(57)【要約】本発明は新たな抗体抗ネクチン−４に関する。ネクチン−４は、いくつかのがん、顕著には、予後不良の腫瘍である乳癌、卵巣癌、肺癌のそれぞれ３０%、４９%、８６%において過剰発現する腫瘍関連抗原である。処置は依然として不明なままである。そのため、本発明者らは、ネクチン−４に特異性を有する抗体（１４Ａ５．２  ｍａｂと呼ばれる）に基づく新たな標的治療を開発した。実際に、本発明者らは、その固有の予防的抗転移特性のために、及びまた、限局性原発癌及び転移癌の処置のためにこの抗体を選択した。さらに、１４Ａ５．２  ｍａｂは、（アステラス社からの）ＡＳＧ−２２ＭＥに耐性のある癌の処置のために適応されうる。このように、本発明は、１４Ａ５．２  ｍａｂ及びその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１、ｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖ならびにｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１、ｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖を有する抗体であって、
それにおいて
−  １４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１は、配列番号１中の位置３１のアミノ酸残基から位置３５のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する；
−  １４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２は、配列番号１中の位置５０のアミノ酸残基から位置６６のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する；
−  １４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３は、配列番号１中の位置９９のアミノ酸残基から位置１０４のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する；
−  １４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１は、配列番号２中の位置２４のアミノ酸残基から位置３８のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する；
−  １４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２は、配列番号２中の位置５４のアミノ酸残基から位置６０のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する；及び
−  １４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３は、配列番号２中の位置９３のアミノ酸残基から位置１０１のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する。
【請求項２】
配列番号１と少なくとも７０%の同一性を有する重鎖及び配列番号２と少なくとも７０%の同一性を有する軽鎖を有する、請求項１記載の抗体。
【請求項３】
配列番号１と同一の重鎖及び配列番号２と同一の軽鎖を有する、請求項２記載の抗体。
【請求項４】
キメラ抗体である請求項１記載の抗体。
【請求項５】
１４Ａ５．２  ｍａｂ抗体のＣＤＲを含むヒト化抗体である、請求項１記載の抗体。
【請求項６】
請求項１記載の抗体をコードする核酸分子。
【請求項７】
細胞傷害性部分に結合されている請求項１記載の抗体。
【請求項８】
タキソール；サイトカラシンＢ；グラミシジンＤ；エチジウムブロマイド；エメチン；マイトマイシン；エトポシド；テノポシド；ビンクリスチン；ビンブラスチン；コルヒチン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；ジヒドロキシアントラシンジオン；チューブリンインヒビター、例えばメイタンシン又はそれらの類似体もしくは誘導体；抗有糸分裂剤、例えばモノメチルオーリスタチンＥ又はＦ又はそれらの類似体もしくは誘導体；ドラスタチン１０もしくは１５又はそれらの類似体；イリノテカン又はその類似体；ミトキサントロン；ミトラマイシン；アクチノマイシンＤ；１−デヒドロテストステロン；グルココルチコイド；プロカイン；テトラカイン；リドカイン；プロプラノロール；ピューロマイシン；カリケアマイシン又はその類似体もしくは誘導体；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート、６メルカプトプリン、６チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、又はクラドリビン；アルキル化剤、例えばメクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ；白金誘導体、例えばシスプラチン又はカルボプラチン；デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、又はそれらの類似体もしくは誘導体；抗生物質、例えばダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）；ピロロ［２、ｌ−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）；ジフテリア毒素及び関連分子、例えばジフテリアＡ鎖及びその活性フラグメント及びハイブリッド分子、リシン毒素、例えばリシンＡ又は脱グリコシル化リシンＡ鎖毒素、コレラ毒素、志賀様毒素、例えばＳＬＴ  Ｉ、ＳＬＴ  ＩＩ、ＳＬＴ  ＩＩＶ、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋプロテアーゼインヒビター、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ゲラニン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、アレウリテス・フォルディタンパク質、ジアンチンタンパク質、フィトラッカ・アメリカナタンパク質、例えばＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ、モモルディカ・チャランチアインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリスインヒビター、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、及びエノマイシン毒素；リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）；ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ；ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質；ジフテリン毒素；及びシュードモナス内毒素からなる群より選択される細胞傷害性部分に結合されている請求項７記載の抗体。
【請求項９】
医薬としての使用のための請求項１記載の抗体。
【請求項１０】
請求項１記載の抗体の治療的有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において癌を処置する方法。
【請求項１１】
癌が、乳癌、卵巣癌、又は肺癌である、請求項１１記載の方法。
【請求項１２】
癌が、転移性癌である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
請求項１記載の抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１記載の抗体の少なくとも１つのＶＨ及び／又はＶＬ配列を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項１５】
ネクチン−４への結合について請求項１記載の抗体と競合する抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野：
本発明は、ネクチン−４への特異性を有する抗体及びその使用に関する。
【０００２】
発明の背景：
ネクチン−４は、タンパク質のネクチンファミリーに属する表面分子であり、４つのメンバーを含む。ネクチンは、発生及び成人期の間での上皮細胞、内皮細胞、免疫細胞、及び神経細胞についての種々の生物学的プロセス、例えば極性、増殖、分化、移動などにおいて重要な役割を果たす細胞接着分子である。それらはヒトにおけるいくつかの病理学的プロセスに含まれる。それらは、ポリオウイルス、単純ヘルペスウイルス、及び麻疹ウイルスについての主な受容体である。ネクチン−１（ＰＶＲＬ１）又はネクチン−４（ＰＶＲＬ４）をコードする遺伝子中での変異は、他の異常に関連付けられる外胚葉異形成症候群を起こす。ネクチン−４は胎児発生中に発現する。成人組織では、その発現はファミリーの他のメンバーの発現よりも制限されている。ネクチン−４は、乳癌、卵巣癌、及び肺癌のそれぞれ３０%、４９%、８６%における腫瘍関連抗原であり、大半が予後不良の腫瘍である。その発現は対応する正常組織中では検出されない。乳房腫瘍では、ネクチン−４は主に三重陰性癌で発現している。これらの癌を伴う患者の血清では、可溶形態のネクチン−４の検出は予後不良と関連付けられる。血清ネクチン−４のレベルが転移進行の間に増加し、処置後に減少する。これらの結果は、ネクチン−４が癌の処置のための信頼できる標的でありうることを示唆する。したがって、いくつかの抗ネクチン−４抗体が先行技術において記載されている。特に、エンフォルツマブ・ベドチン（ＡＳＧ−２２ＭＥ）は、ネクチン−４を標的とする抗体−薬物複合物（ＡＤＣ）であり、現在、固形腫瘍に苦しむ患者の処置のために臨床的に研究されている。
【０００３】
発明の概要：
本発明は、ネクチン−４への特異性を有する抗体及びその使用に関する。特に、本発明は特許請求の範囲により定義する。
【０００４】
発明の詳細な説明：
本発明は、ネクチン−４への特異性を有する抗体（特にモノクローナル抗体）及びその使用に関する。特に、本発明は、１４Ａ５．２抗体（１４Ａ５．２  ｍａｂとも呼ばれる）から由来する抗体を提供する。実際に、本発明者らは、その固有の抗転移特性のためにこの抗体を選択した。また、本発明者らは、１４Ａ５．２が、類似の親和性を伴い、Ｈａ２２−２抗体（アステラス社からのＡＳＧ−２２ＭＥとしても公知である）により認識されるエピトープとは異なるエピトープを認識することを示した。１４Ａ５．２は、転移性疾患の防止及び／又は局在型の原発性もしくは転移性癌の処置のために適応できうる。さらに、１４Ａ５．２は、ＡＳＧ−２２ＭＥに耐性である癌の処置のために適応できうる。
【０００５】
本明細書で使用する用語「ネクチン−４」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、ヒトネクチン−４、特にヒトネクチン−４の天然配列ポリペプチド、アイソフォーム、キメラポリペプチド、全ての相同体、フラグメント、及び前駆体を含む。天然ネクチン−４についてのアミノ酸配列はＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿１１２１７８．２を含む。
【０００６】
本発明に従い、１４Ａ５．２  ｍａｂのＶＨ領域は配列番号１の配列からなる。したがって、１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１は、配列番号１中の位置３１のアミノ酸残基から位置３５のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する。したがって、１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２は、配列番号１中の位置５０のアミノ酸残基から位置６６のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する。したがって、１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３は、配列番号１中の位置９９のアミノ酸残基から位置１０４のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する。
配列番号１：１４Ａ５．２  ｍａｂのＶＨ領域ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
【化１】
2020510432.tif 000002
【０００７】
本発明に従い、１４Ａ５．２  ｍａｂ抗体のＶＬ領域は、配列番号２の配列からなる。したがって、１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１は、配列番号２中の位置２４のアミノ酸残基から位置３８のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する。したがって、１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２は、配列番号２中の位置５４のアミノ酸残基から位置６０のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する。したがって、１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３は、配列番号２中の位置９３のアミノ酸残基から位置１０１のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する。
配列番号２：１４Ａ５．２  ｍａｂ抗体のＶＬ領域ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４
【化２】
2020510432.tif 000003
【０００８】
本明細書で使用する用語「抗体」又は「免疫グロブリン」は同じ意味を有し、本発明において等しく使用する。本明細書で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。そのようなものとして、用語「抗体」は、抗体分子全体だけでなく、抗体フラグメントならびに抗体及び抗体フラグメントの変異体（誘導体を含む）も包含する。天然抗体において、２つの重鎖がジスルフィド結合により互いに連結されており、各々の重鎖はジスルフィド結合により軽鎖に連結されている。２つの型の軽鎖、ラムダ（１）及びカッパ（ｋ）がある。抗体分子の機能的活性を決定する５つの主な重鎖クラス（又はアイソタイプ）がある：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥ。各々の鎖は異なる配列ドメインを含む。軽鎖は２つのドメイン、可変ドメイン（ＶＬ）及び定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は４つのドメイン、可変ドメイン（ＶＨ）及び３つの定常ドメイン（ＣＨＩ、ＣＨ２、及びＣＨ３、まとめてＣＨとして言及する）を含む。軽鎖（ＶＬ）及び重鎖（ＶＨ）の両方の可変領域によって、抗原への結合認識及び特異性が決定される。軽鎖（ＣＬ）及び重鎖（ＣＨ）の定常領域ドメインは、重要な生物学的特性、例えば抗体鎖の会合、分泌、経胎盤移動性、補体結合、及びＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合などを付与する。Ｆｖフラグメントは、免疫グロブリンのＦａｂフラグメントのＮ末端部分であり、１つの軽鎖及び１つの重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基の間の構造的相補性にある。抗体結合部位は、主に超可変領域又は相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基で構成されている。時折、非超可変領域又はフレームワーク領域（ＦＲ）からの残基が抗体結合部位に関与しうる、又は全体のドメイン構造、及び、故に、結合部位に影響しうる。相補性決定領域又はＣＤＲは、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性及び特異性を一緒に定義するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖は各々、それぞれＬ−ＣＤＲ１、Ｌ−ＣＤＲ２、Ｌ−ＣＤＲ３、及びＨ−ＣＤＲ１、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＣＤＲ３と命名される３つのＣＤＲを有する。抗原結合部位は、従って、典型的には、重鎖及び軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲ組を含む６つのＣＤＲを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲの間に挿入されたアミノ酸配列を指す。一実施形態では、本発明の抗体はモノクローナル抗体である。
【０００９】
本発明の文脈において、本発明の抗体のアミノ酸残基は、ＩＭＧＴ番号付けシステムに従って番号付けする。ＩＭＧＴ固有の番号付けは、抗原受容体、鎖の型、又は種にかかわらず可変ドメインを比較するために定義されている（Lefranc M.-P., “Unique database numbering system for immunogenetic analysis” Immunology Today, 18, 509 (1997) ；Lefranc M.-P., “The IMGT unique numbering for Immunoglobulins, T cell receptors and Ig-like domains” The Immunologist, 7, 132-136 (1999)；Lefranc, M.-P., Pommie, C., Ruiz, M., Giudicelli, V., Foulquier, E., Truong, L., Thouvenin-Contet, V. and Lefranc, G., “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains” Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)）。ＩＭＧＴ固有の番号付けにおいて、保存アミノ酸は常に同じ位置を有する（例えば、システイン２３、トリプトファン４１、疎水性アミノ酸８９、システイン１０４、フェニルアラニン又はトリプトファン１１８）。ＩＭＧＴ固有の番号付けは、フレームワーク領域の（ＦＲ１−ＩＭＧＴ：位置１〜２６、ＦＲ２−ＩＭＧＴ：３９〜５５、ＦＲ３−ＩＭＧＴ：６６〜１０４、及びＦＲ４−ＩＭＧＴ：１１８〜１２８）及び相補性決定領域：ＣＤＲ１−ＩＭＧＴ：２７〜３８、ＣＤＲ２−ＩＭＧＴ：５６〜６５、及びＣＤＲ３−ＩＭＧＴ：１０５〜１１７の標準化された区切りを提供する。ＣＤＲ３−ＩＭＧＴの長さが１３アミノ酸未満の場合、ループの上部から以下の順序でギャップを作成する：１１１、１１２、１１０、１１３、１０９、１１４など。ＣＤＲ３−ＩＭＧＴの長さが１３アミノ酸を上回る場合、ＣＤＲ３−ＩＭＧＴループの上部の位置１１１と１１２の間に以下の順序で追加の位置を作成する：１１２．１、１１１．１、１１２．２、１１１．２、１１２．３、１１１．３など（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／ＩＭＧＴＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＣｈａｒｔ／Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ／ＩＭＧＴ−ＦＲＣＤＲｄｅｆｉｎｉｔｉｏｎ．ｈｔｍｌ）。
【００１０】
本明細書で使用する用語「特異性」は、非ネクチン−４タンパク質又は構造（例えば癌性細胞上、又は他の細胞型上に提示される他のタンパク質など）との比較的少ない検出可能な反応性を有しながら、抗原（例えばネクチン−４など）上に提示されるエピトープに検出可能に結合する抗体の能力を指す。特異性は、本明細書の他の箇所に記載されているように、例えばBiacore機器を使用し、結合アッセイ又は競合結合アッセイにより比較的に決定することができる。特異性は、例えば、特異的抗原への結合に対する他の無関係な分子への非特異的結合における親和性／結合力の約１０：１、約２０：１、約５０：１、約１００：１、１０．０００：１又はそれ以上の比率により示すことができる（この場合において特定の抗原はネクチン−４である）。
【００１１】
用語「親和性」は、本明細書で使用するように、エピトープへの抗体の結合の強さを意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］として定義される解離定数Ｋｄにより与えられ、式中、［Ａｂ−Ａｇ］は抗体−抗原複合体のモル濃度、［Ａｂ］は非結合抗体のモル濃度、及び［Ａｇ］は非結合抗原のモル濃度である。親和性定数Ｋａは１／Ｋｄにより定義する。ｍＡｂｓの親和性を決定するための好ましい方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、及びMuller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)において見出すことができ、それらの参考文献は参照により本明細書において完全に組み入れられる。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野において周知の１つの好ましい標準的な方法は、Biacore機器の使用である。
【００１２】
用語「モノクローナル抗体」、「モノクローナルＡｂ」、「モノクローナル抗体組成物」、「ｍＡｂ」などは、本明細書で使用するように、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープについての単一の結合特異性及び親和性を呈する。
【００１３】
本発明の抗体は、単独で又は組み合わせのいずれかで、当技術分野において公知の任意の技術、例えば、限定しないが、任意の化学的、生物学的、遺伝的、又は酵素的技術などにより産生される。典型的には、所望の配列のアミノ酸配列が公知であれば、当業者はポリペプチドの産生のための標準的な技術により、前記抗体を容易に産生することができる。例えば、当業者は、周知の固相法を使用し、好ましくは商業的に利用可能なペプチド合成装置（Applied Biosystems社（カリフォルニア州フォスターシティ）製など）を使用し、製造者の指示に従って合成することができる。あるいは、本発明の抗体は、当技術分野において周知の組換えＤＮＡ技術により合成することができる。例えば、抗体は、抗体をコードするＤＮＡ配列を発現ベクター中に組み入れ、そのようなベクターを所望の抗体を発現する適切な真核生物又は原核生物の宿主に導入した（周知の技術を使用して宿主からベクターを後に単離することができる）後、ＤＮＡ発現産物として得ることができる。
【００１４】
一実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、キメラ抗体、特にキメラマウス／ヒト抗体である。
【００１５】
本発明に従い、用語「キメラ抗体」は、非ヒト抗体のＶＨドメイン及びＶＬドメイン、ならびにヒト抗体のＣＨドメイン及びＣＬドメインを含む抗体を指す。
【００１６】
一部の実施形態では、本発明のヒトキメラ抗体は、以前に記載した通りにＶＬ及びＶＨドメインをコードする核酸配列を得て、ヒト抗体ＣＨ及びヒト抗体ＣＬをコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクター中にそれらを挿入することによりヒトキメラ抗体発現ベクターを構築し、及び発現ベクターを動物細胞中に導入することによりコード配列を発現させることにより産生することができる。ヒトキメラ抗体のＣＨドメインとしては、それは、ヒト免疫グロブリンに属する任意の領域でありうるが、しかし、ＩｇＧクラスの領域が適切であり、ＩｇＧクラスに属するサブクラス（例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４など）の任意の１つを使用することもできる。また、ヒトキメラ抗体のＣＬとしては、それは、Ｉｇに属する任意の領域でありうるが、カッパクラス又はラムダクラスの領域を使用することができる。キメラ抗体を産生するための方法は、従来の組換えＤＮＡを含み、遺伝子トランスフェクション技術は当技術分野において周知である（Morrison SL. et al. (1984)ならびに特許文書ＵＳ５，２０２，２３８；及びＵＳ５，２０４，２４４を参照のこと）。
【００１７】
別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体はヒト化抗体である。特に、前記ヒト化抗体において、可変ドメインは、ヒトアクセプターフレームワーク領域、ならびに、場合により、存在する場合はヒト定常ドメイン、及び非ヒトドナーＣＤＲ（例えばマウスＣＤＲなど）を含む。
