(57)【要約】  本開示は、生体分子を検出するためのセンサアレイ及びその使用方法を提供する。一部の実施形態では、センサアレイは対象の疾病状態を決定することが可能である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のセンサ素子を備えるセンサアレイであって、
前記複数のセンサ素子は、少なくとも１つの物理化学的性質が互いに異なっており、
前記複数のセンサ素子は、少なくとも２つのセンサ素子を備え、
各前記センサ素子は、生体分子コロナシグネチャーを生成するためにサンプル中の複数の生体分子と結合可能であり、
各前記センサ素子は、他の前記センサ素子とは異なる生体分子コロナシグネチャーを有する
ことを特徴とするセンサアレイ。
【請求項２】
前記複数のセンサ素子は、前記サンプルと接触したときに複数の生体分子コロナシグネチャーを生成するよう構成され、
前記複数の生体分子コロナシグネチャーの組み合わせにより、前記サンプルの生体分子フィンガープリントが生成される
ことを特徴とする請求項１に記載のセンサアレイ。
【請求項３】
前記生体分子コロナシグネチャーは、少なくとも１つのタンパク質、少なくとも１つのポリペプチド、少なくとも１つの脂質、少なくとも１つのメタボローム、少なくとも１つのオリゴヌクレオチド又はこれらの組み合わせを備えることを特徴とする請求項１又は２に記載のセンサアレイ。
【請求項４】
前記センサアレイが前記サンプルと接触したときに、前記第１センサ素子は第１生体分子コロナを生成するよう構成され、前記第２センサ素子は第２生体分子コロナを生成するよう構成されたことを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項５】
前記少なくとも１つの物理化学的性質は、組成、サイズ、表面電荷、疎水性、親水性、表面機能性、表面トポグラフィー及び形状からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１〜４の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項６】
前記センサアレイは基板をさらに備えることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項７】
前記センサ素子は前記基板に共有結合されたことを特徴とする請求項６に記載のセンサアレイ。
【請求項８】
前記センサ素子は前記基板に非共有結合されたことを特徴とする請求項６に記載のセンサアレイ。
【請求項９】
前記基板は前記複数のセンサ素子に異なるパターンで結合することを特徴とする請求項６〜８の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１０】
前記複数のセンサ素子は複数の粒子であることを特徴とする請求項１〜９の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１１】
前記複数のセンサ素子は、基板上に固定された複数の粒子であることを特徴とする請求項１〜１０の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１２】
前記センサ素子は、有機粒子、無機粒子又はこれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１〜１１の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１３】
前記センサ素子は粒子であり、
前記粒子は、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、リポソーム、酸化鉄、グラフェン、シリカ、タンパク質ベース粒子、ポリスチレン、銀粒子、金粒子、粒子ドット及びこれらの組み合わせからなるグループから選択される
ことを特徴とする請求項１〜１２の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１４】
前記粒子は、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）−ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＣＨＯＬ（ＤＯＰＣ−コレステロール）及びこれらの組み合わせからなるグループから選択されるリポソームであることを特徴とする請求項１３に記載のセンサアレイ。
【請求項１５】
前記複数のセンサ素子は、鋳造技術によって作成された異なる形状を有する複数の半粒子を備えることを特徴とする請求項１〜１２の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１６】
前記複数の半粒子は、球、棒、立方体及びこれらの組み合わせからなるグループから選択される形状を有することを特徴とする請求項１５に記載のセンサアレイ。
【請求項１７】
前記複数のセンサ素子は、３Ｄプリンティングにより作成された異なる物理化学的性質（例えば球、棒及び立方体）を有する複数の半粒子を備えることを特徴とする請求項１〜１２の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１８】
前記センサアレイは、少なくとも２個から少なくとも１００個のセンサ素子を備えることを特徴とする請求項１〜１７の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１９】
前記生体分子フィンガープリントは疾病又は障害に関連していることを特徴とする請求項２〜１８の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項２０】
前記疾病又は障害は、がん、心血管疾患、内分泌障害、炎症性疾患又は神経性疾患であることを特徴とする請求項１９に記載のセンサアレイ。
【請求項２１】
前記疾病は、肺がん、すい臓がん、骨髄腫、骨髄性白血病、髄膜腫、神経膠芽腫、乳がん、食道扁平上皮がん、胃がん、前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、甲状腺がん、神経内分泌腫瘍からなるグループから選択されるがんであることを特徴とする請求項２０に記載のセンサアレイ。
【請求項２２】
対象における疾病状態を検出する方法であって、
（ａ）前記対象からサンプルを得る工程と、
（ｂ）請求項１〜２１の何れか１項に記載のセンサアレイと前記サンプルとを接触させる工程と、
（ｃ）前記サンプルと関連する生体分子フィンガープリントを決定する工程と、を有し、
前記生体分子フィンガープリントは、前記対象の疾病状態を区別する
ことを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記疾病状態は、疾病又は障害のない状態、疾病又は障害の前駆状態、及び疾病又は障害を有する状態のなかから選択されることを特徴とする請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記工程（ｃ）は、前記サンプルの前記生体分子フィンガープリントを生成するために、前記複数のセンサ素子に関連する前記複数の生体分子コロナの合成組成を決定する工程を有することを特徴とする請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記工程（ｃ）は、
各センサ素子に関連する生体分子コロナシグネチャーを分析する工程と、
前記サンプルに関連する前記生体分子フィンガープリントを生成するために、前記複数の生体分子コロナシグネチャーを組み合わせる工程と、を有する
ことを特徴とする請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記工程（ｃ）は、
各生体分子コロナの前記複数の生体分子を各センサ素子から分離する工程と、
前記生体分子フィンガープリントを決定するために前記生体分子コロナの前記生体分子組成を決定するために、前記複数の生体分子を分析する工程と、を有する
ことを特徴とする請求項２２〜２５の何れか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の生体分子を分析することが、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、質量分析法、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）、円偏光二色性、ラマン分光法及びこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする請求項２２〜２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記生体分子フィンガープリントは、疾病又は障害のステージに関連する疾病状態に関連することを特徴とする請求項２２〜２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾病又は障害は、がん、心血管疾患、内分泌障害、炎症性疾患及び神経性疾患からなるグループから選択されることを特徴とする請求項２２〜２８の何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記疾病状態はがんと関連することを特徴とする請求項２２〜２９の何れか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記がんは、肺がん、すい臓がん、骨髄腫、骨髄性白血病、髄膜腫、神経膠芽腫、乳がん、食道扁平上皮がん、胃がん、前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、甲状腺がん及び神経内分泌腫瘍からなるグループから選択されることを特徴とする請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記方法は、疾病又は障害の初期ステージに関連する前記疾病状態を検出することを特徴とする請求項２２〜３１の何れか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記方法は、
前記サンプルと関連する疾病状態を決定するために、前記サンプルの前記生体分子フィンガープリントと、複数の疾病状態と関連する生体分子フィンガープリントのパネルと、を比較する工程をさらに有する
ことを特徴とする請求項２２〜３２の何れか１項に記載の方法。
【請求項３４】
少なくとも疾病状態又は少なくとも１つの疾病若しくは障害と関連する生体分子フィンガープリントを決定する方法であって、
（ａ）前記疾病状態又は前記少なくとも１つの疾病若しくは障害を有すると診断された少なくとも２つの対象からサンプルを得る工程と、
（ｂ）請求項１〜２１の何れか１項に記載の前記センサアレイと各サンプルとを接触させる工程と、
（ｃ）前記疾病状態又は少なくとも１つの疾病若しくは障害関連する、前記センサアレイについての生体分子フィンガープリントを決定する工程と、を有する
ことを特徴とする方法。
【請求項３５】
前記工程（ｃ）が、各センサ素子の前記生体分子コロナの前記組成を検出することをさらに有し、
前記異なるセンサ素子間の各生体分子コロナの前記組成の組み合わせにより、前記サンプルと関連する前記生体分子フィンガープリントを生成する
ことを特徴とする請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記工程（ｃ）が、複数の生体分子を生成するために各センサ素子から前記生体分子コロナを分離し、前記生体分子フィンガープリントを生成するために前記複数の生体分子を検出することをさらに有することを特徴とする請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの対照対象から対照サンプルを得る工程と、
前記対照サンプルについての生体分子フィンガープリントを生成するために、請求項１〜２１の何れか１項に記載の前記センサアレイと前記対照サンプルとを接触させる工程と、
前記疾病状態又は少なくとも１つの疾病若しくは障害と関連する生体分子フィンガープリントを決定するために、前記対照サンプルの前記生体分子フィンガープリントと、前記疾病状態又は少なくとも１つの疾病若しくは障害を有する対象からの前記生体分子フィンガープリントと、を比較する工程と、をさらに有する
ことを特徴とする請求項３４〜３６の何れか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記複数の生体分子を検出することが、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、質量分析法、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）、円偏光二色性、ラマン分光法及びこれらの組み合わせから選択されることを特徴とする請求項３４〜３７の何れか１項に記載の方法。
【請求項３９】
対象における疾病又は障害を診断又は予後診断する方法であって、
対象からサンプルを得る工程と、
生体分子フィンガープリントを生成するために請求項１〜２１の何れか１項に記載のセンサアレイと前記サンプルとを接触させる工程と、
前記生体分子フィンガープリントと、複数の疾病又は障害と関連する生体分子フィンガープリントのパネルと、を比較する工程と、
前記疾病又は障害を診断又は予後診断する工程と、を有する
ことを特徴とする方法。
【請求項４０】
前記疾病又は障害は、がん、心血管疾患、内分泌障害、炎症性疾患又は神経性疾患であることを特徴とする請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記疾病は、肺がん、すい臓がん、骨髄腫、骨髄性白血病、髄膜腫、神経膠芽腫、乳がん、食道扁平上皮がん及び胃がんからなるグループから選択されるがんであることを特徴とする請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記方法は、がんの初期ステージを診断することが可能であることを特徴とする請求項３９〜４１の何れか１項に記載の方法。
【請求項４３】
疾病又は障害に関連するバイオマーカーのパターンを識別する方法であって、
（ａ）前記疾病又は障害を有すると診断された少なくとも２つの対象と、少なくとも２つの対照対象と、からサンプルを得る工程と、
（ｂ）各対象について複数のセンサ素子についての複数の生体分子コロナを生成するために、請求項１〜２１の何れか１項に記載の前記センサアレイと各サンプルとを接触させる工程と、
（ｃ）前記疾病又は障害に関連するバイオマーカーのパターンを決定するために、前記疾病又は障害を有する前記対象の前記複数の生体分子コロナの組成と、前記対照対象の前記複数の生体分子コロナの組成と、を比較する工程と、を有する
ことを特徴とする方法。
【請求項４４】
前記工程（ａ）は、前記疾病又は障害を有すると診断された少なくとも５つの対象と、少なくとも５つの対照対象と、からサンプルを得ることを含むことを特徴とする請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記複数の生体分子コロナの組成は、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、質量分析法、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）、円偏光二色性、ラマン分光法及びこれらの組み合わせから決定されることを特徴とする請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾病又は障害は、がん、心血管疾患又は神経性疾患であることを特徴とする請求項４３〜４５の何れか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記疾病は、肺がん、すい臓がん、骨髄腫、骨髄性白血病、髄膜腫、神経膠芽腫、乳がん、食道扁平上皮がん及び胃がんからなるグループから選択されるがんであることを特徴とする請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記がんは神経膠芽腫であり、前記バイオマーカーは、ＨＡＢＰ１、ＶＴＮＣ、ＣＯ３、ＩＴＩＨ２、ＩＴＩＨ１、ＣＯ７、ＦＨＲ５、ＣＢＰＮ、ＡＬＢＵ、ＰＬＭＮ、ＣＯ４Ａ、ＰＲＤＸ２、ＶＷＦ、Ｃ４ＢＰＡ、ＡＰＯＢ、ＨＢＢ、ＣＮＤＰ１、ＣＲＰ、ＳＡＡ４、ＡＰＯＥ、ＣＳＣＬ７及びこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記がんは髄膜腫であり、前記バイオマーカーは、ＦＣＮ３、ＲＥＴ４、ＨＡＢＰ２、ＣＢＰＮ及びこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記がんはすい臓がんであり、前記バイオマーカーは、ＫＮＧ１、ＩＣ１、ＣＢＰＢ２、ＴＲＦＥ、ＧＥＬＳ、ＣＸＣＬ７、ＨＰＴＲ、ＰＧＫ１、ＡＡＣＴ、ＬＵＭ、ＡＰＯＥ、ＦＩＢＢ、ＡＰＯＡ２、Ａ１ＢＧ、Ａ１ＡＴ、ＬＢＰ、ＡＰＯＡ１、Ｈ４、ＦＩＢＧ及びこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記がんは肺がんであり、前記バイオマーカーは、ＣＯ０、ＣＲＰ、ＳＡＡ４、ＡＰＯＡ１、Ａ１ＡＴ、ＧＥＬＳ及びこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記がんは骨髄腫であり、前記バイオマーカーはＡＬＢＵであることを特徴とする請求項４３又は４４に記載の方法。
【請求項５３】
前記疾病は冠動脈疾患であることを特徴とする請求項２２〜２９、３２〜４０及び４３〜４６の何れか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記疾病は神経性疾患であることを特徴とする請求項２２〜２９、３２〜４０及び４３〜４６の何れか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記疾病はアルツハイマー病であることを特徴とする請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
疾病又は障害を診断又は予後診断するためのキットであって、
前記キットは、請求項１〜２１の何れか１項に記載のセンサアレイを備える
ことを特徴とするキット。
【請求項５７】
疾病又は障害と関連する少なくとも１つのバイオマーカーを決定及び／又は検出するためのキットであって、
前記キットは、請求項１〜２１の何れか１項に記載のセンサアレイを少なくとも１つ備える
ことを特徴とするキット。
【請求項５８】
前記疾病は冠動脈疾患（ＣＡＤ）であることを特徴とする請求項１９又は２０に記載のセンサアレイ。
【請求項５９】
前記疾病は神経性疾患であることを特徴とする請求項１９又は２０に記載のセンサアレイ。
【請求項６０】
前記疾病はアルツハイマー病であることを特徴とする請求項５９に記載のセンサアレイ。
【請求項６１】
異なる物理化学的性質を有する表面を有する複数の粒子を用いて複雑な生体サンプルの状態を区別する方法であって、
前記複雑な生体サンプルのタンパク質を前記複数の粒子に結合させるために、前記複雑な生体サンプルを前記複数の粒子に接触させる工程と、
前記複数の粒子に結合するタンパク質を示す生体分子フィンガープリントを定める工程と、
前記生体分子フィンガープリントを前記対象の生物学的状態と関連付ける工程と、を有し、
前記複数の粒子間のタンパク質の結合のパターンは、前記粒子の表面の物理化学的性質に応じて異なる
ことを特徴とする方法。
【請求項６２】
前記複雑な生体サンプルは、タンパク質と、核酸と、脂質及び多糖類のうちの少なくとも１つと、を含むことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記複雑な生体サンプルは血漿であることを特徴とする請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記生体分子フィンガープリントは、前記生物学的状態が現れていない第２の対象からの複雑な生体サンプルの第２の生体分子フィンガープリントとは異なることを特徴とする請求項６１〜６３の何れか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記生物学的状態は、前記対象の疾病状態であることを特徴とする請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記対象は、前記疾病状態に関連する疾病又は障害の身体症状が現れていないことを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象は、前記疾病状態に関連する疾病又は障害を有すると診断されたことを特徴とする請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記疾病状態は、がん、心血管疾患、内分泌障害、炎症性疾患及び神経性疾患のうちの少なくとも１つであることを特徴とする請求項６６又は６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記疾病状態はがんであり、前記がんの種類は、肺がん、すい臓がん、大腸がん、骨髄腫、骨髄性白血病、髄膜腫、神経膠芽腫、乳がん、食道扁平上皮がん、胃がん、前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、甲状腺がん、神経内分泌腫瘍及びこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記サンプルの前記生体分子フィンガープリントは前記がんの種類を示すものであることを特徴とする請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記疾病状態は神経性疾患であり、前記神経性疾患は、アルツハイマー病、脳腫瘍、てんかん、パーキンソン病、ＡＬＳ、動静脈奇形、脳血管性疾患、脳動脈瘤、てんかん、多発性硬化症、末梢神経障害、帯状疱疹後神経痛、脳卒中、前頭側頭型認知症、脱髄性疾患、多発性硬化症、デビック病、橋中心髄鞘崩壊症、進行性多巣性白質脳症、白質ジストロフィー、ギラン・バレー症候群、進行性炎症性神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎及び抗ＭＡＧ末梢神経障害からなるグループから選択されることを特徴とする請求項６８に記載の方法。
【請求項７２】
前記疾病状態は神経性疾患であり、前記神経性疾患はアルツハイマー病であることを特徴とする請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記サンプルの生体分子フィンガープリントは前記神経性疾患を示すものであることを特徴とする請求項７１又は７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記複数の粒子の前記表面はリポソームを備えることを特徴とする請求項６１〜７３の何れか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記リポソームは固体脂質を備えることを特徴とする請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記リポソームは、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）−ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＣＨＯＬ（ＤＯＰＣ−コレステロール）及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを備えることを特徴とする請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
各リポソームの脂質ベースの表面は、脂質−タンパク質境界面にて前記複雑な生体サンプルの前記タンパク質と接触し、これにより、前記タンパク質を前記リポソームに結合させることを特徴とする請求項７４〜７６の何れか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記生体分子フィンガープリントを定める工程が、前記複数の粒子から前記タンパク質の少なくともサブセットを分離することを含むことを特徴とする請求項６１〜７７の何れか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記生体分子フィンガープリントを定める工程が、前記複数の粒子から分離された前記タンパク質の前記サブセットのなかの少なくとも１つの前記タンパク質を同定することをさらに含むことを特徴とする請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記少なくとも１つの前記タンパク質を同定することが、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、質量分析法、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）、円偏光二色性、ラマン分光法及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを行うことを特徴とする請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記複数の粒子がナノ粒子を備えることを特徴とする請求項６１〜８０の何れか１項に記載の方法。
【請求項８２】
前記複数の粒子がビーズを備えることを特徴とする請求項６１〜８１の何れか１項に記載の方法。
【請求項８３】
前記複数の粒子が基板に結合されたことを特徴とする請求項６１〜８２の何れか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記複数の粒子は前記基板に共有結合されたことを特徴とする請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記複数の粒子は前記基板に非共有結合されたことを特徴とする請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記生物学的状態が現れた少なくとも２つの対象の各々から及び前記生物学的状態が現れていない少なくとも２つの対照対象の各々から、追加の複雑な生体サンプルを得る工程と、
前記追加の複雑な生体サンプルを別々に前記複数の粒子に接触させる工程と、
複数の生体分子フィンガープリントを定める工程と、
前記複数の生体分子フィンガープリントのなかから、前記対象の前記生物学的状態に関連する前記生体分子フィンガープリントを同定する工程と、をさらに有し、
前記複数の生体分子フィンガープリントの各々は、前記複数のナノ粒子に結合する、対応する追加の複雑な生体サンプルからのタンパク質に対応する
ことを特徴とする請求項６１に記載の方法。
【請求項８７】
前記生物学的状態が現れた少なくとも２つの対象は、少なくとも５つの対象であることを特徴とする請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記生物学的状態が現れていない少なくとも２つの対照対象は、少なくとも５つの対象であることを特徴とする請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
前記複数の生体分子フィンガープリントを定める工程が、前記複数の粒子から、前記追加の複雑な生体サンプルの各々における前記タンパク質の少なくともサブセットを分離することを含むことを特徴とする請求項８６〜８８の何れか１項に記載の方法。
【請求項９０】
前記生体分子フィンガープリントを定める工程が、前記複数の粒子から分離された、前記追加の複雑な生体サンプルの各々における前記タンパク質の前記サブセットのなかの少なくとも１つの前記タンパク質を同定することを特徴とする請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記タンパク質の少なくともサブセットを同定することが、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、質量分析法、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）、円偏光二色性、ラマン分光法及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを行うことを特徴とする請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記対象の前記複雑な生体サンプルの前記生物学的状態は疾病又は障害であることを特徴とする請求項８６〜９１の何れか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記疾病又は障害は、がん、心血管疾患、内分泌障害、炎症性疾患及び神経性疾患のうちの少なくとも１つであることを特徴とする請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記対象の生物学的状態に関連する前記生体分子フィンガープリントは、前記疾病又は障害に関連する少なくとも１つのバイオマーカーを備えることを特徴とする請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記疾病又は障害はがんであることを特徴とする請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記がんは神経膠芽腫であり、前記バイオマーカーは、ＨＡＢＰ１、ＶＴＮＣ、ＣＯ３、ＩＴＩＨ２、ＩＴＩＨ１、ＣＯ７、ＦＨＲ５、ＣＢＰＮ、ＡＬＢＵ、ＰＬＭＮ、ＣＯ４Ａ、ＰＲＤＸ２、ＶＷＦ、Ｃ４ＢＰＡ、ＡＰＯＢ、ＨＢＢ、ＣＮＤＰ１、ＣＲＰ、ＳＡＡ４、ＡＰＯＥ、ＣＳＣＬ７及びこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記がんは髄膜腫であり、前記バイオマーカーは、ＦＣＮ３、ＲＥＴ４、ＨＡＢＰ２、ＣＢＰＮ及びこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
前記がんはすい臓がんであり、前記バイオマーカーは、ＫＮＧ１、ＩＣ１、ＣＢＰＢ２、ＴＲＦＥ、ＧＥＬＳ、ＣＸＣＬ７、ＨＰＴＲ、ＰＧＫ１、ＡＡＣＴ、ＬＵＭ、ＡＰＯＥ、ＦＩＢＢ、ＡＰＯＡ２、Ａ１ＢＧ、Ａ１ＡＴ、ＬＢＰ、ＡＰＯＡ１、Ｈ４、ＦＩＢＧ及びこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする請求項９５に記載の方法。
【請求項９９】
前記がんは肺がんであり、前記バイオマーカーは、ＣＯ０、ＣＲＰ、ＳＡＡ４、ＡＰＯＡ１、Ａ１ＡＴ、ＧＥＬＳ及びこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする請求項９５に記載の方法。
【請求項１００】
前記がんは骨髄腫であり、前記バイオマーカーはＡＬＢＵであることを特徴とする請求項９５に記載の方法。
【請求項１０１】
前記粒子の前記表面の前記物理化学的性質は、電荷、組成、サイズ、疎水性、親水性、表面機能性、表面トポグラフィー及び形状のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項６１〜１００のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０２】
異なる物理化学的性質を有する表面を有する複数の粒子を備えるセンサアレイであって、
複雑な生体サンプルを前記複数の粒子に接触させることで、前記複雑な生体サンプルのタンパク質が前記複数の粒子に結合するよう構成され、
前記複数の粒子間の前記タンパク質の結合パターンが、前記粒子の表面の前記物理化学的性質に依存するよう構成されている
ことを特徴とするセンサアレイ。
【請求項１０３】
前記複雑な生体サンプルは、タンパク質と、核酸と、脂質及び多糖類のうちの少なくとも１つと、を含むことを特徴とする請求項１０２に記載のセンサアレイ。
【請求項１０４】
前記複雑な生体サンプルは血漿であることを特徴とする請求項１０３に記載のセンサアレイ。
【請求項１０５】
前記複数の粒子に結合する前記タンパク質が、前記複雑な生体サンプルの生体分子フィンガープリントを定めることを特徴とする請求項１０２〜１０４の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１０６】
前記生体分子フィンガープリントは、前記複雑な生体サンプルを提供した対象の生物学的状態に関連することを特徴とする請求項１０５に記載のセンサアレイ。
【請求項１０７】
前記生体分子フィンガープリントは、前記生物学的状態が現れていない第２の対象からの複雑な生体サンプルの第２の生体分子フィンガープリントとは異なることを特徴とする請求項１０６に記載のセンサアレイ。
【請求項１０８】
前記生物学的状態は、前記対象の疾病状態であることを特徴とする請求項１０７に記載のセンサアレイ。
【請求項１０９】
前記対象は、前記疾病状態に関連する疾病又は障害の身体症状が現れていないことを特徴とする請求項１０８に記載のセンサアレイ。
【請求項１１０】
前記対象は、前記疾病状態に関連する疾病又は障害を有すると診断されたことを特徴とする請求項１０８に記載のセンサアレイ。
【請求項１１１】
前記疾病状態は、がん、心血管疾患、内分泌障害、炎症性疾患及び神経性疾患のうちの少なくとも１つであることを特徴とする請求項１０９又は１１０に記載のセンサアレイ。
【請求項１１２】
前記疾病状態はがんであり、前記がんの種類は、肺がん、すい臓がん、大腸がん、骨髄腫、骨髄性白血病、髄膜腫、神経膠芽腫、乳がん、食道扁平上皮がん、胃がん、前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、甲状腺がん、神経内分泌腫瘍及びこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１１１に記載のセンサアレイ。
【請求項１１３】
前記サンプルの前記生体分子フィンガープリントは前記がんの種類を示すものであることを特徴とする請求項１１２に記載のセンサアレイ。
【請求項１１４】
前記疾病状態は神経性疾患であり、前記神経性疾患は、アルツハイマー病、脳腫瘍、てんかん、パーキンソン病、ＡＬＳ、動静脈奇形、脳血管性疾患、脳動脈瘤、てんかん、多発性硬化症、末梢神経障害、帯状疱疹後神経痛、脳卒中、前頭側頭型認知症、脱髄性疾患、多発性硬化症、デビック病、橋中心髄鞘崩壊症、進行性多巣性白質脳症、白質ジストロフィー、ギラン・バレー症候群、進行性炎症性神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎及び抗ＭＡＧ末梢神経障害からなるグループから選択されることを特徴とする請求項１１１に記載のセンサアレイ。
【請求項１１５】
前記疾病状態は神経性疾患であり、前記神経性疾患はアルツハイマー病であることを特徴とする請求項１１４に記載のセンサアレイ。
【請求項１１６】
前記サンプルの生体分子フィンガープリントは前記神経性疾患を示すものであることを特徴とする請求項１１４又は１１５に記載のセンサアレイ。
【請求項１１７】
前記複数の粒子の前記表面はリポソームを備えることを特徴とする請求項１０２〜１１６の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１１８】
前記リポソームは固体脂質を備えることを特徴とする請求項１１７に記載のセンサアレイ。
【請求項１１９】
前記リポソームは、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）−ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＣＨＯＬ（ＤＯＰＣ−コレステロール）及びこれらの組み合わせのうちの少なくとも１つを備えることを特徴とする請求項１１７に記載のセンサアレイ。
【請求項１２０】
各リポソームの脂質ベースの表面は、脂質−タンパク質境界面にて前記複雑な生体サンプルの前記タンパク質と接触し、これにより前記タンパク質を前記リポソームに結合させることを特徴とする請求項１１７〜１１９の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１２１】
前記複数の粒子がナノ粒子を備えることを特徴とする請求項１０２〜１２０の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１２２】
前記複数の粒子がビーズを備えることを特徴とする請求項１０２〜１２０の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１２３】
前記複数の粒子が基板に結合されたことを特徴とする請求項１０２〜１２２の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１２４】
前記複数の粒子は前記基板に共有結合されたことを特徴とする請求項１２３に記載のセンサアレイ。
【請求項１２５】
前記複数の粒子は前記基板に非共有結合されたことを特徴とする請求項１２３に記載のセンサアレイ。
【請求項１２６】
前記異なる物理化学的性質は、表面電荷、組成、サイズ、疎水性、親水性、表面機能性、表面トポグラフィー及び形状のうちの少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項１０２〜１２５の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１２７】
前記複数の粒子は、脂質、核酸及び多糖類のうちの少なくとも１つとさらに結合することを特徴とする請求項１０５〜１２６の何れか１項に記載のセンサアレイ。
【請求項１２８】
前記生体分子フィンガープリントが、前記複数の粒子に結合する脂質、核酸及び多糖類のうちに少なくとも１つをさらに示すことを特徴とする請求項１２７に記載のセンサアレイ。
【請求項１２９】
複数のリポソームを備えるセンサアレイであって、
前記複数のリポソームは、各リポソームの脂質ベースの表面により定められた少なくとも１つのタンパク質結合特性が異なっており、
前記各リポソームの脂質ベースの表面は、脂質−タンパク質境界面にてサンプルのタンパク質のサブセットと接触し、これにより前記タンパク質のサブセットと結合してタンパク質結合のパターンを生成するよう構成され、
第１リポソームの前記タンパク質結合のパターンは、前記第１リポソームとは異なる第２リポソームのタンパク質結合のパターンと、前記少なくとも１つのタンパク質結合特性が異なる
ことを特徴とするセンサアレイ。
【請求項１３０】
前記複数のリポソームに結合する前記タンパク質は、前記サンプルの生体分子フィンガープリントを定めることを特徴とする請求項１２９に記載のセンサアレイ。
【請求項１３１】
前記サンプルの前記生体分子フィンガープリントは、前記サンプルを提供した対象の生物学的状態  の特徴を示していることを特徴とする請求項１３０に記載のセンサアレイ。
【請求項１３２】
前記対象の前記生物学的状態は疾病状態であることを特徴とする請求項１３１に記載のセンサアレイ。
【請求項１３３】
前記疾病状態はがんであることを特徴とする請求項１３２に記載のセンサアレイ。
【請求項１３４】
前記がんは、肺がん、すい臓がん、大腸がん、骨髄腫、骨髄性白血病、髄膜腫、神経膠芽腫、乳がん、食道扁平上皮がん、胃がん、前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、甲状腺がん、神経内分泌腫瘍及びこれらの組み合わせからなるグループから選択されることを特徴とする請求項１３３に記載のセンサアレイ。
【請求項１３５】
前記生体分子フィンガープリントが、前記複数のリポソームに結合する脂質、核酸及び多糖類のうちに少なくとも１つをさらに示すことを特徴とする請求項１３４に記載のセンサアレイ。
【請求項１３６】
各リポソームの脂質ベースの表面により定められる少なくとも１つのタンパク質結合特性が異なる複数のリポソームを用いて対象の生物学的状態を識別する方法であって、
前記サンプルのタンパク質を前記複数のリポソームに結合させるために、前記サンプルを前記複数のリポソームに接触させる工程と、
前記タンパク質を前記リポソームから分離する工程と、
前記リポソームから分離された前記タンパク質の生体分子フィンガープリントを定める工程と、
前記生体分子フィンガープリントを前記対象の前記複雑な生体サンプルの状態と関連付ける工程と、を有し、
前記タンパク質の結合のパターンは、異なるタンパク質結合特性を有する前記リポソームの間で異なる
ことを特徴とする方法。
【請求項１３７】
各リポソームの前記脂質ベースの表面は、脂質−タンパク質境界面にてサンプルのタンパク質のサブセットと接触し、これにより、タンパク質結合のパターンを生成するために前記タンパク質のサブセットを結合させることを特徴とする請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記生体分子フィンガープリントが、前記複数のリポソームに結合する脂質、核酸及び多糖類のうちの少なくとも１つをさらに示すことを特徴とする請求項１３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は、２０１６年１２月１６日に出願された米国仮特許出願番号第６２／４３５，４０９号の利益を主張し、当該仮特許出願の内容は全て参照により本明細書に組み込まれているものとする。
【０００２】
＜連邦政府の支援による研究に関する言明＞
該当無し。
【０００３】
＜参照による組み込み＞
本明細書に記載される全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許又は特許出願が参照により組み込まれるために具体的に及び個々に示されているのと同じ程度に、参照により組み込まれているものとする。
【０００４】
本発明の分野は、異なる疾病状態の発見及び診断のためのセンサアレイに関し、特に、本発明は、疾病又は障害の診断又は予後診断をする能力に関する。
【背景技術】
【０００５】
疾病は、早期に診断するほど治癒又は順調に管理できる可能性が高まり、患者にとって予後がより良くなる。疾病を早期に治療すれば疾病に起因する問題を防ぐ又は遅らせることができるとともに、患者の寿命が延びる及び／又はクオリティ・オブ・ライフが改善するなど患者にとって予後が改善される可能性がある。
【０００６】
がんはその多くが初期ステージで治療を成功させることができるので、がんの早期診断は重要である。例えば、乳がん、卵巣がん、肺がんの早期診断及び治療後の５年生存率は、最も疾病が進行したステージで患者を診断した場合の１５％、５％及び１０％と比べると、それぞれ９０％、９０％及び７０％である。がん細胞がその原発組織を離れると、利用可能な確立された治療法を用いた治療を成功させることは非常に困難となる。がんの警告的兆候の認識及び迅速な行動により早期診断が可能ではあるが、がんの多く（例えば肺がん）はがん細胞がすでに周辺組織に浸入し体中に転移した後でしか症状を示さない。例えば、乳がん、肺がん、結腸がん及び卵巣がんの患者の６０％以上が、がんが発見された時点で隠れた又は転移性のコロニーを有する。したがってがんの早期発見の有効なアプローチの開発が緊急に必要とされている。そのようなアプローチは、種々のステージでがんを識別するための感度と、検査対象の人ががんでないときに陰性結果を与えるような特異性と、を有するべきである。がんの早期発見の方法を開発するためにこれまで幅広い努力がなされておりかなりの数のリスク因子及びバイオマーカーが提案されているものの、広範囲のがんの早期発見のための広い関連性を有するプラットフォームは依然としてとらえにくいままである。
【０００７】
種々のがんはその初期ステージにおいてさえも血漿の組成を変更可能なため、早期発見のための有望なアプローチの１つは、バイオマーカーについての分子血液分析である。このストラテジーはすでに一部のがんに関しては成功している（前立腺がんのためのＰＳＡなど）ものの、大部分のがんの早期発見については特異的なバイオマーカーは未だ存在しない。そのようながん（例えば肺がん）については、規定候補血中バイオマーカーは何れも臨床的に実証されておらず、そのうちのわずかなものだけが末期臨床開発に到達している。したがって、極めて早期のステージでがんを発見するために我々の能力を向上させる新規のアプローチが緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、幅広い疾病及び障害の発見並びに対象における疾病状態の決定のための高感度で万能なセンサアレイを提供する。本発明のユニークな点は、一連のヘルスケアにおいて、対象からのサンプルからの生体分子フィンガープリントの認識と前記対象における疾病状態を決定する能力とを組み合わせたことにある。
【０００９】
一部の側面において、本発明は、複数のセンサ素子を備えるセンサアレイであって、前記複数のセンサ素子は、少なくとも１つの物理化学的性質が互いに異なっており、前記複数のセンサ素子は、少なくとも２つのセンサ素子を備えている。一部の側面において、各前記センサ素子は、生体分子コロナシグネチャーを生成するためにサンプル中の複数の生体分子と結合可能であり、各前記センサ素子は、他とは異なる生体分子コロナシグネチャーを有する。一部の側面において、センサ素子はナノスケールセンサ素子である。
【００１０】
一部の側面において、前記複数のセンサ素子は、前記サンプルと接触したときに複数の生体分子コロナシグネチャーを生成するよう構成され、前記複数の生体分子コロナシグネチャーの組み合わせにより、前記サンプルの生体分子フィンガープリントが生成される。
【００１１】
一部の側面において、センサ素子は基板に結合されている。
【００１２】
一部の側面において、センサ素子は、形態及び機能が異なる、基板、プレート又はチップの上の離散的な素子（領域）であり、各異なる素子（領域）は、異なる生体分子コロナシグネチャーを生成する。併せて、基板、チップ又はアレイ自体がセンサアレイを形成し、前記サンプルについての生体分子フィンガープリントを提供する。
【００１３】
