(57)【要約】本開示は、標的核酸を処理するための方法、組成物、およびキット（固体支持体に結合したトランスポソーム複合体を使用して、核酸（例えば、ＤＮＡ）をフラグメント化およびタグ化するための方法および組成物を含む）に関する。本開示は、トランスポザーゼ、第１のトランスポゾン、および第２のトランスポゾンを含むトランスポソーム複合体を提供し、ここで上記第１のトランスポゾンは、（ａ）第１のトランスポゾン末端配列を含む３’部分および（ｂ）上記第１のトランスポゾン末端配列の５’末端において第１のアダプター配列を含み、上記第２のトランスポゾンは、上記第１のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部に相補的な第２のトランスポゾン末端配列を含み得る。
2020510401.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）トランスポザーゼ、
（ｉｉ）以下：
（ａ）第１のトランスポゾン末端配列を含む３’部分；および
（ｂ）該第１のトランスポゾン末端配列の５’末端において第１のアダプター配列
を含む第１のトランスポゾン；
（ｉｉｉ）該第１のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部に相補的な第２のトランスポゾン末端配列を含む第２のトランスポゾン；ならびに
（ｉｖ）該第１のまたは第２のトランスポゾンに結合され、親和性エレメントを含む、リンカー、
を含む、トランスポソーム複合体。
【請求項２】
前記リンカーは、前記第２のトランスポゾンの３’末端において前記第２のトランスポゾンに結合される、請求項１に記載の複合体。
【請求項３】
前記リンカーの第２の末端は、前記親和性エレメントに結合される、請求項２に記載の複合体。
【請求項４】
前記リンカーおよび親和性エレメントは、式（Ｉ）の構造：
【化１２】
2020510401.tif 000021
を有し、ここで：
ＡＥは、該親和性エレメントであり；
Ｙは、Ｃ２−６アルキレンであり；
Ｘ１は、Ｏ、ＮＲ１、またはＳであり；
ここでＲ１は、ＨまたはＣ１−１０アルキルであり；
ｎは、１〜６の整数であり；
Ｘ２は、Ｏ、ＣＨ２、またはＳであり；
Ｒａは、Ｈまたは−ＯＨであり；そして
Ｚは、ＲａがＨであるときに非存在であるか、またはＲａがＨもしくはＯＨであるときにＣＨ２であり；
ここで
【化１３】
2020510401.tif 000022
は、該第２のトランスポゾンへの接続点のマークである、
請求項３に記載の複合体。
【請求項５】
式（Ｉ）中のホスフェート基は、前記第２のトランスポゾンの末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシルに接続される、請求項４に記載の複合体。
【請求項６】
ＡＥは、必要に応じて置換されたビオチンもしくはアミノ基を含むか、または必要に応じて置換されたビオチンもしくはアミノ基である、請求項４または５に記載の複合体。
【請求項７】
ＡＥは、ビオチンである、請求項６に記載の複合体。
【請求項８】
Ｙは、Ｃ２−６アルキレン、Ｃ２−５アルキレン、Ｃ２−４アルキレン、またはＣ２−３アルキレンである、請求項４〜７のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項９】
Ｙは、エチレン、プロピレン、またはブチレンである、請求項８に記載の複合体。
【請求項１０】
Ｘ１は、ＮＲ１であり、そしてここでＲ１は、ＨまたはＣ１−１０アルキルである、請求項４〜９のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１１】
Ｒ１は、Ｈである、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
ｎは、１または２である、請求項４〜１１のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１３】
Ｘ２は、ＣＨ２である、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１４】
Ｘ２は、Ｏである、請求項４〜１２のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１５】
Ｒａは、Ｈであり、Ｚは、非存在である、請求項４〜１４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１６】
Ｒａは、Ｈであり、Ｚは、ＣＨ２である、請求項４〜１４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１７】
Ｒａは、−ＯＨであり、Ｚは、ＣＨ２である、請求項４〜１４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項１８】
前記リンカーおよび親和性エレメントは、式（Ｉ’）の構造：
【化１４】
2020510401.tif 000023
を有し、ここでＺは、非存在であるか、またはＣＨ２である、請求項４に記載の複合体。
【請求項１９】
前記リンカーおよび親和性エレメントは、式（Ｉａ）の構造：
【化１５】
2020510401.tif 000024
を有する、請求項４に記載の複合体。
【請求項２０】
前記リンカーおよび親和性エレメントは、式（Ｉｂ）または（Ｉｃ）の構造：
【化１６】
2020510401.tif 000025
を有し、ここで
ｎは、１または２であり；
Ｘ２は、ＯまたはＣＨ２であり；そして
Ｚは、非存在であるか、またはＣＨ２である、
請求項４に記載の複合体。
【請求項２１】
前記リンカーおよび親和性エレメントは、以下からなる群：
【化１７】
2020510401.tif 000026
【化１８】
2020510401.tif 000027
より選択される構造を有する、請求項４に記載の複合体。
【請求項２２】
前記トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼである、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２３】
前記Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型Ｔｎ５トランスポザーゼもしくは活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼ、またはその変異体であり、ここで該トランスポザーゼは、精製タグに必要に応じて結合体化される、請求項２２に記載の複合体。
【請求項２４】
前記第１のトランスポゾン末端配列および前記第２のトランスポゾン末端配列は、ＭＥおよびＭＥ’である、請求項２２または２３に記載の複合体。
【請求項２５】
前記第１のアダプター配列は、プライマー配列を含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項２６】
前記第１のアダプター配列は、Ａ１４またはＢ１５を含む、請求項２５に記載の複合体。
【請求項２７】
前記第１のアダプターは、第１のプライマー配列を含む、請求項２５に記載の第１の複合体、ならびに該第１のアダプターは、第２のプライマー配列を含む、請求項２５に記載の第２の複合体。
【請求項２８】
前記第１のプライマー配列は、Ａ１４を含み、前記第２のプライマー配列は、Ｂ１５を含む、請求項２７に記載の複合体。
【請求項２９】
第１のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンを含む改変されたオリゴヌクレオチドであって、ここで該第１のトランスポゾンは、（ａ）第１のトランスポゾン末端配列を含む３’部分、および（ｂ）該第１のトランスポゾン末端配列の５’末端において第１のアダプター配列を含み、該第２のトランスポゾンは、該第１のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部に相補的でありかつこれにアニールされる第２のトランスポゾン末端配列を含み、そしてここでリンカーの第１の末端は、該第２のトランスポゾンの３’末端に結合され、該リンカーの第２の末端は、親和性エレメントに結合される、改変されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３０】
前記リンカーおよび親和性エレメントは、請求項１〜２８のいずれか１項に記載されるとおり、式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉ（ａ））、（Ｉ（ｂ））、または（Ｉ（ｃ））の構造を有する、請求項２９に記載の改変されたオリゴヌクレオチド。
【請求項３１】
前記親和性エレメントは、固体支持体上の親和性結合パートナーに結合され、それによって、前記複合体は、該固体支持体に結合される、請求項１〜２８のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項３２】
前記親和性エレメントは、ビオチンであり、前記親和性結合パートナーは、ストレプトアビジンである、請求項３１に記載の複合体。
【請求項３３】
前記固体支持体は、ビーズまたは常磁性ビーズである、請求項３１または３２に記載の複合体。
【請求項３４】
タグ化核酸フラグメントのライブラリーを二本鎖標的核酸から生成するための方法であって、該方法は、該標的核酸を、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の結合した複合体とともに、該標的核酸を複数の標的フラグメントへとフラグメント化し、そして前記第１のトランスポゾンの３’末端を該標的フラグメントの５’末端に繋ぐために十分な条件下でインキュベートして、複数の５’タグ化標的フラグメントを生成する工程を包含する方法。
【請求項３５】
前記５’タグ化標的フラグメントのうちの１またはこれより多くを増幅する工程をさらに包含する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記増幅する工程は、完全二重鎖化した５’タグ化標的フラグメントを生成および／または増幅することを包含する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記増幅することは、各末端にプライマー配列を含む少なくとも１つの完全二重鎖化した５’タグ化標的フラグメントを、二次アダプターキャリア、単一のヌクレオチド、およびポリメラーゼとともに、該標的フラグメントを増幅し、該二次アダプターキャリアを組み込むために十分な条件下でインキュベートする工程であって、ここで該二次アダプターキャリアは、該プライマー配列に対する相補体および二次アダプター配列を含む工程を包含し、それによって、配列決定フラグメントのライブラリーを生成する、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記二次アダプターキャリアは、プライマー配列、インデックス配列、バーコード配列、精製タグ、またはこれらの組み合わせを含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記二次アダプターキャリアは、インデックス配列およびプライマー配列を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記完全二重鎖化した５’タグ化標的フラグメントは、各末端において異なるプライマー配列を含み、必要に応じて、ここで該異なるプライマー配列は、Ａ１４およびＢ１５である、請求項３６〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
前記二次アダプターキャリアは各々、２種のプライマー配列のうちの一方および複数のインデックス配列のうちの１種を含み、必要に応じてここで該２種のプライマー配列は、Ｐ５プライマー配列およびＰ７プライマー配列である、請求項３８〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記フラグメントは、フローセルまたは固体支持体にグラフト化された相補的プライマーにハイブリダイズされる、請求項３４〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記５’タグ化標的フラグメントまたはその増幅生成物のうちの１またはこれより多くを配列決定する工程さらに包含する、請求項３４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
固体支持体に結合したトランスポソーム複合体を調製するための方法であって、該方法は、トランスポザーゼを、請求項２９または３０に記載の改変されたオリゴヌクレオチドで、トランスポソーム複合体において該トランスポザーゼおよび改変されたオリゴヌクレオチドを結合するために十分な条件下で処理する工程を包含する方法。
【請求項４５】
前記トランスポソーム複合体を、親和性結合パートナーを含む固体支持体とともに、前記親和性エレメントが該親和性結合パートナーと結合するために十分な条件下でインキュベートする工程をさらに包含する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記リンカーは、切断可能なリンカーである、請求項１に記載のトランスポソーム複合体。
【請求項４７】
前記切断可能なリンカーは、前記第１のアダプター配列の５’末端に結合される、請求項４６に記載のトランスポソーム複合体。
【請求項４８】
前記リンカーは、前記第１のトランスポゾンの５’末端に結合され、該リンカーは、切断可能なリンカーである、請求項１に記載のトランスポソーム複合体。
【請求項４９】
前記親和性エレメントは、固体支持体上の親和性結合パートナーに結合される、請求項４８に記載の複合体。
【請求項５０】
前記固体支持体は、チューブ、プレートのウェル、スライド、ビーズ、またはフローセルであり、必要に応じて、ここで該固体支持体は、常磁性ビーズである、請求項４９に記載の複合体。
【請求項５１】
前記親和性エレメントは、ビオチンであり、前記親和性結合パートナーは、ストレプトアビジンである、請求項４９または５０に記載の複合体。
【請求項５２】
前記アダプター配列は、ユニバーサル配列、プライマー配列または配列決定関連配列からなる群より選択される１またはこれより多くの配列を含む、請求項４９〜５１のいずれか１項に記載の複合体。
【請求項５３】
配列決定用のサンプルを調製するための方法であって、該方法は、
請求項４９〜５２のいずれか１項に記載の複合体を提供する工程；
核酸を、該複合体にタグメンテーションに適した条件下で適用する工程であって、それによって、該標的核酸のフラグメントを前記固体支持体に固定化する工程；
該固定化されたタグメンテーションした核酸を増幅する工程；
前記切断可能な部分を切断する工程；および
標的化した増幅核酸に関して富化する工程であって、それによって配列決定用のサンプルを調製する工程、
を包含する方法。
【請求項５４】
前記切断可能なリンカーは、光切断可能なまたは酵素により切断可能なヌクレオチドを含み、必要に応じて、ここで該切断可能なヌクレオチドは、ウラシル、ウリジン、８−オキソ−グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、チミジン−ダイマー、７−メチルグアノシン、８−オキソ−デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジンまたは５−メチルシチジンであり、必要に応じて、ここで該切断可能なヌクレオチドは、ウラシルである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記切断は、酵素で達成され、該酵素は、（ａ）グリコシラーゼであって、必要に応じて、ここで該グリコシラーゼは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、ＭＵＧ、ＳＭＵＧ、ＴＤＧ、もしくはＭＢＤ４からなる群より選択され、必要に応じて、ここで該グリコシラーゼは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼである、グリコシラーゼであるか、または（ｂ）脱プリン／脱ピリミジン（ＡＰ）エンドヌクレアーゼであって、必要に応じて、ここで該ＡＰエンドヌクレアーゼは、Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩ、Ｅｎｄｏ  ＩＶまたはＥｎｄｏ  Ｖからなる群より選択され、必要に応じて、ここで該ＡＰエンドヌクレアーゼは、Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩであるＡＰエンドヌクレアーゼである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記固体支持体は、ビーズを含み、必要に応じて、ここで該ビーズは、常磁性ビーズである、請求項５３〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記核酸は、（ａ）ＤＮＡであって、必要に応じて、ここで該ＤＮＡは、二本鎖であり、必要に応じて、ここで該二本鎖ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡであり、必要に応じて、ここで該ゲノムＤＮＡは、単一の細胞、組織、腫瘍、血液、血漿、尿もしくは無細胞核酸を含む群から選択されるＤＮＡであるか、あるいは（ｂ）ＲＮＡもしくはその誘導体またはｃＤＮＡである、請求項５３〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記増幅工程は、ＰＣＲもしくは等温増幅法のうちの１またはこれより多くを含むか、または該増幅工程は、ＰＣＲである、請求項５３〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
トランスポゾン配列は、ユニバーサル配列、プライマー配列または配列決定関連配列を含む群から選択される１またはこれより多くのアダプター配列をさらに含む、請求項５３〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
任意の優先権出願への参照による援用
本出願は、２０１７年２月２１日に出願された米国仮特許出願番号第６２／４６１，６２０号に基づく優先権の利益を主張しており、この仮特許出願は、その全体が参考として本明細書によって援用される。
【０００２】
配列表への参照
本開示は、電子フォーマットの配列表を含む。この配列表は、２０１７年２月２０日に作成されたサイズが約７ＫＢのＩＬＬＩＮＣ−３９８ＷＯ＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと題するファイルとして提供される。この配列表の電子形式中の情報は、その全体が参考として本明細書中に援用される。
【０００３】
背景
分野
本開示は、核酸を処理するための方法、組成物、およびキット（固体支持体上に固定化されたトランスポソーム複合体を使用して、核酸（例えば、ＤＮＡ）をフラグメント化およびタグ化するための方法および組成物を含む）に関する。
【背景技術】
【０００４】
核酸サンプルの次世代配列決定（ＮＧＳ）に関する現在のプロトコルは、慣用的には、ＤＮＡまたはＲＮＡを、フラグメント化した配列決定可能なテンプレートのライブラリーへと変換するサンプル調製プロセスを使用する。サンプル調製法はしばしば、複数の工程および材料の移動、ならびにフラグメント化をもたらすために高価な機器を要し、従って、しばしば困難であり、単調で長く、高価で、効率が悪い。
【０００５】
１つのアプローチにおいて、核酸フラグメントライブラリーは、２つのトランスポゾン末端配列（一方は、タグ配列に連結される）およびトランスポザーゼがトランスポソーム複合体を形成する、トランスポソームベースの方法を使用して調製され得る。そのトランスポソーム複合体は、溶液中の標的核酸をフラグメント化およびタグ化して、配列決定機に供する準備ができた（ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ−ｒｅａｄｙ）タグメンテーションしたライブラリーを生成するために使用される。そのトランスポソーム複合体は、固体表面上に（例えば、その２つの末端配列のうちの一方の５’末端において追加されたビオチンを通じて）固定化され得る。固定化トランスポソームの使用は、実習（ｈａｎｎｄｓ−ｏｎ）および全体的なライブラリー調製時間、コスト、および試薬の必要条件を低減する、サンプルインプットの必要条件を低下させる、ならびにライブラリー調製の出発点として未精製または分解したサンプルの使用を可能にすることによって、液相アプローチを超える顕著な利点を提供する。均一なフラグメントサイズおよびライブラリー収量を生じる固体表面上のトランスポソームの固定化のための例示的な転移手順およびシステムは、ＷＯ２０１４／１０８８１０およびＷＯ２０１６／１８９３３１（これらの各々は、その全体において本明細書に参考として援用される）に詳細に記載される。
【０００６】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／１８９３３１およびＵＳ  ２０１４／０９３９１６Ａ１に記載されるある種のビーズベースのタグメンテーション方法において、トランスポソームは、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を使用して、磁性ビーズに結合される。プロトコルのその後のＰＣＲ増幅工程の間に、ビオチン−ストレプトアビジン結合は、熱変性によって破壊され、それによって、ビオチン化タグメンテーション生成物が溶液へと放出される。目的の配列とのアンプリコン、または標的アンプリコンは、所望であれば、例えば、ハイブリダイゼーション捕捉によって富化され得、配列決定され得る。
【０００７】
しかし、固定化トランスポソームを使用してタグメンテーションによって調製されるライブラリーが、一般的ハイブリダイゼーション捕捉法を使用してゲノムのある種の領域に関して富化される場合、例えば、溶液ベースのトランスポソームアプローチを使用して生成されるライブラリーに関する富化と比較して、ゲノムにおけるある種の領域に関してより低いリード富化が達成され得る。
【０００８】
