(57)【要約】  組織因子（ＴＦ）を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に関係する方法及び組成物を開示する。具体的には、ｆＶＩＩ、又はその機能的断片を含むＣＡＲを開示する。本明細書にて開示したＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞もまた、開示する。
2020537640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む組成物であって、前記ＣＡＲが組織因子（ＴＦ）結合ドメインを含む、組成物。
【請求項２】
前記ＴＦ結合ドメインが因子ＶＩＩ（ｆＶＩＩ）又はその断片を含み、前記断片が、ＴＦを認識するのに十分な長さである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴＦ結合ドメインが、重鎖（ＶＨ）、軽鎖（ＶＬ）、又は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などの可変断片を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＣＡＲが膜貫通ドメインを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記膜貫通ドメインがＣＤ２８を含む、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＣＡＲが１つ以上の細胞質ドメインを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞質ドメインが４−１ＢＢを含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
細胞質ドメインがＣＤ３ζを含む、請求項６又は７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＣＡＲがヒンジ領域を更に含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ヒンジ領域がヒトＩｇＧ１に由来する、請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が組織因子（ＴＦ）を標的化する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
因子ＶＩＩが軽鎖因子ＶＩＩを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
軽鎖ｆＶＩＩが配列番号４を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＣＡＲタンパク質が、配列番号１を含む核酸によりコードされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＣＡＲタンパク質が、配列番号２を含む核酸によりコードされる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＣＡＲが免疫エフェクター細胞内で発現する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記免疫エフェクター細胞がＮＫ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、サイトカイン誘導キラー細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬＳ）、骨髄浸潤リンパ球、及び／又はγδ  Ｔ細胞である、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ｆＶＩＩ又はその断片が、ヒトに由来する、マウスに由来する、又はヒトｆＶＩＩとマウスｆＶＩＩとの組み合わせである、請求項２に記載の組成物。
【請求項１９】
疾患の治療を必要とする対象における、疾患の治療方法であって、前記対象に、有効量の請求項１６に記載の細胞を投与することを含む、方法。
【請求項２０】
前記疾患が、組織因子（ＴＦ）発現と関連している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患が、血管化（若しくは充実性）腫瘍を伴う病理学的新生血管、関節リウマチ、子宮内膜症、リンパ腫、白血病、肉腫、若しくは黄斑変性症、又は、アテローム性動脈硬化症におけるマクロファージなどの、ＴＦを発現する疾患細胞を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
免疫エフェクター細胞が、治療を必要とする患者に由来する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
治療を必要とする対象の治療方法であって、前記方法が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）改変免疫細胞であり、前記ＣＡＲがｆＶＩＩ又はその断片を含む、免疫細胞を産生することと、対象から免疫細胞を誘導することと、前記免疫細胞を前記ＣＡＲで改変することと、前記対象に、前記ＣＡＲ改変免疫細胞を投与することにより、前記対象を治療することと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年９月２７日に出願された米国特許仮出願第６２／５６４，００６号公報の利益を主張し、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
組織因子（「ＴＦ」）は、凝固系カスケードの主たる反応開始剤である膜貫通糖タンパク質である。通常の生理学的条件下において、活性ＴＦは血液と接触しない。血管損傷の間、内皮下ＴＦ及びコラーゲンを血液に曝露することにより、凝固因子及び血小板の活性化、そして結果的に、止血栓形成がもたらされる。様々な臨床設定においてＴＦ発現を不適切に誘発することは、命を脅かす血栓症をもたらし得、かつ／又は病理学的合併症をもたらし得る。プラーク破綻に続くＴＦ曝露は、急性心筋梗塞及び脳卒中をもたらす血栓閉塞を担うと考えられている。これらの設定において、凝固因子により活性化される炎症後のシグナル伝達経路もまた、浮腫形成及び梗塞サイズの増加に寄与する。血管形成に関連する血管損傷は、平滑筋細胞（ＳＭＣ）におけるＴＦの上方制御をもたらし、これは、再狭窄に関連する細胞シグナル伝達経路を誘発すると考えられている。癌及びグラム陰性敗血症における過剰発現は、命を脅かす血栓症、及び炎症性経路の活性化をもたらす。
【０００３】
ＴＦは、病的血管新生のモジュレーターである。ＴＦは、患者又は動物モデルからの、腫瘍脈管構造（Ｃｏｎｔｒｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｆｏｌｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９６；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１１；Ｄｕａｎｍｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）、眼（Ｂｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）、及び子宮内膜症（Ｋｒｉｋｕｎｅｔ  ａｌ．２０１０）新生血管におけるインビボ血管由来ＶＥＣにおける、その選択的発現のために、インビボでの固有の病理学性血管由来の血管内皮細胞（ＶＥＣ）表面受容体でもあるということが、インビボ研究により明らかとなっている。血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管新生依存性癌及び非悪性ヒト疾患（Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００２）、例えば黄斑変性症（Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８７）、関節リウマチ（Ａｆｕｗａｐｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２）、及び子宮内膜症（Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９９）において中心的な役割を果たす。具体的には、ＶＥＧＦは、これらの血管新生依存性疾患（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０１６）における病理学的新生血管（通常、微細血管又は毛細血管）内のＶＥＣにあるＶＥＧＲ受容体に結合することにより血管新生を刺激する。ＶＥＧＦにより誘発されたインビトロ血管内皮モデルを用いて、ＴＦは血管形成特異的受容体であり、因子ＶＩＩ標的化治療薬用の標的であることが示され（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０１６）、このことは、ＴＦ標的化剤が、癌（固形癌及び白血病）、加齢関連黄斑変性症（ＡＭＤ）の湿潤形態、子宮内膜症、並びに関節リウマチを治療する治療的潜在性を有する可能性があることを示唆している。
【０００４】
ＴＦは一般的（かつ特異的）な生体指標であり、かつ癌細胞、癌幹細胞（ＣＳＣ）、（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１６）及び固形癌における腫瘍血管内皮細胞用の治療標的である。ＴＦは、これらの癌細胞で非常に発現する（乳癌では８０％〜１００％、肺癌では４０％〜８０％、及び卵巣癌では８４％）。これら３種類の癌は、制御が困難であるだけでなく、米国及び全世界における死亡率の主たる原因でもあり、多くの場合、化学療法及び放射線治療に対する、ＣＳＣベースの耐性が発達する（Ｖｉｄａｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１４；Ｍｏｎｃｈａｒｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。乳癌、肺癌、及び卵巣癌に加えて、ＴＦは、他の多くのヒト固形癌、白血病、肉腫、骨髄腫、及び潜在性リンパ腫においても高い割合で発現する（表１）。例えば、原発性黒色腫では９５％、転移性黒色腫では１００％、膵臓癌では５３％〜９０％、結腸直腸癌では５７％〜１００％、肝細胞癌では６３％〜１００％、原発性及び転移性前立腺癌では６０％〜７８％、膠腫では４７％〜５７％である（Ｈｕ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ２０１８）。ごく最近、ＴＦは乳癌、肺癌、卵巣癌における癌幹細胞により発現され、また、頭頸癌などの他の固形癌でも潜在的に発現され、ＴＦ標的化作用物質  は、薬剤耐性を有しないこれらのＴＦ発現癌幹細胞を根絶することができることが示された（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１６）。
【０００５】
ＴＦは、実験動物におけるＡＭＤモデルである脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）によって発現されることもまた、示されている（Ｂｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。ＴＦは、子宮内膜症損傷内の血管由来の血管内皮細胞により発現されることもまた、示されている。
【０００６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現免疫エフェクター細胞の養子免疫伝達は、新規の癌免疫治療法アプローチを示す。ＣＡＲの着想は、Ｔ及びＮＫ細胞が、標的細胞の表面上で対応する抗原を識別することを可能にする、Ｔ又はＮＫ細胞表面上で新規の受容体を発現させる発想に基づいている。基本的なＣＡＲ構築物は、細胞外抗原認識ドメイン、通常は、細胞外間隙ドメイン、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、並びに、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＩＣＯＳ、及びＣＤ３ｚｅｔａ鎖（ＣＤ３ζ）などのシグナル伝達細胞質ドメインに結合した、一本鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）からなる。最も発達した用途は、Ｂ細胞悪性腫瘍における表面抗原である、ＣＤ１９を標的化するＣＡＲ−Ｔ細胞を用いることであり、これは、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者における抗腫瘍有効性が示されている。（Ｐ．Ｊ．Ｐａｓｚｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｅｒｍａｎｅｎｔｌｙ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｐｌａｓｉａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２６，４２６２−４２７２（２０１６））当該技術分野において必要とされるのは、ＴＦ標的化ＣＡＲ変性免疫エフェクター細胞である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
添付図面は、本明細書の一部に組み込まれ、本明細書の一部を構成し、本開示のいくつかの態様を表し、明細書と共に、本開示の原理を説明するのに役立つ。
【図１Ａ】図１Ａ〜Ｂは、ＴＦ標的化ＣＡＲ１モノマー（図１Ａ）及びダイマー（図１Ｂ）の図を示す。ｆＶＩＩＬ：因子ＶＩＩ軽鎖。ヒンジ：ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域。ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質。Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン。ＣＡＲ１モノマーとダイマーの唯一の差は、ダイマー構築物はＩｇＧ１ヒンジ領域を含有するという点であり、この中で２個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成し、相同のダイマーを形成する。
【図１Ｂ】図１Ａ〜Ｂは、ＴＦ標的化ＣＡＲ１モノマー（図１Ａ）及びダイマー（図１Ｂ）の図を示す。ｆＶＩＩＬ：因子ＶＩＩ軽鎖。ヒンジ：ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域。ＧＦＰ：緑色蛍光タンパク質。Ｐｕｒｏ：ピューロマイシン。ＣＡＲ１モノマーとダイマーの唯一の差は、ダイマー構築物はＩｇＧ１ヒンジ領域を含有するという点であり、この中で２個のシステイン残基がジスルフィド結合を形成し、相同のダイマーを形成する。
【図２Ａ】図２Ａ〜Ｃは、安定したＴＦ標的化ＣＡＲ１−ＮＫ細胞系の生成を示す。ＣＡＲ１モノマー及びダイマーをコードするレンチウイルスは、ＮＫ９２ＭＩ／完全長ＣＤ１６（ｆＣＤ１６）細胞株のトランスフェクションに成功し、安定した細胞系が、２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンの下で生成した（図２ａ及びｂ）。非感染ＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞を対照として使用し、ＧＦＰは発現しなかった（図２ｃ）。明るく緑色のチャネルを使用して写真撮影をし、Ｚｅｏ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の下でマージした。スケールバー：１００μｍ。
【図２Ｂ】図２Ａ〜Ｃは、安定したＴＦ標的化ＣＡＲ１−ＮＫ細胞系の生成を示す。ＣＡＲ１モノマー及びダイマーをコードするレンチウイルスは、ＮＫ９２ＭＩ／完全長ＣＤ１６（ｆＣＤ１６）細胞株のトランスフェクションに成功し、安定した細胞系が、２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンの下で生成した（図２ａ及びｂ）。非感染ＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞を対照として使用し、ＧＦＰは発現しなかった（図２ｃ）。明るく緑色のチャネルを使用して写真撮影をし、Ｚｅｏ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の下でマージした。スケールバー：１００μｍ。
【図２Ｃ】図２Ａ〜Ｃは、安定したＴＦ標的化ＣＡＲ１−ＮＫ細胞系の生成を示す。ＣＡＲ１モノマー及びダイマーをコードするレンチウイルスは、ＮＫ９２ＭＩ／完全長ＣＤ１６（ｆＣＤ１６）細胞株のトランスフェクションに成功し、安定した細胞系が、２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンの下で生成した（図２ａ及びｂ）。非感染ＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞を対照として使用し、ＧＦＰは発現しなかった（図２ｃ）。明るく緑色のチャネルを使用して写真撮影をし、Ｚｅｏ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の下でマージした。スケールバー：１００μｍ。
【図３】図３Ａ〜Ｆは、ＴＦ標的化ＣＡＲ１ダイマー及びモノマーをコードするプラスミドｐＣＤＨ及びレンチウイルスが、ＰＥＧ−ｉｔ精製ウイルス（図３ｃ、３ｄ）又は上清（ＳＮＴ）中の非精製ベクター（図３ｅ、３ｆ）のいずれかを用いて、チャイニーズハムスター卵巣細胞ＣＨＯ−Ｋ１（図３ａ、３ｂ）をトランスフェクションし、ヒト胎児腎臓細胞２９３ＡＤを感染することができることを示す。明るく緑色のチャネルを使用して写真撮影をし、Ｚｅｏ  Ｃｅｌｌ  Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の下でマージした。スケールバー：１００μｍ。
【図４Ａ】図４Ａ〜Ｄは、ＲＴ−ＰＣＲによる、ＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞中でのＣＡＲ１、ＣＤ１６、及びβアクチンの発現を示す。Ｔｒｉｚｏｌ試薬により、ＣＡＲ１モノマー（Ｍ）又はダイマー（Ｄ）を安定してトランスフェクションしたＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＣＤ１６プラスミドをトランスフェクションしなかった親ＮＫ９２ＭＩ細胞を、ＣＡＲ１及びＣＤ１６に対する陰性対照（Ｃ）として使用した。Ａ．ＣＡＲ１。Ｂ．ＣＤ１６。Ｃ．全ＲＮＡに対するローディング対照として、βアクチンをアッセイした。２つの独立した実験からのそれぞれの写真。Ｄ．抗ヒト因子ＶＩＩ  ＨＰＲＯコンジュゲート（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた、ｆＶＩＩ発現に対するＥＬＩＳＡアッセイ。Ｄのデータは、平均±ＳＥＭとして表した。
【図４Ｂ】図４Ａ〜Ｄは、ＲＴ−ＰＣＲによる、ＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞中でのＣＡＲ１、ＣＤ１６、及びβアクチンの発現を示す。Ｔｒｉｚｏｌ試薬により、ＣＡＲ１モノマー（Ｍ）又はダイマー（Ｄ）を安定してトランスフェクションしたＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＣＤ１６プラスミドをトランスフェクションしなかった親ＮＫ９２ＭＩ細胞を、ＣＡＲ１及びＣＤ１６に対する陰性対照（Ｃ）として使用した。Ａ．ＣＡＲ１。Ｂ．ＣＤ１６。Ｃ．全ＲＮＡに対するローディング対照として、βアクチンをアッセイした。２つの独立した実験からのそれぞれの写真。Ｄ．抗ヒト因子ＶＩＩ  ＨＰＲＯコンジュゲート（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた、ｆＶＩＩ発現に対するＥＬＩＳＡアッセイ。Ｄのデータは、平均±ＳＥＭとして表した。
【図４Ｃ】図４Ａ〜Ｄは、ＲＴ−ＰＣＲによる、ＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞中でのＣＡＲ１、ＣＤ１６、及びβアクチンの発現を示す。Ｔｒｉｚｏｌ試薬により、ＣＡＲ１モノマー（Ｍ）又はダイマー（Ｄ）を安定してトランスフェクションしたＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＣＤ１６プラスミドをトランスフェクションしなかった親ＮＫ９２ＭＩ細胞を、ＣＡＲ１及びＣＤ１６に対する陰性対照（Ｃ）として使用した。Ａ．ＣＡＲ１。Ｂ．ＣＤ１６。Ｃ．全ＲＮＡに対するローディング対照として、βアクチンをアッセイした。２つの独立した実験からのそれぞれの写真。Ｄ．抗ヒト因子ＶＩＩ  ＨＰＲＯコンジュゲート（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた、ｆＶＩＩ発現に対するＥＬＩＳＡアッセイ。Ｄのデータは、平均±ＳＥＭとして表した。
【図４Ｄ】図４Ａ〜Ｄは、ＲＴ−ＰＣＲによる、ＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞中でのＣＡＲ１、ＣＤ１６、及びβアクチンの発現を示す。Ｔｒｉｚｏｌ試薬により、ＣＡＲ１モノマー（Ｍ）又はダイマー（Ｄ）を安定してトランスフェクションしたＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＣＤ１６プラスミドをトランスフェクションしなかった親ＮＫ９２ＭＩ細胞を、ＣＡＲ１及びＣＤ１６に対する陰性対照（Ｃ）として使用した。Ａ．ＣＡＲ１。Ｂ．ＣＤ１６。Ｃ．全ＲＮＡに対するローディング対照として、βアクチンをアッセイした。２つの独立した実験からのそれぞれの写真。Ｄ．抗ヒト因子ＶＩＩ  ＨＰＲＯコンジュゲート（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いた、ｆＶＩＩ発現に対するＥＬＩＳＡアッセイ。Ｄのデータは、平均±ＳＥＭとして表した。
【図５Ａ】図５Ａ〜Ｄは、ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞の、ＴＮＢＣ細胞に対するインビトロでの、及び同所性ＮＳＧマウスモデルにおけるＴＮＢＣ  ＣＤＸのインビボ治療に対する、細胞毒性、有効性、及び安全性を示す。Ａ．ＴＮＢＣ株（標的細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対する、ＮＫ−ＣＡＲ１ダイマー及びモノマー、並びにＮＫ対照（エフェクター細胞）の細胞毒性を、ＣｙｔｏＴｏｘ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアッセイした。ＣＡＲ１ダイマー及びモノマー：ＣＤ１６及びＴＦ標的化ＣＡＲ１ダイマー又はモノマーを発現するＮＫ９２ＭＩ細胞。対照細胞：ＮＫ対照（ＧＦＰ、ＣＤ１６、及びＣＡＲ１で陰性）としての、非感染ＮＫ９２ＭＩ（ＡＴＣＣ）。注：ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫのＴＮＢＣに対する直接殺傷をアッセイするために、エフェクター細胞（Ｅ）を、標的細胞（Ｔ）で直接インキュベートした。Ｂ〜Ｄ：０日目に、２×１０６  のＣＡＲ１−ＮＫ細胞又は対照ＮＫ細胞を１回静脈内注射することで処理した、メスＮＳＧマウスの腫瘍体積（Ｂ）、腫瘍重量（Ｃ）、及びマウス体重（Ｄ）。ｔ検定又はＡＮＯＶＡ（Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）によりデータを分析し、平均±ＳＥＭとして表した。
【図５Ｂ】図５Ａ〜Ｄは、ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞の、ＴＮＢＣ細胞に対するインビトロでの、及び同所性ＮＳＧマウスモデルにおけるＴＮＢＣ  ＣＤＸのインビボ治療に対する、細胞毒性、有効性、及び安全性を示す。Ａ．ＴＮＢＣ株（標的細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対する、ＮＫ−ＣＡＲ１ダイマー及びモノマー、並びにＮＫ対照（エフェクター細胞）の細胞毒性を、ＣｙｔｏＴｏｘ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアッセイした。ＣＡＲ１ダイマー及びモノマー：ＣＤ１６及びＴＦ標的化ＣＡＲ１ダイマー又はモノマーを発現するＮＫ９２ＭＩ細胞。対照細胞：ＮＫ対照（ＧＦＰ、ＣＤ１６、及びＣＡＲ１で陰性）としての、非感染ＮＫ９２ＭＩ（ＡＴＣＣ）。注：ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫのＴＮＢＣに対する直接殺傷をアッセイするために、エフェクター細胞（Ｅ）を、標的細胞（Ｔ）で直接インキュベートした。Ｂ〜Ｄ：０日目に、２×１０６  のＣＡＲ１−ＮＫ細胞又は対照ＮＫ細胞を１回静脈内注射することで処理した、メスＮＳＧマウスの腫瘍体積（Ｂ）、腫瘍重量（Ｃ）、及びマウス体重（Ｄ）。ｔ検定又はＡＮＯＶＡ（Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）によりデータを分析し、平均±ＳＥＭとして表した。
