍ−５株が公的に入手可能であり、このようなウイルスは、本明細書において、本発明に従って、特に、ヨトウガ〔Spodoptera frugiperda〕細胞のトランスフェクションのためにウイルスとして使用され得る。ワタ、トウモロコシ、ジャガイモ、ダイズ、ペチュニア、トマトおよびタバコの植物細胞培養物も宿主として使用され得る。
【０１４５】
しかし、関心は、脊椎動物細胞において最大であり、培養（組織培養）での脊椎動物細胞の増殖は、日常的な手順となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例として、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）；ヒト胚性腎臓株（２９３または懸濁培養における成長のためにサブクローニングされた２９３細胞、Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．第３６巻：５９頁（１９７７））；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  第７７巻：４２１６頁（１９８０年））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４、Ｍａｔｈｅｒ、Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｐｒｏｄ．第２３巻：２４３〜２５１頁（１９８０年））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）；ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２、ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒら、Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．第３８３巻：４４〜６８頁（１９８２年））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；およびヒト肝細胞腫株（Ｈｅｐ  Ｇ２）がある。いくつかの好ましい実施形態では、宿主細胞は、２９３Ｆ細胞である。
【０１４６】
宿主細胞は、抗ＰＣＳＫ９抗体生成のために上記の発現またはクローニングベクターを用いて形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択するか、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された従来の栄養培地で培養される。
【０１４７】
本明細書において提供される抗体または抗原結合断片を生成するために使用される宿主細胞は、種々の培地で培養され得る。ＨａｍのＦ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）および「ダルベッコ改変イーグル培地」（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などの市販の培地は、宿主細胞を培養するのに適している。さらに、Ｈａｍら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．第５８巻：４４頁（１９７９年）、Ｂａｒｎｅｓら．、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１０２巻：２５５頁（１９８０年）、米国特許第４，７６７，７０４号；同４，６５７，８６６号；同４，９２７，７６２号；同４，５６０，６５５号；または同５，１２２，４６９号；ＷＯ９０／０３４３０；ＷＯ８７／００１９５；または再発行米国特許第３０，９８５号に記載される培地のいずれも、宿主細胞のための培養培地として使用され得る。これらの培地のいずれも、必要に応じて、ホルモンおよび／またはその他の増殖因子（インスリン、トランスフェリンまたは上皮成長因子など）、塩（塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸など）、バッファー（ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（アデノシンおよびチミジンなど）、抗生物質（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬など）、微量元素（マイクロモーラー範囲の最終濃度で通常存在する無機化合物として定義される）およびグルコースまたは同等のエネルギー供給源を用いて補給され得る。任意のその他の必要な栄養補助剤もまた、当業者に公知であろう適当な濃度で含まれ得る。温度、ｐＨなどといった培養状態は、発現のために選択された宿主細胞とともにこれまでに使用されたものであり、当業者には明らかとなろう。
【０１４８】
組換え技術を使用する場合には、抗体は、細胞膜周辺腔において細胞内で生成され得る、または培地中に直接分泌され得る。抗体が細胞内で生成される場合には、第１のステップとして、微粒子状細片、宿主細胞または溶解した断片のいずれかが例えば、遠心分離または限外濾過によって除去される。Ｃａｒｔｅｒら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ第１０巻：１６３〜１６７頁（１９９２年）には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞膜周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順が記載されている。手短には、細胞ペーストが、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡおよびフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在下で約３０分かけて解凍される。細胞細片は、遠心分離によって除去され得る。抗体が培地中に分泌される場合には、このような発現系から得られた上清は、一般に、市販のタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを使用してまず濃縮される。タンパク質分解を阻害するために、ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤が前記のステップのいずれにも含まれ得、外来性の混入物質の成長を防ぐために、抗生物質が含まれ得る。
【０１４９】
細胞から調製される抗体は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、ＤＥＡＥ−セルロースイオン交換クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、塩析およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製され得、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに応じて変わる。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２またはγ４重鎖をベースとする抗体を精製するために使用され得る（Ｌｉｎｄｍａｒｋら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．第６２巻：１〜１３頁（１９８３年））。プロテインＧは、すべてのマウスアイソタイプに対して、およびヒトγ３に対して推奨される（Ｇｕｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．第５巻：１５６７  １５７５（１９８６年））。親和性リガンドが付着されるマトリックスは、最も多くはアガロースであるが、その他のマトリックスが利用可能である。コントロールドポアガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリックスは、アガロースを用いて達成され得るものよりも迅速な流速およびより短い処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合には、精製にはＢａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ．ＴＭ．樹脂（Ｊ．Ｔ．  Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー  陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラムなど）でのクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製のためのその他の技術も、回収されるべき抗体に応じて利用可能である。
【０１５０】
任意の予備的精製ステップ（単数または複数）後に、対象の抗体および混入物質を含む混合物は、約２．５〜４．５の間のｐＨの溶出バッファーを使用する、好ましくは、低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍの塩）で実施される低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに付され得る。
【０１５１】
―キット―