さらに、支持体に結合したトランスポソーム複合体の安定性は、トランスポソーム複合体を支持体に接続するために使用されるリンカー構築物に依存して変動する。貯蔵時にまたはライブラリー調製の間に複合体が支持体から除去される場合、得られたライブラリーの品質および効率が影響を及ぼされる。従って、改善された安定性を有する固定化トランスポソーム複合体およびタグメンテーションライブラリー生成の改善された効率、翻って、得られたライブラリーの増大したリード富化を示す関連法が必要である。得られたライブラリーのリード富化を改善する組成物および方法もまた、必要である。
本開示は、改変されたリンカーおよび構成要素の配置を有する支持体に結合したトランスポソーム複合体に関する。本開示は、このような改変された複合体を使用して、配列決定する準備ができた核酸ライブラリーを生成するための方法および組成物を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１４／１０８８１０号
【特許文献２】国際公開第２０１６／１８９３３１号
【特許文献３】米国特許出願公開第２０１４／０９３９１６号明細書
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
要旨
本開示は、核酸を処理するための方法、組成物、およびキット（固体支持体上のトランスポソーム複合体を使用してＤＮＡをフラグメント化およびタグ化するための方法および組成物を含む）に関する。
【００１１】
本開示は、トランスポザーゼ、第１のトランスポゾン、および第２のトランスポゾンを含むトランスポソーム複合体を提供し、ここで上記第１のトランスポゾンは、（ａ）第１のトランスポゾン末端配列を含む３’部分および（ｂ）上記第１のトランスポゾン末端配列の５’末端において第１のアダプター配列を含み、上記第２のトランスポゾンは、上記第１のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部に相補的な第２のトランスポゾン末端配列を含む。代表的には、上記第１のトランスポゾン末端配列および第２のトランスポゾン末端配列は、一緒にアニールしてトランスポザーゼによって認識される二本鎖トランスポゾン末端配列を形成し、これらの組み合わせは、機能的トランスポソーム複合体を形成する。
【００１２】
いくつかの局面において、上記トランスポソーム複合体は、第１のトランスポゾン（および従って複合体）を上記固体支持体に接続し得る切断可能なリンカーを含む。このような局面において、切断可能なリンカーの第１の末端は、上記第１のアダプター配列の５’末端に結合され、いくつかの局面において、上記切断可能なリンカーの第２の末端は、親和性エレメントに結合される。上記親和性エレメントは、固体支持体上の親和性結合パートナーに（共有結合により、または非共有結合により）結合し得る。いくつかの局面において、上記親和性エレメントは、上記固体支持体上の親和性結合パートナーに（共有結合により、または非共有結合により）結合され、固体支持体に結合したトランスポソーム複合体を提供する。これらの複合体は、５’−リンカートランスポソーム複合体および固体支持体に結合した５’−リンカートランスポソーム複合体である。
【００１３】
他の局面において、上記トランスポソーム複合体は、第２のトランスポゾン（および従って上記複合体）を上記固体支持体に接続し得る３’リンカーを含む。このような局面において、上記リンカーの第１の末端は、上記第２のトランスポゾンの３’末端に結合され、上記リンカーの第２の末端は、親和性エレメントに結合される。上記親和性エレメントは、固体支持体上の親和性結合パートナーに（共有結合によりまたは非共有結合により）結合し得る。いくつかの局面において、上記親和性エレメントは、上記固体支持体上の親和性結合パートナーに（共有結合により、または非共有結合により）結合され、固体支持体に結合したトランスポソーム複合体を提供する。いくつかの局面において、上記リンカーは、切断可能なリンカーである。これらの複合体は、３’−リンカートランスポソーム複合体および固体支持体に結合した３’−リンカートランスポソーム複合体である。
【００１４】
いくつかの局面において、本開示は、改変されたオリゴヌクレオチドに関する。いくつかの局面において、上記改変されたオリゴヌクレオチドは、第１のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンを含み、ここで上記第１のトランスポゾンは、（ａ）第１のトランスポゾン末端配列を含む３’部分および（ｂ）上記第１のトランスポゾン末端配列の５’末端において第１のアダプター配列を含み、上記第２のトランスポゾンは、上記第１のトランスポゾン末端配列の少なくとも一部に相補的な、これにアニールされる第２のトランスポゾン末端配列を含み、ここで切断可能なリンカーの第１の末端は、上記第１のアダプター配列の５’末端に結合され、いくつかの局面において、上記切断可能なリンカーの第２の末端は、親和性エレメントに結合される。
【００１５】
他の局面において、上記改変されたオリゴヌクレオチドは、第１のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンを含み、ここで上記第１のトランスポゾンは、（ａ）第１のトランスポゾン末端配列を含む３’部分、および（ｂ）上記第１のトランスポゾン末端配列の５’末端において第１のアダプター配列を含み、上記第２のトランスポゾンは、上記第１の末端配列の少なくとも一部に相補的な、これにアニールされる第２のトランスポゾン末端配列を含み、そしてここでリンカーの第１の末端は、上記第２のトランスポゾンの３’末端に結合され、上記リンカーの第２の末端は、親和性エレメントに結合される。いくつかの局面において、上記リンカーは、切断可能なリンカーである。
【００１６】
３’−リンカートランスポソーム複合体のいくつかの実施形態において、上記親和性エレメントおよびリンカーは、本明細書で記載されるとおりの式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉ（ａ））、（Ｉ（ｂ））、または（Ｉ（ｃ））の構造を有する。いくつかの局面において、上記親和性エレメントは、上記第２のトランスポゾンの３’末端に共有結合的に連結され、ここで上記親和性エレメントおよびリンカーは、式（Ｉ）の構造：
【化１】
2020510401.tif 000003
を有し、ここで：
ＡＥは、親和性エレメントであり；
Ｙは、Ｃ２−６アルキレンであり；
Ｘ１は、Ｏ、ＮＲ１、またはＳであり；
ここでＲ１は、ＨまたはＣ１−１０アルキルであり；
ｎは、１、２、３、４、５、および６からなる群より選択される整数であり；
Ｘ２は、Ｏ、ＣＨ２、またはＳであり；
Ｒａは、Ｈまたは−ＯＨであり；そして
Ｚは、ＲａがＨである場合に非存在であるか、またはＲａがＨまたはＯＨである場合にＣＨ２であり；
ここで
【化２】
2020510401.tif 000004
は、上記第２のトランスポゾンへの接続点のマークである。
【００１７】
いくつかの局面において、本明細書で記載されるリンカーは、５’リンカーであり、ここで式（Ｉ）の中のホスフェート基は、上記第１のトランスポゾンの末端ヌクレオチドの５’位における末端ホスフェート基である。いくつかの局面において、本明細書で記載されるリンカーは、３’リンカーであり、ここで式（Ｉ）の中のホスフェート基は、上記第２のトランスポゾンオリゴヌクレオチド（例えば、３’末端ヌクレオチド）の３’ヒドロキシルに接続される。
【００１８】
他の局面において、本開示は、二本鎖標的核酸からタグ化核酸フラグメントのライブラリーを生成するための方法を提供し、上記方法は、上記標的を、本明細書で記載されるとおりの固体支持体に結合したトランスポソーム複合体とともにインキュベートする工程を包含する。いくつかの局面において、上記方法は、上記標的を、上記固定化されたトランスポソーム複合体で、上記標的がフラグメント化され、上記第１のトランスポゾンの３’末端が上記標的フラグメントの５’末端に繋がれる条件下で処理して、複数の５’タグ化標的フラグメントを生成する工程を包含する。いくつかの実施形態において、複数のトランスポソーム複合体が使用される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記５’タグ化標的フラグメントのうちの１またはこれより多くを増幅する工程をさらに包含する。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記５’タグ化標的フラグメントまたはその増幅生成物のうちの１またはこれより多くを配列決定する工程をさらに包含する。
【００２０】
従って、本開示のいくつかのさらなる実施形態は、タグ化核酸フラグメントのライブラリーを生成するための方法に関し、上記方法は、
固体支持体であって、上記固体支持体に固定化された本明細書に記載されるトランスポソーム複合体を含む固体支持体を提供する工程；および
上記固体支持体と、二本鎖標的核酸とを、上記標的核酸を複数の標的フラグメントにフラグメント化し、そして上記第１のトランスポゾン３’末端を上記標的フラグメントの５’末端に繋げるために十分な条件下で接触させて、複数の５’タグ化標的フラグメントを提供する工程、
を包含する。
【００２１】
いくつかの局面において、上記方法は、上記５’タグ化標的フラグメントを増幅する工程をさらに包含する。
【００２２】
いくつかの局面において、本開示は、本明細書で記載される方法によって生成される５’タグ化標的フラグメントのライブラリーを提供する。
【００２３】
本開示は、本明細書で記載されるとおりの改変されたオリゴヌクレオチド、トランスポソーム複合体、および固体支持体に結合したトランスポソーム複合体を調製するための方法をさらに提供する。いくつかの局面において、このような方法は、トランスポザーゼを、本明細書で記載されるとおりの第１のおよび第２のトランスポゾンで、上記複合体を形成するために適した条件下で処理する工程を包含する。固体支持体に結合したトランスポソーム複合体を調製するための方法は、本明細書で記載されるとおりのトランスポソーム複合体を、親和性結合パートナーを含む固体支持体とともに、上記親和性エレメントが上記親和性結合パートナーと（共有結合により、または非共有結合により）結合するために十分な条件下でインキュベートする工程を包含する。
【００２４】
本明細書で記載される組成物および方法のいくつかの実施形態において、上記トランスポソーム複合体は、２つの集団を含み、ここで各集団における上記第１のアダプター配列は、異なる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、トランスポソーム複合体の一実施形態をビーズ表面に付着させるための方法の例示的工程を図示する。
【００２６】
【図２】図２は、フローセル上でのクラスター形成を通じて、ビーズ表面上での例示的なタグメンテーションプロセスの模式図を図示する。
【００２７】
【図３】図３は、ビーズ表面上に固定化されたトランスポソーム複合体を使用して、ＤＮＡをフラグメント化およびタグ化し、続いて、夾雑するオフターゲットリードをもたらす標的富化を行うための方法の例示的工程を示す。
【００２８】
【図４】図４は、酵素により切断可能なリンカーを使用してビーズ表面上で固定化されたトランスポソーム複合体を使用して、ＤＮＡをフラグメント化およびタグ化し、続いて、標的富化を行うための方法の例示的工程を示す。
【００２９】
【図５Ａ】図５Ａは、タグメンテーションおよびその後の増幅のために固体表面に結合されたトランスポゾン配列のビオチン化５’末端の例を示す。
【００３０】
【図５Ｂ】図５Ｂは、タグメンテーションおよびその後の増幅のために固体表面に結合されたトランスポゾン配列のビオチン化３’末端の例を示す。
【００３１】
【図６Ａ】図６Ａは、２種の異なる３’−ビオチン化リンカーを有するトランスポソーム複合体を使用するストレプトアビジンビーズベースの固相タグメンテーションからのライブラリー収量を比較する。
【００３２】
【図６Ｂ】図６Ｂは、４ヶ月間の時間効果（ａｇｉｎｇ）後の式（Ｉ（ａ））の３’−ビオチン化リンカーを有するトランスポソーム複合体を使用するストレプトアビジンビーズベースの固相タグメンテーションから調製したサンプルライブラリーの加速安定性データを、その同じ複合体の非時間効果バッチ（コントロール）から調製したサンプルライブラリーと比較して示す。
【００３３】
【図６Ｃ】図６Ｃは、４ヶ月間および８ヶ月間の時間効果後の式（Ｉ（ｃ））の３’−ビオチン化リンカーを有するトランスポソーム複合体から調製したサンプルライブラリーの加速安定性データを、非時間効果の複合体（コントロール）から調製したサンプルライブラリーと比較して示す。
【００３４】
【図７Ａ】図７Ａは、ストレプトアビジンビーズベースの固相ライブラリー調製（ここでビーズは、３’−ビオチン化リンカーを通じてそのビーズに固定化されたトランスポソーム複合体を含む）を使用して複合体密度の関数としてＤＮＡ分子の標的挿入物サイズを示す。
【００３５】
【図７Ｂ】図７Ｂは、活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼおよび３’−ビオチン化リンカーを含む固定化トランスポソーム複合体を有するストレプトアビジンビーズ、ならびに１００ｎＭの複合体密度を使用する、ＳＰＲＩ条件の関数としてＤＮＡ分子の標的挿入物サイズを示す折れ線グラフである。
【００３６】
【図７Ｃ】図７Ｃは、活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼおよび３’−ビオチン化リンカーを含む固定化トランスポソーム複合体を有するストレプトアビジンビーズ、ならびに６００ｎＭの複合体密度を使用する、ＳＰＲＩ条件の関数としてＤＮＡ分子の標的挿入物サイズを示す折れ線グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
詳細な説明
フラグメント化した核酸のライブラリーはしばしば、次世代配列決定（ＮＧＳ）適用における使用のためにゲノム核酸から作られる。本開示は、固定化転移ライブラリー調製法のための方法、組成物、およびキットを提供する。上記固定化転移ライブラリー調製法は、他のライブラリー調製法と比較して迅速であり、かつグロスサンプルまたは非精製サンプル（例えば、血液、喀痰、細胞抽出物など）および精製サンプル（例えば、精製されたゲノム核酸）の両方からライブラリーを調製するにあたって有効である。一般に、トランスポソームは、共有結合または非共有結合の結合パートナー（例えば、親和性エレメントおよび親和性結合パートナー）を使用して、基材（例えば、スライドまたはビーズ）上に固定化される（図１）。例えば、トランスポソーム複合体は、トランスポソーム複合体に結合したビオチン化リンカーを通じて上記ストレプトアビジン被覆ビーズ上に固定化される。その標的核酸は、その固定化トランスポソーム複合体によって捕捉され、その核酸は、フラグメント化およびタグ化される（「タグメンテーション」）。そのタグ化されたフラグメントは、増幅され、目的のアンプリコンは、必要に応じて、捕捉され（例えば、ハイブリダイゼーションプローブを介して）、そのタグ化されたフラグメントは、配列決定される。
【００３８】
固体支持体に連結したトランスポソーム複合体をライブラリー調製のために使用することは、ライブラリー調製プロセスへと入るサンプルインプットの正規化、および富化または配列決定工程の前にライブラリーアウトプットの正規化の必要性を低減する。これらの複合体を使用することはまた、種々のサンプルインプット濃度が使用される場合にすら、液相法と比較してより一致した挿入物サイズを有するライブラリーを生成する。しかし、ビオチン化リンカーを有するある種のトランスポソーム複合体は、低減した安定性を有することが観察された。さらに、ある種の支持体に結合した複合体の構成は、オフターゲット生成物を生じる；特に、５’タグ化標的フラグメントのアンプリコンのハイブリダイゼーションおよび捕捉は、固定化された核酸となおハイブリダイズされる核酸のフラグメントによって夾雑され得る（図３）。この非効率性は、試薬の浪費、ならびにオフターゲットフラグメントおよび配列決定データを伴う配列決定機器またはフローセルを生じ得る。本出願は、ライブラリー品質という課題に対処し、オフターゲット捕捉を低減する種々のトランスポソーム複合体デザイン、および改善された化学的安定性を示す改変されたリンカーを有する複合体を開示する。
【００３９】
いくつかの実施形態において、本明細書で開示される方法によって得られる核酸ライブラリーは、標的配列の核酸配列を決定するために任意の適切な核酸配列決定プラットフォームを使用して配列決定され得る。いくつかの点で、目的の配列は、１またはこれより多くの先天的または遺伝性の障害、病原性、抗生物質耐性、または遺伝的改変と相関または関連する。配列決定は、短い縦列反復配列、一塩基多型、遺伝子、エキソン、コード領域、エキソーム、またはこれらの一部の核酸配列を決定するために使用され得る。よって、本明細書で記載される方法および組成物は、がんおよび疾患の診断、予後、および治療剤、ＤＮＡフィンガープリント適用（例えば、ＤＮＡデータバンキング、犯罪ケースワーク）、メタゲノム研究および創薬、アグリゲノム適用、ならびに病原体同定およびモニタリングにおいて有用であるが、これらに限定されない配列決定可能なライブラリーを作ることに関する。
【００４０】
標的核酸（例えば、ＤＮＡ）を、次世代配列決定の準備ができたアダプター改変テンプレートに変換するために必要とされる工程の数は、トランスポザーゼ媒介性フラグメント化およびタグ化の使用によって最小化され得る。このプロセスは、「タグメンテーション（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」と本明細書でいわれ、しばしば、特定の目的のためにデザインされた選択肢的なさらなる配列とともに、一本鎖アダプター配列および二本鎖トランスポゾン末端配列領域を含むトランスポゾン対と複合体化されたトランスポザーゼ酵素を含むトランスポソーム複合体による、標的核酸の改変を含む。タグメンテーションは、標的核酸の同時のフラグメント化および二重鎖核酸フラグメントの両方の鎖の５’末端へのアダプターの連結を生じる。トランスポソーム複合体が、支持体に結合されている場合、その得られたフラグメントは、タグメンテーション反応の後に（５’連結トランスポソーム複合体の場合には直接的に、または３’連結トランスポソーム複合体の場合にはハイブリダイゼーションを介して、のいずれかで）固体支持体に結合される。
【００４１】
別段定義されなければ、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で参照される全ての特許、出願、公開出願および他の刊行物は、別段述べられなければ、それらの全体において参考として援用される。本明細書中の用語に関して複数の定義が存在するということが起こる場合、別段述べられなければ、この節の用語が優先する。本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの、ある（ａ）」、「１つの、ある（ａｎ）」、および「上記、この、その（ｔｈｅ）」は、状況が明らかに別段規定しなければ、複数形への言及を含む。別段示されなければ、質量分析法、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、プロトン化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法が使用される。「または（ｏｒ）」または「および（ａｎｄ）」の使用は、別段述べられなければ、「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」を意味する。さらに、用語「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および他の形態（例えば、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む、包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含まれる、包含される（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」）の使用は、限定されない。本明細書で使用される場合、移行句の中であろうが、請求項の本文の中であろうが、用語「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」および「含む、包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非限定の意味（ｏｐｅｎ−ｅｎｄｅｄ  ｍｅａｎｉｎｇ）を有すると解釈されるべきである。すなわち、これらの用語は、文言「少なくとも〜を有する（ｈａｖｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）」または「少なくとも〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ａｔ  ｌｅａｓｔ）」と同義に解釈されるべきである。プロセスの状況において使用される場合、用語「含む、包含する」とは、そのプロセスが少なくとも記載される工程を包含するが、さらなる工程を包含していてもよいことを意味する。化合物、組成物、またはデバイスの状況において使用される場合、用語「含む、包含する」とは、その化合物、組成物、またはデバイスが少なくとも記載される特徴または構成要素を含むが、さらなる特徴または構成要素をも含んでいてもよいことを意味する。
【００４２】
本明細書で使用される節の見出しは、体系化する目的に過ぎず、記載される主題を限定すると解釈されるべきではない。
【００４３】
化学用語