【図５Ｃ】図５Ａ〜Ｄは、ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞の、ＴＮＢＣ細胞に対するインビトロでの、及び同所性ＮＳＧマウスモデルにおけるＴＮＢＣ  ＣＤＸのインビボ治療に対する、細胞毒性、有効性、及び安全性を示す。Ａ．ＴＮＢＣ株（標的細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対する、ＮＫ−ＣＡＲ１ダイマー及びモノマー、並びにＮＫ対照（エフェクター細胞）の細胞毒性を、ＣｙｔｏＴｏｘ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアッセイした。ＣＡＲ１ダイマー及びモノマー：ＣＤ１６及びＴＦ標的化ＣＡＲ１ダイマー又はモノマーを発現するＮＫ９２ＭＩ細胞。対照細胞：ＮＫ対照（ＧＦＰ、ＣＤ１６、及びＣＡＲ１で陰性）としての、非感染ＮＫ９２ＭＩ（ＡＴＣＣ）。注：ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫのＴＮＢＣに対する直接殺傷をアッセイするために、エフェクター細胞（Ｅ）を、標的細胞（Ｔ）で直接インキュベートした。Ｂ〜Ｄ：０日目に、２×１０６  のＣＡＲ１−ＮＫ細胞又は対照ＮＫ細胞を１回静脈内注射することで処理した、メスＮＳＧマウスの腫瘍体積（Ｂ）、腫瘍重量（Ｃ）、及びマウス体重（Ｄ）。ｔ検定又はＡＮＯＶＡ（Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）によりデータを分析し、平均±ＳＥＭとして表した。
【図５Ｄ】図５Ａ〜Ｄは、ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞の、ＴＮＢＣ細胞に対するインビトロでの、及び同所性ＮＳＧマウスモデルにおけるＴＮＢＣ  ＣＤＸのインビボ治療に対する、細胞毒性、有効性、及び安全性を示す。Ａ．ＴＮＢＣ株（標的細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）に対する、ＮＫ−ＣＡＲ１ダイマー及びモノマー、並びにＮＫ対照（エフェクター細胞）の細胞毒性を、ＣｙｔｏＴｏｘ  Ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてアッセイした。ＣＡＲ１ダイマー及びモノマー：ＣＤ１６及びＴＦ標的化ＣＡＲ１ダイマー又はモノマーを発現するＮＫ９２ＭＩ細胞。対照細胞：ＮＫ対照（ＧＦＰ、ＣＤ１６、及びＣＡＲ１で陰性）としての、非感染ＮＫ９２ＭＩ（ＡＴＣＣ）。注：ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫのＴＮＢＣに対する直接殺傷をアッセイするために、エフェクター細胞（Ｅ）を、標的細胞（Ｔ）で直接インキュベートした。Ｂ〜Ｄ：０日目に、２×１０６  のＣＡＲ１−ＮＫ細胞又は対照ＮＫ細胞を１回静脈内注射することで処理した、メスＮＳＧマウスの腫瘍体積（Ｂ）、腫瘍重量（Ｃ）、及びマウス体重（Ｄ）。ｔ検定又はＡＮＯＶＡ（Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ）によりデータを分析し、平均±ＳＥＭとして表した。
【図６Ａ】図６Ａ〜Ｃは、同所性ＮＳＧマウスモデルにおける、ヒトＴＮＢＣ  ＰＤＸの処理のためのパイロットスタディにおいて、ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞療法は効果的であり、安全であったことを示す。ＴＮＢＣ  ＰＤＸ（ＪＡＸ）を、４週齢のメスＮＳＧマウスで生成した。ＰＤＸ腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、ＣＡＲ１ダイマー及びＣＤ１６（ＣＡＲ１ダイマー）を発現するＮＫ９２ＭＩを、尾静脈を介して静脈内注射した（マウス１匹あたり、３×１０６細胞、矢印）（１群あたり３匹のマウス）。対照マウスに、ＣＡＲ１を有しないＮＫ９２ＭＩマウスを静脈内注射した。
【図６Ｂ】図６Ａ〜Ｃは、同所性ＮＳＧマウスモデルにおける、ヒトＴＮＢＣ  ＰＤＸの処理のためのパイロットスタディにおいて、ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞療法は効果的であり、安全であったことを示す。ＴＮＢＣ  ＰＤＸ（ＪＡＸ）を、４週齢のメスＮＳＧマウスで生成した。ＰＤＸ腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、ＣＡＲ１ダイマー及びＣＤ１６（ＣＡＲ１ダイマー）を発現するＮＫ９２ＭＩを、尾静脈を介して静脈内注射した（マウス１匹あたり、３×１０６細胞、矢印）（１群あたり３匹のマウス）。対照マウスに、ＣＡＲ１を有しないＮＫ９２ＭＩマウスを静脈内注射した。
【図６Ｃ】図６Ａ〜Ｃは、同所性ＮＳＧマウスモデルにおける、ヒトＴＮＢＣ  ＰＤＸの処理のためのパイロットスタディにおいて、ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞療法は効果的であり、安全であったことを示す。ＴＮＢＣ  ＰＤＸ（ＪＡＸ）を、４週齢のメスＮＳＧマウスで生成した。ＰＤＸ腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、ＣＡＲ１ダイマー及びＣＤ１６（ＣＡＲ１ダイマー）を発現するＮＫ９２ＭＩを、尾静脈を介して静脈内注射した（マウス１匹あたり、３×１０６細胞、矢印）（１群あたり３匹のマウス）。対照マウスに、ＣＡＲ１を有しないＮＫ９２ＭＩマウスを静脈内注射した。
【図７Ａ】図７Ａ〜Ｄは、同所性ＮＳＧマウスモデルにおけるヒトＴＮＢＣ  ＰＤＸの治療に対して、ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞療法は効果的であり、安全であったことを示す。ＴＮＢＣ  ＰＤＸ（ＪＡＸ）を、４週齢のメスＮＳＧマウスで生成した。ＰＤＸ腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、ＣＡＲ１ダイマー及びＣＤ１６（ＣＡＲ１ダイマー）を発現するＮＫ９２ＭＩを、尾静脈を介して静脈内注射した（マウス１匹あたり、３×１０６細胞、矢印）（１群あたり５匹のマウス）。ＣＡＲを有しない親ＮＫ９２ＭＩを対照として使用した。ａ．腫瘍体積。ｂ〜ｃ．腫瘍重量及びマウス体重を、動物を犠牲にする時点で測定した。ｎｓ：有意差なし；＊、＊＊＊、＊＊＊＊：ｐ＜０．０５、０．００１、及び０．０００１。
【図７Ｂ】図７Ａ〜Ｄは、同所性ＮＳＧマウスモデルにおけるヒトＴＮＢＣ  ＰＤＸの治療に対して、ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞療法は効果的であり、安全であったことを示す。ＴＮＢＣ  ＰＤＸ（ＪＡＸ）を、４週齢のメスＮＳＧマウスで生成した。ＰＤＸ腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、ＣＡＲ１ダイマー及びＣＤ１６（ＣＡＲ１ダイマー）を発現するＮＫ９２ＭＩを、尾静脈を介して静脈内注射した（マウス１匹あたり、３×１０６細胞、矢印）（１群あたり５匹のマウス）。ＣＡＲを有しない親ＮＫ９２ＭＩを対照として使用した。ａ．腫瘍体積。ｂ〜ｃ．腫瘍重量及びマウス体重を、動物を犠牲にする時点で測定した。ｎｓ：有意差なし；＊、＊＊＊、＊＊＊＊：ｐ＜０．０５、０．００１、及び０．０００１。
【図７Ｃ】図７Ａ〜Ｄは、同所性ＮＳＧマウスモデルにおけるヒトＴＮＢＣ  ＰＤＸの治療に対して、ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞療法は効果的であり、安全であったことを示す。ＴＮＢＣ  ＰＤＸ（ＪＡＸ）を、４週齢のメスＮＳＧマウスで生成した。ＰＤＸ腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、ＣＡＲ１ダイマー及びＣＤ１６（ＣＡＲ１ダイマー）を発現するＮＫ９２ＭＩを、尾静脈を介して静脈内注射した（マウス１匹あたり、３×１０６細胞、矢印）（１群あたり５匹のマウス）。ＣＡＲを有しない親ＮＫ９２ＭＩを対照として使用した。ａ．腫瘍体積。ｂ〜ｃ．腫瘍重量及びマウス体重を、動物を犠牲にする時点で測定した。ｎｓ：有意差なし；＊、＊＊＊、＊＊＊＊：ｐ＜０．０５、０．００１、及び０．０００１。
【図７Ｄ】図７Ａ〜Ｄは、同所性ＮＳＧマウスモデルにおけるヒトＴＮＢＣ  ＰＤＸの治療に対して、ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞療法は効果的であり、安全であったことを示す。ＴＮＢＣ  ＰＤＸ（ＪＡＸ）を、４週齢のメスＮＳＧマウスで生成した。ＰＤＸ腫瘍が約１００ｍｍ３に達したときに、ＣＡＲ１ダイマー及びＣＤ１６（ＣＡＲ１ダイマー）を発現するＮＫ９２ＭＩを、尾静脈を介して静脈内注射した（マウス１匹あたり、３×１０６細胞、矢印）（１群あたり５匹のマウス）。ＣＡＲを有しない親ＮＫ９２ＭＩを対照として使用した。ａ．腫瘍体積。ｂ〜ｃ．腫瘍重量及びマウス体重を、動物を犠牲にする時点で測定した。ｎｓ：有意差なし；＊、＊＊＊、＊＊＊＊：ｐ＜０．０５、０．００１、及び０．０００１。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は本明細書において、１つ、又は２つ以上（すなわち少なくとも１つ）の、冠詞の文法上の目的物を意味するように用いられる。例えば、「構成要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの構成要素、又は２つ以上の構成要素を意味する。
【０００９】
量、時間等の、測定可能な値を指す際に本明細書で用いられる「約」は、明記した値の±２０％、又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、そして更により好ましくは±０．１％の変化を包含することが、このような変化が開示した方法を実施するのに適切であるために意味される。
【００１０】
「予防的」治療とは、病状の進展リスクを低下させる目的で、疾患の兆候を示さない、又は初期の兆候のみを示す対象に投与される治療である。本発明の化合物は、病状が進展する可能性を低下させる、又は、進展した場合、病状の重症度を最小限に抑えるために、予防的治療として与えられ得る。
【００１１】
「治療的」治療とは、病状の兆候又は症状を示す対象に、これらの兆候又は症状を減少又は除去する目的で投与される治療である。兆候又は症状は、生化学的、細胞的、組織学的、機能的、主観的、又は客観的であることができる。
【００１２】
ポリペプチドの「断片」とは、完全長ポリペプチド又はタンパク質発現生成物よりも小さい、ポリペプチドの任意の部分を意味する。一態様において、断片は、１つ以上のアミノ酸残基が、完全長ポリペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシ末端から取り除かれている、完全長ポリペプチドの欠失類似体である。したがって、「断片」とは、後述する欠失類似体のサブセットである。
【００１３】
「アナログ」、「類似体」、又は「誘導体」は同じ意味で用いられ、ある種の例では、自然発生する分子に対して程度は異なるが、構造が実質的に同一であり、同じ生物活性を有する化合物、例えばペプチド又はポリペプチドを意味する。類似体は、（ｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端、及び／又は自然発生するポリペプチド配列の１つ以上の内部領域における、１つ以上のアミノ酸残基の欠失、（ｉｉ）ポリペプチドの１つ以上の末端（典型的には「付加」類似体）、及び／又は自然発生するポリペプチド配列の１つ以上の内部領域（典型的には「挿入」類似体）における、１個以上のアミノ酸の挿入又は付加、あるいは、（ｉｉｉ）自然発生するポリペプチド配列の他のアミノ酸に関する、１個以上のアミノ酸の置換を伴う、１つ以上の変異に基づいて、その類似体が誘導される自然発生するポリペプチドと比較して、アミノ酸配列の組成が異なる。
【００１４】
生命体、組織、細胞、又はその構成成分の文脈で用いる際、用語「異常」とは、「通常」（予想される）それぞれの特徴を表す、これらの生命体、組織、細胞、又はその構成成分とは、少なくとも１つの観察可能な、又は検出可能な特徴（例えば年齢、治療、時刻など）が異なる、これらの生命体、組織、細胞、又はその構成成分を意味する。ある細胞又は組織種で一般的な、又は予想される特徴は、異なる細胞又は組織種に関しては異常であり得る。
【００１５】
本明細書で使用する場合、疾患を「緩和する」とは、疾患又は障害の、少なくとも１つの兆候又は症状の頻度又は重症度を低下させることを意味する。
【００１６】
「核酸」とはポリヌクレオチドを意味し、ポリリボヌクレオチド及びポリデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明に係る核酸は、ピリミジン及びプリン塩基の任意のポリマー又はオリゴマー、好ましくはそれぞれシトシン、チミン、及びウラシル、並びにアデニン及びグアニンを含むことができる。（その全体があらゆる目的のために本明細書に組み込まれている、Ａｌｂｅｒｔ  Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，７９３〜８００（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂ．１９８２）を参照のこと。）実際、本発明は、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、又はペプチド核酸構成成分、及びこれらの任意の化学的多様体、例えばこれらの塩基のメチル化、ヒドロキシメチル化、又はグルコシル化塩基などを想到する。ポリマー及びオリゴマーは、組成物中で不均質又は均質であることができ、自然発生する源から単離することができる、又は人工的に、若しくは合成により生成することができる。更に、核酸はＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はこれらの混合物であることができ、ホモ二重鎖、ヘテロ二重鎖、及びハイブリッド状態を含む、一本鎖又は二重鎖形態で恒久的又は移行的に存在することができる。
【００１７】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は同じ意味で用いられ、ペプチド結合により共有結合されたアミノ酸残基を含む化合物を意味する。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２種類のアミノ酸を含んでいなければならず、タンパク質又はペプチドの配列を含むことができるアミノ酸の最大数に制限はない。ポリペプチドは、ペプチド結合により互いに結合される、２つ以上のアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用する場合、この用語は、当該技術分野においては例えば、ペプチド、オリゴペプチド、及びオリゴマーとも一般的に呼ばれる短鎖、並びに、当該技術分野においてはタンパク質と一般的に呼ばれる、長鎖の両方を意味し、これらには多くの種類が存在する。「ポリペプチド」としては、例えば、とりわけ、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの多様体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質が挙げられる。ポリペプチドとしては、自然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、又はこれらの組み合わせが挙げられる。
【００１８】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」は、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、アンチセンスＲＮＡ、スモールヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、リボザイム、ゲノムＤＮＡ、合成形態、及び混合ポリマー、センス及びアンチセンス鎖の両方を含み、化学修飾又は生化学修飾により、非自然又は誘導体化、合成、若しくは半合成ヌクレオチド塩基を含有することができる。また、欠失、挿入、１つ以上のヌクレオチドの置換、又は他のポリヌクレオチド配列との融合を含むがこれらに限定されない、野生型又は合成遺伝子の変更もまた想到する。
【００１９】
本明細書で使用する場合、用語「診断」とは、疾患又は障害の存在を判定することを意味する。本発明のいくつかの実施形態では、特定の疾患又は障害の存在の判定を可能にする、診断実施方法が提供される。
【００２０】
「疾患」とは、対象の健康状態であって、その対象がホメオスタシスを維持できず、かつ、その疾患が緩和されない場合、対象の健康が悪化し続ける状態である。対照的に、対象の「障害」とは、その対象がホメオスタシスを維持することができるものの、その対象の健康状態が、障害が存在しない場合と比べてさほど好ましくない健康状態である。未治療のままにした場合、障害は必ずしも、対象の健康状態の更なる低下を引き起こすわけではない。
【００２１】
本明細書で使用する場合、用語「治療法」又は「治療レジメン」とは、障害又は病状を緩和させる、又は変化させるために取られるこれらの活動、例えば、薬理学的、外科的、食事的、及び／又は他の技術を用いて、疾患又は障害の少なくとも１つの兆候又は症状を低下させる、又は取り除くことを意図する、一連の治療を意味する。治療レジメンとしては、所定の用量の１種以上の薬物、又は手術を挙げることができる。治療法は最も多くの場合に有益であり、障害又は病状の少なくとも１つの兆候又は症状を低下させる、又は取り除くが、場合によっては、治療法の効果は望ましくないものとなる、又は副作用を有する。治療法の効果はまた、対象の生理学的状態、例えば年齢、性別、遺伝学、体重、他の病状などにより影響を受ける。
【００２２】
用語「治療上有効量」とは、研究者、獣医、医師、又は他の臨床医により探求されている組織、系、又は対象の生物学的又は医学的応答を誘発する、対象となる化合物の量を意味する。用語「治療上有効量」とは、投与された際に、治療されている障害又は疾患の１つ以上の兆候又は症状の進展をある程度予防する、又はこれらをある程度緩和するのに十分な化合物の量を含む。治療上有効量は、化合物、疾患及びその重症度、並びに、治療される対象の年齢、体重などに応じて変化する。
【００２３】
疾患を「治療する」とは、この用語が本明細書で用いられる場合、対象が経験する疾患又は障害の少なくとも１つの兆候又は症状の頻度又は重症度を低下させることを意味する。
【００２４】
本明細書で使用する場合、用語「細胞」は、個々の細胞、細胞株、初代培養物、又は、別様に明記されない限りこのような細胞から由来する培養物もまた意味する。「培養物」とは、同一又は異なる種類の単離細胞を含む組成物を意味する。細胞株とは、不明確に再生産可能である特定の種類の培養物であり、それ故、細胞株は「不死」となる。細胞培養物は、寒天などの培地で増殖した細胞の個体群であることができる。初代細胞培養物とは、細胞からの培養物、又は生体から直接採取された培養物であり、不死化されていない。
【００２５】
用語「生体サンプル」とは、組織（例えば、組織生検）、器官、細胞（培養物中で維持される細胞を含む）、細胞可溶化物（若しくは溶解物の画分）、細胞若しくは細胞材料に由来する生体分子（例えばポリペプチド若しくは核酸）、又は対象の体液を意味する。体液の非限定例としては、血液、尿、血漿、血清、涙、リンパ、胆汁、脳脊髄液、間質液、房水又は硝子体液、初乳、痰、羊水、唾液、肛門及び膣分泌物、発汗、精液、漏出液、排泄物、並びに滑液が挙げられる。
【００２６】
範囲：本開示を通して、本発明の種々の態様は範囲の形式で表すことができる。範囲の形式での記載は単に、便宜上、かつ簡便化のためと理解されるべきであり、本発明の範囲の、柔軟性を欠く限定と解釈してはならない。したがって、範囲の記載は、具体的に開示された起こりうる全ての部分範囲、及びその範囲内の個別の数値を有するものと考えられなければならない。例えば、１〜６などの範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６などの、具体的に開示された部分範囲、並びに、その範囲内の個別の数字、例えば１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び６を有すると考えられなければならない。これは、範囲の大きさに関係なく適用される。
【００２７】
本明細書で教示される方法に従うと、対象には、有効量の作用物質が投与される。用語「有効量」及び「有効用量」は、同じ意味で用いられる。用語「有効量」は、所望の生理的応答を生み出すのに必要な任意の量と定義される。作用物質を投与するための有効量及びスケジュールは実験により決定され、このような決定を行うことは当業者の範囲内である。投与のための用量範囲は、疾患又は障害の１つ以上の症状が影響を受ける（例えば、低下する、又は遅延する）所望の効果を生み出すのに十分大きいものである。用量は、例えば不必要な交差反応、アナフィラキシー型反応等の実質的な副作用を引き起こす程多いものであってはならない。一般的に、用量は、年齢、状態、性別、疾患の種類、疾患若しくは障害の程度、投与経路、又は、他の薬剤がそのレジメンに含まれているか否かと共に変化し、当業者により決定することができる。用量は、任意の禁忌の場合には、個別の医師により調整することができる。用量は変えることができ、１日又は数日間で毎日、１回以上の用量投与で投与されることができる。手引きは、所与の部類の薬剤製品に対する適切な用量に関する文献に見出すことができる。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「治療」「治療する」、又は「治療すること」とは、疾患若しくは状態の効果、又は疾患若しくは状態の症状を低下させる方法を意味する。したがって、開示した方法において、「治療」とは、確立された疾患若しくは状態の重症度、又は疾患若しくは状態の症状の、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％の低下を意味することができる。例えば、疾患の治療方法は、対照と比較して、対象における疾患の１つ以上の症状の１０％の低下があれば、治療であると考えられる。したがって、低下とは、生来のレベル、又は対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、又は１０％〜１００％の間の、任意の割合での低下であることができる。「治療」とは必ずしも、疾患、状態、又は疾患若しくは状態の症状の治癒、又は完全な消失を意味しないと理解されている。
【００２９】
本明細書で使用する場合、用語である、疾患又は障害の「予防する」、「予防すること」、及び「予防」とは、処置、例えば、対象が、疾患又は障害の１つ以上の症状を示し始める前、又はこれとほぼ同じ時間に生じ、その疾患又は障害の１つ以上の症状の開始又は悪化の遅延を示す、治療薬の投与を意味する。本明細書で使用する場合、「減少」、「低下」、又は「阻害」への言及とは、対照レベルと比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又はそれ以上の変化を含む。このような用語は、「完全な除去」を含むことができるが、必ずしも含むわけではない。
【００３０】
概要
組織因子（ＴＦ）標的化ＣＡＲ−ＮＫ及びＣＡＲ−Ｔ細胞を、本明細書にて開示する。ＴＦ標的化ＣＡＲの設計及び開発において、ＴＦの認識ドメインとして、ＴＦに対する抗体又はｓｃＦｖの代わりに、ＴＦの天然リガンドである、因子ＶＩＩ完全長（野生型及び活性部位変異）、又は軽鎖（ｆＶＩＩ若しくはｆＶＩＩＬ）が用いられる。まず、ＴＦに対するｆＶＩＩの親和性は、ＴＦ抗原に対する抗体より、約１００〜１０００倍大きい。次に、ｆＶＩＩは、モノクローナル抗体のヒト化、又はｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングをすることなく、組み換えＤＮＡ技術により合成することができる。更に、ｆＶＩＩの軽鎖（最初の１５２個のアミノ酸残基）は、ＴＦを発現するヒト及びマウス癌細胞に、完全長ｆＶＩＩと同等に、又はこれより強力に結合することができる（Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１８）。したがって、本明細書にて開示したＴＦ標的化ＣＡＲは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域を有しない、又は有し、ＣＤ２８膜貫通及び細胞質ドメインに結合し、４−１ＢＢ及びＣＤ３ζの細胞質ドメインが続き（図１）、ＴＦ標的化ＣＡＲ１モノマー及びダイマー（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＦ８０６３７８及びＭＦ８０６３７９）という名前の、ＴＦ標的化ドメインとしての、ヒト因子ＶＩＩ軽鎖からなる。
