(57)【要約】  βセクレターゼの活性および発現の阻害における、１０質量％以上のオロキシリンＡ、１０質量％以上のバイカレインおよび２質量％以上のクリシンを含む組成物の使用が開示される。本発明はまた、上記の組成物を使用するＰＳ−７０細胞におけるアミロイド含量の低減を開示する。本発明はさらに、βセクレターゼにより媒介される障害の治療管理のための該組成物の使用に言及する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
βセクレターゼ酵素の活性を阻害する方法であって、哺乳動物細胞を、１０質量％以上のオロキシリンＡ、１０質量％以上のバイカレインおよび２質量％以上のクリシンを含む組成物と接触させて、βセクレターゼ活性を阻害する効果を生じさせるステップを含む、方法。
【請求項２】
組成物が、好ましくは、１０％〜１５質量％のオロキシリンＡ、１０％〜２５質量％のバイカレインおよび２％〜１０質量％のクリシンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
βセクレターゼの発現を阻害する方法であって、哺乳動物細胞を、１０質量％以上のオロキシリンＡ、１０質量％以上のバイカレインおよび２質量％以上のクリシンを含む組成物と接触させて、βセクレターゼ酵素の発現を減少させる効果を生じさせるステップを含む、方法。
【請求項４】
組成物が、好ましくは、１０％〜１５質量％のオロキシリンＡ、１０％〜２５質量％のバイカレインおよび２％〜１０質量％のクリシンを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
βアミロイド含量を減少させる方法であって、哺乳動物細胞を、１０質量％以上のオロキシリンＡ、１０質量％以上のバイカレインおよび２質量％以上のクリシンを含む組成物と接触させて、βアミロイドの量を減少させるステップを含む、方法。
【請求項６】
組成物が、好ましくは、１０％〜１５質量％のオロキシリンＡ、１０％〜２５質量％のバイカレインおよび２％〜１０質量％のクリシンを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
哺乳動物におけるβセクレターゼにより媒介される障害の治療管理の方法であって、かかる治療を必要とする哺乳動物に対して、１０質量％以上のオロキシリンＡ、１０質量％以上のバイカレインおよび２質量％以上のクリシンを含む組成物を有効量で投与するステップを含む、方法。
【請求項８】
組成物が、好ましくは、１０％〜１５質量％のオロキシリンＡ、１０％〜２５質量％のバイカレインおよび２％〜１０質量％のクリシンを含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
βセクレターゼにより媒介される障害が、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン関連の疾患、認知低下、軽症認知障害、血管性認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスダッチタイプを有する遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）および緑内障からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物がヒトである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
組成物が、薬学的／栄養補助的に許容できる賦形剤、アジュバント、希釈剤または担体と共に製剤化され、錠剤、カプセル、シロップ、グミ、粉末、懸濁剤、エマルジョン、チュアブル錠、キャンディおよび食品の形態で経口投与される、請求項７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の相互参照
本願は、２０１７年６月１５日に出願された米国仮特許出願第６２５２０１４１号の優先権を主張するＰＣＴ出願である。
発明の分野
本発明は、一般に、βセクレターゼ阻害剤に関する。より具体的には、本発明は、オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシンを含む組成物を使用してβセクレターゼの活性および発現を阻害し、βアミロイド含量を減少させることに関する。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明
アルツハイマー病は、記憶喪失、認知障害、見当識障害および人格変化の存在を特徴とする神経系の消耗性障害である。病理学的特徴としては、アミロイド斑および神経原線維変化の存在が挙げられ、炎症、ニューロン損傷およびアポプトーシスに至る。疾患の進行につながる多くの因子が存在し、それらとして酸化ストレス、炎症、糖尿病、肥満、血圧上昇、遺伝学、食餌療法、外傷およびダウン症候群の存在が挙げられる。多因子性の障害であるため、治療モダリティとしては１つまたは複数の症状の軽減が中心となる。
【０００３】
βアミロイドがアルツハイマー病の病理の中心的なものであり、疾患の進行において主要な役割を果たしうることを示唆する証拠は、多数存在する。アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に対するβ部位ＡＰＰ開裂酵素（ＢＡＣＥ、またβセクレターゼとも呼ばれる）の作用により生じる、１−４２のアミノ酸長のこれらのペプチドは、シナプス空間に蓄積し、ニューロン上の興奮毒性を増加させ、ニューロン損傷およびアポプトーシスに至らしめる。ＢＡＣＥの役割は、以下の先行技術文献において詳述されている：
1.  Vassar et al., (2009) The β-Secretase Enzyme BACE in Health and Alzheimer
's Disease: Regulation, Cell Biology, Function and Therapeutic Potential, 
J Neurosci.; 29(41): 12787-12794.
