(57)【要約】  ＢＡＸのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化するのに有用である、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物を含む組成物、並びに式ＩＶの部分を含む化合物を含む組成物が、本明細書で提供される。ＢＡＸに関連する疾患（例えば、がん）を治療する方法並びにＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化する化合物を同定する方法も提供される。【選択図】図１Ａ
2020514367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
2020514367.tif 000034
（式中、
Ｌ１は、結合、Ｃ１〜３アルキレン、−Ｏ−、−Ｏ（Ｃ１〜３アルキレン）−、Ｃ１〜３シアノアルキレン、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｓ（Ｃ１〜３アルキレン）−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；
Ｒ１は、ハロ、ＯＨ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ハロアルキル、ＮＨ２、ＣＮ、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよく；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｓ）Ｃ１〜３アルキルからなる群から選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ハロアルキル、及びＯ（Ｃ１〜３シアノアルキル）からなる群から選択され；
Ｒ５は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキルからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；
各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ヒドロキシアルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜３アルキル）２からなる群から独立して選択され、Ｃ１〜３アルキル基は、ＮＨ２で置換されていてもよい）
の化合物又は薬学的に許容されるその塩及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２】
Ｌ１が、結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＮ）−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＳＣＨ２−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｌ１が、−Ｏ−、−ＣＨ２−、又は−ＯＣＨ２−である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ１が、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＮＨ２、ＣＮ、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルがそれぞれ、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよい、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
Ｒ１が、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＮＨ２、ＣＮ、フェニル、ピリジル、フラニル、チエニル、ピロリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、ピペリジニル、モルホリニル、及び４，５−ジヒドロチアゾリルからなる群から選択され、フェニル、ピリジル、フラニル、チエニル、ピロリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、ピペリジニル、モルホリニル、及び４，５−ジヒドロチアゾリルがそれぞれ、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよい、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
各ＲＡが、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択される、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
Ｒ１が、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよいフェニルである、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
Ｒ１が、フェニル、４−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシフェニル、４−アミノフェニル、４−カルボキシフェニル、又は４−ヒドロキシメチルフェニルである、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
Ｒ２が、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
Ｒ２が、Ｈ又はＣＨ３である、請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｒ３が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｓ）ＣＨ３からなる群から選択される、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
Ｒ３が、Ｈである、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｒ４が、Ｈ、Ｃｌ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＦ３、及びＯＣＨ３ＣＮからなる群から選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｒ４が、Ｈ又はＯＨである、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｒ５が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）ＣＨ３からなる群から選択される、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
Ｒ５が、Ｈ又はＮＨ２である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
Ｒ６が、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１８】
Ｒ６が、Ｈである、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１９】
式Ｉの化合物が、
2020514367.tif 000035
2020514367.tif 000036
又は薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
式Ｉの化合物が、
2020514367.tif 000037
又は、薬学的に許容されるその塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
式ＩＩ：
2020514367.tif 000038
（式中、
Ｘ１は、ＮＨ又はＳであり；
Ｘ２は、Ｃ又はＮであり；
Ｌ１は、結合、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、及び−ＳＯ２−からなる群から選択され；
Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキル、ＮＨ２、ジ（Ｃ１〜３アルキル）アミノ、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１〜３アルキル、及び５〜６員ヘテロアリールからなる群から選択され；又はＲ３は、Ｘ２がＮである場合、存在せず；
Ｒ４は、Ｈ及びＣ１〜３アルキルからなる群から選択される）
の化合物又は薬学的に許容されるその塩及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２２】
Ｘ１が、ＮＨである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
Ｘ１が、Ｓである、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２４】
Ｘ２が、Ｃである、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
Ｘ２が、Ｎである、請求項２１から２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
Ｒ１が、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＮＨ２、Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、ピペリジニル、及びジヒドロチオフェン−３（２Ｈ）−オニルからなる群から選択される、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
−Ｌ１−Ｒ１が、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、ＳＯ２−ピペリジニル、及びジヒドロチオフェン−３（２Ｈ）−オニルからなる群から選択される基を形成する、請求項２１から２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
Ｒ２が、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３からなる群から選択される、請求項２１から２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２９】
Ｒ３が、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、及びチエニルからなる群から選択される、請求項２１から２８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３０】
Ｒ４が、Ｈ及びＣ１〜３アルキルからなる群から選択される、請求項２１から２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３１】
式ＩＩの化合物が、
2020514367.tif 000039
又は薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３２】
式ＩＩＩ：
2020514367.tif 000040
（式中、
2020514367.tif 000041
は、単結合又は二重結合を指し；
環Ａは、環Ｂと縮合環を形成し、かつ環Ａは、５〜６員シクロアルキル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、環Ａは、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよく；
Ｒ１は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキル、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、及び＝Ｎ−ＯＨからなる群から選択され；
Ｒ１ａは、Ｈであり；又はＲ１ａは、Ｒ１ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；
Ｒ２は、Ｈ及びハロからなる群から選択され；
Ｒ２ａは、Ｈであり；又はＲ２ａは、Ｒ２ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；
Ｒ３は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ヒドロキシアルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及び（Ｃ１〜３アルキレン）ＮＨＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；
Ｒ３ａは、Ｃ１〜３アルキルであり、又はＲ３ａは、Ｒ３ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；
Ｒ４は、Ｈ及びＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；
Ｒ４ａは、Ｈであり、又はＲ４ａは、Ｒ４ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；
各ＲＡは、＝Ｏ、＝Ｓ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ヒドロキシアルキル、Ｓ（Ｃ１〜３アルキル）、及びＣ（Ｏ）ＯＨからなる群から独立して選択される）の化合物又は薬学的に許容されるその塩及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項３３】
環Ａが、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよい５〜６員ヘテロアリールである、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
環Ａが、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよい５〜６員ヘテロシクロアルキル基である、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３５】
各ＲＡが、＝Ｏ、＝Ｓ、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＳＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＨからなる群から独立して選択される、請求項３２から３４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項３６】
環Ａが、非置換の５〜６員シクロアルキルである、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３７】
環Ａが、
2020514367.tif 000042
（式中、各
2020514367.tif 000043
は、縮合した環Ａと環Ｂを連結する結合を示す）からなる群から選択される、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３８】
Ｒ１が、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、及び＝Ｎ−ＯＨからなる群から選択される、請求項３２から３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
Ｒ２が、Ｈ及びＣｌからなる群から選択される、請求項３２から３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
Ｒ２ａが、Ｈである、請求項３２から３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
Ｒ２ａが、存在しない、請求項３２から３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
Ｒ３が、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣＨ２ＮＨＣＨ３からなる群から選択される、請求項３２から４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
Ｒ３ａが、ＣＨ３である、請求項３２から４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
Ｒ３ａが、存在しない、請求項３２から４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
Ｒ４が、Ｈ及びＣＨ３からなる群から選択される、請求項３２から４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
式ＩＩＩの化合物が、
2020514367.tif 000044
又は薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される、請求項３２に記載の組成物。
【請求項４７】
式ＩＶ：
2020514367.tif 000045
（式中、
Ｌ１は、結合、Ｃ１〜３アルキレン、−Ｏ−、−Ｏ（Ｃ１〜３アルキレン）−、Ｃ１〜３シアノアルキレン、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｓ（Ｃ１〜３アルキレン）−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；
Ｒ１は、フェニレン、５〜６員ヘテロアリーレン、及び５〜６員ヘテロシクロアルキレンからなる群から選択され、これらのそれぞれは、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよく；
Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；
Ｒ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｓ）Ｃ１〜３アルキルからなる群から選択され；
Ｒ４は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ハロアルキル、及びＯ（Ｃ１〜３シアノアルキル）からなる群から選択され；
Ｒ５は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキルからなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；
各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ヒドロキシアルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜３アルキル）２からなる群から独立して選択され、Ｃ１〜３アルキル基は、ＮＨ２で置換されていてもよい）の部分又は薬学的に許容されるその塩及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項４８】
Ｌ１が、結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＮ）−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＳＣＨ２−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択される、請求項４７に記載の組成物。
【請求項４９】
Ｒ１が、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよいフェニレンである、請求項４７又は４８に記載の組成物。
【請求項５０】
各ＲＡが、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択される、請求項４７から４９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
Ｒ２が、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
Ｒ３が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｓ）ＣＨ３からなる群から選択される、請求項４７から５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
Ｒ４が、Ｈ、Ｃｌ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＦ３、及びＯＣＨ３ＣＮからなる群から選択される、請求項４７から５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
Ｒ５が、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）ＣＨ３からなる群から選択される、請求項４７から５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
Ｒ６が、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される、請求項４７から５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
ＢＡＸのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化する方法であって、ＢＡＸを含む細胞試料又は組織試料を、請求項１から５５のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項５７】
対象においてＢＡＸのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化する方法であって、対象に請求項１から５５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５８】
対象においてがんを治療する方法であって、対象に、治療的有効量の請求項１から５５のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項５９】
がんが、乳がん、前立腺がん、リンパ腫、皮膚がん、膵臓がん、結腸がん、メラノーマ、悪性メラノーマ、卵巣がん、脳がん、原発性脳癌、頭頸部がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、肝臓がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド癌、絨毛癌、菌状息肉症、悪性高カルシウム血症、子宮頸部過形成、白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性多血症、本態性血小板血症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、骨原性肉腫、原発性マクログロブリン血症、及び網膜芽細胞腫からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
がんが、白血病である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
白血病が、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、及びヘアリー細胞白血病からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
白血病が、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、及び慢性骨髄性白血病からなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
ＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化する化合物を同定するための方法であって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む前記ＢＡＸポリペプチドの結合部位を、ＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化するのに適した条件下で、インビトロで化合物と接触させること、及び
