(57)【要約】  本発明は、ヒトインスリンおよびインスリン類似体などのタンパク質についてのペプチドマスフィンガープリンティングの技法に関する。インスリン類似体は、少なくとも１個のアミノ酸で変化し得、現在利用可能な分析方法によっては識別するにはわかりにくい。本発明は、さらにペプチドの配列の確認を可能とし、ここで該方法の実行時間は４０分である。この方法は、５０ｋＤａまでの分子に適用され得るだろう。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチドまたはポリペプチド（単数または複数）の混合物のアミノ酸配列および質量を決定するための方法であって、以下：
ａ）ポリペプチドをＨＣｌ中に溶解すること、およびトリスでｐＨを調整することによってポリペプチド試料を調製するステップ；
ｂ）２５：１の比率でのエンドヌクレアーゼＧｌｕ  Ｃの添加によってポリペプチド試料を消化するステップ；
ｃ）１Ｍジチオスレイトールの添加によって、ステップ（ｂ）の消化された試料を還元するステップ；
ｄ）ステップ（ｃ）のポリペプチドのＨＰＬＣ分析、それに続く質量分析を実施するステップ；
ｅ）ポリペプチドの分子量と対応する既知のポリペプチドの分子量とを比較し、それによってポリペプチドの同一性を決定するステップ；
ここで、ステップ（ｄ）において使用される有機溶媒は無塩バッファーであり、方法は、同時に複数のフラグメントの配列の確認を可能にする、
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）において、ｐＨが７．５〜８．５に調整される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
無塩ベースのバッファーが、アセトニトリル、ギ酸、ＴＦＡ、またはそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｄ）および（ｅ）のために必要とされる時間が約４０分である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ポリペプチド（単数または複数）が、インスリンまたはインスリン類似体である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドが、アスパルト、リスプロおよびグラルギンからなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ポリペプチドが、少なくとも１個のアミノ酸で異なり得る、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｅ）のポリペプチド（単数または複数）の分析されたフラグメントが、０．４ｋＤａから８ｋＤａまで及ぶ質量を有する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、プロテオミクスおよび分析化学の分野に関する。より具体的に、本発明は、同一性および質量の同時決定のためのタンパク質についてのペプチドマスフィンガープリントの方法であって、さらにペプチドの配列の確認を可能とする方法の開発に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
高感度の機器を用いる、ゲル電気泳動および質量分析法を使用する方法は、タンパク質の迅速な定量分析で知られている。これらの方法は、タンパク質を抽出すること、少なくとも一部のタンパク質を消化すること、および試料を作製することを包含し、電気泳動し、標識されたペプチドの試料中のペプチドに基づく質量分析法によって試料中のタンパク質の発現レベルの違いを検出する。この分析方法は、タンパク質の発現プロファイルの定性および定量分析について使用され得る。しかしながら、該方法は、多くの化学物質およびいくつかのステップを包含し、その莫大な費用に上乗せする。よって、費用および時間を低減させる方法を開発する必要がある。
【０００３】
組み換えＤＮＡ技術によって得られるタンパク質は、ペプチドマッピング方法によって同定される。ペプチドマッピングは、点突然変異におけるエラーなどの事象に起因する単一アミノ酸変化を同定する能力のある有力な試験である。ペプチドマッピング方法は、組み換えＤＮＡ産物のために使用される細胞の発現コンストラクトの安定性を評価し、および産物の安定性を査定し、ならびにタンパク質産物の同一性を保証するか、またはタンパク質バリアントの存在を検出するために使用され得る。ペプチドマッピングは、商業上のインスリン製品の品質を評価し、ヒトインスリンおよびインスリン類似体などのタンパク質のスクリーニングに好適なペプチドマッピング方法を提起するためにもまた使用され得る。
【０００４】
