(57)【要約】本発明は、Ｌ−アミノ酸酸化酵素の遺伝子、α−ケトン酸脱炭酸酵素の遺伝子、アルコール脱水素酵素、及び、ＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元する酵素の遺伝子が導入された組換え大腸菌遺伝子工学菌およびその構築方法、及び、フェニルエタノール類化合物の生物合成における応用を公開している。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
低コストでフェニルエタノール類化合物が生産できる大腸菌組換え菌であって、前記大腸菌組換え菌は、同時にそれぞれＬ−アミノ酸酸化酵素、α−ケトン酸脱炭酸酵素、アルコール脱水素酵素及びＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元する酵素という４つの酵素を発現することを特徴とする、大腸菌組換え菌。
【請求項２】
前記L-アミノ酸酸化酵素は、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓＡＴＣＣ  ２９９０６、または、Ｃｏｓｅｎｚａｅａ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓＡＴＣＣ１９６９２由来であることを特徴とする、請求項１に記載の大腸菌組換え菌。
【請求項３】
前記α−ケトン酸脱炭酸酵素は、Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓＡＴＣＣ  ２９９０６、または、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓＡＴＣＣ  １９４３５由来であることを特徴とする、請求項１に記載の大腸菌組換え菌。
【請求項４】
前記アルコール脱水素酵素は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）由来であることを特徴とする、請求項１に記載の大腸菌組換え菌。
【請求項５】
前記ＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元する酵素は、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、または、亜リン酸脱水素酵素であることを特徴とする、請求項１に記載の大腸菌組換え菌。
【請求項６】
前記ＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元する酵素は、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉＡＴＣＣ  ７６２７３由来のギ酸脱水素酵素、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ  １３９５２由来のグルコース脱水素酵素、または、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａＡＴＣＣ  ７００６８９由来の亜リン酸脱水素酵素であることを特徴とする、請求項５に記載の大腸菌組換え菌。
【請求項７】
前記大腸菌組換え菌は、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−1及びｐＥＴＤｕｅｔ−1の二重プラスミドを用いて、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−1に組み込んだL−アミノ酸酸化酵素の遺伝子、及び、α−ケトン酸脱炭酸酵素の遺伝子、ｐＥＴＤｕｅｔ−1に組み込んだアルコール脱水素酵素の遺伝子、及び、ＮＡＤ（Ｐ）を還元する酵素の遺伝子という４つの酵素をコードする遺伝子を共発現していることを特徴とする、請求項１に記載の大腸菌組換え菌。
【請求項８】
前記大腸菌組換え菌は、２つの共発現組換えプラスミドを宿主Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｂ２１に形質転換して得られたことを特徴とする、請求項７に記載の大腸菌組換え菌。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか１項に記載の大腸菌組換え菌を利用することを特徴とする、フェニルエタノール類化合物を生産する方法。
【請求項１０】
前記フェニルエタノール類化合物は、２−フェニルエタノール、チロソール、ヒドロキシチロソール中のいずれか１つであることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記フェニルエタノール類化合物の生産用の基質は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ドーパ中の、いずれか１つまたは複数であることを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記フェニルエタノール類化合物は、全細胞により変換されて生産されたことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
全細胞変換生産システムにおいて、新鮮な細胞の湿重量が１０〜２００ｇ／Ｌで、基質の濃度が０．５〜２０ｇ／Ｌで、水素供与体の濃度が１〜２０ｇ／Ｌで、ｐＨが４．０〜８．０で、１５〜４０℃で０．５〜４８時間反応することを特徴とする、請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子工学菌（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａ）に関し、生物工学技術分野に属する。
【背景技術】
【０００２】
フェニルエタノール類化合物（Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｉｄｓ）には、主に３つの構造が類似する類縁化合物、すなわち、２−フェニルエタノール（２−Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌ、β−Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌ）、チロソール（p−ヒドロキシフェニルエタノール、Ｔｙｒｏｓｏｌ、４−ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌ、２−（４−Ｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈａｎｏｌ）、ヒドロキシチロソール（３、４−ジヒドロキシフェニルエタノール、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ、３、４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌ、２−（３、４−Ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｅｔｈａｎｏｌ）があり、いずれもＬ−α−芳香族アミノ酸誘導体である。２−フェニルアルコールは、淡くて繊細なバラ香りを持つ芳香族アルコールであり、食品、薬品、化粧品、タバコ及び日用品に広く応用されており、全てのバラフレグランスの基本成分だけでなく、また、協力と効果増加の作用を有し、様々なフレグランス処方に必要な成分である。チロソールは、サリドロシド分子の中心で、優れた耐酸化性を有し、重要な医薬品の中間体でもあり、主に心血管系薬品のメトプロスタジル、ベタプロロール等の合成に用いられる。ヒドロキシチロソールは、最も強力な耐酸化剤の一つとして見なされ、体内のフリーラジカルを取り除き、人体の臓腑器官の健康状態を恢復し、脳の老化を防ぎ、老化を遅延することができる。
【０００３】
