(57)【要約】エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ−Ｄ６８）若しくはその改変形、上記ＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、又は上記ゲノム配列若しくは上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含む核酸分子、上記ＥＶ−Ｄ６８、その改変形若しくは上記核酸分子を含む医薬組成物、及び腫瘍を治療するための医薬組成物の調製における、上記ＥＶ−Ｄ６８、その改変形又は上記核酸分子の使用が提供される。
2020528890.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体における腫瘍の治療における又は被験体における腫瘍を治療するための医薬の製造における、エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ−Ｄ６８）若しくはその改変形、又は単離された核酸分子の使用であって、
前記核酸分子は、以下の：
（１）ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列と、
（２）前記ゲノム配列又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列と、
から選択される配列を含む、使用。
【請求項２】
前記ＥＶ−Ｄ６８は、野生型ＥＶ−Ｄ６８であり、
好ましくは、前記ＥＶ−Ｄ６８は、エンテロウイルスＤ６８に感染した個体から分離された臨床分離株であり、
好ましくは、前記ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するゲノム配列を有し、好ましくは、前記ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列であり、
好ましくは、前記ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するｃＤＮＡ配列を有し、好ましくは、前記ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記改変形は、野生型ＥＶ−Ｄ６８と比較してゲノム中に１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を有する改変ＥＶ−Ｄ６８であり、
好ましくは、野生型ＥＶ−Ｄ６８と比較して、前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、以下の：
（１）非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ）における１つ以上の突然変異と、
（２）１つ以上の外因性核酸の挿入と、
（３）１つ以上の内因性遺伝子の欠失又は突然変異と、
（４）前記３つの項目の任意の組み合わせと、
から選択される１つ以上の改変を有する、請求項１又は２に記載の使用。
【請求項４】
前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、前記５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）における１つ以上の突然変異を含み、
好ましくは、前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、前記５’ＵＴＲ配列の全て又は部分の置換を有し、
好ましくは、前記改変ＥＶ−Ｄ６８の５’ＵＴＲにおける内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列は、外因性ＩＲＥＳ配列、例えばヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列と置き換えられており、
好ましくは、前記ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列は、配列番号２に示されている、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、外因性核酸を含み、
好ましくは、前記外因性核酸は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、好ましくはヒトＧＭ−ＣＳＦ）又は抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチド（例えば、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖ、好ましくはヒトＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖ）をコードし、
好ましくは、前記外因性核酸は、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノムの５’ＵＴＲとＶＰ４遺伝子との間、又はＶＰ１遺伝子と２Ａ遺伝子との間に挿入され、
好ましくは、前記外因性核酸は、１つ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）のマイクロＲＮＡの標的配列を含み、
好ましくは、前記マイクロＲＮＡの標的配列は、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に挿入され、
好ましくは、前記外因性核酸は、ｍｉＲ−１３３及び／又はｍｉＲ−２０６の標的配列を含み、
好ましくは、前記ｍｉＲ−１３３の標的配列は、配列番号３に示されており、
好ましくは、前記ｍｉＲ−２０６の標的配列は、配列番号４に示されている、請求項３又は４に記載の使用。
【請求項６】
前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、請求項５に規定される外因性核酸の少なくとも１つの挿入及び／又は請求項４に規定される非翻訳領域における少なくとも１つの突然変異を含む、請求項３〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、以下の特徴：
（１）前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１３〜配列番号１６に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、好ましくは、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１３〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列から選択されること、及び、
（２）前記改変ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号８〜配列番号１１に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、好ましくは、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列から選択されること、
の１つを有する、請求項３〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項８】
前記単離された核酸分子は、前記ＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、又は前記ゲノム配列若しくは前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列からなり、
好ましくは、前記単離された核酸分子は、前記ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列を有し、
好ましくは、前記単離された核酸分子は、配列番号１２〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
前記単離された核酸分子は、前記ＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、又は前記ゲノム配列若しくは前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）であり、
好ましくは、前記単離された核酸分子は、前記ＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のｃＤＮＡ配列、又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）であり、
好ましくは、前記単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列又はその相補的配列を含むベクターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１０】
前記ＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形、又は前記単離された核酸分子は、追加の薬学的活性剤と組み合わせて使用され、
好ましくは、前記追加の薬学的活性剤は、抗腫瘍活性を有し、
好ましくは、前記追加の薬学的活性剤は、追加の腫瘍溶解性ウイルス、化学療法剤又は免疫療法剤から選択され、
好ましくは、前記追加の腫瘍溶解性ウイルスは、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス又はそれらの任意の組み合わせから選択され、
好ましくは、前記化学療法剤は、５−フルオロウラシル、マイトマイシン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、シクロホスファミド、ダカルバジン、ミトキサントロン、アントラサイクリン類（例えば、エピルビシン又はドキソルビシン）、エトポシド、白金化合物（例えば、カルボプラチン又はシスプラチン）、タキサン類（例えば、パクリタキセル又はタキソテール）又はそれらの任意の組み合わせから選択され、
好ましくは、前記免疫療法剤は、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１阻害薬又はＣＴＬＡ−４阻害薬）、腫瘍特異的標的化抗体（例えば、リツキシマブ又はハーセプチン）又はそれらの任意の組み合わせから選択される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
以下の特徴：
（１）前記腫瘍は、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、乳癌、黒色腫、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、喉頭癌、骨肉腫、造血器悪性腫瘍（例えば、リンパ腫又は白血病）から選択されること、
（２）前記被験体は、ヒト等の哺乳動物であること、
の少なくとも１つを有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１２】
医薬として使用されるＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形、又は単離された核酸分子であって、前記核酸分子は、以下の：
（１）前記ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列と、
（２）前記ゲノム配列又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列と、
から選択される配列を含み、
好ましくは、前記ＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形、又は前記単離された核酸分子は、請求項１〜１１のいずれか一項に規定される通りである、ＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形、又は単離された核酸分子。
【請求項１３】
腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形、又は有効量の単離された核酸分子を投与する工程を含み、ここで、前記単離された核酸分子は、
（１）前記ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列と、
（２）前記ゲノム配列又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列と、
から選択される配列を含み、
好ましくは、前記腫瘍は、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、乳癌、黒色腫、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、喉頭癌、骨肉腫、造血器悪性腫瘍（例えば、リンパ腫又は白血病）から選択され、
好ましくは、前記被験体は、ヒト等の哺乳動物であり、
好ましくは、前記ＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形、又は前記単離された核酸分子は、請求項１〜１１のいずれか一項に規定される通りである、方法。
【請求項１４】
ＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形、又は単離された核酸分子を含む医薬組成物であって、前記核酸分子は、
（１）前記ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列と、
（２）前記ゲノム配列又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列と、
からなる群から選択される配列を含み、
好ましくは、前記医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を更に含み、
好ましくは、前記医薬組成物は、任意に追加の薬学的活性剤を更に含み、好ましくは、前記追加の薬学的活性剤は、追加の腫瘍溶解性ウイルス、化学療法剤又は免疫療法剤等の抗腫瘍活性を有する医薬であり、
好ましくは、前記医薬組成物は、被験体における腫瘍を治療するために使用され、
好ましくは、前記被験体は、ヒト等の哺乳動物であり、
好ましくは、前記腫瘍は、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、乳癌、黒色腫、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、喉頭癌、骨肉腫、造血器悪性腫瘍（例えば、リンパ腫又は白血病）から選択され、
好ましくは、前記ＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形、又は前記単離された核酸分子は、請求項１〜１１のいずれか一項に規定される通りである、医薬組成物。
【請求項１５】
野生型ＥＶ−Ｄ６８と比較してゲノム中に１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を有する改変ＥＶ−Ｄ６８であって、
好ましくは、前記野生型ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、好ましくは、前記野生型ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列であり、
好ましくは、前記野生型ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、好ましくは、前記野生型ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列であり、
好ましくは、前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、前記野生型ＥＶ−Ｄ６８と比較して以下の：
（１）非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ）における１つ以上の突然変異と、
（２）１つ以上の外因性核酸の挿入と、
（３）１つ以上の内因性遺伝子の欠失又は突然変異と、
（４）前記３つの項目の任意の組み合わせと、
から選択される１つ以上の改変を有する、改変ＥＶ−Ｄ６８。
【請求項１６】
請求項１５に記載の改変ＥＶ−Ｄ６８であって、
前記５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）における１つ以上の突然変異を含み、
好ましくは、前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、前記５’ＵＴＲ配列の全て又は部分の置換を有し、
好ましくは、前記改変ＥＶ−Ｄ６８の５’ＵＴＲにおける内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列は、外因性ＩＲＥＳ配列、例えばヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列と置き換えられており、
好ましくは、前記ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列は、配列番号２に示されている、請求項１５に記載の改変ＥＶ−Ｄ６８。
【請求項１７】
請求項１５又は１６に記載の改変ＥＶ−Ｄ６８であって、
前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、外因性核酸を含み、
好ましくは、前記外因性核酸は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、好ましくはヒトＧＭ−ＣＳＦ）又は抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチド（例えば、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖ、好ましくはヒトＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖ）をコードし、
好ましくは、前記外因性核酸は、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノムの５’ＵＴＲとＶＰ４遺伝子との間、又はＶＰ１遺伝子と２Ａ遺伝子との間に挿入され、
好ましくは、前記外因性核酸は、１つ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）のマイクロＲＮＡの標的配列を含み、
好ましくは、前記マイクロＲＮＡの標的配列は、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に挿入され、
好ましくは、前記外因性核酸は、ｍｉＲ−１３３及び／又はｍｉＲ−２０６の標的配列を含み、
好ましくは、前記ｍｉＲ−１３３の標的配列は、配列番号３に示されており、
好ましくは、前記ｍｉＲ−２０６の標的配列は、配列番号４に示されている、請求項１５又は１６に記載の改変ＥＶ−Ｄ６８。
【請求項１８】
前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、請求項１７に規定される外因性核酸の少なくとも１つの挿入及び／又は請求項１６に規定される非翻訳領域における少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１５〜１７のいずれか一項に記載の改変ＥＶ−Ｄ６８。
【請求項１９】
前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、以下の特徴：
（１）前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１３〜配列番号１６に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、好ましくは、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１３〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列から選択されること、及び、
（２）前記改変ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号８〜配列番号１１に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有し、好ましくは、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列から選択されること、
の少なくとも１つを有する、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の改変ＥＶ−Ｄ６８。
【請求項２０】
単離された核酸分子であって、
（１）請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列と、
（２）前記ゲノム配列又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列と、
からなる群から選択される配列を含む、単離された核酸分子。
【請求項２１】
前記単離された核酸分子は、前記ＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、又は前記ゲノム配列若しくは前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列からなり、
好ましくは、前記単離された核酸分子は、前記ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列を有し、
好ましくは、前記単離された核酸分子は、配列番号１２〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を有する、請求項２０に記載の単離された核酸分子。
【請求項２２】
前記単離された核酸分子は、前記ＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、又は前記ゲノム配列若しくは前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）であり、
