(57)【要約】  ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）のプロテアーゼは、ウイルスの基質に加えて宿主の基質に作用することが見いだされた。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＲＮＡｉ／ＲＩＳＣに対するタンパク質アナログとしてタンパク質のレベルで翻訳後のサイレンシング（既存のタンパク質の除去）を促進するために、さらにはウイルス感染症の検出を可能にするために、これらの発見が利用され得るということが企図される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染を検出する方法であって、
第４群ウイルスに感染している疑いのある個体から生物材料を得るステップと、
前記生物材料をアッセイして前記第４群ウイルスのプロテアーゼの切断産物の存在または不存在を検出するステップと、
を含み、
前記切断産物の存在は、前記個体が前記第４群ウイルスに感染している可能性があることを示す、
方法。
【請求項２】
前記第４群ウイルスが、ポリオウイルス、ライノウイルス１ａ型、エコーウイルス１型、コクサッキーＢウイルス、口蹄疫ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング、ジカウイルス、およびベネズエラ馬脳炎ウイルスからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第４群ウイルスが、ベネズエラ馬脳炎ウイルスである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質を切断する方法であって、
細胞に、プロテアーゼによって認識される切断部位が組み込まれた第４群ウイルスの組み換えウイルスポリタンパク質を発現させるステップと、
前記細胞に前記第４群ウイルスを感染させることにより、前記ウイルスのプロテアーゼに前記切断部位で前記組み換えタンパク質を切断させるステップと、
を含む、方法。
【請求項５】
生きている生物における複数の細胞が、前記組み換えタンパク質を発現し、前記生きている生物が、前記ウイルスに感染させられる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第４群ウイルスが、ポリオウイルス、ライノウイルス１ａ型、エコーウイルス１型、コクサッキーＢウイルス、口蹄疫ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、デング、ジカウイルス、およびベネズエラ馬脳炎ウイルスからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第４群ウイルスが、ベネズエラ馬脳炎ウイルスである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記組み換えタンパク質が、前記細胞に対して内因性である、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記組み換えタンパク質が、前記細胞に対して外因性である、請求項４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本出願に組み込まれる２０１６年１１月２５日に出願された米国仮出願第６２／４２６，３５２号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）は、新世界のアルファウイルスである。ＶＥＥＶのウイルス粒子は、乾燥に対して非常に抵抗性であり、安定して凍結乾燥およびエアロゾル化を行うことができることから（１）、潜在的な生物兵器としての使用が予想される。吸入されたウイルスは、嗅神経細胞を介して脳に散在し得て（２−４）、ヒトでは２８〜３３時間以内に発症し得る（５−８）。急性のアルファウイルス感染症は、通常、自然免疫応答および適応免疫応答により回復する。ヒトＶＥＥＶ感染症の約１％のみが、致死性の脳炎となる。しかしながら、神経症状が、この感染症の約１４％で起こる（５；８；９）。他の新世界のアルファウイルスである東部馬脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）および西部馬脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）は、ＶＥＥＶと高い配列同一性を共有している（６８％）が、ヒトにおいてはるかに致死性であり、これらの死亡率はそれぞれ３６％および１０％である（２；４；８；１０；１１）。チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）などの旧世界のアルファウイルスは、より一般的に、発熱、関節痛、発疹、および倦怠感に関連している（１２）。何がビルレンスおよび病原性における差異の原因であるかは、十分に説明されていない。
【０００３】
アルファウイルスは、自然免疫応答を抑制して複製を行うために、非構造タンパク質および構造タンパク質を利用することが知られており、この抑制機構は、アルファウイルス間で異なっている（１３；１４）。ビルレンスにおけるいくつかの類似性は、遺伝子組み換え事象から生じた可能性がある（たとえばＥＥＥＶ様の脳炎惹起性（ｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｅｎｉｃ）の特性を有するＷＥＥＶは、ＳＩＮＶ様およびＥＥＥＶ様の祖先から生じたと考えられている（１５））。ビルレンスは宿主種で異なっており、名称から示唆されるように、ＥＥＶ感染症の死亡率は、ヒトよりもウマで有意に高く、４０％〜９０％の範囲であり得る。
【０００４】
アルファウイルスは、（＋）ｓｓＲＮＡウイルスであり、第４群のトガウイルス科に属している。第４群は、３３の科を含み、コロナウイルス科、ピコルナウイルス科、およびフラビウイルス科を含む。アルファウイルスの複製の間の、ＲＩＧ−ＩまたはＭＤＡ−５による細胞質中の二本鎖ＲＮＡの認識は、ミトコンドリア抗ウイルスシグナロソーム（mitochondrial antiviral signalosome）（ＭＡＶＳ）をもたらし、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）および炎症誘発性サイトカインを迅速に産生させる（１７；１８）。ＩＦＮは、急性アルファウイルス感染症の制限に重要な役割を果たす（１７〜１９）。ＩＦＮは、感染していない細胞を感染症から保護し、さらなるアルファウイルスの複製を予防するための抗ウイルス性状態を作製することができる（２０）。ＩＦＮ誘導遺伝子（IFN-stimulated genes）（ＩＳＧ）は、ＣＨＩＫＶ、ＳＩＮＶ、およびＶＥＥＶの複製を阻害することができる（２１−２４）。アルファウイルスは、ＩＦＮ応答に拮抗するために複数の重複する機構を利用する（２５）。自然免疫応答を回避するために、アルファウイルスは、通常感染後数時間以内に、宿主細胞の転写および翻訳を遮断して（１４；２３）、ＩＳＧの発現を防止する。
【０００５】
非構造タンパク質（ｎｓＰ）は、複製において必須の役割を果たすが、ＩＦＮ−拮抗においても二次的な役割を果たすことができる。ＩＦＮ−拮抗におけるｎｓＰの役割は、酵素的または非酵素的（たとえば結合）であり得る。アルファウイルスのｎｓＰは、Ｎ末端ドメイン、ヘリカーゼ、パパイン様プロテアーゼ、およびＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性ＲＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＳＡＭ  ＭＴａｓｅ）ドメインを含む（図１Ａ）。旧世界のアルファウイルスであるＳＩＮＶ、ＳＦＶ、およびＣＨＩＫＶのｎｓＰは、そのプロテアーゼ活性とは無関係であるがそのヘリカーゼ活性に依存する方法で、転写を阻害することができる（２６）。これらのｎｓＰ２タンパク質は、ｎｓＰ２介在性のユビキチン化を介して、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ複合体の触媒サブユニットであるＲｐｂ１の迅速な分解を誘導する。Ｒｐｂ１のユビキチン化は、旧世界のｎｓＰ２ヘリカーゼの酵素的活性に依存するが、ＳＡＭ  Ｍｔａｓｅドメインの完全性にも依存している。これらドメイン内の変異は、Ｒｐｂ１の分解を無効にすることが示された（２６）。転写を遮断する機構は、旧世界および新世界のアルファウイルスで異なることが知られている（２７）。新世界のアルファウイルス、ＶＥＥＶに感染した細胞では、転写の遮断は、カプシドタンパク質のＮ末端にある３９残基の配列を介して行われており；カプシドが、核膜孔複合体を部分的に妨害して宿主のｍＲＮＡの輸送を遮断すると考えられている（２８；２９）。これらウイルスは、これらの遮断機構を使用して、効率的に自然免疫応答に対抗することができるが、内在性の免疫因子はウイルス感染症の前に存在しており、感染症の早期ではこれら作用を無効にするほど十分な量のウイルスのタンパク質（たとえばカプシド）が存在していない場合があることから、これらのタンパク質はさらなる課題を提起する。よって、触媒量のウイルスの酵素が、感染症を確立するのに重要であり得る。
【０００６】
後述するように、本発明者らは、ＶＥＥＶのｎｓＰ２プロテアーゼが、インターフェロンのアンタゴニズムにおいて役割を果たすことを見出した。この機構は、発現したタンパク質を「サイレンシング」するための技術に関して意味を有する。細胞におけるタンパク質濃度を低減するための従来の方法には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＲＮＡｉ／ＲＩＳＣが包含される。これらの方法は、それぞれＤＮＡおよびＲＮＡのレベルで作用するため、タンパク質発現よりも前に適用されなければならず、従って、すでに細胞で発現しているタンパク質または細胞に入ったタンパク質（たとえばタンパク質毒素）の濃度を変えることはできない。
【発明の概要】
【０００７】
一実施形態では、感染を検出する方法は、第４群ウイルス（Group IV virus）に感染している疑いのある個体から生物材料を得るステップと、生物材料をアッセイして、第４群ウイルスのプロテアーゼの切断産物の存在または不存在を検出するステップと、を含み、特定の宿主タンパク質の切断産物の存在は、その個体が特定の第４群ウイルスに感染している可能性があることを示す。切断される宿主タンパク質は、ウイルスプロテアーゼに特異的であり、ウイルスプロテアーゼの切断部位のモチーフ配列とヒトの宿主タンパク質との間の配列相同性から予測することができる。
【０００８】
さらなる実施形態では、所望の宿主タンパク質標的を切断する方法は、細胞に、（天然の、または操作された）プロテアーゼによって認識される切断部位をコードする組み換えウイルスＲＮＡを発現させるステップと、上記細胞を組み換え第４群ウイルスに感染させることにより、ウイルスのプロテアーゼに切断部位で組み換えウイルスポリタンパク質および対応する標的宿主タンパク質を切断させるステップと、を含む。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１ＡからＣは、アルファウイルスの非構造ポリタンパク質の構成を図示する。図１Ａからわかるように、非構造タンパク質２（ｎｓＰ２）は、Ｎ末端領域、ヘリカーゼ、パパイン様システインプロテアーゼ（白色）、およびＳＡＭメチルトランスフェラーゼ（ＳＡＭ  ＭＴａｓｅ、横縞）を含む。ｎｓＰ２システインプロテアーゼは、このポリタンパク質を切断し、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４を産生する。図１Ｂは、Ｅ６４ｄで阻害されたｎｓＰ２システインプロテアーゼの結晶構造（ＰＤＢ  ５ＥＺＳ）（３０）を示す。プロテアーゼおよびＳＡＭ  Ｍｔａｓｅドメインは、共にパッキングしている。ペプチド様Ｅ６４ｄ阻害剤は、これら２つのドメインの界面でβヘアピンの下に結合する。切断前のｎｓＰ２３複合体（ＰＤＢ  ４ＧＵＡ）の構造は、ｎｓＰ３ドメインのパッキングを示している（９０）。図１Ｃは、基質に使用した３つのアルファウイルスのｎｓＰ切断部位とＴＲＩＭ１４タンパク質の配列アライメントを例示している。新世界のアルファウイルスおよびヒトのＴＲＩＭ１４は、ＱＥＡＧＡ↓Ｇ（配列番号１）配列を共有している。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図２Ａ】図２Ａから２Ｃは、ＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼによるＴＲＩＭ１４の切断を実証するｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイの結果を示している。図２Ａは、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）において、室温で３０分間測定したＣＦＰ−ＴＲＩＭ１４−ＹＦＰ基質に関する、ＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼの定常状態の動態パラメータの測定結果を示している。ＫｍおよびＶｍａｘは、ＶＥＥＶのｎｓＰ１２またはｎｓＰ３４切断部位を含む同様の基質を使用して測定したものと同等であった。図２Ｂは、ＶＥＥＶ、ＥＥＥＶ、ＷＥＥＶ、またはＣＨＩＫＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼ（５μＭ）を、５０μＭのＣＦＰ−ＴＲＩＭ１４−ＹＦＰ基質と共に、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ中、室温で２４時間インキュベートした後の結果を示している。ＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼのみが、ＴＲＩＭ１４基質を完全に消化することができた。図２Ｃは、ＳＦＶのｎｓＰ１２切断部位、ＶＥＥＶのｎｓＰ１２、ｎｓＰ２３、ｎｓＰ３４切断部位、およびＴＲＩＭ１４配列を含むＣＦＰ−ＹＦＰ基質の切断に及ぼす部位特異的変異の作用を示している。切断反応は、１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）および５ｍＭのＤＴＴ中で行い、３０μＭの基質および２．２μＭの酵素を使用して、室温で１９時間インキュベートした。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図３Ａ】図３は、ＣＦＰ−ＴＲＩＭ１４−ＹＦＰのタンパク質分解産物の質量スペクトルを図示する。ＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼによる切断後のＣＦＰ−ＴＲＩＭ１４−ＹＦＰの２５残基の基質のタンパク質分解産物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、切り出し、トリプシン処理し、プロテアーゼの特異性を検証するためにタンデム質量分析法により同定した。ＨＹＷＥＶＤＶＱＥＡＧＡおよびＧＷＷＶＧＡＭＶＳのアノテーション付けしたＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。単に単純化のために、一価のフラグメントのみにアノテーションを付けた。予測された全ての一価フラグメントイオンが見出された。
【図３Ｂ】同上。
【図４Ａ】図４Ａから４Ｅは、感染した細胞のライセートにおけるＴＲＩＭ１４のＶＥＥＶのｎｓＰ２プロテアーゼの切断のエビデンスを示している。ＴＲＩＭ１４の３つ全てのアイソフォームに共通するエピトープを認識する抗ＴＲＩＭ１４  Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅポリクローナル抗体（ＨＰＡ０５３２１７）を使用する、（図４Ａ）ＶＥＥＶ、（図４Ｂ）ＷＥＥＶ、（図４Ｃ）ＥＥＥＶに感染した細胞のライセートのイムノブロット。細胞のライセートを、様々な時点で（６〜９６時間）で採取した。バンド強度の変動が感染過程の間に観察されたが、ＶＥＥＶに感染した細胞のライセートのみが、ｎｓＰ２切断と一致するＭＷを有する新規のバンドをもたらした。切断産物（ＣＰ）のバンドは、非感染対照では検出することができなかった。複数のバンドが、恐らくはＴＲＩＭ１４のポリユビキチン化およびこのタンパク質の複数のアイソフォーム（αおよびβ）により、観察された。図４Ｄは、各アイソフォームおよび切断産物の計算上の分子量（ＭＷ）を示している。図４Ｅは、６時間および２４時間の時点を示す複製物である。
【図４Ｂ】同上。
【図４Ｃ】同上。
【図４Ｄ】同上。
【図４Ｅ】同上。
【図５】図５は、ＣＡ０７４によるＴＲＩＭ１４のＶＥＥＶのｎｓＰ２プロテアーゼ切断の阻害を示している。Ａ５４９細胞を、様々な濃度のｎｓＰ２システインプロテアーゼ阻害剤ＣＡ０７４メチルエステルで処理し（４２）、次に、ＶＥＥＶに感染させた。細胞のライセートを、抗ＴＲＩＭ１４抗体ＨＰＡ０５３２１７を使用したイムノブロット解析により試験した。ＴＲＩＭ１４のＣＰは、プロテアーゼ阻害剤で処理されていない感染細胞に存在し（「化合物なし」をＮＣと表示）、ｎｓＰ２システインプロテアーゼ阻害剤で処理した細胞のライセートには存在していなかった。感染は、下のブロットにおける抗ＶＥＥＶ血清を使用したイムノブロット解析により確認された。
【図６】図６は、他の種由来のＴＲＩＭ１４相同体のＣ末端ドメインの部分的な配列アライメントである。示された領域は、ＴＲＩＭ１４タンパク質の予測されるＰＲＹ／ＳＰＲＹドメインを含む。ＰＲＹ／ＳＰＲＹドメインモチーフ（「ＬＤＰ」、「ＷＥＶＤ」、「ＬＤＹＥ」）を灰色で示す（９１）。ＱＥＡＧＡ↓Ｇ（配列番号１）モチーフを、太線で示す。ヒトでは、ＴＲＩＭ１４のＬｙｓ−３６５（強調されている）は、ポリユビキチン化されていることが示された。このユビキチン化部位は、ＮＥＭＯのＭＡＶＳシグナロソームへの動員に重要である。
【図７】図７は、いくつかの第４群の（＋）ｓｓＲＮＡウイルスのプロテアーゼがＭＡＶＳシグナロソームの構成要素をどのように切断するかを図示する。Ｚｈｏｕらにより提唱されたＭＡＶＳシグナリングカスケードを示す（３２）。ＭＡＶＳシグナロソームは、ＩＦＮおよび炎症誘発性サイトカインの産生を誘発する。ＴＲＩＭ１４におけるＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼ切断部位は、ユビキチン化部位の前に位置している。このシグナロソームに関係するタンパク質の切断は、恐らくは、ＩＦＮの産生および自然免疫応答を妨害するであろう。
【図８】図８は、短い配列により誘導される３つのサイレンシング機構（ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパク質に基づく）を図示する。各場合で、短い配列は、より大きな標的配列を同定するために使用されており、これら機構は、１つのキーワードを利用し、３つの異なる言語で書かれているプログラムの探索および削除に関して類似している。各システムは、この短い配列と標的との間の一致を認識し、次に、大きい方の標的配列を切断する酵素を有する。短い配列および標的配列は宿主または病原在のいずれかに属しており、これら機構の目的は、分子の効果を拮抗させるかまたはサイレンシングすることである。これら機構は、ウイルスから宿主を防御するため、または宿主の免疫系からウイルスを防御するために使用される。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＲＮＡｉの図面は、参照文献（９２）および参照文献（９３）から改変されている。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
