(57)【要約】  人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）は、例えば、乳児栄養、医療用栄養、機能性食品、及び動物用飼料の、機能性成分として用いられてよい。ＨＭＯの製造には、依然として、手法の改善が必要である。本発明は、ＨＭＯの産生を改善する遺伝子組換え微生物、及びそれを用いるＨＭＯの産生方法を提供する。本発明の当該微生物には、細胞内、及び細胞外のＨＭＯを容易に抽出しうる、誘導溶菌系、細胞内ラクトースレベルを高めうる、ラクトース透過酵素変異体、又はＨＭＯの産生の主要な酵素の細胞内可用性を高めうる、シャペロンを含む、１又はそれ以上、の産生を向上させうる改変がされてよい。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
人乳オリゴ糖産生用の遺伝子組換え微生物であって、前記微生物が、場合によっては、細菌、好ましくは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、遺伝子組換え微生物。
【請求項２】
誘導溶菌系を含み、場合によっては、前記誘導溶菌系は、自己誘導性である、請求項１に記載の、遺伝子組換え微生物。
【請求項３】
前記誘導溶菌系は、Ｍｇ２＋により調節されるか、及び／又は前記誘導溶菌系は、場合によっては、外因性遊離Ｍｇ２＋濃度により調節されるか、及び／又は、前記微生物は、場合によっては、Ｍｇ２＋調節プロモーターを含むか、及び／又は、前記微生物は、さらに、場合によっては、さらなるＭｇ２＋調節要素、好ましくは、大腸菌のｍｇｔＡ遺伝子の５’ＵＴＲを含む、請求項２に記載の、遺伝子組換え微生物。
【請求項４】
溶菌遺伝子を含み、場合によっては、前記溶菌遺伝子は、バクテリオファージ由来である、請求項２又は３に記載の、遺伝子組換え微生物。
【請求項５】
前記微生物が、Ｍｇ２＋調節プロモーター、及び溶菌遺伝子を含み、前記溶菌遺伝子の発現が、前記Ｍｇ２＋調節プロモーター、及び、場合によっては、さらなるＭｇ２＋調節要素により制御される、請求項２〜４のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
【請求項６】
前記微生物が、ラクトースを、グルコース、及びガラクトースに切断できない、及び／又は、場合によっては、ｌａｃオペロンが不活化される、好ましくは、欠失により不活化される、前記請求項１〜７のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
【請求項７】
前記微生物が、ラクトース透過酵素をコードする外因性遺伝子を含み、前記ラクトース透過酵素が、好ましくは、大腸菌ＬａｃＹタンパク質であり、場合によっては、Ａ１９８Ｖ、及び／又はＳ２０９Ｉの変異がある、請求項１〜６のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
【請求項８】
人乳オリゴ糖が、２’−フコシルラクトース、及び／又は３’−フコシルラクトースである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
【請求項９】
前記微生物が、フコシル転移酵素をコードする外因性遺伝子を含み、前記フコシル転移酵素は、好ましくは、α−１，２−フコシル転移酵素、及び／又はα−１，３−フコシル転移酵素であり、前記フコシル転移酵素をコードする遺伝子が、場合によっては、異種遺伝子であり、及び／又は場合によっては、異種プロモーターにより駆動され、場合によっては、前記微生物における発現のため、コドンが最適化されている、請求項１〜８のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
【請求項１０】
シャペロンをコードする異種遺伝子を含み、前記シャペロンが、好ましくは、ヒトＨｓｐ７０である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
【請求項１１】
場合によっては、ｒｃｓＡ遺伝子、好ましくは、大腸菌由来の前記遺伝子、が、過剰発現され；及び／又は、場合によっては、Ｌｏｎプロテアーゼファミリータンパク質、好ましくは、大腸菌Ｌｏｎプロテアーゼ、をコードする遺伝子が、不活化され、好ましくは、欠失により不活化され；及び／又は、場合によっては、ｗｃａＪ遺伝子が、不活化され、好ましくは、欠失により不活化され；及び／又は、場合によっては、ｚｗｆ遺伝子、及び２つのｐｎｔＡＢ遺伝子、好ましくは、大腸菌由来の前記遺伝子が、過剰発現され；及び／又は、場合によっては、ｇｓｋ遺伝子、好ましくは、大腸菌由来の前記遺伝子が、過剰発現され；及び／又は、場合によっては、ｔｒｘＡ遺伝子、好ましくは、大腸菌由来の前記遺伝子が、過剰発現され；及び／又は、場合によっては、ｔｒｘＢ遺伝子が、不活化され、好ましくは、欠失により不活化される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
【請求項１２】
人乳オリゴ糖の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物を培地にて培養する工程であって、前記培地は、さらに、場合によっては、ラクトース、及び／又は遊離Ｍｇ２＋を含み、場合によっては、前記培地中の前記人乳オリゴ糖の濃度は、前記培養終了時に、少なくとも３０ｇ／Ｌ、好ましくは、少なくとも５０ｇ／Ｌであり、好ましくは、前記人乳オリゴ糖は、２’−フコシルラクトース、及び／又は３’−フコシルラクトースである、
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の人乳オリゴ糖の製造方法であって、さらに、以下の工程：
（ｂ）前記培養培地由来の、及び／又は前記微生物由来の、人乳オリゴ糖を精製する工程であって、場合によっては、前記人乳オリゴ糖は、溶菌が、誘導溶菌系により誘導された後、前記培養培地から精製されるか、及び／又は、場合によっては、前記人乳オリゴ糖は、前記培地中の遊離Ｍｇ２＋の濃度が、１０μＭ又はそれ未満である場合、及び／又は前記溶菌が、直接可視化されうる場合に、前記培養培地から精製される、
を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法により得られうる、培地、又は請求項１３記載の方法により得られうる、人乳オリゴ糖。
【請求項１５】
動物用飼料の調製のための、請求項１４に記載の培地、又は人乳オリゴ糖の、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人乳オリゴ糖（ｈｕｍａｎ  ｍｉｌｋ  ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅ；ＨＭＯ）を産生する、遺伝子組換え微生物、及び当該微生物を用いてＨＭＯを産生する方法に関する。本発明はさらに、本発明の微生物が培養される培地、本発明の製造方法により産生された、精製ＨＭＯ、及び当該培地、及び当該ＨＭＯの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）は、ヒト母乳中に見出される、構造的に多様な非抱合型グリカンである。現在までに、２００以上のＨＭＯが同定されており、これらはすべて５つの単糖構成要素、すなわちＤ−ガラクトース（Ｇａｌ）、Ｄ−グルコース（Ｇｌｃ）、Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、Ｌ−フコース（Ｆｕｃ）、及びシアル酸誘導体である、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（非特許文献１）のみから構成される。還元末端は、ラクトース、又は、ラクト−Ｎ−ビオース（Ｇａｌ−β１，３−ＧｌｃＮＡｃ、Ｉ型）、又はラクトサミン（Ｇａｌ−β１，４−ＧｌｃＮＡｃ、ＩＩ型、ＬａｃＮＡｃ）である、２構造の、いくつかの二糖単位で伸長された（extended）ラクトースであってよい。ＨＭＯの構造、及び分類は、例えば、非特許文献１の図１、及び表１に記載がある。
【０００３】
ＨＭＯでは、２’−フコシルラクトース（２−ＦＬ）が最も豊富で、全てのＨＭＯの約３０％を占める。さらなる顕著なＨＭＯは、３’−フコシルラクトース（３−ＦＬ）である。他のＨＭＯは、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、及びラクト−Ｎ−フコペンタオースＩである。人乳には、当該中性ＨＭＯ、並びに、酸性ＨＭＯである、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトース、及び３−フコシル−３’−シアリルラクトース、ジシアリルーラクトーＮ−テトラオース等も存在する。ＨＭＯは、カンピロバクター・ジェジュニ菌（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ）、腸管病原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；Ｅ．ｃｏｌｉ）、及び赤痢アメーバ菌（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ）等の病原体を、防御することが知られている（非特許文献２）。２−ＦＬは、毒素や病原体の上皮レベルでの付着を防ぐことにより、感染症を予防する機能があると考えられる。それは、ある種のビフィズス菌、及び受容体アナログの増殖を刺激して、乳児に最も高頻度にみられる毒性、及び病原性の攻撃に対して防御を行う。このような知見に基づき、ＨＭＯ、特に、２−ＦＬ、及び３−ＦＬを、乳児栄養、医療用栄養、機能性食品、及び動物用飼料等の製品の、機能性成分として用いることに、特に、関心がもたれる。
【０００４】
ＨＭＯは、ヒト母乳、又は牛乳から抽出されることができる。しかし、いずれの場合も、大量に獲得すること、及び／又は十分な純度で獲得することは、困難である。
【０００５】
ＨＭＯは化学的に合成されてもよいが、そのための技術は安定しておらず、ＨＭＯを化学的に合成する費用は、高価である。
【０００６】
その一方で、遺伝子組換え微生物におけるＨＭＯ産生は、安定で安全な産生手段を低コストで提供する見込みがある。特許文献１は、ｌａｃＺ遺伝子の不活化を含む、前駆体ラクトース由来の、遺伝子組換えされた大腸菌細胞による、オリゴ糖の産生方法を記載する。特許文献２〜５は、さらに、遺伝子組換え微生物において、２−ＦＬ、又は３−ＦＬを産生する、異なるフコシル転移酵素を記載する。非特許文献３は、遺伝子組換え大腸菌における、２−ＦＬ、又は３−ＦＬの生合成、及びそれに対する複数のモジュール最適化戦略を記載する（非特許文献３）。特許文献４は、培地への２−ＦＬの放出を高める、糖放出体（exporter）を発現する大腸菌を記載する。
【０００７】
２−ＦＬは、ラクトースとフコースからなる（非特許文献４）。大腸菌における、２−（３−）−ＦＬの生合成経路を、図１に模式的に示す。大腸菌は、特定の輸送体を介して、前駆体であるグルコースとラクトースを細胞内に取り込むことができる。グルコースは、リン酸転移酵素系を介して吸収され、グルコース６−リン酸に変換される。後者は、成長を促進する炭素源、及びエネルギー源として、かつ、コラン酸生合成の中間体である、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの前駆体として、機能する。ＧＤＰ−Ｌ−フコースのｄｅ  ｎｏｖｏ生合成経路は、解糖中間体であるフルクトース６−リン酸に由来し、すべて、大腸菌由来である、ＭａｎＡ（マンノース６−リン酸異性化酵素）、ＭａｎＢ（ホスホマンノムターゼ）、ＧＴＰ依存性ＭａｎＣ（マンノース１−リン酸グアニリル転移酵素）、Ｇｍｄ（ＧＤＰ−Ｄ−マンノース４，６−脱水酵素（dehydratase））、及びＮＡＤＰＨ依存性ＷｃａＧ（ＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素）という酵素に基づく（図２）。第２の前駆体であるラクトースは、ラクトース／Ｈ＋共輸送体である、ラクトース透過酵素（permease）ＬａｃＹを介して細胞内に吸収される。２−ＦＬ産生の主要な酵素は、ヘリコバクター・ピロリ（ピロリ菌；Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）由来の、α−１，２−フコシル転移酵素（ＦｕｔＣ）であり、供与体のＧＤＰ−Ｌ−フコースのフコース部分を受容体のラクトースに転移し、２−ＦＬを産生する（図２）。α‐１，３‐フコシル転移酵素をコードするピロリ菌由来のｆｕｔＡ遺伝子で、ｆｕｔＣ遺伝子を置換することで、当該生合成経路を、３’−フコシルラクトースの産生に利用しうる。
