(57)【要約】  フコース残基をドナー基質からラクトテトラオースに転移させることができる新規のフコシル基転移酵素、前記フコシル基転移酵素を利用してフコシル化オリゴ糖を生産するための方法、及び栄養組成物を製造するためのこのようにして生産されたフコシル化オリゴ糖の使用が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フコシル化オリゴ糖を生産するための方法であって、
ａ）異種フコシル基転移酵素を発現するように遺伝的に操作された少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞を提供するステップであって、前記異種フコシル基転移酵素がフコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることができ、前記アクセプター分子がラクトテトラオースである、ステップ；
ｂ）少なくとも１つの炭素源の存在下で及び少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞がフコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させるのに適した条件下で少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞を培養するステップ；並びに
ｃ）任意選択的に、フコシル化オリゴ糖を回収するステップ
を含む方法。
【請求項２】
アクセプター分子がＬＮＴ及びＬＮｎＴからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
異種フコシル基転移酵素が、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチド、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的変異体、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片、及び配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片の機能的変異体からなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
異種フコシル基転移酵素が、
ｉ）配列番号１〜１５のいずれか１つにより表されるヌクレオチド配列；
ｉｉ）好ましくは配列の全長にわたって、配列番号１〜１５のいずれか１つにより表されるヌクレオチド配列の１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
ｉｉｉ）配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｉｖ）配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列のいずれか１つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｖ）ｉｉｉ）及びｉｖ）に従ったポリペプチドのいずれか１つの機能的断片をコードするヌクレオチド配列；又は
ｖｉ）そこでは核酸分子が、厳密な条件下でｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）若しくはｖ）に従った核酸分子の相補鎖にハイブリダイズする
を含む核酸分子によりコードされる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
請求項１に記載の方法においてフコシル化オリゴ糖を生産するために／使用するために遺伝的に操作された細胞であって、前記細胞が異種フコシル基転移酵素を発現するように遺伝的に操作されており、前記異種フコシル基転移酵素がフコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移することができ、前記アクセプター分子がラクトテトラオースである、遺伝的に操作された細胞。
【請求項６】
異種フコシル基転移酵素が、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチド、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的変異体、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片、及び配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片の機能的変異体からなる群から選択される、請求項５に記載の遺伝的に操作された細胞。
【請求項７】
異種フコシル基転移酵素が、
ｉ）配列番号１〜１５のいずれか１つにより表されるヌクレオチド配列；
ｉｉ）好ましくは配列の全長にわたって、配列番号１〜１５のいずれか１つにより表されるヌクレオチド配列の１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
ｉｉｉ）配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｉｖ）配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列のいずれか１つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｖ）ｉｉｉ）及びｉｖ）に従ったポリペプチドのいずれか１つの機能的断片をコードするヌクレオチド配列；又は
ｖｉ）そこでは核酸分子が、厳密な条件下でｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）若しくはｖ）に従った核酸分子の相補鎖にハイブリダイズする
を含む核酸分子によりコードされる、請求項６又は７に記載の遺伝的に操作された細胞。
【請求項８】
細胞が、好ましくは、細胞がｉ）Ｌ−フコースからのＧＤＰ−フコースの形成を触媒する二機能性フコースキナーゼ／Ｌ−フコース−１−ホスフェート−グアニル酸転移酵素をコードする遺伝子を発現する、又はｉｉ）ホスホマンノムターゼ、マンノース−１−ホスフェートグアノシル転移酵素、ＧＤＰ−マンノース−４，６−脱水酵素、及びＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つを過剰発現するように遺伝的に操作されている点で、遺伝的に操作される前の細胞と比べた場合、増加した細胞内ＧＤＰ−フコース生成力を含むように遺伝的に操作されている、請求項６又は７に記載の遺伝的に操作された細胞。
【請求項９】
細胞が、好ましくは、細胞が、遺伝的に操作される前の前駆細胞と比べた場合、イー・コリ由来の主要ファシリテーター輸送体ＦｕｃＰをコードするヌクレオチド配列、イー・コリ由来の主要ファシリテーター輸送体ＦｕｃＰの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列、イー・コリ由来の主要ファシリテーター輸送体ＦｕｃＰの機能的断片をコードするヌクレオチド配列、及びイー・コリ由来の主要ファシリテーター輸送体ＦｕｃＰの機能的断片の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される１つのヌクレオチド配列を発現する又は過剰発現するようにも遺伝的に操作されている点で、この細胞の細胞膜を横断する外因性Ｌ−フコースの増加した移入を有するように遺伝的に操作されている、請求項６〜８のいずれか一項に記載の遺伝的に操作された細胞。
【請求項１０】
細胞が、好ましくは、コラン酸合成の第１ステップを触媒するＷｃａＪをコードする細胞の遺伝子の発現が損なわれている若しくは不活性化されている点で、又は、ＷｃａＪをコードする遺伝子のヌクレオチド配列が、酵素的に不活性なポリペプチドが変更されたＷｃａＪ遺伝子によりコードされるように変更されている点で、細胞の細胞内ＧＤＰ−フコースプールの枯渇を防ぐようにも遺伝的に操作されている、請求項６〜９のいずれか一項に記載の遺伝的に操作された細胞。
【請求項１１】
細胞が、それぞれＬ−フコースイソメラーゼ及びＬ−フクロースキナーゼをコードする遺伝子ｆｕｃｌ及び／若しくはｆｕｃＫが欠失していて、ｆｕｃｌ及び／若しくはｆｕｃＫのヌクレオチド配列が対応するポリペプチドの酵素活性を不可逆的に不活性化するように変更されている点で、又はｆｕｃｌ及び／若しくはｆｕｃＫの発現が損なわれている点でも、遺伝的に操作されている、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の遺伝的に操作された細胞。
【請求項１２】
細胞が、遺伝的に操作される前の細胞と比べた場合、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン及びＵＤＰ−ガラクトースの１つ以上を合成する増加した能力を有するようにも遺伝的に操作されており、好ましくは、前記増加したＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＵＤＰ−ガラクトース、さらに好ましくは、ＣＭＰ−Ｎ−アセチルノイラミン酸生産力が、ａ：Ｌ−グルタミンについての以下の活性：Ｄ−フルクトース−６−ホスフェートアミノ基転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン−１−ホスフェートアセチル基転移酵素、ホスホグルコサミンムターゼ、ＵＤＰ−ガラクトース−４’−エピマー変換酵素、ホスホグルコムターゼ、グルコース−１−ホスフェートウリジリルトランスフェラーゼ、グルコサミン−６−ホスフェートアセチル基転移酵素、Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピマー変換酵素、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン−２−エピマー変換酵素、ホスホエノールピルビン酸合成酵素、シアル酸合成酵素、シアル酸透過酵素、ＣＭＰ−シアル酸合成酵素を含むタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の過剰発現を含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の遺伝的に操作された細胞。
【請求項１３】
細胞が、
（ｉ）任意選択的に、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、
（ｉｉ）β−１，３−ガラクトシル基転移酵素又はβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素；並びに
（ｉｉｉ）糖転移酵素としてα−１，２−及び／又はα−１，３−フコシル基転移酵素
を含む、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の遺伝的に操作された細胞。
【請求項１４】
フコシル化オリゴ糖を生産するための方法であって、
ａ）反応混合物中でフコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることができるフコシル基転移酵素を提供し、前記アクセプター分子がラクトテトラオースであるステップ；並びに
ｂ）前記フコシル基転移酵素をフコース残基を含むドナー基質及びアクセプター分子に接触させ、前記アクセプター分子がラクトテトラオースであるステップ
を含む方法。
【請求項１５】
栄養組成物、好ましくは、乳児用調合物を製造するために、請求項１〜４又は１４のいずれか一項に記載の方法により生産されるフコシル化オリゴ糖の使用。
【請求項１６】
少なくとも１つのフコシル化オリゴ糖を含む栄養組成物であって、前記少なくとも１つのフコシル化オリゴ糖が請求項１〜４又は１４のいずれか一項に記載の方法により生産されている栄養組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は新規のフコシル基転移酵素及びフコシル化オリゴ糖の生産におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
おおよそ２００の構造的に異なるヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）が、これまで同定されている。前記ＨＭＯは二糖類ラクトースを基にしており、Ｎ−アセチルグルコサミン、フコース、シアル酸及びガラクトースを基にする追加の単糖残基を保有している。ヒトミルク中のＨＭＯの濃度及び組成は個体間で変動し、授乳期の間は初乳中の最大２０ｇ／Ｌから成熟乳中の５〜１０ｇ／Ｌまで変動する。
【０００３】
いわゆる「分泌表現型」に属する女性のミルクは、高含量のα−１，２−フコシル化ＨＭＯを含有する。女性たちは、いわゆる「フコシル基転移酵素２」をコードするＦＵＴ２遺伝子を発現する。そのミルク中で最も大量にあるＨＭＯは、２’−フルコシル−ラクトース（２’−ＦＬ；Ｆｕｃ（α１−２）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）及びラクト−Ｎ−フコペンタオース−ｌ（ＬＮＦＰ−Ｉ；Ｆｕｃ（α１−２）Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β１−３）Ｇａｌ（β１−４）Ｇｌｃ）である。
【０００４】
ヒトミルクオリゴ糖は、乳児の腸を通過中は消化されない。乳児腸でのその残留性のせいで、ヒトミルクオリゴ糖は子供に有益な効果を示す。より具体的には、ＨＭＯは、共生微生物であるビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）及びラクトバシラス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の炭素源として役割を果たしているので、プレバイオティックであることが明らかにされている。したがって、ＨＭＯは乳児の腸においてこれらの微生物の増殖を支えている。
【０００５】
ヒトミルクオリゴ糖はまた、腸の粘膜表面上のグリカン構造体への病原体の付着を防ぐことにより、前記病原体による乳児の腸への定着を直接減少させる。ＨＭＯは、上皮表面グリカンに対するその構造的類似性ゆえにデコイとして機能し、病原体の侵入を阻害し、それによって感染のリスクを低減させる。
【０００６】
アルファ−１，２−フコシル化ＨＭＯは、最も一般的な細菌性下痢の原因物質である、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）の感染に対して防御することが明らかにされている。α−１，２−フコシル化ＨＭＯは、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）の熱安定毒素により引き起こされる下痢に対する防御にも関連している。その上、下痢媒介カリシウイルスの感染のリスクは、母乳中の高含量のα−１，２−フコシル化ＨＭＯにより低減される。ＨＭＯは、特にフコシル化ＨＭＯラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ−Ｖ；Ｇａｌ（β１−３）ＧｌｃＮＡｃ（β１−３）Ｇａｌ（β１−４）［Ｆｕｃα１−３］Ｇｌｃ）は、院内下痢の最も一般的な原因である、クロストリジウム・ディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）由来の毒素Ａの炭水化物結合部位に結合する。このように、ＨＭＯは、Ｃ．ディフィシル由来の毒素Ａと細胞受容体の相互作用を妨げると思われる。さらに、上皮細胞へのシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の付着は、２’−ＦＬ及び３−フルコシルラクトース（３−ＦＬ；Ｇａｌ（β１−４）［Ｆｕｃα１−３］Ｇｌｃ）により著しく阻害された。急性胃腸炎の主因であるノロウイルス（ノーウォーク様ウイルス、ＮＬＶ）の組織血液型抗原への結合は、α−１，２−フコシル化ＨＭＯにより、並びにα−１，３−フコシル化ＨＭＯにより妨げられる。これは、宿主受容体グリカンへのノロウイルスカプシド結合を阻害するこれらのＨＭＯの潜在能力を示している。
【０００７】
ＨＭＯの、特にフコシル化ＨＭＯの既知の利点のおかげで、その合成のための経済的に価値ある工程が望まれる。代謝的に操作された細菌を利用するＨＭＯを生産するための生物工学的工程が、記載されてきた。遺伝的に操作された細菌によりフコシル化オリゴ糖を生産するための、いくつかのフコシル基転移酵素が、記載されている。
【０００８】
２’−フルコシルラクトース（２’−ＦＬ）の産生では、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｏ１２６由来のα−１，２−フコシル基転移酵素ＷｂｇＬ及びヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）由来のＦｕｃＴ２（欧州特許第２４７９２６３号Ｂ１）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）Ｏ２２由来のα−１，２−フコシル基転移酵素ＷｂｌＡ、Ｈ．ビリス（Ｈ．ｂｉｌｉｓ）ＡＴＣＣ４３７８７９由来のＦｕｔＤ、Ｈ．シネディ（Ｈ．ｃｉｎａｅｄｅ）ＣＣＵＧ１８８１８由来のＦｕｔＥ、バクテロイデス・ブルガタス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｖｕｌｇａｔｕｓ）ＡＴＣＣ８４８２由来のＦｕｔＮ、バクテロイデス・オバータス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｏｖａｔｕｓ）ＡＴＣＣ８４８３由来のＦｕｔＯ、イー・コリＯ５５：Ｈ７由来のＷｂｇＮ、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＮＣＴＣ９３４３由来のＢｆｔ１及びＢｆｔ３（国際公開第２０１４／０１８５９６号Ａ２）、並びにルイスＹ及びルイスＢ糖類の合成のためのＨ．ピロリ由来のα−１，２−フコシル基転移酵素ＦｕｃＴ２（米国特許第６，６７０，１６０号Ｂ２）が記載されていた。
【０００９】
３−フルコシルラクトースの産生では、アッカーマンシア・ムシニフィラ（Ａｋｋｅｒｍａｎｓｉａ  ｍｕｃｉｎｉｐｈｉｌａ）由来のα−１，３−フコシル基転移酵素Ａｍｕｃ、並びにバクテロイデス・フラジリス由来のＦｕｃＴ６及びＦｕｃＴ７（欧州特許第２４３９２６４号Ａ１）、Ｈ．ピロリ由来のα−１，３−フコシル基転移酵素ＦｕｔＡ（米国特許出願公開第２０１４／０１２０６１１号Ａ１）が記載されている。さらに、国際公開第２０１６／０４０５３１号Ａ１は、３−フルコシルラクトース及びラクトジフコテトラオースの合成のためのＢ．ノルディイ（Ｂ．ｎｏｒｄｉｉ）ＣＬ０２Ｔ１２Ｃ０５由来のα−１，３−フコシル基転移酵素ＣａｆＣ並びにＬＮｎＦＰ−ＩＩＩの生産のためのＨ．ヘパティカス（Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ）ＡＴＣＣ５１４４９由来のＣａｆＤを開示している。
【００１０】
しかし、フコシル基転移酵素を含む糖転移酵素が、動態、基質特異性、ドナー基質及びアクセプター分子に対する親和性、安定性並びに可溶性の点で大幅に変動することがあることは当技術分野では公知である。さらに、所望のフコシル化反応を媒介するためのフコシル基転移酵素の選択は、所望のフコシル化オリゴ糖の最終収量に著しい影響を及ぼす。例えば、国際公開第２０１４／０１８５９６号Ａ１は、ＷｂｇＬを産生するイー・コリが２’−ＦＬを合成し、ラクトジフコテトラオース（ＬＤＦＴ）も合成することができ、イー・コリ由来のＷｂｓＪ又はＶ．コレラ（Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａｅ）由来のＷｂｌＡを産生するイー・コリは、２’−ＦＬ合成を促進することはできたが、ＬＤＦＴを合成しなかったことを教示している。