【００３１】
任意のＴＦ標的化／結合分子を、本明細書にて開示した組成物及び方法と共に使用し、インビボ又はインビトロでＴＦを標的化することができる。前述のように、ｆＶＩＩを使用してＴＦを標的化することができる。ＴＦを標的化可能なあらゆるｆＶＩＩがそれ故、本明細書にて開示される。ｆＶＩＩは、ヒト、霊長類、マウス種、ウシ、ブタ、ラット、イヌ、及びネコ種を含むがこれらに限定されない任意の対象から得ることができる。一例を、配列番号４に見出すことができる（ポリペプチドをコードする核酸は配列番号３で表される）。配列番号４に少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、及び９９％相同であるアミノ酸配列が、本明細書にて開示される。
【００３２】
ある種の非限定的実施形態において、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、膜の少なくとも一部分にまたがる、疎水性αヘリックスを含むことができる。異なる膜貫通ドメインは、異なる受容体安定性をもたらす。抗原認識の後、受容体クラスター及びシグナルが、細胞に伝達される。本明細書にて開示する主題に従うと、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ８ポリペプチド、ＣＤ２８ポリペプチド、ＣＤ３ζポリペプチド、ＣＤ４ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、ＢＴＬＡポリペプチド、若しくは合成ペプチド（免疫応答に関連するタンパク質をベースにはしない）、又はこれらの組み合わせを含むことができる。
【００３３】
ある種の非限定的実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、少なくとも１つのシグナル伝達領域を更に含む。少なくとも１つのシグナル伝達領域としては、ＣＤ２８ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ−１０ポリペプチド、ＰＤ−１ポリペプチド、ＣＴＬＡ−４ポリペプチド、ＬＡＧ−３ポリペプチド、２Ｂ４ポリペプチド、ＢＴＬＡポリペプチド、合成ペプチド（免疫応答に関連するタンパク質をベースにはしない）、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。特定の実施形態において、シグナル伝達領域は、共刺激シグナル伝達領域である。特定の実施形態において、共刺激領域は、最適なリンパ球活性化をもたらすことができる、少なくとも１つの共刺激分子を含む
【００３４】
本明細書で使用する場合、「共刺激分子」とは、抗原に対するリンパ球の効率的な応答が必要とされる抗原受容体、又はそのリガンド以外の、細胞表面分子を意味する。少なくとも１つの共刺激シグナル伝達領域としては、ＣＤ２８ポリペプチド、４−１ＢＢポリペプチド、ＯＸ４０ポリペプチド、ＩＣＯＳポリペプチド、ＤＡＰ−１０ポリペプチド、又はこれらの組み合わせを挙げることができる。共刺激分子は、受容体への結合時に、共刺激応答、即ち、抗原がそのＣＡＲ分子に結合する際にもたらされる刺激をもたらす、細胞内応答を生み出す、細胞表面上に発現するタンパク質である、共刺激リガンドに結合することができる。共刺激リガンドとしては、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＣＤ４８、ＴＮＦＲＳＦ１４、及びＰＤ−Ｌ１が挙げられるが、これらに限定されない。一例として、ＣＡＲシグナルと組み合わせて、ＣＡＲ＋Ｔ細胞のエフェクター細胞機能を誘発する細胞内シグナルを提供するために、４−１ＢＢリガンド（即ち４−１ＢＢＬ）は、４−１ＢＢ（「ＣＤ１３７」としても知られている）に、結合することができる。４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、又はＤＡＰ−１０を含む共刺激シグナル伝達領域を含む細胞内ドメインを含んでいるＣＡＲは、米国特許第７，４４６，１９０号に開示されており（例えば、同第７，４４６，１９０号では、４−１ＢＢをコードするヌクレオチド配列は配列番号１５で説明されており、ＩＣＯＳをコードするヌクレオチド配列は配列番号１６で説明されており、ＤＡＰ−１０をコードするヌクレオチド配列は配列番号１７で説明されている）、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。特定の実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ２８ポリペプチドを含む共刺激シグナル伝達領域を含む。特定の実施形態において、ＣＡＲの細胞内ドメインは、２つの共刺激分子：ＣＤ２８及び４−１ＢＢ、又はＣＤ２８及びＯＸ４０を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。
【００３５】
特定の実施形態において、本明細書にて開示する主題のＣＡＲは、ヒト細胞で核酸配列を発現するための誘導性プロモーターを更に含むことができる。ＣＡＲ遺伝子を発現させるために用いるプロモーターは、ユビキチンＣ（ＵｂｉＣ）プロモーターなどの、構成的プロモーターであることができる。
【００３６】
ＴＦ標的化ＣＡＲを発現する細胞
本明細書にて開示する主題は、上述のとおり、ＴＦ結合ドメインを含むＣＡＲを発現する免疫応答細胞を提供する。免疫応答細胞は、細胞がＣＡＲを発現するように、本明細書にて開示するＣＡＲを形質導入することができる。本明細書にて開示する主題は、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）などの、癌治療のためにこのような細胞を用いる方法もまた提供する。本明細書にて開示する主題の免疫応答細胞は、リンパ系リネージの細胞であることができ、一次細胞、又は、健常なドナー、及び／若しくは患者からの、エクスビボで活性化され膨張した細胞であることができる。細胞は、当業者に既知のあらゆる供給元から入手可能である。Ｂ、Ｔ、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含むリンパ系リネージは、抗体の産生、細胞免疫系の制御、血液中での外来作用物質の検出、宿主に対して外来の細胞の検出などをもたらすことができる。
【００３７】
リンパ系リネージの免疫応答細胞の非限定例としては、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、制御性Ｔ細胞、胚幹細胞、及び多分化能幹細胞（例えば、リンパ系細胞が分化可能なもの）が挙げられる。Ｔ細胞は、胸腺で成熟し、細胞が媒介する免疫を主に担うリンパ球であることができる。Ｔ細胞は、適応免疫系に関係する。本明細書にて開示する主題のＴ細胞は、Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（又は幹様メモリーＴ細胞）、及び２種類のエフェクターメモリーＴ細胞：例えばＴＥＭ細胞及びＴＥＭＲＡ細胞）、制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞としても知られている）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連不変Ｔ細胞、並びにγδ  Ｔ細胞を含むがこれらに限定されない、あらゆる種類のＴ細胞であることができる。特定の実施形態において、ＣＡＲ発現Ｔ細胞はＦｏｘｐ３を発現し、Ｔ制御性表現型を獲得及び維持する。ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、細胞媒介免疫の一部であり、先天性免疫応答の間に作用するリンパ球であることができる。ＮＫ細胞は、標的細胞における細胞毒性効果を実施するために、前もって活性化をする必要はない。細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ又はキラーＴ細胞）は、感染した体細胞又は腫瘍細胞の死を誘発可能なＴリンパ球のサブセットである。
【００３８】
本明細書にて開示する主題の免疫応答細胞は、ＴＦ結合ドメインを発現することができる。このような免疫応答細胞は、癌などの、ＴＦ関連障害の治療を必要とする対象（例えばヒト対象）に投与することができる。特定の実施形態において、免疫応答細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞であることができる。特定の実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ４＋Ｔ細胞である。別の実施形態では、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００３９】
本明細書にて開示する免疫応答細胞は、免疫応答細胞がＴＦ特異的ＣＡＲ、及び少なくとも１つの共刺激リガンドを同時発現する、又は同時発現するように誘発されるように、少なくとも１つの共刺激リガンドを更に形質導入することができる。ＴＦ特異的ＣＡＲと、少なくとも１つの共刺激リガンドとの相互作用により、免疫応答細胞（例えばＴ細胞）の完全な活性化に重要な、非抗原特異的シグナルがもたらされる。共刺激リガンドとしては、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリー、及び免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーリガンドのメンバーが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＮＦは、全身性炎症に関与するサイトカインであり、急性期反応を刺激する。その主たる役割は、免疫細胞の制御である。ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーは、多数の共通した形質を共有している。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーの大部分は、短い細胞質セグメント、及び比較的長い細胞外領域を含有するＩＩ型膜貫通タンパク質（細胞外Ｃ末端）として合成される。ＴＮＦスーパーファミリーメンバーとしては、神経成長因子（ＮＧＦ）、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ４０Ｌ）／ＣＤ１５４、ＣＤ１３７Ｌ／４−１ＢＢＬ、ＴＮＦ、ＣＤ１３４Ｌ／ＯＸ４０Ｌ／ＣＤ２５２、ＣＤ２７Ｌ／ＣＤ７０、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）、ＣＤ３０Ｌ／ＣＤ１５３、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦＰ）／リンホトキシン−α（ＬＴｃｃ）、リンホトキシン−β（ＬＴＰ）、ＣＤ２５７／Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）／Ｂｌｙｓ／ＴＨＡＮＫ／Ｔａｌｌ−１、グルココルチコイド誘発ＴＮＦ受容体リガンド（ＧＩＴＲＬ）、及び、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＬＩＧＨＴ（ＴＮＦＳＦ１４）が挙げられるが、これらに限定されない。免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーは、細胞の認識、結合、又は付着プロセスに関与する、細胞表面及び可溶性タンパク質の大きな群である。これらのタンパク質は、免疫グロブリンドメイン（しわ）を有するという点で、免疫グロブリンと構造的特徴を共有している。免疫グロブリンスーパーファミリーリガンドとしては、共に、ＣＤ２８に対するリガンドであるＣＤ８０及びＣＤ８６、ＰＤ−１に対するリガンドとなるＰＤ−Ｌ１／（Ｂ７−Ｈ１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４０】
特定の実施形態において、少なくとも１つの共刺激リガンドは、４−１ＢＢＬ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ７０、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４８、ＴＮＦＲＳＦ１４、ＰＤ−Ｌ１、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される。特定の実施形態において、免疫応答細胞は、４−１ＢＢＬである１つの共刺激リガンドを形質導入する。特定の実施形態において、免疫応答細胞は、４−１ＢＢＬ及びＣＤ８０である２つの共刺激リガンドを形質導入する。少なくとも１つの共刺激リガンドを形質導入したＣＡＲは、米国特許第８，３８９，２８２号に記載されており、その全体が参照により組み込まれている。
【００４１】
更に、本明細書にて開示する免疫応答細胞は、免疫応答細胞が、少なくとも１種のサイトカインを分泌し、かつＴＦ特異的ＣＡＲを発現するように、少なくとも１種のサイトカインを更に形質導入することができる。特定の実施形態において、少なくとも１種のサイトカインは、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７、及びＩＬ−２１からなる群から選択される。特定の実施形態において、サイトカインはＩＬ−１２である。
【００４２】
末梢性ドナーリンパ球で使用可能な、ＴＦ特異的、又はＴＦ標的化ヒトリンパ球としては、例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ３：３５−４５（ＣＡＲを発現するように遺伝子組み換えした、末梢性ドナーリンパ球を開示）、Ｍｏｒｇａｎ，Ｒ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００６  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１４：１２６−１２９（α及びβヘテロダイマーを含む、完全長腫瘍抗原認識Ｔ細胞受容体複合体を発現するように遺伝子改変した、末梢性ドナーリンパ球を開示）、Ｐａｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４９５−５０４；Ｐａｎｅｌｌｉ，Ｍ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：４３８２−４３９２（腫瘍生検の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来するリンパ球培養物を開示）、及び、Ｄｕｐｏｎｔ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．２００５  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ６５：５４１７−５４２７；Ｐａｐａｎｉｃｏｌａｏｕ，Ｇ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．２００３  Ｂｌｏｏｄ  １０２：２４９８−２５０５（人工抗原提示細胞（ＡＡＰＣ）又はパルス樹状細胞を用いる、インビトロ膨張した抗原特異的末梢血白血球を選択的に開示）に開示されるものが挙げられる。免疫応答細胞（例えばＴ細胞）は自己、非自己（例えば同種異系）、又は改変した前駆細胞若しくは幹細胞のインビトロ由来であることができる。
【００４３】
特定の実施形態において、本明細書にて開示する免疫応答細胞（例えばＴ細胞）は、本明細書にて開示するＴＦ特異的ＣＡＲを、約１〜約４の、約２〜約４の、約３〜約４の、約１〜約２の、約１〜約３の、又は約２〜約３のベクターコピー数／細胞で発現する。
【００４４】
ＣＴＬの非精製源は、骨髄、胎児、新生児、若しくは成人、又は他の造血細胞源、例えば胎児の肝臓、末梢血、若しくは臍帯血液などの、当該技術分野において公知の任意のものであることができる。各種技術を用いて、細胞を分離することができる。例えば、ネガティブセレクション法により、非ＣＴＬをまず取り除くことができる。モノクローナル抗体は、陽性及び陰性選択の両方に対する、特定の細胞リネージ及び／又は分化段階と関連するマーカーを識別するために特に有用である。
【００４５】
大部分の最終分化細胞は、比較的粗い分離により、初期に取り除くことができる。例えば、磁気ビーズ分離をまず用いて、多数の無関係な細胞を取り除くことができる。全造血細胞の、好ましくは少なくとも約８０％、通常少なくとも７０％が、細胞単離前に取り除かれる。
【００４６】
分離手順としては、密度勾配遠心分離；リセット；細胞密度を変更する粒子の連結；抗体をコーティングした磁気ビーズによる磁気分離；親和性クロマトグラフィー；補体及び細胞毒素を含むがこれらに限定されないｍＡｂと結合した、又はこれを用いた細胞毒性剤；並びに、固体マトリックスに取り付けられた抗体によるパニング（例えばプレート、チップ、水簸、又は任意の他の便利な技術）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
分離及び分析技術としては、様々な精密度、例えば複数のカラーチャネル、低角度及び鈍角光散乱検出チャネル、インピーダンスチャネルを有することができるフローサイトメトリーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）などの、死細胞と関連した染料を用いることにより、細胞を死細胞に対して選択することができる。細胞は、２％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）若しくは０．２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む培地、又は任意の他の好適な、好ましくは滅菌した等張性培地で収集するのが好ましい。
【００４９】
ベクター
免疫応答細胞（例えばＴ細胞、ＣＴＬ細胞、ＮＫ細胞）の遺伝子組み換えは、実質的に均質な細胞組成に、組み換えＤＮＡ又はＲＮＡ構築物を形質導入することにより実施することができる。ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡ構築物を宿主細胞ゲノムに導入するために用いられる、レトロウイルス（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１８）又はレンチウイルス（Ｍｅｈｔａ  ａｎｄ  Ｒｅｚｖａｎｉ，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１８；Ｎｏｗａｋｏｗｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ２０１８）ベクター（例えばガンマレトロウイルス）であることができる。図１〜４に記載されているレンチウイルスベクター同様に、例えば、ＴＦ特異的ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドをレトロウイルスベクターにクローニングすることができ、発現を、その内因性プロモーター、レトロウイルス長末端反復、又は代替の内部プロモーターからもたらすことができる。
【００５０】
非ウイルスベクター又はＲＮＡも、同様に使用することができる。ランダムな染色体組み込み、又は標的組み込み（例えば、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、及び／若しくは、クラスター化され、規則的に間隔が空いている短い回文の反復（ＣＲＩＳＰＲ）を用いる）、又は導入遺伝子発現（例えば自然若しくは化学修飾ＲＮＡを用いる）、非ウイルス性「眠れる森の美女」トランスポゾン若しくはｍＲＮＡトランスフェクション  （Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ  ２０１８；Ｍｅｈｔａ  ａｎｄ  Ｒｅｚｖａｎｉ，Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１８）を、使用することができる。
【００５１】
ＴＦ特異的ＣＡＲ発現細胞を提供するための、細胞の初期遺伝子組み換えに関しては、通常はレトロウイルスベクターを、形質導入のために用いるが、任意の他の好適なウイルスベクター、又は非ウイルスデリバリーシステムを使用することができる。少なくとも２種の共刺激リガンドを含む抗原提示複合体を含む細胞を提供するための、後続の細胞の遺伝子改変に関しては、レトロウイルス遺伝子導入（形質導入）が同様に、効果的であることが判明している。キャプシドタンパク質が、ヒト細胞を感染させるのに機能的である場合、レトロウイルスベクターと、適切なパッケージング株の組み合わせもまた、好適である。ＰＡ１２（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４３１−４３７）；ＰＡ３１７（Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５−２９０２）；及びＣＲＩＰ（Ｄａｎｏｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：６４６０−６４６４）を含むが、これらに限定されない、様々なアンホトロピックウイルス産生細胞株が知られている。非アンホトロピック粒子、例えば、ＶＳＶＧ、ＲＤ１１４、又はＧＡＬＶエンベロープ、及び当該技術分野において公知の任意の他のものによる偽型化粒子もまた、好適である。
【００５２】
可能な形質導入方法としては、例えば、Ｂｒｅｇｎｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｌｏｏｄ  ８０：１４１８−１４２２の方法による、細胞を、プロデューサー細胞と直接同時培養するもの、又は、例えば、Ｘｕ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔ．２２：２２３−２３０；及びＨｕｇｈｅｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．８９：１８１７の方法による、ウイルス上清のみでの、又は、適切な成長因子及びポリカチオンを有する、若しくは有しない、濃縮ベクター原液による培養もまた挙げられる。
【００５３】
形質導入ウイルスベクターを使用して、免疫応答細胞内で共刺激リガンド（例えば４−１ＢＢＬ及びＩＬ−１２）を発現することができる。選択したベクターは、高効率の感染、並びに安定した組み込み及び発現を示すのが好ましい（例えば、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：４２３−４３０，１９９７；Ｋｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １５：８３３−８４４，１９９６；Ｂｌｏｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：６６４１−６６４９，１９９７；Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３  ２６７，１９９６；及びＭｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１０３１９，１９９７、を参照のこと）。使用可能な他のウイルスベクターとしては例えば、アデノウイルス、レンチウイルス、及びアデノ随伴ウイルスベクター、ワクシニアウイルス、ウシ乳頭腫ウイルス、又はヘルペスウイルス、例えばエプスタイン・バールウイルスが挙げられる（例えば、Ｍｉｌｌｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １５−１４，１９９０；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２７５−１２８１，１９８９；Ｅｇｌｉｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６０８−６１４，１９８８；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １：５５−６１，１９９０；Ｓｈａｒｐ，Ｔｈｅ  Ｌａｎｃｅｔ  ３３７：１２７７−１２７８，１９９１；Ｃｏｒｎｅｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３６：３１１−３２２，１９８７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２６：４０１−４０９，１９８４；Ｍｏｅｎ，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  １７：４０７−４１６，１９９１；Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：９８０−９９０，１９８９；Ｌｅ  Ｇａｌ  Ｌａ  Ｓａｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０，１９９３；及びＪｏｈｎｓｏｎ，Ｃｈｅｓｔ  １０７：７７Ｓ−８３Ｓ，１９９５のベクターも参照のこと）。レトロウイルスベクターが特に開発されており、臨床設定にて用いられている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ  ３２３：３７０，１９９０；Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，３９９，３４６号）。