現在、このような化合物は、植物抽出、化学合成、微生物等の方法で生産されている。化学方法では、２−フェニルエタノール、チロソール、ヒドロキシチロソール（中国特許２００８８０００２４２６．３、２０１３１０１８３５６９．１、２００９１００９８９８３．６）を成功的に合成しているが、これらの化合物は、何れも重要な食品または保健品の原料である。従って、人々は化学合成された製品を好まれない。現在、市場にあるこれらの製品は、主に植物から抽出して得られており、例えば、中国発明特許２０１５１０６２５６２３．２には、バラの花びらから高純度の２−フェニルエタノールを抽出する方法が開示されており、中国発明特許２０１４１０７４３４０９．２には、ロディオラクレヌラタ（Rhodiola Crenulata）から高純度のチロソールを製造する方法が開示されており、中国特許２０１７１０１９５４６２．７には、オリーブの葉からヒドロキシチロソールを抽出する方法が開示されている。植物資源及びその含有量の制限を受け、これらの製品は高価であるため、微生物方法による生産が注目されている。
【０００４】
Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ドーパは、脱アミノ、脱炭酸、アルデヒド基の還元を経て、２−フェニルエタノール、チロソール、ヒドロキシチロソールを生成することができる。これらの代謝原理に基づいて、種々の微生物で生産する方法は開発されている。
【０００５】
酵母は、２−フェニルエタノールのデノボ合成の代謝経路を有し、アミノ酸の分解代謝経路により、Ｌ−フェニルアラニンを直接に２−フェニルエタノールに変換することもでき、早くも１９０７年にＥｈｒｌｉｃｈらは、酵母培地にＬ−フェニルアラニンを添加することによって、２−フェニルエタノールの収量を大幅に向上させた（Ｂｅｒ  Ｄｔｓｃｈ  Ｃｈｅｍ  Ｇｅｓ、１９０７．４０：１０２７−１０４７）。中国特許０２１３７５７５．５と、２００７１００６６８８４．０と、２００８１００７１８０７．９と、２００９１００４９１７０．８と、２００９１００４９５６５．８と、２０１３１０２４３３８４．５と、２０１４１０６６１１７４．２及び２０１６１０２５６８４５．６には、何れも酵母を用いてＬ−フェニルアラニンを変換して２−フェニルエタノールを生産する菌種、及び、方法が開示されている。Ｒｏｍａｇｎｏｌｉは、酵母の芳香族アミノ酸トランスアミナーゼを削除し、グルコースを基質として２−フェニルエタノールを生産し、収量が約３ｍＭで、同時に少量のチロソールが生産できることを開発した（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  Ａｒｏ８  Ｇｅｎｅ、Ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ａｎ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ、Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  Ｇｌｕｃｏｓｅ、Ｙｅａｓｔ、２０１５、３２（１）：２９−４５）。酵母は成長が遅く、且つ、変換過程で一部のＬ−フェニルアラニンを消耗するため、２−フェニルエタノールの収率が低く、コストが高い。
【０００６】
他に、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）菌（Ｄｅ−Ｎｏｖｏ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ２−Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｌ  ｂｙ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  Ｓｐ  Ｃｇｍｃｃ  ５０８７．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１４、１４）を採用、または、Antrodia Camphorataの深層発酵の技術を採用して２−フェニルエタノールを製造する方法（中国特許２０１４１００４１２０９．２）もあるが、何れも酵母に比べて他の効率はもっと低い。
【０００７】
大腸菌は成長速度が速くて、遺伝子工学菌の好ましい選択である。中国特許２０１２１０２７６４９１．３には、Ｌ−フェニルアラニン高収量大腸菌で、フェニルピルビン酸デカルボキシラーゼ及びアルコール脱水素酵素を過剰発現することにより、２−フェニルエタノールの高収量を実現しているが、過剰発現する２つの酵素は、グルコースからのデノボ合成により成長する大腸菌の代謝を乱すため、２−フェニルエタノールの収量は１３０ｍｇ／Ｌにしか達していない。中国特許２０１５１０６５００２８．４では、大腸菌において、４つの酵素、夫々、芳香族アミノ酸アミノ基転移酵素、及び、外因性のフェニルピルビン酸脱炭酸酵素、フェニルエタノール脱水素酵素、グルタミン酸脱水素酵素を共発現することにより、全細胞がＬ−フェニルアラニンを転化し２−フェニルエタノールを生産することが開示されている。しかし、菌体内のα−ケトグルタル酸は濃度が低いため、充分なアンモニア受容体を提供することが難しい。転化システムにおいて、α−ケトグルタル酸を添加する場合、最高の収量を得ることができ、グルタミン酸を添加しても比較的に収量を大きく向上させることができるが、明らかに、ほかの化合物の添加は転化コストを増加させると共に、転化及び純化操作の複雑性も向上させる。中国特許２０１６１０４６４２５６．７には、無細胞の生物合成方法が開示されており、単独に発現されるアミノ基転移酵素、フェニルピルビン酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素は、共に固定されるか、または、溶液体積の中でＬ−フェニルアラニンを転化し２−フェニルエタノールを生産することが開示されている。開示されている文献から当該システムには、充分なアンモニア受容体及びＮＡＤＨが欠けていることが分かって、よって、当該過程では生産を実現することが難しい。中国特許２０１７１０２５６９００．６には、それぞれ、フェニルアラニン脱水素酵素、２−ケト酸脱炭酸酵素及びアルコール脱水素酵素を発現する３種類の大腸菌湿菌体を混合し、補酵素ＴＰＰ及びＮＡＤの添加し、温度及びｐＨを制御し、Ｌ−フェニルアラニンの転化に用いることが開示されている。しかし、当該方法において、ＮＡＤとＴＰＰは高価で、所定の時間反応した後、分解して失効すると共に、３種類の酵素は夫々培養して得る必要があり、反応コストは大幅に増加し、単独の細胞もＮＡＤの細胞の間での往来、補酵素の再生に影響を及ぼすため、当該転化反応は継続しにくい。
【０００８】
中国特許２０１３１０１３３２３８．７には、大腸菌において、サッカロミセス・セレビシエ由来の４−ヒドロキシフェニル基脱炭酸酵素を過剰発現し、且つ、フェニルアセトアルデヒド脱水素酵素の遺伝子をノックアウトすることによって、チロシンまたはグルコースからチロソールを生産する方法が開示されている。しかし、チロシンを基質とする場合、当該菌には有効的な脱アミノシステムが欠けており、グルコースでデノボ合成する場合、チロソールは菌体に対して毒性があり、菌体の成長及び生成物合成に影響を及ぼすため、当該菌ではチロソールの有効的な生産を実現することが難しい。２０１５１０２４２６２６．８には、大腸菌において、大腸菌由来のモノオキシゲナーゼ遺伝子クラスターＨｐａＢＣを過剰発現させ、グルコースでヒドロキシチロソールをデノボ合成することが開示されている。当該案の主な欠点は、ヒドロキシチロソールが菌体に対して毒性があり、ＨｐａＢＣの発現量が比較的に低いため、ヒドロキシチロソールの生産効率を向上させること難しい。中国発明特許２０１７１００９１９９９．９には、サッカロミセス・セレビシエ由来のピルビン酸脱炭酸酵素及び芳香アミノ酸アミノオキシ転移酵素を過剰発現させる大腸菌、且つ、当該菌の全細胞によりＬ−チロシンに転化しチロソールを生産することが開示されている。明らかに、当該菌にはアミノ基受容体と良好なアルデヒド還元システムが不足しているため、生産効率が比較的に低い。Ｃｈｕｎｇらは、大腸菌において、植物由来の芳香アルデヒド合成酵素（ａｒｏｍａｔｉｃ  ａｌｄｅｈｙｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅｓ）を過剰発現させることによって、ワンステップでＬ−チロシンをｐ−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドに変化させ、再び大腸菌内の還元システムによりチロソールを生成し、また、ＨｐａＢＣを過剰発現させることによって、ヒドロキシチロソールを実現している。しかし、植物遺伝子の大腸菌内における低発現効率は、全細胞の転化効果に影響を及ぼしている（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｒｅｅ  Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｉｄｓ、Ｔｙｒｏｓｏｌ、Ｈｙｄｒｏｘｙｔｙｒｏｓｏｌ、ａｎｄ  Ｓａｌｉｄｒｏｓｉｄｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１７．）。