本明細書で使用される場合、「アルキル（ａｌｋｙｌ）」とは、完全に飽和した（すなわち、二重結合も三重結合も含まない）直線状または分枝状の炭化水素鎖をいう。そのアルキル基は、１〜２０個の炭素原子を有し得る（本明細書で現れる場合は常に、数値範囲（例えば、「１〜２０（１  ｔｏ  ２０）」とは、その所定の範囲の中の各整数に言及する；例えば、「１〜２０個の炭素原子（１  ｔｏ  ２０  ｃａｒｂｏｎ  ａｔｏｍｓ）」とは、そのアルキルが、１個の炭素原子、２個の炭素原子、３個の炭素原子など、２０個を含めて２０個までの炭素原子からなり得ることを意味するが、本定義はまた、数値範囲が指定されていない用語「アルキル」の存在もまた、網羅する）。アルキル基はまた、１〜９個の炭素原子を有する中程度のサイズのアルキルであってもよい。アルキル基はまた、１〜６個の炭素原子を有する低級アルキルであり得る。そのアルキル基は、「Ｃ１−４アルキル」または類似の呼称として指定され得る。例示に過ぎないが、「Ｃ１−６アルキル」は、アルキル鎖の中に１〜６個の炭素原子が存在し、すなわち、そのアルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、およびｔ−ブチルからなる群より選択されることを意味する。代表的なアルキル基としては、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、三級ブチル、ペンチル、ヘキシルなどが挙げられるが、決してこれらに限定されない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ（ａｌｋｏｘｙ）」とは、式−ＯＲであって、ここでＲは、上記で定義されるとおりのアルキルであるもの（例えば、Ｃ１−９アルコキシ）をいい、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、１−メチルエトキシ（イソプロポキシ）、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、およびｔｅｒｔ−ブトキシなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「アリール（ａｒｙｌ）」とは、環骨格の中に炭素のみを含む芳香族環または環系（すなわち、２個の隣接する炭素原子を共有する２個またはこれより多くの縮合環）をいう。アリールが環系である場合、その系の中の全ての環は、芳香族である。アリール基は、６〜１８個の炭素原子を有し得るが、本定義はまた、数値範囲が指定されない用語「アリール」の存在を網羅する。いくつかの実施形態において、アリール基は、６〜１０個の炭素原子を有する。アリール基は、「Ｃ６−１０アリール」、「Ｃ６ないしＣ１０アリール」または類似の呼称として指定され得る。アリール基の例としては、フェニル、ナフチル、アズレニル、およびアントラセニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
「アラルキル（ａｒａｌｋｙｌ）」または「アリールアルキル（ａｒｙｌａｌｋｙｌ）」とは、置換基として、アルキレン基を介して接続されるアリール基であり（例えば、「Ｃ７−１４アラルキル」など）、ベンジル、２−フェニルエチル、３−フェニルプロピル、およびナフチルアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、アルキレン基は、低級アルキレン基（すなわち、Ｃ１−６アルキレン基）である。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「カルボシクリル（ｃａｒｂｏｃｙｃｌｙｌ）」とは、環系の骨格の中に炭素原子のみを含む非芳香族環または環系を意味する。カルボシクリルが環系である場合、２個またはこれより多くの環は、縮合、架橋、またはスピロ接続された様式で一緒に接続され得る。カルボシクリルは、環系の中の少なくとも１個の環が芳香族ではないことを条件として、任意の飽和度を有し得る。従って、カルボシクリルは、シクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルを含む。カルボシクリル基は、３〜２０個の炭素原子を有し得るが、本定義はまた、数値範囲が指定されない用語「カルボシクリル」の存在を網羅する。カルボシクリル基はまた、３〜１０個の炭素原子を有する中程度のサイズのカルボシクリルであり得る。カルボシクリル基はまた、３〜６個の炭素原子を有するカルボシクリルであり得る。カルボシクリル基は、「Ｃ３−６カルボシクリル」または類似の呼称として指定され得る。カルボシクリル環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、２，３−ジヒドロ−インデン、ビシクロ［２．２．２］オクタニル（ｂｉｃｙｃｌｅ［２．２．２］ｏｃｔａｎｙｌ）、アダマンチル、およびスピロ［４．４］ノナニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「Ｃａ〜Ｃｂ（Ｃａ  ｔｏ  Ｃｂ）」または「Ｃａ−ｂ」であって、ここで「ａ」および「ｂ」が整数であるものは、特定された基の中の炭素原子の数に言及する。すなわち、その基は、「ａ」個から「ｂ」個まで（両端を含む）の炭素原子を含み得る。従って、例えば、「Ｃ１〜Ｃ４アルキル」または「Ｃ１−４アルキル」基とは、１〜４個の炭素を有する全てのアルキル基、すなわち、ＣＨ３−、ＣＨ３ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２−、（ＣＨ３）２ＣＨ−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−、ＣＨ３ＣＨ２ＣＨ（ＣＨ３）−および（ＣＨ３）３Ｃ−をいう。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「共有結合される（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ａｔｔａｃｈｅｄ）」または「共有結合される（ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ  ｂｏｎｄｅｄ）」とは、原子間での電子対の共有によって特徴づけられる化学的結合の形成をいう。例えば、共有結合されたポリマー被覆とは、他の手段、例えば、接着または静電的相互作用を介する表面への結合と比較して、化学的結合を基材の官能化された表面と形成するポリマー被覆をいう。表面に共有結合的に結合されるポリマーがまた、共有結合的な結合に加えて、例えば、物理的吸着によって結合され得ることは、認識される。
【００５０】
用語「ハロゲン（ｈａｌｏｇｅｎ）」または「ハロ（ｈａｌｏ）」とは、本明細書で使用される場合、元素周期表の７族の放射性安定原子、例えば、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素のうちのいずれか１種を意味し、フッ素および塩素が好ましい。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール（ｈｅｔｅｒｏａｒｙｌ）」とは、環骨格の中に１個またはこれより多くのヘテロ原子（すなわち、炭素以外の元素（窒素、酸素および硫黄が挙げられるが、これらに限定されない））を含む芳香族環または環系（すなわち、２個の隣接する原子を共有する２個またはこれより多くの縮合環）をいう。ヘテロアリールが環系である場合、その系の中の全ての環は、芳香族である。ヘテロアリール基は、５〜１８個の環員（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含む、環骨格を構成する原子数）を有し得るが、本定義はまた、数値範囲が指定されない用語「ヘテロアリール」の存在を網羅する。いくつかの実施形態において、ヘテロアリール基は、５〜１０個の環員または５〜７個の環員を有する。ヘテロアリール基は、「５〜７員のヘテロアリール」、「５〜１０員のヘテロアリール」、または類似の呼称として指定され得る。ヘテロアリール環の例としては、フリル、チエニル、フタラジニル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、チアジアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、キノリニル、イソキノリニル（ｉｓｏｑｕｉｎｌｉｎｙｌ）、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、インドリル、イソインドリル、およびベンゾチエニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクリル（ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｙｌ）」とは、環骨格の中に少なくとも１個のヘテロ原子を含む非芳香族の環式環または環系を意味する。ヘテロシクリルは、縮合、架橋またはスピロ接続様式で一緒に繋がれ得る。ヘテロシクリルは、環系の中の少なくとも１個の環が芳香族でないことを条件として、任意の飽和度を有し得る。ヘテロ原子は、環系の中の非芳香族または芳香族いずれかの環の中に存在し得る。ヘテロシクリル基は、３〜２０個の環員（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含む、環骨格を構成する原子の数）を有し得るが、本定義はまた、数値範囲が指定されない用語「ヘテロシクリル」の存在を網羅する。ヘテロシクリル基はまた、３〜１０個の環員を有する中程度のサイズのヘテロシクリルであり得る。ヘテロシクリル基はまた、３〜６個の環員を有するヘテロシクリルであり得る。ヘテロシクリル基は、「３〜６員のヘテロシクリル」または類似の呼称として指定され得る。好ましい６員の単環式ヘテロシクリルにおいて、ヘテロ原子は、Ｏ、ＮまたはＳのうちの１〜３個までから選択され、好ましい５員の単環式ヘテロシクリルにおいて、ヘテロ原子は、Ｏ、ＮまたはＳから選択される１個または２個のヘテロ原子から選択される。ヘテロシクリル環の例としては、アゼピニル、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、ジオキソラニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、モルホリニル、オキシラニル、オキセパニル、チエパニル、ピペリジニル、ピペラジニル、ジオキソピペラジニル、ピロリジニル、ピロリドニル、ピロリジニル（ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｏｎｙｌ）、４−ピペリドニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、１，３−ジオキシニル、１，３−ジオキサニル、１，４−ジオキシニル、１，４−ジオキサニル、１，３−オキサチアニル、１，４−オキサチイニル（１，４−ｏｘａｔｈｉｉｎｙｌ）、１，４−オキサチアニル、２Ｈ−１，２−オキサジニル、トリオキサニル、ヘキサヒドロ−１，３，５−トリアジニル、１，３−ジオキソリル、１，３−ジオキソラニル、１，３−ジチオリル、１，３−ジチオラニル、イソオキサゾリル、イソオキサゾリジニル、オキサゾリニル、オキサゾリジニル、オキサゾリジノニル、チアゾリニル、チアゾリジニル、１，３−オキサチオラニル、インドリニル、イソインドリニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロ−１，４−チアジニル、チアモルホリニル、ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリジニル、およびテトラヒドロキノリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
本明細書で使用される場合、置換された基は、置換されていない親基から、その中で１個またはこれより多くの水素原子が別の原子または基で交換されることから得られる。別段示されなければ、基が「置換され（ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ）」ていると考えられる場合、その基は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルケニル、Ｃ１−Ｃ６アルキニル、Ｃ１−Ｃ６ヘテロアルキル、Ｃ３−Ｃ７カルボシクリル（ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシで必要に応じて置換される）、Ｃ３−Ｃ７−カルボシクリル−Ｃ１−Ｃ６−アルキル（ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシで必要に応じて置換される）、３〜１０員のヘテロシクリル（ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシで必要に応じて置換される）、３〜１０員のヘテロシクリル−Ｃ１−Ｃ６−アルキル（ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシで必要に応じて置換される）、アリール（ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシで必要に応じて置換される）、アリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシで必要に応じて置換される）、５〜１０員のヘテロアリール（ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシで必要に応じて置換される）、５〜１０員のヘテロアリール（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（ハロ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６ハロアルキル、およびＣ１−Ｃ６ハロアルコキシで必要に応じて置換される）、ハロ、シアノ、ヒドロキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ、Ｃ１−Ｃ６アルコキシ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（すなわち、エーテル）、アリールオキシ、スルフヒドリル（メルカプト）、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル（例えば、−ＣＦ３）、ハロ（Ｃ１−Ｃ６）アルコキシ（例えば、−ＯＣＦ３）、Ｃ１−Ｃ６アルキルチオ、アリールチオ、アミノ、アミノ（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、ニトロ、Ｏ−カルバミル、Ｎ−カルバミル、Ｏ−チオカルバミル、Ｎ−チオカルバミル、Ｃ−アミド、Ｎ−アミド、Ｓ−スルホンアミド、Ｎ−スルホンアミド、Ｃ−カルボキシ、Ｏ−カルボキシ、アシル、シアナト、イソシアナト、チオシアナト、イソチオシアナト、スルフィニル、スルホニル、スルホ、スルフィノ、スルホネート、およびオキソ（＝Ｏ）から独立して選択される１個またはこれより多くの置換基で置換されることが意味される。基が「必要に応じて置換される」と記載される場合は常に、その基は、上記の置換基で置換され得る。
【００５４】
いくつかの実施形態において、トランスポソーム複合体は、１またはこれより多くのポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）、例えば、トランスポゾン末端配列を含むポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチド）を介して、支持体に固定化される。いくつかの実施形態において、トランスポソーム複合体は、トランスポゾン配列の末端に付加したリンカーを介して、例えば、トランスポザーゼ酵素を固体支持体に連結して、固定化され得る。いくつかの実施形態において、トランスポザーゼ酵素およびトランスポゾンポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）の両方が、固体支持体に固定化される。固体支持体への分子（例えば、核酸、酵素）の固定化に言及する場合、用語「固定化される（ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ）」、「付着される（ａｆｆｉｘｅｄ）」および「結合される（ａｔｔａｃｈｅｄ）」とは、本明細書で交換可能に使用され、両用語が、明示的であっても状況によってであっても、別段示されなければ、直接的なまたは間接的な、共有結合的または非共有結合的な結合を包含することが意図される。本開示のある種の実施形態において、共有結合的な結合が好ましいものであり得るが、一般に、必要とされることは、分子（例えば、核酸、酵素）が、支持体を使用することが意図される条件下で、例えば、核酸増幅および／もしくは配列決定を要する適用において、支持体に固定化または結合されたままであることが全てである。場合によっては、ビーズベースのタグメンテーションにおいて、トランスポソームは、リガンド対（例えば、親和性エレメントおよび親和性結合パートナー）を介してビーズ表面に結合され得る。
【００５５】
トランスポソームおよびトランスポザーゼ
トランスポゾンベースの技術は、例えば、ＮＥＸＴＥＲＡＴＭ  ＸＴおよびＦＬＥＸ  ＤＮＡサンプル調製キット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．）の作業フローに例示されるように、ＤＮＡをフラグメント化するために利用され得、ここで標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）は、標的を同時にタグ化およびフラグメント化（「タグメンテーション（ｔａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）」）するトランスポソーム複合体で処理され、それによって、フラグメントの末端で特有のアダプター配列でタグ化されたフラグメント化核酸分子の集団を作り出す。
【００５６】
転移反応は、１またはこれより多くのトランスポゾンがランダム部位でまたはほぼランダム部位で標的核酸へと挿入される反応である。転移反応における構成要素は、トランスポザーゼ（または本明細書で記載されるとおりの核酸をフラグメント化およびタグ化し得る他の酵素、例えば、インテグラーゼ）および酵素に結合する二本鎖トランスポゾン末端配列を含むトランスポゾンエレメント、ならびに２つのトランスポゾン末端配列のうちの一方に結合されるアダプター配列を含む。その二本鎖トランスポゾン末端配列のうちの一方の鎖は、標的核酸の一方の鎖に移され、相補的なトランスポゾン末端配列鎖は、移されない（すなわち、移されないトランスポゾン配列）。そのアダプター配列は、必要とされるかまたは所望である場合、１またはこれより多くの機能的配列（例えば、プライマー配列）を含み得る。
【００５７】
「トランスポソーム複合体（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ）」とは、少なくとも１種のトランスポザーゼ酵素およびトランスポゾン認識配列から構成される。いくつかのこのようなシステムにおいて、トランスポザーゼは、トランスポゾン認識配列に結合して、転移反応を触媒し得る機能的複合体を形成する。いくつかの局面において、そのトランスポゾン認識配列は、二本鎖トランスポゾン末端配列である。そのトランスポザーゼ、またはインテグラーゼは、標的核酸の中のトランスポザーゼ認識部位に結合し、トランスポゾン認識配列を標的核酸の中に挿入する。いくつかのこのような挿入事象において、トランスポゾン認識配列（または末端配列）のうちの一方の鎖は、標的核酸へと移され、切断事象も生じる。本開示のトランスポザーゼとともに使用するために容易に適合され得る例示的な転移手順およびシステムは、例えば、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１０／０４８６０５、米国特許公開番号２０１２／０３０１９２５、米国特許公開番号２０１２／１３４７００８７、または米国特許公開番号２０１３／０１４３７７４（これらの各々は、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載される。
【００５８】
本明細書で提供されるある種の実施形態とともに使用され得る例示的なトランスポザーゼとしては、以下が挙げられる（または以下によってコードされる）：Ｔｎ５トランスポザーゼ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２０００，  ２６６，  ７２９−７３４を参照のこと）、Ｖｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉ（Ａｇｉｌｅｎｔによって特徴づけられかつＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＱＸＴ製品において使用されるトランスポザーゼ）、Ｒ１およびＲ２末端配列を含むＭｕＡトランスポザーゼおよびＭｕトランスポザーゼ認識部位（Ｍｉｚｕｕｃｈｉ，  Ｋ．，  Ｃｅｌｌ，  ３５：  ７８５，  １９８３；  Ｓａｖｉｌａｈｔｉ，  Ｈ，ら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １４：４８９３，  １９９５）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｔｎ５５２（Ｃｏｌｅｇｉｏ，  Ｏ．ら，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １８３：２３８４−８，  ２００１；  Ｋｉｒｂｙ，  Ｃ．ら，  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，  ４３：１７３−８６，  ２００２）、Ｔｙ１（Ｄｅｖｉｎｅ  ＆  Ｂｏｅｋｅ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２２：３７６５−７２，  １９９４およびＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／２３８７５）、トランスポゾンＴｎ７（Ｃｒａｉｇ，  Ｎ．Ｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７１：１５１２，  １９９６；  Ｃｒａｉｇ，  Ｎ．Ｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０４：２７−４８，  １９９６）、Ｔｎ／ＯおよびＩＳ１０（Ｋｌｅｃｋｎｅｒ  Ｎ．ら，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０４：４９−８２，  １９９６）、Ｍａｒｉｎｅｒトランスポザーゼ（Ｌａｍｐｅ，  Ｄ．Ｊ．ら，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １５：５４７０−９，  １９９６）、Ｔｃ１（Ｐｌａｓｔｅｒｋ，  Ｒ．Ｈ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  ２０４：１２５−４３，  １９９６）、Ｐエレメント（Ｇｌｏｏｒ，  Ｇ．Ｂ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２６０：９７−１１４，  ２００４）、Ｔｎ３（Ｉｃｈｉｋａｗａ  ＆  Ｏｈｔｓｕｂｏ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６５：１８８２９−３２，  １９９０）、細菌挿入配列（Ｏｈｔｓｕｂｏ  ＆  Ｓｅｋｉｎｅ，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０４：１−２６，  １９９６）、レトロウイルス（Ｂｒｏｗｎら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６：２５２５−９，  １９８９）、および酵母のレトロトランスポゾン（Ｂｏｅｋｅ  ＆  Ｃｏｒｃｅｓ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３：４０３−３４，  １９８９）。より多くの例としては、ｉｎｃｌｕｄｅ  ＩＳ５、Ｔｎ１０、Ｔｎ９０３、ＩＳ９１１、およびトランスポザーゼファミリー酵素の操作されたバージョン（Ｚｈａｎｇら，  （２００９）  ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．  ５：ｅ１０００６８９．  Ｅｐｕｂ  Ｏｃｔ．  １６；  Ｗｉｌｓｏｎ  Ｃ．ら  （２００７）  Ｊ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ７１：３３２−５）が挙げられる。本明細書で記載される方法はまた、単一のトランスポザーゼだけではなく、トランスポザーゼの組み合わせを含み得る。
