(57)【要約】  抗原性受容体、例えば、キメラ抗原受容体およびＴ細胞受容体を発現する免疫細胞が、本明細書で提供される。さらに、抗原特異的免疫細胞を投与することによって免疫関連障害を治療する方法が本明細書で提供される。2020517259.tif 000012
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−１５（ｈＩＬ−１５）および少なくとも２個の抗原受容体を発現するように操作された免疫細胞であって、前記少なくとも２個の抗原受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、免疫細胞。
【請求項２】
前記免疫細胞が、ｈＩＬ−１５、ＣＡＲおよびＴＣＲを発現するように操作されている、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項３】
前記免疫細胞が、ｈＩＬ−１５および２個のＣＡＲを発現するように操作されている、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項４】
前記免疫細胞が、ｈＩＬ−１５および２個のＴＣＲを発現するように操作されている、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項５】
前記免疫細胞が、３個、４個または５個の抗原受容体を発現するように操作されている、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項６】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞、末梢血リンパ球、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞または幹細胞としてさらに定義される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項７】
前記免疫細胞がＴ細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項８】
前記免疫細胞がＮＫ細胞である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項９】
前記幹細胞が、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である、請求項６に記載の免疫細胞。
【請求項１０】
前記免疫細胞が、ｉＰＳ細胞に由来する、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項１１】
前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはガンマデルタＴ細胞である、請求項７に記載の免疫細胞。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である、請求項７に記載の免疫細胞。
【請求項１３】
前記免疫細胞が、同種異系である、請求項６に記載の免疫細胞。
【請求項１４】
前記免疫細胞が、自己由来である、請求項６に記載の免疫細胞。
【請求項１５】
前記免疫細胞が、１つ以上のさらなるサイトカインを発現するように操作されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１６】
前記１つ以上のさらなるサイトカインが、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２である、請求項１５に記載の免疫細胞。
【請求項１７】
前記免疫細胞が、グルココルチコイド受容体、ＴＧＦβ受容体および／またはＣＩＳＨの発現を本質的に有さないように操作されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項１８】
前記免疫細胞が、１つ以上のガイドＲＮＡおよびＣａｓ９酵素を用いて操作されている、請求項１７に記載の免疫細胞。
【請求項１９】
前記１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号１〜２を含む、請求項１８に記載の免疫細胞。
【請求項２０】
前記１つ以上のガイドＲＮＡが、配列番号３〜４を含む、請求項１８に記載の免疫細胞。
【請求項２１】
前記ＴＧＦβ受容体が、ＴＧＦβ−ＲＩＩとしてさらに定義される、請求項１７に記載の免疫細胞。
【請求項２２】
前記免疫細胞が、末梢血、臍帯血または骨髄から単離される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項２３】
前記免疫細胞が、臍帯血から単離される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項２４】
前記臍帯血が、２人以上の個人の臍帯血単位からプールされる、請求項２３に記載の免疫細胞。
【請求項２５】
前記免疫細胞が、自殺遺伝子をさらに発現する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項２６】
前記自殺遺伝子は、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３または誘導性カスパーゼ９である、請求項２５に記載の免疫細胞。
【請求項２７】
前記自殺遺伝子が、誘導性カスパーゼ９である、請求項２５に記載の免疫細胞。
【請求項２８】
少なくとも２個の抗原受容体をコードするＤＮＡが、前記細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項２９】
前記ＣＡＲおよび／またはＴＣＲをコードするＤＮＡが、前記細胞のゲノムに組み込まれる、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項３０】
前記少なくとも２個の抗原受容体が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖからなる群から選択される抗原結合領域を含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項３１】
前記少なくとも２個の抗原受容体の抗原結合領域が、１つ以上の腫瘍関連抗原に結合する、請求項３０に記載の免疫細胞。
【請求項３２】
前記腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３１９／ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮性腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１外被糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１外被糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒα、κ鎖、λ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＷＴ−１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４および／またはＶＥＧＦＲ２である、請求項３１に記載の免疫細胞。
【請求項３３】
第１の抗原受容体の抗原結合領域は、第２の抗原受容体の抗原結合領域とは異なる、請求項３０に記載の免疫細胞。
【請求項３４】
前記第１の抗原受容体の抗原結合領域は、第１の抗原に結合し、前記第２の抗原受容体の抗原結合領域は、第２の抗原に結合する、請求項３２に記載の免疫細胞。
【請求項３５】
前記第１の抗原がＥＧＦＲｖＩＩＩであり、前記第２の抗原がＮＹ−ＥＳＯである、請求項３４に記載の免疫細胞。
【請求項３６】
前記第１の抗原がＨＥＲ２／Ｎｅｕであり、前記第２の抗原がＭＵＣ−１である、請求項３４に記載の免疫細胞。
【請求項３７】
前記第１の抗原がＣＡ−１２５であり、前記第２の抗原がＭＵＣ−１である、請求項３４に記載の免疫細胞。
【請求項３８】
前記第１の抗原がＣＡ−１２５であり、前記第２の抗原がＷＴ−１である、請求項３４に記載の免疫細胞。
【請求項３９】
前記第１の抗原がＥＧＦＲｖＩＩＩであり、前記第２の抗原が、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４またはＭａｇｅ−Ａ１０である、請求項３４に記載の免疫細胞。
【請求項４０】
前記第１の抗原がＥＧＦＲｖＩＩＩであり、前記第２の抗原がＴＲＡＩＬ／ＤＲ４である、請求項３４に記載の免疫細胞。
【請求項４１】
前記第１の抗原がＣＥＡ−ＣＡＲであり、前記第２の抗原が、Ｍａｇｅ−Ａ３−ＴＣＲ、Ｍａｇｅ−Ａ４−ＴＣＲまたはＭａｇｅ−Ａ１０である、請求項３４に記載の免疫細胞。
【請求項４２】
前記第１の抗原が、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＣＥＡ−ＣＡＲおよび／またはＣＡ−１２５、ＥＧＦＲｖＩＩＩであり、前記第２の抗原が、ＭＵＣ−１、ＷＴ−１、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４Ｍａｇｅ−Ａ３−ＴＣＲ、Ｍａｇｅ−Ａ４−ＴＣＲおよび／またはＭａｇｅ−Ａ１０である、請求項３４に記載の免疫細胞。
【請求項４３】
前記少なくとも２個の抗原受容体が、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の免疫細胞。
【請求項４４】
前記１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインが、Ｔリンパ球活性化ドメインである、請求項４２に記載の免疫細胞。
【請求項４５】
前記１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ξ、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１２、ＣＤ７０、ＣＤ４０、またはこれらの組み合わせを含む、請求項４２に記載の免疫細胞。
【請求項４６】
前記１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ξ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ−Ｌおよび／またはＤＡＰ１２を含む、請求項４２に記載の免疫細胞。
【請求項４７】
前記少なくとも２個の抗原受容体が、１つ以上の膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の免疫細胞。
【請求項４８】
前記１つ以上の膜貫通ドメインが、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ、Ｆｃ領域、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ３ξ膜貫通ドメイン、システイン変異ヒトＣＤ３ξドメイン、ＣＤ１６膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメインおよび／またはエリスロポエチン受容体膜貫通ドメインを含む、請求項４７に記載の免疫細胞。
【請求項４９】
請求項１〜４８のいずれか一項に記載の免疫細胞の有効量を含む医薬組成物。
【請求項５０】
対象における免疫関連障害の治療のための、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の免疫細胞の免疫細胞の有効量を含む組成物。
【請求項５１】
対象における免疫関連障害の治療のための、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の免疫細胞の免疫細胞の有効量を含む組成物の使用。
【請求項５２】
請求項１〜４８のいずれか一項に記載の免疫細胞の有効量を対象に投与することを含む、前記対象において免疫関連障害を治療する方法。
【請求項５３】
前記免疫関連障害が、癌、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植拒絶または炎症状態である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記免疫関連障害が炎症状態であり、前記免疫細胞は、グルココルチコイド受容体の発現を本質的に有さない、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記対象が、ステロイド治療を施されていたか、または施されている、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記免疫細胞が、自己由来である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記免疫細胞が、同種異系である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記免疫関連障害が癌である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記癌が、固形癌または血液悪性腫瘍である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記癌が、卵巣癌であり、前記免疫細胞が、ＭＵＣ−１、ＣＡ−１２５および／またはＷＴ−１に対する抗原特異性を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記癌が、肺癌であり、前記免疫細胞が、ＮＹ−ＥＳＯ、ＥＧＦＲ−ｖＩＩＩ、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４、Ｍａｇｅ−Ａ１０および／またはＴＲＡＩＬ／ＤＲ４に対する抗原特異性を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６２】
前記癌が、膵臓癌または結腸癌であり、前記免疫細胞が、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４、Ｍａｇｅ−Ａ１０および／またはＣＥＡに対する抗原特異性を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６３】
前記癌が乳癌であり、前記免疫細胞が、ＭＵＣ−１およびＨＥＲ２／Ｎｅｕに対する抗原特異性を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６４】
前記癌が膠芽腫であり、前記免疫細胞が、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４、Ｍａｇｅ−Ａ１０ｖおよび／またはＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗原特異性を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６５】
前記癌が肉腫であり、前記免疫細胞が、ＮＹ−ＥＳＯおよびＥＧＦＲ−ｖＩＩＩに対する抗原特異性を有する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６６】
少なくとも第２の治療剤を投与することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６７】
前記少なくとも第２の治療剤は、化学療法、免疫療法、外科手術、放射線療法または生物学的療法を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記免疫細胞および／もしくは前記少なくとも第２の治療剤は、静脈内、腹腔内、気管内、腫瘍内、筋肉内、内視鏡的、病変内、経皮的、皮下的、局所的に投与されるか、または直接的な注射もしくは灌流によって投与される、請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年４月１９日に出願された米国仮出願番号第６２／４８７，２４８号の優先権の利益を請求し、両出願の内容全体が、本明細書に参考として組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
２ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓで測定した場合）であり、２０１８年４月１８日に作成された「ＵＴＦＣＰ１３２１ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」の名称のファイルに含まれる配列表は、電子提出によって本明細書と共に出願され、本明細書に参考として組み込まれる。
【０００３】
１．分野
本発明は、一般的に、免疫学および医学の分野に関する。より特定的には、本発明は、同じ細胞型において、抗原性受容体、例えば、キメラ抗原受容体およびＴ細胞受容体を発現する免疫細胞に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．関連技術の説明
癌と診断された患者が利用可能な診断および治療の選択肢における技術的進歩にもかかわらず、予後は依然として良くないことが多く、多くの患者は、治癒が不可能である。免疫療法は、種々の腫瘍と診断された患者に対する、正常組織に損傷を引き起こすことなく悪性腫瘍細胞を根絶する可能性を用いた、強力ではあるが、まだ標的化されていない治療を与える将来性を保持している。理論的に、免疫系のＴ細胞は、腫瘍細胞に特異的なタンパク質パターンを認識することができ、種々のエフェクター機能によるタンパク質パターンの破壊に介在する。養子Ｔ細胞療法は、患者自身のＴ細胞が腫瘍を根絶する能力を利用し、増幅させ、次いで、健康な組織に損傷を与えることなく、残った腫瘍を効果的になくすような状態で、これらのエフェクターを患者に戻す試みである。この手法は、腫瘍免疫学の分野で新しいものではないが、養子Ｔ細胞療法の臨床的使用における多くの欠点が、癌治療におけるこの手法の完全な使用を妨げている。
【０００５】
自己由来細胞またはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合する同種異系ドナー細胞を用いた細胞療法は、癌を含む多くの種類の疾患および再生医療のための有望な治療である。多くのグループが、高アフィニティ人工ＴＣＲを発現するようにＴ細胞を操作することによって、Ｔ細胞の抗原特異性を変える戦略を研究してきた。しかし、Ｔ細胞へのさらなるＴＣＲ鎖の導入は、内因性ＴＣＲ鎖と導入されたＴＣＲ鎖との間の混合ダイマーの生成を引き起こすことがあり、未知の特異性および毒性を有するＴ細胞の生成を引き起こす可能性がある。これにより、この戦略の臨床への変換は顕著に制限されてきた。したがって、特異性が向上し、腫瘍を二重標的化する養子細胞治療のために免疫細胞を操作する改良方法を開発することが必要とされている。
【発明の概要】
【０００６】
第１の実施形態では、本開示は、ヒトＩＬ−１５（ｈＩＬ−１５）および少なくとも２個の抗原受容体を発現するように操作された免疫細胞であって、少なくとも２個の抗原受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、免疫細胞を提供する。一実施形態では、ＣＡＲ、ＴＣＲおよびｈＩＬ−１５を発現するように操作された免疫細胞が提供される。別の実施形態では、ｈＩＬ−１５および２つのＣＡＲを発現するように操作された免疫細胞が提供される。さらに別の実施形態では、ｈＩＬ−１５および２つのＴＣＲを発現するように操作された免疫細胞が提供される。さらなる実施形態では、３個、４個、５個またはそれ以上の抗原受容体を発現するように操作された免疫細胞が提供される。いくつかの態様では、免疫細胞は、同種異系である。特定の態様では、免疫細胞は、自己由来である。
【０００７】
いくつかの態様では、免疫細胞は、Ｔ細胞、末梢血リンパ球、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞または幹細胞としてさらに定義される。特定の態様では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞である。いくつかの態様では、免疫細胞は、ｉＰＳ細胞に由来する。特定の態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはガンマデルタＴ細胞である。ある具体的な態様では、Ｔ細胞は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）である。特定の態様では、免疫細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。
【０００８】
特定の態様では、免疫細胞が、１つ以上のさらなるサイトカインを発現するように操作されている。特定の態様では、１つ以上のさらなるサイトカインは、ＩＬ−２１および／またはＩＬ−２である。
【０００９】
さらなる態様では、免疫細胞が、グルココルチコイド受容体、ＴＧＦβ受容体および／またはＣＩＳＨの発現を本質的に有さないように操作されている。いくつかの態様では、前記免疫細胞は、１つ以上のガイドＲＮＡおよびＣａｓ９酵素を用いて操作されている。具体的な態様では、１つ以上のガイドＲＮＡは、例えばサイレンスＧＲに対する、配列番号１〜２を含む。特定の態様では、１つ以上のガイドＲＮＡは、例えばＴＧＦβに対する、配列番号３〜４を含む。いくつかの態様では、１つ以上のガイドＲＮＡは、例えば、ＧＲおよびＴＧＦβを標的とするために、配列番号１〜４を含む。特定の態様では、ＴＧＦβ受容体は、ＴＧＦβ−ＲＩＩとしてさらに定義される。
【００１０】
いくつかの態様では、免疫細胞は、末梢血、臍帯血または骨髄から単離される。特定の態様では、免疫細胞は、臍帯血から単離され、例えば、２人以上の個人の臍帯血単位からプールされた臍帯血から単離される。
【００１１】
さらなる態様では、免疫細胞は、自殺遺伝子をさらに発現する。特定の態様では、自殺遺伝子は、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３または誘導性カスパーゼ９である。特定の態様では、自殺遺伝子は、誘導性カスパーゼ９である。
【００１２】
いくつかの態様では、少なくとも２個の抗原受容体（例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ）は、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖからなる群から選択される抗原結合領域を含む。特定の態様では、少なくとも２個の抗原受容体（例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ）の抗原結合領域は、１つ以上の腫瘍関連抗原に結合する。具体的な態様では、腫瘍関連抗原は、ＣＤ１９、ＣＤ３１９／ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、上皮性腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓ、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＥＲＢＢ２、葉酸結合タンパク質、ＨＩＶ−１外被糖タンパク質ｇｐ１２０、ＨＩＶ−１外被糖タンパク質ｇｐ４１、ＧＤ２、ＣＤ１２３、ＣＤ２３、ＣＤ３０、ＣＤ５６、ｃ−Ｍｅｔ、メソテリン、ＧＤ３、ＨＥＲＶ−Ｋ、ＩＬ−１１Ｒα、κ鎖、λ鎖、ＣＳＰＧ４、ＥＲＢＢ２、ＷＴ−１、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４および／またはＶＥＧＦＲ２である。特定の態様では、第１の抗原受容体（例えばＣＡＲ）の抗原結合領域は、第２の抗原受容体（例えばＴＣＲ）の抗原結合領域とは異なる。いくつかの態様では、第１の抗原受容体（例えばＣＡＲ）の抗原結合領域は、第１の抗原に結合し、第２の抗原受容体（例えばＴＣＲ）の抗原結合領域は、第２の抗原に結合する。具体的な態様では、第１の抗原はＥＧＦＲｖＩＩＩであり、第２の抗原はＮＹ−ＥＳＯである。他の態様では、第１の抗原はＨＥＲ２／Ｎｅｕであり、第２の抗原はＭＵＣ−１である。いくつかの態様では、第１の抗原はＣＡ−１２５であり、第２の抗原はＭＵＣ−１である。特定の態様では、第１の抗原はＣＡ−１２５であり、第２の抗原はＷＴ−１である。いくつかの態様では、第１の抗原はＥＧＦＲｖＩＩＩであり、第２の抗原は、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４またはＭａｇｅ−Ａ１０である。特定の態様では、第１の抗原はＥＧＦＲｖＩＩＩであり、第２の抗原はＴＲＡＩＬ／ＤＲ４である。特定の態様では、第１の抗原がＣＥＡ−ＣＡＲであり、第２の抗原が、Ｍａｇｅ−Ａ３−ＴＣＲ、Ｍａｇｅ−Ａ４−ＴＣＲまたはＭａｇｅ−Ａ１０である。いくつかの態様では、第１の抗原は、ＨＥＲ２／Ｎｅｕ、ＣＥＡ−ＣＡＲおよび／またはＣＡ−１２５、ＥＧＦＲｖＩＩＩであり、第２の抗原は、ＭＵＣ−１、ＷＴ−１、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４Ｍａｇｅ−Ａ３−ＴＣＲ、Ｍａｇｅ−Ａ４−ＴＣＲおよび／またはＭａｇｅ−Ａ１０である。
【００１３】
いくつかの態様では、少なくとも２個の抗原受容体（例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ）は、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の態様では、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｔリンパ球活性化ドメインである。いくつかの態様では、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ξ、ＣＤ２８、ＯＸ４０／ＣＤ１３４、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＦｃεＲＩγ、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＩＬＲＢ／ＣＤ１２２、ＩＬ−２ＲＧ／ＣＤ１３２、ＤＡＰ１２、ＣＤ７０、ＣＤ４０、またはこれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ξ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ−Ｌおよび／またはＤＡＰ１２を含む。具体的な態様では、少なくとも２個の抗原受容体（例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ）は、１つ以上の膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様では、１つ以上の膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＩｇＧ４Ｆｃヒンジ、Ｆｃ領域、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ３ξ膜貫通ドメイン、システイン変異ヒトＣＤ３ξドメイン、ＣＤ１６膜貫通ドメイン、ＣＤ８膜貫通ドメインおよび／またはエリスロポエチン受容体膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様では、少なくとも２個の抗原受容体（例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ）をコードするＤＮＡは、細胞のゲノムに組み込まれる。
【００１４】
さらなる実施形態は、実施形態の免疫細胞（例えば、少なくとも２個の抗原受容体、例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲを発現する）の有効量を含む医薬組成物を提供する。別の実施形態では、対象において免疫関連障害を治療するための実施形態の免疫細胞の免疫細胞（例えば、少なくとも２個の抗原受容体、例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲを発現する）の有効量を含む組成物が提供される。別の実施形態では、実施形態の免疫細胞（例えば、少なくとも２個の抗原受容体、例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲを発現する）の有効量を、対象に投与することを含む、この対象において免疫関連障害を治療する方法が提供される。
【００１５】
いくつかの態様では、免疫関連障害は、癌、自己免疫障害、移植片対宿主病、同種移植拒絶または炎症状態である。特定の態様では、免疫関連障害が炎症状態であり、免疫細胞は、グルココルチコイド受容体の発現を本質的に有さない。いくつかの態様では、対象は、ステロイド治療を施されていたか、または施されている。いくつかの態様では、免疫細胞は、自己由来である。特定の態様では、免疫細胞は、同種異系である。
【００１６】
特定の態様では、免疫関連障害は、癌である。特定の態様では、癌は、固形癌または血液悪性腫瘍である。いくつかの態様では、癌が卵巣癌であり、免疫細胞が、ＭＵＣ−１、ＣＡ−１２５および／またはＷＴ−１に対する抗原特異性を有する。特定の態様では、癌が肺癌であり、免疫細胞が、ＮＹ−ＥＳＯ、ＥＧＦＲ−ｖＩＩＩ、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４、Ｍａｇｅ−Ａ１０および／またはＴＲＡＩＬ／ＤＲ４に対する抗原特異性を有する。具体的な態様では、癌が、膵臓癌または結腸癌であり、免疫細胞が、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４、Ｍａｇｅ−Ａ１０および／またはＣＥＡに対する抗原特異性を有する。いくつかの態様では、癌が乳癌であり、免疫細胞が、ＭＵＣ−１およびＨＥＲ２／Ｎｅｕに対する抗原特異性を有する。特定の態様では、癌が膠芽腫であり、免疫細胞が、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４、Ｍａｇｅ−Ａ１０ｖおよび／またはＥＧＦＲｖＩＩＩに対する抗原特異性を有する。いくつかの態様では、癌が肉腫であり、免疫細胞が、ＮＹ−ＥＳＯおよびＥＧＦＲ−ｖＩＩＩに対する抗原特異性を有する。
【００１７】
さらなる態様では、この方法は、少なくとも第２の治療剤を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも第２の治療剤は、化学療法、免疫療法、外科手術、放射線療法または生物学的療法を含む。特定の態様では、免疫細胞および／または少なくとも第２の治療剤は、静脈内、腹腔内、気管内、腫瘍内、筋肉内、内視鏡的、病変内、経皮的、皮下的、局所的に投与されるか、または直接的な注射または灌流によって投与される。
【００１８】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるだろう。しかし、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単なる具体例として与えられていることが理解されるべきである。本発明の精神および範囲内の種々の変更および改変が、この詳細な説明から当業者には明らかになるからである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに示すために含まれている。本発明は、本明細書に提示する具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これら１つ以上の図面を参照することによって、よりよく理解されるだろう。
【００２０】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃ：臍帯血由来のＮＫ細胞におけるＣＳ１  ＣＡＲの形質導入効率。（図１Ａ）２人の異なるドナー由来のＮＫ細胞におけるＣＡＲ発現のフローサイトメトリー。（図１Ｂ）ｉＣ９／ＣＡＲ．ＣＳ１／ＩＬ−１５が形質導入されたＮＫ細胞は、ＣＳ１を発現する骨髄腫細胞株の優れた死滅性を発揮する。（図１Ｃ）ｉＣ９／ＣＡＲ．ＣＳ１／ＩＬ−１５が形質導入されたＮＫ細胞は、ＣＳ１を発現する骨髄腫細胞株に対して応答し、より多くのエフェクターサイトカインを産生する。
【図１Ｂ】図１Ａの説明を参照。
【図１Ｃ−１】図１Ａの説明を参照。
【図１Ｃ−２】図１Ａの説明を参照。
【図１Ｃ−３】図１Ａの説明を参照。
【００２１】
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｂ：ＩＬ−１５は、腫瘍のＮＫ−ＣＡＲが介在する死滅を向上させ（図２Ａ）、生存を延ばす（図２Ｂ）。
【図２Ｂ】図２Ａの説明を参照。
【００２２】
【図３】図３：造血細胞におけるグルココルチコイド受容体（ＧＲ）ノックアウトのＰＣＲに基づくスクリーニング。
【００２３】
【図４Ａ−１】図４Ａ〜４Ｂ：ＮＫ細胞は、デキサメタゾンによる死滅に感度が高い。（図４Ａ）アネキシンＶ発現は、３種類の異なるドナー由来のＮＫ細胞における４時間のデキサメタゾン処理後に示される。（図４Ｂ）アネキシンＶ発現は、３種類の異なるドナー由来のＮＫ細胞における２４時間のデキサメタゾン処理後に示される。全ての細胞は、２４時間の５００μＭデキサメタゾン処理で死滅した。
【図４Ａ−２】図４Ａ−１の説明を参照。
【図４Ｂ−１】図４Ａ−１の説明を参照。
【図４Ｂ−２】図４Ａ−１の説明を参照。
【００２４】
【図５−１】図５：ＣＡＲ  ＮＫ細胞においてＧＲノックアウトすると、デキサメタゾンによる死滅から守られる。ＣＡＲ  ＮＫコントロール細胞または２００μＭのデキサメタゾンで１２時間処理したＧＲノックアウトを有する細胞のアネキシンＶ染色。
【図５−２】図５−１の説明を参照。
【００２５】
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃ：ＴＦＧβ  ＣＲＩＳＰＲが介在するノックアウトは、ＣＡＲ  ＮＫ細胞を、外因性ＴＧＦβの免疫抑制効果に対して耐性にする。（図６Ａ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術（ＴＧＦβ−ＲＩＩのエキソン３のＣａｓ９およびｇＲＮＡ標的化）を用いたＴＧＦβ−ＲＩＩのノックアウトの成功。（図６Ｂ）野生型およびＴＧＦ−β−ＲＩＩノックアウトＮＫ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの組換えＴＧＦ−βで４８時間処理し、Ｋ５６２標的に対するこれらの応答を評価した。ＴＧＦ−β−ＲＩＩノックアウトＮＫ細胞は、外因性ＴＧＦ−βの免疫抑制効果に対して耐性である。（図６Ｃ）ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術によるＴＧＦβ−ＲＩＩノックアウトは、ＣＡＳ９のみで処理したＮＫ細胞と比較して、１０ｎｇ／ｍｌの組換えＴＧＦ−βに応答して、下流のＳｍａｄ−２／３リン酸化を無効化する。
【図６Ｂ−１】図６Ａの説明を参照。
【図６Ｂ−２】図６Ａの説明を参照。
【図６Ｃ】図６Ａの説明を参照。
【００２６】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｄ：（図７Ａ）２つのＣＡＲおよびｈＩＬ−１５を発現する免疫細胞（例えばＮＫ細胞）を示す模式図。（図７Ｂ）ＣＡＲ、ＴＣＲおよびｈＩＬ−１５を発現する免疫細胞（例えばＮＫ細胞）を示す模式図。（図７Ｃ）２つのＴＣＲおよびｈＩＬ−１５を発現する免疫細胞（例えばＮＫ細胞）を示す模式図。（図７Ｄ）ＣＡＲ−ＣＡＲ、ＴＣＲ−ＣＡＲまたはＴＣＲ−ＴＣＲおよびｈＩＬ−１５を発現する構築物の模式図。
【図７Ｂ】図７Ａの説明を参照。
【図７Ｃ】図７Ａの説明を参照。
【図７Ｄ】図７Ａの説明を参照。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
例示的態様の説明