一部の側面において、本発明は、対象における疾病状態を検出する方法であって、前記対象からサンプルを得る工程と、センサアレイと前記サンプルとを接触させる工程と、前記サンプルと関連する生体分子フィンガープリントを決定する工程と、を有し、前記センサアレイは複数のセンサ素子を備え、前記複数のセンサ素子は少なくとも１つの物理化学的性質が互いに異なっており、前記複数のセンサ素子は少なくとも２つのセンサ素子を備え、前記生体分子フィンガープリントは、前記対象の疾病状態を区別する。一部の側面において、前記方法は、さらに、前記サンプルと関連する疾病状態を決定するために、前記サンプルの前記生体分子フィンガープリントと、複数の疾病状態と関連する生体分子フィンガープリントのパネルと、を比較する工程をさらに有する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、少なくとも疾病状態又は少なくとも１つの疾病若しくは障害と関連する生体分子フィンガープリントを決定する方法であって、（ａ）前記疾病状態又は前記少なくとも１つの疾病若しくは障害を有すると診断された少なくとも２つの対象からサンプルを得る工程と、（ｂ）本明細書に記載のセンサアレイと各サンプルとを接触させる工程と、（ｃ）前記疾病状態又は少なくとも１つの疾病若しくは障害関連する前記センサアレイについての生体分子フィンガープリントを決定する工程と、を有する。一部の側面において、前記工程（ｃ）が、各センサ素子の前記生体分子コロナの前記組成を検出することをさらに有し、前記異なるセンサ素子間の各生体分子コロナの前記組成の組み合わせにより、前記サンプルと関連する前記生体分子フィンガープリントを生成する。他の側面において、前記工程（ｃ）が、各センサ素子から前記生体分子コロナを分離するとともに、各生体分子コロナの複数の生体分子を分析し、分析された生体分子の組み合わせにより生体分子フィンガープリントが生成される。
【００１５】
さらに別の側面において、本発明は、対象における疾病又は障害を診断又は予後診断する方法であって、対象からサンプルを得る工程と、生体分子フィンガープリントを生成するために本明細書に記載のセンサアレイと前記サンプルとを接触させる工程と、前記生体分子フィンガープリントと、複数の疾病又は障害と関連する生体分子フィンガープリントのパネルと、を比較する工程と、前記疾病又は障害を診断又は予後診断する工程と、を有する。
【００１６】
さらに別の側面において、本発明は、疾病又は障害に関連するバイオマーカーのパターンを識別する方法であって、（ａ）前記疾病又は障害を有すると診断された少なくとも２つの対象と、少なくとも２つの対照対象と、からサンプルを得る工程と、（ｂ）各対象について複数の生体分子コロナを生成するためにセンサアレイと各サンプルとを接触させる工程と、（ｃ）前記疾病又は障害に関連するバイオマーカーのパターンを決定するために、前記疾病又は障害を有する前記対象の前記複数の生体分子コロナの組成と、前記対照対象の前記複数の生体分子コロナの組成と、を比較する工程と、を有する。
【００１７】
一部の側面において、前記疾病又は障害はがん、心血管疾患、内分泌障害、炎症性疾患又は神経性疾患である。
【００１８】
一側面において、前記疾病又は障害はがんである。
【００１９】
別の側面において、前記疾病又は障害は心血管疾患である。ある側面において、前記心血管疾患は冠動脈疾患（ＣＡＤ）である。
【００２０】
さらなる側面において、前記疾病又は障害は神経性疾患である。ある側面において、前記神経性疾患はアルツハイマー病である。
【００２１】
一部の側面において、本発明は、疾病又は障害を診断又は予後診断するためのキットであって、前記キットはセンサアレイを備え、前記センサアレイは複数のナノスケールセンサ素子を備え、前記複数のセンサ素子は少なくとも１つの物理化学的性質が互いに異なっており、前記複数のセンサ素子は少なくとも２つのセンサ素子を備える。
【００２２】
他の側面において、本発明は、疾病又は障害と関連する少なくとも１つのバイオマーカーを決定及び／又は検出するためのキットであって、前記キットは、複数のセンサ素子を備える少なくとも１つのセンサアレイを備え、前記複数のセンサ素子は少なくとも１つの物理化学的性質が互いに異なっており、前記複数のセンサ素子は少なくとも２つのセンサ素子を備える。
【００２３】
さらに別の側面において、本発明は、異なる物理化学的性質を有する表面を有する複数の粒子を用いて複雑な生体サンプルの状態を区別する方法であって、前記複雑な生体サンプルのタンパク質を前記複数の粒子に結合させるために、前記複雑な生体サンプルを前記複数の粒子に接触させる工程と、前記複数の粒子に結合するタンパク質を示す生体分子フィンガープリントを定める工程と、前記生体分子フィンガープリントを前記対象の生物学的状態と関連付ける工程と、を有し、前記複数の粒子間のタンパク質の結合のパターンは、前記粒子の表面の物理化学的性質に応じて異なる。
【００２４】
別の側面において、本発明は、異なる物理化学的性質を有する表面を有する複数の粒子を備えるセンサアレイであって、複雑な生体サンプルを前記複数の粒子に接触させることで、前記複雑な生体サンプルのタンパク質が前記複数の粒子に結合するよう構成され、前記複数の粒子間の前記タンパク質の結合パターンが、前記粒子の表面の前記物理化学的性質に依存するよう構成されている。
【００２５】
さらに別の側面において、本発明は、複数のリポソームを備えるセンサアレイであって、前記複数のリポソームは、各リポソームの脂質ベースの表面により定められた少なくとも１つのタンパク質結合特性が異なっており、前記各リポソームの脂質ベースの表面は、脂質−タンパク質境界面にてサンプルのタンパク質のサブセットと接触し、これにより前記タンパク質のサブセットと結合してタンパク質結合のパターンを生成するよう構成され、第１リポソームの前記タンパク質結合のパターンは、前記第１リポソームとは異なる第２リポソームのタンパク質結合のパターンと、前記少なくとも１つのタンパク質結合特性が異なる。
【００２６】
別の側面において、本発明は、各リポソームの脂質ベースの表面により定められる少なくとも１つのタンパク質結合特性が異なる複数のリポソームを用いて対象の生物学的状態を識別する方法であって、  前記サンプルのタンパク質を前記複数のリポソームに結合させるために、前記サンプルを前記複数のリポソームに接触させる工程と、前記タンパク質を前記リポソームから分離する工程と、前記リポソームから分離された前記タンパク質の生体分子フィンガープリントを定める工程と、前記生体分子フィンガープリントを前記対象の前記複雑な生体サンプルの状態と関連付ける工程と、を有し、前記タンパク質の結合のパターンは、異なるタンパク質結合特性を有する前記リポソームの間で異なる。
【００２７】
本発明の上記の及びその他の側面及び利点は以下の記載から明らかとなる。本明細書は、その一部を構成するとともに本発明の好ましい実施形態を例示する添付の図面を参照して記載されている。そのような実施形態は、必ずしも本発明の全範囲を表すものではなく、したがって本発明の範囲は、特許請求の範囲及び本明細書の記載に基づいて解釈されるべきである。
【００２８】
特許又は出願ファイルは少なくとも１つのカラー図面を含む、（複数の）カラー図面を含むこの特許又は特許出願公開のコピーは、申請及び必要費用の支払いにより特許庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】がん発見のためのタンパク質コロナパターンアプローチの研究デザインの例を示す一実施形態の図である。３種類のリポソームが健康者及びがん患者の血漿とともにインキュベーションされ、各対象の血漿（健康及び異なるがん）における各リポソーム上に形成されたタンパク質コロナパターンが液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって特徴付けられた。３種類のリポソーム上におけるタンパク質コロナの形成は、重なり合うが区別可能な選択血漿タンパク質プールの濃縮(enrichment)をもたらし、濃縮されたタンパク質は後続の多変量解析のベースとなる。分類アプローチを介して、コロナパターンにおける重要なタンパク質が同定され、そしてマルチナノ粒子タンパク質コロナナノシステムの精度をテストするためにブラインド（blind）血漿及びコホートサンプルの両方を用いてがんを予測するために用いられた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの２６１回の別個の実行（３リポソーム、２９人の対象、３レプリケート（replicates））を示す２９人の人間の対象（がん患者２５人、即ち５種類のがんにつき患者５人と、健康な対象４人）が、分類モデルのトレーニングに用いられた。ブラインド血漿の１６人の人間の対象（５種類のがんにつき患者３人と、健康な対象１人）と、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの１４４回の別個の実行（３リポソーム、１６人の対象、３レプリケート）が、がん予測に用いられ、即ち分類モデルをテストするために用いられた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳの１３５回の別個の実行（３リポソーム、１５人の対象、３レプリケート）を示すコホート血漿の１５人の人間の対象（３種類のがんにつき患者５人）もまた超早期がん予測に用いられた。
【図２Ａ】リポソームのＴＥＭ画像とこれらのサイズ分布プロファイルである。
【図２Ｂ】異なる疾病を有する患者からのヒト血漿との相互作用の前後における異なるリポソームの物理化学的性質である。健康者及びがん患者からの血漿とともにインキュベーションされた後に得られた、ヒト血漿及び過剰血漿のないコロナ合成体との相互作用の前における各種リポソームについてのＤＬＳ及びゼータ電位データである（Ｐｄｉ：キュムラントフィッティングからの分子量分散度）。
【図２Ｃ】健康者及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における生理的機能による、リポソームからの識別されたコロナタンパク質の分類である（示されたデータは、各グループにつき５つの生体血漿からの計算及び各血漿について３回の技術的レプリケートを反映）。
【図３Ａ１】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における急性期を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ａ２】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における急性期を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ａ３】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における急性期を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｂ１】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における凝固を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｂ２】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における凝固を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｂ３】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における凝固を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｃ１】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における免疫グロブリンを含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｃ２】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における免疫グロブリンを含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｃ３】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における免疫グロブリンを含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｄ１】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿におけるリポタンパク質を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｄ２】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿におけるリポタンパク質を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｄ３】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿におけるリポタンパク質を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｅ１】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における組織漏出を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｅ２】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における組織漏出を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｅ３】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における組織漏出を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｆ１】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における補体タンパク質を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｆ２】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における補体タンパク質を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｆ３】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における補体タンパク質を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｇ１】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における他の血漿タンパク質を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｇ２】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における他の血漿タンパク質を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図３Ｇ３】健康な対象及び異なる種類のがんを有する患者のヒト血漿における他の血漿タンパク質を含む生理的機能に基づくセンサアレイ素子による識別されたコロナの分類である。
【図４Ａ】ＰＬＳ判別分析による各クラスの分離のための予測因子の発見及び個々の予測因子による寄与である。ランク付けされた変数をＰＬＳ−ＤＡモデルに１つずつ足し、内部交差検証（１０分割）について分類エラーを計算することで、重み付けされたＶＩＰによる予測因子調査が行われた。分類エラーの減少により６９個の予測因子の最小セットが発見され、各クラスを他から分離することについての最高潜在的重要度が示された。ＰＬＳ判別分析に基づく各クラスの分離に対する個々のマーカーの寄与である。ＰＬＳ判別分析からの各クラスの分離への寄与についての６９個の選択変数のＶＩＰプロットランキングマーカーである。ＶＩＰスコア＞１は、クラスメンバーシップの良い予測をもたらす重要なタンパク質を示し、一方でＶＩＰスコア＜１である変数は各クラスについての重要でないタンパク質を示す。
【図４Ｂ】神経膠芽腫についての６９個の変数の結果を示す。
【図４Ｃ】髄膜腫についての６９個の変数のＶＩＰ値を示す。
【図４Ｄ】肺がんについての６９個の変数のＶＩＰ値を示す。
【図４Ｅ】骨髄腫についての６９個の変数のＶＩＰ値を示す。
【図４Ｆ】すい臓がんについての６９個の変数のＶＩＰ値を示す。
【図５Ａ】異なるがんサンプルの互いからの及び対照からの分離を示すＰＬＳ−ＤＡプロットである。ＰＬＳツールボックスを用いて得られたＰＬＳスコアプロットであり、モデルの第１、第２及び第３の潜在的変数により作成されたサブ空間内に対象を投影している。
【図５Ｂ】異なるがんサンプルの互いからの及び対照からの分離を示すＰＬＳ−ＤＡプロットである。モデルの第４、第５の潜在的変数が示されたところに対象が表示されている。ここから分かるように、髄膜腫及び神経膠芽腫のケースは３次元に適切に分離されなかったものの、ＰＬＳモデルの第４、第５次元に分離することができる。
【図５ＣＤ】全変数及び選択変数を用いてＣＰＡＮＮにより得られた割り当てマップである。左図は、データセット全体（１８２３個の変数）を用いてＣＰＡＮＮネットワーク（８×８ニューロン）をトレーニングすることで得られた割り当てマップである。マッピングの質は良くなく、マッピングにおいて異なる種類のがんのコンフリクトがある。右図は、６９個の変数を用いたＣＰＡＮＮネットワーク（８×８ニューロン）のトレーニングにより実現された割り当てマップである。高次元入力ベクトル（サンプル）がニューロンの２次元ネットワーク上にマップされて、類似性及びトポロジーを保存する。色は、特定の種類の入力ベクトル（クラス種類）に対するニューロンの類似性を示す。またこのマップは予測因子選択工程の重要度及び情報価値がなく関連性がない予測因子を削除することによるモデルの質への影響を示す。
【図５Ｅ】がんの６つのグループを識別可能と認定された５１のタンパク質を描写するデンドログラムである。
【図５Ｆ】がんの６つのグループを識別可能と認定された５１のタンパク質が教師なしクラスターアルゴリズムと共に作成された「ヒートマップ」に示されている（最長距離連結法を用いる凝集型ＨＣＡ）。デンドログラム（図５Ｅ）及びヒートマップ（図５Ｆ）両方の目視検査により、がん特異的タンパク質コロナシグネチャー及び６つのサンプルのグループ（がんサンプルの５つのグループ足す正常なサンプル）の明確なクラスタリングが示され、また各グループについて５人の患者の予想された類似性が示された。また、ヒートマップは、異なるがんの変数（マーカー）のパターンに顕著な差があることを示す（各例は患者を示し、各行はタンパク質を示す）。より高い及びより低いタンパク質レベルが、それぞれ赤及び緑で示されている。
【図６Ａ】６９個の重要なマーカーを考慮することで得られたＰＬＳスコアプロットであり、モデルの第１及び第２潜在的変数により作成されたサブ空間内にコホート対象が投影されている。
【図６Ｂ】８個の変数を用いてＰＬＳ−ＤＡモデルが作成され、優れた統計値でモデルの第１及び第２潜在的変数により作成されたサブ空間内にコホート対象が投影されている。
【図６Ｃ】６９個の重要なマーカーを用いてＣＰＡＮＮネットワーク（８×８ニューロン）をトレーニングすることで得られた割り当てマップである。
【図６Ｄ】８個のマーカーのみを用いてＣＰＡＮＮネットワーク（８×８ニューロン）をトレーニングすることで得られた割り当てマップであり、分類ミスがない。サンプルの数が各ニューロン上に示されている。
【図７Ａ】研究概略の概略図である。情報的価値のある変数の選択及び分類モデルの構築を示す。
【図７Ｂ】タンパク質の名称及び６９個の選択変数のＩＤがリストされている。一部のタンパク質は２以上のリポソーム（ＤＯＰＧ、ＤＯＴＡＰ及びＣＨＯＬは、それぞれ、イタリック体かつ下線フォント、太字体フォント及びそのままのフォント(plain font)で示されている）のタンパク質コロナ中に存在した。
【図７Ｃ】提案されたモデルによって有意変数としてカバーされた疾病特異的バイオマーカーである。
【図８Ａ】対照について上位６９位にランク付けされた変数に基づくＰＬＳ−ＤＡから得られた受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットである。６つのクラス（対照、神経膠芽腫、髄膜腫、骨髄腫、すい臓がん、肺がん）について最も高い寄与を有する６９個のマーカーから構築されたＰＬＳ−ＤＡに基づく敏感度（真の陽性率、Ｙ軸）対１−特異性（偽陽性率、Ｘ軸）のＲＯＣプロットである。
【図８Ｂ】神経膠芽腫について上位６９位にランク付けされた変数に基づくＰＬＳ−ＤＡから得られた受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットである。６つのクラス（対照、神経膠芽腫、髄膜腫、骨髄腫、すい臓がん、肺がん）について最も高い寄与を有する６９個のマーカーから構築されたＰＬＳ−ＤＡに基づく敏感度（真の陽性率、Ｙ軸）対１−特異性（偽陽性率、Ｘ軸）のＲＯＣプロットである。
【図８Ｃ】髄膜腫について上位６９位にランク付けされた変数に基づくＰＬＳ−ＤＡから得られた受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットである。６つのクラス（対照、神経膠芽腫、髄膜腫、骨髄腫、すい臓がん、肺がん）について最も高い寄与を有する６９個のマーカーから構築されたＰＬＳ−ＤＡに基づく敏感度（真の陽性率、Ｙ軸）対１−特異性（偽陽性率、Ｘ軸）のＲＯＣプロットである。
【図８Ｄ】骨髄腫について上位６９位にランク付けされた変数に基づくＰＬＳ−ＤＡから得られた受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットである。６つのクラス（対照、神経膠芽腫、髄膜腫、骨髄腫、すい臓がん、肺がん）について最も高い寄与を有する６９個のマーカーから構築されたＰＬＳ−ＤＡに基づく敏感度（真の陽性率、Ｙ軸）対１−特異性（偽陽性率、Ｘ軸）のＲＯＣプロットである。
【図８Ｅ】すい臓がんについて上位６９位にランク付けされた変数に基づくＰＬＳ−ＤＡから得られた受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットである。６つのクラス（対照、神経膠芽腫、髄膜腫、骨髄腫、すい臓がん、肺がん）について最も高い寄与を有する６９個のマーカーから構築されたＰＬＳ−ＤＡに基づく敏感度（真の陽性率、Ｙ軸）対１−特異性（偽陽性率、Ｘ軸）のＲＯＣプロットである。
【図８Ｆ】肺がんについて上位６９位にランク付けされた変数に基づくＰＬＳ−ＤＡから得られた受信者動作特性（ＲＯＣ）プロットである。６つのクラス（対照、神経膠芽腫、髄膜腫、骨髄腫、すい臓がん、肺がん）について最も高い寄与を有する６９個のマーカーから構築されたＰＬＳ−ＤＡに基づく敏感度（真の陽性率、Ｙ軸）対１−特異性（偽陽性率、Ｘ軸）のＲＯＣプロットである。
【図９Ａ】スリーウェイデータ行列からツーウェイ行列への展開を示す概略図である。
【図９Ｂ】９０個のサンプル（レプリケート）を用いて全１８２３個の変数を用いてトレーニングされたＣＰＡＮＮ（１４×１４）により得られた割り当てマップである。サンプルの数は各ニューロン上に示されている。ニューロンの色（割り当てされた標識）は、対応するニューロンの出力層におけるクラス標識（６×１バイナリーベクトル）と重みベクトルとの間の類似性に基づき決定された。全バイオマーカーを使用しているにもかかわらず、同じがんクラスのサンプル間で異なる類似性があった。レプリケートされたサンプルもまた隣接又は同一ニューロン上にマップされた。
【図９Ｃ】ＣＰＡＮＮマップの分類エラーが異なるマップサイズにて１０分割交差検証を用いて計算された。
【図９Ｄ】ＣＰＡＮＮネットワークは６９個の重み層を有し、これはモデルのトレーニングに用いられた変数の数と等しい。ｉ番目の重み層は、ｉ番目の変数（バイオマーカー）による割り当てマップのパターンへの影響を反映する。
【図９ＥＦ】割り当てマップと６９個の重み層（重みマップ）との相関を計算して、各がんクラスに関係するバイオマーカーの同定を助けることができる。また、相関は目視でも決定でき、２つのマップの相関係数の絶対値によって類似性をモニターすることができる。
【図１０Ａ】分類におけるタンパク質の重要度対タンパク質コロナナノシステム上に吸着されたタンパク質の割合を示す。パネル（ａ）〜（ｃ）は、特定のがんの予測における観測されたタンパク質−リポソーム相互作用（「変数」）の重要度を説明する。タンパク質はこれらの生理的機能によってグループ分けされる。パネル（ｄ）〜（ｆ）は各リポソーム上に吸着されたタンパク質の割合を説明する。がんの予測に関係があるものとして浮上するタンパク質−リポソームグループは、がんによってはっきり異なるである（パネル（ａ）〜（ｃ））。さらに、この差異は、これらのがんにおけるリポソーム上に吸着されたタンパク質の割合のばらつきよりも実質的により顕著である（パネル（ｄ）〜（ｆ））。
【図１０Ｂ】各リポソームのコロナ組成において同定されたユニークなタンパク質の数とこれらの組み合わせを示すベン図である（右側の表は同じデータを数値的に示す）。
【図１０Ｃ】分類における変数重要度を示す。各列は特異タンパク質の重要度を示す。各列にある３つのドットは、３つのリポソームの各々との観測された相互作用の重要度に対応する。ドット間にまたがる水平な線は、データからトレーニングセットを１０００回ランダムに取り出してトレーニングした分類器での重要度の２５パーセンタイル及び７５パーセンタイルを示す。これらの信頼区間は、依存元であるタンパク質−リポソーム相互作用の観点から、データのランダムな抽出に対するトレーニングされたモデルの「安定性」を示す。
【図１１】タンパク質−リポソーム相互作用分類がんの加重平均である。各患者グループについての絶対Ｚスコアの分布であり、１００の最も含量の多いタンパク質（灰色）及びこれまでに同定されたバイオマーカー（黒のドットを有する白）についてヒストグラムを作成した。長い黒のバーは、タンパク質−リポソーム相互作用の線形結合についてのＺスコアに対応する。特異タンパク質−リポソーム相互作用についての大きなＺスコアは、グループがその特定の相互作用において残りの患者から「分離する」ことを示す。故に図は、個別のタンパク質−リポソーム相互作用はいずれもがんの分類に十分でない一方で、その重み付けされた組み合わせにより２から２．５の標準偏差の分離を引き起こすことを示す。
【図１２】マルチリポソームは低含量でかつ稀少なタンパク質を集結させる。両対数スケールでプロットされたタンパク質コロナの寄与対既知の血漿濃度である。各点は単一のタンパク質及びリポソームを示し、各疾病の及び健康の人についてのコロナの寄与を有し、コロナの寄与及び血漿濃度はアルブミンに対して正規化されている。血漿濃度は１０の１０乗にわたって変動し、リポソームアレイはこれら同じタンパク質を１０の４乗〜５乗にわたって検出する。血漿濃度が未知／未報告であるタンパク質のコロナの寄与が右側の赤い領域にプロットされている。
【図１３】センサアレイの一部の実施形態に使用可能なナノスケールセンサ素子の種類の例を示す。さまざまな物理化学的性質（例えば異なる表面特性、サイズ及び形状）を有する異なる種類のナノ粒子（例えば有機、無機及び重合体ナノ粒子）をセンサ素子として使用することができる。センサアレイは、最低２つの素子から無制限の数の素子によって作成することができる。
【図１４】インビトロ、エクスビボ及びインビボ条件でのコロナ被覆粒子の収集の１つの方法の例を示す。粒子は生体液（例えば異なる種類の疾病を有する患者の血漿）と共にインキュベーションされ、コロナ被覆粒子が収集されて分析のために保存される。
【図１５Ａ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用前における、タンパク質コロナセンサアレイチップを作成するためのナノ物体材料（異なる物理化学的性質を有する）の基板（異なる物理化学的性質を有する）への結合の例を示す。特異タンパク質コロナが異なる物理化学的性質を有するナノ物体材料の表面上に形成される。また基板は数種類のタンパク質で被覆されてもよく、これはチップの検出の有効性にはほとんど影響しない。
【図１５Ｂ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用後における、タンパク質コロナセンサアレイチップを作成するためのナノ物体材料（異なる物理化学的性質を有する）の基板（異なる物理化学的性質を有する）への結合の例を示す。
【図１６Ａ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用前における、異なる物理化学的性質を有するナノ曲率を有するタンパク質コロナセンサアレイチップ（リソグラフィー及び型鋳造などの幅広い利用可能なアプローチにより作成される）の例を示す。特異タンパク質コロナが異なる物理化学的性質を有するナノ物体材料の表面上に形成される。また基板は数種類のタンパク質で被覆されてもよく、これはチップの検出の有効性にはほとんど影響しない。
【図１６Ｂ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用後における、異なる物理化学的性質を有するナノ曲率を有するタンパク質コロナセンサアレイチップ（リソグラフィー及び型鋳造などの幅広い利用可能なアプローチにより作成される）の例を示す。特異タンパク質コロナが異なる物理化学的性質を有するナノ物体材料の表面上に形成される。また基板は数種類のタンパク質で被覆されてもよく、これはチップの検出の有効性にはほとんど影響しない。
【図１７Ａ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用前における、タンパク質コロナセンサアレイマイクロ／ナノ流体チップを作成するためのナノ物体材料（異なる物理化学的性質を有する）の基板（異なる物理化学的性質を有する）への結合の例を示す。特異タンパク質コロナが異なる物理化学的性質を有するナノ物体材料の表面上に形成される。また基板は数種類のタンパク質で被覆されてもよく、これはチップの検出の有効性にはほとんど影響しない。
【図１７Ｂ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用後における、タンパク質コロナセンサアレイマイクロ／ナノ流体チップを作成するためのナノ物体材料の基板への結合の例を示す。特異タンパク質コロナが異なる物理化学的性質を有するナノ物体材料の表面上に形成される。
【図１８Ａ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用前における、異なる物理化学的性質を有するナノ曲率を有するタンパク質コロナセンサアレイマイクロ／ナノ流体チップ（リソグラフィー及び型鋳造などの幅広い利用可能なアプローチにより作成される）の例を示す。
【図１８Ｂ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用後における、異なる物理化学的性質を有するナノ曲率を有するタンパク質コロナセンサアレイマイクロ／ナノ流体チップ（リソグラフィー及び型鋳造などの幅広い利用可能なアプローチにより作成される）の例を示す。
【図１９Ａ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用前における、タンパク質コロナセンサアレイチップを作成するためのランダムオーダーナノ物体材料（異なる物理化学的性質を有する）の基板（異なる物理化学的性質を有する）への結合の例を示す。
【図１９Ｂ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用後における、タンパク質コロナセンサアレイチップを作成するためのランダムオーダーナノ物体材料（異なる物理化学的性質を有する）の基板（異なる物理化学的性質を有する）への結合の例を示す。
【図２０Ａ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用前における、異なる物理化学的性質を有するランダムオーダーナノ曲率を有するタンパク質コロナセンサアレイチップ（リソグラフィー及び型鋳造などの幅広い利用可能なアプローチにより作成される）の例を示す。
【図２０Ｂ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用後における、異なる物理化学的性質を有するランダムオーダーナノ曲率を有するタンパク質コロナセンサアレイチップ（リソグラフィー及び型鋳造などの幅広い利用可能なアプローチにより作成される）の例を示す。
【図２１Ａ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用前における、タンパク質コロナセンサアレイマイクロ／ナノ流体チップを作成するためのランダムオーダーナノ物体材料（異なる物理化学的性質を有する）の基板（異なる物理化学的性質を有する）への結合の例を示す。
【図２１Ｂ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用後における、タンパク質コロナセンサアレイマイクロ／ナノ流体チップを作成するためのランダムオーダーナノ物体材料の基板への結合の例を示す。
【図２２Ａ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用前における、異なる物理化学的性質を有するランダムオーダーナノ曲率を有するタンパク質コロナセンサアレイマイクロ／ナノ流体チップ（リソグラフィー及び型鋳造などの幅広い利用可能なアプローチにより作成される）の例を示す。
【図２２Ｂ】タンパク質源（例えば各種疾病のヒト血漿）との相互作用後における、異なる物理化学的性質を有するランダムオーダーナノ曲率を有するタンパク質コロナセンサアレイマイクロ／ナノ流体チップ（リソグラフィー及び型鋳造などの幅広い利用可能なアプローチにより作成される）の例を示す。
【図２３】ナノ粒子（ＮＰ）の（代表的な基板としての）シリカ基板表面への、シリカ基板表面上のアミノ基とナノ粒子表面上のカルボン酸基との間のアミド化反応を介する結合の例を示す。
【図２４】ナノ粒子の（代表的な基板としての）シリカ基板表面への、シリカ基板表面上のエポキシ基とナノ粒子表面上のアミノ基との間の開環反応を介する結合の例を示す。
【図２５】ナノ粒子の（代表的な基板としての）シリカ基板表面への、シリカ基板表面上のマレイミド基とナノ粒子表面上のチオール又はアミノ基との間のマイケル付加反応を介する結合の例を示す。
【図２６】ナノ粒子の（代表的な基板としての）シリカ基板表面への、シリカ基板表面上のイソシアン酸基とナノ粒子表面上のハイドロキシル又はアミノ基との間のウレタン化反応を介する結合の例を示す。
【図２７】ナノ粒子の（代表的な基板としての）シリカ基板表面への、シリカ基板表面上のチオール基とナノ粒子表面上のチオール基との間の酸化反応を介する結合の例を示す。
【図２８】ナノ粒子の（代表的な基板としての）シリカ基板表面への、シリカ基板表面上のアジド基とナノ粒子表面上のアルキン基との間の「クリック」ケミストリーを介する結合の例を示す。
【図２９】ナノ粒子の（代表的な基板としての）シリカ基板表面への、シリカ基板表面上の２−ピリジンチオール基とナノ粒子表面上のチオール基との間のチオール交換反応を介する結合の例を示す。
【図３０】ナノ粒子の（代表的な基板としての）シリカ基板表面への、シリカ基板表面上のボロン酸基とナノ粒子表面上のジオール基との間の配位反応を介する結合の例を示す。
【図３１】ナノ粒子の（代表的な基板としての）シリカ基板表面への、シリカ基板表面上のＣ＝Ｃ結合とナノ粒子表面上のＣ＝Ｃ結合との間のＵＶ光照射付加反応を介する結合の例を示す。
【図３２】Ａｕ−チオール結合を介する（代表的な基板としての）金基板表面へのナノ粒子の結合の例を示す。
【図３３】ナノ粒子の（代表的な基板としての）金基板表面への、金基板表面上のカルボン酸基とナノ粒子表面上のアミノ基との間のアミド化反応を介する結合の例を示す。
【図３４】ナノ粒子の（代表的な基板としての）金基板表面への、金基板表面上のアジド基とナノ粒子表面上のアルキン基との間の「クリック」ケミストリーを介する結合の例を示す。
【図３５】ナノ粒子の（代表的な基板としての）金基板表面への、金基板表面上のＮＨＳ基とナノ粒子表面上のアミノ基との間のウレタン化反応を介する結合の例を示す。
【図３６】ナノ粒子の（代表的な基板としての）金基板表面への、金基板表面上のエポキシ基とナノ粒子表面上のアミノ基との間の開環反応を介する結合の例を示す。
【図３７】ナノ粒子の（代表的な基板としての）金基板表面への、金基板表面上のボロン酸基とナノ粒子表面上のジオール基との間の配位反応を介する結合の例を示す。
【図３８】ナノ粒子の（代表的な基板としての）金基板表面への、金基板表面上のＣ＝Ｃ結合とナノ粒子表面上のＣ＝Ｃ結合との間のＵＶ光照射付加反応を介する結合の例を示す。
【図３９】ナノ粒子の（代表的な基板としての）金基板表面への、金基板表面上のビオチンとナノ粒子表面上のアビジンとの間の「リガンド−レセプター」相互作用を介する結合の例を示す。
【図４０】ナノ粒子の（代表的な基板としての）金基板表面への、金基板表面上のａ−サイクロデキストリン（ａ−ＣＤ）とナノ粒子表面上のアダマンティン（Ａｄ）との間の「ホスト−ゲスト」相互作用を介する結合の例を示す。
【図４１】ナノ粒子の表面からのタンパク質の解離及びこれらのコロナ組成分析を示す。疾病の同定及び区別のための教師付き及び教師なしアプローチを用いたタンパク質コロナセンサアレイデータの分析である。
【図４２】（ａ）〜（ｄ）は、蛍光及び発光読み出しのためのランダムオーダーナノスケールセンサ素子を有するセンサアレイの例である。
【図４３】（ａ）〜（ｄ）は、蛍光及び発光読み出しのためのオーダーナノスケールセンサ素子を有するセンサアレイの例である。
【図４４Ａ】異なる機能基（未修飾、アミン修飾（ＮＨ2）及びカルボキシル基修飾（ＣＯＯＨ））を有する非被覆(bare)ポリスチレン及びシリカナノ粒子の特性評価であり、用いられた３つの異なるポリスチレンナノ粒子（未修飾、Ｐ−ＮＨ2及びＰ−ＣＯＯＨ）と、これらのサイズ、非被覆粒子のＤＬＳ及びゼータ電位を示す。
【図４４Ｂ】異なる官能基（未修飾、アミン修飾（ＮＨ2）及びカルボキシル基修飾（ＣＯＯＨ））を有する非被覆ポリスチレン及びシリカナノ粒子の特性評価であり、用いられた３つの異なるシリカナノ粒子（未修飾、Ｓ−ＮＨ2及びＳ−ＣＯＯＨ）と、これらのサイズ、ＤＬＳ及びゼータ電位を示す。
【図４４Ｃ】異なる官能基（未修飾、アミン修飾（ＮＨ2）及びカルボキシル基修飾（ＣＯＯＨ））を有する非被覆ポリスチレン及びシリカナノ粒子の特性評価であり、非被覆ポリスチレンナノ粒子のＴＥＭを示す。
【図４４Ｄ】異なる官能基（未修飾、アミン修飾（ＮＨ2）及びカルボキシル基修飾（ＣＯＯＨ））を有する非被覆ポリスチレン及びシリカナノ粒子の特性評価であり、非被覆シリカナノ粒子のＴＥＭを示す。
【図４５Ａ】異なる官能基（未修飾、アミン修飾（ＮＨ2）及びカルボキシル基修飾（ＣＯＯＨ））を有するタンパク質コロナ被覆ポリスチレン及びシリカナノ粒子の特性評価であり、タンパク質コロナが載ったポリスチレンナノ粒子のＤＬＳ及びゼータ電位を示す。
【図４５Ｂ】異なる官能基（未修飾、アミン修飾（ＮＨ2）及びカルボキシル基修飾（ＣＯＯＨ））を有するタンパク質コロナ被覆ポリスチレン及びシリカナノ粒子の特性評価であり、タンパク質コロナが載ったシリカナノ粒子のＤＬＳ及びゼータ電位を示す。
【図４５Ｃ】異なる官能基（未修飾、アミン修飾（ＮＨ2）及びカルボキシル基修飾（ＣＯＯＨ））を有するタンパク質コロナ被覆ポリスチレン及びシリカナノ粒子の特性評価であり、タンパク質コロナが載ったポリスチレンナノ粒子のＴＥＭを示す。
【図４５Ｄ】異なる官能基（未修飾、アミン修飾（ＮＨ2）及びカルボキシル基修飾（ＣＯＯＨ））を有するタンパク質コロナ被覆ポリスチレン及びシリカナノ粒子の特性評価であり、タンパク質コロナが載ったシリカナノ粒子のＴＥＭを示す。
【図４６】ポリスチレン及びシリカナノ粒子を用いてスクリーニングしたがん血漿サンプルの種類の図である。
【図４７】ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて分析された、異なるがんを有する患者の血漿とともにインキュベーションされた後の、未修飾の、アミン修飾及びカルボキシル基修飾された表面を有するポリスチレン及びシリカナノ粒子（１００ｎｍ）のタンパク質コロナプロファイルである。
【図４８】ＳＤＳ−Ｐａｇｅを用いて分析された、健康者の血漿とともにインキュベーションされた後の、未修飾の、アミン修飾及びカルボキシル基修飾された表面を有するポリスチレン及びシリカナノ粒子（１００ｎｍ）のタンパク質コロナプロファイルである。
【図４９】本発明のセンサアレイを用いて健康者とがん患者とが分離されたことを示すプロットである。
【図５０Ａ】ＣＡＤスクリーニングのために用いられたポリスチレン及びシリカナノ粒子の特性評価を示し、非被覆の、ＣＡＤ、ＣＡＤなし及び対照の処理済ナノ粒子のプロファイルを示す。
【図５０Ｂ】ＣＡＤスクリーニングのために用いられたポリスチレン及びシリカナノ粒子の特性評価を示し、ナノ粒子の異なるグループについてのゼータ電位を示す。
【図５０Ｃ】ＣＡＤスクリーニングのために用いられたポリスチレン及びシリカナノ粒子の特性評価を示し、ＣＡＤスクリーニングにおけるナノ粒子の異なるグループについてのＴＥＭを示す。
【図５１Ａ】ＣＡＤ、ＣＡＤなし及びＣＡＤのリスクがない（対照）ナノ粒子の分析から得られた異なるタンパク質コロナのタンパク質濃度を示し、異なるタンパク質コロナのタンパク質濃度のブラッドフォードアッセイを示す。
【図５１Ｂ】ＣＡＤ、ＣＡＤなし及びＣＡＤのリスクがない（対照）ナノ粒子の分析から得られた異なるタンパク質コロナのタンパク質濃度を示し、個別化されたタンパク質コロナプロファイルが分析され１Ｄ−ＳＤＳ−ＰＡＧＥで比較されたことを示す。
【図５１Ｃ】ＣＡＤ、ＣＡＤなし及びＣＡＤのリスクがない（対照）ナノ粒子の分析から得られた異なるタンパク質コロナのタンパク質濃度を示し、デンシトメトリーによるゲル分析によってＣＡＤ、ＣＡＤなし及び対照のタンパク質コロナ（ＰＣ）におけるタンパク質の量の違いが決定されたことを示す。
【図５２−１】ＰＣにおける上位２０含量タンパク質のパーセンテージ寄与の違いを示すバーである。
【図５２−２】ＰＣにおける上位２０含量タンパク質のパーセンテージ寄与の違いを示すバーである。
【図５２−３】ＰＣにおける上位２０含量タンパク質のパーセンテージ寄与の違いを示すバーである。
【図５２−４】ＰＣにおける上位２０含量タンパク質のパーセンテージ寄与の違いを示すバーである。
【図５２−５】ＰＣにおける上位２０含量タンパク質のパーセンテージ寄与の違いを示すバーである。
【図５２−６】ＰＣにおける上位２０含量タンパク質のパーセンテージ寄与の違いを示すバーである。
【図５３】タンパク質コロナ被覆ナノ粒子によって作成されたフィンガープリントの分析による、対象のＣＡＤ、ＣＡＤなし及び対照への分類を示すプロットである。
【図５４Ａ】アルツハイマー病血漿中でのインキュベーション後のナノ粒子の合成の及び生物学的アイデンティティを示す。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ（商標）によるナノ粒子トラッキング解析（サイズ）。ＡＤタンパク質コロナで被覆される前後のポリスチレンナノ粒子。非被覆ナノ粒子は９０〜１００ｎｍであり、サイズが均等である。アルツハイマー病（ＡＤ）タンパク質コロナ（ＰＣ）被覆ナノ粒子はより大きく、サイズはより不均一である。各測定の強度プロファイル及び散布図が報告された。値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。
【図５４Ｂ】アルツハイマー病血漿中でのインキュベーション後のナノ粒子の合成の及び生物学的アイデンティティを示す。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ（商標）によるナノ粒子トラッキング解析（サイズ）。アルツハイマー病タンパク質コロナで被覆される前後のシリカナノ粒子。非被覆ナノ粒子は９０〜１００ｎｍであり、サイズが均等である。アルツハイマー病タンパク質コロナ被覆ナノ粒子はより大きく、サイズはより不均一である。各測定の強度プロファイル及び散布図が報告された。値は平均±ＳＤ（ｎ＝３）である。
【図５５−１】ＴＥＭ分析である。ＡＤタンパク質コロナで被覆する前後のナノ粒子を、形態学及びサイズの電位変化を評価するために透過型電子顕微鏡で分析した。Ｐ：ポリスチレン；ＰＮ：ポリスチレン−ＮＨ2；ＰＣ：ポリスチレン−ＣＯＯＨ；Ｓ：シリカ；ＳＮ：シリカ−ＮＨ2；ＳＣ：シリカ−ＣＯＯＨ。全ナノ粒子において血漿中でのインキュベーション後にサイズの増大が見られた。
【図５５−２】ＴＥＭ分析である。ＡＤタンパク質コロナで被覆する前後のナノ粒子を、形態学及びサイズの電位変化を評価するために透過型電子顕微鏡で分析した。Ｐ：ポリスチレン；ＰＮ：ポリスチレン−ＮＨ2；ＰＣ：ポリスチレン−ＣＯＯＨ；Ｓ：シリカ；ＳＮ：シリカ−ＮＨ2；ＳＣ：シリカ−ＣＯＯＨ。全ナノ粒子において血漿中でのインキュベーション後にサイズの増大が見られた。
【図５６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及び結合のデンシトメリー分析である。ローディング順は、Ｐ、Ｐ−ＮＨ2、Ｐ−ＣＯＯＨ、Ｓ、Ｓ−ＮＨ2、Ｓ−ＣＯＯＨであり、ここでＰ：ポリスチレン；ＰＮ：ポリスチレン−ＮＨ2；ＰＣ：ポリスチレン−ＣＯＯＨ；Ｓ：シリカ；ＳＮ：シリカ−ＮＨ2；ＳＣ：シリカ−ＣＯＯＨである。個別化されたタンパク質コロナプロファイルを分析してＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて比較した。アルツハイマー病のタンパク質コロナの４つの代表的なゲルと１つの健康なタンパク質コロナが示された。ナノ粒子上に吸着された血漿タンパク質に対する結合の強度をＩｍａｇｅＪで分析した（ｙ軸：強度、ｘ軸：分子量）。
【図５７】健康とＡＤ病の分類。白のドットはＡＤであり、黒のドットは健康なサンプルである。
【図５８】同体積（左、１０ｕｌ）ローディングされた又は同量（右、１０ｕｇ）を用いた異なる粒径のシリカナノ粒子（ＮＰ）のＳＤＳ−Ｐａｇｅゲル分析である。
