(57)【要約】  本発明は、血管分化が可能な幹細胞を提供し、前記幹細胞における中胚葉分化を刺激し、前記幹細胞における血管分化を刺激し、前記幹細胞から細胞凝集体を発生させ、前記細胞凝集体をコラーゲン３Ｄマトリックス内に埋め込み、前記コラーゲン３Ｄマトリックス内の前記凝集体の血管分化を刺激することを含む、人工血管オルガノイドを生成する方法と；前記方法から得られるオルガノイドと；試験される操作及びスクリーニングにおける前記方法及びオルガノイドの使用と；前記方法を実施するためのキットと、に関する。
2020523027.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工血管オルガノイドを生成する方法であって、血管分化が可能な幹細胞を提供し、前記幹細胞における中胚葉分化を刺激し、前記幹細胞における血管分化を刺激し、前記幹細胞から細胞凝集体を発生させ、前記細胞凝集体をコラーゲン３Ｄマトリックスに埋め込み、そして前記コラーゲン３Ｄマトリックスにおける前記凝集体の血管分化を刺激することを含む、上記方法。
【請求項２】
コラーゲンマトリックス内に埋め込まれた前記細胞凝集体が少なくとも３０個の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中胚葉分化が、前記幹細胞を、Ｗｎｔアゴニスト又はＧＳＫ阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１で処理することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞における血管分化が、前記幹細胞をＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ−Ａ、及び／又はＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ−２、及び／又ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、及び／又は１２％（ｖ／ｖ）以下の大気酸素の低酸素条件で処理することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記凝集体の血管分化が、前記凝集体の細胞をＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ−Ａ、及び／又はＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ−２で処理することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記コラーゲン３Ｄマトリックスが、少なくとも５０質量％のコラーゲンを含み、及び／又は前記コラーゲン３Ｄマトリックスが、１０％〜５０％のラミニン、２０％〜７０％のコラーゲンＩ、及び／又は２％〜３０％のコラーゲンＩＶを含み、好ましくは、さらに０．５％〜１０％のニドゲン、０．５％〜１０％のヘパラン硫酸プロテオグリカン、及び／又は０．５％〜１０％のエンタクチン（全て質量％）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記３Ｄマトリックスが、好ましくは１０〜３０の粘弾性貯蔵弾性率Ｇ’を有するヒドロゲルである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
毛細血管が内皮及び血管周囲の周皮細胞を有する基底膜を含む、毛細血管の相互接続ネットワークを含む人工血管オルガノイド培養物。
【請求項９】
前記オルガノイドが、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって産生される、請求項８に記載の人工血管オルガノイド培養物。
【請求項１０】
前記毛細血管が、コラーゲンを有するヒドロゲルを含む人工３Ｄマトリックス内に埋め込まれている、請求項８又は９に記載の人工血管オルガノイド培養物。
【請求項１１】
前記オルガノイド培養物が、個々の血管及び毛細血管の交点間の血管を計数すると４０〜１０００個の血管を含む、請求項８、９、又は１０の人工血管オルガノイド培養物。
【請求項１２】
前記毛細血管が１μｍ〜３０μｍの平均直径を有し、及び／又は内皮細胞と血管周囲の周皮細胞の比率が１００：１〜１：５であり、及び／又は前記毛細血管が成熟内皮細胞及び／又は成熟周皮細胞を含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の人工血管オルガノイド培養物。
【請求項１３】
非ヒト動物モデルにヒト毛細血管を提供する方法であって、前記ヒト毛細血管が内皮と血管周囲の周皮細胞を含む基底膜とを含み、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のヒト血管オルガノイドを非ヒト動物に導入する工程と、前記オルガノイドにその毛細血管を増殖させる工程とを含み、好ましくは、前記ヒトオルガノイドは前記非ヒト動物の腎臓の上又は中に導入される、上記方法。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載の挿入された人工血管オルガノイド培養物を含む非ヒト動物モデル、又はヒト毛細血管を有する非ヒト動物モデルであって、前記ヒト毛細血管が、内皮細胞と血管周囲の周皮細胞を含む基底膜とを含み、好ましくは、前記人工血管オルガノイド培養物の毛細血管又は前記ヒト毛細血管が、前記非ヒト動物の血液循環系によって灌流される、上記モデル。
【請求項１５】
前記血管又は毛細血管が病因に曝され、前記オルガノイド又はヒト動物モデルが病態のモデルであり、好ましくは、病因が高血糖症及び／又は炎症を含み、及び／又は前記病態が糖尿病であり、好ましくは前記炎症が１つ以上の炎症性サイトカイン、好ましくはＴＮＦ−アルファ及び／又はＩＬ−６への曝露を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法又は培養物又は非ヒト動物モデル。
【請求項１６】
病因または病態に影響を及ぼす候補化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の培養物又は非ヒト動物モデルの生成中に、前記候補化合物を前記培養物又は非ヒト動物モデルに投与し、候補化合物を投与していない前記培養物又は動物モデルと比較して、前記培養物又は動物モデルの生理学的差異をモニターすることを含む上記方法。
【請求項１７】
組織置換療法、特に好ましくは前記人工血管オルガノイドを創傷内に配置し、前記人工血管オルガノイド培養物を創傷内に組み込むことを含む治療法におけるインプラントとしての、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の人工血管オルガノイドの使用。
【請求項１８】
糖尿病性血管障害、閉塞性血管障害、血管透過性の変化、組織低酸素症、心臓病、脳卒中、腎疾患、失明、創傷治癒障害、又は慢性皮膚潰瘍などにおける、肥厚した毛細血管基底膜の治療又は予防における、Ｎｏｔｃｈ３活性化経路阻害剤の使用。
【請求項１９】
前記Ｎｏｔｃｈ３活性化経路阻害剤が、ガンマセクレターゼ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ３阻害剤、ＤＬＬ４阻害剤、又はこれらの組み合わせである、請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の人工血管オルガノイドの生成に適したキットであって、（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト又はＧＳＫ阻害剤、（ｉｉ）ＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ−Ａ、ＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ−２、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４から選択される血管分化因子、（ｉｉｉ）好ましくは１０％〜５０％のラミニン、２０％〜７０％のコラーゲンＩ、及び／又は２％〜３０％のコラーゲンＩＶ（全て質量％）を含むコラーゲン３Ｄマトリックス、を含む上記キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、人工血管オルガノイドの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
血管は、血管疾患と呼ばれるさまざまな疾患にかかりやすい。血管のネットワークに障害があるとさまざまな健康上の問題が発生する可能性があり、これらは深刻な場合や致命的な場合がある。このような疾患は、環境的な病因により引き起こされるか、又は発生障害に起因する可能性がある。
【０００３】
Goodwin (Microvasc Res. 2007; 74(2-3): 172-183)は、多くの疾患の病因における血管新生に影響を与える薬剤の活性を評価するために、インビトロの血管新生アッセイについて説明している。
【０００４】
Duffy et al. (European Cells and Materials 21, 2011: 15-30)は、表面接着２Ｄ培養におけるコラーゲン−グリコサミノグリカン足場のインビトロ血管新生について説明している。
【０００５】
Nakagami et al. (Hypertension 2006; 48:112-119) は、胚性幹細胞を内皮細胞及び血管平滑筋細胞を含む発芽血管に強制的に発生させるマトリゲルを使用する、細胞−マトリックス相互作用による血管新生の方法を提供する。
【０００６】
Kusuma et al. (PNAS 110(31), 2013: 12601-12606)、 Gerecht-Nir et al. (Laboratory Investigation 83(12), 2003: 1811-1820)、国際公開第２００７／１４０３４０Ａ２号、国際公開第２０１４／１４５８７１Ａ１号、ＵＳ２０１４／２７３２２０Ａ１、及び国際公開第２０１７／０１５４１５Ａ１号は、工学作成されたマトリックスにおける分離された初期血管細胞からの血管構造の形成について記載している。マトリックスに導入する前に、細胞は、初期血管細胞に分化し、次に個別化（トリプシン処理及び／又は４０μｍメッシュによるろ過により）されたヒト多能性（pluripotent）幹細胞から得られる。個々の細胞はマトリックス内で増殖し、そこで集合して血管ネットワークを形成する。これらの論文の目標は、再生医療に役立つ自己集合性細胞を提供することであった。
【０００７】
国際公開第２０１１／１１５９７４Ａ１号は、表面に２Ｄ培養血管ネットワークを形成するための装置に関する。
【０００８】
Shen et al. (Cell Research 13 (5) (2003): 335-341) は、成体ウサギの平滑筋細胞からの、及びマウスの分化内皮細胞からの工学作成血管の形成を記載している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
しかし以前の血管モデルは、インビボで形成された自然の血管ネットワークとの十分な類似性に欠けており、従って、改善された、より実物に近い血管モデルが必要である。
【００１０】
従って、本発明の目的は、疾患モデル及びスクリーニング手順での試験などのより幅広い用途を可能にするモデルに加えて、改善された血管モデルを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、血管分化が可能な幹細胞を提供し、前記幹細胞における中胚葉分化を刺激し、前記幹細胞における血管分化を刺激し、前記幹細胞から細胞凝集体を発生させ、前記細胞凝集体をコラーゲン３Ｄマトリックスに埋め込み、そして前記コラーゲン３Ｄマトリックスにおける凝集体の血管分化を刺激することを含む、人工血管オルガノイドを生成する方法を提供する。
【００１２】
密接に関連する態様において本発明は、１０％〜５０％のラミニン、２０％〜７０％のコラーゲンＩ、及び／又は２％〜３０％のコラーゲンＩＶを含むコラーゲン３Ｄマトリックス内に血管幹細胞を埋め込むことと、前記コラーゲン３Ｄマトリックスにおける前記幹細胞の血管分化を刺激することとを含む、人工血管オルガノイドを生成する方法を提供する。
【００１３】
このような方法を使用して、本発明のさらなる態様を形成する血管オルガノイドを提供することができる。特に本発明は、毛細血管の相互接続ネットワークを含む人工血管オルガノイド培養物を提供し、ここで前記毛細血管は、内皮と血管周囲の周皮細胞を有する基底膜とを含み、（ｉ）前記オルガノイドは本発明の方法により産生され、及び／又は（ｉｉ）前記毛細血管は、コラーゲンを有するヒドロゲルを含む人工３Ｄマトリックス内に埋め込まれており、及び／又は（ｉｉｉ）前記オルガノイド培養物は、個々の血管及び毛細血管の交点間の血管を計数すると４０〜１０００個の血管を含む。３つの全ての特徴（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）は本発明の代表的特徴であり、これらは本発明の人工血管オルガノイド培養物によって個々に又は組み合わせで必要とされ得る。
【００１４】
本発明はさらに、非ヒト動物モデルにヒト毛細血管を提供する方法を提供し、ここで前記ヒト毛細血管は、内皮と血管周囲の周皮細胞を含む基底膜とを含み、前記方法は、本発明のヒト血管オルガノイドを非ヒト動物に導入する工程と、上記オルガノイドに毛細血管を増殖させる工程とを含む。
【００１５】
本発明はまた、このような人工血管オルガノイド培養物、例えば挿入体を含む非ヒト動物モデルにも関する。さらに、ヒト毛細血管を有する非ヒト動物モデルが提供され、ここで前記ヒト毛細血管は、内皮と血管周囲の周皮細胞を含む基底膜とを含む。
【００１６】
本発明はさらに、本発明の培養物又は非ヒト動物モデルの使用、又は例えば糖尿病などの病態のモデルとしてそれらを生成する方法に関し、ここで、オルガノイド又は非ヒト動物モデルにおけるオルガノイドは、病因に曝されて、前記病態、例えば糖尿病における高血糖症又は膵臓ベータ細胞の破壊を発症しやすい。
【００１７】
本発明はさらに、病因または病態に影響を及ぼす候補化合物（candidate chemical compound）をスクリーニングする方法であって、前記候補化合物を、本発明の任意の態様による培養物又は非ヒト動物モデルに、又は前記培養物又は非ヒト動物モデルの生成中に投与し、前記候補化合物を投与していない培養物又は動物モデルと比較して、前記培養物又は動物モデルにおける生理学的差異をモニターすることを含む、上記方法を提供する。
【００１８】
本発明は、糖尿病の新しい治療モデルを提供している。すなわち本発明は、例えば糖尿病性血管障害、閉塞性血管障害、血管透過性の変化、組織低酸素症、心臓病、脳卒中、腎疾患、失明、創傷治癒障害、又は慢性皮膚潰瘍における厚膜毛細血管基底膜の治療又は予防における、Ｎｏｔｃｈ３活性化経路阻害剤（例えば、ガンマセクレターゼ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ３阻害剤、ＤＬＬ４阻害剤、又はこれらの組み合わせ）の使用を提供する。厚膜毛細血管基底膜は、を含む。また、このような治療又は予防で使用するためのＮｏｔｃｈ３活性化経路阻害剤（例えば、ガンマセクレターゼ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ３阻害剤、ＤＬＬ４阻害剤）、又はこのような治療又は予防のための医薬品若しくは医薬組成物の製造に使用するためのＮｏｔｃｈ３活性化経路阻害剤（例えば、ガンマセクレターゼ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ３阻害剤、ＤＬＬ４阻害剤）の使用も提供される。
【００１９】
最後に、本発明は、（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト又はＧＳＫ阻害剤、（ｉｉ）ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＢＭＰから選択される血管分化因子、（ｉｉｉ）コラーゲン３Ｄマトリックスを含む、本発明の任意の方法による人工血管オルガノイドの生成に適したキットを提供する。
【００２０】
本発明の全ての実施態様は、以下の詳細な説明で一緒に説明され、全ての好適な実施態様は、同様に、全ての実施態様、態様、方法、オルガノイド、動物モデル、用途、及びキットに関連する。例えばキット又はこれらの構成要素は、本発明の方法で使用されるか、又は本発明の方法に適している。記載された方法で使用されるいかなる構成要素も全てキットに含まれ得る。本発明のオルガノイドは本発明の方法の結果であるか、又は本発明の方法及び用途に使用することができる。本発明の方法の好適な詳細な説明は、本発明の得られた又は使用されたオルガノイド又は動物モデルの適合性について、同様に理解される。特に他に明記されない限り、全ての実施態様は互いに組み合わせることができる。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】ヒト幹細胞からのヒト血管ネットワークの生成。ａ、ヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）とヒトｉＰＳＣとを、血管ネットワークと自由浮遊性血管オルガノイドに分化させるためのプロトコールの概略図。下のパネルは、示された分化段階で観察された代表的な形態を示す。ｂ、ｃ、ＣＤ３１発現内皮細胞の免疫蛍光は、コラーゲンＩ／マトリゲルマトリックスにおける複雑な相互接続された血管ネットワークの確立を示す。ｄ、共焦点画像解析に基づくＣＤ３１+血管ネットワークの３Ｄ再構成。再構成のスケールは３つの軸で示される。ｅ、ＩＣＡＭ−１発現の誘導により明らかにされた３Ｄ内皮ネットワークのＴＮＦα媒介活性化。ｆ〜ｈ、ＣＤ３１+内皮及び周皮細胞特異的マーカーＣＮＮ１、ＰＤＧＦＲβ、及びＳＭＡによって決定される血管ネットワークの内皮（緑）及び周皮細胞（赤）の範囲。基底膜の形成はＩＶ型コラーゲン（ＣｏｌＩＶ）の発現によって示される。ｉ、内皮管を覆う基底膜の沈着を視覚化するためのＩＶ型コラーゲン（ＣｏｌＩＶ）の免疫蛍光法により示される自己組織化ヒト毛細血管オルガノイド。注目ことに、ｂ〜ｉ中のデータは、ヒト胚性幹細胞に由来する血管オルガノイドからのものである。ＤＡＰＩ染色は核を画像化することが示されている。倍率は各パネルに示される。
【図２】成熟した連続的なヒト毛細血管の生成。ａ、自由浮遊性オルガノイドは、ＰＤＧＦＲβの発現によって決定されるように、周皮細胞によってしっかりと覆われた高密度内皮ネットワーク（ＣＤ３１+）を示す。自由浮遊性オルガンオイド全体について３Ｄ再構成が示される（左上のパネル）。ｂ、ＣＤ３１+内皮の免疫蛍光法及びＨ＆Ｅ染色により示される、自由浮遊性血管オルガノイドにおける内皮管腔形成。ｃ、自由浮遊性血管オルガノイドの代表的な電子顕微鏡写真。密着結合（白い矢じり）と基底膜（黒い矢印）の外観を有する管腔化された連続的な毛細血管様の構造の生成に注目されたい。Ｌ、管腔；Ｅ、内皮細胞。ｄ、ＣＤ３１+端細胞（矢じり）は新しく形成されている細胞を示す。血管新生の部位にＣｏｌＩＶ+基底膜が存在しないことに注目されたい。倍率は各パネルに示されている。
【図３】マウスにおける機能的ヒト血管樹の確立。ａ、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの腎被膜へのヒト血管オルガノイドの移植。左上のパネルは移植部位を示す（矢印）。ヒトオルガノイド由来の血管系は、マウス腎臓の染色（挿入図）に例示されるマウス内皮と交差反応しないヒト特異的ＣＤ３１抗体によって視覚化される。ｂ〜ｃ、ＦＩＴＣ−デキストラン灌流（緑）により明らかにされたマウスにおける機能的ヒト血管系（ヒト特異的抗ＣＤ３１免疫染色により検出、ｈＣＤ３１、赤）。ｄ、灌流されたヒト血管を標識するためのヒト特異的抗ＣＤ３１抗体の注入。マウス血管は、マウス特異的抗ＣＤ３１抗体によって視覚化される（ｍＣＤ３１、緑色）。ｅ、Ｈ＆Ｅ染色された組織切片で示されるヒト血管オルガノイド移植物内に出現する代表的な細動脈（Ａ）及び細静脈（Ｖ）。ｆ、ヒトの移植された血管オルガノイドにおけるヒト細動脈（Ａ）及び細静脈（Ｖ）の生成。細動脈は、ＳＭＡ、カルポニン、及びＭＹＨ１１免疫染色によって検出される血管平滑筋細胞（ｖＳＭＣ）でしっかりと覆われた、ヒトＣＤ３１+内皮細胞（赤色）の染色によって示される。細静脈は、典型的な平らな内皮表現型とまばらなｖＳＭＣ範囲を示す。マウス細動脈の内皮細胞は、腎血管で示されるように、ヒト特異的ＣＤ３１抗体と交差反応しない（右下のパネル）。倍率は各パネルに示されている。ｇ、ＭＲＩで測定された代表的な軸方向Ｔ2強調画像、血流（灌流）、相対血液量（ｒＢＶ）、平均通過時間（ＭＴＴ）及び漏れ（Ｋ2）。軸面は、腎臓（白で縁取られた）とインプラント（赤で縁取られた）の両方が見えるように選択された。筋肉組織は緑色で縁取られている。灌流、ｒＢＶ、ＭＴＴ、及びＫ2の定量値（±ＳＤ）を以下の表に示される。ｎ＝３匹のマウスが分析された。