好ましくは、前記単離された核酸分子は、前記ＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のｃＤＮＡ配列、又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクターであり、
好ましくは、前記単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列又はその相補的配列を含むベクターである、請求項２０に記載の単離された核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ウイルスの分野及び腫瘍治療の分野に関する。特に、本発明は、被験体（例えば、ヒト）における腫瘍を治療するための、及び被験体（例えば、ヒト）における腫瘍を治療するための医薬の製造のための、エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ−Ｄ６８）若しくはその改変形、又はＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、若しくは上記ゲノム配列若しくは上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含む核酸分子の使用に関する。本発明はまた、腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする被験体にＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形、又はＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、若しくは上記ゲノム配列若しくは上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含む核酸分子を投与する工程を含む、方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍の現在の治療方法には、外科手術、化学療法及び放射線療法が含まれる。これらの従来の療法は転移性腫瘍の治療には満足いくものではなく、患者の健康に大きな害を及ぼす場合もある。これに対して、新しい種類の治療法として、腫瘍溶解性ウイルスを使用した腫瘍治療法は特異性が高く、有効性が良好であり、副作用がより少なく、現在では有望な腫瘍治療法とみなされている。
【０００３】
腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞内で自己複製することで、腫瘍細胞を死滅及び溶解させる又は腫瘍細胞の成長を停止させることができるウイルスである。ｉｎ  ｖｉｖｏ治療で使用される場合に、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍細胞に対して特異性を示し、直接的に腫瘍細胞の死を誘導することができるが、正常細胞にはほとんど効果を有しないか又は全く効果を有しない。一方で、腫瘍溶解性ウイルスは免疫系で細胞傷害性Ｔリンパ球応答を誘導することで、間接的に腫瘍細胞を死滅させることもできる。
【０００４】
エンテロウイルスはピコルナウイルス科に属し、そのゲノムは一本鎖プラス鎖ＲＮＡである。腫瘍溶解性ウイルスとしてエンテロウイルスを使用することには、以下の利点がある。第一に、一本鎖ＲＮＡウイルスであるので、そのゲノムは宿主内でＤＮＡの段階を一切経ないため、宿主ＤＮＡへのウイルスゲノムの挿入により引き起こされる遺伝毒性がなくて、より安全性が高いこと、第二に、エンテロウイルスのゲノムは比較的小さく、多数のウイルスが短期間で複製されて他の腫瘍細胞に更に感染し、強い細胞変性効果を引き起こし得ること、次に、エンテロウイルスは癌遺伝子を含まないため、腫瘍を誘発しないこと、そして最後にエンテロウイルスのゲノムを逆遺伝学技術により改変させて、ウイルスの弱毒化を達成し、その副作用を減らすことができること。
【０００５】
現在、腫瘍溶解活性を有する報告されたエンテロウイルスには、悪性神経膠腫等のヒト固形腫瘍の治療のためのキメラポリオウイルス（非特許文献１）、ヒト黒色腫細胞を死滅させるコクサッキーウイルスＡ１３、Ａ１５、Ａ１８及びＡ２１（非特許文献２）、ヒト胃癌細胞及び卵巣癌細胞を死滅させるエコーウイルスＥＣＨＯ１（非特許文献３、非特許文献４）等が含まれる。しかしながら、依然として、腫瘍特異性と腫瘍死滅活性との両方を有するウイルスを得ることが必要とされる。
【０００６】
エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ−Ｄ６８）は、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属のエンテロウイルスＤの一種であり、これは１９６２年にカリフォルニアで呼吸器感染症の小児から初めて分離された（非特許文献５）。耐酸性のヒトの胃腸管で繁殖するほとんどのエンテロウイルスとは異なり、ＥＶ−Ｄ６８は酸感受性であり、主に気道内で複製する。ＥＶ−Ｄ６８感染症は長い間ほとんど報告がなかったので、ＥＶ−Ｄ６８は、鼻垂れ、くしゃみ及び咳を含む軽度の呼吸器疾患を主に引き起こす稀な病原体であると考えられている。現在、当該技術分野においては、エンテロウイルス６８が腫瘍溶解活性を有するという報告はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Dobrikova et al., Mol Ther 2008, 16 (11): 1865-1872
【非特許文献２】Au et al., Virol J 2011, 8: 22
【非特許文献３】Shafren et al., Int J Cancer 2005, 115 (2): 320-328
【非特許文献４】Haley et al., J Mol Med (Berl) 2009, 87 (4): 385-399
【非特許文献５】Schieble et al., Am J Epidemiol 1967, 85 (2): 297-310
【発明の概要】
【０００８】
多くの実験を行うとともに探求を繰り返した末に、予想外にも、エンテロウイルスＤ６８が幅広いスペクトルと顕著な腫瘍細胞死滅能力とを有することが見出された。この知見に基づいて、本発明の発明者らは、腫瘍を治療するための新しい腫瘍溶解性ウイルス及び該ウイルスに基づく腫瘍治療法を開発した。
【０００９】
医療的用途
第１の態様では、本発明は、被験体における腫瘍の治療における又は被験体における腫瘍を治療するための医薬の製造における、エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ−Ｄ６８）若しくはその改変形、又は単離された核酸分子の使用であって、
前記単離された核酸分子は、以下の：
（１）ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列と、
（２）前記ゲノム配列又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列と、
から選択される配列を含む、使用を提供する。
【００１０】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８は野生型ＥＶ−Ｄ６８である。或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８は、エンテロウイルスＤ６８に感染した個体から分離された臨床分離株であり得る。
【００１１】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するゲノム配列を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列である。
【００１２】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するｃＤＮＡ配列を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列である。
【００１３】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変形は、野生型ＥＶ−Ｄ６８と比較してゲノム中に１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を有する改変ＥＶ−Ｄ６８である。
【００１４】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ＥＶ−Ｄ６８と比較して、前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、以下の：
（１）非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ）における１つ以上の突然変異と、
（２）１つ以上の外因性核酸の挿入と、
（３）１つ以上の内因性遺伝子の欠失又は突然変異と、
（４）前記３つの項目の任意の組み合わせと、
から選択される１つ以上の改変を有する。
【００１５】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）における１つ以上の突然変異を含む。
【００１６】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、５’ＵＴＲ配列の全て又は部分の置換を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８の５’ＵＴＲにおける内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列は、外因性ＩＲＥＳ配列、例えばヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列と置き換えられている。或る特定の好ましい実施の形態では、ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列は、配列番号２に示されている。
【００１７】
ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列の使用は、幾つかの場合には有利であり、例えば、それは腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍特異性の改善に資する。正常なヒト神経細胞では、ヒトライノウイルス２の内部リボソーム進入部位配列に宿主ＲＮＡ結合タンパク質（ＤＲＢＰ７６及びＮＦ４５）が特異的に結合し、それによりｅｌＦ４Ｇ等の因子の動員が妨げられ（Merrill et al. J Virol 2006,80 (7): 3147-3156、Merrill and Gromeier, J Virol 2006,80 (14): 6936-6942、Neplioueva et al., PLoS One 2010,5 (7): e11710)、一方で、Ｒａｆ／Ｅｒｋ１／２／ＭＡＰＫ等のシグナル伝達経路に対応していないため、リボソームはヒトライノウイルス２の内部リボソーム進入部位配列に結合することが困難であり、こうしてウイルスタンパク質の翻訳を開始することは不可能である（Dobrikov et al., Mol Cell Biol 2011, 31(14): 2947-2959、Dobrikov et al., Mol Cell Biol 2013, 33(5): 937-946）ことが以前に報告されている。ヒト神経膠腫細胞においては、ヒトライノウイルス２の内部リボソーム進入部位は上記の２つの要因により影響されないため、ウイルスタンパク質の転写及び翻訳を正常に開始することができる。したがって、幾つかの場合には、ＥＶ−Ｄ６８の内部リボソーム進入部位配列をヒトライノウイルス２の内部リボソーム進入部位配列で置き換えることは、正常なヒト神経細胞に対する本発明のウイルスの毒性作用及び副作用を、ヒト神経膠腫の治療でのそのウイルスの使用に影響を与えることなく回避又は低減するのに有益である。
【００１８】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は外因性核酸を含む。
【００１９】
或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、好ましくはヒトＧＭ−ＣＳＦ）又は抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチド（例えば、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖ、好ましくはヒトＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖ）をコードする。或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノムの５’ＵＴＲとＶＰ４遺伝子との間、又はＶＰ１遺伝子と２Ａ遺伝子との間に挿入される。
【００２０】
或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（例えば、ｍｉＲ−１３３又はｍｉＲ−２０６）の標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、マイクロＲＮＡの標的配列は、改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に挿入される。
【００２１】
腫瘍細胞における或る特定のマイクロＲＮＡの発現レベルが正常細胞よりも大幅に低いこと、及び／又は明らかな組織特異性を有することが以前に報告されている。したがって、幾つかの場合には、そのようなマイクロＲＮＡの標的配列を含む本発明の改変ＥＶ−Ｄ６８は有利である。それというのも、正常な細胞又は組織で高度に発現されるそのようなマイクロＲＮＡは、対応する標的配列によって正常な細胞又は組織における改変ＥＶ−Ｄ６８の複製を低減し得るか、又は更には遮断し得るため、非腫瘍細胞に対する改変ＥＶ−Ｄ６８の毒性副作用は減少、更には回避されるからである。そのようなマイクロＲＮＡには、限定されるものではないが、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１４５、ｍｉＲ−２１７、ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１５、ｍｉＲ−１６等が含まれる（例えば、国際公開第２００８１０３７５５号、米国特許出願公開第２０１６０１４３９６９号、又はBaohong Zhang et al., Developmental Biology, Volume 302, Issue 1, 1 February 2007, Pages 1-12を参照；これらの文献の全ては、引用することにより本明細書の一部をなす）。
【００２２】
或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、上記の１つ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）のマイクロＲＮＡの標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、ｍｉＲ−１３３及び／又はｍｉＲ−２０６の標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ｍｉＲ−１３３の標的配列は、配列番号３に示されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ｍｉＲ−２０６の標的配列は、配列番号４に示されている。幾つかの場合には、ｍｉＲ−１３３及び／又はｍｉＲ−２０６の標的配列の挿入が有利である。これは、ｍｉＲ−１３３及びｍｉＲ−２０６が筋肉組織で特異的に発現されるため、ｍｉＲ−１３３及び／又はｍｉＲ−２０６の標的配列を改変ＥＶ−Ｄ６８へと挿入することにより、腫瘍溶解性ウイルスの組織向性を変化させることができ、それにより正常な筋肉組織への損傷が減少する又は回避されるからである。
【００２３】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、上記の外因性核酸の少なくとも１つの挿入及び／又は上記の非翻訳領域における少なくとも１つの突然変異を含む。
【００２４】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１３〜配列番号１６に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１３〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列から選択される。
【００２５】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号８〜配列番号１１に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列から選択される。
【００２６】
本発明において、改変ＥＶ−Ｄ６８は逆遺伝学技術により得ることができ、逆遺伝学技術は当該技術分野において知られており、例えば、Yang LS, Li SX, Liu YJ, et al Virus Res, 2015, 210: 165-168、Hou WH, Yang LS, Li SX, et al. Virus Res, 2015, 205: 41-44を参照のこと（これらは、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）。そのような実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、典型的には、野生型ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡを改変すること（例えば、外因性核酸の挿入、内因性遺伝子の欠失若しくは突然変異、又は非翻訳領域における突然変異）により得られる。
【００２７】
本発明において、ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形を前処理することで、被験体におけるウイルスに対する免疫応答を低減させる又は排除することができ、ここで、上記前処理は、リピドソーム又はミセル中にＥＶ−Ｄ６８をパッケージングすること、及び／又はプロテアーゼ（例えば、キモトリプシン又はトリプシン）を使用してウイルスのキャプシドタンパク質を除去し、宿主のウイルスに対する体液性免疫及び／又は細胞性免疫を低下させることを含み得る。
【００２８】
本発明において、ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形は、腫瘍細胞における馴化のために連続継代され得る。或る特定の好ましい実施の形態では、腫瘍細胞は、当該技術分野において知られる腫瘍細胞系統若しくは腫瘍細胞株であり得る、又は腫瘍を有する個体（例えば、被験体）からの外科的切除若しくは臨床的分離によって得られた腫瘍細胞であり得る。或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形は、腫瘍を有する個体（例えば、被験体）から得られた腫瘍細胞における馴化のために連続継代される。或る特定の好ましい実施の形態では、腫瘍細胞は、腫瘍を有する個体（例えば、被験体）からの外科的切除又は臨床的分離によって得られる。或る特定の好ましい実施の形態では、馴化のための連続継代法は、以下の過程、すなわち１）標的腫瘍細胞にウイルスを感染させる過程と、２）上清中のウイルスを採取する過程と、３）新たな標的腫瘍細胞に得られたウイルスを再感染させる過程とからなる複数のサイクル（例えば、少なくとも５サイクル、少なくとも１０サイクル、少なくとも１５サイクル、少なくとも２０サイクル）を含む。
【００２９】
或る特定の好ましい実施の形態では、上記のＥＶ−Ｄ６８及びその改変形は、組み合わせて使用することができる。したがって、医薬は、ＥＶ−Ｄ６８及びその改変形の１つ又は幾つかを含み得る。
【００３０】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、又は上記ゲノム配列若しくは上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列からなる。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子はＲＮＡである。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、配列番号１２〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を有する。
【００３１】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、又は上記ゲノム配列若しくは上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）である。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のｃＤＮＡ配列、又は上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）である。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列又はその相補的配列を含むベクターである。
【００３２】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列の相補的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、相補的配列は、
（１）配列番号１２に示されるヌクレオチド配列と、
（２）配列番号１２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
（３）配列番号１３〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と、
（４）配列番号１３〜配列番号１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。
