(57)【要約】  生物における微生物感染の診断方法は、前記微生物感染が前記生物の細胞材料中に基本小体として少なくとも部分的に存在することを利用する。前記診断方法は、前記生物から細胞材料のサンプルを得る（１）工程と、当該サンプルを処理して、前記サンプルが基本小体を含む限り、前記基本小体に富む試験組成物を得る（２）工程と、多くても予め定められた最大数の基本小体を含む一体積量の前記試験組成物をＭＡＬＤＩ質量分析法に供して、前記微生物感染の存在を同定する（３）工程と、を含む。より具体的には、サンプルを処理する工程には、細胞溶解と、当該溶解した細胞材料からの基本小体の分離とが含まれる。続いて、基本小体（およびそれに付着したさらなる材料）をマトリックス材料と接触させ、ＭＡＬＤＩ質量分析を容易にする。
2020510829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物における微生物感染の診断方法であって、前記微生物感染が前記生物の細胞材料中に基本小体として少なくとも部分的に存在し、
前記診断方法は、
前記生物から細胞材料のサンプルを得る工程と、
当該サンプルを処理して、前記サンプルが基本小体を含む限り、前記基本小体に富む試験組成物を得る工程と、
多くても予め定められた最大数の基本小体を含む一体積量の前記試験組成物をＭＡＬＤＩ質量分析法に供して、前記微生物感染の存在を同定する工程と、を含む方法。
【請求項２】
前記方法は、前記試験組成物の複数の液滴を生成する工程をさらに含み、
前記複数の液滴のそれぞれは、前記ＭＡＬＤＩ質量分析法に連続的に供される一体積量である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
一体積量当たりの基本小体の予め定められた最大数が１０、好ましくは５である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
各体積量が多くても２つの基本小体を含み、好ましくは１つの液滴が単一の基本小体を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記生成した複数の液滴が、選択工程に供され、当該選択工程が、各液滴の光学画像の登録と、当該光学画像の分析に基づく液滴の選択とを含む、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記サンプルを処理する工程は、前記細胞材料を溶解する工程と、溶解した他の材料から前記基本小体を分離する工程とを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記溶解する工程が超音波処理により行われる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記分離が遠心処理を含む、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記遠心処理が、細胞破片から分離された前記基本小体を含む上澄みを与える、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記分離された基本小体の組成物を濃縮する工程をさらに含む、請求項６〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルを処理する工程が、マトリックス材料の組成物を前記富化サンプルに添加して、それにより前記試験組成物を生成する工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物感染が、少なくとも１つの細胞内細菌種によって生じる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌種がクラミジア属に属し、より具体的にはクラミジアトラコマチスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物感染が、無症候性である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ＭＡＬＤＩ質量分析法が、
一体積量の前記試験組成物、好ましくは前記液滴を処理して、当該一体積量に含まれる少なくとも１つの基本小体上に前記マトリックス材料を結晶化し、それにより検体を得る工程と、
前記検体の少なくとも一部をイオン化する工程と、
飛行時間型検出器を使用して前記イオン化した成分を分離し、スペクトルを取得する工程と、
前記微生物感染の同定のために、前記スペクトルを少なくとも一つのリファレンスと比較する工程と、
を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルの入手が、前もって収集された材料を含む容器からのサンプルの入手である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記生物が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
微生物感染の診断システムであって、前記微生物感染が生物の細胞材料中に基本小体として少なくとも部分的に存在し、
前記診断システムは、
細胞材料のサンプルの溶解手段と、
細胞溶解により得られた他の材料から基本小体を分離するための分離手段と、
前記このように分離された基本小体とマトリクス材料の組成物を混合して、前記基本小体を含む試験組成物を得る混合手段と、
予め定められた最大数の基本小体を含む、一体積量の前記試験組成物を分注するための分注ユニットと、
前記試験組成物の質量スペクトルを生成するために構成されたＭＡＬＤＩ質量分析機と、
個々の体積量の複数の質量スペクトルに基づき平均スペクトルを生成し、当該平均スペクトルをリファレンス、典型的にはデータベースからのリファレンスと比較するためのプロセッサと、
を組み合わせて含む、システム。
【請求項１９】
前記分注ユニットが、前記試験組成物の複数の液滴を生成するための液滴生成器である、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
光学画像記録装置と、記録された光学画像を分析するための処理手段とを含む光学画像分析手段をさらに含む、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
液滴除去手段をさらに含み、当該液滴除去手段が、前記処理手段による前記分析に基づいて駆動される、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
前記溶解手段が超音波処理手段を含む、請求項１８〜２１のいずれかに記載のシステム。
【請求項２３】
前記分離手段が遠心機を含む、請求項１８〜２２のいずれかに記載のシステム。
【請求項２４】