本開示は、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を含むキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、生体サンプルにおいてＰＣＳＫ９の存在またはレベルを検出するために有用である。生体サンプルは、血清を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、検出可能な標識とコンジュゲートしている抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を含む。特定のその他の実施形態では、キットは、未標識抗ＰＣＳＫ９抗体または抗原結合断片を含み、未標識抗ＰＣＳＫ９抗体と結合可能である二次標識抗体をさらに含む。キットは、使用の説明のおよびキット中の成分の各々を分離するパッケージをさらに含み得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、キットは、ＰＣＳＫ９によって媒介される疾患または状態を処置、予防または遅延するのに有用である。特定の実施形態では、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片は、ＥＬＩＳＡなどのサンドイッチアッセイにおいて、またはイムノグラフィー〔immunographic〕アッセイにおいて有用な基質またはデバイスと関連している。有用な基質またはデバイスは例えば、マイクロタイタープレートおよび試験ストリップであり得る。
【０１５３】
特定の実施形態では、キットは、コレステロールを低減するのに有益であるとわかっている１種または複数の薬剤をさらに含む。例示的薬剤として、スタチン、スタチン以外のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ナイアシン（ニコチン酸）、コレステロール吸収阻害剤、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）、胆汁酸金属イオン封鎖剤、フィブラート、フィトステロール、または小分子、ペプチドミメティック、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および天然もしくは修飾脂質から選択される脂質／脂質濃度比のモジュレーターが挙げられる。特定の実施形態では、コレステロール吸収阻害剤は、エゼチミブまたはＳＣＨ−４８４６１であり、ＣＥＴＰは、エバセトラピブ、アナセトラピブまたはダルセトラピブであり、胆汁酸金属イオン封鎖剤は、好ましくは、コレセベラム、コレスチラミンまたはコレスチポールであり、フィブラートは、好ましくは、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、クロフィブラートまたはベザフィブラート、あるいはそれらの組合せである。
【０１５４】
―医薬組成物および治療方法―
本開示は、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片および１種または複数の医薬上許容される担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
【０１５５】
本明細書において開示される医薬組成物において使用するための医薬上許容される担体として、例えば、医薬上許容される液体、ゲルまたは固体担体、水性ビヒクル、非水性ビヒクル、抗菌剤、等張化剤、バッファー、抗酸化剤、麻酔剤、懸濁剤／分配剤〔dispending agents〕、封鎖剤またはキレート化剤、希釈剤、アジュバント、賦形剤または非毒性補助物質、当技術分野で公知のその他の成分またはそれらの種々の組合せを挙げることができる。
【０１５６】
適した成分として、例えば、抗酸化剤、増量剤、結合剤、崩壊剤、バッファー、保存料、滑沢剤、香味料、増粘剤、着色剤、乳化剤または糖およびシクロデキストリンなどの安定化剤を挙げることができる。適した抗酸化剤として、例えば、メチオニン、アスコルビン酸、ＥＤＴＡ、チオ硫酸ナトリウム、白金、カタラーゼ、クエン酸、システイン、チオグリセロール、チオグリコール酸、チオソルビトール、ブチル化ヒドロキシアニソール〔butylated hydroxanisol〕、ブチル化ヒドロキシトルエンおよび／または没食子酸プロピルを挙げることができる。本明細書において開示されるように、本明細書において提供されるような抗体または抗原結合断片およびコンジュゲートを含む組成物中に、メチオニンなどの１種または複数の抗酸化剤を含めることによって、抗体または抗原結合断片の酸化が減少される。酸化の低減は、結合親和性の喪失を防ぐまたは低減し、それによって、抗体安定性を改善し、有効期間を最大化する。したがって、特定の実施形態では、本明細書において開示されるような１種または複数の抗体または抗原結合断片およびメチオニンなどの１種または複数の抗酸化剤を含む組成物が提供される。抗体または抗原結合断片を、メチオニンなどの１種または複数の抗酸化剤と混合することによって、酸化を防ぐための、有効期間を延長するための、および／または本明細書において提供されるような抗体もしくは抗原結合断片の有効性を改善するための方法がさらに提供される。
【０１５７】
さらに例示するために、医薬上許容される担体として、例えば、塩化ナトリウム注射、リンゲル注射、等張性デキストロース注射、滅菌水注射またはデキストロースおよび乳酸リンゲル注射などの水性ビヒクル、植物起源の硬化油、綿実油、トウモロコシオイル、ゴマ油またはピーナッツオイルなどの非水性ビヒクル、静菌性または静真菌性濃度の抗菌剤、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの等張性剤、リン酸またはクエン酸バッファーなどのバッファー、重硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、塩酸プロカインなどの局所麻酔、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはポリビニルピロリドンなどの懸濁剤および分散剤、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ−８０）などの乳化剤、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）またはＥＧＴＡ（エチレングリコール四酢酸）などの封鎖剤またはキレート化剤、エチルアルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸を挙げることができる。担体として利用される抗菌剤は、複数回用量容器中の医薬組成物に添加され得、これとして、フェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンズアルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムが挙げられる。適した賦形剤として、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールを挙げることができる。適した非毒性補助物質として、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、溶解促進剤、または酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンもしくはシクロデキストリンなどの薬剤を挙げることができる。
【０１５８】
医薬組成物は、液体溶液、懸濁液、エマルジョン、丸剤、カプセル剤、錠剤、持続放出製剤または散剤であり得る。経口製剤はとして、医薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどといった標準担体を挙げることができる。
【０１５９】
特定の実施形態では、医薬組成物は、注射用組成物に製剤化される。注射用医薬組成物は、例えば、液体溶液、懸濁液、エマルジョンまたは液体溶液、懸濁液またはエマルジョンを作製するのに適した固体形態などの任意の従来の形態で調製され得る。注射のための調製物として、注射用に準備された滅菌および／または非発熱性溶液、皮下錠剤を含む、使用直前に溶媒と組み合わされるべく準備された凍結乾燥散剤などの滅菌乾燥可溶性製剤、注射用に準備された滅菌懸濁液、使用直前にビヒクルと組み合わされるべく準備された滅菌乾燥不溶性製剤、ならびに滅菌および／または非発熱性エマルジョンを挙げることができる。
【０１６０】
特定の実施形態では、単位用量非経口調製物は、アンプル、バイアルまたはニードルを備えたシリンジ中にパッケージングされる。非経口投与用のすべての調製物は、当技術分野で公知であり、実施されるように滅菌および非発熱性でなくてはならない。
【０１６１】
特定の実施形態では、滅菌、凍結乾燥散剤は、適した溶媒中に本明細書において開示されるような抗体または抗原結合断片を溶解することによって調製される。溶媒は、散剤または散剤から調製された再構成された溶液の安定性またはその他の薬理学的成分を改善する賦形剤を含有し得る。使用され得る賦形剤として、それだけには限らないが、水、デキストロース、ソルビトール〔sorbital〕、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたはその他の適した薬剤が挙げられる。溶媒は、クエン酸、リン酸ナトリウムまたはリン酸カリウムなどのバッファーまたは、一実施形態ではおよそ中性のｐＨの、当業者に公知のその他のこのようなバッファーを含有し得る。当業者に公知の溶液のその後の滅菌濾過と、それに続く標準状態下での凍結乾燥によって、望ましい製剤が提供される。一実施形態では、得られた溶液は、凍結乾燥のためにバイアル中に配分される。各バイアルは、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片またはその組成物の単一投与量または複数回投与量を含有し得る。バイアルに用量または用量のセットに必要なものを上回る少量（例えば、約１０％）を過剰充填することは、正確なサンプル引き出しおよび正確な投薬を促進するために許容される。凍結乾燥散剤は、約４℃〜室温などの適当な状態下で保存され得る。
【０１６２】
