(57)【要約】本発明は、レナラーゼと結合しそれを阻害するための組成物および方法を提供する。一実施形態では、レナラーゼ結合分子は、レナラーゼ活性を阻害する。よって、レナラーゼ活性の低下が有益である疾患および状態において、斯かる阻害性レナラーゼ結合分子は、治療薬として作用する。一実施形態では、本発明は、少なくとも１種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片、および少なくとも１種の抗ＰＤ１抗体またはその結合断片を含む組成物に関する。
2020510681.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片、および少なくとも１種の抗ＰＤ１抗体またはその結合断片を含む組成物。
【請求項２】
前記抗レナラーゼ抗体またはその結合断片が、少なくとも１０−６Ｍの親和性で、レナラーゼに特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記抗ＰＤ１抗体またはその結合断片が、少なくとも１０−６Ｍの親和性で、ＰＤ１に特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号１〜７からなる群より選択されるペプチド配列と特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１種の抗体またはその結合断片が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、イムノコンジュゲート、脱フコシル化抗体、二特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および完全ヒト抗体からなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記抗レナラーゼ抗体が、ａ）配列番号１１および配列番号１９からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号１２および配列番号２０からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号１３および配列番号２１からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号１４および配列番号２２からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号１５および配列番号２３からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２配列；ｆ）配列番号１６および配列番号２４からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３配列からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記抗レナラーゼ抗体が、ａ）配列番号２７および配列番号３５からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号２８および配列番号３６からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号２９および配列番号３７からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号３０および配列番号３８からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号３１および配列番号３９からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２配列；ｆ）配列番号３２および配列番号４０からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３配列からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗レナラーゼ抗体が、ａ）重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号４３；ｂ）重鎖ＣＤＲ２配列、配列番号４４；ｃ）重鎖ＣＤＲ３配列、配列番号４５；ｄ）軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号４６；ｅ）軽鎖ＣＤＲ２配列、配列番号４７；ｆ）軽鎖ＣＤＲ３配列、配列番号４８からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号９、１７、２５、３３および４１からなる群より選択される重鎖配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号１０、１８、２６、３４および４２からなる群より選択される軽鎖配列を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
がんの処置または予防を必要とする被験体においてがんを処置または予防する方法であって、少なくとも１種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片を含む組成物を前記被験体に投与するステップと、少なくとも１種の抗ＰＤ１抗体またはその結合断片を含む組成物を前記被験体に投与するステップとを含む、方法。
【請求項１５】
前記少なくとも１種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片を含む組成物、および前記少なくとも１種の抗ＰＤ１抗体またはその結合断片を含む組成物が、少なくとも１種の追加の治療剤と組み合わせて前記被験体に投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記がんが、急性リンパ芽球性；急性骨髄球性白血病；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児期；虫垂がん；基底細胞癌；胆管がん、肝外；膀胱がん；骨がん；骨肉腫および悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、成人期；脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、中枢神経系非定型奇形様／ラブドイド腫瘍、小児期；中枢神経系胚芽腫；小脳性星状細胞腫；大脳性星状細胞腫／悪性神経膠腫；頭蓋咽頭腫；上衣芽腫；上衣腫；髄芽腫；髄上皮腫；中間分化の松果体実質腫瘍；テント上未分化神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫；視路および視床下部神経膠腫；脳および脊髄腫瘍；乳がん；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍；カルチノイド腫瘍、胃腸管；中枢神経系非定型奇形様／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；中枢神経系リンパ腫；小脳性星状細胞腫大脳性星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児期；子宮頸部がん；脊索腫、小児期；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸がん；結腸直腸がん；頭蓋咽頭腫；皮膚ｔ細胞リンパ腫；食道がん；ユーイングファミリー腫瘍；性腺外生殖細胞腫瘍；肝外胆管がん；眼がん、眼球内メラノーマ；眼がん、網膜芽細胞腫；胆嚢がん；胃（gastric/stomach）がん；胃腸管カルチノイド腫瘍；胃腸管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）；生殖細胞腫瘍、頭蓋外；生殖細胞腫瘍、性腺外；生殖細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；神経膠腫、小児期脳幹；神経膠腫、小児期大脳性星状細胞腫；神経膠腫、小児期視路および視床下部；ヘアリー細胞白血病；頭頸部がん；肝細胞（肝臓）がん；組織球増殖症、ランゲルハンス細胞；ホジキンリンパ腫；下咽頭がん；視床下部および視路神経膠腫；眼球内メラノーマ；島細胞腫瘍；腎臓（腎細胞）がん；ランゲルハンス細胞組織球増殖症；喉頭がん；白血病、急性リンパ芽球性；白血病、急性骨髄球性；白血病、慢性リンパ球性；白血病、慢性骨髄性；白血病、ヘアリー細胞；口唇および口腔がん；肝臓がん；肺がん、非小細胞；肺がん、小細胞；リンパ腫、ａｉｄｓ関連；リンパ腫、バーキット；リンパ腫、皮膚ｔ細胞；リンパ腫、ホジキン；リンパ腫、非ホジキン；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ワルデンストレーム；骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫；髄芽腫；メラノーマ；メラノーマ、眼球内（眼）；メルケル細胞癌；中皮腫；原発不明の転移性扁平上皮頸部がん；口のがん；多発性内分泌腺腫症候群、（小児期）；多発性骨髄腫／形質細胞新生物；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄球性白血病、成人期急性；骨髄球性白血病、小児期急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖性障害、慢性；鼻腔および副鼻腔がん；鼻咽頭がん；神経芽細胞腫；非小細胞肺がん；口内がん；口腔がん；中咽頭がん；骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫；卵巣がん；卵巣上皮がん；卵巣生殖細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵がん；膵がん、島細胞腫瘍；乳頭腫症；副甲状腺がん；陰茎がん；咽頭がん；褐色細胞腫；傍神経節腫；中間分化の松果体実質腫瘍；松果体芽腫およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍；下垂体腫瘍；形質細胞新生物／多発性骨髄腫；胸膜肺芽細胞腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺がん；直腸がん；腎細胞（腎臓）がん；腎盂および尿管、移行細胞がん；第１５染色体上のｎｕｔ遺伝子が関与する気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺がん；肉腫、ユーイングファミリー腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫、軟部組織；肉腫、子宮；セザリー症候群；皮膚がん（非メラノーマ）；皮膚がん（メラノーマ）；皮膚癌、メルケル細胞；小細胞肺がん；小腸がん；軟部組織肉腫；扁平細胞癌、原発不明の扁平上皮頸部がん、転移性；胃（stomach/gastric）がん；テント上未分化神経外胚葉性腫瘍；ｔ細胞リンパ腫、皮膚性；精巣がん；喉のがん；胸腺腫および胸腺癌；甲状腺がん；腎盂および尿管の移行細胞がん；絨毛性腫瘍、妊娠性；尿道がん；子宮がん、子宮内膜；子宮肉腫；膣がん；外陰部がん；ワルデンストレームマクログロブリン血症；ならびにウィルムス腫瘍からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片、および少なくとも１種の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片を含む組成物。
【請求項１８】
前記抗レナラーゼ抗体またはその結合断片が、少なくとも１０−６Ｍの親和性で、レナラーゼに特異的に結合する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片が、少なくとも１０−６Ｍの親和性で、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号１〜７からなる群より選択されるペプチド配列と特異的に結合する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２１】
前記少なくとも１種の抗体またはその結合断片が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、イムノコンジュゲート、脱フコシル化抗体、二特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、および完全ヒト抗体からなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗レナラーゼ抗体が、ａ）配列番号１１および配列番号１９からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号１２および配列番号２０からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号１３および配列番号２１からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号１４および配列番号２２からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号１５および配列番号２３からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２配列；ｆ）配列番号１６および配列番号２４からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３配列からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２３】
前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２４】
前記抗レナラーゼ抗体が、ａ）配列番号２７および配列番号３５からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号２８および配列番号３６からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号２９および配列番号３７からなる群より選択される重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号３０および配列番号３８からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号３１および配列番号３９からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ２配列；ｆ）配列番号３２および配列番号４０からなる群より選択される軽鎖ＣＤＲ３配列からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗レナラーゼ抗体が、ａ）重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号４３；ｂ）重鎖ＣＤＲ２配列、配列番号４４；ｃ）重鎖ＣＤＲ３配列、配列番号４５；ｄ）軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号４６；ｅ）軽鎖ＣＤＲ２配列、配列番号４７；ｆ）軽鎖ＣＤＲ３配列、配列番号４８からなる群より選択される少なくとも１種を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２８】
前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号９、１７、２５、３３および４１からなる群より選択される重鎖配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記抗レナラーゼ抗体が、配列番号１０、１８、２６、３４および４２からなる群より選択される軽鎖配列を含む、請求項１７に記載の組成物。
【請求項３０】
がんの処置または予防を必要とする被験体においてがんを処置または予防する方法であって、少なくとも１種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片を含む組成物を前記被験体に投与するステップと、少なくとも１種の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片を含む組成物を前記被験体に投与するステップとを含む、方法。
【請求項３１】
前記少なくとも１種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片を含む組成物、および前記少なくとも１種の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片を含む組成物が、少なくとも１種の追加の治療剤と組み合わせて前記被験体に投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記がんが、急性リンパ芽球性；急性骨髄球性白血病；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児期；虫垂がん；基底細胞癌；胆管がん、肝外；膀胱がん；骨がん；骨肉腫および悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、成人期；脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、中枢神経系非定型奇形様／ラブドイド腫瘍、小児期；中枢神経系胚芽腫；小脳性星状細胞腫；大脳性星状細胞腫／悪性神経膠腫；頭蓋咽頭腫；上衣芽腫；上衣腫；髄芽腫；髄上皮腫；中間分化の松果体実質腫瘍；テント上未分化神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫；視路および視床下部神経膠腫；脳および脊髄腫瘍；乳がん；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍；カルチノイド腫瘍、胃腸管；中枢神経系非定型奇形様／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；中枢神経系リンパ腫；小脳性星状細胞腫大脳性星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児期；子宮頸部がん；脊索腫、小児期；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸がん；結腸直腸がん；頭蓋咽頭腫；皮膚ｔ細胞リンパ腫；食道がん；ユーイングファミリー腫瘍；性腺外生殖細胞腫瘍；肝外胆管がん；眼がん、眼球内メラノーマ；眼がん、網膜芽細胞腫；胆嚢がん；胃（gastric/stomach）がん；胃腸管カルチノイド腫瘍；胃腸管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）；生殖細胞腫瘍、頭蓋外；生殖細胞腫瘍、性腺外；生殖細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；神経膠腫、小児期脳幹；神経膠腫、小児期大脳性星状細胞腫；神経膠腫、小児期視路および視床下部；ヘアリー細胞白血病；頭頸部がん；肝細胞（肝臓）がん；組織球増殖症、ランゲルハンス細胞；ホジキンリンパ腫；下咽頭がん；視床下部および視路神経膠腫；眼球内メラノーマ；島細胞腫瘍；腎臓（腎細胞）がん；ランゲルハンス細胞組織球増殖症；喉頭がん；白血病、急性リンパ芽球性；白血病、急性骨髄球性；白血病、慢性リンパ球性；白血病、慢性骨髄性；白血病、ヘアリー細胞；口唇および口腔がん；肝臓がん；肺がん、非小細胞；肺がん、小細胞；リンパ腫、ａｉｄｓ関連；リンパ腫、バーキット；リンパ腫、皮膚ｔ細胞；リンパ腫、ホジキン；リンパ腫、非ホジキン；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ワルデンストレーム；骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫；髄芽腫；メラノーマ；メラノーマ、眼球内（眼）；メルケル細胞癌；中皮腫；原発不明の転移性扁平上皮頸部がん；口のがん；多発性内分泌腺腫症候群、（小児期）；多発性骨髄腫／形質細胞新生物；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄球性白血病、成人期急性；骨髄球性白血病、小児期急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖性障害、慢性；鼻腔および副鼻腔がん；鼻咽頭がん；神経芽細胞腫；非小細胞肺がん；口内がん；口腔がん；中咽頭がん；骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫；卵巣がん；卵巣上皮がん；卵巣生殖細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵がん；膵がん、島細胞腫瘍；乳頭腫症；副甲状腺がん；陰茎がん；咽頭がん；褐色細胞腫；傍神経節腫；中間分化の松果体実質腫瘍；松果体芽腫およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍；下垂体腫瘍；形質細胞新生物／多発性骨髄腫；胸膜肺芽細胞腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺がん；直腸がん；腎細胞（腎臓）がん；腎盂および尿管、移行細胞がん；第１５染色体上のｎｕｔ遺伝子が関与する気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺がん；肉腫、ユーイングファミリー腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫、軟部組織；肉腫、子宮；セザリー症候群；皮膚がん（非メラノーマ）；皮膚がん（メラノーマ）；皮膚癌、メルケル細胞；小細胞肺がん；小腸がん；軟部組織肉腫；扁平細胞癌、原発不明の扁平上皮頸部がん、転移性；胃（stomach/gastric）がん；テント上未分化神経外胚葉性腫瘍；ｔ細胞リンパ腫、皮膚性；精巣がん；喉のがん；胸腺腫および胸腺癌；甲状腺がん；腎盂および尿管の移行細胞がん；絨毛性腫瘍、妊娠性；尿道がん；子宮がん、子宮内膜；子宮肉腫；膣がん；外陰部がん；ワルデンストレームマクログロブリン血症；ならびにウィルムス腫瘍からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年３月８日に出願された米国仮出願第６２／４６８，４５３号に対する優先権を主張し、その全体が参照によって本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
レナラーゼ（ＲＮＬＳ）は、腎臓、心臓、骨格筋、精巣において、また、より少ない程度であるが、他の組織において主に産生されるタンパク質である（Xuら、２００５年、J  Clin  Invest.１１５巻（５号）：１２７５〜８０頁およびWangら、２００８年、Mol  Biol  Rep.３５巻（４号）：６１３〜２０頁）。レナラーゼの２種のアイソフォームバリアント、レナラーゼ−１およびレナラーゼ−２について記載されている。これら２種の形態のレナラーゼは、最終エクソンの差次的スプライシングのために異なる。レナラーゼは、カテコールアミンであるエピネフリン、ノルエピネフリンおよびドーパミンを選択的に脱アミノ化する活性を有する、新規フラビンアデニンジヌクレオチド含有モノアミンオキシダーゼとして記載されている。健康な個体と比較した末期腎疾患患者の血漿におけるレナラーゼの欠乏について記載されている。カテコールアミンは、心拍出量および血管抵抗に対する効果を介して、疾患における場合を含む、血圧の維持およびモジュレーションにおける主要な役割を果たす。ラットへの組換え形態のレナラーゼの注入は、心筋収縮能、心拍数および血圧の減少を引き起こした。腎不全患者は、高血圧症および心血管合併症によるより大きい死亡率と相関する、循環カテコールアミンの高められたレベルにより特徴付けられた。よって、タンパク質レナラーゼは、カテコールアミン誘導性の血圧変化の制御および維持における役割を果たすことができ、腎疾患患者において観察されるレナラーゼの欠乏は、転帰にとって有害となり得る。
【０００３】
健康な個体と比較した末期腎疾患患者の血漿におけるレナラーゼの欠乏について記載されている。腎不全患者は、高血圧症および心血管合併症によるより大きい死亡率と相関する、循環カテコールアミンの高められたレベルにより特徴付けられた。よって、タンパク質レナラーゼは、カテコールアミン誘導性の血圧変化の制御および維持における役割を果たすことができ、腎疾患患者において観察されるレナラーゼの欠乏は、転帰にとって有害となり得る。しかし、がんにおけるレナラーゼの役割については殆ど分かっていない。
【０００４】
がんの本質的特色は、細胞老化および細胞死の調節不全である。レナラーゼ（ＲＮＬＳ）は、原形質膜カルシウムＡＴＰａｓｅ  ＰＭＣＡ４ｂを介したシグナル伝達による虚血性および毒性細胞傷害から保護して、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴおよびＭＡＰＫ経路を活性化する、分泌型フラボタンパク質である。
【０００５】
皮膚がんは、一般的なヒト悪性疾患であり、その発生率は、先進国で増加しつつある（Gray-Schopferら、２００７年、Nature.４４５巻：８５１〜７頁；Loweら、２０１４年、Mayo  Clinic  Proceedings.８９巻：５２〜９頁；Lesinskiら、２０１３年、Future  oncology.９巻：９２５〜７頁）。メラノーマは、切除不能となってしまったら生存度が低い、致命的な形態の皮膚がんである（Loweら、２０１４年、Mayo  Clinic  Proceedings.８９巻：５２〜９頁）。これは、分子的に不均一な疾患であり、疾患発症および進行に関与するシグナル伝達経路における肝要な変更の一部が同定されている。Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫおよびＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路は、メラノーマの病因における肝要な役割を果たす（Gray-Schopferら、２００７年、Nature.４４５巻：８５１〜７頁；Lesinskiら、２０１３年、Future  oncology.９巻：９２５〜７頁；Yajimaら、２０１２年、Dermatology  research  and  practice.２０１２巻：３５４１９１頁）。Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＰＩ３ＫまたはＰＴＥＮ（ＰＩ３Ｋ阻害剤）における変異は、ＥＲＫおよびＡＫＴの持続した活性化をもたらすことができ、これは次いで、細胞生存および増殖を促進する。Ｄａｎｋｏｒｔらは、マウスにおけるＢＲａｆＶ６００Ｅの条件的メラニン形成細胞特異的発現により十分にこれを実証し、どのマウスもメラノーマを発症しなかったが、Ｐｔｅｎ腫瘍サプレッサー遺伝子のサイレンシングと組み合わせた場合に、メラノーマ発症の１００％の浸透度を明らかにした（Dankortら、２００９年、Nature  genetics.４１巻：５４４〜５２頁）。これらの病原性経路の解明は、過剰活性化されたキナーゼを標的とする特異的阻害剤の開発を容易にした。これらの薬剤は、転移性メラノーマ患者の選択的な群の処置において有効であると判明したが、その有益な作用は多くの場合、長続きせず、したがって、追加の治療標的の同定の差し迫った必要がある。
【０００６】
ＲＮＬＳ発現は、メラノーマ腫瘍において、具体的にはＣＤ１６３＋腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）において著しく増加される。原発性メラノーマ患者のコホートにおいて、疾患特異的生存は、腫瘍塊におけるＲＮＬＳ発現と逆相関し、ＲＮＬＳの病原性役割を示唆した。ｓｉＲＮＡ、抗ＲＮＬＳ抗体またはＲＮＬＳ由来阻害性ペプチドを使用したＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでメラノーマ細胞生存を大幅に減少させる。モノクローナル抗体による抗ＲＮＬＳ療法は、異種移植マウスモデルにおけるメラノーマ腫瘍成長を著しく阻害する。ｍ２８−ＲＮＬＳ（１Ｄ−２８−４としても公知）による処置は、ＣＤ１６３＋  ＴＡＭにおける内在性ＲＮＬＳ発現、ならびに総およびリン酸化ＳＴＡＴ３の著しい低下を引き起こした。腫瘍細胞におけるアポトーシス増加は、Ｂ細胞リンパ腫２関連タンパク質Ｂａｘのｐ３８  ＭＡＰＫ媒介性活性化に時間的に関係付けられた。細胞周期阻害剤ｐ２１の発現が増加し、細胞周期停止が記録された。これらの結果は、ＣＤ１６３＋  ＴＡＭによるＲＮＬＳ産生増加が、ＳＴＡＴ３を活性化することによりメラノーマ成長を容易にすること、およびＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、メラノーマの管理における潜在的治療適用を有することを示す。
【０００７】
膵がんは、世界的におよそ３３０，０００名の死亡および米国における４０，０００名の死亡の原因となる、最も致死的な新生物の１つである（World  Cancer  Report  2014.  WHO  Press；２０１４年）。膵がんは、検出が困難であり、大部分の症例は、後期に診断される（Nolenら、２０１４年、PLoS  ONE.９巻（４号）：ｅ９４９２８頁）。このがんの化学療法の使用においてある程度の進展はあったが、疾患は依然として、全てのあらゆる薬物療法に対して極めて抵抗性である（Hidalgoら、２０１０年、New  England  Journal  of  Medicine.３６２巻（１７号）：１６０５〜１７頁）。膵がんを有する個体の全５年生存は、＜５％であり（Hidalgoら、２０１０年、New  England  Journal  of  Medicine.３６２巻（１７号）：１６０５〜１７頁）、追加の治療標的が必要とされる。
【０００８】
膵がんの発症は、遺伝子変異の段階的蓄積に頼り（Jonesら、２００８年、Science.３２１巻（５８９７号）：１８０１〜６頁）、そのうちの一部は、異常ＭＡＰＫ、ＰＩ３ＫおよびＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達を引き起こす。最小限の異形成上皮〜形成異常〜浸潤癌への進行は、癌遺伝子（例えば、ＫＲＡＳ２）を活性化する、または腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、ＣＤＫＮ２ａ／ＩＮＫ４ａ、ＴＰ５３およびＤＰＣ４／ＳＭａＤ４）を不活性化する遺伝子変異の段階的蓄積を反映する（Hidalgoら、２０１２年、Annals  of  Oncology.２３巻（追補１０号）：ｘ１３５〜ｘ８頁）。膵腫瘍の９５、９０および７５％は、それぞれＫＲＡＳ２、ＣＤＫＮ２ａおよびＴＰ５３に変異を保有する。これらの変異は、がん成長を特徴付ける持続性の調節不全の増殖をもたらす。膵管腺癌（ＰＤＡＣ）における変異のランドスケープおよびコアシグナル伝達経路が、２４種の進行型ＰＤＡＣの包括的遺伝的解析により定義されている（Jonesら、２００８年、Science.３２１巻（５８９７号）：１８０１〜６頁）。これらのデータは、大部分のＰＤＡＣが、主に点変異であり、およそ１２種の細胞シグナル伝達経路に影響を与える、多数の遺伝的変化を含有することを示す。
【０００９】
当該研究は、また、ＰＤＡＣにおいて、腫瘍の９０％において少なくとも１０倍過剰発現される５４１種の遺伝子を同定した。これは、腫瘍または腫瘍由来細胞株における、近年特徴付けられたタンパク質であるレナラーゼ（ＲＮＬＳ）の２〜４倍増加を含んだ。ＮＡＤＨオキシダーゼ活性（Farzaneh-Farら、２０１０年、PLoS  One.５巻（１０号）：ｅ１３４９６頁；Beaupreら、２０１５年、Biochemistry.５４巻（３号）：７９５〜８０６頁）を有する、新規分泌型フラボタンパク質であるＲＮＬＳ（Xuら、２００５年、J  Clin  Invest.１１５巻（５号）：１２７５〜８０頁；Desirら、２０１２年、J  Am  Heart  Assoc.１巻（ｅ００２６３４頁；Desirら、２０１２年、J  Am  Soc  Hypertens.６巻（６号）：４１７〜２６頁；Liら、２００８年、Circulation.１１７巻（１０号）：１２７７〜８２頁）は、その内因性酵素活性に依存しない受容体媒介性プロセスを介して（Wangら、２０１４年、Journal  of  the  American  Society  of  Nephrology.、DOI:10.1681/asn.2013060665）、細胞および臓器生存を促進する（Leeら、２０１３年、J  Am  Soc  Nephrol.２４巻（３号）：４４５〜５５頁）。ＲＮＬＳは、プロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）およびマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ｐ３８）を迅速に活性化する。ＥＲＫまたはＡＫＴのいずれかの化学的阻害は、ＲＮＬＳの保護効果を抑止した（Wangら、２０１４年、Journal  of  the  American  Society  of  Nephrology.、DOI:10.1681/asn.2013060665）。
【００１０】
ＰＤ−１（別名、ＣＤ２７９）は、Ｔ細胞活性の抑制を介して自己寛容を促進し、自己免疫から保護する免疫チェックポイントとして機能することにより、免疫系の下方調節における役割を果たす細胞表面受容体である。
【００１１】
したがって、がんの予防および処置のための、レナラーゼおよびＰＤ−１と結合する改善された方法および組成物、例えば抗体などの必要がある。本発明は、この必要を満たす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｘｕら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．（２００５年）１１５巻（５号）：１２７５〜８０頁
【非特許文献２】Ｄｅｓｉｒら、Ｊ  Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃ．（２０１２年）１巻（ｅ００２６３４頁）
【非特許文献３】Ｄｅｓｉｒら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．（２０１２年）６巻（６号）：４１７〜２６頁
【非特許文献４】Ｌｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．（２００８年）１１７巻（１０号）：１２７７〜８２頁
【非特許文献５】Ｌｅｅら、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．（２０１３年）２４巻（３号）：４４５〜５５頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片、および少なくとも１種の抗ＰＤ１抗体またはその結合断片を含む組成物に関する。
【００１４】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体またはその結合断片は、少なくとも１０−６Ｍの親和性で、レナラーゼに特異的に結合する。
【００１５】
一実施形態では、抗ＰＤ１抗体またはその結合断片は、少なくとも１０−６Ｍの親和性で、ＰＤ１に特異的に結合する。
【００１６】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７またはこれらの組み合わせのペプチド配列と特異的に結合する。
【００１７】
一実施形態では、少なくとも１種の抗体またはその結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、イムノコンジュゲート、脱フコシル化抗体、二特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または完全ヒト抗体である。
【００１８】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、ａ）配列番号１１または配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号１２または配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号１３または配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号１４または配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号１５または配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ）配列番号１６または配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３配列の少なくとも１種を含む。
【００１９】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する。
【００２０】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、ａ）配列番号２７または配列番号３５の重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号２８または配列番号３６の重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号２９または配列番号３７の重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号３０または配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号３１または配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ）配列番号３２または配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ３配列の少なくとも１種を含む。
【００２１】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する。
【００２２】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、ａ）重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号４３；ｂ）重鎖ＣＤＲ２配列、配列番号４４；ｃ）重鎖ＣＤＲ３配列、配列番号４５；ｄ）軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号４６；ｅ）軽鎖ＣＤＲ２配列、配列番号４７；およびｆ）軽鎖ＣＤＲ３配列、配列番号４８の少なくとも１種を含む。
【００２３】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する。
【００２４】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３または配列番号４１の重鎖配列を含む。
【００２５】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４または配列番号４２からなる群より選択される軽鎖配列を含む。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、がんの処置または予防を必要とする被験体においてがんを処置または予防する方法であって、少なくとも１種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片を含む組成物を被験体に投与するステップと、少なくとも１種の抗ＰＤ１抗体またはその結合断片を含む組成物を被験体に投与するステップとを含む方法に関する。
【００２７】
一実施形態では、少なくとも１種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片を含む組成物、および少なくとも１種の抗ＰＤ１抗体またはその結合断片を含む組成物は、少なくとも１種の追加の治療剤と組み合わせて被験体に投与される。
【００２８】
一実施形態では、がんは、急性リンパ芽球性；急性骨髄球性白血病；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児期；虫垂がん；基底細胞癌；胆管がん、肝外；膀胱がん；骨がん；骨肉腫および悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、成人期；脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、中枢神経系非定型奇形様／ラブドイド腫瘍、小児期；中枢神経系胚芽腫；小脳性星状細胞腫；大脳性星状細胞腫（astrocytotna）／悪性神経膠腫；頭蓋咽頭腫；上衣芽腫；上衣腫；髄芽腫；髄上皮腫；中間分化の松果体実質腫瘍；テント上未分化神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫；視路および視床下部神経膠腫；脳および脊髄腫瘍；乳がん；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍；カルチノイド腫瘍、胃腸管；中枢神経系非定型奇形様／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；中枢神経系リンパ腫；小脳性星状細胞腫大脳性星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児期；子宮頸部がん；脊索腫、小児期；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸がん；結腸直腸がん；頭蓋咽頭腫；皮膚ｔ細胞リンパ腫；食道がん；ユーイングファミリー腫瘍；性腺外生殖細胞腫瘍；肝外胆管がん；眼がん、眼球内メラノーマ；眼がん、網膜芽細胞腫；胆嚢がん；胃（gastric/stomach）がん；胃腸管カルチノイド腫瘍；胃腸管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）；生殖細胞腫瘍、頭蓋外；生殖細胞腫瘍、性腺外；生殖細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；神経膠腫、小児期脳幹；神経膠腫、小児期大脳性星状細胞腫；神経膠腫、小児期視路および視床下部；ヘアリー細胞白血病；頭頸部がん；肝細胞（肝臓）がん；組織球増殖症、ランゲルハンス細胞；ホジキンリンパ腫；下咽頭がん；視床下部および視路神経膠腫；眼球内メラノーマ；島細胞腫瘍；腎臓（腎細胞）がん；ランゲルハンス細胞組織球増殖症；喉頭がん；白血病、急性リンパ芽球性；白血病、急性骨髄球性；白血病、慢性リンパ球性；白血病、慢性骨髄性；白血病、ヘアリー細胞；口唇および口腔がん；肝臓がん；肺がん、非小細胞；肺がん、小細胞；リンパ腫、ａｉｄｓ関連；リンパ腫、バーキット；リンパ腫、皮膚ｔ細胞；リンパ腫、ホジキン；リンパ腫、非ホジキン；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ワルデンストレーム；骨の悪性線維性組織球腫（histiocvtoma）および骨肉腫；髄芽腫；メラノーマ；メラノーマ、眼球内（眼）；メルケル細胞癌；中皮腫；原発不明の転移性扁平上皮頸部がん（metastatic  squamous  neck  cancer  with  occult  primary）；口のがん；多発性内分泌腺腫症候群、（小児期）；多発性骨髄腫／形質細胞新生物；菌状息肉腫（mycosis;  fungoides）；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄球性白血病、成人期急性；骨髄球性白血病、小児期急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖性障害、慢性；鼻腔および副鼻腔がん；鼻咽頭がん；神経芽細胞腫；非小細胞肺がん；口内がん（oral  cancer）；口腔がん；中咽頭がん；骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫；卵巣がん；卵巣上皮がん；卵巣生殖細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵がん；膵がん、島細胞腫瘍；乳頭腫症；副甲状腺がん；陰茎がん；咽頭がん；褐色細胞腫；傍神経節腫；中間分化の松果体実質腫瘍；松果体芽腫およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍��下垂体腫瘍；形質細胞新生物／多発性骨髄腫；胸膜肺芽細胞腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺がん；直腸がん；腎細胞（腎臓）がん；腎盂および尿管、移行細胞がん；第１５染色体上のｎｕｔ遺伝子が関与する気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺がん；肉腫、ユーイングファミリー腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫、軟部組織；肉腫、子宮；セザリー症候群；皮膚がん（非メラノーマ）；皮膚がん（メラノーマ）；皮膚癌、メルケル細胞；小細胞肺がん；小腸がん；軟部組織肉腫；扁平細胞癌、原発不明の扁平上皮頸部がん、転移性；胃（stomach/gastric）がん；テント上未分化神経外胚葉性腫瘍；ｔ細胞リンパ腫、皮膚性；精巣がん；喉のがん；胸腺腫および胸腺癌；甲状腺がん；腎盂および尿管の移行細胞がん；絨毛性腫瘍、妊娠性；尿道がん；子宮がん、子宮内膜；子宮肉腫；膣がん；外陰部がん；ワルデンストレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍である。
【００２９】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片、および少なくとも１種の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片を含む組成物に関する。
【００３０】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体またはその結合断片は、少なくとも１０−６Ｍの親和性で、レナラーゼに特異的に結合する。
【００３１】
一実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片は、少なくとも１０−６Ｍの親和性で、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する。
【００３２】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７またはこれらの組み合わせのペプチド配列と特異的に結合する。
【００３３】
一実施形態では、少なくとも１種の抗体またはその結合断片は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、イムノコンジュゲート、脱フコシル化抗体、二特異性抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体または完全ヒト抗体である。
【００３４】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、ａ）配列番号１１または配列番号１９の重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号１２または配列番号２０の重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号１３または配列番号２１の重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号１４または配列番号２２の軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号１５または配列番号２３の軽鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ）配列番号１６または配列番号２４の軽鎖ＣＤＲ３配列の少なくとも１種を含む。
【００３５】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する。