基本小体の同定および／または微生物感染の診断のための請求項１８〜２３のいずれかに記載のシステムの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物の微生物感染の診断方法に関し、微生物感染は、生物の細胞環境内に封入体として少なくとも部分的に存在する。
本発明はさらに、診断のためのシステムに関する。
【背景技術】
【０００２】
微生物感染は、哺乳類、特にヒトなどの生物の健康に脅威をもたらす。様々な診断方法がこのような感染の同定に利用できる。しかしながら、このような同定は困難になり得る。さらに、微生物感染は、感染した宿主生物が感染に気付かないような、無症候性であることがある。これにより、感染が拡大する。さらに、いくつかの微生物感染は、細胞内感染が存在する。
【０００３】
広義の感染症の特定のグループは、少なくとも部分的に封入体が存在する。このような封入体は、染色可能な物質の核または細胞質凝集体であり、通常はタンパク質である。封入体は、典型的には、ウイルスまたは細菌の増殖部位を表す。様々な場合、特にクラミジア属およびクラミドフィラ属内では、封入体は感染物質を２つの形態で含み得る。１つは増殖に適した形態であり、もう１つは細胞の感染に適した形態である。後者の形態は、感染した細胞を離れ、拡散して他の細胞に入り得る。１つの形態は網様体としても知られ、もう１つの形態は基本小体として知られている。２つの形態は、ＲＮＡ／ＤＮＡ比、核物質の密度、細胞壁の様式など、いくつかの面で異なる。細胞外の形態で生存することができる基本小体は、ＲＮＡ／ＤＮＡ比が低く、例えば１未満であり、高電子密度の核物質と比較的硬い細胞壁を持っている。それらはさらに食作用を誘発し、ファゴソーム機能を抑制する。したがって、網様体は、非感染性であり、代謝的に活性であり、より高いＲＮＡ／ＤＮＡ比、例えば３〜４を有している。それらはさらに、緩く分布した核様体と、より薄くより柔軟な細胞壁と、二分裂による置換とを有する。本発明は、基本小体の特性を利用する。このような基本小体は、クラミジア属およびクラミドフィラ属に存在することが知られているが、他の微生物感染、例えばウイルスまたはグラム陰性細菌の感染が、基本小体の同様のメカニズム（すなわち、密集した核を含み、細胞外の存在を可能にするために全体的に比較的硬い形態またはフェーズを有すること）を介して広がることは除外されていない。
【０００４】
封入体の存在は、宿主生物に感染した細菌、より具体的には細胞内細菌に起因し得る。しかしながら、封入体は、ある種の生物（真核細胞など）から、原核生物細胞などの別の生物への組換え遺伝子の発現によっても生じ得る。封入体のクラスの例には、ウイルス封入体、赤血球中の封入体、皮膚状態の封入体、カウンシルマン体およびデーレ小体が含まれる。ウイルス封入体は、細胞質内、核内、例えば好酸性または好塩基性、さらに、核内および細胞質内の両方であり得る。赤血球中の封入体は、発達オルガネラ、原生動物の封入として、および、異常なヘモグロビン沈殿としてあり得る。多くの重要なウイルスと感染症は、狂犬病のネグリ体、単純ヘルペスウイルスおよび水痘帯状疱疹ウイルスのコウドリーＡ型、黄熱病のトレス体、ポリオとアデノウイルスのコウドリーＢ型を含む、封入体の形であると理解されている。植物におけるウイルス封入体の例には、ウイルス粒子の凝集体（キュウリモザイクウイルスの凝集体など）およびウイルスタンパク質の凝集体（ポティウイルスの円筒状封入など）が含まれる。
【０００５】
細菌の細胞内様式で、少なくとも部分的に封入体の形態であり、網様体と基本小体の両方を含む、関連する細菌感染は、クラミジア属、より具体的にはクラミジアトラコマチスに見られる。また、マイコプラズマ種の感染は、細胞内細菌感染であると理解されている。以下では、クラミジア属の細菌種の封入体に焦点を当てる。
【０００６】
クラミジアトラコマチス（以下、ＣＴとも略す）は、失明（トラコーマ）に関連する唯一の最も重要な感染因子である。世界中で約８４００万人がＣ．トラコマチスの眼感染症に苦しんでおり、８００万人が感染の結果として失明している。クラミジアトラコマチスへの感染は、さらに、最も一般的な細菌性性行為感染症であり、一般人口の女性の約４．２％、男性の約２．７％、性感染症外来診療所（ＳＴＤクリニック）で最大１５％、高リスクグループで２０％超に影響を及ぼしている。米国疾病管理予防センターと欧州疾病予防管理センターの両方が、近年のクラミジア感染率の増加を報告した。性的行動の変化、予防と教育の欠如だけでなく、改善された検出システムを用いたより頻繁な試験を含め、いくつかの要因が診断されたＣＴ感染の増加を説明し得る。しかし、多くの感染症は無症候性であり、依然として検出されていない。女性の８５％および男性の６０％までが無症候性であり、それにより多くの未治療のＣＴ感染症をもたらすと推定されている。当該感染症は、尿道炎および子宮頸管炎の一般的な原因であり、主な問題は、ＰＩＤ、子宮外妊娠、卵管性要因不妊症を含め女性の後期合併症である。これらの後期合併症が、ＣＴ有病率を下げるための多くのスクリーニングイニシアチブの理由であり、また、影響を受ける女性と社会的費用の両方のためにこれらの後期合併症を減らす。
【０００７】
クラミジア種は、偏性細胞内細菌であり、宿主内で２つの発達形態で表される。すなわち、（１）複製形態内の細菌を表す細胞内非感染性網様体（ＲＢ）、および（２）宿主細胞を標的とする感染性粒子として作用する細胞外の基本小体（ＥＢ）である。単純化のため、以下、略語ＲＢおよびＥＢも使用する。
【０００８】
ＥＢは、細菌の外膜タンパク質と異なる宿主細胞の受容体との相互作用後に、宿主細胞に内在化することができる。内在化後、ＥＢは、リソソームとの融合を妨げる細菌封入体タンパク質を発現し、微小管形成中心に輸送される。この場所で、ＥＢはＲＢに分化する。ＲＢは、二分裂によって複製し、その後、発達サイクルの終わりにＥＢに再分化することができる。ＥＢは、宿主細胞の溶解後または放出を介して細胞から出ることができ、他の宿主細胞に感染し得る。クラミジアＥＢは、病原体／パターン認識受容体と呼ばれる自然免疫系の受容体を用いて宿主生物によって認識され、先天性免疫反応と適応免疫反応の両方を誘発する。しかしながら、免疫反応に関連する炎症は、通常それほど明白ではなく、ほとんどの感染症は無症候性である。
【０００９】
残念ながら、クラミジアトラコマチスの現在の診断は時間がかかり、高価であり、また、優れた迅速診断テスト（Ｒａｐｉｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔ：ＲＤＴ）またはいわゆるポイントオブケア（Ｐｏｉｎｔ  ｏｆ  Ｃａｒｅ：ＰｏＣ）テストはまだ高い感受性と特異性を備えていない。主に２つの方法が利用可能であり、２つの方法としては、真に生存可能なＣＴ粒子（ＥＢ）のための古い金標準的培養に基づく診断と、現在、金標準的である核酸増幅検査（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｓ：ＮＡＡＴ）である。