【０００９】
現在、多酵素連鎖の全細胞が簡単な前駆体を触媒することによって、高付加価値の生成物を生成することは、すでに広く応用されており（Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  Ｂｉｏｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｃａｓｃａｄｅｓ：Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｍｕｌｔｉ−Ｅｎｚｙｍｅ  Ｐａｔｈｗａｙｓ、ＡＣＳ  Ｃａｔａｌ．、２０１７、７（１）、７１０−７２４）、全細胞は安価の基質に対して高効率の転化を実現しており、グルコースでのデノボ合成に比べてより経済的で有効である場合がある。
【００１０】
現在の様々な方法の欠点に基づいて、本発明では、多酵素を共発現する大腸菌を構築し、芳香族Ｌ−α−アミノ酸に対する全細胞の触媒転化、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ドーパをそれぞれ触媒し、２−フェニルエタノール、チロソール、ヒドロキシチロソールを生成することを実現した。
【発明の概要】
【００１１】
現在の様々な方法の欠点に基づいて、本発明では、低コストでフェニルエタノール類（Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｉｄｓ）化合物を生産できる大腸菌組換え菌を提供している。同時に、本発明では、当該菌柱の構築及び応用に関する技術課題を解決しようとする。
【００１２】
本発明の第１の目的は、低コストでフェニルエタノール類（Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｉｄｓ）化合物を生産できる大腸菌組み換え菌を提供し、前記大腸菌組み換え菌は同時に４種の酵素、それぞれ、Ｌ−アミノ酸酸化酵素、α−ケトン酸脱炭酸酵素、アルコール脱水素酵素及びＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元する酵素を発現している。
【００１３】
１つの実施形態において、前記Ｌ−アミノ酸酸化酵素は、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）  ＡＴＣＣ  ２９９０６、または、Ｃｏｓｅｎｚａｅａ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓＡＴＣＣ  １９６９２由来のものである。
【００１４】
１つの実施形態において、前記Ｌ−アミノ酸酸化酵素のアミノ酸配列はＮＣＢＩのアクセッション番号がＷＰ＿００４２４４２２４．１、ＯＡＴ３０９２５．１の配列である。
【００１５】
１つの実施形態において、前記Ｌ−アミノ酸酸化酵素のヌクレオチド配列はＮＣＢＩのアクセッション番号がＮＺ＿ＧＧ６６８５７６ＲＥＧＩＯＮ：１３５０３９０..１３５１８０５、ＬＸＥＮ０１００００６６ＲＥＧＩＯＮ：２０５６３..２１９６３の配列である。
【００１６】
１つの実施形態において、前記α−ケトン酸脱炭酸酵素は、プロテウス・ミラビリスＡＴＣＣ２９９０６、または、ラクトコッカス・ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）ＡＴＣＣ１９４３５由来のものである。
【００１７】
１つの実施形態において、前記α−ケトン酸脱炭酸酵素のアミノ酸配列はＮＣＢＩのアクセッション番号がＷＰ＿００４２４７０６７．１、ＷＰ＿０２５０１６８１６．１の配列である。
【００１８】
１つの実施形態において、前記α−ケトン酸脱炭酸酵素のヌクレオチド配列はＮＣＢＩのアクセッション番号がＮＺ＿ＧＧ６６８５９３ＲＥＧＩＯＮ：５０４６３..５２１１２、ＮＺ＿ＬＫＬＣ０１０００００８ＲＥＧＩＯＮ：２０８３２７..２０９９７３の配列である。
【００１９】
１つの実施形態において、前記アルコール脱水素酵素は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）由来のものである。
【００２０】
１つの実施形態において、前記アルコール脱水素酵素のアミノ酸配列はＮＣＢＩのアクセッション番号がＷＰ＿００１３１８４６０．１、ＷＰ＿０００６９２７５４．１の配列である。
【００２１】
１つの実施形態において、前記アルコール脱水素酵素のヌクレオチド配列はＮＣＢＩのアクセッション番号がＮＣ＿０１２８９２ＲＥＧＩＯＮ：４４０６７７７..４４０７７９６、ＮＣ＿０１２８９２ＲＥＧＩＯＮ：３１２５０６..３１３５５５の配列である。
【００２２】
１つの実施形態において、前記ＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元する酵素は、ギ酸脱水素酵素、グルコース脱水素酵素、または、亜リン酸脱水素酵素である。
【００２３】
１つの実施形態において、前記ＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元する酵素は、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉＡＴＣＣ７６２７３由来のギ酸脱水素酵素、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ１３９５２由来のグルコース脱水素酵素、または、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａＡＴＣＣ７００６８９由来の亜リン酸脱水素酵素である。
【００２４】
１つの実施形態において、前記ＮＡＤ（Ｐ）を還元する酵素のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのアクセッション番号がＡＯＡ６３５４４．１、ＷＰ＿０１３３５１０２０．１、または、ＷＰ＿００３１１８４２９．１の配列である。
【００２５】
１つの実施形態において、ＮＡＤ（Ｐ）を還元する酵素のヌクレオチド配列はＮＣＢＩのアクセッション番号がＣＰ０１４７１０  ＲＥＧＩＯＮ：１８３６９９３..１８３８０９０、ＮＺ＿ＣＰ００９７４８ＲＥＧＩＯＮ：３８６１５４..３８６９３、ＮＺ＿ＦＮＣＯ０１００００２７ＲＥＧＩＯＮ：２９４７５..３０４８５の配列である。
【００２６】
１つの実施形態において、前記大腸菌組換え菌は、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−1及びｐＥＴＤｕｅｔ−1の二重プラスミドを採用して、４つの酵素の遺伝子、すなわち、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−1に搭載しているL−アミノ酸酸化酵素の遺伝子、及び、α−ケトン酸脱炭酸酵素の遺伝子、ｐＥＴＤｕｅｔ−1に搭載しているアルコール脱水素酵素の遺伝子、及び、ＮＡＤ（Ｐ）を還元する酵素の遺伝子を共発現している。