【図５９】生体分子コロナ中に核酸が存在することを証明するために行われた実験を示す概略図である。
【図６０】３つの異なるナノ粒子に結合した核酸のアガロースゲル分析である。
【図６１−１】血漿中の核酸含量の分析である。
【図６１−２】血漿中の核酸含量の分析である。
【図６２−１】尿素によってコロナからタンパク質が解離した際のナノ粒子の生体分子コロナに関連する核酸量の分析である。
【図６２−２】尿素によってコロナからタンパク質が解離した際のナノ粒子の生体分子コロナに関連する核酸量の分析である。
【図６３−１】粒子の表面からコロナタンパク質が解離しなかった際のナノ粒子の生体分子コロナに関連する核酸量の分析である。
【図６３−２】粒子の表面からコロナタンパク質が解離しなかった際のナノ粒子の生体分子コロナに関連する核酸量の分析である。
【図６４−１】核酸が最初に精製キットを用いて血漿から精製され、その後ナノ粒子とインキュベーションされた際のナノ粒子の生体分子コロナに関連する核酸量の分析である。
【図６４−２】核酸が最初に精製キットを用いて血漿から精製され、その後ナノ粒子とインキュベーションされた際のナノ粒子の生体分子コロナに関連する核酸量の分析である。
【図６５】複雑な生体サンプルの状態を区別する方法の概略図である。
【図６６】コンピュータシステムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は一以上の好ましい実施形態に関して記載され、明記されたもの以外の多くの同等のもの、代替のもの、バリエーション及び修正したものが可能であるとともに本発明の範囲内である。
【００３１】
本発明は、対象における疾病状態の予後診断、診断及び発見に使用されるセンサアレイ及び方法を提供する。本発明のセンサアレイは、特定の生体分子を検出する個別のセンサを含む既知のセンサアレイと異なる。本発明のセンサアレイでは、システムは特定の生体分子の有無又は特定の疾病マーカーの量に頼らないことから生体分子は既知である必要はない。この新規のセンサアレイは、異なるセンサ素子と関連した生体分子コロナの組成の変化を検出することが可能である。（異なるセンサ素子に関連した実際の生体分子の又は各センサ素子に関連した各生体分子の量及び／若しくは組み合わせの）相対変化又はパターンを検出するこの能力によって、各アレイについてユニークな生体分子フィンガープリントを決定することができる。この生体分子フィンガープリントによって、対象の異なる健康状態及び疾病状態を階級化することができる。一部の実施形態において、生体分子フィンガープリントは、健康な対象と疾病又は障害の種々の異なるステージにある対象とを区別することができるだけでなく、対象において疾病又は障害が後に進行するような病気にかかる前の状態を決定することもできる。これは、疾病の進行の傾向（例えば変化又は可能性）を提供するために疾病又は障害に関連した特異バイオマーカーを測定又は検出する技術におけるシステムとは大きく異なるとともに新規のものである。本発明のセンサ及び方法は、あらゆる兆候又は症状が現れる前に疾病を検出することが可能であり、換言すればあらゆる具体的な兆候又は症状が現れる前に疾病を事前に診断することができる。
【００３２】
本発明のユニークな点は、このような対象からのサンプルからの生体分子フィンガープリントの認識と、一連のヘルスケアにおいてこの対象の疾病状態を決定するための能力との組み合わせである。
【００３３】
本発明は、センサ素子、たとえばナノ分子、の表面が、生体サンプルに接触したときにタンパク質を含む異なる生体分子の層によって急速に被覆されて「生体分子コロナ」を形成することを示した本発明者らの研究に基づいている。これらの生体分子コロナを構成する生体分子の種類、量及びカテゴリは、センサ素子自体の物理化学的性質並びに異なる生体分子それ自体及びセンサ素子間の複雑な相互作用に強く関係する。これらの相互作用により、各センサ素子についてユニークな生体分子コロナシグネチャーが生成される。換言すれば、どの生体分子がセンサ素子と相互作用するかによって、生体分子コロナの構成に影響があるだけでなく、その特定のセンサ素子と相互作用できる他の異なる生体分子も変わる可能性がある。
【００３４】
各々自身の生体分子コロナシグネチャーを有する異なるセンサ素子は、サンプルと接触してそのサンプルについてのユニークな生体分子フィンガープリントを生成することができる。次にこのフィンガープリントを用いて対象の疾病状態を決定することができる。本発明の実施形態について以下により詳細に説明する。
【００３５】
本発明は、複数のセンサ素子を備える、これらから主に構成される又はこれらから構成されるセンサアレイを提供し、複数のセンサ素子は、少なくとも物理化学的性質が互いに異なる。一部の実施形態において、各センサ素子は、生体分子コロナシグネチャーを生成するためにサンプル中の複数の生体分子を結合させることが可能である。一部の実施形態では、各センサ素子は区別可能な(distinct)生体分子コロナシグネチャーを有する。
【００３６】
複数のセンサ素子は、サンプルと接触したときに複数の生体分子コロナシグネチャーを生成し、これらは共同で生体分子フィンガープリントを形成する。「生体分子フィンガープリント」とは、複数のセンサ素子についての少なくとも２つの生体分子コロナシグネチャーからなる生体分子の合成組成又はパターン(combined composition or pattern)である。
【００３７】
本明細書で用いる場合、「センサ素子」との用語は、サンプルと接触したときに複数の生体分子に結合可能な素子を指し、「ナノスケールセンサ素子」との用語を包含する。一実施形態では、センサ素子は、少なくとも一方向において約５ナノメータ〜約５００００ナノメータの素子である。好適なセンサ素子は、例えば、以下に限定されないが、少なくとも一方向において約５ｎｍ〜約５０，０００ｎｍのセンサ素子を含み、約５ｎｍ〜約４０，０００ｎｍあるいは約５ｎｍ〜約３０，０００ｎｍあるいは約５ｎｍ〜約２０，０００ｎｍあるいは約５ｎｍ〜約１０，０００ｎｍあるいは約５ｎｍ〜約５０００ｎｍあるいは約５ｎｍ〜約１０００ｎｍあるいは約５ｎｍ〜約５００ｎｍあるいは約５ｎｍ〜約５０ｎｍあるいは約１０ｎｍ〜約１００ｎｍあるいは約２０ｎｍ〜約２００ｎｍあるいは約３０ｎｍ〜約３００ｎｍあるいは約４０ｎｍ〜約４００ｎｍあるいは約５０ｎｍ〜約５００ｎｍあるいは約６０ｎｍ〜約６００ｎｍあるいは約７０ｎｍ〜約７００ｎｍあるいは約８０ｎｍ〜約８００ｎｍあるいは約９０ｎｍ〜約９００ｎｍあるいは約１００ｎｍ〜約１０００ｎｍあるいは約１，０００ｎｍ〜約１０，０００ｎｍあるいは約１０，０００ｎｍ〜約５０，０００ｎｍ及びこれらの間のあらゆる組み合わせ又は量のセンサ素子を含む（例えば、５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１２５ｎｍ、１５０ｎｍ、１７５ｎｍ、２００ｎｍ、２２５ｎｍ、２５０ｎｍ、２７５ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍ、１２００ｎｍ、１３００ｎｍ、１４００ｎｍ、１５００ｎｍ、１６００ｎｍ、１７００ｎｍ、１８００ｎｍ、１９００ｎｍ、２０００ｎｍ、２５００ｎｍ、３０００ｎｍ、３５００ｎｍ、４０００ｎｍ、４５００ｎｍ、５０００ｎｍ、５５００ｎｍ、６０００ｎｍ、６５００ｎｍ、７０００ｎｍ、７５００ｎｍ、８０００ｎｍ、８５００ｎｍ、９０００ｎｍ、１０００ｎｍ、１１０００ｎｍ、１２０００ｎｍ、１３０００ｎｍ、１４０００ｎｍ、１５０００ｎｍ、１６０００ｎｍ、１７０００ｎｍ、１８０００ｎｍ、１９０００ｎｍ、２００００ｎｍ、２５０００ｎｍ、３００００ｎｍ、３５０００ｎｍ、４００００ｎｍ、４５０００ｎｍ、５００００ｎｍ及びこれらの間のあらゆる数）。ナノスケールセンサ組織とは、少なくとも一方向において１マイクロメートル未満のセンサ素子を指す。ナノスケールセンサ素子の範囲の好適な例は、以下に限定されないが、例えば、一方向において約５ｎｍ〜約１０００ｎｍの素子を含み、例えば約５ｎｍ〜約５００ｎｍあるいは約５ｎｍ〜約４００ｎｍあるいは約５ｎｍ〜約３００ｎｍあるいは約５ｎｍ〜約２００ｎｍあるいは約５ｎｍ〜約１００ｎｍあるいは約５ｎｍ〜約５０ｎｍあるいは約１０ｎｍ〜約１０００ｎｍあるいは約１０ｎｍ〜約７５０ｎｍあるいは約１０ｎｍ〜約５００ｎｍあるいは約１０ｎｍ〜約２５０ｎｍあるいは約１０ｎｍ〜約２００ｎｍあるいは約１０ｎｍ〜約１００ｎｍあるいは約５０ｎｍ〜約１０００ｎｍあるいは約５０ｎｍ〜約５００ｎｍあるいは約５０ｎｍ〜約２５０ｎｍあるいは約５０ｎｍ〜約２００ｎｍあるいは約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ及びこれらの間のあらゆる組み合わせ、範囲又は量  の素子を含む（例えば、５ｎｍ、１０ｎｍ、１５ｎｍ、２０ｎｍ、２５ｎｍ、３０ｎｍ、３５ｎｍ、４０ｎｍ、４５ｎｍ、５０ｎｍ、５５ｎｍ、６０ｎｍ、６５ｎｍ、７０ｎｍ、８０ｎｍ、９０ｎｍ、１００ｎｍ、１２５ｎｍ、１５０ｎｍ、１７５ｎｍ、２００ｎｍ、２２５ｎｍ、２５０ｎｍ、２７５ｎｍ、３００ｎｍ、３５０ｎｍ、４００ｎｍ、４５０ｎｍ、５００ｎｍ、５５０ｎｍ、６００ｎｍ、６５０ｎｍ、７００ｎｍ、７５０ｎｍ、８００ｎｍ、８５０ｎｍ、９００ｎｍ、１０００ｎｍなど）。本明細書に記載のセンサアレイに関して、センサ素子との用語の使用は、センサ及び関連方法についてナノセンサ素子を用いることを含む。
【００３８】
「複数のセンサ素子」との用語は、２以上、例えば少なくとも２つのセンサ素子を指す。一部の実施形態では、複数のセンサ素子は、少なくとも２つのセンサ素子から少なくとも１０００個のセンサ素子を含み、好ましくは約２つのセンサ素子から約１００個のセンサ素子を含む。好適な例では、前記アレイは、少なくとも２つから少なくとも１００個のセンサ素子、あるいは少なくとも２つから少なくとも５０個のセンサ素子、あるいは少なくとも２つから少なくとも３０個のセンサ素子、あるいは少なくとも２つから少なくとも２０個のセンサ素子、あるいは少なくとも２つから少なくとも１０個のセンサ素子、あるいは少なくとも３つから少なくとも５０個のセンサ素子、あるいは少なくとも３つから少なくとも３０個のセンサ素子、あるいは少なくとも３つから少なくとも２０個のセンサ素子、あるいは少なくとも３つから少なくとも１０個のセンサ素子、あるいは少なくとも４つから少なくとも５０個のセンサ素子、あるいは少なくとも４つから少なくとも３０個のセンサ素子、あるいは少なくとも４つから少なくとも２０個のセンサ素子、あるいは少なくとも４つから少なくとも１０個のセンサ素子を備えるとともに、これらの間で考えられるあらゆる数のセンサ素子を含む（例えば、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１１０，１２０，１３０，１４０，１５０，１６０，１７０，１８０，１９０，２００，２２５，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００など）。一部の実施形態では、センサアレイは、少なくとも６つのセンサ素子から少なくとも２０個のセンサ素子を備え、あるいは少なくとも６つのセンサ素子から少なくとも１０個のセンサ素子を備える。
【００３９】
「複数のナノスケールセンサ素子」との用語は、２以上の、例えば少なくとも２つのナノスケールセンサ素子を指す。一部の実施形態では、複数のナノスケールセンサ素子は、少なくとも２つのサノスケールセンサ素子から少なくとも１０００個のナノスケールセンサ素子を含み、好ましくは約２つのナノスケールセンサ素子から少なくとも１００個のナノスケールセンサ素子を含む。好適な実施形態では、前記アレイは、少なくとも２つから少なくとも１００個のナノスケールセンサ素子、あるいは少なくとも２つから少なくとも５０個のナノスケールセンサ素子、あるいは少なくとも２つから少なくとも３０個のナノスケールセンサ素子、あるいは少なくとも２つから少なくとも２０個のナノスケールセンサ素子、あるいは少なくとも２つから少なくとも１０個のナノスケールセンサ素子、あるいは少なくとも３つから少なくとも５０個のナノスケールセンサ素子、あるいは少なくとも３つから少なくとも３０個のナノスケールセンサ素子、あるいは少なくとも３つから少なくとも２０個のナノスケールセンサ素子、あるいは少なくとも３つから少なくとも１０個のナノスケールセンサ素子、あるいは少なくとも４つから少なくとも５０個のナノスケールセンサ素子、あるいは少なくとも４つから少なくとも３０個のナノスケールセンサ素子、あるいは少なくとも４つから少なくとも２０個のナノスケールセンサ素子、あるいは少なくとも４つから少なくとも１０個のナノスケールセンサ素子を備えるとともに、これらの間で考えられるあらゆる数のナノスケールセンサ素子を含んでもよい（例えば、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１１０，１２０，１３０，１４０，１５０，１６０，１７０，１８０，１９０，２００，２２５，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００など）。
【００４０】
本明細書で用いる場合、「生体分子コロナ」との用語は、センサ素子に結合可能な複数の異なる生体分子を指す。「生体分子コロナ」との用語は、当該分野において生体サンプル又は生体システムと接触したときにナノ粒子に結合するタンパク質、脂質及び他の血漿成分を指す用語である「タンパク質コロナ」を包含する。また、本明細書で用いる場合、「生体分子コロナ」との用語は、当該分野においてそうであるようにソフト及びハード両方のタンパク質コロナを包含する。これについては、例えばMilani et al. "Reversible versus Irreversible Binding of Transferring to Polystyrene Nanoparticles: Soft and Hard Corona" ACS NANO, 2012, 6(3), pp. 2532-2541; Mirshafiee et al. "Impact of protein pre-coating on the protein corona composition and nanoparticle cellular uptake" Biomaterials vol. 75, Jan 2016 pp. 295-304, Mahmoudi et al. "Emerging understanding of the protein corona at the nano-bio interfaces" Nanotoday  11(6) Dec. 2016, pp. 817-832, and Mahmoudi et al. "Protein-Nanoparticle Interactions: Opportunities and Challenges" Chem. Rev., 2011, 111(9), pp. 5610-5637参照。これらの内容はその全体が参照により本明細書に盛り込まれる。これらの先行技術文献に記載されるように、吸着曲線は、単層飽和の点（幾何学的に定義されたタンパク質対ＮＰ比における）に至るまで強く結合した単層の構築を示し、それをこえると２次的な弱く結合した層が形成される。第１の層が不可逆的に結合した（ハードコロナ）のに対し、第２の層（ソフトコロナ）は動的な交換を示す。高い親和性で吸着するタンパク質は、簡単には脱着しない強く結合したタンパク質からなるいわゆる「ハード」コロナを形成し、低い親和性で吸着するタンパク質は、弱く結合したタンパク質からなるいわゆる「ソフト」コロナを形成する。また、ソフト及びハードコロナは、これらの交換時間に基づいて定義することもできる。ハードコロナは、大抵、数時間のオーダーのかなり大きい交換時間を示す。例えば、M. Rahman et al. Protein-Nanoparticle Interactions, Spring Series in Biophysics 15, 2013参照。この文献は全体が参照により本明細書に盛り込まれる。
【００４１】
「生体分子コロナシグネチャー」との用語は、各個別センサに結合した異なる生体分子の組成、シグネチャー又はパターンを指す。このシグネチャーは異なる生体分子を指すだけではなく、センサ素子に結合した生体分子の量、レベル若しくは分量の差又はセンサ素子に結合した生体分子の立体配座状態も指す。各センサ素子の生体分子コロナシグネチャーは、同じ生体分子をいくつか含んでもよく、及び／又は他のセンサ素子に関する別の生体分子を含んでもよく、及び／又は生体分子のレベル若しくは分量、種類若しくは確証が異なってもよい。生体分子コロナシグネチャーは、センサ素子の物理化学的性質だけでなくサンプルの性質及び暴露時間に依存してもよい。一部の実施形態では、生体分子コロナシグネチャーはタンパク質コロナシグネチャーである。別のケースでは、生体分子コロナシグネチャーは多糖類コロナシグネチャーである。さらに別のケースでは、生体分子コロナシグネチャーは代謝物質コロナシグネチャーである。一部の実施形態では、生体分子コロナシグネチャーはリピドミックコロナシグネチャーである。
【００４２】
一部の実施形態では、生体分子コロナシグネチャーは、ソフトコロナ及びハードコロナでみつけられた生体分子を備える。一部の実施形態では、ソフトコロナはソフトタンパク質コロナである。一部の実施形態では、ハードコロナはハードタンパク質コロナである。
【００４３】
「生体分子」との用語は、コロナ形成に伴われ得る生体コンポーネントを指し、例えばタンパク質、ポリペプチド、多糖類、糖質、脂質、リポ蛋白、代謝物、オリゴヌクレオチド、メタボローム又はこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない。各センサ素子の生体分子コロナシグネチャーは同じ生体分子をいくつか含んでもよく、及び／又は他のセンサ素子に関する別の生体分子を含んでもよく、及び／又は各センサ素子に結合する生体分子のレベル若しくは分量、種類若しくは確証が異なってもよい。一実施形態では、生体分子は、タンパク質、核酸、脂質及びメタボロームのグループから選択される。
【００４４】
一部の実施形態において、センサアレイは、前記センサアレイが生体サンプルに接触したときに、第１生体分子コロナシグネチャーを生成する第１センサ素子と、少なくとも１つの第２生体分子コロナシグネチャーを生成する少なくとも１つの第２センサ素子と、を備える又は主にこれらから構成される又はこれらから構成される。生体分子フィンガープリントは、第１生体分子シグネチャーと少なくとも１つの第２生体分子コロシグネチャーとの組み合わせである。生体分子シグネチャーは、少なくとも２つの生体分子コロナシグネチャーから多くの異なる生体分子シグネチャーまで、例えば少なくとも１０００個の異なる生体分子コロナシグネチャーから構成され得る。生体分子コロナを、各素子についての生体分子コロナシグネチャーを決定するために各センサ素子について別々に分析（アッセイ）し、生体分子フィンガープリントを決定するために組み合わせてもよく、あるいは２以上の生体分子コロナを同時に分析して生体分子フィンガープリントを一度に作成してもよい。
【００４５】
一部の実施形態では、生体分子フィンガープリントは、少なくとも２つの生体分子コロナシグネチャーを含む。一部の実施形態では、生体分子フィンガープリントは、少なくとも２つの生体分子コロナシグネチャーから少なくとも１０００個の生体分子コロナシグネチャーを含み、好ましくは約２つの生体分子コロナシグネチャーから約１００個の生体分子コロナシグネチャーを含む。好適な例では、生体分子フィンガープリントは、少なくとも２つから少なくとも１００個の生体分子コロナシグネチャーを含み、あるいは少なくとも２つから少なくとも５０個の生体分子コロナシグネチャーを含み、あるいは少なくとも２つから少なくとも３０個の生体分子コロナシグネチャーを含み、あるいは少なくとも２つから少なくとも２０個の生体分子コロナシグネチャーを含み、あるいは少なくとも２つから少なくとも１０個の生体分子コロナシグネチャーを含み、あるいは少なくとも３つから少なくとも５０個の生体分子コロナシグネチャーを含み、あるいは少なくとも３つから少なくとも３０個の生体分子コロナシグネチャーを含み、あるいは少なくとも３つから少なくとも２０個の生体分子コロナシグネチャーを含み、あるいは少なくとも３つから少なくとも１０個の生体分子コロナシグネチャーを含み、あるいは少なくとも４つから少なくとも５０個の生体分子コロナシグネチャーを含み、あるいは少なくとも４つから少なくとも３０個の生体分子コロナシグネチャーを含み、あるいは少なくとも４つから少なくとも２０個の生体分子コロナシグネチャーを含み、あるいは少なくとも４つから少なくとも１０個の生体分子コロナシグネチャーを含み、これらの間で考えられるあらゆる数の生体分子コロナシグネチャーを含む（例えば、少なくとも２，３，４，５，６，７，８，９，１０，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２０，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，２８，２９，３０，３１，３２，３３，３４，３５，３６，３７，３８，３９，４０，４１，４２，４３，４４，４５，４６，４７，４８，４９，５０，６０，７０，８０，９０，１００，１１０，１２０，１３０，１４０，１５０，１６０，１７０，１８０，１９０，２００，２２５，２５０，３００，３５０，４００，４５０，５００，５５０，６００，６５０，７００，７５０，８００など）。
【００４６】
質量分析法を用いたプロテオミクス解析における進展は、健康及び初期がんを含む疾病のスペクトルにわたって生じる変化についての新たな洞察を提供した。しかし、質量分析アプローチの感度及び特異性はまだ、推定濃度がアルブミンについて３５−５０ｍｇ／ｍｌから一部のサイトカインについて１−１０ｐｇ／ｍｌに及ぶヒトのプロテオームを含む１００００個のタンパク質によって生じる大きなノイズが一部原因で、安定したがん早期発見には十分でない。既存の技術は、カバー範囲と血漿タンパク質の処理のスループットとの間のトレードオフを必要とする。現在のタンパク質検出のレベルの低さを大きく高めようといくつかの試みがなされており、これらは、かなり大量にあるタンパク質の減少、多重相対定量におけるペプチドレベルでの等圧ラベリング、減少後血漿分別ストラテジー、バイオマーカー採取技術、高品質データセットの分析のための数学的アプローチ及び多重ワークフロー（即ちアプローチの組み合わせ）を含む。そのような努力にもかかわらず、血漿プロテオミクスに対する質量分析アプローチはがんの早期発見の安定した成功には到達していない。実のところ、これまでの研究、プロテオミクス又はその他は、何れも、最も初期の発症前ステージを含むがんの範囲の正確な予測及び分類を報告していない。本発明のセンサアレイは、数々の疾病についての発症前疾病状態を含む疾病状態を正確に予測及び分類する初の検出システムを提供する。
【００４７】
これまでの試みは、ゲル電気泳動及びナノ粒子の集合体サイズの変化を用いて１つのがんの種類を見出すために「疾病特異的タンパク質コロナ」を用いようとするものであった。しかしながら、以下の例で示すように、１つの種類のナノ粒子の表面におけるタンパク質コロナにおける微妙な差異は、プロテオミクスのカバー範囲が不十分という永続的な問題が主に原因となって、許容可能な予測精度での安定したかつ正確ながんの識別及び区別には十分でない。本発明に記載のセンサアレイは、疾病状態を正確に分類することが可能である。本発明に記載のセンサアレイは、疾病状態を予測することが可能なだけでなく、疾病発症前の患者（例えばアルツハイマー患者）を分類する又は疾病の種類（例えばがんの種類）に応じて患者を分類することも可能である。
【００４８】
優れた予測能力を有する安定したかつ正確ながん発見のためのタンパク質コロナの能力を実質的に促進するために、本発明者らはセンサアレイ（本明細書において時折、タンパク質コロナナノシステム又はセンサアレイナノシステムと称される）を開発した。単一のナノ粒子の表面に限定された以前のアプローチと比べると、前記センサアレイは血漿タンパク質濃度のより広いダイナミックレンジにわたってより大幅に包括的なプロテオームデータを提供する。タンパク質除去せずに同定される低含量及び高含量タンパク質の数及び範囲を大幅に増大させるために、センサアレイによって、異なる物理化学的性質を有する複数のナノ粒子を用いて複雑な生体サンプル（例えばヒト血漿サンプル）をサンプリングすることができる。これにより、利用可能な膨大なプロテオーム情報におけるノイズが効果的に減少し、疾病に特有のプロテオームシグネチャーのより正確な早期差別化ができる。さらに、センサアレイを用いてユニークに得られるタンパク質−ナノ粒子及びタンパク質−タンパク質相互作用の組み合わせのために、各種類のタンパク質は異なるナノ粒子の表面上に異なる濃度で存在し得、これにより追加のプロテオーム情報が提供される。異なる物理化学的性質を有する複数のナノ粒子の使用は、ナノ粒子の物理化学的性質におけるわずかな変化でさえもタンパク質コロナ組成の劇的なしかし再現性のある変化を引き起こすことができるという我々の最近の発見によって主に推進される。
【００４９】
本発明のセンサアレイは、質量分析アプローチを用いるタンパク質検出に関して、１０の１０乗の敏感度及び動的範囲（ダイナミックレンジ）を有する。本発明のアッセイは、サンプル中のナノグラム未満(sub-ng)の範囲内で発見されるタンパク質を検出可能である。このアッセイ又はアプローチは、サンプル中のタンパク質を測定するための現在のアッセイよりもかなり広いダイナミックレンジを有する。例えば、質量分析法はダイナミックレンジが１０の４乗〜６乗しかない。この新規のセンサアレイは、これまで達成可能であったものよりも大きいダイナミックレンジをサンプルする能力を有する。本発明のセンサアレイにより、これまでは検出が不可能であった少量の及び希なタンパク質の検出及び決定が可能となる。
【００５０】
「サンプル」との用語は、対象から得られた生体サンプル又は複雑な生体サンプルを指す。好適な生体サンプルは、全身の血液、血漿、血清、肺洗浄液、細胞溶解液、月経血、尿、処理済組織サンプル、羊水、脳脊髄液、涙、唾液、精液などを含むがこれらに限定されない生体液を含むが、これに限定されない。好ましい実施形態では、サンプルは血液又は血清サンプルである。血漿は、数千の異なるタンパク質を含み、これらのタンパク質においては濃度に１２のオーダーの差がある。本発明のセンサアレイはこれらの血液サンプル中の経時的な又は対象の疾病状態にわたる変化を検出可能である。
【００５１】
一部の実施形態では、生体液又は複雑な生体サンプルを当該分野で周知の方法及びキットにより準備する。例えば、一部の生体サンプル（例えば月経血、血液サンプル、精液など）は、まずアレイと干渉し得る細胞残屑、血栓及び他の細胞成分を除去するために低速で遠心分離にかけられる。他の実施形態では、組織標本を処理してもよく、例えば、組織サンプル内の生体分子の分析及び抽出を可能とするために、組織サンプルを刻む若しくは均等化する、組織を解体するために酵素で処理する及び／又は細胞残屑を除去するために遠心分離してもよい。血液サンプルを分離する及び／又は適切に準備して格納する方法は当該分野で周知であり、その方法は抗凝固剤の追加を含むがこれに限定されない。
【００５２】
好適なセンサ素子は、例えば、有機粒子、無機粒子又はこれらの組み合わせなどの粒子を含むが、これに限定されない。一部の実施形態では、粒子は、例えば、ナノ粒子、マイクロ粒子、ミセル、リポソーム、酸化鉄、グラフェン、シリカ、タンパク質ベース粒子、ポリスチレン、銀粒子、金粒子、粒子ドット、パラジウム、白金、チタン及びこれらの組み合わせである。一部の実施形態では、ナノ粒子はリポソームである。当業者であれば、適切な粒子を選択して準備することができるであろう。好適なナノスケールセンサ素子は、少なくとも一方向において１マイクロメートル未満である。一部の側面においては、ナノスケールセンサ素子は、少なくとも一方向において約１００ｎｍ未満である。
【００５３】
［概要］
本開示は、生体分子コロナナノシステムを用いて疾病状態を検出する方法を提供する。一実施形態において、前記方法は疾病特異的タンパク質コロナを検出することを有する。
【００５４】
＜センサアレイ＞
図６５は、本開示のアレイシステムの例示的スキームを示す。図６５の工程１に示すように、複雑な生体サンプル（例えば血液７０４）を、生物学的状態７０３（例えば、疾病のあらゆる身体症状の前及び／又は疾病の初期及び中間ステージ中などの疾病状態）を示す対象７０２から採取することができる。好適な生体サンプル７０４は、全身の血液、血漿、血清、肺洗浄液、細胞溶解液、月経血、尿、処理済組織サンプル、羊水、脳脊髄液、涙、唾液、精液などを含むがこれらに限定されない生体液を含むが、これに限定されない。好ましい実施形態では、サンプルは血液又は血清サンプルである。一部の実施形態では、血漿７０６は、図６５の工程２に示すように、生体状態７０３を示す対象（例えば健康者（無病状態）及びがん患者（疾病状態））の血液細胞７０８から分離されてもよい。
【００５５】
次に、図６５の工程３で示すように、複雑な生体サンプル（例えば血漿７０６）を、異なる物理化学的性質を有する複数の粒子７１２を含むセンサアレイ７１０とともに培養してもよい。血漿７０６中の生体分子（例えば血漿７０６中のタンパク質）が一以上の粒子７１２に結合できるよう複数の粒子７１２を血漿７０６とともに培養してもよい。続いて、図６５の工程４で示すように、粒子７１２に結合した生体分子（例えばタンパク質）を、さらなる分析のため、例えば各種類の粒子７１２（例えば陰イオン、中性及び陽イオン粒子７１２）に結合したタンパク質の組成を結成するために、タンパク質溶液７１４中で分離させてもよい。
【００５６】
タンパク質溶液７１４は、例えば図６５の工程５で示されるように、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）７１６によって特性評価されてもよい。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ７１６を用いて識別されたタンパク質は、その後、生物学的状態７０３に関連付けられた生体分子フィンガープリント７１８（例えば一以上の粒子７１２に結合するタンパク質、核酸、脂質及び多糖類を表すもの）を決定するために図６５の工程６において分析することができる。
【００５７】
図６５の工程７において、コンピュータ７２０（例えば図６６のコンピュータシステム１０１）を用いて生体分子フィンガープリント７１８（例えばタンパク質フィンガープリント）を生物学的状態７０３（例えば健康状態、疾病状態）に関連付けることができる。例えば、生物学的状態７０３と生体分子フィンガープリント７１８との間の関連７２２を作成するために、コンピュータシステム７２０を用いて少なくとも２つのサンプル（例えば血漿７０６などの複雑な生体サンプル）の生体分子フィンガープリント７１８（例えばタンパク質フィンガープリント）の分析を行うことができる（図６５の工程８）。関連７２２の作成は、とりわけ階層的クラスター分析（ＨＣＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）、部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）、機械学習（ランダムフォレストとしても知られる）、ロジスティック回帰、決定木、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、Ｋ近傍法、ナイーブベイズ、線形回帰、多項式回帰、回帰のためのＳＶＭ、Ｋ平均法及び隠れマルコフモデルなどの種々の教師付き／教師なしデータ解析及びクラスタリングアプローチを含む、しかしこれに限定されない、当該分野で周知の方法を用いた関連解析又は統計分類によって行うことができる。換言すれば、生体分子（例えばタンパク質）フィンガープリント７１８に関連した生物学的状態を決定するために、個々のフィンガープリント間でどのようなパターンが共通なのかを統計学的有意性をもって決定するために各サンプル（例えばプラズマ７０６）の生体分子フィンガープリント７１８が（例えばコンピュータ７２０を用いて）互いに比較／分析される。
【００５８】
関連７２２は、生体分子フィンガープリント７１８（例えばタンパク質フィンガープリント）を種々の生物学的状態７０３にリンクさせることができる。例えば、疾病を有すると診断された対象７０２（即ち生物学的状態７０３が疾病状態）と、疾病を有すると診断されなかった対象７０２（即ち生物学的状態７０３が無病状態）と、の間で生体分子フィンガープリント７１８を比較することによって、疾病を有する対象７０２の生体分子フィンガープリント７１８と疾病状態との間の関連７２２を生み出すことができる。バイオマーカーフィンガープリント７１８と疾病状態（即ち生物学的状態７０３）との間のそのような関連７２２は、一部の実施形態において、疾病の進行におけるかなり初期（即ち、疾病のあらゆる身体症状が現れる前及び／又は疾病の診断前）又は疾病の進行の末期に決定することができる。
【００５９】
生体分子フィンガープリント７１８と関連付けることができる生物学的状態７０３の他の例は、薬物又は医薬品に対する応答性又は非応答性、免疫システムの活性化のレベル（例えば対象が外来抗原にさらされることに起因する）、薬剤投与に関連する副作用に対する対象の感度及び特定の成分若しくは物質の投与に対するアレルギー反応を示す対象の見込みの検証を含む。
【００６０】
＜コンピュータ制御システム＞
本開示は、本開示の方法を実行するようプログラムされたコンピュータ制御システムを提供する。図６６は、生体分子フィンガープリント７１８を生物学的状態７０３に関連付けるようプログラムされたさもなければ構成されたコンピュータシステム１００を示す。この決定、分析又は統計分類は、例えば  とりわけ階層的クラスター分析（ＨＣＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）、部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）、機械学習（ランダムフォレストとしても知られる）、ロジスティック回帰、決定木、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、Ｋ近傍法、ナイーブベイズ、線形回帰、多項式回帰、回帰のためのＳＶＭ、Ｋ平均法及び隠れマルコフモデルなどの種々の教師付き／教師なしデータ解析及びクラスタリングアプローチを含む、しかしこれに限定されない、当該分野で周知の方法によって行われる。コンピュータシステム１００は、本開示の生体分子フィンガープリント７１８の分析の種々の側面を実行でき、例えば、生物学的状態７０３に関連した生体分子フィンガープリント７１８を決定するために個々の生体分子コロナ間でどのようなパターンが共通なのかを統計学的有意性をもって決定するために数々のサンプルの生体分子コロナを比較／分析することなどができる。コンピュータシステムを用いて、異なる生体分子フィンガープリント７１８（例えばタンパク質コロナの組成の特性）を検出及び判別するために分類器を展開することができる。本明細書に開示されたセンサアレイから収集されたデータを用いて、機械学習アルゴリズム、特に患者からアレイ測定値を受信して各患者からの特異的生体分子コロナ組成を出力するアルゴリズムをトレーニングすることができる。アルゴリズムをトレーニングする前に、アレイからの生データについてまず、個々の変数のばらつきを少なくするためにノイズ除去することができる。
【００６１】
機械学習は、学習データセットを経た後に新たなまだ見ぬ例／タスクに対し正確な実行を行うために、学習機械の能力として一般化することができる。機械学習は、以下のコンセプト及び方法を含んでもよい。教師付き学習コンセプトは、ＡＯＤＥ；バックプロパゲーション、オートエンコーダ、ホップフィールド・ネットワーク、ボルツマンマシン、制限ボルツマンマシン及びスパイキングニューラルネットワークなどの人工ニューラルネットワーク；ベイジアンネットワーク及びベイジアン知識ベースなどのベイズ統計；事例ベース推論；ガウス過程回帰；遺伝子発現プログラミング；データ操作のグループ法（ＧＭＤＨ）；帰納論理プログラミング；事例に基づく学習；怠惰学習；学習オートマトン；学習ベクトル量子化；ロジスティックモデルツリー；近傍法及び類推的モデリングなどの最小メッセージ長（決定木、決定グラフなど）；確率的に大体正しい学習（ＰＡＣ）学習；リップルダウンルール、知識獲得手法；シンボリック機械学習アルゴリズム；サポートベクターマシン；ランダムフォレスト；ブートストラップ・アグリゲーティング（バギング）及びブースティング（超アルゴリズム）などの分類器のアンサンブル；順序回帰；情報ファジィネットワーク（ＩＦＮ）；条件付き確率場；ＡＮＯＶＡ；フィッシャーの線形判別分析法、線形回帰、ロジスティック回帰、多項ロジスティック回帰、ナイーブベイズ分類器、パーセプトロン、サポートベクターマシンなどの線形分類器；二次分類器；Ｋ近傍法；ブースティング；Ｃ４．５、ランダムフォレスト、ＩＤ３、ＣＡＲＴ、ＳＬＩＱ、ＳＰＲＩＮＴなどの決定木；ナイーブベイズなどのベイジアンネットワーク；及び隠れマルコフモデルを含んでもよい。教師無し学習コンセプトは、期待値最大化アルゴリズム；ベクトル量子化；生成位相写像；情報ボトルネック法、自己組織化写像などの人工ニューラルネットワーク；アプリオリ・アルゴリズム、Ｅｃｌａｔアルゴリズム及びＦＰ−ｇｒｏｗｔｈアルゴリズムなどの関連ルール学習；単連結法クラスタリング及び概念クラスタリングなどの階層的クラスタリング；Ｋ平均法、ファジィクラスタリング、ＤＢＳＣＡＮ及びＯＰＴＩＣＳアルゴリズムなどのクラスター分析；及び局所外れ値因子法などの外れ値検知を含んでもよい。半教師付き学習コンセプトは、生成モデル；低密度分離；グラフベースのモデル；及び共訓練を含んでもよい。強化学習コンセプトは、時間的差分学習；Ｑ学習；学習オートマトン；及びＳＡＲＳＡを含んでもよい。深層学習コンセプトは、ディープビリーフネットワーク；ディープボルツマンマシン；ディープ畳み込みニューラルネットワーク；ディープ回帰型ニューラルネットワーク；及び階層的時間メモリを含んでもよい。
【００６２】
図６６に示すコンピュータシステム１００は、本明細書に記載の方法を実施するよう構成されている。システム１００は、本明細書に記載の例示的な方法を実施するようプログラムされた中央コンピュータサーバ１０１を含む。サーバ１０１は、シングルコアプロセッサ、マルチコアプロセッサ又は並列処理のための複数のプロセッサであってもよい中央処理装置（ＣＰＵ、「プロセッサ」とも称される）１０５を含む。またサーバ１０１は、メモリ１１０（例えばランダムアクセスメモリ、読み出し専用メモリ、フラッシュメモリ）；電子記憶装置１１５（例えばハードディスク）；一以上の他のシステムと通信する通信用インターフェース１２０（例えばネットワークアダプタ）；並びにキャッシュ、その他のメモリ、データ記憶装置及び／又は電子ディスプレイアダプタを含んでもよい周辺機器１２５も含む。メモリ１１０、記憶装置１１５、インターフェース１２０及び周辺機器１２５は、マザーボードなどの通信バス（実線）を介してプロセッサ１０５と通信する。記憶装置１１５はデータを記憶するためのデータ記憶装置でもよい。サーバ１０１は、通信用インターフェース１２０を用いてコンピュータネットワーク（「ネットワーク」）１３０に動作可能に接続されている。ネットワーク１３０はインターネット、イントラネット及び／若しくはエクストラネット、インターネットと通信するイントラネット及び／若しくはエクストラネット、電気通信又はデータネットワークでもよい。場合によってはネットワーク１３０は、サーバ１０１を用いて、サーバ１０１に接続された装置をクライアント又はサーバとして機能させるピア・ツー・ピアネットワークを実施できる。
【００６３】
記憶装置１１５は、対象レポートなどのファイル及び／又は個人に関するデータを伴う通信又は本開示に関連するデータのあらゆる側面を記憶することができる。
【００６４】
コンピュータサーバ１０１は、ネットワーク１３０を介して一以上の遠隔コンピュータシステムと通信できる。一以上の遠隔コンピュータシステムは、例えばパーソナルコンピュータ、ラップトップ、タブレット、電話、スマートフォン又は携帯端末であってもよい。
【００６５】
一部の応用においては、コンピュータシステム１００は単一のサーバ１０１を含む。他の状況では、システムはイントラネット、エクストラネット及び／又はインターネットを介して互いに通信する複数のサーバを含む。
【００６６】
サーバ１０１は、本明細書に記載のような測定データ若しくはデータベース、例えば病歴、家族歴、人口統計データなどの対象からの患者情報及び／又は特定のアプリケーションに関連する可能性があるような他の臨床的若しくは個人的情報を記憶するよう構成してもよい。そのような情報は記憶装置１１５又はサーバ１０１上に記憶させることができ、そしてそのようなデータはネットワークを介して送信することができる。
【００６７】
本明細書に記載の方法は、例えばメモリ１１０又は電子記憶装置１１５上などのサーバ１０１の電子記憶位置上に記憶された機械（又はコンピュータプロセッサ）実行可能コード（又はソフトウェア）を用いて実施することができる。使用中、プロセッサ１０５によりコードを実行することができる。場合によっては、コードは記憶装置１１５から収集してプロセッサ１０５によりすぐにアクセスできるようメモリ１１０上に記憶することができる。一部の状況においては、電子記憶装置１１５を除外することができ、機械実行可能指示をメモリ１１０上に記憶させてもよい。あるいは、コードを第２のコンピュータシステム１４０で実行することができる。
【００６８】
サーバ１０１などの本明細書に記載のシステム及び方法の側面をプログラミングの中に組み込むことができる。技術の各種側面は、通常、機械（又はプロセッサ）実行可能コード及び／又は機械読取り可能媒体のようなタイプで運ばれる若しくはそれに組み込まれた関連データの形をとった「生産品」又は「製品」として考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば読取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）又はハードディスクなどの電子記憶装置に記憶させることができる。「記憶」型媒体は、ソフトウェアプログラミングのあらゆる時点において非一時的記憶装置を提供するありとあらゆるコンピュータ若しくはプロセッサなどの有形メモリ又は種々の半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどのそれらの関連モジュールを含むことができる。ソフトウェアの全て又は一部は、時に、インターネット又は種々の他の電気通信ネットワークを介して通信してもよい。そのような通信は、例えば１つのコンピュータ又はプロセッサから別のコンピュータ又はプロセッサに、例えば管理サーバ又はホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームに、ソフトウェアをローディングできるようにしてもよい。したがって、ソフトウェア素子を担い得る別の種類の媒体は、有線又は光学地上通信線ネットワークを介して及び種々のエアリンクにわたってローカル機器間の物理的インターフェースにわたって用いられるような光波、電波及び電磁波を含んでもよい。そのような波を伝搬する有線若しくは無線リンク又は光学リンクなどの物理的素子もまたソフトウェアを担う媒体であると考えられる。本明細書で用いる場合、非一時的な有形「記憶」媒体に制限されない限り、コンピュータ又は機械「読取り可能媒体」との用語は、実行用プロセッサへの指示の提供に関与するあらゆる媒体を指す。
【００６９】
本明細書に記載のコンピュータシステムは、本明細書に記載のアルゴリズム又はアルゴリズムベースの方法を実行するためのコンピュータ実行可能コードを備えてもよい。一部のアプリケーションでは、本明細書に記載のアルゴリズムは、少なくとも１つのデータベースからなるメモリ装置を使用する。
【００７０】
本開示に関係するデータは、受信者による受信及び／又はレビューのためにネットワーク又は接続を介して送信することができる。受信者は、レポートに関係する対象、又はその介護者、例えば医療供給者、マネージャー、その他の医療専門家若しくはその他の世話人、又は分析を行った及び／若しくは依頼した個人若しくは組織でもよいが、これらに限定されない。また受信者は、そのようなレポートを記憶するためのローカル又は遠隔システム（例えばサーバ又はその他の「クラウド演算」構築のシステム）でもよい。一実施形態では、コンピュータ読取り可能媒体は、本明細書に記載の方法を用いた生体サンプルの分析結果の送信に適した媒体を含む。
【００７１】
図６６に示したコンピュータシステム１０１などの本明細書に記載のシステム及び方法の側面は、プログラミングの中に組み込むことができる。技術の各種側面は、通常、機械（又はプロセッサ）実行可能コード及び／又は機械読取り可能媒体のようなタイプで運ばれる若しくはそれに組み込まれた関連データの形をとった「生産品」又は「製品」として考えることができる。機械実行可能コードは、メモリ（例えば読取り専用メモリ、ランダムアクセスメモリ、フラッシュメモリ）又はハードディスクなどの電子記憶装置に記憶させることができる。「記憶」型媒体は、ソフトウェアプログラミングのあらゆる時点において非一時的記憶装置を提供するありとあらゆるコンピュータ若しくはプロセッサなどの有形メモリ又は種々の半導体メモリ、テープドライブ、ディスクドライブなどのそれらの関連モジュールを含むことができる。ソフトウェアの全て又は一部は、時に、インターネット又は種々の他の電気通信ネットワークを介して通信してもよい。そのような通信は、例えば１つのコンピュータ又はプロセッサから別のコンピュータ又はプロセッサに、例えば管理サーバ又はホストコンピュータからアプリケーションサーバのコンピュータプラットフォームに、ソフトウェアをローディングできるようにしてもよい。したがって、ソフトウェア素子を担い得る別の種類の媒体は、有線又は光学地上通信線ネットワークを介して及び種々のエアリンクにわたってローカル機器間の物理的インターフェースにわたって用いられるような光波、電波及び電磁波を含んでもよい。そのような波を伝搬する有線若しくは無線リンク又は光学リンクなどの物理的素子もまたソフトウェアを担う媒体であると考えられる。本明細書で用いる場合、非一時的な有形「記憶」媒体に制限されない限り、コンピュータ又は機械「読取り可能媒体」との用語は、実行用プロセッサへの指示の提供に関与するあらゆる媒体を指す。
【００７２】