【００１０】
培養に基づく診断検査は、ＣＴ検出のリファレンス検査と長い間見なされていた。異なる解剖学的部位からのスワブは、培養に基づく診断の検体として使用され得る。サンプルを特殊な細胞株の細胞単層上に遠心分離し、そして、４８〜７２時間後、高度な特異的染色により、特徴的な細胞質内封入体の存在について細胞を分析することができる。しかしながら、培養は生存可能な生物を必要とするため、不適切な検体の収集、保管、及び輸送、臨床検体中の有毒物質によって、感受性が損なわれ得、また、低細菌負荷を検出できない。その上、この方法は非常に時間がかかり、労働集約的であるため、それゆえに、今日では、児童虐待の場合を除き、診断研究所ではほとんど使用されていない。さらに、ＮＡＡＴと比較したときの感度は、最高の培養研究所で最大５０〜６０％である。
【００１１】
ＮＡＡＴは現在、一般的に、ＣＴ診断の金標準的であると考えられている。ＮＡＡＴは、生存可能な病原体および高負荷に依存せず、それゆえに、培養よりもはるかに感受性がある。ＮＡＡＴのほとんどは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づいており、また、蛍光標識されたプローブを使用して、増幅されたＰＣＲ産物をリアルタイムで検出する。現在、ＮＡＡＴは多くの場合２つの領域をターゲットとする。これは、プラスミドフリー変異体を含むターゲット領域の欠失および組換えに関する問題が過去に示されているためであり、また、染色体ターゲットと比較して１０倍多く存在しているのでプラスミド領域が好ましい領域であるためである。原則として、関連するすべての臨床材料はＮＡＡＴで分析できるが、最初の排尿は男性において推奨されるサンプル様式であり、膣スワブは女性において推奨されるサンプル様式である。男性と対比した女性の晩期合併症の負担に基づいて、女性は男性と比較してより頻繁に検査される。
【００１２】
ＮＡＡＴおよび培養ベースの検査は、通常、主要な研究所で実施され、検体の輸送と臨床医への検査結果の送信が必要になる。その結果、それらの検査では患者が２回目の訪問も必要になる。治療が遅れた場合、または患者が再び現れなく（特に社会的、経済的、教育的環境が低い場合）、治療がまったく行われない場合、感染率が高くなることがある。したがって、患者の近く（Ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−Ｃａｒｅ）で実行できる迅速診断検査（Ｒａｐｉｄ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ｔｅｓｔ：ＲＤＴ）を開発することが望まれる。そのようなＲＤＴは、検査が陽性で、２回目の訪問によって経済的レベルで社会の損害がない場合に、即時の抗生物質治療をさらに可能にする。しかしながら、これらの現在のＲＤＴは、培養およびＮＡＡＴと比較して、感受性と特定性が著しく低く、どこも実践していない。ＲＤＴ開発は、先進国と発展途上国の両方でＣＴ感染と戦うための最優先事項である。
【００１３】
さらに、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（換言すれば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析）を適用して、体液中に存在する病原体の感染を検出することが知られている。この手法は、国際公開第２００９／０６５５８０号に明示されており、発明者および共著者であるＣ．Ｂｏｏｇｅｎ、Ｍ．Ｓｃｈｗａｒｚ、Ｍ．Ｋｏｓｔｒｚｅｗａによって、アメリカ感染症学会の２００８年の年次総会で発表された会議論文でさらに議論されている。要約に示されているように、尿（１ｍＬ）を２ステップ（２０００ｇで３０秒、１５５００ｇで５分）で遠心分離してペレットを得た。次に、ギ酸とアセトニトリルを加えることにより、ペレットからタンパク質を抽出した。この方法により、いくつかの細菌を正しく識別することができている。国際公開第２００９／０６５５８０号によれば、本質的に同じ方法をさらに使用して、リケッチアおよびクラミジアなどのウイルスを識別することができている。しかし、ウイルスを十分大きな量でビリオンの形で得るには、超遠心分離が必要である。「ビリオン」という用語は、感染細胞ではなくウイルス粒子を指すことが知られている。ウイルス粒子には、外側のタンパク質シェルとしてカプシドが含まれている。国際公開第２００９／０６５５８０号に提示された方法では、カプシドのコートタンパク質を取得し、それらを溶解してマトリックス結晶内に組み込むために、ウイルス粒子は特別な分解プロセスに従って分解される。当該開示された方法は、体液中のウイルス粒子をペレットに濃縮するための第１工程と、ウイルス粒子のペレットを分解するための第２工程とを有し、その後、関連タンパク質が上清に存在するようになる、と思える。
【００１４】
しかしながら、その説明には複数の見地で問題がある。まず、上記特別な分解プロセスに関する情報がない。さらに、十分な量の同定が行われない。このようなことは、クラミジアの効果的かつ時宜な検出にとって、とにかく難しいようである。実際、ウイルスが患者の病気に発展する前に、言い換えれば、ウイルスの有効量がまだ少ないときに、クラミジアの検出を可能にする方法を得ることは望ましい。
したがって、ＭＡＬＤＩ質量分析によるクラミジアの同定を可能にするために証明された方法が依然として必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明の目的は、クラミジアトラコマチスの診断など、生物における微生物感染の診断のための改善された方法を提供することであり、それは、ＮＡＡＴ型検査の臨床感度に少なくとも匹敵する臨床感度を有し、臨床医への患者の２回目の訪問を必要としない。
さらに、本発明の目的は、微生物感染、特にクラミジアトラコマチスの診断のためのシステムを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
第１の態様によれば、本発明は、生物における微生物感染の診断方法であって、前記微生物感染が前記生物の細胞材料中に基本小体として少なくとも部分的に存在し、
前記診断方法は、
前記生物から細胞材料のサンプルを得る工程と、
当該サンプルを処理して、前記サンプルが基本小体を含む限り、前記基本小体に富む試験組成物を得る工程と、
多くても予め定められた最大数の基本小体を含む一体積量の前記試験組成物をＭＡＬＤＩ質量分析法に供して、前記微生物感染の存在を同定する工程と、を含む方法を提供する。
【００１７】
第２の態様によれば、本発明は、微生物感染の診断システムであって、前記微生物感染が生物の細胞材料中に基本小体として少なくとも部分的に存在し、
前記診断システムは、
細胞材料のサンプルの（１）溶解手段と、
細胞溶解により得られた他の材料から基本小体を分離するための（２）分離手段と、