【００５９】
いくつかの実施形態において、トランスポザーゼは、Ｔｎ５、ＭｕＡ、もしくはＶｉｂｒｉｏ  ｈａｒｖｅｙｉトランスポザーゼ、またはこれらの活性変異体である。他の実施形態において、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼまたはその活性変異体である。いくつかの実施形態において、Ｔｎ５トランスポザーゼは、活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼ（例えば、Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆら，  ＰＣＴ公開番号ＷＯ２００１／００９３６３、米国特許第５，９２５，５４５号、同第５，９６５，４４３号、同第７，０８３，９８０号、および同第７，６０８，４３４号、ならびにＧｏｒｙｓｈｉｎ  ａｎｄ  Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７３：７３６７，  １９９８を参照のこと）、またはその活性変異体である。いくつかの局面において、Ｔｎ５トランスポザーゼは、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１５／１６０８９５（本明細書に参考として援用される）に記載されるとおりのＴｎ５トランスポザーゼである。いくつかの実施形態において、Ｔｎ５トランスポザーゼは、融合タンパク質である。いくつかの実施形態において、Ｔｎ５トランスポザーゼ融合タンパク質は、融合された伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）タグを含む。いくつかの実施形態において、Ｔｎ５トランスポザーゼは、野生型配列に対してアミノ酸５４、５６および３７２において変異を含む活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼである。いくつかの実施形態において、活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼは、融合タンパク質であり、必要に応じて、ここでその融合されたタンパク質は、伸長因子Ｔｓ（Ｔｓｆ）である。いくつかの実施形態において、認識部位は、Ｔｎ５タイプトランスポザーゼ認識部位である（Ｇｏｒｙｓｈｉｎ  ａｎｄ  Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７３：７３６７，  １９９８）。一実施形態において、活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼと複合体を形成するトランスポザーゼ認識部位が使用される（例えば、ＥＺ−Ｔｎ５ＴＭトランスポザーゼ，  Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）。
【００６０】
いくつかの実施形態において、トランスポソーム複合体は、２分子のトランスポザーゼのダイマーである。いくつかの実施形態において、トランスポソーム複合体は、ホモダイマーであり、ここで２分子のトランスポザーゼは、同じタイプの第１のおよび第２のトランスポゾンに各々結合される（例えば、各モノマーに結合されたその２つのトランスポゾンの配列が、同じであり、「ホモダイマー（ｈｏｍｏｄｉｍｅｒ）」を形成する）。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される組成物および方法は、トランスポソーム複合体の２つの集団を使用する。いくつかの実施形態において、各集団中のトランスポザーゼは、同じである。いくつかの実施形態において、各集団中のトランスポソーム複合体は、ホモダイマーであり、ここで第１の集団は、各モノマーにおいて第１のアダプター配列を有し、第２の集団は、各モノマーにおいて異なるアダプター配列を有する。
【００６１】
いくつかの実施形態において、トランスポザーゼは、Ｔｎ５トランスポザーゼである。いくつかの実施形態において、トランスポザーゼ複合体は、第１のおよび第２のモノマーを含むトランスポザーゼ（例えば、Ｔｎ５トランスポザーゼ）ダイマーを含む。各モノマーは、第１のトランスポゾンおよび第２のトランスポゾンを含み、ここでその第１のトランスポゾンは、その３’末端において第１のトランスポゾン末端配列および第１のアダプター配列を含み（ここでダイマーの各モノマーにおけるアダプター配列は、同じであるかまたは異なる）、上記第２のトランスポゾンは、第１のトランスポゾン末端配列に少なくとも部分的に相補的な第２のトランスポゾン末端配列を含む。５’切断可能なリンカー局面のうちのいくつかの実施形態において、第１のトランスポゾンは、その５’末端において親和性エレメントに接続された切断可能なリンカーを含む。３’リンカーの局面のうちのいくつかの実施形態において、第２のトランスポゾンは、その３’末端において親和性エレメントに接続されたリンカー（必要に応じて切断可能）を含む。従って、好ましい実施形態において、各モノマーからの１個のトランスポゾンは、親和性エレメントを含む。しかし、いくつかの実施形態において、２個のモノマーのうちの一方のみが、親和性エレメントを含む。
【００６２】
アダプター配列
本明細書で記載される方法の実施形態のうちのいずれかにおいて、第１のトランスポゾンは、第１のアダプター配列を含む。いくつかの実施形態において、二次アダプターは、二次アダプターキャリアを使用して、本明細書で記載されるとおりのタグ化フラグメントに付加され、二次アダプターキャリアは、プライマー配列および二次アダプター配列を含む。アダプター配列は、ユニバーサル配列、プライマー配列、インデックス配列、捕捉配列、バーコード配列（例えば、計数またはエラー矯正のために使用される）、切断配列、配列決定関連配列、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される１またはこれより多くの機能的配列を含み得る。いくつかの実施形態において、アダプター配列は、プライマー配列を含む。他の実施形態において、アダプター配列は、プライマー配列およびインデックス配列またはバーコード配列を含む。プライマー配列はまた、ユニバーサル配列であり得る。本開示は、使用され得るアダプター配列のタイプに限定されず、当業者は、ライブラリー調製および次世代配列決定のために有用であり得るさらなる配列を認識する。
【００６３】
タグメンテーション反応によって核酸フラグメントの５’末端に移されるアダプター配列（例えば、第１のアダプター配列）は、例えば、ユニバーサル配列を含み得る。ユニバーサル配列は、２またはこれより多くの核酸フラグメントに共通するヌクレオチド配列の領域である。必要に応じて、その２またはこれより多くの核酸フラグメントはまた、配列差異のある領域を有する。複数の核酸フラグメントの異なるメンバーに存在し得るユニバーサル配列は、ユニバーサル配列に相補的な単一のユニバーサルプライマーを使用して、複数の異なる配列の複製または増幅を可能にし得る。
【００６４】
いくつかの実施形態において、本明細書で記載される組成物および方法は、トランスポソーム複合体の２つの集団を使用する。いくつかの実施形態において、各集団は、異なるプライマー配列を有するアダプター配列を含む。いくつかの実施形態において、第１の集団は、Ａ１４プライマー配列を含み、第２の集団は、Ｂ１５プライマー配列を含む。
【００６５】
親和性エレメントおよび親和性結合パートナー
親和性エレメントは、本明細書で使用される場合、共有結合により、または非共有結合により、親和性結合パートナーに結合するために使用され得る部分である。いくつかの局面において、親和性エレメントは、トランスポソーム複合体上にあり、親和性結合パートナーは、固体支持体上にある。
【００６６】
いくつかの実施形態において、親和性エレメントは、固体支持体上の親和性結合パートナーに結合し得るか、またはこれに非共有結合により結合され、それによって、トランスポソーム複合体を固体支持体に非共有結合により結合する。このような実施形態において、親和性エレメントは、例えば、ビオチンを含むかまたはビオチンであり、親和性結合パートナーは、アビジンもしくはストレプトアビジンを含むか、またはアビジンもしくはストレプトアビジンである。他の実施形態において、親和性エレメント／結合パートナーの組み合わせは、ＦＩＴＣ／抗ＦＩＴＣ、ジゴキシゲニン／ジゴキシゲニン抗体、もしくはハプテン／抗体を含むか、またはＦＩＴＣ／抗ＦＩＴＣ、ジゴキシゲニン／ジゴキシゲニン抗体、もしくはハプテン／抗体である。さらに適切な親和性の対としては、ジチオビオチン−アビジン、イミノビオチン−アビジン、ビオチン−アビジン、ジチオビオチン−スクシニル化アビジン、イミノビオチン−スクシニル化アビジン、ビオチン−ストレプトアビジン、およびビオチン−スクシニル化アビジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６７】
いくつかの実施形態において、親和性エレメントは、化学反応を介して親和性結合パートナーに結合し得るか、または固体支持体上の親和性結合パートナーとの反応によって共有結合的に結合され、それによって、固体支持体上のトランスポソーム複合体に共有結合的に結合する。いくつかの局面において、親和性エレメント／結合パートナーの組み合わせは、アミン／カルボン酸を含むか、またはアミン／カルボン酸である（例えば、標準的なペプチドカップリング反応を介して、当業者に公知の条件下で結合する（例えば、ＥＤＣまたはＮＨＳ媒介性カップリング））。２つの構成要素の反応は、親和性エレメントおよび結合パートナーを、アミド結合を通じて繋ぐ。あるいは、親和性エレメントおよび結合パートナーは、２つのクリック化学パートナー（例えば、アジド／アルキン（これが反応して、トリアゾール連結を形成する））であり得る。
【００６８】
切断可能なリンカー
２つの分子実態を連結する結合を壊す能力は、最初のハイブリダイゼーションの間にゲノムワイドオフターゲット捕捉を生じる可能性を崩壊させて、オフターゲットハイブリダイゼーション生成物の捕捉を低減する有効なツールであり得る。本明細書で定義される場合、切断可能なリンカーは、切断可能な結合を通じて一緒に繋がれる２つの機能的先端（ｈｅａｄ）を有する分子である。この２つの機能的先端は、そのリンカーを他の部分に結合するように働く；この場合、切断可能なリンカーは、第１のトランスポゾン配列の５’末端を親和性エレメントに接続する。切断可能なリンカーの切断条件および生物学的適用に従って分類されるそれらリンカーの概観は、Ｗａｇｎｅｒら，  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  ２０，  ５７１−５８２  （２０１２）（これは本明細書に参考として援用される）によって列挙される。
【００６９】
本明細書で使用されるとおりの切断可能なリンカーは、化学的または物理的手段（例えば、光分解、化学的切断、熱切断、または酵素による切断のような）を通じて切断され得るリンカーである。いくつかの実施形態において、その切断は、生化学的、化学的、酵素的、求核性、還元感受性の薬剤または他の手段によってであり得る。
【００７０】
いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、種々の手段によってフラグメント化され得るヌクレオチドまたはヌクレオチド配列を含み得る。例えば、切断可能なリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ部位；ＲＮＡｓｅで切断可能な少なくとも１個のリボヌクレオチド；ある種の化学的薬剤の存在下で切断可能なヌクレオチドアナログ；過ヨウ素酸塩（例えば）での処理によって切断可能なジオール連結；化学的還元剤で切断可能なジスルフィド基；光化学的切断を受けやすい可能性がある切断可能な部分；およびペプチダーゼ酵素または他の適切な手段によって切断可能なペプチドを含み得る。例えば、米国特許公開番号２０１２／０２０８７０５および２０１２／０２０８７２４、ならびにＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２０１２／０６１８３２（これらの各々は、その全体において参考として援用される）を参照のこと。
【００７１】
光切断可能な（ＰＣ）リンカーは、光切断誘導性の精製、タンパク質工学、化合物および生体分子の光活性化、ならびに多重アッセイのための光切断可能なマスタグ化（ｐｈｏｔｏｃｌｅａｖａｂｌｅ  ｍａｓｓ  ｔａｇｇｉｎｇ）のような種々の適用において使用されてきた。ＰＣリンカーは、特定の波長（３００〜３５０ｎｍ）のＵＶ光によって切断可能である光不安定性の官能基を含み得る。そのＰＣリンカーとしては、例えば、適切なスペクトル範囲内のＵＶ光に曝される場合に切断され得る１０原子ユニットを含み得る。このような光切断可能なリンカーおよびホスホロアミダイト試薬は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）、Ａｍｂｅｒｇｅｎ、およびＧｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈから市販されている。光切断可能なヌクレオチド組成物の使用は、米国特許第７，０５７，０３１号、同第７，５４７，５３０号、同第７，８９７，７３７号、同第７，９６４，３５２号および同第８，３６１，７２７号（これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される）に詳細に記載される。
【００７２】
いくつかの実施形態において、切断は、切断可能なヌクレオチドまたは核塩基を切断可能なリンカーの中に組み込むことによって酵素によって媒介される。このような核塩基またはヌクレオチド部分の例としては、ウラシル、ウリジン、８−オキソ−グアニン、キサンチン、ヒポキサンチン、５，６−ジヒドロウラシル、５−メチルシトシン、チミジン−ダイマー、７−メチルグアノシン、８−オキソ−デオキシグアノシン、キサントシン、イノシン、デオキシイノシン、ジヒドロウリジン、ブロモデオキシウリジン、ウリジン、５−メチルシチジン、デオキシウリジン、５，６−ジヒドロキシチミン、チミングリコール、５−ヒドロキシ−５−メチルヒダントイン（５−ｈｙｄｒｏｘｙ−５−ｍｅｔｈｙｌｈｙｄａｎｔｏｎ）、ウラシルグリコール、６−ヒドロキシ−５，６−ジヒドロチミン、メチルタートロニルウレア（ｍｅｔｈｙｌ  ｔａｒｔｒｏｎｙｌ  ｕｒｅａ）（１，２）、または無塩基部位が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、完全な切断を可能にするために十分な数の切断可能なヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、１〜１０個の切断可能なヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、少なくとも１個の切断可能なヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、少なくとも１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の切断可能なヌクレオチドを含む。好ましい実施形態において、切断可能なリンカーは、１個またはこれより多くのウラシルヌクレオチドおよび必要に応じて他の標準的ＤＮＡ塩基を含む。いくつかの実施形態において、ＰＣＲ後のさらなる酵素工程が、切断可能なヌクレオチドまたはヌクレオシド位置において切断可能なリンカーを切断する。このような酵素の例としては、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ（ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼまたはＵＮＧともいわれる））、ホルムアミドピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、ＲＮａｓｅＨ、Ｅｎｄｏ  ＩＩＩ、Ｅｎｄｏ  ＩＶ、Ｅｎｄｏ  Ｖ、Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩ、Ｋｌｅｎｏｗ、またはアピラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、核酸の中のウラシル塩基を切断する酵素およびＡＰヌクレアーゼを含む酵素のブレンドが使用される。酵素の有効濃度は、０．０２５  Ｕ／μｌ〜１０  Ｕ／μｌの範囲に及び得る。好ましい実施形態において、酵素のブレンドは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよびＥｎｄｏ  ＩＶである。本明細書で記載される方法における使用のための市販の酵素混合物としては、ＵＤＥＭ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）が挙げられる。さらに別の実施形態において、酵素のブレンドは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼおよびＥｎｄｏ  ＶＩＩＩである（ＵＳＥＲ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）またはＵｒａｃｉｌ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）として市販されている）。切断は、例えば、小さなオリゴヌクレオチドを捕捉しないで残すビーズベースの方法論を使用する標的核酸の除去のような核酸精製の間に、当業者に公知の多くの方法によって除去され得る短いオリゴヌクレオチド上に５’親和性エレメント（例えば、ビオチン部分）を残す。その切断は、親和性エレメント（例えば、ビオチン）と５’タグ化標的フラグメントとの間の連結を壊す。好ましい実施形態において、切断可能なリンカーは、トランスポゾン二重鎖のトランスポゾン末端配列  の５’末端に隣接して結合される。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、ビオチンに連結される。他の実施形態において、ビオチンは、ストレプトアビジン被覆ビーズに付着される。
【００７４】
トランスポソーム複合体および３’リンカーを有するトランスポゾン
他の局面において、リンカーは、第２のトランスポゾンの３’末端に接続され、ここでそのリンカーは、第２のトランスポゾンを固体支持体に接続し得る。第１のおよび第２のトランスポゾンが、トランスポソーム複合体の一部である場合、リンカーは、その複合体を固体支持体に接続するように働く。このような局面において、リンカーの第１の末端は、第２のトランスポゾンの３’末端に結合され、リンカーの第２の末端は、親和性エレメントに結合される。親和性エレメントは、固体支持体上の親和性結合パートナーに（共有結合により、または非共有結合により）結合し得る。いくつかの局面において、親和性エレメントは、固体支持体上の親和性結合パートナーに（共有結合により、または非共有結合により）結合され、固体支持体に結合したトランスポソーム複合体を提供する。いくつかの局面において、リンカーは、切断可能なリンカーである。これらの複合体は、３’−リンカートランスポソーム複合体および支持体に結合した３’−リンカートランスポソーム複合体である。いくつかの実施形態において、親和性エレメントは、ビオチンであり、親和性結合パートナーは、ストレプトアビジンである。
【００７５】
一実施形態において、リンカーは、第２のトランスポゾンの３’末端に共有結合により結合される。いくつかの実施形態において、リンカーは、第２のトランスポゾン末端配列の３’末端に共有結合により結合される。例えば、本明細書で記載されるリンカーは、第２のトランスポゾンの３’末端ヒドロキシ基に共有結合によりかつ直接的に結合され得るので、−Ｏ−連結を形成し得るか、または別の基（例えば、ホスフェートまたはエステル）を通じて共有結合され得る。あるいは、本明細書で記載されるリンカーは、第２のトランスポゾンまたは第２のトランスポゾン末端配列のホスフェート基に、共有結合により結合され得る（例えば、ホスフェート基を介して３’ヒドロキシルに共有結合により結合され得るので、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）３−連結を形成し得る）。