注射水を用いる凍結乾燥散剤の再構成は、非経口投与において使用するための製剤を提供する。一実施形態では、再構成のために滅菌および／または非発熱性水またはその他の液体の適した担体が、凍結乾燥散剤に付加される。正確な量は、与えられている選択された療法に応じて変わり、経験的に決定され得る。
【０１６３】
本明細書において提供されるような抗体または抗原結合断片の治療上有効な量を、それを必要とする対象に投与し、それによって、ＰＣＳＫ９と関係する関連する状態または障害を処置または予防することを含む治療方法もまた提供される。別の態様では、本明細書において提供されるような抗体または抗原結合断片の治療上有効な量を、それを必要とする対象に投与することを含む、免疫応答の上方制御から恩恵を受ける対象における状態を処置するための方法が提供される。
【０１６４】
本明細書において提供されるような抗体または抗原結合断片の治療上有効な量は、例えば、体重、年齢および過去の病歴、現在の薬物適用、対象の健康の状態および交差反応の可能性、アレルギー、感受性および有害な副作用、ならびに投与経路およびＣＶＤ発達の程度などの当技術分野で公知の種々の因子に応じて変わる。投与量は、これらおよびその他の状況または必要条件によって示されるように、当業者（例えば、医師または獣医師）によって比例的に低減または増大され得る。
【０１６５】
特定の実施形態では、本明細書において提供されるような抗体または抗原結合断片は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約１５ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇまたは約１００ｍｇ／ｋｇ）の治療上有効な投与量で投与され得る。これらの実施形態のうち特定のものでは、抗体または抗原結合断片は、約５０ｍｇ／ｋｇ以下の投与量で投与され、これらの実施形態のうち特定のものでは、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ以下、５ｍｇ／ｋｇ以下、３ｍｇ／ｋｇ以下、１ｍｇ／ｋｇ以下、０．５ｍｇ／ｋｇ以下または０．１ｍｇ／ｋｇ以下である。特定の実施形態では、投薬量は、治療過程にわたって変化し得る。例えば、特定の実施形態では、初期投薬量は、その後の投薬量よりも高い場合がある。特定の実施形態では、投薬量は、対象の反応に応じて治療過程にわたって変わり得る。
【０１６６】
投与計画は、最適な望ましい応答（例えば、治療的応答）を提供するように調整され得る。例えば、単回用量が投与され得、または数回の分割用量が経時的に投与され得る。
【０１６７】
本明細書において開示される抗体および抗原結合断片は、例えば、非経口（例えば、皮下、腹腔内、静脈内注入を含む静脈内、筋肉内または皮内注射）または非経口ではない（例えば、経口、鼻腔内、眼球内、舌下、直腸内または局所）経路などの当技術分野で公知の任意の経路によって投与され得る。
【０１６８】
―使用方法―
本開示は、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片を使用する方法をさらに提供する。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本開示は、個体においてＰＣＳＫ９と関連するまたはそれによって媒介される状態または障害を処置する方法であって、抗ＰＣＳＫ９抗体またはその抗原結合断片の治療上有効な量を投与することを含む方法を提供する。特定の実施形態では、個体は、ＰＣＳＫ９阻害剤に応答する可能性が高い障害または状態を有すると同定されている。特定の実施形態では、個体は、前記疾患または状態の１つまたは複数の症状、例えば、過体重であること、上昇したコレステロールレベルを有すること、ＬＤＬ−ＲもしくはＡＰＯＢをコードする遺伝子中に遺伝子突然変異を有すること、またはこのような疾患または状態の家族歴を有することを示す、ＰＣＳＫ９によって媒介される疾患または状態を有するまたは発生するリスクにある。特定の実施形態では、個体は、療法における別のコレステロール低下剤、例えば、スタチンに耐性である、または耐性ではなく、その結果、コレステロールのレベルは、このような療法において許容されるレベルに効果的に低下できない。特定の実施形態では、ＰＣＳＫ９によって媒介される疾患または状態として、重症蜂巣炎、胃腸炎、敗血症、肺炎、皮膚および軟部組織感染症などの感染性疾患、腎盂腎炎、ウイルス感染、例えば、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヘルペスウイルス、エプスタイン−バーウイルス、ＨＩＶ、サイトメガロウイルス、Ｉ型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、ヒトパピローマウイルス、アデノウイルス、カポジウエスト肉腫関連ヘルペスウイルス伝染病、薄い環状ウイルス（トルクテノウイルス）、ＪＣウイルスまたはＢＫウイルスのウイルス感染が挙げられ、またはアルツハイマー病、強直性脊椎炎、関節炎（変形性関節症、関節リウマチ（ＲＡ）、乾癬の関節炎）、喘息、アテローム性動脈硬化症、クローン病、大腸炎、皮膚炎、憩室炎、線維筋痛症、肝炎、過敏性腸症候群（ＩＢＳ）、全身性エリテマトーデス〔systemic lupus erythematous〕（ＳＬＥ）、腎炎、パーキンソン病および潰瘍性大腸炎などの炎症性疾患が挙げられる。
【０１７０】
目的の生体サンプル上のＬＤＬ−Ｃの存在またはレベルは、生体サンプルが由来する個体が、ＰＣＳＫ９阻害剤に応答する可能性が高いであろうか否かを示し得る。個体から得られた試験生体サンプル中のＰＣＳＫ９の存在またはレベルを調べるために種々の方法が使用され得る。米国では、コレステロールレベルの血液１デシリットル（ｄＬ）あたりのミリグラム（ｍｇ）が測定されるが、カナダおよび多数の欧州の国では、血液１リットル（Ｌ）あたりのミリモル（ｍｍｏｌ）が使用される。
【０１７１】
特定の実施形態では、試験生体サンプルにおけるＬＤＬ−Ｃ、総コレステロールまたは非ＨＤＬ−Ｃの存在または上方制御されたレベルは、応答性の見込みを示す。用語「上方制御された」とは、本明細書において、本明細書において提供される抗体または抗原結合断片を使用して検出されるような試験サンプル中のコレステロールレベルにおける、同一抗体を使用して検出されるような参照サンプル中のコレステロールレベルと比較した、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％以上またはそれを超える全体的な増大を指す。参照サンプルは、健常もしくは非疾患の個体から得られた対照サンプル、または試験サンプルが得られている同一個体から得られた健常もしくは非疾患のサンプルであり得る。
【０１７２】
本明細書において開示される抗体または抗原結合断片は、単独で、または１種もしくは複数のさらなる治療手段または薬剤と組み合わせて投与され得る。例えば、本明細書において開示される抗体または抗原結合断片は、スタチン、スタチン以外のＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、ナイアシン（ニコチン酸）、コレステロール吸収阻害剤、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）、胆汁酸金属イオン封鎖剤、フィブラート、フィトステロール、または小分子、ペプチドミメティック、アンチセンスＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）および天然もしくは修飾脂質から選択される脂質／脂質濃度比のモジュレーターと組み合わせて投与され得る。特定の実施形態では、コレステロール吸収阻害剤は、エゼチミブまたはＳＣＨ−４８４６１であり、ＣＥＴＰは、エバセトラピブ、アナセトラピブまたはダルセトラピブであり、胆汁酸金属イオン封鎖剤は、好ましくは、コレセベラム、コレスチラミンまたはコレスチポールであり、フィブラートは、好ましくは、フェノフィブラート、ゲムフィブロジル、クロフィブラートまたはベザフィブラートである。
【０１７３】
特定のこれらの実施形態では、１種または複数の上記のさらなる治療薬と組み合わせて投与される本明細書において開示される抗体または抗原結合断片は、１種または複数のさらなる治療薬と同時に投与されてもよく、特定のこれらの実施形態では、抗体または抗原結合断片およびさらなる治療薬（複数可）は、同一医薬組成物の一部として投与されてもよい。しかし、別の治療薬と「組み合わせて」投与される抗体または抗原結合断片は、薬剤と同時に、または薬剤と同一組成物中で投与されなくてもよい。別の薬剤に先立って、またはその後に投与される抗体または抗原結合断片は、抗体または抗原結合断片および第２の薬剤が、異なる経路によって投与される場合でさえ、その語句が本明細書において使用される場合、その薬剤と「組み合わせて」投与されると考えられる。可能であれば、本明細書において開示される抗体または抗原結合断片と組み合わせて投与されるさらなる治療薬は、さらなる治療薬の英文添付文書に列挙されるスケジュールに従って、またはＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ２００３年（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、第５７版；  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ；  ＩＳＢＮ：  １５６３６３４４５７；  第５７版（２００２年１１月））もしくは当技術分野で周知のプロトコールに従って投与される。
【０１７４】