前記このように分離された基本小体とマトリクス材料の組成物を混合して、前記基本小体を含む試験組成物を得る（３）混合手段と、
予め定められた最大数の基本小体を含む、一体積量の前記試験組成物を分注するための（４）分注ユニットと、
前記試験組成物の質量スペクトルを生成するために設定された（５）ＭＡＬＤＩ質量分析機と、
個々の体積量の複数の質量スペクトルから平均スペクトルを生成し、当該平均スペクトルをリファレンス、典型的にはデータベースからのリファレンスと比較するための（６）プロセッサと、
を組み合わせて含む、システムを提供する。
【００１８】
第３の態様によれば、本発明は、基本小体の同定システムであって、
前記同定システムは、
細胞材料のサンプルの（１）溶解手段と、
細胞溶解により得られた他の材料から基本小体を分離するための（２）分離手段と、
前記このように分離された基本小体とマトリクス材料の組成物を混合して、前記基本小体を含む試験組成物を得る（３）混合手段と、
予め定められた最大数の基本小体を含む、一体積量の前記試験組成物を分注するための（４）分注ユニットと、
前記試験組成物の質量スペクトルを生成するために設定された（５）ＭＡＬＤＩ質量分析機と、
個々の体積量の複数の質量スペクトルから平均スペクトルを生成するための（６）プロセッサと、
を組み合わせて含む、システムを提供する。
【００１９】
また、さらなる態様では、本発明は、基本小体の同定および／または微生物感染の診断のための本発明のシステムの使用に関する。生物中の基本小体の同定の使用は、前記生物から細胞材料のサンプルを得る（１）工程と、当該サンプルを処理して、前記基本小体に富む試験組成物を得る（２）工程と、少なくとも一部の前記試験組成物をＭＡＬＤＩ質量分析法に供して、１つ以上の前記基本小体を同定する（３）工程と、を含む。
【００２０】
本発明は、基本小体を他の細胞物質から効果的に分離して試験組成物を得ることができ、基本小体中のタンパク質は質量分析によって検出可能であるという洞察に基づいている。より具体的には、一体積量当たり限られた数の基本小体を含む複数の体積量の試験組成物を生成することが可能である。限られた数は、例えば最大で１０、好ましくは最大で５、より好ましくは最大で２である。一体積量当たりに１つの基本小体が最も好ましい。これにより、高いシグナル・ノイズ比の質量分析を使用することができる。さらに、一連の体積量を連続して質量分析にかけることも可能である。各体積量は実質的に同じ含有量（すなわち、限られた数であって、おそらく事前定義された数の基本小体）を有しているため、結果のスペクトルおよび／またはその他の結果を、意味ある方法で組み合わせることおよび／または分析することは、簡単である。
【００２１】
さらに、基本小体中のタンパク質濃度は、ＭＡＬＤＩ質量分析法による診断に有益である。ＭＡＬＤＩ質量分析の特に好ましい様式は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳとして知られており、これは、マトリックス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析の略語である。これは、ハイスループットで費用対効果の高い迅速な微生物同定のための新しい手法である。この中で、微生物は、それらのタンパク質フィンガープリント（すなわち、それらの総タンパク質含有量）を、典型的にはライブラリからのリファレンスと比較することにより同定される。
【００２２】
好ましい実施形態では、本方法は、試験組成物の複数の液滴を生成する工程をさらに含み、複数の液滴のそれぞれは、ＭＡＬＤＩ質量分析法に連続的に供される一体積量である。典型的には、液滴は、例えば圧電アクチュエータなどの既知のアクチュエータによって実行される作動に基づいて、マイクロ流体ディスペンサーチップから生成される。液滴の体積量は、適切にはピコリットルの範囲、例えば１〜１０ピコリットルである。
【００２３】
本明細書の関連性の高い実施では、複数の液滴の生成後に選択工程が実行される。このような選択工程により、各体積量が事前定義された最大値よりも少ない基本小体を含むことが確実に行われる。より具体的には、本工程は、各体積量が少なくとも最小数の基本小体を含むことを確実にするように実行される。好ましくは、すべての体積量は同数の基本小体を含み、より好ましくは、この数は１である。しかしながら、少なくとも一部の体積量において、基本小体の数が１より大きいことは除外されない。さらに、基本小体のない体積量も生成されることが可能である。このような体積量は、バックグラウンドを同定するために使用することができる。さらなる処理工程においては、そのような基本小体を有しない体積量のスペクトルを、１つ以上の基本小体を有する体積量のスペクトルから差し引くことができる。これにより、シグナル・ノイズ比がさらに増加すると思われる。
【００２４】
好ましくは、選択工程が、光学画像分析によって実行される。光学画像解析は、例えばカメラで実施される。質量分析による測定のために選択されていない液滴または他の体積量は、例えば電磁シャッターによって液滴流から除去されてもよい。好ましくは、複数の液滴は、液滴ディスペンサーのオリフィスに隣接する位置で観察される。次に、その観察された複数の液滴は、次の分注イベントで自由に飛ぶ液滴としてオリフィスから放出される。ある型では、粒子は適当な波長で照射され、粒子内、より具体的にはエアロゾル粒子内の特定の物質の蛍光をもたらす。適当な照射源は励起レーザーである。あるいは、これらの液滴は選択的にイオン化されない、すなわち、イオン化のためにレーザーで処理されない。
【００２５】
光学画像分析の１つの利点は、特定の体積量の光学画像を登録することができる点である。登録は、画像の形態でも、任意で分析データの形態でもよい。そのようなデータは、例えば、コントラストを示す画像、および／または基本小体数に対応する画像内のドット数の表示、でもよい。分析データの形態での保存は、保存するデータの量を制限するのに適している場合がある。保存した画像またはその分析データは、質量分析計によって生成された複数のスペクトルに基づいてサンプル結果を生成するために、プロセッサによって使用されてもよい。これは、画像またはその分析データを１つの個別に生成されたスペクトルに直接リンクすることができるため、実現可能である。
【００２６】
さらに、後続の光学画像に基本小体が存在しないことが示された場合、プロセッサは特定のプロトコルに入り得る。光学画像のこのような否定的な結果は、基本小体が存在しないか、エラーが発生したことを意味する。プロトコルの一部は、処理と分注の適切なセットアップを検証するアルゴリズムである。いくつかの実施形態では、これは、オペレータへの信号またはアラームの提供として実践されてもよい。別の実施によれば、それにもかかわらず、事前定義された数の、明らかに基本小体がない液滴を選択してもよい。次に、得られた質量分析を、明らかに否定的な結果を検証するために使用する。
【００２７】