ｂ）化合物が、Ｉｌｅ８０、Ａｌａ８１、Ａｌａ８２、Ｖａｌ８３、Ａｓｐ８４、Ｔｈｒ８５、Ａｓｐ８６、Ｓｅｒ８７、Ｐｒｏ８８、Ｖａｌ９１、Ｐｈｅ１１６、Ｌｙｓ１１９、Ｌｅｕ１２０、Ｖａｌ１２１、Ｌｙｓ１２３、Ａｌａ１２４、Ｔｈｒ１２７、Ｌｅｕ１３２、及びＩｌｅ１３６からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基に結合するかどうかを決定すること
を含み、
ＢＡＸポリペプチドの結合部位が、ＢＡＸポリペプチドのα３−α４及びα５−α６ヘアピンの接合点を含む、方法。
【請求項６４】
決定する工程が、飽和移動差ＮＭＲ、ＨＳＱＣ  ＮＭＲ、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は競合蛍光偏光アッセイによって実施される、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
化合物のＢＡＸポリペプチドへの結合が、化合物のＮＭＲスペクトルのシグナルの変化を引き起こす、請求項６３又は６４に記載の方法。
【請求項６６】
化合物によるＢＡＸポリペプチドの活性化を検出することを更に含む、請求項６３から６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
検出する工程が、ＢＡＸのオリゴマー化の検出、ＢＡＸ配座異性体の抗体ベースの検出、ミトコンドリアシトクロムｃ放出アッセイ、リポソーム放出アッセイ、細胞死アッセイ、ミトコンドリア又は細胞形態アッセイ、ミトコンドリアカルシウムフラックスアッセイ、ミトコンドリア膜貫通定量アッセイ、及びカスパーゼ３活性又はアネキシンＶ結合の定量からなる群から選択されるアッセイを実施することを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記化合物が、前記結合部位に、＜１ｍＭの親和性で結合する、請求項６３から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
化合物が、ＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性の活性化を敏感化する、請求項５６から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
化合物が、ＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性を活性化する、請求項５６から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
ＢＡＸのアポトーシス促進活性を活性化する追加の治療剤の投与を更に含む、請求項５６から７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
追加の治療剤が、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２である、請求項７１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＮＩＨ１Ｒ３５、ＣＡ１９７５８３の下で政府の支援を受けて行われた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
本出願は、ＢＡＸのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化するのに有用である、式Ｉ、ＩＩ、又はＩＩＩの化合物を含有する組成物、並びに式ＩＶの部分を含む化合物を含有する組成物を提供する。ＢＡＸに関連する疾患（例えば、がん）を治療する方法並びにＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化する化合物を同定する方法も記載される。
【背景技術】
【０００３】
ＢＡＸは、９個のα−ヘリックスから構成される２１ｋＤａの球状タンパク質であり、ＢＣＬ−２ファミリーにより制御されるミトコンドリアのアポトーシス経路の重要なエフェクターとして機能する。α５／α６ヘアピンは、タンパク質の疎水性コアを形成し、α−ヘリックス１及び６の並置は、ＢＡＸ活性化の開始を制御するリガンド相互作用表面を創出し、タンパク質の反対側の面では、α−ヘリックス２、３、及び４の部分から構成される疎水性の溝に自己抑制性α９ヘリックスが存在する（例えば、Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００，１０３：６４５−６５４を参照されたい）。ＢＡＸは、細胞質ゾルモノマーから致死的なミトコンドリアオリゴマーに転換され得るアポトーシス制御因子である。
【発明の概要】
【０００４】
本出願は、特に、式Ｉ：
2020514367.tif 000003
（式中、Ｌ１は、結合、Ｃ１〜３アルキレン、−Ｏ−、−Ｏ（Ｃ１〜３アルキレン）−、Ｃ１〜３シアノアルキレン、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｓ（Ｃ１〜３アルキレン）−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；Ｒ１は、ハロ、ＯＨ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ハロアルキル、ＮＨ２、ＣＮ、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよく；Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｓ）Ｃ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ４は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ハロアルキル、及びＯ（Ｃ１〜３シアノアルキル）からなる群から選択され；Ｒ５は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ６は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ヒドロキシアルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜３アルキル）２からなる群から独立して選択され、Ｃ１〜３アルキル基は、ＮＨ２で置換されていてもよい）の化合物又は薬学的に許容されるその塩及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【０００５】
いくつかの実施形態では、式ＩのＬ１は、結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＮ）−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＳＣＨ２−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、−Ｏ−、−ＣＨ２−、又は−ＯＣＨ２−である。
【０００６】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ１は、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＮＨ２、ＣＮ、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルはそれぞれ、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよい。
【０００７】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ１は、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＮＨ２、ＣＮ、フェニル、ピリジル、フラニル、チエニル、ピロリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、ピペリジニル、モルホリニル、及び４，５−ジヒドロチアゾリルからなる群から選択され、フェニル、ピリジル、フラニル、チエニル、ピロリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、ピペリジニル、モルホリニル、及び４，５−ジヒドロチアゾリルはそれぞれ、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよい。
【０００８】
いくつかの実施形態では、式Ｉの各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ１は、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよいフェニルである。いくつかの実施形態では、式ＩのＲ１は、フェニル、４−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシフェニル、４−アミノフェニル、４−カルボキシルフェニル、又は４−ヒドロキシメチルフェニルである。
【００１０】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ２は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、式ＩのＲ２は、Ｈ又はＣＨ３である。
【００１１】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｓ）ＣＨ３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、式ＩのＲ３は、Ｈである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ４は、Ｈ、Ｃｌ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＦ３、及びＯＣＨ３ＣＮからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、式ＩのＲ４は、Ｈ又はＯＨである。
【００１３】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）ＣＨ３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、式ＩのＲ５は、Ｈ又はＮＨ２である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ６は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、式ＩのＲ６は、Ｈである。
【００１５】
いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、
2020514367.tif 000004
2020514367.tif 000005
又は薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、
2020514367.tif 000006
又は薬学的に許容されるその塩である。
【００１７】
本出願は、式ＩＩ：
2020514367.tif 000007
（式中、Ｘ１は、ＮＨ又はＳであり；Ｘ２は、Ｃ又はＮであり；Ｌ１は、結合、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、及び−ＳＯ２−からなる群から選択され；Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキル、ＮＨ２、ジ（Ｃ１〜３アルキル）アミノ、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され；Ｒ２は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１〜３アルキル、及び５〜６員ヘテロアリールからなる群から選択され；又はＲ３は、Ｘ２がＮである場合、存在せず；Ｒ４は、Ｈ及びＣ１〜３アルキルからなる群から選択される）の化合物又は薬学的に許容されるその塩及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物を更に提供する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ１は、ＮＨである。
【００１９】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ１は、Ｓである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ２は、Ｃである。
【００２１】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ２は、Ｎである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＲ１は、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＮＨ２、Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、ピペリジニル、及びジヒドロチオフェン−３（２Ｈ）−オニルからなる群から選択される。
【００２３】
いくつかの実施形態では、式ＩＩの−Ｌ１−Ｒ１は、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、ＳＯ２−、ピペリジニル、及びジヒドロチオフェン−３（２Ｈ）−オニルからなる群から選択される基を形成する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＲ２は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３からなる群から選択される。
【００２５】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＲ３は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、及びチエニルからなる群から選択される。
【００２６】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＲ４は、Ｈ及びＣ１〜３アルキルからなる群から選択される。
【００２７】
いくつかの実施形態では、式ＩＩの化合物は、
2020514367.tif 000008
又は薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。
【００２８】
本出願は、式ＩＩＩ：
2020514367.tif 000009
（式中、
2020514367.tif 000010
は、単結合又は二重結合を指し；環Ａは、環Ｂと縮合環を形成し、かつ環Ａは、５〜６員シクロアルキル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、環Ａは、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよく；Ｒ１は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキル、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、及び＝Ｎ−ＯＨからなる群から選択され；Ｒ１ａは、Ｈであり；又はＲ１ａは、Ｒ１ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；Ｒ２は、Ｈ及びハロからなる群から選択され；Ｒ２ａは、Ｈであり；又はＲ２ａは、Ｒ２ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；Ｒ３は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ヒドロキシアルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及び（Ｃ１〜３アルキレン）ＮＨＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ３ａは、Ｃ１〜３アルキルであり、又はＲ３ａは、Ｒ３ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；Ｒ４は、Ｈ及びＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ４ａは、Ｈであり、又はＲ４ａは、Ｒ４ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；各ＲＡは、＝Ｏ、＝Ｓ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ヒドロキシアルキル、Ｓ（Ｃ１〜３アルキル）、及びＣ（Ｏ）ＯＨからなる群から独立して選択される）の化合物又は薬学的に許容されるその塩及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物を更に提供する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、環Ａは、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよい５〜６員ヘテロアリールである。いくつかの実施形態では、環Ａは、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよい５〜６員ヘテロシクロアルキルである。いくつかの実施形態では、式ＩＩＩの各ＲＡは、＝Ｏ、＝Ｓ、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＳＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＨからなる群から独立して選択される。いくつかの実施形態では、環Ａは、非置換の５〜６員シクロアルキルである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
2020514367.tif 000011
（式中、各
2020514367.tif 000012
は、縮合した環Ａと環Ｂを連結する結合を示す）からなる群から選択される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ１は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、及び＝Ｎ−ＯＨからなる群から選択される。
【００３２】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ２は、Ｈ及びＣｌからなる群から選択される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ２ａは、Ｈである。いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ２ａは、存在しない。
【００３４】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ３は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣＨ２ＮＨＣＨ３からなる群から選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ３ａは、ＣＨ３である。いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ３ａは、存在しない。
【００３６】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ４は、Ｈ及びＣＨ３からなる群から選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩの化合物は、
2020514367.tif 000013
又は薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。
【００３８】
本出願は、式ＩＶ：
2020514367.tif 000014
（式中、Ｌ１は、結合、Ｃ１〜３アルキレン、−Ｏ−、−Ｏ（Ｃ１〜３アルキレン）−、Ｃ１〜３シアノアルキレン、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｓ（Ｃ１〜３アルキレン）−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；Ｒ１は、フェニレン、５〜６員ヘテロアリーレン、及び５〜６員ヘテロシクロアルキレンからなる群から選択され、これらのそれぞれが、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよく；Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｓ）Ｃ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ４は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ハロアルキル、及びＯ（Ｃ１〜３シアノアルキル）からなる群から選択され；Ｒ５は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ６は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ヒドロキシアルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜３アルキル）２からなる群から独立して選択され、Ｃ１〜３アルキル基は、ＮＨ２で置換されていてもよい）の部分又は薬学的に許容されるその塩及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物を更に提供する。
【００３９】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＬ１は、結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＮ）−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＳＣＨ２−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＲ１は、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよいフェニレンである。
【００４１】
いくつかの実施形態では、式ＩＶの各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＲ２は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｓ）ＣＨ３からなる群から選択される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＲ４は、Ｈ、Ｃｌ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＦ３、及びＯＣＨ３ＣＮからなる群から選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）ＣＨ３からなる群から選択される。
【００４６】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＲ６は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される。
【００４７】
本出願は、ＢＡＸのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化する方法であって、ＢＡＸを含む細胞試料又は組織試料を本明細書で提供される組成物と接触させることを含む、ＢＡＸのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化する方法を更に提供する。
【００４８】
本出願は、対象においてＢＡＸのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化する方法であって、対象に本明細書で提供される組成物を投与することを含む、対象においてＢＡＸのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化する方法を更に提供する。
【００４９】
本出願は、対象においてがんを治療する方法であって、対象に、治療的有効量の本明細書で提供される組成物を投与することを含む、対象においてがんを治療する方法を更に提供する。
【００５０】