【００１８】
別の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、同じヒト化方法に基づいてイヌ化又は霊長類化されている。
【００１９】
本発明に従い、用語「ヒト化抗体」は、ヒト抗体からの可変領域フレームワーク及び定常領域を有する抗体を指すが、しかし、以前の非ヒト抗体のＣＤＲを保持する。
【００２０】
本発明のヒト化抗体は、以前に記載した通りにＣＤＲドメインをコードする核酸配列を得て、（ｉ）ヒト抗体のものと同一の重鎖定常領域及び（ｉｉ）ヒト抗体のものと同一の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を有する動物細胞用の発現ベクター中にそれらを挿入することによりヒト化抗体発現ベクターを構築し、及び動物細胞中に発現ベクターを導入することにより遺伝子を発現させることにより産生してもよい。ヒト化抗体発現ベクターは、抗体重鎖をコードする遺伝子及び抗体軽鎖をコードする遺伝子が別々のベクターに存在する型、又は両方の遺伝子が同じベクターに存在する型（タンデム型）のいずれでもよい。ヒト化抗体発現ベクターの構築の容易性、動物細胞中への導入の容易性、及び動物細胞における抗体Ｈ鎖及びＬ鎖の発現レベル間のバランスに関して、タンデム型のヒト化抗体発現ベクターが好ましい。タンデム型ヒト化抗体発現ベクターの例は、ｐＫＡＮＴＥＸ９３（ＷＯ９７／１０３５４）、ｐＥＥ１８などを含む。従来の組換えＤＮＡ及び遺伝子トランスフェクション技術に基づいてヒト化抗体を産生するための方法は、当技術分野において周知である（例、Riechmann L. et al. 1988；Neuberger MS. et al. 1985を参照のこと）。抗体は、当技術分野において公知の種々の技術を使用してヒト化することができ、例えば、ＣＤＲ移植（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開ＷＯ９１／０９９６７；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；及び第５，５８５，０８９号）、ベニアリング又はリサーフェシング（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Padlan EA (1991)；Studnicka GM et al. (1994)；Roguska MA. et al. (1994)）、及びチェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む。そのような抗体の調製のための一般的な組換えＤＮＡ技術も公知である（欧州特許出願ＥＰ１２５０２３及び国際特許出願ＷＯ９６／０２５７６を参照のこと）。
【００２１】
一実施形態では、本発明の抗体は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、単一ドメイン抗体、ＳｃＦｖ、Ｓｃ（Ｆｖ）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ユニボディ、ミニボディ、マキシボディ、小型モジュール式免疫医薬品（ＳＭＩＰ）、単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）として抗体の超可変領域を模倣するアミノ酸残基からなる最小認識単位、及び  ＶＬ鎖又はＶＨ鎖、ならびに配列番号１又は配列番号２と少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、又は１００%の同一性を有するアミノ酸配列を含む又はそれからなるフラグメントからなる群より選択される抗原結合フラグメントである。
【００２２】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、ｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１、ｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖ならびにｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１、ｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖を有する抗体である。
【００２３】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１と少なくとも７０%の同一性を有する重鎖及び配列番号２と少なくとも７０%の同一性を有する軽鎖を有する抗体である。
【００２４】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１と同一の重鎖及び配列番号２と同一の軽鎖を有する抗体である。
【００２５】
別の実施形態では、本発明の抗体は、以下を含む抗体である：
−  ｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１と少なくとも９０%の同一性を有するＨ−ＣＤＲ１、ｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２と少なくとも９０%の同一性を有するＨ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３と少なくとも９０%の同一性を有するＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖、ならびに
−  ｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１と少なくとも９０%の同一性を有するＬ−ＣＤＲ１、ｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２と少なくとも９０%の同一性を有するＬ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３と少なくとも９０%の同一性を有するＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖。
それにおいて
−  １４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１は、配列番号１中の位置３１のアミノ酸残基から位置３５のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する；
−  １４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２は、配列番号１中の位置５０のアミノ酸残基から位置６６のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する；
−  １４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３は、配列番号１中の位置９９のアミノ酸残基から位置１０４のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する；
−  １４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１は、配列番号２中の位置２４のアミノ酸残基から位置３８のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する；
−  １４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２は、配列番号２中の位置５４のアミノ酸残基から位置６０のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する；及び
−  １４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３は、配列番号２中の位置９３のアミノ酸残基から位置１０１のアミノ酸残基まで及ぶ配列により定義する。
【００２６】
抗体の用語「抗原結合フラグメント」は、本明細書で使用するように、所定の抗原（例、［ネクチン−４］）に特異的に結合する能力を保持するインタクトな抗体の１つ又は複数のフラグメントを指す。抗体の抗原結合機能は、インタクトな抗体のフラグメントにより実施することができる。抗体の用語「抗原結合フラグメント」内に包含される結合フラグメントの例は、Ｆａｂフラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント）；Ｆａｂ’フラグメント（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、ＣＨ１ドメイン及びヒンジ領域からなる一価フラグメント）；Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（ヒンジ領域でジスルフィドブリッジにより連結された２つのＦａｂ’フラグメントを含む二価フラグメント）；抗体の単一アームのＶＨドメインからなるＦｄフラグメント；ＶＨドメイン又はＶＬドメインからなる単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）フラグメント（Ward et al., 1989 Nature 341:544-546）；  及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によりコードされているが、それらは、組換え方法を使用して、それらが、ＶＬ及びＶＨ領域が対合して一価分子を形成する単一タンパク質鎖として作製されることを可能にする人工ペプチドリンカーにより結合することができる（一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）として公知である；例、Bird et al., 1989 Science 242:423-426；及びHuston et al., 1988 proc. Natl. Acad. Sci. 85:5879-5883を参照のこと）。「ｄｓＦｖ」は、ジスルフィド結合により安定化されたＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体である。二価及び多価抗体フラグメントは、一価ｓｃＦｖの会合により自発的に形成することができる、又はペプチドリンカー（例えば二価ｓｃ（Ｆｖ）２など）により一価ｓｃＦｖを共役することにより生成することができる。そのような単鎖抗体は、抗体の１つ又は複数の抗原結合部分又はフラグメントを含む。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知の従来の技術を使用して得られ、フラグメントは、インタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングする。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域を欠く別の型の抗体フラグメントである。ヒンジ領域の欠失は、従来のＩｇＧ４抗体のサイズの本質的に半分であり、ＩｇＧ４抗体の二価結合領域ではなく一価結合領域を有する分子をもたらす。抗原結合フラグメントは、単一ドメイン抗体、ＳＭＩＰ、マキシボディ、ミニボディ、イントラボディ、ダイアボディ、トリアボディ、及びテトラボディ中に組み入れることができる（例、Hollinger and Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136を参照のこと）。用語「ダイアボディ」「トリボディ」、又は「テトラボディ」は、多価抗原結合部位（２、３、又は４）を伴う小さな抗体フラグメントを指し、それらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同じ鎖上で２つのドメイン間での対合を可能にするには短過ぎるリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対合を強制され、２つの抗原結合部位を作製する。抗原結合フラグメントは、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒に抗原結合領域の対合を形成するタンデムＦｖセ��メントの対合（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）を含む単鎖分子中に組み入れることができる（Zapata et al., 1995 Protein Eng. 8(10); 1057-1062及び米国特許５，６４１，８７０）。
【００２７】
本発明のＦａｂは、［抗原］と特異的に反応する抗体を、プロテアーゼ、パパインを用いて処理することにより得ることができる。また、Ｆａｂは、抗体のＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物発現系用の、又は真核生物発現系用のベクター中に挿入し、ベクターを原核生物又は真核生物中に導入し（適当な場合）、Ｆａｂを発現させることにより産生することができる。
【００２８】
本発明のＦ（ａｂ’）２は、［抗原］と特異的に反応する抗体を、プロテアーゼ［ペプシン］を用いて処理することにより得ることができる。また、Ｆ（ａｂ’）２は、チオエーテル結合又はジスルフィド結合を介して以下に記載するＦａｂ’を結合することにより産生することができる。
【００２９】
本発明のＦａｂ’は、［抗原］と特異的に反応するＦ（ａｂ’）２を、還元剤、ジチオトレイトールを用いて処理することにより得ることができる。また、Ｆａｂ’は、抗体のＦａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを原核生物用の発現ベクター又は真核生物用の発現ベクター中に挿入し、そのベクターを原核生物又は真核生物中に導入し（適当な場合）、その発現を実施することにより産生することができる。
【００３０】
本発明のｓｃＦｖは、以前に記載した通りにＶＨ及びＶＬドメインをコードするｃＤＮＡを得て、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを構築し、原核生物用の発現ベクター、又は真核生物用の発現ベクター中にＤＮＡを挿入し、次に発現ベクターを原核生物又は真核生物中に導入し（適当な場合）、ｓｃＦｖを発現させることにより産生することができる。ヒト化ｓｃＦｖフラグメントを生成するために、ＣＤＲ移植と呼ばれる周知の技術を使用してもよく、それは、供与体ｓｃＦｖフラグメントから相補性決定領域（ＣＤＲ）を選択し、それらを公知の三次元構造のヒトｓｃＦｖフラグメントフレームワーク上に移植することを含む（例、ＷＯ９８／４５３２２；ＷＯ８７／０２６７１；ＵＳ５，８５９，２０５；ＵＳ５，５８５，０８９；ＵＳ４，８１６，５６７；ＥＰ０１７３４９４を参照のこと）。
【００３１】
ドメイン抗体（ｄＡｂ）は、抗体の最小の機能的結合単位（分子量約１３kDa）であり、抗体の重鎖（ＶＨ）又は軽鎖（ＶＬ）の可変領域に対応する。ドメイン抗体及びそれらの産生方法の詳細は、ＵＳ６，２９１，１５８；６，５８２，９１５；６，５９３，０８１；６，１７２，１９７；及び６，６９６，２４５；ＵＳ２００４／０１１０９４１；ＥＰ１４３３８４６、０３６８６８４、及び０６１６６４０；ＷＯ２００５／０３５５７２、２００４／１０１７９０、２００４／０８１０２６、２００４／０５８８２１、２００４／００３０１９、及び２００３／００２６０９に記載されており、それらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００３２】
ユニボディは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去に基づいた別の抗体フラグメント技術である。ヒンジ領域の欠失は、従来のＩｇＧ４抗体のサイズの本質的に半分であり、二価結合領域ではなく一価結合領域を有する分子をもたらす。さらに、ユニボディはほぼより小さいため、潜在的に有利な有効性を伴うより大きな固形腫瘍にわたってより良好な分布を示しうる。ユニボディに関するさらなる詳細は、ＷＯ２００７／０５９７８２を参照することにより得られうるが、それは参照によりその全体が組み入れられる。
【００３３】
核酸配列、ベクター、及び宿主細胞
したがって、本発明のさらなる目的は、本発明に従った抗体をコードする核酸分子に関する。特に、核酸分子は、本発明の抗体の重鎖又は軽鎖をコードする。
【００３４】
典型的には、前記核酸はＤＮＡ又はＲＮＡ分子であり、それは、任意の適切なベクター（例えばプラスミド、コスミド、エピソーム、人工染色体、ファージ、又はウイルスベクターなど）中に含まれてもよい。本明細書で使用する用語「ベクター」、「クローニングベクター」、及び「発現ベクター」は、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例、外来遺伝子）を宿主細胞中に導入し、宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例、転写及び翻訳）を促進する媒体を意味する。そのため、本発明のさらなる態様は、本発明の核酸を含むベクターに関する。そのようなベクターは、対象への投与時に前記抗体の発現を起こす又はそれに向けるために、調節エレメント（例えばプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）を含みうる。動物細胞用の発現ベクターにおいて使用されるプロモーター及びエンハンサーの例は、ＳＶ４０の初期プロモーター及びエンハンサー（Mizukami T. et al. 1987）、モロニーマウス白血病ウイルスのＬＴＲプロモーター及びエンハンサー（Kuwana Y et al. 1987）、免疫グロブリンＨ鎖などのプロモーター（Mason JO et al. 1985）及びエンハンサー（Gillies SD et al. 1983）などを含む。ヒト抗体Ｃ領域をコードする遺伝子を挿入し、発現させることができる限り、動物細胞用の任意の発現ベクターを使用することができる。適切なベクターの例は、ｐＡＧＥ１０７（Miyaji H et al. 1990）、ｐＡＧＥ１０３（Mizukami T et al. 1987）、ｐＨＳＧ２７４（Brady G et al. 1984）、ｐＫＣＲ（O’Hare K et al. 1981）、ｐＳＧ１ベータｄ２−４−（Miyaji H et al. 1990）などを含む。プラスミドの他の例は、複製起点を含む複製プラスミド、又は組込みプラスミド（例えばｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ、ｐＢＲなど）を含む。ウイルスベクターの他の例は、アデノウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、及びＡＡＶベクターを含む。そのような組換えウイルスは、当技術分野において公知の技術により、例えばパッケージング細胞のトランスフェクション又はヘルパープラスミドもしくはウイルスを用いた一過性トランスフェクションなどにより産生してもよい。ウイルスパッケージング細胞の典型的な例は、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などを含む。そのような複製欠損組換えウイルスを産生するための詳細なプロトコルは、例えばＷＯ９５／１４７８５、ＷＯ９６／２２３７８、ＵＳ５，８８２，８７７、ＵＳ６，０１３，５１６、ＵＳ４，８６１，７１９、ＵＳ５，２７８，０５６、及びＷＯ９４／１９４７８において見出されうる。
【００３５】
本発明のさらなる態様は、本発明に従った核酸及び／又はベクターによりトランスフェクト、感染、又は形質転換された宿主細胞に関する。
【００３６】
用語「形質転換」は、宿主細胞への「外来」（即ち、外因性又は細胞外）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の導入を意味し、宿主細胞は導入された遺伝子又は配列を発現し、所望の物質、典型的には  導入された遺伝子又は配列によりコードされるタンパク質又は酵素を産生する。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受けて発現する宿主細胞は「形質転換」されている。
【００３７】
本発明の核酸を使用し、適切な発現系において本発明の抗体を産生することができる。用語「発現系」は、適切な条件下での（例、ベクターにより運ばれ、宿主細胞に導入された外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質の発現のための）宿主細胞及び適合性のあるベクターを意味する。一般の発現系は、大腸菌宿主細胞及びプラスミドベクター、昆虫宿主細胞及びバキュロウイルスベクター、ならびに哺乳類宿主細胞及びベクターを含む。宿主細胞の他の例は、原核細胞（例えば細菌など）及び真核細胞（例えば酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）を含むが、これらに限定しない。具体的な例は、大腸菌、クルイベロミセス又はサッカロミセス酵母、哺乳動物細胞株（例、ベロ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）、ならびに初代又は樹立された哺乳動物細胞培養物（例、リンパ芽球、線維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから産生）を含む。例はまた、マウスＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８１）、マウスＰ３Ｘ６３−Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５８０）、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子（以下「ＤＨＦＲ遺伝子」として言及する）が欠損しているＣＨＯ細胞（Urlaub G et al; 1980）、ラットＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２、以下「ＹＢ２／０細胞」として言及する）などを含む。本発明はまた、本発明に従った抗体を発現する組換え宿主細胞を産生する方法に関し、前記方法は、（ｉ）上に記載するように組換え核酸又はベクターをインビトロ又はエクスビボでコンピテントな宿主細胞中に導入する、（ｉｉ）得られた組換え宿主細胞をインビトロ又はエクスビボで培養する、及び（ｉｉｉ）場合により、前記抗体を発現及び／又は分泌する細胞を選択する工程を含む。そのような組換え宿主細胞は、本発明の抗体の産生のために使用することができる。
【００３８】
本発明の抗体は、従来の免疫グロブリン精製手順、例えばプロテインＡ−セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィーなどにより培養培地から適切に分離する。
【００３９】
機能的変異体
本発明はこのように、１４Ａ５．２  ｍａｂのＶＬ領域、ＶＨ領域の機能的変異体を含む抗体を提供する。本発明のモノクローナル抗体の文脈において使用されるＶＬ又はＶＨの機能的変異体は、抗体が、親抗体（即ち、１４Ａ５．２  ｍａｂ）の親和性／結合力及び／又は特異性／選択性の少なくとも実質的な割合（少なくとも約５０%、６０%、７０%、８０%、９０%、９５%又はそれ以上）を保持することを依然として可能にし、及び、一部の場合において、本発明のそのようなモノクローナル抗体は、親Ａｂよりも高い親和性、選択性、及び／又は特異性と関連付けられうる。そのような変異体は、ＣＤＲの変異（Yang et al., J. Mol. Biol., 254, 392-403, 1995）、鎖シャッフリング（Marks et al., Bio/Technology, 10, 779-783, 1992）、大腸菌のミューテーター株の使用（Low et al., J. Mol. Biol., 250, 359-368, 1996）、ＤＮＡシャフリング（Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724-733, 1997）、ファージディスプレイ（Thompson et al., J. Mol. Biol., 256, 77-88, 1996）、及びセクシャルＰＣＲ（Crameri et al., Nature, 391, 288-291, 1998）を含む多数の親和性成熟プロトコルにより得ることができる。Vaughan et al.（上記）は親和性成熟のこれらの方法を考察する。そのような機能的変異体は、典型的には、親Ａｂとの有意な配列同一性を保持する。ＣＤＲ変異体の配列は、大半の保存的置換を通じて、親抗体配列のＣＤＲの配列と異なりうる；例えば、変異体における少なくとも約３５%、約５０%又はそれ以上、約６０%又はそれ以上、約７０%又はそれ以上、約７５%又はそれ以上、約８０%又はそれ以上、約８５%又はそれ以上、約９０%又はそれ以上（例、約６５〜９５%、例えば約９２%、９３%、又は９４%など）の置換は保存的アミノ酸残基の置換である。ＣＤＲ変異体の配列は、大半の保存的置換を通じて、親抗体配列のＣＤＲの配列と異なりうる；例えば、変異体における少なくとも１０、例えば少なくとも９、８、７、６、５、４、３、２、又は１などの置換は保存的アミノ酸残基置換である。本発明の文脈において、保存的置換は、以下のように反映されるアミノ酸のクラス内の置換により定義してもよい：