【０００８】
最近の進歩にもかかわらず、遺伝子組換え微生物におけるＨＭＯ、特に２−ＦＬ、及び／又は３−ＦＬの生物工学的産生を改良する方法が、依然として必要である。本発明は、大腸菌における、既知の２−ＦＬ生合成経路による、ＨＭＯの合成、及び培地へのその放出を、有意に改善する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第７，５２１，２１２号明細書
【特許文献２】欧州特許第２６７５８９９号明細書
【特許文献３】欧州特許第２８７７５７４号明細書
【特許文献４】欧州特許第２４４０６６１号明細書
【特許文献５】欧州特許第３１９１４９９号明細書
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Petschacher and Nidetzky, J Biotechnol. 2016, 235:61-83
【非特許文献２】Bode, Early Hum Dev. 2015; 91(11):619-22
【非特許文献３】Huang et al., Metab Eng. 2017;(41):23-38
【非特許文献４】Pereira & McDonald, Sci Rep. 2012; 84(1):637-655
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、ＨＭＯ産生を改良する微生物、及びそれを用いたＨＭＯ産生方法、を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
特に、本発明は、細胞内画分を得るためのさらなるプロセシング工程が必要なく、細胞内、及び細胞外のＨＭＯの抽出を容易にしうる、誘導溶菌系を含む、微生物を提供する。誘導溶菌系の好ましい例としては、Ｍｇ２＋で調節される自己誘導溶菌系があり、当該系では、細胞は、Ｍｇ２＋欠乏条件、すなわち、細胞外Ｍｇ２＋濃度が、特定の閾値を下回る場合に、溶菌される。細胞が溶菌されると、細胞内のＨＭＯが培地に放出され、培地中のＨＭＯ濃度が、高まる。これにより、有利には、ＨＭＯの収率が向上し、かつ、時間、及びコストの節約につながりうる。
【００１３】
本発明はまた、ラクトース透過酵素をコードする、外因性遺伝子を含む微生物を提供する。ラクトース透過酵素は、好ましくは、野生型ＬａｃＹと比較して、細胞内ラクトースによる阻害を受けにくい、ＬａｃＹの変異体である。これは、有利には、ＨＭＯの収率を向上させうる。
【００１４】
本発明はさらに、本発明の上記微生物を用いて、ＨＭＯを産生する方法を提供する。
【００１５】
また、ＨＭＯを産生する方法において、本発明の微生物が培養された、培地、及び本発明のＨＭＯを産生する方法により得られた、精製ＨＭＯを提供する。
【００１６】
好適な実施形態は以下のとおりである：
１．  人乳中のオリゴ糖を産生する、遺伝子組換え微生物。
２．  前記微生物が細菌である、１．に記載の、遺伝子組換え微生物。
３．  前記微生物が大腸菌である、１．、又は２．に記載の、遺伝子組換え微生物。
４．  前記遺伝子組換え微生物が、誘導溶菌系を備えることを特徴とする、１．〜３．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
５．前記誘導溶菌系が自己誘導性である、４．に記載の、遺伝子組換え微生物。
６．  前記誘導溶菌系がＭｇ２＋により調節される、４．、又は５．に記載の、遺伝子組換え微生物。
７．  前記誘導溶菌系が、外因性遊離Ｍｇ２＋濃度により調節される、４．〜６．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
８．  前記微生物がＭｇ２＋調節プロモーターを含む、４．〜７．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
９．  前記Ｍｇ２＋調節プロモーターが、ネズミチフス菌（Salmonella  typhimurium）のｍｇｔＢ遺伝子由来のＰｍｇｔプロモーター、又は大腸菌のＰｍｇｔＡプロモーター、である、８．に記載の、遺伝子組換え微生物。
１０．  前記微生物が、さらに、さらなるＭｇ２＋調節要素、好ましくは、大腸菌のｍｇｔＡ遺伝子の５’ＵＴＲ、を含む、８．、又は９に記載の、遺伝子組換え微生物。
１１．  前記微生物が溶菌遺伝子を含む、４．〜１０．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
１２．  前記溶菌遺伝子が、バクテリオファージ由来の溶菌遺伝子である、１１．に記載の、遺伝子組換え微生物。
１３．  前記バクテリオファージが、ラムダバクテリオファージである、１２．に記載の、遺伝子組換え微生物。
１４．  前記溶菌遺伝子は、ラムダバクテリオファージ溶菌遺伝子ＳＲｚ、又はラムダバクテリオファージ変異体Ｓａｍ７溶菌遺伝子である、１３．に記載の、遺伝子組換え微生物。
１５．  前記溶菌遺伝子が、遊離Ｍｇ２＋欠乏条件下で、誘導的に発現される、１１．〜１４．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
１６．  前記微生物が、Ｍｇ２＋調節プロモーター、及び溶菌遺伝子を含み、前記溶菌遺伝子の発現が、Ｍｇ２＋調節プロモーター、及び、場合によっては、さらなるＭｇ２＋調節要素、により制御される、４．〜１５のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
１７．  前記遺伝子組換え微生物が、ラクトースを、グルコース、及びガラクトースに分解できない、１．〜１６．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
１８．  ｌａｃオペロンが、不活化されている、１．〜１７．の、遺伝子組換え微生物。
１９．  前記微生物が、ラクトース透過酵素をコードする外因性遺伝子を含む、１．〜１８．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
２０．  前記ラクトース透過酵素が、大腸菌ＬａｃＹタンパク質である、１９．に記載の、遺伝子組換え微生物。
２１．  前記ラクトース透過酵素のＡ１９８Ｖ、及び／又はＳ２０９Ｉの変異がある、１９．、又は２０に記載の、遺伝子組換え微生物。
２２．  前記人乳オリゴ糖が、２’−フコシルラクトース、及び／又は３’−フコシルラクトースである、１．〜２０．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
２３．  フコシル転移酵素をコードする外因性遺伝子を含む、１．〜２２．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
２４．  前記フコシル転移酵素が、α−１，２−フコシル転移酵素、及び／又はα−１，３−フコシル転移酵素である、２３．に記載の、遺伝子組換え微生物。
２５．  フコシル転移酵素をコードする遺伝子が、異種遺伝子である、及び／又は異種プロモーターにより駆動される、項目２３．、又は２４．に記載の、遺伝子組換え微生物。
２６．  前記微生物における発現のため、フコシル転移酵素をコードする遺伝子のコドンが最適化されている、２３．〜２５．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
２７．  フコシル転移酵素をコードする遺伝子が、ピロリ菌由来のｆｕｔＣ、又はピロリ菌由来のｆｕｔＡである、２３．〜２６．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
２８．  シャペロンをコードする異種遺伝子を含む、１．〜２７．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
２９．  シャペロンが、ヒトＨｓｐ７０である、２８．に記載の、遺伝子組換え微生物。
３０．  前記微生物が、ＧＤＰ−Ｌ−フコースのｄｅ  ｎｏｖｏ合成に関与する、遺伝子の発現を高める、転写調節タンパクを過剰発現する、１．〜２９．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
３１．  ｒｃｓＡ遺伝子が、過剰発現している、１．〜３０．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
３２．  ｒｃｓＡ遺伝子が、大腸菌由来である、３０．、又は３１．に記載の、遺伝子組換え微生物。
３３．  Ｌｏｎプロテアーゼファミリータンパク質をコードする遺伝子が、不活化される、好ましくは、欠失により不活化される、１．〜３２．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
３４．  Ｌｏｎプロテアーゼファミリータンパク質が、大腸菌Ｌｏｎプロテアーゼである、３３．に記載の、遺伝子組換え微生物。
３５．  ｗｃａＪ遺伝子が、不活化される、好ましくは、欠失により不活化される、１．〜３４．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
３６．  ｚｗｆ遺伝子、及び２つのｐｎｔＡＢ遺伝子が、過剰発現する、１．〜３５．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
３７．  ｚｗｆ遺伝子、及びｐｎｔＡＢ遺伝子が、大腸菌由来である、３６．に記載の、遺伝子組換え微生物。
３８．  ｇｓｋ遺伝子が、過剰発現する、１．〜３７．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
３９．  ｇｓｋ遺伝子が、大腸菌由来である、３８．に記載の、遺伝子組換え微生物。
４０．  ｔｒｘＡ遺伝子が、過剰発現する、１．〜３９．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
４１．  ｔｒｘＡ遺伝子が、大腸菌由来である、３９．に記載の、遺伝子組換え微生物。
４２．  ｔｒｘＢ遺伝子が、不活化される、好ましくは、欠失により不活化される、１．〜４１．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物。
４３．  人乳オリゴ糖の製造方法であって、以下の工程：
（ａ）１．〜４２．のいずれか一項に記載の、遺伝子組換え微生物を、培地で培養する方法
を含む、方法。
４４．  前記培地が、ラクトースをさらに含む、４３．に記載の、人乳オリゴ糖の製造方法。
４５．  前記培地が、遊離Ｍｇ２＋をさらに含む、４３．、又は４４．に記載の、人乳オリゴ糖の製造方法。
４６．  前記培養開始前の、前記培地中の遊離Ｍｇ２＋濃度が、５ｍＭ以上である、４５．に記載の、人乳オリゴ糖の製造方法。
４７．  前記培地中の遊離Ｍｇ２＋濃度が、前記培養終了時に、１０μＭ以下である、４５．、又は４６．に記載の、人乳オリゴ糖の製造方法。
４８．  前記培養が、バッチ培養、場合によっては、フィード−バッチ培養、である、４３．〜４７．のいずれか一項に記載の、人乳オリゴ糖の製造方法。
４９．  培養液量が、１０Ｌ以上、好ましくは、１００Ｌ以上である、４３．〜４８．のいずれか一項に記載の、人乳オリゴ糖の製造方法。
５０．  前記培地中の前記人乳オリゴ糖濃度が、前記培養終了時に、少なくとも１５ｇ／Ｌ、好ましくは、少なくとも２０ｇ／Ｌである、４３．〜４９．のいずれか一項に記載の、人乳オリゴ糖の製造方法。
５１．  前記人乳オリゴ糖が、２’−フコシルラクトース、及び／又は３’−フコシルラクトースである、４３．〜５０．のいずれか一項に記載の、人乳オリゴ糖の製造方法。
５２．  さらに、以下の工程： 
（ｂ）培地、及び／又は微生物それ自体、から、人乳オリゴ糖を精製する工程、
を含む、４３．〜５１．のいずれか一項に記載の、人乳オリゴ糖の製造方法。
５３．  誘導溶菌系を介して溶菌を誘導した後に、前記人乳オリゴ糖を、前記培地から精製する、５２．に記載の、人乳オリゴ糖の製造方法。
５４．  前記培地中の遊離Ｍｇ２＋の濃度が、１０μＭ以下である場合に、及び／又は前記溶菌が直接可視化されうる場合に、前記人乳オリゴ糖を、前記培地から精製する、５２．、又は５３．に記載の、人乳オリゴ糖の製造方法。