本開示は、免疫療法、癌および自己免疫障害を含む免疫関連疾患、および限定されないが、ウイルス（例えば、ＣＭＶ、ＥＢＶおよびＨＩＶ）を含む感染の治療のための免疫療法のための抗原特異的免疫細胞（例えば、Ｔ細胞およびＮＫ細胞）を提供することによる現在の技術に関連する問題を克服する。一実施形態では、本開示は、１個以上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＮＫ細胞を提供する。従来の抗体が指向する標的抗原とは対照的に、ＴＣＲによって認識される抗原は、潜在的な細胞内タンパク質の全アレイを含んでいてもよく、これが処理され、ペプチド／ＭＨＣ複合体として細胞表面に送達される。ＮＫ細胞は、内因性ＴＣＲを発現しないため、ＮＫ細胞への高アフィニティＴＣＲの導入によって、外因性ＴＣＲおよび内因性ＴＣＲを発現するＴ細胞でみられるような混合ダイマーを生成するリスクなく、その抗原特異性を変える。ＮＫ細胞中で最適に機能する、より強力な受容体を作成するために、受容体は、共刺激ドメイン（限定されないが、ＣＤ２８、４１ＢＢリガンド、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０、またはこれらの任意の組み合わせを含む）、およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインをベクター中に有していてもよい（図７Ｄ）。したがって、本開示はまた、通常はＴ細胞によってのみ認識される腫瘍および病原由来の標的抗原に対してＮＫ細胞免疫療法を適用する方法を提供する。さらに、Ｔ細胞とは異なり、同種異系源に由来するＮＫ細胞は、移植片対宿主病を誘発するリスクを増やさない。したがって、ＴＣＲを有する同種異系ＮＫ細胞を使用すると、養子治療のためのＴＣＲ操作されたＮＫ細胞の潜在的な供給源を与える。
【００２８】
さらに、本開示は、さらに、腫瘍を二重標的化するために少なくとも２個の抗原受容体、例えば、ＣＡＲとＴＣＲの組み合わせ、２つのＣＡＲ、または２つのＴＣＲを含む免疫細胞、例えば、ＮＫ細胞およびＴ細胞を提供する。複数の抗原受容体（例えば、ＴＣＲおよびＣＡＲの両方）を単一の細胞型に置くこの方法によって、ＴＣＲによる、ＣＡＲおよびペプチド／ＭＨＣ複合体認識を介する表面抗原認識を含め、２つの完全に異なる抗原認識の機構を用い、２つ以上の抗原を標的化することができる。ＮＫ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性を高めるために、細胞は、ＩＬ−１５を発現するように操作されてもよい。したがって、細胞は、２つのＣＡＲ、１つのＣＡＲ＋１つのＴＣＲ、２つのＴＣＲ、またはＣＡＲとＴＣＲの任意の組み合わせを発現してもよく、ＩＬ−１５または他のサイトカインをさらに発現してもよい。この方法は、抗原陰性の腫瘍逃避のリスクを減らすこともできる。免疫細胞は、末梢血、臍帯血、骨髄、幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ細胞）およびＮＫ細胞株、例えば、限定されないが、ＮＫ−９２細胞株を含むいくつかの供給源に由来していてもよい。
【００２９】
さらなる実施形態は、免疫細胞、例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲで操作された免疫細胞の効能を高めるための遺伝子編集による、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、ＴＧＦβ受容体２（ＴＧＦβＲＩＩ）および／または免疫チェックポイント遺伝子ＣＩＳＨの標的化に関する。特に、ＧＲの標的化によって、免疫細胞が、コルチコステロイドのリンパ球毒性効果に耐性になり、ＴＧＦβＲＩＩの標的化によって、免疫細胞が、免疫抑制腫瘍微小環境に耐性になる。例えば、免疫細胞は、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳシステムまたは他の遺伝子編集システム、例えば、ＴＡＬＥＮまたはジンクフィンガーヌクレアーゼを用い、ステロイド耐性および／またはＴＧＦＢ耐性であるように操作されてもよい。
【００３０】
これに加え、本開示で使用される抗原性受容体は、ＩＬ１５、例えば、ヒトＩＬ−１５、または限定されないがＩＬ−２１またはＩＬ−２を含む他の補助サイトカインを含んでいてもよい。抗原性受容体構築物（ＴＣＲまたはＣＡＲ）は、ＣＤ３ζ、４−１ＢＢ−Ｌ、ＤＡＰ１２、ＤＡＰ１０または他の共刺激分子などの共刺激分子をさらに含んでいてもよい。本開示の免疫細胞は、抗原の任意の組み合わせを標的としてもよいが、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲの例示的な抗原としては、限定されないが、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、ＣＤ３８、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ９９、ＣＬＬ１、ＣＤ５、ＣＤ７、メソテリンおよびＲＯＲ１が挙げられる。特定の態様では、免疫細胞は、ＣＤ１９−ＣＡＲおよびＥＢＮＡペプチドに対するＴＣＲ（例えば、ＥＢＶリンパ腫の場合）；ＷＴ１およびＣＤ１２３（例えば、悪性骨髄腫（例えば、ＡＭＬ、ＭＤＳ、ＣＭＬの場合））；ＮＹ−ＥＳＯ  ＴＣＲおよびＥＧＦＲｖＩＩＩ−ＮＫ−ＣＡＲ（例えば、肉腫および肺癌の場合）；Ｍｕｃ−１−ＴＣＲおよびＨｅｒ−２−ｎｅｕ−ＮＫ−ＣＡＲ（例えば、乳癌の場合）；Ｍｕｃ−１−ＴＣＲおよびＣＡ−１２５−ＮＫ−ＣＡＲ（例えば、卵巣癌の場合）；ＷＴ１−ＴＣＲおよびＣＡ−１２５−ＮＫ−ＣＡＲ（例えば、卵巣癌の場合）；Ｍａｇｅ−Ａ３−ＴＣＲ、Ｍａｇｅ−Ａ４−ＴＣＲまたはＭａｇｅ−Ａ１０−ＴＣＲおよびＥＧＦＲＶＩＩ−ＮＫ−ＣＡＲ（例えば、肺癌および膠芽腫の場合）；ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４−ＴＣＲおよびＥＧＦＲｖ３−ＣＡＲ（例えば、肺癌の場合）；およびＭａｇｅ−Ａ３−ＴＣＲ、Ｍａｇｅ−Ａ４−ＴＣＲまたはＭａｇｅ−Ａ１０−ＴＣＲおよびＣＥＡ−ＣＡＲ（例えば、結腸癌および膵臓癌の場合）を含め、抗原の組み合わせに対して二重に標的化してもよい。
【００３１】
さらなる実施形態では、免疫細胞、特にＮＫ細胞は、２つのＣＡＲ（例えば、ＣＤ９９およびＣＤ３３、または  ＣＤ１２３およびＣＤ３３、またはＣＤ１９およびＲＯＲ１、またはＣＤ３８およびＢＣＭＡまたはＣＳ１、または他の組み合わせ）を保有するベクターを用いて形質導入され、免疫細胞およびＩＬ−１５または別のサイトカインに対する二重特異性を与え、そのｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性を高める。この方法は、オフターゲット毒性を制限することによって、両抗原が腫瘍上で発現する場合に、ＮＫ細胞のみに死滅するシグナルが与えられ、ｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖および持続性が高められるようにＮＫ−ＣＡＲの特異性を増加させる。したがって、１個の抗原のみを発現する正常細胞は、標的とされないだろう。この戦略は、限定されないが、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞およびｉＮＫＴ細胞を含む免疫細胞の任意の一部に適用可能である。
【００３２】
養子癌免疫療法のための免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞およびＴ細胞）の遺伝的再プログラム化は、例えば、（１）従前の感作を必要としない先天性抗腫瘍監視機構、（２）ＮＫ細胞の場合には、移植片対宿主反応性がない同種異系効能、および（３）直接的な細胞介在性細胞傷害および標的腫瘍の細胞崩壊などの臨床的に関連する用途と利益を有する。したがって、本開示はまた、本明細書に提供する操作された免疫細胞のいずれかを用いた養子細胞免疫療法を含む、免疫関連障害（例えば癌）を治療する方法を提供する。
【００３３】
Ｉ．定義
本明細書で使用される場合、具体的な構成要素に関して「本質的に含まない」は、具体的な構成要素が、組成物に意図的に配合されていないか、および／または混入物質として、または痕跡量のみが存在することを意味するために本明細書で使用される。したがって、ある組成物の意図しない混入から生じる具体的な構成要素の合計量は、０．０５％より十分に低く、好ましくは、０．０１％より低い。最も好ましいのは、具体的な構成要素が標準的な分析方法を用いて分析不可能である組成物である。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、１つ以上を意味していてもよい。特許請求の範囲で使用される場合、「〜を含む」との用語と組み合わせて使用される場合、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」といった用語は、１つ、または１つより多くを意味していてもよい。
【００３５】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、代替物のみ、または代替物が相互に排他的であることを指すように明白に示されていない限り、「および／または」を意味するために用いられるが、本開示は、代替物のみ、および「および／または」を指す定義を支持する。本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはもっと多くを意味していてもよい。
【００３６】
本明細書全体で、「約」との用語は、ある値が、値を決定するために使用されるデバイス、方法に関する誤差の固有の偏差、または試験対象の中に存在する偏差を含むことを示すために用いられる。
【００３７】
「外因性」との用語は、細胞または生物におけるタンパク質、遺伝子、核酸またはポリヌクレオチドに関連して使用される場合、人工的な手段または天然の手段によって、その細胞または生物に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸またはポリヌクレオチドを指す。または、ある細胞に関連して、この用語は、単離され、その後に、人工的な手段または天然の手段によって、他の細胞または生物に導入された細胞を指す。外因性核酸は、異なる生物または細胞由来であってもよく、または、生物内または細胞内で天然に存在する核酸の１つ以上のさらなる複製物であってもよい。外因性細胞は、異なる生物由来であってもよく、または同じ生物由来であってもよい。非限定的な例として、外因性核酸は、天然の細胞中とは異なる染色体位置にあるもの、または天然にみられるのとは異なる核酸配列によってその他の方法でフランキングされたものである。
【００３８】
「発現構築物」または「発現カセット」とは、転写を命令することが可能な核酸分子を意味する。発現構築物は、最小で、１つ以上の所望な細胞型、組織または臓器において遺伝子発現を指令する１つ以上の転写制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、またはその機能的に等価な構造）を含む。さらなる要素、例えば、転写終結シグナルも含まれていてもよい。
【００３９】
「ベクター」または「構築物」（時に、遺伝子送達系または遺伝子伝達「ビヒクル」と呼ばれる）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏのいずれかで宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドを含む大きな分子または分子の複合体を指す。
【００４０】
「プラスミド」は、一般的な種類のベクターであり、染色体ＤＮＡとは独立して複製することが可能な、染色体ＤＮＡとは別個の染色体外ＤＮＡ分子である。特定の場合に、プラスミドは、円形および二重鎖である。
【００４１】
「複製起点（ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）」（「ｏｒｉ」）または「複製起点（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｒｉｇｉｎ）」は、例えば、細胞中のプラスミドに存在する場合、プラスミドおよび／またはＤＮＡ合成が開始する部位またはその付近で、連結した配列を維持することが可能なリンパ球指向性ヘルペスウイルス中のＤＮＡ配列である。一例として、ＥＢＶ（Ｅｂｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス）のｏｒｉは、ＦＲ配列（３０ｂｐの反復の２０の不完全な複製）、好ましくは、ＤＳ配列を含む。しかし、ＥＢＶ中の他の部位は、ＥＢＮＡ−１に結合し、例えば、Ｒｅｐ＊配列は、複製起点としてＤＳに置き換えることができる（ＫｉｒｓｈｍａｉｅｒおよびＳｕｇｄｅｎ、１９９８）。したがって、ＥＢＶの複製起点は、核酸改変によって、ＦＲ、ＤＳまたはＲｅｐ＊配列、または任意の機能的に等価な配列、またはこれらに由来する合成による組み合わせを含む。例えば、本開示の方法はまた、例えば、個々の要素の挿入または突然変異によって、ＥＢＶの遺伝的に操作された複製起点を使用してもよい。
【００４２】
特定のタンパク質を「コード」する「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「コード領域」、「配列」、「セグメント」、「フラグメント」または「導入遺伝子」は、適切な制御性配列の制御下におかれる場合、転写され、場合により、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子産物、例えば、ポリペプチドへと変換される核酸分子である。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ形態のいずれかに存在していてもよい。ＤＮＡ形態に存在する場合、核酸分子は、一本鎖（すなわち、センス鎖）または二本鎖であってもよい。コード領域の境界は、５’（アミノ）末端にある開始コドンと、３’（カルボキシ）の末端にある翻訳停止コドンとによって決定される。遺伝子としては、限定されないが、原核生物または真核生物のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、原核生物または真核生物のＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列が挙げられるだろう。転写終結配列は、通常、遺伝子配列に対して３’に配置されているだろう。
【００４３】
「制御要素」との用語は、集合的に、プロモーター領域、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流の制御性ドメイン、複製起点、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、エンハンサー、スプライス接合部などを指し、集合的に、受容者細胞において、複製、転写、転写後処理、コード配列の翻訳を与える。選択されるコード配列が、適切な宿主細胞中で複製され、転写され、翻訳されることが可能な限り、これらの制御要素の全てが存在する必要はない。
【００４４】
「プロモーター」との用語は、ＤＮＡ制御性配列を含むヌクレオチド領域を指すために、本明細書ではその通常の意味で使用され、ここで、制御性配列は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することが可能な遺伝子に由来する。核酸配列の特定の転写を開始させるために、制御性タンパク質および分子（例えば、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子）が結合し得る遺伝要素を含んでいてもよい。「作動可能に配置される」、「作動可能に連結される」、「制御下」および「転写制御下」との句は、プロモーターが、転写開始および／または配列の発現を制御するための核酸配列に関連して、正しい機能位置および／または向きにあることを意味する。
【００４５】
「エンハンサー」とは、プロモーターに隣接して配置されると、エンハンサードメインが存在しない状態でプロモーターから得られる転写活性と比較して、転写活性の増加を与える核酸配列を意味する。
【００４６】
核酸分子に言及しつつ、「作動可能に連結され」または「同時発現され」とは、２つ以上の核酸分子（例えば、転写される核酸分子、プロモーターおよびエンハンサー要素）が、核酸分子の転写を可能にする様式で接続していることを意味する。ペプチドおよび／またはポリペプチド分子に言及しつつ、「作動可能に連結され」または「同時発現され」とは、２つ以上のペプチドおよび／またはポリペプチド分子が、単一のポリペプチド鎖、すなわち、融合の各ペプチドおよび／またはポリペプチド構成要素の少なくとも１つの特性を有する融合ポリペプチドを与えるような様式で接続することを意味する。融合ポリペプチドは、好ましくは、キメラであり、すなわち、異種分子で構成されている。
【００４７】
「ホモロジー」は、２つのポリヌクレオチド間または２つのポリペプチド間の同一性の割合を指す。ある配列と別の配列との対応性は、当該技術分野で既知の技術によって決定することができる。例えば、ホモロジーは、２つのポリペプチド分子間の配列情報をアラインメントし、容易に入手可能なコンピュータプログラムを用いることによって、２つのポリペプチド分子間の配列情報の直接比較によって決定することができる。または、相同領域の間に安定な二重鎖の生成を促進する条件でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションし、その後、一本鎖に特異的なヌクレアーゼで消化し、消化したフラグメントのサイズ決定をすることによって、ホモロジーを決定することができる。２つのＤＮＡ、または２つのポリペプチドの配列は、ヌクレオチドまたはアミノ酸の少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％が、それぞれ、上述の方法を用いて決定される場合に、分子の所定の長さにわたって適合する場合、互いに「実質的に相同性」である。
【００４８】
「細胞」との用語は、本明細書では、当該技術分野で最も広い意味で使用され、多細胞生物の組織の構造単位であり、外側から単離する膜構造によって囲まれており、自己複製能を有し、遺伝子情報と、それを発現するための機構を有する生命体を指す。本明細書で使用される細胞は、天然に存在する細胞または人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝的に改変された細胞など）であってもよい。
【００４９】
「幹細胞」との用語は、本明細書では、適切な条件下、多様な範囲の特殊化された細胞型へと分化することが可能であり、一方、他の適切な条件下、自己再生が可能であり、本質的に分化していない多能性状態を維持することが可能な細胞を指す。「幹細胞」との用語は、多能性細胞、複数の細胞種をつくる細胞、前駆細胞および始原細胞も包含する。例示的なヒト幹細胞は、骨髄組織から得られる造血細胞または間葉系幹細胞、胎児組織から得られる胎児幹細胞、または胎児の生殖組織から得られる胎児生殖細胞から得られてもよい。例示的な多能性幹細胞は、多能性に関連する特定の転写因子の発現によって、体細胞を多能性状態へと再プログラム化することによって、体細胞からも製造することができる。これらの細胞は、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳｃまたはｉＰＳ細胞」と呼ばれる。
【００５０】
「胚性幹（ＥＳ）細胞」は、初期段階の胚（例えば、胚盤胞段階での内細胞塊）から得られるか、または人工的な手段（例えば核移植）によって作られ、生殖細胞（例えば、精子および卵子）を含め、胚または成人において任意の分化した細胞型を生じ得る、分化していない多能性細胞である。
【００５１】
「人工多能性幹細胞（ｉＰＳｃまたはｉＰＳ細胞）」は、因子（本明細書では再プログラム化因子と呼ばれる）の組み合わせを発現するか、またはその発現を誘発することによって体細胞を再プログラム化することによって作られる細胞である。ｉＰＳ細胞は、胎児、出生後、新生児、若年性または成人の体細胞を用いて作成することができる。特定の実施形態では、体細胞を多能性幹細胞に再プログラム化するために使用可能な因子としては、例えば、Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４と呼ばれることがある）、Ｓｏｘ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８が挙げられる。いくつかの実施形態では、体細胞を多能性幹細胞へと再プログラム化するために、体細胞は、少なくとも２個の再プログラム化因子、少なくとも３個の再プログラム化因子、少なくとも４個の再プログラム化因子、少なくとも５個の再プログラム化因子、少なくとも６個の再プログラム化因子、または少なくとも７個の再プログラム化因子を発現することによって、再プログラム化される。
【００５２】
「造血始原細胞」または「造血前駆細胞」は、造血系統に決められているが、さらなる造血分化が可能な細胞を指し、造血幹細胞、複数の細胞種をつくる造血幹細胞、骨髄球系共通前駆細胞、巨核球  前駆細胞、赤血球前駆細胞、およびリンパ前駆細胞が挙げられる。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、血液細胞型の全てを生じる、骨髄（単球およびマクロファージ、顆粒球（好中球、好塩基球、好酸球およびマスト細胞）、赤血球、巨核球／血小板、樹状細胞）、およびリンパ系統（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含め、複数の細胞種をつくる幹細胞である（例えば、Ｄｏｕｌａｔｏｖｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｎｏｔｔａｅｔ  ａｌ．，２０１５を参照）。「多能リンパ前駆細胞」（ＭＬＰ）は、全てのリンパ系統（Ｂ、ＴおよびＮＫ細胞）を生じるが、他の（骨髄）可能性を有していてもよく、または有していなくてもよい、任意の前駆細胞を記載するために定義され（Ｄｏｕｌａｔｏｖｅｔ  ａｌ．，２０１０）、ＣＤ４５ＲＡ＋、／ＣＤ１０＋／ＣＤ７−である。任意のＢ、ＴおよびＮＫ前駆細胞は、ＭＬＰと呼ばれる場合がある。「骨髄球系共通前駆細胞」（ＣＭＰ）は、顆粒球、単球、巨核球および赤血球を生じ得るＣＤ４５ＲＡ−／ＣＤ１３５＋／ＣＤ１０−／ＣＤ７−細胞を指す。
【００５３】
「多能性幹細胞」は、１つ以上の組織または臓器を構成する全ての細胞へと分化する能力を有する幹細胞、または好ましくは、内胚葉（内側の胃内部、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、尿生殖器）、または外胚葉（表皮組織および神経系）といった３種類の胚葉のいずれかを指す。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「体細胞」との用語は、そのＤＮＡを次世代に直接的に移さない、卵子、精子などの生殖細胞以外の任意の細胞を指す。典型的には、体細胞は、制限があるか、または多能性ではない。本明細書で使用される体細胞は、天然に存在していてもよく、または遺伝的に改変されていてもよい。
【００５５】
「プログラム化」は、ある細胞が産生し得る子孫の種類を変えるプロセスである。例えば、ある細胞は、プログラム化されずに、同じ条件で生成し得るものと比較して、少なくとも１つの新しい細胞型を有する子孫を、培養物中、またはｉｎ  ｖｉｖｏで生成し得るように変化した場合、プログラム化されている。このことは、十分な増殖の後に、新しい細胞型の表現型特徴を有する測定可能な割合の子孫が観察されるか、または、本質的にこのような子孫が、プログラム化前に生成する場合には、新しい細胞型の特徴を有する割合が、プログラム化前よりも多く測定可能であることを意味する。このプロセスは、分化、脱分化および分化転換を含む。
【００５６】
「分化」は、ほとんど特殊化していない細胞が、より特殊化された細胞型になるプロセスである。「脱分化」は、部分的に分化した細胞または最後まで分化した細胞を、多能性または多分化能などの初期の発達段階まで戻す細胞プロセスである。「分化転換」は、ある分化した細胞型から、別の分化した細胞型へと形質転換するプロセスである。典型的には、プログラム化による分化転換は、細胞が中間の多能性段階を通ることなく起こり、すなわち、細胞は、ある分化した細胞型から、別の分化した細胞型へと直接的にプログラム化される。特定の条件下、新しい細胞型の特徴を有する子孫の割合は、好ましさが増す順序で、少なくとも約１％、５％、２５％であってもよく、またはもっと多くてもよい。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「対象」または「それを必要とする対象」は、細胞または組織の移植を必要とする、任意の年齢の雄または雌の哺乳動物、好ましくはヒトを指す。典型的には、対象は、障害または病的な状態または望ましくない状態、状況または症候群、または細胞または組織の移植による治療に対して修正可能な身体的、形態的または生理学的異常に起因して、細胞または組織の移植が必要である（本明細書では、受容者とも呼ばれる）。
【００５８】
本明細書で使用される場合、遺伝子の「破壊」または「変化」は、その変化が存在しない状態での遺伝子産物の発現レベルと比較して、ある細胞中の対象遺伝子によってコードされる１つ以上の遺伝子産物の発現がなくなること、または減少することを指す。例示的な遺伝子産物としては、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡおよびタンパク質産物が挙げられる。変化は、ある場合には、一時的または可逆的であり、他の場合には、永久的である。変化は、ある場合には、先端を切断しているか、または切断していない機能産物が製造してもよいが、機能性または全長のタンパク質またはｍＲＮＡである。本明細書のいくつかの実施形態では、発現ではなく、遺伝子の活性または機能が破壊される。遺伝子の変化は、一般的に、すなわち、化合物、分子、複合体または組成物の添加または導入によって、および／または遺伝子の核酸または遺伝子に会合する核酸の変化、例えば、ＤＮＡレベルの変化によって、人工的な方法によって誘発される。遺伝子変化のための例示的な方法としては、遺伝子サイレンシング、ノックダウン、ノックアウトおよび／または遺伝子変化技術、例えば、ゲノム編集が挙げられる。例としては、アンチセンス技術、例えば、一般的に、発現が一時的に減少する、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡおよび／またはリボザイム、例えば破壊および／または相同組換えの誘導による、標的遺伝子の不活化または変化が生じる遺伝子編集技術が挙げられる。例としては、挿入、突然変異および欠失が挙げられる。この変化によって、典型的には、遺伝子によってコードされる正常または「野生型」の産物の発現が抑制されるか、および／または完全になくなる。例示的なこのような遺伝子変化は、遺伝子または遺伝子の一部の挿入、フレームシフトおよびミスセンス突然変異、欠失、ノックインおよびノックアウトであり、全遺伝子の欠失を含む。変化は、コード領域で、例えば、１つ以上のエキソンで起こってもよく、例えば、停止コドンの挿入によって、全長産物、機能的産物、または任意の産物を産生することができなくなる。このような変化は、遺伝子の転写を防ぐように、プロモーターまたはエンハンサー、または転写の活性化に影響を与える他の領域における変化によっても起こり得る。遺伝子の変化としては、相同組換えによる標的遺伝子の不活化を含む遺伝子ターゲティングが挙げられる。
【００５９】
「免疫障害」、「免疫関連障害」または「免疫介在性障害」は、疾患の進行または進みにおいて免疫応答が重要な役割を果たす障害を指す。免疫介在性障害としては、自己免疫障害、同種移植拒絶、移植片対宿主病、および炎症性状態およびアレルギー性状態が挙げられる。
【００６０】
「免疫応答」は、ある刺激に対する、免疫系の細胞、例えば、Ｂ細胞、またはＴ細胞、または自然免疫細胞の応答である。一実施形態では、応答は、特定の抗原に特異的である（「抗原特異的応答」）。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「抗原」との用語は、抗体またはＴ細胞受容体が結合することが可能な分子である。抗原は、一般的に、Ｂおよび／またはＴリンパ球の産生を引き起こす液性免疫応答および／または細胞免疫応答を誘発するために使用されてもよい。
【００６２】
「腫瘍関連抗原」、「腫瘍抗原」および「癌細胞抗原」は、本明細書で相互に置き換え可能に使用される。それぞれの場合、これらの用語は、癌細胞によって特異的または優先的に発現するタンパク質、糖タンパク質または炭水化物を指す。
【００６３】
「エピトープ」は、アミノ酸配列の特異性によって決定されるような、抗体によって認識される抗原上の部位である。２つの抗体は、競争結合アッセイによって測定する場合、それぞれが抗原に対する他の結合を競争的に阻害する（ブロックする）場合、同じエピトープに結合すると言われる。または、２つの抗体は、ある抗体の結合を低下させるか、またはなくす抗原中の大部分のアミノ酸突然変異が、他方の結合を低下させるか、またはなくす場合、同じエピトープを有する。２つの抗体は、それぞれが、抗原に対する他の抗体の結合を部分的に阻害する場合、および／またはある抗体の結合を低下させるか、またはなくすいくつかのアミノ酸突然変異が、他の抗体の結合を低下させるか、またはなくす場合、重なり合うエピトープを有すると言われる。
【００６４】
「自己免疫疾患」は、免疫系が、組織への損傷の結果、正常細胞の一部である抗原（すなわち、自己抗原）に対して、免疫応答（例えば、Ｂ細胞またはＴ細胞応答）を生じさせる疾患を指す。自己抗原は、宿主細胞に由来していてもよく、または片利共生生物、例えば、通常は粘膜表面をコロニー化する微生物（片利共生生物として知られている）に由来していてもよい。
【００６５】
「移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）」との用語は、骨髄または他の組織移植の一般的かつ重篤な合併症を指し、移植受容者自身の組織に対し、提供された免疫学的に競争するリンパ球の反応が存在する。ＧＶＨＤは、関係のあるドナーまたは無関係なドナーのいずれか由来の幹細胞を使用するか、または含む任意の移植のあり得る合併症である。いくつかの実施形態では、ＧＶＨＤは、慢性ＧＶＨＤ（ｃＧＶＨＤ）である。
【００６６】
「免疫応答のパラメーター」は、限定されないが、サイトカイン分泌（ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γなど）、ケモカイン分泌、変化した移動または細胞蓄積、免疫グロブリン産生、樹状細胞の熟成、制御活性、免疫細胞の数および免疫系の任意の細胞の増殖を含め、免疫応答の任意の特定の測定可能な態様である。免疫応答の別のパラメーターは、免疫学的攻撃から生じる任意の臓器の構造的な損傷または機能的な劣化である。当業者は、既知の実験室アッセイを用い、これらのパラメーターのいずれか１つの増加を容易に決定することができる。ある具体的な非限定例では、細胞増殖を評価するために、３Ｈ−チミジンの組み込みを評価することができる。免疫応答のパラメーターの「実質的な」増加は、コントールと比較した場合のこのパラメーターの顕著な増加である。実質的な増加の具体的な非限定例は、少なくとも約５０％の増加、少なくとも約７５％の増加、少なくとも約９０％の増加、少なくとも約１００％の増加、少なくとも約２００％の増加、少なくとも約３００％の増加および少なくとも約５００％の増加である。同様に、免疫応答のパラメーターの抑制または減少は、コントールと比較した場合のこのパラメーターの顕著な減少である。実質的な減少の具体的な非限定例は、少なくとも約５０％の減少、少なくとも約７５％の減少、少なくとも約９０％の減少、少なくとも約１００％の減少、少なくとも約２００％の減少、少なくとも約３００％の減少および少なくとも約５００％の減少である。統計試験、例えば、ノンパラメトリックＡＮＯＶＡまたはＴ検定を使用し、ある剤によって誘発される応答の大きさの差を、第２の剤を用いて応答するサンプルの割合と比較して、比較することができる。ある場合には、ｐ≦０．０５は有意であり、任意の観察されたパラメーターの増加または減少が、無作為な偏差に起因する可能性が５％未満であることを示す。当業者は、使用の他の統計学的アッセイを容易に特定することができる。
【００６７】
ある疾患または状態を「治療する」または治療は、その疾患の徴候または症状を軽減するための努力において、１つ以上の薬物を患者に投与することを含んでいてもよいプロトコルを実施することを指す。治療の望ましい効果としては、疾患の進行速度を下げること、疾患状態を軽減するか、またはやわらげること、寛解および予後の向上が挙げられる。緩和は、疾患または状態の徴候または症状が現れる前に起こってもよく、または現れた後に起こってもよい。したがって、「治療する」または「治療」は、疾患または望ましくない状態を「予防する」または「予防」を含んでいてもよい。これに加え、「治療する」または「治療」は、徴候または症状の完全な緩和を必要とせず、治癒を必要とせず、具体的には、患者に対する限界効果のみを有するプロトコルを含む。
【００６８】
「治療上の利益」または「治療上有効な」との用語は、本明細書全体で使用される場合、この状態の医学的治療に関し、対象の良好な状態を促進するか、または向上させる何かを指す。限定されないが、疾患の徴候または症状の頻度または重篤度の減少が含まれる。例えば、癌の治療は、例えば、腫瘍の大きさの減少、腫瘍の侵襲性の減少、癌の成長速度の減少、または転移の予防を含んでいてもよい。癌の治療は、癌を有する対象の生存を長引かせることも指す。
【００６９】
本明細書の「抗体」との用語は、最も広い意味で使用され、所望な生体活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを含む。
【００７０】
「モノクローナル抗体」との用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、例えば、集合を含む個々の抗体が、少量存在し得る可能な突然変異、例えば、天然に存在する突然変異以外は同一である。したがって、「モノクローナル」との修飾語は、別個の抗体の混合物ではないような抗体の特徴を示す。特定の実施形態では、このようなモノクローナル抗体は、典型的には、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を含み、この標的結合ポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的に結合するポリペプチド配列の選択を含むプロセスによって得られた。例えば、選択工程は、複数のクローン（例えば、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、または組換えＤＮＡクローンのプール）からの固有のクローンの選択であってもよい。選択された標的結合配列を、例えば、標的に対するアフィニティを高めるため、標的結合配列をヒト化するため、細胞培養物中のその産生を高めるため、免疫原性をｉｎ  ｖｉｖｏで下げるため、多重特異性抗体を作成するためなどのために、さらに変化させてもよく、変化した標的結合配列を含む抗体も、本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。その特異性に加え、モノクローナル抗体の調製は、典型的には他の免疫グロブリンが混入しないという点で有利である。
【００７１】
「医薬的又は薬理学的に許容される」との句は、適切な場合、動物（例えばヒト）に投与したときに、有害なアレルギー反応又は他の不都合な反応を引き起こさない分子部分及び組成物を指す。抗体またはさらなる活性成分を含む医薬組成物の調製は、本開示の観点で当業者には知られているだろう。さらに、動物（例えば、ヒト）投与の場合、製剤が、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって必要とされるような滅菌性、発熱原性、全体的な安全性及び純度の基準を満たすべきであることは理解される。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」としては、当業者には知られているだろうが、任意および全ての水性溶媒（例えば、水、アルコール／水溶液、生理食塩水溶液、非経口ビヒクル、例えば、塩化ナトリウム、Ｒｉｎｇｅｒデキストロースなど）、非水性溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチル）、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば、抗細菌剤または抗真菌剤、酸化防止剤、キレート化剤および不活性気体）、等張性剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定化剤、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、染料、流体および栄養素補給剤、このような材料および組み合わせが挙げられる。医薬組成物中のｐＨおよび種々の構成要素の実際の濃度は、よく知られているパラメーターにしたがって調節される。