【００３３】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のｃＤＮＡ配列の相補的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、相補的配列は、
（１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と、
（２）配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
（３）配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と、
（４）配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。
【００３４】
本発明において、単離された核酸分子は、当該技術分野において知られる任意の手段によって送達することができ、例えば、ネイキッド核酸分子（例えば、ネイキッドＲＮＡ）を直接的に注入することができる又は非ウイルス送達システムを使用することができる。非ウイルス送達システムは、限定されるものではないが、"Yin H, et al. Nat Rev Genet. 2014 Aug; 15(8): 541-55."及び"Riley MK, Vermerris W. Nanomaterials (Basel). 2017 Apr 28; 7(5). Pii: E94."（これらは、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に詳細に記載される材料、例えばリポソーム、無機ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）等を含む当該技術分野においてよく知られる様々な材料から得ることができる。
【００３５】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は、治療的有効量の上記のＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形、又は治療的有効量の上記の単離された核酸分子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は、医療技術分野で知られる任意の形で存在し得る。例えば、医薬は、錠剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、ロゼンジ剤、坐剤又は注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態で存在し得る。幾つかの実施の形態では、医薬は、注射液又は凍結乾燥粉末である。
【００３６】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は安定剤を含む。
【００３７】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は、任意に、追加の薬学的活性剤を更に含む。好ましい実施の形態では、追加の薬学的活性剤は、追加の腫瘍溶解性ウイルス、化学療法剤又は免疫療法剤等の抗腫瘍活性を有する医薬である。
【００３８】
本発明において、追加の腫瘍溶解性ウイルスには、限定されるものではないが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。化学療法剤には、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル、マイトマイシン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、シクロホスファミド、ダカルバジン、ミトキサントロン、アントラサイクリン類（例えば、エピルビシン又はドキソルビシン）、エトポシド、白金化合物（例えば、カルボプラチン又はシスプラチン）、タキサン類（例えば、パクリタキセル又はタキソテール）又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。免疫療法剤には、限定されるものではないが、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１阻害薬又はＣＴＬＡ−４阻害薬）、腫瘍特異的標的化抗体（例えば、リツキシマブ又はハーセプチン）又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００３９】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は、例えば少なくとも１×１０２ｐｆｕ、少なくとも１×１０３ｐｆｕ、少なくとも１×１０４ｐｆｕ、１×１０５ｐｆｕ、１×１０６ｐｆｕ、少なくとも１×１０７ｐｆｕ、少なくとも１×１０８ｐｆｕ、少なくとも１×１０９ｐｆｕ、少なくとも１×１０１０ｐｆｕ、少なくとも１×１０１１ｐｆｕ、少なくとも１×１０１２ｐｆｕ、少なくとも１×１０１３ｐｆｕ、少なくとも１×１０１４ｐｆｕ又は少なくとも１×１０１６ｐｆｕのＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形を含む、上記のＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形の単位用量を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は、１×１０２ｐｆｕ〜１×１０１７ｐｆｕの上記のＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形を含む。
【００４０】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は、上記の単離された核酸分子の単位用量、例えば３×１０１０〜３×１０１４のウイルスゲノムコピーを含む核酸分子を含有する。
【００４１】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬は、追加療法と組み合わせて投与され得る。この追加療法は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法又は遺伝子療法等の腫瘍に関して知られている任意の療法であり得る。この追加療法は医薬の投与前に、その投与と同時に又はその投与後に施すことができる。
【００４２】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記腫瘍には、限定されるものではないが、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、乳癌、黒色腫、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、喉頭癌、骨肉腫、造血器悪性腫瘍（例えば、リンパ腫又は白血病）が含まれる。
【００４３】
或る特定の好ましい実施の形態では、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。
【００４４】
別の態様では、本発明はまた、医薬としての、第１の態様で規定されるＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形、又は第１の態様で規定される単離された核酸分子の使用に関する。
【００４５】
治療法
第２の態様では、本発明は、腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、有効量のＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形、又は有効量の単離された核酸分子を投与する工程を含み、ここで、前記単離された核酸分子は、
（１）前記ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列と、
（２）前記ゲノム配列又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列と、
からなる群から選択される配列を含む、方法を提供する。
【００４６】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８は被験体に投与される。或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８は野生型ＥＶ−Ｄ６８である。或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８は、エンテロウイルスＤ６８に感染した個体から分離された臨床分離株であり得る。
【００４７】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列である。
【００４８】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列である。
【００４９】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８の改変形が被験体に投与される。或る特定の好ましい実施の形態では、改変形は、野生型ＥＶ−Ｄ６８と比較して、ゲノム中の１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を有する改変ＥＶ−Ｄ６８である。
【００５０】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ＥＶ−Ｄ６８と比較して、前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、以下の：
（１）非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ）における１つ以上の突然変異と、
（２）１つ以上の外因性核酸の挿入と、
（３）１つ以上の内因性遺伝子の欠失又は突然変異と、
（４）前記３つの項目の任意の組み合わせと、
から選択される１つ以上の改変を有する。
【００５１】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）における１つ以上の突然変異を含む。
【００５２】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、５’ＵＴＲ配列の全て又は部分の置換を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８の５’ＵＴＲにおける内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列は、外因性ＩＲＥＳ配列、例えばヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列と置き換えられている。或る特定の好ましい実施の形態では、ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列は、配列番号２に示されている。
【００５３】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は外因性核酸を含む。
【００５４】
或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、好ましくはヒトＧＭ−ＣＳＦ）又は抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチド（例えば、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖ、好ましくはヒトＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖ）をコードする。或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノムの５’ＵＴＲとＶＰ４遺伝子との間、又はＶＰ１遺伝子と２Ａ遺伝子との間に挿入される。
【００５５】
或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（例えば、ｍｉＲ−１３３又はｍｉＲ−２０６）の標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、マイクロＲＮＡの標的配列は、改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に挿入される。
【００５６】
或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、上記の１つ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）のマイクロＲＮＡの標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、ｍｉＲ−１３３及び／又はｍｉＲ−２０６の標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ｍｉＲ−１３３の標的配列は、配列番号３に示されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ｍｉＲ−２０６の標的配列は、配列番号４に示されている。
【００５７】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、上記の外因性核酸の少なくとも１つの挿入及び／又は上記の非翻訳領域における少なくとも１つの突然変異を含む。
【００５８】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１３〜配列番号１６に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１３〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列から選択される。
【００５９】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号８〜配列番号１１に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列から選択される。
【００６０】
或る特定の好ましい実施の形態では、上記のＥＶ−Ｄ６８及びその改変形は、組み合わせて使用することができる。したがって、ＥＶ−Ｄ６８及び改変形の１つ以上を被験体に投与することができる。
【００６１】
或る特定の好ましい実施の形態では、上記の単離された核酸分子が被験体に投与される。
【００６２】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、又は上記ゲノム配列若しくは上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列からなる。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子はＲＮＡである。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、配列番号１２〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を有する。
【００６３】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、又は上記ゲノム配列若しくは上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）である。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のｃＤＮＡ配列、又は上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）である。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列又はその相補的配列を含むベクターである。
【００６４】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列の相補的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、相補的配列は、
（１）配列番号１２に示されるヌクレオチド配列と、
（２）配列番号１２に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
（３）配列番号１３〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と、
（４）配列番号１３〜配列番号１６のいずれかに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。
【００６５】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のｃＤＮＡ配列の相補的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、相補的配列は、
（１）配列番号１に示されるヌクレオチド配列と、
（２）配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
（３）配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と、
（４）配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。
【００６６】
本発明において、単離された核酸分子は、当該技術分野において知られる任意の手段によって送達することができ、例えば、ネイキッド核酸分子（例えば、ネイキッドＲＮＡ）を直接的に注入することができる又は非ウイルス送達システムを使用することができる。非ウイルス送達システムは、限定されるものではないが、"Yin H, et al. Nat Rev Genet. 2014 Aug; 15(8): 541-55."及び"Riley MK, Vermerris W. Nanomaterials (Basel). 2017 Apr 28; 7(5). Pii: E94."（これらは、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に詳細に記載される材料、例えばリポソーム、無機ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）等を含む当該技術分野においてよく知られる様々な材料から得ることができる。
【００６７】
或る特定の好ましい実施の形態では、上記のＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形、又は上記の単離された核酸分子は、医薬組成物として製剤化して投与することができる。そのような医薬組成物は、治療的有効量の上記のＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形、又は治療的有効量の上記の単離された核酸分子を含み得る。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、医療技術分野で知られる任意の形で存在し得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、ロゼンジ剤、坐剤又は注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形で存在し得る。幾つかの実施の形態では、医薬は、注射液又は凍結乾燥粉末である。
【００６８】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は安定剤を含む。
【００６９】
本発明において、ＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形、又は上記の単離された核酸分子は、任意の適切な投与経路により被験体に投与され得る。幾つかの場合には、ＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形、又は上記の単離された核酸分子の投与経路は、腫瘍の位置及び種類に依存する。例えば、容易にアクセス可能な固形腫瘍の場合に、ウイルス又は核酸分子は任意に腫瘍への直接注射（例えば、腫瘍内注射）により投与され、造血系の腫瘍の場合に、ウイルス又は核酸分子は静脈内又は他の血管内経路で投与することができ、体内の容易にアクセス可能でない腫瘍（例えば、転移）の場合に、ウイルス又は核酸分子は全身を駆け巡ることで腫瘍に到達することができるように全身投与することができる（例えば、静脈内注射又は筋肉内注射）。任意に、本発明のウイルス又は核酸分子は、皮下経路、腹腔内経路、くも膜下経路（例えば、脳腫瘍用）、局所経路（例えば、黒色腫用）、経口経路（例えば、口腔癌用又は食道癌用）、鼻腔内経路又は吸入スプレー経路（例えば、肺癌用）等を介して投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態では、上記のＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形、又は上記の単離された核酸は、皮内経路、皮下経路、筋肉内経路、静脈内経路、経口経路等を介して投与され得る。
【００７０】
或る特定の好ましい実施の形態では、上記方法は、抗腫瘍活性を有する追加の薬学的活性剤を投与することを更に含む。この追加の薬学的活性剤は、ＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形、又は上記の単離された核酸分子の投与の前に、その投与と同時に又はその投与の後に投与され得る。
【００７１】