以下の実施例は、特許請求された本発明をより良好に例示するために提供され、本発明の範囲を制限すると解釈されてはならない。以下に記載されるすべての特定の組成物、材料および方法は、全体で、または一部で本発明の範囲内に入る。これらの特定の組成物、材料および方法は、本発明を制限するものではなく、単に、本発明の範囲内に入る特定の実施形態を例示するものである。当業者は、発明の能力を行使することなく、本発明の範囲から逸脱することなく、同等の組成物、材料および方法を開発し得る。本発明の範囲内にとどまりながら本明細書に記載される手順において多数の変法を行うことができるということは理解されよう。このような変法が本発明の範囲内に含まれることは本発明者らの意図である。
【実施例】
【０１７５】
［実施例１］
抗体およびその他のタンパク質作製
１．１  ヒトおよびマウスＰＣＳＫ９
Ｃ末端に６−ＨｉｓタグまたはマウスＦｃ（ｍＦｃ）を融合した発現ベクターｐｃＤＮＡ３．３に、ヒトおよびマウスＰＣＳＫ９遺伝子を挿入した。次いで、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ  ＵＳＡ、ＢＩＯ−４６０２６）を使用して、このプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。Ｎｉカラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ）を使用して、回収された上清からＨｉｓタグタンパク質を精製した。プロテインＡカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＧＥ）を使用してｍＦｃ融合タンパク質を精製した。
【０１７６】
１．２  ヒトＬＤＬ−Ｒ
Ｃ末端６−Ｈｉｓタグを有するベクターｐｃＤＮＡ３．３に、ＬＤＬ受容体細胞外ドメインの遺伝子を挿入した。ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ  ＵＳＡ、ＢＩＯ−４６０２６）を使用して、このプラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。Ｎｉカラム（Ｑｉａｇｅｎ  Ｉｎｃ）を使用して、回収された上清からＬＤＬ−Ｒタンパク質を最初に精製し、続いて、イオン交換カラムを使用して精製した。
【０１７７】
１．３  参照抗体
参照抗体ＢＭＫ．１１５を、米国特許第８８８９８３４Ｂ２号中の２１Ｂ１２の配列をベースとして作製した。ＶＨおよびＶＬ遺伝子を含有するプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞に同時トランスフェクトした。プロテインＡカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＧＥ）を使用して回収された上清から抗体を精製した。
【０１７８】
［実施例２］
抗体作製
２．１  免疫処置
ヒト免疫グロブリン可変ドメイン遺伝子を含有するＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）（ＯＭＴ）を使用して、完全ヒトＶＨおよびＶＬを有する抗体を作製した。ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標）を足蹠を介してヒトＰＣＳＫ９タンパク質とともに、およそ３日毎に注射した。６回の注射後に最初の力価試験を実施した。その後、２週間毎にラットに注射した。
【０１７９】
２．２  血清力価検出
酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ラット血清中の抗体の力価を測定した。ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、１μｇ／ｍｌのヒトＰＣＳＫ９を用いて４℃で一晩コーティングし、次いで、ブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ／２％ＢＳＡ）を用いて室温で１時間ブロッキングした。ラット血清は、ブロッキングバッファーでの１：１００希釈で出発して１：３力価測定し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、続いて、二次抗体ヤギ抗ラットＩｇＧ１  ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）およびヤギ抗ラットＩｇＧ２ｂ  ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）とともに４５分間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、２Ｍ  ＨＣｌによって相互作用を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して４５０ｎＭでの吸光度を読み取った。
【０１８０】
２．３  免疫処置およびハイブリドーマ作製
無菌条件下で免疫処置したマウスからリンパ節および脾臓を採取し、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ  ＰＬＵＳ勾配遠心分離を使用してリンパ球を調製した。次いで、電気融合デバイス（ＢＴＸ  ＥＣＭ２００１）を使用して、単離された細胞を１：１の比で骨髄腫細胞Ｐ３と融合した。融合後に細胞を１／２ＨＡ培地に移した。９６ウェルプレートあたり５×１０５個細胞を播種した。
【０１８１】
血清中の抗原特異的抗体の力価を、ＥＬＩＳＡアッセイによって決定した。３１２５００またはそれ以上の血清力価を有するラットを、ハイブリドーマ融合のために選択した。
【０１８２】
２．４  ハイブリドーマスクリーニング
ＥＬＩＳＡによる結合アッセイ：プレート（Ｎｕｎｃ）を、１μｇ／ｍｌのストレプトアビジンを用いて４℃で一晩コーティングした。ブロッキングおよび洗浄後、２５０ｎｇ／ｍｌのＰＣＳＫ９−ビオチンを添加し、１時間インキュベートした。次いで、ハイブリドーマ上清をプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、続いて、二次抗体ヤギ抗ラットＩｇＧ１  ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）およびヤギ抗ラットＩｇＧ２ｂ  ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）とともに４５分間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、２Ｍ  ＨＣｌによって相互作用を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して４５０ｎＭでの吸光度を読み取った。
【０１８３】
ＥＬＩＳＡによる遮断アッセイ：プレート（Ｎｕｎｃ）を、ＬＤＬ−Ｒを用いて４℃で一晩コーティングした。ハイブリドーマ上清を２５０ｎｇ／ｍｌのＰＣＳＫ９−ｍＦｃ−ビオチンと混合し、４℃で一晩インキュベートした。ブロッキングおよび洗浄後、プレートに混合物を添加し、１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、続いて、ストレプトアビジン−ＨＲＰとともにインキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、２Ｍ  ＨＣｌによって相互作用を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して４５０ｎＭでの吸光度を読み取った。
【０１８４】
ハイブリドーマ上清を一次スクリーニングのために使用した。一次結合スクリーニングによって、４回の融合から合計１３０００の抗原特異的ハイブリドーマが同定された。次いで、ＥＬＩＳＡ遮断アッセイによって抗原特異的ハイブリドーマをスクリーニングした。遮断アッセイの結果、ヒトＰＣＳＫ９のヒトＬＤＬ−Ｒとの結合を遮断できる１０４のハイブリドーマが得られた。ハイブリドーマ上清から、結合および遮断活性の両方を有する選択された抗体を精製した。その間に、選択されたハイブリドーマ株を制限希釈によってサブクローニングした。ハイブリドーマサブクローンを、結合および遮断ＥＬＩＳＡアッセイによって確認し、そのアイソタイプも検出した。
【０１８５】
精製した抗体を使用して細胞性ＬＤＬ取り込みアッセイを実施した。結合および遮断活性も、ＥＬＩＳＡを使用してさらに評価した。最終リードクローンの選択は、結合親和性、ＬＤＬ−ＲとのＰＣＳＫ９結合の遮断ＩＣ５０および細胞性ＬＤＬ取り込みの回復活性を基にした。
【０１８６】
２．５  サブクローニング
選択された各株のハイブリドーマ細胞を、０．５、１および５個細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートにプレーティングした。単一クローンを選び取り、結合ＥＬＩＳＡで試験した。各ハイブリドーマ株の３つのサブクローンを選択し、凍結した。
【０１８７】
２．６  アイソタイプ
抗体アイソタイプをＥＬＩＳＡによって同定した（表２を参照のこと）。プレート（Ｎｕｎｃ）を、１μｇ／ｍｌのヤギ抗ラットＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃおよびＩｇＭ抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）を用いて４℃で一晩コーティングした。ブロッキングおよび洗浄後、ハイブリドーマ上清を、コーティングされたプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを、二次抗体ヤギ抗ヒトκＨＲＰまたはヤギ抗ヒトλＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）とともに４５分間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、２Ｍ  ＨＣｌによって相互作用を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して４５０ｎＭでの吸光度を読み取った。
