(57)【要約】  少なくとも一つが特異的結合対の第一官能基で官能化されており、該結合対の相補的第二官能基に結合できる、１４〜２４炭素原子を有する複数の脂質分子を含み；そして場合により該第一官能基に結合した相補的該結合対の第二官能基で官能化された免疫系活性化剤をさらに含む脂質二重層を含む融合性リポソームが提供される。融合性リポソームを使用する癌を処置する方法も提供される。
2020517750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫系活性化剤で癌細胞を標識することにより癌を処置する方法であって、該方法は、癌患者に融合性リポソームを投与することを含み、ここで、
(ｉ)該癌患者に(ａ)１４〜２４炭素原子および特定の結合対の相補的第二官能基と結合できる該結合対の第一官能基を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層；および(ｂ)該第一官能基に結合できる該結合対の該相補的第二官能基を含む免疫系活性化剤を含む免疫系活性化融合性リポソームを投与するか；または
(ii)該癌患者に１４〜２４炭素原子を有し、少なくとも一つが特異的結合対の第一官能基で官能化されており、該結合対の相補的第二官能基に結合できる複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む官能化融合性リポソームを投与し；そして過程(ii)に続いて
(iii)該脂質分子の該第一官能基に結合できる結合対の相補的第二官能基で官能化された免疫系活性化剤を投与する
過程を含む、方法。
【請求項２】
該免疫系活性化剤が融合性リポソームの外層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該免疫系活性化剤が融合性リポソームの内層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該免疫系活性化剤が融合性リポソームの外側および内層両者で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
免疫系活性化剤がＴ細胞活性化剤；炎症誘発性サイトカイン；記憶キラーＴ細胞活性化ペプチド；ウイルスペプチドを提示する可溶性ヒト白血球抗原(ｓＨＬＡ)；およびスーパー抗原から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
免疫系活性化剤がＴ細胞活性化剤である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ｔ細胞活性化剤が抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体またはこれらの組み合わせ、ＣＤ３およびＣＤ８両者と結合できる抗体およびＣＤ３およびＮＫＧ２Ｄ両者と結合できる抗体から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該脂質分子の少なくとも一つがカチオン基、カチオン性天然または合成ポリマー、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性癌細胞結合ペプチドをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つが１,２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパンクロライド(ＤＯＴＡＰ)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(ＤＯＧＳ)、１,２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＯＴＭＡ)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(１８：０  ＤＤＡＢ)およびＮ１−[２−((１Ｓ)−１−[(３−アミノプロピル)アミノ]−４−[ジ(３−アミノ−プロピル)アミノ]ブチル−カルボキサミド)エチル]−３,４−ジ[オレイルオキシ]−ベンズアミド(ＭＶＬ５)から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つがＤＯＴＡＰである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該合成ポリマーがポリエチレンイミン(ＰＥＩ)およびポリ(２−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレートから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
該天然ポリマーがキトサンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
該アミノ糖がグルコサミンである、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
該カチオン性ポリアミノ酸がポリ(Ｌ−リシン)、ポリ(Ｌ−アルギニン)、ポリ(Ｄ−リシン)、ポリ(Ｄ−アルギニン)、ポリ(Ｌ−オルニチン)およびポリ(Ｄ−オルニチン)から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
該両親媒性癌細胞結合ペプチドがセクロピンＡ；セクロピンＡ１〜８；および環状ＣＮＧＲＣから選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
該脂質分子の少なくとも一つがホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるリン脂質であり、その各々が１個または２個の同一または異なる脂肪酸残基を含み、ここで、ホスファチジル部分における脂肪酸残基が飽和、モノ−不飽和またはポリ−不飽和であり、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４炭素長の炭素鎖を有し、例えばミリストイル、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル(結合リノレノイルを含む)、リン脂質およびリゾリン脂質配置のアラキドノイルならびにこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
該リン脂質が１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(ＰＯＰＣ)および１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)；１,２−ジミリストイル−３−ホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)；１,２−ジステアロイル−３−ホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)；１,２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１４：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジミリステライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１４：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１６：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジパルミテライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１６：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジペトロセレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：１(Δ６−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルコリン(１８：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ(ＤＯＰＣ))；１,２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：２(Ｃｉｓ)ＰＣ(ＤＬＰＣ))；１,２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：３(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２０：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２０：４(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２２：６(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２２：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジネルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２４：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジミリストイル−３−−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)；１,２−ジパルミトイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)；ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)；１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)；１,２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)；１,２−ジミリストイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＭＰＳ)；１,２−ジパルミトイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＰＰＳ)；パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＰＯＰＥ)；および１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＯＰＳ)からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
該リン脂質がＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
該脂質分子の少なくとも一つに結合した安定化部分をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
該安定化部分がポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル−ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ(アクリロイルモルホリン)およびポリアクリルアミドから選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
安定化部分が約１０６Da〜約４kDaの分子量のＰＥＧである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＰＥＧが約２kDaの分子量である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
該安定化部分が切断可能ペプチドリンカーを経て該脂質分子の少なくとも一つに結合される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
特定の結合対の該第一官能基が該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成できる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
特定の結合対の該第一官能基がクリック化学反応により該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成できる、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ｉ)特定の結合対の第一官能基がアルキンまたはホスフィンであり、該結合対の第二官能基がアジドであるかまたはその逆であり；ii)特定の結合対の第一官能基がシクロアルケン、シクロアルキン、シクロプロパン、イソニトリル(イソシアニド)またはビニルボロン酸であり、該結合対の第二官能基がテトラジンであるかまたはその逆であり；iii)特定の結合対の第一官能基がアルキンまたはマレイミドであり、該結合対の第二官能基がチオールであるかまたはその逆であり；iv)特定の結合対の第一官能基が結合ジエンであり、該結合対の第二官能基が置換アルケンであるかまたはその逆であり；ｖ)特定の結合対の第一官能基がアルケン、アルキンまたはアセチレン化銅であり、該結合対の第二官能基がニトロンであるかまたはその逆であり；vi)特定の結合対の第一官能基がアルデヒドまたはケトンであり、該結合対の第二官能基がアルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドであるかまたはその逆であり；またはvii)特定の結合対の第一官能基がアルデヒド、ケトン、イソチオシアネート、カルボン酸またはその誘導体、例えばエステル、無水物、アシルハライド、トシルおよびＮ−ヒドロスクシンイミド(ＮＨＳ),であり、該結合対の第二官能基がアミンであるかまたはその逆であり；viii)官能基である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
特定の結合対がアルキン−アジドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
特定の結合対の該第一官能基が該結合対の該相補的第二官能基と非共有結合を形成できる、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
特定の結合対の第一官能基がビオチンであり、該結合対の第二官能基がビオチン結合ペプチドまたはビオチン結合タンパク質から選択されるその結合パートナーであるかまたはその逆である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
該ビオチン結合タンパク質がアビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
該ビオチン結合ペプチドがAEGEFCSWAPPKASCGDPAK(配列番号１１)、CSWRPPFRAVC(配列番号１２)、CSWAPPFKASC(配列番号１３)およびCNWTPPFKTRC(配列番号１４)から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
融合性リポソームが脂質二重層と第一官能基の間に第一スペーサーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
免疫系活性化剤が免疫系活性化剤と第二官能基間に第二スペーサーをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
第一または第二スペーサーがＰＥＧ、(Ｃ６−Ｃ１２)アルキル、フェノール酸、安息香酸またはナフトエモノ、ジもしくはトリカルボン酸、テトラヒドロピレンモノ、ジもしくはトリカルボン酸またはその塩、環状エーテル、グルタル酸、コハク酸、ムコン酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸およびセバシン酸および約２〜２０アミノ酸残基長、例えば３アミノ酸残基長のポリ−Ｇｌｙペプチドなどのペプチドからなる群から選択される、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
第一または第二スペーサーが約１０６Da〜約４kDaの分子量のＰＥＧである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ＰＥＧが約１９４Daの分子量(ＰＥＧ４)のものである、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
第一または第二スペーサーが(Ｃ６−Ｃ１２)アルキル、好ましくはヘプチルまたはドデカノイルである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
融合性リポソームがコレステロール(ＣＨＯ)またはその誘導体をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３９】
リポソームが最大２００nm、例えば約１５nm〜約２００nm、約２０nm〜約１００nm、約５０nm〜約１５０nm、約５０nm〜約９０nm、約８０nm〜約１００nm、約１１０nm〜約２００nm、例えば約１００nmのサイズを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４０】
該免疫系活性化剤が融合性リポソーム外層、内側または外側および内側両者で該第二官能基を経て該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合し；免疫系活性化剤がＴ細胞活性化剤；炎症誘発性サイトカイン；記憶キラーＴ細胞活性化ペプチド；ウイルスペプチドを提示する可溶性ヒト白血球抗原(ｓＨＬＡ)；およびスーパー抗原から選択され；該脂質の少なくとも一部がカチオン基、カチオン性天然または合成ポリマー、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性癌細胞結合ペプチドを含み；該脂質の少なくとも一部がホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるリン脂質であり、その各々が１個または２個の同一または異なる脂肪酸残基を含み、ここで、ホスファチジル部分における脂肪酸残基が飽和、モノ−不飽和またはポリ−不飽和であり、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４炭素の炭素鎖長を有し、例えばミリストイル、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル(結合リノレノイルを含む)、リン脂質およびリゾリン脂質配置のアラキドノイルならびにこれらの組み合わせであり；該リポソームが該脂質または該カチオン性ポリマーの少なくとも一つに結合した安定化部分をさらに含み；特定の結合対の該第一官能基が該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成できるまたは特定の結合対の該第一官能基が該結合対の該相補的第二官能基と非共有結合を形成でき；第一または第二スペーサーがＰＥＧ、(Ｃ６−Ｃ１２)アルキル、フェノール酸、安息香酸またはナフトエモノ、ジもしくはトリカルボン酸、テトラヒドロピレンモノ、ジもしくはトリカルボン酸またはその塩、環状エーテル、グルタル酸、コハク酸、ムコン酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸およびセバシン酸、約２〜２０アミノ酸残基長、例えば３アミノ酸残基長のポリ−Ｇｌｙペプチドなどのペプチドからなる群から選択され；そしてリポソームが最大２００nm、例えば約１５nm〜約２００nm、約２０nm〜約１００nm、約５０nm〜約１５０nm、約５０nm〜約９０nm、約８０nm〜約１００nm、約１１０nm〜約２００nm、例えば約１００nmのサイズを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４１】
