(57)【要約】  本発明は、反応体積中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するための方法であって、反応体積が電気エネルギーを使用することにより加熱される方法に関する。ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも１回のパッセージで、反応体積を加熱するために変性ステップで使用される電気エネルギーと反応体積のサイズとの比は２０ジュール／ミリリットルよりも小さい。本発明はさらに、反応体積を収容するための反応容器と、反応体積を加熱するために反応体積と接触する１つまたは複数の加熱要素（１）からなる加熱手段と備える装置の使用であって、反応体積中の核酸を増幅するために、加熱要素のうちの少なくとも１つの加熱要素がオリゴヌクレオチド（５）に接合されている、装置の使用に関する。最後に、本発明は、反応体積中の核酸を増幅するための装置であって、反応体積を収容するための反応容器と、反応体積を加熱するために反応体積と接触する１つまたは複数の加熱要素（１）からなる加熱手段とを備える装置に関する。
2020504596.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反応体積中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するための方法であって、前記反応体積が電気エネルギーの使用により加熱される方法において、
前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも１回のパッセージで、前記反応体積を加熱するために変性ステップで使用される電気エネルギーと前記反応体積のサイズとの比が２０ジュール／ミリリットルよりも小さいことを特徴とする方法。
【請求項２】
反応体積中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するための方法であって、電気的に接触する１つまたは複数の加熱要素（１）からなる加熱手段が前記反応体積を加熱し、前記１つまたは複数の加熱要素（１）が前記反応体積と接触している方法において、
前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも１回のパッセージで、変性ステップで生成されたＣR×５℃よりも少ない熱を前記加熱手段が前記反応体積に供給し、ＣRが前記加熱手段による前記加熱中の前記反応体積の熱容量であることを特徴とする方法。
【請求項３】
反応体積中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するための方法であって、電気的に接触する１つまたは複数の加熱要素（１）からなる加熱手段が前記反応体積を加熱し、前記１つまたは複数の加熱要素（１）が前記反応体積と接触している方法において、
前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも１回のパッセージで、変性ステップ中に起こる前記反応体積の平均温度の最大上昇が１０℃未満であることを特徴とする方法。
【請求項４】
反応体積中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するための方法であって、電気的に接触する１つまたは複数の加熱要素（１）からなる加熱手段が前記反応体積を加熱し、前記１つまたは複数の加熱要素（１）が前記反応体積と接触している方法において、
前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも１回のパッセージで、変性ステップで生成されたＣR×５℃よりも少ない熱を前記加熱手段が前記反応体積に供給し、ＣRが前記加熱手段による前記加熱中の前記反応体積の熱容量であり、前記加熱手段が試料を加熱している間、前記加熱手段と前記反応体積との接触面積のうちの少なくとも１０％の接触面積で、時間的に安定した温度が確立されないことを特徴とする方法。
【請求項５】
前記加熱要素（１）または前記加熱要素（１）のうちの少なくとも１つの加熱要素（１）が加熱抵抗器であることを特徴とする、請求項１から４の一項に記載の方法。
【請求項６】
前記加熱要素（１）の前記反応体積と接触した表面と前記反応体積との比が０．１毎メートルよりも大きいことを特徴とする、請求項１から５の一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ポリメラーゼ連鎖反応中に前記加熱手段による熱供給が変動することを特徴とする、請求項１から６の一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも１回のパッセージで、サイクル継続時間ｔcが６０秒よりも短いことを特徴とする、請求項１から７の一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ポリメラーゼ連鎖反応の継続時間ｔPCRが４５分よりも短いことを特徴とする、請求項１から８の一項に記載の方法。
【請求項１０】
反応体積を収容するための反応容器と、反応体積と接触する１つまたは複数の加熱要素（１）からなる加熱手段であり、反応体積を加熱するための加熱手段とを備える装置の使用であって、前記加熱要素（１）のうちの少なくとも１つの加熱要素（１）が、反応体積中の核酸を増幅するためのオリゴヌクレオチド（５）に接合されている、装置の使用。
【請求項１１】
反応体積中の核酸を増幅するための装置であって、加熱手段を備え、前記加熱手段が１つまたは複数の加熱要素（１）からなり、前記１つまたは複数の加熱要素（１）が前記反応体積を加熱するために前記反応体積と接触している装置。
【請求項１２】
前記加熱要素のうちの少なくとも１つの加熱要素がオリゴヌクレオチド（５）に接合されていることを特徴とする、請求項１１に記載の装置。
【請求項１３】
光源（１５）および光センサー（１６）を備えることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の装置。
【請求項１４】
反応体積中の核酸を増幅するための装置であって、電気エネルギーを使用して前記反応体積を加熱するための１つまたは複数の加熱要素（１）からなる加熱手段と、前記電気エネルギーを前記装置に伝達するための手段とを備える装置において、
前記装置が、ＰＣＲ中の前記装置の電力消費がいずれの時点においても５０ワットを超えないように構成されていることを特徴とする装置。
【請求項１５】
電気蓄積装置を備えること、および前記電気蓄積装置中の使用可能な状態にある電気エネルギーが０．１Ｊ／ｍｌ超となるように前記電気蓄積装置が設計されていることを特徴とする、請求項１１、１２または１４に記載の装置。
【請求項１６】
反応体積中の核酸を増幅するための装置であって、前記反応体積を収容するための反応容器と、電気エネルギーを使用して前記反応体積を加熱するための１つまたは複数の加熱要素（１）からなる加熱手段と、前記電気エネルギーを前記装置に伝達するための手段とを備える装置において、
前記装置が、ＰＣＲ中の前記装置の電力消費と前記反応容器の容積との比がいずれの時点においても１ワット／ミリリットルを超えないように構成されていることを特徴とする装置。
【請求項１７】
反応体積中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するための装置であって、前記反応体積を収容するための反応容器と、１つまたは複数の加熱要素（１）からなる加熱手段と、前記反応体積を加熱するために前記加熱手段に電流を流す制御手段とを備える装置において、
前記制御装置が、前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも１回のパッセージで、変性ステップにおいて前記制御手段によって前記加熱要素に与えられる電気エネルギーと前記反応容器の容積との比が４０ジュール／ミリリットルよりも小さくなるように構成されていることを特徴とする装置。
【請求項１８】
反応体積中の核酸をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅するための装置であって、前記反応体積のための反応容器と、前記反応体積を加熱するための少なくとも１つの加熱要素（１）からなる加熱手段と、前記反応体積への前記加熱手段の熱放出を制御するための制御手段とを備える装置において、
前記制御装置が、前記ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも１回のパッセージで、変性ステップにおいて前記加熱手段によって前記反応体積に放出される熱量と前記反応体積を収容するための前記反応容器の容積との比が２０ジュール／ミリリットルよりも小さくなるように、および、前記加熱手段の少なくとも１つの加熱要素の少なくとも１つの方向の広がりが１．５マイクロメートルよりも大きくなるように構成されていることを特徴とする装置。
【請求項１９】
電気蓄積装置を備えること、および前記電気蓄積装置中の使用可能な状態にある電気エネルギーが１００ジュール／ミリリットル未満になるように前記装置が設計されていることを特徴とする、請求項１１から１８の一項に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、反応体積（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｖｏｌｕｍｅ）中の核酸を増幅するための方法であって、反応体積が加熱される方法に関する。本発明はさらに、反応体積を収容するための反応容器と、核酸を増幅するための加熱手段とを有する装置の使用に関する。最後に、本発明は、反応体積中の核酸を増幅するための装置であって、反応体積を収容するための反応容器と加熱手段とを有する装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国特許第７５６９３６６Ｂ１号明細書は、ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＰＣＲ）によって核酸を増幅するための方法を開示している。この方法では、反応容器をアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）温度まであらかじめ加熱するために反応容器を加熱ブロック上に配置する。この反応容器は、抵抗線コイルまたは抵抗薄膜の形態の加熱手段を備え、この抵抗線コイルまたは抵抗薄膜は、反応容器内の反応体積を一時的に伸長（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ）温度および変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）温度まで加熱するために反応体積と直接に接触する。そのために、この加熱手段に電流パルスを供給する。パルス継続時間（ｐｕｌｓｅ  ｄｕｒａｔｉｏｎ）は少なくともミリ秒程度であり、変性時間は少なくとも約１０ミリ秒である。例示的な実施形態では、パルス継続時間が１００ｍｍ（ミリ秒）であり、反応容器の容積が２００μｌ（マイクロリットル）である。
【０００３】
米国特許第６５８６２３３Ｂ２号明細書は、ＰＣＲを実行するためのシステムを開示している。このシステムはチャンバ（ｃｈａｍｂｅｒ）を有し、このチャンバは、上温度ゾーンおよび下温度ゾーン、ならびに上温度ゾーンと下温度ゾーンとを互いに接続する管路を備える。温度変化を達成するため、対流性ポンピングによって上および下温度ゾーン内に試料液を繰り返し導く。
【０００４】
公衆の縦覧に供されている国際公開第２００７／１４３０３４Ａ１号パンフレットには、ＰＣＲを実行するのに適した方法であって、光学的に温度変化を引き起こす方法が開示されている。たとえば、チタン−サファイヤ・レーザーのフェムト秒パルスをナノ粒子に照射すること、またはアルゴン−イオン・レーザーをナノ粒子あるいは金膜に照射することが提案されている。
【０００５】
公衆の縦覧に供されている欧州特許出願公開第２８０９８０６Ａ１号明細書は、反応体積中のナノ粒子上の核酸をＰＣＲによって増幅するための方法であって、熱を放出するためにレーザーによってナノ粒子を励起する方法を開示している。このナノ粒子はＰＣＲのプライマー（ｐｒｉｍｅｒ）に接合されている（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）。
【０００６】
公衆の縦覧に供されている独国特許出願公開第１９５４３０６０Ａ１号明細書には、電解質溶液の沸点よりも高い温度の直接に加熱された線（ｗｉｒｅ）の形態の電極上で電気化学的測定を実行するのに適した方法が開示されている。そのために、短期の強力な交流電流パルスを用いて試料を電解質溶液の沸点よりも高い温度に加熱する。その間、残りの電解質溶液の温度は事実上影響を受けない。次いで、過大な局所温度は急速に低下し、それによって電解質溶液の沸騰および干渉を引き起こすその他の影響が回避される。
【０００７】
公衆の縦覧に供されている独国特許出願公告第１９９６００３９８Ｂ４号明細書は、生化学分析に適した方法を開示している。この方法では、電気化学センサーの電極の表面が、ターゲット配列を検出するためのプローブ配列の役目を果たす核酸分子または核酸分子の小部分で修飾されている。このセンサーを交流電流によって直接に加熱する。この加熱では、検査対象の溶液の電極表面に近い非常に薄い層だけが加熱され、溶液の大部分の温度は事実上変化しない。
【０００８】
Ｒｅｓｋｅ，Ｆｌｅｃｈｓｉｇ他は、「Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｍｉｕｍ  ｔｅｔｒｏｘｉｄｅ−ｌａｂｅｌｌｅｄ  ＰＣＲ−ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｂｙ  ｍｅａｎｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｓｔｒａｎｄｓ」、Ｔａｌａｎｔａ  ７４（２００７）、３９３〜３９７ページで、ポリメラーゼ連鎖反応の生成物を電気化学的に検出するための方法を報告している。この方法では最初に、検出対象のＤＮＡを増幅するために従来のＰＣＲを実行する。次いで、増幅されたＤＮＡ２本鎖を分離し、電気化学的に活性の四酸化オスミウムビピリジンで標識する。それらのＤＮＡ２本鎖を、表面にＤＮＡプローブ鎖が固定された金電極と接触する。著者は、標識された鎖とプローブ鎖とのハイブリッド形成（ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ）をボルタンメトリー測定によって検出することを試みている。
【０００９】
Ｄｕｗｅｎｓｅｅ，Ｆｌｅｃｈｓｉｇ他は、「Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  ｃｏｎｖｅｃｔｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ」、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  ２５（２００９）、４００〜４０５ページで、対流によってＰＣＲを実行するための方法を報告している。そのために、試料管の下部エリアに白金線を導き、最長４５分の実験継続時間の間、熱流を供給することによって白金線を推定温度８９℃まで加熱した。さらに、その試料管を温度５０℃の水浴中に置いた。著者は、加熱線に平行に延びる中心軸を有する２つの（渦）渦流を伴う対流が反応体積中に生じたと報告している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明の目的は、反応体積中の核酸を増幅するための改良された方法であって、反応体積が加熱される方法を提供することにある。反応体積を収容するための反応容器と加熱手段とを有する装置の新規の使用を提供することも本発明の目的である。最後に、反応体積中の核酸を増幅するための改良された装置であって、反応体積を収容するための反応容器と加熱手段とを有する装置も本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様では、本発明の目的が、反応体積中の核酸をＰＣＲによって増幅するための方法であって、反応体積が電気エネルギーを使用して加熱され、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）のうちの少なくとも１回のパッセージで、反応体積を加熱するために変性ステップで使用される電気エネルギーと反応体積の値との比が２０ジュール／ｍｌ（ミリリットル）よりも小さい方法によって達成される。
【００１２】
本発明の語義において、ＰＣＲは、核酸を増幅するための方法であり、この方法では、変性ステップ、ハイブリッド形成ステップおよび伸長ステップからなる増幅サイクルが、好ましくは実際にこの順番で繰り返し実行される。このサイクルのパッセージごとに、核酸分子の数を増やす（ベスト・ケース・シナリオ（ｂｅｓｔ  ｃａｓｅ  ｓｃｅｎａｒｉｏ）では通常２倍にする）ことができ、その結果、核酸分子数の指数関数的増大を引き起こすことができる。以下では、増幅対象の核酸を「原核酸（ｏｒｉｇｉｎａｌ）」と呼ぶ。原核酸は１本鎖であり、原核酸は、「相補核酸（ｃｏｍｌｅｍｅｎｔ）」と呼ばれる原核酸鎖の相補鎖ととともに２本鎖を形成することができる。原核酸および相補核酸は、より大きな核酸の部分とすることができる。具体的には、ＰＣＲでは、増幅サイクルの１回のパッセージで生成された原核酸のコピーが、後続のパッセージで相補核酸を形成するための鋳型を構成することができ、生成された相補核酸のコピーを、このサイクルの後続のパッセージで原核酸を形成するための鋳型とすることができる。この増幅生成物に対する共通の用語が「アンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）」である。
【００１３】
変性ステップは、核酸２本鎖を変性させる役目、すなわち核酸２本鎖を２本の１本鎖に分離する役目を果たす。変性ステップでは、たとえば、相補核酸から原核酸を分離することができる。本発明によれば、好ましいタイプの変性は熱変性（「融解（ｍｅｌｔｉｎｇ）」とも呼ばれる）である。そのために、核酸２本鎖の少なくとも一部または２本鎖全体を、「変性温度」と記述される温度にさらす。この変性温度は、核酸２本鎖の分離を引き起こし、または少なくとも核酸２本鎖の分離を促す。好ましい変性温度は、一方で、核酸２本鎖を分離することができる高い温度であるように選択される。好ましい変性温度は、他方で、場合によっては同じく試料中に存在しうるＤＮＡポリメラーゼがあまり損傷を受けない低い温度であるように選択される。変性温度の典型値は９５℃である。
【００１４】