定義
本発明を詳細に説明する前に、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することを目的としており、必ずしも限定することを意図するものではないということを理解されたい。本明細書で説明されるものと同様の、それらに対して改変された、またはそれらと同等の、多くの方法、構造、および材料を、過度に実験を行うことなく本発明の実施において使用できるが、好ましい方法、構造、および材料を、本明細書中に記載する。本発明の説明および特許請求の範囲において、以下の用語は、以下に記載される定義に従って使用される。
【００１１】
本出願で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他の意味を明記しない限り、複数形を除外するものではない。
【００１２】
本出願で使用される場合、用語「および／または」は、列挙した関連の項目のあらゆる組み合わせを含む。
【００１３】
本出願で使用される場合、用語「約」は、記載の数値または範囲と共に使用される際、記載の値の±１０％の範囲内で記載の値または範囲よりもいくらか多いかいくらか少ないことを表す。
【００１４】
本出願で使用される場合、「感染している疑いのある」は、感染が事実上確実である場合から感染が存在するとは考えられていない場合までを含むように非常に幅広く解釈されることが意図される。
【００１５】
概説
アルファウイルスの非構造タンパク質２（nonstructural protein 2）（ｎｓＰ２）システインプロテアーゼ（ＥＣ３．４．２２．−）は、非構造（ｎｓ）ポリタンパク質のタンパク質分解プロセシングに関与する。ＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼの基質特異性を試験した後に、ＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼの新規の宿主基質であるヒトのＴＲＩＭ１４が同定された。ＴＲＩＭ１４タンパク質は、ミトコンドリア抗ウイルスシグナリングタンパク質（mitochondrial antiviral-signaling protein）（ＭＡＶＳ）シグナロソームの構成要素である。ｓｈｏｒｔ  ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｈｏｓｔ−ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ＳＳＨＨＰＳ）と呼ばれる、同じアミノ酸配列が、非構造ポリタンパク質およびＴＲＩＭ１４の両方に存在している。
【００１６】
これら知見を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＲＮＡｉ／ＲＩＳＣに対するタンパク質アナログとしてタンパク質のレベルでの翻訳後のサイレンシング（既存のタンパク質の除去）を促進するためにこれらの発見が利用され得るということが企図される。この系は、ＳＳＨＨＰＳおよびこれらを切断する（ヌクレアーゼではなく）プロテアーゼに依存する。さらに、ｎｓＰ２プロテアーゼおよび類似のプロテアーゼの切断産物、またはｎｓＰ２プロテアーゼを用いたシグナリングカスケードのサイレンシングから結果としてもたらされる下流効果、の分析によってウイルス感染症の有無を検出できるということが企図される。
【００１７】
説明
本発明者らは、アルファウイルスのプロテアーゼ切断部位がヒトのタンパク質と相同性を共有し得る、およびこのウイルスが、ＩＦＮ−アンタゴニズムの別の機構として、その切断部位においてこれらの一続きの短い宿主配列を使用し得る、という仮説を立てた。ＶＥＥＶのｎｓＰ２の基質特異性は、動態、変異、および構造の研究を使用して、以前に特徴づけられていた（３０）。本発明者らは、ｎｓＰ１２、ｎｓＰ２３、およびｎｓＰ３４切断部位配列モチーフと配列同一性を共有するタンパク質に関してヒトゲノムを検索することにより、ｎｓＰ２プロテアーゼの有望な宿主タンパク質標的を調べた。ヒトタンパク質の１つであるＴＲＩＭ１４（Ｐｕｂとしても知られている（３１））は、アルファウイルスのｎｓＰ２切断部位と同一の６つの残基を共有しているＶＥＥＶのｎｓＰ２ウイルスプロテアーゼの基質である。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのアッセイ結果と一致して、ＴＲＩＭ１４の切断は、ＶＥＥＶに感染した細胞のライセートのイムノブロットで検出することができた。
【００１８】
ＴＲＩＭ１４は、三要素モチーフタンパク質（tripartite motif protein）（ＴＲＩＭ）であり、近年、ＭＡＶＳシグナロソームにおけるアダプタータンパク質として機能することが示されている（３２；３３）。ＴＲＩＭ１４の安定した過剰発現は、ＳＩＮＶを使用した感染後２４時間でアルファウイルスの複製を３〜４対数阻害することが示されている（３４）。ＴＲＩＭ１４の過剰発現はまた、ＩＦＮおよびインターフェロン誘導遺伝子の転写を増大させた（３３）。ＩＦＮの産生に関与するタンパク質をウイルスプロテアーゼが切断できることは、このウイルスおよび他の第４群ウイルスのプロテアーゼが使用する共通の拮抗的な機構であると思われる。本出願人らは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＲＮＡｉ／ＲＩＳＣの機構とこのサイレンシング機構の類似性を検討している。
【００１９】
少なくとも８個の、他の第４群の（＋）ｓｓＲＮＡウイルスのプロテアーゼが、ＭＡＶＳシグナロソームの構成要素を切断してＩＦＮ産生に拮抗することが示されており、宿主タンパク質配列にこれら短い切断部位モチーフ配列を同化させることが、ＩＦＮ拮抗の組み込まれた機構を表し得ることを示唆している。この干渉機構は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＲＮＡｉ／ＲＩＳＣの機構といくつかの類似点を示しているが、プロテアーゼは、宿主および病原体の両方に共通するタンパク質配列を認識している。
【００２０】
実施例
ＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼにより認識される切断可能な結合のＮ末端配列およびＣ末端の配列は、一組のペプチド基質を使用して以前に同定されていた。Ｐ１９−Ｐ６’を含む２５残基の基質（Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒの命名法（３５））は、最も低いＫｍ値をもたらした（３０）。ｎｓＰ２切断部位およびヒトゲノムを使用したＢＬＡＳＴ検索（３６）により、ＶＥＥＶのｎｓＰ１２切断部位に対して高レベルの配列同一性を有する１つのタンパク質、ＴＲＩＭ１４が発見された。ｎｓＰ１２切断部位ＱＥＡＧＡ↓Ｇ（配列番号１）は、よりビルレントな新世界のアルファウイルス、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ／ＷＥＥＶでは高度に保存されているが、旧世界のアルファウイルス、たとえばＳＩＮＶ、ＳＦＶ、およびＣＨＩＫＶでは保存されていない（図１Ｃ）。基質特異性のいくつかの重複が、ＶＥＥＶおよびＣＨＩＫＶのｎｓＰ２プロテアーゼ間で観察されており；両者は、旧世界のＳＦＶのｎｓＰ１２切断部位を切断することができる（３０）。
【００２１】
ヒトＴＲＩＭ１４タンパク質の２５アミノ酸を含む、シアン・黄色蛍光タンパク質（ＣＦＰ−ＹＦＰ）基質を使用して、精製したＶＥＥＶのｎｓＰ２プロテアーゼが、ＴＲＩＭ１４基質を切断することが見いだされた（図２Ａ）が、近縁のウイルスでは切断は起こらなかった（図２Ｂ）。切断を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認し、ＴＲＩＭ１４基質の切断に及ぼす部位特異的変異誘発の作用は、ＶＥＥＶのｎｓＰ１２切断部位を含む基質で観察されたものと同様であり、酵素および基質の接触が類似であることを示唆していた（図２Ｃ）。ＶＥＥＶのｎｓＰ２プロテアーゼでは、ＣＦＰ−ＹＦＰ基質の切断部位を、タンデム質量分析法により確認し（図３）、切断は、予測された部位ＱＥＡＧＡ↓Ｇ（配列番号１）で起こった。基質の両部分のトリプシンペプチドを同定した。
【００２２】
ＴＲＩＭ１４の２５残基基質で測定したＫｍおよびＶｍａｘが、ウイルスの切断部位を含む基質で得たＫｍおよびＶｍａｘと類似しているかどうかを決定するために、定常状態の動態パラメータを測定した（図２Ａ）。野生型（ＷＴ）ＶＥＥＶのｎｓＰ２プロテアーゼおよびＴＲＩＭ１４基質で得たＫｍおよびＶｍａｘは、ｎｓＰ１２およびｎｓＰ３４基質で得たものと同等であった。また、この基質の長さを変化させ、２５、２２、および１９残基の基質を試験した（表１）。切断可能な結合に対してＮ末端の領域の長さが減少するにつれて、より弱い結合およびより速い産物の放出と一致する、ＫｍおよびＶｍａｘの増加が観察された。
【００２３】
この切断がＶＥＥＶのｎｓＰ２ｐｒｏに特異的であるどうかを決定するために、ＶＥＥＶ、ＥＥＥＶ、ＷＥＥＶ、およびＣＨＩＫＶのプロテアーゼを、発現させ、精製した。２５残基のＴＲＩＭ１４基質を用いた、ＶＥＥＶのプロテアーゼ（５μＭ）による基質（５０μＭ）の完全な切断が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより２３±３℃で２４時間後に視認可能であった（図２Ｂ）；しかしながら、これより短いＴＲＩＭ１４基質を用いると、精製したＣＨＩＫＶ、ＥＥＥＶ、およびＷＥＥＶのｎｓＰ２プロテアーゼは、長時間のインキュベーション（６４時間、２３±３℃）後であっても、低レベルの切断産物のみを産生した（ＶＥＥＶ＞ＷＥＥＶ＞ＥＥＥＶ＞ＣＨＩＫＶ）（データは示さない）。対応するウイルスの切断部位もまた消化されたが、これらプロテアーゼの活性が異なるため相対比較であった。４つ全てのプロテアーゼは、検出可能な活性を有していた。ＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼのみが、ＴＲＩＭ１４基質のすべてを、一貫して切断する。
【表１】
2020502496.tif 000002
【００２４】
基質特異性の構造上の基礎を把握するために、ＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼとＴＲＩＭ１４の結合相互作用のコンピュータモデルを作製した。新世界のアルファウイルスの基質と同様に、ＴＲＩＭ１４は、ＧｌｕをＰ４位で含み、これによりＴＲＩＭ１４の切断が旧世界のＣＨＩＫＶのｎｓＰ２プロテアーゼで観察されなかった理由を説明することができる。ｎｓＰ１２切断部位では、Ｐ１’−Ｐ６’残基は、Ｐ１−Ｐ５残基のように、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ／ＷＥＥＶの配列で同一である。このことは、Ｐ５以降（ｂｅｙｏｎｄ）の残基が、ＴＲＩＭ１４基質の認識に重要であることを示唆している。２５アミノ酸の基質が最小のＫｍおよび最大のｋｃａｔをもたらす理由を理解するために、本出願人らは、遊離のＶＥＥＶのｎｓＰ２プロテアーゼのあらかじめ決定した結晶構造、ＰＤＢ  ５ＥＺＱを調べた（３０）。この結晶構造は、ＶＥＥＶのｎｓＰ２３切断部位のＣ末端のＰ２−Ｐ１９残基（Ｌｅｕ−７７６−Ａｌａ−７９２）を含んでおり；Ｐ１０−Ｐ１９残基は、らせん状であり、結晶のプロテアーゼドメインに対してパッキングしている。Ｐ８−Ｐ９残基は、プロテアーゼおよびＳＡＭ  Ｍｔａｓｅドメインにより形成される間隙に向かっている（データ不図示）。Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎによる二次構造の予測から、ｎｓＰ１２およびｎｓＰ３４の基質は、Ｐ１−Ｐ１９残基内のらせん状の領域を含み得ることが示唆される。
【００２５】
Ｐ５以降の領域を、ＥＥＥＶおよびＷＥＥＶの酵素がＴＲＩＭ１４の切断が不十分である理由を理解するために調べた。Ｋｍ値に基づき（表１）、基質のＰ１３−Ｐ１９残基は、この酵素にさらに接触すると思われる。ＰＤＢ  ５ＥＺＱでは、対称性関連分子のらせん内のＰ１７残基（Ｓｅｒ−７７８）は、パパイン様プロテアーゼドメイン残基Ｍｅｔ−５５５の主鎖のＮＨおよびＣ＝Ｏに対する水素結合の距離内にある。Ｍｅｔ−５５５は、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ／ＷＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼで保存されている。基質のＰ１９−Ｐ１６残基は、新世界のポリタンパク質において、電荷および可動性が異なっており、これらの近縁のプロテアーゼによって異なるように認識され得る：ＶＥＥＶのｎｓＰ１２では「ＶＥＥＰ」；ＥＥＥＶのｎｓＰ１２では「ＶＤＫＥ」；およびＷＥＥＶのｎｓＰ１２では「ＩＥＫＥ」。ＴＲＩＭ１４における相同な残基は「ＤＣＦＡ」である。
【００２６】
プロテアーゼの変異体によるＴＲＩＭ１４基質の切断を、ＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼのモデルを確認するために試験した（図２Ｃ）。Ｋ７０６Ｑ変異は、Ｖ１２およびＴＲＩＭ１４の切断に影響を与え、これは予測されるＳ４サブサイトにおける基質結合相互作用の妨害と一致する。Ｐ４残基（Ｇｌｕ）は、これら基質の両方で同じである。また、ＶＥＥＶのｎｓＰ２プロテアーゼの純度を、Ｃ４７７Ａバリアントを使用して試験した。Ｓｔｒａｕｓｓらは、以前に、この非構造ポリタンパク質が、いずれの宿主の真核細胞の酵素によっても切断されなかったことを示していた（３７）；同様に、これらタンパク質基質の非特異的切断は、大腸菌から発現および精製したＣＦＰ−ＹＦＰ基質で観察されなかった。
【００２７】
配列アライメントの解析は、完全長のＴＲＩＭ１４（４４２アミノ酸、４９．８ｋＤａ）およびＴＲＩＭ１４−αアイソフォーム（４０６アミノ酸、４５．１ｋＤａ）が切断部位を含むが、ＴＲＩＭ１４−βアイソフォーム（２８．３ｋＤａ）は切断部位を含まないことを示した。ＴＲＩＭ１４は、Ｋ４８およびＫ６３でポリユビキチン化されることが示されており（３２）、複数のバンドがイムノブロットで検出された（図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ）。この試験で使用した抗ＴＲＩＭ１４抗体は、以前にバリデートされており、細胞ライセートおよびペプチドライブラリーにおいてこの抗原に特異的であることが示されているＳｉｇｍａ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ（商標）抗体（ＨＰＡ０５３２１７）である；この抗体の特徴は、Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｔｌａｓ（３８）で見出すことができる。
【００２８】
修飾されていないＴＲＩＭ１４の切断産物の計算上の分子量は、３７．２ｋＤａおよび１２．６ｋＤａ（またはＴＲＩＭ１４−αアイソフォームでは７．９）である。イムノブロットにおいて対照として使用した組み換え型のＴＲＩＭ１４は、ＧＳＴ融合タンパク質（約７６ｋＤａ）である。細胞におけるこの切断産物の安定性は不明であり、細胞ライセートを使用すると定量的な結論（たとえばウイルスに感染した細胞で切断されたＴＲＩＭ１４のパーセンテージの計算）が限定されることに留意することが重要である。ＴＲＩＭ１４は、分解のためＫ４８でポリユビキチン化されており（３９）、シグナリングにおける自身の役割を促進するためにＫ６３でポリユビキチン化されている（３２）。ＴＲＩＭ１４の過剰発現は、アルファウイルスの複製を抑制し（３３）、Ｃ型肝炎の複製を抑制する（４０）ことが示されている。
【００２９】
ＶＥＥＶに感染した細胞におけるＴＲＩＭ１４の切断を、経時的にモニタリングし、細胞のライセートを、６時間目、１２時間目、２４時間目、３６時間目、４８時間目、７２時間目、および９６時間目に回収した、バンド強度は、経時的に変化したが、ＶＥＥＶに感染した細胞およびＷＥＥＶに感染した細胞のライセートのみが、非感染対照では見いだされなかった新規の約３７ｋＤａの切断産物を含んでいた（図４Ａおよび４Ｂ）。５０ｋＤａのバンドが、感染の間で強く、これは、ウイルス感染または大きな複合体からの放出の間の、ＴＲＩＭ１４の発現の増強によるものであり得る。切断産物のＭＷは、計算上のＭＷ、ならびに精製した組み換え型ｎｓＰ２プロテアーゼおよび２５−、２２−、および１９残基のＣＦＰ−ＹＦＰ  ＴＲＩＭ１４基質を使用したｉｎ  ｖｉｔｒｏでの結果と一致した。またこの結果は、切断産物がユビキチン化していないタンパク質のＭＷに対応するため、ＴＲＩＭ１４がユビキチン化の前に切断され得ることを示唆している。
【００３０】
ＴＲＩＭ１４の発現は、ウイルスの非存在下で検出することができ（３２）、これは、このタンパク質が、内因性免疫応答のエフェクタータンパク質であることを示している。ＴＲＩＭ１４の発現はまた、ＩＦＮによりさらに誘導することができ、自然免疫応答のエフェクターとみなすこともできる（４１）。ウイルス感染により、ＴＲＩＭ１４のｌｙｓ−６３関連ポリユビキチン化がＬｙｓ−３６５で起こり、ＭＡＶＳシグナロソームの構築に重要であることが示された（３２）。よって、修飾されていないＴＲＩＭ１４の切断は、ＭＡＶＳシグナロソームのアセンブリに干渉し得る。
【００３１】
ＣＡ０７４メチルエステル（ＣＡ０７４ｍｅ）は、以前に、アルファウイルスのＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼを阻害することが示されていた（４２）。ＣＡ０７４ｍｅは、カテプシンＢ阻害剤であるが、非構造ポリタンパク質を切断する他の宿主酵素は示されていない（３７）。ＣＡ０７４は、プロテアーゼの求核性Ｃｙｓと特異的に反応するペプチド様の不可逆的な共有結合性の阻害剤である。ＣＡ０７４ｍｅは、膜透過型の阻害剤（プロドラッグ）である。ＣＡ０７４ｍｅを、ＶＥＥＶに感染した細胞に添加し、細胞のライセートを回収し、イムノブロッティングを行った。ＴＲＩＭ１４切断産物は、ＣＡ０７４ｍｅで処理した細胞にはもはや存在しておらず、これは、ＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼの阻害と一致した（図６）。
【００３２】