免疫系活性化剤がＴ細胞活性化剤であり；カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つが１,２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパンクロライド(ＤＯＴＡＰ)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(ＤＯＧＳ)、１,２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＯＴＭＡ)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(１８：０  ＤＤＡＢ)およびＮ１−[２−((１Ｓ)−１−[(３−アミノプロピル)アミノ]−４−[ジ(３−アミノ−プロピル)アミノ]ブチル−カルボキサミド)エチル]−３,４−ジ[オレイルオキシ]−ベンズアミド(ＭＶＬ５)から選択され、該合成ポリマーがポリエチレンイミン(ＰＥＩ)およびポリ(２−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレートから選択され、該天然ポリマーがキトサンであり、該アミノ糖がグルコサミンであり、該カチオン性ポリアミノ酸がポリ(Ｌ−リシン)、ポリ(Ｌ−アルギニン)、ポリ(Ｄ−リシン)、ポリ(Ｄ−アルギニン)、ポリ(Ｌ−オルニチン)およびポリ(Ｄ−オルニチン)から選択されまたは該両親媒性癌細胞結合ペプチドがセクロピンＡ；セクロピンＡ１〜８；および環状ＣＮＧＲＣから選択され；該脂質分子の少なくとも一つが１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(ＰＯＰＣ)および１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)；１,２−ジミリストイル−３−ホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)；１,２−ジステアロイル−３−ホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)；１,２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１４：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジミリステライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１４：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１６：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジパルミテライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１６：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジペトロセレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：１(Δ６−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルコリン(１８：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ(ＤＯＰＣ))；１,２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：２(Ｃｉｓ)ＰＣ(ＤＬＰＣ))；１,２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：３(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２０：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２０：４(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２２：６(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２２：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジネルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２４：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジミリストイル−３−−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)；１,２−ジパルミトイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)；ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)；１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)；１,２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(Ｄ��ＰＥ)；１,２−ジミリストイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＭＰＳ)；１,２−ジパルミトイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＰＰＳ)；パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＰＯＰＥ)；および１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＯＰＳ)からなる群から選択され；該安定化部分がポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル−ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ(アクリロイルモルホリン)およびポリアクリルアミドから選択され；特定の結合対の該第一官能基がクリック化学反応により該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成でき、ｉ)特定の結合対の第一官能基がアルキンまたはホスフィンであり、該結合対の第二官能基がアジドであるかまたはその逆であり；ii)特定の結合対の第一官能基がシクロアルケン、シクロアルキン、シクロプロパン、イソニトリル(イソシアニド)またはビニルボロン酸であり、該結合対の第二官能基がテトラジンであるかまたはその逆であり；iii)特定の結合対の第一官能基がアルキンまたはマレイミドであり、該結合対の第二官能基がチオールであるかまたはその逆であり；iv)特定の結合対の第一官能基が結合ジエンであり、該結合対の第二官能基が置換アルケンであるかまたはその逆であり；ｖ)特定の結合対の第一官能基がアルケン、アルキンまたはアセチレン化銅であり、該結合対の第二官能基がニトロンであるかまたはその逆であり；vi)特定の結合対の第一官能基がアルデヒドまたはケトンであり、該結合対の第二官能基がアルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドであるかまたはその逆であり；またはvii)特定の結合対の第一官能基がアルデヒド、ケトン、イソチオシアネートまたはカルボン酸またはその誘導体、例えばエステル、無水物、アシルハライド、トシルおよびＮ−ヒドロスクシンイミド(ＮＨＳ)であり、該結合対の第二官能基がアミンであるかまたはその逆であり；viii)または特定の結合対の第一官能基がビオチンであり、該結合対の第二官能基がビオチン結合ペプチドまたはビオチン結合タンパク質から選択されるその結合パートナーであるかまたはその逆であり；および第一または第二スペーサーが約１０６Da〜約４kDaの分子量のＰＥＧまたは(Ｃ６−Ｃ１２)アルキル、好ましくはヘプチルまたはドデカノイルである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
Ｔ細胞活性化剤が抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体またはこれらの組み合わせ、ＣＤ３およびＣＤ８両者と結合できる抗体およびＣＤ３およびＮＫＧ２Ｄ両者と結合できる抗体から選択され；カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つがＤＯＴＡＰであり；該リン脂質がＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥから選択され；安定化部分が約１０６Da〜約４kDaの分子量のＰＥＧであり；特定の結合対がアルキン−アジドであり、該ビオチン結合タンパク質がアビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体から選択されまたは該ビオチン結合ペプチドがAEGEFCSWAPPKASCGDPAK(配列番号１１)、CSWRPPFRAVC(配列番号１２)、CSWAPPFKASC(配列番号１３)およびCNWTPPFKTRC(配列番号１４)から選択され；そして第一または第二スペーサーが約１９４Da(ＰＥＧ４)の分子量のＰＥＧである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
安定化部分が約２kDaの分子量のＰＥＧである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
融合性リポソームが：
ａ. ＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３またはＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−ＢＣＮ；または
ｂ. ＤＭＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３またはＤＭＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ４−ＢＣＮ、
を含み、ここで、ＰＥＧ２Ｋが約２kDaの分子量を有するＰＥＧを表し、そしてＰＥＧ４が約１９４Daの分子量を有するＰＥＧを表し、そしてＤＯＰＣの相対的モル量が最大約８０％であり、ＤＯＴＡＰの相対的モル量が最大約８０％であり、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋの相対的モル量が最大約２０％であり、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４の相対的モル量が最大約２０％であり、ＨＳＰＣの相対的モル量が最大約６５％であり、コレステロールの相対的モル量が最大約４０％であり、そしてＤＭＰＣの相対的モル量が最大約７０％であり、そして融合性リポソームが約５０nmまたは３００nmのサイズを有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
融合性リポソームが
(ｉ)モル比５２.５：３５：０.６：１０、５２.５：３５：１.２５：１０、５２.５：３５：２.５：１０、５２.５：３５：５：１０、５２.５：３５：０.６：５、５２.５：３５：１.２５：５、５２.５：３５：２.５：５、５２.５：３５：５：５、６５：２０：５：１０、５０：３５：５：１０、５２.５：３５：１.２５：７、５２.５：３５：１.２５：５または５２.５：３５：２.５：７でＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３またはＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−ＢＣＮ；または
(ii)モル比６０：３５：５でＤＭＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３またはＤＭＰＣ：Ｃｈｏｌ：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ４−ＢＣＮ
を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
融合性リポソームがモル比５２.５：３５：２.５：５でＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
該Ｔ細胞活性化剤が融合性リポソームの外層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項４４〜４６の何れかに記載の方法。
【請求項４８】
該Ｔ細胞活性化剤が融合性リポソームの内層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項４４〜４６の何れかに記載の方法。
【請求項４９】
該Ｔ細胞活性化剤が融合性リポソームの内層および外層両者で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項４４〜４６の何れかに記載の方法。
【請求項５０】
リポソームの融解温度(Ｔｍ)が４５℃未満であり、そこで融合性リポソームが非結晶転移相を維持し、それにより、リポソームの細胞膜との融合に必要な膜流動性を提供する、請求項１〜４９の何れかに記載の方法。
【請求項５１】
癌がトリプルネガティブ乳癌などの乳癌、黒色腫および肺癌からなる群から選択される、請求項１〜５０の何れかに記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも一つが特異的結合対の第一官能基で官能化されており、該結合対の相補的第二官能基に結合できる、１４〜２４炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む融合性リポソーム。
【請求項５３】
融合性リポソームが脂質二重層と第一官能基の間に第一スペーサーをさらに含む、請求項５２に記載の融合性リポソーム。
【請求項５４】
該第一官能基に結合した相補的該結合対の第二官能基で官能化された免疫系活性化剤をさらに含む、請求項５２に記載の融合性リポソーム。
【請求項５５】
該免疫系活性化剤が融合性リポソームの外層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項５４に記載の融合性リポソーム。
【請求項５６】
該免疫系活性化剤が融合性リポソームの内層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項５４に記載の融合性リポソーム。
【請求項５７】
該免疫系活性化剤が融合性リポソームの外側および内層両者で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される、請求項５４に記載の融合性リポソーム。
【請求項５８】
免疫系活性化剤が免疫系活性化剤と第二官能基間に第二スペーサーをさらに含む、請求項５４に記載の融合性リポソーム。
【請求項５９】
免疫系活性化剤がＴ細胞活性化剤；炎症誘発性サイトカイン；記憶キラーＴ細胞活性化ペプチド；ウイルスペプチドを提示する可溶性ヒト白血球抗原(ｓＨＬＡ)；およびスーパー抗原から選択される、請求項５２〜５８の何れかに記載の融合性リポソーム。
【請求項６０】
免疫系活性化剤がＴ細胞活性化剤である、請求項５９に記載の融合性リポソーム。
【請求項６１】
Ｔ細胞活性化剤が抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体またはこれらの組み合わせ、ＣＤ３およびＣＤ８両者と結合できる抗体およびＣＤ３およびＮＫＧ２Ｄ両者と結合できる抗体から選択される、請求項６０に記載の融合性リポソーム。
【請求項６２】
該免疫系活性化剤が融合性リポソームの外層、内側または外側および内側両者で該第二官能基を経て該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合され；免疫系活性化剤がＴ細胞活性化剤；炎症誘発性サイトカイン；記憶キラーＴ細胞活性化ペプチド；およびスーパー抗原から選択され；該脂質の少なくとも一部がカチオン基、カチオン性天然または合成ポリマー、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性癌細胞結合ペプチドをさらに含み；該脂質の少なくとも一部がホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるリン脂質であり、その各々が１個または２個の同一または異なる脂肪酸残基を含み、ここで、ホスファチジル部分における脂肪酸残基が飽和、モノ−不飽和またはポリ−不飽和であり、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４炭素の炭素鎖長を有し、例えばミリストイル、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル(結合リノレノイルを含む)、リン脂質およびリゾリン脂質配置のアラキドノイルならびにこれらの組み合わせであり；該リポソームが該脂質または該カチオン性ポリマーの少なくとも一つに結合した安定化部分をさらに含み；特定の結合対の該第一官能基が該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成できるまたは特定の結合対の該第一官能基が該結合対の該相補的第二官能基と非共有結合を形成でき；第一または第二スペーサーがＰＥＧ、(Ｃ６−Ｃ１２)アルキル、フェノール酸、安息香酸またはナフトエモノ、ジもしくはトリカルボン酸、テトラヒドロピレンモノ、ジもしくはトリカルボン酸またはその塩、環状エーテル、グルタル酸、コハク酸、ムコン酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸およびセバシン酸、約２〜２０アミノ酸残基長、例えば３アミノ酸残基長のポリ−Ｇｌｙペプチドなどのペプチドからなる群から選択され；そしてリポソームが最大２００nm、例えば約１５nm〜約２００nm、約２０nm〜約１００nm、約５０nm〜約１５０nm、約５０nm〜約９０nm、約８０nm〜約１００nm、約１１０nm〜約２００nm、例えば約１００nmのサイズを有する、請求項５４に記載の融合性リポソーム。
【請求項６３】
免疫系活性化剤がＴ細胞活性化剤であり；カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つが１,２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパンクロライド(ＤＯＴＡＰ)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(ＤＯＧＳ)、１,２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＯＴＭＡ)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(１８：０  ＤＤＡＢ)およびＮ１−[２−((１Ｓ)−１−[(３−アミノプロピル)アミノ]−４−[ジ(３−アミノ−プロピル)アミノ]ブチル−カルボキサミド)エチル]−３,４−ジ[オレイルオキシ]−ベンズアミド(ＭＶＬ５)から選択され、該合成ポリマーがポリエチレンイミン(ＰＥＩ)およびポリ(２−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレートから選択され、該天然ポリマーがキトサンであり、該アミノ糖がグルコサミンであり、該カチオン性ポリアミノ酸がポリ(Ｌ−リシン)、ポリ(Ｌ−アルギニン)、ポリ(Ｄ−リシン)、ポリ(Ｄ−アルギニン)、ポリ(Ｌ−オルニチン)およびポリ(Ｄ−オルニチン)から選択されまたは該両親媒性癌細胞結合ペプチドがセクロピンＡ；セクロピンＡ１〜８；および環状ＣＮＧＲＣから選択され；該脂質分子の少なくとも一つが１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(ＰＯＰＣ)および１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)；１,２−ジミリストイル−３−ホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)；１,２−ジステアロイル−３−ホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)；１,２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１４：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジミリステライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１４：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１６：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジパルミテライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１６：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジペトロセレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：１(Δ６−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルコリン(１８：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ(ＤＯＰＣ))；１,２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：２(Ｃｉｓ)ＰＣ(ＤＬＰＣ))；１,２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：３(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２０：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２０：４(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２２：６(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２２：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジネルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２４：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジミリストイル−３−−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)；１,２−ジパルミトイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)；ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)；１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)；１,２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(Ｄ��ＰＥ)；１,２−ジミリストイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＭＰＳ)；１,２−ジパルミトイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＰＰＳ)；パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＰＯＰＥ)；および１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＯＰＳ)からなる群から選択され；該安定化部分がポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル−ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ(アクリロイルモルホリン)およびポリアクリルアミドから選択され；特定の結合対の該第一官能基がクリック化学反応により該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成でき、ｉ)特定の結合対の第一官能基がアルキンまたはホスフィンであり、該結合対の第二官能基がアジドであるかまたはその逆であり；ii)特定の結合対の第一官能基がシクロアルケン、シクロアルキン、シクロプロパン、イソニトリル(イソシアニド)またはビニルボロン酸であり、該結合対の第二官能基がテトラジンであるかまたはその逆であり；iii)特定の結合対の第一官能基がアルキンまたはマレイミドであり、該結合対の第二官能基がチオールであるかまたはその逆であり；iv)特定の結合対の第一官能基が結合ジエンであり、該結合対の第二官能基が置換アルケンであるかまたはその逆であり；ｖ)特定の結合対の第一官能基がアルケン、アルキンまたはアセチレン化銅であり、該結合対の第二官能基がニトロンであるかまたはその逆であり；vi)特定の結合対の第一官能基がアルデヒドまたはケトンであり、該結合対の第二官能基がアルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドであるかまたはその逆であり；またはvii)特定の結合対の第一官能基がアルデヒドであり、該結合対の第二官能基がアミンであるかまたはその逆であり；viii)官能基または特定の結合対の第一官能基がビオチンであり、該結合対の第二官能基がビオチン結合ペプチドまたはビオチン結合タンパク質から選択されるその結合パートナーであるかまたはその逆であり；そして第一または第二スペーサーが約１０６Da〜約４kDaの分子量のＰＥＧまたは(Ｃ６−Ｃ１２)アルキル、好ましくはヘプチルまたはドデカノイルである、請求項６２に記載の融合性リポソーム。
【請求項６４】
