(57)【要約】本発明は、全身性エリテマトーデス（ループス、ＳＬＥ）を治療するためのＣＤ２４タンパク質の使用に関する。【選択図】図１Ａ
2020510020.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ループスの治療方法であって、ＣＤ２４タンパク質を、必要とする被験体に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記被験体が、ループス腎炎を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記被験体が、脳症を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記被験体が、心血管疾患を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記被験体が、以前に別の薬物で治療されている、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＤ２４タンパク質が、成熟ヒトＣＤ２４又はその変異体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記成熟ヒトＣＤ２４の配列が、配列番号１又は配列番号２に記載の配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＣＤ２４タンパク質が、タンパク質タグを更に含み、前記タンパク質タグが、前記ＣＤ２４タンパク質のＮ末端又はＣ末端で融合している、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質タグが、哺乳動物免疫グロブリン（Ｉｇ）の一部分を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ｉｇ部分が、ヒトＩｇタンパク質のＦｃ領域である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ｆｃ領域が、前記ヒトＩｇタンパク質のヒンジ領域並びにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含み、前記Ｉｇタンパク質が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、及びＩｇＡからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｆｃ領域が、ＩｇＭのヒンジ領域並びにＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＣＤ２４タンパク質の配列が、配列番号６、配列番号１１、又は配列番号１２に記載の配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＣＤ２４タンパク質が、真核生物タンパク質発現系を用いて産生される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記発現系が、チャイニーズハムスター卵巣細胞株に含有されるベクター又は複製欠損レトロウイルスベクターを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記複製欠損レトロウイルスベクターが、真核細胞のゲノムに安定して組み込まれている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＣＤ２４タンパク質が、可溶性である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＣＤ２４タンパク質が、グリコシル化されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）及び関連する症状を治療するための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
全身性エリテマトーデス（systemic  lupus  erythematous）（ループス、ＳＬＥ）は、最も一般的な自己免疫疾患であり、女性への非常に強い性別バイアスを有する。ＳＬＥは、関節、並びに皮膚、心臓、肺、腎臓及び神経系を含む多くの臓器に影響を及ぼす可能性のある、慢性の炎症性結合組織疾患である。それは、様々な臨床症状を伴う複雑な疾患である。しかし、全身性エリテマトーデスの全ての人がそれら全ての症状を有するわけではない。通常、ループスは、フレアと呼ばれる病気の期間、及び健康又は寛解の期間によって特徴付けられる。その症状は大きく異なり、その発症を正確に特定することが多くの場合難しいため、この疾患にかかっている人の数を推定することは困難である。通常、ＳＬＥは、１５歳から４５歳までの間の年齢の人が初めてかかるが、小児期又は中年期以降でも同様に起こる可能性がある。男性よりはるかに多くの女性がループスを有する。ループスは、白人女性よりもアフリカ系アメリカ人女性でより一般的であり、そしてまたヒスパニック系、アジア系、及びネイティブアメリカン系の女性でも、より一般的である。アフリカ系アメリカ人及びヒスパニックの女性はまた、活動性疾患、及び深刻な臓器系の併発を有する可能性がより高くなる。それに加えて、ループスは、家族内発症する可能性があるが、それでも、患者の子供又は兄弟若しくは姉妹もまたループスを有することとなるリスクは非常に低い。ＳＬＥ患者は、年齢が一致する集団と比較して４．６倍の死亡率の増加、仕事の生産性の低下、気分障害及び臓器機能の低下を示す。しかし、他の自己免疫疾患及びアレルギー疾患と比較して、ＳＬＥの治療のための薬物の開発の進歩は遅く、また新しい治療標的を特定すべき緊急かつ満たされていない医学的ニーズがある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本明細書では、ＣＤ２４タンパク質をそれを必要とする被験体に投与することにより、ＳＬＥ及びその随伴症状、適応症、合併症及び症状発現を治療する方法が提供される。ＳＬＥは、疾患自体に起因するか、又は治療中の炎症作用を制御するために使用されるコルチコステロイドの結果としてであるかのいずれかで、組織損傷に関連することが多く、組織損傷により悪化することが多い。
【０００４】
本発明者らは、ＣＤ２４が、組織又は臓器の損傷の結果として放出される細胞ＤＡＭＰに対する宿主反応を負に調節し、少なくとも２つの重複するメカニズムが、この活性を説明し得ることを実証した。第一に、ＣＤ２４は、ＨＳＰ７０、ＨＳＰ９０、ＨＭＧＢ１及びヌクレオリンを含むいくつかのＤＡＭＰに結合し、これらのＤＡＭＰに対する宿主反応を抑制する。これを行うには、ＣＤ２４が炎症性刺激を捕捉して、その受容体であるＴＬＲ又はＲＡＧＥとの相互作用を阻害し得ると推定される。第二に、肝ネクローシスのアセトアミノフェン誘発マウスモデルを使用して、かつ炎症を確実にして、本発明者らは、ＣＤ２４がその受容体であるＳｉｇｌｅｃ  Ｇとの相互作用を通じて、組織損傷に対する宿主反応の強力な負の調節をもたらすことを実証した。この活性を達成するために、ＣＤ２４は、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇに結合してＳｉｇｌｅｃ  Ｇによるシグナル伝達を刺激してもよく、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇ関連ＳＨＰ１は、負の調節をトリガする。両方のメカニズムは、いずれかの遺伝子の標的変異を有するマウスがはるかにより強い炎症反応を起こしたときに、協同して作用し得る。実際に、ＣＤ２４−／−マウス又はＳｉｇｌｅｃ  Ｇ−／−マウスいずれかに由来する骨髄から培養したＤＣは、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ７０、又はＨＳＰ９０のいずれかで刺激したときに、より高いレベルの炎症性サイトカインを産生した。本発明者らの知る限り、ＣＤ２４は、ＤＡＭＰによってトリガされる炎症を遮断できる唯一の抑制性ＤＡＭＰ受容体であり、組織損傷に対する宿主炎症反応を特異的に標的とする薬物は、現在利用できない。
【０００５】
本発明者らは、ＲＡ、ＭＳ及びＧｖＨＤのマウスモデルを用いて、外因性可溶性ＣＤ２４タンパク質が、ＤＡＭＰ媒介性自己免疫疾患を緩和する能力を実証した。ＳＬＥの病因におけるＤＡＭＰの重要性を考慮すると、ＣＤ２４タンパク質は、ＳＬＥ、又はループス腎炎、神経精神医学的ループス、血液学的ループス、筋骨格ループス、及び重篤な皮膚ループスなどのＳＬＥの関連症状の治療又は予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）（予防法（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ））に使用することができる。本発明者らはまた、タンパク尿、脾腫及びリンパ節腫脹などのＳＬＥの症状を緩和するために、ＣＤ２４タンパク質を使用することができることも発見した。通常、ループスは、フレアと呼ばれる病気の期間、及び健康又は寛解の期間を特徴とする、予測不可能な再発寛解の経過をたどる。したがって、本明細書に記載のＣＤ２４タンパク質は、疾患フレアの期間、重症度及び／又は頻度を制御又は予防するために、治療的（すなわち、フレアの間）又は予防的に（すなわち、寛解期間中）投与されてもよい。本明細書に記載のＣＤ２４タンパク質はまた、投与されるコルチコステロイドの頻度及び用量を低減するために、コルチコステロイドと併用することができる。
【０００６】
本発明者らは、ＣＤ２４が脂肪及び脂質の代謝に関与する分子を調節することができることを更に実証した。特に、本発明者らは、ＣＤ２４が循環血清ＬＤＬ−Ｃのレベルを低減させ、循環レプチンを増加させることができることを実証した。脂質異常症は、ＳＬＥ患者に多く見られる（最大６３％。Ｋａｋａｔｉら、２００３）。それに加えて、アテローム硬化性心血管疾患（ＣＶＤ）の発病率は、年齢及び性別を一致させた対照被験体と比較してＳＬＥ患者で最大５０倍まで増加する。これは、ＣＶＤの従来の危険因子によっては部分的にしか説明することができない（２７）。したがって、本明細書に記載のＣＤ２４タンパク質は、脂質血症及び／又は心血管疾患を有するＳＬＥ患者の治療、又はＳＬＥ患者におけるそのような合併症の予防に、特に有用であり得る。
【０００７】
ヒトＣＤ２４は、ＣＤ２４遺伝子中の２４０個の塩基対のオープンリーディングフレームによってコードされる、小さなＧＰＩアンカー型分子である（２８）。８０個のアミノ酸のうち、最初の２６個が、シグナルペプチドを構成し、最後の２３個が、ＧＰＩテールの付加を可能にするための切断のシグナルとして機能する。結果として、成熟ヒトＣＤ２４分子は、３１個のアミノ酸のみを有する。３１個のアミノ酸のうちの１個は、ヒト集団の間で多型である。オープンリーディングフレームのヌクレオチド１７０におけるＣからＴへの塩基転移は、アラニン（ａ）のバリン（ｖ）との置換をもたらす。この残基は、切断部位に対して直近のＮ末端にあり、置換は、非保存的であるため、これら２個のアレルは、細胞表面で様々な効率で発現することができる。実際に、ｃＤＮＡを用いたトランスフェクション研究により、ＣＤ２４Vアレルが細胞表面でより効率的に発現されることが実証された（２８）。これと一致して、ＣＤ２４ｖ／ｖ  ＰＢＬは、特に、Ｔ細胞で、より高いレベルのＣＤ２４を発現した。
【０００８】
ＣＤ２４タンパク質は、成熟ヒトＣＤ２４又はその変異体を含んでもよい。成熟ヒトＣＤ２４の配列は、配列番号１又は配列番号２の配列を含んでもよい。ＣＤ２４タンパク質は、ヒトＣＤ２４の細胞外ドメインのうちのいずれか又は全てを含んでもよい。ＣＤ２４タンパク質の配列は、配列番号４のシグナル配列を含んでもよく、その配列は、そのタンパク質を発現する細胞からの分泌を促進してもよい。シグナルペプチド配列は、他の膜貫通タンパク質又は分泌タンパク質に見られる配列、又は当該技術分野で既知の、既存のシグナルペプチドから修飾された配列であってもよい。ＣＤ２４タンパク質は、可溶性であってもよく、かつ／又はグリコシル化されてもよい。ＣＤ２４タンパク質は、チャイニーズハムスター卵巣細胞株に含有されるベクター又は複製欠損レトロウイルスベクターを含み得る、真核生物タンパク質発現系を用いて産生されてもよい。複製欠損レトロウイルスベクターは、真核細胞のゲノムに安定して組み込まれてもよい。
【０００９】
ＣＤ２４タンパク質は、ＣＤ２４タンパク質のＮ末端又はＣ末端で融合され得る、タンパク質タグを含んでもよい。タンパク質は、ヒトＩｇタンパク質のＦｃ領域であり得る、哺乳動物免疫グロブリン（Ｉｇ）の一部分を含んでもよい。ヒトＩｇタンパク質は、ヒトＩｇタンパク質のヒンジ領域並びにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含んでもよく、ヒトＩｇタンパク質は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＡであってもよい。Ｆｃ領域はまた、ＩｇＭのヒンジ領域並びにＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びＣＨ４ドメインも含んでもよい。ＣＤ２４タンパク質の配列は、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１１、又は配列番号１２の配列を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】全長ＣＤ２４融合タンパク質、ＣＤ２４Ｆｃ（本明細書中ではＣＤ２４Ｉｇとも称する）のアミノ酸組成（配列番号５）を示す図である。下線部の２６個のアミノ酸は、ＣＤ２４のシグナルペプチドであり（配列番号４）、そのタンパク質を発現する細胞からの分泌中に切断されるため、そのタンパク質のプロセシングされたバージョン（配列番号６）からは欠如している。配列の太字部分は、融合タンパク質に使用される成熟ＣＤ２４タンパク質の細胞外ドメインである（配列番号２）。成熟ＣＤ２４タンパク質に通常存在する最後のアミノ酸（Ａ又はＶ）は、免疫原性を回避するために構築体から欠失している。下線部ではなく太字でない文字は、ＩｇＧ１  Ｆｃの配列であり、ヒンジ領域並びにＣＨ１ドメイン及びＣＨ２ドメインを含む（配列番号７）。
【図１Ｂ】ＣＤ２４ｖＦｃの配列（配列番号８）を示す図であり、この配列において、成熟ヒトＣＤ２４タンパク質（太字）は、配列番号１のバリン多型変異体である。
【図１Ｃ】ＣＤ２４ＡＦｃの配列（配列番号９）を示す図であり、この配列において、成熟ヒトＣＤ２４タンパク質（太字）は、配列番号１のアラニン多型変異体である。図１Ｂ及び図１Ｃの融合タンパク質のいくつかの部分に、図１Ａと同様の表示がされており、変異バリン／アラニンアミノ酸は、二重下線付きである。
【図２】マウス（配列番号３）及びヒト（配列番号２）に由来する成熟ＣＤ２４タンパク質の間の、アミノ酸配列の変異を示す。可能性のあるＯ−グリコシル化部位は、太字であり、Ｎ−グリコシル化部位は、下線付きである。
【図３】ＣＤ２４ＩｇＧ１（ＣＤ２４Ｆｃ）の薬物動態（pharmacokenitics）のＷｉｎＮｏｎｌｉｎコンパートメントモデリング解析である。白丸は、３匹のマウスの平均を表し、線は、予測される薬物動態曲線である。  ［図３Ａ］１ｍｇのＣＤ２４ＩｇＧ１のｉ．ｖ．注射である。  ［図３Ｂ］１ｍｇのＣＤ２４ＩｇＧ１（ＣＤ２４Ｆｃ）のｓ．ｃ．注射である。  ［図３Ｃ］曲線下面積（ＡＵＣ）、半減期及び最大血中濃度によって測定された、血液中の抗体の総量の比較である。全体的に、ｓ．ｃ．注射のＡＵＣ及びＣｍａｘは、ｉ．ｖ．注射の約８０％であるが、その差異が統計学的に有意ではないことに留意されたい。
【図４】ＣＤ２４−Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇ（１０）相互作用は、ＰＡＭＰとＤＡＭＰとの間の違いを区別する。  ［図４Ａ］ＰＡＭＰに対する宿主反応は、ＣＤ２４−Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇ（１０）相互作用によって影響されなかった。  ［図４Ｂ］ＣＤ２４−Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇ（１０）相互作用は、おそらくＳｉｇｌｅｃ  Ｇ／１０関連ＳＨＰ−１によって、ＤＡＭＰに対する宿主反応を抑制する。
【図５】ＣＤ２４Ｆｃの単回注射は、ＣＡＩＡの臨床スコアを低減する。  ［図５Ａ］実験のダイアグラムである。ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢）に、ビヒクル又は融合タンパク質のいずれかと共に、１日目にｍＡｂを与えた。３日目に、そのマウスにＬＰＳを注射し、３週間、毎日観察した。  ［図５Ｂ］ＣＤ２４Ｆｃは、ＣＡＩＡの臨床スコアを低減する。融合タンパク質（１ｍｇ／マウス）又はビヒクルを、１日目に１回注射した。二重盲検で臨床スコアを決定した。＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１。全部でＰＢＳ群の５２匹のマウス及びＣＤ２４Ｆｃ群の５４匹のマウスを用いた６回の独立した実験で、ＣＤ２４の効果が再現された。
【図６】ＣＤ２４Ｆｃは、関節及びＣＡＩＡにおいて炎症性サイトカインのレベルを低減する。ＣＡＩＡを、図５Ａのダイアグラムのように開始して処置した。炎症性サイトカインを、ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎのサイトカインビーズアレイによって測定した。  ［図６Ａ］代表的なＦＡＣＳプロファイルである。  ［図６Ｂ］関節ホモジネートで測定した、低減されたサイトカイン（平均±ＳＥ）の概要である。
【図７】ＣＤ２４Ｆｃは、関節において軟骨の炎症及び破壊を低減する。７日目に、ＣＤ２４Ｆｃ処置マウス及び対照マウスの両方から前肢及び後肢を解剖し、４％パラホルムアルデヒドで２４時間固定し、続いて５％ギ酸で脱灰した。次いで、肢をパラフィン包埋し、長手方向断面をＨ＆Ｅ及びサフラニンＯレッド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で染色した。
【図８】ＣＡＩＡ誘発の５日目に投与した、ＣＤ２４Ｆｃの治療効果である。ＣＡＩＡ誘発マウスを２つの群に無作為化し、ビヒクル（ＰＢＳ）又はＣＤ２４Ｆｃのいずれかを与えた。それらのマウスに二重盲検でスコアを与えた。３つの独立した実験のうち代表的なものを示す。