【００３６】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、ａ）配列番号２７または配列番号３５の重鎖ＣＤＲ１配列；ｂ）配列番号２８または配列番号３６の重鎖ＣＤＲ２配列；ｃ）配列番号２９または配列番号３７の重鎖ＣＤＲ３配列；ｄ）配列番号３０または配列番号３８の軽鎖ＣＤＲ１配列；ｅ）配列番号３１または配列番号３９の軽鎖ＣＤＲ２配列；およびｆ）配列番号３２または配列番号４０の軽鎖ＣＤＲ３配列の少なくとも１種を含む。
【００３７】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する。
【００３８】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、ａ）重鎖ＣＤＲ１配列、配列番号４３；ｂ）重鎖ＣＤＲ２配列、配列番号４４；ｃ）重鎖ＣＤＲ３配列、配列番号４５；ｄ）軽鎖ＣＤＲ１配列、配列番号４６；ｅ）軽鎖ＣＤＲ２配列、配列番号４７；およびｆ）軽鎖ＣＤＲ３配列、配列番号４８の少なくとも１種を含む。
【００３９】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むポリペプチドと特異的に結合する。
【００４０】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、配列番号９、配列番号１７、配列番号２５、配列番号３３または配列番号４１の重鎖配列を含む。
【００４１】
一実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、配列番号１０、配列番号１８、配列番号２６、配列番号３４または配列番号４２からなる群より選択される軽鎖配列を含む。
【００４２】
一実施形態では、本発明は、がんの処置または予防を必要とする被験体においてがんを処置または予防する方法であって、少なくとも１種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片を含む組成物を被験体に投与するステップと、少なくとも１種の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片を含む組成物を被験体に投与するステップとを含む方法に関する。
【００４３】
一実施形態では、少なくとも１種の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片を含む組成物、および少なくとも１種の抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片を含む組成物は、少なくとも１種の追加の治療剤と組み合わせて被験体に投与される。
【００４４】
一実施形態では、がんは、急性リンパ芽球性；急性骨髄球性白血病；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児期；虫垂がん；基底細胞癌；胆管がん、肝外；膀胱がん；骨がん；骨肉腫および悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、成人期；脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、中枢神経系非定型奇形様／ラブドイド腫瘍、小児期；中枢神経系胚芽腫；小脳性星状細胞腫；大脳性星状細胞腫／悪性神経膠腫；頭蓋咽頭腫；上衣芽腫；上衣腫；髄芽腫；髄上皮腫；中間分化の松果体実質腫瘍；テント上未分化神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫；視路および視床下部神経膠腫；脳および脊髄腫瘍；乳がん；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍；カルチノイド腫瘍、胃腸管；中枢神経系非定型奇形様／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；中枢神経系リンパ腫；小脳性星状細胞腫大脳性星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児期；子宮頸部がん；脊索腫、小児期；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸がん；結腸直腸がん；頭蓋咽頭腫；皮膚ｔ細胞リンパ腫；食道がん；ユーイングファミリー腫瘍；性腺外生殖細胞腫瘍；肝外胆管がん；眼がん、眼球内メラノーマ；眼がん、網膜芽細胞腫；胆嚢がん；胃（gastric/stomach）がん；胃腸管カルチノイド腫瘍；胃腸管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）；生殖細胞腫瘍、頭蓋外；生殖細胞腫瘍、性腺外；生殖細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；神経膠腫、小児期脳幹；神経膠腫、小児期大脳性星状細胞腫；神経膠腫、小児期視路および視床下部；ヘアリー細胞白血病；頭頸部がん；肝細胞（肝臓）がん；組織球増殖症、ランゲルハンス細胞；ホジキンリンパ腫；下咽頭がん；視床下部および視路神経膠腫；眼球内メラノーマ；島細胞腫瘍；腎臓（腎細胞）がん；ランゲルハンス細胞組織球増殖症；喉頭がん；白血病、急性リンパ芽球性；白血病、急性骨髄球性；白血病、慢性リンパ球性；白血病、慢性骨髄性；白血病、ヘアリー細胞；口唇および口腔がん；肝臓がん；肺がん、非小細胞；肺がん、小細胞；リンパ腫、ａｉｄｓ関連；リンパ腫、バーキット；リンパ腫、皮膚ｔ細胞；リンパ腫、ホジキン；リンパ腫、非ホジキン；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ワルデンストレーム；骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫；髄芽腫；メラノーマ；メラノーマ、眼球内（眼）；メルケル細胞癌；中皮腫；原発不明の転移性扁平上皮頸部がん；口のがん；多発性内分泌腺腫症候群、（小児期）；多発性骨髄腫／形質細胞新生物；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄球性白血病、成人期急性；骨髄球性白血病、小児期急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖性障害、慢性；鼻腔および副鼻腔がん；鼻咽頭がん；神経芽細胞腫；非小細胞肺がん；口内がん；口腔がん；中咽頭がん；骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫；卵巣がん；卵巣上皮がん；卵巣生殖細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵がん；膵がん、島細胞腫瘍；乳頭腫症；副甲状腺がん；陰茎がん；咽頭がん；褐色細胞腫；傍神経節腫；中間分化の松果体実質腫瘍；松果体芽腫およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍；下垂体腫瘍；形質細胞新生物／多発性骨髄腫；胸膜肺芽細胞腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺がん；直腸がん；腎細胞（腎臓）がん；腎盂および尿管、移行細胞がん；第１５染色体上のｎｕｔ遺伝子が関与する気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺がん；肉腫、ユーイングファミリー腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫、軟部組織；肉腫、子宮；セザリー症候群；皮膚がん（非メラノーマ）；皮膚がん（メラノーマ）；皮膚癌、メルケル細胞；小細胞肺がん；小腸がん；軟部組織肉腫；扁平細胞癌、原発不明の扁平上皮頸部がん、転移性；胃（stomach/gastric）がん；テント上未分化神経外胚葉性腫瘍；ｔ細胞リンパ腫、皮膚性；精巣がん；喉のがん；胸腺腫および胸腺癌；甲状腺がん；腎盂および尿管の移行細胞がん；絨毛性腫瘍、妊娠性；尿道がん；子宮がん、子宮内膜；子宮肉腫；膣がん；外陰部がん；ワルデンストレームマクログロブリン血症；またはウィルムス腫瘍である。
【００４５】
前述の概要、および以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むと、より良く理解されると予想される。しかし、本発明が、図面に示されている実施形態の正確な配置および手段に限定されないことを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１Ａおよび１Ｂを含む図１は、レナラーゼ依存性細胞シグナル伝達の時間的経過を示す一連の画像である。図１Ａは、レナラーゼと共にインキュベートしたヒト胎児腎臓細胞（ＨＫ−２）、ならびにウエスタンブロット解析によって決定されたプロテインキナーゼＢ（ＡＫＴ）および細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）の活性化を示す；代表的ブロットを示す（ｎ＝３）；グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼローディング対照に対して正規化されたシグナル（ｎ＝３）；ＥＲＫおよびＡＫＴ（Ｔ３０８）は１〜６０分で、ＡＫＴ（Ｓ４７３）のみは３０分で統計的に有意であるベースラインを上回る変化。図１Ｂは、レナラーゼが、ＨＫ−２細胞およびヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）における抗アポトーシス分子Ｂｃｌ−２を上方調節することを示す。
【００４７】
【図２】図２は、レナラーゼアイソフォームのＲｅｎ１〜７を示す画像である：１〜１０に番号付けされているエクソン；ＲＰ−２２４、Ｒｅｎ１またはＲｅｎ２のレナラーゼペプチドアミノ酸２２４  ２３３；ＲＰ−２２０、アミノ酸２２０〜２３９；ＲＰ−Ｈ２２０、ヒスチジンをタグ付けされたＲＰ−２２０；ＲＰ−Ｓｃｒ２２０、スクランブルされたＲＰ−２２０。
【００４８】
【図３】図３は、ＥＲＫまたはＡＫＴ阻害が、レナラーゼペプチドの保護効果を抑止することを示すチャートである：偽外科手術にまたは３０分間の腎虚血および再灌流に付したＷＴマウス；腎虚血の１０分前に注射されたＲＰ−Ｈ２２０またはビヒクル（生理食塩水）。ＥＲＫ阻害剤ＰＤ９８０５９またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ阻害剤ワートマニンは、ＲＰ−Ｈ２２０の保護効果を抑止した。
【００４９】
【図４】図４は、表１におけるペプチドの配列アライメントを示す画像であり、これらのペプチドは、レナラーゼ−１または２配列に対応する。
【００５０】
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【図５Ｃ−１】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【図５Ｃ−２】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【図５Ｅ−１】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【図５Ｅ−２】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【図５Ｆ】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【図５Ｇ−１】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【図５Ｇ−２】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【図５Ｈ】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【図５Ｉ−１】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【図５Ｉ−２】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【図５Ｊ】図５Ａ〜５Ｊを含む図５は、レナラーゼに結合する抗体の配列を示す一連の画像である；相補性決定領域（ＣＤＲ）に下線が引かれている。図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ１Ｄ−２８−４重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｃおよび図５Ｄは、それぞれ１Ｄ−３７−１０重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｅおよび図５Ｆは、それぞれ１Ｆ−２６−１重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｇおよび図５Ｈは、それぞれ１Ｆ−４２−７重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。図５Ｉおよび図５Ｊは、それぞれ３Ａ−５−２重鎖および軽鎖コード配列の配列を示す。
【００５１】
【図６】図６は、がん細胞株におけるレナラーゼ発現を示すチャートである：定量的ＰＣＲによって決定され、アクチン発現に対して正規化された発現。
【００５２】
【図７】図７は、メラニン形成細胞におけるレナラーゼ発現を示す画像である：正常皮膚と比較した、母斑およびメラノーマにおけるレナラーゼ発現の著しい増加。
【００５３】
【図８】図８は、抗レナラーゼモノクローナルが、培養中のＡ３７５．Ｓ２メラノーマ細胞を阻害することを示すチャートであり、テモゾロミド（temozolamide）との相乗作用を示す：処置後７２時間でＷＳＴ−１方法によって測定した細胞生存度；ＲｅｎＡｂ−１０：レナラーゼモノクローナル、１０μ／ｍｌ；ＴＭＺ：テモゾロミド、１００または１５０μｇ／ｍｌ。
【００５４】
【図９】図９は、抗レナラーゼモノクローナルが、培養中のＡ３７５．Ｓ２メラノーマ細胞を阻害することを示すチャートであり、ダカルバジンとの相乗作用を示す：処置後７２時間でＷＳＴ−１方法によって測定した細胞生存度；ＲＮＬＳＭｏｎｏ：レナラーゼモノクローナル。
【００５５】
【図１０】図１０は、抗レナラーゼモノクローナルが、培養下のＳｋ−Ｍｅｌ−２８メラノーマ細胞を阻害することを示すチャートであり、テモゾロミドとの相乗作用を示す：処置後７２時間でＷＳＴ−１方法によって測定した細胞生存度；ＲｅｎＡｂ−１０：レナラーゼモノクローナル、１０μ／ｍｌ、ＴＭＺ１００：テモゾロミド、１００μｇ／ｍｌ。
【００５６】
【図１１】図１１は、抗レナラーゼモノクローナルが、培養中の白血病細胞株を阻害することを示すチャートである：抗レナラーゼモノクローナル抗体で２４時間処置した培養中のＣＣＬ−１１９細胞；ＷＳＴ−１方法によって測定した細胞生存（ｎ＝３、＊Ｐ、０．０５）。
【００５７】
【図１２】図１２は、抗レナラーゼポリクローナルが、膵がん細胞株ＭｉａＰａｃを阻害することを示すチャートである。
【００５８】
【図１３】図１３は、抗レナラーゼモノクローナルが、膵がん細胞株Ｐａｎｃ１を阻害することを示すチャートである。
【００５９】
【図１４】図１４は、レナラーゼモノクローナルありおよびなしの、培養中のメラノーマ細胞を比較する顕微鏡写真である。レナラーゼ抗体は、生細胞の数を著しく減少させる。
【００６０】
【図１５】図１５は、レナラーゼモノクローナル抗体の１Ｃ−２２−１および１Ｄ−３７−１０が、培養中のメラノーマ細胞を阻害することを実証するチャートである。
【００６１】
【図１６】図１６は、高いレナラーゼレベルを発現するメラノーマ患者における死亡率増加を示す一連の画像である：２６３名のメラノーマ患者由来の生検標本においてＡＱＵＡによって測定したレナラーゼ発現；Ｓ−１００およびｇｐ１００に対する抗体を使用して得た腫瘍マスク；ｘ軸に月単位の経過観察期間；Ｙ軸に示す％累積生存。
【００６２】
【図１７−１】図１７Ａ〜１７Ｄを含む図１７は、メラノーマにおけるＲＮＬＳ過剰発現、および不十分な患者転帰との関連を示す、一連の画像およびチャートである。図１７Ａは、正常ヒト皮膚（ｎ＝１５）、良性母斑（ｎ＝２９５）および悪性メラノーマ（ｎ＝２６４）の組織マイクロアレイの免疫蛍光染色のために抗ＲＮＬＳ−ｍ２８を使用して検出されたＲＮＬＳ発現を示す画像である；それぞれに対して示された代表的結果、青色：核、緑色：メラニン形成細胞、および赤色：ＲＮＬＳ。図１７Ｂは、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェア、Ｙａｌｅ  ＴＭＡを使用して定量化された蛍光強度を描写するチャートである：正常ヒト皮膚（ｎ＝１５）、良性母斑（ｎ＝２９５）および悪性メラノーマ（ｎ＝２６４）。図１７Ｃは、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェア、ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ  ＴＭＡを使用して定量化された蛍光強度を示すチャートである：正常ヒト皮膚（ｎ＝１４）、良性母斑（ｎ＝１４）、原発性メラノーマ（ｎ＝３５）および転移性メラノーマ（ｎ＝１１）、＊は、ｐ＝０．００９を示し、＊＊は、ｐ＜０．００１を示す。図１７Ｄは、メラノーマ特異的死亡のカプラン−マイヤー生存曲線を描写する；１９９７〜２００４年に収集された１１９種の系列原発性メラノーマ、メジアンＡＱＵＡスコア＝７５，７６４．４５によって低および高ＲＮＬＳ発現へと層別化した腫瘍、＊は、ｐ＝０．００８を示す。
【図１７−２】図１７Ａ〜１７Ｄを含む図１７は、メラノーマにおけるＲＮＬＳ過剰発現、および不十分な患者転帰との関連を示す、一連の画像およびチャートである。図１７Ａは、正常ヒト皮膚（ｎ＝１５）、良性母斑（ｎ＝２９５）および悪性メラノーマ（ｎ＝２６４）の組織マイクロアレイの免疫蛍光染色のために抗ＲＮＬＳ−ｍ２８を使用して検出されたＲＮＬＳ発現を示す画像である；それぞれに対して示された代表的結果、青色：核、緑色：メラニン形成細胞、および赤色：ＲＮＬＳ。図１７Ｂは、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェア、Ｙａｌｅ  ＴＭＡを使用して定量化された蛍光強度を描写するチャートである：正常ヒト皮膚（ｎ＝１５）、良性母斑（ｎ＝２９５）および悪性メラノーマ（ｎ＝２６４）。図１７Ｃは、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェア、ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ  ＴＭＡを使用して定量化された蛍光強度を示すチャートである：正常ヒト皮膚（ｎ＝１４）、良性母斑（ｎ＝１４）、原発性メラノーマ（ｎ＝３５）および転移性メラノーマ（ｎ＝１１）、＊は、ｐ＝０．００９を示し、＊＊は、ｐ＜０．００１を示す。図１７Ｄは、メラノーマ特異的死亡のカプラン−マイヤー生存曲線を描写する；１９９７〜２００４年に収集された１１９種の系列原発性メラノーマ、メジアンＡＱＵＡスコア＝７５，７６４．４５によって低および高ＲＮＬＳ発現へと層別化した腫瘍、＊は、ｐ＝０．００８を示す。
【図１７−３】図１７Ａ〜１７Ｄを含む図１７は、メラノーマにおけるＲＮＬＳ過剰発現、および不十分な患者転帰との関連を示す、一連の画像およびチャートである。図１７Ａは、正常ヒト皮膚（ｎ＝１５）、良性母斑（ｎ＝２９５）および悪性メラノーマ（ｎ＝２６４）の組織マイクロアレイの免疫蛍光染色のために抗ＲＮＬＳ−ｍ２８を使用して検出されたＲＮＬＳ発現を示す画像である；それぞれに対して示された代表的結果、青色：核、緑色：メラニン形成細胞、および赤色：ＲＮＬＳ。図１７Ｂは、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェア、Ｙａｌｅ  ＴＭＡを使用して定量化された蛍光強度を描写するチャートである：正常ヒト皮膚（ｎ＝１５）、良性母斑（ｎ＝２９５）および悪性メラノーマ（ｎ＝２６４）。図１７Ｃは、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェア、ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ  ＴＭＡを使用して定量化された蛍光強度を示すチャートである：正常ヒト皮膚（ｎ＝１４）、良性母斑（ｎ＝１４）、原発性メラノーマ（ｎ＝３５）および転移性メラノーマ（ｎ＝１１）、＊は、ｐ＝０．００９を示し、＊＊は、ｐ＜０．００１を示す。図１７Ｄは、メラノーマ特異的死亡のカプラン−マイヤー生存曲線を描写する；１９９７〜２００４年に収集された１１９種の系列原発性メラノーマ、メジアンＡＱＵＡスコア＝７５，７６４．４５によって低および高ＲＮＬＳ発現へと層別化した腫瘍、＊は、ｐ＝０．００８を示す。
【００６３】
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂを含む図１８は、ＲＮＬＳ過剰発現が、がん細胞生存を支持することを示す２枚のチャートである。図１８Ａは、血清飢餓状態にし、次いでＢＳＡ（３０ｕｇ／ｍｌ）またはｒＲＮＬＳ（３０ｕｇ／ｍｌ）で処置し、ＷＳＴ−１アッセイを使用して７２時間後に細胞生存度を測定したＡ３７５．Ｓ２、ＭｅＷｏ、Ｓｋｍｅｌ５およびＳｋｍｅｌ２８細胞を描写するチャートである；ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．００５を示す。図１８Ｂは、２４時間血清飢餓状態にし、次いで未処置の、または３０ｕｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）もしくはｒＲＮＬＳのいずれかと共に３日間インキュベートしたＡ３７５．Ｓ２細胞を描写するチャートである；総および生細胞数は、トリパンブルーおよび自動細胞計数器を使用して決定した；ｎ＝６、＊＊は、ｐ＜０．００１を示す。
【００６４】
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｄを含む図１９は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでメラノーマ細胞にとって細胞傷害性であることを示す一連の画像およびチャートである。図１９Ａは、ＲＮＬＳ特異的ｓｉＲＮＡまたは非特異的対照ｓｉＲＮＡを使用したメラノーマ細胞Ａ３７５．Ｓ２およびＳＫ−Ｍｅｌ−２８の一過性トランスフェクション後の相対的細胞生存度を描写するチャートであり、細胞生存度は、ＷＳＴ−１アッセイを使用して７２時間後に評価した；ｎ＝６、＊は、ｐ＝０．０３を示し、＊＊は、ｐ＝０．００３を示す。図１９Ｂは、相対的細胞生存度を描写する２枚のチャートを含む：左パネル：細胞を表示の抗体で７２時間処置し、ＷＳＴ−１を使用して細胞生存度を決定した；ｍ２８−ＲＮＬＳ（１Ｄ−２８−４としても公知）、ｍ３７−ＲＮＬＳ（１Ｄ−３７−１０としても公知）：ＲＮＬＳペプチドＲＰ２２０に対して作製されたモノクローナル抗体；右パネル：漸増用量のｍ２８−ＲＮＬＳで７２時間処置したＡ３７５．Ｓ２細胞、およびＷＳＴ−１アッセイにより決定した細胞生存度；ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．００５を示す。図１９Ｃは、対照ウサギＩｇＧまたはｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかとの７２時間インキュベーション後の、Ａ３７５．Ｓ２、ＳｋＭｅｌ２８およびＳｋＭｅｌ５の代表的写真を含む。図１９Ｄは、ＲＮＬＳペプチドアンタゴニスト（ＲＰ２２０Ａ）のアミノ酸（ＡＡ）配列を含む相対的細胞生存度を描写するチャートである。表示濃度のＢＳＡまたはＲＰ２２０Ａで処置したＡ３７５．Ｓ２細胞、およびＷＳＴ−１アッセイを使用して７２時間後に測定した細胞生存度；ｎ＝６、＊＊は、ｐ＜０．００５を示す。
【図１９−２】図１９Ａ〜１９Ｄを含む図１９は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでメラノーマ細胞にとって細胞傷害性であることを示す一連の画像およびチャートである。図１９Ａは、ＲＮＬＳ特異的ｓｉＲＮＡまたは非特異的対照ｓｉＲＮＡを使用したメラノーマ細胞Ａ３７５．Ｓ２およびＳＫ−Ｍｅｌ−２８の一過性トランスフェクション後の相対的細胞生存度を描写するチャートであり、細胞生存度は、ＷＳＴ−１アッセイを使用して７２時間後に評価した；ｎ＝６、＊は、ｐ＝０．０３を示し、＊＊は、ｐ＝０．００３を示す。図１９Ｂは、相対的細胞生存度を描写する２枚のチャートを含む：左パネル：細胞を表示の抗体で７２時間処置し、ＷＳＴ−１を使用して細胞生存度を決定した；ｍ２８−ＲＮＬＳ（１Ｄ−２８−４としても公知）、ｍ３７−ＲＮＬＳ（１Ｄ−３７−１０としても公知）：ＲＮＬＳペプチドＲＰ２２０に対して作製されたモノクローナル抗体；右パネル：漸増用量のｍ２８−ＲＮＬＳで７２時間処置したＡ３７５．Ｓ２細胞、およびＷＳＴ−１アッセイにより決定した細胞生存度；ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．００５を示す。図１９Ｃは、対照ウサギＩｇＧまたはｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかとの７２時間インキュベーション後の、Ａ３７５．Ｓ２、ＳｋＭｅｌ２８およびＳｋＭｅｌ５の代表的写真を含む。図１９Ｄは、ＲＮＬＳペプチドアンタゴニスト（ＲＰ２２０Ａ）のアミノ酸（ＡＡ）配列を含む相対的細胞生存度を描写するチャートである。表示濃度のＢＳＡまたはＲＰ２２０Ａで処置したＡ３７５．Ｓ２細胞、およびＷＳＴ−１アッセイを使用して７２時間後に測定した細胞生存度；ｎ＝６、＊＊は、ｐ＜０．００５を示す。
【００６５】
【図２０Ａ】図２０Ａおよび図２０Ｂを含む図２０は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ｉｎ  ｖｉｖｏでメラノーマ成長を遮断することを示すチャートおよび２枚の画像を含む。図２０Ａは、Ａ３７５．Ｓ２細胞を異種移植したヌード胸腺欠損マウスにおける腫瘍体積増加を示すチャートであり、２ｍｇ／ｋｇの陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂ、ｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかによる３日毎の処置に先立ち測定した腫瘍サイズ；１群当たりｎ＝１４；毎日の腫瘍成長速度は、以前の測定値からの腫瘍サイズの変化としてコンピュータ処理される；＊は、ｐ＜０．０５を示す。図２０Ｂは、細胞増殖マーカーＫｉ６７に関する、ｍ２８−ＲＮＬＳまたは対照ウサギＩｇＧで処置したＡ３７５．Ｓ２異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）由来の切片のＩＨＣ染色の代表的画像を含む；褐色：Ｋｉ６７陽性細胞。
【図２０Ｂ】図２０Ａおよび図２０Ｂを含む図２０は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ｉｎ  ｖｉｖｏでメラノーマ成長を遮断することを示すチャートおよび２枚の画像を含む。図２０Ａは、Ａ３７５．Ｓ２細胞を異種移植したヌード胸腺欠損マウスにおける腫瘍体積増加を示すチャートであり、２ｍｇ／ｋｇの陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂ、ｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかによる３日毎の処置に先立ち測定した腫瘍サイズ；１群当たりｎ＝１４；毎日の腫瘍成長速度は、以前の測定値からの腫瘍サイズの変化としてコンピュータ処理される；＊は、ｐ＜０．０５を示す。図２０Ｂは、細胞増殖マーカーＫｉ６７に関する、ｍ２８−ＲＮＬＳまたは対照ウサギＩｇＧで処置したＡ３７５．Ｓ２異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）由来の切片のＩＨＣ染色の代表的画像を含む；褐色：Ｋｉ６７陽性細胞。
【００６６】
【図２１−１】図２１Ａ〜２１Ｆを含む図２１は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ＲＮＬＳ発現およびＳＴＡＴ３活性化を遮断し、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す一連の画像およびチャートである。図２１Ａは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂのいずれかで処置し、免疫蛍光によってＲＮＬＳ、リン酸化ＳＴＡＴ３および総ＳＴＡＴ３に関してプローブした、異種移植腫瘍を示す一連の画像を含む；ホスホＳＴＡＴ３＝ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３；それぞれに対して示された代表的結果、青色：核、緑色：ＲＮＬＳ、および赤色：ホスホＳＴＡＴ３（左パネル）または総ＳＴＡＴ３（右パネル）。図２１Ｂは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂのいずれかで処置した異種移植腫瘍、ならびにウエスタンブロットによってＲＮＬＳ、リン酸化ＳＴＡＴ３、総ＳＴＡＴ３およびｐ２１に関してプローブした腫瘍細胞ライセートを示す画像である；ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３：チロシン７０５におけるリン酸化；代表的研究。図２１Ｃは、図２１Ｂに示す試料におけるＳＴＡＴ３タンパク質発現の定量化を描写するチャートである；総ＳＴＡＴ３に対して正規化されたｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３シグナル、タンパク質ローディング測定値に対して正規化された総ＳＴＡＴ３シグナル；ｎ＝３、＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．００５を示す。図２１Ｄは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂのいずれかで処置し、ｑＰＣＲによってヒトおよびマウスＲＮＬＳ発現に関してプローブした、異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）を示すチャートである、＊は、ｐ＜０．０５を示す。図２１Ｅは、アポトーシス細胞をマークするためのＴＵＮＥＬアッセイまたは細胞周期阻害剤ｐ２１に関する、ｍ２８−ＲＮＬＳまたは対照ウサギＩｇＧで処置したＡ３７５．Ｓ２異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）由来の切片のＩＨＣ染色の代表的画像を含む；褐色：それぞれＴＵＮＥＬまたはｐ２１陽性細胞。図２１Ｆは、抗ＲＮＬＳ抗体または対照ヤギＩｇＧで処置したＡ３７５．Ｓ２細胞を示す画像である；ウエスタンブロットによって評価したｐ３８リン酸化およびＢａｘ発現の時間的経過；ｐ−ｐ３８＝リン酸化ｐ３８；Ｂａｘ＝ｂｃｌ−２様タンパク質４。
【図２１−２】図２１Ａ〜２１Ｆを含む図２１は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ＲＮＬＳ発現およびＳＴＡＴ３活性化を遮断し、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す一連の画像およびチャートである。図２１Ａは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂのいずれかで処置し、免疫蛍光によってＲＮＬＳ、リン酸化ＳＴＡＴ３および総ＳＴＡＴ３に関してプローブした、異種移植腫瘍を示す一連の画像を含む；ホスホＳＴＡＴ３＝ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３；それぞれに対して示された代表的結果、青色：核、緑色：ＲＮＬＳ、および赤色：ホスホＳＴＡＴ３（左パネル）または総ＳＴＡＴ３（右パネル）。図２１Ｂは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂのいずれかで処置した異種移植腫瘍、ならびにウエスタンブロットによってＲＮＬＳ、リン酸化ＳＴＡＴ３、総ＳＴＡＴ３およびｐ２１に関してプローブした腫瘍細胞ライセートを示す画像である；ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３：チロシン７０５におけるリン酸化；代表的研究。図２１Ｃは、図２１Ｂに示す試料におけるＳＴＡＴ３タンパク質発現の定量化を描写するチャートである；総ＳＴＡＴ３に対して正規化されたｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３シグナル、タンパク質ローディング測定値に対して正規化された総ＳＴＡＴ３シグナル；ｎ＝３、＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．００５を示す。図２１Ｄは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂのいずれかで処置し、ｑＰＣＲによってヒトおよびマウスＲＮＬＳ発現に関してプローブした、異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）を示すチャートである、＊は、ｐ＜０．０５を示す。図２１Ｅは、アポトーシス細胞をマークするためのＴＵＮＥＬアッセイまたは細胞周期阻害剤ｐ２１に関する、ｍ２８−ＲＮＬＳまたは対照ウサギＩｇＧで処置したＡ３７５．Ｓ２異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）由来の切片のＩＨＣ染色の代表的画像を含む；褐色：それぞれＴＵＮＥＬまたはｐ２１陽性細胞。図２１Ｆは、抗ＲＮＬＳ抗体または対照ヤギＩｇＧで処置したＡ３７５．Ｓ２細胞を示す画像である；ウエスタンブロットによって評価したｐ３８リン酸化およびＢａｘ発現の時間的経過；ｐ−ｐ３８＝リン酸化ｐ３８；Ｂａｘ＝ｂｃｌ−２様タンパク質４。
【図２１−３】図２１Ａ〜２１Ｆを含む図２１は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ＲＮＬＳ発現およびＳＴＡＴ３活性化を遮断し、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す一連の画像およびチャートである。図２１Ａは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂのいずれかで処置し、免疫蛍光によってＲＮＬＳ、リン酸化ＳＴＡＴ３および総ＳＴＡＴ３に関してプローブした、異種移植腫瘍を示す一連の画像を含む；ホスホＳＴＡＴ３＝ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３；それぞれに対して示された代表的結果、青色：核、緑色：ＲＮＬＳ、および赤色：ホスホＳＴＡＴ３（左パネル）または総ＳＴＡＴ３（右パネル）。図２１Ｂは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂのいずれかで処置した異種移植腫瘍、ならびにウエスタンブロットによってＲＮＬＳ、リン酸化ＳＴＡＴ３、総ＳＴＡＴ３およびｐ２１に関してプローブした腫瘍細胞ライセートを示す画像である；ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３：チロシン７０５におけるリン酸化；代表的研究。図２１Ｃは、図２１Ｂに示す試料におけるＳＴＡＴ３タンパク質発現の定量化を描写するチャートである；総ＳＴＡＴ３に対して正規化されたｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３シグナル、タンパク質ローディング測定値に対して正規化された総ＳＴＡＴ３シグナル；ｎ＝３、＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．００５を示す。図２１Ｄは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂのいずれかで処置し、ｑＰＣＲによってヒトおよびマウスＲＮＬＳ発現に関してプローブした、異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）を示すチャートである、＊は、ｐ＜０．０５を示す。図２１Ｅは、アポトーシス細胞をマークするためのＴＵＮＥＬアッセイまたは細胞周期阻害剤ｐ２１に関する、ｍ２８−ＲＮＬＳまたは対照ウサギＩｇＧで処置したＡ３７５．Ｓ２異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）由来の切片のＩＨＣ染色の代表的画像を含む；褐色：それぞれＴＵＮＥＬまたはｐ２１陽性細胞。図２１Ｆは、抗ＲＮＬＳ抗体または対照ヤギＩｇＧで処置したＡ３７５．Ｓ２細胞を示す画像である；ウエスタンブロットによって評価したｐ３８リン酸化およびＢａｘ発現の時間的経過；ｐ−ｐ３８＝リン酸化ｐ３８；Ｂａｘ＝ｂｃｌ−２様タンパク質４。
【図２１−４】図２１Ａ〜２１Ｆを含む図２１は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ＲＮＬＳ発現およびＳＴＡＴ３活性化を遮断し、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す一連の画像およびチャートである。図２１Ａは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂのいずれかで処置し、免疫蛍光によってＲＮＬＳ、リン酸化ＳＴＡＴ３および総ＳＴＡＴ３に関してプローブした、異種移植腫瘍を示す一連の画像を含む；ホスホＳＴＡＴ３＝ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３；それぞれに対して示された代表的結果、青色：核、緑色：ＲＮＬＳ、および赤色：ホスホＳＴＡＴ３（左パネル）または総ＳＴＡＴ３（右パネル）。図２１Ｂは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂのいずれかで処置した異種移植腫瘍、ならびにウエスタンブロットによってＲＮＬＳ、リン酸化ＳＴＡＴ３、総ＳＴＡＴ３およびｐ２１に関してプローブした腫瘍細胞ライセートを示す画像である；ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３：チロシン７０５におけるリン酸化；代表的研究。図２１Ｃは、図２１Ｂに示す試料におけるＳＴＡＴ３タンパク質発現の定量化を描写するチャートである；総ＳＴＡＴ３に対して正規化されたｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３シグナル、タンパク質ローディング測定値に対して正規化された総ＳＴＡＴ３シグナル；ｎ＝３、＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＜０．００５を示す。図２１Ｄは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳモノクローナルＡｂのいずれかで処置し、ｑＰＣＲによってヒトおよびマウスＲＮＬＳ発現に関してプローブした、異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）を示すチャートである、＊は、ｐ＜０．０５を示す。図２１Ｅは、アポトーシス細胞をマークするためのＴＵＮＥＬアッセイまたは細胞周期阻害剤ｐ２１に関する、ｍ２８−ＲＮＬＳまたは対照ウサギＩｇＧで処置したＡ３７５．Ｓ２異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）由来の切片のＩＨＣ染色の代表的画像を含む；褐色：それぞれＴＵＮＥＬまたはｐ２１陽性細胞。図２１Ｆは、抗ＲＮＬＳ抗体または対照ヤギＩｇＧで処置したＡ３７５．Ｓ２細胞を示す画像である；ウエスタンブロットによって評価したｐ３８リン酸化およびＢａｘ発現の時間的経過；ｐ−ｐ３８＝リン酸化ｐ３８；Ｂａｘ＝ｂｃｌ−２様タンパク質４。
【００６７】
【図２２−１】図２２Ａ〜２２Ｃを含む図２２は、ＲＮＬＳが、メラノーマにおけるＣＤ１６３＋  ＴＡＭにおいて発現されることを示す一連の画像およびチャートである。図２２Ａは、次のものを示す画像を含む：上パネル：ＲＮＬＳおよび汎マクロファージマーカーＣＤ６８の同時発現に関してＩＦによって試験された、組織マイクロアレイヒトメラノーマ試料；青色：核、緑色：ＲＮＬＳ、および赤色：全マクロファージ；ＤＡＰＩ：核染色、ＲＮＬＳ−ＣＤ６８：統合されたＲＮＬＳおよびＣＤ６８染色；中央パネル：ＲＮＬＳおよび選択的活性化マクロファージ（Ｍ２）マーカーＣＤ１６３の同時発現に関してＩＦによって試験された、メラノーマ試料；青色：核、緑色：ＲＮＬＳ、および赤色：Ｍ２マクロファージ；ＤＡＰＩ：核染色、ＲＮＬＳ−ＣＤ１６３：統合されたＲＮＬＳおよびＣＤ１６３染色。ＲＮＬＳおよびＣＤ１６３の顕著な同時発現が認められる；下パネル：ＲＮＬＳおよび古典的活性化マクロファージ（Ｍ１）マーカーＣＤ８６の同時発現に関してＩＦによって試験された、メラノーマ試料；青色：核、緑色：ＲＮＬＳ、および赤色：Ｍ１マクロファージ；ＤＡＰＩ：核染色、ＲＮＬＳ−ＣＤ１６３：統合されたＲＮＬＳおよびＣＤ８６染色。ＲＮＬＳおよびＣＤ１８６の顕著な同時発現は認められない。図２２Ｂは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかで処置し、免疫蛍光によってＲＮＬＳおよびＭ２  ＴＡＭ（ＣＤ１６３＋細胞）に関してプローブした、異種移植腫瘍を示す２枚の画像を含む；それぞれに対して示された代表的結果、緑色：Ｍ２マクロファージ、および赤色：ＲＮＬＳ。ｍ２８−ＲＮＬＳ処置は、ＣＤ１６３＋  ＴＡＭおよびＲＮＬＳ発現を減少させる。図２２Ｃは、ｍ２８−ＲＮＬＳ−  ＴＡＭの提案される作用機構を描写する  ：腫瘍関連マクロファージ、ＣＤ１６３：選択的活性化マクロファージ（Ｍ２）マーカー、ＣＤ８６：古典的活性化マクロファージ（Ｍ１）マーカー、ＲＮＬＳ：レナラーゼ、ｍ２８−ＲＮＬＳ：抗レナラーゼモノクローナル抗体、ｔ−ＳＴＡＴ３：総ＳＴＡＴ３、ｐ−ＳＴＡＴ３：リン酸化ＳＴＡＴ３。
【図２２−２】図２２Ａ〜２２Ｃを含む図２２は、ＲＮＬＳが、メラノーマにおけるＣＤ１６３＋  ＴＡＭにおいて発現されることを示す一連の画像およびチャートである。図２２Ａは、次のものを示す画像を含む：上パネル：ＲＮＬＳおよび汎マクロファージマーカーＣＤ６８の同時発現に関してＩＦによって試験された、組織マイクロアレイヒトメラノーマ試料；青色：核、緑色：ＲＮＬＳ、および赤色：全マクロファージ；ＤＡＰＩ：核染色、ＲＮＬＳ−ＣＤ６８：統合されたＲＮＬＳおよびＣＤ６８染色；中央パネル：ＲＮＬＳおよび選択的活性化マクロファージ（Ｍ２）マーカーＣＤ１６３の同時発現に関してＩＦによって試験された、メラノーマ試料；青色：核、緑色：ＲＮＬＳ、および赤色：Ｍ２マクロファージ；ＤＡＰＩ：核染色、ＲＮＬＳ−ＣＤ１６３：統合されたＲＮＬＳおよびＣＤ１６３染色。ＲＮＬＳおよびＣＤ１６３の顕著な同時発現が認められる；下パネル：ＲＮＬＳおよび古典的活性化マクロファージ（Ｍ１）マーカーＣＤ８６の同時発現に関してＩＦによって試験された、メラノーマ試料；青色：核、緑色：ＲＮＬＳ、および赤色：Ｍ１マクロファージ；ＤＡＰＩ：核染色、ＲＮＬＳ−ＣＤ１６３：統合されたＲＮＬＳおよびＣＤ８６染色。ＲＮＬＳおよびＣＤ１８６の顕著な同時発現は認められない。図２２Ｂは、陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかで処置し、免疫蛍光によってＲＮＬＳおよびＭ２  ＴＡＭ（ＣＤ１６３＋細胞）に関してプローブした、異種移植腫瘍を示す２枚の画像を含む；それぞれに対して示された代表的結果、緑色：Ｍ２マクロファージ、および赤色：ＲＮＬＳ。ｍ２８−ＲＮＬＳ処置は、ＣＤ１６３＋  ＴＡＭおよびＲＮＬＳ発現を減少させる。図２２Ｃは、ｍ２８−ＲＮＬＳ−  ＴＡＭの提案される作用機構を描写する  ：腫瘍関連マクロファージ、ＣＤ１６３：選択的活性化マクロファージ（Ｍ２）マーカー、ＣＤ８６：古典的活性化マクロファージ（Ｍ１）マーカー、ＲＮＬＳ：レナラーゼ、ｍ２８−ＲＮＬＳ：抗レナラーゼモノクローナル抗体、ｔ−ＳＴＡＴ３：総ＳＴＡＴ３、ｐ−ＳＴＡＴ３：リン酸化ＳＴＡＴ３。
【００６８】
【図２３−１】図２３Ａ〜２３Ｅを含む図２３は、一部のがんにおけるＲＮＬＳ発現、およびＰＤＡＣにおける不十分な患者転帰との関連を示す一連の画像およびチャートである。図２３Ａは、１５種の異なる腫瘍型由来の１８２種のヒト腫瘍試料（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するｃＤＮＡアレイにおける、ｑＰＣＲによって測定されたＲＮＬＳ  ｍＲＮＡレベルを示すチャートである；＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＝０．０００１を示す。図２３Ｂは、正常膵臓（ｎ＝６）、膵管腺癌（ｎ＝１１）および膵神経内分泌腫瘍（ｎ＝２３）における、ｑＰＣＲによって測定されたＲＮＬＳ  ｍＲＮＡレベルを示すチャートである；＊は、ｐ＝０．０５を示し；＊＊は、ｐ＝０．０００１７を示す。図２３Ｃは、正常ヒト膵組織（左パネル、ｎ＝９０）、管腺癌（グレード１〜４、各ｎ＝２０）における、ｍ２８−ＲＮＬＳを使用した免疫組織化学によって検出されたＲＮＬＳタンパク質発現を示す画像である；それぞれに対して示された代表的結果；ＲＮＬＳタンパク質は褐色に染色。図２３Ｄは、正常ヒト膵組織（左パネル、ｎ＝９０）、腺管癌（中央パネル、ｎ＝９０）の組織マイクロアレイの免疫蛍光染色のための抗ＲＮＬＳ−ｍ２８を使用して検出されたＲＮＬＳ発現を示す；それぞれに対して示された代表的結果、青色：核、緑色：サイトケラチン、および赤色：ＲＮＬＳ；右パネル：ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェアを使用して定量化された蛍光強度、正常ヒト膵組織（ｎ＝９０）、腺管癌（ｎ＝９０）、＊＊＊は、ｐ＝０．０００１３を示す。図２３Ｅは、生存率についてのカプラン−マイヤー生存曲線を示す；低（ｎ＝３５、ＲＮＬＳ  ＡＱＵＡスコア＜メジアン）および高（ｎ＝３４、ＲＮＬＳ  ＡＱＵＡスコア＞メジアン）ＲＮＬＳ発現へと層別化された６９種のＰＤＡＣのＢｉｏｍａｘコホート、＊は、ｐ＝０．０００１を示す。
【図２３−２】図２３Ａ〜２３Ｅを含む図２３は、一部のがんにおけるＲＮＬＳ発現、およびＰＤＡＣにおける不十分な患者転帰との関連を示す一連の画像およびチャートである。図２３Ａは、１５種の異なる腫瘍型由来の１８２種のヒト腫瘍試料（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するｃＤＮＡアレイにおける、ｑＰＣＲによって測定されたＲＮＬＳ  ｍＲＮＡレベルを示すチャートである；＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＝０．０００１を示す。図２３Ｂは、正常膵臓（ｎ＝６）、膵管腺癌（ｎ＝１１）および膵神経内分泌腫瘍（ｎ＝２３）における、ｑＰＣＲによって測定されたＲＮＬＳ  ｍＲＮＡレベルを示すチャートである；＊は、ｐ＝０．０５を示し；＊＊は、ｐ＝０．０００１７を示す。図２３Ｃは、正常ヒト膵組織（左パネル、ｎ＝９０）、管腺癌（グレード１〜４、各ｎ＝２０）における、ｍ２８−ＲＮＬＳを使用した免疫組織化学によって検出されたＲＮＬＳタンパク質発現を示す画像である；それぞれに対して示された代表的結果；ＲＮＬＳタンパク質は褐色に染色。図２３Ｄは、正常ヒト膵組織（左パネル、ｎ＝９０）、腺管癌（中央パネル、ｎ＝９０）の組織マイクロアレイの免疫蛍光染色のための抗ＲＮＬＳ−ｍ２８を使用して検出されたＲＮＬＳ発現を示す；それぞれに対して示された代表的結果、青色：核、緑色：サイトケラチン、および赤色：ＲＮＬＳ；右パネル：ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェアを使用して定量化された蛍光強度、正常ヒト膵組織（ｎ＝９０）、腺管癌（ｎ＝９０）、＊＊＊は、ｐ＝０．０００１３を示す。図２３Ｅは、生存率についてのカプラン−マイヤー生存曲線を示す；低（ｎ＝３５、ＲＮＬＳ  ＡＱＵＡスコア＜メジアン）および高（ｎ＝３４、ＲＮＬＳ  ＡＱＵＡスコア＞メジアン）ＲＮＬＳ発現へと層別化された６９種のＰＤＡＣのＢｉｏｍａｘコホート、＊は、ｐ＝０．０００１を示す。