【００１１】
さらに、フコシル化四糖、フコシル化五糖、フコシル化六糖又は更にはフコシル化七糖のようなさらに複雑なフコシル化オリゴ糖の生産は、小規模でしか知られていない。
【００１２】
これらの欠点に鑑みて、もっと迅速な動態、ヌクレオチド糖ドナーに対するより大きな親和性及び／又はアクセプター分子に対する異なる特異性を有するさらなるフコシル基転移酵素の必要性が存在する。複雑なフコシル化ヒトミルクオリゴ糖の商業的生産において用いることが可能なフコシル基転移酵素の、すなわち、三、四、五又は六糖でもフコシル化することができ及び／又は所望のフコシル化オリゴ糖の商業的に価値のある量を入手するのに十分な活性を有するフコシル基転移酵素の特定の必要性が存在する。
【００１３】
この問題を解決しようと試みて、発明者らは、いまだ未知のフコシル基転移酵素を表す登録を求めてタンパク質データベース及びヌクレオチド配列データベースを検索した。データベース検索から検索したヒットにより提供される推定フコシル基転移酵素は、対応するポリペプチドのフコシル基転移酵素活性に関して分析した。このアプローチに基づいて、ラクトテトラオースをフコシル化されるアクセプター分子として利用する、いまだ未知のフコシル基転移酵素を同定した。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１４】
【特許文献１】欧州特許第２４７９２６３号明細書
【特許文献２】国際公開第２０１４／０１８５９６号
【特許文献３】米国特許第６，６７０，１６０号明細書
【特許文献４】欧州特許第２４３９２６４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２０１４／０１２０６１１号明細書
【特許文献６】国際公開第２０１６／０４０５３１号
【特許文献７】国際公開第２０１４／０１８５９６号
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
細菌細胞が起源である新規のフコシル基転移酵素が、提供される。前記フコシル基転移酵素は、このフコシル基転移酵素活性のためにラクトテトラオースをアクセプター分子として利用する。前記新規フコシル基転移酵素を使用すれば、ＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴを基にしてフコシル化オリゴ糖を合成することが可能である。
【００１６】
第１の態様によれば、フコシル化オリゴ糖を生産するための方法であって、遺伝的に操作された細胞が前記フコシル化オリゴ糖を生産するために使用される方法が、提供される。前記遺伝的に操作される細胞は、フコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることができる異種フコシル基転移酵素を発現するように遺伝的に操作されており、前記アクセプター分子は、ラクトテトラオースである。
【００１７】
第２の態様によれば、フコシル化オリゴ糖を生産するための方法において使用するための遺伝的に操作された細胞が、提供される。前記遺伝的に操作される細胞は、フコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることができる異種フコシル基転移酵素を発現するように遺伝的に操作されており、前記アクセプター分子は、ラクトテトラオースである。
【００１８】
第３の態様によれば、細胞中で増やされる場合の異種フコシル基転移酵素を発現するための組換え核酸分子であって、前記フコシル基転移酵素はフコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることができ、前記アクセプター分子はラクトテトラオースである、組換え核酸分子が、提供される。
【００１９】
第４の態様によれば、フコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることができるフコシル基転移酵素であって、前記アクセプター分子はラクトテトラオースである、フコシル基転移酵素が、提供される。
【００２０】
第５の態様によれば、フコシル化オリゴ糖を生産するための、フコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることができるフコシル基転移酵素の使用であって、前記アクセプター分子はラクトテトラオースである、フコシル基転移酵素の使用が、提供される。
【００２１】
第６の態様によれば、インビトロ生体触媒によりフコシル化オリゴ糖を生産するための方法であって、フコシル基転移酵素が使用され、前記フコシル基転移酵素がフコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることができる方法が、提供される。
【００２２】
第７の態様によれば、第１の態様に従った方法により又は第６の態様に従った方法により生産されるフコシル化オリゴ糖が、提供される。
【００２３】
第８の態様によれば、栄養組成物を製造するための第７の態様に従ったフコシル化オリゴ糖の使用が、提供される。
【００２４】
第９の態様によれば、第７の態様に従った少なくとも１つのフコシル化オリゴ糖を含有する栄養組成物が、提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】イー・コリにおいて推定フコシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現のために使用された発現ベクターｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｆｕｃＴ−ｚｅｏのプラスミド地図を示す概略図である。
【図２ａ】フコシル化１型（コア構造：Ｇａｌ（β１，３）ＧｌｃＮＡｃ）及び２型（コア構造：Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ）産物のＬＣ／ＭＳ分析のクロマトグラムを示す図である。ＬＮＴ及びＬＮｎＴのフコシル化誘導体のクロマトグラムを示す図である。
【図２ｂ】フコシル化１型（コア構造：Ｇａｌ（β１，３）ＧｌｃＮＡｃ）及び２型（コア構造：Ｇａｌ（β１，４）ＧｌｃＮＡｃ）産物のＬＣ／ＭＳ分析のクロマトグラムを示す図である。Ｂ．フラジリス由来の異種発現されたフコシル基転移酵素、すなわち、糖の標準のクロマトグラムと比べたＦｕｃＴ１０９（上パネル）を含有する細胞抽出物を使用してインビトロ反応において合成されたＬＮＦＰ−ＩＩＩとＬＮｎＦＰ−Ｖの混合物のクロマトグラムを示す図である。
【図３】イー・コリにおけるラクト−Ｎ−テトラオース及びラクト−Ｎ−ネオテトラオースを基にするフルコシル化オリゴ糖の生産のための代謝経路の概略図である。
【図４】ｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｆｕｃＴ１０９−ｚｅｏを含有するラクト−Ｎ−フコペンタオース生産イー・コリ株の培養上澄みのＴＬＣ分析を描いている図である。
【図５】異なるｆｕｃＴ遺伝子の染色体組込み後のイー・コリ（株＃９９３）による細胞外ＬＮＦＰ−Ｉの生産を実証する棒グラフを示す図である。
【図６】炭素源としてグルコースを使用して１Ｌ−発酵におけるイー・コリ（株＃１７７２）によるＬＮＦＰ−Ｉの生産を実証する棒グラフを示す図である。
【図７】イー・コリ株＃１８８６において発現される加水分解酵素によるＬＮＴ−２及びラクトースの分解を例証するグラフを示す図である。
【図８】β−１，３−ガラクトシダーゼＢｇａ４２Ａによる時間依存性ＬＮＴ分解を例証する薄層クロマトグラフィーの画像を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
第１の態様によれば、フコシル化オリゴ糖を生産するための方法であって、
ａ）異種フコシル基転移酵素を発現するように遺伝的に操作された少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞であって、前記異種フコシル基転移酵素がフコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることができ、前記アクセプター分子がラクトテトラオースである、遺伝的に操作された細胞を提供するステップ；
ｂ）少なくとも１つの炭素源の存在下で及び少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞がフコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させるのに適した条件下で少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞を培養するステップ；並びに
ｃ）任意選択的に、フコシル化オリゴ糖を回収するステップ
を含む前記方法が提供される。
【００２７】
第１の態様に従った方法では、遺伝的に操作された細胞が提供される。本明細書で使用される用語「遺伝的に操作された」とは、分子生物学的方法を使用して細胞の遺伝子構成を改変することである。細胞の遺伝子構成の改変は、ヌクレオチド、トリプレット、遺伝子、オープンリーディングフレーム、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター並びに遺伝子発現を媒介する及び／又は制御する他のヌクレオチド配列を挿入する、欠失する、置換する及び／又は修飾して、種境界内の及び／又はこれを超える遺伝子の移動を含んでいてもよい。細胞の遺伝子構成の改変は、特定の所望の特性を有する遺伝的に改変された生物を生み出すことを目標とする。遺伝的に操作された細胞は、細胞の天然の（遺伝的に操作されていない）形態には存在しない１つ以上の遺伝子を含有することが可能である。細胞の遺伝情報のヌクレオチド配列を挿入する、欠失する又は変更するために、外来性の核酸分子を導入する及び／又は外来性の核酸分子（組換え、異種）を細胞の遺伝情報に挿入するための技法は当業者には公知である。遺伝的に改変された細胞は、細胞の天然の形態に存在する１つ以上の遺伝子を含有することが可能であり、前記遺伝子は人工的な手段により改変され細胞内に再導入される。用語「遺伝的に操作された」は、細胞にとって内在性の核酸分子を含有し、細胞から核酸分子を取り除かずに改変されている細胞も包含する。そのような改変は、遺伝子置換、部位特異的突然変異、及び関連する技法により得られる改変を含む。
【００２８】
遺伝的に操作された細胞は原核細胞又は真核細胞である。適切な細胞は、酵母細胞、細菌、古細菌、真菌細胞、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物細胞（ヒト細胞及び細胞株のような）を含む動物細胞を含む。
【００２９】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、原核細胞は細菌細胞であり、好ましくは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ビフィドバクテリウム属（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、スポロラクトバチルス属種（Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、ミクロモノスポラ属種（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｓｐｐ．）、ミクロコッカス属種（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、ロドコッカス属種（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）及びシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）からなる群から選択される属から選択される。適切な細菌種は、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・リケニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バチルス・コアングランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、バチルス・サーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バチルス・ラテロスポルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌａｔｅｒｏｓｐｏｒｕｓ）、バチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バチルス・ミコイデス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｙｃｏｉｄｅｓ）、バチルス・プミルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｕｍｉｌｕｓ）、バチルス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、バチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、バチルス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｉｎｆａｎｔｉｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、シトロバクター・フロインディ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｆｒｅｕｎｄｉｉ）、クロストリジウム・セルロリティカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・リュングダリイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉ）、クロストリジウム・オートエタノゲナム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｕｔｏｅｔｈａｎｏｇｅｎｕｍ）、クロストリジウム・アセトブチリカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、エンテロコッカス・フェシウム（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃｉｕｍ）、エンテロコッカス・サーモフィルス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、エルウィニア・ヘルビコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（パントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ））、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス・サリヴァリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラ��トバチルス・ヘルベティカス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・デルブリュッキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス・ブルガリクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・クリスパタス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス・カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）、ラクトバチルス・イエンセン（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、パンテア・シトレア（Ｐａｎｔｏｅａ  ｃｉｔｒｅａ）、ペクトバクテリウム・カロトボラム（Ｐｅｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒｕｍ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ（Ｐｒｏｐｒｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、シュードモナス・フルオレッセンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ）及びザントモナス・カンペストリス（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ）である。
【００３０】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、真核細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞である。酵母細胞は、好ましくは、サッカロミセス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、特に、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミコプシス属種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、ピキア属種（Ｐｉｃｈｉａ  ｓｐ．）、特に、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンゼヌラ属種（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｓｐ．）、クルイベロマイセス属種（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、ヤロウイア属種（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｓｐ．）、ロドトルラ属種（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｓｐ．）及びシゾサッカロミセス属種（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）からなる群から選択される。
【００３１】
遺伝的に操作された細胞は、異種フコシル基転移酵素を発現するように遺伝的に操作されている。本明細書で使用される用語「異種」とは、細胞又は生物にとって外来性であるヌクレオチド配列、核酸分子又はポリペプチド、すなわち、前記細胞又は生物では天然には存在しないヌクレオチド配列、核酸分子又はポリペプチドのことである。「異種配列」又は「異種核酸」又は「異種ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、特定の宿主細胞にとって外来性である供給源に（例えば、異なる種に）起源を持つ、又は同じ供給源由来の場合には、その最初の形態から改変されている配列又は核酸又はポリペプチドである。したがって、プロモーターに作動可能に連結されている異種核酸は、プロモーターが由来した供給源とは異なる供給源由来であるか、又は同じ供給源由来の場合には、その最初の形態から改変されている。異種配列は、例えば、トランスフェクション、形質転換、コンジュゲーション又は形質導入により、宿主微生物宿主細胞のゲノム中へ安定的に導入され、このようにして、遺伝的に改変された宿主細胞を表し得る。配列が導入されることになる宿主細胞に依存する技法を用いてもよい。種々の技法が当業者には公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｎｄ  Ｅｄ．、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）に開示されている。したがって、「異種ポリペプチド」は、細胞中に天然には存在しないポリペプチドであり、「異種フコシル基転移酵素」は、細胞中に天然には存在しないフコシル基転移酵素である。