Ｔ細胞活性化剤が抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体またはこれらの組み合わせ、ＣＤ３およびＣＤ８両者と結合できる抗体およびＣＤ３およびＮＫＧ２Ｄ両者と結合できる抗体から選択され；カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つがＤＯＴＡＰであり；該リン脂質がＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥから選択され；安定化部分が約１０６Da〜約４kDaの分子量のＰＥＧであり；特定の結合対がアルキン−アジドであり、該ビオチン結合タンパク質がアビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体から選択されまたは該ビオチン結合ペプチドがAEGEFCSWAPPKASCGDPAK(配列番号１１)、CSWRPPFRAVC(配列番号１２)、CSWAPPFKASC(配列番号１３)およびCNWTPPFKTRC(配列番号１４)から選択され；そして第一または第二スペーサーが約１９４Da(ＰＥＧ４)の分子量のＰＥＧである、請求項６３に記載の融合性リポソーム。
【請求項６５】
安定化部分が約２kDaの分子量のＰＥＧである、請求項６４に記載の融合性リポソーム。
【請求項６６】
融合性リポソームが
ａ. ＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３またはＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−ＢＣＮ；または
ｂ. ＤＭＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３またはＤＭＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ４−ＢＣＮ、
を含み、ここで、ＰＥＧ２Ｋが約２kDaの分子量を有するＰＥＧを表し、そしてＰＥＧ４が約１９４Daの分子量を有するＰＥＧを表し、そしてＤＯＰＣの相対的モル量が最大約８０％であり、ＤＯＴＡＰの相対的モル量が最大約８０％であり、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋの相対的モル量が最大約２０％であり、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４の相対的モル量が最大約２０％であり、ＨＳＰＣの相対的モル量が最大約６５％であり、コレステロールの相対的モル量が最大約４０％であり、そしてＤＭＰＣの相対的モル量が最大約７０％であり、そして融合性リポソームが約８０nmまたは１００nmのサイズを有する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
融合性リポソームが
(ｉ)モル比５２.５：３５：０.６：１０、５２.５：３５：１.２５：１０、５２.５：３５：２.５：１０、５２.５：３５：５：１０、５２.５：３５：０.６：５、５２.５：３５：１.２５：５、５２.５：３５：２.５：５、５２.５：３５：５：５、６５：２０：５：１０、５０：３５：５：１０、５２.５：３５：１.２５：７、５２.５：３５：１.２５：５または５２.５：３５：２.５：７でＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３またはＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−ＢＣＮ；または
(ii)モル比６０：３５：５でＤＭＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３またはＤＭＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ４−ＢＣＮ
を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
融合性リポソームがモル比５２.５：３５：２.５：５でＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３を含む、請求項６７に記載の融合性リポソーム。
【請求項６９】
請求項１〜６８の何れかに定義された融合性リポソーム。
【請求項７０】
外層で結合した免疫系活性化剤を伴う融合性リポソームを製造する方法であって、請求項５２に記載の融合性リポソームと、結合対の相補的第二官能基で官能化された免疫系活性化剤の反応を含み、ここで、該第二官能基は該第一官能基に結合し、それにより外層で結合した該Ｔ細胞活性化剤を有する該融合性リポソームを産生する、方法。
【請求項７１】
内層および外層両者に結合した免疫系活性化剤を有する融合性リポソームを製造する方法であって：
(ｉ)複数の請求項５２に記載の脂質分子と、結合対の第二官能基で官能化されたＴ細胞活性化剤を反応させ、ここで、該第二官能基は該脂質分子の該第一官能基に結合し、それにより、Ｔ細胞活性化剤に結合した脂質分子を産生し；そして
(ii)工程(ｉ)で得られた該脂質分子から該融合性リポソームを調製し、
それにより、内層および外層両者で結合した該Ｔ細胞活性化剤で官能化された融合性リポソームを産生する
工程を含む、方法。
【請求項７２】
内層で結合した免疫系活性化剤を伴う融合性リポソームを製造する方法であって、
(ｉ)請求項５２に記載の脂質分子および該脂質分子の該第一官能基に結合できる結合対の第二官能基で官能化された免疫系活性化剤を含むリポソームを溶液中で調製し、それにより、該Ｔ細胞活性化剤の一部を封入し；
(ii)溶液から非封入Ｔ細胞活性化剤を除去し；
(iii)工程(ｉ)で調製したリポソームの水性内部で脂質分子と封入Ｔ細胞活性化剤を反応させここで、該Ｔ細胞活性化剤の該第二官能基は該脂質分子の該第一官能基に結合し、それにより、内層で結合した該Ｔ細胞活性化剤で官能化された融合性リポソームを産生する
工程を含む、方法。
【請求項７３】
該溶液が少なくとも一つの酸化−還元触媒をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
該少なくとも一つの酸化−還元触媒が銅(Ｉ)塩であり、これが非封入Ｔ細胞活性化剤に加えて工程(ii)で除去され、工程(iii)の反応が銅依存的クリック化学反応である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
融合性リポソームが最大２００nm、例えば約１５nm〜約２００nm、約２０nm〜約１００nm、約５０nm〜約１５０nm、約５０nm〜約９０nm、約８０nm〜約１００nm、約１１０nm〜約２００nm、例えば約１００nmのサイズを有する、請求項７０〜７４の何れかに記載の方法。
【請求項７６】
ａ. 請求項５２に記載の融合性リポソームを含む第一容器；
ｂ. 該脂質分子の該第一官能基と結合できる結合対の第二官能基で官能化されたＴ細胞活性化剤を含む第二容器；および
ｃ. 患者に(ａ)の融合性リポソームおよび続いて(ｂ)のＴ細胞活性化剤を投与することを含む、癌を処置する方法についての指示を含むパンフレット
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許または特許出願は、少なくとも１枚のカラー図面を含む。カラー図面を伴う本特許または特許出願公報は、庁への申請および必要な費用の支払いにより提供される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、一般に癌治療に使用するためのリポソーム構築物を含む超分子集合体に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
免疫療法は、癌と戦うために、生体本来の免疫系を利用するため、癌治療の最も有望な領域の一つと考えられる1, 2。腫瘍形成について示唆されたのは3、異型遺伝子性腫瘍細胞(十分なドライバーおよびパッセンジャー変異を含む)4で開始し、これが免疫細胞により攻撃され5、低異型遺伝子性腫瘍ニッチェ6がもたらされ、次いで、これが免疫細胞による有効な同定を逃れ、制御性Ｔ細胞および腫瘍浸潤性マクロファージ(ＴＡＭｓ)などの抗炎症性細胞を動員することであった7。種々の癌タイプは、免疫検出を逃れ、結果的に免疫細胞による致死から逃れる機構を用いる。第一選択治療として通常用いられる対抗手段は、通常、粘膜、皮膚、骨髄および他の組織の損傷により患者のクオリティ・オブ・ライフに重大に影響するオフターゲット副作用を有する。
【０００４】
主な抗癌免疫療法は、キメラ抗原受容体−Ｔ(ＣＡＲ−Ｔ)細胞8、原発および転移癌に対して使用される腫瘍浸潤性白血球(ＴＩＬ)9および阻害遮断抗体を使用する免疫チェックポイント遮断10を含む。これらのアプローチは、癌を殺すために、免疫細胞による癌細胞同定に依存する7。例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞アプローチは癌細胞上のマーカーの存在を必要とし(例えばイエスカルタTMおよびＣＤ１９陽性癌細胞)、ＴＩＬアプローチは腫瘍関連変異の高い存在量を必要とし、そして免疫チェックポイント遮断は癌細胞による阻害性分子の高発現レベルを必要とする(例えば５０％を超えるＰＤ１Ｌ／ＰＤ２Ｌレベル)3, 11。これらのアプローチには、長く続く幾つかの重度の副作用がある。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ細胞を単離し、操作されたＴ細胞受容体を発現するために癌結合タンパク質(一本鎖ＦＶ、ＳＣｆｖ)でトランスフェクションし、エキソビボ条件下でそれらを増殖および拡大する必要がある。さらに、ＣＡＲ−Ｔは、重度の副作用に遭遇した患者の全身的状態を改善する「オフスイッチ」を欠く。ＴＩＬアプローチは、Ｔ細胞単離、その活性化、拡大および患者への再挿入を可能にするために腫瘍生検を必要とする1。ＣＡＲ−Ｔ細胞およびＴＩＬアプローチの両者とも抗癌免疫活性を促進する。免疫チェックポイント阻害剤は、免疫細胞が、例えば、高レベルのＰＤ１Ｌを発現する免疫回避癌を攻撃することを可能とする。抗ＰＤ１治療の利用により、ＰＤ１介在阻害性シグナルは全身的方法で阻害され、自己免疫副作用を含むことが示された。上記アプローチの全て、有効性の必要条件として、癌細胞のキラーＴ細胞同定を必要とする(すなわち癌細胞は、キラーＴ細胞が認識し、それ故に、活性化され、癌細胞を殺すペプチドを提示する)。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
それ故に、腫瘍細胞を攻撃し、殺す免疫系の生来の能力を利用しながら、腫瘍特異的抗原の限定的な自然の選択を回避する技術の緊急の必要性がなお存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
発明の要約
本出願は、免疫系の特異的活性化による癌細胞の死滅を可能とする免疫標識プラットフォームの実施態様を記載する。概念は、標的細胞に統合されるまたは標的細胞と反応することができる脂質であって、膜と融合できるリポソーム、ミセルおよびキューボソームなどの集合体を形成する脂質；および脂質ゲル、脂質スポンジ、二重層または単層脂質シート、線維状脂質構造および脂質渦巻形などの腫瘍内または近傍に脂質を放出するよう設計された超分子集合体の使用による、免疫活性化剤での特異的細胞の標識のための細胞膜の修飾である。標的細胞と反応する脂質粒子は、超分子集合体または免疫系活性化剤に見られる反応基と、細胞表面の反応基(タンパク質表面のアミンまたはその他反応基など)の反応をいう。例えば、トシル−ＰＥＧ４−アジドは、リポソームからの放出により、癌／標的細胞表面のタンパク質と反応できる。
【０００７】
非限定的例において、本発明のリポソームは癌細胞と融合し、癌細胞の膜への抗体の展示をもたらす。我々は、キラーＴ細胞に癌細胞を認識させる新規標的を癌細胞に加える。免疫標識癌細胞は、例えば特定のウイルス／非自己ペプチドに特異的なエフェクター／記憶キラーＴ細胞に結合する。抗体セットはＴ細胞を活性化し、これは癌細胞を殺し、炎症誘発性サイトカイン(ＩＬ２、ＩＦＮγなど)を分泌し、クローン増殖を開始する。得られたクローンは、同じ特異的ウイルス／非自己ペプチド提示細胞を殺すことにのみ特異的な、エフェクターキラーＴ細胞である。拡大Ｔ細胞はこのような細胞を探し、これらまたはリポソーム標識細胞のみ殺す。
【０００８】
あるいは、リポソーム処理癌細胞が「自己」ペプチドに特異的なナイーブキラーＴ細胞に遭遇したとき、抗体は、Ｔ細胞受容体によりナイーブキラーＴ細胞に結合する。ナイーブＴ細胞は正当に活性化されないため(共刺激分子を伴う抗原提示細胞により)、活性化されず、それ故に殺すことが不可能であることを意味するアネルギーを経験し、炎症誘発性サイトカインを分泌するかまたは活性化される。
【０００９】
リポソームの腫瘍への到達を改善する滞留性亢進透過性(ＲＥＳ)効果に加えて12、本発明は、健常細胞の中性性質と逆に、腫瘍細胞に内因性の全般的負電荷13−15を、本発明のリポソームプラットフォームにおける選択性増強要素として使用する。
【００１０】
ある態様において、本発明は、少なくとも一つの脂質の親水性頭部が官能基または１以上の免疫系活性化剤で官能化されている、複数の脂質を含む超分子集合体を提供する。この官能基は、チオール−マレイミド、アジド−アルキン、アルデヒド−ヒドロキシルアミンなどの結合対のメンバーである。
【００１１】
他の態様において、本発明は、１４〜２４炭素原子を有し、少なくとも一つが特異的結合対の第一官能基で官能化されており、該結合対の相補的第二官能基に結合できる複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む融合性リポソームを提供する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、外層(outer leaflet)で結合した免疫系活性化剤を伴う融合性リポソームを製造する方法を提供し、該方法は、(ａ)１４〜２４炭素原子および(ｂ)特異的結合対の相補的第二官能基と結合できる第一官能基を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む官能化融合性リポソームと、結合対の相補的第二官能基で官能化された免疫系活性化剤を反応させることを含み、ここで、該第二官能基は該第一官能基に結合し、それにより外層に結合した該免疫系活性化剤を有する該融合性リポソームを産生する。
【００１３】
なおさらなる態様において、本発明は、内層(inner leaflet)および外層両者で結合した免疫系活性化剤を有する融合性リポソームを製造する方法を提供し、該方法は、(ｉ)１４〜２４炭素原子を有する、少なくとも一つが特定の結合対の第一官能基で官能化されている複数の脂質分子と、該脂質分子の該第一官能基に結合する第二官能基で官能化されている免疫系活性化剤を反応させ、それにより免疫系活性化剤に結合した脂質分子を産生し；そして(ii)工程(ｉ)で得た該脂質分子から該融合性リポソームを調製し、それにより、内層および外層両者で結合した該免疫系活性化剤で官能化された融合性リポソームを産生する工程を含む。
【００１４】
なおさらなる態様において、本発明は、外層に結合した実際的に最小の免疫系活性化剤と共に内層に結合した免疫系活性化剤を有する、融合性リポソームを製造する方法を提供する。
【００１５】
他の態様において、本発明は、免疫系活性化剤で癌細胞を標識することにより癌を処置する方法を提供し、該方法は、癌患者に融合性リポソームを投与することを含み、ここで、方法は、(ｉ)該癌患者に、(ａ)１４〜２４炭素原子および特定の結合対の相補的第二官能基と結合できる該結合対の第一官能基を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層；および(ｂ)該第一官能基に結合できる該結合対の該相補的第二官能基を含む免疫系活性化剤を含む免疫系活性化融合性リポソームを投与する；または(ii)該癌患者に１４〜２４炭素原子を有し、少なくとも一つが特異的結合対の第一官能基で官能化されており、該結合対の相補的第二官能基に結合できる複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む官能化融合性リポソームを投与し、ステップ(ii)に続いて、該脂質分子の該第一官能基に結合できる結合対の相補的第二官能基で官能化された免疫系活性化剤を投与する過程を含む。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、(ａ)１４〜２４炭素原子を有し、少なくとも一つが特異的結合対の第一官能基で官能化されており、該結合対の相補的第二官能基に結合できる複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む融合性リポソームを含む第一容器；(ｂ)該脂質分子の該第一官能基と結合できる結合対の第二官能基で官能化されたＴ細胞活性化剤を含む第二容器；および(ｃ)癌患者に(ａ)の融合性リポソームおよび続いて(ｂ)のＴ細胞活性化剤を投与することを含む、癌を処置する方法についての指示を含むパンフレットを含むキットを提供する。
【００１７】
なおさらなる態様において、本発明は、上記実施態様の何れかに定義される融合性リポソームおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。
【００１８】
種々の実施態様は種々の利益を可能とし得て、種々の適用と組み合わせて使用し得る。１以上の実施態様の詳細を添付する図面および下の記載に示す。記載する技術の他の特徴、目的および利点は、明細書および図面ならびに特許請求の範囲から明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
図面の簡単な説明
開示する実施態様は、添付する図面と併せて、次の詳細な記載からより完全に理解および認識される。ここに含まれ、記載する図面は模式的であり、本開示の範囲を限定しない。図面において、要素のサイズは誇張していることがあり、それ故に、説明目的で原寸に比例していない。寸法および相対的寸法は、本開示の現実の実施化に必ずしも対応していない。
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａは、左側に、脂質二重層を形成し、第一官能基Ｆ１で修飾された脂質分子；および右側に、第二官能基Ｆ２で修飾された免疫系活性化剤を模式的に示す。
【００２１】
【図１Ｂ】図１Ｂは、左側に、脂質二重層を形成し、第一官能基Ｆ１および第一スペーサーを含む第一クロスリンカーで修飾された脂質分子；および右側に、第二官能基Ｆ２および第二スペーサーを含む第二クロスリンカーで修飾された免疫系活性化剤を模式的に示す。
【００２２】
【図２】図２Ａ〜Ｆは、作用機序および癌細胞のリポソーム免疫標識を示す。Ａ. リポソームプラットフォームレイアウト：結合対(Ｉ)はリンカー分子(II)に共有結合し、脂質頭部基に結合される。修飾脂質は、リポソームを構成する他の融合増強脂質と一緒に使用される。Ｂ. 脂質頭部(III)に共有結合した、他の結合対(II)とリンカーを結合する結合対(Ｉ)の一つの官能基を含むリンカーを有するモノクローナル抗体(ｍＡｂ)。Ｃ. 抗体および脂質頭部基へのリンカー結合例：ＮＨＳをリンカーの一端に付加し、アジドまたはＢＣＮ(ビシクロ[６.１.０]ノン−４−イン)をリンカーの他端に付加し、二つの「クリッカブル」クロスリンカーをもたらす。１級アミン(ジアシル−ホスファチジル−エタノールアミンまたは抗体のリシン側鎖基から)はＮＨＳ(脱離基、ＬＧ)を攻撃し、脂質頭部基および抗体をクリッカブルリンカーで標識する。アジドおよびＢＣＮは反応し、２つのクリッカブルクロスリンカーにより形成されたリンカーを介する脂質頭部と抗体間の共有結合形成をもたらすＤ. 融合対取り込みアッセイ：ＦＩＴＣ(緑色蛍光)標識リポソーム(製剤Ｎ８：ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＰＥ−ＦＩＴＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ  ３５：５２.５：１０：０.２：Ｘ、ここで、Ｘは５、２.５、１.２５、０.６２５モル比である)を、アジド結合ＰＥＧリンカー(１９４Da)と共に使用した。リポソームを、０.５mM脂質で癌細胞とインキュベートし、洗浄し、アジドと反応性であるＤＢＣＯ(ジベンゾシクロオクチン)−Ｃｙ５で標識した赤色蛍光プローブを使用して染色した。Ｅ. Ｔ細胞活性化抗体を腫瘍に送達させるのに使用した種々のアプローチの説明：ＩＮ(Ｉ)アプローチを、ｍＡｂのリポソームの内層への結合により達成し、製造過程中の反応材、触媒および未結合ｍＡｂの除去を可能にするための銅依存的クリック反応を使用して達成する。ＯＵＴ(II)アプローチは、リポソーム産生後のリポソームの外層へのｍＡｂの結合により達成する。ＩＮ／ＯＵＴアプローチは、ｍＡｂのリポソームの内層および外層両者への結合により達成する。Ｆ. 癌細胞の免疫標識−作用機序：Ｎ８リポソーム(ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＰＥ−ＦＩＴＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ  ３５：５２.５：１０：０.２：２.５モル比)をアジド結合ＰＥＧ４リンカー(１９４Da)と使用した。リポソームを、５mM脂質で癌細胞と１時間インキュベートし、洗浄し、抗ＣＤ３−ＰＥＧ４−ＢＣＮおよび抗ＣＤ８−ＰＥＧ４−ＢＣＮを使用して１時間標識し、洗浄した。免疫標識癌細胞はキラーＴ細胞を活性化し、殺される(脱果粒赤色矢印および赤色ドットにより説明される)。
【００２３】
【図３】図３Ａ〜Ｃは、カルセイン結合リポソームの製造のキャリブレーションを示す。Ａ. ‘クリック’化学によるリポソーム結合のための６−Ｈｅｐｔｙｎｏｉｃ−ＰＥ合成の薄層クロマトグラフィー。Ｂ. リポソーム細胞取り込み(３７℃)およびリポソーム細胞融合(４℃)に対するリン脂質疎水性テイル長の影響。Ｃ. リポソーム細胞取り込み(３７℃)およびリポソーム細胞融合(４℃)に対するリポソーム製剤中のコレステロール濃度の影響。
【００２４】
【図４】図４は、リポソーム組成物活性試験を示す：癌細胞との融合。ＤＳＰＥ／ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３修飾リポソームまたは対照リポソーム(非修飾ＤＳＰＥ)を、４Ｔ１ｍＣｈｅｒｒｙ細胞と１時間、３７℃で０.５mM脂質でインキュベートし、洗浄し、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５を使用して染色し、続いてフローサイトメトリーを使用して分析した(それぞれ橙色および青色)。示すのは、各リポソーム組成物のＣｙ５標識細胞の平均パーセントである。エラーバーは標準偏差を表す。
【００２５】
【図５】図５Ａ〜Ｂは、ＤＯＸＩＬおよび非標識(無ＦＩＴＣおよび無アジド)リポソームと比較した、種々のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００比を使用するＮ８製剤で処理した癌細胞パネルのパーセント蛍光陽性細胞および平均蛍光強度である。Ａ. リポソーム取り込みおよび融合介在標識を種々の癌細胞株について決定し、蛍光シグナル陽性に対してゲートした細胞のパーセントとして示す。Ｂ. リポソーム処理細胞の平均蛍光指標／強度(ＭＦＩ)を示す。蛍光の増加は、癌細胞中または癌細胞上の蛍光基の数に比例する。総ゲート細胞(１０,０００／チューブ、トリプリケート、２回の独立した反復)中の蛍光標識細胞の平均を棒グラフで示す。エラーバーは標準偏差を表す。