【００５４】
非ウイルスアプローチもまた、細胞内でタンパク質を発現させるために用いることができる。例えば、リポフェクションの存在下における核酸の投与（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７４１３，１９８７；Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １７：２５９，１９９０；Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８，１９８９；Ｓｔａｕｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １０１：５１２，１９８３）、アシアロオロソムコイド−ポリリシンコンジュゲーション（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６３：１４６２１，１９８８；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６４：１６９８５，１９８９）、又は、外科的条件下におけるマイクロ注射（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１４６５，１９９０）により、核酸分子を細胞内に導入することができる。遺伝子導入のための、他の非ウイルス方法としては、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥデキストラン、電気穿孔法、及び原形質融合を用いる、インビトロでのトランスフェクションが挙げられる。リポソームもまた、ＤＮＡを細胞内に送達するのに、潜在的に有益である可能性がある。通常の遺伝子を、対象の感染組織に移植することもまた、通常の核酸を、生体外培養が可能な細胞種（例えば、自己由来又は異種一次細胞又はそれらの後代）に移し、その後、細胞（又はその子孫）を、標的組織に注入する、又は全身注入することにより実行することができる。組み換え受容体もまた、トランスポーゼース、又は標的ヌクレアーゼ（例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、若しくはＴＡＬＥヌクレアーゼ）を用いて誘導、又は入手することができる。一時的発現は、ＲＮＡ電気穿孔法により得ることができる。ポリヌクレオチド治療法で用いるｃＤＮＡの発現は、任意の好適なプロモーター（例えばヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、又はメタロチオネインプロモーター）から行うことができ、任意の適切な哺乳類制御エレメント若しくはイントロン（例えば、延長因子１、エンハンサー／プロモーター／イントロン構造）により、制御することができる。例えば、所望する場合、特定の細胞型で優先的に遺伝子発現を行うことが知られているエンハンサーを使用して、核酸の発現を行うことができる。使用されるエンハンサーとしては、組織又は細胞特異的エンハンサーとして特性決定されるものを挙げることができるが、これらに限定されない。あるいは、ゲノムクローンを治療用構築物として用いる場合、制御は、同族の調節配列により、又は所望する場合、上述したプロモーター又は制御因子のいずれかを含む、異種源に由来する調節配列により、媒介することができる。
【００５５】
得られた細胞は、非組み換え細胞のものに類似の条件下にて増殖することができ、これにより、改変細胞が膨張し、様々な目的に使用することができる。
【００５６】
配列：相同性／変化／最適化
本明細書にて開示する主題は、配列内で変化を生み出すことにより、アミノ酸配列又は核酸配列を最適化する方法を提供する。このような変化は、特定の変異、欠失、挿入、又は翻訳後修飾を含むことができる。本明細書にて開示する主題は、本明細書にて開示する主題の、任意の自然発生するポリペプチドの類似体を更に含む。類似体は、本明細書にて開示する主題の自然発生するポリペプチドとは、アミノ酸配列の差、翻訳後修飾、又はその両方が異なっていることができる。本明細書にて開示する主題の類似体は、本明細書にて開示する主題の自然発生するアミノ酸配列の全て又は一部と、少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又はそれ以上の同一性を一般に示すことができる。配列比較の長さは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００又はそれ以上のアミノ酸残基である。再び、同一性の程度を測定する例示的なアプローチにおいて、密接に関係した配列を示す、ｅ”３〜ｅ”１００の確率スコアと共に、ＢＬＡＳＴプログラムを用いることができる。修飾とは、ポリペプチドの、インビボ及びインビトロでの化学誘導体化、例えばアセチル化、カルボキシル化、リン酸化、又はグリコシル化を含み、このような改変は、ポリペプチド合成若しくは処理の間に生じ得る、又は単離した改変酵素による処理の後で生じ得る。類似体はまた、本明細書にて開示する主題の自然発生するポリペプチドとは、一次配列の変更が異なることもできる。これらは、自然、及び（例えば、エタンメチルサルフェートへの照射若しくは曝露によるランダム突然変異誘発から、又は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｄ  ｅｄ．），ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９，若しくはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａに記載されている部位特異的突然変異誘発により得られる）誘導の両方である、遺伝多様体を含む。Ｌ−アミノ酸以外の残基、例えばＤ−アミノ酸、又は、自然に生じない、若しくは合成アミノ酸、例えばベータ（β）若しくはガンマ（γ）アミノ酸を含有する、環化ペプチド、分子、及び類似体もまた、含まれる。
【００５７】
完全長ポリペプチドに加えて、本明細書にて開示する主題は、本明細書にて開示する主題のポリペプチド又はペプチドドメインのいずれかの断片もまた提供する。断片は、少なくとも５、１０、１３、又は１５のアミノ酸であることができる。特定の実施形態において、断片は少なくとも２０の連続アミノ酸、少なくとも３０の連続アミノ酸、又は少なくとも５０の連続アミノ酸である。特定の実施形態において、断片は少なくとも６０〜８０、１００、２００、３００、又はそれ以上の連続アミノ酸である。本明細書にて開示する主題の断片は、当業者に既知の方法により生成することができる、又は、通常のタンパク質処理（例えば、生物活性に必要でない、初期のポリペプチドのアミノ酸を除去すること、若しくは、代替ｍＲＮＡスプライシング、若しくは代替タンパク質処理事象により、アミノ酸を除去すること）により得ることができる。
【００５８】
非タンパク質類似体は、本発明のタンパク質の機能活性を模倣するように設計された化学構造を有する。本明細書にて開示する主題の方法に従い、このような類似体を投与することができる。このような類似体は、元のポリペプチドの生理学的活性を超える場合がある。類似体の設計方法は当該技術分野において周知であり、類似体の合成は、得られる類似体が、免疫応答細胞内で発現した際に元のポリペプチドの抗新生物薬活性を増加させるように、化学構造を修飾するような方法に従い実施することができる。これらの化学修飾としては、代替Ｒ基の置換、及び、参照ポリペプチドの特定の炭素原子における飽和度の変化が挙げられるが、これらに限定されない。タンパク質類似体は、インビボ分解に対して比較的耐性を有することができ、結果として、投与時により長い治療効果が得られる。機能活性を測定するためのアッセイとしては、以下の実施例に記載するものが挙げられるが、それらに限定されない。
【００５９】
本明細書にて開示する主題に従うと、ＴＦに特異的に結合する抗原結合ドメインをコードするポリヌクレオチドは、コドン最適化により修飾することができる。コドン最適化は、自然に生じる配列、及び組み換え遺伝子配列の両方を変化させ、任意の所与の発現系における、最も可能性の高いレベルの生産性を実現することができる。タンパク質発現の異なる段階で関与する因子としては、コドン適応性、ｍＲＮＡ構造、並びに、転写及び翻訳における様々なｄｓ要素が挙げられる。当業者に既知の、任意の好適なコドン最適化方法又は技術を使用して、ＯＰＴＩＭＵＭＧＥＮＥ（商標）、Ｅｎｃｏｒ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ、及びＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎを含むがこれらに限定されない、本明細書にて開示する主題のポリヌクレオチドを修飾することができる。
【００６０】
本明細書にて開示したＣＡＲを作製するために使用したアミノ酸は、組織因子（ＴＦ）により認識される機能的能力を維持する限り、他のアミノ酸と置換することができる。置換又は置き換え多様体は、典型的には、ポリペプチド内の１つ以上の部位にて、更にもう１つのアミノ酸の交換を含有し、ポリペプチドの１つ以上の性質、特にそのエフェクター機能及び／又は生物学的利用能を制御するように設計することができる。実施形態のキメラポリペプチド内における、ある種の特定のアミノ酸交換は、上で詳述している。更なる置換は、保存的、即ち、１つのアミノ酸が、類似形状及び電荷を有するもので置換されているものであってもよいし、そうでなくてもよい。保存的置換は当該技術分野において周知であり、例えば、アラニンのセリンへの；アルギニンのリジンへの；アスパラギンのグルタミン又はヒスチジンへの；アスパルテートのグルタメートへの；システインのセリンへの；グルタミンのアスパラギンへの；グルタメートのアスパルテートへの；グリシンのプロリンへの；ヒスチジンのアスパラギン又はグルタミンへの；イソロイシンのロイシン又はバリンへの；ロイシンのバリン又はイソロイシンへの；リジンのアルギニンへの；メチオニンのロイシン又はイソロイシンへの；フェニルアラニンのチロシン、ロイシン、又はメチオニンへの；セリンのスレオニンへの；スレオニンのセリンへの；トリプトファンのチロシンへの；チロシンのトリプトファン又はフェニルアラニンへの；及び、バリンのイソロイシン又はロイシンへの変更が挙げられる。
【００６１】
欠失または置換に加えて、修飾ポリペプチドは、通常ポリペプチド内への少なくとも１つの残基の付加を伴う、残基の挿入を有してよい。これは、標的化するポリペプチドの挿入、又は単に１つの残基の挿入を含んでよい。融合タンパク質と呼ばれる末端付加を以下で論じる。
【００６２】
アミノ酸及び核酸配列は、追加の残基、例えば追加のＮ若しくはＣ末端アミノ酸、又は５’若しくは３’配列を含み得、かつ、配列が、タンパク質発現が関係する生物学的タンパク質活性の維持を含む、上述の基準を満たす限り、依然として、本明細書にて開示した配列の１つで説明されるものと事実上同じであることもまた理解されよう。末端配列の付加は特に、例えば、コード領域の５’若しくは３’部分のいずれかに隣接する種々の非コード配列を含み得るか、又は、遺伝子内で発生することが知られている種々の内部配列、すなわちイントロンを含み得る核酸配列に適用される。
【００６３】
治療／治療法
ＣＡＲ−Ｔ及びＮＫ細胞治療法は、臨床試験、及び認可済み臨床用途における血液学的悪性腫瘍で評価されており（Ｌｕｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ａｃｕｔｅ  Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｃｕｒｒ  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｍａｌｉｇ  Ｒｅｐ，２０１７）、固形癌でもまた転用されている（Ｍｏｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＣＡＲｓ：Ｄｒｉｖｉｎｇ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｓｏｌｉｄ  Ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ，２０１６．６（２）：ｐ．１３３−４６）。この方法は、効果的な癌免疫治療法に必要な全身性免疫を付与する（Ｓｐｉｔｚｅｒ，Ｍ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｉｓ  Ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｅｌｌ，２０１７．１６８（３）：ｐ．４８７−５０２  ｅ１５）だけでなく、腫瘍微小環境におけるＴ及びＮＫ細胞の、局所性湿潤もまた増加させることができる。この発想と共に、チェックポイント阻害剤、及びＣＡＲ−Ｔ細胞を、多発性骨髄腫で使用することができる（Ｇａｙ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏ−ｏｎｃｏｌｏｇｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ：ＣＡＲ−Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．Ｃｌｉｎ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｌｅｕｋ，２０１７．１７（８）：ｐ．４７１−４７８）。そのために、多発性骨髄腫を使用して、ＣＡＲ−Ｔ治療法とのチェックポイント遮断の併用療法の発想を試験し、腫瘍微小環境内でのＴ細胞の湿潤を増加させ、耐性を克服することができ、故に、免疫チェックポイント遮断療法の有効性を最適化することができる。
【００６４】
ＣＡＲ−Ｔ及びＮＫ細胞の局所性湿潤を増加させるために、ＣＡＲ−Ｔ又はＮＫ細胞を、例えば、脳腫瘍のための頭蓋内送達、及び肝細胞癌、及び原発性結腸直腸癌からの肝臓転移のための肝臓内注入といった、局在又は局所送達することができる（Ｓｒｉｄｈａｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｆ．Ｐｅｔｒｏｃｃａ，Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＣＡＲ）Ｔ−Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒｓ（Ｂａｓｅｌ），２０１７．９（７））。生体外で膨張及び活性化したＮＫ細胞を含む細胞療法を、血液学的癌、及び固形癌に対して使用することができる（．Ｂａｇｇｉｏ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｃｏｍｉｎｇ  ｏｆ  ａｇｅ．Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０１７．１７７：ｐ．３−１１．）。全身注入したＮＫ細胞の、腫瘍微小環境へのホーミングを増加させるために、ヒトＮＫ細胞を遺伝子組み換えして、ケモカイン受容体ＣＸＣＲ２を発現することにより、ＣＸＣＲ２に対するリガンドを発現する腎細胞癌への移動が改善したことが報告されている（Ｋｒｅｍｅｒ，Ｖ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｅｘｐｒｅｓｓ  ＣＸＣＲ２  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｍｉｇｒａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１７．５（１）：ｐ．７３）。
【００６５】
本明細書に記載する、ｆＶＩＩ−ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞を使用して、様々な疾患及び障害を治療することができる。実際、組織因子（ＴＦ）と関連したあらゆる疾患又は障害を、本明細書にて開示する細胞で治療することができる。新生血管の形成である病的血管新生には、多くの重大な臨床的ヒト疾患、特に癌、加齢関連黄斑変性症（ＡＭＤ）、子宮内膜症、及び関節リウマチ（ＲＡ）が伴う（Ｈｕ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ２０１８）。マクロファージは、アテローム性動脈硬化症並びにウイルス感染症（ＨＩＶ及びエボラ）などの、多くのヒト疾患の進行に関与する（Ｈｕ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ２０１８）。ＴＦは、これらの病的血管新生に依存するヒト疾患での血管由来の血管内皮細胞（ＶＥＣ）、及び疾患に関連するマクロファージにて、選択的に発現し得る。生理学的条件下において、ＴＦは、休止ＶＥＣ及び単核細胞により発現はしないが、血液循環外、及び血管壁の内層に位置するいくつかの細胞（周皮細胞など）で、単に制限されている。癌においては、例えば、癌細胞は、多くの種類の固形癌、白血病（ＡＭＬ及びＡＬＬ）、並びに肉腫においてもまた、ＴＦを過剰発現する。更に、ＴＦは癌開始幹細胞（ＣＳＣ）によってもまた発現し、薬剤耐性を有しないＣＳＣを根絶するための、新規の腫瘍標的として機能することができる。それ故、本明細書で開示される方法により治療可能な疾患の例としては、癌の病理学的新生血管、加齢関連黄斑変性症及び子宮内膜症、白血病及びリンパ腫、充実性腫瘍、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、並びに、ＨＩＶ及びエボラを含むウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ＴＦに関連する癌の一覧は、表１に見出すことができる。
【００６６】
投与
本明細書にて開示する主題のＴＦ特異的ＣＡＲ、及びこれを発現する免疫応答細胞は、ＴＦに関連する疾患を治療又は予防するために、対象に全身的に、又は直接提供することができる。特定の実施形態において、ＴＦ特異的ＣＡＲ、及びこれを発現する免疫応答細胞は、対象の器官（例えば、癌の影響を受けている器官）に、直接注射される。あるいは、又は更に、ＴＦ特異的ＣＡＲ、及びこれを発現する免疫応答細胞は、例えば、循環系（例えば腫瘍脈管系）への投与により、対象の器官に、間接的に提供される。膨張剤及び分化剤は、細胞及び組成物の投与前、投与中、又は投与後に提供して、インビトロ又はインビボでの、Ｔ細胞産生を増加させることができる。
【００６７】
本明細書にて開示する主題のＴＦ特異的ＣＡＲ、及びこれを発現する免疫応答細胞は、任意の生理学上許容できるビヒクル中に投与することができる。通常、少なくとも１×１０５細胞を投与することができ、最終的に１×１０１０、又はそれ以上に達する。ＴＦ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答細胞を含む細胞群は、細胞の精製群を含むことができる。当業者は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの、様々な周知の方法を用いて、細胞群での免疫応答細胞の割合を、速やかに測定することができる。ＴＦ特異的ＣＡＲを発現する、遺伝子組み換え免疫応答細胞を含む細胞群における精製範囲は、約５０％〜約５５％、約５５％〜約６０％、約６５％〜約７０％、約７０％〜約７５％、約７５％〜約８０％、約８０％〜約８５％；約８５％〜約９０％、約９０％〜約９５％、又は約９５〜約１００％であることができる。用量は、当業者によって速やかに調整することができる（例えば、精製を低下させるには、用量の増加が必要となり得る）。免疫応答細胞は注射、カテーテルなどにより導入することができる。所望する場合、因子としては、インターロイキン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ  ６、ＩＬ−１１、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２７、及び他のインターロイキン、コロニー刺激因子、例えばＧ−、Ｍ−、及びＧＭ−ＣＳＦ、インターフェロン、例えばγ−インターフェロンを含むがこれらに限定されないものも挙げることができる。
【００６８】
本明細書にて開示する主題の組成物は、ＴＦ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答細胞、及び製薬上許容できる担体を含む、医薬組成物を含む。投与は、自己であることも、非自己であることもできる。例えば、ＴＦ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答細胞、及びこれを含む組成物は、ある対象から入手することができ、同じ対象、又は異なる、適合性のある対象に投与することができる。本明細書にて開示する主題のＴ細胞に由来する末梢血、又はその後代（例えば、インビボ、エクスビボ、若しくはインビトロ由来）は、カテーテル投与、全身注射、局部注射、静脈内注射、又は非経口的投与を含む局部注射により、投与することができる。本明細書にて開示する主題の医薬組成物（例えば、ＴＦ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答細胞を含む医薬組成物）を投与する際、組成物は、単位用量で注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルション）に製剤化することができる。
【００６９】
製剤
本明細書にて開示する主題の、一般のＴＦ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答細胞、及びこれを含む組成物は、滅菌液調製物、例えば、等張性水溶液、懸濁液、エマルション、分散液、又は粘稠組成物として、便利に提供することができ、これらは、選択されたｐＨまで緩衝化することができる。脂質調製物は、ゲル、他の粘稠組成物、及び固体組成物よりも、調製が通常容易である。更に、液体組成物は、特に注射により、幾分か投与が便利である。一方、粘稠組成物は、適切な粘度範囲内で製剤化し、特定の組織とより長い時間接触させることができる。脂質又は粘稠組成物は担体を含むことができ、担体は、例えば水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの好適な混合物を含有する溶媒又は分散媒であることができる。
【００７０】
無菌注射可能な溶液は、本明細書にて開示する主題の、一般にＴＦ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答細胞を含む組成物を、所望の場合、様々な量の他の成分必要量と共に、適切な溶媒に組み込むことにより調製することができる。このような組成物は、好適な担体、希釈剤、又は、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの賦形剤との混合物であってよい。組成物は、凍結乾燥することもできる。組成物は、所望の投与経路及び調製物に応じて、湿潤剤、分散剤、又は乳化剤（例えばメチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化又は粘度増強添加剤、防腐剤、香料添加剤、色などなどの補助物質を含有することができる。参照により本明細書に組み込まれている標準的なテキスト、例えばＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ，１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５を考慮に入れ、過度な実験をすることなく、好適な調製物を調製することができる。
【００７１】
抗菌性防腐剤、酸化防止剤、キレート剤、及び緩衝剤を含む、組成物の安定性及び滅菌性を向上させる様々な添加剤を加えることができる。微生物の作用の予防は、様々な抗菌及び抗カビ剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などにより確保することができる。注射可能な薬剤形態の吸収を持続させることは、吸収遅延剤、例えばアルミニウムモノステアレート及びゼラチンによりもたらされることができる。しかし、本発明に従うと、使用するあらゆるビヒクル、希釈剤、又は添加剤は、本明細書にて開示する主題の、一般にＴＦ特異的ＣＡＲを発現する免疫応答細胞と適合性を有する必要がある。
【００７２】
組成物は等張性であることができる、即ち、血液及び涙液と同じ浸透圧を有することができる。本明細書にて開示する主題の組成物の、所望の等浸透圧は、塩化ナトリウム、又は、デキストロース、ホウ酸、酒石酸ナトリウム、プロピレングリコール、若しくは他の無機若しくは有機溶質などの、他の製薬上許容できる作用物質を用いて実現することができる。ナトリウムイオンを含有する緩衝液には、塩化ナトリウムが特に好ましい。
【００７３】