【００２７】
１つの実施形態において、前記大腸菌組換え菌は、２つの共発現の組換えプラスミドを宿主大腸菌 Ｂ２１に形質転換して得られたものである。
【００２８】
本発明の第２の目的は、フェニルエタノール類（Ｐｈｅｎｙｌｅｔｈａｎｏｉｄｓ）化合物の生産方法を提供することであり、前記方法は本発明の大腸菌組換え菌を使用している。
【００２９】
１つの実施形態において、前記フェニルエタノール類化合物は、２−フェニルエタノール、チロソール、ヒドロキシチロソール中のいずれか１つである。
【００３０】
１つの実施形態において、前記フェニルエタノール類化合物生産用の基質は、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ドーパ中のいずれか１つまたは複数である。
【００３１】
１つの実施形態において、前記フェニルエタノール類化合物の生産は、全細胞の変換生産である。
【００３２】
１つの実施形態において、前記全細胞の変換生産システムは、新鮮な細胞の湿重量が１０〜２００ｇ／Ｌで、基質の濃度が０．５〜２０ｇ／Ｌで、水素供与体の濃度が１〜２０ｇ／Ｌで、ｐＨが４．０〜８．０で、１５〜４０℃で０．５〜４８時間反応させる。
【００３３】
１つの実施形態において、前記細胞の獲得方法では、組換え大腸菌をＬＢ発酵培地に接種し、細胞ＯＤ６００が０．６〜０．８に達した後、ＩＰＴＧを添加して誘導発現し、誘導発現が終了した後、遠心分離し細胞を収集する。
【００３４】
１つの実施形態において、構築された３つの酵素が共発現するプラスミドにグルコース脱水素酵素が含まれている場合、水素供与体はグルコースであり、構築された３つの酵素が共発現するプラスミドにギ酸脱水素酵素が含まれている場合、水素供与体はギ酸ナトリウムであり、構築された３つの酵素が共発現するプラスミドに亜リン酸脱水素酵素が含まれている場合、水素供与体は亜リン酸である。
【００３５】
［本発明の有益効果］
本発明では、新規の４つの酵素を共発現する大腸菌エンジニアリングバクテリア（工学菌）を構築しており、当該菌は、フェニルエタノール類化合物の生産に応用できる。本発明で選択されたＬ−アミノ酸酸化酵素、α−ケトン酸脱炭酸酵素、アルコール脱水素酵素は、何れも基質の特異性が劣り、活性が強い特徴を有するため、同一株のエンジニアリングバクテリアに芳香Ｌ−α−アミノ酸を採用する場合、多種類のフェニルエタノール類生成物を生産することができ、他のアミノ酸の誘導体化アルコールの生産に用いることができる。当該生産過程は簡単で、且つ、容易に原料を得ることができるため、良好な生産化将来性を有する。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
本発明の大腸菌の機能は、主に同時に４種の酵素、すなわち、それぞれＬ−アミノ酸酸化酵素、α−ケトン酸脱炭酸酵素、アルコール脱水素酵素及びＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元する酵素を発現できることである。その原理は、エンジニアリングバクテリアの全細胞内において、Ｌ−アミノ酸酸化酵素はＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ドーパを対応するフェニルピルビン酸、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン酸、３、４−ジヒドロキシフェニルピルビン酸に酸化し、その後、α−ケトン酸脱炭酸酵素の作用を経て、フェニルアセトアルデヒド、ｐ−ヒドロキシフェニルアセトアルデヒド、３、４−ジヒドロキシフェニルアセトアルデヒドを生成し、アルコール脱水素酵素及びＮＡＤ（Ｐ）をＮＡＤ（Ｐ）Ｈに還元する酵素は、ＮＡＤ補酵素循環の再生システムを構成し、アルコール脱水素酵素でアルデヒドを還元することによって、全細胞のタンデムの４つの酵素によるワンステップ法でＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ドーパを２−フェニルエタノール、チロソール、ヒドロキシチロソールへの変換を実現することである。
【００３７】
上述の技術的な課題を解決するために、本発明では、以下の技術的な構成を採用している。
【００３８】
１．本発明に関する菌株及びプラスミド
アメリカ菌種保存センターからＡＴＣＣのプロテウス・ミラビリスＡＴＣＣ２９９０６、Ｃｏｓｅｎｚａｅａ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓＡＴＣＣ１９６９２、ラクトコッカス・ラクティスＡＴＣＣ１９４３５、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉＡＴＣＣ７６２７３、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ１３９５２、及び、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａＡＴＣＣ７００６８９を購入した。Ｎｏｖａｇｅｎ会社からｐＲＳＦＤｕｅｔ−1プラスミド、ｐＥＴＤｕｅｔ−1プラスミド、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢ２１（ＤＥ３）、ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢ２１ＤＨ５αを購入した。
【００３９】
２．酵素の選択
（１）Ｌ−アミノ酸酸化酵素の選択
Ｌ−アミノ酸酸化酵素は、細菌、真菌、哺乳動物の細胞、蛇毒、昆虫毒素及び藻類に広く存在している（Ｌ−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｏｘｉｄａｓｅ  ａｓ  ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｔ：ａ  ｄｒｅａｍ  ｔｏｏ  ｆａｒ？Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３、９７：９３２３−４１）。Ｌ−アミノ酸酸化酵素は、αアミノ基及びＣα上の水素をＦＡＤ上に転移し、ほとんどは分子酸素を利用して直接に還元型ＦＡＤを酸化し、酸化型ＦＡＤを再生すると共に、過酸化水素を生成しており、この過程において、過酸化水素酵素を添加して、過酸化水素の毒性を除去しなければならない。また、もう１種類のＬ−アミノ酸酸化酵素は、細胞膜上の電子伝達鎖に関与しており、電子は呼吸鎖を経てシトクロム酸化酵素に伝達されることにより、分子酸素が過酸化水素を生成せず、水に還元される。このような酵素類は、主にプロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｓｐ．）、プロビデンシア属（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ  ｓｐ．）、モルガネラ属（Ｍｏｒｇａｎｅｌｌａ  ｓｐ．）等の細菌に存在している（Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｂｏｕｎｄ  １−ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｆｒｏｍ  Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｖｕｌｇａｒｉｓ．Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２０１６、１９５：３０６−１５）。本発明では、２種の過酸化水素を生成しないＬ−アミノ酸酸化酵素を選択し、プロテウス・ミラビリスＡＴＣＣ２９９０６、及び、Ｃｏｓｅｎｚａｅａ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓＡＴＣＣ１９６９２からそれぞれＬ−アミノ酸酸化酵素の遺伝子ｐｍａａｏ及びｃｍａａｏをクローンしており、そのヌクレオチド配列のＮＣＢＩのアクセッション番号はＮＺ＿ＧＧ６６８５７６  ＲＥＧＩＯＮ：１３５０３９０..１３５１８０５及びＬＸＥＮ０１００００６６  ＲＥＧＩＯＮ：２０５６３..２１９６３であり、そのアミノ酸配列は、それぞれＷＰ＿００４２４４２２４．１及びＯＡＴ３０９２５．１で示しており、これらの酵素は何れも基質が広くて活性が強いという特徴を有している。