【０１８８】
【表２】
2020502991.tif 000034
【０１８９】
２．７  抗体精製
回収されたハイブリドーマ上清を、ｐＨを７．０に調整した後にプロテインＡカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＧＥ）にロードした。抗体をグリシンによって溶出し、続いて、１Ｍ  Ｔｒｉｓを使用して直ちに中和した。Ｎａｎｏ  Ｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍａｌ−Ｆｉｓｈｅｒ）によって抗体濃度を調べた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮｕＰＡＧＥ  ４％〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル）およびＨＰＬＣ−ＳＥＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によってタンパク質の純度を評価した。
【０１９０】
［実施例３］
完全ヒト抗体の作製
３．１  ハイブリドーマシーケンシング
Ｔｒｉｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−１５５９６０１８）を使用してハイブリドーマ細胞からＲＮＡを抽出する。５’−ＲＡＣＥキット（Ｔａｋａｒａ−２８００１４８８）を使用してｃＤＮＡを増幅し、続いて、３’縮重プライマーおよび３’アダプタープライマー（ＥｘＴａｑ：Ｔａｋａｒａ−ＲＲ００１Ｂ）を使用してＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ断片をｐＭＤ１８−Ｔベクター（Ｔａｋａｒａ−Ｄ１０１Ｃ）に挿入し、シーケンシング（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｂｉｏｓｕｎｅ）のために送った。選択された抗体１１．４、１８．１５６．８、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７、１９．３．８および４０４０９の可変領域配列（アミノ酸配列および核酸配列）は、配列番号７３〜１００として示されている。
【０１９１】
３．２  組換え完全ヒト抗体の作製
各抗体（ヒト−ラットキメラ抗体）のＶ領域ＤＮＡを、ヒト定常領域遺伝子を含有するｐｃＤＮＡ３．３ベクターにクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞を、抗体重鎖および軽鎖をコードするプラスミドを用いてトランスフェクトした。細胞を除去することおよび濾過によって、トランスフェクトされた細胞から上清を採取した。プロテインＡカラム（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＧＥ）によって抗体を精製し、ＰＢＳにバッファー交換した。Ｎａｎｏｄｒｏｐによって抗体濃度を検出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＮｕＰＡＧＥ４％〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル）およびＨＰＬＣ−ＳＥＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって純度を評価した。
【０１９２】
３．３  親和性成熟
１１．４重鎖（ＨＣ）−ＣＤＲ３ライブラリーの飽和変異誘発を作製し、結合ＥＬＩＳＡアッセイによってスクリーニングし、親クローンと比較してＰＣＳＫ９結合を増大する単一変異を選択した。次いで、選択された変異のコンビナトリアルライブラリーを作製した。ＥＬＩＳＡ結合およびＳＰＲ  ｋｏｆｆランキング結果に基づいて特定の変異組合せを有するクローンを選択した。
【０１９３】
鋳型として１１．４を使用して２つのランダム変異体ライブラリーを作製した。ライブラリーを２ラウンドのパニングおよびスクリーニングによって選択した。結合親和性を改善する変異を選択し、飽和ライブラリーを用いて選択された変異と組み合わせた。
【０１９４】
１１．４  ＨＣ−ＣＤＲ３の飽和変異誘発ライブラリーを作製し、結合ＥＬＩＳＡアッセイによってスクリーニングし、親クローンと比較してＰＣＳＫ９結合を増大した単一変異を選択した（図１）。次いで、選択された変異のコンビナトリアルライブラリーを作製した。ＥＬＩＳＡ結合およびＳＰＲ  ｋｏｆｆランキング結果に基づいて特定の変異組合せを有するクローンを選択した。ＩｇＧ変換クローンＢ４Ｇ２およびＣ１Ｂ４において、１つのＣＤＲにおける３つの変異の組合せが、１０倍の親和性改善をもたらした（表３）。
【０１９５】
【表３】
2020502991.tif 000035
【０１９６】
鋳型として１１．４を使用して２つのランダム変異体ライブラリーも作製した。２ラウンドのパニングによるライブラリー選択によって、親和性改善変異を有する５つのクローンが得られた。これらの変異の３つの組合せを選択し、Ｂ４Ｇ２に導入して、クローン４０４０８、４０４０９および４０４１０を得た。さらなる変異は、２倍のさらなる親和性改善をもたらした。最終親和性成熟リード抗体〔Ab〕は、ＢＭＫ．１１５と比較して２倍高い親和性を有する（表４）。
【０１９７】
【表４】
2020502991.tif 000036
【０１９８】
３．４  一時的にトランスフェクトされた細胞株からの完全ヒト抗体の生成
３．４．１  １８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）
完全ヒト抗体１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）は、軽鎖および重鎖に対応する還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２５ｋＤａおよび５５ｋＤａの見かけの分子量で移動する（図２を参照のこと）。非還元条件下での主なバンドは、約１５０ＫＤのＭ．Ｗ．を有する全ＩｇＧである。純度は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって決定されるように９９．６％である（図３）。内毒素は、＜０．５ＥＵ／ｍｇである。
【０１９９】
３．４．２  ４０４０９（ｈＩｇＧ４）
完全ヒト抗体１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）は、軽鎖および重鎖に対応する還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２５ｋＤａおよび５５ｋＤａの見かけの分子量で移動する（図４を参照のこと）。非還元条件下での主なバンドは、約１５０ＫＤのＭ．Ｗ．を有する全ＩｇＧである。純度は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって決定されるように９８％である（図５を参照のこと）。内毒素は、＜０．５ＥＵ／ｍｇである。
【０２００】
３．４．３  １５．１４．２−ｕＡｂ−ＩｇＧ４Ｌ
完全ヒト抗体１５．１４．２−ｕＡｂ−ＩｇＧ４Ｌは、軽鎖および重鎖に対応する還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２５ｋＤａおよび５５ｋＤａの見かけの分子量で移動する（図６を参照のこと）。非還元条件下での主なバンドは、約１５０ＫＤのＭ．Ｗ．を有する全ＩｇＧである。純度は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって決定されるように９９．８％である（図７を参照のこと）。内毒素は、＜０．５ＥＵ／ｍｇである。
【０２０１】
３．４．４  １７．７２．３−ｕＡｂ２−ＩｇＧ４Ｋ
完全ヒト抗体１７．７２．３−ｕＡｂ２−ＩｇＧ４Ｋは、軽鎖および重鎖に対応する還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２５ｋＤａおよび５５ｋＤａの見かけの分子量で移動する（図８を参照のこと）。非還元条件下での主なバンドは、約１５０ＫＤのＭ．Ｗ．を有する全ＩｇＧである。純度は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって決定されるように９８．９％である（図９を参照のこと）。内毒素は、＜０．５ＥＵ／ｍｇである。
【０２０２】
３．４．５  １８．１３６．７−ＩｇＧ４Ｋ
完全ヒト抗体１８．１３６．７−ＩｇＧ４Ｋは、軽鎖および重鎖に対応する還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２５ｋＤａおよび５５ｋＤａの見かけの分子量で移動する（図１０を参照のこと）。非還元条件下での主なバンドは、約１５０ＫＤのＭ．Ｗ．を有する全ＩｇＧである。純度は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって決定されるように９９．２％である（図１１を参照のこと）。内毒素は、＜０．５ＥＵ／ｍｇである。
【０２０３】
３．４．６  １９．３．８−ｕＡｂ１−ＩｇＧ４Ｌ
完全ヒト抗体１９．３．８−ｕＡｂ１−ＩｇＧ４Ｌは、軽鎖および重鎖に対応する還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２５ｋＤａおよび５５ｋＤａの見かけの分子量で移動する（図１２を参照のこと）。非還元条件下での主なバンドは、約１５０ＫＤのＭ．Ｗ．を有する全ＩｇＧである。純度は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって決定されるように９９．９％である（図３）。内毒素は、＜０．５ＥＵ／ｍｇである。
【０２０４】