【００３２】
本明細書で使用される用語「フコシル基転移酵素」とは、フコース残基のドナー基質からアクセプター分子への転移を触媒することができるポリペプチドのことである。フコース残基のアクセプター分子への転移のためのドナー基質は典型的には、グアノシン−ジホスフェートＬ−フコース（ＧＤＰ−Ｌ−フコース）である。フコース残基に適したアクセプター分子は、オリゴ糖、糖ペプチド、糖タンパク質及び糖脂質を含む。典型的には、フコース残基は、例えば、オリゴ糖又は糖タンパク質若しくは糖脂質の糖部分のＮ−アセチルグルコサミン残基、Ｎ−アセチルガラクトサミン残基、ガラクトース残基、フコース残基、シアル酸残基又はグルコース残基に転移される。本明細書で使用される用語「フコシル基転移酵素」は、前記新規のフコシル基転移酵素の機能的変異体、前記フコシル基転移酵素の機能的断片及び前記機能的変異体の機能的断片も包含すると理解されている。用語「機能的」は、前記変異体及び断片もフコース残基のドナー基質からアクセプター分子への転移を触媒することができること、すなわち、前記変異体及び断片がフコシル基転移酵素活性を有することが可能であることを示している。
【００３３】
本明細書で使用される用語「機能的断片」とは、天然に存在するフコシル基転移酵素と比べた場合、短縮型ポリペプチドのことであり、この断片は、前記断片の起源となる天然に存在するポリペプチドと同じフコシル基転移酵素活性を有することができる。
【００３４】
本明細書で使用される用語「機能的変異体」とは、前記誘導体の起源となる天然に存在するポリペプチドと同じフコシル基転移酵素活性を有することができるが、天然に存在するポリペプチドと比べた場合、変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドのことである。
【００３５】
異種フコシル基転移酵素は、フコース残基をドナー基質からアクセプター分子へ転移させることができる。異種フコシル基転移酵素に関して用語「できる」とは、異種フコシル基転移酵素がフコシル基転移酵素活性を有するためには適切な反応条件が必要とされるという前提のある、異種フコシル基転移酵素のその酵素活性のことである。適切な反応条件がなければ、異種フコシル基転移酵素はその酵素活性を持たないが、その酵素活性は保持しており、適切な反応条件が回復されるとその酵素活性を有する。適切な反応条件は、適切なドナー基質の存在、適切なアクセプター分子の存在、例えば、一価又は二価イオン、適切な範囲のｐＨ値、適切な温度、等のような不可欠な補助因子の存在を含む。異種フコシル基転移酵素の酵素反応を引き起こすありとあらゆる要因の最適値が満たされる必要はないが、反応条件は、異種フコシル基転移酵素がこの酵素活性を遂行するようなものでなければならない。したがって、用語「できる」は、異種フコシル基転移酵素の酵素活性が不可逆的に損なわれるいかなる条件も排除し、異種フコシル基転移酵素のいかなるそのような条件への曝露も排除する。その代わり、「できる」は、フコシル基転移酵素が酵素的に活性である、すなわち、適切な（すべての必要条件はフコシル基転移酵素がその酵素活性を遂行するのに必要である）反応条件が提供される場合には、このフコシル基転移酵素活性を有することを意味する。
【００３６】
フコシル基転移酵素は、フコースとアクセプター分子の糖部分の間にα−１，２−、α−１，３−、α−１，４−又はα−１，６−グリコシド結合を形成することが可能である。したがって、用語「アルファ−１，２−フコシル基転移酵素」とは、フコースのドナー基質からアクセプター分子への転移を触媒して、フコース残基とアクセプター分子の糖残基のアルファ−１，２−結合を形成する糖転移酵素のことである。用語「アルファ−１，３−フコシル基転移酵素」とは、フコースのドナー基質からアクセプター分子への転移を、フコース残基とアクセプター分子の糖残基のアルファ−１，３−結合で触媒する糖転移酵素のことである。用語「アルファ−１，４−フコシル基転移酵素」とは、フコースのドナー基質からアクセプター分子への転移を、フコース残基とアクセプター分子の糖残基のアルファ−１，４−結合で触媒する糖転移酵素のことであり、用語「アルファ−１，６−フコシル基転移酵素」とは、フコースのドナー基質からアクセプター分子への転移を、フコース残基とアクセプター分子の糖残基のアルファ−１，６−結合で触媒する糖転移酵素のことである。
【００３７】
フコース残基をドナー基質からアクセプター分子へ転移させることに関する用語「ドナー基質」とは、フコース残基を含む分子であって、特定のアクセプター分子に転移されることになるフコースの供給源として異種フコシル基転移酵素により利用される前記分子のことである。典型的には、ドナー基質はＧＤＰ−フコースである。
【００３８】
本明細書で使用される用語「アクセプター分子」とは、異種フコシル基転移酵素の酵素活性によりドナー基質からフコース残基を受け取る分子のことである。本明細書で使用される場合、用語「アクセプター分子」とは、さらに具体的には、糖部分からなる又は糖部分を含む分子のことである。別段述べてなければ、本明細書で使用される用語「アクセプター分子」とはラクトテトラオースのことである。
【００３９】
異種フコシル基転移酵素は、フコース残基をアクセプター分子としてのラクトテトラオースに転移させることができる。本明細書で使用される用語「ラクトテトラオース」とは、四糖、すなわち、４つの単糖残基からなるオリゴ糖のことであり、四糖はその還元末端にラクトースモチーフ（Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ）を含む。
【００４０】
実施形態では、ラクトテトラオースは、ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ；Ｇａｌ（β１，３）ＧｌｃＮＡｃ（β１，３）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ）及びラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ；Ｇａｌ（β１，３）ＧｌｃＮＡｃ（β１，４）Ｇａｌ（β１，４）Ｇｌｃ）からなる群から選択される。異種フコシル基転移酵素の酵素活性によりフコシル化オリゴ糖、さらに具体的には、フコシル化ラクトテトラオース、すなわち、ラクトフコペンタオースが生じる。前記ラクトフコペンタオースは、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ−Ｉ）、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ（ＬＮｎＦＰ−Ｉ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ−ＩＩ）、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩＩＩ（ＬＮｎＦＰ−ＩＩＩ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ−Ｖ）及びラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ（ＬＮｎＦＰ−Ｖ）からなる群から好ましくは選択される五糖である。
【００４１】
種々の細菌種のゲノムにおいて同定され、フコース残基をドナー基質からラクトテトラオースへ転移させるためのフコシル基転移酵素活性を有することができるポリペプチドは、表１に示されている。
【００４２】
【表１】
2020526200.tif 000002
【００４３】
したがって、追加の及び／又は代わりの実施形態では、異種フコシル基転移酵素は、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチド、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的変異体、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片、及び配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片の機能的変異体からなる群から選択される。したがって、異種フコシル基転移酵素は、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０のいずれか１つにより表されるポリペプチド、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的変異体、並びに配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９及び配列番号３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片の機能的変異体の群から選択される。
【００４４】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、異種フコシル基転移酵素は、
ｉ）配列番号１〜１５のいずれか１つにより表されるヌクレオチド配列；
ｉｉ）好ましくは、配列の全長にわたって、配列番号１〜１５のいずれか１つにより表されるヌクレオチド配列の１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
ｉｉｉ）配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｉｖ）配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列のいずれか１つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｖ）ｉｉｉ）及びｉｖ）に従ったポリペプチドのいずれか１つの機能的断片をコードするヌクレオチド配列；又は
ｖｉ）そこでは核酸分子は、厳密な条件下でｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）若しくはｖ）に従った核酸分子の相補鎖にハイブリダイズする
を含む核酸分子によりコードされる。
【００４５】
表現「配列番号１〜１５」とは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４及び配列番号１５からなる群のことである。
【００４６】
「厳密な条件下でハイブリダイズする」とは、例えば、全体で約１時間、６５℃、４×ＳＳＣでハイブリダイズし、引き続き６５℃、０．１×ＳＳＣで複数回洗浄することである。より厳密でないハイブリダイゼーション条件は、例えば、３７℃、４×ＳＳＣでハイブリダイズし、引き続き室温、１×ＳＳＣで複数回洗浄することである。「厳密なハイブリダイゼーション条件」は、６８℃、０．２５Ｍのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２、７％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ及び１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡで１６時間ハイブリダイズし、引き続き６８℃、２×ＳＳＣ及び０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳでの２回洗浄を意味することも可能である。
【００４７】
異種フコシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列は、直鎖状核酸分子上に又は環状核酸分子上に存在していてもよい。さらに及び／又は代わりに、異種フコシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列は、染色体外核酸分子上に存在していても、又は細胞の染色体核酸分子に若しくはこの少なくとも１つに組み込まれていてもよく、前記染色体核酸分子は直鎖状又は環状（細菌染色体）核酸分子でもよい。
【００４８】
少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞は少なくとも１つの炭素源の存在下で培養される。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「培養する」は、発酵ブロス中及び所望のフコシル化オリゴ糖の生産に許容的でありかつ適した条件下で細胞を生育させることを意味する。いくつかの適切な発酵ブロス及び細胞培養のための条件は、当業者の技術的専門的背景に関連して本発明の開示を読めば当業者には容易に利用可能である。
【００５０】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、少なくとも１つの炭素源は、グリセロール、サクロース、グルコース、ガラクトース、フルクトース、モラセス、ラクトース、キシロース、セルロース、ピルビン酸塩、コハク酸塩、合成ガス一酸化炭素並びに所望のフコシル化オリゴ糖を生産するように遺伝的に操作された細胞が代謝することが可能な他の任意の炭素及びエネルギー源からなる群から選択される。この文脈では、他のいかなる発酵基質（好ましくは低コストの発酵基質）も炭素源として用いることが可能であることは理解されるべきであり、当業者であれば、所望の単糖を大規模に生産する微生物を生育するために本発明内で適した炭素源を用いることが容易にできる。フコシル化オリゴ糖の生産の好ましい実施形態では、特に遺伝的に操作された細胞がラクトースそれ自体を合成することができない場合には、ラクトースが発酵ブロスに供給される。フコシル化オリゴ糖の生産の追加の及び／又は代わりの実施形態では、特に遺伝的に操作された細胞がフコースそれ自体を合成することができない場合には、フコースが発酵ブロスに供給される。発酵ブロスにフコースを補充すれば、フコースサルベージ経路又はフコースサルベージシステムを使用してＧＤＰ−フコースの細胞内合成が増強される可能性がある。
【００５１】
少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞は、少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞がフコース残基を異種フコシル基転移酵素のドナー基質からアクセプター分子に転移させるのに適した条件下で培養される。フコシル化オリゴ糖を生産するためには、少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞が、少なくとも１つの細胞が代謝的に活性であるのに十分な量の栄養分を提供する発酵ブロスにおいて、異種フコシル基転移酵素が発現されるように、かつ、細胞が異種フコシル基転移酵素が酵素的に活性であるのに十分な量のドナー基質及びアクセプター分子を提供するように、培養される。少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞が、その異種フコシル基転移酵素の活性によってフコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させるのに適している条件では、発酵ブロスは、とりわけ、適切な温度、適切なｐＨ値、発酵ブロスに溶解している適切な量の酸素、並びに適切なモル浸透圧濃度を有する。適切な値は変動する場合があり、培養される細胞型に依存している。適切な値は当業者であれば容易に決定することが可能である。
【００５２】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞がフコース残基を異種フコシル基転移酵素のドナー基質からアクセプター分子に転移させるのに適した条件下での少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞の培養は、少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞を培養しつつ発酵ブロスに外因性のラクトースを供給するステップを含む。これにより、少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞は、ラクトテトラオースの内因性合成のために前記外因性に供給されたラクトースを取り入れることが可能になる。次に、前記内因性に合成されたラクトテトラオースは異種フコシル基転移酵素に対するアクセプター基質として役立つことが可能になる。
【００５３】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞がフコース残基を異種フコシル基転移酵素のドナー基質からアクセプター分子に転移させるのに適した条件下での少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞の培養は、少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞によるラクトースの内因性合成を含む。実施形態では、ラクトースの内因性合成は、遺伝的に操作された細胞のラクトースを合成する天然の能力のせいで起きてもよい。さらに及び／又は代わりに、ラクトースの内因性合成は、遺伝的に操作された細胞において異種β−１，４−ガラクトシル基転移酵素を過剰発現することにより生じる。したがって、遺伝的に操作された細胞は、遺伝的に操作されていない前駆細胞と比べた場合、前記異種β−１，４−ガラクトシル基転移酵素遺伝子を過剰発現するようにも遺伝的に操作されている。前記異種β−１，４−ガラクトシル基転移酵素遺伝子は、ガラクトース及びグルコースからのラクトースの形成を触媒するβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素をコードする。適切なβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素の例は、パスツレラ・マルトシダ（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）由来のＰｍ１１４１（受託番号ＡＥＣ０４６８６）及びアグロゲイティバクター・アフロフィルス（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｂａｃｔｅｒ  ａｐｈｒｏｐｈｉｌｕｓ）ＮＪ８７００由来のＬｅｘ１（受託番号ＡＫ９６５８３２）からなる群から選択される。