本発明の以下の説明を容易にするため、本発明の用語では、反応体積を加熱するため、およびそのようにして２本鎖核酸分子の変性を引き起こすために加熱手段が熱を生み出す方法ステップを記述するために、「変性ステップ」が使用される。これに従い、変性ステップの継続時間は、変性ステップに関係するＰＣＲのサイクルのパッセージにおいて加熱手段が熱を生み出す時間の和である。したがって、加熱手段として加熱抵抗器が使用される場合、変性ステップの継続時間は、反応体積を加熱するため、およびそのようにして２本鎖核酸分子の変性を引き起こすための加熱手段による電気の伝送の継続時間である。増幅サイクルの１回のパッセージで、加熱手段が、１つの時間間隔において熱を生み出すのではなく、互いに分離された複数の時間間隔において熱を生み出す場合（後に説明するようにこのことは有利となりうる）、変性ステップの継続時間は、これらの間隔の継続時間の和である。このように定義された変性ステップには、特に、たとえそこに存在する温度が依然として変性に必要な範囲に含まれる場合であっても、加熱手段自体の熱容量に基づく熱の放出も、反応体積の加熱手段に隣接する部分での温度の低下も含まれない。このことは、特に、本発明に基づく方法では、このように定義された変性ステップの後も変性が依然として起こりうることを意味する。このことはさらに、変性ステップにおいて放出される熱は一般に、変性ステップにおいて生成される熱よりも小さいことを意味する。
【００１５】
さらに、このＰＣＲは、「プライマー」と記述される少なくとも２種類のオリゴヌクレオチド、すなわちフォワード・プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）およびリバース・プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）を使用することが好ましい。フォワード・プライマーは、原核酸の３’末端に対して相補的であり、リバース・プライマーは、相補核酸の３’末端に対して相補的である。ハイブリッド形成ステップ（「アニーリング・ステップ」とも呼ばれる）では、フォワード・プライマーおよび／またはリバース・プライマーが、原核酸または相補核酸中ないしアンプリコン中のそのプライマーに相補的な配列とハイブリッドを形成する。ハイブリッド形成ステップは普通、フォワードおよびリバース・プライマーと、原核酸もしくは相補核酸中ないしアンプリコン中のそれらのプライマーの相補配列とのハイブリッド形成を引き起こす温度、または少なくともそのようなハイブリッド形成を促す温度で実行される。この温度は、その温度が、プライマーのできるだけ特異的なハイブリッド形成を助長するように選択されることが好ましい。ハイブリッド形成温度は通常５０℃から７２℃の間である。
【００１６】
伸長ステップでは、ハイブリッドを形成したプライマーを、ポリメラーゼ酵素によって相補的に伸長させる。したがって、フォワード・プライマーから出発すると相補核酸を合成することができ、リバース・プライマーから出発すると原核酸を合成することができる。伸長させるために、伸長を助長する温度または少なくとも伸長を促す温度にポリメラーゼをさらす。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ（Ｔａｑ）のポリメラーゼを使用するときには通常、７２℃の伸長温度が使用される。このＰＣＲのいくつかの実施形態では、ハイブリッド形成温度と伸長温度とが同一である。すなわち両方のステップが同じ温度で実行される。（このことは、ＰＣＲ中の温度レベルが、結合されたハイブリッド形成および伸長温度（ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｔｅｍｐｅｒｔｕｒｅ）（以後、結合ハイブリッド形成／伸長温度）と変性温度の２つだけであることを意味する。）
【００１７】
本発明の文脈では、用語「核酸」および「オリゴヌクレオチド」が、（デオキシ）リボ核酸および（デオキシ）オリゴリボヌクレオチドを含むだけでなく、さらに、たとえ上記の核酸およびオリゴヌクレオチドが好ましい場合であっても、骨格鎖上に修飾基（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を有する１つもしくは複数のヌクレオチド類似体（たとえばメチルホスホナート、ホスホロチオアートもしくはペプシン核酸（ｐｅｐｔｉｃ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＰＮＡ））を含む核酸およびオリゴヌクレオチド、特に骨格鎖の糖上に修飾基を有する１つもしくは複数のヌクレオチド類似体（たとえば２’−Ｏ−アルキル誘導体、３’−および／もしくは５’−アミノリボース、ロックト核酸（ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ：ＬＮＡ）、ヘキシトール核酸、モルホリノ（ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）もしくはトリシクロＤＮＡ。この点に関しては、Ｄ．ＲｅｎｎｅｂｅｒｇおよびＣ．Ｊ．Ｌｅｕｍａｎｎ、による論文「Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ  ｂａｓｅ−ｐａｉｒｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｔｒｉｃｙｃｌｏ−ＤＮＡ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、２００２年、１２４巻、５９９３〜６００２ページを参照されたい。この論文の関連部分は、参照によって本開示の一部とみなされる）を含む核酸およびオリゴヌクレオチド、または塩基類似体、たとえば７−デアザプリンもしくはユニバーサル塩基、たとえばニトロインドールもしくは修飾された天然塩基、たとえばＮ４−エチルシトシンを含む核酸およびオリゴヌクレオチドを含む。本発明の一実施形態では、これらの核酸またはオリゴヌクレオチドが、非ヌクレオシド類似体との接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）またはキメラ（ｃｈｉｍｅｒａ）、たとえばＰＮＡである。本発明の一実施形態では、これらの核酸またはオリゴヌクレオチドが、１つまたは複数の位置に、非ヌクレオシド単位、たとえばスペーサ、たとえばヘキサエチレングリコールまたはＣｎスペーサを含む。ｎは３から６の間である。これらの核酸またはオリゴヌクレオチドが修飾基を含む場合、それらの修飾基は、その修飾基を用いても、天然ＤＮＡ／ＲＮＡ分析物とハイブリッドを形成することが可能であるように選択される。特に塩基の相補性の程度が異なるハイブリッドを識別すること（ミスマッチ弁別）ができるように、好ましい修飾基は、融解挙動、好ましくは融解温度に影響を与える。好ましい修飾基は、ＬＮＡ、８−アザ−７−デアザプリン、５−プロピニル−ウラシルおよびシトシン、ならびに／または核酸もしくはオリゴヌクレオチド中のアベーシック（ａｂａｓｉｃ）インターラプション（ｉｎｎｔｅｒｒｕｐｔｉｏｎ）もしくは修飾基を含む。本発明の語義において、追加の修飾は、たとえば、ビオチン、チオール、蛍光供与体分子および蛍光受容体分子による修飾である。
【００１８】
本発明に基づく方法は反応体積中で実施される。このことは、本発明の語義において、凝集性の（ｃｏｈｅｓｉｖｅ）反応体積の少なくとも一部で核酸の増幅が起こることを意味する。反応体積は溶液または懸濁液であり、普通は、溶媒または懸濁媒質、好ましくは水の他に増幅対象の核酸（以下では「ターゲット核酸」も使用される）を含む。さらに、反応体積は一般に、原核酸および相補核酸、ならびに／または他の成分、たとえばポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓおよび塩を含み、これらは分散したり溶解したりすることができる。
【００１９】
本発明の語義において、「加熱に使用される電気エネルギー」は、反応体積を加熱するために直接にまたは間接的に使用されるエネルギーである。この定義によれば、この電気エネルギーは、反応体積に供給される熱とは異なる。たとえば加熱手段として加熱抵抗器を使用するとき、この相違はほとんどまたは全く分からない。この場合には、加熱抵抗器を適当に配置することによって、加熱に使用される電気エネルギーをほぼ完全に反応体積に供給することができるような形で、加熱に使用される電気エネルギーが、電流が通る加熱抵抗器でほぼ完全に熱に変換されるためである。しかしながら、たとえばレーザーでナノ粒子を励起して熱を放出する欧州特許出願公開第２８０９８０６Ａ１号明細書から知られている方法の場合には、この相違が非常に明確に知覚可能である。これは、この場合の加熱に使用される電気エネルギーがレーザーを動作するために使用される電気エネルギーであり、このエネルギーは、レーザーおよびナノ粒子を経由して迂回するまで反応体積を加熱しないためである。レーザーおよびナノ粒子を経由する迂回の効率が低いため、実際には、加熱に使用される電気エネルギーの小部分だけが熱として反応体積に供給される。
【００２０】
本発明に関連して「反応体積を加熱する」ことに言及された場合、本発明の語義において、このことは、反応体積全体を加熱しなければならないことを必ずしも意味せず、反応体積全体を均一に加熱しなければならないことを必ずしも意味しないことは言うまでもない。その代わりに、本発明の語義では、不均質な加熱、すなわち反応体積の部分だけを加熱することも、反応体積を加熱することとみなされる。
【００２１】
本発明の他の態様では、本発明の目的が、反応体積中の核酸をＰＣＲによって増幅するための方法であって、電気的に接触する１つまたは複数の加熱要素からなる加熱手段が反応体積を加熱し、この１つまたは複数の加熱要素が反応体積と接触し、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回のパッセージで、変性ステップで生成されたＣR×５℃（摂氏５度）よりも少ない熱を加熱手段が反応体積に供給し、ＣRが、加熱手段による加熱中の反応体積の熱容量である方法によって達成される（ここでは、および以下においても、物体の熱容量は大文字「Ｃ」によって示され、比熱容量は小文字「ｃ」によって示される）。言い換えると、この他の熱流入および熱流出を考慮しない場合、この加熱手段は、平均して５℃未満の温度だけ反応体積を加熱する。
【００２２】
本発明の他の態様では、本発明の目的が、反応体積中の核酸をＰＣＲによって増幅するための方法であって、反応体積と接触した加熱手段が反応体積を加熱し、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回のパッセージで、変性ステップ中に起こる反応体積の平均温度の最大上昇（以下では反応体積の「ＭＧＴＥ」とも呼ぶ）が１０℃未満である方法によって達成される。
【００２３】
このように、本発明の語義において、加熱手段は、加熱要素の総体である。本発明の語義において、「接触」は、加熱要素および反応体積に関して、反応体積が、加熱要素の１つのエリアに隣接していることを意味する。加熱要素が、加熱要素の熱発生構成要素と反応体積との間に配置された材料（以後、「分離層」とも呼ぶ）を含む場合、「接触」は、この分離層の反応体積に面した面を介して、加熱要素が反応体積と接触していること意味する。加熱要素と反応体積の間のこの接触の達成可能な利点は、加熱要素の近傍で加熱要素によって反応体積を加熱することができることである。
【００２４】
本発明の他の態様では、本発明の目的が、反応体積中の核酸をＰＣＲによって増幅するための方法であって、１つまたは複数の加熱要素からなる加熱手段が反応体積を加熱し、この１つまたは複数の加熱要素が反応体積と接触し、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回のパッセージで、変性ステップで生成されたＣR×５℃よりも少ない熱を加熱手段が反応体積に供給し、ＣRが、加熱手段による加熱中の反応体積の熱容量であり、全変性ステップの間、加熱手段と反応体積との接触面積のうちの少なくとも１０％の接触面積で、時間的に安定した温度勾配が確立されない方法によって達成される。
【００２５】
本発明の語義において、加熱要素による加熱の開始時刻ｔ0の後の時点ｔ1における温度勾配の最大傾斜量に対する時刻ｔ2＝ｔ0＋２×（ｔ1−ｔ0）における温度勾配の最大傾斜量の変化が２０％未満である場合、温度勾配は、時点ｔ1において「時間的に安定している」とみなされる。この時間的安定性の確認のためにいえば、この時間的安定性は単に、関連する最大勾配の量の比較であり、時点ｔ2において加熱手段が熱を生成しているか否かではない。時点ｔ2における勾配の量は１０％未満であることが好ましく、５％未満であることが特に好ましく、３％未満であることが特に好ましく、１％未満であることが特に好ましい。この勾配は一般に、加熱手段の表面においてその最大傾斜を有する。
【００２６】
本発明の他の態様では、本発明の目的が、反応体積を収容するための反応容器と、反応体積を加熱するために反応体積と接触する１つまたは複数の加熱要素からなる加熱手段とを備える、反応体積中の核酸を増幅するための装置の使用であって、これらの加熱要素のうちの少なくとも１つの加熱要素がオリゴヌクレオチドに接合されている装置の使用によって達成される。
【００２７】
本発明の他の態様では、本発明の目的が、反応体積中の核酸を増幅するための装置であって、１つまたは複数の加熱要素からなる加熱手段を備え、この１つまたは複数の加熱要素は、反応体積を加熱するために反応体積と接触することができる装置によって達成される。
【００２８】
本発明の他の態様では、本発明の目的が、反応体積中の核酸を増幅するための装置であって、電気エネルギーを使用して反応体積を加熱するための１つまたは複数の加熱要素からなる加熱手段と、電気エネルギーを装置に運ぶための手段とを備え、装置の電力消費がいずれの時点においても５０Ｗ（ワット）を超えないように設計されている装置によって達成される。
【００２９】
本発明の他の態様では、本発明の目的が、反応体積中の核酸を増幅するための装置であって、反応体積を収容するための反応容器と、電気エネルギーを使用して反応体積を加熱するための１つまたは複数の加熱要素からなる加熱手段と、電気エネルギーを装置に運ぶための手段とを備え、電力消費と反応容器の容積との比がＰＣＲ中のいずれの時点においても１Ｗ／ｍｌ（ワット／ミリリットル）を超えないように設計されている装置によって達成される。この制約は、装置のスイッチオン工程中に生じる高い電力消費には適用されない。このような高い電力消費は、技法に基づく始動電流によって生じる可能性がある。このような高い電力消費はＰＣＲ中の電力消費とはみなされず、したがってここでは考慮されない。
【００３０】
本発明の他の態様では、本発明の目的が、反応体積中の核酸をＰＣＲによって増幅するための装置であって、反応体積を収容するための反応容器と、１つまたは複数の加熱抵抗器からなる加熱手段と、反応体積を加熱するために加熱手段に電流を流す制御装置とを備え、この制御装置が、ＰＣＲ応の増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも１回のパッセージで、変性ステップにおいて制御装置によって加熱要素に与えられる電気エネルギーと反応容器の容積との比が４０Ｊ／ｍｌ（ジュール／ミリメートル）よりも小さくなるように設計されている装置によって達成される。
【００３１】
本発明の他の態様では、本発明の目的が、反応体積中の核酸をＰＣＲによって増幅するための装置であって、反応体積のための反応容器と、反応体積を加熱するための少なくとも１つの加熱要素からなる加熱手段と、反応体積への加熱手段の熱放出を制御するための制御装置とを備え、この制御装置が、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回のパッセージで、変性ステップにおいて加熱手段によって反応体積に放出される熱量と反応体積を収容するための反応容器の容積との比が２０Ｊ／ｍｌよりも小さくなるように、および、加熱手段の少なくとも１つの加熱要素の少なくとも１つの方向の広がりが１．５μｍ（マイクロメートル）よりも大きくなるように構成されている装置によって達成される。
【００３２】
本発明はとりわけ、知られている増幅法では、核酸増幅の異なるステップに対して確立する必要がある反応体積温度のために必要な熱平衡化（ｔｈｅｒｍａｌｉｓａｔｉｏｎ）の継続時間が方法の継続時間にかなり寄与すること、およびこれらの段階を短くすることによって方法の継続時間を短縮することができることを本発明の発明者が認識したことに基づく。本発明はまた、ＰＣＲに必要な１つまたは複数の温度が反応体積の一部だけで達成されるときであってもこの方法を効率的に実行することができることを本発明の発明者が認識したことに基づく。本発明はさらに、先行技術よりもかなり小さなエネルギーを使用してこれを達成することができることを認識したことに基づく。
【００３３】
特に、本発明を用いると、好ましくは反応体積中の核酸分子の変性を実行するために、たとえば短い電気インパルスの助けを借りて、加熱手段の加熱要素のすぐ近傍だけを短時間、加熱し、同時に、反応体積の大部分を、（この語義では「大域（ｇｌｏｂａｌ）」）ベース温度のままにしておくことを達成することができる。このベース温度では特に、伸長および好ましくはさらにハイブリッド形成を実行することができる。これは、加熱手段による加熱の継続時間を、周囲の反応体積中に生じた熱場（ｔｈｅｒｍａｌ  ｆｉｅｌｄ）が数マイクロメートルしか広がらないような非常に短いものにすることによって達成されることが好ましい。このようにして加熱ゾーンが形成され、加熱ゾーンは、反応体積のうちのごく小さな部分だけを含むことが好ましい。特に、運ばれる熱量を、反応体積の重大な大域加熱（ｇｌｏｂａｌ  ｈｅａｔｉｎｇ）が起こらないような非常に小さいものにすることができる。
【００３４】
本発明の語義において、「大域温度」は、体積に関する反応体積の平均温度であり、したがって反応体積の熱平衡化後に反応体積中で確立される温度または確立されるであろう温度である。「大域加熱」は、このように定義される大域温度の上昇である。
【００３５】
さらに、本発明を用いると、加熱後に、特に変性ステップにおいて、加熱ゾーンから反応体積の残りの部分に広がるこの運ばれた熱が、ごくわずかな大域温度上昇しか引き起こさないことを達成することができる。ここでは「ごくわずかな」が特に、好ましくは、核酸分子を変性するには温度上昇が小さすぎることを意味し、特に好ましくは、ハイブリッド形成および伸長を阻むには温度上昇が小さすぎることを意味する。
【００３６】
したがって、変性ステップおよび好ましくはさらに核酸増幅の他のステップを、加熱要素のすぐ近傍で局所的に実行することができ、加熱手段上には、加熱手段上でさらにアンプリコンが形成されることを可能にし、したがって局所加熱を用いた変性を助長することを可能にするために、必要なプライマーのうちの少なくとも１つのプライマーが固定（以後、「官能基化（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｓｅｄ）」）されている。言い換えると、この加熱手段の官能基化に基づき、ＰＣＲの諸ステップ、特にハイブリッド形成、伸長および／または変性ステップの限局化、ならびに好ましくはさらにＰＣＲの進捗を観察するための信号の生成が、加熱手段のすぐ近傍において達成されることにより、反応体積の加熱を反応体積の小部分だけに限定することができる。
【００３７】