５５．  前記溶菌が、前記培養物のＯＤ６００値の低下により、直接可視化されうる、５４．に記載の人乳オリゴ糖の製造方法。
５６．  ４３．〜５１．のいずれか一項に記載の方法で得られる、培地。
５７．  ５２．〜５５．のいずれか一項に記載の方法により得られうる、人乳オリゴ糖。
５８．  ５６．の培地、又は５７．の人乳オリゴ糖の、動物用飼料の調製への使用。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】大腸菌における２’−（３’）−フコシルラクトースの生合成を示す図である。Ｇｌｃ−６−Ｐ：グルコース６−リン酸；Ｆｒｕ−６−Ｐ：フルクトース６−リン酸；Ｍａｎ−６−Ｐ：マンノース６−リン酸；６−Ｐ−Ｇｌｕｃ：６−リン酸−グルコン酸；Ｒｉｂｕ−５−Ｐ：リブロース５−リン酸（ribolusoe-5-phosphate）；Ｒｉｂｏ−５−Ｐ：リボース５−リン酸；ＰＰＰ：ホスホリボシルピロリン酸；ｇａｌ：ガラクトース；ｇｌｃ：グルコース；ＸＭＰ：キサントシン５’−一リン酸；ＩＭＰ：イノシン５−一リン酸；Ｐｇｉ：ホスホグルコース異性化酵素；ＭａｎＡ：マンノース６−リン酸異性化酵素；ＭａｎＢ：ホスホマンノムターゼ；ＭａｎＣ：α−Ｄ−マンノース１−リン酸グアニル転移酵素；Ｇｍｄ：ＧＤＰ−マンノース６−デヒドロゲナーゼ；ＷｃａＧ：ＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素；ＷｃａＪ：ＵＤＰ−グルコース担体転移酵素；Ｗｃａ  Ａ−Ｆ、Ｉ−Ｍ：コラン酸生合成遺伝子；ＬａｃＡ：β−ガラクトシドトランスアセチラーゼ；ＬａｃＺ：β−ガラクトシダーゼ；ＬａｃＹ：ラクトース透過酵素；Ｌｏｎ：プロテアーゼ；ＣｌｐＹＱ（ＨｓｌＵＶ）：プロテアーゼ；ＲｓｃＡ：正の転写調節因子；ｇｕａＡ：ＧＭＰ−シンテターゼ；ＧｕａＢ：ＩＭＰ−デヒドロゲナーゼ；ＧｕａＣ：ＧＭＰ−レダクターゼ；ＤｅｏＤ：プリンヌクレオチドホスホリラーゼ；Ｇｐｔ：グアニンホスホリボシル転移酵素；Ｇｎｄ：６−ホスホグルコン酸デヒドロゲナーゼ；Ｎｄｋ：ヌクレオチド二リン酸キナーゼを、各々示す。
【図２】大腸菌発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ−１．を示す図であり、当該ベクターは、二重Ｔ７プロモーター（ＰＴ７）、Ｔ７ターミネーター（ＴＴ７）、ＣｏｌＥ１  ｏｒｉ、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）、ｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）を備える。
【図３】ｐＥＴ−ｍａｎＣＢ−ｇｍｄ−ｗｃａＧを示す図であり、上記大腸菌発現ベクターｐＥＴＤｕｅｔ−１が二重Ｔ７プロモーター（ＰＴ７）、Ｔ７ターミネーター（ＴＴ７）、ｐＢＲ３２２  ｏｒｉ、アンピシリン耐性遺伝子（ａｍｐＲ）、及びｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）を備え、ｍａｎＢ：ホスホマンノムターゼ、ｍａｎＣ：α−Ｄ−マンノース１−リン酸グアニリル転移酵素、ｇｍｄ：ＧＤＰ−マンノース６−デヒドロゲナーゼ、ｗｃａＧ：ＧＤＰ−Ｌ−フコース合成酵素を備える。
【図４】大腸菌発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ−１Ｅを示す図であり、当該ベクターは、二重Ｔ７プロモーター（ＰＴ７）、Ｔ７ターミネーター（ＴＴ７）、ＣｌｏＤＦ１３  ｏｒｉ、ストレプトマイシン耐性遺伝子（ＳｍＲ）、ｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）を備える。
【図５】大腸菌クローニングベクターｐＵＣ１９を示す図であり、当該ベクターは、アンピシリン耐性遺伝子（ＡｍｐＲ）、ｌａｃＺアルファペプチド（ｌａｃＺ’）、ｏｒｉを備える。
【図６】ｐＣＤＦ−ｆｕｔＣ−ｌａｃＹ＊−ｈＨＳＰ７０−ｔｒｘＡ−ＳＲｚを示す図であり、上記大腸菌発現ベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ−１は、二重Ｔ７プロモーター（ＰＴ７）、Ｔ７ターミネーター（ＴＴ７）、ＣｌｏＤＦ１３  ｏｒｉ、ストレプトマイシン耐性遺伝子（ＳｍＲ）、及びｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）を備え、ｆｕｔＣ：α−１，２−フコシル転移酵素、ｌａｃＹ＊：Ｓ２０９Ｉ含有ラクトース透過酵素、ｈＨＳＰ７０：ヒト熱ショックタンパク質７０、ｔｒｘＡ：チオレドキシン、ＳＲＲｚ：５’−ＵＴＲ、及び３’ＬｕｘＩＣＤＡＢＥＧターミネーターを備えるｍｔｇＡ−プロモーターの制御下における、バクテリオファージラムダ由来の溶菌遺伝子。
【図７】大腸菌発現ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１を示す図であり、当該ベクターは、二重Ｔ７プロモーター（ＰＴ７）、Ｔ７ターミネーター（ＴＴ７）、ＣｏｌＡ  ｏｒｉ、カナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）、及びｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）を備える。
【図８】ｐＣＯＬＡ−ｐｎｔＡＢ−ｒｃｓＡ−ｚｗｆ−ｇｓｋを示す図であり、大腸菌発現ベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１は、二重Ｔ７プロモーター（ＰＴ７）、Ｔ７ターミネーター（ＴＴ７）、ＣｏｌＡ  ｏｒｉ、カナマイシン耐性遺伝子（ＫｍＲ）、ｌａｃリプレッサー（ｌａｃＩ）を備え、ｐｎｔＡＢ：膜結合トランスヒドロゲナーゼ、ｒｃｓＡ：コラン酸生合成の正の転写調節因子、ｚｗｆ：グルコース６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ｇｓｋ：グアノシンイノシンキナーゼを備える。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
〔定義と一般的な手法〕
特段の定めのない限り、本明細書中で用いられる全ての技術用語、及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が、一般的に理解するものと同じ意味である。
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ、又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の用語は各々、場合によっては、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ、及びｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」に置き換えられるように用いられてよい。
用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ、又はｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」等の用語は各々、場合によっては、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ、及びｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」に置き換えられるように用いられてよい。
【００１９】
用語「遺伝的組換えされた（genetically  modified）」とは、細胞の遺伝物質が、当該細胞に導入された、いかなる改変をもいう。これには、新規遺伝物質の導入、遺伝物質の欠失、遺伝物質の変異等があげられる。
用語「誘導溶菌系」とは、細胞溶菌が、外的刺激により誘導されてもよいことをいう。用語「自己誘導性」は、外的刺激が、必ずしも、本発明を実施する当業者により、能動的に適用される必要がないことをいう。
用語「外的刺激（external stimulus、又はexternal stimuli）」とは、細胞外から当該細胞に、適用される、化学的、又は物理的な刺激をいう。
【００２０】
用語「Ｍｇ２＋調節」とは、遊離マグネシウム（Ｍｇ２＋）イオンの有無により、ある物質が調節されることをいう。用語「外因性遊離Ｍｇ２＋濃度」とは、細胞を取り囲む培地等の、外部から、細胞に作用される、遊離Ｍｇ２＋イオンの濃度をいう。用語「Ｍｇ２＋欠乏条件」とは、培地中の遊離Ｍｇ２＋濃度が低いか、又は培地中に遊離Ｍｇ２＋が完全に存在しないことをいう。
【００２１】
「溶菌遺伝子」とは、ある因子、例えば、細胞内で発現されると、細胞溶菌を引き起こすようなタンパク質、をコードする遺伝子である。
用語「誘導的に発現される」は、遺伝子が構成的に発現されるのではなく、代わりに、発現が外的刺激により誘導されてよいことをいう。
【００２２】
用語「溶菌遺伝子は、Ｍｇ２＋調節プロモーターにより制御される」は、遊離のＭｇ２＋イオンの有無により、当該プロモーターが各々、活性、又は不活性である場合に、当該遺伝子が発現されるか、又は発現されないことをいう。
「遊離Ｍｇ２＋イオン」とは、例えば、ＥＤＴＡ等のキレート剤により複合体化されていない、例えば、培養培地、に溶解されたものをいう。すなわち、例えば、キレート剤を添加して、培地中の遊離Ｍｇ２＋の濃度を低下させてよい。本明細書において、特記しない限り、「Ｍｇ２＋」は、「遊離Ｍｇ２＋イオン」をいう。
【００２３】
用語「外因性遺伝子」は、例えば、遺伝子導入により、細胞外から細胞に導入される遺伝子をいう。しかしながら、用語「外因性遺伝子」は、当該遺伝子の起源を決定づけるものではなく、例えば、大腸菌中の外因性遺伝子が、大腸菌由来であっても、又は他の生物に由来するものでもよい。外因性遺伝子は、例えば、プラスミド等の、（発現）ベクター中に存在する、エピソームであってもよく、又は、当該細胞の染色体中に組み込まれてもよい。
【００２４】
用語「異種遺伝子」とは、外部から細胞に導入され、かつ、導入された当該細胞とは異なる生物に由来する遺伝子をいい、例えば、大腸菌中の異種遺伝子は、大腸菌に由来しない。異種遺伝子は、例えば、プラスミド等の、（発現）ベクター中に存在する、エピソームであってもよく、又は、当該細胞の染色体中に組み込まれてもよい。
【００２５】
「異種プロモーター」とは、ある遺伝子に作動しうるように連結される場合に、当該遺伝子と本来的に結合するプロモーターではないプロモーターをいう。
【００２６】
外因性、又は異種の遺伝物質は、当技術分野で一般的な公知技術により、微生物に導入することができる。たとえば、遺伝物質を、遺伝子導入により、細菌に導入することができる。遺伝子導入は、例えば、化学的にコンピテントな細菌の熱ショックにより、又はエレクトロコンピテントな細菌のエレクトロポレーションにより、行うことができる（例えば、Hanahan  et  al.,  Methods  Enzymol.1991;204:63-113;Miller  and  Nickoloff,Methods  Mol  Biol.1995;47:105-13参照）。
【００２７】
外因性、又は異種性遺伝物質は、ラムダレッド系を介する組込み、又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９等の、当技術分野で一般的な公知技術により、細胞の染色体に組み込まれることもできる（例えば、Juhas  and  Ajioka,Microb  Cell  Fact.2016;15(1):172;Reisch  and  Prather,Sci  Rep.2015;5:15096を参照）。
【００２８】
大腸菌等の、特定の生物に「由来」する遺伝子は、（すなわち、変異、及び／又はコドン最適化によって、配列を修飾せずに）前記生物から（直接得られる）各遺伝子であってよい。あるいは、また、当該生物由来の元来の配列に、（例えば、１〜１０、好ましくは１〜５、より好ましくは１〜３の）突然変異が導入されることにより得られる、突然変異体が含まれてもよく、及び／又はコドンが最適化された変異体もまた、含まれる。
【００２９】
用語「微生物における発現のために最適化されたコドン」とは、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の核酸配列が、当該遺伝子が導入される生物における、タンパク質への翻訳のために、最適化されることをいう。
【００３０】