所望する場合、組成物の粘度は、製薬上許容できる増粘剤を用いて、選択したレベルにて維持することができる。メチルセルロースは、速やかに、かつ経済的に入手可能であり、取り扱いが容易であるため、使用することができる。他の好適な増粘剤としては、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択した作用物質に応じて変化することができる。重要な点は、選択した粘度を実現する量を用いるということである。明確なことであるが、好適な担体及びその他の添加の選択は、投与の正確な経路、及び特定の投薬形態、例えば液体投薬形態の性質（例えば、組成物が溶液、懸濁液、ゲル、又は他の液体形態、例えば徐放性形態若しくは液体充填形態に製剤化可能であるか否か）に左右される。
【００７４】
当業者は、組成物の成分は、化学的に不活性となるように選択されなければならず、本明細書にて開示する主題にて記載する、免疫応答細胞の生存能又は有効性に影響を及ぼさないであることを理解するであろう。このことは、化学及び薬学原理の当業者に問題を呈することはない、又は、標準的なテキストを参照することにより、若しくは、本開示及び本明細書で引用する文書の簡便な実験（過度の実験を伴わない）により、問題は速やかに回避することができる。
【００７５】
当事者は、細胞、並びに、組成物中、及び、本明細書にて開示する主題の方法により投与可能な、任意の添加剤、ビヒクル、及び／又は担体の量を速やかに決定することができる。典型的には、任意の添加剤（活性細胞及び／又は作用物質に加えて）は、約０．００１重量％の溶液〜約５０重量％の量で、リン酸緩衝生理食塩水溶液に存在し、活性成分は、マイクログラム〜ミリグラムのオーダーで、例えば、約０．０００１重量％〜約５重量％、約０．０００１重量％〜約１重量％、約０．０００１重量％〜約０．０５重量％、約０．００１重量％〜約２０重量％、約０．０１重量％〜約１０重量％、又は約０．０５重量％〜約５重量％で存在する。動物又はヒトに投与される任意の組成物に関して、及び、任意の特定の投与方法に関して、例えば、好適な動物モデル、例えばマウスなどの齧歯類における、致死量（ＬＤ）及びＬＤ５０；並びに、好適な応答を誘発する、組成物の用量、組成物中の成分の濃度、及び、組成物の投与タイミングを測定することにより、毒性が測定されなければならない。このような測定には、当事者、本開示、及び本明細書に引用する文書の知識からの、過度の実験を必要としない。そして、連続投与の時間は、過度な実験をすることなく確認することができる。
【００７６】
要するに、ｆＶＩＩ−ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞は、それを必要とする対象に投与することができる。投与は、治療法に関係する病状の種類に応じて、局所的又は全身性であることができる。投与は、例えば、ｆＶＩＩ−ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞の、静脈内、腹腔内、肝臓内、筋肉内、腫瘍内、皮下、滑液包内、眼内、プラーク内、頭蓋内、又は皮内注射などの、当該技術分野において公知の任意の方法により行うことができる。
【００７７】
治療処置をもたらすのに必要なｆＶＩＩ−ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞の量は、それ自体固定されておらず、必要に応じて、医薬担体と共に投与される組成物中の成分濃度、以下でより完全に図示する免疫系応答を増加させる、投与される組成物の添加化合物、並びに、治療される患者の年齢、体重、及び臨床状態に左右される。好ましい組成物は、患者にとって許容できない毒性を生み出すことなく、有効量で修飾細胞を送達する。
【００７８】
本発明の医薬組成物又は製剤は、他の担体、アジュバント、安定剤、防腐剤、分散剤、及び、問題の製剤の種類を考慮した、当該技術分野において慣習的な他の作用物質もまた含むことができる。
【００７９】
キット
本明細書にて開示する主題は、癌などの、ＴＦを発現する疾患の治療又は予防のためのキットを提供する。特定の実施形態において、キットは、単位剤形にＴＦ特異的ＣＡＲを含む、有効量の免疫応答細胞を含有する治療用又は予防用組成物を含む。特定の実施形態では、細胞は、少なくとも１つの共刺激リガンドを更に発現する。特定の実施形態において、キットは、治療用又は予防用ワクチンを含有する滅菌容器を含み、このような容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル瓶、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、又は、当該技術分野において公知の他の好適な容器形態であることができる。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート加工紙、金属箔、又は、薬剤を保持するのに好適な他の材料から製造することができる。
【００８０】
所望する場合、免疫応答細胞は、癌などの疾患を有する、又はこれが進展するリスクのある対象に細胞を投与するための、指示と共に提供される。指示は一般に、疾患の治療又は予防のために組成物を使用することについての情報を含む。別の実施形態において、指示は、以下の少なくとも１つを含む：治療薬の説明、疾患又はその症状を治療又は予防するための、投薬スケジュール及び投与、注意、警告、効能、逆効能、過量投与情報、副作用、動物薬理学、臨床研究、及び／又は参照。指示は、容器（存在する場合）に直接印刷されてもよいし、容器に貼り付けられるラベルとして印刷されてもよいし、容器内で供給される、又は容器と共に供給される、個別のシート、パンフレット、又はフォルダとして印刷されてもよい。
【００８１】
実施例
実施例１：ＴＦ標的化ＣＡＲ構築物
ＣＡＲ構築物をＮＫ及びＴ細胞に効率良く形質導入するために、ＣＡＲ１ダイマー及びモノマーｃＤＮＡ（配列番号１及び２）を、ｐＣＤＨレンチベクターのマルチクローン部位（ＭＣＳ）にサブクローニングし、これは、ヒトＮＫ株及びＮＫ９２Ｘの感染に成功した（（Ｘ．Ｃｈｅｎｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｒａｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ７，２７７６４−２７７７７（２０１６））。ＣＡＲ１モノマー及びダイマーのｃＤＮＡ配列を、Ｓａｎｇｅｒ  ＤＮＡ塩基配列決定法により確認し、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託した（アクセッション番号ＭＦ８０６３７８及びＭＦ８０６３７９、配列番号１及び２）。
【００８２】
ｐＣＤＨプラスミド及びレンチウイルスが、確実にＣＡＲ１の発現をもたらすようにするために、ＣＡＲ１（ＧＦＰ及びＰｕｒｏを有する）をコードするｐＣＤＨプラスミドを、ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクションした。この細胞は事前に、ＴＦ標的化免疫複合体ｆＶＩＩ−ＩｇＧ１Ｆｃ（ＩＣＯＮと呼ばれる）（２０−２３）、及びｆＶＩＩＬ−ＩｇＧ１Ｆｃ（第二世代ＩＣＯＮとして、軽鎖ＩＣＯＮのため、Ｌ−ＩＣＯＮ１と呼ばれる）を産生するために、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミドベクターをトランスフェクションしている。２９３ＡＤ細胞もまた、上清及びＰＥＧ−ｉｔ精製ベクター内で、ｐＣＤＨ由来のレンチウイルスで感染させた。図３は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞及び２９３ＡＤ細胞は全て、ＳＮＴ又は精製ベクターのいずれかにおける、ｐＣＤＨ又はレンチウイルスのトランスフェクションの後にＧＦＰを発現したことを示し、このことは、哺乳類細胞（ハムスター及びヒト由来）が、レンチウイルスによりトランスフェクション及び感染可能であることを示している。次いで、レンチ−ＣＡＲ１ダイマー及びモノマーベクターを使用してＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞を感染させた。この細胞は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介可能な、ＩｇＧ１Ｆｃに対するＦｃ受容体である、完全長ヒトＣＤ１６をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）をトランスフェクションしている。図２は、ＮＫ９２ＭＫ／ｆＣＤ１６細胞が、レンチ−ＣＡＲ１ダイマー及びモノマーの感染後にＧＦＰを発現した一方、非感染対照細胞はＧＦＰを有しなかったことを示しており、このことは、そのレンチウイルスがＮＫ細胞株の感染に成功したことを示している。ＣＡＲ１発現は、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、及びウェスタンブロッティングにて抗ヒト因子ＶＩＩ抗体を使用して試験する。
【００８３】
実施例２：トリプルネガティブ乳癌の免疫療法のための、組織因子標的化ＣＡＲ−ＮＫ細胞
導入
組織因子（ＴＦ）は、標的化免疫療法が欠如することによる、典型的な治癒不可能な悪性疾患である、トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）に対する、新規であり一般的でありながら、選択的表面腫瘍標的であることが測定された。満たされていない治療の必要性に取り組むために、ＴＮＢＣのＣＡＲ−ＮＫ免疫療法のための、ＴＦ−ＣＡＲ１ダイマー及びモノマーとしての、細胞外標的化ドメイン（因子ＶＩＩ軽鎖、ｆＶＩＩＬ）と、膜貫通ドメイン（ＣＤ２８）との間に、（潜在的ホモ二量体化のための）ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域を有する、又は有しない、ｆＶＩＩＬ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚｅｔａを発現する、ＴＦ標的化ＣＡＲ−ＮＫ細胞を、本明細書にて開示する。ＴＦ−ＣＡＲ１−ＮＫ細胞は、インビトロでＴＮＢＣ細胞を殺傷することができ、細胞株由来、及び患者の腫瘍由来の、異種移植片マウスモデルにおけるＴＮＢＣの治療に対して効果的であり、かつ安全であることを、結果は表している。
【００８４】
トリプルネガティブ乳癌（ＴＮＢＣ）は、世界で診断された乳癌の約１５％に相当する（Ａ．Ｊｅｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｏｂａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ＣＡ：ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ６１，６９−９０（２０１１）；Ｃ．Ｋ．Ａｎｄｅｒｓ，Ｌ．Ａ．Ｃａｒｅｙ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐａｔｔｅｒｎｓ，ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ９  Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｓ７３−８１（２００９）；Ｃ．Ａ．Ｈｕｄｉｓ，Ｌ．Ｇｉａｎｎｉ，Ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ａｎ  ｕｎｍｅｔ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｎｅｅｄ．Ｔｈｅ  ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １６  Ｓｕｐｐｌ  １，１−１１（２０１１））。有効な治療標的を欠いているために、ＴＮＢＣは、悪性腫瘍を治療するのが最も困難なものであり、大部分の場合において、治癒不可能な悪性疾患であると考えられる。ＴＮＢＣに対して認可された分子標的療法は、現在のところ存在しない。
【００８５】
ＴＦは、子宮内膜症、加齢関連黄斑変性症（ＡＭＤ）、及びヒト黒色腫（Ｚ．Ｈｕ，Ｙ．Ｓｕｎ，Ａ．Ｇａｒｅｎ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９６，８１６１−８１６６（１９９９）；Ｚ．Ｈｕ，Ａ．Ｇａｒｅｎ，Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９７，９２２１−９２２５（２０００））、肺癌（Ｊ．Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ  １１，１０６９−１０８１（２０１１）、及び、患者からのマウス又は乳癌組織における腫瘍異種移植片からの、乳癌（Ｊ．Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ  １１，１０６９−１０８１（２０１１））を含む、固形癌の病理学的新生血管の血管由来ＶＥＣ（内層）における、インビトロ及びインビボの、ＶＥＧＦ刺激性の血管由来微小血管内皮モデルにおける、血管新生特異的受容体として識別されている（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｉｎｏ，Ｇ．Ｈａｉｒ，Ｄ．Ｌ．Ｋｒｅｕｔｚｅｒ，Ｆ．Ｒ．Ｒｉｃｋｌｅｓ，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２，２０９−２１５（１９９６））。固形癌及び白血病において、ＴＦはまた、様々な固形癌細胞及び白血病細胞にて、頻繁に過剰発現する（Ｚ．Ｈｕ，Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  Ｏｔｈｅｒ  Ｓｏｌｉｄ  Ｃａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ−Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕ��ｉｃ  Ｍｏｄａｌｉｔｉｅｓ，Ｅｓｒａ  Ｇｕｎｄｕｚ  ａｎｄ  Ｍｅｈｍｅｔ  Ｇｕｎｄｕｚ（Ｅｄ．），ＩＳＢＮ：９７８−９５３−３０７−７７６−５）。ＴＦはまた、胸、肺、及び卵巣癌の癌細胞株、腫瘍異種移植片、及び癌患者から単離した癌幹細胞（ＣＳＣ）に対する新規の腫瘍標的でもある（Ｚ．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ，ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ８，１４８１−１４９４（２０１７））。ＣＳＣは、ＴＦ標的化治療法に対する耐性が発達しないことが見出されている。ＴＮＢＣ治療法に対する、標的化可能な表面分子を識別するために、ＴＦは、ＴＮＢＣ癌細胞（ＴＮＢＣを有する患者の最大８５％）における、新規で共通でありながら、選択的な腫瘍標的、及び血管内皮細胞（ＶＥＣ）であることを測定した（Ｚ．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｐｌｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＣＯＮ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ６，６７１−６８４（２０１８））。したがって、ＴＦは、３つの主たる腫瘍区画、即ち、ＴＮＢＣを含む数種類の固形癌における、癌細胞、腫瘍血管由来の血管内皮細胞、及び、癌幹細胞に対する、一般的でありながら特異的な腫瘍標的である。
【００８６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）発現Ｔ及びナチュラルキラー細胞の養子免疫伝達は、新規の癌免疫治療アプローチを示す。ＣＡＲの着想は、Ｔ及びＮＫ細胞の、標的細胞の表面における対応する抗原の識別を可能にする、Ｔ又はＮＫ細胞表面における、新規受容体の発現の発想に基づいている。基本的なＣＡＲ構築物は、細胞外抗原認識ドメイン、通常は、細胞外間隙ドメイン、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、並びに、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０、ＩＣＯＳ、及びＣＤ３ｚｅｔａ鎖（ＣＤ３ζ）などのシグナル伝達細胞質ドメインに結合した、一本鎖抗体可変断片（ｓｃＦｖ）からなる。最も発展した応用は、Ｂ細胞悪性腫瘍の表面抗原である、ＣＤ１９を標的化するＣＡＲ−Ｔ細胞を使用することであり、Ｂ細胞悪性腫瘍を有する患者における、抗腫瘍有効性が示されている（Ｐ．Ｊ．Ｐａｓｚｋｉｅｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｅｒｍａｎｅｎｔｌｙ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｐｌａｓｉａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２６，４２６２−４２７２（２０１６））。
【００８７】
結果
ＴＦ標的化ＣＡＲの設計及び開発において、ＴＦの認識ドメインとして、ＴＦに対する抗体又はｓｃＦｖの代わりに、ＴＦの天然リガンドである、因子ＶＩＩを使用した。まず、ＴＦに対するｆＶＩＩの親和性（Ｅ．Ｗａｘｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ：ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，３９９８−４００３（１９９２））は、ＴＦ抗原に対する抗体（Ｌ．Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ，ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉ−ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ８５，３７９−３８９（２００１））よりも、約１００〜１０００倍大きい。次に、ｆＶＩＩは、モノクローナル抗体のヒト化、又はｓｃＦｖライブラリーのスクリーニングをすることなく、組み換えＤＮＡ技術により合成することができる。更に、ｆＶＩＩの軽鎖（最初の１５２個のアミノ酸残基）は、ＴＦを発現するヒト及びマウス癌細胞に、完全長ｆＶＩＩと同等に、又はこれより強力に結合することができることが示されている（Ｚ．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｐｌｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＣＯＮ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ６，６７１−６８４（２０１８））。したがって、ＴＦ標的化ＣＡＲは、ヒトＩｇＧ１のヒンジ領域を有しない、又は有し、ＣＤ２８膜貫通及び細胞質ドメインに結合し、そして４−１ＢＢ及びＣＤ３ζの細胞質ドメインが続き（図１）、ＴＦ標的化ＣＡＲ１モノマー及びダイマー（それぞれ、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＭＦ８０６３７８及びＭＦ８０６３７９、配列番号１及び２）という名前の、ＴＦ標的化ドメインとしての、ヒト因子ＶＩＩ軽鎖からなる。
【００８８】
ＣＡＲ構築物をＮＫ細胞に効率良く形質導入するために、ＣＡＲ１ダイマー及びモノマーｃＤＮＡを、ヒトＮＫ株ＮＫ９２への感染が成功したため（Ｚ．Ｈｕ，Ｊ．Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｘｕ，Ｗ．Ｒｕｆ，Ｃ．Ｊ．Ｌｏｃｋｗｏｏｄ，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０，８５−９６（２０１７））、ｐＣＤＨレンチベクターのマルチクローン部位（ＭＣＳ）にサブクローニングした。ＣＡＲ１モノマー及びダイマーのｃＤＮＡ配列を、Ｓａｎｇｅｒ  ＤＮＡ塩基配列決定法により確認し、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託した（アクセッション番号ＭＦ８０６３７８及びＭＦ８０６３７９、配列番号１及び２）。
【００８９】
ｐＣＤＨプラスミド及びレンチウイルス（上清及びＰＥＧ−ｉｔ精製ベクター）が、確実にＣＡＲ１の発現をもたらすようにするために、ＣＡＲ１（ＧＦＰ及びＰｕｒｏを有する）をコードするｐＣＤＨプラスミドを、ＣＨＯ−Ｋ１及び２９３ＡＤ細胞にトランスフェクションした。ＣＨＯ−Ｋ１細胞は、ＴＦ標的化免疫複合体ｆＶＩＩ−ＩｇＧ１Ｆｃ（ＩＣＯＮと呼ばれる）を産生するためのｐｃＤＮＡ３．１（＋）プラスミドベクターのトランスフェクションに成功している（Ｚ．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ，ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ８，１４８１−１４９４（２０１７）；Ｚ．Ｈｕ，Ａ．Ｇａｒｅｎ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９８，１２１８０−１２１８５（２００１）；Ｚ．Ｈｕ，Ｊ．Ｌｉ，Ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｒｅ  ｃｒｕｃｉａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｉｃｏｎ（ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ／ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  Ｆｃ）ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｏｎｇｕｅ  ｃａｎｃｅｒ．ＢＭＣ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１，４９（２０１０）ａｎｄ  ｆＶＩＩＬ−ＩｇＧ１Ｆｃ（ｃａｌｌｅｄ  Ｌ−ＩＣＯＮ１，ｆｏｒ  ｌｉｇｈｔ  ｃｈａｉｎ  ＩＣＯＮ，ａｓ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＣＯＮ）（Ｚ．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｐｌｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＣＯＮ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ６，６７１−６８４（２０１８）Ｚ．Ｈｕ，Ｊ．Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｘｕ，Ｗ．Ｒｕｆ，Ｃ．Ｊ．Ｌｏｃｋｗｏｏｄ，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０，８５−９６（２０１７））。図３は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞及び２９３ＡＤ細胞の両方が、ＳＮＴ又は精製ベクターのいずれかにおいて、ｐＣＤＨ又はレンチウイルスのトランスフェクション後にＧＦＰを発現したことを示しており、このことは、哺乳類細胞（ハムスター及びヒト由来）が、レンチウイルスによりトランスフェクション及び感染可能であることを示している。抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、ＮＫ９２ＭＩ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２４０８）を媒介する能力を有するＣＡＲ１−ＮＫ細胞を産生するために、ヒトＩＬ−２  ｃＤＮＡの安定したトランスフェクションにより、親株ＮＫ９２に由来するヒト細胞株をトランスフェクションした。これはＩＬ−２独立性である。（Ｋ．Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ａｌｔｅｒｅｄ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０，１３５９−１３７３（１９９９））。レンチウイルス感染の前に、エフェクター細胞として、抗体（ＩＣＯＮ及びＬ−ＩＣＯＮ１）依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するＣＤ１６＋ＮＫ細胞株を精製するために、ＮＫ９２ＭＩを、ＩｇＧ１Ｆｃに対するＦｃ受容体である完全長ヒトＣＤ１６（ｆＣＤ１６）をコードするプラスミドｐｃＤＮＡ３．１（＋）でも、トランスフェクションした。ＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６として示される得られた細胞を次に、ＧＦＰもまたコードする、レンチ−ＣＡＲ１ダイマー及びモノマーベクターで感染させた。図２は、ピューロマイシン選択の後、安定したＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞は、ＣＡＲ１ダイマー及びモノマー（図２Ａ）（以下、それぞれＣＡＲ１ダイマー及びモノマーと略す）をコードするレンチウイルスベクターの感染後にＧＦＰを発現したが、未感染ＮＫ９２ＭＩ又はＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６細胞は、ＧＦＰを発現しなかった（対照細胞として）ことを示し、このことは、レンチウイルスが、ＮＫ細胞株ＮＫ９２ＭＩ、及びその誘導体であるＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６の感染に成功したことを示している。