或る特定の好ましい実施の形態では、追加の薬学的活性剤には、追加の腫瘍溶解性ウイルス、化学療法剤又は免疫療法剤が含まれる。本発明において、追加の腫瘍溶解性ウイルスには、限定されるものではないが、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、レオウイルス、ニューカッスル病ウイルス、水疱性口内炎ウイルス、麻疹ウイルス又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。化学療法剤には、限定されるものではないが、５−フルオロウラシル、マイトマイシン、メトトレキサート、ヒドロキシ尿素、シクロホスファミド、ダカルバジン、ミトキサントロン、アントラサイクリン類（例えば、エピルビシン又はドキソルビシン）、エトポシド、白金化合物（例えば、カルボプラチン又はシスプラチン）、タキサン類（例えば、パクリタキセル又はタキソテール）又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。免疫療法剤には、限定されるものではないが、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１阻害薬又はＣＴＬＡ−４阻害薬）、腫瘍特異的標的化抗体（例えば、リツキシマブ又はハーセプチン）又はそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００７２】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形は、被験体の体重１ｋｇ当たり１ｐｆｕ〜１×１０１５ｐｆｕの任意の量で投与することができ、例えば、ＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形は、被験体の体重１ｋｇ当たり少なくとも１×１０３ｐｆｕ、少なくとも１×１０４ｐｆｕ、１×１０５ｐｆｕ、１×１０６ｐｆｕ、少なくとも１×１０７ｐｆｕ、少なくとも１×１０８ｐｆｕ、少なくとも１×１０９ｐｆｕ、少なくとも１×１０１０ｐｆｕ、少なくとも１×１０１１ｐｆｕ、又は少なくとも１×１０１２ｐｆｕの量で投与される。或る特定の好ましい実施の形態では、上記の単離された核酸分子は、被験体の体重１ｋｇ当たり３×１０１０〜３×１０１４のウイルスゲノムコピーのいずれかの量で投与され得る。或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形、又は上記の単離された核酸分子は、１日３回、１日２回、１日１回、２日毎に１回又は週に１回投与することができ、任意に上記投与計画は、必要に応じて毎週又は毎月繰り返すことができる。
【００７３】
或る特定の好ましい実施の形態では、上記方法は、追加療法を施すことを更に含む。この追加療法は、外科手術、化学療法、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法又は遺伝子療法等の腫瘍に関して知られている任意の療法であり得る。この追加療法は上記方法を施す前に、それと同時に又はその後に施すことができる。
【００７４】
或る特定の好ましい実施の形態では、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。
【００７５】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記腫瘍には、限定されるものではないが、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、乳癌、黒色腫、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、喉頭癌、骨肉腫、造血器悪性腫瘍（例えば、リンパ腫又は白血病）が含まれる。
【００７６】
医薬組成物
第３の態様では、本発明は、第１の態様若しくは第２の態様で規定されるＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形、又は第１の態様若しくは第２の態様で規定される単離された核酸分子を含む医薬組成物を提供する。
【００７７】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、第１の態様又は第２の態様で規定されるＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形は組み合わせて使用することができる。したがって、本発明の医薬組成物は、ＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形の１つ又は幾つかを含み得る。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、ＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形の単位用量、例えば、少なくとも１×１０２ｐｆｕ、少なくとも１×１０３ｐｆｕ、少なくとも１×１０４ｐｆｕ、１×１０５ｐｆｕ、１×１０６ｐｆｕ、少なくとも１×１０７ｐｆｕ、少なくとも１×１０８ｐｆｕ、少なくとも１×１０９ｐｆｕ、少なくとも１×１０１０ｐｆｕ、少なくとも１×１０１１ｐｆｕ、少なくとも１×１０１２ｐｆｕ、少なくとも１×１０１３ｐｆｕ、少なくとも１×１０１４ｐｆｕ又は少なくとも１×１０１６ｐｆｕのＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、１×１０２ｐｆｕ〜１×１０１７ｐｆｕのＥＶ−Ｄ６８及び／又はその改変形を含む。
【００７８】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、第１の態様又は第２の態様で規定される単離された核酸分子を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は組み合わせて使用され得る。したがって、本発明の医薬組成物は、単離された核酸分子の１つ又は幾つかを含み得る。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、単離された核酸分子の単位用量、例えば３×１０１０〜３×１０１４のウイルスゲノムコピーの単離された核酸分子を含む。
【００７９】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、医療技術分野で知られる任意の形で存在し得る。例えば、医薬組成物は、錠剤、丸剤、懸濁剤、乳剤、液剤、ゲル剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤、エリキシル剤、ロゼンジ剤、坐剤又は注射剤（注射液、凍結乾燥粉末を含む）等の形態で存在し得る。幾つかの実施の形態では、医薬は、注射液又は凍結乾燥粉末である。
【００８０】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体又は賦形剤を更に含む。或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は安定剤を含む。
【００８１】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、任意に、追加の薬学的活性剤を更に含む。好ましい実施の形態では、追加の薬学的活性剤は、追加の腫瘍溶解性ウイルス、化学療法剤又は免疫療法剤等の抗腫瘍活性を有する医薬である。
【００８２】
或る特定の好ましい実施の形態では、医薬組成物は、被験体における腫瘍を治療するために使用される。
【００８３】
或る特定の好ましい実施の形態では、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。
【００８４】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記腫瘍には、限定されるものではないが、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、乳癌、黒色腫、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、喉頭癌、骨肉腫、造血器悪性腫瘍（例えば、リンパ腫又は白血病）が含まれる。
【００８５】
改変ＥＶ−Ｄ６８
第４の態様では、本発明は、野生型ＥＶ−Ｄ６８と比較してゲノム中に１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を有する改変ＥＶ−Ｄ６８を提供する。
【００８６】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１２に示されるヌクレオチド配列である。
【００８７】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号１に示されるヌクレオチド配列である。
【００８８】
或る特定の好ましい実施の形態では、野生型ＥＶ−Ｄ６８と比較して、前記改変ＥＶ−Ｄ６８は、以下の：
（１）非翻訳領域（例えば、５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲ）における１つ以上の突然変異と、
（２）１つ以上の外因性核酸の挿入と、
（３）１つ以上の内因性遺伝子の欠失又は突然変異と、
（４）前記３つの項目の任意の組み合わせと、
から選択される１つ以上の改変を有する。
【００８９】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）における１つ以上の突然変異を含む。
【００９０】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、５’ＵＴＲ配列の全て又は部分の置換を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８の５’ＵＴＲにおける内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列は、外因性ＩＲＥＳ配列、例えばヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列と置き換えられている。或る特定の好ましい実施の形態では、ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列は、配列番号２に示されている。
【００９１】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は外因性核酸を含む。
【００９２】
或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、好ましくはヒトＧＭ−ＣＳＦ）又は抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチド（例えば、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖ、好ましくはヒトＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖ）をコードする。或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノムの５’ＵＴＲとＶＰ４遺伝子との間、又はＶＰ１遺伝子と２Ａ遺伝子との間に挿入される。
【００９３】
或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）（例えば、ｍｉＲ−１３３又はｍｉＲ−２０６）の標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、マイクロＲＮＡの標的配列は、改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に挿入される。
【００９４】
或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、上記の１つ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）のマイクロＲＮＡの標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、ｍｉＲ−１３３及び／又はｍｉＲ−２０６の標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ｍｉＲ−１３３の標的配列は、配列番号３に示されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ｍｉＲ−２０６の標的配列は、配列番号４に示されている。
【００９５】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、上記の外因性核酸の少なくとも１つの挿入及び／又は上記の非翻訳領域における少なくとも１つの突然変異を含む。
【００９６】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１３〜配列番号１６に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１３〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列から選択される。
【００９７】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号８〜配列番号１１に示されるヌクレオチド配列から選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、前記改変ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列から選択される。
【００９８】
本発明において、改変ＥＶ−Ｄ６８は逆遺伝学技術により得ることができ、逆遺伝学技術は当該技術分野において知られており、例えば、Yang LS, Li SX, Liu YJ, et al Virus Res, 2015, 210: 165-168、Hou WH, Yang LS, Li SX, et al. Virus Res, 2015, 205: 41-44を参照のこと（これらは、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）。そのような実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、典型的には、野生型ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡを改変すること（例えば、外因性核酸の挿入、内因性遺伝子の欠失若しくは突然変異、又は非翻訳領域における突然変異）により得られる。
【００９９】
本発明において、改変ＥＶ−Ｄ６８を前処理することで、被験体におけるウイルスに対する免疫応答を低減させる又は排除することができ、ここで、上記前処理は、リピドソーム又はミセル中にＥＶ−Ｄ６８をパッケージングすること、及び／又はプロテアーゼ（例えば、キモトリプシン又はトリプシン）を使用してウイルスのキャプシドタンパク質を除去し、宿主のウイルスに対する体液性免疫及び／又は細胞性免疫を低下させることを含み得る。
【０１００】
本発明において、改変ＥＶ−Ｄ６８は、腫瘍細胞における馴化のために連続継代され得る。或る特定の好ましい実施の形態では、腫瘍細胞は、当該技術分野において知られる腫瘍細胞系統若しくは腫瘍細胞株であり得る、又は腫瘍を有する個体（例えば、被験体）からの外科的切除若しくは臨床的分離によって得られた腫瘍細胞であり得る。或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、腫瘍を有する個体（例えば、被験体）から得られた腫瘍細胞における馴化のために連続継代される。或る特定の好ましい実施の形態では、腫瘍細胞は、腫瘍を有する個体（例えば、被験体）からの外科的切除又は臨床的分離によって得られる。或る特定の好ましい実施の形態では、馴化のための連続継代法は、以下の過程、すなわち１）標的腫瘍細胞にウイルスを感染させる過程と、２）上清中のウイルスを採取する過程と、３）新たな標的腫瘍細胞に得られたウイルスを再感染させる過程とからなる複数のサイクル（例えば、少なくとも５サイクル、少なくとも１０サイクル、少なくとも１５サイクル、少なくとも２０サイクル）を含む。
【０１０１】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、被験体における腫瘍を治療するために又は被験体における腫瘍を治療するための医薬を調製するために使用される。
【０１０２】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記腫瘍には、限定されるものではないが、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、乳癌、黒色腫、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、喉頭癌、骨肉腫、造血器悪性腫瘍（例えば、リンパ腫又は白血病）が含まれる。
【０１０３】
或る特定の好ましい実施の形態では、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。
【０１０４】
或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の改変ＥＶ−Ｄ６８は、野生型ＥＶ−Ｄ６８と比較して、ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）の内部リボソーム進入部位配列と置き換えられた５’ＵＴＲ中の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列を有する。
【０１０５】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は外因性核酸を更に含む。
【０１０６】
或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、好ましくはヒトＧＭ−ＣＳＦ）又は抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチド（例えば、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖ、好ましくはヒトＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１に対するｓｃＦｖ）をコードする。或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノムの５’ＵＴＲとＶＰ４遺伝子との間、又はＶＰ１遺伝子と２Ａ遺伝子との間に挿入される。
【０１０７】
或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）（例えば、ｍｉＲ−１３３又はｍｉＲ−２０６）の標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、マイクロＲＮＡの標的配列は、改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノムの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）に挿入される。
【０１０８】
或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、上記の１つ以上（例えば、２つ、３つ又は４つ）のマイクロＲＮＡの標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、外因性核酸は、ｍｉＲ−１３３及び／又はｍｉＲ−２０６の標的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、ｍｉＲ−１３３の標的配列は、配列番号３に示されている。或る特定の好ましい実施の形態では、ｍｉＲ−２０６の標的配列は、配列番号４に示されている。
【０１０９】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、上記の少なくとも１つの外因性核酸の挿入を含む。
【０１１０】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列は、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列である。
【０１１１】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列である。
【０１１２】
或る特定の好ましい実施の形態では、改変ＥＶ−Ｄ６８は、被験体における腫瘍を治療するために使用される。
【０１１３】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記腫瘍には、限定されるものではないが、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、乳癌、黒色腫、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、喉頭癌、骨肉腫、造血器悪性腫瘍（例えば、リンパ腫又は白血病）が含まれる。
【０１１４】
或る特定の好ましい実施の形態では、腫瘍は、胃癌、子宮内膜癌、子宮頸癌及び甲状腺癌からなる群から選択される。
【０１１５】
第５の態様において、本発明は、
（１）第４の態様による改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列と、
（２）前記ゲノム配列又は前記ｃＤＮＡ配列の相補的配列と、
から選択される配列を含む、単離された核酸分子を提供する。
【０１１６】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記の改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、又は上記ゲノム配列若しくは上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列からなる。
【０１１７】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記の改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列を有する。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子はＲＮＡである。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、配列番号１２〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列を有する。