急性ウイルス感染では、ウイルスの複製に干渉または対抗する、種に特異的な抗ウイルス性の酵素およびタンパク質（場合によりウイルス制限因子と呼ばれている）が存在する。ＴＲＩＭ１４の中の１つのドメインは、その抗ウイルス性の機能に重要であると思われており、種特異的な抗アルファウイルスの応答の原因であり得る（４０）。ヒトのＶＥＥＶ感染は、致死性の脳炎をもたらすことは稀であるが（感染したヒトのうち約１％）、対してウマの死亡率は、有意に高く（たとえばＥＥＥＶの死亡率は、９０％に達し得る）、このことは、ウマ対ヒトの自然免疫応答間に固有の差があることを示唆している。様々な種のＴＲＩＭ１４相同体を比較することにより、ヒト、サル、げっ歯類、ブタ、ウシ、およびニワトリにおいて完全長のＴＲＩＭ１４配列が強力に保存されていることが示される（図６）。ウマのＴＲＩＭ１４のＣ末端領域は著しく切断されており、ウマが、切断されたＴＲＩＭ１４の相同体を有し得ることを表している。このＣ末端領域は、ＰＲＹ／ＳＰＲＹドメインを形成することが予測されていた。ＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼ切断部位は、この予測されたドメインの中にある。ＳＰＲＹドメインは、自然免疫および適応免疫を調節するヒトタンパク質で一般に見いだされるβ鎖タンパク質相互作用モジュールである（４３）；ＰＲＹモチーフは、ＳＰＲＹドメインのＮ末端にある３つの追加的なβ鎖からなる。ＰＲＹ／ＳＰＲＹドメインは、超可変ループ領域および抗体の可変ドメインに類似する保存されたコアを含む（４４）。ＳＰＲＹドメインの結合特異性は、ＴＲＩＭタンパク質の機能を決定し、このドメイン内の変異は、疾患の易罹患性に関連している（４４）。このドメインは、アルファウイルスおよびＨＣＶに対して有効な免疫応答を開始するために重要であると思われる（４０）。感染の間のＰＲＹ／ＳＰＲＹドメインの一過性のタンパク質分解による切断、またはウマのＴＲＩＭ１４の場合のようにこのドメインが存在しないことは、アルファウイルスに対して有効な抗ウイルス性の免疫応答を種が開始する能力を弱める可能性がある。
【００３３】
ＰＲＹ／ＳＰＲＹドメインは、３つの高度に保存された配列モチーフ（「ＬＤＰ」、「ＷＥＶＤ／Ｅ」、「ＬＤＹＥ／Ｄ」）により同定することができる。これら３つのモチーフは、ヒトＴＲＩＭ１４相同体に存在するが、ウマＴＲＩＭ１４相同体には存在していない（図６）。興味深いことに、ロバ相同体は、「ＬＤＹＥ」モチーフを含むが、他の２つのモチーフを欠いている。ＴＲＩＭ１４のＰＲＹ／ＳＰＲＹドメインの有無は、他の種におけるＶＥＥＶのビルレンスまたは病原性を予測するには十分ではなく、たとえば、ＶＥＥＶの感染は、マウスでは致死性であり得て、マウスＴＲＩＭ１４は、ＰＲＹ／ＳＰＲＹドメインを含む。この経路のＴＲＩＭ１４および下流のエフェクター（たとえばＩＦＮ−誘導遺伝子、ＩＳＧ）の役割は、種を超えて試験されてはおらず、異なる場合がある。Ｉ型ＩＦＮにより誘導される経路であるＪａｋ／ＳＴＡＴ経路の種特異的な差異もまた、除外することができない。
【００３４】
ＰＲＹ／ＳＰＲＹドメインは、ＴＲＩＭ１４の、ＭＡＶＳのＣ末端ドメイン（残基３６０〜５４０）への結合を媒介すると考えられている（３２）（図７）。ＴＲＩＭ１４は、ＰＲＹ／ＳＰＲＹドメイン内の部位、Ｌｙｓ−３６５で、ユビキチン化を受け、ＮＦ−κＢ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒ（ＮＥＭＯ）を動員して、ＩＦＮ調節因子３および７（ＩＲＦ−３／７）ならびにＮＦ−κＢ経路を活性化する（３２）。Ｌｙｓ−３６５のユビキチン化は、Ｚｈｏｕらにより、ＮＥＭＯのＭＡＶＳシグナロソームへの結合に重要であることが示された（図７）。ＩＲＦ−３のリン酸化は、Ｉ型ＩＦＮの産生をもたらす。ＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼ切断部位は、Ｌｙｓ−３６５の前の３１残基であり、恐らくは切断は、このカスケードの回路を短絡させて、下流効果を妨げる。
【００３５】
考察
ウイルスプロテアーゼによるＭＡＶＳシグナロソームの構成要素のタンパク質分解による切断は、第４群の（＋）ｓｓＲＮＡウイルスによる自然免疫応答の回避に共通する機構であると思われる（図２）が、同様に他のウイルス（たとえばインフルエンザ（５５））でも観察されている。ウイルスプロテアーゼは、ＩＦＮおよびＩＳＧの産生をもたらす宿主タンパク質を直接切断することができる。いくつかの標的の切断により、宿主の転写および翻訳の遮断が促進される。たとえば、ピコルナウイルス科に属するウイルスの３Ｃｐｒｏは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写因子、ＴＡＴＡ−結合タンパク質（５６；５７）、ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答配列結合タンパク質）、Ｏｃｔ−１、ｐ５３、ＳＬ−１  ＴＢＰ−関連因子（５８）、ポリ（Ａ）−結合タンパク質（５９；６０）、ｅＩＦ５Ｂ（６１）、ｅＩＦ４ＡＩ（６２）、ｅＩＦ４ＧＩ（６３）、ＴＲＩＦ（６４）、ＲＩＧ−Ｉ（６５）、ＭＤＡ−５（６６）、ＭＡＶＳ（６７）ＮＦ−κＢ（６８）、およびＮＥＭＯ（６９；７０）を切断することが示されている。Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）ウイルスのｎｓ３／４Ａプロテアーゼ（フラビウイルス科）は、ＭＡＶＳを切断することが示されていた（７１−７４）。ここで、本出願人らは、ＶＥＥＶのｎｓＰ２プロテアーゼ（トガウイルス科）が、ＴＲＩＭ１４を切断できることを示した。ＴＲＩＦ（ＴＩＲ−ｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｄａｐｔｅｒ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−β）は、ウイルスプロテアーゼの別の一般的な標的である。デングウイルスのｎｓ２Ｂ／ｎｓ３プロテアーゼは、ＲＩＧ−ＩおよびＭＡＶＳと相互作用できるがＭＤＡ−５とは相互作用できないタンパク質であるＳＴＩＮＧ（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｇｅｎｅ；ＭＩＴＡ（ｍｅｄｉａｔｏｒ  ｏｆ  ＩＲＦ３  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）としても知られている）（７５）を切断することが示されていた。ＳＴＩＮＧの切断は、Ｉ型ＩＦＮの産生の阻害をもたらした（７５−７７）。Ｚｉｋａは、第４群の別の注目すべきメンバーであるが、このウイルスプロテアーゼにより切断される宿主タンパク質は、まだ報告されていない。
【００３６】
ウイルスプロテアーゼの特徴的な切断産物はまた、ウイルス感染の有用なバイオマーカーを生み出すことができ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗ウイルスプロテアーゼ阻害剤の治療上の有効性の評価に有用であり得る。たとえば、ＭＡＶＳ切断産物は、慢性ＨＣＶ感染症を有するヒトで観察されたが、対照では観察されず、ＨＣＶのｎｓ３−４ＡプロテアーゼによるＭＡＶＳの切断は、高いウイルス量に関連していた（７３）。アルファウイルス感染症に関するバイオマーカーは、比較的特徴付けされていないことから、ＴＲＩＭ１４の切断もしくは切断の下流での作用、またはその両方が、ＶＥＥＶ感染症の有用な指標であり得る。
【００３７】
ウイルスプロテアーゼによるヒト宿主タンパク質の切断は、他の研究者により以前に認識されており（５６；６５；６６；６９；７８−８３）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＲＮＡｉ／ＲＩＳＣに類似している一般的な拮抗戦略を反映し得る（図８）。ウイルスプロテアーゼが認識する切断部位配列は、無作為に選択されていないように思われる（表２）。いくつかのグループは、ウイルスポリタンパク質におけるプロテアーゼ切断部位配列に対して相対的にほとんど配列同一性を有しない部位で、ウイルスプロテアーゼが宿主タンパク質を切断できることを示した。ここで提示した事例は、同一の残基の最も長い連続する一続きの配列を示している（表２）。第４群の（＋）ｓｓＲＮＡウイルスによるこの機構の使用は、本質的にメッセンジャーＲＮＡであるウイルスゲノムの翻訳によるものであり得る。ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むウイルス酵素の産生は、ｄｓＲＮＡの中間体の産生より先に起こる。よって、これらウイルスプロテアーゼは、細胞内の抗ウイルス応答がｄｓＲＮＡの中間体により誘発される前に、ＭＡＶＳシグナロソームを短絡させる機会を有し得る。
【００３８】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＲＮＡｉ／ＲＩＳＣのタンパク質型は、以前に記載されてはいないが、ｓｈｏｒｔ  ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｈｏｓｔ−ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ＳＳＨＨＰＳ）およびこれらを切断するプロテアーゼに依存し得る。比較的短いウイルスプロテアーゼ切断部位（約２５残基）を、抗ウイルス性の細胞内宿主タンパク質の切断部位に同化させることにより、ウイルスは、有意な量の新規ゲノム材料を組み込むことなく、機能を有効に獲得し得る。これらウイルスが使用する戦略は、ウイルスプロテアーゼ（通常、ウイルスの複製に必須である酵素）の酵素的活性に依存するＩＦＮ−拮抗の別の機構を組み込んでいる。ウイルスはその宿主と共に進化するため、非構造タンパク質の切断部位におけるこれら宿主タンパク質配列の使用は、ウイルスの複製がプロテアーゼに左右されるため、進化上好適であり得る。宿主の自然免疫応答の良好な抑制は、ウイルスの複製に好ましく、ウイルスの適応度を増大させ得る。
【００３９】
これら３つのサイレンシング機構に共通していることは、これらが、それぞれ、破壊すべき大きな標的配列を同定するために短い配列に依存していること；これらが、削除すべきファイルを同定するための「キーワード」を利用するアルゴリズムを検索および削除することに類似していることである（図８）。これらプログラムは、それぞれ、短い配列と大きな配列との間のマッチを同定し、次に同定した標的を切断することができる酵素を有する。これら機構はすべて、応答をサイレンシングまたは拮抗させるために使用され、短い配列と標的配列との間の関係は、通常、宿主と病原体、より具体的にはウイルスとの関係である。最後に、これら機構は、防御機構として使用され、宿主をウイルスから保護するか、またはウイルスを宿主から保護する。それぞれの場合で、「キーワード」、または短い配列を作製できる酵素（たとえばダイサー）が、標的配列の切断の原因である酵素と共に見いだされた。
【００４０】
材料および方法
材料．ＲＩＰＡバッファー、Ｈａｌｔ（商標）プロテアーゼ阻害剤カクテル、および全ての一般的な化学物質は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ）から購入した。プラスミド構築物は、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ，  Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）が合成した。ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）およびＩＰＴＧ（４２０２９１）は、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｂｉｌｅｒｉｃａ，  ＭＡ）から購入した。カラム樹脂およびＰＤ−１０ゲルろ過カラムは、Ｇ．Ｅ．Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ（Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，  ＭＡ）から購入した。ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤のタブレットは、Ｒｏｃｈｅ，  Ｉｎｃから購入した。黒色のハーフエリアのＣｏｒｎｉｎｇ  ３９９３の表面に結合能がない９６ウェルプレートは、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．（Ｃｏｒｎｉｎｇ，  ＮＹ）から購入した。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｅｃｉｓｅ  Ｔｒｉｓ−ＨＥＰＥＳアクリルアミドゲル（８〜１６％の勾配）およびＢｕｐＨ  Ｔｒｉｓ−ＨＥＰＥＳ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥランニングバッファーは、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，  ＩＬ）から購入した。抗ＴＲＩＭ１４抗体（ＨＰＡ０５３２１７）、抗アクチン抗体（Ａ１９７８）、およびＨＲＰ結合型二次抗体は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）から購入した。
【００４１】
ＦＲＥＴ基質のプラスミドコンストラクト
シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ｎｓＰ２プロテアーゼ切断部位モチーフＡＧ（Ａ／Ｃ）↓（Ｇ／Ｙ／Ａ）、および黄色蛍光タンパク質（ＹＥＰ）をＮｄｅＩとＸｈｏＩの間にコードするｐＥＴ−１５Ｂプラスミド（アンピシリン耐性（ＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎＲ））を合成した。Ｎ末端のヘキサヒスチジンタグは、トロンビン切断部位の前にある。６つのＣＦＰ−ＹＦＰコンストラクト：ＶＥＥＶのｎｓＰ１２切断部位の２５残基を含むＶ１２；ＶＥＥＶのｎｓＰ３４切断部位の２５残基を含むＶ３４；ＳＦＶのｎｓＰ１２切断部位の２５残基を含むＳ１２；およびヒトのＴＲＩＭ１４の２５、２２、または１９残基を含むコンストラクトを、使用した。
【００４２】
改変したｐＭＣＳＧ９ベクター（８４）中のＣＨＩＫＶのｎｓＰ１２システインプロテアーゼ−ＳＡＭ  Ｍｔａｓｅは、ＮＹＳＢＣ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ）のＪｏｎａｈ  Ｃｈｅｕｎｇ博士によって提供された。ＣＨＩＫＶプロテアーゼ／ＳＡＭ  Ｍｔａｓｅを、ＴＥＶプロテアーゼを使用して切断できるデカヒスチジンでタグ付けされたマルトース結合タンパク質にＮ末端で融合した。
【００４３】
ｎｓＰ２システインプロテアーゼの発現および精製
還元状態のＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼの精製を確実にするために（８５）、本出願人らは、プロテアーゼおよびＳＡＭ  Ｍｔａｓｅドメイン（残基４５７〜７９２）を含むｎｓＰ２−チオレドキシン（Ｔｒｘ）融合タンパク質を使用した。ＥＥＥＶおよびＷＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼを、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの前の追加的なＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの精製ステップを伴う同様のプロトコルを使用して、発現および精製した。ＢＬ−２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ  Ｅ．ｃｏｌｉを、Ｔｒｘ−ＶＥＥＶ−ｎｓＰ２プラスミドで形質転換した。５０μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地（３〜６Ｌ）に植菌し、ＯＤ６００が約１．０となるまで増殖させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧで１７℃において一晩誘導した。細胞をペレット化し、溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５００ｍＭのＮａＣｌ、３５％のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、５％のグリセロール、２ｍＭのβ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、２５ＵのＤＮａｓｅ  ０．３ｍｇ／ｍＬのリゾチーム）で溶解し、氷浴中１５秒間隔で１０回超音波処理を行った。ライセートを、２０，０００×ｇで３０分間遠心分離することにより清澄にし、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＢＭＥ、５％のグリセロールで平衡化したニッケルカラムにローディングした。このカラムを、６０ｍＭのイミダゾールを含む同じバッファーで洗浄した。タンパク質を、３００ｍＭのイミダゾールを含む同じバッファーで溶出した。タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５％のグリセロールに対してトロンビンと共に（４℃で一晩）透析し、次に、Ａバッファー（Ｂｕｆｆｅｒ  Ａ）（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５％のグリセロール、５ｍＭのＤＴＴ）で１：３希釈し、Ａバッファーで平衡化したＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにローディングした。タンパク質を、塩勾配（０−１．２５ＭのＮａＣｌ）を使用して溶出し、次に濃縮し、液体窒素で急速凍結し、−８０℃で保存するか、５０％のグリセロールを含むバッファーにおいて−２０℃で保存した。バッファーを、対応するアッセイバッファー（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０））に交換した後に、ＰＤ−１０カラムを使用して、全ての動態実験を行った。ＣＨＩＫＶのｎｓＰ２プロテアーゼを、Ｃｈｕｎｇらにより生成されたコンストラクトから発現させ（８６）、同様の方法を使用して精製した；ＨｉｓタグおよびＭＢＰを除去した。
【００４４】
ＦＲＥＴタンパク質基質の発現および精製
ＢＬ−２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌを、基質をコードしたプラスミドを用いて形質転換した。ＬＢ／Ａｍｐ（１．５〜３．０Ｌ）に植菌し、ＯＤ６００が約１．０となるまで増殖させ、振とうしながら１７℃で一晩、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。細胞を、遠心分離によりペレット化し、溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５００ｍＭのＮａＣｌ、３５％のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ、２ｍＭのＢＭＥ、０．３ｍｇ／ｍＬのリゾチーム、１ＥＤＴＡフリーのプロテアーゼ阻害剤のタブレット）で溶解し、氷浴中で１分間手短に超音波処理した。ライセートを、遠心分離（２０，５００×ｇ、４℃で３０分間）により清澄にし、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５００ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＢＭＥで平衡化したニッケルカラムにローディングした。ローディング後に、カラムを同じバッファーで洗浄し、Ａ２８０がベースラインに戻るまで、６０ｍＭのイミダゾールを含む１０〜２０カラム体積のバッファーで洗浄した。タンパク質を３００ｍＭのイミダゾールを含む同じバッファーで溶出した。タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１５０ｍＭのＮａＣｌに対して、４℃で一晩、５０Ｕのトロンビンと共に透析した。このタンパク質をニッケルカラムに再度かけ、フロースルーを回収することにより、Ｈｉｓタグを除去した。次に、タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）、５ｍＭのＥＤＴＡ、２５０ｍＭのＮａＣｌに対し透析し（４℃で一晩）、次に、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）に対して透析を行った（２時間）。タンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．６）で平衡化したＱ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにローディングし、塩勾配（０〜１ＭのＮａＣｌ）で溶出した。全ての基質が、高収率（典型的な収率は、培地１リットルあたり６０〜８０ｍｇ）でもたらされ、９．０〜１０．５ｍｇ／ｍＬに容易に濃縮することができた。これら基質を、連続アッセイおよび不連続アッセイに使用した。同様の基質を使用して、他のプロテアーゼを試験した（８７；８８）。