【００５４】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞がフコース残基を異種フコシル基転移酵素のドナー基質からアクセプター分子に転移させるのに適した条件下での少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞の培養は、少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞を培養しつつ発酵ブロスにラクト−Ｎ−トリオース−２（ＬＮＴ−２）を供給するステップを含み、前記少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞は、（ｉ）β−１，３−ガラクトシル基転移酵素又はβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素、並びに（ｉｉ）糖転移酵素としてα−１，２−及び／又はα−１，３−フコシル基転移酵素を含む。ＬＮＴ−２は、かなり効率的に生産することが可能な三糖である。発酵ブロスにＬＮＴ−２を補充すれば、少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞は、前記外因性に供給されるＬＮＴ−２をＬＮＴ又はＬＮｎＴの内因性合成のための前駆体として取り入れることが可能になり、このＬＮＴ又はＬＮｎＴは、今度は異種フコシル基転移酵素のためのアクセプター分子として役立てる。
【００５５】
フコシル化オリゴ糖を生産するための方法の追加の及び／又は代わりの実施形態によれば、少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞を培養するステップを含む方法は、連続発酵工程又は回分発酵工程、好ましくは、流加回分発酵工程である。
【００５６】
したがって、培養が連続発酵工程、すなわち、遺伝的に操作された細胞の培養ステップ中、少なくとも１つの炭素源が発酵ブロスに絶えず添加され、発酵ブロスが発酵工程から連続して回収される工程である実施形態によれば、培養ステップ中炭素源を絶えず添加することにより、オリゴ糖の一定の効果的な生産が達成される。
【００５７】
培養が回分発酵工程である実施形態によれば、発酵の開始時に特定の栄養組成物並びに成長を最適化する特定の温度、圧力、通気及び他の環境条件を用いる閉鎖培養系が使用される。細胞の培養中、栄養分は発酵工程に添加されず、廃棄物も発酵工程から取り除かれない。
【００５８】
流加回分発酵工程は、培養中１つ以上の栄養分（基質）がバイオリアクターに与えられ（供給され）、産物は行程の最後までバイオリアクター中に残る又は細胞及び産物を含む発酵ブロスの少なくとも一部分が発酵工程中にバイオリアクターから取り除かれる操作技法であると理解されている。発酵ブロスの部分は、発酵工程中バイオリアクターから複数回及び／又は異なる間隔で取り除くことが可能である。
【００５９】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、フコシル化オリゴ糖を生産するための方法は、生産細胞の培養物からの所望のフコシル化オリゴ糖の回収を含む。本明細書で使用される場合、用語「回収する」は、本発明に従って宿主微生物により生産されるオリゴ糖を宿主微生物培養物から単離するか、収穫するか、精製するか、収集するか又は他の方法で分離することを意味する。本明細書で使用される用語「精製する」とは、少なくとも相当量の不純物及び望ましくない化合物の除去のことである。前記不純物及び望ましくない化合物（望ましくない副産物）は、細胞、イオン及び塩、所望のラクトフコペンタオース以外の糖、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、特にラクトテトラオース及び所望のラクトフコペンタオース以外の五糖を含む。
【００６０】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、フコシル化オリゴ糖の回収及び／又は精製は、（ｉ）フコシル化オリゴ糖を前記フコシル化オリゴ糖の溶液から結晶化すること、及び（ｉｉ）フコシル化オリゴ糖を噴霧乾燥することからなる群から選択されるステップを含む。これらのステップは、フコシル化オリゴ糖を結晶化形又は非晶形で提供する。
【００６１】
所望のフコシル化オリゴ糖の回収又は精製の追加の及び／又は代わりの実施形態では、少なくとも１つのグリコシダーゼが適用され、少なくとも１つのグリコシダーゼは、邪魔をする及び／又は望ましくない不純物又は副産物、未使用の出発基質並びに所望のオリゴ糖の生産中に生成される中間産物を分解するのに使用される。少なくとも１つのグリコシダーゼを使用することによって、例えば、所望のフコシル化オリゴ糖以外の他の（オリゴ）糖は、所望のフコシル化オリゴ糖の合成中に少なくとも１つの遺伝的に操作された細胞において又はこれによって生成され、他の糖は所望のオリゴ糖の精製ステップを妨害するが、代謝可能であることが実現される。
【００６２】
少なくとも１つのグリコシダーゼは、発酵工程の終了時に発酵ブロスに外部から添加すること、又は１つの遺伝的に操作された細胞により内因性に合成することも可能である。
【００６３】
例えば、前記１つ以上のグリコシダーゼをコードする遺伝的に操作された細胞の内因性遺伝子が欠失しているため、又は前記１つ以上のグリコシダーゼをコードする内因性遺伝子の発現が損なわれているために、遺伝的に操作された細胞が１つ以上のグリコシダーゼを合成しない場合には、少なくとも１つのグリコシダーゼを発酵ブロスに添加するのが有利である。
【００６４】
少なくとも１つのグリコシダーゼが発酵ブロスに添加される実施形態では、少なくとも１つのグリコシダーゼはフコシル化オリゴ糖を生産するために遺伝的に操作された細胞以外の少なくとも１つの他の細胞により産生され、前記少なくとも１つの他の細胞は少なくとも１つのグリコシダーゼをコードする遺伝子を発現するために発酵ブロスにさらに添加される。
【００６５】
この実施形態では、少なくとも１つの他の細胞により発現されている少なくとも１つのグリコシダーゼは、前記１つの他の細胞の天然に存在するグリコシダーゼ又は異種グリコシダーゼであり、前記他の細胞は異種グリコシダーゼを発現するように安定的に形質変換されている、及び他の細胞における異種グリコシダーゼの発現は誘導性である。好ましくは、異種グリコシダーゼは、少なくとも１つの他の細胞のゲノム中に安定的に組み込まれているヌクレオチド配列によりコードされている。
【００６６】
この実施形態は、連続発酵工程ではフコシル化オリゴ糖の生産に特に適しており、例えば、２つの別々の発酵容器又はコンテナが提供され、１つの容器はオリゴ糖合成反応に使用され、第２の容器は本質的に、異種グリコシダーゼを発現する細胞を培養するのに用いられる。
【００６７】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、少なくとも１つの他の細胞により発現されている少なくとも１つのグリコシダーゼは細胞内グリコシダーゼである。したがって、少なくとも１つの細胞により発現されている少なくとも１つのグリコシダーゼが前記少なくとも１つの細胞内に存在する。したがって、前記少なくとも１つの他の細胞は、内在化された化合物が少なくとも１つの細胞内グリコシダーゼにより分解されるように、望ましくない不純物、副産物、未使用の出発基質及び／又は所望のオリゴ糖の生産中に生み出される中間産物を摂取する。
【００６８】
代わりの実施形態では、少なくとも１つの他の細胞により発現されている少なくとも１つのグリコシダーゼは、少なくとも１つの他の細胞から発酵ブロス中に分泌される。次に、望ましくない不純物、副産物、未使用の出発基質及び／又は所望のオリゴ糖の生産中に生み出される中間産物は発酵ブロス中で分解される。この実施形態は、少なくとも１つの他の細胞が望ましくない不純物、副産物、未使用の出発基質及び／又は所望のオリゴ糖の生産中に生み出される中間産物を内在化できなくてもよい点で有利である。
【００６９】
好ましい実施形態では、グリコシダーゼはラクトースを分解する。ラクトースを分解するのに適したグリコシダーゼは、イー・コリのβ１，４−ガラクトシダーゼＬａｃＺである。中間産物であるＬＮＴ−２を加水分解するのに適したグリコシダーゼは、ビフィドバクテリウム・ビフィドゥムＪＣＭ１２５４由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼＢｂｈｌである。中間産物ＬＮＴを加水分解するのに適したグリコシダーゼは、ビフィドバクテリウム・ロングム亜種インファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）由来のβ−１，３−ガラクトシダーゼＢｇａ４２Ａである。
【００７０】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、少なくとも１つのグリコシダーゼも産生する遺伝的に操作された細胞又は少なくとも１つのグリコシダーゼを産生する少なくとも１つの他の細胞は、外部誘導されると、例えば、温度誘導発現を介して又は基質誘導発現を介して少なくとも１つのグリコシダーゼを発現する。これは、少なくとも１つのグリコシダーゼの発現が、所望のフコシル化オリゴ糖の合成中下方調節されており、例えば、発酵工程の終了時に温度又はＩＰＴＧのような誘導因子の添加により誘導されてもよいことを意味する。グリコシダーゼの発現は、十分な及び／又は本質的に最大量のオリゴ糖が遺伝的に操作された細胞の培養中に生産された後に誘導される。引き続いて、発現されているグリコシダーゼは、望ましくない糖中間体、基質、等を分解し、培地から、所望のオリゴ糖の精製を邪魔する又は複雑にすると考えられる糖中間体又は基質を本質的に非含有にする。いくつかの適切な誘導性発現ツールは先行技術において公知であり（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、上記参照）、当業者であれば、所望のオリゴ糖にそれぞれ適したツールを用いることができる。
【００７１】
遺伝子に関して本文脈内での「調節された」は、一般には、その転写が制御された様式で調節されている遺伝子、例えば下方又は上方調節されることが可能である遺伝子として理解されており、すなわち、例えば下方調節も上方調節もされていない他の調節されていない遺伝子とは、調節された遺伝子によりコードされるタンパク質の合成された量が、異なっている。
【００７２】
追加の実施形態では、望ましくない糖中間体、基質、等の分解から生じる単糖は、遺伝的に操作された細胞が代謝することが可能である。
【００７３】
第２の態様によれば、フコシル化オリゴ糖を生産するための又はこれを生産するための方法において使用するための遺伝的に操作された細胞が提供される。前記遺伝的に操作された細胞は、フコース残基をドナー基質からアクセプター分子へ転移させることができる異種フコシル基転移酵素を発現するように遺伝的に操作されており、前記アクセプター分子はラクトテトラオースである。
【００７４】
宿主細胞に関連して本明細書で使用される用語「遺伝的に操作された」は、宿主細胞が異種若しくは組換え核酸分子を複製し、及び／又は異種ヌクレオチド配列（すなわち、「前記細胞にとって外来性の」ヌクレオチド配列）によりコードされるペプチド若しくはタンパク質を発現することを示す。遺伝的に操作された細胞は、天然（非組換え）型の細胞内には見出されない遺伝子を含有することが可能である。遺伝的に操作された細胞は、天然型の細胞に見出される遺伝子で、人工的手段により改変され細胞内に再導入されている遺伝子も含有することが可能である。この用語は、細胞にとって内因性であって、細胞から核酸を取り除かずに改変されている核酸分子を含有する細胞も包含しており、そのような改変は、遺伝子置換、部位特異的突然変異及び関連する技法により得られる改変を含む。したがって、「組換えポリペプチド」は遺伝的に操作された細胞により産生されているポリペプチドである。
【００７５】
したがって、「遺伝的に操作された細胞」は形質転換されている細胞又はトランスフェクトされている細胞として理解されている。
【００７６】
このように、本発明において使用されるヌクレオチド配列は、例えば、宿主微生物細胞中に安定的に形質転換される／トランスフェクトされる又は他の方法で導入されることになるベクターに含まれていてもよい。
【００７７】
選択された宿主細胞を形質転換するか又はトランスフェクトするのに使用するための、遺伝物質の単離、合成、精製及び増幅を含む、「組換えＤＮＡ」を作製するための方法は、当業者には公知である。したがって、細胞を、選択された外因性（すなわち、外来性又は「異種」）ヌクレオチド配列を含む「ハイブリッド」ウイルス又は環状プラスミドＤＮＡで形質転換するのは、一般常識である。当技術分野で公知のこれらの手順は、環状ウイルス又はプラスミドＤＮＡを酵素的に切断して直鎖状ＤＮＡ鎖を形成することにより、形質転換ベクターを作製することを含む。通常、所望のタンパク質産物をコードする配列を含む選択された外来ＤＮＡ鎖は、同じ／類似する酵素の使用を通じて直鎖状形態に調製される。直鎖状ウイルス又はプラスミドＤＮＡは、修復工程を引き起こしウイルス又は環状ＤＮＡプラスミド中に「スプライシングされた」選択された外因性ＤＮＡセグメントを含む「ハイブリッド」ベクターを形成することができるライゲーティング酵素の存在下で外来性ＤＮＡと一緒にインキュベートされる。
【００７８】
遺伝的に操作された細胞は、原核細胞又は真核細胞である。適切な細胞は、酵母、細菌、古細菌、真菌、昆虫細胞、植物細胞及び哺乳動物細胞（ヒト細胞及び細胞株のような）を含む動物細胞を含む。
【００７９】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、原核細胞は細菌細胞、好ましくは、バチルス属、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、エンテロコッカス属、ビフィドバクテリウム属、スポロラクトバチルス属種、ミクロモノスポラ属種、ミクロコッカス属種、ロドコッカス属種及びシュードモナス属からなる群から選択される属から選択される。適切な細菌種は、バチルス・スブチリス、バチルス・リケニフォルミス、バチルス・コアングランス、バチルス・サーモフィルス、バチルス・ラテロスポルス、バチルス・メガテリウム、バチルス・ミコイデス、バチルス・プミルス、バチルス・レンタス、バチルス・セレウス、バチルス・サーキュランス、ビフィドバクテリウム・ロングム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、シトロバクター・フロインディ、クロストリジウム・セルロリティカム、クロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・オートエタノゲナム、クロストリジウム・アセトブチリカム、コリネバクテリウム・グルタミクム、エンテロコッカス・フェシウム、エンテロコッカス・サーモフィルス、エシェリキア・コリ、エルウィニア・ヘルビコラ（パントエア・アグロメランス）、ラクトバチルス・アシドフィルス、ラクトバチルス・サリヴァリウス、ラクトバチルス・プランタルム、ラクトバチルス・ヘルベティカス、ラクトバチルス・デルブリュッキイ、ラクトバチルス・ラムノサス、ラクトバチルス・ブルガリクス、ラクトバチルス・クリスパタス、ラクトバチルス・ガセリ、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・イエンセン、ラクトコッカス・ラクティス、パンテア・シトレア、ペクトバクテリウム・カロトボラム、プロピオニバクテリウム・フロイデンライヒ、シュードモナス・フルオレッセンス、シュードモナス・エルジノーサ、ストレプトコッカス・サーモフィルス及びザントモナス・カンペストリスである。
【００８０】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、真核細胞は、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞又は哺乳動物細胞である。酵母細胞は、好ましくは、サッカロミセス属種、特に、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロミコプシス属種、ピキア属種、特に、ピキア・パストリス、ハンゼヌラ属種、クルイベロマイセス属種、ヤロウイア属種、ロドトルラ属種及びシゾサッカロミセス属種からなる群から選択される。
【００８１】
遺伝的に操作された細胞は、フコース残基をドナー基質からラクトテトラオースであるアクセプター分子へ転移させることができる異種フコシル基転移酵素を発現するように遺伝的に操作されている。追加の及び／又は代わりの実施形態では、異種フコシル基転移酵素は、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチド、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的変異体、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片、及び配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片の機能的変異体からなる群から選択される。
【００８２】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、異種フコシル基転移酵素は、
ｉ）配列番号１〜１５のいずれか１つにより表されるヌクレオチド配列；
ｉｉ）好ましくは、配列の全長にわたって、配列番号１〜１５のいずれか１つにより表されるヌクレオチド配列の１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
ｉｉｉ）配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｉｖ）配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列のいずれか１つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｖ）ｉｉｉ）及びｉｖ）に従ったポリペプチドのいずれか１つの機能的断片をコードするヌクレオチド配列；又は
ｖｉ）そこでは核酸分子は、厳密な条件下でｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）若しくはｖ）に従った核酸分子の相補鎖にハイブリダイズする、
を含む核酸分子によりコードされる。
【００８３】
異種フコシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列は、遺伝的に操作された細胞内で直鎖状又は環状染色体外核酸分子上に存在している、又は細胞の染色体核酸分子中に組み込まれていてもよく、前記染色体核酸分子は直鎖状又は環状（細菌染色体）核酸分子でもよい。
【００８４】
遺伝的に操作された細胞はＧＤＰ−フコースを合成することができるが、ＧＤＰ−フコースは、異種フコシル基転移酵素によりラクトテトラオースに転移されるフコース残基のドナー基質としての役割を果たすので、フコース残基をドナー基質からラクトテトラオースへ転移させて所望のフコシル化オリゴ糖を生産するためのフコシル基転移酵素活性を有することができる異種ポリペプチドにより触媒される反応に不可欠である。したがって、実施形態では、遺伝的に操作された細胞は、遺伝的に操作される前の細胞と比べた場合、増加した細胞内ＧＤＰ−フコース生産力も含むように遺伝的に操作されている。
【００８５】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、フコシル化オリゴ糖を生産するためのＧＤＰ−フコースの細胞内プールを提供することが達成され、遺伝的に操作された細胞は、二機能性フコースキナーゼ／Ｌ−フコース−１−ホスフェート−グアニル酸転移酵素（Ｆｋｐ）をコードする遺伝子、好ましくは、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースに変換することができるバクテロイデス・フラジリス由来の二機能性フコースキナーゼ／Ｌ−フコース−１−ホスフェート−グアニル酸転移酵素（Ｆｋｐ）をコードする遺伝子（受託番号ＡＹ８４９８０６）が前記細胞により発現される又は過剰発現されるようにも遺伝的に操作されている。好ましくは、Ｌ−フコースは、所望のフコシル化オリゴ糖を生産するための細胞の発酵中に遺伝的に操作された細胞に与えられる。
