(57)【要約】  本発明は、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）を阻害する、β−ラパコン及びその誘導体などのβ−ラパコン化合物を使用した、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）の発現に関連する癌などの病状の治療に関する。５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）の発現に関連する病状の治療方法とともに、そのような方法におけるβ−ラパコン化合物の医学的使用と、癌患者を選定又は予後する方法が提供される。
2020533327.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）の発現を特徴とする癌を治療する方法であって、
β−ラパコン化合物を、それを必要とする患者に投与することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記β−ラパコン化合物が５−ＬＯの可逆的アロステリックアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記β−ラパコン化合物がβ−ラパコン又はその類似体、誘導体又はプロドラッグである、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記β−ラパコン化合物が式（Ａ）、並びにその塩、溶媒和物及び保護形態を含む、請求項３に記載の方法：
2020533327.tif 000026
（式中、
Ｎｑは任意に置換されるナフトキノンであり、
Ｃｙは、Ｎｑに縮合されたた、任意に置換される複素環である。）
【請求項５】
Ｃｙが前記ナフトキノンのキノン環に縮合される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
Ｎｑがナフトキノンである、請求項４又は５に記載の方法。
【請求項７】
Ｎｑが、１，２−ナフトキノン又は１，４−ナフトキノンであり、例えば１，２−ナフトキノンである、請求項４〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
Ｃｙは、それが縮合されるナフトキノン基からの２つの炭素原子を含めて、５個、６個又は７個の環原子を有し、例えば５個又は６個の環原子を有し、例えば５個の環原子を有する、請求項４〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
Ｃｙが酸素含有複素環である、請求項４〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
Ｃｙは、それが縮合されるナフトキノン基からの２つの炭素原子を含めて、２，３−ジヒドロフラン基又は２，５−ジヒドロフラン基であり、例えば２，３−ジヒドロフラン基である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
Ｃｙは、それが縮合されるナフトキノン基からの２つの炭素原子を含めて、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン基又は３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン基であり、例えば３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン基である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
Ｃｙが、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2、ハロゲン、及び−Ｌ1−Ｒ4からなる群から選択される１つ又は複数の置換基−ＲCyにより任意に置換され、
ここで、
−Ｌ1−は共有結合、アルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、及び−Ｎ（ＲL1）−から選択され、−ＲL1はアルキルであり、
Ｒ4はアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールからなる群から選択され、かつ前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールのそれぞれが独立して任意に置換される、
請求項４〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
Ｃｙが、−ＯＨ及び−Ｌ1−Ｒ4により任意に置換され、さらに一つ以上の置換基−ＲCyにより任意に置換される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
Ｃｙが、２つのアルキル置換基、例えば２つのメチル基により置換され、さらに一つ以上の置換基−ＲCy、例えばもう一つの置換基−ＲCy、例えば−ＯＨ又は−Ｌ1−Ｒ4により任意に置換される、請求項１２に記載の方法、
【請求項１５】
前記β−ラパコン化合物がβ−ラパコンである、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記β−ラパコン化合物がイミン保護形態、例えば任意に置換されるフェニルイミン保護形態であり、例えば前記β−ラパコン化合物がＡＲＱ７６１である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記β−ラパコン化合物が式（Ｄ）並びにその塩、溶媒和物及び保護形態を含む、請求項３に記載の方法：
2020533327.tif 000027
（式中、
Ｎｑは任意に置換されるナフトキノンであり、
−Ａは−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＮＨＲから選択され、Ｒはアルキル、アリール及びアラルキルから選択され、
−Ｄは任意に置換されるアルケニル基である。）
【請求項１８】
−Ａが−ＯＨである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
Ｎｑがナフトキノンである、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｎｑが、１，２−ナフトキノン又は１，４−ナフトキノンであり、例えば１，２−ナフトキノンである、請求項１７〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
−Ｄが下式である、請求項１７〜２０のいずれかに記載の方法。
2020533327.tif 000028
（式中、
−Ｇ3−は共有結合又はアルキレンであり、
−Ｒ1、-Ｒ2、−Ｒ3はそれぞれ独立して−ＲCyであり、各−ＲCyが−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2、ハロゲン、及び−Ｌ1−Ｒ4から選択され、
ここで、
Ｌ1は共有結合、アルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、及び−Ｎ（ＲL1）−から選択され、−ＲL1はアルキルであり、
−Ｒ4はアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールからなる群から選択され、かつ前記アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールのそれぞれが独立して任意に置換される。）
【請求項２２】
前記患者が事前に、５−ＬＯの発現を特徴とする癌を有するか、又はそのおそれがあると識別されている、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
さらに、前記投与の前に、前記患者が５−ＬＯの発現を特徴とする癌を有するか、又はそのおそれがあると識別することを含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記患者の１つ以上の癌細胞が、コントロール細胞と比べて５−ＬＯの発現が増加している、請求項１〜２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記患者の１つ以上の癌細胞における５−ＬＯの発現が所定の閾値より大きい、請求項１〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
さらに、前記癌が、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシレダクターゼ１（ＮＱＯ１）の発現を特徴とする、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
前記患者が事前に、５−ＬＯ及びＮＱＯ１の発現を特徴とする癌を有するか、又はそのおそれがあると識別されている、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
さらに、前記投与の前に、前記患者が５−ＬＯ及びＮＱＯ１の発現を特徴とする癌を有するか、又はそのおそれがあると識別することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記患者の１つ以上の癌細胞が、対照細胞と比べて５−ＬＯ及びＮＱＯ１の発現が増加している、請求項２６〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記患者の１つ以上の癌細胞における５−ＬＯ及びＮＱＯ１の発現が所定の閾値より大きい、請求項２６〜２９のいずれかに記載の方法。
【請求項３１】
癌が血液癌である、請求項１〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
前記血液癌がＡＭＬ又はＣＬＬである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記β−ラパコン化合物が第２の治療剤と組み合わせて投与される、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の治療剤が抗癌化合物である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記抗癌化合物が、アントラサイクリン、ゲムシタラビン、シタラビン、ビンクリスチン、Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロホスファミド、フィブロムン、ダカルバジン、メトトレキサートと６−メルカプトプリン、クロラムブシル、アルキル化剤、シクロホスファミド、コルチコステロイド、イマチニブ、クラドリビン、ペントスタチン、リツキシマブ、クロラムブシル、タキサン、及びドキソルビシンから選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記β−ラパコン化合物が放射と組み合わせて投与される、請求項１〜３２のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれかに記載の、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）の発現を特徴とする癌を治療する方法に使用されるβ−ラパコン化合物。
【請求項３８】
請求項１〜３６のいずれかに記載の、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）の発現を特徴とする癌を治療する方法に使用される医薬品の製造におけるβ−ラパコン化合物の使用。
【請求項３９】
β−ラパコン化合物による治療のために癌患者を選定する方法であって、
癌患者からの癌細胞のサンプルを提供すること、
癌細胞における５−ＬＯ発現の存在を判定すること、及び
前記β−ラパコン化合物による治療のために５−ＬＯを発現する癌細胞を有する癌患者を選定すること
を含む方法。
【請求項４０】
癌患者の予後方法であって、
癌患者からの癌細胞のサンプルを提供すること、及び
前記患者の予後を示す、癌細胞における５−ＬＯの発現のレベルを判定すること
を含む方法。
【請求項４１】
前記癌が血液癌である、請求項３９又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記血液癌がＣＬＬ又はＡＭＬである、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、β−ラパコン（β−ｌａｐａｃｈｏｎｅ）化合物を使用による５−リポキシゲナーゼ（５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ）の阻害に関する。本発明は、例えば癌の治療に役立ち得る。
【背景技術】
【０００２】
天然物（Ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ、ＮＰ）とその基礎となる構造は、長い間、疾患を調節する化学物質を開発するためのインスピレーションの源である1。特に、生物活性であるフラグメントライク（ｆｒａｇｍｅｎｔ−ｌｉｋｅ）のＮＰは、合成小分子でカバーされていない化学空間をしばしば探索する領域であるヒットからリード（ｈｉｔ−ｔｏ−ｌｅａｄ）の最適化に関連する出発点を提供する2,3。ＮＰのプレバリデーション（ｐｒｅ−ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ）にもかかわらず、標的及び非標的（ｏｎ−  ａｎｄ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ）の両方についての限られた知識により、ケミカルバイオロジー及び分子医学におけるその広範な使用が妨げられている4,5。さらに、ＮＰには、しばしば「フリークエントヒッター」6（ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｈｉｔｔｅｒｓ）と、いわゆる「パンアッセイ干渉化合物」3,7〜9（ｐａｎ  ａｓｓａｙ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｃｏｕｍｐｏｕｎｄｓ、ＰＡＩＮＳ）として表示されるサブストラクチャー（ｓｕｂｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）が大量であり、これらは、前臨床（ｐｒｅ−ｃｌｉｎｉｃａｌ）のケミカルエンティティ（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｉｅｓ）の開発において、扱いにくいアッセイのリードアウト（ｒｅａｄｏｕｔ）及び失敗（ａｔｔｒｉｔｉｏｎ）をもたらす可能性がある。もっとも、実験的証拠は、合成小分子と比較した場合、ＮＰはより少ない無差別なターゲットエンゲージメントプロファイルを提供することを示唆している10。
【０００３】
β−ラパコンは、ラパチョの木（Ｔａｂｅｂｕｌａ  ａｖｅｌｌａｎｄｅｄａｅ）から単離された、フラグメントライクのナフトキノンベースの天然物である。β−ラパコンは、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシレダクターゼ１（ＮＱＯ１）による生体活性化時に有意な抗腫瘍活性を示すことが発表されている11。そのため、そのプロドラッグＡＲＱ７６１は現在、癌性疾患の臨床試験中である（ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０２５１４０３１及びＮＣＴ０１５０２８０）。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは、β−ラパコン（１、図１）が、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）に対する、強力で、リガンド効率的、かつアロステリックな阻害剤であり、そしてβ−ラパコンの抗癌活性が５−ＬＯ活性の調節と相関することを見出した。
【０００５】
本発明の一側面は、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）の発現を特徴とする癌を治療する方法であって、β−ラパコン化合物を、それを必要とする患者に投与することを含む方法を提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態では、癌は５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）及びＮＡＤ（Ｐ）Ｈ：キノンオキシレダクターゼ１（ＮＱＯ１）の発現を特徴とし得る。
【０００７】
β−ラパコン化合物は式（Ａ）、並びにその塩、溶媒和物及び保護形態（ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｆｏｒｍ）であり得る：
2020533327.tif 000003
（式中、
Ｎｑは任意に置換されるナフトキノンであり、
Ｃｙは、Ｎｑに縮合された、任意に置換される複素環である。）
【０００８】
β−ラパコン化合物は式（Ｄ）並びにその塩、溶媒和物及び保護形態であり得る：
2020533327.tif 000004
（式中、
Ｎｑは任意に置換されるナフトキノンであり、
−Ａは−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＮＨＲから選択され、Ｒはアルキル、アリール及びアラルキルから選択され、
−Ｄは任意に置換されるアルケニル基である。）
【０００９】
好ましいβ−ラパコン化合物はβ−ラパコン又はその類似体（ａｎａｌｏｇ）、誘導体及びプロドラッグを含み、ＡＲＱ７６１を含む。
【００１０】
本発明の別の側面は、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）の発現を特徴とする癌を治療する方法に使用されるβ−ラパコン化合物を提供する。
【００１１】
本発明の別の側面は、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）の発現を特徴とする癌を治療する方法に使用される医薬品の製造におけるβ−ラパコン化合物の使用を提供する。
【００１２】
別の側面では、β−ラパコン化合物、例えば式（Ａ）又は（Ｄ）の化合物が提供される。
【００１３】
本発明の側面及び実施形態は、以下、より詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、開発の潜在的なリードとしてのＲＥＯＳ／ＰＡＩＮＳサブストラクチャーを含むＮＰの開発を示す。図１ａは、ＲＤＫｉｔ記述子を使用した、ＺＩＮＣ１５におけるＲＥＯＳ／ＰＡＩＮＳフリーのフラグメントライクのケミカルエンティティ（灰色）及びＲＥＯＳ／ＰＡＩＮＳを含むフラグメントライクのＮＰ（赤）の、次元縮小及び視覚化のための主成分分析を示す。図１ｂは、ＦＤＡ承認済み薬物と、ＺＩＮＣ１５のＲＥＯＳ／ＰＡＩＮＳフリーフラグメントライクエンティティと、ＲＥＯＳ／ＰＡＩＮＳフリーフラグメントライクＮＰと（緑色）、ＲＥＯＳ／ＰＡＩＮＳヒットフラグメントライクＮＰ（赤）について、ＤａｔａＷａｒｒｉｏｒで計算された薬物らしさのボックスプロットを示す。外れ値は除外されている。薬物らしさの分布は、ＦＤＡ承認済み薬物といずれのタイプのフラグメントライクＮＰの間で有意に異なっていた（両側マンホイットニー検定（ｔｗｏ−ｓｉｄｅｄ  Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ  ｔｅｓｔ）、ｐ＜０．０００１）。分析した分子の数：ＦＤＡ承認済み薬物＝１５０６；ＲＥＯＳ／ＰＡＩＮＳフリーフラグメントライクＮＰ＝３５３７６；ＲＥＯＳ／ＰＡＩＮＳヒットフラグメントライクＮＰ＝３５５４４。
【図２】図２は、β−ラパコン１がヒト５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）を阻害することを示す。ａ）１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）の存在下又は非存在下での無細胞アッセイにおける５−ＬＯの阻害。ＩＣ50（ＤＴＴあり）＝０．２４μＭ±０．１３ログ単位、ｎ＝３。ＩＣ50（ＤＴＴなし）＞３０μＭ、ｎ＝３。コントロール：ジロートン、ＩＣ50＝１μＭ。ｂ）０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００の存在下又は非存在下での１プラス１ｍＭＤＴＴによる５−ＬＯの阻害。ＩＣ50（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００あり）＝０．０９μＭ±０．２１ログ単位、ｎ＝３；ＩＣ50（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００なし）＝０．１２μＭ±０．１４ログ単位、ｎ＝３。ｃ）１ｍＭのＤＴＴの存在下又は非存在下での好中球ホモジネートにおける５−ＬＯ活性の阻害。ＩＣ50（ＤＴＴあり）＝０．０９μＭ±０．１３ログ単位、ｎ＝３；ＩＣ50（ＤＴＴなし）＝５．２μＭ±０．４６ログ単位、ｎ＝３。ジロートンによる阻害はＤＴＴとは独立である。