［実施例４］
リード抗体特性決定
４．１  完全ヒト抗体の結合および遮断活性
ＰＣＳＫ９との完全ヒト抗体結合の活性を、ＥＬＩＳＡによって確認した（図１４）。ＰＣＳＫ９のＬＤＬ−Ｒとの結合を遮断する完全ヒト抗体の活性を、競合的ＥＬＩＳＡ法によって確認した（図１５）。結合ＥＣ５０および遮断ＩＣ５０値を、表５および６にまとめた。リード抗体１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）、４０４０９（ｈＩｇＧ４）、１５．１４．２−ｕＡｂ−ＩｇＧ４Ｌおよび１７．７２．３−ｕＡｂ２−ＩｇＧ４Ｋは、比較可能な結合を示し、遮断活性はＢＭＫ．１１５およびレパーサを用いた。
【０２０５】
【表５】
2020502991.tif 000037
【０２０６】
【表６】
2020502991.tif 000038
【０２０７】
４．２  完全ヒト抗体のＬＤＬ取り込みアッセイ
ＨｅｐＧ２またはＨｕｈ−７細胞を、１０％  ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地中、９６ウェルプレートに１×１０５個細胞／ウェルの密度で播種した。プレートを、３７℃のインキュベーター中で一晩維持した。培地を、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭと置換した。ヒトＰＣＳＫ９および種々の濃度の抗体の混合物を細胞に添加した。野生型ＰＣＳＫ９および変異体ＰＣＳＫ９（Ｄ３７４Ｙ）の最終濃度は、それぞれ２０μｇ／ｍｌおよび１．３μｇ／ｍｌとした。１時間後、細胞に、Ｂｏｄｉｐｙ  ＦＬ標識ＬＤＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌ−３４８３）を添加して、１．５μｇ／ｍｌの最終濃度とした。３７℃のインキュベーター中で３時間インキュベートした後、プレート中のＬＤＬを含有する培地を廃棄した。細胞をトリプシン処理し、２回洗浄した。ＬＤＬ取り込みを、ＦＡＣＳによって決定される、細胞におけるＢｏｄｉｐｙ  ＦＬ標識ＬＤＬの蛍光によって特性決定した。次式：ＬＤＬ取り込み回復（％）＝（ＭＦＩサンプル−ＭＦＩＬＤＬ＋Ａｇ１Ｈ）／（ＭＦＩＬＤＬのみ−ＭＦＩＬＤＬ＋Ａｇ１Ｈ）×１００％に従って、ＬＤＬ取り込み回復率を算出した。
【０２０８】
最終リード抗体１８．１５６．８および４０４０９を、野生型および変異体ＰＣＳＫ９の両方を使用して、ＨｅｐＧ２およびＨｕｈ−７細胞においてＬＤＬ取り込みアッセイで評価した（図１６および１７を参照のこと）。結果は、１８．１５６．８および４０４０９が、ＷＴ  ＰＣＳＫ９または変異体ＰＣＳＫ９が存在する場合に、細胞性ＬＤＬ取り込みを効率的に回復させることができることを実証する。抗体１５．１４．２、１７．７２．３および１９．３．８の細胞性ＬＤＬ取り込みを回復させる能力を、野生型ＰＣＳＫ９を有するＨｅｐＧ２細胞を使用して評価した（図１８を参照のこと）。結果は、１５．１４．２、１７．７２．３および１９．３．８は、ＷＴ  ＰＣＳＫ９が存在する場合に細胞性ＬＤＬ取り込みを効率的に回復させることができることを実証する。各抗体のＩＣ５０値は、表７および８にまとめられた。
【０２０９】
【表７】
2020502991.tif 000039
【０２１０】
【表８】
2020502991.tif 000040
【０２１１】
４．３  動態学的親和性
４．３．１  ＳＰＲによる結合動態学
ヒトおよびアカゲザルＰＣＳＫ９との抗体結合親和性を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００を使用するＳＰＲアッセイによって検出した。各抗体を、プロテインＡまたは抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ抗体固定化ＣＭ５センサーチップ（ＧＥ）で捕獲した。種々の濃度のヒトまたはアカゲザルＰＣＳＫ９を、１８０秒の会合相、続いて、１２００秒の解離の間３０μＬ／分の流速でセンサーチップ上に注入した。各結合サイクル後に２Ｍ  ＭｇＣｌ２によってチップを再生した。
【０２１２】
ブランク表面およびバッファーチャネルのセンサーグラムを、試験センサーグラムから差し引いた。実験データは、Ｌａｎｇｍｉｕｒ解析を使用する１：１モデルによってフィッティングした。８５ＫＤａの分子量を使用して、解析物のモル濃度を算出した。
【０２１３】
４．３．２  ＥＬＩＳＡによるアカゲザルＰＣＳＫ９に対する交差反応性
ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、１μｇ／ｍｌの抗Ｈｉｓ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を用いて４℃で一晩コーティングした。ブロッキングおよび洗浄後１μｇ／ｍｌのアカゲザルＰＣＳＫ９−Ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を添加し、１時間インキュベートした。プレートに抗体サンプルを添加し、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートを洗浄し、続いて、二次抗体ヤギ抗ラットＩｇＧ１  ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）およびヤギ抗ラットＩｇＧ２ｂ  ＨＲＰ（Ｂｅｔｈｙｌ）とともに４５分間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、２Ｍ  ＨＣｌによって相互作用を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して４５０ｎＭでの吸光度を読み取った。
【０２１４】
抗体リードの動態学的親和性を、ＳＰＲアッセイによって測定した。ヒトおよびサルＰＣＳＫ９に対する親和性が、表９にまとめられている。
【０２１５】
【表９】
2020502991.tif 000041
【０２１６】
４．４  血清安定性
抗体を、新たに単離されたヒト血清（血清含量＞９５％）中、３７℃で、それぞれ０、１、３、７、１４日間インキュベートした。３７℃でのインキュベーション後、サンプルを、ドライアイスエタノール浴中で迅速に凍結し、−８０℃で維持した。安定性試験の前にサンプルを迅速に解凍した。プレートを、Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３（ｐＨ９．２）バッファー中でストレプトアビジンを用いて、４℃で一晩コーティングした。プレートを、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて１回洗浄し、その後、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳを用いてブロッキングした。ビオチン標識ＰＣＳＫ９を添加し、１時間インキュベートした。次いで、洗浄後、希釈した血清サンプルをプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。ウェルにヤギ抗ヒトＨＲＰ抗体を添加し、１時間インキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ基質を添加し、２Ｍ  ＨＣｌによって相互作用を停止させた。マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ）を使用して４５０ｎＭでの吸光度を読み取った。
【０２１７】
ヒト血清中、３７℃でのインキュベーション後にＥＬＩＳＡによってヒトＰＣＳＫ９との抗体結合を試験した（図１９）。１、３、７および１４日のインキュベーション後の抗体１８．１５６．８およびＢ４Ｇ２の結合は、インキュベーション前サンプルと有意な相違を示さなかった。したがって、抗体１８．１５６．８およびＢ４Ｇ２は両方とも、ヒト血清中、３７℃で１４日間安定である。３日のインキュベーション後の抗体１５．１４．２、１７．７２．３および１９．３．８の結合は、インキュベーション前サンプルと有意な相違を示さなかった。
【０２１８】
［実施例５］
動物研究
５．１  非ヒト霊長類における単回用量有効性
ＬＤＬＣおよびＨＤＬＣ３キット（Ｒｏｃｈｅ）を使用するＲｏｃｈｅ／Ｈｉｔａｃｈｉ  ｃｏｂａｓ  ｃシステムで、サル血清中のＬＤＬ−ＣおよびＨＤＬ−Ｃ濃度を試験した。総コレステロール（ＴＣＨＯ）を、コレステロールＦＳキット（ＤｉａＳｙｓ）によって試験した。
【０２１９】
５．１．１  研究１：合計６匹の雌のカニクイザル、投薬開始時におよそ３〜４年齢および体重２．６〜２．９ｋｇ。６匹の雌のサルを、１匹の雌／群の６群に無作為に割り当てた。１匹の雌のサルの６群に各々、１０または３０ｍｇ／ｋｇのＢＭＫ．１１５、１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）または４０４０９（ｈＩｇＧ４）を単回用量静脈内注射によって与えた。最初の投薬日を、１日目と定義した。各群の動物を、投薬後３６日間観察した：
【０２２０】
【表Ａ】
2020502991.tif 000042
【０２２１】
カニクイザルにおける抗体１８．１５６．８および４０４０９のＬＤＬ−Ｃ低下効果。ＢＭＫ．１１５および１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）の投与は、カニクイザルにおいて１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇで、ＬＤＬ−Ｃおよび総コレステロール（ＴＣＨＯ）における迅速な持続した低減をもたらした。
【０２２２】