【００７３】
「Ｔ細胞」との用語は、Ｔリンパ球を指し、限定されないが、γ：δ＋  Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＴＨ０、ＴＨ１およびＴＨ２細胞、および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含む。少なくとも３種類の制御性Ｔ細胞が存在する。ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇ、ＣＤ２５ＴＨ３ＴｒｅｇおよびＣＤ２５ＴＲ１Ｔｒｅｇ。「細胞傷害性Ｔ細胞」は、別の細胞を死滅させ得るＴ細胞を指す。細胞傷害性Ｔ細胞の大部分は、ＣＤ８＋ＭＨＣクラスＩ制限Ｔ細胞であるが、ある種の細胞傷害性Ｔ細胞は、ＣＤ４＋である。好ましい実施形態では、本開示のＴ細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋である。
【００７４】
Ｔ細胞の活性化状態は、Ｔ細胞が「休止している」（すなわち、細胞周期のＧ０段階）か、または「活性化し」、特異的な抗原の認識などの適切な刺激の後に、またはＯＫＴ３抗体、ＰＨＡまたはＰＭＡを用いた刺激によって増殖するかどうかを規定する。Ｔ細胞の「表現型」（例えば、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、溶解エフェクター、ヘルプエフェクター（ＴＨ１およびＴＨ２細胞）および制御性エフェクター）は、活性化されたときの細胞が発揮する機能を記載する。健康なドナーは、これらの表現型それぞれのＴ細胞を有し、これらは主に休止状態にある。ナイーブＴ細胞は、活性化すると増殖し、次いで、メモリーＴ細胞またはエフェクターＴ細胞へと分化する。次いで、新しい機能を発揮するために次に活性化されるまで、再び休止状態を想定してもよく、その表現型を再び変更してもよい。エフェクターＴ細胞は、活性化すると分裂し、抗原特異的エフェクター機能を有するだろう。
【００７５】
「キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）」との用語は、本明細書で使用される場合、人工のＴ細胞受容体、キメラＴ細胞受容体、またはキメラ免疫受容体を指していてもよく、例えば、特定の免疫エフェクター細胞に人工の特異性を付与する操作された受容体を包含する。ＣＡＲは、モノクローナル抗体の特異性をＴ細胞に付与するために使用されてもよく、例えば、養子細胞療法での使用のために、それにより多数の特異的なＴ細胞を生成することが可能になる。具体的な実施形態では、ＣＡＲは、例えば、腫瘍関連抗原に対する細胞の特異性を指令する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、細胞内活性化ドメインと、膜貫通ドメインと、腫瘍関連抗原結合領域を含む細胞外ドメインとを含む。特定の態様では、ＣＡＲは、ＣＤ３−ゼータ膜貫通ドメインおよびエンドドメインに融合した、モノクローナル抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）の融合物を含む。ＣＡＲ設計の特異性は、受容体のリガンド（例えば、ペプチド）に由来していてもよく、またはパターン認識受容体、例えば、デクチンに由来していてもよい。特定の場合に、抗原認識ドメインの間隔は、活性化誘導細胞死を減らすように改変されてもよい。特定の場合に、ＣＡＲは、さらなる共刺激シグナル伝達のためのドメイン、例えば、ＣＤ３ζ、ＦｃＲ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＤＡＰ１０および／またはＯＸ４０を含む。ある場合、共刺激分子、イメージングのためのレポーター遺伝子（例えば、ポジトロン断層法のためのもの）、プロドラッグを加えると、条件によりＴ細胞を除去する遺伝子産物、ホーミング受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体、サイトカインおよびサイトカイン受容体を含め、分子は、ＣＡＲと同時発現してもよい。
【００７６】
「抗原提示細胞（ＡＰＣ）」は、免疫系の特定のエフェクター細胞によって認識可能なペプチド−ＭＨＣ複合体の形態で１つ以上の抗原を提示することが可能であり、それにより、提示される１つ以上の抗原に対する効果的な細胞免疫応答を誘発することが可能な細胞の一種を指す。ＡＰＣは、無傷な全細胞、例えば、マクロファージ、Ｂ細胞、内皮細胞、活性化Ｔ細胞および樹状細胞、または天然に存在するか、または合成の他の分子、例えば、β２−ミクログロブリンに複合体化された精製ＭＨＣクラスＩ分子であってもよい。多くの種類の細胞が、Ｔ細胞認識のためにその細胞表面に抗原を提示させることが可能な場合があるが、樹状細胞だけが、細胞傷害性Ｔ−リンパ球（ＣＴＬ）応答のためにナイーブＴ細胞を活性化するのに効果的な量で抗原を提示する能力を有する。
【００７７】
「培養する」との用語は、適切な媒体中での細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの管理、分化および／または繁殖を指す。「濃縮される」とは、生物中に存在する組織中でみられるよりも、全細胞の割合が多い状態で存在する細胞を含む組成物を意味する。
【００７８】
「抗癌」剤は、例えば、癌細胞の死滅を促進し、癌細胞のアポトーシスを誘発し、癌細胞の成長速度を下げ、転移の発生または数を減らし、腫瘍の大きさを小さくし、腫瘍の成長を阻害し、腫瘍または癌細胞に対する血液供給を減らし、癌細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進し、癌の進行を予防するか、または阻害し、または癌を有する対象の寿命を延ばすことによって、対象における癌細胞／腫瘍に悪影響を及ぼすことができる。
【００７９】
ＩＩ．免疫細胞
本開示の特定の実施形態は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／またはＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する免疫細胞に関する。免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはガンマデルタＴ細胞）、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、幹細胞（例えば、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または人工多能性幹（ｉＰＳＣ）細胞）であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、単球または顆粒球、例えば、骨髄系細胞、マクロファージ、好中球、樹状細胞、マスト細胞、好酸球および／または好塩基球である。免疫細胞を製造し、操作する方法、養子細胞療法のために細胞を使用し、投与する方法も本明細書で提供され、どの場合でも、細胞は、自己由来であってもよく、または同種異系であってもよい。したがって、免疫細胞は、免疫療法として、例えば、癌細胞を標的化するために使用されてもよい。
【００８０】
免疫細胞は、対象、特にヒト対象から単離されてもよい。免疫細胞は、例えば、特定の疾患または状態を有することが疑われる対象、特定の疾患または状態に対する素因を有することが疑われる対象、またはある特定の疾患または状態の治療を受けている対象など、目的の対象から得られてもよい。免疫細胞は、限定されないが、血液、臍帯血、脾臓、胸腺、リンパ節および骨髄を含む、対象中に存在する任意の場所から集められてもよい。単離された免疫細胞は、直接使用されてもよく、または例えば凍結によって、所定期間保存されてもよい。
【００８１】
免疫細胞は、限定されないが、血液（血液バンクまたは臍帯血バンクから集められた血液を含む）、外科手術中に除去および／または露出した脾臓、骨髄、組織、および生検手順によって得られた組織を含め、免疫細胞が存在する任意の組織から濃縮／精製されてもよい。免疫細胞が濃縮され、単離され、および／または精製されている組織／臓器は、生物対象および非生物対象の両方から単離されてもよく、非生物対象は、臓器ドナーである。特定の実施形態では、免疫細胞は、血液、例えば、末梢血または臍帯血から単離される。いくつかの態様では、臍帯血から単離される免疫細胞は、ＣＤ４陽性またはＣＤ８陽性のＴ細胞抑制によって測定されるように、向上した免疫調整能力を有する。具体的な態様では、免疫細胞は、免疫調整能力を高めるために、プールされた血液から、特に、プールされた臍帯血から単離される。プールされた血液は、２人以上の供給源、例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはもっと多くの供給源（例えば、ドナー対象）に由来していてもよい。
【００８２】
免疫細胞の集合は、治療が必要であるか、または免疫細胞の活性低下に関連する疾患を患う対象から得られてもよい。したがって、細胞は、治療が必要な対象に対して自己由来であろう。または、免疫細胞の集合は、ドナーから得られてもよく、好ましくは、組織適合性のドナーから得られてもよい。免疫細胞の集合は、末梢血、臍帯血、骨髄、脾臓、または免疫細胞が対象またはドナー内に存在する任意の他の臓器／組織から集められてもよい。免疫細胞は、対象および／またはドナーのプールから、例えば、プールされた臍帯血から単離されてもよい。
【００８３】
免疫細胞の集合が、対象とは異なるドナーから得られる場合、ドナーは、好ましくは、同種異系であるが、但し、得られた細胞は、対象に導入し得るという点で対象に適合性である。同種異系ドナー細胞は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合するものであってもよく、または適合しないものであってもよい。対象に適合性なものにするために、同種異系細胞は、免疫原性を減らすために処理されてもよい。
【００８４】
Ａ．Ｔ細胞
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞である。機能性抗腫瘍エフェクター細胞の誘導体化、活性化および増殖のためのいくつかの基本的な手法は、過去数十年間に記載されてきた。これらの細胞としては、自己由来細胞、例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）；自己由来ＤＣ、リンパ球、人工の抗原提示細胞（ＡＰＣ）、またはＴ細胞リガンドおよび活性化抗体でコーティングされたビーズ、または標的細胞膜を捕捉するという観点で単離された細胞を用いてｅｘ−ｖｉｖｏで活性化されたＴ細胞；抗宿主腫瘍ＴＣＲを天然で発現する同種異系細胞；および「Ｔボディ」として知られる抗体に似た腫瘍認識能力を示す腫瘍反応性ＴＣＲまたはキメラＴＣＲ分子を発現するように遺伝的に再プログラム化または「再指令された」、腫瘍特異的ではない自己由来または同種異系細胞が挙げられる。これらの手法は、本明細書に記載の方法で使用可能なＴ細胞調製および免疫化のための多くのプロトコルを生じる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、血液、骨髄、リンパ、臍帯またはリンパ系器官に由来する。いくつかの態様では、細胞は、ヒト細胞である。細胞は、典型的には、初代細胞、例えば、対象から直接的に単離されたもの、および／または対象から単離され、凍結されたものである。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔ細胞の１つ以上の一部または他の細胞型、例えば、全Ｔ細胞集合、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ８＋細胞、およびこれらの部分集合、例えば、機能、活性化状態、成熟度、分化、増殖、再循環、局在化の能力および／または持続性能、抗原特異性、抗原受容体の種類、特定の臓器またはコンパートメント中の存在、マーカーまたはサイトカイン分泌プロファイルおよび／または分化の程度などによって定義されるものを含む。治療される対象に関し、細胞は、同種異系および／または自己由来であってもよい。いくつかの態様では、例えば、既製の技術について、細胞は、多能性であり、および／また複数の細胞種をつくり、例えば、幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。いくつかの実施形態では、この方法は、対象から細胞を単離することと、これを調製し、処理し、培養し、および／または操作することと、本明細書に記載されるように、凍結乾燥による保存の前または後に、同じ患者にこれを再び導入することとを含む。
【００８６】
特に、Ｔ細胞の一部の種類および部分集合（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）は、ナイーブＴ（ＴＮ）細胞、エフェクターＴ細胞（ＴＥＦＦ）、メモリーＴ細胞およびこれらの一部の種類、例えば、幹細胞メモリーＴ（ＴＳＣＭ）、セントラルメモリーＴ（ＴＣＭ）、エフェクターメモリーＴ（ＴＥＭ）、または最後まで分化したエフェクターメモリーＴ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、未成熟Ｔ細胞、成熟Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、粘膜関連インバリアントＴ（ＭＡＩＴ）細胞、天然に存在する適応制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞、ヘルパーＴ細胞、例えば、ＴＨ１細胞、ＴＨ２細胞、ＴＨ３細胞、ＴＨ１７細胞、ＴＨ９細胞、ＴＨ２２細胞、濾胞性ヘルパーＴ細胞、アルファ／ベータＴ細胞、およびデルタ／ガンマＴ細胞である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞集合のうち１つ以上が、特定のマーカー（例えば表面マーカー）について陽性である細胞、または特定のマーカーについて陰性である細胞が濃縮されているか、または枯渇している。ある場合、このようなマーカーは、Ｔ細胞の特定の集合（例えば、非メモリー細胞）では、存在しないか、または比較的低レベルで発現するが、Ｔ細胞の特定の他の集合（例えば、メモリー細胞）では、存在するか、または比較的高レベルで発現するマーカーである。
【００８８】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、非Ｔ細胞、例えば、Ｂ細胞、単球、または他の白血球細胞、例えば、ＣＤ１４で発現するマーカーの陰性選択によって、ＰＢＭＣサンプルから分離される。いくつかの態様では、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋選択工程は、ＣＤ４＋へルパー細胞と、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞とを分離するために使用される。このようなＣＤ４＋およびＣＤ８＋集合は、発現するマーカーの陽性選択または陰性選択によって、さらに部分集合へとソートされ、１つ以上のナイーブ、メモリーおよび／またはエフェクターＴ細胞部分集合で比較的高い程度に発現してもよい。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、例えば、それぞれの部分集合に関連する表面抗原に基づく陽性または陰性の選択によって、さらに、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリーおよび／またはセントラルメモリー幹細胞が濃縮されているか、または枯渇している。
【００９０】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、自己由来のＴ細胞である。この方法では、腫瘍サンプルは、患者から得られ、単一細胞懸濁物が得られる。単一細胞懸濁物は、任意の適切な様式で、例えば、機械的に（例えばｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳＴＭＤｉｓｓｏｃｉａｔｏｒ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、オーバーン、カリフォルニアを用いて腫瘍をばらばらにする）、または酵素的に（例えば、コラゲナーゼまたはＤＮアーゼ）得ることができる。腫瘍酵素消化物の単細胞懸濁物は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）中で培養される。
【００９１】
培養されたＴ細胞は、プールされ、急速に増殖させることができる。急速増殖は、抗原特異的Ｔ細胞の数を、約１０〜約１４日間で少なくとも約５０倍（例えば、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍または１００倍、またはもっと多く）増加させる。より好ましくは、急速増殖は、約１０〜約１４日間で少なくとも約２００倍（例えば、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、またはもっと多く）増加させる。
【００９２】
増殖は、当該技術分野で知られているような任意の多くの方法によって達成することができる。例えば、Ｔ細胞は、非特異的なＴ細胞受容体刺激を用いて、フィーダーリンパ球およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）のいずれか存在下で迅速に増殖させることができ、ＩＬ−２が好ましい。非特異的なＴ細胞受容体刺激は、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ｏｒｔｈｏ−ＭｃＮｅｉｌ（登録商標）、Ｒａｒｉｔａｎ、Ｎ．Ｊ．）を含んでいてもよい。または、Ｔ細胞は、癌の１つ以上の抗原（その抗原性部分、例えば、エピトープまたは細胞）を用いた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの刺激によって、迅速に増殖させることができ、Ｔ細胞成長因子（例えば、３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２またはＩＬ−１５）の存在下、場合により、ベクター、例えば、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチドペプチドから発現させることができ、ＩＬ−２が好ましい。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘発されるＴ細胞は、ＨＬＡ−Ａ２を発現する抗原提示細胞上に存在する癌の同じ抗原を用いた再刺激によって迅速に増殖する。または、Ｔ細胞は、例えば、照射された自己由来リンパ球で、または照射されたＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球およびＩＬ−２で、再び刺激されてもよい。
【００９３】
自己由来Ｔ細胞は、自己由来Ｔ細胞の成長および活性化を促進するＴ細胞成長因子を発現するように改変されてもよい。適切なＴ細胞成長因子としては、例えば、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２が挙げられる。適切な改変方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、３ｒｄｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．２００１；およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓおよびＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、１９９４を参照。特定の態様では、改変された自己由来Ｔ細胞は、Ｔ細胞成長因子を高レベルで発現する。Ｔ細胞成長因子コード配列（例えば、ＩＬ−１２のコード配列）は、当該技術分野で容易に入手可能であり、プロモーターと同様に、Ｔ細胞成長因子コード配列に対する作動可能な連結が、高レベルの発現を促進する。
【００９４】
Ｂ．ＮＫ細胞
いくつかの実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞である。ＮＫ細胞は骨髄および胸腺における種々の腫瘍細胞、ウイルス感染した細胞、およびいくつかの正常細胞に対し、自発的な細胞傷害性を有する、リンパ球の部分集合である。ＮＫ細胞は、形質変換され、ウイルス感染した細胞に対する初期の自然免疫応答の重要なエフェクターである。ＮＫ細胞は、ヒト末梢血中のリンパ球の約１０％を構成する。リンパ球がＩＬ−２存在下で培養される場合、強い細胞毒性の反応性が生じる。ＮＫ細胞は、サイズが大きいこと、その細胞質に特徴的なアズール顆粒が存在するため、大顆粒リンパ球として知られるエフェクター細胞である。ＮＫ細胞は、分化し、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃腺および胸腺で成熟する。ＮＫ細胞は、特定の表面マーカー、例えば、ヒトにおけるＣＤ１６、ＣＤ５６およびＣＤ８によって検出することができる。ＮＫ細胞は、Ｔ細胞抗原受容体、ｐａｎ  ＴマーカーＣＤ３、または表面免疫グロブリンＢ細胞受容体を発現しない。
【００９５】
ＮＫ細胞の刺激は、細胞表面の活性化および阻害性の受容体に由来するシグナルのクロストークによって達成される。ＮＫ細胞の活性化状態は、生殖株によってコードされる活性化受容体および阻害性受容体のアレイから受信した細胞内シグナルのバランスによって制御される（Ｃａｍｐｂｅｌｌ、２００６）。ＮＫ細胞が、異常細胞（例えば、腫瘍またはウイルス感染した細胞）に出会い、活性化シグナルが優勢である場合、ＮＫ細胞は、パーフォリンおよびグランザイムを含有する細胞傷害性顆粒、またはデスドメインを含有する受容体の直接的な分泌によって、標的細胞のアポトーシスをすぐに誘発することができる。活性化ＮＫ細胞はまた、Ｉ型の分泌型サイトカイン、例えば、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子−α、および先天性および獲得性の免疫細胞の両方を活性化する顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、他のサイトカインおよびケモカインであってもよい（Ｗｕｅｔ  ａｌ．，２００３）。初期の自然免疫応答におけるＮＫ細胞によるこれらの可溶性因子の産生は、他の造血細胞の動員および機能に顕著な影響を与える。また、サイトカインの物理的な接触および産生の間、ＮＫ細胞は、免疫応答を促進するか、または制限するために、樹状細胞および好中球との制御性クロストークネットワークにおいて中心的な役割をはたす。
【００９６】
特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、当該技術分野でよく知られている方法によって、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、非刺激白血球除去産物（ＰＢＳＣ）、ヒト胚幹細胞（ｈＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、骨髄、または臍帯の臍帯血に由来する。特に、ＮＫ細胞を誘導するために、臍帯ＣＢが使用される。特定の態様では、ＮＫ細胞は、ＮＫ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ増殖の既に記載されている方法によって単離され、増殖される（Ｓｈａｈｅｔ  ａｌ．，２０１３）。この方法で、ＣＢ単核細胞は、フィコール密度勾配遠心分離によって単離され、ＩＬ−２および人工の抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含むバイオリアクター中で培養する。７日後、細胞培養物は、ＣＤ３を発現する細胞が枯渇しており、これをさらに７日間再培養する。細胞は、再びＣＤ３が枯渇し、ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞またはＮＫ細胞の割合を決定するために特性決定される。他の方法では、臍帯のＣＢは、ＳＣＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−２を含有する培地中で培養することによって、ＣＤ３４＋細胞によってＮＫ細胞を導き、ＣＤ５６＋／ＣＤ３−細胞へと分化させるために使用される。
【００９７】
Ｃ．幹細胞
いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞（ＰＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または造血幹細胞（ＨＳＣ）であってもよい。
【００９８】
本明細書で使用される多能性幹細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞であってもよく、一般的に、ｉＰＳ細胞またはｉＰＳＣと省略される。多能性の誘発は、多能性と関連がある転写因子の導入によって体細胞を再プログラム化することによって、マウス細胞を用い、２００６年に初めて達成され（Ｙａｍａｎａｋａ  ｅｔ  ａｌ．２００６）、２００７年にヒト細胞を用いて達成された（Ｙｕｅｔ  ａｌ．２００７；Ｔａｋａｈａｓｈｉｅｔ  ａｌ２００７）。ｉＰＳＣの使用は、ＥＳ細胞の大規模な臨床的使用に関連する倫理的および現実的な問題の大部分を回避し、ｉＰＳＣ由来の自己由来移植片を有する患者は、移植拒絶を防ぐために、一生にわたる免疫抑制治療を必要としないだろう。
【００９９】
生殖細胞を除き、ｉＰＳＣの出発点として任意の細胞を使用することができる。例えば、細胞型は、ケラチノサイト、線維芽細胞、造血細胞、間葉系細胞、肝臓細胞、または胃細胞であってもよい。細胞分化の程度または細胞が集められる動物の年齢には、制限がない。まだ分化していない始原細胞（体細胞性幹細胞を含む）であっても、最後まで分化した成熟細胞であっても、本明細書に開示する方法で、体細胞源として使用することができる。
【０１００】
当業者に知られている方法を用い、ｉＰＳ細胞を製造するために体細胞を再プログラム化することができる。当業者は、ｉＰＳ細胞を容易に製造することができ、例えば、公開された米国特許出願第２００９／０２４６８７５号、公開された米国特許出願第２０１０／０２１００１４号、公開された米国特許出願第２０１２／０２７６６３６号、米国特許第８，０５８，０６５号、米国特許第８，１２９，１８７号、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ  ２００７／０６９６６６  Ａ１号、米国特許第８，２６８，６２０号、米国特許第８，５４６，１４０号、米国特許第９，１７５，２６８号、米国特許第８，７４１，６４８号、米国特許出願第２０１１／０１０４１２５号および米国特許第８，６９１，５７４号を参照（これらは本明細書に参考として組み込まれる）。一般的に、核再プログラム化因子を使用し、体細胞から多能性幹細胞を製造する。いくつかの実施形態では、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８のうち少なくとも３個または少なくとも４個が利用される。他の実施形態では、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ−ＭｙｃおよびＫｌｆ４が利用されるか、またはＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ＮａｎｏｇおよびＬｉｎ２８が利用される。
【０１０１】
これらの核再プログラム化物質のマウスおよびヒトｃＤＮＡ配列は、ＷＯ  ２００７／０６９６６６号および米国特許第８，１８３，０３８号（本明細書に参考として組み込まれる）に述べられているＮＣＢＩ寄託番号を参照しつつ入手可能である。１つ以上の再プログラム化物質、またはこれらの再プログラム化物質をコードする核酸を導入する方法は、当該技術分野で知られており、例えば、米国特許第８，２６８，６２０号、同第８，６９１，５７４号、同第８，７４１，６４８号、同第８，５４６，１４０号、公開された米国特許第８，９００，８７１号および米国特許第８，０７１，３６９号に開示され、これらは本明細書に参考として組み込まれる。
【０１０２】
誘導されると、ｉＰＳＣは、多能性を維持するのに十分な培地で培養されてもよい。ｉＰＳＣは、米国特許第７，４４２，５４８号および米国特許出願公開第２００３／０２１１６０３号に記載されるように、多能性幹細胞（より特定的には、胚性幹細胞）を培養するために開発された種々の媒体および技術と共に使用されてもよい。マウス細胞の場合、分化抑制因子として白血病阻害因子（ＬＩＦ）を通常培地に添加しつつ、培養を行う。ヒト細胞の場合、ＬＩＦの代わりに塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）を加えることが望ましい。当業者には知られているだろうが、ｉＰＳＣの培養および管理のための他の方法を、本明細書に開示する方法と共に使用されてもよい。
【０１０３】
特定の実施形態では、定義されていない状態を使用してもよい。例えば、多能性細胞は、幹細胞を未分化状態に維持するために、線維芽細胞フィーダー細胞、または線維芽細胞フィーダー細胞に露出した培地で培養されてもよい。いくつかの実施形態では、細胞は、フィーダー細胞として、細胞分裂を止めるために放射線または抗生物質で処理されたマウス胎児線維芽細胞が同時に存在する状態で培養される。または、多能性細胞は、所定のフィーダーから独立した培養系、例えば、ＴＥＳＲＴＭ培地またはＥ８ＴＭ／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８ＴＭ培地を用い、本質的に未分化の状態で培養され、維持されてもよい。
【０１０４】
プラスミドは、例えば、制御された高複製数を達成すること、および細菌におけるプラスミド不安定性の潜在的な原因を回避すること、ヒト細胞を含む哺乳動物細胞における使用と適合性のプラスミド選択のための手段を与えることなど、多くの目標を念頭に置きつつ設計されている。ヒト細胞に使用するためのプラスミドの２つの要求事項に、特に注意がはらわれてきた。第１に、プラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉでの管理および発酵に適しており、そのため、大量のＤＮＡを製造し、精製することができる。第２に、プラスミドは、ヒト患者および動物に使用するために安全であり、適している。第１の要求事項は、細菌発酵中に選択され、比較的容易に安定に維持されることが可能な高複製数のプラスミドを要求する。第２の要求事項は、選択可能なマーカーおよび他のコード配列などの要素に注意をはらう。いくつかの実施形態では、マーカーをコードするプラスミドは、以下のもので構成される。（１）高複製数の複製起点、（２）選択可能なマーカー、例えば、限定されないが、カナマイシンを用いた抗生物質選択のためのネオ遺伝子、（３）チロシナーゼエンハンサーを含む、転写終結配列、および（４）種々の核酸カセットを組み込むためのマルチクローニング部位、および（５）チロシナーゼプロモーターに作動可能に連結するマーカーをコードする核酸配列。特定の態様では、プラスミドは、チロシナーゼエンハンサーまたはプロモーターを含まない。あるタンパク質をコードする核酸を誘発するために当該技術分野で知られている多くのプラスミドベクターが存在する。これらのプラスミドベクターとしては、限定されないが、本明細書に参考として組み込まれる米国特許第６，１０３，４７０号、米国特許第７，５９８，３６４号、米国特許第７，９８９，４２５号および米国特許第６，４１６，９９８号、および米国特許出願第１２／４７８，１５４号に開示されるベクターが挙げられる。
【０１０５】
エピソーム遺伝子送達系は、プラスミド、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）系エピソームベクター、酵母系ベクター、アデノウイルス系ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）系エピソームベクター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）系ベクター、またはレンチウイルスベクターであってもよい。ウイルス遺伝子送達系は、ＲＮＡ系またはＤＮＡ系のウイルスベクターであってもよい。
【０１０６】
Ｄ．遺伝的に操作された抗原受容体
免疫細胞（例えば、自己由来または同種異系Ｔ細胞（例えば、制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、またはガンマデルタＴ細胞）、ＮＫ細胞、インバリアントＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、幹細胞（例えば、ＭＳＣまたはｉＰＳ細胞）は、操作されたＴＣＲおよび／またはＣＡＲなどの抗原受容体を発現するように遺伝的に操作されていてもよい。例えば、宿主細胞（例えば、自己由来または同種異系のＴ細胞）は、癌抗原に対する抗原特異性を有するＴＣＲを発現するように改変されている。特定の実施形態では、ＮＫ細胞は、ＴＣＲを発現するように操作されている。ＮＫ細胞は、ＣＡＲを発現するようにさらに操作されていてもよい。複数のＣＡＲおよび／またはＴＣＲ（例えば、異なる抗原に対するもの）は、単一の細胞型（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）に加えられてもよい。
【０１０７】
適切な改変方法は、当該技術分野で既知である。例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＡｕｓｕｂｅｌ（前掲）を参照。例えば、細胞は、Ｈｅｅｍｓｋｅｒｋｅｔ  ａｌ．，２００８およびＪｏｈｎｓｏｎｅｔ  ａｌ．，２００９に記載される形質導入技術を用い、ある癌の抗原に抗原特異性を有するＴＣＲを発現するように形質導入されてもよい。
【０１０８】
全長ＴＣＲαおよびβ（またはγおよびδ）鎖をコードするＲＮＡのエレクトロポレーションを、レトロウイルスによって形質導入され、内因性のＴＣＲ鎖の対形成によって生じる自己反応性に伴う長期間にわたる問題を克服するための代替物として使用してもよい。このような代替的な対形成が、一時的なトランスフェクション戦略で起こる場合であっても、生成する可能性がある自己反応性Ｔ細胞は、導入されたＴＣＲα鎖およびβ鎖が一時的にのみ発現するため、あるときから、その自己反応性を失うだろう。導入されたＴＣＲα鎖およびβ鎖の発現が減少したら、通常の自己由来Ｔ細胞のみが残される。これは、全長ＴＣＲ鎖が、安定なレトロウイルス形質導入によって導入される場合ではなく、導入されたＴＣＲ鎖は決して失われず、患者において自己反応性が一定して存在する。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上の抗原受容体をコードする遺伝子操作によって導入された１つ以上の核酸と、このような核酸の遺伝的に操作された産物を含む。いくつかの実施形態では、核酸は、異種であり、すなわち、細胞または細胞から得られたサンプル中には通常存在せず、例えば、別の生物または細胞から得られたものであり、例えば、操作される生物および／またはこのような細胞の由来となる生物において、通常はみられないものである。いくつかの実施形態では、核酸は、天然に存在せず、例えば、天然にはみられない核酸（例えば、キメラ）である。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、細胞表面で発現するタンパク質である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲ様のＣＡＲであり、抗原は、処理されたペプチド抗原、例えば、細胞内タンパク質のペプチド抗原であり、ＴＣＲと同様に、腫瘍組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子の観点で細胞表面で認識される。
【０１１１】