本発明に関する微生物が、特定のタンパク質をコードする遺伝子を含むと特定される場合は、当該微生物はまた、当該コードされたタンパク質を産生する遺伝子を発現することが意図される。
【００３１】
遺伝子の文脈における用語「過剰発現された」、又は「過剰発現」は、遺伝子が過剰発現される微生物における当該遺伝子の発現レベルが、当該遺伝子を過剰発現しない同一微生物における同一遺伝子の発現レベルよりも高いことをいう。遺伝子は、当技術分野で一般的な公知技術により、過剰発現されることができる。例えば、さらなる外因性遺伝子のコピーを細胞に導入することができ、細胞を外因性転写アクチベーターで処理することができ、又は転写アクチベーターをコードする外因性遺伝子を、細胞に導入することができる。本発明では、さらなる遺伝子のコピーの導入が、好ましい。
【００３２】
遺伝子の「不活化」とは、当該遺伝子が、いかなる機能的なタンパク質をも発現しないことをいう。これには、機能不全のタンパク質がほぼ完全に、又は完全に発現しないことがあげられる。ほぼ完全に、又は完全に発現しないことは、例えば、プロモーター等の制御配列の欠失、遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の（一部の）欠失、又はプロモーター、及びＯＲＦを含む遺伝子全体の欠失により、達成されることができる。すなわち、遺伝子のノックアウトもまた、当該用語により包含される。機能不全タンパク質の発現は、例えば、部分的欠失、点変異、及び／又は、例えば、切断された、及び／又は触媒的に不活性な、タンパク質の発現をもたらす、ＯＲＦ中の／又はＯＲＦへの挿入により達成されることができる。欠失、点変異、及び／又は挿入を導入する方法は、当技術分野において周知である。例えば、Reisch  and  Prather,2015(supra)、Zerbini  et  al.(Microb  Cell  Fact.2017;16(1):68)、又はJensen  et  al.(Sci  Rep.2015;5:17874)を参照されたい。
【００３３】
特定のヌクレオチド配列、例えば、目的の特定の遺伝子のもとになる配列、又はプロモーター配列等は、例えば、大腸菌等の生物のゲノム配列から、ポリメラーゼ連鎖反応により増幅することができるか、又は当技術分野で一般的に公知の方法により、化学的に合成することができる。
【００３４】
ＧｅｎＢａｎｋ受託番号（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）番号とは、ＧｅｎＢａｎｋで用いられる固有の識別子をいい、例えば、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/からアクセスしうる。遺伝子識別子（ＧＩ）とは、特定の遺伝子を識別するために用いられる固有の番号いい、例えば、https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/から、クエリーされる。
【００３５】
〔実施形態〕
＜ＨＭＯ産生用の遺伝子組換え微生物＞
本発明は、ＨＭＯの産生用の遺伝子組換え微生物の提供に関する。
【００３６】
本発明において産生される当該ＨＭＯは、二糖ラクトース、又はＮ−アセチルラクトサミンに基づく。ラクトースに基づくＨＭＯが、好ましい。
【００３７】
本発明に関連する、好ましい人乳中のオリゴ糖類としては、２’−フコイルラクトース（２−Fucoyllactose（ＦＬ））、３’−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、３’−シアリルラクトース（３−ＳＬ）、６’−シアリルラクトース（６−ＳＬ）、ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）、ラクト−Ｎ−ヘキサオース（ＬＮＨ）、イソ−ラクト−Ｎ−オクタオース、イソ−ラクト−Ｎ−ネオオクタオース、パラ−ラクト−Ｎ−オクタオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ  Ｉ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩ（ＬＮＦＰ  ＩＩ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ（ＬＮＦＰ  ＩＩＩ）、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ（ＬＮＦＰ  Ｖ）、ＬＳ−四糖ａ（ＬＳＴ  ａ）、ＬＳ−四糖ｂ（ＬＳＴ  ｂ）、ＬＳ−四糖ｃ（ＬＳＴ  ｃ）、及びジシアリルラクト−Ｎ−テトラオース（ＤＳＬＮＴ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００３８】
２−ＦＬ、及び／又は３−ＦＬの三糖類は、好ましくは、本発明において製造され、２−ＦＬが、特に、好ましい。２−ＦＬ、及び３−ＦＬの構造は、非特許文献４に示される。
【００３９】
本発明は、２−ＦＬ、及び／又は３−ＦＬの産生に関する、遺伝子操作、及び腸内細菌大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）Ｋ−１２株における経路に関して、より詳細に記載される。しかし、本発明は、大腸菌、又は大腸菌以外の微生物における、他のＨＭＯの産生についても、同様に適用することができる。２−ＦＬ、及び／又は３−ＦＬ以外のＨＭＯの微生物学的産生は、以前から報告がある。例えば、Ｐｒｉｅｍらは、髄膜炎菌（Neisseria  meningitides）由来のβ１，３−Ｎ−アセチルグルコサミニル転移酵素ＬｇｔＡ（例えば、ＧＩ：９０４２２６）の発現を用いて、ラクトースをグリコシル化して、ＧｌｃＮＡｃ−β１，３−Ｇａｌβ１，４−Ｇｌｃを獲得しうることを示した。これは、同様に髄膜炎菌由来である、β１，４−ガラクトシル転移酵素ＬｇｔＢ（例えば、ＧＩ：９０４２２７）により、さらに、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）に延伸することができる（Priem  et  al.,Glycobiology.2002;12(4):235-40）。さらに、ピロリ菌のβ１，３−フコシル転移酵素ＦｕｔＡ、又はＦｕｔＢにより触媒される、ＬＮｎＴの細胞内フコシル化により、ラクト−Ｎ−ネオジフコヘキサオースＩＩ  （ＬＮｎＤＦＨＩＩ）を主生成物とする、ＨＭＯ混合物を得ることができる（Dumon  et  al.,Biotechnol  Prog.2004;20(2):412-9）。Ｈａｎらは、異なる製造方法について、さらに議論する（Han  et  al.,2012,Biotechnol  Adv.2012; 30(6):1268-78）。
【００４０】
本発明で用いられる微生物は、特に限定されない。好ましくは、ＨＭＯを産生する本来的な機能が備わっているか、又はＨＭＯを細胞内で産生する前駆体分子を産生しうるか、又は細胞外空間から当該前駆体を導入しうる、微生物である。微生物の例としては、細菌、又は酵母があげられる。細菌の例としては、大腸菌、エルウイニア‐ヘルビコラ（Erwinia  herbicola（パントエア菌；Pantoea agglomerans）、シトロバクター‐フロインディ（Citrobacter  freundii）、Pantoea  citrea菌、軟腐病菌（Pectobacterium  carotovorum）、又はカンキツかいよう病菌（Xanthomonas  campestris）があげられる。バチルス属の細菌もまた、用いることができ、それらには、枯草菌（Bacillus  subtilis）、バチルス‐リケニフォルミス菌（Bacillus  licheniformis）、バチルス‐コアグランス菌（Bacillus  coagulans）、Bacillus  thermophilus菌、Bacillus  laterosporus菌、バシラス‐メガテリウム菌（Bacillus  megaterium）、Bacillus  mycoides、Bacillus  pumilus、Bacillus lentus、セレウス菌（Bacillus  cereus）、及びBacillus circulansがあげられる。同様に、属ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属、及びラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌は、本発明の方法を用いて、改変されてよく、これらの細菌としては、アシドフィルス菌（Lactobacillus  acidophilus）、乳酸菌LS1（Lactobacillus  salivarius）、プランタルム菌（Lactobacillus  plantarum）、ラクトバチルス・ヘルベティカス菌（Lactobacillus  helveticus）、ラクトバチルス・デルブリッキー菌（Lactobacillus  delbrueckii）、ラクトバチルス・ラムノーサス菌（Lactobacillus  rhamnosus）、ブルガリア菌（Lactobacillus bulgaricus）、Lactobacillus  crispatus、ラクトバチルス・ガセリ菌 （Lactobacillus  gasseri）、カゼイ菌（Lactobacillus  casei）、ラクトバチルス・ロイテリ菌(Lactobacillus  reuteri)、Lactobacillus  jensenii、及びラクティス菌（Lactococcus  lactis）があげられるが、これらに限定されない。サーモフィルス菌（Streptococcus  thermophilus）、及びプロピオニバクテリウム‐フロイデンライヒ菌（Propionibacterium  freudenreichii）もまた、本発明に適する細菌種である。また、本発明の一部としては、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属（例えば、エンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus  faecium）、及びEnterococcus  thermophiles）、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium  longum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス(Bifidobacterium  infantis)、及びビフィドバクテリウム・ビフィダム（Bifidobacterium bifidum）、Ｓｐｏｒｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属の細菌、Ｍｉｃｒｏｍｏｓｐｏｒａ属の細菌、マイクロコッカス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌、ロドコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）属の細菌、及びシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属（例えば、シュードモナス・フルオレッセンス菌（Pseudomonas  fluorescens）、及び緑膿菌（Pseudomonas  aeruginosa））から改変された菌株があげられる。酵母の例としては、出芽酵母（Saccharomyces  cerevisiae）、乳酵母（Kluyveromyces  lactis）、及びメタノール資化酵母（Pichia pastoris）があげられる。微生物は好ましくは細菌であり、大腸菌が、特に好ましい。用いられる大腸菌株は特に限定されない。
【００４１】