【００８６】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、所望のフコシル化オリゴ糖の合成のためのＧＤＰ−フコースは、「新規の経路」を使用する細胞自体のＧＤＰ−フコース代謝から採取可能である。「新規の経路」を介して細胞内ＧＤＰ−フコースプールを増やすために、遺伝的に操作された細胞は、遺伝的に操作される前の細胞と比べた場合、ホスホマンノムターゼ、マンノース−１−ホスフェートグアノシル転移酵素、ＧＤＰ−マンノース−４，６−脱水酵素、及びＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素をコードする遺伝子の少なくとも１つを発現する又は過剰発現するようにも遺伝的に操作されている。好ましい実施形態では、細胞は前記遺伝子の４つすべてを過剰発現するように遺伝的に改変されている。
【００８７】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、遺伝的に操作された細胞は、その細胞膜を横断する外因性Ｌ−フコースの増加した移入を有するようにも遺伝的に操作されている。好ましくは、遺伝的に操作された細胞は、遺伝的に操作される前の前駆細胞と比べた場合、イー・コリＭＧ１６５５由来の主要ファシリテーター輸送体ＦｕｃＰをコードするヌクレオチド配列（受託番号ＡＩＺ９０１６２）、イー・コリ由来の主要ファシリテーター輸送体ＦｕｃＰの機能的変異体をコードするヌクレオチド配列、イー・コリ由来の主要ファシリテーター輸送体ＦｕｃＰの機能的断片をコードするヌクレオチド配列、及びイー・コリ由来の主要ファシリテーター輸送体ＦｕｃＰの機能的断片の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択される１つのヌクレオチド配列を発現するか又は過剰発現するようにも、遺伝的に操作されている。主要ファシリテーター輸送体ＦｕｃＰの発現又は過剰発現は、遺伝的に操作された細胞での機能的変異体及び／又はこの機能的断片であり、その細胞膜を横断する外来性Ｌ−フコースの細胞取り込みを増やす。
【００８８】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、遺伝的に操作された細胞は、細胞の細胞内ＧＤＰ−フコースプールの枯渇を防ぐようにも遺伝的に操作されている。実施形態では、コラン酸合成の第１ステップを触媒するＷｃａＪをコードする遺伝子の発現が損なわれているか又は不活性化されている点で、好ましくは、ＷｃａＪ遺伝子が細胞の遺伝情報から少なくとも部分的に欠失している点で、又はＷｃａＪ遺伝子のヌクレオチド配列がＷｃａＪをコードする遺伝子の転写が不可能になるように変更されている点で、細胞は遺伝的に操作されている。追加の及び／又は代わりのアプローチでは、例えば、停止コドンがオープンリーディングフレーム中に導入されていて、ＷｃａＪの短縮型変異体をもたらし、これは非機能的断片が発現されることを表している点で、又はＷｃａＪ遺伝子のヌクレオチド配列が、前記変更されたＷｃａＪ遺伝子によりコードされるポリペプチドが１つ以上のアミノ酸残基で野生型ＷｃａＪとは異なっていて、得られたポリペプチドは酵素的に不活性になるように変更されている点で、ＷｃａＪをコードする遺伝子のヌクレオチド配列は、酵素的に不活性なポリペプチドが変更されたＷｃａＪ遺伝子によりコードされるように変更されている。
【００８９】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、それぞれＬ−フコースイソメラーゼ及びＬ−フクロースキナーゼをコードする遺伝子ｆｕｃｌ及び／又はｆｕｃＫが欠失していて、ｆｕｃｌ及び／又はｆｕｃＫのヌクレオチド配列が対応するポリペプチドの酵素活性を不可逆的に不活性化するように変更されている点で、又はｆｕｃｌ及び／又はｆｕｃＫの発現が損なわれている点でも、遺伝的に操作された細胞は遺伝的に操作されている。Ｆｕｃｌ及び／又はＦｕｃＫの細胞内合成を消失させると、対応する細胞においてフコース代謝が消失し、それによって、ＧＤＰ−フコースを作製するのに利用可能であるフコースの量が増える。
【００９０】
追加の実施形態では、遺伝的に操作された細胞は、細胞が（ｉ）生産される所望のフコシル化オリゴ糖の１つ以上の前駆体を細胞内で分解する１つ以上のポリペプチドを発現しないか、又は（ｉｉ）その天然に存在する類似物と比べた場合、生産される所望のフコシル化オリゴ糖の１つ以上の前駆体を細胞内で分解するような酵素の活性を損なう変更されたアミノ酸配列及び／若しくは長さを有する１つ以上のポリペプチドを発現するようにも、遺伝的に操作されている。
【００９１】
所望のフコシル化オリゴ糖に関連して本明細書で使用される用語「前駆体」とは、生産される所望のフコシル化オリゴ糖の生合成経路における中間体である化合物のことである。これらの中間体は、内因性化合物、すなわち、細菌宿主細胞におけるこの合成が宿主の遺伝的改変により増強される場合でも宿主細胞において生成されそして天然に存在していてもよい、化合物を含む。
【００９２】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、遺伝的に操作された細胞は、酵素的に活性なβ−ガラクトシダーゼを含まないようにも、遺伝的に操作されている。
【００９３】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、遺伝的に操作された細胞は、機能的ＬａｃＺを欠くように、又はその発現が厳重に調節されており、フコシル化オリゴ糖を生産するための発酵工程中は発現されない機能的ＬａｃＺ遺伝子を含むようにも、遺伝的に改変されている。
【００９４】
さらに及び／又は代わりに、遺伝的に操作された細胞は、細胞が、ラクトース、例えば、ＬＮＴ−２、ＬＮＴ若しくはＬＮｎＴ、又はＬＮＴ及びＬＮｎＴのより大きな誘導体以外の所望のフコシル化オリゴ糖の別の前駆体を加水分解する酵素活性を有するポリペプチドを、含まずかつ発現もしないようにも、遺伝的に操作されている。この目的のため、遺伝的に操作された細胞は、細胞のゲノムが所望のフコシル化オリゴ糖の前記別の前駆体を加水分解することができるポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有しないように、又はそのようなタンパク質をコードする遺伝子の発現が、フコシル化オリゴ糖を生産するための発酵工程中は発現されないように調節されているようにも、遺伝的に操作されている。
【００９５】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、遺伝的に操作された細胞は、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を示すことができるポリペプチドをコードする、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。この実施形態の遺伝的に操作された細胞は、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を示すことができるポリペプチドを、発現することができる。好ましくは、遺伝的に操作された細胞は、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を示すことができる前記ポリペプチドを発現する。さらに好ましくは、前記遺伝的に操作された細胞は、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を示すことができるポリペプチドを含む。好ましくは、β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を示すことができるポリペプチドをコードする、前記少なくとも１つのヌクレオチド配列は、異種核酸配列、すなわち、該遺伝的に操作された細胞の遺伝的に操作されていない祖先細胞において、天然には存在しないヌクレオチド配列である。
【００９６】
β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を示すことができるポリペプチドを発現することにより、前記ポリペプチドがこのβ−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を有しており、それによってＬＮＴ−２を細胞内で作製する場合には、宿主細胞はＮ−アセチルグルコサミンをアクセプター基質のラクトースにライゲートすることができる。
【００９７】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、Ｎ−アセチルグルコサミンをラクトースに転移するためのβ−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素活性を示すことができるポリペプチドは、ナイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）ＭＣ５８由来のＬｇｔＡ（受託番号ＮＰ＿２７４９２３）及びパスツレラ・マルトシダ亜種マルトシダ（ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）ｓｔｒ．ＨＮ０６由来のβ−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（受託番号ＰＭＣＮ０６＿００２２）からなる群から選択することが可能なβ−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素である。
【００９８】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、遺伝的に操作された細胞は、β−１，３−ガラクトシル基転移酵素活性又はβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素活性を示すことができるポリペプチドをコードする、少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。この実施形態の遺伝的に操作された細胞は、β−１，３−ガラクトシル基転移酵素活性又はβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素活性を示すことができるポリペプチドを発現することができる。好ましくは、遺伝的に操作された細胞は、β−１，３−ガラクトシル基転移酵素活性又はβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素活性を示すことができる前記ポリペプチドを発現する。さらに好ましくは、前記遺伝的に操作された細胞は、β−１，３−ガラクトシル基転移酵素活性又はβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素活性を示すことができるポリペプチドを含む。好ましくは、β−１，３−ガラクトシル基転移酵素活性又はβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素活性を示すことができるポリペプチドをコードする前記少なくとも１つのヌクレオチド配列は、異種核酸配列、すなわち、遺伝的に操作された細胞の遺伝的に操作されていない祖先細胞において天然には存在しないヌクレオチド配列である。β−１，３−ガラクトシル基転移酵素活性又はβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素活性を示すことができるポリペプチドを発現することにより、遺伝的に操作された細胞は、ＬＮＴ−２をガラクトシル化する又はそれぞれＬＮＴ若しくはＬＮｎＴを細胞内で生み出すことができる。
【００９９】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、ＬＮＴ−２をガラクトシル化してＬＮＴを生産するためのβ−１，３−ガラクトシル基転移酵素活性を示すことができるポリペプチドは、サルモネラ・エンテリカ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ）由来のβ−１，３−ガラクトシル基転移酵素ＷｂｄＯ（受託番号ＡＹ７３０５９４）、及びイー・コリＯ５５：Ｈ７由来のｗｂｇＯ（受託番号ＢＡＧ１１８３８）、ルチエラ・ニトロフェラム（Ｌｕｔｉｅｌｌａ  ｎｉｔｒｏｆｅｒｒｕｍ）由来のｆｕｒＡ（ＦｕｒａＤＲＡＦＴ＿０４１９）からなる群から選択される遺伝子によりコードされるβ−１，３−ガラクトシル基転移酵素、及び前記β−１，３−ガラクトシル基転移酵素の機能的断片からなる群から選択されるβ−１，３−ガラクトシル基転移酵素である。
【０１００】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、ＬＮＴ−２をガラクトシル化してＬＮｎＴを生成するためのβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素活性を示すことができるポリペプチドは、ナイセリア・メニンギティディス由来のＬｇｔＢ（受託番号ＡＡＦ４２２５７）、アグリゲイティバクター・アフロフィルスＮＪ８７００由来のＬｅｘ１（受託番号ＹＰ＿００３００８６４７）、キンゲラ・デニトリフィカンス（Ｋｉｎｇｅｌｌａ  ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＡＴＣＣ３３３９４由来のＧａｌＴ（受託番号ＨＭＰＲＥＦ９０９８＿２４０７）、パスツレラ・マルトシダＭ１４０４由来のＧａｔＤ（受託番号ＧＱ４４４３３１）、バクテロイデス・フラジリスＮＣＴＣ９３４３由来のＧａｌＴ（受託番号ＢＦ９３４３＿０５８５）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）由来のｌｓｇＤ（受託番号ＡＡＡ２４９８１）、ヘリコバクター・ピロリ由来のＧａｌＴ（受託番号ＡＢ０３５９７１）、及び前記β−１，４−ガラクトシル基転移酵素の機能的断片からなる群から選択されるβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素である。
【０１０１】
ＵＤＰ−ガラクトース及びＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、遺伝的に操作された細胞におけるＬＮＴ若しくはＬＮｎＴ、又はこれらのもっと大きな誘導体の細胞内合成に必要である。
【０１０２】
遺伝的に操作された細胞における細胞内ＵＤＰ−ガラクトースは、細胞がガラクトースを含有する発酵ブロスにおいて培養される点において、ガラクトースを遺伝的に操作された細胞に与えることにより提供することが可能である。ガラクトースは細胞により取り入れられ、ガラクトース−１−ホスフェートにリン酸化され、次にＵＤＰ−ガラクトースに変換される。これらの反応に必要とされる酵素活性を保有するポリペプチドをコードする遺伝子は周知である。
【０１０３】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、ＵＤＰ−ガラクトースの細胞内供給は、細胞自体の代謝からも得ることが可能であり、細胞自体の代謝は、例えば、細胞がＵＤＰ−ガラクトース−４’−エピメラーゼを過剰発現するか、又はグルコース−１−ホスフェート−１−ウリジニル転移酵素と組み合わせてＵＤＰ−ガラクトース−４’−エピメラーゼを過剰発現するように、細胞の遺伝的改変により改善することが可能である。
【０１０４】
遺伝的に操作された細胞における細胞内ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンは、細胞自体のＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン代謝からも得ることが可能である。遺伝的に操作された細胞において細胞内ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンプールを増やすため、細胞は、Ｌ−グルタミン：Ｄ−フクトース−６−ホスフェートアミノ基転移酵素、ホスホグルコサミンムターゼ、ホスホグルコムターゼ、及びＮ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ／グルコサミン−１−ホスフェートアセチル基転移酵素をコードする遺伝子の１つ以上が過剰発現されるように遺伝的に改変することが可能である。
【０１０５】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、細胞は、遺伝的に操作された細胞内でのＮ−アセチルグルコサミン異化反応が不活性化されているように遺伝的に改変される。細胞のＮ−アセチルグルコサミン異化反応を不活性化すると、Ｎ−アセチルグルコサミンの細胞内合成に利用可能であるＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの細胞内レベルが改善される。
【０１０６】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、複雑なフコシル化ＨＭＯの合成において使用するための遺伝的に改変された細胞は、この細胞膜を横断してラクトースを取り込み、所望のフコシル化オリゴ糖の生産のための出発物質としてラクトースを蓄積することができる。したがって、細胞は、ラクトース透過酵素をコードするこの内因性遺伝子を発現することが可能である。追加の及び／又は代わりの実施形態では、細胞は、特に細胞が天然にはラクトース透過酵素をコードする遺伝子を含まず発現しない場合には、異種ラクトース透過酵素遺伝子を含有し発現するように遺伝的に改変される。
【０１０７】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、所望のフコシル化オリゴ糖を生産するためのラクトースは、細胞によるラクトースの細胞内合成により提供される。好ましくは、これは、細胞がβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素をコードする内因性遺伝子又は組換え遺伝子を発現し、前記β−１，４−ガラクトシル基転移酵素はＵＤＰ−ガラクトースのガラクトース部分をグルコース分子に転移することができる点で、達成される。このβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素は、パスツレラ・マルトシダ由来のＰｍ１１４１（受託番号ＡＥＣ０４６８６）又はアグリゲイティバクター・アフロフィルスＮＪ８７００由来のＬｅｘ１（受託番号ＹＰ＿００３００８６４７）から選択することが可能である。
【０１０８】
したがって、追加の及び／又は代わりの実施形態では、遺伝的に操作された細胞は、
（ｉ）β−１，３−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素、
（ｉｉ）β−１，３−ガラクトシル基転移酵素又はβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素；並びに
（ｉｉｉ）α−１，２−及び／又はα−１，３−フコシル基転移酵素
を含む。
【０１０９】
別の実施形態では、遺伝的に操作された細胞が、ＬＮＴ−２がアクセプター分子の前駆体として発酵ブロスに添加される点で、フコシル化オリゴ糖を生産するために培養される場合、遺伝的に操作された細胞は、
（ｉ）β−１，３−ガラクトシル基転移酵素又はβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素；並びに