米国特許第７，６２２，２７３号は、タンパク質が、タンパク質マイクロアレイ（タンパク質チップ）に直接結合し、化学処理／酵素消化／化学消化が続く、段階的な方法を記載している。化学処理ステップによる消化は、タンパク質の変性、還元およびアルキル化を包含する。酵素消化ステップは、脱グリコシル化タンパク質または脱リン酸化および酵素加水分解またはタンパク質の化学的なタンパク質分解を包含する。タンパク質マイクロアレイ上のすべての反応は、迅速なタンパク質の同定および構造上の特徴付けについて段階的に実施される。この方法は、約２４時間費やすものである、従来の方法よりもより短い期間しか要しないが、いまだに不十分なものである。より重要なことには、複合試料（血漿、尿、脳脊髄液、等々）は、この方法を実行して標的タンパク質の単離を得る前に分画を必要とし、したがって全体の処理および期間が増加するだろう。ゆえに、試料の調製および期待される結果のために余分な費用および時間が必要とされることにつながる。
【０００５】
米国特許第９，５８１，６０１号は、２以上のスルホニル基を含む化合物によるペプチド／タンパク質の誘導体化の方法および質量分析計のネガティブモードの操作における誘導体化されたアナライトの分析を記載する。この方法は、長鎖のペプチド／タンパク質のアミノ酸配列の分析を可能にする。それはまた、誘導体化化合物として５−ホルミル−ベンゼン−１，３−ジスルホン酸の合成手順に関する。新しい試薬の誘導体化は、時間のかかるものであり、それと関連して追加の費用がかかるものである。
従来の脱塩処理は、一度に単一のフラグメントのみ検出することができ、複数のクロマトグラフィーの実行とこれに続く収集された単一のピークの脱塩処理を必要とする。該方法は、最大で２作業日を要する。
【０００６】
文献からこれまでのところ入手可能なインスリンおよびその類似体についてのペプチドマッピングの手順は、塩ベースの方法に適切であり、ＬＣ−ＭＳの使用とは両立できない。よって、より短い実行時間を有し、ＬＣ−ＭＳと両立ができる新たなペプチドマッピングフィンガープリンティング方法を開発する必要がある。インスリン類似体が、１〜３個のアミノ酸を変更しているために、とくにこのようなペプチドのタンパク質マッピングを時間的に効率よく実施することは困難である。
よって、かかる時間および費用を低減するだけでなく、信頼性のある結果を提供する方法についての必要性が残存している。
【０００７】
発明の目的
結果的に、本発明の目的は、タンパク質／ペプチドの同一性および質量の決定のためのペプチドマッピングフィンガープリンティングの時間および費用効果のある方法を提供することである。
本発明の別の目的は、従来の方法との比較において実行時間の徹底的な低減をもたらす無塩バッファー中にタンパク質が溶解している方法を提供することである。
本発明の別の目的は、複数のフラグメントの同時検出もまた可能とする方法を提供することである。
本発明の別の目的は、脱塩処理ステップを除去することによる配列の確認を提供し、試料を分析するために必要とされる時間を低減することである。
【０００８】
発明の概要
本発明の側面は、インスリンまたはインスリン類似体（アスパルト、リスプロまたはグラルギン）などの０．４ｋＤａから８ｋＤａまでの範囲をとるポリペプチド（単数または複数）のアミノ酸配列および質量を決定するための方法であって、ここでポリペプチドは、少なくとも１個のアミノ酸が異なり、還元条件において、以下のステップを含む：エンドプロテアーゼＧｌｕ  Ｃの添加によるポリペプチド試料の消化、消化された試料の還元；ＨＰＬＣ分析とこれに続く質量分析を実施し、該ポリペプチドの分子量と対応する既知のポリペプチドの分子量を比較すること。本発明は、ポリペプチドの同一性の決定およびペプチドの配列の確認を可能とし、ここで本発明の方法の実行時間は、ほぼ４０分である。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】図１は、標準試薬（自社内のもの）および商業上の製品の酵素消化のフローチャートを表す。
【図２】図２は、標準試薬（自社内のもの）および商業上の製品の還元条件下の酵素消化のフローチャートを表す。
【図３】図３は、ヒトインスリン上のエンドヌクレアーゼＧｌｕ−ＣおよびＤＴＴの作用点を表す。
【図４】図４は、消化および還元後のインスリン−ペプチドフラグメントを表す。
【００１０】
【図５】図５は、消化条件下でのインスリン試料の重ね合わせを表す。
【図６】図６は、消化および還元条件下でのインスリン試料の重ね合わせを表す。
【図７】図７は、ヒトインスリン、インスリングラルギン、インスリンアスパルトおよびインスリンリスプロの消化プロファイルを表す。
【図８】図８は、ヒトインスリン、インスリングラルギン、インスリンアスパルトおよびインスリンリスプロの消化−還元プロファイルを表す。
【００１１】
【図９】図９は、フラグメントの質量を確認する消化後のヒトインスリンの４個のフラグメントを表す。