好ましくは、試料の試験組成物への処理は、細胞溶解の工程と、溶解した細胞材料の他の部分からの基本小体の分離の工程とを含む。本発明者らは、細胞溶解およびその後の分離により基本小体の完全性を維持できる一方で、例えば網様体および細胞膜を含む他の細胞材料が細胞破片へ崩壊してから除去されることを理解した。細胞溶解にはいくつかの方法が知られているが、最も好ましい方法は超音波処理である。この方法は、細胞を溶解し、より堅固な基本小体はそのまま残すが、さまざまな細胞部分を破壊することができる。しかしながら、液体の均質化、機械的技術、電気的技術（電気穿孔）、化学的技術、あるいはビードビーティングと組み合わせた技術などの別の溶解技術は、除外されない。超音波処理では、高周波音波が細胞をせん断する。超音波処理に使用される電力は、例えば４０〜１００Ｗの範囲で、例えば５０〜８０Ｗである。好ましくは、超音波浴または超音波プローブを使用して実施される。プローブに取り付けられた電源は、例えば２０〜５０ｋＨｚの範囲内で電子的に音エネルギーを生成する。好ましくは、超音波処理は、断続的な期間を伴う複数の期間で実行される。適切には、ボルテックスは、前記超音波処理期間の間に実行される。超音波処理期間は、１５〜４０秒の範囲、例えば２０〜３０秒の範囲が適切であり、断続的な期間は０．５〜５秒と短くてもよい。このバリエーションは除外されない。これらの超音波処理の設定は、従来の細胞溶解用である。そのような設定により、細胞壁は溶解されるが、基本小体は溶解されないことがわかった。
【００２８】
さらなる実施では、分離工程は遠心機によって実行される。この遠心処理は、基本小体が最終的に上清になり、細胞破片から分離されるように構成されている。最も適切には、その後、基本小体を含む組成物が濃縮される。ここでも、遠心処理が適用され、基本小体がペレット化される。あるいは、ろ過や免疫磁気分離などの別の分離技術を使用することもできる。基本小体のこのさらなる濃縮は、ＭＡＬＤＩ質量分析によるその後の測定の分解能を高めると理解されている。明確にするために、国際公開第２００９／０６５５８０号に開示された細菌の細胞溶解技術と比較して、基本小体から細胞破片を除去するために、本発明は細胞溶解後に遠心処理を行うことが認められる。ペレットを得るために分離した基本小体を処理した。
【００２９】
好ましくは、この濃縮工程の後、マトリックス材料を含む組成物を加えて、試験組成物を得る。ＭＡＬＤＩ（Ｍａｔｒｉｘ  ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｉｏｎｉｓａｔｉｏｎ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化）法のフルネームから明らかなように、マトリックス材料の使用はＭＡＬＤＩ法で必要である。好ましいマトリックス材料は、欧州特許第２２１０１１０号から知られ、参照により本明細書に含まれる。マトリックス材料は、典型的には、揮発性溶媒およびさらに１つ以上の添加剤中の組成物として提供される。エタノールなどのアルコールが好ましい溶媒である。添加剤は、例えば、試験組成物のｐＨの制御のために存在する。例えば、添加物は、水、およびトリフルオロ酢酸などの揮発性酸が含まれる。用語「揮発性」は、本発明の文脈において、室温から１００℃までの範囲の温度で蒸発可能な化合物を指すために使用される。より好ましくは、シングルセルＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳとして知られるＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ  ＭＳの様式が使用される。これはそれ自体既知の技術であり、サンプルは、質量分析計によって検出された各サンプルが単一の細胞からの材料を含むように準備する。
【００３０】
一実施態様では、ＭＡＬＤＩ質量分析法で使用するためのマトリックス材料の組成物との混合は、ペレット化された基本小体の再懸濁によって実施される。一実施形態では、試験組成物の富化は、基本小体の実質的な分離を伴うことが認められる。ただし、これは必要とは見なされない。また、試験組成物は基本小体で富化されているが他の固形物は組成物の一部のままである、ということも可能性がある。適切には、基本小体の量は、試験組成物中の全固形物質量に対して少なくとも５０質量％である。より好ましくは、当該量は、全固形物質量に対して少なくとも７０質量％、または少なくとも８０％である。
【００３１】
複数の液滴の分注および任意の液滴の選択に続いて、マトリックス材料は固形物上に、より具体的には基本小体上に結晶化される。ここで、マトリックス材料の組成物の揮発性溶媒が蒸発する。ここで、コーティングされた複数の液滴の流れが生成され、それはエアロゾルビームとしても知られている。次に、１つ以上の基本小体の表面上に結晶化された材料を有する分析物は、レーザーで、典型的には紫外線を使用したレーザーで、照射される。これには、結晶化したマトリックスがレーザー光のエネルギーを吸収し、それを基本小体に伝達するという効果がある。基本小体への直接照射は、むしろそのような基本小体を破壊し得る。さらに、レーザー光の吸収によりプロトンなどの荷電粒子が生成され、タンパク質がイオン化される。このタンパク質のイオン化は、飛行時間型質量分析測定の成功の基礎を形成する。さらなる一実施形態では、液滴は、周囲の雰囲気から真空雰囲気へさらに伝達される。ここで、真空雰囲気は、質量分析を可能にするのに十分に低い圧力の雰囲気である。
【発明の効果】
【００３２】
本発明の方法の第１の利点は、サンプル収集が重要であると見なされないことである。ＣＴを診断する場合、診断を受けている患者がサンプルを収集するか、臨床医がサンプルを収集し得る。予備的な経験に基づいて、懸濁液中の細菌細胞を含むすべてのサンプルは、単一粒子ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析に適したサンプルであり、最初の排尿とスワブ（の安定化バッファー）を含む。
【００３３】
本発明の方法のさらなる利点は、診断を短期間で実行できることである。予備的な実験では、１５〜３０分の時間、例えば２０分などが示されるが、ＮＡＡＴｓテストには５時間かかる。これにより、患者の近く（Ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−Ｃａｒｅ）の治療による方法の適用が可能になる。つまり、患者は診断の結果を待つことができる。診断が陽性の場合、患者は抗生物質などの薬の形態で治療を処方され得る。
【００３４】