2.  Cole and Vassar (2007) The Alzheimer's disease β-secretase enzyme, BACE1,
Molecular Neurodegeneration; 2:22
3.  Macini et al., (2011) Beta-secretase as a target for Alzheimer’s disease 
drug discovery: an overview of in vitro methods for characterization of in
hibitors, Analytical and Bioanalytical Chemistry; 400 (7):1979-1996.
4.  Fukumoto et al., (2002) β-Secretase Protein and Activity Are Increased in
the Neocortex in Alzheimer Disease, Arch Neurol.;59(9):1381-1389.
5.  Lange et al., (2015) Association of a  BACE1  Gene Polymorphism with Parki
nson's disease in a Norwegian Population, Parkinsons Dis.; 2015: 973298.
ＢＡＣＥ１は、神経変性疾患でのその役割とは別に、緑内障の進行においても役割を果たすことが報告されている（Guo et al., (2007) Targeting amyloid-β in glaucoma treatment, Proc Natl Acad Sci U S A; 104(33): 13444-13449）。
【０００４】
βセクレターゼの活性および発現を阻害することは、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン関連の疾患、認知低下、軽症認知障害、血管性認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスダッチタイプを有する遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）および緑内障などのβセクレターゼ関連障害の症状を軽減するための有効なオプションとなる。βセクレターゼの活性を阻害できる天然分子が現在ますます試験されている。βセクレターゼ阻害活性を有するものとして報告されている天然分子のいくつかについて、以下の先行技術文献に示されている：
1.  Zang and Tanzi (2012) Natural Modulators of Amyloid-Beta Precursor Protein
Processing, Curr Alzheimer Res. 2012 PMID: 22998566.
2.  Youn et al., (2017) Polymethoxyflavones: Novel β-Secretase (BACE1) Inhibi
tors from Citrus Peels, Nutrients; 9(9): 973.
3.  Fang et al.,(2017) β‐Secretase (BACE1) Inhibitors from Natural Products,
In: Natural Products Targeting Clinically Relevant Enzymes, ed: Paula B.
Andrade,  Patricia Valentao,  David M. Pereira, Wiley Publishers,
4.  Zang et al., (2013) baicalein  reduces β-amyloid and promotes nonamyloido
genic amyloid precursor protein processing in an Alzheimer's disease trans
genic mouse model, J Neurosci Res.;91(9):1239-46.