いくつかの実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、リンパ腫、皮膚がん、膵臓がん、結腸がん、メラノーマ、悪性メラノーマ、卵巣がん、脳がん、原発性脳癌、頭頸部がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、肝臓がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド癌、絨毛癌、菌状息肉症、悪性高カルシウム血症、子宮頸部過形成、白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性多血症、本態性血小板血症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、骨原性肉腫、原発性マクログロブリン血症、及び網膜芽細胞腫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、がんは白血病である。いくつかの実施形態では、白血病は、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、及びヘアリー細胞白血病からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、白血病は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、及び慢性骨髄性白血病からなる群から選択される。
【００５１】
本出願は、ＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化する化合物を同定するための方法であって、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む前記ＢＡＸポリペプチドの結合部位を、ＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化するのに適した条件下で、インビトロで化合物と接触させること、及び
ｂ）化合物が、Ｉｌｅ８０、Ａｌａ８１、Ａｌａ８２、Ｖａｌ８３、Ａｓｐ８４、Ｔｈｒ８５、Ａｓｐ８６、Ｓｅｒ８７、Ｐｒｏ８８、Ｖａｌ９１、Ｐｈｅ１１６、Ｌｙｓ１１９、Ｌｅｕ１２０、Ｖａｌ１２１、Ｌｙｓ１２３、Ａｌａ１２４、Ｔｈｒ１２７、Ｌｅｕ１３２、及びＩｌｅ１３６からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基に結合するかどうかを決定すること
を含み、
ＢＡＸポリペプチドの結合部位が、ＢＡＸポリペプチドのα３−α４及びα５−α６ヘアピンの接合点を含む、化合物を同定するための方法を更に提供する。
【００５２】
いくつかの実施形態では、決定する工程は、飽和移動差ＮＭＲ、ＨＳＱＣ  ＮＭＲ、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は競合蛍光偏光アッセイによって実施される。
【００５３】
いくつかの実施形態では、化合物のＢＡＸポリペプチドへの結合は、化合物のＮＭＲスペクトルのシグナルの変化を引き起こす。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本方法は、化合物によるＢＡＸポリペプチドの活性化を検出することを更に含む。いくつかの実施形態では、検出する工程は、ＢＡＸのオリゴマー化の検出、ＢＡＸ配座異性体の抗体ベースの検出、ミトコンドリアシトクロムｃ放出アッセイ、リポソーム放出アッセイ、細胞死アッセイ、ミトコンドリア又は細胞形態アッセイ、ミトコンドリアカルシウムフラックスアッセイ、ミトコンドリア膜貫通定量アッセイ、及びカスパーゼ３活性又はアネキシンＶ結合の定量からなる群から選択されるアッセイを実施することを含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、本化合物は、前記結合部位に、＜１ｍＭの親和性で結合する。いくつかの実施形態では、本化合物は、ＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性の活性化を敏感化する。いくつかの実施形態では、本化合物は、ＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性を活性化する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＢＡＸのアポトーシス促進活性を活性化する追加の治療剤の投与を更に含む。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２である。
【００５７】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明で使用するための方法及び材料が本明細書に記載されているが、当該技術分野において公知の他の好適な方法及び材料も使用することが可能である。材料、方法、及び実施例は例示的なものにすぎず、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、配列、登録データベース、及び他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合、定義を含めて本明細書が優先する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１ａ】ＢＨ３結合トリガー及びカノニカル部位と、阻害性ＢＣＬ−２  ＢＨ４及びｖＭＩＡ相互作用ポケットとを含む、そのアポトーシス促進活性を制御する一連の表面溝を含有するＢＡＸを示している。
【図１ｂ】１０、３、及びその後のシングレットのプールにおける逐次的ＳＴＤ−ＮＭＲスクリーニングによる本明細書に記載の化合物（ＢＡＸ相互作用断片（ＢＩＦ）とも称される）の同定が、５６個の候補ＢＩＦをもたらすことを示している。
【図１ｃ】ＢＩＦ−４４が、リポソームに対して独立した作用を有さず（黒色、左）、最小の直接的ＢＡＸ活性化活性を有する（黒色、中央）が、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２の添加時のリポソーム放出の動態及び量を著しく増強させ（黒色、右）、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２とＢＡＸとの組み合わせ単独によって達成される放出の最大レベル（灰色、右）を超えることを示している。エラーバーは、技術的三通りで行われ、独立したリポソーム及びタンパク質調製物を用いて同様な結果で少なくとも２回繰り返された実験についての平均値±ＳＤである。
【図１ｄ】競合ＳＴＤ  ＮＭＲが、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２との共インキュベーションによってＢＩＦ−４４  ＳＴＤシグナルが影響されないことを実証することを示している。
【図２ａ】リポソーム放出アッセイが、広範な用量範囲にわたるＢＩＦ−４４の直接的なＢＡＸ活性化効果はほとんどないか又は全くないが、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２との共インキュベーション時に、ＢＨ３が誘発する直接ＢＡＸ活性化を敏感化することを実証することを示している（図２ｂ）。エラーバーは、技術的三通りで実施された実験についての平均値±ＳＤである。
【図２ｂ】リポソーム放出アッセイが、広範な用量範囲にわたるＢＩＦ−４４の直接的なＢＡＸ活性化効果はほとんどないか又は全くないが、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２との共インキュベーション時に、ＢＨ３が誘発する直接ＢＡＸ活性化を敏感化することを実証することを示している（図２ｂ）。エラーバーは、技術的三通りで実施された実験についての平均値±ＳＤである。
【図２ｃ】競合蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）が、ＢＩＦ−４４がＢＡＸ相互作用に対してＦＩＴＣ  ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２と効果的に競合しないが（図２ｃ）、ＦＩＴＣ−ｖＭＩＡと用量応答的様式で競合する（図２ｄ）ことを実証することを示している。対応するＮ末端アセチル化ペプチドは、各アッセイにおける競合の陽性対照として機能する：Ａｃ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２、青色（図２ｃ）；ＡｃｖＭＩＡ，紫色（図２ｄ）。エラーバーは、技術的四通りで実施された実験についての平均値±ＳＤである。
【図２ｄ】競合蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）が、ＢＩＦ−４４がＢＡＸ相互作用に対してＦＩＴＣ  ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２と効果的に競合しないが（図２ｃ）、ＦＩＴＣ−ｖＭＩＡと用量応答的様式で競合する（図２ｄ）ことを実証することを示している。対応するＮ末端アセチル化ペプチドは、各アッセイにおける競合の陽性対照として機能する：Ａｃ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２、青色（図２ｃ）；ＡｃｖＭＩＡ，紫色（図２ｄ）。エラーバーは、技術的四通りで実施された実験についての平均値±ＳＤである。
【図２ｅ】競合ＳＴＤ−ＮＭＲが、図２ｃ〜２ｄに示した競合ＦＰＡの結果と一致して、ｖＭＩＡペプチド（灰色）との共インキュベーション時にＢＩＦ−４４  ＳＴＤシグナル（黒色）を抑制するが、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２との共インキュベーションの場合には抑制しないことを実証することを示している。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。
【図３ａ】ＢＩＦ−４４アナログの構造活性関係を示している。ＢＩＦ−４４アナログの化学構造（左）、ＳＴＤ結合（灰色）及びＢＡＸ媒介リポソーム放出敏感化活性が提供されている。エラーバーは、技術的三通り（右）で実施されたリポソーム放出実験についての平均値±ＳＤである。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。
【図３ｂ】ＢＩＦ−４４アナログの構造活性関係を示している。ＢＩＦ−４４アナログの化学構造（左）、ＳＴＤ結合（灰色）及びＢＡＸ媒介リポソーム放出敏感化活性が提供されている。エラーバーは、技術的三通り（右）で実施されたリポソーム放出実験についての平均値±ＳＤである。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。
【図３ｃ】ＢＩＦ−４４アナログの構造活性関係を示している。ＢＩＦ−４４アナログの化学構造（左）、ＳＴＤ結合（灰色）及びＢＡＸ媒介リポソーム放出敏感化活性が提供されている。エラーバーは、技術的三通り（右）で実施されたリポソーム放出実験についての平均値±ＳＤである。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。
【図３ｄ】ＢＩＦ−４４アナログの構造活性関係を示している。ＢＩＦ−４４アナログの化学構造（左）、ＳＴＤ結合（灰色）及びＢＡＸ媒介リポソーム放出敏感化活性が提供されている。エラーバーは、技術的三通り（右）で実施されたリポソーム放出実験についての平均値±ＳＤである。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。
【図３ｅ】ＢＩＦ−４４アナログの構造活性関係を示している。ＢＩＦ−４４アナログの化学構造（左）、ＳＴＤ結合（灰色）及びＢＡＸ媒介リポソーム放出敏感化活性が提供されている。エラーバーは、技術的三通り（右）で実施されたリポソーム放出実験についての平均値±ＳＤである。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。
【図４ａ】ＢＩＦ−４４がＢＡＸのｖＭＩＡ結合領域を標的化し、立体配座動態に影響を及ぼすことを示している。ＢＡＸ残基数の関数としてプロットされた、ＢＩＦ−４４の添加時（６：１、ＢＩＦ：ＢＡＸ）の測定された１５Ｎ−ＢＡＸの化学シフト変化を示している。２ＳＤカットオフ（≧０．０１８ｐｐｍの有意な閾値）を上回る化学シフト変化を反映する最も顕著な効果は、赤色で着色されており、α３−α４及びα５−α６ヘアピンの接合点に局在する。１ＳＤカットオフ（≧０．０１２ｐｐｍの有意な閾値）における有意な変化は、オレンジ色で着色されており、α５及びα６コアの内部残基並びにα１及びα２の別個の並置する残基を包含する。
【図４ｂ】ＢＩＦ−４４がＢＡＸのｖＭＩＡ結合領域を標的化し、立体配座動態に影響を及ぼすことを示している。図４ａの残基プロットにおいて赤色及びオレンジ色のバーとして表されている残基が、対応的に単量体ＢＡＸ（ＰＤＢ  ＩＤ：１Ｆ１６）のリボンダイヤグラム上にマッピングされていることを示している。最も顕著な化学シフト変化（２ＳＤカットオフ）は、ｖＭＩＡペプチド（紫色）相互作用に関与する領域に局在する。化学シフト変化の第２のクラスター（１ＳＤカットオフ）は、α５、α６及びα１、α２の内部の並置した残基に局在し、ＢＡＸ  Ｎ末端面の隣接する疎水性コアからα１−ループ−α２領域までのアロステリックセンシングを示唆している。
【図４ｃ】ＢＩＦ−４４がＢＡＸのｖＭＩＡ結合領域を標的化し、立体配座動態に影響を及ぼすことを示している。ＢＩＦ−４４滴定時の観察された１５Ｎ−ＢＡＸの化学シフト変化（黒色、２ＳＤ、灰色、１ＳＤ）に基づくＢＩＦ−４４の分子ドッキングを示している。ＢＡＸの疎水性α５及びα６ヘリックス、並びにα３−α４ヘアピンによって形成された深い裂け目にかみ合っているＢＩＦ−４４は、表面図（左）及びリボン図（中央、右）で示されている。
【図４ｄ】ＢＩＦ−４４がＢＡＸのｖＭＩＡ結合領域を標的化し、立体配座動態に影響を及ぼすことを示している。ＢＩＦ−４の存在下（灰色）又は不在下（黒色）でのＢＡＸについての１００ｎｓの分子動態シミュレーションの過程での各ＢＡＸ残基のＣαのＲＭＳＦ値を示している。
【図４ｅ】ＢＩＦ−４４がＢＡＸのｖＭＩＡ結合領域を標的化し、立体配座動態に影響を及ぼすことを示している。ＢＡＸのリガンド非結合型とリガンド結合型との間のＲＭＳＦの差（ΔＲＭＳＦ）を示している。１ＳＤ閾値を上回る残基は灰色で示され、ＢＩＦ−４４結合時の移動性の上昇、及びＢＡＸのα１−α２領域への局在を示している。Ｎ末端及びＣ末端の非構造化部分の残基（それぞれ、残基１〜１５及び１８８〜１９２）は、プロットから除外されている。
【図５ａ】ＨＸＭＳが、ＢＩＦ−４４結合時のα１−α２ループ及びＢＡＸ  ＢＨ３ドメインのアロステリック脱保護を明らかにすることを示している。リポソーム環境内でのＢＩＦ−４４のＢＡＸへの添加（３０μＭ、１０：１  ＢＩＦ：ＢＡＸ）が、ＨＸＭＳによって測定されるとき、リガンド非結合型ＢＡＸと比べて重水素取り込みの位置特異的増加を誘発することを示している。相対差プロットは、ＢＩＦ−４４／ＢＡＸの相対的重水素取り込みからのＢＡＸの相対的重水素取り込みの差し引きを反映している。暗灰色の網掛けは、０．５Ｄａの有意な閾値を下回るプロットにおける変化を表し、一方、薄い灰色の網掛け及び白色の領域は、それぞれ、０．５Ｄａのベースラインの有意な閾値及び０．８Ｄａのより厳しい閾値を上回る変化を強調している。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。
【図５ｂ】ＨＸＭＳが、ＢＩＦ−４４結合時のα１−α２ループ及びＢＡＸ  ＢＨ３ドメインのアロステリック脱保護を明らかにすることを示している。ＢＩＦ−４４に誘導された脱保護の領域が、リボンダイヤグラム（左、ＰＤＢ  ＩＤ：１Ｆ１６）及びアミノ酸配列（配列番号１、右）上に黒色で強調され、ＢＡＸの重要なα１−α２ループ及びＢＨ３領域にマッピングするアミノ酸４６〜７４に相当するペプチド断片を包含することを示している。
【図５ｃ】ＨＸＭＳが、ＢＩＦ−４４結合時のα１−α２ループ及びＢＡＸ  ＢＨ３ドメインのアロステリック脱保護を明らかにすることを示している。ＢＩＦ−４４によって誘導される脱保護が、抗ＢＡＸ  ＢＨ３抗体との共インキュベーションによって抑制されるが（図５ｃ）、立体配座的に活性化されたＢＡＸのＮ末端残基に結合するＢＡＸ  ６Ａ７抗体との共インキュベーションによっては抑制されないこと（図５ｄ）を示している。ＢＡＸ  ＢＨ３及び６Ａ７抗体によって認識されるＢＡＸアミノ酸配列は、それぞれ、薄い灰色及び暗灰色で下線が施されている。相対差プロットは、ＢＩＦ−４４／ＢＡＸ／ＢＨ３  Ａｂ（図５ｃ）及びＢＩＦ−４４／ＢＡＸ／６Ａ７  Ａｂ（図５ｄ）の相対的重水素取りこみからのＢＡＸの相対的重水素取り込みの差し引きを反映している。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。
【図５ｄ】ＨＸＭＳが、ＢＩＦ−４４結合時のα１−α２ループ及びＢＡＸ  ＢＨ３ドメインのアロステリック脱保護を明らかにすることを示している。ＢＩＦ−４４によって誘導される脱保護が、抗ＢＡＸ  ＢＨ３抗体との共インキュベーションによって抑制されるが（図５ｃ）、立体配座的に活性化されたＢＡＸのＮ末端残基に結合するＢＡＸ  ６Ａ７抗体との共インキュベーションによっては抑制されないこと（図５ｄ）を示している。ＢＡＸ  ＢＨ３及び６Ａ７抗体によって認識されるＢＡＸアミノ酸配列は、それぞれ、薄い灰色及び暗灰色で下線が施されている。相対差プロットは、ＢＩＦ−４４／ＢＡＸ／ＢＨ３  Ａｂ（図５ｃ）及びＢＩＦ−４４／ＢＡＸ／６Ａ７  Ａｂ（図５ｄ）の相対的重水素取りこみからのＢＡＸの相対的重水素取り込みの差し引きを反映している。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。
【図６ａ】ＢＩＦ−４４が、ＢＡＸのＢＨ３誘発立体配座的活性化及びシトクロムｃ放出活性を敏感化したことを示している。ＢＩＦ−４４（薄い灰色の境界線）、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２（暗灰色）、又は両方のリガンド（黒色）への曝露時のリポソームの存在下でのＢＡＸの比較ＨＸＭＳプロファイルを示している。相対差プロットは、ＢＩＦ−４４／ＢＡＸ（薄い灰色の境界線）、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２／ＢＡＸ（暗灰色）、及びＢＩＦ−４４／ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２／ＢＡＸ（黒色）の相対的重水素取り込みからのＢＡＸの相対的重水素取り込みの差し引きを反映している。暗灰色の網掛けは、０．５Ｄａの有意な閾値を下回るプロットでの変化を表し、一方薄い灰色の網掛け及び白色領域は、それぞれ、０．５Ｄａのベースラインの有意な閾値及び０．８Ｄａのより厳しい閾値を上回る変化を強調している。データは、少なくとも２つの独立した実験を代表するものである。
【図６ｂ】ＢＩＦ−４４が、ＢＡＸのＢＨ３誘発立体配座的活性化及びシトクロムｃ放出活性を敏感化したことを示している。ＢＡＸを相乗的ＢＩＦ−４４／ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２の組み合わせで処理することによって誘導された脱保護の顕著な領域（α１、α１−α２ループ、及びα２）が、リボンダイヤグラム（ＰＤＢ  ＩＤ：１Ｆ１６）及びアミノ酸配列（配列番号１）において緑色で強調されていることを示している。
【図６ｃ】ＢＩＦ−４４が、ＢＡＸのＢＨ３誘発立体配座的活性化及びシトクロムｃ放出活性を敏感化したことを示している。単離されたＡｌｂＣｒｅＢａｘｆ／ｆＢａｋ−／−マウスの肝臓のミトコンドリアからの、ＢＩＦ−４４の用量応答的に敏感化したＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２が誘発するＢＡＸ媒介シトクロムｃ放出を示している。エラーバーは、技術的三通りで行われ、ミトコンドリアの独立した調製及び処置を用いて同様な結果でさらに２回繰り返された実験についての平均値±ＳＤである。
【図７ａ−７ｃ】ａ〜ｃは、ＢＩＦ−４４／ＢＡＸ相互作用のＳＴＤ及びＣＰＭＧ  ＮＭＲ分析を示している。ａ〜ｂは、ＢＡＸタンパク質の存在下及び不在下でのＢＩＦ−４４のＳＴＤ  ＮＭＲを示している。オフ共鳴条件は、ＢＡＸの存在又は不在下でのＢＩＦ−４４の芳香族領域に及ぼす効果を示さない（図７ａ）。リガンド−タンパク質相互作用を反映する、ＢＩＦ−４４についてのＳＴＤシグナル（ＳＴＤ＝オフ共鳴マイナスオン共鳴）は、ＢＡＸの存在下でのみ検出される（図７ｂ）。ｃは、ＢＡＸタンパク質の添加は、ＢＩＦ−４４リガンドの横緩和速度、Ｒ２を増強させ、これは、１Ｈ−ＮＭＲシグナルの急激な減少によって反映され、リガンド−タンパク質相互作用を示す。
【図８ａ】ＦＩＴＣ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２及びｖＭＩＡペプチドが、ＢＡＸに直接的に結合することを示している。蛍光偏光アッセイは、ＢＡＸとＦＩＴＣ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２ペプチドとの間の直接相互作用（図８ａ）及びＦＩＴＣ−ｖＭＩＡペプチドとの間の直接相互作用（図８ｂ）を実証している。エラーバーは、四通りで実施された実験についての平均値±ＳＤである。
【図８ｂ】ＦＩＴＣ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２及びｖＭＩＡペプチドが、ＢＡＸに直接的に結合することを示している。蛍光偏光アッセイは、ＢＡＸとＦＩＴＣ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２ペプチドとの間の直接相互作用（図８ａ）及びＦＩＴＣ−ｖＭＩＡペプチドとの間の直接相互作用（図８ｂ）を実証している。エラーバーは、四通りで実施された実験についての平均値±ＳＤである。
【図９】ＢＩＦ−４４滴定時のＢＡＸの１５Ｎ−ＨＳＱＣ分析を示している。ＢＩＦ−４４の４：１、６：１、及び８：１（ＢＩＦ：ＢＡＸ）の比での添加時の１５Ｎ−ＢＡＸの測定された化学シフト変化を、ＢＡＸ残基の数の関数としてプロットした。各投与比についての１ＳＤカットオフ閾値（≧０．０１２、０．０１８、及び０．０２２ｐｐｍの有意な閾値）における有意な変化を、それぞれ黒色、青色、及び赤色で着色している。
【図１０】ＢＩＦ−４４がＢＡＸに、３７±１２μＭの解離定数で結合することを実証する等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）測定値を示している。結合の生熱を、単一部位結合モデルに適合させた。ＢＩＦ−４４を１ｍＭの濃度で、０．１５ｍＭのＢＡＸを含有する細胞に注入した（注入当たり２μＬ）。試料を、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．２、１％ＤＭＳＯ中に指示された濃度まで希釈した。
【図１１】ＢＡＸ媒介リポソーム放出のＢＩＦ−４４敏感化が、添加の順序に依存しないことを示している。同一レベルのＢＡＸ活性化は、ＢＩＦ−４４が、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２の添加と同時に（左）添加されようが、その前に（右）添加されようが、又はその後に（中央）添加されようが達成される。ＢＡＸ及びＢＩＦ−４４の濃度は、それぞれ７５０ｎＭ及び１１３μＭ（１５０倍）であった。試料をリポソーム放出アッセイ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０）中で希釈した。
【図１２】ＢＩＦ−４４が、既知の小分子アグリゲータの４−ＡＤＰＡ及びＩ４ＰＴＨとは異なり、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルの線広がりを呈さないことを示している。試料を、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．２、１０％Ｄ２Ｏ中に指示された濃度まで希釈した。
【図１３】ＢＩＦ−４４が、Ｔ２減衰において急速又は用量依存的減少を示さず、一方凝集性化合物の４−ＡＤＰＡが、急速なＴ２減衰を実証する（上部、灰色）ことを示している。ＢＩＦ−４４は、濃度に依存しない長い減衰時間を有した（下部）。試料を、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．２、１０％Ｄ２Ｏ中に指示された濃度まで希釈した。
【図１４】ＢＩＦ−４４が溶液中で凝集しないことを示す動的光散乱を示している。４−ＡＤＰＡ（灰色）及びＩ４ＰＴＨ（黒色）は、光散乱の用量依存的増加を実証したが、ＢＩＦ−４４シグナルは、平坦なままである。試料を、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．２中に指示された濃度まで希釈した。