細菌細胞からのＨＭＯの放出は、工業的産生に不可欠なプロセスである。２−ＦＬの収率の約５０％は細胞内に残存し、残りは、培地中に放出される（非特許文献３）。全２−ＦＬ量を獲得するには、１００℃での熱誘導溶菌が必要である。本発明の微生物では、自己溶菌系を確立して、回収プロセスを改善する。すなわち、本発明の微生物は、誘導溶菌系を含んでよい。当該溶菌系の種類は、外的刺激により溶菌を誘導できるのであれば、特に限定されない。例えば、バクテリオファージラムダ（Ｓ、Ｒ、及びＲｚ）の溶菌遺伝子は、Ｍｇ２＋−抑制性ＰｍｇｔＡ−ＵＴＲプロモーター（Tamekou  Lacmata  et  al.,Bioengineered.2017;26:1-6）の制御を受けうる。遊離Ｍｇ２＋が（例えば、１０μＭ以下に）消費されると、溶菌遺伝子の合成が誘導され、細胞壁成分のペプチドグリカンの分解により、培地への２−ＦＬの放出が、促進される。Ｚｈａｎｇら（J  Microbiol  Methods.2009;79(2):199-204）に記載されるＭｇ２＋制御プロモーター、Ｌｉｕ、及びＣｕｒｔｉｓｓ（Proc  Natl  Acad  Sci  USA.2009;106(51):21550-4）に記載されるニッケル誘導系、熱感受性ラムダリプレッサー（Juhas  et  al.,PLoS  One.2016;11(10):e0165778）、ナイシン誘導性プロモーター（Visweswaran  et  al.,Appl  Microbiol  Biotechnol.2017  Feb;101(3):1099-1110）、アラビノース誘導性プロモーター（Masuda  et  al.,FEMS  Microbiol  Lett.2016;363(6)）、MgSO4がシステムに対抗するアラビノース誘導性プロモーター（Li  et  al.,Curr  Microbiol.2016;72(4):390-6）、又は溶媒の添加による溶菌誘導（Hajnal  et  al.,Appl  Microbiol  Biotechnol.2016;100(21):9103-9110）に基づく、自己溶菌系の確立に利用可能な、いくつかの代替手段がある．当該系をまた、表１にまとめる。
【００４２】
表１  誘導自己溶菌系
【００４３】
【表１】
2020528759.tif 000003
Ｍｇ２＋制御系には、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、（Ｃａ２＋やＭｇ２＋等の）金属イオンを隔離するキレート剤を添加することによって、細胞溶菌を促進することができるという利点がある。さらに、二価金属イオンとしてのＭｇ２＋が、α−１，２−、及びα−１，３−フコシル転移酵素活性に必要である（Zhang  et  al.,Glycobiology.2010;20(9):1077-88;Zhao et al.,Chem Commun(Camb).2016;52(20):3899-902）。すなわち、Ｍｇ２＋の存在下では、酵素活性が促進されるために、２’−フコシルラクトース合成が改善されうるが、その一方で、Ｍｇ２＋の非存在下では、細胞溶菌は、細胞壁破壊を介して、生成物の回収を促進するように誘導される。したがって、Ｍｇ２＋調節系は、本発明において、好ましく用いられ、好ましくは、Ｍｇ２＋調節系はＭｇ２＋抑制性である。
【００４４】
誘導溶菌系では、Ｍｇ２＋調節プロモーターを用いることができる。Ｍｇ２＋調節プロモーターは、好ましくは、外因性遊離Ｍｇ２＋濃度で、調節される。好ましくは、Ｍｇ２＋欠乏条件下で、活性である。Ｍｇ２＋欠乏条件は、増殖培地が、遊離Ｍｇ２＋を５００μＭ以下、１００μＭ以下、５０μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、又は０μＭ含む条件である。好ましくは、Ｍｇ２＋欠乏条件は、遊離Ｍｇ２＋が、１０μＭ以下である。Ｍｇ２＋調節プロモーターは、好ましくは、ネズミチフス菌のｍｇｔＢ遺伝子（例えば、ＧＩ：１２５０９９８）由来のＰｍｇｔＢプロモーター、ネズミチフス菌のｐａｇＣ遺伝子（例えば、１２４８２４１）由来のＰｐａｇＣプロモーター、又は大腸菌のｍｇｔＡ遺伝子（例えば、ＧＩ：９４８７７８）由来のＰｍｇｔＡプロモーターである。ネズミチフス菌のｍｇｔＢ遺伝子由来のＰｍｇｔＢプロモーターは、例えば、Ｚｈａｎｇら（２００９；前出）に記載のとおりであり、かつ、例えば、ネズミチフス菌ゲノムを鋳型として、以下のプライマー、５’−ＧＴＡＴＡＣＴＣＣＧＧＡＧＣＡＡＡＡＣＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＣ−３’（配列番号１）、及び５’−ＴＣＴＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＴＡＣＧＴＧＣＴＡＴＴＴＴＡＧ−３’（配列番号２）を用いた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により獲得することができる。大腸菌由来のＰｍｇｔＡプロモーターは、例えば、Tamekou  Lacmataら,2017(前出)に記載のとおりであり、は、例えば、大腸菌ゲノムを鋳型として、以下のプライマー、５’−ＣＧＡＧＣＴＣＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＣＧＣＧ−３’（配列番号３）、及び５’−ＣＧＡＧＣＴＣＧＣＧＣＧＡＴＡＡＴＡＴＡＣＣＴＣＴＧＧＧＣ−３’（配列番号４）を用いた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により獲得することができる。
【００４５】
Ｍｇ２＋調節プロモーターは、大腸菌のｍｇｔＡ遺伝子の５’ＵＴＲ等の、さらなるＭｇ２＋調節要素と組み合わされてもよい。大腸菌由来のｍｇｔＡ遺伝子の５’ＵＴＲは、例えば、Tamekou  Lacmataら,2017(前出)記載のとおりであり、かつ、ＰｍｇｔＡプロモーターは、ｍｇｔＡ  ５’ＵＴＲと共に、例えば、大腸菌ゲノムを鋳型として、プライマー５’−ＣＧＡＧＣＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＣＡＴＣＡＧＣＣＣＧ−３’（配列番号３）、及び５’−ＣＧＡＧＣＴＣＡＡＧＧＴＣＣＴＣＣＣＧＣＡＣＴＧＴ−３’（配列番号５）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により獲得することができる。
【００４６】
誘導溶菌系を含む微生物は、さらに、１又はそれ以上の溶菌遺伝子を含んでよい。当該溶菌遺伝子は、細胞内で発現されると、細胞を溶菌することができる限り、特に限定されない。例えば、当該溶菌遺伝子は、ラムダバクテリオファージ、ＭＳ２バクテリオファージ、ファイＸ１７４バクテリオファージ、又はＲＬＴバクテリオファージ等のバクテリオファージ由来であってもよい。溶菌遺伝子の例としては、Ｍａｓｕｄａら、２０１６（前出）により記載される、大腸菌由来のｙｄｆＤ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｄｙｓｇａｌａｃｔｉａｓｅ亜種ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓ由来のｓｉｃＧ、大腸菌由来のｖａｎＸ、サルモネラファージＰ２２由来のＳＲＲｚ、サルモネラ菌（Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｃａ）血清型パラチフス菌（Ｐａｒａｔｙｐｈｉ  Ａ）由来のｙｎｃＥ、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus  aureus）ファージＰ６８由来の溶菌遺伝子があげられる。
【００４７】
溶菌遺伝子の好ましい例としては、（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ＿００１４１６の配列に見られるような）ラムダバクテリオファージ由来のＳＲＲｚ遺伝子、又はＳ遺伝子の１６１位のＧがＡへ変異した、そのＳａｍ７変異体、Ｅタンパク質をコードするＭＳ２ファージ溶菌遺伝子、又はＬタンパク質をコードするファイＸ１７４バクテリオファージ溶菌遺伝子である。ＳＲＲｚ遺伝子は、例えば、Ｚｈａｎｇら（２００９；前出）に記載のとおりであり、例えば、ラムダバクテリオファージゲノムを鋳型とし、かつ、プライマー５’−ＣＣＧＣＡＴＡＴＧＡＡＡＡＡＡＡＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＴＧＡＧ−３’（配列番号６）、及び５’−ＴＴＡＧＴＣＧＡＣＧＣＡＡＣＴＣＴＴＣＴＴＧＣＴＣ−３’（配列番号７）を用いた、ＰＣＲにより獲得することができる。ＭＳ２バクテリオファージ溶菌遺伝子、又はファイＸ１７４バクテリオファージ溶菌遺伝子は、Ｊｕｈａｓら（２０１６；前出）記載のとおりである。
【００４８】
当該微生物はまた、同じか、又は異なる、２又はそれ以上の溶菌遺伝子を含んでよい。異なる作用メカニズムが、より効率的な溶菌につながる場合があるため、場合によっては、２又はそれ以上の異なる溶菌遺伝子の組み合わせを用いることができる。例えば、当該微生物は、ラムダ、及びＭＳ２バクテリオファージ、ラムダ、及びファイＸ１７４バクテリオファージ、ＭＳ２、及びファイＸ１７４バクテリオファージ、又はラムダ、ＭＳ２、及びファイＸ１７４バクテリオファージ、由来の溶菌遺伝子を含んでよい。しかしながら、本発明は、これらの組合せに限定されず、記載された他の溶菌遺伝子を、単独、又は組合せて用いてよい。好ましくは、２又はそれ以上の溶菌遺伝子は、タンデムに配置されてよく、多シストロン的に、同一のプロモーター、及び同一の、場合によっては、さらなる調節要素により制御される。
【００４９】
１又はそれ以上の溶菌遺伝子を、Ｍｇ２＋欠乏条件下で、誘導的に発現させることができ、好ましくは、さらなる調節要素の有無にかかわらず、Ｍｇ２＋調節プロモーターにより、制御される。ｍｇｔＡ遺伝子の５’ＵＴＲがさらなる調節要素として用いられる場合、溶菌遺伝子の発現カセットは、好ましくは、Ｍｇ２＋調節プロモーター、ｍｇｔＡ遺伝子の５’ＵＴＲ、溶菌遺伝子のＯＲＦをその順で含む。
【００５０】
上記のように誘導可能な溶菌に用いられうる発現カセットは、発現ベクター、例えばプラスミド等の、エピソームベクターとして当該微生物中に存在し得るか、又は宿主染色体中に組み込まれてよい。
【００５１】
さらに、ＨＭＯの前駆体はラクトースであるので、ＨＭＯの細胞内産生では、ラクトースの細胞内レベルが高いことが望ましい。したがって、本発明の微生物は、ラクトースを、グルコース、及びガラクトースに切断することができなくてもよい。これは、ラクトース切断に関与する、β−ガラクトシダーゼＬａｃＺをコードするｌａｃＺ遺伝子を不活化するか、ＬａｃＺ、ラクトースリプレッサーＬａｃＩ、トランスアセチラーゼＬａｃＡ、及び、ラクトース透過酵素ＬａｃＹ、をコードするｌａｃオペロン全体を不活化することで、達成することができる。不活化は、発現の阻害剤により、不活化変異の導入により、又は欠失により、達成される。ｌａｃＩ、ｌａｃＺ、ｌａｃＹ、及びｌａｃＡ遺伝子を含むｌａｃオペロン全体を不活化すると、ｉ）ラクトースが、グルコースとガラクトースへ分解することを防ぎ、ｉｉ）アロラクトース、又はアセチルラクトースの生成を防ぐことにより、細胞内のラクトースの可用性を高めることができる。後者はさらに、２つの糖分子の混在を除去して、当該精製プロセスを単純化することができる。
【００５２】
ラクトース透過酵素は、細胞内へのラクトースの取り込みを担う。多くの細菌は、（例えば、バチルス‐リケニフォルミス菌に見られるような）大腸菌のラクトース透過酵素のホモログである輸送タンパク質か、あるいは（例えば、カゼイ菌、及びラクトバチルス・ラムノーサス菌に見られるような）ＰＴＳ糖輸送ファミリーのメンバーのいずれかである、輸送タンパク質を用いて、培地から細胞へラクトースを輸送する固有の機能を備える。したがって、大腸菌ＬａｃＹ等の、外因性ラクトース透過酵素遺伝子を導入すると、細胞内ラクトースレベルが高まる可能性がある。細胞外ラクトースを細胞内に輸送する固有の機能が備わっていない細菌（ｌａｃオペロン全体が不活化されている細菌を含む）の場合、当該機能は、大腸菌ｌａｃＹ等の外因性ラクトース透過酵素遺伝子を導入することにより、付与、又は回復することができる。したがって、本発明の微生物は、ラクトース透過酵素をコードする外因性遺伝子を含んでもよい。ラクトース透過酵素は、大腸菌ＬａｃＹ（例えば、ＧＩ：９４９０８３）であることが好ましい。大腸菌ＬａｃＹが、Ａ１９８Ｖ、及び／又はＳ２０９Ｉの変異を備えることが、特に好ましい(Wilson  et  al.,Biochim  Biophys  Acta.1990;1029(1):113-6）。当該変異はともに、ＬａｃＹとその阻害剤タンパク質Ｅｎｚｙｍｅ−ＩＩａＧｌｃの間の相互作用を妨げると予測される（Hogema  et  al.,Mol  Microbiol.1999;31(6):1825-33）。その結果、細胞内ラクトース濃度が高い場合には、自己調節機構が抑制されるかもしれない。このように、ＨＭＯの収量は、ラクトース摂取が高まることにより、増加するかもしれない。さらに、ラクトースは、Ｔ７プロモーター発現系（後述）の本来的な誘導因子であるため、例えば、２−ＦＬ合成に必要な酵素の発現は、細胞内ラクトースの可用性が高まると、より改善される可能性がある。