【００４５】
連続ＦＲＥＴアッセイ
定常状態の動態パラメータの測定については、Ｒｕｇｅらにより記載された方法に従った（８８）。ＹＦＰ／ＣＦＰ  ＦＲＥＴ基質の切断を、放出速度を計算するために、４３４／４７０ｎｍおよび４３４／５２７ｎｍの励起／放出波長と、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ製のＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５プレートリーダーを使用して、室温（２３±３℃）で連続的にモニタリングした。この基質は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）にバッファー交換された。１μＭ以下の酵素濃度および１０〜１４０μＭの範囲の基質濃度（８つの異なる濃度）を使用して、定常状態の動態パラメータを測定した。Ｃｏｒｎｉｎｇ，  Ｉｎｃのハーフエリアの黒色の低結合表面９６ウェルプレート（half-area black low binding surface 96-well plate）において三連でデータを収集した（反応体積５０μＬ）。読み取りが完了した後に、プレートをフィルムで密閉し、室温２３±３℃で一晩消化させた。翌日、最終的な放出速度を読み取った。切断された基質のフラクション、ｆを、以下の式：
【数１】
2020502496.tif 000003
を使用して、各時点の放出速度から計算した。
各時点での切断された基質のｎｍｏｌを、ｆとｔ＝０での基質のｎｍｏｌ（Ｓ０）を乗算することにより計算した。ｒｕｎｃｕｔの値は、酵素の非存在下で測定した放出速度に対応しており、ｒｃｕｔの値は、基質が完全に切断された際に測定した放出速度であった。初速度を、線形の範囲（ｆ≦２０％）から各濃度［Ｓ］で計算した。時間対ｎｍｏｌのプロットを、各［Ｓ］の濃度で線形にフィットさせ、ｖｏを直線の勾配から得た。自然加水分解の速度を、酵素の非存在下で測定し、酵素触媒速度から減算した。データを、Ｇｒａｆｉｔ（Ｅｒｉｔｈｒｉｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｔｄ．，  Ｓｕｒｒｅｙ，  ＵＫ）を使用して、ミカエリス・メンテン式ｖｏ＝（Ｖｍａｘ＊［Ｓ］）／（Ｋｍ＋［Ｓ］）にフィットさせた。
【００４６】
不連続なゲルベースのアッセイ
反応混合物（５μＭのｎｓＰ２−Ｔｒｘ、５０μＭのＦＲＥＴ基質、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ）を、室温（２３±３℃）で一晩（約１８時間）インキュベートした。基質の９０％超が酵素により切断されるまで、反応を行った。Ｌａｅｍｅｌｌｉバッファーと混合し（１：１）、試料を７０℃以上で３分間加熱することにより、反応を停止させた。切断産物（１０μｌ）を、ＢｕｐＨランニングバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、３ｍＭのＳＤＳ、ｐＨ８±０．５）中での１２ウェルの８〜１６％の勾配のゲルにおけるＳＤＳ−ＰＡＧＥ（１１０Ｖ、５０分間）により分離した。２５アミノ酸の切断配列を含む切断されていないＴＲＩＭ１４  ＦＲＥＴ基質の計算上の分子量は、５６．７ｋＤであり、切断したＣＦＰおよびＹＦＰの産物ではそれぞれ２９．２ｋＤａおよび２７．５ｋＤａであった。チオレドキシン−Ｈｉｓタグ付けされた酵素では酵素の分子量は、５２．２０８ｋＤａであり、タグのない酵素では３８．２９ｋＤａであった。バンドは、８〜１６％の勾配のゲルで良好に分離し、明確なバンドパターンを達成するためには、試料の煮沸が必要であった。デンシトメトリーを、ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｌ  Ｄｏｃｋ  Ｉｍａｇｅｒのソフトウェア（ＢｉｏＲａｄ  Ｉｎｃ．，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を使用して行った。
【００４７】
質量分析
ゲルバンドを、完全に脱染するまで、５０％のアセトニトリル（ＡＣＮ）において２５０ｍＭの重炭酸アンモニウムで洗浄した。次に、バンドを小さなキューブ状に切断し、１００％（ＡＣＮ）により脱水した。改変ブタトリプシン溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ，製造番号Ｖ５１１）を含む５０ｍＭの重炭酸アンモニウムをゲルのキューブに添加し、ゲルの中のタンパク質を一晩消化させた。得られたペプチドを、６０％のＣＡＮにおいて２％のギ酸（ＦＡ）における超音波処理により、ゲルの断片から抽出した。次に抽出物を回収し、このステップを、さらに３回反復した。最終的なゲルの脱水ステップ（すなわち１００％を用いた超音波処理）を用いて、ペプチドの減少を最小限にした。同じバンドに対応するペプチドの消化物を合わせて、ｓｐｅｅｄ−ｖａｃにより濃縮した。
【００４８】
ゲル消化物の濃縮物を、０．１％のＦＡおよび５％のＡＣＮ中で再構成し、四重極飛行時間型ＭＳ／ＭＳのＱ−Ｓｔａｒ  Ｅｌｉｔｅ質量分析計（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）に接続したＴｅｍｐｏ  ＭＤＬＣシステム（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ，  Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，  ＣＡ）を使用する逆相カラム（Ｃ１８，  Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｍａｇｉｃ−Ｃ１８ＡＱ−５μ  ２００Å  ０．１×１５０ｍＭ）に注入した。ペプチドを、９８％のＡ溶媒（水において５％のＡＣＮ、０．１％のＦＡ）、および２％のＢ溶媒（水において９５％のＡＣＮ、０．１％のＦＡ）を使用して、カラムに３０分間ローディングし、Ｂ溶媒を、０．３７％／分で最終濃度５０％に増大させる１３０分の線形勾配により、分離した。ＭＳおよびＭＳ／ＭＳのペプチドスペクトルを、情報非依存的解析（ＩＤＡ）を使用して得た。３５０〜１６００Ｄａの質量範囲を、ＴＯＦ  ＭＳスキャンでモニタリングした。１秒間に２０個を超える計数の強度を有する、ＴＯＦ  ＭＳスキャンからの最も豊富な３つの前駆体イオンを、ＭＳ／ＭＳ解析に提出した。前者の標的イオンを、１５秒間でのＭＳ／ＭＳ提出から除外した。ＭＳデータを、Ａｎａｌｙｓｔ  ＱＳ（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を使用して獲得し、タンデム質量スペクトルを、ｍａｓｃｏｔ．ｄｌｌにより抽出し、Ｍａｓｃｏｔ（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  Ｌｏｎｄｏｎ，  ＵＫ；  Ｍａｓｃｏｔ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．４．１）を使用して解析した。Ｍａｓｃｏｔを、３つの社内データベース：１：混入物質２０１２０７１３（２４７配列；  １２８，１３０残基）、２：ｃＲＡＰ  ２０１２１１２８（１１２配列；  ３７，４１８残基），および３：ＶＥＥＶデータベース（６配列；１，９８０残基）を検索するように設定した。一般的な混入物質が、最初の２つのデータベースに含まれていたが、同時に完全なＶＥＥＶプロテアーゼ、チオレドキシン、ＣＦＰ−ＴＲＩＭ１４−ＹＦＰの完全な配列、ならびにＶＥＥＶにより産生されるその予測されたＮ末端配列およびＣ末端配列も含まれていた。消化が半トリプシン性（ｓｅｍｉｔｒｙｐｔｉｃ）（少なくとも１つのペプチド末端がＲまたはＫである）であると仮定して、３つの誤切断を許容した。フラグメントイオンの質量許容差を、０．２０Ｄａに設定し、親イオンの許容差を０．２０Ｄａに設定した。アスパラギンおよびグルタミンの脱アミドおよびメチオニンの酸化を、変数の修正として設定した。Ｍａｓｃｏｔにより同定した後に、ＶＥＥＶタンパク質分解からのＴＲＩＭ１４の産物の得られたＮ末端およびＣ末端のペプチド：それぞれＨＹＷＥＶＤＶＱＥＡＧＡ（配列番号７）およびＧＷＷＶＧＡＭＶＳ（配列番号８）のスペクトルを、獲得したローデータにおいて手動で検査し、得られた一価のフラグメントには手動でアノテーションを付けた。
【００４９】
ウェスタンブロット
細胞を、Ｈａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテルを２×の最終濃度で含むＲＩＰＡバッファーに溶解した。ライセートを、１０％のＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル中で分離し、ｉＢｌｏｔシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してニトロセルロース膜にエレクトロブロットした。タンパク質を転写した後に、ブロットを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０および５％の粉乳を含む１×ＰＢＳでブロッキングし、４℃で一晩インキュベートした。タンパク質に特異的な一次抗体を、ブロッキングバッファーで希釈し、室温で２時間インキュベートした。インキュベーション後に、ブロットを、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）で３回洗浄した。洗浄後にブロットを、対応する二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳＴで３回洗浄した。タンパク質を検出するために、ブロットを、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（商標）Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅで処理し、ＢｉｏＲａｄのイメージングのソフトウェアを使用して撮像した。Ｔｒｉｍ１４タンパク質を、ポリクローナルな抗Ｔｒｉｍ１４  Ａｂ（１：５００，ＨＰＡ０５３２１７）、次にヤギの抗ウサギ西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ，１：５００）二次Ａｂを使用して検出した。アクチンタンパク質を、抗アクチンＡｂ（１：５０００）、次いでヤギの抗マウスＨＲＰ（１：５０００）の二次Ａｂを使用して検出した。ＶＥＥＶのｎｓＰ２タンパク質を、ヤギの抗ＶＥＥＶのｎｓＰ２  Ａｂ（ＡｌｐｈａＶａｘ，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，  ＮＣからの寄贈、１：１０００）、次いでウサギの抗ヤギＨＲＰ（１：５０００）二次Ａｂを使用して検出した。
【００５０】
Ａ５４９細胞（腺癌のヒト肺胞基底上皮細胞）を使用した。感染後６時間目および２４時間目に収集した、感染したＡ５４９細胞のライセート（１０μｇ／レーン）を、１０％のＮｕＰＡＧＥ  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲルで分離し、ニトロセルロース膜に転写した。Ｔｒｉｍ１４−α、Ｔｒｉｍ１４−α切断産物（ＣＰ）、およびαアクチンを、タンパク質特異的抗体を使用するウェスタンブロット解析により検出した。組み換え型のヒトＴｒｉｍ１４タンパク質を、対照として使用した。ＶＥＥＶ  Ｔｒｉｎｉｄａｄ、ＥＥＥＶ  ＦＬ９３−９３９、ＷＥＥＶ  ＣＢＡ８７、およびＣＨＩＫＶ  ＡＦ１５５６１のウイルスを使用した。
【００５１】
以前に同定されたＶＥＥＶのｎｓＰ２システインプロテアーゼ阻害剤（４２）、ＣＡ０７４メチルエステル（ＣＡ０７４ｍｅ）の効果を試験するために、Ａ５４９細胞を、ＣＡ０７４ｍｅで処理し、ＶＥＥＶまたはＣＨＩＫＶを用いて１０に等しい感染多重度で感染させた。細胞とウイルスを１時間インキュベーションした後、細胞の単層を、培地で２回洗浄して、残存するウイルスを除去した。ＣＡ０７４ｍｅ（５０、１００、２００μＭ）を含む完全培地を添加し、細胞を、５％ＣＯ２下、３７℃でインキュベートした。感染後１８〜２４時間目に、上清および細胞のライセートを、ウェスタンブロットによる解析のため回収した。
【００５２】
ポリクローナルウサギＳｉｇｍａ  Ｐｒｅｓｔｉｇｅ（商標）抗ＴＲＩＭ１４抗体（ＨＰＡ０５３２１７）の特異性は、すでに解析されており、オンラインで入手可能である（３８）。Ｎ末端配列を使用して作製されたＨＰＡ０５３２１７抗体は、完全長のＴＲＩＭ１４、ならびにＴＲＩＭ１４のαおよびβのアイソフォームに共通する。この配列は、ユビキチン化部位の前にある。
【００５３】
基質結合相互作用のモデリング
ＶＥＥＶのＰ１２、Ｐ２３、Ｐ３４、およびＴＲＩＭ１４を含む基質の結合モデルを、ＡｕｔｏＤｏｃｋプログラムを使用したアンサンブルドッキング（ｅｎｓｅｍｂｌｅ−ｄｏｃｋｉｎｇ）プロトコルを用いて予測した（８９）。ＶＥＥＶのｎｓＰ２の構造（ＰＤＢ  ２ＨＷＫ）およびＣＨＩＫＶのｎｓＰ２（ＰＤＢ  ３ＴＲＫ）の複数の立体構造を、ＭＤシミュレーションおよびクラスター解析から得た。タンパク質の活性部位を、触媒残基Ｃｙｓ−４７７を中心とする０．３７５Åの格子間隔を伴う７０×７０×７０ポイントの格子により定義した。ラマルク遺伝的アルゴリズム（ＬＧＡ）を、５０回の実行で適用し、最も好ましい結合自由エネルギーを伴う最良の形態を選択した。ＭＤシミュレーションを、ＡＭＢＥＲ  １２パッケージおよびｆｆ９９ｓｂ力場を使用する予測基質結合モデルで行った。溶媒和の系をエネルギー最小化に供した後に、ＭＤシミュレーションを行った。連続系をシミュレートするために、周期的境界条件を適用した。粒子・メッシュ・エバルト法（ＰＭＥ）を、ロングレンジ静電相互作用を計算するために使用した。シミュレートした系を、最初に、１００ピコ秒の間に０Ｋから３００Ｋの段階的な温度上昇に供し、次に３００Ｋで５００ピコ秒平衡化し、次いで、全体で２ナノ秒の長さの生産工程を行った。結合自由エネルギーを、ＭＭ−ＰＢＳＡ法を使用して計算した。計算した結合自由エネルギーの分解を、ＡＭＢＥＲ  １２パッケージの同じＭＭ−ＰＢＳＡモジュールを使用して行った。
【００５４】
感染の検出
ＴＲＩＭ１４のＶＥＥＶ特異的切断は、ＶＥＥＶ感染症の診断バイオマーカーとして使用することができる。ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ／ＷＥＥＶ、およびＣＨＩＫＶはすべて、同様の症状を有しており、現在、ＶＥＥＶ感染症に関する公知のバイオマーカーはない。
【００５５】
たとえば、個体由来の材料（血液または組織など）を、患者がＶＥＥＶに感染している可能性があるかどうかを決定するために、ＴＲＩＭ１４からのＶＥＥＶ特異的切断産物の潜在的な存在に関してアッセイすることができる。このようなアッセイは、任意の適切な技術、たとえば免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、質量分析、および／またはフローサイトメトリーを使用して行うことができる。
【００５６】
少なくとも８個の、他の第４群の（＋）ｓｓＲＮＡウイルスのプロテアーゼは、ＭＡＶＳシグナロソームの構成要素を切断してＩＦＮの産生を拮抗させることが示されており、これは、宿主のタンパク質配列に対するこれら短い切断部位のモチーフ配列の同一化が、組み込まれたＩＦＮ拮抗作用の機構を表し得ることを示唆している。よって、このウイルスの科の他のメンバーによる感染の間の宿主−病原体の相互作用を検出するために、本技術を使用できることが予想される。たとえば、本方法を、ジカウイルス感染症の小頭症の原因であり得る潜在的な宿主タンパク質の標的を同定するために使用した。
【００５７】
このような技術は、診断アッセイまたは予測ソフトウェアプログラムに組み込むことができる。
【００５８】
プロテオームの編集
また、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９およびＲＮＡｉ／ＲＩＳＣのタンパク質アナログも企図される。この系は、ｓｈｏｒｔ  ｓｔｒｅｔｃｈｅｓ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｈｏｓｔ−ｐａｔｈｏｇｅｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（ＳＳＨＨＰＳ）およびこれらを切断するプロテアーゼ（ヌクレアーゼとは対照的）に依存している。
【００５９】
ウイルスゲノムは、野生型または変異型のｎｓＰ２プロテアーゼをコードするＲＮＡを細胞質に直接送達する（エンドソーム小胞ではない）媒体を提供する。プロテアーゼの触媒的性質によって、プロテアーゼは、細胞内の多くの基質を代謝回転させ得る。変異体または野生型のウイルスの複製は、この作用を一過的に増大させる機構を提供する。この種類のプロテオーム編集法は、以前には利用されていないが、治療応用の可能性を有する。
【００６０】
一実施形態では、宿主の細胞または生物は、ＶＥＥＶのｎｓＰ２プロテアーゼの作用を受ける相同な配列が組み込まれた組み換えウイルス非構造ポリタンパク質を発現する。上記の細胞または生物に当該ウイルスが導入されると、当該ポリタンパク質と宿主のタンパク質の中の配列が切断され、これは、切断されるタンパク質の機能が喪失し得る。
【００６１】
さらなる実施形態では、ｎｓＰ２プロテアーゼは、目的のアミノ酸配列（相同な宿主―病原体のタンパク質配列とは異なる）に作用するように変異しており、これにより、変異したプロテアーゼを保持するウイルスの導入により、所望の標的のタンパク質分解がもたらされる。
【００６２】
利点および新規の特性