【０１１８】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のゲノム配列若しくはｃＤＮＡ配列、又は上記ゲノム配列若しくは上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）である。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記のＥＶ−Ｄ６８若しくはその改変形のｃＤＮＡ配列、又は上記ｃＤＮＡ配列の相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）である。或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、配列番号１、配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列又はその相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）である。
【０１１９】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記の改変ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列の相補的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、相補的配列は、
（１）配列番号１３〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と、
（２）配列番号１３〜配列番号１６のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。
【０１２０】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、上記の改変ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列の相補的配列を含む。或る特定の好ましい実施の形態では、相補的配列は、
（１）配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列と、
（２）配列番号８〜配列番号１１のいずれか１つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列と、
から選択されるヌクレオチド配列に対して相補的である。
【０１２１】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、配列番号１３に示されるヌクレオチド配列を有する、又は単離された核酸分子は、配列番号８に示されるヌクレオチド配列若しくはその相補的配列を含むベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクター）である。
【０１２２】
本発明において、単離された核酸分子は、当該技術分野において知られる任意の手段によって送達することができ、例えば、ネイキッド核酸分子（例えば、ネイキッドＲＮＡ）を直接的に注入することができる又は非ウイルス送達システムを使用することができる。非ウイルス送達システムは、限定されるものではないが、"Yin H, et al. Nat Rev Genet. 2014 Aug; 15(8): 541-55."及び"Riley MK, Vermerris W. Nanomaterials (Basel). 2017 Apr 28; 7(5). Pii: E94."（これらは、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）に詳細に記載される材料、例えばリポソーム、無機ナノ粒子（例えば、金ナノ粒子）、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）等を含む当該技術分野においてよく知られる様々な材料から得ることができる。
【０１２３】
或る特定の好ましい実施の形態では、単離された核酸分子は、被験体における腫瘍を治療するために又は被験体における腫瘍を治療するための医薬を調製するために使用される。
【０１２４】
或る特定の好ましい実施の形態では、前記腫瘍には、限定されるものではないが、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、肺癌、肝臓癌、腎臓癌、神経芽細胞腫、神経膠腫、乳癌、黒色腫、前立腺癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸直腸癌、食道癌、甲状腺癌、喉頭癌、骨肉腫、造血器悪性腫瘍（例えば、リンパ腫又は白血病）が含まれる。
【０１２５】
或る特定の好ましい実施の形態では、被験体は、ヒト等の哺乳動物である。
【０１２６】
別の態様では、本発明はまた、第４の態様による改変ＥＶ−Ｄ６８、又は第５の態様による単離された核酸分子を含む医薬組成物に関する。
【０１２７】
別の態様では、本発明はまた、被験体における腫瘍の治療における、又は被験体における腫瘍を治療するための医薬の製造における、第４の態様による改変ＥＶ−Ｄ６８、又は第５の態様による単離された核酸分子の使用に関する。
【０１２８】
別の態様では、本発明はまた、腫瘍を治療する方法であって、それを必要とする被験体に、第４の態様に記載される改変ＥＶ−Ｄ６８、又は第５の態様による単離された核酸分子を有効量投与する工程を含む、方法に関する。
【０１２９】
用語の定義
本発明においては、特段の定めがない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、生化学、細胞生物学、核酸化学等の実験室法は全て、対応する分野で広く使用されている常用の工程である。一方で、本発明をより良く理解するために、関連する用語の定義及び説明を以下に示す。
【０１３０】
本明細書で使用される場合に、「エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ−Ｄ６８）」という用語は、ピコルナウイルス科のエンテロウイルス属のエンテロウイルスＤの一種を指し、そのゲノムは５’非コーディング領域（５’ＵＴＲ）、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、３’非コーディング領域（３’ＵＴＲ）及びポリ（Ａ）テールからなる一本鎖プラス鎖ＲＮＡであり、ここで、そのＯＲＦは前駆体ポリタンパク質をコードし、この前駆体ポリタンパク質は、そのプロテアーゼによって加水分解され切断されて、構造タンパク質ＶＰ１〜ＶＰ４及び非構造タンパク質２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、３Ａ、３Ｂ、３Ｃ及び３Ｄが生成し得る。本発明をより明確に記載するために、上記タンパク質に対応するＥＶ−Ｄ６８ゲノム内の核酸配列は、それぞれＶＰ１遺伝子、ＶＰ２遺伝子、ＶＰ３遺伝子、ＶＰ４遺伝子、２Ａ遺伝子、２Ｂ遺伝子、２Ｃ遺伝子、３Ａ遺伝子、３Ｂ遺伝子、３Ｃ遺伝子及び３Ｄ遺伝子と呼ばれる。本発明において、「エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ−Ｄ６８）」という表現は、天然源から分離することができ、意図的に人工的に改変されていない野生型ＥＶ−Ｄ６８を指し、その例には、限定されるものではないが、原型株ＡＹ４２６５３１（ＣＡ６２−１）及びＡＹ４２６４８８（ＣＡ６２−３）並びに様々な臨床分離株（例えば、本発明の実施例１に記載される臨床分離株）が含まれる。野生型ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列又はｃＤＮＡ配列は、当該技術分野においてよく知られており、様々な公共データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、アクセッション番号ＫＭ８８１７１０）において見出すことができる。
【０１３１】
本明細書で使用される場合に、ウイルスの「改変形」という用語は、野生型ウイルスを改変することにより得られる、野生型ウイルスの所望の活性（例えば、腫瘍溶解活性）を保持する改変ウイルスを指す。本発明において、ＥＶ−Ｄ６８の「改変形」には、限定されるものではないが、野生型ＥＶ−Ｄ６８のゲノム配列と比較して、ゲノム配列が１つ以上のヌクレオチドの置換、挿入又は欠失を有し、少なくともＥＶ−Ｄ６８の腫瘍溶解活性を保持する改変ＥＶ−Ｄ６８ウイルスが含まれる。
【０１３２】
本明細書で使用される場合に、「腫瘍溶解性ウイルス」という用語は、腫瘍細胞に感染し、腫瘍細胞内で複製し、腫瘍細胞死、溶解を引き起こし、又は腫瘍細胞成長を遮断することが可能なウイルスを指す。このウイルスは、非腫瘍細胞に対して最小限の毒性効果を有することが好ましい。
【０１３３】
本明細書で使用される場合に、「腫瘍特異的」という用語は、腫瘍細胞内で生物学的機能又は生物学的活性を選択的に示すことを指す。例えば、本発明において「腫瘍特異性」という用語がウイルスの死滅選択性を説明するために使用される場合に、そのウイルスは非腫瘍細胞を死滅させることなく若しくは実質的に死滅させることなく腫瘍細胞を選択的に死滅させることができ、又はそのウイルスは、非腫瘍細胞を死滅させるよりも腫瘍細胞を死滅させることにおいて有効であることを意味する。
【０１３４】
本明細書で使用される場合に、「腫瘍溶解活性」という用語は、主に腫瘍死滅活性を含む。ウイルスの腫瘍溶解活性を記載する場合に、ウイルスの腫瘍溶解活性は、典型的には、ウイルスが腫瘍細胞に感染する能力、腫瘍細胞内で複製する能力、及び／又は腫瘍細胞を死滅させる能力等の指標によって測定することができる。ウイルスの腫瘍溶解活性は、当該技術分野において知られる任意の方法を用いて測定され得る。例えば、ウイルスが腫瘍細胞に感染する能力は、所与の割合の腫瘍細胞（例えば、５０％の細胞）に感染するのに必要なウイルス量を測定することによって評価することができ、腫瘍細胞内で複製する能力は、腫瘍細胞内でのウイルスの増殖を測定することにより評価することができ、腫瘍細胞を死滅させる能力は、細胞変性効果（ＣＰＥ）を観察する又は腫瘍細胞活性を測定することにより評価することができる。
【０１３５】
本明細書で使用される場合に、「ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ配列」という表現は、ＲＮＡ配列中のリボヌクレオチドが、対応するデオキシリボヌクレオチドにより置き換えられていること、例えばウラシルリボヌクレオチド（ＵＭＰ）がチミンデオキシリボヌクレオチド（ｄＴＭＰ）により置き換えられている点のみがウイルスゲノムＲＮＡ配列と異なるウイルスゲノムＲＮＡ配列のＤＮＡ形を意味する。
【０１３６】
本明細書で使用される場合に、「外因性核酸」という用語は、元の配列に対して外来である人工的に導入されたヌクレオチド配列を指す。外因性核酸には、限定されるものではないが、ウイルスゲノムには見られない任意の遺伝子又はヌクレオチド配列が含まれる。しかしながら、本発明において、外因性核酸は、最大１５００ヌクレオチド、例えば最大１２００ヌクレオチド、及び最大１０００ヌクレオチドから構成されていることが特に好ましい。幾つかの場合には、好ましくは、外因性核酸は、サイトカイン等の抗腫瘍死滅活性を有するタンパク質若しくはポリペプチド若しくは抗腫瘍タンパク質若しくはポリペプチドをコードする、又は外因性核酸は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）の標的配列を含む。本発明において、マイクロＲＮＡは、好ましくは、腫瘍細胞における発現レベルが正常細胞における発現レベルより大幅に低く、及び／又は明らかな組織特異性を有するマイクロＲＮＡである。マイクロＲＮＡの例には、限定されるものではないが、肝臓組織で特異的に発現されるｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−４８３等、心臓で特異的に発現されるｍｉＲ−１、ｍｉＲ−１３３ａ／ｂ、ｍｉＲ−２０８等、腎臓組織で特異的に発現されるｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９６ａ／ｂ、ｍｉＲ−２０４、ｍｉＲ−２１５等、筋肉組織で特異的に発現されるｍｉＲ−１３３ａ／ｂ、ｍｉＲ−２０６等、脳組織で特異的に発現されるｍｉＲ−１２４ａ、ｍｉＲ−１２５ａ／ｂ、ｍｉＲ−１２８ａ／ｂ、ｍｉＲ−１３８等、及び肝臓腫瘍組織で過少発現されるｍｉＲ−３４、ｍｉＲ−１２２ａ、ｍｉＲ−２６ａ、腎臓腫瘍組織で過少発現されるｍｉＲ−３４、膀胱腫瘍組織で過少発現されるｍｉＲ−１４３、ｍｉＲ−１３３ａ／ｂ、肺腫瘍組織で過少発現されるｍｉＲ−Ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−２９等が含まれる（例えば、Ruiz AJ and Russell S J. MicroRNAs and oncolytic viruses. [J]. Curr Opin Virol, 2015, 13: 40-48を参照；これは、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）。
【０１３７】
本発明においては、改変ＥＶ−Ｄ６８が上記のマイクロＲＮＡの標的配列を含む場合に、その改変ＥＶ−Ｄ６８は、該マイクロＲＮＡが高度に発現される又は特異的に発現される細胞／組織において該マイクロＲＮＡによって調節されるので、腫瘍溶解性ウイルスの複製は弱まり、更にはその死滅活性が失われ、その一方で、マイクロＲＮＡが過少発現される又は発現すらされない腫瘍細胞／組織では、腫瘍溶解性ウイルスは正常に複製するため、腫瘍細胞を死滅させることができる。
【０１３８】
本明細書で使用される場合に、「サイトカイン」という用語は、当業者によく知られる意味を有する。しかしながら、本発明において、本発明の腫瘍溶解性ウイルスを腫瘍の治療に使用する場合に、サイトカインは腫瘍治療のために使用することができるサイトカインであることが特に好ましい。「サイトカイン」の例には、限定されるものではないが、インターロイキン類（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５）、インターフェロン類（例えば、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（例えば、ＴＮＦα）及びコロニー刺激因子（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）並びにそれらの任意の組み合わせが含まれる（例えば、Ardolino M, Hsu J, Raulet D H. Cytokine treatment in cancer immunotherapy [J]. Oncotarget, 2015, 6 (23): 19346-19347を参照）。
【０１３９】
本明細書で使用される場合に、「抗腫瘍タンパク質又はポリペプチド」という用語は、限定されるものではないが、（１）細胞に対して毒性を有し、細胞増殖を阻害する又はアポトーシスを誘導することができるタンパク質又はポリペプチド（それらの例には、限定されるものではないが、チミジンキナーゼＴＫ（ＴＫ／ＧＣＶ）、ＴＲＡＩＬ及びＦａｓＬが含まれる）（例えば、Candolfi M, King GD, Muhammad AG, et al. Evaluation of proapototic transgenes to use in combination with Flt3L in an immune-stimulatory gene therapy approach for Glioblastoma multiforme (GBM) [J]. FASEB J, 2008, 22: 1077.13を参照）、（２）免疫療法効果を有するタンパク質又はポリペプチド（それらの例には、限定されるものではないが、細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（抗ＣＴＬＡ−４）、プログラム死受容体１（抗ＰＤ−１）及びプログラム死リガンド１（抗ＰＤＬ−１）に対する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる）（例えば、Nolan E, Savas P, Policheni AN, et al. Combined immune checkpoint blockade as a therapeutic strategy for BRCA1-mutated breast cancer [J]. Science Trans Med, 2017, 9: eaal 4922を参照；これは、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）、（３）腫瘍血管新生を阻害するタンパク質又はポリペプチド（それらの例には、限定されるものではないが、血管内皮成長因子（抗ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ由来ポリペプチド（例えば、Ｄ（ＬＰＲ）、ＫＳＶＲＧＫＧＫＧＱＫＲＫＲＫＫＳＲＹＫ等）及びＡＴＮ−１６１に対する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる）（例えば、Rosca EV, Koskimaki JE, Rivera CG, et al. Anti-angiogenic peptides for cancer therapeutics [J]. Curr Pharm Biotechnol, 2011, 12 (8): 1101-1116を参照；これは、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす）を含む抗新生物活性を有するタンパク質又はポリペプチドを指す。
【０１４０】
本明細書で使用される場合に、「ｓｃＦｖ」という用語は、重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、ＶＬとＶＨとがリンカーによって連結されている単一ポリペプチド鎖を指す（例えば、Bird et al., Science 242: 423-426 (1988)、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)、及びPluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, No. Volume 113, edited by Roseburg and Moore, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照）。そのようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨ又はＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨを有し得る。
【０１４１】
本明細書で使用される場合に、「同一性」という用語は、２つのポリペプチド間又は２つの核酸間の一致度を指す。比較される２つの配列が或る特定の部位に同じ単量体サブユニットの塩基又はアミノ酸を有する（例えば、２つのＤＮＡの各々が或る特定の部位にアデニンを有する、又は２つのタンパク質／ポリペプチドの各々が或る特定の部位にリジンを有する）場合に、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列間の同一性のパーセントは、比較される部位の総数に対する、２つの配列が共有する同一の部位の数に１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列の１０個の部位の６個が一致している場合に、これらの２つの配列は６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴとは、５０％の同一性を共有する（６個の部位の３個が一致している）。一般的に、２つの配列の比較は、最大の同一性が得られるように行われる。そのようなアラインメントは、例えばNeedlemanらの方法（J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970）に基づくＡｌｉｇｎプログラム（DNAstar, Inc.社）等のコンピュータープログラムを使用することにより実施することができる。２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers及びW. Millerのアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）を使用して、ＰＡＭ１２０残基重み付け表を使用して、１２のギャップ長ペナルティー及び４のギャップペナルティーで決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman及びWunschのアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）によって、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２行列又はＰＡＭ２５０行列のいずれかを使用して、１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ重み付け及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重み付けで決定することができる。
【０１４２】