【００２６】
【図６】図６は、ＦＩＴＣ標識リポソームで処理した４Ｔ１ｍＣｈｅｒｒｙ細胞のＺ層板を示す。４Ｔ１ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を(ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＰＥ−ＦＩＴＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ  ３５：５２.５：１０：０.２：２.５)と、５mM脂質で、１時間、３７℃でインキュベートした。核をＨｏｅｃｈｓｔを使用して染色した。細胞を洗浄し、共焦点レーザー走査型顕微鏡(ＬＳＭ  ７１０)を使用して造影した。スケールバーは２０μmを表す。
【００２７】
【図７】図７Ａ〜Ｃは、癌細胞のリポソーム標的細胞質膜を示す。Ａ. Ａ５４９ヒト肺癌細胞を実験前にＰＫＨ２６色素を使用して染色し、リポソーム(ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＰＥ−ＦＩＴＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ  ３５：５２.５：１０：０.２：２.５)と、５mM脂質で１時間インキュベートした。核をＨｏｅｃｈｓｔを使用して染色した(青色)。細胞を洗浄し、共焦点レーザー走査型顕微鏡(ＬＳＭ  ７１０)を使用して造影した。Ｂ. Ｌｏｕｉｓ肺癌(マウス)を、Ｂの細胞と同一に処理した。Ｃ. Ｂ１６マウス黒色腫細胞を、Ａの細胞と同一に処理した。スケールバーは２０μm。
【００２８】
【図８】図８は、キラーＴ細胞と共インキュベートした、免疫標識リポソーム処置４Ｔ１ｍＣｈｅｒｒｙ細胞の共焦点タイムラプスを示す。４Ｔ１ｍＣｈｅｒｒｙ細胞(赤色、大型接着細胞−各チャネルが異なるカラムに分離されるため、グレースケールでは薄灰色として見える)を、５mM脂質で１時間処理し、ＰＥＧ４−ＢＣＮ(２ＳＴＥＰアプローチ)を使用して修飾した抗ＣＤ３および抗ＣＤ８を添加し、ＣＦＳＥ(緑色)標識初代キラーＴ細胞(小型、非接着細胞)と共インキュベートした。共培養を、５％ＣＯ２で、３７℃に維持した。示すのは、５０分毎に撮った共焦点画像である。スケールバーは２０μmを表す。
【００２９】
【図９】図９は、キラーＴ細胞と共インキュベートした未処理４Ｔ１ｍＣｈｅｒｒｙ細胞の共焦点タイムラプスを示す。４Ｔ１ｍＣｈｅｒｒｙ細胞(赤色、大型接着細胞−各チャネルが異なるカラムに分離されるため、グレースケールでは薄灰色として見える)を、ＣＦＳＥ標識初代キラーＴ細胞と共インキュベートした。共培養を、５％ＣＯ２で、３７℃に維持した。示すのは、５０分毎に撮った共焦点画像である。スケールバーは２０μmを表す。
【００３０】
【図１０】図１０は、共焦点タイムラプス画像における赤色ピクセルパーセントの画像解析である。示すのは、図８および９に示す種々の時点(０分、３００分、６００分および９００分)でのタイムラプスからとった画像における赤色ピクセルのパーセントである。赤色ピクセル(癌細胞シグナル)のパーセントは、２ＳＴＥＰ(黒丸)または未処理対照(灰色丸)について示される。画像定量化を、同一パラメータ下、ＦＩＪＩ画像解析ソフトウェアを使用して実施した。
【００３１】
【図１１】図１１Ａ〜Ｃは、トリプルネガティブ乳癌マウスモデルにおける免疫標識リポソームの全身有効性および体内分布を示す。腫瘍担持マウスで１ＳＴＥＰおよび２ＳＴＥＰアプローチの二つのアプローチを比較した。リポソーム製剤を３日目および１０日目にＩ.Ｖ.注射した(赤色矢印)。２ＳＴＥＰ−ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−ＢＣＮを含む標識リポソームを注射し、注射３時間後「クリッカブル」ｍＡｂ(ＰＥＧ−アジドで標識したｍＡｂ)をＩ.Ｖ.注射した；１ＳＴＥＰ：ＩＮ−内層に結合したｍＡｂ；またはＩＮ＋ＯＵＴ−内層および外層両者に結合したｍＡｂ；２ＳＴＥＰ対照−非標識ｍＡｂを伴う以外、２ＳＴＥＰと同じ脂質製剤を含む。Ａ. 腫瘍サイズ平均およびエラーバー(標準誤差)を示す。Ｂ. 個々のレーダーチャート(各グラフは一つの群を表し、各シリーズは１マウスからの腫瘍サイズデータを示す)を示す。Ｃ. 注射２４時間後の、ＤＯＸＩＬ製剤と比較した外層に結合した抗ＣＤ３および抗ＣＤ８  ｍＡｂ(ＯＵＴ)を伴うＮ８リポソーム(ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００  ３５：５２.５：１０：２.５(ここで、ＤＯＰＥはＰＥＧ−アジド(Ｎ８)を使用してまたは抗ＣＤ３および抗ＣＤ８とと共に(Ｎ８＋ＯＵＴ)修飾した)の体内分布。
【００３２】
【図１２】図１２Ａ〜Ｃは、免疫標識リポソーム７２時間後の動物から単離した腫瘍、腎臓および肝臓の免疫組織化学的および組織学的分析を示す。Ａ. 腫瘍、腎臓および肝臓を単離し、中性塩基ホルマリン固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリンおよびエオシン(Ｈ＆Ｅ)を使用してまたは抗ＣＤ３で染色した。Ｈ＆Ｅ染色は、一般に組織形態学における変化の検出に使用され、組織損傷を示す。抗ＣＤ３染色を、選択組織中のＴ細胞検出に使用した(暗褐色、幾つかを緑色矢頭で強調)。各顕微鏡写真左側の挿入図は、スライド全体像を示す。Ｂ. 腫瘍、腎臓、肝臓、肺および脾臓を４Ｔ１腫瘍担持マウスから単離し、単一細胞に消化させた。細胞を０.５mM脂質のＮ８製剤(２ＳＴＥＰまたはＯＵＴ)と１時間インキュベートし、洗浄し、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５を使用して染色した。２マウスからの初代細胞のトリプリケートを、Ｃｙ５蛍光についてフローサイトメトリーを使用して分析した。Ｃ. 褐色ピクセル(Ｔ細胞シグナル)をＦＩＪＩを使用して定量し、目的の試験領域(ＲＯＩ)のパーセントとして示す。腫瘍、肝臓および腎臓画像を少なくとも１０  ＲＯＩ(約１００μm2、腫瘍壊死性コアを除く)に分け、ＣＤ３染色について分析した。エラーバーは標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
発明の詳細な記載
次の記載の中で、本出願の種々の態様を記載する。説明の目的で、特定の配置および詳細を、本出願の完全な理解を提供するために示す。しかしながら、本出願は、ここに呈示する特定の詳細がなくても実施し得ることは当業者には明らかである。さらに、周知の事項は、本出願を不明瞭にしないために省くかまたは単純化していることがある。
【００３４】
特許請求の範囲で使用する用語「含む」は「オープン・エンド」のものであり、記載する要素またはその構造もしくは機能等価物に加えて、記載していない任意の他の要素または要素を意味する。この意味を、その前に列記されているものに限定すると解釈してはならない；他の要素または工程を除外しない。記載する特徴、整数、工程または要素の存在を言及するとおり解釈する必要はあるが、１以上の他の特徴、整数、工程または要素またはその群の存在または追加を除外しない。それ故に、表現「ｘおよびｚを含むデバイス」の範囲は、要素ｘおよびｚのみからなるデバイスに限定されるべきではないまた、表現「工程ｘおよびｚを含む方法」の範囲は、これらの工程のみからなる方法に限定してはならない。
【００３５】
特に断らない限り、ここで使用する用語「約」は当分野での通常の、許容度の範囲内、例えば標準の２標準偏差内と理解される。ある実施態様において、用語「約」は、それと共に使用される数字の記載される数値の１０％内、好ましくは記載される数値の５％内と理解される。例えば、用語「約」は、記載される値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０.５％、０.１％、０.０５％または０.０１％内とすぐに理解され得る。他の実施態様において、用語「約」は、例えば使用する実験技術による変動の高い許容度を意味し得る。特定の値の該変動は当業者には理解され、本発明の状況の範囲内である。説明として、「約１〜約５」の数値範囲は、約１〜約５の明示的に言及される値だけでなく、示されている範囲内の個々の値およびより狭い範囲も含むと解釈すべきである。それ故に、この数値範囲に含まれるのは、２、３および４などの個々の値およびより狭い範囲、例えば１〜３、２〜４および３〜５ならびに個々に１、２、３、４、５または６である。この同じ原理は、最小または最高として一つの数値しか記載していない範囲にも適用される。文脈から他の解釈が明らかではない限り、ここに提供される全ての数値は用語「約」により修飾される。「実質的に」、「一般に」、「最大」などの他の類似用語も、絶対ではないように用語または値を修飾すると解釈される。このような用語は、それらの用語が当業者によって理解されるとおり、それらが修飾する状況および用語によって定義される。これは、最低限、値の測定に使用するある実験、技術または装置の実験誤差、技術誤差および装置誤差の予測される程度を含む。
【００３６】
ここで使用する、用語「および／または」は、列記する関連項目の１以上の任意かつ全ての組み合わせを含む。他に定義しない限り、ここで使用する全ての用語(技術および科学用語を含む)は、本発明が属する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般的に使用される辞書に定義されているような用語は、明細書の文脈および関連技術に一致する意味を有するとして解釈すべきであり、ここで明示的に定義しない限り、理想的なまたはあまりに形式張った意味で解釈してはならないことはさらに理解される。周知の機能また構成は、簡潔さおよび／または明瞭さのために詳細を記載しないことがある。
【００３７】
本発明の超分子集合体、その製造およびその使用を、次の態様、文および実施態様に関して記載する。特に断らない限り、全ての態様、文および実施態様は、任意の他の態様、文および実施態様と、組み合わせが技術的意味をなさないかまたは明示的に他の解釈が示されない限り、組み合わせることが可能であると解釈される。
【００３８】
明確にするために、超分子集合体の特定の実施態様を、融合性リポソームの特定の配置の状況で定義するが、それらは、超分子集合体の他の配置にも適用される。
【００３９】
正荷電(例えばＤＯＴＡＰ)および双性イオン脂質(例えばＤＡＰＥ、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ＤＡＰＣ)の種々の比率での脂質のある組み合わせが、癌細胞との融合を顕著に改善することが、本発明により判明した。本発明のリポソーム標識プラットフォームを、クリック化学などの結合対の一つの官能基で癌細胞を優先的に標識するのに使用した(図２Ａ)。この官能基を使用して、モノクローナル抗体(ｍＡｂ)などの免疫活性化剤を付加する(実施例１〜４)。本発明のリポソームの、癌の動物モデルへの投与が、癌の処置に常に処方され、処置の基準または「ゴールドスタンダード」として使用されるＤＯＸＩＬ製剤(リポソーム封入ドキソルビシン)のものに類似する体内分布プロファイルをもたらすことがさらにここで示された(実施例５)。さらに、Ｔ細胞活性化抗体を担持する本発明のリポソームの投与は、腫瘍へのＴ細胞動員をもたらすが、肝臓および腎臓にはもたらさない。さらに、初代腫瘍細胞、腎臓、肝臓、肺または脾臓細胞とインキュベートされ、融合について試験されたリポソームは、腫瘍細胞と効率的な融合をするが、健常組織由来細胞は、免疫標識リポソームと極めて低い融合を示したことも判明した(図１１Ｂ)。纏めて、図１０Ｃに示すデータは、図１１Ａ〜Ｃと共に、種々の作用機序により存在が増加するにも関わらず、肝臓などの健常組織とは逆に、リポソームの腫瘍細胞への選択性を強調する。最後に、腫瘍増殖は、Ｔ細胞活性化抗体の官能基を欠く対照リポソームで処置した動物と比較して、本発明のリポソームで処置した動物で有意に阻害された。
【００４０】
ある態様において、本発明は、少なくとも一つの脂質の親水性頭部が官能基または１以上の免疫系活性化剤で官能化されている、複数の脂質を含む超分子集合体を提供する。この官能基は結合対のメンバーである。
【００４１】
ここで使用する用語「結合対」は、各々がそれ自体の特定の官能基を含む異なる分子の対をいい、両官能基は、互いに特定の特異性(または相補性)を有する。換言すると、これらの基は、通常の条件下、他の分子への結合に優先して、互いに結合できる。結合は共有結合でも非共有結合でもよい。このような結合対の非限定的例は、チオール−マレイミド、アジド−アルキン、アルデヒド−ヒドロキシルアミンなどである。
【００４２】
一般に、官能基は、分子の特徴的化学反応を担う、該分子内の原子または結合の特定の基もしくは部分をいう。特に、官能基または結合対の官能基は、ここに定義するように、結合対の他方の官能基(以後「第二官能基」)と結合できる、該結合対の特定の原子または結合の反応性基もしくは部分(以後「第一官能基」)をいう。上記のとおり、第一および第二官能基は互いに相補的である。上記非限定的例において、第一官能基はチオール、アジドまたはアルデヒドであり、その相補的(第二)官能基はそれぞれマレイミド、アルキンまたはヒドロキシルアミンである。
【００４３】
一般に、架橋剤(またはクロスリンカー)は、ここに定義するように、タンパク質または他の分子上の特定の反応基(１級アミン、スルフヒドリルなど)に化学的に結合できる、２以上の反応性末端(官能基)を含む分子をいう。特に、クロスリンカーは、ここに定義するように、官能基およびスペーサーを含む。
【００４４】
ある実施態様において、第一官能基は、ここに定義するように、第一クロスリンカーの反応性末端を構成し、第二官能基は、ここに定義するように、第二クロスリンカーの反応性末端を構成する(図１Ｂ)。他の実施態様において、クロスリンカーのスペーサーは省略され、それにより、結合対に官能基のみ残る(図１Ａ)。
【００４５】
ある実施態様において、超分子集合体は、リポソーム、ミセルおよびキューボソームなどの標的細胞と融合するまたは反応することができる脂質粒子；および脂質ゲル、脂質スポンジ、二重層または単層脂質シート、線維状脂質構造または脂質渦巻形などの腫瘍内または近傍に脂質を放出するよう設計された超分子集合体から選択される。
【００４６】
ある態様において、本発明は免疫系活性化剤で癌細胞を標識することにより癌を処置する方法を提供し、該方法は、癌患者に融合性リポソームを投与することを含み、ここで、該方法は、(ｉ)該癌患者に、(ａ)１４〜２４炭素原子および特定の結合対の相補的第二官能基と結合できる該結合対の第一官能基を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層；および(ｂ)該第一官能基に結合できる該結合対の該相補的第二官能基を含む免疫系活性化剤を含む免疫系活性化融合性リポソームを投与する；または(ii)該癌患者に１４〜２４炭素原子を有し、少なくとも一つが特異的結合対の第一官能基で官能化されており、該結合対の相補的第二官能基に結合できる複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む官能化融合性リポソームを投与し、ステップ(ii)に続いて、該脂質分子の該第一官能基に結合できる結合対の相補的第二官能基で官能化された免疫系活性化剤を投与する過程を含む。
【００４７】
同様に、本発明は、(１)(ａ)１４〜２４炭素原子および特定の結合対の相補的第二官能基と結合できる該結合対の第一官能基を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層；および(ｂ)該第一官能基に結合できる該結合対の該相補的第二官能基を含む免疫系活性化剤を含む、免疫系活性化剤で癌細胞を標識することにより癌を処置するために使用する融合性リポソーム；または(２)官能化融合性リポソームが１４〜２４炭素原子を有し、少なくとも一つが特異的結合対の第一官能基で官能化されており、該結合対の相補的第二官能基に結合できる複数の脂質分子を含む脂質二重層を含み、官能化免疫系活性化剤が該脂質分子の該第一官能基と結合できる結合対の相補的第二官能基で官能化されており、官能化免疫系活性化剤の前に該官能化融合性リポソームの投与を含む投与レジメンによる投与のためである、癌の処置に使用するための官能化融合性リポソームと官能化免疫系活性化剤の組み合わせを提供する。
【００４８】
ここで使用する用語「リポソーム」は、リポソームの水性内部に封入された、内層および外層からなる脂質二重層を含む脂質ナノ粒子または構築物をいう。
【００４９】
ここで使用する用語「融合性リポソーム」は、標的細胞の原形質膜と優先的に融合し、エンドサイトーシスにより多少は取り込まれる、リポソーム構築物をいう。
【００５０】
一般に、ここに定義するように、用語「細胞(の)標識」は、非修飾細胞から構造的に区別される、細胞の何らかの修飾をいう。特に、本発明の細胞は、融合性リポソームまたは免疫系活性化剤の官能基で修飾または「標識」される。
【００５１】
ある実施態様において、該免疫系活性化剤は、融合性リポソームの外層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合する。
【００５２】
ある実施態様において、該免疫系活性化剤は、融合性リポソームの内層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合する。
【００５３】
ある実施態様において、該免疫系活性化剤は、融合性リポソームの外側および内層両者で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合する。
【００５４】
ある実施態様において、免疫系活性化剤は、Ｔ細胞活性化剤；炎症誘発性サイトカイン；記憶キラーＴ細胞活性化ペプチド；ウイルスペプチドを提示する可溶性ヒト白血球抗原(ｓＨＬＡ)；およびスーパー抗原から選択される。特に、免疫系活性化剤は、Ｔ細胞活性化剤、例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体またはこれらの組み合わせ、ＣＤ３およびＣＤ８両者と結合できる抗体およびＣＤ３およびＮＫＧ２Ｄ両者と結合できる抗体または抗ＮＫＧ２Ｄ二量体化抗体または該抗体の機能的フラグメント(ｓｃＦｖまたはＦａｂ)であってよく；炎症誘発性サイトカインは、場合により加水分解性リンカーを経て脂質に可逆的に結合した、ＩＬ２、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＩＦＮγまたはこれらの組み合わせから選択され；記憶キラーＴ細胞活性化ペプチドは、α−デフェンシンなどの抗微生物ペプチドであり；そしてスーパー抗原は、ブドウ球菌性毒素ショック症候群毒素−１、ＴＳＳＴ−１または同様にＴ細胞受容体を標的細胞のＭＨＣ／ＨＬＡに結合させ、結果的にキラーＴ細胞活性化のカスケードを誘発することができる抗原である。
【００５５】
ここに記載する抗体またはその機能的フラグメントはまた一本鎖可変フラグメント(ｓｃＦｖ)；抗体の機能的フラグメント；ナノボディなどの単一ドメイン抗体；および組み換え抗体；(ii)アフィボディ分子などの抗体模倣物；アフィリン；アフィマー；アフィチン；アルファボディ；アンチカリン；アビマー；ＤＡＲＰｉｎ；フィノマー；クーニッツドメインペプチド；およびモノボディ；または(iii)アプタマーもいう。
【００５６】
本発明で使用する抗体またはその機能的フラグメントは、(リポソームをある標的細胞に結合させるための)標的化剤の機能を果たさないが、その代わり、免疫系活性化剤の機能を果たすことが明確にされるべきである。
【００５７】
ある実施態様において、免疫活性化剤は、免疫チェックポイントにより発揮される免疫抑圧を開放することにより、作用し得る。本発明により免疫抑制を開放するために操作し得るチェックポイントは、ＰＤ１−ＰＤＬ１、ＰＤ１−ＰＤＬ２、ＣＤ２８−ＣＤ８０、ＣＤ２８−ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４−ＣＤ８０、ＣＴＬＡ４−ＣＤ８６、ＩＣＯＳ−Ｂ７ＲＰ１、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、Ｂ７Ｈ７、Ｂ７−ＣＤ２８様分子、ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ、ＫＩＲ−ＭＨＣクラスＩまたはII、ＬＡＧ３−ＭＨＣクラスＩまたはII、ＣＤ１３７−ＣＤ１３７Ｌ、ＯＸ４０−ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ２７−ＣＤ７０、ＣＤ４０Ｌ−ＣＤ４０、ＴＩＭ３−ＧＡＬ９、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー(ＶＩＳＴＡ)、インターフェロン遺伝子刺激因子(ＳＴＩＮＧ)、Ｔ細胞免疫グロブリンおよび免疫受容体チロシンベースの阻害性モチーフドメイン(ＴＩＧＩＴ)、Ａ２ａＲ−アデノシンおよびインドールアミン−２,３−ジオキシゲナーゼ(ＩＤＯ)−Ｌ−トリプトファンからなる群から選択され得る。
【００５８】
免疫チェックポイントを遮断できる薬剤は当分野で知られ16、これらの薬剤を本発明により使用し得る。下記引用文献の各々およびPardoll, 201217を、ここに完全に開示されているかのように、引用により包含させる。
【００５９】
リポソームに結合する、例えば、抗ＰＤ１抗体などの抗免疫チェックポイント抗体は、抗体の半減期が改善し得る。あるいは、小分子免疫チェックポイント阻害剤はリポソームに封入され、腫瘍環境で放出され得る。このような抗体または小分子阻害剤の標的化放出は、副作用を顕著に低減することが予測される。
【００６０】
例えば、本発明により使用する抗ＰＤ−１抗体は、Ohaegbulam et al18(その全内容を引用により本明細書に包含させる)に開示のもの、すなわちＣＴ−０１１(ピディリズマブ；ヒト化ＩｇＧ１；Curetech)、ＭＫ−３４７５(ランブロリズマブ、ペンブロリズマブ；ヒト化ＩｇＧ４；Merck)、ＢＭＳ−９３６５５８(ニボルマブ；ヒトＩｇＧ４；Bristol-Myers Squibb)、ＡＭＰ−２２４(ＰＤ−Ｌ２  ＩｇＧ２ａ融合タンパク質；AstraZeneca)、ＢＭＳ−９３６５５９(ヒトＩｇＧ４；Bristol-Myers Squibb)、ＭＥＤＩ４７３６(ヒト化ＩｇＧ；AstraZeneca)、ＭＰＤＬ３２８０Ａ(ヒトＩｇＧ；Genentech)、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ(ヒトＩｇＧ１；Merck-Serono)から選択でき；または発明により使用する抗体は、ヒト化ＩｇＧ４  ｍＡｂであるＭＥＤＩ０６８０(ＡＭＰ−５１４；AstraZeneca)であり得る。
【００６１】
抗ＣＴＬＡ４抗体は、完全ヒトＩｇＧ２モノクローナル抗体であるトレメリムマブ(Pfizer)；または完全ヒトヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体であるイピリムマブであり得る。
【００６２】
抗キラー細胞免疫グロブリン様受容体(ＫＩＲ)抗体は、リリルマブ(ＢＭＳ−９８６０１５；Innate Pharmaが開発し、Bristol-Myers Squibbにライセンス)、完全ヒトモノクローナル抗体であり得る。
【００６３】
抗ＬＡＧ−３抗体はリンパ球活性化遺伝子−３を指向する。本発明により使用し得るこのような抗体の一つは、モノクローナル抗体ＢＭＳ−９８６０１６(ペンブロリズマブ；ヒト化ＩｇＧ４；Merckである)。
【００６４】
小分子免疫チェックポイント阻害剤の代表的リストを表２に示す。