【００５３】
好ましくは、本発明の微生物は、２−ＦＬ、及び／又は３−ＦＬの産生用である。
【００５４】
大腸菌における２−ＦＬ産生を高める、例示的な遺伝子組換えを表２に示す。
表２  大腸菌における２’−フコシルラクトースの産生を高める、遺伝子組換え
【００５５】
【表２】
2020528759.tif 000004
２−ＦＬ、又は３−ＦＬは、活性化糖ＧＤＰ−Ｌ−フコースをラクトースにカップリングさせて、生成することができる。上記のように、大腸菌は、ラクトース透過酵素ＬａｃＹ（ラクトース／Ｈ＋共輸送体）を介して、前駆体分子ラクトースを細胞内に取り込むことができる。さらに、大腸菌は、リン酸転移酵素系を介して、グルコースを細胞内に取り込むことができる。グルコースは、成長を促進するエネルギー源として、かつ、コラン酸生合成の天然中間体である、ＧＤＰ−Ｌ−フコース産生の前駆体として、ｄｅ  ｎｏｖｏ経路を介して機能することができる（図１参照）。活性化糖ＧＤＰ−Ｌ−フコースの生合成のｄｅ  ｎｏｖｏ経路は、解糖中間体であるフルクトース−６−リン酸から分岐し、大腸菌由来酵素であるＭａｎＡ、及びＭａｎＢ、ＧＴＰ依存性ＭａｎＣ、ＮＡＤＰＨ依存性Ｇｍｄ、及びＷｃａＧに基づく。あるいは、ＧＤＰ−Ｌ−フコースは、細胞内に取り込まれたフコースから、サルベージ経路によっても、生成されることができる。
【００５６】
ＧＤＰ−Ｌ−フコースのフコース部分は、フコース転移酵素（ＥＣ２．４．１．ｘ）を介して細胞内の受容体ラクトースに転移されることができ、それにより、２−ＦＬ、又は３−ＦＬが生成される（図１参照）。２−ＦＬ生成に重要な酵素は、ピロリ菌由来のＦｕｔＣ等のα−１，２−フコシル転移酵素である。３−ＦＬの生成には、ピロリ菌由来のＦｕｔＡ等のα−１，３−フコシル転移酵素を用いることができる。したがって、本発明の微生物はまた、フコシル転移酵素、好ましくは、α−１，２−フコシル転移酵素、及び／又はα−１，３−フコシル転移酵素をコードする外因性遺伝子を含む。フコシル転移酵素をコードする遺伝子は、好ましくは、異種遺伝子であり、及び／又は異種プロモーターにより駆動される。いくつかのフコシル転移酵素が、バクテロイデス・フラギリス菌（Bacteroides  fragilis）、バクテロイデス・ブルガータス菌（Bacteroides vulgatus）、カンピロバクター・ジェジュニ菌、大腸菌、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｂｉｌｉｓ、Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ、Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ、ピロリ菌、及びＴｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ等の細菌で同定されている。多くの生物ではコドンの使用頻度が異なるため、同族ｔＲＮＡアンチコドンの可用性が限定されるようなコドンがあると、リボソームが停動するために、異種遺伝子の発現を低下させうる。本発明の微生物において、高いタンパク質発現を確実にするために、（例えば、ｆｕｔＣ、及びｆｕｔＡ）遺伝子をコードする、α−１，２−、及びα−１，３−フコシル転移酵素のコドンの使用頻度を、本発明の微生物に対して最適化してもよい。したがって、フコシル転移酵素をコードする遺伝子は、当該微生物での発現のためにコドンを最適化することができる。コドンを最適化すると、細胞内フコシル転移酵素タンパク質レベルが上昇し、２−ＦＬ、及び／又は３−ＦＬの収量が改善される可能性がある。
【００５７】
本発明における使用に好ましい、α−１，２−フコシル転移酵素の例は、ピロリ菌由来のＦｕｔＣ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＫＹ４９９６１３）、Ｈ．ｍｕｓｔｅｌａｅ由来のＦｕｔＬ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ．０１３０２３５２９．１）、Ｈ．ｂｉｌｉｓ由来のＦｕｔＦ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ．０２０９９５６７６．１）、バクテロイデス
フラジリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒａｇｉｌｉｓ）ＮＣＴＣ  ９３４３由来のＷｃｆＢ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ．００５８１７１４５．１）、大腸菌Ｏ１２８由来のＷｂｓＪ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＯ３７６８．１）、大腸菌Ｏ８６由来のＷｂｗＫ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡ３７７１９．１）、大腸菌Ｏ１２６由来のＷｂｇＬ（例えば、ＮＣＢＩ）受託番号ＡＤＮ４３８４７．１、大腸菌Ｏ１２７由来のＷｂｉＱ（例：ＮＣＢＩ受託番号ＣＡＳ０９７１９．１）、カンピロバクター・ジェジュニ菌由来のＦｕｔＧ（例：ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿００２８６１８５９．１）、バクテロイデス・ブルガータス菌ATCC 8482由来のＦｕｔＮ（例：ＮＣＢＩ受託番号ALK85429.1）、バクテロイデス・フラギリス菌ＮＣＴＣ９３４３由来のＷｃｆＢ、及びＷｃｆＷ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿００５８１７１４５．１、及びＷＰ＿００５８１３０１０．１）、があげられる。
【００５８】
本発明における使用に好ましい、α−１，３−フコシル転移酵素の例は、ピロリ菌由来のＦｕｔＡ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＤ０７４４７．１）、ピロリ菌２６６９５由来のＦｕｔＢ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＡＡＤ０７７１０．１）、Ｈ．ｔｒｏｇｏｎｔｕｍ由来のＦｕｔＤ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０５２０８９２４２．１）、Ｈ．ｂｉｌｉｓ由来のＦｕｔＥ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０３４８０２８２８３．１）、Ｈ．ｔｙｐｈｌｏｎｉｕｓ由来のＦｕｔＨ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０５２０８２１５４．１）、Ｈ．ｈｅｐａｔｉｃｕｓ由来のＦｕｔＪ（Ｈｈ００７２）、及びＦｕｔＫ（Ｈｈ１７７６）（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＷＰ＿０１１１１４９１５．１、及びＡＡＰ７８３７３）、及びＢ．ｆｒａｇｉｌｉｓ由来のＦｕｔＭ（例えば、ＮＣＢＩ受託番号ＣＡＨ０９１５１．１．１）である。
【００５９】
好ましい態様では、フコシル転移酵素の活性は、Ｍｇ２＋が存在すると、促進される。
【００６０】
フコシル転移酵素は不溶性の細胞内封入体を形成する場合があるが、これにより、細胞内の活性フコシル転移酵素の可用性が低下する可能性がある。外因的に導入されたシャペロンの存在は、フコシル転移酵素の溶菌性に有利に影響し、それにより、２−ＦＬ、及び／又は３−ＦＬの産生を改善する可能性がある。したがって、本発明の微生物は、シャペロンをコードする外因性遺伝子をさらに含んでよい。好ましい実施形態では、シャペロンは、ヒトＨｓｐ７０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ１１２９６３）である。シャペロン機能に加えて、ヒトＨｓｐ７０を利用して、さらに、培養培地に、発現誘導体ＩＰＴＧを添加せず、自己誘導性発現系を確立することができる（Briand  et  al.,Sci  Rep.2016;6:33037）。ＩＰＴＧはまた、ラクトース透過酵素の基質でもあるため、ＩＰＴＧが添加されなければ、ラクトースの取り込みが高まり、ＨＭＯ、特に２−ＦＬ、及び／又は３−ＦＬ、の産生がさらに改善されることができる。
【００６１】
上記の改変修飾に加えて、当該細胞に、他の多くの遺伝子を導入、又は不活化して、ＨＭＯ、特に、２−ＦＬ、及び／又は３−ＦＬ、の産生をさらに最適化することができる。ＲｃｓＡは、大腸菌における、コラン酸生合成の正の転写調節因子であり、ＧＤＰ−Ｌ−フコースを中間体として用いる。ｒｃｓＡ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｍ５８００３）の過剰発現により、ＧＤＰ−Ｌ−フコース中間体の生合成に関与する遺伝子の転写が高まるが（図１参照）、これにより、ＧＤＰ−Ｌ−フコース経路を強化して、２−ＦＬ、及び／又は３−ＦＬ合成を改善することができる（非特許文献３）。したがって、本発明の微生物はまた、好ましくは、大腸菌由来の、ｒｃｓＡ遺伝子を過剰発現するものであってもよい。
【００６２】
しかしながら、ＲｃｓＡは、Ｌｏｎ−、及びＣｌｐＹＱプロテアーゼの制御を受ける。したがって、各々のｌｏｎ、及びｃｌｐＹＱ遺伝子が不活化されて、所望のＧＤＰ−Ｌ−フコース生合成遺伝子のダウンレギュレーションを妨げることができる。ｒｃｓＡの過剰発現を、ｌｏｎ／ｃｌｐＹＱ不活化と組み合わせると、ＧＤＰ‐Ｌ‐フコース、すなわち、２‐ＦＬ産生が劇的に改善される可能性がある。つまり、本発明の微生物では、Ｌｏｎプロテアーゼファミリー遺伝子、好ましくは、大腸菌Ｌｏｎプロテアーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｌ２０５７２）、及び／又はｃｌｐＹＱ遺伝子（ＮＣ＿０００９１３．３）を不活化することができる。
【００６３】
さらに、ｗｃａＪ遺伝子（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号（アミノ酸）ＢＡＡ１５９００）は、コラン酸生合成を開始すると予測される、ＵＤＰ‐グルコース脂質担体転移酵素をコードする。ｗｃａＪ遺伝子の不活化を行うことにより、ｉ）競合的コラン酸経路による、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの消費を妨げ、ｉｉ）外多糖類コラン酸の放出により。培地の粘度の増加を妨げ、かつ、ｉｉｉ）他に混在する糖分子（コラン酸）を除去して、２−ＦＬ精製プロセスを単純化する。したがって、本発明の微生物では、当該ｗｃａＪ遺伝子、好ましくは、大腸菌ｗｃａＪ遺伝子が不活化されてよい。
【００６４】
補因子ＮＡＤＰＨ、及びＧＴＰはまた、ＧＤＰ−Ｌ−フコース生合成においても重要な機能を担い、これらの可用性により、活性化糖（ＧＤＰ−Ｌ−フコース）の合成が制限されて、２−ＦＬ、及び／又は３−ＦＬ等のＨＭＯの全収率も制限されることがある。本発明の微生物において、４つの遺伝子が過剰発現されると、ＧＤＰ−Ｌ−フコース合成の補因子の可用性が高まる場合がある。Ｚｗｆはペントースリン酸経路の一部であるが、ＰｎｔＡ、及びＰｎｔＢはトランスヒドロゲナーゼ系に属する。ｚｗｆ、及びｐｎｔＡＢの過剰発現は、ＧＤＰ−Ｌ−フコース合成に関与する、ＮＡＤＰＨ依存性ＷｃａＧ酵素に必要な補因子をもたらすことにより、ＮＡＤＰＨの再生に、多大に寄与することができる（図１）。したがって、本発明の微生物は、ｚｗｆ遺伝子、及び両ｐｎｔＡＢ遺伝子を共過剰発現し得る（KEGG  Entry,大腸菌K-12  MG1655:b1852,b1603  and  b1602）が、好ましくは、それらは大腸菌由来である。
【００６５】