【図２３−３】図２３Ａ〜２３Ｅを含む図２３は、一部のがんにおけるＲＮＬＳ発現、およびＰＤＡＣにおける不十分な患者転帰との関連を示す一連の画像およびチャートである。図２３Ａは、１５種の異なる腫瘍型由来の１８２種のヒト腫瘍試料（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するｃＤＮＡアレイにおける、ｑＰＣＲによって測定されたＲＮＬＳ  ｍＲＮＡレベルを示すチャートである；＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＝０．０００１を示す。図２３Ｂは、正常膵臓（ｎ＝６）、膵管腺癌（ｎ＝１１）および膵神経内分泌腫瘍（ｎ＝２３）における、ｑＰＣＲによって測定されたＲＮＬＳ  ｍＲＮＡレベルを示すチャートである；＊は、ｐ＝０．０５を示し；＊＊は、ｐ＝０．０００１７を示す。図２３Ｃは、正常ヒト膵組織（左パネル、ｎ＝９０）、管腺癌（グレード１〜４、各ｎ＝２０）における、ｍ２８−ＲＮＬＳを使用した免疫組織化学によって検出されたＲＮＬＳタンパク質発現を示す画像である；それぞれに対して示された代表的結果；ＲＮＬＳタンパク質は褐色に染色。図２３Ｄは、正常ヒト膵組織（左パネル、ｎ＝９０）、腺管癌（中央パネル、ｎ＝９０）の組織マイクロアレイの免疫蛍光染色のための抗ＲＮＬＳ−ｍ２８を使用して検出されたＲＮＬＳ発現を示す；それぞれに対して示された代表的結果、青色：核、緑色：サイトケラチン、および赤色：ＲＮＬＳ；右パネル：ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェアを使用して定量化された蛍光強度、正常ヒト膵組織（ｎ＝９０）、腺管癌（ｎ＝９０）、＊＊＊は、ｐ＝０．０００１３を示す。図２３Ｅは、生存率についてのカプラン−マイヤー生存曲線を示す；低（ｎ＝３５、ＲＮＬＳ  ＡＱＵＡスコア＜メジアン）および高（ｎ＝３４、ＲＮＬＳ  ＡＱＵＡスコア＞メジアン）ＲＮＬＳ発現へと層別化された６９種のＰＤＡＣのＢｉｏｍａｘコホート、＊は、ｐ＝０．０００１を示す。
【図２３−４】図２３Ａ〜２３Ｅを含む図２３は、一部のがんにおけるＲＮＬＳ発現、およびＰＤＡＣにおける不十分な患者転帰との関連を示す一連の画像およびチャートである。図２３Ａは、１５種の異なる腫瘍型由来の１８２種のヒト腫瘍試料（ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含有するｃＤＮＡアレイにおける、ｑＰＣＲによって測定されたＲＮＬＳ  ｍＲＮＡレベルを示すチャートである；＊は、ｐ＜０．０５を示し、＊＊は、ｐ＝０．０００１を示す。図２３Ｂは、正常膵臓（ｎ＝６）、膵管腺癌（ｎ＝１１）および膵神経内分泌腫瘍（ｎ＝２３）における、ｑＰＣＲによって測定されたＲＮＬＳ  ｍＲＮＡレベルを示すチャートである；＊は、ｐ＝０．０５を示し；＊＊は、ｐ＝０．０００１７を示す。図２３Ｃは、正常ヒト膵組織（左パネル、ｎ＝９０）、管腺癌（グレード１〜４、各ｎ＝２０）における、ｍ２８−ＲＮＬＳを使用した免疫組織化学によって検出されたＲＮＬＳタンパク質発現を示す画像である；それぞれに対して示された代表的結果；ＲＮＬＳタンパク質は褐色に染色。図２３Ｄは、正常ヒト膵組織（左パネル、ｎ＝９０）、腺管癌（中央パネル、ｎ＝９０）の組織マイクロアレイの免疫蛍光染色のための抗ＲＮＬＳ−ｍ２８を使用して検出されたＲＮＬＳ発現を示す；それぞれに対して示された代表的結果、青色：核、緑色：サイトケラチン、および赤色：ＲＮＬＳ；右パネル：ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）ソフトウェアを使用して定量化された蛍光強度、正常ヒト膵組織（ｎ＝９０）、腺管癌（ｎ＝９０）、＊＊＊は、ｐ＝０．０００１３を示す。図２３Ｅは、生存率についてのカプラン−マイヤー生存曲線を示す；低（ｎ＝３５、ＲＮＬＳ  ＡＱＵＡスコア＜メジアン）および高（ｎ＝３４、ＲＮＬＳ  ＡＱＵＡスコア＞メジアン）ＲＮＬＳ発現へと層別化された６９種のＰＤＡＣのＢｉｏｍａｘコホート、＊は、ｐ＝０．０００１を示す。
【００６９】
【図２４−１】図２４Ａ〜２４Ｄを含む図２４は、ＲＮＬＳ過剰発現が、がん細胞生存を支持することを示す一連のチャートである。図２４Ａは、ＰＤＡＣＣ株のＢｘＰＣ３、Ｐａｎｃ１およびＭｉａＰａＣａ２を４８時間血清飢餓状態にし、次いで３０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはｒＲＮＬＳのいずれかと共に３日間インキュベートしたことを示す；トリパンブルーおよび自動細胞計数器を使用して決定した、総および生細胞数；ｎ＝４、＊＊は、ｐ＜０．０００１を示す。図２４Ｂは、対照と比べて細胞生存度を描写するチャートである：血清飢餓状態にされ、次いでＭＥＫ１阻害剤Ｕ０１２６による前処置ありおよびなしで、ＢＳＡ（３０μｇ／ｍｌ）またはｒＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）で処置したＭｉａＰａＣａ２細胞、ならびにＷＳＴ−１アッセイを使用して、７２時間後に測定された細胞生存度；ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．００５を示す。図２４Ｃは、ＰＭＣＡ４ｂ発現のｓｉＲＮＡ媒介性阻害が、ＲＮＬＳ媒介性ＭＡＰＫシグナル伝達を遮断することを示す画像およびチャートを含む；左および中央パネル：非標的化またはＰＭＣＡ４ｂ  ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトし、無血清培地において３日間維持し、２５μｇのＢＳＡまたは２５μｇのＲＮＬＳペプチドＲＰ−２２０のいずれかで表示時間処置したＭｉａＰａＣａ２細胞；ウエスタンブロットおよび代表的イムノブロットによって評価したＲＰ−２２０媒介性ＥＲＫおよびＳＴＡＴ３活性化を示す；；ｐ−ＥＲＫ＝リン酸化ＥＲＫ、ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３＝リン酸化ＳＴＡＴ３、ｐ−Ｓ７２７−ＳＴＡＴ３＝リン酸化ＳＴＡＴ３、ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン、ＲＰ−２２０＝ＲＮＬＳペプチドアゴニスト；右パネル：グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ローディング対照に対して正規化されたシグナルである、リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）の定量化；ｎ＝３、＊＝Ｐ＜０．０５。図２４Ｄは、ＢＳＡ（３０μｇ／ｍｌ）またはｒＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）で処置したＭｉａＰａＣａ２細胞の蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）解析を示すグラフである、ｎ＝３。
【図２４−２】図２４Ａ〜２４Ｄを含む図２４は、ＲＮＬＳ過剰発現が、がん細胞生存を支持することを示す一連のチャートである。図２４Ａは、ＰＤＡＣＣ株のＢｘＰＣ３、Ｐａｎｃ１およびＭｉａＰａＣａ２を４８時間血清飢餓状態にし、次いで３０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはｒＲＮＬＳのいずれかと共に３日間インキュベートしたことを示す；トリパンブルーおよび自動細胞計数器を使用して決定した、総および生細胞数；ｎ＝４、＊＊は、ｐ＜０．０００１を示す。図２４Ｂは、対照と比べて細胞生存度を描写するチャートである：血清飢餓状態にされ、次いでＭＥＫ１阻害剤Ｕ０１２６による前処置ありおよびなしで、ＢＳＡ（３０μｇ／ｍｌ）またはｒＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）で処置したＭｉａＰａＣａ２細胞、ならびにＷＳＴ−１アッセイを使用して、７２時間後に測定された細胞生存度；ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．００５を示す。図２４Ｃは、ＰＭＣＡ４ｂ発現のｓｉＲＮＡ媒介性阻害が、ＲＮＬＳ媒介性ＭＡＰＫシグナル伝達を遮断することを示す画像およびチャートを含む；左および中央パネル：非標的化またはＰＭＣＡ４ｂ  ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトし、無血清培地において３日間維持し、２５μｇのＢＳＡまたは２５μｇのＲＮＬＳペプチドＲＰ−２２０のいずれかで表示時間処置したＭｉａＰａＣａ２細胞；ウエスタンブロットおよび代表的イムノブロットによって評価したＲＰ−２２０媒介性ＥＲＫおよびＳＴＡＴ３活性化を示す；；ｐ−ＥＲＫ＝リン酸化ＥＲＫ、ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３＝リン酸化ＳＴＡＴ３、ｐ−Ｓ７２７−ＳＴＡＴ３＝リン酸化ＳＴＡＴ３、ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン、ＲＰ−２２０＝ＲＮＬＳペプチドアゴニスト；右パネル：グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ローディング対照に対して正規化されたシグナルである、リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）の定量化；ｎ＝３、＊＝Ｐ＜０．０５。図２４Ｄは、ＢＳＡ（３０μｇ／ｍｌ）またはｒＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）で処置したＭｉａＰａＣａ２細胞の蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）解析を示すグラフである、ｎ＝３。
【図２４−３】図２４Ａ〜２４Ｄを含む図２４は、ＲＮＬＳ過剰発現が、がん細胞生存を支持することを示す一連のチャートである。図２４Ａは、ＰＤＡＣＣ株のＢｘＰＣ３、Ｐａｎｃ１およびＭｉａＰａＣａ２を４８時間血清飢餓状態にし、次いで３０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはｒＲＮＬＳのいずれかと共に３日間インキュベートしたことを示す；トリパンブルーおよび自動細胞計数器を使用して決定した、総および生細胞数；ｎ＝４、＊＊は、ｐ＜０．０００１を示す。図２４Ｂは、対照と比べて細胞生存度を描写するチャートである：血清飢餓状態にされ、次いでＭＥＫ１阻害剤Ｕ０１２６による前処置ありおよびなしで、ＢＳＡ（３０μｇ／ｍｌ）またはｒＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）で処置したＭｉａＰａＣａ２細胞、ならびにＷＳＴ−１アッセイを使用して、７２時間後に測定された細胞生存度；ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．００５を示す。図２４Ｃは、ＰＭＣＡ４ｂ発現のｓｉＲＮＡ媒介性阻害が、ＲＮＬＳ媒介性ＭＡＰＫシグナル伝達を遮断することを示す画像およびチャートを含む；左および中央パネル：非標的化またはＰＭＣＡ４ｂ  ｓｉＲＮＡのいずれかをトランスフェクトし、無血清培地において３日間維持し、２５μｇのＢＳＡまたは２５μｇのＲＮＬＳペプチドＲＰ−２２０のいずれかで表示時間処置したＭｉａＰａＣａ２細胞；ウエスタンブロットおよび代表的イムノブロットによって評価したＲＰ−２２０媒介性ＥＲＫおよびＳＴＡＴ３活性化を示す；；ｐ−ＥＲＫ＝リン酸化ＥＲＫ、ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３＝リン酸化ＳＴＡＴ３、ｐ−Ｓ７２７−ＳＴＡＴ３＝リン酸化ＳＴＡＴ３、ＢＳＡ＝ウシ血清アルブミン、ＲＰ−２２０＝ＲＮＬＳペプチドアゴニスト；右パネル：グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ローディング対照に対して正規化されたシグナルである、リン酸化ＥＲＫ（ｐ−ＥＲＫ）の定量化；ｎ＝３、＊＝Ｐ＜０．０５。図２４Ｄは、ＢＳＡ（３０μｇ／ｍｌ）またはｒＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）で処置したＭｉａＰａＣａ２細胞の蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）解析を示すグラフである、ｎ＝３。
【００７０】
【図２５−１】図２５Ａ〜２５Ｅを含む図２５は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでがん細胞にとって細胞傷害性であることを示す一連のチャートおよび画像である。図２５Ａは、ＲＮＬＳ特異的ｓｉＲＮＡまたは非特異的対照ｓｉＲＮＡを使用してＰａｎｃ１細胞を一過性トランスフェクションし、ＷＳＴ−１試薬を使用して９６時間後に細胞生存度をアッセイした後の相対的細胞生存度を示すチャートである；ｎ＝６、＊＊は、ｐ＜０．００１を示す。図２５Ｂは、細胞を表示の抗体で７２時間処置し、ＷＳＴ−１を使用して細胞生存度を決定した場合の、相対的細胞生存度を示すチャートである；ｍ２８−ＲＮＬＳおよびｍ３７−ＲＮＬＳ：ＲＮＬＳペプチドＲＰ２２０に対して作製されたモノクローナル抗体、ａｂ３１２９１：ＲＰ−２２０の部分的配列に対して作製されたＡｂｃａｍポリクローナル抗体；ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．００５を示す。図２５Ｃは、ｍ２８−ＲＮＬＳとの３日間インキュベーション後のＭｉａＰａＣａ２細胞の代表的写真を示す、ｎ＝１０。図２５Ｄは、胸腺欠損ヌードマウスが、ＲＮＬＳ  ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ＲＮＬＳ）または対照（ｓｈ−対照）を形質導入されたＰａｎｃ１細胞の皮下注射を受けた後の腫瘍体積増加を示すチャートである；最大３０日間、２３日毎に測定した腫瘍体積、各ｎ＝６；＊は、ｐ＜０．０５を示す。図２５Ｅは、ヌードマウスにＢｘＰＣ３を異種移植した後の腫瘍体積増加を示すチャートである；２ｍｇ／ｋｇの陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかによる３〜４日毎の処置に先立ち測定した腫瘍体積、ｎ＝１０、＊は、ｐ＜０．０５を示す。
【図２５−２】図２５Ａ〜２５Ｅを含む図２５は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでがん細胞にとって細胞傷害性であることを示す一連のチャートおよび画像である。図２５Ａは、ＲＮＬＳ特異的ｓｉＲＮＡまたは非特異的対照ｓｉＲＮＡを使用してＰａｎｃ１細胞を一過性トランスフェクションし、ＷＳＴ−１試薬を使用して９６時間後に細胞生存度をアッセイした後の相対的細胞生存度を示すチャートである；ｎ＝６、＊＊は、ｐ＜０．００１を示す。図２５Ｂは、細胞を表示の抗体で７２時間処置し、ＷＳＴ−１を使用して細胞生存度を決定した場合の、相対的細胞生存度を示すチャートである；ｍ２８−ＲＮＬＳおよびｍ３７−ＲＮＬＳ：ＲＮＬＳペプチドＲＰ２２０に対して作製されたモノクローナル抗体、ａｂ３１２９１：ＲＰ−２２０の部分的配列に対して作製されたＡｂｃａｍポリクローナル抗体；ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．００５を示す。図２５Ｃは、ｍ２８−ＲＮＬＳとの３日間インキュベーション後のＭｉａＰａＣａ２細胞の代表的写真を示す、ｎ＝１０。図２５Ｄは、胸腺欠損ヌードマウスが、ＲＮＬＳ  ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ＲＮＬＳ）または対照（ｓｈ−対照）を形質導入されたＰａｎｃ１細胞の皮下注射を受けた後の腫瘍体積増加を示すチャートである；最大３０日間、２３日毎に測定した腫瘍体積、各ｎ＝６；＊は、ｐ＜０．０５を示す。図２５Ｅは、ヌードマウスにＢｘＰＣ３を異種移植した後の腫瘍体積増加を示すチャートである；２ｍｇ／ｋｇの陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかによる３〜４日毎の処置に先立ち測定した腫瘍体積、ｎ＝１０、＊は、ｐ＜０．０５を示す。
【図２５−３】図２５Ａ〜２５Ｅを含む図２５は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでがん細胞にとって細胞傷害性であることを示す一連のチャートおよび画像である。図２５Ａは、ＲＮＬＳ特異的ｓｉＲＮＡまたは非特異的対照ｓｉＲＮＡを使用してＰａｎｃ１細胞を一過性トランスフェクションし、ＷＳＴ−１試薬を使用して９６時間後に細胞生存度をアッセイした後の相対的細胞生存度を示すチャートである；ｎ＝６、＊＊は、ｐ＜０．００１を示す。図２５Ｂは、細胞を表示の抗体で７２時間処置し、ＷＳＴ−１を使用して細胞生存度を決定した場合の、相対的細胞生存度を示すチャートである；ｍ２８−ＲＮＬＳおよびｍ３７−ＲＮＬＳ：ＲＮＬＳペプチドＲＰ２２０に対して作製されたモノクローナル抗体、ａｂ３１２９１：ＲＰ−２２０の部分的配列に対して作製されたＡｂｃａｍポリクローナル抗体；ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．００５を示す。図２５Ｃは、ｍ２８−ＲＮＬＳとの３日間インキュベーション後のＭｉａＰａＣａ２細胞の代表的写真を示す、ｎ＝１０。図２５Ｄは、胸腺欠損ヌードマウスが、ＲＮＬＳ  ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ＲＮＬＳ）または対照（ｓｈ−対照）を形質導入されたＰａｎｃ１細胞の皮下注射を受けた後の腫瘍体積増加を示すチャートである；最大３０日間、２３日毎に測定した腫瘍体積、各ｎ＝６；＊は、ｐ＜０．０５を示す。図２５Ｅは、ヌードマウスにＢｘＰＣ３を異種移植した後の腫瘍体積増加を示すチャートである；２ｍｇ／ｋｇの陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかによる３〜４日毎の処置に先立ち測定した腫瘍体積、ｎ＝１０、＊は、ｐ＜０．０５を示す。
【図２５−４】図２５Ａ〜２５Ｅを含む図２５は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでがん細胞にとって細胞傷害性であることを示す一連のチャートおよび画像である。図２５Ａは、ＲＮＬＳ特異的ｓｉＲＮＡまたは非特異的対照ｓｉＲＮＡを使用してＰａｎｃ１細胞を一過性トランスフェクションし、ＷＳＴ−１試薬を使用して９６時間後に細胞生存度をアッセイした後の相対的細胞生存度を示すチャートである；ｎ＝６、＊＊は、ｐ＜０．００１を示す。図２５Ｂは、細胞を表示の抗体で７２時間処置し、ＷＳＴ−１を使用して細胞生存度を決定した場合の、相対的細胞生存度を示すチャートである；ｍ２８−ＲＮＬＳおよびｍ３７−ＲＮＬＳ：ＲＮＬＳペプチドＲＰ２２０に対して作製されたモノクローナル抗体、ａｂ３１２９１：ＲＰ−２２０の部分的配列に対して作製されたＡｂｃａｍポリクローナル抗体；ｎ＝６、＊は、ｐ＜０．００５を示す。図２５Ｃは、ｍ２８−ＲＮＬＳとの３日間インキュベーション後のＭｉａＰａＣａ２細胞の代表的写真を示す、ｎ＝１０。図２５Ｄは、胸腺欠損ヌードマウスが、ＲＮＬＳ  ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ＲＮＬＳ）または対照（ｓｈ−対照）を形質導入されたＰａｎｃ１細胞の皮下注射を受けた後の腫瘍体積増加を示すチャートである；最大３０日間、２３日毎に測定した腫瘍体積、各ｎ＝６；＊は、ｐ＜０．０５を示す。図２５Ｅは、ヌードマウスにＢｘＰＣ３を異種移植した後の腫瘍体積増加を示すチャートである；２ｍｇ／ｋｇの陰性対照としてのウサギＩｇＧまたはｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかによる３〜４日毎の処置に先立ち測定した腫瘍体積、ｎ＝１０、＊は、ｐ＜０．０５を示す。
【００７１】
【図２６−１】図２６Ａ〜２６Ｅを含む図２６は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す一連の画像およびチャートである。図２６Ａは、抗ｍ２８−ＲＮＬＳまたは対照ウサギＩｇＧで処置したＢｘＰＣ３異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）由来の切片のＴＵＮＥＬ染色の代表的画像を示す；矢印：ＴＵＮＥＬ陽性細胞。図２６Ｂは、ｍ２８−ＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）または１００μＭエトポシド（陽性対照）のいずれかで４日間処置した培養中のＰａｎｃ１細胞のＦＡＣＳ解析を描写するチャートである；ｎ＝３、＊は、ｐ＜０．０５を示す。図２６Ｃは、ポリクローナルａｂ３１２９１または陰性対照としてのヤギＩｇＧで処置したＰａｎｃ１細胞、ならびにウエスタンブロットによってｐ３８およびＢａｘ活性化に関してプローブした細胞ライセートを示す画像である。図２６Ｄは、細胞増殖マーカーｋｉ６７および細胞周期阻害剤ｐ２１に関する、抗ｍ２８−ＲＮＬＳまたは対照ウサギＩｇＧで処置したＢｘＰＣ３異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）由来の切片のＩＨＣ染色の代表的画像を示す。図２６Ｅは、ＦＡＣＳ解析によって決定された、Ｐａｎｃ１細胞の細胞周期に対するｍ２８−ＲＮＬＳの効果を示すチャートである；緑色曲線：処置なし、紫色曲線：ウサギＩｇＧ、赤色曲線：ｍ２８−ＲＮＬＳ  ３０μｇ／ｍｌ。
【図２６−２】図２６Ａ〜２６Ｅを含む図２６は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す一連の画像およびチャートである。図２６Ａは、抗ｍ２８−ＲＮＬＳまたは対照ウサギＩｇＧで処置したＢｘＰＣ３異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）由来の切片のＴＵＮＥＬ染色の代表的画像を示す；矢印：ＴＵＮＥＬ陽性細胞。図２６Ｂは、ｍ２８−ＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）または１００μＭエトポシド（陽性対照）のいずれかで４日間処置した培養中のＰａｎｃ１細胞のＦＡＣＳ解析を描写するチャートである；ｎ＝３、＊は、ｐ＜０．０５を示す。図２６Ｃは、ポリクローナルａｂ３１２９１または陰性対照としてのヤギＩｇＧで処置したＰａｎｃ１細胞、ならびにウエスタンブロットによってｐ３８およびＢａｘ活性化に関してプローブした細胞ライセートを示す画像である。図２６Ｄは、細胞増殖マーカーｋｉ６７および細胞周期阻害剤ｐ２１に関する、抗ｍ２８−ＲＮＬＳまたは対照ウサギＩｇＧで処置したＢｘＰＣ３異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）由来の切片のＩＨＣ染色の代表的画像を示す。図２６Ｅは、ＦＡＣＳ解析によって決定された、Ｐａｎｃ１細胞の細胞周期に対するｍ２８−ＲＮＬＳの効果を示すチャートである；緑色曲線：処置なし、紫色曲線：ウサギＩｇＧ、赤色曲線：ｍ２８−ＲＮＬＳ  ３０μｇ／ｍｌ。
【図２６−３】図２６Ａ〜２６Ｅを含む図２６は、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導することを示す一連の画像およびチャートである。図２６Ａは、抗ｍ２８−ＲＮＬＳまたは対照ウサギＩｇＧで処置したＢｘＰＣ３異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）由来の切片のＴＵＮＥＬ染色の代表的画像を示す；矢印：ＴＵＮＥＬ陽性細胞。図２６Ｂは、ｍ２８−ＲＮＬＳ（３０μｇ／ｍｌ）または１００μＭエトポシド（陽性対照）のいずれかで４日間処置した培養中のＰａｎｃ１細胞のＦＡＣＳ解析を描写するチャートである；ｎ＝３、＊は、ｐ＜０．０５を示す。図２６Ｃは、ポリクローナルａｂ３１２９１または陰性対照としてのヤギＩｇＧで処置したＰａｎｃ１細胞、ならびにウエスタンブロットによってｐ３８およびＢａｘ活性化に関してプローブした細胞ライセートを示す画像である。図２６Ｄは、細胞増殖マーカーｋｉ６７および細胞周期阻害剤ｐ２１に関する、抗ｍ２８−ＲＮＬＳまたは対照ウサギＩｇＧで処置したＢｘＰＣ３異種移植腫瘍（各ｎ＝１４）由来の切片のＩＨＣ染色の代表的画像を示す。図２６Ｅは、ＦＡＣＳ解析によって決定された、Ｐａｎｃ１細胞の細胞周期に対するｍ２８−ＲＮＬＳの効果を示すチャートである；緑色曲線：処置なし、紫色曲線：ウサギＩｇＧ、赤色曲線：ｍ２８−ＲＮＬＳ  ３０μｇ／ｍｌ。
【００７２】
【図２７−１】図２７Ａ〜２７Ｅを含む図２７は、ＲＮＬＳおよびＳＴＡＴ３の間の相互作用、ならびにｍ２８−ＲＮＬＳによる阻害の機構的モデルを示す一連の画像およびチャートである。図２７Ａは、Ｐａｎｃ１細胞におけるＲＮＬＳによるＳＴＡＴ３の活性化を示す画像である；ＢＳＡまたはＲＮＬＳのいずれかで処置した培養中のＰａｎｃ１細胞、およびウエスタンブロットによって評価したＳＴＡＴ３リン酸化；ｐ−Ｓｅｒ７２７−ＳＴＡＴ３：セリン７２７におけるリン酸化、ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３：チロシン７０５におけるリン酸化；代表的研究。図２７Ｂは、ＲＮＬＳによるＳＴＡＴ３リン酸化の定量化を描写するチャートである；総ＳＴＡＴ３に対して正規化したシグナル；ｎ＝３、＊＝Ｐ＜０．０５。図２７Ｃは、ｍ２８−ＲＮＬＳが、ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害することを示す画像である；培養中、ウサギＩｇＧまたは抗ＲＮＬＳモノクローナルｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかで最大４日間処置したＰａｎｃ１細胞、およびウエスタンブロットによって評価したＳＴＡＴ３リン酸化；ｐ−Ｓｅｒ７２７−ＳＴＡＴ３：セリン７２７におけるリン酸化、ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３：チロシン７０５におけるリン酸化；ＧＡＰＤＨローディング対照；代表的研究。図２７Ｄは、ｍ２８−ＲＮＬＳによるＳＴＡＴ３リン酸化の定量化を示すチャートである；ＧＡＰＤＨローディング対照に対して正規化したシグナル；ｎ＝３、＊＝Ｐ＜０．０５。図２７Ｅは、ｍ２８−ＲＮＬＳの抗腫瘍活性のための提案される機構的モデルを描写する。
【図２７−２】図２７Ａ〜２７Ｅを含む図２７は、ＲＮＬＳおよびＳＴＡＴ３の間の相互作用、ならびにｍ２８−ＲＮＬＳによる阻害の機構的モデルを示す一連の画像およびチャートである。図２７Ａは、Ｐａｎｃ１細胞におけるＲＮＬＳによるＳＴＡＴ３の活性化を示す画像である；ＢＳＡまたはＲＮＬＳのいずれかで処置した培養中のＰａｎｃ１細胞、およびウエスタンブロットによって評価したＳＴＡＴ３リン酸化；ｐ−Ｓｅｒ７２７−ＳＴＡＴ３：セリン７２７におけるリン酸化、ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３：チロシン７０５におけるリン酸化；代表的研究。図２７Ｂは、ＲＮＬＳによるＳＴＡＴ３リン酸化の定量化を描写するチャートである；総ＳＴＡＴ３に対して正規化したシグナル；ｎ＝３、＊＝Ｐ＜０．０５。図２７Ｃは、ｍ２８−ＲＮＬＳが、ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害することを示す画像である；培養中、ウサギＩｇＧまたは抗ＲＮＬＳモノクローナルｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかで最大４日間処置したＰａｎｃ１細胞、およびウエスタンブロットによって評価したＳＴＡＴ３リン酸化；ｐ−Ｓｅｒ７２７−ＳＴＡＴ３：セリン７２７におけるリン酸化、ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３：チロシン７０５におけるリン酸化；ＧＡＰＤＨローディング対照；代表的研究。図２７Ｄは、ｍ２８−ＲＮＬＳによるＳＴＡＴ３リン酸化の定量化を示すチャートである；ＧＡＰＤＨローディング対照に対して正規化したシグナル；ｎ＝３、＊＝Ｐ＜０．０５。図２７Ｅは、ｍ２８−ＲＮＬＳの抗腫瘍活性のための提案される機構的モデルを描写する。
【図２７−３】図２７Ａ〜２７Ｅを含む図２７は、ＲＮＬＳおよびＳＴＡＴ３の間の相互作用、ならびにｍ２８−ＲＮＬＳによる阻害の機構的モデルを示す一連の画像およびチャートである。図２７Ａは、Ｐａｎｃ１細胞におけるＲＮＬＳによるＳＴＡＴ３の活性化を示す画像である；ＢＳＡまたはＲＮＬＳのいずれかで処置した培養中のＰａｎｃ１細胞、およびウエスタンブロットによって評価したＳＴＡＴ３リン酸化；ｐ−Ｓｅｒ７２７−ＳＴＡＴ３：セリン７２７におけるリン酸化、ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３：チロシン７０５におけるリン酸化；代表的研究。図２７Ｂは、ＲＮＬＳによるＳＴＡＴ３リン酸化の定量化を描写するチャートである；総ＳＴＡＴ３に対して正規化したシグナル；ｎ＝３、＊＝Ｐ＜０．０５。図２７Ｃは、ｍ２８−ＲＮＬＳが、ＳＴＡＴ３リン酸化を阻害することを示す画像である；培養中、ウサギＩｇＧまたは抗ＲＮＬＳモノクローナルｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかで最大４日間処置したＰａｎｃ１細胞、およびウエスタンブロットによって評価したＳＴＡＴ３リン酸化；ｐ−Ｓｅｒ７２７−ＳＴＡＴ３：セリン７２７におけるリン酸化、ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３：チロシン７０５におけるリン酸化；ＧＡＰＤＨローディング対照；代表的研究。図２７Ｄは、ｍ２８−ＲＮＬＳによるＳＴＡＴ３リン酸化の定量化を示すチャートである；ＧＡＰＤＨローディング対照に対して正規化したシグナル；ｎ＝３、＊＝Ｐ＜０．０５。図２７Ｅは、ｍ２８−ＲＮＬＳの抗腫瘍活性のための提案される機構的モデルを描写する。
【００７３】
【図２８】図２８は、ＲＮＬＳ発現が、ＰＤＡＣグレード１〜４に存在し、がん細胞に主に局在化したことを描写する画像を含む。
【００７４】
【図２９】図２９は、膵臓の神経内分泌腫瘍におけるＲＮＬＳ発現を示し、ＲＮＬＳが、腫瘍全体にわたる細胞において発現されたことを示す画像を含む。
【００７５】
【図３０】図３０は、ＲＮＬＳ遺伝子発現が、ＫＲＡＳ変異を有する膵管腺癌細胞（ＰＤＡＣＣ）株（ＭｉａＰａＣａ２およびＰａｎｃ１）において、ＢｘＰＣ３などの野生型ＫＲＡＳを有する株よりも高かったことを示す、β−アクチンに対して正規化された相対的ＲＮＬＳ  ｍＲＮＡレベルを描写するチャートである。
【００７６】
【図３１】図３１は、ｓｉＲＮＡによるＲＮＬＳノックダウンによって評価される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞生存度に対する減少するＲＮＬＳ発現の効果を示す、β−アクチンにより正規化された相対的ＲＮＬＳ  ｍＲＮＡレベルを描写するチャートである；この処置は、ＰＤＡＣＣ株Ｐａｎｃ１およびＭｉａＰａＣａ２の生存度を著しく低下させた。
【００７７】
【図３２】図３２は、ＲＮＬＳおよびＰＭＣＡ４ｂ発現が同時調節されることを示唆する、ＲＮＬＳ標的化ｓｈＲＮＡによるＲＮＬＳ発現の阻害が、その受容体ＰＭＣＡ４ｂの発現の著しい低下をもたらしたことを示すチャートである。
【００７８】
【図３３】図３３は、ｍ２８−ＲＮＬＳがアポトーシスを引き起こしたことを確認した、培養中のＰａｎｃ１細胞のＦＡＣＳ解析を描写する一連のチャートである。
【００７９】
【図３４】図３４は、ＲＮＬＳで処置したＨＫ−２細胞において、セリン７２７（ｐ−Ｓｅｒ７２７−ＳＴＡＴ３）およびチロシン７０５（ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３）におけるＳＴＡＴ３リン酸化が、それぞれ２および４倍増加するが、ＳＴＡＴ１に影響がないことの観察によって、正のＲＮＬＳ−ＳＴＡＴ３フィードバックループが示唆されることを示す画像およびチャートを含む。
【００８０】
【図３５】図３５は、抗ＰＤ１薬剤に対して抵抗性である腫瘍細胞株（すなわち、ＹＵＭＭ）に対する、抗ＲＮＬＳ抗体および抗ＰＤ１抗体の間の相乗作用を実証する例示的実験の結果を描写する。抗ＰＤ１抵抗性マウスメラノーマ細胞株（ＹＵＭＭ）を、免疫応答性Ｃ５７Ｂ６マウスに生着させた。生着されたＹＵＭＭ腫瘍体積が、約１００ｍｍ３に達した後（すなわち、０日目）、図２３の矢印によって示される通り、０、７、９および１２日目に処置を投与した。図２３に示す通り、抗ＲＮＬＳ抗体（ｍ２８；１５μｇ、３０μｇまたは６０μｇ）および抗ＰＤ１抗体（１２０μｇ）の組み合わせによる処置は、抗ＲＮＬＳ抗体（６０μｇ）単独または抗ＰＤ１抗体（１２０μｇ）単独のいずれかよりも優れた程度に腫瘍成長を低下させた。
【００８１】
【図３６】図３６は、抗ＲＮＬＳ抗体（ｍ２８）単独、抗ＰＤ１抗体単独、ならびに抗ＲＮＬＳ抗体（ｍ２８）および抗ＰＤ１抗体の組み合わせによる処置後の未分画腫瘍塊における、ｑＰＣＲによりＰＤ１およびＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡ発現を測定する例示的実験の結果を描写する。
【００８２】
【図３７】図３７は、抗ＲＮＬＳ抗体（ｍ２８）単独、抗ＰＤ１抗体単独、ならびに抗ＲＮＬＳ抗体（ｍ２８）および抗ＰＤ１抗体の組み合わせによる処置後の未分画腫瘍塊における、ｑＰＣＲによりＣＤ８ａ  ｍＲＮＡ発現を測定する例示的実験の結果を描写する。結果は、ｍ２８が、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化させることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
本発明は、ＰＤ１の阻害剤と組み合わせてレナラーゼの阻害剤を使用した、がんの処置、阻害、予防または低下に関する。一実施形態では、レナラーゼの阻害剤は、抗レナラーゼ抗体またはその結合断片であり、ＰＤ１の阻害剤は、抗ＰＤ１抗体またはその結合断片である。別の実施形態では、レナラーゼの阻害剤は、抗レナラーゼ抗体またはその結合断片であり、ＰＤ１の阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片である。
【００８４】
定義
他に定めがなければ、本明細書で使用されている全ての技術および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。
【００８５】
一般に、細胞培養、分子遺伝学、有機化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションにおける、本明細書で使用されている命名法および実験室手順は、本技術分野で周知かつ一般的に用いられているものである。
【００８６】
核酸およびペプチド合成のために標準技法が使用される。技法および手順は一般に、本文書を通じて提供される、本技術分野の従来方法および様々な一般参考文献（例えば、SambrookおよびRussell、２０１２年、Molecular  Cloning,  A  Laboratory  Approach、Cold  Spring  Harbor  Press、Cold  Spring  Harbor、NYならびにAusubelら、２０１２年、Current  Protocols  in  Molecular  Biology、John  Wiley  &  Sons、NY）に従って行われる。
【００８７】
本明細書で使用されている命名法、ならびに後述する分析化学および有機合成において使用されている実験室手順は、本技術分野で周知かつ一般的に用いられているものである。化学合成および化学解析のために標準技法またはその修正が使用される。
【００８８】
冠詞「１つの（a）」および「１つの（an）」は、冠詞の文法上の目的語の１つまたは１つより多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すように本明細書で使用されている。例として、「１つのエレメント（an  element）」は、１つのエレメントまたは１つより多くのエレメントを意味する。
【００８９】
「約」は、本明細書において使用される場合、量、および時間的な期間などの測定可能な値を指す場合、指定の値から±２０％または±１０％または±５％または±１％または±０．１％の変動を包含することを意味するが、その理由として、このような変動が、開示されている方法を行うのに適切であることが挙げられる。
【００９０】
用語「異常な」は、生物、組織、細胞またはその構成成分の文脈で使用される場合、少なくとも１種の観察可能または検出可能な特徴（例えば、年齢、処置、時刻など）が、「正常」な（予想される／恒常性）それぞれの特徴を呈する生物、組織、細胞またはその構成成分とは異なる、生物、組織、細胞またはその構成成分を指す。ある細胞、組織型または被験体にとって正常なまたは予想される特徴は、異なる細胞または組織型にとって異常であり得る。
【００９１】
用語「アナログ」は、本明細書において使用される場合、それがアナログである化合物または「親」化合物と一般に構造的に同様な化合物を一般に指す。一般に、アナログは、親化合物のある特定の特徴、例えば、生物学的または薬理学的活性を保持する。アナログは、他のより望ましくない特徴、例えば、抗原性、タンパク質分解不安定性、および毒性などを欠くことができる。アナログは、親の特定の生物学的活性が低下されるが、親の１種または複数の別個の生物学的活性は「アナログ」において影響されない、化合物を含む。ポリペプチドに適用される場合、用語「アナログ」は、親化合物に対する変動する範囲のアミノ酸配列同一性、例えば、親、または親の選択される部分もしくはドメインの所与のアミノ酸配列におけるアミノ酸の少なくとも約７０％、より好ましくは、少なくとも約８０％〜８５％または約８６％〜８９％、さらにより好ましくは、少なくとも約９０％、約９２％、約９４％、約９６％、約９８％または約９９％を有し得る。ポリペプチドに適用される場合、用語「アナログ」は、結合ドメイン融合タンパク質の少なくとも部分と実質的同一性を有する少なくとも約３アミノ酸のセグメントで構成されるポリペプチドを一般に指す。アナログは、典型的に、少なくとも５アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長またはそれより長い、少なくとも５０アミノ酸長またはそれより長い、少なくとも１００アミノ酸長またはそれより長い、少なくとも１５０アミノ酸長またはそれより長い、少なくとも２００アミノ酸長またはそれより長く、より典型的には、少なくとも２５０アミノ酸長またはそれより長い。一部のアナログは、実質的な生物学的活性を欠くことができるが、依然として、所定のエピトープに対する抗体の作製のため、親和性クロマトグラフィーによって反応性抗体を検出および／もしくは精製するための免疫学的試薬として、または結合ドメイン融合タンパク質機能の競合的もしくは非競合的アゴニスト、アンタゴニストもしくは部分的アゴニストとしてなど、様々な使用に用いることができる。
【００９２】
用語「抗体」は、本明細書において使用される場合、結合パートナー分子の特異的エピトープに特異的に結合することができる免疫グロブリン分子を指す。抗体は、天然供給源に由来するまたは組換え供給源に由来するインタクト免疫グロブリンであり得、インタクト免疫グロブリンの免疫反応性部分であり得る。本発明における抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（「イントラボディ（intrabody）」）、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２、ならびに単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、ラクダ科抗体などの重鎖抗体、およびヒト化抗体を含む、種々の形態で存在することができる（Harlowら、１９９９年、Using  Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press、NY；Harlowら、１９８９年、Antibodies:  A  Laboratory  Manual、Cold  Spring  Harbor、New  York；Houstonら、１９８８年、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：５８７９〜５８８３頁；Birdら、１９８８年、Science  ２４２巻：４２３〜４２６頁）。
【００９３】
用語「抗体断片」または「結合断片」は、抗体の少なくとも１つの部分を指し、インタクト抗体の抗原性決定可変領域を指す。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片、直鎖状抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、ｓｃＦｖ抗体、ならびに抗体断片から形成された多特異性抗体が挙げられるがこれらに限定されない。用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１種の抗体断片、および重鎖の可変領域を含む少なくとも１種の抗体断片を含む融合タンパク質を指し、軽および重鎖可変領域は、短い可撓性ポリペプチドリンカーを介して近接して連結されており、単鎖ポリペプチドとして発現され得、ｓｃＦｖは、これが由来するインタクト抗体の特異性を保持する。指定されない限り、本明細書において使用される場合、ｓｃＦｖは、例えば、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端側の端に関して、いずれかの順序でＶＬおよびＶＨ可変領域を有することができ、ｓｃＦｖは、ＶＬ−リンカー−ＶＨを含むことができる、またはＶＨ−リンカー−ＶＬを含むことができる。
【００９４】
「抗体重鎖」は、本明細書において使用される場合、その天然に存在するコンフォメーションにおける抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖の大きい方を指し、これは、通常、抗体が属するクラスを決定する。
【００９５】
「抗体軽鎖」は、本明細書において使用される場合、その天然に存在するコンフォメーションにおける抗体分子に存在する２種類のポリペプチド鎖の小さい方を指す。カッパー（κ）およびラムダ（λ）軽鎖は、２種の主要な抗体軽鎖アイソタイプを指す。
【００９６】
用語「合成抗体」とは、本明細書において使用される場合、例えば、本明細書に記載されているバクテリオファージによって発現される抗体など、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される抗体を意味する。用語はまた、抗体をコードするＤＮＡ分子の合成によって生成された抗体を意味すると解釈されるべきであり、このＤＮＡ分子は、抗体タンパク質または抗体を指定するアミノ酸配列を発現し、ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、本技術分野で利用可能かつ周知の合成ＤＮＡまたはアミノ酸配列決定技術を使用して得た。
【００９７】
「キメラ抗体」は、アクセプター抗体に由来する軽および重鎖定常領域と会合した、ドナー抗体に由来する天然に存在する可変領域（軽鎖および重鎖）を含有する操作された抗体の種類を指す。
【００９８】
「ヒト化抗体」は、非ヒトドナー免疫グロブリンに由来するそのＣＤＲを有する操作された抗体の種類を指し、分子の残っている免疫グロブリン由来部分は、１種（または複数）のヒト免疫グロブリン（複数可）に由来する。加えて、フレームワーク支持残基は、結合親和性を保存するように変更させることができる（例えば、１９８９年、Queenら、Proc.  Natl.  Acad  Sci  USA、８６巻：１００２９〜１００３２頁；１９９１年、Hodgsonら、Bio/Technology、９巻：４２１頁を参照）。適したヒトアクセプター抗体は、従来データベース、例えば、ＫＡＢＡＴデータベース、Ｌｏｓ  ＡｌａｍｏｓデータベースおよびＳｗｉｓｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎデータベースから、ドナー抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列に対する相同性によって選択される抗体であり得る。ドナー抗体のフレームワーク領域に対する相同性（アミノ酸ベースで）によって特徴付けられるヒト抗体は、ドナーＣＤＲの挿入のための重鎖定常領域および／または重鎖可変フレームワーク領域の提供に適することができる。軽鎖定常または可変フレームワーク領域を供与することができる適したアクセプター抗体は、同様の様式で選択することができる。アクセプター抗体重および軽鎖は、同じアクセプター抗体に起源をもつことを要求されないことに留意されたい。先行技術は、斯かるヒト化抗体を産生するいくつかの仕方について記載する（例えば、ＥＰ−Ａ−０２３９４００およびＥＰ−Ａ−０５４９５１を参照）。
【００９９】
用語「ドナー抗体」は、変更された免疫グロブリンコード領域、ならびにドナー抗体の結合特異性および中和活性特徴を有するその結果生じる発現された変更された抗体を提供するように、その可変領域、ＣＤＲ、またはそれらの他の機能的断片もしくはアナログのアミノ酸配列を、第１の免疫グロブリンパートナーに与える抗体（モノクローナルおよび／または組換え）を指す。
【０１００】
用語「アクセプター抗体」は、その重および／もしくは軽鎖フレームワーク領域、ならびに／またはその重および／もしくは軽鎖定常領域をコードするアミノ酸配列の全て（または任意の部分、ただし、一部の実施形態では、全て）を、第１の免疫グロブリンパートナーに与える、ドナー抗体にとって異種の抗体（モノクローナルおよび／または組換え）を指す。ある特定の実施形態では、ヒト抗体がアクセプター抗体である。
【０１０１】
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン重および軽鎖の高頻度可変領域である、抗体の相補性決定領域アミノ酸配列として定義される。例えば、Kabatら、Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest、第４版、U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services、National  Institutes  of  Health（１９８７年）を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分には、３個の重鎖および３個の軽鎖ＣＤＲ（またはＣＤＲ領域）が存在する。よって、「ＣＤＲ」は、本明細書において使用される場合、全３個の重鎖ＣＤＲまたは全３個の軽鎖ＣＤＲ（または適切であれば全重鎖ＣＤＲおよび全軽鎖ＣＤＲの両方）を指す。抗体の構造およびタンパク質フォールディングは、他の残基が、結合領域の一部と考慮され、当業者によってそのように理解されると予想されることを意味し得る。例えば、Chothiaら（１９８９年）Conformations  of  immunoglobulin  hypervariable  regions；Nature  ３４２巻、８７７〜８８３頁を参照されたい。
【０１０２】
用語「フレームワーク」または「フレームワーク配列」は、可変領域マイナスＣＤＲの残っている配列を指す。ＣＤＲ配列の正確な定義は、異なる方式によって決定することができるため、フレームワーク配列の意味は、対応して異なる解釈に付される。６個のＣＤＲ（軽鎖のＣＤＲ−Ｌ１、−Ｌ２および−Ｌ３、ならびに重鎖のＣＤＲ−Ｈ１、−Ｈ２および−Ｈ３）はまた、軽鎖および重鎖におけるフレームワーク領域を、各鎖における４個の小領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）へと分け、この場合、ＣＤＲ１はＦＲ１およびＦＲ２の間に、ＣＤＲ２はＦＲ２およびＦＲ３の間に、ならびにＣＤＲ３はＦＲ３およびＦＲ４の間に位置する。ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３またはＦＲ４として特定の小領域を指定することなく、フレームワーク領域は、他によって参照される通り、単一の天然に存在する免疫グロブリン鎖の可変領域内の組み合わされたＦＲを表す。ＦＲは、４個の小領域の１個を表し、ＦＲ（複数）は、フレームワーク領域を構成する４個の小領域の２個またはそれよりも多くを表す。
【０１０３】
本明細書において使用される場合、「イムノアッセイ」は、標的分子に特異的に結合することができる抗体を使用して、標的分子を検出および定量化する、任意の結合アッセイを指す。
【０１０４】
抗体に関して、用語「特異的に結合する」とは、本明細書において使用される場合、特異的結合パートナー分子を認識するが、試料中の他の分子を実質的に認識も結合もしない抗体を意味する。例えば、ある種由来の結合パートナー分子に特異的に結合する抗体は、１つまたは複数の種由来の当該結合パートナー分子にも結合することができる。ただし、斯かる種間反応性それ自体は、特異的として抗体の分類を変更しない。別の例では、結合パートナー分子に特異的に結合する抗体は、結合パートナー分子の異なるアレル型にも結合することができる。しかし、斯かる交差反応性それ自体は、特異的として抗体の分類を変更しない。
【０１０５】