【図１０】図１０は、フラグメントの質量を確認する消化後のインスリングラルギンの４個のフラグメントを表す。
【図１１】図１１は、フラグメントの質量を確認する消化後のインスリンアスパルトの４個のフラグメントを表す。
【図１２】図１２は、フラグメントの質量を確認する消化後のインスリンリスプロの４個のフラグメントを表す。
【００１２】
【図１３】図１３は、フラグメントの質量を確認する消化とこれに続く還元後のヒトインスリンの６個のフラグメントを表す。
【図１４】図１４は、フラグメントの質量を確認する消化とこれに続く還元後のインスリングラルギンの６個のフラグメントを表す。
【図１５】図１５は、フラグメントの質量を確認する消化とこれに続く還元後のインスリンアスパルトの６個のフラグメントを表す。
【図１６】図１６は、フラグメントの質量を確認する消化とこれに続く還元後のインスリンリスプロの６個のフラグメントを表す。
【００１３】
発明の説明
定義
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」は、天然に存在するかまたは、化学的にまたは他の手段によって産生されるかまたは修飾される組換え体であって、天然のタンパク質と本質的に同じように、翻訳後にプロセシングされるだろうタンパク質の三次元構造を推測するだろう、ペプチドおよびポリペプチドの両方を指す。
用語「ペプチドマップ」は、所与のポリペプチドの断片化によって得られる、よって、前記ポリペプチドに特異的なポリペプチドのセットを指す。
用語「タンパク質試料」は、自社内の標準試薬およびインスリンおよびインスリン類似体、すなわちインスリンアスパルト（ノボログ）、インスリンリスプロ（ヒューマログ）、インスリングラルギン（ランタス）の商業上の製品を指す。
【００１４】
用語「消化」は、アスパラギン酸残基で切断するエンドプロテアーゼＧｌｕＣによるペプチドの切断を指す。
用語「還元」は、分子内および分子間ジスルフィド結合がタンパク質のシステイン残基間で形成されることを防ぐために、タンパク質のジスルフィド結合を還元することを指す。
用語「インスリン」は、５１アミノ酸残基のポリペプチド（５８０８ダルトン）であって、多くの極めて重要な細胞のプロセスにおいて重要な役割を担うホルモンを指す。それは、細胞の増殖および分化の刺激に関わる。それは、そのモノマー形態におけるホルモンのそのダイマーの、チロシン−キナーゼ型膜受容体への結合によって開始されるシグナル経路を通して、その調節性機能（例として、細胞内へのグルコースの取り込み）もまた発揮する。ヒトインスリンの成熟した形態は、合計分子量が５８０８Ｄａの、Ａ−鎖（ＧｌｙＡ１−ＡｓｎＡ２１）およびＢ−鎖（ＰｈｅＢ１−ＴｈｒＢ３０）に配列された５１個のアミノ酸からなる。該分子は、２つの鎖間（Ａ２０−Ｂ１９、Ａ７−Ｂ７）および１つの鎖内ジスルフィド結合（Ａ６−Ａ１１）によって安定化されている。
【００１５】
インスリン類似体「リスプロ」は、一次構造においてインスリンヒトと同一であり、Ｂ２８の位置のリシンおよびＢ２９の位置のプロリンを変更していることでインスリンと異なる。それは、短時間作用性のインスリンモノマー類似体である。溶液製剤において、リスプロは、本質的に不安定なヘキサマーとして存在するが、注入されるときには、自然にモノマー形態へと分離する。Ｂ鎖Ｃ末端の修飾は、インスリンモノマー間の非極性接触およびｂ−シート相互作用を減少させ、より少ない自己会合をもたらす。
インスリン類似体「アスパルト」は、リスプロと同様に作用する。即効性のある類似体であるアスパルトは、Ｂ２８の位置でのプロリンについてのアスパラギン酸の単一置換でヒトインスリンと異なる。この置換は、モノマー間での電荷の反発およびＢ鎖のカルボキシル末端の局所構造の変化に起因した立体障害をもたらし、ヘキサマーおよびダイマーの両方の形成を低減し、それによってモノマーのアスパルトインスリンの吸収速度を増加する。
【００１６】
インスリン類似体「グラルギン」は、Ａ２１でのグリシンについてのアスパラギンの置換、およびＢ−鎖のＣ末端への２個のアルギニン残基の付加でヒトインスリンと異なる。インスリングラルギン溶液は、ｐＨ４．０で処方され、注入される。これらの修飾は、等電点をより中性のｐＨへと増加させ、生理学的条件下での可溶性を低減し、および注入部位でのグラルギンの沈殿を引き起こし、よって吸収を遅らせる。グラルギンは、ウルトラレンテインスリンのように２０〜２４時間持続する延長した作用の類似体であり、中間型プロタミンハーゲドン（ＮＰＨ）インスリンよりもよく、１型および２型糖尿病患者において夜間低血糖症を低減する。
【００１７】
発明の詳細な記載
本発明は、以下のステップを含む、ポリペプチドまたはポリペプチド（単数または複数）の混合物のアミノ酸配列および質量を決定するための方法を提供する：