例示的な抗原受容体（ＣＡＲおよび組換えＴＣＲを含む）、および操作し、受容体を細胞に導入する方法としては、例えば、国際特許出願公開番号第ＷＯ２０００１４２５７号、ＷＯ２０１３１２６７２６号、ＷＯ２０１２／１２９５１４号、ＷＯ２０１４０３１６８７号、ＷＯ２０１３／１６６３２１号、ＷＯ２０１３／０７１１５４号、ＷＯ２０１３／１２３０６１号、米国特許出願公開番号第ＵＳ２００２１３１９６０号、ＵＳ２０１３２８７７４８号、ＵＳ２０１３０１４９３３７号、米国特許第６，４５１，９９５号、同第７，４４６，１９０号、同第８，２５２，５９２号、同第８，３３９，６４５号、同第８，３９８，２８２号、同第７，４４６，１７９号、同第６，４１０，３１９号、同第７，０７０，９９５号、同第７，２６５，２０９号、同第７，３５４，７６２号、同第７，４４６，１９１号、同第８，３２４，３５３号および同第８，４７９，１１８号、および欧州特許出願番号第ＥＰ２５３７４１６号、および／またはＳａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３；Ｄａｖｉｌａｅｔ  ａｌ．，２０１３；  Ｔｕｒｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２；Ｗｕｅｔ  ａｌ．，２０１２に記載されるものが挙げられる。いくつかの態様では、遺伝的に操作された抗原受容体としては、米国特許第７，４４６，１９０号に記載されるＣＡＲ、および国際特許出願公開番号第ＷＯ／２０１４０５５６６８  Ａ１号に記載されるものが挙げられる。
【０１１２】
１．キメラ抗原受容体
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（ａ）細胞内シグナル伝達ドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）抗原結合領域を含む細胞外ドメインとを含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、操作された抗原受容体は、活性化ＣＡＲまたは刺激ＣＡＲ、共刺激ＣＡＲ（ＷＯ２０１４／０５５６６８号を参照）および／または阻害ＣＡＲ（ｉＣＡＲ、Ｆｅｄｏｒｏｖｅｔ  ａｌ．，２０１３を参照）を含むＣＡＲを含む。ＣＡＲは、一般的に、いくつかの態様では、リンカーおよび／または膜貫通ドメインを介して、１つ以上の細胞内シグナル伝達構成要素に連結する細胞外抗原（またはリガンド）結合ドメインを含む。このような分子は、典型的には、天然抗原受容体によるシグナル、共刺激受容体と組み合わせた、このような受容体によるシグナル、および／または共刺激受容体のみによるシグナルを模倣し、またはそれに近づく。
【０１１４】
本発明の特定の実施形態は、免疫原性（ｈＣＡＲ）を減らすためにヒト化されたＣＡＲを含み、細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、１つ以上のシグナル伝達モチーフを含む細胞外ドメインとを含む、抗原特異的ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸を含め、核酸の使用に関する。特定の実施形態では、ＣＡＲは、１つ以上の抗原間に共有する空間を含むエピトープを認識してもよい。特定の実施形態では、結合領域は、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域および／またはその抗原結合フラグメントを含んでいてもよい。別の実施形態では、この特異性は、受容体に結合するペプチド（例えば、サイトカイン）に由来する。
【０１１５】
ヒトＣＡＲ核酸は、ヒト患者のための細胞免疫療法を向上させるために使用されるヒト遺伝子であってもよいことが想定される。具体的な実施形態では、本発明は、全長ＣＡＲ  ｃＤＮＡまたはコード領域を含む。抗原結合領域またはドメインは、例えば、本明細書に参考として組み込まれる米国特許第７，１０９，３０４号に記載されるような、特定のヒトモノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のＶＨおよびＶＬ鎖のフラグメントを含んでいてもよい。フラグメントはまた、ヒト抗原特異的抗体の任意の数の異なる抗原結合ドメインであってもよい。より具体的な実施形態では、フラグメントは、ヒト細胞において発現するためのヒトコドンの使用に適した配列によってコードされる、抗原特異的なｓｃＦｖである。
【０１１６】
この配置は、マルチマー性、例えば、ダイアボディまたはマルチマーであってもよい。マルチマーは、軽鎖および重鎖の可変部分が交差対形成してダイアボディになることによって大部分が形成されるようである。構築物のヒンジ部分は、全体的に欠失しているものから、第１のシステインが維持されているもの、セリン置換ではなくプロリンであるもの、第１のシステインまで先端切断されているものまで、複数の代替物を有していてもよい。Ｆｃ部分は、欠失していてもよい。安定であり、および／または二量体化する任意のタンパク質が、この目的に役立つだろう。Ｆｃドメインの１つだけ、例えば、ヒト免疫グロブリン由来のＣＨ２ドメインまたはＣＨ３ドメインのいずれかを使用してもよい。二量体化を改善するために改変されたヒト免疫グロブリンのヒンジ領域、ＣＨ２領域およびＣＨ３領域も使用してもよい。また、免疫グロブリンのヒンジ部分のみを使用してもよい。また、ＣＤ８αの一部を使用してもよい。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲ核酸は、他の共刺激受容体、例えば、膜貫通ドメインおよび改変されたＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列を含む。他の共刺激受容体としては、限定されないが、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ−４０（ＣＤ１３４）、ＤＡＰ１０および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）のうち１つ以上が挙げられる。ＣＤ３ζによって開始される一次シグナルに加え、ヒトＣＡＲに挿入されるヒト共刺激受容体によって与えられるさらなるシグナルは、ＮＫ細胞の全活性化にとって重要であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでの持続性を高め、養子免疫療法の治療上の成功に役立つだろう。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、特定の抗原（またはマーカーまたはリガンド）、例えば、養子治療によって標的とされる特定の細胞型で発現する抗原、例えば、癌マーカーおよび／または大きな応答を誘発することを意図する抗原、例えば、正常または疾患にかかっていない細胞型で発現する抗原についての特異性を有しつつ構築される。したがって、ＣＡＲは、典型的には、その細胞外部分に、１つ以上の抗原結合分子、例えば、１つ以上の抗原結合フラグメント、ドメイン、または一部、または１つ以上の抗体可変ドメインおよび／または抗体分子を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗原結合部分または抗体分子の一部、例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）に由来する一本鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。
【０１１９】
キメラ抗原受容体の特定の実施形態では、受容体の抗原特異的部分（抗原結合領域を含む細胞外ドメインと呼ばれることがある）は、腫瘍関連抗原または病原体に特異的な抗原結合ドメインを含む。抗原としては、パターン認識受容体によって認識される炭水化物抗原、例えば、Ｄｅｃｔｉｎ−１が挙げられる。腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞の細胞表面上で発現する限り、任意の種類のものであってもよい。腫瘍関連抗原の例示的な実施形態としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、アルファフェトプロテイン、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１、ＣＤ５６、ＥＧＦＲ、ｃ−Ｍｅｔ、ＡＫＴ、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、上皮性腫瘍抗原、メラノーマ関連抗原、変異ｐ５３、変異ｒａｓなどが挙げられる。特定の実施形態では、ＣＡＲは、少量の腫瘍関連抗原が存在する場合、持続性を高めるためにサイトカインと共に同時発現してもよい。例えば、ＣＡＲは、ＩＬ−１５と同時発現してもよい。
【０１２０】
キメラ受容体をコードするオープンリーディングフレームの配列は、ゲノムＤＮＡ源、ｃＤＮＡ源から得られてもよく、または合成されてもよく（例えば、ＰＣＲによる）、またはこれらの組み合わせであってもよい。イントロンがｍＲＮＡを安定化させることがわかっているので、ゲノムＤＮＡの大きさおよびイントロンの数に応じて、ｃＤＮＡまたはこれらの組み合わせを使用することが望ましい場合がある。また、ｍＲＮＡを安定化するために、内因性または外因性の非コード領域を使用することがさらに有利であろう。
【０１２１】
キメラ構築物は、裸のＤＮＡとして免疫細胞に、または適切なベクターに導入可能であることが想定される。裸のＤＮＡを用いるエレクトロポレーションによって細胞を安定にトランスフェクションする方法は、当該技術分野で既知である。例えば、米国特許第６，４１０，３１９号を参照。裸のＤＮＡは、一般的に、発現のための適切な向きにおいて、プラスミド発現ベクター中に含まれるキメラ受容体をコードするＤＮＡを指す。
【０１２２】
または、キメラ構築物を免疫細胞に導入するために、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター）を使用してもよい。本開示の方法にしたがって使用するのに適したベクターは、免疫細胞中で複製しない。細胞中に維持されるウイルスの複製数が、細胞の生存率を維持するのに十分なほど低い、ウイルスに由来する多数のベクター、例えば、ＨＩＶ、ＳＶ４０、ＥＢＶ、ＨＳＶまたはＢＰＶに基づくベクターが知られている。
【０１２３】
いくつかの態様では、抗原に特異的に結合するか、または認識する構成要素は、１つ以上の膜貫通および細胞内シグナル伝達ドメインに連結する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合した膜貫通ドメインを含む。一実施形態では、ＣＡＲ中のドメインの１つと天然で会合する膜貫通ドメインが使用される。ある場合に、受容体複合体の他の膜との相互作用を最小限にするために、同じかまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに対する、このようなドメインの結合を避けるために、膜貫通ドメインは、アミノ酸置換によって選択されるか、または改変される。
【０１２４】
膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態では、天然源または合成源のいずれかに由来する。その供給源が天然源である場合、ドメインは、いくつかの態様では、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域としては、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖またはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ３エプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ  １６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＧＩＴＲ／ＣＤ３５７、ＮＫＧ２ＤおよびＤＡＰ分子に由来するもの（すなわち、少なくとも膜貫通領域を含む）が挙げられる。または、膜貫通ドメインは、いくつかの実施形態では、合成である。いくつかの態様では、合成膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンなどの主に疎水性の残基を含む。いくつかの態様では、合成膜貫通ドメインのそれぞれの末端に、フェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンの３つが見出されるだろう。
【０１２５】
特定の実施形態では、免疫細胞（例えばＮＫ細胞）を遺伝的に改変するために本明細書に開示されるプラットフォーム技術は、（ｉ）エレクトロポレーションデバイス（例えば、ヌクレオフェクター）を用いた、非ウイルス性の遺伝子移動と、（ｉｉ）エンドドメインによってシグナル伝達するＣＡＲ（例えば、ＣＤ２８／ＣＤ３−ζ、ＣＤ１３７／ＣＤ３−ζ、または他の組み合わせ）と、（ｉｉｉ）細胞表面に対して抗原認識ドメインを接続する可変長の細胞外ドメインを有するＣＡＲと、ある場合に、（ｉｖ）ＣＡＲ＋免疫細胞を頑強に数値的に増殖させることができる、Ｋ５６２由来の人工の抗原提示細胞（ａＡＰＣ）（Ｓｉｎｇｈｅｔ  ａｌ．，２００８；Ｓｉｎｇｈｅｔ  ａｌ．，２０１１）。
【０１２６】
２．Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
いくつかの実施形態では、遺伝的に操作された抗原受容体は、組換えＴＣＲおよび／または天然に存在するＴ細胞からクローン化されたＴＣＲを含む。「Ｔ細胞受容体」または「ＴＣＲ」は、可変鎖およびβ鎖（それぞれＴＣＲαおよびＴＣＲβとしても知られる）または可変γ鎖およびδ鎖（これもそれぞれＴＣＲγおよびＴＣＲδとして知られる）を含み、ＭＨＣ受容体に結合した抗原ペプチドに特異的に結合することが可能な分子を指す。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、αβ形態である。
【０１２７】
典型的には、αβ形態およびγδ形態で存在するＴＣＲは、一般的に、構造的に似ているが、これらを発現するＴ細胞は、別個の解剖学的位置または機能を有していてもよい。ＴＣＲは、細胞表面に見出されてもよく、または可溶性形態で見出されてもよい。一般的に、ＴＣＲは、一般的に主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識を担うＴ細胞（またはＴリンパ球）の表面に見出されてもよい。いくつかの実施形態では、ＴＣＲはまた、定常ドメイン、膜貫通ドメインおよび／または短い細胞質尾部も含んでいてもよい（例えば、Ｊａｎｅｗａｙｅｔ  ａｌ、１９９７を参照）。例えば、いくつかの態様では、ＴＣＲの各鎖は、１つのＮ末端免疫グロブリン可変ドメインと、１つの免疫グロブリン定常ドメインと、膜貫通領域と、Ｃ末端に短い細胞質尾部とを有していてもよい。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、シグナル形質導入の介在に関与するＣＤ３複合体のインバリアントタンパク質と会合する。特に明記しない限り、「ＴＣＲ」との用語は、その機能性ＴＣＲフラグメントを包含すると理解すべきである。この用語は、αβ形態またはγδ形態のＴＣＲを含め、インタクトなＴＣＲまたは全長ＴＣＲも包含する。
【０１２８】
したがって、本明細書の目的のために、ＴＣＲとの言及は、任意のＴＣＲまたは機能性フラグメント、例えば、ＭＨＣ分子に結合する特定の抗原性ペプチド、すなわち、ＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するＴＣＲの抗原結合部分を含む。ＴＣＲの「抗原結合部分」または「抗原結合フラグメント」は、相互に置き換え可能に使用することができ、ＴＣＲの構造ドメインの一部を含むが、全長ＴＣＲに結合する抗原（例えば、ＭＨＣ−ペプチド複合体）に結合する分子を指す。ある場合、抗原結合部分は、一般的に各鎖が３個の相補性決定領域を含むため、特定のＭＨＣ−ペプチド複合体に結合するための結合部位を作成するのに十分な、ＴＣＲの可変ドメイン、例えば、ＴＣＲの可変α鎖および可変β鎖を含む。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖の可変ドメインが会合してループを形成するか、または免疫グロブリンに類似した相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成し、ペプチド特異性を決定し、ＴＣＲ分子の結合部位を生成することによって抗原認識を与え、ペプチド特異性を決定する。典型的には、免疫グロブリンと同様に、ＣＤＲは、フレームワーク領域（ＦＲ）によって分離される（例えば、Ｊｏｒｅｓｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；  Ｌｅｆｒａｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，２００３を参照）。いくつかの実施形態では、ＣＤＲ３は、処理された抗原を認識することに関与する主要ＣＤＲであるが、α鎖のＣＤＲ１は、抗原性ペプチドのＮ末端部分と相互作用することも示されており、一方、β鎖のＣＤＲ１は、ペプチドのＣ末端部分と相互作用する。ＣＤＲ２は、ＭＨＣ分子を認識すると考えられる。いくつかの実施形態では、β鎖の可変領域は、さらなる超可変性（ＨＶ４）領域を含んでいてもよい。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖は、定常ドメインを含む。例えば、免疫グロブリンと同様に、ＴＣＲ鎖の細胞外部分（例えばα鎖、β鎖）は、２つの免疫グロブリンドメイン、可変ドメイン（例えば、ＶａまたはＶｐ；典型的には、Ｋａｂａｔｅｔ  ａｌ、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、ＵＳ  Ｄｅｐｔ．  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、１９９１、５ｔｈｅｄ．）によるＫａｂａｔ番号付けに基づき、Ｎ末端にアミノ酸１〜１１６、細胞膜に隣接して、１つの定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインまたはＣａ、典型的には、Ｋａｂａｔに基づき、アミノ酸１１７〜２５９、β鎖定常ドメインまたはＣｐ、典型的には、Ｋａｂａｔに基づき、アミノ酸１１７〜２９５）を含んでいてもよい。例えば、ある場合、２つの鎖によって形成されるＴＣＲの細胞外部分は、２つの膜に近位の定常ドメインと、ＣＤＲを含む２つの膜に遠位の可変ドメインとを含む。ＴＣＲドメインの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成する短い接続配列を含み、２つの鎖の間に連結を生成する。いくつかの実施形態では、ＴＣＲが２個のジスルフィド結合を定常ドメイン中に含むように、ＴＣＲは、α鎖およびβ鎖それぞれにおいて、さらなるシステイン残基を有していてもよい。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖は、膜貫通ドメインを含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、正に帯電していてもよい。ある場合、ＴＣＲ鎖は、細胞質尾部を含む。ある場合、この構造によって、ＴＣＲはＣＤ３のような他の分子と会合することができる。例えば、膜貫通領域を有する定常ドメインを含むＴＣＲは、細胞膜にタンパク質を固定し、ＣＤ３シグナル伝達装置または複合体のインバリアントサブユニットと会合してもよい。
【０１３２】
一般的に、ＣＤ３は、哺乳動物において３個の別個の鎖（γ、δおよびε）およびζ鎖を有していてもよい、複数タンパク質の複合体である。例えば、哺乳動物において、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３δ鎖、２つのＣＤ３ε鎖およびＣＤ３ζ鎖のホモダイマーを含んでいてもよい。Ｔｈｅ  ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖は、単一の免疫グロブリンドメインを含む免疫グロブリンスーパーファミリーの高度に関連する細胞表面タンパク質である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖の膜貫通領域は、負に帯電しており、これらの鎖を、正に帯電したＴ細胞受容体鎖と会合可能にする特徴である。ＣＤ３γ、ＣＤ３δおよびＣＤ３ε鎖の細胞内尾部は、それぞれ、免疫受容体チロシン系活性化モチーフ、すなわちＩＴＡＭとして知られる、単一の保存されたモチーフを含み、一方、各ＣＤ３ζ鎖は、３個を有する。一般的に、ＩＴＡＭは、ＴＣＲ複合体のシグナル伝達能力に関与する。これらの補助分子は、負に帯電した膜貫通領域を有し、細胞内のＴＣＲからのシグナルを伝播する役割をはたす。ＣＤ３鎖およびζ鎖は、ＴＣＲと共に、Ｔ細胞受容体複合体として知られるものを生成する。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、２つの鎖αおよびβ（または場合によりγおよびδ）のヘテロダイマーであってもよく、または一本鎖ＴＣＲ構築物であってもよい。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、例えば、１つまたは複数のジスルフィド結合によって連結した２個の別個の鎖（α鎖およびβ鎖またはγ鎖およびδ鎖）を含むヘテロダイマーである。いくつかの実施形態では、標的抗原（例えば、癌抗原）のためのＴＣＲは、同定され、細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＴＣＲをコードする核酸は、例えば、公的に入手可能なＴＣＲ  ＤＮＡ配列のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅によって、種々の供給源から得られてもよい。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、生物学的供給源から、Ｔ細胞（例えば細胞傷害性Ｔ細胞）、Ｔ細胞ハイブリドーマまたは他の公的に利用可能な供給源からの細胞から得られる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで単離された細胞から得られてもよい。いくつかの実施形態では、高アフィニティＴ細胞クローンは、患者から単離されてもよく、ＴＣＲが単離される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、培養されたＴ細胞ハイブリドーマまたはクローンであってもよい。いくつかの実施形態では、標的抗原のためのＴＣＲクローンは、ヒト免疫系遺伝子（例えば、ヒト白血球抗原系、すなわちＨＬＡ）で操作されたトランスジェニックマウスにおいて作成された。例えば、腫瘍抗原（例えば、Ｐａｒｋｈｕｒｓｔｅｔ  ａｌ、２００９およびＣｏｈｅｎｅｔ  ａｌ．，２００５を参照）。いくつかの実施形態では、ファージディスプレイは、標的抗原に対してＴＣＲを単離するために使用される（例えば、Ｖａｒｅｌａ−Ｒｏｈｅｎａｅｔ  ａｌ、２００８およびＬｉ、２００５を参照）。いくつかの実施形態では、ＴＣＲまたはその抗原結合部分は、ＴＣＲ配列の知識から合成によって作られてもよい。
【０１３４】
３．抗原提示細胞
抗原提示細胞は、マクロファージ、Ｂリンパ球および樹状細胞を含み、特定のＭＨＣ分子のこれらの発現とは区別される。ＡＰＣは、抗原を内在化し、その外側細胞膜上のＭＨＣ分子と共に、その抗原の一部を再び発現する。ＭＨＣは、多重遺伝子座との大きな遺伝的複合体である。ＭＨＣ遺伝子座は、クラスＩおよびクラスＩＩ  ＭＨＣと呼ばれる２つの主要なクラスのＭＨＣ膜分子をコードする。Ｔヘルパーリンパ球は、一般的に、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合する抗原を認識し、Ｔ細胞傷害性リンパ球は、ＭＨＣクラスＩ分子と会合する抗原を認識する。ヒトにおいて、ＭＨＣは、ＨＬＡ複合体と呼ばれ、マウスにおいて、Ｈ−２複合体と呼ばれる。
【０１３５】
ある場合、ａＡＰＣは、実施形態の治療組成物および細胞治療産物を調製するのに有用である。調製に関する一般的なガイダンスと抗原提示系の使用について、例えば、米国特許番号第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号、同第６，３６２，００１号および同第６，７９０，６６２号、米国特許出願公開番号第２００９／００１７０００号および同第２００９／０００４１４２；および国際公開番号第ＷＯ２００７／１０３００９号を参照。
【０１３６】
ａＡＰＣ系は、少なくとも１つの外因性補助分子を含んでいてもよい。任意の適切な数および組み合わせの補助分子を使用してもよい。補助分子は、共刺激分子および接着分子などの補助分子から選択されてもよい。例示的な共刺激分子としては、ＣＤ８６、ＣＤ６４（ＦｃγＲＩ）、４１ＢＢリガンドおよびＩＬ−２１が挙げられる。接着分子としては、炭水化物結合糖タンパク質、例えば、セレクチン、膜貫通結合糖タンパク質、例えば、インテグリン、カルシウム依存性タンパク質、例えば、カドヘリン、１回通過膜貫通免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリータンパク質、例えば、細胞と細胞の接触または細胞とマトリックスの接触を促進する細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）が挙げられる。例示的な接着分子としては、ＬＦＡ−３およびＩＣＡＭ、例えば、ＩＣＡＭ−１が挙げられる。共刺激分子および接着分子を含め、例示的な補助分子の選択、クローニング、調製および発現に有用な技術、方法および試薬は、例えば、米国特許第６，２２５，０４２号、同第６，３５５，４７９号および同第６，３６２，００１号に例示される。
【０１３７】
４．インターロイキン−１５
インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）は、組織制限されており、病的な状態でのみ、血清中または全身に任意のレベルで観察される。ＩＬ−１５は、養子治療にとって望ましいいくつかの属性を有する。ＩＬ−１５は、ナチュラルキラー細胞の成長および細胞増殖を誘発し、耐腫瘍性の細胞の機能的抑制を軽減することによって、確立された腫瘍の根絶を促進し、ＡＩＣＤを阻害する恒常性サイトカインである。
【０１３８】
一実施形態では、本開示は、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲ免疫細胞をＩＬ−１５を用いて同時改変することに関する。ＩＬ−１５に加え、他のサイトカインが想定される。これらとしては、限定されないが、サイトカイン、ケモカイン、およびヒト用途に使用される細胞の活性化および増殖に寄与する他の分子が挙げられる。ＩＬ−１５を発現するＮＫ細胞またはＴ細胞は、継続的な補助的なサイトカインシグナル伝達が可能であり、これは注入後の生存にとって重要である。
【０１３９】
特定の実施形態では、所望な抗原抗原（例えば、ＣＤ１９）を、共刺激分子、例えば、ＣＤ２８、ＩＬ−１５およびＣＤ３ζと共に発現するＫ５６２  ａＡＰＣが開発され、持続性のＣＡＲが介在する増殖が可能な免疫細胞（例えば、ＮＫ細胞）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで選択した。この強力な技術によって、臨床的に関連する数（１０１０まで）のヒト用途に適したＣＡＲ＋ＮＫ細胞を製造することができる。必要な場合、さらに多数の遺伝的に改変されたＮＫ細胞を作成するために、さらなる刺激サイクルを受けてもよい。典型的には、繁殖させたＮＫ細胞の少なくとも９０％がＣＡＲを発現し、注入のために凍結乾燥させることができる。さらに、この手法は、導入されたＣＡＲの特異性と、ａＡＰＣ上のＣＡＲによって認識される腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現とを対にすることによって、ＮＫ細胞から多様な腫瘍型が生成するのを抑制することができる。
【０１４０】
遺伝的改変の後、細胞をすぐに注入してもよく、または保存してもよい。特定の態様では、遺伝的改変の後、細胞への遺伝子移動から約１日、２日、３日、４日、５日以内に塊集合として、細胞は、数日間、数週間または数ヶ月間、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖されてもよい。さらなる態様では、形質転換体は、クローン化され、クローンは、単一の統合されているか、またはエピソームにより維持された発現カセットまたはプラスミドの存在を示し、キメラ受容体の発現は、ｅｘ  ｖｉｖｏで増殖される。増殖のために選択されるクローンは、ＣＤ１９を発現する標的細胞を特異的に認識し、溶解する能力を示す。組換え免疫細胞は、ＩＬ−２、または共通のγ鎖に結合する他のサイトカイン（例えば、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１など）を用いた刺激によって増殖してもよい。組換え免疫細胞は、人工の抗原提示細胞を用いた刺激によって増殖してもよい。さらなる態様では、遺伝的に改変された細胞は、凍結保存されてもよい。
【０１４１】
５．抗原
遺伝的に操作された抗原受容体によって標的とされる抗原は、特に、養子細胞治療によって標的とされる疾患、状態または細胞型の観点で表されるものである。特に、疾患および状態は、増殖性、新生物性および悪性の疾患および障害であり、癌および腫瘍を含み、血液癌、免疫系の癌、例えば、リンパ腫、白血病および／または骨髄腫、例えば、Ｂ、Ｔおよび骨髄性白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、正常細胞または標的とされていない細胞または組織と比較して、疾患または状態の細胞、例えば、腫瘍または病原体細胞で選択的に発現するか、または過剰発現する。他の実施形態では、抗原は、正常細胞で発現するか、および／または操作された細胞で発現する。
【０１４２】
任意の適切な抗原が、本発明での用途が見つかるだろう。例示的な抗原としては、限定されないが、感染因子からの抗原性分子、自己／自家抗原、腫瘍／癌に関連する抗原、および腫瘍ネオアンチゲンが挙げられる（Ｌｉｎｎｅｍａｎｎｅｔ  ａｌ．，２０１５）。特定の態様では、抗原としては、ＮＹ−ＥＳＯ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、Ｍｕｃ−１、Ｈｅｒ２、ＣＡ−１２５、ＷＴ−１、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４、Ｍａｇｅ−Ａ１０、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４およびＣＥＡが挙げられる。特定の態様では、２つ以上の抗原受容体のための抗原としては、限定されないが、ＣＤ１９、ＥＢＮＡ、ＷＴ１、ＣＤ１２３、ＮＹ−ＥＳＯ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＭＵＣ１、ＨＥＲ２、ＣＡ−１２５、ＷＴ１、Ｍａｇｅ−Ａ３、Ｍａｇｅ−Ａ４、Ｍａｇｅ−Ａ１０、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４および／またはＣＥＡが挙げられる。これらの抗原のための配列は、当該技術分野で既知であり、例えば、ＣＤ１９（寄託番号ＮＧ＿００７２７５．１）、ＥＢＮＡ（寄託番号ＮＧ＿００２３９２．２）、ＷＴ１（寄託番号ＮＧ＿００９２７２．１）、ＣＤ１２３（寄託番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＮＹ−ＥＳＯ（寄託番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（寄託番号ＮＧ＿００７７２６．３）、ＭＵＣ１（寄託番号ＮＧ＿０２９３８３．１）、ＨＥＲ２（寄託番号ＮＧ＿００７５０３．１）、ＣＡ−１２５（寄託番号ＮＧ＿０５５２５７．１）、ＷＴ１（寄託番号ＮＧ＿００９２７２．１）、Ｍａｇｅ−Ａ３（寄託番号ＮＧ＿０１３２４４．１）、Ｍａｇｅ−Ａ４（寄託番号ＮＧ＿０１３２４５．１）、Ｍａｇｅ−Ａ１０（寄託番号ＮＣ＿００００２３．１１）、ＴＲＡＩＬ／ＤＲ４（寄託番号ＮＣ＿０００００３．１２）および／またはＣＥＡ（寄託番号ＮＣ＿００００１９．１０）である。
【０１４３】
腫瘍関連抗原は、前立腺、乳房、結腸直腸、肺、膵臓、腎臓、中皮腫、卵巣、または黒色腫癌に由来していてもよい。例示的な腫瘍関連抗原または腫瘍細胞由来の抗原としては、ＭＡＧＥ  １、３およびＭＡＧＥ  ４（または他のＭＡＧＥ抗原、例えば、国際特許公開番号第ＷＯ９９／４０１８８号に開示されているもの）；ＰＲＡＭＥ；ＢＡＧＥ；ＲＡＧＥ、Ｌａｇｅ（ＮＹ  ＥＳＯ  １としても知られる）；ＳＡＧＥ；およびＨＡＧＥまたはＧＡＧＥが挙げられる。腫瘍抗原のこれらの非限定例は、黒色腫、肺癌腫、肉腫および膀胱癌腫などの多種多様な種類の腫瘍で発現する。例えば、米国特許第６，５４４，５１８号を参照。前立腺癌の腫瘍関連抗原としては、例えば、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、前立腺酸ホスフェート、ＮＫＸ３．１および前立腺（ＳＴＥＡＰ）の６回膜貫通形上皮抗原が挙げられる。
【０１４４】
他の腫瘍関連抗原としては、Ｐｌｕ−１、ＨＡＳＨ−１、ＨａｓＨ−２、ＣｒｉｐｔｏおよびＣｒｉｐｔｉｎが挙げられる。さらに、腫瘍抗原は、自己ペプチドホルモン、例えば、多くの癌の治療に有用な、短い１０アミノ酸長のペプチドである全長ゴナドトロフィンホルモン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）であってもよい。
【０１４５】
腫瘍抗原としては、腫瘍関連抗原発現、例えば、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現によって特徴付けられる癌に由来する腫瘍抗原が挙げられる。目的の腫瘍関連抗原としては、系統特異的な腫瘍抗原、例えば、メラニン細胞−黒色腫系統の抗原ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ｇｐ７５、ｍｄａ−７、チロシナーゼおよびチロシナーゼ関連タンパク質が挙げられる。具体的な腫瘍関連抗原としては、限定されないが、ｐ５３、Ｒａｓ、ｃ−Ｍｙｃ、細胞質セリン／トレオニンキナーゼのうち任意の１つ以上に由来するか、またはこれらを含む腫瘍抗原（例えば、Ａ−Ｒａｆ、Ｂ−ＲａｆおよびＣ−Ｒａｆ、サイクリン依存性キナーゼ）、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＲＴ−１、ＢＡＧＥ、ＤＡＭ−６、−１０、ＧＡＧＥ−１、−２、−８、ＧＡＧＥ−３、−４、−５、−６、−７Ｂ、ＮＡ８８−Ａ、ＭＡＲＴ−１、ＭＣ１Ｒ、Ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＰＳＭ、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＡＲＴ−４、ＣＡＭＥＬ、ＣＥＡ、Ｃｙｐ−Ｂ、ｈＴＥＲＴ、ｈＴＲＴ、ｉＣＥ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ホスホイノシチド  ３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）、ＴＲＫ受容体、ＰＲＡＭＥ、Ｐ１５、ＲＵ１、ＲＵ２、ＳＡＲＴ−１、ＳＡＲＴ−３、ウィルムス腫瘍抗原（ＷＴ１）、ＡＦＰ、−カテニン／ｍ、カスパーゼ−８／ｍ、ＣＥＡ、ＣＤＫ−４／ｍ、ＥＬＦ２Ｍ、ＧｎＴ−Ｖ、Ｇ２５０、ＨＳＰ７０−２Ｍ、ＨＳＴ−２、ＫＩＡＡ０２０５、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ミオシン／ｍ、ＲＡＧＥ、ＳＡＲＴ−２、ＴＲＰ−２／ＩＮＴ２、７０７−ＡＰ、アネキシンＩＩ、ＣＤＣ２７／ｍ、ＴＰＩ／ｍｂｃｒ−ａｂｌ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、インターフェロン制御因子４（ＩＲＦ４）、ＥＴＶ６／ＡＭＬ、ＬＤＬＲ／ＦＵＴ、Ｐｍｌ／ＲＡＲ、腫瘍関連カルシウムシグナルトランスデューサー１（ＴＡＣＳＴＤ１）、ＴＡＣＳＴＤ２、受容体チロシンキナーゼ（｛例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）（特に、ＥＧＦＲｖＩＩＩ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、血管内皮成長因子受容体（ＶＥＧＦＲ））、細胞質チロシンキナーゼ（例えば、ｓｒｃ−ファミリー、ｓｙｋ−ＺＡＰ７０ファミリー）、インテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）、転写ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴＳおよびＳＴＡＴＥのシグナルトランスデューサーおよびアクチベーター、低酸素誘導因子（例えば、ＨＩＦ−１およびＨＩＦ−２）、核因子κＢ（ＮＦ−Ｂ）、ノッチ受容体（例えば、Ｎｏｔｃｈ１−４）、ｃ−Ｍｅｔ、ラパマイシン（ｍＴＯＲ）の哺乳動物標的、ＷＮＴ、細胞外シグナル制御キナーゼ（ＥＲＫ）、およびこれらの制御サブユニット、ＰＭＳＡ、ＰＲ−３、ＭＤＭ２、メソテリン、腎細胞癌−５Ｔ４、ＳＭ２２−α、炭酸脱水酵素Ｉ（ＣＡＩ）およびＩＸ（ＣＡＩＸ）（Ｇ２５０としても知られる）、ＳＴＥＡＤ、ＴＥＬ／ＡＭＬ１、ＧＤ２、プロテイナーゼ３、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座切断点、ＥｐｈＡ２、ＭＬ−ＩＡＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、���皮、ＰＳＣＡ、ｓＬｅ、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧＬｏｂｏＨ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧｓＳ、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ  １、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、ＴＩＥ２、Ｐａｇｅ４、ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＦＡＰ、ＭＡＤ−ＣＴ−２、Ｆｏｓ関連抗原１、ＣＢＸ２、ＣＬＤＮ６、ＳＰＡＮＸ、ＴＰＴＥ、ＡＣＴＬ８、ＡＮＫＲＤ３０Ａ、ＣＤＫＮ２Ａ、ＭＡＤ２Ｌ１、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＳＵＮＣ１、ＬＲＲＮ１およびイディオタイプが挙げられる。