【００７６】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるトランスポソーム複合体は、リンカーを介して固体支持体に固定化される。いくつかのこのような実施形態において、親和性エレメントは、ビオチンであり、固体支持体は、ストレプトアビジンを含む。いくつかのさらなる実施形態において、固体支持体は、ビーズを含むかまたはビーズである。一実施形態において、ビーズは、常磁性ビーズである。
【００７７】
いくつかの実施形態において、リンカーおよび親和性エレメントは、式（Ｉ）の構造：
【化３】
2020510401.tif 000005
を有し、ここで：
ＡＥは、親和性エレメントであり；
Ｙは、Ｃ２−６アルキレンであり；
Ｘ１は、Ｏ、ＮＲ１、またはＳであり；
ここでＲ１は、ＨまたはＣ１−１０アルキルであり；
ｎは、１、２、３、４、５、および６からなる群より選択される整数であり；
Ｘ２は、Ｏ、ＣＨ２またはＳであり；
Ｒａは、Ｈまたは−ＯＨであり；そして
Ｚは、ＲａがＨである場合に非存在であるか、またはＲａがＨもしくはＯＨである場合にＣＨ２であり；
ここで
【化４】
2020510401.tif 000006
は、第２のトランスポゾンへの接続点のマークである。
【００７８】
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、ＡＥは、必要に応じて置換されたビオチンまたはアミノ基である。他の実施形態において、ＡＥは、必要に応じて置換されたビオチンである。このような実施形態において、ビオチンは、Ｃ１−４アルキルで必要に応じて置換される。他の実施形態において、ＡＥは、ビオチンである。
【００７９】
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｙは、Ｃ２−６アルキレンである。他の実施形態において、Ｙは、Ｃ２−５アルキレンである。他の実施形態において、Ｙは、Ｃ２−４アルキレンである。他の実施形態において、Ｙは、Ｃ２−３アルキレンである。他の実施形態において、Ｙは、非分枝状アルキレンである。他の実施形態において、Ｙは、Ｃ２アルキレンである。他の実施形態において、Ｙは、Ｃ３アルキレンである。他の実施形態において、Ｙは、Ｃ４アルキレンである。他の実施形態において、Ｙは、エチレンである。他の実施形態において、Ｙは、プロピレンである。他の実施形態において、Ｙは、ブチレンである。
【００８０】
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｘ１は、ＮＲ１であり、ここでＲ１は、ＨまたはＣ１−１０アルキルである。いくつかのこのような実施形態において、Ｒ１は、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｒ１は、Ｃ１−３アルキルである。他の実施形態において、Ｘ１は、Ｏである。他の実施形態において、Ｘ１は、Ｓである。
【００８１】
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、ｎは、１である。他の実施形態において、ｎは、２である。他の実施形態において、ｎは、３である。他の実施形態において、ｎは、４である。
【００８２】
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｘ２は、ＣＨ２である。いくつかの他の実施形態において、Ｘ２は、Ｏである。他の実施形態において、Ｘ２は、Ｓである。
【００８３】
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｒａは、Ｈである。他の実施形態において、Ｒａは、−ＯＨである。
【００８４】
式（Ｉ）のいくつかの実施形態において、Ｚは、非存在であり、Ｒａは、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｚは、ＣＨ２であり、Ｒａは、Ｈである。いくつかの実施形態において、Ｚは、ＣＨ２であり、Ｒａは、ＯＨである。
【００８５】
いくつかの実施形態において、リンカーおよび親和性エレメントは、式（Ｉ’）の構造：
【化５】
2020510401.tif 000007
を有し、ここでＡＥ、Ｙ、Ｘ１、ｎ、Ｘ２は、式（Ｉ）に関して本明細書で記載されるとおりに定義され、Ｚは、非存在であるかまたはＣＨ２である。
【００８６】
いくつかの実施形態において、リンカーおよび親和性エレメントは、式（Ｉａ）の構造：
【化６】
2020510401.tif 000008
を有し、ここでＸ１、ｎ、Ｘ２、Ｒａ、およびＺは、式（Ｉ）に関して本明細書で記載されるとおりに定義される。いくつかの実施形態において、Ｒａは、Ｈである。
【００８７】
いくつかの実施形態において、リンカーおよび親和性エレメントは、式（Ｉｂ）の構造：
【化７】
2020510401.tif 000009
を有し、ここでＡＥは、式（Ｉ）に関して本明細書で定義されるとおりであり；ｎは、１または２である。
【００８８】
式（Ｉｂ）のうちのいくつかの局面において、ＡＥは、必要に応じて置換されたビオチンまたはアミノ基である。いくつかの実施形態において、ＡＥは、ビオチンである。
【００８９】
いくつかの実施形態において、リンカーおよび親和性エレメントは、式（Ｉｃ）の構造：
【化８】
2020510401.tif 000010
を有し、ここでＡＥは、式（Ｉ）に関して本明細書で定義されるとおりであり；Ｘ２は、ＯまたはＣＨ２であり；ｎは、１または２であり；そしてＺは、非存在であるか、またはＣＨ２である。
【００９０】
式（Ｉｃ）のいくつかの実施形態において、ＡＥは、必要に応じて置換されたビオチンまたはアミノ基である。いくつかの実施形態において、ＡＥは、ビオチンである。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、Ｏである。いくつかの実施形態において、Ｘ２は、ＣＨ２である。いくつかの実施形態において、ｎは、１である。いくつかの実施形態において、ｎは、２である。いくつかの実施形態において、Ｚは、非存在である。いくつかの実施形態において、Ｚは、ＣＨ２である。いくつかの実施形態において、ｎは、１であり、Ｘ２は、Ｏであり、そしてＺは、非存在である。いくつかの実施形態において、ｎは、１であり、Ｘ２は、ＣＨ２であり、Ｚは、ＣＨ２である。
【００９１】
いくつかの実施形態において、リンカーおよび親和性エレメントは、以下からなる群：
【化９】
2020510401.tif 000011
より選択される構造を有する。
【００９２】
いくつかの実施形態において、リンカーおよび親和性エレメントは、構造（Ｉ（ｃ））を有する。
【００９３】
いくつかの実施形態において、アダプター配列は、プライマー配列を含む。いくつかの実施形態において、プライマー配列は、Ａ１４またはＢ１５プライマー配列である。いくつかの実施形態において、プライマー配列は、Ｐ５プライマー配列またはＰ７プライマー配列である。いくつかの実施形態において、トランスポザーゼは、ダイマーであり、各モノマーは、本明細書で記載されるとおりのアダプター配列を有するトランスポゾン二重鎖に結合され、ここで各モノマーの中のアダプター配列は、同じである。トランスポザーゼがダイマーである実施形態において、一方のまたは両方のモノマーは、トランスポソーム複合体を固体支持体に接続するリンカーを含む。各モノマーは、アダプター配列を有する第１のトランスポゾンを含む。
【００９４】
固体支持体
用語「固体表面（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｒｆａｃｅ）」、「固体支持体（ｓｏｌｉｄ  ｓｕｐｐｏｒｔ）」および他の文法的等価物は、トランスポソーム複合体の結合に適切であるか、または適切であるように改変され得る任意の材料に言及する。当業者によって認識されるように、可能な基材の数は複数である。可能な基材としては、ガラスおよび改変または官能化されたガラス、プラスチック（アクリル物質、ポリスチレンならびにスチレンおよび他の材料のコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）などが挙げられる）、ポリサッカリド、ナイロンまたはニトロセルロース、セラミック、樹脂、シリカまたはシリカベースの材料（ケイ素および改変ケイ素を含む）、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバー束、ビーズ、常磁性ビーズ、および種々の他のポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
いくつかのこのような実施形態において、トランスポソーム複合体は、本明細書で記載されるとおりのリンカーを介して固体支持体上に固定化される。いくつかのさらなる実施形態において、固体支持体は、チューブ、プレートのウェル、スライド、ビーズ、もしくはフローセル、またはこれらの組み合わせを含むか、あるいはチューブ、プレートのウェル、スライド、ビーズ、もしくはフローセル、またはこれらの組み合わせである。いくつかのさらなる実施形態において、固体支持体は、ビーズを含むかまたはビーズである。一実施形態において、ビーズは、常磁性ビーズである。
【００９６】
本明細書で示される方法および組成物において、トランスポソーム複合体は、固体支持体に固定化される。一実施形態において、固体支持体は、ビーズである。適切なビーズ組成としては、プラスチック、セラミック、ガラス、ポリスチレン、メチルスチレン、アクリルポリマー、常磁性材料、ソリアゾル（ｔｈｏｒｉａ  ｓｏｌ）、カーボングラファイト、二酸化チタン、ラテックスまたは架橋デキストラン（例えば、セファロース）、セルロース、ナイロン、架橋ミセルおよびＴＥＦＬＯＮ（登録商標）、ならびに固体支持体に関して本明細書で概説される任意の他の材料が挙げられるが、これらに限定されない。ある種の実施形態において、マイクロスフェアは、磁性マイクロスフェアまたはビーズ（例えば、常磁性粒子、スフェアまたはビーズ）である。ビーズは、球形である必要はなく；不規則な粒子が使用されてもよい。代わりにまたはさらに、ビーズは、多孔性であり得る。ビーズサイズは、ナノメートル（例えば、１００ｎｍ）からミリメートル（例えば、１ｍｍ）までの範囲に及び、約０．２ミクロンから約２００ミクロンまでのビーズが好ましく、約０．５〜約５ミクロンが特に好ましいが、いくつかの実施形態において、より小さなまたはより大きなビーズが使用されてもよい。ビーズは、親和性結合パートナーで被覆され得、例えば、ビーズは、ストレプトアビジン被覆され得る。いくつかの実施形態において、ビーズは、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  ＭｙＯｎｅストレプトアビジンＣ１ビーズ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号６５６０１）、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ＭａｇｎｅＳｐｈｅｒｅ  Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ粒子（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号＃Ｚ５４８１）、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｍａｇｎｅｔｉｃビーズ（ＮＥＢカタログ番号＃Ｓ１４２０Ｓ）およびＭａｘＢｅａｄ  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ａｂｎｏｖａカタログ番号Ｕ００８７）である。固体支持体はまた、スライド、例えば、フローセルまたはトランスポソーム複合体が上に固定化され得るように改変された他のスライドであり得る。
【００９７】
いくつかの実施形態において、親和性結合パートナーは、１０００〜約６０００ｐｍｏｌ／ｍｇ、または約２０００〜約５０００ｐｍｏｌ／ｍｇ、または約３０００〜約５０００ｐｍｏｌ／ｍｇ、または約３５００〜約４５００ｐｍｏｌ／ｍｇという密度において、固体支持体またはビーズ上に存在する。
【００９８】
一実施形態において、固体表面は、サンプルチューブの内表面である。一例において、サンプルチューブは、ＰＣＲチューブである。別の実施形態において、固体表面は、捕捉膜である。一例において、その捕捉膜は、ビオチン捕捉膜（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから入手可能）である。別の例において、捕捉膜は、濾紙である。本開示のいくつかの実施形態において、固体支持体は、不活性基材またはマトリクス（例えば、ガラススライド、ポリマービーズなど）から構成され、例えば、分子（例えば、ポリヌクレオチド）への共有結合的な結合を可能にする層の適用または反応性基を含む中間物質の被覆によって官能化されている。このような支持体の例としては、不活性基材（例えば、ガラス、特にＷＯ２００５／０６５８１４およびＵＳ２００８／０２８０７７３（これらの内容は、それらの全体において本明細書に参考として援用される）に記載されるとおりのポリアクリルアミドヒドロゲル）上で支持されたポリアクリルアミドヒドロゲルが挙げられるが、これらに限定されない。タグメンテーションしたＤＮＡライブラリーの構築のために固体表面上でＤＮＡをタグメンテーションする（フラグメント化およびタグ化する）方法は、ＷＯ２０１６／１８９３３１およびＵＳ２０１４／００９３９１６Ａ１（これらは、それらの全体において本明細書に参考として援用される）に記載される。
【００９９】
本開示のいくつかのさらなる実施形態は、本明細書で記載されるように固体支持体上に固定化されたトランスポソーム複合体を含む固体支持体に関連し、ここでそのリンカーおよび親和性エレメントは、本明細書で記載されるとおりの式（Ｉ）、（Ｉ’）、（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、（Ｉ（ａ））、（Ｉ（ｂ））、または（Ｉ（ｃ））の構造を有する。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるトランスポソーム複合体は、親和性エレメントを介して固体支持体に固定化される。いくつかのこのような実施形態において、固体支持体は、親和性結合パートナーとしてのストレプトアビジンを含み、親和性エレメントは、ビオチンである。いくつかのさらなる実施形態において、固体支持体は、ビーズを含むかまたはビーズである。一実施形態において、ビーズは、常磁性ビーズである。
【０１００】
いくつかの実施形態において、トランスポソーム複合体は、固体支持体（例えば、ビーズ）上に特定の密度または密度範囲において固定化される。ビーズ上の複合体の密度は、その用語が本明細書で使用される場合、固定化反応の間の溶液中のトランスポソーム複合体の濃度に言及する。その複合体密度は、その固定化反応が定量的であると仮定する。複合体が特定の密度で一旦形成された後、その密度は、表面に結合したトランスポソーム複合体のバッチに関して一定のままである。得られたビーズは希釈され得、その希釈された溶液中の複合体の得られる濃度は、希釈率によって除算されたビーズの好ましい密度である。希釈ビーズストックは、それらの調製からの複合体密度を保持するが、その複合体は、希釈した溶液中で低い濃度で存在する。希釈工程は、ビーズ上の複合体の密度を変化させないので、ライブラリー収量に影響を及ぼすが、挿入物（フラグメント）サイズには影響を及ぼさない。いくつかの実施形態において、その密度は、約５ｎＭ〜約１０００ｎＭの間、または約５〜１５０ｎＭの間、または約１０ｎＭ〜８００ｎＭの間である。他の実施形態において、密度は、約１０ｎＭ、または約２５ｎＭ、または約５０ｎＭ、または約１００ｎＭ、または約２００ｎＭ、または約３００ｎＭ、または約４００ｎＭ、または約５００ｎＭ、または約６００ｎＭ、または約７００ｎＭ、または約８００ｎＭ、または約９００ｎＭ、または約１０００ｎＭである。いくつかの実施形態において、密度は、約１００ｎＭである。いくつかの実施形態において、密度は、約３００ｎＭである。いくつかの実施形態において、密度は、約６００ｎＭである。いくつかの実施形態において、密度は、約８００ｎＭである。いくつかの実施形態において、密度は、約１００ｎＭである。いくつかの実施形態において、密度は、約１０００ｎＭである。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、ビーズまたは常磁性ビーズであり、１０，０００個を超える、２０，０００個、３０，０００個、４０，０００個、５０，０００個、または６０，０００個のトランスポソーム複合体が各ビーズに結合されている。
【０１０２】
固体支持体に結合したトランスポソーム複合体の異なる密度は、異なる長さ（例えば、異なる挿入物サイズ）のフラグメントを生じる。例えば、図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃに示されるように、種々の複合体密度が種々の挿入物サイズをもたらす。挿入物サイズは、約５０ｂｐ〜約１０００ｂｐ、または約１００〜約６００ｂｐ、または約１７５〜約２００ｂｐ、または約５００ｂｐであり得る。
【０１０３】
改変されたオリゴヌクレオチドおよび固定化されたトランスポソーム複合体の調製法
本開示は、本明細書に記載されるとおりの、改変されたオリゴヌクレオチド、トランスポソーム複合体、および固体支持体に結合したトランスポソーム複合体を調製するための方法をさらに提供する。いくつかの局面において、このような方法は、トランスポザーゼを、本明細書で記載されるとおりの第１のおよび第２のトランスポゾンで、複合体を形成するために適した条件下で処理する工程を包含する。固体支持体に結合したトランスポソーム複合体を調製するための方法は、本明細書で記載されるとおりのトランスポソーム複合体を、親和性結合パートナーを含む固体支持体とともに、親和性エレメントが親和性結合パートナーと（共有結合により、または非共有結合により）結合するために十分な条件下でインキュベートする工程を包含する。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、改変されたオリゴヌクレオチドを調製するための方法がある。いくつかの局面において、親和性エレメントに接続されたリンカーを有する改変されたオリゴヌクレオチドを調製するための方法は、当該分野で公知である。本明細書で企図されるある種の方法は、第１の反応性官能基（Ｌ−ＦＧ１）を含むリンカー（または切断可能なリンカー）試薬と、第２の反応性官能基（Ｎ−ＦＧ２）を含むヌクレオチドとを反応さる工程を包含し、それによって、その第１のおよび第２の反応性官能基が反応して、そのリンカーとヌクレオチドとの間に共有結合（ＣＢ）を有するリンカー−ヌクレオチド生成物（Ｌ−（ＣＢ）−Ｎ）を形成する。いくつかの実施形態において、そのリンカー試薬は、ＡＥ部分を含む（ＡＥ−リンカー−ＦＧ１）。他の実施形態において、そのリンカー試薬は、リンカー構造の一部を含み、ＡＥは、第２のカップリング反応を通じて導入されて、完全なＡＥ−リンカー構造を生成する。
【０１０５】
その第１の反応性官能基は、例えば、カルボキシル、活性化カルボキシル（例えば、エステル、ＮＨＳエステル、アシルハライド、無水物など）、アジド、アルキン、ホルミル、またはアミノであり得る。いくつかの実施形態において、第１の反応性官能基は、活性化カルボキシル、好ましくはＮＨＳエステルである。
【０１０６】
第２の反応性官能基は、ヌクレオチド上の任意の適切な位置に存在し得る。いくつかの実施形態において、第２の反応性官能基は、ヌクレオチドの３’ヒドロキシル位置または５’ホスフェート位置に、天然の置換基の代わりにもしくはつなぎ（ｔｅｔｈｅｒ）（例えば、アルキレンまたはヘテロアルキレン基）、またはヌクレオチドヒドロキシルの場合にはホスフェート基を介してそこに付加してのいずれかで存在する。いくつかの実施形態において、第２の反応性官能基は、Ｃ２−１０−アルキルアミノ基を含む。いくつかの実施形態において、第２の反応性官能基は、ヘキシルアミノ基を含む。いくつかの実施形態において、第２の反応性官能基は、−ＯＰ（Ｏ）３−（ＣＨ２）６−ＮＨ２である。いくつかの実施形態において、第２の反応性官能基は、ヌクレオチドの３’ヒドロキシルを通じて、ホスフェートつなぎを介してヌクレオチドに接続される。
【０１０７】
改変されたヌクレオチドは、リンカーを結合する前に、オリゴヌクレオチドの一部であり得、この場合、ヌクレオチドは、例えば、オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端に存在し得る。あるいは、リンカーは、ヌクレオチドにまず結合され、改変されたヌクレオチドは、標準的手段によってオリゴヌクレオチドを合成するにあたって出発物質として使用される。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、式（Ｉ）のリンカーは、ヌクレオチド（例えば、シチジン）の３’位に接続される。いくつかの実施形態において、改変されたヌクレオチドを作製するための方法は、式（ＩＩ）の化合物と式（ＩＩＩ）の化合物であって：
【化１０】
2020510401.tif 000012
ここでＡＥ、Ｙ、ｎ、Ｘ２、Ｒａ、およびＺは、本明細書で定義されるとおりであり；
−Ｃ（Ｏ）Ｘ３は、活性化エステル（例えば、エステル、アシルハライド、エステル無水物、またはＮＨＳエステル）であり；そして
Ｘ４は、−ＯＨまたは−ＮＨ２基である、
