(57)【要約】  本発明は、少なくとも２つのペプチドから構成されるＣＥＤ−４タンパク質配列由来の殺線虫ペプチドから構成される殺線虫剤の相乗的組成物を提供する。殺線虫ペプチドは、個々に１ｍｇ／ｍｌの濃度で１００％殺線虫活性を示し、同時に、１：１比の少なくとも２つのペプチドの組み合わせは、相乗的効果をもたらすので０．８ｍｇ／ｍｌという低い濃度で１００％殺線虫活性を示す。この相乗的殺線虫組成物は、１００％活性に必要なペプチド濃度が２０％低いため、非常に経済的であり、さらに本組成物は、環境面で安全であり、ヒト及び動物に対して無毒性である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＥＤ−４タンパク質由来の少なくとも２つのペプチドから構成される線虫を制御するための相乗的組成物であって、
前記ペプチドが配列番号２〜４のアミノ酸配列からなり；
前記ペプチドの比が１：１であり；
組成物が約０．８ｍｇ／ｍｌの濃度で１００％の相乗的抗線虫効力を有する、相乗的組成物。
【請求項２】
全ての類縁体、ホモローグ、誘導体及びその保存的変異体を包含する、１５アミノ酸の長さを有する配列番号２のアミノ酸配列からなるペプチドから構成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
全ての類縁体、ホモローグ、誘導体及びその保存的変異体を包含する、１６アミノ酸の長さを有する配列番号３のアミノ酸配列からなるペプチドから構成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
全ての類縁体、ホモローグ、誘導体及びその保存的変異体を包含する、１２アミノ酸の長さを有する配列番号４のアミノ酸配列からなるペプチドから構成される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
少なくとも１つの増量剤、乳化剤及び／又は界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
農薬活性を有する化合物を少なくとも１つさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
農薬活性を有する化合物が、植物を処理可能な物質、殺真菌剤、殺菌剤、殺虫剤、殺ダニ剤、殺線虫剤、軟体動物防除剤、セーフナー、植物成長調節物質、植物栄養剤及び生物学的防除剤から選択されるが限定されない、請求項３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、植物寄生虫、具体的には線虫を死滅させるために農業分野で使用される組成物である殺線虫剤に関する。より具体的には、本発明は、ＣＥＤ−４タンパク質由来の殺線虫ペプチドを含む殺線虫剤の相乗的組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
線虫は、収量に大きな損害をもたらし、それにより経済に甚大な影響が及ぶため、農産業にとって大きな脅威である。線虫は、昆虫に次いで、トマト及び他の野菜、柑橘類、ジャガイモ、コメ、ココナツ、コムギ及び他の穀類、観賞植物などの作物に深刻な損害を与えるものであることが知られている。線虫は、単独又は他の土壌微生物との組み合わせで、根、茎、葉、果実及び種子を含む植物の殆ど全ての部分を攻撃することが分かっている。これらにより、世界中で推定で１２．３％（＄１５７０億ドル）の収量損失が引き起こされる。このうち、＄４０３０万がインドから報告されている（Ｓｉｎｇｈら、２０１５）。
【０００３】
メロイドギネ属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｇｅｎｕｓ）に属する根瘤線虫は、園芸作物及び農作物において植物寄生線虫のうち３つの最も経済的に損害を与える属の１つである。これらは、いくつかの植物の根の偏性寄生生物であり；メロイドギネ・インコグニタ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）はとりわけ世界の主要害虫である。
【０００４】