本発明を用いると、核酸をより迅速に増幅することが達成可能である。特に、加熱および冷却過程に多くの秒数を要する従来のサーモサイクラとは対照的に、本発明を用いると、ＰＣＲの継続時間が、もはや加熱速度、冷却速度などの技術的限界によっては決まらないことを達成することができる。加熱手段の近傍で絶えず熱が生成されるため、反応容器中での熱平衡化時間も省くことができる。たとえＰＣＲの増幅サイクルのパッセージが４０回に及ぶ場合であっても、核酸分子の変性、ならびに伸長およびハイブリッド形成温度（以後、伸長／ハイブリッド形成温度）への核酸分子の冷却に、全体で数ミリ秒しかかからないことを本発明の発明者は確認した。本発明によって、ＰＣＲの継続時間が主に、変性ステップと変性ステップの間の継続時間によって決定されることを達成することができる。この変性ステップと変性ステップの間の継続時間は、拡散および反応過程、ならびにポリメラーゼによる伸長などの生化学的過程のために必要である。
【００３８】
本発明を用いると、より小さなエネルギーを使用して核酸を増幅することも達成可能である。さらに、本発明は、増幅過程をより効果的に制御すること、およびたとえば、知られている方法では温度制御の範囲内で起こる反応体積の温度変動を示量的に（ｅｘｔｅｎｓｉｖｅｌｙ）回避することを可能にする。本発明によって、核酸を増幅するための装置であって、費用効果がより高く、よりコンパクトな装置を提供することができる。たとえば、核酸を増幅するための本発明に基づく装置を、ユニバーサル・シリアル・バス（ＵＳＢ）スティックの形態で提供することを達成することができる。
【００３９】
発明の好ましい実施形態
有利な実施形態および改良が従属請求項の主題である。それらの有利な実施形態および改良は、個別にまたは互いに組み合わせて使用することができる。
【００４０】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、反応体積を加熱するために変性ステップで使用される電気エネルギーと反応体積のサイズとの比が２０Ｊ／ｍｌよりも小さく、好ましくは１０Ｊ／ｍｌよりも小さい。本発明のこの実施形態を用いると、有利には、本発明に基づく方法の低エネルギー消費を達成することができる。加えて、有利には、変性ステップにおけるエネルギーの追加が、反応体積の過度の大域加熱につながるほどに大きくなることを回避することができる。
【００４１】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、反応体積を加熱するために変性ステップで使用される電気エネルギーと反応体積のサイズとの比が０．０１から３０Ｗ／ｍｌ（ワット／ミリリットル）の間、好ましくは０．０５から１０Ｗ／ｍｌの間、特に好ましくは０．１Ｗから５Ｗ／ｍｌの間である。
【００４２】
本発明の一実施形態では、変性ステップが、互いに離隔した複数の時間間隔であって、変性ステップに関係するＰＣＲのサイクルのパッセージにおいて加熱手段が熱を生み出す複数の時間間隔を含む。場合ごとに、電流パルスの時間間隔と時間間隔の間の時間ベースの距離は、試料熱平衡化時間（ｓａｍｐｌｅ  ｔｈｅｒｍａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ）よりもはるかに小さくなければならない。特に好ましくは、電流パルスの時間間隔と時間間隔の間の時間ベースの距離は、時間間隔と時間間隔の間の加熱手段の温度低下が２０％未満となるように選択されなければならない。たとえばエネルギー供給にスイッチング電源が使用される場合、本発明のこの実施形態は有利となりうる。１つまたは複数の電流インパルスによって変性ステップが実現されることが特に好ましく、好ましい一実施形態では、継続時間中または電流インパルス中の電流強度の絶対量の変動が１０％未満である。このようにすると、反応体積の加熱の滑らかな変動を達成することができる。
【００４３】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、反応体積を加熱するために変性ステップで使用される電気エネルギーと反応体積のサイズとの比が１０Ｊ／ｍｌ（ミリジュール／ミリリットル）よりも大きく、好ましくは３０Ｊ／ｍｌよりも大きく、特に好ましくは１００ｍＪ／ｍｌよりも大きい。一定の電力が使用される一実施形態では、このエネルギーが単純に、この使用電力と変性ステップの継続時間との積から計算される。本発明のこの実施形態の達成可能な利点は、反応体積と接触したエリアであり、ＰＣＲの反応速度に対する一般的な要件を満たすのに十分なサイズを有するエリアに対して加熱手段を動作させるのに、このエネルギーが十分に大きいことである。
【００４４】
ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの好ましくは少なくとも１回、特に好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、加熱手段は、変性ステップで生成されたＣR×５℃（摂氏）よりも少ない熱を反応体積に供給する。これによって、ＣRは、加熱手段による加熱中の反応体積の熱容量である。言い換えると、この他の熱流入および熱流出を考慮しない場合、この加熱手段は、平均して５℃未満の温度だけ反応体積を加熱する。
【００４５】
ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの好ましくは少なくとも１回、特に好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、反応体積の最大ＭＧＴＥは１０℃未満、特に好ましくは７℃未満、特に好ましくは５℃未満、特に好ましくは４℃未満、特に好ましくは３℃未満、特に好ましくは２℃未満、特に好ましくは１℃未満、特に好ましくは０．７５℃未満、特に好ましくは０．５℃未満、よりいっそう好ましくは０．３℃未満である。
【００４６】
ＭＧＴＥの値が４℃以上であることは、特に（たとえばＰＣＲ中に加熱要素上の局所アンプリコン密度が大幅に増大するため）ＰＣＲ中に結合ハイブリッド形成／伸長温度が上昇する場合に、すなわち局所加熱によって大域温度も（わずかに）変化するために有利となりうる。加えて、このようにすると、外部から供給されるヒート・パワー（ｈｅａｔ  ｐｏｗｅｒ）、たとえば温度調節ブロックによって供給されるヒート・パワーを減らすことができ、これによってさらに、本発明に基づく装置の全体の電力必要量を低減することができる。ＰＣＲの増幅サイクルのパッセージを非常に迅速に連続して代わるがわる実行することができるようにするため、または近傍に対して試料ウェルを断熱し、それによって試料ウェルを周囲条件から独立させることをできるようにするために、ＭＧＴＥの値が低いことは有利となりうる。たとえば、結合ハイブリッド形成／伸長温度が７０℃であり、変性ステップ後の反応体積の体積平均温度が７０．６℃に上昇した場合、ＭＧＴＥ＝０．６℃である。
【００４７】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、変性ステップの間、加熱手段と反応体積との接触表面積のうちの少なくとも１０％、好ましくは少なくとも３０％、特に好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも８０％の接触表面積で、時間的に安定した温度勾配が確立されない。
【００４８】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、変性ステップの継続時間のうちの少なくも半分の継続時間中の温度勾配の最大傾斜が０．５℃／μｍ超、特に好ましくは１℃／μｍ超、よりいっそう好ましくは３℃／μｍ超である。本発明のこの実施形態の達成可能な利点は、加熱要素によって引き起こされる温度上昇の良好な限局化を達成することである。これは、温度上昇の限局化が必然的に勾配の形成を要求するからである（したがって、この実施形態では、温度勾配が時間的に一定である必要はない）。
【００４９】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、変性ステップの継続時間のうちの少なくも半分の継続時間中の温度勾配の最大傾斜が１０００℃／μｍ未満、特に好ましくは３００℃／μｍ未満である。本発明のこの実施形態の達成可能な利点は、溶液中での熱泳動効果（ｔｈｅｒｍｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｅｆｆｅｃｔ）を回避することができることである。
【００５０】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、サイクル継続時間ｔcが６０ｓ（秒）よりも短く、好ましくは４０ｓよりも短く、特に好ましくは２０ｓよりも短く、特に好ましくは１５ｓよりも短く、特に好ましくは１０ｓよりも短い。本発明の語義において、サイクル継続時間ｔcは、ポリメラーゼ連鎖反応の増幅サイクルの１回のパッセージの継続時間であり、１回のパッセージは、変性ステップ、ハイブリッド形成ステップおよび伸長ステップからなり、これらのステップはこの順番で実行される。本発明のこの実施形態では、特に短いサイクル継続時間ｔcを選択することによって、特に高速なＰＣＲ法を実現することができる。
【００５１】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、ＰＣＲの継続時間ｔPCRが４５分よりも短く、特に好ましくは３０分よりも短く、特に好ましくは２０分よりも短く、特に好ましくは１５分よりも短く、特に好ましくは１０分よりも短い。この継続時間は、ＰＣＲの開始から終了までの時間であり、ＰＣＲの開始は、増幅サイクルの最初の完全なパッセージの変性ステップの開始時点であり、このパッセージは、変性ステップ、ハイブリッド形成ステップおよび伸長ステップからなり、これらのステップはこの順番で実行される。ＰＣＲの終了時刻は、増幅サイクルの最後の完全なパッセージの変性ステップの終了であり、このパッセージでは、変性ステップ、ハイブリッド形成ステップおよび伸長ステップがこの順番で実行される。
【００５２】
加熱手段
本発明の好ましい一実施形態では、１つまたは複数の加熱要素からなる加熱手段によって反応体積が加熱され、特に好ましくはこの加熱要素または加熱要素のうちの少なくとも１つの加熱要素が電気的に接触しており、特に好ましくはすべての加熱要素が電気的に接触している。このようにすると、有利には、電流が加熱要素を流れることを達成することができる。本発明のこの実施形態は、電気的に接触する加熱要素を、特に単純には電気的制御装置によって動作させ、調節することができることを利用することができる。
【００５３】
この加熱要素または加熱要素のうちの１つの加熱要素が、電流を熱に変換する装置、たとえばそのオーム抵抗によって電流を熱に変換する装置であることが好ましい。本発明のこの実施形態は、このような加熱要素が電気エネルギーを効率的に熱に変換可能なことを利用できる。好ましい加熱要素は加熱抵抗器またはペルティエ素子である。加熱要素が複数ある場合には、それらの加熱要素を直列もしくは並列に配置することができ、またはそれらの加熱要素の一部を直列に配置し、一部を並列に配置することもできる。
【００５４】
好ましい加熱要素は、加熱要素の熱発生構成要素と反応体積との間に配置された材料を有することができる。このような材料は、加熱要素をたとえば腐食からもしくはＰＣＲケミストリとの他の化学的相互作用から保護するため、および／または加熱要素を電気的に絶縁するために（したがってここではこの材料が「分離層」と記述される）役立ちうる。このような材料はたとえばポリマーからなることができる。このような加熱要素と反応体積は、厚さ５００μｍ未満、好ましくは厚さ１００μｍ未満、好ましくは厚さ２０μｍ未満、好ましくは厚さ５μｍ未満、好ましくは厚さ１μｍ未満、好ましくは厚さ０．２μｍ未満、好ましくは厚さ０．０５μｍ未満の分離層によって最大限に分離されていることが好ましい。加熱要素と反応体積との間に分離層が存在しない別の実施形態、または反応体積への加熱手段の熱放出に対する分離層の影響がごくわずかとなるように分離層の熱特性が選択された別の実施形態がよりいっそう好ましい。
【００５５】
加熱要素上のどこでもできるだけ均一な温度または安定した温度に到達することは有利となりうる。加熱抵抗器の場合には、たとえば加熱抵抗器のサブピースまたはサブボリュームごとに加熱中の均一な電流密度および一定の表面積／体積比（ＯＶＶ）を助長することで、これを達成することができる。有利には、加熱要素全体で、一定の導体断面積および導体の単位長当たりの一定の電圧降下を保証することで、これが達成可能である。複数の加熱要素がある場合、本発明の好ましい一実施形態では、それらの加熱要素が反応体積を同じように加熱する。しかしながら、本発明はさらに、それらの加熱要素が反応体積を異なるやり方で加熱する実施形態、たとえばそれらの加熱要素が反応体積を異なる時間、加熱する実施形態、またはそれらの加熱要素が反応体積を異なる強度で加熱する実施形態を含む。加熱手段の複数の加熱要素は、たとえば加熱要素の長さまたは幾何学的形状に関して同じでもよくまたは異なっていてもよい。
【００５６】
反応体積は、１つまたは複数の加熱要素からなる加熱手段によって加熱されることが好ましく、特に好ましくはこの加熱要素または加熱要素のうちの少なくとも１つの加熱要素が反応体積と接触し、特に好ましくはすべての加熱要素は反応体積と接触している。本発明の好ましい一実施形態では、複数の加熱要素のうちの少なくとも１つの加熱要素の表面全体は反応体積と接触している。特に好ましくは、すべての加熱要素の表面全体は反応体積と接触している。本発明のこの実施形態の達成可能な利点は、加熱要素の近傍の対応するそれぞれの加熱要素によって反応体積を効率的に加熱することができることである。有利にはさらに、本発明のこの実施形態によって、高い反応速度（特に核酸分子とプライマーとのハイブリッド形成の速度。後に示すようにプライマーは加熱要素上に配置されていることが好ましい）を保証するために、加熱手段のアクセス可能表面をできるだけ大きくすることを達成することができる。
【００５７】
加熱要素は、（すぐ）近傍へのできるだけ効果的な熱の放出を助長するために、できるだけ大きな表面積／体積比（ＯＶＶ）を有することが好ましく、同時に、加熱要素の低い熱容量を保証するためにできるだけ小さな体積を有することが好ましい。本発明に基づく好ましい実施形態では、加熱要素の表面積／体積比が、１０3ｍ-1（毎メートル）よりも大きい、好ましくは１０4ｍ-1よりも大きい、特に好ましくは５×１０4ｍ-1よりも大きい。しかしながら、表面積／体積比が大きすぎると、場合によっては構造が非常に繊細になり、したがって機械的に不安定になることがある。そのため、本発明によれば、表面積／体積比を１０9ｍ-1未満、好ましくは１０8ｍ-1未満、場合によっては１０7ｍ-1未満に保つことが有利となりうる。
【００５８】
長い（直径よりも長さの方がはるかに大きい）線については、表面積／体積比がたとえば２／ｒによって計算される。ｒは線の半径である。（長さおよび横方向の広がりよりも厚さの方がはるかに小さい）薄膜または箔については、表面積／体積比が１／ｄによって計算される。ｄは膜または箔の厚さである。本発明によれば、上記の実施形態が、反応体積と接触する表面積だけを考慮することが好ましい。反応体積と接触する表面に対応する体積だけを考慮することも好ましい（すなわち、本発明によれば、たとえば溶液の中を通らないインレット・ライン（ｉｎｌｅｔ  ｌｉｎｅ）は関連体積および表面積とはみなされない）。これに対応して、体積充填率（ｖｏｌｕｍｅ  ｆｉｌｌ  ｆａｃｔｏｒ）および熱容量の後続の考慮についても同じことが言える。
【００５９】
本発明の好ましい一実施形態では、加熱手段の反応体積と接触した表面と反応体積との比が、０．１ｍ-1よりも大きく、特に好ましくは１ｍ-1よりも大きく、特に好ましくは５ｍ-1よりも大きく、特に好ましくは１０ｍ-1よりも大きく、特に好ましくは２０ｍ-1よりも大きく、特に好ましくは５０ｍ-1よりも大きく、特に好ましくは１００ｍ-1よりも大きい。有利には、本発明のこの実施形態は、反応体積の大部分において、反応体積の成分が、加熱要素の表面で実行されている核酸増幅法の諸ステップに加わるために、拡散によって加熱要素の表面に迅速に到達することができることで、有利な反応速度を達成することを可能にする。さらに、後にさらに説明するケースでは、反応パートナー（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｐａｒｔｎｅｒ）のうちの１つ（たとえばプライマー）で少なくとも一部の表面が官能基化された加熱要素に関して、より大きな表面積にわたってより多くの反応パートナーが使用可能であることを利用することが可能である。
【００６０】
加熱要素構造体が繊細になりすぎること、または表面が多すぎることによって反応体積中に位置する核酸分子および他の反応物の移動が妨げられることを防ぐために、比の中の１つまたは複数の加熱要素の表面積と反応体積のサイズとの比が、１０6ｍ-1よりも小さく、特に好ましくは１０5ｍ-1よりも小さく、特に好ましくは１０4ｍ-1よりも小さく、よりいっそう好ましくは１０3ｍ-1よりも小さい。
【００６１】
変性ステップにおいて加熱手段によって反応体積に供給される熱をできるだけ少なくするためには、加熱手段の熱容量を小さくすることが有利となりうる。これは、ある温度上昇を加熱要素の表面で達成するためには、加熱手段の熱容量が大きいほどますます大きなエネルギー量が必要となるためである。変性ステップにおいて加熱手段によって反応体積に供給されたエネルギー量は続いて反応体積全体に広がる。加熱要素の熱容量は、対応するそれぞれの体積と、その対応するそれぞれの体積を形作る対応するそれぞれの材料の比体積熱容量との積によって与えられる。加熱手段の構成の大きな自由度はその寸法にある。
【００６２】
したがって、加熱手段の体積、特に材料の太さ／厚さをできるだけ小さくすることが有利となりうる。この点に関して、熱拡散範囲が加熱手段のサイズには依存せず、その代わりに単に加熱継続時間に依存することは注目に値する。本発明の好ましい一実施形態では、加熱手段のすべての加熱要素の体積が、反応体積の１０％よりも小さく、好ましくは５％よりも小さく、特に好ましくは３％よりも小さく、よりいっそう好ましくは１％よりも小さい。本発明のこの実施形態を用いると、有利には、小さな体積充填率によって加熱手段の小さな熱容量を達成することができる。
【００６３】
本発明の好ましい一実施形態では、加熱手段が、その中を電流が流れる複数の導体の配置を備え、それらの複数の導体は反応体積によって取り囲まれる。有利には、ここでは、反応体積の多くの異なる位置または部分において加熱手段を有効にすることを達成することができる。このことは特に、ＰＣＲの開始時に増幅対象の核酸分子が非常に低い濃度でしか存在せず、したがって最も近い加熱要素からそれらの分子までの平均距離が長い典型的なケースにおいて有利である。長さ１００塩基対の核酸１本鎖は、その核酸１本鎖自体が拡散によって出発点から距離ｘのところまで移動するのに時間ｔ＝ｘ2／ＤDNAを要すると推定することができる（ＤDNA≒１０-11ｍ2／ｓ）。本発明の好ましい一実施形態では、最も近い加熱要素から反応体積中の所与の点までの空間距離が、３ｍｍ（ミリメートル）未満、好ましくは２ｍｍ未満、特に好ましくは１ｍｍ未満、特に好ましくは０．７５ｍｍ未満、特に好ましくは０．５ｍｍ未満、特に好ましくは０．２５ｍｍ未満である。
【００６４】