ウイルスのｎｓＰ２プロテアーゼを変異させるかまたはそのまま使用して、他の宿主のタンパク質配列を認識して、遺伝子発現をもたらすカスケードをタンパク質分解により遮断するか、または１つのタンパク質をタンパク質分解することができる。実施形態は、当該分野で利用可能な技術、たとえばトランスフェクション、遺伝子導入、野生型または遺伝子操作されたウイルスによる感染などを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで細胞（たとえば細胞培養物、組織培養物、および／または任意選択でヒトを含む生きた動物の中の細胞）に、野生型または改変したプロテアーゼを導入するステップを含むことができる。任意選択で、プロテアーゼの１つ以上の遺伝子操作されたまたは野生型の標的を、同様に導入することができる。この戦略は、癌遺伝子の発現がすでに起こっている腫瘍細胞を殺滅すること、またはタンパク質毒素を除去することに有用であり得る。他の応用として、様々な疾患を治療または予防するための治療、ウイルス感染症の研究、および細胞内のタンパク質を切断することが望ましいとされ得る他の状況を挙げることができる。
【００６３】
アルファウイルスは、様々な細胞種に感染することができ、汎親和性である。これらウイルスは、一過性の急性のウイルス感染を引き起こし、弱毒化したアルファウイルスが、現在ワクチン接種に使用されている。ＴＣ−８３ワクチン株を弱毒化する変異は、ｎｓＰ２システインプロテアーゼのプロテアーゼ活性に影響しない。ＶＥＥＶのような一部のアルファウイルスもまた、血液脳関門を通過することができる。ビリオンは、ＲＮＡおよびプロテアーゼを脳に送達するための有用な媒体として働き得る。
【００６４】
結論
本明細書中記載の全ての文献は、本文書が引用した特定の物質および方法を開示および説明するために、参照として本明細書中に援用されている。
【００６５】
本発明を、その好ましい実施形態と関連させて説明してきたが、当業者は、特に記載されていない追加、削除、修正、および置換が、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなくなされ得ることを理解するものである。本出願で使用される用語は、用語「ｍｅａｎｓ」が明らかにそれに関連して使用されていない限り「ｍｅａｎｓ−ｐｌｕｓ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ」の言語であると解釈されるべきではない。
【表２】
2020502496.tif 000004
【００６６】
参照文献
１．Ｓｔｅｅｌｅ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｒｅｅｄ，  Ｄ．，  Ｇｌａｓｓ，  Ｐ．  Ｊ．，  Ｈａｒｔ，  Ｍ．  Ｋ．，  Ｌｕｄｗｉｇ，  Ｇ．  Ｖ．，  Ｐｒａｔｔ，  Ｗ．  Ｄ．，  Ｐａｒｋｅｒ，  Ｍ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．  Ｆ．  （２００７）  Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｄｅｓ，  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｗａｒｆａｒｅ  （Ｄｅｍｂｅｋ，  Ｚ．  Ｆ．，  Ｅｄ．）  ｐｐ  ２４１−２７０，  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｇｅｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ，  Ｆａｌｌｓ  Ｃｈｕｒｃｈ．
２．Ｓｃｈａｆｅｒ，  Ａ．，  Ｂｒｏｏｋｅ，  Ｃ．  Ｂ．，  Ｗｈｉｔｍｏｒｅ，  Ａ．  Ｃ．，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ｒ．  Ｅ．  （２０１１）  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ｂａｒｒｉｅｒ  ｄｕｒｉｎｇ  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８５，  １０６８２−１０６９０．
３．Ｒｙｚｈｉｋｏｖ，  Ａ．  Ｂ．，  Ｔｋａｃｈｅｖａ，  Ｎ．  Ｖ．，  Ｓｅｒｇｅｅｖ，  Ａ．  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｒｙａｂｃｈｉｋｏｖａ，  Ｅ．  Ｉ．  （１９９１）  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｏｌｆａｃｔｏｒｙ  ｔｒａｃｔ  ｏｆ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｉｚｅｄ  ｍｉｃｅ，  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｓｃｉ．  ２，  ６０７−６１４．
４．Ｓｔｅｅｌｅ，  Ｋ．  Ｅ．  ａｎｄ  Ｔｗｅｎｈａｆｅｌ，  Ｎ．  Ａ．  （２０１０）  ＲＥＶＩＥＷ  ＰＡＰＥＲ：  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ，  Ｖｅｔ．  Ｐａｔｈｏｌ．  ４７，  ７９０−８０５．
５．Ｓｔｅｅｌｅ，  Ｋ．  Ｅ．，  Ｒｅｅｄ，  Ｄ．，  Ｇｌａｓｓ，  Ｐ．  Ｊ．，  Ｈａｒｔ，  Ｍ．  Ｋ．，  Ｌｕｄｗｉｇ，  Ｇ．  Ｖ．，  Ｐｒａｔｔ，  Ｗ．  Ｄ．，  Ｐａｒｋｅｒ，  Ｍ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．  Ｆ．  （２００７）  Ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｄｅｓ，  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｗａｒｆａｒｅ  （Ｄｅｍｂｅｋ，  Ｚ．  Ｆ．，  Ｅｄ．）  ｐｐ  ２４１−２７０，  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｕｒｇｅｏｎ  Ｇｅｎｅｒａｌ，  Ｆａｌｌｓ  Ｃｈｕｒｃｈ．
６．Ｈａｎｓｏｎ，  Ｒ．  Ｐ．，  Ｓｕｌｋｉｎ，  Ｓ．  Ｅ．，  Ｂｅｕｓｃｈｅｒ，  Ｅ．  Ｌ．，  Ｈａｍｍｏｎ，  Ｗ．  Ｍ．，  ＭＣＫＩＮＮＥＹ，  Ｒ．  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｗｏｒｋ，  Ｔ．  Ｈ．  （１９６７）  Ａｒｂｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｗｏｒｋｅｒｓ．  Ｅｘｔｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｂｌｅｍ  ｅｍｐｈａｓｉｚｅｓ  ｔｈｅ  ｎｅｅｄ  ｆｏｒ  ｍｏｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｍｅａｓｕｒｅｓ  ｔｏ  ｒｅｄｕｃｅ  ｈａｚａｒｄｓ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５８，  １２８３−１２８６．
７．Ｅｈｒｌｉｃｈ，  Ｒ．  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｓ．  （１９７１）  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｈｕｍｉｄｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｎ  ａｉｒｂｏｒｎｅ  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ，  Ａｐｐｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ２２，  １９４−１９９．
８．Ｚａｃｋｓ，  Ｍ．  Ａ．  ａｎｄ  Ｐａｅｓｓｌｅｒ，  Ｓ．  （２０１０）  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｃ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｖｅｔ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  １４０，  ２８１−２８６．
９．Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｋ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｍａｒｔｉｎ，  Ｄ．  Ｈ．  （１９７４）  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ，  Ａｄｖ．  Ｖｅｔ．  Ｓｃｉ．  Ｃｏｍｐ  Ｍｅｄ  １８，  ７９−１１６．
１０．Ｄｅｒｅｓｉｅｗｉｃｚ，  Ｒ．  Ｌ．，  Ｔｈａｌｅｒ，  Ｓ．  Ｊ．，  Ｈｓｕ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｚａｍａｎｉ，  Ａ．  Ａ．  （１９９７）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｇｒａｐｈｉｃ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｅａｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３６，  １８６７−１８７４．
１１．（２００９）  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．
１２．Ｆｉｅｌｄｓ，  Ｂ．  Ｎ．，  Ｋｎｉｐｅ，  Ｄ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ，  Ｐ．  Ｍ．  （２００７）  Ｆｉｅｌｄｓ’  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｗｏｌｔｅｒｓ  Ｋｌｕｗｅｒ  Ｈｅａｌｔｈ／Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．
１３．Ｙｉｎ，  Ｊ．，  Ｇａｒｄｎｅｒ，  Ｃ．  Ｌ．，  Ｂｕｒｋｅ，  Ｃ．  Ｗ．，  Ｒｙｍａｎ，  Ｋ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｋｌｉｍｓｔｒａ，  Ｗ．  Ｂ．  （２００９）  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｍ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｎ  ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｂｙ  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｓｉｎｄｂｉｓ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８３，  １００３６−１００４７．
１４．Ｇａｒｍａｓｈｏｖａ，  Ｎ．，  Ｇｏｒｃｈａｋｏｖ，  Ｒ．，  Ｖｏｌｋｏｖａ，  Ｅ．，  Ｐａｅｓｓｌｅｒ，  Ｓ．，  Ｆｒｏｌｏｖａ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｆｒｏｌｏｖ，  Ｉ．  （２００７）  Ｔｈｅ  Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ  ｕｓｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｈｕｔｏｆｆ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８１，  ２４７２−２４８４．
１５．Ｈａｈｎ，  Ｃ．  Ｓ．，  Ｌｕｓｔｉｇ，  Ｓ．，  Ｓｔｒａｕｓｓ，  Ｅ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ，  Ｊ．  Ｈ．  （１９８８）  Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓ  ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｖｉｒｕｓ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８５，  ５９９７−６００１．
１６．Ｆｕｒｒ，  Ｍ．  ａｎｄ  Ｒｅｅｄ，  Ｓ．  （２０１５）  Ｅｑｕｉｎｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  Ｗｉｌｅｙ，  Ｓｏｍｅｒｓｅｔ．
１７．Ａｋｈｒｙｍｕｋ，  Ｉ．，  Ｆｒｏｌｏｖ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｆｒｏｌｏｖａ，  Ｅ．  Ｉ．  （２０１６）  Ｂｏｔｈ  ＲＩＧ−Ｉ  ａｎｄ  ＭＤＡ５  ｄｅｔｅｃｔ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｏｄｅ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４８７，  ２３０−２４１．
１８．Ｎｉｋｏｎｏｖ，  Ａ．，  Ｍｏｌｄｅｒ，  Ｔ．，  Ｓｉｋｕｔ，  Ｒ．，  Ｋｉｉｖｅｒ，  Ｋ．，  Ｍａｎｎｉｋ，  Ａ．，  Ｔｏｏｔｓ，  Ｕ．，  Ｌｕｌｌａ，  Ａ．，  Ｌｕｌｌａ，  Ｖ．，  Ｕｔｔ，  Ａ．，  Ｍｅｒｉｔｓ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｕｓｔａｖ，  Ｍ．  （２０１３）  ＲＩＧ−Ｉ  ａｎｄ  ＭＤＡ−５  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｓ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ−ｓｔｒａｎｄ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．  ９，  ｅ１００３６１０．
１９．Ｋｅｌｌ，  Ａ．  Ｍ．  ａｎｄ  Ｇａｌｅ，  Ｍ．，  Ｊｒ．  （２０１５）  ＲＩＧ−Ｉ  ｉｎ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４７９−４８０，  １１０−１２１．
２０．Ｆｒｏｌｏｖａ，  Ｅ．  Ｉ．，  Ｆａｙｚｕｌｉｎ，  Ｒ．  Ｚ．，  Ｃｏｏｋ，  Ｓ．  Ｈ．，  Ｇｒｉｆｆｉｎ，  Ｄ．  Ｅ．，  Ｒｉｃｅ，  Ｃ．  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｆｒｏｌｏｖ，  Ｉ．  （２００２）  Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｎｓＰ２  ａｎｄ  Ａｌｐｈａ／Ｂｅｔａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ  ｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７６，  １１２５４−１１２６４．
２１．Ｚｈａｎｇ，  Ｙ．，  Ｂｕｒｋｅ，  Ｃ．  Ｗ．，  Ｒｙｍａｎ，  Ｋ．  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｋｌｉｍｓｔｒａ，  Ｗ．  Ｂ．  （２００７）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｈａｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８１，  １１２４６−１１２５５．
２２．Ｓｃｈｏｇｇｉｎｓ，  Ｊ．  Ｗ．  ａｎｄ  Ｒｉｃｅ，  Ｃ．  Ｍ．  （２０１１）  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  １，  ５１９−５２５．
２３．Ｓｉｍｍｏｎｓ，  Ｊ．  Ｄ．，  Ｗｈｉｔｅ  ＬＪ  ＦＡＵ  −  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｔ．，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ＴＥ  ＦＡＵ  −  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ，  Ｓ．，  Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ＳＡ  ＦＡＵ  −  Ｗｈｉｔｍｏｒｅ，  Ａ．，  Ｗｈｉｔｍｏｒｅ  ＡＣ  ＦＡＵ  −  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ，  Ｒ．，  Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＲＥ  ＦＡＵ  −  Ｈｅｉｓｅ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｈｅｉｓｅ，  Ｍ．  Ｔ．  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ＳＴＡＴ１  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｈｏｓｔ  ｓｈｕｔｏｆｆ．
２４．Ｓｃｈｏｇｇｉｎｓ，  Ｊ．  Ｗ．  （２０１４）  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ−ｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ  ｇｅｎｅｓ：  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｖｉｒａｌ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６，  ４０−４６．
２５．Ｈｏｌｌｉｄｇｅ，  Ｂ．  Ｓ．，  Ｗｅｉｓｓ，  Ｓ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓｏｌｄａｎ，  Ｓ．  Ｓ．  （２０１１）  Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔ，  ｎｏｎ−ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｒｂｏｖｉｒｕｓｅｓ，  Ｖｉｒｕｓｅｓ．  ３，  ６２９−６５８．