したがって、コンピュータ実行可能コードのような機械読取り可能媒体は、有形記憶媒体、伝搬波媒体又は物理的送信媒体を含むがこれらに限定されない多くの形をとってもよい。不揮発性メモリは、例えば、図面に示すデータベースなどの実行に用いることができるようなあらゆる（複数の）コンピュータなどにおける記憶装置の何れかなどの光学又は磁気ディスクを含む。揮発性記憶媒体は、そのようなコンピュータプラットフォームのメインメモリなどのダイナミックメモリを含む。有形送信媒体は、コンピュータシステム内でバスを備えるようなワイヤを含む同軸ケーブル、銅線及び光ファイバーを含む。伝搬波送信媒体は、無線（ＲＦ）及び赤外線（ＩＲ）データ通信において生成される電気若しくは電磁信号又は音響波若しくは光波の形であってもよい。したがって、コンピュータ読取り可能媒体の共通形態は、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、あらゆる他の磁気媒体、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ若しくはＤＶＤ−ＲＯＭ、あらゆる他の光学媒体、パンチカード紙テープ、孔のパターンを有するあらゆる他の物理的記憶媒体、ＲＡＭ、ＲＯＭ及びＥＰＲＯＭ、ＦＬＡＳＨ−ＥＰＲＯＭ、あらゆる他のメモリチップ若しくはカートリッジ、データ若しくは指示を運搬する伝搬波、そのような伝搬波を運搬するケーブル若しくはリンク、又はプログラミングコード及び／若しくはデータをコンピュータがそこから読み取れるあらゆる他の媒体を含む。これらのコンピュータ読取り可能媒体の形態の多くが、一以上の指示の一以上のシーケンスを実行用プロセッサに伝搬する際に用いられてもよい。
【００７３】
＜物理化学的性質＞
一部の実施形態において、複数のセンサ素子は複数の粒子を備え、主にこれらから構成され又はこれらから構成され、各粒子は、各センサ素子が同じサンプルと接触したときにユニークな生体分子コロナシグネチャーを有するよう少なくとも１つの物理化学的性質によって互いに区別される。
【００７４】
アレイ内にあるセンサ素子の物理化学的性質は、例えば組成、サイズ、表面電荷、疎水性、親水性、表面機能性（表面官能基）、表面トポグラフィー、表面の曲率及び形状を参照する。組成との用語は、異なる種類の材料の使用並びに例えばセンサ素子間で選択された材料の伝導率などの材料の化学的及び／又は物理的性質の差異の使用を包含する。
【００７５】
表面曲率は、通常、ナノ粒子のサイズによって決定される。したがって、ナノメートルのスケールにおいて、ナノ粒子のサイズが変化すると、粒子の表面曲率が変化し、この表面曲率の変化は表面の結合選択性に影響を及ぼす。例えば、所定の曲率において、粒子の表面は特定の種類の生体分子に対して結合親和性を有し、一方で、異なる曲率において、別の結合親和性を有する及び／又は異なる生体分子に対して結合親和性を有する。異なる生体分子に対して変更された親和性を有する複数のセンサ素子を作成するために曲率を調整することができる。センサアレイは、異なる曲率（例えば異なるサイズ）を有する複数のセンサ素子を有するよう作成することができ、これにより各々が異なる生体分子コロナシグネチャーを有する複数のセンサ素子を得る。
【００７６】
異なる親和性を与えるために表面をパターニングしたり、表面曲率を複数の長さスケールで設計したりするなどの方法により、表面モルホロジーを修正することもできる。表面のパターニングは、例えば、少なくとも２つのブロックが異なる化学的性質を有するブロック重合によりセンサ素子を形成することによって、少なくとも２つの異なるポリマーを用い、重合中にポリマーを相分離してナノ粒子を形成することによって、及び／又は相分離に続いて分離したポリマーを架橋結合することによってなされる。例えばナノ粒子の合成のために細かく分割された粒子によって安定化されたピッカリングエマルション（Ｓａｃａｎｎａら、２００７年）を採用することによって、複数の長さスケールで設計された表面率が得られる。一部の実施形態では、細かく分割された粒子は、例えば、とりわけ、ケイ酸塩、アルミン酸塩、チタン酸塩、アルミニウム、ケイ素、チタン、ニッケル、コバルト、鉄、マンガン、クロムなどの金属酸化物又はバナジウム酸化物、カーボンブラック及び例えば窒化ホウ素、炭化ホウ素、窒化ケイ素又は炭化ケイ素などの窒化物又は炭化物から選択される。
【００７７】
例えば、ナノスケールセンサ素子を含むセンサ素子は、各々異なる物理化学的性質を有するよう機能化（官能基を持たせる）してもよい。センサ素子を機能化するための最適な方法は、当該分野で周知であるとともにセンサ素子の組成（例えば金、酸化鉄、シリカ、銀など）に依存し、例えば、アミノプロピル基修飾、アミノ基修飾、ボロン酸修飾、カルボン酸修飾、メチル化修飾、Ｎ−スクシンイミジルエステル修飾、ＰＥＧ修飾、ストレプトアビジン修飾、メチルエーテル修飾、トリエトキシプロピルアミノシラン（triethoxylpropylaminosilane）修飾、チオール修飾、ＰＣＰ修飾、クエン酸塩修飾、リポ酸修飾、ＢＰＥＩ修飾、カルボキシル基修飾及びヒドロキシル基修飾などを含むが、これらに限定されない。一実施形態において、ナノ粒子は、アミングループで修飾されてもよい（−ＮＨ2又はカルボキシルグループ（ＣＯＯＨ））。一部の実施形態では、ナノスケールセンサ素子は、極性を有する官能基を用いて機能化される。極性を有する官能基の非限定的な例は、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、シアノ基、ニトロ基、アンモニウム基、イミダゾリウム基、スルホニウム基、ピリジニウム基、ピロリジニウム基、ホスホニウム基又はこれらのあらゆる組み合わせを含む。一部の実施形態では、官能基は、酸性官能基（例えばスルホン酸基、カルボキシル基など）、塩基性官能基（例えばアミノ基、環状２級アミノ基（ピロリジル基及びピペリジル基）、ピリジル基、イミダゾール基、グアニジン基）、カルバモイル基、ヒドロキシル基、アルデヒド基などである。一部の実施形態では、極性を有する官能基は、イオン性官能基である。イオン性官能基の非限定的な例は、アンモニウム基、イミダゾリウム基、スルホニウム基、ピリジニウム基、ピロリジニウム基、ホスホニウム基を含む。一部の実施形態では、センサ素子は重合性官能基で機能化される。重合性官能基の非限定的な例は、ビニル基及びアクリル（メタクリル）基を含む。一部の実施形態では、官能基は、アクリル酸ピロリジル、アクリル酸、メタクリル酸、アクリルアミド、メタクリル酸２−(ジメチルアミノ)エチル、ヒドロキシエチルメタクリレートなどである。
【００７８】
他の実施形態では、センサ素子の物理化学的性質は、表面電荷の修正により修正することができる。例えば、表面を、正味中性電荷、正味正表面電荷、正味負表面電荷又は双性イオン電荷を与えるように修正することができる。表面の電荷は、元素の合成中に又は表面機能化中における電荷の合成後の修正（修飾）によって制御することができる。高分子ナノ粒子においては、異なる合成方法及び異なる荷電コモノマーを用いて合成中に、並びに酸化状態を混合させた無機物において、電荷の差を得ることができる。
【００７９】
＜ナノ粒子＞
一部の実施形態において、粒子はナノ粒子である。一部の実施形態において、粒子はリポソームである。リポソームは、粒子を形成することができるあらゆる脂質を備えてもよい。「脂質」との用語は、脂肪酸エステルであるとともに水に不溶でかつ多くの有機溶剤に可溶である有機化合物のグループを指す。脂質は通常少なくとも３つのクラスに分けられ、それらは（１）油脂及び蝋を含む「単純脂質」、（２）リン脂質及び糖脂質を含む「複合脂質」、（３）ステロイドなどの「誘導脂質」である。一実施形態では、リポソームは、一以上の陽イオン脂質又は陰イオン脂質と一以上の安定化脂質とを有する。安定したリポソームは当該分野で周知であり、例えばＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）−ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＣＨＯＬ（ＤＯＰＣ−コレステロール）及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。
【００８０】
リポソームの脂質ベースの表面は、脂質−生体分子（例えばタンパク質）境界面において、複雑な生体サンプル（例えば血漿、あるいはタンパク質、核酸並びに多糖類及び脂質のうち少なくとも１つなどの生体分子の複雑混合物を含むあらゆるサンプル）の生体分子（例えばタンパク質）のサブセットと接触でき、これにより生体分子（例えばタンパク質）結合のパターンを生成するためにタンパク質のサブセットを結合させる。
【００８１】
一実施形態では、リポソームは陽イオン脂質を含む。本明細書で用いる場合、「陽イオン脂質」との用語は、陽イオンである脂質、あるいはｐＨが脂質のイオン化基のｐＫよりも低くなるにつれ陽イオンになる（プロトン化する）がより高いｐＨ値では次第により中性となる脂質を指す。ｐＫよりも低いｐＨ値では、脂質は負に帯電した核酸と結びつくことができる。ある実施形態では、陽イオン脂質は、ｐＨが減少すると正に帯電すると推測される双性イオン脂質を含むことができる。ある実施形態では、リポソームは陽イオン脂質を含む。一部の実施形態では、陽イオン脂質は、生理学的ｐＨなどの選択的なｐＨにて正味正電荷を有する多数の脂質種のいずれかを含む。そのような脂質は、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）；Ｎ−（２，３−ジオレイル）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）；Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）；Ｎ−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）；３−（Ｎ−（Ｎ’Ｎ’−ジメチルアミノエタン）−カルバモイル）コレステロール（ＤＣ−Ｃｈｏｌ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）−Ｎ−２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−（トリフルオロ酢酸アンモニウム）（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）、１，２−ジオレオイル−３−ジメチルアンモニウムプロパン（ＤＯＤＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、Ｎ−（１，２−ジミリスチルオキシプロップ−３−イル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル）−Ｎ−（２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−トリフルオロ酢酸アンモニウム（ＤＯＳＰＡ）、ジオクタデシルアミドグリシルカルボキシスペルミン（ＤＯＧＳ）及び１，２−  ジテトラデカノイル(ditetradecanoyl)−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）を含むが、これらに限定されない。以下の脂質は陽イオンであり、生理学的ｐＨ未満で正の電荷を有する：ＤＯＤＡＰ、ＤＯＤＭＡ、ＤＭＤＭＡ、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレニルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）。一部の実施形態では、脂質はアミノ脂質である。
【００８２】
ある実施形態では、リポソームは、粒子の形成をその形成中に安定させる一以上の追加の脂質を含む。好適な安定化脂質は、中性脂質及び陰イオン脂質を含む。「中性脂質」との用語は、生理学的ｐＨにおいて荷電されていない又は中性双性イオンの形で存在する数々の脂質種のうちのいずれか１つを指す。代表的な中性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン（diaclphosphatidylcholines）、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、ジヒドロスフィンゴミエリン、ケファリン及びセレブロシドを含む。例示的な中性脂質は、例えば、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロル（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロル（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル−ホスファチジルエタノールアミン４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボン酸塩（ＤＯＰＥ−ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６−Ｏ−モノメチルＰＥ、１６−Ｏ−ジメチルＰＥ、１８−１−トランスＰＥ、１−ステアロイル−２−オレオイル−ホスファチジルエタノールアミン（ＳＯＰＥ）及び１，２−ジエライドイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ｔｒａｎｓＤＯＰＥ）を含む。一実施形態では、中性脂質は１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）である。
【００８３】
「陰イオン脂質」との用語は、生理学的ｐＨにおいて負に帯電したあらゆる脂質を指す。これらの脂質は、ホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルフォスファチジン酸、Ｎ−ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、リジルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール（ＰＯＰＧ）及び中性脂質に結合したその他の陰イオン修飾基を含む。ある実施形態では、リポソームは、糖脂質（例えば、モノシアロガングリオシド  ＧＭ．ｓｕｂ．１）を含む。ある実施形態では、リポソームは、コレステロールなどのステロールを含む。ある実施形態では、リポソームは、ポリエチレングリコール脂質である追加の安定化脂質を含む。好適なポリエチレングリコール脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジン酸、ＰＥＧ修飾セラミド（例えばＰＥＧ−ＣｅｒＣ１４又はＰＥＧ−ＣｅｒＣ２０）、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミネ、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールを含む。代表的なポリエチレングリコール脂質は、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ及びＰＥＧ−ｓ−ＤＭＧを含む。一実施形態では、ポリエチレングリコール脂質は、Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）．ｓｕｂ．２０００）カルバミル］−１，２−ジミリスチルオキシルプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−ｃ−ＤＭＡ）である。一実施形態では、ポリエチレングリコール脂質はＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧである。
【００８４】
好適なリポソームは、固体脂質、乳化剤及び／又は水／溶媒からなる固体脂質ナノ粒子（ＳＬＮ）でもよい。ＳＬＮは、トリアシルグリセロール（トリステアリン）、部分グリセリド（インビトール（登録商標））、脂肪酸（ステアリン酸、パルミチン酸）、ステロイド（コレステロール）及び蝋（パルミチン酸セチル）の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。種々の乳化剤及びこれらの組み合わせ（プルロニック（登録商標）Ｆ６８、Ｆ１２７）が脂質分散を安定化させるために用いられている。ＳＮＬセンサ素子の準備に用いるのに好適な成分は、例えば、リン脂質、グリセロール、ポロクサマー１８８、大豆ホスファチジルコリン、コンプリトール（登録商標）、パルチミン酸セチル、ＰＥＧ２０００、ＰＥＧ４５００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８５、オレイン酸エチル、Ｎａアルジネート、エタノール／ブタノール、トリステアリングリセリド、ＰＥＧ４００、ミリスチン酸イソプロピル、プルロニック（登録商標）Ｆ６８、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、トリミリスチン、トリステアリン、トリラウリン、ステアリン酸、Ｃａｐｍｕｌ（登録商標）ＭＣＭ  Ｃ１０などのカプリン酸グリセリル、カカオ脂、トリグリセリドココナッツ脂、１−オクタデカノール、コンプリトール（登録商標）８８８ＡＴＯなどのグリセリルベヘネート、プレシロール（登録商標）ＡＴＯ５などのパルミトステアリン酸グリセリン及びパルチミン酸セチル蝋などを含むが、これらに限定されない。
【００８５】
一部の実施形態では、複数のセンサ素子は、鋳造技術、３Ｄプリンティング又は４Ｄプリンティングによって作成できる異なる幾何学的形状を有する複数の半粒子（a plurality of half particles）を備える、主にこれらから構成される又はこれらから構成される。好適な半粒子は当該分野で周知であり、例えば、球、棒、三角形、立方体及びこれらの組み合わせのあらゆる幾何学的形状の半及び部分的粒子を含むが、これらに限定されない。好適には、一実施形態において、複数の半粒子は、３Ｄプリンティングによって得られる異なる物理化学的性質を有する。
【００８６】
一部の実施形態では、ナノスケールセンサ素子を含むセンサ素子は、３Ｄ又は４Ｄプリンティングから作成される。ナノスケールセンサ素子を含むセンサ素子の３Ｄ及び４Ｄプリンティングの好適な方法は、当該分野で周知である。３Ｄ及び４Ｄプリンティングに好適な材料は、例えば、プラスチック及び合成ポリマー（例えば、ポリエチレングリコールジアクリラート（ＰＥＧ−ＤＡ）、ポリ（ｅ−カプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリ（プロピレンオキシド（ＰＰＯ）、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）など）、金属、粉末、ガラス、セラミックス及びハイドロゲルを含むが、これらに限定されない。３Ｄ又は４Ｄプリンティングによって作成される好適な形状は、例えば、完全な若しくは部分的な球（例えば３／４又は半球）、棒、立方体、三角形又は他の幾何学的若しくは非幾何学的形状を含むが、これらに限定されない。
【００８７】
３Ｄプリンティング方法は、マイクロ押出プリンティング、インクジェットバイオプリンティング、レーザー補助バイオプリンティング、ステレオリソグラフィー、全方向性プリンティング及びスタンププリンティングを含むが、これらに限定されない。
【００８８】
一部の実施形態では、ナノスケールセンサ素子はナノ粒子である。好適なナノ粒子は当該分野で周知であり、例えば、天然又は合成ポリマー、コポリマー、ターポリマー（コアが、磁心を含む金属又は無機酸化物から構成されるもの）を含むが、これらに限定されない。好適なポリマーナノ粒子は、例えば、ポリスチレン、ポリ（リシン）、キトサン、デキストラン、ポリ（アクリルアミド）及びその派生物である例えばＮ−イソプロピルアクリルアミド、Ｎ−ｔｅｒｔ−ブチルアクリルアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド、ポリエチレングリコール、ポリ（ビニルアルコール）、ゼラチン、澱粉、分解可能バイオポリマー、シリカなどを含むが、これらに限定されない。
【００８９】
種々の実施形態において、ナノ粒子のコアは、有機粒子、無機粒子又は有機物質と無機物質の両方を含む粒子を含んでもよい。例えば、粒子は、金属粒子、量子ドット粒子、金属酸化物粒子又はコアシェル粒子である又はこれらを含むコア構造を有してもよい。例えば、コア構造は、ポリマー粒子又は脂質ベースの粒子であってもよく又はこれらを含んでもよく、リンカーは、脂質、界面活性剤、ポリマー、炭化水素鎖又は両親媒性ポリマーを含んでもよい。例えば、リンカーは、ポリエチレングリコール又はポリアルキレングリコールを含んでもよく、例えば、リンカーの第一端はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に結合した脂質を含んでもよく、第二端は前記ＰＥＧに結合した官能基を含んでもよい。これらの方法では、第一又は第二官能基は、アミン基、マレイミド基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、ピリジルチオール基又はアジド基を含んでもよい。
【００９０】
ある実施形態では、ナノ粒子は、例えば、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム（ＰＳＳ）、ポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）、ポリオキシエチレングリコール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリ（ラクタイド−ｃｏ−グリコリド）ポリマー（ＰＬＧＡ）、セルロースエーテルポリマー、ポリビニルピロリドン、酢酸ビニル、ポリビニルピロリドン−酢酸ビニルコポリマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アクリレート、ポリアクリル酸（ＰＡＡ）、酢酸ビニル、クロトン酸コポリマー、ポリアクリルアミド、ポリエチレンホスホン酸、ポリブテンホスホン酸、ポリスチレン、ポリビニルホスホン酸、ポリアルキレン、カルボキシビニルポリマー、アルギン酸ナトリウム、カラギーナン、キサンタンガム、アカシアゴム、アラビアゴム、グアーガム、プルラン、アガー、キチン、キトサン、ペクチン、カラヤゴム、ローカストビーンガム、マルトデキストリン、アミロース、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、米澱粉、タピオカ澱粉、豆類澱粉、甘しょ澱粉、大麦澱粉、小麦澱粉、ヒドロキシプロピレート・ハイアミローススターチ、デキストリン、レバン、エルシナン、グルテン、コラーゲン、分離乳清タンパク質、カゼイン、ミルクプロテイン、大豆プロテイン、ケラチン、ゼラチン又はこれらのコポリマー、派生物又は混合物を含むポリマーを備えてもよい。
【００９１】
他の実施形態では、ポリマーは、ポリエチレン、ポリカーボネート、ポリ酸無水物、ポリヒドロキシ酸、ポリプロピルフマラート、ポリカプロラクトン、ポリアミド、ポリアセタール、ポリエーテル、ポリエステル、ポリ（オルトエステル）、ポリシアノアクリレート、ポリビニルアルコール、ポリウレタン、ポリホスファゼン、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリシアノアクリレート、ポリ尿素、ポリスチレン、ポリアミン又はこれらのコポリマー、派生物又は混合物であってもよい又はこれらを含んでもよい。
【００９２】
一部の実施形態では、本開示は、生分解性ポリマーを備えるナノ粒子を提供する。生分解性ポリマーの非限定的な例は、ポリ−β−アミノ−エステル（ＰＢＡＥ）、ポリ（アミドアミン）、ポリ乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）を含むポリエステル、ポリ無水物、生体還元性ポリマー及びその他の生体分解性ポリマーでもよい。一部の実施形態では、生体分解性ポリマーは、２−（３−アミノプロピルアミノ）エタノール末端修飾ポリ（１，４−ブタンジオールジアクリラート−ｃｏ−４−アミノ−１−ブタノール）、（１−（３−アミノプロピル）−４−メチルピペラジン末端修飾ポリ（１，４−ブタンジオールジアクリラート−ｃｏ−４−アミノ−１−ブタノール）、２−（３−アミノプロピルアミノ）エタノール末端修飾ポリ（１，４−ブタンジオールジアクリラート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノール）、（１−（３−アミノプロピル）−４−メチルピペラジン末端修飾ポリ（１，４−ブタンジオールジアクリラート−ｃｏ−５−アミノ−１−ペンタノール）、２−（３−アミノプロピルアミノ）エタノール末端修飾ポリ（１，５−ペンタンジオールジアクリラート−ｃｏ−３−アミノ−１−プロパノール）及び（１−（３−アミノプロピル）−４−メチルピペラジン末端修飾ポリ（１，５−ペンタンジオールジアクリラート−ｃｏ−３−アミノ−１−プロパノール）を備える。
【００９３】
＜アレイ基板＞
一部の実施形態では、センサアレイは基板を備える。センサ素子のアイデンティティに関係なく、本発明は、固体基板上に固定された、接続された及び／又は結合されたマトリクス状のセンサ素子によって実施することができる。基板は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、シリカ、金又は金でコーティングされた基板、銀又は銀でコーティングされた基板、プラチナ又はプラチナでコーティングされた基板、亜鉛又は亜鉛でコーティングされた基板、炭素でコーティングされた基板などを備えてもよい又は主にこれらから構成されてもよい又はこれらから構成されてもよい。当業者であれば、センサアレイのための適切な基板を選択することができるであろう。一部の実施形態では、センサ素子及び基板は、同じ元素、例えば金、から作成されてもよい。一部の実施形態では、基板及びセンサ素子（例えばナノ粒子）はチップを形成する。
【００９４】
一部の実施形態において、複数のセンサ素子は、各離散した要素（領域）において離散した生体分子コロナが形成されるようトポロジー差を有する２以上の離散したセンサ要素（領域）を含む単一の表面、プレート又はチップを備える。表面プレート又はチップは、本明細書に記載の方法によって２以上の離散した要素（領域）を含むよう製造されてもよい。離散した領域は、異なる幾何学的形状、異なるサイズ、異なる電荷又は離散した生体分子コロナを形成する能力を有する離散したセンサ素子が得られるその他のトポロジー差を有する隆起した表面でもよい。
【００９５】
一部の実施形態では、センサ素子は、基板に非共有的に取付けられる。非共有的な取付けの好適な方法は、当該分野で周知であり、例えば、金属配位、電荷相互作用、疎水性−疎水性相互作用、キレート化などを含むが、これらに限定されない。他の実施形態では、センサ素子は基板に共有的に取付けられる。センサ素子と基板を共有結合させる好適な方法は、例えば、クリックケミストリー、照射などを含むが、これらに限定されない。
【００９６】
説明のために、基板にセンサ素子、例えばナノスケールセンサ素子、を結合させる方法を図２３〜図４０に示す。例えば、センサ素子は、シリカ基板表面上のアミノ基とナノ粒子表面上のカルボン酸基との間のアミド化反応を介して（図２３）、シリカ基板表面上のエポキシ基とナノ粒子表面上のアミノ基との間の開環反応を介して（図２４）、シリカ基板表面上のマレイミド基とナノ粒子表面上のチール又はアミノ基との間のマイケル付加反応を介して(図２５)、シリカ基板表面上のイソシアネート基とナノ粒子表面上のヒドロキシル又はアミノ基との間のウレタン反応を介して(図２６)、シリカ基板表面上のチオール基とナノ粒子表面上のチオール基との間の酸化反応を介して(図２７)、シリカ基板表面上のアジド基とナノ粒子表面上のアルキン基との間の「クリック」ケミストリーを介して(図２８)、シリカ基板表面上の２−ピリジルジチオール基とナノ粒子表面上のチオール基との間のチオール交換反応を介して(図２９)、シリカ基板表面上のボロン酸基とナノ粒子表面上のジオール基との間の配位反応を介して(図３０)、基板表面上のＣ＝Ｃ結合とナノ粒子表面上のＣ＝Ｃ結合との間のＵＶ光照射付加反応を介して(図３１) などして基板（例えばシリカ基板）に結合させてもよい。センサ素子を金基板に結合させる好適な方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ａｕ−チオール結合を介して(図３２)、金基板表面上のカルボン酸基とナノ粒子表面上のアミノ基との間のアミド化反応を介して(図３３)、金基板表面上のアジド基とナノ粒子表面上のアルキン基との間の「クリック」ケミストリーを介して(図３４)、金基板表面上のＮＨＳ基とナノ粒子表面上のアミノ基との間のウレタン化反応を介して(図３５)、金基板表面上のエポキシ基とナノ粒子表面上のアミノ基との間の開環反応を介して(図３６)、金基板表面上のボロン酸基とナノ粒子表面上のジオール基との間の配位反応を介して(図３７)、金基板表面上のＣ＝Ｃ結合とナノ粒子表面上のＣ＝Ｃ結合との間のＵＶ光照射付加反応を介して(図３８)、金基板表面上のビオチンとナノ粒子表面上のアビジンとの間の「リガンド−レセプター」相互作用を介して(図３９)、金基板表面上のａ−サイクロデキストリン（ａ−ＣＤ）とナノ粒子表面上のアダマンティン（Ａｄ）との間の「ホスト−ゲスト」相互作用を介して(図４０) などして行われる結合を含む。
【００９７】
別の例では、所謂「クリックケミストリー」を用いて修飾表面基をナノ粒子のコア構造に取付けてもよい（例えば、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社のカタログ及び米国特許第７，３７５，２３４号を参照。これらはその全内容が参照により本明細書に盛り込まれる）。クリックケミストリー分野を備える反応のうち、一例として挙げられるのは、１，４−二置換−１，２，３−トリアゾ−ルを形成するためのアルキンからアジドへのヒュスゲン１，３−二極性環状付加である。銅（Ｉ）触媒反応は、穏やかでかつ非常に効率的で、保護基が不要であり、そして多くの場合精製が不要である。アジド及びアルキン修飾基は、通常、生物学的分子及び水溶液環境に対し不活性である。トリアゾールは、自然に存在する遍在アミド部分との類似性を有するが、アミドとは異なり、切断されにくい。加えて、これらは酸化又は還元させることがほぼ不可能である。
【００９８】
複数のセンサ素子は、ランダムに又は異なる（区別可能な）パターンで基板に取付けられてもよい。センサ素子は、ほぼ均一に配置してもよい。配列されたセンサ素子のパターンは、センサ素子を基板に取付けたときのパターンに応じて異ならせてもよい。各センサ素子は距離をおいて離隔している。基板上に配列されたセンサ素子（例えばナノ粒子）間の距離は、取付けに使用されたリンカーの長さ又はその他の製造条件に応じて異ならせてもよい。種々の実施形態によれば、アレイ上の複数のセンサ素子は、所望の素子間距離及びパターンを有して製造することができる。好適な区別可能なパターンは、当該分野において周知であり、平行線、正方形、円形、三角形などを含むが、これらに限定されない。さらに、センサ素子は、行又は列に配置してもよい。一部の実施形態では基板は平坦な基板であり、他の実施形態では基板はマイクロチャネル又はナノチャネルの形であってもよい。説明のため、好適な実施形態を図１５Ａ〜図２２Ｂに示す。センサ素子は、センサアレイを通るサンプルの流れを規制又は制御するマイクロチャネル又はナノチャネル内に含まれてもよい。好適なマイクロチャネルはサイズが１０μｍ〜約１００μｍである。
【００９９】
一部の実施形態では、複数のセンサ素子の非限定的な例は、とりわけ、（ａ）同じ材料から作成されるが異なる物理化学的性質を有する複数のセンサ素子、（ｂ）１以上のセンサ素子が同じ又は異なる物理化学的性質を有する異なる材料で作成された、複数のセンサ素子、（ｃ）異なるサイズの同じ材料から作成された複数のセンサ素子、（ｄ）比較的同じサイズの異なる材料から作成された複数のセンサ素子、（ｅ）異なる材料から作成されるとともに異なるサイズで作成された複数のセンサ素子、（ｆ）各素子が異なる材料から作成された、複数のセンサ素子、（ｇ）異なる電荷を有する複数のセンサ素子を含むが、これらに限定されない。複数のセンサ素子は、各センサ素子がユニークな生体分子コロナシグネチャーを与えるような、２以上のセンサ素子のあらゆる適切な組み合わせとすることができる。例えば、複数のセンサ素子は、１以上のリポソーム又は本明細書に記載した１以上のナノ粒子を含んでもよい。一実施形態では、複数のセンサ素子は、さまざまな脂質含量及び／又はさまざまな電荷（陽イオン／陰イオン／中性イオン）を有する複数のリポソームとすることができる。別の実施形態では、複数のセンサは、同じ材料から作成されるがサイズ及び物理化学的性質の異なる１以上のナノ粒子を含んでもよい。別の実施形態では、複数のセンサは、異なる材料（例えばシリカ及びポリスチレン）から作成されるとともに同様の又は異なるサイズ及び／又は物理化学的性質（例えば修飾、例えば−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ機能化）を有する１以上のナノ粒子を含んでもよい。これらの組み合わせは純粋に例として挙げられるものであって本発明の範囲を限定するものではない。
【０１００】
粒子の表面の曲率(angle of curvature)は、粒子のサイズに応じて変えることができる。この曲率の変化により、タンパク質が結合でき粒子上で互いに相互作用できる表面積が変化する。図５８に示すように、粒子のサイズを大きくすることで結合するタンパク質の量が変化するとともに、異なるサイズのナノ粒子に結合したタンパク質のパターンが変化する（この例では、直径が０．１μｍ、３μｍ及び４μｍのナノ粒子上のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析が示される）。
【０１０１】
前記センサアレイの新規性は、異なるセンサ素子間の異なるタンパク質を検出できることだけでなく、異なるセンサ素子間の同じタンパク質のレベルを比較できることにある。例えば、いかなる理論にも束縛されるものではないが、本発明のセンサアレイの特異性を説明するために理論的な例を記載する。一部の実施形態では、サンプルを第１センサ素子Ａ、第２センサ素子Ｂ及び第３センサ素子Ｃと接触させ、各センサ素子は遠隔タンパク質コロナシグネチャー（即ちＡ’、Ｂ’及びＣ’）を生成する。各タンパク質コロナシグネチャーＡ’、Ｂ’及びＣ’の組成は互いに異なることができる。一部の実施形態では、Ａ’、Ｂ’及びＣ’は異なる量の同じタンパク質を備えてもよく、これにより、これまで知られているアプローチを用いてサンプルを特性評価することによっては得ることができない追加のプロテオーム情報を提供することができる。換言すれば、各ナノ粒子からの各ユニークなコロナタンパク質情報は、ユニークな変数（変量）の役割をし、したがってより多くのプロテオームデータ(provides more data proteomics data)を提供する。例えば、アルブミンは、１つのセンサ素子Ａのみのタンパク質コロナシグネチャーにおいて、２つのセンサ、例えばＡ及びＢ、Ｂ及びＣ若しくはＡ及びＣ、のシグネチャーにおいて又は３つ全てのセンサ生体分子シグネチャー（Ａ，Ｂ，Ｃ）において、発見されてもよい。さらに、センサアレイは、タンパク質、例えばアルブミン、の存在の有無を決定するだけではなく、１つのセンサと他のセンサとでのタンパク質の量の比較を決定することもできる。例えば、アルブミンは、特定の生体分子フィンガープリントについて、Ａのシグネチャーにおいて濃度Ｘで、センサＢにおいて１／３Ｘの濃度で、センサＣにおいて２Ｘの濃度で発見されてもよい。別の生体分子フィンガープリントでは、同じタンパク質、アルブミン、は、例えば、センサＤにおいて１／８Ｘ、センサＥにおいて３Ｘ、センサＦにおいて１／４Ｘといった３つの異なる濃度で発見されてもよい。したがって、複数のセンサは、タンパク質の濃度のデータポイントを提供するだけではなく、２以上のセンサ間でタンパク質の濃度の比較を提供することができる。さらに、稀少な又は低含量のタンパク質の濃度を既知のタンパク質の濃度と比較することで、タンパク質コロナに関するさらなるデータを提供することができる。例えば、説明のために、未知のタンパク質、例えばタンパク質Ｚ、の濃度を、異なる生体分子コロナにおける既知のタンパク質、例えばアルブミン、の量と比較してもよい。例えば、Ｚは、アルブミンに対する比率が、センサＡ上で１：８、センサＢ上で１：５０で発見されるとともに、センサＣ上では存在しなくてもよい。図１２は、分析されたタンパク質コロナにおける稀少タンパク質対アルブミン濃度の比較を提供する。したがって、統計学的分析により、タンパク質の存在と各センサ素子間の相対濃度との両方を得ることができるとともに、データを分析する際に特定の濃度の既知のタンパク質と比較したときの稀少又は低含量タンパク質の濃度を得ることができる。
【０１０２】
一部の実施形態では、チャネルは、リソグラフィー、エッチング、エンボス加工又はポリマー表面の成形によって形成される。通常、製造プロセスはこれらのプロセスの何れか１以上のプロセスを用いてもよく、アレイの異なる部品は異なる方法を用いて製造されて組み立てられる又は互いに結合されてもよい。
【０１０３】
リソグラフィーは、材料を変化させるために光又は電子ビームなどのエネルギーの他の形態を用いる。典型的には、ポリマー表面又は前駆体（例えばフォトレジスト、遮光材料）が基板上にコーティングされ、光又はエネルギーの他の形態に選択的にさらされる。フォトレジストに依って、一般に「現像」として知られる後続プロセス工程においてフォトレジストの露出領域が維持される又は溶解される。このプロセスによって、基板上のフォトレジストのパターンが得られる。一部の実施形態では、フォトレジストは成形プロセスにおいて種型として用いられる。一部の実施形態では、ポリマー前駆体を、フォトレジストを有する基板上に注ぎ、重合（即ち硬化）させてから剥がす。
【０１０４】
一部の実施形態では、フォトレジストはエッチングプロセスのためのマスクとして用いられる。例えば、シリコン基板上でフォトレジストをパターニングした後、深堀反応性イオンエッチング（ＤＲＩＥ）プロセス又は当該分野で周知の他の化学エッチングプロセス（例えばプラズマエッチング、ＫＯＨエッチング、ＨＦエッチングなど）を用いて、基板にチャネルをエッチングすることができる。フォトレジストは除去され、そして基板は、当該分野で周知のあらゆる結合方法（例えば陽極結合、接着剤結合、直接結合、共晶結合など）のうちの１つを用いて別の基板に結合される。複数のリソグラフィー工程、エッチング工程及びドリル加工などの機械加工工程を必要に応じて含めてもよい。
【０１０５】
一部の実施形態では、ポリマー基板を加熱し種型に押し付けてエンボス加工してもよい。種型は、リソグラフィー及び機械加工を含む種々のプロセスにより形成してもよい。その後、チャネル及び／又は混合装置を形成するためにポリマー基板が別の基板に結合される。必要に応じて機械加工プロセスを含めてもよい。
【０１０６】
一部の実施形態では、射出成形プロセスのために、融解ポリマー又は金属又は合金を適切な型内に射出し、冷却して固める。通常、型は、成型された部品を取り除くための２つの部分から構成される。したがって製造された部品は基板に結合されて基板に設けられる。
【０１０７】
一部の実施形態では、チャネルを形成するために犠牲層エッチングを用いてもよい。リソグラフィー手法を用いて基板上に材料をパターニングしてもよい。この材料は、異なる化学的性質を有する別の材料によって被覆される。この材料にリソグラフィー及びエッチングプロセス又は他の機械加工プロセスを施してもよい。その後、基板は、第１材料を選択的に除去する化学薬剤にさらされる。チャネルは第２材料に形成されて、エッチングプロセス前に存在した第１材料があった場所に空隙を残す。
【０１０８】
一部の実施形態では、マイクロチャネルは、レーザー加工又はＣＮＣ加工によって基板に直接加工される。したがって加工された複数の層が互いに結合されて最終基板が得られる。
【０１０９】
一部の実施形態では、各チャネルの幅又は高さは約１μｍ〜約１０００μｍである。一部の実施形態では、各チャネルの幅又は高さは約５μｍ〜約５００μｍである。一部の実施形態では、各チャネルの幅又は高さは約１０μｍ〜約１００μｍである。一部の実施形態では、各チャネルの幅又は高さは約２５μｍ〜約１００μｍである。一部の実施形態では、各チャネルの幅又は高さは約５０μｍ〜約１００μｍである。一部の実施形態では、各チャネルの幅又は高さは約７５μｍ〜約１００μｍである。一部の実施形態では、各チャネルの幅又は高さは約１０μｍ〜約７５μｍである。一部の実施形態では、各チャネルの幅又は高さは約１０μｍ〜約５０μｍである。一部の実施形態では、各チャネルの幅又は高さは約１０μｍ〜約２５μｍである。
【０１１０】
一部の実施形態では、チャネルの最大幅又は高さは、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約２５０μｍ、約５００μｍ又は約１０００μｍである。
【０１１１】
一部の実施形態では、各チャネルの幅は約５μｍ〜約１００μｍである。一部の実施形態では、チャネルの幅は約５μｍ、約１０μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約２５μｍ、約３０μｍ、約３５μｍ、約４０μｍ、約４５μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍである。
【０１１２】
一部の実施形態では、各チャネルの高さは約１０μｍ〜約１０００μｍである。一部の実施形態では、チャネルの高さは約１０μｍ、約１００μｍ、約２５０μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７５０μｍ又は約１０００μｍである。特定の実施形態では、サンプルが流れる（複数の）チャネルの高さは約５００μｍである。特定の実施形態では、サンプルが流れる（複数の）チャネルの高さは約５００μｍである。
【０１１３】
一部の実施形態では、各チャネルの長さは約１００μｍ〜約１０ｃｍである。一部の実施形態では、チャネルの長さは約１００μｍ、約１．０ｍｍ、約１０ｍｍ、約１００ｍｍ、約５００ｍｍ、約６００ｍｍ、約７００ｍｍ、約８００ｍｍ、約９００ｍｍ、約１．０ｃｍ、約１．１ｃｍ、約１．２ｃｍ、約１．３ｃｍ、約１．４ｃｍ、約１．５ｃｍ、約５ｃｍ又は約１０ｃｍである。特定の実施形態では、サンプルが流れる（複数の）チャネルの長さは約１．０ｃｍである。特定の実施形態では、サンプルが流れる（複数の）チャネルの長さは約１．０ｃｍである。
【０１１４】
＜生体分子コロナナノシステム＞
本明細書において提供されるのは、生体分子コロナナノシステム又はセンサアレイであって、複数のセンサ素子を備え、主にこれらから構成され又はこれらから構成され、前記複数のセンサ素子は、少なくとも１つの物理化学的性質が互いに異なる。一部の実施形態では、複数のセンサ素子は複数のナノ粒子である。一部の実施形態では、複数のナノ粒子は複数のリポソームである。一部の実施形態では、各センサ素子は、生体分子コロナシグネチャーを生成するために複雑な生体サンプル中の複数の生体分子を結合させることが可能である。一部の実施形態では、各センサ素子は区別可能な生体分子コロナシグネチャーを有する。
【０１１５】
生体分子コロナシグネチャーは、各個別センサ素子又は各ナノ粒子に結合した異なる生体分子の組成、シグネチャー又はパターンを指す。一部の実施形態では生体分子コロナシグネチャーはタンパク質コロナシグネチャーである。別の実施形態では、生体分子コロナシグネチャーは多糖類コロナシグネチャーである。さらに別の実施形態では、生体分子コロナシグネチャーは代謝物コロナシグネチャーである。一部の実施形態では、生体分子コロナシグネチャーはリピドミックコロナシグネチャーである。シグネチャーとは、異なる生体分子を指すだけではなく、センサ素子若しくはナノ粒子に結合した生体分子の量、レベル若しくは分量の差、又はセンサ素子若しくはナノ粒子に結合した生体分子の立体構造の差をも指す。各センサ素子の生体分子コロナシグネチャーは、同じ生体分子を一部含んでもよい、他のセンサ素子若しくはナノ粒子に関する区別可能な生体分子を含んでもよい及び／又は生体分子のレベル若しくは分量、タイプ若しくはコンファメーション(confirmation)が異なってもよいと考えられる。生体分子コロナシグネチャーは、センサ素子又はナノ粒子の物理化学的性質だけではなく、サンプルの性質及び露出時間にも依存してもよい。一部の実施形態では、生体分子コロナシグネチャーは、ソフトコロナ及びハードコロナのなかで発見される生体分子を備える。
【０１１６】
一部の実施形態では、センサアレイは、第１生体分子コロナシグネチャーを生成する第１センサ素子と、前記センサアレイが複雑な生体サンプルと接触したときに少なくとも１つの第２生体分子コロナシグネチャーを生成する少なくとも１つの第２センサ素子又は少なくとも１つのナノ粒子と、を備える、これらから主に構成される又はこれらから構成される。生体分子フィンガープリントは、第１生体分子シグネチャーと少なくとも１つの第２生体分子シグネチャーとの組み合わせである。生体分子シグネチャーは、少なくとも２つの生体分子コロナシグネチャーから例えば少なくとも１０００個の異なる生体分子コロナシグネチャーの多くの異なる生体分子シグネチャーから作成することができると考えられる。生体分子コロナを各センサ素子について別々に分析して各素子、各ナノ粒子若しくは各リポソームについての生体分子コロナシグネチャーを決定し、これらを組み合わせて生体分子フィンガープリントを決定することができる、又は２以上の生体分子コロナを同時に分析して生体分子フィンガープリントを一度に生成してもよい。
【０１１７】
生体分子フィンガープリントは、対象の異なる潜在的生物学的状態（例えば疾病状態）を区別することができる。一部の実施形態では、生体分子フィンガープリントは、疾病若しくは障害の進行と関連付けられる及び／又は対象の疾病状態と関連付けることが可能である。
【０１１８】