【図９】低用量のＣＤ２４Ｆｃは、ＣＡＩＡの発症を防ぐ。  ［図９Ａ］実験のダイアグラムである。  ［図９Ｂ］二重盲検で与えた、関節炎の臨床スコアである。
【図１０】Ｓｉｇｌｅｃｇは、ＣＤ２４Ｆｃの治療効果に不可欠であり、ＷＴ（図１０Ａ）及びＳｉｇｌｅｃｇ−／−マウス（図１０Ｂ）に、ビヒクル対照又はＣＤ２４Ｆｃのいずれかを抗コラーゲンｍＡｂのカクテルと共に与えた。二重盲検で臨床スコアを毎日記録した。
【図１１−１】ＣＤ２４ｖＦｃ及びＣＤ２４Ｆｃの構築である。  ［図１１Ａ］融合タンパク質のダイアグラムである。細胞外ドメインの多型残基は、ＣＤ２４Ｆｃにおいて欠失した。  ［図１１Ｂ］２つの融合タンパク質の純度に関するＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。表示されている数値は、ロードされたタンパク質のμｇである。  ［図１１Ｃ］ＣＤ２４ｖＦｃとＣＤ２４Ｆｃとの、それらのＳｉｇｌｅｃ  １０Ｆｃへの結合に関する比較である。脱シアル化ＣＤ２４Ｆｃをネガティブ対照として使用した。  ［図１１Ｄ］ＣＡＩＡモデルにおける治療効果に関する、ＣＤ２４ＦｃとＣＤ２４ｖＦｃとの比較。１日目に、ＣＤ２４Ｆｃ又はＣＤ２４ｖＦｃ（２００μｇ／マウス）を、抗コラーゲン抗体のカクテルと共にマウスに注射した。３日目に、ＬＰＳで処理することにより関節炎が誘発された。その疾患に二重盲検でスコアを与えた。図１１Ｃ及び図１１Ｄに示すデータは、平均及びＳＥＭである。図１１Ｅ及び図１１Ｆもまた、ＩｇＧ１  Ｆｃがネガティブ対照として使用されたことを除いて図１１Ｄに示されたものと同様に実施された実験において、ＣＤ２４Ｆｃ及びＣＤ２４ｖＦｃの治療効果を比較する。図１１Ｅに示すように、ＣＤ２４Ｆｃは、４日目という早さでＲＡスコアを低減させ、３週間の観察を通じて統計的に有意な保護を示した。一方、図１１Ｆに示すように、ＣＤ２４ｖＦｃは、８日目からＲＡスコアの低減を示した。その後、スコアの低減が観察されたが、その低減は、統計的有意性に達しなかった。
【図１１−２】同上。
【図１２】ＣＤ２４Ｆｃは、ＤＢＡ／１マウスにおいてＣＩＡに対する保護を与えた。  ［図１２Ａ］ＣＤ２４Ｆｃは、ＣＩＡモデルにおいて関節炎の発症を抑制した。臨床症状が発現しなかった１７日目に、マウスに単回処置（１ｍｇ／マウス）を与えた。示されているデータは、疾患スコアが３〜８の関節炎を発症したマウスの疾患スコアである。ＣＤ２４Ｆｃ群とＰＢＳ群との差異は、有意であった（Ｐ＝０．０２、フィッシャーのＰＬＳＤ検定）。ビヒクルについてＮ＝９、ＣＤ２４Ｆｃ群についてＮ＝７。  ［図１２Ｂ］ＤＢＡ／１マウスのＣＩＡにおける、ＣＤ２４Ｆｃの治療効果である。３〜８のスコアの臨床症状を有するマウスを無作為化し、２００μｇのＣＤ２４Ｆｃ又は等しい容積の対照ビヒクル（ＰＢＳ）のいずれかを、ｉ．ｐ．注射により隔日に５回与えた。マウスを２週間にわたって毎日検査し、臨床症状にスコアを与えた。関節炎を発症したとき、ＣＤ２４Ｆｃは、関節炎の臨床症状を有意に軽減した（Ｐ＝０．０２、フィッシャーのＰＬＳＤ検定）。ＰＢＳについてＮ＝６、ＣＤ２４Ｆｃ群についてＮ＝５。
【図１３】ＣＤ２４Ｆｃは、進行中のニワトリＣＩＡを有するマウスにおいて、急速な回復を引き起こした。１日目に、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、１００μＬのコラーゲン−ＣＦＡエマルジョン（４ｍｇ／ｍＬのヒヨコ（ｃｈｉｃｋ）ＩＩ型コラーゲンを、５ｍｇ／ｍＬのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する等しい容積のＣＦＡと混合することにより作製される）により、尾根部において皮内に免疫化した。２１日目に、同じコラーゲン−ＣＦＡエマルジョンによる追加免疫を、尾根部から１．５ｃｍの皮内に施した。  ［図１３Ａ］２８日目に、臨床スコア＞３を有するマウスを無作為化し、ビヒクル又はＣＤ２４Ｆｃ（１ｍｇ／マウス）のいずれかを与えた。エンドポイントは、スコアが５０％（上）又は８０％（下）低減したことであった。ＰＢＳについてＮ＝１２、ＣＤ２４ＦｃについてＮ＝１１。  ［図１３Ｂ］ニワトリＣＩＡモデルにおける、ＣＤ２４Ｆｃの用量依存性治療効果である。処置が疾患のピーク（３３日目において両群の平均スコア５．５）で開始されたことを除き、詳細は図１３Ａと同様である。臨床スコア＞３を有するマウスを無作為化し、ビヒクル又はＣＤ２４Ｆｃのいずれかの注射を５回与えた。エンドポイントは、スコアの５０％（上）又は８０％（下）のいずれかの低減であった。Ｎ＝１１。１００μｇの実験群とビヒクル対照群との間の差異は、統計的に有意であった。
【図１４】ＣＤ２４は、ヒトマクロファージによる炎症性サイトカインの産生を抑制した。  ［図１４Ａ］ＣＤ２４のＳｈＲＮＡサイレンシングにより、ＴＮＦα、ＩＬ−６及びＩＬ−Ｉβが自然産生された。ＴＨＰ１細胞は、スクランブルされたｓｈＲＮＡ又は２種の独立したＣＤ２４  ｓｈＲＮＡのいずれかをコードするレンチウイルスベクターにより形質導入された。形質導入された細胞は、ＰＭＡ（１５ｎｇ／ｍＬ）で４日間培養することにより、マクロファージに分化した。ＰＭＡ及び非吸着細胞を洗い流した後、サイトカインビーズアレイによる炎症性サイトカインの測定のために、細胞を更に２４時間培養した。  ［図１４Ｂ］所定の濃度のＣＤ２４Ｆｃ又は対照ＩｇＧ  Ｆｃが最後の２４時間でマクロファージに加えられたことを除き、図１４Ａと同様である。  ［図１４Ｃ］ＣＤ２４Ｆｃは、ＣＤ２４サイレンシングマクロファージ細胞株ＴＨＰ１による炎症性サイトカインの自発産生の抑制において、ＣＤ２４ｖＦｃよりも効率的であった。示されているデータは、ＣＤ２４ＦｃとＣＤ２４ｖＦｃとが並べて比較されていることを除き、図１１の凡例に詳述されているのと同様である。
【図１５】ＣＤ２４Ｆｃによる保護へのＳｉｇｌｅｃ  Ｇの影響を示す図である。  ［図１５Ａ］ＣＤ２４Ｆｃは、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇのチロシンリン酸化、及びＳｉｇｌｅｃ  ＧへのＳＨＰ−１結合を刺激した。ＣＤ２４欠損マウスの脾臓細胞を、ビヒクル、Ｆｃ対照、又はＣＤ２４Ｆｃ（１μｇ／ｍＬ）のいずれかにより３０分間刺激した。溶解後、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇタンパク質は、抗Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇ抗血清により沈殿した。Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇのリン酸化及びＳＨＰ−１への会合は、ウエスタンブロットにより検出された。  ［図１５Ｂ］Ｓｉｇｌｅｃｇは、低用量の抗コラーゲン抗体を有するマウスにおいて、ＣＤ２４Ｆｃの治療効果に不可欠であった。ＷＴ（図１５Ａ）及びＳｉｇｌｅｃｇ−／−マウス（図１５Ｂ）に、抗コラーゲンｍＡｂのカクテル（２ｍｇ／マウス）と共に、ビヒクル対照又はＣＤ２４Ｆｃのいずれかを与えた。３日目に、ＬＰＳを注射した（１００μｇ／マウス）。二重盲検で臨床スコアを毎日記録した。データは、２つの実験の代表的なものである。  ［図１５Ｃ］Ｓｉｇｌｅｃｇの標的変異は、抗コラーゲン抗体の２倍用量を伴うＣＤ２４Ｆｃの治療効果を弱めたが、阻害しなかった。抗コラーゲン抗体（４ｍｇ／マウス）及びＣＤ２４Ｆｃ（１ｍｇ／マウス）を１日目に加え、ＬＰＳ（１００μｇ／マウス）を３日目に加えた。オスのＷＴ（図１５Ａ）及びＳｉｇｌｅｃｇ−／−マウス（図１５Ｂ）を、臨床スコアについて毎日観察した。累積ＲＡスコアのパーセント低減率により、パーセント抑制率を計算した。Ｎ＝５。オスマウスは、８週齢で使用された。
【図１６】ヒト被験体におけるＰＫ評価可能集団の処置による、平均血漿ＣＤ２４Ｆｃ濃度（±ＳＤ）のプロットを示すグラフである。ＰＫ＝薬物動態。ＳＤ＝標準偏差。
【図１７】ＰＫ評価可能集団の用量に対する、ＣＤ２４Ｆｃ  Ｃｍａｘの用量比例プロットを示すグラフである。
【図１８】ＰＫ評価可能集団の用量に対する、ＣＤ２４Ｆｃ  ＡＵＣ０−４２ｄの用量比例プロットを示すグラフである。
【図１９】ＰＫ評価可能集団の用量に対する、ＣＤ２４Ｆｃ  ＡＵＣ０−ｉｎｆの用量比例プロットを示すグラフである。
【図２０】ベースラインレベルのパーセンテージとして表した、ＣＤ２４Ｆｃ処置後のヒト血清ＬＤＬ−Ｃの減少を示すグラフである。１０ｍｇのＣＤ２４Ｆｃを与えられたコホート１を参照として使用して、ＣＤ２４Ｆｃが用量及び時間依存的にＬＤＬ−Ｃレベルを低減させたかどうかを決定した。ＬＤＬ−Ｃレベルの有意な用量依存的低下が観察された（ｐ＜０．０００１）。
【図２１】処置前の１日目と比較した、ＣＤ２４Ｆｃ処置後の３日目における、健康なヒト被験体の血清中のレプチンの比率を示すグラフである。薬物は、０日目に投与された。データは、ＣＤ２４Ｆｃ投与コホート別に表される。０ｍｇ／ｋｇ群は、プラセボ対照群を表す。
【図２２】ＣＤ２４Ｆｃ処置が、ＭＲＬ．ｌｐｒループスモデルにおいてタンパク尿の進行を防ぐことを示すグラフである。示されているデータは、Ａｌｂｕｓｔｉｘにより測定した尿タンパク質レベルの平均値及びＳＥＭである（ｎ＝１０）。
【図２３】ＣＤ２４Ｆｃを単回注射すると、ＭＲＬ．ｌｐｒマウスのタンパク尿が低減されることを示すグラフである。１１週齢でタンパク尿のレベルが一致したメスＭＲＬ．ｌｐｒマウスに、１２週目にＰＢＳ（ビヒクル対照）又は２００μｇ／マウスのＣＤ２４Ｆｃのいずれかの単回注射を腹腔内に与えた。シーメンスＡＵ６８０化学分析装置により、１６週目に尿アルブミンレベルを測定した。Ｐ＝０．０３、対をなさない片側ｔ検定。Ｎ＝１０。
【図２４】ＣＤ２４Ｆｃの単回注射でＭＲＬ．ｌｐｒマウスにおける脾腫が軽減されることを示すグラフである。１１週齢でタンパク尿のレベルが一致したメスＭＲＬ．ｌｐｒマウスに、１２週目にＰＢＳ（ビヒクル対照）又は２００μｇ／マウスのＣＤ２４Ｆｃのいずれかの単回注射を腹腔内に与えた。１６週目にマウスを安楽死させ、それらの脾臓の重量を測定した。Ｐ＝０．０５、対をなさない片側ｔ検定。Ｎ＝１０。
【図２５】ＣＤ２４Ｆｃの単回注射でＭＲＬ．ｌｐｒマウスにおけるリンパ節症が軽減されることを示すグラフである。１１週齢でタンパク尿のレベルが一致したメスＭＲＬ．ｌｐｒマウスに、１２週目にＰＢＳ（ビヒクル対照）又は２００μｇ／マウスのＣＤ２４Ｆｃのいずれかの単回注射を腹腔内に与えた。１６週目にマウスを安楽死させ、それらのリンパ節（腋窩、上腕、鼠径）を組み合わせて重量を測定した。Ｐ＝０．０３、対をなさない片側ｔ検定。Ｎ＝１０。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明者らは、驚くべきことに、ＣＤ２４の可溶形態がＳＬＥの治療に非常に効果的であることを発見した。この効果は、損傷関連分子パターンによって媒介されるものであり得る。パターン認識は、それぞれＰＡＭＰ及びＤＡＭＰと呼ばれる、病原体関連分子パターン及び組織の損傷関連分子パターンの両方の分子パターンによってトリガされる、炎症反応に関与している。本発明者らは、最近の研究により、ＤＡＭＰに対する悪化した宿主反応が、自己免疫疾患の病因において役割を担い得ることが実証されたことを認識した。第一に、壊死細胞の残骸を除去できないことは、ヒトの自己免疫疾患、特にＳＬＥの原因として長い間示唆されてきた（１）。クリアランス不良と一致して、ＳＬＥ患者及びＳＬＥを起こしやすいマウスの血漿中に、より高レベルのヌクレオソームが検出されている（２）。その関連付けられたＨＭＧＢ１を介して、これらのヌクレオソームは、ＴＬＲ２／４を介して炎症性サイトカインの放出をトリガする（２）。第二に、ＳＬＥにおけるＨｍｇｂ１の役割を支持して、Ｗｅｎらは、ＤＮＡを含有する免疫複合体に対する自己抗体の産生には、ＴＬＲ２と相互作用する複合体中のＨＭＧＢ１が必要であると報告した（３）。ＤＡＭＰは、炎症性サイトカインの産生及び自己免疫疾患を促進することが見出され、動物モデルにおいて、ＨＭＧＢ１及びＨＳＰ９０などのＤＡＭＰの阻害剤は、結果として関節リウマチ（ＲＡ）を改善することが見出された（４〜６）。ＴＬＲ、ＲＡＧＥ−Ｒ、ＤＮＧＲ（Ｃｌｅｃ９Ａでコードされる）、及びＭｉｎｃｌｅは、様々なＤＡＭＰによって開始される炎症の、媒介の原因となる受容体であることが示されている（２、７〜１４）。
【００１２】
本発明者らの最近の研究により、ＣＤ２４−Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇ相互作用が、ＤＡＭＰに対する先天免疫をＰＡＭＰから識別することが実証された（１５、１６）。Ｓｉｇｌｅｃタンパク質は、様々なシアル酸含有構造を認識する、膜結合免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーメンバーである。ほとんどのＳｉｇｌｅｃは、ＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２及びＣｂｌ−ｂと結合して炎症反応の重要な調節因子を制御する、細胞内免疫チロシン抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を有する。本発明者らは、ＣＤ２４を、Ｓｉｇｌｅｃ、マウスのＳｉｇｌｅｃ  Ｇ及びヒトのＳｉｇｌｅｃ  １０の、最初のナチュラルリガンドとして同定した（１５）。Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇは、シアル酸付加ＣＤ２４と相互作用して、ＳＬＥ病因において重要なＳＨＰ−１／２シグナル伝達機構（１５）を介して、ＨＭＧＢ１などのＤＡＭＰに対するＴＬＲ媒介宿主反応を抑制する（２）。ごく最近、発明者らによる実験により、Ｓｉｇｌｅｃ  ＧがＣｂｌと結合してＲＩＧ−Ｉの分解をトリガし、ヒトのループスの病因の重要な因子であるＩ型インターフェロン反応の抑制をもたらすことが実証された（１７）。
【００１３】
多発性硬化症（１８〜２１）、ＳＬＥ（２０、２２）、関節リウマチ（２３）、及び巨細胞関節炎（２４）を含む、ヒトにおける様々な自己免疫疾患の遺伝学的分析は、ＣＤ２４多型及び自己免疫疾患のリスクの間に有意な関連を示した。特に、７５０７人の患者及び８８０３人の対照を含む最近のメタ分析により、ＣＤ２４多型と、ＳＬＥを含む複数の自己免疫疾患のリスクとの間の関連が確認された（２５）。具体的には、ＣＤ２４  ｍＲＮＡの位置１５２７（Ｐ１５２７）におけるジヌクレオチドの欠失は、ＭＳのリスクの有意な低下（オッズ比ＯＲ＝０．５３、９５％ブートストラップ信頼区間＝０．３４〜０．８１）及び進行の遅延（ｐ＝０．０１６）に関連している。より重要なことに、２つの独立したコホートからの１５０の家族を用いて、Ｐ１５２７ｄｅｌアレルが、罹患していない個人に選択的に伝達されたことが見出された（ｐ＝０．００３）。ヘテロ接合個体においては、ジヌクレオチド欠失アレルのｍＲＮＡレベルは、野生型アレルのｍＲＮＡレベルよりも２．５倍低かった（ｐ＝０．００４）。本発明者らが実施したトランスフェクション研究により、ジヌクレオチドの欠失によってＣＤ２４  ｍＲＮＡの安定性が劇的に低下したことが明らかになった（ｐ＜０．００１）。結果は、ＣＤ２４  ｍＲＮＡの３’ＵＴＲにおけるジヌクレオチドの欠失による不安定化により、ＭＳのリスクが大幅に低下し、その進行が大幅に遅延したことを実証した。本発明者らはまた、Ｐ１５２７ｄｅｌアレルもまたＳＬＥのリスク低下と強く関連しているということも見出した。本発明者らの知る限り、これは、臓器特異的な自己免疫疾患と全身性の自己免疫疾患の両方に対して保護を与える遺伝子多型の最初の例であり、またいずれかの自己免疫疾患に対して保護を与える最初の３’ＵＴＲ  ｍＲＮＡ不安定化ＳＮＰである（２０）。更に、ＳｉｇｌｅｃとＳＬＥの病因との間の因果関係は、ＭＲＬ／ｌｐｒマウスにおけるＳｉｇｌｅｃｇの標的変異が自発性ループスを多少悪化させたことを示す、最近の報告によって支持されている（２６）。ＳＬＥにおけるＳｉｇｌｅｃの役割は、ヒト及びマウスにおける遺伝学的研究によって支持されている。
１．定義
【００１４】
本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図していない。明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないと明白に示すのでない限り、複数の指示対象を含む。
【００１５】
本明細書における数値範囲の列挙について、それらの間に介在する同一精度のそれぞれの数字は、明示的に企図されている。例えば、６〜９の範囲について、６及び９に加えて数字７及び８が企図され、範囲６．０〜７．０について、数字６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、及び７．０が明示的に企図されている。
【００１６】
「ペプチド」又は「ポリペプチド」は、結合されたアミノ酸の配列であり、天然、合成、又は天然及び合成の修飾若しくは組み合わせであってもよい。
【００１７】
「実質的に同一」は、第１のアミノ酸配列及び第２のアミノ酸配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、又は３００個のアミノ酸の領域にわたって、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％であることを意味してもよい。
【００１８】
「治療」又は「治療する」とは、疾患からの動物の保護を指すとき、疾患を予防、抑制、抑止、又は完全に排除することを意味する。疾患を予防することは、疾患の発症の前に本発明の組成物を動物に投与することを含む。疾患を抑制することは、疾患の誘発の後であって、しかしその臨床的な出現の前に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。
疾患を抑止することは、疾患の臨床的な出現の後に、本発明の組成物を動物に投与することを含む。
【００１９】