【図１５】ＢＡＸ上のＢＩＦ−４４結合部位を画定するためのアンサンブルドッキングを示している。ＢＩＦ−４４は、ドッキングをガイドするためにＨＳＱＣ結果を用いて、全ての２０個のＮＭＲ溶液構造（ＰＤＢ：１Ｆ１６）にドッキングされた。各モデルについての最良な結合スコアを有するポーズが示されている。ＢＩＦ−４４結合ポケット（底部、黒色）は、以下の残基：Ｉｌｅ８０、Ａｌａ８１、Ａｌａ８２、Ｖａｌ８３、Ａｓｐ８４、Ｔｈｒ８５、Ａｓｐ８６、Ｓｅｒ８７、Ｐｒｏ８８、Ｖａｌ９１、Ｐｈｅ１１６、Ｌｙｓ１１９、Ｌｅｕ１２０、Ｖａｌ１２１、Ｌｙｓ１２３、Ａｌａ１２４、Ｔｈｒ１２７、Ｌｅｕ１３２、及びＩｌｅ１３６から構成される。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
このような小タンパク質について、図１ａに示されるように、驚くほど大きな一連の制御面及び複雑な立体配座変化が、ＢＡＸについて規定されている。その立体配座的に不活性な状態では、ＢＡＸは、主に細胞質ゾルにあり、ＢＣＬ−ＸＬなどの抗アポトーシスタンパク質によって媒介されるレトロ転移（ｒｅｔｒｏｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）プロセスを通してミトコンドリア外膜（ＭＯＭ）領域を往復して循環することも可能である（例えば、Ｅｄｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２０１１，１４５：１０４−１１６を参照されたい）。ストレスに応答して、ＢＩＭ、ＢＩＤ、及びＰＵＭＡなどのＢＨ３のみを直接活性化するタンパク質が、直接的かつ逐次的にα１／α６トリガー部位及びカノニカル疎水性溝にかみ合って、ＢＡＸホモオリゴマー化を開始かつ伝播させるが（例えば、Ｃｚａｂｏｔａｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２０１３，１５２：５１９−５３１；Ｅｄｗａｒｄｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．２０１３，２０：８８８−９０２；Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１０，４０：４８１−４９２；Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５５：１０７６−１０８１を参照されたい）、一方ＢＣＬ−２カノニカル溝、ＢＣＬ−２ＢＨ４モチーフ、及びサイトメガロウイルスｖＭＩＡタンパク質は、ＢＡＸに結合し、かつＢＡＸを阻害することができる（例えば、Ｂａｒｃｌａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１５，５７：８７３−８８６；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０１２；１０９：２０９０１−２０９０６；Ｐｅｔｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２００１，９８：３０１２−３０１７を参照されたい）。ＢＡＸのアポトーシス誘導における中心的な役割は、不可逆的ミトコンドリア転移、膜内ホモオリゴマー化、及びＭＯＭポレーションをもたらす大きな立体配座変化を起こすその能力に由来する（例えば、Ｗａｌｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２０１１，３６：６４２−６５２を参照されたい）。ＢＡＸ活性化に反抗する細胞への固有のリスクは、その多面的な制御についての基本機構が根底にあり得る。
【００６０】
健康及び疾患の間のアポトーシス制御におけるＢＣＬ−２ファミリータンパク質の中心的役割を考慮して、アポトーシス促進性メンバーの隔離及び不活性化が細胞の不死化を駆動するがんにおける抗アポトーシスタンパク質を緩和するための取り組みが進行中である。具体的には、ＢＣＬ−２などの抗アポトーシスタンパク質が、アポトーシス促進タンパク質のアポトーシス誘発ＢＣＬ−２相同性３（ＢＨ３）ヘリックスを捕捉するために表面溝を展開する機構は、ここでは、選択的ＢＣＬ−２ポケット阻害剤であるベネトクラックスによって薬物処理されている（例えば、Ｓｏｕｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２０１３，１９：２０２−２０８；Ｓａｔｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７，２７５：９８３−９８６）。この「阻害剤を阻害する」治療戦略は、ＢＣＬ−ＸＬ（例えば、Ｌｅｓｓｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１３，９：３９０−３９７；Ｔａｏ  ｅｔ  ａｌ，ＡＣＳ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１４，５：１０８８−１０９３；Ｔｓｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００８，６８：３４２１−３４２８を参照されたい）、ＭＣＬ−１（例えば、Ｂｒｕｎｃｋｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１５，５８：２１８０−２１９４；Ｃｏｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２，１９：１１７５−１１８６；Ｋｏｔｓｃｈｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２０１６，５３８：４７７−４８２；Ｌｅｖｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｉｓ．２０１５，６：ｅ１５９０；Ｐｅｌｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２０１６，５９：２０５４−２０６６；Ｓｔｅｗａｒｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．２０１０，５９５−６０１を参照されたい）、及びＢＦＬ−１／Ａ１（例えば、Ｈｕｈｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．２０１６，２３：１１２３−１１３４）を含む、がんに関与する広範囲の抗アポトーシス標的に対する薬物を開発するために適用されている。
【００６１】
アポトーシス促進性ＢＨ３ドメインによる直接的ＢＡＸ活性化のためのα１／α６トリガー部位を発見したことで、がん細胞死を促進するための「活性化剤を活性化する」戦略もまた治療的探索に値することが理にかなうようになった（例えば、Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１０，４０：４８１−４９２；Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５５：１０７６−１０８１を参照されたい）。以前の報告は、インシリコスクリーニングによってこの取り組みを開始しており、なぜなら、高度に安定な抗アポトーシス標的とは対照的に、直接的な実験的スクリーニングのためのＢＡＸの産生が、十分な量の組換えＢＡＸの発現における課題及び特に潜在的な活性剤に曝される場合のＢＡＸの溶液中での一般的な不安定性によって妨げられたためである。インシリコ及び追跡生化学的及び細胞的検証の取り組みは、最初の直接的及び選択的ＢＡＸ活性化分子（ＢＡＭ）をもたらした（例えば、Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２，８：６３９−６４５を参照されたい）。本出願は、以前のロジスティックな課題を克服し、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって小分子断片スクリーニングを直接実行することにより、可能性のある臨床開発のためのＢＡＸ活性化化合物を提供する。
【００６２】
したがって、本出願は、ＢＣＬ−２のＢＡＸ阻害性ＢＨ４ドメインによって（例えば、Ｂａｒｃｌａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ，２０１５，５７：８７３−８８６を参照されたい）又はサイトメガロウイルスｖＭＩＡペプチドによって（例えば、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２０１２，１０９：２０９０１−２０９０６を参照されたい）によってそうでなければ自然に塞がれ得る領域内の深い疎水性ポケットにおいてＢＡＸとかみ合う化合物又は分子断片を提供する。加えて、本出願は、分子のかみ合わせが、α１−α２ループ及びＢＡＸ  ＢＨ３ヘリックスのアロステリック可動化によりＢＡＸを敏感化することを記載し、ＢＡＸのＢＨ３媒介直接活性化及びホモオリゴマー化に関与する重要な機構的工程をハイライトする（例えば、Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ，２０１０，４０：４８１−４９２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．１９９８，１８：６０８３−６０８９を参照されたい）。
【００６３】
化合物及び組成物
本出願は、特に、式Ｉ：
2020514367.tif 000015
（式中、Ｌ１は、結合、Ｃ１〜３アルキレン、−Ｏ−、−Ｏ（Ｃ１〜３アルキレン）−、Ｃ１〜３シアノアルキレン、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｓ（Ｃ１〜３アルキレン）−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；Ｒ１は、ハロ、ＯＨ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ハロアルキル、ＮＨ２、ＣＮ、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルはそれぞれ、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよく；Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｓ）Ｃ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ４は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ハロアルキル、及びＯ（Ｃ１〜３シアノアルキル）からなる群から選択され；Ｒ５は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ６は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ヒドロキシアルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜３アルキル）２からなる群から独立して選択され、Ｃ１〜３アルキル基は、ＮＨ２で置換されていてもよい）の化合物又は薬学的に許容されるその塩及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物を提供する。
【００６４】
いくつかの実施形態では、式ＩのＬ１は、結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＮ）−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＳＣＨ２−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択される。
【００６５】
いくつかの実施形態では、式ＩのＬ１は、−Ｏ−、−ＣＨ２−、又は−ＯＣＨ２−である。
【００６６】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ１は、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＮＨ２、ＣＮ、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルはそれぞれ、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよい。
【００６７】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ１は、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＮＨ２、ＣＮ、フェニル、ピリジル、フラニル、チエニル、ピロリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、ピペリジニル、モルホリニル、及び４，５−ジヒドロチアゾリルからなる群から選択され、フェニル、ピリジル、フラニル、チエニル、ピロリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、ピペリジニル、モルホリニル、及び４，５−ジヒドロチアゾリルはそれぞれ、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよい。
【００６８】
いくつかの実施形態では、式Ｉの各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択される。
【００６９】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ１は、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよいフェニルである。
【００７０】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ１は、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよいフェニルであり、各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＨ２ＯＨ、及びＣ（Ｏ）ＯＨからなる群から独立して選択される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ１は、フェニル、４−ヒドロキシフェニル、３−ヒドロキシフェニル、４−アミノフェニル、４−カルボキシルフェニル、又は４−ヒドロキシメチルフェニルである。
【００７２】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ２は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される。
【００７３】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ２は、Ｈ又はＣＨ３である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｓ）ＣＨ３からなる群から選択される。
【００７５】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ３は、Ｈである。
【００７６】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ４は、Ｈ、Ｃｌ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＦ３、及びＯＣＨ３ＣＮからなる群から選択される。
【００７７】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ４は、Ｈ又はＯＨである。
【００７８】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）ＣＨ３からなる群から選択される。
【００７９】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ５は、Ｈ又はＮＨ２である。
【００８０】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ６は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される。
【００８１】
いくつかの実施形態では、式ＩのＲ６は、Ｈである。
【００８２】
いくつかの実施形態では、式ＩのＬ１は、結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＮ）−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＳＣＨ２−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；式ＩのＲ１は、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＦ３、ＮＨ２、ＣＮ、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルはそれぞれ、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよく；式Ｉの各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択され；式ＩのＲ２は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択され；式ＩのＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｓ）ＣＨ３からなる群から選択され；式ＩのＲ４は、Ｈ、Ｃｌ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＦ３、及びＯＣＨ３ＣＮからなる群から選択され；式ＩのＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）ＣＨ３からなる群から選択され；式ＩのＲ６は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、式ＩのＬ１は、結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＮ）−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＳＣＨ２−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；式ＩのＲ１は、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよいフェニルであり；式Ｉの各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択され；式ＩのＲ２は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択され；式ＩのＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｓ）ＣＨ３からなる群から選択され；式ＩのＲ４は、Ｈ、Ｃｌ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＦ３、及びＯＣＨ３ＣＮからなる群から選択され；式ＩのＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）ＣＨ３からなる群から選択され；式ＩのＲ６は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、
2020514367.tif 000016
2020514367.tif 000017
又は薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、
2020514367.tif 000018
又は、薬学的に許容されるその塩である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、式Ｉの化合物は、
2020514367.tif 000019
又は薬学的に許容されるその塩である。
【００８７】
本出願は、式ＩＩ：
2020514367.tif 000020
（式中、Ｘ１は、ＮＨ又はＳであり；Ｘ２は、Ｃ又はＮであり；Ｌ１は、結合、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、及び−ＳＯ２−からなる群から選択され；Ｒ１は、Ｃ１〜３アルキル、ＮＨ２、ジ（Ｃ１〜３アルキル）アミノ、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され；Ｒ２は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ３は、Ｈ、Ｃ１〜３アルキル、及び５〜６員ヘテロアリールからなる群から選択され；又はＲ３は、Ｘ２がＮである場合、存在せず；Ｒ４は、Ｈ及びＣ１〜３アルキルからなる群から選択される）の化合物又は薬学的に許容されるその塩及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物を更に提供する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ１は、ＮＨである。
【００８９】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ１は、Ｓである。
【００９０】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ２は、Ｃである。
【００９１】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ２は、Ｎである。
【００９２】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ１はＮＨであり、かつ式ＩＩのＸ２はＣである。
【００９３】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ１はＮＨであり、かつ式ＩＩのＸ２はＮである。
【００９４】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ１はＳであり、かつ式ＩＩのＸ２はＣである。
【００９５】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ１はＳであり、かつ式ＩＩのＸ２はＮである。
【００９６】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＲ１は、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＮＨ２、Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、ピペリジニル、及びジヒドロチオフェン−３（２Ｈ）−オニルからなる群から選択される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、式ＩＩの−Ｌ１−Ｒ１は、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、ＳＯ２−、ピペリジニル、及びジヒドロチオフェン−３（２Ｈ）−オニルからなる群から選択される基を形成する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＲ２は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３からなる群から選択される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＲ３は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、及びチエニルからなる群から選択される。