（ｉｉ）糖転移酵素としてα−１，２−及び／又はα−１，３−フコシル基転移酵素
を含む。
【０１１０】
第３の態様によれば、遺伝的に操作された細胞において異種フコシル基転移酵素を発現するための、組換え核酸分子が提供される。用語「核酸分子」とは、一本鎖又は二本鎖デオキシリボヌクレオチド巨大分子又はリボヌクレオチド巨大分子のことであり、１つ以上の既知の類似物又は天然に若しくは合成的に生成されるヌクレオチドを含む鎖デオキシリボヌクレオチド巨大分子又はリボヌクレオチド巨大分子を含む。
【０１１１】
組換え核酸分子は、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチド、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的変異体、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片、及び配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片の機能的変異体からなる群から選択されるフコシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１１２】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、フコシル基転移酵素をコードするヌクレオチド配列は、
ｉ）配列番号１〜１５のいずれか１つにより表されるヌクレオチド配列；
ｉｉ）好ましくは、配列の全長にわたって、配列番号１〜１５のいずれか１つにより表されるヌクレオチド配列の１つに少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列；
ｉｉｉ）配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｉｖ）配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるアミノ酸配列のいずれか１つに少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列；
ｖ）ｉｉｉ）及びｉｖ）に従ったポリペプチドのいずれか１つの機能的断片をコードするヌクレオチド配列；
又は
ｖｉ）厳密な条件下でｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）又はｖ）に従った核酸分子の相補鎖にハイブリダイズする核酸分子
からなる群から選択される。
【０１１３】
本発明の範囲内では、核酸／ポリヌクレオチド及びポリペプチド多型変異体、対立遺伝子、突然変異体及び種間相同物もこれらの用語に含まれ、ポリペプチド多型変異体は配列番号１６〜３０のアミノ酸配列の１つに似ているポリペプチドに対して、好ましくは、少なくとも約２５、５０、１００、２００、５００、又はこれよりも多いアミノ酸の領域にわたって、約６０％よりも大きなアミノ酸配列同一性、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％又はこれよりも大きなアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１１４】
本明細書で使用される用語としての「変異体」は、それぞれ参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドとは異なるポリヌクレオチド又はポリペプチドであるが、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチドの本質的（酵素的）特性を保持している。ポリヌクレオチドの典型的変異体は、別の参照ポリヌクレオチドとはヌクレオチド配列が異なる。変異体のヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変更する場合もあれば変更しない場合もある。下で考察されるように、ヌクレオチド変化は、参照配列によりコードされるポリペプチドに、アミノ酸置換、付加、欠失、融合及び短縮型をもたらす場合がある。ポリペプチドの典型的な変異体は、別の参照ポリペプチドとはアミノ酸配列が異なる。一般的には、違いは限定されているので、参照ポリペプチドと変異体の配列は全体で密接に類似しており、多くの領域では同一である。変異体と参照ポリペプチドは、いかなる組合せでも１つ以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列が異なる場合がある。置換された又は挿入されたアミノ酸残基は、遺伝コードによりコードされているアミノ酸残基でもよく又はそうでなくてもよい。ポリヌクレオチド又はポリペプチドの変異体は、対立遺伝子変異型のように天然に存在していてもよく、又は天然に存在することが知られていない変異体でもよい。ポリヌクレオチド及びポリペプチドの天然には存在しない変異体は、変異誘発技法により、直接合成により、及び当業者に公知である他の組換え法により作ってもよい。
【０１１５】
組換え核酸分子では、フコシル基転移酵素、この機能的変異体、フコシル基転移酵素の機能的断片又は機能的断片の機能的変異体をコードするヌクレオチド配列は、組換え核酸分子が細胞中に存在しているという条件で、フコシル基転移酵素、この変異体又は断片の発現を媒介する及び／又は制御する少なくとも１つのヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【０１１６】
本明細書で使用される用語「作動可能に連結される」とは、核酸発現制御配列（プロモーター、オペレーター、エンハンサー、レギュレーター、転写因子結合部位のアレー、転写ターミネーター、リボソーム結合部位のような）と第２のヌクレオチド配列の間の機能的連鎖のことであり、発現制御配列は第２のヌクレオチド配列に従って核酸の転写及び／又は翻訳に影響を及ぼす。したがって、用語「プロモーター」は通常、ＤＮＡポリマーにおいて遺伝子「に先行する」ＤＮＡ配列を指し、ｍＲＮＡへの転写の開始部位を提供する。「レギュレーター」ＤＮＡ配列も、通常、所与のＤＮＡポリマーにおいて遺伝子の「上流」である（すなわち、に先行している）が、転写開始の頻度（又は速度）を決定するタンパク質に結合する。合わせて「プロモーター／レギュレーター」又は「制御」ＤＮＡ配列と呼ばれるが、機能的ＤＮＡポリマーにおいて選択された遺伝子（又は一連の遺伝子）に先行するこれらの配列は協同して遺伝子の転写（及び最終的発現）が起こるかどうかを決定する。ＤＮＡポリマーにおいて遺伝子「に続き」、ｍＲＮＡへの転写の終結のためのシグナルを提供するＤＮＡ配列は、転写「ターミネーター」配列と呼ばれる。
【０１１７】
多種多様な発現系を使用すれば、本発明のポリペプチドを産生することが可能である。そのような系は、とりわけ、染色体由来、エピソーム由来及びウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、ウイルス由来のベクター、並びにプラスミドに由来するベクターのようなこれらの組合せとコスミド及びファージミドのようなバクテリオファージ遺伝子エレメント由来のベクターを含む。発現系構築物は、発現を調節する並びに生み出す制御領域を含有していてもよい。一般に、宿主においてポリヌクレオチドを維持する、増幅するか又は発現しそしてポリペプチドを合成するのに適したいかなる系又はベクターをも、これに関して発現に使用し得る。適切なＤＮＡ配列は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記に述べられている技法のような種々の周知で常用の技法のいずれかにより発現系に挿入され得る。したがって、遺伝的に操作された細胞において異種フコシル基転移酵素を発現するための核酸分子は、プラスミド、ファージミド、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）からなる群から選択される。
【０１１８】
第４の態様によれば、フコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることができ、前記アクセプター分子がラクトテトラオースであるフコシル基転移酵素が提供される。
【０１１９】
フコシル基転移酵素は細菌起源である。フコシル基転移酵素を使用すれば、フコシル化オリゴ糖、好ましくは、ラクトース、ＬＮＴ及び／若しくはＬＮｎＴに基づく複合フコシル化ＨＭＯ、又は他のオリゴ糖を合成することが可能である。フコシル化オリゴ糖はラクトフコペンタオースである。
【０１２０】
フコシル基転移酵素は、フコース残基をドナー基質、好ましくはＧＤＰ−フコースからアクセプター分子に転移させることができる。好ましい実施形態では、アクセプター分子はラクトテトラオース、好ましくはＬＮＴ及び／又はＬＮｎＴである。
【０１２１】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、フコシル基転移酵素は、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチド、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的変異体、配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片、及び配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるポリペプチドの機能的断片の機能的変異体からなる群から選択される。
【０１２２】
配列番号１６〜３０のいずれか１つにより表されるフコシル基転移酵素は、フコース残基をドナー基質からアクセプター基質としてのラクトテトラオースに転移させることができるフコシル基転移酵素であるとは記載されていない。配列番号１６〜２７のいずれか１つにより表される新規のフコシル基転移酵素は、これまで、フコシル基転移酵素それ自体であるとさえ記載されておらず、すなわち、そのアクセプター分子とは無関係に、記載されていなかった。
【０１２３】
前に本明細書に記載されたフコシル基転移酵素は、例えば、前に本明細書に記載されたホールセル発酵工程により、又はインビトロ生体触媒によって複合フコシル化オリゴ糖を生産するために、使用することが可能である。したがって、第５の態様によれば、フコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることができ、前記アクセプター分子がフコシル化オリゴ糖を生産するためラクトテトラオースである、フコシル基転移酵素のうちの少なくとも１つの使用が提供される。
【０１２４】
追加の及び／又は代わりの実施形態では、前に本明細書に記載されたフコシル基転移酵素は、インビトロ生体触媒により複合フコシル化ＨＭＯを合成するのに使用される。
【０１２５】
インビトロ生体触媒工程において新規のフコシル基転移酵素のうちの少なくとも１つを使用することは、フコース残基、好ましくは、ＧＤＰ−フコースを含有する適切なドナー基質、及び適切なアクセプター分子を、溶媒中の新規のフコシル基転移酵素のうちの少なくとも１つに、フコシル基転移酵素がフコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させ、それによってフコシル化オリゴ糖を合成するのに適した条件下で添加することを含む。好ましくは、適切なアクセプター分子はラクトテトラオース、さらに好ましくはＬＮＴ又はＬＮｎＴである。アクセプター分子としてラクトテトラオースを使用すれば、インビトロ生体触媒反応におけるフコシル基転移酵素の反応産物は、ラクトフコペンタオースである。前記ラクトフコペンタオースは、好ましくは、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ及びラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶからなる群から選択される１つの五糖である。
【０１２６】
第６の態様によれば、インビトロ生体触媒により、フコシル化オリゴ糖、好ましくは、フコシル化ヒトミルクオリゴ糖、さらに好ましくは、複合ヒトミルクオリゴ糖、最も好ましくは、ラクトフコペンタオースを生産するための方法であって、フコシル基転移酵素が使用され、前記フコシル基転移酵素がフコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることができる、方法が提供される。
【０１２７】
インビトロ生体触媒の実施形態では、方法は、
ａ）反応混合物中でフコース残基をドナー基質からアクセプター分子に転移させることができるフコシル基転移酵素を提供するステップ；
ｂ）フコシル化オリゴ糖を合成するために、前記フコシル基転移酵素をフコース残基を含むドナー基質及びアクセプター分子に接触させ、前記アクセプター分子がラクトテトラオースである、ステップ
を含む。
【０１２８】
この実施形態は、反応混合物中にフコシル基転移酵素を提供することを含む。本明細書で使用される用語「フコシル基転移酵素」は、前記フコシル基転移酵素の機能的変異体、機能的断片及びフコシル基転移酵素の断片の機能的変異体も含み、「機能的」とは、前記変異体及び断片が前に本明細書に記載されたフコシル基転移酵素活性を有することができることを示している。
【０１２９】
この実施形態に従った方法は、ドナー基質、好ましくはＧＤＰ−フコースからアクセプター分子のアクセプター部分に転移されるフコース残基を有するのに適した条件下で混合物を反応させることをさらに含み、前記アクセプター分子は好ましくはラクトテトラオースである。
【０１３０】
追加の実施形態では、インビトロ生体触媒の方法は、反応混合物からフコシル化したアクセプター分子を引き続き精製する及び／又は単離することをさらに含む。
【０１３１】
第７の態様によれば、前に本明細書に記載されたホールセル発酵アプローチ又はインビトロ生体触媒により生産されるフコシル化オリゴ糖が提供される。
【０１３２】
実施形態では、フコシル化オリゴ糖はヒトミルクオリゴ糖である。選択されるヒトミルクオリゴ糖は、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、２’，３−ジフコシルラクトース、３−フコシル−３’−シアリルラクトース、３−フコシル−６’−シアリルラクトース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ジフコシルヘキサオースＩ、ラクト−Ｎ−ジフコシルヘキサオースＩＩ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｂ、フコシル−ラクト−Ｎ−シアリルペンタオースｃ、ラクト−Ｎ−ネオジフコヘキサオースＩ、ジシアリル−ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ及びフコシル−パラ−ラクト−Ｎ−ヘキサオースＩＶである。選択されるヒトミルクオリゴ糖の構造は表２に表示されている。
【０１３３】
前に本明細書に記載されたフコシル基転移酵素を利用することにより生産可能なフコシル化オリゴ糖は、好ましくは、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶからなる群から選択される、五糖からなる群から選択される。
【０１３４】
前の段落で名付けられたラクトフコペンタオースは前に本明細書に記載されたフコシル基転移酵素の酵素活性の直接反応産物を構成するけれども、前記ラクトフコペンタオースはさらに処理されてもよい。例えば、前記ラクトフコペンタオースは、得られたヘキサオース、例えば、表２のエクサオース及びヘプタオースが、本明細書で開示されるフコシル基転移酵素を利用することにより生産可能なフコシル化オリゴ糖と見なすことも可能であるように、アクセプター分子としてさらなる糖転移酵素に提供することが可能である。さらに、フコシル基転移酵素は、表２で同定されている糖のような三糖及び／又は四糖を生産する際に用いることも可能であることを想定することが可能である。
【０１３５】
【表２】
2020526200.tif 000003
【０１３６】
第８の態様によれば、栄養組成物を製造するための前に本明細書に記載されたホールセル発酵アプローチ又はインビトロ生体触媒により生産されるフコシル化オリゴ糖の使用が、提供される。前記栄養組成物は、前に本明細書に開示された方法により生産された少なくとも１つのフコシル化オリゴ糖を含有する。
【０１３７】
したがって、第９の態様によれば、前に本明細書に開示された方法により生産された少なくとも１つのフコシル化オリゴ糖を含有する栄養組成物が提供される。少なくとも１つのフコシル化オリゴ糖はラクトフコペンタオースである。栄養組成物中の少なくとも１つのラクトフコペンタオースは、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ及びラクト−Ｎ−ネオフコペンタオースＶからなる群から選択される。
【０１３８】
追加の実施形態では、栄養組成物は、薬用製剤、乳児用製剤及び栄養補助食品からなる群から選択される。
【０１３９】
栄養組成物は、液状でも粉末、顆粒、フレーク及びペレットを含むがこれらに限定されない固体状で存在していてもよい。
【０１４０】
本発明は、特定の実施形態に関連して及び図を参照して記載されることになるが、本発明はそれに限定されることはなく、しかし特許請求の範囲のみに限定される。さらに、記述における及び特許請求の範囲における用語第１の、第２の、等は類似する要素を区別するために使用され、必ずしも順序を時間的に、空間的に、順位で又は他の何らかの様式で記載するためではない。そのように使用される用語は適切な状況下では交換可能であり、本明細書に記載される本発明の実施形態は、本明細書に記載される又は例証される以外の順序で機能することができると理解されるべきである。
【０１４１】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が、特許請求の範囲で使用される場合、その後に列挙される手段に制限されると解釈するべきではなく、この用語は他の要素もステップも排除しないことに留意するべきである。したがって、この用語は、言及される明言された特長、整数、ステップ又は構成要素の存在を明示していると解釈するべきであるが、１つ以上の他の特長、整数、ステップ若しくは構成要素、又はこれらの群の存在又は追加を排除しない。したがって、表現「手段Ａ及びＢを含むデバイス」の範囲は、構成要素Ａ及びＢのみからなるデバイスに限定するべきではない。この表現は、本発明に関して、デバイスの唯一妥当な構成要素はＡ及びＢであることを意味する。
【０１４２】
本明細書全体を通じての「一実施形態」又は「実施形態」への言及は、実施形態に関連して記載される特定の特長、構造又は特徴が本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれていることを意味する。したがって、本明細書全体を通じて様々な場所に語句「一実施形態では」又は「実施形態では」が出現するのは必ずしもすべてが同じ実施形態に言及しているわけではないが、その場合もある。さらに、本開示から当業者には明らかになるように、特定の特長、構造又は特徴は、１つ以上の実施形態において、いかなる適切な様式で組み合わせてもよい。
【０１４３】
同様に、本発明の例示的実施形態の記述においては、本発明の種々の特長は、開示を合理化し、種々の創意に富んだ態様の１つ以上を理解するのを助ける目的で、この単一の実施形態、図、又はこれらの記述にグループ分けされる場合があることは認識すべきである。しかし、この開示の方法は、請求されている発明が、それぞれの請求に明確に列挙されているよりも多くの特長を要求するという意図を反映していると解釈するべきではない。むしろ、以下の請求が反映するように、創意に富んだ態様は、単一の先に開示された実施形態のすべての特長よりも少ない特長にある。したがって、発明を実施するための形態に続く特許請求の範囲はこれによって、この発明を実施するための形態に組み込まれ、それぞれの請求は本発明の別個の実施形態として独立している。