２６．Ａｋｈｒｙｍｕｋ，  Ｉ．，  Ｋｕｌｅｍｚｉｎ，  Ｓ．  Ｖ．，  ａｎｄ  Ｆｒｏｌｏｖａ，  Ｅ．  Ｉ．  （２０１２）  Ｅｖａｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ：  ｔｈｅ  Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  ｎｓＰ２  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｒａｐｉｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｐｂ１，  ａ  ｃａｔａｌｙｔｉｃ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８６，  ７１８０−７１９１．
２７．Ｇａｒｍａｓｈｏｖａ，  Ｎ．，  Ｇｏｒｃｈａｋｏｖ，  Ｒ．，  Ｖｏｌｋｏｖａ，  Ｅ．，  Ｐａｅｓｓｌｅｒ，  Ｓ．，  Ｆｒｏｌｏｖａ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｆｒｏｌｏｖ，  Ｉ．  （２００７）  Ｔｈｅ  Ｏｌｄ  Ｗｏｒｌｄ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓｅｓ  ｕｓｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｓｈｕｔｏｆｆ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８１，  ２４７２−２４８４．
２８．Ｇａｒｍａｓｈｏｖａ，  Ｎ．，  Ａｔａｓｈｅｖａ，  Ｓ．，  Ｋａｎｇ，  Ｗ．，  Ｗｅａｖｅｒ，  Ｓ．  Ｃ．，  Ｆｒｏｌｏｖａ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｆｒｏｌｏｖ，  Ｉ．  （２００７）  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８１，  １３５５２−１３５６５．
２９．Ａｔａｓｈｅｖａ，  Ｓ．，  Ｆｉｓｈ，  Ａ．，  Ｆｏｒｎｅｒｏｄ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｆｒｏｌｏｖａ，  Ｅ．  Ｉ．  （２０１０）  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｃａｐｓｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒｍｓ  ａ  ｔｅｔｒａｍｅｒｉｃ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ＣＲＭ１  ａｎｄ  ｉｍｐｏｒｔｉｎ  ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ  ｔｈａｔ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｒｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８４，  ４１５８−４１７１．
３０．Ｈｕ，  Ｘ．，  Ｃｏｍｐｔｏｎ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｌｅａｒｙ，  Ｄ．  Ｈ．，  Ｏｌｓｏｎ，  Ｍ．  Ａ．，  Ｌｅｅ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｃｈｅｕｎｇ，  Ｊ．，  Ｙｅ，  Ｗ．，  Ｆｅｒｒｅｒ，  Ｍ．，  Ｓｏｕｔｈａｌｌ，  Ｎ．，  Ｊａｄｈａｖ，  Ａ．，  Ｍｏｒａｚｚａｎｉ，  Ｅ．  Ｍ．，  Ｇｌａｓｓ，  Ｐ．  Ｊ．，  Ｍａｒｕｇａｎ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｌｅｇｌｅｒ，  Ｐ．  Ｍ．  （２０１６）  Ｋｉｎｅｔｉｃ，  Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ，  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  Ｅｑｕｉｎｅ  Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｎｏｎｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  Ｃｙｓｔｅｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５５，  ３００７−３０１９．
３１．Ｈｉｒｏｓｅ，  Ｓ．，  Ｎｉｓｈｉｚｕｍｉ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｓａｋａｎｏ，  Ｈ．  （２００３）  Ｐｕｂ，  ａ  ｎｏｖｅｌ  ＰＵ．１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ＰＵ．１，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ３１１，  ３５１−３６０．
３２．Ｚｈｏｕ，  Ｚ．，  Ｊｉａ，  Ｘ．，  Ｘｕｅ，  Ｑ．，  Ｄｏｕ，  Ｚ．，  Ｍａ，  Ｙ．，  Ｚｈａｏ，  Ｚ．，  Ｊｉａｎｇ，  Ｚ．，  Ｈｅ，  Ｂ．，  Ｊｉｎ，  Ｑ．，  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  （２０１４）  ＴＲＩＭ１４  ｉｓ  ａ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ａｄａｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ−Ｉ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ  １１１，  Ｅ２４５−Ｅ２５４．
３３．Ｎｅｎａｓｈｅｖａ，  Ｖ．  Ｖ．，  Ｋｏｖａｌｅｖａ  ＧＶ，  Ｆ．  Ａ．  Ｕ．，  Ｕｒｙｖａｅｖ  ＬＶ，  Ｆ．  Ａ．  Ｕ．，  Ｉｏｎｏｖａ  ＫＳ，  Ｆ．  Ａ．  Ｕ．，  ｄｏｖａ  ＡＶ，  Ｆ．  Ａ．  Ｕ．，  Ｖｏｒｋｕｎｏｖａ  ＧＫ，  Ｆ．  Ａ．  Ｕ．，  Ｃｈｅｒｎｙｓｈｅｎｋｏ  ＳＶ，  Ｆ．  Ａ．  Ｕ．，  Ｋｈａｉｄａｒｏｖａ  ＮＶ，  Ｆ．  Ａ．  Ｕ．，  ａｎｄ  Ｔａｒａｎｔｕｌ，  Ｖ．  Ｚ．  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒｉｍ１４  ｇｅｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ．
３４．Ｂａｌｉｓｔｒｅｒｉ，  Ｇ．，  Ｃａｌｄｅｎｔｅｙ，  Ｊ．，  Ｋａａｒｉａｉｎｅｎ，  Ｌ．，  ａｎｄ  Ａｈｏｌａ，  Ｔ．  （２００７）  Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｄｅｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｓＰ２  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｓｅｍｌｉｋｉ  Ｆｏｒｅｓｔ  ｖｉｒｕｓ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｕｔａｎｔｓ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８１，  ２８４９−２８６０．
３５．Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，  Ｉ．  ａｎｄ  Ｂｅｒｇｅｒ，  Ａ．  （１９６７）  Ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｉｚｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ．  Ｉ．  Ｐａｐａｉｎ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ２７，  １５７−１６２．
３６．Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．  Ｆ．，  Ｇｉｓｈ，  Ｗ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｗ．，  Ｍｙｅｒｓ，  Ｅ．  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｄ．  Ｊ．  （１９９０）  Ｂａｓｉｃ  ｌｏｃａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｓｅａｒｃｈ  ｔｏｏｌ，  Ｊ  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５，  ４０３−４１０．
３７．        Ｓｔｒａｕｓｓ，  Ｅ．  Ｇ．，  Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ，  Ｒ．  Ｊ．，  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｓｔｒａｕｓｓ，  Ｊ．  Ｈ．  （１９９２）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｓＰ２  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｏｆ  Ｓｉｎｄｂｉｓ  ｖｉｒｕｓ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９１，  ９３２−９４０．
３８．Ｕｈｌｅｎ，  Ｍ．，  Ｆａｇｅｒｂｅｒｇ，  Ｌ．，  Ｈａｌｌｓｔｒｏｍ，  Ｂ．  Ｍ．，  Ｌｉｎｄｓｋｏｇ，  Ｃ．，  Ｏｋｓｖｏｌｄ，  Ｐ．，  Ｍａｒｄｉｎｏｇｌｕ，  Ａ．，  Ｓｉｖｅｒｔｓｓｏｎ，  Ａ．，  Ｋａｍｐｆ，  Ｃ．，  Ｓｊｏｓｔｅｄｔ，  Ｅ．，  Ａｓｐｌｕｎｄ，  Ａ．，  Ｏｌｓｓｏｎ，  Ｉ．，  Ｅｄｌｕｎｄ，  Ｋ．，  Ｌｕｎｄｂｅｒｇ，  Ｅ．，  Ｎａｖａｎｉ，  Ｓ．，  Ｓｚｉｇｙａｒｔｏ，  Ｃ．  Ａ．，  Ｏｄｅｂｅｒｇ，  Ｊ．，  Ｄｊｕｒｅｉｎｏｖｉｃ，  Ｄ．，  Ｔａｋａｎｅｎ，  Ｊ．  Ｏ．，  Ｈｏｂｅｒ，  Ｓ．，  Ａｌｍ，  Ｔ．，  Ｅｄｑｖｉｓｔ，  Ｐ．  Ｈ．，  Ｂｅｒｌｉｎｇ，  Ｈ．，  Ｔｅｇｅｌ，  Ｈ．，  Ｍｕｌｄｅｒ，  Ｊ．，  Ｒｏｃｋｂｅｒｇ，  Ｊ．，  Ｎｉｌｓｓｏｎ，  Ｐ．，  Ｓｃｈｗｅｎｋ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｈａｍｓｔｅｎ，  Ｍ．，  ｖｏｎ，  Ｆ．  Ｋ．，  Ｆｏｒｓｂｅｒｇ，  Ｍ．，  Ｐｅｒｓｓｏｎ，  Ｌ．，  Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，  Ｆ．，  Ｚｗａｈｌｅｎ，  Ｍ．，  ｖｏｎ，  Ｈ．  Ｇ．，  Ｎｉｅｌｓｅｎ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｐｏｎｔｅｎ，  Ｆ．  （２０１５）  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．  Ｔｉｓｓｕｅ−ｂａｓｅｄ  ｍａｐ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｐｒｏｔｅｏｍｅ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４７，  １２６０４１９．
３９．Ｊｉａ，  Ｘ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｈ．，  Ｗｕ，  Ｃ．，  Ｗｕ，  Ｑ．，  Ｍａ，  Ｓ．，  Ｗｅｉ，  Ｃ．，  Ｃａｏ，  Ｙ．，  Ｓｏｎｇ，  Ｊ．，  Ｚｈｏｎｇ，  Ｈ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｚ．，  ａｎｄ  Ｗａｎｇ，  Ｊ．  （２０１７）  Ｔｈｅ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ  Ｌｉｇａｓｅ  ＲＮＦ１２５  Ｔａｒｇｅｔｓ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＴＲＩＭ１４  ｆｏｒ  Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９８，  ４６５２−４６５８．
４０．Ｗａｎｇ，  Ｓ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｙ．，  Ｌｉ，  Ｃ．，  Ｗｕ，  Ｙ．，  Ｇｕｏ，  Ｌ．，  Ｐｅｎｇ，  Ｃ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｙ．，  Ｃｈｅｎｇ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｑｉｎ，  Ｆ．  Ｘ．  ＴＲＩＭ１４  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ＳＰＲＹ  ｄｏｍａｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ＮＳ５Ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ．
４１．Ｃａｒｔｈａｇｅｎａ，  Ｌ．，  Ｂｅｒｇａｍａｓｃｈｉ，  Ａ．，  Ｌｕｎａ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｄａｖｉｄ，  Ａ．，  Ｕｃｈｉｌ，  Ｐ．  Ｄ．，  Ｍａｒｇｏｔｔｉｎ−Ｇｏｇｕｅｔ，  Ｆ．，  Ｍｏｔｈｅｓ，  Ｗ．，  Ｈａｚａｎ，  Ｕ．，  Ｔｒａｎｓｙ，  Ｃ．，  Ｐａｎｃｉｎｏ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｎｉｓｏｌｅ，  Ｓ．  Ａ．  （２００９）  Ｈｕｍａｎ  ＴＲＩＭ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，  ｅ４８９４．
４２．Ｃａｍｐｏｓ−Ｇｏｍｅｚ，  Ｊ．，  Ａｈｍａｄ，  Ｆ．，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｓａｅｅｄ，  Ｍ．  Ｆ．  （２０１６）  Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｃｅｌｌ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓａｙ  ｔｏ  ｍｅａｓｕｒｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ  ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｎｓＰ２  ｐｒｏｔｅａｓｅ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４９６，  ７７−８９．
４３．Ｄ’Ｃｒｕｚ，  Ａ．  Ａ．，  Ｂａｂｏｎ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｎｏｒｔｏｎ，  Ｒ．  Ｓ．，  Ｎｉｃｏｌａ，  Ｎ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，  Ｓ．  Ｅ．  （２０１３）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＳＰＲＹ／Ｂ３０．２  ｄｏｍａｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ２２，  １−１０．
４４．Ｊａｍｅｓ，  Ｌ．  Ｃ．，  Ｋｅｅｂｌｅ，  Ａ．  Ｈ．，  Ｋｈａｎ，  Ｚ．，  Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｄ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ，  Ｊ．  （２００７）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ＰＲＹＳＰＲＹ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｍｏｔｉｆ  （ＴＲＩＭ）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４，  ６２００−６２０５．
４５．Ｏｚａｔｏ，  Ｋ．，  Ｓｈｉｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｔ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｍｏｒｓｅ，  Ｈ．  Ｃ．，  ＩＩＩ  （２００８）  ＴＲＩＭ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８，  ８４９−８６０．
４６．Ｖａｙｓｂｕｒｄ，  Ｍ．，  Ｗａｔｋｉｎｓｏｎ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｃｏｏｐｅｒ，  Ｈ．，  Ｒｅｅｄ，  Ｍ．，  Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，  Ｋ．，  Ｓｍｉｔｈ，  Ｊ．，  Ｃｒｕｉｃｋｓｈａｎｋｓ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｊａｍｅｓ，  Ｌ．  Ｃ．  （２０１３）  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＴＲＩＭ２１  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｆａｔａｌ  ｖｉｒａｌ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１０，  １２３９７−１２４０１．
４７．        Ｄｉ，  Ｐ．  Ａ．，  Ｋａｊａｓｔｅ−Ｒｕｄｎｉｔｓｋｉ，  Ａ．，  Ｏｔｅｉｚａ，  Ａ．，  Ｎｉｃｏｒａ，  Ｌ．，  Ｔｏｗｅｒｓ，  Ｇ．  Ｊ．，  Ｍｅｃｈｔｉ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｖｉｃｅｎｚｉ，  Ｅ．  （２０１３）  ＴＲＩＭ２２  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｖｉｒａｌ  ｎｕｃｌｅｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｏｒ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８７，  ４５２３−４５３３．