脂肪族残基Ｉ、Ｌ、Ｖ、及びＭ
シクロアルケニル関連残基Ｆ、Ｈ、Ｗ、及びＹ
疎水性残基Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｒ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹ
負荷電残基Ｄ及びＥ
極性残基Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＴ
正荷電残基Ｈ、Ｋ、及びＲ
小さな残基Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｇ、Ｎ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、及びＶ
非常に小さな残基Ａ、Ｇ、及びＳ
ターンＡ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｐ、及びフォーメーションＴに含まれる残基
柔軟な残基Ｑ、Ｔ、Ｋ、Ｓ、Ｇ、Ｐ、Ｄ、Ｅ、及びＲ
【００４０】
より保存的な置換グループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンを含む。ヒドロパシー／親水性及び残留物の重量／サイズに関する保存も、［Ａｂ名］のＣＤＲと比較し、変異体ＣＤＲにおいて実質的に保持される。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際でのヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野において一般的に理解されている。アミノ酸の相対的なヒドロパシー特性は、結果としてのタンパク質の二次構造に寄与し、それは次に、タンパク質と他の分子、例えば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定義することが受け入れられている。各々のアミノ酸は、それらの疎水性及び荷電特性に基づいてヒドロパシー指数が割り当てられており、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；及びアルギニン（−４．５）。類似残基の保持はまた、又はあるいは、ＢＬＡＳＴプログラム（例、標準設定ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｏｐｅｎ  Ｇａｐ＝１１、Ｅｘｔｅｎｄｅｄ  Ｇａｐ＝１を使用してＮＣＢＩを通じて利用可能なＢＬＡＳＴ  ２．２．８）の使用により決定される類似スコアにより測定してもよい。適切な変異体は、典型的には、親ペプチドと少なくとも約７０%の同一性を示す。本発明に従い、第２のアミノ酸配列と少なくとも７０%の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が第２のアミノ酸配列と７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００%の同一性を有することを意味する。本発明に従い、第２のアミノ酸配列と少なくとも９０%の同一性を有する第１のアミノ酸配列は、第１の配列が第２のアミノ酸配列と９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；９９；又は１００%を有することを意味する。
【００４１】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、ｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ１、ｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＨ−ＣＤＲ３を含む重鎖ならびにｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ１、ｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ２、及びｉｉｉ）１４Ａ５．２  ｍａｂのＬ−ＣＤＲ３を含む軽鎖を有する抗体である。
【００４２】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１と少なくとも７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有する重鎖及び配列番号２と少なくとも７０；７１；７２；７３；７４；７５；７６；７７；７８；７９；８０；８１；８２；８３；８４；８５；８６；８７；８８；８９；９０；９１；９２；９３；９４；９５；９６；９７；９８；又は９９%の同一性を有する軽鎖を有する抗体である。
【００４３】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、配列番号１と同一の重鎖及び配列番号２と同一の軽鎖を有する抗体である。
【００４４】
特定の実施形態では、上に記載する抗体は同じ抗原に結合し、本発明の抗体、即ち、配列番号１及び２のＶＨ及びＶＬを伴う抗体の同じ特性を有する。
【００４５】
本発明の抗体と競合する抗体
別の態様では、本発明は、ネクチン−４への結合について本発明の抗体と競合する抗体を提供する。
【００４６】
本明細書で使用するように、所定の抗原又はエピトープへの抗体の結合の文脈における用語「結合」は、典型的には、例えば、可溶形態の抗原をリガンドとして、抗体を分析物として使用してBIAcore 3000装置において表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術により決定した場合、約１０−７M又はそれ以下、例えば約１０−８M又はそれ以下など、例えば約１０−９M又はそれ以下、約１０−１０M又はそれ以下、あるいは約１０−１１M又はさらにそれ以下などのＫＤに対応する親和性を伴う結合である。BIACORE（登録商標）（GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ）は、モノクローナル抗体のエピトープビンパネルに日常的に使用される種々の表面プラズモン共鳴アッセイフォーマットの１つである。典型的には、抗体は、所定の抗原と同一ではない、又は密接に関連していない非特異的抗原（例、ＢＳＡ、カゼイン）への結合についてのそのＫＤよりも少なくとも１０倍低い、例えば少なくとも１００倍低いなど、例えば少なくとも１，０００倍低い、例えば少なくとも１０，０００倍低いなど、例えば少なくとも１００，０００倍低いＫＤに対応する親和性を伴い所定の抗原に結合する。抗体のＫＤが非常に低い（すなわち、抗体が高い親和性を有する）場合、次に、それが抗原と結合するＫＤは、典型的には、非特異的抗原についてのそのＫＤよりも少なくとも１０，０００倍低くなる。抗体は、そのような結合が検出可能ではない（例えば、可溶形態の抗原をリガンドとして、抗体を分析物として使用したBIAcore 3000機器においてプラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用する）、あるいは、その抗体及び異なる化学構造又はアミノ酸配列を有する抗原又はエピトープにより検出される結合よりも１００倍、５００倍、１０００倍、又は１０００倍を上回り少ない場合、抗原又はエピトープに本質的に結合しないと言う。
【００４７】
追加の抗体を、標準的なネクチン−４結合アッセイにおいて本発明の他の抗体と交差競合する（例、統計的に有意な様式で結合を競合的に阻害する）能力に基づいて同定することができる。ネクチン−４への本発明の抗体の結合を阻害するテスト抗体の能力は、テスト抗体がネクチン−４への結合についてその抗体と競合することができることを実証する；そのような抗体は、非限定的な理論に従って、それが競合する抗体と同じ又は関連する（例、構造的に類似の又は空間的に近位の）ネクチン−４上のエピトープに結合しうる。このように、本発明の別の態様は、本明細書に開示する抗体と同じ抗原に結合し、それと競合する抗体を提供する。本明細書で使用するように、競合抗体が本発明の抗体又は抗原結合フラグメントのネクチン−４結合を、等モル濃度の競合抗体の存在において、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、又は９９%を上回って阻害する場合、抗体は結合について「競合する」。
【００４８】
他の実施形態では、本発明の抗体又は抗原結合フラグメントは、ネクチン−４の１つ又は複数のエピトープに結合する。一部の実施形態では、本抗体又は抗原結合フラグメントが結合するエピトープは線形エピトープである。他の実施形態では、本抗体又は抗原結合フラグメントが結合するエピトープは非線形の立体構造エピトープである。
【００４９】
本発明の抗体は、当技術分野において公知の任意の方法により特異的結合についてアッセイされうる。多くの異なる競合結合アッセイフォーマットをエピトープ結合のために使用することができる。使用することができるイムノアッセイは、技術、例えばウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈殿アッセイ、ゲル拡散沈殿アッセイ、免疫放射測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、プロテインＡイムノアッセイ、及び補体固定アッセイなどを使用した競合アッセイ系を含むが、これらに限定しない。そのようなアッセイはルーチンであり、当技術分野において周知である（例、Ausubel et al., eds, 1994 Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & sons, Inc., New Yorkを参照のこと）。
【００５０】
抗体操作
本発明の操作抗体は、例えば、抗体の特性を改善するために、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に改変が作製されたものを含む。典型的には、そのようなフレームワークの改変は、抗体の免疫原性を減少させるために作製する。例えば、１つのアプローチは、１つ又は複数のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「逆変異」させることである。より具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含みうる。そのような残基は、抗体のフレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することにより同定することができる。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列配置に戻すために、体細胞変異は、例えば、部位特異的変異誘発又はＰＣＲ媒介性変異誘発により生殖系列配列に「復帰変異」することができる。そのような「復帰変異」抗体も本発明により包含されることが意図される。別の型のフレームワーク改変は、フレームワーク領域内、あるいは１つ又は複数のＣＤＲ領域内の１つ又は複数の残基を変異させてＴ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的な免疫原性を低下させることを含む。このアプローチは「脱免疫化」としても言及され、Carr et al.による米国特許公開第２００３０１５３０４３号においてさらに詳細に記載されている。
【００５１】
一部の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。グリコシル化は、例えば、抗原についての抗体の親和性を増加させるために変化させることができる。そのような糖修飾は、例えば、抗体配列内の１つ又は複数のグリコシル化部位を変化させることにより達成することができる。例えば、１つ又は複数のアミノ酸置換を作製し、それによって１つ又は複数の可変領域フレームワークのグリコシル化部位の除去をもたらし、それによりその部位でのグリコシル化を除去することができる。そのような非グリコシル化は、抗原についての抗体の親和性を増加させうる。そのようなアプローチは、Co et al.による米国特許第５，７１４，３５０号及び第６，３５０，８６１号においてさらに詳細に記載されている。
【００５２】
一部の実施形態では、一部の変異を、第１のＣＤＲ（ＣＤＲ１）内及びその近くの凝集「ホットスポット」に局在化するアミノ酸に作製し、凝集への抗体感受性を減少させる（Joseph M. Perchiacca et al., Proteins 2011; 79:2637-2647を参照のこと）。
【００５３】
本発明の抗体は任意のアイソタイプでありうる。アイソタイプの選択は、典型的には、所望のエフェクター機能により導かれる。ＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４がそうでないか又はより低い様式である場合、ＡＤＣＣ又はＣＤＣとしてそのようなエフェクター機能を媒介するアイソタイプである。ヒト軽鎖定常領域、カッパ又はラムダのいずれかを使用してもよい。望ましい場合、本発明のモノクローナル抗体のクラスは、公知の方法によりスイッチしてもよい。典型的なクラススイッチング技術を使用し、ＩｇＧサブクラスを別のサブクラスに変換してもよい（例えば、ＩｇＧ１からＩｇＧ２）。このように、本発明のモノクローナル抗体のエフェクター機能は、種々の治療的使用のために、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、又はＩｇＭ抗体へのアイソタイプスイッチングにより変化させてもよい。
【００５４】
一部の実施形態では、本発明の抗体は全長抗体である。一部の実施形態では、全長抗体はＩｇＧ１抗体である。一部の実施形態では、全長抗体はＩｇＧ３抗体である。
【００５５】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、非ＩｇＧ２／４型の抗体、例えば、エフェクター機能（例えばＡＤＣＣなど）を媒介する能力が低下又はさらには除去されるように変異されたＩｇＧ１又はＩｇＧ３である。そのような変異は、例えば、Dall’Acqua WF et al., J Immunol. 177(2): 1129-1138 (2006)及びHezareh M, J Virol. 75(24): 12161-12168 (2001)に記載されている。
【００５６】
一部の実施形態では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域中のシステイン残基の数が変化するように、例えば増加又は減少するように改変する。このアプローチは、Bodmer et al.による米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域中のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖の組立を促すために、又は抗体の安定性を増加もしくは減少させるために変化させる。
【００５７】
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体のエフェクター機能を変化させるために、少なくとも１つのアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することにより変化させる。例えば、１つ又は複数のアミノ酸は、抗体がエフェクターリガンドについて変化した親和性を有するが、しかし、親抗体の抗原結合能力を保持するように、異なるアミノ酸残基で置換することができる。親和性が変化したエフェクターリガンドは、例えば、Ｆｃ受容体又は補体のＣ１成分でありうる。このアプローチは、米国特許第５，６２４，８２１号及び第５，６４８，２６０号（両方ともWinter et al.による）にさらに詳細に記載されている。
【００５８】
一部の実施形態では、抗体がＣ１ｑ結合を変化させる、及び／又は補体依存的な細胞傷害性（ＣＤＣ）を低下もしくは消失させるように、アミノ酸残基から選択される１つ又は複数のアミノ酸を異なるアミノ酸残基で置換することができる。このアプローチは、ldusogie et al.による米国特許第６，１９４，５５１号にさらに詳細に記載されている。
【００５９】
一部の実施形態では、１つ又は複数のアミノ酸残基を変化させ、それにより補体を固定する抗体の能力が変化する。このアプローチは、Bodmer et al.によるＰＣＴ公開ＷＯ９４／２９３５１にさらに記載されている。
【００６０】
一部の実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体依存的な細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を媒介する抗体の能力を増加させるため、ならびに／あるいは１つ又は複数のアミノ酸を改変することによりＦｃ受容体についての抗体の親和性を増加させるために改変する。このアプローチは、PrestaによるＰＣＴ公開ＷＯ００／４２０７２にさらに記載されている。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、及びＦｃＲｎについてのヒトＩｇＧＩ上の結合部位がマッピングされており、改善された結合を伴う変異体が記載されている（Shields, R. L. et al., 2001 J. Biol. Chen. 276:6591-6604、ＷＯ２０１０１０６１８０を参照のこと）。
【００６１】
用語「抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害性」又は「ＡＤＣＣ」は、当技術分野において十分に理解されている用語であり、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合抗体を認識してその後に標的細胞の溶解を起こす細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣを媒介する非特異的な細胞傷害性細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、マクロファージ、単球、好中球、及び好酸球を含む。
【００６２】
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因するそれらの生物学的活性を指し、抗体アイソタイプとともに変動する。抗体エフェクター機能の例は、Ｃｌｑ結合及び補体依存的な細胞傷害性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体の下方調節（例、Ｂ細胞受容体）；及びＢ細胞活性化を含む。
【００６３】
加えて又はあるいは、改変型のグリコシル化を有する抗体、例えばフコシル残基の量が低下したもしくはない低フコシル化もしくは非フコシル化抗体又は増加した二分枝ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体などを作製することができる。そのような変化したグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増加させることが実証されている。そのような糖修飾は、例えば、変化したグリコシル化機構を伴う宿主細胞において抗体を発現させることにより達成することができる。変化したグリコシル化機構を伴う細胞は当技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それにより変化したグリコシル化を伴う抗体を産生する宿主細胞として使用することができる。例えば、Hang et al.によるＥＰ１，１７６，１９５には、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を伴う細胞株について記載されており、そのような細胞株において発現される抗体は低フコシル化を示すか、又はフコシル残基を欠いている。従って、一部の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、低フコシル化又は非フコシル化パターンを示す細胞株、例えば、フコシルトランスフェラーゼをコードするＦＵＴ８遺伝子の不十分な発現を伴う哺乳動物細胞株における組換え発現により産生されうる。PrestaによるＰＣＴ公開ＷＯ０３／０３５８３５には、フコースをＡｓｎ（２９７）連結糖に付着する低下した能力を伴い、その宿主細胞において発現される抗体の低フコシル化ももたらす変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃｌ３細胞について記載されている（Shields, R.L. et al, 2002 J. Biol. Chem. 277:26733-26740も参照のこと）。Umana et al.によるＰＣＴ公開ＷＯ９９／５４３４２には、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例、ベータ（１，４）−ＮアセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））を発現するように操作され、操作された細胞株において発現された抗体が、抗体の増加したＡＤＣＣ活性をもたらす増加した二分ＧｌｃＮａｃ構造を示す細胞株について記載されている（Umana et al, 1999 Nat. Biotech. 17: 176-180も参照のこと）。Eureka Therapeuticsはさらに、フコシル残基を欠く、変化した哺乳動物グリコシル化パターンを伴う抗体を産生することが可能な遺伝子操作されたＣＨＯ哺乳動物細胞について記載されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｅｋａｉｎｃ．ｃｏｍ／ａ＆ｂｏｕｔｕｓ／ｃｏｍｐａｎｙｏｖｅｒｖｉｅｗ．ｈｔｍｌ）。あるいは、本発明のモノクローナル抗体は、哺乳動物様グリコシル化パターンについて操作され、グリコシル化パターンとしてフコースを欠く抗体を産生することが可能な酵母又は糸状菌において産生することができる（例えば、ＥＰ１２９７１７２Ｂ１を参照のこと）。
【００６４】
別の実施形態では、抗体は、その生物学的半減期を増加させるように修飾する。種々のアプローチが可能である。例えば、以下の変異の１つ又は複数を、Wardによる米国特許第６，２７７，３７５号に記載されているように導入することができる：Ｔ２５２Ｌ、Ｔ２５４Ｓ、Ｔ２５６Ｆ。あるいは、生物学的半減期を増加させるために、抗体をＣＨ１又はＣＬ領域内で変化させて、Presta et al.による米国特許第５，８６９，０４６号及び第６，１２１，０２２号に記載されているように、ＩｇＧのＦｃ領域のＣＨ２ドメインの２つのループから取られたサルベージ受容体結合エピトープを含む。増加した半減期及び胎児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善した結合（胎児への母体ＩｇＧの移行に関与する）（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. immunol. 24:249 (1994)）を伴う抗体がＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Hinton et al.）に記載されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ又は複数の置換をそれにおいて伴うＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１，３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４の１つ又は複数に置換を伴うものを含む（例、Ｆｃ領域残基４３４の置換）（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【００６５】
本発明により熟慮される本明細書における抗体の別の修飾はペグ化である。抗体をペグ化し、例えば抗体の生物学的（例、血清中）半減期を増加させることができる。抗体をペグ化するために、抗体又はそのフラグメントは、典型的には、１つ又は複数のＰＥＧ基が抗体又は抗体フラグメントに付着する条件下で、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、例えばＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体などと反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応により実行することができる。本明細書で使用する用語「ポリエチレングリコール」は、他のタンパク質、例えばモノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−もしくはアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドなどを誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のいずれかを包含することを意図する。特定の実施形態では、ペグ化される抗体は、非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化するための方法は当技術分野において公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、Nishimura et al.によるＥＰ０１５４３１６及びIshikawa et al.によるＥＰ０４０１３８４を参照のこと。