【０１４４】
さらに、当業者であれば理解すると考えられるように、本明細書に記載される一部の実施形態は、他の実施形態に含まれる特長を含む場合と含まない場合があるが、異なる実施形態の特長の組合せは本発明の範囲内であり、異なる実施形態を形成することが意図されている。例えば、以下の特許請求の範囲では、請求された実施形態のいずれでもいかなる組合せでも使用することが可能である。
【０１４５】
さらに、実施形態の一部は、コンピュータシステムの処理装置により又はこの機能を遂行する他の手段により実行することが可能な方法又は方法の要素の組合せとして、本明細書では記載される。したがって、そのような方法又は方法の要素を遂行するために必要な説明書のある処理装置は、方法又は方法の要素を遂行するため手段を形成する。さらに、器具実施形態の本明細書に記載される要素は、本発明を遂行する目的で要素により実施される機能を遂行するための手段の例である。
【０１４６】
本明細書で提供される記述及び図では、数多くの特定の詳細が示されている。しかし、本発明の実施形態はこれらの特定の詳細なしで実行してもよいことは理解される。他の例では、周知の方法、構造及び技法は、この記述の理解を不明瞭にしないために詳細に明らかにされてはいない。
【０１４７】
本発明は、今や本発明のいくつかの実施形態の詳細な説明により記載される。本発明の他の実施形態は、本発明の真の精神又は技術上の教示から逸脱することなく、当業者の知識に従って設定することが可能であることは明らかであり、本発明は添付の特許請求の範囲の条項によってのみ限定される。
【実施例】
【０１４８】
［実施例１］  ラクト−Ｎ−テトラオース及びラクト−Ｎ−ネオテトラオースをフコシル化するフコシル基転移酵素の同定
ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）データベースを、種々の細菌種のゲノムにコードされている推定フコシル基転移酵素について再検討した。以前はフコシル基転移酵素と注釈を付けられていなかった１２５の推定フコシル基転移酵素をこのアプローチにより明らかにした。
【０１４９】
推定フコシル基転移酵素（ｆｕｃＴ）をコードする遺伝子は、イー・コリにおける発現のためにコドン最適化されており、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＵＳＡ）から購入した。フコシル基転移酵素遺伝子は、配列及びライゲーション非依存性クローニング（ＳＬＩＣ）により、ベクターｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｚｅｏにおいてｍａｌＥ遺伝子の下流にサブクローニングされ、この遺伝子はマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードし、ＭＢＰ融合タンパク質の合成を可能にする（図１）が、ｆｕｃＴ−遺伝子の増幅ではプライマー２７００及び２７０２並びにｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｚｅｏの増幅ではプライマー２７０１及び２７０３（使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは表３に収載されている）を使用する。
【０１５０】
ｆｕｃＴ−遺伝子はイー・コリＥＲ２５０８（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｉｐｓｗｉｃｈ、ＵＳＡ）において発現された。アルファ−１，２−フコシル基転移酵素をコードする遺伝子イー・コリＯ１２６由来のｗｂｇＬ及びヘリコバクター・ピロリ由来のｆｕｃＴ２Ｈｐもイー・コリでの発現のためにコドン最適化されており、これらもＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎから購入し、Ｔ７プロモーターの転写制御下のベクターｐＡＣＹＣ（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｍｅｒｃｋ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のＮｃｏｌ及びＢａｍＨＩ部位にクローニングした。ＷｂｇＬ及びｆｕｃＴ２Ｈｐは、それぞれオリゴヌクレオチド１４１と１４２、及び１４３と１４４を用いて増幅させた。ベクター並びにＰＣＲ増幅産物は、制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌ及びＢａｍＨＩを用いて消化し、ライゲートした。イー・コリ形質転換体はクロラムフェニコール上で選択した。ＷｂｇＬ及びｆｕｃＴ２Ｈｐは、イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）△ｌａｃＺで発現された（本研究で使用した細菌株は表４に収載されている）。
【０１５１】
【表３】
2020526200.tif 000004
【０１５２】
【表４】
2020526200.tif 000005
2020526200.tif 000006
【０１５３】
ｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｆｕｃＴ−ｚｅｏプラスミドを含有するイー・コリＥＲ２５０８は、ｍａｌＥ−ｆｕｃＴ遺伝子の発現が２００μｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサイクリンを添加することにより誘導される前に、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びゼオシン４０μｇ／ｍｌを含有する２ＹＴブロス（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、上記）で０．３のＯＤ６００ｎｍまで生育させた。ｐＡＣＹＣ−ｗｂｇＬ又はｐＡＣＹＣ−ｆｕｃＴ２Ｈｐを内部に持つイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）△ｌａｃＺは、３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する２ＹＴブロスで生育した。０．３のＯＤ６００ｎｍに到達すると、発現を０．３ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。３０℃で１６時間のインキュベーション後、細胞は遠心分離により収穫した。
【０１５４】
細胞は、ガラスビーツを使用して機械的に破壊した。等タンパク質濃度を含有する発現クローンの無細胞抽出物は１００μｌのフコシル基転移酵素活性アッセイにおいて３７℃で２２時間インキュベートした。アッセイは、５ｍＭのＧＤＰ−Ｌ−フコース、５ｍＭのＬＮＴ又はＬＮｎＴ及び２０ｍＭのトリス／ＨＣｌ中１ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．４を２００ｍＭのＮａＣｌと一緒に含有した。
【０１５５】
フコシル化ＬＮＴ又はＬＮｎＴの形成は、シリカゲルＴＣＬプレート（Ｓｉｌｉｃａ  Ｇｅｌ６０Ｆ２５４（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用する薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により判定した。ブタノール：アセトン：酢酸：Ｈ２Ｏ（３５／３５／７／２３（ｖ／ｖ／ｖ／ｖ））の混合物を移動相として使用した。分離された物質の検出では、ＴＣＬをチモール試薬（９５ｍｌのエタノールに溶解した０．５ｇのチモール、５ｍｌの硫酸を添加）に浸漬し、加熱した。
【０１５６】
産物生成及び同定はさらに、マススペクトロメトリーにより決定された。質量分析は、ＬＣ  Ｔｒｉｐｌｅ−Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＭＳ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−ＭＳ  ８０５０）（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を使用してＭＲＭ（多重反応モニタリング）により実施した。前駆イオンは四重極１において選択され分析され、フラグメンテーションはＣＩＤガスとしてアルゴンを使用して衝突セルで行われ、フラグメントイオンの選択は四重極３において実施される。中間体及び最終産物代謝物についての選択されたトラジション及び衝突エネルギー（ＣＥ）は表５に収載されている。それぞれ培養上澄み、無粒子生体触媒反応又は粗抽出の希釈、Ｈ２Ｏ（ＬＣ／ＭＳグレード）での１：５０又は１：１００、後のラクトース、ＬＮＴ−ＩＩ、ＬＮＴ及びＬＮＦＰ変異体のクロマトグラフ分離は、ＸＢｒｉｄｇｅ  Ａｍｉｄｅ  ＨＰＬＣカラム（３．５μｍ、２．１×５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ、ＵＳＡ）上で実施された。ＬＣ／ＭＳ分析に適用する前に、試料は、濾過（０．２２μｍポアサイズ）及びイオン交換マトリックス（Ｓｔｒａｔａ  ＡＢＷ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上固相抽出によるクリアリングにより調製した。ＨＰＬＣ装置は、８℃で実行するＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｎｅｘｅｒａ  Ｘ２  ＳＩＬ−３０ＡＣＭＰオートサンプラー、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＬＣ−２０ＡＤポンプ、及び３５℃で実行したＳｈｉｍａｄｚｕ  ＣＴＯ−２０ＡＣカラムオーブン（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）で構成されていた。移動相はアセトニトリル：Ｈ２Ｏと０．１％（ｖ／ｖ）水酸化アンモニウムで構成されていた。１μｌの試料を機器に注入し、次にランは流速３００μｌ／分で５．００分間実施した。代謝物はすべてＭＲＭによりＥＳＩ負イオン化モードで分析した。マススペクトロメトリーは単位導出で操作した。衝突エネルギーＱ１及びＱ３Ｐｒｅ  Ｂｉａｓは分析物ごとに個々に最適化した。定量化法は市販の標準（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ、Ｃｏｍｐｔｏｎ、ＵＫ及びＥｌｉｃｉｔｙｌ、Ｃｒｏｌｌｅｓ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用して確立した。
【０１５７】
中間体ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）のフコシル化に基づくＬＮＦＰ変異体はクロマトグラフィー分離（ＬＮＦＰ−１−２．４分；及びＬＮＦＰ−Ｖ−２．５分）により同定することが可能である。わずかに異なる保持時間は、ＬＮＴのフコシル化のタイプ（ＬＮＦＰ−Ｉではガラクトース上のアルファ−１，２−フコシル化；ＬＮＦＰ−ＩＩではＮ−アセチル−グルコサミン上のアルファ−１，４−フコシル化及びＬＮＦＰ−Ｖではグルコース上のアルファ−１，３−フコシル化）の違いにより引き起こされる。さらに、ＬＮＦＰ変異体は、フコシル化の位置と関係する特定のフラグメンテーションパターンに起因するその移行パターン（表５参照）により同定することが可能である。
【０１５８】
中間体ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）のフコシル化の位置（ＬＮｎＦＰ−Ｉではガラクトース上のアルファ−１，２−フコシル化並びにＬＮｎＦＰＩＩＩではＮ−アセチルグルコサミン上の及びＬＮｎＦＰ−Ｖではグルコース上のアルファ−１，３−フコシル化）の違いに基づくＬＮｎＦＰ変異体は、クロマトグラフィー分離により同定することが可能である（図２ａ）。さらに、ＬＮｎＦＰ変異体は、フコシル化の位置と関係する特定のフラグメンテーションパターンに起因するその移行パターン（表５参照）により同定することが可能である。
【０１５９】
ＬＮｎＦＰ−ＩＩＩ及びＬＮｎＦＰ−Ｖは、０．１分の保持時間のわずかな違いしかない。α−１，３−フコシル基転移酵素ＦｕｃＴ１０９を使用するインビトロ酵素反応の分析により、ＬＮｎＦＰ−ＩＩＩとＬＮｎＦＰ−Ｖの混合物が明らかにされた（図２ｂ参照）。
【０１６０】
表６は、フコペンタオース生産について試験されたフコシル基転移酵素及びそれぞれＬＮＴ、及びＬＮｎＴをグリカン基質として使用した場合の生体触媒反応からの検出された産物をまとめている。
【０１６１】
【表５】
2020526200.tif 000007
【０１６２】
［実施例２］  イー・コリラクト−Ｎ−トリオースＩＩ生産株の開発
エシェリキア・コリＢＬ２１（ＤＥ３）を使用してラクト−Ｎ−トリオースＩＩ（ＬＮＴ−２）生産株を構築した。代謝操作は、それぞれ特定の遺伝子の変異誘発及び欠失、並びに異種遺伝子のゲノム組込みを含んでいた。遺伝子ｌａｃＺ及びａｒａＡは、ミスマッチオリゴヌクレオチドを使用する変異誘発により不活性化された。
【０１６３】
ゲノム欠失はＤａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法に従って実施した。Ｎ−アセチルグルコサミンの細胞内分解を防ぐため、Ｎ−アセチルグルコサミン−６−ホスフェート脱アセチル化酵素（ｎａｇＡ）及びグルコサミン−６−ホスフェート脱アミノ化酵素（ｎａｇＢ）をコードする遺伝子を、イー・コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）株のゲノムから欠失させた。遺伝子ｗｚｘＣ−ｗｃａＪも欠失させた。ｗｃａＪは、コラン酸合成の第１ステップを触媒するＵＤＰ−グルコース：ウンデカプレニルリン酸グルコース−１−リン酸転移酵素をコードする。さらに、それぞれＬ−フコースイソメラーゼ及びＬ−フクロースキナーゼをコードする遺伝子ｆｕｃｌ及びｆｕｃＫを取り除いた。
【０１６４】
異種遺伝子のゲノム組込みは遺伝子転位により実施した。ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポサーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、ＵＳＡ）を使用して直鎖状ＤＮＡ断片を組み込むか、又はマリナートランスポサーゼＨｉｍａｒ１の活動亢進Ｃ９−突然変異体を遺伝子転位に用いた。ＥＺ−Ｔｎ５トランスポソームを作製するため、目的の遺伝子をＦＲＴ−部位隣接抗生物質耐性マーカーと一緒にプライマー１１１９又は１１２０で増幅させ、得られたＰＣＲ産物は両方の部位に、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポサーゼについての１９ｂｐモザイクエンド認識部位を保持していた。Ｈｉｍａｒ１を使用する組込みでは、目的のトランスポサーゼ発現構築物（オペロン）をＦＲＴ−部位隣接抗生物質耐性マーカーと一緒にｐＥｃｏｍａｒベクターに同様にクローニングした。ｐＥｃｏｍａｒベクターは、アラビノース誘導性プロモーターＰａｒａＢの制御下でマリナートランスポサーゼＨｉｍａｒ１の活動亢進Ｃ９−突然変異体をコードしている。発現断片＜Ｐｔｅｔ−ｌａｃＹ−ＦＲＴ−ａａｄＡ−ＦＲＴ＞（配列番号３１）は、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポサーゼを使用することにより組み込んだ。イー・コリＫ１２ＴＧ１由来のラクトースインポーターＬａｃＹの遺伝子（受託番号ＡＢＮ７２５８３）を首尾よく組み込んだ後、耐性遺伝子は、プラスミド上にコードされているＦＬＰ組換え酵素によりストレプトマイシン耐性クローンから取り除いた。その改変により得られた株は株＃５３４であった。ナイセリア・メニンギティディスＭＣ５８由来のＮ−アセチルグルコサミン糖転移酵素遺伝子ｌｇｔＡ（受託番号ＮＰ＿２７４９２３）は、イー・コリでの発現のためにコドン最適化され、遺伝子合成により合成的に調製された。遺伝子合成により同様に得られたイー・コリＫ１２亜系ＭＧ１６５５由来のガラクトース−１−ホスフェートウリジリル転移酵素をコードする遺伝子ｇａｌＴ（受託番号ＮＰ＿４１５２７９）と一緒に、ｌｇｔＡをプラスミドｐＥｃｏｍａｒ−ｌｇｔＡ−ｇａｌＴを使用する遺伝子転位により挿入した（配列番号３２）。ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミンの新規合成を増強するため、Ｌ−グルタミン：Ｄ−フクトース−６−ホスフェートアミノ基転移酵素（ｇｌｍＳ）、イー・コリＫ１２亜系ＭＧ１６５５由来のホスホグルコサミンムターゼ（ｇｌｍＭ）及びイー・コリＫ１２亜系ＭＧ１６５５由来のＮ−アセチルグルコサミン−１−ホスフェートウリジル転移酵素／グルコサミン−１−ホスフェートアセチル基転移酵素（ｇｌｍＵ）をコードする遺伝子（それぞれ受託番号ＮＰ＿４１８１８５、ＮＰ＿４１７６４３、ＮＰ＿４１８１８６）は、コドン最適化され、遺伝子合成により得られた。オペロンｇｌｍＵＭは構成的テトラサイクリンプロモーターＰｔｅｔの制御下でクローニングされ、ｇｌｍＳは構成的ＰＴ５プロモーターの下でクローニングされた。マリナー様エレメントＨｉｍａｒ１トランスポサーゼにより特異的に認識される逆位末端配列が隣接している、トランスポゾンカセット＜Ｐｔｅｔ−ｇｌｍＵＭ−ＰＴ５−ｇｌｍＳ−ＦＲＴ−ｄｈｆｒ−ＦＲＴ＞（配列番号３３）は、ｐＥｃｏｍａｒ−ｇｌｍＵＭ−ｇｌｍＳから挿入され、ラクト−Ｎ−トリオース２生産株（＃７２４）を明らかにした。株イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）は、イー・コリ産生株の開発のための最初の宿主株として使用した。
【０１６５】
［実施例３］  フコシル化ＬＮＴを生産するためにインビボでフコシル基転移酵素をスクリーニングするためのイー・コリ株の操作