本発明の一実施形態では、加熱要素のうちの１つまたはすべての加熱要素が、導電性金属もしくは金属合金から、または低い電気抵抗率を有する他の導電性材料、たとえば炭素、半導体材料または導電性プラスチックから作られている。
【００６５】
一実施形態では、加熱要素のうちの１つまたはすべての加熱要素が単に、１本の線もしくは１つの電気導体または複数の線もしくは電気導体からなる。それらは、まっすぐでも、曲がっていても、またはコイルに巻かれていてもよい。複数の線または電気導体は、互いの距離が等しくてもまたは等しくなくてもよく、互いに交差してもまたは交差しなくてもよい。それぞれの線または電気導体は、円形、楕円形、平面または他の任意の断面形状を有することができる。加熱要素を単純に、パサブル（ｐａｓｓａｂｌｅ）な表面エリア、すなわちパススルー（ｐａｓｓ−ｔｈｏｕｇｈ）表面エリア、たとえば金属でダンプされた（ｄａｍｐｅｄ）平らな表面とすることもできる。
【００６６】
加熱手段の特に好ましい実施形態は、導電性金属線の配置またはアレイ、好ましくは導電性金属線の周期的配置である。それらの線が互いに平行に配置されていることが特に好ましい。アレイ内の線の直径は、０．５から１００μｍ（マイクロメートル）の間であることが好ましく、１から５０μｍの間であると特に好ましい。それらの線は、互いに５０から１５００μｍの間の間隔を置いて配置されていることが好ましい。
【００６７】
それらの線は、金もしくは他の金属でできていることが好ましく、または心線（ｃｏｒｅ）がより安価でより安定した材料、好ましくは金属からなる被覆線（ｓｈｅａｔｈｅｄ  ｗｉｒｅ）として設計されていることが好ましい。ステンレス鋼、モリブデンを含む被覆線であることが特に好ましく、または不活性材料、好ましくは金で被覆されたタングステン心線を含む被覆線であることがよりいっそう好ましい。有利には、心線の高い強度のため、このような線を、非常に細い（したがって大きな表面積／体積比を有する）が、それにもかかわらず好ましくはステンレス鋼の被覆の所望の化学的性質を被覆材料によって助長するように設計することができる。５から４０μｍの間の心線直径を有することが好ましいタングステン心線（有利にはタングステンは金よりもはるかに高い引張強度を有する）と、厚さ０．１から２μｍの間の金被覆とを有する被覆線が特に好ましい。
【００６８】
別の実施形態では、たとえばスタンピング／パンチング、電鋳、レーザーまたはハイドロジェット切削、エッチング技術または他の方法による格子として設計された金属箔であって、反応体積を横切る金属箔が加熱要素として使用される。
【００６９】
本発明の別の実施形態では、導電性でない材料または不十分な導電率を有する材料に加熱要素を付着させる。好ましい加熱要素は、電気化学的方法、化学的方法、ＰＶＤ法、加圧法または他の方法によって非導電性構造体に付着させた金属膜でできている。この非導電性構造体は、たとえば射出成形された非常に微細な部品（好ましい構造サイズは３００μｍ未満である）として、またはラピッド・プロトタイピング（ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｔｏｔｙｐｉｎｇ）法によって設計することができる。加熱要素としてまたは加熱要素の担体として織物構造体を使用することを検討することもができる。具体的には、メッシュ・サイズが２０μｍから３ｍｍの間、特に好ましくは１００μｍから１．５ｍｍの間である織物材料を、加熱要素としてまたは加熱要素の担体として使用することができる。織物構造体自体が導電性である場合、有利には、その織物構造体の全体を加熱要素として使用することができる。織物構造体が非導電性材料（たとえばプラスチック）でできている場合には、織物構造体に金属をめっきして、薄い表面層（通常＜１０μｍ）にだけ電流が流れるようにすることができ、また大きな表面ができるようにすることができる。言い換えると、格子の織物の線または繊維は比較的に大きな表面積を有するが、付着させた薄い金属ボリュームだけが能動的に加熱される。本発明の語義において、加熱要素とみなされるのは電流が実質的に流れる部分だけである。たとえば、ＰＭＭＡのプラスチック構造体に金膜が蒸着されている場合には、金膜だけが加熱要素とみなされる。
【００７０】
加熱手段の官能基化
本発明の好ましい一実施形態では、加熱手段の加熱要素のうちの少なくとも１つの加熱要素が、オリゴヌクレオチドに接合されている。すなわち加熱要素にオリゴヌクレオチドがつながれている。加熱手段のすべての加熱要素がオリゴヌクレオチドに接合されていることが特に好ましい。このようにすると、有利には、反応体積全体を加熱する必要なしに、本発明に基づく方法の部分であるオリゴヌクレオチドを加熱手段によって特異的に加熱することを達成することができる。本発明の特に好ましい実施形態では、加熱要素が、ＰＣＲ法のプライマー、よりいっそう好ましくはフォワードおよびリバース・プライマーに接合されている。本発明の好ましい一実施形態では、加熱要素もしくは加熱要素の一部分にフォワード・プライマーが取り付けられており、リバース・プライマーは取り付けられておらず、かつ／または加熱要素もしくは加熱要素の一部分にリバース・プライマーが取り付けられており、フォワード・プライマーは取り付けられていない。それぞれの場合に、もう一方のプライマーの分子は、遊離した状態で反応体積中に分散させることができる。加熱手段の熱発生構成要素と反応体積との間に分離層が使用される場合には、オリゴヌクレオチドが液体の反応体積からアクセス可能となるような方式で官能基化が実現されなければならない。すなわち、分離層の表面にオリゴヌクレオチドが取り付けられていることが好ましい。
【００７１】
好ましい他の実施形態では、加熱要素のうちの少なくとも１つの加熱要素がフォワード・プライマーおよびリバース・プライマーに接合されている。特に好ましい実施形態では、加熱手段のすべての加熱要素がフォワード・プライマーおよびリバース・プライマーに接合されている。本発明のこの実施形態を用いると、有利には、フォワード・プライマーのＰＣＲ生成物が、同じ加熱要素のリバース・プライマーとハイブリッドを形成するのに、短い距離を移動するだけでよく、その結果、ハイブリッド形成がより迅速に起こることができ、したがってＰＣＲ法をより迅速に実行することができる。
【００７２】
本発明の好ましい一実施形態では、加熱要素の表面に、核酸の結合を可能にする材料が提供される。たとえば、１つまたは複数のチオール結合を介して加熱要素上にプライマーを結合するために、金めっきされた表面を使用することができる。さらに、たとえばストレプトアビジンビオチン結合を使用して加熱要素にプライマーを結合することもできる。これはたとえば、好ましくは前もって、これらの２つのパートナーのうちの一方のパートナー（ストレプトアビジンまたはビオチン）が加熱要素に結合されており、プライマー（の５’−末端）が、これらの２つのパートナーうちのもう一方のパートナーで修飾されており、それによって続いてそのプライマーが加熱要素に結合される場合に達成される。たとえばアミノ基またはカルボキシ基などの他の修飾基を使用して加熱要素にプライマーを結合することもできる。そのために、たとえば、加熱要素の表面を、好ましくは前もって、エポキシで修飾することができる。プライマーの３’−末端が空位となり、したがってＰＣＲ中にポリメラーゼによって３’−末端を伸長させることができるように、結合は、５’−末端が加熱要素に結合されるような方式で実現されることが好ましい。
【００７３】
加熱要素上にフォワード・プライマーとリバース・プライマーの両方が固定される実施形態では、異なるタイプのプライマー分子が平均して互いからたとえば１ｎｍ（ナノメートル）未満、３ｎｍ未満、５ｎｍ未満、１５ｎｍ未満または５０ｎｍ未満の距離のところにあるように、プライマー分子間の距離を意図的に選択することができる。この実施形態を用いると、有利には、加熱要素の表面でフォワード・プライマーを伸長させたらすぐに、この新たに書かれた核酸鎖が、変性後に、加熱要素の表面の対応する隣接リバース・プライマー分子または近傍のリバース・プライマー分子とハイブリッドを形成する。この過程は加熱要素の表面で実施されるため、局所濃度が極めて高い。したがって、数ナノメートルしか離れていないすぐ近傍に多くの反応パートナーが存在するため、新たな核酸鎖は、リバース・プライマー分子を見つけるために、多くのマイクロメートルを拡散により移動する必要がない（その逆に、伸長したリバース・プライマー分子が近傍で固定されたフォワード・プライマー分子を見つける場合にも同じことが言える）。
【００７４】
一実施形態では、加熱要素上に、プライマー分子の他に、充填（ｆｉｌｌ）オリゴヌクレオチドまたは充填分子も存在する。充填オリゴヌクレオチドまたは充填分子はすなわち、ＰＣＲのプライマーもしくは蛍光プローブまたはターゲット核酸として能動的には関与しないが、その代わりに単に、アンプリコンまたはターゲット核酸が加熱要素の表面に非特異的に（したがってターゲット・プライマーとハイブリッドを形成することなく）結合することを防ぐための表面飽和またはパッシベーションの役目を果たすオリゴヌクレオチドまたは分子である。充填オリゴヌクレオチドの長さは５から５０ヌクレオチドの間であることが好ましく、１０から４０ヌクレオチドの間であることが特に好ましく、２０から３０ヌクレオチドの間であることがよりいっそう好ましい。特に、充填オリゴヌクレオチドは、１つのタイプのヌクレオチド、たとえば３０個のアデニン塩基を有するＡ３０配列だけからなることができる。充填分子はたとえば、ビオチンまたはポリエチレングリコール、たとえば加熱要素表面に充填分子を固定するためにたとえばチオール基などの官能基がさらに付与されたビオチンまたはポリエチレングリコールとすることができる。しかしながら、充填分子をたとえばウシ血清アルブミンとすることもできる。
【００７５】
本発明の方法の好ましい他の実施形態では、加熱要素上のオリゴヌクレオチドが、サブシーケンスとしてスペーサ配列を有する。これに関して、このスペーサ配列は、対応するそれぞれのオリゴヌクレオチドの加熱に面した側にある。したがって、スペーサ配列は、オリゴヌクレオチドのスペーサ配列以外の部分のスペーサの役目を果たす。好ましい一実施形態では、オリゴヌクレオチドが、プライマーの機能を有し、プライマー配列と記述されるサブシーケンスと、スペーサ配列であるサブシーケンスの両方を含む。スペーサ配列によってプライマー配列が加熱要素からさらに離隔されることにより、有利には、増幅対象の核酸およびＤＮＡポリメラーゼによるプライマー配列へのアクセスがよくなる。
【００７６】
本発明に基づく方法の好ましい一実施形態では、スペーサ配列とプライマー配列の間に１つまたは複数の非塩基（アベーシック）修飾基が存在する。これらのアベーシック修飾基は、ポリメラーゼによるスペーサ配列の上書きを防ぐ。この点に関する独国特許出願公開第１０２０１３２１５１６８Ａ１号明細書の内容は、この参照により本開示の一部とみなされる。このような修飾基はたとえば、３’方向のさらなるポリメラーゼ活性を阻害する１’，２’−ジデオキシリボース（ｄＳｐａｃｅｒ）、トリエチレングリコール・スペーサ（ｓｐａｃｅｒ  ９）またはヘキサエチレングリコール・スペーサ（ｓｐａｃｅｒ  １８）とすることができる。このようにすると、スペーサ配列が、ポリメラーゼによって合成される核酸鎖の鋳型の役目を果たさないこと、および結果として生じるＰＣＲ生成物が不必要に長くならないことを達成することができる。伸長後のＰＣＲ生成物がスペーサ配列に対する相補配列をも含む場合には、ナノ粒子上にこれらのオリゴヌクレオチドがあるため融解温度がかなり高くなり、また後続のハイブリッド形成ステップにおいて不必要に非特異的なハイブリッドが形成され、したがってＰＣＲ全体がより非特異的になる。
【００７７】
加熱の継続時間
加熱手段による熱供給はＰＣＲ中に変動することが好ましい。加熱手段による熱供給は、ＰＣＲの増幅サイクルの少なくとも１回のパッセージ中に変動することが特に好ましく、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも３回のパッセージ中に変動することが特に好ましく、少なくとも１０回のパッセージ中に変動することが特に好ましく、少なくとも２０回のパッセージ中に変動することが特に好ましく、周期的に変動することが特に好ましい。
【００７８】
本発明の好ましい一実施形態では、変性ステップにおける加熱手段による加熱（以後、変性ステップにおける加熱手段による加熱は「熱パルス」とも呼ばれる）の継続時間が、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、１００ｎｓ（ナノ秒）から３０ｍｓの間、特に好ましくは０．５μｓ（マイクロ秒）から１０ｍｓの間、特に好ましくは１μｓから５ｍｓの間、特に好ましくは１μｓから３ｍｓの間、特に好ましくは１μｓから１ｍｓの間、特に好ましくは１μｓから８００μｓの間、よりいっそう好ましくは１μｓから５００μｓの間の間隔にある。本発明のこの実施形態の達成可能な利点は、熱の限局化、したがって結果として生じる温度分布の限局化である。言い換えると、加熱継続時間が短いため、限られた熱だけが、加熱要素によって熱拡散により溶液中へ輸送される。同時に、本発明のこの実施形態を用いると、局所加熱の時間中に核酸２本鎖が十分に融解もしくは遊離することを可能にするため、および／または両方の一本鎖が互いに再びハイブリッドを形成しないように、局所加熱の時間中にブラウン運動（および／または他の力）によってそれらの一本鎖が互いから十分に離れることを可能にするために、加熱継続時間が短くなりすぎないようにすることを達成することができる。
【００７９】
本発明の好ましい一実施形態では、変性ステップの継続時間が、ＰＣＲの全継続時間のうちの小部分だけを占める。変性ステップは、ＰＣＲの増幅サイクルの少なくとも１回のパッセージの間、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの特に好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージの間に、ＰＣＲの増幅サイクルのそのパッセージ全体が占める時間のうちの１０％未満、さらに好ましくは５％未満、特に好ましくは３％未満、特に好ましくは１％未満、特に好ましくは０．５％未満、特に好ましくは０．０５％未満、特に好ましくは０．０１％未満の時間を占めることが好ましい。本発明のこの実施形態によって、有利には、事実上ＰＣＲの全継続時間の間、ハイブリッドを形成させることができる。局所ＰＣＲのポリメラーゼは事実上全継続時間の間、機能することができるため、処理時間を短縮することができる。さらに、加熱は局所でのみ実現され、加えて非常に短いため、関与するポリメラーゼ酵素および他の反応パートナーが保護されること、およびそれらの処理可能性（ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ）がよりゆっくりと失われることが達成可能である。
【００８０】
本発明の好ましい一実施形態では、増幅サイクルの少なくとも１回のパッセージ中、特に好ましくはＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージ中の変性ステップの継続時間ｔheatが、ｔheat≦（ｓ１・｜ｘ｜）2／Ｄよりも短い。この式で、ｓ１はスケーリング・ファクタ、｜ｘ｜は臨界距離、Ｄは温度伝導度（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）である。スケーリング・ファクタｓ１は、ｓ１＝１００であることが好ましく、ｓ１＝１０であることが特に好ましく、ｓ１＝１であることが特に好ましく、ｓ１＝０．１であることが特に好ましく、ｓ１＝０．０１であることが特に好ましい。臨界距離｜ｘ｜は、加熱手段の間接的に隣接する最も近い部分からの距離、たとえば加熱手段の最も近い加熱要素からの距離である。加熱要素が２Ｄ構造体（たとえば格子、織物、ハニカムなど）から構築されている場合には、メッシュ・サイズまたは穴／凹部のサイズが関連値｜ｘ｜である。加熱要素が３Ｄ構造体からなる場合にはポア・サイズ（ｐｏｒｅ  ｓｉｚｅ）が関連値｜ｘ｜である。
【００８１】
本発明のこの実施形態を用いると、加熱継続時間が短く、そのため熱拡散範囲が平均距離｜ｘ｜よりもはるかに小さくなること、したがって加熱手段の隣接する複数の加熱要素または加熱手段の概ね隣接する複数の非接触部分の熱場が重なり合わないことを達成することができる。特に、１より大きなスケーリング・ファクタは、非常に長いアンプリコンに対して有利となりうる。非常に長いアンプリコンでは、２本の核酸鎖のもつれを解くのにより長い時間がかかる（核酸２本鎖のもつれがブラウン運動によって解けるまでにかかる時間は長さの４乗に増大する）。１よりも小さいスケーリング・ファクタは、可能な最良の加熱および冷却ダイナミクスに対して有利となりうる。
【００８２】
電気蓄積装置
本発明に基づく好ましい装置は、ＰＣＲ中のいずれの時点においてもその電力消費が５０Ｗ、特に好ましくは２０Ｗ、特に好ましくは１０Ｗ、特に好ましくは３Ｗ、特に好ましくは２．５Ｗ、特に好ましくは１．５Ｗ、特に好ましくは０．５Ｗを超えないように構成されている。この制限は、装置のスイッチオン工程中に生じうる高い電力消費には適用されない。このような高い電力消費は、技術的理由によりスイッチオン電流によって生じる可能性がある。このような高い電力消費はＰＣＲ中の電力消費とはみなされず、したがってここでは考慮されない。本発明のこの実施形態を用いると、有利には、一般的なポータブル電源で装置を動作すること、たとえば自動車バッテリー、自動車のシガレット・ライター、またはＰＣ、タブレット・コンピューターもしくはモバイル・フォンのポート、たとえばＵＳＢまたはＡｐｐｌｅ  ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ  ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎで装置を動作することを達成することができる。
【００８３】
本発明の装置は、電気蓄積装置（ｅｌｅｃｔｒｉｃｉｔｙ  ｓｔｏｒａｇｅ）を備えることが好ましい。この電気蓄積装置は、電気蓄積装置内に保持される電気エネルギーが、反応容器の容積に対して、０．１Ｊ／ｍｌ超、特に好ましくは１Ｊ／ｍｌ超、特に好ましくは２Ｊ／ｍｌ超、特に好ましくは３Ｊ／ｍｌ超となるように設計されていることが好ましい。熱供給の変動によってやはり変動する加熱手段の電気要求に応える電気を、この電気蓄積装置を用いて中間位置に蓄積することができる。
【００８４】
電気蓄積装置を備える本発明に基づく装置は、電気蓄積エネルギーに保持される電気エネルギーが、反応容器の容積に対して、１００Ｊ／ｍｌ未満、特に好ましくは５０Ｊ／ｍｌ未満、特に好ましくは３０Ｊ／ｍｌ未満となるように設計されていることが好ましい。本発明のこの実施形態は、加熱手段による加熱が特に効率的であるために電気蓄積装置の外形を小さくすることができることを利用することができる。このようにすると、有利には、特にコンパクトで、費用効果が高く、持ち運びができるように、本発明に基づく装置を設計することができる。
【００８５】