【図３】図３は、β−ラパコンの生化学的プロファイルを示す。ａ）インタクトなヒト好中球（ＤＴＴなし）における５、１２、１５−ＬＯの阻害。ＩＣ50（５−ＬＯ）＝８．６μＭ±０．１０ログ単位、ｎ＝３；ＩＣ50（１２−ＬＯ）＞３０μＭ；ＩＣ50（１５−ＬＯ）＞３０μＭ。ｂ）１ｍＭのＤＴＴを添加したインタクトなヒト好中球における５−ＬＯ活性の阻害。ＩＣ50＝０．４２μＭ±０．１１ログ単位、ｎ＝４。
【図４】図４は、β−ラパコンからインスパイアされるナフトキノンのフォーカストライブラリー（ｆｏｃｕｓｅｄ  ｌｉｂｒａｒｙ）を示す。図５ａは、合成された化合物の構造を示す。図５ｂは、５−ＬＯに対して５μＭの濃度でのフォーカストライブラリーのスクリーニングを示す（ｎ＝２）。
【図５】図５は、ヒドロキノン１が５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）への結合モデル及び抗癌活性との関係を示す。ａ）テンプレートとして使用されるミュータント（ｍｕｔａｎｔ）５−ＬＯ（ＰＤＢ  ３Ｖ９８）。ｂ）野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）ヒト５−ＬＯのホモロジーモデル。ｃ）体積が１１０Å3を超えると予測される結合ポケット。ｄ）予測されたアロステリックポケットへのヒドロキノン１のドッキングポーズ（ｄｏｃｋｉｎｇ  ｐｏｓｅ）。ｅ）１と５−ＬＯの間において予測される相互作用の詳細。
【図６】図６は、１とホスファチジルコリン（ＰＣ）の間の競合アッセイ（ＩＣ50曲線）を示す（ｎ＝３）。ＩＣ50（３μｇ／ｍＬ、ＰＣ）＝１００ｎＭ。ＩＣ50（３０μｇ／ｍＬ、ＰＣ）＝１０００ｎＭ。データは競合事象を表している。
【図７】図７（左側のパネル）は、５−ＬＯタンパク質の発現を示す。コントロール：ＨＬ−６０細胞；分化：ＤＭＳＯ刺激ＨＬ−６０細胞。中央のパネルは、両方のＨＬ−６０細胞株グループに対する１のＩＣ50値を示す。ＩＣ50（分化）＝０．１８μＭ；ＩＣ50（コントロール）＝０．３９μＭ、ｎ＝１。右側のパネルは、０．５μＭの１、ｎ＝３で処理した場合の、分化グループとコントロールグループの生存ＨＬ−６０細胞の割合を示す。統計：両側スチューデントのｔ検定（ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｔ−Ｓｔｕｄｅｎｔ  ｔｅｓｔ）；**ｐ＜０．００５。
【図８】図８は、ＮＣＩ−６０パネルの分析を示す。図８ａは、起源の組織によってグループ化された、ＮＣＩ−６０細胞株に対するβ−ラパコンの活性分布を（１、ｐＧＩ50  ｚスコア）示す。外れ値は除外されている。図８ｂは、ＮＣＩ−６０癌細胞株にわたる５−ＬＯ発現を示す。外れ値は除外されている。図８ｃは、血液癌における１の活動（ｐＧＩ50  ｚスコア）と５−ＬＯ発現の相関を示す（ピアソン相関係数（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）＝０．８５、ｐ＝０．０３、信頼区間＝９５％）。図８ｄは、白血病細胞株における相関を示す（ピアソン相関係数＝１；ｐ＝０．００２、信頼区間＝９５％）。図８ｅは、２つの独立したコホートにおける５−ＬＯの高（赤）又は低（緑）発現の急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ、ＡＭＬ）患者の全生存曲線を示す。５−ＬＯのより高い発現は最悪の予後と関連する（１つのコホートでｐ＝０．０４７）。患者は、５−ＬＯ発現の中央値によって区切られる。プロットはＰＲＯＧｇｅｎｅＶ２で生成される41。
【図９】図９は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）モデルに対するβ−ラパコン１のイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及びイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）アッセイを示す。図９ａは、細胞生存率に対する１の濃度依存効果を示す。ＩＣ50（ＨＬ−６０）＝２．７μＭ±０．０４ログ単位、ｎ＝３；ＩＣ50（ＨＥＬ）＝０．９μＭ±０．０２ログ単位、ｎ＝３。図９ｂは、ＨＬ−６０細胞におけるＮＱＯ１及び５−ＬＯタンパク質の発現を示す。図９ｃは、５−ＨＥＴＥラクトン（１μＭ）とＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ、１μＭ）の補充による５−ＬＯレスキュー実験（ｒｅｓｃｕｅ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）を示す。化合物１は１μＭでテストした。**ｐ＜０．０１、Ｔｕｋｅｙ  ＨＳＤ事後検定（Ｔｕｋｅｙ  ＨＳＤ  ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  ｔｅｓｔ）を用いた一元配置分散分析（Ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）、ｎ＝８。図９ｄは、イン・ビボ実験計画を示す。使用されるヒトＡＭＬの異種移植モデルは、事前に放射された（２００ｒａｄ）ＮＳＧマウスの右脛骨への５×１０5のＨＥＬ−ＧＦＰ細胞の骨髄内注射に依拠する。血液中の腫瘍誘発のうえ、マウスは１（５０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）又は賦形剤による治療にランダムに割り当てられる。図９ｅは生存率を示す。図９ｆは、治療後０日目と９日目の血中腫瘍量を示す。図９ｇは、示された各臓器における腫瘍浸潤評価のためのフローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）分析を示す。
【図１０】図１０は、β−ラパコンの抗癌活性の提唱されるメカニズムを示す。β−ラパコンは、上皮内（ｉｎ  ｓｉｔｕ）においてＮＱＯ１（又はグルタチオン）によって対応するヒドロキノン型に還元され、５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）を阻害し、癌細胞死を誘発する。β−ラパコンとそのヒドロキノン型は、追加の創薬ターゲットを提示し、５−ＬＯとともに、全体的な表現型効果（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ）に寄与する活性酸素種（ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｏｘｙｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ、ＲＯＳ）を形成する可能性がある。
【図１１】図１１は、白血病ＨＬ−６０細胞株の生存率に対するβ−ラパコンのＩＣ50曲線を示す。
【図１２】図１２は、蛍光促進セルソーティング（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）データを示す。細胞内５−ＬＯは両方の細胞株で検出された。通常のＨＬ−６０細胞では、バックグラウンド染色が比較的高く、５−ＬＯ染色へのシフトがバックグラウンドと重なり、非特異的染色になる。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、β−ラパコン化合物が５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）を阻害し、そして５−ＬＯの阻害がβ−ラパコン化合物の細胞毒性効果と相関するという発見に関する。この発見は、β−ラパコン化合物を使用して５−ＬＯの発現に関連する病状を治療することを可能とする。
【００１６】
β−ラパコン化合物は５−ＬＯを阻害し得、そして好ましくは５−ＬＯの可逆的かつアロステリックアンタゴニストであり得る。β−ラパコン化合物は、５−ＬＯ及び／又はリポキシゲナーゼの選択的阻害剤である。
【００１７】
５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）（別名アラキドン酸５−リポキシゲナーゼ、５ＬＰＧ；ＬＯＧ５；５−ＬＯＸ）は骨髄由来細胞で発現し、アラキドン酸から、５（Ｓ）−ヒドロペルオキシ−６−トランス−８，１１，１４−シス−エイコサテトラエン酸、さらにはアリルエポキシド５（Ｓ）−トランス−７，９−トランス−１１，１４−シス−エイコサトレノイン酸（ロイコトリエンＡ４）への変換を触媒する。５−ＬＯはヒト５−ＬＯであり得る。ヒト５−ＬＯ（Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ２４０）は、参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００６８９．１を有し、参照ヌクレオチド配列ＮＭ＿０００６９８．４によってエンコードされ得る。
【００１８】
５−ＬＯ活性を測定し、阻害活性をアッセイするための技術は、本明細書の他の場所に記載され、無細胞アッセイが含まれる（Ｐｕｆａｈｌら（２００７）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３６４  ２０４−２１２）。
【００１９】
本発明において使用されるβ−ラパコン化合物は、任意に置換される複素環と縮合された、任意に置換されるナフトキノンであり得る。
【００２０】
β−ラパコン化合物は式（Ａ）、並びにその塩、溶媒和物及び保護形態であり得る。：
2020533327.tif 000005
（式中、
Ｎｑは任意に置換されるナフトキノンであり、
Ｃｙは、Ｎｑに縮合された、任意に置換される複素環である。）
【００２１】
基Ｎｑは任意に置換されるナフトキノンであり、好ましくは、Ｎｑがナフトキノンである。基Ｎｑは１，２−ナフトキノン又は１，４−ナフトキノンであり得、好ましくは１，２−ナフトキノンである。
【００２２】
ナフトキノンが置換される場合、置換基は、ナフトキノンのベンゼン環への置換基である。置換基は、ナフトキノンのベンゼン環上の１つ以上、例えば１つ又は２つの位置に存在し得る。置換基は、５、６、７及び８位から選択される１つ以上の位置に設けられ得る。
【００２３】
ナフトキノンの任意の置換基である−ＲNpは、ハロゲン、ニトロ、シアノ、−ＲS1、−ＯＨ、−ＯＲS1、−ＳＨ、−ＳＲS1、−ＮＨ2、ＮＨＲS1、−ＮＲS1ＲS2、−ＣＯＯＨ、−ＣＯＯＲS1、−ＣＯＮＨ2、ＣＯＮＨＲS1、−ＣＯＮＲS1ＲS2、−ＮＨＣＯＲS1、−Ｎ（ＲS1）ＣＯＲS1からなるグループから選択され得る。ここで、各−ＲS1及び各−ＲS2は独立して、任意にハロゲンで置換される、アルキル、アリール又はアラルキルであるか、あるいは、−ＲS1及び−ＲS2は一緒になって複素環を形成してもよい。
【００２４】
−ＲS1又は−ＲS2がアルキルである場合、Ｃ1〜6のアルキルであり得、例えばＣ1〜4のアルキルであり得、例えばＣ1〜2のアルキルであり得、例えばメチルである。
−ＲS1又は−ＲS2がアリールである場合、カルボアリールであり得、例えばＣ6〜10のカルボアリールであり得、例えばフェニルであり得、又はヘテロアリールであり得、例えばＣ5〜10のヘテロアリールであり得、例えばＣ5〜6のヘテロアリールであり得る。
−ＲS1又は−ＲS2がアラルキルである場合、アルキレン基を介して窒素原子に接続されたアリール基である。アルキレン基はＣ1〜6のアルキレンであり得、例えばＣ1〜2のアルキレンであり得、例えばＣ1のアルキレン（メチレン、−ＣＨ2−）であり得る。アリール基は、上記のアリール基であり得る。一つの例はベンジルである。
−ＲS1及び−ＲS2が一緒になって複素環を形成する場合、例えばＣ4〜10の複素環であり得、例えばＣ5〜6複素環であり得、例えばＣ5複素環又はＣ6複素環であり得、例えばピペリジンであり得る。複素環は、単環であっても、２つ以上の縮合環であってもよく、少なくとも１つの環は複素環である。複素環は、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）からなる群から選択される１つ又は２つのヘテロ原子を含み得る。
【００２５】
Ｃｙは、ナフトキノン基のキノン環に縮合されていることが好ましい。Ａｒが１，２−ナフトキノンの場合、Ｃｙはナフトキノン基のキノン環の３位と４位に縮合される。したがって：
2020533327.tif 000006
式中、Ｃｙは任意に置換される複素環であり、−ＲNpは１，２−ナフトキノン基のベンゼン環に対する１つ以上の任意の置換基を表す。
【００２６】
Ａｒが１，４−ナフトキノンの場合、Ｃｙはナフトキノン基のキノン環の２位と３位に縮合される：
2020533327.tif 000007
式中、Ｃｙは任意に置換される複素環であり、−ＲNpは１，４−ナフトキノン基のベンゼン環に対する１つ以上の任意の置換基を表す。
【００２７】
基Ｃｙは、それが縮合されるナフトキノン基からの２つの炭素原子を含めて、５個、６個又は７個の環原子を有し、例えば５個又は６個の環原子を有し、例えば５個の環原子を有する。
【００２８】
Ｃｙは複素環であり、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）からなる群から選択される１つ又は２つ、例えば１つの環ヘテロ原子を含む。２つの環ヘテロ原子が存在する場合、これらは環内で隣接しない。
【００２９】
Ｏなどの複素環の環ヘテロ原子は、ナフトキノン基のキノン環の炭素環原子に結合していることが好ましい。
【００３０】
Ｃｙが１，２−ナフトキノンである場合、複素環の環ヘテロ原子は、３位又は４位、例えば４位で炭素環原子に結合することができる。Ｃｙが１，４−ナフトキノンである場合、複素環の環ヘテロ原子は、２位又は３位、例えば２位で炭素環原子に結合することができる。
【００３１】
Ｃｙは、酸素含有複素環であることが好ましい。したがって、複素環の一つの環原子は酸素原子になる。好ましい程度が劣るが、複素環は、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）から選択される１つのさらなるヘテロ原子を任意に含んでもよい。
【００３２】
複素環は、ナフトキノン基への縮合により、部分的に不飽和である。複素環は完全に不飽和であってもよく、芳香族であってもよい。好ましくは、複素環は部分的に不飽和である。
【００３３】
基Ｃｙは、それが縮合されるナフトキノン基からの２つの炭素原子、例えばナフトキノン基のキノン環からの炭素環原子を含めて、２，３−ジヒドロフラン基又は２，５−ジヒドロフラン基であり得、例えば２，３−ジヒドロフラン基であり得る。
【００３４】
基Ｃｙは、それが縮合されるナフトキノン基からの２つの炭素原子、例えばナフトキノン基のキノン環からの炭素環原子を含めて、３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン基又は３，６−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン基であり得、例えば３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラン基であり得る。
【００３５】
複素環は任意に置換され、好ましくは置換される。複素環は、１つ又は複数の置換基を有することができ、好ましくは一置換、二置換又は三置換される。
【００３６】
環ヘテロ原子に対してα位にある複素環炭素環原子（その環原子はナフトキノン基の環原子ではない）は置換されてもよく、好ましくは置換されており、最も好ましくは二置換される。α位は、複素環の２位と呼ばれることがある。
【００３７】
複素環Ｃｙは、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2、ハロゲン、及び−Ｌ1−Ｒ4からなる群から選択される１つ又は複数の置換基−ＲCyにより任意に置換される。ここで、−Ｌ1−は共有結合、アルキレン、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、及び−Ｎ（ＲL1）−から選択され、−ＲL1はアルキルであり、−Ｒ4はアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル及びアリールからなる群から選択され、かつこれらのアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、及びアリールのそれぞれが独立して任意に置換され、例えば独立して、以下に記載されるような、１つ以上の基−ＲTにより任意に置換される。−Ｒ4がアルキルである場合、−Ｌ1−基はアルキレンではない。
【００３８】
複素環は、１つ、２つ、又は３つの基−ＲCyで置換されてもよい。好ましくは、複素環は、３つの基−ＲCyで置換される。最も好ましくは、これらの３つの基のうちの２つはメチルなどのアルキルである。−ＲCy基が２つ以上ある場合、これらの基の２つは複素環の同じ炭素原子に結合してもよい（ジェミナル置換）。
【００３９】
複素環は、アルキルで置換され、例えばアルキルで二置換されてもよく、任意にさらに−ＯＨで置換されてもよい。
【００４０】
複素環は、アルキルで置換され、例えばアルキルで二置換されてもよく、任意にさらに−Ｌ1−Ｒ4で置換されてもよい。
【００４１】
一実施形態では、−Ｌ1−は、共有結合、アルキレン、−Ｏ−又は−Ｎ（Ｈ）から選択される。
基−Ｌ1−は、−Ｎ（Ｈ）−、アルキレン又は共有結合から選択されることが好ましい。
基−Ｌ1−は共有結合であってもよい。基−Ｌ1−は共有結合であってもよい。基−Ｌ1−は−Ｎ（Ｈ）−であってもよい。
−Ｌ1−がアルキレン基である場合、Ｃ1〜6のアルキレンであり得、例えばＣ1〜2のアルキレンであり得、例えばＣ1のアルキレン（メチレン、−ＣＨ2−）であり得る。
基−ＲL1はアルキルであり、例えばＣ1〜6のアルキルであり、例えばＣ1〜2のアルキルであり、例えばメチルであり得る。
【００４２】
基−Ｒ4は、カルボアリール又はヘテロアリールなどのアリールであることが好ましい。アリール基は任意に置換される。
カルボアリール基は、フェニル又はナフチル、例えばフェニルであってもよい。
ヘテロアリール基は、Ｃ5〜10のヘテロアリールであり得、例えばＣ5〜6のヘテロアリールであり得、例えばＣ5ヘテロアリールであり得る。Ｃ5ヘテロアリールの例は、１，２，３−トリアゾリルなどのトリアゾリル、フラニル、チオフェニル、ピロリル、及びオキサゾリルであり、Ｃ6ヘテロアリールの例は、ピリジニル及びピリミジニルであり得る。
アリール基は、フェニル及びＣ5ヘテロアリールから選択でき、例えば１，２，３−トリアゾリルなどのトリアゾリルであり得る。
【００４３】
−Ｒ4がアルキルである場合、Ｃ1〜6のアルキルであり得、例えばＣ1〜4のアルキルであり得、例えばＣ1〜2のアルキルであり得、例えばメチルであり得る。
−Ｒ4がアルケニルである場合、Ｃ2〜6のアルケニルであり得、例えばＣ2〜4のアルケニルであり得、例えばＣ2〜3のアルケニルであり得、例えばＣ2のアルケニル（ビニル）又はＣ3のアルケニル（アリル）であり得る。
−Ｒ4がアルキニルである場合、Ｃ2〜6のアルキニルであり得、例えばＣ2〜4のアルキニルであり得、例えばＣ2〜3のアルキニルであり得、例えばＣ3のアルキニル（プロパルギル）であり得る。
アルキル、アルケニル及びアルキニル基は、直鎖状又は分枝状であり得る。
−Ｒ4がシクロアルキルである場合、Ｃ3〜10のシクロアルキルであり得、例えばＣ5〜6のシクロアルキルであり得、例えばＣ6のシクロアルキル（シクロヘキシル）であり得る。シクロアルキルは、単環又は２つ以上の縮合環であってもよい。
−Ｒ4がヘテロシクリルである場合、Ｃ4〜10のヘテロシクリルであり得、例えばＣ5〜6のヘテロシクリルであり得、例えばＣ5のヘテロシクリル又はＣ6のヘテロシクリルであり得、例えばピペリジニルであり得る。ヘテロシクリルは、単環又は２つ以上の縮合環であってもよく、少なくとも１つの環はヘテロシクリル環である。ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）からなる群から選択される１つ又は２つのヘテロ原子を含み得る。
【００４４】
−Ｒ4がアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はアリールである場合、これらの基は任意に１つ以上の基−ＲTにより置換されてもよい。ここで、各−ＲTは独立して、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2、ハロゲン、及び−Ｌ2−Ｌ3−Ｒ5からなる群から選択され、−Ｌ2−は共有結合、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−、−Ｎ（ＲL2）−から選択され、−ＲL2はアルキル及び−Ｃ（Ｏ）−であり、−Ｌ3−は共有結合、アルキレン及びアルケニレンから選択され、−Ｒ5はアルキル、アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及び糖基からなる群から選択され、かつこれらのアルキル、アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール及び糖基のそれぞれが独立して置換される。−Ｒ5がアルキル又はアルケニルである場合、基−Ｌ3−は共有結合である。