【０１００】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＲ４は、Ｈ及びＣ１〜３アルキルからなる群から選択される。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ１は、ＮＨ又はＳであり；式ＩＩのＸ２は、Ｃ又はＮであり；式ＩＩのＬ１は、結合、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、及び−ＳＯ２−からなる群から選択され；式ＩＩのＲ１は、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＮＨ２、Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、ピペリジニル、及びジヒドロチオフェン−３（２Ｈ）−オニルからなる群から選択され；式ＩＩのＲ２は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３からなる群から選択され；式ＩＩのＲ３は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、及びチエニルからなる群から選択され；式ＩＩのＲ４は、Ｈ及びＣ１〜３アルキルからなる群から選択される。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、式ＩＩのＸ１は、ＮＨ又はＳであり；式ＩＩのＸ２は、Ｃ又はＮであり；式ＩＩの−Ｌ１−Ｒ１は、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３、Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ２ＣＨ３）２、ＳＯ２−、ピペリジニル、及びジヒドロチオフェン−３（２Ｈ）−オニルからなる群から選択される基を形成し；式ＩＩのＲ２は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ２ＣＨ３からなる群から選択され；式ＩＩのＲ３は、Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、及びチエニルからなる群から選択され；式ＩＩのＲ４は、Ｈ及びＣ１〜３アルキルからなる群から選択される。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、式ＩＩの化合物は、
2020514367.tif 000021
又は薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。
【０１０４】
本出願は、式ＩＩＩ：
2020514367.tif 000022
（式中、
2020514367.tif 000023
は、単結合又は二重結合を指し；環Ａは、環Ｂと縮合環を形成し、かつ環Ａは、５〜６員シクロアルキル、５〜６員ヘテロアリール、及び５〜６員ヘテロシクロアルキルからなる群から選択され、環Ａは、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよく；Ｒ１は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキル、ＯＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、及び＝Ｎ−ＯＨからなる群から選択され；Ｒ１ａは、Ｈであり；又はＲ１ａは、Ｒ１ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；Ｒ２は、Ｈ及びハロからなる群から選択され；Ｒ２ａは、Ｈであり；又はＲ２ａは、Ｒ２ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；Ｒ３は、Ｈ、ハロ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ヒドロキシアルキル、ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及び（Ｃ１〜３アルキレン）ＮＨＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ３ａは、Ｃ１〜３アルキルであり、又はＲ３ａは、Ｒ３ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；Ｒ４は、Ｈ及びＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ４ａは、Ｈであり、又はＲ４ａは、Ｒ４ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；各ＲＡは、＝Ｏ、＝Ｓ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ヒドロキシアルキル、Ｓ（Ｃ１〜３アルキル）、及びＣ（Ｏ）ＯＨからなる群から独立して選択される）の化合物又は薬学的に許容されるその塩及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物を更に提供する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、環Ａは、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよい５〜６員ヘテロアリールである。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、環Ａは、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよい５〜６員ヘテロシクロアルキルである。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩの各ＲＡは、＝Ｏ、＝Ｓ、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＳＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＨからなる群から独立して選択される。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、環Ａは、非置換の５〜６員シクロアルキルである。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、環Ａは、
2020514367.tif 000024
（式中、各
2020514367.tif 000025
は、縮合した環Ａと環Ｂを連結する結合を示す）からなる群から選択される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ１は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、及び＝Ｎ−ＯＨからなる群から選択される。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ２は、Ｈ及びＣｌからなる群から選択される。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ２ａは、Ｈである。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ２ａは、存在しない。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ３は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣＨ２ＮＨＣＨ３からなる群から選択される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ３ａは、ＣＨ３である。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ３ａは、存在しない。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩのＲ４は、Ｈ及びＣＨ３からなる群から選択される。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、環Ａは、５〜６員ヘテロアリール、５〜６員ヘテロシクロアルキル、及び非置換の５〜６員シクロアルキルからなる群から選択され、５〜６員ヘテロアリール及び５〜６員ヘテロシクロアルキル基はそれぞれ、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよく；式ＩＩＩのＲ１は、Ｈ、Ｃ（Ｏ）ＯＣＨ３、ＯＣ（Ｏ）ＣＨ３、Ｃ（Ｓ）ＮＨ２、及び＝Ｎ−ＯＨからなる群から選択され；式ＩＩＩのＲ２は、Ｈ及びＣｌからなる群から選択され；式ＩＩＩのＲ２ａは、Ｈであり；又はＲ２ａは、Ｒ２ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；式ＩＩＩのＲ３は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＮＨＣ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣＨ２ＮＨＣＨ３からなる群から選択され；式ＩＩＩのＲ３ａは、Ｃ１〜３アルキルであり、又はＲ３ａは、Ｒ３ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；式ＩＩＩのＲ４は、Ｈ及びＣＨ３からなる群から選択され；式ＩＩＩのＲ４ａは、Ｈであり、又はＲ４ａは、Ｒ４ａが結合している炭素原子が二重結合を形成する場合、存在せず；式ＩＩＩの各ＲＡは、＝Ｏ、＝Ｓ、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＳＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＨからなる群から独立して選択される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、式ＩＩＩの化合物は、
2020514367.tif 000026
又は薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される。
【０１２０】
本出願は、式ＩＶ：
2020514367.tif 000027
（式中、Ｌ１は、結合、Ｃ１〜３アルキレン、−Ｏ−、−Ｏ（Ｃ１〜３アルキレン）−、Ｃ１〜３シアノアルキレン、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−Ｓ（Ｃ１〜３アルキレン）−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；Ｒ１は、フェニレン、５〜６員ヘテロアリーレン、及び５〜６員ヘテロシクロアルキレンからなる群から選択され、これらのそれぞれが、１、２、又は３個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよく；Ｒ２は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ３は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｓ）Ｃ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ４は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ハロアルキル、及びＯ（Ｃ１〜３シアノアルキル）からなる群から選択され；Ｒ５は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキルからなる群から選択され；Ｒ６は、Ｈ、ハロ、ＯＨ、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）ＯＣ１〜３アルキルからなる群から選択され；各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、Ｃ１〜３アルキル、Ｃ１〜３ヒドロキシアルキル、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）Ｃ１〜３アルキル、及びＣ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜３アルキル）２からなる群から独立して選択され、Ｃ１〜３アルキル基は、ＮＨ２で置換されていてもよい）の部分又は薬学的に許容されるその塩及び１つ又は複数の薬学的に許容される担体を含む組成物を更に提供する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＬ１は、結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＮ）−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＳＣＨ２−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択される。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＲ１は、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよいフェニレンである。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、式ＩＶの各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＲ２は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｓ）ＣＨ３からなる群から選択される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＲ４は、Ｈ、Ｃｌ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＦ３、及びＯＣＨ３ＣＮからなる群から選択される。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）ＣＨ３からなる群から選択される。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＲ６は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、式ＩＶのＬ１は、結合、−ＣＨ２−、−Ｏ−、−ＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＣＮ）−、−Ｓ−、−ＳＯ２−、−ＳＣＨ２−、及び−Ｃ（Ｏ）−からなる群から選択され；式ＩＶのＲ１は、１又は２個の独立して選択されるＲＡ基で置換されていてもよいフェニレンであり；式ＩＶの各ＲＡは、ＯＨ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＨ２ＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）Ｎ（ＣＨ３）２からなる群から独立して選択され；式ＩＶのＲ２は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択され；式ＩＶのＲ３は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、及びＣ（Ｓ）ＣＨ３からなる群から選択され；式ＩＶのＲ４は、Ｈ、Ｃｌ、ＮＨ２、ＣＮ、ＣＨ３、ＣＦ３、及びＯＣＨ３ＣＮからなる群から選択され；式ＩＶのＲ５は、Ｈ、Ｆ、Ｃｌ、ＮＨ２、及びＣ（Ｏ）ＣＨ３からなる群から選択され；式ＩＶのＲ６は、Ｈ、Ｃｌ、ＣＮ、ＣＨ３、及びＣ（Ｏ）ＯＣＨ３からなる群から選択される。
【０１３０】
医薬品として使用される場合、本明細書に提供される組成物は、医薬組成物の形態で投与することができる。これらの組成物は、本明細書又は他の箇所で記載されるように調製することができ、局部又は全身治療が望ましいかどうかに応じて、及び処置される領域に応じて、様々な経路によって投与することができる。投与は、局所（経皮、上皮、点眼、及び鼻腔内、経膣、及び直腸送達を含む粘膜への投与）、肺（例えば、噴霧器などによる粉末又はエアロゾルの吸入若しくは吹送；気管内又は鼻腔内による）、経口、又は非経口であってもよい。非経口投与としては、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内筋肉内注射、若しくは腹腔内筋肉内点滴；又は頭蓋内（例えば、髄腔内又は脳室内投与）が挙げられる。非経口投与は、単回ボーラス投与とすることができ、又は例えば、連続灌流ポンプによるものであってもよい。
【０１３１】
局所投与用の医薬組成物としては、経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル剤、ドロップ、坐剤、スプレー、液剤及び粉末剤を挙げることができる。従来の薬学的担体、水性、粉末又は油状基剤、増粘剤などが必要であるか又は望ましい場合がある。
【０１３２】
活性成分として本明細書に提供される化合物（例えば、式Ｉ〜ＩＩＩの化合物、又は式ＩＶの部分を含む化合物）、又は薬学的に許容されるその塩を、１つ又は複数の薬学的に許容される担体（例えば、賦形剤）と組み合わせて含有する組成物も提供される。本明細書に提供される組成物の調製において、活性成分は、典型的には、賦形剤と混合され、賦形剤で希釈され、又は例えば、カプセル、サシェ、紙、若しくは他の容器の形態のこのような担体内に封入される。賦形剤が希釈剤として機能するとき、これは、活性成分のためのビヒクル、担体又は媒体として作用する、固体、半固体、又は液体材料とすることができる。したがって、組成物は、錠剤、ピル、粉末剤、トローチ剤、サシェ剤、オブラート、エリキシル剤、懸濁液、乳剤、溶液、シロップ剤、エアロゾル（固体として、又は液体媒体中の）、軟膏剤、軟質及び硬質ゼラチンカプセル、坐剤、無菌注射液、並びに無菌包装粉末剤の形態とすることができる。
【０１３３】
好適な賦形剤の例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカント、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、及びメチルセルロースが挙げられるが、これらに限定されない。組成物は、限定されないが、タルク、ステアリン酸マグネシウム、及び鉱油などの滑沢剤；湿潤剤；乳化及び懸濁化剤；メチル−及びプロピルヒドロキシ−ベンゾエートなどの防腐剤；甘味剤；風味剤、又はこれらの組み合わせを更に含んでもよい。
【０１３４】
活性成分は、広範な投与量範囲にわたって有効であることができ、一般に、治療的有効量で投与される。しかしながら、実際に投与される化合物及び／又は組成物の量は、通常、治療される状態、選択される投与の経路、投与される実際の化合物又は組成物、個々の対象の年齢、体重、応答、対象の症状の重症度などを含む関連する状況に従って医師によって決定されることが理解されよう。
【０１３５】
本明細書の様々な場所で、二価の連結置換基が記載されている。各二価の連結置換基が、連結置換基のフォワード形及びバックワード形の両方を含むことが具体的に意図される。例えば、−ＮＲ（ＣＲ’Ｒ”）ｎ−は、−ＮＲ（ＣＲ’Ｒ”）ｎ−及び−（ＣＲ’Ｒ”）ｎＮＲ−の両方を含む。構造が明らかに連結基を必要とする場合、その基について列挙されるマーカッシュ変数が連結基であると理解される。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「置換されていてもよい」という語句は、非置換であるか又は置換されていることを意味する。本明細書で使用される場合、「置換された」という用語は、水素原子が除去され、置換基に取って代わられることを意味する。所与の原子における置換が、原子価によって限定されることを理解するべきである。
【０１３７】
定義の全体を通して、「Ｃｎ〜ｍ」という用語は、端点を含む範囲を示し、ｎ及びｍは整数であり、炭素の数を示す。例としては、Ｃ１〜４、Ｃ１〜６などが挙げられる。
【０１３８】
本明細書で使用する場合、単独で、又は他の用語と組み合わされて使用される、「Ｃｎ〜ｍアルキレン」という用語は、ｎ〜ｍ個の炭素を有する二価のアルキル連結基を指す。アルキレン基の例としては、メチレン、エタン−１，２−ジイル、プロパン−１，３−ジイル、プロパン−１，２−ジイルなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アルキレン部分は、１〜３個の炭素原子又は１〜２個の炭素原子を含有する。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「Ｃｎ〜ｍシアノアルキレン」という用語は、ｎ〜ｍ個の炭素を有する二価のアルキル連結基であって、１つ又は複数のシアノ（すなわち、−ＣＮ）基で置換されているアルキル連結基を指す。いくつかの実施形態では、シアノアルキレン基は、１個のシアノ基を含有する。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、単独で、又は他の用語と組み合わされて使用される、「Ｃｎ〜ｍアルキル」という用語は、ｎ〜ｍ個の炭素を有する、直鎖又は分岐鎖であってもよい飽和炭化水素基を指す。アルキル部分の例としては、化学基、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル；高級同族体、例えば、２−メチル−１−ブチル、ｎ−ペンチル、３−ペンチル、ｎ−ヘキシル、１，２，２−トリメチルプロピルなどが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アルキル基は、１〜３個の炭素原子又は１〜２個の炭素原子を含有する。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「ハロ」とは、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、又はＩを指す。いくつかの実施形態では、ハロは、Ｆ、Ｃｌ、又はＢｒである。いくつかの実施形態では、ハロは、Ｆ又はＣｌである。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、単独で、又は他の用語と組み合わされて使用される、「Ｃｎ〜ｍハロアルキル」という用語は、同じであっても、又は異なっていてもよい１つのハロゲン原子から２ｓ＋１個のハロゲン原子を有するアルキル基を指し、「ｓ」はアルキル基中の炭素原子の数であり、アルキル基は、ｎ〜ｍ個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、ハロアルキル基は、１〜３個の炭素原子又は１〜２個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、ハロアルキル基は、１個のハロ基を含有する。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、単独で、又は他の用語と組み合わされて使用される、「Ｃｎ〜ｍヒドロキシアルキル」という用語は、１つのヒドロキシ基（すなわち、−ＯＨ）から２ｓ＋１個のヒドロキシ基を有するアルキル基を指し、「ｓ」はアルキル基中の炭素原子の数であり、アルキル基は、ｎ〜ｍ個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアルキル基は、１〜３個の炭素原子又は１〜２個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、ヒドロキシアルキル基は、１個のヒドロキシ基を含有する。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、単独で、又は他の用語と組み合わされて使用される、「Ｃｎ〜ｍシアノアルキル」という用語は、１つのシアノ基（すなわち、−ＣＮ）から２ｓ＋１個のシアノ基を有するアルキル基を指し、「ｓ」はアルキル基中の炭素原子の数であり、アルキル基は、ｎ〜ｍ個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、シアノアルキル基は、１〜３個の炭素原子又は１〜２個の炭素原子を含有する。いくつかの実施形態では、シアノアルキル基は、１個のシアノ基を含有する。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「ジ（Ｃｎ〜ｍ−アルキル）アミノ」という用語は、式−Ｎ（アルキル）２の基を指し、式中、２つのアルキル基はそれぞれ独立してｎ〜ｍ個の炭素原子を有する。いくつかの実施形態では、各アルキル基は、独立して、１〜３個の炭素原子、又は１〜２個の炭素原子を有する。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」は、環化アルキル及び／又はアルキレン基を含む非芳香族環状炭化水素を指す。シクロアルキル基は、単環式又は多環式（例えば、２、３又は４個の縮合環を有する）基及びスピロ環を含むことができる。シクロアルキル基は、３、４、５、又は６個の環形成炭素を有することができる（すなわち、Ｃ３〜６シクロアルキル基）。シクロアルキル基の環形成炭素原子は、オキソ又はスルフィド（例えば、＝Ｏ又は＝Ｓ）で置換されていてもよい。