【００６６】
本発明により熟慮される抗体の別の修飾は、血清タンパク質、例えば結果として得られる分子の半減期を増加させるためのヒト血清アルブミン又はそのフラグメントなどへの本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域の複合体又はタンパク質融合体である。そのようなアプローチは、例えば、Ballance et al.、ＥＰ０３２２０９４に記載されている。別の可能性は、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域と、血清タンパク質、例えば結果として得られた分子の半減期を増加させるためのヒト血清アルブミンなどに結合することが可能なタンパク質との融合体である。そのようなアプローチは、例えば、Nygren et al.、ＥＰ０  ４８６  ５２５に記載されている。
【００６７】
ポリシアリル化は別の技術であり、それによって、天然高分子ポリシアル酸（ＰＳＡ）を使用して活性期間を延長させ、治療用ペプチド及びタンパク質の安定性を改善させる。ＰＳＡはシアル酸（糖）のポリマーである。タンパク質及び治療用ペプチドの薬物送達のために使用される場合、ポリシアル酸によって、結合時に保護的な微小環境が提供される。これによって、循環中の治療用タンパク質の活性期間が増加し、免疫系による認識が防止される。ＰＳＡポリマーは人体において自然に見出される。それは、何百万年もかけて進化した特定の細菌により採用され、それらの壁をそれでコーティングした。これらの自然にポリシアル化された細菌は、分子擬態により、身体の防御系を阻止することができた。ＰＳＡは自然の究極のステルス技術であり、そのような細菌から大量に、所定の物理的特性を伴い簡単に産生することができる。細菌のＰＳＡは、人体におけるＰＳＡと化学的に同一であるため、タンパク質と共役した場合でも完全に非免疫原性である。
【００６８】
別の技術は、抗体に連結されたヒドロキシエチルデンプン（「ＨＥＳ」）誘導体の使用を含む。ＨＥＳは、ろう状コーンスターチから由来する修飾された天然ポリマーであり、身体の酵素により代謝されることができる。ＨＥＳ溶液は通常、不十分な血液量の代わりとなり、血液のレオロジー特性を改善するために投与される。抗体のヘシル化によって、分子の安定性が増加され、ならびに腎クリアランスが低下されることにより循環半減期の延長が可能になり、増加した生物学的活性をもたらす。様々なパラメーター（例えばＨＥＳの分子量など）を変動させることにより、広範囲のＨＥＳ抗体複合体をカスタマイズすることができる。
【００６９】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、抗体が、ネガティブのＦｃヒンジドメインＳｐＡ結合に対して、ブドウ球菌プロテインＡ（ＳｐＡ）結合を障害するように１つ又は複数のアミノ酸変異をＦｃヒンジフラグメントのＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域中に導入する。このアプローチは、Ward et al.による米国特許第６，１６５，７４５号においてさらに詳細に記載されている。
【００７０】
本発明の特定の実施形態では、抗体を操作し、脱アミド化の部位を除去している。脱アミド化は、ペプチド又はタンパク質における構造的及び機能的変化を起こすことが公知である。脱アミド化は、減少した生物活性、ならびにタンパク質医薬品の薬物動態及び抗原性における変化をもたらしうる（Anal Chem. 2005 Mar 1 ;77(5):1432-9）。
【００７１】
本発明の特定の実施形態では、抗体を操作し、ｐＩを増加させ、それらの薬物様特性を改善させる。タンパク質のｐＩは、分子の全体的な生物物理学的特性の重要な決定因子である。低ｐＩを有する抗体は、溶解性が低く、安定性が低く、凝集する傾向があることが公知である。さらに、低ｐＩを伴う抗体の精製は困難であり、特に臨床使用のためのスケールアップの間に問題になりうる。本発明の抗ネクチン−４抗体又はそのフラグメントのｐＩを増加させることによって、その溶解性が改善され、抗体をより高い濃度（＞１００mg/ml）で製剤化することが可能になった。高濃度（例、＞１００mg/ml）での抗体の製剤化は、硝子体内注射を介して患者の眼中に高用量の抗体を投与できるという利点を提供し、それによって次には投与頻度の低下が可能になり、心血管障害を含む慢性疾患の処置のための有意な利点である。高ｐＩはまた、抗体のＩｇＧバージョンのＦｃＲｎ媒介性リサイクルを増加させることがあり、このように、薬物を体内に長時間にわたり持続させることができ、より少ない注射を要求する。最後に、抗体の全体的な安定性は、より高いｐｉに起因して有意に改善され、より長い有効期間及びインビボでの生物活性をもたらす。好ましくは、ｐＩは８．２より大きいか、又はそれに等しい。
【００７２】
グリコシル化修飾はまた、シアル化グリカンの添加により、抗体の抗炎症特性の増強を誘導することができる。Ｆｃグリカンへの末端シアル酸の添加は、ＦｃγＲ結合を低下させ、新規結合活性の獲得を通じてＩｇＧ抗体を抗炎症メディエーターに変換する（Robert M. Anthony et al., J Clin Immunol (2010) 30 (Suppl 1):S9-S14；Kai-Ting C et al., Antibodies 2013, 2, 392-414を参照のこと）。
【００７３】
抗体模倣物
一部の実施形態では、開示される重鎖及び軽鎖、可変領域ドメイン、ならびにＣＤＲを使用し、ネクチン−４に特異的に結合することができる抗原結合領域を含むポリペプチドを調製することができる。例えば、１４Ａ５．２  ｍａｂのＣＤＲを共有結合的に又は非共有結合的に分子（例、ポリペプチド）中に組み入れて、免疫接着を作製することができる。免疫接着は、より大きなポリペプチド鎖の一部としてＣＤＲを組み入れうる、ＣＤＲを別のポリペプチド鎖に共有結合的に連結させうる、又はＣＤＲを非共有結合的に組み入れうる。ＣＤＲは、免疫接着が目的の特定の抗原（例、ネクチン−４又はそのエピトープ）に特異的に結合することを可能にする。
【００７４】
用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用し、アミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ又は複数のアミノ酸残基が対応する天然アミノ酸の人工化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然アミノ酸ポリマー及び非天然アミノ酸ポリマーに適用する。他に示さない場合、特定のポリペプチド配列はまた、その保存的に修飾された変異体も暗に包含する。
【００７５】
一部の実施形態では、本発明の抗原結合フラグメントは、アフィボディ、アフィリン、アフィチン、アドネクチン、アトリマー、エバシン、ＤＡＲＰｉｎ、アンチカリン、アビマー、フィノマー、及びバーサボディからなる群より選択される抗体模倣物とも呼ばれる非免疫グロブリンベースの抗体中に移植する。
【００７６】
用語「抗体模倣物」は、抗原に結合する抗体の能力を模倣することが可能であるが、しかし、天然抗体構造に限定されない分子を指すことを意図する。そのような抗体模倣物の例は、アドネクチン、アフィボディ、ＤＡＲＰｉｎｓ、アンチカリン、アビマー、及びバーサボディを含むが、これらに限定せず、それらは全てが、従来の抗体結合を模倣する一方で、異なる機構から生成され、それらを介して機能する結合構造を用いている。抗体の抗原結合フラグメントは、ポリペプチドに基づいて足場（例えばフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）など）中に移植することができる（フィブロネクチンポリペプチドモノボディを記載する米国特許第６，７０３，１９９号を参照のこと）。アフィボディは当技術分野において周知であり、ブドウ球菌プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１つから由来する５８アミノ酸残基のタンパク質ドメインに基づく親和性タンパク質を指す。ＤＡＲＰｉｎｓ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）は当技術分野において周知であり、  非抗体タンパク質の結合能力を活用するために開発された抗体模倣ＤＲＰ（設計されたリピートタンパク質）技術を指す。アンチカリンは当技術分野において周知であり、別の抗体模倣技術を指し、それにおいて結合特異性はリポカリンから由来する。アンチカリンはまた、デュオカリンと呼ばれる二重標的タンパク質としてフォーマット化してもよい。アビマーは当技術分野において周知であり、別の抗体模倣技術を指し、アビマーはタンパク質を含む天然Ａドメインから由来する。バーサボディは、当技術分野において周知であり、別の抗体模倣技術を指し、それらは、＞１５%のシステインを伴う３〜５  ｋＤａの小さなタンパク質であり、それらは高いジスルフィド密度の足場を形成し、典型的なタンパク質の有する疎水性コアを置換する。そのような抗体模倣物は、足場中に含まれうる。用語「足場」は、調整された機能及び特徴を備えた新たな産物の操作のためのポリペプチドプラットフォームを指す。
【００７７】
一態様では、本発明は、本発明のＣＤＲを移植することができる非免疫グロブリン足場を使用し、抗体模倣物とも呼ばれる非免疫グロブリンベースの抗体を生成することに関する。公知の又は将来の非免疫グロブリンフレームワーク及び足場を、それらが標的ネクチン−４タンパク質について特異的な結合領域を含む限り用いてもよい。
【００７８】
フィブロネクチン足場は、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（例、フィブロネクチンＩＩＩ型の１０番目のモジュール（１０  Ｆｎ３ドメイン））に基づく。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、２つのベータシート間に分布する７又は８つのベータ鎖を有し、それらは互いに充填されてタンパク質のコアを形成し、さらにベータ鎖を互いに接続し、溶剤に曝露されているループ（ＣＤＲに類似）を含む。ベータシートサンドイッチの各々の縁には少なくとも３つのそのようなループがあり、縁はベータストランドの方向に垂直なタンパク質の境界である（ＵＳ６，８１８，４１８を参照のこと）。これらのフィブロネクチンベースの足場は免疫グロブリンではないが、全体の折り畳みは、最も小さな機能抗体フラグメント、重鎖の可変領域の折り畳みと密接に関連しており、それらはラクダ及びラマＩｇＧ中の抗原認識単位全体を含む。この構造のため、非免疫グロブリン抗体は、抗体と性質及び親和性が類似している抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、インビボでの抗体の親和性成熟のプロセスに類似した、インビトロでのループのランダム化及びシャッフリング戦略において使用することができる。これらのフィブロネクチンベースの分子は、足場として使用することができ、ここで、分子のループ領域を、標準的なクローニング技術を使用して本発明のＣＤＲで置換することができる。
【００７９】
アンキリン技術は、異なる標的への結合のために使用することができる可変領域を持つための足場として、アンキリン由来のリピートモジュールを伴うタンパク質を使用することに基づく。アンキリンリピートモジュールは、２つの逆平行αヘリックス及びβターンからなる３３アミノ酸のポリペプチドである。可変領域の結合は、リボソームディスプレイを使用することにより、大半が最適化される。
【００８０】
アビマーは、タンパク質（例えばＬＲＰ−１など）を含む天然Ａドメインから由来する。これらのドメインは、本来タンパク質間相互作用のために使用され、ヒトにおいて２５０を超えるタンパク質が、アミノ酸リンカーを介して連結された「Ａドメイン」単量体（２〜１０）に構造的に基づく。標的抗原に結合することができるアビマーは、例えば、米国特許出願公開第２００４０１７５７５６号；第２００５００５３９７３号；第２００５００４８５１２号、及び第２００６０００８８４４号に記載されている方法論を使用して作製することができる。
【００８１】
アフィボディ親和性リガンドは、プロテインＡのＩｇＧ結合ドメインの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルで構成される小さな単純なタンパク質である。プロテインＡは、黄色ブドウ球菌からの表面タンパク質である。この足場ドメインは５８のアミノ酸で構成され、そのうちの１３がランダム化されて、多数のリガンド変異体を伴うアフィボディライブラリーを生成する（例、ＵＳ５，８３１，０１２を参照のこと）。アフィボディ分子は抗体を模倣し、それらは６kDaの分子量を有する。その小さなサイズにもかかわらず、アフィボディ分子の結合部位は抗体の結合部位に類似している。
【００８２】
アンチカリンは、Pieris ProteoLab AG社により開発された産物である。それらはリポカリン（化学的に感受性又は不溶性の化合物の生理学的輸送又は保存に通常含まれる小さく頑強なタンパク質の広範囲のグループ）から由来する。いくつかの天然リポカリンがヒトの組織又は体液中に生じる。タンパク質構築は免疫グロブリンを連想させ、強固なフレームワークの上部に超可変ループを伴う。しかし、抗体又はその組換えフラグメントとは対照的に、リポカリンは１６０〜１８０のアミノ酸残基を伴う単一のポリペプチド鎖で構成され、単一の免疫グロブリンドメインよりわずかに大きいだけである。４つのループのセットは、結合ポケットを構成し、顕著な構造的可塑性を示し、種々の側鎖を許容する。結合部位は、このように、高い親和性及び特異性を伴う異なる形状の処方された標的分子を認識するために、独自のプロセスにおいて再形成することができる。リポカリンファミリーのタンパク質の１つであるオオモンシロチョウ（Ｐｉｅｒｉｓ  Ｂｒａｓｓｉｃａｅ）のビリン結合タンパク質（ＢＢＰ）は、４つのループのセットを変異誘発することによりアンチカリンを発生するために使用されてきた。アンチカリンを記載した特許出願の１つの例は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ１９９９１６８７３にある。
【００８３】
アフィリン分子は、タンパク質及び小分子に対する特定の親和性のために設計された小さな非免疫グロブリンタンパク質である。新たなアフィリン分子は、２つのライブラリーから非常に迅速に選択することができ、それらの各々が異なるヒト由来の足場タンパク質に基づいている。アフィリン分子は、免疫グロブリンタンパク質と任意の構造的な相同性を示さない。現在、２つのアフィリン足場が用いられており、その１つはガンマ結晶であり、ヒトの構造的な眼水晶体タンパク質で、他は「ユビキチン」スーパーファミリータンパク質である。両方のヒトの足場は非常に小さく、高温安定性を示し、ｐＨ変化及び変性薬剤にほとんど耐性である。この高い安定性は、主にタンパク質の拡大されたベータシート構造に起因する。「ユビキチン様」タンパク質の例は、ＷＯ２００４１０６３６８に記載されている。
【００８４】
バーサボディは高度に溶解性であり、高濃度に製剤化することができる。バーサボディは例外的に熱安定性が高く、延長した有効期間を提供する。バーサボディに関する追加情報は、ＵＳ２００７／０１９１２７２に見出すことができ、その全体を参照により本明細書に組み入れる。
【００８５】
抗体フラグメント及び模倣技術の上の記載は、包括的であることを意図しない。代替ポリペプチドベースの技術、例えばQui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007)に概説されている相補性決定領域の融合、ならびに核酸ベースの技術、例えば米国特許第５，７８９，１５７号；第５，８６４，０２６号；第５，７１２，３７５号；第５，７６３，５６６号；第６，０１３，４４３号；第６，３７６，４７４号；第６，６１３，５２６号；第６，１１４，１２０号；第６，２６１，７７４号；及び第６，３８７，６２０号（これらの全てを参照により本明細書に組み入れる）に記載されているＲＮＡアプタマー技術などを含む種々の追加の技術を本発明の文脈において使用することができる。
【００８６】
ＣＡＲ−Ｔ細胞
本発明はまた、本発明の抗体の抗原結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。典型的には、前記キメラ抗原受容体は、本発明の抗体の少なくとも１つのＶＨ及び／又はＶＬ配列を含む。本発明のキメラ抗原受容体はまた、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。
【００８７】
本明細書で使用する用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔ細胞シグナリングドメインに連結された抗体（例、ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインを含む人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドを指す。ＣＡＲの特徴は、モノクローナル抗体の抗原結合特性を活用して、非ＭＨＣ制限の様式において選択された標的に向かってＴ細胞の特異性及び反応性を向け直すそれらの能力を含む。非ＭＨＣ制限抗原認識は、ＣＡＲを発現するＴ細胞に、抗原プロセシングに非依存的な抗原を認識する能力を与え、このように、腫瘍回避の主要な機構を迂回する。さらに、Ｔ細胞中で発現される場合、ＣＡＲは、有利には、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖と二量体化しない。
【００８８】
一部の実施形態では、本発明は、１４Ａ５．２  ｍａｂの単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、それからなる、又は本質的にそれからなる抗原結合ドメインを含むＣＡＲを提供する。一部の実施形態では、抗原結合ドメインはリンカーペプチドを含む。リンカーペプチドは、軽鎖可変領域と重鎖可変領域の間に位置していてもよい。
【００８９】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、細胞外ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、及びＣＤ２８、４−１ＢＢ、及びＣＤ３ζ細胞内ドメインからなる群より選択される細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインを含む。ＣＤ２８は、Ｔ細胞の同時刺激において重要なＴ細胞マーカーである。４−１ＢＢは強力な同時刺激シグナルをＴ細胞に伝達し、分化を促進し、Ｔリンパ球の長期生存を増強する。ＣＤ３ζはＴＣＲと会合してシグナルを産生し、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。
【００９０】
一部の実施形態では、本発明のキメラ抗原受容体は、グリコシル化、アミド化、カルボキシル化、リン酸化、エステル化、Ｎ−アシル化、例えばジスルフィド架橋を介して環化、又は酸付加塩に変換、及び／又は場合により二量化もしくは重合することができる。
【００９１】
本発明はまた、本発明のキメラ抗原受容体をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、核酸は、上に記載するようなベクター中に組み入れる。
【００９２】
本発明はまた、本発明のキメラ抗原受容体をコードする核酸を含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は任意の細胞型でありうる、任意の型の組織から由来しうる、任意の発生段階でありうる；宿主細胞は、例えば、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されたＴ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、任意のＴ細胞、例えば培養Ｔ細胞など（例、初代Ｔ細胞）、又は培養Ｔ細胞株からのＴ細胞（例、ジャーカット、ＳｕｐＴ１など）、又は哺乳動物から得られたＴ細胞などでありうる。哺乳動物から得られる場合、Ｔ細胞は、多数の供給源（血液、骨髄、リンパ節、胸腺、又は他の組織もしくは体液を含むが、これらに限定しない）から得ることができる。Ｔ細胞は濃縮又は精製することもできる。Ｔ細胞は、任意の型のＴ細胞でありうる、任意の発生段階（ＣＤ４  ＋／ＣＤ８＋二重陽性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、例、Ｔｈ２細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例、細胞傷害性Ｔ細胞）、腫瘍浸潤細胞、記憶Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞などを含むが、これらに限定しない）でありうる。Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞又はＣＤ４＋Ｔ細胞でありうる。
【００９３】
上に記載するように調製されたそれらのＴ細胞の集団は、本開示に基づいて当業者に明らかである公知の技術又はそれらの変法に従った養子免疫療法のための方法及び組成物中で利用することができる。例えば、Gruenberg et al.による米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号を参照のこと；Rosenbergによる米国特許第４，６９０，９１５号も参照のこと。癌の養子免疫療法は、抗腫瘍反応性を伴う免疫細胞を担腫瘍宿主に投与する治療アプローチを指し、細胞が、確立された腫瘍の退行を直接的又は間接的のいずれかで媒介することを目的とする。リンパ球、特にＴリンパ球の注入はこのカテゴリー中に分類される。現在、大半の養子免疫療法は、患者自身の免疫細胞を使用した処置に向けられた自己リンパ球治療（ＡＬＴ）である。これらの治療は、患者自身のリンパ球を処理して、免疫細胞媒介性応答を増強する、又は体内の特定の抗原もしくは異物（癌細胞を含む）を認識することを含む。処置は、患者のリンパ球を除去し、これらの細胞をインビトロで生物製剤及び薬物に曝露して細胞の免疫機能を活性化することにより達成する。一度、自己細胞が活性化されると、これらのエクスビボで活性化された細胞を患者に再注入して、免疫系を増強して癌を処置する。一部の実施形態では、細胞は、最初にそれらの培養培地からそれらを採取し、次に処置有効量での投与のために適切な媒質及び容器系（「医薬的に許容可能な」担体）中で細胞を洗浄及び濃縮することにより製剤化する。適切な注入媒質は任意の等張性媒質製剤、典型的には生理食塩水、Normosol R（Abbott）、又はPlasma-Lyte A（Baxter）でありうるが、しかし、また、水中の５%デキストロース又は乳酸リンゲル液も利用することができる。注入媒質には、ヒト血清アルブミンを補充することができる。組成物中の細胞の処置有効量は、所望の特異性を伴うＴ細胞の相対的な表現、レシピエントの年齢及び体重、標的状態の重症度、及び標的Ａｇの免疫原性に依存する。これらの細胞の量は、約１０３/kg、好ましくは５×１０３/kgと低く；及び１０７/kg、好ましくは１０８/kgと高くなりうる。細胞の数は、その中に含まれる細胞の型と同様に、組成物が意図される最終的な使用に依存しうる。例えば、特定のＡｇに特異的である細胞が望まれる場合、次にその集団はそのような細胞を７０%超、一般的に８０%超、８５%及び９０−９５%超含むであろう。本明細書で提供する使用のために、細胞は一般的に１リットル又はそれ以下の容積であり、５００ml又はそれ以下、さらには２５０ml又は１００ml又はそれ以下でありうる。臨床的に関連する数の免疫細胞は、所望の総細胞量に累積的に等しい、又はそれを超える複数の注入中に配分することができる。
【００９４】
特に、本発明の細胞は、癌の処置のために特に適切である。したがって、本発明のさらなる目的は、治療有効量の本発明の細胞集団を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において癌を処置する方法に関する。
【００９５】
多特異性抗体
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で上に記載する本発明の分子の抗体からの第１の抗原結合部位及び少なくとも１つの第２の抗原結合部位を含む多特異性抗体を提供する。