殺線虫剤は、これらの植物寄生虫、線虫を死滅させるために使用される組成物である。使用される殺線虫剤のうち殆どは、ヒトにとって非常に毒性が高い化学組成物であり、有用な土壌細菌にも有害である。一部の殺線虫剤は、地下水に混入し、オゾン層の枯渇を引き起こすことも示されている。周知の殺線虫剤の１つである臭化メチルは、米国及びインドを含む一部の国で禁止されている。農作物で広く使用される非常に毒性が高い別の殺線虫剤はカルボフランであり；１粒のカルボフランによって数分以内に鳥が死亡し得る。ホレートなどの殺線虫剤は容易に土壌を通って地下水に達し、それに混入し得る。
【０００５】
化学殺線虫剤に付随する重大な欠点は、線虫を防除するための新規技術の開発を必要とする。あるこのような方法は、線虫に対する耐性に対するトランスジェニック遺伝子を発現するトランスジェニック植物ラインを作製することである。しかし、これは、大規模な事前調査活動を必要とする、時間がかかり、高価な方法である。インドを含む多くの国において、いくつかの道徳的、倫理的及び見えない環境問題に基づき、トランスジェニックラインの導入に対する激しい異論がある。
【０００６】
ある有効な方法は、環境面で安全で無毒性であり、作製及び使用が容易な殺線虫剤の組成物の作製を含む。
【０００７】
米国特許第９１２５４１３Ｂ１号明細書は、強力な殺線虫活性を示すカエノルハブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ．  ｅｌｅｇａｎｃｅ）ＣＥＤ−４タンパク質由来のペプチドを記載する。配列番号１のアミノ酸からなるＣＥＤ−４タンパク質はアポトーシスタンパク質のファミリーに属する。配列番号１は、
ＭＬＣＥＩＥＣＲＡＬＳＴＡＨＴＲＬＩＨＤＦＥＰＲＤＡＬＴＹＬＥＧＫＮＩＦＴＥＤＨＳＥＬＩＳＫＭＳＴＲＬＥＲＩＡＮＦＬＲＩＹＲＲＱＡＳＥＬＧＰＬＩＤＦＦＮＹＮＮＱＳＨＬＡＤＦＬＥＤＹＩＤＦＡＩＮＥＰＤＬＬＲＰＶＶＩＡＰＱＦＳＲＱＭＬＤＲＫＬＬＬＧＮＶＰＫＱＭＴＣＹＩＲＥＹＨＶＤＲＶＩＫＫＬＤＥＭＣＤＬＤＳＦＦＬＦＬＨＧＲＡＧＳＧＫＳＶＩＡＳＱＡＬＳＫＳＤＱＬＩＧＩＮＹＤＳＩＶＷＬＫＤＳＧＴＡＰＫＳＴＦＤＬＦＴＤＩＬＬＭＬＫＳＥＤＤＬＬＮＦＰＳＶＥＨＶＴＳＶＶＬＫＲＭＩＣＮＡＬＩＤＲＰＮＴＬＦＶＦＤＤＶＶＱＥＥＴＩＲＷＡＱＥＬＲＬＲＣＬＶＴＴＲＤＶＥＩＳＮＡＡＳＱＴＣＥＦＩＥＶＴＳＬＥＩＤＥＣＹＤＦＬＥＡＹＧＭＰＭＰＶＧＥＫＥＥＤＶＬＮＫＴＩＥＬＳＳＧＮＰＡＴＬＭＭＦＦＫＳＣＥＰＫＴＦＥＫＭＡＱＬＮＮＫＬＥＳＲＧＬＶＧＶＥＣＩＴＰＹＳＹＫＳＬＡＭＡＬＱＲＣＶＥＶＬＳＤＥＤＲＳＡＬＡＦＡＶＶＭＰＰＧＶＤＩＰＶＫＬＷＳＣＶＩＰＶＤＩＣＳＮＥＥＥＱＬＤＤＥＶＡＤＲＬＫＲＬＳＫＲＧＡＬＬＳＧＫＲＭＰＶＬＴＦＫＩＤＨＩＩＨＭＦＬＫＨＶＶＤＡＱＴＩＡＮＧＩＳＩＬＥＱＲＬＬＥＩＧＮＮＮＶＳＶＰＥＲＨＩＰＳＨＦＱＫＦＲＲＳＳＡＳＥＭＹＰＫＴＴＥＥＴＶＩＲＰＥＤＦＰＫＦＭＱＬＨＱＫＦＹＤＳＬＫＮＦＡＣＣを含む。
【０００８】
配列番号１由来の３つのペプチドは、約１ｍｇ／ｍｌの有効濃度で殺線虫活性を有することが示され、このペプチドは次の配列：
１）１５アミノ酸ＤＬＬＲＰＶＶＩＡＰＱＦＳＲＱ（９９〜１１３アミノ酸区間、配列番号２）からなるペプチド２、
２）１９アミノ酸ＲＱＭＬＤＲＫＬＬＬＧＮＶＰＫＱＭＴＣ（１１２〜１３０アミノ酸区間、配列番号３）からなるペプチド３及び
３）１２アミノ酸ＦＰＫＦＭＱＬＨＱＫＦＹ（５２９〜５４０アミノ酸区間、配列番号４）からなるペプチド１２
から構成された。
【０００９】
しかし、ペプチドの合成は高価な技術であり；組成物をコスト効率の良いものとするためには、生産コストを削減する必要がある。一般に、１０〜２０アミノ酸の範囲のペプチド５０ｍｇの合成コストは、ＩＮＲ２５，０００〜３０，０００及びＵＳ＄２４０〜２５０の範囲になる。したがって、生産コストが低い組成物を作製することは重要である。
【００１０】
本発明は、先行技術の欠点を考慮し、無毒性であり、環境面で安全である抗寄生虫ペプチドを使用して線虫を防除するための方法を提供する。
【００１１】
発明の目的
したがって、本発明の主要な目的は、殺線虫ペプチドを含む殺線虫剤の組成物を提供することである。
【００１２】
本発明の別の目的は、配列番号１のＣＥＤ−４タンパク質由来の少なくとも２つのペプチドから構成される相乗的殺線虫組成物を提供することであり、このペプチドは、
ａ．ＤＬＬＲＰＶＶＩＡＰＱＦＳＲＱ（配列番号２）、
ｂ．ＲＱＭＬＤＲＫＬＬＬＧＮＶＰＫＱＭＴＣ（配列番号３）及び
ｃ．ＦＰＫＦＭＱＬＨＱＫＦＹ（配列番号４）
のアミノ酸配列からなる。
【００１３】
本発明のまた別の目的は、殺線虫活性を示す相乗的殺線虫組成物を提供することであり、このペプチドの濃度は１ｍｇ／ｍｌ未満である。