「変異体」とは、アミノ酸の挿入、欠失、又は保存的な置換によりアミノ酸配列が異なっているが、少なくとも１つの生物活性を保持する、ペプチド又はポリペプチドを意味してもよい。「生物活性」の代表的な例として、Ｔｏｌｌ様受容体に結合する能力、及び特異抗体によって結合される能力が挙げられる。変異体はまた、少なくとも１つの生物活性を保持するアミノ酸配列を有する参照タンパク質と実質的に同一のアミノ酸配列を有する、タンパク質も意味してもよい。アミノ酸の保存的な置換、すなわち、アミノ酸を類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の度合い及び分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、通常はわずかな変化を伴うものとして、当該技術分野において認識されている。当該技術分野において理解されているように、これらのわずかな変化は、アミノ酸のハイドロパシー指標を考慮することによって部分的に特定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ.，Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ.１５７:１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指標は、アミノ酸の疎水性及び電荷の考慮に基づく。類似のハイドロパシー指標のアミノ酸は、置換され、かつ依然としてタンパク質機能を保持することができることが当該技術分野において既知である。一態様では、±２のハイドロパシー指標を有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性もまた、生体機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするために使用できる。ペプチドの観点でアミノ酸の親水性の考慮することにより、抗原性及び免疫原性とよく相関すると報告されている有用な尺度である、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算が可能になる。米国特許第４，５５４，１０１号は、参照により本明細書に全体が組み込まれる。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換により、当該技術分野で理解されるように、生物活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドがもたらされる可能性がある。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で実施されてもよい。アミノ酸の疎水性指標及び親水性値の両方が、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響を受ける。その観察と一致して、生体機能に適合するアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、及び他の特性によって明らかにされるような、アミノ酸及び特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対的類似性に依存すると理解される。
２．ＣＤ２４
【００２０】
本明細書では、、成熟ヒトＣＤ２４のアミノ酸配列若しくはＣＤ２４の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対応する他の哺乳動物由来のアミノ酸配列を含み得るＣＤ２４タンパク質、又はその変異体が提供される。上記で説明したように、成熟ヒトＣＤ２４タンパク質の配列は、３１アミノ酸長であり、そのＣ末端にバリン（Ｖ）残基との可変アラニン（Ａ）を有する。
【００２１】
ＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴＴＫ（Ｖ／Ａ）（配列番号１）
【００２２】
Ｃ末端バリン又はアラニンは、免疫原性であってもよく、その免疫原性を低減するためにＣＤ２４タンパク質から取り除かれてもよい。したがって、ＣＤ２４タンパク質は、次の、Ｃ末端アミノ酸を欠く、アミノ酸配列又は成熟ヒトＣＤ２４を含んでもよい。
【００２３】
ＳＥＴＴＴＧＴＳＳＮＳＳＱＳＴＳＮＳＧＬＡＰＮＰＴＮＡＴＴＫ（配列番号２）
【００２４】
マウス及びヒト由来の成熟ＣＤ２４タンパク質のアミノ酸配列における大幅な配列変異にもかかわらず、ヒトＣＤ２４Ｆｃがマウスにおいて活性であることが示されているため、それらは機能的に同等である。ヒトＣＤ２４  ＥＣＤのアミノ酸配列は、マウスタンパク質とのいくらかの配列保存を示す（３９％の同一性。ジェンバンク受託番号ＮＰ_０３３９７６）。しかし、ＣＤ２４  ＥＣＤの長さは、種に応じて２７〜３１個だけのアミノ酸であり、Ｓｉｇｌｅｃ  １０／Ｇなどのその受容体（複数可）のいくつかへの結合は、そのシアル酸及び／又は糖タンパク質のガラクトース糖によって媒介されるため、同一性パーセントがより高くないことは、それほど驚くべきことではない。ヒトＳｉｇｌｅｃ−１０（ジェンバンク受託番号ＡＦ３１０２３３）とそのマウスホモログＳｉｇｌｅｃ−Ｇ（ジェンバンク受託番号ＮＰ_７６６４８８）の受容体タンパク質間の、細胞外ドメインのアミノ酸配列同一性は、６３％である（図２）。主としてＣ末端において、グリコシル化部位が豊富にある場合のマウスとヒトのＣＤ２４間の配列保存の結果、成熟ＣＤ２４タンパク質におけるかなりの変異を、特にこれらの変異がＣ末端における保存残基に影響を及ぼさないか、又はマウス若しくはヒトのＣＤ２４からのいずれのグリコシル化部位にも影響を及ぼさない場合に、ＣＤ２４タンパク質の使用において許容することができる。したがって、ＣＤ２４タンパク質は、次の成熟マウスＣＤ２４のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００２５】
ＮＱＴＳＶＡＰＦＰＧＮＱＮＩＳＡＳＰＮＰＴＮＡＴＴＲＧ（配列番号３）。
【００２６】
ヒトＣＤ２４ＥＣＤのアミノ酸配列は、マウスよりもカニクイザルタンパク質とより多くの配列保存を示す（５２％の同一性。ユニプロット受託番号ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｉ７ＧＫＫ１）。この場合もまた、これらの種でＥＣＤの長さが２９〜３１個だけのアミノ酸であるため同一性パーセントがより高くないこと、及びその受容体への結合における糖残基の役割を考慮すると、これは、驚くべきことではない。カニクイザルＳｉｇｌｅｃ−１０受容体のアミノ酸配列は、決定されていないが、ヒトとアカゲザルのＳｉｇｌｅｃ−１０（ジェンバンク受託番号ＸＰ＿００１１１６３５２）タンパク質間のアミノ酸配列の同一性は、８９％である。
したがって、ＣＤ２４タンパク質はまた、成熟カニクイザル（又はアカゲザル）ＣＤ２４のアミノ酸配列も含んでもよい。
【００２７】
ＴＶＴＴＳＡＰＬＳＳＮＳＰＱＮＴＳＴＴＰＮＰＡＮＴＴＴＫＡ（配列番号１０）。
【００２８】
ＣＤ２４タンパク質は、可溶性であってもよい。ＣＤ２４タンパク質は、そのタンパク質を発現する細胞からの分泌を可能にするために、Ｎ末端シグナルペプチドを更に含んでもよい。シグナルペプチド配列は、アミノ酸配列ＭＧＲＡＭＶＡＲＬＧＬＧＬＬＬＬＡＬＬＬＰＴＱＩＹＳ（配列番号４）を含んでもよい。代替として、シグナル配列は、他の膜貫通タンパク質又は分泌タンパク質に見られる配列のうちのいずれか、又は当該技術分野で既知の、既存のシグナルペプチドから修飾された配列であってもよい。
ａ．融合
【００２９】
ＣＤ２４タンパク質は、そのＮ末端又はＣ末端で、ヒト又はマウス又は他の種であり得る、哺乳動物Ｉｇタンパク質の一部分を含み得る、タンパク質タグに融合されてもよい。この部分は、Ｉｇタンパク質のＦｃ領域を含んでもよい。Ｆｃ領域は、Ｉｇタンパク質のヒンジ領域、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメインのうちの少なくとも１つを含んでもよい。Ｉｇタンパク質は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、又はＩｇＡであってよく、Ｆｃ領域は、Ｉｇタンパク質のヒンジ領域並びにＣＨ２ドメイン及びＣＨ３ドメインを含んでもよい。Ｆｃ領域は、配列番号７の配列を含み得る、ヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１）アイソタイプを含んでもよい。Ｉｇタンパク質はまた、ＩｇＭであってもよく、Ｆｃ領域は、ＩｇＭのヒンジ領域並びにＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、及びＣＨ４ドメインを含んでもよい。タンパク質タグは、タンパク質の精製を補助するアフィニティタグ、及び／又は機能性タンパク質の溶解度及び回収を向上させる、溶解度向上タグであってもよい。タンパク質タグはまた、ＣＤ２４タンパク質の結合価を増加してもよい。タンパク質タグはまた、ＧＳＴ、Ｈｉｓ、ＦＬＡＧ、Ｍｙｃ、ＭＢＰ、ＮｕｓＡ、チオレドキシン（ＴＲＸ）、小さなユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン（Ｕｂ）、アルブミン、又はラクダＩｇを含んでもよい。融合タンパク質を作製し、融合タンパク質を精製する方法は、当該技術分野で周知である。
【００３０】
前臨床研究に基づいて、実施例において同定された融合タンパク質ＣＤ２４Ｆｃの構築のために、ＧＰＩシグナル切断部位の前の最終多型アミノ酸が欠如している、３０個のアミノ酸の天然ＣＤ２４分子の切断型（つまり、配列番号２を有する成熟ＣＤ２４タンパク質）が、使用されている。成熟ヒトＣＤ２４配列は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインに融合される（配列番号７）。全長ＣＤ２４Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号５（図１）において提供され、細胞から分泌されるＣＤ２４Ｆｃ融合タンパク質のプロセシングされたバージョン（すなわち、切断されるシグナル配列が欠失しているもの）は、配列番号６において提供される。ＩｇＧ１  Ｆｃに融合される、成熟ＣＤ２４のプロセシングされた多型変異体（すなわち、配列番号１を有する成熟ＣＤ２４タンパク質）は、配列番号１１又は配列番号１２を含んでもよい。
ｂ．産生
【００３１】
ＣＤ２４タンパク質は、高度にグリコシル化されていてもよく、免疫細胞の共刺激及び損傷関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ）との相互作用など、ＣＤ２４の機能に関与してもよい。ＣＤ２４タンパク質は、真核生物発現系を用いて調製されてもよい。発現系は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞におけるベクターからの発現を伴ってもよい。この系はまた、真核細胞に感染するために使用され得る、複製欠損レトロウイルスベクターなどのウイルスベクターであってもよい。ＣＤ２４タンパク質はまた、細胞ゲノムに組み込まれたベクター又はベクターの一部分からＣＤ２４タンパク質を発現する、安定な細胞株からも産生されてもよい。安定な細胞株は、組み込まれた複製欠損レトロウイルスベクターからＣＤ２４タンパク質を発現してもよい。発現系は、ＧＰＥｘ（商標）であってもよい。
ｃ．医薬組成物
【００３２】
ＣＤ２４タンパク質は、薬学的に許容可能な量のＣＤ２４タンパク質を含み得る、医薬組成物に含有されてもよい。医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体を含んでもよい。医薬組成物は、ＣＤ２４タンパク質を長期間にわたって安定に保ち得る、溶媒を含んでもよい。溶媒は、ＣＤ２４タンパク質を−２０°Ｃ（−１５〜−２５°Ｃ）で少なくとも６６か月間安定に保ち得る、ＰＢＳであってもよい。溶媒は、別の薬物と組み合わせてＣＤ２４タンパク質を収容することができてもよい。
【００３３】
医薬組成物は、注射又は持続注入を含むがこれらに限定されない、非経口投与のために製剤化されてもよい。注射用製剤は、油性又は水性のビヒクル中の懸濁液、溶液、又はエマルジョンの形態であってもよく、懸濁剤、安定剤、及び分散剤が挙げられるがこれらに限定されない、製剤用の薬剤を含有してもよい。組成物はまた、滅菌された発熱因子を含まない水が挙げられるがこれに限定されない、適切なビヒクルで再構成するための粉末形態で提供されてもよい。
【００３４】
医薬組成物はまた、埋め込み又は筋肉内注射により投与され得る、デポー製剤として製剤化されてもよい。組成物は、（例えば、許容可能な油中のエマルジョンのような）適切なポリマー材料若しくは疎水性材料、イオン交換樹脂、又は（例えば、難溶性の塩のような）難溶性誘導体と共に製剤化されてもよい。皮下注射用製剤は、ループス並びにその関連症状及び合併症のような適応症に特に関連するものであってもよい。
ｄ．用量
【００３５】
ＣＤ２４タンパク質の用量は、許容可能な毒性及び臨床有効性を有する用量を決定するための臨床試験を通じて、最終的に決定されてもよい。初回臨床用量は、げっ歯類及び非ヒト霊長類における薬物動態及び毒性研究を通じて推定されてもよい。ＣＤ２４タンパク質の用量は、所望の量の治療効果及び投与経路に応じて、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１０００ｍｇ／ｋｇであってもよく、１〜５００ｍｇ／ｋｇであってもよい。ＣＤ２４タンパク質は、静脈内注入又は皮下注射若しくは壁内［すなわち、腔又は臓器の壁内］注射によって投与されてもよく、用量は、被験体がヒトである場合、１０〜１０００ｍｇ、１０〜５００ｍｇ、１０〜２４０ｍｇ、１０〜１２０ｍｇ、又は１０、３０、６０、１２０、若しくは２４０ｍｇであってもよい。
３．治療の方法
【００３６】
本明細書におけるＣＤ２４タンパク質は、ＳＬＥ又はその１つ以上の症状、合併症若しくは症状発現を治療するために、全身性エリテマトーデス（ループス、ＳＬＥ）を有する被験体に投与されてもよい。ＳＬＥは、関節、並びに皮膚、心臓、肺、腎臓及び神経系を含む多くの臓器に影響を及ぼす可能性のある、慢性の炎症性結合組織疾患である。それは、複雑な自己免疫疾患であり、多くの異なる症状を引き起こす可能性がある。しかし、ＳＬＥを有する全ての人がそれら全ての症状を有するわけではない。ＳＬＥでは腎障害（ｒｅｎａｌ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ）が一般的であり、またループス腎炎では急性又は慢性の腎臓機能障害（ｒｅｎａｌ  ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ）を発症して急性又は末期の腎不全を引き起こし得る。ループス腎炎は、糸球体が炎症を起こすタイプの糸球体腎炎であり、またＳＬＥ患者における最も頻繁かつ深刻な合併症の１つである。他の症状としては、神経精神医学的ループス、脳症ループス、血液学的ループス、筋骨格ループス、及び重篤な皮膚ループスが挙げられる。ＣＤ２４タンパク質はまた、ＳＬＥに関連するタンパク尿、脾腫及びリンパ節腫脹のうちの少なくとも１つを治療するために使用されてもよい。被験体は、ヒト、ネコ、イヌ、大型動物、又は鳥類であってもよい。
【００３７】
長期予後不良の主な決定要因の１つは、臓器損傷であり、これは、更なる損傷及び死の前兆となる。そしてまた、制御されていない疾患活動、及び特に、通常、炎症を迅速に抑制するために疾患の経過中においてＳＬＥ患者に処方される、コルチコステロイドの長期使用によって損傷が引き起こされる。それらは強力な薬物であるため、医師は望ましい利益を達成するために必要なコルチコステロイドの最低用量を求める。コルチコステロイドに関連する副作用を最小限に抑えるために、研究者は、コルチコステロイドの使用を制限し、又は埋め合わせる方法の開発に取り組んでいる。本発明者らは、ＲＡ、ＭＳ及びＧｖＨＤのマウスモデルを用いて、外因性可溶性ＣＤ２４タンパク質が、組織損傷に起因するＤＡＭＰ媒介性自己免疫疾患を緩和する能力を実証した。ＳＬＥの病因におけるＤＡＭＰの重要性を考慮すると、ＣＤ２４タンパク質は、ＳＬＥに関連する臓器損傷を低減させ、疾患の進行とフレアを最小限に抑えるために使用されてもよい。更に、ＣＤ２４タンパク質は、疾患を制御するために必要とされるコルチコステロイドの用量を減らし、又はコルチコステロイド治療からの治療休止日を提供するために、コルチコステロイドとともに断続的に投与されてもよい。
【００３８】
ループス腎炎の主な合併症は、永続的な腎障害である。この損傷は、腎不全を引き起こし、透析に頼るようになるほど重篤な場合がある。高血圧、体液過負荷、早発性血管石灰化、高脂血症、早発性冠動脈疾患など、腎不全に関連する全ての合併症は、これらの患者に当てはまる。ＳＬＥ患者の約６３％が脂質血症を有し、アテローム硬化型心血管疾患（ＣＶＤ）の発病率は、年齢及び性別を一致させた対照被験体と比較してＳＬＥ患者で最大５０倍まで増加する。これは、ＣＶＤの従来の危険因子によっては部分的にしか説明することができない。本発明者らは、ＣＤ２４が脂肪及び脂質の代謝に関与する分子を調節することができることを実証した。特に、本発明者らは、ＣＤ２４が循環血清ＬＤＬ−Ｃのレベルを低減させ、循環レプチンを増加させることができることを実証した。したがって、本明細書に記載のＣＤ２４タンパク質は、脂質血症及び／又は心血管疾患を有するＳＬＥ患者の治療、又はＳＬＥ患者、特にループス腎炎患者におけるそのような合併症の予防に、特に有用であり得る。患者は、リソソーム酸性リパーゼ（ＬＡＬ）欠損症、家族性高コレステロール血症、又は高脂血症を患っている場合がある。被験体はまた、アテローム性動脈硬化症の治療若しくは予防、又はアテローム硬化型心血管疾患（ＡＳＣＶＤ）イベントであり得る心血管疾患イベントのリスクを低下させることを必要としている場合もある。ＡＳＣＶＤイベントは、急性冠症候群、心筋梗塞、安定狭心症若しくは不安定狭心症、冠動脈若しくはその他の動脈血行再建、脳卒中、一過性虚血発作、又はアテローム性動脈硬化症に起因すると推定される末梢動脈疾患であり得る。更に、インビボのＣＤ２４タンパク質の生物活性は、ＳＬＥ患者におけるＬＤＬ−Ｃ及び／又はトリグリセリドの血清レベルのモニタリングにより検出されることができるため、臨床使用のための便利なバイオマーカーを提供する。
【００３９】
通常、ループスは、フレアと呼ばれる病気の期間、及び健康又は寛解の期間を特徴とする、予測不可能な再発寛解の経過をたどる。損傷を予防し、安定した寛解を追求することが、ＳＬＥ治療の主な目標である。したがって、ＣＤ２４タンパク質は、疾患フレアの期間、重症度及び／又は頻度を制御又は予防するために、治療的（すなわち、フレアの間）又は予防的に（すなわち、寛解期間中）投与されてもよい。特に、ＣＤ２４タンパク質は、他の治療選択肢に対して抵抗性である患者に投与されてもよい。
ａ．投与
【００４０】
医薬組成物の投与の経路は、非経口であってもよい。