ａ）強酸であるＨＣｌ中にポリペプチドを溶解し、トリスでｐＨを調整することによってポリペプチド試料を調製するステップ；
ｂ）１：２５の酵素−タンパク質の比率でのエンドプロテアーゼＧｌｕ  Ｃの添加によって、ステップ（ａ）のポリペプチド試料を消化するステップ；
ｃ）１Ｍジチオスレイトールの添加によって、ステップ（ｂ）の消化されたポリペプチドを還元するステップ；
ｄ）有機溶媒を含むステップ（ｃ）のポリペプチドのＨＰＬＣ分析とこれに続く質量分析を実施するステップ；
ｅ）消化されたポリペプチドの分子量を対応する既知のポリペプチドの分子量と比較し、それによってポリペプチドの同一性を決定するステップ、
ここで、有機溶媒は、無塩バッファーである；および
該方法は、同時に複数のフラグメントの配列の確認を可能とする。
【００１８】
無塩バッファーは、アセトニトリル、ギ酸、ＴＦＡ、またはその組み合わせからなる群より選択され得る。
従来の方法において、ＬＣ−ＭＳ検出のために塩ベースのバッファーが使用されていたが、しかしながら、本発明者らは、ＬＣＭＳと両立できる無塩ベースのバッファーの使用が、ステップ（ｄ）および（ｅ）に費やされる時間を有意に低減することにつながり、よって本プロセスを時間および費用効果のあるものにすることを見出した。
驚くべきことに、従来の方法が１〜２日要する一方で、質量および配列を同定するための消化および還元のステップ後である、ステップ（ｄ）および（ｅ）は、約４０分要するということを見出した。
【００１９】
本方法は、５０ｋＤａまでのポリペプチドの質量および配列を分析し、同定することに適用され得る。
ペプチドまたはタンパク質の消化は、増加した荷電およびイオン化基（ionisable group）の露出の結果として、質量分析法の検出を改善し得る。本発明において、タンパク質の還元は、ペプチドまたはタンパク質中のジスルフィド架橋を切断することに関わる。ジスルフィド結合の再形成を低減し、防ぐためのアルキル化剤の添加がこれに続き、ジスルフィド結合スクランブリングにつながり、よってアモルファスの凝集物を促進し得る。
【００２０】
Ｉ．２５：１（タンパク質対酵素）の比率でのエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃによるタンパク質の酵素消化。
ＩＩ．比率２５：１（タンパク質対酵素）でのエンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃを用いた消化手順後の１Ｍ  ＤＴＴを添加することによる酵素消化および還元。
ＩＩＩ．ＨＰＬＣとしてＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）を使用する分析。
ＩＶ．タンパク質のマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）のプロファイルを使用する分析。
Ｖ．複数のフラグメントの検出およびペプチドの配列確認。
ＶＩ．消化段階の後に、本発明の時間は、最大４０〜６０分である。
【００２１】
例に記載されるように、以下の材料および試薬が本発明に使用された。
１．０．０１Ｎ  ＨＣｌがタンパク質／ペプチド試料を調製するために使用され、一方でトリス−ＨＣｌバッファーがｐＨを調整するために使用された。
２．提示された例において、無塩ベースのバッファーである有機溶媒は、分光光度法用のギ酸（ＦＡ）（Sigma-Aldrich社より入手した）を０．１％含有するJ.T Baker社のアセトニトリル（ＡＣＮ）が使用されたが、メタノール（ＭｅＯＨ）、イソプロパノール（ＩＰＡ）、またはＡＣＮ、ＭｅＯＨおよびＩＰＡの混合物などの他の有機溶媒もまた使用され得る。
３．提示された例において、溶液は、ジチオール還元剤である１Ｍジチオスレイトール（ＤＴＴ）を含む還元剤を含む。しかしながら、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、２−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、および２−メルカプトエタノールアミン（２−ＭＥＡ）もまた使用され得る。
【００２２】
４．自社内ならびに商業上の製品のフラグメントを調製するために使用される、エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃ（１ｍｇ／ｍｌ）シーケンシンググレード（Roche、Cat# 11047817001）。
５．例に提示されるように、ヒトインスリン、インスリングラルギン、インスリンアスパルトおよびインスリンリスプロの自社内の標準試薬と、一方で商業上の製品−ノボリン−Ｒ（Novo-Nordisk社のインスリン）、ランタス（Aventis社により製造されたインスリングラルギン）、ノボログ（Novo-Nordisk社により製造されたインスリンアスパルト）およびヒューマログ（Eli-Lilly社により製造されたインスリンリスプロ）が使用された。