本明細書で使用される場合に、「ベクター」という用語は、ポリヌクレオチドがその中に挿入され得る核酸の運搬体を指す。ベクターが、挿入されたポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質の発現を可能にする場合に、そのベクターは発現ベクターと呼ばれる。ベクターを形質転換、形質導入又はトランスフェクションによって宿主細胞へと導入することができるので、ベクターによって運ばれる遺伝物質エレメントは宿主細胞において発現され得る。ベクターは当業者によく知られており、限定されるものではないが、プラスミド、ファージミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）又はＰ１由来人工染色体（ＰＡＣ）等の人工染色体、λファージ又はＭ１３ファージ等のバクテリオファージ及び動物ウイルスが含まれる。ベクターとして使用され得る動物ウイルスには、限定されるものではないが、レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス）、ポックスウイルス、バキュロウイルス、パピローマウイルス及びパポバウイルス（例えば、ＳＶ４０）が含まれる。ベクターは、限定されるものではないが、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、選択用のエレメント及びレポーター遺伝子を含む発現を制御する様々なエレメントを含み得る。さらに、ベクターは複製開始部位を含み得る。
【０１４３】
本明細書で使用される場合に、「内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）」という用語は、５’キャップ構造を必要とせずに翻訳を開始することができるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列中に位置するヌクレオチド配列を指す。ＩＲＥＳは、通常は５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）内に位置しているが、ｍＲＮＡ内の別の場所に位置する場合もある。
【０１４４】
本明細書で使用される場合に、「ヒトライノウイルス２（ＨＲＶ２）」という用語は、ピコルナウイルス科のウイルスであって、そのゲノム配列又はｃＤＮＡ配列が当該技術分野においてよく知られており、様々な公的データベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋデータベース、アクセッション番号Ｘ０２３１６．１）に見出すことができるウイルスを指す。
【０１４５】
本明細書で使用される場合に、「ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列を含む核酸分子」又は「核酸分子がＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列を含む」という表現は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。すなわち、核酸分子がＤＮＡである場合に、その核酸分子は、ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のＤＮＡの形のゲノム配列を含み、核酸分子がＲＮＡである場合に、その核酸分子は、ＥＶ−Ｄ６８又はその改変形のゲノム配列を含む。
【０１４６】
本明細書で使用される場合に、「薬学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤」という用語は、被験体及び活性成分と薬理学的及び／又は生理学的に適合可能な担体及び／又は賦形剤を指し、その担体及び／又は賦形剤は、当該技術分野においてよく知られており（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照）、限定されるものではないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、イオン強度増強剤、浸透圧維持剤、吸収遅延剤、希釈剤、アジュバント、防腐剤、安定剤等が含まれる。例えば、ｐＨ調整剤には、限定されるものではないが、リン酸緩衝生理食塩水が含まれる。界面活性剤には、限定されるものではないが、カチオン界面活性剤、アニオン界面活性剤又は非イオン界面活性剤、例えばＴｗｅｅｎ−８０が含まれる。イオン強度増強剤には、限定されるものではないが、塩化ナトリウムが含まれる。浸透圧維持剤には、限定されるものではないが、糖、ＮａＣｌ等が含まれる。吸収遅延剤には、限定されるものではないが、モノステアレート及びゼラチンが含まれる。希釈剤には、限定されるものではないが、水、水性緩衝液（例えば、緩衝生理食塩水）、アルコール類及びポリオール類（例えば、グリセロール）等が含まれる。アジュバントには、限定されるものではないが、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、フロイント完全アジュバント）等が含まれる。防腐剤には、限定されるものではないが、様々な抗細菌剤及び抗真菌剤、例えば、チメロサール、２−フェノキシエタノール、パラベン類、トリクロロ−ｔ−ブタノール、フェノール、ソルビン酸等が含まれる。安定剤は、当業者により一般的に理解される意味を有し、薬物中の活性成分の所望の活性（例えば、腫瘍溶解活性）を安定化することができ、限定されるものではないが、グルタミン酸ナトリウム、ゼラチン、ＳＰＧＡ、糖類（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、ラクトース、デキストラン又はグルコース）、アミノ酸（例えば、グルタミン酸、グリシン）、タンパク質（例えば、乾燥ホエー、アルブミン又はカゼイン）又はそれらの分解産物（例えば、ラクトアルブミン加水分解物）が含まれる。
【０１４７】
本明細書で使用される場合に、「治療する」という用語は、疾患（例えば、腫瘍）の治療若しくは治癒、疾患（例えば、腫瘍）の症状の発症の遅延、及び／又は疾患（例えば、腫瘍）の進行の遅延を指す。
【０１４８】
本明細書で使用される場合に、「有効量」という用語は、意図される目的を有効的に達成することができる量を指す。例えば、治療的有効量は、疾患（例えば、腫瘍）を治療若しくは治癒する、疾患（例えば、腫瘍）の症状の発症を遅延させる、及び／又は疾患（例えば、腫瘍）の進行を遅延させるのに有効な又は十分な量であり得る。そのような有効量は、当業者又は医師によって容易に決定することができ、治療されるべき疾患の、意図される目的（例えば、治療）、一般的な健康状態、年齢、性別、被験者の体重、重症度、合併症、投与経路に関連し得る。そのような有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１４９】
本明細書で使用される場合に、「被験体」という用語は、哺乳動物、例えば霊長類哺乳動物、例えばヒトを指す。或る特定の実施の形態では、被験体（例えば、ヒト）は腫瘍を有する、又は腫瘍を有するリスクがある。
【０１５０】
本発明の有益な効果
従来技術と比較して、本発明の技術的解決策は少なくとも以下の有益な効果を有する。
【０１５１】
本出願の発明者らは、エンテロウイルスＤ６８（ＥＶ−Ｄ６８）が幅広いスペクトルの腫瘍死滅活性を有することを初めて見出した。この知見に基づき、本発明は、より幅広いスペクトルの腫瘍死滅活性及びより高い腫瘍特異性を有し、特に造血器悪性腫瘍（例えば、リンパ腫又は白血病）に対して非常に高い死滅効果も有するため、腫瘍の治療のために単独で使用することができ、また従来の腫瘍治療の補助的方法として又は他の治療方法なしでの治療として使用することもできる、ＥＶ−Ｄ６８ベースの腫瘍溶解性ウイルスを更に提供する。
【０１５２】
本発明のＥＶ−Ｄ６８又はその改変形は、正常細胞に対してほとんど又は全く効果を有さず、被験体（例えば、ヒト）においてウイルスに対する免疫原性応答を誘発しないため、被験体（例えば、ヒト）に安全に投与することができる。したがって、本発明のＥＶ−Ｄ６８又はその改変形は、大きな臨床的価値を有する。
【０１５３】
本発明の実施形態を以下で図面及び実施例を参照して詳細に説明するが、当業者であれば、以下の図面及び実施例は、本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を例示するためにのみ使用されることを理解するであろう。本発明の様々な対象及び有利な態様は、当業者には以下の図面の詳細な説明及び好ましい実施形態から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１５４】
【図１】実施例２におけるヒト臍静脈内皮細胞系統ＨＵＶＥＣ、ヒト食道癌細胞系統ＴＥ−１、ヒト甲状腺癌細胞系統ＳＷ−５７９及びＴＴに対する野生型ＥＶ−Ｄ６８のｉｎ  ｖｉｔｒｏ死滅試験の顕微鏡写真を示す図であり、ここで、ＭＯＣＫは、ウイルスに感染していない細胞を表す。これらの結果は、ＥＶ−Ｄ６８が、感染多重度（ＭＯＩ）１０で感染の７２時間後にヒト腫瘍細胞系統ＴＥ−１、ＳＷ−５７９及びＴＴに対して顕著な腫瘍溶解性効果を有するが、ヒト正常細胞のＨＵＶＥＣに対しては効果を有しないことを示した。
【図２】実施例２におけるヒト肝臓癌細胞系統ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ７７２１、ＢＥＬ７４０４、ＢＥＬ７４０２及びＨｕｈ７、ヒト子宮頸癌細胞系統Ｈｅｌａ及びＣａｓｋｉ、ヒト肺癌細胞系統ＮＣＩ−Ｈ１２９９及びＡ５４９、ヒト包皮線維芽細胞系統ＨＦＦ−１、ヒト胎児腎臓細胞系統ＨＥＫ−２９３、並びに分化したヒト肝前駆細胞系統ＨｅｐａＲＧに対する野生型ＥＶ−Ｄ６８のｉｎ  ｖｉｔｒｏ死滅試験のクリスタルバイオレット染色の写真を示す図であり、ここで、ＭＯＣＫは、ウイルスに感染していない細胞を表す。これらの結果は、ＥＶ−Ｄ６８が１０、１及び０．１のＭＯＩでの感染の７２時間後にヒト腫瘍細胞系統ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ７７２１、ＢＥＬ７４０４、ＢＥＬ７４０２、Ｈｕｈ７、Ｈｅｌａ、Ｃａｓｋｉ、ＮＣＩ−Ｈ１２９９及びＡ５４９に対して顕著な腫瘍溶解効果を有するが、ＨＦＦ−１、ＨＥＫ−２９３及びヒト正常細胞の分化したＨｅｐａＲＧに対しては限定的な効果しか有しないことを示した。
【図３】実施例２におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法により得られた同じバッチの野生型ＥＶ−Ｄ６８ウイルスゲノムＲＮＡの４つの試料の電気泳動画像を示す図である。
【図４】実施例２におけるヒト子宮頸癌腫瘍細胞系統Ｈｅｌａに対する野生型ＥＶ−Ｄ６８ウイルスゲノムＲＮＡの死滅効果を示す図である。これらの結果は、Ｈｅｌａ細胞がＥＶＡ−Ｄ６８ゲノムＲＮＡでのトランスフェクションの２４時間後に明らかなＣＰＥを示し、４８時間までにほとんど全てが溶解されて死に至ることを示した。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃは、実施例３におけるヒト子宮頸癌細胞系統Ｈｅｌａ（Ａ）、ヒト神経膠腫細胞系統Ｕ１１８−ＭＧ（Ｂ）及びヒトリンパ腫細胞系統Ｒａｊｉ（Ｃ）に対する野生型ＥＶ−Ｄ６８のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍実験の結果を示す図である。これらの結果は、チャレンジ実験群では、腫瘍量当たり１０６のＴＣＩＤ５０のＥＶ−Ｄ６８が、３日毎に腫瘍内注射されることを示した。合計５回の処理後に、ＳＣＩＤマウスにおけるＨｅｌａ細胞、Ｕ１１８−ＭＧ細胞又はＲａｊｉ細胞の皮下接種によって形成された腫瘍の成長は大幅に遅くなって停止し、腫瘍は更には溶解されて消失した。それに対して、腫瘍溶解性ウイルスの処理をしていないネガティブ群（ＣＴＲＬ）の腫瘍は通常の成長を維持し、その腫瘍体積はチャレンジ群の腫瘍よりも有意に大きかった。
【図６Ａ】実施例４におけるＢＡＬＢ／ｃマウスでのＥＶ−Ｄ６８−ＷＴの毒性検出の結果を示す図である。図６Ａは、腹腔内注射による種々の用量（１０３、１０４、１０５、１０６及び１０７のＴＣＩＤ５０／マウス）でのＥＶ−Ｄ６８によるチャレンジ後の１日齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率及び健康スコアを示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、腹腔内注射により非常に高い用量（１０７のＴＣＩＤ５０／マウス）でチャレンジされた種々の齢（１日齢、２日齢、３日齢、７日齢及び１４日齢）のＢＡＬＢ／ｃマウスの生存率及び健康スコアを示す。ＥＶ−Ｄ６８のＢＡＬＢ／ｃマウスに対する全体的な毒性は比較的弱く、高用量により１日齢〜３日齢のＢＡＬＢ／ｃマウスのみの死を招いたが、４日齢以上のＢＡＬＢ／ｃマウスに対しては影響がなかったことから、ＥＶ−Ｄ６８がｉｎ  ｖｉｖｏで良好な安全性を有することを指摘している。
【発明を実施するための形態】
【０１５５】
配列情報
本発明に関係する配列の一部の情報を以下の表１に示す。
【０１５６】
【表１】
2020528890.tif 000003
【０１５７】
本発明を実施するための具体的なモデル
ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらの実施例は、本発明を例示することを意図するものである（本発明を限定することを意図するものではない）。
【０１５８】
特段の指示がない限り、本発明で使用される分子生物学実験方法及びイムノアッセイは、実質的にJ. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989及びF. M. Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995に記載される方法を参照することにより実施され、制限酵素は、製品の製造業者により推奨される条件下で使用した。実施例に具体的な条件が示されていない場合には、従来の条件又は製造業者により推奨される条件を使用した。使用される試薬又は機器が製造業者により特定されていない場合に、それらは全て市販される慣用の製品であった。当業者は、実施例が本発明を例として説明し、本発明によって請求される保護範囲を限定することを意図しないことを理解するであろう。本明細書で挙げられる全ての刊行物及び他の参考文献は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【実施例】
【０１５９】
実施例１：ＥＶ−Ｄ６８及びその改変形の取得及び準備
１．１  患者の臨床試料からのエンテロウイルスＥＶ−Ｄ６８の分離
（１）患者の咽頭スワブは、中国廈門市の疾病管理予防センター（Center for Disease Control and Prevention）から得られ、アフリカミドリザル腎臓細胞（Ｖｅｒｏ細胞；ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−８１（商標））は、中国国立感染病診断ワクチン開発研究所（National Institute of Diagnostics and Vaccine Development in Infectious Diseases）（廈門大学、中国）によって維持され、１０％ウシ胎児血清と、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンとを含有するＭＥＭ培地中で培養された。
【０１６０】
（２）試料処理：患者の咽頭スワブを、試料保存溶液中で十分に撹拌して、スワブに付着したウイルス及びウイルス含有細胞を洗い流した後に、試料保存溶液を４０００ｒｐｍ及び４℃で３０分間にわたり高速遠心分離にかけた。
【０１６１】
（３）接種及び観察：
Ａ）Ｖｅｒｏ細胞を、２４ウェルプレートに１×１０５細胞／ウェルで播種した。成長培地（１０％ウシ胎児血清と、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンとを含有するＭＥＭ培地）を吸引し、１ｍＬの維持培地（２％ウシ胎児血清と、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンとを含有するＭＥＭ培地）を各ウェル中に加えた。次いで、ネガティブコントロールウェルを除き、各ウェルに５０μＬの試料上清を接種し、各ウェルをインキュベーターにおいて３７℃、５％ＣＯ２で培養した。
【０１６２】
Ｂ）細胞を顕微鏡下で１週間にわたり毎日観察し、接種されたウェルにおける特異的な細胞変性効果（ＣＰＥ）の発生を記録した。
【０１６３】
Ｃ）接種されたウェル中の細胞にエンテロウイルス特異的な細胞変性効果が７日以内に現れたら、細胞及び上清を回収して−８０℃で凍結させた。ＣＰＥが７日後に現れなかったら、それらの細胞を盲継代した。
【０１６４】
Ｄ）ＣＰＥが６回の盲継代の間に現れたら、細胞及び上清を回収して−８０℃で凍結させた。６回の盲継代後にＣＰＥが現れなかったら、それらの細胞は陰性と決定した。
【０１６５】
（４）ウイルスの分離及びクローニング
ＲＴ−ＰＣＲ（Piralla et al., J Clin Microbiol 2015, 53 (5): 1725-1726）及び特定の抗体に基づく酵素結合免疫スポット法（Yang et al., Clin Vaccine Immunol 2014, 21 (3): 312 -320、Hou et al., J Virol Methods 2015, 215-216: 56-60）を使用して、臨床試料から分離されたウイルスを特定し、ＥＶ−Ｄ６８陽性培養物を選択して、少なくとも３回のクローニング実験を行った。各実験で限界希釈法によって得られたウイルスクローンもまた、ＲＴ−ＰＣＲ及びＥＬＩＳＰＯＴによって特定し、ＥＶ−Ｄ６８陽性クローンを後続回のクローニングのために選択した。増殖生存性の強い単一のＥＶ−Ｄ６８株を、腫瘍溶解性ウイルスの候補株として選択した。
【０１６６】
１．２  感染性クローニング及び逆遺伝学技術により得られたエンテロウイルスＥＶ−Ｄ６８及びその改変形のレスキュー株
この実施例は、逆遺伝学技術により本発明のためのＥＶ−Ｄ６８及びその改変形をどのようにして得るかを示すために、一例として野生型ＥＶ−Ｄ６８（配列番号１）を使用した。具体的な方法は以下の通りである。
【０１６７】
（１）ウイルス感染性クローンの構築：野生型エンテロウイルスＥＶ−Ｄ６８（ＥＶ−Ｄ６８−ＷＴと呼称される）のｃＤＮＡ配列は配列番号１に示されており、そのゲノムＲＮＡ配列は配列番号１２であり、又はエンテロウイルスＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ（配列番号１）に基づく遺伝子挿入若しくは置換を行った。以下の改変形が含まれる。
【０１６８】
改変形１：野生型ＥＶ−Ｄ６８の内部リボソーム進入部位配列をヒトライノウイルス２の内部リボソーム進入部位配列（配列番号２０に示されるＤＮＡ配列を有する）に置き換えることで、配列番号１３として示されるゲノムＲＮＡ配列を有する組み換えウイルス（ＥＶ−Ｄ６８−ＨＲＶ２と呼称される）のｃＤＮＡ（配列番号８）を得た。
【０１６９】
改変形２：ｍｉＲ−１３３標的配列（配列番号１７に示されるＤＮＡ配列を有する）及びｍｉＲ−２０６標的配列（配列番号１８に示されるＤＮＡ配列を有する）のタンデム配列（配列番号１９に示されるＤＮＡ配列を有する）を野生型ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ（配列番号１）の３’非翻訳領域の７２９３ｂｐから７２９４ｂｐの間に挿入することで、配列番号１４として示されるゲノムＲＮＡ配列を有する組み換えウイルス（ＥＶ−Ｄ６８−ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔと呼称される）のｃＤＮＡ（配列番号９）を得た。
【０１７０】
改変形３：ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）遺伝子（配列番号６）を野生型ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ（配列番号１）のＶＰ１遺伝子と２Ａ遺伝子との間に挿入することで、配列番号１５として示されるゲノムＲＮＡ配列を有する組み換えウイルス（ＥＶ−Ｄ６８−ＧＭ−ＣＳＦと呼称される）のｃＤＮＡ（配列番号１０）を得た。
【０１７１】
改変形４：ヒトプログラム死受容体１に対する一本鎖抗体（Ａｎｔｉ−ＰＤ−１  ｓｃＦｖ）をコードする配列（配列番号７）を野生型ＥＶ−Ｄ６８のｃＤＮＡ（配列番号１）のＶＰ１遺伝子と２Ａ遺伝子との間に挿入することで、配列番号１６として示されるゲノムＲＮＡ配列を有する組み換えウイルス（ＥＶ−Ｄ６８−Ａｎｔｉ−ＰＤ−１と呼称される）のｃＤＮＡ（配列番号１１）を得た。
【０１７２】
次いで、上記５つの腫瘍溶解性ウイルスのｃＤＮＡ配列（配列番号１、配列番号８〜配列番号１１）を、全遺伝子合成のために遺伝子合成会社（Shanghai Biotech Engineering Co., Ltd.社）に送り、ｐＳＶＡプラスミド（Hou et al. Virus Res 2015, 205: 41-44、Yang et al., Virus Res 2015, 210: 165-168）へとライゲーションすることで、エンテロウイルスＥＶ−Ｄ６８又はその改変形（すなわち、ＥＶ−Ｄ６８−ＷＴ、ＥＶ−Ｄ６８−ＨＲＶ２、ＥＶ−Ｄ６８−ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＥＶ−Ｄ６８−ＧＭ−ＣＳＦ及びＥＶ−Ｄ６８−Ａｎｔｉ−ＰＤ−１）の感染性クローニングプラスミドを得た。
【０１７３】
（２）プラスミドミニキット及び大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞は、Beijing Tiangen Biochemical Technology Co., Ltd.社から購入し、Ｈｅｌａ細胞（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−２（商標））及びヒト横紋筋肉腫細胞（ＲＤ細胞；ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−１３６（商標））は、中国国立感染病診断ワクチン開発研究所（廈門大学、中国）によって維持され、それぞれ１０％ウシ胎児血清並びにグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンが添加されたＤＭＥＭ培地及びＭＥＭ培地を用いて培養され、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆａｃｔａｍｉｎｅ２０００及びＯｐｔｉ−ＭＥＭは、Thermo Fisher Scientific Company社から購入した。
【０１７４】
（３）上記５つの腫瘍溶解性ウイルスのｃＤＮＡ配列を含む感染性クローニングプラスミドを、大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞へと形質転換し、単クローン株をクローンの成長後に採取して振盪し、プラスミドミニキットを使用してそれらのプラスミドを抽出した後に、シーケンシング分析のために会社（Shanghai Biotech Engineering Co., Ltd.社）に送った。