【表１】
2020517750.tif 000003
【００６５】
ある実施態様において、リポソームは、生理的ｐＨでカチオン性である部分を含む。それ故に、ある実施態様において、該脂質分子の少なくとも一つは、さらにカチオン基、カチオン性天然または合成ポリマー、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸またはカチオン性両親媒性癌細胞結合ペプチドを含む。
【００６６】
特に、カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つは、１,２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパンクロライド(ＤＯＴＡＰ)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(ＤＯＧＳ)、１,２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＯＴＭＡ)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(１８：０  ＤＤＡＢ)およびＮ１−[２−((１Ｓ)−１−[(３−アミノプロピル)アミノ]−４−[ジ(３−アミノ−プロピル)アミノ]ブチル−カルボキサミド)エチル]−３,４−ジ[オレイルオキシ]−ベンズアミド(ＭＶＬ５)から選択され；合成ポリマーは、ポリエチレンイミン(ＰＥＩ)およびポリ(２−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレートから選択され；天然ポリマーはキトサンなどの多糖であり；アミノ糖はグルコサミンであり、カチオン性ポリアミノ酸はポリ(Ｌ−リシン)、ポリ(Ｌ−アルギニン)、ポリ(Ｄ−リシン)、ポリ(Ｄ−アルギニン)、ポリ(Ｌ−オルニチン)およびポリ(Ｄ−オルニチン)から選択され；または該両親媒性癌細胞結合ペプチドは、セクロピンＡ(KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIKAGPAVAVVGQATQIAK；(配列番号１)；セクロピンＡ１〜８(KWKLFKKI；(配列番号２)および環状CNGRC(配列番号３)から選択される。
【００６７】
より具体的な実施態様において、カチオン基を含む該脂質分子はＤＯＴＡＰである。
【００６８】
ある実施態様において、該脂質分子の少なくとも一つは、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるリン脂質であり、その各々は１個または２個の同一または異なる脂肪酸残基を含み、ここで、ホスファチジル部分における脂肪酸残基は飽和、モノ−不飽和またはポリ−不飽和であり、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４炭素の炭素鎖長を有し、例えば、ミリストイル、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル(結合リノレノイルを含む)、リン脂質およびリゾリン脂質配置のアラキドノイルならびにこれらの組み合わせである。
【００６９】
具体的実施態様において、該リン脂質は、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(ＰＯＰＣ)および１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)；１,２−ジミリストイル−３−ホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)；１,２−ジステアロイル−３−ホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)；１,２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１４：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジミリステライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１４：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１６：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジパルミテライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１６：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジペトロセレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：１(Δ６−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルコリン(１８：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ(ＤＯＰＣ))；１,２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：２(Ｃｉｓ)ＰＣ(ＤＬＰＣ))；１,２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：３(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２０：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２０：４(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２２：６(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２２：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジネルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２４：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジミリストイル−３−−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)；１,２−ジパルミトイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)；ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)；１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)；１,２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)；１,２−ジミリストイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＭＰＳ)；１,２−ジパルミトイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＰＰＳ)；パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＰＯＰＥ)；および１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＯＰＳ)からなる群から選択される。より特には、該リン脂質はＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥから選択される。
【００７０】
ある実施態様において、融合性リポソームは、該脂質分子の少なくとも一つに結合した安定化部分をさらに含む。
【００７１】
ここで使用する用語「安定化部分」は、リポソームの脂質二重層内に取り込まれたとき、安定化部分を欠く同一リポソームと比較して、リポソームの血液循環半減期を延長させる、部分をいう。
【００７２】
具体的実施態様において、該安定化部分は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル−ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ(アクリロイルモルホリン)およびポリアクリルアミドから選択される。例えば、安定化部分は、約１０６Da〜約４kDa、例えば１０６Da(ＰＥＧ２)、１９４Da(ＰＥＧ４)、６００Da(ＰＥＧ６００)、２kDa(ＰＥＧ２０００)および４kDa(ＰＥＧ４０００)の分子量のＰＥＧである。より具体的な実施態様において、安定化部分は、約２kDaの分子量のＰＥＧである。
【００７３】
ある実施態様において、該安定化部分は、マトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＭＰ)−１についてVPMSMRGG(配列番号４)、ＭＭＰ−２についてIPVSLRSG(配列番号５)もしくはGGGGPLGVRGGGGK(配列番号６)、ＭＭＰ−３についてRPFSMIMG(配列番号７)、ＭＭＰ−７についてVPLSLTMG(配列番号８)、ＭＭＰ−９についてVPLSLYSG(配列番号９)および膜タイプ１−マトリクスメタロプロテイナーゼ(ＭＴ１−ＭＭＰ)についてIPESLRAG(配列番号１０)などの切断可能ペプチドリンカーを経て該脂質分子の少なくとも一つに結合でき、これらすべてＮおよび／またはＣ末端でアミノ酸残基、ＰＥＧおよび他のリンカーで修飾され得る。
【００７４】
ある実施態様において、切断可能リンカーは、ジチオジプロピオネートアミノエタノール(ＤＴＰ)またはジチオ−３−ヘキサノール(ＤＴＨ)などのｐＨ感受性切断可能リンカーである。
【００７５】
ある実施態様において、脂質を放出するが、融合性リポソームはしないように設計された超分子集合体は、ＰＥＧ、ポリ(乳酸−コ−グリコール酸)(ＰＬＧＡ)およびアルギネートなどのポリマーを含む。
【００７６】
ある実施態様において、複数の脂質の少なくとも一つの脂質の親水性頭部は、通常の条件下、他の分子への結合またはそれら自体の間での共有結合または非共有結合高親和性結合体の形成に優先して、互いに結合できる結合対の第一官能基または第二官能基で各々官能化されており、ここで、結合対の第一官能基および第二官能基は、例えば、(ｉ)クリック化学反応の反応基；または(ii)ビオチンおよびビオチン結合ペプチドまたはビオチン結合タンパク質であるが、これらに限定されない。
【００７７】
ここで使用する用語「高親和性」は、キレーター−金属カップリング(例えばＮｉおよびＨｉｓ６などの数Ｈｉｓを含むペプチド配列)または結合対の２メンバー間、例えば抗体とその標的エピトープまたはビオチンとストレプトアビジンの結合などの化学的または生物物理学的会合をいい、ここで、２結合対間の会合は、１０−4Ｍ〜１０−30Ｍ、例えば１０−6Ｍ、１０−7Ｍ、１０−8Ｍ、１０−9Ｍ、１０−10Ｍ、１０−11Ｍ、１０−12Ｍまたは１２−13ＭのＫｄを有する。
【００７８】
ある実施態様において、特定の結合対の該第一官能基は、該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成できる。
【００７９】
具体的実施態様において、特定の結合対の該第一官能基は、クリック化学反応により該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成できる。
【００８０】
具体的実施態様において、ｉ)特定の結合対の第一官能基はアルキンまたはホスフィンであり、該結合対の第二官能基はアジドであるかまたはその逆であり；ii)特定の結合対の第一官能基はシクロアルケン、シクロアルキン、シクロプロパン、イソニトリル(イソシアニド)またはビニルボロン酸であり、該結合対の第二官能基はテトラジンであるかまたはその逆であり；iii)特定の結合対の第一官能基はアルキンまたはマレイミドであり、該結合対の第二官能基はチオールであるかまたはその逆であり；iv)特定の結合対の第一官能基は結合ジエンであり、該結合対の第二官能基は置換アルケンであるかまたはその逆であり；ｖ)特定の結合対の第一官能基はアルケン、アルキンまたはアセチレン化銅であり、該結合対の第二官能基はニトロンであるかまたはその逆であり；vi)特定の結合対の第一官能基はアルデヒドまたはケトンであり、該結合対の第二官能基はアルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドであるかまたはその逆であり；またはvii)特定の結合対の第一官能基はアルデヒド、ケトン、イソチオシアネート、カルボン酸またはその誘導体、例えばエステル、無水物、アシルハライド、トシルおよびＮ−ヒドロスクシンイミド(ＮＨＳ)であり、該結合対の第二官能基はアミンであるかまたはその逆である。より具体的な実施態様において、特定の結合対はアルキン−アジドである。
【００８１】
ある実施態様において、特定の結合対の該第一官能基は該結合対の該相補的第二官能基と非共有結合を形成できる。
【００８２】
具体的実施態様において、特定の結合対の第一官能基はビオチンであり、該結合対の第二官能基はビオチン結合ペプチドまたはビオチン結合タンパク質から選択されるその結合パートナーであるかまたはその逆である。例えば、該ビオチン結合タンパク質はアビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体から選択でき；そして該ビオチン結合ペプチドはAEGEFCSWAPPKASCGDPAK(配列番号１１)、CSWRPPFRAVC(配列番号１２)、CSWAPPFKASC(配列番号１３)およびCNWTPPFKTRC(配列番号１４)から選択される[Saggio and Laufer. Biotin binders selected from a random peptide library expressed on phage. Biochem. J. (1993) 293, 613-616；引用により完全に開示されているかのように本明細書に包含させる]。システイン残基はジスルフィド結合を形成でき、リンカーは、ＮもしくはＣ末端または両端に結合する。
【００８３】
ある実施態様において、融合性リポソームは、脂質二重層と第一官能基の間に第一スペーサーをさらに含む(図１Ｂ)。
【００８４】
ある実施態様において、免疫系活性化剤は、免疫系活性化剤と第二官能基間に第二スペーサーをさらに含む(図１Ｂ)。
【００８５】
ある実施態様において、第一または第二スペーサーは、ＰＥＧ、(Ｃ６−Ｃ１２)アルキル、フェノール酸、安息香酸またはナフトエモノ、ジもしくはトリカルボン酸、テトラヒドロピレンモノ、ジもしくはトリカルボン酸またはその塩、環状エーテル、グルタル酸、コハク酸、ムコン酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸およびセバシン酸および約２〜２０アミノ酸残基長、例えば３アミノ酸残基長のポリ−Ｇｌｙペプチドなどのペプチドからなる群から選択される。
【００８６】
具体的実施態様において、第一または第二スペーサーは、約１０６Da〜約４kDa約１０６Da〜約４kDa、例えば１０６Da(ＰＥＧ２)、１９４Da(ＰＥＧ４)、６００Da(ＰＥＧ６００)、２kDa(ＰＥＧ２０００)および４kDa(ＰＥＧ４０００)の分子量のＰＥＧである；そして、より特には、第一または第二スペーサーは約１９４Da(ＰＥＧ４)の分子量のＰＥＧである。
【００８７】
あるいは、具体的実施態様において、第一または第二スペーサーは(Ｃ６−Ｃ１２)アルキル、好ましくはヘプチルまたはドデカノイルである。
【００８８】
ある実施態様において、融合性リポソームは、コレステロール(ＣＨＯ)またはその誘導体をさらに含む。
【００８９】
ある実施態様において、リポソームは、最大２００nm、例えば約１５nm〜約２００nm、約２０nm〜約１００nm、約５０nm〜約１５０nm、約５０nm〜約９０nm、約８０nm〜約１００nm、約１１０nm〜約２００nm、例えば約１００nmのサイズを有する。
【００９０】
ある実施態様において、融合性リポソームは、炎症誘発性サイトカイン、例えばＩＬ２、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１、ＴＮＦαおよびＩＦＮγなどの１以上の免疫系活性化剤；少なくとも一つの刺激性分子、例えばイオノマイシン；および少なくとも一つの記憶キラーＴ細胞活性化ペプチドをその親水性コアにさらに含む。
【００９１】
ある実施態様において、該免疫系活性化剤は、融合性リポソームの外層、内層または外側および内層両者で、該第二官能基を経て該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合し；免疫系活性化剤はＴ細胞活性化剤；炎症誘発性サイトカイン；記憶キラーＴ細胞活性化ペプチド；およびスーパー抗原から選択され；該脂質の少なくとも一部はカチオン基、カチオン性天然または合成ポリマー、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性癌細胞結合ペプチドを含み；脂質の少なくとも一部はホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸またはこれらの組み合わせからなる群から選択されるリン脂質であり、その各々は１個または２個の同一または異なる脂肪酸残基を含み、ここで、ホスファチジル部分における脂肪酸残基は飽和、モノ−不飽和またはポリ−不飽和であり、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４炭素などの炭素鎖長を有し、例えばミリストイル、ステアロイル、パルミトイル、オレオイル、リノレオイル、リノレノイル(結合リノレノイルを含む)、リン脂質およびリゾリン脂質配置のアラキドノイルならびにこれらの組み合わせであり；該リポソームは、該脂質または該カチオン性ポリマーの少なくとも一つに結合した安定化部分を有し；特定の結合対の該第一官能基は、該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成できるまたは特定の結合対の該第一官能基は該結合対の該相補的第二官能基と非共有結合を形成できる；第一または第二スペーサーはＰＥＧ、(Ｃ６−Ｃ１２)アルキル、フェノール酸、安息香酸またはナフトエモノ、ジもしくはトリカルボン酸、テトラヒドロピレンモノ、ジもしくはトリカルボン酸またはその塩、環状エーテル、グルタル酸、コハク酸、ムコン酸、アジピン酸、ピメリン酸、スベリン酸、アゼライン酸およびセバシン酸、約２〜２０アミノ酸残基長、例えば３アミノ酸残基長のポリ−Ｇｌｙペプチドなどのペプチドからなる群から選択され；そしてリポソームは、最大２００nm、例えば約１５nm〜約２００nm、約２０nm〜約１００nm、約５０nm〜約１５０nm、約５０nm〜約９０nm、約８０nm〜約１００nm、約１１０nm〜約２００nm、例えば約１００nmのサイズを有する。
【００９２】
具体的実施態様において、免疫系活性化剤はＴ細胞活性化剤であり；カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つは、１,２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウムプロパンクロライド(ＤＯＴＡＰ)、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン(ＤＯＧＳ)、１,２−ジ−Ｏ−オクタデセニル−３−トリメチルアンモニウムプロパン(ＤＯＴＭＡ)、ジメチルジオクタデシルアンモニウム(１８：０  ＤＤＡＢ)およびＮ１−[２−((１Ｓ)−１−[(３−アミノプロピル)アミノ]−４−[ジ(３−アミノ−プロピル)アミノ]ブチル−カルボキサミド)エチル]−３,４−ジ[オレイルオキシ]−ベンズアミド(ＭＶＬ５)から選択され、該合成ポリマーはポリエチレンイミン(ＰＥＩ)およびポリ(２−(ジメチルアミノ)エチルメタクリレートから選択され、該天然ポリマーはキトサンであり、該アミノ糖はグルコサミンであり；該カチオン性ポリアミノ酸はポリ(Ｌ−リシン)、ポリ(Ｌ−アルギニン)、ポリ(Ｄ−リシン)、ポリ(Ｄ−アルギニン)、ポリ(Ｌ−オルニチン)およびポリ(Ｄ−オルニチン)から選択されまたは該両親媒性癌細胞結合ペプチドはセクロピンＡ；セクロピンＡ１〜８；および環状ＣＮＧＲＣから選択され；該脂質分子の少なくとも一つは１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(ＰＯＰＣ)および１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)；１,２−ジミリストイル−３−ホスファチジルコリン(ＤＭＰＣ)；１,２−ジステアロイル−３−ホスファチジルコリン(ＤＳＰＣ)；１,２−ジミリストレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１４：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジミリステライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１４：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジパルミトレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１６：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジパルミテライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１６：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジペトロセレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：１(Δ６−Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルコリン(１８：１(Δ９−Ｃｉｓ)ＰＣ(ＤＯＰＣ))；１,２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：１(Δ９−Ｔｒａｎｓ)ＰＣ)；１,２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：２(Ｃｉｓ)ＰＣ(ＤＬＰＣ))；１,２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(１８：３(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジエイコセノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２０：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジアラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２０：４(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２２：６(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２２：