例示的なシクロアルキル基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、シクロアルキルは、３〜６個の環形成炭素原子を有する（すなわち、Ｃ３〜６シクロアルキル基）。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」という用語は、硫黄、酸素、及び窒素から選択される少なくとも１つのヘテロ原子環員を有する芳香族単環式又は多環式複素環を指す。いくつかの実施形態では、ヘテロアリール環は、窒素、イオウ、及び酸素から独立して選択される１、２、３、又は４個のヘテロ原子環員を有する。いくつかの実施形態では、ヘテロアリールは、５〜６個の環原子と、窒素、硫黄、及び酸素から独立して選択される１、２、３、又は４個のヘテロ原子環員とを有する。例示的な５員環のヘテロアリールとしては、チエニル、フリル、ピロリル、イミダゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、１，２，３−トリアゾリル、テトラゾリル、１，２，３−チアジアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，４−トリアゾリル、１，２，４−チアジアゾリル、１，２，４−オキサジアゾリル、１，３，４−トリアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、及び１，３，４−オキサジアゾリルが挙げられるが、これらに限定されない。例示的な６員環のヘテロアリールとしては、ピリジル、ピラジニル、ピリミジニル、トリアジニル、及びピリダジニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクロアルキル」という用語は、Ｏ、Ｎ、又はＳから選択される１、２、３、又は４個の環形成ヘテロ原子を有する非芳香族単環式又は多環式複素環を指す。ヘテロシクロアルキルに含まれるものは、単環式４員、５員、及び６員ヘテロシクロアルキル基である。例示的なヘテロシクロアルキル基としては、ピラニル、オキセタニル、アゼチジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、ピペラジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピペリジニル、ピロリジニル、イソオキサゾリジニル、イソチアゾリジニル、ピラゾリジニル、オキサゾリジニル、チアゾリジニル、イミダゾリジニルなどが挙げられる。ヘテロシクロアルキル基の環形成炭素原子及びヘテロ原子は、オキソ又はスルフィド（例えば、＝Ｏ、＝Ｓ）で置換されていてもよい。ヘテロシクロアルキル基は、環形成炭素原子又は環形成ヘテロ原子を通して結合され得る。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキル基は、０〜３個の二重結合を含有する。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキル基は、０〜２個の二重結合を含有する。またヘテロシクロアルキルの定義に含まれるものは、シクロアルキル環に縮合した（すなわち、シクロアルキル環と共通の結合を有する）１つ又は複数の芳香族環を有する部分であり、例えば、ピペリジン、モルホリン、アゼピンなどのベンゾ又はチエニル誘導体である。縮合芳香族環を含有するヘテロシクロアルキル基は、縮合芳香族環の環形成原子を含む任意の環形成原子を通して結合され得る。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキルは、窒素、酸素、又は硫黄から独立して選択される１又は２個のヘテロ原子を伴う５〜６個の環原子を有する。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「フェニレン」という用語は、二価のフェニル連結基を指す。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリーレン」という用語は、二価のヘテロアリール連結基を指す。いくつかの実施形態では、ヘテロアリーレンは、５〜６個の環原子を有する。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、二価のヘテロシクロアルキル連結基を指す。いくつかの実施形態では、ヘテロシクロアルキレンは、５〜６個の環原子を有する。
【０１５２】
ある場所では、定義又は実施形態は特定の環（例えば、アゼチジン環、ピリジン環など）を指す。別途指示がない限り、これらの環は、その原子の原子価を超えないという条件で、いかなる環員にも結合することができる。例えば、アゼチジン環は、環のいかなる位置で結合してもよいが、一方ピリジン−３−イル環は、３位に結合される。
【０１５３】
本明細書で使用される「化合物」という用語は、描写される構造の全ての立体異性体、幾何異性体、互変異性体、及び同位体を含むことを意味する。本明細書で名称又は構造によって１つの特定の互変異性形態と特定された化合物は、別段の定めがない限り、他の互変異性形態を含むことが意図される。
【０１５４】
本明細書に提供される化合物は、互変異性形態も含む。互変異性形態は、単結合の隣接する二重結合との交換、及びプロトンの付随する移動からもたらされる。互変異性形態は、同じ実験式及び総電荷を有する異性体プロトン化状態であるプロトン互変異性体（ｐｒｏｔｏｔｒｏｐｉｃ  ｔａｕｔｏｍｅｒｓ）を含む。例示的なプロトン互変異性体には、ケトン−エノール対、アミド−イミド酸対、ラクタム−ラクチム対、エナミン−イミン対、及びプロトンが複素環式系の２つ以上の位置を占有し得る環状型、例えば、１Ｈ−及び３Ｈ−イミダゾール、１Ｈ−、２Ｈ−、及び４Ｈ−１，２，４−トリアゾール、１Ｈ−及び２Ｈ−イソインドール、並びに１Ｈ−及び２Ｈ−ピラゾールが含まれる。互変異性形態は、平衡し得るか、又は適切な置換によって１つの形態へと立体的に固定され得る。
【０１５５】
「薬学的に許容される」という語句は、本明細書で、健全な医療判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は他の問題若しくは合併症を伴わずにヒト及び動物の組織と接触して使用するのに好適であり、妥当な便益／危険性比率に見合った、化合物、組成物、及び／又は剤形を指すように用いられる。
【０１５６】
本出願は、本明細書に記載の化合物の薬学的に許容される塩も含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」は、既存の酸又は塩基部分をその塩形態に変換することによって親化合物が修飾される、開示される化合物の誘導体を指す。薬学的に許容される塩の例としては、アミンなどの塩基性残基の鉱酸塩又は有機酸塩、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩又は有機塩などが挙げられるが、これらに限定されない。本出願の薬学的に許容される塩としては、例えば、非毒性無機酸又は有機酸から形成される、親化合物の従来の非毒性塩が挙げられる。本出願の薬学的に許容される塩は、従来の化学方法によって、塩基性又は酸性部分を含有する親化合物から合成することができる。一般に、このような塩は、これらの化合物の遊離酸型又は遊離塩基型を、化学量論的量の適切な塩基又は酸と、水中若しくは有機溶媒中で、又はその２つの混合物中で反応させることによって調製することができ、一般に、エーテル、酢酸エチル、アルコール（例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、又はブタノール）、又はアセトニトリル（ＭｅＣＮ）のような非水性媒体が好ましい。好適な塩の一覧は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．１４１８及びＪｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２（１９７７）において見出される。塩形態を調製するための従来の方法は、例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２に記載されている。
【０１５７】
使用方法
本出願は、ＢＡＸのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化する方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、ＢＡＸを含む細胞試料又は組織試料を、本明細書に提供される組成物（例えば、式Ｉ〜ＩＩＩの化合物若しくは式ＩＶの部分を含む化合物、又は薬学的に許容されるその塩）と接触させることを含む。本明細書で使用される場合、「接触させる」という用語は、指示された成分をインビトロ系において一緒にさせることを指す。例えば、ＢＡＸポリペプチドを本明細書に提供される組成物と「接触させる」ことは、本発明の化合物を、ＢＡＸポリペプチドを含有する細胞調製物又は精製調製物を含有する試料（例えば、細胞試料又は組織試料）に導入することを含む。いくつかの実施形態では、式Ｉ〜ＩＩＩの化合物又は式ＩＶの部分を含む化合物を含む組成物は、細胞試料又は組織試料中で、ＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性の活性化を、別のアポトーシス促進剤によって敏感化する（すなわち、ＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性を、アポトーシス促進剤によって増強させる）。このような実施形態では、本明細書に記載の組成物は、それ自体がＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性を活性化してもよく、又は活性化しなくてもよい。いくつかの実施形態では、式Ｉ〜ＩＩＩの化合物又は式ＩＶの部分を含む化合物を含む組成物は、細胞試料又は組織試料中でＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性を活性化する。このような実施形態では、組成物は、別のアポトーシス促進剤の存在下又は不在下のいずれかで投与することができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、本出願は、対象においてＢＡＸのアポトーシス促進活性を敏感化及び／又は活性化する方法を提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、対象に本明細書に提供される化合物又は組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される化合物又は組成物は、対象においてＢＡＸのアポトーシス促進活性の活性化を敏感化する（例えば、組成物が、別のアポトーシス促進剤と組み合わせて投与される場合）。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される化合物又は組成物は、対象においてＢＡＸのアポトーシス促進活性を活性化する（例えば、組成物が、別のアポトーシス促進剤の存在下又は不在下で投与される場合）。本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、哺乳動物を含む任意の動物を指す。対象の例としては、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、霊長類、及びヒトが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、本方法は、対象に、治療的有効量の本明細書に提供される組成物を投与することを含む。本明細書で使用される場合、「治療的有効量」という語句は、研究者、獣医師、医師、又は他の臨床医により組織、系、動物、個体又はヒトにおいて求められている生物学的又は医学的応答を引き出す活性化合物又は医薬品の量を指す。
【０１５９】
本出願は、対象においてがんを治療する方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、このような治療を必要とする対象に、治療的有効量の本明細書に提供される組成物を投与することを含む。
【０１６０】
例示的ながんとしては、乳がん、前立腺がん、リンパ腫、皮膚がん、膵臓がん、結腸がん、メラノーマ、悪性メラノーマ、卵巣がん、脳がん、原発性脳癌、頭頸部がん、神経膠腫、膠芽細胞腫、肝臓がん、膀胱がん、非小細胞肺がん、頭頸部癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、小細胞肺癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣癌、膀胱癌、膵臓癌、胃癌、結腸癌、前立腺癌、泌尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、悪性膵インスリノーマ、悪性カルチノイド癌、絨毛癌、菌状息肉症、悪性高カルシウム血症、子宮頸部過形成、白血病、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性多血症、本態性血小板血症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、骨原性肉腫、原発性マクログロブリン血症、及び網膜芽細胞腫が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１６１】
例示的な白血病及びリンパ腫としては、赤芽球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性リンパ球性白血病、急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性顆粒球性白血病、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（例えば、Ｂ系列ＡＬＬ及びＴ系列ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性顆粒球性白血病、前リンパ球性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）、ワルデンストレームガンマグロブリン血症（ＷＭ）、非ホジキンリンパ腫、末梢性Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、ホジキン病、及びリード・ステンベルグ病が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、白血病は、急性リンパ球性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、及びヘアリー細胞白血病からなる群から選択される。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、白血病は、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ芽球性白血病、及び慢性骨髄性白血病からなる群から選択される。
【０１６４】
本出願は、ＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性を活性化する化合物を同定するための方法を更に提供する。いくつかの実施形態では、本方法は、
ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含む前記ＢＡＸポリペプチドの結合部位を、ＢＡＸポリペプチドのアポトーシス促進活性を活性化するのに適した条件下で、インビトロで化合物と接触させることと、
ｂ）化合物が、Ｉｌｅ８０、Ａｌａ８１、Ａｌａ８２、Ｖａｌ８３、Ａｓｐ８４、Ｔｈｒ８５、Ａｓｐ８６、Ｓｅｒ８７、Ｐｒｏ８８、Ｖａｌ９１、Ｐｈｅ１１６、Ｌｙｓ１１９、Ｌｅｕ１２０、Ｖａｌ１２１、Ｌｙｓ１２３、Ａｌａ１２４、Ｔｈｒ１２７、Ｌｅｕ１３２、Ｉｌｅ１３６からなる群から選択される１つ又は複数のアミノ酸残基に結合するかどうかを決定することと、を含み、
ＢＡＸポリペプチドの結合部位は、ＢＡＸポリペプチドのα３−α４及びα５−α６ヘアピンの接合点を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、決定する工程は、飽和移動差ＮＭＲ、ＨＳＱＣ  ＮＭＲ、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、又は競合蛍光偏光アッセイによって実施される。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、化合物のＢＡＸポリペプチドへの結合は、化合物のＮＭＲスペクトルのシグナルの変化を引き起こす。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本方法は、化合物によるＢＡＸポリペプチドの活性化を検出することを更に含む。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、検出する工程は、ＢＡＸのオリゴマー化の検出、ＢＡＸ配座異性体の抗体ベースの検出、ミトコンドリアシトクロムｃ放出アッセイ、リポソーム放出アッセイ、細胞死アッセイ、ミトコンドリア又は細胞形態アッセイ、ミトコンドリアカルシウムフラックスアッセイ、ミトコンドリア膜貫通定量アッセイ、及びカスパーゼ３活性又はアネキシンＶ結合の定量からなる群から選択されるアッセイを実施することを含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、前記化合物は、前記結合部位に、＜１ｍＭの親和性で、例えば、＜７５０ｎＭ、＜５００ｎＭ、＜２５０ｎＭ、＜１００ｎＭ、＜５０ｎＭ、＜２５ｎＭ、＜１０ｎＭなどの親和性で結合する。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される本方法は、対象、インビトロ細胞試料、組織試料、及び／又は臓器試料に、１つ若しくは複数の追加の治療剤（例えば、化学療法剤）を投与すること、及び／又は１つ若しくは複数の追加の医療技法（例えば、放射線療法、外科的介入など）を実施することを更に含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本方法は、アポトーシスを誘導する薬剤；ポリヌクレオチド（例えば、アンチセンス、リボザイム、ｓｉＲＮＡ）；ポリペプチド（例えば、酵素及び抗体）；生物学的模倣物（例えば、ＢＨ３模倣物）；抗アポトーシスタンパク質に結合し、かつそれを阻害する薬剤（例えば、抗アポトーシスＢＣＬ−２タンパク質を阻害する薬剤）；アルカロイド；アルキル化剤；抗腫瘍抗生物質；代謝拮抗剤；ホルモン剤；白金化合物；モノクローナル又はポリクローナル抗体（例えば、抗がん剤、毒素、デフェンシンなどとコンジュゲートした抗体）、毒素、放射性核種；生物学的応答修飾剤（例えば、インターフェロン、例えばＩＦＮ−αなど）及びインターロイキン（例えば、ＩＬ−２など）；養子免疫療法剤；造血成長因子；腫瘍細胞分化を誘導する薬剤（例えば、オールトランスレチノイン酸など）；遺伝子療法試薬（例えば、アンチセンス療法試薬及びヌクレオチド）；腫瘍ワクチン；血管新生阻害剤；プロテアソーム阻害剤；ＮＦカッパβモジュレーター；抗ＣＤＫ化合物；ＨＤＡＣ阻害剤などからなる群から選択される１つ又は複数の追加の治療剤を投与することを更に含む。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本方法は、抗アポトーシスタンパク質に結合し、かつこれを阻害する１つ又は複数の追加の治療剤（例えば、抗アポトーシスＢＣＬ−２タンパク質を阻害する薬剤）、例えば、ＡＢＴ−２６３、オバトクラックス（ｏｂａｔｏｃｌａｘ）、ギシポール（ｇｏｓｓｙｐｏｌ）誘導体、ＩＡＰ阻害剤、及び抗アポトーシスタンパク質を標的とするステープルペプチド（例えば、ＭＣＬ−１  ＳＡＨＢ、ＢＩＤ  ＳＡＨＢ、ＢＡＤ  ＳＡＨＢ、ＢＩＭ  ＳＡＨＢなど）を投与することを更に含む。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＢＡＸに結合し、かつＢＡＸのアポトーシス促進活性を活性化する１つ又は複数の追加の治療剤（例えば、アポトーシス促進剤）（例えば、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２）を投与することを更に含む。ＢＡＸに結合し、かつＢＡＸのアポトーシス促進活性を活性化する化合物の追加の例は、例えば、米国特許第９，３０３，０２４号；米国特許公開第ＵＳ２０１６−０１７１１５０号；Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２，  ８：６３９−６４５；Ｂｒａｈｍｂｈａｔｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２０１６，４７３：１０７３−１０８３；Ｘｉｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４，５：４９３５；及びＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２０１４，３４：１１９８−１２０７で見出すことができ、これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、本方法は、アポトーシスを誘導又は刺激する１つ又は複数の追加の治療剤を投与することを更に含む。アポトーシスを誘導する薬剤としては、放射線（例えば、Ｘ線、ガンマ線、ＵＶ）；キナーゼ阻害剤（例えば、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）キナーゼ阻害剤、血管成長因子受容体（ＶＧＦＲ）キナーゼ阻害剤、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）キナーゼ阻害剤、血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）キナーゼ阻害剤、及びＢｃｒ−Ａｂｌキナーゼ阻害剤、例えばＧＬＥＥＶＥＣ）；アンチセンス分子；抗体（例えば、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ、ＲＩＴＵＸＡＮ、ＺＥＶＡＬＩＮ、及びＡＶＡＳＴＩＮ）；抗エストロゲン剤（例えば、ラロキシフェン及びタモキシフェン）；抗アンドロゲン剤（例えば、フルタミド、ビカルタミド、フィナステリド、アミノグルテタミド、ケトコナゾール、及びコルチコステロイド）；シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）阻害剤（例えば、セレコキシブ、メロキシカム、ＮＳ−３９８、及び非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ））；抗炎症薬（例えば、ブタゾリジン、ＤＥＣＡＤＲＯＮ、ＤＥＬＴＡＳＯＮＥ、デキサメタゾン、デキサメタゾンインテンソール、ＤＥＸＯＮＥ、ＨＥＸＡＤＲＯＬ、ヒドロキシクロロキン、ＭＥＴＩＣＯＲＴＥＮ、ＯＲＡＤＥＸＯＮ、ＯＲＡＳＯＮＥ、オキシフェンブタゾン、ＰＥＤＩＡＰＲＥＤ、フェニルブタゾン、ＰＬＡＱＵＥＮＩＬ、プレドニゾロン、プレドニゾン、ＰＲＥＬＯＮＥ、及びＴＡＮＤＥＡＲＩＬ）；並びにがん化学療法薬（例えば、イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ）、ＣＰＴ−１１、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、デキサメタゾン、ミトキサントロン、ＭＹＬＯＴＡＲＧ、ＶＰ−１６、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、５−ＦＵ、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ボルテゾミド、ゲフィチニブ、ベバシズマブ、ＴＡＸＯＴＥＲＥ又はＴＡＸＯＬ）；細胞シグナル伝達分子；セラミド及びサイトカイン；並びにスタウロスポリンなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、対象は、それを必要としている対象（例えば、このような治療を必要とすると特定された対象、例えば、本明細書に提供される疾患のうちの１つ又は複数を有するか、又は有する危険性がある対象）である。このような治療を必要とする対象を特定することは、対象又は医療専門家の判断でなされることができ、主観的（例えば、見解）であるか、又は客観的（例えば、試験又は診断法によって測定可能）であり得る。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、対象は、以前に化学療法を受けていない。いくつかの実施形態では、対象は、がん又はリンパ腫の治療としての化学療法、放射線療法、又は骨髄移植から生じる血小板減少症などの血小板減少症に罹患していないか、又はその危険性がない。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、本明細書に提供される組成物の投与の前に、その投与と同時に、又は投与後に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物は、外科的処置の間に投与される。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物は、外科的処置の間に追加の治療剤と組み合わせて投与される。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、「治療する」又は「治療」という用語は、（１）疾患を阻害すること、例えば、疾患、状態又は障害の病理若しくは症候を経験しているか又は示している個体における疾患、状態又は障害を阻害すること（すなわち、病理及び／又は症候の更なる発症を阻止すること）、及び（２）疾患を改善すること、例えば、疾患の重症度を低減させるか、又は疾患の１つ若しくは複数の症状を低減若しくは緩和することなどの、疾患、状態又は障害の病理若しくは症候を経験しているか又は示している個体における疾患、状態又は障害を改善すること（すなわち、病理及び／又は症候を回復に向かわせること）のうちの１つ又は複数を指す。いくつかの実施形態では、このような用語は、１つ又は複数の療法を施した後の１つ、２つ、３つ又はそれ以上の結果：（１）がん細胞集団の安定化、低減、又は排除、（２）がん寛解期間の長さの延長、（３）がんの再発率の低下、（４）がんの再発までの時間の延長、及び（６）患者の生存期間の延長を指す。