【０１７５】
（４）正しい配列を有する感染性クローニングプラスミドとヘルパープラスミドｐＡＲ３１２６とを細胞へと同時トランスフェクションさせることで、ウイルスをレスキューした（Hou et al. Virus Res 2015, 205: 41-44、Yang et al. Virus Res 2015, 210: 165-168）。Ｈｅｌａ細胞をまずはトランスフェクション試薬の使用説明書に従ってトランスフェクションさせた後に、顕微鏡下で観察した。Ｈｅｌａ細胞においてＣＰＥが現れたら、細胞及び培養上清を採取し、ＲＤ細胞を接種した後に継代培養することにより、腫瘍溶解性ウイルスの候補株を得た。
【０１７６】
実施例２：ＥＶ−Ｄ６８及びその改変形のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍実験
２．１  使用されるウイルス及び細胞系統
（１）ウイルス：この実施例は、実施例１に示されるＥＶ−Ｄ６８−ＷＴ（配列番号１２）、ＥＶ−Ｄ６８−ＨＲＶ２（配列番号１３）、ＥＶ−Ｄ６８−ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ（配列番号１４）、ＥＶ−Ｄ６８−ＧＭ−ＣＳＦ（配列番号１５）及びＥＶ−Ｄ６８−Ａｎｔｉ−ＰＤ−１（配列番号１６）を使用した。
【０１７７】
（２）細胞系統：ヒト横紋筋肉腫細胞ＲＤ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−１３６（商標））；ヒト子宮頸癌細胞系統Ｈｅｌａ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−２（商標））、ＳｉＨａ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−３５（商標））、Ｃａｓｋｉ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−１５５０（商標））及びＣ−３３Ａ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−３１（商標））；ヒト卵巣癌細胞系統ＳＫＯＶ−３／ＴＲ（ＳＫＯＶ−３の薬剤耐性株）、ＳＫＯＶ−３（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−７７（商標））及びＣａｏｖ３（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−７５（商標））；ヒト子宮内膜癌細胞系統Ｈｅｃ−１−Ａ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−１１２（商標））、Ｈｅｃ−１−Ｂ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−１１３（商標））及びＩｓｈｉｋａｗａ（ＥＣＡＣＣ番号９９０４０２０１）；ヒト肺癌細胞系統ＳＰＣ−Ａ−１（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ０５０）、ＮＣＩ−Ｈ１２９９（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−５８０３（商標））、ＮＣＩ−Ｈ１４１７（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−５８６９（商標））、ＮＣＩ−Ｈ１７０３（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−５８８９（商標））、ＮＣＩ−Ｈ１９７５（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−５９０８（商標））、Ａ５４９（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−１８５（商標））、ＮＣＩ−Ｈ６６１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−１８３（商標））、ＥＢＣ−１（Thermo Fisher Scientific社、カタログ番号：１１８７５１０１）及びＤＭＳ１１４（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−２０６６（商標））；ヒト肝臓癌細胞系統ＭＨＣＣ９７Ｈ（復旦大学の肝臓癌研究所（Institute of Liver Cancer）から購入）、Ｃ３Ａ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−１０７４１（商標））、Ｈｅｐ３Ｂ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＢ−８０６４（商標））、ＨｅｐＧ２（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＢ−８０６５（商標））、ＳＭＭＣ７７２１（中国医学科学院基礎医学研究所基礎医学細胞センター（Basic Medical Cell Center of the Institute of Basic Medical Sciences, Chinese Academy of Medical Sciences）から購入、番号：３１１１Ｃ０００１ＣＣＣ００００８７）、ＢＥＬ７４０２（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ０３５）、ＢＥＬ７４０４（中国科学院上海生物科学研究所細胞資源センター（Cell Resource Center, Shanghai Institutes of Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences）から購入、番号：３１３１Ｃ０００１０００７０００６４）、Ｈｕｈ７（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ１３４）、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−８０２４（商標））及びＳＫ−Ｈｅｐ−１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−５２（商標））；ヒト腎臓癌細胞系統Ａ−４９８（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−４４（商標））、７８６−Ｏ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−１９３２（商標））及びＣａｋｉ−１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−４６（商標））；ヒト神経芽腫細胞系統ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−２２６６（商標））及びＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−２２７１（商標））；ヒト神経膠腫細胞系統Ｕ８７−ＭＧ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−１４（商標））及びＵ１１８−ＭＧ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−１５（商標））；ヒト乳癌細��系統ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−２２（商標））、ＢｃａＰ３７（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ２０６）、ＢＴ−４７４（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−２０（商標））、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＭ−ＨＴＢ−２６（商標））及びＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−１３１（商標））；ヒト黒色腫細胞系統Ａ−３７５（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−１６１９（商標））、ＳＫ−ＭＥＬ−１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−６７（商標））及びＭｅＷｏ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−６５（商標））；ヒト前立腺癌細胞系統ＰＣ−３（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−１４３５（商標））、ＬＮＣａｐ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−１７４０（商標））及びＤＵ１４５（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−８１（商標））；ヒト膀胱癌細胞系統Ｊ８２（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−１（商標））及び５６３７（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−９（商標））；ヒト膵臓癌細胞系統Ｃａｐａｎ−２（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−８０（商標））、ＨＰＡＦ−２（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−１９９７（商標））及びＰＡＮＣ−１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−１４６９（商標））；ヒト胃癌細胞系統ＡＧＳ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−１７３９（商標））、ＳＧＣ７９０１（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ１５０）、ＢＧＣ８２３（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ１５１）及びＮＣＩ−Ｎ８７（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−５８２２（商標））；ヒト結腸直腸癌細胞系統ＤＬＤ−１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−２２１（商標））、ＳＷ１１１６（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−２３３（商標））、ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−２２８（商標））、ＨＣＴ−１１６（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−２４７（商標））及びＨＴ−２９（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−３８（商標））；ヒト食道癌細胞系統ＴＥ−１（中国科学院上海生物科学研究所細胞資源センターから購入、番号３１３１Ｃ０００１０００７０００８９）；ヒト甲状腺癌ＳＷ−５７９（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−１０７（商標））及びＴＴ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−１８０３（商標））；ヒト喉頭癌Ｈｅｐ−２（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−２３（商標））；骨肉腫１４３Ｂ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−８３０３（商標））及びＵ２ＯＳ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−９６（商標））；ヒトリンパ腫及び白血病細胞系統Ｋ５６２（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−２４３（商標））、Ｕ９３７（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−１５９３．２（商標））、ＴＨＰ−１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＴＩＢ−２０２（商標））、Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−８６（商標））、Ｄａｕｄｉ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−２１３（商標））、Ｊｕｒｋａｔ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＴＩＢ−１５２（商標））及びＭＴ−４（米国国立衛生研究所から入手）。ヒト正常細胞系統には、ヒト胎児肺線維芽細胞系統ＭＲＣ−５（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−１７１（商標））、ヒト胎児腎臓細胞系統ＨＥＫ−２９３（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−１５７３（商標））、ヒト包皮線維芽細胞系統��ＦＦ−１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＳＣＲＣ−１０４１（商標））、ヒト皮膚ケラチノサイト細胞系統ＨａＣａｔ（ＣＣＴＣＣ寄託番号：ＧＤＣ１０６）、ヒト前立腺間質細胞系統ＷＰＭＹ−１（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＲＬ−２８５４（商標））、ヒト臍静脈内皮細胞系統ＨＵＶＥＣ（Thermo Fisher Scientific社、カタログ番号：Ｃ０１５１０Ｃ）及び分化したヒト肝前駆細胞系統ＨｅｐａＲＧ（初代肝細胞の特徴を有する；Thermo Fisher Scientific社、カタログ番号：ＨＰＲＧＣ１０）が含まれる。上記の細胞は、中国国立感染病診断ワクチン開発研究所（廈門大学、中国）によって維持された。ＨｅｐａＲＧ細胞は、ＷＭＥ培地（１．５％ＤＭＳＯを添加）中で培養され、ＡＧＳ及びＴＴはＦ−１２Ｋ培地を用いて培養され、ＳＷ−５７９はＬ−１５培地を用いて培養され、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ及びＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）はＤＭＥＭ：Ｆ１２（１：１）培地を用いて培養され、ＲＤ、Ｃ−３３Ａ、ＥＢＣ−１、Ｊ８２、ＳＫ−Ｈｅｐ−１、ＳＫ−ＭＥＬ−１及びＤＵ１４５はＭＥＭ培地を用いて培養され、Ｋ５６２、Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、Ｒａｊｉ、Ｄａｕｄｉ、Ｊｕｒｋａｔ、ＭＴ−４、５６３７、７８６−Ｏ、ＴＥ−１、Ｃａｓｋｉ、ＮＣＩ−Ｈ１４１７、ＮＣＩ−Ｈ１７０３、ＮＣＩ−Ｈ１９７５、ＮＣＩ−Ｈ６６１、ＳＧＣ７９０１、ＢＧＣ８２３、ＤＬＤ−１、ＳＷ１１１６、Ｈｅｐ−２及びＬＮＣａｐはＲＰＭＩ−１６４０培地を用いて培養され、その他の細胞はＤＭＥＭ培地を用いて培養された。上記の全ての培地には、１０％ウシ胎児血清、グルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシンを補充した。上記の全ての細胞は３７℃及び５％ＣＯ２の標準条件下で培養した。
【０１７８】
２．２  ウイルス培養
ＲＤ細胞を１０ｃｍの細胞培養プレート上に均等に播種した。培養条件は１０％ウシ胎児血清とグルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンとを含有するＭＥＭ培地、３７℃、５％のＣＯ２、並びに飽和湿度を含むものであった。細胞コンフルエンスが９０％以上に達したら、細胞培養培地を無血清ＭＥＭ培地と交換し、各プレートに１０７のＴＣＩＤ５０のＥＶ−Ｄ６８−ＷＴ、ＥＶ−Ｄ６８−ＨＲＶ２、ＥＶ−Ｄ６８−ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＥＶ−Ｄ６８−ＧＭ−ＣＳＦ又はＥＶ−Ｄ６８−Ａｎｔｉ−ＰＤ−１を接種し、培養環境を３３℃、５％のＣＯ２、飽和湿度に変更した。２４時間後にＥＶ−Ｄ６８又はその改変形はＲＤ細胞内で増殖し、細胞内でＣＰＥを生じた。９０％を超える細胞が収縮して丸くなり、粒状性の増加を示し、剥離して溶解されたら、細胞及びその培養上清を採取した。３回のサイクルの凍結融解後に、培養上清を回収して遠心分離をすることで、細胞片を除去した。その際、遠心分離条件は４０００ｒｐｍ、１０分、４℃であった。最後に上清を０．２２μｍの使い捨てフィルター（Millipore社）で濾過して、細胞片等の不純物を除去した。
【０１７９】
２．３  ウイルス力価の決定
ＲＤ細胞を、９６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルの細胞密度で播種した。細胞が接着した後に、実施例２．２で得られたウイルス溶液を、最初の１０倍希釈から無血清ＭＥＭ培地で１０倍希釈した。５０μｌのウイルスの希釈液を細胞が入ったウェルに加えた。７日後に、ＣＰＥが現れたウェルを観察して記録し、引き続きKarber法を使用して計算した。ここで、計算式は、ｌｇＴＣＩＤ５０＝Ｌ−Ｄ（Ｓ−０．５）
（式中、Ｌ：最高希釈の対数、Ｄ：希釈の対数間の差、Ｓ：陽性のウェルの割合の合計）であった。このように計算されたＴＣＩＤ５０の単位はＴＣＩＤ５０／５０μｌであり、これはＴＣＩＤ５０／ｍｌに変換されるべきである。
【０１８０】
２．４  ウイルスのｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍実験
ヒト腫瘍細胞及び正常細胞を９６ウェルプレートへと１０４細胞／ウェルで接種した。細胞が接着した後に、各ウェル中の培地を対応する無血清の細胞培養培地と置き換え、ウイルスを０．１、１、１０又は１００のＭＯＩで接種した。引き続き、細胞のＣＰＥを顕微鏡により毎日観察した。
【０１８１】
図１は、ウイルスに感染させていない（ネガティブコントロール群、Ｍｏｃｋ）又はＭＯＩ＝１０でＥＶ−Ｄ６８−ＷＴにより７２時間処理されたヒト臍静脈内皮細胞系統ＨＵＶＥＣ、ヒト食道癌細胞系統ＴＥ−１並びにヒト甲状腺癌細胞系統ＳＷ−５７９及びＴＴの顕微鏡写真を示す。これらの結果は、感染多重度（ＭＯＩ）１０での感染の７２時間後に、ウイルス感染群において腫瘍細胞数の大幅な減少、顕著な収縮及び溶解等が検出されるが、Ｍｏｃｋ群の非腫瘍細胞と比較すると、ウイルスに感染した非腫瘍細胞は細胞形態にほとんど変化を示さないことを示した。上記結果により、ＥＶ−Ｄ６８がヒト腫瘍細胞系統ＴＥ−１、ＳＷ−５７９及びＴＴに対して大きな腫瘍溶解効果を示すが、非腫瘍細胞ＨＵＶＥＣに対しては一切効果を有しないことが裏付けられた。
【０１８２】
ウイルス感染及び培養の７２時間後に、Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  Ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８キット；Shanghai Biyuntian Biotechnology Co., Ltd.社）及びクリスタルバイオレット染色法（接着細胞についてのみ）を使用して、細胞生存率を検出した。その具体的な方法は以下の通りであった。
【０１８３】
（１）ＣＣＫ８法により検出された細胞生存率
接着細胞については、９６ウェル細胞培養プレート中の元の培地を直接廃棄し、懸濁細胞については、９６ウェル細胞培養プレートの元の培地は遠心分離後に慎重に廃棄し、その後に、ウェル毎に１００μｌの新鮮な無血清培地を加えた。１０μｌのＣＣＫ−８溶液を、細胞が接種された各ウェルに添加し、また等量のＣＣＫ−８溶液をネガティブコントロールとしてブランク培養培地に添加し、引き続き細胞培養インキュベーター中、３７℃で０．５時間〜３時間インキュベートした。吸光度を、マイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍで、それぞれ０．５時間、１時間、２時間、３時間で検出し、吸光度が適切な範囲内であった時点を細胞生存率のための参照として選択した。各種類の細胞についてのＥＶ−Ｄ６８−ＷＴのＣＣＫ−８試験結果を表２に示した。ここで、「−」は、ウイルス処理後の細胞生存率がＭＯＣＫ群の細胞生存率と有意に異ならないことを示し、「＋」は、ウイルス処理後に、細胞数が減少し、生存率が依然として５０％を超えているが、ＭＯＣＫ群の生存率とは有意に異なることを示し、「＋＋」は、ウイルス処理後の細胞生存率が５０％未満であり、ＭＯＣＫ群の細胞生存率とは有意に異なることを示した。
【０１８４】
細胞生存率の計算は、
細胞生存率（％）＝（試験群の読取値−ネガティブ群の読取値）／（ポジティブ群の読取値−ネガティブ群の読取値）×１００％
であった。
【０１８５】
（２）クリスタルバイオレット染色法により検出された細胞生存率（接着細胞についてのみ）