非経口投与としては、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、髄腔内、関節内、及び直接注射が挙げられるが、これらに限定されない。医薬組成物は、ヒト被験体、ネコ、イヌ、大型動物、又は鳥類に投与されてもよい。組成物は、１日ごとに１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２回投与されてもよい。
ｂ．併用治療
【００４１】
ＣＤ２４タンパク質は、ＳＬＥを治療するために用いられる、別の処置と組み合わせてもよい。疾患の複雑さのために、ＳＬＥの全ての患者、又は全てのタイプのＳＬＥに対する標準的な治療計画はないが、免疫抑制薬及び生物学的薬剤は、ＳＬＥにおける炎症性疾患制御の基礎である。一実施形態において、ＣＤ２４タンパク質は、疾患の症状を更に弱め、寛解を誘導し、維持療法として、又はフレアを制御するために、標準のケア治療の背景において投与される。ＳＬＥの治療に現在使用されている薬剤としては、抗マラリア薬（ヒドロキシクロロキンなど）、コルチコステロイド（プレドニゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、及びデキサメタゾンなど）、免疫抑制薬（免疫細胞の産生をブロックすることにより過活動免疫系を抑制する、シクロホスファミド及びミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）、並びにアザチオプリン（ＡＺＡ）など）、Ｂ細胞阻害剤（ベリムマブのようなＢＬｙＳ特異的阻害剤、リツキシマブのような抗ＣＤ２０抗体、及びアタシセプトなど）、共刺激分子（アバタセプトなど）、抗インターフェロン薬、抗サイトカイン抗体、並びに代替療法及び補完療法（食事療法、栄養補助食品、魚油、軟膏及びクリーム、カイロプラクティック治療、並びにホメオパシーなど）が挙げられる。ループス腎炎などの一部の症例では、寛解を誘導するための高強度誘導療法（例えば、高用量のシクロホスファミド又はＭＭＦとコルチコステロイド）が最初に行われ、フレアを制御するために使用されるコルチコステロイドとともに、安定した寛解を維持するための低強度維持療法（例えば、ＭＭＦ及びＡＺＡ）が続く。
【００４２】
特に、ＣＤ２４タンパク質は、投与されるコルチコステロイドの頻度及び用量を低減するために、コルチコステロイドと組み合わせて使用されてもよい。コルチコステロイドは、ＳＬＥ治療の主力とされてきたものであり、また今もなおＳＬＥ治療の主力を代表するが、それでも早発性骨粗しょう症、糖尿病、心血管疾患、進行性臓器不全などの臓器障害に関連しており、これらは、疾患を更に一層、悪化させる可能性がある。これは、より攻撃的な療法を必要とする、拙劣に管理された疾患で作られたサイクルにつながる可能性があり、損傷を引き起こし、そしてまたその損傷が更なる損傷及び死をもたらす。したがって、ステロイドの節約は、長期的に有利な点となるため、新薬についてのステロイド節約の可能性には、より大きな関連性が与えられるべきである。ＤＡＭＰ媒介性の炎症を低減するＣＤ２４タンパク質の能力を考慮すると、ＣＤ２４タンパク質は、制御されていない疾患活動及びコルチコステロイドの長期使用によってトリガされる損傷、並びにそのために更にステロイドを使用することへの依存を、低減するために役立ち得る。
【００４３】
ＣＤ２４タンパク質は、他の治療が施されるのと同時に、又は他の治療が施されるのと共にメトロノミックに、投与されてもよい。本明細書で使用される「同時の（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）」又は「同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）」という用語は、ＣＤ２４タンパク質及びその他の処置が、互いに４８時間以内、好ましくは２４時間以内、より好ましくは１２時間以内、更により好ましくは６時間以内、及び最も好ましくは３時間以下以内に投与されることを意味する。本明細書で使用される「メトロノミックに」という用語は、他の処置とは異なる時点で、かつ反復投与に対して一定の頻度で薬剤を投与することを意味する。
【００４４】
ＣＤ２４タンパク質は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、１分を含む、別の処置の前の任意の時点で投与されてもよい。ＣＤ２４タンパク質は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、１分を含む、ＣＤ２４タンパク質の第２の処置の前の任意の時点で投与されてもよい。
【００４５】
ＣＤ２４タンパク質は、約１分、２分、３分、４分、５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、２４時間、２６時間、２８時間、３０時間、３２時間、３４時間、３６時間、３８時間、４０時間、４２時間、４４時間、４６時間、４８時間、５０時間、５２時間、５４時間、５６時間、５８時間、６０時間、６２時間、６４時間、６６時間、６８時間、７０時間、７２時間、７４時間、７６時間、７８時間、８０時間、８２時間、８４時間、８６時間、８８時間、９０時間、９２時間、９４時間、９６時間、９８時間、１００時間、１０２時間、１０４時間、１０６時間、１０８時間、１１０時間、１１２時間、１１４時間、１１６時間、１１８時間、１２０時間を含む、別の処置の後の任意の時点で投与されてもよい。ＣＤ２４タンパク質は、約１２０時間、１１８時間、１１６時間、１１４時間、１１２時間、１１０時間、１０８時間、１０６時間、１０４時間、１０２時間、１００時間、９８時間、９６時間、９４時間、９２時間、９０時間、８８時間、８６時間、８４時間、８２時間、８０時間、７８時間、７６時間、７４時間、７２時間、７０時間、６８時間、６６時間、６４時間、６２時間、６０時間、５８時間、５６時間、５４時間、５２時間、５０時間、４８時間、４６時間、４４時間、４２時間、４０時間、３８時間、３６時間、３４時間、３２時間、３０時間、２８時間、２６時間、２４時間、２２時間、２０時間、１８時間、１６時間、１４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、５５分、５０分、４５分、４０分、３５分、３０分、２５分、２０分、１５分、１０分、９分、８分、７分、６分、５分、４分、３分、２分、１分を含む、前のＣＤ２４タンパク質処置の後の、いずれかの前の時点で投与されてもよい。
４．ＣＤ２４タンパク質活性のモニタリングの方法
【００４６】
本明細書に記載のＣＤ２４タンパク質の患者における活性の検出は、抗ｄｓＤＮＡ、抗核抗体（ＡＮＡ）、タンパク尿、補体レベル（Ｃ３及びＣ４）、Ｂ細胞サブセット及びＴ細胞サブセット、尿クレアチン、ＩＦＮシグネチャー並びにＩＬ−６などの、ＳＬＥに関連する血清学的マーカーに着目することにより行うことができる。
【００４７】
被験体に投与されたＣＤ２４タンパク質の活性はまた、被験体におけるＬＤＬ−Ｃの濃度を検出することにより、モニターされてもよい。被験体は、ＳＬＥ及び免疫媒介性組織損傷などの治療のような、ＣＤ２４タンパク質による治療を受けていてもよい。ＬＤＬ−Ｃの濃度は、被験体におけるＣＤ２４タンパク質活性のレベルを示してもよく、患者におけるＬＤＬ−Ｃの減少は、ＣＤ２４タンパク質活性がより高いことを示している。この方法は、被験体からサンプルを採取することと、サンプル中のＬＤＬ−Ｃの量を検出することと、を含んでもよい。サンプルは、血清又は血漿などの血液サンプルであってもよい。コレステロールエステラーゼ処理及びコレステロールオキシダーゼ処理の後の、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ又は比色／蛍光アッセイなどのＬＤＬ−Ｃ濃度の測定方法は、当該技術分野で周知である。ＬＤＬ−Ｃの量は、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄ計算によって測定されてもよい。この計算は、サンプル中で測定される総コレステロール、トリグリセリド、及び高密度リポタンパク質コレステロール（ＨＤＬ−Ｃ）の量に基づいて、ＬＤＬ−Ｃの量を計算することを含み得る。ＨＤＬ−Ｃの量は、デキストラン硫酸−Ｍｇ２＋を用いた沈殿法又は直接ＨＤＬ−Ｃアッセイのいずれかで測定されてもよい。ＬＤＬ−Ｃの量はまた、ＤＩＲＥＣＴ  ＬＤＬ（商標）アッセイ、均一Ｎ−ＧＥＮＥＯＵＳ（商標）ＬＤＬアッセイ、又は次のＡｐｏＢベースの方程式から導かれる、ＬＤＬ−Ｃの計算値によって測定されてもよい。０．４１ＴＣ−０．３２ＴＧ＋１．７０ＡｐｏＢ−０．２７、（Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  １９９７；４３：８０８−８１５。その内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。ＬＤＬ−Ｃのレベルは、処置に対する反応をモニターするために、経時的に、かつＣＤ２４タンパク質処置の過程を通じて、モニターすることができる。
【００４８】
本明細書に記載され、又は当該技術分野で既知の適応症を治療するために、被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、ＬＤＬ−Ｃを用いて検出されるＣＤ２４タンパク質活性のレベルに基づいて調整されてもよい。ＬＤＬ−Ｃのレベルは、一定期間に渡って、又はＣＤ２４タンパク質処置の過程を通じて、モニターすることができる。被験体におけるＬＤＬ−Ｃ濃度が正常範囲内のレベルに低下した場合、被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、ＣＤ２４タンパク質の用量を減らす又はより低い頻度で投与することなどにより、低減されてもよい。ＬＤＬ−Ｃ濃度が依然として変化しないままであるか又は正常範囲を超えたままである場合、被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、ＣＤ２４タンパク質の用量を増やすか又はより高い頻度で投与することなどにより、増加されてもよい。ＬＤＬ−Ｃの代替として、ＬＤＬ粒子（ＬＤＬ−Ｐ）の濃度もまた、ＣＤ２４タンパク質活性をモニターするために測定されてもよい。ＬＤＬ−Ｐ濃度は、ＮＭＲを用いて直接検出されてもよい。
【００４９】
被験体に投与されたＣＤ２４タンパク質のレベルもまた、モニターされてもよく、これは、被験体からサンプルを取得し、サンプル中のＣＤ２４タンパク質の量を検出することを含む方法によってもよい。サンプルは、そのような血清又は血漿の血液サンプルであってもよい。タンパク質検出方法は、当該技術分野で周知である。サンプル中のＣＤ２４タンパク質は、ＥＬＩＳＡ、Ｇｙｒｏｓ、ＭＳＤ、Ｂｉａｃｏｒｅ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ、Ｄｅｌｆｉａ、Ｓｉｎｇｕｌｅｘ、Ｌｕｍｉｎｅｘ、イムノＰＣＲ、セルベースアッセイ、ＲＩＡ、ウエスタンブロット、及びアフィニティカラムなどを含む免疫学的検定のような、任意のタンパク質検出方法によって検出されてもよい。ＥＬＩＳＡ法は、サンドイッチＥＬＩＳＡ又は競合ＥＬＩＳＡであってもよい。例えば、ＥＬＩＳＡは、サンプルを抗ＣＤ２４タンパク質抗体に接触させることと、ＣＤ２４タンパク質−ＣＤ２４タンパク質抗体複合体を抗ＣＤ２４タンパク質抗体に結合する標識抗体と接触させることと、標識によって生成されるシグナルを検出することによって標識抗体の量を測定することと、を含んでもよく、シグナルの量は、サンプル中のＣＤ２４タンパク質の量と相関している。
【００５０】
被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、ＣＤ２４タンパク質の薬物動態パラメータに基づいて（投与の用量及び頻度を調整することなどにより）調整されてもよい。例えば、被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、１ｎｇ／ｍＬを超える血漿ＣＤ２４濃度を得るために調整されてもよい。別の例では、被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、１ｎｇ／ｍＬを超える定常状態の血漿濃度を維持するために調整される。別の例では、被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、少なくとも約１ｎｇ／ｍＬのＣＤ２４タンパク質のＣｍａｘを得るために調整されてもよい。更に別の例では、被験体に投与されるＣＤ２４タンパク質の量は、少なくとも約４００，０００ｎｇ＊時間／ｍＬの、ＣＤ２４タンパク質のＡＵＣ０−ｉｎｆによって定義される薬物曝露レベルを達成するために調整されてもよい。
【００５１】
本発明は、以下の非限定的な実施例により例示される、複数の態様を有する。
【実施例１】
【００５２】
マウスのＣＤ２４薬物動態
１ｍｇのＣＤ２４Ｆｃ（ＣＤ２４Ｆｃ）を未処置のＣ５７ＢＬ／６マウスに注射し、様々な時点（５分、１時間、４時間、２４時間、４８時間、７日、１４日及び２１日）で、各時点において３匹のマウスから血液サンプルを採取した。その血清を１：１００に希釈し、ＣＤ２４Ｆｃのレベルを、捕捉抗体として精製抗ヒトＣＤ２４（３．３μｇ／ｍＬ）、及び検出抗体としてペルオキシダーゼ結合体化ヤギ抗ヒトＩｇＧＦｃ（５μｇ／ｍＬ）を用いて、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検出した。図３ａに示すように、ＣＤ２４Ｆｃの減衰曲線は、タンパク質の典型的な二相性の減衰を明らかにした。最初の体内分布相は、１２．４時間の半減期を有していた。第２の相は、中心コンパートメントからの１次消失のモデルに従う。第２の相の半減期は、９．５４日であり、これは、インビボの抗体の半減期に類似する。これらのデータは、融合タンパク質が、血流中で非常に安定であることを示唆する。融合タンパク質を皮下に注射した別の研究では、ほとんど同一の９．５２日の半減期を観察した（図３ｂ）。更に重要なことに、ＣＤ２４Ｆｃが血液中でピークレベルに達するためには約４８時間かかるが、ＡＵＣによって測定される、血液中の融合タンパク質の総量は、いずれの注射経路によっても実質的に同じであった。したがって、治療の見地からみると、注射経路が異なることは、薬物の治療効果に影響を与えないであろう。この観察は、霊長類に関する毒性についての実験デザイン及び臨床試験を大いに単純化した。
【実施例２】
【００５３】
ＲＡの治療のためのＣＤ２４
数十年間、関節リウマチ（ＲＡ）は、主にＴ細胞媒介性の自己免疫疾患であると考えられてきた。過去２０年間において、ＲＡの病因における、抗体及びＢリンパ球の可能性のある役割について再び注目されている。したがって、それに加えて又はリウマチ因子、自己反応性抗体の宿主がＲＡ患者において見出されたが、それは、ヒトにおいて決定的に取り組まれてこなかった。しかし、種々の方向での証拠が、マウスモデルにおいて、ユビキタスな抗原又は組織特異的抗原のいずれかに特異的な抗体が、ＲＡ症状を引き起こすのに十分であることを実証した。例えば、Ｋ／ＢｘＮ  ＴＣＲトランスジェニックマウス由来の抗体は、新規宿主においてＲＡ様疾患を伝達することが完全にできるということが見出された。同様に、４種類の抗コラーゲン抗体についてのカクテルが、マウスにおいてＲＡを誘発するために現在広く使用されている。このモデルは、現在、コラーゲン抗体誘発関節炎としてＣＡＩＡと呼ばれる。
【００５４】
ＣＡＩＡモデルの遺伝学的分析は、補体の重要な役割を示している。他の可能性は存在するが、これらの要件は、ＲＡの病因における抗体媒介性の組織損傷の潜在的な関与を示唆している。組織損傷と炎症との間の関連は、免疫学において長年観察されている。２０年近く前、Ｍａｔｚｉｎｇｅｒは、危険理論と一般に呼ばれるものを提案した。本質的に、Ｍａｔｚｉｎｇｅｒは、宿主において危険を感じたときに免疫系がオンになると主張した。そのときは危険の性質は明確に定義されなかったが、ネクローシスは、ＨＭＧＢ１及び熱ショックタンパク質などの細胞内成分の放出に関連することが決定され、それらは、危険関連分子パターンとしてＤＡＭＰと呼ばれた。ＤＡＭＰは、炎症性サイトカインの産生及び自己免疫疾患を促進することが見出された。動物モデルにおいて、ＨＭＧＢ１及びＨＳＰ９０の阻害剤は、ＲＡを改善することが見出された。ＤＡＭＰが関与していることは、ＲＡの療法のために、ＤＡＭＰに対する宿主反応への負の調節を探索することができるという見込みを示した。
組織損傷に対する宿主反応におけるＣＤ２４−Ｓｉｇｌｅｃ  １０の相互作用
【００５５】
アセトアミノフェン誘発肝ネクローシスを使用して、炎症を確実にして、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇの相互作用によってＣＤ２４が組織損傷に対する宿主反応の強力な負の調節を提供することが観察された。ＣＤ２４は、造血性細胞及び他の組織幹細胞に広く発現する、ＧＰＩアンカー分子である。多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、ＲＡ及び巨細胞動脈炎を含む、ヒトにおける様々な自己免疫疾患の遺伝学的分析は、ＣＤ２４多型及び自己免疫疾患のリスクの間に有意な関連を示した。Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇは、シアル酸含有構造を認識する能力によって定義される、Ｉ−レクチンファミリーのメンバーである。Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇは、ＣＤ２４のシアル酸含有構造を認識して、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇは、樹状細胞による炎症性サイトカインの産生を負に調節する。ＣＤ２４と相互作用するその能力に関して、ヒトＳｉｇｌｅｃ  １０及びマウスＳｉｇｌｅｃ  Ｇは、機能的に等価である。しかし、マウスホモログとヒトホモログとの間に１対１の関連が存在するかどうかは、不明である。そのメカニズムはまだ完全に明らかではないが、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇ関連ＳＨＰ１が、その負の調節に関与し得ることが妥当であろう。最近Ｓｃｉｅｎｃｅにおいて報告されたこれらのデータは、ＣＤ２４−Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇ／１０の相互作用が、ＤＡＭＰからの病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の区別に重要な役割を果たし得る、新しいモデルを導く（図４）。