一部の実例では、用語「特異的結合」または「特異的に結合すること」は、抗体、タンパク質またはペプチドの第２の結合パートナー分子との相互作用を参照して使用して、相互作用が、結合パートナー分子における特定の構造（例えば、抗原性決定基またはエピトープ）の存在に依存性であることを意味し得る；例えば、抗体は、概してタンパク質ではなく特異的タンパク質構造を認識しこれに結合する。抗体が、エピトープ「Ａ」に特異的である場合、標識された「Ａ」および抗体を含有する反応における、エピトープＡ（または遊離した、標識されていないＡ）を含有する分子の存在は、抗体に結合された標識されたＡの量を低下させる。一部の実例では、用語「特異的結合」および「特異的に結合すること」は、選択的結合を指し、抗体は、結合パートナー分子への結合の親和性増強に重要な配列またはコンフォメーションエピトープを認識する。
【０１０６】
本明細書において使用される場合、結合タンパク質が、レナラーゼと特異的に結合する場合、用語「中和」は、レナラーゼの生物学的活性の中和を指す。好ましくは、中和結合タンパク質は、中和抗体であり、そのレナラーゼへの結合は、レナラーゼの生物学的活性の阻害をもたらす。好ましくは、中和結合タンパク質は、レナラーゼと結合し、レナラーゼの生物学的な活性を、少なくとも約２０％、４０％、６０、８０％、８５％またはそれよりも多く低下させる。一部の実施形態では、レナラーゼは、ヒトレナラーゼである。
【０１０７】
用語「エピトープ」は、例えば、ｓｃＦｖなど、抗体もしくはその結合部分または他の結合分子によって認識される結合パートナー分子における部位のその通常の意味を有する。エピトープは、タンパク質またはポリペプチド全体の小部分を表すセグメントを含む、アミノ酸の分子またはセグメントであり得る。エピトープは、コンフォメーション性（すなわち、不連続）であり得る。すなわち、エピトープは、タンパク質フォールディングによって並置された、一次配列の非近接部分によってコードされるアミノ酸から形成され得る。
【０１０８】
語句「生物学的試料」は、本明細書において使用される場合、核酸またはポリペプチドの発現が検出され得る、細胞、組織または体液を含む任意の試料を含むことが意図される。斯かる生物学的試料の例として、血液、リンパ液、骨髄、生検材料およびスメアが挙げられるがこれらに限定されない。本来液体である試料は、本明細書において使用される場合、「体液」と称される。生物学的試料は、例えば、区域の擦過もしくは拭き取りによる、または体液を得るための針の使用によるものを含む種々の技法によって患者から得ることができる。様々な身体試料を収集するための方法は、本技術分野で周知である。
【０１０９】
用語「がん」は、本明細書において使用される場合、異常な細胞の異常成長によって特徴付けられる疾患として定義される。がん細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を介して他の身体部分に拡散することができる。様々ながんの例として、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、子宮頸部がん、皮膚がん（例えば、メラノーマ）、膵がん、結腸直腸がん、腎がん、肝臓がん、脳がん、リンパ腫、白血病、肺がん、および肉腫などが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１０】
本明細書において使用される場合、「コンジュゲートされる」は、ある分子の、第２の分子への共有結合的付着を指す。
【０１１１】
遺伝子の「コード領域」は、遺伝子の転写によって産生されるｍＲＮＡ分子のコード領域とそれぞれ相同または相補的な、遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基および遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドからなる。
【０１１２】
ｍＲＮＡ分子の「コード領域」はまた、ｍＲＮＡ分子の翻訳の際にトランスファーＲＮＡ分子のアンチコドン領域とマッチする、または終止コドンをコードするｍＲＮＡ分子のヌクレオチド残基からなる。よって、コード領域は、ｍＲＮＡ分子によってコードされる成熟タンパク質に存在しないアミノ酸残基（例えば、タンパク質輸送シグナル配列におけるアミノ酸残基）のコドンを含むヌクレオチド残基を含むことができる。
【０１１３】
核酸を指すための「相補的」は、本明細書において使用される場合、２個の核酸鎖の領域の間の、または同じ核酸鎖の２個の領域の間の配列相補性の広い概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、第１の領域と逆平行である第２の核酸領域の残基と（残基がチミンまたはウラシルである場合）特異的水素結合を形成（「塩基対形成」）することができることが公知である。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、第１の鎖と逆平行である第２の核酸鎖の残基と（残基がグアニンである場合）塩基対形成することができることが公知である。２個の領域が逆平行様式で配置されると、第１の領域の少なくとも１個のヌクレオチド残基が、第２の領域の残基と塩基対形成することができる場合、核酸の第１の領域は、同じまたは異なる核酸の第２の領域に相補的である。好ましくは、第１の領域は、第１の部分を含み、第２の領域は、第２の部分を含み、それによって、第１および第２の部分が逆平行様式で配置されると、第１の部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは、少なくとも約７５％、少なくとも約９０％または少なくとも約９５％は、第２の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。より好ましくは、第１の部分の全てのヌクレオチド残基は、第２の部分におけるヌクレオチド残基と塩基対形成することができる。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、用語「誘導体」は、ポリペプチド、ポリヌクレオチドまたは他の分子の化学修飾を含む。本発明の文脈では、「誘導体ポリペプチド」、例えば、グリコシル化、ペグ化または任意の同様のプロセスによって修飾されたポリペプチドは、結合活性を保持する。例えば、結合ドメインの「誘導体」という用語は、例えば、１個または複数のポリエチレングリコール分子、糖、ホスフェートおよび／または他の斯かる分子の付加によって化学修飾された結合ドメイン融合タンパク質、バリアントまたは断片を含み、分子（単数または複数）は、野生型結合ドメイン融合タンパク質に天然に付着されていない。ポリペプチドの「誘導体」は、例えば、参照ポリペプチドと比べてアミノ酸置換、欠失または挿入を有することにより、参照ポリペプチドに「由来」するポリペプチドをさらに含む。よって、ポリペプチドは、野生型ポリペプチドまたは任意の他のポリペプチドに「由来」することができる。本明細書において使用される場合、ポリペプチドを含む化合物は、特定の供給源、例えば、特定の生物、組織型、または特定の生物もしくは特定の組織型に存在する特定のポリペプチド、核酸もしくは他の化合物に「由来」することもできる。
【０１１５】
用語「ＤＮＡ」は、本明細書において使用される場合、デオキシリボ核酸として定義される。
【０１１６】
「コードする」は、ヌクレオチド（すなわち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡおよびｍＲＮＡ）の定義される配列またはアミノ酸の定義される配列のいずれか、およびそれに起因する生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおける他のポリマーおよび高分子の合成のための鋳型として機能する、遺伝子、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡなど、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特異的配列の固有の特性を指す。よって、遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写および翻訳が、細胞または他の生物系においてタンパク質を産生する場合、当該遺伝子は、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり、配列表に通常提示されるコード鎖、および遺伝子またはｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コード鎖の両方が、当該遺伝子またはｃＤＮＡのタンパク質または他の産物をコードすると称されてよい。
【０１１７】
他に指定がなければ、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、互いの縮重バージョンであり、同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列を含む。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、一部のバージョンにおいてイントロン（複数可）を含有することができる程度まで、イントロンを含むこともできる。
【０１１８】
「疾患」は、動物の健康状態であり、動物は、恒常性を維持することができず、疾患が好転（ameliorate）されない場合には、動物の健康は、悪化し続ける。
【０１１９】
対照的に、動物における「障害」は、動物が恒常性を維持することができるが、動物の健康状態は、障害の非存在下よりも都合が悪い健康状態である。未処置のままでは、障害は、動物の健康状態のさらなる低下を必ずしも引き起こさない。
【０１２０】
疾患もしくは障害の徴候もしくは症状の重症度、患者によって斯かる徴候もしくは症状が経験される頻度、または両方が低下される場合、疾患または障害は、「軽減される」。
【０１２１】
化合物の「有効量」または「治療有効量」は、化合物が投与される被験体に有益な効果をもたらすのに十分な化合物の量である。
【０１２２】
本明細書に記載されている結合ドメインポリペプチドに対する「高い親和性」という用語は、少なくとも約１０−６Ｍ、好ましくは、少なくとも約１０−７Ｍ、より好ましくは少なくとも約１０−８Ｍまたはそれよりも強い、より好ましくは少なくとも約１０−９Ｍまたはそれよりも強い、より好ましくは少なくとも約１０−１０Ｍまたはそれよりも強い、例えば、最大１０−１２Ｍまたはそれよりも強い解離定数（Ｋｄ）を指す。しかし、「高い親和性」の結合は、他の結合ドメインポリペプチドに対して変動し得る。
【０１２３】
用語「阻害する」は、本明細書において使用される場合、活性または機能を、例えば、対照値と比べて約１０パーセント抑制または遮断することを意味する。好ましくは、活性は、対照値と比較して５０％、より好ましくは７５％、なおより好ましくは９５％抑制または遮断される。「阻害する」は、本明細書において使用される場合、分子、反応、相互作用、遺伝子、ｍＲＮＡおよび／またはタンパク質の発現、安定性、機能または活性のレベルを測定可能な量だけ低下させること、または完全に予防することも意味する。阻害剤は、例えば、タンパク質、遺伝子、ならびにｍＲＮＡ安定性、発現、機能および活性に結合する、活性を部分的にまたは総体的に遮断する、活性化を減少させる、予防する、遅延させる、不活性化する、脱感作するまたは下方調節する化合物、例えば、アンタゴニストである。
【０１２４】
目的の分子の「モジュレーター」および「モジュレーション」という用語は、本明細書において使用される場合、その様々な形態において、目的のプロテアーゼに関連する活性のアンタゴニズム、アゴニズム、部分的アンタゴニズムおよび／または部分的アゴニズムを包含することが意図される。様々な実施形態では、「モジュレーター」は、プロテアーゼ発現または活性を阻害または刺激することができる。斯かるモジュレーターは、プロテアーゼ分子の小分子アゴニストおよびアンタゴニスト、アンチセンス分子、リボザイム、三重鎖分子、ならびにＲＮＡｉポリヌクレオチドその他を含む。
【０１２５】
本明細書において使用される場合、「指導的材料」は、本明細書に列挙されている様々な疾患または障害の軽減をもたらすためのキット内の本発明の化合物、組成物、ベクターまたは送達系の有用性を伝えるために使用することができる、刊行物、記録、図表または任意の他の表現媒体を含む。必要に応じてまたはその代わりに、指導的材料は、哺乳動物の細胞または組織における疾患または障害を軽減する１種または複数の方法について記載することができる。本発明のキットの指導的材料は、例えば、本発明の同定された化合物、組成物、ベクターもしくは送達系を含有する容器に貼る、または同定された化合物、組成物、ベクターもしくは送達系を含有する容器と一緒に発送することができる。あるいは、指導的材料および化合物がレシピエントによって協同的に使用される意図により、指導的材料は、容器とは別々に発送することができる。
【０１２６】
「単離された」は、天然状態から変更または除去されることを意味する。例えば、生きている動物におけるその通常の状況で天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離されて」いないが、その天然の状況の共存する材料から部分的にまたは完全に分離された同じ核酸またはペプチドは、「単離されている」。単離された核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形態で存在することができる、または例えば、宿主細胞などの非ネイティブ環境に存在することができる。
【０１２７】
「単離された核酸」は、天然に存在する状態でこれに近接する配列から分離された核酸セグメントまたは断片、すなわち、断片に通常隣接する配列、すなわち、これが天然に存在するゲノム内で断片に隣接する配列から除去されたＤＮＡ断片を指す。用語は、核酸に天然に付随する他の構成成分、すなわち、細胞においてこれに天然に付随するＲＮＡまたはＤＮＡまたはタンパク質から実質的に精製された核酸にも適用される。したがって、用語は、例えば、ベクターに、自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスに、または原核生物もしくは真核生物のゲノムＤＮＡに取り込まれた、または他の配列とは独立して別々の分子として（すなわち、ＰＣＲまたは制限酵素消化によって産生されたｃＤＮＡまたはゲノムもしくはｃＤＮＡ断片として）存在する組換えＤＮＡを含む。これはまた、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えＤＮＡを含む。
【０１２８】
本発明の文脈では、一般的に存在する核酸塩基のための以下の略語が使用される。「Ａ」は、アデノシンを指し、「Ｃ」は、シトシンを指し、「Ｇ」は、グアノシンを指し、「Ｔ」は、チミジンを指し、「Ｕ」は、ウリジンを指す。
【０１２９】
用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書において使用される場合、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸は、ヌクレオチドのポリマーである。よって、核酸およびポリヌクレオチドは、本明細書において使用される場合、互換的である。当業者は、核酸が、加水分解されて単量体「ヌクレオチド」となることができるポリヌクレオチドであるという一般知識を有する。単量体ヌクレオチドは加水分解されてヌクレオシドとなることができる。本明細書において使用される場合、ポリヌクレオチドとして、組換え手段、すなわち、通常のクローニング技術およびＰＣＲを使用した、組換えライブラリーまたは細胞ゲノムからの核酸配列のクローニングなどを限定することなく含む本技術分野で利用可能な任意の手段によって、ならびに合成手段によって、得られる全ての核酸配列が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３０】
本明細書において使用される場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合的に連結されたアミノ酸残基で構成される化合物を指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２個のアミノ酸を含有する必要があり、タンパク質またはペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数に限界はない。ポリペプチドは、ペプチド結合によって互いに接合された２個またはそれよりも多いアミノ酸を含む任意のペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書において使用される場合、この用語は、本技術分野において一般的に、例えば、ペプチド、オリゴペプチドおよびオリゴマーとも称される、短い鎖、ならびに本技術分野において一般に、多くの種類があるタンパク質と称される、より長い鎖の両方を指す。「ポリペプチド」は、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドのバリアント、修飾されたポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質を含む。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、またはこれらの組み合わせを含む。
【０１３１】
用語「保存的置換」は、ポリペプチドについて記載する場合、ポリペプチドの活性を実質的に変更しない、ポリペプチドのアミノ酸組成の変化、すなわち、アミノ酸の、同様の特性を有する他のアミノ酸による置換を指す。機能的に同様のアミノ酸を提示する保存的置換表は、本技術分野で周知である。以下の６群はそれぞれ、互いに対する保存的置換を表すと一般に理解されているアミノ酸を含有する：（１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；（２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；（３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；（４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；（５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；および（６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）（Creighton、１９８４年、Proteins、W.H.  Freeman  and  Companyも参照）。上で定義された保存的置換に加えて、アミノ酸残基の他の修飾も、「保存的に修飾されたバリアント」をもたらすことができる。例えば、正であれ負であれ、全ての荷電アミノ酸を、互いに対する置換として考慮することができる。加えて、保存的に修飾されたバリアントは、コードされる配列における単一のアミノ酸または少ないパーセンテージのアミノ酸、例えば、多くの場合、５％未満を変更、付加または欠失する、個々の置換、欠失または付加に起因することもできる。さらに、保存的に修飾されたバリアントは、ネイティブまたは野生型遺伝子によって用いられるアミノ酸のコドンを、同じアミノ酸の異なるコドンにより置換することにより、組換えポリペプチドから作製することもできる。
【０１３２】
用語「ＲＮＡ」は、本明細書において使用される場合、リボ核酸として定義される。
【０１３３】
用語「組換えＤＮＡ」は、本明細書において使用される場合、異なる供給源由来のＤＮＡの小片を接合することにより産生されるＤＮＡとして定義される。
【０１３４】
用語「組換えポリペプチド」は、本明細書において使用される場合、組換えＤＮＡ方法を使用することにより産生されるポリペプチドとして定義される。
【０１３５】
「薬学的に許容される」とは、例えば、製剤の他の成分と適合性であり、一般に、そのレシピエントへの投与に安全である担体、希釈剤または賦形剤を意味する。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、コンジュゲートと組み合わされた場合、コンジュゲートの活性を保持し、被験体の免疫系と非反応性である任意の材料を含む。例として、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水エマルションなどのエマルション、および様々な種類の湿潤剤など、標準医薬担体のいずれかが挙げられるがこれらに限定されない。他の担体は、無菌溶液、コーティングされた錠剤を含む錠剤、およびカプセルを含むこともできる。典型的には、斯かる担体は、デンプン、ミルク、糖、ある特定の種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸もしくはその塩、ステアリン酸マグネシウムもしくはカルシウム、タルク、植物性脂肪もしくは油、ガム、グリコール、または他の公知の賦形剤など、賦形剤を含有する。斯かる担体は、矯味矯臭および着色添加物または他の成分を含むこともできる。斯かる担体を含む組成物は、周知の従来方法によって製剤化される。
【０１３６】
用語「患者」、「被験体」、および「個体」などは、本明細書で互換的に使用され、状態もしくはその続発症の治療法を必要とするヒト、または状態もしくはその続発症に対して感受性を有するヒトを含む、補体系を有する任意の動物、好ましくは、哺乳動物、最も好ましくは、ヒトを指す。よって、個体は、例えば、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ラット、サルおよびマウスおよびヒトを含むことができる。
【０１３７】
語句「パーセント（％）同一性」は、２種またはそれよりも多いアミノ酸配列の比較において見出される配列類似性のパーセンテージを指す。パーセント同一性は、任意の適したソフトウェアを使用して電子的に決定することができる。同様に、２種のポリペプチド（またはそのいずれか一方もしくは両方の１種もしくは複数の部分）の間の「類似性」は、あるポリペプチドのアミノ酸配列を、第２のポリペプチドのアミノ酸配列と比較することにより決定される。斯かる比較に有用な任意の適したアルゴリズムは、本発明の文脈における適用に適応させることができる。
【０１３８】
「治療的」処置は、病理の徴候を示す被験体に、それらの徴候を縮小または排除する目的で投与される処置である。
【０１３９】
「治療有効量」は、患者に投与されると疾患の症状を好転させる、本発明の化合物の量である。「治療有効量」を構成する本発明の化合物の量は、化合物、疾患状態およびその重症度、および処置されるべき患者の年齢などに応じて変動する。治療有効量は、当業者が、自身の知識および本開示を考慮することによって慣例的に決定することができる。
【０１４０】
用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は、本明細書に記載されている治療的または予防的方策を指す。「処置」の方法は、障害または再発する障害の１種または複数の症状を予防する、治癒する、遅延させる、その重症度を低下させる、または好転させるための、あるいは斯かる処置の非存在下で予想される生存を越えて被験体の生存を延長するための、斯かる処置、本発明の組成物を必要とする被験体、例えば、がんを含む疾患もしくは障害を患う被験体、またはがんを含む斯かる疾患もしくは障害を最終的に得る可能性がある被験体への投与を用いる。
【０１４１】
「バリアント」は、用語が本明細書で使用される場合、それぞれ参照核酸配列またはペプチド配列とは配列が異なるが、参照分子の本質的生物学的特性を保持する核酸配列またはペプチド配列である。核酸バリアントの配列の変化は、参照核酸によってコードされるペプチドのアミノ酸配列を変更させなくてよい、またはアミノ酸置換、付加、欠失、融合およびトランケーションをもたらしてよい。参照ペプチドおよびバリアントの配列が、全体的に密接に類似し、多くの領域で同一となるように、ペプチドバリアントの配列の変化は典型的に、限定的または保存的である。バリアントおよび参照ペプチドは、任意の組み合わせの１個または複数の置換、付加、欠失によって、アミノ酸配列において異なることができる。核酸またはペプチドのバリアントは、アレルバリアントなど、天然に存在し得る、または天然に存在することが知られていないバリアントであり得る。核酸およびペプチドの天然に存在しないバリアントは、変異誘発技法によってまたは直接的合成によって作製することができる。
【０１４２】
範囲：本開示を通して、本発明の様々な態様が、範囲形式で提示され得る。範囲形式での記載が、単に便利さおよび簡潔さのためであり、本発明の範囲における柔軟性がない限定として解釈するべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分的範囲ならびに当該範囲内の個々の数値を具体的に開示したと考慮するべきである。例えば、１〜６など、範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの部分的範囲、ならびに当該範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３および６を具体的に開示したと考慮するべきである。このことは、範囲の幅に関係なく適用される。
【０１４３】
記載
本発明は、ＰＤ１の阻害剤と組み合わせてレナラーゼの阻害剤を使用した、がんの処置、阻害、予防または低下のための組成物および方法に関する。一実施形態では、レナラーゼの阻害剤は、抗レナラーゼ抗体またはその結合断片であり、ＰＤ１の阻害剤は、抗ＰＤ１抗体またはその結合断片である。別の実施形態では、レナラーゼの阻害剤は、抗レナラーゼ抗体またはその結合断片であり、ＰＤ１の阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその結合断片である。
【０１４４】
様々な実施形態では、本発明は、抗体またはその結合断片などのＰＤ１の阻害剤と組み合わせて、抗体またはその結合断片などのレナラーゼの阻害剤を、それを必要とする被験体に投与することにより、個体におけるがんを処置、阻害、予防または低下させるための組成物および方法に関する。
【０１４５】
様々な実施形態では、本発明は、ＰＤ１のレベル、産生、活性または結合活性の１種または複数と組み合わせて、レナラーゼのレベル、産生または活性の１種または複数を減少させるための組成物および方法を提供する。他の様々な実施形態では、本発明は、ＰＤ−Ｌ１のレベル、産生、活性または結合活性の１種または複数と組み合わせて、レナラーゼのレベル、産生または活性の１種または複数を減少させるための組成物および方法を提供する。
【０１４６】
治療用阻害剤組成物および使用方法
様々な実施形態では、本発明は、レナラーゼの縮小されたレベルまたは活性が望まれる疾患または障害の処置または予防における使用のための、レナラーゼ阻害剤組成物および方法ならびにＰＤ１阻害剤組成物および方法の組み合わせを含む。本発明の組成物および方法で処置または予防することができる、ＰＤ１の縮小されたレベルまたは活性と組み合わせたレナラーゼの縮小されたレベルまたは活性が望まれる疾患または障害の一例は、がんを含む。様々な実施形態では、本発明の処置または予防のレナラーゼ阻害剤組成物および方法は、レナラーゼポリペプチドの量、レナラーゼペプチド断片の量、レナラーゼｍＲＮＡの量、レナラーゼ酵素活性の量、レナラーゼ基質結合活性の量、レナラーゼ受容体結合活性の量、またはこれらの組み合わせを縮小する。様々な実施形態では、本発明の処置または予防のＰＤ１阻害剤組成物および方法は、ＰＤ１ポリペプチドの量、ＰＤ１  ｍＲＮＡの量、ＰＤ１酵素活性の量、ＰＤ１結合活性の量、ＰＤ１受容体結合活性の量、またはこれらの組み合わせを縮小する。当業者は、ＰＤ１活性の量を縮小するための１種の仕方が、抗ＰＤ１抗体もしくはその結合断片とＰＤ１を結合させることによる、および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体もしくはその結合断片とＰＤ−Ｌ１を結合させることによるなど、ＰＤ１へのＰＤ−Ｌ１の結合に干渉するおよび／またはこれを予防することによることを理解すると予想される。
【０１４７】
当業者であれば、本明細書に提供される本開示に基づき、レナラーゼのレベルの減少が、転写、翻訳または両方を含むレナラーゼ発現の減少を包含し、ＲＮＡレベル（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡなど）およびタンパク質レベル（例えば、ユビキチン化など）を含むレナラーゼの分解の促進も包含することが理解されよう。当業者は、本発明の教示を具備したら、レナラーゼのレベルの減少が、レナラーゼ活性（例えば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性など）の減少を含むことも認めると予想される。当業者であれば、本明細書に提供される本開示に基づき、ＰＤ１のレベルの減少が、転写、翻訳または両方を含むＰＤ１発現の減少を包含し、ＲＮＡレベル（例えば、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡなど）およびタンパク質レベル（例えば、ユビキチン化など）を含むＰＤ１の分解の促進も包含することも理解されよう。当業者は、本発明の教示を具備したら、ＰＤ１のレベルの減少が、ＰＤ１活性（例えば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性、リガンド結合活性など）の減少を含むことも認めると予想される。よって、レナラーゼまたはＰＤ１のレベルまたは活性を減少させることとして、レナラーゼまたはＰＤ１をコードする核酸の転写、翻訳または両方を減少させることが挙げられるがこれらに限定されず；これは、同様に、レナラーゼもしくはＰＤ１ポリペプチド、またはそれらのペプチド断片の任意の活性を減少させることも含む。
【０１４８】
阻害は、本明細書に開示されている方法、ならびに本技術分野で公知のまたは将来開発されることになる方法を含む多種多様な方法を使用して評価することができる。すなわち、慣例に従う者（routineer）は、本明細書に提供される本開示に基づき、レナラーゼまたはＰＤ１のレベルまたは活性を減少させることを、レナラーゼまたはＰＤ１をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ）のレベル、生物学的試料中に存在するレナラーゼもしくはＰＤ１ポリペプチドまたはそれらのペプチド断片のレベル、レナラーゼ活性（例えば、酵素活性、基質結合活性、受容体結合活性、リガンド結合活性など）のレベル、あるいはこれらの組み合わせを評価する方法を使用して容易に評価することができることを認めると予想される。
【０１４９】
当業者は、本明細書に提供される本開示に基づき、被験体が、同様に他の薬物療法または治療法によって処置されているか否かにかかわらず、本発明が、それを必要とする被験体におけるがんの処置または予防において有用であることを理解すると予想される。さらに、当業者は、本明細書に提供される教示に基づき、本明細書に記載されている組成物および方法によって処置可能な疾患または障害が、レナラーゼおよびＰＤ１が役割を果たし、縮小されたＰＤ１レベルまたは活性と組み合わせた縮小されたレナラーゼレベルまたは活性が、肯定的な治療転帰を促進すると予想される任意の疾患または障害を包含することをさらに認めると予想される。一実施形態では、本発明の化合物および方法を使用して処置可能または予防可能な疾患または障害は、がんである。
【０１５０】
ＰＤ１のレベルまたは活性と組み合わせてレナラーゼのレベルまたは活性を減少させる本発明の阻害剤組成物および方法は、抗体およびその結合断片を含む。本発明の抗体は、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、細胞内抗体（「イントラボディ」）、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦ（ａｂ）２、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、重鎖抗体（ラクダ科抗体など）、合成抗体、キメラ抗体ならびにヒト化抗体を含む、種々の形態の抗体を含む。一実施形態では、本発明の抗体は、レナラーゼに特異的に結合する抗体である。別の実施形態では、本発明の抗体は、ＰＤ１に特異的に結合する抗体である。
【０１５１】
一部の実施形態では、被験体への、がんの処置のための本発明の抗体の投与は、がんに対する被験体の免疫系による免疫応答を惹起および／または補充するように機能する。がんに対する被験体の免疫応答は、自然免疫応答、液性免疫応答、細胞媒介性免疫応答またはこれらの組み合わせを含む、いずれかの宿主防御または応答であり得る。
【０１５２】
当業者は、抗レナラーゼ抗体ならびに抗ＰＤ１抗体および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の組み合わせを、急性的に（例えば、１日間、１週間または１ヶ月間など、短い期間にわたる）または慢性的に（例えば、数ヶ月間または１年間もしくはそれよりも長いなど、長い期間にわたる）投与することができることを認めると予想される。当業者は、両方の抗体が同時発生的に投与されるように、またはそれぞれが他方の前および／もしくは後に単独で投与され得るという点において、各抗体が被験体に時間的な意味で単独で投与されるように、抗レナラーゼ抗体および抗ＰＤ１抗体の組み合わせを投与することができることも認めると予想される。当業者は、２種の抗体のそれぞれが単独で投与され、一方が他方の前に投与される場合、投与された抗体のそれぞれの活性が依然として被験体において生じている限りにおいて、２種の抗体は依然として、組み合わせて送達されていることを理解すると予想される。よって、組み合わせの第１の抗体は、数秒間から数分間、数時間、数日間、数週間までの範囲の間隔で、組み合わせの第２の抗体に先行するまたは後続することができる。
【０１５３】
様々な実施形態では、本明細書に記載されている本発明のレナラーゼまたはレナラーゼ断片の阻害剤のいずれかは、単独で、またはがんに関連する他の分子の他の阻害剤と組み合わせて投与することができる。
【０１５４】
当業者であれば、本明細書に詳述されている方法を含む本開示を具備すると、本発明が、既に確立されているがんなどの疾患または障害の処置に限定されないことが認められよう。特に、疾患または障害は、被験体への損傷時点に顕在化している必要はない；実際に、疾患または障害は、処置が投与される前の被験体において検出されている必要はない。すなわち、顕著な疾患または障害は、本発明が利益をもたらすことができる前に発生している必要はない。したがって、本明細書の他の箇所に以前に考察されている抗レナラーゼ抗体および抗ＰＤ１抗体またはそれらの結合断片の組み合わせが、疾患または障害の発病に先立ち被験体に投与し、これにより、疾患または障害の発症を予防することができるという点において、本発明は、被験体における疾患または障害を予防するための方法を含む。本明細書に記載されている予防的方法は、疾患または障害の再発の予防のための、寛解にある被験体の処置も含む。
【０１５５】
本発明のその結合断片を含む抗体は、ある特定の実施形態では、任意の適したポリヌクレオチドによってコードされる、本明細書に開示されている抗体アミノ酸配列、または任意の単離もしくは製剤化された抗体を含む。さらに、本開示の抗体は、本明細書に記載されている抗レナラーゼまたは抗ＰＤ１抗体の構造的および／または機能的特色を有する抗体を含む。
【０１５６】
一実施形態では、本発明の抗体は、レナラーゼもしくはＰＤ１もしくはＰＤ−Ｌ１タンパク質、ペプチド、サブユニット、断片、部分、またはこれらの任意の組み合わせに特異的な少なくとも１種の指定されたエピトープを免疫特異的に結合し、他のポリペプチドには特異的に結合しない。少なくとも１種のエピトープは、標的タンパク質（すなわち、レナラーゼ、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１）の少なくとも１種の部分を含む少なくとも１種の抗体結合領域を含むことができる。用語「エピトープ」は、本明細書において使用される場合、抗体に結合することができるタンパク質決定基を指す。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面グループ分けからなり、通常、特異的三次元構造的特徴ならびに特異的電荷特徴を有する。コンフォメーションエピトープおよび非コンフォメーションエピトープは、変性溶媒の存在下で前者への結合が失われるが後者への結合は失われないという点において区別される。一部の実施形態では、本発明の抗レナラーゼ抗体は、配列番号１〜７、８、５０、９２、９４およびこれらの断片の少なくとも１種に特異的に結合する。
【０１５７】
抗体の結合部分は、結合パートナー分子（例えば、レナラーゼ）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１種または複数の断片を含む。抗体の結合機能は、全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。抗体の「結合部分」という用語内に包含される結合断片の例として、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域におけるジスルフィド架橋によって連結された２個のＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Wardら（１９８９年）Nature  ３４１巻：５４４〜５４６頁）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２個のドメインであるＶＬおよびＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対形成して一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として作製することができるようにする合成リンカーによって接合されていてよい（単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知；例えば、Birdら（１９８８年）Science  ２４２巻：４２３〜４２６頁；およびHustonら（１９８８年）Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８５巻：５８７９〜５８８３頁を参照）。斯かる単鎖抗体はまた、抗体の「結合部分」という用語内に包含されることが意図される。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技法を使用して得られ、断片は、インタクト抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。結合部分は、組換えＤＮＡ技法によって、またはインタクト免疫グロブリンの酵素によるもしくは化学的な切断によって産生することができる。
【０１５８】
一部の実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、レナラーゼ−１に特異的に結合する。他の実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、レナラーゼ−２に特異的に結合する。さらに別の実施形態では、抗レナラーゼ抗体は、レナラーゼ−１およびレナラーゼ−２の両方に特異的に結合する。加えて、エピトープ特異的抗体が生成された。本発明の好ましい抗体は、モノクローナル抗体１Ｃ−２２−１、１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７および３Ａ−５−２を含む。二重特異性抗体、例えば、レナラーゼ−１およびレナラーゼ−２を認識する抗体の例として、抗体１Ｃ−２２−１、１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、および表１に記載されているポリクローナル抗体が挙げられる。レナラーゼ型特異的抗体の例として、レナラーゼ−１に特異的な１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７が挙げられる。３Ａ−５−２は、レナラーゼ−２に特異的である。抗レナラーゼモノクローナル抗体をコードする配列は、図５に表記されている。
【０１５９】
モノクローナル抗体１Ｄ−２８−４の重鎖コード配列の核酸（配列番号５２）およびアミノ酸配列（配列番号９）は、図５Ａに見出される。モノクローナル抗体１Ｄ−２８−４の軽鎖コード配列の核酸（配列番号５３）およびアミノ酸配列（配列番号１０）は、図５Ｂに見出される。
【０１６０】
モノクローナル抗体１Ｄ−３７−１０の重鎖コード配列の核酸（配列番号６０）およびアミノ酸配列（配列番号１７）は、図５Ｃに見出される。モノクローナル抗体１Ｄ−３７−１０の軽鎖コード配列の核酸（配列番号６１）およびアミノ酸配列（配列番号１８）は、図５Ｄに見出される。
【０１６１】
モノクローナル抗体１Ｆ−２６−１の重鎖コード配列の核酸（配列番号６８）およびアミノ酸配列（配列番号２５）は、図５Ｅに見出される。モノクローナル抗体１Ｆ−２６−１の軽鎖コード配列の核酸（配列番号６９）およびアミノ酸配列（配列番号２６）は、図５Ｆに見出される。
【０１６２】
モノクローナル抗体１Ｆ−４２−７の重鎖コード配列の核酸（配列番号７６）およびアミノ酸配列（配列番号３３）は、図５Ｇに見出される。モノクローナル抗体１Ｆ−４２−７の軽鎖コード配列の核酸（配列番号７７）およびアミノ酸配列（配列番号３４）は、図５Ｈに見出される。
【０１６３】
モノクローナル抗体３Ａ−５−２の重鎖コード配列の核酸（配列番号８４）およびアミノ酸配列（配列番号４１）は、図５Ｉに見出される。モノクローナル抗体３Ａ−５−２の軽鎖コード配列の核酸（配列番号８５）およびアミノ酸配列（配列番号４２）は、図５Ｊに見出される。
【０１６４】
配列のそれぞれにおける下線を引かれた配列は、重および軽鎖のそれぞれのＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を取り込む。
【０１６５】
モノクローナル抗体のうちの特定のものが、レナラーゼタンパク質に結合することができることを考慮すると、ＶＨおよびＶＬ配列を「混合およびマッチ」して、本開示の他の抗レナラーゼ結合分子を創出することができる。斯かる「混合およびマッチされた」抗体のレナラーゼ結合は、上および実施例に記載されている結合アッセイを使用して検査することができる（例えば、イムノブロット、Ｂｉａ−Ｃｏｒｅなど）。好ましくは、ＶＨおよびＶＬ鎖が混合およびマッチされる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対形成由来のＶＨ配列は、構造的に同様のＶＨ配列により置き換えられる。同様に、好ましくは、特定のＶＨ／ＶＬ対形成由来のＶＬ配列は、構造的に同様のＶＬ配列により置き換えられる。
【０１６６】
したがって、一態様では、本開示は、（ａ）配列番号９、１７、２５、３３および４１からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域；ならびに（ｂ）配列番号１０、１８、２６、３４および４２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその結合部分であって、抗体が、レナラーゼタンパク質と特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその結合部分を提供する。
【０１６７】
好ましい重および軽鎖組み合わせは、（ａ）配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または（ｂ）配列番号１７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号１８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または（ｃ）配列番号２５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号２６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または（ｄ）配列番号３３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号３４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域；または（ｅ）配列番号４１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域および配列番号４２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【０１６８】
別の態様では、本開示は、１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７もしくは３Ａ−５−２、またはこれらの組み合わせの重鎖および軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む抗体を提供する。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７および３Ａ−５−２のＶＨ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１１、１９、２７、３５および４３に示す配列を取り込む。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７または３Ａ−５−２のＶＨ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２、２０、２８、３６および４４に示す配列を取り込む。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７または３Ａ−５−２のＶＨ  ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３、２１、２９、３７および４５に示す配列を取り込む。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７または３Ａ−５−２のＶＫ  ＣＤＲ１のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４、２２、３０、３８および４６に示す配列を取り込む。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７または３Ａ−５−２のＶＫ  ＣＤＲ２のアミノ酸配列は、配列番号１５、２３、３１、３９および４７に示す配列を取り込む。１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７または３Ａ−５−２のＶκＣＤＲ３のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１６、２４、３２、４０および４８に示す配列を取り込む。ＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔ方式を使用して描写される（Kabat,  E.  A.ら（１９９１年）Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest、第５版、U.S.  Department  of  Health  and  Human  Services、ＮＩＨ公開番号９１−３２４２）。
【０１６９】
これらの抗体のそれぞれが、レナラーゼファミリーメンバーに結合することができ、結合特異性が、主にＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域によってもたらされることを考慮すると、ＶＨ  ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列ならびにＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を「混合およびマッチ」して（すなわち、各抗体は、ＶＨ  ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ならびにＶＬ  ＣＤＲｌ、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含有しなければならないが、異なる抗体由来のＣＤＲを混合およびマッチすることができる）、本開示の他の抗レナラーゼ結合分子を創出することができる。斯かる「混合およびマッチされた」抗体のレナラーゼ結合は、上および実施例に記載されている結合アッセイを使用して検査することができる（例えば、イムノブロット、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）解析など）。好ましくは、ＶＨ  ＣＤＲ配列が混合およびマッチされる場合、特定のＶＨ配列由来のＣＤＲｌ、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、構造的に同様のＣＤＲ配列（複数可）により置き換えられる。同様に、ＶＬ  ＣＤＲ配列が混合およびマッチされる場合、特定のＶＬ配列由来のＣＤＲｌ、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３配列は、好ましくは、構造的に同様のＣＤＲ配列（複数可）により置き換えられる。当業者には、１個または複数のＶＨおよび／またはＶＬ  ＣＤＲ領域配列を、モノクローナル抗体１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７または３Ａ−５−２について本明細書に開示されているＣＤＲ配列由来の構造的に同様の配列により置換することにより、新規ＶＨおよびＶＬ配列を創出することができることが容易に明らかとなると予想される。