【００４０】
（２）α−ケトン酸脱炭酸酵素の選択
文献に基づいて選択された細菌由来の、芳香族ケト酸に対して強い活性を有するα−ケト酸脱炭酸酵素は、他の特許で選択された酵母または植物由来の酵素に比べて、より良く大腸菌で発現する特性を有している。本発明は、それぞれ、プロテウス・ミラビリスＡＴＣＣ２９９０６及びラクトコッカス・ラクティスＡＴＣＣ１９４３５からα−ケトン酸脱炭酸酵素の遺伝子ｐｍｋｄｃ及びｌｌｋｄｃをクローンしており、そのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのアクセッション番号がＷＰ＿００４２４７０６７．１、ＷＰ＿０２５０１６８１６．１の配列であり、そのヌクレオチド配列はＮＣＢＩのアクセッション番号がＮＺ＿ＧＧ６６８５９３  ＲＥＧＩＯＮ：５０４６３..５２１１２、ＮＺ＿ＬＫＬＣ０１０００００８  ＲＥＧＩＯＮ：２０８３２７..２０９９７３の配列である。
【００４１】
（３）アルコール脱水素酵素の選択
アルコール脱水素酵素は各種類の細菌に広く存在し、報告によると、大腸菌自体にも多種の基質が広いアルコール脱水素酵素が含まれているため（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ  ｂｙ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｓｈｉｋｉｍａｔｅ  ｐａｔｈｗａｙ、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１２  ７８（１７）、６２０３−６２１６）、直接にＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）から、２つのアルコール脱水素酵素の遺伝子ｅｃａｄｈ１及びｅｃａｄｈ２をクローンすることができる。前記アルコール脱水素酵素は、そのアミノ酸配列がＮＣＢＩのアクセッション番号ＷＰ＿００１３１８４６０．１、ＷＰ＿０００６９２７５４．１の配列であり、そのヌクレオチド配列がＮＣＢＩのアクセッション番号ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：４４０６７７７..４４０７７９６、ＮＣ＿０１２８９２  ＲＥＧＩＯＮ：３１２５０６..３１３５５５の配列であり、従って、アルコール脱水素酵素の大腸菌における過剰発現をより有利にする。
【００４２】
（４）ＮＤＡ（Ｐ）を還元する酵素の選択
生物の変換反応において、アルコール脱水素酵素はＮＡＤＨ及び／またはＮＡＤＰＨを補酵素とする必要があり、本発明では、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉＡＴＣＣ７６２７３からギ酸脱水素酵素の遺伝子ｋｐｆｄｈを得ており、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ１３９５２からグルコース脱水素酵素の遺伝子ｂｓｇｄｈを得ており、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａＡＴＣＣ７００６８９から亜リン酸脱水素酵素の遺伝子ｐａｐｄｈを得ている。そのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩのアクセッション番号がＡＯＡ６３５４４．１、ＷＰ＿０１３３５１０２０．１、または、ＷＰ＿００３１１８４２９．１の配列であり、そのヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩのアクセッション番号がＣＰ０１４７１０  ＲＥＧＩＯＮ：１８３６９９３..１８３８０９０、ＮＺ＿ＣＰ００９７４８  ＲＥＧＩＯＮ：３８６１５４..３８６９３、ＮＺ＿ＦＮＣＯ０１００００２７  ＲＥＧＩＯＮ：２９４７５..３０４８５の配列である。
【００４３】
３．４つの酵素の共発現システムの構築
上記で選択されたＬ−アミノ酸酸化酵素、α−ケトン酸脱炭酸酵素、アルコール脱水素酵素、ＮＤＡ（Ｐ）を還元する酵素中の、各々の種類で何れか１つの酵素を選択し、４つの酵素を組合せて共発現させる。現在、大腸菌の多遺伝子の共発現には、様々な方法（大腸菌多遺伝子の共発現策略、中国生物工学雑誌、２０１２、３２（４）：１１７−１２２）があり、本発明では、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１及びｐＥＴＤｕｅｔ−１の二重プラスミドを採用してｐＲＳＦＤｕｅｔ−1に組み込んだL−アミノ酸酸化酵素の遺伝子、及び、α−ケトン酸脱炭酸酵素の遺伝子、ｐＥＴＤｕｅｔ−1に組み込んだアルコール脱水素酵素の遺伝子、及びＮＡＤ（Ｐ）を還元する酵素の遺伝子という４つの遺伝子を共発現させている。
共発現組換えプラスミドを得た後、２種のプラスミドを大腸菌Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉＢ２１に形質転換し、アンピシリン（Ａｍｐｉｃｌｌｉｎ）及びカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）添加シャーレによるスクリーニングにより陽性形質転換体（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔ）を得、即ち、組換え大腸菌を得る。
【００４４】
４．全細胞によるフェニルエタノール類の変換
細胞の準備：典型的な組換え大腸菌の培養、及び、誘導発現の方法に応じて、組換え大腸菌を体積比で２％の量でＬＢ発酵培地（ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母粉５ｇ／Ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ）に導入し、細胞のＯＤ６００が０．６〜０．８に達した後、最後の濃度が０．４ｍＭになるようにＩＰＴＧを添加し、２０℃で８ｈ誘導発現の培養を行う。誘導発現が終了した後、２０℃、８０００ｒｐｍ、２０分、遠心分離し細胞を収集する。
全細胞の変換システム：異なる基質の溶解性に応じて、基質の濃度を０．５〜２０ｇ／Ｌに制御し、且つ、構築された異なるプラスミドの性質に応じて、濃度が１〜２０ｇ／Ｌになるように水素供与体を添加し、ｐＨは４．０〜８．０の間に調整し、新鮮な湿菌体の量は１０〜２００ｇ／Ｌである。その後、１５〜４０℃で、０．５〜４８時間変換を行う。変換が終了した後、液体クロマトグラフィーにより収量と光学活性を測定する。構築された４つの酵素の共発現プラスミドに、グルコース脱水素酵素が含まれている場合、水素供与体はグルコースである。構築された４つの酵素の共発現プラスミドに、ギ酸脱水素酵素が含まれている場合、水素供与体はギ酸ナトリウムである。構築された４つの酵素の共発現プラスミドに、亜リン酸脱水素酵素が含まれている場合、水素供与体は亜リン酸である。
全細胞の変換システムにおける基質は以下、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ドーパ中の１つである。
これらの基質は、相応する全細胞の変換を経て、対応的に２−フェニルエタノール、チロソール、ヒドロキシチロソールを生成することができる。
【００４５】
５．サンプルの検出分析
定量分析：変換液はＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｓｅｒｉｅｓ２００高速液体クロマトグラフを用いて検出分析し、クロマトグラフ条件は、移動相がメタノール−０．１％ギ酸水（４０：６０）であり、漢邦ＭｅｇｒｅｓＣ１８クロマトカラム（４．６×２５０ｍｍ、５μｍ）を採用し、流速が１ｍｌ／ｍｉｎ、カラム温度が３０℃、注入量が２０μｌ、検出波長が２１０ｎｍである。