一部の実施形態では、生体分子フィンガープリントは対象の疾病状態を決定することが可能である。本明細書で用いる場合、対象の「疾病状態」との用語は、対象における疾病の異なる状態間を区別できる本技術のセンサアレイの能力を指す。この用語は、疾病又は障害の発症前状態又は前駆状態（対象において疾病又は障害の外見的兆候又は症状が何もないものの将来的に疾病又は障害を発症するステージ）、及び対象が疾病又は障害の病期を有する疾病状態（例えば疾病又は障害の初期、中期又は末期ステージ）を包含する。換言すれば、疾病状態は、疾病又は障害に対する対象の一連のヘルスケアを包含するスペクトルである。本発明のアレイは、スペクトル上の異なる疾病状態に関連した異なる生体分子フィンガープリント及び健康な対象と比較することができる生体分子フィンガープリントを決定することによって対象の異なる疾病状態を区別することができる。別の例では、生体分子フィンガープリントは、対象は疾病の外見的兆候又は症状がないときは健康である様に見えるものの将来的に疾病を発症するような発症前状態又は前駆疾病状態と関連付けることができる。別の例では、生体分子フィンガープリントは、対象が疾病を有することを示してもよく、疾病が初期、中期又は末期のものである場合には各ステージに関連付けられたユニークな生体分子フィンガープリントによって区別することができる。
【０１１９】
上述のように、疾病状態は疾病又は障害の前駆状態も含む。この前駆状態は、対象が疾病又は障害の外見的兆候又は症状を何も有していない（ただし、対象の血中又は他の生体液中に見つかる対象の生体分子におけるサブマクロな変化はあり得る）ものの将来的に疾病又は障害を発症する状態である。この前駆状態は、疾病の第１病理学的変化、例えば患者からの生体サンプルの生体分子フィンガープリントの変化、がみられる状態としても記載できる。
【０１２０】
生物学的状態の別の例は、健康で疾病のない状態である。アレイは、対象が将来的に疾病を発症しない健康で疾病のない状態に関連付けられた特異的生体分子フィンガープリントを決定することもできる。この場合、対象は試験時において疾病にかかっていないし将来的に疾病を発症もしないという証拠はない。
【０１２１】
本明細書において、「生物学的状態」との用語は、本明細書で定義したように生体サンプルにおいて明らかとすることができる対象のあらゆる生物学的特徴を包含する。生物学的状態は本明細書に開示された方法を用いて検出することができ、生物学的状態が異なる２つの対象は、サンプルの組成においてこれらの差異が明らかとなる。例えば、生物学的状態は、対象の疾病状態を含む。疾病状態によって、疾病状態を有さない（即ち生物学的状態が健康状態又は疾病にかかっていない状態）対象のサンプルに対して疾病状態を示す対象のサンプルの分子組成（例えば１以上のタンパク質のレベル）に変化が生じたときに、疾病状態を検出することができる。
【０１２２】
生物学的状態の別の例は、特定の治療処置（例えば薬剤又は医薬品の１つ又は組み合わせの投与）に対する対象の応答性のレベルである。一部の実施形態では、生物学的状態は特定の薬剤に対する対象の（例えば分析における特定の閾値に関する）応答性である。別の実施形態では、生物学的状態は特定の薬剤に対する対象の（例えば分析における特定の閾値に関する）非応答性である。一部の実施形態では、薬剤に対する対象の応答性のレベル（即ち薬剤に対する応答性の生物学的状態又は薬剤に対する非応答性の生物学的状態）は、対象間における薬剤の代謝又は薬物動態のばらつきなどの因子に関連している。
【０１２３】
生物学的状態の別の例は、対象が示す免疫応答のレベルである。一部の実施形態では、生物学生状態は増大した免疫応答とすることができる。別の実施形態では、生物学的状態は減少した免疫応答とすることができる。免疫応答は変数の多さの結果として対象間で異なることができる。例えば、免疫応答は、外因的に導入された抗原（例えばウイルス又は細菌に関連するもの）へのさらされ程度の差の結果として、自己免疫疾患若しくは障害へのかかりやすさの差の結果として又は副次的に対象における他の生物学的状態（例えばがんなどの疾病状態）への応答の結果として、対象間で異なることができる。
【０１２４】
生体分子フィンガープリントに関連付けることができる生物学的状態の他の例は、対象の薬剤投与に関連する副作用の受けやすさ及び対象の特定の成分又は物質の投与へのアレルギー反応を示す可能性の確認を含む。
【０１２５】
このセンサアレイ及び関連方法における革新は、兆候又は症状がモニターできる又は分析できる前の疾病のかなり初期のステージで対象が疾患又は障害を発症する傾向又は可能性を有し得るか否かを予想するために特異的バイオマーカーの存在の有無又はレベルを検出又は測定する現在の方法とは異なる。好適には、アレイは、対象の健康について疾病又は障害がないと区別でき、疾病又は障害の前兆を有することを区別でき、及び疾病又は障害を有することを区別できる。しかしながら、本発明はこれらの実施形態には限定されず、対象の一連のヘルスケア及び疾患において生じ得る他の疾患状態のスペクトルをカバーする。
【０１２６】
さらに、本発明のセンサアレイの革新は、以下の例によって示すことができる。本発明のセンサアレイは非常に敏感で、サンプル中の生体分子のわずかな量の変化を検出可能であるだけでなく、生体分子間の相互作用にも依存する。例えば、いかなる理論にも束縛されるものではないが、本発明のセンサアレイのユニークさを説明するために理論的な例を記載する。例えば生体サンプルが時間とともに（例えば疾病状態、発症前状態の兆候及び症状が現れる前並びに疾病の初期及び中期ステージの間）対象から採取された場合。これらのサンプルにおいて、サンプル中の生体分子Ｘのレベルを測定する（例えば量の定量化）だけで、異なる疾病状態にわたって濃度が変わらないことが認められるかもしれない。したがって、生体分子Ｘの測定は有用な疾患のマーカーではない場合がある。しかしながら、本発明のセンサアレイを用いることで、生体分子Ｘのレベルは同じかもしれないが、生体分子Ｘの他の生体分子Ｙ，Ｚとの相互作用によってサンプルに関連したタンパク質コロナシグネチャーの組成が時間とともに及びサンプルにわたって変化し得る。例えば、バイオマーカーＸはその関連性を生体分子Ｙから生体分子Ｚに関連するように変化してもよく、あるいはＸとＹ及びＺの経時的相互作用によってＸの立体構造的な変化がもたらされる。全濃度は変化しないが疾病状態に関連したユニークな生体分子フィンガープリント（生体分子Ｘを含む）が変化するこのタイプの変化により、他の疾病状態と区別する及び関連付けることができる。これは、サンプル中の生体分子Ｘの量を測定するだけの従来の方法を使用した場合にはこのレベルは全疾病において同じままである為分からない。これはこれまでにない予想外に非常に特異的かつ有用なアッセイである。このアッセイを用いることで、これまでバイオマーカーとしての特徴を有していなかった疾病のバイオマーカーについて、これらのマーカーはサンプル中の絶対量が変化しないもののセンサアレイのセンサ素子との相互作用に関し一定の及び測定可能な変化を有することから、バイオマーカーのパターンを含めて、判定することができる。生体分子コロナの分析によるパターンを区別する能力によって、これらのパターンを異なる疾病状態と関連付ける能力が得られる。
【０１２７】
上述のように、本発明のセンサアレイは１０の１０乗(ten order of magnitude)を超えるタンパク質を検出する能力を有し、これはこれまでの方法よりもより高い感度である。本発明のセンサアレイのユニークさは、タンパク質をサンプル中の濃度のレベルに関係なく検出できるアレイの能力にある。アッセイは、サンプル中の生体分子（例えばタンパク質）、既知又は未知、のセンサ素子と相互作用する能力に依存し、そして異なるセンサ素子と異なる量で及び異なるように相互作用する能力並びにセンサ素子に関連する他の生体分子と相互作用する能力にも依存する。そしてこれによって、サンプル中に高含量のタンパク質（アルブミンなど）が存在していても、低含量の及び稀少なタンパク質を検出することができる。例１の図１２に示すように、高含量タンパク質の存在下でも１０の１０乗を超える濃度(concentrations over 10 order of magnitude)を検出するセンサアレイの能力が示されている。また、センサアレイは、現在の方法を用いてはこれまでに分かっていない未知の／報告されていない血漿濃度でタンパク質を検出することも可能である。本発明のセンサアレイのユニークな特徴の１つは、低含量及び稀少タンパク質を検出できる本発明のシステムの能力である。本発明のセンサアレイは、疾病状態（疾病無し、発症前又は初期及び末期疾病）を決定するために用いることができるだけでなく、場合によっては疾病のサブタイプを区別する（例えば、肺がん、乳がん、骨髄腫など、がんの種類を区別する）ためにも用いることができる。
【０１２８】
＜検出方法＞
本発明のセンサアレイは、本明細書に記載の種々の方法に用いてもよい。サンプルについてのユニークな生体分子フィンガープリントを決定する能力は、対象における特定の疾病状態を測定するための新規の及び革新的な手段を提供する。これらの生体分子フィンガープリントは、対象の疾病状態の決定、対象の疾病の診断若しくは予後診断又は疾病若しくは障害の疾病状態に関連したバイオマーカーのユニークなパターンの識別に用いることができる。例えば、対象における生体分子フィンガープリントの経時的（日、月、年）変化は、対象における疾病又は障害（例えば疾病状態）を追跡する能力を与え、これは疾病の初期ステージ又はあらゆる他の疾病状態に関連付けることができる生体分子フィンガープリントの決定に広く応用することができる。上述のように、例えばがんについて、がんが完全に進行する又は転移する前ともできる早期に疾病を検出する能力は、これらの患者についてよりよい転帰をもたらし、余命を延ばす能力を与え、そしてその疾病に関連する死亡率を低下させる。したがって、本発明のセンサアレイは、疾病の発症前又は前駆状態に関連した生体分子フィンガープリントを得ることができるユニークな機会を提供する。
【０１２９】
疾病が目に見える兆候又は症状を示すほど進行する前であっても、肉眼的レベルで、対象の体内及び生体系内において変化が起こっていると解釈されている。本発明のセンサアレイの使用により予期されるこれらの初期発症前兆候を認識することが可能である。発明者らは、疾病状態の異なる時点（例えば疾病が症状を示し発症する前、疾病の初期兆候若しくは症状が現れた後及び／又は疾病の末期）において対象の生体分子フィンガープリントを比較することにより、疾病の進行に関連する異なる疾病状態に関連したユニークな生体分子フィンガープリントが得られることを見出した。換言すると、今後疾病を発症する対象を識別することを可能とする生体分子フィンガープリントを決定することができる。これにより、早期モニタリング及び早期治療が可能となり、疾病があると診断された対象のよりよい転帰をもたらす。
【０１３０】
一部の実施形態では、対象の疾病又は障害を検出する方法が提供される。前記方法は、（ａ）前記対象からサンプルを取得する工程と、（ｂ）本明細書に記載のようなセンサアレイに前記サンプルを接触させる工程と、（ｃ）前記サンプルに関連する生体分子フィンガープリントを決定する工程と、を有し、前記生体分子フィンガープリントは、疾病状態にある対象の健康状態を区別し、例えば、疾病又は障害がないか、疾病又は障害の前駆状態を有するか、疾病又は障害を有するか、を区別する。
【０１３１】
サンプルと関連する生体分子フィンガープリントを決定する工程は、少なくとも２つのセンサ素子について生体分子コロナシグネチャーを検出することを含み、少なくとも２つの生体分子コロナシグネチャーの組み合わせによって生体分子フィンガープリントが生成される。一部の実施形態では、前記少なくとも２つのセンサ素子の生体分子コロナシグネチャーは別々に分析され、その結果を組み合わせて生体分子フィンガープリントを決定する。一部の実施形態では、少なくとも２つの素子の生体分子コロナシグネチャーを同時に又は同じサンプル中で分析する。
【０１３２】
一部の実施形態では、生体分子フィンガープリントを決定する方法は、少なくとも２つのセンサ素子の生体分子コロナシグネチャーを検出及び決定する工程を含む。一部の実施形態では、この工程は、各センサ素子に結合した複数の生体分子を分離して（例えば生体分子コロナをセンサ素子から分離する）、生体分子フィンガープリントを決定するために複数の生体分子コロナの組成を決定するために複数の生体分子を分析することによって行うことができる。アレイの設計に依っては、場合により、各センサ素子の各生体分子コロナシグネチャーの組成が個別に分析され、その結果が組み合わされて生体分子フィンガープリントが生成される（例えば、各センサ素子が別個のチャネル又はコンパートメント内にあり、その特定のセンサ素子についての生体分子コロナの具体的な組成を個別に分析できる（例えば、生体分子を切り離して質量分析法若しくはクロマトグラフィーによって分析する又はセンサ素子に結合したままの複数の生体分子を蛍光、発光若しくは他の手段によって検出する））。別の実施形態では、前記少なくとも２つのセンサ素子は同じアレイ上にあり、そして、両センサ素子からの生体分子コロナを１つの溶液中で分離させて生体分子シグネチャーを決定するためにその溶液を分析することによって、前記少なくとも２つのセンサ素子についての生体分子コロナの組成が同時に分析される。
【０１３３】
生体分子コロナシグネチャー又は生体分子フィンガープリントを構成する複数の生体分子を分析する方法は、当該分野で周知であり、例えば、ゲル電気泳動法、液体クロマトグラフィー、質量分析、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）、フーリエ変換赤外分光分析（ＦＴＩＲ）、円偏光二色性、ラマン分光法及びこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、分析は、液体クロマトグラフィー、質量分析又はこれらの組み合わせによって行われる。
【０１３４】
好ましい実施形態では、センサアレイは非標識アレイである。
【０１３５】
一部の実施形態では、標識アレイを用いてもよく、コロナシグネチャーは信号（例えば蛍光、発光、電荷、比色染料）の変化として決定することが可能であると考えられる。好適な例を図４２〜図４３に示す。例えば、アレイは、生体分子と応答性染料との間の平衡相互作用に基づいて生体分子を検出及び識別するために印刷可能な配合で(in a printable formulation)化学応答性着色料を含んでもよい。
【０１３６】
一部の実施形態では、センサ素子は、第１成分と、第１成分を化学的に補足するポリマー蛍光体又は他の消光剤成分と、からなる複合体を備え、そのような複合体は初期背景又はリファレンス蛍光を有する。第１成分が生体分子コロナと接触すると、第１成分は蛍光体の消光に影響を及ぼし、この蛍光の変化を測定することができる。センサをレーザーで照射及び／又は励起した後、各センサ素子についての蛍光の影響及び／又は変化を測定し、背景蛍光と比較して、生体分子フィンガープリントを生成することができる。
【０１３７】
疾病状態及び／又は疾病若しくは障害の予後診断若しくは診断を決定するために本明細書に記載のセンサアレイ及び方法を用いることができる。考え得る疾病又は障害は、例えば、がん、心血管疾患、内分泌障害、炎症性疾患、神経性疾患などを含むがこれらに限定されない。
【０１３８】
一実施形態では、疾病又は障害はがんである。好適な実施形態では、本明細書に記載のセンサアレイ及び方法は、がんを診断可能（例えば対象が（ａ）がんでない、（ｂ）がん発症前ステージである、（ｃ）初期がんである、（ｄ）末期がんであるかを決定する）なだけでなく、一部の実施形態ではがんの種類を決定することが可能である。以下の例に示すように、６つのセンサ素子を備えるセンサアレイによって、がんの有無の疾病状態を正確に決定することが可能であった。加えて、これらの例は、６つのセンサ素子を備えるセンサアレイによって異なるがんの種類（例えば肺がん、神経膠芽腫、髄膜腫、骨髄腫、すい臓がん）を区別することが可能であったことを示す。
【０１３９】
本明細書で用いられる「がん」及び「腫瘍」との用語は、互換的であり、細胞の異常成長により特徴付けられるあらゆるがん、腫瘍性及び前腫瘍性疾病を包含する意味で用いられる。がんは、例えば、肺がん、すい臓がん、骨髄腫、骨髄性白血病、髄膜腫、神経膠芽腫、乳がん、食道扁平上皮がん、胃がん、前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、甲状腺がん、神経内分泌腫瘍、大腸がん、卵巣がん、頭頸部がん、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、直腸がん、尿路がん、子宮がん、口腔がん、皮膚がん、胃がん、脳腫瘍、肝がん、喉頭がん、食道がん、乳腺腫瘍、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、ユーイング肉腫、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、嚢胞腺がん、髄様がん、気管支原性がん、腎細胞がん、へパトーマ、胆管がん、絨毛がん、セミノーマ、胎児性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、精巣腫瘍、子宮体がん、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮性がん、神経膠芽腫、神経腫、頭蓋咽頭腫、神経鞘腫、グリオーマ、星細胞系腫瘍、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、網膜芽細胞腫、白血病及びリンパ腫、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性真性赤血球増加症、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、Ｈ鎖病、急性非リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、小児悪性急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、胸腺ＡＬＬ、Ｂ細胞ＡＬＬ、急性巨核芽球性白血病、バーキットリンパ腫、Ｔ細胞白血病、小細胞及び大細胞及び非小細胞肺がん、急性顆粒球白血病、胚細胞腫瘍、子宮体がん、胃がん、有毛細胞性白血病、甲状腺がん並びに当該分野で周知の他のがんからなるグループから選択され得る。好ましい実施形態では、がんは、肺がん、すい臓がん、骨髄腫、骨髄性白血病、髄膜腫、神経膠芽腫、乳がん、食道扁平上皮がん、胃がん、前立腺がん、膀胱がん、卵巣がん、甲状腺がん、神経内分泌腫瘍からなるグループから選択される。
【０１４０】
本明細書で用いる場合、「心血管疾患」（ＣＶＤ）又は「心血管障害」との用語は、心臓、心臓弁及び体の血管系（例えば静脈及び動脈）に影響を及ぼす多数の状態を分類するために用いられ、アテローム性動脈硬化症、心筋梗塞、急性冠症候群、狭心症、うっ血性心不全、大動脈瘤、大動脈解離、腸骨又は大腿動脈瘤、肺塞栓症、心房細動、脳卒中、一過性脳虚血発作、縮期心不全、弛緩期心不全、心筋炎、房頻拍、心室細動、心内膜炎、末梢動脈疾患及び冠動脈疾患（ＣＡＤ）を含む、しかしこれらに限定されない、疾病及び状態を包含する。さらに、心血管疾患との用語は、心血管系イベント又は心血管系の合併症を最終的に有する対象を指し、心筋梗塞、不安定狭心症、動脈瘤、脳卒中、心不全、非致死的心筋梗塞、脳卒中、狭心症、一過性脳虚血発作、大動脈瘤、大動脈解離、心筋症、異常心臓カテーテル法、異常心臓画像化、ステント又は移植片血管再建、異常ストレステストを経るリスク、心筋かん流を経るリスク及び死を含む、しかしこれらに限定されない、心臓突然死又は急性冠症候群などの心血管疾患に起因する対象における悪条件の症状を指す。
【０１４１】
本明細書で用いる場合、心血管疾患、例えば動脈硬化症、を発見、診断又は予後診断する能力は、患者が心血管疾患の発症前ステージにあるか、初期、中程度若しくは重度の心血管疾患にかかっているか又は１以上の心血管系イベント若しくは心血管疾患に関連する合併症にかかったか否かを決定することを含むことができる。
【０１４２】
アテローム性動脈硬化症（アテローム動脈硬化性心血管疾患又はＡＳＶＤ）は、動脈の壁の最も内側の層への白血球を含む動脈プラークの浸入、蓄積及び堆積の結果として動脈壁が厚くなり動脈が狭まるとともに硬化する心血管疾患である。動脈プラークはマクロファージ細胞又は細胞片の蓄積であり、脂質（コレステロール及び脂肪酸）、カルシウム及び不定量の線維性結合組織を含む。アテローム性動脈硬化症に関連する疾病は、アテローム血栓症、冠動脈心疾患、深部静脈血栓症、頸動脈疾患、狭心症、末梢動脈疾患、慢性腎臓病、急性冠症候群、血管狭窄症、心筋梗塞、動脈瘤又は脳卒中を含むが、これらに限定されない。
【０１４３】
説明のために、一実施形態では、センサアレイは、対象の狭窄の異なる程度を含む、しかしこれに限定されない、アテローム性動脈硬化症の異なるステージを区別してもよい。
【０１４４】
さらに、説明のために、以下の例は、冠動脈疾患の異なる状態を検出するためのセンサアレイの使用を示す。６つのセンサ素子を含むセンサアレイは、冠動脈造影検査でＣＡＤと診断された対象、健康な冠状動脈を有する症状が現れた患者（ＣＡＤなし）、再狭窄（治療後のＣＡＤの再発）があった患者及び危険因子のない健康な対象を区別可能であった（図５３）。本発明のセンサアレイは、冠動脈疾患の症状を有するが動脈狭窄がない人々との差を検出するのに十分な感度を有していた（例えばＣＡＤなし対ＣＡＤグループ）。これは、リスクがある患者のための無侵襲的なスクリーニングとして使用できる新規の診断ＣＡＤテストを提供する。
【０１４５】
「内分泌障害」との用語は、対象の内分泌系の異常調節に関連する障害を指す。内分泌障害は、腺が内分泌ホルモンを過剰に又は過小に生成することにより生じてホルモンバランスを乱し、あるいは内分泌系での病変（小結節又は腫瘍など）の発症が原因となりホルモンレベルに影響を及ぼす又は影響を及びさない。治療が可能な好適な内分泌障害は、例えば、末端肥大症、アジソン病、副腎がん、副腎障害、組織非形成性甲状腺がん、クッシング症候群、ド・ケルバン甲状腺炎、糖尿病、濾胞性甲状腺がん、妊娠糖尿病、甲状腺腫、グレーブス病、成長異常、成長ホルモン分泌不全、慢性甲状腺炎（橋本病）、好酸性細胞甲状腺がん、高血糖症、副甲状腺機能亢進症、甲状腺機能亢進症、低血糖症、副甲状腺機能低下症、甲状腺機能低下症、低テストステロン、甲状腺髄様がん、ＭＥＮ１、ＭＥＮ２Ａ、ＭＥＮ２Ｂ、閉経、メタボリックシンドローム、肥満症、骨粗しょう症、乳頭様甲状腺がん、副甲状腺疾患、褐色細胞腫、下垂体障害、下垂体腫瘍、多嚢胞性卵巣症候群、前糖尿病、無症状、甲状腺炎、甲状腺がん、甲状腺疾患、結節性甲状腺腫、甲状腺炎、ターナー症候群、１型糖尿病、２型糖尿病などを含むが、これらに限定されない。
【０１４６】
本明細書で称するように、炎症性疾患とは対象の体内の抑制不能な炎症によって生じる疾病を指す。炎症は、病原体、壊死した細胞及び組織、刺激物質などの外部又は内部の痛みを伴う刺激に対する対象の生物学的応答である。しかしながら、炎症性反応が異常になると、軟部組織損傷がおこり、さまざまな疾病及び障害を引き起こし得る。炎症性疾患は、喘息、糸球体腎炎、炎症性腸疾患、関節リウマチ、過敏症、骨盤内炎症性疾患、自己免疫疾患、関節炎；壊死性腸炎（ＮＥＣ）、胃腸炎、骨盤内炎症性疾患（ＰＩＤ）、肺気腫、胸膜炎、腎盂炎、咽頭炎、狭心症、尋常性ざ瘡、尿路感染症、虫垂炎、滑液包炎、大腸炎、膀胱炎、皮膚炎、静脈炎、鼻炎、腱炎、扁桃炎、血管炎、自己免疫疾患；セリアック病；慢性前立腺炎、過敏症、再潅流障害；サルコイドーシス、移植拒絶反応、血管炎、間質性膀胱炎、花粉症、歯周炎、アテローム性動脈硬化症、乾せん、強直性脊椎炎、若年性関節リウマチ、ベーチェット病、脊椎関節炎、ブドウ膜炎、全身性エリテマトーデス及びがんを含むが、これらに限定されない。例えば、関節炎はリウマチ性関節炎、乾癬性関節炎、変形性関節炎又は若年性特発性関節炎などを含む。
【０１４７】
神経障害又は神経疾患は、互換的に用いられ、脳、脊椎及びこれらを繋ぐ神経の疾病を指す。神経疾患は、脳腫瘍、てんかん、パーキンソン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、動静脈奇形、脳血管性疾患、脳動脈瘤、てんかん、多発性硬化症、末梢神経障害、帯状疱疹後神経痛、脳卒中、前頭側頭型認知症、脱髄性疾患、多発性硬化症、デビック病（即ち視神経脊髄炎）、橋中心髄鞘崩壊症、進行性多巣性白質脳症、白質ジストロフィー、ギラン・バレー症候群、進行性炎症性神経障害、シャルコー・マリー・トゥース病、慢性炎症性脱髄性多発神経炎及び抗ＭＡＧ末梢神経障害を含むがこれらに限定されない）などを含むが、これらに限定されない。また、神経障害は、免疫介在性神経障害（ＩＭＮＤ）をも含み、これは、免疫系の少なくとも１つのコンポーネントが中枢又は末梢神経系に存在するホストタンパク質に対して反応して疾患病態に寄与する疾病を含む。ＩＭＮＤは、脱髄性疾患、傍腫瘍性神経症候群、免疫介在性脳脊髄炎、免疫介在性自律神経障害、重症筋無力症、自己抗体関連脳症及び急性散在性脳脊髄炎を含むが、これらに限定されない。
【０１４８】
非限定的な例において、以下の例は、本明細書に記載のセンサアレイ及び方法を用いて患者におけるアルツハイマー病を診断する方法を提供する。センサアレイは、アルツハイマー病にかかっている患者とかかっていない患者とを正確に区別することが可能なだけでなく、兆候がでる前の患者であってスクリーニングの数年後にアルツハイマー病を発症した（コホート血漿により決定）患者を検出することも可能であった。このことは、疾病が発症する前のかなり初期のステージで疾病を治療することが可能であるという利点をもたらす。
【０１４９】
一部の実施形態における本発明のセンサアレイ及び方法は、疾病又は障害の発症前ステージを検出することが可能である。発症前ステージとは、患者に疾病の兆候又は症状が何も現れていないステージである。がん発症前ステージとは、対象内でがん又は腫瘍又はがん細胞が確認されていないステージである。神経疾患発症前ステージとは、人に神経疾患の１以上の症状が現れていないステージである。疾病の１以上の兆候又は症状が現れる前に疾病を診断する能力により、対象を緊密にモニタリングすることができるとともに、疾病をかなり初期のステージで治療することができ、これにより疾病の進行を止める又は疾病の重症度を低くすることができるよりよい見通しをもたらすことができる。
【０１５０】
一部の実施形態における本発明のセンサアレイ及び方法は、疾病又は障害の初期ステージを検出することが可能である。疾病の初期ステージとは、疾病の最初の兆候又は症状が対象において明らかとなった時を指す。大抵の場合、疾病発症前又は初期ステージで見つけることができる疾病は、治療がより簡単で患者にとってより前向きな転帰をもたらす。例えば、がんについて、疾病の初期ステージは、ステージ０及びステージ１のがんを含む。ステージ０は生体内原位置のがんであり、生体内原位置とは「その位置にある」、つまりがんが発生した位置に依然留まっており付近の組織に広がっていないことを意味する。このステージにあるがんは、大抵の場合腫瘍全体を外科的に除去することによってしばしば治癒できる可能性が高い。ステージ１のがんは、大抵の場合付近の組織の深くに入り込んで成長しておらずかつリンパ節又は体の他の部分に広がっていない小さいがん又は腫瘍である。さらに、疾病の色ステージは、外見的な兆候又は症状がないステージでもよい。例えば、アルツハイマー病では、初期ステージはアルツハイマー病発症前ステージであり、このステージでは症状はまだ検出されず患者は数ヶ月後又は数年後にアルツハイマー病を発症する。
【０１５１】
一部の実施形態では、センサアレイ及び方法は、疾病の中期ステージを検出することが可能である。疾病の中期ステージとは、最初の兆候及び症状の出現後、患者に疾病の１以上の症状が現れている疾病のステージである。例えば、がんについて、ステージＩＩ又はＩＩＩがんは中期ステージと考えられ、付近の組織に深く入り込んで成長したより大きながん又は腫瘍を示す。場合によっては、ステージＩＩ又はＩＩＩがんはリンパ節にも広がっているが体の他の部分には広がっていないものとしてもよい。
【０１５２】
さらに、センサアレイ及び方法は、疾病の末期又は進行ステージを検出することが可能である。疾病の末期又は進行ステージは、「重度」又は「進行した」と称してもよく、大抵の場合、患者が疾病の複数の症状及び影響により苦しんでいることを示す。例えば、重度のステージのがんはステージＩＶを含み、このステージではがんは体の他の臓器又は部分に広がっており、時に進行性又は転移性がんと称される。
【０１５３】
一部の実施形態では、本技術の方法は、サンプルが疾病及び／又は疾病状態を示すか否かを決定するために、サンプルのタンパク質フィンガープリントと、複数の疾病及び／又は複数の疾病状態と関連するタンパク質フィンガープリントのパネルと、を比較することを含む。例えば、対象の集団から経時的にサンプルを採取することができる。対象が疾病又は障害を発症したとき、本発明は、対象が疾病を発症する前の同じ対象からのサンプルの生体分子フィンガープリントと、疾病を発症した後の対象の生体分子フィンガープリントと、を比較することによって、対象における生体分子フィンガープリントの変化を経時的に特性評価及び検出できる。一部の実施形態において、全員が同じ疾病を発症した患者のコホートからサンプルを得ることができ、これによりこれらの患者について疾病の異なるステージ（例えば発症前状態から疾病状態）に関連した生体分子フィンガープリントを分析及び特性付けすることができる。
【０１５４】
説明のために、例は、本発明の方法及びセンサアレイが、がんの異なる種類を区別可能なだけでなく、がんの異なるステージ（例えばがんの初期ステージ）も区別可能であることを示した。
【０１５５】
少なくとも１つの疾病若しくは障害及び／又は疾病状態に関連した生体分子フィンガープリントを決定する方法が考えられる。前記方法は、少なくとも１つの疾病若しくは障害を有すると診断された又は同じ疾病状態を有する少なくとも２つ（２人）の対象からサンプルを得る工程と、各センサアレイについて生体分子フィンガープリントを決定するために各サンプルを本明細書に記載されたセンサアレイと接触させる工程と、少なくとも１つの疾病若しくは障害及び／又は疾病状態に関連した生体分子フィンガープリントを決定するために少なくとも２つのサンプルのフィンガープリントを分析する工程と、を備える。
【０１５６】
＜生体分子コロナの分類＞
疾病若しくは障害及び／又は疾病状態に関連した生体分子フィンガープリントを決定する方法は、少なくとも２つのサンプルの生体分子フィンガープリントの分析を含む。この決定、分析又は統計分類は、当該分野で周知の方法によって行われ、例えば、とりわけ、さまざまな教師付き及び教師なしデータ分析、機械学習、深層学習並びに階層的クラスター分析（ＨＣＡ）、主成分分析（ＰＣＡ）、部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）、ランダムフォレスト、ロジスティック回帰、決定木、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）、Ｋ近傍法、ナイーブベイズ、線形回帰、多項式回帰、回帰のためのＳＶＭ、Ｋ平均法クラスタリング及び隠れマルコフモデルを含むクラスタリングアプローチを含むが、これらに限定されない。換言すれば、疾病若しくは障害又は疾病状態に関連した生体分子フィンガープリントを決定するために個々のフィンガープリントで共通のパターンを統計学的有意性をもって決定するために、各サンプルの生体分子フィンガープリントが互いに比較されて分析される。
【０１５７】
通常、機械学習アルゴリズムは、例を記述する入力特徴に基づいて例にクラス標識を正確に割り当てるモデルを構築するために用いられる。場合によっては、本明細書に記載の方法において機械学習及び／又は深層学習アプローチを採用することが有利であるかもしれない。例えば、機械学習は、生体分子フィンガープリントを種々の疾病状態（例えば、疾病なし、疾病の前駆状態、疾病の初期又は末期ステージなど）と関連付けるために用いることができる。例えば、場合によっては、生体分子コロナ及びこれらから導出された生体分子フィンガープリントによって検出及び取得されたデータを分析するために、１以上の機械学習アルゴリズムを本発明の方法に関連して採用される。例えば、一実施形態では、対象ががん発症前か、がんであるか又はがんを有さない若しくは発症していないか否かを決定するだけでなくがんの種類をも決定するために、機械学習を本明細書に記載のセンサアレイと結びつけることができる。
【０１５８】
以下の例は、がん、心血管疾患及び神経性疾患（例えばアルツハイマー病）を含む数々の異なる疾病について疾病状態を統計学的有意性をもって決定する本明細書に記載のセンサアレイの能力を示した。以下に記載の通りセンサアレイはさまざまな疾病及び疾病状態に適用することができる為、このアッセイはこれらの特定の実施形態に限定されない。
【０１５９】
一部の実施形態において、方法は、対照生体分子フィンガープリントを生成するためにセンサアレイと接触させた対照対象からサンプルを得る工程を含む。次に、これらの対照生体分子フィンガープリントを用いて、疾病若しくは障害及び／又は具体的な疾病状態を有する対象の生体分子フィンガープリントと比較して、その疾病若しくは障害及び／又は具体的な疾病状態に特有の生体分子フィンガープリントを決定することができる。
【０１６０】
方法は、例えば、少なくとも１つ（１人）の対照対象から対照サンプルを得る工程と、複数の対照生体分子コロナを生成するために対照サンプルをセンサアレイに接触させる工程と、各対照生体分子コロナの複数の生体分子を分析する工程と、を有する。方法は、少なくとも１つの疾病又は障害に関連した生体分子フィンガープリントを決定するために、複数の対照生体分子コロナの複数の生体分子を、疾病又は障害を有する対象からの複数の生体分子コロナの複数の生体分子と比較する工程をさらに有する。
【０１６１】
疾病又は障害を診断又は予後診断するための方法も考えられる。方法は、対象からサンプルを得る工程と、生体分子フィンガープリントを生成するために前記サンプルをセンサアレイに接触させる工程と、前記生体分子フィンガープリントと、複数の疾病又は障害に関連した生体分子フィンガープリントのパネルと、を比較する工程と、疾病又は障害を診断又は予後診断する工程と、を有する。
【０１６２】
一部の実施形態では、疾病又は障害に関連したバイオマーカーのパターン又は特異的バイオマーカーを識別する方法が考えられる。好適な方法は、例えば、上記の方法を実施する工程、例えば、疾病又は障害を有すると診断された少なくとも２つ（２人）の対象と少なくとも２つ（２人）の対照対象からサンプルを得る工程と、生体分子フィンガープリントを生成するために各サンプルをセンサアレイに接触させる工程と、疾病又は障害に関連した少なくとも１つのパターン及び／又はバイオマーカーを決定するために、疾病又は障害を有する対象の生体分子フィンガープリントと対照対象の生体分子フィンガープリントを比較する工程と、を含む。好適には、方法は、少なくとも２人の疾病にかかった対象及び少なくとも２人の対照対象、あるいは少なくとも５人の疾病にかかった対象及び少なくとも５人の対照対象、少なくとも１０人の疾病にかかった対象及び少なくとも１０人の対照対象、少なくとも１５人の疾病にかかった対象及び少なくとも１５人の対照対象、少なくとも２０人の疾病にかかった対象及び少なくとも２０人の対照対象を備え、またこれらの間のあらゆるバリエーションを含む（例えば少なくとも２〜１００人の疾病にかかった対象及び少なくとも２〜１００人の対照対象）。
【０１６３】
一部の実施形態では、アレイ及び方法により、疾病状態又は疾病若しくは障害に関連したバイオマーカーのパターン、あるいは一部の実施形態では疾病又は障害に関連した特異バイオマーカー、を決定することができる。例えば本明細書にリストされた疾病状態に関連し得るバイオマーカーを識別できるだけでなく、疾病状態又は疾病若しくは障害に関連した新たなバイオマーカー又はバイオマーカーのパターンを決定することもできる。上述したように、特定の疾病又は障害についての一部のバイオマーカー又はバイオマーカーのパターンは、本発明のセンサアレイに関連する生体分子の変化であり得るとともに、通常当該分野でバイオマーカーと称されるものとは異なり得、例えば、疾病に関連した特定の生体分子の発現増加であり得る。上述したように、生体分子（例えば生体分子Ｘ）と他の生体分子（例えば生体分子Ｙ及びＺ）との間の相互作用は、特定の疾病状態と関連付ける能力をもたらし、サンプル中のバイオマーカーＸの絶対濃度とは経時的に又は疾病状態にわたって互いに関係が無い。したがって、発症前から疾病状態においてサンプル中の絶対濃度が変化しないために従来の意味ではバイオマーカーとしては考えられないであろう分子が、本開示の観点では、本発明のアレイによって測定されるその相対変化が疾病状態に関連していることから、生体分子であると考えられる。換言すれば、生体分子Ｘとアレイとの間の相互作用の増大又は減少（Ｘとセンサ素子及びサンプル中の他の生体分子との相互作用による）が、バイオマーカーが疾病状態と関連しているとの信号をもたらす。
【０１６４】
好適ながんバイオマーカーは、例えば、ＡＨＳＧ（α２−ＨＳ−糖タンパク質）、ＡＫＲ７Ａ２（アフラトキシンＢ１アルデヒドレダクターゼ）、ＡＫＴ３（ＰＫＢγ）、ＡＳＧＲ１（ＡＳＧＰＲ１）、ＢＤＮＦ、ＢＭＰ１（ＢＭＰ−１）、ＢＭＰＥＲ、Ｃ９、ＣＡ６（炭酸脱水酵素ＶＩ）、ＣＡＰＧ（ＣａｐＧ）、ＣＤＨ１（カドヘリン−１）、ＣＨＲＤＬ１（Ｃｈｏｒｄｉｎ−Ｌｉｋｅ１）、ＣＫＢ−ＣＫＭ−（ＣＫ−ＭＢ）、ＣＬＩＣ１（細胞内塩素チャネル１）、ＣＭＡ１（キマーゼ）、ＣＮＴＮ１（コンタクチン−１）、ＣＯＬ１８Ａ１（エンドスタチン）、ＣＲＰ、ＣＴＳＬ２（カテプシンＶ）、ＤＤＣ（ドーパ脱炭酸酵素）、ＥＧＦＲ（ＥＲＢＢ１）、ＦＧＡ−ＦＧＢ−ＦＧＧ（Ｄダイマー）、ＦＮ１（フィブロネクチンＦＮ１．４）、ＧＨＲ（成長ホルモン受容体）、ＧＰＩ（グルコースリン酸イソメラーゼ）、ＨＭＧＢ１（ＨＭＧ−１）、ＨＮＲＮＰＡＢ（ｈｎＲＮＰ  Ａ／Ｂ）、ＨＰ（ハプトグロビン、混合型）、ＨＳＰ９０ＡＡ１（ＨＳＰ９０α）、ＨＳＰＡ１Ａ（ＨＳＰ７０）、ＩＧＦＢＰ２（ＩＧＦＢＰ−２）、ＩＧＦＢＰ４（ＩＧＦＢＰ−４）、ＩＬ１２Ｂ−ＩＬ２３Ａ（ＩＬ−２３）、ＩＴＩＨ４（インター−α−トリプシンインヒビター重鎖Ｈ４）、ＫＩＴ（ＳＣＦ  ｓＲ）、ＫＬＫ３−ＳＥＲＰＩＮＡ３（ＰＳＡ−ＡＣＴ）、Ｌ１ＣＡＭ（ＮＣＡＭ−Ｌ１）、ＬＲＩＧ３、ＭＭＰ１２（ＭＭＰ−１２）、ＭＭＰ７（ＭＭＰ−７）、ＮＭＥ２（ＮＤＰキナーゼＢ）、ＰＡ２Ｇ４（ＥｒｂＢ３結合タンパク質Ｅｂｐ１）、ＰＬＡ２Ｇ７（ＬｐＰＬＡ２／ＰＡＦＡＨ）、ＰＬＡＵＲ（ｓｕＰＡＲ）、ＰＲＫＡＣＡ（ＰＲＫＡ  Ｃ−α）、ＰＲＫＣＢ（ＰＫＣ−βＩＩ）、ＰＲＯＫ１（ＥＧ−ＶＥＧＦ）、ＰＲＳＳ２（トリプシン−２）、ＰＴＮ（プレイオトロフィン）、ＳＥＲＰＩＮＡ１（α１−アンチトリプシン）、ＳＴＣ１（スタニオカルシン−１）、ＳＴＸ１Ａ（シンタキシン  １Ａ）、ＴＡＣＳＴＤ２（ＧＡ７３３−１タンパク質）、ＴＦＦ３（トレフォイルファクター３）、ＴＧＦＢＩ（βＩＧＨ３）、ＴＰＩ１（トリオースリン酸イソメラーゼ）、ＴＰＴ１（ホルチリン）、ＹＷＨＡＧ（１４−３−３タンパク質γ）、ＹＷＨＡＨ（１４−３−３タンパク質ｅｔａ）、前立腺がんバイオマーカー、例えばＰＳＡ、Ｐｒｏ−ＰＳＡ、ＰＨＩ、ＰＣＡ３、ＴＭＰＲＳＳ３：ＥＲＧ、ＰＣＴＭＴ、ＭＴＥＮ、乳がんマーカー、例えば上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）がん遺伝子、メラノーマバイオマーカーＢＲＡＦ、肺がんバイオマーカーＥＭＬ４−ＡＬＫ、Ａ２ＭＬ１、ＢＡＸ、Ｃ１０ｏｒｆ４７、Ｃｌｏｒｆｌ６２、ＣＳＤＡ、ＥＩＦＣ３、ＥＴＦＢ、ＧＡＢＡＲＡＰＬ２、ＧＵＫＩ、ＧＺＭＨ、ＨＩＳＴ１Ｈ３Ｂ、ＨＬＡ−Ａ、ＨＳＰ９０ＡＡ１、ＮＲＧＮ、ＰＲＤＸ５、ＲＡＢＡＣＩ、ＲＡＢＡＧＡＰ１Ｌ、ＲＰＬ２２、ＳＡＰ１８、ＳＥＰＷ１、ＳＯＸ１、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質ＣＩＩＩ、ミオグロビン、テネイシンＣ、ＭＳＨ６、クローディン−３、クローディン−４、カベオリン−１、凝固因子ＩＩＩ、ＣＤ９、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ１３６、ＣＤ１４７、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、Ｒａｂｌ３���デスモコリン−１、ＥＭＰ−２、ＣＫ７、ＣＫ２０、ＧＣＤＦ１５、ＣＤ８２、Ｒａｂ−５ｂ、アネキシンＶ、ＭＦＧ−Ｅ８、ＨＬＡ−ＤＲ、ｍｉＲ２００マイクロＲＮＡ、ＭＤＣ、ＮＭＥ−２、ＫＧＦ、ＰＩＧＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＨＧＦ、ＭＣＰ１、ＳＡＴ−１、ＮＩＰ−１−ｂ、ＧＣＬＭ、ＯＰＧ、ＴＮＦ  ＲＩＩ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＩＴＡＣ、ＭＭＰ−１０、ＧＰＩ、ＰＰＰ２Ｒ４、ＡＫＲ１Ｂ１、Ａｍｙ１Ａ、ＭＩＰ−１ｂ、Ｐカドヘリン、ＥＰＯなどを含むが、これらに限定されない。例えば、乳がんのバイオマーカーは、ＥＲ／ＰＲ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕなどを含むが、これらに限定されない。大腸がんのバイオマーカーは、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳ、ＵＧＴ１Ａ１などを含むが、これらに限定されない。白血病／リンパ腫に関連するバイオマーカーは、例えば、ＣＤ２０抗原、ＣＤ３０、ＦＩＰ１Ｌ１−ＰＤＧＦＲａｌｐｈａ、ＰＤＧＦＲ、フィラデルフィア染色体（ＢＣＲ／ＡＢＬ）、ＰＭＬ／ＲＡＲアルファ、ＴＰＭＴ、ＵＧＴ１Ａ１などを含むがこれらに限定されない。肺がんに関連するバイオマーカーは、例えば、ＡＬＫ、ＥＧＦＲ、ＫＲＡＳなどを含むがこれらに限定されない。バイオマーカーは当該分野で知られており、例えば、Bigbee W, Herberman RB. Tumor markers and immunodiagnosis. In: Bast RC Jr., Kufe DW, Pollock RE, et al., editors. Cancer Medicine. 6th ed. Hamilton, Ontario, Canada: BC Decker Inc., 2003; Andriole G, Crawford E, Grubb R, et al. Mortality results from a randomized prostate-cancer screening trial. New England Journal of Medicine 2009; 360(13):1310-1319; Schroder FH, Hugosson J, Roobol MJ, et al. Screening and prostate-cancer mortality in a randomized European study. New England Journal of Medicine 2009; 360(13):1320-1328; Buys SS, Partridge E, Black A, et al. Effect of screening on ovarian cancer mortality: the Prostate, Lung, Colorectal and Ovarian (PLCO) Cancer Screening Randomized Controlled Trial. JAMA 2011; 305(22):2295-2303; Cramer DW, Bast RC Jr, Berg CD, et al. Ovarian cancer biomarker performance in prostate, lung, colorectal, and ovarian cancer screening trial specimens. Cancer Prevention Research 2011; 4(3):365-374; Sparano JA, Gray RJ, Makower DF, et al. Prospective validation of a 21-gene expression assay in breast cancer. New England Journal of Medicine 2015; First published online September 28, 2015. doi: 10.1056/NEJMoa1510764に記載されており、これらはその全内容が参照により本明細書に盛り込まれている。
【０１６５】
好適には、これらの方法は、がんに関連するバイオマーカーを決定するために用いることができる。例えば、一実施形態においてがんは神経膠芽腫であり、バイオマーカーは、ＨＡＢＰ１、ＶＴＮＣ、ＣＯ３、ＩＴＩＨ２、ＩＴＩＨ１、ＣＯ７、ＦＨＲ５、ＣＢＰＮ、ＡＬＢＵ、ＰＬＭＮ、ＣＯ４Ａ、ＰＲＤＸ２、ＶＷＦ、Ｃ４ＢＰＡ、ＡＰＯＢ、ＨＢＢ、ＣＮＤＰ１、ＣＲＰ、ＳＡＡ４、ＡＰＯＥ、ＣＳＣＬ７及びこれらの組み合わせからなるグループから選択される。別の実施形態においてがんは髄膜腫であり、バイオマーカーは、ＦＣＮ３、ＲＥＴ４、ＨＡＢＰ２、ＣＢＰＮ及びこれらの組み合わせからなるグループから選択される。別の実施形態においてがんはすい臓がんであり、バイオマーカーは、ＫＮＧ１、ＩＣ１、ＣＢＰＢ２、ＴＲＦＥ、ＧＥＬＳ、ＣＸＣＬ７、ＨＰＴＲ、ＰＧＫ１、ＡＡＣＴ、ＬＵＭ、ＡＰＯＥ、ＦＩＢＢ、ＡＰＯＡ２、Ａ１ＢＧ、Ａ１ＡＴ、ＬＢＰ、ＡＰＯＡ１、Ｈ４、ＦＩＢＧ及びこれらの組み合わせからなるグループから選択される。別の実施形態においてがんは肺がんであり、バイオマーカーは、ＣＯ０、ＣＲＰ、ＳＡＡ４、ＡＰＯＡ１、Ａ１ＡＴ、ＧＥＬＳ及びこれらの組み合わせからなるグループから選択される。別の実施形態においてがんは骨髄腫であり、バイオマーカーはＡＬＢＵである。
【０１６６】
またバイオマーカーは、心血管疾患にも関連付けることができ、これらは当該分野において周知であり、とりわけ、脂質プロファイル、グルコース及びホルモンレベル並びに血清フェリチンなどの重要な生体分子のレベル、トリグリセリド対ＨＤＬｐ（高密度リポタンパク）比、リポホリン対コレステロール比、脂質対リポホリン比、ＬＤＬコレステロールレベル、ＨＤＬｐ及びアポリタンパク質レベル、リポホリン及びＬＴＰ比、スフィンゴ脂質、オメガ３インデックス及びＳＴ２レベルの測定値に基づく生理学的バイオマーカーを含む、しかしこれらに限定されない。心血管疾患の好適なバイオマーカーは、例えば、以下に限定されるものではないが、van Holten et al. "Ciculating Biomarkers for Predicting Cardiovascular Disease Risk; a Systemic Review and Comprehensive Overview of Meta-Analyses" PLoS One, 2013 8(4): e62080に記載されており、その全内容は参照により本明細書に盛り込まれる。