【００２３】
本発明において２つの個別の実験が行われた。第一の実験において、インスリンおよびインスリン類似体のタンパク質／ペプチド試料は、消化についてのみ処理された。第二の実験において、インスリンおよびインスリン類似体のタンパク質／ペプチド試料は、消化ならびに還元について処理された。
両方の試料は、ＨＰＬＣとしてＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）を使用して、およびタンパク質のマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）のプロファイルを使用して、分析された。
記載はさらに、ベストモードの手順を記載する。
【００２４】
ステップ１  自社内の標準試薬および商業上の製品の酵素消化
段階的な手順は、図１に表示されるように続けられ、ここで、タンパク質試料（１ｍｇ／ｍＬ）は、０．０１Ｎ  ＨＣｌ中に溶解され、ｐＨは、トリス−ＨＣｌバッファーを用いて７．５〜８．５に調整される。エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃは、比率２５：１（タンパク質対酵素）で添加された。試料は、３７℃で３時間インキュベートされ、次いで最終の試料は、ＨＰＬＣとしてＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）およびタンパク質のマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）のプロファイルを使用して分析された。試料はまた、さらに使用されるまで−２０℃で保管された。
インスリン分子について消化後に得られたペプチドフラグメントが、表１中に列挙される。４個のペプチドフラグメントは、プロテアーゼＶ８の消化後に、インスリンヒトから生成され、フラグメントＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶと表示を付けられた。
【００２５】
【表１】
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【００２６】
フラグメントＩＶは、アミノ酸Ａ５〜Ａ１７およびＢ１〜Ｂ１３を含有し、フラグメントＩＩＩは、Ａ１８〜Ａ２１およびＢ１４〜Ｂ２１、フラグメントＩＩは、Ｂ２２〜Ｂ３０、およびフラグメントＩは、Ａ１〜Ａ４であった。これらの４個のペプチドフラグメントは、より迅速に溶離するより小さなペプチドフラグメントと共に順次溶離した。４個のアミノ酸のフラグメントＩは、１０分以内に最初に溶離し、最も低いＵＶ吸光度を示した。９個のアミノ酸のフラグメントＩＩは、約１６分に溶離し、これに続き１２個のアミノ酸を含有するフラグメントＩＩＩが、フラグメントＩＩよりも約２．７分遅れてカラムから溶離した。２６個のアミノ酸を含有しているフラグメントＩＶは、約２６分に溶離し、最も高いレベルのＵＶ吸収を示した。
【００２７】
フラグメントＩおよびＩＶは、インスリンと比較したときに（アミノ酸の数に関して）配列中に変化がないために、残りの類似体（アスパルト、グラルギン＆リスプロ）についてほぼ同じ保持時間で溶離した。アスパルト＆リスプロについてのフラグメントＩＩは（配列中に以下の変化があるにもかかわらず：アスパルト−ＡｓｐＢ２８によって置換されたＰｒｏＢ２８；リスプロ−ＬｙｓＢ２９→ＰｒｏＢ２９の変更）、インスリンのものと同じ保持時間で溶離した。アスパルト＆リスプロについてのフラグメントＩＩＩは、（アミノ酸の数に関して）配列中に変化がないために、インスリンのものと同じ保持時間で溶離した。インスリングラルギンは、インスリンヒトのそれらと比較して、フラグメントＩＩおよびＩＩＩの保持時間において有意なシフトを示した。インスリングラルギン上のＡｓｎＡ２１とＧｌｙの置換は、フラグメントＩＩＩの保持時間を遅らせた。その上、インスリングラルギンのフラグメントＩＩ上の２個のアルギニンの付加（ＡｒｇＢ３１〜３２）は、インスリンヒトのそれよりも前の溶離をもたらした。
【００２８】
ステップ２  自社内の標準試薬および商業上の製品の還元を伴う酵素消化
段階的な手順は、図２に表示されるように続けられ、ここで、タンパク質試料（１ｍｇ／ｍＬ）は、０．０１Ｎ  ＨＣｌ中に溶解され、ｐＨは、トリス−ＨＣｌバッファーを用いて７．５〜８．５に調整される。
エンドプロテアーゼＧｌｕ−Ｃは、比率２５：１（タンパク質対酵素）で添加された。試料は、３７℃で３時間インキュベートされた。還元についてのステップは、１Ｍ  ＤＴＴを添加し、３７℃で１時間インキュベートを続ける。次いで最終の試料は、ＨＰＬＣとしてＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ）およびタンパク質のマスフィンガープリンティング（ＰＭＦ）のプロファイルを使用して分析された。試料はまた、さらに使用されるまでー２０℃で保管された。