【０１４６】
抗原は、腫瘍細胞の遺伝子変異に由来するか、または正常細胞と比較して、腫瘍細胞で異なるレベルで転写される遺伝子に由来するエピトープ領域またはエピトープペプチド、例えば、テロメラーゼ酵素、サバイビン、メソテリン、変異ｒａｓ、ｂｃｒ／ａｂｌ再配置、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、変異または野生型ｐ５３、チトクロムＰ４５０  １Ｂ１、異常に発現したイントロン配列、例えば、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ−Ｖ；骨髄腫およびＢ細胞リンパ腫において固有のイディオタイプを生成する免疫グロブリン遺伝子のクローン性の再配置；癌ウイルス工程、例えば、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６およびＥ７に由来するエピトープ領域またはエピトープペプチドを含む腫瘍抗原；Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｂａｒウイルスタンパク質ＬＭＰ２；腫瘍が選択的に発現する、変異していない腫瘍胎児タンパク質、例えば、癌胎児性抗原およびα−フェトプロテインを含んでいてもよい。
【０１４７】
他の実施形態では、抗原は、病原体微生物または日和見的病原体微生物（本明細書では感染症微生物とも呼ばれる）、例えば、ウイルス、真菌、寄生虫および細菌から得られるか、またはこれらに由来する。特定の実施形態では、このような微生物に由来する抗原は、全長タンパク質を含む。
【０１４８】
抗原が本明細書に記載する方法で使用することが想定されている具体的な病原性生物としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）、呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）、インフルエンザＡ、ＢおよびＣ、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、ポリオーマウイルス（例えば、ＢＫウイルスおよびＪＣウイルス）、アデノウイルス、メチシリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを含むＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種が挙げられる。当業者によって理解されるだろうが、本明細書に記載されるように抗原として使用するためのこれらおよび他の病原性微生物に由来するタンパク質、およびこのタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、刊行物および公的なデータベース、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）で特定されてもよい。
【０１４９】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来する抗原としては、ＨＩＶビリオン構造タンパク質（例えば、ｇｐ１２０、ｇｐ４１、ｐ１７、ｐ２４）、プロテアーゼ、逆転写酵素、または、ｔａｔ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｉｆ、ｖｐｒおよびｖｐｕによってコードされるＨＩＶタンパク質のいずれかが挙げられる。
【０１５０】
ヘルペス単純ウイルス由来の抗原（例えば、ＨＳＶ１およびＨＳＶ２）は、限定されないが、ＨＳＶ後期遺伝子から発現されるタンパク質を含む。この後期の遺伝子群は、ビリオン粒子を形成するタンパク質を優先的にコードする。このようなタンパク質は、ウイルスカプシドＵＬ６、ＵＬ１８、ＵＬ３５、ＵＬ３８および主要なカプシドタンパク質ＵＬ１９、ＵＬ４５およびＵＬ２７を形成する５種類のタンパク質（ＵＬ）を含み、それぞれが、本明細書に記載される抗原として使用されてもよい。本明細書で抗原としての使用について想定される他の具体的なＨＳＶタンパク質としては、ＩＣＰ２７（Ｈ１、Ｈ２）、糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）および糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）タンパク質が挙げられる。ＨＳＶゲノムは、少なくとも７４の遺伝子を含み、それぞれが、抗原として潜在的に使用可能なタンパク質をコードする。
【０１５１】
サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の抗原としては、ＣＭＶ構造タンパク質、ウイルス複製の最初期および初期段階中に発現するウイルス抗原、糖タンパク質ＩおよびＩＩＩ、カプシドタンパク質、コートタンパク質、下側マトリックスタンパク質ｐｐ６５（ｐｐＵＬ８３）、ｐ５２（ｐｐＵＬ４４）、ＩＥ１および１Ｅ２（ＵＬ１２３およびＵＬ１２２）、ＵＬ１２８−ＵＬ１５０由来の遺伝子のクラスターからのタンパク質産物（Ｒｙｋｍａｎ、ｅｔ  ａｌ．，２００６）、外被糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、ｇＨ、ｇＮおよびｐｐ１５０が挙げられる。当業者によって理解されるだろうが、本明細書に記載される抗原として使用するためのＣＭＶタンパク質は、公的データベース、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）で特定されてもよい（例えば、Ｂｅｎｎｅｋｏｖｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｌｏｅｗｅｎｄｏｒｆｅｔ  ａｌ、２０１０；Ｍａｒｓｃｈａｌｌｅｔ  ａｌ、２００９を参照）。
【０１５２】
特定の実施形態での使用が想定されているＥｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｎウイルス（ＥＢＶ）由来の抗原としては、ＥＢＶ溶解タンパク質ｇｐ３５０およびｇｐ１１０、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｎ核抗原（ＥＢＮＡ）−１、ＥＢＮＡ−２、ＥＢＮＡ−３Ａ、ＥＢＮＡ−３Ｂ、ＥＢＮＡ−３Ｃ、ＥＢＮＡ−リーダータンパク質（ＥＢＮＡ−ＬＰ）および後期膜タンパク質（ＬＭＰ）−１、ＬＭＰ−２ＡおよびＬＭＰ−２Ｂを含む後期周期感染中に作られるＥＢＶタンパク質が挙げられる（例えば、Ｌｏｃｋｅｙｅｔ  ａｌ．，２００８を参照）。
【０１５３】
本明細書での使用が想定されている呼吸系発疹ウイルス（ＲＳＶ）由来の抗原としては、ＲＳＶゲノムによってコードされる１１種類のタンパク質のいずれか、またはその抗原性フラグメントが挙げられる。ＮＳ１、ＮＳ２、Ｎ（ヌクレオカプシドタンパク質）、Ｍ（マトリックスタンパク質）ＳＨ、ＧおよびＦ（ウイルスコートタンパク質）、Ｍ２（第２のマトリックスタンパク質）、Ｍ２−１（伸長因子）、Ｍ２−２（転写制御）、ＲＮＡポリメラーゼおよびホスホタンパク質Ｐ。
【０１５４】
使用が想定されているＶｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓウイルス（ＶＳＶ）由来の抗原としては、ＶＳＶゲノムによってコードされる５種類の主要タンパク質、およびその抗原性フラグメント：大きなタンパク質（Ｌ）、糖タンパク質（Ｇ）、核タンパク質（Ｎ）、ホスホタンパク質（Ｐ）およびマトリックスタンパク質（Ｍ）のうちいずれか１つが挙げられる（例えば、Ｒｉｅｄｅｒｅｔ  ａｌ．，１９９９を参照）。
【０１５５】
特定の実施形態で使用が想定されているインフルエンザウイルス由来の抗原としては、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ノイラミニダーゼ（ＮＡ）、核タンパク質（ＮＰ）、マトリックスタンパク質Ｍ１およびＭ２、ＮＳ１、ＮＳ２（ＮＥＰ）、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ１−Ｆ２およびＰＢ２が挙げられる。
【０１５６】
また、例示的なウイルス抗原としては、限定されないが、アデノウイルスポリペプチド、アルファウイルスポリペプチド、カリシウイルスポリペプチド（例えば、カリシウイルスカプシド抗原）、コロナウイルスポリペプチド、ジステンパーウイルスポリペプチド、エボラウイルスポリペプチド、エンテロウイルスポリペプチド、フラビウイルスポリペプチド、肝炎ウイルス（ＡＥ）ポリペプチド（肝炎Ｂコアまたは表面抗原、肝炎ＣウイルスＥ１またはＥ２糖タンパク質、コアまたは非構造タンパク質）、ヘルペスウイルスポリペプチド（ヘルペス単純ウイルスまたは水痘帯状疱疹ウイルス糖タンパク質を含む）、伝染性腹膜炎ウイルスポリペプチド、白血病ウイルスポリペプチド、マールブルグウイルスポリペプチド、オルトミクソウイルスポリペプチド、パピローマウイルスポリペプチド、パラインフルエンザウイルスポリペプチド（例えば、血球凝集素およびノイラミニダーゼポリペプチド）、パラミクソウイルスポリペプチド、パルボウイルスポリペプチド、ペスチウイルスポリペプチド、ピコルナウイルスポリペプチド（例えば、ポリオウイルスカプシドポリペプチド）、ポックスウイルスポリペプチド（例えば、ワクシニアウイルスポリペプチド）、狂犬病ウイルスポリペプチド（例えば、狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇ）、レオウイルスポリペプチド、レトロウイルスポリペプチドおよびロタウイルスポリペプチドが挙げられる。
【０１５７】
特定の実施形態では、抗原は、細菌抗原であってもよい。特定の実施形態では、目的の細菌抗原は、分泌されたポリペプチドであってもよい。他の特定の実施形態では、細菌抗原としては、細菌の外側細胞表面に露出したポリペプチドの一部または複数の部分を有する抗原が挙げられる。
【０１５８】
使用が想定されるメシチリン耐性Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＭＲＳＡ）を含むＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ種に由来する抗原としては、病原性制御因子、例えば、Ａｇｒ系、ＳａｒおよびＳａｅ、Ａｒｌ系、Ｓａｒホモログ（Ｒｏｔ、ＭｇｒＡ、ＳａｒＳ、ＳａｒＲ、ＳａｒＴ、ＳａｒＵ、ＳａｒＶ、ＳａｒＸ、ＳａｒＺおよびＴｃａＲ）、Ｓｒｒ系およびＴＲＡＰが挙げられる。抗原として役立ち得る他のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓタンパク質としては、Ｃｌｐタンパク質、ＨｔｒＡ、ＭｓｒＲ、アコチナーゼ、ＣｃｐＡ、ＳｖｒＡ、Ｍｓａ、ＣｆｖＡおよびＣｆｖＢが挙げられる（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２００８  Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｅｄ．Ｊｏｄｉ  Ｌｉｎｄｓａｙを参照）。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓの２つの種についてのゲノム（Ｎ３１５およびＭｕ５０）は、配列決定され、公的に入手可能であり、例えば、ＰＡＴＲＩＣ（ＰＡＴＲＩＣ：Ｔｈｅ  ＶＢＩ  ＰａｔｈｏＳｙｓｔｅｍｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｓｎｙｄｅｒｅｔ  ａｌ．，２００７）で入手可能である。当業者によって理解されるだろうが、抗原として使用するためのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓタンパク質は、他の公的データベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ（登録商標）およびＴｒＥＭＢＬ（登録商標）で特定されてもよい。
【０１５９】
本明細書で記載される特定の実施形態での使用が想定されるＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来の抗原としては、ニューモリシン、ＰｓｐＡ、コリン結合タンパク質Ａ（ＣｂｐＡ）、ＮａｎＡ、ＮａｎＢ、ＳｐｎＨＬ、ＰａｖＡ、ＬｙｔＡ、Ｐｈｔおよびピリンタンパク質（ＲｒｇＡ；ＲｒｇＢ；ＲｒｇＣ）が挙げられる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの抗原性タンパク質も、当該技術分野で既知であり、いくつかの実施形態では、抗原として使用されてもよい（例えば、Ｚｙｓｋｅｔ  ａｌ、２０００を参照）。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの毒性株の完全ゲノム配列は、配列決定され、当業者によって理解されるだろうが、本明細書で使用するためのＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅタンパク質も、他の公的なデータベース、例えば、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）、ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ（登録商標）およびＴＲＥＭＢＬ（登録商標）で特定されてもよい。本開示の抗原に関して特定の目的のタンパク質としては、ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｉの表面に露出することが予想される病原性因子およびタンパク質が挙げられる（例えば、Ｆｒｏｌｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０を参照）。
【０１６０】
抗原として使用可能な細菌抗原の例としては、限定されないが、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓポリペプチド、Ｂａｃｉｌｌｕｓポリペプチド、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓポリペプチド、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａポリペプチド、Ｂａｒｔｏｎｅｌｌａポリペプチド、Ｂｏｒｒｅｌｉａポリペプチド（例えば、Ｂ．  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉＯｓｐＡ）、Ｂｒｕｃｅｌｌａポリペプチド、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒポリペプチド、Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａｇａポリペプチド、Ｃｈｌａｍｙｄｉａポリペプチド、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチド、Ｃｏｘｉｅｌｌａポリペプチド、Ｄｅｒｍａｔｏｐｈｉｌｕｓポリペプチド、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド、Ｅｈｒｌｉｃｈｉａポリペプチド、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａポリペプチド、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａポリペプチド、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍポリペプチド、Ｈａｅｍｏｂａｒｔｏｎｅｌｌａポリペプチド、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓポリペプチド（例えば、Ｈ．ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ型外側膜タンパク質）、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒポリペプチド、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａポリペプチド、Ｌ形態細菌ポリペプチド、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａポリペプチド、Ｌｉｓｔｅｒｉａポリペプチド、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａポリペプチド、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａポリペプチド、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａポリペプチド、Ｎｅｏｒｉｃｋｅｔｔｓｉａポリペプチド、Ｎｏｃａｒｄｉａポリペプチド、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａポリペプチド、Ｐｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド、Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド（すなわち、Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅポリペプチド）（本明細書の記載を参照）、Ｐｒｏｔｅｕｓポリペプチド、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓポリペプチド、Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａポリペプチド、Ｒｏｃｈａｌｉｍａｅａポリペプチド、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａポリペプチド、Ｓｈｉｇｅｌｌａポリペプチド、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド、グループＡｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓＭタンパク質）、グループＢｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）ポリペプチド、ＴｒｅｐｏｎｅｍａポリペプチドおよびＹｅｒｓｉｎｉａポリペプチド（例えば、Ｙ  ｐｅｓｔｉｓＦ１およびＶ抗原）が挙げられる。
【０１６１】
真菌抗原の例としては、限定されないが、Ａｂｓｉｄｉａポリペプチド、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍポリペプチド、Ａｌｔｅｒｎａｒｉａポリペプチド、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓポリペプチド、Ｂａｓｉｄｉｏｂｏｌｕｓポリペプチド、Ｂｉｐｏｌａｒｉｓポリペプチド、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓポリペプチド、Ｃａｎｄｉｄａポリペプチド、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓポリペプチド、Ｃｏｎｉｄｉｏｂｏｌｕｓポリペプチド、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓポリペプチド、Ｃｕｒｖａｌａｒｉａポリペプチド、Ｅｐｉｄｅｒｍｏｐｈｙｔｏｎポリペプチド、Ｅｘｏｐｈｉａｌａポリペプチド、Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍポリペプチド、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａポリペプチド、Ｍａｄｕｒｅｌｌａポリペプチド、Ｍａｌａｓｓｅｚｉａポリペプチド、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍポリペプチド、Ｍｏｎｉｌｉｅｌｌａポリペプチド、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａポリペプチド、Ｍｕｃｏｒポリペプチド、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓポリペプチド、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍポリペプチド、Ｐｈｉａｌｅｍｏｎｉｕｍポリペプチド、Ｐｈｉａｌｏｐｈｏｒａポリペプチド、Ｐｒｏｔｏｔｈｅｃａポリペプチド、Ｐｓｅｕｄａｌｌｅｓｃｈｅｒｉａポリペプチド、Ｐｓｅｕｄｏｍｉｃｒｏｄｏｃｈｉｕｍポリペプチド、Ｐｙｔｈｉｕｍポリペプチド、Ｒｈｉｎｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍポリペプチド、Ｒｈｉｚｏｐｕｓポリペプチド、Ｓｃｏｌｅｃｏｂａｓｉｄｉｕｍポリペプチド、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘポリペプチド、Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎポリペプチド、ＴｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎポリペプチドおよびＸｙｌｏｈｙｐｈａポリペプチドが挙げられる。
【０１６２】
原虫寄生体抗原の例としては、限定されないが、Ｂａｂｅｓｉａポリペプチド、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍポリペプチド、Ｂｅｓｎｏｉｔｉａポリペプチド、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍポリペプチド、Ｅｉｍｅｒｉａポリペプチド、Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｏｚｏｏｎポリペプチド、Ｅｎｔａｍｏｅｂａポリペプチド、Ｇｉａｒｄｉａポリペプチド、Ｈａｍｍｏｎｄｉａポリペプチド、Ｈｅｐａｔｏｚｏｏｎポリペプチド、Ｉｓｏｓｐｏｒａポリペプチド、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａポリペプチド、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａポリペプチド、Ｎｅｏｓｐｏｒａポリペプチド、Ｎｏｓｅｍａポリペプチド、Ｐｅｎｔａｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓポリペプチド、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍポリペプチドが挙げられる。寄生蠕虫抗原の例としては、限定されないが、Ａｃａｎｔｈｏｃｈｅｉｌｏｎｅｍａポリペプチド、Ａｅｌｕｒｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａポリペプチド、Ａｎｇｉｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ａｓｃａｒｉｓポリペプチド、Ｂｒｕｇｉａポリペプチド、Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍポリペプチド、Ｃａｐｉｌｌａｒｉａポリペプチド、Ｃｈａｂｅｒｔｉａポリペプチド、Ｃｏｏｐｅｒｉａポリペプチド、Ｃｒｅｎｏｓｏｍａポリペプチド、Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓポリペプチド、Ｄｉｏｃｔｏｐｈｙｍｅポリペプチド、Ｄｉｐｅｔａｌｏｎｅｍａポリペプチド、Ｄｉｐｈｙｌｌｏｂｏｔｈｒｉｕｍポリペプチド、Ｄｉｐｌｙｄｉｕｍポリペプチド、Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａポリペプチド、Ｄｒａｃｕｎｃｕｌｕｓポリペプチド、Ｅｎｔｅｒｏｂｉｕｓポリペプチド、Ｆｉｌａｒｏｉｄｅｓポリペプチド、Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓポリペプチド、Ｌａｇｏｃｈｉｌａｓｃａｒｉｓポリペプチド、Ｌｏａポリペプチド、Ｍａｎｓｏｎｅｌｌａポリペプチド、Ｍｕｅｌｌｅｒｉｕｓポリペプチド、Ｎａｎｏｐｈｙｅｔｕｓポリペプチド、Ｎｅｃａｔｏｒポリペプチド、Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓポリペプチド、Ｏｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍポリペプチド、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａポリペプチド、Ｏｐｉｓｔｈｏｒｃｈｉｓポリペプチド、Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａポリペプチド、Ｐａｒａｆｉｌａｒｉａポリペプチド、Ｐａｒａｇｏｎｉｍｕｓポリペプチド、Ｐａｒａｓｃａｒｉｓポリペプチド、Ｐｈｙｓａｌｏｐｔｅｒａポリペプチド、Ｐｒｏｔｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ｓｅｔａｒｉａポリペプチド、Ｓｐｉｒｏｃｅｒｃａポリペプチド、Ｓｐｉｒｏｍｅｔｒａポリペプチド、Ｓｔｅｐｈａｎｏｆｉｌａｒｉａポリペプチド、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｉｄｅｓポリペプチド、Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ｔｈｅｌａｚｉａポリペプチド、Ｔｏｘａｓｃａｒｉｓポリペプチド、Ｔｏｘｏｃａｒａポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓポリペプチド、Ｔｒｉｃｈｕｒｉｓポリペプチド、ＵｎｃｉｎａｒｉａポリペプチドおよびＷｕｃｈｅｒｅｒｉａポリペプチドが挙げられる。（例えば、Ｐ．ｆａｌｃｉｐａｒｕｍｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｏｉｔｅ（ＰｆＣＳＰ））、種虫表面タンパク質２（ＰｆＳＳＰ２）、肝臓状態抗原１のカルボキシ末端（ＰｆＬＳＡ１  ｃ−ｔｅｒｍ）、および輸送体タンパク質１（ＰｆＥｘｐ−１）���Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓポリペプチド、Ｓａｒｃｏｃｙｓｔｉｓポリペプチド、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａポリペプチド、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａポリペプチド、ＴｏｘｏｐｌａｓｍａポリペプチドおよびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａポリペプチド。
【０１６３】
外部寄生虫抗原の例としては、限定されないが、ノミ；ダニ、硬ダニおよび軟ダニを含む；ハエ、例えば、小昆虫、蚊、サンドフライ、ブユ、ウシアブ、ノサシバエ、メクラアブ、ツェツェバエ、サシバエ、ハエうじ症を引き起こすハエおよびヌカカ；アリ；クモ、シラミ；ダニ；およびカメムシ、例えば、トコジラミおよびキスバグに由来するポリペプチド（抗原およびアレルゲンを含む）が挙げられる。
【０１６４】
６．自殺遺伝子
本開示の免疫細胞のＣＡＲおよび／またはＴＣＲは、１つ以上の自殺遺伝子を含んでいてもよい。「自殺遺伝子」との用語は、本明細書で使用される場合、プロドラッグを投与すると、その宿主細胞を死滅させる化合物への遺伝子産物の移動を行う遺伝子であると定義される。使用可能な自殺遺伝子／プロドラッグの組み合わせの例は、ヘルペス単純ウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）およびガンシクロビル、アシクロビル、またはＦＩＡＵ；酸化還元酵素およびシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼおよび５−フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジレートキナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）およびＡＺＴ；およびデオキシシチジンキナーゼおよびシトシンアラビノシドである。
【０１６５】
Ｅ．Ｃｏｌｉプリンヌクレオシドホスホリラーゼ、プロドラッグ  ６−メチルプリンデオキシリボシドを毒性のプリン  ６−メチルプリンに変換する、いわゆる自殺遺伝子。プロドラッグ療法と共に使用される自殺遺伝子の他の例は、Ｅ．ｃｏｌｉシトシンデアミナーゼ遺伝子およびＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子である。
【０１６６】
例示的な自殺遺伝子としては、ＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥＧＦＲｖ３または誘導性カスパーゼ９が挙げられる。一実施形態では、ＥＧＦＲバリアント  ＩＩＩ（ＥＧＦＲｖ３）の先端を切断した態様は、セツキシマブによって除去することが可能な適切な抗原として使用されてもよい。本開示で使用可能な、当該技術分野で知られているさらなる自殺遺伝子としては、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）、チトクロムｐ４５０酵素（ＣＹＰ）、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）、カルボキシエステラーゼ（ＣＥ）、ニトロレダクターゼ（ＮＴＲ）、グアニンリボシルトランスフェラーゼ（ＸＧＲＴＰ）、グリコシダーゼ酵素、メチオニン−α，γ−リアーゼ（ＭＥＴ）およびチミジンホスホリラーゼ（ＴＰ）が挙げられる。
【０１６７】
７．送達方法
当業者は、本開示の抗原受容体を発現するために、標準的な組換え技術によって、ベクターを構築する準備が十分にできているだろう（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．，２００１およびＡｕｓｕｂｅｌｅｔ  ａｌ．，１９９６、両方とも本明細書に参考として組み込まれる）。ベクターとしては、限定されないが、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）、および人工の染色体（例えば、ＹＡＣ）、例えば、レトロウイルスベクター（例えばモロニーマウス白血病ウイルスベクター（ＭｏＭＬＶ）、ＭＳＣＶ、ＳＦＦＶ、ＭＰＳＶ、ＳＮＶなどに由来するもの）、レンチウイルスベクター（例えばＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＳＩＶ、ＢＩＶ、ＦＩＶなどに由来するもの）、複製能を有するもの、複製欠損およびその能力の低い形態を含む、アデノウイルス（Ａｄ）ベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ−４０）ベクター、ウシパピローマウイルスベクター、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ハーベイマウス肉腫ウイルスベクター、マウス乳腺腫瘍ウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ポリオウイルスベクター、水胞性口炎ウイルスベクター、マラバウイルスベクターおよびグループＢアデノウイルスエナデノツシレブベクターが挙げられる。
【０１６８】
ａ．ウイルスベクター
抗原受容体をコードするウイルスベクターは、本開示の特定の態様で与えられてもよい。組換えウイルスベクターを作成する際に、必須ではない遺伝子は、典型的には、異種（または非ネイティブ）タンパク質の遺伝子またはコード配列と置き換えられる。ウイルスベクターは、核酸および場合によりタンパク質を細胞に導入するためにウイルス配列を利用する発現構築物の一種である。特定のウイルスが、受容体が介在するエンドサイトーシスを介して細胞を感染させ、または細胞に入り込む能力、宿主細胞ゲノムに組み込み、外来核酸を細胞（例えば、哺乳動物細胞）に移動するための魅力的な候補物にするウイルス遺伝子を安定にかつ効率的に発現する能力。本発明の特定の態様の核酸を送達するために使用可能なウイルスベクターの非限定例を以下に記載する。
【０１６９】
レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖに加え、制御機能または構造機能を有する他の遺伝子を含む。レンチウイルスベクターは、当該技術分野でよく知られている（例えば、米国特許第６，０１３，５１６号および同第５，９９４，１３６号を参照）。
【０１７０】
組換えレンチウイルスベクターは、分裂しない細胞を感染させることができ、核酸配列のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏでの遺伝子移動および発現に使用することができる。例えば、分裂しない細胞を感染させることができる（適切な宿主細胞は、封入機能を有する２つ以上のベクター（すなわち、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ、およびｒｅｖ）でトランスフェクションされる）組換えレンチウイルスは、本明細書に参考として組み込まれる米国特許第５，９９４，１３６号に記載される。
【０１７１】
ｂ．制御要素