ＬＤＬの低減パーセンテージは、投与前値と比較して、ＢＭＫ．１１５  １０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ用量群において、それぞれ最大８３．４％および８９．６％であった。１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）は、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ用量群において、それぞれ最大７９．５％および８３．５％のＬＤＬ−Ｃの有意な低減をもたらした。最大低減は、８日目に達成された。１８．１５６．８  （ｈＩｇＧ４）処置動物についてＬＤＬ−Ｃの低減は、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ用量群両方においてインライフ相を通じて持続した。ＢＭＫ．１１５処置動物については、ＬＤＬ−Ｃの低減は、３０ｍｇ／ｋｇ用量群においてインライフ相を通じて持続したが、１０ｍｇ／ｋｇ群のＬＤＬ−Ｃは、２４日目に回復し始め、２８日目に投与前レベルに戻った（図２０Ａおよび２０Ｂ）。したがって、ＬＤＬ−Ｃの低減は、レパーサ処置群と比較して１０ｍｇ／ｋｇ用量の１８．１５６．８処置動物においてより長期間持続した。
【０２２３】
４０４０９（ｈＩｇＧ４）は、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇ用量群において、それぞれＬＤＬ−Ｃを最大３２．２％および３８．１％低減した（図２０Ａおよび２０Ｂを参照のこと）。
【０２２４】
高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）は、１０ｍｇ／ｋｇおよび３０ｍｇ／ｋｇの１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）または４０４０９（ｈＩｇＧ４）を投与されたサルにおいて全般的に良好に維持された。ＨＤＬ−Ｃは、１０ｍｇ／ｋｇ用量のＢＭＫ．１１５を投与されたサルにおいて全般的に維持されたが、投与前値と比較してＨＤＬ−Ｃの減少（最大３０．４％）は、ＢＭＫ．１１５  ３０ｍｇ／ｋｇ群において認められた（図２１Ａおよび２１Ｂ）。
【０２２５】
５．１．２  研究２：合計１０匹の雌のカニクイザル、投薬開始時におよそ３〜４年齢および体重２．５〜３．５ｋｇ。１０匹の雌のサルを、１匹の雌／群の８群に無作為に割り当てた。１匹の雌のサルの１０群に各々、３ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのレパーサ、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７または１９．３．８を単回用量静脈内注射によって与えた。最初の投薬日を、１日目と定義した。各群の動物を、投薬後３６日間観察した：
【０２２６】
【表Ｂ】
2020502991.tif 000043
【０２２７】
カニクイザルにおける抗体１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７および１９．３．８のＬＤＬ−Ｃ低下効果
【０２２８】
レパーサおよび１５．１４．２の投与は、カニクイザルにおいて３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇでＬＤＬ−Ｃおよび総コレステロール（ＴＣＨＯ）の迅速な持続した低減をもたらした（図２２Ａおよび２２Ｂ）。１８．１３６．７はまた、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇで最大約５０％のＬＤＬ−Ｃの有意な低減を示した。１７．７２．３および１９．３．８は、１０ｍｇ／ｋｇでＬＤＬ−Ｃの中程度の低減を示した。
【０２２９】
ＬＤＬの低減パーセンテージは、投与前値と比較して、レパーサ３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ用量群において、それぞれ最大８０％および７７％であった。１５．１４．２では、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ用量群の両方において、それぞれ最大７７％のＬＤＬ−Ｃの有意な低減をもたらした。最大低減は、８〜１６日目に達成された。１０ｍｇ／ｋｇ用量群では、ＬＤＬ−Ｃの低減は、１５．１４．２処置動物についてインライフ相を通じて持続したが、レパーサ処置動物については、ＬＤＬ−Ｃレベルは、２４日目に回復し始め、３６日目までに投与前レベルに戻った（図２２Ａおよび２２Ｂ）。１０ｍｇ／ｋｇ用量群では、レパーサ処置サルのＬＤＬ−Ｃレベルは、１２日目に投与前レベルの８０％に戻り、２０日目に投与前レベルに完全に戻った。３ｍｇ／ｋｇ  １５．１４．２処置サルのＬＤＬ−Ｃの低減は、２８日目まで５０％より低く保った。したがって、ＬＤＬ−Ｃの低減は、レパーサ処置群と比較して、１５．１４．２処置動物において３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ用量群の両方においてより長期間持続された。
【０２３０】
高比重リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）は、３ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇのすべての試験された抗体を用いて処置されたサルにおいて全般的に良好に維持された（図２３Ａおよび２３Ｂ）。
【０２３１】
５．２  薬物動態学（ＰＫ）研究
全身曝露（ＴＫ）を調べるために、ＢＭＫ．１１５、１８．１５６．８−ｈＩｇＧ４、４０４０９−ｈＩｇＧ４、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７および１９．３．８の血清濃度を調べた。０（投与前）、投与後０．５、１、２、４、２４、４８、９６、１６８、３３６、５０４、６７２、７４４および８４０時間で、すべての入手可能なサルから血液サンプルを採取した。
【０２３２】
動物から、頭部または大腿静脈を介しておよそ２ｍＬの血液を採取した。血液を、抗凝固薬を含まない適宜ラベルが付けられた管中に採取した。管を室温で少なくとも３０分間置き、２０００×ｇ、約４℃で１０分間、遠心分離によって、採取の２時間内に血清を得た。血清を独特にラベルが付けられたポリプロピレン管中に移し、直立位置でドライアイス上で直ちに凍結し、≦−６０℃を維持するよう設定されたフリーザーセット中で保存した。
【０２３３】
血清サンプルをＰＫ試験の前に迅速に解凍した。プレートを、Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３バッファー中でポリクローナルヤギ抗ヒト抗体を用いて、４℃で一晩コーティングした。プレートを、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて１回洗浄し、その後、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳを用いてブロッキングした。希釈したカニクイザル血清サンプルをプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。ウェルにビオチン標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体およびストレプトアビジン−ＨＲＰを添加し、それぞれ１時間インキュベートした。基質および停止溶液の添加後に各ウェルの４５０ｎｍのＯＤ値を読み取った。血清サンプル中の抗体の濃度を、標準曲線によって調べた。
【０２３４】
初期血清濃度（Ｃ０）を含む（データが許す場合には）が、必ずしもそれに限らないＴＫパラメータ値および投与後０〜８４０時間の血清濃度対時間曲線下面積（ＡＵＣ）ＡＵＣ０−８４０ｈを、確認されたＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラム（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、バージョン６．２．１）を使用して調べた。ＡＵＣ０−８４０ｈを、薬物処置動物のみから、非コンパートメント法によって線形上昇／対数下降台形ルールを使用して算出した。定量化の下限未満（ＢＬＱ）の血清濃度を、ＴＫパラメータ算出のためにゼロに設定した。
【０２３５】
サル血清中の抗体濃度を、ＥＬＩＳＡによって試験した（図２４および２５）。雌のサルへの１０または３０ｍｇ／ｋｇのＢＭＫ．１１５、１８．１５６．８  （ｈＩｇＧ４）、４０４０９（ｈＩｇＧ４）の１回の単回ＩＶ注射後のＢＭＫ．１１５、１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）、４０４０９（ｈＩｇＧ４）のＣ０およびＡＵＣ０−８４０ｈが以下に示されている。各抗体の半減期も表１０に列挙した。
【０２３６】
投与量が１０ｍｇ／ｋｇから３０ｍｇ／ｋｇに増大するにつれ、１８．１５６．８および４０４０９に対する全身曝露（ＡＵＣ０−８４０ｈおよび／またはＣ０）が用量比例的に増大したが、ＢＭＫ．１１５に対して用量比例的よりも多く増大した。
【０２３７】
【表１０】
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【０２３８】
雌のサルへの３または１０ｍｇ／ｋｇでの１回の単回ＩＶ注射後のレパーサ、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７および１９．３．８のＣ０およびＡＵＣ０−８４０ｈが以下に示されている（表１１を参照のこと）。各抗体の半減期も表１１に列挙した。１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７および１９．３．８はすべて、両用量においてレパーサよりも長く示した。
【０２３９】