【００４６】
本発明が解決しようとする技術的な課題、技術的な構成及び有益効果をより明確に分かるために、以下、実施例により本発明に対して詳細に説明する。なお、ここで説明する具体的な実施例は、本発明の解釈のみに用いられ、決して本発明を限定しない。
【００４７】
実施例１
４つの遺伝子の共発現システムの構築。
（１）プライマー設計
ＰＣＲ増幅に用いられるプライマーを設計する。
（２）ＰＣＲ増幅
メーカーが提供した取扱説明書に従って、Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）を用いて対数増殖期にある菌株のゲノムＤＮＡを抽出し、表１のプライマーを用いて、各々に対応する菌株からＰＣＲ増幅を行う。増幅システムは、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲＨＳ  ＤＮＡ  ポリメラーゼ（２．５５Ｕ／μＬ）０．５μＬ、１０×Ｐｒｉｍｅ  ＳＴＡＲ  Ｂｕｆｆｅｒ  １０μＬ、ｄＮＴＰ  Ｍｉｘｔｕｒｅ（各２．５ｍＭ）４μＬ、テンプレートＤＮＡ１μＬ、上流プライマー（２０μＭ）１μＬ、下流プライマー（２０μＭ）１μＬ、５０μＬになるまでｄｄＨ２Ｏを補足する。増幅プログラムは、９４℃で１０分、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で２分、合計３０回循環し、７２℃で１０分間置く。ＰＣＲの生成物は華大に送って遺伝子配列を測定した。
後に、それぞれ、プロテウス・ミラビリスＡＴＣＣ２９９０６、Ｃｏｓｅｎｚａｅａ  ｍｙｘｏｆａｃｉｅｎｓＡＴＣＣからＬ−アミノ酸酸化酵素の遺伝子ｐｍａａｏ、ｃｍａａｏをクローンしており、プロテウス・ミラビリスＡＴＣＣ２９９０６、ラクトコッカス・ラクティスＡＴＣＣ１９４３５からそれぞれα−ケトン酸脱炭酸酵素の遺伝子ｐｍｋｄｃ、ｌｌｋｄｃを得ており、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１からアルコール脱水素酵素の遺伝子ｅｃａｄｈ１、ｅｃａｄｈ２を得ており、Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉＡＴＣＣ７６２７、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓＡＴＣＣ１３９５２、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｂｉｅｔａｎｉｐｈｉｌａ  ＡＴＣＣ  ７００６８から、それぞれＮＡＤ（Ｐ）を還元する酵素の遺伝子ｋｐｆｄｈ、ｂｓｇｄｈ、ｐａｐｄｈを得た。
（３）ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１及びｐＥＴＤｕｅｔ−１シングル遺伝子プラスミドの構築
ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１及びｐＥＴＤｕｅｔ−１ベクタープラスミド及びステップ（２）のｃｍａａｏ、ｐｍａａｏ、ｅｃａｄｈ１、ｅｃａｄｈ２のＰＣＲ生成物は、３７℃の水浴で１時間制限酵素で二重消化した。消化システムは、１０×ｃｕｔ  ｂｕｆｆｅｒ５μＬ、ＤＮＡ１０μＬ、制限酵素ＳａｃＩ及び制限酵素ＨｉｎｄIIIはそれぞれ１μＬ、無菌水３３μＬであった。
その後、酵素により消化された生成物をそれぞれ回収し、１６℃の水浴で１２〜１６時間ライゲーションさせ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１は、それぞれｃｍａａｏ、ｐｍａａｏにライゲーションし、ｐＥＴＤｕｅｔ−１は、それぞれｅｃａｄｈ−１、ｅｃａｄｈ２にライゲーションした。ライゲーションシステムは、１０×ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ２．５μＬ、ＤＮＡ断片  ８μＬ、キャリア  ＤＮＡ  ２μＬ、Ｔ４ＤＮＡ  ｌｉｇａｓｅ  １μＬ、無菌水１１．５μＬ、合計２５μＬであった。
その後、ライゲーションシステムに１００μＬのＤＨ５αコンピテント細菌を添加し、軽くブレンディングし、３０分間氷浴した。予熱した４２℃の水浴に入れ、９０秒間置いて熱ショック処理を行った。直ちに２分間の氷浴した。抗生物質を含まないＬＢ培養液１ｍＬを添加し、菌体が回復するように３７℃で１時間培養した。最後に、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１が、それぞれｃｍａａｏ、ｐｍａａｏにライゲーションされた菌体はカナマイシンを含むＬＢプレートへ均一に塗布し、ｐＥＴＤｕｅｔ−１が、それぞれｅｃａｄｈ１、ｅｃａｄｈ２にライゲーションされた菌体はアンピシリンを含むＬＢプレートへ均一に塗布した。シングルコロニーをピックアップして１２時間培養し、その後、プラスミドを抽出し、制限酵素で二重消化しその正確性を検証し、同時にＤＮＡシークエンシングを行い、その正確性を保証し、最後に正確な形質転換体を保存し、以下のプラスミド、Ｌ−アミノ酸酸化酵素の遺伝子を含むｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ、アルコール脱水素酵素の遺伝子を含むｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ１、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ２を得た。
（４）Ｌ−アミノ酸酸化酵素の遺伝子、α−ケトン酸脱炭酸酵素の遺伝子ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１共発現プラスミド、及び、アルコール脱水素酵素の遺伝子、ＮＡＤ（Ｐ）を還元する酵素の遺伝子ｐＥＴＤｕｅｔ−１共発現プラスミドの構築。
消化システムは、１０×ｃｕｔ  Ｂｕｆｆｅｒ  ５μＬ、ＤＮＡ１０μＬ、制限酵素１及び制限酵素２それぞれ１μＬ、無菌水３３μＬであった。ステップ（３）で構築された単遺伝子プラスミド、及び、ステップ（２）におけるｐｍｋｄｃ、ｌｌｋｄｃ、ｋｐｆｄｈ、ｂｓｇｄｈ、ｐａｐｄｈのＰＣＲ生成物を３７℃の水浴で１時間制限酵素で二重消化した。
各々遺伝子の制限酵素の切断位置が異なるため、以下のような２種の情況がある。
ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ、ｐｍｋｄｃ、ｌｌｋｄｃは、ＥｃｏＲＶ及びＫｐｎＩを用いて二重消化した。
ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ１、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ２、ｋｐｆｄｈ、ｂｓｇｄｈ、ｐａｐｄｈは、ＢｇｌII及びＸｈｏＩを用いて二重消化した。
その後、上述の２種情況で消化された生成物をそれぞれ回収し、１６℃の水浴で１２〜１６時間ライゲーションさせ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏは、それぞれｐｍｋｄｃ、ｌｌｋｄｃにライゲーションさせ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ１、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ２は、それぞれｋｐｆｄｈ、ｂｓｇｄｈ、ｐａｐｄｈにライゲーションさせた。ライゲーションシステムは、１０×ＤＮＡｌｉｇａｓｅ  ｂｕｆｆｅｒ２．５μＬ、ＤＮＡ断片８μＬ、キャリアＤＮＡ  ２μＬ、Ｔ４  ＤＮＡｌｉｇａｓｅ  １μＬ、無菌水１１．５μＬ、合計２５μＬであった。