【０１７０】
したがって、別の態様では、本発明は、（ａ）配列番号１１、１９、２７、３５および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号１２、２０、２８、３６および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１３、２１、２９、３７および４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１４、２２、３０、３８および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号１５、２３、３１、３９および４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；ならびに（ｆ）配列番号１６、２４、３２、４０および４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択される少なくとも１種を含む、単離されたモノクローナル抗体またはその結合部分であって、抗体が、レナラーゼと特異的に結合する、単離されたモノクローナル抗体またはその結合部分を提供する。
【０１７１】
別の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１１を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号１２を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１３を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号１５を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号１６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲの少なくとも１種を含む。
【０１７２】
別の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１９を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号２０を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２１を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号２２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号２３を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号２４を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲの少なくとも１種を含む。
【０１７３】
別の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号２７を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号２８を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号２９を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号３０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号３１を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号３２を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲの少なくとも１種を含む。
【０１７４】
別の他の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号３５を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号３６を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号３７を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号３８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号３９を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号４０を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲの少なくとも１種を含む。
【０１７５】
別の実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号４３を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号４４を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号４５を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号４６を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号４７を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；および（ｆ）配列番号４８を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３から選択されるＣＤＲの少なくとも１種を含む。
【０１７６】
様々な実施形態では、本発明の抗体は、１×１０−６Ｍもしくはそれに満たない、より好ましくは１×１０−７Ｍもしくはそれに満たない、より好ましくは１×１０−８Ｍもしくはそれに満たない、より好ましくは５×１０−９Ｍもしくはそれに満たない、より好ましくは１×１０−９Ｍもしくはそれに満たない、またはなおより好ましくは３×１０−１０Ｍもしくはそれに満たないＫＤで、その標的タンパク質（すなわち、レナラーゼまたはＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１）に結合する。タンパク質にも細胞にも「実質的に結合しない」という用語は、本明細書において使用される場合、タンパク質にも細胞にも結合しないことまたは高い親和性で結合しないこと、すなわち、１×１０６Ｍまたはそれよりも高い、より好ましくは１×１０５Ｍまたはそれよりも高い、より好ましくは１×１０４Ｍまたはそれよりも高い、より好ましくは１×１０３Ｍまたはそれよりも高い、なおより好ましくは１×１０２Ｍまたはそれよりも高い値を超えるＫＤでタンパク質または細胞に結合することを意味する。用語「ＫＤ」は、本明細書において使用される場合、ＫｄのＫａに対する比（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表現される解離定数を指すことが意図される。レナラーゼ結合分子（例えば、抗体など）に対するＫＤ値は、本技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。結合分子（例えば、抗体など）のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴を使用すること、好ましくは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる。
【０１７７】
本明細書において使用される場合、ＩｇＧ抗体に対する「高い親和性」という用語は、標的結合パートナー分子に対して１×１０−７Ｍまたはそれに満たない、より好ましくは５×１０−８Ｍまたはそれに満たない、なおより好ましくは１×１０−８Ｍまたはそれに満たない、なおより好ましくは５×１０−９Ｍまたはそれに満たない、なおより好ましくは１×１０−９Ｍまたはそれに満たないＫＤを有する抗体を指す。しかし、「高い親和性」結合は、他の抗体アイソタイプに対して変動し得る。例えば、ＩｇＭアイソタイプに対する「高い親和性」結合は、１０−６Ｍまたはそれに満たない、より好ましくは１０−７Ｍまたはそれに満たない、なおより好ましくは１０−８Ｍまたはそれに満たないＫＤを有する抗体を指す。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域など、重鎖定常領域を含む。好ましくは、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１重鎖定常領域またはＩｇＧ４重鎖定常領域である。さらに、抗体は、カッパー軽鎖定常領域またはラムダ軽鎖定常領域のいずれかの軽鎖定常領域を含むことができる。好ましくは、抗体は、カッパー軽鎖定常領域を含む。あるいは、抗体部分は、例えば、Ｆａｂ断片または単鎖Ｆｖ断片であり得る。
【０１７９】
抗レナラーゼ抗体の生成
本発明は、レナラーゼに結合する組成物を提供する。本明細書に開示されているレナラーゼ分子は、本明細書に開示されている他のポリペプチドと高いおよび／または有意な配列同一性を有する分子を含む分子のクラスである。より具体的には、推定レナラーゼは、配列番号４９または５１の配列を有する核酸と少なくとも約４０％の配列同一性を共有する。より好ましくは、レナラーゼをコードする核酸は、本明細書に開示されている配列番号４９または５１と少なくとも約４５％の同一性、または少なくとも約５０％の同一性、または少なくとも約５５％の同一性、または少なくとも約６０％の同一性、または少なくとも約６５％の同一性、または少なくとも約７０％の同一性、または少なくとも約７５％の同一性、または少なくとも約８０％の同一性、または少なくとも約８５％の同一性、または少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。なおより好ましくは、核酸は、配列番号４９または５１または９３または９５である。用語「レナラーゼ」は、レナラーゼアイソフォームも含む。レナラーゼ遺伝子は、ヒトゲノムの第１０染色体における３１０１８８ｂｐに及ぶ９個のエクソンを含有する。本明細書に開示されているレナラーゼクローン（配列番号４９、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＢＣ００５３６４）は、エクソン１、２、３、４、５、６、８を含有する遺伝子である。ヒトゲノムデータベースに示す通り、レナラーゼタンパク質の少なくとも２種の追加の選択的にスプライシングされた形態が存在する。一方の選択的にスプライシングされた形態は、その配列を明確に参照により本明細書に組み込む、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＡＫ００２０８０およびＮＭＪ）１８３６３としてのヒトゲノムデータベースにおけるクローンによって同定された、エクソン１、２、３、４、５、６、９を含有する。他方の選択的にスプライシングされた形態は、その配列を明確に参照により本明細書に組み込む、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＸ６４８１５４としてのヒトゲノムデータベースにおけるクローンによって同定された、エクソン５、６、７、８を含有する。他に断りがなければ、「レナラーゼ」は、本明細書に開示されているレナラーゼの特徴および／または物理的特色を有する、ヒトレナラーゼおよびチンパンジーレナラーゼが挙げられるがこれらに限定されない、全ての公知のレナラーゼ（例えば、ラットレナラーゼおよびヒトレナラーゼ）、および発見されるはずのレナラーゼを包含する。
【０１８０】
加えて、推定レナラーゼは、配列番号８または５０の配列を有するポリペプチドと少なくとも約６０％の配列同一性を共有する。より好ましくは、レナラーゼは、本明細書に開示されている配列番号８または５０と少なくとも約４５％の同一性、または少なくとも約５０％の同一性、または少なくとも約５５％の同一性、または少なくとも約６０％の同一性、または少なくとも約６５％の同一性、または少なくとも約７０％の同一性、または少なくとも約７５％の同一性、または少なくとも約８０％の同一性、または少なくとも約８５％の同一性、または少なくとも約９０％の同一性、または少なくとも約９５％の同一性、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有する。なおより好ましくは、レナラーゼポリペプチドは、配列番号８または５０または９２または９４のアミノ酸配列を有する。
【０１８１】
一実施形態では、レナラーゼの配列に由来するペプチドを使用して動物を免疫化し、それによって、動物が、免疫原に対する抗体を産生することにより、本発明の抗体を生成することができる。例示的な免疫原は、レナラーゼに由来するペプチドを含む。すなわち、レナラーゼ配列の断片を有するペプチドを、本発明において使用することができる。ペプチドは、組換えペプチドとしての発現、より大型のポリペプチドとしての発現および酵素によるまたは化学的な切断を含む種々の仕方で産生することができる。あるいは、これは、本技術分野で公知の通り、合成により産生することができる。本発明の親和性試薬を生成するために使用される好ましいペプチドは、表１（配列番号１〜７）に見出される。
【０１８２】
本発明の抗レナラーゼ抗体は、KohlerおよびMilstein（１９７５年）Nature  ２５６巻：４９５頁の標準体細胞ハイブリダイゼーション技法（ハイブリドーマ方法）を含む、種々の技法によって必要に応じて産生することができる。ハイブリドーマ方法において、マウスまたはハムスターもしくはマカクザルなどの他の適切な宿主動物は、本明細書に記載されている通りに免疫化されて、免疫化に使用されるタンパク質に特異的に結合すると予想される抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫化することができる。次いで、リンパ球は、ポリエチレングリコールなどの適した融合剤を使用して骨髄腫細胞と融合されて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Goding、Monoclonal  Antibodies:  Principles  and  Practice、５９〜１０３頁（Academic  Press、１９８６年））。
【０１８３】
ハイブリドーマ技術を使用して特異的抗体を産生およびスクリーニングするための方法は、本技術分野で慣例的かつ周知である。一実施形態では、本発明は、本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養するステップを含む、モノクローナル抗体を生成する方法、およびこの方法によって産生された抗体を提供し、ここで好ましくは、ハイブリドーマが、本発明のポリペプチドまたはペプチドにより免疫化されたマウスまたはウサギまたは他の種から単離された脾細胞を骨髄腫細胞と融合し、次いで、融合に起因するハイブリドーマを、本発明のポリペプチドと結合できる抗体を分泌するハイブリドーマクローンに関してスクリーニングすることにより生成される。簡潔に説明すると、マウスは、レナラーゼポリペプチドまたはそのペプチドにより免疫化することができる。好ましい実施形態では、レナラーゼポリペプチドまたはそのペプチドは、アジュバントと共に投与されて、免疫応答を刺激する。斯かるアジュバントは、フロイントの完全もしくは不完全アジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）またはＩＳＣＯＭ（免疫賦活性複合体）を含む。斯かるアジュバントは、局所的沈着においてポリペプチドを隔絶することにより、急速分散からポリペプチドを保護することができる、またはマクロファージおよび免疫系の他の構成成分に対して走化性の因子を分泌するように宿主を刺激する物質を含有することができる。好ましくは、ポリペプチドが投与されている場合、免疫化スケジュールは、数週間かけて拡散する、ポリペプチドの２回またはそれよりも多い投与を含む。
【０１８４】
あるいは、ウサギを、レナラーゼポリペプチドまたはそのペプチドにより免疫化することができる。本実施形態では、全長レナラーゼタンパク質またはレナラーゼに由来するペプチドのいずれかを、免疫原として使用することができる。
【０１８５】
本発明において使用されるレナラーゼは、種々の形態をとることができる。例えば、これは、精製されたレナラーゼタンパク質またはその断片、組換えにより産生されたレナラーゼまたはその断片を含むことができる。一部の実施形態では、レナラーゼは、ヒトレナラーゼである。組換えレナラーゼが使用される場合、これは、本技術分野で公知の通り、真核または原核細胞において産生することができる。追加の免疫原は、レナラーゼに由来するペプチドを含む。すなわち、レナラーゼ配列の断片を有するペプチドを本発明において使用することができる。ペプチドは、組換えペプチドとしての発現、より大型のポリペプチドとしての発現および酵素によるまたは化学的な切断を含む種々の仕方で産生することができる。あるいは、これは、本技術分野で公知の通り、合成により産生することができる。本発明の親和性試薬を生成するために使用されるペプチドは、表１（配列番号１〜７）に見出される。ヒトレナラーゼの全長アミノ酸配列は、配列番号８に描写され、示されている通りに公知の多型が可能である（配列番号９２と比較）。レナラーゼ−２のアミノ酸配列は、配列番号５０に見出され、これもまた、示されている通りに公知の多型が可能である（配列番号９４と比較）。他の多型が存在することが認められる。これらもレナラーゼの定義に含まれる。一部の実施形態では、本発明のレナラーゼ結合分子は、配列番号１〜７、８、５０、９２、９４、およびこれらの断片の少なくとも１種に特異的に結合する。
【０１８６】
抗レナラーゼ抗体は、本明細書に記載されている通りおよび／または本技術分野で公知の通り、ヒト抗体のレパートリーを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、および非ヒト霊長類など）の免疫化によって必要に応じて生成することもできる。ヒト抗レナラーゼ抗体を産生する細胞は、斯かる動物から単離し、本明細書に記載されている方法など、適した方法を使用して不死化することができる。あるいは、本明細書に教示されている方法および本技術分野で公知の方法による抗体の発現および単離のために、抗体コード配列をクローニングし、適したベクターに導入し、宿主細胞のトランスフェクトに使用することができる。
【０１８７】
その生殖系列構成でヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座を保有するトランスジェニックマウスの使用は、正常ヒト免疫系が寛容性であるヒト自己抗原を含む、種々の標的に対する高い親和性の完全ヒトモノクローナル抗体の単離をもたらす（Lonberg,  N.ら、米国特許第５，５６９，８２５号、米国特許第６，３００，１２９号および１９９４年、Nature  ３６８巻：８５６〜９頁；Green,  L.ら、１９９４年、Nature  Genet.７巻：１３〜２１頁；Green,  L.およびJakobovits、１９９８年、Exp.  Med.１８８巻：４８３〜９５頁；Lonberg,  N.およびHuszar,  D.、１９９５年、Int.  Rev.  Immunol.１３巻：６５〜９３頁；Kucherlapatiら、米国特許第６，７１３，６１０号；Bruggemann,  M.ら、１９９１年、Eur.  J.  Immunol.２１巻：１３２３〜１３２６頁；Fishwild,  D.ら、１９９６年、Nat.  Biotechnol.１４巻：８４５〜８５１頁；Mendez,  M.ら、１９９７年、Nat.  Genet.１５巻：１４６〜１５６頁；Green,  L.、１９９９年、J.  Immunol.  Methods  ２３１巻：１１〜２３頁；Yang,  X.ら、１９９９年、Cancer  Res.５９巻：１２３６〜１２４３頁；Bruggemann,  M.およびTaussig,  M  J.、Curr.  Opin.  Biotechnol.８巻：４５５〜４５８頁、１９９７年；Tomizukaら、ＷＯ０２０４３４７８）。斯かるマウスにおける内在性免疫グロブリン遺伝子座が破壊または欠失されて、内在性遺伝子によってコードされる抗体を産生する動物の能力を排除することができる。加えて、本明細書の他の箇所に記載されている技術を使用して、選択された標的結合パートナー分子（例えば、抗原など）に対するヒト抗体を提供するように、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ、Ｃａｌｉｆ．）およびＭｅｄａｒｅｘ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、Ｃａｌｉｆ．）などの会社を手配することができる。
【０１８８】
別の実施形態では、ヒト抗体は、ファージライブラリーから選択され、このファージは、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含み、ライブラリーは、例えば、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、または対形成されたもしくは対形成されていない抗体可変領域を示す他の何らかの構築物としてヒト抗体結合ドメインを発現する（Vaughan  et  lo  al.、Nature  Biotechnology  １４巻：３０９〜３１４頁（１９９６年）：Sheetsら、PITAS  (USA)  ９５巻：６１５７〜６１６２頁（１９９８年））；HoogenboomおよびWinter、J.  Mol.  Biol.、２２７巻：３８１頁（１９９１年）；Marksら、J.  Mol.  Biol.、２２２巻：５８１頁（１９９１年））。本発明のヒトモノクローナル抗体は、ヒト免疫グロブリン遺伝子のライブラリーをスクリーニングするためのファージディスプレイ方法を使用して調製することもできる。ヒト抗体を単離するための斯かるファージディスプレイ方法は、本技術分野で確立されている。例えば：米国特許第５，２２３，４０９号；同第５，４０３，４８４号；および同第５，５７１，６９８号、Ladnerら；米国特許第５，４２７，９０８号および同第５，５８０，７１７号、Dowerら；米国特許第５，９６９，１０８号および同第６，１７２，１９７号、McCaffertyら；ならびに米国特許第５，８８５，７９３号；同第６，５２１，４０４号；同第６，５４４，７３１号；同第６，５５５，３１３号；同第６，５８２，９１５号および同第６，５９３，０８１号、Griffithsらを参照されたい。
【０１８９】
免疫原性抗原の調製、およびモノクローナル抗体産生は、組換えタンパク質産生など、任意の適した技法を使用して行うことができる。免疫原性抗原は、精製されたタンパク質、または細胞全体もしくは細胞もしくは組織抽出物を含むタンパク質混合物の形態で動物に投与することができる、あるいは抗原は、前記抗原またはその部分をコードする核酸から動物の身体においてｄｅ  ｎｏｖｏで形成することができる。
【０１９０】
本発明の単離された核酸は、本技術分野で周知の通り、（ａ）組換え方法、（ｂ）合成技法、（ｃ）精製技法、またはこれらの組み合わせを使用して作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、本技術分野で公知の方法を使用して容易に単離および配列決定される（例えば、マウス抗体の重および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）。ハイブリドーマが産生される場合、斯かる細胞は、斯かるＤＮＡの供給源として機能することができる。あるいは、ファージまたはリボソームディスプレイライブラリーなど、コード配列および翻訳産物が連結されているディスプレイ技法を使用して、結合剤および核酸の選択が単純化される。ファージ選択後に、ファージ由来の抗体コード領域を単離および使用して、ヒト抗体を含む抗体全体、または任意の他の所望の結合断片を生成し、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む任意の所望の宿主において発現させることができる。
【０１９１】
ヒト化抗体
本発明はさらに、ヒトレナラーゼまたはＰＤ１またはＰＤ−Ｌ１と結合するヒト化免疫グロブリン（または抗体）を提供する。ヒト化形態の免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリン（アクセプター免疫グロブリンと命名）に実質的に由来する可変フレームワーク領域（複数可）、およびレナラーゼと特異的に結合する非ヒトｍＡｂに実質的に由来するＣＤＲを有する。存在するのであれば、定常領域（複数可）も、ヒト免疫グロブリンに実質的に由来する。ヒト化抗体は、少なくとも約１０−６Ｍ（１マイクロＭ）、約１０−７Ｍ（１００ｎＭ）またはそれに満たない、レナラーゼに対するＫＤを示す。ヒト化抗体の結合親和性は、これが由来するマウス抗体のものよりも大きいまたは小さい場合がある。レナラーゼに対するヒト化抗体の親和性の変化に影響を与え、親和性を改善するために、ＣＤＲ残基またはヒト残基のいずれかにおける置換を作製することができる。
【０１９２】
レナラーゼに結合するヒト化抗体の産生のための供給源は、好ましくは、その生成、単離および特徴付けが本明細書に提供される実施例に記載されている、１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７または３Ａ−５−２マウス抗体であるが、レナラーゼへの結合に関して１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ４２−７または３Ａ−５−２マウス抗体と競合する他のマウス抗体を使用することもできる。配列表に表記されている同定されたＣＤＲは、ヒト化プロセスの出発点であり得る。例えば、以下のアミノ酸配列（およびその対応する核酸配列）のいずれか１種または複数は、ヒト化プロセスの出発点であり得る：（ａ）配列番号１１、１９、２７、３５および４３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｂ）配列番号１２、２０、２８、３６および４４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ２；（ｃ）配列番号１３、２１、２９、３７および４５からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域ＣＤＲ３；（ｄ）配列番号１４、２２、３０、３８および４６からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲｌ；（ｅ）配列番号１５、２３、３１、３９および４７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ２；ならびに（ｆ）配列番号１６、２４、３２、４０および４８からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域ＣＤＲ３。
【０１９３】
ヒト可変ドメインフレームワークが、ＣＤＲの起源であるマウス可変フレームワークと同じまたは同様のコンフォメーションを採用する場合、ヒト可変ドメインフレームワークへのマウスＣＤＲの置換が、その正しい空間的配向性の保持をもたらす可能性が最も高い。これは、ヒト抗体からヒト可変ドメインを得ることにより達成され、そのフレームワーク配列は、ＣＤＲが由来するマウス可変フレームワークドメインと高度な配列同一性を示す。重および軽鎖可変フレームワーク領域は、同じまたは異なるヒト抗体配列に由来し得る。ヒト抗体配列は、天然に存在するヒト抗体の配列であるか、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来し得る、またはいくつかのヒト抗体および／もしくは生殖系列配列のコンセンサス配列であり得る。
【０１９４】
適したヒト抗体配列は、マウス可変領域の、公知のヒト抗体の配列とのアミノ酸配列のコンピュータ比較によって同定される。比較は、重および軽鎖に対して別々に行われるが、それぞれの原理は同様である。
【０１９５】
一例では、抗レナラーゼｍＡｂのアミノ酸配列を使用して、公開抗体配列データベースからコンパイルされたヒト抗体データベースを検索する。重鎖可変領域を使用して、最高の配列同一性を有するヒト可変領域を見出すことができる。同様に、軽鎖の可変領域を使用して、最高の配列同一性を有するヒト可変領域を見出すことができる。マウスｍＡｂドナー由来の重鎖可変領域の１種のＣＤＲをコードする領域が、選択されたヒト重鎖可変配列に移入されてヒト可変領域のＣＤＲを置き換えているＤＮＡ構築物が、各マウス可変領域に調製される。
【０１９６】
マウスＣＤＲ領域の、ヒト可変フレームワーク領域との非天然並置は、非天然コンフォメーション的制約をもたらし得、これは、ある特定のアミノ酸残基の置換によって補正されない限り、結合親和性の損失につながる。上に記す通り、本発明のヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリンに実質的に由来する可変フレームワーク領域（複数可）、およびマウス免疫グロブリンに実質的に由来するＣＤＲを含む。マウス抗体のＣＤＲおよび適切なヒトアクセプター免疫グロブリン配列を同定したら、次のステップは、これらの構成成分由来のどの残基（あるとすれば）を置換して、その結果得られるヒト化抗体の特性を最適化するべきかどうかを決定することである。一般に、マウス残基の導入は、ヒトにおいてＨＡＭＡ応答を誘発する抗体のリスクを増加させるため、マウスによるヒトアミノ酸残基の置換は最小化されるべきである。アミノ酸は、ＣＤＲコンフォメーションおよび／または標的結合パートナー分子への結合に対するその可能な影響に基づき、置換のために選択される。斯かる可能な影響の調査は、モデル化、特定の位置におけるアミノ酸の特徴の試験、または特定のアミノ酸の置換もしくは変異誘発の効果の経験的観察によって行うことができる。経験的方法に関して、所望の活性、結合親和性または特異性に関してスクリーニングされ得るバリアント配列のライブラリーを創出することが特に簡便であることが見出された。斯かるバリアントのライブラリーの創出のための一形式は、ファージディスプレイベクターである。あるいは、バリアントは、可変ドメイン内の標的化残基をコードする核酸配列の多様化のための他の方法を使用して生成することができる。
【０１９７】
さらなる置換が要求されるかどうかを決定する別の方法、および置換のためのアミノ酸残基の選択は、コンピュータモデル化を使用して達成することができる。免疫グロブリン分子の三次元画像を産生するためのコンピュータハードウェアおよびソフトウェアが広く利用できる。一般に、分子モデルは、免疫グロブリン鎖またはそのドメインの解析された構造から出発して産生される。モデル化されるべき鎖は、解析された三次元構造の鎖またはドメインと、アミノ酸配列類似性に関して比較され、最大配列類似性を示す鎖またはドメインが、分子モデルの構築のための出発点として選択される。解析された出発構造は、モデル化されている免疫グロブリン鎖またはドメインにおける実際のアミノ酸と、出発構造におけるアミノ酸との間の差を許容するように修飾される。次いで、修飾された構造は、複合的免疫グロブリンへとアセンブルされる。最後に、エネルギー最小化により、また、全原子が、互いに適切な距離内にあること、ならびに結合の長さおよび角度が、化学的に許容される限界内にあることを検証することにより、モデルが緻密化される。
【０１９８】
通常、ヒト化抗体におけるＣＤＲ領域は、これが由来するマウス抗体における対応するＣＤＲ領域と実質的に同一であり、より通常では、同一である。通常望ましくないが、その結果得られるヒト化免疫グロブリンの結合親和性に認識できるほど影響を与えることなく、ＣＤＲ残基の１個または複数の保存的アミノ酸置換を作製することが可能な場合もある。時おり、ＣＤＲ領域の置換は、結合親和性を増強することができる。
【０１９９】
上に記述されている特異的アミノ酸置換に関する以外に、ヒト化免疫グロブリンのフレームワーク領域は、通常、これが由来するヒト抗体のフレームワーク領域と実質的に同一であり、より通常では、同一である。当然ながら、フレームワーク領域におけるアミノ酸の多くは、抗体の特異性または親和性に対する直接的な寄与を殆ど有さないかまたは全く有さない。よって、フレームワーク残基の多くの個々の保存的置換は、その結果得られるヒト化免疫グロブリンの特異性または親和性の認識できる変化を伴わずに耐容性を示すことができる。
【０２００】
コードの縮重のため、種々の核酸配列が、各免疫グロブリンアミノ酸配列をコードする。所望の核酸配列は、ｄｅ  ｎｏｖａ固相ＤＮＡ合成によって、または所望のポリヌクレオチドの早期に調製されたバリアントのＰＣＲ変異誘発によって産生することができる。本願に記載されている抗体をコードする全核酸が、本発明に明確に含まれている。
【０２０１】
上に記載されている通りに産生されたヒト化抗体の可変セグメントは、典型的に、ヒト免疫グロブリン定常領域の少なくとも部分に連結される。抗体は、軽鎖および重鎖定常領域の両方を含有する。重鎖定常領域は通常、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、および場合により、ＣＨ４ドメインを含む。
【０２０２】
ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む任意のクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む任意のサブクラス（アイソタイプ）の抗体由来のいずれかの種類の定常ドメインを含むことができる。ヒト化抗体が、細胞傷害活性を示すことが望まれる場合、定常ドメインは通常、補体結合定常ドメインであり、クラスは典型的に、ＩｇＧ１である。斯かる細胞傷害活性が望ましくない場合、定常ドメインは、ＩｇＧ２クラスのものであり得る。ヒト化抗体は、１つより多くのクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含むことができる。
【０２０３】
定常領域に必要に応じて連結された、ヒト化軽および重鎖可変領域をコードする核酸は、発現ベクターに挿入される。軽および重鎖は、同じまたは異なる発現ベクターにおいてクローニングすることができる。免疫グロブリン鎖をコードするＤＮＡセグメントは、免疫グロブリンポリペプチドの発現を確実にする、発現ベクター（複数可）における制御配列に作動可能に連結される。斯かる制御配列は、シグナル配列、プロモーター、エンハンサーおよび転写終結配列を含む（あらゆる目的のためにそれらの全体を参照により本明細書に組み込む、Queenら、Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  ８６巻、１００２９頁（１９８９年）；ＷＯ９０／０７８６１；Coら、J.  Immunol.１４８巻、１１４９頁（１９９２年）を参照）。
【０２０４】
処置および予防方法
一般に、本発明の処置および予防方法は、治療または予防有効量の抗レナラーゼ抗体またはその結合断片および抗ＰＤ１抗体（および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）またはその結合断片の組み合わせを、それを必要とする被験体に投与するステップを含む。被験体に、抗レナラーゼおよび抗ＰＤ１抗体（および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）を提供する際に、投与される薬剤の投薬量は、患者の年齢、体重、身長、性別、全身の医学的状態、以前の病歴などのような因子に応じて変動する。
【０２０５】
一般に、全身性用量を投与する場合、レシピエントに、約１ｎｇ／ｋｇ〜１００ｎｇ／ｋｇ、１００ｎｇ／ｋｇ〜５００ｎｇ／ｋｇ、５００ｎｇ／ｋｇ〜１μｇ／ｋｇ、１μｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇ、１００μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇ、５００μｇ／ｋｇ〜１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、１００ｍｇ／ｋｇ〜５００ｍｇ／ｋｇ（レシピエントの体重）の範囲内の投薬量を提供することが望ましいが、より低いまたはより高い投薬量を投与してもよい。約１．０ｍｇ／ｋｇもの低さの投薬量は、ある程度の有効性を示すと予想することができる。好ましくは、約５ｍｇ／ｋｇが許容される投薬量であるが、最大約５０ｍｇ／ｋｇの投薬量レベルも、特に治療使用に好ましい。あるいは、１μｇ〜１００μｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇまたは１ｇｍ〜１００ｇｍの範囲内の量など、患者の体重に基づかない特異的な量の投与を与えることができる。例えば、部位特異的投与は、関節内、気管支内、腹内、包内、軟骨内、腔内性、腔内、小脳内（intracelebella）、脳室内、結腸内、子宮頚管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液包内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病巣内、腟、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、眼科的または経皮手段など、身体区画または腔への投与であり得る。
【０２０６】
抗体またはその結合断片は、特に、液体の溶液もしくは懸濁物の形態での、非経口的（皮下、筋肉内または静脈内）もしくは任意の他の投与のための使用のため；特に、クリーム剤および坐剤などだがこれらに限定されない、半固体形態での、腟もしくは直腸投与における使用のため；錠剤もしくはカプセル剤の形態などだがこれらに限定されない、頬側もしくは舌下投与のため；または散剤、点鼻剤もしくはエアゾール剤もしくはある特定の薬剤の形態などだがこれらに限定されない、鼻腔内；または点眼剤などだがこれらに限定されない、眼科的に；または歯科疾患の処置のため；またはゲル剤、軟膏剤、ローション剤、懸濁剤、もしくは皮膚構造を修飾するためもしくは経皮パッチにおける薬物濃度を増加させるためのジメチルスルホキシドなどの化学的エンハンサーによる、もしくはタンパク質およびペプチドを含有する製剤の皮膚への塗布（ＷＯ９８／５３８４７）、もしくはエレクトロポレーションなどの一過性輸送経路を創出するためもしくはイオントフォレーシスなどの皮膚を通した荷電薬物の移動度を増加させるための電場の印加、またはソノフォレーシスなどの超音波の適用（米国特許第４，３０９，９８９号および同第４，７６７，４０２号）を可能にする酸化剤によるパッチ送達系などだがこれらに限定されない、経皮のために調製することができる。
【０２０７】
本発明の抗体またはその結合断片は、薬学的に有用な組成物を調製するための公知の方法に従って製剤化することができ、それによって、これらの材料またはその機能的誘導体は、薬学的に許容される担体ビヒクルとの混和物において組み合わされる。他のヒトタンパク質、例えば、ヒト血清アルブミンを含む、適したビヒクルおよびその製剤は、例えば、Remington's  Pharmaceutical  Sciences（第１６版、Osol,  A.編、Mack  Easton  Pa.（１９８０年））に記載されている。有効な投与に適した薬学的に許容される組成物を形成するために、斯かる組成物は、適した量の担体ビヒクルと共に、有効量の上述の化合物を含有する。追加の薬学的方法を用いて、作用の持続時間を制御することができる。制御放出調製物は、化合物を複合体形成または吸収するためのポリマーの使用により達成することができる。制御放出調製物による作用の持続時間を制御するための別の可能な方法は、ポリエステル、ポリアミノ酸、ハイドロゲル、ポリ（乳酸）またはエチレン酢酸ビニルコポリマーなど、ポリマー材料の粒子へと本発明の化合物を取り込むことである。あるいは、ポリマー粒子へとこれらの薬剤を取り込む代わりに、調製されたマイクロカプセル、例えば、界面重合、例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタクリレート（methylmethacylate））−マイクロカプセルにおいて、またはコロイド薬物送達系、例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノカプセルにおいて、またはマクロエマルションにおいて、これらの材料を捕捉することが可能である。
【０２０８】
処置は、単一用量スケジュール、または好ましくは、複数用量スケジュールで与えることができ、複数用量スケジュールにおいて、処置の一次コースが１〜１００の別々の用量を用い、続いて他の用量を、応答の維持およびまたは強化に要求されるその後の時間間隔で、例えば、１〜４ヶ月目に第２の用量、および必要であれば数ヶ月後にその後の用量（複数可）を与えることができる。適した処置スケジュールの例として、（ｉ）０、１ヶ月および６ヶ月、（ｉｉ）０、７日および１ヶ月、（ｉｉｉ）０および１ヶ月、（ｉｖ）０および６ヶ月、または疾患症状を低下もしくは疾患の重症度を低下させることが予想される所望の応答の誘発に十分な他のスケジュールが挙げられる。
【０２０９】
本発明はまた、本発明の実行に有用なキットを提供する。本キットは、上述の抗体を含有するまたはこれと関連付けられて包装された第１の容器を含む。キットは、本発明の実行に必要なまたは簡便な溶液を含有するまたはこれと関連付けられて包装された別の容器を含むこともできる。容器は、ガラス、プラスチックまたはホイルでできていてよく、バイアル、ボトル、パウチ、チューブ、バッグなどであってよい。キットは、第１の容器手段に含有される試薬の量など、本発明を実行するための手順または分析情報など、書面の情報を含有することもできる。容器は、別の容器器具、例えば、箱またはバッグ内に、書面の情報と共に入っていてよい。
【０２１０】
本発明のさらに別の態様は、生物学的試料におけるレナラーゼを検出するためのキットである。キットは、レナラーゼのエピトープと結合する１種または複数のレナラーゼ結合分子を保持する容器、およびレナラーゼに結合させて複合体を形成し、複合体の存在または非存在が試料におけるレナラーゼの存在または非存在と相関するように、複合体の形成を検出する目的で、レナラーゼ結合分子を使用するための指示を含む。容器の例として、複数試料におけるレナラーゼの同時検出を可能にするマルチウェルプレートが挙げられる。
【０２１１】
本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせは、がんを処置するための別の治療的処置または薬剤と組み合わせて使用することができる。例えば、本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせは、単独で、または１種もしくは複数の治療的に有効な薬剤もしくは処置と組み合わせて投与することができる。他の治療的に有効な薬剤は、本発明の抗体もしくはその結合断片にコンジュゲートする、本発明の抗体もしくはその結合断片と同じ組成物に取り込むことができる、または別々の組成物として投与することができる。他の治療的薬剤または処置は、本発明の抗体もしくはその結合断片の組み合わせまたは関連化合物の投与に先立ち、その間におよび／またはその後に投与することができる。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせは、１種または複数の他の治療剤または処置と同時投与される。他の実施形態では、本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせは、１種または複数の他の治療剤または処置の投与とは独立して投与される。例えば、本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせが先ず投与され、続いて１種または複数の他の治療剤または処置が投与される。あるいは、１種または複数の他の治療剤が先ず投与され、続いて本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせが投与される。別の例として、処置（例えば、外科手術、放射線照射など）が先ず実行され、続いて本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせが投与される。
【０２１３】
他の治療的に有効な薬剤／処置は、外科手術、抗新生物薬（anti-neoplastics）（化学療法剤および放射線照射を含む）、抗血管新生剤、他の標的に対する抗体、小分子、光ダイナミック療法、免疫療法、免疫増強療法、細胞傷害剤、サイトカイン、ケモカイン、成長阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、心保護薬、免疫賦活剤、免疫抑制剤、および血液学的細胞の増殖を促進する薬剤を含む。
【０２１４】
一実施形態では、「別の治療剤」は、本明細書において使用される場合、第２の別個の治療剤または抗がん剤、すなわち、本発明のレナラーゼ結合分子「以外の」治療剤または抗がん剤である。本発明の併用療法において、任意の二次治療剤を使用することができる。また、二次治療剤または「第２の抗がん剤」は、以下のガイダンスに従って、相加的、相加的よりも大きい、および潜在的に相乗的な効果を達成することを目的として選択することができる。
【０２１５】
組み合わせた抗腫瘍療法を実施するために、本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせを、別の、すなわち、第２の別個の抗がん剤と組み合わせて、動物または患者内にそれらの組み合わせた抗腫瘍作用をもたらすのに有効な様式で、動物または患者に投与すると予想される。したがって、薬剤は、腫瘍または腫瘍脈管構造内にそれらの組み合わせたまたは同時発生的な存在および腫瘍環境にそれらの組み合わせた作用をもたらすのに有効な量で、有効な期間にわたり提供されると予想される。この目標を達成するために、本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせおよび第２の別個の抗がん剤は、単一の組成物において、または異なる投与経路を使用した２種の別個の組成物として、実質的に同時に動物に投与することができる。
【０２１６】
あるいは、本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせは、第２の別個の抗がん剤に、数秒間から数分間、数時間、数日間、数週間までの範囲の間隔で先行するまたは後続することができる。
【０２１７】
別々のタイミングの併用療法のための二次治療剤は、本明細書の他の箇所に記述されている判定基準を含む、ある特定の判定基準に基づき選択することができる。しかし、先のまたはその後の投与のための１種または複数の第２の別個の抗がん剤を選択するための優先度は、望むのであれば、実質的に同時投与におけるそれらの使用を妨げない。第２の別個の抗がん剤は、本発明の一次治療剤「に先立つ」投与のために選択され、増大した潜在的に相乗的な効果を達成するように設計される。
【０２１８】
本発明の一次治療剤「の後の」投与のために選択され、増大した潜在的に相乗的な効果を達成するように設計された、第２の別個の抗がん剤は、一次治療剤の効果から利益を得る薬剤を含む。したがって、その後の投与のための有効な第２の別個の抗がん剤は、転移を阻害する抗血管新生剤；ｉｎ  ｖｉｖｏで悪性細胞から到達可能になる細胞内結合パートナー分子に特異的な抗体など、壊死性腫瘍細胞を標的とする薬剤（それぞれ具体的に参照により本明細書に組み込む、米国特許第５，０１９，３６８号、同第４，８６１，５８１号および同第５，８８２，６２６号）；化学療法剤；および任意の腫瘍細胞を攻撃する抗腫瘍細胞イムノコンジュゲートを含む。
【０２１９】
本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせは、がん免疫療法と組み合わせて投与することもできる。がん免疫療法は、被験体のがん細胞に対する液性免疫応答、または被験体のがん細胞に対する細胞媒介性免疫応答、または被験体のがん細胞に対する液性応答および細胞媒介性応答の組み合わせを誘発するように設計された療法であり得る。本発明のレナラーゼ結合分子と組み合わせて有用ながん免疫療法の非限定例として、がんワクチン、ＤＮＡがんワクチン、養子細胞療法、養子免疫療法、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法、抗体、免疫増強化合物、サイトカイン、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２など）、インターフェロン（ＩＦＮ−αなど）およびチェックポイント阻害剤（例えば、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤、ＣＴＬＡ−４阻害剤など）が挙げられる。