【００４５】
−Ｒ4がアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はアリールである場合、これらの基は任意に１つの基−ＲTにより置換されてもよい。
好ましくは、基−ＲTがハロゲン又は−Ｌ2−Ｌ3−Ｒ5であり、例えば−Ｌ2−Ｌ3−Ｒ5である。
【００４６】
基−Ｇ3−は共有結合であることが好ましい。ここで、酸素複素環は５員の複素環（ジヒドロフラン環）である。
基−Ｇ3−はアルキレンであり得、例えばＣ1〜2のアルキレンであり得、例えば−ＣＨ2−又は−ＣＨ2ＣＨ2−であり得、例えば−ＣＨ2−であり得る。
基−Ｇ3−がアルキレンである場合、−ＣＨ2−であることが好ましい。ここで、酸素複素環は６員の複素環（ジヒドロピラン環）である。一方、−Ｇ3−が−ＣＨ2ＣＨ2−である場合、酸素複素環は７員の複素環である。
基−Ｌ2−は共有結合又は−Ｃ（Ｏ）−であることが好ましい。
【００４７】
基−Ｌ3−はアルキレン又はアルケニレンから選択されることが好ましい。
基−Ｌ3−がアルキレンである場合、Ｃ1〜6のアルキレンであり得、例えばＣ1〜2のアルキレンであり得、例えばＣ1のアルキレン（メチレン、−ＣＨ2−）であり得る。
基−Ｌ3−がアルケニレンである場合、Ｃ2〜6のアルケニレンであり得、例えばＣ2〜3のアルケニレンであり得、例えばＣ2のアルケニレンであり得、例えば−ＣＨ＝ＣＨ−であり得る。
【００４８】
−Ｒ5がアルキルである場合、Ｃ1〜6のアルキルであり得、例えばＣ1〜4のアルキルであり得、例えばＣ1〜2のアルキルであり得、例えばメチルであり得る。
−Ｒ5がアルケニルである場合、Ｃ2〜6のアルケニルであり得、例えばＣ2〜4のアルケニルであり得、例えばＣ2〜3のアルケニルであり得、例えばＣ2のアルケニル（ビニル）又はＣ3のアルケニル（アリル）であり得る。
−Ｒ5がアルキニルである場合、Ｃ2〜6のアルキニルであり得、例えばＣ2〜4のアルキニルであり得、例えばＣ2〜3のアルキニルであり得、例えばＣ3のアルキニル（プロパルギル）であり得る。
アルキル、アルケニル及びアルキニル基は、直鎖状又は分枝状であり得る。
−Ｒ5がシクロアルキルである場合、Ｃ3〜10のシクロアルキルであり得、例えばＣ5〜6のシクロアルキルであり得、例えばＣ6のシクロアルキル（シクロヘキシル）であり得る。シクロアルキルは、単環又は２つ以上の縮合環であってもよい。
−Ｒ5がヘテロシクリルである場合、Ｃ4〜10のヘテロシクリルであり得、例えばＣ5〜6のヘテロシクリルであり得、例えばＣ5のヘテロシクリル又はＣ6のヘテロシクリルであり得、例えばピペリジニルであり得る。ヘテロシクリルは、単環又は２つ以上の縮合環であってもよく、少なくとも１つの環はヘテロシクリル環である。ヘテロシクリルは、Ｏ、Ｓ及びＮ（Ｈ）からなる群から選択される１つ又は２つのヘテロ原子を含み得る。
−Ｒ5がアリールである場合、カルボアリールであり得、例えばＣ6〜10のカルボアリールであり得、例えばフェニルであり得、又はヘテロアリールであり得、例えばＣ5〜10のヘテロアリールであり得、例えばＣ5〜6のヘテロアリールであり得る。
【００４９】
−Ｒ5が糖基である場合、単糖であり得る。単糖は、トリオース、テトロース、ペントース又はヘキソースであり得、好ましくはヘキソースである。
単糖は、アルドース又はケトースであってもよく、好ましくはアルドースである。
単糖はグルコースであってもよい。
【００５０】
糖基は、糖の酸素原子、例えばヒドロキシル基の酸素原子を介して結合されてもよく、好ましくは結合される。ここで、ヒドロキシル基は、糖基の環状型のヘミアセタール基のヒドロキシル基（通常、１位の炭素原子に結合しているヒドロキシル基）であり得る。
【００５１】
グルコサミンなどのアミノ糖は、この場合、糖と見なすことができる。いくつかの実施形態では、糖は、酸素、炭素及び水素のみを有する炭水化物であり得る。
【００５２】
−Ｒ5がアルキル、アルケニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、又はアリールである場合、これらの基は任意に、-ＯＨ、−ＯＲQ、-ＳＨ、-ＳＲT、-ＮＨ2、−ＮＨＲQ、−Ｎ（ＲQ）2、ハロゲン、ニトロ、−ＣＯＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲQ、−ＯＣ（Ｏ）ＲQ、-ＣＯＮＨ2、-Ｃ（Ｏ）ＮＨＲQ、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲQ）2、及び−ＮＨＣ（Ｏ）ＲQから選択される一つ以上の基に置換され得る。ここで、各−ＲQは独立してアルキル又はアラルキルである。
【００５３】
基−ＲQは、Ｃ1〜6のアルキルであり得、例えばメチル又はエチルであり得、例えばメチルであり得る。
基−ＲQはベンジルであってもよい。
【００５４】
基−Ｒ5が糖基である場合、ヒドロキシル官能基はアシル化（−Ｃ（Ｏ）Ｍｅ）されてもよい。１つ以上、又はすべての基がアシル化されてもよい。同様に、例えばアミノ糖中にアミノ官能基が存在する場合、その官能基はアシル化され得る。
【００５５】
複素環の環原子は、非置換、一置換又は二置換であってもよい。
【００５６】
ナフトキノンに縮合される複素環の２位は、一置換又は二置換されてもよく、各置換基はアルキルであり得、例えばＣ1〜6のアルキルであり得、例えばメチルであり得る。好ましくは、２位はメチルで二置換される。
【００５７】
環ヘテロ原子に対してβ位にある複素環炭素環原子（その環原子はナフトキノン基の環原子ではない）は置換されてもよく、一置換されてもよい。
【００５８】
複素環が５つより多くの環原子を含む場合、環ヘテロ原子に対してγ位にある複素環炭素環原子（その環原子はナフトキノン基の環原子ではない）は置換されてもよく、好ましくは置換されており、最も好ましくは一置換される。
【００５９】
複素環が窒素環原子Ｎ（Ｈ）を含む場合、これは、アルキル、アリール及びアラルキルから選択される基で任意に置換されてもよい。
【００６０】
好ましい実施形態では、式（Ａ）の化合物は、化合物（Ｂ）、並びにその塩、溶媒和物及び保護形態である：
2020533327.tif 000008
式中、
−Ｇ1−は−ＣＨ2−、−ＣＨＲ1-又は−Ｃ（Ｒ1）（Ｒ2）−であり、
−Ｇ2−は−ＣＨ2−又は−ＣＨＲ3−であり、
−Ｇ3−は共有結合又はアルキレンであり、
−Ｒ1、−Ｒ2及び−Ｒ3のそれぞれが独立して、基−ＲCyであり、例えば基−Ｌ1−Ｒ4である。
【００６１】
各基−ＲCyは前述と同様である。
【００６２】
−Ｇ1−は−Ｃ（Ｒ1）（Ｒ2）−であることが最も好ましい。ここで、Ｒ1及びＲ2のそれぞれが独立して、−Ｌ1−Ｒ4から選択される。
好ましくは、−Ｒ1及び−Ｒ2のそれぞれがアルキルであり、例えばＣ1〜6のアルキルであり、例えばＣ1〜2のアルキルであり、例えばＣ1のアルキル（メチル）である。
基−Ｇ1−は−Ｃ（ＣＨ3）2−であることが好ましい。
基−Ｒ1は基−Ｒ2と同じであってもよい。
【００６３】
基−Ｇ2−は−ＣＨ2−であってもよい。
基−Ｇ2−は−ＣＨＲ3−であってもよい。
【００６４】
式（Ａ）の化合物は、好ましくはβ−ラパコンである：
2020533327.tif 000009
式（Ａ）の化合物は、化合物（Ｃ）であってもよい：
2020533327.tif 000010
ここで、−ＲNp、−Ｇ1−、−Ｇ2−及び−Ｇ3−は式（Ｃ）の化合物において同様の意味を有する。
【００６５】
β−ラパコン化合物は、β−ラパコン（３，４−ジヒドロ−２，２−ジメチル−２Ｈ−ナフト［１，２−ｂ］ピラン−５，６−ジオン）又はβ−ラパコンの類似体、誘導体若しくはプロドラッグであり得る。β−ラパコン（ＣＡＳ  ４７０７−３２−８）は、商業的供給業者から入手するか、標準的な手法を使用して合成するか、標準的な方法に従ってラパチョの木（Ｔａｂｅｂｕｉａ  ａｖｅｌｌａｎｅｄａｅ）から単離することができる。
【００６６】
本発明はまた、式（Ｄ）、並びにその塩、溶媒和物及び保護形態のβ−ラパコン化合物の使用を提供する：
2020533327.tif 000011
（式中、
Ｎｑは任意に置換されるナフトキノンであり、
−Ａは−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2及び−ＮＨＲから選択され、Ｒはアルキル、アリール及びアラルキルから選択され、
−Ｄは任意に置換されるアルケニル基である。）
【００６７】
式（Ｄ）の化合物は、ラパコール化合物と呼ばれることがある。
【００６８】
基−Ａ及び−Ｄは、任意に置換されるナフトキノンのキノン環に対する置換基であることが好ましい。基−Ａ及び−Ｄは、隣接する環原子上に位置し、例えば任意に置換されるナフトキノンのキノン環の隣接する環原子上に位置する。
【００６９】
基−Ａは、好ましくは−ＯＨ、−ＮＨ2及びＮＨＲからされ、より好ましくは−ＯＨ及びＮＨ2から選択され、最も好ましくは−ＯＨである。
基−Ｎｑは、式（Ａ）の化合物について前述のような基であり得る。例えば、Ｎｑは任意に置換されるナフトキノンであり得、そして好ましくはナフトキノンである。基Ｎｑは、１，２−ナフトキノン又は１，４−ナフトキノンであり得、好ましくは１，２−ナフトキノンである。
【００７０】
−Ｒがアルキルである場合、Ｃ1〜6のアルキルであり得、例えばＣ1〜4のアルキルであり得、例えばＣ1〜2のアルキルであり得、例えばメチルである。
−Ｒがアリールである場合、カルボアリールであり得、例えばＣ6〜10のカルボアリールであり得、例えばフェニルであり得、又はヘテロアリールであり得、例えばＣ5〜10のヘテロアリールであり得、例えばＣ5〜6のヘテロアリールであり得る。
−Ｒがアラルキルである場合、アルキレン基を介して窒素原子に接続されたアリール基である。アルキレン基はＣ1〜6のアルキレンであり得、例えばＣ1〜2のアルキレンであり得、例えばＣ1のアルキレン（メチレン、−ＣＨ2−）であり得る。アリール基は、上記のアリール基であり得る。一つの例はベンジルである。
基−Ｒは前述の基−ＲL1であってもよい。
【００７１】
−Ｄのアルケニル二重結合は、キノン二重結合と共役していないことが好ましい。
【００７２】
好ましくは、基−Ｄは以下である：
2020533327.tif 000012
式中、−Ｒ1、−Ｒ2、−Ｒ3及び−Ｇ3−は式（Ｂ）の化合物における−Ｒ1、−Ｒ2、−Ｒ3及び−Ｇ3−と同様の意味を有する。
【００７３】
式（Ｄ）の化合物は、好ましくは以下のラパコールである：
2020533327.tif 000013
【００７４】
本発明の化合物は、溶媒和物として、例えば水和物として提供されてもよい。
【００７５】
本発明の化合物はまた、適切な場合、例えば、化合物がカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）とアミングループ（ＮＨ2など）などの適切な官能基を有する場合、上記の式（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）の化合物の塩形態も含む。これらの塩は、薬学的に許容される塩であり得る。
【００７６】
本発明の化合物はまた、プロドラッグ形態を含む保護形態で提供されてもよい。
【００７７】
例えば、β−ラパコン化合物の一方又は両方のカルボニル基をイミン又はアセタールとして保護することができ、これらの基は、本明細書に記載の治療方法で使用する前に除去することができ、あるいはこれらの基のイン・ビボでの開裂を予期して、イミン又はアセタール形態で投与することもできる。ＷＯ２０１２／０４０５１３は、β−ラパコン化合物のカルボニル基の保護のための適切なイミン及びアセタール形態を開示している。
【００７８】
一実施形態では、β−ラパコン化合物は、イミン保護形態で提供される。イミン基は、１位のカルボニル基などのβラパコン化合物のカルボニル基の一方又は両方、例えば一方を保護することができる。
β−ラパコン中のカルボニル基の代わりに、任意に置換されるフェニルイミン基が提供されてもよい。フェニル基は、非置換であっても、メチルなどのアルキル、メトキシなどのアルコキシ、ニトロ、及びブロモなどのハロゲンから選択される１つ以上の基で置換されていてもよい。典型的には、フェニル基は非置換又は一置換であり、一置換基は４位に提供されてもよい。
例えば、β−ラパコン化合物は、ＡＲＱ  ７６１であり得る。
【００７９】
本発明の化合物が、式（Ｄ）の化合物中に存在し得るようなヒドロキシル基を有する場合、このヒドロキシル基は、例えば、アルキルエステルなどのエステル、又はシリルエーテルとして保護され得る。
【００８０】
本発明で使用するための化合物は、商業的供給業者から入手してもよく、天然材料から抽出してもよく、又は市販のあるいは天然材料から抽出した出発材料を使用して合成により調製してもよい。βラパコンの誘導体、例えば、修飾及び／又は置換された複素環を有する誘導体は、当技術分野で周知である。
【００８１】
例えば、ラパコールは、タベブイア種（Ｔａｂｅｂｕｉａ  ｓｐ）の心材から単離することができる。β−ラパコンは、ラパコールから直接調製することができる。本発明の他の化合物は、ノルラパコール（ｎｏｒ−ｌａｐａｈｃｏｌ）又はこの化合物の誘導体化バージョンを介して調製され得る。例えば、本明細書の実施例に記載されるように、ノルラパコールは、二重結合の臭素化、それに続く酸素、硫黄又は窒素求核試薬、Ｈ−ＲCyなどの適切な求核試薬との反応によって誘導体化される（例えばＲCyは−Ｌ1−Ｒ4であり、−Ｌ1−は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｎ（Ｈ）−又はＮ（ＲL1）−であり、−Ｒ4は前述のとおりである）。
【００８２】
本明細書に記載の治療に適した患者は、５−ＬＯの発現を特徴とする疾患を有し得る。いくつかの実施形態では、疾患は、ＮＱＯ１の発現を特徴とし得る。
【００８３】
ＮＱＯ１（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈキノンデヒドロゲナーゼ；ＤＴＤ、ＱＲ１、ＤＨＱＵ、ＤＩＡ４、ＮＭＯＲ１、又はＮＭＯＲＩとしても知られている）は細胞質２電子還元酵素であり、キノンをヒドロキノンに還元し、癌感受性と関連する。ＮＱＯ１はヒトＮＱＯ１であり得る。ヒトＮＱＯ１（Ｇｅｎｅ  ＩＤ  １７２８）は、参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００８９４．１を有し、参照ヌクレオチド配列ＮＭ＿０００９０３．２によってエンコードされ得る。
【００８４】
５−ＬＯの発現を特徴とする疾患には、癌及び炎症性疾患が含まれ得る。
【００８５】
本明細書に記載の治療に適した炎症性疾患には、アレルギー、喘息、尋常性座瘡、自己免疫疾患、セリアック病、慢性前立腺炎、大腸炎、炎症性腸疾患、膀胱炎、肥満細胞症、リウマチ性関節炎、肝炎、前灌流障害、糸球体腎炎、エリテマトーデス、鼻炎、移植拒絶反応及び血管炎が含まれ得る。他の適切な炎症性疾患は、Sharma et al (2006) Inflammopharmacology 14 (1-2) 10-16に開示されている。
【００８６】
本明細書に記載の治療に適した癌には、あらゆる種類の固形又は非固形癌又は悪性リンパ腫、特に白血病、肉腫、皮膚癌、膀胱癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、食道癌、膵臓癌、腎臓癌、胃癌、脳癌が含まれ得る。癌は家族性又は散発性であり得る。癌は転移性癌であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、癌は腎臓癌、結腸癌又は血液癌であり得る。
【００８７】
好ましい実施形態では、癌は、血液癌、例えば、ＣＭＬ、ＡＭＬ、ＣＬＬ又はＡＬＬなどの白血病、最も好ましくはＡＭＬであり得る。
【００８８】
５−ＬＯの発現を特徴とする癌は、コントロール細胞と比較して５−ＬＯの発現が増加している患者の１つ以上の癌細胞を含み得る。例えば、患者の１つ以上の癌細胞における５−ＬＯの発現は、コントロール細胞における発現より大きくてもよく、又は所定の閾値より大きくてもよい。
【００８９】
５−ＬＯ及びＮＱＯ１の発現を特徴とする癌は、コントロール細胞と比較して５−ＬＯ及びＮＱＯ１の両方の発現が増加している患者の１つ以上癌細胞を含み得る。例えば、患者の１つ以上の癌細胞における５−ＬＯ及びＮＱＯ１の発現は、コントロール細胞における発現より大きくてもよく、又は所定の閾値より大きくてもよい。
【００９０】
５−ＬＯの発現及び任意にＮＱＯ１の発現を特徴とする癌は、任意の適切な技術によって識別され得る。例えば、患者由来の１つ以上の癌細胞における５−ＬＯの発現を判断することができる。細胞における標的遺伝子の発現を決定するための適切な技術は、当技術分野において周知であり、蛍光活性化細胞選別（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ、ＦＡＣＳ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、ＴａｑＭａｎ（商標）、又はＴａｑＭａｎ（商標）低密度アレイ（ＴＬＤＡ）などのＰＣＲベースの方法、マイクロアレイ、マルチアナライトプロファイルテスト、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、ノーザンブロットアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降アッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ドットブロットアッセイ、スロットブロットアッセイ、又はプロテオミクスベースの方法が含まれる。
【００９１】
患者は、事前に、５−ＬＯの発現を特徴とする癌を有するか、又は５−ＬＯの発現を特徴とする癌を有するおそれ、若しくは発症のおそれがあると識別されている。
【００９２】
方法は、投与の前に、患者が５−ＬＯの発現を特徴とする癌を有するか、又はそのおそれがあると識別することを含み得る。
【００９３】
上記のような治療に適した個体は、齧歯類（例えば、モルモット、ハムスター、ラット、マウス）、ネズミ科（例えば、マウス）、イヌ科（例えば、犬）、ネコ科（例えば、猫）、ウマ科（例：馬）、霊長目、真猿型下目（例：サル、類人猿）、サル（例：マーモセット、ヒヒ）、類人猿（例：ゴリラ、チンパンジー、オランウータン、テナガザル）、又はヒトなどの哺乳類であり得る。
【００９４】
いくつかの好ましい実施形態では、個体はヒトである。他の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳類、特に、ヒトにおける治療効果を実証するためのモデルとして従来使用されている哺乳動類（例えば、マウス、霊長類、ブタ、イヌ科、又はウサギ）を使用することができる。
【００９５】
いくつかの実施形態では、個体は、最初の癌治療の後に微小残存病変（ＭＲＤ）を有し得る。
【００９６】
５−ＬＯの発現を特徴とする癌を有する個体は、当技術分野で公知の臨床基準に従って癌の診断を行うのに十分である少なくとも１つの識別可能な徴候、症状、又は検査所見を示し得る。そのような臨床基準の例は、Harrison’s Principles of Internal Medicine, 15th Ed., Fauci AS et al., eds., McGraw-Hill, New York, 2001などの医学のテキストにある。いくつかの例では、個体における癌の診断は、個体から得られた体液又は組織のサンプル中の特定の細胞型（例えば、癌細胞）の識別を含み得る。いくつかの実施形態では、個体は、事前に５−ＬＯの発現を特徴とする癌で識別又は診断されていてもよく、あるいは、本発明の方法は、例えば個体における５−ＬＯの発現を特徴とする癌を示す識別可能な徴候、症状、又は検査所見の存在を判定することにより、個体の５−ＬＯの発現を特徴とする癌の識別又は診断を含み得る。
【００９７】
β−ラパコンなどのβ−ラパコン化合物を個体に単独で投与することは可能であるが、化合物を医薬組成物又は製剤で提供することが好ましい。
【００９８】