【図４】ヒトの血管オルガノイドにおける糖尿病性微小血管障害のモデル化。ａ、ＰＡＳ染色（左）及び基底膜を検出するためのＣＤ３１+内皮細胞とＣｏｌＶの染色により示される、後期２型糖尿病患者の皮膚生検における皮膚毛細血管の基底膜肥厚。非糖尿病患者の皮膚血管が対照として示される。ｂ、後期２型糖尿病患者及び非糖尿病患者の皮膚毛細血管の代表的な電子顕微鏡写真は、非糖尿病対照（矢じり）の基底膜と比較して、糖尿病患者（両側の矢印）の異常に厚い基底膜の形成を示す。Ｌ、管腔；Ｅ、内皮細胞；Ｐ、周皮細胞。棒グラフは、基底膜の肥厚の定量を示す（平均値±ＳＤ）。ｎ＝６。＊＊＊ｐ＜０．００１（対応のない両側ｔ検定）。ｃ〜ｄ、ヒト血管オルガノイドは、高血糖［７５ｍＭグルコース］時のＩＶ型コラーゲンの沈着の増加を示し、これは、炎症誘発性サイトカインＩＬ６［１ｎｇ／ｍＬ］及びＴＮＦα［１ｎｇ／ｍｌ］と組合せた高グルコース（「糖尿病カクテル」）による処理により、さらに顕著に増加している。ｃ、基底膜の肥厚の代表的な画像。挿入図は管腔血管の共焦点断面を示す。ｄ、共焦点断面を使用して、ＩＶ型コラーゲンの肥厚を定量した。個別に測定された血管は点で示される。３つの独立した生物学的複製物から、実験条件ごとに１３０を超える血管内腔を分析した。＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。ｅ、高グルコース／ＩＬ６／ＴＮＦα処理は、ヒト毛細血管の内側を覆うＣｏｌＩＶ陽性基底膜の顕著な拡張をもたらす。右のパネルは、ＣＤ３１+内皮管を直接被覆する基底膜の肥厚の３Ｄ再構築を示す。カプロニン免疫染色は周皮細胞をマークする。ｆ、「糖尿病」及び非糖尿病条件下で培養された血管オルガノイドの代表的な電子顕微鏡画像は、糖尿病治療時の顕著な基底膜肥厚を確認している。糖尿病条件における基底膜の複数の層（両側矢印）に注目されたい。これは、対照オルガノイド（矢じり）では観察することができない。Ｌ、管腔；Ｅ、内皮細胞；Ｐ、周皮細胞。全ての倍率が示されている。
【図５】γ−セクレターゼの阻害は、糖尿病性血管オルガノイドの血管基底膜の肥厚を抑止する。ａ、糖尿病条件（高グルコース／ＩＬ６／ＴＮＦα）及び非糖尿病条件下で培養した血管オルガノイドから選別したＣＤ３１+内皮細胞ＦＡＣＳのトランスクリプトーム分析。示差的に発現された遺伝子及び上位５つのアップレギュレートされた遺伝子（ｐ値でランク付け）とアップレギュレートされた遺伝子のＧＯ：生物学的プロセスのヒートマップが、糖尿病と非糖尿病の状態を比較して示されている。「糖尿病」血管オルガノイドとＩＩ型患者由来の皮膚内皮ＣＤ３１+細胞からのアップレギュレートされた遺伝子を比較する一般的なＧＯ：分子機能項は、それぞれのｐ値でプロットされる。患者のアップレギュレートされた遺伝子は、非糖尿病の個体からの選別されたＣＤ３１+内皮細胞と比較して、ＩＩ型糖尿病患者から選別されたＣＤ３１+内皮細胞から得られた。ｂ、ｃ、一般的に処方されている糖尿病薬は、糖尿病カクテル（高グルコース／ＩＬ６／ＴＮＦα）によるヒト血管オルガノイドの処理時の基底膜肥厚に影響しない。ｂ、コラーゲンＩＶ（ＣｏｌＩＶ）染色を使用した基底膜肥厚の代表的な画像。挿入図は、コラーゲンＩＶで覆われた内腔血管の共焦点断面を示す（緑）。ｃ、基底膜の肥厚を定量するために光学断面を使用した。各管腔化された血管は点として表示される。３つの独立した生物学的複製物から各実験条件について、１３０を超える管腔を分析した。＊＊＊ｐ＜０．００１（ビヒクルと薬物処理されたオルガノイドを、オルガノイドが非糖尿病条件下で並行して培養されたオルガノイドを比較するスチューデントのｔ検定）。示された比較に加えて、他の全ての薬物処理は、非糖尿病条件と比較してｐ＜０．００１であり、それぞれのビヒクル糖尿病条件対照と比較して有意ではなかった。薬剤の投与量と培養条件は、方法に記載されている。ｄ、ｅ、ＤＡＰＴによるγ−セクレターゼの阻害は、ＣｏｌＩＶによって視覚化された、「糖尿病」条件下で培養された血管オルガノイドの血管基底膜の肥厚を抑止する。ｄ、さまざまなシグナル伝達経路の小分子阻害剤で処理された糖尿病血管における基底肥厚の代表的な画像。挿入図は、コラーゲンＩＶに包まれた内腔血管の共焦点断面を示す（ＣｏｌＩＶ、緑）。ｅ、共焦点断面を使用して、基底膜の肥厚を定量した。１３０を超える管腔化された血管（各血管は個々の点として表示される）は、３つの独立した生物学的複製物から各実験条件で分析された。＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。注目すべきことに、示された比較に加えて、他の全ての薬物処理は非糖尿病条件と比較してｐ＜０．００１であり、ビヒクル糖尿病条件対照と比較して有意ではなかった。薬物の投与量及び培養条件は、方法に記載されている。ｆ、ｇ、γ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴによる基底膜肥厚の防止は用量依存的である。定量により、示された条件に曝露された少なくとも異なるオルガノイドからの１３０を超える管腔の管腔化構造（点）のＣｏｌＩＶ厚さが示される。＊＊＊ｐ＜０．００１（スチューデントｔ検定）。
【図６】ヒトＥＳ細胞の血管オルガノイドへの分化。ａ、３Ｄ内皮管における内皮マーカーＣＤ３１及びＶＥ−カドヘリンの共発現。コラーゲンＩマトリックス中で増殖されたＥＳＣ由来のオルガノイドの代表的なデータを示す。ｂ、ｃ、ヒトｉＰＳ細胞は、ＣＤ３１+陽性管中で効率的に分化する。ｂ、２０回を超えて繰り返した実験の代表的な画像を示す。ｃ、共焦点画像解析に基づくｉＰＳ細胞に由来するＣＤ３１+血管ネットワークの３Ｄ再構築。再構成のスケールは３つの軸で示される。ｂ及びｃのデータ、及びコラーゲンマトリックス内で増殖されたオルガノイドのデータ。ｄ、ｉＰＳ細胞由来の自由浮遊性オルガノイド全体の３Ｄ再構築を示す。データは、抗ＣＤ３１抗体で画像化されたオルガノイド全体の共焦点画像解析を使用して得られた。再構成のスケールは３つの軸で示される。全ての倍率はパネルに示される。
【図７】血管オルガノイドの分子特性解析。ａ、示された組織からの遺伝子型−組織発現（ＧＴＥｘ）ＲＮＡＳｅｑデータと比較した、血管オルガノイドからのＦＡＣＳ選別したＣＤ３１+内皮細胞のトランスクリプトームのヒートマップ（ＲＮＡｓｅｑ）。インビトロで生成された内皮管の遺伝子発現プロフィールは、ヒトの血管組織（ＧＴＥＸ＿Ａｒｔｅｒｙ＿Ｃｏｒｏｎａｒｙ、ＧＴＥＸ＿Ａｒｔｅｒｙ＿Ａｏｒｔａ  ＧＴＥＸ＿Ａｒｔｅｒｙ＿Ｔｉｂｉａｌ）と最も密接にクラスター形成する。ｂ、多能性、血管周囲細胞、及び内皮細胞のマーカー遺伝子のヒートマップ。血管オルガノイドからのＦＡＣＳで選別されたＣＤ３１+内皮細胞を、既に公開された２Ｄ培養条件のｉＰＳ細胞由来の初代及び分化内皮細胞と比較した（Patsch et al. Nat. Cell Biol. 17, 994-1003 (2015)）。ｃ、血管オルガノイド中のＣＤ３１+内皮管（緑）を取り囲む基底膜を画像化するラミニン発現（青）。コラーゲンＩマトリックス中で増殖したヒトＥＳＣ由来の血管オルガノイドの代表的な画像を示す。倍率はパネルに示される。
【図８】一般的な糖尿病のげっ歯類モデルは、皮膚の微小血管系に基底膜肥厚を示さない。ａ、非糖尿病対照コホートと比較した、示された糖尿病のラット及びマウスモデルにおける皮膚の毛細血管の基底膜の厚さの定量。詳細については、補足表２を参照されたい。データは、分析された血管の平均値±ＳＤとして示される。コホートあたり５匹を超える動物。年齢を合わせたＣ５７ＢＬ／ＫｓＪ及びＣ５７ＢＬ／ＫｓＷＴマウスを対照として使用した。ＺＤＦラットモデルについて、ヘテロ接合性ラット（ｆａ／＋）を対照として使用した。基底膜の肥厚は、コラーゲンＩＶ免疫染色の形態計測分析に基づいて決定された。ｂ、ＣＤ３１+（赤）陽性血管を覆うＣｏｌＩＶ（緑）沈着を証明するためのさまざまなマウスモデルの皮膚切片の代表的な画像。
【図９】ヒトＥＳＣ由来血管オルガノイドの基底膜肥厚。ａ、ＥＳ細胞由来の血管を糖尿病培地（高グルコース／ＩＬ６／ＴＮＦα）又は通常の条件下（非糖尿病）で処理した。基底膜の肥厚は、ＣＤ３１陽性（赤）内皮管の周りのＣｏｌＩＶ特異抗体（緑）を用いて視覚化された。挿入図は共焦点断面を示す。ＣＮＮ１は周皮細胞を示す。ｂ、糖尿病性血管オルガノイドにおけるＣｏｌＩＶ発現の増強。Ｃｏｌ４ａ１及びＣｏｌ４ａ２の発現は、糖尿病培地（高グルコース／ＩＬ６／ＴＮＦα）で２週間処理された血管オルガノイド中でｑＰＣＲにより決定され、未処理の対照オルガノイドと比較した。値は平均±ＳＤとして示される。＊ｐ＜０．０５（スチューデントｔ検定）。１５を超える血管オルガノイドのプールを２つの独立した実験で使用した。
【図１０】血管オルガノイドにおける内皮細胞及び周皮細胞への多能性幹細胞の効率的な分化。ａ、１８日目の確立された血管ネットワークと３０日目の後期血管オルガノイドを、ＦＡＣＳによって内皮細胞と細胞周囲の含有量について分析した。いずれの場合も、分化後の細胞集団の８０％超が内皮細胞（ＣＤ３１+）及び周皮細胞（ＣＤ１４０ｂ+）である。Ｐ、周皮細胞；ＥＣ、内皮細胞。ｂ、造血細胞（ＣＤ４５+）はほとんど生成されず（約１％）、分化後に見られた細胞の約１０％は間葉系幹細胞様の細胞（ＣＤ７３+、ＣＤ９０+）である。
【図１１】血管オルガノイド中の成熟内皮細胞。ａ、血管オルガノイド中の内皮細胞は、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）を発現し、ワイベルパラード体の形成を示す（右のパネル）。ｂ、血管オルガノイド中の毛細血管構造へのUlex Europaeus アグルチニン１（ＵＥＡ−１）の結合は、成熟内皮細胞の存在を示す。ｃ、自由浮遊性血管オルガノイド中の成熟内皮細胞は、アセチル化ＬＤＬ（ａｃ−ＬＤＬ）を効率的に取り込む。
【図１２】糖尿病マウス中の移植されたヒト血管の基底膜肥厚。血管オルガノイドを免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ガンマ（ＮＳＧ）マウスに移植し、その後（１か月後）マウスをストレプトゾトシン（ＳＴＺ）で処理して重度の高血糖症を誘発した。３ヶ月後、ヒト移植物を採取し、糖尿病性基底膜肥厚について分析した。移植されたオルガノイド由来の血管は、ヒト特異的ＣＤ３１（ｈＣＤ３１）抗体を使用して同定された。ＩＶ型コラーゲン染色（上のパネル）及び電子顕微鏡（中央のパネル；矢印は沈着したコラーゲンフィブリルを示す）により、正常血糖マウス（Ｃｔｒｌ）と比較して、糖尿病マウス（ＳＴＺ）由来のヒト血管オルガノイド中の重度の基底膜肥厚が証明された。対照的に、マウス腎臓の内因性血管は、その段階で基底膜の変化を示さない（下のパネル；Ａ、細動脈、Ｃ、毛細血管）。腎臓にＣＤ３１シグナルが存在しないことは、抗体のヒト特異性を証明する。
【図１３】糖尿病性血管退縮は、ヒト血管オルガノイド移植物で再現される。ヒト血管オルガノイドは、糖尿病を誘発するためにＳＴＺで１ヶ月処理されたＮＳＧマウスに移植された。糖尿病誘発の３か月後に内皮（ＣＤ３１）及び周皮細胞（ＳＭＡ）染色（上のパネル）で示されるように、正常血糖マウス（Ｃｔｒｌ）と比較して、糖尿病マウス（ＳＴＺ）からの移植物は血管密度の全体的な低下を示す。糖尿病マウス（ＳＴＺ）のヒト血管は、丸くなった細胞（塗りつぶされた矢じり）で示される内皮アポトーシスやＳＭＡ陽性血管壁での内皮細胞の欠如（空の矢じり）などの血管退行の兆候を示す。
【図１４】Ｎｏｔｃｈ３受容体又はリガンドＤｌｌ４をブロックすると、糖尿病性基底膜肥厚が阻害される。血管オルガノイドを糖尿病培地（高血糖＋ＩＬ−６＋ＴＮＦ−α）を用いてインビトロで２週間処理すると、ＩＶ型コラーゲン染色（ＣｏｌＩＶ）で示されるように、対照培地（Ｃｔｒｌ）と比較して、毛細血管の大きな基底膜肥厚を引き起こした。糖尿病性血管基底膜肥厚を防ぐことが可能な、以前同定されたγ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴの直接の標的を解明するために、機能的ブロッキング抗体（α−Ｎｏｔｃｈ１、α−Ｎｏｔｃｈ３、α−Ｊａｇｇｅｄ１）及び非架橋組換えタンパク質（Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ４）を糖尿病条件下で使用して、Ｎｏｔｃｈ経路の特定のメンバーを阻害した。Ｎｏｔｃｈ−１、Ｊａｇｇｅｄ−１、又はＤｌｌ１のブロッキングは、血管基底膜の糖尿病媒介肥厚に影響を与えなかったが、Ｎｏｔｃｈ−３又はＤｌｌ４のブロッキングは、基底膜肥厚を完全にブロックした。血管系では、Ｎｏｔｃｈ３受容体は周皮細胞上に特異的に発現され、ＮｏｔｃｈリガンドＤｌｌ４は内皮に発現され、これは、Ｎｏｔｃｈ３／Ｄｌｌ４を介したこれら２つの細胞タイプ間のクロストークが糖尿病性血管基底膜肥厚を媒介することを示唆している。
【図１５】血管オルガノイドの細胞的及び機能的特性解析。ａ、最初に生成された血管ネットワークと後期血管オルガノイド（ＮＣ８）中に存在するさまざまな細胞集団を決定するためのＦＡＣＳ分析。ＣＤ３１+内皮細胞、ＰＤＧＦＲ−β+周皮細胞、ＣＤ４５+造血細胞、及びＣＤ９０+ＣＤ７３+間葉系幹細胞（ＭＳＣ）様細胞の割合。右のパネルの棒グラフは、血管ネットワークと血管オルガノイドにおける内皮細胞（ＥＣ）と周皮細胞（Ｐ）との相対的な集団を示す。グラフは、実験ごとに５０を超える血管ネットワーク／オルガノイドを有するｎ＝２の独立した実験からの平均±Ｓ．Ｅ．Ｍを示す。ｂ、多能性、周皮細胞、及び内皮細胞のプロトタイプマーカー遺伝子のヒートマップ。血管ネットワーク又は血管オルガノイドからのＦＡＣＳで選別したＣＤ３１+内皮細胞（ＥＣ）とＰＤＧＦＲ−β+周皮細胞（Ｐ）をＲＮＡｓｅｑによって分析し、親のｉＰＳＣ系統（ＮＣ８）と比較した。ｃ、ＩＣＡＭ−１発現の誘導により明らかにされた血管オルガノイド（ＮＣ８）のＴＮＦα媒介活性化。ＴＮＦα（用量）の添加の２４時間後に、ＩＣＡＭ−１誘導を測定した。ＤＡＰＩは核の対比染色に使用された。ｄ、血管オルガノイド（ＮＣ８）からの内皮細胞（ＣＤ３１+）におけるフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）の発現。ＣｏｌＩＶ染色はまた、基底膜の輪郭を示す。右のパネルは電子顕微鏡写真を示し、バイベルパラーデ小体の外観を明らかにしている。ｅ、血管オルガノイド（ＮＣ８）の内皮ネットワーク（ＣＤ３１+）はアセチル化低密度リポタンパク質（ａｃ−ＬＤＬ）を取り込む。ｆ、レクチンであるUlex europaeus アグルチニン１（ＵＥＡ−１）染色が陽性である血管オルガノイド（ＮＣ８）。スケール棒：ｄ＝５０μｍ、５００ｎｍ（ＥＭ上部パネル）、１００ｎｍ（ＥＭ下部パネル）、ｅ、ｆ＝１００μｍ、又は画像に示されているとおり。
【図１６】糖尿病性血管オルガノイドの分析。ａ、ｂ、非糖尿病培地及び糖尿病（高グルコース／ＩＬ６／ＴＮＦα）培地中で培養された、（ａ）ＣＤ３１+内皮細胞画分、及び（ｂ）ＰＤＧＦＲ−β+周皮細胞、の割合を決定するための、血管オルガノイド（Ｈ９）のＦＡＣＳ分析。
【図１７】γ−セクレターゼの阻害は、ヒト血管オルガノイドの糖尿病性微小血管障害を抑止にする。ａ、ＦＩＴＣデキストランを静脈内注射しｈＣＤ３１で共染色してヒトの血管を可視化することにより、血管透過性を評価した。血管漏出を示す糖尿病性ＳＴＺマウスにおける拡散ＦＩＴＣシグナルに注目されたい。ＤＡＰＴ処理により、糖尿病性血管透過性が正常化された。ｂ、ＦＩＴＣ−デキストランの血管外遊出により測定される血管漏出の定量。ｎ＝（対照＝３、ＳＴＺ＝７、ＳＴＺ＋ＤＡＰＴ＝５）マウス。＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５（一元配置分散分析）。ｃ、ｄ、ＤＡＰＴ処理は、糖尿病性ＳＴＺマウスのヒト血管密度を回復する。ヒト血管移植物の毛細血管密度は、ヒト特異的抗ＣＤ３１抗体（黒）で染色することにより測定された。ｃ、移植された血管オルガノイドにおけるヒト血管密度の定量。ｎ＝（対照＝３、ＳＴＺ＝５、ＳＴＺ＋ＤＡＰＴ＝４）マウス。＊＊＊ｐ＜０．００１（一元配置分散分析）。ｄ、対照、ＳＴＺ、及びＳＴＺ＋ＤＡＰＴ処理マウスにおけるヒトＣＤ３１+血管密度の代表的な画像。スケール棒、ａ、ｄ＝５０μｍ、又は画像に示されているとおり。
【図１８】糖尿病性血管基底膜肥厚の候補経路としてのＤｌｌ４−Ｎｏｔｃｈ３の同定。ａ、高グルコース／ＩＬ６／ＴＮＦα（糖尿病）に曝露され、Ｊａｇｇｅｄ−１、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ３、又は組換えＤｌｌ１及びＤｌｌ４に対する抗体で処理された血管オルガノイド（ＮＣ８  ｉＰＳＣ由来）におけるＣｏｌＩＶについて染色された基底膜の代表的な画像。挿入図は、ＩＶ型コラーゲン（ＣｏｌＩＶ、緑色）で囲まれた個々の血管の共焦点断面を示す。ＣｏｌＩＶで連続的に囲まれた内腔の厚さを光学断面で測定した。定量（右のパネル）のために、等しい試料サイズの３つの独立した生物学的複製物から、各実験条件について合計１３０を超える管腔を分析した。管腔化された血管からの個々の測定値は点として示される。非糖尿病のオルガノイドの代表的な画像と定量値が対照として示されている。＊＊＊ｐ＜０．００１（一元配置分散分析）。ｂ、高グルコース／ＩＬ６／ＴＮＦα（糖尿病）に曝露されたか、又は標準的な培養条件（非糖尿病）下で維持された、対照、Ｄｌｌ４  ＫＯ、及びＮｏｔｃｈ３  ＫＯ血管眼オルガノイド（ＮＣ８  ｉＰＳＣ）からのＣｏｌＩＶについて染色された基底膜の代表的な画像。ＣｏｌＩＶで連続的に囲まれた内腔の厚さを光学断面で測定した。管腔化された血管からの個々の測定値は、右のパネルに点として表示される。等しい試料サイズの３つの独立した生物学的複製物から、各実験条件について合計１８０を超える管腔を分析した。＊＊＊ｐ＜０．００１（一元配置分散分析）。ｃ、ヒト血管オルガノイド（Ｈ９  ＥＳＣ）を移植したＳＴＺマウスをＮｏｔｃｈ３ブロッキング抗体で処理し、移植物を基底膜マーカーＣｏｌＩＶ及びヒト特異的ＣＤ３１で染色して、ヒト血管を可視化した。個々のヒト血管の基底膜の厚さ（ｈＣＤ３１+）は、ＣｏｌＩＶ染色に基づいて決定された。ｎ＞１４０の血管。＊＊＊ｐ＜０．００１（一元配置分散分析）。ｎ＝（対照＝３、ＳＴＺ＝３、ＳＴＺ＋αＮｏｔｃｈ３＝２）マウス。スケール棒、ａ、ｂ、ｃ＝５０μｍ、ｃ  挿入体＝１０μｍ。
【図１９】Ｄｌｌ４及びＮｏｔｃｈ３ノックアウトｉＰＳＣの作成と内皮細胞及び周皮細胞におけるＮｏｔｃｈ受容体／リガンドの発現。ａ、ｂ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集を使用して、Ｄｌｌ４及びＮｏｔｃｈ３ノックアウトｉＰＳＣ（ＮＣ８）を生成した。シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、Ｎｏｔｃｈ３／Ｄｌｌ４配列及び生成されたインデル（挿入欠失）で示される。ｃ、ウェスタンブロットは、標的ｉＰＳＣ中のＮｏｔｃｈ３発現の除去を示す。クローン＃４（赤）を機能アッセイに使用した。ＦＬ、完全長Ｎｏｔｃｈ３；ＴＴＭ、膜貫通Ｎｏｔｃｈ３サブユニット。ｄ、血管オルガノイドの免疫染色は、内皮細胞（ＣＤ３１+）中のＤｌｌ４の発現を示すが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集ｉＰＳＣでは発現されない。スケール棒：ｅ＝５０μｍ。ｅ、ＦＡＣＳソーティングにより血管オルガノイドから分離された内皮細胞（ＥＣ）及び周皮細胞中で発現されたＮｏｔｃｈ受容体／リガンドのヒートマップ。スケールはログを示す（標準化されたＦＫＰＭ）。
【図２０】血管オルガノイドの表現型の特性解析。ａ、コラーゲン１／マトリゲルマトリックスにおける分化した（ＮＣ８）内皮細胞と周皮細胞の同時培養。形成された内皮ネットワーク（ＣＤ３１+）は、周皮細胞（ＰＤＧＦＲ−β+）との弱い相互作用のみを示し、ＣｏｌＩＶ+基底膜で覆われていなかった。ｂ、胚性幹細胞（Ｈ９）及び２つの独立したｉＰＳ細胞株からの血管ネットワークの生成の成功。ＰＤＧＦＲ−β+周皮細胞が内皮管（ＣＤ３１+）に近接しており、ＣｏｌＩＶ+基底膜が形成されていることに注目されたい。
【図２１】いくつかのα−セクレターゼ阻害剤は、ヒト血管オルガノイドにおける糖尿病誘発性血管基底膜肥厚を防止する。血管オルガノイドを、糖尿病培地（７５ｍＭのグルコース、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６、１ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α）中で、γ−セクレターゼ阻害剤（１０μＭのＲＯ４９２９０９７、１μＭのデヒドロキシ−ＬＹ４１１５７５、１μＭのＬＹ４１１５７５）の存在下又は非存在下で培養した。続いてオルガノイドを固定し、内皮細胞（ＣＤ３１）、周皮細胞（ＰＤＧＦＲ）、及び血管基底膜タンパク質ＣｏｌＩＶについて染色した。代表的な画像が示される。糖尿病条件は、ＣｏｌＩＶ＋基底膜（ビヒクル）の量を増加させる。３つの独立したγ−セクレターゼ阻害剤による処理は、糖尿病条件下の基底膜（ＣｏｌＩＶ）の肥厚を防ぐ。スケール棒５０μｍ。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、人工血管オルガノイドを生成する方法を提供する。このような人工オルガノイドはインビトロで増殖されるが、インビボの毛細血管構造によく似ている。オルガノイドは、生体外で３次元で産生された、臓器の小型化物及び簡略化物であり、実物のような微小解剖学的構造を示す。これらは、組織、胚性幹細胞、又は人工多能性幹細胞からの１つ又は少数の細胞に由来し、その自己再生能力と分化能力とにより３次元培養で自己組織化することができる。