【０２２０】
一部の状況では、処置のための期間を大幅に拡張することが望ましい場合があり、その場合、数日間（２、３、４、５、６または７）、数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）またはさらには数ヶ月間（１、２、３、４、５、６、７または８）が、それぞれの投与の間に経過する。これは、１回の処置が、本発明の一次治療剤など、腫瘍を実質的に破壊するように意図され、別の処置が、抗血管新生剤の投与など、微小転移または腫瘍再成長を予防するように意図された局面で有利と予想される。抗血管新生薬は、外科手術後の注意を要する時間(careful  time)において、しかし、有効な創傷治癒を可能にするように投与されるべきである。次いで、抗血管新生剤は、患者の生存期間にわたり投与することができる。
【０２２１】
本発明の抗体もしくはその結合断片の組み合わせまたは第２の別個の抗がん剤のいずれかの１回より多くの投与が利用されることを想定することもできる。本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせおよび第２の別個の抗がん剤は、隔日もしくは隔週で交互に投与することができる；または一連の一方の薬剤処置を与え、続いて一連の他方の処置を行うことができる。いずれにしても、組み合わせた治療法を使用して腫瘍退縮を達成するために、要求されることは、投与の回数とは無関係に、抗腫瘍効果の発揮に有効な組み合わせた量で両方の薬剤を送達することのみである。
【０２２２】
化学療法薬は、本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせと組み合わせて使用することができる。化学療法薬は、増殖している腫瘍細胞を死滅させ、全体的処置によって創出された壊死性区域を増強することができる。
【０２２３】
本発明の一態様は、本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせを使用してがんを処置または予防する方法を提供する。当業者は、患者におけるがんの処置または予防が、非限定例として、がん細胞を死滅および破壊する、ならびにがん細胞の増殖または細胞分裂速度を低下させることを含むことを理解すると予想される。当業者は、がん細胞が、非限定例として、原発性がん細胞、がん幹細胞、転移性がん細胞であり得ることも理解すると予想される。以下は、開示されている方法および組成物によって処置され得るがんの非限定例である：急性リンパ芽球性；急性骨髄球性白血病；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児期；虫垂がん；基底細胞癌；胆管がん、肝外；膀胱がん；骨がん；骨肉腫および悪性線維性組織球腫；脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、成人期；脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、中枢神経系非定型奇形様／ラブドイド腫瘍、小児期；中枢神経系胚芽腫；小脳性星状細胞腫；大脳性星状細胞腫／悪性神経膠腫；頭蓋咽頭腫；上衣芽腫；上衣腫；髄芽腫；髄上皮腫；中間分化の松果体実質腫瘍；テント上未分化神経外胚葉性腫瘍および松果体芽腫；視路および視床下部神経膠腫；脳および脊髄腫瘍；乳がん；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍；カルチノイド腫瘍、胃腸管；中枢神経系非定型奇形様／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；中枢神経系リンパ腫；小脳性星状細胞腫大脳性星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児期；子宮頸部がん；脊索腫、小児期；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性障害；結腸がん；結腸直腸がん；頭蓋咽頭腫；皮膚ｔ細胞リンパ腫；食道がん；ユーイングファミリー腫瘍；性腺外生殖細胞腫瘍；肝外胆管がん；眼がん、眼球内メラノーマ；眼がん、網膜芽細胞腫；胆嚢がん；胃（gastric/stomach）がん；胃腸管カルチノイド腫瘍；胃腸管間質腫瘍（ｇｉｓｔ）；生殖細胞腫瘍、頭蓋外；生殖細胞腫瘍、性腺外；生殖細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛性腫瘍；神経膠腫；神経膠腫、小児期脳幹；神経膠腫、小児期大脳性星状細胞腫；神経膠腫、小児期視路および視床下部；ヘアリー細胞白血病；頭頸部がん；肝細胞（肝臓）がん；組織球増殖症、ランゲルハンス細胞；ホジキンリンパ腫；下咽頭がん；視床下部および視路神経膠腫；眼球内メラノーマ；島細胞腫瘍；腎臓（腎細胞）がん；ランゲルハンス細胞組織球増殖症；喉頭がん；白血病、急性リンパ芽球性；白血病、急性骨髄球性；白血病、慢性リンパ球性；白血病、慢性骨髄性；白血病、ヘアリー細胞；口唇および口腔がん；肝臓がん；肺がん、非小細胞；肺がん、小細胞；リンパ腫、ａｉｄｓ関連；リンパ腫、バーキット；リンパ腫、皮膚ｔ細胞；リンパ腫、ホジキン；リンパ腫、非ホジキン；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ワルデンストレーム；骨の悪性線維性組織球腫および骨肉腫；髄芽腫；メラノーマ；メラノーマ、眼球内（眼）；メルケル細胞癌；中皮腫；原発不明の転移性扁平上皮頸部がん；口のがん；多発性内分泌腺腫症候群、（小児期）；多発性骨髄腫／形質細胞新生物；菌状息肉腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄球性白血病、成人期急性；骨髄球性白血病、小児期急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖性障害、慢性；鼻腔および副鼻腔がん；鼻咽頭がん；神経芽細胞腫；非小細胞肺がん；口内がん；口腔がん；中咽頭がん；骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫；卵巣がん；卵巣上皮がん；卵巣生殖細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵がん；膵がん、島細胞腫瘍；乳頭腫症；副甲状腺がん；陰茎がん；咽頭がん；褐色細胞腫；傍神経節腫；中間分化の松果体実質腫瘍；松果体芽腫およびテント上未分化神経外胚葉性腫瘍；下垂体腫瘍；形質細胞新生物／多発性骨髄腫；胸膜肺芽細胞腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺がん；直腸がん；腎細胞（腎臓）がん；腎盂および尿管、移行細胞がん；第１５染色体上のｎｕｔ遺伝子が関与する気道癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺がん；肉腫、ユーイングファミリー腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫、軟部組織；肉腫、子宮；セザリー症候群；皮膚がん（非メラノーマ）；皮膚がん（メラノーマ）；皮膚癌、メルケル細胞；小細胞肺がん；小腸がん；軟部組織肉腫；扁平細胞癌、原発不明の扁平上皮頸部がん、転移性；胃（stomach/gastric）がん；テント上未分化神経外胚葉性腫瘍；ｔ細胞リンパ腫、皮膚性；精巣がん；喉のがん；胸腺腫および胸腺癌；甲状腺がん；腎盂および尿管の移行細胞がん；絨毛性腫瘍、妊娠性；尿道がん；子宮がん、子宮内膜；子宮肉腫；膣がん；外陰部がん；ワルデンストレームマクログロブリン血症；ならびにウィルムス腫瘍。
【０２２４】
一実施形態では、本発明は、本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせの投与に先立ち、それと同時発生的に、またはその後に、外科手術、化学療法、化学療法剤、放射線療法もしくはホルモン療法またはこれらの組み合わせなど、がんのための補完療法により被験体を処置するステップを含む、がんを処置するための方法を提供する。
【０２２５】
化学療法剤は、細胞傷害剤（例えば、５−フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキセート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、オキソルビシン（oxorubicin）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シタラビンＵＳＰ、シクロホスファミド、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム(estramucine  phosphate  sodium)、アルトレタミン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シクロホスファミド、ミトキサントロン、カルボプラチン、シスプラチン、インターフェロンアルファ−２ａ組換え、パクリタキセル、テニポシドおよびストレプトゾシン（streptozoci））、細胞傷害性アルキル化剤（例えば、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファランまたはエタンスルホン酸（ethylesulfonic  acid））、アルキル化剤（例えば、アサレイ（asaley）、ＡＺＱ、ＢＣＮＵ、ブスルファン、ビスルファン（bisulphan）、カルボキシフタレート白金（carboxyphthalatoplatinum）、ＣＢＤＣＡ、ＣＣＮＵ、ＣＨＩＰ、クロラムブシル、クロロゾトシン、シス−白金、クロメソン、シアノモルホリノドキソルビシン、シクロジソン、シクロホスファミド、ジアンヒドロガラクチトール、フルオロドパン（fluorodopan）、ヘプスルファム、ヒカントン、イフォスファミド（iphosphamide）、メルファラン、メチルＣＣＮＵ、マイトマイシンＣ、ミトゾラミド（mitozolamide）、ナイトロジェンマスタード、ＰＣＮＵ、ピペラジン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、ストレプトゾトシン、テロキシロン（teroxirone）、テトラプラチン、チオテパ、トリエチレンメラミン、ウラシルナイトロジェンマスタードおよびＹｏｓｈｉ−８６４）、有糸分裂阻害薬剤（例えば、アロコルヒチン、ハリコンドリンＭ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドラスタチン１０、マイタンシン、リゾキシン、パクリタキセル誘導体、パクリタキセル、チオコルヒチン、トリチルシステイン、ビンブラスチン硫酸塩およびビンクリスチン硫酸塩）、植物アルカロイド（例えば、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、Ｌ−アスパラギナーゼ、イダルビシン、ビンブラスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩、ミトラマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、ＶＰ−１６−２１３、ＶＭ−２６、ナベルビンおよびタキソテール）、生物製剤（biologicals）（例えば、アルファインターフェロン、ＢＣＧ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびインターロイキン−２）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン、カンプトテシン誘導体およびモルホリノドキソルビシン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、ミトキサントロン、アモナフィド、ｍ−ＡＭＳＡ、アントラピラゾール誘導体、ピラゾロアクリジン、ビサントレンＨＣＬ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、メノガリル、Ｎ，Ｎ−ジベンジルダウノマイシン、オキサントラゾール（oxanthrazole）、ルビダゾン（rubidazone）、ＶＭ−２６およびＶＰ−１６）および合成剤（synthetics）（例えば、ヒドロキシウレア、プロカルバジン、ｏ，ｐ’−ＤＤＤ、ダカルバジン、ＣＣＮＵ、ＢＣＮＵ、シス−ジアミンジクロロ白金、ミトキサントロン、���ＢＤＣＡ、レバミゾール、ヘキサメチルメラミン、オールトランスレチノイン酸、ギリアデルおよびポルフィマーナトリウム）を含む。
【０２２６】
抗増殖剤は、細胞の増殖を減少させる化合物である。抗増殖剤は、アルキル化剤、代謝拮抗薬、酵素、生物学的応答調節剤、種々の薬剤、ホルモンおよびアンタゴニスト、アンドロゲン阻害剤（例えば、フルタミドおよびリュープロリド酢酸塩）、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェンクエン酸塩およびそのアナログ、トレミフェン、ドロロキシフェンならびにロロキシフェン（roloxifene））を含む。具体的な抗増殖剤の追加の例として、レバミゾール、ガリウム硝酸塩、グラニセトロン、サルグラモスチムストロンチウム−８９クロライド、フィルグラスチム、ピロカルピン、デクスラゾキサンおよびオンダンセトロンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２７】
本発明のレナラーゼ結合分子は、単独で、または細胞傷害性／抗新生物剤および抗血管新生剤を含む他の抗腫瘍薬剤と組み合わせて投与することができる。細胞傷害性／抗新生物剤は、がん細胞を攻撃および死滅させる薬剤として定義される。一部の細胞傷害性／抗新生物剤は、腫瘍細胞における遺伝的材料をアルキル化するアルキル化剤、例えば、シス−プラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホラミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン（chlomaphazin）およびダカルバジン（dacabazine）である。他の細胞傷害性／抗新生物剤は、腫瘍細胞のための代謝拮抗薬、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキセート、メルカプトプリン（mercaptopuirine）、アザチオプリン（azathioprime）およびプロカルバジンである。他の細胞傷害性／抗新生物剤は、抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミスラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシン（mytomycin）Ｃおよびダウノマイシンである。これらの化合物のための市販の多数のリポソーム製剤が存在する。さらに他の細胞傷害性／抗新生物剤は、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）である。これは、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびエトポシドを含む。種々の細胞傷害性／抗新生物剤は、タキソールおよびその誘導体、Ｌ−アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ−２６、イホスファミド、ミトキサントロンならびにビンデシンを含む。
【０２２８】
抗血管新生剤は、当業者に周知である。本開示の方法および組成物における使用に適した抗血管新生剤は、ヒト化およびキメラ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマーならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。血管新生の他の公知の阻害剤は、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（アルファおよびベータを含む）、インターロイキン１２、レチノイン酸、ならびにメタロプロテイナーゼ−１および−２の組織阻害剤（ＴＩＭＰ−１および−２）を含む。抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼＩＩ阻害剤である、ラゾキサンなどのトポイソメラーゼを含む小分子を使用することもできる。
【０２２９】
開示されている化合物と組み合わせて使用することができる他の抗がん剤として、アシビシン；アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アンボマイシン（ambomycin）；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン（azotomycin）；バチマスタット；ベンゾデパ（benzodepa）；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシル酸塩（bisnafide  dimesylate）；ビセレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー（carbetimer）；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフィンゴール；クロラムブシル；シロレマイシン（cirolemycin）；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシル酸塩；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン（dexormaplatin）；デザグアニン（dezaguanine）；デザグアニンメシル酸塩；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；ドロモスタノロンプロピオン酸塩；デュアゾマイシン（duazomycin）；エダトレキセート；エフロルニチン塩酸塩；エルサミトルシン（elsamitrucin）；エンロプラチン（enloplatin）；エンプロメート（enpromate）；エピプロピジン（epipropidine）；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール（erbulozole）；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸エステルナトリウム；エタニダゾール；エトポシド；エトポシドリン酸塩；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；フルダラビンリン酸塩；フルオロウラシル；フルオロシタビン；フォスキドン（fosquidone）；フォストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；ヒドロキシウレア；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イルモフォシン（ilmofosine）；インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩまたはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ−２ａ；インターフェロンアルファ−２ｂ；インターフェロンアルファ−ｎ１；インターフェロンアルファ−ｎ３；インターフェロンベータ−Ｉａ；インターフェロンガンマ−Ｉｂ；イプロプラチン（iproplatin）；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；リュープロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；マイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸塩；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキセート；メトトレキセートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；ミトカルシン（mitocarcin）；ミトクロミン（mitocromin）；ミトギリン；ミトマルシン（mitomalcin）；マイトマイシン；ミトスペル（mitosper）；ミトタン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン（oxisuran）���パクリタキセル；アルブミン結合パクリタキセル；ペグアスパルガーゼ；ペリオマイシン（peliomycin）；ペンタムスチン（pentamustine）；ペプロマイシン硫酸塩；ペルフォスファミド（perfosfamide）；ピポブロマン；ピポスルファン；ピロキサントロン（piroxantrone）塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン（plomestane）；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニムスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド（rogletimide）；サフィンゴール；サフィンゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン（simtrazene）；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシン；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン（spiromustine）；スピロプラチン（spiroplatin）；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；スロフェヌル（sulofenur）；タリソマイシン；テコガラン（tecogalan）ナトリウム；テガフール；テロキサントロン（teloxantrone）塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トレミフェンクエン酸塩；トレストロン酢酸塩；トリシリビンリン酸塩；トリメトレキセート；トリメトレキセートグルクロン酸塩；トリプトレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ（uredepa）；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；ビングリシネート硫酸塩；ビンロウロシン（vinleurosine）硫酸塩；ビノレルビン；ビノレルビン酒石酸塩；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン（vinzolidine）硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン（zeniplatin）；ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩が挙げられるがこれらに限定されない。他の抗がん薬として、２０−ｅｐｉ−１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３；５−エチニルウラシル；アビラテロン；アクラルビシン；アシルフルベン；アデシペノール；アドゼレシン；アルデスロイキン；ＡＬＬ−ＴＫアンタゴニスト；アルトレタミン；アンバムスチン（ambamustine）；アミドックス；アミホスチン；アミノレブリン酸；アムルビシン；アムサクリン；アナグレリド；アナストロゾール；アンドログラホリド；血管新生阻害剤；アンタゴニストＤ；アンタゴニストＧ；アンタレリックス；抗背側化形態形成タンパク質−１；抗アンドロゲン、前立腺癌；抗エストロゲン；アンチネオプラストン；アンチセンスオリゴヌクレオチド；アフィディコリングリシネート（aphidicolin  glycinate）；アポトーシス遺伝子モジュレーター；アポトーシス調節因子；アプリン酸；ａｒａ−ＣＤＰ−ＤＬ−ＰＴＢＡ；アルギニンデアミナーゼ；アスラクリン（asulacrine）；アタメスタン；アトリムスチン；アキシナスタチン１；アキシナスタチン２；アキシナスタチン３；アザセトロン；アザトキシン；アザチロシン；バッカチンＩＩＩ誘導体；バラノール；バチマスタット；ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト；ベンゾクロリン；ベンゾイルスタウロスポリン；ベータラクタム誘導体；ベータ−アレチン；ベタクラマイシンＢ；ベツリン酸；ｂＦＧＦ阻害剤；ビカルタミド；ビサントレン；ビサジリジニルスペルミン（bisaziridinylspermine）；ビスナフィド；ビストラテ���（bistratene）Ａ；ビセレシン；ブレフレート；ブロピリミン；ブドチタン（budotitane）；ブチオニンスルホキシミン；カルシポトリオール；カルフォスチンＣ；カンプトテシン誘導体；カナリアポックスＩＬ−２；カペシタビン；カルボキサミド−アミノ−トリアゾール；カルボキシアミドトリアゾール；ＣａＲｅｓｔ  Ｍ３；ＣＡＲＮ  ７００；軟骨由来阻害剤；カルゼレシン；カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）；カスタノスペルミン；セクロピンＢ；セトロレリクス；クロリン；クロロキノキサリンスルホンアミド；シカプロスト；シス−ポルフィリン；クラドリビン；クロミフェンアナログ；クロトリマゾール；コリスマイシン（collismycin）Ａ；コリスマイシンＢ；コンブレタスタチンＡ４；コンブレタスタチンアナログ；コナゲニン；クランベシジン８１６；クリスナトール；クリプトフィシン８；クリプトフィシンＡ誘導体；クラシンＡ；シクロペンタントラキノン（cyclopentanthraquinone）；シクロプラタム（cycloplatam）；シペマイシン（cypemycin）；シタラビンオクホスフェート；細胞溶解性因子；サイトスタチン（cytostatin）；ダクリキシマブ（dacliximab）；デシタビン；デヒドロジデムニン（dehydrodidemnin）Ｂ；デスロレリン；デキサメタゾン；デクスイホスファミド；デクスラゾキサン；デクスベラパミル；ジアジコン；ジデムニンＢ；ジドックス；ジエチルノルスペルミン；ジヒドロ−５−アザシチジン；ジヒドロタキソール、９−；ジオキサマイシン；ジフェニルスピロムスチン；ドセタキセル；ドコサノール；ドラセトロン；ドキシフルリジン；ドロロキシフェン；ドロナビノール；デュオカルマイシンＳＡ；エブセレン；エコムスチン（ecomustine）；エデルホシン；エドレコロマブ；エフロルニチン；エレメン；エミテフル；エピルビシン；エプリステリド；エストラムスチンアナログ；エストロゲンアゴニスト；エストロゲンアンタゴニスト；エタニダゾール；エトポシドリン酸塩；エキセメスタン；ファドロゾール；ファザラビン；フェンレチニド；フィルグラスチム；フィナステリド；フラボピリドール；フレゼラスチン（flezelastine）；フルアステロン；フルダラビン；フルオロダウノルニシン（fluorodaunorunicin）塩酸塩；フォルフェニメクス（forfenimex）；フォルメスタン；フォストリエシン；フォテムスチン；ガドリニウムテクサフィリン；ガリウム硝酸塩；ガロシタビン（galocitabine）；ガニレリクス；ゼラチナーゼ阻害剤；ゲムシタビン；グルタチオン阻害剤；ヘプスルファム；ヘレグリン；ヘキサメチレンビスアセトアミド；ヒペリシン；イバンドロン酸；イダルビシン；イドキシフェン；イドラマントン；イルモフォシン；イロマスタット；イミダゾアクリドン；イミキモド；免疫賦活薬ペプチド；インスリン様増殖因子−１受容体阻害剤；インターフェロンアゴニスト；インターフェロン；インターロイキン；ヨーベングアン；ヨードドキソルビシン；イポメアノール、４−；イロプラクト（iroplact）；イルソグラジン；イソベンガゾール（isobengazole）；イソホモハリコンドリン（isohomohalicondrin）Ｂ；イタセトロン；ジャスプラキノリド；カハラリド（kahalalide）Ｆ；ラメラリン−Ｎトリアセテート；ランレオチド；レイナマイシン；レノグラスチム；レンチナン硫酸塩；レプトルスタチン；レトロゾー���；白血病阻害因子；白血球アルファインターフェロン；リュープロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン；リュープロレリン；レバミゾール；リアロゾール；直鎖状ポリアミンアナログ；親油性二糖ペプチド；親油性白金化合物；リソクリナミド（lissoclinamide）７；ロバプラチン；ロムブリシン；ロメトレキソール；ロニダミン；ロソキサントロン；ロバスタチン；ロキソリビン；ルルトテカン；ルテチウムテクサフィリン；リソフィリン；溶解性ペプチド；マイタンシン；マンノスタチンＡ；マリマスタット；マソプロコール；マスピン；マトリライシン阻害剤；マトリクスメタロプロテイナーゼ阻害剤；メノガリル；メルバロン；メテレリン；メチオニナーゼ（methioninase）；メトクロプラミド；ＭＩＦ阻害剤；ミフェプリストン；ミルテホシン；ミリモスチム；ミスマッチした二本鎖ＲＮＡ；ミトグアゾン；ミトラクトール；マイトマイシンアナログ；ミトナフィド（mitonafide）；マイトトキシン線維芽細胞増殖因子−サポリン；ミトキサントロン；モファロテン（mofarotene）；モルグラモスチム；モノクローナル抗体、ヒト絨毛性ゴナドトロピン；モノホスホリルリピドＡ＋マイコバクテリウム（myobacterium）細胞壁ｓｋ；モピダモール；多剤耐性遺伝子阻害剤；マルチプル腫瘍サプレッサー（multiple  tumor  suppressor）１に基づく治療法；マスタード抗がん剤；マイカペルオキシド（mycaperoxide）Ｂ；マイコバクテリア細胞壁抽出物；ミリアポロン（myriaporone）；Ｎ−アセチルジナリン；Ｎ−置換ベンズアミド；ナファレリン；ナグレスチプ（nagrestip）；ナロキソン＋ペンタゾシン；ナパビン（napavin）；ナフテルピン；ナルトグラスチム；ネダプラチン；ネモルビシン；ネリドロン酸（neridronic  acid）；中性エンドペプチダーゼ；ニルタミド；ニサマイシン；一酸化窒素モジュレーター；窒素酸化物抗酸化剤；ニトルリン（nitrullyn）；Ｏ６−ベンジルグアニン；オクトレオチド；オキセノン（okicenone）；オリゴヌクレオチド；オナプリストン（onapristone）；オンダンセトロン；オンダンセトロン；オラシン（oracin）；経口サイトカイン誘導因子；オルマプラチン；
オサテロン；オキサリプラチン；オキサウノマイシン；パクリタキセル；パクリタキセルアナログ；パクリタキセル誘導体；パラウアミン；パルミトイルリゾキシン；パミドロン酸；パナキシトリオール；パノミフェン（panomifene）；パラバクチン；パゼリプチン（pazelliptine）；ペグアスパルガーゼ；ペルデシン；ペントサンポリ硫酸ナトリウム；ペントスタチン；ペントロゾール（pentrozole）；ペルフルブロン；ペルフォスファミド；ペリリルアルコール；フェナジノマイシン；フェニル酢酸塩；ホスファターゼ阻害剤；ピシバニール；ピロカルピン塩酸塩；ピラルビシン；ピリトレキシム；プラセチン（placetin）Ａ；プラセチンＢ；プラスミノーゲン活性化因子阻害剤；白金錯体；白金化合物；白金−トリアミン錯体；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニゾン；プロピルビス−アクリドン；プロスタグランジンＪ２；プロテアソーム阻害剤；プロテインＡに基づく免疫モジュレーター；プロテインキナーゼＣ阻害剤；プロテインキナーゼＣ阻害剤、微細藻類；プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤；プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤；プルプリン；ピラゾロアクリジン；ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート；ｒａｆアンタゴニスト；ラルチトレキセド；ラモセトロン；ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤；ｒａｓ阻害剤；ｒａｓ−ＧＡＰ阻害剤；レテリプチン（retelliptine）脱メチル化；レニウムＲｅ  １８６エチドロネート；リゾキシン；リボザイム；ＲＩＩレチンアミド；ログレチミド；ロヒツキン（rohitukine）；ロムルチド；ロキニメックス；ルビギノンＢ１；ルボキシル（ruboxyl）；サフィンゴール；サイントピン（saintopin）；ＳａｒＣＮＵ；サルコフィトールＡ；サルグラモスチム；Ｓｄｉ  １模倣物；セムスチン；老化由来阻害剤１；センスオリゴヌクレオチド；シグナル伝達阻害剤；シグナル伝達モジュレーター；単鎖抗原結合タンパク質；シゾフラン（sizofuran）；ソブゾキサン；ナトリウムボロカプテート（sodium  borocaptate）；フェニル酢酸ナトリウム；ソルベロール（solverol）；ソマトメジン結合タンパク質；ソネルミン（sonermin）；スパルフォス酸（sparfosic  acid）；スピカマイシンＤ；スピロムスチン；スプレノペンチン；スポンジスタチン（spongistatin）１；スクアラミン；幹細胞阻害剤；幹細胞分裂阻害剤；スチピアミド；ストロメライシン阻害剤；スルフィノシン；超活性血管作用性腸ペプチドアンタゴニスト（superactive  vasoactive  intestinal  peptide  antagonist）；スラジスタ（suradista）；スラミン；スウェインソニン；合成グリコサミノグリカン；タリムスチン（tallimustine）；タモキシフェンメチオジド；タウロムスチン；タザロテン；テコガランナトリウム；テガフール；テルラピリリウム（tellurapyrylium）；テロメラーゼ阻害剤；テモポルフィン；テモゾロミド；テニポシド；テトラクロロデカオキシド；テトラゾミン；サリブラスチン（thaliblastine）；チオコラリン；トロンボポエチン；トロンボポエチン模倣物；サイマルファシン；サイモポエチン受容体アゴニスト；チモトリナン（thymotrinan）；甲状腺刺激ホルモン；スズエチルエチオプルプリン；チラパザミン；チタノセンビクロライド（titanocene  bichloride）；トプセンチン；トレミフェン；全能性幹細胞因子；翻訳阻害剤；トレチノイン；トリアセチルウリジン；トリシリビン；トリメトレキセート；トリプトレリン；トロピセトロン；ツロステリド（turosteride）；チロシンキナーゼ阻害剤；チルホスチン；ＵＢＣ阻害剤；ウベニメクス；尿生殖洞由来成長阻害性因子（urogenital  sinus-derived  growth  inhibitory  factor）；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；バプレオチド；バリオリンＢ；ベクター系、赤血球遺伝子療法；ベラレソール；ベラミン（veramine）；ベルジン；ベルテポルフィン；ビノレルビン；ビンキサルチン（vinxaltine）；ビタキシン（vitaxin）；ボロゾール；ザノテロン（zanoterone）；ゼニプラチン；ジラスコルブ（zilascorb）；イミリムマブ（imilimumab）；ミルタザピン；ＢｒＵＯＧ  ２７８；ＢｒＵＯＧ  ２９２；ＲＡＤ０００１；ＣＴ−０１１；ｆｏｌｆｉｒｉｎｏｘ；ティピファニブ；Ｒ１１５７７７；ＬＤＥ２２５；カルシトリオール；ＡＺＤ６２４４；ＡＭＧ  ６５５；ＡＭＧ  ４７９；ＢＫＭ１２０；ｍＦＯＬＦＯＸ６；ＮＣ−６００４；セツキシマブ；ＩＭ−Ｃ２２５；ＬＧＸ８１８；ＭＥＫ１６２；ＢＢＩ６０８；ＭＥＤＩ４７３６；ベムラフェニブ；イピリムマブ；イボルマブ（ivolumab）；ニボルマブ；パノビノスタット；レフルノミド；ＣＥＰ−３２４９６；アレムツズマブ；ベバシズマブ；オファツムマブ；パニツムマブ；ペムブロリズマブ；リツキシマブ；トラスツズマブ；ＳＴＡＴ３阻害剤（例えば、ＳＴＡ−２１、ＬＬＬ−３、ＬＬＬ１２、ＸＺＨ−５、Ｓ３１−２０１、ＳＦ−１０６６、ＳＦ−１０８７、ＳＴＸ−０１１９、クリプトタンシノン、クルクミン、ジフェルロイルメタン、ＦＬＬＬ１１、ＦＬＬＬ１２、ＦＬＬＬ３２、ＦＬＬＬ６２、Ｃ３、Ｃ３０、Ｃ１８８、Ｃ１８８−９、ＬＹ５、ＯＰＢ−３１１２１、ピリメタミン、ＯＰＢ−５１６０２、ＡＺＤ９１５０など）；低酸素誘導因子１（ＨＩＦ−１）阻害剤（例えば、ＬＷ６、ジゴキシン、ラウレンジテルペノール、ＰＸ−４７８、ＲＸ−００４７、ビテキシン、ＫＣ７Ｆ２、ＹＣ−１など）およびジノスタチンスチマラマーが挙げられるがこれらに限定されない。一実施形態では、抗がん薬は、５−フルオロウラシル、タキソールまたはロイコボリンである。
【０２３０】
キット
本発明はまた、本発明の抗体（すなわち、抗レナラーゼおよび抗ＰＤ１（および／または抗ＰＤ−Ｌ１抗体））またはその結合断片の組み合わせと、例えば、本明細書の他の箇所に記載されている通り、治療的または予防的処置としての個体への抗体またはその結合断片の組み合わせを投与することについて記載する指導的材料とを含むキットを含む。ある実施形態では、本キットは、例えば、個体への本発明のレナラーゼ結合分子を投与することに先立つ、本発明の抗体またはその結合断片の組み合わせを含む治療組成物（複数可）を溶解または懸濁するために適した（好ましくは無菌の）薬学的に許容される担体をさらに含む。必要に応じて、キットは、レナラーゼ結合分子を投与するためのアプリケーターを含む。
【実施例】
【０２３１】
次に、以下の実施例を参照しつつ、本発明について記載する。これらの実施例は、単なる説明目的のために提供されており、本発明は、決して、これらの実施例に限定されるものとして解釈するべきではなく、むしろ、本明細書に提供される教示の結果として明らかになる、ありとあらゆる変化形を包含するものと解釈するべきである。
【０２３２】
さらなる記載なしで、当業者であれば、先行する記載および以下の説明的な実施例を使用して、本発明の化合物を作製および利用し、特許請求されている方法を実施することができると考えられる。したがって、以下の実際の実施例は、本発明の好ましい実施形態に具体的に注目し、決して、本開示の残りを限定するものとして解釈するべきではない。
【０２３３】
（実施例１：レナラーゼ抗体の開発）
免疫原としてペプチドを使用した。生成されたペプチドは、９〜２１アミノ酸の範囲にあり、レナラーゼ−１およびレナラーゼ−２タンパク質の領域に対応した。ペプチドは全て、ＮまたはＣ末端システイン残基を有した。ペプチドの配列は、表１に見出すことができ、レナラーゼ−１または２配列に対応するこれらのペプチドは、図４の配列アライメントに示されている。示されている通り、レナラーゼ−１特異的ペプチドは、１Ａ−Ｆと標識されており、レナラーゼ−２特異的ペプチドは、３Ａ５と標識されている。各ペプチドを、システインを介してアジュバントＫＬＨにコンジュゲートし、６匹のウサギの免疫化に使用した。各動物から収集された抗血清を、関連ペプチド（ＢＳＡ−コンジュゲート）または全長レナラーゼ−１もしくは２の両方を使用したＥＬＩＳＡアッセイによって、抗レナラーゼ抗体力価に関してスクリーニングした。抗血清は、ウエスタンブロットによって、組織ライセートにおける内在性レナラーゼを検出するその能力に関しても検査した。これらのスクリーニング判定基準を使用して、好ましい特徴を有する抗体を産生する動物を選択した。一部の例では、また、一部のペプチドのため、数匹の動物が、要求される特異性を有する抗体を産生した。これらの場合、１匹の動物に、ポリクローナル抗体産生のために最終抗血清出血させ、他の１匹または一部の例では２匹の動物を使用して、脾臓リンパ球を回収した。他の例では、単一の動物に終末出血させ、脾摘出術を行った。プロテインＧクロマトグラフィーによる終末出血からの総ＩｇＧの精製の後、ペプチド親和性クロマトグラフィーにおけるさらなる精製によって、全てのペプチドに対して作製されたポリクローナル抗体を生成した。さらに、標準手順を使用して、選択された動物の脾臓由来のリンパ球を、ハイブリドーマ生成のために骨髄腫細胞に融合させた。ハイブリドーマ上清を、これらが作製されたペプチドの両方への結合に関してスクリーニングし、レナラーゼタンパク質全体に対して二次的にスクリーニングした。抗体精製のため、選択されたハイブリドーマをサブクローニングし、増やした。馴化されたハイブリドーマ培養上清から、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を精製した。
【表１】
2020510681.tif 000003
【０２３４】
Ｂｉｏｃｏｒｅによって決定された抗体親和性
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００を使用して結合研究を行った。ランニングバッファーとして２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．００５％Ｔｗｅｅｎ−２０および０．１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを使用して、２５℃で結合研究を行った。ビオチン化抗体を、下に示す通り、個々のストレプトアビジンセンサーチップフローセルに捕捉した。研究は、２個のセンサーチップを採用したため、第２のセンサーチップにおけるｍＡｂの２種の解析を反復して、より多くのデータを集めた。レナラーゼ−１は、３倍希釈系列における最高濃度として、５０ｎＭで検査した。５種の濃度のそれぞれを２連で検査した。１／１０００リン酸の短い瞬間適用（short  pulse）により、結合した複合体を再生した。データセットをグローバルフィットして、表２に要約されている結合定数の推定値を抽出した。
【表２】
2020510681.tif 000004
【０２３５】
抗レナラーゼ抗体のヌクレオチドおよびアミノ酸配列
モノクローナル抗体１Ｄ−２８−４、１Ｄ−３７−１０、１Ｆ−２６−１、１Ｆ−４２−７および３Ａ−５−２を、そのレナラーゼ結合特異性および高い親和性のために選択した。標準ポリメラーゼ連鎖反応手順および縮重プライマーセットを使用して、サブクローニングされたハイブリドーマから、これらの抗体の抗体重および軽鎖可変領域のｃＤＮＡを増幅した。１Ｄ−２８−４（ＲＰ−２２０）の可変領域ヌクレオチドおよびアミノ酸配列を図５に示す。このようにして、好ましい特徴を有する抗体の組成を例証する。
【０２３６】
抗体によるレナラーゼシグナル伝達の阻害は、がん細胞の生存を減少させる
レナラーゼ発現は、いくつかのがん細胞株において上方調節されるため（図６）、実験を行って、レナラーゼが、がん細胞に生存利点をもたらしたか否かを決定した。レナラーゼ発現が、正常皮膚と比較して、母斑および転移性メラノーマにおいて著しく増加したことが見出され（図７）、レナラーゼが、メラニン形成細胞に生存利点をもたらしたことを示唆する。加えて、ＲｅｎＭｏｎｏＡｂ１（ＲＰ−２２０に対して作製されたモノクローナル）は、Ａ３７５．Ｓ２（変異体Ｂ−Ｒａｆ（Ｖ６００Ｅ）を有するメラノーマ細胞株）の生存度を低下させることにおいて高度に有効であり、メラノーマに対して活性な２種のアルキル化剤：テモゾロミド（図８）およびダカルバジン（図９）との相乗作用を呈した。ＲｅｎＭｏｎｏＡｂ１は、メラノーマ細胞株Ｓｋ−Ｍｅｌ−２８（変異体Ｂ−Ｒａｆ（Ｖ６００Ｅ）および野生型Ｎ−Ｒａｓを発現）の生存度を低下させることにおいても有効であり、テモゾロミドとの相乗作用を示した（図１０）。
【０２３７】
次に、実験を行って、ＲｅｎＭｏｎｏＡｂ１の阻害性作用が、メラノーマに特異的であるか否か、またはより広い範囲の腫瘍細胞に影響を与えたか否かを決定した。ＣＣＬ−１１９細胞（ＣＣＦ−ＭＥＣ、急性リンパ芽球性白血病細胞株；アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（American  Type  Culture  Collection））は、急速に分裂し、ＮＣＩ−６０パネルを構成する細胞の間の平均よりもおよそ３．８倍と（ＢｉｏＧＰＳ．ｏｒｇ由来のマイクロアレイデータ）、高レベルのレナラーゼを発現する。ＲｅｎＭｏｎｏＡｂ１は、培養中のＣＣＬ−１１９細胞の生存度を大幅に減少させた（図１１）。同様に、ＲｅｎＭｏｎｏＡｂ１は、２種の膵がん細胞株、ＭｉａＰａｃおよびＰａｎｃ１の成長も阻害した（図１２〜１３）。図１４は、メラノーマ細胞の数および形態に対するレナラーゼモノクローナル抗体の効果を描写する顕微鏡写真である。レナラーゼモノクローナル（例えば、１Ｄ−２８−４）が、培養中のメラノーマ細胞を阻害することが観察された。図１５は、２種の追加の１Ｃ−２２−１およびＤ−３７−１０レナラーゼモノクローナル抗体も、メラノーマ細胞成長を阻害することを示す。これらのデータは、レナラーゼ阻害が、いくつかのがんにおいて有用な治療選択肢であり得ることを示す。
【０２３８】
レナラーゼ過剰発現は、メラノーマ患者における不十分な転帰に関連した
イェール大学の発見および転移シリーズ（Yale  discovery  and  metastatic  series）（最大３０年間追跡した２６３名の患者）から得られた原発性および転移性腫瘍試料におけるレナラーゼの発現を試験した。抗Ｓ−１００および抗ｇｐ１００の両方による標識化によって定義された区画内の標的抗原発現が決定される方法である、自動定量的解析（ＡＱＵＡ）技術（Gouldら、２００９年、Journal  of  Clinical  Oncology、２７巻：５７７２〜５７８０頁）を使用して、蛍光に基づく免疫組織化学的染色を行った。メラノーマ組織におけるレナラーゼ発現上昇が、疾患特異的死亡率の大幅な増加に関連したことが見出され（図１６）、レナラーゼの作用の阻害が、この疾患における有用な治療選択肢であり得ることを示唆する。
【０２３９】
（実施例２：選択的活性化腫瘍関連マクロファージによるレナラーゼ発現は、ＳＴＡＴ３媒介性機構によるメラノーマ成長を促進する）
ＲＮＬＳは、ＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路に関与する生存因子として機能するため、また、その発現は、ＳＴＡＴ３によって調節されるため（Sonawaneら、２０１４年、Biochemistry.５３巻（４４号）：６８７８〜６８９２頁）、問題は、ＲＮＬＳ発現およびシグナル伝達が、がん細胞に生存利点をもたらすかということである。ＭＡＰＫ、ＰＩ３ＫおよびＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路が異常に調節され、追加の治療標的が望ましいと思われる障害であるメラノーマに焦点が置かれる。
【０２４０】
ＲＮＬＳ発現は、メラノーマ細胞株および腫瘍試料において著しく増加される。転移性メラノーマ患者において、ＲＮＬＳ発現は、疾患特異的生存と逆相関する。メラノーマにおけるＲＮＬＳの発現のパターンの試験は、上方調節が、主に腫瘍関連間質の細胞構成成分において、特にＣＤ１６３＋マクロファージにおいて発生することを示唆する。実験データは、腫瘍に動員された選択的活性化マクロファージ（Ｍ２様、ＣＤ１６３＋）が、腫瘍に対する免疫応答を抑制し、血管新生を増加させ、腫瘍細胞遊走、浸潤および播種を容易にすることを示す（Ruhrbergら、２０１０年、Nat  Med.１６巻：８６１〜２頁；Pollardら、２００４年、Nat  Rev  Cancer.４巻：７１〜８頁；Haoら、２０１２年、Clinical  and  Developmental  Immunology.２０１２年：１１頁）。ＴＡＭは、ヒトメラノーマにおける、また、本研究に記載されている異種移植モデルにおける腫瘍塊の大幅なパーセンテージを占める。
【０２４１】
ＲＮＬＳは、ＣＤ１６２＋  ＴＡＭにおいて優先的に発現され、Ｍ２様ＴＡＭが、ＲＮＬＳを分泌することにより腫瘍進行を容易にすることができることを示唆する。図２２Ｃは、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害により観察される抗腫瘍効果の根底にある肝要な機構を取り込む実用モデルを説明する。ＲＮＬＳモノクローナルｍ２８−ＲＮＬＳによるＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、ＣＤ８６＋のＣＤ１６３＋  ＴＡＭに対する比を増加させ、ＣＤ１６３＋  ＴＡＭによるＲＮＬＳ分泌を減少させる。加えて、ｍ２８−ＲＮＬＳは、メラノーマ細胞におけるＲＮＬＳシグナル伝達を阻害する。正味の結果は、アポトーシスをもたらす、総およびリン酸化ＳＴＡＴ３の劇的な下落である。
【０２４２】