医薬組成物は、β−ラパコン化合物に加えて、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、アジュバント、賦形剤、希釈剤、充填剤、緩衝剤、安定剤、保存剤、潤滑剤、又は当業者に周知の他の材料を含むことができる。これらの物質は無毒であるべきであり、活性化合物の効力を妨げるべきではない。担体他の物質の正確な性質は、投与経路に依存し、これは、以下で考察するように、ボーラス、点滴、注射又は他の任意の適切な経路によるものであり得る。適切な材料は無菌で発熱物質を含まず、適切な等張性と安定性を備える。例として、無菌生理食塩水（例えば、０．９％ＮａＣｌ）、水、ブドウ糖、グリセロール、エタノールなど、又はそれらの組み合わせが含まれる。組成物は、シクロデキストリン、湿潤剤、乳化剤、pH緩衝剤などの補助物質をさらに含んでもよい。
【００９９】
適切な担体、賦形剤などは、標準的な医薬品のテキスト、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990.から分かる。
【０１００】
本明細書で使用される「薬学的に許容される」という用語は、健全な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー反応、又はその他の問題や合併症がなく、合理的な利益／リスク比に見合い、対象（例えば、ヒト）の組織との接触に用いることに適した化合物、材料、組成物、及び／又は剤形に関する。各担体、賦形剤なども、製剤の他の成分と適合性があるという意味で「許容可能」でなければならない。
【０１０１】
製剤は、便宜上、単位剤形で提供されてもよく、製薬業界で周知の任意の方法によって調製されてもよい。これらの方法は、活性化合物を、１つ又は複数の副成分で構成される担体と結合させることを含む。一般に、製剤は、活性化合物を液体担体又は微粉固体担体又はその両方と均一かつ密接に結合させ、その後、必要に応じて製品を成形することによって調製される。
【０１０２】
製剤は、液体、溶液、懸濁液、乳濁液、エリキシル、シロップ、錠剤、ロゼンジ、顆粒、粉末、カプセル、オブラート、ピル、アンプル、坐剤、ペッサリー、軟膏、ゲル、ペースト、クリーム、スプレー、ミスト、フォーム、ローション、オイル、ボーラス、舐剤、又はエアロゾルの形であり得る。
【０１０３】
β−ラパコン化合物又はβ−ラパコン化合物を含む医薬組成物は、全身的／末梢的又は所望の作用部位において、任意の便宜的な投与経路によって対象に投与することができる。投与経路は、以下を含むがこれらに限定されない：経口（例えば摂取による）;非経口、例えば、皮下、皮内、筋肉内、静脈内、動脈内、心臓内、くも膜下腔内、脊髄内、嚢内、被膜下、眼窩内、腹腔内、気管内、表皮下、関節内、くも膜下、及び胸骨内を含む注射；デポーの、例えば皮下又は筋肉内へのインプラント。通常、投与は経口経路によるものであるが、腹腔内、皮下、経皮、静脈内、鼻腔内、筋肉内、又は他の便宜的な経路は除外されない。
【０１０４】
β−ラパコン化合物を含む医薬組成物は、意図された投与経路に適切な投薬単位製剤に製剤化され得る。
【０１０５】
経口（例えば、摂取による）投与に適した製剤は、それぞれが所定量の活性化合物を含有するカプセル、オブラート、又は錠剤などの個別の単位として提供することができ、それぞれが、粉末又は顆粒として;水性又は非水性液体中の溶液又は懸濁液として;又は水中油型液体エマルジョン若しくは油中水型液体エマルジョンとして；ボーラスとして;舐剤として;又はペーストとして、所定量の活性化合物を含有する。
【０１０６】
錠剤は、従来の手段、例えば、任意に１つ以上の副成分を用いて、圧縮又は成形によって作製することができる。圧縮錠剤は、粉末又は顆粒などの自由流動形態の活性化合物を適切な機械で圧縮することにより調製することができ、任意的に、１つ以上の結合剤（例えば、ポビドン、ゼラチン、アカシア、ソルビトール、トラガカント、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤又は希釈剤（例えば、乳糖、微結晶セルロース、リン酸水素カルシウム）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ）；崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）；界面活性剤又は分散剤又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）；及び防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、アスコルビン酸）と混合される。成形錠剤は、適切な機械で、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末状化合物の混合物を成形することによって作製することができる。錠剤は、任意にコーティング又は刻み目を入れてもよく、例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な比率で使用して、所望の放出プロフィールを提供して、その中の活性化合物の徐放又は制御放出を提供するように製剤化してもよい。錠剤は任意に、胃以外の消化管の部分での放出を提供するために、腸溶性コーティングを設けられてもよい。
【０１０７】
非経口（例えば、皮膚、皮下、筋肉内、静脈内及び皮内を含む注射による）投与に適した製剤には、水性及び非水性の等張で発熱物質を含まない、無菌の注射溶液が含まれ、抗酸化剤、緩衝剤、保存剤、安定剤、静菌剤、及び意図されたレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含み得、及び懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性無菌懸濁液、化合物が血液成分又は１つ以上の臓器を標的にするように設計されるリポソームその他の微粒子系を含み得る。そのような製剤での使用に適した等張性ビヒクルの例には、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、又は乳酸加リンゲル注射液が含まれる。典型的には、溶液中の活性化合物の濃度は、約１ｎｇ／ｍｌ〜約１０ｍｇ／ｍｌ、例えば約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１ｍｇ／ｍｌである。製剤は、単位用量又は複数用量の密封容器、例えば、アンプル及びバイアルで提供することができ、使用直前に無菌液体担体、例えば注射のための水を加えるだけでよい凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｓｅｄ）状態で保管することができる。即席の注射溶液及び懸濁液は、無菌の粉末、顆粒、及び錠剤から調製され得る。製剤は、活性化合物が血液成分又は１つ以上の臓器を標的にするように設計されるリポソームその他の微粒子系の形態であり得る。
【０１０８】
必要に応じて、他の治療剤又は予防剤が、医薬組成物又は製剤中に含まれ得る。
【０１０９】
本明細書に記載のβ−ラパコン化合物は、５−ＬＯの発現、及び任意にＮＱＯ１の発現を特徴とする癌の治療に役立ち得る。
【０１１０】
治療は、ヒト又は動物（例えば、獣医学的適用において）のいずれかの治療又は療法であり得、そこで、いくつかの所望の治療効果、例えば、病状の発症又は進行の阻害又は遅延が達成され、進行速度の低下、進行速度の停止、転移の抑制、病状の改善、病状の治癒又は寛解（部分的又は全体的）、１つ以上の症状及び／又は病状の兆候の予防、遅延、軽減又は停止、又は治療なしで予想されるものを超える対象又は個体の生存の延長を含む。
【０１１１】
癌の成長とは、一般的に、癌内がより発達した形に変化することを示す多数の指標のいずれかを指す。したがって、癌の成長の阻害を測定するための指標には、癌細胞の生存率の低下、腫瘍の体積又は形態の低下（例えば、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、又は他の撮像方法を使用して判定する）、腫瘍の成長の遅延、腫瘍血管系の破壊、遅延型過敏性皮膚テストのパフォーマンスの向上、細胞溶解性Ｔリンパ球の活性の向上、及び腫瘍特異的抗原のレベルの低下が含まれる。本明細書に記載されるように、癌を有する個体における５−ＬＯの阻害は、癌の成長、特に既に対象に存在する癌の成長に抵抗する個体の能力を改善し得、及び／又は個体の癌の成長傾向を減少させる。
【０１１２】
本明細書に記載される治療は、予防的治療（すなわち、予防法）を含み得、すなわち、治療されている個体は、治療時点において５−ＬＯの発現を特徴とする癌を有しなくてもよく、又は有すると診断されていなくてもよい。例えば、５−ＬＯの発現を特徴とする癌の発生又は再発の感受性があるか、又はそのリスクがある個体は、本明細書に記載されるように治療され得る。そのような治療は、個体における５−ＬＯの発現を特徴とする癌の発生又は再発を防止又は遅延させるか、発生又は再発後のその症状又は重症度を軽減し得る。いくつかの実施形態では、個体は、一般集団と比較して５−ＬＯの発現を特徴とする癌の感受性又はそのリスクがあると事前に識別されていてもよく、又は方法は、５−ＬＯ発現を特徴とする癌の感受性又はリスクが高い個体を識別することを含んでもよい。いくつかの実施形態では、予防法又は予防的治療が好ましい場合がある。
【０１１３】
β−ラパコン化合物は、本明細書に記載されるように、治療有効量で投与され得る。
【０１１４】
本明細書で使用される「治療有効量」という用語は、ある程度の望ましい治療効果を生み出すのに有効であり、合理的な利益／リスク比に見合った、活性化合物、又は活性化合物を含む組み合わせ、材料、組成物もしくは剤形の量に関する。
【０１１５】
β−ラパコン化合物の適切な投与量は、個体によって異なる。最適な投与量の決定には、一般に、投与のリスク又は有毒な副作用に対する治療効果のレベルのバランスをとることが含まれる。選択される投与量レベルは、以下のさまざまな要因に依存するが、これらに限定されない：投与経路、投与時間、組み合わせで使用される活性化合物、他の薬物、化合物、及び／又は材料の排泄速度、及び年齢、性別、体重、病状、一般的な健康状態、及び当該個体の過去の病歴。活性化合物の量及び投与経路は、最終的には医師の裁量によるが、一般に、投薬量は、実質的な有害又は有毒な副作用を引き起こすことなく、活性化合物の治療血漿濃度を達成するためのものである。
【０１１６】
一般に、活性化合物の適切な用量は、１日あたり、対象の体重１ｋｇあたり約１００μｇ〜約４００ｍｇ、好ましくは１日あたり、対象の体重１ｋｇあたり２００μｇ〜約２００ｍｇの範囲である。活性化合物が塩、エステル、プロドラッグなどである場合、投与量は元の化合物に基づいて計算されるため、使用される実際の重量は比例して増加する。例えば、５０〜１００ｍｇのβ−ラパコン化合物は、カプセル又は錠剤の形態で１日２回経口投与され得る。
【０１１７】
β−ラパコン化合物は、５０％を超える５−ＬＯの阻害をもたらすレベルで血清濃度を維持するのに十分な量で経口投与され得る。
【０１１８】
イン・ビボでの投与は、１回の用量を、連続的又は断続的に（例えば、適切な間隔で分割された用量で）行うことができる。
【０１１９】
最も有効な投与手段及び投与量を決定する方法は当技術分野で周知であり、治療に使用される製剤、治療の目的、治療される標的細胞、及び治療される対象によって変化する。単回又は複数回の投与は、医師が選択した用量レベル及びパターンで行うことができる。
【０１２０】
β−ラパコン化合物の複数回用量を投与することができ、例えば２、３、４、５、又は５回を超える用量を投与することができる。β−ラパコン化合物の投与は、持続的な期間にわたって継続し得る。例えば、β−ラパコン化合物による治療は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１ヶ月、又は少なくとも２ヶ月継続され得る。β−ラパコン化合物による治療は、癌の症状を軽減し、又は完全な寛解を達成するために必要な限り継続することができる。
【０１２１】
β−ラパコン化合物は、個々の状況に応じて、単独で、又は他の治療と組み合わせて、同時に又は逐次的に投与することができる。例えば、本明細書に記載のβ−ラパコン化合物は、１つ以上の追加の活性化合物と組み合わせて投与することができる。
【０１２２】
β−ラパコン化合物は、第２の治療剤と組み合わせて投与され得る。
【０１２３】
第２の治療剤は、抗癌化合物であってもよく、例えば、抗癌化合物は、ダウノルビシン又はイダルビシンなどのアントラサイクリン、シタラビン、ビンクリスチン、ミトキサントロン、Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロホスファミド、フィブロムン、ダカルバジン、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、クロラムブシル、アルキル化剤、デシタビン、アザシチジン、シクロホスファミド、コルチコステロイド、イマチニブ、ミドスタウリン、クラドリビン、ペントスタチン、フルダラビン、トポテカン、リツキシマブ、クロラムブシル、パクリタキセルなどのタキサン、及びドキソルビシンから選択される。いくつかの好ましい実施形態では、第２の治療化合物は、ゲムシタビン又はナブパクリタキセルであり得る。
【０１２４】
β−ラパコン化合物は、放射と組み合わせて投与されてもよい。癌状態の治療のための放射の使用は、当技術分野でよく知られている。
【０１２５】
５−ＬＯの発現はまた、β−ラパコン化合物による治療に対して反応性（「感受性」）又は非反応性（「耐性」）である可能性が高い癌の識別、及びβ−ラパコン化合物による治療に適した患者の選択に役立ち得る。β−ラパコン化合物による治療のために癌患者を選定する方法は、
癌患者からの癌細胞のサンプルを提供すること、
癌細胞における５−ＬＯ発現の存在又は量を判定すること
を含む。
【０１２６】
５−ＬＯを発現する癌細胞を、閾値を超えるレベル又は対照細胞よりも高いレベルで５−ＬＯを発現させる癌細胞有する癌患者は、β−ラパコン化合物による治療のために選択され得る。細胞における５−ＬＯの発現の存在又は量を決定するのに適した技術は、当技術分野で周知である。
【０１２７】
患者は、上記のように５−ＬＯの発現を特徴とする癌を有し得る。
【０１２８】
本発明者らはまた、癌患者、例えば、ＣＬＬ及びＡＭＬなどの血液癌を有する患者における５−ＬＯ発現と悲観的な予後（例えば、３年間の生存率が５０％未満）との間の相関関係を同定した。
【０１２９】
本発明の別の側面は、癌患者の予後方法であって、
癌患者からの癌細胞における５−ＬＯの発現の量を判定することを含み、
５−ＬＯの発現のレベルが前記患者の予後を示す、
方法を提供する。
【０１３０】
患者は、上記のような癌、例えば、ＣＬＬ又はＡＭＬなどの血液癌を有し得る。
【０１３１】
癌細胞における５−ＬＯの発現の量は、任意の適切な技術を使用して判断され得る。
【０１３２】
本発明の他の態様及び実施形態は、用語「含む」が「からなる」に置き換えられた上記の態様及び実施形態と、用語「からなる」が「本質的に…からなる」に置き換えられた上記の態様及び実施形態を提供する。
【０１３３】
本出願は、文脈が別段断らない限り、上記の態様及び上記の実施形態のいずれかを互いに組み合わせたすべての組み合わせを開示することを理解されたい。同様に、本出願は、文脈別段断らない限り、好ましい及び／又は任意の特徴の、単独又は他の態様のいずれかと共同の、すべての組み合わせを開示する。
【０１３４】
上記の実施形態の改変、さらなる実施形態及びその改変は、本開示を閲読した当業者にとって明らかであり、したがって、これらは本発明の範囲内である。
【０１３５】
本明細書で言及されているすべての文書及び配列データベースの記載事項は、あらゆる目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３６】
本明細書で使用される「及び／又は」は、２つの特定の特徴又は構成要素のそれぞれの、他方を伴うか又は伴わない特定の開示として解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、あたかもそれぞれが本明細書で個別に述べられているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ及び（ｉｉｉ）Ａ及びＢのそれぞれの特定の開示と見なされるべきである。
【実施例】
【０１３７】
次に、本発明の特定の態様及び実施形態を、例として、上記の図を参照して説明する。
【０１３８】
実験
材料
試薬と溶媒は、ＡＢＣＲ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ、Ａｃｒｏｓ、Ｆｌｕｋａ、又はＴＣＩ  Ｄｅｕｔｓｃｈｌａｎｄから購入し、さらに精製せずに使用した。プロトン及び炭素核磁気共鳴（１Ｈ及び１３Ｃ  ＮＭＲ）スペクトルは、Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＶＡＮＣＥ  ＤＲＸ４００  ＭＨｚ及びＶａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  ５００  ＭＨｚ分光計で記録された。すべての化学シフトは、ＴＭＳを内部参照として使用して、δスケールでｐｐｍ単位で示される。結合定数（Ｊ）はＨｚで報告され、次の分割略語が使用される：ｓ＝シングレット、ｄ＝ダブレット、ｔ＝トリプレット、ｄｄ＝ダブレットのダブレット、ｔｄ＝ダブレットのトリプレット、ｍ＝マルチプレット。特に明記しない限り、すべての化合物の純度は９５％以上である。
【０１３９】
ラパコール
2020533327.tif 000014
ラパコール（２−ヒドロキシ−３−（３’−メチル−２’−ブテニル）−１，４−ナフトキノン）は、Ｔａｂｅｂｕｉａ  ｓｐ（Ｔｅｃｏｍａ）の心材から抽出された。最初に、飽和炭酸ナトリウム水溶液を調製し、イペの木のおがくずに加えた。ラパコールナトリウム塩の急速な形成（濃い赤色）を観察した後、塩酸を添加して、ラパコールを沈殿させた。次に、溶液を濾過し、黄色の固体を得た。この固体を、ヘキサンを溶媒とする一連の再結晶により精製した。次に、ラパコールは高純度（＞９９％）の黄色の結晶性固体として得られた。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、３０３Ｋ）δ：８．１１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．６及び１．４Ｈｚ）、８．０６（ｄｄ、１Ｈ，Ｊ＝７．６及び１．４Ｈｚ）、７．７４（ｔｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．６及び１．４Ｈｚ）、７．６６（ｔｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．６及び１．４Ｈｚ）、７．３６（ｓ，１Ｈ）、５．２５−５．１７（ｍ、１Ｈ）、３．３１（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、１．７９（ｓ，３Ｈ）、１．６９（ｓ、３Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、３０３Ｋ）δ：１８４．４、１８１．５、１５２．５、１３４．７、１３３．７、１３２．７、１２９．３、１２６．６、１２５．９、１２３．３、１１９．５、２５．６、２２．５、１７．８。
【０１４０】
β−ラパコン（１）
2020533327.tif 000015
キノンが完全に溶解して赤色の溶液が形成されるまで、硫酸をラパコール（１ｍｍｏｌ、２４２ｍｇ）にゆっくりと加えた。次に、溶液を氷に注ぎ、形成された沈殿物を濾別し、水で洗浄した。β−ラパコンをエタノールで再結晶し、オレンジ色の固体（２４０ｍｇ、収率９９％）として得た。ｍｐ１５３〜１５５℃。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、３０３Ｋ）δ：８．０６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．６及び１．４Ｈｚ）、７．８１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．８及び１．１Ｈｚ）、７．６５（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．８、７．６及び１．４Ｈｚ）、７．５１（ｔｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．６、７．６及び１．１Ｈｚ）、２．５７（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、１．８６（ｔ、２Ｈ、Ｊ＝６．７Ｈｚ）、１．４７（ｓ、６Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、３０３Ｋ）δ：１７９．８、１７８．５、１６２．０、１３４．７、１３２．６、１３０．６、１３０．１、１２８．５、１２４．０、１１２．７、７９．３、３１．６、２６．８、１６．２。データは文献で報告されたものと一致している（４２及び４３を参照）。
【０１４１】
ノルラパコール
2020533327.tif 000016