【００９６】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ＵＳ７２３５６４１に記載されているＴ細胞上の標的抗原及びＣＤ３に対して向けられた二重特異性ｓｃＦｖ２であるＢｉＴＥ（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）抗体としてヒトエフェクター細胞上の抗原を結合することにより、又は細胞傷害性剤もしくは第２の治療的薬剤を結合することにより、殺害機構の動員のために使用される。本明細書で使用する用語「エフェクター細胞」は、免疫応答の認知期及び活性化期とは対照的に、免疫応答のエフェクター期に含まれる免疫細胞を指す。例示的な免疫細胞は、骨髄又はリンパ起源の細胞、例えばリンパ球（例えば細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＢ細胞及びＴ細胞など）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、マスト細胞及び顆粒球、例えば好中球、好酸球、及び好塩基球などを含む。一部のエフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現し、特定の免疫機能を実行する。一部の実施形態では、エフェクター細胞はＡＤＣＣ（例えばナチュラルキラー細胞など）を誘導することができる。例えば、単球、マクロファージは、ＦｃＲを発現し、標的細胞の特異的な死滅及び免疫系の他の成分への抗原の提示に含まれる。一部の実施形態では、エフェクター細胞は、標的抗原又は標的細胞を貪食しうる。エフェクター細胞上の特定のＦｃＲの発現は、体液性因子（例えばサイトカインなど）により調節されうる。エフェクター細胞は標的抗原を貪食する、又は標的細胞を貪食もしくは溶解することができる。適切な細胞傷害性薬剤及び第２の治療的薬剤を以下に例示し、毒素（例えば放射標識ペプチドなど）、化学療法剤、及びプロドラッグを含む。
【００９７】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ヒトＢ細胞上の抗原（例えば、例、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ４６、ＣＤ８０、ＣＤ１３８、及びＨＬＡ−ＤＲなど）に結合する。
【００９８】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は組織特異的抗原に結合し、特定の組織への二重特異性抗体の局在化を促進する。
【００９９】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、ネクチン−４発現細胞と同じ型の細胞上に位置する抗原、典型的には腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合するが、しかし、第１の抗原結合部位の結合特異性とは異なる結合特異性を有する。そのような多又は二重特異性抗体は、腫瘍細胞結合の特異性を増強し、及び／又は複数のエフェクター経路に関与することができる。例示的なＴＡＡは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＲＡＧＥ（腎抗原）、α−フェトプロテイン、ＣＡＭＥＬ（メラノーマ上のＣＴＬ認識抗原）、ＣＴ抗原（例えばＭＡＧＥ−Ｂ５、−Ｂ６、−Ｃ２、−Ｃ３、及びＤ；Ｍａｇｅ−１２；ＣＴ１０；ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＳＳＸ−２、ＧＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＭＡＧＥ、及びＳＡＧＥなど）、ムチン抗原（例、ＭＵＣ１、ムチン−ＣＡ１２５など）、ガングリオシド抗原、チロシナーゼ、ｇｐ７５、ｃ−Ｍｅｔ、Ｍａｒｔｉ、メランＡ、ＭＵＭ−１、ＭＵＭ−２、ＭＵＭ−３、ＨＬＡ−Ｂ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、又は癌関連インテグリン（例えばα５β３インテグリンなど）を含む。あるいは、第２の抗原結合部位は、あるいは、血管新生因子又は他の癌関連成長因子、例えば血管内皮成長因子、線維芽細胞成長因子、表皮成長因子、アンジオジェニン又はこれらのいずれかの受容体、特に癌進行に関連付けられる受容体などに結合しうる。
【０１００】
一部の実施形態では、第２の抗原結合部位は、本発明の第２の抗体又はＡＤＣ（例えば本発明の抗体など）から由来する。
【０１０１】
本発明の多特異性抗体分子の例示的なフォーマットは以下を含むが、これらに限定しない：（ｉ）化学的ヘテロ結合により架橋された２つの抗体（１つは［抗原］への特異性を伴い、他は第２の抗原への特異性を伴う）；（ｉｉ）２つの異なる抗原結合領域を含む単一の抗体；（ｉｉｉ）２つの異なる抗原結合領域（例、余分なペプチドリンカーによりタンデムに連結された２つのｓｃＦｖ）を含む単鎖抗体；（ｉｖ）二重可変ドメイン抗体（ＤＶＤ−Ｉｇ）、ここで各々の軽鎖及び重鎖は短いペプチド結合を通じてタンデムに２つの可変ドメインを含む（Wu et al., Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin (DVD-IgTM) Molecule, In : Antibody Engineering, Springer Berlin Heidelberg (2010)）；（ｖ）化学的に連結された二重特異性（Ｆａｂ’）２フラグメント；（ｖｉ）Ｔａｎｄａｂ（標的抗原の各々について２つの結合部位を有する四価の二重特異性抗体をもたらす２つの単鎖ダイアボディの融合体）；（ｖｉｉ）フレキシボディ（ｓｃＦｖとダイアボディとの組み合わせで、多価分子をもたらす）；（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼＡの「二量体化及びドッキングドメイン」に基づく、いわゆる「ドックアンドロック」分子（Ｆａｂに適用された場合、異なるＦａｂフラグメントに連結された２つの同一のＦａｂフラグメントからなる三価の二重特異性結合タンパク質を生じる）；（ｉｘ）例えば、ヒトＦａｂアームの両方の末端に融合された２つのｓｃＦｖを含む、いわゆるスコーピオン分子；及び（ｘ）ダイアボディ。二重特異性抗体の別の例示的なフォーマットは、ヘテロ二量体化を強制する相補的なＣＨ３ドメインを伴うＩｇＧ様分子である。そのような分子は、公知の技術、例えばＴｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（Trion Pharma/Fresenius Biotech）、Ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−Ｈｏｌｅ（Genentech）、ＣｒｏｓｓＭＡｂ（Roche）及び静電的整合（Amgen）、ＬＵＺ−Ｙ（Genentech）、鎖交換操作ドメインボディ（SEEDbody）（EMD Serono）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Merus）及びＤｕｏＢｏｄｙ（Genmab A/S）技術などとして公知のものを使用して調製することができる。
【０１０２】
一部の実施形態では、二重特異性抗体は、典型的にはＤｕｏＢｏｄｙ技術を使用し、制御されたＦａｂアーム交換を介して得る、又は入手可能である。制御されたＦａｂアーム交換により二重特異性抗体を産生するためのインビトロ方法が、ＷＯ２００８１１９３５３及びＷＯ２０１１１３１７４６（両方ともGenmab A/Sによる）に記載されている。ＷＯ２００８１１９３５３に記載されている１つの例示的な方法では、二重特異性抗体が、還元条件下でのインキュベーション時に、２つの単一特異性抗体（両方ともＩｇＧ４様ＣＨ３を含む）間の「Ｆａｂアーム」又は「半分子」交換（重鎖と付着軽鎖の取り替え）により形成される。結果として得られた産物は、異なる配列を含みうる２つのＦａｂアームを有する二重特異性抗体である。ＷＯ２０１１１３１７４６に記載されている別の例示的な方法では、本発明の二重特異性抗体は、以下の工程を含む方法により調製され、それにおいて第１及び第２の抗体の少なくとも１つは本発明の抗体である：ａ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第１の抗体を提供すること（前記Ｆｃ領域は第１のＣＨ３領域を含む）；ｂ）免疫グロブリンのＦｃ領域を含む第２の抗体を提供すること（前記Ｆｃ領域は第２のＣＨ３領域を含み；それにおいて前記第１及び第２のＣＨ３領域の配列は異なり、前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用は、前記第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強い）；ｃ）還元条件下で、前記第１の抗体を前記第２の抗体とインキュベートすること；ならびにｄ）前記二重特異性抗体を得ること（それにおいて第１の抗体は本発明の抗体であり、第２の抗体は異なる結合特異性を有する、又はその逆）。還元条件は、例えば、還元剤（例、２−メルカプトエチルアミン、ジチオトレイトール、及びトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィンより選択）を加えることにより提供しうる。工程ｄ）はさらに、例えば還元剤の除去により（例、脱塩により）非還元又は低還元性になるように条件を回復させることを含みうる。好ましくは、第１及び第２のＣＨ３領域の配列は異なり、わずかのかなり保存的な非対称変異だけを含み、前記第１及び第２のＣＨ３領域間のヘテロ二量体相互作用が、前記第１及び第２のＣＨ３領域のホモ二量体相互作用の各々よりも強いようにする。これらの相互作用及びそれらをどのように達成することができるかについての詳細は、ＷＯ２０１１１３１７４６に提供されており、それは、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。以下は、そのような非対称変異の組み合わせの例示的な実施形態であり、場合により、それにおいて１つ又は両方のＦｃ領域がＩｇＧ１アイソタイプである。
【０１０３】
一部の実施形態では、第１のＦｃ領域は、３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、４０７、及び４０９からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、第２のＦｃ領域は、３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、４０７、及び４０９からなる群より選択される位置にアミノ酸置換を有し、それにおいて第１及び第２のＦｃ領域は同じ位置で置換されていない。
【０１０４】
一部の実施形態では、第１のＦｃ領域は、位置４０５にアミノ酸置換を有し、前記第２のＦｃ領域は、３６６、３６８、３７０、３９９、４０７、及び４０９からなる群より選択される位置、場合により４０９にアミノ酸置換を有する。
【０１０５】
一部の実施形態では、第１のＦｃ領域は、位置４０９にアミノ酸置換を有し、前記第２のＦｃ領域は、３６６、３６８、３７０、３９９、４０５、及び４０７からなる群より選択される位置、場合により４０５又は３６８にアミノ酸置換を有する。
【０１０６】
一部の実施形態では、第１及び第２のＦｃ領域は両方がＩｇＧ１アイソタイプであり、第１のＦｃ領域は位置４０５にＬｅｕを有し、第２のＦｃ領域は位置４０９にＡｒｇを有する。
【０１０７】
免疫複合体
本発明の抗体を検出可能な標識と結合させて、抗ネクチン−４免疫複合体を形成することができる。適切な検出可能な標識は、例えば、放射性同位体、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識、生物発光標識、又はコロイド金を含む。そのような検出可能に標識された免疫複合体を作製及び検出する方法は、当業者に周知であり、以下により詳細に記載されている。検出可能な標識は、オートラジオグラフィーにより検出される放射性同位元素でありうる。本発明の目的のために特に有用な同位体は、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、及び１４Ｃである。
【０１０８】
抗ネクチン−４免疫複合体はまた、蛍光化合物を用いて標識することができる。蛍光標識抗体の存在は、免疫複合体を適した波長の光に曝露し、結果としての蛍光を検出することにより決定する。蛍光標識化合物は、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリテリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、及びフルオレスカミンを含む。
【０１０９】
あるいは、抗ネクチン−４免疫複合体を、抗体を化学発光化合物に共役することにより、検出可能に標識することができる。化学発光タグ付き免疫複合体の存在は、化学反応の過程の間に生じる発光の存在を検出することにより決定する。化学発光標識化合物の例は、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエステル、イミダゾール、アクリジニウム塩、及びシュウ酸エステルを含む。
【０１１０】
同様に、生物発光化合物を使用して、本発明の抗ネクチン−４免疫複合体を標識することができる。生物発光は、触媒タンパク質が化学発光反応の効率を増加させる生物系において見出される化学発光の型である。生物発光タンパク質の存在は、発光の存在を検出することにより決定する。標識のために有用な生物発光化合物は、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、及びエクオリンを含む。
【０１１１】
あるいは、抗ネクチン−４免疫複合体は、抗［抗原］抗体を酵素に連結させることにより検出可能に標識することができる。抗ネクチン−４−酵素複合体が適当な基質の存在においてインキュベートされる場合、酵素部分は基質と反応して、例えば分光測光法、蛍光測光法、又は視覚的手段により検出することができる化学的部分を産生する。多特異性免疫複合体を検出可能に標識するために使用することができる酵素の例は、β−ガラクトシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、及びアルカリホスファターゼを含む。
【０１１２】
当業者には、本発明に従って用いることができる他の適切な標識が公知であろう。抗ネクチン−４モノクローナル抗体へのマーカー部分の結合は、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して達成することができる。これに関する典型的な方法論が、Kennedy et al., Clin. Chim. Acta 70:1, 1976；Schurs et al., Clin. Chim. Acta 81:1, 1977；Shih et al., Int’l J. Cancer 46:1101, 1990；Stein et al., Cancer Res. 50:1330, 1990；及びColigan（上記）に記載されている。
【０１１３】
さらに、免疫化学的検出の利便性及び汎用性を、アビジン、ストレプトアビジン、及びビオチンと結合した抗ネクチン−４モノクローナル抗体を使用することにより増強することができる（例、Wilchek et al. (eds.), “Avidin-Biotin Technology,” Methods In Enzymology (Vol. 184) (Academic Press 1990)；Bayer et al., “Immunochemical Applications of Avidin-Biotin Technology,” in Methods In Molecular Biology (Vol. 10) 149-162 (Manson, ed., The Humana Press, Inc. 1992)を参照のこと）。
【０１１４】
イムノアッセイを実施するための方法は十分に確立されている（例、Cook and Self, “Monoclonal Antibodies in Diagnostic Immunoassays,” Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application 180-208 (Ritter and Ladyman, eds., Cambridge University Press 1995)；Perry, “The Role of Monoclonal Antibodies in the Advancement of Immunoassay Technology,” Monoclonal Antibodies: Principles and Applications 107-120 (Birch and Lennox, eds., Wiley-Liss, Inc. 1995)；Diamandis, Immunoassay (Academic Press, Inc. 1996)を参照のこと）。
【０１１５】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、治療的部分、即ち、薬物に結合されている。治療的部分は、例えば、細胞毒素、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、免疫刺激剤、溶解性ペプチド、又は放射性同位元素でありうる。そのような複合体は、本明細書において「抗体−薬物複合体」又は「ＡＤＣ」として言及する。
【０１１６】
一部の実施形態では、抗体は細胞傷害性部分に結合されている。細胞傷害性部分は、例えば、タキソール；サイトカラシンＢ；グラミシジンＤ；エチジウムブロマイド；エメチン；マイトマイシン；エトポシド；テノポシド；ビンクリスチン；ビンブラスチン；コルヒチン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；  ジヒドロキシアントラシンジオン；チューブリンインヒビター（例えばメイタンシンなど）又はそれらの類似体もしくは誘導体；有糸分裂インヒビター（例えばモノメチルオーリスタチンＥ又はＦなど）又はそれらの類似体もしくは誘導体；ドラスタチン１０もしくは１５又はそれらの類似体；イリノテカン又はその類似体；ミトキサントロン；ミトラマイシン；アクチノマイシンＤ；１−デヒドロテストステロン；グルココルチコイド；プロカイン；テトラカイン；リドカイン；プロプラノロール；ピューロマイシン；カリケアマイシン又はその類似体もしくは誘導体；代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート、６メルカプトプリン、６チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５フルオロウラシル、デカルバジン、ヒドロキシウレア、アスパラギナーゼ、ゲムシタビン、又はクラドリビンなど）；アルキル化剤（例えばメクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣなど）；白金誘導体（例えばシスプラチン又はカルボプラチンなど）；デュオカルマイシンＡ、デュオカルマイシンＳＡ、ラケルマイシン（ＣＣ−１０６５）、又はそれらの類似体もしくは誘導体；抗生物質（例えばダクチノマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、プリカマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）など）；ピロロ［２、ｌ−ｃ］［１，４］−ベンゾジアゼピン（ＰＤＢ）；ジフテリア毒素及び関連分子（例えばジフテリアＡ鎖及びその活性フラグメント及びハイブリッド分子）、リシン毒素（例えばリシンＡ又は脱グリコシル化リシンＡ鎖毒素など）、コレラ毒素、志賀様毒素（例えばＳＬＴ  Ｉ、ＳＬＴ  ＩＩ、ＳＬＴ  ＩＩＶなど）、ＬＴ毒素、Ｃ３毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風毒素、大豆Ｂｏｗｍａｎ−Ｂｉｒｋプロテアーゼインヒビター、シュードモナス外毒素、アロリン、サポリン、モデシン、ゲラニン、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファサルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアンチンタンパク質、アメリカヤマゴボウタンパク質（例えばＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓなど）、モモルディカ・チャランチアインヒビター、クルシン、クロチン、サパオナリア・オフィシナリスインヒビター、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、及びエノマイシン毒素；リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）；ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシンＡ；ヨウシュヤマゴボウ抗ウイルスタンパク質；ジフテリン毒素；及びシュードモナス内毒素からなる群より選択してもよい。
【０１１７】
一部の実施形態では、抗体は核酸又は核酸関連分子に結合させる。そのような一実施形態では、結合核酸は、細胞傷害性リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）又はデオキシリボヌクレアーゼ（例、ＤＮａｓｅ  Ｉ）、アンチセンス核酸、阻害性ＲＮＡ分子（例、ｓｉＲＮＡ分子）、又は免疫刺激性核酸（例、免疫刺激性ＣｐＧモチーフ含有ＤＮＡ分子）である。一部の実施形態では、抗体はアプタマー又はリボザイムに結合させる。
【０１１８】
一部の実施形態では、抗体は、例えば融合タンパク質として、溶解性ペプチド（例えばＣＬＩＰ、マガイニン２、メリチン、セクロピン、及びＰ１８など）に結合させる。
【０１１９】
一部の実施形態では、抗体は、サイトカイン（例、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８ａ、ＩＬ−２８ｂ、ＩＬ−２９、ＫＧＦ、ＩＦＮａ、ＩＦＮ３、ＩＦＮｙ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、Ｆｌｔ３リガンド、幹細胞因子、アンセスチム、  及びＴＮＦａなど）に結合させる。
【０１２０】
一部の実施形態では、抗体は、放射性同位体又は放射性同位体含有キレートに結合させる。例えば、抗体をキレート剤リンカー（例、ＤＯＴＡ、ＤＴＰＡ、又はチウキセタン、これらは抗体を放射性同位元素と複合化することができる）に結合させることができる。抗体はまた、又はあるいは、１つ又は複数の放射性標識アミノ酸又は他の放射性標識分子を含む、又はそれらに結合させてもよい。放射性同位体の非限定的な例は、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８６Ｒｅ、２１３Ｂｉ、２２５Ａｃ、及び２２７Ｔｈを含む。治療目的のために、ベータ又はアルファ粒子放射線を放出する放射性同位体を使用することができる（例、１３１１、９０Ｙ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、６７Ｃｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、及び２１２Ｐｂ）。
【０１２１】
特定の実施形態では、抗体−薬物複合体は抗チューブリン薬剤を含む。抗チューブリン薬剤の例は、例えば、タキサン（例、タキソール（登録商標）（パクリタキセル）、タキソテール（登録商標）（ドセタキセル））、Ｔ６７（Tularik）、ビンカアルキドイド（例、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、及びビノレルビン）、及びドラスタチン（  例、アウリスタチンＥ、ＡＦＰ、ＭＭＡＦ、ＭＭＡＥ、ＡＥＢ、ＡＥＶ）を含む。他の抗チューブリン薬剤は、例えば、バッカチン誘導体、タキサン類似体（例、エポチロンＡ及びＢ）、ノコダゾール、コルヒチン及びコルシミド、エストラムスチン、クリプトフィシン、セマドチン、メイタンシノイド、コンブレタスタチン、ディスコデルモリド、及びエレウテロビンを含む。一部の実施形態では、細胞傷害性薬剤はメイタンシノイド（抗チューブリン薬剤の別の群）である。例えば、特定の実施形態では、メイタンシノイドはメイタンシン又はＤＭ−１である（ImmunoGen, Inc.;Chari et al., Cancer Res. 52:127-131, 1992も参照のこと）。
【０１２２】
他の実施形態では、細胞傷害性薬剤は代謝拮抗剤である。代謝拮抗薬は、例えば、プリン拮抗薬（例、アゾチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル）、ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター（例、メトトレキサート）、アシクロビル、ガンシクロビル、ジドブジン、ビダラビン、リババリン、アジドチミジン、シチジンアラビノシド、アマンタジン、ジデオキシウリジン、ヨードデオキシウリジン、ポスカネット、又はトリフルリジンでありうる。