【００９０】
これらの安定したＣＡＲ１−ＮＫ細胞株を確立した後、ＣＡＲ１及びＣＤ１６  ｃＤＮＡの発現を、特異的プライマー（例えば、ＣＡＲ１に対するｆＶＩＩＬ及びＣＤ３ｚｅｔａ）を用いるＲＴ−ＰＣＲにより、そして、ｆＶＩＩ軽鎖を認識可能であると我々が示した、抗ヒト因子ＶＩＩ抗体を用いるＥＬＩＳＡにより、これらの細胞内で検証した。図４ａは、ＣＡＲ１モノマー及びダイマーのｃＤＮＡがそれぞれ、ＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６／ＣＡＲ１モノマー及びダイマー細胞内で検出され、これらの分子量は、図１に示す配列と一致することを示した一方、対照のＮＫ９２ＭＩ細胞は、ＣＡＲ１に対して陰性であったことを示した。図４ｂは、ＣＤ１６  ｃＤＮＡが、ＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６／ＣＡＲ１モノマー及びダイマーの両方に存在したが、ＮＫ９２ＭＩ対照細胞には存在しなかったことを示した。βアクチンを、ＲＴ−ＰＣＲアッセイにおいて、ハウスキーピング遺伝子対照として当量で使用した（図４ｃ）。
【００９１】
ＮＫ−ＣＡＲ１モノマー及びダイマー細胞における、ＣＡＲ１及びＣＤ１６の発現を検証してから、インビトロにおける、ＴＮＢＣ細胞の殺傷能（細胞傷害）、並びに、同所性ＴＮＢＣ  ＣＤＸ  ＮＳＧマウスモデルにおける、インビボでの治療効果及び安全性を試験した。図５Ａは、ＮＫ−ＣＡＲ１モノマー及びダイマー細胞の両方が、対照ＮＫ細胞と比較して、ヒトＴＮＢＣ株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に対して、著しい直接細胞傷害を示した（ｐ＜０．０００１、ＣＡＲ１モノマー又はダイマーｖｓ対照）ことを示した。恐らく、結合活性によって、ＣＡＲ１ダイマーは、１０：１のＥ：Ｔ比において、ＣＡＲ１モノマーの細胞傷害（７７％）よりも、ＴＮＢＣ細胞に対してわずかに高い細胞傷害（８５％）を示した。しかし、差は統計的に有意ではなかった（図５Ａ）。図５Ｂ〜５Ｄは、ＣＡＲ１−ＮＫモノマー及びダイマー細胞は、同所性ＣＤＸ  ＮＳＧマウスモデルにおけるＴＮＢＣの治療に対して、効果的かつ安全であったことを示した。２×１０６個のＮＫ−ＣＡＲ１モノマー又はダイマー細胞を１回静脈内注射した後、ＴＮＢＣ  ＣＤＸの増殖は、非レンチ−ＣＡＲ１感染ＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６対照細胞を注射した対照マウスにおける増殖と比較して、著しく阻止された。我々のインビトロデータと同様に、腫瘍体積（図５Ｂ）及び腫瘍重量（図５Ｃ）を測定することにより明示されるように、ＮＫ−ＣＡＲ１ダイマー細胞は、ＮＫ−ＣＡＲ１モノマーよりも、ＴＮＢＣ  ＣＤＸの治療により効果的であったが、差は統計的に有意ではなかった。対照群とＮＫ−ＣＡＲ１治療群との全マウス体重において差はなく（図５Ｄ）、このことは、ＴＦ標的化ＣＡＲ１−ＮＫ治療法が安全であったことを示唆している。インビトロ及びインビボでのＴＮＢＣの治療に対して、ＴＦ−ＣＡＲ１ダイマー細胞は、ＴＦ−ＣＡＲ１モノマー細胞よりも強い効果を有したため、モノマーではなく、ＮＫ−ＣＡＲ１ダイマー細胞を、後での研究に使用した。
【００９２】
クリニックでのＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ治療法により良く転用するため、ＮＫ−ＣＡＲ１細胞の有効性及び安全性を、同所性ＴＮＢＣ  ＰＤＸ  ＮＳＧマウスモデルで調査した（１群あたり３匹のマウス）。図６は、腫瘍体積（図６ａ）、腫瘍重量（図６ｂ）、及びマウスの体重（図６ｃ）を測定して判定すると、同所性ＰＤＸ  ＮＳＧマウスモデルにおいて、ＴＦ−ＣＡＲ１ダイマー細胞免疫療法は、ＴＮＢＣ  ＰＤＸの治療に対して効果的かつ安全であることを示した。
【００９３】
パイロットスタディで観察した知見を検証するために、同所性ＰＤＸ  ＮＳＧマウス（１群あたり５匹のマウス）における、ＴＦ−ＣＡＲ１ダイマー治療法の有効性及び安全性調査を繰り返した。図７は、腫瘍体積（図７Ａ）、腫瘍増殖率％（図７Ｂ）、腫瘍重量（図７Ｃ）、及びマウスの体重（図７Ｄ）を測定して判定すると、症状発現前のマウスモデルにおけるＴＮＢＣ  ＰＤＸの治療に対して、ＴＦ標的化ＣＡＲ１−ＮＫ細胞免疫療法は効果的かつ安全であることを示した。
【００９４】
議論
細胞免疫療法に対してＴＦを標的化するために、ＴＦ標的化ＣＡＲベースのレンチウイルスベクターを開発し、ヒトＮＫ株（ＮＫ９２ＭＩ）をＴＦ−ＣＡＲ１レンチウイルスベクターで感染させることにより、ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞を産生した。各ＣＡＲ構築物に２つ又は１つのいずれかのＴＦ標的化ドメインを有するＣＡＲ１−ＮＫ細胞は、同所性ＣＤＸ及びＰＤＸマウスモデルにおいて、インビトロ及びインビボでＴＮＢＣを治療することに対して効果的かつ安全であることが示された。これらのＴＦ−ＣＡＲ１  ＮＫ細胞はＣＤ１６も発現するため、ＴＮＢＣの治療に関して、Ｌ−ＩＣＯＮ１及び他の治療用抗体との併用療法において、潜在的にＬ−ＩＣＯＮ１−ＡＤＣＣを媒介することができる。したがって、本研究では、ＴＮＢＣのＣＡＲ−ＮＫ細胞免疫療法に対する、ＴＦを標的化する着想の証拠が確立された。ＴＦは、癌だけでなく、病的血管新生依存性及びマクロファージ随伴ヒト疾患においても、選択的に発現される（Ｚ．Ｗ．Ｈｕ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｌｉｋｅ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｓ  Ｗｅｌｌ  ａｓ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ７，（２０１８））。新生血管の形成である病的血管新生は、多くの臨床的に重大なヒト疾患、特に癌、加齢関連黄斑変性症（ＡＭＤ）、子宮内膜症、及び関節リウマチ（ＲＡ）に関与している。マクロファージは、様々なヒト疾患、例えばアテローム性動脈硬化症並びにウイルス感染症（ヒト免疫不全ウイルス・ＨＩＶ及びエボラ）の進行に関与する。ＴＦは、これらの病的血管新生依存性ヒト疾患における血管由来ＶＥＣ、及び疾患随伴マクロファージにおいて選択的に発現されることが十分に実証されている。ＣＡＲ−ＮＫ及び−Ｔ治療法は、これらの血管新生依存性、及びマクロファージ随伴ヒト疾患を治療する能力を持つ新規の治療的アプローチをもたらすため、これらの臨床的に重大なヒト疾患に対する治療レジメンに、幅広く影響を及ぼすことができる。
【００９５】
実施例２のサポート材料及び方法
細胞株
チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−Ｋ１）及びＮＫ９２ＭＩを、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から、それぞれ２００４年と２００７年に購入した。ＣＨＯ−Ｋ１は、１０％加熱不活性化ウシ胎児血清（ＨＩ−ＦＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）、並びに１×ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充した、Ｆ１２Ｋ完全増殖培地（ＡＴＣＣ）で増殖させた。２９３ＴＮ（ＳＢＩ）、２９３ＦＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び２９３ＡＤ（Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を商業供給元から購入し、レンチウイルスベクター産生のため、ＤＭＥＭ完全増殖培地で増殖させた。ヒトＴＮＢＣ細胞株ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＢＲＣＡ１−ｗｔ、ＢＲＣＡ２−変異）を、ＡＴＣＣから２００９年に購入し、１０％ＨＩ−ＦＢＳ、並びに１×ペニシリン及びストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したＬ−１５完全増殖培地で増殖させた。培養物を年に一度、マイコプラズマ汚染について試験した。Ｍｙｃｏａｌｅｒｔ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ，カタログ番号ＬＴ０７−１１８）を用いてこの汚染を試験した最近の日付は、２０１７年６月２６日であった。フローサイトメトリー、ウェスタンブロット、及び／又は細胞ＥＬＩＳＡによりＴＦ発現を検証することにより、癌細胞株の真偽を測定した。
【００９６】
ＣＡＲプラスミドＤＮＡ及びレンチウイルスベクターの構築
ＴＦ標的化ＣＡＲ１ダイマー及びモノマー構築物を、ヒトＩｇＧ１ヒンジ領域（ＣＡＲ１のホモ二量体を形成するため）を有する、又はヒンジ領域（モノマーＣＡＲ１として）を有しない、ヒト因子ＶＩＩ軽鎖を（ＴＦ認識ドメインとして）、その後、ＣＤ２８膜貫通及び細胞質ドメイン、４−１ＢＢ及びＣＤ３ｚｅｔａをコードするように、設計した。ｃＤＮＡ構築物を個別対応で、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ）のレンチウイルスシャトルベクターｐＣＤＨ（ＳＢＩカタログ番号ＣＤ７１３Ｂ）内に合成した。ＴＦ標的化ＣＡＲ１モノマー及びダイマーのｃＤＮＡ配列を、Ｓａｎｇｅｒ  ＤＮＡ塩基配列決定法により検証し、それぞれ、アクセッション番号ＭＦ８０６３７８及びＭＦ８０６３７９で、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託した。ＣＡＲ１ダイマー及びモノマーをコードするレンチウイルスを、メーカーの指示に従い、ＰｕｒＦｅｃｔｉｏｎトランスフェクション試薬を用いて、ｐＣＤＨ−ＣＡＲ１及びｐＰＡＣＫＨ１（ＳＢＩ）と共に２９３ＴＮ（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に同時トランスフェクションすることにより産生した。細胞培養上清中のレンチウイルスを４８及び７２時間で回収し、上清（ＳＮＴ）中で、非濃縮ウイルス粒子として使用した、又は、ＰＥＧ−ｉｔ試薬（ＳＢＩ）を使用して濃縮した。
【００９７】
レンチウイルス感染、及び発現プラスミドＤＮＡによるトランスフェクションによる、付着細胞（ＣＨＯ−Ｋ１、２９３ＡＤ）及び懸濁細胞における、ＣＡＲ１ダイマー、モノマー、又は対照ＧＦＰの安定した発現
メーカーの指示に従い、細胞に、ＴｒａｎｓＤＵＸ及びＭＡＸ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ（ＳＢＩ）の存在下において、レンチウイルスを感染させた。要約すると、付着細胞又は懸濁細胞のいずれかの、ウェルあたり５０，０００個の細胞を、細胞培養培地の２４ウェルプレートに播種する。翌日、２．５μＬのＴｒａｎｓＤｕｘ（ＳＢＩ）、１００μＬのＭＡＸ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ、及び４００μＬの培地を含有する、５００μＬ感染培地で細胞培養培地を交換し、その後、各ウェルに１５０μＬの２９３ＴＮレンチウイルス含有上清（ＳＮＴ）を添加し、撹拌混合した。形質導入の７２時間後、ウイルスゲノムを宿主細胞ゲノムに組み込み、細胞を、５μｇ／ｍＬのピューロマイシン及び１００ｎｇ／ｍＬのハイグロマイシンを補充した完全増殖培地に移して増殖させ、安定した細胞株を確立する、又は後の実験で用いる。
【００９８】
ＣＤ７１３Ｂ（ＳＢＩ）由来のプラスミドＤＮＡベクター発現ＣＡＲ１モノマー、ダイマー、又は対照を、メーカーの指示に従い、ｘＴｒｅｍｅＧｅｎｅ  ＨＰトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）により、ＮＫ９２及びＮＫ９２ＭＩ細胞にトランスフェクションした。要約すると、１００，０００個のＮＫ９２及びＮＫ９２ＭＩ細胞を、２ｍＬの増殖培地に播種した。同じ日に、プラスミドＤＮＡ（２μｇ）を２００μＬのＯｐｔｉ−Ｍｅｄｉｕｍ（血清非含有）に添加し、その後６μＬのＸ−ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ  ＨＰトランスフェクション試薬を添加し、室温で１５分間インキュベートした。ＤＮＡトランスフェクション混合物を各ウェルに、滴下により加えた。トランスフェクションの７２時間後、安定してトランスフェクションした細胞を選択するために、ピューロマイシンを添加し、５μｇ／ｍＬの終濃度にした。
【００９９】
ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロットによる、ＣＡＲ１−ＮＫ細胞におけるＣＡＲ１及びＣＤ１６の発現
ＲＴ−ＰＣＲ及びウェスタンブロットを実施し、レンチウイルス感染、又はプラスミドトランスフェクション済みの細胞にて、ＣＡＲ１及びＣＤ１６の発現を検証した。ＴｒｉＺｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６対照、ＣＡＲ１ダイマー及びモノマー細胞から、全てのＲＮＡを抽出した。Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ＰＣＲキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，カタログＮｏ．Ｅ５３１５）、及び対応するプライマーを使用して、ＣＡＲ１、ＣＤ１６、及びβアクチンのＲＴ−ＰＣＲを行い、アガロースゲル電気泳動により分析した。
【０１００】
ヒトＴＮＢＣ細胞に対する、ＣＡＲ１−ＮＫ細胞の細胞傷害
ＣｙｔｏＴｏｘ均質アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、細胞傷害アッセイを試験した。ヒトＴＮＢＣ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞（標的細胞）を、９６ウェルＵ底組織培養物処理済みマイクロプレート内の、１０％加熱不活性化ＦＢＳを補充した１００μＬのＭＥＭα増殖培地内で、ウェルあたり１０，０００個の細胞で一晩播種した。翌朝、５０μＬの培地を各ウェルから取り出した。ＮＫ９２ＭＩ／ｆＣＤ１６を発現するＣＡＲ１ダイマー、モノマー、又は非感染対照（エフェクター細胞として）を、ＡＤＣＣエフェクターアッセイ培地（０．５％の超低ＩｇＧ  ＨＩーＦＢＳを含むＤＭＥＭ）に再懸濁し、１０：１及び５：１のＥ：Ｔ比で、ウェルに添加した。５％  ＣＯ２及び３７℃にて４時間インキュベーションした後、３００×ｇで５分間、マイクロプレートを遠心分離し、新しい９６ウェル平底マイクロプレートに、５０μＬの上清を移した。細胞傷害アッセイ溶液を添加し（ウェルあたり５０μＬ）て３７Ｃで３０分間インキュベートした後、メーカーの指示に従い停止溶液を添加した。４９０ｎｍでの吸光度を、マイクロプレート読み取り機（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ｉ３）で読み取った。
【０１０１】
ＴＮＢＣ細胞由来の異種移植片（ＣＤＸ）、及び患者由来の異種移植片（ＰＤＸ）の、同所性マウスモデルの生成。要約すると、腫瘍株由来の異種移植片の同所性マウスモデルを生成するために、５０μＬのＰＢＳ中の、５×１０５個のヒトＴＮＢＣ  ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／Ｌｕｃ＋ＧＦＰ細胞を、４〜６週齢のメスＮＳＧ（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）の、左の４番目の乳腺脂肪パッドに注射した。同所性ＴＮＢＣ  ＰＤＸモデルを生成するために、ＢＲＣＡ１変異を有する、ＴＮＢＣ  ＰＤＸドナーＮＳＧマウス（ＮＯＤ  ＳＣＩＤ  γ、成熟Ｂ、Ｔ、ＮＫ細胞なし、及び補体なし）を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＪＡＸ  ＴＭ０００８９，胸腫瘍マーカー：ＴＮＢＣ  ＥＲ−／ＰＲ−／ＨＥＲ２−，ＢＲＣＡ１  Ｖ７５７ｆｓ）から購入した。ＯＳＵ  ＩＡＣＵＣ  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  Ｐｏｌｉｃｙに従い、手術を行った。イソフルランでマウスに麻酔をかけた。ドナーＮＳＧマウス（ＪＡＸ，ＴＭ０００８９）に関して、腫瘍の側面にわたり切り込みを入れて腫瘍組織を取り出し、これを、１×ペニシリン及びストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ培地内で１回洗浄し、レシピエントマウスに移植するために、滅菌ＰＢＳ中で、直径約３ミリメートル（ｍｍ）片に切断した。ＣＢ−１７  ＳＣＩＤマウス（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ）を、レシピエントマウスとして使用した。レシピエントマウスに対して、ドナー腫瘍組織からこのマウスに、約３ｍｍのＰＤＸ腫瘍組織１つを直接移植するために、右の４番目の乳腺に切り込みを入れた。一滴の組織接着剤（Ｖｅｔｂｏｎｄ）、及び／又は創傷クリップ１つ（Ｓｉｇｍａ）を使用して、ルーチンの方法で切り込み部位を閉じた。動物が麻酔から回復することを監視した後、ルーチンの飼育に戻した。創傷が治癒するまで、動物を毎日確認し、鎮痛剤（ブプレノルフィン、皮下投与、１００μＬの滅菌ＰＢＳ中に０．１ｍｇ／ｋｇ）を投与して、手術後最大７２時間、鎮痛させた。
【０１０２】
ＴＦ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞療法のインビボ研究。４週齢のメスＮＳＧマウスにおいて、ＴＮＢＣ  ＣＤＸ及びＰＤＸ（ＪＡＸ）を生成した。ＣＤＸ又はＰＤＸ腫瘍が約１００〜３００ｍｍ３に達したとき、ＣＤ１６及びＣＡＲ１ダイマー又はモノマー（ＣＡＲ１ダイマー及びモノマー）を発現するＮＫ９２ＭＩを、尾静脈を通して２週間毎に、静脈内注射した（マウス１匹あたり、２〜３×１０６個の細胞）。ＣＤ１６及びＣＡＲ１の両方を有しないＮＫ９２ＭＩ細胞を、対照マウスに静脈内注射した。キャリパーを用いて腫瘍の幅（Ｗ）及び長さ（Ｌ）をミリメートル（ｍｍ）で測定し、式（Ｗ）２×Ｌ／２（ｍｍ３）を用いて、腫瘍体積（ｍｍ３）を計算することにより、治療効果を測定した。
【０１０３】
統計分析。インビトロ及びインビボデータを、平均±ＳＥＭとして表し、Ｐｒｉｓｍ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して、統計的有意性のためにＡＮＯＶＡ及びｔ検定により、分析した。統計的有意性の分析のために、組織培養プレート内で、インビトロアッセイのために、各群において二重又は三重のウェルを用い、各群あたり３〜５匹のマウスを、動物研究においてインビボで使用した。統計的有意性を＊：Ｐ＜０．０５；＊＊：Ｐ＜０．０１；＊＊＊：Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊：Ｐ＜０．０００１として表し、「ｎｓ」は、（統計的）有意性がないことを意味する。
【０１０４】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、開示された発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で引用した刊行物及びそれらが引用されている資料は、参照により具体的に組み込まれる。
【０１０５】
当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識し、又は日常的な実験のみを用いて確かめることができるであろう。そのような等価物は、添付の特許請求の範囲によって包含されることを意図している。
【０１０６】
【表１−１】
2020537640.tif 000003
【表１−２】
2020537640.tif 000004
【表１−３】
2020537640.tif 000005
【表１−４】
2020537640.tif 000006
【表１−５】
2020537640.tif 000007
【０１０７】
表１の参照文献
１．Ｕ．Ｓｔｕｒｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ａｂｎｏｒｍａｌ  ｈｕｍａｎ  ｍａｍｍａｒｙ  ｇｌａｎｄｓ  ｕｓｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｖｉｒｃｈｏｗｓ  Ａｒｃｈｉｖ  ４２１，７９−８６（１９９２）．
２．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｉｎｏ，Ｇ．Ｈａｉｒ，Ｄ．Ｌ．Ｋｒｅｕｔｚｅｒ，Ｆ．Ｒ．Ｒｉｃｋｌｅｓ，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２，２０９−２１５（１９９６）．
３．Ｔ．Ｕｅｎｏ，Ｍ．Ｔｏｉ，Ｍ．Ｋｏｉｋｅ，Ｓ．Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｔ．Ｔｏｍｉｎａｇａ，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ：ｉｔｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｌａｓｍａ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ８３，１６４−１７０（２０００）．
４．Ｊ．Ｄｕａｎｍｕ，Ｊ．Ｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｘｕ，Ｃ．Ｊ．Ｂｏｏｔｈ，Ｚ．Ｈｕ，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ａ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  １０４，１４０１−１４０９（２０１１）．
５．Ｚ．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｔｒｉｐｌｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｕｓｉｎｇ  ａ  Ｓｅｃｏｎｄ−Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ＩＣＯＮ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ，（２０１８）．
６．Ｔ．Ｋａｇｅｓｈｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｒｕｍ  ｌｅｖｅｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅ  ｗｉｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １４，１９５−２００（２００１）．
７．Ｚ．Ｈｕ，Ｙ．Ｓｕｎ，Ａ．Ｇａｒｅｎ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９６，８１６１−８１６６（１９９９）．
８．Ｍ．Ｓｈｏｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ：ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｏｆ  ｃｌｏｔｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １５２，３９９−４１１（１９９８）．
９．Ｒ．Ｋｏｏｍａｇｉ，Ｍ．Ｖｏｌｍ，Ｔｉｓｓｕｅ−ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｍｅａｓｕｒｅｄ  ｂｙ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ７９，１９−２２（１９９８）．
１０．Ｍ．Ｓａｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ７９，４７２−４７７（１９９９）．
１１．Ｂ．Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ＮＳＣＬＣ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｎｕｄｅ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ９０Ｙ−ｌａｂｅｌｅｄ  ａｎｔｉ−ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ＆ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ２０，３００−３０９（２００５）．