ＲＮＬＳ遺伝子発現を調節する調節プロモーターエレメントおよび転写因子は、近年調査されており（Sonawaneら、２０１４年、Biochemistry.５３巻（４４号）：６８７８〜６８９２頁）、これらのデータは、ＳＴＡＴ３についての肝要な役割を指し示す。結果は、ＳＴＡＴ３を上方調節するシグナルがＲＮＬＳ遺伝子発現を増加させ、これが次いでＳＴＡＴ３活性を増加させる、ＲＮＬＳおよびＳＴＡＴ３の間のフィードフォワードループの存在を示唆する。ＲＮＬＳおよびＳＴＡＴ３の間の斯かる相互作用の存在は、がんの病因におけるＲＮＬＳシグナル伝達の役割に関する重要な意義を有する。実際に、悪性形質転換およびがん進行を容易にする炎症性微小環境の誘導および維持における、ＳＴＡＴファミリータンパク質、特に、ＳＴＡＴ３のための肝要な役割を指し示す大規模データが存在する（Yuら、２００９年、Nat  Rev  Cancer.９巻：７９８〜８０９頁）。ＳＴＡＴ３シグナル伝達は多くの場合、悪性細胞において持続的に活性化され、斯かる活性化は、腫瘍細胞増殖を駆動するだけではなく、腫瘍微小環境における炎症を持続する多数の遺伝子の産生も増加させる。がん細胞および形質転換していない間質細胞の間のＳＴＡＴ３フィードフォワードループが、がんにおいて記録された（Catlett-Falconeら、１９９９年、Immunity.１０巻：１０５〜１５頁；Yuら、２００７年、Nat  Rev  Immunol.７巻：４１〜５１頁；Araら、２００９年、Cancer  Res.６９巻：３２９〜３７頁）。例えば、ＳＴＡＴ３は、多発性骨髄腫患者において構成的に活性化される。ＩＬ−６依存性ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６において、ＩＬ−６は、ヤヌスキナーゼを介してシグナル伝達して、ＳＴＡＴ３を活性化し、これは次いで、抗アポトーシス因子を上方調節し、腫瘍細胞の生存を促進する（Catlett-Falconeら、１９９９年、Immunity.１０巻：１０５〜１５頁）。様々な機構により、ＳＴＡＴ３は、大部分のメラノーマにおいて構成的に活性化され、腫瘍細胞生存、増殖、転移、血管新生の増加、および腫瘍免疫応答の減少をもたらすことも見出された（Lesinskiら、２０１３年、Future  oncology.９巻：９２５〜７頁；Kortylewskiら、２００５年、Cancer  metastasis  reviews.２４巻：３１５〜２７頁；Emeagiら、２０１３年、Gene  therapy.２０巻：１０８５〜９２頁；Yangら、２０１０年、International  journal  of  interferon,  cytokine  and  mediator  research  :  IJIM.、２０１０年：１〜７頁）。
【０２４３】
ＲＮＬＳは、抗アポトーシス因子Ｂｃｌ２を増加させ、エフェクターカスパーゼの活性化を予防することにより、細胞保護を媒介する（Wangら、２０１４年、Journal  of  the  American  Society  of  Nephrology.、DOI:10.1681/asn.2013060665）。Ａ３７５．Ｓ２細胞におけるＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、ｐ３８  ＭＡＰＫの持続した活性化と続くアポトーシス因子Ｂａｘの活性化、およびアポトーシスと関連する。ＭＡＰＫ  ｐ３８は、炎症、細胞分化、細胞周期調節およびアポトーシスに関係付けられたストレス活性化プロテインキナーゼである（Onoら、２０００年、Cellular  Signalling.１２巻：１〜１３頁）。例えば、神経増殖因子の中止は、ＪＮＫおよびｐ３８の持続した活性化、ならびにＥＲＫの下方調節の後に、アポトーシスを引き起こすことが示された（Xiaら、１９９５年、Science.２７０巻：１３２６〜３１頁）。しかし、ある特定の条件下で、ｐ３８の阻害は、アポトーシスを遮断することができるため（Onoら、２０００年、Cellular  Signalling.１２巻：１〜１３頁）、アポトーシスにおけるｐ３８の役割は、明らかに状況依存性である。データは、Ａ３７５．Ｓ２細胞において、ｐ３８のＲＮＬＳ依存性活性化が、アポトーシスを引き起こすことを示唆する。
【０２４４】
ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、メラノーマの異種移植におけるＫｉ−６７の発現を著しく減少させる。Ｋｉ−６７は、腫瘍の増殖能の評価に大規模に使用されてきた細胞増殖の十分に定義されたマーカーであるため、データは、ＲＮＬＳシグナル伝達が、腫瘍増殖の肝要な駆動因子であり、ＲＮＬＳ阻害が、腫瘍の増殖速度を減少させることを示すものとして解釈される。細胞周期進行を決定する肝要な因子の多くが同定されており、２つのクラスのＣＤＫ阻害剤、すなわち、サイクリン依存性キナーゼ４の阻害剤（ＩＮＫ４）およびＣＤＫ相互作用タンパク質／キナーゼ阻害剤タンパク質（ＣＩＰ／ＫＩＰ）ファミリー（Jungら、２０１０年、Cellular  Signalling.２２巻：１００３〜１２頁）と共にサイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）のセットを含む。ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーに属するＣＤＫ阻害剤であるｐ２１の発現は、ＲＮＬＳシグナル伝達によって調節される。ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、ｐ２１発現の著しい増加に関連する。ｐ２１は、細胞をＧ０に維持し、Ｇ１／Ｓ移行を遮断し、Ｇ１またはＳ期の間の停止を引き起こすことができる、細胞周期の負の調節因子である（Jungら、２０１０年、Cellular  Signalling.２２巻：１００３〜１２頁）。したがって、ｐ２１発現の増加は、抗ＲＮＬＳ抗体で処置した腫瘍において観察される細胞増殖の減少を説明することができる。加えて、ｐ３８は、細胞周期進行に影響を与えることも示され（Onoら、２０００年、Cellular  Signalling.１２巻：１〜１３頁）、抗ＲＮＬＳ処置によるｐ３８の活性化は、細胞周期停止に寄与することもできる。
【０２４５】
これらの知見は、がん細胞の生存および成長を促進することができる分泌タンパク質としてＲＮＬＳを同定し、単独での、またはそれぞれＣＳＦ−１Ｒ阻害剤もしくはＭＡＰＫ経路阻害剤などの他のＴＡＭもしくはメラノーマ阻害薬物と併せた、悪性メラノーマの処置のための抗ＲＮＬＳ療法の使用をさらに調査するためのフレームワークを提供する。ＭＡＰＫおよびＰＩ３ＫおよびＪＡＫ／ＳＴＡＴ３を調節するための複数の機構が存在するため、また、経路間にクロストークが存在するため、細胞運命は、複数のシグナルの動的平衡および統合に依存し、データは、ＲＮＬＳ阻害が、がん細胞死に向けて平衡を傾けることを示唆する。
【０２４６】
次に、本実施例で使用されている材料および方法について記載する。
【０２４７】
試薬
ヒトメラノーマ細胞株Ａ３７５．Ｓ２、ＳｋＭｅｌ２８、ＳｋＭｅｌ５、ＭｅＷｏおよびＷＭ２６６−４をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関から得て、推奨される通りに維持した。記載されている通りに、組換えヒトＲＮＬＳを発現させ、精製し、濃縮し、ＰＢＳに対して透析した（Desirら、Journal  of  the  American  Heart  Association.２０１２年；１巻：ｅ００２６３４頁）。ＲＮＬＳペプチドＲＰ２２０および変異したペプチドＲＰ２２０ＡをＵｎｉｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅで合成した。ウサギ抗ＲＮＬＳモノクローナル抗体（ＡＢ１７８７００）、ヤギポリクローナル抗ＲＮＬＳ抗体（ＡＢ３１２９１）、ヤギＩｇＧおよびウサギＩｇＧは、Ａｂｃａｍから購入した。
【０２４８】
抗ＲＮＬＳモノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳ（１Ｄ−２８−４としても公知）、ｍ３７−ＲＮＬＳ（１Ｄ−３７−１０としても公知）の合成
ＲＮＬＳペプチドＲＰ−２２０をＫＬＨにコンジュゲートし、６匹のウサギの免疫化に使用し、選択された動物の脾臓由来のリンパ球を、ハイブリドーマ生成のために骨髄腫細胞に融合させた。ハイブリドーマ上清をｒＲＮＬＳに対してスクリーニングし、選択されたハイブリドーマを、抗体精製のためにクローニングし、増やした。馴化されたハイブリドーマ培養上清から、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を精製した。
【０２４９】
２種のクローン、ｍ２８−ＲＮＬＳ（１Ｄ−２８−４としても公知）、ｍ３７−ＲＮＬＳ（１Ｄ−３７−１０としても公知）を、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００システムを使用して決定された、それらの高い結合親和性（それぞれ０．３１６および２．６７ｎＭのＫＤ）に基づき選択した。ｍ２８−ＲＮＬＳのヌクレオチド配列をＰＣＲによって決定し、合成し、これを哺乳動物発現ベクターへとクローニングした。２９３−Ｆ細胞への一過性発現によって合成されたｍ２８−ＲＮＬＳをプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。
【０２５０】
組織標本
ヒトメラノーマｃＤＮＡアレイＩおよびＩＩをＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から得た。関連病理報告は、オンラインで利用できる：http://www.origene.com/assets/documents/TissueScan。ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から得たヒトメラノーマおよび正常皮膚組織試料を、免疫組織化学または免疫蛍光に使用した。
【０２５１】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
以前に記載された通りに、様々な遺伝子の相対的発現レベルをｑＲＴ−ＰＣＲによって評価した（Leeら、２０１３年、J  Am  Soc  Nephrol.２４巻：４４５〜５５頁）。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現リアルタイムＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＲＮＬＳ、２’−５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ１（ＯＡＳ１）、β−アクチンおよび１８ｓ  ｒＲＮＡのｍＲＮＡレベルを評価した。結果は、閾値サイクル（Ｃｔ）として表現した。内在性対照１８ｓ  ｒＲＮＡまたはβ−アクチンに対して正規化された標的転写物の相対的定量化を、比較Ｃｔ方法（ΔＣｔ）によって決定し、製造業者のプロトコール（ユーザー会報番号２、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、２−ΔΔＣｔ方法を使用して、被験細胞株間の遺伝子発現の相対的変化を解析した。
【０２５２】
免疫組織化学的染色およびウエスタンブロット解析
以前に記載された通りに免疫組織化学を行った（Guoら、２０１２年、Cancer  science.１０３巻：１４７４〜８０頁）。簡潔に説明すると、腫瘍組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、スライドグラス上で５μｍ切片にカットした。スライドを脱パラフィンし、水分添加した後、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６バッファーを含有する圧力釜において抗原回復を行った。切片を３％過酸化水素において３０分間、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中２．５％正常ウマ血清において１時間ブロッキングした後、一次抗体およびアイソタイプ対照ＩｇＧと共に一晩４℃でインキュベートした。本研究において以下の抗体を使用した：ｍ２８−ＲＮＬＳ、５００ｎｇ／ｍｌ；ヤギポリクローナル抗ＲＮＬＳ、２５０ｎｇ／ｍｌ（Ａｂｃａｍ、ａｂ３１２９１）；ウサギモノクローナル抗ＣＤ６８（ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１：１００）；ウサギモノクローナル抗ＣＤ１６３（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ、１：１００）；ウサギモノクローナル抗ＣＤ８６（Ａｂｃａｍ、１：１００）；ウサギモノクローナル抗Ｋｉ６７（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ、ＶＰ−ＲＭ０４、１：１００）；ウサギモノクローナル抗ｐ２１、ホスホ−Ｔｙｒ７０５−Ｓｔａｔ３および総Ｓｔａｔ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、それぞれ＃２９４７、１：１００、＃９１４５、１：４００および＃４９０４、１：４００）。ＩｍｍＰＲＥＳＳペルオキシダーゼ−抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、一次抗体を検出した。Ｖｅｃｔｏｒ  ＤＡＢ基質キットを使用して発色させ、ヘマトキシリン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で対比染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１顕微鏡およびカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ、ＵＳＡ）を使用して、スライドを観察および撮影した。
【０２５３】
以前に記載された通りにウエスタンブロット解析を実行した（Wangら、２０１４年、Journal  of  the  American  Society  of  Nephrology.、DOI:10.1681/asn.2013060665）。
【０２５４】
組織マイクロアレイ
メラノーマ組織マイクロアレイは、ＵＳ  ＢｉｏＭａｘ，Ｉｎｃ．およびイェール大学組織病理サービスから購入した。本研究は、イェール大学医学部の人体研究倫理委員会（Human  Investigation  Committee  of  Yale  University  School  of  Medicine）（ＨＩＣプロトコール番号１００３００６４７９）によって承認された。以前に記載された通りにイェール大学メラノーマ組織マイクロアレイを構築した（Bergerら、２００３年、Cancer  research.６３巻：８１０３〜７頁；Rimmら、２００１年、Cancer  journal.７巻：２４〜３１頁）。５４２種の総メラノーマ症例を表す総計５７０種の組織コアおよび０．６ｍｍの寸法の小さい一連の対照を、単一のスライドグラス上に０．８ｍｍ離れた間隔をあけて置いた。イェール大学医学部病理学科のアーカイブから得た、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した組織ブロックからコホートを構築した。病理学者は、各症例を試験して、組織マイクロアレイにおける組み入れのための領域を選択した。標本由来のコア生検材料を、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｍｉｃｏｒａｒｒａｙｅｒ（Ｂｅｅｃｈｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｓｕｎ  Ｐｒａｉｒｉｅ、ＷＩ）を用いて組織マイクロアレイに置いた。次いで、組織マイクロアレイを５ｕｍ切片にカットし、ＵＶ架橋による粘着テープ移行システム（Ｉｎｓｔｕｍｅｄｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｈａｃｋｅｎｓａｃｋ、ＮＪ）を有するスライドグラスに置いた。２ヶ月間〜３８年間（メジアンの経過観察時間、６０ヶ月間）の経過観察範囲により、１９５９年〜１９９４年の間に切除された腫瘍のアーカイブから標本を全て引き出した。コホート特徴は、以前に記載されている（Bergerら、２００４年、Cancer  research.６４巻：８７６７〜７２頁）。
【０２５５】
以前に記載された通りに組織マイクロアレイスライドを染色した（Bergerら、２００４年、Cancer  research.６４巻：８７６７〜７２頁；Nicholsonら、２０１４年、Journal  of  the  American  College  of  Surgeons.２１９巻：９７７〜８７頁）。上述の免疫組織化学の処理と同じ仕方でスライドを脱パラフィンし、再度水分添加し、露出させ、ブロッキングした。メラノーマ組織アレイを、ＢＳＡ／ＴＢＳに希釈したｍ２８−ＲＮＬＳプラス抗Ｓ１００マウスモノクローナル（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）および抗ＨＭＢ４５マウスモノクローナル（１：１００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ、ＵＳＡ）のカクテルで４℃にて一晩染色した。ＢＳＡ／ＴＢＳに希釈した二次抗体Ａｌｅｘａ  ４８８コンジュゲートヤギ抗マウス（１：１００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）プラスＥｎｖｉｓｉｏｎ抗ウサギ（ＤＡＫＯ）を１時間室温で適用した。スライドをＴＢＳＴで（各５分間を３回）洗浄し、次いでＣｙ５−チラミド（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼによって活性化し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体に直接隣接する多数の共有結合的に会合したＣｙ５色素の沈着をもたらした。Ｃｙ５は、その発光ピーク（赤色）が、組織自家蛍光の緑色−橙色スペクトルの十分に外側にあるため使用した。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを含有するＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止試薬によりカバーガラスでスライドを封着して、核を可視化した。
【０２５６】
細胞生存度アッセイ
総細胞数および生細胞のパーセンテージをトリパンブルー排除によって評価し、ＢｉｏＲａｄ  ＴＣ１０自動細胞計数器を使用して細胞を計数した。追加の研究のため、製造業者の指示に従ってＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を使用して細胞生存度を決定した。マイクロプレートリーダー（Ｐｏｗｅｒ  Ｗａｖｅｓ  ＸＳ、ＢｉｏＴｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ、ＵＳＡ）を使用して吸光度を読み取った。
【０２５７】
ＲＮＡ干渉
ＲＮＬＳを標的とする４種の個々のｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＲＴプールは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ、ＵＳＡ）から購入した。製造業者によって指示される通りにＤｈａｒｍａＦＥＣＴ  ４試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、細胞に、ＲＮＬＳ  ｓｉＲＮＡまたはユニバーサル陰性対照低分子干渉ＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）をトランスフェクトした。ｑＰＣＲによってノックダウン効率を決定した。
【０２５８】
マウス腫瘍モデル
１８〜２０ｇの雌胸腺欠損ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）を、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｌｉｍａｎｔｉｃ、ＣＴ）から得て、１２時間の明／暗周期による、特定の病原体を含まない施設におけるオートクレーブした寝床を備えるマイクロアイソレーターケージに収容した。動物に、水および食物を自由に与え、ＶＡＣＨＳ  ＩＡＣＵＣによって承認された研究プロトコールに従って、腫瘍成長の徴候、活動性、採餌および疼痛に関して観察した。
【０２５９】
Ａ３７５．Ｓ２細胞（１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．６における２×１０６個）の皮下注射によって異種移植腫瘍を確立した。腫瘍が、５０〜１００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを対照群（ｎ＝１４、腹腔内注射（ＩＰ）週１回によるウサギＩｇＧ、４０μｇ、および３日毎に腫瘍部位周囲に４０ｕｇ皮下（ＳＱ）で処置）と、ｍ２８−ＲＮＬＳ（４０μｇ  ＩＰ、週１回および４０ｕｇ  ＳＱ、３日毎）を受ける実験群（ｎ＝１４）とに分けた。腫瘍サイズをデジタルノギスで測定し、体積を式（長さ×幅２）×π／２に従って計算した。
【０２６０】
研究の終わりに、マウスを屠殺し、腫瘍を切除し、液体窒素中で直ちに瞬間凍結し、−８０℃で貯蔵した。製造業者の指示に従って、ＴＵＮＥＬアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕアポトーシス検出システム）を使用してアポトーシスを試験した。切片を光学顕微鏡で調べ、１０個のランダムに選択された高倍率視野（×２００拡大率）における≧１０００個の細胞を計数することにより、アポトーシス指数を決定した。
【０２６１】
統計解析
ウィルコクソン順位和検定およびマン−ホイットニーのＵ検定を、それぞれ対形成したおよび対形成していないデータのために使用した。ノンパラメトリック反復処理に適切な場合、ＡＮＯＶＡ（フリードマン検定）を使用して、統計的有意性を評価した。フリードマン検定が、統計的有意性を明らかにした場合、ダンの検定をペアワイズ比較のために使用した。カプラン−マイヤー生存解析および多変量Ｃｏｘ回帰解析も実行した。全データは、平均±平均の標準誤差（平均±ＳＥＭ）であり、統計的有意差としてＰ＜０．０５の値が許容された。ＳＰＳＳ（登録商標）ソフトウェア、バージョン２１．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して組織アレイデータの統計解析を行った。
【０２６２】
次に、本実施例の結果について記載する。
【０２６３】
メラノーマにおけるＲＮＬＳ過剰発現
ＲＮＬＳ発現が、正常ヒト皮膚および悪性メラノーマの間で異なるかどうかを決定するために、正常皮膚から良性母斑から原発性および転移性メラノーマの進行に及ぶ、組織マイクロアレイ（ＴＭＡ；イェール大学組織マイクロアレイ施設およびＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ，Ｉｎｃ．）を試験した。Ｙａｌｅ  ＴＭＡは、１９５９年〜１９９４年の間に収集された１９２種の原発性メラノーマのコホート、１９９７年〜２００４年に収集された２４６種の系列原発性および転移性メラノーマのコホート、２９５名の良性母斑患者のコホート、ならび１５名の患者に由来するマッチした正常皮膚標本から得た、ホルマリン固定し、パラフィン包埋した標本を含有した。これらの組織マイクロアレイの人口統計学および臨床特徴は、以前に記載されている（Gould  Rothbergら、２００９年、Journal  of  clinical  oncology：official  journal  of  the  American  Society  of  Clinical  Oncology.２７巻：５７７２〜８０頁）。ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘアレイは、３５種の原発性メラノーマ、１１種の転移性病変、１４種の良性母斑および１４種の正常試料を含む７４種の標本を含有した。定量的自動免疫蛍光（ＩＦ）顕微鏡システム（ＡＱＵＡ）を使用した、ＲＮＬＳタンパク質発現のためのおよそ６００種のヒストスポット（histospot）の試験は、正常皮膚から良性母斑から原発性悪性メラノーマから転移性メラノーマへの進行が、ＲＮＬＳ発現の大幅な増加を伴うことを明らかにした（それぞれｐ＝０．００９、ｐ＝０．０００３およびｐ＜０．００１、図１７Ａ〜Ｃ）。
【０２６４】
問題は、調節不全のＲＮＬＳ発現およびシグナル伝達が、メラノーマ成長を容易にし、したがって、予後マーカーとして機能することができるかどうかである。１９９７年〜２００４年に収集された２４６種の系列原発性および転移性試料のコホート由来の各原発性メラノーマを試験した。１１９名の患者が、ＡＱＵＡ技術による評価に適したヒストスポットを有した。この群において、その腫瘍が、高いＲＮＬＳレベル（ＲＮＬＳ  ＡＱＵＡスコア＞メジアンＡＱＵＡスコア７５，７６４．４５）を発現した患者の転帰を、低いＲＮＬＳ発現を有する患者の転帰と比較した。高いＲＮＬＳ発現は、メラノーマ特異的死亡増加に関連した：５年間および１０年間の疾患特異的生存率、それぞれ５５％対６９％および３９．７％対５８．５％、ｐ＝０．００８（図１７Ｄ）。このコホートの多変量解析後に、ＲＮＬＳレベルは、メラノーマにおける生存を独立して予測することが判明した（ｐ＝０．００４、ＨＲ＝３．１３０）。診断時の疾患のステージ（ｐ＝０．０５、ＨＲ＝３．９４０）、クラークレベル（ｐ＝０．０１５、ＨＲ＝１．６８７）および原発性腫瘍の潰瘍化（ｐ＝０．００１、ＨＲ＝２．５４）も、メラノーマにおける生存を独立して予測することが判明した。これらの知見は、ＲＮＬＳ発現が、メラノーマにおける有用な予後マーカーとして機能することができ、より高悪性度表現型を有する患者のサブセットの同定に役立つことができることを示唆する。
【０２６５】
ＲＮＬＳ過剰発現は、がん細胞生存を支持する
ＲＮＬＳ媒介性シグナル伝達は、抗アポトーシス性であり、毒性ストレスに曝露された正常細胞をアポトーシス死から保護する（Wangら、２０１４年、J  Am  Soc  Nephrol.；Leeら、２０１３年、J  Am  Soc  Nephrol.２４巻：４４５〜５５頁）。ＲＮＬＳシグナル伝達が、がん細胞の生存を支持したか探索するために、組換えＲＮＬＳ（ｒＲＮＬＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のいずれかを、培養中の血清飢餓状態にされたメラノーマ細胞（Ａ３７５．Ｓ２、ＭｅＷｏ、ＳｋＭｅｌ５およびＳｋＭｅｌ２８）に添加し、細胞生存度を決定した。ＢＳＡと比較して、ＲＮＬＳは、血清飢餓状態にされた細胞の生存を著しく増加させ、ＷＳＴ−１アッセイによって測定される増殖速度の見かけの増加を引き起こした（ｎ＝６、ｐ＜０．０５、図１８Ａ）。ＲＮＬＳで処置された細胞の総細胞数および生細胞のパーセンテージを計数して、増殖速度の見かけの増加が、細胞増殖の増加またはアポトーシスの速度の減少によるものであったかを決定した。図１８Ｂに示す通り、ＲＮＬＳによる処置は、ＢＳＡで処置した細胞と比較して、増加した細胞計数および増加した生細胞のパーセンテージを示し、ＲＮＬＳが、抗アポトーシス生存因子として機能することを示唆する。
【０２６６】
ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでメラノーマ細胞にとって細胞傷害性である
メラノーマにおけるＲＮＬＳ発現およびシグナル伝達を阻害する機能的帰結を決定するための３種のアプローチを使用した。第一に、細胞生存度に対するＲＮＬＳ発現減少の効果を評価した。ｓｉＲＮＡによるＲＮＬＳノックダウンは、メラノーマ細胞株Ａ３７５．Ｓ２およびＳｋＭｅｌ２８の生存度を著しく低下させた（それぞれｐ＝０．０３およびｐ＝０．００３、図１９Ａ）。第二に、ＲＮＬＳペプチドＲＰ−２２０は、ｒＲＮＬＳの保護効果およびシグナル伝達特性を模倣するため、これが、細胞外ＲＮＬＳに対する受容体の決定的な領域と相互作用する可能性が高く、これに対する抗体が、阻害特性を有し得ると判断された。したがって、ＲＰ−２２０に対するモノクローナル抗体のパネルを開発し、がん細胞生存に対するこれらの効果を検査した。ＲＮＬＳに対して生成された２種のモノクローナル抗体［クローン＃２８−４（ｍ２８−ＲＮＬＳ）、３７−１０（ｍ３７−ＲＮＬＳ）］は、検査した全（総計５種の）メラノーマ細胞株の生存度を減少させ、代表例を図１９Ｂ〜Ｃに示す。ｍ２８−ＲＮＬＳは、処置濃度増加と相関した細胞傷害性のレベル増加を実証した（ｐ＜０．０５、図１９Ｂ）。第三に、ＲＰ−２２０の正味の電荷を減少させることにより（３個のリシン／アルギニンをアラニンに変化、図１９Ｄ）、ペプチドアンタゴニスト（ＲＰ−２２０Ａ）を生成した。ＲＰ２２０Ａは、ＲＮＬＳ依存性シグナル伝達を媒介しないが、ＰＭＣＡ４ｂに結合し、内在性ＲＮＬＳの作用をアンタゴナイズする（Wangら、２０１５年、PLoS  ONE.１０巻：ｅ０１２２９３２頁）。ＲＰ−２２０Ａは、培養中のメラノーマ細胞にとって、漸増用量において細胞傷害性であることが判明した（ｐ＜０．００５、図１９Ｄ）。
【０２６７】
ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍成長を遮断する
Ａ３７５．Ｓ２（ヒトメラノーマ）細胞を、胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射して、腫瘍を生成した。腫瘍が、ほぼ５０ｍｍ３の体積に達したら、次いで、対照ウサギＩｇＧまたはＲＮＬＳ中和モノクローナル抗体、ｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかで動物を処置した。全体的な動物の健康および活動性は、研究を通して維持されたため、抗体処置は、毒性であるとは思われなかった。腫瘍サイズを１日おきに測定し、ｍ２８−ＲＮＬＳによる処置は、検査した全てのポイントにおいて腫瘍体積を減少させた（ｐ＜０．０５、図２０Ａ）。一部の動物において全体的腫瘍サイズおよび潰瘍化のために１１日目に動物を屠殺した。細胞増殖マーカーＫｉ６７による異種移植腫瘍由来の切片のＩＨＣ染色は、抗ＲＮＬＳ抗体で処置した腫瘍内の、ウサギＩｇＧで処置した腫瘍と比べて細胞増殖の大幅な減少を明らかにした：対照群における３５．１±２．３陽性細胞／高倍率視野  対  ＲＮＬＳ  Ａｂ処置群における１３．４±３．０、ｎ＝１４、ｐ＝０．０００４（図２０Ｂ）。
【０２６８】
ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、内在性ＲＮＬＳ発現およびＳＴＡＴ３活性化を遮断し、アポトーシスおよび細胞周期停止を誘導する
ＳＴＡＴ３は、ＲＮＬＳ遺伝子のプロモーター領域に結合し、その発現を増加させることが公知であり、正のＲＮＬＳ−ＳＴＡＴ３フィードバックループが示唆されている（Sonawaneら、２０１４年、Biochemistry.５３巻（４４号）：６８７８〜６８９２頁）。免疫蛍光組織染色、ならびに対照ＩｇＧおよびｍ２８−ＲＮＬＳで処置した異種移植腫瘍由来の細胞ライセートの研究により、この関係性をさらに調査した。リン酸化および総ＳＴＡＴ３とＲＮＬＳの顕著な同時発現が、ＩＦによって評価される通り、腫瘍試料において認められた（図２１Ａ）。ｍ２８−ＲＮＬＳによる処置は、ＲＮＬＳタンパク質発現の、ならびに総およびリン酸化ＳＴＡＴ３の両方の劇的な低下を引き起こした（図２１Ａ）。図２１Ｂ〜Ｃに示す通り、ウエスタンブロットによりタンパク質発現の変化が確認された。ｍ２８−ＲＮＬＳで処置した腫瘍において、チロシン７０５におけるＳＴＡＴ３リン酸化（ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３）および総ＳＴＡＴ３は、大幅に減少した（ｎ＝８、ｐ＜０．００５、図２１Ｂ〜Ｃ）。
【０２６９】
ＲＮＬＳ発現の大幅な減少が、メラノーマ細胞において主に発生していたか検査するために、ヒトおよびマウス特異的プライマーを使用して、腫瘍塊における腫瘍（ヒト）および内在性（マウス）ＲＮＬＳを増幅した。図２１Ｄに描写される通り、ｍ２８−ＲＮＬＳによる処置は、ヒト（腫瘍）発現に影響を与えることなく、マウスＲＮＬＳ発現の大幅な低下を引き起こし、腫瘍浸潤細胞が、ＲＮＬＳ産生および分泌における肝要な役割を果たすことを示唆する。
【０２７０】
加えて、細胞周期阻害剤ｐ２１の発現増加が認められた。抗体処置は、腫瘍試料における細胞周期調節因子ｐ２１の発現を著しく増加させた：抗体処置群における２４．２±２．４陽性細胞  対  対照群における１２．２±１．０、ｎ＝１４、ｐ＝０．００９（図２１Ｅ）。末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼｄＵＴＰニック末端標識化（ＴＵＮＥＬ）染色は、対照群を上回る抗体処置腫瘍におけるアポトーシスを起こす細胞の平均数の大幅な増加を明らかにした、平均１３．３±０．６陽性細胞  対  ４．３±０．２、ｎ＝１４、ｐ＜０．００１（図２１Ｅ）。アポトーシスの増加は、ｐ３８  ＭＡＰＫのリン酸化およびＢ細胞リンパ腫２関連タンパク質Ｂａｘのその後の活性化に時間的に関係付けられた（図２１Ｆ）。これらのデータは、抗ＲＮＬＳ抗体による処置が、総およびリン酸化ＳＴＡＴ３の著しい低下を引き起こし、腫瘍細胞における細胞増殖を減少させ、アポトーシスを増加させることを示す。
【０２７１】
ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、ＣＤ８６＋のＣＤ１６３＋  ＴＡＭに対する比を増加させる
ＲＮＬＳおよびメラニン形成細胞染色の間に認められる重複は最小であるため、メラニン形成細胞は、メラノーマヒストスポットにおけるＲＮＬＳの主な供給源であるとは思われなかった（図１７Ａ）。メラノーマは、多くの場合、マクロファージを含む免疫細胞の顕著な浸潤を有する。浸潤マクロファージは、汎マクロファージマーカーＣＤ６８と大幅に重複した、各ヒストスポットに認められるＲＮＬＳ染色の実質的構成成分として大部分の腫瘍ＲＮＬＳに寄与すると思われた（図２２Ａ上パネル）。さらなる調査の際に、ＲＮＬＳが、ＣＤ１６３＋（Ｍ２様）ＴＡＭと主に同時発現されたことが決定された（図２２Ａ、中央パネル）。ＣＤ８６＋（Ｍ１様）マクロファージとのＲＮＬＳの同時発現は、最小であった（図２２Ａ、下パネル）。Ｍ２様（ＣＤ１６３＋）マクロファージは、免疫回避と関連し、がん発症および拡散を促進することが示される一方、Ｍ１様（ＣＤ８６＋）マクロファージは典型的に炎症促進性であり、腫瘍成長を阻害する（Biswasら、２０１０年、Nat  Immunol.１１巻：８８９〜９６頁；Mantovaniら、Trends  in  Immunology.２３巻：５４９〜５５頁）。ｍ２８−ＲＮＬＳ抗体による異種移植片の処置は、ＣＤ１６３＋  ＴＭＡの数の相当な減少をもたらし、残っている細胞は、検出可能なレベルのＲＮＬＳを発現しなかった（図２２Ｂ）。
【０２７２】
（実施例３：原形質膜カルシウムＡＴＰａｓｅ  ＰＭＣＡ４ｂを介した持続したレナラーゼシグナル伝達は、膵がん成長を促進する）
ＲＮＬＳは、膵がんにおいて障害されているＭＡＰＫおよびＰＩ３Ｋ経路に関与する生存因子として機能するため、また、その発現は、シグナル伝達性転写因子ＳＴＡＴ３によって調節されるため（Sonawaneら、２０１４年、Biochemistry.５３巻（４４号）：６８７８〜６８９２頁）、ＲＮＬＳ発現およびシグナル伝達の異常調節が、がん細胞に生存利点をもたらし、腫瘍形成を促進し得ることが仮定された（Guoら、２０１４年、Curr  Opin  Nephrol  Hypertens.２３巻（５号）：５１３〜８頁）。
【０２７３】
本明細書において示されるように、ＲＮＬＳ発現が、いくつかの種類のがんにおいて増加され、膵管腺癌（ＰＤＡＣ）患者のコホートにおいて、全生存は、腫瘍においてＲＮＬＳ発現と逆相関し、ＲＮＬＳについての病原性役割を示唆した。ｓｉＲＮＡまたは阻害性抗ＲＮＬＳ抗体を使用したＲＮＬＳ発現の阻害は、培養ＰＤＡＣ細胞生存度を減少させた。異種移植マウスモデルにおいて、ＲＮＬＳモノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳは、ＰＤＡＣ成長を阻害し、ＳＴＡＴ３を下方調節し、ｐ２１およびｐ３８を上方調節することにより、アポトーシスおよび細胞周期停止を引き起こした。腫瘍細胞におけるＲＮＬＳ発現の下方調節は、ＰＭＣＡ４ｂ（ＲＮＬＳ受容体）発現の等しい減少をもたらし、阻害性抗ＲＮＬＳ抗体により観察されるものと同様の腫瘍サイズの低下をもたらした。これらの結果は、がんにおけるＲＮＬＳ経路の以前に認識されなかった生存促進性機能を明らかにし、ＲＮＬＳ発現が、予後マーカーとして機能し得ることを示し、膵がんの管理のための新規治療標的を同定する。
【０２７４】
ＰＤＡＣにおけるＲＮＬＳ発現増加の病原性役割、およびＲＮＬＳシグナル伝達を阻害することの治療有用性の両方の証拠が本明細書に提供される。加えて、ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害剤の観察される抗腫瘍活性を媒介する分子機構が探索されている。
【０２７５】
まとめると、これらの知見は、上方調節されたＲＮＬＳ媒介性シグナル伝達が、ＰＤＡＣにおける病原性役割を果たすことを示す。本明細書において、高いＲＮＬＳ腫瘍発現が、全体的３年死亡率の２倍増加に関連することが示されており、診断または予後マーカーとしてのＲＮＬＳの使用を支持する。さらに、ＲＮＬＳは、分泌タンパク質であるため、腫瘍の一次検出のためのバイオマーカーとして、または処置応答もしくは再発のための代理マーカーとして使用することができる。
【０２７６】
ＲＮＬＳ媒介性細胞保護の一次機構は、ＡＫＴ、ＥＲＫおよびＳＴＡＴを活性化する、抗アポトーシス因子Ｂｃｌ２を増加させる、ならびにエフェクターカスパーゼの活性化を予防する能力であると思われる（Wangら、２０１４年、Journal  of  the  American  Society  of  Nephrology.、DOI:10.1681/asn.2013060665）。Ｐａｎｃ１細胞におけるＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、ｐ３８  ＭＡＰＫの持続した活性化およびアポトーシスと関連する。ｐ３８は、炎症、細胞分化、細胞周期調節およびアポトーシスに関係付けられたストレス活性化キナーゼである（Onoら、２０００年、Cellular  Signalling.１２巻（１号）：１〜１３頁）。例えば、神経増殖因子の中止は、ＪＮＫおよびｐ３８の持続した活性化ならびにＥＲＫの下方調節と共にアポトーシスを引き起こす（Xiaら、１９９５年、Science.２７０巻（５２４０号）：１３２６〜３１頁）。しかし、ある特定の条件下で、ｐ３８の阻害は、アポトーシスを遮断することができるため（Onoら、２０００年、Cellular  Signalling.１２巻（１号）：１〜１３頁）、アポトーシスプロセスにおけるｐ３８の役割は、明らかに状況依存性である。本明細書に記載されているデータは、Ｐａｎｃ１細胞において、ｐ３８のｍ２８−ＲＮＬＳ依存性活性化が、アポトーシスに関連するという説明と一貫している。
【０２７７】
ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、膵がんの異種移植片におけるＫｉ−６７の発現を著しく減少させる。Ｋｉ−６７は、細胞分裂のレベルの評価に使用されるため、データは、ＲＮＬＳ阻害が、腫瘍の増殖速度を減少させるという説明と一貫する。細胞周期進行を決定する肝要な因子の多くが同定されており、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）ならびに２つのクラスの内在性ＣＫＤ阻害剤、すなわち、サイクリン依存性キナーゼ４の阻害剤（ＩＮＫ４）およびＣＤＫ相互作用タンパク質／キナーゼ阻害剤（ＣＩＰ／ＫＩＰ）タンパク質ファミリーを含む（Jungら、２０１０年、Cellular  Signalling.２２巻（７号）：１００３〜１２頁）。データは、ＣＩＰ／ＫＩＰファミリーに属するＣＫＤ阻害剤であるｐ２１の発現が、ＲＮＬＳシグナル伝達によって調節されることを明らかにする。ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害は、ｐ２１発現の著しい増加に関連する。ｐ２１は、細胞をＧ０に維持し、Ｇ１／Ｓ移行を遮断し、Ｇ１またはｓ期の間の停止を引き起こすことができる細胞周期の負の調節因子であるため（Jungら、２０１０年、Cellular  Signalling.２２巻（７号）：１００３〜１２頁）、その上方調節は、ｍ２８−ＲＮＬＳで処置した腫瘍において観察される細胞増殖の減少を説明することができる。加えて、ｐ３８も、細胞周期進行に影響を与えることが示されており（Onoら、２０００年、Cellular  Signalling.１２巻（１号）：１〜１３頁）、抗ＲＮＬＳ処置によるその活性化も、細胞周期停止に寄与することができる。
【０２７８】
ＲＮＬＳ遺伝子発現を調節する調節プロモーターエレメントおよび転写因子は、近年調査され（Sonawaneら、２０１４年、Biochemistry.５３巻（４４号）：６８７８〜６８９２頁）、これらのデータは、ＳＴＡＴ３についての肝要な役割を指し示す。結果は、ＲＮＬＳおよびＳＴＡＴ３の間のフィードフォワードループを示唆する：ＳＴＡＴ３を上方調節するシグナルが、ＲＮＬＳ遺伝子発現を増加させ、次いでＲＮＬＳが、ＳＴＡＴ３活性を増加させる。ＲＮＬＳおよびＳＴＡＴ３の間の斯かる相互作用は、がんの病因におけるＲＮＬＳシグナル伝達の役割に関する重要な意義を有する。ＳＴＡＴファミリータンパク質、特に、ＳＴＡＴ３は、悪性形質転換およびがん進行を容易にする炎症性微小環境の誘導および維持に堅く関係付けられる（Yuら、２００９年、Nat  Rev  Cancer.９巻（１１号）：７９８〜８０９頁）。ＳＴＡＴ３シグナル伝達は多くの場合、がん細胞において持続的に活性化され、斯かる活性化は、腫瘍細胞増殖を駆動するだけではなく、腫瘍微小環境における炎症を持続させる多数の遺伝子の産生も増加させる。がん細胞および形質転換していない間質細胞の間のＳＴＡＴ３フィードフォワードループが、がんにおいて記録された（Catlett-Falconeら、１９９９年、Immunity.１０巻（１号）：１０５〜１５頁；Yuら、２００７年、Nat  Rev  Immunol.７巻（１号）：４１〜５１頁；Araら、２００９年、Cancer  Res.６９巻（１号）：３２９〜３７頁）。例えば、ＳＴＡＴ３は、多発性骨髄腫患者において構成的に活性化される。ＩＬ−６依存性ヒト骨髄腫細胞株Ｕ２６６において、ＩＬ−６は、ヤヌスキナーゼを介してシグナル伝達して、ＳＴＡＴ３を活性化し、これは次いで、抗アポトーシス因子を上方調節し、腫瘍細胞の生存を促進する（Catlett-Falconeら、１９９９年、Immunity.１０巻（１号）：１０５〜１５頁）。同様に、ＳＴＡＴ３は、大部分の膵管腺癌において構成的に活性化され、ＫＲＡＳ誘導性膵腫瘍形成の惹起および進行に要求されると思われる（Corcoranら、２０１１年、Cancer  Res.７１巻（１４号）：５０２０〜９頁）。
【０２７９】
ＳＴＡＴ３経路およびＲＮＬＳは、ＰＤＡＣ発症における最も一般的かつ重要な環境因子、紙巻きタバコ喫煙の促進における役割を有することもできる（Muscatら、１９９７年、Cancer  epidemiology,  biomarkers  &  prevention:  a  publication  of  the  American  Association  for  Cancer  Research,  cosponsored  by  the  American  Society  of  Preventive  Oncology.６巻（１号）：１５〜９頁；Boyleら、１９９６年、International  journal  of  cancer  Journal  international  du  cancer.６７巻（１号）：６３〜７１頁；Fuchsら、１９９６年、Archives  of  internal  medicine.１５６巻（１９号）：２２５５〜６０頁）。紙巻タバコ煙の肝要な構成要素であるニコチンは、がんにおける増殖の速度および血管新生を増強することが示された（Heeschenら、２００２年、J  Clin  Invest.１１０巻（４号）：５２７〜３６頁；Heeschenら、２００１年、Nat  Med.７巻（７号）：８３３〜９頁）。腫瘍成長および転移のニコチンの作用は、ＪＡＫ−ＳＴＡＴ３およびＭＥＫ−ＥＲＫ１−２下流シグナル伝達カスケードをもたらすアセチルコリン受容体アルファ−７ｎＡＣＨＲとの、その相互作用によって媒介されると考えられる（Momiら、２０１３年、Oncogene.３２巻（１１号）：１３８４〜９５頁）。この文脈において、ニコチンは、Ｓｐ１およびＳＴＡＴ３の相乗的な作用により、ＲＮＬＳプロモーター活性を増加させる（Sonawaneら、２０１４年、Biochemistry.５３巻（４４号）：６８７８〜６８９２頁）。
【０２８０】
ＰＭＣＡ４ｂは、細胞シグナル伝達、心肥大およびがんに関与する原形質膜ＡＴＰａｓｅとして以前に特徴付けされた（Cartwrightら、２００７年、Annals  of  the  New  York  Academy  of  Sciences.１０９９巻（１号）：２４７〜５３頁；Pintonら、２００１年、EMBO  J.２０巻（１１号）：２６９０〜２７０１頁；Oceandyら、２０１１年、Biochimica  et  Biophysica  Acta  (BBA)  -  Molecular  Cell  Research.１８１３巻（５号）：９７４〜８頁）。これは、サイトゾルから外部環境へとＣａ２＋を輸送し、局所的カルシウム濃度を調節すると思われる。細胞質Ｃａ２＋の調節におけるその役割に加えて、ＰＭＣＡ４ｂは、ＲａｓおよびＭＡＰＫを介してシグナル伝達することもできる高分子複合体の中心である（Araら、２００９年、Cancer  Res.６９巻（１号）：３２９〜３７頁；Corcoranら、２０１１年、Cancer  Res.７１巻（１４号）：５０２０〜９頁；Muscatら、１９９７年、Cancer  epidemiology,  biomarkers  &  prevention:  a  publication  of  the  American  Association  for  Cancer  Research,  cosponsored  by  the  American  Society  of  Preventive  Oncology.６巻（１号）：１５〜９頁）。例えば、これは、腫瘍サプレッサーＲＡＳＳＦ１との、その相互作用を介してＲａｓシグナル伝達およびＥＲＫ活性化をモジュレートする（Armesillaら、２００４年、Journal  of  Biological  Chemistry.２７９巻（３０号）：３１３１８〜２８頁）。データは、ＲＮＬＳが、ＰＭＣＡ４ｂを介してシグナル伝達すること、ＰＭＣＡ４ｂ発現の下方調節またはその酵素機能の阻害が、膵腺癌細胞にとって細胞傷害性であることを示す。これらの知見は、ＰＭＣＡ４ｂが、ＰＤＡＣの管理における治療標的を表すことを示唆する。
【０２８１】
要約すると、これらの知見は、ＲＮＬＳが、ＰＤＡＣの生存および成長を促進することができる分泌タンパク質であることを実証する。これは、がんの処置のためにＲＮＬＳを阻害する治療法の使用をさらに調査するためのフレームワークを提供する。この文脈において、ＭＡＰＫ、ＰＩ３ＫおよびＪＡＫ−ＳＴＡＴ３を媒介する複数の相互に関係するシグナルをモジュレートするＲＮＬＳは、がんにおいて活性であり、この分子は、特に魅力的な治療標的であり得る（図２７Ｅ）。
【０２８２】
次に、本実施例で使用されている材料および方法について記載する。
【０２８３】
試薬
ヒト管膵腺癌細胞株ＢｘＰＣ−３、Ｐａｎｃ１およびＭｉａＰａＣａ−２をアメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から得て、推奨される通りに維持した。ｐ３８およびＳＴＡＴ３遮断薬ＳＢ２０３５８０およびＳｔａｔｔｉｃは、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）から購入した。ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５およびＥＲＫ阻害剤Ｕ０１２６は、それぞれＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）およびＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ  ＭＡ、ＵＳＡ）から得た。以前に記載された通りに、組換えヒトＲＮＬＳ（ｒＲＮＬＳ）を発現させ、精製し、濃縮し、ＰＢＳに対して透析した（Desirら、２０１２年、J  Am  Heart  Assoc.１巻（４号）：ｅ００２６３４頁）。ウサギ抗ＲＮＬＳモノクローナル（ＡＢ１７８７００）、ヤギポリクローナル抗ＲＮＬＳ（ＡＢ３１２９１）、ヤギＩｇＧおよびウサギＩｇＧは、Ａｂｃａｍから購入した。