【０１６７】
またバイオマーカーは神経性疾患にも関連付けられる。好適なバイオマーカーは、当該分野で周知であり、例えばとりわけＡβ１−４２、ｔ−ｔａｕ及びｐ−ｔａｕ１８１、α−シヌクレインを含むが、これらに限定されない。例えばChintamaneni and Bhaskar "Biomarkers in Alzheimer's Disease: A Review" ISRN Pharmacol. 2012. 2012: 984786. Published online 2012 Jun 28参照。その全内容は参照により本明細書に盛り込まれる。
【０１６８】
炎症性疾患についてのバイオマーカーは、当該分野で周知であり、例えば、とりわけ、サイトカイン／ケモカイン、免疫関連エフェクター、急性期タンパク質［Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）及び血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）］、活性酸素種（ＲＯＳ）、並びに、例えばＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、Ｓ１００、ＬＩＦ、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ２、ＣＸＣＬ４、ＣＸＣＬ５、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＣＬ２、ＣＣＬ２３、ＩＬ−Ｉβ、ＩＬ−ＩＲａ、ＴＮＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＦＮγ、ＣＸＣＲｌ、ＣＸＣｒ４、ＣＸＣＲ５、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦＲ、ＥＧＦ、ＶＥＧＦＡ、ＬＥＰ、ＳＡＡ１、ＶＣＡＭ１、ＣＲＰ、ＭＭＰ１ＭＭＰ３、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ、ＲＥＴＮ、ＣＨＩ３Ｌ１、抗核抗体（ＡＮＡ）、リウマトイド因子（ＲＦ）、環状シトルリン化ペプチドに対する抗体（抗ＣＣＰ）及び慢性ＩＢＤ（糞便カルプロテクチン）に対する抗体を含む転写因子及び増殖因子などのメディエータを含むがこれらに限定されない。例えば炎症性腸疾患の適切なバイオマーカーは、ＣＲＰ、ＥＳＲ、ｐＡＮＣＡ、ＡＳＣＡ及び糞便カルプロテクチンを含む。例えばYi Fengming and Wu Jianbing, "Biomarkers of Inflammatory Bowel Disease," Disease Markers, vol. 2014, Article ID 710915, 11 pages, 2014. doi:10.1155/2014/710915参照。その全内容は参照により本明細書に盛り込まれる。
【０１６９】
「個別」、「対象」及び「患者」との用語は、対象があらゆる形の治療が行われた又は行われているか否かに関係なく、本明細書において互換的に用いられる。本明細書で用いる場合、「対象」との用語は、通常、哺乳類を含むがこれに限定されないあらゆる脊椎動物を指す。哺乳類の例としては、サル及び人間を含む霊長類、ウマ（例えば馬）、イヌ（例えば犬）、ネコ、種々の飼い慣らされた家畜（例えばブタ、豚、山羊、羊などの有蹄動物）並びに飼い慣らされたペット（例えば猫、ハムスター、マウス及びモルモット）が挙げられる。対象は人間であることが好ましい。
【０１７０】
本明細書に記載のアレイ及び方法は、所望の生体分子フィンガープリントを提供するために多くの異なる条件下で用いることができる。例えば、センサ素子のサイズ、センサを通るサンプルの流量、センサアレイをサンプルとともにインキュベーションする時間及びセンサアレイをインキュベーションする温度は、全て再現性のある生体分子フィンガープリントを提供するために変更可能である。センサ素子の好適なサイズは、少なくとも一方向においてマイクロメートル未満のナノスケールセンサ素子を含む。
【０１７１】
アレイ又は複数のセンサ素子をインキュベーションする好適な時間は、少なくとも数秒、例えば少なくとも１０秒〜約２４時間、例えば少なくとも約１０秒、少なくとも約１５秒、少なくとも約２０秒、少なくとも約２５秒、少なくとも約３０秒、少なくとも約４０秒、少なくとも約５０秒、少なくとも約６０秒、少なくとも約９０秒、少なくとも約２分、少なくとも約３分、少なくとも約４分、少なくとも約５分、少なくとも約６分、少なくとも約７分、少なくとも約８分、少なくとも約９分、少なくとも約１０分、少なくとも約１５分、少なくとも約２０分、少なくとも約２５分、少なくとも約３０分、少なくとも約４５分、少なくとも約５０分、少なくとも約６０分、少なくとも約９０分、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間を含み、これらの間のあらゆる時間及び増大を含む（例えば、１０秒、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０秒など；１分、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０など；１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間など）。
【０１７２】
さらに、分析を行う温度は、当業者が決定することができ、約４℃〜約４０℃、あるいは約４℃〜約２０℃、あるいは約１０℃〜約１５℃、あるいは約１０℃〜約４０℃、例えば約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、約３７℃などの温度を含む。好適には、分析は、室温で行ってもよい（例えば約３７℃付近、例えば約３５℃〜約４０℃）。
【０１７３】
本発明の方法は、サンプルをセンサアレイに接触させる工程を備えてもよい。サンプルをセンサアレイに接触させる工程は、サンプルがセンサアレイを流れることができるあらゆる流量を用いてもよい。一部の側面では、ストリームの流速、レイノルズ数又は流れストリームの相対断面積は、サンプルとセンサアレイ間の適切な接触を与えるために変更可能である。
【０１７４】
例えば、ナノチャネル又はマイクロチャネルを用いる実施形態では、第１ストリームの断面積はチャネルの断面積の１％よりも大きくてもよい。別の例では、第１ストリームの断面積はチャネルの断面積の９０％よりも小さくてもよい。断面積比は、１０：１〜１：１０、１：５〜５：１、１：３〜３：１、１：２〜２：１又は１：１でもよい。
【０１７５】
その他の所定の状況においては、アレイを通るサンプルの流れは、サンプルの導入位置において、レイノルズ数が、３００〜１，０００，０００でもよい。場合によっては、サンプルの導入位置はナノチャネル又はマイクロチャネルでもよい。
【０１７６】
＜キット＞
方法に関して記載した本開示の側面は本開示にて議論したセンサアレイ又はキットに関連して用いることができる。同様に、センサアレイ及び方法に関して記載した本開示の側面はキットに関連して用いることができ、キットに関して記載した本開示の側面は方法及びセンサアレイに関連して用いることができる。
【０１７７】
本開示はキットを提供する。キットは、本明細書に記載の方法での使用に好適である。好適なキットは、本明細書に記載のようなセンサアレイを備える、サンプルについての生体分子フィンガープリントを決定するためのキットを含む。一側面において、キットは、互いに異なる物理化学的性質を有する少なくとも２つのセンサ素子を備えるセンサアレイを提供する。一部の側面では、キットは、対象の疾病状態を決定するために生体分子フィンガープリントを用いるために生体分子フィンガープリントの比較パネルを提供する。一部の側面では、生体分子フィンガープリントを決定するための説明書を含む。一部の好適な実施形態では、センサアレイはキット中のチップアレイとして提供される。
【０１７８】
他の側面では、対象の疾病状態を決定する又は対象の疾病を診断若しくは予後診断するためのキットが提供される。好適なキットは、生体分子フィンガープリントを決定するために互いに異なる物理化学的性質を有する少なくとも２つのセンサ素子を備えるセンサアレイを含む。さらに、キットは、異なる疾病状態又は異なる疾病若しくは障害の生体分子フィンガープリントの比較パネルをさらに含む。生体分子フィンガープリントの決定及び分析の説明書が提供される。
【０１７９】
本発明のコンセプトから逸脱することなくすでに記載したもの以外の多くの追加の修正を行うことが可能であることは当業者に明らかである。本開示の解釈において、全ての用語は、内容と調和するよう最大限広く解釈すべきである。「備える」との用語のバリエーションは、要素、コンポーネント又は工程を包括的に指すと解釈すべきであり、したがって参照された要素、コンポーネント又は工程は特に参照していない他の要素、コンポーネント又は工程と組み合わせてもよい。特定の要素を「備える」とされた実施形態はこれらの要素から「主に構成される」及び「構成される」とも考えられる。「（これ（ら）から）主に構成される」及び「（これ（ら）から）構成される」との用語は、ＭＰＥＰ及び関連する連邦巡回裁判所の解釈に則して解釈されるべきである。「（これ（ら）から）主に構成される」との移行句は特許請求の範囲の範囲を、特定された材料又は工程及び「クレームした発明の基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しないもの」に限定する。「（これ（ら）から）構成される」は、特許請求の範囲に記載のない要素、工程又は成分を排除する用語である。
【０１８０】
以下の非限定的な例は、説明を目的として挙げただけであり、本発明の成分及び方法が利用できる技法及びプロトコルの幅の範囲を限定するものではなく、当業者であればこれは容易に理解するであろうしすぐに実施できるものである。
【０１８１】
［例］
＜例１Ａ  がんの早期発見のための非標識センサアレイ＞
この例は、種々のがんの早期発見のための非標識センサアレイを提供する。センサアレイは、異なる表面電荷（即ち、陽イオン（ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、陰イオン（ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）−ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン））及び中間（ＣＨＯＬ（ＤＯＰＣ−コレステロール）））を有する３つの異なる交差反応性リポソームから構成され、そのタンパク質コロナ組成は、異なる種類のさまざまながん、即ち肺がん、すい臓がん、骨髄腫、髄膜腫及び神経膠芽腫を有する患者の血漿との相互作用に応答して変化する。何れの種類のがんについても特異的なタンパク質コロナ組成は１つもなかったものの、コロナ組成パターンの変化ががんの各種類についてユニークな「フィンガープリント」を提供する。ハードコロナは、初期、中期及び進行期のがんを有する患者からの血漿を用いてセンサアレイ素子のプロファイルを作成する。センサアレイ素子（ナノ粒子）の表面上に形成されるタンパク質コロナは、それらのナノ粒子の物理化学的性質に強く依存し、同時にインキュベーションに用いられたヒト血漿のドナー中に存在する疾病の種類の影響を強く受け得る。がんの５つの異なる種類（即ち、多形神経膠芽腫、肺がん、髄膜腫、多発性骨髄腫及びすい臓がん）を有する患者及び健康者（表１参照）からの血漿とともにインキュベーションした後のコロナ被覆ナノ粒子のサイズ及び電荷を、動的光散乱法（ＤＬＳ／Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ（商標））及び透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて調べた結果、コロナ被覆ナノ粒子の物理化学的性質ががんの種類に実質的に依存することが示された（図２Ａ、２Ｂ）。
【０１８２】
【表１】
2020502514.tif 000003
2020502514.tif 000004
【０１８３】
ナノ粒子上に吸着された全タンパク質の定量評価をＢＣＡ又はＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）アッセイを介して行った結果、異なる種類のがんを有する患者から得た血漿においてインキュベーション後に吸着タンパク質の量に顕著な差があることが示された（図２Ｂ）。リポソームの表面上に吸着された全タンパク質の定量評価により、タンパク質の量ががんの種類に大きく依存することが示された（図２Ｂ）。３つのリポソームの表面におけるタンパク質コロナ組成を、液体クロマトグラフィー−質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって評価し、多量の１，８００の周知のタンパク質が明らかにされた。コロナ組成に対する個々のタンパク質及びこれらのカテゴリ（即ち、補体、凝固、組織漏出、リポタンパク質、急性期、免疫グロブリン及び他の血漿タンパク質）の寄与が明らかにされた（図２Ｃ、図３Ａ〜３Ｆ）。これらの結果は、タンパク質組成と、がんの種類とそしてそれだけではなくセンサ素子の種類（即ちナノ粒子の種類）と、の間の重要な関連性を示した。
【０１８４】
広範な文献よれば、がんの発生と、補体、凝固、組織漏出、リポタンパク質、急性期、免疫グロブリンのバリエーションとの間には重要な関係性がある。したがって、これらのタンパク質カテゴリのナノ粒子との交差反応性相互作用はがんの各種類についてユニークな「フィンガープリント」を提供でき、これによりがんの識別及び判別が容易になる。故に、タンパク質コロナセンサアレイががんの誘発及び発生に関わる幅広いタンパク質を交差反応的に吸着し、これをがんの識別及び判別に使用できることが期待される。
【０１８５】
タンパク質コロナセンサアレイによる結果を用いてがんを識別及び判別するために教師付き分類を展開する。種々のセンサ素子のタンパク質コロナフィンガープリント（ＰＣＦ）がバイオセンサとして利用できるか否か、そして異なる疾病のユニークなパターンを形成することができるか否かを調べるために、３つのリポソームのタンパク質コロナ組成（陽イオン、陰イオン及び中性）のプロテオームデータに対して集中分類アプローチを適用した。この方法の詳細については方法の章で説明している。重み付けされた射影における変数重要度（ＶＩＰ）スコアが導入され、線形射影法としての部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）に基づき変数のランキングに適用された。分類モデルの構築における最重要変数（タンパク質）の選択は、得られたランク付けされた変数のセットにより導くことができる。これに関し、上位にランク付けされた変数を１つずつモデルに足していき、ＰＬＳ−ＤＡモデルの分類エラーをモニターした。我々は上位６９個の特徴のみ用いることによって分類モデルのエラーが最小となることを見出した（図４Ａ）。１個抜き及び１０分割交差検証を用いて高い分類精度（０．９７）でＰＬＳ−ＤＡにより６つのクラスに属する３０個のサンプルを判別するために、新たな６９次元特徴空間がうまく用いられた（図４Ａ、４Ｂ）。分類パラメータを表２に示す。発見の相対的な特異度の目に見える表現を提供するために、各がんグループの分離に対する各単一の選択されたタンパク質の寄与（ＶＩＰ）をｙ軸及びｘ軸にそれぞれプロットした（図４Ｂ〜４Ｆ）。ＶＩＰスコアがより高いタンパク質は、対照から及び全てのがんカテゴリの中から各疾病を判別するにあたって最良の情報価値のあるセット又は最良の診断上のセットであると考えることができる。
【０１８６】
【表２】
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【０１８７】
次にＰＬＳ−ＤＡ及びカウンタープロパゲーション人工ニューラルネットワーク（ＣＰＡＮＮ）が、選択された変数並びに教師付き分類、線形及び非線形アプローチとしてのサンプル全体にそれぞれ適用された。変数選択前の全変数を有する一次データセットは判別が不十分であり６つのグループに分けることができなかったことに留意されたい。
【０１８８】
次に、データをさらに検証及び分析するために、我々は非線形分類法を利用することとした。特徴空間を視覚化することで隠れた構造及びパターンのなかの位相的関係の理解を助けることができる。データ構造内の位相的関係を保存しながら特徴空間の次元数を減らすために、パターンのクラスメンバーシップを学習して予想し、同時にニューロンの２次元マップを作成してデータ構造に関する価値ある情報を提供する（非線形アプローチから）ために、ＣＰＡＮＮ（自己組織化マップ／ＳＯＭの教師付き変形）が用いられた。ＣＰＡＮＮの詳細は方法の章で説明している。異なるサイズのＣＰＡＮＮマップが１０分割交差検証を用いてチェックされ、最小分類エラーによって６４（８×８）個のニューロンを含むマップが選択された（図９Ｃ）。さらに、高次元空間内のデータの位相構造は、ＣＰＡＮＮにより作成された割り当てマップに反映される（図５Ｃ、５Ｄ）。入力ベクトルに対するニューロンの類似性を考慮し、マップを、異なる種類のがん及び対照サンプルに関連する６つの別個のゾーンに区分することができる。同じクラス標識のサンプルは付近の又は同じニューロン上にマップされ、これは選択された変数が特徴空間内のサンプルの判別に役立つ情報を提供することを意味する。マップ上の６つのゾーンの相対位置及び配向は、がんの種類の間の類似性に関する質的情報に寄与することができる。マッピングの質への変数選択の影響を表すために、別のＣＰＡＮＮを全１８２３個の変数を用いてトレーニングし、結果として得られたマップは、選択されたバイオマーカー（変数）ががんの種類の判別及びこれらの正確な分類において重要な役割を果たすことを示した（図５Ｃ及び５Ｄ）。
【０１８９】
得られた結果に基づき、線形モデル及び非線形モデルによって、許容可能な特異性、感度及びクラスエラー値から推定される高い精度を示した。これらの発見と一致して、６９個のマーカーに基づく教師なしクラスタリング（ＨＣＡ）によって各種がん及び対照サンプルをはっきり分離することができた（図５Ｅ〜５Ｆ）。図５Ａ〜５Ｆに示されるように、サンプルの神経膠芽腫と髄膜腫のグループの間にはかなりの類似性があり、判別が難しく、これらの２つの脳がんにおける類似した血漿のプロテオームパターンにおそらく密接に関係している。これらの結果は、コロナ中の多くのタンパク質の血漿濃度が、異なる種類のがんを有する患者の間だけではなく、健康者の間でも大きく異なるという事実を反映している。
【０１９０】
バイオセンサのパターン認識の能力を説明するために、個々のナノ粒子から得られたデータについて一連の分析を行った。予想通り、がんに特異的なフィンガープリントのパターンを各ナノ粒子のＰＣＦから単独で抽出することはできなかった。我々は、３つの異なるリポソーム（陽イオン、陰イオン、中性）上に形成されたタンパク質コロナにおける大量のタンパク質に適用されたパターン認識技法によって、対照サンプルからがんのものが正しく区別されただけではなく、考慮しているがんの各種類も他から区別されたことを見出した。
【０１９１】
特定の種類のがんについての有望なバイオマーカーとしての、がん発見及び判別における重要な役割を有するタンパク質の同定
がんの診断前（リスクアセスメント及びスクリーニング／早期発見における）及びがんの診断後（治療のモニタリング、追加の治療の選択及び再発発見における）の両方におけるバイオマーカーの使用により、大きな治療効果及び医療経済効果を生み出すことができるであろう。がんサンプルを区別する６９個の選択されたタンパク質の潜在的な生物学的関連性を理解するために、我々はＰｕｂＭｅｄにある、異なる疾病ステージに応じてアップレギュレート又はダウンレギュレートされた特定の種類のがんのタンパク質バイオマーカーについてのこれまでに刊行された報告を手作業で調べた。マッチしたマーカーの識別及び提案されたモデルの生物学的関連性の決定のために、結果として得られたデータをモデル内の選択されたタンパク質と比較した。興味深いことに、我々は、特異性がんバイオマーカーとして報告されている選択された予測因子のうちの５つのがんの調査グループに特異的なかなりの数のバイオマーカーがあることに気がついた（図７Ｂ）。
【０１９２】
導入されたタンパク質コロナセンサアレイアプローチから得られたがんの５つのグループを区別するための選択されたマーカーの高い特異性によって、複雑ながんプロテオーム空間において現在進行中の作業との有意な相関関係が示された。したがってこのストラテジーはがん予測のための根拠を提供するだけでなくその見込みを現実に移す。注目すべきことに、異なるグループ間の判別は体系的に同時に変化する複数の予測因子（個々のバイオマーカーではない）の結果として生じ、これにより各特定の種類のがんについてユニークなパターンが形成される。この証拠に基づき、これまでにがんと悔い的バイオマーカーとして報告されていない提案されたモデルによって選択された最も有益な予測因子は、新たな診断用バイオマーカー候補として大きな可能性を有する。がん発生におけるこれらの役割を定義するために、がん患者におけるこれらの有望な候補のバリエーション及び機能について詳細にモニターすべきである。有益な予測因子のセットを介して膨大な数の対象から得られたユニークなパターンに注目することで、リサーチャーは、異なるステージにおけるがんを、現在の方法を用いた場合よりもより正確に予測することが可能であろう。
【０１９３】
コホートデータ分析
本発明のセンサアレイのがん超早期発見の能力を調べるために、我々は、血漿採取の数年後に５つの種類のがんのうちの１つにかかったと診断された健康な患者から得られたコホート血漿を用いた。我々はコホートサンプルを用いて、我々の提案した、６９個の選択された予測因子を有するモデル、線形及び非線形、を、がんの予測に利用できるか否か評価した。
【０１９４】
この目標を達成するために、６９個の変数に関連する値がモデルに入力され、与えられた固定最適パラメータ値で各コホート対象のクラスメンバーシップが予測された。注目すべきことに、６９個の変数のうち１９個の変数（タンパク質）がコホートサンプルのタンパク質コロナセンサアレイのプロテオームプロファイル中に存在せず、したがって検証データ行列におけるこれらの量はゼロであった。興味深いことに、線形及び非線形モデルは５つのサンプル全てについて両方とも良い予測をもたらした。トレーニング及びコホートサンプル間の観測された距離（図６Ａ及び６Ｂ）はおそらくこれら１９個の存在しなかった変数についてのデータ行列に追加されたゼロ値の影響を受けた。図６Ｃ及び６Ｄに示すように、コホートサンプルはＣＰＡＮＮマップ法の神経膠芽腫に関係する正しいニューロンに配置された。
【０１９５】
リポソーム
コレステロール（Ｃｈｏｌ）はＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社（米国ミズーリ州セントルイス郡）から購入した。ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）、ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）、ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））及びＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社（米国アラバマ州アラバスター市）から購入した。ＤＯＰＧ、ＤＯＴＡＰ−ＤＯＰＥ（１：１のモル比）及びＤＯＰＣ−Ｃｈｏｌ（１：１のモル比）リポソームは、クロロホルム：メタノール＝９：１（ｖ／ｖ）のなかに適切な量の脂質を溶かすことで調製された。クロロホルム：メタノール混合物は回転蒸発装置によって蒸発された。脂質フィルムを一晩真空下におき、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１０ミリモル／ｌ（ｐＨ７．４）で水和して、最終脂質濃度を１ｍｇ／ｍｌとした。得られたリポソーム懸濁液は、Ａｖａｎｔｉミニエクストルーダー（アラバマ州アラバスター市のＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ社製）によって５０ｎｍのポリカーボネートカーボネートフィルタを通して押出しすることで寸法決めされた。
【０１９６】
ヒト血漿採取、調整及び保存
ヒト血漿（ＨＰ）を健康者及び多形神経膠芽腫、肺がん、髄膜腫、多発性骨髄腫又はすい臓がんと診断されたがんの患者から採取した。本研究は、ローマ・ラ・サピエンツァ大学の倫理委員会（多形神経膠芽腫、髄膜腫、多発性骨髄腫）、フェデリコ２世・ナポリ大学（肺がん）及びローマバイオ医療大学（すい臓がん）によって承認された。要するに、汚染リスクを最小に留めながら血液廃棄を減少させるプッシュボタン技術を備えたＢＤ（登録商標）Ｐ１００採血システム（米国ニュージャージー州フランクリンレイクス）を用いて、健康な対象及びがん患者から静脈せん刺により血液が採血された。血栓形成後、サンプルを１０００×ｇで５分間遠心分離して血液細胞をペレット状にし、上澄みを除去した。溶血がないことを確認した後、各ドナーから採取された血漿（１ｍｌ）を２００マイクロリットルのアリコートに分け、標識Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄチューブ内で−８０℃にて使用するときまで保存した。分析については、アリコートを４℃で解凍し、その後室温（ＲＴ）で温めた。
【０１９７】
コホート血漿サンプル
我々は、血漿採取後８年以内に脳、肺及びすい臓がんと診断された健康者から採取されたヒト血漿を用いた。血漿サンプルは、米国の国立がん研究所（ＮＣＩ）、フランスの国際がん研究機関（ＩＡＲＣ）及びイランのテヘラン医科大学（ＴＵＭＳ）により実施された、ＮＩＨにより資金援助されたゴレスタンコホート調査を介して収集された。本研究では、５０，０００人の健康な対象から血漿を採取して保存し、このうち１，０００人以上がその後数年間に様々な種類のがんを発症した。この研究では各がんにつき５人の人からのサンプルを用いた。これらの重要な血漿サンプルは、我々の発明のタンパク質コロナセンサアレイのがん早期発見の能力を調べるためのユニークな機会を我々に提供する。
【０１９８】
サイズ及びゼータ電位
非被覆リポソームをＨＰ（１：１  ｖ／ｖ）とともに３７℃で１時間インキュベーションした。その後、サンプルを４℃で１４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してリポソーム−ＨＰ（ヒト血漿）複合体をペレット状にした。得られたペレットをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いて３度洗浄し、超純水中に再懸濁した。サイズ及びゼータ電位測定のために、１０μＬの各サンプルを９９０μＬの蒸留水で希釈した。全てのサイズ及びゼータ電位測定を、５ｍＷのＨｅＮｅレーザー（波長λ＝６３２．８ｎｍ）及びデジタル対数相関器を備えたゼータサイザーナノＺＳ９０（英国モルバーン）を用いて室温で実施した。粒子の拡散係数Ｄの分布を得るために、正規化強度自己相関機能をＣＯＮＴＩＮ法によって分析した。ストークス−アインシュタインの式（ＲH＝ＫBＴ／６πηＤ）によってＤを有効流体力学半径ＲHに変換した。ここでＫBＴは熱エネルギーであり、ηは溶液粘性率である。サンプルの電気泳動移動度、ｕ、を、レーザードップラー電気泳動法を用いて測定した。ゼータ電位をスモルコフスキーの関係式（ゼータ電位＝ｕη／ε）を用いて計算した。ここでη及びεはそれぞれ溶媒の粘度及び誘電率である。リポソーム−ＨＰ複合体のサイズ及びゼータ電位は、５つの個々の測定の平均±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）として与えられる。
【０１９９】
タンパク質分析
リポソーム製剤をＨＰとともに（１：１  ｖ／ｖ）、３７℃で１時間インキュベーションした。その後、リポソーム−ＨＰ複合体を４℃で１５分間、１５０００×ｇでペレット状にし、ＰＢＳで３度洗浄した。洗浄したペレットをの尿素８モル／ｌ、ＮＨ4ＣＯ3５０ミリモル／ｌ中に再懸濁した。各サンプルについて１０マイクロリットルを９６ウェルプレートの５個のウェルに足した。１５０マイクロリットル／ウェルのタンパク質アッセイ試薬（Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）、米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を足してタンパク質定量化を行った。マルチウェルを振動させて室温で５分間インキュベーションした。ＧｌｏＭａｘ（登録商標）検出システム（米国ワイオミング州マディソン市のＰｒｏｍｅｇａ社製）を用いて６６０ｎｍで吸収度を測定した。適切にバックグランド補正を行い、標準曲線を用いてタンパク質濃度を計算した。結果は、５個の個別のレプリケートの平均±Ｓ．Ｄ．として与えられた。
【０２００】
タンパク質同定及び定量化。インキュベーションは別の文献（Label-free quantitative analysis for studying the interactions between nanoparticles and plasma proteins. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 405, 2-3, 635-645、当該文献の全内容は参照により本明細書に盛り込まれる）に記載のとおりの手順で行われた。リポソーム製剤をＨＰとともに（１：１  ｖ／ｖ）３７℃で１時間インキュベーションした。サンプルを１５０００×ｇで１５分間遠心分離してリポソーム−ＨＰ複合体をペレットにした。ペレットを１０ミリモル／ｌのトリス塩酸（ｐＨ７．４）、１５０ミリモル／ｌの塩化ナトリウム及び１ミリモル／ｌのＥＤＴＡを用いて３度洗浄した。洗浄後、ペレットを空気乾燥し、分解バッファ中に再懸濁した。分解及びペプチド脱塩を以前記載したように行った（Shotgun proteomic analytical approach for studying proteins adsorbed onto liposome surface. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 401, 4, 1195-1202、この全内容は参照により本明細書に盛り込まれる）。要するに、ペレットは４０マイクロリットルの尿素８モル／ｌ及びＮＨ4ＣＯ3５０ミリモル／ｌ中に再懸濁され、２マイクログラムのトリプシンを添加することによって分解された。分解されたペプチドはＳＰＥ  Ｃ１８カラムを用いて脱塩され、適切な体積の０．１％のギ酸溶液を用いて再構成され、分析まで−８０℃で保存される。分解されたペプチドは、タンデム質量分析計（ＭＳ／ＭＳ）に連結されたナノ高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により分析された。ナノＨＰＬＣ  ＭＳ／ＭＳ分析は、ナノエレクトロスプレーイオン源によってハイブリッド線形イオントラップ及びオービトラップ質量分析計（Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＬＴＱ−ＸＬ（登録商標）、ドイツブレーメン市のＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）に直接接続されたＤｉｏｎｅｘ  Ｕｌｔｉｍａｔｅ（登録商標）３０００（米国カリフォルニア州サニーベールＤｉｏｎｅｘ社製）を用いて行われた。ペプチド混合物は３００μｍＩＤ×５ｍｍのＡｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ（登録商標）１００  Ｃ１８プレカラム（米国カリフォルニア州サニーベールのＤｉｏｎｅｘ社製）上で濃縮され、流量１０マイクロリットル／分にて、０．１％（ｖ／ｖ）ＨＣＯＯＨを含むｄｄＨ２Ｏ／ＡＣＮ、９８／２（ｖ／ｖ）から構成されるプレミックス移動相を用いた。その後ペプチド混合物は逆相（ＲＰ）クロマトグラフィーによって分離された。ｄｄＨ２Ｏ／ＨＣＯＯＨ（９９．９／０．１、ｖ／ｖ）の移動相Ａ及びＡＣＮ／ＨＣＯＯＨ（９９．９／０．１、ｖ／ｖ）の移動相Ｂから構成される３時間最適化ＬＣグラジエントを用いてペプチドの最大セットを検出した。Ｄａｔａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔモードの動作で６０，０００の分解能セッティング（ｍ／ｚが４００での半値全幅）を用いて、溶出用ペプチドのＭＳスペクトルを３５０〜１７００のｍ／ｚ範囲にわたって収集した。各ＭＳスキャンにおける５つの最も含量が多いイオンについてＭＳ／ＭＳスペクトルを収集した。さらなる詳細については別の文献から見つけることができる（Shotgun proteomic analytical approach for studying proteins adsorbed onto liposome surface. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 401, 4, 1195-1202）。各実験条件において３つの個々のサンプル（生物学的レプリケート(biological replicates)）��準備し、その各々が３反復（triplicate）測定され（技術的レプリケート(technical replicates)）、各実験条件について９つの測定値が得られた。非重複Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔデータベース（０９−２０１４、５４６０００個のシーケンス、ホモサピエンス分類制限）に対するデータベースサーチを行うために、ＲＡＷデータファイルはＴｈｅｒｍｏ−Ｆｉｎｎｉｎｇａｎ  ＬＣＱ／ＤＥＣＡ  ＲＡＷファイルデータインポートフィルタを用いてＭａｓｃｏｔ（ｖ２．３、英国ロンドンのＭａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）に送られた。データベースサーチについて、最大２つのｍｉｓｓｅｄ  ｃｌｅａｖａｇｅで、トリプシンがタンパク質分解酵素として特定された。システインのｆｉｘｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎとしてカルバミドメチル化が設定され、ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎとしてメチオニンの酸化が選択された。前駆イオンについて及びフラグメンテーションイオンのモノアイソトピック質量許容差はそれぞれ１０ｐｐｍ及び０．８Ｄａに設定された。前駆イオンとして＋２又は＋３の電荷状態が選択された。プロテオーム解析の出力ファイルは市販ソフトＳｃａｆｆｏｌｄ（ｖ３．６、米国オレゴン州ポートランドのＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社製）に送られた。ペプチド同定は、ペプチドプロフェットアルゴリズムによって設定された確率閾値９５％を上回ったときに有効とされた。タンパク質同定は、確率９９．０％よりも大きいとすることができたときかつ少なくとも２つのユニークなペプチドを含むときに認容された。共有ペプチドを含み、ＭＳ／ＭＳ分析のみでは区別できなかったタンパク質は、オッカムの剃刀の原理を満たすようグループ分けされた。定量的分析において生物学的レプリケートの一貫性を評価するために重み付けのないスペクトルカウント（ＵＳＣ）を用い、タンパク質含量を収集するために正規化スペクトルカウント（ＮＣＳ）を用いた。
【０２０１】
統計分析
全統計分析はＰＬＳ、コホネン及びＣＰＡＮＮツールボックスを用いて行われ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）、ＸＬＳＴＡＴ（登録商標）及びＭＡＴＬＡＢ（登録商標）を用いてグラフが作成された。
【０２０２】
データ行列
個々のものに関係する予測行列（Ｘ）の各行は、３タンパク質コロナセンサアレイから得られた全タンパク質含量から導出された（図４Ａ）。処理前工程において、行列Ｘ中の正規化データ、即ち相対タンパク質含量（ＲＰＡ）がオートスケーリングされた。
【０２０３】
＜分類及びクラスタリング＞
部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）
部分的最小二乗判別分析は、線形分析並びに２つの主要部分及び構造的部分からなる次元削減法とみなされる周知の多変数アプローチであり、対応する従属変数（即ちクラスメンバーシップ、Ｙ）と最大共変動を有するオリジナルの独立変数（即ちデータ行列Ｘ）の線形組み合わせとしての潜在変数をサーチする。測定された成分は、スコア及びローディングのような潜在変数を含み、これらは潜在変数とその元々の変数がどのような関係にあるのかを示す。データの次元を削減するＰＬＳＤＡの能力に基づき、異なるデータパターンの線形マッピング及びグラフとしての視覚化をすることができる。ＰＬＳ−ＤＡは、かなり同線的及び雑音のあるパターンを扱うときに特に適する。プロテオミクスにおける大きなセータセットに関連する主な問題は、モニターする変数（即ちタンパク質）の数が多いことと、サンプルの数が比較的少ないことである。故に、変数において重複性が高いかもしれず、変数が情報価値のないものとなり分類に無関係となる。このようにして、情報価値のない変数を省く又は新たな無相関なものを見つけることによって、分類の予測性能が改善され得る。本研究のような生体応用においては、サンプルが多数の既知のグループのうちの１つに属するか否かを決定しなければならないだけでなく、クラス間の最良の区別においてどの変数が最も関連性が高いかを決定せねばならない為、ＰＬＳ−ＤＡのような方法はデータのバリエーションを保ちながら相関性のない新たな潜在変数を見つけるための良い候補アプローチである。潜在的な予測を生成するための元の変数の重要なべき乗は、射影における変数重要度（ＶＩＰ）分析によって計算することもでき、変数に関する決定を行うにおいて重要な役割をする。
【０２０４】
重み付けＶＩＰに基づく最適変数の識別。変数に関するＶＩＰ値を探すために部分的最小二乗判別分析（ＰＬＳ−ＤＡ）を用いた。ＶＩＰは、データの２つのセット、従属（Ｙ）及び独立変数（Ｘ）、の記述に変数がどの程度寄与するかについての組み合わせ測定である。ＰＬＳモデルにおける重みは独立及び従属変数間の共分散を反映し、重みを含ませること、ＶＩＰは、従属変数がどれほど良く記述されたかを反映できるだけでなく、その情報が独立変数のモデルにとってどれほど重要なのかも反映することができる。
【０２０５】
変数の最良のサブセットを識別するためにＶＩＰスコアに基づくアプローチが展開された。ＶＩＰスコアはデータセットについてＰＬＳ−ＤＡを実行することにより計算することができる。このアプローチにおいて、変数のＶＩＰスコアは５０回計算され、トレーニング及び検証セットのランダム順列が毎回用いられた（ランダムトレーニングセットは、対象の各クラスの８０パーセントカバレッジを考慮することで繰り替えし選択される）。最重要変数、ラージＶＩＰスコア値（＞２）、を考慮すると、上位２００の変数を各繰り返しで選択して上位変数プールに追加することができる。その後、各変数についての発生頻度（Ｆｒｅｑi）及び平均ＶＩＰスコア
【数１】
2020502514.tif 000006
を上位変数プールに応じて得ることができる。したがって、変数ｉの選択
【数２】
2020502514.tif 000007
は、トレーニング及び検証セットへの依存によりあまり推奨されない。したがって、各変数の
【数３】
2020502514.tif 000008
はＦｒｅｑiにより重み付けすることができ、重み付けされた
【数４】
2020502514.tif 000009
を用いて最も関連する変数のランキングをすることができる。図は提案されたアプローチの概略図である。分類モデルを構築するための最も関連する変数の選択は、得られたランキングによって以下のように導かれる。高ランク付けされた変数は１つずつデータセットに追加され、ＰＬＳ−ＤＡの分類エラーが関連予測因子の最低数を見つけるために計算された（図４Ａ）。
【０２０６】
カウンタープロパゲーション人工ニューラルネットワーク（ＣＰＡＮＮ）
カウンタープロパゲーション人工ニューラルネットワーク（ＣＰＡＮＮ）は、規定のＮ×Ｎグリッド上に配置された２層のニューロンからなる自己組織化マップの教師付き変数である。ＣＰＡＮＮは、ニューロンの高次元特徴空間から低次元（通常は２）離散空間にデータをマップするために、そして未知のサンプルのクラスメンバーシップを予測するために、用いることができる。入力ベクトル（サンプル特徴ベクトル）及び対応するクラスメンバーシップベクトル（バイナリーベクトル）はＣＰＡＮＮの入力及び出力層にそれぞれ提示された。両層におけるニューロンの重み付け補正は、競合学習及びニューロンの連携に基づき行われる（表３参照）。故に、類似した入力ベクトルを同じ又は隣接したニューロン上にマップすることができ、逆もしかりである。最終割り当てマップは特徴空間内のデータの構造を適正に明らかにし、ニューロンの低次元グリッド内のパターンの距離を保存する。図９Ｃは、上位にランクされたバイオマーカーを用いたＣＰＡＮＮの高品質割り当てマップを示す。各クラスについて区別された領域であることにより、分類エラーのリスクが最小化される。マップの適正なサイズは、異なるマップサイズにおいて１０分割交差検証を実行することで決定することができる。クラスメンバーシップを非標識サンプルに割り当てるためにトレーニングされたＣＰＡＮＮを用いることができる。データのトレーニングにおいて重複した情報価値のない変数が存在すると、マップの品質に影響し、分類のエラーのリスクが高まる（図５Ｃ）。プロセスは、２次元ニューロングリッド上で高次元入力対象を視覚化することを助ける非線形マッピングである。これは自己組織化手順であり、明白な方法で分類の問題を解決する。ＣＰＡＮＮ法に関する詳細は以下の参考文献のなかで見つけることができる。
【０２０７】
階層的クラスター分析（ＨＣＡ）
階層的クラスター分析は、プロテオミクスにおいて頻繁に用いられるような異種の膨大なデータセット全体を探索して区別された均一なクラスターに可視化するために広く用いられる教師なし方法である。階層的クラスターのストラテジーは、凝集型方法及び分割型方法の２つのカテゴリに分類することができる。凝集型手法は、最初に各対象をそれ自体の個別クラスターに分離し、その後クラスターを順に組み合わせ、類似した対象又はクラスターは、すべての対象が１つのクラスターだけに属するまで統合される。一方で、分割型手法は、１つの大きなクラスター内にある全対象から開始し、これらを、各対象が個々のクラスター内に属するまで徐々により小さいクラスターに区分けする。最後に、対象は、定義されたクラスターを枝に有するデンドログラムに組織化される。クラスター分析では、均一なサブグループを識別するために、２つの重要なコンセプトである類似性（対象間の類似性について数字的な値を決定するとともに類似性マトリックスを構成する）及び連結（対象をグループに連結する又はしない）が定義されるべきである。ここでは、我々は、選択された変数に基づく教師なし分析のために凝集型階層的クラスターを最長距離連結アルゴリズムとともに適用する。
【０２０８】
コホートサンプル予測
６９個の選択された予測因子を伴う線形及び非線形変数の予測性能を、コホートサンプル分析によって評価した。コレを達成するために、６９個の変数に関係する値をモデルに入れ、各コホート対象のクラスメンバーシップを固定最適パラメータ値において予測した。コホートサンプルについての我々のタンパク質コロナセンサアレイのプロテオームプロファイル内の１９個の変数（タンパク質）は検出されず、検証データ行列においてこれら変数についてゼロと考慮した。興味深いことに、線形及び非線形モデルは、全ての５つのサンプル良い予測を与える。図６Ａに示すトレーニング及びコホートサンプル間の距離は、これら１９個の不在変数についてデータ行列に足されたゼロ値におそらく関係する。我々は、トレーニング及び予測セットの両データ行列からこれら１９個のタンパク質を削除することで不在変数について入れ替えられたゼロ値による影響を調べ、次にＰＬＳ−ＤＡモデルを構築してコホートサンプルを予測した。期待した通り、コホート及びトレーニングサンプル間の長い距離は観測されなかった。
【０２０９】
【表３】
2020502514.tif 000010
2020502514.tif 000011
【０２１０】
各変数について、割り当てマップパターンを有する対応する重みマップの相関係数を計算することができる。
ＣＣ＝０：バイオマーカーと関連クラスとの間に相関がないことを示す。
１＞ＣＣ（ｉ）＞０：バイオマーカー強度とがん関連クラスとの間の一致。
０＜ＣＣ＜−１：バイオマーカー値とがん関連クラスとの間の逆相関。
また、＞０．５又は＜−０．５のＣＣ値を色付けした。例えば、バイオマーカー１２８２の重みマップは、割り当てマップ上のがんクラス４パターンとかなり相関があり、骨髄腫を有する患者からのサンプルについて重要なバイオマーカーとなり得る。
【０２１１】
＜例１Ｂ  マルチナノ粒子タンパク質コロナ特性評価及び機械学習を用いたヒトプロテオームの深さ分析により、初期ステージのがんの正確な識別及び判別が可能となる＞
【０２１２】
第２実施形態において、個々のナノ粒子のタンパク質コロナプロファイルから導出された、与えられた血漿サンプルについての集合的なタンパク質コロナデータは、データを分析するために機械学習（例えばランダムフォレストアプローチ）を用いることにより異なる種類のがんを識別及び判別することが可能である。例１Ａに記載されたセンサアレイを用い、収集されたデータを機械学習によりさらに詳細に分析した。このセンサアレイ（即ちタンパク質コロナナノシステム）はがんを明白にかつ安定して識別し、異なる種類のがんの判別を可能とする。このシステムは、ブラインド血漿サンプルを用いてがんの種類を予測するために用いることができる。がん発症前生体分子フィンガープリントを決定するための、血漿採取の数年後にがんと診断された生存コホート内の健康者の血漿を用いることによる超早期発見のための能力である。
【０２１３】