第二の補因子ＧＴＰは、２つの代替経路、すなわち、ホスホリボシルピロリン酸の生成を介したｄｅ  ｎｏｖｏＧＴＰ生合成経路、又は外因的送達グアノシン由来のサルベージ経路、を介して、合成される。どちらの場合も、ＧＭＰが十分に供給されると、ＧＴＰ濃度が上昇し、ＧＤＰ−Ｌ−フコースの産生効率が向上する。本発明の微生物における、両代謝経路に関与するｇｓｋ遺伝子（グアノシンイノシンキナーゼ、例えば、ＧＩ：９４６５８４）の過剰発現により、ＭａｎＣに必要なＧＴＰ−可用性が高まる可能性がある（図１）。その結果、ＧＤＰ−Ｌ−フコース合成、及び、ＨＭＯ産生が劇的に向上する能性がある（Lee  et  al.,Appl  Microbiol  Biotechnol.2012;93(6):2327-34）。したがって、本発明の微生物は、ｇｓｋ遺伝子を過剰発現してもよく、好ましくは大腸菌由来ｇｓｋ遺伝子を過剰発現してもよい。
【００６６】
上記の例示的遺伝子のクローニング用プライマーは、例えば、非特許文献３の表Ｓ２（前出）にありうる。
【００６７】
さらなる最適化には、チオレドキシン活性の操作が含まれる場合がある。ｔｒｘＡ遺伝子（ＫＥＧＧ Entry、大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５：ｂ３７８１）は、大腸菌の主要な生理的電子供与体をコードする。チオレドキシン（ＴｒｘＡ）の過剰発現は、難溶性タンパク質におけるジスルフィド結合形成の形成を促進して、異種タンパク質発現を向上させることが知られている。しかしながら、潜在的シャペロン機能、及びＴ７−ＤＮＡポリメラーゼの連続反応性因子としての機能という、２の他の機能も、ＴｒｘＡに関連してきた（Weickert  et  al.,Curr  Opin  Biotechnol.1996;7(5):494-9）。したがって、ｔｒｘＡの過剰発現を行うことにより、ｉ）ＨＭＯ合成に必要な酵素の溶菌性が向上し、ｉｉ）各遺伝子の発現に正の影響が付与されてよい。したがって、本発明の微生物は、チオレドキシンｔｒｘＡ遺伝子を過剰発現してもよく、好ましくは、大腸菌由来チオレドキシンｔｒｘＡ遺伝子を過剰発現してもよい。
【００６８】
さらに、ｔｒｘＢ遺伝子（ＫＥＧＧ Entry、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）：ＥＣＤ＿００８９２）は、酸化型からＴｒｘＡを再生する、ＮＡＤＰＨ依存性チオレドキシンレダクターゼ（ＴｒｘＢ）を、コードする。ｔｒｘＢが不活化されると、細胞質における還元電位を制限し、ジスルフィド結合が形成されうる（Ｗｅｉｃｋｅｒｔら、１９９６年、前出）。ｔｒｘＢが不活化されると、ｉ）タンパク質の溶菌性と酵素活性が向上し、ｉｉ）ＷｃａＧに必要な補因子ＮＡＤＰＨの枯渇が妨げられる（図１）。したがって、本発明の微生物において、ｔｒｘＢ遺伝子は不活化されてよい。
【００６９】
〔ＨＭＯの製造方法〕
本発明はまた、本発明の遺伝子組換え微生物を用いて、ＨＭＯを製造する方法を、提供する。
【００７０】
本発明の微生物を培地で培養することにより、ＨＭＯを産生することができる。
【００７１】
培地は、微生物の増殖が維持される限り、特に限定されない。本発明の微生物を培養する培地の例としては、ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン；５ｇ／Ｌ酵母抽出物；１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）、炭素源としてグルコース（又はグリセロール）を含む、改変Ｍ９最小培地（３６ｇ／Ｌグルコース；１２．８ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ、３ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、２ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、０．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、０．２５ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１４．７ｍｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１０ｍｇ／Ｌチアミン、２ｇ／Ｌ酵母抽出物、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００、及び１ｍＬ／Ｌ微量金属溶液；保存金属溶液：２５ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、２ｇ／Ｌ  ＺｎＣｌ２、２ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、１．９ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ  Ｈ３ＢＯ３、ｐＨ  ７．２（非特許文献３、前出参照）、２．６８ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２−Ｈ−クエン酸、２６．４２ｇ／Ｌグリセロール、１４．６ｇ／Ｌ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．２４１ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４、２ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＳＯ４、４ｇ／Ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ、０．５ｇ／Ｌ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍｇ／Ｌチアミン、及び３ｍｌ／Ｌトレース元素溶液（０．５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１６．７ｇ／Ｌ  ＦｅＣｌ３・６Ｈ２Ｏ、２０．１ｇ／Ｌ  Ｎａ２−ＥＤＴＡ、０．１８ｇ／Ｌ  ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．１６ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、及び０．１８ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ）を含む最小培地（Baumgaertner  et  al.,Microb  Cell  Fact.2013;12:40）、又は２０ｇ／Ｌのグリセロール、１３．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＰＯ４、４．０ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）２ＨＰＯ４、１．７ｇ／Ｌクエン酸、１．４ｇ／Ｌ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｍｌ／Ｌ微量元素溶液（クエン酸鉄（ＩＩＩ）１０ｇ／Ｌ、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．０ｇ／Ｌ  ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．３５ｇ／Ｌ  ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、０．２３ｇ／Ｌ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７・１０Ｈ２Ｏ、０．１１ｇ／Ｌ  （ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４、２．０ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏを含む最小培地（Chin  et  al.,J  Biotechnol.2016.pii:S0168-1656(16)31632-7）である。
【００７２】
本発明の微生物は、すなわち、１６℃〜３７℃、例えば、１６℃〜３０℃、好ましくは、１６℃〜２５℃の温度の、増殖に適するいかなる温度にて、培養されてよい。
【００７３】
好ましい態様では、当該培地は、ラクトースを含む。培養開始前の当該培地中のラクトース濃度は、２０ｇ／Ｌ以上、１２ｇ／Ｌ以上、１０ｇ／Ｌ以上、８ｇ／Ｌ以上、８〜２０ｇ／Ｌ、１０〜２０ｇ／Ｌ、又は１２〜２０ｇ／Ｌである。好ましくは、培養開始前の当該培地中のラクトース濃度は、１０〜２０ｇ／Ｌである。
【００７４】
さらなる好ましい実施形態では、当該培地は、遊離Ｍｇ２＋を含む。
【００７５】
培養開始前の当該培地中の遊離Ｍｇ２＋濃度（すなわち、遊離Ｍｇ２＋濃度）は、８０ｍＭ以上、７０ｍＭ以上、６０ｍＭ以上、５０ｍＭ以上、４０ｍＭ以上、３０ｍＭ以上、２０ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、５ｍＭ以上、１ｍＭ以上、１〜５０ｍＭ、５〜５０ｍＭ、１０〜５０ｍＭ、２０〜５０ｍＭ、１〜１０ｍＭ、１〜５ｍＭ、又は約５０〜６０μＭであってよい。
【００７６】
培養終了時の遊離Ｍｇ２＋濃度は、５００μＭ以下、１００μＭ以下、５０μＭ以下、１０μＭ以下、１μＭ以下、又は０μＭとすることができる。好ましくは、培養終了時の遊離Ｍｇ２＋濃度は、１０μＭ以下である。
【００７７】
好ましくは、Ｍｇ２＋は、ＭｇＳＯ４として、当該培地に添加される。
【００７８】
培養終了時に、場合によっては、ＥＤＴＡ、又はＥＧＴＡ等のキレート剤を、添加してもよく、好ましくは、残留遊離Ｍｇ２＋イオンを隔離し、溶菌を誘発するのに十分な量で、添加してもよい。
【００７９】
本発明のＨＭＯを産生する方法は、好ましくは、回分培養（バッチ、batch  culture）、又は流加培養（フェッドバッチ、fed-batch  culture）で、行われる。回分培養は閉鎖系培養であり、特定の環境条件下で、細胞を、一定量の栄養培地で、栄養素を追加添加せずに、増殖させる。流加培養では、培養中に栄養素がバイオリアクターに供給される。どちらの培養でも、培養終了時まで、バイオリアクター中に、細胞、及び生成物が残存する。
【００８０】
本発明のＨＭＯの製造方法における培養液量は、好ましくは、１０Ｌ以上、１００Ｌ以上、１０００Ｌ以上、１００００Ｌ以上、５００００Ｌ以上、１０Ｌ〜１００Ｌ、１００Ｌ〜１０００Ｌ、１０００Ｌ〜１００００Ｌ、又は１００００Ｌ以上が、好ましい。好ましくは、当該培養液量は、１００Ｌ〜１０００Ｌである。
【００８１】
培養終了時の培地中のＨＭＯ濃度は、好ましくは、少なくとも１５ｇ／Ｌ、より好ましくは、少なくとも２０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは、少なくとも３０ｇ／Ｌ、最も好ましくは、少なくとも５０ｇ／Ｌである。
【００８２】
本発明では、同時に、単一のＨＭＯを、又は２つ以上のＨＭＯを、産生することができるが、好ましくは、単一の遺伝子組換え微生物により、産生されてよい。例えば、同一細胞内で、α−１，２−フコシル転移酵素、及びα−１，３−フコシル転移酵素を発現させると、２−ＦＬ、３−ＦＬ、及び／又はラクトジフコテトラオース、又はラクト−Ｎ−ジフコヘキサオース等のジフコシル化構造物が、生成される場合がある。
【００８３】
本発明で製造されるＨＭＯは、好ましくは、２−ＦＬ、及び／又は３−ＦＬであり、２−ＦＬが、特に、好ましい。
【００８４】
当該ＨＭＯは、上記培地、及び／又は上記微生物それ自体から回収することができる。当該微生物からＨＭＯを回収する場合、微生物を破壊する必要がある。細胞溶菌による細胞破壊は、当技術分野で一般的に公知の化学的、又は物理的手段により行うか、又は上記のような誘導溶菌系により、溶菌が誘導されてもよい。
【００８５】
本発明のＨＭＯを製造する方法は、さらに、上記培養培地からＨＭＯを精製する工程を含んでよい。この文脈での精製は、当該ＨＭＯが、精製後に、純粋な形態、又は本質的に純粋な形態で存在することをいう。精製後、当該ＨＭＯ、例えば、２−ＦＬ、及び／又は３ＦＬは、好ましくは、乾燥重量に関して、精製生成物の、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％、又は１００％（ｗ／ｗ）で構成される。
【００８６】
精製は、当業者に公知な技術により、行ってよい。例えば、ＨＭＯは、当業者に一般的に公知の方法、例えば、エタノール勾配、又はサイズ排除による、木炭工程、及び３５〜５０％エタノールでの溶出、を用いたカラムクロマトグラフィー、により、上記培地から精製されてよい。