【実施例】
【０１７９】
本発明は、特定の実施例を通して非常に詳細に説明される。以下の実施例は、例示を目的として提供されており、いかなる方法によっても本発明を限定することを意図していない。当業者であれば、本質的に同じ結果をもたらすように変更又は修正され得る様々な重要性の低いパラメータを容易に認識するであろう。
【０１８０】
実施例１
ペプチドの合成
Ｆｍｏｃ化学を用いる固相ペプチド合成を、以前に記載されたように実施した（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２００８，４４６：３６９−３８６；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１１，３：９９−１１７を参照されたい）。ｖＭＩＡ（１３１ＥＡＬＫＫＡＬＲＲＨＲＦＬＷＱＲＲＱＲＡ１５０−ＣＯＮＨ２）（配列番号２）及びＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２（１４５Ａｃ−ＥＩＷＩＡＱＥＬＲＸＩＧＤＸＦＮＡＹＹＡ１６４−ＣＯＮＨ２、Ｘ＝ステープルアミノ酸）（配列番号３）ペプチドを、ＮＭＲ及び生化学的実験での指示された適用のために、アセチル基又はフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）−β−アラニンのいずれかでＮ末端誘導体化した。ペプチドを、ＬＣ−ＭＳにより、＞９５％の純度まで精製し、アミノ酸分析によって定量した。実験で使用するために、凍結乾燥ペプチドを、１００％ＤＭＳＯ又はＤＭＳＯ−ｄ６中で再構成し、指示された水性緩衝液中で希釈した。
【０１８１】
実施例２
完全長ＢＡＸの発現及び精製
組換え完全長ＢＡＸを、ｐＴＹＢ１ベクターを用いて、ＢＬ２１（ＤＥ３）大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現させた（例えば、Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２０００，１０３：６４５−６５４；Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５５：１０７６−１０８１を参照されたい）。細胞ペレットを、２０ｍＭのＴｒｉｓ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２中に再懸濁し、４℃に冷やしたマイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）に２回通過させることによって溶解させた。溶解物を、２０，０００ｒｐｍで遠心分離することによって清澄化させた。ＢＡＸを、キチン樹脂（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いた４℃でのバッチ親和性結合、続いて重力流カラムにかけて、洗浄及び溶出することによって精製した。インテイン−キチン結合ドメインタグを、５０ｍＭのジチオスレイトール中、４℃での３６時間のインキュベーションによって切断した。純粋なタンパク質を、ＦＰＬＣシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００；２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．２）によって単離した。
【０１８２】
実施例３
ＳＴＤ−ＮＭＲによる断片スクリーニング
Ｒｏ３多様性化合物ライブラリーを、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅから購入し、１Ｈ−ＮＭＲによって特徴付けし、次いでスペクトルの重なりを最小化するために１０のグループにプールした。４０個の化合物を、動作不良の化合物を識別する品質管理手段の一部として、スクリーニング前に除外した。断片プールを、１０％（ｖ／ｖ）Ｄ２Ｏ中２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．２中の非標識の完全長ヒトＢＡＸの５μＭの溶液に添加し、３００μＭの最終化合物濃度をもたらした。試料の混合及び５ｍｍのＮＭＲ管への充填は、リキッドハンドリング用ロボット（Ｇｉｌｏｎ）を用いて実施した。ＳＴＤ−ＮＭＲ測定値を、ヘリウム冷却クライオプローブを装備したＶａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ  ５００−ＭＨｚ分光計で２５℃にて取得した。一連の５０ｍｓのガウスパルスを合計で３秒用いて、タンパク質の低電力飽和を達成し、オンレゾナンス時の照射を０．８ｐｐｍで実施し、オフレゾナンス時の照射を３０ｐｐｍで実施した。標準的な励起彫刻（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｓｃｕｌｐｔｉｎｇ）を溶媒消去に使用した。各実験は、１４分間行った。最初に、各プールについてのオンレゾナンス及びオフレゾナンス時のＳＴＤスペクトルを比較して、結合体の存在を決定することによって、結果を分析し、９６のプールのうち３７でタンパク質相互作用の証拠を示した。続いて、インハウスディスプレイ分析及びディスプレイソフトウェアを用いて、各プールを分析して、個々の結合体を特定し、これが、オンレゾナンス及びオフレゾナンス時のスペクトルの正確なアライメントを可能にした。正のＳＴＤシグナルをもたらしたプール中の化合物を、次いで、再試験用に、３つのグループに細分した。両方の実験でＳＴＤを示したこれらの化合物を、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅに再注文し、単一化合物として、及び競合結合実験の両方で試験した。
【０１８３】
リガンドのスクリーニングを実行するのに十分な量及び安定性の組換え完全長ＢＡＸを生成するために、産生方法を、４８リットルの全体の培養液量にスケールアップし、温度制御マイクロフルイダイザー（４℃に設定）、続いて溶解物のキチン親和性樹脂へのバッチ結合、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）溶出を用いて細菌ペレットの順次溶解を実施し、サイズ排除クロマトグラフィーによる精製を行った。このアプローチを使用して、初期スクリーニング用に、２１．６ｍｇのＢＡＸタンパク質を、細菌培養物１リットル当たり０．４５ｍｇの純粋な完全長タンパク質の全体の収量を表す０．６４ｍｇ／ｍＬの濃度で生成した。次いで、上記のように、飽和移動差（ＳＴＤ）ＮＭＲによるリガンドスクリーニングを用いて、ＢＡＸと相互作用する分子を同定した。ＳＴＤ−ＮＭＲは、標的タンパク質の選択的照射後のリガンドの１Ｈ−ＮＭＲシグナルにおける変化を測定し、タンパク質からリガンドへの磁化の移動は、リガンド−タンパク質相互作用を反映するシグナルの減少を引き起こす。
【０１８４】
１０００個の化合物のＭａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｒｏ３ライブラリを、ＢＡＸスクリーニング用に使用した。分析した９６のプールのうちで、正のＳＴＤシグナルを３７のプールで検出し、これは８６個の個々のヒットを表し、これを次いで３つのプールで再スクリーニングし、最終的に、５６個を相互作用物質として確認した（図１ｂ）。５３個の市販の化合物を注文し、シングルトンとしてＳＴＤによって再試験して、ＢＡＸ相互作用断片（ＢＩＦ  １〜５３）として確認した。ＳＴＤ  ＮＭＲ及びリポソーム放出アッセイから得られた結果を、表１に示す。活性化合物ＢＩＦ−１〜ＢＩＦ−５３の構造を表２に示す。
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【０１８５】
実施例４
リポソーム放出アッセイ
ミトコンドリア外膜に類似する脂質組成を有する大単ラメラ小胞（ＬＵＶ）を、以前に記載されたようにリポソーム押出によって形成した（例えば、Ｌｅｓｈｃｈｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０１３，１１０：Ｅ９８６−９９５；Ｌｏｖｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００８，１３５：１０７４−１０８４を参照されたい）。簡単に言うと、４８：２８：１０：１０：４のモル比のホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジオレオイルホスファチジルセリン、及びテトラオレオリルカルジオリピン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）を含有する脂質混合物を、クロロホルム中で生成した。脂質薄膜を、最初に窒素ガス下で、次いで終夜の真空による溶媒の蒸発によって形成し、続いて窒素下で−８０℃にて保存した。脂質薄膜を、１ｍＬのアッセイ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＨ７．０）中で水和させて、フルオロフォア及びクエンチャー対の８−アミノナフタレン−１，３，６−トリスルホン酸（ＡＮＴＳ、１２．５ｍＭ）及びｐ−キシレン−ビス−ピリジニウムブロミド（ＤＰＸ、４５ｍＭ）と混合した。凍結／解凍サイクルを５回行い、続いて１００ｎｍのポリカーボネート膜を通して押し出し、セファロースＣＬ−２Ｂサイズ排除カラムを用いて精製することによって、リポソームを形成させた。ＢＡＸ活性化の測定については、ＢＡＸ（７５０ｎＭ）を、リポソームの存在下で指示された濃度の分子断片に添加し、続いてＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２（７５０ｎＭ）を指示された時点で添加した。アッセイを、黒不透明３８４ウェルプレート（ウェル当たり３０μｌ）で行った。ＡＮＴＳ／ＤＰＸの放出を、分光蛍光計（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ１０００）において、３５５ｎｍの励起波長、５４０ｎｍの発光波長、及び２０ｎｍの帯域幅を用いて、室温で経時的に監視した。最大放出を、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を０．２％（ｖ／ｖ）の最終濃度まで添加することによって決定した。放出率を、以下に示した等式１に従って計算し、式中、Ｆは、観測された放出であり、Ｆ０及びＦ１００は、それぞれ、ベースライン及び最大蛍光である。
等式１．
（（Ｆ−Ｆ０）／（Ｆ１００−Ｆ０））×１００
【０１８６】
同定したＢＩＦのいずれかがＢＡＸの機能に影響を及ぼしたかを決定するために、５３個のＢＩＦを、ステープルＢＩＭ  ＢＨ３ヘリックスのＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２（ａａ  １４５〜１６４）によって誘導された（１）直接的ＢＡＸ活性化物質及び（２）直接的ＢＡＸ活性化の敏感化物質又は阻害物質の両方を同定するように設計された、上記のリポソーム放出アッセイにおいてスクリーニングした（例えば、Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５５：１０７６−１０８１を参照されたい）。最初に、リポソーム及び化合物単独を用いてベースライン蛍光を読み取り、続いてＢＡＸを添加して直接活性化を評価し、次いでＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２をこの混合物に添加し、組み合わせの効果を監視し、化合物の不在下でのＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２及びＢＡＸの誘発活性と比較した。このアッセイ形式を用いて、表１に示されるように、ＢＡＸ媒介リポソーム放出の４個の直接的活性化物質及びＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２誘発ＢＡＸ活性化の８個の敏感化物質を同定した。直接的活性化物質のプロファイルは、陽性対照のＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２ペプチドによって例示され、これは、ＢＡＸ単独の存在下で、時間応答性のリポソーム放出を誘導した（図１ｃ）。新規な敏感化物質プロファイルは、ＢＩＦ−４４の活性によって最も著しく反映され、これは、単剤としてインキュベートされるとき、ＢＡＸに対して最小の効果を有したが、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２と組み合わされるとき、最大のＢＡＸ媒介放出は、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２単独での５０％から組み合わせでの８０％に跳び上がり、より迅速な動態を表した（図１ｃ）。
【０１８７】
加えて、ＢＡＸ媒介リポソーム放出のＢＩＦ−４４の敏感化が、ＢＩＦ−４４及びＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２の添加の順序に依存することを見出した。図１１に示されるように、同じレベルのＢＡＸ活性化が、ＢＩＦ−４４を、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２の添加と同時に（左）添加しようと、その前に（右）添加しようと、又はその後に（中央）に添加しようと達成された。
【０１８８】
実施例５
競合ＳＴＤ−ＮＭＲ
個々の化合物を、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．２中の、５μＭの競合阻害物質（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）ペプチドを含むか、又は含まない５μＭのＢＡＸに添加した。ＳＴＤ−ＮＭＲを、上記のように測定した。ｖＭＩＡ又はＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２によって競合阻害を受けた断片は、ペプチドの不在下に対してペプチドの存在下で減少した飽和移動差を示した。
【０１８９】
直接的ＢＡＸ活性化分子（すなわち、ＢＡＭ）を特徴付ける先行研究においては、ＢＡＭとＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２との間の直接的競合が、ＢＨ３誘発部位において観察された（例えば、Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１２，８：６３９−６４５を参照されたい）。新たに特定されたＢＡＸ敏感化活性の評価において、驚くべきことに、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２が、ＳＴＤシグナルに影響を及ぼさないことが見出され（図１ｄ）、これはＢＩＦ−４４についての代替相互作用機構の可能性を高めた。
【０１９０】
観察されたＢＩＦ−４４活性の構造ベースの再現性及び選択性を評価するために、一連のＢＩＦ−４４アナログの結合及び機能特性を評価した。ヒドロキシル基を同じ位置でアミンに置き換えるか、ヒドロキシルをメタ位にシフトさせるか、又はエーテル結合をメチレン基で置き換えるかのいずれかのＢＩＦ−４４様ジアリールエーテルが、ＳＴＤ  ＮＭＲによって評価されるように、全てがｖＭＩＡによって競合阻害を受けるＢＡＸ結合活性を保持することが見出され、ロバストなＢＡＸ敏感化活性を実証した（図３ａ〜３ｃ）。対照的に、第２の芳香族環にパラ−ヒドロキシル基を保有するか、又はＢＩＦ−４４ヒドロキシルをカルボキシレート基に置き換えるジアリールエーテルは、ＢＡＸ結合又は敏感化活性をほとんど又は全く示さなかった（図３ｄ〜３ｅ）。これらのデータは、ＢＡＸへの結合、ｖＭＩＡとの競合、及びＢＨ３媒介ＢＡＸ活性化の敏感化におけるＢＩＦ−４４の作用の特異性を支援する構造活性関係についての証拠を提供した。
【０１９１】
実施例６
ＣＰＭＧ  ＮＭＲ
ＣＰＭＧ実験を、標準方法を用いて実施した（例えば、Ｈａｊｄｕｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１９９７，１１９：１２２５７−１２２６１を参照されたい）。ＮＭＲ分析は、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．２中で、ＢＡＸ（５μＭ）を添加して、又は添加せずに、ＢＩＦ−４４を３００μＭの濃度で使用した。０．５ミリ秒のタウ遅延（ＣＰＭＧエコーサイクル当たり１ｍｓ）を適用し、エコーサイクルの数は、５００ｍｓに相当する。報告したように、励起彫刻を溶媒消失に使用した（例えば、Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍａｇｎ．Ｒｅｓｏｎ．Ａ，１９９５，１１２：２７５−２７９を参照されたい）。
【０１９２】
リポソーム放出及びＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２競合ＳＴＤ二次スクリーニングの両方でＢＩＦ−４４について得られた結果を考慮すると、ＳＴＤに基づくＢＩＦ−４４／ＢＡＸの相互作用の発見は、直交するＮＭＲ尺度を用いて裏付けられた（図７ａ〜７ｂ）。ＢＡＸとのインキュベーションの際のＢＩＦ−４４シグナルの電位変化を監視するために、リガンドと比べてタンパク質のより速いＴ２緩和時間を活用する方法であるＣａｒｒ−Ｐｕｒｃｅｌｌ−Ｍｅｉｂｏｏｍ−Ｇｉｌｌ（ＣＰＭＧ）−ＮＭＲを、上記のように適用した。タンパク質−リガンド複合体の形成は、リガンドの緩和時間を低減し、１Ｈ−ＮＭＲシグナルの測定可能な減少をもたらす（例えば、Ｄｉａｓ  ｅｔ  ａｌ，ＡＣＳ  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．２０１４，５：２３−２８；Ｓｔｏｃｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌ．Ｍａｇ．Ｒｅｓｏｎ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．２００２，４１：１８７−２３１を参照されたい）。ＢＡＸの存在下では、ＢＩＦ−４４の結合を示す、シグナルの急激な低下が観察された（図７ｃ）。加えて、ＢＩＦ−４４は、ＢＩＦ−４４対ＢＡＸの広範な１０〜１７５：１のモル比を用いて適用される場合、ＢＡＸ媒介リポソーム放出に及ぼす独立した誘発効果をほとんど又は全く有さないが（図２ａ）、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２の存在下では、ＢＩＦ−４４は、ＢＡＸ媒介リポソーム放出の動態及び最大レベルの両方を用量応答的に増強させたことが確認された。
【０１９３】
実施例７
蛍光偏光（ＦＰ）アッセイ
ＦＩＴＣ−ペプチド（２５ｎＭ）を、結合緩衝液（２０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ６．２）中で、連続希釈した組換え完全長ＢＡＸとインキュベートした。競合ＦＰについては、ＦＩＴＣ−ペプチド（２５ｎＭ）を、固定濃度のＢＡＸ（２５０ｎＭ）と混合し、連続希釈したアセチル化ペプチド又は本明細書に記載の化合物とインキュベートした。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５マイクロプレートリーダーを用いて、蛍光偏光を平衡状態で測定した。用量応答曲線の非線形回帰分析を、Ｐｒｉｓｍソフトウェア７（ＧｒａｐｈＰａｄ）を用いて実施した。
【０１９４】
最後に、競合蛍光偏光アッセイの代替法を用いて、ＢＩＦ−４４のＢＡＸとの結合についてのＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２の不在を、ＳＴＤによって最初に実証されたように（図１ｄ）確認した。この実験については、ＦＩＴＣ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２とＢＡＸとの間の直接的相互作用を、Ｎ末端アセチル化ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２及びＢＩＦ−４４による比較競合のための基準として使用した（図８ａ）。Ａｃ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２が、ＢＡＸ結合に対してＦＩＴＣ−ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２と用量応答的に競合したのに対して、ＢＩＦ−４４は、ほとんど又は全く効果を有さなかった（図２ｃ）。したがって、一連の三次スクリーニング実験において、ＢＩＦ−４４がＢＡＸに直接結合し、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２と競合しない相互作用であること、及びＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２が誘発するＢＡＸ媒介膜ポレーションを用量応答的に敏感化することを決定した。
【０１９５】
同定されたＢＩＦが、ＢＡＸとの相互作用に対して阻害性ｖＭＩＡペプチドと競合し得るかどうかも試験した。ｖＭＩＡは、ＢＡＸ媒介アポトーシスのブロックに関与するサイトメガロウイルスタンパク質であり、ウイルス感染及び複製中の宿主細胞生存を確実にする（例えば、Ａｒｎｏｕｌｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００４，１０１：７９８８−７９９３；Ｐｏｎｃｅｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，２７９：２２６０５−２２６１４を参照されたい）。ｖＭＩＡのＢＡＸ結合ドメインは、ヘリックスα１／α２、α３／α４、及びα５／α６と、Ｃ末端α９ヘリックスの一部（α３／α４及びα５／α６ヘアピン８を安定化させることにより、ＢＡＸ活性化による立体配座変化を妨害する）との間の柔軟なループによって形成された別個のポケットに結合することによってその阻害効果を達成する。驚くべきことに、競合蛍光偏光アッセイ（ＦＰＡ）によって評価されたように（図２ｄ、図８ｂ）、ＢＩＦ−４４は、ＢＡＸとの相互作用に対してＦＩＴＣ−ｖＭＩＡと用量応答的に競合した。この発見は、競合−ＳＴＤ  ＮＭＲによって確認され、ｖＭＩＡペプチドとの共インキュベーション時に、ＢＩＦ−４４のＳＴＤシグナルの低減を実証した（図２ｅ）。
【０１９６】
実施例８
ＨＳＱＣ  ＮＭＲ