それ以上に、この方法の全体的な分解能は良いようである。基本小体中のタンパク質の密度が高いため、タンパク質に依存する、ＭＡＬＤＩ  ＭＳによる適切な検出が容易になる。それぞれが事前定義された限られた数の基本小体を含む液滴の定義は、個々の液滴に基づいたスペクトルを意味のある方法で組み合わせることができるため、さらに役立つ。例えば、平均スペクトルは、個々の液滴の複数のスペクトルに基づいて生成される。スペクトルの数は、適切には１０〜２００、例えば２０〜１００または４０〜８０スペクトルである。十分なシグナル・ノイズ比でスペクトルを取得するこの機能により、感染を示す基本小体があることを確認できるだけでなく、感染の様式、より具体的には感染の原因となる特定の微生物を同定することもできる。
【００３５】
この方法はテストされており、尿中、肛門スワブおよび膣スワブ中でクラミジアを検出するのに適していることがわかっている。ここで、病原体濃度は、スワブに典型的であるように、１０4ＣＦＵ／ｍＬ以下、たとえば１０3ＣＦＵ／ｍＬ以下である。本発明は、わずか１０ＣＦＵ／ｍＬの存在に基づいてクラミジアを検出する可能性を有する。
【００３６】
本方法は、ＣＴによる感染などの微生物感染の検出を主に意図しているが、この方法が基本小体自体の同定に適用されることを排除するものではないことを理解されたい。
【００３７】
本発明のこれらおよび他の態様は、図を参照してさらに説明される。なお、当該図は純粋に図式的であり、縮尺通りに描かれていない。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】図１は、液体試験組成物のための好ましい前処理を有するＭＡＬＤＩ質量分析のための装置の概略図を示す。
【図２】図２は、図１の装置内の粒子流路と質量分析計の概略図を示す。
【図３】図３Ａ〜Ｂは、本発明の方法の一実施形態によるプロセス工程を図式的に示し、図３Ａは液滴の生成および選択を示し、図３ＢはＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析を示す。
【図４】図４は、本発明の方法の一実施形態によるサンプルの処理のフローチャートを示す。
【図５】図５は、本発明による予備実験で得られた質量スペクトルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
図１は、ＭＡＬＤＩ質量分析のための装置の第１実施形態の概略図を示している。図２は、装置の部分２００（以下、飛行経路ユニット２００とも称す）をより詳細に示す。ＭＡＬＤＩ質量分析は、生体物質の同定に特に適している。生物学的材料の好ましい様式の１つは、細菌、真菌、ウイルスなどの微生物である。ＭＡＬＤＩで同定できる他の種類の生物学的材料には、たとえば血球、ペプチドが含まれる。
【００４０】
装置は、サンプルレシーバー１０、導管１１、第１混合ユニット１２、第２混合ユニット１４、および飛行経路ユニット２００を含む。飛行経路ユニットは、乾燥室１５、イオン化室１９１、および飛行時間管１９４を含む。液滴は、例えば、圧電共振器に基づくものなどの液滴噴射器１６によって噴射される。液滴は、乾燥室１５から飛行時間管１９４内に延びる液滴ビーム２４に従う。乾燥すると、液滴ビーム２４は実際に粒子ビーム１９２に変換される。パルスレーザー１８からの放射によるイオン化により、粒子ビーム１９２は、イオンビーム１９５に変換される。質量分析計（図示せず）は、イオンビーム１９５のイオンを測定し、それに基づいてスペクトルを作成する。本発明の一実施形態によれば、パルスレーザー１８のレーザーパルスによってイオン化される粒子を選択するために、形態パラメータ（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）を決定するためのセンサ２０、２２が使用される。これは、特に、有用なスペクトル情報につながり得る、これら粒子のみをイオン化するために行われる。
【００４１】
第１混合ユニット１２は、第１ミキサー１２０、溶媒および／または水のような貧溶媒用の容器１２２、および検出器１２４を含む。１つの容器１２２ではなく、２つの別個の容器が存在してもよい。例えば、患者から得られたサンプル材料は、第１ミキサー１２０内の溶媒および／または貧溶媒で希釈される。検出器１２４は、微生物が測定ビームを流れるときに個々の微生物から散乱される光を検出するように構成された光学検出器が適切である。時間間隔の単位ごとに平均して検出される微生物の数から、密度を決定することができる。そのような検出器１２４はそれ自体知られており、例えばサイトメーターまたはフローサイトメーターである。粒子検出器１２４は、第１ミキサー１２０の制御入力に結合されて示されている。制御機構は、測定密度が事前定義の密度以下になるまで、溶媒および／または貧溶媒の量を増加させる。好ましくは、両方が事前定義された比率で追加される。液体循環回路を使用して、所望の密度が達成されるまで組成物を循環させてもよい。第２混合ユニット１４は、第２ミキサー１４およびマトリックス材料リザーバ１４２を備える。マトリックス材料リザーバ１４２は、第２ミキサー１４０に結合される。第２ミキサー１４は、第１混合ユニット１２から得られる試験組成物にマトリックス材料を混合するように構成される。
【００４２】
液滴発生器１６には、液滴が単一の微生物または他の任意の数の微生物を含むかどうかを評価する手段を設けることができる。そのような検出手段は、ノズルによる噴射の前にチャネル内の懸濁液が見えるように配置されてもよい。発生器１６は、検出手段から得られた情報に応じて、噴射された液滴を第１位置または第２位置に方向付けるための手段をさらに備えることができる。その場合、第１位置は目標位置、すなわち、レーザー源が粒子に放射してイオン化する位置に向かう流路である。第２位置は廃物を入れる位置である。方向付け手段は、液滴を偏向させるように構成されたものか、ノズルを方向付けるように構成された電動ステージである。そのような装置は、欧州特許第２５７７２５４号明細書からそれ自体知られており、参照により本明細書に含まれる。
【００４３】
図３Ａは、液滴発生器１６およびチャンバ１５の一実施形態をより詳細に示している。この図では、チャンバ１５を通る液滴ビーム２４の流路は、垂直方向を有し得る。この実施形態では、検出手段１６１は、液滴発生器１６のノズルからの噴射時に液滴を光学的に感知するように配置される。センサ１６１は、微生物を含まれない液滴を除去するための選択手段１６２、好ましくは電磁シャッターに結合されている。
【００４４】
液滴サイズが小さいため、液滴は迅速に、すなわち流路の最初の数センチメートルで、一定の速度に到達することがわかっている。この速度は、重力と空力抵抗のバランスである。乾燥により、液滴ビーム２４は粒子ビーム１９２に変換される。チャンバ１５には、チャンバ１５内の温度を一定に保つように温度制御された壁が設けられている。一実施形態では、２２〜３０℃の温度が選択される。チャンバ１５にはさらに、均一に分布したシースフローを生成するガス用の入口１６５が設けられている。ガスは、例えば空気または窒素を含み、水蒸気および任意の溶媒の濃度に関して制御される。適切には、水蒸気濃度は、例えば相対湿度が３０％以上になるように、制御される。乾燥室１５を通る飛行中、液滴中のマトリックス材料は検体上で、典型的には微生物上で結晶化し、液滴は飛行中に乾燥し、試験サンプルとして参照される乾燥粒子をもたらす。典型的には、液滴は直径３０〜６０μｍの範囲で発射される。乾燥粒子は、第１実施形態では、３．０μｍ未満の空気力学的径を有し、試験サンプルが単一の細菌を含む。シースフローは、液滴をエアロゾル飛行時間型質量分析計の入口に向けて輸送する。