好ましい電気蓄積装置は、１つもしくは複数のコンデンサー、コイルもしくはバッテリー、またはこれらの組合せを備える。本発明の好ましい一実施形態では、このエネルギー蓄積装置の蓄積容量が、ＰＣＲの増幅サイクルの１回のパッセージの変性ステップに必要な電気エネルギーの少なくとも２０％、特に好ましくは少なくとも４０％、特に好ましくは少なくとも５０％、特に好ましくは少なくとも６０％、特に好ましくは少なくとも８０％、特に好ましくは少なくとも１００％、特に好ましくは少なくとも１５０％、特に好ましくは少なくとも２００％、特に好ましくは少なくとも３００％を、使用可能な形態で保持することができるように構成されている。本発明のこの実施形態を用いると、変性ステップに必要な電力を提供することができる電源を変性ステップの全継続時間にわたって使用可能な状態にしておかなければならない状況を回避することができる。その代わりに、有利には、変性ステップと変性ステップの間の時間にエネルギー蓄積装置を充電することができる。この変性ステップと変性ステップの間の時間は一般に変性ステップの継続時間よりもかなり長い。このようにすると、本発明に基づく装置が、その電気出力に関してより弱い電源、たとえばより弱いネットワーク装置を備えることができることを達成することができる。電気蓄積装置が、ＰＣＲの増幅サイクルの１回のパッセージの変性ステップに必要なエネルギーの１００％未満のエネルギーを供給する場合、有利には、電気蓄積装置を非常に小さくすることができるが、変性ステップ中に、対応する寸法の追加の電源によって、たとえば電力ネットワーク接続によって残りのエネルギーを供給しなければならない。値が１００％以上であると有利である。これは、コンデンサーに給電する電源をそれに対応して小さくすることができ、加えて加熱の負荷によって電圧が低下しないためである。特に、有利には、本発明に基づく装置の電源は、すでにそれよりもかなり短い変性時間中にではなく、ＰＣＲの増幅サイクルの継続時間にわたって変性ステップに必要なエネルギー量を提供することができる寸法を有するだけでよいことを達成することができる。
【００８６】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、装置の電力消費と反応容器の容積との比が、ＰＣＲ中のいずれの時点においても１Ｗ／ｍｌ、好ましくは０．５Ｗ／ｍｌ、特に好ましくは０．２５Ｗ／ｍｌ、特に好ましくは０．１Ｗ／ｍｌを超えない。この制限は、装置のスイッチオン工程中に生じうる高い電力消費には適用されない。このような高い電力消費は、技術的理由によりスイッチオン電流によって生じる可能性がある。このような高い電力消費はＰＣＲ中の電力消費とはみなされず、したがってここでは考慮されない。
【００８７】
本発明の好ましい一実施形態では、電気蓄積装置が、ＰＣＴの増幅サイクルの少なくとも５回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回、特に好ましくは少なくとも４０回、特に好ましくは少なくとも１００回のパッセージの変性ステップのためのエネルギーを、使用可能な形態で保持することができるように構成されている。このようにすると、有利には、１回または数回のポリメラーゼ連鎖反応を別の電源から独立して実行することができる装置、特に可搬式の装置を生み出すことができる。
【００８８】
好ましいコンデンサーは大容量コンデンサー、好ましくは電解コンデンサーまたはスーパーキャパシタ（ｓｕｐｅｒ−ｃａｐ）、特に好ましくはＥＳＲ値が小さい電解コンデンサーまたはスーパーキャパシタである。このようなコンデンサーは、費用効果の高いものが販売されており、必要な寸法のものを容易に得ることができる。たとえば、式
【数１】
2020504596.tif 000003
を使用して、３０Ｖの電圧Ｕで１Ｊ（ジュール）の電気エネルギーを供給する目的には、静電容量が２２２２μＦ（マイクロファラド）のコンデンサーで十分であると考えられると計算することができる。１ｍｌの反応体積の変性ステップのための実施形態によれば、この１Ｊの電気エネルギーの供給は、電気エネルギーから熱への変換に事実上損失がなければ十分であろう。しかしながら、このコンデンサーは、熱パルスの終わりに完全に放電すると考えられる。そのため、実際のところ、電力のかなりの部分を電源が供給できない場合には、少なくとも１．５倍の静電容量を有するコンデンサーの使用が推奨される。
【００８９】
本発明に基づく好ましい１つのエネルギー蓄積装置では、コンデンサーの静電容量、またはコンデンサーが複数ある場合にはそれらの複数のコンデンサーの静電容量の和が、１００μＦ超、特に好ましくは２００μＦ超、特に好ましくは５００μＦ超、特に好ましくは１ｍＦ（ミリファラド）超、特に好ましくは１．５ｍＦ超である。本発明に基づく好ましい１つのエネルギー蓄積装置では、コンデンサーの静電容量と反応体積のサイズとの比、またはコンデンサーが複数ある場合にはそれらの複数のコンデンサーの静電容量の和と反応体積のサイズとの比が、０．０１ｍＦ／ｍｌ（ミリファラド／ミリリットル）超、特に好ましくは０．１ｍＦ／ｍｌ超、特に好ましくは１ｍＦ／μｌ超、特に好ましくは５ｍＦ／ｍｌ超、特に好ましくは１０ｍＦ／ｍｌ超である。本発明のこの実施形態を用いると、有利には、変性ステップにおいて加熱要素の十分な加熱を達成するのに十分なエネルギーを中間位置に蓄積することができる。
【００９０】
特に好ましい電池は、大電流バッテリーまたはアキュムレータであり、特にリチウム−ポリマー・アキュムレータ、リチウム・イオンまたはリチウム−リン酸鉄アキュムレータである。本発明の一実施形態では、このバッテリーが１つまたは複数のコンデンサーとともに使用される。別の実施形態では、このバッテリーが、内部抵抗が有利に小さいことを特徴とする、コンデンサーの追加の使用のないリチウム−リン酸鉄アキュムレータであることが特に好ましい。本発明によれば、インレット・ラインの干渉に起因するインダクタンスおよびオーム抵抗を低減するために、コンデンサーおよび／またはバッテリー間に延びるインレット・ラインならびに加熱要素ができるだけ短い場合には有利となりうる。
【００９１】
反応容器
核酸を増幅するための好ましい装置は、反応体積を収容するための反応容器を有する。本発明に基づく方法の適当な反応容器は、ＰＣＲ管もしくはＰＣＲ管の複合体（たとえばいわゆる８連管）または多穴プレートなどの従来のＰＣＲ反応容器であることがあり、さらにたとえばフラット・プレートまたは充填することができる他の形状／形態であることがある。加熱手段、たとえば多穴プレートまたはＰＣＲ管の壁を貫いて延びる線を、すでに製造工程（たとえば射出成形）中に反応容器に収容することができ、または（たとえば多穴プレートの個々のウェル内に吊り下げることができるコイルの形態の線の場合にように）製造工程後に追加することができる。
【００９２】
制御装置
本発明に基づく好ましい装置は、反応体積を加熱するために加熱手段に電流を流す制御装置を備える。この制御装置は、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、反応体積を加熱するために変性ステップで使用される電気エネルギーと反応容器の容積との比が４０Ｊ／ｍｌ（ミリジュール／ミリリットル）未満、特に好ましくは２０Ｊ／ｍｌ未満、特に好ましくは１０Ｊ／ｍｌ未満、特に好ましくは３Ｊ／ｍｌ未満となるように構成されていることが好ましい。
【００９３】
本発明に基づく好ましい１つの装置では、制御装置が、加熱手段の少なくとも１つの加熱要素が少なくとも１つの方向の広がりが１．５μｍよりも大きくなるように構成されている。加熱手段のそれぞれの加熱要素の少なくとも１つ、特に好ましくは２つの方向の広がりが１．５μｍよりも大きくなるように構成されていると特に好ましい。この広がりはたとえば、細長い加熱要素の長さまたは直径である。好ましい細長い加熱要素は、少なくとも１μｍ、特に好ましくは少なくとも２μｍ、特に好ましくは少なくとも５μｍの直径を有する。好ましい細長い加熱要素は、少なくとも０．１ｍｍ、特に好ましくは少なくとも１ｍｍ、特に好ましくは少なくとも２ｍｍの長さを有する。網目（ｎｅｔｏｗｏｒｋ）の形態またはハニカムの形態の加熱要素の場合、この広がりはさらに、たとえばウェブの太さ（網目の形態またはハニカムの表面に対して垂直なウェブ（ｗｅｂ）の広がりを意味する）または直径でありうる。好ましいウェブは、少なくとも１μｍ、特に好ましくは少なくとも５μｍ、特に好ましくは少なくとも１０μｍの太さまたは直径を有する。
【００９４】
好ましい制御装置は、電流パルスを生成するために、変性ステップの開始時に、または変性ステップが互いに分離された複数の時間間隔からなる場合には変性ステップのそれぞれの時間間隔の始めに、加熱手段に電流が流れることを許しまたは加熱手段を流れる電流を増大させ、変性ステップの終了時に、または変性ステップのそれぞれの時間間隔の終りに前記電流を再び抑制しまたは低減するように構成されている。加熱要素内で、この電流パルスを熱パルスに変換することができる。好ましい制御装置は電源を備え、この電源は、電源として、たとえば電力網構成要素、１つもしくは複数のバッテリーもしくはアキュムレータ、または燃料電池を含むことができる。好ましい制御装置は１つまたは複数のコンデンサーを備える。好ましい制御装置はスイッチを備え、このスイッチは、電源から加熱手段に流れる電流をオンおよびオフすることができ、好ましくはその継続時間が選択可能である。適当なスイッチは、ＭＯＳＦＥＴ、ＳＳＲ、非常に高速なリレーおよびトランジスタを含む。この制御装置は、時間制御用の１つまたは複数のパルスもしくは周波数発生器、ＤＡＣまたはマイクロコントローラーを有することができる。
【００９５】
ＰＣＲの観察およびＰＣＲ生成物の検出
本発明に基づく方法では、アンプリコンが検出されること、または試料中のターゲット原核酸の存在が検出されることが好ましい。これはたとえば、ＰＣＲ後のゲル電気泳動によって、アンプリコンとそのアンプリコンまたはそのアンプリコンの部分に相補的な固定されたオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成によって、たとえば蛍光染料による検出によって、または電子的方法による検出によって実現することができる。別の好ましい実施形態では、光学的方法の助けを借りてポリメラーゼ連鎖反応の進捗を観察するために、すでに反応体積中でのＰＣＲ中にリアルタイム検出が実施される。そのためには、光学的方法、特に蛍光法、たとえばＴａｑＭａｎフォーマットの蛍光法が特に好ましい。米国特許第５２１００１５号明細書およびＨｏｌｌａｎｄ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８（１６）、１９９１、７２７６〜７２８０ページの関連する開示は、この参照によって本開示の一部とみなされる。この方法では、ＰＣＲ中に特定の蛍光信号が生成され、この信号は、増幅反応のリアルタイム観測および最初に使用されたターゲット核酸の数の数量化を可能にする。他のリアルタイム検出法、たとえばＳｙｂｒＧｒｅｅｎなどのインターカレーション染料の使用および分子ビーコン・プローブの使用も可能である。しかしながら、本発明はさらに、たとえば後続のプロセスでアンプリコンがさらに使用されるという意味で、核酸の増幅が純粋に予備的なものである実施形態を含む。
【００９６】
本発明に基づく好ましい１つの装置は光源、たとえば半導体光源、たとえば発光ダイオードまたはレーザー・ダイオードを備える。有利には、好ましくは光学的方法の助けを借りてポリマー連鎖反応の進捗を観察するために、この光源を用いて反応体積中の染料を励起することができる。
【００９７】
本発明に基づく好ましい１つの装置は光センサー、たとえば半導体光センサー、たとえばフォトダイオードを備える。有利には、好ましくは光学的方法の助けを借りてポリマー連鎖反応の進捗を観察するために、この光センサーを用いて反応体積中の染料を検出することができる。この光センサーは１つまたは複数のフィルターを備えることができる。
【００９８】
本発明に関係する検出法または観察法に関して「光」に言及されている場合、この光は、光学的検出法に適したすべての可能なタイプおよび波長の光を含み、特に蛍光染料の励起または検出に適したすべての可能なタイプおよび波長の光も含む。この光は可視光であることが好ましいが、紫外光または赤外光とすることもできる。この光をレーザー光とすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１Ａ】プライマーに対して官能基化された加熱要素を概略的に示す図である。スイッチが開いているため加熱要素に電流は流れていない。加熱要素の近傍には遊離のＤＮＡ配列が存在する。
【図１Ｂ】ＤＮＡによって官能基化された加熱要素を概略的に示す図である。スイッチが開いているため加熱要素に電流は流れていない。加熱要素上にプライマーとターゲット核酸の２本鎖が形成されており、一部の２本鎖はすでに伸長している。
【図１Ｃ】ＤＮＡによって官能基化された加熱要素を概略的に示す図である。スイッチが閉じているため加熱要素に電流が流れている。加熱要素上で２本鎖の変性が起こっており、その結果、伸長したプライマーだけが残っている。
【図２Ａ】あらかじめ加熱された円筒形加熱要素の冷却段階における温度の空間的推移および時間ベースの推移を示す図である。
【図２Ｂ】加熱中の、直径が異なる複数の円筒形加熱要素の表面温度の時間ベースの推移を示す図である。
【図２Ｃ】冷却中の、直径が異なる複数の円筒形加熱要素の表面温度の時間ベースの推移を示す図である。
【図２Ｄ】加熱されていない円筒形担体上のあらかじめ加熱された金膜の冷却段階における温度の空間的推移および時間ベースの推移を示す図である。
【図３Ａ】電流パルスを発生する電子回路を示す図である。
【図３Ｂ】加熱要素を含む反応容器の可能な実施形態を示す図である。
【図３Ｃ】加熱要素を含む反応容器の可能な実施形態を示す図である。
【図３Ｄ】加熱要素を含む反応容器の可能な実施形態を示す図である。
【図３Ｅ】異なる電流による水溶液中の大域温度上昇、すなわち加熱要素の加熱による水溶液中の大域温度上昇を示す図である。
【図４】局所加熱およびゲノム鋳型（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｔｅｍｐｌａｔｅ）を用いたリアルタイムＰＣＲを示す図である。
【図５Ａ】局所加熱およびゲノム鋳型を用いたリアルタイムＰＣＲであり、異なる電圧を使用して加熱手段を動作したリアルタイムＰＣＲを示す図である。
【図５Ｂ】局所加熱およびゲノム鋳型を用いたリアルタイムＰＣＲであり、異なる電圧を使用して加熱手段を動作したリアルタイムＰＣＲを示す図である。
【図５Ｃ】局所加熱およびゲノム鋳型を用いたリアルタイムＰＣＲであり、異なる電圧を使用して加熱手段を動作したリアルタイムＰＣＲを示す図である。
【図５Ｄ】局所加熱およびゲノム鋳型を用いたリアルタイムＰＣＲであり、多くの異なる加熱要素を使用したリアルタイムＰＣＲを示す図である。
【図５Ｅ】局所加熱およびゲノム鋳型を用いたリアルタイムＰＣＲであり、多くの異なる加熱要素を使用したリアルタイムＰＣＲを示す図である。
【図５Ｆ】局所加熱およびゲノム鋳型を用いたリアルタイムＰＣＲであり、多くの異なる加熱要素を使用したリアルタイムＰＣＲを示す図である。
【図５Ｇ】局所加熱およびゲノム鋳型を用いたリアルタイムＰＣＲであり、多くの異なる加熱要素を使用したリアルタイムＰＣＲを示す図である。
【図６Ａ】電気的に加熱することができるハニカム構造を示す図である。
【図６Ｂ】電気的に加熱することができるハニカム構造の細部を示す図である。
【図６Ｃ】局所加熱およびゲノム鋳型を用いたリアルタイムＰＣＲであり、局所加熱にハニカム構造を使用したリアルタイムＰＣＲを示す図である。
【図７】局所加熱および加熱要素を用いたリアルタイムＰＣＲであり、加熱要素上にフォワード・プライマーとリバース・プライマーの両方が官能基化されたリアルタイムＰＣＲを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０１００】
本発明に基づく方法の経過
一例として、本発明に基づく方法では、ＰＣＲの増幅サイクルの最初のパッセージを以下のように実行することができる。反応体積への核酸分子（以後、「ターゲット核酸」として説明する）の追加（および場合によっては大域加熱によるターゲット核酸の変性）ならびにターゲット核酸と１つまたは複数の加熱要素に結合されたフォワード・プライマーとのハイブリッド形成の後、ポリメラーゼがフォワード・プライマーを伸長させ、それによってターゲット核酸の相補鎖を生成する。変性、すなわち伸長させたフォワード・プライマーからのターゲット核酸分子の分離は、反応体積全体の大域加熱によって実現されるのではなく、加熱手段の加熱要素を流れる電流パルスによって生み出される熱パルスによって実現される。
【０１０１】
ＰＣＲの増幅サイクルの後続の２回目のパッセージも同様の方式で実現することができる。ターゲット原核酸分子が、１つまたは複数の加熱要素に結合されたフォワード・プライマーと再びハイブリッドを形成し、ポリメラーゼがフォワード・プライマーを伸長させ、これによってターゲット核酸の（または少なくともターゲット核酸の一部分の）相補鎖を生成する。それと並行して、（遊離した状態で分散したまたはやはり加熱要素に結合された）リバース・プライマーが、ＰＣＲの増幅サイクルの最初のパッセージで生成された加熱要素に結合した伸長したフォワード・プライマーの伸長部分に結合することができ（フォワード・プライマーはそのとき、ターゲット核酸の少なくとも一部分との相補鎖を構成している）、続いて、これに対応してポリメラーゼが、リバース・プライマーを伸長させる。このようにして初めて、ターゲット原核酸の少なくとも一部の真正のコピーが生成される。加熱手段を流れる電流パルスによって生じた熱パルスによって、変性、すなわちポリメラーゼによる伸長によって生成された２本鎖の分離（この２本鎖はいずれにせよ加熱手段に再び結合される）が再び実現される。ＰＣＲの増幅サイクルの３回目のパッセージ以降、ターゲット原核酸とポリメラーゼによるプライマー配列の伸長によって生成された核酸鎖（実施形態に応じて反応体積中に遊離した状態で分散しているかまたは加熱要素に結合されている）はともに、次回の増幅のための鋳型として機能する。これらの核酸は、対応するプライマー（実施形態に応じて溶液中に遊離した状態で存在しまたは加熱要素に結合されている）とのハイブリッド形成によって増幅され、続いてポリメラーゼによって伸長し、次いで加熱手段を流れる電流インパルスによって生み出される局所熱パルスによって変性する。増幅サイクルの追加のそれぞれのパッセージにおいてターゲット核酸の少なくとも一部分のコピーをさらに生成するために、ＰＣＲの増幅サイクルの最後に説明したパッセージが何度か繰り返される。ターゲット核酸の少なくとも一部分コピーが、実行された増幅の検出または試料中のターゲット原核酸の存在の検出を実行することができる十分な数、存在するまで、必要な回数、パッセージが繰り返される。上で説明した方法の１つ、たとえば蛍光法を使用して、このように生成されたアンプリコンを検出することができる。
【０１０２】