ノルラパコールはフッカー酸化（Ｈｏｏｋｅｒ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ）によって合成され、データは文献で報告されたものと一致している（４８〜５０を参照）。５００ｍＬのフラスコに、４．８４ｇのラパコール、次に４０ｍＬのＴＨＦを加えた。別に、５０ｍＬのＨ2Ｏに２．４ｇの無水Ｎａ2ＣＯ3の溶液を調製し、これもフラスコに加えて、暗赤色の溶液を形成した。６０℃加熱下、約６．０ｍＬの３０％Ｈ2Ｏ2を約１時間で１０滴ずつ、溶液全体が変色してピンクがかった色の溶液になるまでゆっくりと加えた。溶液を０℃〜−２℃とした。次に、撹拌しながら、白い沈殿物が現れるまで、濃いＨＣｌを滴下した。混合物を冷蔵庫に２時間放置した後、真空濾過して、白色固形物を収率７０％で得た。この物質を３２ｍＬのＴＨＦに溶解した。次に、５９．２５ｍＬのＨ2Ｏに１．４３ｇのＮａ2ＣＯ3を溶解した溶液を添加した。沈殿物を溶解させるために、溶液を機械的攪拌下に置いた。この溶液に、１９．７５ｍＬの２５％ＮａＯＨを加え、続いて、別の５９．２５ｍｌのＨ2Ｏ中に１１．８５ｇのＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏの溶液を、持続的に攪拌しながら加えた。溶液を１時間４５分水浴したあと、Ｃｅｌｉｔｅ（登録商標）（注入グラウンド）で濾過して、濾過されたワインの色を得た。溶液を濃ＨＣｌで酸性化してオレンジ色の沈殿物を形成し、それを濾過し、完全に中和するまで蒸留Ｈ2Ｏで連続的に洗浄した。ノルラパコールはオレンジ色の固体（１６０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ、収率７０％）として得られた。ｍｐ１２１〜１２２℃37。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、３０３Ｋ）δ：８．１３（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．５、１．５及び０．５Ｈｚ）、８．１０（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．５、１．５及び０．５Ｈｚ）、７．７６（ｔｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．５、７．５及び１．５Ｈｚ）、７．６９（ｔｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．５、７．５及び１．５Ｈｚ）、６．０３−５．９９（ｍ、１Ｈ）、２．０（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝１．５Ｈｚ）、１．６８（ｄ、３Ｈ、Ｊ＝１．２Ｈｚ）。13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、３０３Ｋ）δ：１８４．７、１８１．５、１５１．１、１４３．６、１３４．９、１３３．０、１３２．９、１２９．５、１２６．９、１２６．０、１２０．９、１１３．６、２６．５、２１.7。
【０１４２】
３−アリールアミノ−ノル−β−ラパコン
2020533327.tif 000017
ノルラパコール（２２８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）を２５ｍＬのジクロロメタンに溶解し、２ｍＬの臭素を添加した。ブロモ中間体がオレンジ色の固体としてすぐに沈殿した。ジクロロメタンを加え、溶媒を真空中で蒸発させて臭素を除去した。過剰の必要なアニリン（２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を一晩撹拌した。粗反応混合物を５０ｍＬの水に注いだ。有機相を分離し、１０％ＨＣｌ（３×５０ｍＬ）で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、減圧下で蒸発させて固体を得て、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで精製し、ヘキサンと酢酸エチルの増加極性勾配混合物（９／１から７／３）で溶出した41、42。３−アリールアミノ−ノル−β−ラパコンが赤色固体として得られた（３０３ｍｇ、収率９５％）。ｍｐ１２６〜１２８℃。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、３０３Ｋ）δ：８．００（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．６２（ｄｔ、１Ｈ、Ｊ＝１４．８及び７．４Ｈｚ）、７．５４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１０．５及び４．２Ｈｚ）、７．１０（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、６．６６（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、６．５０（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．９Ｈｚ）、４．７２（ｓ、１Ｈ）、３．８７（ｓｌ、１Ｈ）、１．５９（ｓ、３Ｈ）、１．５０（ｓ、３Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、３０３Ｋ）δ：１８１．１７、１７５．６２、１６９．７７、１４７．５８、１３４．８４、１３２．７４、１３１．４２、１２９．７４、１２９．５６、１２７．６９、１２５．２９、１１８．３５、１１５．４７、１１３．３６、９７．０９、６１．９２、２７．５２、２２．００。データは文献で報告されたものと一致している（４４を参照）。
【０１４３】
ｐ−クロロ−３−アリールアミノ−ノル−β−ラパコン
2020533327.tif 000018
ｐ−クロロ−３−アリールアミノ−ノル−β−ラパコンを上記のように合成し、赤色の固体として得た（３１７ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ、収率９０％）。ｍｐ２１０〜２１４℃）。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3)δ：８．１（ｄｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．９、２．２及び０．７Ｈｚ）、７．７２−７．６０（ｍ、３Ｈ）、７．１３（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝６．７及び２．１Ｈｚ）、６．５（ｄｄ、２Ｈ、Ｊ＝６．７及び２．１Ｈｚ）、４．７５（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝５．７Ｈｚ）、１．６６（ｓ、３Ｈ）、１．５６（ｓ、３Ｈ）；13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ：１８０．８、１７５．３、１６９．６、１４５．８、１３４．６、１３２．６、１３１．１、１２９．５、１２９．１、１２７．２、１２５．０、１２２．６、１１４．６、１１４．１、９６．６、６１．７、２７．３、２１．７。
【０１４４】
３−ヒドロキシ−ノル−β−ラパコン
2020533327.tif 000019
２５ｍＬのジクロロメタン中のノル−ラパコール（２２８ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）の溶液、及び２ｍＬの臭素を準備した。ブロモ中間体はオレンジ色の固体としてすぐに沈殿した。反応混合物を分液漏斗に移し、亜硫酸水素ナトリウム（３×１０ｍＬ）で抽出して、ヒドロキシル化生成物を形成した。生成物はオレンジ色の固体として得られた（１７０ｍｇ、収率７０％）。ｍｐ１１０〜１１２℃。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、３０３Ｋ）δ：７．９６（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．５及び０．７Ｈｚ）、７．５８（ｄｔｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．８、７．５及び１．３Ｈｚ）、７．５１（ｔｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．４及び１．６Ｈｚ）；４．９５（ｓ、１Ｈ）、３．８２（ｓ、１Ｈ）、１．５６（ｓ、３Ｈ）、１．４０（ｓ、３Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、３０３Ｋ）δ：１８１．５、１７６．４、１７１．２、１３４．８、１３２．８、１３１．４、１２９．６、１２７．７、１２５．４、１１７．８、９７．２、７５．３、２６．８、２０．８。データは文献で報告されたものと一致している（４５を参照）。
【０１４５】
３−ヒドロキシ−β−ラパコン
2020533327.tif 000020
ラパコール（１００ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２０ｍＬ）溶液にｍ−クロロ過安息香酸（９０ｍｇ、０．５２ｍｍｏｌ）を加え、混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物を炭酸水素ナトリウムの飽和溶液、水で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、溶媒を蒸発させた。残留物を、溶離液としてクロロホルム／酢酸エチル（２：１）を使用するシリカゲルのカラムクロマトグラフィーにより精製して、生成物を得た。生成物を赤色の固体として得た（５４ｍｇ、収率５０％）。ｍｐ２０２〜２０４℃。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、３０３Ｋ）δ：７．９８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．６及び０．９Ｈｚ）、７．７４（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．８Ｈｚ）、７．６０（ｔｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．７及び１．３Ｈｚ）、７．４６（ｔｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．６及び１．０Ｈｚ）、４．１８（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．３及び５．４Ｈｚ）、３．１４（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１８．１及び５．４Ｈｚ）、２．９１（ｄｄ、１Ｈ、Ｊ＝１８．１及び７．４Ｈｚ）、１．５６（ｓ、３Ｈ）、１．５３（ｓ、３Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3、３０３Ｋ）δ：１７９．３、１７８．２、１６１．３、１３５．２、１３１．９、１３１．４、１３０．３、１２９．１、１２４．５、１１１．３、８１．３、５０．２、２８．２、２６．４、２３．９。データは文献で報告されたものと一致している（４６及び４７を参照）。
【０１４６】
３−（（４−シンナモイルフェニル）アミノ）−２，２−ジメチル−２，３−ジヒドロナフト［１，２−ｂ］フラン−４，５−ジオン
2020533327.tif 000021
必要なカルコンを、エタノール中の水酸化ナトリウムの存在下で、４’−アミノアセトフェノンをそれぞれのアルデヒドと縮合させることによって調製した。次に、過剰の臭素（２ｍＬ）を、２５ｍＬのジクロロメタン中のノルラパコール（２２８ｍｇ、１ｍｍｏｌ）の冷却溶液に加えた。臭素化中間体がオレンジ色の固体として得られた。過剰の臭素を除去した後、それぞれのカルコン（１ｍｍｏｌ）の２５ｍＬジクロロメタンの溶液を加え、一晩撹拌した。反応混合物を減圧下で濃縮し、残留物を、ヘキサンと酢酸エチルの増加極性勾配混合物で溶離することにより、シリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで精製した47。標題の化合物を赤色固体として得た（１５７ｍｇ、０．３５ｍｍｏｌ、収率３５％）。ｍｐ１９６〜１９９℃。1Ｈ  ＮＭＲ（５００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ：７．９８（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．８８（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．４Ｈｚ）、７．６９（ｄｔ、３Ｈ、Ｊ＝１４．８及び１１．６Ｈｚ）、７．５９（ｔ、３Ｈ、Ｊ＝７．４Ｈｚ）、７．４９（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝１５．６Ｈｚ）、７．３９−７．３５（ｍ、３Ｈ）、６．６１（ｄ、２Ｈ、Ｊ＝８．７Ｈｚ）、４．９１（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝７．３Ｈｚ）、１．６９（ｓ、３Ｈ）、１．５７（ｓ、３Ｈ）。13Ｃ−ＡＰＴ  ＮＭＲ（１２５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ：１８７．８、１８０．７、１７５．２、１７０．０、１５１．３、１４２．９、１３５．３、１３４．６、１３２．７、１３１．１、１３１．０、１２９．９、１２９．５、１２８．８、１２８．２、１２８．０、１２７．２、１２５．２、１２１．９、１１４．５、１１２．２、９６．７、６０．８、２７．４、２１．８。
【０１４７】
（２Ｓ、３Ｓ、４Ｒ、５Ｓ、６Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−６−（（１−（２，２−ジメチル−４，５−ジオキソ−２，３，４，５−テトラヒドロナフト［１，２−ｂ］フラン−３−イル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４，５−トリイルトリアセテート
2020533327.tif 000022
８ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2／Ｈ2Ｏ（１：１ｖ／ｖ）中の、３−アジド−ノル−β−ラパコン（２６９ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）とＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（１２．４８ｍｇ、５ｍｏｌ％）及びアスコルビン酸ナトリウム（１９．８１ｍｇ、５ｍｏｌ％）の混合物に、必要なアルキン−炭水化物（１．１当量）を添加した。混合物を室温で一晩攪拌した。有機相をジクロロメタンで抽出し、ＮａＳＯ4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。得られた残渣を、ヘキサンと酢酸エチルの増加極性勾配混合物を溶離液とするシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで精製した。ノル−β−ラパコンベースの１，２，３−トリアゾール−炭水化物は黄色の固体として得られた（５３７ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ、収率８２％）。ｍｐ８８〜９０℃。1Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ：８．２０−８．１７（ｍ、１Ｈ）、７．８２−７．７１（ｍ、３Ｈ）、７．５５／７．５１（ｓ、１Ｈ）、５．９８／５．９７（ｓ、１Ｈ）、５．２５−５．１５（ｍ、１Ｈ）、５．０７（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝１０Ｈｚ）、５．００−４．７８（ｍ、３Ｈ）、４．６７（ｔ、１Ｈ、Ｊ＝７．６Ｈｚ）、４．３０−４．１０（ｍ、２Ｈ）、３．７７−３．７０（ｍ、１Ｈ）、２．０７、２．０１、２．００、１．９８、１．９７、１．７７（６つの一重項分析、１２Ｈ）、１．１９（ｓ、３Ｈ）、０．９８−０．８３（ｍ、３Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ：１８０．０、１８０．０、１７４．６、１７４．５、１７１．３、１７１．２、１７０．７、１７０．６、１７０．１、１７０．１、１６９．６、１６９．５、１６９．４、１４４．４、１４４．２、１３４．８、１３４．８、１３３．４、１３３．４、１３１．６、１３１．５、１３０．０、１３０．０、１２６．６、１２６．６、１２５．６、１２５．５、１２２．６、１２２．３、１１１．１、１００．２、９９．９、９５．９、９５．８、７２．８、７２．６、７１．９、７１．３、７１．２、６８．３、６８．３、６７．０、６６．９、６３．３、６３．０、６１．８、６１．７、３１．５、２９．０、２７．７、２７．６、２２．６、２２．６、２１．１、２０．７、２０．６、２０．５、２０．５、２０．４、１４．１、１１．４。
【０１４８】
（２Ｓ、３Ｓ、４Ｒ、５Ｓ、６Ｓ）−２−（アセトキシメチル）−６−（（１−（（２，２−ジメチル−４，５−ジオキソ−２，３，４，５−テトラヒドロナフト［１、２−ｂ］フラン−３−イル）メチル）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾール−４−イル）メトキシ）テトラヒドロ−２Ｈ−ピラン−３，４，５−トリイルトリアセテート
2020533327.tif 000023
８ｍＬのＣＨ2Ｃｌ2／Ｈ2Ｏ（１：１ｖ／ｖ）中の、２５６ｍｇ（１ｍｍｏｌ）の必要なアジドキノンとＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ（１２．４８ｍｇ、５ｍｏｌ％）及びアスコルビン酸ナトリウム（１９．８１ｍｇ、５ｍｏｌ％）の混合物に、対応するアルキン−炭水化物（１．１当量）を加えた。混合物を室温で一晩攪拌した。有機相をジクロロメタンで抽出し、ＮａＳＯ4で乾燥させ、減圧下で濃縮した。得られた残留物を、溶離剤として、ヘキサンと酢酸エチルの増加極性勾配混合物を溶離液とするシリカゲルでのカラムクロマトグラフィーで精製した48。キノンベースの１，２，３−トリアゾール−炭水化物は黄色の固体（５４４ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ、収率８５％）として得られた。ｍｐ１１７〜１１９℃。１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ：８．０６（ｂｓ、１Ｈ）、７．７６−７．６７（ｍ、２Ｈ）、７．６１−７．５９（ｂｓ、２Ｈ）、５．５３−５．４８（ｍ、１Ｈ）、５．２５−４．７０（ｍ、８Ｈ）、４．２５−４．１５（ｍ、２Ｈ）、３．７７（ｄ、１Ｈ、Ｊ＝４Ｈｚ）、３．３８−３．３２（ｍ、１Ｈ）、２．９８−２．９３（ｍ、１Ｈ）、２．０８（ｓ、３Ｈ）、２．０４（ｓ、３Ｈ）、２．０１（ｓ、３Ｈ）、１．９７（ｓ、３Ｈ）。13Ｃ  ＮＭＲ（１００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）δ：１８０．４、１７８．７、１７５．２、１７３．８、１７０．６、１７０．１、１６９．４、１４４．７、１３４．９、１３２．４、１３０．５、１２９．７、１２６．８、１２４．６、１２３．８、１１４．７、１００．０、８４．５、７２．７、７２．０、７１．２、６８．３、６３．２、６１．８、５３．４、２９．７、２０．７、２０．７、２０．６、２０．６。
【０１４９】
方法
１．データベース分析
ユニバーサルナチュラルプロダクトデータベース（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄａｔａｂａｓｅ）、ＺＩＮＣデータベース（ＺＩＮＣ  ｄａｔａｂａｓｅ）及び中医薬（漢方）データベース（Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ  ｄａｔａｂａｓｅ）から、５１５，５８１個の構造からなる天然物コレクションが収集された。このライブラリは、ＭＯＥ２０１５．１０（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、カナダ）で「洗浄」機能を使用して標準化され、重複が除外されて、４２８，３０８個の特有な天然物が得られた。ＺＩＮＣ１５及びＦＤＡ承認済みの薬物のフラグメントライクのエンティティは、それぞれＺＩＮＣ１５及びＤｒｕｇＢａｎｋｖ５．０から収集され、同じように処理された。キャンバス（Ｃａｎｖａｓ、ＳｃｈｒоｄｉｎｇｅｒＬＬＣ）に実装されているＰＡＩＮＳ及びＲＥＯＳフィルターを使用して、ＺＩＮＣ１５からの３４２，１１４個のフラグメントライクのエンティティ、３６，３６５個のフラグメントライクのＰＡＩＮＳ／ＲＥＯＳフリーの天然物、３７，９４２個のフラグメントライクのＰＡＩＮＳ／ＲＥＯＳ含有天然物を提供した。Ｍｕｒｃｋｏ下地（Ｍｕｒｃｋｏ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ）、Ｍｏｒｇａｎフィンガープリント（Ｍｏｒｇａｎ  ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｓ、半径２、２０４８ビット）、ＲＤＫｉｔ及びＣＡＴＳ記述子は、ＲＤＫｉｔ及びＭＯＥネイティブノードを通じてＫＮＩＭＥで計算された。主成分分析はＫＮＩＭＥで実行された。薬物らしさはＤａｔａＷａｒｒｉｏｒで計算された57。データはＰｙｔｈｏｎ２．７．１０でプロットされた。