【００１４】
本発明のまた別の目的は、生産コストが低い相乗的殺線虫組成物を提供することである。
【００１５】
本発明のまた別の目的は、ヒトに対して無毒性である相乗的殺線虫組成物を提供することである。
【００１６】
本発明のまた別の目的は、広域スペクトル活性がなく、土壌微生物にとって有害ではない相乗的殺線虫組成物を提供することである。
【００１７】
本発明のまた別の目的は、合成し易く、トランスジェニック植物の作製の必要がなく、経済性に優れた相乗的殺線虫組成物を提供することである。
【発明の概要】
【００１８】
本発明は、植物寄生虫、具体的には線虫を死滅させるために農業の目的で使用される殺線虫剤の組成物に関する。より具体的には、本発明は、殺線虫ペプチドを含む殺線虫剤の相乗的組成物に関する。
【００１９】
本発明の主な実施形態において、本発明は、配列番号１のＣＥＤ−４タンパク質由来のペプチドから構成される殺線虫剤の組成物を提供する。より具体的には、本組成物は、アミノ配列：
ａ．ＤＬＬＲＰＶＶＩＡＰＱＦＳＲＱ（配列番号２）、１５アミノ酸から構成されるペプチド２、
ｂ．ＲＱＭＬＤＲＫＬＬＬＧＮＶＰＫＱＭＴＣ（配列番号３）、１９アミノ酸から構成されるペプチド３及び
ｃ．ＦＰＫＦＭＱＬＨＱＫＦＹ（配列番号４）、アミノ酸から構成されるペプチド１２
からなる少なくとも２つのペプチドの相乗的組み合わせから構成される。
【００２０】
本ペプチドは、個々に、１ｍｇ／ｍｌという低い濃度で１００％殺線虫活性を示す。
【００２１】
しかし、少なくとも２つのペプチドの組み合わせは、相乗的に作用し、１００％殺線虫活性に対して、ペプチドのそれぞれの濃度を０．４ｍｇ／ｍｌまで低下させる。活性に必要とされるペプチド量の顕著な減少によって生産コストが大きく削減され、それによりユニークな組成物が非常に経済的なものとなる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】図１は、９６ウェルプレートでの、線虫に対する、ペプチド２及びペプチド３；ペプチド２及びペプチド１２；ペプチド３及びペプチド１２；及びペプチド２、３及び１２から構成される混合物の処理の効果を示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
ここで、本明細書中で以下、本発明をより詳細に記載する。しかし、本発明は、多くの異なる形態で具体化され得、本明細書中で示される実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、実施形態は、この開示が完全なものであり、当業者に本発明の範囲を十分に伝えるように提供される。
【００２４】
本発明は、植物寄生虫、具体的には線虫を死滅させる能力を有する相乗的組成物に関する。より具体的には、本発明は、殺線虫ペプチドから構成される殺線虫剤の相乗的組成物に関し、このペプチドはＣＥＤ−４タンパク質配列由来である。
【００２５】
本発明の主な実施形態において、本発明は、配列番号１のＣＥＤ−４タンパク質由来の少なくとも２つのペプチドから構成される殺線虫剤の相乗的組成物を提供する。より具体的には、本組成物は、次のペプチド：
ａ．ペプチド２、配列ＤＬＬＲＰＶＶＩＡＰＱＦＳＲＱ（配列番号２）から構成される１５アミノ酸長ペプチド、
ｂ．ペプチド３、配列ＲＱＭＬＤＲＫＬＬＬＧＮＶＰＫＱＭＴＣ（配列番号３）から構成される１９アミノ酸長及び
ｃ．ペプチド１２、配列ＦＰＫＦＭＱＬＨＱＫＦＹ（配列番号４）から構成される１２アミノ酸長
の組み合わせから構成される。
【００２６】
１：１の比で配列番号２〜４のアミノ酸を含有する少なくとも２つのペプチドは、０．８ｍｇ／ｍｌという低い総ペプチド濃度で１００％殺線虫活性を示す非常に強力な殺線虫剤として作用する。２つのペプチドの組み合わせは相乗的効果をもたらし、この組み合わせは個々のペプチド単独と比較して、より低い濃度で作用する。相乗的組成物によって総ペプチド濃度の必要量が２０％減少し、それにより本発明が非常に経済的となり、さらに本組成物は他の既存の方法よりも環境面で安全であり、殺線虫活性を有するトランスジェニックラインの作製よりも容易である。
【００２７】
例１−含まれる手順：
Ａ）Ｍ．インコグニタ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）増殖