１２．Ｐ．Ｇｏｌｄｉｎ−Ｌａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｎｄｉｃａｔｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  ２０，１２３−１２８（２００８）．
１３．Ｒ．Ｔ．Ｐｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ９，５３３９−５３４５（２００３）．
１４．Ｔ．Ｋａｉｄｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｕｓｅｆｕｌ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｆ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｉｎ  ５−ｙｅａｒ  ｓｕｒｖｉｖｏｒｓ．Ｈｅｐａｔｏ−ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ５２，１３８３−１３８７（２００５）．
１５．Ａ．Ｋ．Ｋａｋｋａｒ，Ｎ．Ｒ．Ｌｅｍｏｉｎｅ，Ｍ．Ｆ．Ｓｃｕｌｌｙ，Ｓ．Ｔｅｂｂｕｔｔ，Ｒ．Ｃ．Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｇｒａｄｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅ  Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｓｕｒｇｅｒｙ  ８２，１１０１−１１０４（１９９５）．
１６．Ｎ．Ｎｉｔｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｄｕｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １１，２５３１−２５３９（２００５）．
１７．Ａ．Ａ．Ｋｈｏｒａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １３，２８７０−２８７５（２００７）．
１８．Ｃ．Ｓｈｉｇｅｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ８０，８９４−８９８（１９９８）．
１９．Ｔ．Ｎａｋａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ６９，２４７−２５４（２００２）．
２０．Ｄ．Ｆ．Ａｌｔｏｍａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ：ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ．Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｄｉｓ  ９，１３３−１３８（２００７）．
２１．Ｓ．Ａ．Ａｂｄｕｌｋａｄｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  ３１，４４３−４４７（２０００）．
２２．Ｔ．Ａｋａｓｈｉ，Ｙ．Ｆｕｒｕｙａ，Ｓ．Ｏｈｔａ，Ｈ．Ｆｕｓｅ，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ．Ｕｒｏｌｏｇｙ  ６２，１０７８−１０８２（２００３）．
２３．Ｖ．Ｋａｕｓｈａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．Ａｐｐｌ  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｍｏｌ  Ｍｏｒｐｈｏｌ  １６，１−６（２００８）．
２４．Ｚ．Ｈｕ，Ａ．Ｇａｒｅｎ，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９８，１２１８０−１２１８５（２００１）．
２５．Ｋ．Ｕｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｓ  ａ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ９６，２９０−２９５（２００７）．
２６．Ｋ．Ｈａｍａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｇｒａｄｅ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ．Ｃａｎｃｅｒ  ７７，１８７７−１８８３（１９９６）．
２７．Ｓ．Ｔａｋａｎｏ，Ｋ．Ｔｓｕｂｏｉ，Ｙ．Ｔｏｍｏｎｏ，Ｙ．Ｍｉｔｓｕｉ，Ｔ．Ｎｏｓｅ，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ，ｏｓｔｅｏｐｏｎｔｉｎ，ａｌｐｈａｖｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｇｌｉｏｍａｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ８２，１９６７−１９７３（２０００）．
２８．Ｍ．Ｇｕａｎ，Ｊ．Ｊｉｎ，Ｂ．Ｓｕ，Ｗ．Ｗ．Ｌｉｕ，Ｙ．Ｌｕ，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｉｏｍａ．Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３５，３２１−３２５（２００２）．
２９．Ｊ．Ｔｈａｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｖｅｎｏｕｓ  ｔｈｒｏｍｂｏｅｍｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  １３１，１６２−１６５（２０１３）．
３０．Ｆ．Ｒ．Ｒｉｃｋｌｅｓ，Ｇ．Ａ．Ｈａｉｒ，Ｒ．Ａ．Ｚｅｆｆ，Ｅ．Ｌｅｅ，Ｒ．Ｄ．Ｂｏｎａ，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ７４，３９１−３９５（１９９５）．
３１．Ｋ．Ａｎｄｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｐｅｃｉａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  ｔｏ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ  ５９，７４８−７５４（１９８７）．
３２．Ｋ．Ａ．Ｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ５６，４２５−４３０（１９８９）．
３３．Ｈ．Ｔａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ５３，５３５−５４９（１９８９）．
３４．Ｍ．Ｔａｎａｋａ，Ｔ．Ｋｉｓｈｉ，Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｙ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ（ＡＭＬ）ｃｅｌｌｓ．Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ４，１−８（１９９０）．
３５．Ｍ．Ｔａｎａｋａ，Ｈ．Ｙａｍａｎｉｓｈｉ，Ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｏｆ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｌｅｕｋ  Ｒｅｓ  １７，１０３−１１１（１９９３）．
３６．Ｔ．Ｎａｋａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌ  ｈｏｍｏｇｅｎａｔｅ．Ｃｌｉｎ  Ａｐｐｌ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ  ６，１４−１７（２０００）．
３７．Ｔ．Ｋｕｂｏｔａ，Ｋ．Ａｎｄｏｈ，Ｈ．Ｓａｄａｋａｔａ，Ｈ．Ｔａｎａｋａ，Ｎ．Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｌｅａｓｅｄ  ｆｒｏｍ  ｌｅｕｋｅｍｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ６５，５９−６３（１９９１）．
３８．Ｔ．Ｎａｋａｓａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｉｎ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ６４，１４５−１５０（２０００）．
３９．Ｙ．Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｂｌｏｏｄ  ｆｌｏｗ  ｂｙ  ｒｅｄｕｃｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｉｂｒｉｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｅｔｈ−Ａ  ｓａｒｃｏｍａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ９７，２２１３−２２２４（１９９６）．
４０．Ｊ．Ｇ．Ｂｌｅｄｓｏｅ，Ｓ．Ｍ．Ｓｌａｃｋ，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｒａｔ  ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ  ｃｅｌｌｓ  ａｄｈｅｒｅｎｔ  ｔｏ  ｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃ  ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ  ９，１３０５−１３１２（１９９８）．
４１．Ｙ．Ｍ．Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  Ｋａｐｏｓｉ’ｓ  ｓａｒｃｏｍａ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ−１，ｔｈｒｏｍｂｏｍｏｄｕｌｉｎ，ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ．Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  １４４，５１−５９（１９９４）．
４２．Ｇ．Ｃｅｓａｒｍａｎ−Ｍａｕｓ，Ｅ．Ｂｒａｇｇｉｏ，Ｃ．Ｌｏｍｅ−Ｍａｌｄｏｎａｄｏ，Ａ．Ｌ．Ｍｏｒａｌｅｓ−Ｌｅｙｔｅ，Ｒ．Ｆｏｎｓｅｃａ，Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  Ｔ−ａｎｄ  Ｂ−ｃｅｌｌ  ｏｒｉｇｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  １３３，６０６−６０９（２０１４）．
４３．Ｇｕｐｔａ  ｅｔ  ａｌ．’Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｉｓ  Ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｉｎ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｍｙｅｌｏｍａ  Ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ’２００９’１１４：２１３２；Ａｂｓｔｒａｃｔ  ２１３２
【０１０８】
配列
配列番号１：ＴＦ標的化ＣＡＲ１モノマー
ＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣＴＴＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＴＧＴＧＣＣＴＣＡＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＧＡＡＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＡＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＧＡＡＣＴＧＴＧＡＧＡＣＧＣＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＡＡＣＧＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＡＣＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＣＧＧＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣＣＡＣＡＧＴＴＧＡＡＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣ
ＣＡＲ１モノマー（ｈｆＶＩＩＬ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚｅｔａ）の図
ＮｈｅＩ−Ｋｏｚａｋ−ｆＶＩＩ軽鎖（開始コドン＋シグナル＋成熟ｆＶＩＩ軽鎖）−ＢａｍＨＩ−ＣＤ２８（ＴＭ＋ＣＤ）−ＢｓｔＢＩ−４−１ＢＢ−ＥｃｏＲＩ−ＣＤ３ｚｅｔａ  ＣＤ−Ｓｔｏｐコドン−ＰｍｅＩ−＜ｕ＞ＮｏｔＩ
＜／ｕ＞  配列番号２：ＴＦ標的化ＣＡＲ１ダイマー
ＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣＴＴＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＴＧＴＧＣＣＴＣＡＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＧＡＡＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＡＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＧＡＡＣＴＧＴＧＡＧＡＣＧＣＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＡＡＣＧＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＡＣＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＣＧＧＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣＣＡＣＡＧＴＴＧＡＡＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＴＣＣＧＣＡＧＡＧＣＣＣＡＡＡＴＣＴＴＧＴＧＡＣＡＡＡＡＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣＣＣＡＣＣＧＴＧＣＣＣＡＧＧＡＴＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＴＴＣＧＡＡＣＧＴＴＴＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴＡＡＡＣＧＧＧＧＣＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＴＡＴＡＴＴＣＡＡＡＣＡＡＣＣＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＣＣＡＧＴＡＣＡＡＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＴＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＣＧＡＴＴＴＣＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＧＡＡＴＴＣＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＡＧＧＡＧＣＧＣＡＧＡＣＧＣＣＣＣＣＧＣＧＴＡＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＣＴＡＴＡＡＣＧＡＧＣＴＣＡＡＴＣＴＡＧＧＡＣＧＡＡＧＡＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＴＴＴＧＧＡＣＡＡＧＡＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＡＧＡＡＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＴＡＡＧＡＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＴＧＡＧＡＴＴＧＧＧＡＴＧＡＡＡＧＧＣＧＡＧＣＧＣＣＧＧＡＧＧＧＧＣＡＡＧＧＧＧＣＡＣＧＡＴＧＧＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＧＴＣＴＣＡＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＴＣＧＣＴＧＡＧＴＴＴＡＡＡＣＧＣＧＧＣＣＧＣ
ｈｆＶＩＩＬ−ヒンジ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚｅｔａの図
ＮｈｅＩ−Ｋｏｚａｋ−ｆＶＩＩ軽鎖（開始コドン＋シグナル＋成熟ｆＶＩＩ軽鎖）−ＢａｍＨＩ＊−ｈＩｇＧ１ヒンジ−ＢａｍＨＩ＊−ＣＤ２８（ＴＭ＋ＣＤ）−ＢｓｔＢＩ−４−１ＢＢ−ＥｃｏＲＩ−ＣＤ３ｚｅｔａ  ＣＤ−Ｓｔｏｐコドン−ＰｍｅＩ−＜ｕ＞ＮｏｔＩ
＜／ｕ＞  ＴＭ：膜貫通ドメイン。ＣＤ：細胞質ドメイン。ＮｈｅＩ、ＢａｍＨＩ、ＢｓｔＢＩ、ＥｃｏＲＩ、ＰｍｅＩ、及びＮｏｔＩ：制限酵素は、個々の認識及びシグナル伝達断片を、プラスミド構築物に分子サブクローニングするために使用し、ＣＡＲシグナル伝達断片の改変、例えば、４−１ＢＢのＯＸ４０（ＴＦ標的化ＣＡＲ２）での置き換え、又は、第四世代のＣＡＲ（ＴＦ標的化ＣＡＲ３）として、ＯＸ４０をＣＡＲ１に付加することを可能にする。
配列番号３：ヒト凝固因子ＶＩＩ軽鎖のｃＤＮＡ配列
ＡＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＣＴＣＡＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＴＴＣＴＧＣＴＴＧＧＧＣＴＴＣＡＧＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＣＴＴＣＧＴＡＡＣＣＣＡＧＧＡＧＧＡＡＧＣＣＣＡＣＧＧＣＧＴＣＣＴＧＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＡＡＣＧＣＧＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＣＧＧＣＣＧＧＧＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＣＡＧＴＧＣＴＣＣＴＴＣＧＡＧＧＡＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＧＡＣＧＣＧＧＡＧＡＧＧＡＣＧＡＡＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧＡＴＴＴＣＴＴＡＣＡＧＴＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＡＧＴＧＴＧＣＣＴＣＡＡＧＴＣＣＡＴＧＣＣＡＧＡＡＴＧＧＧＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＡＧＧＡＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＴＣＣＴＡＴＡＴＣＴＧＣＴＴＣＴＧＣＣＴＣＣＣＴＧＣＣＴＴＣＧＡＧＧＧＣＣＧＧＡＡＣＴＧＴＧＡＧＡＣＧＣＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＡＴＣＴＧＴＧＴＧＡＡＣＧＡＧＡＡＣＧＧＣＧＧＣＴＧＴＧＡＧＣＡＧＴＡＣＴＧＣＡＧＴＧＡＣＣＡＣＡＣＧＧＧＣＡＣＣＡＡＧＣＧＣＴＣＣＴＧＴＣＧＧＴＧＣＣＡＣＧＡＧＧＧＧＴＡＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＡＧＡＣＧＧＧＧＴＧＴＣＣＴＧＣＡＣＡＣＣＣＡＣＡＧＴＴＧＡＡＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＧＡＡＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＣＴＡＧＡＡＡＡＡＡＧＡＡＡＴＧＣＣＡＧＣＡＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＧＣＧＡ
配列番号４：３８個のアミノ酸シグナルペプチド（下線）に、１５２個の成熟ｆＶＩＩ軽鎖ペプチドが続く
ＭＶＳＱＡＬＲＬＬＣ  ＬＬＬＧＬＱＧＣＬＡ  ＡＶＦＶＴＱＥＥＡＨ  ＧＶＬＨＲＲＲＲＡＮ  ＡＦＬＥＥＬＲＰＧＳ  ＬＥＲＥＣＫＥＥＱＣ  ＳＦＥＥＡＲＥＩＦＫ  ＤＡＥＲＴＫＬＦＷＩ  ＳＹＳＤＧＤＱＣＡＳ  ＳＰＣＱＮＧＧＳＣＫ  ＤＱＬＱＳＹＩＣＦＣ  ＬＰＡＦＥＧＲＮＣＥ  ＴＨＫＤＤＱＬＩＣＶ  ＮＥＮＧＧＣＥＱＹＣ  ＳＤＨＴＧＴＫＲＳＣ  ＲＣＨＥＧＹＳＬＬＡ  ＤＧＶＳＣＴＰＴＶＥ  ＹＰＣＧＫＩＰＩＬＥ  ＫＲＮＡＳＫＰＱＧＲ  ／／
【０１０９】
参考文献
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６．  Ａｆｕｗａｐｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ＶＥＧＦ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，１７（３）：９６１−９７２（２００２）．
７．  Ａｎｄｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐａｔｔｅｒｎｓ，ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ９  Ｓｕｐｐｌ  ２，Ｓ７３−８１（２００９）．
８．  Ｂａｙｒａｋｔａｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  １３８，２１−３５（２０１３）．
９．  Ｂｅｒｒａｄａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｔｏｗａｒｄ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｉｚｅｄ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ  ｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ？  Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ／  ＥＳＭＯ  ２１  Ｓｕｐｐｌ  ７，ｖｉｉ３０−３５（２０１０）．
１０．  Ｂｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｓｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｅｘｕｄａｔｉｖｅ（ｗｅｔ）ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １００，２６７９−２６８４（２００３）．
１１．  Ｂｒｏｍｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｂｙ  ａ  ｐａｔｈｗａｙ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９２，８２０５−８２０９（１９９５）．
１２．  Ｃａｉｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｃｏａｇｕｌａｂｌｅ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｙ：ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｄｅｂａｔｅ．Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  ４，４６５−４７３（２００２）．
１３．  Ｃａｌｌａｎｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ７０，１１９４−１２０１（１９９２）．