その後、ライゲーションシステムに１００μＬの大腸菌ＤＨ５αコンピテント細菌を添加し、軽くブレンディングし、３０分間氷浴した。予熱した４２℃の水浴に入れ、９０秒間置いて熱ショック処理を行った。直ちに２分間氷浴した。抗生物質を含まないＬＢ培養液１ｍＬを添加し、菌体が回復するように３７℃で１時間培養した。最後に、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏが、それぞれｐｍｋｄｃ、ｌｌｋｄｃにライゲーションされた菌体はカナマイシンを含むＬＢプレート上に均一に塗布し、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ１、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ２が、それぞれｋｐｆｄｈ、ｂｓｇｄｈ、ｐａｐｄｈにライゲーションされた菌体はアンピシリンを含むＬＢプレート上に均一に塗布し、シングルコロニーをピックアップして１２時間培養し、その後、ＤＮＡシークエンシングを行い、その正確性を保証し、最後に正確な形質転換体を保存し、以下のプラスミド、すなわち、Ｌ−アミノ酸酸化酵素の遺伝子、α−ケトン酸脱炭酸酵素の遺伝子を含む、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ−ｐｍｋｄｃ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ−ｌｌｋｄｃ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ−ｐｍｋｄｃ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ−ｌｌｋｄｃと、
アルコール脱水素酵素の遺伝子、ＮＡＤ（Ｐ）を還元する酵素の遺伝子を含む、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ１−ｋｐｆｄｈ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ１−ｂｓｇｄｈ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ１−ｐａｐｄｈ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ２−ｋｐｆｄｈ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ２−ｂｓｇｄｈ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ２−ｐａｐｄｈとを得た。
（５）ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１及び、ｐＥＴＤｕｅｔ−１の二重プラスミドの４つ遺伝子の共発現システムの構築。
メーカーが提供した取扱説明書に従って、ＴａＫａＲａ  ＭｉｎｉＢＥＳＴ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ  Ｖｅｒ．４．０を用いて、ステップ（４）で得たｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ−ｐｍｋｄｃ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ−ｌｌｋｄｃ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ−ｐｍｋｄｃ、ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ−ｌｌｋｄｃプラスミドＤＮＡ１、及び、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ１−ｋｐｆｄｈ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ１−ｂｓｇｄｈ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ１−ｐａｐｄｈ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ２−ｋｐｆｄｈ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ２−ｂｓｇｄｈ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｅｃａｄｈ２−ｐａｐｄｈプラスミドＤＮＡ２を抽出し、その後、上述のプラスミドＤＮＡ１及びプラスミドＤＮＡ２をそれぞれ１μＬ取って、１００μＬのＥ. ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）コンピテント細菌を添加し、軽くブレンディングし、３０分間氷浴させた。予熱した４２℃の水浴に入れ、９０秒間置いて熱ショック処理を行う。直ちに２分間氷浴した。抗生物質を含まないＬＢ培養液１ｍＬを添加し、菌体が回復するように３７℃で１時間培養した。最後に、菌体をアンピシリンとカナマイシンを含むＬＢプレート上に均一に塗布し、シングルコロニーをピックアップして１２時間培養し、その後、さらにＰＣＲで４つの遺伝子が成功的にＥ. ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）へ形質転換されたことを検証すると共に、ＤＮＡシークエンシングを行い、その正確性を保証し、菌株を保存した。
本実施例では、最終的に以下の８株のエンジニアリングバクテリア、Ｅ. ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ−ｐｍｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｂｓｇｄｈ−ｅｃａｄｈ１）、Ｅ. ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ−ｌｌｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｂｓｇｄｈ−ｅｃａｄｈ２）、Ｅ. ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ−ｐｍｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｂｓｇｄｈ−ｅｃａｄｈ２）、Ｅ. ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ−ｐｍｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｐａｐｄｈ−ｅｃａｄｈ１）、Ｅ. ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ−ｐｍｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｋｐｆｄｈ−ｅｃａｄｈ２）、Ｅ. ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ−ｌｌｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｂｓｇｄｈ−ｅｃａｄｈ１）、Ｅ. ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ−ｌｌｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｋｐｆｄｈ−ｅｃａｄｈ２）、Ｅ. ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ−ｌｌｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｐａｐｄｈ−ｅｃａｄｈ１）を構築し、それぞれ組換え菌の番号はＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈである。