しかしながら、βセクレターゼの発現および活性の阻害に効果的である天然分子および／または天然分子の組合せが欠けている。本発明は、βセクレターゼの活性および発現を阻害するための、オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシンを含む組成物を開示することにより、上記の問題を解決するものである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の主な目的は、βセクレターゼの活性および発現を阻害するための、オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシンを含む組成物の使用を開示することである。
本発明の他の目的は、βアミロイド含量を減少させるための、オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシンを含む組成物の使用を開示することである。
本発明の他の目的は、オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシンを含む組成物を使用して、βセクレターゼにより媒介される障害の治療管理の方法を開示することである。
本発明は、上記の目的を満たし、さらに関連する利点を提供するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、βセクレターゼの活性および発現を阻害するための、１０質量％以上のオロキシリンＡ、１０質量％以上のバイカレインおよび２質量％以上のクリシンを含む組成物の使用を開示する。本発明はまた、上記の組成物を使用するＰＳ−７０細胞におけるアミロイド含量の低減を開示する。本発明はさらに、βセクレターゼにより媒介される障害の治療管理のための該組成物の使用に言及する。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシンを含む組成物によるβセクレターゼ活性の阻害を示すグラフである。
【図２】オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシンを含む組成物によるβセクレターゼの発現の阻害を示すグラフである。
【図３】対照と比較した、オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシンを含む組成物によるβセクレターゼの発現の減少を示すウエスタンブロット画像である。
【図４】オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシンを含む組成物によるアミロイド含量の減少を示すグラフである。対照との有意差が見られた、Ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
最も好適な実施形態では、本発明は、βセクレターゼ酵素の活性を阻害する方法であって、哺乳動物細胞を、１０質量％以上のオロキシリンＡ、１０質量％以上のバイカレインおよび２質量％以上のクリシンを含む組成物と接触させて、βセクレターゼ活性を阻害する効果を生じさせるステップを含む、方法を開示する。関連する実施形態では、組成物は、好ましくは、１０％〜１５質量％のオロキシリンＡ、１０％〜２５質量％のバイカレインおよび２％〜１０質量％のクリシンを含む。
最も好適な実施形態では、本発明は、βセクレターゼの発現を阻害する方法であって、哺乳動物細胞を、１０質量％以上のオロキシリンＡ、１０質量％以上のバイカレインおよび２質量％以上のクリシンを含む組成物と接触させて、βセクレターゼ酵素の発現を減少させる効果を生じさせるステップを含む、方法を開示する。関連する実施形態では、組成物は、好ましくは、１０％〜１５質量％のオロキシリンＡ、１０％〜２５質量％のバイカレインおよび２％〜１０質量％のクリシンを含む。
最も好適な実施形態では、本発明は、βアミロイド含量を減少させる方法であって、哺乳動物細胞を、１０質量％以上のオロキシリンＡ、１０質量％以上のバイカレインおよび２質量％以上のクリシンを含む組成物と接触させて、βアミロイドの量を減少させるステップを含む、方法を開示する。関連する実施形態では、組成物は、好ましくは、１０％〜１５質量％のオロキシリンＡ、１０％〜２５質量％のバイカレインおよび２％〜１０質量％のクリシンを含む。
【０００９】
最も好適な実施形態では、本発明は、哺乳動物におけるβセクレターゼにより媒介される障害の治療管理の方法であって、かかる治療を必要とする哺乳動物に対して、１０質量％以上のオロキシリンＡ、１０質量％以上のバイカレインおよび２質量％以上のクリシンを含む組成物を有効量で投与するステップを含む、方法を開示する。関連する実施形態では、組成物は、好ましくは、１０％〜１５質量％のオロキシリンＡ、１０％〜２５質量％のバイカレインおよび２％〜１０質量％のクリシンを含む。他の関連する実施形態では、βセクレターゼにより媒介される障害は、アルツハイマー病、パーキンソン病、プリオン関連の疾患、認知低下、軽症認知障害、血管性認知症、ダウン症候群、アミロイドーシスダッチタイプを有する遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）および緑内障からなる群から選択される。好適な実施形態では、哺乳動物はヒトである。他の好適な実施形態では、組成物は、薬学的／栄養補助的に許容できる賦形剤、アジュバント、希釈剤または担体と共に製剤化され、錠剤、カプセル、シロップ、グミ、粉末、懸濁剤、エマルジョン、チュアブル錠、キャンディおよび食品の形態で経口投与される。