本発明の別の例示的な実施形態では、異なる複数のターゲット核酸が並行して増幅される（これは「マルチプレックスＰＣＲ」としても記述される）。そのためには、それぞれのアンプリコン用に、（それぞれの場合にフォワード・プライマーとリバース・プライマーとからなる）互いに異なる複数のプライマー対が必要である（１つのプライマーが、２つのアンプリコン、たとえば長さが異なる２つのアンプリコンに対するプライマーの働きをすることもあり、したがって１つのプライマーが２つのプライマー対の部分であることもある）。１つの加熱要素が、複数のプライマー対、または、それぞれの場合に、複数のプライマー対からなる（少なくとも）１つのプライマーを担持することができる。しかしながら、加熱要素の異なるサブ部分がそれぞれ１つのプライマー対だけを担持し、またはプライマー対の一方のパートナーだけを担持するような形で、複数のプライマーまたはプライマー対を分布させることもできる。例示的な実施形態では、１つの（場合によってはプライマー対ごとに１つだけの、またはそれぞれの）プライマー種（ｓｏｒｔ）またはプライマー配列が、加熱要素に結合された形態と遊離した状態で分散した形態の両方で反応体積中に存在する。たとえば異なる染料を使用することにより、（異なる波長を有する）異なるカラー信号が生成されるような方式で、検出を実現することができる。それらの異なるカラー信号は、異なるアンプリコンの形成に割り当てることができる。しかしながら、その代わりに、異なるアンプリコンが、識別することができない同じカラー信号を生成することもある。異なるアンプリコンは、たとえばゲル電気泳動法または他の方法を使用して識別することもできる。
【０１０３】
大域反応温度の設定または確立
好ましい例示的な実施形態では、たとえば従来の外部ヒータ、たとえば温度調節ブロックによって、または加熱要素を流れる一定の（もしくは調節された）オフセット電流による加熱要素の一定の（もしくは調節された）励起によって、ＰＣＲの全過程の間、（大域）伸長／ハイブリッド形成温度が一定に保たれる。
【０１０４】
（大域）伸長／ハイブリッド形成温度または加熱温度の調節は、反応体積中の温度センサーもしくは複数の反応体積のうちの１つの反応体積中の温度センサー上で、または対応するそれぞれの反応体積中の対応するそれぞれのセンサーによってそれぞれの個々の反応体積に対して個別に、または反応体積の外側のセンサーによって、または反応体積のヒータもしくは記録装置内のセンサーによって実現することができる。一実施形態では、すべての反応体積の（大域）伸長／ハイブリッド形成温度が同じであり、別の実施形態では、異なる反応体積の（大域）伸長／ハイブリッド形成温度が異なる。別の実施形態では、ＰＣＲの継続時間中またはＰＣＲの前もしくは後に、（大域）伸長／ハイブリッド形成温度を変動または変化させる。一実施形態では、ヒータが、複数の部分、たとえば底部および頂部からなり、その際、反応体積の壁での凝縮を防ぐために頂部の温度が底部の温度よりもやや高い。ヒータの頂部と底部の温度差は１℃から３０℃の間であることが好ましく、２℃から２０℃の間であることが特に好ましく、３℃から１５℃の間であることがよりいっそう好ましい。
【０１０５】
一実施形態では、加熱手段の電気加熱による反応容器中の反応液の大域加熱が、入熱の一部、または所望の伸長／ハイブリッド形成温度に到達するのに必要な熱のすべてを占める。これはたとえば、熱的平衡状態にある反応容器中の反応液の大域加熱、またはＰＣＲの終了時の、もしくはＰＣＲの開始時の、もしくはＰＣＲの継続時間の大部分の間の反応容器中の反応液の大域加熱が、反応液中の所望の伸長／ハイブリッド形成温度につながるように、加熱手段の加熱要素のデューティ・サイクルおよび／または連続電流（もしくは電圧）を選択することによって達成することができる。それによって外部加熱（すなわちこの加熱要素によらない入熱のための要素）の寸法をより小さくすることができ、または外部加熱を完全に省略することができる。
【０１０６】
結合ハイブリッド形成／伸長温度に対する本発明に基づく好ましい温度は、３０℃から８５℃の間であることが好ましく、４０℃から８０℃の間であることが特に好ましく、５０℃から７５℃の間であることが特に好ましく、５５℃から７２℃の間であることがよりいっそう好ましい。
【０１０７】
一実施形態では、ＰＣＲサイクルの最初の実際のパッセージの前に、（後のハイブリッド形成および伸長温度よりも高い大域温度を使用する）大域加熱ステップを実行することができ、前記大域加熱ステップは、存在する２本鎖ターゲット核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡまたは他の核酸）の初期変性、および／またはたとえば（ホットスタート）ポリメラーゼなど、ＰＣＲの他の反応パートナーの熱活性化、および／またはＰＣＲ前は活性であるべきだがＰＣＲ中は活性であってはならない反応体積の成分（たとえば酵素ウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼなど）の失活に役立ちうる。
【０１０８】
一実施形態では、上述の大域加熱ステップの前に、上述の大域加熱ステップの大域温度よりも低い大域温度を使用する別の大域加熱ステップを実行することができ、この別の大域加熱ステップを利用してたとえば、酵素を放出させたり、ＰＣＲ前に反応（たとえばトランスクリプターゼ酵素によるＲＮＡのＤＮＡへの上書きなど）を実行したりすることができる。
【０１０９】
変性ステップ中および変性ステップ後の熱の空間的広がり
変性ステップにおいて加熱要素に電流が流れ始めるとすぐに、加熱要素は発熱し始める。最も良く電流を伝導する材料（特に金属）は熱も非常によく伝えるため、熱パルスの継続時間の間、加熱要素はほぼ均質に発熱する。この熱は、好ましい例示的な実施形態では水性反応体積によって取り囲まれている加熱要素の表面で反応体積に伝達され、そこで広がる。反応体積中でのこの熱場の広がりは熱拡散によって実現され、この熱拡散には平方根形の規則が適用される。
【数２】
2020504596.tif 000004
上式で、ｄは、時間ｔ後に熱フロント（ｈｅａｔ  ｆｒｏｎｔ）が到達する、温度伝導度Ｄを有する反応体積中の１つの空間方向に沿った経路距離を表し、以下ではこのｄを「熱拡散範囲（ｈｅａｔ  ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｒａｎｇｅ）」と呼ぶ。このことは、加熱要素内で発生した熱は、たとえば１００μｓの加熱継続時間の間に、Ｄ≒１．６・１０-7ｍ2／ｓの典型的な温度拡散率（ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｄｉｆｆｕｓｉｖｉｔｙ）（「温度伝導度」としても知られている）で、反応体積中を、下式の換算値のところまで拡散することができることを意味する。
【数３】
2020504596.tif 000005
【０１１０】
言い換えると、加熱要素内でたとえばオーム損によって発生した熱は、１００μｓ後、加熱要素を取り囲む反応体積中へ、すなわち４μｍの範囲の大きさで広がっている。
【０１１１】
上記の式に対応する熱の空間的広がりにより、運ばれた熱量は、ますます大きな体積にわたって分布し、その結果、大域平均温度よりも温度ΔＴだけ高温である加熱要素の表面に対して垂直に値ΔＴ／ｄの温度勾配が生じ、これが熱輸送を助長する。加熱要素の対応するそれぞれの幾何学的形状に対する熱パルス中および熱パルス後の空間的な熱の広がりは、熱拡散方程式の数値的解法を容易にする有限要素法、たとえばＣｏｍｓｏｌのような市販の解決策などによってより正確に推定することができる。熱拡散範囲の厚さを有する層内の反応体積は、加熱手段の周囲で、少なくとも１０℃よりも高い温度だけ加熱されることが好ましい。
【０１１２】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージの変性ステップの終了時の熱拡散範囲が、好ましくは０．０５μｍから２００μｍの間、特に好ましくは０．２μｍから１００μｍの間、特に好ましくは０．５μｍから５０μｍの間、よりいっそう好ましくは１μｍから２５μｍの間である。本発明のこの実施形態の達成可能な利点は、一方で、加熱要素の表面に対して垂直な被加熱エリアの十分な空間的広がりを達成することができること、加熱要素上に形成された、通常は０．０２μｍから３μｍの間の長さ（この長さは大体６０個から１００００個の間の塩基対に相当する）を有するＰＣＲアンプリコンをできるだけ均質に加熱することができ、それによってそれらを変性させることができること、および熱拡散範囲があまり大きくなく、そのため、加熱ゾーンと加熱されない受動的体積（以下、非加熱受動体積）との体積比が小さくなりすぎないことである。
【０１１３】
本発明の語義において、「加熱ゾーン」は、反応体積のうち変性ステップ中に熱が拡散しうる部分である。加熱要素の表面に対して垂直な加熱ゾーンの広がりは、上で定義した熱拡散範囲によって近似的に推定することができる。加熱ゾーンに含まれない反応液の体積は「非加熱受動体積」と呼ばれる。たとえば円筒形の加熱要素（たとえば加熱線）の場合、このことは、円筒表面からの熱拡散範囲の距離ｄ（すなわち厚さｄの円筒殻）に位置する体積として加熱ゾーンを推定することができることを意味する。加熱要素がたとえば半径ｒ、長さｌの細長い円筒（たとえば線）である場合、加熱ゾーンの体積は大まかに下式として推定することができる。
ＶAHZ≒π・ｌ・（（ｒ＋ｄ）2−ｒ2）  式２
【０１１４】
本発明の好ましい一実施形態では、増幅サイクルの複数回のパッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージの変性ステップの終了時における加熱ゾーンと非加熱受動体積との体積比が、１０％未満、好ましくは５％未満、特に好ましくは２％未満、特に好ましくは１％未満、特に好ましくは０．５％未満、特に好ましくは０．２５％未満、よりいっそう好ましくは０．１％未満である。本発明のこの実施形態を用いると、熱の高度な限局化を達成することができ、このことは、変性ステップにおいて運ばれた熱量は、変性ステップ後に非加熱受動体積まで広がりうることを意味する。非加熱受動体積は加熱ゾーンよりも何倍も大きいため、反応体積全体（＝加熱ゾーン＋非加熱受動体積）の熱量のこの分布は、好ましくもごくわずかな大域温度上昇につながりうる。そのため、加熱ゾーンの非常に急速な冷却が可能であり、加えて、その冷却過程は、試料外への熱の排出から（示量的に）独立している。
【０１１５】
変性ステップにおける局所温度上昇の推定
８５℃から９８℃の間である２本鎖核酸の典型的な変性温度に関して、一実施形態では、結合ハイブリッド形成／伸長温度から概ね２０℃から４０℃の間の局所温度上昇を、加熱要素の表面および変性させる２本鎖核酸の長さにわたって達成しなければならない。
【０１１６】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージの変性ステップ中の、反応体積と接触した加熱手段のエリアの温度が、７０℃から２５０℃の間、特に好ましくは７５℃から１５０℃の間、特に好ましくは８０℃から１２０℃の間、よりいっそう好ましくは８０℃から１００℃の間である。
【０１１７】
本発明の好ましい一実施形態では、加熱手段の反応体積と接触したエリアの平均温度が１００℃よりも高い。本発明のこの実施形態を用いると、有利には、２本鎖の特に急速な分離が可能である。本発明のこの実施形態は、蒸気泡が形成されない（これはとりわけ、加熱要素の表面の湾曲に起因する高いラプラス圧力による。ヤング−ラプラス方程式に関する専門家の文献を参照されたい）加熱手段の表面における反応体積の短期の過熱も可能であることを利用する。
【０１１８】
加熱手段の幾何学的形状が複雑な場合には、および／または高い精度を保証するために、有限要素法（たとえばＣｏｍｓｏｌ）を使用して、加熱要素の温度を、電気的動作パラメーターの関数として決定することが推奨される。このようなシミュレーションの最も単純なケースでは、一定の体積加熱密度を仮定すること、または加熱手段を流れる電流をシミュレートすることができる。しかしながら、多くの場合に、以下の例で説明される単純な計算によって、加熱手段によって引き起こされる温度上昇を推定することができる。
【０１１９】
最初に、導体を流れる電流によって導体内に放出される熱量を決定する。加熱要素を加熱するために電気的熱パルス中に使用可能な電力Ｐを、加熱要素の抵抗Ｒおよび加熱要素に供給される電圧Ｕから、Ｐ＝Ｕ2／Ｒとして計算する。加熱要素内に放出される熱量Ｑは、電力Ｐに加熱継続時間ｔheatを乗じたものである。
Ｑ＝Ｕ2・ｔheat／Ｒ  式３
上式では、熱パルスの継続時間の間、電圧および抵抗は時間的に一定であると仮定した。これが当てはまらない場合には下式が適用される。
【数４】
2020504596.tif 000006
【０１２０】
一実施形態では、加熱手段が（部分的に）、断面積が一定の均質な導体からなる場合、導体の断面積Ａおよび導体の長さｌ、ならびにこの導体要素の比導電率σから、均質な導体の抵抗Ｒを、下式のように計算することができる。
【数５】
2020504596.tif 000007
【０１２１】
比導電率の典型値は専門家の文献中の表に示されており、典型的な材料に関して言えば、たとえば金では
【数６】
2020504596.tif 000008
、タングステンでは
【数７】
2020504596.tif 000009
、Ｖ２Ａ（ステンレス鋼）では
【数８】
2020504596.tif 000010
である。
【０１２２】
熱パルスの継続時間が短く、そのためこのエネルギーが最初は加熱要素および加熱ゾーンだけを加熱すると仮定した場合、実際に変性温度まで加熱される加熱手段の局所温度上昇は、以下のように推定することができる。
【数９】
2020504596.tif 000011
【０１２３】
上式で、ＣMHは、加熱要素の（単位質量ｘｘ当たりの）比熱容量を表し、ｍMHは、加熱要素の質量を表し、ｃAHZは、加熱ゾーンの（質量に関係する）比熱容量（ＰＣＲ水溶液に対してはｃAHZ＝４．２Ｊ／（℃・ｇ）である）を表し、ｍAZは加熱ゾーンの質量である。上記の式の近似は、加熱要素の熱容量に比べて加熱ゾーンの熱容量が小さいほど、よりいっそう正確である。これは、上記の式が、加熱ゾーンでは温度が急速に低下すること（すなわち加熱要素の周囲ではソリッド（ｓｏｌｉｄ）な温度勾配ができること）を考慮していないことに起因する。
【０１２４】
加熱ゾーンのサイズが非常に小さい（加熱要素自体よりもかなり小さい）ままであり、したがって加熱要素の熱容量に対して加熱ゾーンの熱容量がごくわずかであるような短い加熱継続時間が選択される場合には、上記の式を下式のように単純化にすることができる。
【数１０】
2020504596.tif 000012
【０１２５】
式６を適用することができるのは、特別なケースおよび非常に短い加熱継続時間だけに限られ、加熱要素の表面の局所温度を決定する近似としては式５を使用することができ、それぞれの場合に、幾何学的形状および実際の電流から、どのようにすればとりわけ加熱ゾーンの質量を計算することができるのかを確認しなければならない。多くの場合、加熱ゾーンの質量は、加熱要素の幾何学的形状をおよび熱拡散範囲（上記参照）を考慮することにより、加熱ゾーンの体積から推定することができる。
【０１２６】
次に、加熱手段が、少なくとも部分的に（ほぼ）円筒形に形成されており、少なくとも部分的に均質であり、一定の断面を有する、本発明によれば特に有意義なケースについて考える。以下の計算は、加熱手段の円筒形の幾何学的形状に対する例と考えるべきであり、以下の計算を他の幾何学的形状に合わせて変形することは非常に容易である。次いで、式５の加熱要素の質量を、加熱要素の体積および密度から計算することができる。
ｍMH＝ｐMH・Ａ・ｌ
上式で、Ａは、加熱要素（または加熱要素の考慮する部分）の断面積、ｌは、加熱要素（または加熱要素の考慮する部分）の長さである。次いで、式３および式４を用いて熱量Ｑを計算することができる。
【０１２７】
半径ｒ、長さｌの（ほぼ）円筒形の導体部分を取り囲む加熱ゾーンの体積を近似的に記述する式２を用いて、式５の加熱ゾーンの質量を以下のように推定することができる。
ｍAZ＝ＶAHZ・ｐAHZ＝π・ｌ・（（ｒ＋ｄ）2−ｒ2）・ｐAHZ
反応体積中の加熱ゾーンの密度は水の密度に等しい（ｐAHZ≒ｐH2O≒１ｇ・ｃｍ-3）。したがって、（ほぼ）円筒形に形成されており、少なくとも部分的に均質であり、一定の断面を有する加熱要素に対しては、式２、式３、式４、式５を使用して以下の推定を与えることができる。
【数１１】
2020504596.tif 000013
【０１２８】
円筒形の導体部分に関しては、半径から断面積を計算することができＡ＝πｒ2、その結果、式１と合わせて、以下の単純化が与えられる。
【数１２】
2020504596.tif 000014
【０１２９】
このように、上の式を用いて、好ましくは変性温度を達成するためのパラメーターを決定することができるようにするために、（ほぼ）円筒形の導体が加熱継続時間ｔheat中に加熱される温度を近似的に推定することができる。（たとえば加熱要素が一連の複雑な幾何学的配置の導体からなるために）加熱要素の一部分だけを考慮する場合には、電圧に関しては、考慮するそれぞれの導体に沿って降下する電圧だけが重要であることが明白である。
【０１３０】
上の式の最初の因数
【数１３】
2020504596.tif 000015
は体積加熱密度であり、これは以後ｑと記述される。すなわち
【数１４】
2020504596.tif 000016
である。このことは、式８の温度上昇が体積加熱密度に比例することを意味する。
【０１３１】
加熱要素がたとえば、長さｌ＝０．１ｍ、半径ｒ＝１２．５μｍならびに材料パラメーター
【数１５】
2020504596.tif 000017
を有する金（Ａｕ）の線として設計されている場合、電圧Ｕ＝１０．５Ｖおよび加熱継続時間ｔheat＝２００μｓに基づくと、式７によれば、加熱要素上の局所温度上昇はΔＴlocal≒１４．４℃となる（
【数１６】
2020504596.tif 000018
を使用。これらの値は、加熱ゾーンに含まれる反応体積の典型値である）。図２Ｂの有限要素法シミュレーションの結果との比較が可能になるように、使用した動作パラメーターから、体積電力／加熱密度ｑを、
【数１７】
2020504596.tif 000019
によって計算することができる。この図は、５・１０11Ｗ／ｍ3の前記加熱密度で円筒形の加熱線を加熱すると、２００μｓの加熱継続時間の後、加熱がちょうど約１７℃になることを示している。
【０１３２】
電力およびエネルギー密度の供給
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、加熱手段の平均体積電力密度が１０9Ｗ／ｍ3よりも大きく、好ましくは１０10Ｗ／ｍ3よりも大きく、特に好ましくは１０11Ｗ／ｍ3よりも大きい。本発明のこの実施形態の達成可能な利点は、たとえ熱パルスの継続時間が短くても、加熱要素が十分に急速に加熱されることである。
【０１３３】
本発明の好ましい一実施形態では、ＰＣＲ増幅サイクルの複数回パッセージのうちの少なくとも１回、好ましくは少なくとも３回、特に好ましくは少なくとも１０回、特に好ましくは少なくとも２０回のパッセージで、加熱手段の平均比電力密度が、好ましくは１０16Ｗ／ｍ3よりも小さく、特に好ましくは１０15Ｗ／ｍ3よりも小さく、特に好ましくは１０14Ｗ／ｍ3よりも小さい。本発明のこの実施形態を用いると、有利には、加熱要素に対する損傷を防ぐことができる。
【０１３４】
加熱要素として加熱抵抗器が使用される場合、加熱要素内で生成される比電力密度ｑは下式によって与えられる。