【００５６】
少なくとも２つの重複するメカニズムが、ＣＤ２４の機能を説明し得る。第一に、様々なＤＡＭＰに結合することによって、ＣＤ２４は、炎症性刺激を捕捉して、そのＴＬＲ又はＲＡＧＥとの相互作用を阻害し得る。この考えは、ＣＤ２４が、ＨＳＰ７０、９０、ＨＭＧＢ１及びヌクレオリンを含む種々のＤＡＭＰ分子と結合するという観察によって支持される。第二に、おそらくＤＡＭＰと会合した後、ＣＤ２４は、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇによるシグナル伝達を刺激してもよい。両方のメカニズムは、いずれかの遺伝子の標的変異を有するマウスがはるかにより強い
炎症反応を起こしたときに、協同して作用してもよい。実際に、ＣＤ２４−／−又はＳｉｇｌｅｃ  Ｇ−／−マウスいずれかに由来する骨髄から培養したＤＣは、ＨＭＧＢ１、ＨＳＰ７０、又はＨＳＰ９０のいずれかで刺激した場合、はるかにより多い炎症性サイトカインを産生した。対照的に、ＬＰＳ及びＰｏｌｙＩ：ＣなどのＰＡＭＰに対するその反応においては、影響は見られなかった。これらのデータは、先天免疫系が病原体を組織損傷から区別するメカニズムを提供するだけでなく、ＣＤ２４及びＳｉｇｌｅｃ  Ｇを、組織損傷に関連する疾患の潜在的な治療標的として示唆する。
コラーゲン抗体誘発関節炎に対するＣＤ２４Ｆｃの治療効果
【００５７】
ＲＡの病因における組織損傷に対する先天免疫の疑われる役割、及びそのような反応を負に調節するＣＤ２４−Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇ／１０経路の役割を考慮して、ＲＡを治療するためにこの経路を刺激することの可能性を探索した。本質的に全ての自己免疫疾患の病因は、自己抗原に対する免疫反応及び自己免疫性破壊の誘発を含む。ＣＤ２４−Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇ相互作用の今までにない機能に基づいて、その自己免疫性破壊期に焦点を当てた。したがって、予備的分析のために、コラーゲン抗体誘発関節炎モデルを選んで潜在的な治療効果を評価した。
【００５８】
図５ａに示すように、４種類の抗コラーゲンｍＡｂのカクテル（ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）を、２ｍｇ／マウスで１日目にｉ．ｖ．注射し、３日目に１００μｇ／マウスのＬＰＳ（ＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）をｉ．ｐ．注射することによって、８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスにＣＡＩＡを誘発した。そのマウスを、１日目に、１ｍｇのＣＤ２４Ｆｃ、又はネガティブ対照として等しい容積の１ｘＰＢＳビヒクルのいずれかで処置した。図５ｂに示すように、ビヒクル対照との比較において、ＣＤ２４Ｆｃは、非常に有意な治療効果をもたらした。
【００５９】
ＣＤ２４Ｆｃがこのモデルで関節炎を低減するメカニズムを理解するために、ＣＤ２４Ｆｃ処置マウス又はＰＢＳ対照群のホモジナイズした関節からサイトカインを測定し、サイトカインビーズアレイによって２００μｇの組織ホモジネートの上清を測定した。典型的な例を図７ａに示し、まとめたデータを図６ｂに示す。これらのデータは、意図的に投与したＣＤ２４が、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１（ＣＣＬ２）及びＩＬ−１βを含む、複数の炎症性サイトカインのレベルを低減することを実証した。
【００６０】
ＣＤ２４Ｆｃの効果を、図７で示したように、ＣＡＩＡマウスの滑膜関節の組織学的分析によって実証する。関節炎の誘発後７日目に、Ｈ＆Ｅ染色は、ＰＢＳ群の関節滑膜に好中球、マクロファージ、及びリンパ球を含む炎症性細胞が重度に浸潤していることを実証した（図７ａ）。これは、ＣＤ２４Ｆｃ処置マウスにおいて大いに低減された（図７ｂ）。それに加えて、ＰＢＳ処置（図７ｃ）マウスにおいて、サフラニンＯレッド染色の喪失によって、重度の（sever）軟骨損傷が明らかになったが、ＣＤ２４Ｆｃ処置群（図７ｄ）にはなかった。
【００６１】
マウスにおいてＣＤ２４Ｆｃが進行中のＲＡに対して治療効果を有するかどうかを決定するために、ＲＡの誘発後５日目又は７日目のいずれかに処置を開始した。図８に示すように、ＲＡスコアの有意な低減が、ＣＤ２４Ｆｃ処置から２日後すぐに観察された。その治療効果は、追加的な処置なしであっても、残りの観察期間中続いた。これらのデータは更に、進行中の疾患に対するＣＤ２４Ｆｃの治療可能性を増強する。
【００６２】
ヒトにおけるＣＤ２４Ｆｃの治療量を推定するために、ＣＤ２４Ｆｃを、広範囲の用量で漸増した。図９に示すように、２マイクログラム／マウスと少ない量が、統計学的に有意な治療効果を有するために十分である。
ＣＤ２４ＦｃのＳｉｇｌｅｃｇ依存性治療効果
【００６３】
ＣＤ２４ＦｃがＳｉｇｌｅｃ  Ｇとの相互作用によってマウスを保護するかどうかを決定するために、その治療効果がＳｉｇｌｅｃｇ遺伝子に依存するかどうかが決定された。Ｓｉｇｌｅｃｇ欠損マウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来のＥＳ細胞で産生されたので、対照としてＷＴ  Ｃ５７ＢＬ／６マウスが使用された。図１０ａに示すように、Ｂ６マウスはＣＡＩＡによりかかりにくいことが知られているので、全体的な疾患スコアは、ＢＡＬＢ／ｃマウスで観察されたものより低い。それにも関わらず、ＣＤ２４Ｆｃの単回注射は、ＷＴマウスにおいて臨床徴候を本質的に一掃した。重要なことに、その疾患はＳｉｇｌｅｃｇ欠損マウスにおいてより軽度であるが、ＣＤ２４Ｆｃは、治療効果を有さなかった。したがって、ＣＤ２４Ｆｃの治療効果は、厳密にＳｉｇｌｅｃｇ遺伝子に依存する。
【００６４】
総合すると、本明細書中で述べたデータは、ＣＡＩＡに関するＣＤ２４Ｆｃの高い治療有効性を実証している。安全性、安定性及び本発明者らの成功したＣＤ２４Ｆｃの製造についての、本発明者らの広範なデータを考慮すると、全てＲＡの治療薬としての融合タンパク質の高い可能性を示している。
【実施例３】
【００６５】
変異体ＣＤ２４は、野生型ＣＤ２４を上回る改善された活性を有する
本実施例は、位置５７で多型アミノ酸が欠如しているヒトＣＤ２４を含有する、ＣＤ２４ポリペプチド（配列番号１）（ＣＤ２４Ｆｃ）が、ＲＡの治療に対して、野生型ＣＤ２４を含有するＣＤ２４ポリペプチド（配列番号２）（ＣＤ２４ＶＦｃ）よりも効果的であること示す。
【００６６】
方法
【００６７】
抗体、融合タンパク質及びその他の材料
【００６８】
ＣＤ２４Ｆｃ及びＣＤ２４ｖＦｃは、Ｏｎｃｏｌｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．によって製造された。ウシＩＩ型コラーゲン（カタログ番号２００２２、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）。４種類の抗コラーゲンｍＡｂのカクテル、ＢＡＬＢ／ｃマウス用のカタログ番号ＣＩＡ−ＭＡＢ−５０及びＣ５７ＢＬ／６マウス用のカタログ番号ＣＩＡ−ＭＡＢ−２Ｃ（ＭＤ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）。ヒヨコＩＩ型コラーゲン（カタログ番号２００１１、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ，ＷＡ）。完全フロイントアジュバント（カタログ番号７００８、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）、１ｍｇ／ｍＬの濃度で熱殺菌されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７  Ｒａ（生育不能）を含む。完全フロイントアジュバント（カタログ番号７０２３、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）、５ｍｇ／ｍＬの濃度で熱殺菌されたＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ  Ｈ３７  Ｒａ（生育不能）を含む。不完全フロイントアジュバント（カタログ番号７００２、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）。リポ多糖（ＬＰＳ）（カタログ番号９０２８、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）、大腸菌０１１１：Ｂ４由来。サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）マウス炎症キット（カタログ番号５５２３６４、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）。サイトメトリックビーズアレイ（ＣＢＡ）ヒト炎症性サイトカインキット（カタログ番号５５１８１１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）。
【００６９】
実験動物
【００７０】
ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒ（０１Ｂ０５、ＮＣＩ）及びＣ５７ＢＬ／６ＮＣｒ（０１Ｃ５５、ＮＣＩ）マウス、オス、７週齢を、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ、ＭＤ）から購入した。ＤＢＡ／１Ｊ（０００６７０、ＪＡＸ）マウス、オス、７週齢を、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから受け取った。全てのマウスは、免疫化の前に７日間、隔離された。隔離中に、この研究で使用するための、一般的な健康状態と適合性について動物を検査した。個々の動物は、耳標により識別された。動物のケージは、研究番号、動物番号、及び群番号によって識別された。ケージのばらつきを最小限に抑えるために、同じケージ内の個々のマウスに異なる処置を施し、そして二重盲検プロトコルでスコアを与えた。
【００７１】
ＣＡＩＡモデル
【００７２】
１日目に、ＢＡＬＢ／ｃマウス（８週齢）にビヒクル又は融合タンパク質のいずれかとともにｍＡｂ（２ｍｇ／マウス）を与えた。３日目に、マウスにＬＰＳ（１００μｇ／マウス）を与え、それらのマウスを３週間毎日観察した。１日目に、融合タンパク質（０．２又は１ｍｇ／マウス）又はビヒクルを１回注射した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいては、抗コラーゲン抗体の用量は、２ｍｇ／マウス又は４ｍｇ／マウスのいずれかであった。
【００７３】
ＣＩＡモデル
【００７４】
ＤＢＡ／１マウスにおけるＣＩＡ。１日目に、８週齢のＤＢＡ／１マウスを、１００μＬのコラーゲン−ＣＦＡエマルジョン（２ｍｇ／ｍＬのウシＩＩ型コラーゲンを、１ｍｇ／ｍＬのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する等しい容積のＣＦＡと混合することにより作製される）により、尾根部において皮下に免疫化した。１０日目に、マウスを、６０μＬのコラーゲン−ＩＦＡエマルジョン（２ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを、等しい容積のＩＦＡと混合することにより作製される）により、尾根部から１．５ｃｍの皮下に追加免疫化した。治療は、関節炎の症状が発現する前又は後のいずれかに開始された。
【００７５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおけるＣＩＡ。１日目に、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、１００μＬのコラーゲン−ＣＦＡエマルジョン（４ｍｇ／ｍＬのヒヨコＩＩ型コラーゲンを、５ｍｇ／ｍＬのＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含有する等しい容積のＣＦＡと混合することにより作製される）により、尾根部において皮内に免疫化した。２１日目に、同じコラーゲン−ＣＦＡエマルジョンによる追加免疫を、尾根部から１．５ｃｍの皮内に施した。２８日目に、臨床症状を有するマウスを無作為化し、ビヒクル又はＣＤ２４Ｆｃのいずれかを与えた。
【００７６】
ＲＡモデルにおける治療
【００７７】
関節炎のスコアリングは、以下のスケールに基づいた。
【００７８】
０、通常。１、足関節又は手関節の軽度であるがはっきりした発赤及び腫脹、又は影響される指の数に関係なく、個々の指に限定される明らかな発赤及び腫脹。２、手関節の足関節の中程度の発赤及び腫脹。３、指を含む脚全体の重篤な発赤及び腫脹。４、複数の関節が関与して最大限に炎症を起こした四肢。１匹のマウスにおける４本の肢の総合スコアは、そのマウスの疾患スコアとして報告された。
【００７９】
ＣＡＩＡにおける予防的治療は、抗コラーゲン抗体と同時に開始された。
【００８０】
ＤＢＡ／１マウスのＣＩＡモデルにおける予防モデル。１７日目に、免疫化されたマウスを無作為に２つの群に分け、ビヒクル（ＰＢＳ）又は所定の用量のＣＤ２４Ｆｃで処置した。それらのマウスを３週間、二重盲検で観察した。
【００８１】
進行中の疾患を伴うＤＢＡ／１モデルにおける治療ＣＩＡは、３〜８の臨床スコアを有するマウスを使用して、最初の免疫化の２５日後にも開始された。
【００８２】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける治療ＣＩＡは、２８日目に、又は３〜８の臨床スコアを有するマウスのみを使用して開始された。
【００８３】
統計的方法
【００８４】
得られた全ての数値データについて、群平均及び標準偏差値（適切と考えられる場合）を計算した。ＣＤ２４Ｆｃと対照マウスの間の差を、フィッシャーＰＬＳＤ検定、又は対比較のためのｔ検定で統計的に分析した。
【００８５】
結果
【００８６】
コラーゲ抗体誘発関節炎に対する非多型ＣＤ２４Ｆｃの治療効果
【００８７】
ヒト成熟ＣＤ２４は、バリン又はアラニンのいずれかがＣ末端（ＣＤ２４アミノ酸配列の位置５７）に存在する、２つのアレル形態で存在する。いずれかのアレル形態を含む融合タンパク質は、一部のＲＡ患者において、抗薬物抗体を誘発する場合がある。したがって、免疫原性を回避するために、ＣＤ２４の調節機能を維持しながら、多型残基をＣＤ２４から除去することができるかどうかをテストした。図１１Ａのダイアグラムのように、２種類の融合タンパク質が作成され、１つはＣＤ２４Ｖアレルの細胞外ドメイン全体（ＣＤ２４ＶＦｃ）を有し（配列番号２を有する成熟ＣＤ２４配列）、他方は、得られた成熟ＣＤ２４（ＣＤ２４Ｆｃ）のＣ末端に１つのアミノ酸欠失を有していた（配列番号１を有する成熟ＣＤ２４配列）。１）．両方の形態は、同程度に発現及び精製された（図１１Ｂ）。
【００８８】
ＣＤ２４上のバリンがＣＤ２４−Ｓｉｇｌｅｃ  １０相互作用に必要かどうかを決定するために、それらによる、ＣＤ２４Ｆｃ及びＣＤ２４ＶＦｃのＳｉｇｌｅｃ  １０Ｆｃ融合タンパク質への結合を比較した。図１１Ｃに示すように、ＣＤ２４Ｆｃは、Ｓｉｇｌｅｃ  １０Ｆｃと用量依存的に相互作用した。相互作用は、シアリダーゼによるＣＤ２４Ｆｃの前処理が結合を阻害したため、ＣＤ２４Ｆｃ上のシアル酸に依存していた。驚くべきことに、ＣＤ２４ＶＦｃもまたＳｉｇｌｅｃ  １０Ｆｃと相互作用したが、相互作用は、ＣＤ２４−Ｆｃ−Ｓｉｇｌｅｃ  １０Ｆｃの相互作用よりも有意に弱かった。８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、ＣＤ２４ＶＦｃ、ＣＤ２４Ｆｃ、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ、又はネガティブ対照として等しい容積の１ｘＰＢＳビヒクルと共に、４種類の抗コラーゲンｍＡｂのカクテルをｉ．ｖ．注射することによりＣＡＩＡを誘導した。図１１Ｄに示すように、ビヒクル対照との比較において、ＣＤ２４Ｆｃは、非常に有意な治療効果を提供した。驚くべきことに、ＣＤ２４ＶＦｃの効果ははるかに低く、活性はネガティブ対照とあまり変わらなかった。図１１Ｄに示したものと同様の実験では、図１１Ｅ及び図１１Ｆもまた、ＣＤ２４ＦｃがＣＤ２４ＶＦｃよりも効果的であることを示しているが、図１１Ｄの実験とは異なり、ＣＤ２４ＶＦｃは、ネガティブ対照よりも活性を有していた。ＣＤ２４ＦｃとＣＤ２４ＶＦｃの治療効果の比較は、多型アミノ酸残基を欠失させることにより、免疫原性の潜在的な問題が除去される可能性が高いだけでなく、ＣＤ２４タンパク質の抗炎症活性も有意に増加することを示している。Ｆｃ部分は２つの構築体で同一であったため、治療効果は、大部分ＣＤ２４機能に起因している。Ｆｃタンパク質は、多くの場合関節炎を悪化させたため（データは示していない）、交絡効果の誘発を回避するために、インビボの研究にビヒクル対照を使用した。
【００８９】
コラーゲン誘発関節炎（ＣＩＡ）モデルにおけるＣＤ２４Ｆｃの治療効果
【００９０】
ＣＡＩＡは、主に抗体誘発性組織損傷によって引き起こされる関節の炎症を反映するため、ＲＡは、ＣＩＡの環境においてよりよく反映されることができる、適応免疫媒介性及び先天免疫媒介性の両方の破壊を伴うため、２つのＣＩＡモデルを用いてＣＤ２４Ｆｃの潜在的な治療効果を調べた。初めに、ＣＤ２４Ｆｃの予防効果をＤＢＡ／１マウスでテストした。図１２Ａに示すように、臨床症状が発現する前のＣＤ２４Ｆｃの単回投与による治療は、その後の疾患スコアを大幅に低減させた（Ｐ＝０．０２）。ＣＤ２４ＦｃがＤＢＡ／１マウスにおける進行中のＣＩＡに対して治療効果を与えるかどうかを決定するために、マウスが関節炎スコア３〜８を有したときに治療を開始した。ＣＤ２４Ｆｃ（２００μｇ／マウス）又はビヒクルを、隔日に５回与えた。図１２Ｂに示すように、関節炎スコアの明らかな低減が、２回の処置の後という早さで観察された。臨床症状の有意な低減がＣＤ２４Ｆｃ群で観察された（Ｐ＝０．０２）。
【００９１】