【００２３】
ヒト幹細胞に由来する本発明のオルガノイドは、ヒト血管の構造と機能を再現する。胚性幹細胞及び人工多能性幹細胞からの３Ｄ血管オルガノイドが提供される。これらの血管オルガノイドは、内皮、血管周囲の周皮細胞、及び基底膜を含み、自己集合して相互接続された内腔毛細血管ネットワークを形成する。マウスに移植されたヒトの血管オルガノイドは、ヒトの細動脈及び細静脈を含む灌流されたヒトの血管樹を形成する。興味深いことに、インビトロでの血管オルガノイドの高血糖及び炎症性サイトカインへの曝露は、基底膜の肥厚及び内皮細胞の転写変化を引き起こし、糖尿病患者における微小血管の変化を模倣していた。薬物スクリーニングにより、γ−セクレターゼ阻害剤が、血管オルガノイドにおけるこの「糖尿病」血管障害を軽減することが明らかになった。数億人の患者に影響を与える糖尿病性血管障害の治療標的候補としてγ−セクレターゼを特定することで我々が示したように、血管オルガノイドを使用して創薬の疾患モデルを生成することができる。
【００２４】
このようなオルガノイドを生成する方法は、血管分化が可能な幹細胞を提供する工程と、前記幹細胞における中胚葉分化を刺激する工程と、前記幹細胞における血管分化を刺激する工程と、前記幹細胞から細胞凝集体を発生させる工程と、前記細胞凝集体をコラーゲン３Ｄマトリックスに埋め込む工程と、前記コラーゲン３Ｄマトリックスにおける前記凝集体の血管分化を刺激する工程とを含む。
【００２５】
血管分化が可能な幹細胞は、例えば多能性幹細胞（pluripotent stem cell）である。多能性幹細胞は胚性幹細胞に由来するか、又は人工多能性幹細胞（pluripotent stem cell：ｉＰＳ）であり得る。ｉＰＳが好ましい。
【００２６】
幹細胞は中胚葉血管経路に分化する。分化は、細胞に組織（中胚葉／血管）特異的増殖因子又は分化因子を接触させることにより達成され得る。次に、細胞を所望の組織に発生させることができる。このような組織特異的増殖因子又は分化因子は、好ましくは本発明の方法の異なる段階で使用される中胚葉及び／又は血管分化因子であり得る。これにより、後の発生におけるそれぞれのタイプの細胞組織への発生が決定される。これにより、細胞は多能性（pluripotent）細胞から複能性（multipotent）細胞に移行する。その場合、他のタイプの組織は多能性状態になり得ないか、又は復帰によってのみ多能性状態が再び可能になる。通常、全ての細胞が選択した組織タイプに分化するわけではない。通常、細胞の約５０％以上、又は少なくとも５５％、又は少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％が、選択されたタイプの組織（特に中胚葉）への分化を開始し、形質転換して、最初のそれぞれの組織の運命を有する複能性細胞（細胞量の割合としての％値）による分化能を低下させるなら、充分である。もちろん、この分化の運命は、人工的な増殖と脱分化の刺激を使用により未分化状態又は低分化状態に戻らない細胞にのみ適用される。明らかに体細胞でさえも多能性細胞に戻すことができるが、これは本明細書で分化状態を定義する場合には当てはまらない。好ましくは、いったん中胚葉又は血管分化が開始されると、細胞を多能性細胞に戻す因子は細胞に導入されない。
【００２７】
本発明のオルガノイドは、多能性幹細胞を培養することから得ることができる。原則として、倫理的な理由が許せば、細胞はまた全能性（totipotent）でもあり得る。
【００２８】
「全能性」細胞は、発生中に通常生じるような刺激への曝露後に、体内のあらゆる細胞型（生殖細胞系を含む）に分化することができる。従って全能性細胞は、生物全体に成長する、すなわち発生することができる細胞として定義され得る。
【００２９】
本発明の方法で使用される細胞は、好ましくは全能性ではなく、（厳密に）多能性である。
【００３０】
特定の好適な実施態様において、本発明の細胞（それに関連する全てのさらなる実施態様を含む）は多能性である。
【００３１】
「多能性」幹細胞は、全生物に成長することはできないが、３つの胚葉全て、つまり中胚葉、内胚葉、外胚葉に由来する細胞タイプを生じさせることができ、生物の全てのタイプの細胞を生じさせることができる。多能性は、例えば特定の幹細胞における細胞自体の特徴であり得るか、又は人工的に誘導することができる。例えば。本発明の好適な実施態様において、多能性幹細胞は、多能性が誘導される体細胞、複能性細胞、単能性細胞、又は前駆体細胞から得られる。このような細胞は、本明細書では人工多能性幹細胞と呼ばれる。体細胞、複能性、単能性、又は前駆細胞は、例えば本発明の方法の対象である多能性細胞に変換される患者由来のものが使用される。このような細胞又は得られたオルガノイド培養物は、例えば、本発明の方法によるオルガノイド培養物の発生中に、異常について試験することができる。患者は例えば血管障害に苦しんでいる場合がある。前記障害の特徴は、本発明のオルガノイドで再現し、研究することができる。
【００３２】
「複能性」細胞は、生物の２つ以上の異なる器官又は組織のそれぞれから少なくとも１つの細胞型を生じさせることができ、ここで、前記細胞型は同じ又は異なる胚葉に由来し得るが、生物の全ての細胞型を生じさせることはできない。
【００３３】
対照的に、「単能性」細胞は、たった１つの細胞系統の細胞に分化することができる。
【００３４】
「前駆細胞」とは、幹細胞のように、特定のタイプの細胞に分化する能力を有する細胞であるが、分化する選択肢が限られており、通常は１つの標的細胞のみである。前駆細胞は通常単能性細胞であるが、多能性細胞でもある。
【００３５】
分化能力が低下すると、幹細胞は次の順序で分化する：全能性、多能性、複能性、単能性。本発明のオルガノイドの発生中、幹細胞は多能性（全能性細胞も可能）から複能性中胚葉、血管又は内皮幹細胞、さらに内皮細胞及び周皮細胞の単能性幹細胞に分化する。
【００３６】
好ましくは、幹細胞は、哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、又は魚類などの脊椎動物に由来する。特に好ましいのは陸生脊椎動物である。可能なのは、非ヒト動物と人間である。特に好ましいのは、マウス、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類などの哺乳動物であり、ヒト細胞が最も好ましい。オルガノイドを含む非ヒト動物モデルは、同じ動物から選択されてもよい。幹細胞と動物モデルは同じ生物でなくてもよい。
【００３７】
幹細胞の分化は、当技術分野における標準的な技術となっている。例えば、血管移植物を形成する分化及び成長因子は、国際公開第２０１６／０９４１６６Ａ１号に開示されている。このような増殖因子も、本発明に従って分化因子として使用することができる。
【００３８】
本発明の方法は、中胚葉分化を誘導する工程を含む。分化刺激を特異的に１方向（例えば中胚葉）に進める分化刺激と、他のいくつかの分化経路に中胚葉が含まれる非特異的な分化を進める刺激がある。このような非特異的な分化は、Gerecht-Nir et al.で使用されているＦＢＳ（胎児牛血清）などの血清によって実現できる（背景欄を参照）。非特異的分化は、外胚葉、神経外胚葉、及び内胚葉を含む、さまざまな胚葉の存在につながる可能性がある。
【００３９】
本発明の好適な実施態様によれば、中胚葉特異的分化因子などによって、特定の中胚葉分化が行われる。あるいは、あまり好ましくないが、分化した細胞から中胚葉を選択することができる。選択は、特定の分化刺激と組み合わせることができる。細胞の選択は、細胞の単離と個別化を必要とするため、好ましくない。本発明によれば、細胞はこの段階で凝集体を形成するか凝集体を形成し始めるため、そのような個別化は不利である。好ましくは中胚葉刺激後の細胞は、中胚葉分化におけるその細胞の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、又は少なくとも８０％を有する。好ましくは、中胚葉分化は、幹細胞をＷｎｔアゴニスト又はＧＳＫ阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１で処理することを含む。Ｗｎｔアゴニスト又はＧＳＫ阻害剤は、高率の中胚葉分化を達成する。Ｗｎｔアゴニストは、ＣＨＩＲ９９０２１のようなＷｎｔ刺激物質でもよい。
【００４０】
幹細胞は血管分化によっても処理される。本発明の方法において血管分化は、特に３Ｄマトリックス内で連続して又は繰り返して刺激されるが、細胞が凝集体を形成している場合は、細胞の凝集体が３Ｄマトリックスに導入される前にも刺激される。
【００４１】
血管分化は内皮分化を含む場合があり、小さな毛細血管又は毛細血管前駆体形成をもたらす。本方法の初期段階で、例えば３Ｄマトリックス処理の前に、このような内皮／血管の分化は、３Ｄマトリックス内の形状を変化させる、充分に規定された実物そっくりの同じ毛細血管はもたらさないかもしれない。
【００４２】
中胚葉分化と同様に、好ましくは血管分化は特定の血管分化であり、その細胞の好ましくは少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、又は少なくとも８０％が血管分化している。好ましくは前記幹細胞における血管分化は、幹細胞をＶＥＧＦ及び／又はＦＧＦ及び／又はＢＭＰ及び／又は１２％（ｖ／ｖ）以下の低酸素条件で処理することを含む。ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、ＢＭＰ、及び低酸素は組み合わせてもよい。好ましいＶＥＧＦはＶＥＧＦ−Ａである。好ましいＦＧＦはＦＧＦ−２である。好ましいＢＭＰはＢＭＰ４である。低酸素状態とは、１２％（ｖ／ｖ）以下の大気酸素、つまり細胞に供給される気相中の酸素である。気相は大気圧であることが好ましい。好ましくは、酸素含有量はさらに少なく、好ましくは１０％以下、より好ましくは８％以下、例えば６％以下（全てｖ／ｖの％）である。酸素含有量は、好ましくは２％以上、例えば２％〜１２％（全てｖ／ｖの％）である。好ましくは細胞は、１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約３０ｎｇ／ｍｌの濃度のＶＥＧＦを含む培地で培養される。好ましくは細胞は、１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約３０ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦを含む培地で培養される。好ましくは、細胞は、１０ｎｇ／ｍｌ〜５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約３０ｎｇ／ｍｌの濃度のＢＭＰを含む培地で培養される。
【００４３】
３Ｄマトリックスに導入される前の幹細胞は、細胞の集合体を形成している。好ましくは、これらの細胞は、そのような凝集を可能にする懸濁培養にある。これは、中胚葉及び／又は血管分化のために処理される幹細胞がすでに小さな凝集体であることを意味する。このような凝集体は、通常、安定した３Ｄマトリックスなしで、液体培地の懸濁培養物に懸濁できるほど小さい。
【００４４】
分化後、凝集体中にある分化した幹細胞を３Ｄマトリックスに埋め込む前に、通常、凝集体の細胞の少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、例えば約５０％は内皮細胞である。好ましくは凝集体の細胞の少なくとも２０％、例えば３０％は周皮細胞である。一緒にすると、好ましくは細胞の少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、例えば約８０％は血管細胞である。
【００４５】
いったん凝集体が３Ｄマトリックス内に埋め込まれると、本発明の方法はまた、前記３Ｄマトリックスにおける凝集体の血管分化も含む。好ましくは、この血管分化も、特定の血管分化を含む。凝集体の特に好ましい血管分化は、凝集体の細胞をＶＥＧＦ及び／又はＦＧＦで処理することを含む。好ましいＶＥＧＦはＶＥＧＦ−Ａである。好ましいＦＧＦはＦＧＦ−２である。好ましくは、マトリックス中の凝集体は、６０ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＶＥＧＦを含む培地で培養される。好ましくは、マトリックス中の凝集体は、６０ｎｇ／ｍｌ〜１５０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは約１００ｎｇ／ｍｌの濃度のＦＧＦを含む培地で培養される。
【００４６】
培養後、特に中胚葉及び／又は血管分化中に、幹細胞から形成された細胞凝集体は、３Ｄマトリックス内に埋め込まれる。３Ｄマトリックス内に埋め込まれたこの凝集体は、好ましくは少なくとも３０個の細胞、又は少なくとも５０個の細胞、好ましくは少なくとも１００個の細胞、特に好ましくは少なくとも３００個の細胞、例えば約１０００個の細胞のサイズを有する。好ましくはサイズは、１００，０００細胞未満、例えば３０，０００細胞未満である。細胞凝集体は確立されたサイズを有する必要があるが、大きすぎると液体懸濁培養での低い安定性に悩まされる。凝集体とは、細胞間結合と細胞間連結によって互いに結合した細胞の集積である。
【００４７】
好ましくは、前記凝集体は、凝集体形成の開始から７〜１５日目にコラーゲン３Ｄマトリックス内に埋め込まれる。この時点では、集合体は通常、適切なサイズと分化状態を持っている。望ましいタイムラインを図１ａに示す。好ましくは、中胚葉分化刺激（中胚葉誘導）は２〜６日目であり、好ましくは血管分化刺激（血管系統の促進）は４〜１４日目である。
【００４８】
細胞を３Ｄマトリックス内に埋め込むことは、当技術分野で公知である任意の方法によって実行することができる。好ましい方法は、３Ｄマトリックス材料を流動化し、細胞の凝集体の周りで３Ｄマトリックスを固化又はゲル化することである。
【００４９】
３Ｄマトリックスはコラーゲンマトリックスであり、これは好ましくは少なくとも５０質量％のコラーゲンを有する。コラーゲンには、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、及びコラーゲンＩＶが含まれる。コラーゲンＩ及びコラーゲンＩＶが最も好ましい。好ましくは、前記少なくとも５０％は、コラーゲンＩ又はコラーゲンＩＶからなり、最も好ましくはコラーゲンＩとコラーゲンＩＶの混合物からなる。
【００５０】
凝集体は、３次元（３Ｄ）マトリックス中で培養される。３Ｄマトリックスは、平らな面上の皿の中の２Ｄ培養物などの２Ｄ培養物とは異なる。「３Ｄ培養」とは、培養が片側の壁（皿の底板など）に遮られずに３次元全ての方向に拡張できることを意味する。好ましくは３Ｄマトリックスを含むこのような培養物は、好ましくは懸濁状態にある。３Ｄマトリックスはゲル、特に堅く安定したゲルであり、これは、増殖する細胞培養物／組織のさらなる拡張と分化をもたらす。ゲルはヒドロゲルであってもよい。本発明による適切な３Ｄマトリックスはコラーゲンを含む。より好ましくは３Ｄマトリックスは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、又はコラーゲン、ラミニン、エンタクチン（entactin）、及びヘパリン硫酸化プロテオグリカン、又はこれらの任意の組み合わせから選択される、細胞外マトリックスの任意の成分を含む。細胞外マトリックスは、Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍その任意の成分、例えばラミニン、コラーゲン、好ましくは４型コラーゲン、エンタクチン、及び任意選択的にさらなるヘパラン硫酸化プロテオグリカン、又はこれらの任意の組み合わせに由来し得る。このようなマトリックスはマトリゲルである。マトリゲルは、当技術分野で公知であり（米国特許第４，８２９，０００号）、すでに３Ｄ心臓組織（国際公開第０１／５５２９７Ａ２号）又は神経組織（国際公開第２０１４／０９０９９３号）をモデル化するために使用されている。好ましくはマトリックスは、ラミニン、コラーゲン、及びエンタクチンを含み、好ましくは２０％〜８５％のラミニン、３％〜５０％のコラーゲン、及びマトリックスがゲルを形成するのに充分なエンタクチン、通常０．５％〜１０％のエンタクチンを含む。コラーゲンの量がゲル形成に不十分な場合、ラミニンはゲルを形成するためにエンタクチンの存在を必要とする場合がある。マトリゲルが豊富なマトリックスは、質量部で約５０％〜８５％のラミニン、５％〜４０％のコラーゲンＩＶ、任意選択的に１％〜１０％のニドゲン（nidogen）、任意選択的に１％〜１０％のヘパラン硫酸プロテオグリカン、及び１％〜１０％のエンタクチンを含む少なくとも３．７ｍｇ／ｍｌの濃度を含んでもよい。本発明によれば、コラーゲン含有量は好ましくは増加し、特にコラーゲンＩが特に好ましい。全ての実施態様において本発明の特に好ましいマトリックスは、１０％〜５０％のラミニン、２０％〜７０％のコラーゲンＩ、及び／又は２％〜３０％のコラーゲンＩＶを含み、好ましくは、さらに０．５％〜１０％のニドゲン、０．５％〜１０％のヘパラン硫酸プロテオグリカン、及び／又は０．５％〜１０％のエンタクチン（全て質量％）を含む。これらの割合は、固体のタンパク質成分のみに関連し、すなわち水（これはヒドロゲルの主要成分である）などの液体成分ではない。マトリゲルの固形成分は通常、約６０％のラミニン、３０％のコラーゲンＩＶ、及び８％のエンタクチンを含む。３Ｄマトリックスは、マトリゲルとコラーゲンの混合物、例えば２：１〜１：３、好ましくは約１：１のマットリゲル：コラーゲンＩの混合物でもよい。マトリックス成分に与えられた全ての％値は質量％である。これらの値は供給源に応じて、例えば±３０％異なる場合がある。エンタ���チンは、ラミニン及びコラーゲンと相互作用する架橋分子である。このようなマトリックス成分は、工程ｒ）で追加することができる。これらの構成要素はまた、本発明のキットの好ましい部品でもある。３Ｄマトリックスは、ＥＧＦ（表皮増殖因子）、ＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ（インスリン様増殖因子）、特にＩＧＦ−１、ＴＧＦ−β、組織プラスミノーゲンアクチベーターのなどの増殖因子をさらに含むことができる。３Ｄマトリックスはまた、これらの成長因子のいずれも含まない場合もある。
【００５１】
一般に、３Ｄマトリックスは生体適合性マトリックスの３次元構造物である。これは好ましくは、コラーゲン、ゼラチン、キトサン、ヒアルロナン、メチル細胞ロース、ラミニン、及び／又はアルギン酸塩を含む。マトリックスは、ゲル、特にヒドロゲルでもよい。有機化学ヒドロゲルは、ポリビニルアルコール、ポリアクリル酸ナトリウム、アクリル酸ポリマー、及び豊富な親水性基を有するコポリマーを含んでもよい。ヒドロゲルは、親水性のポリマー鎖のネットワークを含み、時々、水が分散媒体であるコロイドゲルとして見られる。ヒドロゲルは、吸収性が非常に高い（９９質量％を超える水を含む）天然又は合成ポリマーである。また、ヒドロゲルはと水分量が多いため、天然組織に非常に近い柔軟性を備えている。３次元マトリックス、又はその成分、特にＥＣＭ又はコラーゲンが、生成された組織培養物中にまだ残っている可能性がある。好ましくは、３Ｄマトリックスはコラーゲンマトリックスであり、これは好ましくはＩ型及び／又はＩＶ型コラーゲンを含む。
【００５２】
好ましくは、３Ｄマトリックスはヒドロゲルである。マトリックス、特にヒドロゲルは１０〜３０の粘弾性貯蔵弾性率Ｇ’を有する。粘弾性材料の貯蔵弾性率は、弾性部分を表す貯蔵エネルギーと、粘性部分を表す熱として放散されるエネルギーを測定する。本発明に従って使用することができる貯蔵弾性率を、例えばレオメーターにより測定する方法は、Anguiano et al. PLoS ONE 2017, 12(2): e0171417に記載されている。
【００５３】
好ましくはコラーゲン３Ｄマトリックスは、１０％〜５０％のラミニン、２０％〜７０％のコラーゲンＩ、及び／又は２％〜３０％のコラーゲンＩＶを含み、好ましくは、さらに０．５％〜１０％のニドゲン、０．５％〜１０％のヘパラン硫酸プロテオグリカン、及び／又は０．５％〜１０％のエンタクチン（全て質量％）を含む。マトリゲルは通常、５０％〜８５％のラミニン、５％〜４０％のコラーゲンＩＶ、１％〜１０％のニドゲン、１％〜１０％のヘパラン硫酸プロテオグリカン、及び１％〜１０％のエンタクチン（固体のタンパク質成分のみ）を含む。
【００５４】