【数１８】
2020504596.tif 000020
すなわち、電圧Ｕができるだけ高いこと、導電率σができるだけ大きいこと、および加熱要素内で電圧が降下する長さｌが短いことが大きな比電力密度につながる。したがって、熱パルスを供給するために必要な全体の電力必要量は、必要な体積電力密度および加熱手段のすべての加熱要素を合わせた総体積から計算され、それはとりわけ処理対象の反応体積に依存する。
【０１３５】
変性のための局所加熱ステップによる試料の大域加熱
本発明の好ましい一実施形態では、加熱手段および加熱手段の表面のすぐ近傍の反応体積だけが相当に加熱され、したがって局所的な加熱だけが起こるように、加熱手段を流れる電流パルスが選択される。変性ステップ全体の間に運ばれる熱量Ｑは加熱手段内で局所的に生成される。後に説明するように拡散による放熱は徐々にしか起こらないため、熱量Ｑは当初、加熱手段自体および加熱手段のすぐ近傍に分布する。このことは、運ばれる熱量Ｑが、最初は非常に小さな体積にわたって分布し、次いで周囲の反応体積中へ広がる（「流れる」）エネルギー量であることを意味する。この熱量（しばしば単に「熱」とも記述される）がそのまま加熱要素内および加熱要素のすぐ近傍に空間的に集中するとすれば、この熱量はそこで相当な温度上昇を引き起こす。しかしながら、この熱量がますます大きな体積にわたって分布するとすぐに、この熱量はそこでも温度上昇を引き起こすが、最初に運ばれた熱量は当然ながら変わらないため、これに対応してその温度上昇は小さい（反応体積の液体体積だけを考慮した場合、温度は、その熱量が分布する体積に反比例して低下する）。
【０１３６】
熱量が反応体積全体に分布し、そこで大域温度上昇を引き起こすのは、次の段落で定義されるある時間が経過した後だけである。以後、この時間を「試料熱平衡化時間」と呼ぶ。反応体積がどれくらいよく断熱されているのかによって、または反応体積がどれくらいよく外部熱タンクに結合されているのかによって、運ばれた熱量は反応体積中にとどまる（非常に良好に断熱されている場合。この場合、ＰＣＲの増幅サイクルのそれぞれのパッセージでの反応体積の大域温度の上昇は緩やかでわずかなものになる）か、または反応体積が良好に熱接触している場合には、この熱は流れ去り、その結果、反応体積は（加熱ステップ前の）元の温度に戻る。実際、ほとんどの場合、２回の変性ステップと変性ステップの間の時間に、運ばれた熱量の一部は流れ去り、そのため、ＰＣＲの増幅サイクルの最初のパッセージの間、反応体積の大域温度はわずかに（通常３℃未満）上昇し、それは、平衡状態が成立し、それぞれのサイクルで流れ去る熱量と同じ熱量が運び込まれるまで続く。
【０１３７】
試料熱平衡化時間は、加熱手段から運ばれた熱量が反応体積全体に広がるまでの時間である。試料熱平衡化時間は、最初に、最も近い加熱要素から最大距離ｄmaxのところにある点を決定することによって推定することができる（通常、多くの場合に、この点は、反応体積の境界を画定する表面にある）。試料熱平衡化時間は、熱拡散範囲がｄmaxに等しくなるまでにかかる時間である。すなわち、イメージ的には、加熱要素内で発生した熱が反応体積の最後の「コーナ（ｃｏｒｎｅｒ）」に拡散するまでにかかる時間である。たとえば、反応体積が半径１．０１ｍｍの円筒形であり、加熱要素が、半径０．０１ｍｍの１本の円筒形の線からなり、この線が、円筒の軸に沿って同心で延びている場合、反応体積中の１つの点が最も近い加熱要素（このケースでは唯一の加熱要素）からとなりうる最大距離はｄmax＝１ｍｍである。式１によれば、１ｍｍの熱拡散範囲は６．３ｓ後に生成される。そのため、この特別なケースでは試料熱平衡化時間が約６．３ｓである。
【０１３８】
変性ステップによって起こる平均温度の最大上昇であるＭＧＴＥは、熱量Ｑおよび加熱ステップによって反応体積中に運ばれる熱キャパシタンスから、
【数１９】
2020504596.tif 000021
を用いて以下のように推定することができる。反応体積の密度ｐ、体積Ｖ、比熱容量ｃを用い、相関Ｃ＝ｃ・ｐ・Ｖの助けを借りると、
【数２０】
2020504596.tif 000022
であると推定することができる。この不等号は、加熱手段および反応容器の熱容量が考慮に入れられていないことで裏付けられる。反応体積の密度および熱容量は概ね実質的に水の密度および熱容量である。すなわちｐ＝１ｇ・ｃｍ3およびｃ＝４．２Ｊ・℃-1・ｇ-1である。熱量Ｑは、電気的動作パラメーターから決定することができる。熱パルスｔHeatが継続し、熱パルスが継続している間の電圧Ｕおよび電流Ｉが一定である場合には、Ｑ＝Ｕ・Ｉ・ｔheatである。（電流および電圧が時間とともに可変である限りにおいては下式が適用される：
【数２１】
2020504596.tif 000023
）。
【０１３９】
これは、最初のケースにおいて、ＭＧＴＥの上限を下式によって決定することができることを意味する。
【数２２】
2020504596.tif 000024
（体積Ｖはミリリットルで示す。）ここでは、言うまでもなく、反応体積Ｖ中の加熱手段によって降下する電圧Ｕおよび反応体積Ｖ中の加熱手段を実際に流れる電流Ｉだけが考慮される。（このことは、たとえばインレット・ライン中での電圧降下は考慮する必要がないことを意味する。）
【０１４０】
ＭＧＴＥは、１回の変性ステップの前後に測定された反応体積の温度によって実験的に決定することができる。この後者のケースでは、試料熱平衡化時間の後に限り、反応体積中の温度の物理的測定を実行する。これらの２つの測定温度間の差がＭＧＴＥに等しい。本発明によれば、反応体積の完全な熱平衡化、すなわち反応体積中の熱の均一な分布が保証され、温度センサーが加熱ゾーンの温度を、たとえばランダムに検出しないため、この手順は有利である）。実際には、ＭＧＴＥのこの測定値はたとえば、反応体積中に入れられた温度センサーを用いて検出することができ、この温度センサーは、特に小さな熱容量を有することが好ましい。
【０１４１】
加熱手段の例
図１Ａは、加熱手段を形成する加熱要素の略図である。加熱要素は電圧源２に接続することができ、電気パルスを発生させる装置３が時間的電流パターン４を変化させる。この図では、電気パルスを発生させる装置３がスイッチであり、示された状態ではスイッチが開いており、そのため時間的／時間ベース関連電流パターン４にパルスは見出せない。加熱要素１はプライマー５によって官能基化されており、プライマー５に対して遊離のターゲット核酸６はハイブリッドを形成することができる。図の右側には、加熱要素内および加熱要素の周囲の温度分布の空間的推移が示されている。スイッチが開いているこの時点では、周囲の液体に対して加熱要素が加熱されておらず、したがって温度プロファイルは平坦である。
【０１４２】
図１Ｂも加熱要素１の略図である。プライマー５がターゲット６とハイブリッドを形成した後、プライマーと結合したターゲット核酸７をポリメラーゼによって伸長させて、核酸２本鎖８を形成することができる。
【０１４３】
図１Ｃは、核酸の伸長後に、電気パルスを発生させる装置３が起動し（この図に示されたスイッチはこの時点で閉状態にある）、それによって時間的電流パターン４上に電気パルスが現れた様子を示している。これにより、加熱要素１および加熱要素１の局所的近傍が加熱され（この加熱は、図の右側の加熱要素内および加熱要素の周囲の温度分布の空間的推移に示されている）、それにより局所的近傍が十分に加熱された場合には、核酸２本鎖が変性し、遊離のターゲットおよびアンプリコン６が再び形成され、加熱要素上には伸長したプライマー９が残る。遊離のターゲットおよびアンプリコンと伸長したプライマーはともに、後続の増幅サイクルにおいて、さらなる増幅のための鋳型の役目を果たすことができる。
【０１４４】
温度パターンのシミュレーション
図２Ａは、異なる時点、すなわち熱パルスの開始から５０、１００、２００、４００、８００および１６００μｓ後の時点における、加熱線（これはたとえば加熱要素を代表している）内および加熱線の近傍の空間的温度パターンの有限要素法シミュレーションを示す。縦軸には、熱パルス開始前の値に対する温度上昇が記録されている。横軸には、加熱線の円筒軸からの距離が記録されている。このシミュレーションでは、加熱線が、金でできた直径２５μｍの線であり、それを、水性近傍中において、体積電力密度２・１０12Ｗ／ｍ3（式
【数２３】
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によれば加熱線長１メートル当たり２１０Ｖの電圧に相当する）で５０μｓ間、加熱すると仮定する。
【０１４５】
５０μｓ後、線の表面の温度上昇は約２５．５℃に達するが、表面から数マイクロメートルのところの温度上昇はすでに小さくなっていることが分かる。他方、１６００μｓ後（すなわち熱パルスの終了から１５５０μｓ後）にはすでに、熱は加熱線の表面から約１０μｍ離れたところまで拡散しており、したがってこれよりもはるかに大きな体積に広がっている。その結果、線の表面の温度は熱パルスの前よりも約３℃しか高くない。
【０１４６】
この曲線の推移は、体積電力密度に比例して拡大縮小されることを指摘しておく。このことはたとえば、電力密度が４倍になると（線長が一定なら２倍の電圧に相当する）、空間的温度パターンの温度上昇が４倍になることを意味する。
【０１４７】
図２Ｂは、異なる加熱線（これはたとえば加熱要素を代表している）の熱パルスの開始からの時間ベースの温度パターンの有限要素法シミュレーションを示す。すなわち、この図には加熱線の加熱挙動が示されている。縦軸には、熱パルス開始前の値に対する温度上昇が記録されている。横軸には、熱パルスの開始からの時間が記録されている。このシミュレーションでは、金でできた直径１０、２５、５０および１００μｍのフル・ワイヤがあり、それらを、体積電力密度５・１０11Ｗ／ｍ3（加熱線長１メートル当たり１０４Ｖの電圧に相当）で加熱すると仮定する。このシミュレーションでは、体積電力密度が一定であることにより、より大径の線は（より大きな体積を有するため）より大きな電力で加熱され、結局、より大径の線には、そのより小さな電気抵抗のため、一定の電圧ではより大きな電流が流れることに留意すべきでる。
【０１４８】
当初（最初の数十マイクロ秒のうちは）、線表面の温度上昇は、加熱継続時間とともにほぼ直線的に増大し、その後、とりわけ小径の線で平らになり、直線的でなくなることが分かる。この効果は、小径の加熱要素では、加熱ゾーンの熱容量がより大きな役割を演じることに起因する。言い換えると、この効果は、小径の線では体積／表面積比はより大きいため、初期には、拡散によって熱の除去を運び去る輸送が重大であることに起因する。この曲線パターンは、体積電力密度に比例して拡大縮小されることを指摘しておく。このことはたとえば、電力密度が４倍になると（線長が一定なら２倍の電圧に相当する）、到達する線の表面の温度も４倍になることを意味する。
【０１４９】
図２Ｃは、継続時間２００μｓの熱パルス終了後の異なる加熱線（これはたとえば加熱要素を代表している）の標準化された時間ベースの温度パターンの有限要素法シミュレーションを示す。すなわち、この図には加熱線の冷却挙動が示されている。縦軸には、熱パルス開始前の値に対する、なおも存在する標準化された温度上昇が記録されている。横軸には、熱パルス終了後の時間が記録されている。このシミュレーションでは、２００μｓ間、加熱された、金でできた直径１０、２５、５０および１００μｍのフル・ワイヤがあると仮定する。１０ｍｓ後にはすでに、すべての直径の線で、元の（熱パルス終了時の）温度上昇はわずかなものになっていることが分かる。直径１０および２５μｍの線では、温度上昇の残分が初期値の５％未満にまで低下している。このことは本発明の可能性を示している。すなわち、直径１０μｍの線の場合、１０ｍｓ後にはすでに次の熱パルス（すなわち変性ステップまたはＰＣＲサイクル）が可能である。線直径が小さいほど表面積／体積比は大きくなり、熱パルス後の冷却はより迅速に進む。
【０１５０】
図２Ｄは、熱パルスの開始からの加熱要素の時間的温度パターンの有限要素法シミュレーションを示す。すなわち、この図には加熱線の加熱挙動が示されている。加熱要素は、直径２００μｍの非導電性ＰＭＭＡ円筒に付着させた厚さ２００ｎｍ（ナノメートル）の金膜からなる。縦軸には、熱パルス開始前の値に対する温度上昇が記録されている。横軸の値は、その量とともに、円筒軸からの距離を示す。このシミュレーションでは、体積電力密度２．２・１０13Ｗ／ｍ3（円筒被覆長１メートル当たり６９２Ｖの電圧に相当）で２００μｓの継続時間の間、加熱される金でできた厚さ２００ｎｍの円筒被覆があり、その一方で、（プラスチックでできた）円筒の内側では、周囲の水性反応体積と同様に熱は発生しない（すなわち円筒の内側の体積電力密度は０Ｗ／ｍ3である）と仮定した。２００μｓの加熱継続時間の後、（半径方向の）温度分布はまだ金膜の付近に強く限局されており、この短い時間では、外側の水性領域または円筒の中央に熱が広がることはできない。パルス終了後（ｔ＞２００μｓ）、金膜は冷え、熱は、外側水性領域および円筒の内部に広がる。約６．４ｍｓ後、円筒被覆内で発生した熱場は円筒の中央で合流し、その結果、円筒の中央の温度は最初、さらに上昇することが分かる。一方、外側領域では、２５ｍｓ後にはすでに、温度上昇が２℃未満でしかないことが分かる。このシミュレーションから、本発明に従って金属薄膜を加熱要素として使用することの２つの利点が分かる。すなわち、大きな表面（ここでは直径２００μｍの円筒）に金属薄膜を付着させることができること、および同時に、金属薄膜が非常に小さな体積（したがって非常に小さなサーミック・マス（ｔｈｅｒｍｉｃ  ｍａｓｓ））を有することができ、そのため、金属薄膜は、非常に短い時間（＜＜１ｓ）で再びほぼ完全に冷えることである。
【０１５１】
試験的改造
図３Ａは、加熱手段に電流を流すために電気パルスを発生させる制御装置としての電気回路の例１０を示す。この回路は、アース（ＧＮＤ）とＵ＋の間に（たとえば３０から１００Ｖの間の）電圧（本明細書で常に「Ｕ」として示される）が供給されるように構築されている。この電圧によって加熱手段は加熱される。Ｒ３「負荷」の位置に加熱手段が配置されており、そのためＲ３が加熱手段の抵抗器である。一例として使用されているパワーＭＯＳＦＥＴ  Ｑ（ＩＲＦＰ４４６８、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｃｔｉｆｉｅｒ）が、接点Ｔ２と接点Ｔ３の間に、加熱手段Ｒ３に電流が流れるような方式の低オーム接続を、スルー接続（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）で形成する。アースとＭＯＳＦＥＴのゲート（接点Ｔ１）との間に、制御端子ＦＥＴ  ＧＮＤ  ｒｔ／ｇｅを介して制御電圧が供給される。この制御電圧は、たとえばパルスもしくは周波数発生器またはデジタル−アナログ変換器によって提供される。ＭＯＳＦＥＴのクリーン・コネクション（ｃｌｅａｎ  ｃｏｎｎｅｃｉｔｏｎ）を可能にする、５Ｖ程度の電圧とたとえば１０から１０００μｓの間の継続時間とを有するパルスが特に適している。位置Ｃ１には、十分な静電容量、たとえば４ｍＦの静電容量と可能な最も小さいＥＳＲ値とを有するコンデンサーが提供されている。このコンデンサーは、すべての加熱要素の抵抗の合計が典型的には１Ω（オーム）未満である低オーム加熱手段であっても、熱パルスの継続時間の間、供給電圧が維持されることを可能にする。抵抗器Ｒ１、Ｒ２、Ｒ７およびＲ９の抵抗値はたとえば１、１００、２４および２４ｋΩ（キロオーム）である。
【０１５２】
図３Ｂは、本発明の一実施形態の断面を概略的にかつ簡略化された形で示す。この実施形態では、加熱手段が、電圧源１１に接続された連続線１２の部分によって形成されている。図を単純にするため、電気パルスを生成する装置は省略されている。加えて、この図面の倍率は一定ではない。線は、試料プレート１３内の試料液チャンバ（「ウェル」としても知られている）の形態の互いに分離された複数の反応容器を貫いて延びている。試料プレート１３は、２部分温度調節ブロック１４間に位置する。温度調節ブロック１４の機能は、試料液チャンバ内の反応体積をハイブリッド形成／伸長温度にすること、および反応体積をその温度に維持することである。この図に示された実施形態では、温度調節ブロック１４の下部のそれぞれの試料液チャンバの下方に、対応するそれぞれの反応体積中の染料を励起するための（この場合には光学低域フィルターを有する発光ダイオード１５の形態の）励起光源があり、温度調節ブロック１４の上部のそれぞれの試料液チャンバを覆って／の上方に、対応するそれぞれの反応体積中の励起された染料の蛍光を検出するための（蛍光を通す光学高域フィルターを備える）光センサーとしてフォトダイオード１６がある。
【０１５３】
図３Ｃは、本発明の別の実施形態の断面を概略的にかつ簡略化された形で示す。この実施形態は、図３Ｂの例示的な実施形態とは異なり、加熱要素が、電圧源１１に接続された線１２からなるコイルとして設計されている。図を単純にするため、パルスを生成する装置はこの図でも省略されている。コイルに巻かれた線の形態の加熱要素が、対応するそれぞれの反応容器内の反応体積と接触している。この図に加熱要素が示されている態様に反して、加熱要素は、反応体積によって完全に取り囲まれていることが好ましい。この例示的な実施形態の反応容器は、反応体積をハイブリッド形成／伸長温度にし、反応体積をその温度に保つための温度調節ブロック１４内に位置する反応管の形態の互いに分離された複数の試料液チャンバである。この図に示された実施形態では、温度調節ブロック１４の下部のそれぞれの試料液チャンバの下方に、反応体積中の染料を励起するための励起光源として発光ダイオード１５があり、それぞれの試料液チャンバの上方に、反応体積中の励起された染料の蛍光を検出するための光センサーとしてフォトダイオード１６がある。
【０１５４】
線状加熱要素を含む試料プレートの製作
図３Ｄは、線状加熱要素を含む本発明に基づく装置の試料プレートを構成する構成要素を概略的に示す。この図で使用されている加熱要素は、金めっきされた直径２５μｍの被覆線１２（約１μｍの金被覆を有する２３μｍのタングステン心線、ＬＵＭＡ  ＭＥＴＡＬＬ  ＡＢ（スウェーデン、Ｋａｌｍａｒ））の部分である。被覆線１２は、厚さ０．５ｍｍのアクリル・ガラス・プレート１７（中央の明色のプレート）に巻き付けられている。このプレートには７つの開口（６ｍｍ×６ｍｍ）があり、その中に試料液チャンバ（ウェル）が画定されている。この巻線によって、それぞれの試料液チャンバ内に平行な２つの層ができており、それぞれの層は平行な１５本の加熱要素を有する。このプレートがあるため、加熱手段のこれらの２つの層の距離は０．５ｍｍであり、１つの層内の加熱要素の距離は約０．４ｍｍである。両側から、試料液チャンバの受け入れ場所を有する両面接着箔１８（黒色で示されている。３Ｍの厚さ１００〜２５０μｍのＶＨＢ接着テープ）を用いて、等しい複数の開口を有する別のアクリル・ガラス・プレート１９（下プレートの厚さは０．５ｍｍ、上プレートの厚さは３ｍｍである）を、接着テープ１８の製造業者の指示に従ってプレート１７に貼り付け、押圧する。下方から、薄箔２０（この図では明色の接着ＰＣＲ箔シール、４ｔｉｔｕｔｅ）でそれぞれのウェルを閉じる。箔２０は、底部アクリル・ガラス・プレートに貼り付ける。このようにして、７つのウェルを有する試料プレートを形成する。これを通して平行な線１２を引っ張ることができる。線１２は、プレートの外側にある２つの端部で互いに接続されており（すなわちすべての線／加熱要素は並列に接続されてり）、電気的に接触している。このようにすると、すべてのウェルに電流パルスを直列で送ることが可能になる。次いで、試料プレートの（ここでは頂部の）開口を薄箔２１（明色で示されている）で閉じることができる。試料プレートの幅は２０ｍｍ、長さは９０ｍｍである（そのため、接触目的に必要な端部における線の３ｍｍの張出しを考慮した場合、熱パルスの電圧は実質的に約９６ｍｍの長さにわたって降下する）。