【００２９】
図３および４は、Ｇｌｕ−ＣおよびＤＴＴの作用点、およびインスリンまたはインスリン類似体のタンパク質試料が、還元条件下で消化されるときに生成されるフラグメントを描く。
６個のペプチドフラグメントは、還元条件下でのＧｌｕ−Ｃ消化後に、ヒトインスリン分子から生成された。４個のアミノ酸のフラグメントＩは、５．２分以内に最初に溶離した；４個のアミノ酸のフラグメントＩＩは、約９．７分で溶離して、最も低いＵＶ吸光度を示し、これに続き１３個のアミノ酸を含有するフラグメントＩＩＩは、フラグメントＩＩよりも約５．０分遅れてカラムから溶離した。９個のアミノ酸を含有しているフラグメントＩＶは、約１５．５分で溶離した；８個のアミノ酸のフラグメントＶは、約２３．８分で溶離し、最終的に１３個のアミノ酸のフラグメントＶＩが、約２８．５分で溶離した。
【００３０】
【表２】
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【００３１】
インスリンリスプロにおいて、ヒトインスリンのフラグメントＩＶの溶離のほぼ１分前である１４．４分にはっきりと溶離したフラグメントＩＶを除いて、フラグメントについての溶離パターンにおいて変化がなかった。
インスリングラルギンは、配列中に変化がないために、フラグメントＩＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＶＩについての溶離パターンにおいて変化はなかった。フラグメントＩは、配列中に変化（ＡｓｎＡ２１のＧｌｙとの置換）があるために、５．８分に溶離した。フラグメントＩＶは、２個のアルギニン（ＡｒｇＢ３１〜３２）の付加があるという配列中の変化のために、ヒトインスリンおよびインスリンリスプロと比較すると、１１．４分の前に溶離した。
【００３２】
インスリンアスパルトは、溶離液Ｂとして８０％ＡＣＮを使用してペプチドマスフィンガープリンティングが実行された。４個のアミノ酸のフラグメントＩは、５．３分以内に最初に溶離した；４個のアミノ酸のフラグメントＩＩは、約１０．４分に溶離して、最も低いＵＶ吸光度を示し、これに続き１３個のアミノ酸を含有するフラグメントＩＩＩは、フラグメントＩＩよりも約５．５分遅れてカラムから溶離した。９個のアミノ酸を含有するフラグメントＩＶは、約１６．２分に溶離した；８個のアミノ酸のフラグメントＶは、約２６．９分に溶離し、最終的に１３個のアミノ酸のフラグメントＶＩは、約３０．５分に溶離した。
【００３３】
ステップ３：逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）
ＲＰ−ＨＰＬＣを、質量分析計（Bruker HCT）に接続されたダイオードアレイ検出器（USA）を備えたAgilent 1200ＨＰＬＣシステム上で実施した。勾配システムを、１．０ｍＬ／ｍｉｎの流速で用いた。
表３に示すように、移動相は、溶離液Ａとして０．１％ＦＡを伴う１００％水および溶離液Ｂとして９０％アセトニトリルを包含した［インスリンおよびインスリン類似体（消化）について＆インスリン、グラルギン、リスプロ（消化＆還元）について］。アスパルト（消化＆還元）のケースにおいて、８０％ＡＣＮが、溶離液Ｂとして使用された。
【００３４】
【表３】
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【００３５】
【表４】
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【００３６】
初期条件は、５％の溶離液Ｂであり、次いで０から１２分までで５−２０％の溶離液Ｂ、１２から１８分までで２０−２１％の溶離液Ｂ、１８から２５分までで２１−３０％の溶離液Ｂ、および２５から３４分までで３０−７０％の溶離液Ｂおよび３４から３４．１０分までで７０−５％の溶離液Ｂおよびさらに６．０分間再平衡化させた（表４）。
５マイクロリットルの消化された試料の溶液が、４０℃のカラム温度に維持されたACE C18-300カラム（４．６×２５０ｍｍ、粒径５μｍ；アバディーン、スコットランド）に注入され、分析された。分画されたインスリンおよびインスリン類似体ペプチドは、２２０ｎｍのＵＶ吸光度で検出された。
【００３７】
ステップ４：質量分析法
Bruker社のHigh Capacity Trapを、分析参照について以下のパラメーターを用いて質量分析に使用した；
１．Ion source type- ESI Positive、
２．Mass Range Mode - Ultra Scan、
３．Ion Polarity - Positive、