本発明はまた、１０％〜５０％のラミニン、２０％〜７０％のコラーゲンＩ、及び／又は２％〜３０％を含むコラーゲン３Ｄマトリックス内に血管幹細胞を埋め込み、前記コラーゲン３Ｄマトリックスにおける前記幹細胞の血管分化を刺激することとを含む、人工血管オルガノイドを生成する方法を提供する。これまで説明した全ての態様及び好適な実施態様はこの方法にも適用され、これも本発明の独立した態様を形成する。本明細書では、このような３Ｄマトリックスは、インビボの血管ネットワークを連想させる非常に好適な血管ネットワークをもたらすことが示される。特に、このようなネットワークは大きな管腔を有し、モデル動物の循環系に接続してモデル動物に組み込むことができる。好ましくは、血管幹細胞は、中胚葉幹細胞を血管幹細胞に分化させることにより生成され、中胚葉幹細胞は好ましくは、前述のように、特に多能性幹細胞における中胚葉分化を刺激することにより得られる。これらの全ての態様は、上記の説明と組み合わせることができる。
【００５５】
本発明の全ての実施態様及び態様において、好ましくは凝集体の細胞は、前記３Ｄマトリックス中で少なくとも５日間、好ましくは少なくとも７日間培養される。３Ｄマトリックス中での培養は、５〜６０日間以上、好ましくは少なくとも１０日間であり得る。
【００５６】
３Ｄマトリックス自体は、懸濁培養で懸濁してもよい。
【００５７】
３Ｄマトリックス内では、集合体は血管ネットワークを形成し、基底膜を形成する血管周囲の周皮細胞に囲まれた内皮細胞によって形成される内皮を含む血管ネットワークを形成し、これはさらに後で説明される。血管ネットワークの自己集合は、通常、マトリックスへの血管の発芽による発芽する血管新生を通じて生じる。
【００５８】
本発明はさらに、毛細血管の相互接続ネットワークを含む人工血管オルガノイド培養物を提供し、前記毛細血管は内皮と血管周囲の周皮細胞を有する基底膜とを含み、（ｉ）前記オルガノイドは本発明の方法により産生され、及び／又は（ｉｉ）前記毛細血管は、コラーゲンを有するヒドロゲルを含む人工３Ｄマトリックス内に埋め込まれており、及び／又は（ｉｉｉ）前記オルガノイド培養物は、個々の血管及び毛細血管の交点間の血管を計数すると４０〜１０００個の血管を含む。３つの全ての特徴（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）は、本発明の代表的特徴であり、本発明の人工血管オルガノイド培養物によって個々に又は組み合わせで必要とされ得る。オルガノイドは、依然として３Ｄマトリックス又はその一部を含んでもよい（ｉｉ）。この方法における３Ｄマトリックスについて前述したものと同じことが、オルガノイドに適用される。
【００５９】
オルガノイドは人工組織と見なされる。「人工」とは、インビトロで増殖され、人工培養の特定の特徴、例えば同様のサイズ、粘度、形状、細胞組織を有することを意味する。形状は不規則であり、天然に存在する組織とは異なる場合があり、細胞組織化はサイズのひずみのために異なる場合がある。特に「人工」は、自然に発生する組織及び器官とその部分、例えば天然の組織切片を除外する。３Ｄマトリックスはまだ培養物中にあってもよく、及び／又はオルガノイドは、そのようなマトリックス中での増殖により決定される形状を有し得る。例えば。オルガノイドは、３Ｄマトリックス、特に上記のようなマトリックスで増殖させることで得ルことができる。人工オルガノイド培養物は、特に、インビボで発生させた血管系の培養物又はその組織試料ではない。
【００６０】
オルガノイド内の血管の数は驚くほど多く、これまで人工培養物では達成されていない（ｉｉｉ）。好ましくはオルガノイド培養物は、個々の血管及び毛細血管の交点間の血管を計数すると、少なくとも４０、さらにより好ましくは少なくとも６０、少なくとも１００、少なくとも２００、又は少なくとも３００以上の血管を含む。上限値である１０００の毛細血管は、例えば細胞培養ウェルプレートでのスクリーニングのために、まだ扱いやすいサイズを有する通常のオルガノイドの結果であるが、もちろん、オルガノイド培養を継続することにより、さらに大きなサイズと毛細血管数が可能である。毛細血管の数は、この分野で一般的に行われているように、すなわち個々の血管及び毛細血管の交点間の血管を計数することにより計数される。この数は、オルガノイドのごく一部を数えて、その数をオルガノイド全体に外挿することから推測することができる。
【００６１】
好ましくは人工血管オルガノイド培養物の毛細血管は、１μｍ〜３０μｍ、好ましくは５μｍ〜２０μｍの平均直径を有する。毛細血管のこのように大きな直径と体積は、循環動物モデルでの灌流を可能にする。好ましくは毛細血管の平均直径は少なくとも１μｍ、より好ましくは少なくとも２μｍ、さらにより好ましくは少なくとも３μｍ、少なくとも４μｍ、少なくとも５μｍ、少なくとも６μｍ以上である。
【００６２】
人工血管オルガノイドは、好ましくはその最長寸法が１００μｍ〜１０ｍｍのサイズを有する。２５０μｍ〜１０ｍｍ又は５００μｍ〜５ｍｍのサイズが好ましい。このサイズはオルガノイド自体であり、すなわち血管ネットワーク全体を含む培養物であり、好ましくはオルガノイドはまだ３Ｄマトリックス内にある。
【００６３】
特に約１〜２ｍｍのこのようなサイズにより、９６ウェルプレートなどの細胞培養ウェルプレートでオルガノイドを管理しやすくなり、大規模な試験目的に使用することができる。オルガノイドは安定であり、物理的ストレスに耐え、例えばピペットによる移動を可能にすることができ、日常の実験室での取り扱いやスクリーニングロボットでの自動処理に適している。
【００６４】
人工血管オルガノイドは、球状体の形態で提供されてもよく、例えば、特に最短寸法が最長寸法の２０％以上、特に最長寸法の３０％以上、又は４０％以上である。好ましくは人工血管オルガノイドの体積は、少なくとも１×１０6μｍ3、特に好ましくは少なくとも２×１０6μｍ3、少なくとも４×１０6μｍ3、少なくとも６×１０6μｍ3、少なくとも８×１０6μｍ3、少なくとも１０×１０6μｍ3、少なくとも１５×１０6μｍ3であり、及び／又は少なくとも２５０μｍ、特に少なくとも３５０μｍのサイズである。
【００６５】
オルガノイドはディスクで提供することもでき、これは取り扱いを簡単にするために、自由な浮遊環境に懸濁することができる。
【００６６】
本発明の人工オルガノイド内の十分な血管周囲の周皮細胞の存在は特に驚くべきものであり、オルガノイドにおける本発明の血管ネットワークがインビボ特性を達成したことを示す。血管周囲の周皮細胞は内皮細胞を支持する。内皮細胞と血管周囲の周皮細胞の比率は、オルガノイドの培養時間によって異なる。好ましくは人工血管オルガノイド培養物中の内皮細胞と血管周囲の周皮細胞との比率は、１００：１〜１：１０である。好ましくは比率は、５０：１〜１：５、又は２５：１〜１：４、又は１０：１〜１：３、又は５：１〜１：２である。通常、若いオルガノイドでは内皮細胞が過剰であり、古いオルガノイドでは比率は約１：１のこともあり、又は内皮細胞に対して周皮細胞が過剰になることさえある。
【００６７】
好ましくは、人工血管オルガノイド培養物の毛細血管は成熟内皮細胞を含む。成熟内皮細胞は、ＩＣＡＭ−１発現で応答することにより、ＴＮＦ−アルファに反応する可能性がある。好ましくは、人工血管オルガノイド培養物の毛細血管は成熟周皮細胞を含む。周皮細胞の成熟度は、成熟周皮細胞の発現マーカーを測定することで検出することができる。
【００６８】
内皮細胞は基底膜（basal membraneであり、basement membraneとも呼ばれる）で囲まれている場合がある。基底膜は、コラーゲンＩＶ、フィブロネクチン、及び／又はラミニンを含んでもよい。コラーゲンＩＶが豊富でもよい。基底膜の厚さは毛細血管の健康状態のマーカーであり得、スクリーニング又は他の検査方法で指標として測定される。人工血管オルガノイド培養物の毛細血管の基底膜は、毛細血管のサイズに応じて０．１μｍ〜３μｍ、好ましくは０．３μｍ〜２．５μｍの範囲の厚さを有し得る。好ましくは人工血管オルガノイドの毛細血管の基底膜の平均厚さは、０．３μｍ〜２．５μｍ、好ましくは０．６μｍ〜２．１μｍ、特に好ましくは０．８μｍ〜１．８μｍ、最も好ましくは約１．２μｍである。「約」とは、この場合は±３０％を意味する。
【００６９】
本発明のさらなる代表的特徴は、オルガノイドが、インビボ血管樹に見られるように細静脈及び小動脈を発生させることである。
【００７０】
本発明はさらに、ヒト毛細血管が内皮と血管周囲の周皮細胞を有する基底膜とを含む、ヒト毛細血管を有する非ヒト動物モデルを提供する方法であって、前記方法は、特に前述した本発明のヒト血管オルガノイドを非ヒト動物に導入する工程と、前記オルガノイドに毛細血管を増殖させる工程とを含む。好ましくは、前記ヒトオルガノイドは、非ヒト動物の腎臓上又は腎臓内に導入される。本発明はまた、本発明の挿入された人工血管オルガノイド培養物を含む非ヒト動物モデルを提供する。前述のように本発明のオルガノイドの利点は、毛細血管の汎用性と生体様構造である。これらの毛細血管を非ヒト動物に導入することにより、その挙動をインビボで研究することが可能である。
【００７１】
糖尿病などの血管疾患を研究及び調査するための動物モデルは、当技術分野で公知である（例えば、国際公開第２０１５／０４４３３９Ａ１号）。これらのモデルは通常、疾患状態を引き起こす遺伝的改変を有する動物に基づいている。ただし、このような変異は研究の前提も変化させ、潜在的には病気の発生だけでなく、試験済みの治療選択肢に対する反応も変える。従って実物のような状況を調べる必要がある。特に好ましいのは、ヒトの血管系のモデルである。本発明は、試験動物への移植に適したオルガノイドを提供することにより、その目標を達成する。しかし上記のように、インビトロで増殖される本発明のオルガノイドは、人工的で制御可能な環境（例えば、結合組織ではなく３Ｄマトリックス内）で、インビボで形成される血管ネットワークと非常によく似ている。非ヒト動物に導入可能な本発明の血管系の特性の中には、内皮と血管周囲の周皮細胞を有する基底膜とを有する毛細管がある。従って本発明はまた、ヒト毛細血管を有する非ヒト動物モデルを提供し、ここで前記ヒト毛細血管は内皮と血管周囲の周皮細胞を含む基底膜とを含む。これらの種類の動物モデルの全てはまとめて説明されており、それぞれの好ましい又はさらなる実施態様は、全ての本発明の動物モデルについて適用される。
【００７２】
本発明は、非ヒト動物におけるヒト毛細血管の研究を可能にする。従ってオルガノイドは好ましくは、ヒト細胞由来であり、すなわち非ヒト動物中にヒト毛細血管を有する。非ヒト動物は、好ましくは脊椎動物、例えば哺乳類、爬虫類、鳥類、両生類、又は魚類である。特に好ましいのは陸生脊椎動物である。本発明の全ての態様及び実施態様において特に好ましいのは、マウス、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、非ヒト霊長類である。もちろん、あらゆる脊椎動物を、オルガノイドの供給源として、従って毛細血管の供給源として使用することもできる。しかしもちろん、驚くべき利点は、オルガノイドを使用する必要なしで、非ヒト動物をモデル生物として作成することも可能にするヒトのオルガノイドと関連している。好ましくは非ヒト動物は、オルガノイド拒絶を回避するために、免疫不全状態である。
【００７３】
背景技術欄で要約したヒト内皮細胞を含む以前の非ヒト動物とは対照的に、本発明は、ヒト細胞を非ヒト動物に導入するだけでなく、ヒトの完全に発生した毛細血管系を非ヒト動物に導入する。すなわちヒトの内皮は、ヒト毛細血管を、特に細静脈と小動脈を含む毛細血管系を連想させる構造中で、ヒト基底膜及び周皮細胞の周囲で研究される。
【００７４】
好ましくは、動物モデルにおける人工血管オルガノイド培養物の毛細血管又はヒト毛細血管は、非ヒト動物の血液循環系によって灌流される。前述のように、オルガノイドの毛細血管が非ヒト動物モデルの血管系に接続できることは、本発明の利点の１つである。このような接続は、動物の適切な場所に埋め込まれると形成される。非常に反応性の高い場所は腎臓膜であるが、組織移植及び移植技術の研究のために当技術分野で公知である他の位置も同様に適切である。腹腔内の又は皮下移植による臓器などの他の臓器を使用することもできる。ある場合には、特定の場所では、例えばヒドロゲルやスポンジのような適切なマトリックス中に増殖因子を供給するなどして、毛細血管の増殖をさらに刺激する必要かも知れない。
【００７５】
本発明の人工血管オルガノイド培養物はまた、オルガノイド内の細胞の増殖及び活性に対する外部的（例えば、薬物又は他の刺激）又は内部的（突然変異）影響を調べるための研究ツールとして使用することができる。すなわち追加の態様において本発明は、発生中の血管組織の作用、例えば欠陥、特に発生の欠陥を研究する方法を提供し、この方法は、（ｉ）本発明の方法のいずれかの段階で、又は発生した（完成した）オルガノイド又は動物モデルに対して、細胞内の目的の遺伝子の発現を減少又は増加させること、又は（ｉｉ）本発明の方法のいずれかの段階で、又は発生した（完成した）オルガノイド又は動物モデルに対して、細胞に目的の候補化合物を投与することを含む。目的の遺伝子は、健康な血管組織の発生中に活性である場合に、必須又は有害であると疑われる遺伝子であり得る。好ましい遺伝子は、疾患に関連する遺伝子、例えば遺伝性疾患の原因物質である遺伝子である。遺伝子の発現を減少又は増加させる方法は、当技術分野で公知であり、それぞれノックアウト、ノックダウン方法、又は突然変異誘発（特にＲＮＡ干渉、アンチセンス阻害、ｓｈＲＮＡサイレンシング、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓによる突然変異誘発など）、又はトランス遺伝子の導入（例えばノックイン）を含む。このような減少又は増加は、条件付きであり得、例えば、誘導性プロモーター及び／又は条件付きノックアウト又はノックダウン又はノックインを備えた遺伝子構築物の導入による。必須遺伝子の条件付き突然変異の導入又は致死遺伝子の導入は、例えば可逆的遺伝子トラップを含む適切な条件付き突然変異ベクターを使用することにより可能である。条件付き突然変異は、好ましくは可逆的突然変異を促進し、これは、例えばダブルフレックスシステム（国際公開第２００６／０５６６１５Ａ１号；国際公開第２００６／０５６６１７Ａ１号；  国際公開第２００２／８８３５３Ａ２号；国際公開第２００１／２９２０８Ａ１号）のように、刺激により、それぞれ遺伝子活性又は不活性状態に逆転させることができる。突然変異は、特定の遺伝子でランダム又は部位特異的突然変異のいずれかである。従って、本発明の好適な実施態様において、ランダム（順方向）又は部位特異的（逆方向）突然変異誘発のいずれかにより、可逆的突然変異が多能性幹細胞に導入される。適切なベクターは、可逆的変異を伴う挿入カセットを含む。突然変異は、本発明の方法の任意の段階でオン又はオフに切り替えることができる。ベクター又は他の核酸は、当技術分野で公知の任意の方法、例えば電気穿孔法により、細胞中に導入することができる。もちろん、所定の突然変異を有する細胞を提供することも可能である。このような細胞は患者から単離することができ、次に多能性幹細胞状態を誘導し、上記の方法で細胞を本発明の組織に発生させることができる。患者は、目的の特定の疾患、特に血管の欠陥又は毛細血管の変形を有する場合がある。候補化合物は、治療薬候補の可能性に関して、以下でさらに説明される。ただし、細胞、毛細血管、又はオルガノイド全体に対する望ましい効果について、任意の候補化合物をアッセイすることもできる。好ましい候補化合物は、小さな有機分子である。
【００７６】
本発明の任意の方法又は培養物又は非ヒト動物モデルにおいて、好ましくは、血管又は毛細血管は病因に曝され、前記オルガノイド又はヒト動物モデルは病態のモデルである。
【００７７】
本発明の毛細血管形成プロセスは障害を受けやすい可能性がある。あるいは、例えば培養物中の又は動物モデル中のインプラントとして、オルガノイド自体に病理学的状態が誘発される場合がある。
【００７８】
研究目的での病態の誘発は当技術分野で公知であり、有害な化合物又は病原体、不利な食事、機械的ストレス、又は傷害、又はこれらの組み合わせへの曝露である可能性がある（例えば、ＵＳ２０１０／１２４５３３Ａ１に開示されているように）。病原体には、微生物、特に細菌又は真菌及びウイルスが含まれる。病態は、遺伝的障害又は機能不全の結果である場合もある。
【００７９】
病因には、高血糖症及び／又は炎症が含まれる場合がある。いずれも、例えば糖尿病中に見いだされ得る。特に好ましくは、病態は糖尿病である。炎症は、１つ以上の炎症性サイトカイン、好ましくはＴＮＦ−アルファ及び／又はＩＬ−６への曝露又は誘導を含むことができる。高血糖症とは、２型糖尿病を思わせるグルコースレベルの増加を意味する。そのようなグルコースレベルは、例えば少なくとも５０ｍＭ、好ましくは少なくとも７０ｍＭである。糖尿病を誘発する条件の例は、７５ｍＭのＤ−グルコース＋１ｎｇ／ｍＬのＴＮＦ−α＋１ｎｇ／ｍＬのＩＬ−６を１〜２．５週間である。オルガノイドの血管の糖尿病性変化には、基底膜の肥厚（ＩＶ型コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、パールカンの増加）、血管増殖の減少、内皮／周皮細胞の死が含まれる。動物モデルでは、膵臓ベータ細胞の欠乏など、糖尿病の器質的な原因を有する動物を選択することにより、又は膵臓ベータ細胞の不足を引き起こすことによって、糖尿病を誘発することもある。ベータ細胞の不足は、１型糖尿病などの自己免疫破壊により、又は例えばストレプトゾトシンにより誘発される化学毒性によって引き起こされる場合がある。
【００８０】
自己免疫１型、特に２型真性糖尿病（Ｔ２Ｄ）の罹患率は増加し続けており、すでに患者が４億２，０００万人を超える世界的な流行になっている。Ｔ２Ｄには、さまざまな集団において遺伝的素因に加えて、肥満、老化、栄養状態、身体的不活動などのさまざまな危険因子がある。高血糖の結果には、血管の損傷が含まれ、動脈硬化症と慢性糖尿病性微小血管障害を引き起こす。糖尿病性微小血管障害の構造的特徴は、特にＩＶ型コラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質の発現及び沈着の増加による毛細血管基底膜の肥厚である。これらの変化は、閉塞性血管障害、血管透過性の変化、又は組織低酸素症を引き起こし、心臓病、脳卒中、腎臓病、失明、創傷治癒障害、慢性皮膚潰瘍、又は手足切断などの合併症をもたらす。このような症状は、本発明のオルガノイドにおいて研究することができ、必ずしも動物モデルでの研究ではない。
【００８１】
糖尿病の微小血管の変化はイヌ、ハムスター、又はサルで発生する可能性があるが、ヒトの患者に見られる血管の変化の全ての臨床的特徴を示す単一の実験動物モデルはない。さらに、これらの血管の変化は、以前のヒトのインビトロ細胞培養モデルでは十分に再現されていない。従って、生命にかかわる病的状態及び増加し続ける死亡率を引き起こしている、何億人もの糖尿病患者に影響を及ぼす血管の変化についての包括的な理解は、まだ不足している。本発明の３Ｄヒト血管オルガノイドは、真正のヒト微小血管構造の形態学的特徴及び分子的特徴を示す。これらのヒト３Ｄ血管は、マウスなどの非ヒト動物でインビボで血管樹を発生させることができる。重要なことに、これらのオルガノイドは、糖尿病性微小血管障害のモデル化や、「糖尿病」誘発性の血管損傷からの防御を目的とする経路のスクリーニングに使用することができる。
【００８２】
本発明はさらに、病因又は病態に影響を及ぼす候補化合物をスクリーニングする方法に関し、この方法は、前記候補化合物を、本発明の任意の態様及び実施態様による培養物又は非ヒト動物モデルに、又は前記培養物又は非ヒト動物の生成中に投与し、前記候補化合物を投与していない前記培養物又は動物モデルと比較して、前記培養物又は動物モデルの生理学的差異をモニターすることを含む。本方法で使用される幹細胞、スクリーニングに使用されるオルガノイド又は非ヒト動物モデルは、上記のように病態を有するか又は発症しつつあるか、又は病因に曝露されている。毛細血管及びこれらのネットワークの特性、修飾、及び発生への影響について候補化合物を試験又はスクリーニングする方法が提供され、この方法は、本発明のいずれか１つの方法で細胞又はオルガノイド又は動物に候補化合物を接触させるか、又は本発明のオルガノイドに候補化合物を接触させ、接触したオルガノイドを培養物中で又はインビボで維持し、オルガノイドの毛細血管における発生的変化などの任意の変化［オルガノイドの発生した又は発生している毛細血管中の変化（生理学的変化又は遺伝子発現変化など）を含む］を、前記候補化合物が接触していない前記オルガノイドと比較して観察することを含む。
【００８３】
接触工程は、本発明のオルガノイドに発生すべき細胞の、又はオルガノイド又はその前駆細胞凝集体の、処理工程である。候補化合物は、例えば１００Ｄａ〜５０００Ｄａの質量を有する分子などの小さな有機分子であってもよい。他の候補化合物は、タンパク質、核酸、又は炭水化物などの生体分子であり得る。さらなる候補化合物は、エタノールなどの溶媒（もちろん、一般的に細胞に有効な濃度で使用される）又はポリマーなどのバルク化学物質である。処理は、化合物の特定の効果が期待できる濃度でなければならない。さまざまな濃度を並行して試験することができる。通常、候補化合物の濃度は１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、例えば１００ｎｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌまでである。