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジネルボノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン(２４：１(Ｃｉｓ)ＰＣ)；１,２−ジミリストイル−３−−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＭＰＥ)；１,２−ジパルミトイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＰＰＥ)；ジパルミトイルホスファチジルコリン(ＤＰＰＣ)；１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)；１,２−ジステアロイル−３−ホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)；１,２−ジミリストイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＭＰＳ)；１,２−ジパルミトイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＰＰＳ)；パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン(ＰＯＰＥ)；および１,２−ジオレイル−３−ホスファチジルセリン(ＤＯＰＳ)からなる群から選択され；該安定化部分は、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン(ＰＶＰ)、デキストラン、ポリアミノ酸、メチル−ポリオキサゾリン、ポリグリセロール、ポリ(アクリロイルモルホリン)およびポリアクリルアミドから選択され；特定の結合対の該第一官能基はクリック化学反応により該結合対の該相補的第二官能基と共有結合を形成でき、ｉ)特定の結合対の第一官能基はアルキンまたはホスフィンであり、該結合対の第二官能基はアジドであるかまたはその逆であり；ii)特定の結合対の第一官能基はシクロアルケン、シクロアルキン、シクロプロパン、イソニトリル(イソシアニド)またはビニルボロン酸であり、該結合対の第二官能基はテトラジンであるかまたはその逆であり；iii)特定の結合対の第一官能基はアルキンまたはマレイミドであり、該結合対の第二官能基はチオールであるかまたはその逆であり；iv)特定の結合対の第一官能基は結合ジエンであり、該結合対の第二官能基は置換アルケンであるかまたはその逆であり；ｖ)特定の結合対の第一官能基はアルケン、アルキンまたはアセチレン化銅であり、該結合対の第二官能基はニトロンであるかまたはその逆であり；vi)特定の結合対の第一官能基はアルデヒドまたはケトンであり、該結合対の第二官能基はアルコキシアミン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジンまたはヒドラジドであるかまたはその逆であり；またはvii)特定の結合対の第一官能基はアルデヒド、ケトン、イソチオシアネート、カルボン酸またはその誘導体、例えばエステル、無水物、アシルハライド、トシルおよびＮ−ヒドロスクシンイミド(ＮＨＳ)であり、該結合対の第二官能基はアミンであるかまたはその逆であり；viii)官能基であるかまたは特定の結合対の第一官能基はビオチンであり、該結合対の第二官能基はビオチン結合ペプチドまたはビオチン結合タンパク質から選択されるその結合パートナーであるかまたはその逆であり；そして第一または第二スペーサーは約１０６Da〜約４kDaの分子量のＰＥＧまたは(Ｃ６−Ｃ１２)アルキル、好ましくはヘプチルまたはドデカノイルである。
【００９３】
より具体的な実施態様において、Ｔ細胞活性化剤は抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体、抗ＮＫＧ２Ｄ抗体またはこれらの組み合わせ、ＣＤ３およびＣＤ８両者と結合できる抗体およびＣＤ３およびＮＫＧ２Ｄ両者と結合できる抗体または抗ＮＫＧ２Ｄ二量体化抗体から選択され；カチオン基を含む該脂質分子の少なくとも一つはＤＯＴＡＰであり；該リン脂質はＤＯＰＣ、ＰＯＰＣ、ＤＭＰＣ、ＤＰＰＣ、ＤＯＰＥ、ＰＯＰＥ、ＤＳＰＥ、ＤＭＰＥおよびＤＰＰＥから選択され；安定化部分は約１０６Da〜約４kDaの分子量のＰＥＧであり；特定の結合対はアルキン−アジドであり、該ビオチン結合タンパク質はアビジン、ストレプトアビジンおよび抗ビオチン抗体から選択されまたは該ビオチン結合ペプチドはAEGEFCSWAPPKASCGDPAK(配列番号１１)、CSWRPPFRAVC(配列番号１２)、CSWAPPFKASC(配列番号１３)およびCNWTPPFKTRC(配列番号１４)から選択され；そして第一または第二スペーサーは約１９４Da(ＰＥＧ４)の分子量のＰＥＧである。
【００９４】
より具体的な実施態様において、安定化部分は、約２kDaの分子量のＰＥＧである。
【００９５】
最初のある具体的実施態様において、融合性リポソームは(ａ)ＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３またはＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−ＢＣＮ；または(ｂ)ＤＭＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３またはＤＭＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ４−ＢＣＮを含み、ここで、ＰＥＧ２Ｋは約２kDaの分子量を有するＰＥＧを表し、そしてＰＥＧ４は約１９４Daの分子量を有するＰＥＧを表し、そしてＤＯＰＣの相対的モル量は最大約８０％であり、ＤＯＴＡＰの相対的モル量は最大約８０％であり、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋの相対的モル量は最大約２０％であり、ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４の相対的モル量は最大約２０％であり、ＨＳＰＣの相対的モル量は最大約６５％であり、コレステロールの相対的モル量は最大約４０％であり、そしてＤＭＰＣの相対的モル量は最大約７０％であり、そして融合性リポソームは約５０nm〜約３００nm、例えば８０nmまたは１００nmのサイズを有する。
【００９６】
第二のある具体的実施態様において、融合性リポソームは、(ｉ)モル比５２.５：３５：０.６：１０、５２.５：３５：１.２５：１０、５２.５：３５：２.５：１０、５２.５：３５：５：１０、５２.５：３５：０.６：５、５２.５：３５：１.２５：５、５２.５：３５：２.５：５、５２.５：３５：５：５、６５：２０：５：１０、５０：３５：５：１０、５２.５：３５：１.２５：７、５２.５：３５：１.２５：５または５２.５：３５：２.５：７でＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３またはＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−ＢＣＮ：または(ii)モル比６０：３５：５でＤＭＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３またはＤＭＰＣ：コレステロール：ＤＭＰＥ−ＰＥＧ４−ＢＣＮを含む。
【００９７】
第三のある具体的実施態様において、融合性リポソームは、モル比５２.５：３５：２.５：５または５２.５：３５：２.５：１０でＤＯＰＣ：ＤＯＴＡＰ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ：ＤＯＰＥ−ＰＥＧ４−Ｎ３を含む。
【００９８】
第一〜第三のある具体的実施態様において、該Ｔ細胞活性化剤は、融合性リポソームの外層で、該第二クロスリンカーを経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一クロスリンカーに結合する。
【００９９】
第一〜第三のある具体的実施態様において、該Ｔ細胞活性化剤は、融合性リポソームの内層で、該第二クロスリンカーを経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一クロスリンカーに結合する。
【０１００】
第一〜第三のある具体的実施態様において、該Ｔ細胞活性化剤は、融合性リポソームの内層および外層両者で、該第二クロスリンカーを経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一クロスリンカーに結合する。
【０１０１】
第一〜第三のある具体的実施態様において、該Ｔ細胞活性化剤は、融合性リポソームの外層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合する。
【０１０２】
第一〜第三のある具体的実施態様において、該Ｔ細胞活性化剤は、融合性リポソームの内層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合する。
【０１０３】
第一〜第三のある具体的実施態様において、該Ｔ細胞活性化剤は、融合性リポソームの内層および外層両者で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合する。
【０１０４】
ある実施態様において、(ii)の第一工程は、(iii)の第二工程の直前、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、１日、２日、３日または最大１週間前に実施する。
【０１０５】
ある実施態様において、上記実施態様のいずれかのリポソームの融解温度(Ｔｍ)は４５℃未満であり、そこで融合性リポソームは非結晶転移相を維持し、それにより、リポソームの細胞膜との融合に必要な膜流動性を提供する。
【０１０６】
ある実施態様において、上記実施態様のいずれかの方法を使用して処置される癌は、トリプルネガティブ乳癌などの乳癌、黒色腫および肺癌からなる群から選択される。
【０１０７】
他の態様において、本発明は、少なくとも一つが特異的結合対の第一官能基で官能化されており、該結合対の相補的第二官能基に結合できる、１４〜２４炭素原子を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む融合性リポソームを提供する。
【０１０８】
脂質分子、官能基、スペーサー、免疫系活性化剤、カチオン基、カチオン性天然または合成ポリマー、カチオン性アミノ糖、カチオン性ポリアミノ酸または両親媒性癌細胞結合ペプチドおよび安定化部分などの融合性リポソームの要素およびサイズは、それらが使用され得る処置方法に関連して、上記実施態様において定義されるとおりである。
【０１０９】
ある実施態様において、融合性リポソームは、脂質二重層と第一官能基の間に第一スペーサーをさらに含む。
【０１１０】
ある実施態様において、融合性リポソームは、該第一官能基に結合する相補的該結合対の第二官能基で官能化された免疫系活性化剤をさらに含む
【０１１１】
ある実施態様において、免疫系活性化剤は、融合性リポソームの外層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される。
【０１１２】
ある実施態様において、免疫系活性化剤は、融合性リポソームの内層で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される。
【０１１３】
ある実施態様において、免疫系活性化剤は、融合性リポソームの外側および内層両者で、該第二官能基を経て、該脂質分子の少なくとも一つの第一官能基に結合される。
【０１１４】
ある実施態様において、免疫系活性化剤は、免疫系活性化剤と第二官能基間に第二スペーサーをさらに含む。
【０１１５】
ある実施態様において、免疫系活性化剤は、Ｔ細胞活性化剤；炎症誘発性サイトカイン；記憶キラーＴ細胞活性化ペプチド；およびスーパー抗原から選択される。
【０１１６】
ある実施態様において、免疫系活性化剤はＴ細胞活性化剤である。
【０１１７】
ある実施態様において、Ｔ細胞活性化剤は、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ８抗体またはこれらの組み合わせ；およびＣＤ３およびＣＤ８両者と結合できる抗体から選択される。
【０１１８】
さらなる態様において、本発明は、外層で結合した免疫系活性化剤を伴う融合性リポソームを製造する方法を提供し、該方法は、(ａ)１４〜２４炭素原子および特定の結合対の相補的第二官能基と結合できる該結合対の第一官能基を有する複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む官能化融合性リポソームと、結合対の相補的第二官能基で官能化された免疫系活性化剤の反応を含み、ここで、該第二官能基は該第一官能基に結合し、それにより外層で結合した該Ｔ細胞活性化剤に結合した該融合性リポソームを産生する。
【０１１９】
なおさらなる態様において、本発明は、内層および外層両者で結合した免疫系活性化剤を有する融合性リポソームを製造する方法を提供し、該方法は、(ｉ)１４〜２４炭素原子を有する、少なくとも一つが特定の結合対の第一官能基で官能化されている複数の脂質分子と、結合対の第二官能基で官能化されたＴ細胞活性化剤を反応させ、ここで、該第二官能基は該脂質分子の該第一官能基に結合し、それにより、Ｔ細胞活性化剤に結合した脂質分子を産生し；そして(ii)工程(ｉ)で得た該脂質分子から該融合性リポソームを調製し、それにより、内層および外層両者で結合した該Ｔ細胞活性化剤で官能化された融合性リポソームを産生する工程を含む。
【０１２０】
なおさらなる態様において、本発明は、内層で結合した免疫系活性化剤を伴う融合性リポソームを製造する方法を提供する。方法は、速度論的反応管理の概念に基づく。リポソームは、２官能基間で化学結合が形成されるよりはるかに速い反応速度で脂質二重層から自己集合する。それ故に、未反応免疫系活性化剤および他の反応材または銅依存的クリック化学反応のための銅触媒などの触媒は、溶液で何らかの顕著な化学反応が起こる前に、リポソームの水性内部に封入される。免疫系活性化剤および／または化学反応に必要な他の反応材はリポソーム内に封入されず、例えば形成されたリポソームの洗浄により、溶液から物理的に除去される。あるいは、溶液のｐＨなどの反応条件を、リポソームの外で生じる化学反応の停止または阻止のためにある時点で変えてよく、一方リポソームの水性内部の反応条件は、脂質二重層バリアにより未変化のままである。本発明のリポソーム形成のためのクリック化学反応用触媒の非限定的例は、(II)アセチルアセトネート、銅(Ｉ)イソニトリルおよび還元剤としてアスコルビン酸ナトリウムを使用して銅(Ｉ)塩または銅(II)塩から産生されるすべての他の活性銅(Ｉ)触媒である。免疫系活性化剤および他の反応材または触媒を例えば透析またはゲル濾過により除去でき、または免疫活性化剤または脂質の一方または両方の官能基と対応する遊離官能基の過剰分を反応させて、免疫活性化剤または脂質の官能基を枯渇させ、それにより反応を停止させまたは阻止することにより除去できる。
【０１２１】
それ故に、内層で結合した免疫系活性化剤を伴う融合性リポソームを製造する方法は、次の工程を含む。第一工程で、１４〜２４炭素原子を有する、少なくとも一つが特定の結合対の第一官能基で官能化されている複数の脂質分子を、溶液中、適当な反応条件で該脂質分子の該第一官能基と結合できる結合対の第二官能基で官能化されたＴ細胞活性化剤と反応させる。反応材または触媒を何ら導入しなければ、２官能基間の化学反応は比較的ゆっくりである。その結果、脂質分子は第一反応工程でリポソームに自己集合し、それにより、該Ｔ細胞活性化剤分子の一部をリポソームの水性内部に封入する。第二工程で、封入されず、リポソーム外側の溶液に残っているＴ細胞活性化剤分子を除去するかまたは洗い流す。場合により、脂質分子と非封入Ｔ細胞活性化剤分子の反応は、上記のとおり阻止し得る。第三段階で、第一工程で製造したリポソームの水性内部で脂質分子と封入Ｔ細胞活性化剤の反応を実施し、ここで、該Ｔ細胞活性化剤の該第二官能基は該脂質分子の該第一官能基に結合し、それにより、内層で結合した該Ｔ細胞活性化剤で官能化された融合性リポソームを産生する。
【０１２２】
ある実施態様において、内層で結合した免疫系活性化剤を伴う融合性リポソームを製造する方法は、(ｉ)１４〜２４炭素原子を有する、少なくとも一つが特定の結合対の第一官能基で官能化されている複数の脂質分子および該脂質分子の該第一官能基と結合できる結合対の第二官能基で官能化されているＴ細胞活性化剤を含むリポソームを溶液中で調製し、それにより、該Ｔ細胞活性化剤の一部を封入し；(ii)溶液から非封入Ｔ細胞活性化剤および全ての任意の反応材および触媒を除去し；(iii)工程(ｉ)で調製したリポソームの水性内部で脂質分子と封入Ｔ細胞活性化剤を反応させ、ここで、該Ｔ細胞活性化剤の該第二官能基は該脂質分子の該第一官能基に結合し、それにより、内層で結合した該Ｔ細胞活性化剤で官能化された融合性リポソームを産生する工程を含む。
【０１２３】
ある実施態様において、溶液は、少なくとも一つの酸化−還元触媒をさらに含む。具体的実施態様において、少なくとも一つの酸化−還元触媒は銅(Ｉ)塩であり、これは非封入Ｔ細胞活性化剤に加えて工程(ii)で除去され、工程(iii)の反応は銅依存的クリック化学反応である。
【０１２４】
リポソームを製造する方法は当分野で周知である19。例えば、有機溶媒中の脂質溶液を、リポソームの形成に至る条件でＴｍを超える温度を有する水溶液に、例えばナノ−アセンブラーまたは他の類似機器で注入し、それにより、融合性リポソームを産生する；または脂質溶液Ｔｍを超える温度を有する水溶液に注入し、混合し、それにより、リポソーム溶液を得て、リポソーム溶液を少なくとも一つの支持体および少なくとも５０〜４００nmの直径の孔を有する一つのエッチングされた膜を含む押出器から押し出すものであり得る。
【０１２５】
さらなる態様において、本発明は、(ａ)１４〜２４炭素原子を有し、少なくとも一つが特異的結合対の第一官能基で官能化されており、該結合対の相補的第二官能基に結合できる複数の脂質分子を含む脂質二重層を含む融合性リポソームを含む第一容器；(ｂ)該脂質分子の該第一官能基と結合できる結合対の第二官能基で官能化されたＴ細胞活性化剤を含む第二容器；および(ｃ)癌患者に(ａ)の融合性リポソームおよび続いて(ｂ)のＴ細胞活性化剤を投与することを含む、癌を処置する方法についての指示を含むパンフレットを含むキットを提供する。
【０１２６】
ある実施態様において、超分子集合体は、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＯＰＥ)、場合によりコレステリルヘミスクシネート(ＣＨＥＭＳ)および場合によりジチオジプロピオネートアミノエタノール(ＤＴＰ)を経てメトキシ−ＰＥＧ(ｍＰＥＧ)に結合したジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(ＤＳＰＥ)またはジチオ−３−ヘキサノール(ＤＴＨ)を経てｍＰＥＧに結合した１,２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジン酸(ＤＳＰＡ)を含み、ここで、超分子集合体は酸性ｐＨで不安定化され、すなわち酸誘発不安定化に付される。ｐＨ感受性製剤は、ＤＯＰＥ：ＣＨＥＭＳのモル比６：４および５〜１５％のｍＰＥＧ−ＤＴＰ−ＤＳＰＥまたはｍＰＥＧ−ＤＴＨ−ＤＳＰＡを有し得る。
【０１２７】
なおさらなる態様において、本発明は、上記実施態様の何れかに定義される融合性リポソームおよび薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物を提供する。
【０１２８】
ある実施態様において、上記実施態様のいずれかの融合性リポソームは標的化剤を欠く。
【０１２９】
用語「担体」は、活性剤と共に投与される希釈剤、アジュバント、添加物または媒体をいう。医薬組成物の担体は、結合剤、例えば微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン(ポリビドンまたはポビドン)、トラガカントガム、ゼラチン、デンプン、ラクトースまたはラクトース一水和物；崩壊剤、例えばアルギン酸、トウモロコシデンプンなど；滑沢剤または界面活性剤、例えばステアリン酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム；および流動促進剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素を含み得る。
【０１３０】
組成物を、注射、例えば、ボーラス注射または連続点滴または直接腫瘍注射による非経腸投与のために製剤し得る。注射用製剤は、単位投与量形態、例えば、アンプルまたは多用量容器で、防腐剤または安定化剤を添加して、提供され得る。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液またはエマルジョンなどの形をとってよく、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤用材を含んでよい。あるいは、活性成分は、使用前に適当な媒体、例えば、無菌パイロジェンフリー水で構成する、粉末形態であり得る。
【０１３１】
経口投与のために、医薬製剤は液体形態、例えば、溶液、シロップまたは懸濁液であってよくまたは使用前に、注射用等張水または他の適当な媒体で再構成する医薬品として提供され得る。このような液体製剤は、懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用油脂)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)；非水性媒体(例えば、アーモンド油、油性エステルまたは分画植物油)；および防腐剤(例えば、メチルまたはｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピルまたはソルビン酸)などの薬学的に許容される添加剤と共に慣用の手段により製造され得る。医薬組成物は、例えば、結合剤(例えば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)；充填剤(例えば、ラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム)；滑沢剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ)；崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム)；または湿潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などの薬学的に許容される添加物と共に慣用の手段により製造された錠剤またはカプセルの形をとり得る。錠剤は、当分野で周知の方法でコーティングされてよい。
【０１３２】
経口投与用製剤は、活性化合物の制御放出を提供するために適当に製剤され得る。
【０１３３】
バッカル投与のために、組成物は、慣用法で製剤された錠剤、粘膜付着パッチ／シールまたはロゼンジの形をとり得る。
【０１３４】
組成物は、例えば、カカオバターまたは他のグリセリドなどの慣用の坐薬基剤を含む、坐薬または停留浣腸などの直腸組成物で製剤され得る。
【０１３５】