４．Scan Range- 50-2200 m/z、Auto MSn- On。
ペプチドマスフィンガープリンティングを、ステップ１およびステップ２のプロトコルについて実施した。
【００３８】
消化および消化＆還元についてのＨＰＬＣクロマトグラムを、分析されたすべての試料について検査した。加えて質量分析データは、獲得されたピークについての質量の確認のためにもまた得られた。ペプチドマッピング技法は、わかりにくい違いを明らかにする能力を保証され、表示されている液体クロマトグラフィーよりも有効にヒトインスリンと様々な型のインスリン類似体との間を識別することができた。
以下の例は、特定の好ましい態様および本発明の側面を説明するために役立つのであり、その範囲を制限するように解釈されるべきではない。
【００３９】
例１：インスリン分子の消化
プロテアーゼＶ８の消化後に、インスリンヒトからＡ５〜Ａ１７およびＢ１〜Ｂ１３のアミノ酸を含有するフラグメントＩＶ、Ａ１８〜Ａ２１およびＢ１４〜Ｂ２１のフラグメントＩＩＩ、Ｂ２２〜Ｂ３０のフラグメントＩＩ、およびＡ１〜Ａ４のフラグメントＩＶの４個のペプチドフラグメントを生成した。これらの４個のペプチドフラグメントは、より迅速に溶離するより小さなペプチドフラグメントと共に順次溶離した。４個のアミノ酸のフラグメントＩは、１０分以内に最初に溶離し、最も低いＵＶ吸光度を示した。９個のアミノ酸のフラグメントＩＩは、約１６分に溶離し、これに続き１２個のアミノ酸を含有するフラグメントＩＩＩが、フラグメントＩＩよりも約２．７分遅れてカラムから溶離した。２６個のアミノ酸を含有しているフラグメントＩＶは、約２６分に溶離し、最も高いレベルのＵＶ吸収を示した。
図５は、消化条件下でのインスリン試料（自社内の製品であるインスゲン（Insugen）および商業上の製品であるノボリン）の重ね合わせを表している。図７は、消化のプロセスによって生成されたフラグメントをＵＶクロマトグラムとして示し、一方で図９は、フラグメントの質量を確認している。
【００４０】
例２：インスリンアスパルトの消化
プロテアーゼＶ８の消化後に、インスリンヒトからＡ５〜Ａ１７およびＢ１〜Ｂ１３のアミノ酸を含有するフラグメントＩＶ、Ａ１８〜Ａ２１およびＢ１４〜Ｂ２１のフラグメントＩＩＩ、Ｂ２２〜Ｂ３０のフラグメントＩＩ、およびＡ１〜Ａ４のフラグメントＩＶの４個のペプチドフラグメントを生成した。フラグメントＩおよびＩＶは、インスリンと比較したときに配列中に変化がないために、インスリン分子のものとほぼ同じ保持時間で溶離した。アスパルトについてのフラグメントＩＩは（配列中に以下の変化があるにもかかわらず：アスパルト−ＡｓｐＢ２８によって置換されたＰｒｏＢ２８の変更）、インスリンのものと同じ保持時間で溶離した。アスパルトについてのフラグメントＩＩＩは、配列中に変化がないために、インスリンのものと同じ保持時間で溶離した。
図７は、消化のプロセスによって生成されたフラグメントをＵＶクロマトグラムとして表し、ここで図１１は、フラグメントの質量を確認している。
【００４１】
例３：インスリンリスプロの消化
プロテアーゼＶ８の消化後に、インスリンヒトからＡ５〜Ａ１７およびＢ１〜Ｂ１３のアミノ酸を含有するフラグメントＩＶ、Ａ１８〜Ａ２１およびＢ１４〜Ｂ２１のフラグメントＩＩＩ、Ｂ２２〜Ｂ３０のフラグメントＩＩ、およびＡ１〜Ａ４のフラグメントＩＶの４個のペプチドフラグメントを生成した。フラグメントＩおよびＩＶは、インスリンと比較すると配列中に変化がないため、インスリン分子のものとほぼ同じ保持時間で溶離した。リスプロについてのフラグメントＩＩは（配列中に以下の変化があるにもかかわらず：リスプロ−ＬｙｓＢ２９→ＰｒｏＢ２９の変更）、インスリンのものと同じ保持時間で溶離した。リスプロについてのフラグメントＩＩＩは、配列中に変化がないために、インスリンのものと同じ保持時間で溶離した。
図７は、消化のプロセスによって生成されたフラグメントをＵＶクロマトグラムとして表し、一方で図１２は、フラグメントの質量を確認している。
【００４２】
例４：インスリングラルギンの消化
プロテアーゼＶ８の消化後に、インスリンヒトからＡ５〜Ａ１７およびＢ１〜Ｂ１３のアミノ酸を含有するフラグメントＩＶ、Ａ１８〜Ａ２１およびＢ１４〜Ｂ２１のフラグメントＩＩＩ、Ｂ２２〜Ｂ３０のフラグメントＩＩ、およびＡ１〜Ａ４のフラグメントＩＶの４個のペプチドフラグメントを生成した。インスリングラルギンは、インスリンヒトのそれらと比較して、フラグメントＩＩおよびＩＩＩの保持時間において有意なシフトを示した。インスリングラルギン上のＡｓｎＡ２１とＧｌｙの置換は、フラグメントＩＩＩの保持時間を遅らせた。その上、インスリングラルギンのフラグメントＩＩ上の２個のアルギニンの付加（ＡｒｇＢ３１〜３２）は、インスリンヒトのそれよりも前の溶離をもたらした。図７は、消化のプロセスによって生成されたフラグメントをＵＶクロマトグラムとして示し、一方で図１０は、フラグメントの質量を確認している。