本開示で有用なベクターに含まれる発現カセットは、特に、（５’から３’方向に）タンパク質コード配列、介在する配列を含むスプライスシグナルおよび転写停止／ポリアデニルか配列に作動可能に連結する真核生物転写プロモーターを含む。真核生物細胞においてタンパク質コード遺伝子の転写を制御するプロモーターおよびエンハンサーは、複数の遺伝子要素で構成される。細胞機構は、各要素によって運ばれてきた制御情報を集め、統合することができ、異なる遺伝子に、別個の、多くは複雑な転写制御パターンを発生させることができる。本開示の観点で私用されるプロモーターは、構成プロモーター、誘発性プロモーターおよび組織特異的プロモーターを含む。
【０１７２】
（ｉ）プロモーター／エンハンサー
本明細書で提供される発現構築物は、抗原受容体の発現を行わせるためのプロモーターを含む。プロモーターは、一般的に、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置決めするための機能を有する配列を含む。この最も良く知られた例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスを欠いたいくつかのプロモーター、例えば、哺乳動物ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のためのプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子のためのプロモーターでは、開始部位自体の上にある別個の要素が、開始場所を固定するのに役立つ。さらなるプロモーター要素は、転写開始の頻度を制御する。典型的には、開始部位の領域から３０１１０ｂｐ上流に位置しているが、多くのプロモーターは、同様に開始部位の下流の機能的要素を含有することが示されている。コード配列をプロモーターの「制御下」におくために、１つは、選択したプロモーターの（すなわち、３’の）「下流」にある転写リーディングフレームの転写開始部位の５’末端に置かれる。「上流」プロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コードＲＮＡの発現を促進する。
【０１７３】
プロモーター要素の間の空間は、多くは自由度が高く、そのため、要素が互いに逆になっているか、または互いに対して移動しているとき、プロモーター機能が保存される。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーター要素間の感覚は、活性が減り始めるまで、５０ｂｐまで増加させることができる。プロモーターに依存して、個々の要素が協働して、または独立して転写を活性化する機能を発揮し得るようである。プロモーターは、「エンハンサー」と組み合わせて使用されてもよく、または使用されなくてもよく、核酸配列の転写活性化に関与する、シスで作用する制御性配列を指す。
【０１７４】
プロモーターは、コード配列および／またはエキソンの上流に配置される５’非コード配列を単離することによって得られ得るように、核酸配列と天然で会合しているものであってもよい。このようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれることがある。同様に、エンハンサーは、核酸配列と天然で会合し、その配列の下流または上流のいずれかに配置されるものであってもよい。または、特定の利点は、組換えプロモーターまたは異種プロモーターの制御下、コード核酸セグメントを配置することによって得られるだろう。組換えプロモーターまたは異種プロモーターは、その天然環境で核酸配列と通常は会合しないプロモーターを指す。組換えまたは異種エンハンサーは、その天然環境で核酸配列と通常は会合しないエンハンサーも指す。このようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他のウイルス、または原核生物または真核生物の細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、「天然に存在」しないプロモーターまたはエンハンサー（すなわち、発現を変える異なる転写制御領域および／または突然変異の異なる要素を含む）を含んでいてもよい。例えば、組換えＤＮＡ構築に最も一般的に使用されるプロモーターとしては、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成によって製造することに加え、配列は、本明細書に開示する組成物と組み合わせて、組換えクローニングおよび／またはＰＣＲＴＭを含む核酸増幅技術を用いて作られてもよい。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核オルガネラ内の配列の転写および／または発現を指令するコントロール配列を同様に使用してもよいことが想定される。
【０１７５】
通常、発現のためにオルガネラ、細胞型、組織、臓器、または生物中のＤＮＡセグメントの発現を効果的に指令するプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することが重要であろう。分子生物学の当業者は、一般的に、タンパク質発現のためのプロモーター、エンハンサーおよび細胞型の組み合わせの使用を知っている（、例えば、本明細書に参考として組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋｅｔ  ａｌ．１９８９を参照）。使用されるプロモーターは、例えば、組換えタンパク質および／またはペプチドの大規模生産に有利なような、構成的であり、組織特異的であり、誘発性であり、および／または適切な条件下で導入されるＤＮＡセグメントの高レベル発現を指令するのに有用なものであってもよい。プロモーターは、異種であってもよく、または内因性であってもよい。
【０１７６】
さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせ（例えば、真核生物プロモーターのＤａｔａ  Ｂａｓｅ  ＥＰＤＢあたり、ワールドワイドウェブを通じてｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／で）を、発現させるために使用することができる。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系の使用は、別の可能な実施形態である。真核生物細胞は、送達複合体の一部として、またはさらなる遺伝子発現構築物として、適切な細菌ポリメラーゼが提供される場合、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を補助し得る。
【０１７７】
プロモーターの非限定例としては、初期または後期ウイルスプロモーター、例えば、ＳＶ４０初期または後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス（ＲＳＶ）初期プロモーター；真核生物細胞プロモーター、例えば、βアクチンプロモーター、ＧＡＤＰＨプロモーター、メタロチオネインプロモーター；および連鎖状の応答要素プロモーター、例えば、サイクリックＡＭＰ応答要素プロモーター（ｃｒｅ）、血清応答要素プロモーター（ｓｒｅ）、ホルボールエステルプロモーター（ＴＰＡ）および最小ＴＡＴＡボックス付近の応答要素プロモーター（ｔｒｅ）が挙げられる。ヒト成長ホルモンプロモーター配列を使用することも可能である（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋに寄託番号Ｘ０５２４４で記載されるヒト成長ホルモン最小プロモーター、ヌクレオチド２８３−３４１）またはマウス乳房腫瘍プロモーター（ＡＴＣＣからカタログ番号ＡＴＣＣ  ４５００７で入手可能）。特定の実施形態では、プロモーターは、ＣＭＶ  ＩＥ、デクチン−１、デクチン−２、ヒトＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＳＭ２２、ＲＳＶ、ＳＶ４０、Ａｄ  ＭＬＰ、β−アクチン、ＭＨＣクラスＩまたはＭＨＣクラスＩＩプロモーターであるが、治療遺伝子を発現させるのに有用な任意の他のプロモーターが、本発明の実施に適用可能である。
【０１７８】
特定の態様では、本開示の方法は、エンハンサー配列、すなわち、プロモーターの活性を増加させ、その向きにもかかわらず、比較的長い距離にわたっていても（標的プロモーターから数キロ塩基まで離れている）、シスで作用する能力を有する核酸配列にも関する。しかし、エンハンサー機能は、所与のプロモーターに近接しても機能し得るため、必ずしもこのような長い距離に制限されない。
【０１７９】
（ｉｉ）開始シグナルおよびこれに連結した発現
特定の開始シグナルを、コード配列の効率的な翻訳のために、本開示で提供される発現構築物に使用してもよい。これらのシグナルとしては、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列が含まれる。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御シグナルが提供されることが必要な場合がある。当業者は、これを決定し、必要なシグナルを提供することが容易に可能であろう。全挿入物の翻訳を確実にするために、所望なコード配列のリーディングフレームと共に、開始コドンは、「フレーム内」になければならないことがよく知られている。外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然または合成のいずれかであってもよい。発現効率は、適切な転写エンハンサー要素を含むことによって高められるだろう。
【０１８０】
特定の実施形態では、配列内リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）要素の使用は、多重遺伝子、または多シストロン性のメッセージを作成するために用いられる。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを迂回し、内部の部位で翻訳を開始することができる。ピルコナウイルスファミリー（ポリオおよび脳心筋炎）の２つのメンバー由来のＩＲＥＳ要素が、哺乳動物メッセージ由来のＩＲＥＳと同様に記載されている。ＩＲＥＳ要素は、異種オープンリーディングフレームに連結していてもよい。複数のオープンリーディングフレームを一緒に転写してもよく、それぞれがＩＲＥＳによって分割され、ポリシストロン性のメッセージを作成する。ＩＲＥＳ要素という観点で、各オープンリーディングフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。複数の遺伝子は、単一のメッセージを転写するために単一のプロモーター／エンハンサーを用いて効果的に発現させることができる。
【０１８１】
さらに、特定の２Ａ配列要素は、本開示で提供される構築物中の遺伝子の連結した発現または同時発現を生じるために使用されてもよい。例えば、開裂配列を使用し、オープンリーディングフレームを連結して単一のシストロンを生成することによって同時発現させてもよい。例示的な開裂配列は、Ｆ２Ａ（手足口病ウイルス２Ａ）または「２Ａ様」配列（例えば、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ、Ｔ２Ａ）である。
【０１８２】
（ｉｉｉ）複製起点
宿主細胞中でベクターを増殖させるために、１つ以上の複製起点部位（多くは「ｏｒｉ」と呼ばれる）を含んでいてもよい（例えば、複製が開始される特定の核酸配列である、上述のようにＥＢＶのｏｒｉＰ、またはプログラム化において同様の機能または向上した機能を有する遺伝的に操作されたｏｒｉＰに対応する核酸配列）。または、上述の他の染色体外で複製するウイルスの複製起点または自己複製配列（ＡＲＳ）を使用してもよい。
【０１８３】
ｃ．選択およびスクリーニング可能なマーカー
いくつかの実施形態では、本開示の構築物を含む細胞は、発現ベクターにマーカーを含ませることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで特定されてもよい。このようなマーカーは、発現ベクターを含有する細胞の容易な特定を可能にする、細胞に対して特定可能な変化を与えるだろう。一般的に、選択マーカーは、選択を可能にする特性を与えるマーカーである。陽性選択マーカーは、マーカーの存在によって、その選択が可能になるマーカーであり、一方、陰性選択マーカーは、その存在が、その選択を妨げるマーカーである。陽性選択マーカーの一例は、薬物耐性マーカーである。
【０１８４】
通常、薬物選択マーカーを含むと、形質転換体のクローニングおよび特定に役立つ。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールに耐性を与える遺伝子は、有用な選択マーカーである。状態の実行に基づく形質転換体の区別が可能になる表現型を与えるマーカーに加え、基本が比色分析である、ＧＦＰなどのスクリーニング可能なマーカーを含む他の種類のマーカーも想定される。または、ヘルペス単純ウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの陰性選択マーカーとしてのスクリーニング可能酵素を利用してもよい。当業者は、免疫マーカーを、可能ならばＦＡＣＳ分析と組み合わせてどのように使用するかも知っているだろう。使用されるマーカーは、核酸をコードする遺伝子産物と同時に発現可能なものであれば、重要であるとは考えられない。選択およびスクリーニング可能なマーカーのさらなる例は、当業者にはよく知られている。
【０１８５】
ｄ．他の核酸送達方法
抗原受容体をコードする核酸のウイルス送達に加え、以下は、所与の宿主細胞に対する組換え遺伝子送達のさらなる方法であり、したがって、これも本開示で考慮される。
【０１８６】
本開示の免疫細胞への核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の導入は、本明細書に記載されるように、または当業者に知られているように、ある細胞の形質転換のための核酸送達のための任意の適した方法を使用してもよい。このような方法としては、限定されないが、ＤＮＡの直接送達、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏでのトランスフェクションによるもの、注射によるもの、マイクロインジェクションを含む）、エレクトロポレーションによるもの、リン酸カルシウム沈降によるもの、ＤＥＡＥ−デキストランの後、ポリエチレングリコールを使用することによるもの、直接的な音波負荷によるもの、リポソームが介在するトランスフェクションによるもの、および受容体が介在するトランスフェクションによるもの；微量注入による衝撃によるもの、炭化ケイ素繊維と共に撹拌することによるもの、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍが介在する形質転換によるもの、乾燥／阻害が介在するＤＮＡ取り込みによるもの、およびこのような方法の任意の組み合わせが挙げられる。これらのような技術の適用中、オルガネラ、細胞、組織または生物は、安定に、または一時的に形質転換されてもよい。
【０１８７】
Ｅ．遺伝子発現の改変
いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞は、グルココルチコイド受容体、ＴＧＦβ受容体（例えば、ＴＧＦβ−ＲＩＩ）および／またはＣＩＳＨなどの特定の遺伝子の発現を変化させるように改変されている。一実施形態では、免疫細胞は、内因性ＴＧＦβを枯渇させるためのサイトカインシンクとして機能し得るドミナントネガティブＴＧＦβ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩＤＮ）を発現するように改変されてもよい。
【０１８８】
サイトカインシグナル伝達は、造血細胞の正常な機能にとって必須である。タンパク質のＳＯＣＳファミリーは、固有のブレーキとして作用する、サイトカインシグナル伝達の陰性制御に重要な役割をはたす。ＣＩＳは、ＣＩＳＨ遺伝子によってコードされるタンパク質のＳＯＣＳファミリーのメンバーであり、マウスにおけるＮＫ細胞中の重要なチェックポイント分子であると特定されている。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞など、細胞傷害性を向上させるための免疫細胞におけるＣＩＳＨのノックアウトに関する。この手法は、単独で使用してもよく、または抗腫瘍活性を向上させるために、他のチェックポイント阻害剤と組み合わせて使用してもよい。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、変化した遺伝子発現は、遺伝子の破壊、例えば、遺伝子の全てまたは一部のノックアウト、挿入、ミスセンスまたはフレームシフト突然変異、例えば、２対立遺伝子フレームシフト突然変異、欠失、例えば、１つ以上のエキソンまたは一部および／またはノックインを行うことによって行われる。例えば、変化した遺伝子発現は、ＤＮＡ結合を標的とするヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）および転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、およびＲＮＡガイドされるヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（Ｃａｓ）、特定的には、遺伝子またはその一部の配列を標的とするように設計されたものを含め、配列特異的なヌクレアーゼまたは標的とされたヌクレアーゼによって行われてもよい。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、遺伝子の発現、活性および／または機能の変化は、遺伝子を破壊することによって行われる。いくつかの態様では、遺伝子は、その発現が、遺伝子改変が存在しない状態での発現または改変を行うために導入される構成要素が存在しない状態での発現と比較して、少なくとも約２０％、約３０％、または約４０％、一般的に少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％減少するように改変される。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、変化は、一時的または可逆的であり、そのため、遺伝子の発現は、後の時間に回復する。他の実施形態では、変化は、可逆的でも一時的でもなく、例えば、永久的である。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、遺伝子の変化は、遺伝子中に、典型的には標的化された様式で、１つ以上の二本鎖の破壊および／または１つ以上の一本鎖の破壊の誘導によって行われる。いくつかの実施形態では、二本鎖または一本鎖の破壊は、ヌクレアーゼ、例えば、エンドヌクレアーゼ、例えば、遺伝子を標的とするヌクレアーゼによって行われる。いくつかの態様では、破壊は、遺伝子のコード領域で、例えば、エキソンで誘導される。例えば、いくつかの実施形態では、誘導は、コード領域のＮ末端付近で、例えば、第１のエキソンで、第２のエキソンで、またはその後のエキソンで起こる。
【０１９３】
いくつかの態様では、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同配列指向性修復（ＨＤＲ）によって、二本鎖または一本鎖の破壊は、細胞修復工程による修復を受ける。いくつかの態様では、修復プロセスはエラーが起こりやすく、遺伝子の破壊、例えば、フレームシフト突然変異、例えば、二対立遺伝子のフレームシフト突然変異が起こり、遺伝子の完全なノックアウトが起こる場合がある。例えば、いくつかの態様では、破壊は、欠失、突然変異および／または挿入を誘導することを含む。いくつかの実施形態では、破壊は、初期停止コドン存在下で生じる。いくつかの態様では、挿入、欠失、転座、フレームシフト突然変異および／または未成熟終止コドンの存在によって、遺伝子の発現、活性および／または機能が破壊される。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、遺伝子の変化は、アンチセンス技術を用いて達成される。例えば、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）および／またはリボザイムを使用し、遺伝子の発現を選択的に抑制または阻止する。ｓｉＲＮＡ技術は、遺伝子から転写されるｍＲＮＡのヌクレオチド配列と相同性の配列と、ヌクレオチド配列と相補性の配列とを含む二本鎖ＲＮＡ分子を使用するＲＮＡｉである。ｓｉＲＮＡは、一般的に、遺伝子から転写されるｍＲＮＡの１つの領域と相同性／相補性であるか、または異なる領域と相同性／相補性である複数のＲＮＡ分子を含むｓｉＲＮＡであってもよい。いくつかの態様では、ｓｉＲＮＡは、ポリシストロン性構築物に含まれる。
【０１９５】
１．ＺＦＰおよびＺＦＮ
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、ＤＮＡ結合タンパク質、例えば、エンドヌクレアーゼなどのエフェクタータンパク質に融合した、１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）または転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）を含む。例としては、ＺＦＮ、ＴＡＬＥおよびＴＡＬＥＮが挙げられる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、１つ以上のジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）、またはＤＮＡに結合するそのドメインを配列特異的な様式で含む。ＺＦＰまたはそのドメインは、１つ以上のジンクフィンガー、亜鉛イオンの配位によって構造が安定化されている結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域によって配列特異的な様式でＤＮＡに結合するさらに大きなタンパク質の中のタンパク質またはドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質との用語は、多くは、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。特に、ＺＦＰは、個々のフィンガーのアセンブリによって作られる特定のＤＮＡ配列（典型的には９〜１８ヌクレオチド長）を標的とする人工のＺＦＰドメインである。
【０１９７】
ＺＦＰとしては、単一のフィンガードメインが、約３０アミノ酸長であり、単一のβターンの２個のシステインと亜鉛によって配位された２個のインバリアントヒスチジン残基を含むαらせんを含み、２個、３個、４個、５個または６個のフィンガーを含むものが挙げられる。一般的に、ＺＦＰの配列特異性は、ジンクフィンガー認識らせん上のらせん位置（−１、２、３および６）でアミノ酸置換を行うことによって変化し得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＺＦＰまたはＺＦＰ含有分子は、天然に存在せず、例えば、選択の標的部位に結合するように操作されている。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を形成するためにＤＮＡ開裂ドメインに融合したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインであるか、またはこれを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＴｙｐｅ  ｌｉＳ制限酵素由来の開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）と、１つ以上のジンクフィンガー結合ドメインとを含み、操作されていてもよく、または操作されていなくてもよい。いくつかの実施形態では、開裂ドメインは、Ｔｙｐｅ  ｌｉＳ制限エンドヌクレアーゼＦｏｋ  Ｉ由来である。Ｆｏｋ  Ｉは、一般的に、片方の鎖上の認識部位から９ヌクレオチドにあるＤＮＡの二本鎖開裂を触媒し、他方の鎖の認識部位から１３ヌクレオチドにあるＤＮＡの二本鎖開裂を触媒する。
【０１９９】
多くの遺伝子特異的に操作されたジンクフィンガーが市販されている。例えば、Ｓａｎｇａｍｏ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（リッチモンド、ＣＡ、ＵＳＡ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡ）と協力し、ジンクフィンガー構築のためのプラットフォーム（ＣｏｍｐｏＺｒ）を開発し、研究者に、ジンクフィンガー構築を迂回させ、完全に検証し、数千のタンパク質のための特異的に標的化するジンクフィンガーを提供する（Ｇａｊｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２０１３、３１（７）、３９７−４０５）。いくつかの実施形態では、市販のジンクフィンガーが使用されるか、または特注される。（例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈカタログ番号ＣＳＴＺＦＮＤ、ＣＳＴＺＦＮ、ＣＴｉｌ−ｌＫＴおよびＰＺＤ００２０を参照。）
【０２００】
２．ＴＡＬ、ＴＡＬＥおよびＴＡＬＥＮ
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化分子は、天然に存在するか、または操作された（天然に存在しない）転写アクチベーター様タンパク質（ＴＡＬ）ＤＮＡ結合ドメイン、例えば、転写アクチベーター様タンパク質エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質を含む。例えば、本明細書に参考として組み込まれる米国特許公開第２０１１／０３０１０７３号を参照。
【０２０１】
ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインまたはＴＡＬＥは、１つ以上のＴＡＬＥ反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復ドメインは、ＴＡＬＥのその同族標的ＤＮＡ配列への結合に関与する。１個の「反復単位」（「反復」とも呼ばれる）は、典型的には、３３〜３５アミノ酸長であり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質中の他のＴＡＬＥ反復配列と、少なくともいくらかの配列ホモロジーを示す。各ＴＡＬＥ反復単位は、典型的には、反復の位置１２および／または１３で、反復可変２塩基（ＲＶＤ）を構成する１または２のＤＮＡ結合残基を含む。これらのＴＡＬＥのＤＮＡ認識の天然の（標準的な）コードは、位置１２および１３にあるＨＤ配列によってシトシン（Ｃ）に結合し、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡに結合し、ＮＮがＧまたはＡに結合し、ＮＯはＴに結合するように決定され、非標準的な（変則的な）ＲＶＤも知られている。いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥは、標的ＤＮＡ配列に対する特異性を有するＴＡＬアレイの設計によって、任意の遺伝子を標的としてもよい。標的配列は、一般的にチミジンで始まる。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、分子は、ＤＮＡ結合エンドヌクレアーゼ、例えば、ＴＡＬＥヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）である。いくつかの場合に、ＴＡＬＥＮは、ＴＡＬＥ由来のＤＮＡ結合ドメインと、核酸標的配列を開裂させるためのヌクレアーゼ触媒ドメインとを含む融合タンパク質である。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、遺伝子中の標的配列を認識し、開裂させる。いくつかの態様では、ＤＮＡの開裂によって、二本鎖の破壊が起こる。いくつかの態様では、破壊は、相同組換えまたは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の速度を刺激する。一般的に、ＮＨＥＪは、開裂部位にあるＤＮＡ配列に変化が起こることが多い、不完全な修復工程である。いくつかの態様では、修復機構は、直接的な再ライゲーションによるか、またはいわゆるマイクロホモロジーが介在する末端接続による、２つのＤＮＡ末端の残りの再結合を含む。いくつかの実施形態では、ＮＨＥＪによる修復によって、小さな挿入または欠失が起こり、これを遺伝子の破壊、それによる遺伝子の抑制に使用してもよい。いくつかの実施形態では、改変は、少なくとも１つのヌクレオチドの置換、欠失または付加であってもよい。いくつかの態様では、開裂が誘発する突然変異誘発事象、すなわち、ＮＨＥＪ事象に連続する突然変異誘発事象が起こった細胞は、当該技術分野でよく知られている方法によって特定し、および／または選択することができる。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥ反復は、遺伝子を特異的に標的にするようにアセンブリされる。（Ｇａｊｅｔ  ａｌ．，２０１３。）ＴＡＬＥＮターゲティングの１８，７４０ヒトタンパク質コード遺伝子のライブラリが構築されている（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。特注のＴＡＬＥアレイは、Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ（パリ、フランス）、Ｔｒａｎｓｐｏｓａｇｅｎ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（レキシントン、ＫＹ、ＵＳＡ）およびＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（グランドアイランド、ＮＹ、ＵＳＡ）によって市販されている。具体的には、ＣＤ３８を標的とするＴＡＬＥＮは、市販されている（Ｇｅｎｃｏｐｏｅｉａ、カタログ番号ＨＴＮ２２２８７０−ｌ、ＨＴＮ２２２８７０−２およびＨＴＮ２２２８７０−３を参照）。例示的な分子は、例えば、米国特許出願公開第ＵＳ  ２０１４／０１２０６２２号および同第２０１３／０３１５８８４号に記載される。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、ＴＡＬＥＮは、１つ以上のプラスミドベクターによってコードされる導入遺伝子として導入される。いくつかの態様では、プラスミドベクターは、前記ベクターを受け入れた細胞の特定および／または選択を行う選択マーカーを含んでいてもよい。
【０２０６】
３．ＲＧＥＮ（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）
いくつかの実施形態では、変化は、１つ以上のＤＮＡ結合核酸を用いて行われ、例えば、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ（ＲＧＥＮ）を介した変化である。例えば、変化は、クラスター化され、規則的に配置された短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）およびＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いて行うことができる。一般的に、「ＣＲＩＳＰＲシステム」は、集合的に、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランスで活性化するＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡまたは活性な部分的なｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの観点で、「直接反復」およびｔｒａｃｒＲＮＡで処理された部分直接反復を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲシステムの観点で、「スペーサー」とも呼ばれる）および／またはＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からの他の配列および転写体を含め、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ」）遺伝子の発現または活性の指令に関与する転写体および他の要素を指す。
【０２０７】
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓヌクレアーゼまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡに配列特異的に結合する非コードＲＮＡ分子（ガイド）ＲＮＡと、ヌクレアーゼ機能（例えば、２つのヌクレアーゼドメイン）を有するＣａｓタンパク質（例えば、Ｃａｓ９）とを含んでいてもよい。ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の要素は、Ｉ型、ＩＩ型またはＩＩＩ型のＣＲＩＳＰＲシステムに由来していてもよく、例えば、特定の生物を含む内因性ＣＲＩＳＰＲシステム、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来していてもよい。
【０２０８】
いくつかの態様では、ＣａｓヌクレアーゼおよびｇＲＮＡ（標的配列に特異的なｃｒＲＮＡと固定されたｔｒａｃｒＲＮＡの融合を含む）は、細胞に導入される。一般的に、ｇＲＮＡの５’末端にある標的部位は、相補性塩基対形成を用いて、その標的部位に対するＣａｓヌクレアーゼを標的とする（例えば、その遺伝子）。標的部位は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列のすぐ５’の位置、例えば、典型的にはＮＧＧ、またはＮＡＧに基づいて選択されてもよい。この観点で、ｇＲＮＡは、ガイドＲＮＡ療法を、標的ＤＮＡ配列に対応するように、最初の２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１４、１２、１１または１０ヌクレオチドを改変することによって、所望の配列を標的とする。一般的に、ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的配列の部位でＣＲＩＳＰＲ複合体の生成を促進する要素によって特徴付けられる。典型的には、「標的配列」は、一般的に、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションは、ＣＲＩＳＰＲ複合体の生成を促進する。ハイブリダイゼーションを引き起こし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の生成を促進するのに十分な相補性が存在すれば、完全な相補性は、必ずしも必要ではない。
【０２０９】
ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位での二本鎖破壊（ＤＳＢ）を誘発し、その後、本明細書に記載する破壊または変化を誘発することができる。他の実施形態では、「ニッカーゼ」と呼ばれるＣａｓ９バリアントを使用し、標的部位の一本鎖にニックを入れる。対形成するニッカーゼを使用し、例えば、特異性を高めてもよく、それぞれは、ニックが同時に導入されると、５’オーバーハングが導入されるように配列を標的化する異なるｇＲＮＡの対によって指向される。他の実施形態では、触媒的に不活性なＣａｓ９は、異種エフェクタードメイン（例えば、転写レプレッサーまたはアクチベーター）に融合し、遺伝子発現を行う。
【０２１０】
標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリヌクレオチドを含んでいてもよい。標的配列は、細胞の核または細胞質に（例えば、細胞のオルガネラ内）配置されていてもよい。一般的に、標的配列を含む標的となる遺伝子座内の組換えに使用可能な配列またはテンプレートは、「編集テンプレート」または「編集ポリヌクレオチド」または「編集配列」と呼ばれる。いくつかの態様では、外因性テンプレートポリヌクレオチドは、編集テンプレートと呼ばれる場合がある。いくつかの態様では、組換えは、相同組換えである。
【０２１１】