１４．  Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ＥＧＦＲ−ＣＡＲ  ＮＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  １  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｒａｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ７，２７７６４−２７７７７（２０１６）．
１５．  Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｕｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ−Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  １１，１０６９−１０８１（２０１１）．
１６．  Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ−−ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｏｎ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ：ＡＡＣＲ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６６，９３３９−９３４４（２００６）．
１７．  Ｃｏｎｔｒｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ：ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２（２）：２０９−２１５（１９９６）．
１８．  Ｃｏｎｔｒｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｒｓ  ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ  ａｓ  ｐｒｏｂｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １４５，１３１５−１３２２（１９９４）．
１９．  Ｄｕａｎｍｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃｈｅｍｏｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｙ  ａ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｂｒｉｔｉｓｈ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ．１０４（９）：１４０１−１４０９（２０１１）．
２０．  Ｅｌ  Ｇｕｅｒｒａｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ＥＧＦＲ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｏｎ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．ＰｌｏＳ  ｏｎｅ  ６，ｅ２５０８０（２０１１）．
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２７．  Ｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９７，９２２１−９２２５（２０００）．
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３０．  Ｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｓｏｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ，ｔｕｍｏｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ａｎｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｏｆ  ｂｒｅａｓｔ，ｌｕｎｇ  ａｎｄ  ｏｖａｒｉａｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，（２０１６）．
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３３．  Ｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｖｅｒｔｅｐｏｒｆｉｎ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．ＢＭＣ  ｃａｎｃｅｒ  １０：２３５（２０１０）．
３４．  Ｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９６，８１６１−８１６６（１９９９）．
３５．  Ｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｌｉｋｅ  Ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｏ  Ｔｒｅａｔ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ａｓ  Ｗｅｌｌ  ａｓ  Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ７，（２０１８）．
３６．  Ｈｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｐｈｏｔｏｄｙｎａｍｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ２０，８５−９６（２０１７）．
３７．  Ｈｕｄｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ａｎ  ｕｎｍｅｔ  ｍｅｄｉｃａｌ  ｎｅｅｄ．Ｔｈｅ  ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ  １６  Ｓｕｐｐｌ  １，１−１１（２０１１）．
３８．  Ｈｕｆｎａｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｃｏｎ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｎｏｎ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅ（Ｐａｐｉｏ  ａｎｕｂｉｓ）ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ．Ｒｅｐｒｏｄ  Ｂｉｏｌ  １８１０９−１１４（２０１８）．
３９．  Ｊｅｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｏｂａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．ＣＡ：ａ  ｃａｎｃｅｒ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ  ６１，６９−９０（２０１１）．
４０．  Ｋａｓｓａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｒｉａｌ  ｄｅｓｉｇｎ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ９，２９−３３（２００９）．
４１．  Ｋａｓｔｈｕｒｉ，Ｍ．Ｂ．Ｔａｕｂｍａｎ，Ｎ．Ｍａｃｋｍａｎ，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２７，４８３４−４８３８（２００９）．
４２．  Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  ｆｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦｃＲｎ．Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２９，２８１９−２８２５，ｄｏｉ：１０．１００２／（ＳＩＣＩ）１５２１−４１４１（１９９９０９）２９：０９＆＃６０；２８１９：：ＡＩＤ−ＩＭＭＵ２８１９＆＃６２；３．０．ＣＯ；２−６（１９９９）．
４３．  Ｋｌａｇｓｂｒｕｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｂｙ  ｈｅｐａｒｉｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １４７：９５−１０５（１９８７）．
４４．  Ｋｏｃｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｃｒｏｓｓｒｏａｄｓ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆａｉｌｕｒｅｓ−−ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０（２）：１１６−１２４（２０１０）．
４５．  Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＤＮＡ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  ５２（５）：６３９−６４０（１９８８）．
４６．  Ｋｒｉｋｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ’ｉｃｏｎ’ｔａｒｇｅｔｓ  ａｂｅｒｒａｎｔｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｃａｕｓｉｎｇ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｏｓｉｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １７６，１０５０−１０５６（２０１０）．
４７．  Ｌｉｅｄｔｋｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｓｓｕｅｓ  ｏｆ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｔｒｉｐｌｅ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ．Ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｅ  ６，２３４−２３９（２０１１）．
４８．  Ｌｏｐｅｚ−Ｐｅｄｒｅｒａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｓ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０，１３３１−１３４０（２００６）．
４９．  Ｌｙｋｋｅ，ｅ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｏｎｃｏｌ  ２９，４１７−４２２（２００３）．
５０．  Ｍｉｌｓｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：ｉｓ  ｔｈｅｒｅ  ａ  ｌｉｎｋａｇｅ？  Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｖａｓｃ  Ｂｉｏｌ  ２９，２００５−２０１４（２００９）．
５１．  Ｍｏｎｃｈａｒｍｏｎｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａ  ｃｏｒｎｅｒｓｔｏｎｅ  ｏｆ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ：ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ．Ｃａｎｃｅｒ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ３２２（２）：１３９−１４７（２０１２）．
５２．  Ｍｏｎｔｅｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ：ｆｒｉｅｎｄ  ｏｒ  ｆｏｅ？  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｒｅｐｏｒｔｓ  １４，１−１１（２０１２）．
５３．  Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃＤＮＡ  ｆｏｒ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ，ｔｈｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃａｓｃａｄｅ．Ｃｅｌｌ  ５０，１２９−１３５（１９８７）．
５４．  Ｍｏｕｓａ，Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ．Ｔｉｍｅｌｙ  ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  １０，Ｅ１９（２００６）．
５５．  Ｎｅｍｅｒｓｏｎ，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ２１４：８３−９４（１９８７）．
５６．  Ｎｅｍｅｒｓｏｎ，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ．Ｂｌｏｏｄ  ７１，１−８（１９８８）．
５７．  Ｏｓｔｅｒｕｄ，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ：ａ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｒｏｌｅ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ７８，７５５−７５８（１９９７）．
５８．  Ｐａｓｚｋｉｅｗｉｃｚ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ＣＤ１９  ＣＡＲ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｐｅｒｍａｎｅｎｔｌｙ  ｒｅｖｅｒｓｅｓ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｐｌａｓｉａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２６，４２６２−４２７２（２０１６）．
５９．  Ｐｅｉｔｚｓｃｈ，Ａｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：Ｔｈｅ  ｒｏｏｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  ４４，１０−２４（２０１７）．
６０．  Ｐｅｎｋａ，［Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｐａｔｉｅｎｔｓ］．Ｖｎｉｔｒｎｉ  ｌｅｋａｒｓｔｖｉ  ４３，３３７−３３９（１９９７）．
６１．  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｏｆ  ＣＤ２４（−／ｌｏｗ）／ＣＤ４４＋ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ−ｉｎｉｔｉａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ９８，１７７７−１７８５（２００６）．
６２．  Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ，ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉ−ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｕｓｅ  ａｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ８５，３７９−３８９（２００１）．
６３．  Ｒａｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｌｉｎｋ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，ｔｕｍｏｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｏａｇｕｌｏｐａｔｈｙ．Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ３２，５４−７０（２００６）．
６４．  Ｒａｋｈａ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｔｒｉｐｌｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２３，５８７−６００（２０１１）．
６５．  Ｒａｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｏｎ  ｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ  Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ９  Ｓｕｐｐｌ  １，Ｓ２７−３５（１９９８）．
６６．  Ｒｉｃｋｌｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｍｏｓｔａｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ，ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ：ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｂｏｔｈ  ｆｉｂｒｉｎ  ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ７３，１４５−１５０（２００１）．
６７．  Ｒｕｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ．Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ  ９  Ｓｕｐｐｌ  １，３０６−３１５（２０１１）．
６８．  Ｓｅｍｅｒａｒｏ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ７８，７５９−７６４（１９９７）．
６９．  Ｓｈｅｒｉｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＤ４４＋／ＣＤ２４−ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｉｎｖａｓｉｖｅ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ：ａｎ  ｅａｒｌｙ  ｓｔｅｐ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８，Ｒ５９（２００６）．
７０．  Ｓｐｉｃｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃＤＮＡ  ｃｌｏｎｅｓ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ：ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｃＤＮＡ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８４（１５）５１４８−５１５２（１９８７）．
７１．  Ｓｔａｐｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＦｃＲｎ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｇｉｖｅｓ  ｒｉｓｅ  ｔｏ  ｓｈｏｒｔ  ｈａｌｆ−ｌｉｆｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ３  ａｎｄ  ｏｆｆｅｒｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ２，５９９，ｄｏｉ：１０１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１６０８（２０１１）．
７２．  Ｔａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ａｌｔｅｒｅｄ，ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｓｕｉｔａｂｌｅ  ｆｏｒ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０，１３５９−１３７３（１９９９）．
７３．  Ｔａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １４，３４６−３５３（２００７）．
７４．  Ｔｅｚｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩ−Ｆｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．Ｏｃｕｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｎｆｌａｍｍ  １５，３−１０（２００７）．
７５．  Ｖｅｒｓｔｅｅｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ：ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  １０，６−１１（２００４）．
７６．  Ｖｉｄａｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３３（３６），４４５１−４４６３（２０１４）．
７７．  Ｗａｘｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｉｓｓｕｅ  ｆａｃｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｏｌｕｂｌｅ  ｄｏｍａｉｎ：ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩａ  ａｎｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１，３９９８−４００３（１９９２）．
７８．  Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈｏｗ  ｔｏ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅ  ＭＹＣＮ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｔｈｅ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ？  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  １１５，Ｅ６３８８−Ｅ６３８９（２０１８）．
【図１Ａ】
2020537640.tif 000008
【図１Ｂ】
2020537640.tif 000009
【図２Ａ】
2020537640.tif 000010
【図２Ｂ】
2020537640.tif 000011
【図２Ｃ】
2020537640.tif 000012
【図３】
2020537640.tif 000013
【図４Ａ】
2020537640.tif 000014
【図４Ｂ】
2020537640.tif 000015
【図４Ｃ】
2020537640.tif 000016
【図４Ｄ】
2020537640.tif 000017
【図５Ａ】
2020537640.tif 000018
【図５Ｂ】
2020537640.tif 000019
【図５Ｃ】
2020537640.tif 000020
【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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