サルモネラ・サラメ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓａｌａｍａｅ）由来の１，３−ガラクトシル基転移酵素遺伝子ｗｂｄＯ（受託番号ＡＡＶ３４５２５）は、イー・コリでの発現のためにコドン最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの協力により合成的に調製された。ｇａｌＥ遺伝子はイー・コリＫ１２のゲノムＤＮＡから増幅した。両方の遺伝子は、プラスミドｐＥｃｏｍａｒ−ｗｂｄＯ−ｇａｌＥを使用する遺伝子転位によって、＜Ｐｔｅｔ−ｗｂｄＯｃｏ−ＰＴ５−ｇａｌＥ−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ＞（配列番号３４）トランスポゾンとして株＃７２４に挿入された。得られた株は＃７５３である。ＧＤＰ−フコースの供給を増強するため、Ｌ−フコースをＧＤＰ−フコースに変換するバクテロイデス・フラジリス由来の二機能性フコセキナーゼ／Ｌ−フコース−１−ホスフェートグアニル酸転移酵素（ｆｋｐ）（受託番号ＡＹ８４９８０６）は、イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株で過剰発現された。ｆｋｐ遺伝子（最初にバクテロイデス・フラジリス（ＡＴＣＣ  ２５２８５Ｄ）のゲノムＤＮＡから増幅される）は、先行するプロモーターＰｔｅｔと一緒に、オーバーラップ伸長ＰＣＲ（ＳＯＥ−ＰＣＲ）によるスプライシング並びにプライマー１１１９及び１１２０を使用してｌｏｘ部位隣接ゲンタマイシン耐性遺伝子に融合され、得られたＥＺ−Ｔｎ５＜Ｐｔｅｔ−ｆｋｐ−ｌｏｘ−ａａｃＣ１−ｌｏｘ＞（配列番号３５）トランスポゾンは、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポサーゼにより媒介されてイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株に組み込まれ、株＃９９３を得た。代わりに、ホスホマンノムターゼをコードするＧＤＰ−Ｌ−フコース遺伝子（ｍａｎＢ）の新規合成では、イー・コリＫ１２  ＤＨ５α由来のマンノース−１−ホスフェートグアノシル転移酵素（ｍａｎＣ）、ＧＤＰ−マンノース−４，６−脱水酵素（ｇｍｄ）及びＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素（ｗｃａＧ）は、イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株において過剰発現され、オペロンｍａｎＣＢは構成的プロモーターＰｔｅｔの制御下に置かれ、オペロンｇｍｄ、ｗｃａＧはやはり構成的ＰＴ５プロモーターから転写される。細菌宿主にゲンタマイシン耐性を与える遺伝子ａａｃＣ１を含む、トランスポゾンカセット＜Ｐｔｅｔ−ｍａｎＣＢ−ＰＴ５−ｇｍｄ、ｗｃａＧ−ＦＲＴ−ａａｃＣ１−ＦＲＴ＞（配列番号３６）は、マリナー様エレメントＨｉｍａｒ１トランスポサーゼにより特異的に認識される逆位末端配列が隣接していた。このカセットは、ｐＥｃｏｍａｒ  Ｃ９−ｍａｎＣＢ−ｇｍｄ、ｗｃａＧ−ａａｃＣ１から株＃７５３のゲノムに挿入され、株＃１４４５を生じた。
【０１６６】
［実施例４］  フコシル化ＬＮｎＴを生産するためにインビボでフコシル基転移酵素をスクリーニングするためのイー・コリ株の操作
ナイセリア・メニンジティディス由来のβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素遺伝子ｌｇｔＢ（受託番号ＡＡＦ４２２５７）はイー・コリでの発現のために最適化され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔの協力により合成的に調製された。ＦＲＴ部位隣接テトラサイクリン耐性遺伝子と一緒に、β−１，４−ガラクトシル基転移酵素遺伝子ｌｇｔＢは、プラスミドｐＥｃｏｍａｒ−ｌｇｔＢを使用する遺伝子転位により株＃７２４中に＜ＰＴ５−ｌｇｔＢ−ＦＲＴ−ｔｅｔＡ−ＦＲＴ＞（配列番号３７）トランスポゾンとして挿入された。ｇａｌＥ遺伝子はイー・コリＫ１２のゲノムＤＮＡから増幅され、ＳＯＥ−ＰＣＲによりプロモーターＰｔｅｔ及びクロラムフェニコール耐性遺伝子と融合された。ＥＺ−Ｔｎ５トランスポサーゼについての１９ｂｐモザイクエンド認識部位を生み出すプライマー（プライマー２１９４及び２２３５）を使用して、ＥＺ−トランスポゾン＜Ｐｔｅｔ−ｇａｌＥ−ＦＲＴ−ｃａｔ−ＦＲＴ＞を構築してイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株中に組み込み株＃１０４６を得た。代わりに、アグロゲイティバクター・アフロフィルス由来のβ−１，４−ガラクトシル基転移酵素遺伝子ｌｅｘ１（受託番号ＹＰ＿００３００８６４７）は、合成的に合成されイー・コリ用にコドン最適化されており、株＃７２４に組み込まれた。ｌｅｘ１遺伝子は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）をコードするｍａｌＥ遺伝子に融合されて、Ｌｅｘ１へのＭＢＰのＮ末端融合物を得た。ｍａｌＥ−ｌｅｘ１融合物は、ｐＥｃｏｍａｒ−ｍａｌＥ−ｌｅｘ１−ｇａｌＥ−ｃａｔを使用する遺伝子転位により、Ｐｔｅｔプロモーターの転写制御下でｇａｌＥと同時に組み込まれた（配列番号３８）。ＥＺ断片ＥＺ−Ｔｎ５＜Ｐｔｅｔ−ｆｋｐ−ＦＲＴ−ａａｃＣ１−ＦＲＴ＞（実施例３参照）を使用して、バクテロイデス・フラジリス由来のフコースキナーゼ／Ｌ−フコース−１−リン酸グアニル酸転移酵素をコードする遺伝子（ｆｋｐ）を株＃１０４６に染色体性に組み込み、株＃１０７６を生じた。
【０１６７】
［実施例５］  ＬＮＴ、及びＬＮｎＴをフコシル化するフコシル基転移酵素のインビボスクリーニング
フコペンタオースの合成用の株の培養のために使用した無機塩（ＭＳ）培地は、７ｇ／ＬのＮＨ４Ｈ２ＰＯ４、７ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２ｇ／ＬのＫＯＨ、０．３ｇ／Ｌのクエン酸、２ｇ／ＬのＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、及び０．０１５ｇ／ＬのＣａＣｌ２×６Ｈ２Ｏを含有し、１ｍＬ／Ｌの微量元素溶液（５４．４ｇ／Ｌのクエン酸アンモニウム鉄、９．８ｇ／ＬのＭｎＣｌ２×４Ｈ２Ｏ、１．６ｇ／ＬのＣｏＣｌ２×６Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＣｕＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、１．９ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、９ｇ／ＬのＺｎＳＯ４×７Ｈ２Ｏ、１．１ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４×２Ｈ２Ｏ、１．５ｇ／ＬのＮａ２ＳｅＯ３、１．５ｇ／ＬのＮｉＳＯ４×６Ｈ２Ｏ）が補充されている。
【０１６８】
ＦｕｃＴ基質としてそれぞれＬＮＴでは株＃９９３又は＃１４４５、及びＬＮｎＴでは＃１０７６を使用して、プラスミドｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｆｕｃＴ−ｚｅｏを使用してフコシル化五糖をインビボで生産した。プラスミド含有株は、炭素源として２％のグルコース、遺伝子発現の誘導因子として２００ｎｇ／ｍｌのアンヒドロテトラサイクリン並びに抗生物質アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びゼオシン２０μｇ／ｍｌを有する２０ｍｌの無機塩（ＭＳ）培地で生育した。細菌は、バッフル付き振盪フラスコにおいて０．３のＯＤ６００ｎｍまで３０℃で培養し、その後株＃９９３及び＃１０７６の派生物では３ｍＭのラクトース及び２ｍＭのＬ−フコース、並びに株＃１４４５の派生物では３ｍＭのラクトースを添加した。
【０１６９】
２４時間〜７２時間の培養後、細胞を遠心分離により収穫し、生理食塩水（０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ）で１回洗浄し、１５０μｌ〜２００μｌ（ペレットサイズに応じて）の生理食塩水に再懸濁し、ガラスビーツを使用して機械的に破壊した。細胞片をペレット化することにより澄んだ上澄みを得た。フコシル化ＬＮＴの形成は、ＴＣＬにより細胞内代謝物を分析することにより検出し、その結果は表６にまとめられている。培養上澄み中に分泌されているバクテロイデス・フラジリスＮＴＣＴ９３４３由来のＦｕｃＴ１０９によりＬＮＦＰ−Ｖの形成を分析するため、無傷の細胞を遠心分離し、その上澄みをＴＬＣ分析に適用した（図４）。図４は、ｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｆｕｃＴ１０９−ｚｅｏを含有する、ラクト−Ｎ−フコペンタオース生産イー・コリ株の培養上澄みのＴＬＣ分析を描いている。ＬＮＦＰ−Ｖは、精製された標準糖と移行速度を比較することにより、ｍａｌＥ−ｆｕｃＴ１０９融合遺伝子を発現する株の上澄み中で検出される。参照糖：レーン１：ラクトース、レーン２：ＬＮＴ−２、レーン３：ＬＮＴ＋ＬＮＦＰ−Ｖ、レーン４：ＬＮＴ；レーン５：株＃９９３由来の上澄み試料、レーン６：株＃９９３ｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｆｕｃＴ１０９−ｚｅｏ由来の上澄み試料、レーン７：株＃１４４５由来の上澄み試料、レーン８：＃１４４５ｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｆｕｃＴ１０９−ｚｅｏ由来の上澄み試料。
【０１７０】
［実施例６］  発酵工程におけるＬＮＦＰ−Ｉの合成
イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）派生物でのｆｕｃＴ遺伝子の組込み
株＃９９３を宿主として使用して、フコシル基転移酵素ｆｕｃＴ４１（グラムエラ・フォルセティ（Ｇｒａｍｅｌｌａ  ｆｏｒｓｅｔｉｉ）ＫＴ０８０３、受託番号ＷＰ＿０１１７０８４７９）、ＦｕｃＴ４８（フランシセラ・フィロミラギア属種フィロミラギアＡＴＣＣ  ２５０１５、受託番号ＥＥＴ２１２４３．１）、ＦｕｃＴ４９（シュードガルベンキアニア・フェロオキシダンス（Ｐｓｅｕｄｏｇｕｌｂｅｎｋｉａｎｉａ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、受託番号ＥＥＧ１０４３８．１）、ＦｕｃＴ５４（シデロキシダンス・リソトロフィカスＥＳ−１１、受託番号ＡＤＥ１３１１４．１）、ＦｕｃＴ６１（シュードアルテロモナス・ハロプランクティスＡＮＴ／５０５、受託番号ＥＧＩ７４６９３．１）、ＦｕｃＴ６６（ロゼオバリウス・ヌビンヒベンスＩＳＭ、受託番号ＥＡＰ７８４５７．１）及びＦｕｃＴ６９（タラソスピラ・プロフンディマリス（Ｔｈａｌａｓｓｏｓｐｉｒａ  ｐｒｏｆｕｎｄｉｍａｒｉｓ）ＷＰ０２１１、受託番号ＥＫＦ０９２３２．１）をコードする遺伝子は染色体性に組み込まれた。ｍａｌＥ−ｆｕｃＴ融合遺伝子は、先行するプロモーターＯｔｅｔ及びゼオシン耐性遺伝子と一緒に、鋳型としてｐＩＮＴ−ｍａｌＥ−ｆｕｃＴ−ｚｅｏプラスミドを使用してプライマー１１１９及び１１２０で増幅され、トランスポゾンカセットＥＺ−Ｔｎ５＜Ｐｔｅｔ−ｍａｌＥ−ｆｕｃＴ−ｚｅｏ＞は、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポサーゼを使用してイー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）株に挿入された。
【０１７１】
ｍａｌＥ−ｆｕｃＴ組込みを内部に持つ株は、２％のグルコース、及び２０μｇ／ｍｌのゼオシンを含有する２００μｌのＭＳ培地中の９６ウェルプレートにおいて３０℃で振盪しながら生育した。２４時間の培養後、５０μｌの培養物を、２％のグルコース、２０μｇ／ｍｌのゼオシン、３ｍＭのラクトース及び２ｍＭのＬ−フコースを有する、４００μｌの新鮮なＭＳ培地に移した。４８時間培養後、培養物の上澄みをＬＣ／ＭＳにより分析した。異なるＦｕｃＴ遺伝子の結果は図５に示しており、エラーバーは、同じ株の５つの別々の培養物の標準偏差を示している。ｆｕｃＴ６１発現株（＃１１９７）は、その他の組込み体と比べて最も高いＬＮＦＰ−Ｉ力価を達成した（図５）。
【０１７２】
ＬＮＦＰ−Ｉの生産のためのフコース移入の操作
株１１９７による増強されたＬＮＦＰ−Ｉ生産は、イー・コリＭＧ１６５５の主要な促進物質輸送体ＦｕｃＰ（受託番号ＡＩＺ９０１６２）の組込みにより達成された。ＦｕｃＰは先行するＰｔｅｔプロモーター及びストレプトマイシン耐性遺伝子と共に、プライマー１１１９及び１１２０（＜Ｐｔｅｔ−ｆｕｃＰ−ＦＲＴ−ａａｄ１−ＦＲＴ＞、配列番号３９）を用いて増幅され、ＥＺ−Ｔｎ５（商標）トランスポサーゼを使用する遺伝子転位により染色体性に組み込まれた。ｆｕｃＴ６及びｆｕｃＰを有する株は株＃１７７２と名付けられた。
【０１７３】
３ｍＭのラクトース及び２ｍＭのＬ−フコースの存在下炭素源として２％のグルコースを有するＭＳ培地中の９６ウェルプレートにおいて株＃１１９７及び＃１７７２を生育して、株＃１７７２の上澄みで検出されたＬＮＦＰ−Ｉ濃度は株＃１１９７の上澄みで見出された濃度の２倍であった。
【０１７４】
発酵によるＬＮＦＰ−Ｉの生産
株＃１７７２の予備的発酵は、１ＬのＭＳ培地を含有する３Ｌの発酵槽において３０℃で行った。２％のグルコース及び２．５ｇ／ＬのＮＨ４Ｃｌを播種に先立って培地に添加し、発酵は抗生物質を添加せずに実行した。ｐＨは、１０％のアンモニアで滴定することにより絶えず７．０に保持した。発酵槽に振盪フラスコから培養物を０．１のＯＤ６００ｎｍまで播種した。約１０のＯＤ６００ｎｍで、１ｍＭのラクトース及び１ｍＭのＬ−フコースを添加し、この２つの基質は成長及び生産率に従って繰り返し１〜２ｍＭの用量で与えた。２％のグルコースバッチが枯渇すると、グルコースは５０％のグルコースストックから持続的に与えられた。８７時間の培養後、培養物は１８５のＯＤ６００ｎｍに達した。ＬＮＦＰ−Ｉの濃度４．３ｇ／ＬはＬＣ／ＭＳ分析により培養上澄みで決定した。ラクトース、ＬＮＴ−２及びＬＮＴは上澄み中の糖副産物として見出した（図６）。図６のグラフは、炭素源としてグルコースを使用する１Ｌの発酵においてイー・コリ（株＃１７７２）によるＬＮＦＰ−Ｉの生産を実証している。産物濃度は８７時間の発酵後培養物上澄みで測定した。ＬＮＦＰ−Ｉ（４．３ｇ／Ｌ）に加えて、ラクトース（１３．１１ｇ／Ｌ）、ＬＮＴ−２（４．６ｇ／Ｌ）及びＬＮＴ（１．１ｇ／Ｌ）を上澄みにおいて検出した。
【０１７５】
【表６】
2020526200.tif 000008
2020526200.tif 000009
【０１７６】
副産物の分解
所望の産物ＬＮＦＰ−Ｉの副産物ラクトース、ＬＮＴ−２及びＬＮＴからの分離を促進するため、これらの糖は酵素的に分解することが可能であり、得られた分解産物イー・コリ株により代謝される。
【０１７７】
β−１，４−ガラクトシダーゼ、例えば、イー・コリのＬａｃＺはラクトースをＤ−グルコース及びｄＤ−ガラクトースに効率的に分解する。この２つの単糖は、機能的ｇａｌ−オペロンを発現しているイー・コリ株により代謝される。
【０１７８】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼＢｂｈｌはＬＮＴ−２をＮ−アセチルグルコサミン及びラクトースに高度に特異的に効率的に加水分解する。
【０１７９】
ビフィドバクテリウム・ロングム亜種インファンティス由来のβ−１，３−ガラクトシダーゼＢｇａ４２Ａは、ＬＮＴをガラクトース及びＬＮＴ−２に特異的に加水分解する。
【０１８０】
副産物の分解のためのイー・コリ株の操作
発酵生産後上澄みから糖副産物なしでＬＮＦＰ−Ｉを回収するために、イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）＃５３４を使用して分解株を構築した。
【０１８１】
機能的ｇａｌＥＴＫＭオペロンは、その天然のプロモーターと一緒に、オリゴヌクレオチド６４７３及び６４７４を使用してイー・コリＫ１２のゲノムＤＮＡから増幅し、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポサーゼについての５’１９ｂｐモザイクエンド認識部位のある断片を作製した。断片＜ｇａｌＥＴＫＭ＞（配列番号４０）はＥＺ−Ｔｎ５トランスポサーゼにより媒介されてイー・コリ株のゲノム中に組み込まれた。正確な組込みを有するクローンは、１％のガラクトースを含有するＭａｃＣｏｎｃｅｙ寒天（Ｄｉｆｃｏ、Ｓｐａｒｋｓ、ＵＳＡ）上で選択し、正確な組込みを有するクローンは３７℃で３６時間のインキュベーション後赤いコロニーとして出現した。
【０１８２】
ビフィドバクテリウム・ビフィダムＪＣＭ１２５４由来のβ−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼＢｂｈｌをコードする遺伝子は合成的に合成し、イー・コリでの発現のためにコドン最適化した。Ｐｔｅｔプロモーターの転写制御下にあるＢｂｈｌ及び宿主にゼオシン耐性を与える遺伝子（＜Ｐｔｅｔ−ｂｂｈｌ−ｚｅｏ＞（配列番号４１））は、Ｈｉｍａｒ１トランスポサーゼにより媒介されてプラスミドｐＥｃｏｍａｒ−ｂｂｈｌ−ｚｅｏから組み込まれた。
【０１８３】
完全β−１，４−ガラクトシダーゼ活性を保証するため、イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）由来のｌａｃＺ（受託番号ＡＭ９４６９８１）を、構成的プロモーターＰｔｅｔの転写制御下でクローニングした。ゲンタマイシン耐性遺伝子ａａｃＣ１と一緒に、断片＜Ｐｔｅｔ−ｌａｃＺ−ＦＲＴ−ａａｃＣ１−ＦＲＴ＞（配列番号４２）をプライマー１１１９及び１１２０を用いて増幅し、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポサーゼにより組み込んで、株＃１３６９を得た。
【０１８４】
ビフィドバクテリウム・ロングム亜種インファンティス由来のβ−１，３−ガラクトシダーゼＢｇａ４２Ａは、イー・コリについてコドン最適化し、合成的に合成した。Ｐｔｅｔプロモーターの転写制御下にあるＢｇａ４２Ａ及び宿主にクロラムフェニコール耐性を与えるｃａｔ遺伝子（＜Ｐｔｅｔ−ｂｇａ４２Ａ−ｃａｔ＞（配列番号４３））は、ＥＺ−Ｔｎ５トランスポサーゼを使用して組み込まれた。３つの加水分解酵素遺伝子をすべて発現する株を株＃１８８６と命名した。
【０１８５】
ラクトース及びＬＮＴ−２の分解は、株＃１７７２のＬＮＦＰ−Ｉ生産培養物に株＃１８８６の培養物を添加することにより効率的に達成された。ＬａｃＺ及びＢｂｈｌによるＬＮＴ−２及びラクトースの分解を実証するため、炭素源としてグルコースを有するＭＳ培地で生育された株＃１８８６の培養物を、ＬＮＦＰ−Ｉの生産のためにラクトース及びＬ−フコースの存在下でグルコースを有するＭＳ培地で生育された株＃１７７２の培養物に１対４０の体積比で添加した。
【０１８６】
図７は、イー・コリ株＃１８８６で発現されている加水分解酵素によるラクトース及びＬＮＴ−２の分解を示している。イー・コリ株＃１８８６の成長している培養物を、ＬＮＦＰ−Ｉを主産物として、ＬＮＴ及びＬＮＴ−２を副産物として生産したイー・コリ株＃１７７２の培養物に添加した。ＬＮＴ−２及びラクトースはインキュベーション１０時間以内に培養物上澄み中でほぼ完全に枯渇した。代謝物は、ラクトースは円形：ＬＮＴ−２は四角形：ＬＮＦＰ−Ｉは三角形：ＬＮＴはバツ印を付ける。１０時間以内に、ＬＮＴ−２及びラクトースはほぼ完全な枯渇まで分解され、ＬＮＦＰ−Ｉ及びＬＮＴは＃１８８６細胞により分解されなかった。株＃１８８６は活性なｇａｌＥＴＫＭオペロンを含有しているので、ラクトース加水分解から生じる単糖グルコース及びガラクトースは完全に代謝される。
【０１８７】
加水分解酵素Ｂｇａ４２Ａは細胞外では活性ではない。しかし、炭素源としてグルコースを有するＭＳ培地上で生育された株＃１８８６の細胞が機械的に破壊されると、ＬＮＴに対するＢｇａ４２Ａの加水分解活性は実証され、薄層クロマトグラフィーの画像を表示している図８に示される。イー・コリ株＃１８８６由来の細胞可溶化液を含有する試料（レーン１：酵素なし、レーン２〜６：１００μｇタンパク質）及び２０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７中５ｍＭのＬＮＴは、３０℃で及び９５℃で５分間加熱することにより不活性化する前に、１２０分までの時間（レーン１：１２０分、レーン２：０分、レーン３：１５分、レーン４：３０分、レーン５：６０分、レーン６：１２０分）をかけてインキュベートした。
【０１８８】
図８では、株＃１８８６の無細胞抽出物中のＬＮＴ並びに得られた分解産物ＬＮＴ−２及びラクトースの加水分解が示されている。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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