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲシステムという観点で、ＣＲＩＳＰＲ複合体の生成（標的配列にハイブリダイズされ、１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体化されたガイド配列を含む）によって、標的配列中または標的配列付近（例えば、標的配列から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、５０、またはもっと多くの塩基対）の片方の鎖または両方の鎖を開裂させる。ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全てまたは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、約２６、約３２、約４５、約４８、約５４、約６３、約６７、約８５、またはもっと多くのヌクレオチド）を含んでもよく、またはこれらからなっていてもよく、例えば、ガイド配列に作動可能に連結するｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の全てまたは一部に対する、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿ったハイブリダイゼーションにより、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も生成してもよい。ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列に対して、ＣＲＩＳＰＲ複合体の生成においてハイブリダイズし、関与するのに十分な相補性、例えば、最適にアラインメントした場合、ｔｒａｃｒ  ｍａｔｅ配列の長さに沿って少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％の配列相補性を有する。
【０２１２】
ＣＲＩＳＰＲシステムの１つ以上の要素を発現させる１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲシステムの要素の発現が、１つ以上の標的部位でＣＲＩＳＰＲ複合体を直接形成するように、細胞に導入されてもよい。構成要素は、タンパク質および／またはＲＮＡとして細胞に送達されてもよい。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列に連結するガイド配列、およびｔｒａｃｒ配列は、それぞれ、別個のベクター上の別個の制御要素に作動可能に連結していてもよい。または、同じまたは異なる制御要素から発現する要素のうち２つ以上が、単一のベクター内で合わさっていてもよく、１つ以上のさらなるベクターが、第１のベクターに含まれないＣＲＩＳＰＲシステムの任意の構成要素を与える。ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレアーゼ認識配列（「クローニング部位」とも呼ばれる）を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の挿入部位は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列の上流および／または下流に配置される。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一の発現構築物を使用し、細胞内の複数の異なる対応する標的配列にＣＲＩＳＰＲ活性を標的化してもよい。
【０２１３】
ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列に作動可能に連結した制御要素を含んでいてもよい。Ｃａｓタンパク質の非限定例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１およびＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、またはこれらの改変された態様が挙げられる。これらの酵素が知られており、例えば、アミノ酸配列Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９タンパク質は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにおいて、寄託番号Ｑ９９ＺＷ２で見出されるだろう。
【０２１４】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９であってもよい（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓまたはＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａに由来）。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、例えば、標的配列内および／または標的配列の相補体内の標的配列の位置で片方の鎖または両方の鎖を直接開裂することができる。ベクターは、変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含有する標的ポリヌクレオチドの片方の鎖または両方の鎖を開裂する能力を欠くように、対応する野生型に対して変異しているＣＲＩＳＰＲ酵素をコードしていてもよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９のＲｕｖＣ  Ｉ触媒ドメイン中のアスパラギン酸とアラニンの置換（Ｄ１０Ａ）は、両方の鎖を開裂するヌクレアーゼ由来のＣａｓ９をニッカーゼに変換する（一本鎖を開裂する）。いくつかの実施形態では、Ｃａｓ９ニッカーゼを、ガイド配列例えばＤＮＡ配列のそれぞれのセンス鎖およびアンチセンス鎖を標的とする２つのガイド配列と組み合わせて使用してもよい。この組み合わせによって、両方の鎖にニックを付け、ＮＨＥＪまたはＨＤＲを誘発するために使用することができる。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば、真核生物細胞における発現のために最適化されたコドンである。真核生物細胞は、特定の生物、例えば、哺乳動物（限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌまたは非ヒト霊長類を含むものであってもよく、またはこれらに由来するものであってもよい。一般的に、コドン最適化は、ネイティブアミノ酸配列を維持しつつ、ネイティブ配列の少なくとも１つのコドンを、その宿主細胞の遺伝子中でより頻繁に、または最も頻繁に用いられるコドンと置き換えることによって、目的の宿主細胞中の発現を高めるために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種が、ある特定のアミノ酸の特定のコドンについて、特定の偏りを示す。コドンの偏り（生物間のコドン使用の差）は、多くは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関関係にあり、これは、特に、翻訳されるコドンの性質および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞中の選択されたｔＲＮＡの優位性は、一般的に、ペプチド合成中に最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物における最適な遺伝子発現のために調整することができる。
【０２１６】
一般的に、標的配列とハイブリダイズし、標的配列のＣＲＩＳＰＲ複合体の直接的な配列特異的な結合のために、ガイド配列は、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの実施形態では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適にアラインメントした場合、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％以上であるか、またはもっと大きい。
【０２１７】
ＮＲ３ＣＳ（グルココルチコイド受容体）のための例示的なｇＲＮＡ配列としては、
2020517259.tif 000003
が挙げられる。ＴＧＦ−β受容体２のための例示的なｇＲＮＡ配列としては、
2020517259.tif 000004
が挙げられる。Ｔ７プロモーター、標的配列およびオーバーラップ配列は、配列
2020517259.tif 000005
を有していてもよい。
【０２１８】
最適アラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定されてもよく、その非限定例としては、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍに基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ  Ｗｈｅｅｌｅｒ  Ａｌｉｇｎｅｒ）、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、サンディエゴ、カリフォルニア）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）およびＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。
【０２１９】
ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の異種タンパク質ドメインを含む融合タンパク質の一部であってもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意のさらなるタンパク質配列と、場合により、任意の２つのドメインの間にリンカー配列を含んでいてもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合可能なタンパク質ドメインの例としては、限定されないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、および以下の活性のうち１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン改変活性、ＲＮＡ開裂活性および核酸結合活性が挙げられる。エピトープタグの非限定例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグおよびチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されないが、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、および青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自家蛍光タンパク質が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＤＮＡ分子に結合するか、または、限定されないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合物、ＧＡＬ４Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン融合物およびヘルペス単純ウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合物を含む他の細胞分子に結合するタンパク質またはタンパク質のフラグメントをコードする遺伝子配列に融合してもよい。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得るさらなるドメインは、ＵＳ  ２０１１００５９５０２号に記載され、本明細書に参考として組み込まれる。
【０２２０】
ＩＩＩ．使用方法
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示の免疫細胞の有効量を投与することを含む、免疫療法のための方法を提供する。一実施形態では、医学的な疾患または障害は、免疫応答を誘発する免疫細胞集合の移動によって治療される。本開示の特定の実施形態では、癌または感染は、免疫応答を誘発する免疫細胞集合の移動によって治療される。個人に、有効量の抗原特異的細胞療法を投与することを含む、前記個人において癌を治療するか、または癌の進行を遅らせる方法が本明細書で提供される。本発明の方法は、免疫障害、固形癌、血液癌およびウイルス感染の治療に適用されてもよい。
【０２２１】
本発明の方法が有用である腫瘍としては、任意の悪性細胞型、例えば、固形腫瘍または血液腫瘍にみられるものが挙げられる。例示的な固形腫瘍としては、限定されないが、膵臓、結腸、盲腸、胃、脳、頭部、頸部、卵巣、腎臓、咽頭、肉腫、肺、膀胱、黒色腫、前立腺および乳房からなる群から選択される臓器の腫瘍が挙げられるだろう。例示的な血液腫瘍としては、骨髄の腫瘍、Ｔ細胞またはＢ細胞の悪性腫瘍、白血病、リンパ腫、芽腫、骨髄腫などが挙げられる。本明細書で提供される方法を用いて治療可能な癌のさらなる例としては、限定されないが、肺癌（小細胞肺癌、非小細胞細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む）、腹膜の癌、胃の癌または胃癌（胃腸癌および消化管間質癌）、膵臓癌、頸部癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌または腎癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、さまざまな種類の頭部および頸部の癌、および黒色腫が挙げられる。
【０２２２】
癌は、特定的には、以下の組織学的種類を有していてもよいが、これらに限定されない。新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌腫；小細胞癌腫；乳糖癌腫；扁平上皮細胞癌腫；リンパ上皮癌腫；基底細胞  癌腫；石灰化上皮癌腫；移行細胞癌腫；乳糖移行細胞癌腫；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌腫；肝細胞癌腫；肝細胞がん胆管細胞がんの混合型；索状腺癌；腺様嚢胞癌腫；腺腫性ポリープ中の腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌腫；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支−肺胞腺癌；乳糖腺癌；色素嫌性癌腫；好酸性癌腫；好酸性腺癌；好塩基性癌腫；明細胞腺癌；顆粒細胞癌腫；濾胞状腺癌；乳糖および濾胞状腺癌；非被包性硬化性癌腫；副腎皮質癌腫；類内膜癌腫；皮膚付属器癌腫；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌腫；嚢胞腺癌；乳糖嚢胞腺癌；乳糖漿液性嚢胞腺癌；粘液嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌腫；浸潤性導管癌腫；髄様癌腫；小癌腫；炎症性癌腫；ページェット病、乳房；腺房細胞癌腫；腺扁平上皮癌；腺癌ｗ／扁平上皮化生；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；卵胞膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；男性胚腫、悪性；セルトリ細胞癌腫；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；黒子型悪性黒色腫；末端性黒子性黒色腫；結節性黒色腫；巨大色素性母斑中の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌腫；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨ユーイング肉腫の巨細胞腫瘍；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽腫；乏突起膠腫；乏突起膠腫；未分化神経外胚葉性腫瘍；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅神経腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；側肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞状；菌状息肉腫；他の特定の非ホジキンリンパ腫；Ｂ細胞リンパ腫；軽度／濾胞状非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球型（ＳＬ）ＮＨＬ；中程度／濾胞状ＮＨＬ；中程度びまん性ＮＨＬ；高度免疫芽球性ＮＨＬ；高度リンパ芽球性ＮＨＬ；高度小型非開裂細胞性細胞ＮＨＬ；巨大病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ヴァルデンストレームマクログロブリン血症；悪性組織球増殖症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫���免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；ヘアリー細胞白血病；慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；急性骨髄白血病（ＡＭＬ）；および慢性骨髄芽球性白血病が挙げられる。
【０２２３】
特定の実施形態は、白血病の治療方法に関する。白血病は、血液または骨髄の癌であり、血液細胞、通常は白血球細胞（白血球）の異常な増殖（何倍もの繁殖による産生）によって特徴付けられる。白血病は、血液新生物と呼ばれる広い疾患群の一部である。白血病は、ある範囲の疾患を包含する広い用語である。白血病は、臨床的かつ病理学的に、急性と慢性の形態に分けられる。
【０２２４】
本開示の特定の実施形態では、免疫細胞は、それを必要とする個人（例えば、癌または感染を有する個人）に送達される。次いで、細胞は、個々の免疫系を高め、それぞれの癌または病原体細胞を攻撃する。ある場合、個人は、１回以上の用量の免疫細胞が与えられる。個人が、２回以上の投薬量の免疫細胞を与えられる場合、投与と投与の間の時間は、その個人において増殖するための時間が可能なほど十分であるべきであり、具体的な実施形態では、投薬と投薬の間の時間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、またはもっと多くの日数である。
【０２２５】
本開示の特定の実施形態は、免疫介在性障害を治療または予防する方法を提供する。一実施形態では、対象は、自己免疫疾患を有する。自己免疫疾患の非限定例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質抗体症候群、自己免疫アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫溶血性貧血、自己免疫肝炎、自己免疫卵巣炎および精巣炎、自己免疫血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、大量のセリアック皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発性神経障害、Ｃｈｕｒｇ−Ｓｔｒａｕｓｓ症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛−線維筋炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパシー、若年性関節炎、扁平苔癬、ループスエリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織疾患、多発性硬化症、１型または免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群（例えば、微小変化型疾患、巣状糸球体硬化、または膜性腎症）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発筋痛および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、ループスエリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、脈管炎（例えば、結節性多発動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、または疱疹状皮膚炎脈管炎）、白斑およびウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。したがって、本明細書に開示する方法を用いて治療可能な自己免疫疾患のいくつかの例としては、限定されないが、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病、潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、脈管炎、または乾癬が挙げられる。対象は、喘息などのアレルギー性障害も有している場合がある。
【０２２６】
さらに別の実施形態では、対象は、移植された臓器または幹細胞の受容者であり、拒絶を予防および／または治療するために免疫細胞が使用されている。特定の実施形態では、対象は、移植片対宿主病が進行しているか、または進行するリスクがある。ＧＶＨＤは、関係のあるドナーまたは無関係なドナーのいずれか由来の幹細胞を使用するか、または含む任意の移植のあり得る合併症である。ＧＶＨＤには急性および慢性の２種類がある。急性ＧＶＨＤは、移植から最初の３ヶ月以内に生じる。急性ＧＶＨＤの徴候としては、手および足の赤みがかった皮膚発疹が挙げられ、この皮膚発疹は、広がり、さらに重篤になる場合があり、皮膚の剥離または水ぶくれを伴う。急性ＧＶＨＤは、胃および腸にも影響を及ぼすことがあり、この場合、筋痙攣、吐き気、下痢が存在する。皮膚および目の黄変（黄疸）は、急性ＧＶＨＤが肝臓に影響を及ぼしていることを示す。慢性ＧＶＨＤは、その重篤度に基づきランク分けされ、ステージ／グレード１が軽度であり、ステージ／グレード４が重症である。慢性ＧＶＨＤは、移植から３ヶ月以上たってから進行する。慢性ＧＶＨＤの症状は、急性ＧＶＨＤの症状と似ているが、これに加え、慢性ＧＶＨＤは、目の粘膜腺、口の唾液腺、胃の内部および腸を潤滑にする腺にも影響を及ぼす場合がある。本明細書に開示される免疫細胞の任意の集合を利用してもよい。移植された臓器の例としては、固形臓器の移植、例えば、腎臓、肝臓、皮膚、膵臓、肺および／または心臓、または細胞移植、例えば、島細胞、幹細胞、筋芽細胞、骨髄、または造血または他の幹細胞が挙げられる。移植は、顔の組織などの複合移植であってもよい。免疫細胞は、移植前に、移植と同時に、または移植後に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、移植前に、例えば、移植の少なくとも１時間前、少なくとも１２時間前、少なくとも１日前、少なくとも２日前、少なくとも３日前、少なくとも４日前、少なくとも５日前、少なくとも６日前、少なくとも１週間前、少なくとも２週間前、少なくとも３週間前、少なくとも４週間前、または少なくとも１ヶ月前に投与される。ある具体的な非限定例では、治療上有効量の免疫細胞の投与は、移植の３〜５日前に行う。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、対象は、免疫細胞両方の前に、骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法を投与されてもよい。骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法は、任意の適したこのような治療であってもよく、任意の適切な経路で投与されてもよい。骨髄非破壊的リンパ球枯渇化学療法は、特に癌が黒色腫であり、転移性であり得る場合に、例えば、シクロホスファミドおよびフルダラビンの投与を含んでいてもよい。シクロホスファミドおよびフルダラビンの例示的な投与経路は、静脈内である。同様に、任意の適切な用量のシクロホスファミドおよびフルダラビンを投与してもよい。特定の態様では、約２５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンが５日間投与された後に、約６０ｍｇ／ｋｇのシクロホスファミドが２日間投与される。
【０２２８】
特定の実施形態では、免疫細胞の成長および活性化を促進する成長因子は、免疫細胞と同時に、または免疫細胞の後に対象に投与される。免疫細胞成長因子は、免疫細胞の成長および活性化を促進する任意の適切な成長因子であってもよい。適切な免疫細胞成長因子の例としては、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２が挙げられ、これらは、単独で、または種々の組み合わせ、例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−７、ＩＬ−２およびＩＬ−１５、ＩＬ−７およびＩＬ−１５、ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５、ＩＬ−１２およびＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５、またはＩＬ−１２およびＩＬ２で使用されてもよい。
【０２２９】
治療上有効量の免疫細胞は、非経口投与、例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、胸骨内、または関節内の注射または注入を含め、多くの経路によって投与されてもよい。
【０２３０】
養子細胞療法に使用するための免疫細胞の治療上有効量は、治療される対象において望ましい効果を達成する量である。例えば、この量は、進行を阻害するのに必要な、または自己免疫または同種免疫疾患の退縮を起こさせるのに必要な、または自己免疫疾患によって引き起こされる症状（例えば疼痛および炎症）を緩和することが可能な免疫細胞の量であってもよい。この量は、炎症に関連する症状、例えば、疼痛、浮腫および高温を緩和するために必要な量であってもよい。この量は、移植された臓器の拒絶を減らすか、または予防するのに必要は量であってもよい。
【０２３１】
免疫細胞集合は、例えば、ある疾患状態を軽減するために、１日〜数日にわたって１回または複数回の投薬、または疾患の進行を抑え、疾患の再発を防ぐために、長期間にわたって周期的な投薬など、疾患に合った治療計画で投与されてもよい。製剤に使用される正確な用量も、投与経路、疾患または障害の重篤度に依存して変化し、実施者の判断および各患者の状況にしたがって決定されるべきである。免疫細胞の治療上有効量は、治療される対象、重篤度および罹患の種類、投与様式に依存するだろう。いくつかの実施形態では、ヒト対象の治療に使用可能な用量は、少なくとも３．８×１０４、少なくとも３．８×１０５、少なくとも３．８×１０６、少なくとも３．８×１０７、少なくとも３．８×１０８、少なくとも３．８×１０９、または少なくとも  ３．８×１０１０の免疫細胞／ｍ２の範囲である。特定の実施形態では、ヒト対象の治療に使用される用量は、約３．８×１０９〜約３．８×１０１０免疫細胞／ｍ２の範囲である。さらなる実施形態では、免疫細胞の治療上有効量は、体重１ｋｇあたり約５×１０６細胞〜体重１ｋｇあたり約７．５×１０８細胞、例えば、体重１ｋｇあたり約２×１０７細胞〜体重１ｋｇあたり約５×１０８細胞、または体重１ｋｇあたり約５×１０７細胞〜体重１ｋｇあたり約２×１０８細胞の範囲でさまざまであってもよい。免疫細胞の実際の量は、対象の年齢、体重、性別および生理学的状態に基づき、当業者によって容易に決定される。効果的な用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデルの試験系から誘導される用量応答曲線から外挿することができる。
【０２３２】
免疫細胞は、免疫介在性障害を治療するための１つ以上の他の治療剤と組み合わせて投与されてもよい。併用療法としては、限定されないが、１つ以上の抗微生物剤（例えば、抗生物質、抗ウイルス剤および抗真菌剤）、抗腫瘍剤（例えば、フルオロウラシル、メトトレキサート、パクリタキセル、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン、またはビンクリスチン）、免疫除去剤（例えば、フルダラビン、エトポシド、ドキソルビシン、またはビンクリスチン）、免疫抑制剤（例えば、アザチオプリン、または  グルココルチコイド、例えば、デキサメタゾンまたはプレドニゾン）、抗炎症剤（例えば、グルココルチコイド、例えば、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾンまたはプレドニゾン、または非ステロイド系抗炎症剤、例えば、アセチルサリチル酸、イブプロフェンまたはナプロキセンナトリウム）、サイトカイン（例えば、インターロイキン−１０またはトランスフォーミング成長因子−β）、ホルモン（例えば、エストロゲン）、またはワクチンが挙げられるだろう。これに加え、免疫抑制剤または寛容性付与剤としては、限定されないが、カルシニューリン阻害剤（例えば、シクロスポリンおよびタクロリムス）；ｍＴＯＲ阻害剤（例えば、ラパマイシン）；ミコフェノール酸モフェチル、抗体（例えば、認識するＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ１５４、ＣＤ４５、ＩＶＩＧ、またはＢ細胞）；化学療法剤（例えば、メトトレキサート、トレオサルファン、ブスルファン）；照射；またはケモカイン、インターロイキンまたはこれらの阻害剤（例えば、ＢＡＦＦ、ＩＬ−２、抗ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＪＡＫキナーゼ阻害剤）が挙げられ、これらが投与されてもよい。このようなさらなる医薬的剤は、所望な効果に応じて、免疫細胞の投与前、投与中または投与後に投与されてもよい。細胞および剤のこの投与は、同じ部位または異なる部位に、同じ経路または異なる経路によるものであってもよい。
【０２３３】
Ａ．医薬組成物
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物および製剤も本明細書で提供される。
【０２３４】
本明細書に記載される医薬組成物および製剤は、凍結乾燥した製剤または水溶液の形態で、所望な程度の純度を有する活性成分（例えば、抗体またはポリペプチド）と、１つ以上の任意要素の医薬的に許容される担体とを混合することによって調製することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２２ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ、２０１２）。医薬的に許容される担体は、使用される投薬量および濃度で受容者にとって一般的に非毒性であり、限定されないが、バッファー、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物、グルコース、マンノース又はデキストリンを含む；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。本発明の例示的な医薬的に許容される担体は、更に、間質性薬物分散剤、例えば、可溶性中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えば、ｒＨｕＰＨ２０（ＨＹＬＥＮＥＸ（登録商標）、Ｂａｘｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．）を含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用方法は、ｒＨｕＰＨ２０を含め、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号及び第２００６／０１０４９６８号に記載される。一態様では、ｓＨＡＳＥＧＰを、１つ以上の更なるグリコサミノグリカナーゼ（例えば、コンドロイチナーゼ）と合わせる。
【０２３５】
Ｂ．併用療法
特定の実施形態では、本発明の実施形態の組成物および方法は、少なくとも１つのさらなる治療と組み合わせて、免疫細胞の集合を含む。さらなる治療は、放射線療法、外科手術（例えば、腫瘍摘出手術および乳腺切除）、化学療法、遺伝子療法、ＤＮＡ療法、ウイルス療法、ＲＮＡ療法、免疫療法、骨髄移植、ナノ治療、モノクローナル抗体療法、または上述のものの組み合わせであってもよい。さらなる治療は、補助療法または術前補助療法の形態であってもよい。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、さらなる治療は、低分子酵素阻害剤または抗転移剤の投与である。いくつかの実施形態では、さらなる治療は、副作用を制限する剤の投与である（例えば、治療の副作用の発生および／または重篤度を下げることを意図した剤、例えば、吐き止め剤など）。いくつかの実施形態では、さらなる治療は、放射線療法である。いくつかの実施形態では、さらなる治療は、手術である。いくつかの実施形態では、さらなる治療は、放射線療法と外科手術の組み合わせである。いくつかの実施形態では、さらなる治療は、γ線照射である。いくつかの実施形態では、さらなる治療は、ＰＢＫ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路、ＨＳＰ９０阻害剤、チューブリン阻害剤、アポトーシス阻害剤および／または化学予防剤を標的とする治療である。さらなる治療は、当該技術分野で既知の１つ以上の化学療法剤であってもよい。
【０２３７】
免疫細胞療法は、さらなる癌療法、例えば免疫チェックポイント療法の前、最中、後、または種々の組み合わせで投与されてもよい。投与は、同時から、数分から数日間、また数週間までの範囲の間隔でされてもよい。免疫細胞療法が、さらなる治療剤とは別個に患者に与えられる実施形態では、一般的に、確実に、それぞれの送達時間の間に十分な時間を過ぎないようにするだろう。その結果、２つの化合物は、患者に対して有利な併用効果を発揮することができるだろう。この場合、抗体療法および抗癌療法を互いに約１２〜２４時間または７２時間以内に、より特定的には、互いに約６〜１２時間以内に患者に与えてもよいことが想定される。ある状況では、それぞれの投与の間に数日間（２、３、４、５、６または７日間）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週間）が経過するように治療のための期間を顕著に延ばすことが望ましい場合がある。
【０２３８】
種々の組み合わせが使用されてもよい。例えば、以下、免疫細胞療法は「Ａ」であり、抗癌療法は「Ｂ」である。
2020517259.tif 000006
【０２３９】
患者に対する本発明の実施形態の任意の化合物または治療の投与は、もし存在する場合には剤の毒性を考慮して、このような化合物の投与についての一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法に起因する毒性をモニタリングする工程が存在する。
【０２４０】
１．化学療法
多種多様な化学療法剤を、本発明の実施形態にしたがって使用してもよい。「化学療法」との用語は、癌を治療するための薬物の使用を指す。「化学療法剤」は、癌の治療において投与される化合物または組成物を暗示するために使用される。これらの剤または薬物は、例えば、細胞周期に影響を与える段階で、細胞内のこれらの活性態様に分類される。または、ある剤は、ＤＮＡを直接的に架橋する能力、ＤＮＡにインターカレーションする能力、または核酸合成を行うことによって染色体および有糸分裂の異常を誘発する能力に基づいて特徴付けられてもよい。
【０２４１】