【０１５５】
大域温度上昇の測定
図３Ｅは、図３Ｄに基づく本発明の例示的な実施形態の反応体積中における大域温度上昇の測定結果を示す。図３Ｄで説明したとおりに製作した試料プレートのそれぞれのウェルに水１００μｌを入れる。さらに、温度センサーとしてＰＴ１００センサーを中央の１つのウェルに挿入する。３Ａの定電流を線に流した場合、水試料中において２００ｓで約４７℃の温度上昇が観察された（ハッシュ記号で描かれた曲線）。他方、本発明に従って、継続時間７０μｓの８０Ａの電流パルスを３ｓおきに線に流した場合（供給電圧３２Ｖ、線の負荷抵抗０．４Ω）、この測定法によって測定された水試料の大域温度上昇は１℃未満でしかなかった（丸で描かれた曲線）。
【０１５６】
ゲノム核酸を用いたＰＣＲおよび背景
図４は、ポリメラーゼ連鎖反応の結果を、図３Ｄに基づく本発明の例示的な実施形態の反応体積中でのゲノム核酸および対照の測定によって示す。図３Ｄで説明したとおりに製作した試料プレートのウェル内の加熱要素をフォワード・プライマーで官能基化する。官能基化にはフォワード・プライマーＩＤ１を使用する。チオールは金表面への結合に役立ち、最初の５つのチミン塩基は、実際のプライマー配列と金表面との間の空間または距離をより大きくし、それによってたとえば可能な立体障害ｘｘを防ぐためのスペーサ配列の役目を果たす。官能基化の前に、このようにして形成したオリゴヌクレオチドのチオール修飾基の保護基を脱保護する。この脱保護は、このオリゴヌクレオチドを、ＰＢＳ緩衝液（５ｍＭリン酸緩衝液、１０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中の濃度０．５μｍで１５分間、１ｍＭ  トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィンとともにインキュベートすることによって実施する。続いて、官能基化のためのＮａＣｌの最終濃度５００ｍＭに到達するためにＮａＣｌ（５Ｍ）を加える。脱保護されたオリゴヌクレオチドの懸濁液を用いて線を３時間インキュベートした後、結合していない過剰のオリゴヌクレオチドを除去するため、ＰＢＳ緩衝液を用いた洗浄ステップを２回実施する。このようにして調製されたプレートは増幅反応に使用可能である。
【０１５７】
ウェル当たり９０μｌの総体積で増幅反応を実施した。反応混合物は、Ｈ2Ｏ  ３６μｌ、１２０ｍＭ  ＭｇＣｌ2  ９μｌ、５×Ａｐｔａｔａｑ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｍａｓｔｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）  １８μｌ、５μｍリバース・プライマーＩＤ２  ９μｌ、ＴａｑＭａｎプローブ９μｌ、オリゴＩＤ３  ２μｍからなる。これに試料９μｌを加える。この試料は、ウェルによって、煮沸したゲノム核酸または水だけを含む。フォワードおよびリバース・プライマーならびにＴａｑＭａｎプローブは、抵抗性遺伝子ＭｅｃＡが増幅および検出されるように選択した。この遺伝子はたとえばメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）のゲノム中に存在する。
【０１５８】
このプレートを、アルミニウムでできた２つの温度調節ブロック間に置く。下ブロックの温度は６５℃、上ブロックの温度は７０℃である。この温度差は、上カバー箔上での凝縮物形成を防ぐのに役立つ。図３Ａに対応する加熱要素を含む加熱手段を回路の位置Ｒ３に配置する。ここではこの加熱手段が電圧Ｕ＋＝３２Ｖで動作する。この加熱線は０．４Ωの負荷抵抗を形成し、この負荷抵抗には、続くＰＣＲ中に、長さ７０μｓの電気パルスが３ｓおきに送られる。
【０１５９】
ＴａｑＭａｎフォーマットのリアルタイム検出のために、下温度調節ブロックには、励起発光ダイオード、および中心波長４７８ｎｍ、ＦＷＨＭ２９ｎｍの対応する帯域フィルター（ＥＴ４８０／３０ｘ、米国Ｃｈｒｏｍａ  Ｉｎｃ．）があり、上温度調節ブロックには、フォトダイオード、および通過エリア５１５〜７００ｎｍの光学フィルター（ＥＴ５１０ｌｐ、米Ｃｈｒｏｍａ  Ｉｎｃ）がある。
【０１６０】
上述のＰＣＲの結果は図４に示されている。この図には、ＰＣＲプロセス中の蛍光信号Ｉの（ＰＣＲ開始時の蛍光ベース信号Ｉ0に対する）変化百分率が示されている。第１のウェルでは、ＭＲＳＡから分離されたゲノム核酸の１０6個のコピーを試料として使用した。このゲノム核酸はＭｅｃＡ遺伝子、したがってこのＰＣＲのターゲット配列を含むため、約１９０ｓのＰＣＲ継続時間の後、対応する蛍光曲線（実線）は増大している。これは、この時には、ベース蛍光から識別することができる信号を生成するのに十分な量の大量のアンプリコンが形成されている（したがって、ポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性によって十分な量の大量のＦＡＭ染料がＴａｑＭａｎプローブから放出されている）ためである。第２のウェルでは、同じ生物からのターゲット核酸を、量を１／１００にして使用した。対応する蛍光曲線（粗い破線）は遅れて２２０ｓのＰＣＲ継続時間以降に増大する。したがってこの方法は、（ｑＰＣＲの通例のとおり）使用したターゲット濃度と蛍光曲線の増大の時間との間の相関を可能にする。第３のウェルでは、反応混合物に加え、負の対照として水だけを加え（細かい破線）、第４のウェルでは、このＰＣＲの特異性を実証するために、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（大腸菌。この菌のゲノムはＭｅｃＡ遺伝子を含まない）から分離されたゲノム核酸の１０6個のコピーを試料として使用した（点線）。これらの蛍光曲線（水：細かい破線、大腸菌：点線）はいずれも有意な増大を示さなかった。最後に、第５のウェルでは、ＭＲＳＡから分離されたゲノム核酸の１０4個のコピーと大腸菌から分離されたゲノム核酸の１０4個のコピーの両方を試料として使用した。対応する蛍光曲線（一点鎖線）は、ＭＲＳＡから分離されたゲノム核酸の１０4個のコピーだけを含む第２のウェルの試料の蛍光曲線と同様の振舞いを示す。このことは、大腸菌核酸の存在がＭＲＳＡ核酸の増幅を抑制しないことを示している。加えて、同様の増幅実験で、生成されたアンプリコンの量の外部数量化（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を、従来のサーモサイクラ（Ｒｏｃｈｅ  Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ  １．５）の助けを借りて実施した。そのために、蛍光曲線の増大が認識可能になったすぐ後に上述のＰＣＲプロセスを中断し、試料を取り出し、水で１：１００に希釈し、この希釈試料１μｌをｑＰＣＲに挿入した。このｑＰＣＲは、上述のＰＣＲの場合と同じプライマー配列を使用する（ここではフォワード・プライマーだが、チオールおよび５Ｔスペーサ配列を含まない）。既知のターゲット濃度の一連の希釈列との比較により、明らかな信号増大の時点で、反応中に約３ｎＭ（ナノモル濃度ないしナノモル／リットル）のアンプリコン濃度が存在したとの結果が得られた。このことはさらに、すべて他のサーモサイクラの場合に蛍光に基づいて識別することができる信号に対する典型的な領域であり、このことはさらに、実行されたＰＣＲ中に、所望のアンプリコンが非常に大量に生成されたことを明らかに示している。図３Ｅとの比較は、所与の条件（供給電圧３２Ｖ、線の負荷抵抗０．４Ω）下で、２００ｓ以内に検出されうる反応体積の大域温度上昇は＜１℃でしかなく、したがって反応体積の変性温度（約９５℃）に到達することを妨げることができることを示している。しかしながら、チオール修飾基を有するフォワード・プライマーを用いた官能基化によってアンプリコンは依然として加熱要素に結合している。加熱ステップ中および電気パルス中の加熱要素における局所温度は、アンプリコンの変性を達成するのに十分な高い温度であることは明らかである（ここには示されていない。反応混合物に加えられているが、線には結合していない、配列ＩＤ４を有する修飾されていない遊離のフォワード・プライマーを、他の条件は全く同じにして、チオール修飾基を有するフォワード・プライマーの代わりに使用した場合、増幅を観察することはできない。したがって、局所加熱の場合、増幅反応は、好ましくは局所加熱要素上に限局され、これによりフォワード・プライマーは加熱要素上に固定されている）。
【０１６１】
体積電力密度が異なる場合の測定
図５Ａから５Ｃは、供給電圧に対するＰＣＲ成績の依存性を、本発明の例示的な実施形態の助けを借りて示す。供給電圧は、式
【数２４】
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に従って体積加熱密度を変化させる。ここでは、加熱手段に異なる電圧を供給する一連の測定を実施した。パラメーターおよび反応混合物組成は図４の例示的な実施形態のものと全く同じである。１つのウェルでは、試料として水を負の対照として使用し（破線の蛍光曲線）、さらに、２つのウェルでは、配列ＩＤ５を有する合成ターゲット核酸を、反応開始時のターゲット核酸の最終濃度がそれぞれ１００ｆＭ（フェムトモル濃度ないしフェムトモル／リットル）になるような濃度で使用した（正の対照。実線の蛍光曲線）。ターゲット核酸は、選択したプライマー対によって増幅することができるＭｅｃＡ遺伝子のカットアウト（ｃｕｔ−ｏｕｔ）である。第１の測定（図５Ａの蛍光曲線）では、供給電圧が２６Ｖであり、信号の増大はほとんどみられない。第２の測定（図５Ｂの蛍光曲線）では、供給電圧が２８Ｖであり、正の対照はこの場合に、ほぼ平坦ながら増大し、後になって立ち上がる弱い信号を示す。第３の測定（図５Ｃの蛍光曲線）では、電圧が３６Ｖであり、２つの正の対照はこの場合に、約１８０ｓのＰＣＲ継続時間以降、明らかに鋭く急に増大し、負の対照はこれによる信号を示さない。この一連の測定は、加熱要素上でアンプリコンの必要な変性温度に局所的に到達するためには、加熱手段によって反応体積中に運ばれる熱が十分に大きくなければならないことを示している。
【０１６２】
図５Ｄから５Ｇは、一連の測定の結果を示す。この測定では、上の図３Ｄの説明で示したとおりに試料プレートを正確に製作した。しかしながら、試料プレートごとに異なる数の線を使用した。図５Ｄでは３本、図５Ｅでは５本、図５Ｆでは１０本、図５Ｇでは３０本の線を使用した（これらの線は、試料プレートの全長にわたって並列に接続した。線の抵抗は３７００、２１００、２２１０および４００ｍΩ（ミリオーム）である）。ＰＣＲを実行するために、対応する化学薬品および緩衝液を、図４に関して本文に記載したとおりに使用した。熱パルスを発生させるために、電圧Ｕ＋＝４０Ｖ、パルス継続時間４０μｓ、およびパルス繰返し速度（すなわちＰＣＲサイクル継続時間）３ｓのうちの１つを使用した。下温度調節ブロックの温度は６３℃、上ブロックの温度は６８℃とした。ターゲット核酸として合成ＤＮＡ  ＩＤ５を使用した（実線）。ＩＤ５の反応開始時の濃度は１ｆＭである。負の対照ではターゲットを使用しなかった（破線）。試料プレート内で線を３本だけ使用したときには（第１の測定、図５Ｄの蛍光曲線）、正の対照でさえ信号の増大はみられない（すなわちＴａｑＭａｎ信号がみられない。すなわち増幅が起こっていない）ことが分かる。試料プレート内の線が５本の場合（図５Ｅ）、正の対照は弱い信号を示す。試料プレート内の線が１０本の場合（図５Ｆ）、信号はかなり大きいが、それでも、通常の本数（すなわち３０本）を使用した第４の測定（図５Ｇ）に比べればかなり弱い。
【０１６３】
ハニカム構造を有する加熱要素
図６Ａから６Ｃは、ハニカム構造の加熱手段の一実施形態を示す。この加熱手段の製作では、光化学的微細エッチング法によってステンレス鋼箔からハニカム構造を製作し、続いてそのハニカム構造を金でコーティングする。この例示的な実施形態のハニカム構造は六角格子だが、当然ながら他の格子も考えられる。電流は、この構造をその全長ｘｘに沿って流れる。図６Ａに示されているように、試料チェンバのエリアにだけ、したがって箔が加熱要素を形成しているところにだけ、ハニカム構造をエッチングした。加熱要素の長さｆはたとえば８．２ｍｍであり、加熱要素間の距離ｇはたとえば３．８ｍｍである。加熱要素のできるだけ均一に焼き戻されたエリアだけを使用するために、試料チェンバは、加熱要素の上方の加熱要素の中心に配置されることが好ましく、加熱要素よりも小さな寸法（たとえば６ｍｍ×６ｍｍ）を有することが好ましい。箔の全長ｈはたとえば１００ｍｍである。すなわち電気的接触は短辺において実施される。そのため、電圧は、約１００ｍｍの長さにわたって降下する。ハニカム構造のウェブは、ウェブを流れる電流によって加熱され、ウェブに結合した２本鎖核酸を変性することができる。
【０１６４】
図６Ｂは、図６Ａの加熱要素のハニカム構造および隣接する縁の拡大図である。この例示的なハニカム構造では、ハニカム構造内で全体としてできるだけ均一な電流密度、したがって体積加熱密度が達成されるように、ウェブ幅が構成されている。この例示的な実施形態では、このことが、縦方向のウェブの幅ｄを横方向のウェブの幅ｂの正確に２倍にすることで達成される。寸法の例は、ハニカム直径ａが０．８７ｍｍ、横方向のウェブの幅ｂが０．０６５ｍｍ、ウェブの長さｃが０．５ｍｍ、縦方向のウェブの幅ｄが０．１３ｍｍ、長縁３の幅が０．５７ｍｍである。長縁ａはとりわけ機械的安定性に寄与し、ハニカム構造とは異なる電流密度を経験する。
【０１６５】
図６ｃは、図４と同様に、ＰＣＲプロセス中の蛍光信号Ｉの（ＰＣＲ開始時の蛍光ベース信号Ｉ0に対する）変化百分率を示す。図４の例とは対照的に、ここでは、使用される加熱要素が、図６Ａおよび６Ｂに示された構造を有する、約０．５μｍの金でコーティングされたステンレス鋼箔（箔厚２０μｍ）である。この金めっきされた格子は、図３Ｄの例示的な実施形態でも使用された７つのウェル開口を有する２枚のアクリル・ガラス・プレート（下プレートの厚さは０．５ｍｍ、上プレートの厚さは３ｍｍである）間に貼り付けられている。したがってここでも、以前の図３Ｄの例示的な実施形態と同様に、加熱手段が横断した試料プレートがある。ハニカム構造は、プレートの外側にある２つの端部のところで電気的に接触されている。これにより、すべてのウェルに電流パルスを直列で送ることが可能になる。続いて、試料プレートの開口を薄箔で閉じることができる。ハニカム構造の官能基化は、図３Ｄおよび４のタングステン−金被覆線の官能基化と同様に実現される。反応体積はウェル当たり６０μｌであり、反応混合物の組成および濃度は図４の組成および濃度に対応する。供給される電圧は４１Ｖ、負荷抵抗は０．３５Ωである。ここでは、ＰＣＲ中に、継続時間１５０μｓの電気パルスを１０ｓおきに加熱要素に流した。ステンレス鋼は、以前の例で被覆線の心線としたタングステンよりもかなり劣った電流導体であるため、この例でステンレス鋼の加熱要素を使用するときには、より高い電圧とより長い加熱継続時間の両方を使用する。図６Ｃには、３つのウェルからの蛍光曲線が示されている。試料として水を使用した負の対照は信号の増大を示さず（点線の蛍光曲線）、配列ＩＤ５を含む合成核酸ターゲットを高い初期濃度（１００ｆＭ）で含む試料は、４００ｓのＰＣＲ継続時間以降、蛍光信号の増大を示し（実線の蛍光曲線）、配列ＩＤ５を含む合成核酸ターゲットを低い出発濃度（１ｆＭ）で含む試料は、遅れて蛍光信号の増大を示す（破線の蛍光曲線）。
【０１６６】
ブリッジＰＣＲ
図７の例示的な実施形態では、加熱手段の表面に両方のプライマー（フォワード・プライマーおよびリバース・プライマー）がある。この例示的な実施形態の手順は実質的に図４の例示的な実施形態の手順に対応する。しかしながら、加熱手段の官能基化には、フォワード・プライマーＩＤ６  １部とリバース・プライマーＩＤ７  ３部の混合物を使用した（脱保護中のこれらの２つのプライマーの合計濃度は０．５μｍである）。これらのプライマーはともにチオール修飾基を担持している。チオール修飾基は、加熱手段の表面での固定化に役立つ。フォワード・プライマーは、スペーサ配列に加えて、スペーサ配列とプライマー配列の間に２つのアベーシック修飾基ｓｐａｃｅｒ９を担持している。これは、ポリメラーゼによるスペーサ配列の上書きを防ぐ。リバース・プライマーはすでに加熱要素上に存在しているため、もはや反応体積中に存在する必要はない。これに対応して不足する反応体積の体積は水で置き換えられている。図７の蛍光曲線は、水を含む負の試料（破線）および配列ＩＤ５を含む合成核酸ターゲットを出発濃度１００ｆＭで含む正の試料（実線）の信号パターンの推移を示す。実際に、この図の蛍光信号は、これまでの例示的な実施形態における信号よりもかなり小さいが、４５０ｓのＰＣＲ継続時間以降は、この場合も、正の試料の信号が負の試料に比べて増大していることが明らかに分かる。この例示的な実施形態は、両方のプライマーが表面に固定されたＰＣＲプロセス（「ブリッジＰＣＲ」。Ｋａｗａｓｈｉｍａ他の国際公開第１９９８／０４４１５１Ａ１号パンフレットおよびＡｄａｍｓ他の米国特許第５６４１６５８号明細書を参照されたい）が本発明に基づく方法で機能することを示している。
【０１６７】
本発明をそのさまざまな実施形態で実現するために、以上の説明、特許請求の範囲および図面に開示された特徴は、個別におよび所望の組合せで重要となりうる。
【符号の説明】
【０１６８】
１  加熱手段の線の形態の加熱要素
２  電圧源
３  電気パルスを発生させる装置
４  時間ベースの電流推移の図解
５  プライマー
６  遊離のターゲット核酸
７  プライマーに結合したターゲット核酸
８  核酸２本鎖
９  伸長したプライマー
１０  電気回路
ＧＮＤ  電気回路のアース接続
Ｕ＋  電気回路の電圧供給接続
Ｑ１  電気回路のＭＯＳＦＥＴ
Ｔ１  ＭＯＳＦＥＴ  Ｑ１のゲート端子
Ｔ２  ＭＯＳＦＥＴ  Ｑ１のドレイン端子
Ｔ３  ＭＯＳＦＥＴ  Ｑ１のソース端子
Ｃ１  電気回路のコンデンサー
ＦＥＴ  ＧＮＤ  電気回路の制御端子
Ｒ１  電気回路の抵抗器
Ｒ２  電気回路の抵抗器
Ｒ３  加熱手段
Ｒ７  電気回路の抵抗器
Ｒ９  電気回路の抵抗器
１１  電圧源
１２  線
１３  試料プレート
１４  温度調節ブロック
１５  発光ダイオード
１６  フォトダイオード
１７  アクリル・ガラス・プレート
１８  両面接着フィルム
１９  アクリル・ガラス・プレート
２０  薄膜（底部）
２１  薄膜（頂部）
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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