【０１２３】
他の実施形態では、抗ネクチン−４抗体はプロドラッグ変換酵素に結合させる。プロドラッグ変換酵素は、公知の方法を使用して抗体に組換え的に融合させる、又はそれに化学的に結合させることができる。例示的なプロドラッグ変換酵素は、カルボキシペプチダーゼＧ２、β−グルクロニダーゼ、ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ、ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ、β−ラクタマーゼ、β−グルコシダーゼ、ニトロレダクターゼ、及びカルボキシペプチダーゼＡである。
【０１２４】
治療部分として使用する他の分子は、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ）でありうる。
【０１２５】
特定の実施形態では、抗体は、配列番号１と同一の重鎖及び配列番号２と同一の軽鎖を有し、ＭＭＡＥに結合されたキメラ抗体である。
【０１２６】
別の特定の実施形態では、抗体は、配列番号１と同一の重鎖及び配列番号２と同一の軽鎖を有し、ピロロベンゾジアゼピン二量体（ＰＢＤ）に結合されたキメラ抗体である。
【０１２７】
典型的には、抗体−薬物複合体化合物は、薬物単位と抗体単位の間にリンカー単位を含む。一部の実施形態では、リンカーは細胞内条件下で切断可能であり、リンカーの切断によって細胞内環境において抗体から薬物単位が放出される。さらに他の実施形態では、リンカー単位は切断可能ではなく、薬物は、例えば、抗体分解により放出される。
【０１２８】
一部の実施形態では、リンカーは、細胞内環境（例、リソソーム又はエンドソーム又はカベオレア内）において存在する切断薬剤により切断可能である。リンカーは、例えば、細胞内ペプチダーゼ又はプロテアーゼ酵素（リソソーム又はエンドソームプロテアーゼを含むが、これらに限定しない）により切断されるペプチジルリンカーでありうる。一部の実施形態では、ペプチジルリンカーは、少なくとも２アミノ酸長又は少なくとも３アミノ酸長である。切断薬剤はカテプシンＢ及びＤならびにプラスミンを含みうるが、これらは全てが、ジペプチド薬物誘導体を加水分解して、標的細胞内で活性薬物の放出をもたらすことが公知である（例、Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123を参照のこと）。
【０１２９】
最も典型的なのは、１９１Ｐ４Ｄ１２発現細胞中に存在する酵素により切断可能なペプチジルリンカーである。そのようなリンカーの例は、例えば、米国特許第６，２１４，３４５号に記載されており、その全体を全ての目的のために参照により本明細書中に組み入れる。特定の実施形態では、細胞内プロテアーゼにより切断可能なペプチジルリンカーはＶａｌ−Ｃｉｔリンカー又はＰｈｅ−Ｌｙｓリンカーである（例、Ｖａｌ−Ｃｉｔリンカーを用いたドキソルビシンの合成を記載する米国特許第６，２１４，３４５号を参照のこと）  。治療用薬剤の細胞内タンパク質分解放出を使用する利点の１つは、結合された場合に典型的には弱毒化され、複合体の血清中安定性が典型的には高いことである。
【０１３０】
他の実施形態では、切断可能なリンカーはｐＨ感受性、即ち、特定のｐＨ値での加水分解に感受性である。
【０１３１】
典型的には、ｐＨ感受性リンカーは酸性条件下で加水分解可能である。例えば、リソソーム中で加水分解可能な酸不安定性リンカー（例、ヒドラゾン、セミカルバゾン、チオセミカルバゾン、シス−アコニットアミド、オルトエステル、アセタール、ケタールなど）を使用することができる（例、米国特許第５，１２２，３６８号；第５，８２４，８０５号；第５，６２２，９２９号；Dubowchik and Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123；Neville et al., 1989, Biol. Chem. 264:14653-14661を参照のこと）。そのようなリンカーは、中性のｐＨ条件（例えば血液中のｐＨなど）下では比較的安定であるが、リソソームのおおよそのｐＨであるｐＨ  ５．５又は５．０未満では不安定である。特定の実施形態では、加水分解可能なリンカーはチオエーテルリンカー（例えば、アシルヒドラゾン結合を介して治療用薬剤に付着されたチオエーテルなど）である（例、米国特許第５，６２２，９２９号を参照のこと）。
【０１３２】
さらに他の実施形態では、リンカーは還元条件下で切断可能である（例、ジスルフィドリンカー）。種々のジスルフィドリンカーが当技術分野において公知であり、例えば、ＳＡＴＡ（Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート）、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）、ＳＰＤＢ（Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）ブチレート）、及びＳＭＰＴ（Ｎ−スクシイミジル−オキシカルボニル−アルファ−メチル−アルファ−（２−ピリジル−ジチオ）トルエン）、ＳＰＤＢ及びＳＭＰＴを使用して形成することができるものを含む（例、Thorpe et al., 1987, Cancer Res. 47:5924-5931；Wawrzynczak et al., In Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimagery and Therapy of Cancer (C. W. Vogel ed., Oxford U. Press, 1987を参照のこと。米国特許第４，８８０，９３５号も参照のこと）。
【０１３３】
さらに他の特定の実施形態では、リンカーはマロン酸リンカー（Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15:1387-93）、マレイミドベンゾイルリンカー（Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1299-1304）、又は３’−Ｎ−アミド類似体（Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem. 3(10):1305-12）である。
【０１３４】
さらに他の実施形態では、リンカー単位は切断可能ではなく、薬物は抗体分解により放出される。
【０１３５】
通常、リンカーは細胞外環境に実質的に感受性ではない。本明細書で使用する「細胞外環境に実質的に感受性ではない」は、リンカーの文脈において、抗体−薬物複合体化合物のサンプル中のリンカーの約２０%未満、典型的には約１５%未満、より典型的には約１０%未満、さらにより典型的には約５%未満、約３%未満、又は約１%未満が、抗体−薬物複合体化合物が細胞外環境中（例、血漿中）に存在する場合に切断される。リンカーが細胞外環境に実質的に感受性ではないか否かは、例えば、所定の時間（例、２、４、８、１６、又は２４時間）にわたり抗体−薬物複合体化合物を血漿とインキュベートし、次に血漿中に存在する遊離薬物の量を定量化することにより決定することができる。
【０１３６】
分子を抗体に結合させるための技術は、当技術分野において周知である（例、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy,” Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy (Reisfeld et al. eds., Alan R. Liss, Inc., 1985)；Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery,” Controlled Drug Delivery (Robinson et al. eds., Marcel Deiker, Inc., 2nd ed. 1987)；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review,” Monoclonal Antibodies’84: Biological And Clinical Applications (Pinchera et al. eds., 1985)；“Analysis, Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy,”Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy (Baldwin et al. eds., Academic Press, 1985)；及びThorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119-58を参照のこと。また、例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ  ８９／１２６２４を参照のこと。典型的には、核酸分子は、それぞれＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル又はマレイミド官能基を通じて、抗体のリジン又はシステインに共有結合的に付着される。操作されたシステインを使用した結合又は非天然アミノ酸の組み入れの方法によって、複合体の均一性が改善されることが報告されている（Axup, J.Y., Bajjuri, K.M., Ritland, M., Hutchins, B.M., Kim, C.H., Kazane, S.A., Halder, R., Forsyth, J.S., Santidrian, A.F., Stafin, K., et al. (2012). Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109, 16101-16106.；Junutula, J.R., Flagella, K.M., Graham, R.A., Parsons, K.L., Ha, E., Raab, H., Bhakta, S., Nguyen, T., Dugger, D.L., Li, G., et al. (2010). Engineered thio-trastuzumab-DM1 conjugate with an improved therapeutic index to target humanepidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. Clin. Cancer Res.16, 4769-4778.）。Junutula et al. (2008)は、「ＴＨＩＯＭＡＢ」（ＴＤＣ）と呼ばれるシステインベースの部位特異的結合を開発し、これは、従来の結合方法と比較して改善された治療指数を呈すると主張している。抗体中に組み入れられた非天然アミノ酸への結合もＡＤＣについて探索されている；しかし、このアプローチの一般性はまだ確立されていない（Axup et al., 2012）。特に、当業者はまた、ポリペプチド操作により（例  、ポリペプチドのアミノ酸の欠失、挿入、置換、又は変異を介して）反応性に作製されるアシル供与体グルタミン含有タグ（例、Ｇｉｎ含有ペプチドタグ又はＱタグ）又は内因性グルタミンを用いて操作されたＦｃ含有ポリペプチドを予想することができる。次に、トランスグルタミナーゼは、アミン供与体薬剤（例、反応性アミンを含む又はそれに付着された小分子）と共有結合的に架橋し、操作されたＦｃ含有ポリペプチド複合体の安定した均質な集団を形成することができ、アミン供与体薬剤は、アシル供与グルタミン含有タグ又はアクセス可能／曝露／反応性内因性グルタミンを通じてＦｃ含有ポリペプチドに部位特異的に結合されている（ＷＯ２０１２０５９８８２）。
【０１３７】
診断的及び治療的使用
本発明のさらなる態様は、癌、特にネクチン−４が過剰発現している癌を診断及び／又はモニター及び／又は病期分類するための本発明の抗ネクチン−４抗体に関する。
【０１３８】
本発明に従い、ネクチン−４が過剰発現している癌は、正常細胞（非腫瘍細胞）により発現されるネクチン−４のレベルよりも優れた癌性細胞の表面で発現されるネクチン−４のレベルを伴う癌を表す。
【０１３９】
本発明に従い、ネクチン−４が過剰発現されている癌は、乳癌、卵巣癌、肺癌、尿路上皮癌、及び膵臓癌でありうる。一実施形態では、乳癌は三重陰性乳癌である。
【０１４０】
好ましい実施形態では、本発明の抗体は、検出可能な分子又は物質（例えば蛍光分子、放射性分子、又は上に記載するような当技術分野において公知の任意の他の標識など）を用いて標識してもよい。例えば、本発明の抗体は、当技術分野に公知の任意の方法により放射性分子を用いて標識してもよい。例えば、放射性分子は、シンチグラフィー試験用の放射性原子（例えばＩ１２３、Ｉ１２４、Ｉｎ１１１、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８など）を含むが、これらに限定しない。本発明の抗体はまた、核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（磁気共鳴画像法、ＭＲＩとしても公知である）用のスピン標識（例えばヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、又は鉄など）を用いて標識してもよい。抗体の投与に続いて、患者内の抗体の分布を検出する。任意の特定の標識の分布を検出するための方法は、当業者に公知であり、任意の適当な方法を使用することができる。一部の非限定的な例は、コンピューター断層撮影（ＣＴ）、位置放射断層撮影（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、蛍光、化学発光、及び超音波検査を含む。
【０１４１】
典型的には、前記診断方法は、患者から得られた生物学的サンプルの使用を含む。本明細書で使用する用語「生物学的サンプル」は、対象から得られた種々の種類のサンプルを包含し、診断アッセイ又はモニタリングアッセイにおいて使用することができる。生物学的サンプルには、血液及び生物学的起源の他の液体サンプル、固形組織サンプル（例えば生検標本又は組織培養物など）、又はそれらから由来する細胞、及びそれらの後代を含むが、これらに限定しない。例えば、生物学的製剤サンプルは、ネクチン−４過剰発現に関連付けられる癌を有する疑いのある個体から収集された組織サンプルから、好ましい実施形態では、乳癌、卵巣癌、肺癌、尿路上皮癌、及び膵臓癌から得られた細胞を含む。
【０１４２】
従って、生物学的サンプルは、臨床サンプル、癌サンプル、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、血清、血漿、生物学的液体、及び組織サンプルを包含する。
【０１４３】
本発明の抗体、フラグメント、又は免疫複合体は、ネクチン−４の過剰発現に関連付けられる任意の疾患、特に癌及び転移性癌を処置するために有用でありうる。
【０１４４】
本発明の抗体は、単独で、又は任意の適切な薬剤との組み合わせにおいて使用してもよい。
【０１４５】
本明細書に記載する処置方法の実施形態の各々では、抗ネクチン−４抗体又は抗ネクチン−４抗体−薬物複合体は、処置が求められる疾患又は障害の管理に関連付けられる従来の方法論と一致する様式で送達させる。本明細書における開示によれば、有効量の抗体又は抗体−薬物複合体は、疾患又は障害を防止又は処置するために十分な時間及び条件下で、そのような処置を必要とする患者に投与する。
【０１４６】
本明細書で使用する用語「処置」及び「処置する」は、予防又は防止的処置、ならびに治療又は疾患修飾処置の両方を指し、疾患に罹患するリスクのある又は疾患に罹患した疑いのある対象ならびに病気である、又は疾患もしくは医学的状態に苦しんでいると診断された対象の処置を含み、臨床的再発の抑制を含む。処置は、障害又は再発障害の１つ又は複数の症状を防止、治癒、その発症の遅延、その重症度の軽減、又は寛解するために、又はそのような処置の非存在において予想されるものを超えて対象の生存を延長するために、医学的障害を有する又は究極的に障害を獲得しうる対象に施してもよい。「治療レジメン」により、病気の処置のパターン、例えば、治療の間に使用される投薬のパターンを意味する。治療レジメンは導入レジメン及び維持レジメンを含みうる。語句「導入レジメン」又は「導入期間」は、疾患の初期処置のために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。導入レジメンの一般的な目標は、処置レジメンの初期期間の間に対象に高レベルの薬物を提供することである。導入レジメンは（部分的又は全体的に）「負荷レジメン」を用いてもよく、それは、医師が維持レジメンの間に用いうるよりも多い用量の薬物を投与すること、医師が維持レジメンの間に薬物を投与しうるよりも頻繁に薬物を投与すること、又はそれらの両方を含みうる。語句「維持レジメン」又は「維持期間」は、病気の処置の間での対象の維持のために、例えば、対象を長期間（月又は年）にわたり緩解に保つために使用される治療レジメン（又は治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンでは、継続治療（例、毎週、毎月、毎年などの定期的な間隔で薬物を投与すること）又は間欠治療（例、中断処置、間欠処置、再発時での処置、又は特定の所定の基準［例、疾患の発現など］の達成時での処置）を用いうる。
【０１４７】
本明細書で使用する用語「治療的有効量」は、所望の治療的な結果を達成するために必要な投与量で、及び期間にわたり効果的な量を指す。本発明の抗体の治療的有効量は、因子、例えば患者の疾患状態、年齢、性別、及び体重、ならびに抗体が個人において所望の応答を誘発する能力などに従って変動しうる。治療的有効量はまた、抗体又は抗体部分の任意の毒性又は有害効果よりも治療的に有益な効果が勝るものである。本発明の抗体についての効率的な投与量及び投与レジメンは、処置される疾患又は状態に依存し、当業者により決定されうる。当技術分野における通常の能力を有する医師は、要求される医薬組成物の有効量を容易に決定及び処方するであろう。例えば、医師は、所望の治療効果を達成するために、要求されるレベルよりも低いレベルで医薬組成物において用いられる本発明の抗体の用量を開始し、所望の効果が達成されるまで投与量を徐々に増加させることができうる。一般的に、本発明の組成物の適切な用量は、特定の投与レジメンに従って治療効果を産生するために効果的な最低用量である化合物の量である。そのような有効用量は一般的に、上に記載する因子に依存する。例えば、治療的使用のための治療的有効量は、疾患の進行を安定化させるその能力により測定しうる。癌を阻害する化合物の能力を、ヒト腫瘍における有効性を予測する動物モデル系において評価しうる。あるいは、組成物のこの特性は、細胞傷害性を誘導する化合物の能力を、当業者に公知のインビトロアッセイにより検証することにより評価してもよい。治療的化合物の治療有効量は、腫瘍サイズを減少させうる、又は、その他の点では、対象における症状を寛解させうる。当業者は、対象のサイズ、対象の症状の重症度、及び特定組成物又は選択された投与の経路などの因子に基づいてそのような量を決定することができるであろう。本発明の抗体の治療的有効量の例示的で非限定的な範囲は、約０．１〜１００mg/kg（例えば約０．１〜５０mg/kgなど）、例えば約０．１〜２０mg/kg（例えば約０．１〜１０mg/kgなど）、例えば約０．５（例えば約０．３、約１、約３mg/kg、約５mg/kg、又は約８mg/kgなど）である。本発明の抗体の治療的有効量についての例示的で非限定的な範囲は、約０．０２〜１００mg/kg、例えば約０．０２〜３０mg/kgなど、例えば約０．０５〜１０mg/kg又は０．１〜３mg/kg、例えば、約０．５〜２mg/kgである。投与は、例えば  静脈内、筋肉内、腹腔内、又は皮下でありうるが、例えば、標的部位の近位に投与する。上の処置及び使用の方法における投与レジメンは、最適な望ましい応答（例、治療応答）を提供するために調整する。例えば、単一ボーラスを投与してもよく、いくつかに分けた用量を経時的に投与してもよく、又は用量を、治療状況の緊急性により示されるように、比例的に低下又は増加させてもよい。一部の実施形態では、処置の有効性は、例えば、事前に定められた時点で治療の間にモニターする。一部の実施形態では、有効性は、疾患領域の視覚化により、又は本明細書でさらに記載する他の診断方法、例えば、例えば本発明の標識抗体、本発明の抗体から由来するフラグメント又はミニ抗体を使用して１つ又は複数のＰＥＴ−ＣＴスキャンを実施することによりモニターしうる。望まし���場合、医薬組成物の効果的な１日用量は、１日を通して適当な間隔で別々に、場合により単位剤形で投与される２、３、４、５、６、又はそれ以上のサブ用量として投与してもよい。一部の実施形態では、本発明のモノクローナル抗体は、任意の不必要な副作用を最小限にするために、長期間（例えば２４時間超など）にわたる緩徐な連続注入により投与する。本発明の抗体の有効用量はまた、毎週、隔週、又は３週間毎の投与期間を使用して投与してもよい。投与期間は、例えば、８週間、１２週間、又は臨床的進行が確立されるまでに制限されうる。非限定的な例として、本発明に従った処置は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、もしくは４０日目の少なくとも１つ、又は、あるいは、処置の開始後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０週目の少なくとも１つ、又はそれらの組み合わせに、２４、１２、８、６、４、もしくは２時間毎、又はそれらの任意の組み合わせで単回又は分割投与を使用して、約０．１〜１００mg/kg（例えば０．２、０．５、０．９、１．０、１．１、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００mg/k/日など）の量で本発明の抗体の１日投与量として提供する。
【０１４８】
したがって、本発明の１つの目的は、治療有効量の本発明の抗体を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において癌及び転移癌を処置する方法に関する。
【０１４９】
別の態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書における任意の態様又は実施形態で定義するような、本発明の抗体に関する。
【０１５０】
一部の実施形態では、対象は癌に苦しむ。したがって、本発明のさらなる目的は、治療有効量の本発明の抗体を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において癌を処置する方法に関する。
【０１５１】
本明細書で使用する用語「癌」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、固形腫瘍及び血液由来腫瘍を含むが、これらに限定しない。用語「癌」は、皮膚、組織、器官、骨、軟骨、血液、及び血管の疾患を含む。用語「癌」は原発癌及び転移癌の両方をさらに包含する。本発明の方法及び組成物により処置されうる癌の例は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮からの癌細胞を含むが、これらに限定しない。また、癌は具体的には以下の組織型でありうるが、これらに限定しない：新生物、悪性；癌；癌、未分化；巨細胞及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌：扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；石灰化上皮腫；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管細胞癌；肝細胞癌；肝細胞癌及び胆管細胞癌の組み合わせ；索状腺癌；アデノイド嚢胞癌；腺腫性ポリープ中の腺癌；腺癌、家族性大腸ポリポーシス；固形癌；カルチノイド腫瘍、悪性；細気管支肺胞腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性癌；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺癌；乳頭状及び濾胞性腺癌；非被嚢性硬化性癌；副腎皮質癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳道腺；腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液腺癌；印環細胞癌；浸潤管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳腺；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平上皮化生を伴う腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；線維芽細胞腫（ｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳腺外傍神経節腫、悪性；褐色細胞腫；グロムス血管肉腫；悪性黒色腫；無色素性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素性母斑中の悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣型横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胎児性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管周皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍皮質骨肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星状細胞腫；原形質星状細胞腫；線維性星細胞腫；星状芽細胞腫；膠芽腫；乏突起膠腫；乏突起膠芽腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅覚神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；傍肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫、大細胞、びまん性；悪性リンパ腫、濾胞；菌状息肉症；他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；及び有毛細胞白血病。