【０１５０】
２．ターゲット予測
ターゲットの予測は、以前に報告されている、公に利用可能なＳＰｉＤＥＲ  Ｗｅｂサーバー（チューリッヒ工科大学）で実行された58〜62。要するに、β−ラパコンとラパコールは、ＣＯＢＲＡデータベースの参照化合物とともに自己組織化マップに投影された63。化学構造は、ＣＡＴＳ２64及びＭＯＥ２Ｄ記述子を使用して記述する前に、分子動作環境（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ、ＭＯＥ、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、モントリオール、カナダ）の「ウォッシュ」機能で処理される。予測は、分子のＣＯＢＲＡ内の参照化合物までのユークリッド距離（Ｅｕｃｌｉｄｅａｎ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）を計算することによって実行される。出力には、ｐ＜５％の信頼水準のターゲットファミリーが含まれる。距離は、異なるターゲットに結合するように注釈が付けられた分子間の距離の事前計算されたバックグラウンド分布に従って、ｐ値に変換される。これらのｐ値の算術平均は、ターゲット予測の信頼スコアとして機能する。信頼スコアのバックグラウンド分布により、各予測は、予測の統計的有意性を示す別のｐ値に関連付けることができる58。ＳＥＡ65及びＳｕｐｅｒＰｒｅｄ66予測は、それぞれのＷｅｂサーバーから実行された。
【０１５１】
対象となるターゲットのリガンド及び生物活性データは、ＣｈＥＭＢＬ２２から収集された。リガンドはＭＯＥ２０１５．１０の「ウォッシュ」機能で正規化され、生物親和性データ（Ｋi、ＫD、ＩＣ50又はＥＣ50）はそれぞれ、真数値（ｐＡｆｆｉｎｉｔｙ）に変換された。ＣＡＴＳ２記述子を使用して、個々のターゲットごとに回帰ランダムフォレストモデル（Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｏｒｅｓｔ  ｍｏｄｅｌ）が構築された。各ターゲットについて、５００のモデルがツリーの深さなしで構築され、最小分割ノードサイズは２であった。モデルは、１０分割交差検証を受け、平均誤差が計算された。
【０１５２】
３．バインディングポケット予測
５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）のホモロジーモデルは、Ｓｗｉｓｓ−Ｍｏｄｅｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ）を使用して、ネイティブの酵素配列を変異型ａｐｏ（ＰＤＢ３Ｖ９８67）５−ＬＯ構造に復元することにより構築された。水素原子、電荷、エネルギーの最小化（Ａｍｂｅｒ１０：ＥＨＴ力場）は、ＭＯＥ２０１５．１０（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、モントリオール、カナダ）と結合ポケット予測で実行された。体積が１１０Å3を超えるポケットのみが、さらなるの研究で検討された68。モデルの立体化学的クオリティは、ラマチャンドランプロット（Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ  ｐｌｏｔ）によって評価された。
【０１５３】
４．分子ドッキング
ＧＯＬＤ  ５．４．１で予測される結合ポケットにドッキングする前に、ＭＯＥ２０１５．１０でβ−ラパコンの構造を「ウォッシュ」し、エネルギーを最小化した。ドッキングランは、アポ５−ＬＯモデルで実行された。スコアリング関数ＣｈｅｍＰＬＰを含むデフォルト設定が使用された69。異なるポケットセンターを使用したドッキング実行がいくつか実施され。５００の遺伝的アルゴリズムの実行が実施され、上位１０％のポーズが手動検査のために保存された。
【０１５４】
５．動的光散乱
動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  Ｓ、Ｍａｌｖｅｒｎ、英国）を使用して、化合物のコロイド凝集ポテンシャルと動的溶解度を測定した。粒子サイズは２５℃で測定された。水溶性は他のところで説明されているように測定され、６０分以内に連続して測定された56。β−ラパコンの１００ｍＭストック溶液をＤＭＳＯで調製し、続いて脱イオン水で希釈して、１００μＭ（０．１％ＤＭＳＯ）の検体溶液を得た。コロイド凝集は、逐次希釈により測定された。溶解性は、０及び３０分後に２５μＭで評価された。
【０１５５】
６．固有のトリプトファン蛍光
５−リポキシゲナーゼ（Ｃａｔ  Ｎｏ．ａｂ１１４３１０、Ａｂｃａｍ）をバッファー（５０ｍＭのトリス塩酸、ｐＨ８．０、５ｍＭのＣａＣｌ2）で０．５μＭに濃縮された。β−ラパコンのストック溶液はＤＭＳＯで調製され、０〜１０μＭの濃度範囲で酵素溶液に添加された。最終ＤＭＳＯ濃度は０．１％未満に保たれた。蛍光測定は、１ｃｍの経路長の石英キュベットを使用して行った。スペクトルは、Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＦＬＳ９２０シリーズ蛍光分光光度計により２５℃で収集され、蛍光励起及び走査発光は、それぞれ２９５ｎｍ及び３１０〜４５０ｎｍに設定されていた。すべてのアッセイは三重に行った。
【０１５６】
７．ヒト組換え５−ＬＯの発現、精製及び無細胞活性アッセイ。
Ｅ．ｃｏｌｉ（ＢＬ２１）はｐＴ３−５−ＬＯプラスミドで形質転換され、組換え５−ＬＯタンパク質は、記載されているように34、３０℃で発現された。細胞を５０ｍＭ、ｐＨ８．０のトリエタノールアミン／ＨＣｌ、５ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのフェニルメタンスルホニルフルオリド、大豆トリプシン阻害剤（６０μｇ／ｍＬ）、及びリゾチーム（１ｍｇ／ｍＬ）で溶解し、超音波処理（３×１５秒）でホモジナイズされ、４℃で２０分間４０，０００×ｇで遠心分離された。５−ＬＯを部分的に精製するため、記載されているように70、４０，０００×ｇの上清（Ｓ４０）はＡＴＰアガロースカラムに適用された。半精製５−ＬＯ（０．５μｇ）のアリコートを、１ｍＭのＥＤＴＡを含む１ｍＬの氷冷ＰＢＳで希釈されした。示されるように、サンプルは、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００及び／又は１ｍＭのＤＴＴの有無にかかわらず、試験化合物又はビヒクル（０．１％のＤＭＳＯ）とプレインキュベートされた。４℃で１０分後、サンプルを３７℃で３０秒間予熱し、２ｍＭのＣａＣｌ2と指定濃度のアラキドン酸（ＡＡ）が加えられ、５−ＬＯ生成物の形成が開始された。１０分後、氷冷メタノール１容量を加えることで反応を停止させ、形成された５−ＬＯ生成物は、記載されているように71、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析された。５−ＬＯ生成物には、ＬＴＢ4のオールトランス異性体（ｔｒ−ＬＴＢ4異性体）と５（Ｓ）−ヒドロペルオキシ−６−トランス−８，１１，１４−シス−エイコサテトラエン酸（５−ＨＰＥＴＥ）及びそれに対応するアルコール５（Ｓ）−ヒドロキシ−６−トランス−８，１１，１４−シス−エイコサテトラエン酸（５−ＨＥＴＥ）が含まれる。ホスファチジルコリン競合アッセイ（３又は３０μｇ／ｍｌ  ＰＣ）のため、サンプルは氷上でβ−ラパコンと共に１ｍＭのＤＤＴ又はビヒクル（０．１％のＤＭＳＯ）あり又はなしで１０分間プレインキュベートされた。２ｍＭのＣａＣｌ2と２０μＭのＡＡを添加した後、インキュベートは３７℃で１０分間を続けられ、その後、メタノールで停止された。
【０１５７】
８．好中球の分離
末梢血（イェーナ大学病院、ドイツ）は、過去１０日間抗炎症薬を服用していなかったと承諾した健康な成人ボランティアから、ヘパリン処理したチューブに静脈穿刺することにより（１６ＩＥヘパリン／ｍＬ血液）採血された。白血球濃縮液を調製するために、血液は２０℃で２０分間４０００ｇで遠心分離された。次に、白血球濃縮物は、デキストラン沈降及びリンパ球分離培地（ＬＳＭ１０７７、ＰＡＡ、ケルベ、ドイツ）での遠心分離に供された。ペレット化した好中球の混入赤血球は低張溶解により除去された。次に好中球は氷冷ＰＢＳで２回洗浄され、最後に１ｍｇ／ｍＬグルコースを含むｐＨ７．４のＰＢＳ、又は１ｍｇ／ｍＬグルコースと１ｍＭＣａＣｌ2を含むｐＨ７．４のＰＢＳ（ＰＧＣバッファー）に再懸濁された（純度＞９６〜９７％）。
【０１５８】
方法Ａ：５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）、１２−リポキシゲナーゼ（１２−ＬＯ）及び１５−リポキシゲナーゼ−２（１５−ＬＯ−２）阻害アッセイは、出来高払い方式で、表１に示すように、Ｃｅｒｅｐ、ＳＡ（Ｃｅｌｌｅ  ｌ’Ｅｖｅｓｃａｕｌｔ、フランス）で実施された（それぞれ、Ｒｅｆ  ０７７２36、０８８３37、及び０８９３38）。
【０１５９】
【表１】
2020533327.tif 000024
【０１６０】
方法Ｂ：インタクトの好中球での５−ＬＯ産物を測定するために、細胞（５×１０6）は１ｍＬのＰＧＣバッファーに再懸濁され、β−ラパコン又はビヒクル（０．１％のＤＭＳＯ）とともに３７°Ｃで１５分間プレインキュベートされ、２．５μＭのＣａ2+−イオノフォアＡ２３１８７と２０μＭのＡＡとともに、３７°Ｃで１０分間インキュベートされた。氷上で１ｍＬのメタノール、３０μＬ、１ＮのＨＣＬ、５００μＬのＰＢＳ、及び２００ｎｇのプロスタグランジンＢ1を加えて反応が停止され、サンプルはＣ１８カラム（１００ｍｇ、ＵＣＴ、ブリストル、ペンシルベニア州、米国）での固相抽出に供された。５−ＬＯ生成物（ＬＴＢ4、ｔｒ−ＬＴＢ4異性体、及び５−ＨＥＴＥ）は、ＲＰ−ＨＰＬＣで分析され、内部標準ＰＧＢ１に基づいて量が計算された。システイニル−ＬＴのＣ4、Ｄ4、及びＥ4は検出されず（量は検出限界未満だった）、ＬＴＢ4の酸化生成物は測定されなかった。
【０１６１】
対応するホモジネートにおける５−ＬＯ生成物の分析のために、好中球は１ｍＭのＥＤＴＡを含むＰＢＳに４℃で５分間再懸濁され、超音波処理（４×１０秒、４℃）された。５×１０6細胞／ｍＬに対応するホモジネートは、３７℃で３０秒間予熱の上、１ｍＭのＤＴＴあり又はなしに、４℃で１５分間、試験化合物又はビヒクル（０．１％のＤＭＳＯ）とともにインキュベートされた。反応は、２ｍＭのＣａＣｌ2と指示された濃度のＡＡ（通常２０μＭ）の添加により開始された。反応は１０分後に停止され、サンプルは上記のインタクトの細胞について記載されたように分析された。
【０１６２】
データは平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表される。ＩＣ50値は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（サンディエゴ、カリフォルニア州）のワンサイト結合競合を使用した非線形回帰によって、化合物の６つの異なる濃度での平均測定値から計算された。データの統計的評価は、一元配置分散分析（ｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ）によって実行され、その後、複数の比較のためのＴｕｋｅｙ−Ｋｒａｍｅｒ事後検定がそれぞれ実行された。ｐ値＜０．０５（＊）は有意であると見なされた。
【０１６３】
９．ホスホジエステラーゼ５アッセイ
ホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）アッセイは、出来高払い方式で、表２に示すようにＣｅｒｅｐ、ＳＡ（Ｃｅｌｌｅ  ｌ’Ｅｖｅｓｃａｕｌｔ、フランス）で実施された（Ｒｅｆ  ０２０４39）。
【０１６４】
【表２】
2020533327.tif 000025
【０１６５】
１０．最小発育阻止濃度（Ｍｉｎｉｍｕｍ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＭＩＣ）アッセイ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｋ１２及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ  ２５９２３を３７℃で一晩培養し、２．５ｍＬのＬｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ培地（ＬＢ）を含む２４ウェルプレートに再播種して、６００ｎｍで約０．０１までの光学密度が得られた。β−ラパコン、及びラパコールの原液をＤＭＳＯで調製し（最終濃度１％）、細胞懸濁液に加えて、５〜２１０μＭの最終濃度が得られた。成長コントロール（１％のＤＭＳＯを含む細胞懸濁液）と無菌培地コントロールを含むウェルも準備された。プレートは３７℃及び９０ｒｐｍで１８時間インキュベートされた。目に見える成長の兆候を示さなかったシリーズの最初のウェルの化合物の濃度は、ＭＩＣとして報告された。培養物のＯＤ６００も測定された。すべてのＭＩＣウェルはリン酸緩衝生理食塩水（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓａｌｉｎｅ、ＰＢＳ）で逐次に希釈され、ＬＢ寒天プレートに播種された。最小殺菌濃度（ｍｉｎｉｍｕｍ  ｂａｃｔｅｒｉｃｉｄａｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ、ＭＢＣ）を入手するために、３７℃で２４時間のインキュベートの後の成長が評価された。
【０１６６】
１１．癌細胞アッセイ
ＨＬ−６０細胞は、１０％のＦＢＳ、１％のＰｅｎ−ｓｔｒｅｐ、及び１％ＨＥＰＥＳを５×１０5細胞／ｍＬで補充したＲＰＭＩ培地で通常培養された。５−ＬＯの過剰発現は、最初に少なくとも２〜３継代で１％のＦＢＳを含む培地で細胞を飢餓状態にし、その後１．５％のＤＭＳＯでさらに３〜４日間細胞を増殖させることにより刺激される55。５−ＬＯの細胞内染色のために、１０6個の細胞が収集され、５０ｍＬのＰＢＳに濃縮された。ボルテックスしながら、細胞は１００ｍＬのＢＤ固定バッファーで固定された。細胞はＰＢＳで完全に洗浄され、Ｐｅｒｍ  Ｂｕｆｆｅｒで透過処理された後、一次抗５−ＬＯ抗体（ＡＢ３７６、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）と１時間インキュベートされた。必要なインキュベート時間の後、細胞は洗浄され、ヤギ抗ウサギＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８抗体とさらに１時間インキュベートされた。次に、細胞は洗浄されＰＢＳに再懸濁され、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）フローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）により、４８８ｎｍレーザー、５０５ｎｍロングパスフィルター、及び５３０／３０ｎｍバンドパスフィルター（ＦＩＴＣ検出用）を使用して取得された。データはＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析された。
【０１６７】
ＤＭＳＯ刺激あり又はなしのＨＬ−６０細胞は、９６ウェルプレート形式で５×１０5細胞／ｍＬの濃度で播種された。細胞は様々な濃度のβ−ラパコンで４８時間処理された。細胞死は、標準のアラマーブルーアッセイ（Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅ  ａｓｓａｙ）で分析された。データは、ビヒクルコントロールに正規化されて表示される。
【０１６８】
結果
我々は、１（β−ラパコン）の多薬理学的プロフィールを明確にし、高分子ターゲット認識の根底にある分子基盤を調査することに着手した。興味深いことに、Ｃｌｅｍｏｎｓら10によってアッセイされた化学物質の構造分析は、ＮＰの３０％のみが残液（ＲＥＯＳ）13による快速除去及びＰＡＩＮＳフィルターを通過することを示す一方、より乱雑になりやすい合成分子の５３％は、ＲＥＯＳとＰＡＩＮＳの両方につきサブストラクチャーフリーである。さらに、部分構造及びトポロジーのファーマコフォアレベルから、ＲＥＯＳ／ＰＡＩＮＳに準拠する化学物質と違背する化学物質の間に化学空間が重複していることが分かった（図１ａ）。一方、ＦＤＡ承認済み薬物の薬物らしさ、ＺＩＮＣ１５及びＲＥＯＳ／ＰＡＩＮＳヒットフラグメントライクＮＰの「クリーン」フラグメント（１を含む）は非常に分散しており、スクリーニングキャンペーンで小分子に優先順位を付けるための指標としては不十分であることを示唆している（図１ｂ）。したがって、我々のデータは、一般的なアプローチとして、ライブラリのスクリーニングから構造的に「悪い」化合物を除外することを合理化できないことを示している。注意すべきこととして、これらのフィルターに完全に準拠ＦＤＡ承認済み薬物は約５０％にすぎないと計算されており、ケミカルエンティティをスクリーニングキャンペーンから事前に除外するのではなく、適切なヒット検証を行うことが、機会を逃さないために特定のケースでより適切な場合があることを示唆している。
【０１６９】
そのことを念頭に置いて、物理化学的及びトポロジー的なファーマコフォア機能のコンセンサスに基づいて、１の潜在的な高分子対応物を高信頼性で予測するために、我々はリガンドベースの機械学習アルゴリズム14、15を使用した。サブストラクチャーフィンガープリントを使用する他のツール16、17とは対照的に、さまざまなファミリをカバーする一連のターゲットがＳＰｉＤＥＲウェブサーバーで予測され、１の薬理学的及び毒性学的プロフィールの両方を仲介する複数のターゲットの係合をサポートした。重要なのは、１の既知のターゲット（例えば、ＤＮＡトポイソメラーゼ、18シクロオキシゲナーゼ19）が過去にさかのぼって予測され、我々のアプローチの適切さを表している。アルゴリズムの観点から見ると、使用される記述子の配列が原因で、この場合は競合ツールのパフォーマンスが低下する可能性がある。実際、１は、ターゲット係合の事実に関する知識がなくても、表現型アッセイのリードアウトに注釈が付けられた構造と最も一致する下地を提示し、競合するツールによる信頼できる予測の欠如をさらに裏付けている。
【０１７０】
信頼できる予測をもとに、我々は２２８のキナーゼ、５−ＬＯを優先し、追加の分析ではＧタンパク質共役受容体（Ｇ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｕｐｌｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＧＰＣＲ）と一過性受容体電位チャネルを選択した。これらが１の異性体であるラパコールについても高信頼性で予測され、下流のアッセイに容易にアクセスできるためである。我々は追加の予測信頼性を求めるため、自己組織化マップへの直交学習アプローチとして回帰ランダムフォレストテクノロジーを使用するＤｒｕｇ−Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  Ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ（ＤＥｃＲｙＰＴ）マシンインテリジェンスワークフローを構築した。そうすることで、我々はＳＰｉＤＥＲからの信頼予測のキュレーションを目指し、２３６個の事前に選択されたターゲットに対して１のアフィニティ値を推定した。ＤＥｃＲｙＰＴは、手動及び自動でキュレートされたＣｈＥＭＢＬ２２データを使用して構築され、モデルの組み立てに関連する生物活性情報のみを含めた。生物活性の注釈は、親和性データを−ｌｏｇ10値（ｐＡｆｆｉｎｉｔｙ）に変換することによって正規化された。次に、ＣＡＴＳ２トポロジカルファーマコフォア記述子は各参照リガンドについて計算された（ＭＯＥ、ＣＣＧカナダ実装）51。要するに、ＣＡＴＳ２は、分子内のファーマコフォア機能（正／負電荷、親油性、芳香族、水素結合ドナー／アクセプター）と組み合わせて、トポロジー距離が１０結合まで自己相関する。分子記述子の「あいまいさ」を考えると、結果として得られる高次元ベクトルを使用して、明らかなリガンド構造の類似性がない場合に機械知能を活用することができる。これは、デノボ（ｄｅ  ｎｏｖｏ）で設計された化合物52とＮＰ3の両方に間違いなく理想的である。構築されたモデルは、品質を評価するために層別化された１０分割交差検証を受けた。０．５３３±０．１０３ログ単位の平均絶対誤差は、計算モデルの一般的な有用性を示唆している。さらに、モデルは１のさまざまな活性をサポートし、ＳＰｉＤＥＲなどのクラスタリングアルゴリズムに補足情報を提供し、さらにスクリーニングの優先順位付けを可能にする。