４８．Ｅｖｅｒｅｔｔ，  Ｒ．  Ｄ．  ａｎｄ  Ｃｈｅｌｂｉ−Ａｌｉｘ，  Ｍ．  Ｋ．  （２００７）  ＰＭＬ  ａｎｄ  ＰＭＬ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｂｏｄｉｅｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｄｅｆｅｎｃｅ，  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８９，  ８１９−８３０．
４９．Ｏｚａｔｏ，  Ｋ．，  Ｓｈｉｎ，  Ｄ．  Ｍ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｔ．  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｍｏｒｓｅ，  Ｈ．  Ｃ．，  ＩＩＩ  （２００８）  ＴＲＩＭ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８，  ８４９−８６０．
５０．Ｊａｍｅｓ，  Ｌ．  Ｃ．，  Ｋｅｅｂｌｅ，  Ａ．  Ｈ．，  Ｋｈａｎ，  Ｚ．，  Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｄ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ，  Ｊ．  （２００７）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ＰＲＹＳＰＲＹ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｍｏｔｉｆ  （ＴＲＩＭ）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０４，  ６２００−６２０５．
５１．Ｍａｌｉｍ，  Ｍ．  Ｈ．  ａｎｄ  Ｂｉｅｎｉａｓｚ，  Ｐ．  Ｄ．  （２０１２）  ＨＩＶ  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｅｖａｓｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｍｅｄ  ２，  ａ００６９４０．
５２．Ｎｉｓｏｌｅ，  Ｓ．，  Ｓｔｏｙｅ，  Ｊ．  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｓａｉｂ，  Ａ．  （２００５）  ＴＲＩＭ  ｆａｍｉｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｄｅｆｅｎｃｅ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ３，  ７９９−８０８．
５３．Ｃａｒｔｈａｇｅｎａ，  Ｌ．，  Ｂｅｒｇａｍａｓｃｈｉ，  Ａ．，  Ｌｕｎａ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｄａｖｉｄ，  Ａ．，  Ｕｃｈｉｌ，  Ｐ．  Ｄ．，  Ｍａｒｇｏｔｔｉｎ−Ｇｏｇｕｅｔ，  Ｆ．，  Ｍｏｔｈｅｓ，  Ｗ．，  Ｈａｚａｎ，  Ｕ．，  Ｔｒａｎｓｙ，  Ｃ．，  Ｐａｎｃｉｎｏ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｎｉｓｏｌｅ，  Ｓ．  （２００９）  Ｈｕｍａｎ  ＴＲＩＭ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ，  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ４，  ｅ４８９４．
５４．Ｂｈｏｊ，  Ｖ．  Ｇ．，  Ｓｕｎ，  Ｑ．，  Ｂｈｏｊ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｓｏｍｅｒｓ，  Ｃ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｘ．，  Ｔｏｒｒｅｓ，  Ｊ．  Ｐ．，  Ｍｅｊｉａｓ，  Ａ．，  Ｇｏｍｅｚ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｊａｆｒｉ，  Ｈ．，  Ｒａｍｉｌｏ，  Ｏ．，  ａｎｄ  Ｃｈｅｎ，  Ｚ．  Ｊ．  （２００８）  ＭＡＶＳ  ａｎｄ  ＭｙＤ８８  ａｒｅ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０５，  １４０４６−１４０５１．
５５．Ｍｉｂａｙａｓｈｉ，  Ｍ．，  Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｓｏｂｒｉｄｏ，  Ｌ．  Ｆ．，  Ｌｏｏ  ＹＭ  ＦＡＵ  −  Ｃａｒｄｅｎａｓ，  Ｗ．，  Ｃａｒｄｅｎａｓ  ＷＢ  ＦＡＵ  −  Ｇａｌｅ，  Ｍ．  Ｊ．，  Ｇａｌｅ，  Ｍ．，  Ｊｒ．，  ａｎｄ  Ｇａｒｃｉａ−Ｓａｓｔｒｅ，  Ａ．  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｅ  Ｉ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＮＳ１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｆ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  Ａ  ｖｉｒｕｓ．
５６．Ｋｕｎｄｕ，  Ｐ．，  Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ，  Ｓ．，  Ｔｓａｉ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｄａｓｇｕｐｔａ，  Ａ．  （２００５）  Ｓｈｕｔｏｆｆ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｓ  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＴＡＴＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｔ  ａｎ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ：  ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｓｈｕｔｏｆｆ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｖｉｒａｌ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７９，  ９７０２−９７１３．
５７．Ｄａｓ，  Ｓ．  ａｎｄ  Ｄａｓｇｕｐｔａ，  Ａ．  （１９９３）  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ａｎｄ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ３ＣＰｒｏ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ＴＡＴＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ＴＢＰ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ６７，  ３３２６−３３３１．
５８．Ｗｅｉｄｍａｎ，  Ｍ．  Ｋ．，  Ｓｈａｒｍａ，  Ｒ．，  Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ，  Ｓ．，  Ｋｕｎｄｕ，  Ｐ．，  Ｔｓａｉ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｄａｓｇｕｐｔａ，  Ａ．  （２００３）  Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ，  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  ９５，  ７５−８５．
５９．Ｋｕｙｕｍｃｕ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｎ．  Ｍ．，  Ｖａｎ  Ｅｄｅｎ，  Ｍ．  Ｅ．，  Ｙｏｕｎａｎ，  Ｐ．，  ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ，  Ｒ．  Ｅ．  （２００４）  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ：  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｈｏｓｔ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｓｈｕｔｏｆｆ，  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ２４，  １７７９−１７９０．
６０．Ｋｕｙｕｍｃｕ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ，  Ｎ．  Ｍ．，  Ｊｏａｃｈｉｍｓ，  Ｍ．，  ａｎｄ  Ｌｌｏｙｄ，  Ｒ．  Ｅ．  （２００２）  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｐｏｌｙ（Ａ）−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７６，  ２０６２−２０７４．
６１．ｄｅ，  Ｂ．  Ｓ．，  Ｂｏｎｄｅｒｏｆｆ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｃｈｕｍａｋｏｖ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｌｌｏｙｄ，  Ｒ．  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｈｅｌｌｅｎ，  Ｃ．  Ｕ．  （２００８）  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｅＩＦ５Ｂ  ｂｙ  ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３７８，  １１８−１２２．
６２．Ｌｉ，  Ｗ．，  Ｒｏｓｓ−Ｓｍｉｔｈ，  Ｎ．，  Ｐｒｏｕｄ，  Ｃ．  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｂｅｌｓｈａｍ，  Ｇ．  Ｊ．  （２００１）  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４ＡＩ  （ｅＩＦ４ＡＩ）  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｅＩＦ４ＡＩＩ  ｂｙ  ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ：  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅＩＦ４ＡＩ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ，  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５０７，  １−５．
６３．Ｆｏｅｇｅｒ，  Ｎ．，  Ｇｌａｓｅｒ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｎ，  Ｔ．  （２００２）  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４Ｇ  ｉｓｏｆｏｒｍｓ  ｂｙ  ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７，  ４４３００−４４３０９．
６４．Ｑｕ，  Ｌ．，  Ｆｅｎｇ，  Ｚ．，  Ｙａｍａｎｅ，  Ｄ．，  Ｌｉａｎｇ，  Ｙ．，  Ｌａｎｆｏｒｄ，  Ｒ．  Ｅ．，  Ｌｉ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｌｅｍｏｎ，  Ｓ．  Ｍ．  （２０１１）  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＬＲ３  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ＴＲＩＦ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ，  ３ＣＤ，  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．  ７，  ｅ１００２１６９．
６５．Ｂａｒｒａｌ，  Ｐ．  Ｍ．，  Ｓａｒｋａｒ，  Ｄ．，  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｐ．  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ，  Ｖ．  Ｒ．  （２００９）  ＲＩＧ−Ｉ  ｉｓ  ｃｌｅａｖｅｄ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３９１，  １７１−１７６．
６６．Ｂａｒｒａｌ，  Ｐ．  Ｍ．，  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，  Ｊ．  Ｍ．，  Ｄｒａｈｏｓ，  Ｊ．，  Ｇｕｐｔａ，  Ｐ．，  Ｓａｒｋａｒ，  Ｄ．，  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ｐ．  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｒａｃａｎｉｅｌｌｏ，  Ｖ．  Ｒ．  （２００７）  ＭＤＡ−５  ｉｓ  ｃｌｅａｖｅｄ  ｉｎ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８１，  ３６７７−３６８４．
６７．Ｙａｎｇ，  Ｙ．，  Ｌｉａｎｇ，  Ｙ．，  Ｑｕ，  Ｌ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｚ．，  Ｙｉ，  Ｍ．，  Ｌｉ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｌｅｍｏｎ，  Ｓ．  Ｍ．  （２００７）  Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １０４，  ７２５３−７２５８．
６８．Ｎｅｚｎａｎｏｖ，  Ｎ．，  Ｃｈｕｍａｋｏｖ，  Ｋ．  Ｍ．，  Ｎｅｚｎａｎｏｖａ，  Ｌ．，  Ａｌｍａｓａｎ，  Ａ．，  Ｂａｎｅｒｊｅｅ，  Ａ．  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｇｕｄｋｏｖ，  Ａ．  Ｖ．  （２００５）  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐ６５−ＲｅｌＡ  ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ＮＦ−ｋａｐｐａＢ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０，  ２４１５３−２４１５８．
６９．Ｗａｎｇ，  Ｄ．，  Ｆａｎｇ，  Ｌ．，  Ｌｉ，  Ｋ．，  Ｚｈｏｎｇ，  Ｈ．，  Ｆａｎ，  Ｊ．，  Ｏｕｙａｎｇ，  Ｃ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｈ．，  Ｄｕａｎ，  Ｅ．，  Ｌｕｏ，  Ｒ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｚ．，  Ｌｉｕ，  Ｘ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｈ．，  ａｎｄ  Ｘｉａｏ，  Ｓ．  （２０１２）  Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃｌｅａｖｅｓ  ＮＥＭＯ  ｔｏ  ｉｍｐａｉｒ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８６，  ９３１１−９３２２．
７０．Ｗａｎｇ，  Ｄ．，  Ｆａｎｇ，  Ｌ．，  Ｗｅｉ，  Ｄ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｈ．，  Ｌｕｏ，  Ｒ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｈ．，  Ｌｉ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｘｉａｏ，  Ｓ．  （２０１４）  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃｌｅａｖｅｓ  ＮＥＭＯ  ｔｏ  ｉｍｐａｉｒ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｅｔａ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８８，  １０２５２−１０２５８．
７１．Ｌｉｎ，  Ｒ．，  Ｌａｃｏｓｔｅ，  Ｊ．，  Ｎａｋｈａｅｉ，  Ｐ．，  Ｓｕｎ，  Ｑ．，  Ｙａｎｇ，  Ｌ．，  Ｐａｚ，  Ｓ．，  Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ，  Ｐ．，  Ｊｕｌｋｕｎｅｎ，  Ｉ．，  Ｖｉｔｏｕｒ，  Ｄ．，  Ｍｅｕｒｓ，  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｈｉｓｃｏｔｔ，  Ｊ．  （２００６）  Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＭＡＶＳ／ＩＰＳ−１／ＶＩＳＡ／Ｃａｒｄｉｆ−ＩＫＫｅｐｓｉｌｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｏｕｔｅｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｙ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＮＳ３−４Ａ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ８０，  ６０７２−６０８３．