【００８４】
また、目的のオルガノイドの病態を治療するのに適した候補治療薬をスクリーニング又は試験する方法が提供され、この方法は、例えば、本発明の分化方法を実施することにより本発明のオルガノイドを提供し、本方法（上記）中の任意の段階、好ましくは全ての段階で前記細胞に、又は病態に影響を受けたオルガノイドに、候補物質を投与することを含む。上記のように、オルガノイドの血管ネットワークの変化は、このような候補薬剤がない場合と比較して観察される。このような変化は、例えば糖尿病の場合に観察されるように、例えば基底膜の厚さでもよい。
【００８５】
この方法は、上記の糖尿病モデルで使用されている。すなわちＮｏｔｃｈ３活性化経路、特にガンマセクレターゼとその経路は、糖尿病の治療に適した改善剤として同定された。すなわち本発明はまた、例えば糖尿病性血管障害における肥厚した毛細血管基底膜、閉塞性血管障害、血管透過性の変化、組織低酸素症、心臓病、脳卒中、腎疾患、失明、創傷治癒障害、又は慢性皮膚潰瘍の治療又は予防における、Ｎｏｔｃｈ３活性化経路阻害剤（例えばガンマセクレターゼ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ３阻害剤、ＤＬＬ４阻害剤、又はこれらの組み合わせ）の使用を提供する。
【００８６】
Ｎｏｔｃｈ３活性化経路阻害剤の例、特にガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４の阻害剤は、ガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４の阻害抗体及び結合パートナーである。抗体には、これらの任意の機能的同等物及び誘導体が含まれ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）2、Ｆｖ、単一鎖抗体（ｓｃＡｂ）、ナノボディ又は同様のラクダ科抗体、又は抗体抗原結合ドメインなどの抗体断片を含む。ガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４に特異的に結合する抗体は、本発明に包含される。抗体は、完全長タンパク質、タンパク質の可溶性形態、又はその断片を用いる免疫化により産生され得る。本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであってもよく、又は組換え抗体、例えば軽鎖及び重鎖上のマウス定常領域がヒト配列によって置換されたキメラ抗体、又は相補性決定領域のみがマウス起源であるＣＤＲ移植抗体であってもよい。本発明の抗体はまた、例えばヒト抗体を産生することができるトランスジェニック動物の免疫化により調製されたヒト抗体であってもよい（国際公開第９３／１２２２７号）。抗体は、生物学的試料中のガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４を検出するのに有用であり、それにより、タンパク質をさらに産生する細胞又は組織、ガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４に結合する（及び他の結合化合物との相互作用をブロックする）抗体の同定を可能にし、ガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４阻害剤として治療用途がある。抗ガンマセクレターゼ抗体が特に好ましい。好ましい抗Ｎｏｔｃｈ３−抗体は、タレクツマブ（tarextumab）である。アブカム（Abcam）抗ＤＬＬ４抗体は、例えばａｂ７２８０、ａｂ１７６８７６、ａｂ１８３５３２である。
【００８７】
これらの成分のさらなる阻害剤は、ガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４を隔離し、こうして生物学的活性を低下させる、任意の（生理学的）結合パートナー、例えば、受容体又はリガンドであり得る。結合パートナーは、結合タンパク質であることが好ましい。Ｎｏｔｃｈ３のリガンドの例は、組換え可溶性ＤＬＬ４タンパク質である。このような結合パートナー（好ましくは基質又は膜に架橋していない、例えばプレート上に架橋していない）は、活性化することなく対応するＮｏｔｃｈ受容体に結合する。従って、組換えＤＬＬ４タンパク質は、内皮細胞表面などの細胞表面に提示されないため、阻害剤として作用し得る（Scehnet et al. Blood 2007 109(11): 4753-4760; Noguera-Troise et al. Nature 2006 444(7122): 1032-1037）。好ましくはこのような結合タンパク質は、固体の表面又は細胞膜に固定化されることなく、特に別のタンパク質と複合体を形成することなく、可溶化形態で提供される。そのような可溶化形態は、それぞれの標的（例えばガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４）に結合するが、シグナル伝達カスケードを活性化することはできず、その代わり標的をブロックすることで阻害する。結合タンパク質はまた隔離剤又はマスキング剤として提供され得、これは、標的に結合し、活性化シグナル伝達分子の結合を妨げる複合体形成によりその作用をブロックする。
【００８８】
さらなるＮｏｔｃｈ３活性化経路阻害剤、特にガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４阻害剤は、低分子阻害剤である。小分子は通常、５０００ダルトン以下、２５００ダルトン以下、さらには１０００ダルトン以下のサイズを有する小さな有機化合物である。本明細書に開示される方法により容易に試験することができるように、小分子阻害剤は、糖尿病性オルガノイドに対するガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４の活性を阻害する。ガンマセクレターゼ阻害剤の例は、セマガセスタット（Semagacestat）、アバガセスタット（Avagacestat）、ＲＯ４９２９０９７、ＤＡＰＴ、ＬＹ３０３９４７８（クレニガスタット（Crenigacestat））、ＬＹ４１１５７５、デヒドロキシＬＹ４１１５７５、ＬＹ４５０１３９、ＭＫ−０７５２、ＩＭＲ−１、ジベンザゼピン（Dibenzazepine）、ＰＦ−０３０８４０１４（ニロガセスタット（Nirogacestat））、Ｌ−６８５，４５８、ＦＬＩ−０６、ＮＧＰ５５５、フルルビプロフェン（Flurbiprofen）、及びスリンダク（Sulindac）である。
【００８９】
さらなる阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はｓｇＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓと組み合わせて）などの阻害性核酸である。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、配列特異的な方法で遺伝子発現を抑制するメカニズムである。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、真核細胞の特定の遺伝子機能を抑制するための非常に効果的な方法である。ＲＮＡｉは細胞や生物に適用すると、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）オリゴ又は低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）をコードするベクターのトランスフェクション時に、標的ｍＲＮＡの分解を伴う。ＲＮＡｉの様々な方法が記載されており、例えばＵＳ２００２／０１６２１２６及びＵＳ２００２／０１７３４７８に記載されているように、植物細胞、ショウジョウバエ、及びヒトメラノーマ細胞における遺伝子発現を変化させることが一般的に知られている。本発明の方法及び組成物で使用されるｓｉＲＮＡは、ガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４シグナル伝達経路の所望の分子、又はこのような分子の組み合わせを標的とするように選択される。このようにして、これらは標的遺伝子に対応するさまざまなＲＮＡを標的にする。本明細書に記載のｓｉＲＮＡはまた、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡ構築物又はその任意の同等物である変更されたｓｉＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ならびにｓｉＲＮＡ形態、例えばウイルス及び非ウイルスベクター中のｓｉＲＮＡ複製物、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、及びキャリア中のｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを含み得ることを当業者は理解している。
【００９０】
例えば国際公開第０２／０５５６９２号、国際公開第０２／０５５６９３号、ＥＰ１  １４４６２３Ｂ１、及び国際公開第０３／０７４６５４号に記載されているようなＲＮＡｉを使用して、遺伝子発現を阻害するいくつかの方法が当技術分野に存在する。ｓｉＲＮＡ治療法を使用することにより、本発明のガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４拮抗及び阻害治療法のために、任意の細胞因子を標的化及び阻害することができる。従って、このような化合物は、ガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４阻害剤として使用することができる。
【００９１】
核酸をコードする形態の阻害剤も提供される。阻害性の核酸、抗体、又は結合パートナー（例えば、受容体又はリガンド）は、細胞内で前記阻害剤を発現する核酸上にコードされ、それにより阻害作用を示すことができる。
【００９２】
阻害剤は通常、治療有効量で投与され、この量は、ガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４の活性を低下させて、糖尿病の形態を著しく低下させる。好ましくは、ガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４活性は、治療なしの量と比較して（ただし、その他は同様の条件）、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％低下する。好適な実施態様において、この低下は、ガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４の細胞内レベルに等しい。
【００９３】
阻害剤は、医薬組成物で提供されてもよい。治療的又は予防的使用のための医薬組成物又は製剤は、医薬的に許容し得る希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、及び／又は補助剤を含んでもよい。本発明はまた、治療有効量のガンマセクレターゼ、Ｎｏｔｃｈ３、又はＤＬＬ４阻害剤を含む医薬組成物を提供する。「治療有効量」という用語は、特定の条件及び投与経路に対して治療効果を提供する量を意味する。組成物は液体又は凍結乾燥形態であってもよく、さまざまなｐＨ値及びイオン強度を有する希釈剤（トリス、酢酸、はリン酸緩衝液）、ツイーン又はポリソルベートなどの可溶化剤、ヒト血清アルブミン又はゼラチンなどの担体、チメロサール又はベンジルアルコールなどの防腐剤、及びアスコルビン酸又はメタ重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤を含む。特定の組成物の選択は、所望の治療される状態、投与経路、及び薬物動態パラメーターを含む多くの要因に依存する。ｓｉＲＮＡ製剤は、リポソーム製剤中で投与することが好ましい。
【００９４】
本発明はさらに、組織置換療法におけるインプラントとしての、好ましくはコラーゲンを含むヒドロゲルを用いた本発明の培養物から得られるような、本発明による人工血管オルガノイドの使用を提供する。本発明のオルガノイドを使用する治療は、人工血管オルガノイドを創傷に配置し、前記人工血管オルガノイド培養物を創傷に組み込ませることを含み得る。インプラントとしての使用は、特に結合組織の再増殖を必要とする位置で、治療すべき対象にオルガノイドを配置することを含むことができる。このような再増殖は、例えば糖尿病のような再増殖を損なう疾患、又は薬物療法、又は他の療法、例えば化学療法や放射線事故におけるような化学療法又は放射線などにより、停止する可能性がある。創傷は治療されることが好ましい。そのような創傷は、慢性創傷、特に３０日又は６０日又は９０日でも閉じることができない創傷であり得る。慢性創傷は、上記の状況、疾患、薬物療法、又は治療法が原因である可能性がある。特に、創傷は、糖尿病性足部潰瘍などの糖尿病性創傷、又は第３度熱傷などの熱傷である。創傷は皮膚創傷を含み得る。皮膚創傷には、表皮層と真皮層の両方の損傷が含まれる場合がある。皮膚の創傷を含む創傷は、下にある筋肉、骨、腱の外傷を含むことがある。治療法は、創傷の洗浄、特に再生を容易にするために死んだ組織の除去を含む場合がある。
【００９５】
このような治療法では、その数が創傷のサイズに依存する１つ以上のオルガノイドが、創傷などの治療対象の体積に入れられ、オルガノイドは体積を取り巻く組織と一体化することができる。前記体積は、好ましくは前記１つ以上のオルガノイドの外側に面する１つ以上のオルガノイド表面積の少なくとも５０％、好ましくは少なくとも７５％において、患者の組織に囲まれている（他のオルガノイドに面する複数のオルガノイドの場合、内部の表面積を数えない）。これは、体積がほとんど内部にあり、対象内に組み込むことができることを意味する。創傷は、内部創又は開放創であり得る。開放創でさえ、皮膚の創傷などの開いた表面に面したこのような体積を有する場合がある。
【００９６】
オルガノイドを創傷に組み込むことは、通常、本発明のオルガノイドの血管の存在によって改善される再生プロセスを含む。前記血管は、患者の循環系と接続することができ、損傷した組織の酸素化を改善し、その結果、その再生を改善する。
【００９７】
オルガノイド及びその細胞に対する免疫反応を回避するために、オルガノイドの細胞は、好ましくは患者と同じ生物であり（好ましくは両方がヒト、又は両方が同じ非ヒト動物、好ましくは哺乳動物）、患者とＭＨＣが一致する。このようなぴったりのオルガノイドを迅速に提供するために、記録されたさまざまなＭＨＣタイプを有するオルガノイドライブラリを作成することができる。そのオルガノイドは、患者に迅速に提供できる。
【００９８】
さらに、化合物と物質のキットが提供される。キットは、本発明のいかなる方法も実行する手段を含み得る。もちろん、一部の物質は標準化学物質であるか通常入手可能なものであるため、全ての物質を含める必要はない。それにもかかわらず、好ましくはコア物質が提供される。他のキットでは、より希少な物質が提供される。本発明のキット又はこれらの物質は組み合わせることができる。キットの構成要素は、通常、バイアルやフラスコなどの別々の容器で提供される。容器はまとめて梱包することができる。好ましくはキットは、本発明の方法又はこれらの工程を実行するためのマニュアル又は使用説明書を含む。
【００９９】
本発明の方法による人工血管オルガノイドの生成に適したキットが提供される。キットは、（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト又はＧＳＫ阻害剤；（ｉｉ）ＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ−Ａ、ＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ−２、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４から選択される血管分化因子；（ｉｉｉ）好ましくは１０％〜５０％のラミニン、２０％〜７０％のコラーゲンＩ、及び／又は２％〜３０％のコラーゲンＩＶ（全て質量％）を含むコラーゲン３Ｄマトリックスを含み得る。
【０１００】
好ましくは、キットは、上記の３Ｄマトリックス、又はこのような３Ｄマトリックスを生成するためのそれらの構成要素を含む。マトリックス成分は、例えば水和によって、マトリックスに復元される凍結乾燥状態などの固体状態で提供されてもよい。上記の任意のマトリックス又はそれらの成分を、キット内に含めることができる。好ましくはマトリックスはヒドロゲル、特に上記のコラーゲンヒドロゲルである。キットは、このような復元可能な（好ましくはコラーゲン性の）成分を含んでもよい。さらに好ましいマトリックス成分は、特にポリマー形態の炭水化物（多糖類）である。好ましい多糖はアガロースである。
【０１０１】
いかなるキットも、細胞増殖栄養物質、好ましくはＤＭＥＭ／Ｆ１２、ノックアウト血清代替（ＫＯＳＲ）培地、グルタマックス（Glutamax）、又は必須アミノ酸、及び／又は非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、又はこれらの任意の組み合わせをさらに含むことができる。実施例で言及されている任意の化合物をキットに含めることができる。
【０１０２】
本明細書に記載された任意の方法又は製品は、本明細書に記載された他の任意の方法又は製品に関して実施することができ、異なる実施態様を組み合わせることができることが企図される。
【０１０３】
キットはさらに、本発明の方法を実施するための使用説明書を含み得る。このような使用説明書は、印刷された形式で、又は適切なデータ担体上のコンピュータ可読形式であり得る。
【０１０４】
最初に出願された特許請求の範囲は、任意の出願された特許請求の範囲又は出願された特許請求の範囲の組み合わせに多重に依存する特許請求の範囲をカバーすることが企図される。本明細書で説明するいかなる実施態様も、本発明の方法又は製品に関して実施することができ、逆もまた真であることが企図される。特定の条件に関して検討された任意の実施態様は、異なる条件に関して適用又は実施することができる。さらに本発明の組成物及びキットを、本発明の方法を達成するため使用することができる。
【０１０５】
「含む（comprising）」は、開いた用語、すなわち物質の追加の成分又は工程を可能にすると理解される。「からなる（consisting of）」とは、物質の追加の成分又は工程を含まない閉じた用語として理解される。
【０１０６】
本出願全体を通して、「約」という用語は、ある値がその値の決定に使用される装置又は方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために使用することができ、あるセットにおいて、値は±１０％をさす場合がある。
【０１０７】
本発明は、以下の好適な実施態様及び定義においてさらに定義され、これらは全て上記の詳細な説明と組み合わせ可能である。
【０１０８】
１．人工血管オルガノイドを生成する方法であって、血管分化が可能な幹細胞を提供し、前記幹細胞における中胚葉分化を刺激し、前記幹細胞における血管分化を刺激し、前記幹細胞から細胞凝集体を発生させ、前記細胞凝集体をコラーゲン３Ｄマトリックスに埋め込み、前記コラーゲン３Ｄマトリックスにおける凝集体の血管分化を刺激することを含む、上記方法。
【０１０９】
２．前記コラーゲン３Ｄマトリックスが少なくとも５０質量％のコラーゲンを含む１に記載の方法。
【０１１０】
３．前記コラーゲン３Ｄマトリックスが、１０％〜５０％のラミニン、２０％〜７０％のコラーゲンＩ、及び／又は２％〜３０％のコラーゲンＩＶを含み、好ましくは、さらに０．５％〜１０％のニドゲン、０．５％〜１０％のヘパラン硫酸プロテオグリカン、及び／又は０．５％〜１０％のエンタクチン（全て質量％）を含む、１又は２に記載の方法。
【０１１１】
４．１０％〜５０％のラミニン、２０％〜７０％のコラーゲンＩ、及び／又は２％〜３０％のコラーゲンＩＶを含むコラーゲン３Ｄマトリックス内に血管幹細胞を埋め込み、前記コラーゲン３Ｄマトリックスにおける前記幹細胞の血管分化を刺激することを含む、人工血管オルガノイドを生成する方法。
【０１１２】
５．中胚葉幹細胞を血管幹細胞に分化させることにより血管幹細胞が生成され、好ましくは、前記中胚葉幹細胞が、多能性幹細胞における中胚葉分化を刺激することにより得られたものである、４に記載の方法。
【０１１３】
６．血管分化が可能な前記幹細胞が多能性幹細胞、好ましくは人工多能性幹細胞である、１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０１１４】
７．コラーゲンマトリックス内に埋め込まれた前記細胞凝集体が少なくとも５０個の細胞を含む、１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【０１１５】
８．中胚葉分化が、前記幹細胞をＷｎｔアゴニスト又はＧＳＫ阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１で処理することを含む、１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０１１６】