吸入による投与のために、本発明により使用する組成物は、適当な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスを使用した、加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示の形で好都合に送達される。加圧エアロゾルの場合、投与量単位は定量を送達するためのバルブの提供により決定され得る。化合物とラクトースまたはデンプンなどの適当な粉末基剤の混合物を含む、吸入器または吹き入れ器(insufflator)で使用するための、例えば、ゼラチンまたはグリセロールのカプセルおよびカートリッジを製剤し得る。
【０１３６】
ここで使用する用語「処置する」は、所望の生理学的効果を得ることを意味する。効果は、疾患および／または疾患に起因する症状の部分的なまたは完全な治癒の観点で治療的であり得る。本用語は、疾患の阻止、すなわちその発症の停止、または疾患の改善、すなわち疾患退行を引き起こすことを意味する。
【０１３７】
本出願のある特徴は説明的であり、ここで記載されているが、多くの修飾、置き換え、変更および均等物が当業者には明らかである。それ故に、添付する特許請求の範囲は、本出願の真の精神の範囲内に入るものとして、このような修飾および変更を網羅することを意図すると理解される。
【０１３８】
細胞塗布プラットフォームの適用：
プラットフォームは、末端使用者が、異なる官能基を有するリポソームを使用してまたは化学修飾の手段により直接、標的細胞の細胞表面を修飾することを可能とする。
【０１３９】
１. 標的細胞標識(インビボ細胞修飾)：
１.１. 抗癌：
１.１.１. 免疫系細胞による癌細胞致死のための標識。例えば、キラーＴ細胞による癌細胞致死を誘発するための、癌細胞上のアルキン基の提示およびアルキンまたはアジド−抗ＣＤ３およびアルキンまたはアジド−抗ＣＤ８の全身注射による提示。
１.１.２. 抗癌ペプチドによる癌細胞致死のための標識。例えば、癌細胞上のそれぞれアルキンまたはアジド基の提示および細胞致死のために膜アンカーを必要とするアジド−抗癌ペプチドの注射による提示。
１.２. 抗自己免疫性疾患：免疫系細胞による致死のための自己反応性細胞の標識。
【０１４０】
２. エフェクター細胞標識(エキソビボ細胞修飾)：
２.１. 患者由来キラーＴ細胞を、標的細胞認識および続く標的細胞致死のために新規化学基でエキソビボで標識し得る。例えば、抗ＣＤ３−アルキンまたはアジドを、Ｂ細胞リンパ腫処置に使用できる標的指向化ペプチド−アジドまたはアルキン(エピトープ)または抗ＣＤ１９抗体−アジドまたはアルキン、または黒色腫細胞致死のためのＨＬＡ−ＭＡＲＴ１抗体−アジドまたはＨＩＶ感染Ｔ細胞致死のための抗ＧＰ１２０抗体−アジドまたはアルキンと共有結合させ得る。
２.２. 初代制御性Ｔ細胞を、ＭＳ、関節炎、乾癬などで炎症進行を阻止するために慢性炎症部位標的指向化抗体−アジドまたはアルキンまたはペプチド−アジドまたはアルキンに共有結合できる抗ＣＤ３−アルキンまたはアジドを使用して標識し得る。
２.３. 循環腫瘍細胞修飾：腫瘍細胞を、新規癌ワクチン製剤をもたらす、これらの細胞に対する免疫エフェクター細胞の活性化をもたらす免疫活性化部分で標識し得る。
【０１４１】
本発明を、ここで次の非限定的実施例により説明する。
【実施例】
【０１４２】
材料および方法：
エタノール注入を使用する免疫標識リポソームの産生：
脂質(アバンティ極性脂質またはリポイド)を必要な組成に従い秤量し、必要なリポソーム体積の１０％の最終体積で無水ＥｔＯＨに可溶化した。脂質−ＥｔＯＨ混合物を、脂質のＴｍ(融解温度)を超えて加熱した。ＥｔＯＨ注入を、同一温度で適切な緩衝液中で実施し、脂質−緩衝液を混合し、押出器を使用して、所望のサイズ分布でリポソームを得るために押し出した。
【０１４３】
産生後リポソーム修飾：
エタノールアミン基含有リポソームを、ＮＨＳエステル化学反応(Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド)を使用して、リンカーおよびアジド(結合対の一方のメンバー)で押し出し後化学修飾した。一般に、ＮＨＳ−ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)４−アジド(ＮＨＳ基)を、１級アミン基(ＤＯＰＥ脂質)あたり５モル当量で使用した。未結合過剰物を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去した。
あるいはリポソームを、銅依存的または非依存的クリック反応を可能とする類似のリポソーム製品を得るために、前修飾脂質を使用して製造した。簡潔には、ＰＥＧ４−アルキンまたはアジドで前修飾したＤＳＰＥまたはＤＯＰＥ脂質を、ＥｔＯＨ注入前に脂質混合物に封入した。
ＰＥＧ４は、約１９４Daの分子量を有するＰＥＧを表す。
【０１４４】
抗体修飾：
抗体は、リポソーム化学修飾と同じ方法を、わずかに改変して使用して、日常的に修飾され、浄化される。簡潔には、抗体あたり、５０モル過剰のＮＨＳ−ＰＥＧ４−ＢＣＮ(この結合対の他方のメンバー)を加える。未結合過剰物を、サイズ排除クロマトグラフィーを使用して除去した。
【０１４５】
修飾抗体および修飾リポソームを使用する、２ＳＴＥＰ、ＯＵＴ、ＩＮ＋ＯＵＴ、ＩＮアプローチの創製：
２ＳＴＥＰ：結合対の一方のメンバー(例えばアジド)に共有結合したリポソームを、適切な希釈で直接細胞に使用し(または動物モデルではＩＶ注射)、続いて処理細胞を洗浄し(インビボ設定下では適用不可)、結合対の相補的メンバー(例えばＢＣＮ)で修飾した抗体と反応させた。検出目的で、免疫リポソーム標識細胞を結合対の相補的メンバー(例えばＤＢＣＯ)を伴う蛍光色素と反応させた。
【０１４６】
ＯＵＴ：結合対の一方のメンバー(例えばアジド)に共有結合したリポソームを、結合対の相補的メンバー(例えばＢＣＮ)を有する抗体と反応させた。次いで修飾リポソームを適切な希釈で細胞に使用し(または動物モデルではＩＶ注射)、続いて処理細胞を洗浄した(インビボ設定下では適用不可)。検出目的で、免疫リポソーム標識細胞を結合対の相補的メンバー(例えばＤＢＣＯ)を伴う蛍光色素と反応させた。
【０１４７】
ＩＮ＋ＯＵＴ：結合対の一方のメンバーと共有結合した脂質を結合対の相補的メンバーを有する抗体と押し出し前に混合した。次いでリポソームを押出器を使用して作製し、反応を終了させた(１８時間、４００RPMで２５℃)。修飾リポソームを適切な希釈で細胞に使用し(または動物モデルではＩＶ注射)、続いて処理細胞を洗浄し(インビボ設定下では適用不可)、結合対の相補的メンバーを有する蛍光色素と反応させた。
【０１４８】
ＩＮ：結合対の一方のメンバーと共有結合した脂質を結合対の相補的メンバーを有する抗体および必要な触媒または反応材と押し出し前に反応させた。次いでリポソームを押出器を使用して作製し、サイズ排除または透析を透析してすぐに浄化して、外層上の抗体との反応を阻止した。内層反応を、無触媒または反応材緩衝液で完了させた(１８時間、４００RPMでＲＴ)。修飾リポソームを適切な希釈で細胞に使用し(または動物モデルではＩＶ注射)、続いて処理細胞を洗浄し(インビボ設定下では適用不可)、結合対の相補的メンバーを有する蛍光色素と反応させた。
【０１４９】
細胞増殖および選択：
細胞株を、３７℃で５％ＣＯ２下、ペニシリンおよびストレプトマイシン、アンフォテリシンＢ、熱不活性化ウシ胎児血清およびＬ−グルタミンを添加した、ＡＴＣＣにより推奨される培地、一般にＲＰＭＩまたはＤＭＥＭで増殖させる。細胞をＨＢＳＳ中のトリプシン溶液を、５〜１０分、３７℃で使用して回収し、ピペットを使用して集め、４００ｇで５分間遠心分離する。ペレット化細胞をパイロジェンフリーＰＢＳ−−緩衝液(カルシウムおよびマグネシウム不含)または増殖培地に再懸濁し、トリパンブルーを生死判別色素として使用し、位相差顕微鏡下、血球計算盤で計数する。細胞を、１０継代まで継代培養し、マイコプラズマについて定常的に試験する。
【０１５０】
単一細胞のフローサイトメトリーベースの細胞塗布分析：
一般に、チューブあたり５００,０００細胞を使用し、実験を、トリプリケートで２生物学的反復で実施する。細胞を、増殖培地でＦＩＴＣ標識リポソームと、０.５mM脂質で必要な時間(一般に１時間)、３７℃で５％ＣＯ２下インキュベートする。次いで細胞をパイロジェンフリーＰＢＳ−−を使用して３回洗浄する。細胞を、その後１時間、ＰＢＳ−−中で、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５(クリッカブル蛍光色素)を使用して染色する。細胞をＰＢＳ−−でさらに３回洗浄し、ＰＢＳ−−中１.６％ＰＦＡを使用して１５分間固定し、洗浄し、ＰＢＳ−−に再懸濁する。固定細胞を、数分間から最大７日間、４℃で貯蔵し、その後ＢＤ  ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを使用してＦＡＣＳ分析する。
細胞を、側方散乱および前方散乱検出シグナルの手動ゲーティングを使用して分析し、インタクト細胞と残骸を区別するために、それに応じてゲート開閉する。チューブあたり１０,０００細胞を計数し、必要な蛍光チャネル：ＦＬ１チャネル：緑色蛍光チャネル(５３０±１５nm、ＦＬ１)を使用して分析する。使用するレーザーは４８８nm、１５mW；ＦＬ４チャネル：赤色蛍光チャネル(６６１±８nm、ＦＬ４)である。使用するレーザーは６３５nm、９mWである。シグナル閾値を対照リポソーム(または無リポソーム)処理細胞を使用して決定し、ゲートを未染色対照の蛍光シグナルより高く設定し、陽性シグナルを決定し、陽性細胞パーセントを計算する。
【０１５１】
初代キラーＴ細胞単離：
クエン酸三ナトリウム(希釈１：９  クエン酸０.１１Ｍ対血液)を添加した初代マウス脾細胞または静脈血を、パイロジェンフリーＦｉｃｏｌｌ(１.０７７)を使用して分離し、ＩＬ２および抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８を５〜１３日間、３７℃で５％ＣＯ２下使用して刺激した。これらを初代エフェクター／記憶キラーＴ細胞源として使用した20。
【０１５２】
細胞のＣＦＳＥ染色：
フローサイトメトリー用途：１μlのＣＦＳＥ原液(ＤＭＳＯ中２.５mg／ml)を１mlの１００万〜８００万細胞を含む増殖培地に加える。細胞をすぐにボルテックス処理し、組織培養インキュベーターで３０分間インキュベートする。染色細胞を増殖培地を使用して３回洗浄する(１洗浄：細胞を４００ｇで５分間遠心分離し、ペレット化細胞を培地に再懸濁する)。
蛍光顕微鏡用修飾プロトコール：１μlのＣＦＳＥ原液(ＤＭＳＯ中２.５mg／ml)を１mlの１００万〜８００万細胞含有パイロジェンフリーＰＢＳに加える。細胞をすぐにボルテックス処理し、組織培養インキュベーターで３０分間インキュベートする。染色細胞を増殖培地を使用して３回洗浄する。
【０１５３】
初代免疫細胞による免疫リポソーム標識癌細胞致死の造影：
４Ｔ１ｍＣｈｅｒｒｙ細胞を、Ｎ８リポソーム(ＰＥＧ４−アジドで修飾)で、５mM脂質で１時間、３７℃で５％ＣＯ２下、処理した。細胞をパイロジェンフリーＰＢＳを使用して３回洗浄し、１００μlの１００mM脂質あたり１２.５μｇの各ｍＡｂの比で、増殖培地で１時間、ＰＥＧ４−ＢＣＮを使用して標識した抗体と反応させた。癌細胞をＣＦＳＥ染色初代キラーＴ細胞と、３７℃で５％ＣＯ２下共インキュベートし、ＬＳＭ  ７１０共焦点顕微鏡の緑色および赤色チャネルで、５分毎に２４時間造影した。対照を、同一条件下、癌細胞をリポソームに曝さずに、しかし、同じドナーのキラーＴ細胞を使用して行った。
【０１５４】
マウスでのインビボ直交異方性トリプルネガティブ乳癌モデル誘導：
マウスをHarlan(Envigo, Israel)から得て、ＳＰＦ(特定の病原微生物がいない)施設で、１２時間明／暗サイクルで、餌および水は自由にして維持する。全ての実施した実験は、施設内動物実験倫理審査委員会により承認された。４Ｔ１マウス癌細胞株(５０μlのＰＢＳ−−中３００,０００細胞)を、７〜８週齢雌ｂａｌｂ／Ｃマウスの乳房脂肪体に３０Ｇ針を使用して注射した。触知可能腫瘍は、細胞注射５〜１０日後に現れる。一般に、１００mm3の平均腫瘍サイズで処置を開始する。施設内動物実験倫理審査委員会により決定されるとおり、１０００mm3の腫瘍サイズでまたは動物が処置体重の１５％を失ったら、動物をＣＯ２を使用して屠殺する。腫瘍サイズを、腫瘍の最長寸法(Ｌ)およびそれに垂直な寸法(Ｗ)を測定するためにノギスを使用して決定する。腫瘍体積(Ｖ)を下式を使用して推定する：
Ｖ＝Ｗ＊Ｗ＊Ｌ／２
全処置を、腫瘍担持マウスへのＩＶ注射により全身的に行う。
【０１５５】
ここに示す結果を得るために合成し、使用した化合物構造およびそのプロトコールは次のとおりである。
【表２】
2020517750.tif 000004
【表３】
2020517750.tif 000005
【０１５６】
ビオチン−ＮＨＳの合成：
０.７２grのビオチン(２.９４mmol)に、４０mlのジメチルホルムアミドを加え、続いて１.６９gr  ＮＨＳ(１４.６８mmol)を加えた。反応溶液２.００grのＤＣＣ(１４.８０mmol)を加え、１８時間、環境温度で撹拌し、その後完了させた。反応をＴＬＣ(ＴＬＣ移動相：８０％酢酸エチル：２０％メタノール；染色ＰＭＡ)で試験した。反応溶液を濾過し、次いで１００mlの溶液(３０％酢酸エチル：７０％ヘキサン)で希釈した。生成物を濾過して、微量のいくつかの反応材を含む６００mgの生成物を得た。次いでさらに５０mlの溶液を加えて、さらに多く沈殿させた。沈殿を濾過により取り、６６mgの純粋生成物(ＴＬＣおよびＮＭＲにより試験)を得た。次いで反応溶液にさらに１００mlの同溶液を加えて、さらに多く沈殿させた。単離後、ある尿素副産物と混合した６００mgの生成物を単離した。純粋生成物(６６mg)を、生物学的適用のための反応に使用した。
【０１５７】
ＢＣＮ−ＰＥＧ１１００−ＮＨＳの合成：
３０mgのＢＣＮ−ＮＨＳ(０.１０mmol)に、５mlのクロロホルムを加え、続いて０.２ml  トリエチルアミンを加えた。反応物に、１００mgのＮＨ２−Ｐｅｇ１１００ＣＯＯＨ(０.０９mmol)を加え、反応物を２時間撹拌し、その後ＴＬＣ(ＴＬＣ移動相：８０％クロロホルム、２０％メタノールおよび１００％クロロホルム；染色ＰＭＡ)で試験した。反応は完了していなかった(ＮＨ２−ＰＥＧ１１００ＣＯＯＨ残存)。それ故にさらに１５mgのＢＣＮ−ＮＨＳ(０.０５mmol)を加え、反応物をさらに１時間撹拌した。ＴＬＣ試験によれば反応は完了していた(反応後ＮＨ２−ＰＥＧ１１００ＣＯＯＨ残存なく、新規の低極性スポットが観察される)。トリエチルアミンをロータリーエバポレーターにより蒸発させた。次いで、反応物を３ml  クロロホルムで希釈した。生成物を３０mlのジエチルエーテルを加えて沈殿させた。粗製生成物１２０mgを蒸発により得て、そのまま次工程で使用した。
１２０mgのＢＣＮ−ＰＥＧ１１００ＣＯＯＨ(０.０９mmol)に、５mlのアセトニトリルを加え、続いて０.２ml  トリエチルアミンを加えた。反応溶液に、５０mgのＤＳＣ(０.２０mmol)を加え、反応物を２時間撹拌した。ＴＬＣ(ＴＬＣ移動相：８０％クロロホルム、２０％メタノール；染色ＰＭＡ)で反応を試験した。反応は完了した(反応後ＢＣＮ−ＰＥＧ１１００ＣＯＯＨは残存せず、新規低極性スポットが観察される)。反応溶液を、減圧下ロータリーエバポレーターにより蒸発乾固した。次いで、残留物を、１０mlの溶液(５ml：５ml  ジクロロメタン：ジエチルエーテル)に溶解した。反応混合物を１５分間撹拌し、反応溶液をロータリーエバポレーターにより蒸発乾固しながら、残渣をフラスコに残した。得られた固体−１２０mg(収率約９３％)−を、ＴＬＣおよびＮＭＲにより試験した。生成物を冷凍庫で保存した。
【０１５８】
蛍光脂質ＤＳＰＥ−ＦＩＴＣ、ＤＯＰＥ−ＦＩＴＣの合成：
１０５mgの脂質(ＤＳＰＥまたはＤＯＰＥ)に、１０mlのクロロホルムを加え、続いて５０mgのＦＩＴＣおよび１.０mlのトリエチルアミンを加えた。反応物を、１５分間、環境温度で撹拌し、その後５mlのＤＭＦを加えた。反応物を１時間、環境温度で撹拌し、ＴＬＣ(ＴＬＣ移動相：２５％メタノール、７５％クロロホルム；染色ＰＭＡ)によると完了した。次いで、反応物をクロロホルムで１０倍に希釈し、フラッシュクロマトグラフィーにより精製した。生成物を３０％メタノール：７０％クロロホルムで溶出した。純粋生成物フラクションを合わせ、蒸発乾固した。９５mgのＤＯＰＥ−ＦＩＴＣおよび７０mgのＤＳＰＥ−ＦＩＴＣを単離した。生成物構造をＮＭＲ、ＴＬＣにより確認した。
【０１５９】
アルキン−ＰＥＧ−ＤＳＰＥ結合体の合成
１０gr  ＰＥＧ２００または２０gr  ＰＥＧ４００(０.０５mole)に、不活性条件下、１５０mlの乾燥ＴＨＦを加え、溶液を氷浴で０℃に冷却した。１５分後、水素化ナトリウム１.８grを、各反応物について各約０.６grずつ３回で加えた。反応物をさらに３０分間、環境温度で撹拌し、その後プロパルギルブロマイドを加えた(各反応物に２.８ml)。次いで、反応物を、一夜撹拌した。全例で、ＴＬＣ(５％ＭｅＯＨ：９５％酢酸エチル)によると生成物が得られた。４mlのＨＣｌ  ３２％を加えて反応を中和させ、続いて蒸発乾固した。次いで、微量のプロパルギルブロマイドをヘキサン洗浄により除去した。シリカゲルフラッシュカラムで生成物を精製した。生成物を、酢酸エチル〜９０％酢酸エチル：１０％ＭｅＯＨで溶出した。合わせたフラクションを蒸発乾固し、ＭＳ分析に付した。最良の生成物フラクションを次工程にそのまま使用した。ＰＥＧ２００−プロパルギルの場合、フラクションは１.２grであり、ＰＥＧ４００−プロパルギルの場合、フラクションは２.７grであった。
各反応物に１０mlのＴＨＦおよび２mlのトリエチルアミンと共に０.５grのＰＥＧ２００−プロパルギルおよび１.０grのＰＥＧ４００−プロパルギルを加えた。両反応物を１５分間撹拌し、その後０.４grのトシルクロライドを各反応物に加えた。ＴＬＣ(２０％メタノール：８０％クロロホルム)によると、一夜撹拌後、反応は完了した。両反応物に、２mlのトリエチルアミン、０.５grのＤＳＰＥおよび５mlのクロロホルムを加え、反応物を、ＴＬＣで観察して完了するまで、４０℃で一夜撹拌した。両反応物を濾過して不溶性粒子を除去し、蒸発乾固した。シリカゲルフラッシュカラムで生成物を精製した。反応混合物を各５ml  クロロホルムに溶解し、カラムに載せ、２０％ＭｅＯＨ：８０％クロロホルムまでの勾配により溶出した。ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２００−プロパルギルおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ４００−プロパルギルを蒸発させて、ＮＭＲで同定して、約４００mgの各生成物を得た。
【０１６０】
ＤＯＰＥ−ＰＥＧ２０００アジドおよびＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００アジドの合成
２００mgの脂質(ＤＳＰＥまたはＤＯＰＥ)に、１０mlのクロロホルムを加え、続いて１.５０grの粗製ＮＨＳ−ＰＥＧ２０００−アジドおよび２.０mlのトリエチルアミンを加えた。反応物を一夜撹拌し、ＴＬＣによると反応は完了した(ＴＬＣ移動相：１０％メタノール、９０％クロロホルム；染色ＰＭＡ)。４００mgの２−アジドエチルアミンを加え、両反応物をさらに４時間撹拌した。次いで、反応物をロータリーエバポレーターで蒸発させて、トリエチルアミンおよび微量の２−アジドエチルアミンを除去した。粗製反応物を２０mlの溶液(５％ＭｅＯＨ：９５％クロロホルム)で希釈し、シリカカラムで精製した。生成物を８％メタノール：９２％ジクロロメタンで溶出した。ＴＬＣで純度≧９０％の生成物フラクションを合わせ、蒸発乾固した。純粋化合物を得るために、結晶化を行った。両生成物を最小量のジクロロメタンに溶解し、ジエチルエーテルを加え、生成物は溶存しながら、不純物を沈殿させた。次いで、生成物溶液を濾過し、生成物脂質の沈殿が観察されるまで、さらにジエチルエーテルを加えた。合計２８０mgの純粋ＤＯＰＥ−ＰＥＧ２０００−アジドおよび７５mgの純粋ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００−アジドが結晶化後に得られた。生成物の構造をＮＭＲで確認した。
【０１６１】
６−ヘプチン酸ＮＨＳと１４  ＤＭＰＥ、１６  ＤＰＰＥまたは１８  ＤＳＰＥの結合体の形成：
２００mgの脂質(ＤＰＰＥ、ＤＭＰＥまたはＤＳＰＥ)に、１０mlのクロロホルムを加え、続いて２.５mlのトリエチルアミンを加えた。各反応物を１５分間、環境温度で撹拌し、その後１００mgの６−ヘプチン酸ＮＨＳエステルを加えた。反応物を２時間、ＲＴで撹拌し、ロータリーエバポレーターにより最小量まで濃縮した。次いで、反応残渣を１５０mlの酢酸エチル、ジエチルエーテル溶液(１００ml酢酸エチル、５０ml  ジエチルエーテル)に溶解した。反応の変換レベルを試験するためにＴＬＣ(ＴＬＣ移動相：２０％メタノール、８０％クロロホルム；染色ＰＭＡ)を行った。全例で反応は完了していた(脂質は反応後残存しなかった)。反応溶液を、５０mlの飽和重炭酸ナトリウム溶液と共に１５分間撹拌し、次いで水層を除去し、有機層を５０ml塩化ナトリウム溶液で洗浄した。水層廃棄後、有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させ、ロータリーエバポレーターで蒸発させた。２２６mgのＤＰＰＥ−６ヘプチン(収率９８％)、２００mgのＤＰＰＥ−６ヘプチン(収率９８％)および１５０mgのＤＳＰＥ−６ヘプチン(収率７０％)の固体生成物が得られた。すべての生成物は、ＮＭＲおよびＴＬＣにより同定された。
【０１６２】
ＢＣＮ−ＮＨＳの合成：
方法を、文献法(molecules 2013, 18, 7346-7363)を少し変更して実施した。４００mgのＢＣＮ−ＯＨ(２.６６mmol)に、１０mlのアセトニトリルを加え、続いて１.５ml  トリエチルアミンを加えた。反応溶液に１.７０grのＤＳＣ(６.６４mmol)を加え、不活性条件下反応物を撹拌した。反応溶液を、環境温度で一夜撹拌し、その後ＴＬＣ(ＴＬＣ移動相：５０％酢酸エチル、５０％ヘキサン；染色ＰＭＡ)で反応完了を観察した。反応溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させた。次いで、反応残渣を５mlのクロロホルムに溶解し、５０mlのジエチルエーテルを加えた。反応混合物を１５分間撹拌し、反応溶液をロータリーエバポレーターにより蒸発乾固しながら残渣をフラスコに残した。得られた固体−９５０mg(収率約９５％)−ＴＬＣによると純度は９０〜９５％を超えており、この生成物を次の１以上の工程にそのまま使用した。
【０１６３】
ＢＣＮ−ＰＥＧ４−ＯＨの合成：
３００mgのＢＣＮ−ＮＨＳ(１.０３mmol)に、１０mlのアセトニトリルを加え、続いて１.０ml  トリエチルアミンを加えた。反応溶液に先ず０.３mlのＯＨ−ＰＥＧ４−ＮＨ２を加え、反応物を半時間撹拌し、その後ＴＬＣで試験して、反応は完了していなかった。次いでさらに０.２mlのＯＨ−ＰＥＧ４−ＮＨ２を加え、計０.５mlのＯＨ−ＰＥＧ４−ＮＨ２(２.８３mmol)を使用したことになり、ＴＬＣ(ＴＬＣ移動相：９０％クロロホルム、１０％メタノール；染色ＰＭＡ)で反応完了が観察されるまで、半時間反応物を撹拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターで減圧下に蒸発乾固し、続いてシリカカラムで精製した。反応溶液を５％ＭｅＯＨ：９５％ジクロロメタンで溶出した。純粋フラクションをロータリーエバポレーターで蒸発させた。得られた生成物−２００mg(５３％)−をＴＬＣで試験した。ＴＬＣによると純度は約９０％であり、この生成物を次の１以上の工程にそのまま使用した。