【００４８】
実施例２
実施例１で獲得した遺伝子工学菌の誘導発現。
構築された遺伝子工学菌のコロニーをピックアップして１０ｍＬのＬＢ培地（０．１ｇ／Ｌのアンピシリンを含む）に接種し、３７℃で１２時間培養し、２％の体積割合でＬＢ培地（１０００ｍＬの振動フラスコに２００ｍＬの培地を含み、０．１ｇ／Ｌのアンピシリンを含む）に接種し、３７℃で２．５時間培養し、細菌対数増殖期（ＯＤ６００が０．６〜０．８に達する）になると、濃度が０．４ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、２０℃、２００ｒｍｐ条件下で８時間培養した。誘導発現が終了した後、２０℃、８０００ｒｐｍ、２０分間遠心分離し、細胞を収集した。変換に必要な菌体量に応じて、振動フラスコの数量を増加することによって、充分な菌体を獲得することができる。
【００４９】
実施例３
実施例２に記載の誘導発現方法に応じて、実施例１で得られた番号がＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈの組換え菌は、それぞれ誘導発現が終了した後、菌体が収集され、１００ｍｌの反応体積の中で、異なる基質をそれぞれ全細胞に混合した後の変換情況を観察した。基質の最終の濃度は０．５ｇ／Ｌで、グルコース濃度は１０ｇ／Ｌで、ｐＨは８．０に調節し、重量が２０ｇ（湿重量）の新鮮な全細胞を添加し、３０℃の温度で、２４時間変換させた後、結果を検出したところ、各種類の基質の反応情況は、以下の表に示す通りである。
基質は、それぞれＬ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−ドーパで、それぞれに対応する生成物は、２−フェニルエタノール、チロソール、ヒドロキシチロソールである。
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【００５０】
実施例５
実施例２に記載の誘導発現方法に応じて、実施例１で得られたＥ． ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ−ｐｍｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｂｓｇｄｈ−ｅｃａｄｈ２）の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、１００ｍｌの反応体積の中で、Ｌ−フェニルアラニンの濃度は２０ｇ／Ｌで、グルコースの濃度は２０ｇ／Ｌで、ｐＨは８．０に調節し、重量が２０ｇ（湿重量）の新鮮な全細胞を添加し、２０℃の温度で、４８時間変化した後、結果を検出したところ、濃度が１８ｇ／Ｌの２−フェニルエタノールが生成された。
【００５１】
実施例６
実施例２に記載の誘導発現方法に応じて、実施例１で得られたＥ． ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ−ｐｍｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｐａｐｄｈ−ｅｃａｄｈ１）の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、１００ｍｌの反応体積の中で、Ｌ−ドーパの濃度は１ｇ／Ｌで、亜リン酸の濃度は１ｇ／Ｌで、ｐＨは４．０に調節し、重量が１０ｇ（湿重量）の新鮮な全細胞を添加し、３５℃の温度で、０．５時間変換した後、結果を検出したところ、濃度が５２ｍｇ／Ｌのヒドロキシチロソールが生成された。
【００５２】
実施例７
実施例２に記載の誘導発現方法に応じて、実施例１で得られたＥ． ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ−ｐｍｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｋｐｆｄｈ−ｅｃａｄｈ２）の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、１００ｍｌの反応体積の中で、Ｌ−チロシンの濃度は０．５ｇ／Ｌで、ギ酸ナトリウムの濃度は２０ｇ／Ｌで、ｐＨは６．０に調節し、重量が１ｇ（湿重量）の新鮮な全細胞を添加し、３０℃の温度で、１２時間変換した後、結果を検出したところ、濃度が１０４ｍｇ／Ｌのチロソールが生成された。
【００５３】
実施例８
実施例２に記載の誘導発現方法に応じて、実施例１で得られたＥ． ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ−ｐｍｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｋｐｆｄｈ−ｅｃａｄｈ２）の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、１００ｍｌの反応体積の中で、Ｌ−ロイシンの濃度は０．５ｇ／Ｌで、ギ酸ナトリウムの濃度は１ｇ／Ｌで、ｐＨは７．０に調節し、重量が２０ｇ（湿重量）の新鮮な全細胞を添加し、３０℃の温度で、４８時間変換した後、結果を検出したところ、濃度が３２０ｍｇ／Ｌのイソアミルアルコールが生成された。
【００５４】
実施例９
実施例２に記載の誘導発現方法に応じて、実施例１で得られたＥ． ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ−ｌｌｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｂｓｇｄｈ−ｅｃａｄｈ１）の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、１００ｍｌの反応体積の中で、Ｌ−フェニルアラニンの濃度は０．５ｇ／Ｌで、グルコースの濃度は１ｇ／Ｌで、ｐＨは８．０に調節し、重量が１ｇ（湿重量）の新鮮な全細胞を添加し、４０℃の温度で、３６時間変換した後、結果を検出したところ、濃度が１５５ｍｇ／Ｌの２−フェニルエタノールが生成された。
【００５５】
実施例１０
実施例２に記載の誘導発現方法に応じて、実施例１で得られたＥ． ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｃｍａａｏ−ｌｌｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｋｐｆｄｈ−ｅｃａｄｈ２）の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、１００ｍｌの反応体積の中で、Ｌ−チロシンの濃度で０．５ｇ／Ｌ、ギ酸ナトリウムの濃度は２０ｇ／Ｌで、ｐＨは５．０に調節し、重量が１５ｇ（湿重量）の新鮮な全細胞を添加し、３０℃の温度で、４８時間変換した後、結果を検出したところ、濃度が３９８ｍｇ／Ｌのチロソールが生成された。
【００５６】
実施例１１
実施例２に記載の誘導発現方法に応じて、実施例１で得られたＥ． ｃｏｌｉＢＬ２１（ｐＲＳＦＤｕｅｔ−ｐｍａａｏ−ｌｌｋｄｃ、ｐＥＴＤｕｅｔ−ｐａｐｄｈ−ｅｃａｄｈ１）の誘導発現が終了した後、菌体を収集し、１００ｍｌの反応体積の中で、Ｌ−チロシンの濃度は０．５ｇ／Ｌで、亜リン酸の濃度は５ｇ／Ｌで、ｐＨは７．０に調節し、重量が５ｇ（湿重量）の新鮮な全細胞を添加し、２５℃の温度で、６時間変換した後、結果を検出したところ、濃度が２１０ｍｇ／Ｌのチロソールが生成された。
【００５７】
以上に記載のＬ−アミノ酸酸化酵素、α−ケトン酸脱炭酸酵素、アルコール脱水素酵素、ＮＡＤ（Ｐ）を還元する酵素、及び、その共発現する遺伝子工学菌の構築、菌体の培地組成、及び、培養方法と全細胞の生物変換は、本発明の好ましい実施形態のみであり、決して本発明を限定しない。本発明の原則及び精神に基づいて、なされるいかなる修正、同等の置換および改良は、何れも本発明の保護範囲内に含まれる。
【国際調査報告】
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