【０１７１】
我々は、４つのキナーゼ、４つのＧタンパク質共役受容体（Ｐｒｏｓｔａｎｏｉｄ  ＥＰ1〜4）、２つの一過性受容体電位チャネル（ＴＲＰＶ１及びＴＲＰＭ８）、及び１つの酵素（５−ｌｉｐｏｘｙｇｅｎａｓｅ、５−ＬＯ）を含む、異なるファミリのターゲットに対して、機能アッセイを使用して、１スクリーニングした。これらのターゲットはすべて、１の異性体であるラパコール（２）についても高信頼性で予測されており、アッセイのアクセスが可能であるため、我々はこれらのターゲットを優先した。１５０μＭの濃度で、すなわち５０％効果が約０．３０のリガンド効率（ＬＥ）に相当する濃度で、１がキナーゼアッセイテクノロジーに干渉し、弱いＴＲＰチャネル効果のみを示すことを発見した。ＥＰ受容体の活性化は、サブタイプＥＰ4の場合にのみ関連していた（１によって５３％の活性化）。一方、１と２の両方は、ＥＰ2（１で６０％の効果）、ＥＰ3（１と２でそれぞれ９５％と５０％の効果）及びＥＰ4（２で５６％の効果）に対してアンタゴニスト作用を示した。ＴＲＰＶ８チャネルは２（９１％の効果）によってのみ拮抗されたのに対し、ＴＲＰＶ１チャネルは１と２（それぞれ６３％と６５％の効果）によって等しく拮抗された。喜ばしいことに、両方の化合物は、アッセイされた濃度で５−ＬＯを強力に阻害した（１と２でそれぞれ９６％と８７％）。観測された、無関係なターゲットに対する活性の範囲は、特定のターゲット認識を示唆しており、これは、いくつかの場合に２つの異性体のターゲットエンゲージメントプロフィールを分岐させることによっても表されている。
【０１７２】
予備的なスクリーニングデータに動機付けられて、我々は８５％を超える活性調節（すなわち、１の場合はＥＰ3／５−ＬＯ、２の場合はＴＲＰＭ８／５−ＬＯ）を示したターゲットに対する濃度反応曲線を取得するよう努めた。これらの化合物は、アッセイされたターゲットに対する濃度依存効果と良好なリガンド効率（ＬＥ＞０．３０）を示し、これらの下地にインスパイアされたより強力なエンティティが医薬品化学の最適化により得られることを裏付けている。これらのうち、１は無細胞アッセイ及び還元条件で５−ＬＯを強力に阻害した（ＩＣ50＝２．１μＭ±０．２３ログ単位；ＬＥ＝０．４４；図３ａ）。直交５−ＬＯ機能アッセイが得られたデータを確証した。より控えめではあるが、１はＤＥｃＲｙＰＴによって予測されたものと同一の効力でＥＰ3を阻害した。したがって、我々のデータは、ターゲット親和性の予測のための新しい方法の正確さと一般的な有用性を示している。直交技術として円二色性を使用して、１から５−ＬＯへの結合を確認し、異なるリガンド濃度でのタンパク質融解曲線を判定した。５．７μＭのＫD値が１に対して測定された。重要なことに、人工的な５−ＬＯ阻害につながる可能性のあるコロイド凝集は、関連する濃度での動的光散乱によって測定されなかった。
【０１７３】
１による５−ＬＯ阻害の分子基盤を理解するために、ジチオトレイトールの非存在下で無細胞機能アッセイを実施したところ、３０μＭの濃度まで無視できる５−ＬＯ調節が生じた（図２ａ）。学習アルゴリズムの観点から見ると、創薬ターゲット予測がオルトキノン１で実行されたため、結果は不可解である。しかし、ＣｈＥＭＢＬ２２に含まれ、トレーニングデータセットとして使用されたキノン／オルトキノン５−ＬＯ阻害剤の割合について、活性種の注釈が不適切である可能性があり、これは予測結果を説明できる。０．０１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００の存在又は不存在も、無細胞５−ＬＯ阻害アッセイで同一の濃度反応曲線を導き（図２ｂ）、これも１による非特異的干渉を除外する。次に、Ａ２３１８７と外因性アラキドン酸で刺激したインタクトなヒト好中球の５−ＬＯ阻害を分析し、ロイコトリエン生合成阻害剤としての１の効率を評価した19。β−ラパコンは５−ＬＯ生成物の形成を抑制し、ＩＣ50値は８．６μＭ±０．１０ログ単位であった。好中球での５−ＬＯ生成物の阻害における１の効力の低下は、化合物の細胞への取り込みの妨害又は内因性因子との競合が原因である可能性がある。それでも、好中球に１ｍＭのジチオトレイトールを補充すると、１は５−ＬＯを阻害し、ＩＣ50値は０．４２μＭ±０．１０ログ単位であり、これは無細胞アッセイのデータと一致している。したがって、ネイティブの好中球環境で１は完全には還元され可能性がある。さらに、１は１ｍＭのジチオトレイトールを含む好中球ホモジネートで５−ＬＯを強力に阻害し、ＩＣ50値は８５．５ｎＭ±０．１３ログ単位であった（図２ｃ）。これは無細胞５−ＬＯアッセイと一致している。したがって、我々のデータは、ヒドロキノン１が５−ＬＯに対する活性種であることを示すだけでなく、好中球内でのヒドロキノン形成が不十分であることも裏付ける。しかしながら、抗癌活性の観点から、癌細胞内の、例えばグルタチオン又はＮＱＯ１を介する明白な還元環境及び微小環境は、５−ＬＯ過剰発現の細胞による１による表現型調節の理想的な設定を提示し得る。
【０１７４】
金属酵素の選択性を調べるために、我々は２つの異なる方法を使用して、１２−ＬＯ及び１５−ＬＯ−２に対して１をスクリーニングした。両方のケースで弱い阻害（ＩＣ50＞３０μＭ）が得られ、５−ＬＯに対する１の選択性を強調している（図３）。溶媒に曝露されたＺｎ2+を含むホスホジエステラーゼ５（ＰＤＥ５）に対するスクリーニングでも不活性を示し、１は一般的な金属キレート剤ではないことを示唆している。全体として、１が真の５−ＬＯ阻害剤であるという強力な証拠を提示する。特に、１の下地は、ターゲットエンゲージメントのファーマコフォア機能を維持しているにもかかわらず、５−ＬＯリガンド間では利用されない。したがって、他のオルソキノン５−ＬＯ阻害剤が存在するにもかかわらず、一般的に使用されるフィンガープリントを使用した類似性検索では、１と５−ＬＯの関係を特定できない可能性がある。つまり、リガンドとターゲットの関連付けは明らかではない。特定の５−ＬＯ認識をさらに調査するために、我々はラセミβ−ラパコンにインスパイアされたエンティティのフォーカストライブラリーを合成することでヒットを拡大した。無細胞５−ＬＯアッセイでさまざまな阻害効力が得られ、生物活性と、１と５−ＬＯの特定の有向相互作用に対する、置換パターンの重要性が裏付けられた（図４）。
【０１７５】
次に、５−ＬＯの活動が１のウォッシュアウトで回復できることと、アラキドン酸濃度の変動（２．５〜４０μＭ）が１の効力のわずかな変化のみにつながることを確認した。まとめると、我々のデータは、抗癌活性を媒介するための潜在的な手段として、ヒドロキノン１による５−ＬＯの可逆的かつアロステリックな調節を強く表している39。この結果は、関連する（１２−／１５−ＬＯ）及び無関係な（ＰＤＥ５）金属含有ターゲットの調節がないことに合致するだけでなく、ＩＤＯ１のＦｅ3+センターのキレート化を示唆するレポートとも対照的である53。我々の結果は、５−ＬＯを調節するために、β−ラパコンがそのヒドロキノン型に（例えば、癌細胞ではＮＱＯ１を介して）還元される必要があることも示している（図１０）。
【０１７６】
我々の以前のデータと一致して、１は既知の化学物質と構造的に無関係であるため（最近傍：ＣＨＥＭＢＬ２７５１２０39、Ｔａｎｉｍｏｔｏインデックス＝０．２３；すべての５−ＬＯリガンド：平均Ｔａｎｉｍｏｔｏインデックス＝０．１１±０．０３；モーガンフィンガープリント、半径２、２０４８ビット）、５−ＬＯ阻害剤空間を拡張するが、ターゲットエンゲージメントに必要なファーマコフォア機能を保持している。
【０１７７】
特定の５−ＬＯ認識を調査するために、我々はラセミβ−ラパコンにインスパイアされたナフトキノンのフォーカストライブラリーを合成することでヒットを拡大した（図４ａ）。化合物は以前に報告されたように調製された21〜23。一般に、適切な出発物質の現場での臭素化により、重要な中間体が得られ、必要な求核種で機能化された。さまざまな機能阻害効力が得られ（図４ｂ）、５−ＬＯを備えたこれらの小分子による特定の指向性相互作用を裏付ける。例えば、５−ＬＯの阻害は、リングの収縮／拡張に敏感であるように見え、レドックス中心の存在のみに依存するわけではない。さらに、同族の１２−ＬＯ及び１５−ＬＯ−２の対応物に対して濃度５μＭの１でスクリーニングした結果、弱い阻害から無阻害、すなわちそれぞれ３８％及び１３％の結果を得た。さらに、Ｚｎ2+含有ホスホジエステラーゼ５に対して１をスクリーニングすると、２μＭで不活性であることが明らかになり、１は溶媒アクセス可能な金属依存性触媒中心を持つタンパク質系の一般的な金属キレート剤ではないことが示唆された24。
【０１７８】
カウンタースクリーンとして、活性酸素種を生成する化学物質によって引き起こされる酸化ストレスに対する感受性を考慮して、グラム陰性（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）とグラム陽性（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、黄色ブドウ球菌）のバクテリアに対して１をテストした25〜28。黄色ブドウ球菌に対して６０μＭの最小発育阻止濃度と、両方の細菌に対して２００μＭを超える最小殺菌濃度が得られた。したがって、我々のデータは、１による一般的なターゲット調節がないことを裏付ける。
【０１７９】
１から５−ＬＯの推定結合モードの考察を得るために、我々は野生型５−ＬＯのホモロジーモデルを作成した（図５ａ、ｂ）。アラキドン酸の結合時の高い５−ＬＯ柔軟性の観察に基づいて、テンプレートとしてリガンド及びアポ変異５−ＬＯ構造の両方を使用した。次に、ポケットの小さい体積のごく一部のみがリガンドを収容することを考慮して、ＭＯＥ  ２０１６．１０（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ、カナダ）を使用して、すべての５−ＬＯモデルの体積が１１０Å３を超える結合ポケットを予測した29（図５ｃ）。
【０１８０】
次に、シード構造として１を使用して、ＤＵＤ−Ｅ30で５０のデコイ（ｄｅｃｏｙ）を生成した。これらについて、構造的に１とは無関係で既知の５−ＬＯ阻害剤とは薬理学的に異なる化合物は結合の可能性が低いと仮定して、ＳＰｉＤＥＲでさらに処理した。
【０１８１】
合計２１の小分子が両方の基準を満たし、５−ＬＯ阻害剤間の構造の多様性と、デコイの選択に純粋に化学構造ベースの記述子を使用することの潜在的な制限を表している。デコイと１はその後、すべての予測されたポケットにＧＯＬＤ31とドッキングされ、ドッキングポーズの視覚的検査とともに、ポケットの優先順位付けのために濃縮係数が計算された（図５ｄ〜ｅ）。結果のモデルは、ヒドロキノン１が水素結合を介してＤ１７０、Ｒ４０１、Ｅ６２２に結合し、Ｃ２ライクの触媒ドメインの界面でＱ１２とのアミド−πスタッキングを行うことを示唆している。Ｃ２と触媒ドメインの相互作用の妨害は５−ＬＯ活性を高めることが知られており54、これはヒドロキノンによって打ち消される。
【０１８２】
我々の分子ドッキングシミュレーションは、１は、鉄の中心又はその付近のドックと相互作用する可能性が低いことを示す。これは、酵素データによって完全に裏付けられている。したがって、１は、Ｗ１３との相互作用を介して、Ｃ２ライクのドメインと触媒ドメインの間の一時的なアロステリックサイトに位置すると予測される。Ｈａｎｋｅら29は以前、同じループ（リン脂質を収容し、５−ＬＯの機能とダイナミクスにとって重要であると知られている領域32、33）でのピリニクス酸誘導体の結合を仮定していた。５−ＬＯ、１２−ＬＯ、１５−ＬＯ−２配列のアラインメントは、予測された結合ポケット領域における実質的な非類似性を示す。具体的には、後者の２つのにはＷ１３がないため、これらに対する１の弱い影響を説明できる。１−５−ＬＯ複合体の分子動力学シミュレーションは、観察された阻害活性と一致して、相互作用の適度な安定性を示した。この結果は、構造モデルでサンプリングされていない一時的な結合部位を除外できないことも示している。
【０１８３】
β−ラパコン自体がこれまで未知の創薬ターゲットを調節する可能性がある一方で、酸化還元サイクルで生成された活性酸素種も表現型の影響の原因となる。確かに、β−ラパコンはホスファチジルコリンと競合的に５−ＬＯと結合し、ホスファチジルコリンは、５−ＬＯの触媒活性を高めることが知られている。予測される結合ポーズは、トリプトファン残基との相互作用がないことを示す。トリプトファン残基は特定の実験条件下で蛍光を表示するため、我々はリプトファン蛍光を監視することにより、結合モデルを試した。そこで、青いシフトは結合相互作用を示す。精製されたヒト５−ＬＯを使用して１ｍＭのジチオトレイトールを添加し、β−ラパコンの対応するヒドロキノンへの還元を確実にしたうえ、１の濃度を増加させると、トリプトファンの蛍光に青いシフトが観察された。これは、ＮＰの結合時にトリプトファン残基が徐々に埋没することを示す。注意すべきこととして、１はモニターされた波長で自己蛍光を示さず、アーチファクトのリードアウトを除外している。結合モデルをさらに検査すると、残りの１４個のトリプトファン残基は、結合できない浅い表面に位置し、Ｗ１３が１の潜在的な結合相手であることを裏付ける。
【０１８４】
我々は次に、１と、予測された溝に結合するホスファチジルコリンの間の競合アッセイを実行した。ホスファチジルコリンの濃度を上げると、５−ＬＯ生成物の形成が促進され、ヒドロキノン１の５−ＬＯブロッキング効率が著しく低下することが分かり（図６）、競合的結合の証拠が得られた。さらに、５−ＬＯ、１２−ＬＯ及び１５−ＬＯ−２配列のアラインメントは、予測された結合ポケット領域に非類似性を示した。これは、後者の２つに対する１の弱い影響を説明できる。全体として、イン・シリコ（ｉｎ  ｓｉｌｉｃｏ）モデルと生化学データの間の完璧な合致は、Ｃ２触媒ドメイン界面における、これまで未知のアロステリック認識メカニズムを通じて、ヒドロキノン１と５−ＬＯの間の直接的な相互作用があることを示唆している。
【０１８５】
１の抗癌活性におけるアロステリック結合と５−ＬＯ阻害の重要性を確認するために、ＨＬ−６０細胞株を用いて細胞生存率アッセイを実施した。この白血病細胞株は、分化した場合を除いて５−ＬＯを過剰発現しない56、57（図７及び１２）。両方のグループを１で処理すると、５−ＬＯを過剰発現する細胞はコントロールよりも感受性が高く（図７中央のパネル、図１１）、それぞれ０．１８μＭ及び０．３９μＭのＩＣ50値を示した。確かに、結果は統計的に有意であり（図７右パネル）、イン・ビトロでは５−ＬＯは１の抗癌ターゲットであることを裏付けている（図１０）。その結果は、最終的に、癌細胞における強力な還元環境が５−ＬＯ調整のためのヒドロキノン１を効率的に生成するという我々の仮説を肯定する。
【０１８６】
化合物１は、既にヒト癌細胞株のＮＣＩ−６０パネルに対する抗癌活性について評価されている34。分析のために、我々はｚ変換されたｐＧＩ50値を取得した。これにより、高いｚ値は１に対する高い細胞株感度に対応する。化合物１は、ＡＭＬ細胞株ＨＬ−６０を含み（ｐＧＩ50  ｚスコア＝２．３８、ＧＩ50＝６２．４ｎＭ）、血液及び皮膚癌の生存率を強く調節した（図９ａ）。
【０１８７】
ＮＣＩ−６０パネルはｍＲＮＡ発現35と薬物感受性についてプロフィールされているため、我々は両方のデータを相関させて、１の抗癌活性のメカニズムに対する理解を活用した。我々のデータは、既に予測された複数のターゲットの係合と完全に裏付けている。発現とＧＩ50相関に従って遺伝子をランク付けし、その後遺伝子セット濃縮分析を適用することにより36、我々は抗癌活性と薬剤耐性の両方を媒介する経路を特定することができた。
【０１８８】
１による５−ＬＯの係合に動機付けられて、我々はこのリガンドとターゲットのペアを癌の環境で活かす方法を調査した。５−ＬＯとＮＱＯ１の両方が血液癌細胞株及びＡＭＬで発現していることを確認した。したがって、我々のデータは、１の抗癌活性に関する、これまで利用されていない、補完的なメカニズムを示す。
【０１８９】
我々は癌の活動と５−ＬＯ発現との相関を調べた。実際、強い正の相関（ピアソン相関係数＝０．８５、ｐ＝０．０３、図８ｃ）が得られ、白血病細胞株ＨＬ−６０が最も感度が高く、そこで５−ＬＯが最も多く発現していることが分かった。興味深いことに、白血病細胞株（ＣＣＲＦ−ＣＥＭ、ＨＬ−６０、Ｋ−５６２及びＭＯＬＴ−４）のみ再分析すると、さらに高い相関が得られた（ピアソン相関係数＝１、ｐ＝０．００２、図８ｄ）。最も重要なのは、ログランクテスト（ｌｏｇ−ｒａｎｋ  ｔｅｓｔ）を使用した生存率分析により、２つの独立したＡＭＬコホートにおける５−ＬＯの予後値が明らかになった37。すなわち、高い５−ＬＯ発現が患者の低下生存率と相関する（ｐ＝０．０９２及び０．０４７、図８ｅ）。さらに、我々は慢性リンパ性白血病サンプル38について同様の相関関係を発見した（ｐ＝０．００２）。まとめると、我々のデータは白血病環境における５−ＬＯ調節の臨床的重要性を明らかにし、それが１の生物活性の高分子ターゲットであることを確認した。
【０１９０】
次に、我々はイン・シリコの調査結果とモデルを実験的に活用することに着手した。我々のところでは、化合物１はＨＬ−６０に対して２．７μＭ±０．０４ログ単位のＩＣ50値を示した（９５％信頼区間＝２．２〜３．２μＭ；図９ａ）。ＨＬ−６０について、５−ＬＯとＮＱＯ１の両方の発現が確認された（図９ｂ）。さらに、５−ＬＯ代謝産物である５−ＨＥＴＥラクトンを使用したＨＬ−６０細胞での１による５−ＬＯ阻害のレスキューは、生存率の向上の傾向を示した。これは、１μＭの活性酸素種（ＲＯＳ）クエンチャーＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ、図９ｃ）の添加時に有意であった。ＮＡＣは、ＮＱＯ１による１の生体活性化に起因するＲＯＳを打ち消すが、選択的５−ＬＯ阻害剤は、初期アポトーシスイベントを媒介するＲＯＳの形成にもつながることが現在確立されている39。したがって、我々のデータは、両方の作用メカニズムがＡＭＬ環境に関連していることを示す。
【０１９１】
イン・ビボでの１の抗ＡＭＬ有効性を評価するために、我々は標準のＡＭＬ治療では難治であるＨＥＬ細胞（ＩＣ50（１）＝０．９μＭ±０．０２ログ単位；９５％信頼区間＝０．８〜１．０μＭ、図９ａ）を、照射されたＮＳＧマウスの右脛骨に注入し、血液中の腫瘍誘発したうえ治療を開始した（図９ｄ）。５０ｍｇ／ｋｇで１を腹腔内投与すると、このモデルの全生存期間が有意に増加したことが分かった（図９ｅ）。統計的に有意ではないが、治療ラウンドの中間の９日目の血液中の腫瘍負荷の評価は、１での治療の方が負荷が低い傾向を示した（図９ｆ）。実際、１で治療され最長に生存し、検出可能な症状がなく３０日目に殺処分されたマウスは、分析されたすべての臓器（肝臓、脾臓、及び肺）において非処理のコントロールマウスのいずれと比較しても低い腫瘍負荷を示した（図９ｇ）。高用量（１００ｍｇ／ｋｇから開始）での１による治療の有効性をテストするためのその後の取り組みは、腹腔内又は静脈内注射時の毒性によって断念された。それにもかかわらず、これらの結果は、１のイン・ビボでの腫瘍特異的な、ひいてはより安全な送達戦略に関する、将来開発のための重要な実証実験を構成する。
【０１９２】
抗癌活性を有するＮＰは伝統的に、人生を変えるような治療法の開発のための優れた出発点として役立ってきた。ただし、基礎となる作用機序と多薬理学ネットワークはほとんど分かっていないため、薬物リードとしての可能性を開拓することは、困難で大変な作業である。そのために、リガンドベースの機械学習ツールは、スクリーニングキャンペーンを優先付けるための、迅速で費用効果の高いソリューションを提供する。ナフトキノン１は、臨床試験で積極的に探究されており、創薬候補として大きな注目を集めている。イン・シリコのデータマイニングプラットフォームを使用して、我々は５−ＬＯのアロステリック調節と１の抗癌活性との前例のない関連を明らかにした。重要なことに、１は、現在の標準治療の化学療法では難治である播種性疾患のイン・ビボモデルで有意な効果を示した。重要なことに、５−ＬＯはＡＭＬ及びＣＬＬの予後の標識として使用できる。
【０１９３】
参考文献
(1) Harvey, A. L.; Edrada-Ebel, R.; Quinn, R. J. The re-emergence of natural products for drug discovery in the genomics era. Nat. Rev. Drug Discov. 2015, 14, 111-129.