一様に、１５Ｎ標識組換えＢＡＸを、以前に記載されたように生成した（例えば、Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２０００，１０３：６４５−６５４；Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５５：１０７６−１０８１を参照されたい）。断片の指示されたモル比を有するタンパク質試料を、１０％（ｖ／ｖ）Ｄ２Ｏ中、２５ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭのＮａＣｌ溶液、ｐＨ６．０中で調製した。相関１Ｈ−１５Ｎ  ＨＳＱＣスペクトルを、低温プローブを装備したＢｒｕｋｅｒ  ６００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計で、２５℃において取得し、Ｔｏｐｓｐｉｎ（Ｂｒｕｋｅｒ）で処理して、ＣｃｐＮｍｒ分析を用いて分析した（例えば、Ｖｒａｎｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，２００５，５９：６８７−６９６を参照されたい）。加重平均化学シフト差を、等式２のように計算し、式中、ΔＨ／ΔＮは、指示された交差ピークについての１Ｈ又は１５Ｎのｐ．ｐ．ｍ．の変化である。
等式２．
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【０１９７】
バーの不在は、化学シフト差がないこと、或いはプロリン又は重複したか、若しくは割り当てられなかった残基の存在を示した。ＢＡＸの交差ピーク割り当てを以前に報告されたように適用した（例えば、Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０００，１０３：６４５−６５４を参照されたい）。化学シフト変化についての有意な閾値を、標準的方法に従って、全ての残基にわたる平均化学シフト＋標準偏差に基づいて計算した（例えば、Ｍａｒｉｎｔｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ，２００７，４３０：２８３−３３１を参照されたい）。
【０１９８】
１５Ｎ−ＢＡＸ  ＮＭＲを、ＢＩＦ−４４の滴定時に実施し、ＢＡＸ上のｖＭＩＡ結合部位に関与するまさにその領域に共局在化する一連の限局的な用量応答的化学シフト変化を特定した（図４ａ、図９）。最も顕著な変化（２ＳＤ）は、並置して結合界面を形成する、α３−α４とα５−α６ヘアピンの接合点に局在化していた（図４ｂ）。特に興味深いことは、ＢＩＦ−４４投入量の増加と共に増幅し、α５及びα６の内部らせん領域（すなわち、ＢＡＸの疎水性コア）、並びにα１とα２との間の隣接する内部相互作用面の両方に局在化するより微妙な変化（１ＳＤ）であった（図４ａ〜４ｂ及び図９）（後者のヘリックスは、ＢＡＸ活性化及びオリゴマー化が続いて起こるために、反転して露出されるようにならねばならない重要なＢＨ３モチーフである）。したがって、これらのＮＭＲデータは、非常によく似た相互作用部位におけるＢＩＦ−４４のｖＭＩＡとの競合に関するＳＴＤ及びＦＰＡデータを裏付けるだけでなく、ＢＩＦ−４４の結合がα５−α６疎水性コアを通して、そのＮ末端面におけるＢＡＸのＢＩＭ  ＢＨ３媒介直接活性化に関与する領域であるα１及びα２の内部面まで伝えられる構造的反響を誘導することも示唆した（例えば、Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１０，４０：４８１−４９２；Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５５：１０７６−１０８１を参照されたい）。ＢＩＦ−４４の敏感化活性についての機構的仮説をさらに発展させるために、ＨＳＱＣ  ＮＭＲの結果を、ＢＩＦ−４４／ＢＡＸ複合体のドッキング構造を予測するために適用した。ＢＩＦ−４４は、コア疎水性α５及びα６ヘリックスと、α３とα４との間のループとによって形成された深いポケットに結合して示された（図４ｃ）。
【０１９９】
実施例９
分子ドッキング
次いで、ドッキング部位で、ＢＩＦ−４４の存在下又は非存在下でタンパク質の移動を評価する分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを実施した。計算は、用量応答ＨＳＱＣ  ＮＭＲの結果からも明らかなように、ＢＩＦ−４４ドッキング位置からは遠いが、アロステリックセンシングに供される部位である、ＢＡＸのα１−α２領域（図４ｄ〜４ｅ）に関与する立体配座柔軟性における特異的な増加を示唆した（図９）。本明細書に記載の測定において同定されたＢＡＸの新規な結合部位が、図１５に示されている。
【０２００】
Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒソフトウェアスイート（バージョン２０１６−２）を、ドッキング計算用に使用した。分子ＢＩＦ−４４の立体配座を、ＯＰＬＳ３配位場を用いてＭａｃｒｏＭｏｄｅｌで生成した（例えば、Ｈａｒｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｈｅｏｒｙ  Ｃｏｍｐｕｔ．２０１６，１２：２８１−２９６を参照されたい）。Ｂａｘの２０のＮＭＲ立体配座（ＰＤＦ：１Ｆ１６）のそれぞれを、ＭａｅｓｔｒｏのＰｒｅＷｉｚウィザードのデフォルトパラメータを用いて別個に調製した。ドッキングレセプターグリッド（半径１ｎｍ）を、最高のＨＳＱＣシフトを有するアミノ酸であるＡｌａ１２４の中心で定義した。次いで、Ｇｌｉｄｅ  Ｅｘｔｒａ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ（ＸＰ）モードを用いて、ＢＩＦ−４４を全ての２０個の構造にドッキングさせた（例えば、Ｆｒｉｅｓｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００６，４９：６１７７−６１９６を参照されたい）。次いで、トップスコアのポーズを、複合体について実験的に決定されたＨＳＱＣシフトとの整合性について手動で検査した。
【０２０１】
実施例１０
分子動力学シミュレーション
ＰＤＢ  ＩＤ  １Ｆ１６からのＢＡＸの第１のＮＭＲ構造を、ＭＤ計算用の出発構造として用いた。ＭａｅｓｔｒｏのＰｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｗｏｒｋｆｌｏｗのデフォルトパラメータを用いて、タンパク質を調製した（例えば、Ｓａｓｔｒｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．２０１３，２７：２２１−２３４を参照されたい）。プロトン化状態は、Ｅｐｉｋモジュールを用いてｐＨ７．０で生じると予測されたものであった（例えば、Ｓｈｅｌｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．２００７，２１：６８１−６９１を参照されたい）。タンパク質を、ＤｅｓｍｏｎｄのＳｙｓｔｅｍ  Ｂｕｉｌｄｅｒワークフローを用いて、ＴＩＰ３Ｐ水分子の立方体ボックス中で予備浸漬させた（例えば、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，１９８３，７９：９２６−９３５を参照されたい）。このボックスは、全てのペプチド原子が境界から少なくとも１ｎｍにあるようにサイズ調整した。全ての重複する溶媒分子を除去し、システムを適切な対イオンで荷電中和し、緩衝液条件をシミュレートするために１５０ｍＭのＮａＣｌを添加した。全ての相互作用をモデル化するためにＯＰＬＳ３配位場を加えて、Ｄｅｓｍｏｎｄパッケージを用いて、全てのＭＤシミュレーションを実施した。周期的境界条件を、全体にわたって維持した。粒子メッシュエバルト法を用いて、長距離静電相互作用を計算し（例えば、Ｅｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９９５，１０３：８５７７−８５９３を参照されたい）、ファンデルワールス及び短距離静電相互作用を、０．９ｎｍでスムーズに切り捨てた。能勢−フーバーサーモスタットを用いて、３００Ｋの一定のシステム温度を維持し（例えば、Ｈｏｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｈｙｓ．Ｒｅｖ．Ａ．Ｇｅｎ．Ｐｈｙｓ．１９８５，３１：１６９５−１６９７を参照されたい）、Ｍａｒｔｉｎａ−Ｔｏｂｉａｓ−Ｋｌｅｉｎ法を用いて、システム圧を１気圧に維持した（例えば、Ｍａｒｔｙｎａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９９４，１０１：４１７７−４１８９を参照されたい）。ＲＥＳＰＡ積分器を用いて、結合した短距離相互作用には２．０ｆｓの時間刻みで、０．９ｎｍカットオフを超える非結合の相互作用には６．０ｆｓの時間刻みで、運動方程式を積分した（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．，１９９４，９８：６８８５−６８９２を参照されたい）。シミュレーションの前に、Ｄｅｓｍｏｎｄのデフォルトパラメータを用いて、システムを緩和させた（例えば、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．２０１０，７５：３４８−３５９を参照されたい）。この手順の後に、１００ｎｓのプロダクションシミュレーションを走らせ、設定を４ｐｓ間隔で保存した。全てのシミュレーションを、回転半径の計算及びＲＭＳＤに基づいて収束したことを判定した。
【０２０２】
実施例１１
水素−重水素交換質量分析
水素−重水素交換質量分析（ＨＸＭＳ）実験を、以前に記載されたように実施した（例えば、Ｂａｒｃｌａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１５，５７：８７３−８８６；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０１６，２３：６００−６０７を参照されたい）。重水素標識を、各ＢＡＸタンパク質、分子、ペプチド、及び／又は抗体（ＢＡＸ  ＢＨ３、Ａｂｇｅｎｔ  ＡＰ１３０２ａ；ＢＡＸ  ６Ａ７、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｓｃ−２３９５９）混合物の予備平衡化した（１５分間、室温）アリコートのＤ２Ｏ緩衝液（１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、２００ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、ｐＤ７．０）中への１８倍希釈物で開始した。指示された時点において、標識反応を、等量のクエンチ緩衝液（０．８Ｍの塩化グアニジニウム、０．８％のギ酸［ｖ／ｖ］）の添加によってクエンチした。各重水素標識実験を、少なくとも二通り実施した。４０μｇのペプシン及び２０μｇの第ＸＩＩＩ因子との氷上での５分間のインキュベーションによって、タンパク質分解を実施した。次いで、消化された試料を、以前に記載されたように処理し、分析した（例えば、Ｂａｒｃｌａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１５，５７：８７３−８８６を参照されたい）。全ての評価された条件に共通の同定されたペプチド相対的重水素レベルが示されている。各ペプチドについての平均重水素取り込み量の決定での誤差は、＋／−０．２５Ｄａ以下であった。各ペプチドについての相対的重水素レベルを、非重水素化対照試料の平均質量を、重水素標識試料の平均質量から差し引くことによって計算した。全ての質量スペクトルを、ＤｙｎａｍＸ  ３．０（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて処理した。重水素レベルは逆交換に対して修正されておらず、したがって相対なものとして報告された（例えば、Ｗａｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．Ｒｅｖ．２００６，２５：１５８−１７０を参照されたい）。
【０２０３】
ＢＩＦ−４４敏感化機構が、Ｎ末端誘発部位を介するＢＡＸ活性化のＢＨ３に媒介される開始に関与するα１−α２領域のアロステリック可動化に由来するかどうかを評価するために、比較水素−重水素交換質量（ＨＸＭＳ）分析を、骨格アミド水素の重水素取り込み量を測定することによって、ＢＩＦ−４４．ＨＸＭＳプローブタンパク質構造の存在下又は非存在下で、ＢＡＸ及びリポソームの混合物で、上記のように実施した（例えば、Ｅｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００９，８１：７８７０−７８７５を参照されたい）。重水素緩衝液中に希釈すると、柔軟な及び／又は露出されたタンパク質領域の骨格水素は、急速に重水素と交換するが、一方埋設ドメイン及び／又は骨格アミド水素に関与する水素結合を含有する領域（α−ヘリックスなど）は、減速又は抑制された重水素交換を示す（例えば、Ｌａｉｋｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９６９，８：５１９−５２６；Ｐｒｉｎｔｚ ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９７２，６９：３７８−３８２；Ｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２０１３，８５：１１１８５−１１１８８を参照されたい）。ここでは、ＢＡＸとのインキュベーションの際に、ＢＩＦ−４４が、ＢＡＸのα１−α２ループ及びＢＨ３  α２ヘリックスの遠位部分を包含する領域であるアミノ酸４６〜７４に相当するペプチド断片の限局的な脱保護を誘導することを見出した（図５ａ〜ｂ）。この発見の特異性を更に検証するために、ＢＡＸの別個の領域に結合する２つの抗体の影響を、観察されたＢＩＦ−４４誘導脱保護で試験した。ＢＩＦ−４４が、ＢＡＸのＢＨ３領域を特異的に固定化又は露出させているならば、ＢＡＸ−ＢＨ３特異的抗体は、この領域に迅速に結合して、この領域の重水素交換へのアクセスを抑制すると推論した。逆に、ＢＨ３誘発ＢＡＸ活性化（ａａ１２〜２４）の際に露出するようになる、タンパク質の別の領域に結合する６Ａ７などの抗体（例えば、Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ，２００８，４５５：１０７６−１０８１；Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９７，２７２：１３８２９−１３８３４を参照されたい）は、陰性対照として機能するであろう。実際、ＢＨ３  Ａｂが、ＢＡＸ  ＢＨ３領域のＢＩＦ−４４によって促進された観察した重水素交換を選択的に抑制する（図５ｃ）が、一方６Ａ７抗体がＢＩＦ−４４媒介脱保護に阻害効果を有さないこと（図５ｄ）を見出した。まとめると、ＮＭＲ、ＭＤ、及びＨＸＭＳの結果は、ＢＨ３誘導立体配座変化がＢＡＸ活性化を開始させるα１−α２領域のアロステリック可動化への非カノニカル相互作用部位におけるＢＩＦ−４４結合の連結において一貫性があった。
【０２０４】
別個の部位におけるＢＩＦ−４４及びＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２の結合が、どのように協同してＢＡＸ活性化を誘発するかを検討するために、ＢＩＦ−４４、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２、又はこれらの組み合わせの存在下でのＢＡＸのＨＸＭＳ分析を実施した。ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２及びＢＩＦ−４４の水素−重水素交換プロファイルは、それらの結合の異なる部位及び別個の作用機構と一致して、著しく異なっていた。これに対して、ＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２は、α−ヘリックス１及び６の合流点によって形成されたＮ末端誘発部位に直接結合し、α１−α２ループを移動させて６Ａ７エピトープ露出をもたらす（例えば、Ｇａｖａｔｈｉｏｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１０，４０：４８１−４９２；Ｂａｒｃｌａｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１５，５７：８７３−８８６を参照されたい）。ＢＩＦ−４４は遠位部位に結合し、遠位α１−α２ループ及びＢＨ３  α２ヘリックスに局在化した限局的なアロステリック変化を引き起こした（図６ａ）。組み合わせ処置は、ＢＩＦ−４４の、ＢＡＸのＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２媒介立体配座活性化を効果的に敏感化する能力と一致して、α１−α２領域の本質的に全体の脱保護を著しく増幅させた（図６ａ〜６ｂ）。
【０２０５】
実施例１２
ミトコンドリアシトクロムｃ放出アッセイ
ＡｌｂＣｒｅＢａｘｆ／ｆＢａｋ−／−マウスから肝臓のミトコンドリア（０．５ｍｇ／ｍＬ）を単離し、放出アッセイを記載されたように実施した（例えば、Ｗａｌｅｎｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２００６，２４：１９９−２１０を参照されたい）。簡単に言うと、ミトコンドリアを、実験用緩衝液（２００ｍＭのマンニトール、６８ｍＭのスクロース、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ［ｐＨ］７．４、１１０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤）中で、１００ｎＭのＢＡＸ、２５０ｎＭのＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２及び／又は指示された濃度のＢＩＦ−４４と、室温で４５分間インキュベートした（例えば、Ｌｌａｍｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，２０１１，４４：５１７−５３１を参照されたい）。ペレット及び上清画分を、遠心分離によって単離し、比色ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて、シトクロムｃを定量した。上清中に放出されたシトクロムｃの割合（％ｃｙｔｏ  ｃ放出）を、等式３に従って計算し、式中、ｃｙｔｏ  ｃｓｕｐ及びｃｙｔｏ  ｃｍａｘは、それぞれ、化合物処理試料又は１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００処理試料の上清で検出されたシトクロムｃの量を表す。
等式３
％ｃｙｔｏ  ｃ放出＝［ｃｙｔｏ  ｃｓｕｐ］／［ｃｙｔｏ  ｃｍａｘ］＊１００
【０２０６】
最後に、これらの興味深い機構的発見を生理学的状況に結びつけるために、処置されたマウスの肝臓のミトコンドリアからのシトクロムｃ放出によって測定される、ＢＩＦ−４４の、ＢＡＸ媒介ミトコンドリアアポトーシスを敏感化する能力を試験した。ＨＸＭＳによって観察されたようなＢＡＸのＮ末端領域の立体配座活性化における相乗作用と一致して、ＢＩＦ−４４は、ＢＡＸが媒介するミトコンドリアからのシトクロムｃ放出のＢＩＭ  ＳＡＨＢＡ２が誘導する誘発を用量応答的に敏感化した（図６ｃ）。したがって、ＮＭＲスクリーニングは、新規なアロステリック機構によって、ＢＨ３が媒介する直接的ＢＡＸ活性化の開始を促進する小分子のＢＡＸ敏感化物質を同定した。
【０２０７】
実施例１３
等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）
Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ＩＴＣ（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて、２５℃で、０．１５ｍＭの組換えＢＡＸタンパク質を細胞に添加し、２．０μＬの１．０ｍＭのリガンドを注射器で合計３０回の注射により注入することによって、結合親和性を測定した。ＢＡＸ及びＢＩＦ−４４溶液を、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．２）中で、２％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯの最終濃度で調製した。試料を４℃で１５分間遠心分離した後に、滴定した。ＩＴＣ実験を二通りで実施し、単一結合部位モデル及び等式４に従って計算された熱力学パラメータ（式中、ΔＧ、ΔＨ及びΔＳは、それぞれ、結合の自由エネルギー、エンタルピー及びエントロピーの変化である）を用いて、データをＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅソフトウェアパッケージ（ＴＡ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で分析した。ＩＴＣ測定の結果を、図１０に示している。
等式４
ΔＧ＝ΔＨ−ＴΔＳ＝−ＲＴｌｎＫＢ
【０２０８】
実施例１４
小分子アグリゲータのＮＭＲベースの検出
線広がりを検出するために、標準的１Ｈ−ＮＭＲスペクトルを取得した。上記のように実施した、分子のＣＰＭＧ  ＮＭＲスペクトルを測定することによって、Ｔ２減衰曲線を生成した。エコーサイクルの数は、減衰時間に相当する。指示された減衰時間における芳香族ピークの強度を測定し、１０ｍｓの減衰時間における１の最大強度に正規化した。Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｇｒａｐｈｐａｄ）を用いて、曲線を１フェーズ減衰モデルに適合させた。励起彫刻を、溶媒消去に使用した。両方の分析用の試料は、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液ｐＨ６．２、１０％（ｖ／ｖ）Ｄ２Ｏ中で調製した。これらの測定の結果を、図１２〜１３に記載する。
【０２０９】
実施例１５
動的光散乱
９０°検出器角度を有するＤｙｎａＰｒｏ−９９機器で、測定当たり１０秒の取得時間を用いて、試料を測定した。化合物を１００ｍＭのストックから、２０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．２中で、１％のＤＭＳＯ最終濃度で希釈した。動的光散乱測定の結果を、図１４に示している。
【０２１０】
他の実施形態
本発明が、その詳細な説明と共に説明されてきたが、前述の説明は、本発明を例解することを意図しており、添付の特許請求の範囲の範囲によって定義される本発明の範囲を限定するものではないことが理解されるべきである。他の態様、利点、及び変更は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。組み合わせの互換性を保証するために、必要に応じて変更を伴って、本発明の任意の特定の実施形態に関して本明細書に記載された特徴のいずれかを、本明細書に記載された本出願の任意の他の実施形態の他の特徴のいずれかのうちの１つ又は複数と組み合わせることができることを、本発明に関連する分野の当業者は理解されたい。このような組み合わせは、本出願の一部であると見なされる。
【図１Ａ】
2020514367.tif 000046
【図１Ｂ】
2020514367.tif 000047
【図１Ｃ】
2020514367.tif 000048
【図１Ｄ】
2020514367.tif 000049
【図２Ａ】
2020514367.tif 000050
【図２Ｂ】
2020514367.tif 000051
【図２Ｃ】
2020514367.tif 000052
【図２Ｄ】
2020514367.tif 000053
【図２Ｅ】
2020514367.tif 000054
【図３Ａ】
2020514367.tif 000055
【図３Ｂ】
2020514367.tif 000056
【図３Ｃ】
2020514367.tif 000057
【図３Ｄ】
2020514367.tif 000058
【図３Ｅ】
2020514367.tif 000059
【図４Ａ】
2020514367.tif 000060
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
2020514367.tif 000062
【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2020514367.tif 000070
【図６Ｃ】
2020514367.tif 000071
【図７Ａ−７Ｃ】
2020514367.tif 000072
【図８Ａ】
2020514367.tif 000073
【図８Ｂ】
2020514367.tif 000074
【図９】
2020514367.tif 000075
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2020514367.tif 000081
【配列表】
2020514367000001.app
【国際調査報告】
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