図１は、既知のがん患者におけるがん発見のため及びがん予測のために、ブラインド血漿及びコホートサンプルの両方を用いるマルチタンパク質コロナプロテオミクスを用いるためのセンサアレイ（ナノ粒子システム）の使用の概要を表す。
【０２１４】
[結果]
＜初期、中期及び進行ステージのがんを有する患者からの血漿を用いたナノシステムのタンパク質コロナプロファイル＞
【０２１５】
我々のタンパク質コロナナノシステムは、異なる表面電荷［即ち、陽イオン（ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール）））、陰イオン（ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）−ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）））及び中間（ＣＨＯＬ（ＤＯＰＣ−コレステロール））］を有する３つの異なる交差反応性リポソームから構成され、そのタンパク質コロナプロファイルは、健康な患者又は５つのがん、即ち肺がん、すい臓がん、骨髄腫、髄膜腫及び神経膠芽腫のうちの１つを有する患者の血漿への接触後に測定された。
【０２１６】
我々は、各患者（患者５人／グループ）に対し、我々のタンパク質コロナナノシステムを用いて３つのリポソーム（リポソームのサイズ及び電荷の詳細については図２Ａ及び２Ｂ参照）の各々について３連でプロテオーム解析を行った（即ち、総試験数：３＊（２９）＊３＝２６１）。例１Ａでも記載したようにいずれの種類のがんについても特異的なタンパク質コロナ組成は１つもなかったものの、異なるリポソームから得られた所定の血漿サンプルについての集合的なタンパク質コロナ組成により、がんの各種類についてユニークな「フィンガープリント」が提供された。
【０２１７】
リポソームの表面上に形成されるタンパク質コロナの組成は、それらの物理化学的性質に大きく依存するものの、所定の患者の血漿中に存在するタンパク質及び他の生体分子のユニークな種類、濃度及び立体構造によっても大きく影響され得る。コロナ被覆リポソームのサイズ及び電荷は、５つの種類のがんを有する患者（表１参照）及び健康者からの血漿とともにインキュベーションした後に、動的光散乱法（ＤＬＳ／Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ（商標））を用いて調査された。結果、コロナ被覆ナノ粒子の物理化学的性質が異なる種類のがんについて異なったことが確認された（図２Ａ、２Ｂ）。
【０２１８】
リポソーム上に吸着された全タンパク質の定量評価は、ＢＣＡ（ビシンコニン酸）又はＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）アッセイを用いて行われ、結果、各種のがんを有する患者からの血漿中でのインキュベーション後に、吸着されたタンパク質の量が大きく異なったことが確認された（図３Ａ１〜３Ｆ３）。リポソームの表面上に吸着された総タンパク質の定量評価により、タンパク質量のがんの種類への依存が示された（図３Ａ１〜３Ｆ３）。３つのリポソームの表面におけるタンパク質コロナ組成は、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分光法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって評価され、８７６の既知のタンパク質が明らかにされた。個別のタンパク質及びこれらのカテゴリ（即ち、相補体、凝固、組織漏出、リポタンパク質、急性期、免疫グロブリン及び他の血漿タンパク質）のコロナ組成への寄与が明らかにされた（図３Ａ１〜３Ｆ３）。結果、タンパク質組成とがんの種類との関連性だけでなく、タンパク質組成とリポソームの種類との関連性も示された。このバリエーションの背後にあるメカニズムは、ナノ粒子の表面積対体積比が高いことで幅広いヒト血漿タンパク質（高含量タンパク質、低含量血漿タンパク質及び極めて稀少なタンパク質）がコロナ組成に関与するユニークな機会が与えられ、血漿タンパク質の濃度との直接的な相関はないというものである。さらに、我々のシステムでは、血漿タンパク質における立体構造を変化させることでも、タンパク質とナノ粒子との相互作用部位の大きな変更を介してタンパク質コロナ組成を変化させることができる。これらの特性により、ヒト血漿中のタンパク質の分析のために開発された他のアプローチがある中でもとりわけ、タンパク質コロナプロファイルがユニークなものとなる。
【０２１９】
リポソームの表面におけるタンパク質コロナ組成は、高含量タンパク質（例えばアルブミン、トランスフェリン、補体タンパク質、アポリポタンパク質及びα−２−マクログロブリン）と、トランスフォーミング増殖因子β−１−誘起トランスクリプト１タンパク質（〜１０ｎｇ／ｍｇ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼＡ（〜２０ｎｇ／ｍｌ）、チオレドキシン（〜１８ｎｇ／ｍｌ）及びＬ−セレクチン（〜９２ｎｇ／ｍｌ）などの極めて稀少なタンパク質（＜１００ｎｇ／ｍｌとして定義）と、を含む幅広いヒト血漿タンパク質を含む。また我々は、既知のこれまでの血漿濃度なしに、３８８のタンパク質を同定した（http://plasmaproteomedatabase.org/）。得られたタンパク質情報は、その後、安定した正確ながん発見に関する我々のタンパク質コロナナノシステムの能力を調べるために、機械学習アプローチにより分析された。
【０２２０】
＜タンパク質コロナナノシステムから得られた結果を用いてがんを発見及び判別するための分類器の開発＞
種々のタンパク質コロナナノシステムのがんを発見する能力を評価するために、我々は、３つの区別可能なリポソームから収集された、２９個の血漿サンプル（５つのがんの種類の各々について患者５人；及び４つの健康なサンプル）についてのプロテオームデータを用いて、分類器をトレーニングした、特に、患者からアレイ測定値を受診し６つの標識のうちの１つ（５つのがんの種類のうちの１つ又は健康）を出力するアルゴリズムをトレーニングした。分類器をトレーニングする前に、３つのナノ粒子からの生データを最初に後節で説明する低ランクテンソル分解を介して「ノイズ除去」した。このノイズ除去は、個々のコロナ要素において観測される大きなばらつきを黙示的に軽減する。その後我々は、結果得られたノイズ除去されたデータに対し、よく知られている非線形分類アルゴリズムであるランダムフォレスト分類器をトレーニングした。
【０２２１】
我々は、１６個のブラインドサンプル（５つのがんの種類の各々について患者３人；及び１つの健康なサンプル）に対してこの分類器の精度をテストした。我々は、これらのブラインドサンプルを６つの標識のうちの１つに正確に割り当てる作業のために全体的な分類精度を測定し、これと併せて５つのがんの種類の各々について敏感度及び特異性を別々に測定した（表４）。血漿サンプルの数（合計４５個）が比較的少ないことから、また我々の結果のロバスト性を確保するために、我々はこの手順（２９個のサンプルについてランダムフォレスト分類器をトレーニングし、残りの１６個のサンプルについて精度、敏感度及び特異性を測定）を計１０００回行った。１０００回の反復実験の各々におけるトレーニングとテストのセットは、全てのクラス層別に分割されたデータのなかからランダムに選択された。このアプローチにより、我々が報告する分類精度についてのｐ値のバイアスのない見積りを計算することができる（表４参照）。特に、表４の最後の列は１０００回の反復実験について全体精度が９６．２％であった又は同等に全体エラーが３．８％であったことを示す。また我々は、全体分類エラーが８７．５％未満であるとの帰無仮説についてｐ値が０．０４であったことを観測し、したがって我々はこの帰無仮説を９５％の信頼度で棄却することができる。５つの個々のがんの種類について敏感度は範囲が８７．４％〜１００．０％に及び、個別の特異性は範囲が９７．９％〜１００．０％に及んだ。
【０２２２】
表４は、全体分類精度、敏感度及び特異性を示す。１、２及び３つのリポソームを有するタンパク質コロナナノシステムの全体分類精度（２列目）を示す。分類精度と関連するｐ値との両方が、リポソームの追加とともに向上した。神経膠芽腫、肺がん、髄膜腫、骨髄腫及びすい臓がんについての個別の敏感度及び特異性（３〜１２列目）もまた、リポソームの追加とともに敏感度及び特異性が向上したことを示した。実験結果は２９個の血漿を備えるトレーニングセットからの１０００回の個別の抽出について平均をとり、残りの１６個の血漿で評価を行った。ｐ値は分類エラーが８７．５％未満であるとの帰無仮説についてのものである。
【０２２３】
【表４】
2020502514.tif 000012
【０２２４】
＜タンパク質コロナナノシステムにおけるマルチ（複数の）リポソームの価値＞
タンパク質コロナナノシステムにマルチ（複数の）リポソームを含めることの重要性を評価するために、我々は、１０００個に分割されたデータをサンプルのトレーニング及びテストに用いて分類手順全体を繰り返し、今回は１つのリポソームのみから測定されたデータのみを用いた。これは３つのリポソームの各々について行われ、結果を表４の１行目に示した。３つのリポソーム全てを含む完全なアレイに比べて、１つのリポソームのアレイは有意に低い精度、敏感度及び特異性を示した。我々は２つのリポソームからなるセットについてもこの手順を再度実行し、結果を表４の２行目に示した。２つのリポソームからなるシステムは１つのリポソームからなるシステムよりも精度が良いものの、３つのリポソームからなる完全なアレイよりは劣った。総合的に、このことは、異なるリポソーム間のコロナ組成パターンの変化の価値と、そのような複数の観測を盛り込むことの必要性を示した。
【０２２５】
＜変数並びにタンパク質重要度及び安定性＞
ランダムフォレストモデルは、各変数（即ち各リポソーム−タンパク質対）についての重要度スコアももたらす。このスコアは、その変数が異なる種類のがんを有する患者の判別においてどれほど重要であるかを主に測る。ランダムフォレストの個々の「ツリー（木）」において、ツリーを構成するのに用いられたあらゆる変数の重要度スコアが、その変数を利用する「リーフ（葉）」ノードに属するトレーニングセットの割合として定義され（ツリーを構成するのに用いられていない変数にはゼロのスコアが割り当てられる）、故に変数についての全体重要度スコアは各ツリーにおけるその重要度スコアの平均である。
【０２２６】
タンパク質の異なる生物学的家族（図３Ａ１〜３Ｆ３で用いたものと同じ）について、我々は異なるがんの種類の判別における全体重要度を計算した（図１０Ａ、（ａ）〜（ｃ））。結果、タンパク質の異なる家族が異なるがんの発見において重要であることが示唆された。例えば、急性期タンパク質は髄膜種の発見に比較的重要であり、リポタンパク質は神経膠芽腫の発見に比較的重要であった。注目すべきことに、これらのバリエーションはリポソーム上に吸着された各カテゴリの割合のばらつきとは異なっていた（図１０Ａ、（ｄ）〜（ｆ））。興味深いことに、これらの結果はこれらのタンパク質カテゴリの生物的機能と良く一致した。例えば、健康な組織と比べて神経膠芽腫において脂質代謝が大きく変更されることは一般に認められており、これが、観測されたリポタンパク質とリポソームとの相互作用における大きな変化の主たる理由であるかもしれない（図２Ｃ及び図１０Ａ）。異なるリポソームのコロナ組成における同定されたタンパク質及びユニークなタンパク質の数並びにこれらの組み合わせを図１０Ｂに示す。
【０２２７】
また我々は最重要全タンパク質を計算した（図１０Ｃ及び表５）。これらのタンパク質は３つ全てのリポソームからなる組み合わせにおいて検出され、ナノシステムにおけるマルチリポソームの重要な役割を再度示した。また我々は、前述の１０００個に分割されたトレーニングデータに対して見積もられた分類器についてこの「重要な」タンパク質のセットのロバスト性を評価した。特に、図１０Ｂは、平均して３０の最重要タンパク質についての重要度スコアの２５パーセンタイルから７５パーセンタイルを示す。これらは、重要なタンパク質のセットがモデルのトレーニングに用いられたデータの分割に対して安定であることを示す。これらの最重要タンパク質（表５参照）のうち、一部はがんの発生において重要な役割をすると認識されている。例えば、フィコリン（フィコリン２及びフィコリン３の両方）は、補体活性化を調整するかなりの能力を有するオプソニン性質を有する血清パターン認識分子である。フィコリン３の血清濃度は、健康な対象よりも卵巣がんの患者においてより高いことが示されている。さらに、フィコリン３は前立腺がん血清の層別プロテオーム解析において同定され、これはこのタンパク質が前立腺がんでも役割があることを示唆する。一方で、アポリポタンパク質Ａ２及びそのアイソフォームが前立腺がん血清中に過剰発現すること並びにがんなどの炎症性疾病があると急性期タンパク質（例えば補体タンパク質）の濃度が≧２５％変化し得ることが証明されている。がんと止血系との間の明確な関連性は昔から文書で十分に立証されている。止血は血小板の接着及びフィブリンの堆積を調整することにより血流を調節する。止血に関与する数々のタンパク質が血管形成の調整に結びつけられてきた。このうち、フィブリノゲンは止血プロセスにおける主たるタンパク質であるとともに多くの腫瘍で発見されており、フィブリノゲンは血管形成及び腫瘍の増殖を調節し、転移形成に結びつけられてきた。実際に、フィブリノゲンの血漿レベルは  非転移性腎細胞がんを有する患者における臨床成果を予想するため及びすい臓がんにおける遠隔転移を予測するために用いられている。
【０２２８】
表５は、全３つのリポソームの組み合わせにおいて検出されることが判明した最重要全タンパク質に関する情報を示す。*濃度は血漿プロテオームデータベース（www.plasmaproteomedatabase.org）からのスペクトルカウントを用いて得られた値である。
【０２２９】
【表５】
2020502514.tif 000013
2020502514.tif 000014
【０２３０】
我々の機械学習アプローチによって同定された重要なタンパク質の役割をさらに調べるために、我々はこれらを治療ターゲットの同定及び検証のためのプラットフォームである及びＯｐｅｎ  Ｔａｒｇｅｔｓデータベースのなかで検索した。このデータベースは、疾病関連性について０（最低）から１．０（最高）のスケールでスコアを導出するために、種々の他のデータベース（ＧＷＡＳカタログ、ＵｎｉＰｒｏｔ、Ｇｅｎｅ２Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｃｅｎｓｕｓ、ＩｎｔＯＧｅｎ、Ｅｕｒｏｐｅ  ＰＭＣ及びＲｅａｃｔｏｍｅを含む）からの証拠に基づき各タンパク質について疾病関連スコアを計算する。挙げられたタンパク質のうち、３つががんと強い関連性を有する。ヒアルロン酸結合タンパク質はがんとの非常に強い一般的関連性（１．０）を有し、フィブリノゲンβ鎖は肺がんとの適度に強い関連性（０．４）を有し、一方で、ケラチン、タイプ１細胞骨格１４は前立腺がんとの強い関連性（０．７２）を有する。表５にある他のタンパク質のほぼ全てが各種のがんとのある程度の弱い関連性（０．０５〜０．４）を有する。したがって、総合的に、タンパク質は既知のがんの関連付けと結びつきがある。
【０２３１】
＜テンソル分解法を用いた単一測定におけるばらつきの解消＞
我々は、患者集団における大きなばらつき及び測定エラーによって生じるノイズによって、どのタンパク質も１つでは分類には不十分であることを見出した。１００の最も含量の多いタンパク質の各々について（３＊１００＝３００個の変数をもたらす）、我々は各種類のがんの患者について観測されたコロナにおけるそのタンパク質濃度の平均絶対Ｚスコアを計算した。所定のタンパク質におけるある種類のがんについてのより高いＺスコアは、このタンパク質がこの種類のがんの発見に有用であることを示す。図１１（青いバー）は、各種類のがん及び健康なグループについてのこれら平均絶対Ｚスコアのヒストグラムを示す。我々は、これらの特定の種類のがんにこれまで結びつけられたタンパク質について平均絶対Ｚスコアも測定し、これらは図１０の同じヒストグラムに示されている（明るい灰色のバー）。これら数百の変数のうちで、絶対Ｚスコアが２．０より上なのは１つのみであり、また１つの種類のがん（骨髄腫）のみであり、このことは正確な分類に十分なタンパク質は１つもないことを示唆している。
【０２３２】
我々のランダムフォレストの構築に先行するテンソル分解は、所定のサンプルについて観測されたコロナにおけるタンパク質組成のわずかな数の加重平均を計算する役割を効率的に果たす。この平均は所定の血漿サンプルにおける全タンパク質及びナノ粒子についてもののであり、あらゆる所定のタンパク質の観測された濃度のばらつきを軽減する役割をする。例えば、図１１（長い黒いバー）において、これら加重平均の１つについての平均絶対Ｚスコアが各種類のがんについてプロットされている。これら加重平均の絶対Ｚスコアは１つの変数の何れの絶対Ｚスコアよりもかなり高い。これにより我々のアプローチがどのように同じ指標（indication）を有するサンプル間における１つのタンパク質のばらつきを解消するかという直感に加えて、このノイズ除去は我々の分類能力に重大なインパクトを与える。ノイズ除去をせず、単に生コロナデータに対しランダムフォレスト分類器をトレーニングするだけでは、分類精度は９４％（ｐ値は０．０７）であり、表４にて報告した９６．２％（ｐ値は０．０４）には及ばない。表７で報告したコホートデータについては、ノイズ除去により分類精度が９２％（ｐ値は０．０４）から９４．１％（ｐ値は０．０１）まで上げることが可能であった。
【０２３３】
＜分類精度のデータ依存性＞
４５人の非コホート患者に対する我々の最後の評価は、データの価値（value）である。我々のオリジナルの分類器は各種類のがんについて５個のサンプルに対してトレーニングした。多少のトレーニングデータを含むことの価値を測るために、我々は、４つから６つ（表６）のクラス毎に異なる数のトレーニングサンプルについて、分類手順（データをトレーニング及びテストサンプルに分け、トレーニングサンプルに対して分類器をトレーニングし、テストサンプルに対して性能を測定し、全てを１０００回行った）を繰り返した。分類精度、敏感度及び特異性の全てがトレーニングサンプルの数の増大とともに増大した。クラス毎に６つのトレーニングサンプルを用いると、全体精度は９６．８％に達した（即ち全体エラー率は３．２％）。このことは、精度、敏感度及び特異性が、より多くのデータを分類器のトレーニングに含むことによって増大し続けることを強く示唆している。
【０２３４】
表６は、より多くのデータにより分類精度が向上することを示す。２列目は、トレーニングセットが各がんからの４つ、５つ及び６つのサンプルにより構成される場合の全分類エラーと関連するｐ値とを示す。分類エラー及び関連するｐ値の両方が各がんからのサンプルの追加とともに向上した。３列目〜１２列目は、トレーニングセットが４つ〜６つのサンプルにより構成される場合の神経膠芽腫、肺がん、髄膜腫、骨髄腫及びすい臓がんについての敏感度及び特異性を示す。実験結果は、４人の健康な患者及び各種類のがんを有する４人〜６人の患者についてのトレーニングセットを１０００回個別に抽出したものについて平均をとった。ｐ値は少なくとも２つの分類エラーの帰無仮説に関するものである。
【０２３５】
【表６】
2020502514.tif 000015
【０２３６】
＜タンパク質除去が不要なリポソームを用いた低含量及び高含量血漿タンパク質のサンプリング＞
マルチリポソームタンパク質コロナナノシステムは、機械学習法を用いて、各種類のがん及び健康者についてのユニークな「フィンガープリント」タンパク質パターンを生成する。がんの同定及び判別におけるタンパク質コロナのユニークな能力の根底にあるメカニズムを追求するにあたり、我々は高含量タンパク質及び低含量タンパク質の両方の寄与についてコロナ組成を徹底的に分析し、そしてこれらの結果をヒト血漿中のコロナタンパク質の濃度と比較した。これに関し、各タンパク質（例えばタンパク質Ｘ）のコロナ組成及び血漿に対する寄与を、（タンパク質コロナ中の全アルブミンペプチド）／（タンパク質コロナ中の全タンパク質Ｘペプチド）及び（血漿中のアルブミン濃度）／（血漿中のタンパク質Ｘ濃度）を用いて、ぞれぞれアルブミンに対し正規化した。我々が血漿中の識別されたコロナタンパク質の濃度をオンラインプロテオームデータベース（http://plasmaproteomedatabase.org/）を用いて手作業で調査したことに注目すべきである。タンパク質コロナ中の全アルブミンペプチドはタンパク質コロナ中のアルブミンの総量に比例することから、これらのペプチドをタンパク質Ｘペプチドで割ることは、血漿中におけるアルブミン濃度対タンパク質Ｘ濃度比に相当する。図１２に示されるように、我々は、血漿濃度が（両対数スケールで）１０の１０乗にわたって変動し、同時にリポソームがこれら同じタンパク質を１０の４乗〜５乗にわたって検出したことを発見した。換言すると、我々は、タンパク質コロナ組成が幅広い低含量タンパク質（≦１００ｎｇ／ｍｇ）及び極めて稀少なタンパク質（≦１０ｎｇ／ｍｇ）を集結する優れた能力を有することを明らかにした。このことは、タンパク質コロナ中の高含量タンパク質についてデータを取得することは低含量及び極めて稀少なタンパク質に由来するペプチドの検出を妨げないことを意味する。注目すべき点は、検出されたタンパク質の多くは低含量、稀少又は未知／未報告のタンパク質であることである。コロナ組成における低含量タンパク質の関与は、低親和性コロナタンパク質と高親和性タンパク質との交換及びより緩慢な吸着キネティクスに主に起因する。
【０２３７】
ヒト血漿中の低含量タンパク質の検出は高含量タンパク質の除去及び除去後血漿分画ストラテジーを必要とするが、これらの分解ストラテジーを用いたとしても、血漿プロテオミクスはがんの早期発見において安定して成功していない。我々のシステムを用いて得られた結果は、ヒト血漿タンパク質とは対照的に、タンパク質コロナ組成が除去（これは低含量タンパク質／バイオマーカーの意図しない除去をもたらす可能性がある）を必要とせずに幅広い低含量及び極めて稀少な血漿タンパク質を含むことを示す。加えて、我々は、タンパク質コロナにおいて、ヒト血漿中の濃度が極めて低いためにヒト血漿中の濃度が未知／未報告であるいくつかのタンパク質を発見した。より具体的には、陽イオン、中性及び陰イオンリポソームが、それぞれ、血漿濃度が未知／未報告の、３２３、１８９、１５５のタンパク質から成る。これらタンパク質のタンパク質コロナへの寄与は図１２の右側にある四角いボックスで示されている。
【０２３８】
マルチリポソーム（異なる表面特性を有する）の使用により、低含量タンパク質及び極めて稀少なタンパク質の検出深さが増大するユニークな機会がもたらされ（図１２参照）、これによりタンパク質コロナナノシステムの敏感度、特異性及び予測精度が大幅に向上した。各リポソームは、がんの種類に大きく依存する、寄与したタンパク質の異なるパターンを提供した。
【０２３９】
＜コホートサンプルについてのがん発見及び判別＞
最後に、タンパク質コロナナノシステムの超初期のがんを発見する能力を調べるために、我々は、血漿採取の数年後にすい臓がん、肺がん及び脳がんと診断された健康者からのコホート血漿（ＮＩＨにより資金援助されたゴレスタンコホート調査から得た。詳細については方法の章に記載する）を用いた。我々は同じ手順に沿って１０００回の実験を行った。各実験において、我々はデータを１２個（３つのがんの種類の各々につき４つ）のトレーニングサンプルと、３つのテストサンプル（３つのがんの種類の各々につき１つ）とに分割した。観測されたものを前述の方法でノイズ除去し、その後ランダムフォレスト分類器をトレーニングサンプルについてトレーニングした。最後に、全体精度、敏感度及び特異性をテストサンプルについて測定した（表７）。全体精度は９４．１％（エラー率は５．９％）であり、全体精度が＜６６．７％との帰無仮説に関するｐ値は０．０１（故に９５％の信頼度で棄却された）であった。３つのがんの種類について敏感度は範囲が８３．２％〜１００．０％に及び、特異性は範囲が９１．６％〜１００．０％に及んだ。これらの比較的高い値は、タンパク質コロナアレイががんを最も初期のステージでよく発見できることを示唆する。
【０２４０】
表７は、コホートサンプルについての全体分類精度、敏感度及び特異性を示す。２列目は、１、２及び３つのリポソームについての全体分類精度を示す。分類エラーと関連するｐ値の両方が、ナノシステムへのリポソームの追加とともに向上した。３〜８列目は、それぞれ脳がん、肺がん及びすい臓がんについての敏感度及び特異性を示す。再度、リポソームの追加とともに敏感度及び特異性が向上した。実験結果は１２人の患者を含むトレーニングセットからの１０００回の個別の抽出しについて平均をとり、残りの３人の患者で評価を行った。ｐ値は分類精度が＜６６．７％であるとの帰無仮説についてのものである。
【０２４１】
【表７】
2020502514.tif 000016
【０２４２】
また我々は、各リポソームを個別に含むリポソームのより小さいサブセットと、２つのリポソームからなる３つのユニークなセット全てとについて、同じ実験を行った。再度、リポソームの数の増大とともに全体精度、敏感度及び特異性が大幅に向上し、このことはアレイシステムの価値を再度示している。
【０２４３】
[考察]
タンパク質コロナ又は血漿プロテオーム分画のための他のアプローチを用いるこれまでの研究では、許容可能な特異性、敏感度及び予測精度を有する同時複数がんスクリーニングは可能でなかった。がんだけでなく具体的ながんのサブタイプについての特異性、敏感度及び予測精度を有してセンサアレイが開発されたのは今回が初めてである。
【０２４４】
タンパク質コロナによる血漿プロテオームの分画は、特定の血漿タンパク質の豊富さには無関係であり、むしろ、クーロン力、ロンドン分散力、水素結合酸性度及び塩基性度、分極率、孤立電子対並びにコロナ構造に関与するタンパク質間のタンパク質−タンパク質相互作用を含む幅広い力を介するナノ粒子表面へのタンパク質親和性を含む数々の因子を介してなされることを示した。タンパク質コロナ組成は動的であって、初めは、アルブミン、免疫グロブリン及びフィブリノゲンを含む、これらとその他の１９種類のタンパク質とで血漿プロテオーム中のタンパク質質量の９９％以上を構成する豊富なタンパク質が支配的である。血漿プロテオームの残りの１％は１０，０００種類以上のタンパク質から構成され、ナノ粒子表面に対するより高い親和性及び／又はより低い吸着キネティクスを有するこれらのタンパク質のサブセットが、コロナ組成への包含において高含量タンパク質と競り合う。ナノ粒子の表面において、より高い結合親和性を有するタンパク質がより低い結合親和性を有するタンパク質と交換されることに加えて、外側タンパク質コロナ層における他の低親和性タンパク質は既に形成されているタンパク質層と有利にタンパク質−タンパク質相互作用することから、これらの他の低親和性タンパク質による寄与もあり得る。このことは、交換された低含量タンパク質によって、タンパク質コロナの形成をより低含量のタンパク質の吸着に向かわせることが可能であり得ることを意味する。
【０２４５】
本開示において、我々は初めて、増大した(enriching)低含量タンパク質（＜１００ｎｇ／ｍｌとして定義される）のタンパク質コロナの相対濃度能力(relative concentration capacity)を分析し、これによりこれらのタンパク質の多くが＜１０ｎｇ／ｍｌの濃度であり１ｐｇ／ｍｌに近づく濃度であることを示す。より重要なのは、我々がこれらのタンパク質の多くが、機械学習アプローチを介するがんの同定及び判別において重要な役割を果たすことを示すということである。幅広い低含量タンパク質及び極めて稀少なタンパク質の集結におけるタンパク質コロナの役割は、がんの早期発見における現在の質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳを含む）が１０の４乗〜６乗のダイナミックレンジでしかタンパク質を検出できないことから限られた成功しか収めていないことから、現在の質量分析法の背景にある主な原因を解消するのに大いに効果がある。換言すると、タンパク質コロナ組成は、血漿プロテオームの広大なダイナミックレンジについてサンプリングを可能にし、これによりタンパク質除去せずともタンパク質カバー範囲を大幅に広げることができる。１つのナノ粒子から得られたタンパク質コロナはせいぜい数百の異なるタンパク質（全プロテオームの小さいサブセット）から構成されるので、我々は、異なる物理化学的性質を有するマルチナノ粒子を用いることでプロテオーム情報の追加の側面がもたらされると仮定した。この側面は、１）異なる物理化学的性質を有する各追加ナノ粒子は、追加のユニークな低含量タンパク質を動員できる可能性がある（図１２）；２）２以上のナノ粒子表面に重なるコロナタンパク質が異なるコロナ寄与率で関与し、故に他の関与しているコロナタンパク質の濃度及びアイデンティティを変更する；及び３）各ナノ粒子からのユニークかつ重なっているコロナタンパク質情報がユニークな変数として機能し、故に我々の機械学習アプローチにより多くのデータを提供する、ということを含む。血漿分画及びプロテオーム解析のためにより多くのナノ粒子を組み合わせることで、がんの発見及び判別のための、より少ないナノ粒子と比べて優れた敏感度、特異性及び予測精度を有するより多くの情報が提供される（表４）。概念的に、我々のマルチナノ粒子アプローチは嗅覚系に似ており、嗅覚系では匂い認識の特異性は数百の高交差反応匂い分子受容体からの反応パターンに由来し、どの受容体も１つでは完全な情報を提供しないものの、組み合わわることで所定の匂い分子の同定に非常に特異的となる（即ち、ヒトでは〜４００個の活性受容体が〜１０，０００個の匂い分子を検出及び区別でき、イヌでは〜１２００個の活性受容体が〜１，０００，０００個の匂い分子を検出できる）。分析物の多様なファミリ、種々の食物及び飲料、病原菌及び真菌、生体分子並びにナノ粒子自体のなかで検出及び区別をするために、同様のアプローチが他の研究者らによって用いられてもいる。
【０２４６】
３つの異なる交差反応性リポソーム（表面電荷が負、中性及び正であるもの）が用いられ、これらのタンパク質コロナプロファイルは、肺がん、すい臓がん、骨髄腫、髄膜腫又は神経膠芽腫の５つのがんのうちの１つを有する個々の患者の血漿に接触させられた後に測定された。タンパク質コロナナノシステムの結果を用いてがんを同定及び判別するために、我々は、明確に定義されたランダムフォレスト機械学習アプローチを用いた。我々のタンパク質コロナナノシステムが優れた予測精度で安定してかつ正確にがんを発見することを保証するために、我々は１０００個の異なるサンプルセットをトレーニング用サンプル（即ち既知のがんを有する血漿及び健康な状態の血漿）又はテスト用サンプル（即ちブラインド血漿）に指定した。１つのナノ粒子からのタンパク質コロナ組成はいずれもどの特定のがんの種類にも許容可能な予測精度（即ち８６．０％、分類エラーが８７．５％未満であることについてｐ値は０．４３）でもって特異的ではなかったものの、我々は、マルチリポソームから得られたコロナ組成のパターンが、優れた予測精度（即ち９６．２％、分類エラーが８７．５％未満であることについてｐ値は０．０４）でもって各種類のがんについてユニークな「フィンガープリント」を提供することを発見した。マルチリポソームタンパク質コロナ特性評価及び機械学習を用いたヒトプロテオームの深い分析に基づくこれらの結果により、がんの明瞭な同定及び判別並びに健康な対象とのエラーのない判別を優れた特異性（９７．０％〜１００．０％）で行うためにこのシステムが有望であることが確認された。
【０２４７】
がんの超早期発見におけるタンパク質コロナナノシステムの能力を調べるために、コホート血漿サンプルが用いられた。これらのサンプルは、血漿の採取から８年後に肺がん、すい臓がん又は脳がんであると診断された健康者から採取された。コホート調査における１５人の患者から得た血漿を用いたタンパク質コロナナノシステムの結果により、我々のアプローチが、現在の代替手段ではがん発見は不可能であったこれらの診断前コホートサンプルにおいてでも、がんを正確に同定及び判別したことが明らかとなった。新鮮な血漿サンプルについての我々の発見と一致して、マルチリポソーム血漿サンプリングは、単一リポソームサンプリングと比べて、非常に優れた分類精度（９４．１％対７５．４％）及び特異性［即ち脳がん（１００．０％対８６．１％）、肺がん（９６．６％対９０．０％）及びすい臓がん（９１．６％対８６．９％）］を提供した。注目すべきことに、コホートサンプルのタンパク質コロナプロファイルは、これまでの新鮮ながんサンプルに比べて異なる。これは主に、コホートサンプルが健康者のスクリーニング時に採取されたためにコホートサンプルが長期（約１０年間）にわたって凍結保管されていたことが原因である。血漿の長期保管がタンパク質のサブセットの濃度及び完全性に大きな影響を及ぼすことがますます認められており、これによりタンパク質コロナ組成が変更されて我々のタンパク質コロナナノシステムの敏感度が低下した。したがって、ナノシステムの最大敏感度は、がんスクリーニング又は診断後のがん精密検査の一部として新鮮な血漿を用いた場合に実現され得る。後者の設定は、タンパク質コロナパターンの経時的変化が、初期腫瘍再発又は腫瘍摘出後の残存疾病の存在に関連する有益な情報を提供し得るという点で価値がある。
【０２４８】
要約すれば、我々は、マルチナノ粒子タンパク質コロナナノシステムがタンパク質検出の深さを増大させる潜在能力を有し、故に既存の技術が疾病の検出をできない場合にがんを最も初期のステージにおいてでも正確に発見及び判別するユニークな能力を有するという概念実証を提示した。我々のタンパク質コロナナノシステムから得られたマルチナノ粒子タンパク質コロナパターンは、がん発見においてユニークかつ多変量の「フィンガープリント」を提供し、これは１つのみのナノ粒子のタンパク質コロナを分析しただけでは不可能である。さらに、タンパク質コロナパターンは、異なるナノ粒子を用いて幅広い血漿タンパク質（高含量タンパク質及び稀少タンパク質の両方を含む）の集合的濃縮を表し、これにより、初期がん発見についての好適な結果をもたらすことができなかった他の多変量全血漿プロテオームアプローチと差別化される。タンパク質検出の深さ（ヒト血漿におけるタンパク質分析の主な限界）及びナノシステムの予測精度は、異なる物理化学的性質を有する追加のナノ粒子を用いることでさらに向上する。ブラインドの新鮮な血漿及び遡及的コホート血漿の両方についての我々の機械学習及びタンパク質コロナ特性評価アプローチの好予測結果は、後続のがんの前向き研究のための好適な基板を提供する。さらに、マルチナノ粒子タンパク質コロナナノシステムを、早期発見によって寿命が大きく延びるとともにクオリティ・オブ・ライフが大幅に改善される他の重要なヒト疾病に利用することができる。
【０２４９】
リポソームは、例１Ａで記載したように調製された。
【０２５０】
ヒト血漿採取、調製及び保存は例１Ａで記載したように行われた。
【０２５１】
コホート血漿サンプルは例１Ａで記載したように調製された。
【０２５２】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）。リポソーム製剤は、これまでに報告したようにＴＥＭによって特性評価された。簡潔に説明すると、１０μｌの各サンプルを、１％酢酸ウラニルを用いてネガティブ染色されたフォルムバー被覆グリッド上に充填し、超純水で洗浄し、空気乾燥させた。Ｚｅｉｓｓ  Ｌｉｂｒａ（登録商標）１２０を用いて測定を行い、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて画像解析を行った。
【０２５３】
サイズ及びゼータ電位は、例１Ａに詳細に記載したように決定された。
【０２５４】
タンパク質アッセイは、例１Ａに記載したように行われた。
【０２５５】
タンパク質同定及び定量化は、例１Ａと同じように行われた。定量的分析において生物学的レプリケートの一貫性を評価するために重み付けのないスペクトルカウント（ＵＳＣ）を用い、タンパク質含量を収集するために正規化スペクトルカウント（ＮＣＳ）を用いた。
【０２５６】
統計的分析。本明細書本文における統計的分析は、ｓｃｉｋｉｔ−ｌｅａｒｎ、ｎｕｍｐｙ及びｓｃｉｐｙパッケージを用いてパイソンで行われ、図及びグラフはパイソンのｂｏｋｅｈパッケージ、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）、ＸＬＳＴＡＴ（登録商標）及びＭＡＴＬＡＢ（登録商標）を用いて作成された。
【０２５７】
データ行列
ｉ＝１，・・・，６０と標識付けされた６０個の血漿サンプル（非コホート４５個、コホート１５個）全てについて、データ行列Ｘi（３行及び〜９００列）が、行列の各行がタンパク質コロナナノシステムから得られた１つのナノ粒子のタンパク質含量に対応するよう、作成された。前処理工程として、我々は、全行列の行を正規化することでタンパク質含量を相対タンパク質含量（ＲＰＡ）に変換した。
【０２５８】
＜分類及びクラスタリング＞
テンソル分解
我々は、データを３モードのテンソルとして扱い、最初の２つのモードはナノ粒子及びタンパク質に対応し、３番目のモードは血漿サンプルに対応し、これは各サンプル、Ｘi、に対応する観測行列を互いに積み重ねることに等しい。データは、このプロジェクトのためにパイソンで実行されたコード（申請により研究などへの使用のために入手可能）を用いて低Ｔｕｃｋｅｒランクテンソル分解（１３５，１３６，１３７）を介してノイズ除去された。各行列Ｘiは、Ｘi≒ＵＳiＶTの形のテンソル分解により概算され、ここでＵは各ナノ粒子に対応する潜在特徴としてみることができる行を有する行列であり、同様にＶは各タンパク質に対応する潜在特徴としてみることができる列を有する行列であり、これらの潜在特徴は全データ行列でシェアされる。最後に、各Ｓiはナノ粒子とタンパク質の特徴間の相互作用をエンコードする行列であり、これらはサンプル間でユニークなものとすることができる。我々はこの分解を２つの工程で見積り、即ち我々は、（ａ）テンソルのモード１及びモード２展開に対する打ち切り特異値分解によりＵ及びＶを見積り、次に我々はこれらの見積りを考慮し（ｂ）最小２乗法を用いて各Ｓi行列を別々にフィッティングした。
【０２５９】
ランダムフォレスト分類
ランダムフォレストモデルは周知の分類のための機械学習アルゴリズムである。ランダムフォレストは、各々が比較的少ない変数に基づき単純な分類決定をする複数の決定木から構成されている。これらの木（ツリー）は、２つのツリーが同一とならないよう異なるかつランダムに抽出された変数のサブセットにより作成（又は「トレーニング」）された。新たなサンプルについて、トレーニングサンプルのセットが底に到達するまで各ツリーを上下にトラバースする。分類量についてフォレスト全体を用いて複数の決定木に標識（この場合５つの種類のがん又は健康のうちの１つ）に「投票」させ、ここで各ツリーの投票は底にあるトレーニングサンプルのセットにより行われる。我々の独自のアルゴリズムは、各ランダムフォレストは、１０００個の決定木から構成されるとともに、ｓｃｉｋｉｔ−ｌｅａｒｎパッケージを用いてトレーニングされた。また重要度スコアも同じパッケージを用いて計算された。
【０２６０】
＜例２  疾病発見のための追加のセンサアレイ構築＞
３つのリポソーム、３つの超常磁性酸化鉄ナノ粒子及び６つの金ナノ粒子を含む１２個の異なる交差反応性ナノ粒子からなるセンサアレイを作成した。負、中性及び正の表面電荷を有するこれらの種類のリポソーム（ＤＯＰＧ（１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−（１’−ｒａｃ−グリセロール））、ＤＯＴＡＰ（１，２−ジオレイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン）−ＤＯＰＥ（ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン）及びＣＨＯＬ（ＤＯＰＣ−コレステロール））を、我々の以前の報告に基づき合成した。サイズが２０ｎｍで種々のＰＥＧ分子量（即ち３００、３０００及び６０００）を有する超均一ＰＥＧ被覆超常磁性酸化鉄ナノ粒子をＭｉｃｒｏｍｏｄ（登録商標）社から入手した。コアサイズが〜２ｎｍでかつ異なる表面機能性を有する金ナノ粒子を合成した。
【０２６１】
ナノ粒子は全て同サイズであるが表面特性が異なり、これにより、各種のがんを発症した患者の血漿に対する応答により大きく異なるコロナ組成が形成されることが予想される。センサアレイは、例１に記載したように、患者の血漿タンパク質を介してがんの種類を同定及び判別するタンパク質コロナセンサアレイの可能性を探る。
【０２６２】
肺がん、すい臓がん、髄膜腫、骨髄腫、神経膠芽腫、食道扁平上皮がん及び胃腺腫を含む幅広いがんからのサンプルが調べられた。異なるナノ粒子（リポソーム、酸化鉄及び金）に基づくタンパク質コロナアレイは、種々のがんの種類についての生体分子フィンガープリントのバリエーションを調べるよう指定された。また、センサアレイは、異なるがん細胞の種類についての新たな未知のバイオマーカーを含む特定の種類のがんについてのマーカーであるタンパク質の同定も行うことができる。パターン認識は異なる種類のがん又はがんのステージに基づき決定することができる。
【０２６３】
血漿採取の数年後に種々のがんと診断された健康者からの幅広いヒト血漿を分析する。血漿サンプルは、米国の国立がん研究所（ＮＣＩ）、フランスの国際がん研究機関（ＩＡＲＣ）及びイランのテヘラン医科大学（ＴＵＭＳ）により実施された、ＮＩＨにより資金援助されたゴレスタンコホート調査と称されるコホート調査を介して収集された。本研究では、５０，０００人の健康な対象から血漿を採取して保存した。これらの対象のうち１，０００人以上がその後数年間に種々のがんを発症した。サンプルはＩＡＲＣにて保管され、我々のチームによって分析のために用いられた。これらの重要な血漿サンプルは、我々の発明のタンパク質コロナセンサアレイのがん早期発見の能力を調べるためのユニークな機会を我々に提供する。加えて、我々は、これらのがんの同定及び判別に有用なタンパク質を評価及び同定もする。
【０２６４】
我々は、本発明のセンサアレイをコホート血漿サンプルに適用して得られる成果は初期がんの発見及びスクリーニングに役立つだけでなく、がんの発症に関与する新規のタンパク質マーカーの同定を助けもすると確信する。我々のセンサアレイのコンポーネントの選択は、がんの同定及び判別のために非特異的かつ交差反応性の方法で幅広いタンパク質についてのフィンガープリントを提供するための他の開発された方法よりも特有な能力を有する。
【０２６５】
中期及び進行期のがんを有する患者からの血漿を用いてセンサアレイ素子のハードコロナプロファイルを調べた。
センサアレイ素子の表面上に形成されるタンパク質コロナは、それらのナノ粒子の物理化学的性質に強く依存し、同時にインキュベーションに用いられたヒト血漿のドナー中に存在する疾病の種類の影響を強く受け得る。コロナ被覆ナノ粒子を準備するために、準備された１２個のナノ粒子を、９つの種類のがん（肺がん、すい臓がん、骨髄腫、骨髄性白血病、髄膜腫、神経膠芽腫、乳がん、食道扁平上皮がん及び胃腺腫）のヒト血漿と（別々に）インキュベーションし、明確に定義された遠心分離アプローチを用いて関与していない自由なタンパク質と分離した。遠心分離は、通常１５℃で３０分間１３０００ｇで行われる。上澄みを除去し、回収された粒子を５００マイクロリットルのＰＢＳ中に再分散させてもよい。この手順を、緩く結合したタンパク質を除去するために繰り返す。緩く結合したタンパク質をナノ粒子の表面から除去するために、回収されたナノ粒子は冷却ＰＢＳ（１５℃）中に再分散され、遠心分離により回収される。その後コロナ被覆ナノ粒子のサイズ及び電荷を、ＤＬＳ／Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ（登録商標）を用いて決定し、バッファ中で得られたこれらの初期値と比較する。ナノ粒子上に吸着された全タンパク質の定量評価はＢＣＡ又はＮａｎｏＯｒａｎｇｅ（登録商標）アッセイを用いて行われ、一方で定性的ショットガンプロテオーム分析により１２個のナノ粒子の表面上に吸着されたタンパク質を同定する。簡潔に説明すると、ナノ粒子の表面からタンパク質を分離した後（参照により本明細書に盛り込まれるSaha, K.; Rahimi, M.; Yazdani, M.; Kim, S. T.; Moyano, D. F.; Hou, S.; Das, R.; Mout, R.; Rezaee, F.; Mahmoudi, M. ACS nano 2016, 10, (4), 4421-4430のプロトコルに基づく）、タンパク質は液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）装置に注入される。タンパク質は、関連データベースのスクリーニングにより得られたデータから同定される。マッチしたタンパク質に帰因する全ペプチドについてＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペクトルの総数を得るために、タンパク質量のキュムラントフィッティング定量評価から得られた半多分散指数(semi-aPolydispersity index)をスペクトルカウント（ＳｐＣ）に用いる。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳスペクトルにおいて同定された各タンパク質の正規化ＳｐＣ（ＮｐＳｐＣ）量は、以下の式を用いて計算される。
【数５】
2020502514.tif 000017
ここで、ＮｐＳｐＣｋはタンパク質ｋについてのスペクトルカウント数（即ちイオンの生カウント数）の正規化された割合であり、ＳｐＣはスペクトルカウント数であり、Ｍｗはタンパク質ｋの分子量（ｋＤａ）である。
【０２６６】
センサアレイから得られた結果を用いてがんを同定及び判別するために教師付き及び教師なしクラスタリング分析を展開する。
種々のセンサ素子のタンパク質コロナフィンガープリント（ＰＣＦ）がバイオセンサとして利用可能か否か、また異なる疾病についてのユニークなパターン（生体分子コロナシグネチャー）を形成するか否かを調べるために、我々は例１に記載のように重点的な分類アプローチを３つのリポソーム（陽イオン、陰イオン及び中性）のタンパク質コロナ組成からのプロテオームデータに適用した。
【０２６７】
＜例３  センサアレイを作成するための基板へのナノ粒子の結合＞
本発明の実施においてはナノスケールセンサ素子として異なる種類の粒子を用いてもよい。さらに、基板にナノスケールセンサ素子を結合させるための異なる方法が提供される。加えて、ナノスケールセンサ素子は異なるパターンで基板に結合させることができる。