【０２８４】
抗ＲＮＬＳモノクローナル抗体ｍ２８−ＲＮＬＳ（１Ｄ−２８−４としても公知）、ｍ３７−ＲＮＬＳ（１Ｄ−３７−１０としても公知）の合成
ＲＮＬＳペプチドＲＰ−２２０をＫＬＨにコンジュゲートし、６匹のウサギの免疫化に使用し、選択された動物の脾臓由来のリンパ球を、ハイブリドーマ生成のために骨髄腫細胞に融合させた。ハイブリドーマ上清をｒＲＮＬＳに対してスクリーニングし、選択されたハイブリドーマを、抗体精製のためにクローニングし、増やした。馴化されたハイブリドーマ培養上清から、プロテインＡ親和性クロマトグラフィーによってモノクローナル抗体を精製した。
【０２８５】
２種のクローン、ｍ２８−ＲＮＬＳ、ｍ３７−ＲＮＬＳを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００システムを使用して決定された、それらの高い結合親和性（それぞれ０．３１６および２．６７ｎＭのＫＤ）に基づき選択した。ｍ２８−ＲＮＬＳのヌクレオチド配列をＰＣＲによって決定し、合成し、これを哺乳動物発現ベクターへとクローニングした。２９３−Ｆ細胞への一過性発現によって合成されたｍ２８−ＲＮＬＳをプロテインＡクロマトグラフィーによって精製した。
【０２８６】
組織標本
ＯｒｉＧｅｎｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）からヒトがんｃＤＮＡアレイ（Ｓｃｒｅｅｎ  ｃＤＮＡ  Ａｒｒａｙｓ  ＩおよびＩＩ、膵がんｃＤＮＡアレイ）を得た。関連病理報告は、オンラインで利用できる：www.origene.com/assets/documents/TissueScan。ＵＳ  Ｂｉｏｍａｘ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ、ＵＳＡ）から得たヒト膵がんおよび正常組織試料を、免疫組織化学または免疫蛍光に使用した。
【０２８７】
定量的ＰＣＲ
様々な遺伝子の相対的発現レベルをｑＰＣＲによって評価した。ＴａｑＭａｎ遺伝子発現リアルタイムＰＣＲアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、ＲＮＬＳ、２’−５’−オリゴアデニル酸シンテターゼ１（ＯＡＳ１）、β−アクチンおよび１８ｓ  ｒＲＮＡのｍＲＮＡレベルを評価した。結果は、閾値サイクル（Ｃｔ）として表現した。内在性対照１８ｓ  ｒＲＮＡまたはβ−アクチンに対して正規化された標的転写物の相対的定量化は、比較Ｃｔ方法（ΔＣｔ）によって決定し、製造業者のプロトコール（ユーザー会報番号２、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に従って、２−ΔΔＣｔ方法を使用して、被験細胞株間の遺伝子発現の相対的変化を解析した。
【０２８８】
免疫組織化学およびウエスタンブロット解析
以前に記載された通りに免疫組織化学を行った（Guoら、２０１２年、Cancer  Science.１０３巻（８号）：１４７４〜８０頁）。簡潔に説明すると、腫瘍組織をホルマリン固定し、パラフィン包埋し、スライドグラス上で５μｍ切片にカットした。スライドを脱パラフィンし、水分添加した後、１０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ６バッファーを含有する圧力釜において抗原回復を行った。切片を３％過酸化水素において３０分間、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ２０中２．５％正常ウマ血清において１時間ブロッキングした後、一次抗体およびアイソタイプ対照ＩｇＧと共に一晩４℃でインキュベートした。本研究において以下の抗体を使用した：ｍ２８−ＲＮＬＳ、５００ｎｇ／ｍｌ；ヤギポリクローナル抗ＲＮＬＳ、２５０ｎｇ／ｍｌ（Ａｂｃａｍ、ＡＢ３１２９１）；ウサギモノクローナル抗Ｋｉ６７（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ、ＶＰ−ＲＭ０４、１：１００）；ウサギモノクローナル抗ｐ２１およびホスホ−Ｔｙｒ７０５−Ｓｔａｔ３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、それぞれ＃２９４７、１：１００および＃９１４５、１：４００）。ＩｍｍＰＲＥＳＳペルオキシダーゼ−抗ウサギＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、一次抗体を検出した。Ｖｅｃｔｏｒ  ＤＡＢ基質キットを使用して発色させ、ヘマトキシリン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で対比染色した。Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ４１顕微鏡およびカメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ａｍｅｒｉｃａ  Ｉｎｃ、Ｃｅｎｔｅｒ  Ｖａｌｌｅｙ、ＰＡ、ＵＳＡ）を使用して、スライドを観察および撮影した。
【０２８９】
以前に記載された通りにウエスタンブロット解析を実行した（Wangら、２０１４年、Journal  of  the  American  Society  of  Nephrology.、DOI:10.1681/asn.2013060665）。
【０２９０】
組織マイクロアレイ
膵臓組織マイクロアレイは、ＵＳ  ＢｉｏＭａｘから購入した。以前に記載された通りに組織マイクロアレイスライドを染色した（Nicholsonら、２０１４年、Journal  of  the  American  College  of  Surgeons.２１９巻（５号）：９７７〜８７頁）。手短に言えば、標本は、ｍ２８−ＲＮＬＳおよびマウスモノクローナル汎サイトケラチン抗体（１：１００、ＤＡＫＯ  Ｍ３５１５）で４℃にて一晩共染色した。二次抗体Ａｌｅｘａ  ４８８コンジュゲートヤギ抗マウス（１：１００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）およびＥｎｖｉｓｉｏｎ抗ウサギ（ＤＡＫＯ）を１時間室温で適用した。スライドをＴｒｉｓ緩衝食塩水で洗浄し（５分間を３回）、Ｃｙ５−チラミド（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）と共にインキュベートし、西洋ワサビペルオキシダーゼによって活性化した。Ｃｙ５は、その発光ピーク（赤色）が組織自家蛍光の緑色−橙色スペクトルの外側にあるため使用した。４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドールを含有するＰｒｏｌｏｎｇ  Ｇｏｌｄ退色防止試薬によりカバーガラスでスライドを封着して、核の可視化を容易にした。
【０２９１】
細胞生存度アッセイ
トリパンブルー排除によって細胞生存度を評価し、ＢｉｏＲａｄ  ＴＣ１０自動計数器を使用して細胞を計数した。一部の研究のため、細胞生存度を、以前に記載された通りにＷＳＴ−１試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、ＵＳＡ）を使用して決定した（Wangら、２０１４年、Journal  of  the  American  Society  of  Nephrology.、DOI:10.1681/asn.2013060665）。
【０２９２】
アポトーシスおよび細胞周期解析
細胞周期解析のため、培養細胞を、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを使用して解離し、氷冷７０％エタノールで固定し、ＲＮＡｓｅ  Ａで消化し、ヨウ化プロピジウムで染色した。プロピジウム染色を、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して検出し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して解析した。
【０２９３】
以前に行った通りにアポトーシスを検出および定量化した（Guoら、２０１２年、Cancer  Science.１０３巻（８号）：１４７４〜８０頁）。手短に言えば、製造業者の指示に従って、ＦＩＴＣ標識アネキシン−Ｖおよびヨウ化プロピジウムで細胞を染色した（Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）。少なくとも２０，０００個のイベントを、ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ、ＵＳＡ）において収集し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェアを使用して解析した。
【０２９４】
ＲＮＡ干渉
ＲＮＬＳを標的とする４種の個々のｓｉＲＮＡおよびｓｉＲＮＡ  ＳＭＡＲＴプールは、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ、ＣＯ、ＵＳＡ）から購入した。製造業者によって示唆される通りにＤｈａｒｍａＦＥＣＴ  ４試薬（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）を使用して、細胞に、ＲＮＬＳ  ｓｉＲＮＡまたはユニバーサル陰性対照ｓｉＲＮＡ（対照ｓｉＲＮＡ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）をトランスフェクトした。
【０２９５】
安定にトランスフェクトされたＰａｎｃ１細胞株を生成するために、製造業者のプロトコールに従って、細胞に、ＲＮＬＳ  ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ＲＮＬＳ）または対照ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−対照）のいずれかを保有するレンチウイルス（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を形質導入した。細胞を２回形質導入して、ｓｈＲＮＡコピー数を増加させ、１０日間の８０μｇ／ｍｌピューロマイシンにおける選択後に、安定したクローンを樹立した。ｑＰＣＲによってノックダウン効率を決定した。
【０２９６】
マウス異種移植腫瘍モデル
１８〜２０ｇの雌胸腺欠損ヌードマウス（ｎｕ／ｎｕ）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｗｉｌｌｉｍａｎｔｉｃ、ＣＴ）から得て、１２時間の明／暗周期で、特定の病原体を含まない施設におけるオートクレーブした寝床を備えるマイクロアイソレーターケージに収容した。動物に、水および食物を自由に与え、ＶＡＣＨＳ  ＩＡＣＵＣによって承認された研究プロトコールに従って、腫瘍成長の徴候、活動性、採餌および疼痛に関して観察した。
【０２９７】
ＢｘＰＣ３細胞（１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．６における２×１０６個）の皮下注射によって異種移植腫瘍を確立した。腫瘍が、５０〜１００ｍｍ３の体積に達したら、マウスを対照群（ｎ＝１４、腹腔内注射（ＩＰ）によりウサギＩｇＧ、４０μｇで処置）と、ｍ２８−ＲＮＬＳ（４０μｇ  ＩＰ、３日毎）を受ける実験群（ｎ＝１４）とに分けた。腫瘍サイズをデジタルノギスで測定し、式（長さ×幅２）×π／２に従って体積を計算した。別の動物群において（各ｎ＝６）、ｓｈ−ＲＮＬＳまたはｓｈ−対照Ｐａｎｃ１細胞（１００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．６における２×１０６個）を皮下注射した。これらの動物は、さらなる処置を受けず、腫瘍サイズおよび体積を最大３０日間測定した。
【０２９８】
研究の終わりに、マウスを屠殺し、腫瘍を切除し、液体窒素中で直ちに瞬間凍結し、−８０℃で貯蔵した。製造業者の指示に従ってＴＵＮＥＬアッセイ（Ｒｏｃｈｅ  ｉｎ  ｓｉｔｕアポトーシス検出システム）を使用して、アポトーシスを試験した。切片を光学顕微鏡で調べ、５個のランダムに選択された高倍率視野（×２００拡大率）における≧１０００個の細胞を計数することによりアポトーシス指数を決定した。
【０２９９】
統計解析
ウィルコクソン順位検定およびマン−ホイットニー検定は、それぞれ対形成したおよび対形成していないデータのために使用した。適切であれば、ノンパラメトリック反復処理ＡＮＯＶＡ（フリードマン検定）を使用して、統計的有意性を評価した。フリードマン検定が、統計的有意性を明らかにした場合、ダンの検定をペアワイズ比較のために使用した。全データは、平均±平均の標準誤差（平均±ＳＥＭ）であり、統計的有意差としてＰ＜０．０５の値が許容された。ＳＰＳＳ（登録商標）ソフトウェア、バージョン２１．０（ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．、Ｃｈｉｃａｇｏ、ＩＬ、ＵＳＡ）を使用して、組織アレイデータの統計解析を行った。
【０３００】
次に、本実施例の結果について記載する。
【０３０１】
ＰＤＡＣにおけるＲＮＬＳ過剰発現および生存減少との関連
ＲＮＬＳ発現が、正常およびがん組織の間で異なるかどうかを決定するために、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を使用して市販のヒト組織ｃＤＮＡアレイをスクリーニングすることにより、１５種の異なる種類のがんを試験した。ＲＮＬＳ発現は、膵臓、膀胱および乳房のがんならびにメラノーマにおいて大幅に増加された（図２３Ａ）。その特に不十分な生存および限定的な治療選択肢のため、膵新生物に焦点を置いた。ＲＮＬＳ発現は、ＰＤＡＣ（ほぼ３倍）および膵神経内分泌（８倍）腫瘍の両方において上昇された（図２３Ｂ）。抗ＲＮＬＳモノクローナルｍ２８−ＲＮＬＳを使用した免疫細胞化学的研究は、図２３Ｃおよび図２８）に示す通り、ＲＮＬＳ発現が、ＰＤＡＣグレード１〜４に存在し、がん細胞に主に局在化されたことを示した。大部分のＲＮＬＳは、がん細胞における細胞質分布を有すると思われた；これは、全ての腫瘍グレードに存在したが、より分化したがん（グレードＩ〜ＩＩＩ）において最も明らかであった。膵臓の神経内分泌腫瘍において、ＲＮＬＳは、腫瘍の至るところの細胞において発現された（図２９）。ＲＮＬＳ遺伝子発現は、ＫＲＡＳ変異を有する膵管腺癌細胞（ＰＤＡＣＣ）株（ＭｉａＰａＣａ２およびＰａｎｃ１）において、ＢｘＰＣ３などの野生型ＫＲＡＳを有する株よりも高かった（図３０）。
【０３０２】
マッチした隣接正常組織を有するホルマリン固定し、パラフィン包埋した腫瘍コアからなる組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を使用して、６９名のＰＤＡＣ患者におけるＲＮＬＳ発現を特徴付けた。試料を得た個体の人口統計学および臨床特徴を表３に示す。不偏の定量的自動免疫蛍光顕微鏡システム（ＡＱＵＡ）（Gould  Rothbergら、２００９年、Journal  of  Clinical  Oncology.２７巻（３４号）：５７７２〜８０頁）を使用した、対形成したＰＤＡＣ腫瘍およびその非腫瘍隣接組織由来の１３８種のヒストスポットの、ＲＮＬＳタンパク質発現に関する試験は、全体的ＲＮＬＳレベルが、ＰＤＡＣ腫瘍において、その隣接非腫瘍膵組織よりも２倍を超えて大きかったことを示した（ｐ＜０．００１、図２３Ｄ）。
【表３】
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【０３０３】
ＲＮＬＳ発現増強が、ＰＤＡＣの臨床挙動に影響を与え得るかどうかを決定するために、発現のレベルが予後に影響を与えたかに関する疑問を呈した。その腫瘍が高いＲＮＬＳレベルを発現した個体（ｎ＝３４、ＲＮＬＳ  ＡＱＵＡスコア＞メジアン）は、劇的に低下した３年生存率を有した（２４％対４９％、ｐ＝０．０２４、図２３Ｅ）。これらの知見は、ＲＮＬＳ発現の腫瘍レベルが、ＰＤＡＣにおける有用な予後マーカーであり、より高悪性度表現型を有する患者のサブセットの同定に役立つことができることを示す。
【０３０４】
ＲＮＬＳは、ＰＭＣＡ４ｂを介してシグナル伝達し、膵がん細胞のための生存因子として機能する
ＲＮＬＳ媒介性シグナル伝達は、毒性ストレスに曝露されたＨＫ−２細胞をアポトーシスから保護する（Leeら、２０１３年、J  Am  Soc  Nephrol.２４巻（３号）：４４５〜５５頁；Wangら、２０１４年、Journal  of  the  American  Society  of  Nephrology.、DOI:10.1681/asn.2013060665）。ＲＮＬＳシグナル伝達が、ストレスに曝露された膵管腺癌細胞（ＰＤＡＣＣ）に生存利点をもたらしたか探索するために、培養ＢｘＰＣ３、Ｐａｎｃ１およびＭｉａＰａＣａ２細胞から血清を４８時間取り除き、組換えＲＮＬＳ（ｒＲＮＬＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のいずれかを培養培地にさらに７２時間添加した；総および生（トリパンブルー排除）細胞計数を決定した。ＢＳＡと比較して、ｒＲＮＬＳは、ＰＤＡＣＣ生存率を２〜５倍増加させた（図２４Ａ）。
【０３０５】
過酸化水素またはシスプラチン傷害に曝露されたＨＫ−２細胞へのｒＲＮＬＳの添加によって提供された細胞保護は、ＥＲＫ活性化に依存したことが示された（Leeら、２０１３年、J  Am  Soc  Nephrol.２４巻（３号）：４４５〜５５頁；Wangら、２０１４年、Journal  of  the  American  Society  of  Nephrology.、DOI:10.1681/asn.2013060665）。図２４Ｂに示す結果は、ＭＡＰＫキナーゼＭＥＫ１の阻害剤であるＵ０１２６による前処置が、ｒＲＮＬＳの保護効果を抑止したため、ｒＲＮＬＳが、ＥＲＫ依存性様式でＰＤＡＣＣ生存も改善することを示す。
【０３０６】
ｓｉＲＮＡを使用してＰＭＣＡ４ｂ発現を特異的に下方調節することにより、膵がんにおけるＲＮＬＳ依存性シグナル伝達におけるＰＭＣＡ４ｂの役割に関する証拠を得た。対照研究において、非標的化ｓｉＲＮＡは、ＰＭＣＡ４ｂ遺伝子発現にもＲＮＬＳ媒介性ＥＲＫリン酸化にも影響を与えなかった（図２４Ｃ）。対照的に、ＰＭＣＡ４ｂ標的化ｓｉＲＮＡは、遺伝子発現を９０％を超えて減少させ、ＲＮＬＳ依存性ＥＲＫリン酸化をほぼ７０％低下させた（図２４Ｃ）。ＰＭＣＡ４ｂ阻害は、ＲＮＬＳ媒介性ＳＴＡＴ３リン酸化に識別可能な効果がなく、追加のＲＮＬＳ受容体（複数可）の存在を示唆する。
【０３０７】
ｒＲＮＬＳの存在下において観察されるＰＤＡＣ細胞数増加は、細胞死を予防するおよび／または細胞増殖を増加させるＲＮＬＳシグナル伝達と一貫する。蛍光標識細胞分取（ＦＡＣＳ）解析によって細胞周期に対するＲＮＬＳの効果を試験して、ＰＤＡＣＣ生存度の見かけの増加が、細胞増殖増加によるものであるか、または細胞死の速度の減少によるものであるかを決定した。図２４Ｄに示す通り、ＢＳＡによる処置と比較して、ｒＲＮＬＳは、細胞周期進行に効果がなく、ＲＮＬＳが、増殖プログラムに影響を与えないが、むしろ、細胞死を予防し、生存因子として機能することを示す。
【０３０８】
ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害剤は、膵がん成長を遮断する
膵がん細胞におけるＲＮＬＳ発現およびシグナル伝達阻害の機能的帰結を決定するために、ｓｉＲＮＡによるＲＮＬＳノックダウンによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞生存度に対するＲＮＬＳ発現減少の効果を評価した。この処置は、ＰＤＡＣＣ株Ｐａｎｃ１およびＭｉａＰａＣａ２の生存度を著しく低下させた（図２５Ａおよび３１）。ＲＮＬＳペプチドＲＰ−２２０は、ｒＲＮＬＳの保護効果およびシグナル伝達特性を模倣するため、これが、細胞外ＲＮＬＳに対する受容体の決定的な領域と相互作用する可能性が高く、これに対して生成された抗体が阻害性であり得ると判断された。ＲＰ−２２０に対してウサギにおいて生成されたモノクローナル抗体のパネルから、２種のクローン、ｍ２８−ＲＮＬＳ、ｍ３７−ＲＮＬＳを、それらの高い結合親和性（それぞれ０．３１６および２．６７ｎＭのＫＤ）に基づき選択した。ＰＤＡＣＣ成長に対するｍ２８−ＲＮＬＳ、ｍ３７−ＲＮＬＳおよび市販のポリクローナル（ＲＰ−２２０の部分的配列に対する）の阻害性効果は、図２５Ｂおよび２５Ｃにおいて描写される代表例によって示されている。培養細胞におけるこれらの研究は、ＲＮＬＳが、自己分泌／パラ分泌経路を介して作用して、ＰＤＡＣＣ成長を刺激することができることを示唆する。
【０３０９】
ＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ｉｎ  ｖｉｖｏで腫瘍成長に影響を与えたかどうかを決定するために、ｓｈＲＮＡを使用して、２種の安定にトランスフェクトされたＰａｎｃ１細胞株を生成した：一方は、非標的化ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−対照）を含有し、もう一方は、ＲＮＬＳ標的化ｓｈＲＮＡ（ｓｈ−ＲＮＬＳ）を含む。ｓｈ−ＲＮＬＳ細胞におけるＲＮＬＳ発現は、ｑＰＣＲによって評価された場合、９０％を超えて減少された（図３１）。驚いたことに、ＲＮＬＳ標的化ｓｈＲＮＡによるＲＮＬＳ発現の阻害は、その受容体ＰＭＣＡ４ｂの発現の著しい低下をもたらし、ＲＮＬＳおよびＰＭＣＡ４ｂ発現が同時調節されることを示唆する（図３２）。トランスフェクトされた細胞を胸腺欠損ヌードマウスに皮下注射し、３０日間の期間にわたって腫瘍サイズを評価した。ｓｈ−ＲＮＬＳ細胞によって生成された腫瘍体積は、８日目から動物が屠殺された３０日目までｓｈ−対照細胞のものよりも大幅に小さかった（図２５Ｄ）。宿主マウスによるＲＮＬＳ産生および分泌は影響を受けなかったため、これらの結果は、ＲＮＬＳ受容体ＰＭＣＡ４ｂの随伴性阻害のため、ｓｈ−ＲＮＬＳ腫瘍細胞が、循環ＲＮＬＳに対して無応答性であったことを示す。
【０３１０】
阻害性抗体の治療潜在能を評価するために、対照ウサギＩｇＧまたはｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかで処置した、胸腺欠損ヌードマウスにＢｘＰＣ３細胞を皮下注射し、腫瘍体積を最大３週間測定した。図２５Ｅに示す通り、ウサギＩｇＧと比較して、ｍ２８−ＲＮＬＳ処置は、腫瘍体積の大幅な減少を引き起こした。まとめると、培養ＰＤＡＣＣ細胞におけるおよびＰＤＡＣＣのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおけるこれらの研究は、ＲＮＬＳ経路が、膵がん成長をモジュレートし、治療標的として機能し得ることの説得力のある証拠を提供する。
【０３１１】
ｍ２８−ＲＮＬＳによる腫瘍細胞におけるアポトーシスおよび細胞周期停止の誘導
ＲＮＬＳレベルを低下させるために、ウサギＩｇＧまたはｍ２８−ＲＮＬＳのいずれかで処置したマウス由来のＢｘＰＣ３異種移植腫瘍の切片は、抗体処置腫瘍におけるアポトーシス（ＴＵＮＥＬ染色）のほぼ２倍増加を明らかにした（図２６Ａ）：ｍ２８−ＲＮＬＳ  対  ＩｇＧ；２８．４±３．３陽性細胞／高倍率視野  対  ＩｇＧ−１４．８±２．３、ｎ＝１４、ｐ＝０．００２。培養中のＰａｎｃ１細胞のＦＡＣＳ解析は、ｍ２８−ＲＮＬＳがアポトーシスを引き起こしたことを確認した（図２６Ｂおよび３３）。ｍ２８−ＲＮＬＳ抗体による処置は、処置後１日目から始まるｐ３８  ＭＡＰＫの持続したリン酸化を引き起こした（図２６Ｃ）。
【０３１２】
ＢｘＰＣ３腫瘍のｍ２８−ＲＮＬＳ処置はまた、細胞増殖マーカーＫｉ６７の発現の２．５分の１への減少（ｍ２８−ＲＮＬＳ  対  ＩｇＧ：ＩｇＧ、１３７．１±１４．９  対  ３４０．２±１１．９陽性細胞／高倍率視野、ｎ＝１４、ｐ＝１．４×１０−８）（図２６Ｄ、上パネル）、および細胞周期調節因子ｐ２１発現の発現のほぼ４倍の増加をもたらした（ｍ２８−ＲＮＬＳ  対  ＩｇＧ：ＩｇＧ、１７８．１±１１．４  対  ４２．２±４．７．６陽性細胞／高倍率視野、ｎ＝１４、ｐ＝１．６×１０−１０）（図２６Ｄ、下パネル）。Ｐａｎｃ１細胞のＦＡＣＳ解析を行って、細胞周期に対するＲＮＬＳシグナル伝達阻害の効果を試験した。図２６Ｅに示すデータは、大きいプレＧ１ピークの出現によって証明される通り、ＲＮＬＳ阻害がアポトーシスを引き起こしたことを確認する。これらは、Ｇ２の著しい減少も明らかにし、ｍ２８−ＲＮＬＳによるＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、プレＧ２細胞周期停止を引き起こすことを示す。
【０３１３】
正のＲＮＬＳ−ＳＴＡＴ３フィードバックループの存在およびｍ２８−ＲＮＬＳによるその中断
ＳＴＡＴ３は、ＲＮＬＳ遺伝子のプロモーター領域に結合し、その発現を増加させる（Sonawaneら、２０１４年、Biochemistry.５３巻（４４号）：６８７８〜６８９２頁）。正のＲＮＬＳ−ＳＴＡＴ３フィードバックループは、ＲＮＬＳで処置したＨＫ−２細胞において、セリン７２７（ｐ−Ｓｅｒ７２７−ＳＴＡＴ３）およびチロシン７０５（ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３）におけるＳＴＡＴ３リン酸化が、それぞれ２および４倍増加するが、ＳＴＡＴ１は影響を受けないことの観察によって示唆される（図３４）。図２７Ａ〜Ｂに描写される通り、ＰＤＡＣＣ株Ｐａｎｃ１へのＲＮＬＳの添加は、リン酸化ＳＴＡＴ３（ｐ−Ｓｅｒ７２７−ＳＴＡＴ３およびｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３）の急速増加を引き起こした。ＲＮＬＳ−ＳＴＡＴ３フィードバックループのための追加の支持は、ｍ２８−ＲＮＬＳによるＰａｎｃ１におけるＲＮＬＳシグナル伝達の阻害が、ｐ−Ｙ７０５−ＳＴＡＴ３の長続きするおよび持続した減少をもたらすという知見によって提供される（図２７Ｃ〜Ｄ）。
【０３１４】
（実施例４：がんに対する抗レナラーゼ抗体および抗ＰＤ１抗体の間の相乗作用）
実験を行って、抗ＰＤ１薬剤に対して抵抗性である腫瘍細胞株（すなわち、ＹＵＭＭ）に対する抗ＲＮＬＳ抗体および抗ＰＤ１抗体の間の相乗作用を評価した（図３５）。抗ＰＤ１抵抗性マウスメラノーマ細胞株（ＹＵＭＭ）を、免疫応答性Ｃ５７Ｂ６マウスに生着させた。生着されたＹＵＭＭ腫瘍体積が、約１００ｍｍ３に達した後（すなわち、０日目）、図２３の矢印によって示される通り、０、７、９および１２日目に処置を投与した。図３５に示す通り、抗ＲＮＬＳ抗体（ｍ２８；１５μｇ、３０μｇまたは６０μｇ）および抗ＰＤ１抗体（１２０μｇ）の組み合わせによる処置は、抗ＲＮＬＳ抗体（６０μｇ）単独または抗ＰＤ１抗体（１２０μｇ）単独のいずれかよりも高い程度まで腫瘍成長を低下させた。
【０３１５】
実験を行って、抗ＲＮＬＳ抗体（ｍ２８）単独、抗ＰＤ１抗体単独、ならびに抗ＲＮＬＳ抗体（ｍ２８）および抗ＰＤ１抗体の組み合わせによる処置後の未分画腫瘍塊において、ｑＰＣＲによってＰＤ１およびＰＤ−Ｌ１  ｍＲＮＡ発現を測定した（図３６）。
【０３１６】
実験を行って、抗ＲＮＬＳ抗体（ｍ２８）単独、抗ＰＤ１抗体単独、ならびに抗ＲＮＬＳ抗体（ｍ２８）および抗ＰＤ１抗体の組み合わせによる処置後の未分画腫瘍塊において、ｑＰＣＲによってＣＤ８ａ  ｍＲＮＡ発現を測定した。結果は、ｍ２８が、細胞傷害性Ｔ細胞を活性化することを示す（図３７）。
【０３１７】
配列
＜配列番号１−抗原ｓｅｑ１ａ；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号２−抗原ｓｅｑ１ｂ；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号３−抗原ｓｅｑ１ｃ；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号４−抗原ｓｅｑ１ｄ；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号５−抗原ｓｅｑ１ｅ；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号６−抗原ｓｅｑ１ｆ；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号７−抗原ｓｅｑ３ａ；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号８−Ｈｕレナラーゼ−１タンパク質（３７位にグルタミン酸のアミノ酸をもたらす多型）；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号９−１Ｄ−２８−４全長重鎖アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号１０−１Ｄ−２８−４全長軽鎖アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号１１−１Ｄ−２８−４重鎖ＣＤＲ１アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号１２−１Ｄ−２８−４重鎖ＣＤＲ２アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号１３−１Ｄ−２８−４重鎖ＣＤＲ３アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号１４−１Ｄ−２８−４軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号１５−１Ｄ−２８−４軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号１６−１Ｄ−２８−４軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号１７−１Ｄ−３７−１０全長重鎖アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号１８−１Ｄ−３７−１０全長軽鎖アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号１９−１Ｄ−３７−１０重鎖ＣＤＲ１アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号２０−１Ｄ−３７−１０重鎖ＣＤＲ２アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号２１−１Ｄ−３７−１０重鎖ＣＤＲ３アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号２２−１Ｄ−３７−１０軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号２３−１Ｄ−３７−１０軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号２４−１Ｄ−３７−１０軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号２５−１Ｆ−２６−１全長重鎖アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号２６−１Ｆ−２６−１全長軽鎖アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号２７−１Ｆ−２６−１重鎖ＣＤＲ１アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号２８−１Ｆ−２６−１重鎖ＣＤＲ２アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号２９−１Ｆ−２６−１重鎖ＣＤＲ３アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号３０−１Ｆ−２６−１軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号３１−１Ｆ−２６−１軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号３２−１Ｆ−２６−１軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号３３−１Ｆ−４２−７全長重鎖アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号３４−１Ｆ−４２−７全長軽鎖アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号３５−１Ｆ−４２−７重鎖ＣＤＲ１アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号３６−１Ｆ−４２−７重鎖ＣＤＲ２アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号３７−１Ｆ−４２−７重鎖ＣＤＲ３アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号３８−１Ｆ−４２−７軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号３９−１Ｆ−４２−７軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号４０−１Ｆ−４２−７軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号４１−３Ａ−５−２全長重鎖アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号４２−３Ａ−５−２全長軽鎖アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号４３−３Ａ−５−２重鎖ＣＤＲ１アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号４４−３Ａ−５−２重鎖ＣＤＲ２アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号４５−３Ａ−５−２重鎖ＣＤＲ３アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号４６−３Ａ−５−２軽鎖ＣＤＲ１アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号４７−３Ａ−５−２軽鎖ＣＤＲ２アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号４８−３Ａ−５−２軽鎖ＣＤＲ３アミノ酸；ＰＲＴ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号４９−ヒトレナラーゼ−１核酸配列（ヌクレオチド１１１位における可能な多型）；ＤＮＡ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号５０−ヒトレナラーゼ−２アミノ酸配列（３７位にグルタミン酸のアミノ酸をもたらす多型；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号５１−ヒトレナラーゼ−２核酸配列（ヌクレオチド１１１位における可能な多型）；ＤＮＡ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号５２−１Ｄ−２８−４全長重鎖核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号５３−１Ｄ−２８−４全長軽鎖核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号５４−１Ｄ−２８−４重鎖ＣＤＲ１核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号５５−１Ｄ−２８−４重鎖ＣＤＲ２核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号５６−１Ｄ−２８−４重鎖ＣＤＲ３核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号５７−１Ｄ−２８−４軽鎖ＣＤＲ１核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号５８−１Ｄ−２８−４軽鎖ＣＤＲ２核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号５９−１Ｄ−２８−４軽鎖ＣＤＲ３核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号６０−１Ｄ−３７−１０全長重鎖核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号６１−１Ｄ−３７−１０全長軽鎖核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号６２−１Ｄ−３７−１０重鎖ＣＤＲ１核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号６３−１Ｄ−３７−１０重鎖ＣＤＲ２核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号６４−１Ｄ−３７−１０重鎖ＣＤＲ３核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号６５−１Ｄ−３７−１０軽鎖ＣＤＲ１核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号６６−１Ｄ−３７−１０軽鎖ＣＤＲ２核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号６７−１Ｄ−３７−１０軽鎖ＣＤＲ３核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号６８−１Ｆ−２６−１全長重鎖核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号６９−１Ｆ−２６−１全長軽鎖核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号７０−１Ｆ−２６−１重鎖ＣＤＲ１核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号７１−１Ｆ−２６−１重鎖ＣＤＲ２核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号７２−１Ｆ−２６−１重鎖ＣＤＲ３核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号７３−１Ｆ−２６−１軽鎖ＣＤＲ１核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号７４−１Ｆ−２６−１軽鎖ＣＤＲ２核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号７５−１Ｆ−２６−１軽鎖ＣＤＲ３核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号７６−１Ｆ−４２−７全長重鎖核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号７７−１Ｆ−４２−７全長軽鎖核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号７８−１Ｆ−４２−７重鎖ＣＤＲ１核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号７９−１Ｆ−４２−７重鎖ＣＤＲ２核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号８０−１Ｆ−４２−７重鎖ＣＤＲ３核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号８１−１Ｆ−４２−７軽鎖ＣＤＲ１核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号８２−１Ｆ−４２−７軽鎖ＣＤＲ２核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号８３−１Ｆ−４２−７軽鎖ＣＤＲ３核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号８４−３Ａ−５−２全長重鎖核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号８５−３Ａ−５−２全長軽鎖核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号８６−３Ａ−５−２重鎖ＣＤＲ１核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号８７−３Ａ−５−２重鎖ＣＤＲ２核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号８８−３Ａ−５−２重鎖ＣＤＲ３核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号８９−３Ａ−５−２軽鎖ＣＤＲ１核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号９０−３Ａ−５−２軽鎖ＣＤＲ２核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号９１−３Ａ−５−２軽鎖ＣＤＲ３核酸；ＤＮＡ；Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ＞
＜配列番号９２−代替ヒトレナラーゼ−１タンパク質（３７位にアスパラギン酸のアミノ酸をもたらす多型；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号９３−代替ヒトレナラーゼ−１核酸配列（注記：ヌクレオチド１１１位における可能な多型；ＤＮＡ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号９４−代替ヒトレナラーゼ−２アミノ酸配列（３７位にアスパラギン酸のアミノ酸をもたらす多型；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号９５−代替ヒトレナラーゼ−２核酸配列（注記：ヌクレオチド１１１位における可能な多型；ＤＮＡ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号９６−Ｒｅｎ−７ペプチド；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号９７−Ｒｐ−２２４；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号９８−ＲＰ−２２０；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号９９−ＲＰ−Ｈ２２０；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号１００−Ｒｐ−Ｓｃｒ２２０；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
＜配列番号１０１−抗原ｓｅｑ３ｂ；ＰＲＴ；Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ＞
【０３１８】
本明細書に引用されているありとあらゆる特許、特許出願および刊行物の開示は、本明細書より、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。
【０３１９】
具体的な実施形態を参照しつつ本発明を開示してきたが、当業者であれば、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、本発明の他の実施形態および変化形を考案することができることが明らかである。添付の特許請求の範囲は、斯かる実施形態および均等な変化形の全てを含むものと解釈されることが意図される。
【図１】
2020510681.tif 000006
【図２】
2020510681.tif 000007
【図３】
2020510681.tif 000008
【図４】
2020510681.tif 000009
【図５Ａ】
2020510681.tif 000010
【図５Ｂ】
2020510681.tif 000011
【図５Ｃ−１】
2020510681.tif 000012
【図５Ｃ−２】
2020510681.tif 000013
【図５Ｄ】
2020510681.tif 000014
【図５Ｅ−１】
2020510681.tif 000015
【図５Ｅ−２】
2020510681.tif 000016
【図５Ｆ】
2020510681.tif 000017
【図５Ｇ−１】
2020510681.tif 000018
【図５Ｇ−２】
2020510681.tif 000019
【図５Ｈ】
2020510681.tif 000020
【図５Ｉ−１】
2020510681.tif 000021
【図５Ｉ−２】
2020510681.tif 000022
【図５Ｊ】
2020510681.tif 000023
【図６】
2020510681.tif 000024
【図７】
2020510681.tif 000025
【図８】
2020510681.tif 000026
【図９】
2020510681.tif 000027
【図１０】
2020510681.tif 000028
【図１１】
2020510681.tif 000029
【図１２】
2020510681.tif 000030
【図１３】
2020510681.tif 000031
【図１４】
2020510681.tif 000032
【図１５】
2020510681.tif 000033
【図１６】
2020510681.tif 000034
【図１７−１】
2020510681.tif 000035
【図１７−２】
2020510681.tif 000036
【図１７−３】
2020510681.tif 000037
【図１８】
2020510681.tif 000038
【図１９−１】
2020510681.tif 000039
【図１９−２】
2020510681.tif 000040
【図２０Ａ】
2020510681.tif 000041
【図２０Ｂ】
2020510681.tif 000042
【図２１−１】
2020510681.tif 000043
【図２１−２】
2020510681.tif 000044
【図２１−３】
2020510681.tif 000045
【図２１−４】
2020510681.tif 000046
【図２２−１】
2020510681.tif 000047
【図２２−２】
2020510681.tif 000048
【図２３−１】
2020510681.tif 000049
【図２３−２】
2020510681.tif 000050
【図２３−３】
2020510681.tif 000051
【図２３−４】
2020510681.tif 000052
【図２４−１】
2020510681.tif 000053
【図２４−２】
2020510681.tif 000054
【図２４−３】
2020510681.tif 000055
【図２５−１】
2020510681.tif 000056
【図２５−２】
2020510681.tif 000057
【図２５−３】
2020510681.tif 000058
【図２５−４】
2020510681.tif 000059
【図２６−１】
2020510681.tif 000060
【図２６−２】
2020510681.tif 000061
【図２６−３】
2020510681.tif 000062
【図２７−１】
2020510681.tif 000063
【図２７−２】
2020510681.tif 000064
【図２７−３】
2020510681.tif 000065
【図２８】
2020510681.tif 000066
【図２９】
2020510681.tif 000067
【図３０】
2020510681.tif 000068
【図３１】
2020510681.tif 000069
【図３２】
2020510681.tif 000070
【図３３】
2020510681.tif 000071
【図３４】
2020510681.tif 000072
【図３５】
2020510681.tif 000073
【図３６】
2020510681.tif 000074
【図３７】
2020510681.tif 000075
【配列表】
2020510681000001.app
【国際調査報告】
2020510681.tif 000076
2020510681.tif 000077
2020510681.tif 000078
2020510681.tif 000079