ニワトリコラーゲンは、Ｃ５７ＢＬ／６を背景として重篤な関節炎を誘発することが報告されている。それゆえ、このモデルは、ＣＤ２４Ｆｃの治療効果を実証するために使用された。同じ群内で疾患スコアの有意なばらつきが観察されたため、疾患スコアの５０％及び８０％の低減を研究のエンドポイントとして使用した。３週間の期間中いずれかの治療エンドポイントに達したマウスについて、そのパーセンテージを比較した。図１３Ａに示すように、ＣＤ２４Ｆｃは、重篤な臨床徴候が発現した後のマウスの回復を促進した。疾患のピークで治療効果をテストするために、マウスがピーク臨床スコアに達するように余分に１週間経過させ、その時点でマウスを１００μｇ／マウス又は５０μｇ／マウスのいずれかの繰り返し注射で処置した（隔日に１回ずつ、合計で５回の注射）。図１３Ｂに示すように、５０μｇ／マウス／注射で回復の一時的な増強を達成した。しかし、持続的な回復は、わずか１００μｇ／マウス／注射で達成された。これらのデータは、疾患のピーク時に薬物を投与した場合でさえも用量依存的な治療効果を実証している。
【００９２】
ＣＤ２４Ｆｃは、ＣＤ２４のｓｈＲＮＡサイレンシングによりヒトマクロファージ細胞株による炎症性サイトカインの産生を抑制する
【００９３】
ＣＤ２４がヒト細胞株において炎症性サイトカインの産生を調節するかどうかを決定するために、ヒトＴＨＰ１細胞株においてＣＤ２４をサイレンシングし、次にＰＭＡでその細胞を処理することにより、マクロファージへの分化を誘導した。図１４Ａに示すように、ＣＤ２４サイレンシングは、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、及びＩＬ−６の産生を大幅に増加した。これらのデータは、炎症性サイトカインの産生における内因性ヒトＣＤ２４の本質的な役割を実証している。重要なことに、ＣＤ２４ＦｃはＴＮＦαの産生を強く阻害するとともに、ＩＬ−１β及びＩＬ−６も阻害した（図１４Ｂ）。インビボの治療効果と一致して、ＣＤ２４ＶＦｃは、マクロファージ細胞株において炎症性サイトカインの産生を阻害する効果が約１０倍低かった（図１４Ｃ）。
【００９４】
ＣＤ２４Ｆｃは、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇを介したシグナル伝達により保護を与える
【００９５】
ＣＤ２４Ｆｃは、マウスにおいてはＳｉｇｌｅｃ  Ｇと相互作用し、またヒトにおいてはＳｉｇｌｅｃ  １０と相互作用することが報告されている。ＣＤ２４ＦｃがＳｉｇｌｅｃ  Ｇを介してシグナルを伝達するかどうかを決定するために、ＣＤ２４−／−マウスの脾臓細胞をビヒクル、Ｆｃ又はＣＤ２４Ｆｃのいずれかと共に３０分間インキュベートし、チロシンリン酸化、及びＳｉｇｌｅｃ  Ｇに結合しているＳＨＰ−１を測定した。図１５Ａに示すように、ＣＤ２４Ｆｃは、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇのチロシンリン酸化を強く刺激した。これに対応して、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇと共沈したＳＨＰ１の量は劇的に増加した。これらの結果は、ＣＤ２４ＦｃがＳｉｇｌｅｃ  Ｇを介してシグナルを伝達することができることを実証している。
【００９６】
ＲＡの療法におけるＳｉｇｌｅｃ  Ｇを介したＣＤ２４Ｆｃシグナル伝達の有意性をテストするために、ＷＴマウス及びＳｉｇｌｅｃ  Ｇ欠損マウスのＣＤ２４Ｆｃに対する反応を比較した。図１５Ｂに示すように、低用量の抗コラーゲン抗体を使用した場合、疾患はそれほど重篤ではなかったが、それでも保護はＳｉｇｌｅｃｇ遺伝子に完全に依存していた。しかし、抗コラーゲン抗体の用量を増加しても、それほど顕著ではないとはいえ、それでも保護は明白であるように、保護効果はＳｉｇｌｅｃｇに部分的にだけ依存していた（ＫＯの５２％に対し、ＷＴマウスで７２％）（図１５Ｃ）。これらのデータは、ＣＤ２４ＦｃはＳｉｇｌｅｃ  Ｇを介してシグナルを伝達してＣＡＩＡに対する保護を与えることができるが、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇが存在しない場合においてＣＤ２４ＦｃによるＲＡに対する保護を可能にする、追加的なメカニズムが存在することを実証している。
【００９７】
考察
【００９８】
総合すると、結果は、ＣＡＩＡモデル及び２つのＣＩＡモデルを含む３つのマウスＲＡモデルにおいて、ＣＤ２４Ｆｃが強力な治療効果を有することを実証している。複数のモデルにおける有効性は、ＣＤ２４Ｆｃが、種々の根本的な病因を有するヒトのＲＡの間で一般に治療効果を有することを示している。数十年間、ＲＡは、主にＴ細胞媒介性の自己免疫疾患であると考えられてきた。過去２０年間において、ＲＡの病因における、抗体及びＢリンパ球の可能性のある役割について再び注目されている。こうして、リウマチ因子に加えて、自己抗体の宿主がＲＡ患者で発見されている。種々の方向での証拠が、マウスモデルにおいて、ユビキタスな抗原又は組織特異的抗原のいずれかに特異的な抗体が、ＲＡ症状を引き起こすのに十分であることを実証した。例えば、Ｋ／ＢｘＮ  ＴＣＲトランスジェニックマウス由来の抗体は、新規宿主においてＲＡ様疾患を伝達することが完全にできるということが見出された。同様に、４種類の抗コラーゲン抗体のカクテルが、マウスにおいてＲＡを誘発するために現在広く使用されている。ＣＡＩＡモデルの遺伝学的分析は、補体の重要な役割を示している。他の可能性は存在するが、これらの要件は、ＲＡの病因における抗体媒介性の組織損傷の潜在的な関与を示唆している。このモデルにおけるＣＤ２４Ｆｃの有効性は、融合タンパク質がＲＡ患者における抗体媒介性の破壊期に対して有用であり得ることを実証している。
【００９９】
ＣＩＡモデルは、適応免疫と先天免疫の両方の、誘導機能とエフェクター機能の両方を模倣することができるため、ＲＡに対して一般的に使用される。２つのＣＩＡモデルを用いて、ＣＤ２４Ｆｃの治療効果を検証した。ＤＢＡ／１マウスにおけるウシコラーゲン誘発ＲＡは、最も一般的に使用されるモデルである。上記のデータは、ＣＤ２４Ｆｃがこのモデルにおける疾患の発症の前又は後のいずれかにおいて疾患スコアを低減させたことを示している。ウシＣＩＡモデルの欠点の１つは、かかりやすい系統が比較的少数しかないことである。特に、遺伝学的研究に一般的に使用されるＣ５７ＢＬ／６マウスは耐性がある。ごく最近、ニワトリコラーゲンを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてＣＩＡを誘導するプロトコルが開発されている。上記で示したように、ＣＤ２４Ｆｃは、ニワトリコラーゲンによって誘発された関節炎の回復を促進した。ＣＤ２４Ｆｃが複数のモデルにおいて保護を与えるという事実は、その治療効果の堅牢性を実証している。
【０１００】
薬物の開発に関する重要な問題は、作用のメカニズムである。ＣＤ２４Ｆｃは、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇ及びヒトＳｉｇｌｅｃ  １０の両方に結合することが報告されているため、この相互作用の重要性が評価された。インビトロにおいては、上記で示したように、ＣＤ２４Ｆｃは、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇを介してシグナルを伝達し、チロシンリン酸化をトリガする。インビボにおいては、上記で示したように、ＣＤ２４Ｆｃは少なくとも部分的にＳｉｇｌｅｃ  Ｇを介して機能する。これらの結果は、ＤＡＭＰへの先天免疫からの、Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇが媒介する保護を増強することを通じて、ＣＤ２４ＦｃがＲＡから保護するということが妥当と思われることを実証している。現在に至るまで、負の調節を強化してＤＡＭＰに対する生得的反応を制するようなＲＡ薬は、開発されていない。したがって、ＣＤ２４Ｆｃ及び多型Ａ／Ｖアミノ酸（配列番号１）が欠如している変異体ＣＤ２４を含有するその他の融合タンパク質は、ＲＡの新しい種類の治療用物質を代表する。このアプローチは、個別のＤＡＭＰ又は炎症性サイトカインを標的とする抗体よりも好ましい場合がある。自己免疫性破壊の間に複数種類のＤＡＭＰが放出されるため、個別のＤＡＭＰを標的とすることは、ＣＤ２４−Ｓｉｇｌｅｃ  Ｇ経路など、広範囲の調節因子を標的とすることよりも効果が低い場合がある。それでもやはり、保護がＳｉｇｌｅｃ  Ｇを介したシグナル伝達に完全に依存しているわけではないということを、本実施例におけるデータが実証しているということは、指摘されるべきである。少なくとも２つの追加的なメカニズムを引き起こしている可能性がある。第一に、ＣＤ２４は、ＤＡＭＰに結合することにより、ＲＡＧＥ、ＴＬＲなど、そのアゴニスト受容体が利用可能なＤＡＭＰの量を低減させ得る。第二に、ＣＤ２４は、不均一にグリコシル化されているため、Ｓｉｇｌｅｃの他のメンバーと結合して負の調節を与え得る。
【０１０１】
結論
【０１０２】
ヒトＣＤ２４の非多型細胞外ドメインを含む融合タンパク質（配列番号１を含む）は、抗コラーゲン抗体、又はコラーゲンの免疫化のいずれかによって開始された関節炎からマウスを保護する。保護は、そのＳｉｇｌｅｃ  Ｇとの相互作用に少なくとも部分的に依存している。データは、組織損傷に対する先天免疫の負の調節を利用する可能性を実証している。予想外に、ＣＤ２４の非多型変異体は、炎症性サイトカインの産生を抑制し、マウスをＲＡから保護する点で、野生型ＣＤ２４よりも優れている。
【実施例４】
【０１０３】
ヒトにおけるＣＤ２４薬物動態
本実施例は、ヒトにおけるＣＤ２４タンパク質の薬物動態の分析を示す。これは、健康な成人男性及び成人女性の被験体における、ＣＤ２４Ｆｃの安全性、忍容性、及びＰＫを評価するための、フェーズＩ、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、単回用量漸増試験から導かれた。本研究においては、それぞれ８人の被験体からなる５つのコホートで、合計４０人の被験体が登録された。それぞれのコホートにおける８人の被験体のうち６人に被験薬を与え、２人の被験体にプラセボ（０．９％塩化ナトリウム、生理食塩水）を与えた。最初のコホートには、１０ｍｇを投薬した。後続のコホートには、３０ｍｇ、６０ｍｇ、１２０ｍｇ、及び２４０ｍｇのＣＤ２４Ｆｃ又は対応するプラセボを与え、少なくとも３週間の間隔で投薬することで、それぞれの前のコホートの安全性及び忍容性データのレビューができるようした。新たな被験体のコホートへの次のより高い用量の投与は、十分な安全性と忍容性が実証された場合にのみ、許可された。
【０１０４】
それぞれのコホートにおいて、最初の２人の被験体は、１日目において、被験薬を与えられる１人及びプラセボを与えられる１人であった。３〜５人目、及び６〜８人目の被験体には、７日目の後（小群間で最低２４時間の間隔）に投薬した。それぞれの被験体には、同じ小群の中で少なくとも１時間の間隔で投薬した。必要に応じて、そのコホートの第１の小群又は第２の小群が関与する、投薬後期間中に発生し得た、あらゆる重大な安全性の問題のレビューを待つ間、残りの被験体への投薬を遅らせた。その後のコホートには、前のコホートの少なくとも３週間後に投薬した。
【０１０５】
スクリーニング期間：
【０１０６】
スクリーニング訪問（訪問１）は、積極的治療期間の開始前、２１日まで行った。インフォームドコンセントの提供後、被験体は、適格性のためのスクリーニング手順を受けた。
【０１０７】
治療期間：
【０１０８】
被験体は、１日目に臨床薬理施設（ＣＰＵ）に入れられ（訪問２）、無作為化した治療期間は、１０時間最小の前夜からの絶食の後、１日目に開始した。被験体は、単回投与としてのＣＤ２４Ｆｃ又はプラセボによる治療に無作為に割り当てられた。被験体は、４日目の朝まで収容されたままであった。
【０１０９】
追跡調査：
【０１１０】
全ての被験体は、７日目、１４日目、２１日目、２８日、及び４２日目（±１日）に、追跡調査訪問（訪問３、訪問４、訪問５、訪問６、訪問７）のためにＣＰＵに戻った。訪問７は、全ての被験体にとっての最終訪問であった。
【０１１１】
治療の期間：各被験体の合計研究期間は、最大６３日間であった。
１日目に、単回投与を行った。
【０１１２】
被験体数：
【０１１３】
計画人数：４０人の被験体
【０１１４】
スクリーニング人数：２２４人の被験体
【０１１５】
無作為化人数：４０人の被験体
【０１１６】
完了人数：３９人の被験体
【０１１７】
中止人数：１人の被験体
【０１１８】
診断及び主要な組入れ基準：本研究のための集団は、１８歳〜５５歳全体を含み、ボディマス指数が１８ｋｇ／ｍ２〜３０ｋｇ／ｍ２全体を含む、健康な男性及び女性であった。
【０１１９】
治験薬及び対照薬の情報：
【０１２０】
ＣＤ２４Ｆｃ：ＩＶ注入を介して投与される、１０ｍｇ、３０ｍｇ、６０ｍｇ、１２０ｍｇ、又は２４０ｍｇの単回投与。ロット番号：０９ＭＭ−０３６。ＣＤ２４Ｆｃは、ヒトＣＤ２４の成熟配列及びヒト免疫グロブリンＧ１（ＩｇＧ１  Ｆｃ）のフラグメント結晶化可能領域からなる、完全ヒト化融合タンパク質であった。ＣＤ２４Ｆｃは、ＩＶ投与用の、滅菌した、透明な、無色の、防腐剤を含まない水溶液として供給された。ＣＤ２４Ｆｃは、１０ｍｇ／ｍＬの濃度及び７．２のｐＨで、単回投与の注射液として製剤化された。それぞれのＣＤ２４Ｆｃバイアルは、１６ｍＬ±０．２ｍＬのＣＤ２４Ｆｃ中に、１６０ｍｇのＣＤ２４Ｆｃ、５．３ｍｇの塩化ナトリウム、３２．６ｍｇのリン酸ナトリウム二塩基性七水和物、及び１４０ｍｇのリン酸ナトリウム一塩基性一水和物を含有した。ＣＤ２４Ｆｃは、クロロブチルゴムストッパー及びアルミニウムフリップオフシール付きの、透明なホウケイ酸ガラスバイアルで供給された。
【０１２１】
ＩＶ注入を介して投与される、対応するプラセボ（０．９％塩化ナトリウム、生理食塩水）、ロット番号：Ｐ２９６８５５、Ｐ３１１８５２、Ｐ３００７１５、Ｐ３１５９５２。
【０１２２】
治療意図（ＩＴＴ）集団は、被験薬の少なくとも１回の投与を与えられた、全ての被験体からなっていた。ＩＴＴ集団は、被験体情報及び安全性評価のための主要な分析集団であった。
【０１２３】
臨床検査値の評価（化学、血液学、及び尿検査）を、治療及び訪問別にまとめた。ベースラインからの変化もまとめた。バイタルサイン（血圧、心拍数、呼吸数、及び体温）を、治療及び時点別にまとめた。ベースラインからの変化もまとめた。全ての身体的検査データを一覧表にした。心電図パラメータ及びベースラインからの変化をまとめた。全体的な解釈を一覧表にした。
【０１２４】
血漿ＣＤ２４Ｆｃ濃度
【０１２５】
図１６に示すように、ＣＤ２４Ｆｃの平均血漿濃度は、投与されたＣＤ２４Ｆｃの用量に比例して増加した。１２０ｍｇを除く全ての用量群について、投与後１時間でＣＤ２４Ｆｃの最大平均血漿濃度に達した。１２０ｍｇ群についてのＣＤ２４Ｆｃの最大平均血漿濃度には、投与後２時間で到達した。４２日目（９８４時間）までに、全ての群についてのＣＤ２４Ｆｃの平均血漿濃度は、最大平均血漿濃度の２％〜４％へ減少した。
【０１２６】
表１は、ＰＫ評価可能集団に対する処置別に、血漿ＣＤ２４ＦｃのＰＫパラメータをまとめたものである。
【表１−１】
2020510020.tif 000003
【表１−２】
2020510020.tif 000004
【表１−３】
2020510020.tif 000005
【０１２７】
血漿ＣＤ２４Ｆｃの用量比例性分析
【０１２８】
図１７は、ＰＫ評価可能集団の用量に対する、ＣＤ２４Ｆｃ  Ｃｍａｘの用量比例プロットを示す。図１８は、ＰＫ評価可能集団の用量に対する、ＣＤ２４Ｆｃ  ＡＵＣ０−４２ｄの用量比例プロット示す。図１９は、ＰＫ評価可能集団の用量に対する、ＣＤ２４Ｆｃ  ＡＵＣ０−ｉｎｆの用量比例プロットを示す。表２に、用量比例性の検定力分析を示す。
【表２】
2020510020.tif 000006
【０１２９】
Ｃｍａｘの勾配推定値は、１．１０５〜１．２４０の９０％ＣＩで１．１７２であった。ＡＵＣ０−４２ｄの勾配推定値は、１．０２７〜１．１４８の９０％ＣＩで１．０８８であった。ＡＵＣ０−４２ｄの勾配推定値は、１．０２６〜１．１の９０％ＣＩで１．０８７であった。
【０１３０】
薬物動態の結論
【０１３１】
血漿ＣＤ２４ＦｃのＣｍａｘ及びＡＵＣは、マウス、サル及びヒトに投与された用量に比例して増加した。血漿ＣＤ２４Ｆｃは、１．０１時間〜１．３４時間にＴｍａｘに達した。血漿ＣＤ２４Ｆｃのｔ1/2は、２８０．８３時間〜３２７．１０時間の範囲であった。
【実施例５】
【０１３２】
ＣＤ２４はＬＤＬ−Ｃレベルを低下させる
本実施例は、ＣＤ２４ＦｃがＬＤＬ−Ｃを低下させることを実証する。血漿中の絶食ＬＤＬ−Ｃのベースラインからの変化を、上記でより詳細に説明した臨床試験において分析した（実施例４の方法のセクションを参照されたい）。コホート１（ＣＤ２４Ｆｃ１０ｍｇ群）について１日目、７日目、及び４２日目に取得されたサンプルにおいて、絶食ＬＤＬ−Ｃレベルを決定した。コホート２（ＣＤ２４Ｆｃ３０ｍｇ群）以降、この脂質サンプリングは、１４日目を含めるように拡張された。データを表３にまとめた。コホート１のデータセットが不完全であるため、コホート２〜５を用いて、ＬＤＬ−Ｃレベルの用量依存的低下について分析した。統計的に有意な用量依存的な低下が観察された（表３）。
【表３】
2020510020.tif 000007
【０１３３】
コホート１を参照として使用して、ＣＤ２４Ｆｃが用量及び時間依存的にＬＤＬ−Ｃレベルを低減させたかどうかを決定した。表４に示すように、１０ｍｇのＣＤ２４Ｆｃを与えられたコホート１と比較して、ＬＤＬ−Ｃレベルの有意な用量依存的低下が観察された（ｐ＜０．０００１）。
【表４】
2020510020.tif 000008
【０１３４】
これは、ヒト患者においてＣＤ２４ＦｃがＬＤＬ−Ｃの低減に効果的であることを実証している。このデータを図２０にグラフで示す。
【実施例６】
【０１３５】
ＣＤ２４はレプチンレベルを低減する
本実施例は、ＣＤ２４Ｆｃが循環レプチンレベルを増加することを実証する。血漿中のレプチンのベースラインからの変化を、上記でより詳細に説明した臨床試験において分析した（実施例４の方法のセクションを参照されたい）。
【０１３６】
Ｌｕｍｉｎｅｘビーズベースの免疫学的検定を用いて、ＣＤ２４Ｆｃ又はプラセボを与えられる４０人の健康な被験体から処置前の１日目、及び処置後の３日目に取得された、８０サンプルにおける血漿レプチンレベルを決定した。データを表５にまとめた。
【表５−１】
2020510020.tif 000009