【０２６８】
異なる基板上の異なるセンサ素子の構成について具体例を図１５Ａ〜図４３に示す。
【０２６９】
＜例４  がんのスクリーニングのためにシリカ及びポリスチレンナノ粒子を備えたセンサアレイ＞
この例は、例１で用いたものとは異なるナノ粒子を有する本発明のセンサアレイもまた健康な患者のサンプルのなかからがんサンプルを検出することができることを示す。
【０２７０】
例１の実験的プロトコルを用いて、修飾シリカ及びポリスチレン粒子を用いてセンサアレイを設計した。この例では、合計で６つのナノ粒子、即ち３つの異なる表面官能基（即ち未修飾、アミン修飾及びカルボキシル基修飾（Ｐ−ＮＨ2、Ｐ−ＣＯＯＨ、Ｓ−ＮＨ2及びＳ−ＣＯＯＨ））を有する２種類（即ちポリスチレン（Ｐ）及びシリカ（Ｓ））のナノ粒子、が用いられた。
【０２７１】
異なる官能基（未修飾、アミン修飾（ＮＨ2）及びカルボキシル基修飾（ＣＯＯＨ））を有する非被覆ポリスチレン及びシリカナノ粒子の特性評価が図４４Ａ〜４４Ｄに示されており、これらのサイズと、非被覆粒子のＤＬＳ及びゼータ電位と、ＴＥＭ画像とが示されている。異なる官能基を有するタンパク質コロナ被覆ポリスチレン及びシリカナノ粒子の特性評価が図４５Ａ〜４５Ｄに示されており、これらのサイズと、タンパク質コロナが載ったポリスチレン及びシリカナノ粒子のＤＬＳ、ゼータ電位及びＴＥＭ画像と、が示されている。
【０２７２】
６つのナノ粒子センサアレイを、例１に記載の方法を用いて、健康者又は図４６に示すように直腸がん、乳がん、膀胱がん、甲状腺がん、子宮がん、卵巣がん、腎臓がん（各がんについて５人の患者）を有する患者の血漿と接触させた。ポリスチレン及びシリカナノ粒子（１００ｎｍ）のタンパク質コロナプロファイルを、ＳＤＳ  ＰＡＧＥにより分析した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる未修飾、アミン修飾及びカルボキシル基修飾粒子のタンパク質コロナの比較を図４７に示す。
【０２７３】
図４８に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析されたポリスチレン及びシリカナノ粒子（１００ｎｍ）についての健康な血漿についてのタンパク質コロナプロファイルを示す。未修飾、アミン修飾及びカルボキシル基修飾粒子のタンパク質コロナの比較が示されている。
【０２７４】
データは例１Ａに記載したように分析した。統計分析及びクラスタリングの結果を図４９に示す。示されるように、がん患者と比べて、健康者を同定及び分類することが可能であった（図４９に示されるように、がん患者のサンプルに対し、健康な対照は直交する空間にある）。
【０２７５】
この例は、６つのナノ粒子アレイを用いたこのセンサアレイが健康者からがんを有する患者を区別して検出することができることを示す。
【０２７６】
材料：３つの異なる修飾が施されたシリカ粒子をＫｉｓｋｅｒ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（https://www.kisker-biotech.com/）から購入し、３つの異なる修飾が施されたポリスチレン粒子をＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社（http://www.polysciences.com/）から購入した。粒子は全て同じサイズ（１００ｎｍ）であった。これらの粒子の形態、平均サイズ、多分散指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位をＴＥＭ、ＤＬＳ及びゼータ電位測定により特性評価した。
【０２７７】
実験情報：５０％ヒト健康血漿中において１時間インキュベーションした。ＳＤＳ  ＰＡＧＥ：４〜２０％アクリルアミド、４５分、４０ｍＡ／ｇｅｌ。染色：Ｃｏｌｌｏｉｄａｌ  Ｂｌｕｅ  Ｃｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）で一晩。用いたナノ粒子：０．５ｍｇ。
【０２７８】
＜例５  タンパク質コロナセンサアレイナノシステムにより冠動脈疾患が同定される＞
冠動脈疾患（ＣＡＤ）は最も一般的な種類の心疾患であり、男性及び女性両方の主な死因である。ＣＡＤの早期発見は死の防止、生存期間延長及び患者のクオリティ・オブ・ライフの改善に必須である。この例は、特異的タンパク質コロナ（ＰＣ）パターン認識を用いるＣＡＤの超正確な検出のための非侵襲的な６つのナノ粒子を含むセンサアレイナノシステムを記載する。１つのナノ粒子のタンパク質コロナからは必要な特異性は得られないものの、異なる表面化学特性を有する６つの異なるナノ粒子による多変量タンパク質コロナにより、検査中の各心血管状態を選択積に判別するための所望の情報が提供される。
【０２７９】
ＣＡＤは、青年期に開始し発症した人の一生にわたって徐々に進行する慢性的な状態である。これは、冠動脈内におけるアテローム性動脈硬化プラークの存在により特徴付けられる。アテローム性動脈硬化の起源は血管内皮の機能障害にあり、ストレス刺激及び炎症性因子（例えば酸化ストレス及び血行動態力）にさらされると、内皮細胞が循環白血球及びコレステロールを含む低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の動員を引き起こす表面接着分子を発現させる。5  これらの事象はアテローム性動脈硬化プラークの形成を引き起こし、これにより冠動脈を狭めて血流を悪くする。プラークの発生速度及び動脈閉塞の深刻度に依存して、症状が最高潮に達して心筋梗塞をまねく。5
【０２８０】
リスク対象におけるＣＡＤの正確かつ早期の診断はアドホック治療を早急に開始するとともにさらなる合併症を回避するために非常に重要である。冠動脈造影は今まで最も正確かつ信頼できるＣＡＤ診断の方法であった。しかしながら、腕（又は首又は上もも）の動脈から心臓までカテーテルを挿入することは侵襲的で、費用がかかり、そして感染、カテーテル処置された動脈の損傷、アレルギー及び出血多量を含む多くの副作用の原因ともなる。したがって、ＣＡＤ発見のための新たな検査を開発する緊急の必要性がある。数々の炎症性バイオマーカーが診断に有用であると報告されているものの、残念ながら、これらのなかで臨床診療に用いられているものはなく、このことは依然として一般に行うことのできる新たな診断検査が必要とされていることを強調している。本発明者らは、ＣＡＤ診断用の新たなツールとしてのナノベースの血液検査を開発した。
【０２８１】
がんについて前述の例のなかで示したように、個別化された（personalized）タンパク質コロナは所定の血漿状態のフィンガープリントとしての機能を果たす。この例は、生じた血漿成分の変化を介してアテローム性動脈硬化プラークの形成を正確に定めるために同じアプローチを用いる。実際に、プラークに関連する細胞（例えば泡沫細胞、マクロファージ、マスト細胞、単球及びＴ細胞）は血液にさまざまな生体分子（例えばサイトカイン、タンパク質分解酵素及び血管作動性生体分子）を流し、22故にプラーク形成のない患者のタンパク質コロナに対して各種ナノ粒子の表面においてコロナタンパク質組成のパターンの変化を引き起こし得る。
【０２８２】
この例は、ｉ）冠動脈造影後にＣＡＤと診断された患者（ＣＡＤ）、ｉｉ）症状があり冠動脈造影を行ったが冠血管は健康とされた患者（ＣＡＤなし）、ｉｉｉ）再狭窄（治療後のＣＡＤの再発）及びｉｖ）血管疾患のリスク因子（例えば家族歴、喫煙、肥満、高血圧）のない健康なボランティア（対照）から得られた血漿を用いてナノ粒子の周囲に形成されたタンパク質コロナを分析した。
【０２８３】
吸着されたタンパク質のより広いスペクトルを得るために、この例は、センサアレイ素子として市販の６つのナノ粒子を用いて、異なる組成、表面化学特性及び／又は官能基を与えて、簡単かつ非侵襲的な診断検査として用いることが可能な、６つのナノ粒子からなるタンパク質コロナベースセンサアレイを作成した。この新規の診断用ＣＡＤ検査はリスク患者のための事前非侵襲的スクリーニングとして用いられる。注目すべきことに、これらの結果は、タンパク質コロナパターンによってＣＡＤ、ＣＡＤなし、再狭窄及び対照患者を極めて正確に判別できることを示し、これによって新規の、正確な、非侵襲的なこれまでに開発されていない血管ベースのＣＡＤ診断のためのツールが提供される。
【０２８４】
＜結果＞
この例では、図５０Ａ〜５０Ｃに示すように、合計で６つのナノ粒子、即ち３つの異なる表面官能基（即ち未修飾、アミン修飾及びカルボキシル基修飾（Ｐ−ＮＨ2、Ｐ−ＣＯＯＨ、Ｓ−ＮＨ2及びＳ−ＣＯＯＨ））を有する２種類（即ちポリスチレン（Ｐ）及びシリカ（Ｓ））のナノ粒子、が用いられた。非被覆ナノ粒子の合成による新たなアイデンティティとこれらの対応する生物学的アイデンティティ（タンパク質コロナ被覆ナノ粒子）間の結果における差を比較するために、血漿中でのインキュベーションの前後におけるナノ粒子のサイズ、ゼータ電位及び形態学を測定した。動的光散乱法により、非被覆ナノ粒子は全て、多分散指標が≦０．０２で、サイズが均一で約１００ｎｍ（約９３ｎｍ〜１２０ｎｍの範囲）であったことから示されるように、大いに単分散であることが示された（図５０Ａ）。患者の血漿とともに１時間インキュベーションした後、全ナノ粒子のサイズは、吸着されたタンパク質（ＰＣ）の層の存在により増大し、この層の厚さ及び組成はナノ粒子のタンパク質濃度、表面特性及びサイズに依存することが示された。全ての非被覆ナノ粒子は表面電荷が負であり（図５０Ｂ）、アミン修飾されたものは正のアミン基の寄与により他のものよりもわずかに負の程度が小さい。これらの結果はサプライヤにより提供された仕様書及び他の研究と一致する。アミン基修飾は、生理的ｐＨにおける表面上の全ての負に帯電した残基によって特徴付けられるシリカ及びポリスチレンナノ粒子の表面電荷を切り換えるには不十分であった。
【０２８５】
一旦血漿にさらされると、生理的ｐＨにおける多くの血漿タンパク質の電荷により全表面電荷の負の程度は小さくなる（−５ｍＶ〜−２５ｍＶ）。総合すると、タンパク質コロナ被覆ナノ粒子は物理化学的性質が同様の傾向であり、インキュベーションに用いた血漿に関係なく非被覆の場合よりも大きくかつ負の程度が小さい。しかしながら、ＣＡＤなしの血漿とともにインキュベーションした場合、Ｐ及びＳナノ粒子は≒８５ｎｍまでサイズが増大し、これは他の状態の血漿を用いて示されたもの（４０〜５０ｎｍ）。よりも大きい。一方、ＣＡＤ血漿とともにインキュベーションしたＳ−ＮＨ2ナノ粒子のタンパク質コロナの厚さは、同じナノ粒を他の種類の血漿とともにインキュベーションして得られたもの（≒３０ｎｍ）よりも大きかった（≒４０ｎｍ）。透過型電子顕微鏡により、ナノ粒子は血漿中でのインキュベーション後にその形態及び構造は変化しなかったことが示された（図５０Ｃ）。さらに、被覆後におけるサイズの増大が観測され、したがって動的光散乱法により得られた結果が裏付けられた。ことなるタンパク質コロナのタンパク質濃度はブラッドフォードアッセイにより評価され、タンパク質コロナにおいて全シリカナノ粒子がポリスチレンナノ粒子よりも少ないタンパク質を吸着したことが示された（図５１Ａ）。この観測結果は、１Ｄ−ＳＤＳ  ＰＡＧＥによるタンパク質コロナの分析によって裏付けられた。ＣＡＤ、ＣＡＤなし及びＣＡＤリスクなし（対照）の５人の患者から血漿を採取し、全ナノ粒子について得られたタンパク質コロナはＣｏｍａｓｓｉｅ染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル上で分離された（図５１Ｂ）。ゲルはデンシトメトリーによって分析され、そして同じナノ粒子のＣＡＤ、ＣＡＤなし及び対照のタンパク質コロナ中のタンパク質の量の差が検出された（図５１Ｃ、矢印）。一部のケースにおいて、我々は特異タンパク質コロナ中のいくつかのタンパク質の有無にも注目した（図５１Ｃ、青い矢印）。これらの結果により、アテローム性プラークの形成が血漿組成を変化させ、したがってタンパク質コロナの差を生じさせることが裏付けられた。タンパク質コロナはＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって分析された。タンパク質被覆ナノ粒子サンプルの各々において１５０個よりも多くのタンパク質が同定された。加えて、タンパク質の含量に関する情報を得るため、したがってタンパク質コロナ中の同定されたタンパク質の各々の寄与率に関する情報を得るために、特異タンパク質に帰因する全ペプチドのフラグメンテーションスペクトルの総数を表すスペクトルカウント値が用いられた。タンパク質コロナ中の上位２０個の豊富なタンパク質の寄与率の違いを図５２−１〜５２−６に報告する。
【０２８６】
全サンプルから得られたデータが収集され、分析されそして分類され、各測定のキーが、ナノ粒子、表面修飾、血漿の種類及び標識を連結することで作成された。２ペプチド未満と同定されたタンパク質は検討から除外し、そして、行がタンパク質登録番号（accession）、列がキー及び寄与率を含む値となるようデータをピボット処理するためにＴＩＢＣＯ  Ｓｐｏｔｆｉｒｅ（登録商標）  Ａｎｓｌｙｓｔ  ７．６．１を用いた。
【０２８７】
解析学に加えて、我々は所定の状態のコロナ中の独占的タンパク質(exclusive proteins)の存在を分析した。我々はこのために、タンパク質又は遺伝子のビッグデータセットのなかの共通でユニークなタンパク質の調査を容易にするためにベン図を作成した。各ナノ粒子のタンパク質コロナは、全６分類について別々に分析された。我々は５つの患者から得られたＣＡＤ、ＣＡＤなし及び対照のタンパク質コロナの全てで共通のタンパク質を比較することで独占的タンパク質を探した。その結果、本研究に用いられた各ナノ粒子において、特異タンパク質コロナパターンのなかでさまざまな特異タンパク質が独占的に同定された。このうち、補体活性化の調整に関与する複数のタンパク質（Ｈ因子関連タンパク質３、補体成分Ｃ８γ）がＣＡＤ患者のタンパク質コロナパターンにおいて独占的に同定された。この結果は、最近記述された心血管疾病の病態形成（アテローム性動脈硬化の発生、プラーク破裂及び血栓症）における補体活性化の役割と一致する。別の例が、ＣＡＤの臨床診療での使用における魅力的なバイオマーカー候補として考えられるアポリポタンパク質（ａ）により示され、我々はこれをＣＡＤ患者のタンパク質コロナパターンのなかで独占的に検出した。アポリポタンパク質（ａ）はリポタンパク質（ａ）の主成分であり、タンパク質分解切断されてそのフラグメントがアテローム性プラークに堆積することが知られている。
【０２８８】
我々は、９つのブラインド血漿サンプル（各状態につき３つ及び対照３つ）を分析することでＣＡＤ及びＣＡＤなしの患者の判別のアプローチの精度を確認した。我々のタンパク質コロナセンサアレイナノシステムの６つのナノ粒子の周囲にタンパク質コロナが形成された。次に、タンパク質コロナ中のタンパク質をＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（補足情報）により同定し、結果を同じ分類及びクラスタリングアプローチを用いて分析した。
【０２８９】
統計及びデータ分析が図５４Ａ、５４Ｂにグラフで示されており、ＣＡＤ、ＣＡＤなし及び対照（ＣＡＤリスクなし）の分類の離散的な分離が示されている。
【０２９０】
結論として、我々はＣＡＤの発見のために６ナノ粒子タンパク質コロナセンサアレイの精度を示した。本研究で開発されたタンパク質コロナセンサアレイナノシステムは、ＣＡＤ、再狭窄、ＣＡＤなし及び健康者の判別において敏感かつ正確であり、このことは臨床環境に使用される技術プラットフォームとしての大きな潜在的価値をさらに示している。実際に、アテローム性プラークに典型的に関連する多くの症状の存在にも関わらず、本研究で調査したＣＡＤなしグループの患者は動脈内に閉塞はなにもなかった。
【０２９１】
このプラットフォームから得られるタンパク質コロナパターンは、ユニークな多変量フィンガープリントを表し、これは単一のナノ粒子のタンパク質コロナを用いて得られるものよりもより正確でかつ広域性がある。本明細書に記載のアプローチはＣＡＤだけでなく他の種々の人間の疾病の発見において大きく役立ち、多くの患者のクオリティ・オブ・ライフを改善する可能性がある。特に本検査の非侵襲性により、我々はそのような検査は血管造形法よりもより積極的にそしてより頻繁に患者によって使用されるであろうと想定する。そして、血管造影法とは異なり、この検査は実施が簡単で副作用もなく、このため患者は超初期の症状から動脈のステータスをチェックすることができ、早期発見によりＣＡＤ合併症を大幅に減少させることができる。
【０２９２】
＜方法＞
ナノ粒子
３つの異なる修飾が施されたシリカ粒子をＫｉｓｋｅｒ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（https://www.kisker-biotech.com/）から購入し、３つの異なる修飾が施されたポリスチレン粒子をＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社（http://www.polysciences.com/）から購入した。粒子は全て同じサイズ（１００ｎｍ）であった。これらの粒子の形態、平均サイズ、多分散指数（ＰＤＩ）及びゼータ電位をＴＥＭ、ＤＬＳ及びゼータ電位測定により特性評価した。
【０２９３】
タンパク質コロナ形成
脱イオン水中で０．５ｍｇのナノ粒子を同体積のヒト血漿とともにインキュベーションすることでタンパク質コロナを作成した。インキューべーションは攪拌しながら３７℃で１時間行った。インキュベーション直後に、ペレットを形成するために遠心分離を１４，０００ｒｐｍで１０℃で３０分間行った。次にペレットを洗浄して２００μｌの４℃のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁した。遠心分離測定を前回と同じ条件下で３回繰り返し行った。タンパク質コロナ被覆ナノ粒子のペレットは、後の工程でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行うために８Ｍ尿素、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中に再懸濁された又は後の工程でサイズ及びゼータ電位を分析するために脱イオン水中に再懸濁された。
【０２９４】
ナノ粒子の特性評価
非被覆の及びタンパク質被覆されたナノ粒子のサイズ及びゼータ電位について、合計１ｍｌの蒸留水中に各サンプルを１０μｌ希釈することで特性評価した。測定はＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０（英国のＭａｌｖｅｒｎ社製）を用いて行なわれた。サイズ及び表面電荷値は３つの個別の測定値の平均±Ｓ．Ｄ．で示された。
【０２９５】
タンパク質濃度アッセイ
コロナ中のタンパク質の量は、５点標準曲線（Ｒ2＝０．９９）を構築するためのスタンダードとしての既知の濃度でウシ血清アルブミンを用いてブラッドフォードアッセイ（バイオ・ラッド）により評価された。タンパク質濃度は３つの実験の平均±Ｓ．Ｄ．として記録された。
【０２９６】
１Ｄ−ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲル
コロナ中のタンパク質を８Ｍ尿素、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中に溶解した。等量のＬａｅｍｍｌｉバッファ２Ｘをペレットに追加し、９０℃で５分間加熱し、その後４〜２０％Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（商標）ＴＧＸ（登録商標）プレキャストゲル（カリフォルニア州ハーキュリーズ市にあるバイオ・ラッド  ラボラトリーズ社製）上に充填して１２０Ｖで１時間分離させた。タンパク質を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（商標登録）ブリリアントブルー（米国ニュージャージー州フェアローンのＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で一晩染色し、その後超純水中でよく洗浄(extensive washing)した。
【０２９７】
質量分析法／統計／ＰＬＳ−ＤＡ
質量分析法、統計分析及びＰＬＳ−ＤＡを例１で記載したように行った。
【０２９８】
＜例６  初期アルツハイマー病の発見のためのマルチナノ粒子タンパク質コロナ検査＞
アルツハイマー病（ＡＤ）の病理は臨床症状の発見の数十年前から始まる。アルツハイマー病の正確かつ非侵襲的早期診断の必要性は急速に高まっている。問題に対処するために、血漿タンパク質パターンのごくわずかな変化をよく検出するとともにアルツハイマー病の存在を確定するためにクラスタリング法を用いる最先端のセンサアレイナノシステムが開発された。センサアレイは疾病に起因する各血漿プロテオームの変化についてユニークなフィンガープリントを生成することともに現在の技術とは異なりそのような変化を捉えるのに十分敏感であることから、開発された技術は将来的に他の疾病の診断にも適用することができる。
【０２９９】
前述の例のなかで議論したように、タンパク質コロナの組成は疾病の結果として変更し得る血漿プロテオームに基づき変化することから、「個別化されたタンパク質コロナ」（ＰＰＣ）をもたらす。しかしながらＰＰＣは、主にタンパク質コロナ組成中の類似タンパク質の大きな重なりが原因で、疾病の早期発見のための安定したかつ正確なストラテジーを提供することはできない。本研究では、６つのナノ粒子を含むマルチナノ粒子プラットフォームの周囲に形成されたＰＰＣを用いることで、我々は、今までにない予測精度及び特異性でアルツハイマー病の安定したかつ正確な発見のためのフィンガープリントパターンを提供する。開発されたセンサアレイ検査はアルツハイマー病の患者とそうでない人とをよく区別し、また数年後にアルツハイマー病を発症した患者をもよく区別した（コホート血漿を使用）。これらの例は実現可能で非侵襲的な、現在のアルツハイマー病発見手段の代替手段を提供し、比類のない早期発見及び治療を提供する能力をもたらす。
【０３００】
＜結果及び考察＞
センサアレイ検査は、血漿サンプルを６つの異なるナノ粒子とともにインキュベーションする工程を含む。後者は１００ｎｍのポリスチレン及びシリカナノ粒子であり、例５のなかでＣＡＤ分析について記載したように、各々、調整可能な表面化学特性（未修飾、アミノ基修飾及びカルボキシル基修飾(-amino and -carboxyl conjugated)、以下、Ｐ、Ｐ−ＮＨ2、Ｐ−ＣＯＯＨ、Ｓ、Ｓ−ＮＨ2、Ｓ−ＣＯＯＨと称する）を有するとともにサイズ分布が狭い。最初の概念実証として、アルツハイマー病血漿と対照血漿との間の違いを調べるために、タンパク質コロナ形成の前後のナノ粒子のサイズ、表面電荷及び形態を分析した。ナノ粒子のサイズの特性評価のためにナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ）が用いられた。そのような分析において、レーザビームがナノ粒子を照らし、ここから光学顕微鏡を介して散乱光が視覚化される。一方で、ビームと整列されたカメラによってビデオが記録され、ナノ粒子の動きを示している（３０〜６０フレーム／秒）。血漿中でインキュベーションする前において、全ナノ粒子はサイズが均一であり（図５８、ポリスチレンナノ粒子９０〜１００ｎｍ；シリカナノ粒子８０〜１００ｎｍ）、負の表面電荷は製造元から提供されたものと一致した（表８）。血漿中で攪拌しながら３７℃で１時間インキュベーションした後、タンパク質コロナ被覆ナノ粒子を遠心分離によって回収し、その後、未結合の又は緩く結合されたタンパク質を取り除くためによく洗浄した。全てのケースにおいて、我々はタンパク質コロナ被覆ナノ粒子のサイズが増大したこと及びサイズ分布がより広くなったことを明らかにし、このことは集団の均一性が低減したことを示す（図５４Ａ及び５４Ｂ、散布図）。サイズの平均的な増加は３０ｎｍであり、したがってタンパク質コロナ層の厚さは１５ｎｍであることを示し、このことは文献1で報告されたデータと一致しているとともに健康なボランティアからの血漿を用いた観測結果（データは示していない）とも一致している。ナノ粒子の表面上における血漿タンパク質の存在によりその電荷が変化し、即ち負の程度が小さくなり、血漿タンパク質の通常の値に到達する（表８、−２０ｍＶ〜−０ｍＶ）。
【０３０１】
【表８】
2020502514.tif 000018
【０３０２】
アルツハイマー病血漿及び健康血漿とともにインキュベーションされた同じナノ粒子の表面電荷において、わずかな差が観測された（表８）。しかしながら、この差は大きくなく、したがって異なる血漿状態の区別には有用でない。また透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）がナノ粒子の形態の評価に用いられ、ナノ粒子の形態はタンパク質コロナの形成後においてそのまま変化がなかった。実際に、血漿とのインキュベーションの前後の両方において、全ナノ粒子は形態が丸形であった（図５５−１及び５５−２）。Ｎａｎｏｓｉｇｈｔにより得られた結果を裏付ける、タンパク質コロナ被覆ナノ粒子のサイズの増大に関連するタンパク質の薄い層の存在が、観測された（図５５−１及び５５−２）。
【０３０３】
粒子と関連するタンパク質コロナは、ゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分離され、後にＣｏｏｍａｓｓｉｅ（登録商標）ブリリアントブルーで染色されることで視覚化される（図５６）。概して、レーンを視覚的に評価することにより６つのナノ粒子は異なるタンパク質コロナパターンを有しており、このことは我々のアプローチのベストパフォーマンスにとって期待されたものであり所望されたものであった。シリカナノ粒子は、ポリスチレンナノ粒子よりもその表面に吸着されるタンパク質が少ないようであった。多くのサンプルでは、未修飾のポリスチレンのタンパク質コロナは他のものよりもタンパク質がより濃縮されており、分子量は≒６０ｋＤａであり、これはアルブミンに起因する可能性が最も高い。このことはアルツハイマー病患者の血漿と対照の血漿の両方についていえることであった（図５６、矢印）。各タンパク質コロナに関連するバンドのデンシトメリー分析により、シリカナノ粒子は通常より少ない量のタンパク質を吸着したことが裏付けられたが、そのタンパク質コロナを構成するタンパク質の数はより多いことも明らかとされた。例えば、ポリスチレンナノ粒子のタンパク質コロナについてはアルブミンのレベルに２以上のバンドがあった（図５６、矢印）。一方で、特にシリカナノ粒子の場合に、アルツハイマー病患者及び健康者のＰＰＣ（個別化されたタンパク質コロナ）において複数の違いが記録された（図５６、矢印）。しかしながら、これらの違いは統計学的に有意なものではなく、調査中の２グループの患者を正確に区別するには不十分であった。タンパク質コロナについてより深く調査するため並びに異なるタンパク質コロナを構成するタンパク質の正確なアイデンティティ及び量を知るために、全サンプルを質量分析法で分析した。タンパク質コロナ中の各タンパク質の寄与率を決定するために、ナノ粒子の周囲のタンパク質コロナの定量的プロファイリングのために広く採用されているスペクトルカウンティング非標識解析2-4が用いられた。この計算は各血漿患者（各ナノ粒子とともに別々にインキュベーションされた）について６回行われ、したがって６つのナノ粒子に関係するタンパク質コロナの寄与の組み合わせから得られたアルツハイマー病特異的タンパク質コロナプロファイルが形成された。表９は用いられた患者集団を示す。
【０３０４】
【表９】
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【０３０５】
＜結論＞
本研究は、アルツハイマー病の診断のためのＭＮＰＣ血液検査の開発のための概念実証研究である。ＭＮＰＣ検査により、今までにない予測精度及び特異性が示された。個々のバイオマーカー血液ベース検査がしばしば偽陽性となりしたがって診断を確認するためにさらなる分析を必要とする一方で、我々のアプローチは、６つのナノ粒子からなるセットと高親和性を有するタンパク質全てとの相互作用を記録し、したがって所定の疾病の高特異的タンパク質コロナフィンガープリントを生成することができる。ナノ粒子はその表面において血漿タンパク質のナノ集結手段(nano-concentrator)として機能し（各ナノ粒子は親和性がより高い血漿タンパク質をその表面に集結させる）、このことは病理状態では健康なステータスに対してレベルがわずかにしか変化しないタンパク質の発見を助ける。これらのわずかな変化は高含量及び低含量の両方の血漿タンパク質のものである。本研究では、各患者の血漿は異なるナノ粒子を用いて６回分析され、故に各患者について得られた結果はただ１回の分析を行ったときに得られる結果よりも６倍以上詳しいものであることから、我々は比較的少数のタンパク質を報告した。
【０３０６】
＜材料及び方法＞
ナノ粒子
シリカ粒子（未修飾、アミノ基修飾及びカルボキシル基修飾）をＫｉｓｋｅｒ−Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（https://www.kisker-biotech.com/）から購入した。ポリスチレン粒子をＰｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ社（http://www.polysciences.com/）から購入した。製造元によれば、粒子は全て同じサイズ（９０〜１００ｎｍ）であった。これらの形態、平均サイズ及びゼータ電位を本章で後述するように特性評価した。
【０３０７】
個別化タンパク質コロナ形成
脱イオン水中で０．５ｍｇのナノ粒子を同体積のヒト血漿とともにインキュベーションすることでタンパク質コロナを作成した。インキューべーションは攪拌しながら３７℃で１時間行った。インキュベーション直後に、タンパク質被覆ナノ粒子を遠心分離（１４，０００ｒｐｍ、１０℃で３０分間）及び結合していない又は弱く結合したタンパク質を除去するための冷却リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中での洗浄(extensive washing)により回収した。タンパク質コロナ被覆ナノ粒子のペレットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル及びＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行うために８Ｍ尿素、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中に、又は動的散乱法及びゼータ電位分析のために脱イオン水中に再懸濁させた。
【０３０８】
ナノ粒子の物理化学特性評価
サイズはナノ粒子追跡分析（Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ、英国のＭａｌｖｅｒｎ社製）により測定された。Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて決定された非被覆及びタンパク質コロナ被覆ナノ粒子のゼータ電位に基づき、サイズがソフトウェアを用いて計算された。ナノ粒子は、分析前に水中で５０μｇ／ｍｌの濃度に希釈された。サイズ及び表面電荷値は、３つの個々の実験の平均±Ｓ．Ｄ．とした。透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析において、サンプル及びグリッドを１％酢酸ウラニルで標識した。ＡＭＴ  ２ｋ  ＣＣＤカメラを備えた、Ｔｅｃｎａｉ  Ｇ２  Ｓｐｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ透過型電子顕微鏡が用いられた。
【０３０９】
１次元ゲル電気泳動
個別化タンパク質コロナを８Ｍ尿素、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム中に溶解した。等量のＬａｅｍｍｌｉバッファ２Ｘをペレットに追加し、９０℃で５分間加熱し、その後４〜２０％Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（商標）ＴＧＸ（登録商標）プレキャストゲル（カリフォルニア州ハーキュリーズ市にあるバイオ・ラッド  ラボラトリーズ社製）上に充填して１２０Ｖで１時間分離させた。タンパク質を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（商標登録）ブリリアントブルー（米国ニュージャージー州フェアローンのＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で一晩染色し、その後超純水中でよく洗浄した。バンド強度のデンシトメトリー分析をＩｍａｇｅＪ（website: imagej.nih.gov/ij/）により行った。
【０３１０】
質量分析方によるタンパク質同定及び定量化
タンパク質を１０ｍＭジチオトレイトール（Ｓｉｇｍａ社製）を用いて５６℃で１時間還元させ、その後５５ｍＭヨードアセトアミド（米国ミズーリ州セントルイス郡Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いて暗所で２５℃で１時間アルキル化させた。その後タンパク質を、１００ｍＭの酢酸アンモニウム中で酵素／基質比１：５０にて、ｐＨ８．９で２５℃にて一晩、修飾トリプシン（米国ワイオミング州マディソン市のＰｒｏｍｅｇａ社製）を用いて分解させた。トリプシン活性は酢酸（９９．９％、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社製）の追加により停止されて、最終濃度を５％とした。ペプチドは、Ｃ１８  ＳｐｉｎＴｉｐｓ（米国ウェストバージニア州モーガンタウンのＰｒｏｔｅａ社製）を用いて脱塩され、その後真空遠心分離されて、分析の日まで−８０℃で保存された。ペプチドは、プレカラム（自主制作、６ｃｍの１０μｍ  Ｃ１８）及びセルフパックの５μｍの先端（tip）を有する分析用カラム（１２ｃｍの５μｍ  Ｃ１８、Ｎｅｗ  Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ社製）を用いて、１４０分クラジエントをかけて逆相ＨＰＬＣ（米国マサチューセッツ州ウォルサムのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製のＥａｓｙ  ｎＬＣ１０００）により分離され、その後、ＱＥｘａｃｔｉｖｅ（登録商標）質量分析装置（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）を用いてナノエレクトロスプレーされた。溶媒Ａは０．１％ギ酸、溶媒Ｂは８０％ＭｅＣＮ／０．１％ギ酸であった。グラジエント条件は２〜１０％Ｂ（０〜３分）、１０〜３０％Ｂ（３〜１０７分）、３０〜４０％Ｂ（１０７〜１２１分）、４０〜６０％Ｂ（１２１〜１２６分）、６０〜１００％Ｂ（１２６〜１２７分）、１００％Ｂ（１２７〜１３７分）、１００〜０％Ｂ（１３７〜１３８分）、０％Ｂ（１３８〜１４０分）であり、質量分析装置は、ｄａｔａ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔモードで動作させた。フルスキャンＭＳについてのパラメータは、３５０〜２０００ｍ／ｚについて７０，０００の分解能、ＡＧＣは３ｅ６、そして最大ＩＴは５０ｍｓであった。各サイクルにおいて上位１０個の前駆イオンについて、ＮＣＥを２８、ｄｙｎａｍｉｃ  ｅｘｃｌｕｓｉｏｎを３０秒に設定して、フルＭＳスキャンの後にＭＳ／ＭＳが行われた。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社製）及びＭａｓｃｏｔバージョン２．４．１（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を用いて生の質量スペクトルデータファイル（．ｒａｗ）をサーチした。Ｍａｓｃｏｔサーチパラメータは、前駆イオンについて１０ｐｐｍの質量許容差、フラグメントイオン質量許容差が１５ミリ質量単位（ｍｍｕ）、トリプシン未断片(missed cleavages)が２、ｆｉｘｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎがシステインのカルバミドメチル化、ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓがメチオニン酸化であった。Ｍａｓｃｏｔスコアが≧２５のペプチドのみをデータ分析に含めた。各タンパク質のフラグメンテーションについて選択されたペプチドの総数を足しあわせることでスペクトルカウントを行った。
【０３１１】
＜例７  粒子のサイズが結合したタンパク質の量に影響を及ぼす＞
この例は、同じ材料から成る異なるサイズのナノ粒子の使用が各サイズについて異なる生体分子フィンガープリントを提供することを示す。３つの異なる直径（１００ｎｍ（０．１μｍ）、３μｍ及び４μｍ）のシリカナノ粒子が、同じ血漿サンプルとともにインキュベーションされた。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによりビーズが分析された。図５８に示すように、ビーズが大きいほど、生体分子シグネチャーの中に含まれるタンパク質が多かった。さらに、各ビーズのサイズは区別可能な生体分子コロナシグネチャーを有し、したがって異なるサイズのナノ粒子の組み合わせ単独で、区別可能な生体分子フィンガープリントを発生させることができる。示されるように、３つの異なるサイズのビーズ間でパターン又はタンパク質に明白な差異があった。
【０３１２】
センサアレイは、異なるサイズのナノ粒子を用いて作成することができ、各々が異なる生体分子フィンガープリントを与える。
【０３１３】
＜例８  センサアレイは核酸を含む生体分子フィンガープリントを提供することができる＞
センサアレイ、及びタンパク質を含む関連する生体分子コロナシグネチャーは、生体分子コロナを構成する核酸を含む。この例は、中性表面ナノ粒子のシリカナノ粒子に結合する核酸の組成を示す。ナノ粒子は血漿とともにインキュベーションされ、関連する核酸が分析された（図５９）。図６０、図６１−１及び図６１−２は全サンプルにおける核酸の分析及びその血漿中の含有量（血漿中の核酸量は３３．８ｐｇ／μｌであった）を示したものである。ナノ粒子に関連した生体分子コロナの核酸含有量が分析された。タンパク質は尿素を用いてナノ粒子から分離されてその後核酸が分析された（図６２−１及び６２−２、核酸量は１４．０）、又はタンパク質はコロナから分離されずに核酸が分析された（図６３−１及び６３−２，１４．４ｐｇ／μｌ）。あるいは、ナノ粒子を、血漿キットを用いて血漿から精製された核酸とともにインキュベーションし、その後、非被覆粒子とともにインキュベーションしてもよい（図６４−１及び６４−２、核酸量は１３．２ｐｇ／μｌ）。
【０３１４】
結果により生体分子コロナ組成における核酸の吸着についてのナノ粒子の能力が明らかとなった。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ１】
2020502514.tif 000024
【図３Ａ２】
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【図３Ａ３】
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【図３Ｂ１】
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【図３Ｂ２】
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【図３Ｂ３】
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【図３Ｃ１】
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【図３Ｃ２】
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【図３Ｃ３】
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【図３Ｄ１】
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【図３Ｄ２】
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【図３Ｄ３】
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【図３Ｅ１】
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【図３Ｅ２】
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【図３Ｅ３】
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【図３Ｆ１】
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【図３Ｆ２】
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【図３Ｆ３】
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【図３Ｇ１】
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【図３Ｇ２】
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【図３Ｇ３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
2020502514.tif 000052
【図５ＣＤ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７Ａ】
2020502514.tif 000060
【図７Ｂ】
2020502514.tif 000061
【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
2020502514.tif 000063
【図８Ｂ】
2020502514.tif 000064
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９ＥＦ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４４Ｃ】
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【図４４Ｄ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４５Ｄ】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０Ａ】
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【図５０Ｂ】
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【図５０Ｃ】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５１Ｃ】
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【図５２−１】
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【図５２−２】
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【図５２−３】
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【図５２−４】
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【図５２−５】
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【図５２−６】
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【図５３】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５５−１】
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【図５５−２】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１−１】
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【図６１−２】
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【図６２−１】
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【図６２−２】
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【図６３−１】
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【図６３−２】
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【図６４−１】
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【図６４−２】
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【図６５】
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【図６６】
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【国際調査報告】
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