本明細書の以下に含まれる具体的な例は、本発明の上記の最も好適な実施形態を例示するものである。
【００１０】
（例１）
βセクレターゼの活性および発現に対する、オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシンを含む組成物（ＯＢＣ）の効果
オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシン（ＯＢＣ）を含む組成物を、米国特許出願第１５８０５３２０号に記載のプロセスに従い、Ｏｒｏｘｙｌｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍから単離した。
方法：組成物（１μｇおよび１０μｇ）を、ＰＳ−７０細胞と共に（２つの別々の処理にて）２４時間インキュベートした。Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ社から購入した市販の蛍光定量キット（カタログ＃Ｋ３６０−１００）を使用し、βセクレターゼ活性を測定した。標準化され確立されたウエスタンブロット手順を用い、βセクレターゼのタンパク質発現を試験した。βアクチンをローディング対照として用いた。ＡｌｐｈａＶｉｅｗソフトウェアを使用した濃度測定分析により、バンド強度を算出した。
【００１１】
結果：組成物（１μｇおよび１０μｇ）は、対照と比較し、βセクレターゼ活性（図１）（ｐ＜０．０００３）およびタンパク質発現（図２）を用量依存的に阻害した。ウエスタンブロット画像（図３）でも上記が確認され、すなわちオロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシンを含む組成物がＢＡＣＥ１により媒介される障害の治療に効果的に使用できることを示すものであった。
ＢＡＣＥ１関連の病因は、アルツハイマー病でのその役割以外にも、血管性認知症（Cole and Vassar (2009). Linking vascular disorders and Alzheimer's disease: Potential involvement of BACE1, Neurobiol Aging; 30(10): 1535-1544)、パーキンソン病（Lange et al., (2015) Association of a BACE1 Gene Polymorphism with Parkinson's Disease in a Norwegian Population, Parkinsons Dis.; 2015: 973298）、プリオン病（Parkin et al., (2007) Cellular prion protein regulates β-secretase cleavage of the Alzheimer's amyloid precursor protein, PNAS; 104 (26):11062-11067）、認知低下、軽症認知障害、ダウン症候群、アミロイドーシスダッチタイプを有する遺伝性脳出血（ＨＣＨＷＡ−Ｄ）（米国特許第９５２６７２７号、βセクレターゼ阻害剤）、および緑内障、（Guo et al., (2007) Targeting amyloid-β in glaucoma treatment, Proc Natl Acad Sci U S A; 104(33): 13444-13449）に関連する。
【００１２】
（例２）
βアミロイド含量に対する、オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシンを含む組成物（ＯＢＣ）の効果
オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシン（ＯＢＣ）を含む組成物を、米国特許出願第１５８０５３２０号に記載のプロセスに従い、Ｏｒｏｘｙｌｕｍ  ｉｎｄｉｃｕｍから単離した。
方法：組成物（２５μｇ、５０μｇおよび１００μｇ）を、ＰＳ−７０細胞と共に２４時間インキュベートした。βアミロイド含量は、市販のβアミロイドＥＬＩＳＡキットを使用して測定した。βアミロイド標準曲線を最初に作成し、インキュベート後に含量を測定した。ピオグリタゾン（５および１０μＭ）を陽性対照として用いた。
結果：組成物（２５μｇ、５０μｇおよび１００μｇ）は、βアミロイド含量を用量依存的に減少させた（ｐ＜０．０００１）（図４）。本発明者らの結果は、本試験におけるピオグリタゾンの使用によりさらに裏付けられた。
【００１３】
結論として、オロキシリンＡ、バイカレインおよびクリシンを含む組成物は、βセクレターゼ酵素の活性および発現の阻害、さらにはアミロイド含量の低減に対し非常に効果的であり、該組成物が、βセクレターゼにより媒介される障害に関連する症状に対処するために効果的に投与されうることを示唆するものであった。
好ましい実施形態を参照しながら本発明を記載したが、本発明がそれらに限定されないことは、当業者により明らかに理解されることである。むしろ、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲との関係においてのみ解釈されるものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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