【表５−２】
2020510020.tif 000010
【表５−３】
2020510020.tif 000011
【０１３７】
分析感度又は検出限界（ＬＯＤ）を、平均背景より２標準偏差上にある点における、標準曲線から計算された値として決定した（２０個のゼロ標準レプリケート）。定量下限（ＬＬＯＱ）を、３回の異なるラウンドで３重に分析された標準希釈剤における、標準の２倍希釈系列を用いて決定し、そして測定値の変動係数（ＣＶ）が３０％であった点として定義した。ＣＶを計算して濃度に対してプロットし、ＬＬＯＱをプロットから補間した。分析性能特性は、以下の表６の通りである。
【表６】
2020510020.tif 000012
【０１３８】
図２１は、投薬コホート別に群化された患者の、３日目／１日目のレプチンの比率を示す。図が示すように、ＣＤ２４Ｆｃ処置後の循環レプチンの相対量には増加傾向があり、０、６０、１２０及び２４０ｍｇコホートの間でこの増加は統計的に有意であり（Ｐ＝０．００９３９７、用量依存の一般線形モデル回帰）、６０ｍｇより上での用量依存的な増加を実証している。更に、プラセボ（０ｍｇ）と比較して、２４０ｍｇコホートにおいてＣＤ２４Ｆｃ投与後のレプチンのレベルに統計的に有意な増加があり（スチューデントのＴ検定により決定されるものとして、Ｐ＝０．０５）、ヒト患者においてＣＤ２４Ｆｃがレプチンの増加に効果的であることを示している。
【実施例７】
【０１３９】
ＳＬＥのマウスモデルにおけるＣＤ２４タンパク質の有効性の評価
二十四（２４）匹のＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒ／Ｊ（ＪＡＸ  ｓｔｏｃｋ＃０００４８５）（ＭＲＬ．ｌｐｒ）８週齢のメスマウスを、Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥにあるインビボの研究飼育器に移した。マウスは、識別のために耳に切れ込みを入れ、ケージ１つにつきマウス５匹の密度でＨＥＰＡ濾過空気の個別に積極換気されたポリスルホネートケージに収容された。動物室は、制御された１２時間の明暗サイクル（午前６時から午後６時）で、人工の蛍光照明で完全に照らされた。動物室における通常の温度及び相対湿度の範囲は、それぞれ２２±４°Ｃ及び５０±１５％であった。動物室は、１時間につき１５回の換気がされるように設定された。ろ過された水道水は、２．５〜３．０のｐＨに酸性化され、通常のげっ歯類の餌は、随意提供された。
【０１４０】
１１週齢で、Ａｌｂｕｓｔｉｘを用いてタンパク尿をテストした。１のスコアを示すマウスを１０匹の群２つに無作為化した。群１には、２００μＬの１ｘＰＢＳの単回ＩＰ注射を与えた。群２には、２００μＬの１０ｍｇ／ｍＬ  ｈＣＤ２４−Ｆｃの単回ＩＰ注射を与えた。タンパク尿を試験の終点まで毎週測定した。１６週齢で、マウスを安楽死させた。それらの脾臓の重量を量り、単核細胞用に処理した。リンパ節（腋窩、上腕、鼠径）を組み合わせ、重量を記録した。
【０１４１】
１１週齢以降、尿中のタンパク質レベルをＡｌｂｕｓｔｉｘを用いて毎週測定した。タンパク質レベルは、以下のように割り当てられた。１＋、３０ｍｇ／ｄＬ。２＋、１００ｍｇ／ｄＬ。３＋、３００ｍｇ／ｄＬ。図２２に示すように、ＰＢＳを与えられたマウスは次の４週間にわたってタンパク尿の進行性増加を示すが、ＣＤ２４Ｆｃを与えられたマウスは極めてわずかな増加を示した。
【０１４２】
タンパク尿をより正確に測定するために、１６週齢で、シーメンスＡＵ６８０化学分析装置を用いてマウスの尿アルブミンをテストした。図２３に示すように、ＣＤ２４Ｆｃ処置は、タンパク尿を有意に低減させた。総合すると、これらのデータは、モデルにおいてＣＤ２４Ｆｃがタンパク尿の進行を防いだことを実証した。
【０１４３】
脾腫及びリンパ節腫脹は、ＭＲＬ．ｌｐｒループスモデルの主な特徴である。治療効果を実証するために、脾臓とリンパ節の重量を低減するＣＤ２４Ｆｃの能力をテストした。図２４及び図２５に示すように、ＣＤ２４Ｆｃは、１６週目で測定したときにおいて、それぞれ脾臓及びリンパ節の重量を有意に低減させた。
【０１４４】
総合すると、マウスループスモデルのデータは、ＳＬＥの治療のためのＣＤ２４Ｆｃの有効性を実証している。
【実施例８】
【０１４５】
ループス腎炎の治療のための臨床試験
以下に、ループス腎炎の治療におけるＣＤ２４Ｆｃの使用を評価するための、フェーズＩ臨床試験の概要を説明する。
【０１４６】
目的：
【０１４７】
第１の目的：
・標準のケア治療免疫抑制薬に対して抵抗性のループス腎炎の患者における、複数回投与ＣＤ２４Ｆｃに加えてＳＯＣの安全性と忍容性を評価すること
・対象集団におけるＣＤ２４Ｆｃの推奨フェーズ２用量（ＲＰ２Ｄ）及び／又は最大耐量（ＭＴＤ）を定義すること。
【０１４８】
第２の目的：
・複数回投与ＣＤ２４Ｆｃの薬物動態（ＰＫ）プロファイルを評価すること
・ループス腎炎の標準のケア療法に加えた場合のＣＤ２４Ｆｃの有効性を評価すること
・臨床反応に関する試験的な薬力学的バイオマーカーを評価すること
【０１４９】
治験対象母集団：
【０１５０】
中程度の基礎療法／ＳＯＣ（高用量ステロイドに加えてＭＭＦ又はシクロホスファミド）を伴う標準のケア免疫抑制薬に抵抗性の、活動性／増殖性ループス腎炎の患者
【０１５１】
組入れ基準：
・年齢≧１８歳。
・改訂された米国リウマチ学会の基準に基づく、ＳＬＥとの診断。
・スクリーニング時の活動性疾患（ＳＥＬＥＮＡ−ＳＬＥＤＡＩスコア≧６）
・増殖性疾患（クラスＩＩＩ／ＩＶ）
・２つの陽性のＡＮＡ又は抗ｄｓＤＮＡの検査結果（ＡＮＡ力価≧１：８０及び／又は抗ｄｓＤＮＡ抗体≧３０ＩＵ／ｍＬ）によって定義される、血清反応陽性。そのうち≧１つの検査結果は、スクリーニング中に得られたものである必要があった。・タンパク尿高値
【０１５２】
除外基準：
【０１５３】
＞５０％の糸球体硬化若しくは間質性線維化、又は＜２５ｍＬ／分／１．７３ｍ２の推定糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）の患者。
【０１５４】
治験デザイン：
【０１５５】
多施設、無作為化、二重盲検、複数回投与試験であり、増殖性抵抗性ループス腎炎の患者において、ＣＤ２４ＦｃプラスＳＯＣ対プラセボプラスＳＯＣの、反復投与の安全性、忍容性、ＰＫ及び生物活性を評価する。１、１４、２８及び４２日目に、患者にＣＤ２４Ｆｃを与える。ＣＤ２４Ｆｃは、ＩＶ注入により投与される。
【０１５６】
用量漸増フェーズは、患者１０人の３つの異なる用量コホート（８：２の治療：プラセボ）で構成され、合計３０人の患者が登録される。用量漸増フェーズの用量レベルは、非臨床優良試験所基準（ＧＬＰ）の反復投与毒性試験の結果、関連する非臨床薬力学的測定情報に基づいて、かつ単回投与ＦＩＨ試験及びＧｖＨＤ予防のフェーズＩＩ試験の安全性、ＰＫ及びＰＤの結果に基づいて決定された。
【０１５７】
コホート１：２４０ｍｇ  ＣＤ２４Ｆｃ
【０１５８】
コホート２：４８０ｍｇ  ＣＤ２４Ｆｃ
【０１５９】
コホート３：９６０ｍｇ  ＣＤ２４Ｆｃ
【０１６０】
用量漸増の主要な安全性エンドポイントは、グレード３（重篤）又はグレード４（生命を脅かす）の有害事象（ＡＥ）の発生率である。１つのコホート内の患者＜２人が最終投与日の２半減期内にグレード３又はグレード４のＡＥを経験した場合、用量漸増が認められる。
【０１６１】
臨床活性、生物活性、及びＣＤ２４Ｆｃ  ＭＯＡに基づく一連の潜在的ＰＤマーカーは、治験を通じて評価される。患者は、７８週間追跡される。
【０１６２】
臨床サンプル：
【０１６３】
安全性、ＰＫ、及びＰＤマーカーの評価のために、治療中の投与前及び複数の投与後の時点で、全ての被験体から採血が必要となる。
【０１６４】
治験評価：
【０１６５】
安全性：
・有害事象
・臨床検査値異常
・感染
・死亡率
・悪性腫瘍
【０１６６】
臨床活性：
・ＳＬＥレスポンダー指数（ＳＲＩ）−５２週目における全身性エリテマトーデスレスポンダー指数（ＳＲＩ）の改善（ＳＥＬＥＮＡ−ＳＬＥＤＡＩスコアにおいて≧４ポイントの低減。Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｉｓｌｅｓ  Ｌｕｐｕｓ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｇｒｏｕｐ［ＢＩＬＡＧ］の新しいＡ臓器ドメインスコアなし、及び１つを超える新しいＢ臓器ドメインスコアなし。そして医師による全般的評価［ＰＧＡ］スコアにおける、ベースラインに対する悪化［＜０・３の増加］なし）。
・ＢＩＣＬＡ（ＢＩＬＡＧベースの総合ループス評価）
・腎パラメータ−毎日のタンパク尿、ｅＧＦＲにおける減少
・６か月寛解率
・ステロイドの節約（ステロイド投薬量の低減）−ベースラインから≧２５％減少し、かつ４０〜５２週目の間に≦７．５ｍｇ／ｄであった、平均プレドニゾン用量の患者のパーセンテージ
・重篤なフレアの減少（修正ＳＬＥフレア指数、又はＢＩＬＡＧ  Ａ）
【０１６７】
薬物動態：
【０１６８】
ＰＫは、注入終了（ＥＯＩ）後の様々な時点でのＣＤ２４Ｆｃの血清レベルを評価することにより決定される。
【０１６９】
薬力学：
・血液サンプルは、絶食低比重リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ−Ｃ）レベルの変化を含む潜在的バイオマーカーの評価のために、治験の間を通じて収集される。
・正規化された脂質プロフィール
・抗ｄｓＤＮＡ
・ＡＮＡ
・補体レベル（Ｃ３及びＣ４）
・Ｂ細胞サブセット及びＴ細胞サブセット
・尿タンパク質／クレアチン
・ＩＦＮシグネチャー
・ＩＬ−６
【０１７０】
統計解析：
【０１７１】
安全性：
【０１７２】
被験体における、増加する静脈内複数回投与のＣＤ２４Ｆｃの安全性と忍容性は、有害事象を集計することによって、また臨床検査データの臨床的評価によって評価される。
【０１７３】
薬物動態：
【０１７４】
ＰＫパラメータとしては、ＡＵＣ  ０−ｔ、ＡＵＣ０−ｉｎｆ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、ｔ１／２、Ｋｅｌ、分布容積量（Ｖｄ）、クリアランス（ＣＬ）が挙げられる。０からｔまでの血漿薬物濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０−ｔ）、０から無限までの血漿薬物濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ０−∞）、及び最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）は、全ての統計解析のためにｌｏｇ変換され、要約統計量は逆変換されて元のスケールで表示される。用量比例性は、ＡＵＣ０−∞及びＣｍａｘを用いて、用量範囲全体にわたって分析される。
【０１７５】
参考文献
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６．Ｒｉｃｅ  ＪＷ，Ｖｅａｌ  ＪＭ，Ｆａｄｄｅｎ  ＲＰ，Ｂａｒａｂａｓｚ  ＡＦ，Ｐａｒｔｒｉｄｇｅ  ＪＭ，Ｂａｒｔａ  ＴＥ，Ｄｕｂｏｉｓ  ＬＧ，Ｈｕａｎｇ  ＫＨ，Ｍａｂｂｅｔｔ  ＳＲ，Ｓｉｌｉｎｓｋｉ  ＭＡ，Ｓｔｅｅｄ  ＰＭ，Ｈａｌｌ  ＳＥ．Ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｈｓｐ９０  ｐｏｔｅｎｔｌｙ  ａｆｆｅｃｔ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００８；５８（１２）：３７６５−７５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１９０３５４７４．
７．Ａｈｒｅｎｓ  Ｓ，Ｚｅｌｅｎａｙ  Ｓ，Ｓａｎｃｈｏ  Ｄ，Ｈａｎｃ  Ｐ，Ｋｊａｅｒ  Ｓ，Ｆｅｅｓｔ  Ｃ，Ｆｌｅｔｃｈｅｒ  Ｇ，Ｄｕｒｋｉｎ  Ｃ，Ｐｏｓｔｉｇｏ  Ａ，Ｓｋｅｈｅｌ  Ｍ，Ｂａｔｉｓｔａ  Ｆ，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｂ，Ｗａｙ  Ｍ，Ｒｅｉｓ  ｅ  Ｓｏｕｓａ  Ｃ，Ｓｃｈｕｌｚ  Ｏ．Ｆ−ａｃｔｉｎ  ｉｓ  ａｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｉｌｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｄａｍａｇｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ  ｂｙ  ＤＮＧＲ−１，ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｄｅａｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｉｍｍｕｎｉｔｙ．２０１２；３６（４）：６３５−４５．Ｅｐｕｂ  ２０１２／０４／１０．ｄｏｉ：Ｓ  １０７４−  ７６１３（１２）００１２６−４［ｐｉｉ］１０．１０１６／ｊ．ｉｍｍｕｎｉ．２０１２．０３．００８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２２４８３８００．
８．Ｙａｍａｓａｋｉ  Ｓ，Ｉｓｈｉｋａｗａ  Ｅ，Ｓａｋｕｍａ  Ｍ，Ｈａｒａ  Ｈ，Ｏｇａｔａ  Ｋ，Ｓａｉｔｏ  Ｔ．Ｍｉｎｃｌｅ  ｉｓ  ａｎ  ＩＴＡＭ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｓｅｎｓｅｓ  ｄａｍａｇｅｄ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８；９（１０）：１１７９−８８．Ｅｐｕｂ  ２００８／０９／０９．ｄｏｉ：ｎｉ．１６５１［ｐｉｉ］１０．１０３８／ｎｉ．１６５１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８７７６９０６．
９．Ｃａｖａｓｓａｎｉ  ＫＡ，Ｉｓｈｉｉ  Ｍ，Ｗｅｎ  Ｈ，Ｓｃｈａｌｌｅｒ  ＭＡ，Ｌｉｎｃｏｌｎ  ＰＭ，Ｌｕｋａｃｓ  ＮＷ，Ｈｏｇａｂｏａｍ  ＣＭ，Ｋｕｎｋｅｌ  ＳＬ．ＴＬＲ３  ｉｓ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｓｅｎｓｏｒ  ｏｆ  ｔｉｓｓｕｅ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｅｖｅｎｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２００８；２０５（１１）：２６０９−２１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８８３８５４７．
１０．Ｉｖａｎｏｖ  Ｓ，Ｄｒａｇｏｉ  ＡＭ，Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｄａｌｌａｃｏｓｔａ  Ｃ，Ｌｏｕｔｅｎ  Ｊ，Ｍｕｓｃｏ  Ｇ，Ｓｉｔｉａ  Ｇ，Ｙａｐ  ＧＳ，Ｗａｎ  Ｙ，Ｂｉｒｏｎ  ＣＡ，Ｂｉａｎｃｈｉ  ＭＥ，Ｗａｎｇ  Ｈ，Ｃｈｕ  ＷＭ．Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＨＭＧＢ１  ｉｎ  ＴＬＲ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ＣｐＧ−ＤＮＡ．Ｂｌｏｏｄ．２００７；  １１０（６）：１９７０−８１．Ｅｐｕｂ  ２００７／０６／０６．ｄｏｉ：ｂｌｏｏｄ−２００６−０９−０４４７７６［ｐｉｉ］
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１２．ｖａｎ  Ｂｅｉｊｎｕｍ  ＪＲ，Ｂｕｕｒｍａｎ  ＷＡ，Ｇｒｉｆｆｉｏｅｎ  ＡＷ．Ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ  ａｎｄ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｏｌｌ−ｌｉｋｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴＬＲ）ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｇｌｙｃａｔｉｏｎ  ｅｎｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（ＲＡＧＥ）ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｖｉａ  ｈｉｇｈ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ  Ｂ１（ＨＭＧＢ１）．Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．２００８；１１（１）：９１−９．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８２６４７８７．
１３．Ｗａｒｇｅｒ  Ｔ，Ｈｉｌｆ  Ｎ，Ｒｅｃｈｔｓｔｅｉｎｅｒ  Ｇ，Ｈａｓｅｌｍａｙｅｒ  Ｐ，Ｃａｒｒｉｃｋ  ＤＭ，Ｊｏｎｕｌｅｉｔ  Ｈ，ｖｏｎ  Ｌａｎｄｅｎｂｅｒｇ  Ｐ，Ｒａｍｍｅｎｓｅｅ  ＨＧ，Ｎｉｃｃｈｉｔｔａ  ＣＶ，Ｒａｄｓａｋ  ＭＰ，Ｓｃｈｉｌｄ  Ｈ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＴＬＲ２  ａｎｄ  ＴＬＲ４  ｌｉｇａｎｄｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｇｐ９６  ａｍｐｌｉｆｉｅｓ  ｉｎｎａｔｅ  ａｎｄ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００６；２８１（３２）：２２５４５−５３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１６７５４６８４．