【００４３】
例５：還元条件下でのインスリン分子の消化
還元条件下でのＧｌｕ−Ｃの消化後に、ヒトインスリン分子から６個のペプチドフラグメントを生成した。４個のアミノ酸のフラグメントＩは、５．２分以内に最初に溶離した；４個のアミノ酸のフラグメントＩＩは、約９．７分に溶離して、最も低いＵＶ吸光度を示し、これに続き１３個のアミノ酸を含有するフラグメントＩＩＩが、フラグメントＩＩよりも約５．０分遅れてカラムから溶離した。９個のアミノ酸を含有するフラグメントＩＶは、約１５．５分に溶離した；８個のアミノ酸のフラグメントＶは、約２３．８分に溶離し、最終的に１３個のアミノ酸のフラグメントＶＩが、約２８．５分に溶離した。
図６は、還元を伴った消化条件下でのインスリン試料（自社内の製品であるインスゲンおよび商業上の製品であるノボリン）の重ね合わせを表す。図８は、消化とこれに続く還元のプロセスによって生成されたフラグメントをＵＶクロマトグラムとして表し、図１３は、フラグメントの質量を確認する。
【００４４】
例６：還元条件下でのインスリンアスパルトの消化
インスリンアスパルトについて、８０％ＡＣＮを溶離液Ｂとして使用してペプチドマスフィンガープリンティングを実行した。４個のアミノ酸のフラグメントＩは、５．３分以内に最初に溶離した；４個のアミノ酸のフラグメントＩＩは、約１０．４分に溶離して、最も低いＵＶ吸光度を示し、これに続き１３個のアミノ酸を含有するフラグメントＩＩＩは、フラグメントＩＩよりも約５．５分遅れてカラムから溶離した。９個のアミノ酸を含有するフラグメントＩＶは、約１６．２分に溶離した；８個のアミノ酸のフラグメントＶは、約２６．９分に溶離し、最終的に１３個のアミノ酸のフラグメントＶＩは、約３０．５分に溶離した。図８は、消化とこれに続く還元のプロセスによって生成されたフラグメントをＵＶクロマトグラムとして表し、図１５は、フラグメントの質量を確認する。
【００４５】
例７：還元条件下でのインスリンリスプロの消化
インスリンリスプロは、ヒトインスリンのフラグメントＩＶの溶離の約１分前である１４．４分にはっきりと溶離したフラグメントＩＶを除いて、フラグメントについての溶離パターンにおいて変化がなかった。図８は、消化とこれに続く還元のプロセスによって生成されたフラグメントをＵＶクロマトグラムとして表し、ここで図１６は、フラグメントの質量を確認する。
【００４６】
例８：還元条件下でのインスリングラルギン（Gargine）の消化
インスリングラルギンについて、配列中に変化がないために、フラグメントＩＩ、ＩＩＩ、ＶおよびＶＩについての溶離パターンにおいて変化はない。フラグメントＩは、配列中に変化（ＡｓｎＡ２１のＧｌｙとの置換）があるために、５．８分に溶離した。フラグメントＩＶは、配列中の変化；２個のアルギニン（ＡｒｇＢ３１〜３２）の付加のために、ヒトインスリンおよびインスリンリスプロと比較すると、１１．４分の前に溶離した。図８は、消化とこれに続く還元のプロセスによって生成されたフラグメントをＵＶクロマトグラムとして表す。図１４は、６個のフラグメントの質量を確認する。
【００４７】
例９：ペプチドマップの比較
試験され、分析された自社内の製品のペプチドマッピングは、参照製品と同一であった。その上、様々なインスリン類似体とヒトインスリンについてのＰＭＦの比較は、単一アミノ酸変化でさえ、ペプチドマッピングによって検出され得ることを示した。インスリンヒトとインスリンリスプロに関して、インスリンヒトのそれよりも早く溶離されたインスリンリスプロのフラグメントＩＶは、アミノ酸の再配列が、構造変化を誘導し、ペプチドフラグメントの保持時間を変えるであろうことを示唆した。
ＡｓｎＡ２１のＧｌｙとの置換によって引き起こされるインスリングラルギンのフラグメントＩでの低減した極性は、保持時間を遅らせることをもたらす。対照的に、フラグメントＩＶ上の２個のアルギニンの付加が極性を増加させることは、保持時間を短縮させた。ゆえに我々は、インスリン類似体の型が、インスリン類似体とヒトインスリンとの間に最大でも３個のアミノ酸にすぎない違いがあるために、ＰＭＦによってのみ有効に同定され得ると結論付けた。図７および８からのクロマトグラムは、そこから結論が生成された、ペプチドマップの比較を表す。
【００４８】
質量の検出は、両方のプロセスを用いて達成されたが、しかしながら、ポリペプチドの配列の確認は、ポリペプチド（ここで最大でも３個のアミノ酸にすぎない違いがある）の消化とこれに続く還元のプロセスによって達成された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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