投与量が３ｍｇ／ｋｇから１０ｍｇ／ｋｇに増大するにつれ、レパーサ、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７および１９．３．８に対する全身曝露（ＡＵＣ０−８４０ｈおよび／またはＣ０）が、用量比例的に増大した。
【０２４０】
【表１１】
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【０２４１】
５．３  免疫原性
０（投与前）、投与後３３６、６７２および８４０時間に、動物から頭部または大腿静脈を介して血液を採取した。
【０２４２】
プレートを、Ｎａ２ＣＯ３／ＮａＨＣＯ３バッファー中でＢＭＫ．１１５、１８．１５６．８、４０４０９、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７または１９．３．８を用いて、４℃で一晩コーティングした。プレートを、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−ＰＢＳを用いて１回洗浄し、その後、２％  ＢＳＡ／ＰＢＳを用いてブロッキングした。ＰＢＳ希釈したカニクイザル血清サンプルをプレートに移し、室温で１時間インキュベートした。洗浄後、ヤギ抗カニクイザルＩｇＧ−ＨＲＰ抗体（ヒトＩｇＧと交差相互作用なし）を添加した。基質および停止溶液の添加後に、各ウェルの４５０ｎｍでのＯＤ値を読み取った。
【０２４３】
ＢＭＫ．１１５、１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）、４０４０９（ｈＩｇＧ４）の免疫原性試験結果が、図２６に示されている。投与後３３６、６７２、８４０時間のサル血清におけるＢＭＫ．１１５、１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）、４０４０９（ｈＩｇＧ４）に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の力価は、投与前と有意差がない。したがって、雌のサルへの１０または３０ｍｇ／ｋｇのＢＭＫ．１１５、１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）、４０４０９（ｈＩｇＧ４）の単回ＩＶ注射後に、結果は、ＢＭＫ．１１５、１８．１５６．８（ｈＩｇＧ４）、４０４０９（ｈＩｇＧ４）が、血清において低い免疫原性を誘導したことを示す。
【０２４４】
レパーサ、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７および１９．３．８の免疫原性試験結果は、図２７に示されている。投与後３３６、６７２、８４０時間のサル血清におけるレパーサ、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７および１９．３．８に対する抗薬物抗体（ＡＤＡ）の力価は、投与前と有意差がない。したがって、雌のサルへの３または１０ｍｇ／ｋｇの抗体の単回ＩＶ注射後に、結果は、レパーサ、１５．１４．２、１７．７２．３、１８．１３６．７および１９．３．８が、血清において低い免疫原性を誘導したことを示す。
【０２４５】
５．４  毒性
死亡率／瀕死：研究の間、各動物の健康状態を、動物を１回検査した動物開放時およびインライフ完了日を除いて、１日に２回、朝に１回および午後に１回報告した。
【０２４６】
研究過程の間、予定外の死亡はなかった。
【０２４７】
詳細な観察：すべての動物（予備動物を含む）について予備試験の間に１回、投薬日に１回（投与後２±０．５時間）およびすべての研究動物について、その後週に１回、研究の間、詳細な観察を実施した。
【０２４８】
インライフ相の間に試験品関連臨床徴候は観察されなかった。
【０２４９】
ケージサイドの観察：ケージサイドの観察を、すべての動物（予備動物を含む）について−２日からの予備試験の間毎日、１日目の投与前に１回および投薬日に１日２回（投与後３０分内およびおよそ６±０．５時間）および回復相の間は１日１回実施した。詳細な観察が同一時間帯で予定されていた場合には、ケージサイドの観察は実施しなかった。
【０２５０】
体重：各動物を、すべての動物について予備試験の間に１回、投薬前に１日目に１回および研究動物についてその後週に１回秤量した。
【０２５１】
体重に関して、試験品関連知見は観察されず、すべての変化は、生物学的変動内と考えられた。
【０２５２】
摂食量：摂食量を、投与開始の２日前ならびに投薬日および観察期間を通じて、すべての動物について毎日推定した。毎日の食物評価は、全体的な食欲についての目視検査によって評価した（記述は、動物が摂食していたか否かからなる）。
【０２５３】
摂食量の試験品関連変化はなかった。
【０２５４】
［実施例６］
抗体１８．１５６．８および参照抗体間の活性比較
１．  参照抗体作製
参照抗体１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４Ｋおよび２４Ｂ９．１．ｕＩｇＧ４Ｌを、実施例１および実施例２に記載される方法を使用して、特許ＣＮ１０１９３２６０７中の１２Ｈ１１．１および２４Ｂ９．１の配列をベースとして作製した。
【０２５５】
抗体１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４Ｋおよび２４Ｂ９．１．ｕＩｇＧ４Ｌは、軽鎖および重鎖に対応する還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて２５ｋＤａおよび５５ｋＤａの見かけの分子量で移動する（図２８Ａ）。非還元条件下での主なバンドは、約１５０ＫＤのＭ．Ｗ．を有する全ＩｇＧである。２４Ｂ９．１．ｕＩｇＧ４Ｌの純度は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって決定されるように９６．８％である（図２８Ｂ）。１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４Ｋの純度は、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって決定されるように９５．３％である（図２８Ｃ）。
【０２５６】
２．  ＥＬＩＳＡによるヒトＰＣＳＫ９との結合
実施例２の節２．４ハイブリドーマスクリーニングに記載される方法に従って、ＥＬＩＳＡによって、参照抗体１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４Ｋおよび２４Ｂ９．１．ｕＩｇＧ４ＬのヒトＰＣＳＫ９との結合の活性が確認された（図２９）。結合ＥＣ５０値を表１２にまとめた。参照抗体１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４Ｋは、１８．１５６．８およびＢＭＫ．１１５よりも低い結合活性を示した。参照抗体２４Ｂ９．１．ｕＩｇＧ４Ｌは、ヒトＰＣＳＫ９と結合しない。
【０２５７】
【表１２】
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【０２５８】
３．  ＥＬＩＳＡによる遮断アッセイ
参照抗体１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４Ｋおよび２４Ｂ９．１．ｕＩｇＧ４Ｌの、ＰＣＳＫ９のＬＤＬＲとの結合を遮断する活性を、実施例２の節２．４  ハイブリドーマスクリーニングに記載される方法に従って、競合的ＥＬＩＳＡ法によって評価した（図３０）。ＩＣ５０値を表１３にまとめた。抗体２４Ｂ９．１．ｕＩｇＧ４Ｌは、遮断活性を示さなかった。抗体１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４Ｋは、１８．１５６．８に対して同様のＩＣ５０を示したが、ＰＣＳＫ９とＬＤＬＲの結合を完全に遮断できなかった。
【０２５９】
【表１３】
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【０２６０】
４．  ＳＰＲによる親和性
抗体１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４Ｋの動態学的親和性は、実施例４の節４．３．１  ＳＰＲによる結合動態学に記載される同一方法を使用して試験されるように、１８．１５６．８よりもかなり低い。結果は、表１４に示されている。
【０２６１】
【表１４】
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【０２６２】
５．  ＬＤＬ取り込みアッセイ
抗体１８．１５６．８および１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４Ｋを、実施例４の節４．２  完全ヒト抗体のＬＤＬ取り込みアッセイに記載される方法に従って、ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬ取り込みアッセイにおいて評価した（表１５および図３１を参照のこと）。１２Ｈ１１．１．ｕＩｇＧ４Ｋは、ＨｅｐＧ２細胞において細胞性ＬＤＬ取り込みを回復させるわずかに低い活性を示した。
【０２６３】
【表１５】
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【０２６４】
本開示は、特定の実施形態（その一部は好ましい実施形態である）に関して特に示され、記載されているが、本明細書において開示されるような本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、形態および詳細の種々の変法が行われ得るということは当業者によって理解されなくてはならない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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