９．前記幹細胞における血管分化が、幹細胞をＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ−Ａ、及び／又はＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ−２、及び／又はＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、及び／又は大気酸素が１２％（ｖ／ｖ）以下の低酸素条件で処理することを含む、１〜８のいずれか１つに記載の方法。
【０１１７】
１０．前記凝集体の血管分化が、前記凝集体の細胞をＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ−Ａ、及び／又はＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ−２で処理することを含む、１〜９のいずれか１つに記載の方法。
【０１１８】
１１．前記凝集体が、凝集体形成の開始から７〜１５日目にコラーゲン３Ｄマトリックス内に埋め込まれる、１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０１１９】
１２．前記凝集体の細胞が前記３Ｄマトリックス中で少なくとも５日間、好ましくは少なくとも７日間培養される、１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【０１２０】
１３．前記３Ｄマトリックスが、好ましくは１０〜３０の粘弾性貯蔵弾性率Ｇ’を有するヒドロゲルである、１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０１２１】
１４．毛細血管が内皮と血管周囲の周皮細胞を有する基底膜とを含む、前記毛細血管の相互連結ネットワークを含む人工血管オルガノイド培養物であって、前記オルガノイドが１〜１３のいずれか１つの方法によって生成され、及び／又は前記毛細血管が、コラーゲンを有するヒドロゲルを含む人工３Ｄマトリックス内に埋め込まれ、及び／又は前記オルガノイド培養物が、個々の血管及び毛細血管の交点間の血管を計数すると４０〜１０００個の血管を含む、上記培養物。
【０１２２】
１５．前記毛細血管が１μｍ〜３０μｍの平均直径を有する、１４に記載の人工血管オルガノイド培養物。
【０１２３】
１６．内皮細胞と血管周囲の周皮細胞の比率が１００：１〜１：５である、１４又は１５に記載の人工血管オルガノイド培養物。
【０１２４】
１７．前記毛細血管が成熟内皮細胞及び／又は成熟周皮細胞を含む、１４〜１６のいずれか１つに記載の人工血管オルガノイド培養物。
【０１２５】
１８．前記ヒト毛細血管が内皮と血管周囲の周皮細胞を有する基底膜とを含む、ヒト毛細血管を有する非ヒト動物モデルを提供する方法であって、１４〜１７のいずれか１つに記載のヒト血管オルガノイドを非ヒト動物に導入する工程と、前記オルガノイドをその毛細血管に増殖させる工程とを含み、好ましくは、前記ヒトオルガノイドが、非ヒト動物の腎臓上又は腎臓内に導入される、上記方法。
【０１２６】
１９．１４〜１８のいずれか１つに記載の、挿入された人工血管オルガノイド培養物を含む非ヒト動物モデル。
【０１２７】
２０．前記ヒト毛細血管が内皮と血管周囲の周皮細胞を含む基底膜とを含む、ヒト毛細血管が内皮と血管周囲の周皮細胞を有する基底膜とを含む、ヒト毛細血管を有する非ヒト動物モデル。
【０１２８】
２１．前記人工血管オルガノイド培養物の毛細血管又は前記ヒト毛細血管が、非ヒト動物の血液循環系によって灌流される、１９又は２０に記載の非ヒト動物モデル。
【０１２９】
２２．前記血管又は毛細血管が病因に曝され、前記オルガノイド又はヒト動物モデルが病態のモデルである、１〜２１のいずれか１つに記載の方法又は培養物又は非ヒト動物モデル。
【０１３０】
２３．病因が高血糖症及び／又は炎症を含み、及び／又は上記病態が糖尿病であり、好ましくは前記炎症が、１つ以上の炎症性サイトカイン、好ましくはＴＮＦ−アルファ及び／又はＩＬ−６への曝露を含む、２２に記載の方法又は培養物又は非ヒト動物モデル。
【０１３１】
２４．病因または病態に影響を及ぼす候補化合物をスクリーニングする方法であって、前記候補化合物を、１〜２３のいずれか１つに記載の前記培養物若しくは非ヒト動物モデルに、又は前記培養物若しくは非ヒト動物モデルの生成中に投与し、候補化合物を投与していない前記培養物又は動物モデルと比較して前記培養物又は動物モデルの生理学的差異をモニターすることを含む、上記方法。
【０１３２】
２５．発生中の血管組織の作用、例えば欠陥、特に発生の欠陥を研究する方法であって、（ｉ）本発明の方法のいずれかの段階で、又は１〜２１のいずれか１つに記載のオルガノイド若しくは動物に対して、細胞内の目的の遺伝子の発現を減少又は増加させ、又は（ｉｉ）１〜２１のいずれか１つに記載のオルガノイド若しくは動物の任意の段階でオルガノイドの発生中に、細胞に目的の候補化合物を投与することを含む、上記方法。
【０１３３】
２６．組織置換療法、特に好適には前記人工血管オルガノイドを創傷内に配置し、前記人工血管オルガノイド培養物を創傷内に組み込む治療法におけるインプラントとしての、１４〜１７のいずれか１つに記載の人工血管オルガノイドの使用。
【０１３４】
２７．糖尿病性血管障害、閉塞性血管障害、血管透過性の変化、組織低酸素症、心臓病、脳卒中、腎疾患、失明、創傷治癒障害、又は慢性皮膚潰瘍などにおける、肥厚した毛細血管基底膜の治療又は予防における、Ｎｏｔｃｈ３活性化経路阻害剤（例えば、ガンマセクレターゼ阻害剤、Ｎｏｔｃｈ３阻害剤、ＤＬＬ４阻害剤、又はこれらの組み合わせ）の使用。
【０１３５】
２８．１〜１３のいずれか１つに記載の方法による人工血官オルガノイドの生成に適したキットであって、（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト又はＧＳＫ阻害剤、（ｉｉ）ＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ−Ａ、ＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ−２、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４から選択される血管分化因子、（ｉｉｉ）好ましくは１０％〜５０％のラミニン、２０％〜７０％のコラーゲンＩ、及び／又は２％〜３０％のコラーゲンＩＶ（全て質量％）を含むコラーゲン３Ｄマトリックスを含む、上記キット。
【０１３６】
本発明は以下の図面及び実施例によってさらに例示されるが、本発明は、本発明のこれらの具体的な実施態様に限定されるものではない。
【実施例】
【０１３７】
実施例１
材料と方法
ヒト幹細胞と血管オルガノイドへの分化。提示された全ての実験は、ヒトｉＰＳ細胞株ＮＣ８（Pripuzova et al. Stem Cell Res. 14, 323-338 (2015)）又はヒト胚性幹細胞（ＥＳＣ）株Ｈ９（Thomson et al. Science 282, 1145-1147 (1998)）で行った。全ての幹細胞は、既に記載されている化学的に定義されたフィーダー細胞を含まない条件下で培養された（Chen et al. Nat. Methods 8, 424-9 (2011)）。分化のために、Ｈ９  ＥＳＣ又はＮＣ８  ｉＰＳ細胞を０．５ｍＭ  ＥＤＴＡを使用して２分間脱凝集させ、その後０．１％ ステムプロアキュターゼ（Stempro Accutase）（Life Technologies）とともに３分間インキュベートした。２×１０5個の細胞を５０μＭ  Ｙ−２７６３２（Calbiochem）を含む分化培地（ＤＭＥＭ：Ｆ１２培地、２０％  ＫＯＳＲ、グルタマックス、ＮＥＡＡ、全てGibcoから）に再懸濁し、細胞凝集用に、超低付着表面の６ウェルプレートの１つのウェルに播種した（Corning）。細胞凝集体を３日目に１２μＭ  ＣＨＩＲ９９０２１（Tocris）で処理し、５、７、及び９日目に、ＢＭＰ４（３０ｎｇ／ｍＬ、Stemcell Tech.）、ＶＥＧＦ−Ａ（３０ｎｇ／ｍＬ、Peprotech）、及びＦＧＦ−２（３０ｎｇ／ｍＬ、Miltenyi）を添加した。１１日目に、細胞を、ＶＥＧＦ−Ａ（３０ｎｇ／ｍＬ）、ＦＧＦ−２（３０ｎｇ／ｍＬ）、及びＳＢ４３１５２（１０μＭ）を含む培地に切り替えて、内皮細胞／周皮細胞比のバランスを取った。得られた細胞凝集体を、１３日目にマトリゲル：コラーゲンＩ（１：１）ゲルに埋め込み、１００ｎｇ／ｍＬ  ＶＥＧＦ−Ａ及び１００ｎｇ／ｍｌ  ＦＧＦ−２を含む分化培地で覆った。この分化培地は２〜３日ごとに交換した。約１８日後に血管ネットワークが確立され、直接分析するか、個々の細胞凝集体のネットワークをゲルから切り出し、さらに９６ウェルの低付着プレート（Sumilon、PrimeSurface 96U）中で、自由浮遊血管オルガノイドとして最大３か月間培養した。
【０１３８】
ヒトｉＰＳＣの再プログラミングと特性解析。ヒト皮膚線維芽細胞（ＡＴＣＣ）及び血液試料を、既に記載されているように再プログラムした（Agu et al. Stem cell reports 5, 660-71 (2015）。染色体の完全性を確認するために、多重蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（Ｍ−ＦＩＳＨ）を、Agu et al.に記載のように行った。遺伝子型判定については、Illumina Inc.が推奨するInfinium HTSプロトコールガイドに従って試料調製を行った。遺伝子型判定は、製造業者の説明書に従ってIllumina iScanシステムでスキャンしたIllumina Infinium PsychArray-24 BeadChipを使用して行った。遺伝子型判定ソフトウェア（モジュール２．０．１）とともにIllumina GenomeStudio（Illumina, San Diego, CA, USA）を使用して、遺伝子型を呼び出し、コールレート＜０．９９５の試料を除いた。分析のために、Illuminaによるデフォルト設定、InfiniumPsychArray-24v1-1_A1マニフェスト、及びInfinium PsychArray-24v1-1_A1_ClusterFileクラスターファイルを適用した。ＣＮＶ分析とプロットは、bcftools cnvを使用して実施した。
【０１３９】
免疫細胞化学。コラーゲンＩ：マトリゲルゲル中の血管ネットワークを２０分間固定し、自由浮遊性の血管オルガノイドを４％ＰＦＡ、室温（ＲＴ）で１時間固定し、３％ＦＢＳ、１％ＢＳＡ、０．５％トリトン、０．５％ツイーンを用いてシェーカー上、室温で２時間ブロックした。注目すべきことに、血管オルガノイドは、３Ｄゲル中で最初に形成された血管ネットワークよりも安定しているため、標準的な免疫組織化学手順に使用することができた。１次抗体をブロッキング緩衝液で１：１００〜１：２００に希釈し、４℃で一晩インキュベートした。これらの研究では以下の抗体を使用した：抗ＣＤ３１（DAKO, Ｍ０８２３２９）、抗ＶＥ−カドヘリン（Santa Cruz, ｓｃ−９９８９）、抗ＩＣＡＭ−１（Sigma, ＨＰＡ００２１２６）、抗ＰＤＧＦＲ−β（CST, ３１６９Ｓ）、抗ＳＭＡ（Sigma,  Ａ２５４７）、抗カルポニン（Abcam、ＡＢ４６７９４）、抗ＩＶ型コラーゲン（Merck, ＡＢ７６９）、抗ラミニン（Merck, １９０１２）、抗ＭＹＨ１１（Sigma, ＨＰＡ０１４５３９）。ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％ツイーン）で１０分間洗浄を３回繰り返した後、試料をLife Technologiesの対応する２次抗体［Alexa Fluor 555 ロバ抗マウス（Ａ３１５７０）、Alexa Fluor 647 ロバ抗ウサギ（Ａ３１５７３）、Alexa Fluor 488 ロバ抗ヤギ（Ａ１１０５５）、Alexa Fluor 488 ロバ抗ヒツジ（Ａ１１０１５）］でブロッキング緩衝液中１：２５０で室温で２時間インキュベートした。ＴＢＳＴで２０分間洗浄を３回行った後、試料をＤＡＰＩで対比染色した。試料をマウントし（DAKO Ｓ３０２３８０）、一晩乾燥させ、続いてZeiss 780 レーザー走査顕微鏡で画像化した。
【０１４０】
血管オルガノイド移植。血管オルガノイドを、１２〜１５週齢のＮＳＧマウスの腎臓被膜下に移植した。全ての外科的処置は、オーストリアの法律及び倫理的承認に従って行われた。ＭＲＩを使用してマウスを画像化し、移植を経時的にモニターした。ヒト血管移植物の灌流を試験するために、マウスにＦＩＴＣ−デキストラン（１．２５ｍｇ／マウス、Invitrogen Ｄ１８２２）又は抗ヒトＣＤ３１−Ａｌｅｘａ  ６４７（２μｇ／マウス、BD ５５８０９４）のいずれかを静脈内注射した。切除した移植物を４％ＰＦＡで室温で２時間固定し、上記の血管オルガノイドについて説明したように全体を染色するか、又は免疫組織染色又は標準Ｈ＆Ｅ組織染色で処理した。内因性マウス血管と移植されたヒト血管を区別するために、特異的抗ヒトＣＤ３１抗体（DAKO、Ｍ０８２３２９）を使用し、マウスの血管を視覚化するために特異的抗マウスＣＤ３１抗体（Abcam、ＡＢ５６２９９）を使用した。交差反応の可能性を排除するために、これらの抗体をヒト及びマウスの両方の対照切片で試験して特異性を検証した。試料は、Zeiss 780 レーザー走査顕微鏡で画像化した。
【０１４１】
ＭＲＩ画像化。ＭＲＩは、３５ｍｍ直交バードケージコイルを備えた15.2 T Brukerシステム（Bruker BioSpec, Ettlingen Germany）で行った。画像化の前に、造影剤の送達用のテールラインを挿入した（シリコンチューブ付きの３０ゲージ針）。全ての動物（Ｎ＝３）をイソフルランで麻酔した（４％で誘導、１．５％で維持）。画像化中、呼吸をモニターし、呼吸が毎分５０未満又は８０超の場合、イソフルランのレベルを調整した。マウスは、水ポンプを用いて循環して３７℃に加熱した水で保温した。インプラントの解剖学的位置確認と視覚化のために、マルチスライスマルチエコー（ＭＳＭＥ）スピンエコーシーケンスを使用した（繰り返し時間（ＴＲ）／エコー時間（ＴＥ）＝３０００／５．８〜８１．１８ｍｓ、１４エコー、１１７μｍ２面内解像度、０．５ｍｍ切片厚、実験数［ＮＥＸ］＝１）。造影剤の漏出を補正するために、０．０１ｍｏｌ／ｌガドリニウムベースの造影剤（Magnevist, Berlex）０．０５ｍｌのボーラス前注射を行った。動的感受性造影剤（ＤＳＣ）灌流ＭＲＩは、０．２５ｍｏｌ／ＬのMagnevistの０．０５ｍＬを尾静脈注入後に、５００．６ｍｓの時間分解（１切片；ＴＲ／ＴＥ＝５００／１．７ｍｓ；フリップ角＝５度；４６８Ｘ４６８μｍ2の面内解像度；１ｍｍ切片厚；ＮＥＸ＝２；３６０回の繰り返し）の定常状態歳差運動（ＦＩＳＰ）による高速画像化を使用して採取した。ＤＳＣデータを使用して、灌流、相対血液量（ｒＢＶ）、平均通過時間（ＭＴＴ）、及び漏出（Ｋ２）を計算した。処理は、ＩｍａｇｅＪ（National Institutes of Health; rsbweb.nih.gov/ij/）及びＤＳＣｏＭＡＮプラグイン（Duke University, dblab.duhs.duke.edu/wysiwyg/downloads/DSCoMAN_1.0.pdf）を使用してオフラインで行った。分析では、ＤＳＣ−ＭＲＩ時系列の最初の５つの時点を切り捨てて、定常状態の磁化を確保し、プレボーラス信号強度
【数１】
2020523027.tif 000003
をピクセル単位で計算し、切り捨てられたＤＳＣ−ＭＲＩ時系列を緩和時間曲線
【数２】
2020523027.tif 000004
に変換し、前述のようにガドリニウム漏出（Ｋ2）について補正する（Boxerman et al. Am. J. Neuroradiol. 27, 859-867 (2006)）。
【０１４２】
ヒト血管オルガノイドにおける糖尿病性血管障害のモデル化。血管オルガノイドで確立された内皮ネットワークを、非糖尿病対照培地（１７ｍＭグルコース）又は糖尿病培地［７５ｍＭグルコース、ヒトＴＮＦα（１ｎｇ／ｍＬ、Invitrogen ＰＨＣ３０１１）及び／又はＩＬ−６（１ｎｇ／ｍＬ、Peprotech  ２００−０６）の存在下］で最大３週間培養した後、基底膜をＩＶ型コラーゲン免疫染色及び電子顕微鏡で調べた。高浸透圧効果の対照とするために、非糖尿病培地中でＤ−マンニトールを使用した。基底膜の定量のために、取得したＺスタックを分析し、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、管腔構造の周りのＣｏｌＩＶコートの厚さを測定した。薬物処理については、オルガノイドを以下の薬物の存在下又は非存在下で糖尿病培地（７５ｍＭグルコース、１ｎｇ／ｍＬヒトＴＮＦα、及び１ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−６）に曝露した：２，４−チアゾリジンジオン（５ｍＭ、Abcam  ａｂ１４４８１１）、メトホルミン（５ｍＭ、Abcam ａｂ１２０８４７）、アカルボース（８０μｇ／ｍＬ、Sigma  Ａ８９８０）、ナテグリンジン（１００μＭ、Sigma Ｎ３５３８）、ジフェニレンヨードニウム（１０μＭ）、グリメピリド（３０ｎＭ、Sigma  Ｇ２２９５）、ピオグリタゾン（１０μＭ、Sigma Ｅ６９１０）。以下の小分子阻害剤を使用した：Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン（５００μＭ、Sigma、Ａ７２５０）、ＣＨＩＲ９９０２１（１０μＭ、Tocris  ４４２３）、Ｇｏｅ６９７６（１００ｎＭ、Merck ＵＳ１３６５２５０）、ＭＫ２２０６（１０μＭ、EubioS1078）、ＱＮＺ（１０μＭ、Eubio Ｓ４９０２）、ＳＢ２０３５８０（１０μＭ、Eubio Ｓ１０７６）、ＳＣＨ７７２９８４（５００ｎＭ、Eubio Ｓ７１０１）、ＳＰ６００１２５（１０μＭ、Eubio Ｓ１４６０）、Ｙ−２７６３２（１０μＭ、Calbiochem ６８８０００）、ＤＡＰＴ（２５μＭ、Sigma Ｄ５９４２）、ＳＢ４３１５４２（１０μＭ）、Abcam ａｂ１２０１６３）。
【０１４３】
血管オルガノイドのＦＡＣＳ分析。非糖尿病及び糖尿病性血管オルガノイドは、ＰＢＳ中で２５μｇ／ｍＬヒアルロニダーゼ（Worthington）、３Ｕ／ｍＬディスパーゼ（Gibco）、２Ｕ／ｍＬリベラーゼ（Roche）、及び１００Ｕ  ＤＮＡｓｅ（Stemcell Tech）を使用して、３７℃で４５〜６０分間脱凝集させた。次に、単一細胞を以下の抗体で染色した：抗ＣＤ３１（BD、５５８０９４）、抗ＰＤＧＦＲ−β（BD、５５８８２１）、抗ＣＤ９０（Biolegend、３２８１１７）、抗ＣＤ４５（ebioscience、１１−０４５９−４１）、及び抗ＣＤ７３（BD ７４２６３３）。ＤＡＰＩ染色を使用して、死細胞を除外した。BD FACS Aria IIIは細胞選別に、BD FACS LSR Fortessa IIは細胞分析に使用した。
【０１４４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用するゲノム編集。２Ａ−Ｐｕｒｏカセット13（Addgene Plasmid：＃６２９８８；）を有する化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）からＣａｓ９を発現する哺乳類発現ベクターを、Ｕ６プロモーターの少し後でＢｂＳＩ（Thermo Fisher ＥＲ１０１１）で切断した。続いてプラスミドを再連結して、神経原性遺伝子座ノッチ相同タンパク質３（Ｎｏｔｃｈ３）又はデルタ様タンパク質４（Ｄｌｌ４）のいずれのためにｓｇＲＮＡを導入した。ｓｇＲＮＡアニーリングには以下のプライマーを使用した。Ｎｏｔｃｈ３：前進プライマー、ｃａｃｃｇＧＣＣＡＣＴＡＴＧＴＧＡＧＡＡＣＣＣＣＧ（配列番号７）；逆進プライマー、ａａａｃＣＧＧＧＧＴＴＣＴＣＡＣＡＴＡＧＴＧＧＣｃ（配列番号８）；Ｄｌｌ４：前進プライマー、ｃａｃｃｇＣＡＧＧＡＧＴＴＣＡＴＣＡＡＣＧＡＧＣＧ（配列番号：９）；逆進プライマー、ａａａｃＣＧＣＴＣＧＴＴＧＡＴＧＡＡＣＴＣＣＴＧｃ（配列番号１０）。ｓｇＲＮＡプラスミドは、サンガー配列決定法によって検証され、4D-Nucleofector System（Lonza）を用いるｉＰＳＣ（ＮＣ８）の電気穿孔法に使用された。P3 Primary Cell 4D-Nucleofector キットを使用して、２μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクトされたＮＣ８細胞を、マトリゲル被覆６ウェルプレート上で５０μＭ  Ｙ２７６３２（Calbiochem）を含むEssential 8 培地（Gibco）に播種し、２４時間培養した後、４８時間ピューロマイシン処理（０．２μｇ／ｍｌ）をした。残りの細胞をコロニー形成が観察されるまで培養し、サンガー配列決定法による遺伝子型判定のために単一コロニーをさらに拡張した。ノックアウト細胞株は、ウェスタンブロット又は免疫蛍光染色によって検証された。
【０１４５】