細胞にウイルスを３日間にわたり感染させた後に、９６ウェル細胞培養プレート中の培養上清を廃棄し、各ウェルに１００μｌのメタノールを加え、その後に１５分間暗所で固定した。クリスタルバイオレット粉末（Shanghai Biotech Biotechnology Co., Ltd.社）を秤量し、２％（重量／容量）のクリスタルバイオレットのメタノール溶液として調合し、それを４℃で貯蔵した。適切な量の２％のクリスタルバイオレットのメタノール溶液を取り、ＰＢＳ溶液を用いて調合して、０．２％のクリスタルバイオレット作業溶液を調製した。１５分間固定した後に、９６ウェル細胞培養プレート中のメタノール固定溶液を廃棄し、そのプレートに１００μｌのクリスタルバイオレット作業溶液を加え、３０分間染色を行った。クリスタルバイオレット染色溶液を廃棄した後に、ＰＢＳ溶液を使用して過剰な染色溶液を洗い流すまで３回〜５回洗浄し、風乾を行った。ＩｍｍｕｎＳｐｏｔ＠Ｓ５  ＵＶ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Cellular Technology Limited社、米国）を使用して写真を撮影した。図２に、コントロール群（ＭＯＣＫ）及び実験群（７２時間にわたりそれぞれ０．１、１及び１０のＭＯＩでＥＶ−Ｄ６８−ＷＴに感染させた）におけるヒト肝臓癌細胞系統ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ７７２１、ＢＥＬ７４０４、ＢＥＬ７４０２及びＨｕｈ７、ヒト子宮頸癌細胞系統Ｈｅｌａ及びＣａｓｋｉ、ヒト肺癌細胞系統ＮＣＩ−Ｈ１２９９及びＡ５４９、ヒト包皮線維芽細胞系統ＨＦＦ−１、ヒト胎児腎臓細胞系統ＨＥＫ−２９３、並びに分化したヒト肝前駆細胞系統ＨｅｐａＲＧのクリスタルバイオレット染色結果を示した。結果に示されるように、１０、１及び０．１のＭＯＩでの感染の７２時間後に、ウイルスを加えていないコントロール群（ＭＯＣＫ）と比較して、実験群における腫瘍細胞は有意に減少したが、非腫瘍細胞の数は有意な変化を示さなかった。上記結果は、ＥＶ−Ｄ６８−ＷＴがヒト腫瘍細胞系統ＨｅｐＧ２、ＳＭＭＣ７７２１、ＢＥＬ７４０４、ＢＥＬ７４０２、Ｈｕｈ７、Ｈｅｌａ、Ｃａｓｋｉ、ＮＣＩ−Ｈ１２９９及びＡ５４９に対して有意な腫瘍溶解効果を有するが、非腫瘍細胞系統ＨＦＦ−１、ＨＥＫ−２９３及び分化したＨｅｐａＲＧに対しては有意な効果を有しないことを示した。
【０１８６】
【表２Ａ】
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【表２Ｂ】
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【表２Ｃ】
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表２：野生型エンテロウイルスＥＶ−Ｄ６８のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍実験の結果
備考：「−」は、ウイルス処理群とＭＯＣＫ群との間の細胞生存率に有意差がないことを示し、「＋」は、ウイルス処理後に、細胞数が減少し、生存率が５０％を超えているが、ＭＯＣＫ群の生存率とは有意に異なることを示し、「＋＋」は、ウイルス処理後の細胞生存率が５０％未満であり、ＭＯＣＫ群の細胞生存率とは有意に異なることを示した。
【０１８７】
表２から、野生型エンテロウイルスＥＶ−Ｄ６８が、試験された腫瘍細胞に対して死滅効果を有し、したがって幅広いスペクトルの抗腫瘍活性を有することが分かった。特に、このウイルスは、肝臓癌細胞系統、神経膠腫細胞系統、前立腺癌細胞系統、白血病及びリンパ腫細胞系統に対して有意な死滅効果を有した。他方で、このウイルスは、試験された非腫瘍細胞系統にほとんど又は全く毒性を有しないが、ただし、より高いＭＯＩでヒト胎児肺線維芽細胞ＭＲＣ−５に対して有意に毒性であった。
【０１８８】
さらに、ＥＶ−Ｄ６８−ＨＲＶ２、ＥＶ−Ｄ６８−ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＥＶ−Ｄ６８−ＧＭ−ＣＳＦ及びＥＶ−Ｄ６８−Ａｎｔｉ−ＰＤ−１のｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍実験により、４種の改変ＥＶ−Ｄ６８は、試験された腫瘍細胞に対する野生型エンテロウイルスＥＶ−Ｄ６８の幅広いスペクトルの死滅効果を保持し、ヒト肝細胞癌細胞系統、前立腺癌細胞系統、白血病及びリンパ腫細胞系統の試験された腫瘍細胞に対して有意な死滅効果を実質的に保持することが示された。ここで、子宮頸癌細胞系統Ｈｅｌａ、神経膠腫細胞系統Ｕ１１８−ＭＧ、肝臓癌細胞系統Ｈｕｈ７、前立腺癌細胞系統ＰＣ−３及びリンパ腫細胞系統Ｒａｊｉに対する４種の改変ＥＶ−Ｄ６８の腫瘍溶解効果のＣＣＫ−８試験結果を表３に示した。
【０１８９】
【表３】
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備考：「−」は、ウイルス処理群とＭＯＣＫ群との間の細胞生存率に有意差がないことを示し、「＋」は、ウイルス処理後に、細胞数が減少し、生存率が５０％を超えているが、ＭＯＣＫ群の生存率とは有意に異なることを示し、「＋＋」は、ウイルス処理後の細胞生存率が５０％未満であり、ＭＯＣＫ群の細胞生存率とは有意に異なることを示した。
【０１９０】
さらに、本発明者らは、予想外にも、ＥＶ−Ｄ６８−ＨＲＶ２がＥＶ−Ｄ６８−ＷＴと比較して幾つかの腫瘍に対して有意に改善された死滅活性を示すことを見出した。ここで、ヒト胃癌細胞系統ＡＧＳ、ヒト子宮内膜癌細胞系統ＨＥＣ−１−Ａ及びＩｓｈｉｋａｗａ、ヒト子宮頸癌細胞系統Ｃ−３３Ａ並びにヒト甲状腺癌細胞系統ＳＷ５７９の腫瘍溶解活性のＣＣＫ−８試験結果を表４に示した。
【０１９１】
【表４】
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備考：「−」は、ウイルス処理群とＭＯＣＫ群との間の細胞生存率に有意差がないことを示し、「＋」は、ウイルス処理後に、細胞数が減少し、生存率が５０％を超えているが、ＭＯＣＫ群の生存率とは有意に異なることを示し、「＋＋」は、ウイルス処理後の細胞生存率が５０％未満であり、ＭＯＣＫ群の細胞生存率とは有意に異なることを示した。
【０１９２】
２．５  馴化のためのＥＶ−Ｄ６８の連続継代
この実施例では、或る特定の種類の腫瘍細胞における馴化のためにＥＶ−Ｄ６８を連続継代することで、腫瘍細胞に対する死滅活性が高められたウイルス株を得た。
【０１９３】
野生型エンテロウイルスＥＶ−Ｄ６８を、ＥＶ−Ｄ６８の腫瘍溶解効果があまり大きくなかったヒト子宮頸癌細胞系統ＳｉＨａ、ヒト卵巣癌細胞系統ＳＫＯＶ−３、ヒト肝臓癌細胞系統ＳＫ−ｈｅｐ−１、ヒト膵臓癌細胞系統Ｃａｐａｎ−２、ヒト胃癌細胞系統ＡＧＳ又はヒト結腸直腸癌細胞系統ＨＣＴ−１１６における馴化のために連続継代した。具体的な方法は、以下の通りであった。
【０１９４】
上記腫瘍細胞の１種類を１０ｃｍの細胞培養プレート上に均等に播種した。培養条件は１０％ウシ胎児血清と、グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシンとを含有する対応する細胞培養培地、３７℃、５％のＣＯ２、並びに飽和湿度を含むものであった。細胞コンフルエンスが９０％以上に達したら、細胞培養培地を無血清細胞培養培地と置き換え、各プレートに１０７のＴＣＩＤ５０のＥＶ−Ｄ６８を接種し、培養環境を３３℃、５％のＣＯ２、飽和湿度に変更した。ＥＶ−Ｄ６８が腫瘍細胞内で増殖し、細胞内にＣＰＥが引き起こされたら（最長３日間の感染後）、細胞及びそれらの培養上清を採取した。３回のサイクルの凍結融解後に、遠心分離を４℃、４０００ｒｐｍで１０分間行った。遠心上清を採取し、９０％より高い細胞コンフルエンスの新しい腫瘍細胞上に加えることで、１回のウイルスの継代が完了した。継代を１１回以上繰り返し、各回の継代でＲＤ細胞におけるウイルス力価を検出するためにウイルス溶液の一部を採取した。具体的な方法は実施例２．３を参照した。一般的に、ウイルス複製能力は世代とともに増加すると考えられる。比較的高い感染力価に達し、ウイルス複製が腫瘍細胞において安定した場合に、その腫瘍細胞に馴化されたＥＶ−Ｄ６８株が得られた。
【０１９５】
引き続き、実施例２．４に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍実験法により、ヒト腫瘍細胞ＳｉＨａ、ＳＫＯＶ−３、ＳＫ−ｈｅｐ−１、Ｃａｐａｎ−２、ＡＧＳ又はＨＣＴ−１１６を９６ウェルプレートに１０４細胞／ウェルで接種した。細胞が接着した後に、各ウェル中の培地を対応する無血清の培養培地と置き換え、その後に３７℃で３０分間インキュベートし、次いで、上記種類の細胞の各々について馴化された連続継代されたＥＶ−Ｄ６８ウイルス株（そのウイルス力価はＲＤ細胞で検出された）を、０．１、１、１０及び１００のＭＯＩで接種した。引き続き、細胞のＣＰＥを顕微鏡で毎日観察し、ウイルスの感染及び培養の７２時間後にＣＣＫ−８法を使用して細胞生存率を検出した。
【０１９６】
これらの結果を表５に示した。ここで、ＥＶ−Ｄ６８が不十分な腫瘍溶解効果を有する或る特定の種類の腫瘍細胞における野生型エンテロウイルスＥＶ−Ｄ６８の連続継代後に、腫瘍細胞に対するその死滅活性は大幅に高められ、こうして連続継代法を使用することで、腫瘍細胞に対する腫瘍溶解効果が高められたＥＶ−Ｄ６８馴化株を得ることができることが指摘される。
【０１９７】
【表５】
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備考：「−」は、ウイルス処理群とＭＯＣＫ群との間の細胞生存率に有意差がないことを示し、「＋」は、ウイルス処理後に、細胞数が減少し、生存率が５０％を超えているが、ＭＯＣＫ群の生存率とは有意に異なることを示し、「＋＋」は、ウイルス処理後の細胞生存率が５０％未満であり、ＭＯＣＫ群の細胞生存率とは有意に異なることを示した。
【０１９８】
２．６  ＥＶ−Ｄ６８のゲノムＲＮＡの腫瘍溶解効果の評価
この実施例では、ＥＶ−Ｄ６８の精製されたゲノムＲＮＡを或る特定の種類の腫瘍細胞にトランスフェクションさせることにより、大量のＥＶ−Ｄ６８の感染性の生ウイルスが産生されるため、該腫瘍細胞を死滅させることができる。
【０１９９】
ウイルスのゲノムＲＮＡを、まずはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって得た。この方法は、例えばHadac E M, Kelly E J and Russell S J. Mol Ther, 2011, 19(6): 1041-1047に見出すことができる。具体的には、実施例１で得られた野生型ＥＶ−Ｄ６８の感染性クローニングプラスミドを線状化し、線状化されたプラスミドを、ＭＥＧＡｓｃｒｉｐｔ（商標）Ｔ７  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Thermo Fisher Scientific社、ＡＭ１３３３）を用いるｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための鋳型として使用することで、大量のウイルスＲＮＡを産生させた。そして得られたウイルスＲＮＡを、ＭＥＧＡｃｌｅａｒ（商標）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｋｉｔ（Thermo Fisher Scientific社、ＡＭ１９０８）を使用して後続使用のために精製した。４つの並列試料のＲＮＡ電気泳動図を図３に示した。
【０２００】
引き続き、実施例２．４に記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏ抗腫瘍実験の方法に従って、ヒト子宮頸癌腫瘍細胞系統Ｈｅｌａを、２４ウェルプレートに１０５細胞／ウェルで接種した。細胞が接着した後に、各ウェル中の培地を、対応する無血清の細胞培養培地と置き換え、その後に３７℃で３０分間インキュベートした。次いで、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００（Thermo Fisher Scientific社、１１６６８０１９）を使用して、Ｈｅｌａ細胞に１ウェル当たり１μｇで精製されたウイルスＲＮＡをトランスフェクションさせた。ネガティブコントロール群には、無関係のＲＮＡ核酸分子をトランスフェクションさせた。引き続き、細胞のＣＰＥを顕微鏡により毎日観察した。
【０２０１】
これらの結果は、トランスフェクションの約８時間後にＥＶ−Ｄ６８のゲノムＲＮＡがトランスフェクションされたＨｅｌａ細胞にＣＰＥが現れ始め、その後に、細胞変性が徐々に増加することを示した。４８時間後に、ＣＣＫ８法を使用して生存率を測定した。Ｈｅｌａ細胞は、ほとんど全てが死滅して溶解された。そして感染の０時間後、２４時間後及び４８時間後のＨｅｌａ細胞の顕微鏡写真を図４に示した。培養上清を新しいＨｅｌａ細胞へと接種すると、ＣＰＥが素早く生じた。これらの結果は、ＥＶ−Ｄ６８の核酸による直接投与も良好な死滅活性を有し、腫瘍の治療に使用することができることを示した。
【０２０２】
実施例３：エンテロウイルスＥＶ−Ｄ６８及びその改変形のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍実験
３．１  ウイルス、細胞系統及び実験動物
（１）ウイルス：この実施例では、実施例１に示されるＥＶ−Ｄ６８−ＷＴ（配列番号１２）、ＥＶ−Ｄ６８−ＨＲＶ２（配列番号１３）、ＥＶ−Ｄ６８−ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ（配列番号１４）、ＥＶ−Ｄ６８−ＧＭ−ＣＳＦ（配列番号１５）及びＥＶ−Ｄ６８−Ａｎｔｉ−ＰＤ−１（配列番号１６）を使用した。ウイルス培養及びウイルス力価測定の方法は、それぞれ実施例２．２及び実施例２．３において理解することができる。
【０２０３】
（２）細胞系統：ヒト子宮頸癌細胞系統Ｈｅｌａ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−２（商標））、神経膠腫細胞系統Ｕ１１８−ＭＧ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＨＴＢ−１５（商標））及びリンパ腫細胞系統Ｒａｊｉ（ＡＴＣＣ（商標）番号：ＣＣＬ−８６（商標））。ＲＰＭＩ−１６４０培地を用いてＲａｊｉを培養すること除いて、他のＨｅｌａ及びＵ１１８−ＭＧは全てＤＭＥＭ培地を用いて培養した。これらの培地には、全て１０％ウシ胎児血清、グルタミン及びペニシリン−ストレプトマイシンを補充した。上記の全ての細胞は、３７℃及び５％ＣＯ２の標準条件下で培養した。
【０２０４】
（３）実験動物：６週齢〜８週齢の雌のＣ．Ｂ１７  ＳＣＩＤマウスは、Shanghai Slark Experimental Animal Co., Ltd.社から得られ、これらのマウスは、廈門大学の実験動物センター及び倫理委員会により承認されたプロトコルに従ってＳＰＦ条件下で飼育された。
【０２０５】
３．２  ウイルスのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍実験
ＳＣＩＤマウスにおける皮下腫瘍形成のために使用された腫瘍細胞を０．０１％のトリプシンで消化し、次いで１０％のウシ胎児血清を含む細胞培養培地を使用して再懸濁して、単一細胞懸濁液にした。その懸濁液の細胞密度を計数した。細胞を１０００ｇで３分間の遠心分離により沈殿させた後に、細胞を適切な容量のＰＢＳで再懸濁して、約１０６細胞／１００μｌ（ＰＢＳ）〜１０７細胞／１００μｌ（ＰＢＳ）の濃度に到達させた。腫瘍細胞を注射器でＳＣＩＤマウスの背部に１０６細胞／１００μｌ（ＰＢＳ）／部位〜１０７細胞／１００μｌ（ＰＢＳ）／部位で皮下接種した。腫瘍細胞が約１４日〜２１日後にＳＣＩＤマウスの皮下で約１００ｍｍ３の腫瘍量に成長したら、担癌のＳＣＩＤマウスを実験群（ＥＶ−Ｄ６８−ＷＴ、ＥＶ−Ｄ６８−ＨＲＶ２、ＥＶ−Ｄ６８−ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＥＶ−Ｄ６８−ＧＭ−ＣＳＦ又はＥＶ−Ｄ６８−Ａｎｔｉ−ＰＤ−１）及びネガティブコントロール群に無作為に分けた。ここで各群には４匹のマウス（ｎ＝４）が含まれる。１０６のＴＣＩＤ５０／１００μｌ（無血清培地）／腫瘍量での腫瘍溶解性ウイルス（ＥＶ−Ｄ６８−ＷＴ、ＥＶ−Ｄ６８−ＨＲＶ２、ＥＶ−Ｄ６８−ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＥＶ−Ｄ６８−ＧＭ−ＣＳＦ又はＥＶ−Ｄ６８−Ａｎｔｉ−ＰＤ−１）又は同等量の無血清培地を、合計５回の処理につき２日毎に腫瘍内注射した。腫瘍サイズをノギスで計測し、２日毎に記録した。腫瘍サイズの計算方法は以下の通りであった。
腫瘍サイズ（ｍｍ３）＝腫瘍の長さの値×（腫瘍の幅の値）２／２
【０２０６】
上記の３種の腫瘍についてのＥＶ−Ｄ６８−ＷＴの治療結果を、図５Ａ〜図５Ｃに示した。これらの結果は、ＥＶ−Ｄ６８−ＷＴのチャレンジ後に、Ｈｅｌａ（Ａ）、Ｕ１１８−ＭＧ（Ｂ）及びＲａｊｉ（Ｃ）の３種の試験腫瘍の成長が徐々に遅くなって停止し、更に腫瘍は溶解して消失するが、それに対して、ネガティブ群（ＣＴＲＬ）の腫瘍は正常な成長を維持し、その腫瘍サイズは実験群の腫瘍サイズよりも有意に大きいことを示した。
【０２０７】
表６は、Ｒａｊｉ腫瘍モデルを１０日間にわたりＥＶ−Ｄ６８−ＷＴ、ＥＶ−Ｄ６８−ＨＲＶ２、ＥＶ−Ｄ６８−ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＥＶ−Ｄ６８−ＧＭ−ＣＳＦ又はＥＶ−Ｄ６８−Ａｎｔｉ−ＰＤ−１で処理した後に得られた結果を示した。これらの結果は、ＥＶ−Ｄ６８−ＷＴ、ＥＶ−Ｄ６８−ＨＲＶ２、ＥＶ−Ｄ６８−ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＥＶ−Ｄ６８−ＧＭ−ＣＳＦ及びＥＶ−Ｄ６８−Ａｎｔｉ−ＰＤで処理した後に、腫瘍溶解性ウイルスで処理されていないネガティブコントロール群と比較して、腫瘍体積が有意に減少し、ここで、４種の腫瘍溶解性ウイルスＥＶ−Ｄ６８−ＷＴ、ＥＶ−Ｄ６８−ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＥＶ−Ｄ６８−ＧＭ−ＣＳＦ及びＥＶ−Ｄ６８−Ａｎｔｉ−ＰＤ−１で処理した後にも腫瘍体積の同様の減少が検出されたことを示した。上記の結果は、ＥＶ−Ｄ６８−ＷＴ、ＥＶ−Ｄ６８−ＨＲＶ２、ＥＶ−Ｄ６８−ｍｉＲ１３３＆２０６Ｔ、ＥＶ−Ｄ６８−ＧＭ−ＣＳＦ及びＥＶ−Ｄ６８−Ａｎｔｉ−ＰＤ−１の全てがｉｎ  ｖｉｖｏで顕著で好ましい抗腫瘍活性を示すことを示した。
【０２０８】
【表６】
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備考：「＋」は、処理後に腫瘍体積が減少し、ネガティブコントロール群の５０％より大きいが、ネガティブコントロール群の腫瘍体積とは有意に異なることを示し、「＋＋」は、処理後に腫瘍体積がネガティブコントロール群の５０％未満に減少し、ネガティブコントロール群の腫瘍体積とは有意に異なることを示した。
【０２０９】
実施例４：腫瘍溶解性ウイルスの安全性評価
４．１  使用されるウイルス及び実験動物
（１）ウイルス：実施例１に示されるＥＶ−Ｄ６８−ＷＴ（配列番号１２）を、この実施例で使用した。ウイルス培養及びウイルス力価測定の方法は、それぞれ実施例２．２及び実施例２．３を参照することができる。
【０２１０】
（２）実験動物：ＢＡＬＢ／ｃ妊娠マウスは、Shanghai Slark Experimental Animal Co., Ltd.社から得られ、廈門大学の実験動物センター及び倫理委員会により承認されたプロトコルに従って、マウスを清浄条件下で飼育し、次いでＢＡＬＢ／ｃ妊娠マウスから産まれた１日齢、２日齢、３日齢、７日齢及び１４日齢のマウスを、ＥＶ−Ｄ６８のｉｎ  ｖｉｖｏ病毒性評価のために使用した。
【０２１１】
４．２  マウスにおけるウイルスの安全性の評価
（１）１日齢のＢＡＬＢ／ｃ授乳マウスを、腹腔内注射によりＥＶ−Ｄ６８−ＷＴでチャレンジするために選択し、チャレンジのための力価用量は１０３、１０４、１０５、１０６又は１０７のＴＣＩＤ５０／マウスであった。次いで、種々の用量でチャレンジされたＢＡＬＢ／ｃマウスについての生存率及び健康スコアを毎日記録した。ここで、健康スコアの評価基準は以下の通りであった。スコア５は瀕死又は死亡を表し、スコア４は重度の四肢麻痺を表し、スコア３は、四肢の脱力又は軽度の変形を表し、スコア２は衰弱を表し、スコア１は不活発、起毛及び震えを表し、スコア０は健康を表す。
【０２１２】
これらの結果を図６Ａに示した。チャレンジ後２０日以内に、１０７のＴＣＩＤ５０の非常に高用量の群における全てのマウスは病気に罹り、１週間以内に死亡し、１０６のＴＣＩＤ５０の高用量の群のマウスの８０％は最終的に生存し、ごくわずかなマウスだけしか病気に罹って死亡せず、更にその他の用量のチャレンジ群のマウスにおいては病的状態及び死亡は起こらなかった。
【０２１３】
（２）１日齢、２日齢、３日齢、７日齢及び１４日齢のＢＡＬＢ／ｃマウスにＥＶ−Ｄ６８−ＷＴを１０７のＴＣＩＤ５０／マウスの極めて高用量で注射し、その後に、異なる日齢のＢＡＬＢ／ｃについて生存率及び健康スコアを毎日記録した。ここで、健康スコアの評価基準は上記と同じであった。
【０２１４】
これらの結果を図６Ｂに示した。チャレンジ後２０日以内に、１日齢のマウスは全て１週間以内に死亡し、２日齢のマウスはＥＶ−Ｄ６８毒性に対して或る程度耐性があり、最終的に７０％の生存率を有したが、疾患の発生率は比較的高く、症状は比較的重症であり、３日齢のマウスは既にＥＶ−Ｄ６８に対して無防備ではなく、最終的に９０％の生存率を示し、病気の発生率は低く、症状は軽度であり、４日齢以上のマウスは高用量のＥＶ−Ｄ６８に対して完全に耐性があり、病的状態及び死亡は起こらなかった。
【０２１５】
上記の結果は、ＥＶ−Ｄ６８−ＷＴがマウスに対してほとんど毒性でなく、１０７のＴＣＩＤ５０／マウスの極めて高用量で１日齢〜３日齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに対してのみ致死的であり、４日齢以上のマウスに対しては影響がないことを示し、それによりｉｎ  ｖｉｖｏでの良好な安全性が指摘される。
【０２１６】
本発明の具体的な実施形態を詳細に説明したが、当業者は、公開されているあらゆる教示に従って、その詳細に対して様々な変更及び変化を加えることができ、これらの変化が全て本発明の保護範囲内であることを理解するであろう。本発明の保護範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらのあらゆる均等物によって与えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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