化学療法剤の例としては、アルキル化剤、例えば、チオテパおよびシクロホスファミド；アルキルスルホネート、例えば、ブスルファン、イムプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えば、ベンゾドーパ、カルボコン、メツレドーパおよびウレドーパ；エチレンイミンおよびメチラメラミン、アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミドおよびトリメチロロメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトセシン（合成アナログであるトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成アナログを含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成アナログであるＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリューセロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソ尿素、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムスチン；抗生物質、例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケアミシン、特に、カリケアミシンガンマＩおよびカリケアミシンオメガＩ１）；ダイネミシン、ダイネミシンＡを含む；ビスホスホネート、例えば、クロンドロネート；エスペラミシン；およびネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６ージアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、例えば、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチンおよびゾルビシン；代謝拮抗剤、例えば、メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）；葉酸アナログ、例えば、デノプテリン、プテロプテリンおよびトリメトレキサート；プリンアナログ、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリンおよびチオグアニン；ピリミジンアナログ、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビンおよびフロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタンおよびテストラクトン；抗副腎剤、例えば、ミトタンおよびトリロスタン；葉酸補充剤、例えば、フォリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エフロールニチン；酢酸エリプチニウム；エポシロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド、例えば、メイタンシンおよびアンサマイトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメト；ピラルビシン；ロキソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラキュリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセルおよびドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位複合体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビンブラスチン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド、例えば、レチノイン酸；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン，プリコマイシン、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル−タンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、および上述のいずれかの医薬的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられる。
【０２４２】
２．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範囲に使用されてきた他の因子としては、γ線、Ｘ腺として一般的に知られているもの、および／または腫瘍細胞への放射線同位体の指向性送達が挙げられる。マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号および同第４，８７０，２８７号）、およびＵＶ照射など、ＤＮＡ損傷因子の他の形態も想定される。これらの因子の全てが、ＤＮＡに対し、ＤＮＡの前駆体に対し、ＤＮＡの複製および修復に対し、染色体のアセンブリおよび管理に対し、広範囲の損傷を与える可能性が最も高い。Ｘ線の投薬範囲は、長期間にわたって（３〜４週間）１日線量が５０〜２００レントゲンから、１回の線量２０００〜６０００レントゲンまでの範囲である。放射線同位体の投薬範囲は、非常にさまざまであり、同位体の半減期、発せられる放射線の強度および種類、新生物性細胞による取り込みに依存する。
【０２４３】
３．免疫療法
当業者は、さらなる免疫療法を、本実施形態の方法と組み合わせて、または本実施形態の方法と共に使用してもよいことを理解するだろう。癌治療の観点で、免疫療法は、一般的に、癌細胞を標的とし、破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存する。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））は、このような一例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞表面にあるいくつかのマーカーに特異的な抗体であってもよい。抗体のみが、治療のエフェクターとして役立ってもよく、または細胞の死滅に実際に影響を与える様に、他の細胞を動員してもよい。抗体はまた、薬物または毒素（化学療法薬、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に抱合され、標的化剤として役立ってもよい。または、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を保有するリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。
【０２４４】
抗体−薬物抱合体は、癌治療の開発に対する画期的な手法として出現した。癌は、世界中の死因の上位の１つである。抗体−薬物抱合体（ＡＤＣ）は、細胞を死滅させる薬物に共有結合したモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。この手法を、高効能の細胞傷害性薬を用いた抗原標的に対し、高特異性のＭＡｂと合わせ、濃縮されたレベルの抗原を含む腫瘍細胞に対してペイロード（薬物）を送達する「アーム」付きのＭＡｂが得られる。薬物の標的への送達は、正常組織への露出も最小限にしており、毒性が低下し、治療指数が向上する。ＦＤＡによる２種類のＡＤＣ薬物の承認（ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブベドチン）は２０１１年に、ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブエムタンシンまたはＴ−ＤＭ１）は２０１３年に）は、この手法を認証した。現時点で、癌治療のための臨床試験のさまざまな段階において、３０種類を超えるＡＤＣ薬物候補が存在する。（Ｌｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）抗体操作およびリンカーペイロード最適化は、ますます成熟しつつあり、新しいＡＤＣの発見および開発は、この手法および標的とするＭＡｂの生成に適した新しい標的の特定および検証にますます依存している。ＡＤＣ標的のための２つの基準は、腫瘍細胞においてアップレギュレーションされた／高レベルの発現と、頑強な内在化である。
【０２４５】
免疫療法の一態様では、腫瘍細胞は、標的化（すなわち、他の細胞の大部分には存在しない）のために修正可能ないくつかのマーカーを有していなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかが、本発明の実施形態の観点でのターゲティングに適している場合がある。一般的な腫瘍マーカーとしては、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂおよびｐ１５５が挙げられる。免疫療法の代替的な態様は、抗癌効果と免疫刺激効果を合わせることである。サイトカイン、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−ＩＦＮ、ケモカイン、例えば、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８、および成長因子、例えば、ＦＬＴ３リガンドを含め、免疫刺激分子も存在する。
【０２４６】
現在調査中または使用中の免疫療法の例は、免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物（米国特許第５，８０１，００５号および同第５，７３９，１６９号；ＨｕｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ、１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓｅｔ  ａｌ、１９９８）；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎｅｔ  ａｌ、１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄｅｔ  ａｌ、１９９８）；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２およびｐ５３（Ｑｉｎｅｔ  ａｌ、１９９８；Ａｕｓｔｉｎ−ＷａｒｄおよびＶｉｌｌａｓｅｃａ、１９９８；米国特許第５，８３０，８８０号および同第５，８４６，９４５号）；およびモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２および抗ｐ１８５（Ｈｏｌｌａｎｄｅｒ、２０１２；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉｅｔ  ａｌ、１９９８；米国特許第５，８２４，３１１号）である。１つ以上の抗癌療法を、本明細書に記載の抗体療法と共に使用してもよいことが想定される。
【０２４７】
いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント阻害剤であってもよい。免疫チェックポイントは、シグナルを上向きにするか（例えば、共刺激分子）、またはシグナルを下向きにする。免疫チェックポイントの遮断によって標的とされ得る阻害性免疫チェックポイントとしては、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）、ＢおよびＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても知られる）、インドールアミン  ２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）、プログラム死１（ＰＤ−１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメインおよびムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）およびＴ細胞活性化（ＶＩＳＴＡ）のＶ−ドメインＩｇサプレッサーが挙げられる。特に、免疫チェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１  ａｘｉｓおよび／またはＣＴＬＡ−４を標的とする。
【０２４８】
免疫チェックポイント阻害剤は、リガンドまたは受容体の低分子組換え形態などの薬物であってもよく、または特に、抗体、例えば、ヒト抗体である（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１５０１６７１８号；Ｐａｒｄｏｌｌ、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、１２（４）：  ２５２−６４，  ２０１２。両方とも本明細書に参考として組み込まれる）。免疫チェックポイント  タンパク質またはそのアナログの既知の阻害剤を使用してもよく、特に、キメラ化、ヒト化またはヒト形態の抗体を使用してもよい。当業者は知っているだろうが、本開示で述べられる特定の抗体について、代替的および／または等価な名称が使用される場合がある。このような代替的および／または等価な名称は、本開示の内容において相互に置き換え可能である。例えば、ラムブロリズマブは、代替的および等価な名称でＭＫ−３４７５およびペンブロリズマブとしても知られていることが知られている。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＰＤ−１のそのリガンド結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤ−１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２である。別の実施形態では、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、ＰＤＬ１のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ−１および／またはＢ７−１である。別の実施形態では、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、ＰＤＬ２のその結合パートナーに対する結合を阻害する分子である。具体的な態様では、ＰＤＬ２結合パートナーは、ＰＤ−１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドであってもよい。例示的な抗体は、米国特許第ＵＳ８７３５５５３号、同第ＵＳ８３５４５０９号および同第ＵＳ８００８４４９号に記載されており、全て本明細書に参考として組み込まれる。本明細書で提供される方法で使用するための他のＰＤ−１  ａｘｉｓアンタゴニストは、米国特許出願番号第ＵＳ２０１４０２９４８９８号、同第ＵＳ２０１４０２２０２１号および同第ＵＳ２０１１０００８３６９号（全て本明細書に参考として組み込まれる）に記載されるように、当該技術分野で既知である。
【０２５０】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブおよびＣＴ−０１１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合したＰＤＬ１またはＰＤＬ２の細胞外またはＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシンである。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、ＡＭＰ−２２４である。ニボルマブは、ＭＤＸ−１１０６−０４、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８およびＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られており、ＷＯ２００６／１２１１６８号に記載される抗ＰＤ−１抗体である。ペンブロリズマブは、ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ  ３４７５、ラムブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）およびＳＣＨ−９００４７５としても知られており、ＷＯ２００９／１１４３３５号に記載される抗ＰＤ−１抗体である。ＣＴ−０１１は、ｈＢＡＴまたはｈＢＡＴ−１としても知られており、ＷＯ２００９／１０１６１１号に記載される抗ＰＤ−１抗体である。ＡＭＰ−２２４は、Ｂ７−ＤＣＩｇとしても知られており、ＷＯ２０１０／０２７８２７号およびＷＯ２０１１／０６６３４２号に記載されるＰＤＬ２−Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【０２５１】
本明細書で提供される方法で標的にされ得る別の免疫チェックポイントは、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）であり、ＣＤ１５２としても知られている。ヒトＣＴＬＡ−４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞表面で見出され、抗原提示細胞の表面にあるＣＤ８０またはＣＤ８６に結合すると、「オフ」スイッチとして作用する。ＣＴＬＡ４は、ヘルパーＴ細胞の表面で発現し、Ｔ細胞に阻害性シグナルを伝える、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞共刺激タンパク質、ＣＤ２８に似ており、両分子は、抗原提示細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６（それぞれＢ７−１およびＢ７−２とも呼ばれる）に結合する。ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞に阻害シグナルを伝え、一方、ＣＤ２８は、刺激シグナルを伝える。細胞内ＣＴＬＡ４は、制御性Ｔ細胞で見出され、その機能にとって重要な場合がある。Ｔ細胞受容体およびＣＤ２８によるＴ細胞活性化によって、Ｂ７分子の阻害性受容体であるＣＴＬＡ−４の発現が増加する。
【０２５２】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体）、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質またはオリゴペプチドである。
【０２５３】
本発明の方法で使用するのに適した抗ヒト−ＣＴＬＡ−４抗体（またはこれらに由来するＶＨドメインおよび／またはＶＬドメイン）は、当該技術分野でよく知られた方法を用いて作成することができる。または、当該技術分野で認識されている抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用してもよい。例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体は、以下に開示されている。ＵＳ  ８，１１９，１２９号、ＷＯ  ０１／１４４２４号、ＷＯ  ９８／４２７５２号、ＷＯ  ００／３７５０４号（ＣＰ６７５，２０６、トレメリムマブとしても知られている、以前はチシリムマブ）、米国特許第６，２０７，１５６号；Ｈｕｒｗｉｔｚｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ９５（１７）：１００６７−１００７１；Ｃａｍａｃｈｏｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．  ２５０５（抗体ＣＰ−６７５２０６）；およびＭｏｋｙｒｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ５８：５３０１−５３０４を、本明細書に開示する方法に使用してもよい。上述の刊行物それぞれの教示は、本明細書に参考として組み込まれる。ＣＴＬＡ−４に対する結合について、これらの当該技術分野で認識されている任意の抗体と競争する抗体も使用可能である。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ−４抗体は、国際特許出願第ＷＯ２００１０１４４２４号、ＷＯ２００００３７５０４号および米国特許第８，０１７，１１４号に記載されており、全て本明細書に参考として組み込まれる。
【０２５４】
例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ−０１０、ＭＤＸ−１０１およびＹｅｒｖｏｙ（登録商標））またはその抗原結合フラグメントｓおよびバリアントである（例えば、ＷＯ  ０１／１４４２４号を参照）。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖および軽鎖ＣＤＲまたはＶＲを含む。したがって、一実施形態では、抗体は、イピリムマブのＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインと、イピリムマブのＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３ドメインとを含む。別の実施形態では、抗体は、上述の抗体と同様に、ＣＴＬＡ−４上の同じエピトープとの結合について競争し、および／またはこれに結合する。別の実施形態では、抗体は、上述の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性を有する（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％、または９９％の可変領域同一性）。
【０２５５】
ＣＴＬＡ−４を調整する他の分子としては、ＣＴＬＡ−４リガンド、および米国特許第ＵＳ５８４４９０５号、ＵＳ５８８５７９６号および国際特許出願第ＷＯ１９９５００１９９４号およびＷＯ１９９８０４２７５２号（全て本明細書に参考として組み込まれる）に記載されるような受容体、および本明細書に参考として組み込まれる米国特許第ＵＳ８３２９８６７号に記載されるようなイムノアドヘシンが挙げられる。
【０２５６】
４．手術
癌を有するヒトの約６０％が、ある種の外科手術を受けており、予防手術、診断手術、または病気診断、治療、緩和の手術が含まれる。治療の外科手術は、癌組織の全てまたは一部を物理的に除去し、切除し、および／または破壊する切除術を含み、他の治療、例えば、本発明の実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法および／または代替療法などと組み合わせて使用されてもよい。腫瘍切除は、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を指す。腫瘍切除に加え、外科手術による治療としては、レーザー手術、凍結手術、電気手術、および顕微鏡下手術（モース手術）が挙げられる。
【０２５７】
癌性細胞、組織または腫瘍の一部または全てを切除すると、体内に空洞が作られる場合がある。治療は、さらなる抗癌療法を用いた灌流、直接的な注射、または領域への局所的な適用によって達成されてもよい。このような治療は、例えば、１日ごと、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、または７日ごと、または１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、または１ヶ月ごと、２ヶ月ごと、３ヶ月ごと、４ヶ月ごと、５ヶ月ごと、６ヶ月ごと、７ヶ月ごと、８ヶ月ごと、９ヶ月ごと、１０ヶ月ごと、１１ヶ月ごと、または１２ヶ月ごとに繰り返されてもよい。これらの治療は、同様にさまざまな投薬量であってもよい。
【０２５８】
５．他の剤
他の剤を、治療の治療効能を高めるために、本発明の実施形態の特定の態様と組み合わせて使用してもよいことが想定される。これらのさらなる剤としては、細胞表面受容体およびＧＡＰ接合部のアップレギュレーションに影響を与える剤、細胞増殖抑制剤および分化剤、細胞接着阻害剤、アポトーシス誘発剤に対する過剰増殖性細胞の感度を高める剤、または他の生物学的剤が挙げられる。ＧＡＰ接合部の数を増やすことによる、細胞内シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖する細胞集合に対する抗過剰増殖効果を高めるだろう。他の実施形態では、治療の抗過剰増殖効能を高めるために、細胞増殖抑制剤および分化剤を、本発明の実施形態の特定の態様と組み合わせて使用してもよい。細胞接着の阻害剤は、本発明の実施形態の効能を高めると考えられる。細胞接着阻害剤の例は、焦点接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。過剰増殖性細胞のアポトーシスに対する感度を高める他の剤、例えば、抗体ｃ２２５を、治療効能を向上させるために、本発明の実施形態の特定の態様と組み合わせて使用してもよいことがさらに想定される。
【０２５９】
ＩＶ．製造物品またはキット
免疫細胞を含む製造物品またはキットも本明細書で提供される。製造物品またはキットは、さらに、個人において癌を治療するか、または癌の進行を遅らせるために、または癌を有する個人の免疫機能を高めるために免疫細胞を用いるための指示を含む添付文書を含んでいてもよい。本明細書に記載する任意の抗原特異的免疫細胞は、製造物品またはキットに含まれていてもよい。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、袋およびシリンジが挙げられる。容器は、種々の材料、例えば、ガラス、プラスチック（例えば、ポリ塩化ビニルまたはポリオレフィン）、または金属アロイ（例えば、ステンレス鋼またはハステロイ）から作られていてもよい。いくつかの実施形態では、容器は、製剤を保持し、ラベルが付けられているか、または関連して、容器は、使用のための指示を示していてもよい。製造物品またはキットは、他のバッファー、希釈剤、フィルター、ニードルおよびシリンジと、使用指示を含む添付文書を含め、商業的およびユーザの観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、製造物品は、別の剤（例えば、化学療法剤および抗新生物剤）のうち１つ以上をさらに含む。１つ以上の剤に適した容器としては、例えば、瓶、バイアル、袋およびシリンジが挙げられる。
【実施例】
【０２６０】
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれている。以下の実施例に開示される技術は、本発明の実施において十分に機能するように本願発明者によって開発された技術を表し、そのため、その実施のための好ましい態様を構成すると考えることができることが、当業者によって理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示の観点で、開示される具体的な実施形態において、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、同じまたは同様の結果が依然として得られる多くの変更をなし得ることを理解するべきである。
【０２６１】
実施例１−ＩＬ−１５を発現するＣＡＲ−ＮＫ細胞
ＮＫ細胞は、臍帯血に由来し、その特異性は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）のリスクを高めることなく、その抗腫瘍活性を高めることが可能な腫瘍特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝的に操作し、そのため、治療（例えば、標的を発現する任意の癌の免疫療法）のための「既製品の」細胞源を与えることによって再変更された。遺伝子改変のために、ＣＢ−ＮＫ細胞を、レトロウイルス構築物（ｉＣ９／ＣＡＲ．ＣＳ１／ＩＬ−１５）を用いて形質導入し、腫瘍抗原ＣＳ１および標的骨髄腫を認識するように、その特異性を再変更させた。レトロウイルスベクターを用いて形質導入されたＣＢ−ＮＫ細胞の形質導入効率をモニタリングし、導入遺伝子の発現が安定していることがわかった。２人の異なるドナー由来のＮＫ細胞におけるＣＡＲ発現の形質導入効率を図１Ａに示す。形質導入されたＮＫ細胞を、ＣＳ１を発現する骨髄腫細胞株の優れた死滅性を発揮し（図１Ａ）、ＣＳ１を発現する骨髄腫細胞株に応答して、より多くのエフェクターサイトカインを産生する（図１Ｃ）ことを観察した。
【０２６２】
ＣＡＲが形質導入されたＮＫ細胞の抗白血病効果を判定するために、リンパ芽球性白血病の「ヒト化」マウスモデル、ルシフェラーゼを発現するＲａｊｉ  ＮＳＧマウスモデルに注入した。ｉｎ  ｖｉｖｏでの主要部位に対するＣＡＲ−ＣＤ１９１＋ＣＢ−ＮＫ細胞のトラフィッキングをモニタリングするために、細胞をＦＦＬｕｃベクターで標識し、生物発光イメージングによるモニタリングを可能にした。移植されたマウスは、ＣＳ１＋Ｒａｊｉ白血病Ｂ細胞（２ｘ１０６）を静脈内注射により投与され、腫瘍成長をモニタリングするために、ＲＬｕｃベクターで標識された。腫瘍の移植から６〜１０日後、マウスに、静脈内で、改変されていない２×１０７の増殖したＣＢ−ＮＫ細胞またはＦＦＬｕｃで標識されたＣＤ１９−ＣＤ２８−ゼータ−２Ａ−ＩＬ１５  ＣＢ−ＮＫ細胞を注入した。全てのイメージングを週に１回、３週間行った。４群の動物（１群あたりｎ＝１０）を試験し、安楽死させた後、マウスの脾臓、血液およびリンパ節を集めた。ＣＡＲが形質導入された細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの生物発光イメージングによって示されるように、強い抗腫瘍応答を生じた。ＮＫ−ＣＡＲが介在する腫瘍の死滅を増やし、生存を長引かせるために、ＩＬ−１５を観察した（図２Ａ〜２Ｂ）。
【０２６３】
ＩＬ−１５の自己分泌による産生に起因する、自律性の制御されないＮＫ細胞成長に関する関心のため、誘発性カスパーゼ−９（ＩＣ９）遺伝子に基づく自殺遺伝子は、構築物に組み込まれた。レトロウイルスベクターに組み込まれた誘発性カスパーゼ−９自殺遺伝子を試験するために、１０ｎＭのＣＩＤ  ＡＰ２０１８７を、ｉＣ９／ＣＳ１／ＩＬ１５＋ＮＫ細胞の培養物に加えた。ＡＰ２０１８７は、アネキシンＶ−７ＡＡＤ染色によって評価した場合、トランスジェニック細胞のアポトーシス／壊死を４時間以内に誘発した。
【０２６４】
実施例２−グルココルチコイド受容体のノックアウト
耐ステロイド性免疫細胞を製造するために、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９システムを使用し、ｇＲＮＡの配列番号１〜２を用い、造血細胞中のグルココルチコイド受容体をノックアウトした。グルココルチコイド受容体ノックアウトのＰＣＲによるスクリーニングは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞における効果的なノックダウンを示した（図３）。
【０２６５】
ＣＡＲが形質導入されたＮＫ細胞が３人の異なるドナーから得られ、デキサメタゾン死滅に対する感度について評価した。異なる用量のデキサメタゾンで４時間および２４時間処理した後、アネキシンＶ染色を行い、細胞死を評価した。３人のドナー由来のＮＫ細胞は全て、デキサメタゾンに対して高感度であることがわかり、２４時間の５００μＭのデキサメタゾン治療で全ての細胞が死滅した（図４Ａ〜４Ｂ）。ＣＡＲ  ＮＫ細胞においてＧＲノックアウトすると、デキサメタゾンによる死滅から守られることがわかった。ＣＡＲ  ＮＫコントロール細胞または２００μＭのデキサメタゾンで１２時間処理したＧＲノックアウトを有する細胞のアネキシンＶ染色を図５に示す。ＧＲノックアウトを有するＮＫ細胞は、コントロールＮＫ細胞と比較して、デキサメタゾン死滅に対して顕著に耐性があることがわかった（図５）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９システムを用いたＧＲノックアウトから、耐ステロイド性ＮＫ細胞を作成することができた。
【０２６６】
実施例３−免疫細胞におけるＴＧＦβ−ＲＩＩのノックアウト
次に、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９を使用し、ＣＡＲ  ＮＫ細胞においてＴＧＦβをノックアウトし、ＣＡＲ  ＮＫ細胞を、外因性ＴＧＦβの免疫抑制効果に対して耐性にした。（図６Ａ）ＴＧＦβ−ＲＩＩのノックアウトの成功は、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術を用いて達成された（配列番号３〜４のｇＲＮＡを用い、ＴＧＦβ−ＲＩＩのエキソン３のＣａｓ９およびｇＲＮＡ標的化）（図６Ａ）。野生型およびＴＧＦ−β−ＲＩＩノックアウトＮＫ細胞を、１０ｎｇ／ｍｌの組換えＴＧＦ−βで４８時間処理し、Ｋ５６２標的に対するこれらの応答を評価した。ＴＧＦ−β−ＲＩＩノックアウトＮＫ細胞は、外因性ＴＧＦ−βの免疫抑制効果に対して耐性であることがわかった（図６Ｂ）。ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９技術によるＴＧＦβ−ＲＩＩノックアウトも、ＣＡＳ９のみで処理したＮＫ細胞と比較して、１０ｎｇ／ｍｌの組換えＴＧＦ−βに応答して、下流のＳｍａｄ−２／３リン酸化を無効化することがわかった（図６Ｃ）。したがって、ＣＲＩＳＰＲ−ＣＡＳ９が介在するＴＧＦβ−ＲＩＩのノックアウトによって、ＮＫ細胞をＴＧＦβ耐性にする。
【０２６７】
実施例４−複数の抗原受容体を発現するように操作された免疫細胞
免疫細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）は、血液、例えば、臍帯血由来であり、腫瘍特異的な抗原受容体、例えば、ＣＡＲおよび／またはＴＣＲを発現するように遺伝的に操作されている（図７Ａ〜７Ｄ）。遺伝子改変のために、細胞を、レトロウイルス構築物（図７Ｄ）を用いて形質導入し、２つ以上の腫瘍抗原を認識するように、その特異性を再変更させた。形質導入効率および導入遺伝子発現をモニタリングする。これに加え、抗原特異的な標的細胞の死滅時の免疫細胞の効能を、細胞毒性アッセイによって測定する。
【０２６８】
受容体が形質導入された免疫細胞の抗癌効果を決定するために、癌のマウスモデルに注入する。細胞を、例えば、生物発光イメージングによってｉｎ  ｖｉｖｏでモニタリングするための検出可能な部分で標識する。移植されたマウスは、抗原特異的な標的細胞（例えば、２ｘ１０６）を静脈内注射により投与され、腫瘍成長をモニタリングするために、ベクター（例えば、ＲＬｕｃベクター）で標識された。腫瘍の移植後、マウスに、改変されていないか、または抗原受容体を発現する、増殖した形質導入した免疫細胞を静脈内で注入する。例えば、毎週１回、３週間にわたるイメージングによって、動物をモニタリングする。安楽死させた後に、マウスの脾臓、血液およびリンパ節を集める。
【０２６９】
本明細書に開示され、請求される全ての方法は、本開示の観点で過度な実験を行うことなく、なされ、実行されてもよい。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態の観点で記載されてきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書に記載の方法、工程または工程の順序に変化が加えられてもよいことは当業者には明らかであろう。より特定的には、化学的および生理学的に関連する特定の剤を、同じ結果または同様の結果が達成されつつ、本明細書に記載される剤に交換されてもよいことは明らかであろう。当業者に明らかな全てのこのような同様の代替物および改変は、添付の特許請求の範囲に定義されるような本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると考えられる。
【０２７０】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に示されるものに対して補助的な例示的な手順または他の詳細を与える程度まで、本明細書に参考として組み込まれる。
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ−１】
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【図１Ｃ−２】
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【図１Ｃ−３】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ−１】
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【図６Ｂ−２】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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