インビボでのヒト血管オルガノイドにおける糖尿病性血管障害のモデル化。ヒト血管オルガノイド移植物を有する免疫不全ＮＳＧマウスに、４０ｍｇ／ｋｇのストレプトゾトシン（ＳＴＺ）（Merck、５７２２０１）を５日間連続して毎日腹腔内注射した。毎日ＳＴＺをクエン酸緩衝液（ｐＨ４．６）に新たに溶解し、すぐに使用した。OneTouch UltraEasy システム（Lifetouch、ＡＷ０６６３７５０２Ｃ）を使用して非空腹時グルコースを測定することにより、糖尿病を確認した（血糖＞３００ｍｇ／ｄＬ）。ＤＡＰＴ（Selleckchem  Ｓ２２１５）をエタノールに溶かし、９０％コーンオイルを用いて５ｍｇ／ｋｇで５日間連続して注入し、１週間に２日は処理をしなかった。抗Ｎｏｔｃｈ３ブロッキング抗体（R&D  ＡＦ１５５９）を１ｍｇ／ｋｇで週３回注射した。血管漏出を定量するために、ＦＩＴＣ−Ｄｅｘｔｒａｎ+面積を測定し、ＦＩＪＩソフトウェアを使用して、灌流したヒト血管（ｈＣＤ３１+）の面積に標準化した。次に、この比をさらに対照非糖尿病マウスに標準化した。血管透過性に対するＤＡＰＴの急性作用の測定を避けるために、２日間の治療停止後に、長期ＤＡＰＴ治療血管の透過性を測定した。
【０１４６】
次世代配列決定法及びｑＲＴ−ＰＣＲ分析。非糖尿病性及び糖尿病性血管オルガノイドの血管ネットワークを、ＰＢＳ中の２５μｇ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（Worthington）、３Ｕ／ｍＬのディスパーゼ（Gibco）、２Ｕ／ｍＬのリベラーゼ（Roche）、及び１００ＵのＤＮＡｓｅ（Stemcell Tech）を使用して、３７℃で４５〜６０分間脱凝集させた。次に、単一細胞をＣＤ３１発現について染色し（BD  ５５８０９４）、ＤＡＰＩ陰性（＝生存細胞）をFACS Aria IIIマシンを使用してＦＡＣＳ選別した。ＣＤ３１陽性、ＤＡＰＩ陰性内皮細胞を直接トリゾールLS緩衝液（Invitrogen）に選別し、さらに処理してＲＮＡ分離した。ＲＮＡ  Ｓｅｑについて、ｍＲＮＡをポリＡ濃縮（NEB）により濃縮し、Il-lumnia HiSeq2500で配列決定した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析では、トリゾール（Invitrogen）を使用して全ＲＮＡを全血管オルガノイドから抽出し、Biorad CFX リアルタイムＰＣＲ機でSYBR Greenマスターミックス（Thermo）を使用して行ったiscript cDNA合成キット（Biorad）を使用して、ｃＤＮＡを合成した。全てのデータは最初にＧＡＰＤＨに標準化され、次に非糖尿病性対照試料と比較した。次のプライマーを使用した。
Ｃｏｌ４ａ１−ＦＷＤ：ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＡＧＧＴＧＡＡＡＧＡＧ（配列番号１）
Ｃｏｌ４ａ１−ＲＥＶ：ＣＴＴＧＧＴＧＧＣＧＡＡＧＴＣＴＣＣ（配列番号２）
Ｃｏｌ４ａ２−ＦＷＤ：ＡＣＡＧＣＡＡＧＧＣＡＡＣＡＧＡＧＧ（配列番号３）
Ｃｏｌ４ａ２−ＲＥＶ：ＧＡＧＴＡＧＧＣＡＧＧＴＡＧＴＣＣＡＧ（配列番号４）
ＧＡＰＤＨ−ＦＷＤ：ＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＣＧＴＣＧＣＣＡＧ（配列番号５）
ＧＡＰＤＨ−ＲＥＶ：ＡＧＣＣＣＣＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡ（配列番号６）
ＦＮ１−ＦＷＤ：ＡＣＡＣＡＡＧＧＡＡＡＴＡＡＧＣＡＡＡＴＧ（配列番号１１）
ＦＮ１−ＲＥＶ：ＴＧＧＴＣＧＧＣＡＴＣＡＴＡＧＴＴＣ（配列番号１２）
ＴＵＢＢ−ＦＷＤ：ＣＣＡＧＡＴＣＧＧＴＧＣＣＡＡＧＴＴＣＴ（配列番号１３）
ＴＵＢＢ−ＲＥＶ：ＧＴＴＡＣＣＴＧＣＣＣＣＡＧＡＣＴＧＡＣ（配列番号１４）
【０１４７】
バイオインフォマティクス分析。ＲＮＡ−ｓｅｑリードを、Ｔｏｐｈａｔ  ｖ２．０．１０及びｂｏｗｔｉｅ２／２．１．０を使用してヒトゲノム（ＧＲＣｈ３８／ｈｇ３８）に整列させ、ＴＰＭ、ＦＰＫＭでの遺伝子及び転写産物レベルの存在量の推定及びカウント予測は、ＲＳＥＭ  ｖ１．２．２５を用いて行い、整列されたリードはＨＴＳｅｑ  ｖ０．６．１ｐ１で計数し、示差的発現分析はＤＥＳｅｑ２  ｖ１．１０．１を使用し、ＦＤＲ閾値は０．０５を用いて行った。Ｅｎｒｉｃｈｒ（Kuleshov et al. Nucleic Acids Res. 44, W90-7 (2016)）を使用して、アップレギュレートされた遺伝子のＧＯ項を特定した。発現プロフィール類似性検索サーバーＣｅｌｌＭｏｎｔａｇｅ  ｖ２（cellmontage2.cira.kyoto-u.ac.jp; Fujibuchi et al. Bioinformatics 23, 3103-3104 (2007)）を使用して、通常の細胞タイプに関する細胞に対してｉＰＳ．ＥＣ細胞の発現プロフィールを分類した。ＴＰＭ中の平均ｉＰＳ．ＥＣ細胞転写物の相対存在量を、２９１９の前処理されたヒト遺伝子発現データセットと比較した。得られた結果に基づいて、ｉＰＳ．ＥＣは内皮細胞に最も類似している−最も相関の高い７５のデータセットは全て内皮細胞に由来し−５５は静脈内皮細胞に由来し、１３は微小血管内皮細胞に由来し、５は動脈内皮細胞に由来し、２はリンパ管内皮細胞に由来し、相関係数は０．６９〜０．６４の範囲であり、ｐ値５．３８ｅ−２２１２〜６．３９ｅ−１８２８の範囲である。ｉＰＳ．ＥＣ発現プロフィールを公開されたヒト組織ＲＮＡ−ｓｅｑデータ（Lonsdale et al. Nat. Genet. 45, 580-5 (2013)）と比較するために、２３３８の組織特異的遺伝子（Cavalli et al. Genome Biol. 12, R101 (2011)）の対数変換Ｆ／ＲＰＫＭ値を使用して、我々のプロフィールを既に説明されている（Danielsson et al. Brief. Bioinform. 16, 941-949 (2015)）入手できる発現プロフィールと組合せ、ＣｏｍＢａｔを使用して配列決定試験バッチ作用を除去し、相関ヒートマップ中の試料クラスター形成を検査した。ｉＰＳ．ＥＣの発現プロフィールは、ＧＴＥｘ動脈試料の発現プロフィールとクラスターを形成することがわかる。
【０１４８】
ＩＩ型糖尿病患者及び正常血糖対照患者の皮膚試料。ヒト皮膚の手術試料をＴ２Ｄ及び非糖尿病患者から採取した。非壊死性の健康な皮膚は、下肢切断物から採取した。Ｔ２Ｄ患者の下肢切断は、糖尿病性足症候群のために必要であった。非糖尿病患者の足切断は、事故、静脈潰瘍、又はＴ２Ｄに関連しないその他の血管疾患の結果として実施された。本研究は地元の倫理委員会によって承認され、含まれる全ての患者はインフォームドコンセントを提出した（番号４４９／２００１；８１／２００８）。注目すべきことに、我々は、潰瘍又は下肢切断部の壊死の可能な最大距離で分離した皮膚を含めた。患者集団の詳細を次の表１に示す。
【表１】
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【０１４９】
患者の皮膚の免疫組織化学。ヒトの皮膚材料をゲルトール（Geltol）で凍結固定し、−８０℃で保存するか、又は４％パラホルムアルデヒド固定後、パラフィン包埋した。２〜５μｍの切片を切り取り、その後の免疫蛍光染色又は免疫組織化学染色に使用した。パラフィン切片を脱蝋し、水和させ、熱誘導抗原回復を実施した。抗原性は、マイクロ波処理（３×５分、６２０Ｗ）又は１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ  ６．０）中でオートクレーブで切片を加熱（６０分）することで回復した。凍結切片を−２０℃で保存し、使用時に解凍して乾燥させ、氷冷アセトンで２０分間固定した。続いて、示された１次抗体とインキュベートし、ビオチン−ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ法、又は蛍光標識２次抗体を使用して可視化した。
【０１５０】
ヒト患者由来の内皮細胞調製物。４人のＴ２Ｄ患者と６人の非糖尿病患者を分析した。ＢＥＣｓのエクスビボ調製物（スペルアウト）用に、既に記載されているように11、ディスペースＩ（Roche Inc., ＃２１０４５５）の使用を含む、機械的及び酵素的微量調製プロトコールを使用した。得られた単一細胞懸濁液を１×ＰＢＳ−１％ＦＣＳでブロックし、洗浄工程を介在させた３工程手順を用いて抗ＣＤ３１抗体、抗ＣＤ４５抗体、及び抗ポドプラニン抗体とインキュベートした。抗体については、上記のセクションを参照されたい。次に、FACStar Plus（Becton Dickinson）を使用して細胞選別にかけた。総ＣＤ３１+ポドプラニン-内皮細胞を分離し、再分析し、２回ペレット化し（２００ｇ）、ＲＬＴ緩衝液（Qiagen；＃７４１０４）に溶解し、さらにＲＮＡｓｅｑ用に処理した。
【０１５１】
電子顕微鏡法。血管オルガノイドを、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ  ７．２中の２．５％グルタルアルデヒドを使用して室温で１時間固定した。糖尿病及び非糖尿病患者の足切断物からの皮膚の血管の電子顕微鏡検査用に、ヒトの皮膚を４％ＰＦＡ及び０．１％グルタルアルデヒドで固定し、Ｌｏｗｉｃｒｙｌ−Ｋ４Ｍに包埋した。次に、試料を同じ緩衝液で洗浄し、ｄｄＨ２Ｏ中の１％四酸化オスミウムで後固定し、一連の段階的なアセトンで脱水し、Ａｇａｒ１００樹脂に包埋した。糖尿病及び非糖尿病患者の足切断物からの皮膚の血管の電子顕微鏡検査用めに、ヒトの皮膚を４％ＰＦＡ及び０．１％グルタルアルデヒドで固定し、Ｌｏｗｉｃｒｙｌ−Ｋ４Ｍに包埋した。７０ｎｍの切片をカットし、２％酢酸ウラニル及びレイノルズクエン酸鉛で後染色した。切片を、８０ｋＶで運転したＦＥＩ  Ｍｏｒｇａｇｎｉ  ２６８Ｄ（FEI, Eindhoven, The Netherlands）で検査した。１１メガピクセルのＭｏｒａｄａ  ＣＣＤカメラ（Olympus-SIS）を使用して画像を取得した。
【０１５２】
糖尿病のげっ歯類モデル。この研究で使用したげっ歯類モデルと参考文献を表２に示す。対照は、表に示すように、年齢が一致したＷＴ動物又は未処理系統のいずれかであった。全てのげっ歯類モデルのパラフィン包埋皮膚試料の切片をＨＥ及びＰＡＳで染色して、血管形態を視覚化した。
【表２】
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【０１５３】
統計学。特に明記しない限り、全ての値は平均値±ＳＥＭとして示されている。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍを使用して統計分析を実施した。使用された全ての統計的検定は、図の凡例で説明されている。Ｐ＜０．０５は統計的に有意であると認められた。
【０１５４】
実施例２
ヒト３Ｄ血管オルガノイドの確立
毛細血管は、壁の内層を形成する内皮細胞と、周囲の基底膜に埋め込まれた周皮細胞で構成されている。ヒト内皮細胞は  既にヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得られている（James et al. Nat Biotechnol 28, 161-6 (2010); Patsch et al. Nat. Cell Biol. 17, 994-1003 (2015)）。さらに、血管平滑筋細胞などの血管周囲細胞は、ヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣから生成することができる（Cheung et al. Nat. Biotechnol. 30, 165-73 (2012)）。しかし、複雑な血管疾患のメカニズムを調べるには、内腔化内皮、内皮細胞−周皮細胞相互作用、一般的な基底膜の形成などのヒトの微小血管構造の全ての特徴に類似しており、ハイスループット薬物スクリーニングに適用できる、高度に洗練されたモデルが必要である。従って我々は、ｈＥＳＣ及びｉＰＳ細胞から３Ｄヒト血管オルガノイドを確立することに着手した。
【０１５５】
これを達成するために、我々は中胚葉の発生と血管の特定に関与するシグナル伝達経路を調節する多段階プロトコールを開発した（図１）。最初に我々は、低酸素条件下でヒトＥＳ細胞凝集体を培養し、これらの細胞凝集体をＧＳＫ阻害剤ＣＨＩＲ９９０２１に曝露してＷｎｔ経路を活性化することにより、中胚葉分化を誘導した（Pasch et al., supra; Sumi et al. Development 135, 2969-2979 (2008)）。続いて、細胞凝集塊をＢＭＰ４、ＶＥＧＦ−Ａ、及びＦＧＦ−２（Bai et al. J. Cell. Biochem. 109, 363-374 (2010); Goldman et al. Stem Cells 27, 1750-1759 (2009)）で処理し、次にＶＥＧＦ−Ａ、ＦＧＦ−２、及びＳＢ４３１５４２（ＴＧＦβシグナル伝達をブロックするため）（James et al., supra; Watabe et al. J. Cell Biol. 163, 1303-11 (2003)）で処理して、血管分化を促進した。次に、これらの細胞凝集体を３Ｄマトリックス内に埋め込み、さらにＶＥＧＦ−Ａ及びＦＧＦ−２で刺激して血管分化を促進した。定義された実験条件を複数のパイロットにより試験した後、３Ｄマトリゲル／コラーゲンＩマトリックスを開発し、こうして血管樹に似た構造の再現性の高い伸長を可能にした（図１ａ）。血管マーカーＣＤ３１の免疫染色により、これらの伸長物が内皮管を高率に含有していることが確認された（図１ｂ、ｃ）。また我々は、内皮細胞の追加のプロトタイプマーカーであるＶＥ−カドヘリンの染色も観察した（図６ａ）。共焦点画像解析により、ＣＤ３１+内皮構造の複雑な相互接続ネットワークの形成が示された（図１ｄ）。また我々は、このアプローチを使用してヒトｉＰＳＣからＣＤ３１+血管オルガノイドを開発することができた（図６ｂ〜ｄ）。
【０１５６】
次に我々は、ＣＤ３１+血管オルガノイドがインビボでヒト血管の特徴を再現することを確認した。遺伝子発現をプロフィール化するために、オルガノイドを脱凝集させ、ＣＤ３１+内皮細胞用について選別し、ＲＮＡｓｅｑを実行した。３Ｄ培養物からのＣＤ３１+内皮細胞の遺伝子発現プロフィールは、実際、ヒト血管の遺伝子発現プロフィール（ＧＴＥｘ）と最も密接にクラスター生成をした（図７ａ）。ＳＨＯＧｏｉｎ  Ｃｅｌｌｍｏｎｔａｇｅ２分析はさらに、我々のオルガノイド内皮細胞がヒト内皮細胞と排他的に一致することを示した（図示せず）。さらに、オルガノイドから分離された内皮細胞は、プロトタイプのｈＥＳＣマーカーであるＳＯＸ２とＮａｎｏｇを発現せず、平滑筋マーカーであるジストロフィン、デスミン、ミオグエニンも発現しなかった。しかし重要なことは、これらが、初代ヒト内皮細胞又は既に報告された２Ｄインビトロヒト内皮培養物のバイオマーカー、例えばＣＤ３４、ＣＤＨ５、ｖＷＦ、ＰＥＣＡＭ１、ＮＯＳ３、又はＲＡＭＰ２を発現したことである（図７ｂ）。オルガノイドから単離された内皮細胞はまた、細胞接着分子ＩＣＡＭ１を誘導することによりＴＮＦα刺激に応答し（図１ｅ）、これらの機能的能力を示していた。最も重要なことは、これらの３Ｄ血管オルガノイドが自己組織化性であり、我々は、分子マーカーＣＮＮ１、ＳＭＡ、及びＰＤＧＦＲβによって定義される周皮細胞の形成と適切な局在化を観察したことである（図１ｆ−ｈ）。プロトタイプの血管基底膜マーカーであるコラーゲンＩＶ（図１ｈ、ｉ）及びラミニン（図７ｃ）の免疫染色によって決定されるように、３Ｄ構造体も基底層に囲まれていた。注目すべきは、同じ条件下で精製され分化した内皮細胞と周皮細胞の同時培養は、周皮細胞の相互作用をほとんど示さずコラーゲンＩＶで覆われない弱々しい内皮細胞ネットワークを生じさせたことである（図２０ａ）。重要なことは、我々は、試験したヒト胚性幹細胞株Ｈ９と２つの追加のｉＰＳＣ株を使用して、同様の３Ｄ血管ネットワークを再現可能に生成できたことである（図２０ｂ）。
【０１５７】
薬物スクリーニングアプローチのために、これらのインビトロ微小血管構造をさらに改善し標準化するために、我々は９６マイクロウェル形式で自由浮遊性３Ｄオルガノイド培養物を開発した（図１ａ）。これらの１〜２ｍｍの自由浮遊性オルガノイドは、ＣＤ３１+内皮細胞と密接に結合した周皮細胞とからなる複雑な分岐３Ｄ毛細血管ネットワークを形成した（図２ａ）。ヒトＥＳＣ及びｉＰＳＣからの自由浮遊性オルガノイドの生成は、堅牢で再現性があった。重要なことに、自由浮遊性オルガノイド培養物は、免疫組織学及び電子顕微鏡（ＥＭ）観察による処理のための単一のオルガノイドのウェルへの分離を可能にした。免疫組織学とＥＭ画像化は、内皮細胞、周皮細胞、基底膜との典型的な毛細血管の形成と、内皮細胞間の典型的な密着結合の形成を実際に示した（図２ｂ、ｃ）。また我々は、増殖している血管の縁にＣＤ３１+端細胞を観察し、これは新たに血管が形成されていることを示す（図２ｄ）。予想どおり、これらの端細胞は、成熟した毛細血管でのみ形成される基底膜に囲まれていない（図２ｄ）。自由浮遊性血管オルガノイドは約３〜４週間の培養で拡張され、その後成長が停止し、以後少なくとも２か月間維持された。
【０１５８】
次に我々は、ＦＡＣＳを使用して、血管ネットワークと自由浮遊性オルガノイドの細胞組成を評価した。両方とも、ＰＤＧＦＲ−β+周皮細胞とＣＤ３１+内皮をさまざまな程度で含んでいた。残りの細胞は、主にＣＤ９０+ＣＤ７３+間葉系幹細胞様細胞、及びＣＤ９０-ＣＤ４５+造血細胞の少数集団であった（図１５ａ）。我々の血管ネットワーク及び自由浮遊性オルガノイドから分離されたＣＤ３１+内皮細胞の遺伝子発現プロフィールは、これらの細胞がフォンビルブラント因子（ｖＷＦ）などの成熟内皮マーカーを発現し、親ｉＰＳＣ多能性マーカーを効率的にダウンレギュレートすることを確認した（図１５ｂ）。３Ｄ培養物からのＰＤＧＦＲ−β+単離細胞は、ＮＧ２（ＧＳＰＧ４）、ＳＭＡ（Ａｃｔａ２）、又はカルポニン−１（ＣＮＮ１）の発現などの典型的な周皮細胞の特徴に向かって血管オルガノイドで変化させた初期血管ネットワーク段階で、内皮／周皮細胞マーカーの混合発現を示した（図１５ｂ）。この段階で我々は、血管オルガノイドにまだ存在している可能性のある初期ＰＤＧＦＲ−β+周皮細胞前駆体から生じ得るＯｃｔ−４及びＮａｎｏｇの発現も見つけた。重要なことに、我々の自由浮遊性オルガノイド中の内皮細胞は、細胞接着分子ＩＣＡＭ１（図１５ｃ）を誘導することによりＴＮＦ−α刺激に応答し、機能的能力を反映していた。さらに我々は、フォンビルブラント因子（ｖＷＦ）の免疫染色、ワイベルパラード体の生成、アセチル化ＬＤＬの取り込み、並びにレクチンＵＥＡ−１による染色（図１５ｄ〜ｆ）を観察し、これらは全て成熟内皮細胞を示している。
【０１５９】
従って我々は、真正のヒト微小血管系の形態学的特徴と分子的特徴とを示すｈＥＳＣ及びｉＰＳＣからの自己組織化性３Ｄヒト血管オルガノイドを確立した。
【０１６０】
実施例３
血管オルガノイドはマウスにおいて機能的なヒト血管を確立する
血管オルガノイドがインビボで機能的な血管を形成できるかどうかを試験するために、我々はインビトロでｈｉＰＳＣとｈＥＳＣを血管オルガノイドに分化させ、これらを免疫不全宿主マウスの腎被膜下に移植した。ヒトのオルガノイドは、そのコンパクトな構造のため再現性よく移植でき、実際にマウス環境で増殖し、場合によっては６ヶ月以上生存した。オルガノイド及び腎臓組織をヒト特異的抗ＣＤ３１で染色すると、内因性マウス血管の横にヒト血管構造が確立されることが示された（図３ａ）。我々はまた、端細胞の形成と隣接組織へのヒト血管の増殖によって決定されるように、ヒト血管の発芽を観察した。血液循環を評価するために、我々は受容体マウスをＩＴＣ−デキストランで灌流した。我々は、ヒトの血管が内因性のマウス血管にアクセスできることを発見した（図３ｂ、ｃ）。同様に我々は、マウスにヒト特異的抗ＣＤ３１抗体を灌流すると、マウス特異的抗ＣＤ３１染色によって決定されるように、内因性マウス血管とは異なる血管の灌流と染色を観察した（図３ｄ）。
【０１６１】
重要なことに、組織学的切片法は、これらのヒト血管が細動脈、毛細血管、及び細静脈に特定されることを示した（図３ｅ）。この特定は、ヒトＣＤ３１+内皮、及び内皮を取り囲む平滑筋細胞のマーカーとしての平滑筋アクチン（ＳＭＡ）若しくはカルポニンの免疫組織染色を使用して、さらに確認された（図３ｆ）。我々はまた、ヒトミオシン重鎖１１（ＭＹＨ１１）に特異的な抗体を用いて平滑筋細胞を検出した（図３ｆ）。さらに、移植されたヒト血管オルガノイドの灌流はＭＲＩ画像化で確認され、これは移植されたヒト血管オルガノイドへの流れと、重要なことに血管樹からの血液の排出も検出した（図３ｇ）。灌流速度と血液量の定量的ＭＲＩ測定は、十分に血管形成され灌流された移植物を示した。さらに、平均通過時間（ＭＴＴ）と少ない血管漏出（Ｋ2）により、隣接する内因性マウスの腎臓と筋肉中の血流パラメーターと比較して、ヒトの血管の明らかに正常な組織と機能が確認された（図３ｇ）。これらのデータは、我々のヒト３Ｄ毛細血管オルガノイドがインビボで細動脈と細静脈に特定され、受容体マウスにおいて灌流された機能的なヒト血管を形成することができることを示す。
【０１６２】
実施例４