【００４５】
図３Ｂは、粒子ビーム中の生成された試験サンプルに基づく同定プロセスを示している。レーザーパルスは、パルスレーザー１８から乾燥粒子に発射される。これにより、試験サンプルからの材料のイオン化が行われる。次いで、イオン化された材料は、イオン化された材料を加速するために高電圧が存在するイオン化チャンバ１９１で加速される。イオン化された成分は、荷電グリッド２１６を通過する。結果として、イオンビーム１９５の個々のイオンは、電界のないドリフト領域１９４で分離される。このドリフト領域は、飛行時間管としても知られている。分離されたイオンは、検出器２２０によって検出される。それに結合されたプロセッサは、取得したデータを処理して、既知のデータセットと比較できるスペクトルまたはデータセット２３０（フィンガープリント（指紋））を生成する。
このような既知のデータセットは、典型的にはライブラリに保存される。
【実施例】
【００４６】
ＨｅＬａ細胞の細胞株で増殖させたクラミジアトラコマチス種を用いて試験を実施した。ＨｅＬａ細胞は、科学研究で使用される不死の細胞株の細胞型である。サンプルの準備を図４に示す。出発組成物は、培地ＭにＡ（ＨｅＬａ細胞中の上記種）を含んでいた。ボルテックスを使用する２秒の断続的な期間によって中断された、７０Ｗで２０秒ずつ３回の超音波処理期間を用いて、ＨｅＬａ細胞を超音波処理によって溶解した。その結果、基本小体（ＥＢ）が収集され、他の細胞材料は細胞破片（Ｄ）に破壊された。したがって、超音波処理後、培地（Ｍ）中にＥＢ＋Ｄが存在していた。次に、細胞破片（Ｄ）と基本小体（ＥＢ）を分離するために、細胞材料を遠心分離機に移した。この例では、３つの後続の工程（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）を、増加する回転速度、つまり５００ｘｇ、２５００ｘｇおよび１５，０００ｘｇを使用して実行した。結果として、最初に培地Ｍが除去され、次に細胞破片Ｄの一部が除去され、次に残りの細胞破片Ｄが除去された。これが基本小体（ＥＢ）のペレットにつながった。細胞破片の除去では、典型的には、最初に、より粗い細胞破片が除去され、その後、より細かい細胞破片が除去される。この図では、単純化のために、両方の工程でそれぞれ５０％が削除されるかのように、１／２Ｄを参照している。これは単なる概略であり、厳しい要件ではない。さらに、正確な回転速度を補正できることが理解されよう。さらに、本発明による一実施形態では、３つのステップが実行されるが、この数は変えることができる。その後、ペレットを、保管（例えば−８０℃）または直接使用するためにバッファー（ＢＵＦ）に再懸濁した。
【００４７】
この図は、本発明の方法の特徴付けのための具体的な実施形態を示しているが、診断目的で使用される場合、クラミジアトラコマチスおよびＨｅＬａ細胞の使用は、典型的には、クラミジアトラコマチスを含む可能性のある細胞の使用に置き換えられることが理解されるであろう。そのような診断方法では、破壊工程の前に、細胞を培地と混合してもよい。破壊工程に続いて、基本小体ＥＢは細胞破片と培地から分離される。遠心分離機の使用が好ましいが、遠心分離機は、濾過、膜濾過および／または活性化（常）磁性のビーズを含む他の分離技術によって部分的または全体的に交換することができる。
【００４８】
次に、基本小体（ＥＢ）のペレットをマトリックス材料と接触させることにより、試験組成物を生成した。この例では、マトリックス材料として２−メルカプト−４，５−ジメチルチアゾールを用いた再懸濁が使用された。液滴は、液滴ジェネレータで生成された。各液滴は１０〜１００ピコリットルの範囲の体積量を有する。イメージセンサー、より具体的にはカメラを、液滴ディスペンサーの出口での液滴の記録を可能にするための場所に設置した。イメージセンサーをプロセッサに接続して、典型的には液滴の他の部分よりも暗いドット状の成分が液滴内に存在するかどうかを確認した。液滴が１つのドット状の成分を含む場合、液滴が選択された。液滴が選択されなかった場合、電磁シャッターによって液滴ビームから取り出された。その後、液滴は乾燥セクションを通過した。これにより、ＭＡＬＤＩ質量分析に適したコーティング粒子が生成された。
【００４９】
その後、個々の液滴のＭＡＬＤＩ質量分析を実施した。個々の液滴の質量スペクトルが生成された。スペクトルには十分な信号が含まれていたため、シングル／ノイズ比が十分に大きくなり、スペクトル内の２０〜３０個の重要なピークを区別することができた。本明細書では、粒子ごとに異なる信号部分によって引き起こされるスペクトルレベルに対応するベースラインが、信号から差し引かれる。強度は、ベースラインの高さの局所分散で正規化されている。少なくとも１つの強度を持つピークは、十分に重要であると見なされる。図５に示すスペクトルが得られた。
【００５０】
基本小体だけでなく他のオブジェクトが存在すると予想される場合、分類が行われ得る。そこでは、欧州特許出願公開第２８３６９５８号で明示された方法を使用することができ、それは参照により本明細書に含まれる。
【図１】
2020510829.tif 000003
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月15日(2019.4.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物における微生物感染の診断方法であって、前記微生物感染が、網様体として知られる増殖に適した形態と、基本小体として知られてる細胞の感染に適した別の形態で存在する様式であり、前記微生物感染が前記生物の細胞材料中に基本小体として少なくとも部分的に存在し、
前記診断方法は、
前記生物から細胞材料のサンプルを得る工程と、
前記基本小体の完全性を維持するように前記細胞材料を溶解する工程と、当該溶解した細胞材料から前記基本小体を富化サンプルに分離する工程と、それにマトリックス材料の組成物を添加する工程とを含む、前記サンプルを処理する工程を行い、それにより、前記サンプルが基本小体を含む限り、基本小体に富む試験組成物を生成する工程と、
少なくとも一つで多くても予め定められた最大数の基本小体を含む一体積量の前記試験組成物を、前記サンプルが基本小体を含む限り、ＭＡＬＤＩ質量分析法に供して、前記微生物感染の存在を同定する工程と、を含む方法。
【請求項２】
基本小体に富む前記試験組成物は、当該試験組成物中の全固形物質量に対して少なくとも５０質量％、より好ましくは７０質量％、さらに好ましくは８０質量％の当該基本小体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記方法は、前記試験組成物の複数の液滴を生成する工程をさらに含み、