【０１５２】
特に、本発明は、乳癌、卵巣癌、肺癌、尿路上皮癌、及び膵臓癌を処置するために適切である。一実施形態では、乳癌は三重陰性乳癌である。
【０１５３】
特定の実施形態では、抗ネクチン−４抗体又は抗体−薬物複合体は、疾患又は障害の処置のために第２の薬剤との組み合わせにおいて使用する。癌を処置するために使用する場合、本発明の抗ネクチン−４抗体又は抗体−薬物複合体は、従来の癌治療、例えば手術、放射線療法、化学療法、又はそれらの組み合わせなどとの組み合わせにおいて使用してもよい。
【０１５４】
本発明はまた、本発明の抗体が、例えば癌及び転移癌を処置するために、少なくとも１つのさらなる治療薬剤との組み合わせにおいて使用される治療適用を提供する。そのような投与は、同時、別々、又は連続的でありうる。同時投与のために、薬剤は、適当な場合、１つの組成物として、又は別々の組成物として投与してもよい。さらなる治療薬剤は、典型的には、処置する障害に関連している。例示的な治療薬剤は、他の抗癌抗体、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、抗血管新生薬剤、抗癌免疫原、細胞周期制御／アポトーシス調節薬剤、ホルモン調節薬剤、及び以下に記載する他の薬剤を含む。
【０１５５】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、化学療法剤との組み合わせにおいて使用する。用語「化学療法剤」は、腫瘍成長を阻害する際に効果的である化学的化合物を指す。化学療法剤の例は、アルキル化剤（例えばチオテパ及びシクロホスファミドなど）；アルキルスルホン酸（例えばブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなど）；アジリジン（例えばベンゾドパ、カルボコン、メトレドパ、及びウレドパなど）；エチレンイミン及びメチルアメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスファオラミド、及びトリメチルオロメラミンを含む）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カルプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ−２１８９及びＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；窒素マスタード（例えばクロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラルムスチン（ｅｓｔｒａｒｎｕｓｔｉｎｅ）、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムチン（ｐｒｅｄｎｉｍｕｓ  ｔｉｎｅ）、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなど）；ニトロソ尿素（例えばカルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなど）；抗生物質（例えばエンジイン抗生物質など）（例、カリケアマイシン、特にカリケアマイシン（１１及びカリケアマイシン２１１、例えば、Agnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186 (1994)を参照のこと）；ダイネミシン（ダイネミシンＡを含む）；エスペラマイシン；ならびにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カンニノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダンルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラルマイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｇｒｉｎ）、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗剤（例えばメトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）など）；葉酸類似体（例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなど）；プリン類似体（例えばフルダラビン、６−メルカプトプリン、��アミプリン、チオグアニンなど）；ピリミジン類似体（例えばアンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５−ＦＵなど）；アンドロゲン（例えばカルステロン、プロピオン酸ドロスタノロン（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど）；抗副腎剤（例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど）；葉酸補充剤（例えばフロリン酸など）；アセグラトン；アルドホスファニド配糖体；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート（ｅｄａｔｒａｘａｔｅ）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド（例えばメイタンシン及びアンサミトシンなど）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲナニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロムトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（“Ａｒａ−Ｃ”）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例、パクリタキセル（TAXOL（登録商標）、Bristol-Myers Squibb Oncology、ニュージャージー州プリンストン）及びドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、ローヌ−プーランクロラー、フランス、アントニー）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；白金類似体（例えばシスプラチンやカルボプラチンなど）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルバイン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロン酸；ＣＰＴ−１  １；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；及び上のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸、又は誘導体を含む。また、この定義において含まれるのは、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように作用する抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲンなど（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、及びトレミフェン（Fareston）；ならびに抗アンドロゲン（例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、ゴセレリンなど）；ならびに上のいずれかの医薬的に許容可能な塩、酸、又は誘導体である。
【０１５６】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、標的癌治療との組み合わせにおいて使用する。標的癌治療は、癌の成長、進行、及び伝播に含まれる特定の分子（「分子標的」）に干渉することにより、癌の成長及び伝播を遮断する薬物又は他の物質である。標的癌治療は時折、「分子標的薬物」、「分子標的治療」、「精密医療」、又は類似の名前で呼ばれる。一部の実施形態では、標的治療は、対象にチロシンキナーゼインヒビターを投与することからなる。用語「チロシンキナーゼインヒビター」は、受容体及び／又は非受容体チロシンキナーゼの選択的又は非選択的インヒビターとして作用する種々の治療薬剤又は薬物のいずれかを指す。チロシンキナーゼインヒビター及び関連化合物は、当技術分野において周知であり、米国特許公開第２００７／０２５４２９５号に記載されており、それは、参照によりその全体を本明細書に組み入れる。チロシンキナーゼインヒビターに関連する化合物は、チロシンキナーゼインヒビターの効果を再現すること、例えば、関連化合物がチロシンキナーゼシグナル伝達経路の異なるメンバーに作用し、そのチロシンキナーゼのチロシンキナーゼインヒビターと同じであろう効果を産生することが当業者により理解されるであろう。本発明の実施形態の方法における使用のための適切なチロシンキナーゼインヒビター及び関連化合物の例は、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）、ＰＰ２、ＢＥＺ２３５、サラカチニブ、ゲフィチニブ（イレッサ）、スニチニブ（ステンチ；ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（タルセバ；ＯＳＩ−１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ  １０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ  ４３−９００６）、イマチニブ（グリベック；ＳＴＩ５７１）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（ザクティマ；ＺＤ６４７４）、ＭＫ−２２０６（８−［４−アミノシクロブチル）フェニル］−９−フェニル−１，２，４−トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン塩酸塩）、それらの誘導体、それらの類似体、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定しない。本発明における使用のための適切な追加のチロシンキナーゼインヒビター及び関連化合物は、例えば、米国特許公開第２００７／０２５４２９５号、米国特許第５，６１８，８２９号、第５，６３９，７５７号、第５，７２８，８６８号、第５，８０４，３９６号、第６，１００，２５４号、第６，１２７，３７４号、第６，２４５，７５９号、第６，３０６，８７４号、第６，３１３，１３８号、第６，３１６，４４４号、第６，３２９，３８０号、第６，３４４，４５９号、第６，４２０，３８２号、第６，４７９，５１２号、第６，４９８，１６５号、第６，５４４，９８８号、第６，５６２，８１８号、第６，５８６，４２３号、第６，５８６，４２４号、第６，７４０，６６５号、第６，７９４，３９３号、第６，８７５，７６７号、第６，９２７，２９３号、及び第６，９５８，３４０号に記載されており、それらはすべて参照により本明細書に組み入れる。一部の実施形態では、チロシンキナーゼインヒビターは、経口投与されており��少なくとも１つの第Ｉ相臨床試験、より好ましくは少なくとも１つの第ＩＩ相臨床試験、さらにより好ましくは少なくとも１つの第ＩＩＩ相臨床試験での対象となっており、最も好ましくは少なくとも１つの血液学的又は腫瘍学的適応症についてＦＤＡにより承認された小分子キナーゼインヒビターである。そのようなインヒビターの例は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＢＭＳ−５９９６２６（ＡＣ−４８０）、ネラチニブ、ＫＲＮ−６３３、ＣＥＰ−１１９８１、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ＡＺＭ−４７５２７１、ＣＰ−７２４７１４、ＴＡＫ−１６５、スニチニブ、バタラニブ、ＣＰ−５４７６３２、バンデタニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、タンドゥチニブ、ミドスタウリン、エンザスタウリン、ＡＥＥ−７８８、パゾパニブ、アキシチニブ、モタセニブ、ＯＳＩ−９３０、セジラニブ、ＫＲＮ−９５１、ドビチニブ、セリシクリブ、ＳＮＳ−０３２、ＰＤ−０３３２９９１、ＭＫＣ−Ｉ（Ｒｏ−３１７４５３；Ｒ−４４０）、ソラフェニブ、ＡＢＴ−８６９、ブリバニブ（ＢＭＳ−５８２６６４）、ＳＵ−１４８１３、テラチニブ、ＳＵ−６６６８、（ＴＳＵ−６８）、Ｌ−２１６４９、ＭＬＮ−８０５４、ＡＥＷ−５４１、及びＰＤ−０３２５９０１を含むが、これらに限定しない。
【０１５７】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、免疫療法薬剤との組み合わせにおいて使用する。本明細書で使用する用語「免疫療法薬剤」は、癌細胞に対する身体の免疫応答を間接的もしくは直接的に増強、刺激、もしくは増加する、及び／又は他の抗癌治療の副作用を減少させる化合物、組成物、又は処置を指す。免疫療法は、このように、癌細胞への免疫系の応答を直接的もしくは間接的に刺激又は増強する、及び／又は他の抗癌薬剤により起こされたであろう副作用を軽減する治療である。免疫療法はまた、当技術分野において、免疫学的治療、生物学的治療、生物学的応答調節治療、及び生物療法として言及される。当技術分野において公知の一般の免疫療法薬剤の例は、サイトカイン、癌ワクチン、モノクローナル抗体、及び非サイトカインアジュバントを含むが、これらに限定しない。あるいは、免疫療法的処置は、一定量の免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞・・・）を用いて対象に投与することからなる。免疫療法薬剤は非特異的である、即ち、免疫系を一般的にブーストし、人体が癌細胞の成長及び／又は伝播と戦う際により効果的になるか、あるいは、それらは特異的である、即ち、癌細胞自体を標的化することができ、免疫療法レジメンは非特異的及び特異的免疫療法薬剤の使用を組み合わせてもよい。非特異的免疫療法薬剤は、免疫系を刺激する、又は間接的に改善する物質である。非特異的免疫療法薬剤は、癌の処置のための主な治療として単独で、ならびに主な治療に加えて使用されており、その場合において、非特異的免疫療法薬剤は、他の治療（  例：癌ワクチン）の有効性を増強するためのアジュバントとして機能する。非特異的免疫療法薬剤は、この後者の状況においても機能し、他の治療の副作用、例えば、特定の化学療法剤により誘導される骨髄抑制を低下させることができる。非特異的免疫療法薬剤は、主要な免疫系細胞に作用し、二次応答（例えばサイトカイン及び免疫グロブリンの産生増加など）を起こすことができる。あるいは、薬剤はそれ自体がサイトカインを含むことができる。非特異的免疫療法薬剤は一般的に、サイトカイン又は非サイトカインアジュバントとして分類される。多くのサイトカインが、免疫系をブーストするように設計された一般的な非特異的免疫療法として、又は他の治療で提供されるアジュバントとして、癌の処置における適用が見出されている。適切なサイトカインは、インターフェロン、インターロイキン、及びコロニー刺激因子を含むが、これらに限定しない。本発明により熟慮されるインターフェロン（ＩＦＮ）は、一般的な型のＩＦＮ、ＩＦＮ−アルファ（ＩＦＮ−α）、ＩＦＮ−ベータ（ＩＦＮ−β）、及びＩＦＮ−ガンマ（ＩＦＮ−γ）を含む。ＩＦＮは、例えば、それらの成長を遅らせたり、より正常な挙動を伴う細胞中への発生を促進したり、及び／又はそれらの抗原の産生を増加させたりすることにより、癌細胞に直接的に作用し、このように、免疫系が癌細胞を認識して破壊することを簡単にする。ＩＦＮはまた、例えば、血管新生を遅くする、免疫系をブーストする、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、及びマクロファージを刺激することにより、癌細胞に間接的に作用することができる。組換えＩＦＮ−アルファ���、ロフェロン（Roche Pharmaceuticals）及びイントロンＡ（Schering Corporation）として商業的に入手可能である。本発明により熟慮されるインターロイキンは、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１１、及びＩＬ−１２を含む。商業的に入手可能な組換えインターロイキンの例は、Proleukin（登録商標）（ＩＬ−２；Chiron Corporation）及びNeumega（登録商標）（ＩＬ−１２；Wyeth Pharmaceuticals）を含む。Zymogenetics社（ワシントン州シアトル）は現在、組換え型のＩＬ−２１をテストしているが、これも本発明の組み合わせにおける使用について熟慮されている。本発明により熟慮されるコロニー刺激因子（ＣＳＦ）は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ又はフィルグラスチム）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ又はサルグラモスチム）、及びエリスロポエチン（エポエチンアルファ、ダルベポエチン）を含む。１つ又は複数の成長因子を用いた処置は、従来の化学療法を受けている対象において新たな血液細胞の生成を刺激するのに有用になりうる。したがって、ＣＳＦを用いた処置は、化学療法に関連付けられる副作用を減少する際に有用でありうるが、より高い用量の化学療法剤を使用することを可能にする。種々の組換えコロニー刺激因子が商業的に入手可能であり、例えば、Neuupogen（登録商標）（Ｇ−ＣＳＦ；Amgen）、Neurasta（ペグフィルグラスチム；Amgen）、Leukine（ＧＭ−ＣＳＦ；Berlex）、Procrit（エリスロポエチン；Ortho Biotech）、Epogen（エリスロポエチン；Amgen）、Arnesp（エリトロポエチン）である。本発明の組み合わせ組成物及び組み合わせ投与方法はまた、「全細胞」及び「養子」免疫療法の方法を含みうる。例えば、そのような方法は、免疫系細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、例えばＣＣ２＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞など（例えば、腫瘍特異的抗原及び／又は遺伝的増強を伴い増殖されたＴ細胞）、抗体発現Ｂ細胞又は他の抗体産生もしくは提示細胞、樹状細胞（例、ＤＣ増殖薬剤、例えばＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＦｌｔ３−Ｌなどと培養された樹状細胞、ならびに／あるいは腫瘍関連抗原負荷樹状細胞）、抗腫瘍ＮＫ細胞、いわゆるハイブリッド細胞、又はそれらの組み合わせの注入又は再注入を含みうる。細胞溶解物もそのような方法及び組成物において有用でありうる。そのような態様において有用でありうる臨床試験における細胞性「ワクチン」は、Canvaxin（商標）、ＡＰＣ−８０１５（Dendreon）、ＨＳＰＰＣ−９６（Antigenics）、及びMelacine（登録商標）細胞溶解物を含む。癌細胞から排出される抗原、及びそれらの混合物（例えば、Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol. 7, 1882-1887, July 2001を参照のこと）は、場合によりアジュバント（例えばミョウバンなど）と混合され、そのような方法及び組み合わせ組成物における成分でもありうる。
【０１５８】
特に、本発明の抗体は、特許出願ＷＯ２０１２０４７７２４に記載されている抗体Ｈａ２２−２（Seattle Genetics）のような別の抗体との組み合わせにおいて使用してもよい。
【０１５９】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、放射線療法との組み合わせにおいて使用する。放射線療法は、患者への放射線又は放射性医薬品の関連投与を含みうる。放射線の供給源は、処置中の患者の外部又は内部のいずれでもよい（放射線処置は、例えば、外部ビーム放射線治療（ＥＢＲＴ）又は近接照射療法（ＢＴ）の形態でありうる）。そのような方法を実行する際に使用してもよい放射性元素は、例えば、ラジウム、セシウム−１３７、イリジウム−１９２、アメリシウム−２４１、金−１９８、コバルト−５７、銅−６７、テクネチウム−９９、ヨウ化物−１２３、ヨウ化物−１３１、及びインジウム−１１１を含む。
【０１６０】
一部の実施形態では、本発明の抗体は、同時刺激分子について特異的である抗体との組み合わせにおいて使用する。同時刺激分子について特異的である抗体の例は、抗ＣＴＬＡ４抗体（例、イピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＴＩＭＰ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、又は抗Ｂ７Ｈ６抗体を含むが、これらに限定しない。
【０１６１】
一部の実施形態では、第２の薬剤は、ＡＤＣＣを介して、第２の薬剤が結合する抗原を発現する細胞の死を誘導する薬剤である。一部の実施形態では、薬剤は抗体（例、ＩｇＧ１又はＩｇＧ３アイソタイプ）であり、その作用様式は、抗体が結合する細胞に向けられたＡＤＣＣの誘導を含む。ＮＫ細胞はＡＤＣＣを誘導する際に重要な役割を有し、ＮＫ細胞の反応性の増加は、そのような第２の薬剤の使用を通じて標的細胞に向けることができる。一部の実施形態では、第２の薬剤は、細胞表面抗原（例、膜抗原）について特異的な抗体である。一部の実施形態では、第２の抗体は、上に記載する腫瘍抗原（例、腫瘍細胞により特異的に発現される分子）、例えばＣＤ２０、ＣＤ５２、ＥｒｂＢ２（又はＨＥＲ２／Ｎｅｕ）、ＣＤ３３、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＭＵＣ−１、ＣＥＡ、ＫＤＲ、αＶβ３など、特にリンパ腫抗原（例、ＣＤ２０）について特異的である。したがって、本発明は、腫瘍抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の抗腫瘍効果を増強するための方法も提供する。本発明の方法では、ＡＤＣＣ機能は、１つ又は複数の腫瘍抗原に対して向けられた抗体及び本発明の抗体の連続投与により、特異的に増大され、次に標的細胞の死滅が増強される。
【０１６２】
したがって、さらなる目的は、抗体を対象に投与すること、及び本発明の抗体を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において抗体のＮＫ細胞抗体依存的な細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を増強する方法に関する。
【０１６３】
本発明のさらなる目的は、癌細胞抗原について選択的な一次抗体を対象に投与すること、及び本発明の抗体を対象に投与することを含む、それを必要とする対象において癌を処置する方法に関する。
【０１６４】