トマト植物にＭ．インコグニタ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）幼虫を接種し、栽培箱中で維持した。少なくとも２か月後、Ｍ．インコグニタ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）卵を実験のために根から抽出した。Ｍ．インコグニタ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）卵を抽出するために従った手順を以下で説明する。
【００２８】
手術用メス及び時計皿を使用して根の組織を手作業により細切するか、又はフードプロセッサを使用して細切した。次に、細切した組織をボトルに入れ、漂白剤の１０％希釈液で洗浄した。次いで、滅菌条件下で、ふるい（上に６０カウントシーブ（ｃｏｕｎｔ  ｓｉｅｖｅ）、下に５００カウントシーブ（ｃｏｕｎｔ  ｓｉｅｖｅ））に根の溶液を注いだ。粗製卵回収物（ｃｒｕｄｅ  ｅｇｇ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を５００カウントシーブ（ｃｏｕｎｔ  ｓｉｅｖｅ）の下部から回収して、１５ｍＬファルコンチューブ中で各５ｍＬの漂白剤及び卵の混合物になるようにした。次に、５ｍＬの７０％スクロース溶液を各ファルコンチューブに入れた。次に、二重蒸留滅菌水の１ｍＬ層を各ファルコンチューブ中のスクロース混合物の上部に静かに置いた。次いで、１２００ｒｐｍで５分間試料を遠心分離した。各ファルコンチューブから新しい１５ｍＬファルコンチューブに全部で３ｍＬ（溶液の３ｍＬの上層）、スクロース溶液と１ｍＬ水層との間に浮遊した胚を回収した。１０ｍＬの５％漂白剤溶液を添加し、卵を１０分間ボルテックス処理した。次に、ファルコンチューブを２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。次に、上清を除去し、１０ｍＬの滅菌二重蒸留水中で卵をすすぎ、２０００ｒｐｍで５分間再び遠心分離した。この工程をさらに２回反復した。最後の洗浄後、５ｍＬの上清を除去し、一方で残った５ｍＬの水を卵と混合し、５ｍＬのペトリ皿に入れた。次に、卵を２５〜２７℃のインキュベーターに入れ、約１０日後に幼虫（Ｊ２期）が孵化した。この虫を保管のために２５〜２７℃のインキュベーター中で維持した。
【００２９】
Ｂ）試験溶液の調製及び線虫の配置
二重蒸留水中で凍結乾燥ペプチドを必要量溶解させて必要な濃度を得た。
【００３０】
必要な濃度の１００μＬのペプチド溶液をピペットで９６ウェルプレートのうち３０ウェルに入れ、抽出したＪ２  Ｍ．インコグニタ（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）の保存物から各ウェルに１匹を移した。陰性対照について、各実験に対して３０匹の虫を１００μＬの滅菌二重蒸留水に入れた。
【００３１】
Ｃ）線虫の監視
この寄生虫を死滅させるためのペプチド及びカルコンの能力を試験するためにバイオアッセイを設計する（％死亡率）。各ウェル（全部で３０ウェル）中線虫１匹を使用して９６ウェルプレート中で各試験を行った。５日間にわたり処理溶液中で線虫を温置した。プローブでの撹乱後、運動性についてそれぞれを調べることによって、手術用顕微鏡下で線虫の生存能を試験した。
【００３２】
例２−殺線虫ペプチドの組み合わせから構成される殺線虫組成物の有効性
図１で示されるように、水中でのＪ２期幼若線虫の温置によって、第５日に線虫の死亡率は１０〜２０％前後となり、これを陰性対照とした。０．８ｍｇ／ｍｌの濃度でのペプチド２、ペプチド３又はペプチド１２のみとの幼若線虫の温置の結果、第５日で幼若線虫の死亡率が６０〜６６％前後となった。しかし、１：１比の、ペプチド２及びペプチド３、ペプチド２及びペプチド１２又はペプチド３及びペプチド１２の組み合わせから構成される殺線虫組成物によって、第５日で幼若線虫の死亡率はほぼ１００％となり、本ペプチドの総濃度は０．８ｍｇ／ｍｌであった。さらに、１：１：１比のペプチド２、３及び１２の組み合わせでも、第５日で幼若線虫死亡率が１００％となった。
【００３３】
これらの結果から、ＣＥＤ−４タンパク質由来のペプチドは、一緒に組み合わせた場合、殺線虫組成物として相乗的に作用することが示唆される。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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