前記複数の液滴のそれぞれは、前記ＭＡＬＤＩ質量分析法に連続的に供される一体積量である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
一体積量の前記試験組成物をＭＡＬＤＩ質量分析法に供する工程が、前記複数の液滴の分注に続いて、マトリックス材料を固体物、より具体的には基本小体上に結晶化し、マトリックス材料の組成の揮発性溶媒を蒸発させ、それにより当該マトリックス材料でコーティングされた基本小体のエアロゾルビームを生成する工程と、
前記コーティングされた基本小体にレーザーを照射し、タンパク質をイオン化させる工程と、
前記イオン化タンパク質の飛行時間型質量分析測定を実行する工程と、
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
一体積量当たりの基本小体の予め定められた最大数が１０、好ましくは５である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
各体積量が多くても２つの基本小体を含み、好ましくは１つの液滴が単一の基本小体を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記生成した複数の液滴が、選択工程に供され、当該選択工程が、各液滴の光学画像の登録と、当該光学画像の分析に基づく液滴の選択とを含む、請求項３〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記溶解する工程が超音波処理により行われる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記分離が遠心処理を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記遠心処理が、細胞破片から分離された前記基本小体を含む上澄みを与える、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記分離された基本小体の組成物を濃縮する工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記微生物感染が、少なくとも１つの細胞内細菌種によって生じる、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記細菌種がクラミジア属に属し、より具体的にはクラミジアトラコマチスである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記微生物感染が、無症候性である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記ＭＡＬＤＩ質量分析法が、
一体積量の前記試験組成物、好ましくは前記液滴を処理して、当該一体積量に含まれる少なくとも１つの基本小体上に前記マトリックス材料を結晶化し、それにより検体を得る工程と、
前記検体の少なくとも一部をイオン化する工程と、
飛行時間型検出器を使用して前記イオン化した成分を分離し、スペクトルを取得する工程と、
前記微生物感染の同定のために、前記スペクトルを少なくとも一つのリファレンスと比較する工程と、
を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記サンプルの入手が、前もって収集された材料を含む容器からのサンプルの入手である、請求項１〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
前記生物が哺乳動物、好ましくはヒトである、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１８】
網様体として知られる増殖に適した形態と、基本小体として知られてる細胞の感染に適した別の形態で存在する様式の微生物感染の診断システムであって、前記微生物感染が前記生物の細胞材料中に基本小体として少なくとも部分的に存在し、
前記診断システムは、
前記基本小体の完全性を維持するように構成された、細胞材料のサンプルの溶解手段と、
細胞溶解の前記手段により得られた他の材料から基本小体を分離するための分離手段と、
前記このように分離された基本小体とマトリクス材料の組成物を混合して、前記基本小体を含む試験組成物を得る混合手段と、
予め定められた最大数の基本小体をそれぞれ含む前記試験組成物の体積量を分注するための分注ユニットであって、前試験組成物の液滴を生成するための液滴発生器である当該分注ユニットと、
前記試験組成物の質量スペクトルを生成するためであって、飛行経路ユニットを含むように構成されたＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析計装置と、
個々の体積量の複数の質量スペクトルに基づき平均スペクトルを生成し、当該平均スペクトルをリファレンス、典型的にはデータベースからのリファレンスと比較するためのプロセッサと、
を組み合わせて含み、
前記飛行経路ユニットは、
前記マトリックス材料の前記組成物の溶媒を蒸発させて、前記マトリックス材料を固体物上に、より具体的には基本小体上に結晶化させ、コーティングされた前記基本小体のエアロゾルビームを生成する乾燥チャンバーであって、前記液滴発生器から分注された前記液滴が当該乾燥チャンバーに入り、当該乾燥チャンバー内を飛ぶ間に乾燥するように配置された前記乾燥チャンバーと、
前記コーティングされた基本小体にレーザーを照射してタンパク質をイオン化し、当該イオン化した材料を加速して荷電グリッドを通過させるイオン化チャンバーと、
前記イオン化された材料の個々のイオンを分離する飛行時間管と、
を含み、
前記ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ質量分析計装置が、前記分離したイオンを検出するための検出器をさらに含む、システム。
【請求項１９】
光学画像記録装置と、記録された光学画像を分析するための処理手段とを含む光学画像分析手段をさらに含む、請求項１８に記載のシステム。
【請求項２０】
液滴除去手段をさらに含み、当該液滴除去手段が、前記処理手段による前記分析に基づいて駆動される、請求項１９に記載のシステム。
【請求項２１】
前記溶解手段が超音波処理手段を含む、請求項１８〜２０のいずれかに記載のシステム。
【請求項２２】
前記分離手段が遠心機を含む、請求項１８〜２１のいずれかに記載のシステム。
【請求項２３】
基本小体の同定および／または微生物感染の診断のための請求項１８〜２２のいずれかに記載のシステムの使用。
【国際調査報告】
2020510829.tif 000009
2020510829.tif 000010
2020510829.tif 000011