７２．Ｈｉｓｃｏｔｔ，  Ｊ．，  Ｌａｃｏｓｔｅ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｌｉｎ，  Ｒ．  （２００６）  Ｒｅｃｒｕｉｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ：  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ  ＮＳ３−４Ａ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ７２，  １４７７−１４８４．
７３．Ｂｅｌｌｅｃａｖｅ，  Ｐ．，  Ｓａｒａｓｉｎ−Ｆｉｌｉｐｏｗｉｃｚ，  Ｍ．，  Ｄｏｎｚｅ，  Ｏ．，  Ｋｅｎｎｅｌ，  Ａ．，  Ｇｏｕｔｔｅｎｏｉｒｅ，  Ｊ．，  Ｍｅｙｌａｎ，  Ｅ．，  Ｔｅｒｒａｃｃｉａｎｏ，  Ｌ．，  Ｔｓｃｈｏｐｐ，  Ｊ．，  Ｓａｒｒａｚｉｎ，  Ｃ．，  Ｂｅｒｇ，  Ｔ．，  Ｍｏｒａｄｐｏｕｒ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｈｅｉｍ，  Ｍ．  Ｈ．  （２０１０）  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ５１，  １１２７−１１３６．
７４．Ｍｅｙｌａｎ，  Ｅ．，  Ｃｕｒｒａｎ，  Ｊ．，  Ｈｏｆｍａｎｎ，  Ｋ．，  Ｍｏｒａｄｐｏｕｒ，  Ｄ．，  Ｂｉｎｄｅｒ，  Ｍ．，  Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｔｓｃｈｏｐｐ，  Ｊ．  （２００５）  Ｃａｒｄｉｆ  ｉｓ  ａｎ  ａｄａｐｔｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＲＩＧ−Ｉ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ｐａｔｈｗａｙ  ａｎｄ  ｉｓ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｂｙ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｃ  ｖｉｒｕｓ，  Ｎａｔｕｒｅ  ４３７，  １１６７−１１７２．
７５．Ｙｕ，  Ｃ．  Ｙ．，  Ｃｈａｎｇ，  Ｔ．  Ｈ．，  Ｌｉａｎｇ，  Ｊ．  Ｊ．，  Ｃｈｉａｎｇ，  Ｒ．  Ｌ．，  Ｌｅｅ，  Ｙ．  Ｌ．，  Ｌｉａｏ，  Ｃ．  Ｌ．，  ａｎｄ  Ｌｉｎ，  Ｙ．  Ｌ．  （２０１２）  Ｄｅｎｇｕｅ  Ｖｉｒｕｓ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ｔｈｅ  Ａｄａｐｔｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＭＩＴＡ  ｔｏ  Ｓｕｂｖｅｒｔ  Ｈｏｓｔ  Ｉｎｎａｔｅ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ８，  ｅ１００２７８０．
７６．Ａｇｕｉｒｒｅ，  Ｓ．，  Ｍａｅｓｔｒｅ，  Ａ．  Ｍ．，  Ｐａｇｎｉ，  Ｓ．，  Ｐａｔｅｌ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｓａｖａｇｅ，  Ｔ．，  Ｇｕｔｍａｎ，  Ｄ．，  Ｍａｒｉｎｇｅｒ，  Ｋ．，  Ｂｅｒｎａｌ−Ｒｕｂｉｏ，  Ｄ．，  Ｓｈａｂｍａｎ，  Ｒ．  Ｓ．，  Ｓｉｍｏｎ，  Ｖ．，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｍａｄｏｚ，  Ｊ．  Ｒ．，  Ｍｕｌｄｅｒ，  Ｌ．  Ｃ．  Ｆ．，  Ｂａｒｂｅｒ，  Ｇ．  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｓｅｓｍａ，  Ａ．  （２０１２）  ＤＥＮＶ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  ＩＦＮ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  Ｃｌｅａｖｉｎｇ  Ｈｕｍａｎ  ＳＴＩＮＧ，  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ  ８，  ｅ１００２９３４．
７７．Ｌｉ，  Ｊ．，  Ｌｉｍ  ＳＰ  ＦＡＵ  −  Ｂｅｅｒ，  Ｄ．，  Ｂｅｅｒ，  Ｄ．  Ｆ．，  Ｐａｔｅｌ，  Ｖ．  Ｆ．，  Ｗｅｎ，  Ｄ．  Ｆ．，  Ｔｕｍａｎｕｔ，  Ｃ．  Ｆ．，  Ｔｕｌｌｙ  ＤＣ  ＦＡＵ  −  Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｊ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＪＡ  ＦＡＵ  −  Ｊｉｒｉｃｅｋ，  Ｊ．，  Ｊｉｒｉｃｅｋ，  Ｊ．  Ｆ．，  Ｐｒｉｅｓｔｌｅ  ＪＰ  ＦＡＵ  −  Ｈａｒｒｉｓ，  Ｊ．，  Ｈａｒｒｉｓ  ＪＬ  ＦＡＵ  −  Ｖａｓｕｄｅｖａｎ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｖａｓｕｄｅｖａｎ，  Ｓ．  Ｇ．  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＮＳ３  ｐｒｏｔｅａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｌｌ  ｆｏｕｒ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｏｃｔａｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ．
７８．Ｂｌｏｍ，  Ｎ．，  Ｈａｎｓｅｎ，  Ｊ．，  Ｂｌａａｓ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｂｒｕｎａｋ，  Ｓ．  （１９９６）  Ｃｌｅａｖａｇｅ  ｓｉｔｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒａｌ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎｓ：  ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｂｙ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ５，  ２２０３−２２１６．
７９．Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，  Ａ．，  Ｍｏｒｏｓｋｙ，  Ｓ．  Ａ．，  ｏｒｍｅ−Ａｘｆｏｒｄ，  Ｅ．，  Ｄｙｂｄａｈｌ−Ｓｉｓｓｏｋｏ，  Ｎ．，  Ｏｂｅｒｓｔｅ，  Ｍ．  Ｓ．，  Ｗａｎｇ，  Ｔ．，  ａｎｄ  Ｃｏｙｎｅ，  Ｃ．  Ｂ．  （２０１１）  Ｔｈｅ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅｖｉｒｕｓ  Ｂ  ３Ｃ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｃｌｅａｖｅｓ  ＭＡＶＳ  ａｎｄ  ＴＲＩＦ  ｔｏ  ａｔｔｅｎｕａｔｅ  ｈｏｓｔ  ｔｙｐｅ  Ｉ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，  ＰＬｏＳ  Ｐａｔｈｏｇ．  ７，  ｅ１００１３１１．
８０．Ｂａｄｏｒｆｆ，  Ｃ．，  Ｂｅｒｋｅｌｙ，  Ｎ．，  Ｍｅｈｒｏｔｒａ，  Ｓ．，  Ｔａｌｈｏｕｋ，  Ｊ．  Ｗ．，  Ｒｈｏａｄｓ，  Ｒ．  Ｅ．，  ａｎｄ  Ｋｎｏｗｌｔｏｎ，  Ｋ．  Ｕ．  （２０００）  Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒａｌ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ２Ａ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ  ａｎｄ  ｉｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ，  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５，  １１１９１−１１１９７．
８１．Ｗｅｉｄｍａｎ，  Ｍ．  Ｋ．，  Ｓｈａｒｍａ，  Ｒ．，  Ｒａｙｃｈａｕｄｈｕｒｉ，  Ｓ．，  Ｋｕｎｄｕ，  Ｐ．，  Ｔｓａｉ，  Ｗ．，  ａｎｄ  Ｄａｓｇｕｐｔａ，  Ａ．  （２００３）  Ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅｕｓ，  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．  ９５，  ７５−８５．
８２．Ｆａｌｋ，  Ｍ．  Ｍ．，  Ｇｒｉｇｅｒａ，  Ｐ．  Ｒ．，  Ｂｅｒｇｍａｎｎ，  Ｉ．  Ｅ．，  Ｚｉｂｅｒｔ，  Ａ．，  Ｍｕｌｔｈａｕｐ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｂｅｃｋ，  Ｅ．  （１９９０）  Ｆｏｏｔ−ａｎｄ−ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ３Ｃ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｈｉｓｔｏｎｅ  Ｈ３，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６４，  ７４８−７５６．
８３．Ｙａｌａｍａｎｃｈｉｌｉ，  Ｐ．，  Ｂａｎｅｒｊｅｅ，  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｄａｓｇｕｐｔａ，  Ａ．  （１９９７）  Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ−ｅｎｃｏｄｅｄ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ２ＡＰｒｏ  ｃｌｅａｖｅｓ  ｔｈｅ  ＴＡＴＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｕｔ  ｄｏｅｓ  ｎｏｔ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７１，  ６８８１−６８８６．
８４．Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，  Ｍ．  Ｉ．，  Ｚｈｏｕ，  Ｍ．，  Ｍｉｌｌａｒｄ，  Ｃ．  Ｓ．，  Ｃｌａｎｃｙ，  Ｓ．，  Ｓｔｏｌｓ，  Ｌ．，  Ｅｓｃｈｅｎｆｅｌｄｔ，  Ｗ．  Ｈ．，  Ｃｏｌｌａｒｔ，  Ｆ．  Ｒ．，  ａｎｄ  Ｊｏａｃｈｉｍｉａｋ，  Ａ．  （２００６）  Ａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔａｉｌｏｒｅｄ  ｆｏｒ  ｌａｒｇｅ−ｓｃａｌｅ，  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．  Ｐｕｒｉｆ．  ４７，  ４４６−４５４．
８５．Ｌｅｇｌｅｒ，  Ｐ．  Ｍ．，  Ｃａｉ，  Ｍ．，  Ｐｅｔｅｒｋｏｆｓｋｙ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｃｌｏｒｅ，  Ｇ．  Ｍ．  （２００４）  Ｔｈｒｅｅ−ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｂ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍａｎｎｉｔｏｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  ＩＩｍａｎｎｉｔｏｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ｓｙｓｔｅｍ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７９，  ３９１１５−３９１２１．
８６．Ｃｈｅｕｎｇ，  Ｊ．，  Ｆｒａｎｋｌｉｎ，  Ｍ．，  Ｍａｎｃｉａ，  Ｆ．，  Ｒｕｄｏｌｐｈ，  Ｍ．，  Ｃａｓｓｉｄｙ，  Ｍ．，  Ｇａｒｙ，  Ｅ．，  Ｂｕｒｓｈｔｅｙｎ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｌｏｖｅ，  Ｊ．  （２０１１）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ  ｖｉｒｕｓ  ｎｓＰ２  ｐｒｏｔｅａｓｅ．
８７．Ｄｏｎｇ，  Ｍ．，  Ｔｅｐｐ，  Ｗ．  Ｈ．，  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｅ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｃｈａｐｍａｎ，  Ｅ．  Ｒ．  （２００４）  Ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｅｎｓｏｒｓ  ｔｏ  ｄｅｔｅｃｔ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ  １０１，  １４７０１−１４７０６．
８８．Ｒｕｇｅ，  Ｄ．  Ｒ．，  Ｄｕｎｎｉｎｇ，  Ｆ．  Ｍ．，  Ｐｉａｚｚａ，  Ｔ．  Ｍ．，  Ｍｏｌｌｅｓ，  Ｂ．  Ｅ．，  Ａｄｌｅｒ，  Ｍ．，  Ｚｅｙｔｉｎ，  Ｆ．  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｔｕｃｋｅｒ，  Ｗ．  Ｃ．  （２０１１）  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｘ  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ  ｎｅｕｒｏｔｏｘｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｅｒｓ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ４１１，  ２００−２０９．
８９．Ｍｏｒｒｉｓ，  Ｇ．  Ｍ．，  Ｈｕｅｙ，  Ｒ．，  Ｌｉｎｄｓｔｒｏｍ，  Ｗ．，  Ｓａｎｎｅｒ，  Ｍ．  Ｆ．，  Ｂｅｌｅｗ，  Ｒ．  Ｋ．，  Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，  Ｄ．  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｏｌｓｏｎ，  Ａ．  Ｊ．  （２００９）  ＡｕｔｏＤｏｃｋ４  ａｎｄ  ＡｕｔｏＤｏｃｋＴｏｏｌｓ４：  Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｄｏｃｋｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ，  Ｊ  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｃｈｅｍ．  ３０，  ２７８５−２７９１．
９０．Ｓｈｉｎ，  Ｇ．，  Ｙｏｓｔ，  Ｓ．  Ａ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｍ．  Ｔ．，  Ｅｌｒｏｄ，  Ｅ．  Ｊ．，  Ｇｒａｋｏｕｉ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｍａｒｃｏｔｒｉｇｉａｎｏ，  Ｊ．  （２０１２）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｉｎｔｏ  ａｌｐｈａｖｉｒｕｓ  ｐｏｌｙｐｒｏｔｅｉｎ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．  Ｓ．  Ａ  １０９，  １６５３４−１６５３９．
９１．Ｊａｍｅｓ，  Ｌ．  Ｃ．，  Ｋｅｅｂｌｅ，  Ａ．  Ｈ．，  Ｋｈａｎ，  Ｚ．，  Ｒｈｏｄｅｓ，  Ｄ．  Ａ．，  ａｎｄ  Ｔｒｏｗｓｄａｌｅ，  Ｊ．  （２００７）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ＰＲＹＳＰＲＹ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  ｍｏｔｉｆ  （ＴＲＩＭ）  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １０４，  ６２００−６２０５．
９２．（２０１７）  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｎｄ  Ｃａｓ９．
９３．Ｈａｒｔｉｇ，  Ｊ．  Ｓ．  （２０１７）  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．
【図１Ａ】
2020502496.tif 000005
【図１Ｂ】
2020502496.tif 000006
【図１Ｃ】
2020502496.tif 000007
【図２Ａ】
2020502496.tif 000008
【図２Ｂ】
2020502496.tif 000009
【図２Ｃ】
2020502496.tif 000010
【図３Ａ】
2020502496.tif 000011
【図３Ｂ】
2020502496.tif 000012
【図４Ａ】
2020502496.tif 000013
【図４Ｂ】
2020502496.tif 000014
【図４Ｃ】
2020502496.tif 000015
【図４Ｄ】
2020502496.tif 000016
【図４Ｅ】
2020502496.tif 000017
【図５】
2020502496.tif 000018
【図６】
2020502496.tif 000019
【図７】
2020502496.tif 000020
【図８】
2020502496.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】令和1年7月19日(2019.7.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2020502496000001.app
【国際調査報告】
2020502496.tif 000022
2020502496.tif 000023
2020502496.tif 000024