式（ＩＩ）の化合物と式（ＩＩＩ）の化合物とを反応させて、［式（Ｉ）］−ヌクレオチドの化合物を形成する工程を包含する。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、式（ＩＩ）の化合物は、ＡＥ−（ＣＨ２）４Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ＮＨＳであり、式（ＩＩＩ）の化合物は、Ｈ２Ｎ−（ＣＨ２）６−ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−ヌクレオチドであり、そして生成物は、ＡＥ−（ＣＨ２）４Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、ホスフェートは、ヌクレオチド（例えば、シチジン）の３’ヒドロキシル基に接続される。いくつかの実施形態において、［式（Ｉ）］−ヌクレオチドの化合物（またはＡＥ−（ＣＨ２）４Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−ヌクレオチド）は、さらなるヌクレオチドと反応して、［式（Ｉ）］−オリゴヌクレオチド（またはＡＥ−（ＣＨ２）４Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−オリゴヌクレオチド）を形成する。いくつかの実施形態において、第２のトランスポゾンは、［式（Ｉ）］−オリゴヌクレオチド（またはＡＥ−（ＣＨ２）４Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）６−ＯＰ（Ｏ）（Ｏ−）Ｏ−オリゴヌクレオチド）である。
【０１１０】
本開示はまた、本明細書で記載される改変されたオリゴヌクレオチドを使用してトランスポソーム複合体を調製するための方法に関する。このような方法は、トランスポザーゼ、第１のトランスポゾン、および第２のトランスポゾン（本明細書で定義されるとおり）を混合する工程を包含し、ここで第１のおよび第２のトランスポゾン末端配列は、互いにアニールされて、トランスポソーム複合体を形成する。本明細書で記載される場合、第１のおよび第２のトランスポゾンのうちの一方は、親和性エレメントを（第１のトランスポゾンの場合には５’末端に；第２のトランスポゾンの場合には３’末端に）含む。いくつかの実施形態において、その方法は、親和性エレメントを、親和性結合パートナーを含む固体支持体に結合する工程をさらに包含する。その結合は、トランスポソーム複合体の形成前または形成後に行われ得る。
【０１１１】
配列決定フラグメントの調製−タグ化フラグメントの増幅
いくつかの局面において、標的核酸から配列決定フラグメントを調製するための方法が提供され、上記方法は、本明細書で記載されるとおりの固体支持体上に固定化された本明細書に記載されるトランスポソーム複合体を含む固体支持体を提供する工程；その固体支持体と標的核酸とを、その標的核酸をフラグメント化し、第１のトランスポゾンをそのフラグメントの５’末端に連結する条件下で接触させる工程を包含し、それによって、そのフラグメントは、固体支持体上に固定化される。いくつかの局面において、その方法は、そのフラグメント化された核酸を増幅する工程をさらに包含する。ある実施形態において、そのフラグメント条件は、トランスポソーム複合体を使用して、その標的核酸をフラグメント化およびタグ化することによって、タグメンテーションするために適した条件である。
【０１１２】
本明細書で記載される方法のいくつかの実施形態において、フラグメント化およびタグ化の後に、その方法は、トランスポザーゼを５’タグ化標的フラグメントから除去して、非複合体化５’タグ化標的フラグメントを提供する工程をさらに包含する。トランスポザーゼの除去は、化学的条件（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような変性剤での処理）下で達成され得る。このような方法は、５’タグ化標的フラグメントの完全二重鎖化したバージョンを生成する工程をさらに包含し得る。その完全二重鎖を生成する工程は、そのアニールされた（しかし連結されていない）第２のトランスポゾン（ＡＥ−リンカー−第２のトランスポゾン）を５’タグ化標的フラグメントから除去する工程、およびその５’タグ化標的フラグメントを伸長して、完全二重鎖化した５’タグ化標的フラグメントを生成する工程を包含し得る。その生成する工程は、例えば、非複合体化５’タグ化標的フラグメントを、第２のトランスポゾンを選択的に変性するために十分な温度へと加熱し、そのフラグメントの残りの二重鎖領域を無傷なままにすることによって達成され得る。伸長する工程は、ｄＮＴＰおよび適切なポリメラーゼの存在下で達成され得る。あるいは、その生成する工程は、非複合体化５’タグ化標的フラグメントを単一のヌクレオチド（ｄＮＴＰｓ）およびポリメラーゼの存在下でインキュベートすることによって、一反応において達成され得る。いくつかの実施形態において、そのインキュベートする工程は、そのアニールされた第２のトランスポゾンを変性し、その残りの二重鎖を伸長するために十分な１またはこれより多くの温度において加熱する工程を包含する。他の実施形態において、ポリメラーゼは、鎖置換ポリメラーゼであり、これは、第２のトランスポゾンを除去し、残りの二重鎖を伸長して、完全二重鎖化した５’タグ化標的フラグメントを生成するように働く。適切なポリメラーゼとしては、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ、Ｐｆｕ、および類似の酵素が挙げられる。適切なポリメラーゼとしては、鎖置換ポリメラーゼ（例えば、Ｂｓｔ、Ｂｓｕ  Ｖｅｎｔ、Ｋｌｅｎｏｗ、および類似の酵素）が挙げられる。
【０１１３】
いくつかの局面において、その方法は、完全二重鎖化した５’タグ化標的フラグメントを増幅する工程をさらに包含する。その増幅する工程は、任意の適切な増幅法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、ローリングサークル増幅法（ＲＣＡ）、または多置換増幅法（ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＭＤＡ）によって行われ得る。いくつかの実施形態において、増幅する工程は、ＰＣＲによって行われる。いくつかの実施形態において、増幅および伸長する工程は、ｄＮＴＰとポリメラーゼの存在下で反応させることによって、一反応工程において行われる。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、その増幅する工程は、１またはこれより多くの二次アダプター配列をその完全二重鎖化した５’タグ化標的フラグメントに付加して、配列決定フラグメントを形成するように働く。その増幅する工程は、各末端にプライマー配列を含む完全二重鎖化した５’タグ化標的フラグメントを、二次アダプターキャリア、単一のヌクレオチド、およびポリメラーゼとともに、その標的フラグメントを増幅しその二次アダプターキャリア（またはその相補体）を組み込むために十分な条件下でインキュベートすることによって達成され、ここでその二次アダプターキャリアは、プライマー配列に対する相補体および二次アダプター配列を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、二次アダプターキャリアは、プライマー配列、インデックス配列、バーコード配列、精製タグ、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、二次アダプターキャリアは、プライマー配列を含む。いくつかの実施形態において、二次アダプターキャリアは、インデックス配列を含む。いくつかの実施形態において、二次アダプターキャリアは、インデックス配列およびプライマー配列を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、完全二重鎖化した５’タグ化標的フラグメントは、各末端において異なるプライマー配列を含む。このような実施形態において、各二次アダプターキャリアは、その２種のプライマー配列のうちの一方に対する相補体を含む。いくつかの実施形態において、２種のプライマー配列は、Ａ１４プライマー配列およびＢ１５プライマー配列である。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、複数の二次アダプターが増幅によって付加される。いくつかの実施形態において、二次アダプターキャリアは各々、２種のプライマー配列のうちの一方を含む。いくつかの実施形態において、二次アダプターキャリアは各々、複数のインデックス配列のうちの１つを含む。いくつかの実施形態において、二次アダプターキャリアは、Ｐ５プライマー配列を有する二次アダプターおよびＰ７プライマー配列を有する二次アダプターを含む。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、配列決定フラグメントは、フローセル上に沈積される。いくつかの実施形態において、配列決定フラグメントは、フローセルまたは表面にグラフト化された相補的プライマーにハイブリダイズされる。いくつかの実施形態において、配列決定フラグメントの配列は、アレイ配列決定法または次世代配列決定法（例えば、合成時配列決定（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ））によって検出される。
【０１１９】
Ｐ５およびＰ７プライマーは、種々のＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームで配列決定するために、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，  Ｉｎｃ．によって販売される市販のフローセルの表面上で使用される。そのプライマー配列は、米国特許公開番号２０１１／００５９８６５  Ａ１（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載される。Ｐ５およびＰ７プライマーの例（これは、５’末端においてアルキン末端化され得る）は、以下：
Ｐ５：    ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡＣ（配列番号１）
Ｐ７：    ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧ＊ＡＴ（配列番号２）
およびこれらの誘導体を含む。
【０１２０】
いくつかの例では、Ｐ７配列は、Ｇ＊位置において改変されたグアニン、例えば、８−オキソ−グアニンを含む。他の例では、上記＊は、Ｇ＊と隣接する３’Ａとの間の結合がホスホロチオエート結合であることを示す。いくつかの例では、Ｐ５および／またはＰ７プライマーは、非天然のリンカーを含む。必要に応じて、Ｐ５およびＰ７プライマーのうちの一方または両方は、ポリＴテールを含み得る。そのポリＴテールは、一般に、上記で示される配列の５’末端に、例えば、５’塩基と末端アルキンユニットとの間に位置するが、いくつかの場合には、３’末端に位置し得る。そのポリＴ配列は、任意の数のＴヌクレオチド（例えば、２〜２０個）を含み得る。Ｐ５およびＰ７プライマーが例として示される一方で、任意の適切な増幅プライマーが本明細書で示される例の中で使用され得ることは、理解されるべきである。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、上記方法の増幅工程は、ＰＣＲまたは等温増幅法を含む。いくつかの実施形態において、上記方法の増幅工程は、ＰＣＲを含む。
【０１２２】
図面の説明
図１は、トランスポソーム複合体を調製し、これを固体表面（例えば、ビーズ）に、第１のトランスポゾンの５’末端に連結した親和性エレメントを通じて付着させるための方法の例示的工程を図示する。この例において、アニールした第１のおよび第２のトランスポゾン（トランスポゾン末端配列を含むアニールされた二本鎖領域および一本鎖領域を含むオリゴヌクレオチド）の２つの集団（１３０ａおよび１３０ｂ）（ここで各集団において、第１のトランスポゾンは、２種のアダプター配列のうちの一方および５’末端における親和性エレメント（１１０、ここで＊は、親和性エレメントを示す）（例えば、ビオチン）を含む）、例えば、２種のアダプター配列（例えば、Ａ１４およびＢ１５のようなプライマー配列）を含む複数のビオチン化された第１のおよび第２のトランスポゾンが、生成される。示されるように、テンプレート核酸に移される二重鎖トランスポゾン配列の鎖は、第１のトランスポゾンであり、これは親和性エレメント（例えば、ビオチン）を有する。工程１１５において、オリゴヌクレオチドの各集団（１３０ａおよび１３０ｂ）は、トランスポザーゼモノマー（例えば、Ｔｎ５（１３５））と代表的には別個の反応において複合体化されて、トランスポソーム複合体（１４０）の２種の別個の集団を作り、各々は、異なるアダプター配列（例えば、Ａ１４およびＢ１５のようなプライマー配列）を有する。複合体の２つの集団が形成された後、それらは、基材（この例では、ビーズ）上に固定化される（１２０）。いくつかの実施形態において、その２つの集団は、固定化の前に合わされ、各集団からの複合体を含む固体表面またはビーズを生じる。他の実施形態において、その２つの集団は、別個に固定化され、２種の固体表面またはビーズを生じ、各々は、２種の複合体タイプの内の一方を含む。トランスポソーム複合体形成の後、トランスポソーム１４０は、親和性結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）で被覆された表面１４５に結合される。
【０１２３】
図２は、本明細書で記載される５’リンカーストラテジーを使用するトランスポソームの固定化の後の、ビーズ表面上でのタグメンテーションおよびライブラリー調製プロセス２００を例示する。プロセス２００において示されるのは、ビーズに結合されたトランスポソーム１４０を有するビーズ２０５である。ＤＮＡ２１０は、ビーズのサンプルに付加される。ＤＮＡ２１０は、トランスポソーム１４０と接触する場合、そのＤＮＡは、タグメンテーションされ（フラグメント化およびタグ化され）、そしてビーズ２０５にトランスポソーム１４０を介して結合される。結合しそしてタグメンテーションしたＤＮＡは、ビーズなしアンプリコン２１５のプールを生成するためにＰＣＲ増幅され得る。そのＰＣＲ工程は、二次アダプター配列（例えば、プライマー配列（例えば、Ｐ５およびＰ７））を組み込むために使用され得る。アンプリコン２１５は、フローセル２２０の表面に、例えば、フローセル表面上の相補的プライマーにグラフト化またはハイブリダイズすることによって、移され得る。クラスター生成プロトコル（例えば、ブリッジ増幅プロトコルまたはクラスター生成のために使用され得る任意の他の増幅プロトコル）は、フローセルの表面上に複数のクラスター２２５を生成するために使用され得る。クラスターは、タグメンテーションされたＤＮＡのクローン性増幅生成物である。クラスターは、ここで配列決定プロトコルにおける次の工程の準備ができる。ビーズ表面上でのタグメンテーションプロセスの例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／１８９３３１（これは、その全体において本明細書に参考として援用される）に詳細に記載される。
【０１２４】
図３は、５’連結トランスポソーム複合体を使用する場合に生じ得る論点を図示する。工程３００は、ゲノムＤＮＡ３１５を有するビーズ３０５上で固定化したトランスポソーム複合体１４０のタグメンテーションプロセス、続いて、非標的核酸の捕捉を含め、その後の増幅および標的富化を絵入りで図示する。タグメンテーションしたゲノムＤＮＡの固定化したライブラリーは、３１０に示される。タグメンテーションしたＤＮＡを有するストレプトアビジン被覆捕捉ビーズは、洗浄緩衝液（例えば、５％  ＳＤＳ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む）を使用して洗浄され得（３２０）、それによって、トランスポザーゼをトランスポソーム複合体から変性させる。次いで、その上清は、洗浄工程の後に、ストレプトアビジン被覆常磁性粒子（例えば、ビーズ）の磁性捕捉を介して除去され得、その固定化タグメンテーションされたライブラリーを含む捕捉ビーズは、保持され得、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を使用してさらに洗浄される。その結合したオリゴヌクレオチドは、完全な相補性を有する結合した二重鎖を形成するために、３３０において伸長される。
【０１２５】
３４０において、標的増幅は、サーマルサイクリングを介して進んで、そのタグメンテーションしたＤＮＡを当業者に公知の方法によって増幅する。例えば、ＰＣＲ試薬（例えば、最小限でも、ＰＣＲ緩衝液、デオキシ−ヌクレオチド、二価カチオン、およびＤＮＡポリメラーゼを含む混合物）および効率的増幅に必要とされる添加物の溶液は、ビーズ含有溶液に添加され得、その捕捉ビーズに結合したタグメンテーションＤＮＡは、当業者に公知の方法論であるサーマルサイクリング（例えば、１０回のサーマルサイクル）によって増幅され得る。３５０において、その増幅されたタグメンテーションＤＮＡは、例えば、精製カラム（例えば、Ｚｙｍｏスピンカラム）を使用して必要に応じて精製および溶離され得る。その増幅されたタグメンテーションＤＮＡはまた、ＳＰＲＩまたはＡｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して必要に応じて精製され得、精製方法は、本開示に限定されない。
【０１２６】
工程３６０において、そのタグメンテーションライブラリーは、ＮＥＸＴＥＲＡ  Ｒａｐｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）または任意の他の標的捕捉法に記載されるとおりのプロトコルを使用して富化され得る。ライブラリー調製の開始からのそのビオチン化ゲノムフラグメントは、増幅後混合物（３７０）の中に存在し、ビオチン化標的プローブ（３８０）と競合し得、標的富化の間に全ゲノムハイブリダイゼーションプローブとして働き得る。この段階でのこれらビオチン化ゲノムフラグメントの存在は、富化の効率を損ない得る。さらに、ビオチン化ゲノムフラグメントは、ポリメラーゼプライミングによるＰＣＲ増幅およびタグメンテーション反応において消費されなかった遊離ビオチン化アダプターの伸長の間に生成され得、それによって、さらなるオフ−ターゲット捕捉プローブを標的富化工程に付加する。
【０１２７】
本開示は、この問題に対するいくつかの解決策を提供する。本明細書で記載される１つのアプローチにおいて、１またはこれより多くの切断可能なリンカーは、親和性エレメントと第１のトランスポゾンのアダプター配列との間に含められる。一旦、タグメンテーションが完了し、そのタグメンテーション核酸が増幅された後、その切断可能なリンカーが切断され得、ビオチン化部分を放出し、オフターゲット捕捉を最小化または排除し得る。この改変は、オフ−ターゲット捕捉を徹底的にかつ驚くべきことに減少し、他のビーズベースのタグメンテーション方法論と比較して富化を改善する。第２に、その親和性エレメントは、第２のトランスポゾンの３’末端に移され、必要に応じて切断可能なリンカーを通じて結合される。
【０１２８】
図４は、切断可能なリンカーを使用して固体表面上に固定化されたトランスポソーム複合体を使用して、ＤＮＡをフラグメント化およびタグ化する方法４００の工程を絵で図示する。図４を参照すると、工程４１０、４２０、４３０、４４０、および４５０は、増幅後混合物（４７０）に存在するビオチン化ゲノムフラグメントが、切断可能なリンカー（例えば、１個またはこれより多くのウラシルを含むリンカー）を含むことを除いて、図３に関して記載されるとおりである（それぞれ、３１０、３２０、３３０、３４０、および３５０）。工程４６０において、ビオチンは、適切な切断剤を使用してリンカーを切断することによって、ゲノムフラグメントから切断される。ウラシルの例に関しては、切断は、ウラシル切断酵素（例えば、ＥｐｉｃｅｎｔｒｅのＵｒａｃｉｌ  ＤＮＡ  Ｅｘｃｉｓｉｏｎ  Ｍｉｘ）で達成される。富化工程４８０の間に、オフ−ターゲットゲノムフラグメントは、もはやビオチン化されていないので、ビオチン化標的プローブのようには捕捉されない（４９０）。このようにして、上記方法は、切断可能なリンカーなしの５’連結アプローチと比較した場合、オフ−ターゲット捕捉を減少し、標的富化の効率を増大する。
【０１２９】
５’末端においてビオチンのような親和性エレメントを含むアダプター配列を使用するビーズベースのタグメンテーションアプローチは、図５Ａに示される。簡潔には、アダプターオリゴヌクレオチド５０１および５０２という２タイプの５’末端の親和性エレメントは、トランスポソームの２つの集団を表面に（例えば、一方はＡ１４アダプター配列を有し、一方はＢ１５アダプター配列を有する）結合するために使用される。ＭＥおよびＭＥ’は、トランスポゾン末端配列である。そのタグメンテーション事象は、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）から５’タグ化フラグメントを作る。そのフラグメントのうちのいくつかは、示されるように、一方の鎖の５’末端においてＡ１４を、フラグメントの他方の鎖の５’末端においてＢ１５を含む。フラグメントは、完全二重鎖またはアンプリコン（必要に応じて二次アダプター（例えば、Ｐ５およびＰ７のようなプライマー配列ならびに／または最も下の図で示されるとおりのインデックス配列）を含む）を調製するために、増幅（例えば、ＰＣＲ）によって、必要に応じて二次アダプターキャリアの存在下で、伸長および／または反応する。ビオチン／ストレプトアビジンが使用される場合、親和性結合は、ＰＣＲの間に壊され、溶液中にビオチン化フラグメントアンプリコンを残し、これは、その後の富化の努力を複雑にし得る。あるいは、図５Ｂにおいて、親和性エレメントおよびリンカーの結合は、第２のトランスポゾン上の３’位に変更される。この場合、その親和性エレメントおよびリンカーは、相補的トランスポゾン末端配列５０３（ＭＥ’配列）の３’末端に結合される。この構成において、第１のトランスポゾン５０１および５０２は、親和性エレメントを含まない。このプロセスを用いると、そのタグメンテーション事象は、標識されていないフラグメント化ゲノムＤＮＡを作る。なぜなら第１のトランスポゾン（これは親和性エレメントを欠く）は、そのフラグメントに移され、その親和性エレメントは、第１のトランスポゾンへの第２のトランスポゾンのハイブリダイゼーションに起因して接続されるに過ぎないからである。そのアダプター配列Ａ１４−ＭＥ、ＭＥ、Ｂ１５−ＭＥ、ＭＥ’、Ａ１４、Ｂ１５、およびＭＥは、以下に提供される：