(2) Rodrigues, T.; Reker, D.; Kunze, J.; Schneider, P.; Schneider, G. Revealing the Macromolecular Targets of Fragment-Like Natural Products. Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 10516-10520.
(3) Rodrigues, T.; Reker, D.; Schneider, P.; Schneider, G. Counting on natural products for drug design. Nat. Chem. 2016, 8, 531-541.
(4) Reker, D.; Perna, A. M.; Rodrigues, T.; Schneider, P.; Reutlinger, M.; Monch, B.; Koeberle, A.; Lamers, C.; Gabler, M.; Steinmetz, H.; Muller, R.; Schubert-Zsilavecz, M.; Werz, O.; Schneider, G. Revealing the macromolecular targets of complex natural products. Nat. Chem. 2014, 6, 1072-1078.
(5) Rollinger, J. M.; Schuster, D.; Danzl, B.; Schwaiger, S.; Markt, P.; Schmidtke, M.; Gertsch, J.; Raduner, S.; Wolber, G.; Langer, T.; Stuppner, H. In silico target fishing for rationalized ligand discovery exemplified on constituents of Ruta graveolens. Planta Med. 2009, 75, 195-204.
(6) Roche, O.; Schneider, P.; Zuegge, J.; Guba, W.; Kansy, M.; Alanine, A.; Bleicher, K.; Danel, F.; Gutknecht, E. M.; Rogers-Evans, M.; Neidhart, W.; Stalder, H.; Dillon, M.; Sjogren, E.; Fotouhi, N.; Gillespie, P.; Goodnow, R.; Harris, W.; Jones, P.; Taniguchi, M.; Tsujii, S.; von der Saal, W.; Zimmermann, G.; Schneider, G. Development of a virtual screening method for identification of "frequent hitters" in compound libraries. J. Med. Chem. 2002, 45, 137-142.
(7) Baell, J. B.; Holloway, G. A. New substructure filters for removal of pan assay interference compounds (PAINS) from screening libraries and for their exclusion in bioassays. J. Med. Chem. 2010, 53, 2719-2740.
(8) Pouliot, M.; Jeanmart, S. Pan Assay Interference Compounds (PAINS) and Other Promiscuous Compounds in Antifungal Research. J. Med. Chem. 2016, 59, 497-503.
(9) Baell, J. B. Feeling Nature's PAINS: Natural Products, Natural Product Drugs, and Pan Assay Interference Compounds (PAINS). J. Nat. Prod. 2016, 79, 616-628.
(10) Clemons, P. A.; Bodycombe, N. E.; Carrinski, H. A.; Wilson, J. A.; Shamji, A. F.; Wagner, B. K.; Koehler, A. N.; Schreiber, S. L. Small molecules of different origins have distinct distributions of structural complexity that correlate with protein-binding profiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2010, 107, 18787-18792.
(11) Reinicke, K. E.; Bey, E. A.; Bentle, M. S.; Pink, J. J.; Ingalls, S. T.; Hoppel, C. L.; Misico, R. I.; Arzac, G. M.; Burton, G.; Bornmann, W. G.; Sutton, D.; Gao, J.; Boothman, D. A. Development of beta-lapachone prodrugs for therapy against human cancer cells with elevated NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 levels. Clin. Cancer Res. 2005, 11, 3055-3064.
(12) Lipinski, C. A. Rule of five in 2015 and beyond: Target and ligand structural limitations, ligand chemistry structure and drug discovery project decisions. Adv. Drug Deliv. Rev. 2016, 101, 34-41.
(13) Walters, W. P.; Murcko, A. A.; Murcko, M. A. Recognizing molecules with drug-like properties. Curr. Opin. Chem. Biol. 1999, 3, 384-387.
(14) Reker, D.; Rodrigues, T.; Schneider, P.; Schneider, G. Identifying the macromolecular targets of de novo-designed chemical entities through self-organizing map consensus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2014, 111, 4067-4072.
(15) Rodrigues, T.; Sieglitz, F.; Somovilla, V. J.; Cal, P. M.; Galione, A.; Corzana, F.; Bernardes, G. J. Unveiling (-)-Englerin A as a Modulator of L-Type Calcium Channels. Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 11077-11081.
(16) Nickel, J.; Gohlke, B. O.; Erehman, J.; Banerjee, P.; Rong, W. W.; Goede, A.; Dunkel, M.; Preissner, R. SuperPred: update on drug classification and target prediction. Nucleic Acids Res. 2014, 42, W26-31.
(17) Keiser, M. J.; Roth, B. L.; Armbruster, B. N.; Ernsberger, P.; Irwin, J. J.; Shoichet, B. K. Relating protein pharmacology by ligand chemistry. Nat. Biotechnol. 2007, 25, 197-206.
(18) Li, C. J.; Averboukh, L.; Pardee, A. B. beta-Lapachone, a novel DNA topoisomerase I inhibitor with a mode of action different from camptothecin. J. Biol. Chem. 1993, 268, 22463-22468.
(19) Lee, J. H.; Cheong, J.; Park, Y. M.; Choi, Y. H. Down-regulation of cyclooxygenase-2 and telomerase activity by beta-lapachone in human prostate carcinoma cells. Pharmacol. Res. 2005, 51, 553-560.
(20) Janusz, J. M.; Young, P. A.; Ridgeway, J. M.; Scherz, M. W.; Enzweiler, K.; Wu, L. I.; Gan, L.; Darolia, R.; Matthews, R. S.; Hennes, D.; Kellstein, D. E.; Green, S. A.; Tulich, J. L.; Rosario-Jansen, T.; Magrisso, I. J.; Wehmeyer, K. R.; Kuhlenbeck, D. L.; Eichhold, T. H.; Dobson, R. L.; Sirko, S. P.; Farmer, R. W. New cyclooxygenase-2/5-lipoxygenase inhibitors. 1. 7-tert-buty1-2,3-dihydro-3,3-dimethylbenzofuran derivatives as gastrointestinal safe antiinflammatory and analgesic agents: discovery and variation of the 5-keto substituent. J. Med. Chem. 1998, 41, 1112-1123.
(21) da Silva Junior, E. N.; de Souza, M. C.; Pinto, A. V.; Pinto Mdo, C.; Goulart, M. O.; Barros, F. W.; Pessoa, C.; Costa-Lotufo, L. V.; Montenegro, R. C.; de Moraes, M. O.; Ferreira, V. F. Synthesis and potent antitumor activity of new arylamino derivatives of nor-beta-lapachone and nor-alpha-lapachone. Bioorg. Med. Chem. 2007, 15, 7035-7041.
(22) da Silva Junior, E. N.; de Souza, M. C.; Fernandes, M. C.; Menna-Barreto, R. F.; Pinto Mdo, C.; de Assis Lopes, F.; de Simone, C. A.; Andrade, C. K.; Pinto, A. V.; Ferreira, V. F.; de Castro, S. L. Synthesis and anti-Trypanosoma cruzi activity of derivatives from nor-lapachones and lapachones. Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 5030-5038.
(23) Jardim, G. A. M.; Guimaraes, T. T.; Pinto, M. d. C. F. R.; Cavalcanti, B. C.; Farias, K. M. d.; Pessoa, C.; Gatto, C. C.; Nair, D. K.; Namboothiri, I. N. N.; Junior, E. N. d. S. Naphthoquinone-based chalcone hybrids and derivatives: synthesis and potent activity against cancer cell lines. Med. Chem. Commun. 2015, 6, 120-130.
(24) Owen, D. R.; Walker, J. K.; Jon Jacobsen, E.; Freskos, J. N.; Hughes, R. O.; Brown, D. L.; Bell, A. S.; Brown, D. G.; Phillips, C.; Mischke, B. V.; Molyneaux, J. M.; Fobian, Y. M.; Heasley, S. E.; Moon, J. B.; Stallings, W. C.; Joseph Rogier, D.; Fox, D. N.; Palmer, M. J.; Ringer, T.; Rodriquez-Lens, M.; Cubbage, J. W.; Blevis-Bal, R. M.; Benson, A. G.; Acker, B. A.; Maddux, T. M.; Tollefson, M. B.; Bond, B. R.; Macinnes, A.; Yu, Y. Identification, synthesis and SAR of amino substituted pyrido[3,2b]pyrazinones as potent and selective PDE5 inhibitors. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19, 4088-4091.
(25) Imlay, J. A. The molecular mechanisms and physiological consequences of oxidative stress: lessons from a model bacterium. Nat. Rev. Microbiol. 2013, 11, 443-454.
(26) Medina, L. F.; Hertz, P. F.; Stefani, V.; Henriques, J. A.; Zanotto-Filho, A.; Brandelli, A. Aminonaphthoquinone induces oxidative stress in Staphylococcus aureus. Biochem. Cell Biol. 2006, 84, 720-727.
(27) Becerra, M. C.; Albesa, I. Oxidative stress induced by ciprofloxacin in Staphylococcus aureus. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002, 297, 1003-1007.
(28) Goswami, M.; Mangoli, S. H.; Jawali, N. Involvement of reactive oxygen species in the action of ciprofloxacin against Escherichia coli. Antimicrob. Agents Chemother. 2006, 50, 949-954.
(29) Hanke, T.; Dehm, F.; Liening, S.; Popella, S. D.; Maczewsky, J.; Pillong, M.; Kunze, J.; Weinigel, C.; Barz, D.; Kaiser, A.; Wurglics, M.; Lammerhofer, M.; Schneider, G.; Sautebin, L.; Schubert-Zsilavecz, M.; Werz, O. Aminothiazole-featured pirinixic acid derivatives as dual 5-lipoxygenase and microsomal prostaglandin E2 synthase-1 inhibitors with improved potency and efficiency in vivo. J. Med. Chem. 2013, 56, 9031-9044.
(30) Mysinger, M. M.; Carchia, M.; Irwin, J. J.; Shoichet, B. K. Directory of useful decoys, enhanced (DUD-E): better ligands and decoys for better benchmarking. J. Med. Chem. 2012, 55, 6582-6594.
(31) Jones, G.; Willett, P.; Glen, R. C. Molecular recognition of receptor sites using a genetic algorithm with a description of desolvation. J. Mol. Biol. 1995, 245, 43-53.
(32) Hornig, C.; Albert, D.; Fischer, L.; Hornig, M.; Radmark, O.; Steinhilber, D.; Werz, O. 1-Oleoyl-2-acetylglycerol stimulates 5-lipoxygenase activity via a putative (phospho)lipid binding site within the N-terminal C2-like domain. J. Biol. Chem. 2005, 280, 26913-26921.
(33) Kulkarni, S.; Das, S.; Funk, C. D.; Murray, D.; Cho, W. Molecular basis of the specific subcellular localization of the C2-like domain of 5-lipoxygenase. J. Biol. Chem. 2002, 277, 13167-13174.
(34) Shoemaker, R. H. The NCI60 human tumour cell line anticancer drug screen. Nat. Rev. Cancer 2006, 6, 813-823.
(35) Gmeiner, W. H.; Reinhold, W. C.; Pommier, Y. Genome-wide mRNA and microRNA profiling of the NCI 60 cell-line screen and comparison of FdUMP[10] with fluorouracil, floxuridine, and topoisomerase 1 poisons. Mol. Cancer Ther. 2010, 9, 3105-3114.
(36) Subramanian, A.; Tamayo, P.; Mootha, V. K.; Mukherjee, S.; Ebert, B. L.; Gillette, M. A.; Paulovich, A.; Pomeroy, S. L.; Golub, T. R.; Lander, E. S.; Mesirov, J. P. Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2005, 102, 15545-15550.
(37) Metzeler, K. H.; Hummel, M.; Bloomfield, C. D.; Spiekermann, K.; Braess, J.; Sauerland, M. C.; Heinecke, A.; Radmacher, M.; Marcucci, G.; Whitman, S. P.; Maharry, K.; Paschka, P.; Larson, R. A.; Berdel, W. E.; Buchner, T.; Wormann, B.; Mansmann, U.; Hiddemann, W.; Bohlander, S. K.; Buske, C.; Cancer; Leukemia Group, B.; German, A. M. L. C. G. An 86-probe-set gene-expression signature predicts survival in cytogenetically normal acute myeloid leukemia. Blood 2008, 112, 4193-4201.
(38) Herold, T.; Jurinovic, V.; Metzeler, K. H.; Boulesteix, A. L.; Bergmann, M.; Seiler, T.; Mulaw, M.; Thoene, S.; Dufour, A.; Pasalic, Z.; Schmidberger, M.; Schmidt, M.; Schneider, S.; Kakadia, P. M.; Feuring-Buske, M.; Braess, J.; Spiekermann, K.; Mansmann, U.; Hiddemann, W.; Buske, C.; Bohlander, S. K. An eight-gene expression signature for the prediction of survival and time to treatment in chronic lymphocytic leukemia. Leukemia 2011, 25, 1639-1645.
(39) Ghosh, J.; Myers, C. E. Inhibition of arachidonate 5-lipoxygenase triggers massive apoptosis in human prostate cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998, 95, 13182-13187.
(40) Gilbert, N. C.; Rui, Z.; Neau, D. B.; Waight, M. T.; Bartlett, S. G.; Boeglin, W. E.; Brash, A. R.; Newcomer, M. E. Conversion of human 5-lipoxygenase to a 15-lipoxygenase by a point mutation to mimic phosphorylation at Serine-663. FASEB J. 2012, 26, 3222-3229.
(41) Goswami, C. P.; Nakshatri, H. PROGgeneV2: enhancements on the existing database. BMC cancer 2014, 14, 970.
(42) Hooker, S. C. The constitution of lapachol and its derivatives. Part V. The structure of paterno's “isolapachone”. J. Am. Chem. Soc. 58, 1190-1197 (1936).
(43) Schaffner-Sabba, K., Schmidt-Ruppin, K. H., Wehrli, W., Schuerch, A. R. & Wasley, J. W. Beta-Lapachone: synthesis of derivatives and activities in tumor models. J. Med. Chem. 27, 990-994 (1984).
(44) Silva, R. S. et al. Synthesis of naphthofuranquinones with activity against Trypanosom26a cruzi. Eur. J. Med. Chem. 41, 526-530 (2006).
(45) da Silva Junior, E. N. et al. Synthesis and anti-Trypanosoma cruzi activity of derivatives from nor-lapachones and lapachones. Bioorg. Med. Chem. 16, 5030-5038 (2008).
(46) Sun, J. S., Geiser, A. H. & Frydman, B. A preparative synthesis of lapachol and related naphthoquinones. Tetrahedron Lett. 39, 8221-8224 (1998).
(47) Salas, C. et al. Trypanosoma cruzi: activities of lapachol and alpha- and beta-lapachone derivatives against epimastigote and trypomastigote forms. Bioorg. Med. Chem. 16, 668-674 (2008).
(48) Rocha, D. R. d. et al. Synthesis of fused chromene-1,4-naphthoquinones via ring-closing metathesis and Knoevenagel-electrocyclization under acid catalysis and microwave irradiation. Tetrahedron 70, 3266-3270 (2014)
(49) Niehues, M. et al. Biomimetic in vitro oxidation of lapachol: a model to predict and analyse the in vivo phase I metabolism of bioactive compounds. Eur. J. Med. Chem. 54, 804-812 (2012).
(50) Sacau, E. P. et al. Inhibitory effects of lapachol derivatives on Epstein-Barr virus activation. Bioorg. Med. Chem. 11, 483-488 (2003).
(51) M. Reutlinger et al. Mol. Inf., 2013, 32, 133
(52) D. Reker et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 2014, 111, 4067.
(53) H. E. Flick et al Int. J. Tryptophan Res., 2013, 6, 35.
(54) M. Rakonjac Ryge et al Arch. Biochem. Biophys., 2014, 545, 179
(55) G. Piechele et al Pharmacol. Res., 1993, 27, 53.
(56) M. Brungs et al Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 205, 1572
【図１】
2020533327.tif 000029
【図２】
2020533327.tif 000030
【図３】
2020533327.tif 000031
【図４】
2020533327.tif 000032
【図５】
2020533327.tif 000033
【図６】
2020533327.tif 000034
【図７】
2020533327.tif 000035
【図８】
2020533327.tif 000036
【図９】
2020533327.tif 000037
【図１０】
2020533327.tif 000038
【図１１】
2020533327.tif 000039
【図１２】
2020533327.tif 000040
【国際調査報告】
2020533327.tif 000041
2020533327.tif 000042
2020533327.tif 000043
2020533327.tif 000044
2020533327.tif 000045