多くの抗体が現在、癌の処置のために臨床的に使用されており、他は臨床開発の種々の段階にある。本発明の方法のための目的の抗体はＡＤＣＣを通じて作用し、典型的には腫瘍細胞について選択的であるが、当業者は一部の臨床的に有用な抗体が非腫瘍細胞に作用することを認識するであろう（例、ＣＤ２０）。Ｂ細胞悪性腫瘍の処置のための多くの抗原及び対応するモノクローナル抗体がある。１つのポピュラーな標的抗原はＣＤ２０であり、これはＢ細胞悪性腫瘍に見出される。リツキシマブは、ＣＤ２０抗原に向けられたキメラ非結合モノクローナル抗体である。ＣＤ２０は、Ｂ細胞の活性化、増殖、及び分化において重要な機能的役割を有する。ＣＤ５２抗原は、慢性リンパ性白血病の処置のために適応されるモノクローナル抗体アレムツズマブにより標的化される。ＣＤ２２は多くの抗体により標的化され、化学療法抵抗性の有毛細胞白血病において毒素と組み合わせた有効性が最近実証されている。ＣＤ２０を標的化するモノクローナル抗体はまた、トシツモマブ及びイブリツモマブを含む。本発明の方法において有用なモノクローナル抗体は、固形腫瘍において使用されてきたが、エドコロマブ及びトラスツズマブ（ハーセプチン）を含むが、これらに限定しない。エドコロマブは、結腸癌及び直腸癌において見られる１７−１  Ａ抗原を標的化し、これらの適応症について欧州における使用のために承認されている。その抗腫瘍効果は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び抗イディオタイプネットワークの誘導を通じて媒介される。トラスツズマブはＨＥＲ−２／ｎｅｕ抗原を標的化する。この抗原は、乳癌の２５%〜３５%で見られる。トラスツズマブは種々の方法で機能すると考えられている：ＨＥＲ−２受容体発現の下方調節、ＨＥＲ−２タンパク質を過剰発現するヒト腫瘍細胞の増殖の阻害、ＨＥＲ−２タンパク質を過剰発現する腫瘍細胞に対する免疫動員及びＡＤＣＣの増強、及び血管新生因子の下方調節。アレムツズマブ（Campath）は、慢性リンパ性白血病；結腸癌及び肺癌の処置において使用される；ゲムツズマブ（Mylotarg）は、急性骨髄性白血病の処置における使用が見出される；イブリツモマブ（ゼバリン）は、非ホジキンリンパ腫の処置における使用が見出される；パニツムマブ（Vectibix）は、結腸癌の処置における使用が見出される。セツキシマブ（アービタックス）はまた、本発明の方法における使用について興味深い。この抗体はＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に結合し、固形腫瘍（結腸癌及び頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）を含む）の処置において使用されてきた。
【０１６５】
医薬組成物
典型的には、本発明の抗体は、医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物の形態で対象に投与する。これらの組成物中で使用されうる医薬的に可能な担体は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質（例えばヒト血清アルブミンなど）、緩衝物質（例えばリン酸塩など）、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物性脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩、又は電解質（例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩など）、コロイドシリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロースベースの物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリレート、ワックス、ポリエチレン−ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及び羊毛脂肪を含むが、これらに限定しない。患者への投与における使用のために、組成物は患者への投与用に製剤化する。本発明の組成物は、経口、非経口、吸入噴霧、局所、直腸、経鼻、頬側、経膣、又は埋め込み貯蔵部により投与してもよい。本明細書で使用するのは、皮下、静脈内、筋肉内、関節内、滑液内、胸骨内、くも膜下腔内、肝内、病巣内及び頭蓋内注射又は注入技術を含む。本発明の滅菌注射剤型の組成物は、水性又は油性懸濁剤でよい。これらの懸濁剤は、適当な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して、当技術分野において公知の技術に従って製剤化してもよい。滅菌注射用製剤はまた、毒性のない非経口の許容可能な希釈剤又は溶媒、例えば、１，３−ブタネジオール中の溶液としての滅菌注射用溶液又は懸濁剤でもよい。用いてもよい許容可能な媒体及び溶媒のなかには、水、リンガー溶液、及び等張の塩化ナトリウム溶液がある。また、滅菌固定油は従来、溶媒又は懸濁媒体として用いられる。この目的のために、任意の無菌性の固定油を用いてもよく、合成モノ又はジグリセリドを含む。脂肪酸（例えばオレイン酸及びそのグリセリド誘導体など）は、注入剤の調製において有用であり、天然の医薬的に許容可能な油（例えばオリーブ油又はヒマシ油、特にそれらのポリオキシエチル化型など）と同様である。これらの油剤又は懸濁剤はまた、長鎖アルコール希釈剤もしくは分散剤（例えばカルボキシメチルセルロースなど）又は医薬的に許容可能な剤形（乳剤及び懸濁剤を含む）の製剤化において一般に使用される同様の分散剤を含みうる。他の一般に使用される界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎｓ、Ｓｐａｎｓ、及び他の乳化剤など）、又は医薬的に許容可能な固形、液体、又は他の剤形の製造において一般に使用される生物学的利用率の賦活薬は、製剤化の目的でも使用してもよい。本発明の組成物は、経口で許容可能な任意の剤形（カプセル、錠剤、水性懸濁液、又は溶液などを含むが、これらに限定しない）で経口投与できる。経口使用のための錠剤の場合において、一般に使用される担体はラクトース及びコーンスターチを含む。潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウムなど）も典型的に加えられる。カプセル形状での経口投与のために、有用な希釈剤は、例えばラクトースを含む。水性懸濁剤が経口使用のために要求される場合、活性成分を乳化剤及び懸濁剤と組み合わせる。望ましい場合、特定の甘味剤、香味剤、又は着色剤も加えてもよい。あるいは、本発明の組成物は、直腸投与のために坐剤の形状で投与してもよい。これらは、室温では固体であるが、しかし、直腸温で液体であり、従って、直腸において溶けて薬物を放出する適切な非刺激性賦形剤と薬剤とを混合させることにより調製することができる。そのような材料は、カカオ脂、蜜蝋、及びポリエチレングリコールを含む。本発明の組成物はまた、特に処置の標的に、眼、皮膚、又は下部腸管の疾患を含む、局所適用により容易に接近可能な領域又は器官が含まれる場合、局所投与してもよい。適当な局所製剤は、これらの領域又は器官の各々について容易に調製される。局所適用のために、組成物を、１又は複数の担体中に懸濁又は溶解させた活性成分を含む適切な軟膏剤中に製剤化してもよい。本発明の化合物の局所投与のための担体は、鉱物油、液体ワセリン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン化合物、乳化ワックス、及び水を含むが、これらに限定しない。あるいは、組成物を、１又は複数の医薬的に許容可能な担体中に懸濁又は溶解させた活性成分を含む適切なローション又はクリーム中に製剤化することができる。適切な担体は、鉱物油、モノステアリン酸ソルビタン、ポリソルベート６０、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、２−オクチルドデカノール、ベンジルアルコール、及び水を含むが、これらに限定しない。下部腸管のための局所適用は、直腸坐剤製剤（上を参照のこと）中又は適切な浣腸製剤中でもたらすことができる。貼付剤を使用してもよい。本発明の組成物はまた、鼻エアロゾル又は吸入により投与してもよい。そのような組成物は、医薬製剤化の技術分野において周知の技術に従って調製され、ベンジルアルコール又は他の適切な保存剤、生物学的利用率を増強させるための吸収促進剤、フルオロカーボン、及び／又は他の従来の可溶化剤もしくは分散剤を用いて、生理食塩水中の溶液として調製してもよい。例えば、本発明の医薬組成物中に存在する抗体は、１００mg（１０mL）又は５００mg（５０mL）の使い捨てバイアルのいずれかにおいて１０mg/mLの濃度で供給することができる。この産物は、静脈内投与用に９．０mg/mL塩化ナトリウム、７．３５mg/mLクエン酸ナトリウム二水和物、０．７mg/mLポリソルベート８０、及び注射用滅菌水を用いて製剤化する。ｐＨは６．５に調整する。本発明の医薬組成物中の抗体についての例示的な適切な投与量の範囲は、約１mg/m2から５００mg/m2の間でありうる。しかし、これらのスケジュールは例示であり、臨床試験において決定しなければならない医薬組成物中の特定の抗体の親和性及び忍容性を考慮して最適なスケジュール及びレジメンを適応することができることが理解されるであろう。注射用（例、筋肉内、静脈内）の本発明の医薬組成物は、滅菌緩衝水（例、筋肉内では１ml）、及び約１ng〜約１００mgの間（例、約５０ng〜約３０mg、又はより好ましくは約５mg〜約２５mg）の本発明の抗ミオシン１８Ａ抗体を含むように調製することができうる。
【０１６６】
特定の実施形態では、リポソーム及び／又はナノ粒子の使用を宿主細胞中への抗体の導入のために熟慮する。リポソーム及び／又はナノ粒子の形成及び使用は当業者に公知である。
【０１６７】
ナノカプセルは一般的に、化合物を安定で再現可能な方法で封入することができる。細胞内ポリマーの過負荷に起因する副作用を回避するために、そのような超微粒子（約０．１μｍのサイズ）は一般的に、インビボで分解されることができるポリマーを使用して設計される。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子は、本発明における使用のために熟慮されており、そのような粒子は簡単に作製されうる。
【０１６８】
リポソームは、水性媒質中に分散したリン脂質から形成され、自発的に多層の同心二重層小胞（多層小胞（ＭＬＶ）とも呼ぶ）を形成する。ＭＬＶは一般的に２５nm〜４μmの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理によって、コア中に水溶液を含む、２００〜５００Aの範囲の直径を伴う小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成がもたらされる。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度、及び二価カチオンの存在に依存する。
【０１６９】
本発明を、以下の図面及び実施例によりさらに例証する。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するものとして、任意の方法で解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】１４Ａ５．２モノクローナル抗体を使用したネクチン−４発現のウエスタンブロット分析。
【図２】１４Ａ５．２エピトープの特徴付け。競合分析を、示すように、異なるモノクローナル抗体を使用してＥＬＩＳＡにより実行した。ネクチン−４への１４Ａ５．２−ＨＲＰ抗体の結合は、１４Ａ５．２自体及びｍａｂ１により阻害され、ｍａｂ２及びＨａ２２−２により阻害されない。
【図３】ＳＵＭ１９０細胞上のｃｈ１４Ａ５．２及びＨａ２２−２により誘導された細胞傷害性。この実験では、ＡＤＣが、示された濃度の抗体及びタンパク質−Ｇ−ＤＭ１とのインキュベーションにより模倣される。細胞成長を５日目に測定した。１４Ａ５．２及びＨａ２２．２は、同様のＩＣ５０を伴い細胞傷害性を誘導した。効率は、ハーセプチンと比較して高い。
【図４Ａ】ＳＵＭ１９０細胞でのｃｈ１４Ａ５．２−ｖｃ−ＭＭＡＥ及びＨａ２２−２−ｖｃ−ＭＭＡＥにより誘導された細胞毒性。ＩＣ５０は両方のＡＤＣ（５ng/ml）について類似していた。
【図４Ｂ】ＳＵＭ１９０細胞でのｃｈ１４Ａ５．２−ｖｃ−ＭＭＡＥ及びＨａ２２−２−ｖｃ−ＭＭＡＥにより誘導された細胞毒性。ＩＣ５０は両方のＡＤＣ（５ng/ml）について類似していた。
【図５】腫瘍成長に対するｃｈＮ４１ｍａｂ−ｖｃ−ＭＭＡＥ、Ｎ４１ｍａｂ−ｖｃ−ＭＭＡＥ、ｃｈ１４Ａ５．２−ｖｃ−ＭＭＡＥ、及びＨａ２２−２−ｖｃ−ＭＭＡＥ  ＡＤＣの効果。ＮＳＧマウスにおいて腫瘍として同所的に成長したＳＵＭ１９０細胞は、異なるＡＤＣを用いた単一処置（全ての抗体について６日間隔で２．５mg/kg（交差）を用いた２回静脈内注射）後に退行を示す。
【図６Ａ】Ａ．示した抗体濃度により誘導されたＡＤＣＣ。発光は、標的細胞のアポトーシスに対応する。Ｂ．ＡＤＣＣ媒介性の溶解効率は、テストした各々の抗体についてのアポトーシスの最大レベルを表す。
【図６Ｂ】Ａ．示した抗体濃度により誘導されたＡＤＣＣ。発光は、標的細胞のアポトーシスに対応する。Ｂ．ＡＤＣＣ媒介性の溶解効率は、テストした各々の抗体についてのアポトーシスの最大レベルを表す。
【０１７１】
実施例：
材料＆方法
ウエスタンブロット
ネクチン−４の発現は、１００mmディッシュ中のＭＤＡ−ＭＢ−２３１  ｗｔ又はネクチン４トランスフェクト細胞において分析し、氷冷ＰＢＳで３回洗浄し、５０mM  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ  ７．５）、１５０mM  ＮａＣｌ、１．５mM  ＭｇＣｌ２、１mM  ＥＧＴＡ、１%Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び１０%グリセロールを含む７５０μlの氷冷溶解緩衝液中で３０分間にわたり再懸濁した。プロテアーゼインヒビター混合物を推奨の通りに加えた（Roche Diagnostics）。溶解物をＳＤＳサンプル緩衝液（６０mM  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ６．７、３%  ＳＤＳ、２%（ｖ／ｖ）２−メルカプトエタノール、及び５%グリセロール）中で加熱し、８%ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ポリフッ化ビニリデン膜（Immobilon-P、Millipore、米国マサチューセッツ州ボストン）に半乾燥で移し、１μg/ml  １４Ａ５．２モノクローナル抗体を用いてプローブした。可視化をＥＣＬ（Pierce）で行った。
【０１７２】
競合アッセイ
Ｍａｂ競合アッセイをＥＬＩＳＡにより実施した。９６ウェルトレイを、示すように、＋４℃で一晩ネクチン４ＶＣＣ−Ｆｃを用いてコーティングした。ペルオキシダーゼ結合１４Ａ５．２−ＨＲＰ  ｍａｂの結合を、変動濃度の４つの異なる抗ネクチン−４  ｍａｂ（ｍａｂ１、ｍａｂ２、ｍａｂ３、及びＨａ２２−２  ｍａｂ）の存在において測定した。
【０１７３】
ＳＵＭ１９０細胞でのｃｈ１４Ａ５．２及びＨａ２２−２（アステラス社のＡＳＧ−２２ＭＥとしても公知である）により誘導される細胞傷害性。
ヒト化抗体の効果を分析するために、ＳＵＭ１９０細胞を、０．６５nMタンパク質−Ｇ−ＤＭ１の存在において、示した濃度の抗体とインキュベートした。細胞成長を、製造者（Biosource、米国カリフォルニア州）により推奨されるａｌａｍａｒＢｌｕｅ染色手順を使用して測定した。テストには、蛍光酸化−還元指示薬が組み入れられている。蛍光強度は細胞の代謝低下に比例している。実験を、９６ウェルプレート中で０日目に３０００個細胞／ウェルをインキュベートすることにより行った。ａｌａｍａｒＢｌｕｅを５日目に、３７℃で２時間にわたり１／１０容量のａｌａｍａｒＢｌｕｅ溶液をインキュベートすることにより測定し、５９５nmで読み取った（FLUOstar Optima、BMG Labtech）。
【０１７４】
ＡＤＣの産生
ＡＤＣはConcortis（米国カリフォルニア州サンディエゴ）により産生された。複合体は、精製されたｃｈ１４Ａ５．２モノクローナル抗体から産生した。使用したリンカーは、モノメチルアウリスタチン−Ｅ（ＭＭＡＥ）に共有結合的に結合されたＭＣ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−ＰＡＢ−ＰＮＰ（マレイミドカプロイル−Ｌ−バリン−Ｌ−シトルリン−ｐ−アミノベンジルアルコールｐ−ニトロフェニルカーボネート）であった。この切断可能なリンカーを選択した。なぜなら、強力なバイスタンダー死滅を誘導したためである。薬物と抗体の比率は約４であった。ＡＤＣの効果を分析するために、ＳＵＭ１９０細胞を、示した濃度のＡＤＣとインキュベートした。細胞成長を、製造者（Biosource、米国カリフォルニア州）により推奨されるａｌａｍａｒＢｌｕｅ染色手順を使用して測定した。テストには、蛍光酸化−還元指示薬が組み入れられている。蛍光強度は細胞の代謝低下に比例している。実験を、９６ウェルプレート中で０日目に３０００個細胞／ウェルをインキュベートすることにより行った。ａｌａｍａｒＢｌｕｅを５日目に、３７℃で２時間にわたり１／１０容量のａｌａｍａｒＢｌｕｅ溶液をインキュベートすることにより測定し、５９５nmで読み取った（FLUOstar Optima、BMG Labtech）。
【０１７５】
動物モデル
全ての実験は、動物の取り扱いに関するフランスのガイドラインと一致して実施し、地元の倫理委員会により承認された（Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ  ｎ°０１１５２−０１）。ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃｎｕｌｌマウス（ＮＳＧ）は、C.Rivers博士（英国マーゲイト）から得た。マウスを滅菌条件下で飼育し、滅菌食品及び水を自由に提供し、１２時間の明サイクル及び１２時間の暗サイクルで維持した。ＳＵＭ１９０細胞を、５０%フェノールレッド不含Matrigel（Becton Dickinson Bioscience）中に懸濁した（０．５×１０６）を用いて乳房脂肪パッド中に接種した。
【０１７６】
腫瘍成長を、デジタルキャリパーを用いて測定し、腫瘍容積（長さ×幅２×π／６）を算出することによりモニターした。全ての動物は、各々の群の平均腫瘍容積が１００〜２００mm3になるように、処置群に無作為に割り当てた。ＡＤＣを用いた処置を、それぞれの実験で言及したように実施した。
【０１７７】
抗体依存的な細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
ＳＵＭ１９０標的細胞（１０Ｅ５細胞）を９６ウェルの白色マイクロプレートに一晩播種した。ＮＫ細胞を、製造者により推奨されるようにEasySep（商標）キットを使用して健常ドナーから精製した。１０Ｅ６細胞（比率Ｅ：Ｔ＝１０）を、示した濃度の抗体と４時間にわたりインキュベートした。カスパーゼ−３／−７活性化は、PromegaからのCaspase-Glo発光キットを使用して測定した。発光を、３０分間のインキュベーション後に測定した（FLUOstar Optima、BMG Labtech）。
【０１７８】
結果
本明細書で提示する１４Ａ５．２モノクローナル抗体は、特異性、エピトープマッピング、及び抗腫瘍活性などの厳しい基準に従って一連の抗ネクチン−４モノクローナル抗体の選択からもたらされる。これは、クリニックにおける使用、即ち、最小限の有害作用を伴い抗腫瘍活性を最適化することに関して最も重要である。
【０１７９】
ウエスタンブロット
一連の抗ネクチン−４モノクローナル抗体のうち、１４Ａ５．２によって、ヌルベクターでトランスフェクトされた細胞ではなく、トランスフェク細胞でユニークな７２ｋＤａバンドが検出される（図１）。このｍ．ｗ．は、以前に記載するように、ネクチン−４単量体に対応する（Reymond et al. JBC, 2001）。ＭＤＡＭＢ２３１  ｗｔ細胞はネクチン−１、ネクチン−２、及びネクチン−３を発現した。これは、１４Ａ５．２がネクチン−４について高度に特異的であり、他のネクチンメンバー又は他の無関係なタンパク質を検出しないことを示す。同様の結果がＦＡＣＳ分析により得られた。
【０１８０】
競合アッセイ
一連の抗ネクチン−４モノクローナル抗体のうち、本発明者らは、Ｈａ２２−２とは異なるエピトープに結合する抗体についてスクリーニングした。１４Ａ５．２エピトープは、ネクチン−４のＩｇＶ遠位ドメイン中のＨａ２２−２について異なる。図２に見られるように、Ｈａ２２−２は１４Ａ５．２結合について競合しなかった。Ｍａｂ１は抗ネクチン４陽性対照である（１４Ａ５．２結合について競合する）。Ｍａｂ２は抗ネクチン４陰性対照である（１４Ａ５．２結合について競合しなかった）。
【０１８１】
一連の抗ネクチン−４モノクローナル抗体のうち、本発明者らは、強い結合親和性を伴うモノクローナル抗体についてスクリーニングした。１４Ａ５．２のキメラ形態の結合をＨａ２２−２と比較し、ＦＡＣＳ分析により同様の親和性を示した（２０ng/ml）（データは示さず）。
【０１８２】
ＳＵＭ１９０細胞上のｃｈ１４Ａ５．２及びＨａ２２．２により誘導される細胞傷害性
この結果（図３）は、プロテインＧ−ＤＭ１の存在において、ｃｈ１４Ａ５．２（ＩＣ５０＝６ng/ml）及びＨａ２２．２（ＩＣ５０＝５ng/ml）の同様の細胞傷害特性を示す。同じ条件において、本発明者らは、トラスツズマブについてのＩＣ５０が１００ng/mlであることを記述している。
【０１８３】
ＡＤＣの産生
この結果（図４）は、ｃｈ１４Ａ５．２−ＭＭＡＥ及びＨａ２２．２−ＭＭＡＥの同様の細胞傷害特性を示す。ＩＣ５０は５ng/mlである。
【０１８４】
インビボ実験
本発明者らのＡＤＣの活性を、ＳＵＭ１９０細胞株を異種移植した免疫不全ＮＳＧマウスでテストした。マウスを、静脈内用量のｃｈＮ４１−ｖｃ−ＭＭＡＥ、ｃｈ１４Ａ５．２−ｖｃ−ＭＭＡＥ、及びＨａ２２．２−ｖｃ−ＭＭＡＥ抗体を用いて２回連続で処理した（図５）。ＣＤ３０−ｖｃ−ＭＭＡＥを無関係な対照として使用した。これらの用量はマウスについて毒性はなかった。両方のＡＤＣは、ｃｈＮ４１（本発明者の別の抗ネクチン−４抗体）と比較し、迅速（４日間）で顕著な腫瘍退縮を示し、ｃｈ１４Ａ５．２の優れた効果を伴った（期間は最大２０日間続いた）。
【０１８５】
さらに、図５中の結果は、キメラ１４Ａ５．２抗体（ｃｈ１４Ａ５．２−ｖｃ−ＭＭＡＥ）が、Ｆｃがマウスモデルにおいて機能的である完全なマウス抗体Ｎ４１（Ｎ４１−ｖｃ−ＭＭＡＥ）と同じ有効性を有することを示した（免疫系の活性化）。このように、ＮＧＳ（使用したマウスモデル）においてでさえ、食作用又はオプソニン作用が依然として可能である。本発明者らは、１４Ａ５．２がマウスモデルにおいて機能的なＦｃを有する場合（ｃｈ１４Ａ５．２とは反対）、この抗体はＮ４１抗体よりも良好な有効性を有しうると結論付けることができる。
【０１８６】
インビボでの原発部位からの転移進行の阻害
マウスに、ネクチン−４を発現するルシフェラーゼ陽性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を同所異種移植する。原発腫瘍の容量を３５日後に測定する。マウスを、毎週１０mg/kgのネイキッド１４Ａ５．２  ｍａｂを用いて静脈内処置する。殺したマウスの肺及び肝臓を生物発光により分析する。定量化は、肺について及び肝臓について示す。ＭＭＡＥに結合された２つの連続した静脈内用量の１４Ａ５．２  ｍａｂを用いて同所異種移植の処置によって、３５日間にわたる発光分析により観察される、全ての転移病変の迅速な低下及び消失が誘導される（データは示さず）。
【０１８７】
ＡＤＣＣアッセイ
１４Ａ５．２抗体を含む異なる抗体のＡＤＣＣ活性を実施した。１４Ａ５．２のＡＤＣＣ活性はＮ４１抗体と同様であったが、しかし、ＩＣ５０に関してＨａ２２より４倍良好であった（図６Ａ）。１４Ａ５．２及びＮ４１抗体の溶解効率は、Ｈａ２２より２倍良好であった（図６Ｂ）。トラスツズマブ／ハーセプチン及びリツキシマブは、それぞれ陽性対照及び陰性対照として使用した。
【０１８８】
結論：
実現した異なるテストによって、抗体１４Ａ５．２はＡＤＣにおいてＮ４１よりも良好であり、ＡＤＣＣにおいてＨａ２２よりも良好であることが示された。１４Ａ５．２抗体は、このように、テストした最良の抗体である（表１）。
【表１】
2020510432.tif 000004
【０１８９】
参考文献：
本願を通して、種々の参考文献によって、本発明が関係する最新技術が記載されている。これらの参考文献の開示を、参照により本開示中に組み入れる。
【図１】
2020510432.tif 000005
【図２】
2020510432.tif 000006
【図３】
2020510432.tif 000007
【図４Ａ】
2020510432.tif 000008
【図４Ｂ】
2020510432.tif 000009
【図５】
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【図６Ａ】
2020510432.tif 000011
【図６Ｂ】
2020510432.tif 000012
【配列表】
2020510432000001.app
【国際調査報告】
2020510432.tif 000013
2020510432.tif 000014
2020510432.tif 000015
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