Ａ１４−ＭＥ：    ５′−ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３′  （配列番号３）
Ｂ１５−ＭＥ：    ５′−ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ−３′  （配列番号４）
ＭＥ’：    ５′−ｐｈｏｓ−ＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ−３’  （配列番号５）
Ａ１４：    ５′−ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣ−３′  （配列番号６）
Ｂ１５：    ５′−ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧ−３’  （配列番号７）
ＭＥ：    ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ  （配列番号８）
【０１３０】
標的核酸
標的核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡなどを含む任意のタイプであり得る。例えば、その標的核酸は、精製された核酸を含め、種々の精製状態にあり得る。しかし、その核酸は、完全に精製する必要もまたは精製する必要も全くなく、生物学的サンプルの一部（例えば、生のサンプル溶解物、体液、血液、血漿または血清）であり得るか、またはさもなければタンパク質、他の核酸種、他の細胞構成要素、および／または任意の他の夾雑物質と混合され得る。いくつかの実施形態において、その生物学的サンプルは、適切にはインビボで見出されるものと同じ割合で存在する、核酸（例えば、ＤＮＡ）、タンパク質、他の核酸種、他の細胞構成要素、および／または任意の他の夾雑物質の混合物を含む。例えば、いくつかの実施形態において、その構成要素は、無傷の細胞において見出されるものと同じ割合で見出される。本明細書で提供される方法は、核酸またはＤＮＡがタグメンテーションプロセスを通じて固体支持体に結合されることを可能にすることから、他の夾雑物質は、タグメンテーションが起こった後に、その固体支持体を洗浄することによって除去され得る。その生物学的サンプルは、例えば、粗製細胞溶解物または全細胞を含み得る。例えば、本明細書で示される方法において固体支持体に適用される粗製細胞溶解物は、核酸を他の細胞構成要素から単離するために旧来から使用される分離工程のうちの１またはこれより多くに供されている必要はない。
【０１３１】
従って、いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、任意の供給源から精製された核酸を含み得るのみならず、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、粘液、喀痰、尿、精液、脳脊髄液、気管支吸引物、糞便、および浸軟組織（ｍａｃｅｒａｔｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ）、またはこれらの溶解物、または核酸もしくはＤＮＡ物質を含む任意の他の生物学的標本において見出されるとおりの非精製核酸をも含み得る。標的核酸は、組織サンプル、腫瘍サンプル、がん細胞、または生検サンプルに由来し得る。
【０１３２】
標的核酸は、任意の種に由来してもよいし、種の混合物に由来してもよい。例えば、標的核酸は、哺乳動物（例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヒツジ、または他の家畜）、または他の種（例えば、魚類、細菌、ウイルス、真菌まあたは古細菌）に由来してもよい。核酸は、環境サンプル（例えば、土壌または水）に由来してもよい。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、標的核酸は、ＤＮＡである。１つのこのような実施形態において、ＤＮＡは、二本鎖である。いくつかのさらなる実施形態において、二本鎖ＤＮＡは、ゲノムＤＮＡを含む。いくつかの他の実施形態において、標的核酸は、ＲＮＡもしくはその誘導体、またはｃＤＮＡである。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、生物学的サンプル（生のサンプルまたは抽出物）は、本明細書で記載されるタグメンテーション法の前に、標的核酸を精製するために加工処理される。いくつかの実施形態において、生物学的サンプルは、生のサンプルまたは生のサンプル溶解物（例えば、血液または唾液）である。いくつかの実施形態において、処理法は、生のサンプル、生のサンプル溶解物、または予め加工処理されたサンプル（例えば、血液または唾液サンプル）を提供する工程、そのサンプルと溶解緩衝液およびプロテイナーゼＫとを混合する工程、その混合物をインキュベートして、そのサンプル中の細胞を溶解し、ＤＮＡをその細胞から放出させる工程を包含し、それによって標的核酸が本明細書に記載されるタグメンテーション法のために提供される。
【０１３５】
生のサンプルもしくは生のサンプル溶解物（例えば、血液）中の構成要素、または予め加工処理されたサンプル（例えば、Ｏｒａｇｅｎｅ収集チューブの中に集められた唾液）中の添加物（収集チューブの中の安定化剤）は、タグメンテーション反応を阻害し得る。従って、本明細書で提供されるのは、生のサンプル、生のサンプル溶解物、または予め加工処理されたサンプルを処理して、この問題を克服するための方法である。いくつかの実施形態において、その方法は、生のサンプル、生のサンプル溶解物、または予め加工処理されたサンプル（例えば、血液または唾液サンプル）を提供する工程、そのサンプルと溶解緩衝液、プロテイナーゼＫ、およびＤＮＡ精製ビーズ（例えば、ＳＰＲＩビーズ、カルボキシル基を含むビーズであって、ここでそのビーズは、必要に応じて磁性ビーズである）とを混合する工程、その混合物をインキュベートして、そのサンプル中の細胞を溶解し、その細胞からＤＮＡを放出し、それによって、そのＤＮＡをＤＮＡ精製ビーズもしくはＳＰＲＩビーズ上に捕捉する工程、およびその捕捉されたＤＮＡを含むビーズをその混合物から分離する工程を包含する。その分離する工程は、上清中に存在する潜在的なタグメンテーションインヒビターを除去するように働く。その方法はさらに、必要に応じてその捕捉されたＤＮＡを含むビーズを洗浄する工程、およびそのＤＮＡをビーズから溶離して、標的核酸を提供する工程を包含する。
【０１３６】
配列決定法
本明細書で提供される方法のうちのいくつかは、核酸を分析するための方法を包含する。このような方法は、標的核酸のテンプレート核酸のライブラリーを調製する工程、配列データをテンプレート核酸のライブラリーから得る工程、およびその標的核酸の配列表示をアセンブリする工程を包含する。いくつかの実施形態において、本明細書で記載される方法は、合成時配列決定（ＳＢＳ）が挙げられるが、これらに限定されない次世代配列決定作業フローにおいて使用され得る。本開示の方法によって生成される核酸ライブラリーとともに使用するのに容易に適合され得る、例示的なＳＢＳ手順、流体システム、および検出プラットフォームは、例えば、Ｂｅｎｔｌｅｙら，  Ｎａｔｕｒｅ  ４５６：５３−５９  （２００８）、ＷＯ  ０４／０１８４９７；ＵＳ  ７，０５７，０２６；ＷＯ  ９１／０６６７８；ＷＯ  ０７／１２３７４４；ＵＳ  ７，３２９，４９２；ＵＳ  ７，２１１，４１４；ＵＳ  ７，３１５，０１９；ＵＳ  ７，４０５，２８１、およびＵＳ  ２００８／０１０８０８２（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）に記載される。
【０１３７】
いくつかのＳＢＳ実施形態は、ヌクレオチドを伸長生成物へと組み込む際に放出されるプロトンの検出を含む。例えば、放出プロトンの検出に基づく配列決定は、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔから市販される電気的検出器および関連技術（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ，  ＣＴ，  ａ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｓｕｂｓｉｄｉａｒｙ）またはＵＳ  ２００９／００２６０８２  Ａ１；ＵＳ  ２００９／０１２７５８９  Ａ１；ＵＳ  ２０１０／０１３７１４３  Ａ１；もしくはＵＳ  ２０１０／０２８２６１７  Ａ１（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）に記載される分離法およびシステムを使用し得る。
【０１３８】
別の有用な配列決定技術は、ナノポア配列決定法（例えば、Ｄｅａｍｅｒら  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １８，  １４７−１５１  （２０００）；  Ｄｅａｍｅｒら  Ａｃｃ．  Ｃｈｅｍ．  Ｒｅｓ．  ３５：８１７−８２５  （２００２）；  Ｌｉら  Ｎａｔ．  Ｍａｔｅｒ．  ２：６１１−６１５（２００３）（それらの開示は、本明細書に参考として援用される）を参照のこと）である。本明細書で記載される方法は、使用される配列決定機器のいかなる特定のタイプにも限定されない。
【実施例】
【０１３９】
以下の実施例は、本明細書で提供される開示を説明するように供するのであって、限定するものではない。
【０１４０】
実施例１：酵素により切断可能なヌクレオチドを有するリンカーを使用する、固体表面上でのタグメンテーション
トランスポゾンを、２セットのオリゴヌクレオチド（配列番号９〜１１のうちのいずれか１種（改変されたＡ１４−ＭＥ）および配列番号１２〜１４のうちのいずれか１種（改変されたＢ１５−ＭＥ）として表される）をアニールすることによって形成し、それらはともに、１９塩基のモザイク末端（ＭＥ）配列（配列番号８、小文字で示される）にわたって、相補的異なモザイク末端配列（ＭＥ’；配列番号５）と塩基対を形成する。配列番号９〜配列番号１４によって表されるオリゴヌクレオチドを、５’ビオチン化して、ストレプトアビジン被覆常磁性ビーズへのその後の表面結合を可能にした。そのアニールしたトランスポゾンを、５０μＭの各ビオチン化オリゴヌクレオチドと５０μＭのＭＥ’（配列番号５）とを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および２５ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で合わせることによって調製し、９５℃において１０分間加熱し、室温へと２時間にわたって冷却した。次いで、そのアニールしたトランスポゾンをトランスポザーゼ酵素と最終濃度２μＭにおいて混合し、３７℃で一晩インキュベートした。
【０１４１】
切断可能なヌクレオチド部分を有する切断可能なリンカー配列の例は、配列番号９〜１４の中に提供される。配列番号９〜１４として表示される配列は、１９塩基のモザイク末端（ＭＥ）配列（小文字で示される）ならびにリード１およびリード２配列、Ａ１４およびＢ１５（斜体で示される）を含む。配列番号９および配列番号１２として表示される配列は、一連のチミン残基（太字）の後に３個のウラシルヌクレオチド（下線）を含む。同様に、配列番号１０および配列番号１３として表示される配列は、一連のチミン残基の３’側に３個のウラシルヌクレオチドを含む。配列番号１１および配列番号１４は、一連のチミン残基の後に１個のウラシルヌクレオチドを含む。本明細書で言及されるように、チミン残基は、切断可能なリンカーの一部であり、ビオチンを、トランスポゾンおよび／またはアダプター配列の５’側にある切断可能な部分に接続するように働く。いくつかの実施形態において、切断可能なリンカーは、１〜１０個の切断可能なウラシルヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態において、その切断可能なリンカーは、少なくとも１個の切断可能なウラシルヌクレオチドを含む。ある実施形態において、その切断可能なリンカーは、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、または１０個の切断可能なウラシルヌクレオチドを含む。配列番号８は、１９塩基のモザイク末端（ＭＥ）配列であり、配列番号５は、その相補体である。
【化１１】
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【０１４２】
トランスポソームが一旦形成された後、そのトランスポソームを、ストレプトアビジン被覆ビーズに付着させた。次いで、そのビーズを、ＨＴ１緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）中のトランスポソームの希釈溶液で洗浄した。ＨＴ１は、ビオチン−ストレプトアビジンがビーズに結合するために必要とされる高塩を含む。ビーズおよびトランスポソームを、ミキサーで１時間にわたって混合している間にインキュベートした。混合の後に、ビーズを、１５％  グリセロールおよび他の緩衝化剤（例えば、Ｔｒｉｓ）を含む貯蔵緩衝液中で再懸濁した。
【０１４３】
次に、タグメンテーションを行った。例えば、タグメンテーション溶液を、その固定化したトランスポソームを含むサンプルに添加し、５５℃において約１５分間インキュベートした。そのタグメンテーション反応は、ＤＮＡ（例えば、約５０ｐｇ〜５μｇのＤＮＡ）およびタグメンテーション緩衝液を含んだ。一例において、そのタグメンテーション緩衝液は、米国特許第９，０８０，２１１号、同第９，０８５，８０１号、および同第９，１１５，３９６号（これらの各々は、本明細書に参考として援用される）に記載されるように、タグメンテーション反応が起こるために必要な構成要素を含む（例えば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓアセテート（ｐＨ７．６）、５ｍＭ  酢酸マグネシウム、および１０％  ジメチルホルムアミドを含む緩衝液）。タグ化ＤＮＡフラグメントの固定化ライブラリーを生成した。
【０１４４】
実施例２：タグメンテーションＤＮＡのＰＣＲ増幅および酵素による切断
タグメンテーションＤＮＡをストレプトアビジン被覆捕捉ビーズ上に有するストレプトアビジン被覆捕捉ビーズ（実施例１に記載されるとおり）を、５％  ＳＤＳ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含む洗浄緩衝液を使用して洗浄し（例えば、３回）、それによって、トランスポソーム複合体のトランスポザーゼ酵素を変性した。その上清を、ストレプトアビジン被覆常磁性粒子（例えば、ビーズ）の磁性捕捉を介する洗浄工程後に除去し、固定化したタグメンテーションライブラリーを含むビーズを保持し、さらに、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を使用して洗浄した。
【０１４５】
ＤＮＡフラグメントのギャップ充填（ＭＥ’配列の５’末端とのフラグメントの３’末端との間のギャップを埋めること（例えば、図５Ｂを参照のこと））を、例えば、ＮＥＭミックス（ＮＥＸＴＥＲＡ  Ｒａｐｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ，  Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を添加し、７２℃において３分間インキュベートすることによって行った。
【０１４６】
サーモサイクリングを介する標的増幅を行って、当業者に公知の方法によってタグメンテーションＤＮＡを増幅した。いくつかの例では、ＰＣＲ試薬の溶液（例えば、最小限でも、ＰＣＲ緩衝液、デオキシヌクレオチド、二価カチオン、ＤＮＡポリメラーゼを含むマスターミックス（例えば、ＮＥＭミックス（ＮＥＸＴＥＲＡ  Ｒａｐｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ，  Ｉｌｌｕｍｉｎａ））および効率的増幅に必要とされる添加剤を、ビーズに添加し、そのビーズに結合したタグメンテーションＤＮＡを、サーマルサイクリング（例えば、１０回のサーマルサイクル）によって増幅した。
【０１４７】
その増幅したタグメンテーションＤＮＡを含む上清を、反応チャンバから除去し、新しい反応チャンバ（例えば、チューブ、ウェルなど）に移した。その増幅したフラグメント混合物を、切断可能なリンカー中の塩基を切断する１種またはこれより多くの酵素で処理した。公知のヌクレオチド骨格を壊す酵素の数のうちのいずれか１種は、オフターゲット生成物を消化して、ゲノムへのオフターゲットハイブリダイゼーションを防止するために使用され得る。適切な酵素の例としては、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ（ＵＮＧともいわれる））、ホルムアミド−ピリミジンＤＮＡグリコシラーゼ（Ｆｐｇ）、ＲＮＡｓｅＨ、Ｅｎｄｏ  ＩＶ、Ｅｎｄｏ  ＶＩＩＩ、Ｋｌｅｎｏｗ、またはアピラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
その増幅されたタグメンテーションＤＮＡを、ＳＰＲＩまたはＡｍｐｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して精製した。その精製法は、本開示に限定されない。そのタグメンテーションライブラリーを、ＮＥＸＴＥＲＡ  Ｒａｐｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔプロトコル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）または任意の他の標的捕捉法に記載されるプロトコルを使用して富化し得る。その富化したＤＮＡライブラリーは、ここで配列決定の準備ができる。
【０１４９】
実施例３：ウラシルを含む切断可能なリンカーの酵素による切断を使用するリード富化
簡潔には、５０ｎｇのＮＡ１２８７８ゲノムＤＮＡ（Ｃｏｒｉｅｌｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）を、試験される各条件に使用した。コントロール反応として、ＤＮＡを、タグメンテーションし、ライブラリーを調製し、製造業者の推奨に従ってＮＥＸＴＥＲＡ  Ｒａｐｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）プロトコル後に富化した。ウラシル含有切断可能リンカーである配列番号９および配列番号１３を使用した。
【０１５０】
簡潔には、各５０μＬ  反応物は、５×タグメンテーション緩衝液、５０ｎｇ  ＤＮＡ、配列番号９および配列番号１３に記載される切断可能ウラシルリンカーを有する５μＬの２５０ｎＭのトランスポソーム結合体化Ｄｙｎａｌ常磁性ビーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含んだ。反応物を、５５℃において１５分間インキュベートし、続いて、１５μＬのＳｔｏｐ  Ｔａｇｍｅｎｔ（ＳＴ）緩衝液を添加し、次いで、室温においてさらに５分間インキュベートした。サンプルを、磁石上に置き、上清を除去した。そのビーズを、５０μＬ  ＮＥＭ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）中に再懸濁し、７２℃において５分間インキュベートし、続いて、１０℃へと冷却した。サンプルを磁石上に置き、その上清を除去し、ＨＴ２洗浄緩衝液（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）中で洗浄した。
【０１５１】
ＰＣＲ反応を、４０μＬのＥＰＭ、１０μＬの各インデックスプライマー（例えば、Ｐ５’−インデックス−Ａ１４’およびＰ７’−インデックス−Ｂ１５’）および水を添加することによって準備した。ＰＣＲ増幅を、以下のように行った：７２℃、３分間；９８℃、３０秒間、続いて、９８℃、１０分間；６５℃、３０秒間；７２℃、６０秒間を１０サイクル。そのＰＣＲ生成物を、５μＬのＵＳＥＲ酵素ミックス（１  Ｕ／μｌ−ＮＥＢ部品番号Ｍ５５０５Ｌ）で処理し、３７℃において３０分間インキュベートし、続いて、ＳＰＲＩベースの（Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）常磁性ＡＭＰｕｒｅ  ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒカタログ番号Ａ６３８８０）を使用して製造業者の推奨に従ってサイズ選択した。まず、１００μＬのＵＳＥＲ処理したＰＣＲ生成物を、５５μＬ  水および１０５μＬ  常磁性ビーズと混合した。そのサンプルを、５分間磁石から外して置き、５分間磁石上に置き、続いて、その上清を第２のサイズ選択へと除去した（２５０μＬ  上清＋３０μｌ  常磁性ビーズ）。そのビーズを、８０％  エタノール中で洗浄し、風乾し、２５μｌ  ＲＳＢ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）中で溶離した。
【０１５２】
ＵＳＥＲ酵素処理し、サイズ選択したサンプルの富化を、ＴｒｕＳｉｇｈｔ  Ｏｎｅ  ｐｒｏｂｅ  ｐａｎｅｌ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してＮＥＸＴＥＲＡ  Ｒａｐｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔキットのプロトコルに従って、製造業者の推奨（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って行った。そのサンプルを、ＨｉＳｅｑ  ２５００で製造業者の推奨（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って配列決定した。
【表１】
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【０１５３】