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１５．Ｃｈｅｎ  ＧＹ，Ｔａｎｇ  Ｊ，Ｚｈｅｎｇ  Ｐ，Ｌｉｕ  Ｙ．ＣＤ２４  ａｎｄ  Ｓｉｇｌｅｃ−１０  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｒｅｐｒｅｓｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ｄａｍａｇｅ−  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００９；３２３（５９２２）：１７２２−５．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１１６８９８８．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１９２６４９８３；  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２７６５６８６．
１６．Ｃｈｅｎ  ＧＹ，Ｃｈｅｎ  Ｘ，Ｋｉｎｇ  Ｓ，Ｃａｖａｓｓａｎｉ  ＫＡ，Ｃｈｅｎｇ  Ｊ，Ｚｈｅｎｇ  Ｘ，Ｃａｏ  Ｈ，Ｙｕ  Ｈ，Ｑｕ  Ｊ，Ｆａｎｇ  Ｄ，Ｗｕ  Ｗ，Ｂａｉ  ＸＦ，Ｌｉｕ  ＪＱ，Ｗｏｏｄｉｇａ  ＳＡ，Ｃｈｅｎ  Ｃ，Ｓｕｎ  Ｌ，Ｈｏｇａｂｏａｍ  ＣＭ，Ｋｕｎｋｅｌ  ＳＬ，Ｚｈｅｎｇ  Ｐ，Ｌｉｕ  Ｙ．Ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｐｓｉｓ  ｂｙ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ  ｓｉａｌｉｄａｓｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ２４−  ＳｉｇｌｅｃＧ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１１；２９（５）：４２８−３５．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．１８４６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２１４７８８７６；  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４０９００８０．
１７．Ｃｈｅｎ  Ｗ，Ｈａｎ  Ｃ，Ｘｉｅ  Ｂ，Ｈｕ  Ｘ，Ｙｕ  Ｑ，Ｓｈｉ  Ｌ，Ｗａｎｇ  Ｑ，Ｌｉ  Ｄ，Ｗａｎｇ  Ｊ，Ｚｈｅｎｇ  Ｐ，Ｌｉｕ  Ｙ，Ｃａｏ  Ｘ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｔｈｅ  ｉｎｎａｔｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｂｙ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ＲＩＧ−Ｉ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．２０１３；１５２（３）：４６７−７８．Ｅｐｕｂ  ２０１３／０２／０５．ｄｏｉ：
１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１３．０１．０１１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２３３７４３４３．
１８．Ｇｏｒｉｓ  Ａ，Ｍａｒａｎｉａｎ  Ｍ，Ｗａｌｔｏｎ  Ａ，Ｙｅｏ  ＴＷ，Ｂａｎ  Ｍ，Ｇｒａｙ  Ｊ，Ｄｕｂｏｉｓ  Ｂ，Ｃｏｍｐｓｔｏｎ  Ａ，Ｓａｗｃｅｒ  Ｓ．ＣＤ２４  Ａｌａ／Ｖａｌ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．２００６．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１６６３１２５９．
１９．Ｏｔａｅｇｕｉ  Ｄ，Ｓａｅｎｚ  Ａ，Ｃａｍａｎｏ  Ｐ，Ｂｌａｚｑｕｅｚ  Ｌ，Ｇｏｉｃｏｅｃｈｅａ  Ｍ，Ｒｕｉｚ−Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｊ，Ｏｌａｓｋｏａｇａ  Ｊ，Ｅｍｐａｒａｎｚａ  ＪＡ，Ｌｏｐｅｚ  ｄｅ  Ｍｕｎａｉｎ  Ａ．ＣＤ２４  Ｖ／Ｖ  ｉｓ  ａｎ  ａｌｌｅｌｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｓｐａｎｉｓｈ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ（Ｈｏｕｎｄｍｉｌｌｓ，Ｂａｓｉｎｇｓｔｏｋｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．２００６；  １２（４）：５１１−４．Ｅｐｕｂ  ２００６／０８／１２．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１６９００７６７．
２０．Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｌｉｎ  Ｓ，Ｒａｍｍｏｈａｎ  Ｋ，Ｌｉｕ  Ｚ，Ｌｉｕ  Ｊ，Ｌｉｕ  Ｒ−Ｈ，Ｇｕｉｎｔｈｅｒ  Ｎ，Ｚｈｏｕ  Ｑ，Ｗａｎｇ  Ｔ，Ｚｈｅｎｇ  Ｘ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ＤＪ，Ｒｏｖｉｎ  ＢＨ，Ｈｅｒｂｅｒｔ  ＬＡ，Ｗｕ  Ｙ，Ｌｙｎｎ  ＤＪ，Ｃｏｏｋｅ  Ｇ，Ｙｕ  ＣＹ，Ｚｈｅｎｇ  Ｐ，Ｌｉｕ  Ｙ．Ａ  ｄｉ−ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ＣＤ２４  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｐｌｏｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２００７；３：ｅ４９．
２１．Ｚｈｏｕ  Ｑ，Ｒａｍｍｏｈａｎ  Ｋ，Ｌｉｎ  Ｓ，Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｎ，Ｌｉ  Ｏ，Ｌｉｕ  Ｘ，Ｂａｉ  ＸＦ，Ｙｉｎ  Ｌ，Ｓｃａｒｂｅｒｒｙ  Ｂ，Ｄｕ  Ｐ，Ｙｏｕ  Ｍ，Ｇｕａｎ  Ｋ，Ｚｈｅｎｇ  Ｐ，Ｌｉｕ  Ｙ．ＣＤ２４  ｉｓ  ａ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ  ｆｏｒ  ｒｉｓｋ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．２００３；  １００（２５）：１５０４１−６．ｄｏｉ：
１０．１０７３／ｐｎａｓ．２５３３８６６１００．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１４６５７３６２；  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ２９９８９８．
２２．Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｅ，Ａｂｅｌｓｏｎ  ＡＫ，Ｓａｂｉｏ  ＪＭ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇａｙ  ＭＡ，Ｏｒｔｅｇｏ−Ｃｅｎｔｅｎｏ  Ｎ，Ｊｉｍｅｎｅｚ−Ａｌｏｎｓｏ  Ｊ，ｄｅ  Ｒａｍｏｎ  Ｅ，Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒｏｍａｎ  Ｊ，Ｌｏｐｅｚ−Ｎｅｖｏｔ  ＭＡ，Ｇｕｎｎａｒｓｓｏｎ  Ｉ，Ｓｖｅｎｕｎｇｓｓｏｎ  Ｅ，Ｓｔｕｒｆｅｌｔ  Ｇ，Ｔｒｕｅｄｓｓｏｎ  Ｌ，Ｊｏｎｓｅｎ  Ａ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ  ＭＦ，Ｗｉｔｔｅ  Ｔ，Ａｌａｒｃｏｎ−Ｒｉｑｕｅｌｍｅ  ＭＥ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ＣＤ２４  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００７；５６（９）：３０８０−６．Ｅｐｕｂ  ２００７／０９／０１．ｄｏｉ：
１０．１００２／ａｒｔ．２２８７１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１７７６３４３８．
２３．Ｓａｎｃｈｅｚ  Ｅ，Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−  Ｇｕｔｉｅｒｒｅｚ  Ｂ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇａｙ  ＭＡ，Ｂａｌｓａ  Ａ，Ｇａｒｃｉａ  Ａ，Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｌ，Ｐａｓｃｕａｌ−Ｓａｌｃｅｄｏ  Ｄ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｅｓｃｒｉｂａｎｏ  ＭＦ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＣＤ２４  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｈｅｕｍａｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．２００８；６７（８）：１１９７−８．Ｅｐｕｂ  ２００８／０７／１６．ｄｏｉ：１０．１１３６／ａｒｄ．２００７．０８４４７５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８６２１９７３．
２４．Ｒｕｅｄａ  Ｂ，Ｍｉｒａｎｄａ−Ｆｉｌｌｏｙ  ＪＡ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｇａｙ  ＭＡ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ２４  ｇｅｎｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｂｉｏｐｓｙ−ｐｒｏｖｅｎ  ｇｉａｎｔ  ｃｅｌｌ  ａｒｔｅｒｉｔｉｓ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ．２００８；３５（５）：８５０−４．Ｅｐｕｂ  ２００８／０４／０３．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８３８１７８０．
２５．Ｌｅｅ  ＹＨ，Ｂａｅ  ＳＣ．Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＣＤ２４  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  ｍｅｔａ−ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ（Ｎｏｉｓｙ−ｌｅ−ｇｒａｎｄ）．２０１５；６１（８）：９７−１０４．Ｅｐｕｂ  ２０１６／０１／０１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２６７１８４３６．
２６．Ｂｏｋｅｒｓ  Ｓ，Ｕｒｂａｔ  Ａ，Ｄａｎｉｅｌ  Ｃ，Ａｍａｎｎ  Ｋ，Ｓｍｉｔｈ  ＫＧ，Ｅｓｐｅｌｉ  Ｍ，Ｎｉｔｓｃｈｋｅ  Ｌ．Ｓｉｇｌｅｃ−Ｇ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｍｏｒｅ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｌｌａｇｅｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｅａｒｌｉｅｒ  ｏｎｓｅｔ  ｏｆ  ｌｕｐｕｓ−ｌｉｋｅ  ｓｙｍｐｔｏｍｓ  ｉｎ  ＭＲＬ／ｌｐｒ  ｍｉｃｅ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ：１９５０）．
２０１４；１９２（７）：２９９４−３００２．Ｅｐｕｂ  ２０１４／０３／０７．ｄｏｉ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎｏｌ．１３０３３６７．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４６０００３３．
２７．Ｗｉｇｒｅｎ  Ｍ，Ｎｉｌｓｓｏｎ  Ｊ，Ｋａｐｌａｎ  ＭＪ．Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｉｎ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ａｎｄ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｃｏｍｍｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ．２０１５；２７８（５）：４９４−５０６．Ｅｐｕｂ  ２０１５／０２／２８．ｄｏｉ：１０．１１１１／ｊｏｉｍ．ｌ２３５７．
ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２５７２０４５２；  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ４５５０５７５．
２８．Ｋａｙ  Ｒ，Ｒｏｓｔｅｎ  ＰＭ，Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓ  ＲＫ．ＣＤ２４，ａ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  Ｂ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ，ｉｓ  ａ  ｖｅｒｙ  ｓｈｏｒｔ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｗｉｔｈ  ａ  ｇｌｙｃｏｓｙｌ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｃｈｏｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ：１９５０）．１９９１；１４７（４）：１４１２−６．Ｅｐｕｂ  １９９１／０８／１５．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：１８３１２２４．
２９．Ｐｅｒｒｙ  Ｄ，Ｓａｎｇ  Ａ，Ｙｉｎ  Ｙ，Ｚｈｅｎｇ  ＹＹ，Ｍｏｒｅｌ  Ｌ．Ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ＆  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２０１１；２０１１：２７１６９４．Ｅｐｕｂ  ２０１１／０３／１６．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／２７１６９４．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２１４０３８２５；  ＰＭＣＩＤ：ＰＭＣ３０４２６２８．
３０．Ｇｅ  Ｙ，Ｊｉａｎｇ  Ｃ，Ｓｕｎｇ  ＳＳ，Ｂａｇａｖａｎｔ  Ｈ，Ｄａｉ  Ｃ，Ｗａｎｇ  Ｈ，Ｋａｎｎａｐｅｌｌ  ＣＣ，Ｃａｔｈｒｏ  ＨＰ，Ｇａｓｋｉｎ  Ｆ，Ｆｕ  ＳＭ．Ｃｇｎｚ１  ａｌｌｅｌｅ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｋｉｄｎｅｙ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｄａｍａｇｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｏｍｐｌｅｘ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ａｃｕｔｅ  ｌｕｐｕｓ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２０１３；２１０（１１）：２３８７−４０１．Ｅｐｕｂ  ２０１３／１０／０９．ｄｏｉ：１０．１０８４／ｊｅｍ．２０１３０７３１．ＰｕｂＭｅｄ  ＰＭＩＤ：２４１０１３７９；  ＰＭＣＩＤ：
ＰＭＣ３８０４９４３．
【図１Ａ】
2020510020.tif 000013
【図１Ｂ】
2020510020.tif 000014
【図１Ｃ】
2020510020.tif 000015
【図２】
2020510020.tif 000016
【図３】
2020510020.tif 000017
【図４】
2020510020.tif 000018
【図５】
2020510020.tif 000019
【図６】
2020510020.tif 000020
【図７】
2020510020.tif 000021
【図８】
2020510020.tif 000022
【図９】
2020510020.tif 000023
【図１０】
2020510020.tif 000024
【図１１−１】
2020510020.tif 000025
【図１１−２】
2020510020.tif 000026
【図１２】
2020510020.tif 000027
【図１３】
2020510020.tif 000028
【図１４】
2020510020.tif 000029
【図１５】
2020510020.tif 000030
【図１６】
2020510020.tif 000031
【図１７】
2020510020.tif 000032
【図１８】
2020510020.tif 000033
【図１９】
2020510020.tif 000034
【図２０】
2020510020.tif 000035
【図２１】
2020510020.tif 000036
【図２２】
2020510020.tif 000037
【図２３】
2020510020.tif 000038
【図２４】
2020510020.tif 000039
【図２５】
2020510020.tif 000040
【配列表】
2020510020000001.app
【国際調査報告】
2020510020.tif 000041
2020510020.tif 000042
2020510020.tif 000043