ヒト血管オルガノイドにおける糖尿病性血管障害
糖尿病は、失明、腎不全、心臓発作、脳卒中、又は下肢切断の主要な原因である。血管の顕著な変化のために、大部分は基底膜の拡張によって定義される。糖尿病性微小血管障害によるこのような構造変化は、人間の腎臓又は筋肉生検で観察されている。ヒトの糖尿病性微小血管の変化を確認するために、我々は、正常血糖個体と２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）患者の手術標本で皮膚の微小血管を調べた。年齢、性別、体格指数（ＢＭＩ）、血清クレアチニンレベル、及び罹病年数を含む臨床特性を表１に示す。正常血糖対照の皮膚の血管では、コラーゲンＩＶ及びＰＡＳ染色（図４ａ）及び電子顕微鏡（図４ｂ）によって決定されるように、ＣＤ３１+毛細血管内皮は薄い基底膜に囲まれていた。我々の研究に含まれた全ての２型糖尿病患者の皮膚の微小血管は、細胞外細胞マトリックスタンパク質の沈着の顕著な変化と、基底膜層の大幅に厚くなったタマネギの皮膚のような積層と典型的な分裂を明らかにした（図。４ａ、ｂ）。従って、予想通り、Ｔ２Ｄ患者の皮膚毛細血管の大きな基底膜の肥厚が観察される。
【０１６３】
糖尿病性微小血管障害は、糖尿病患者の皮膚では明らかであるが、糖尿病のさまざまなげっ歯類モデルではまだ観察されていない。従って我々は、複数の遺伝的及び環境誘発性糖尿病のマウスモデルとラットモデルの皮膚微小血管系の包括的な評価を実施した。しかし、レプチン及びレプチン受容体変異体ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウス、ストレプトゾトシン処理マウス、マウスにおけるインシュリンのドキシサイクリン誘発ノックアウト、ＬＤＬＲ変異マウスの高脂肪食、高脂肪とグルコース、又はレプチン受容体変異を有するＺｕｃｋｅｒ糖尿病脂肪ラット、及びストレプトゾトシン処理ラットを含む、これらのモデルのいずれにおいても、皮膚の血管病態を示す基底膜の肥厚を検出できなかった（図９ａ、ｂ、及び表２）。従って、１型及び２型糖尿病のこれらの非常に重度の長期げっ歯類モデルはいずれも、毛細血管基底膜の肥厚というヒト糖尿病性血管障害の代表的な特徴を示さなかった。
【０１６４】
糖尿病のげっ歯類モデルが、糖尿病患者に存在する皮膚の血管障害を再現しないことから、我々は、我々のヒト血管オルガノイドでこの重要な表現型をモデル化できるかどうかを試験したいと考えた。これを達成するために我々は、高グルコース濃度の培地で３Ｄ血管オルガノイドを培養し、ヒトの皮膚試料と同様に、コラーゲンＩＶで検出される基底膜の拡張をモニターした。興味深いことに、高血糖症は、ヒト血管オルガノイドにおいてコラーゲンＩＶの顕著な増加をもたらした（図４ｃ、ｄ）。糖尿病はＴＮＦ−αやＩＬ−６などの炎症性サイトカインの血清レベルの上昇を含む炎症状態を伴うため、我々はまた、正常血糖又は高血糖状態でＴＮＦα及びＩＬ６有り又は無しで血管オルガノイドを培養した。正常血糖条件下では、血管オルガノイドにおけるコラーゲンＩＶ発現は、ＴＮＦαとＩＬ６の単独又は組み合わせへの曝露によって大きくに変化しなかった。しかし、高濃度グルコースとＴＮＦ−αとＩＬ−６の両方に曝露された血管オルガノイドでは、コラーゲンＩＶの沈着が著しく増加した（図４ｃ、ｄ）。これらのオルガノイドの共焦点断面により、ＴＮＦα、ＩＬ６、及び高グルコースの「糖尿病カクテル」による処理に応答してコラーゲンＩＶの顕著な拡張と基底膜の肥厚が確認された（図４ｅ）。さらに我々は、ヒトＴ２Ｄ患者に関する我々の知見（図４ｂ）と一致して、ＥＭによる基底膜層の大きな肥厚と分裂が観察した（図４ｆ）。糖尿病カクテルに応答した血管基底膜のこの肥厚は、ヒトｉＰＳＣ（図４ｃ〜ｆ）及びヒトＥＳＣに由来する血管オルガノイドで観察された。
【０１６５】
次に我々は、遺伝子発現に基づいて、高グルコース／ＴＮＦα／ＩＬ６に曝露された「糖尿病性オルガノイド」を特性解析した。ＴＮＦ−α、ＩＬ６、及び高グルコースに曝露された血管オルガノイドにおいて内皮細胞の顕著な減少並びに周皮細胞の消失が観察された（図１６ａ、ｂ）。我々は、対照及び糖尿病性ヒト血管オルガノイドから選別されたＣＤ３１+内皮細胞に対してＲＮＡｓｅｑを実施した。アンギオポエチン２、アペリン、ＥＳＭ１、及びＴＮＦＲＳＦ１１Ｂなどを含むヒトの糖尿病のマーカーとして既に関係が示唆されていた遺伝子は、対照オルガノイドと比較して糖尿病性オルガノイド中の最もアップレギュレートされた遺伝子の上位５位に含まれていた（図５ａ）。実際、糖尿病オルガノイド対対照のオルガノイド、及びＴ２Ｄ患者対正常血糖の個体の皮膚の血管から生成された示差的遺伝子発現プロフィールは、糖尿病性オルガノイドとＴ２Ｄ患者の間に、細胞外マトリックス、細胞接着、成長因子の活性／結合に関連する顕著な重複が証明された（図５ａ）。我々はまた、対照と比較して糖尿病性オルガノイドにおいてコラーゲンＩＶのｍＲＮＡレベルが増加していることを発見し（図９ｂ）、対照と糖尿病性オルガノイドからのＣＤ３１+内皮間の示差的発現遺伝子の上位５つの遺伝子のオントロジー（ＧＯ）経路項が全て、コラーゲン生合成と細胞外マトリックスの再編成に関連していることを発見した（図５ａ）。血管オルガノイドとは対照的に、ＴＮＦα／ＩＬ６の有無にかかわらず高グルコースに曝露されたさまざまな内皮細胞は、細胞外マトリックス及びコラーゲン生合成成分（ＨＵＶＥＣを含む）、不死化ヒト微小血管内皮細胞株ＨＭＥＣ１、及び初代又はＴＥＲＴ不死化ヒト血管内皮細胞（ＢＥＣ）をアップレギュレートしなかった。従って、高グルコースと炎症環境へのヒト血管オルガノイドの曝露は、基底血管膜の大きな肥厚と、遺伝子発現プロフィールの変化をもたらし、ヒト糖尿病性微小血管障害をモデル化している。
【０１６６】
実施例５
γ−セクレターゼ活性の阻害は血管オルガノイドにおける「糖尿病性」変化を消失させる
ヒト糖尿病性血管障害のインビトロのオルガノイドモデルを作成したため、次に我々は、高グルコース／ＴＮＦα／ＩＬ６で処理したヒト血管オルガノイドの基底膜の肥厚と拡張をブロックできる薬剤を特定したいと考えた。この目的のために我々はまず、現在糖尿病の治療にクリニックで使用されている複数の承認薬を試験した。しかし、我々が試験した薬、すなわちメトホルミン、ピオグリタゾン、グリメピリド、アカルボース、ナテグリジン、チアゾリジンジオン、及びジフェニレンヨードニウムのいずれも、血管オルガノイドにおける基底血管膜の高グルコース／ＴＮＦα／ＩＬ６誘発性肥厚に影響を及ぼさなかった（図５ｂ、ｃ）。
【０１６７】
次に我々は、さまざまな一般的なシグナル伝達及び下流経路の小分子阻害剤、すなわちＧＳＫ３、ＰＫＣ、ＡＫＴ、ＮＦｋＢ、ＲＯＳ、ｐ３８−ＭＡＰＫ、ＪＮＫ、ＲＯＣＫ、ＥＲＫを使用して、糖尿病血管オルガノイドをスクリーニングした。これらの阻害剤はいずれも、コラーゲンＩＶの拡張と毛細血管基底膜の肥厚に大きな影響を及ぼさないことがわかった（図５ｄ、ｅ）。注目すべきことに、ＮＦｋＢをブロックすると、基底膜の肥厚が実際に著しく増加した。次に我々は、異なる受容体を切断して、Ｎｏｔｃｈを含む明確なシグナル伝達経路を活性化する酵素であるγ−セクレターゼの阻害剤を評価した。γ−セクレターゼ阻害剤であるＤＡＰＴは、「糖尿病カクテル」に曝露されたヒト血管オルガノイドにおけるコラーゲンＩＶの拡張と基底膜の肥厚を完全に抑止することがわかった（図５ｃ、ｄ）。さらに、γ−セクレターゼ阻害剤の作用は用量依存的であり（図５ｅ）、その特異性と有効性がさらに確認された。重要なことに、我々はヒトの血管が糖尿病マウスにおいて漏れやすくなることも観察し、これは、我々が観察した形態変化が血管機能の障害にも関連しており、過剰な血管漏出（leakiness）がＤＡＰＴ治療によりレスキューされたことの直接的な証拠を提供している（図１７ａ、ｂ）。さらに、インビボでのＤＡＰＴ処理は、糖尿病マウスにおけるＣＤ３１+ヒト血管の消失をレスキューした（図１７ｃ、ｄ）。これらのデータは、γ−セクレターゼ活性の阻害が、インビトロ及びインビボでの糖尿病性血管の構造的及び機能的変化を阻害することを示す。
【０１６８】
実施例６
糖尿病性基底膜肥厚の候補経路としてのＤｌｌ４−Ｎｏｔｃｈ３の同定
γ−セクレターゼは、複数の異なる受容体を切断して、Ｎｏｔｃｈを含む明確なシグナル伝達経路を活性化できる酵素である。我々の実験的な糖尿病血管の変化からの防御に関与する分子的ＤＡＰＴ標的を同定するために、我々は、ＮｏｔｃｈリガンドであるＪａｇｇｅｄ１、Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ４、及びＮｏｔｃｈ１とＮｏｔｃｈ３（これらは全て、血管で顕著に発現されている）をブロックした。Ｊａｇｇｅｄ１、Ｄｌｌ１、及びＮｏｔｃｈ１の阻害は、我々の自由浮遊性オルガノイドの「糖尿病性」変化に明らかな影響は与えなかった。しかし、Ｄｌｌ４とＮｏｔｃｈ３のブロックは、基底膜肥厚を有意にレスキューした（図１８ａ）。これらの知見を確認するために、我々はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用して、Ｄｌｌ４及びＮｏｔｃｈ３変異体ヒトｉＰＳ細胞を生成した（図１９ａ〜ｄ）。これらの変異体ｉＰＳ細胞から、我々は血管ネットワークと自由浮遊性の血管オルガノイドを容易に得ることができた（図１８ｂ）。重要なことに、Ｄｌｌ４及びＮｏｔｃｈ３変異体血管の両方とも、高グルコース、ＩＬ６、及びＴＮＦａに曝露された対照オルガノイドと比較して、基底膜拡張の著しい低下を示した（図１８ｂ）。最後に、抗Ｎｏｔｃｈ３抗体によるヒト血管樹を保持するＳＴＺ処理マウスのインビボ処理は、Ｎｏｔｃｈ３のブロックが、糖尿病環境に曝露されたヒト血管の基底膜の変化を軽減することを示した（図１８ｃ）。従って他の経路を除外せずに、我々は、Ｄｌｌ４−Ｎｏｔｃｈ３を、糖尿病性血管障害における基底膜肥厚を媒介できる重要なリガンド−受容体対であることを明らかにした。
【０１６９】
結論
血管は、本質的に全ての器官系の発生に寄与し、脳卒中から心臓発作又は癌に至るまでの複数の疾患において重要な役割を担っている。これらの重要性のため、ＨＵＶＥＣ細胞などの古典的な内皮細胞株の使用を含む、発生及び疾患中の血管生物学を研究するための複数の細胞システムが開発された。さらに、内皮細胞及び周皮細胞は、それぞれヒト幹細胞から開発されている。
【０１７０】
私たちは、ｈＥＳＣ及びｉＰＳＣから真正のヒト毛細血管を発生させるための堅牢で再現可能なシステムを開発した。これらの血液オルガノイドは、既に定義されたヒトオルガノイドの全ての基準を満たしている。興味深いことに、免疫不全マウスに移植された血管オルガノイドは、デキストランの灌流、抗体注入、及び内因性マウス器官に匹敵する潅流と漏れ速度を明らかにしている血流のＭＲＩによって示されるように、ヒトの血管とマウスの循環系との接続をもたらした。ヒトの血管系をマウス循環系に接続すると、明確な血管樹が示される。最も重要なことは、移植されたヒトオルガノイドは、インビボで細動脈と細静脈にさらに発生し、こうして真の血管樹を形成することであり、これはこれまで証明されなかった。従って、これらのオルガノイドを使用して、より複雑な多系統のオルガノイドを開発することもでき、例えば心筋細胞を含む血管を形成したり、脳又は肝臓のオルガノイドの血管を発生させることを試みることができるであろう。またこれらは、患者由来のｉＰＳＣを用いて、まれな血管疾患を研究するのに使用できるであろう。
【０１７１】
糖尿病の世界的な有病率は過去３０年間でほぼ２倍になり、現在の推定では約４億２０００万人の糖尿病患者と、さらに多くの前糖尿病患者がおり、多くの場合長期間の病的状態と死亡率の上昇をもたらしている。糖尿病は、多くの場合、不十分な組織酸素化、細胞輸送の障害、又は血管の破裂をもたらす基底膜の大きな肥厚などの血管病変の結果として、失明、腎不全、心臓発作、脳卒中、及び下肢切断の主要な原因となっている。げっ歯類の網膜及び腎臓における糖尿病性血管の変化の特定の態様をモデル化することはできるが、これまで、ヒトで見られる糖尿病性の血管の変化の全ての臨床的特徴を示す単一のモデルはなかった。さらに、我々が試験した糖尿病のげっ歯類モデルのいずれにも皮膚の微小血管の変化は起こらないため、これらの微小血管の変化で機能する経路や潜在的な薬物標的を同定するための新しいシステムを開発することが不可欠である。我々の血管オルガノイドの有用性を証明するために、これらを高グルコース、ＩＬ６、及びＴＮＦαを含む「糖尿病カクテル」に曝露した結果、Ｔ２Ｄ患者の皮膚毛細血管で観察される微小血管の変化に似た、コラーゲンの基底膜の著しい拡張と遺伝子発現プロフィールが得られた。
【０１７２】
我々は、多くの現在の抗糖尿病薬、及び複数の一般的なシグナル伝達経路の小分子阻害剤を試験したが、糖尿病性オルガノイドの基底膜の拡張に影響を与えたのはごくわずかであった。興味深いことに、我々は、γ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴが我々のオルガノイド培養物の基底膜の肥厚をほぼ完全に防止することを見つけた。γ−セクレターゼ阻害剤はすでにアルツハイマー病の臨床試験を受けており、現在癌治療薬として試験中である。これらの薬物は、ヒトの糖尿病性血管障害の治療に再利用できる。重要なことに、これらのデータが、糖尿病性微小血管障害のヒト血管オルガノイドモデルが、微小血管の変化を緩和する新薬を発見するための有用なスクリーニングツールであるという原理の証拠を提供している。
【０１７３】
γ−セクレターゼ阻害剤はすでにアルツハイマー病について臨床試験を受けており、γ−セクレターゼ阻害剤とＮｏｔｃｈ２／３ブロッカーは現在癌治療薬として試験されている。さらに、γ−セクレターゼ阻害剤によるＮｏｔｃｈ経路の阻害は、糖尿病ラットにおけるアポトーシスにより、糖尿病に誘発された糸球体硬化症と糸球体上皮細胞の消失を減少させた。従って、これらの薬物は、ヒトの糖尿病性血管障害の治療に再利用できる。重要なことに、これらのデータは、ヒトの血管オルガノイドと我々のインビボの糖尿病性微小血管障害モデルが、糖尿病の微小血管変化を緩和する新薬を開発するための有用なスクリーニングツールとなり得るという原理の証明を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年2月14日(2020.2.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
人工血管オルガノイドを生成する方法であって、血管分化が可能な幹細胞を提供し、前記幹細胞における中胚葉分化を刺激し、前記幹細胞における血管分化を刺激し、前記幹細胞から細胞凝集体を発生させ、前記細胞凝集体をコラーゲン３Ｄマトリックスに埋め込み、そして前記コラーゲン３Ｄマトリックスにおける前記凝集体の血管分化を刺激することを含む、上記方法。
【請求項２】
コラーゲンマトリックス内に埋め込まれた前記細胞凝集体が少なくとも３０個の細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記中胚葉分化が、前記幹細胞を、Ｗｎｔアゴニスト又はＧＳＫ阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１で処理することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記幹細胞における血管分化が、前記幹細胞をＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ−Ａ、及び／又はＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ−２、及び／又ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、及び／又は１２％（ｖ／ｖ）以下の大気酸素の低酸素条件で処理することを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記凝集体の血管分化が、前記凝集体の細胞をＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ−Ａ、及び／又はＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ−２で処理することを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記コラーゲン３Ｄマトリックスが、少なくとも５０質量％のコラーゲンを含み、及び／又は前記コラーゲン３Ｄマトリックスが、１０％〜５０％のラミニン、２０％〜７０％のコラーゲンＩ、及び／又は２％〜３０％のコラーゲンＩＶを含み、好ましくは、さらに０．５％〜１０％のニドゲン、０．５％〜１０％のヘパラン硫酸プロテオグリカン、及び／又は０．５％〜１０％のエンタクチン（全て質量％）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記３Ｄマトリックスが、好ましくは１０〜３０の粘弾性貯蔵弾性率Ｇ’を有するヒドロゲルである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
毛細血管が内皮及び血管周囲の周皮細胞を有する基底膜を含む、毛細血管の相互接続ネットワークを含む人工血管オルガノイド培養物。
【請求項９】
前記オルガノイドが、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法によって産生される、請求項８に記載の人工血管オルガノイド培養物。
【請求項１０】
前記毛細血管が、コラーゲンを有するヒドロゲルを含む人工３Ｄマトリックス内に埋め込まれている、請求項８又は９に記載の人工血管オルガノイド培養物。
【請求項１１】
前記オルガノイド培養物が、個々の血管及び毛細血管の交点間の血管を計数すると４０〜１０００個の血管を含む、請求項８、９、又は１０の人工血管オルガノイド培養物。
【請求項１２】
前記毛細血管が１μｍ〜３０μｍの平均直径を有し、及び／又は内皮細胞と血管周囲の周皮細胞の比率が１００：１〜１：５であり、及び／又は前記毛細血管が成熟内皮細胞及び／又は成熟周皮細胞を含む、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の人工血管オルガノイド培養物。
【請求項１３】
非ヒト動物モデルにヒト毛細血管を提供する方法であって、前記ヒト毛細血管が内皮と血管周囲の周皮細胞を含む基底膜とを含み、請求項８〜１２のいずれか１項に記載のヒト血管オルガノイドを非ヒト動物に導入する工程と、前記オルガノイドにその毛細血管を増殖させる工程とを含み、好ましくは、前記ヒトオルガノイドは前記非ヒト動物の腎臓の上又は中に導入される、上記方法。
【請求項１４】
請求項８〜１３のいずれか１項に記載の挿入された人工血管オルガノイド培養物を含む非ヒト動物モデル、又はヒト毛細血管を有する非ヒト動物モデルであって、前記ヒト毛細血管が、内皮細胞と血管周囲の周皮細胞を含む基底膜とを含み、好ましくは、前記人工血管オルガノイド培養物の毛細血管又は前記ヒト毛細血管が、前記非ヒト動物の血液循環系によって灌流される、上記モデル。
【請求項１５】
前記血管又は毛細血管が病因に曝され、前記オルガノイド又はヒト動物モデルが病態のモデルであり、好ましくは、病因が高血糖症及び／又は炎症を含み、及び／又は前記病態が糖尿病であり、好ましくは前記炎症が１つ以上の炎症性サイトカイン、好ましくはＴＮＦ−アルファ及び／又はＩＬ−６への曝露を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法又は培養物又は非ヒト動物モデル。
【請求項１６】
病因または病態に影響を及ぼす候補化合物をスクリーニングする方法であって、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の培養物又は非ヒト動物モデルの生成中に、前記候補化合物を前記培養物又は非ヒト動物モデルに投与し、候補化合物を投与していない前記培養物又は動物モデルと比較して、前記培養物又は動物モデルの生理学的差異をモニターすることを含む上記方法。
【請求項１７】
組織置換療法、特に好ましくは前記人工血管オルガノイドを創傷内に配置し、前記人工血管オルガノイド培養物を創傷内に組み込むことを含む治療法におけるインプラントとしての、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の人工血管オルガノイドの使用。
【請求項１８】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の人工血管オルガノイドの生成に適したキットであって、（ｉ）Ｗｎｔアゴニスト又はＧＳＫ阻害剤、（ｉｉ）ＶＥＧＦ、好ましくはＶＥＧＦ−Ａ、ＦＧＦ、好ましくはＦＧＦ−２、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４から選択される血管分化因子、（ｉｉｉ）好ましくは１０％〜５０％のラミニン、２０％〜７０％のコラーゲンＩ、及び／又は２％〜３０％のコラーゲンＩＶ（全て質量％）を含むコラーゲン３Ｄマトリックス、を含む上記キット。
【国際調査報告】
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