【０１６４】
ＢＣＮ−ＰＥＧ４−ＮＨＳの合成
２００mgのＢＣＮ−ＰＥＧ４−ＯＨ(０.５４mmol)に、５mlのアセトニトリルを加え、続いて１ml  トリエチルアミンを加えた。反応溶液に４００mgのＤＳＣ(１.５６mmol)を加え、反応物を２時間、環境温度で、ＴＬＣ(ＴＬＣ移動相：１０％メタノール、９０％ジクロロメタン；染色ＰＭＡ)で観察して反応完了まで撹拌した。次いで、反応溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させ、続いてシリカカラムで精製した。カラムをジクロロメタンで洗浄し、生成物を１００％酢酸エチルで溶出した。純粋フラクションをロータリーエバポレーターで蒸発させた。得られた生成物−２５０mg(９１％)−をＴＬＣで試験し、ＴＬＣおよびＮＭＲにより同定した。ＴＬＣおよびＮＭＲによると、純度は９５％を超え、この生成物を次工程にそのまま使用した。生成物を−２０℃で保存した。
【０１６５】
テトラエチレングリコールｐ−トルエンスルホネート(ＨＯＰｅｇ４ＯＴｓ)の形成
５５grのｐｅｇ４(０.２８３mole)に、４００mlの乾燥クロロホルムを加え、溶液を氷浴で０℃に冷却した。１５分後、１００mlのトリエチルアミンを加え、反応物をさらに１５分間撹拌した。次いで、２５grのトシルクロライド(０.１３２mole)を加え、反応物を、一夜、環境温度で撹拌した。一夜後、反応をＴＬＣ(１００％酢酸エチル)で試験した。次いで、反応をロータリーエバポレーターにより蒸発させ、続いて残渣をヘキサン：エーテル(２：１)溶液で洗浄して、微量のトシルを除去した。次いで、残渣に酢酸エチルを加え、５％ＨＣｌ水溶液、１０％ＮＨ４Ａｃおよび５％ＮａＣｌで洗浄し、続いて有機層を硫酸ナトリウムで乾燥させた。酢酸エチルをロータリーエバポレーターにより蒸発させて、１８.６grのＨＯｐｅｇ４ＯＴｓ(収率４１％)を得た。ＴＬＣによると純度は約９０％であり、生成物を次の１以上の工程にそのまま使用した。生成物を４℃に保存した。
【０１６６】
テトラエチレングリコールアジド(ＨＯＰＥＧ４Ｎ３)の形成
６.０grのＨＯＰＥＧ４ＯＴｓ(１７.２mmol)に、６０mlのエタノールを加え、溶液を５分間撹拌した。次いで、６.０grのナトリウムアジド(９２.３mmol)を加え、反応混合物を６５℃に加熱し、ＴＬＣ(ＴＬＣ移動相：９０％クロロホルム、１０％メタノール；染色ＰＭＡ)で観察して反応完了まで一夜撹拌した。次いで、混合物を濾過して、不溶性ナトリウムアジドを除去した。エタノール溶液をロータリーエバポレーターにより蒸発させ、残渣をジエチルエーテルに溶解した。生成物を含有するエーテル層を濾過し、ロータリーエバポレーターで濃縮して、粗製生成物を得て、続いてフラッシュシリカカラムでさらに精製した。生成物を５％ＭｅＯＨ：９５％クロロホルムで溶出した。純粋フラクション(ＴＬＣで≧９０％)を合わせ、蒸発乾固して、０.５０grのＨＯＰｅｇ４Ｎ３を得て、それを次の１以上の工程にそのまま使用した。
【０１６７】
Ｎ３−ｐｅｇ４−ＮＨＳの形成：
４５０mgのＨＯＰｅｇ４Ｎ３(２.０５mmol)に、１５mlのアセトニトリルを加え、続いて１ml  トリエチルアミンを加えた。反応溶液に８００mgのＤＳＣ(３.１２mmol)を加え、反応物を、一夜、環境温度にてＴＬＣ(ＴＬＣ移動相：１０％メタノール、９０％ジクロロメタン；染色ＰＭＡ)で観察ながら、反応完了まで撹拌した。反応溶液をロータリーエバポレーターで蒸発させ、続いて残渣をジクロロメタンに溶解した。ジクロロメタン層を３mlまで濃縮し、３０mlの石油エーテルを加えた。反応混合物を１５分間撹拌し、石油エーテル溶液を廃棄した。残渣をジクロロメタン：ジエチルエーテル(各１０ml、１：１)に溶解した。得られた溶液を蒸発乾固して、３７０mgのＮＨＳＰｅｇ４Ｎ３(収率５０％)。ＴＬＣおよびＮＭＲによると、純度は９５％を超え、この生成物を次工程にそのまま使用した。生成物を−２０℃で冷凍保存した。
【０１６８】
実施例１. 融合性リポソームを使用する細胞の標識
インビトロ：
飽和(二重結合の存在)およびアシルテイル長により決定して、種々のＴｍ(融解温度)値を有する種々の脂質を使用して、免疫標識リポソームプラットフォームを作成した。種々の比率の正荷電および双性イオン性脂質(例えばＤＡＰＥ、ジアシルホスファチジルエタノールアミン)のこのような脂質組成物の組み合わせは、癌細胞との融合を顕著に改善した。このリポソーム標識プラットフォームを使用して、癌細胞をクリック化学などの結合対の一官能基で標識した(図２Ａ)。この官能基を、数化学合成工程を使用してモノクローナル抗体(ｍＡｂ)などの免疫活性化剤の付加に使用し(図２ＢおよびＣに示す例)、リン脂質頭部基およびｍＡｂ両者へのクリック反応可能なリンカーの付加を可能とした。
【０１６９】
実施例２. リポソーム組成物、リポソーム取り込みおよびリポソーム融合
リポソームを次の製剤で製造した。ＨＳＰＣ：コレステロール：６−Ｈｅｐｔｙｎｏｉｃ−ＰＥ(ＤＳＰＥ／ＤＰＰＥ／ＤＭＰＥ)  ６０：３５：５を製造し、安定であることが判明した。
全ての材料は、合成が記載されていなければ、市販されている。リポソームを次の製剤で製造した：ＨＳＰＣ：コレステロール：６−Ｈｅｐｔｙｎｏｉｃ−ＰＥ(ＤＳＰＥ／ＤＰＰＥ／ＤＭＰＥ)  ６０：３５：５を製造し、安定であることが判明した。
ＨＳＰＣ  −  水素化大豆ホスファチジルコリン；
ＰＥ  −  ホスファチジルエタノールアミン
ＤＳＰＥ  −  ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン
ＤＰＰＥ  −  １,２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
ＤＭＰＥ  −  １,２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン
６−ヘプチン酸リンカーは、内層にのみ結合したｍＡｂを有するリポソームの製造に使用した銅依存的アルキンのサンプルである。このリンカーを後に無銅アルキンリンカーと置き換えた。ＢＣＮまたはＤＢＣＯは、インビボ条件下でアジドと共有結合形成可能な銅非依存的アルキン基である。
【０１７０】
第一工程として、６−ヘプチン酸をＮＨＳと結合させて、ＮＨＳ基およびアルキン基を有する二官能性リンカーを作製した。このリンカーを使用して、ＰＥのアミン基をＮＨＳ基を経て６−Ｈｅｐｔｙｎｏｉｃ−ＮＨＳと結合させ、官能化ＰＥをリポソーム製剤のために精製した。
これらのアルキン官能化リンカー担持リポソームを、ペプチド、抗体、フルオロフォア、ビオチンおよび糖類などの種々のアジド修飾分子の結合に使用し得る。我々は、フルオロフォア、カルセイン−アジド(社内産生)をアルキンリンカー含有リポソームと結合させた(図３Ａ)。結合効率は１７〜２０％であった。これらの蛍光リポソームを使用して、細胞取り込みまたはリポソームとの融合について種々のリポソーム製剤の効果を試験した。疎水性テイルの長さおよびリポソーム製剤中のコレステロールのパーセンテージは、細胞によるリポソーム取り込みまたは融合に顕著な影響を有しなかった(図３Ｂ〜Ｃ)。
頭部基修飾は、標的細胞に対するリポソームの効果に影響した：頭部基の修飾により、我々は、エンドサイトーシスによるリポソーム取り込みに対するリポソーム標的細胞融合の有効性を微調整できる。
【０１７１】
４Ｔ１細胞株(ＡＴＣＣから入手可能なマウストリプルネガティブ乳癌細胞(ＡＴＣＣ(登録商標)  ＣＲＬ−２５３９TM))を、本発明のプラットフォームを使用する標的細胞標識について調査した。４Ｔ１細胞を、標的細胞との融合を増強する蛍光標識リポソームの新規製剤とインキュベートした。標的細胞との融合を、外側リポソーム膜小葉またはリポソームの内層および外層両者に結合する種々のリンカーを使用して決定する。
【０１７２】
実施例３. 癌細胞融合に対するリポソーム組成物の効果
種々の脂質組成物を、図２Ｄに説明するとおり、癌細胞と融合する能力について、リポソームとして試験し、ＤＯＰＥ−ＦＩＴＣを有しないリポソームも使用した。我々は、脂質混合物の正味正電荷、アシルテイル飽和およびそれ故にＴｍ(融解温度)を修飾した。我々は、癌細胞の膜に官能基(結合対の一方のメンバー)を付加する、調節可能癌標識リポソームを得た(図４)。
【０１７３】
実施例４. 製剤最適化
ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を安定化剤として使用し、インビボ条件下の循環半減期を改善するだけでなく、立体障害による癌−リポソーム融合の減少ももたらす。それ故に、我々は、広範なＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００を、我々のリポソーム免疫標識製剤Ｎ８、コア製剤ＤＯＴＡＰ：ＤＯＰＣ：ＤＯＰＥ：ＤＯＰＥ−ＦＩＴＣ：ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ  ３５：５２.５：１０：０.２：Ｘ(ここで、Ｘは５、２.５、１.２５、０.６２５モル比である)で試験した。癌細胞の取り込みおよび融合に対するＰＥＧ２０００の効果を決定するために、リポソームをＤＯＰＥ−ＦＩＴＣ(励起４８８nm、発光５３０nm)を使用して蛍光標識し、ＮＨＳ−ＰＥＧ４−Ｎ３を使用して産生後にリンカーＰＥＧ４−Ｎ３と結合した(図２Ｄ)。癌細胞をリポソームに０.５mM脂質で１時間、３７℃で曝し、洗浄し、ＤＢＣＯ−Ｃｙ５(ＦＬ４)を使用して染色した。緑色蛍光チャネル(ＦＬ１)のシグナルは、癌細胞によるリポソーム取り込みの指標である。赤色蛍光チャネル(ＦＬ４)のシグナルは、この塗布リポソームと癌細胞の膜の融合の指標である。細胞を１.６％パラホルムアルデヒドのＰＢＳ溶液を使用して、１５分間、室温で固定し、ＦＡＣＳ分析まで４℃で維持した。図５Ａは、ＦＩＴＣシグナル(リポソームの取り込みの指標)およびＣｙ５シグナル(これらの細胞のアジド基にクリックされ、故に融合の指標)に対する陽性癌細胞の平均化パーセントを示す。さらに、図５Ｂにおいて、平均蛍光強度の平均が示され、癌細胞当たりのフルオロフォア数に比例する。纏めて、免疫標識製剤中のＤＳＰＥ−ＰＥＧ２０００の増加した量は、融合および取り込み両方の阻害を示した。
フローサイトメトリーを使用して得られた上記結果を補完するために、我々は、種々の癌細胞における我々の蛍光標識リポソームの局在化を試験した。図６は、免疫標識リポソームの４Ｔ１ｍＣｈｅｒｒｙ細胞膜への空間的局在化を示し、これは、我々の脂質の膜局在化とよく相関する。我々は、図７に見られ得るとおり、肺癌細胞株(ヒトおよびマウス)および黒色腫細胞株(マウス)の他の癌細胞型を免疫標識する我々の能力を試験した。
【０１７４】
次に、我々は、我々の免疫標識リポソームが、キラーＴ細胞活性化により癌細胞死を誘発する能力について試験した。これは、それぞれ図８および図９に示す同じドナーからのマウス初代キラーＴ細胞を用いて、処理癌細胞対未処理癌細胞で、共焦点タイムラプス実験を使用して実施した。我々は、癌細胞進行／致死マーカーとして赤色ピクセルを使用して、画像定量化を実施した(１０)。
我々は、腫瘍へのキラーＴ細胞活性化ｍＡｂ送達のために、４つの異なるアプローチを使用した。我々が使用した最初のアプローチは、「２ＳＴＥＰ」なる名称であり、図２Ａに記載するリポソームを注射し、結合対の一方の官能基(例えばアジド基)で癌細胞を標識し、リポソーム注射３時間後、我々は、結合対の他方の官能基で標識したｍＡｂを注射する。第二のアプローチ(図２Ｅ、Ｉ)は「ＩＮ」なる名称であり、内層を、結合対の他方の官能基と共有結合した１以上のｍＡｂの結合に使用する。第三のアプローチ、「ＯＵＴ」(図２Ｅ、II)は、結合対の他方の官能基と共有結合した１以上のｍＡｂの結合にリポソームの外層を使用する。第四のアプローチ、「ＩＮ＋ＯＵＴ」(図２Ｅ、III)は、合対の他方の官能基と共有結合した１以上のｍＡｂの結合に内層および外層両者を使用する。
【０１７５】
実施例５. 動物モデルにおける癌の処置
図１１Ａに示すとおり、我々は、２ＳＴＥＰ、ＩＮおよびＩＮ＋ＯＵＴアプローチ対２ＳＴＥＰ対照(同じ２ＳＴＥＰリポソーム、非クリッカブル抗体と結合)を使用して、我々の免疫標識リポソームの有効性を試験した。個々のマウスのレーダーチャートを図１１Ｂに示し、そこで、マウスあたりの腫瘍サイズ対時間を、各処置群グラフにおける単一シリーズとして示す。我々は、腫瘍担持動物における注射２４時間後の我々のリポソーム製剤の生物学的分布をさらに試験した(図１１Ｃ)。リポソーム標識体内分布プロファイルは、基準または「ゴールドスタンダード」として使用されるＤＯＸＩＬ製剤のものに類似する。
【０１７６】
組織学的および免疫組織化学的分析を、腫瘍および他の組織損傷ならびにＴ細胞動員を試験するために、処置から７２時間目にマウスで実施した。データは腫瘍への顕著なＴ細胞動員を示すが、肝臓および腎臓へはない(損傷分析は、未決定カスパーゼおよびＴＵＮＥＬ染色)。インビボ試験を、４Ｔ１腫瘍担持マウスから臓器を摘出し、単一細胞に消化するエキソビボ選択性試験で補完した。これらの正常組織および腫瘍起源細胞をＮ８(２ＳＴＥＰまたはＯＵＴ)リポソームに０.５mM脂質で曝し、クリッカブル色素(ＤＢＣＯ−Ｃｙ５)を使用して染色した。単一細胞を、図１２Ｂに示すとおり、フローサイトメトリーを使用して分析した。このデータを、Ｎ８の体内分布プロファイル(２ＳＴＥＰまたはＯＵＴ)および組織学的分析と共に考慮したとき、我々のリポソームプラットフォームは、いくつかの臓器に到達するが、腫瘍に選択的に融合され、Ｔ細胞を動員することが示される。
我々のリポソームで処置した腫瘍担持動物は、図１２Ａに見られ、２ＳＴＥＰおよびＯＵＴアプローチについて図１２Ｃで定量されるとおり、腫瘍へのＴ細胞動員が増加されるが、肝臓または腎臓へはされないことが示される。ここに示すデータは、エキソビボ選択性試験と合わせたとき、リポソームが腫瘍由来細胞との融合に選択的であり、健常臓器由来初代細胞とほとんど融合しないことを示す(図１２Ｂ)。このデータは、体内分布試験と合わせたとき、肝臓組織スライドがＴ細胞浸潤の増加を示さないかを説明する。機構的に、リポソームは負荷電癌細胞と融合し、キラーＴ細胞を活性化し、これが走化性によりさらなるＴ細胞を癌部位に動員させる。肝臓におけるクッパー細胞などの貪食細胞による取り込みにより、融合はないが、リポソームは存在し、それ自体、癌組織に対するようにはキラーＴ細胞を活性化しない。
【０１７７】
纏めて、我々のデータは、ここに記載する本発明が、種々の癌タイプに対して全身性に使用でき、インビボ条件下で腫瘍細胞の致死を目的とする免疫反応を誘発することを示す。
【０１７８】
参考文献
1 Rosenberg, S. A., Spiess, P. & Lafreniere, R. A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor-infiltrating lymphocytes. Science 233, 1318-1321 (1986).
2 de Visser, K. E., Eichten, A. & Coussens, L. M. Paradoxical roles of the immune system during cancer development. Nat Rev Cancer 6, 24-37, doi:10.1038/nrc1782 (2006).
3 Patel, S. P. & Kurzrock, R. PD-L1 Expression as a Predictive Biomarker in Cancer Immunotherapy. Mol Cancer Ther 14, 847-856, doi:10.1158/1535-7163.MCT-14-0983 (2015).
4 Rheinbay, E. et al. Recurrent and functional regulatory mutations in breast cancer. Nature 547, 55-60, doi:10.1038/nature22992 (2017).
5 Schumacher, T. N. & Schreiber, R. D. Neoantigens in cancer immunotherapy. Science 348, 69-74, doi:10.1126/science.aaa4971 (2015).
6 Ali, H. R., Chlon, L., Pharoah, P. D., Markowetz, F. & Caldas, C. Patterns of Immune Infiltration in Breast Cancer and Their Clinical Implications: A Gene-Expression-Based Retrospective Study. PLoS Med 13, e1002194, doi:10.1371/journal.pmed.1002194 (2016).
7 Sharma, P., Hu-Lieskovan, S., Wargo, J. A. & Ribas, A. Primary, Adaptive, and Acquired Resistance to Cancer Immunotherapy. Cell 168, 707-723, doi:10.1016/j.cell.2017.01.017 (2017).
8 Lee, D. W. et al. T cells expressing CD19 chimeric antigen receptors for acute lymphoblastic leukaemia in children and young adults: a phase 1 dose-escalation trial. Lancet 385, 517-528, doi:10.1016/S0140-6736(14)61403-3 (2015).
9 Dudley, M. E. et al. Cancer regression and autoimmunity in patients after clonal repopulation with antitumor lymphocytes. Science 298, 850-854, doi:10.1126/science.1076514 (2002).
10 Topalian, S. L. et al. Safety, activity, and immune correlates of anti-PD-1 antibody in cancer. N Engl J Med 366, 2443-2454, doi:10.1056/NEJMoa1200690 (2012).
11 Herbst, R. S. et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. Lancet 387, 1540-1550, doi:10.1016/S0140-6736(15)01281-7 (2016).
12 Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. J Control Release 160, 117-134, doi:10.1016/j.jconrel.2012.03.020 (2012).
13 Utsugi, T., Schroit, A. J., Connor, J., Bucana, C. D. & Fidler, I. J. Elevated expression of phosphatidylserine in the outer membrane leaflet of human tumor cells and recognition by activated human blood monocytes. Cancer Res 51, 3062-3066 (1991).
14 Alves, A. C., Ribeiro, D., Nunes, C. & Reis, S. Biophysics in cancer: The relevance of drug-membrane interaction studies. Biochim Biophys Acta 1858, 2231-2244, doi:10.1016/j.bbamem.2016.06.025 (2016).
15 Held-Kuznetsov, V., Rotem, S., Assaraf, Y. G. & Mor, A. Host-defense peptide mimicry for novel antitumor agents. FASEB J 23, 4299-4307, doi:10.1096/fj.09-136358 (2009).
16 Colombo, M. P. & Piconese, S. Regulatory-T-cell inhibition versus depletion: the right choice in cancer immunotherapy. Nature reviews. Cancer 7, 880-887, doi:10.1038/nrc2250 (2007).
17 Pardoll, D. M. The blockade of immune checkpoints in cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer 12, 252-264, doi:10.1038/nrc3239 (2012).
18 Ohaegbulam, K. C., Assal, A., Lazar-Molnar, E., Yao, Y. & Zang, X. Human cancer immunotherapy with antibodies to the PD-1 and PD-L1 pathway. Trends in molecular medicine 21, 24-33, doi:10.1016/j.molmed.2014.10.009 (2015).
19 Batzri, S. & Korn, E. D. Single bilayer liposomes prepared without sonication. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes 298, 1015-1019 (1973).
20 Oren, R. et al. Functional comparison of engineered T cells carrying a native TCR versus TCR-like antibody-based chimeric antigen receptors indicates affinity/avidity thresholds. The Journal of Immunology 193, 5733-5743 (2014).
【図１】
2020517750.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
2020517750.tif 000015
【図１１−１】
2020517750.tif 000016
【図１１−２】
2020517750.tif 000017
【図１２−１】
2020517750.tif 000018
【図１２−２】
2020517750.tif 000019
【配列表】
2020517750000001.app
【国際調査報告】
2020517750.tif 000020
2020517750.tif 000021
2020517750.tif 000022
2020517750.tif 000023
2020517750.tif 000024