【００８７】
純度は、当技術分野で一般的に公知の、薄層クロマトグラフィー、又は他の電気泳動、又はクロマトグラフィー等の技術の、いかなる公知の方法によって評価されることができる。
【００８８】
好ましくは、当該ＨＭＯは、誘導溶菌系を介して溶菌が誘導された後、上記培養培地から精製される。細胞が溶菌されると、細胞内ＨＭＯが培地中に放出され、培地のＨＭＯ濃度が高まる。これにより、ＨＭＯ生産性が向上し、並びに生産性が向上し、及び処理工程が少なくなるため、時間、及びコストを節約することができる。したがって、当該ＨＭＯは、培地中の遊離Ｍｇ２＋の濃度が、１０μＭ以下である場合、及び／又は溶菌が直接可視化されうる場合、上記培養培地から精製されることが、好ましい。溶菌は、例えば、培養物を視覚的に除去することにより、及び／又は６００ｎｍ（光学密度）で培養物のＯＤ６００吸光度値を測定することにより、直接可視化することができる。培養物のＯＤ６００値は、当業者に一般的に公知の方法、例えば、分光光度計を用いて、測定することができる。ＯＤ６００値が下がると、細胞が溶菌されたことを示す。したがって、本発明では、培養物のＯＤ６００値が低下することにより、溶菌を、直接可視化することができる。
【００８９】
本発明は、さらに、本発明のＨＭＯを製造するための方法により得られうる、培地を提供する。本発明の微生物を培養して、ＨＭＯを産生するため、当該培地には、ＨＭＯが含まれる。培養終了時の培地のＨＭＯ濃度は、好ましくは、少なくとも１５ｇ／Ｌ、より好ましくは、少なくとも２０ｇ／Ｌ、さらに好ましくは、少なくとも３０ｇ／Ｌ、最も好ましくは、少なくとも５０ｇ／Ｌである。本発明の媒体は、さらに、例えば、凍結乾燥により、脱水することができる。
【００９０】
本発明はまた、本発明のＨＭＯを製造する方法により得られうる、精製ＨＭＯを提供する。
【００９１】
本発明の培地、及び精製ＨＭＯは、乳児栄養、及び／又は動物等の、ヒトによる消費のための製品の調製に用いてよい。本発明の培地、及び精製ＨＭＯは、動物用飼料の調製に用いてよい。当該動物用飼料は、愛玩動物（イヌ、ネコ）、家畜（ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、又はブタ、及び家禽）、及び／又は魚であってもよい。当該動物用飼料は、牛用であることが、好ましい。好ましくは、動物用飼料は、子牛用の代用乳製品である。
【００９２】
本発明を、以下の非限定的な実施例により、例示する。
【実施例】
【００９３】
〔材料及び方法〕
使用した株、プラスミド、及びプライマーを表３、及び４に示す。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を、ＨＭＯ産生用の宿主株として、大腸菌ＴＯＰ１０株を、プラスミド構築用、及び維持用に、用いる。大腸菌は、ＬＢ培地（１０ｇ／Ｌトリプトン、５ｇ／Ｌ酵母抽出物、１０ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ）で培養し、必要に応じて、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）、又はカナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）を添加する。遺伝子欠失は、Jensen  et  al.2015(Sci  Rep  2015;5:17874)のラムダＲｅｄ組換え酵素／フリッパーゼ系を用いることができる。ベクターｐＳＩＪ８を大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテント細胞に遺伝子導入する。ラムダＲｅｄ遺伝子は、１５ｍＭのＬ−アラビノースの存在下で誘導される。カナマイシン耐性カセット（ｋａｎＲ）は、ベクターｐＫＤ１３（Ｄａｔｓｅｎｋｏ、及びＷａｎｎｅｒ、２０００）から増幅されるが、５０ｂｐ長の相同的標的配列、及びＦＲＴ部位で隣接し、Ｌ‐アラビノース誘導性コンピテント細胞に遺伝子導入される。欠失後、５０ｍＭＬ−ラムノースの存在下で、フリッパーゼリコンビナーゼの誘導により抗生物質カセットが除去される。温度感受性ヘルパープラスミド（ｐＳＩＪ８）を硬化させるため、細胞を４２℃で、増殖させる。遺伝子発現には、ベクターｐＥＴＤｕｅｔ−１、ｐＣＤＦＤｕｅｔ−１、及びｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１を用いてよい（表３、図２、４、及び７）。プラスミドは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）のコンピテント細胞に遺伝子導入される。回分発酵では、大腸菌を、１００ｍｌの３６ｇ／Ｌグルコース含有ＬＢ中で、増殖させる。ＯＤ６００が０．６〜０．８に到達した時点で、０．１ｍＭ  ＩＰＴＧ、又は０．２％ラクトースを添加して、誘導する。１６〜２５℃で、２〜１０時間、増殖させた後、５ｇ／Ｌのラクトースを添加して、ＨＭＯ産生を行う。
【００９４】
表３  株、及びプラスミド
【００９５】
【表３】
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表４  遺伝子の過剰発現や欠失に用いられるプライマー
【００９６】
【表４】
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【表５】
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下線：制限部位（過剰発現）、ベクター結合部位（ノックアウト）
〔発現ベクターの構築〕
ｐＥＴ−ｍａｎＣＢ−ｇｍｄ−ｗｃａＧ
ｍａｎＣ−ｍａｎＢ、及びｇｍｄ−ｗｃａＧ遺伝子は、表４に記載されるプライマーを用いて、大腸菌Ｋ−１２  ＭＧ１６５５株のゲノムＤＮＡから増幅される。まず、ｇｍｄ−ｗｃａＧのＰＣＲ産物を、ＮｄｅＩ／ＫｐｎＩで消化し、同様に切断されたベクターｐＥＴＤｕｅｔ−１（図２）に挿入して、ｐＥＴ−ｇｍｄ−ｗｃａＧを得る。次に、ｍａｎＣ−ｍａｎＢのＰＣＲ断片をＮｃｏＩ／ＨｉｎｄＩＩで消化し、類似の切断ベクターｐＥＴ−ｇｍｄ−ｗｃａＧに挿入して、ベクターｐＥＴ−ｍａｎＣＢ−ｇｍｄ−ｗｃａＧ（図３）を作製する。選択したクローンを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有ＬＢで増殖させ、制限酵素マッピング、及びＤＮＡ配列決定により確認する。
【００９７】
ｐＣＤＦ−ｆｕｔＣ−ｌａｃＹ＊−ｈＨＳＰ７０−ｔｒｘＡ−ＳＲＲｚ
大腸菌に最適化されたコドンを備えるヒトＨＳＰ７０遺伝子を合成し、ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）で提供する。当該ｈＨＳＰ７０遺伝子は、ＮｄｅＩ／ＢｇｌＩＩ制限を介して、当該ベクターから単離され、同様に切断されたベクターｐＣＤＦＤｕｅｔ−１（図４）に挿入されて、ｐＣＤＦ−ｈＨＳＰ７０を獲得する。ｌａｃＹ−遺伝子は、表４に記載されるプライマーを用いて、大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５のゲノムＤＮＡから増幅される。サブクローニングには、ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ制限を介して、ベクターｐＵＣ１９（図５）に挿入する。部位特異的突然変異誘発を行い、アミノ酸置換Ｓ２０９Ｉ（ｌａｃＹ＊）の突然変異を導入する。次いで、ｌａｃＹ＊遺伝子を、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩＩを介して、ベクターｐＵＣ１９−ｌａｃＹ＊から消化し、同様に切断されたベクターｐＣＤＦ−ｈＨＳＰ７０に挿入して、ｐＣＤＦ−ｌａｃＹ＊−ｈＨＳＰ７０を生成させる。ｐＵＣ５７ベクター（ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔ）には、Ｎ末端トリプルＡｓｐ−ｔａｇの有無にかかわらず、ピロリ菌由来のｆｕｔＣ遺伝子が、結合し、大腸菌のコドンで最適化される。当該ｆｕｔＣ断片は、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ制限を介して、ｐＵＣ５７から単離され、ｐＣＤＦ−ｌａｃＹ＊−ｈＨＳＰ７０／ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩに挿入され、ｐＣＤＦ−ｆｕｔＣ−ｌａｃＹ＊−ｈＨＳＰ７０が生成される。当該ｔｒｘＡ遺伝子は、大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株から増幅され、ＢｇｌＩＩ／ＫｐｎＩ消化を介して、ｐＣＤＦ−ｆｕｔＣ−ｌａｃＹ＊−ｈＨＳＰ７０に挿入され、プラスミドｐＣＤＦ−ｆｕｔＣ−ｌａｃＹ＊−ｈＨＳＰ７０−ｔｒｘＡを、生成する。最後に、バクテリオファージラムダ由来ＳＲＲｚ遺伝子を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株から増幅し、発光バクテリア（Vibrio  fischeri）由来双方向性ＬｕｘＩＣＤＡＢＥＧ終結因子（terminator）を、３’末端に導入し、ＳａｃＩ／ＰｓｔＩで消化し、同様に切断したベクターｐＵＣ１９に、挿入した。ｍｇｔＡのプロモーターを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株由来の５’ＵＴＲ領域で増幅し、ＳａｃＩで消化し、ｐＵＣ１９−ＳＲｚ−ｌａｘＴｅｒｍ／ＳａｃＩに挿入して、ｐＵＣ−ＰｍｇｔＡ−ＵＴＲ−ＳＲｚ−ｌａｘＴｅｒｍを、生成する。最終的に、遺伝子カセットＰｍｇｔＡ−ＵＴＲ−ＳＲｚ−ｌａｘＴｅｒｍを増幅し、Ｂｓｕ３６ｉで消化した後、ｐＣＤＦ−ｆｕｔＣ−ｌａｃＹ＊−ｈＨＳＰ７０−ｔｒｘＡ／Ｂｓｕ３６ｉに挿入し、ｐＣＤＦ−ｆｕｔＣ−ｌａｃＹ＊−ｈＨＳＰ７０−ｔｒｘＡ−ＳＲｚ（図６）を、生成する。選択したクローンを、ストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢで増殖させ、制限酵素マッピング、及びＤＮＡ配列決定により確認する。
【００９８】
ｐＣＯＬＡ−ｐｎｔＡＢ−ｒｃｓＡ−ｚｗｆ−ｇｓｋ
大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株からｒｃｓＡ遺伝子を増幅し、ＮｄｅＩ／ＢｇｌＩＩで消化し、同様に切断したベクターｐＣＯＬＡＤｕｅｔ−１（図７）に挿入して、ｐＣＯＬ−ｒｃｓＡを生成する。次に、大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株からｚｗｆ遺伝子を増幅し、ｐＣＯＬＡ−ｒｃｓＡ／ＢｇｌＩＩ／ＫｐｎＩに挿入して、ｐＣＯＬＡ−ｒｃｓＡ−ｚｗｆを得る。続いて、大腸菌Ｋ１２−ＡＴＣＣ１０７９８株からｇｓｋ遺伝子を増幅し、ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩで消化し、ｐＣＯＬＡ−ｒｃｓＡ−ｚｗｆ／ＫｐｎＩ／ＸｈｏＩに挿入して、ｐＣＯＬＡ−ｒｃｓＡ−ｚｗｆ−ｇｓｋを生成する。最終的に大腸菌Ｋ１２−ＭＧ１６５５株からｐｎｔＡＢ遺伝子を増幅し、ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ｐＣＯＬＡ−ｒｃｓＡ−ｚｗｆ−ｇｓｋ／ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩに挿入して、ベクターｐＣＯＬＡ−ｐｎｔＡＢ−ｒｃｓＡ−ｚｗｆ−ｇｓｋ（図８）を作製する。選択されたクローンを、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）含有ＬＢで増殖させ、制限酵素マッピング、及びＤＮＡ配列決定により確認する。
【産業上の利用可能性】
【００９９】
本発明は、人乳オリゴ糖（ＨＭＯ）の改良された産生手段を提供する。本発明の微生物、及び産生方法により製造されるＨＭＯは、広く産業的に適用することができ、例えば、乳児栄養、医療用栄養、機能性食品、及び動物用飼料の、機能性成分として適用されてよい。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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