表１に示されるように、溶液ベースのタグメンテーションおよび富化（例えば、ＮＥＸＴＥＲＡ  Ｒａｐｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ）を行ったところ、７０％  リード富化が生じた。ウラシル含有リンカーを介して、しかし酵素による切断処理なしでビーズに付着したトランスポソームを使用したところ、その％リード富化は、４５％で有意に低かった。しかし、リンカー中のウラシルが酵素処理を介して切断される場合、その富化は、６７％に増大した。それによって、非固定化の、または溶液ベースの、タグメンテーション、および富化のレベルまで富化が取り戻された。
【０１５４】
実施例４：ウラシルリンカーの酵素による切断ありおよびなしでの６−ｐｌｅｘおよび１２−ｐｌｅｘエキソーム富化
以下の実施例は、ＴｒｕＳｅｑ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｘｏｍｅ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）と比較して、２個のチミンと３個のウラシル（２Ｔ３Ｕ）のリンカーと比較して、酵素による切断なしおよび酵素による切断ありで（２Ｔ３Ｕ＋ＥＮＺ）、５個のチミン（５Ｔ）のリンカーを使用するエキソーム富化実験を示す。
【０１５５】
実験手順は、７．５μＬ  トランスポソーム固定化ビーズを使用し、ギャップ充填工程を省略したことを除いて、実施例３に関して記載されるとおりであった。富化を、ＴｒｕＳｅｑ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｘｏｍｅキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して行った。配列決定を、ＨｉＳｅｑ  ２５００で製造業者の推奨（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って行った。
【表２】
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【０１５６】
表２に示されるように、酵素による切断ありの２Ｔ３Ｕリンカーのみが、ＴｒｕＳｅｑ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｘｏｍｅキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）または５Ｔ残基での標準的な表面ベースのタグメンテーションを使用する溶液ベースのＮＥＸＴＥＲＡに匹敵する富化指標（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ  ｍｅｔｒｉｃｓ）を示した。
【０１５７】
実施例５：５’ビオチン化および３’ビオチン化アダプターオリゴヌクレオチド法の比較
ある種のビーズベースのタグメンテーションアプローチは、図５Ａに示されるとおりの５’末端においてビオチン化されているアダプター配列を使用する。簡潔には、その５’ビオチン化アダプターオリゴヌクレオチド５０１および５０２は、トランスポソームを表面に結合する。そのタグメンテーション事象は、５’ビオチン化し、フラグメント化した全ゲノムＤＮＡを作り、それは、その後の富化工程を夾雑し得る。一実施形態において、ビオチンの結合を、図５Ｂに示されるように、トランスポソームを表面に結合するために、相補鎖（第２のトランスポゾン）上の３’位に変更する。簡潔には、そのオリゴヌクレオチド５０１および５０２は、ビオチンを含まない。この例では、ビオチンを、相補鎖（ＭＥ’配列）上のトランスポゾン末端配列５０３に結合する。この構成において、そのタグメンテーション事象は、ビオチンなしのゲノムＤＮＡフラグメントを作る。
【０１５８】
さらに別の実施形態において、リンカーは、３’オリゴヌクレオチド５０３とビオチンとの間にある。これは、固体表面上で起こり得る転移活性に関するいかなる立体障害をも低減するのに役立ち得る。
【０１５９】
以下の実施例は、配列決定ライブラリーの調製における式（Ｉ（ａ））のリンカー（グリセロールタイプリンカー）を有する３’ビオチン化オリゴヌクレオチドの使用を示す。コントロール反応として、ＤＮＡを、タグメンテーションし、ライブラリーを調製し、ＮＥＸＴＥＲＡ  Ｒａｐｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔプロトコルに従って、製造業者の推奨（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）に従って富化した。タグメンテーションし、増幅したＤＮＡを、エキソームパネルを使用するＸｇｅｎ  Ｌｏｃｋｄｏｗｎハイブリダイゼーション捕捉キットプロトコル（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  ＩＤＴ）を使用して、製造業者の推奨されるプロトコルに従って富化したことを除いて、実施例３に記載される実験プロトコルに倣った。基本的には、決して最適ではない富化が全体的に観察された。なぜなら最適には及ばないブロッキングオリゴヌクレオチドを、Ｘｇｅｎ  ｌｏｃｋｄｏｗｎキットで供給される推奨ユニバーサルブロッキングオリゴヌクレオチドの代用として使用したからである。しかし、その実験の焦点は、最適なブロッキングプローブを要することではなく、実験の焦点において測定可能な変化を観察することができることだけである。最適には及ばないブロッキングオリゴヌクレオチドは、その実験の焦点に影響を及ぼすとは予測されない。
【表３】
2020510401.tif 000016
【０１６０】
表３に認められるように、５’ビオチンとウラシルリンカー＋酵素切断は、コントロールおよび３’ビオチン（リンカーありまたはなし）と比較して、有意に低い富化を示した。５’ビオチンとウラシルリンカー＋酵素切断法に伴うその低いリード富化は、酵素ミックスによる不完全な切断の結果であり得る。３’接続での実験は、溶液ベースのコントロールに匹敵するリード富化を達成することが示された。
【０１６１】
実施例６：小さな挿入物（１５０〜２００ｂｐ）のためのＰビオチン化ビーズの調製
工程１．トランスポゾンのアニール
Ａ１４−ＭＥおよびＢ１５−ＭＥを各々、ＭＥ’−リンカー−ビオチンオリゴ（以下で考察される調製物）にアニールしたところ、２種の二本鎖複合体が生じ、両方とも、トランスポザーゼによって特異的に認識されるモザイク末端（ＭＥ）および二次アダプターを付加するためにＰＣＲにおいて使用されるＡ１４またはＢ１５配列を有した。そのＡ１４−ＭＥ、Ｂ１５−ＭＥ、およびＭＥ’オリゴを、２００ｎＭへと再懸濁した。９６ウェルＰＣＲプレートにおいて、以下の表４に示される調製物を、２個のウェルに添加した（１個のウェルは、Ａ１４：ＭＥ’、および１個のウェルは、Ｂ１５−ＭＥ’）。そのウェルプレートを、サーマルサイクラーの中に１０分間、９５℃で入れ、次いで、サーマルサイクラーから出し、室温のベンチに２時間置いた。
【表４】
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【０１６２】
工程２．トランスポソーム形成
Ｔｎ５トランスポザーゼを上記のアニールしたトランスポゾンに添加したところ、Ａ１４−ＭＥ／ＭＥ’−リンカー−ビオチンおよびＢ１５−ＭＥ／ＭＥ’−リンカー−ビオチン複合体を含むトランスポソーム複合体を形成した。先の工程から調製したアニールしたオリゴを使用して、９６ウェルＰＣＲプレートにおいて以下の反応を設定した。Ａ１４−ＭＥ用に１個のウェルおよびＢ１５−ＭＥ用に１個のウェルであった。各ウェルを、サーマルサイクラーの中で３７℃において一晩インキュベートし、トランスポソーム複合体の２つの集団を提供した；次いで、その２個のウェルの内容物を一緒に混合した。混合工程の後、約２２０μＬを除去し、別のウェルに添加した。約２２０μＬの標準貯蔵緩衝液（合計４４０μＬ）を添加した。
【表５】
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【０１６３】
工程３．ストレプトアビジンビーズ装填
ビオチン連結を含む上記で形成したトランスポソーム複合体を、ストレプトアビジンビーズに付加した。そのビーズ上の複合体の密度は、タグメンテーション生成物における挿入物サイズを制御するために調整され得る。そのストレプトアビジンビーズを、十分混合した。約２００μＬのストレプトアビジンビーズを、１．５ｍｌチューブの中に入れ、チューブ磁石上に置いた。そのビーズを、１ｍＬ  ＨＴ１で２回洗浄し、次いで、そのビーズを再懸濁し、洗浄の間にスピンダウンした。２回目の洗浄の後に、そのビーズを６００μＬのＨＴ１で十分に再懸濁した。４００μＬの上記で作製したトランスポソーム複合体を、ＨＴ１入りのチューブに添加した。その混合物をロータリーミキサーで１時間混合し、磁石上に置き、その上清を除去した。その混合物を、５００μＬの１５％  標準貯蔵緩衝液中で再懸濁した。そのビーズを、１０００ｎＭ  トランスポソーム複合体の存在下で装填し、その得られた１０００ｎＭ  密度複合体を、溶液中４００ｎＭの濃度に希釈して貯蔵した。従って、そのストック溶液は、複合体密度１０００ｎＭを有するビーズを含み、４００ｎＭ  濃度へと希釈した。この希釈工程は、ビーズ上の複合体の密度を変化させるのではなく、ストック溶液中の複合体の最終濃度のみを変化させる。
【０１６４】
工程４．タグメンテーション
ＤＮＡサンプルを、タグメンテーションして、ビーズ装填トランスポソームを使用することによってフラグメントを作製し、トランスポゾン配列を切断しそのＤＮＡサンプルに添加した。９６ウェルＰＣＲプレートにおいて、５×Ｍｇタグメンテーション緩衝液（１０μＬ）、ＤＮＡ（＞５０ｎｇ；  １０μＬ）、ｄＨ２Ｏ（２０μＬ）、およびトランスポソームビーズ（工程３におけるとおり調製；１０μＬ）を合わせた。その混合物を十分に混合し、５５℃において５分間、続いて、２分間、２０℃においてインキュベートした。そのタグメンテーションプロセスを、ＳＤＳでの処理によるトランスポザーゼ酵素の不活性化によって停止した。１０μＬのＳＤＳを添加し、上記の工程からの反応混合物と十分に混合した。次いで、その混合物をベンチ上で５分間、室温においてインキュベートし、磁性撹拌機上に置いた。その溶液が一旦透明になった後、その上清を除去した。
【０１６５】
工程５．タグメンテーションの洗浄停止
そのＳＤＳを、ビーズから洗い流して、ＰＣＲ用のサンプルを調製した。その反応混合物を、タグメンテーションを停止した後に、磁石から外し、１００μＬの洗浄緩衝液を添加した。そのサンプルを、２０秒間、１６００ｒｐｍにおいてボルテックスにかけた。次いで、それを磁性撹拌機上に再び置き、その溶液が一旦透明になった後、その上清を除去した。その洗浄工程を合計で３回反復した。その洗浄が一旦完了した後、全ての上清を除去し、そのサンプルを磁性撹拌機から外した。
【０１６６】
工程６．ＰＣＲ
工程５からのサンプルを、Ａ１４およびＢ１５を認識するプライマーとともにＰＣＲ増幅し、二次アダプターを添加した。そのプライマーはまた、インデックス配列および配列決定プライマー（Ｐ５およびＰ７）を含んだ。表６に示されるマスターミックスを、各サンプルウェルに添加した。そのビーズを、マスターミックス中で再懸濁し、表７に示されるプログラムを使用してサーモサイクラーの中に置いた。この工程は、移されない／ビオチン化された鎖を除去し、伸長し、そしてＰ５およびＰ７全てを１プロセスで導入するために増幅するように働いた。
【表６】
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【表７】
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【０１６７】
そのサンプルをサーモサイクラーから外し、磁性撹拌機上に置いた。次いで、そのサンプルのうちの４５μＬを、ＰＣＲプレートからＭＩＤＩプレートへと移した。７７μＬの水をＭＩＤＩプレートサンプルに添加し、８８μＬのＡｍｐｕｒｅ  ＳＰＲＩビーズを各サンプル／水に添加した。その混合物を十分に混合し、室温において５分間インキュベートし、次いで、磁性撹拌機上に置いた。その溶液が一旦透明になった後、そのサンプルのうちの２００μＬを、その同じＭＩＤＩプレート上の新しいウェルに添加した。２０μＬのＡｍｐｕｒｅ  ＳＰＲＩビーズを添加し、そのサンプルを十分に混合し、室温において５分間静置した。次いで、それを磁性撹拌機上に再び置いた。
【０１６８】
その溶液が一旦透明になった後、その上清を除去し、廃棄した。そのプレートを磁性撹拌機上に静置し、２００μＬの８０％  エタノールを、ペレットを壊さないようにして添加した。そのエタノールを、後に除去した。そのエタノール洗浄工程を、合計でさらに２回反復した。その洗浄が一旦完了した後、任意の過剰なエタノールを、その撹拌機上にプレートがある間にピペットで除去した。そのサンプルを室温において５分間乾燥させた。２７μｌの水を添加し、十分に混合した。そのサンプルを室温において２分間静置し、磁性撹拌機上に戻して置いた。そのサンプルのうちの２５μｌをきれいなプレートに移し、−２０℃で貯蔵した。
【０１６９】
実施例７．Ａ１４−ＭＥおよびＢ１５−ＭＥトランスポゾン
Ａ１４−ＭＥおよびＢ１５−ＭＥトランスポゾンを、３’ビオチンを含むＭＥ’に各々アニールした。その３’ビオチンを、ＭＥ’にカップリングして、３’−（Ｉ（ａ））および３’−（Ｉ（ｃ））リンカーを形成した。そのアニーリング反応物は、ＮａＣｌ緩衝液を使用して、２５μＬ容積にあった。その得られた二本鎖トランスポゾンを、トランスポザーゼと、３７℃において一晩の反応で各々複合体化した。トランスポソーム複合体を形成した後、そのＡ１４およびＢ１５トランスポソーム複合体を等容積で一緒に混合し、ストレプトアビジンビーズ上に濃度３００ｎＭで装填し、密度３００ｎＭで結合した複合体を得た。一旦ビーズに結合した後、その（Ｉ（ａ））および（Ｉ（ｃ））の３００ｎＭ  密度の混合物を、濃度１２０ｎＭへとさらに希釈した。従って、そのビーズは、３００ｎＭ  密度をなお有するが、その複合体は、希釈溶液中に濃度１２０ｎＭで存在する。その希釈工程は、ビーズ上の複合体の密度を変化させないので、ライブラリー収量には影響を及ぼすが、挿入物サイズには影響を及ぼさない。
【０１７０】
その得られた２タイプのビーズ連結トランスポソーム、３’−（Ｉ（ａ））および３’−（Ｉ（ｃ））を、２５℃において２８日間および５６日間貯蔵した。アレニウスの式は、これらを４ヶ月（２８日間）および８ヶ月（５６日間）へと加速されると推定する。その加速された時間が終了した後、その２タイプのビーズ連結トランスポソームを、上記で考察されるとおりのタグメンテーションおよびライブラリー調製工程を通じて採取して、そのトランスポソームの活性を評価した。
【０１７１】
そのビーズ連結トランスポソーム複合体を、マグネシウムベースの緩衝液とともにｇＤＮＡに添加し、５５℃において５分間置いた。一旦完了した後、ＳＤＳ緩衝液をその反応物に添加し、その混合物を室温において５分間インキュベートさせた。次いで、その混合物を磁性撹拌機上に置き、ＮａＣｌおよびＴｒｉｓ緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ＰＣＲマスターミックスとインデックス配列を含む二次アダプターキャリアをビーズに添加し、十分に再懸濁した。次いで、そのサンプルをＰＣＲ増幅して、さらなるアンプリコンを作った。ＰＣＲの後、ＳＰＲＩクリーンアップを行って、過剰なキャリアを除去した。そのサンプルを、ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ上で泳動して、活性（ライブラリー調製法の収量）を測定した。図６Ａに示されるように、式（Ｉ（ａ））および（３’−（Ｉ（ａ））；グリセロールリンカー）および式（Ｉ（ｃ））（３’−（Ｉ（ｃ））；ヘキシルリンカー）という３’−ビオチン化リンカーを有するトランスポソーム複合体を使用するストレプトアビジンビーズベースの固相タグメンテーションからのライブラリー収量を、比較した。リンカー３’−（Ｉ（ｃ））は、顕著なライブラリー収量を提供した。リンカー３’−（Ｉ（ａ））は、低い収量を提供したが、なお配列決定可能な収量であった。図の中のＬＳＣラインは、任意の下限仕様限界であった。
【０１７２】
図６Ｂは、４ヶ月間の時間効果（２５℃において２８日間の加速貯蔵条件）後の３’−（Ｉ（ａ））リンカーを有するトランスポソーム複合体を使用するストレプトアビジンビーズベースの固相タグメンテーションから調製したサンプルライブラリーの加速安定性データを、４℃において２８日間のその同じリンカーの時間効果に供していないコントロールから調製したサンプルライブラリーと比較して、図示する。図６Ｃは、４ヶ月間および８ヶ月間の時間効果（２５℃において２８日間および５６日間の加速貯蔵条件）後の３’−（Ｉ（ｃ））リンカーを有するトランスポソーム複合体から調製したサンプルライブラリーの加速貯蔵データを、それぞれ、４℃において２８日間および５６日間のその同じリンカーの時間効果に供していないコントロールから調製したサンプルライブラリーと比較して、示す。
【０１７３】
実施例８．Ａ１４−ＭＥおよびＢ１５−ＭＥトランスポゾン
Ａ１４−ＭＥおよびＢ１５−ＭＥトランスポゾンを、３’ビオチンを含むＭＥ’に各々アニールした。その３’ビオチンを、３’−（Ｉ（ｃ））リンカーを通じてＭＥ’にカップリングした。そのアニーリング反応物は、ＮａＣｌ緩衝液を使用して、２５μＬ容積にあった。その得られた二本鎖トランスポゾンを、トランスポザーゼに、３７℃において一晩の反応で各々結合させた。トランスポソームを形成した後、そのＡ１４およびＢ１５トランスポソーム複合体を等容積で一緒に混合し、ストレプトアビジンビーズ上に種々の密度（１０ｎＭ〜８００ｎＭ）で装填した。
【０１７４】
種々の密度のビーズ連結トランスポソームを、マグネシウムベースの緩衝液とともにｇＤＮＡに添加し、５５℃において５分間置いた。一旦完了した後、ＳＤＳ緩衝液をその反応物に添加し、室温において５分間インキュベートした。次いで、その混合物を磁性撹拌機上に置き、ＮａＣｌおよびＴｒｉｓ緩衝液で３回洗浄した。洗浄後、ＰＣＲマスターミックスとインデックス配列を含む二次アダプターキャリアをビーズに添加し、十分に再懸濁した。次いで、ＰＣＲ反応をサンプル上で実施して、そのフラグメントを増幅した。ＰＣＲの後、ＳＰＲＩサイズ選択を種々のＳＰＲＩ比で行ったところ、異なる挿入物サイズを生じた。そのサンプルを、ＢＡ上およびＨｉＳｅｑ  ２５００  Ｒａｐｉｄ  Ｏｕｔｐｕｔで泳動して、活性を測定した。
【０１７５】
図７Ａは、ストレプトアビジンビーズベースの固相ライブラリー調製を使用するビーズ密度の関数としてＤＮＡ分子の標的挿入物サイズを示す。ここでそのビーズは、３’−（Ｉ（ｃ））を通じてそのビーズに結合した固定化トランスポソーム複合体を含む。図７Ｂは、活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼおよび３’−（Ｉ（ｃ））リンカーを含む固定化トランスポソーム複合体を有するストレプトアビジンビーズを、複合体密度１００ｎＭで使用するＳＰＲＩ条件の関数としてＤＮＡ分子の標的挿入物サイズを示す；そして図７Ｃは、活性亢進Ｔｎ５トランスポザーゼおよび３’−（Ｉ（ｃ））リンカーを含む固定化トランスポソーム複合体を有するストレプトアビジンビーズを、複合体密度６００ｎＭで使用するＳＰＲＩ条件の関数としてＤＮＡ分子の標的挿入物サイズを示す。
【０１７６】
実施例９．血液および唾液の一体化抽出プロトコル
新鮮な全血を、Ｆｌｅｘ  Ｌｙｓｉｓ  Ｒｅａｇｅｎｔキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，カタログ番号２００１５８８４）を使用して加工処理した。新鮮な全血をＥＤＴＡ収集チューブへと集め、加工処理する前に４℃において貯蔵した。溶解マスターミックスを、各サンプルに関して以下の容積を混合することによって調製した：７μｌのＢｌｏｏｄ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ、２μｌのプロテイナーゼＫ、および３１μｌのヌクレアーゼ非含有水。各サンプルに関して、１０μｌの血液、４０μｌの溶解マスターミックス、および２０μｌのＳＰＲＩビーズを、９６ウェルＰＣＲプレートの１ウェルに添加し、その溶液を１０回ピペッティングすることによって混合した。そのプレートをシールし、１０分間、５６℃において加熱したふた付きのサーマルサイクラーでインキュベートした。次いで、そのプレートを、板状の磁石の上に５分間置き、その上清を廃棄し、１５０μｌの８０％  エタノールを添加した。３０秒間磁石上でインキュベートした後、そのエタノールを廃棄し、そのプレートを磁石から外した。そのビーズを３０μｌの水の中で再懸濁すると、ライブラリー調製の準備ができた。
【０１７７】
唾液を、Ｏｒａｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｓａｌｉｖａ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎチューブ（ＤＮＡ  Ｇｅｎｏｔｅｋ，カタログ番号ＯＧＲ−５００、ＯＧＤ−５１０）の中に集め、それらを、少なくとも１時間、５０℃においてインキュベートして、その細胞を溶解し、その後、ボルテックスにかけることによって徹底的に混合した。各サンプルに関して、２０μｌの水および３０μｌの唾液を、９６ウェルＰＣＲプレートの１ウェルに添加し、ピペッティングすることによってゆっくりと混合した。次いで、２０μｌのＳＰＲＩビーズをそのサンプルウェルに添加し、その溶液を１０回ピペッティングすることによって、そのビーズを徹底的に混合した。そのプレートを、５分間、室温においてインキュベートし、その後、板状の磁石の上に５分間置いた。その上清を除去し、１５０μｌの８０％  エタノールを、そのビーズペレットに添加した。次いで、そのプレートを、磁石上に３０秒間静置させ、その後、エタノールを除去し、次いで、プレートを磁石から外した。そのビーズを３０μｌの水の中に再懸濁したところ、ライブラリー調製の準備ができた。
【０１７８】
多くの実施形態が記載されてきた。にも拘わらず、種々の改変が行われ得ることは、理解される。よって、他の実施形態は、以下の特許請求の範囲内にある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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